Safra asitlerinin biyolojik örneklerden tayini için Sk-kS/KS yönteminin geliştirilmesi ve validasyonu
Development and validation of LC-MS/MS method for the determination of bile acids from biological samples
Yazar: KADRİ GÜLEÇ
Danışman: DOÇ. DR. EROL ŞENER
Anadolu Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Kütle spektroskopisi = Mass spectroscopy ; Safra asit ve tuzları = Bile acids and salts ; Validasyon = Validation ; Yüksek basınç sıvı kromatografisi =

Özet:
Safra asidi atipik steroid molekül olup karaciğer enzimleri ve bağırsak bakterileri tarafından kolesterolden sentezlenir. Birincil ve ikincil safra asidi olarak ikiye ayrılır. Safra asitleri sentez basamaklarında konjuge hale gelerek farklı safra asitlerini oluşturur. 
Günümüzde başta analitik kimya olmak üzere çok çeşitli alanda farklı birçok analizde kullanılmakta olan sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi (SK-KS/KS), biyolojik numune analizlerinde de yüksek hassasiyete sahip olması sebebiyle sıklıkla kullanılmaktadır.
Yirmi üç farklı safra asidi ve bir tane iç standart kullanılarak, biyolojik örneklerde safra asidi tayini için SK-KS/KS parametreleri ve farklı sabit fazların optimizasyonu yapılmıştır. Optimizasyon için parçalama voltajları, parçalama enerjileri, iyon kaynağı, iyonlaştırıcı ajan, iyon modu gibi MS parametreleri her bir safra asidi için optimize edilmiş, hareketli faz, sıcaklık, akış hızı gibi parametreler ile sabit fazlar denenmiştir. Elde edilen optimizasyon parametrelerine göre negatif iyonlaştırma modunda, elektrosprey iyon kaynağı ile 100 x 3,00 mm, 1,8 µm, 95 Å, C18 sabit fazı kullanılarak 60 °C sıcaklıkta, %0,5 formik içeren su ve %20 asetonitril içeren metanol hareketli fazı ile analiz yapılmıştır ve optimum çalışma şartlarında ICH M10 biyoanalitik validasyon kılavuzuna göre validasyonu yapılmıştır. 
Kan, idrar ve gaita örnekleri kantitatif analiz için hazırlama prosedürü uygulanarak analiz edilmiştir. Analiz sonuçları ICH M10 biyoanalitik validasyon kılavuzunda belirtilen limitler çerçevesinde değerlendirilmiştir.

Abstract:
Bile acid is an atypical steroid molecule synthesised from cholesterol by liver enzymes and intestinal bacteria. It is divided into primary and secondary bile acids. Bile acids become conjugated in the synthesis steps and form different bile acids. 
Today, liquid chromatography/mass spectrometry (LC-MS/MS), which is used in many different analyses in many different fields, especially in analytical chemistry, is frequently used in biological sample analysis due to its high sensitivity. 
LC-MS/MS parameters and different stationary phases were optimised for bile acid determination in biological samples using twenty-three different bile acids and one internal standard. For optimisation, MS parameters such as fragmentation voltages, fragmentation energies, ion source, ionising agent, and ion mode were optimised for each bile acid, and parameters such as mobile phase, temperature, flow rate, and stationary phases were tested. According to the obtained optimisation parameters, the analysis was performed in negative ionisation mode with an electrospray ion source, 100 x 3.00 mm, 1.8 µm, 95 Å, using C18 stationary phase at a temperature of 60 °C, with water containing 0.5% formic acid and methanol mobile phase containing 20% acetonitrile, and validated according to the ICH M10 bioanalytical validation guideline under optimum operating conditions. 
Blood, urine, and stool samples were analysed by applying the preparation procedure for quantitative analysis. The analysis results were evaluated within the limits specified in the ICH M10 bioanalytical validation guideline.