Süperkritik akışkan karbondioksit ekstraksiyonu ile elde edilen bazı bitkisel özütlerin biyojen amin oluşumu üzerine etkilerin değerlendirilmesi
Evaluation of the effects of certain plant extracts obtained by supercritical fluid carbon dioxide extraction on biogenic amine formation
Yazar: MUSTAFA HAMZA MAWLOOD AL BAYATI
Danışman: PROF. DR. MEHMET FATİH CENGİZ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Enzim ve Mikrobiyal Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyojenik aminler = Biogenic amines ; Ekstraksiyon =   ; Süperkritik özütleme = Supercritical extraction ; Özüt = Extract

Özet:
Biyojen aminler, bitki, hayvan ve mikroorganizmaların metabolik faaliyetleri sonucu oluşan, düşük moleküler ağırlığa sahip biyolojik olarak aktif organik bileşiklerdir. Gıdalarda, özellikle et ürünlerinde mikroorganizmalar ile etkileşime giren aminoasitlerin dekarboksilasyonu veya aldehit ve ketonların aminasyon ve transaminasyonu ile meydana gelmektedirler. Bu aminler, insan sağlığı üzerinde kanser, hipertansiyon ve alerjik reaksiyonlara neden oldukları literatürde bildirilmektedir. Gıda maddelerinde bulunan biyojen aminlerin oluşumunun engellenmesi ve uzaklaştırılması konusunda ultraviyole, gamma irradiasyon, depolama koşullarının optimizasyonu gibi teknikler önerilmekle birlikte ortamda bulunan bazı aktif bileşiklerin de biyojen amin azaltımı üzerine ciddi etkileri bulunmaktadır. Bu kapsamda gerçekleştirilen bu tez çalışmasının amacı; son zamanlarda bitkisel aktif maddelerin özütlemesi konusunda yenilikçi ve çevreci bir yöntem olan süperkritik akışkan karbon dioksit (SKA-CO2) ekstraksiyonu yöntemi kullanılarak elde edilen bitki özütlerinin et ürünlerinde oluşan biyojen aminler üzerine etkilerinin değerlendirilmesidir.
Belirtilen amaç doğrultusunda öncelikle biyojen amin üzerine etki gösterebileceği öngörülen kekik (Origanum onites), karabiber (Piper nigrum), kırmızı biber (Capsicum annuum L.) ve kimyon (Cuminum cyminum) bitkileri tedarik edilmiş ve bu bitkilerin özütleri cevap yüzey yöntemi yardımıyla optimize edilen SKA-CO2 ekstraksiyon yöntemi kullanılarak elde edilmiştir. Numunelerdeki aktif bileşenler Yüksek Performans Sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. İn-vitro ortamda biyojen amin oluşumunun sağlanması için tirosin, lisin, histidin ve ornitin içeren dekarboksilaz sıvısı hazırlanmış ve bu dekarboksilaz sıvısına bakteriler (Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus) aşılanmıştır. Elde edilen her bir dekarboksilaz sıvısında oluşan biyojen amin tür (dopamin (DOP), putresin (PUT), kadaverin (CAD), triptamin (TYP), feniletilamin (PHEM), spermidin (SPM), spermin (SPR), histamin (HIS) ve tiramin (TYR)) ve düzeyleri HPLC yöntemi ile analiz edilmiştir. Oluşan biyojen aminlerin inhibisyonu konusunda farklı tür ve düzeylerde hazırlanan bitkisel özütler uygulanmış ve özütlerin gerek mikroorganizmalar gerekse oluşan biyojen aminler üzerin etkinlikleri değerlendirilerek en etkili bulunan özüt tür ve düzeyi gerçek numuneler üzerine tatbik edilmiştir. Bu amaçla kıyma haline getirilmiş et numunesine mikroorganizmalar ile birlikte bitki özütü ilave edilerek farklı sıcaklık ve sürelerde et numunesinde meydana gelen biyojen amin değişimleri incelenmiştir. Numunelerde biyojen amin analizlerine ilave olarak mikrobiyal, kimyasal, fiziksel ve duyusal analizler de gerçekleştirilmiştir.
Bitkisel özütlerde bulunan en etkili aktif maddeler kimyon, kırmızı biber, karabiber ve kekik bitkileri için sırasıyla kuminaldehit, kapsaisin, piperin ve karvakrol bileşikleri olarak bulunmuştur. Dekarboksilaz sıvılarında biyojen amin üretimi üzerinde yapılan analizlerde, E. coli'in en yüksek biyojen amin üretim kapasitesine sahip olduğu sonucuna varılmıştır. Benzer şekilde dekarboksilaz sıvısında meydana gelen biyojen aminler üzerine özütlerin farklı etkiler göstermesine rağmen en etkili özütün %0.5 düzeyindeki kekik özütü olduğu belirlenmiştir. Dekarboksilaz sıvısında elde edilen veriler ışığında gerçek numune olarak et numunesinde biyojen amin oluşturabilmek amacıyla E. coli mikroorganizması ve bu mikroorganizma ve oluşan biyojen aminleri inhibe edebilmek için farklı düzeylerde kekik özütü kullanılmıştır. Elde edilen bulgulara göre, %0.5 konsantrasyonda kekik özütü, toplam biyojen amin içeriğini 106.38 mg'dan 34.84 mg'a düşürerek önemli bir azalma sağlamış ve aynı zamanda PUT, CAD, HIS ve TYR gibi biyojen aminlerde önemli düzeylerde azalmalara yol açmıştır. 
İlave edilen kekik özütünün etin fizikokimyasal ve duyusal özelliklerine olan etkileri bağlamında %0.5 kekik özütü eklenilmiş E. coli içermeyen ve içeren örneklerde serbest yağ asitliği (SYA) seviyeleri sırasıyla %3.08'den %2.26'ya, ve %3.58'den %2.52'ye düşmüştür. Aynı koşullarda toplam uçucu baz azot (TVB-N) seviyeler için bu değerler sırasıyla 25.76 mg N/100 g'dan 15.74 mg N/100 g'a ve 27.82 mg N/100 g'dan 18.56 mg N/100 g'a azalmıştır. TBARS değerleri için ise, aynı koşullarda 1.03 mg MDA/kg'dan 0.74 mg MDA/kg'a ve 1.18 MDA/kg'dan 0.84 MDA/kg'a düşmüştür. E. coli içermeyen ve %0.5 kekik özütü içeren örneklerde, en yükseksu tutma kapasitesi (STK) seviyesi (%31.14) göstermiştir. Toplam aerobik bakteri sayısı (TAB) ise, kekik özütü konsantrasyonları arttıkça genellikle düşüş göstermekle birlikte E. coli içeren örneklere %0.5 kekik özütü ilave edilmesiyle TAB sayısı 9.63'den 7.28 log kob/g'a azalmıştır. Benzer şekilde bu değerler psikrotrofik bakteri ve koliform bakteriler için sırasıyla 8.14'ten 6.48 log kob/g ve 4.25'ten 3.29 log kob/g olarak tespit edilmiştir. Ürün kalite özelliklerinden olan duyusal testlerde ise %0.25 kekik özütünün, farklı depolama sürelerinde kalite parametrelerinde iyileştirerek tat ve aroma ve genel kabul açısından duyusal kabul için en uygun değer olduğu sonucuna varılmıştır. 
Elde edilen sonuçlar, kekik özütünün konsantrasyonuna bağlı olarak patojenik mikroorganizmaların büyümesini önleme ve engelleme ile birlikte biyojen aminlerin oluşumunu da azaltma yeteneğine sahip olduğuna ve aynı zamanda etin kalite kriterleri üzerine de olumlu etkiler gösterdiğine işaret etmektedir.

Abstract:
Biogenic amines are biologically active organic compounds with low molecular weight that are formed as a result of the metabolic activities of plants, animals, and microorganisms. In foods, especially in meat products, they are formed through the decarboxylation of amino acids interacting with microorganisms or through the amination and transamination of aldehydes and ketones. These amines are reported in the literature to cause cancer, hypertension, and allergic reactions in humans. Various techniques such as ultraviolet, gamma irradiation, and optimization of storage conditions are suggested to prevent and eliminate the formation of biogenic amines in foodstuffs. Additionally, some active compounds present in the environment have significant effects on reducing biogenic amines. This thesis aims to evaluate the effects of plant extracts obtained using supercritical fluid carbon dioxide (SFE-CO2) extraction, an innovative and environmentally friendly method for extracting plant active substances, on biogenic amines formed in meat products.
	In line with this aim, thyme (Origanum onites), black pepper (Piper nigrum), red pepper (Capsicum annuum L.), and cumin (Cuminum cyminum), which are predicted to affect biogenic amines, were procured. Extracts of these plants were obtained using the SFE-CO2 extraction method optimized with the response surface method. The active components in the samples were determined using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). To induce the formation of biogenic amines in vitro, a decarboxylase liquid containing tyrosine, lysine, histidine, and ornithine was prepared and inoculated with bacteria (Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus). The types (dopamine (DOP), putrescine (PUT), cadaverine (CAD), tryptamine (TYP), phenylethylamine (PHEM), spermidine (SPM), spermine (SPR), histamine (HIS), and tyramine (TYR)) and levels of biogenic amines formed in each decarboxylase liquid were analyzed using the HPLC method. Different types and levels of plant extracts were applied to inhibit the biogenic amines formed, and the efficacy of the extracts on both the microorganisms and the formed biogenic amines was evaluated. The most effective type and level of extract were then applied to real samples. For this purpose, plant extracts were added to minced meat samples along with microorganisms, and the changes in biogenic amines in the meat samples were examined at different temperatures and durations. In addition to biogenic amine analyses, microbial, chemical, physical, and sensory analyses were also conducted on the samples.
	The most effective active compounds in the plant extracts were found to be cuminaldehyde for cumin, capsaicin for red pepper, piperine for black pepper, and carvacrol for oregano. Analyses conducted on the production of biogenic amines in decarboxylase liquids revealed that E. coli had the highest biogenic amine production capacity. Despite the different effects of the extracts on biogenic amines formed in the decarboxylase liquid, oregano extract at a 0.5% level was found to be the most effective. Based on the data obtained from the decarboxylase liquid, E. coli was used to form biogenic amines in real meat samples, and different levels of oregano extract were used to inhibit this microorganism and the formed biogenic amines. According to the findings, a 0.5% concentration of oregano extract significantly reduced the total biogenic amine content from 106.38 mg to 34.84 mg and caused significant reductions in biogenic amines such as PUT, CAD, HIS, and TYR.
	Regarding the effects of the added oregano extract on the physicochemical and sensory properties of the meat, in samples without E. coli and with 0.5% oregano extract, the free fatty acid (FFA) levels decreased from 3.08% to 2.26%, and from 3.58% to 2.52% in samples with E. coli. Similarly, total volatile basic nitrogen (TVB-N) levels decreased from 25.76 mg N/100 g to 15.74 mg N/100 g, and from 27.82 mg N/100 g to 18.56 mg N/100 g under the same conditions. For TBARS values, the same conditions resulted in decreases from 1.03 mg MDA/kg to 0.74 mg MDA/kg and from 1.18 mg MDA/kg to 0.84 mg MDA/kg. The highest water-holding capacity (WHC) level (31.14%) was observed in samples without E. coli and with 0.5% oregano extract. The total aerobic bacteria count (TAB) generally decreased as the concentration of oregano extract increased, with the TAB count reducing from 9.63 to 7.28 log CFU/g when 0.5% oregano extract was added to samples containing E. coli. Similarly, these values for psychrotrophic bacteria and coliform bacteria were found to be 8.14 to 6.48 log CFU/g and 4.25 to 3.29 log CFU/g, respectively. In sensory tests evaluating product quality characteristics, 0.25% oregano extract was found to be the most suitable concentration for sensory acceptance in terms of improving quality parameters over different storage periods, enhancing taste, aroma, and overall acceptance.
	The obtained results indicate that oregano extract, depending on its concentration, has the ability to prevent and inhibit the growth of pathogenic microorganisms, reduce the formation of biogenic amines, and positively affect the quality criteria of meat.