Kolon kanseri hücrelerinde PDL-1 geninin susturulmasının dna tamir mekanızması üzerine etkisinin araştırılması
Investigationof theeffect of silencing the PDL-1 gene on the DNA repair  mechanism in colon cancer cells
Yazar: GONCA KABAK
Danışman: PROF. DR. YAVUZ SİLİĞ
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Bağırsaklar = Intestines ; DNA onarımı = DNA repair

Özet:
PD-L1, bağışıklık sisteminin tümör hücrelerini tanımasını engelleyerek immün kaçışa katkıda bulunur. Aynı zamanda kanser hücrelerinde DNA hasar onarımı süreçlerine etki edebileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada, PD-L1 geni susturulmuş kolon kanseri hücre hattı HT-29 ve sağlıklı kolon epitel CCDCo-18 hücre hatlarında, DNA tamir mekanizmasında görev alan ATR, CDKN1A, ERCC1, RAD51 genlerinin ekspresyon düzeylerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızın başlangıcında DNA tamir mekanizmasında görev alan proteinlerin birbirleriyle ve PD-L1 proteini ile etkileşimini belirlemek için String database v11 programı kullanıldı. Analiz sonucunda PD-L1 proteinin, ATR, CDKN1A, ERCC1, RAD51 proteinleriyle etkileşimleri belirlendi. Sonra hücre hatlarında siRNA yardımıyla PD-L1 geni susturuldu. PD-L1 geni susturulan HT-29 ve CCDCo-18 hücre hatlarından kit protokolüne uygun olarak RNA izole edildi. Elde edilen RNA'lardan yine kit protokolüne göre cDNA sentezlendi. RT-PCR cihazında 2- ∆∆CT yöntemi kullanılarak gen ekspresyonu analizi gerçekleştirildi. PD-L1 geni susturulan hücrelerde susturma düzeyleri %90'ın üstünde olacak şekilde RT-PCR ile belirlendi. Susturma işlemini takiben cDNA örneklerinde belirlenen DNA tamir genlerinin ekspresyon düzeyleri ölçüldü. Sonuç olarak, kolon kanseri hücre hattında PD-L1, ATR, CDKN1A genlerinin ekspresyonunun kontrol grubuna kıyasla azaldığı ve ERCC1, RAD51 genlerinin ekspresyonunun ise kontrol grubuna kıyasla arttığı tespit edilmiştir. Sağlıklı kolon epitel hücrelerinde bu durum; PD-L1, ERCC1, ATR genlerinin ekspresyonu kontrol grubuna kıyasla azaldığı ve RAD51 ve CDKN1A'in ise arttığı tespit edilmiştir.

Abstract:
PD-L1 is a gene that contributes to immune evasion by preventing the immune system from recognizing tumor cells. It is also believed to influence DNA damage repair processes in cancer cells. In this study, we aimed to investigate the expression levels of ATR, CDKN1A, ERCC1, RAD51 genes involved in DNA repair mechanism in colon cancer cell line HT-29 and healthy colon epithelial CCDCo-18 cell lines in which PD-L1 gene was silenced. At the beginning of our study, String v11 programme was used to determine the interaction of proteins involved in DNA repair mechanism with each other and with PD-L1 gene. As a result of the analysis, the interactions of PD-L1 protein with ATR, CDKN1A, ERCC1, RAD51 proteins were determined. Then, PD-L1 gene was silenced in cell lines by siRNA. RNA was isolated from HT-29 and CCDCo-18 cell lines in which PD-L1 gene was silenced according to the kit protocol. From the obtained RNAs, cDNA was synthesised according to the kit protocol. Gene expression analysis was performed using the 2- ∆∆CT method in RT-PCR device. In PD-L1 gene silenced cells, silencing levels were determined by RT-PCR to be above 90%. Following silencing, the expression levels of DNA repair genes determined in cDNA samples were measured. As a result, it was found that the expression of PD-L1, ATR, CDKN1A genes decreased in the colon cancer cell line compared to the control group and the expression of ERCC1, RAD51 genes increased compared to the control group. In healthy colon epithelial cells, the expression of PD-L1, ERCC1, ATR genes decreased and RAD51 and CDKN1A increased compared to the control group.