Deneysel testis torsiyonu modelinde hidrojen sülfürün etkinliğinin araştırılması /
Yazar: SEÇİL YÜKSEL
Danışman: PROF. DR. ERBUĞ KESKİN
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Çocuk Cerrahisi = Pediatric Surgery
Dizin: Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hidrojen sülfür = Hydrogen sulfide ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; Spermatik kord torsiyonu = Spermatic cord torsion ; Sıçanlar = Rats ; Testiküler hastalıklar = Testicular diseases ; Testis = Testis ; İskemi = Ischemia

Özet:
Amaç: Testis torsiyonu spermatik kordun vertikal eksende dönmesi ile testis ve yapılarının kanlanmasının bozulmasına bağlı olarak testiste kalıcı iskemik hasara sebep olabilen akut seyirli, her yaşta görülebilen ve hızlı tanı ve tedavi gerektiren ürolojik acil bir durumdur. Doğru teşhis konulamaz, uygun ve erken tedavi yapılmazsa geri dönüşümsüz testis kaybı ile sonuçlanabilmektedir. Testis hasarının oluşmasında iskeminin etkisi ile birlikte testisin detorsiyonu sonrasıda gelişen reperfüzyonun da etkisi vardır. Testis torsiyonunda bu iskemi/reperfüzyon hasarını azaltmak için birçok tedavi yöntemi denenmekte ve araştırılmaktadır
Hidrojen sülfür (H₂S)  renksiz, yanıcı, uçucu ve karakteristik çürümüş yumurta kokusuna sahip suda çözünebilen bir gazdır. Uzun yıllar toksik bir gaz olduğu bilinen  H₂S' in daha sonra Kımura ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalarda organizmada endojen olarak sentezlendiği ve birçok fizyolojik ve patolojik süreci etkilediği saptanmıştır. Wang ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalar sonrası karbon monoksit  (CO) ve nitrik oksit (NO)'ten sonra üçüncü gazotransmitter olarak kabul edilmiştir.  H₂S' in  kardiyovasküler sistemin düzenlenmesinde, hücre proliferasyonu ve apoptozunda, glukoz metabolizmasında, nörotransmisyonda, inflamasyonda ve damar yataklarında gevşetici etki gösterdiği çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir.
 Son zamanlarda yapılan çalışmalarda H₂S tedavisinin oksidatif stresin neden olduğu doku hasarını iyileştirdiği ve iskemi /reperfüzyon hasarınının önlenmesinde rolü olduğu gösterilmiştir. Özellikle enflamasyonun düzenlenmesi konusunda önemli bir rol oynadığı ve doğru oranda kullanılan hidrojen sülfidin iskemi / reperfüzyon hasarına karşı inhibitör-enflamatuvar sitokinlerin salınmasını sağlayarak antiinflamatuar, antioksidan ve ayrıca antifibrotik aktiviteye katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Bu özelliği  ile  hidrojen sülfür iskemi /reperfüzyon , şok, sepsis tedavisinde de kullanılabilir.              
 Testis torsiyonuna bağlı iskemi / reperfüzyon hasarı sonrası testislerde meydana gelen histolojik ve fonksiyonel değişiklikleri ve farklı tedavi metodlarını inceleyen çok sayıda yayın bulunmaktadır.
İskemi/reperfüzyon hasarını azaltmak için, serbest radikal kurtarıcıları da içeren birçok farmakolojik ajan kullanılmıştır. H₂S tedavisi de testisteki iskemi/reperfüzyon hasarında, hasarı sınırlamak ve geri çevirmekte kullanilabilecek bir serbest radikal kurtarıcısıdır. Hidrojen sülfür tedavisiyle ilgili birçok yeni çalışma olmasına karşın literatür verileri incelendiğinde testis torsiyonu ile ilgili bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu tez çalışmasında amacımız testis torsiyon-detorsiyonu modeli oluşturduğumuz sıçanlarda testistin iskemi ve reperfüzyonuna bağlı oluşan hasarın önlenmesinde hidrojen sülfür (H₂S) tedavisinin iskemi/reperfüzyon hasarına etkisini biyokimyasal ve histopatolojik parametreler kullanarak araştırılmasıdır.
 Materyal ve Metod: Deneysel çalışmada 18 adet erkek, erişkin, ortalama ağırlığı 300- 400 gr olan Wistar albino cinsi sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar sıcaklığı 21+/- 2 °C, %40-60 bağıl nem altında ve ışık 12 saat aydınlık 12 saat karanlık olacak şekilde bir odadaki ayrı kafeslere yerleştirildi. Tüm sıçan deneylerinde, İstanbul Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylanan protokole uygun hareket edildi. Sıçanlar her grupta 6 adet olacak şekilde rastgele seçilerek 3 gruba ayrıldı. 1. Grup cerrahi stres uygulanan sham grubuydu. 2. Grup testis torsiyonu yapılıp 1 saat sonrasında detorsiyon yapılan iskemi reperfüzyon grubuydu. 3. Grup ise testis torsiyonu yapılması sonrasında detorsiyondan 30 dk önce iskemi evresinde Hidrojen sülfür kaynağı olarak NaHS (Sodium hydrosulfide monohydrate , Sigma-Aldrich) kullanılarak normal salinle çözündürülmesi sonrası oluşan çözeltinin (1ml salin de 10 mg/kg/gün doz NaHS) intraperitoneal olarak uygulandığı I/R+NaHS tedavi grubuydu. Tüm cerrahi işlemler intraperitoneal ketamin ( 50 mg/ kg) ve ksilazin (10 mg/ kg) anestezisi altında yapıldı. Operasyonlarda midskrotal vertikal insizyon sonrası bilateral testisler serbestlendi ve  insizyon dışına alındı. Sham grubuna torsiyon uygulanmadan tekrar scrotuma yerleştirildi. Diğer tüm gruplarda bilateral testislerin serbestlenmesinin ardından 720º torsiyone edilerek nontravmatik sütürler ile tespit edildi.1 saat sonrasında detorsiyon yapıldı. Yalnızca tedavi grubu olan I/R+ NaHS grubuna torsiyon süresinin 30dk sında intraperitoneal olarak NaHS çözeltisi  enjeksiyonu uygulandı. Testis torsiyonu toplam süresi bir saat  olunca testisin dartosa sabitleme sütürü kesilerek testisler manuel olarak saat yönünün tersi yönünde detorsiyone edilerek reperfüzyon sağlandı. Ardından testisler skrotuma yerleştirilerek anatomik katlar nontravmatik sütür ile kapatıldı. Postoperatif ilk günden itibaren 1 hafta boyunca I/R +NaHS grubuna intraperitoneal olarak günde 1 kez olmak üzere NaHS çözeltisi enjeksiyonu uygulandı. Tüm grupların detorsiyonun 7. gününde skrotum eski insizyon yerinden açılarak bilateral orşiektomi yapılarak doku ve aynı zamanda kan örnekleri alındı. Deney bitiminde bilateral orşiektomi sonrası alınan testis dokuları sol testis ve sağ testis olmak üzere ayrıldı. Sol testislerin tümü histopatolojik inceleme için Bouin solüsyonunda fikse edilerek Patoloji Anabilim Dalına gönderildi. Sağ testislerinde tümü serum fizyolojik ile yıkandıktan ve steril şekilde kurulandıktan biyokimyasal işlemler için ölçüm yapılacağı güne kadar – 80°C'de derin dondurucuya kaldırıldı. Sıçanlardan biyokimyasal işlemler için intrakardiyak kan alındıktan sonra yüksek doz anestezi altında sakrifiye edilerek deneyin cerrahi kısmı sonlandırıldı. 
 Bulgular: Grupların  intraoperatif  ve postoperatif cerrahi değerlendirmesinde 1. grup olan sham grubuna göre makroskopik görünümü baz alındığında, 2. Grup olan ve torsiyon uygulanan I/R  grubunda doku canlılığının kötüleştiği, hidrojen sülfür uygulanan 3. Grup olan   I/R+NaHS grubunda ise I/R grubuna göre daha iyi doku canlılığının olduğu saptandı. Bir saatlik torsiyon süresinin sonunda testiste mor renk değişikliği ve ödem artışının olduğu görüldü.   Testislerin detorsiyone edilmesi sonrasında testislerin renginde kısmi düzelme olmasına rağmen minimal ödemin devam ettiği gözlendi.1 hafta sonra yapılan orşiektomi sonrasında özellikle  I/R grubunda testislerdeki mor rengin minimal olduğu ve 1 tanesinde atrofi geliştiği,  sham grubuyla I /R +NaHS grubu testisleri arasında morfolojik olarak belirgin fark saptanmadı.
Yapılan mikroskobik incelemede sham grubunda normal spermatogenez gösteren seminifer tubulusların olduğu I/R grubunda seminifer tübül yapılarının ve spermatogenik hücrelerin düzeninin bozulduğu, tübül içerisinde çok çekirdekli granülasyon hücrelerinin gözlendiği, bazı seminifer tübülüslarda spermatogenik hücrelerin bulunmadığı, I/R +NaHS grubunda ise seminifer tubuluslarda spermatosit ve  spermatozoa  düzeyine ulaşan maturasyon gösteren germ hücreleri saptandı. Histopatolojik incelemede modifiye Johnsen skorlaması kullanılarak bu skora göre gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulundu ( p<0.05). Farklılığın tespiti için yapılan ikili karşılaştırmalar sonucunda; sham grubunun değerleri ile I/R  grubu arasında yapılan değerlendirme sonrasında sham grubunun değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek olduğu saptandı. (p<0.05).I/R  grubunun değerleri ile I/R+NaHS grubunu değerlerinin karşılaştırılması sonrasında I/R  grubu değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı düzeyde düşük olduğu saptandı (p<0.05). Sham grubu ve I/R+NaHS grubu arasında ise Johnsen skoru değerleri açısından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunamadı. (p>0.05)
Serum ve testis dokusu TNF-α düzeylerine bakıldığında gruplar arasında anlamı bir değişiklik göstermediği saptandı. (p>0,05). Miyelperoksidaz (MPO) aktivitesinin I / R grubundaki sıçanların testis dokusunda sham grubuna göre anlamlı artışlar gösterdiği ve I/R+NaHS grubunda H₂S uygulaması ile artmış olan MPO aktivitesi düzeylerinde anlamlı bir azalma olduğu saptandı. (p<0,05).Yine aynı şekilde ileri oksidasyon protein ürünü (AOPP) aktivitesinin I / R grubundaki sıçanların testis dokusunda sham grubuna göre anlamlı artışlar gösterdiği ve I/R+NaHS grubunda H₂S uygulaması ile artmış olan AOPP aktivitesi düzeylerinde anlamlı bir azalma olduğu saptandı. (p<0,05) Malondialdehit(MDA) düzeylerine bakıldığında gruplar arasında anlamı bir değişiklik göstermediği saptandı. (p>0,05) . 
Glutatyon (GSH) düzeylerinin I/ R grubundaki sıçanların testis dokusunda sham grubuna göre anlamlı bir azalma gösterdiği ve I/R+NaHS grubunda ise H₂S uygulaması ile GSH düzeylerinde anlamlı bir artış gösterdiği saptandı. (p<0,05) Buna karşılık Süperoksit dismutaz (SOD) , Glutatyon peroksidaz (GSH-Px)  ve Demir azaltıcı antioksidan güç (FRAP) aktivitelerinde herhangibir değişiklik görülmedi.
Sonuç: Testis torsiyonunda hidrojen sülfürün detorsiyon sonucu oluşan iskemi/reperfüzyon hasarını önlemede etkili olduğunu saptadık. Fakat literatürde bu konuyla ilgili ilk çalışma olduğundan saptadığımız bulguların daha geniş kapsamlı deneysel çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: Testis torsiyonu, Hidrojen sülfür, İskemi, Reperfüzyon hasarı, Oksidatif stres

Abstract:
Objective: Testicular torsion is an acute urological emergency in all ages requiring rapid diognosis to prevent the permanent ischaemic damage of the testicles due to the vertikal rotation of spermatic cord cutting off the  blood supply to testicles.  Irreversible testicular loss may occur if the disease diagnosed not correctly and not treated properly.  The reperfusion has also an effect on the testicular loss. Several  approaches have beed tried to reduce the damage of ischemia reperfusion in testicular torsion
Hydrogen Sulfide (H₂S) is a colorless, flammable and volatile water-soluble gas with a characteristic odor of rotten egg. H₂S  which has been known to be a toxic gas for many years, was later identified that it is synthesised as an endogenous in the organism and effect many physiological and pathological processes in studies performed by Kımura and his colleagues.  H2S was accepted as the third gasotransmitter after Carbon Monoxide (CO) and Nitric Oxide (NO) by Wang and his colleagues. Relaxing effect of the H2S on regulation of cardiovascular system, cell proliferation and its apoptosis, glucose metabolism, neurotransmission, inflammation and vascular beds has been shown in several studies.
Recent studies have shown that H₂S treatment cure tissue damage which is caused by oxidative stress and has a role in the prevention of I / R damage. It has been shown that, the correct use of H₂S which is play an important role, especially in regulation of inflammation, contribute to antiinflammatory, antioxidant and antifibrotic activity by releasing inhibitory-inflammatory cytokines against I / R damage. With this feature, H₂S can be used in the treatment of ischemia / reperfusion, shock, sepsis.
There are numerous studies examining histological and functional changes in the testicles and different treatment modalities after ischemia /reperfusion injury due to testicular torsion. In order to reduce ischemia / reperfusion damage, many pharmacological agents including free radical scavenger have been used. H₂S is also a free radical scavenger that can be used to limit and reverse in the ischemia / reperfusion damage in the testicles. There are many recent studies on the treatment of H₂S and no available studies have been found  in terms of the treatment of testicular torsion. In this thesis, we aimed to investigate the effect of H₂S treatment on ischemia / reperfusion injury by using biochemical and histopathological parameters to prevent damage caused by ischemia / reperfusion in testis torsion-detorsion model.
Materials and Method: In the exprimental study, 18 ea, male, adult, Wistar albino rats with an average weight of 300-400 gr were used. The rats were placed in seperate cages in a 12 hours illuminated, 12 hours darkened room with temperature of 21+/- 2 °C, %40-60 relative humidity. All the rat experiments has been performed according to protocol which is approved by Istanbul University Animal Experiments Local Ethics Committee. The rats were randomly divided into 3 group with 6 number in each group. 1st group was the sham group which is applied surgical stress. 2nd group was the ischemia /reperfusion group which detorsion performed 1 hour later than testicular torsion application. 3rd group was the  I  / R + NaHS treatment group which is applied intraperitoneally during the ischemia phase with normal saline solutionized NaHS  (Sodium hydrosulfide monohydrate,  Sigma-Aldrich) solution  (10 mg / kg / day dose NaHS in 1ml Saline) as a source of Hydrogen Sulfide after the testicular torsion was performed 30 minutes before the detorsion.  All surgical procedures have been performed under anesthesia with intraperitoneal ketamine  (50 mg / kg) and xylazine (10 mg / kg). Bilateral testicles released and then taken out of incision after midscrotal incision. It was placed in the scrotum  before torsion was applied to the sham group. Bilateral testicles were determined by nontraumatic sutures with 720º torsion after releasing of bilateral testicles in all other groups. Detorsion has been performed after 1 hour. Only the I / R + NaHS treatment group received intraperitoneal injection of NaHS solution at 30th minute of the torsion time period. Referperfusion has been conducted by cutting the dartos fixation suture of testicles and manually counterclockwised when the total duration of the testical torsion was over 1 hour. Then the testicles were placed in to the scrotum and the anatomic layers were closed with non-traumatic sutures. NaHS solution was injected intraperitoneally once once a day for 1 week from the first postoperative day to the I/ R+ NaHS group. The scrotum was opened from old incision location and bilateral orchiectomy has been performed due to receive testis tissue and blood samples on the 7th day of the detorsion of all groups. Testicular tissues which ware taken after bilateral orchiectomy seperated into two as right and left testis at the end of the experiment. All left testes were fixed in Bouin solution and sent to Pathology Department for histopathological examination. All right testes were washed with normal saline, dried in a sterile way and stored in – 80°C deepfreeze up to the date of biochemical processes. Intracardiac blood has been received from rats for the biochemical procedures. After the procedure, rats were sacrificed under high dose anesthesia and the surgical phase of the expriment has been completed.
Results: The intraoperative and postoperative surgical evaluation of the groups based on the macroscopic appearance according to the sham group .Tissue viality worsened in the torsion applied I / R group . Better tissue viality has been found in the Hydrogen Sulfide applied I / R + NaHS group  according to I / R group. Purple discoloration and increase in edema have been observed at the end of one hour torsion period. It was observed that minimal edema continued despite partial improvement in the color of the testes after detorsion of the testes. After the orchiectomy which was performed 1 week later, it was observed that the purple color in the testis was minimal and atrophy developed in one especially I / R group . No significant morphological difference has been found between sham group and  I  / R + NaHS group .
According to microscopic examination; it was observed the existence of seminiferous tubules that shows normal spermatogenesis in sham group. It was also observed that there is no spermatogenic cells observation in some seminiferous tubules, there is multi-core granulation cells in tubule, distorsion of spermatogenic cells and seminiferous tubule structures in I / R group . Mature showing germ cells reaching spermatocytes and spermatozoa have been observed in seminiferous tubules in I / R + NaHS group . According to Johnsen scoring, it was found that there is significant statistical differences between groups (p<0.05). As a result of the paired comparisons to determine the differences; sham group values were found statistically and significantly higher according to comparision between sham and I/ R groups (p<0.05). I /R group values were found statistically and significantly lower according to comparision between I / R and  I / R + NaHS groups (p<0.05). No significant and statistical difference has been found according to comparision between sham and I / R + NaHS groups based on Johnsen scoring (p<0.05). 
When serum and testis tissue TNF-α levels were examined; it was found that examination results not showed any significant difference between groups (p<0.05).   It was also found that Myelperoxidase  (MPO) activity of the rats placed in I / R group showed significant increases in testicular tissue compared to sham group  and MPO activity levels which was increase due to application of H₂S showed significant decrease in I /R + NaHS group (p<0.05).  Likewise;  it was found that advanced oxidation protein product (AOPP) activity of the rats placed in I / R group showed significant increase in testicular tissue compared to sham group and AOOP activity levels which was increase due to application of H₂S showed significant decrease in  I  / R +NaHS group  (P<0.05). 
When the malondialdehyde (MDA) levels were examined, ıt was found that there was no difference between groups (p<0.05).
It was found that Glutathione (GSH) levels of the rats placed in I / R group showed significant decrease in testical tissue compared to sham group and GSH levels of I / R + NaSH group showed significant increase with H₂S application (p<0.05). On the contrary, any change has not been observed in Superoxide dismutase (SOD), Glutathione peroxidase (GSH-Px) and and Ferric reducing antioxidant power (FRAP) activities.
Conclusion: We found that Hydrogen Sulfide is effective on preventing ischemia / reperfusion which is caused by detorsion in testicular torsion. The findings of our study should be supported with more extensive experimental studies because our study is the first study on this subject in the literature.
Key Words: Testicular torsion, Hydrogen sulfide, İschemia, Reperfusion damage, Oxidative stress