Fenilketonüri hastalığının erken teşhisi ve takibi için disk tabanlı hasta başı tanı sisteminin geliştirilmesi
Development of a disk-based point-of-care system for early diagnosis and follow-up of phenylketonuria
Yazar: İPEK AKYILMAZ
Danışman: DOÇ. DR. MEMED DUMAN ; DR. ÖĞR. ÜYESİ DENİZ BAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Fenilketonüri (FKÜ) otozomal çekinik kalıtım gösteren metabolik bir hastalık olup, hastalarda fenilalanin (FA) amino asitini, tirozin amino asitine çeviren fenilalanin hidroksilaz (FAH) enziminin fonksiyon bozukluğundan kaynaklanmaktadır. Hastaların kan, idrar ve diğer vücut sıvılarında biriken FA amino asiti ve yan metabolit ürünleri (fenilpirüvat, fenillaktik asit vb.) santral sinir siteminde miyelinizasyonu bozarak mental-motor geriliğe neden olmaktadır. Ülkemiz hastalığın görülme sıklığı ve sahip olduğu hasta popülasyonu açısından dünyada 1. sırada yer almaktadır. Yenidoğan döneminde tanı alan hastalarda fenilalaninden fakir diyet tedavisi ile zekâ geriliği önlenebildiğinden erken tanı, tedavi ve takibe başlanması önem taşımaktadır. Günümüzde kan FA ölçümü için bakteriyel büyüme inhibisyon testi (Guthrie), florimetrik immünoassay, enzimatik kolorimetrik test, HPLC (direkt amino asit analizi için) ve tandem kütle spektrometrisi (MS/MS) metodları kullanılmaktadır. Tüm bu metodlar için tam donanımlı sağlık merkezlerine ve bu merkezlerde bulunan gelişmiş cihazlara, teknik alt yapıya ve eğitilmiş personele ihtiyaç duyulmaktadır. Ülkemizde, FKÜ hastalarından toplanan tüm kan örnekleri, sadece Ankara ve İstanbul olmak üzere 2 merkez tarafından taranmaktadır. Fakat hastaların bir bölümü, bulundukları illerde bu taramanın rutin bir şekilde yapılamamasından dolayı, belli aralıklarla vermeleri gereken kan örneklerini düzenli bir şekilde vermemektedir. Ayrıca verilen kan örneklerinin her iki kente gönderimi ve saklanması ise tarama işlemine ekstra bir maliyet getirmektedir. Bu nedenle kan FA ölçümü için kolay, ucuz ve mümkünse en küçük yerleşim biriminde bulunan sağlık ocaklarında bile uygulanabilir bir metodun geliştirilmesi oldukça önemlidir. Bu sebeplerden dolayı tamamlanan tezin amacı, Fenilketonüri hastalığının erken tanısına ve tedavi sürecinin takibine imkân veren Disk-Üstü-Laboratuvar analiz (Lab-on-a-CD) sistemi tabanlı yeni bir hasta başı test sistemi geliştirmekti. Bu sistem kapsamında CD şeklinde tek kullanımlık kartuşlar ve bu kartuşlardaki odacıklarda kullanılacak elektrotlar geliştirilmiştir. Sistem, FKÜ hastalığının tanı ve tedavisinde kullanılacak elektrokimyasal ölçüm yapan Disk-Üstü-Laboratuar analiz (Lab-on-a-CD) sistemi olarak hazırlanmıştır. Geliştirilen test sistemi hem taşınabilir hem de kantitatif sonuç verebilen bir sistem olmuştur. Test kiti, tanısı istenen teste göre özelleşebilen, 10 cm çapında 3,5 mm kalınlığında biyouyumlu polimetilmetakrilat (PMMA, pleksi) malzemeden, sifon sistemi geometrisi ile tasarlanan tek kullanımlık kartuşlardan meydana gelmiştir. Elektrokimyasal ölçümlerde serigrafi baskılı altın elektrotlar kullanılmıştır. Grafen oksitin, elektrot üzerinde elektrokimyasal olarak indirgenerek biriktilmesiyle elektrotlara modifikasyon yapılmış ve ölçüm hassasiyeti 1,5 kat arttırılmıştır. FA miktarının elektrokimyasal olarak ölçülmesi, fenilalanin dehidrogenaz (PDH) enzimi varlığında NAD+'nin NADH'e oksidasyonunun sağlanması ve NADH oksidasyon reaksiyonunun amperometrik olarak saptanması esas alınmıştır. 0-20 mg/dL ölçüm aralığında R2 0,9955 doğrusallık elde edilmiş, tespit limiti 0,0524 mg/dL, ölçüm limiti 0,1587 mg/dL ve hassasiyet 0,3338 (mg/dL)/µA olarak saptanmıştır. Yapılan seçicilik çalışmalarıyla sistemin FA'ya özgü olduğu belirlenmiştir. Tez çalışmasının son aşamasında geliştirilen sistemle valide yöntem olan HPLC metodu karşılaştırılmıştır. HPLC ölçümlerinin numune içerisindeki FA derişimlerine yakınlık doğruluk yüzdesi 83,1 iken geliştirilen test kitinin doğruluk yüzdesi 84,1 olarak hesaplanmıştır.

Abstract:
Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive metabolic disease due to dysfunction of phenylalanine hydroxylase (PAH) enzyme, which converts phenylalanine (Phe) amino acid to tyrosine amino acid. Phe amino acid and byproduct metabolites (phenylpyruvic acid, phenyllactic acid, etc.) that accumulate in blood, urine and other body fluids disrupt the myelination in the Central Nervous Systems (CNS) and cause mental - motor retardation. Turkey ranks first in terms of the PKU prevalence and the patient population in the world.  Since mental retardation can be prevented by Phe poor diet in patients diagnosed during the neonatal period, early diagnosis, treatment and follow-up of the disease hold great importance. In routine tests, commonly used methods are Guthrie test, fluorometric methods, enzymatic colorimetric test, HPLC (for direct amino acid analysis) and tandem mass spectrometry (MS/MS). To conduct such tests, it is necessary to have fully equipped health centers with technical infrastructure, advanced tools and well-trained staff. In Turkey, there are only two health centers which are located in Istanbul and Ankara that collect and analyse the blood samples of PKU patients. Since the screen test cannot be done routinely in the provinces where some of the PKU patients are located, they do not give the blood samples at regular intervals. Furthermore, storage and delivery of the blood samples to these cities increase the cost. Therefore, it is quite important to develop an easy, low-cost and point of care applicable blood Phe monitoring system. For all these reasons, the purpose of the completed thesis was to develop a Lab-on-a-CD based bedside test system that allows the early diagnosis and the follow-up of the treatment process of PKU. To achieve that CD shaped disposable cartridges, and electrodes to be used in the chambers of these cartridges were developed. Prepared Lab-on-a-CD system is based on the electrochemical measurements for the diagnosis and the treatment of PKU. Developed test system proved to be a portable device that provides quantitative results. The test kit consists of disposable cartridges designed with siphon system geometry, and a biocompatible  polymethyl methacrylate   (PMMA, plexi) material with a diameter of 10 cm and a thickness of 3,5 mm, which can be customized according to the desired test. Screen-printed gold electrodes were used for the electrochemical measurements. Electrode modification was conducted by electrochemical graphene oxide reduction and deposition on the electrode surface. The sensitivity of the measurement was 1,5 fold increased as a result of the modification. In the electrochemical measurement of Phe, amperometric detection was applied during the oxidation of NAD+ to NADH in the presence of phenylalanine dehydrogenase (PDH) enzyme. Between 0-20 mg/dL measuring range (R2 = 0,9955), calculated limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), and sensitivity were 0,0524, 0,1587 mg/dL and 0,3338 (mg/dL)/µA, respectively. The system's specificity to Phe was determined by conducting selectivity studies. In the final stage of the thesis, the developed system was compared with the validation method (HPLC). Calculated percent success in proximity to Phe concentrations in samples for HPLC and developed test kits were 83,1 and 84,1, respectively.