İmmünoinformatik yaklaşımlarla Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi'ne (KKKA)karşı aşı tasarımı ve etkinliğinin sorgulanması
Evaluation vaccine design and efficacy against Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) with immunoinformatic approaches
Yazar: SÜMEYYE ALTUNOK
Danışman: PROF. DR. AYKUT ÖZKUL ; DR. ÖĞR. ÜYESİ MUTLU ERDOĞAN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyoinformatik = Bioinformatics ; Bulaşıcı hastalıklar = Communicable diseases ; DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Gen klonlama = Gene cloning ; Moleküler klonlama = Molecular cloning ; Viral aşılar = Viral vaccines

Özet:
Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA), yaygın coğrafi dağılımı ve ciddiyeti nedeniyle Dünya Sağlık Örgütü'nün öncelikli hastalıklar listesinde yerini almıştır. KKKA virüsü (KKKAV) için klinik öncesi aşı geliştirme çalışmaları, farklı platformlar kullanarak birden fazla antijeni hedef almalarına karşın, korumanın hücresel immün bağışıklıktaki rolü eksiktir. Ayrıca, aşılanmış hayvan modellerinde nötralize edici antikorların seviyeleri mutlak korumayla doğrudan ilişkili değildir; bu durum, T lenfosit yanıtlarının viral enfeksiyonlardan korunmada ve bunların ortadan kaldırılmasında rol oynadığı bilinmesi, CD8+ yanıtlarının önemini vurgulamış ve bu çalışmada antiviralsitokinlerin üretimi gibi KKKAV'ya özgü antiviralefektör yanıtların değerlendirilmesine yol açmıştır. Bu çalışma, hesaplamalı yöntemler kullanarak elde edilen verilerin farklı kombinasyonlarıyla, immünojenik olma potansiyeline sahip epitop tabanlı bir DNA tasarımları değerlendirilmiştir. Sitotoksik T hücresi epitopları, biyoinformatik sunucular kullanılarak KKKAV-NP için değerlendirildi.  Biyoinformatik araçlar kullanılarak tahmin edilen epitoplarantijenite, toksisite, popülasyonda bulunma yüzdesi, korunmuşluk gibi çeşitli parametreler açısından değerlendirildikten sonra, 4 farklı aşı vektörü oluşturuldu ve in vitro ve in vivo analizlerle etkinlik testlerine tabi tutuldu. Invitro testlerde antijenleri ifadeleyenmonosit kökenli THP-1 hücreleriyle, T lenfosit hücreleri olan Jurkat hücreleri birlikte kültüre edilmiş ve antijenlerin T hücre uyarımı kaynaklı sitokin üretimi değerlendirildi. Seçilen antijenleri ifadeleyenmonosit kökenli THP-1 hücrelerinin T lenfosit Jurkat hücreleriyle birlikte kültivasyonu, TCR'nin THP-1 hücreleri tarafından sunulan MHC/antijen kompleksini tanıyarak T lenfositlerinin aktivasyonunu indükledi. Invivo testlerde iki farklı hayvan grubu kullanıldı. Serolojik yanıtın kontrolü amacıyla Balb/c fareler kullanılırken, hücresel bağışıklık parametrelerinin değerlendirilmesi amacıyla ise tip I interferon ifade etmeyen (IFN-/-) transgenik fareler kullanıldı. İki farklı ELISA tekniği kullanılarak gerçekleştirilen ELISA testi (rekombinant NP proteini ve virüsle enfekte hücre lizatı ile kaplanan ELISA tabletlerinde) ile IFNAR-/- farelerde total IgG yanıtlarında negatif kontrole (backbone) kıyasla anlamlı bir artış görülmedi. Bu durumun gerek kullanılan hayvanın ırkından ve gerekse antijenikepitopların seçiminde T hücre reseptörlerine uyumlu olan motiflerin tercih edilmesiyle ilişkili olacağı sonucuna varıldı. IFN-I bloke hayvan modelinde (IFNAR-/-) KKKAV-NP MHC-I epitoplarını içeren DNA bazlı aşılar kullanarak bu farelerde hücresel bağışıklığın rolü araştırıldı. Sentezlenen aşı formülasyonlarına karşı oluşan immün yanıtlar, fare aşılamalarının ardından ELISpot ve Th1 ve Th2 ilişkili sitokin yanıtları ile doğrulandı. Sonuç olarak; çalışmada öngörülen T hücre epitopları ile IFNAR-/- farelerde hücresel bağışıklığın uyarıldığı ancak bu immünizasyonların koruyucu kapasitesinin araştırılması için daha ileri çalışmalara ihtiyaç olduğu sonucuna varıldı.

Abstract:
Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) has been included in the World Health Organization's list of priority diseases due to its widespread geographical distribution and severity. Preclinical vaccine development efforts for CCHF virus (CCHFV) have targeted multiple antigens using different platforms, but the role of cellular immunity in protection is missing. Furthermore, thelevels of neutralizing antibodies in vaccinated animal models do not directly correlate with absolute protection; this, coupled with the known role of T lymphocyte responses in protection from and elimination of viral infections, has highlighted the importance of CD8+ responses and led to the evaluation of CCHF-specific antiviral effector responses such as the production of antiviral cytokines in this study. This study evaluated epitope-based DNA designs with the potential to be immunogenic, with different combinations of the data obtained using computational methods. Cytotoxic T cell epitopes were evaluated for KKKAV-NP using bioinformatic servers. After the epitopes predicted using bioinformatic tools were evaluated in terms of various parameters such as antigenicity, toxicity, percentage of presence in the population, conservation, 4 different vaccine vectors were created and subjected to efficacy tests with in vitro and in vivo assays. In in vitrotests, monocyte-derived THP-1 cells expressing antigens and Jurkat cells, whichare T lymphocyte cells, were co-cultured and cytokine production caused by T cell stimulation of antigens was evaluated. Co-cultivation of monocyte-derived THP-1 cells expressing selected antigens with Jurkat cells induced activation of T lymphocytes by TCR recognition of the MHC/antigen complex presented by THP-1 cells. Two different animal groups were used in in vivo tests. Balb/c mice were used to control serologic response, while transgenic mice that do not express type I interferon (IFN-/-) were used to evaluate cellular immune response parameters. The ELISA test using two different ELISA techniques (ELISA tablets coated with recombinant NP protein andvirus-infectedcelllysate) showed no significant increase in total IgG responses in IFNAR-/- mice compared to the negative control (backbone). It was concluded that this may be related to both the breed of animal used and the choice of antigenic epitopes that are compatible with T cell receptors. We investigated the role of cellular immunity in IFN-I blocked animal model (IFNAR-/-) mice by using DNA-based vaccines containing CCHFV-NP MHC-I epitopes. Immune responses to the synthesized vaccine formulations were confirmed by ELISpot and Th1 and Th2-associated cytokine responses following mouse vaccinations. As a result, it was concluded that cellular immunity was stimulated in IFNAR-/- mice with the T cell epitopes predicted in the study, but further studies are needed to investigate the protective capacity of these immunizations.