Alkol düzeyi belirleme yönteminin validasyonu ve toplumumuzda alkol metabolize eden enzim polimorfizmi
Validation of alcohol determination method and polymorphisms of alcohol metabolizing enzymes in our population
Yazar: ŞEBNEM ŞEFİKA ÇEÇEN
Danışman: PROF.DR. TÜLİN SÖYLEMEZOĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Adli Tıp Ana Bilim Dalı / Adli Kimya ve Adli Toksikoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine

Özet:
ÖZETAlkol Düzeyi Belirleme Yönteminin Validasyonu Ve Toplumumuzda Alkol MetabolizeEden Enzim PolimorfizmiŞebnem Şefika ÇeçenÇalışmamızın ilk bölümünde biyolojik materyalde alkol tespiti için kurulan headspace gazkromatografi yönteminin validasyonu gerçekleştirildi. Kalibrasyon eğrisini çizmek amacıylaetanolün ve metanolün sudaki 400, 300, 200, 100 ve 50 mg/100 ml'lik stok çözeltilerihazırlandı. Tüm stok çözeltiler üçer defa analiz edilerek kalibrasyon grafiği hazırlandı.Tekrarlanabilirlik çalışmaları sonucunda her üç konsantrasyon için (50, 200, 400 mg/100 ml)SD, CV ve RSD değerleri hesaplandı. Tüm RSD değerleri <5 olarak bulundu. Bu da yöntemintekrarlanabilirliğinin çok iyi olduğunu gösterdi. Su, idrar, kan ve tükrükten katma yöntemi ileyapılan verim hesabı çalışmaları sonucunda yöntemin geri-kazanılabilirliğinin %90'nınüzerinde olduğu gözlemlendi. Hassasiyet çalışmalarında seyreltmelerle LOD ve LOQ(metanol için sırasıyla 1.56 mg/100 ml ve 5.148 mg/100 ml; etanol için 0.781 mg/100 ml ve2.577 mg/100 ml) olarak hesaplandı. Yapılan tüm bu validasyon çalışmaları ile yöntemingüvenilirliği sağlandı.Çalışmamızın ikinci bölümünde Türk toplumundan 77 gönüllü bireyin kan örnekleritoplanarak alkol metabolize eden ADH2 ve ALDH2 gen polimorfizmi PCR-CTPP yöntemi ileçalışıldı. Yapılan deneyler sonucunda homozigot ADH2*1/1 bireylerin jel görüntülerinde 219ve 459 bp'lik oligonükleotidler gözlenirken (n=70, %90.9), heterozigot ADH2*1/2 genotiplibireylerin (n=7, %9.09) jel görüntülerinde 219, 280 ve 459 bp uzunluğunda amplifikasyonürünleri gözlenmiştir. Çalışmalarımız sonucunda homozigot ADH2*2/2 genotipli bireyerastlanmamıştır. Toplumumuzda ALDH2 gen polimorfizmini belirlemek amacıyla iki farklıçalışma grubunun geliştirdikleri yöntem karşılaştırmalı olarak çalışılmıştır. lk çalışmagrubunun geliştirdiği yöntemle yapılan ALDH2 gen polimorfizmi çalışmalarında tümpopulasyon homozigot ALDH2*1/1 genotipli olduğu için jel üzerinde 296 ve 455 bp'likürünler gözlenirken ikinci çalışma grubunun geliştirdiği yöntemle aynı bireylerin jelgörüntülerinde 219 ve 176 bp'lik oligonükleotid uzunlukları gözlenmiştir.Anahtar Kelimeler: Headspace gaz-kromatografi, yöntem validasyonu, ADH2 genpolimorfizmi, ALDH2 gen polimorfizmi, PCR-CTPP

Abstract:
SUMMARYValidation of Alcohol Determination Method and Polymorphisms of AlcoholMetabolizing Enzymes In Our PopulationŞebnem Şefika ÇeçenFor the first part of our study we aimed to validate headspace gas chromatographic method todetermine alcohol in biological materials. To set up calibration curve, standards wereprepared with increasing ethanol and methanol concentrations: 50, 100, 200, 300, 400 mg/dland were injected three times. CV, SD and RSD were used to determine the reproducibility ateach concentration (low 50 mg/dl, medium 200 mg/dl and high 400 mg/dl). RSD values werefound to be all below 5 indicating a good reproducibility. Recovery studies were performedby spiking free water, blood, urine and saliva specimens with 200 mg/dl ethanol. A recoveryrate of over 90% was obtained. LOD and LOQ values (for methanol 1.56 mg/100 ml and5.148 mg/100 ml; for ethanol 0.781 mg/100 ml and 2.577 mg/100 ml respectively) weredetermined. Reliability was provided by these validation procedures.For the second part of our study, we aimed to determine genetic polymorphisms ofthe two alcohol metabolizing enzymes ADH2 and ALDH2 in 77 volunteers selected randomlyfrom Turkish population. Oligonucleotides of 219 and 459 bp length were screened forindividuals with ADH2*1/1 genotypes (n=70 %90.9) whereas oligonücleotides of 219, 280and 459 bp length were observed for the heterozygote ADH2*1/2 (n=7, %9.09) volunteers.To determine genetic polymorphism of ALDH2, we established two different methods. Withthe first procedure oligonucleotides with 296 and 455 bp length; and with the second method219 and 176 bp length PCR products were observed. Results showed that Turkish populationwas all homozygotes for ALDH2*1/1 allele.Key Words: Headspace gas-chromatography, method validation, genetic poymorphism ofADH2, genetic poymorphism of ALDH2, PCR-CTPP.