Rumenden izole edilen bakterilerden α-amilaz ve likenaz genlerinin klonlanması, genlerin ve enzimlerin moleküler karakterizasyonu
Cloning of α-amylase and lichenase genes of bacteria isolated from rumen, molecular characterization of genes and enzymes
Yazar: DİLEK ÖZGÜN EKİZ
Danışman: DOÇ. DR. ASHABİL AYGAN
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Rumen bakterileri yüksek aktivite ve geniş biyokütlesi sebebiyle, ruminant besinlerinin biyolojik parçalanmasında önemli bir göreve sahiptir. Bu çalışmada, rumen bakterileri rumen içeriği, rumen sıvısı ve ruminant dışkı örneklerinden izole edilmiş ve 16S rRNA geninin sekansı ile tanımlanmıştır. Tanımlanan bu bakteriler arasından, S. bovis RB4 ve Bacillus licheniformis RB16 suşları seçilmiş ve bu suşların enzim genleri çalışılmıştır. S. bovis RB4'ün amilaz ve B. licheniformis RB16'nın likenaz kodlayan genleri, tasarlanan primerlerinin yardımıyla polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) tarafından amplifiye edilmiştir. Bu genler pGEMT-Easy vektörüne klonlanmış ve Escherichia coli DH5α'da eksprese edilmiştir. Klonlanan enzim genlerinin moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. 
α-Amilaz geni (amy1A) 1640 bç uzunluğunda ve Alpha Amilaz Katalitik alana ait iki açık okuma çerçevesi (ORF) içermektedir. Bununla beraber, bu iki ORF ayrı ayrı aktivite göstermemiştir. Dolayısıyla, bunların birbirini tetiklediği düşünülmüştür. Likenaz geni (lic1A) 650 bç uzunluğunda ve glikozil hidrolaz 16 ailesine ait tek ORF içermektedir. Hücresel aktivite gösteren Amy1A amilaz ve Lic1A likenaz enzimlerinin optimum sıcaklık, pH, termal ve pH stabilitesi çalışılmıştır. Amy1A'nın optimum sıcaklığı 40 °C, pH'ı ise 7.5 olarak belirlenmiştir. Amy1A enzimi ince tabaka kromatografisi ile nişastayı glikoza kadar hidrolize etmiş ve amilaz enziminin SDS-PAGE'de moleküler ağırlığı 31.30 kDa olarak belirlenmiştir. Lic1A likenazın optimum enzim aktivitesi 45 °C ve 7.5 pH'da görülmüştür. Lic1A ince tabaka kromatografisinde likenanı parçalamıştır. Lic1A likenaz enziminin SDS-PAGE analizinde moleküler ağırlığı 26.97 kDa olarak tespit edilmiştir. Ek olarak ruminant dışkı örnekleri için ekonomik, kolay, yüksek DNA verimine sahip optimum metagenomik DNA izolasyon protokolü belirlenmeye çalışılmıştır. Bu protokolün belirlenmesi ile ticari kitlere olan bağımlılık azalacak ve ülke ekonomisine katkıda bulunulacaktır. Dolayısıyla, optimum metagenomik DNA izolasyonun protokolünün belirlenmesi büyük bir önem oluşturmaktadır. İleriki çalışmalarda metagenomik DNA'lar kullanılarak elde edilen enzim genlerinin tam sekanslarının belirlenmesi ve karakterizasyonunun yapılması amaçlanmaktadır.

Abstract:
Rumen bacteria have important roles in the biodegradation of feeds ruminant due to high activity and large biomass. In this study, rumen bacteria were isolated from rumen content, rumen liquid and stool samples of ruminant and identified by sequencing of 
16S rRNA gene. Among identifying these bacteria, S. bovis RB4 and Bacillus licheniformis RB16 strains were selected and enzyme genes of these strains were studied. The genes encoding amylase of S. bovis RB4 and lichenase of B. licheniformis RB16 were amplified by polymerase chain reaction (PCR) with the aid of designing primers. These genes were cloned into pGEMT-Easy vector and expressed in Escherichia coli DH5α. Molecular characterization of the cloned enzyme genes were performed. The α-amylase gene has 1640 bp and contains two open reading frames (ORFs) belongs to Alpha Amylase Catalytic domain. However, these two ORFs did not indicate individual activities. Therefore, they are thought to trigger each other. The lichenase gene (lic1A) has 650 bp and contains an ORF belongs to glycosyl hydrolase family 16. Optimum temperature, pH, thermal and pH stability of intracellular Amy1A amylase and Lic1A lichenase enzymes were studied. The optimum temperature and pH for Amy1A activity was 40 °C and 7.5, respectively. Amy1A enzyme was hydrolyzed starch by thin layer chromatography to glucose and molecular weight of the amylase enzyme was determined as 31.30 kDa on SDS-PAGE. The optimum enzyme activity of Lic1A lichenase was obtained at 45 °C, pH 7.5. Lic1A was hydrolyzed lichenen by thin layer chromatography. Molecular weight of the Lic1A lichenase enzyme was detected as 26.97 on SDS-PAGE. Otherwise, the optimum metagenomic DNA isolation protocol as economic, simple, high DNA yields was determined for stool samples of ruminants. This protocol will decrease dependence to commercial kits and contribute to the economy of the country. Therefore, the optimization of metagenomic DNA isolation protocol is very important. Subsequently, determination of the complete sequences of isolated enzyme genes from metagenomic DNA and characterization of these genes is aimed.