Goose parvovirus (GPV) VP2 geni temelli rekombinant subunit proteinin üretilmesi
Production of goose parvovirus (GPV) VP2 based recombinant subunit protein
Yazar: REMZİYE ÖZBEK
Danışman: PROF. DR. KEZBAN ŞAHNA
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Baculovirüs = Baculovirus ; DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Parvovirüs enfeksiyonları = Parvovirus infections

Özet:
İlk kez 1960'lı yıllarda Avrupa'da Derzsy's hastalığı olarak tanımlanan Goose parvovirusu (GPV), su kuşu endüstrisinde büyük ekonomik kayıplara ve yüksek mortalitelere sebebiyet vermektedir. Bu nedenle hastalıkla mücadele noktasında korunma/kontrol hedeflerinin oluşturulması oldukça önemlidir. GPV genomu yaklaşık 5.1 kilobaz (kb) uzunluğunda olup iki açık okuma çerçevesi (ORF) içerir. Virüsün yapısal proteinleri olan VP1, VP2 ve VP3 aynı ORF'nin alternatif uçbirleştirme (splicing) mekanizmaları ile meydana getirilir. Bunlardan VP2 proteini en fazla ifade edilen protein olup konakçı immün yanıtını en güçlü şekilde uyaran proteindir. Bu nedenle tez çalışmasında, GPV'ye karşı rekombinant aşı veya hızlı test kiti geliştirilmesinde aday antijen olarak kullanılması hedeflenen VP2 proteininin Baculovirus ekspresyon vektör sisteminde (BEVS) üretilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla öncelikle GPV'ye yönelik spesifik primerler kullanılarak yapılan PCR ile VP2 geninin amplifikasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen VP2 amplikonu saflaştırıldıktan sonra ticari pENTR™/TEV/D-TOPO™ entry vektörüne klonlandı. Daha sonra pENTR™/TEV/D-TOPO™ vektörü bünyesinde bulunan hedef gen, LR Rekombinasyonu aracılığı ile linear N-Term BaculoDirect™ DNA'sına aktarıldı. Oluşturulan bu yapı Spodoptera frugiperda (Sf9) insekt hücrelerine transfekte edilerek baculoviral virionlar elde edildi. VP2 geninin BaculoDirect™ Linear DNA'ya aktarılıp aktarılmadığını doğrulamak amacıyla hem VP2 genine hem ekspresyon vektörüne yönelik eksternal primer setleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonu sonucunda yaklaşık 600 bp uzunluğunda band elde edildi. Rekombinant protein üretimini doğrulamak amacıyla, üretilen proteinin N ucunda bulunan V5 epitopundan yararlanılarak Western Blot analizi yapıldı. Analiz sonucunda VP2 genine ait beklenen moleküler ağırlıkta (~65 kDa) band görüldü. Rekombinant baculovirus ile enfekte Sf9 hücrelerinde protein ekspresyonun tespiti için ise aynı epitoptan yararlanılarak IFA analizi yapılmıştır. Ekspresyonu doğrulanan protein, proteinde bulunan 6×His tag kuyruğundan faydalanılarak Ni-NTA nikel şelatlayıcı resin kiti ile saflaştırıldı. Son olarak füzyon etiketli rekombinant protein AcTEV proteazı ile kesilerek His ve V5 epitoplarından arındırıldı.
Bu tez çalışması ile BEVS tekniği kullanılarak doğala en yakın rekombinant proteinin elde edilmesi hedeflenmiştir. Üretilen bu proteinin seroloji temelli hızlı tespit kitlerinin veya aşı niteliği taşıyabilecek rekombinant subunit partiküllerin geliştirilmesine öncü olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Goose parvovirus (GPV), first identified as Derzsy disease in Europe in the 1960s, causes great economic losses and high mortality in the waterfowl industry. For this reason, it is very important to establish prevention/control targets at the point of fighting the disease. The GPV genome is approximately 5.1 kilobases (kb) long and contains two open reading frames (ORFs). The structural proteins of the virus, VP1, VP2 and VP3, are formed by alternative splicing mechanisms of the same ORF. Of these, the VP2 protein is the most expressed protein, and it is the protein that most strongly stimulates the host immune response. For this reason, in thesis the aim was to produce the VP2 protein in the Baculovirus expression vector system (BEVS), intended for use as a candidate antigen in the development of a recombinant vaccine or rapid test kit against GPV. For this purpose, the VP2 gene was first amplified by PCR using specific primers for GPV. After the obtained VP2 amplicon was purified, it was cloned into the commercial pENTR™/TEV/D TOPO™ entry vector. Then, the target gene contained in the pENTR™/TEV/D-TOPO™ vector was transferred to linear N-Term BaculoDirect™ DNA via LR Recombination. This created structure was transfected into Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells and baculoviral virions were obtained. In order to confirm whether the VP2 gene was transferred to BaculoDirect™ Linear DNA, PCR was performed using external primer sets for both the VP2 gene and the expression vector. As a result of amplification, a band of approximately 600 bp in size was observed. To verify the production of the recombinant protein, Western Blot analysis was performed using the V5 epitope located at the N terminus of the produced protein. As a result of the analysis, a band with the expected molecular weight (~65 kDa) belonging to the VP2 gene was detected. IFA analysis was performed using the same epitope to demonstrate protein expression in Sf9 cells infected with recombinant baculovirus. After the expression was confirmed, the protein was purified with the Ni-NTA nickel chelating resin kit by utilizing the 6×His tag in the protein. Finally, the fusion-tagged recombinant protein was cut with AcTEV protease and purified from His and V5 epitopes.
This thesis research aimed to obtain recombinant protein closest to indigenous by using the BEVS technique. It is believed that the production of this protein could pave the way for rapid serology-based detection kits or recombinant subunit particles suitable for use as vaccines.