Bor nitrür nanopartiküllerinin in vitro koşullarda beta amiloid (Aβ) toksisitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
The investigation of the effects of boron nitride nanoparticles on beta amyloid (Aβ) toxicity in in vitro conditions
Yazar: NURŞAH AYDIN
Danışman: PROF. DR. HASAN TÜRKEZ
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı / Nanobiyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Nanopartiküller = Nanoparticles

Özet:
Alzheimer hastalığı (AH),  histolojik olarak beyindeki intraselüler nörofibriller yumru oluşumu ve ekstraselüler amiloid birikimleriyle tanımlanan, demans olgularının %75'inden sorumlu yaşa bağlı nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu hastalık ilerleyici bilişsel bozukluklar, çeşitli nöropsikiyatrik-davranış bozukluklar ve günlük yaşam aktivitelerindeki kısıtlamalar ile karakterize olmaktadır. Hastalığın oluşmasına neden olan etkenlerin yok edilmesine yönelik tedavi henüz bulunamamıştır. Nanopartiküller boyutlarından dolayı birçok eşsiz özelliğe sahiptir. Bu üstün özelliklerinden dolayı çeşitli alanlarda yaygın olarak kullanılan nanopartiküller sağlık alanında da oldukça önemli hale gelmiştir ve  bilim insanlarının dikkatini üzerine çekmiştir.  Bu nedenle nanopartiküllerle yapılan terapötik çalışmalar büyük öneme sahiptir. Bu çalışmamızda kararlı yapıdaki kimyasal özellikler, antioksidan özellikler gibi boyut kaynaklı üstün fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerinden dolayı hekzagonal bor nitrür nanopartikülleri kullanılmıştır. Mevcut tez kapsamında, retinoik asit uygulamasıyla farklılaştırılmış insan nöroblastom hücre hattı (SH-SY5Y) kullanılarak farklı konsantrasyonlardaki hekzagonal bor nitrür (hBN) nanopartiküllerinin beta amiloid (Aβ) toksisitesi üzerine etkilerinin ilk defa araştırılması amaçlanmıştır. İn vitro Alzheimer hastalığı modelinde hücre canlılık oranları 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) 2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) ve laktat dehidrogenaz (LDH) salınım testleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Ardından, hücre kültüründeki oksidatif değişimler toplam antioksidan kapasitesi (TAK) ve toplam oksidan durum (TOD) parametreleri kullanılarak belirlenmiştir. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon (qRT-PZR) metodu kullanılarak gen ekspresyon seviyeleri incelenmiştir. Hücrelerdeki apoptozisin gösterilmesi amacıyla Hoechst 33258 floresan boyama yöntemi kullanılmıştır. Ayrıca hücrelerde toksisitenin neden olduğu ölüm türünü tespit etmek için akış sitometri yöntemi kullanılmıştır. Son olarak, Aβ protein miktarının belirlenmesi amacıyla western blot yöntemi yapılmıştır.
Elde edilen sonuçlara göre, farklı hBN nanopartikül konsantrasyonlarının Aβ toksistesine karşı doza bağlı koruyucu etki gösterdiği hücre canlılık testleriyle belirlenmiştir. hBN nanopartikül uygulamasının deneysel Alzheimer hastalığı modelinde Aβ toksistesinin neden olduğu oksidatif stresi azalttığı, antioksidan kapasiteyi desteklediği gözlenmiştir. Moleküler genetik analizler ile hBN nanopartikül uygulamasının β-sekretaz ve γ-sekretaz aktivitelerini azaltırken α-sekretaz aktivitesini arttırdığı bulunmuştur. hBN nanopartikül uygulamasının deneysel Alzheimer hastalığı modelinde hücrelerde gerçekleşen nekroz ölümlerinde önemli ölçüde azalmaya sebep olduğu bunun sonucunda da hücre canlılığını arttırdığı akış sitometri sonuçlarıyla belirlenmiştir. Ayrıca hBN nanopartikül uygulamasının Aβ protein miktarında azalmaya neden olduğu western blot yöntemiyle tespit edilmiştir. Bu çalışma sonucunda, hBN nanopartiküllerinin Aβ'ye bağlı toksisteye karşı nörokoruyucu etkiye sahip olduğu ve ileri çalışmalarla desteklenerek AH tedavisine yönelik araştırmalara katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Alzheimer's disease (AD) is an age-related neurodegenerative disease that is responsible for 75% of dementia cases histologically defined by intracellular neurofibrillary tuber formation and extracellular amyloid deposits in the brain. This disease is known to be characterized by progressive cognitive disorders, various neuropsychiatric-behavioral disorders, and restrictions on daily life activities. Treatment for the elimination of the factors that cause the formation of the disease has not yet been found. Nanoparticles have many unique properties due to their size. Because of these superior properties, nanoparticles, which are widely used in various fields, have become important in the health field and have attracted the attention of scientists. Therefore, therapeutic studies with nanoparticles are of great importance. In this study, hexagonal boron nitride nanoparticles were used due to their superior physical, chemical and biological properties resulting from the nano dimension such as stable structure chemical properties and antioxidant properties. In scope of the present thesis it is for the first time aimed to investigate the effects of different concentrations of hexagonal boron nitride (hBN) nanoparticles on beta amyloid (Aβ) toxicity by using human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y)  differentiated by retinoic acid administration. Cell viability rates in the in vitro Alzheimer model were evaluated using 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) release tests. Subsequently, oxidative changes in cell culture were determined using the total antioxidant capacity (TAC) and total oxidant state (TOS) parameters. Gene expression levels were examined using the real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method. Hoechst 33258 fluorescent staining method was used to demonstrate apoptosis in cells. In addition, flow cytometry method was used to determine the type of death caused by toxicity in cells. Finally, western blot method was performed determine the amount of Aβ protein. 
According to the results, it was determined by cell viability tests that different concentrations of hBN nanoparticles showed a dose-dependent protective effect against Aβ toxicity. It was observed that hBN nanoparticle application reduces oxidative stress caused by Aβ toxicity and supports antioxidant capacity in experimental Alzheimer disease model. By molecular genetic analysis were founded that hBN nanoparticle application β-secretase and γ-secretase decreases activities while increasing α-secretase activity. It was identified by flow cytometry that hBN nanoparticle application in experimental Alzheimer's disease model caused a significant decrease in necrosis deaths in cells and as a result increased cell viability. In addition, it was also determined by the western blot method that hBN nanoparticle application causes a reduction in the amount of Aβ protein. According to the results obtained, the hBN nanoparticles was thought to be a neuroprotective effect against Aβ-induced toxicity and contribute to the researches about the treatment of AD by supporting with further studies.