İnfertil erkeklerde paternal kalıtımla ilişkili endog geninin analizi
Analysis of the endog gene associated with paternal inheritance in infertile men
Yazar: MEHMET ULAŞ BİLİR
Danışman: PROF. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Dünya çapındaki çiftlerin yaklaşık %15'i infertiliteden etkilenmektedir ve üreme başarısızlıklarının yaklaşık %50'si erkek faktöründen kaynaklanmaktadır. Erkek infertilitesinin nedenleri çok farklı değişkenlere bağlı olmakla birlikte, genelde spermatogenezi etkileyen nedenler; idiyopatik, konjenital, edinsel veya sebebi bilinmeyen faktörlerdir. Kişinin yaşı, ameliyat geçmişi, kullandığı ilaç, çevresel dış toksinlere maruz kalmaları, sistemik hastalıklar ve mitokondri fonksiyonu da dahil birçok sağlık durumu erkek doğurganlığını doğrudan veya dolaylı şekilde etkileyebilir. Sperm ve mitokondri ile yapılan çalışmalarda, spesifik mtDNA delesyonları, yetersiz sperm fonksiyonu ile ilişkilendirilmiştir. Mitokondriyal mutasyonlar azospermiye sebep olabileceği gibi "Intra Sitoplazmik Sperm Enjeksiyonu" (ICSI) gibi yardımcı üreme yöntemlerinin de sperm mtDNA'larını aktarabileceği gösterilmiştir.İnsanda ve memelilerde mitokondri ve mitokondriyal DNA'nın maternal kalıtımı yaygın olarak kabul gören bilimsel görüştür. Preimplantasyon sürecinde sperm kaynaklı mitokondrilerin eliminasyonu sağlıklı embriyo gelişiminde işleyen biyolojik süreçtir.ENDOG (endonukleaz G), DNA ve RNA'yı parçalayan, nüklear üretilen, mitokondride lokalize bir nükleazdır. Apoptoz, erken embriyogenez, paternal mitokondriyal eliminasyon ve otofaji dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde yer almaktadır. ENDOG proteini, mtDNA ile yakın etkileşim içerisinde olması nedeniyle mtDNA replikasyonu, metabolizması ve onarımına katılır. ENDOG geni kopya sayısının azospermi hastalarından elde edilen DNA örneklerinde düşük olması, infertil erkekler üzerinde araştırılmasının önemini arttırmıştır.Tez kapsamında azospermi hastalarında nükleer genomda lokalize olan ENDOG geni üzerindeki varyasyonların mitokondrinin paternal eliminasyondaki rolü ve implantasyon başarısındaki etkisi araştırılmıştır.  Azospermi tanısı alan 25 infertil erkek hasta ve 25 sağlıklı erkekten elde edilen periferik kan örneklerinden total genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. Hedefe yönelik yeni nesil dizileme teknolojilerinden "Illumina NextSeq 550" platformuna özgü dizileme prosedürü takip edilerek, toplam 50 ENDOG geni DNA dizilemesi gerçekleştirilmiş, Referans veri tabanlarında analiz edilerek sonuçlar hasta-kontrol grupları arasında değerlendirilmiştir. Ayrıca, periferik kanlardan elde edilen genomik DNA örneklerinde mitokondriye ait olan mt-ND1 geni kullanılarak kantitatif real-time PCR yöntemiyle mtDNA kopya sayısı belirlenmiştir. Mitokondriyal kopya sayısının, infertil hasta grubunda implantasyon başarısına etkisi, infertil-fertil grubu arasında ise fertilite durumlarına göre etkisini ortaya koymak üzere analizleri gerçekleştirilmiştir.ENDOG dizilemesine ilişkin ham veri bilgisinden, verilerin görünebilir hale getirilmesi için kullanılan algoritmalara, web-temelli açık erişim sunan "Galaxy" biyoenformatik platformu aracılığıyla ulaşılmıştır. NGS cihazından elde edilen 25 hasta ve 25 kontrol örneğine ait ham dizileme verisi, Bowtie2 (Galaxy Version 2.5.0+galaxy0) algoritması ile referans insan genomuna [Human (Homo sapiens) (b38): hg38] karşı hizalanarak "BAM (Binary Alignment Map – İkili Hizalama Haritası)" formatında veri setleri elde edilmiştir. Genomik veriler Integrative Genomics Viewer (IGV) uygulaması kullanılarak, indekslenmiş BAM dosyalarından referans insan genomuna (hg38) karşı hasta ve kontrol örneklerine ait yapısal genetik varyant analizi yapılmış ve sonuçlar kaydedilmiştir. ENDOG dizileme verileri 25 infertil ve 25 fertil erkek olguda karşılaştırıldığında 11 farklı varyant elde edilmiştir. Bu varyantlardan dördü "novel" varyant, yedisi dbSNP ID'leri bulunan varyantlardır. ID'leri bulunmayan "novel" varyantlardan ikisi ENDOG geninin "upstream" bölgesinde, biri "terminatör" diğeri ise "intron" bölgesindedir. Veritabanında dbSNP ID bulunan 7 varyanttan üçü "ekson" (rs74750652, rs959785492, rs2280844) dördü intron (rs56778081, rs1217568273, rs112269930, rs569132609) bölgesinde görülmektedir. İnfertil ve fertil erkeklerde ortak olarak 29 varyant tespit edilmiş; bunlardan dördü ise alkolik olmayan karaciğer hastalığı ve lösemi (rs2977998), kolorektal tümör lezyonları (rs2997922), kardiyovasküler risk (rs2293969) ve yaşa bağımlı immün sistemi etkileyen (rs2280845) çeşitli hastalıklarla ilişkili olarak bildirilmiştir. İnfertil erkek olgularda gerçekleştirilen mitokondriyal kopya sayısı analizlerinde başarısız implantasyon olgularına ait relatif kopya sayısı 2.3, başarılı olgularda ise relatif kopya sayısı 0.70 bulunmuş ve istatistiksel olarak anlamlı (p<0.5) tespit edilmiştir. Tek bir olguda ise mitokondriyal delesyon ve bu olguya özgü "novel" ENDOG varyasyonu bulunmuştur.Sadece infertil erkeklerde ENDOG geni üzerinde saptadığımız varyantların paternal mitokondriyal eliminasyon mekanizmasında etkin olabileceğini, özellikle tek bir olguda saptanan mitokondri delesyonuyla bu olguda "novel" bir varyasyonun bulunması, mitokondrilerinin embriyolarda eliminasyon mekanizmalarından kaçarak paternal sızıntıya sebep olabileceğini düşünmekteyiz. Aynı zamanda in vitro fertilizasyonun başarı oranını da etkileyeceği için mitokondrilerin karar verme kriterleri arasına girmesinin önemini göstermektedir.

Abstract:
About 15% of couples worldwide are affected by infertility and about 50% of reproductive declines are driven by the male factor. Although the causes of male infertility depend on many different variables, the reasons that usually involve spermatogenesis are; idiopathic, congenital, acquired or unknown causes. Many health conditions directly or deplete male fertility, including a person's age, history of surgery, medication used, exposure to external toxins at work, systemic diseases, and mitochondrial function. Restrictions with sperm and mitochondria did their job with specific mtDNA deletions, inadequate sperm function. Mitochondrial mutations can cause azoospermia, as well as assisted reproductive methods such as "Intra-Cytoplasmic Sperm Injection" (ICSI) can transfer sperm mtDNA.
Maternal inheritance of mitochondria and mitochondrial DNA in humans and mammals is widely accepted scientific view. Elimination of sperm-derived mitochondria during the preimplantation process is the biological process involved in healthy embryo development.
ENDOG (endonuclease G) is a nuclear produced, mitochondrial localized nuclease that degrades DNA and RNA. It is involved in various biological processes, including apoptosis, early embryogenesis, paternal mitochondrial elimination, and autophagy. The ENDOG protein participates in mtDNA replication, metabolism and repair due to its close interaction with mtDNA. The low number of copies of the ENDOG gene in DNA samples obtained from patients with azoospermia has increased the importance of research on infertile men.
Within the scope of the thesis, the role of variations on the ENDOG gene localized in the nuclear genome in patients with azoospermia in paternal elimination of mitochondria and the effect on implantation success were investigated. Total genomic DNA was isolated from peripheral blood samples obtained from 25 infertile male patients diagnosed with azoospermia and 25 healthy men. By following the sequencing procedure specific to the "Illumina NextSeq 550" platform, one of the targeted next-generation sequencing technologies, a total of 50 ENDOG genes were DNA sequenced, analyzed in reference databases, and the results were evaluated among patient-control groups. In addition, mtDNA copy number was determined by quantitative real-time PCR method using mt-ND1 gene belonging to mitochondria in genomic DNA samples obtained from peripheral blood. Analyzes were carried out to reveal the effect of mitochondrial copy number on implantation success in the infertile patient group and the effect of fertility status among the infertile-fertile group.
From the raw data information on ENDOG sequencing to the algorithms used to make the data visible, the web-based open access "Galaxy" bioinformatics platform was accessed. Raw sequencing data of 25 patients and 25 control samples obtained from the NGS device were aligned against the reference human genome [Human (Homo sapiens) (b38): hg38] with the Bowtie2 (Galaxy Version 2.5.0+galaxy0) algorithm and "BAM (Binary Alignment Map"). – Binary Alignment Map" format data sets were obtained. Genomic data Structural genetic variant analysis of patient and control samples against the reference human genome (hg38) was performed from indexed BAM files using the Integrative Genomics Viewer (IGV) application and the results were recorded. When ENDOG sequencing data were compared in 25 infertile and 25 fertile male cases, 11 different variants were obtained. Four of these variants are "novel" variants and seven are variants with dbSNP IDs. Two of the "novel" variants without IDs are in the "upstream" region of the ENDOG gene, one in the "terminator" region and the other in the "intron" region. Of the 7 variants with dbSNP ID in the database, three appear in the "exon" region (rs74750652, rs959785492, rs2280844) and four appear in the intron (rs56778081, rs1217568273, rs112269930, rs569132609) region. 29 common variants were detected in infertile and fertile men; four of them have been reported in association with non-alcoholic liver disease and leukemia (rs2977998), colorectal tumor lesions (rs2997922), cardiovascular risk (rs2293969) and various diseases affecting the age-dependent immune system (rs2280845). In mitochondrial copy number analyzes performed in infertile male cases, the relative copy number of unsuccessful implantation cases was 2.3, and the relative copy number was 0.70 in successful cases, and it was found to be statistically significant (p<0.5). In a single case, mitochondrial deletion and a "novel" ENDOG variation specific to this case were found.
Variants we detected on the ENDOG gene only in infertile men may be effective in the paternal mitochondrial elimination mechanism, and that a "novel" variation, especially in a single case with mitochondrial deletion, may result in paternal leakage by escaping the elimination mechanisms of mitochondria in embryos. At the same time, it shows the importance of including mitochondria among the decision-making criteria, as it will also affect the success rate of in vitro fertilization.