Meme kanseri hücrelerinde hsp70 inhibisyonunun antiksanser etkilerinin araştırılması
Investigation of anticancer hsp70 inhibition effects on breast cancer cells
Yazar: MUSTAFA ERGÜL
Danışman: PROF. DR. FÜGEN AKTAN ; PROF. DR. YUSUF TUTAR
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Gen ifadesi = Gene expression ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sıcaklık şoku proteinleri = Heat shock proteins ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Hsp70, yeni sentezlenen proteinlerin katlanması, yanlış katlanmış proteinlerin yeniden
katlanması, protein agregasyonunun önlenmesi, hücre içi protein taşınması gibi fizyolojik
rollere sahip bir şaperondur. Sağlıklı hücrelerde makul düzeylerde sentezlenen bu protein
tümörlü hücrelerde aşırı miktarda sentezlenerek tümör hücrelerinin zorlu şartlarda hayatta
kalmasına yardımcı olur. Hsp70, tümörlü hücrelerde apoptozun engellenmesi, kemoterapiye
karşı direnç, metastaz, invazyon gibi kötü prognozla ilişkili birçok süreçte rol oynar.
Dolayısıyla tümörlü hücrelerde Hsp70'in spesifik olarak inhibe edilmesi kanser tedavisinde
önemli bir stratejidir. Ayrıca Hsp70'in inhibe edilmesi tümör hücreleri için toksik etki
gösterirken, normal hücrelerde bu etki görülmez, dolayısıyla kanser tedavisindeki sistemik
toksisitenin önlenmesinde Hsp70 inhibisyonu büyük önem taşımaktadır.
Bu çalışmanın amacı Hsp70 inhibisyonunun antikanser etkilerinin araştırılması ve
Hsp70 üzerinde yapılan nokta mutasyonlarının protein fonksiyonunu ne şekilde etkilediğini
araştırmaktır. Çalışmada öncelikle Hsp70 NBD üzerindeki inhibitörlerle etkileşen kritik bazı
amino asitlerde nokta mutasyonu yapılarak inhibitör/protein etkileşimine ait bağlanma
katsayılarının ve minimum inhibitör konsantrasyonlarının ne şekilde değiştiği moleküler
simülasyon çalışmaları (doking) ile belirlenmiştir. Ayrıca saflaştırılan Hsp70 ve mutant
Hsp70 proteinleri inhibitörlerle ayrı ayrı etkileştirilerek ATP hidroliz ve lüsiferaz katlama
deneyleri yapılmıştır. Veriler, yapılan nokta mutasyonları sonucunda mutant proteinlerin
ATP hidroliz ve lüsiferaz katlama aktivitelerinde kontrol grubuna göre belirgin bir azalma
olduğunu göstermiştir (p<0.05). İkinci olarak inhibitörlerin MCF-7 hücre hattı üzerindeki
antikanser etkileri ve kullanılacak dozlar XTT yöntemi ile belirlenmiştir. İnhibitörlerin
Hsp70i protein miktarları üzerindeki etkileri ise ELISA yöntemi ile belirlenmiştir. ELISA
sonuçları inhibitörlerin MCF-7 hücrelerindeki Hsp70i miktarını kontrol grubuna göre
artırdığını göstermiştir (p<0.05). Son olarak PES'in MCF-7 hücrelerinin gen ekspresyon
profilini ne şekilde değiştirdiği PCR array yöntemleri ile araştırılmış ve PES'in kanserle
ilişkili yolaklardaki birçok genin ekspresyonunda değişmeye neden olduğu sonucuna
varılmıştır.
Bütün deneysel veriler göz önüne alındığında bu çalışmanın kanser tedavisi için
inhibisyon alanında bilimsel bilgi birikimi ve daha ileri çalışmalar için alt yapı sağlayacağı
düşünülmektedir.

Abstract:
Hsp70 is a chaperone has physiological roles such as folding of newly synthesized
proteins, refolding of misfolded proteins, inhibition of protein aggregation, intracellular
protein transport. This protein which is expressed at marginally levels in healthy cells, is
greatly overexpressed in tumor cells, helping tumor cells to survive in hard conditions.
Hsp70 plays role in many processes related to poor prognosis such as inhibition of apoptosis
in tumor cells, resistance to chemotherapy, metastasis, invasion. Thus, specific inhibition of
Hsp70 in tumor cells is an important strategy in the treatment of cancer. In addition, while
inhibition of Hsp70 has toxic effects on tumor but not normal cells; therefore, Hsp70
inhibition is of great importance in the prevention of systemic toxicity in the treatment of
cancer.
The aim of this study was to investigate the anticancer effects of Hsp70 inhibition and
to investigate how point mutations on Hsp70 affect protein function. Firstly, point mutations
were made in some crucial amino acids interacting with the inhibitors on Hsp70 NBD, and
the binding coefficient of the inhibitor/protein interaction and the changes of the minimum
inhibitor concentrations were determined by molecular simulation studies (docking). In
addition, ATP hydrolysis and luciferase folding experiments were carried out purified Hsp70
and mutant Hsp70 proteins with inhibitors. The datas showed that mutant proteins resulted in
a marked reduction in ATP hydrolysis and luciferase folding activities compared to the
control group as a result of point mutations (p<0,05). Secondly, the anticancer effects and the
doses to be used on the MCF-7 cell line of the inhibitors were determined by the XTT
method. The effects of inhibitors on Hsp70i protein amounts were determined by ELISA.
ELISA results showed that inhibitors increased the amount of Hsp70i in MCF-7 cells
compare to the control group. Finally, the way in which PES alter the gene expression profile
of MCF-7 cells was investigated by PCR array methods, resulting in the PES being altered in
the expression of many genes in the cancer related pathways.
Taking into account all experimental data, it is thought that this study will provide an
infrastructure for scientific knowledge and further studies in the field of inhibition for cancer
treatment.