Hücre kültüründe apoptozun moleküler mekanizmaları üzerine gama radyasyonunun etkileri
The effects of gamma radiation on molecular mechanisms of apoptosis on cell culture
Yazar: WALID KHALILIA
Danışman: DOÇ. DR. FATMA GÜL ÖZCAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Radyobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
İyonlaştırıcı radyasyon katı tümörlerin tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Tedavi sürecinde tüm kanser hastalarının yarısından fazlası radyoretapi görmektedir. Bununla birlikte, radyoterapinin etkisini apoptoz uyarımı ile gerçekleştirip gerçekleştirmediği bilinmemektedir. Bu nedenle, çalışmamızda gama radyasyonunun serviks karsinoması kökenli ve farklı radyoduyarlılığa sahip kanser hücre soylarında apoptoz sinyal yolağında görev alan özgün genlerin ifadesini uyarıp uyarmadığının belirlenmesi amaçlamıştır. Bu bağlamda, farklı radyoduyarlılıktaki kanser hücrelerinde ifadesi artan veya azalan genlerin tanımlanması kanser dinamiğinin daha iyi anlaşılması, serviks kanseri biyobelirteçleri ve tedavi hedeflerinin belirlenmesi ve radyoduyarlılık mekanizmasının aydınlatılmasına önemli katkılar sağlayacaktır.
C-4 I ve HeLa serviks karsinoma hücreleri beş farklı dozda (0, 2, 8, 16, 32 ve 64 Gy) gama radyasyonuna maruz bırakılmış ve beş farklı zaman diliminde (0, 24, 48, 60 ve 72 saat) inkübasyona bırakılmıştır. HeLa hücelerinin çoğalması MTT yöntemi ile ölçülmüştür. Apoptotik indeks (AI) apoptoz ile ilişkili morfolojik özellikler floresan mikroskobunda DAPI ile değerlendirilmiştir. Ayrıca, apoptotik genlerin ifadesi mikrodizi ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon (qRT-PCR) yöntemi ile saptanmıştır. Ayrıca, yukarı ve aşağı regüle olan genlerin ifadesi için gen ontoloji ve yolak analizleri yapılmıştır. Önemli işlevlere sahip olan genler ve yolak analizleri sırasıyla kat değişim (FC) ve p değeri hesabına dayalı olarak belirlenmiştir (p <  0.05 ve FC ≥ ±2).
Sonuçlar, doza ve zamana bağlı olarak gama radyasyonunun C-4 I ve HeLa hücrelerinin çoğalmasını anlamlı ölçüde azalttığını göstermiştir. C4-I ve HeLa hücre soyları arasında önemli bir farklılık gözlenmiştir (p < 0.01). Çalışmamızda HeLa hücrelerinin radyodireçli olmasına karşın,  C-4 I hücrelerinin radyoduyarlı olduğu gösterilmiştir. C-4 I ve HeLa hücreleri için sırasıyla 16 Gy ve 32 Gy değerleri hücrelerin %50'sini çoğalmasını öldüren dozu (IC50) olarak belirlenmiştir. Apoptotik morfolojinin gama radyasyonuna maruziyet süresine ve dozuna bağlı olarak arttığı saptanmıştır.  C-4 I ve HeLa hücreleri için sırasıyla 16 Gy ve 32 Gy gama radyasyonu uygulanması sonrasında optimum AI değerleri 60. saatte belirlenmiştir. Mikrodizi sonuçları, farklı veri analiz yöntemlerinin kullanılması ile normalize edildi ve filtrelendi. Hiyerarşik kümeleme, 47.071 filtrelenmiş prob üzerinde uygulandı. HeLa hücrelerinde 343 genin ifadesi önemli ölçüde değişmiştir. Bu genlerden, 150 genin ifadesi yukarı regüle olurkan, 193 genin ifadesi de aşağı regüle olmuştur. Bununla birlikte, C-4 I hücrelerinde 317 genin ifadesi anlamlı ölçüde değişmiştir. Bu genlerden, 212 genin ifadesinin azalmasına karşın, 105 genin ifadesi yukarı regüle olmuştur. Yolak analizleri C-4 I ve HeLa hücrelerinde apoptoz, WNT ve P53 yolaklarının anlamlı ölçüde teşvik edildiğini göstermiştir. Radyoduyarlı olan C-4 I hücrelerinde gama radyasyonu uygulamasından sonra qRT-PCR sonuçları değerlendirildiğinde BID, BIK, TNFRSF10B, TNFRSF10D, TRAF (2, 3 ve 6), TP53I3, DFFA, SOCS2, SOCS3, NF-kB1, NF-kB2 ve FAM96 faktörlerin ifadesinin yukarı regüle olduğu saptanmıştır. Radyodirencli olan HeLa hücrelerinde ise apoptoz aktivatörleri olarak bilinen BAX, CASP 9, TNFRSF21, TRAF2, NF-kB, STAT, P53 ve diğer faktörlerin ifadesi yukarı regüle olmuştur. Buna karşın, BCL-2 anti-apoptotik genlerin bazıları, apoptoz inhibe edici protein ailesi  (IAP) ve diğer üyelerin ifadesi C-4 I ve HeLa hücrelerinde aşağı regüle olmuştur.
Çalışmamızın sonunda gama radyasyonunun farklı radyoduyarlılıkta olan serviks kanseri hücre soylarında hücre çoğalması ve apoptoz ile ilişkili genlerin ifadesini değiştirerek antiproliferatif bir etki meydana getirdiği saptanmıştır. Radyasyona direncli HeLa hücreleri ile radyasyona duyarlı C-4 I hücrelerinde apoptoz sinyal yolağında farklı moleküllerin aktive ya da inaktive olması, radyoduyarlılıkta apoptozun önemli bir rol oynadığı sonucunu ortaya konmuştur.

Anahtar Kelimeler: Apoptoz; HeLa; C-4 I; qRT-PCR; Mikrodizi

Abstract:
Ionizing radiation is commonly used in the treatment of solid tumors. More than half of all cancer patients receiving radiotherapy during the course of treatment. It is unclear, however, whether radiotherapy exerts its effects via induction of apoptosis. Therefore, the present study aimed to determine whether a single-fraction of gamma radiation could induce the expression of specific genes involved in apoptosis signaling pathways in different radio-sensitivity cervical carcinoma cell lines. In this context, identifying up-regulated or down-regulated genes in different radiosensitivity cancer cells helps us in better understanding cancer dynamics to identify markers and treatment targets for cervical cancer and it will make an important contribution to the elucidation the mechanism of radiosensitivity. 
C-4 I and HeLa cervix carcinoma cells were treated with a gamma radiation at five different doses (0, 2, 8, 16, 32 and 64 Gy) and investigated after incubation for five time periods (0, 24, 48, 60 and 72 h). The proliferation of HeLa cells was measured by MTT assay. Apoptotic index (AI) and apoptotic morphological features were assessed by fluorescent microscopy using DAPI. Moreover, the expression of the apoptotic genes was evaluated using microarray and real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) molecular processes. In addition, gene ontology and pathway analysis were performed on the up-regulated and down-regulated genes. Significant functions for genes and pathways were identified based on fold change and P-value respectively (FC) (p <  0.05 and FC ≥ ±2).
Results showed that gamma irradiation inhibits proliferation of C-4 I and HeLa cells in a dose- and time- dependent manner. A significant difference was observed between C4-1 and HeLa cell lines (p < 0.01). From our results C-4 I cells seemed to be radiosensitive, wile HeLa cells were radio resistant. 16 Gy and 32 Gy were identified as the IC50 dose for C-4 I and HeLa cells respectively. Apoptotic morphological features depend on the value of the dose and duration after exposure to gamma rays. After 60 h of a single-dose of gamma radiation, 16 Gy and 32 Gy were determined as optimum AI for C-4 I and HeLa cells respectively. Microarray results were normalized and filtered using different types of data analysis. Hierarchical clustering was performed on a 47.071 member filtered probe. For HeLa cells there were 343 genes for which the expression changed significantly. From these 150 genes were up-regulated, while 193 genes were down-regulated. However, for C-4 I there were 317 number of genes for which the expression changed significantly. From these 105 genes up-regulated, while 212 genes down-regulated. Pathway analysis identified that significant pathways related to apoptosis, WNT and P53 were significantly enriched for C-4 I and HeLa cells. qRT-PCR results monitored the expression of BID, BIK, TNFRSF10B, TNFRSF10D, TRAF (2, 3 and 6), TP53I3, DFFA, SOCS2, SOCS3, NF-kB1, NF-kB2, FAM96B were up regulated by gamma radiation treatment of radio-sensitive C-4 I cells.  BAX, CASP 9, TNFRSF21, TRAF2, NF-kB, STAT, P53 and other factors that are known apoptosis activators were up regulated by gamma radiation treatment of radioresistant HeLa cells. Whereas, some of anti-apoptosis BCL-2 family, inhibitor of apoptosis protein (IAP) and other members, were down regulated for C-4 I and HeLa cells.
At the end of our study, modifying the expression of genes associated with cell proliferation and apoptosis has been found and antiproliferative effect occurs in different radio sensitivity cervical cancer cell lines treated with gamma radiation.
Radiation resistant HeLa cells with radiation sensitive C4 II cells of different molecules in apoptosis signaling pathway is activated or inactivated as a result of apoptosis plays an important role in radiosensitivity is disclosed.

Keywords: Apoptosis; C-4 I; HeLa; Gamma radiation; qRT-PCR; Microarray