Rhodotorula cinsine ait bazı maya türlerinin beta-karoten üretimlerinin incelenmesi
Investigation of beta-carotene productions of some yeast species that belong to rhodotorula genus
Yazar: FAZİLET MIDIK
Danışman: PROF. DR. ZEKİYE YEŞİM ÖZBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında, Rhodotorula glutinis var. glutinis NBRC 1125 suşunun β-karoten üretimi üzerine çeşitli fermantasyon parametrelerinin etkileri incelenmiştir. Araştırmada, tüm fermantasyon deneyleri kesikli sistemde, sıcaklığı ve çalkalama hızı kontrol edilebilen su banyolarında gerçekleştirilmiştir. Çalışmada ilk olarak, Rhodotorula cinsine ait on farklı suşun β-karoten üretimleri karşılaştırılmalı olarak incelenmiştir. İncelenen suşlar arasından en yüksek β-karoten üretimi (3.68 mg/L), R. glutinis var. glutinis NBRC 1125 suşu ile elde edilmiştir. Daha sonra seçilen bu suşun farklı karbon ve azot kaynakları içeren fermantasyon ortamlarında β-karoten üretimleri araştırılmıştır. Karbon kaynağı olarak glukoz, fruktoz, galaktoz, maltoz ve sakkarozun etkilerinin incelendiği deneylerde, en yüksek β-karoten üretimi sırasıyla; galaktoz (5.57 mg/L) ve fruktoz (3.88 mg/L) ile çalışıldığında elde edilmiş, çalışmaya daha ucuz bir substrat olan fruktoz ile devam edilmesine karar verilmiştir. İnorganik azot kaynakları olarak; amonyum sülfat, sodyum nitrat ve amonyum klorür, organik azot kaynakları olarak; et, kazein, soya kaynaklı pepton ve maya özütünün çeşitli kombinasyonlarının etkilerinin incelendiği deneylerde çalışılan suş ile en yüksek β-karoten üretimi (6.84 mg/L), kazein kaynaklı pepton ile amonyum sülfat karışımı kullanıldığında elde edilmiştir. 
Bu tez çalışmasında daha sonra, yanıt yüzey yöntemi kullanılarak R. glutinis var. glutinis NBRC 1125 suşu ile  β-karoten üretiminin optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, kullanılan programda yer alan; dönüşümlü merkezi karma tasarım yöntemi kullanılarak oluşturulan,  merkezde 6 tekrarlı, toplam 30 deneysel noktadan oluşan, bir deney tasarım planı kullanılmıştır. Tasarımda bağımsız değişkenler olarak; fermantasyon ortamının fruktoz ve pepton başlangıç derişimleri, başlangıç pH'ı ve sıcaklık seçilirken, bağımlı değişkenler; en yüksek β-karoten derişimi, R. glutinis var. glutinis NBRC 1125'in özgül üreme hızı ve ürün oluşum hızı olarak belirlenmişlerdir. Tasarım planında verilen koşullarda gerçekleştirilen deneylerden elde edilen sonuçlara, çoklu regresyon analizi uygulanarak, bağımsız değişkenlerin bağımlı değişkenler üzerine etkilerini gösteren model eşitlikler türetilmiş ve türetilen bu eşitliklerin uygunlukları, varyans analizi (ANOVA) ile değerlendirilmiştir. Optimizasyon, programda yer alan istenen hedefe ulaşma oranı kullanılarak, nümerik olarak gerçekleştirilmiştir. Program tarafından oluşturulan 100 çözümden, istenen hedefe ulaşma oranının; 1.000, fermantasyon ortamının fruktoz ve pepton başlangıç derişimleri ile başlangıç pH'ı ve sıcaklığın sırasıyla; 49.459 g/L, 8.371 g/L, 3.815 ve 27.402ºC olduğu bir çözüm seçilmiştir. Seçilen koşullarda gerçekleştirilen deneyde, maksimum β-karoten derişimi; 7.18 mg/L, R. glutinis var. glutinis NBRC 1125'in özgül üreme hızı; 0.025 sa-1 ve maksimum β-karoten üretim hızı; 0.031 mg β-karoten/(L.sa) olarak elde edilmiştir. Optimum koşullarda gerçekleştirilen bu deneylerin sonuçları değerlendirildiğinde, tüm deneysel sonuçların kabul edilebilir sınırlar içerisinde ve optimum koşulların %95 güven aralığında olduğu doğrulanmıştır. 

Bu tez çalışmasında, çeşitli doğal substrat kaynaklarının, doğrudan fermantasyon ortamı olarak veya sentetik fermantasyon ortamında karbon kaynağı yerine kullanılmalarının, R. glutinis var. glutinis NBRC 1125 suşunun β-karoten üretimine etkileri de araştırılmıştır. Çalışmada doğal substrat kaynakları olarak; şeker pancarı küspesi, üzüm, elma ve armut posası özütleri, kestane ve fındık kabuğu ile yer elması hidrolizatları ve üzüm suyu denenmiştir. İncelenen suş ile en yüksek  β-karoten derişimi (8.46 mg/L), fermantasyon ortamında karbon kaynağı yerine elma posası özütü kullanıldığında elde edilmiştir. Doğal substratların doğrudan fermantasyon ortamı olarak kullanıldığı deneylerde ise, en yüksek β-karoten derişimi (5.48 mg/L) yer elması hidrolizatı ile çalışıldığında elde edilmiştir. 
Bu tez çalışmasında incelenen suş tarafından üretilen bazı β-karoten örneklerinin, FT-IR spektrometresiyle moleküler yapı analizleri de gerçekleştirilmiş ve elde edilen spektrumların, saf β-karoten örneği ile uyumlu karakteristik pikler içerdikleri tespit edilmiştir.


Anahtar kelimeler: Rhodotorula glutinis, β-karoten, fermantasyon, yanıt yüzey yöntemi, optimizasyon, doğal substrat

Abstract:
In this thesis, the effects of various fermentation parameters on β-carotene production by the Rhodotorula glutinis var. glutinis NBRC 1125 strain were studied. All batch fermentations were carried out in water baths with controlled temperature and agitation speed. β-carotene production by each of ten different strains belonging to the genus Rhodotorula was quantitatively assessed. Among the strains examined, the highest β-carotene production (3.68 mg/L) was obtained in the Rhodotorula glutinis var. glutinis NBRC 1125 strain. Thus, β-carotene production by this strain was investigated using different fermentation media containing various carbon and nitrogen sources. In experiments using glucose, fructose, galactose, maltose, or sucrose were used as carbon source, the highest β-carotene production was obtained with galactose (5.57 mg/L) followed by fructose (3.88 mg/L). Further studies were conducted using fructose (the cheaper of these 2 substrates). In experiments in which ammonium sulfate, sodium nitrate, and ammonium chloride were used as inorganic nitrogen sources, and meat, casein, soy-based peptone, and yeast extract were used as organic nitrogen sources, the highest β-carotene yield (6.84 mg/L) was obtained in medium containing a mixture of casein-based peptone and ammonium sulfate. 
To optimize the β-carotene production of the R. glutinis var. glutinis NBRC 1125 strain, it was subjected to response surface methodology. Using a rotatable central composite design method, an experimental plan consisting of 30 experiments with six replicates at the center point was adopted. Initial fructose and peptone concentrations in the fermentation media, and initial pH and temperature of fermentation medium were selected as independent variables. The dependent variables were β-carotene concentrations, specific growth rates of R. glutinis var. glutinis NBRC 1125, and product formation rate. Multiple regression analysis was applied to the results of all experiments, and equations were derived to model the effects of independent variables on dependent variables. Performance of the derived equations was evaluated using analysis of variance (ANOVA). Optimization was performed numerically using the program's desirability function. Among the 100 solutions derived from the program, the one having a desirability value of 1.000 was selected for further experiments. In this solution initial fructose and peptone concentrations, initial pH, and temperature of the fermentation medium were 49.459 g/L, 8.371 g/L, 3.815 ve 27.402ºC, respectively. These conditions were selected for further experiments. Experiments performed under these selected conditions yielded a maximum β-carotene concentration was found as 7.18 mg/L, the specific growth rate of R. glutinis var. glutinis NBRC 1125 was 0.025 h-1, and the maximum β-carotene production rate was 0.031 mg β-carotene/(L.h). Statistical analyses of these experiments performed under optimum conditions verified that all experimental results were within acceptable limits, and optimum conditions were confirmed to be within 95% confidence intervals. 
 
This thesis also reported the effects of the direct usage of various natural substrates as fermentation media or usage of natural substrates as carbon source in synthetic fermentation medium on β-carotene production by R. glutinis var. glutinis NBRC 1125. In this study, sugar beet pulp, grape, apple, and pear pulp extracts, chestnut and hazelnut shells, Jerusalem artichoke hydrolysates, and grape juice were used as natural substrates. The highest β-carotene concentration (8.46 mg/L) was obtained using apple pulp extract as carbon source in fermentation medium. In the experiments in which natural substrates were used directly as fermentation media, the highest β-carotene concentration (5.48 mg/L) was obtained with Jerusalem artichoke hydrolysate. 
 
The molecular structures of some β-carotene samples produced by the studied strain were analyzed using FT-IR spectrometer. The spectra of all analyzed samples were consistent with the characteristic peaks of pure β-carotene.


Keywords: Rhodotorula glutinis, β-carotene, fermentation, response surface methodology, optimization, natural substrate