Bevacizumab'ın antianjiyogenik ve apoptotik etkilerinin meme kanseri hücre hattında araştırılması
Investigation of anti-angiogenic and anti-apoptotic effects of Bevacizumab in breast cancer cell line
Yazar: EBRU ALP
Danışman: PROF. DR. EMİNE SEVDA MENEVŞE
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Anjiyogenez = Angiogenesis ; Apoptozis = Apoptosis ; Bevacizumab = Bevacizumab ; Gen ifadesi = Gene expression ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis

Özet:
Tümör anjiyogenezi tümör hücreleri tarafından anjiyogenik faktörlerin salınımı, proteolitik enzimlerin aktivasyonu ve endotelyal hücrelerin proliferasyonu ve göçünü içeren çok aşamalı kompleks bir mekanizmadır. VEGF büyüme ve metastaz için kritik olan anjiyogenik bir fenotipe geçişte sınırlayıcı bir faktördür. Anjiyogenez hedefli son yaklaşımlar vasküler endotelyal hücreleri uyaran faktörlerin ve bunların reseptörlerinin baskılanmasına bağlıdır. VEGF bu alandaki araştırmalarda en önemli hedef moleküllerden biri haline gelmiştir. VEGF'ye karşı geliştirilen ilaçlardan biri monoklonal bir antikor olan Bevacizumab' dır (Avastin, Altuzan). Prostoglandinlerin COX-2 ile indüklenmiş artışı, anjiyogenez, kanser hücrelerinin çoğalması, apoptozun baskılanması ve metastatik potansiyelin artışını uyarmaktadır. Bu çalışma ile Bevacizumab'ın meme kanseri hücre hattı olan MDA-MB-231 üzerindeki antianjiyogenik ve apoptotik etkisi ile VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 ve COX-2 mRNA ifadeleri üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlandı.Çalışmamızda, MDA-MB-231 hücrelerinde, çeşitli doz ve inkübasyon sürelerinde, Bevacizumab uygulanması sonrası, ?XTT? yöntemi ve ?akridin oranj-etidyum bromür? boyamasıyla hücre canlılığı belirlendi. Aynı sinyal iletim yolağında görev alan VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 ve bu yolak üzerine de etki eden COX-2 genlerinin mRNA ifade düzeylerinin belirlenmesi için kantitatif Real-Time PCR yöntemi kullanıldı. Çalışmamızda, Bevacizumab' ın etkisiyle 24 ve 48. saatlerde COX-2 ifade düzeyinde artış gözlense de 72 ve 96. saatlerde bu COX-2 ifade oranı 50 ?g/ml' den sonraki dozlarda düşük düzeylerde seyretmektedir. Anjiyogenezde önemli görevi olduğu bilinen VEGF-A, VEGF-C ve VEGFR2 mRNA ifade düzeylerinin ve invazyon yeteneklerinin 24, 48 ve 72. saattlerde doza bağımlı olarak amlamlı düzeyde arttığı belirlendi. 96. saatte ise VEGF-A, VEGF-C ve VEGFR2 mRNA ifade düzeylerinin ve hücrelerin invazyon yeteneklerinin anlamlı düzeyde azaldığı gözlendi. Elde ettiğimiz veriler, MDA-MB-231 hücrelerinin anjiyogenik özelliklerinin baskılanması için uzun süreli Bevacizumab uygulaması gerektiğini düşündürmektedir.

Abstract:
Tumor angiogenesis is a complex mechanism consisting of multi-step events including secretion or activation of angiogenic factors by tumor cells, activation of proteolytic enzymes, proliferation and migration of endothelial cells. VEGF may be the rate limiting factor in the tumor-related switch to an angiogenic phenotype that is critical for growth and metastasis. Current approaches to target angiogenesis rely on inhibiting growth factors that stimulate vascular endothelial cells or blocking their receptors. VEGF has become a major target of investigation in this area. Bevacizumab is a monoclonal antibody developed against VEGF. Enhanced COX2-induced synthesis of prostaglandins stimulates cancer cell proliferation, promotes angiogenesis, inhibits apoptosis, and increases metastatic potential. In the present study, we aimed to investigate the antiangiogenic and apoptotic effect of Bevacizumab on MDA-MB-231 cell line and changes of VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 and COX-2 mRNA expressions. In our study, cell viability was detected in the MDA-MB-231 cells by XTT assay method and acridin-orange/ethidium bromide staining, for different dosages and incubation time, following Bevacizumab treatment. Quantitative Real-Time PCR method was used for analysis of mRNA expression levels of VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 genes which take part in same signal pathway and COX-2 acting on this pathway. In this study, although COX-2 mRNA expression was higher in breast cancer cells at 24 and 48h, its expression level was low in MDA-MB-231 at 72 and 96h after the 50 ?g/ml dose. VEGF-A, VEGF-C and VEGFR2 mRNA expression level and invasion ability of MDA-MB-231 cells significantly increased at 24, 48 and 72h in a dose dependent manner. VEGF-A, VEGF-C and VEGFR2 mRNA expression and invasion ability of MDA-MB-231 significantly decreased at 96h in a dose dependent manner. Our data suggest that the long-term application of bevacizumab is required for the suppression of angiogenic properties.