Kıyısal sular ve midyelerden izole edilen enterik bakterilerin antibiyotik direncinin moleküler karakterizasyonu
Molecular characterization of antibiotic resistance of enteric bacteria isolated from coastal waters and mussels
Yazar: ŞEYMA UYSAL MANAV
Danışman: PROF. DR. SEMİHA ARAYICI
İstanbul Üniversitesi / Adli Tıp Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Bakteriler = Bacteria ; Enterobacteriaceae = Enterobacteriaceae ; Kıyı suları = Coastal waters ; Midyeler = Mussels ; Mytilus galloprovincialis = Mytilus galloprovincialis ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Mikrobiyal enfeksiyonların önlenmesi ve tedavisinde, tıp ve veteriner hekimlikte yaygın şekilde kullanılan antibiyotikler ve bunlara bağlı olarak gelişen antibiyotik direnci, tüm dünyada yoğun ilgi alanı bulmaktadır.  Fekal kirliliğe neden olan dirençli bakterileri içeren evsel atık sular, yeterli düzeyde veya hiç arıtılmadan sucul ortama deşarj edilerek, rekreasyon ve balıkçılık aktiviteleri amaçlı kullanılan deniz ekosistemlerinde antibiyotik direncinin kazanımına ve yayılımına katkıda bulunurlar.  Çevrede doğal olarak bulunan dirençli mikroorganizmalar ile insan veya hayvan kaynaklı mikroorganizmalar arasında aktarılan direnç genleri, mikroorganizmaların gen havuzunda uzun vadeli ve geri dönüşümsüz etkiler meydana getirerek çok sayıda direnç genine sahip olmalarına neden olur.  
Bu çalışmada endüstrileşme ve nüfus yoğunluğunun gittikçe arttığı İstanbul?da bakteriyel kirlenmeye maruz kalan kıyısal sulardaki fekal kirlilik yoğunluğu ve kıyısal sular ve midyelerde bulunan enterik bakterilerin antibiyotik direncinin bölgeye özgü moleküler karakterleri araştırılmıştır.
Haziran 2010-Mayıs 2011 tarihleri arasında yürütülen bu çalışmada, İstanbul Güneybatı sahilinde 6 farklı istasyondan deniz suyu örnekleri ile İstanbul Avrupa Yakasında 3 farklı istasyondan Mytilus galloprovincialis ile M.galloprovincialis?in yetiştiği deniz suyu örnekleri toplanmıştır.  Mevsimsel olarak alınan örneklerde, bakteriyolojik kirliliği belirlemek amacıyla toplam koliform bakteri sayımı yapılmış ve örneklerden izole edilen E.coli suşlarının Disk Difüzyon yöntemiyle antibiyotik duyarlılıkları belirlenmiştir.  E.coli suşlarında, integraz 1 genine spesifik intI-1 ve integraz 2 genine spesifik intI-2 geni ile tetrasikline dirençli olan suşlarda tet(A) ve tet(B) direnç genlerinin varlığı PCR analizi ile incelenmiştir.  intI-1ve intI-2 pozitif E.coli suşlarında sınıf 1 ve sınıf 2 integronların varlığı araştırılarak, her bir integronun taşıdığı antibiyotik direnç genleri dizi analizi ile belirlenmiştir. 
Kıyısal su örneklerinde toplam koliform bakteri sayısı 7x101 - >11x103 EMS/100ml, M.galloprovincialis?lerde TKBS 3x102 - >11x104 EMS/100 ml aralığında ölçülmüştür.  İzole edilen örneklerde en yoğun gözlenen bakteri türü E.coli  (%61,11) olup, bu suşlarda en yüksek direnç frekansı ampisilin (%54,54) antibiyotiğinde gözlenmiştir. Tetrasikline dirençli suşlar arasında tet(B) direnç geninin yaygın olduğu belirlenmiştir.  101 E. coli suşunun PCR analizleri sonucunda 55 E. coli suşunda int I-1 geni (0,5 kb), 60 E.coli suşunda int I-2 geni (0,9 kb) ve 4 E.coli suşunda sınıf 1 integron (1,2-2,0 kb), 6 E. coli suşunda sınıf 2 integron (2,1 kb) tespit edilmiştir.  Sınıf 1 ve sınıf 2 integronun dfrA1, dfrA12, aadA1, aadA2, aadA5, sat2 ve blaoxa-2 gen kasetlerini içerdiği belirlenmiştir. 
Bu çalışma ile kıyısal sular ve midyelerde fekal kökenli bakterilerin yoğunluğu belirlenerek, izole edilen enterik bakterilerde antibiyotik direncinden kaynaklanan çevre kirliliği ve rasyonel antibiyotik kullanımının teşviki konularına açıklık getirilmeye çalışılmıştır.  Bununla birlikte antibiyotik direnç genlerinin moleküler karakterizasyonu ile Türkiye deniz ekosistemine özgü antibiyotik direnç profilinin oluşturulması için gerekli olan temel bilgiler sağlanmıştır.

Abstract:
Antibiotics commonly used in medicine and veterinary medicine for prevention and treatment of microbial infections and consequently developing antibiotic resistance has been garnering great interest worldwide.  Domestic waste water with resistant bacteria that cause fecal pollution is discharged to the aquatic environment with inadequate or no purification, contributing to developments and expansion of antibiotic resistance in marine ecosystems used for recreation and fishing activities.  Resistance genes transferred between resistant microorganisms naturally present in the environment and human or animal microorganisms create long-term and irreversible impacts on gene pool of microorganisms, causing a large number of resistance genes. 
This study examines density of fecal pollution in coastal waters exposed to bacterial contamination in Istanbul, where industrialization and increasing population has been gradually increasing, and region-specific molecular characters of antibiotic resistance of enteric bacteria in coastal waters and mussels.
This study was conducted between June 2010 and May 2011 whereby sea water were sampled from 6 different stations in the Southwest coast of Istanbul, and also Mytilus galloprovincialis and sea water in M.galloprovincialis grow were collected from 3 different stations in the European Side of Istanbul.  Total coliform bacteria were counted in seasonally collected samples to detect bacteriological pollution, and antibiotic susceptibilities of E.coli strains isolated from the samples were identified by Disk Diffusion method.  For E. coli strains, presence of intI-1 specific to the integrase 1 gene and intI-2 specific to the integrase 2 gene, and presence of resistance genes tet(A) and tet(B) in tetracycline resistant strains were examined through PCR analysis.  Presence of class 1 and class 2 integrons in intI-1 and intI-2 positive E. coli strains was investigated, and antibiotic resistance genes carried by each integron were identified through sequencing analysis. 
The total number of coliform bacteria in coastal water samples was measured in a range of 7x101 - >11x103 EMS/100ml and for M.galloprovincialis, in a range of TKBS 3x102 - >11x104 EMS/100 ml.  E. coli is the most frequently observed bacterial species in isolated samples (61.11%), and the highest frequency of resistance in these strains was observed in ampicillin antibiotic (54.54%).  The resistant strain tet (B) was found out to be frequent among tetracycline resistant strains.  As a result of PCR analyses on 101 E.coli strains, the int I-1 gene (0,5 kb) was detected in 55 E.coli strains, the int I-2 gene (0,9 kb) in 60 E.coli strains, class 1 integron (1,2-2,0 kb) in 4 E.coli strains and class 2 integron (2,1 kb) in 6 E.coli strains.  Class 1 and class 2 integrons were found out to contain the gene cassettes dfrA1, dfrA12, aadA1, aadA2, aadA5, sat2 and blaoxa-2.
This study aims at identifying the density of bacteria of fecal origin in coastal waters and mussels, and clarifying the issues of environmental pollution caused by antibiotic resistance in isolated enteric bacteria and promotion of the rational use of antibiotics. Additionally, basic information required to ensure the molecular characterization of antibiotic resistance genes and to create an antibiotic resistance profile specific to the marine ecosystem of Turkey is provided.