Nanoceria katalizörü ile üretilen reaktif türlerin süpürülme etkinliğinin ölçümü için yöntem geliştirilmesi
Development of a novel method to measure the scavenging activity of reactive species produced using nanoceria as a catalyst
Yazar: GÖZDE MEDİHA KAMER
Danışman: PROF. DR. BİRSEN DEMİRATA ÖZTÜRK
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Oksijen molekülündeki eşleşmemiş elektronlar aynı spin ve farklı orbitallerdeyken minimum enerjiye sahiptir. Ancak oksijene elektron veren yapılardaki zıt spinli bir elektron çifti, moleküler oksijenin reaksiyona girme eğilimini sınırlar. Gerekli elektron ve enerji takviye edilirse spin sınırlaması kalkar ve ardışık indirgenme sonucu eşlenmemiş elektronlar yüksek enerjili "reaktif oksijen türleri" (ROS) adı verilen ve "oksidatif strese" sebep olan formlara dönüşürler. ROS hücrede oksijenli solunum sırasında veya in vitro çalışmalarda metal iyonlarının katalizör etkisi ile oluşmaktadır. Serbest radikaller de bu türlerin bir sınıfıdır. Günümüzde kanser gibi hastalıkları anlamak açısından serbest radikal mekanizmasının incelenmesi önemlidir. Bu radikaller en basit şekilde demir(II) iyonlarının demir(III) iyonlarına yükseltgendiği Haber Weiss mekanizması da denilen Fenton reaksiyonunda üretilirler.
Fenton kimyası, günümüzde organik kirleticilerden pestisitlere, endüstriyel ürünlerin yükseltgenmesi için yaygın olarak kullanılan, basit ve kolay ulaşılabilen reaktiflere sahip, ancak reaksiyon pH değerinin asidik olması sebebi ile biyolojik sistemlerde sınırlı uygulaması olan bir mekanizma dizisidir. Son yıllarda fenton benzeri mekanizmalar heterojen reaksiyon ortamlarında tercih edilerek fenton mekanizmasının dezavantajları giderilmeye çalışılmıştır. Bu tezin amacı fenton benzeri reaksiyon ortamında üretilen reaktif türlerin konsantrasyonlarındaki değişmeyi bir prob ve süpürücü madde varlığında spektrofotometrik olarak izlemektir. Bunu sağlamak amacıyla da tez dört bölümden oluşmaktadır. 
Birinci bölümde reaktif türlerin üretiminde bir heterojen katalizör görevi görecek olan nano boyutta seryum oksit (nanoceria) partikülleri, Türkiye'ye özgü bir bitki türü olan zahter infüzyonu içerisinde yeşil sentez prensipleri takip edilerek sentezlenmiştir. CeONP üretimi Seryum(III) aşamasından başlamaktadır. Literatürde Seryum(III)'ten yola çıkılarak üretilen nanopartiküllerin üretim şartlarına, tane boyutuna ve pH'a bağlı olarak Ce3+/ Ce4+ oranlarının değiştiği karma valens bir oksit oluşturduğu rapor edilmekte olup çoğunda "Cerium oxide nanoparticles-nanoceria-CeONP" genel ifadesi yeralmaktadır. Bazı literatürlerde ise partiküllerin yapısının xCeO2.yCe2O3 şeklinde verildiği görülmüştür.  Çalışmamızda üretilen partiküllerin "mix valence-oxide" olduğu düşünülmektedir. CeONP üretimi için kullanılan çöktürme yönteminde; 4,5 µM Ce(NO3)3 çözeltisi ve 10,0 g/ 100 mL zahter infüzyonundan oluşan karışıma çöktürücü madde olarak 1 M sodyum karbonat çözeltisi 80°C'de damla damla, pH 9 değerine ulaşılana kadar eklenmiştir. 4-6 saat arası sabit sıcaklıkta karıştırılan süspansiyon aseton:su karışımı ile üç kez yıkanmıştır. CeONP sentezinde pH değerinin 9 olması nanopartikül çekirdekleşmesi ve oluşumu için önemliyken, zahter infüzyonunda bulunan flavonoidler ve fenolik bileşikler bazik ortamda seryum'un indirgenmesini kolaylaştırıp ortamdaki diğer büyük moleküller ile birlikte kümelenmesini önlemektedir. Çöktürme yöntemi ile sentezlenen nanoceria hava ortamında kurutulmuş ve ince partiküller elde edilene kadar mekanik olarak agat havanda öğütülmüştür. Ayrıca zahter infüzyonunda üretilen nanopartiküllerin boyut ve renk olarak karşılaştırması literatürde yer alan nişasta ve amonyak yöntemleri uygulanarak yapılmıştır. Bu iki yöntemin bizim geliştirdiğimiz Zahterle sentez yönteminden en büyük farkı, çöktürme ajanı olarak saf amonyak çözeltisinin kullanılmasıdır. Nişasta yönteminde amonyak dışında ortama stabilizatör olarak nişasta çözeltisi eklenirken klasik sentez yönteminde herhangi bir stabilizatör eklenmesine ihtiyaç duyulmamaktadır. Taramalı elektron mikroskopu (SEM) ile yapılan karakterizasyon çalışmalarında, Zahter infüzyonu ortamında sentezlenen CeONP'nin ortalama 30 nm partikül büyüklüğüne sahip olduğu bulunurken, bu değer klasik amonyak yönteminde 30-60 nm, nişasta yönteminde ise 51 nm'ye ulaşmıştır. 
Tezin ikinci kısmında nanoboyutta seryum partiküllerinin üretilmesini sağlayan zahter infüzyonu toplam fenolik, flavonoid ve antioksidan içerikleri bakımından incelenmiştir. Toplam fenolik içeriğin belirlenmesi için literatürde yaygın olarak kullanılan klasik toplam fenol içeriği yöntemi (TPC) ve klasik yöntemdeki çözücü ortamının değiştirilmesi ile geliştirilen modifiye Folin-Cicoalteu antioksidan kapasitesi (FC) yöntemi kullanılmıştır. Toplam antioksidan içeriği seryum(IV) temelli antioksidan kapasitesi yöntemi (CERAC) ile, toplam flavonoid içeriği ise alüminyum klorür testi ile belirlenmiştir. Tüm değerler Alüminyum klorür testi hariç gallik asit eşdeğeri olarak hesaplanırken, alüminyum klorür testi kateşin eşdeğeri olarak hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlara göre Zahter infüzyonunun fenolik içeriği TPC yöntemi ile 0,107 M, modifiye FC ile 0,0814 M, CERAC yöntemi ile toplam antioksidan kapasitesi 0,1057 M ve flavonoid içeriği 0,0178 M olarak hesaplanmıştır. Sonuçların değerlendirilmesinde antioksidan tayini yöntemlerinde gerçekleşebilen sinerjistik ve antogonistik etkiler göz önüne alınarak sonuçların aynı bitki için birbirinden farklı olabileceği düşünülmüştür. TPC yönteminde elde edilen sonucun CERAC yönteminden biraz yüksek olması fenolik yöntemlerde yaygın olarak görülebilen girişimlere ve reaktifin yan reaksiyonuna bağlı bulunmuştur. TPC yöntemi dışındaki diğer üç yöntemin birbirleri ile anlamlı sonuç verdiği gözlenmiştir. 
Tezin üçüncü kısmında, sentezlenen nanoceria partikülleri kullanılarak reaktif türlerin üretimi DMPD ortamında incelenmiştir. Geliştirilen kolorimetrik yöntem fenton benzeri ortamda nanoceria ve hidrojen peroksit aktivitesi ile üretilen reaktif türlerin, 515 nm'de kırmızı-mor renkli DMPD katyonunun absorbansına bağlı olarak indirekt şekilde ölçülmesini sağlamaktadır. Ortama eklenen süpürücü maddenin, ortamda bulunan DMPD çözeltisi ile reaktif türler için yarışmalı bir reaksiyon verdiği ve sonuçta DMPD katyonunun absorbansında bir azalmaya yol açtığı bulunmuştur. Süpürücü maddenin antioksidan gücü de 515 nm'deki ilk ve son ölçülen absorbans değerleri arasındaki farka bağlı olarak yüzde cinsinden ifade edilmiştir. Reaktif türlerin üretimi için optimizasyon çalışması yapılmış ve hidrojen peroksit ve DMPD konsantrasyonlarının, sıcaklık, zaman ve pH'ın reaksiyona etkisi incelenmiştir. Sonuçta en uygun reaksiyon ortamının 2,14 mM hidrojen peroksit, 1,14x10-4 M DMPD, 228 ppm nanoceria konsantrasyonu kullanılarak pH 7'de, oda sıcaklığında 30 dakikalık bekleme süresi ile gerçekleştiği bulunmuştur. Heterojen fenton-benzeri reaksiyon ortamının dezavantajlarından biri ortamda kalan nanopartiküllerin UV spektrofotometre ile ölçümlerde girişim yapmasıdır. Bu sebepten çözeltilerin reaksiyondan sonra santrifüj veya süzme yapılması ihtiyacı doğmaktadır. Bu dezavantajın giderilmesi için yöntemin uygulama kolaylığı açısından her çalışma öncesi reaktif türlerin "taze" stok çözeltisi hazırlanmıştır. Bu stok çözelti için 0,2 g nanoceria ile 1 M hidrojen peroksit çözeltisinin karıştırılıp ortama hidrojen peroksitin fazlasının giderilmesi amacıyla 804 U/mL katalaz çözeltisi eklenmiştir. Taze olarak hazırlanan stok radikal çözeltisinin 0,9 mL'si her bir deneme için kullanılmıştır. Geliştirilen DMPD metodu ile hem standart antioksidan çözeltilerinin hem de bitki infüzyonlarının yüzde süpürülme aktiviteleri belirlenmiştir. Bu değer antioksidan maddeler için azalan sırayla kuersetin, gallik asit, kafeik asit, rutin, ferulik asit, kateşin ve trolox şeklinde bulunurken, bitki infüzyonları için; kuşburnu, hibiskus, kekik, yeşil çay, nane, adaçayı, ıhlamur ve ispanyol kekiği olarak bulunmuştur. 
Tezin dördüncü bölümünde geliştirilen DMPD metodunun karşılaştırılması amacıyla daha önce üretilen çözeltiye CUPRAC metodu uygulanmıştır. Bu metod 450 nm'de neokuprain reaktifinin absorbans değerinin süpürücü madde ortamında azalmasına dayanmaktadır. Bu amaçla daha önce bahsi geçen stok çözeltisi ortamından alınan 0,9 mL radikal çözeltisi 5x10-4 M antioksidan çözeltisi ile karıştırılmış ve ardından bu karışıma CUPRAC metodu uygulanmıştır. 450 nm'de absorbans farkına dayanarak hem aynı sentetik antioksidan çözeltileri hem de bitki infüzyonları için yüzde süpürme aktiviteleri ölçülmüştür. Bu değer antioksidan maddeler için azalan sırayla Kuersetin, kafeik asit, rutin, gallik asit, ferulik asit, kateşin, trolox olarak bulunurken, bitki infüzyonları için; kekik, yeşil çay, nane, ispanyol kekiği, adaçayı, kuşburnu, hibiscus ve ıhlamur olarak bulunmuştur.
DMPD yönteminde kuşburnu çayının daha yüksek absorbans vermesi çayın kendi pembe rengi ile ilişkilendirilmiştir. Genel olarak sonuçlar birbiri ile orantı olsa da CUPRAC metodunda antioksidan maddenin fazlasının ortama eklenmesi zorunluluğu ile beraber yöntem zamana bağlıdır ve ancak 30 dakikalık inkübasyon süresi sonunda sağlıklı sonuçlar alınabilir. Geliştirilen DMPD yönteminde ise antioksidan çözeltisinin fazlası aranmaz ve yöntem zamandan bağımsız olarak oda sıcaklığında hızlı ve kolay sonuç vermektedir. Ayrıca karşılaştırma için elde edilen sonuçlar DMPD metodunda zaman açısından yöntemde esneklik sağlanabildiğini göstermektedir. Sistem ayrıca oda sıcaklığında ve pH 7 değerinde çalıştığı için biyolojik ROS incelemeleri için de uygun koşullar sağlamaktadır. Ancak DMPD katyonunun reaktif yapısı sebebi ile yöntem, her çalışmadan önce yeni çözelti hazırlanmasını gerektirmektedir. 
Sonuç olarak Nanoceria partiküllerinin katalizör olarak kullanılması ile ortam pH'ından bağımsız olarak, heterojen bir sistem ile hidrojen peroksitten reaktif türlerin üretilmesi sağlanmıştır. Üretilen reaktif türler antioksidan maddelerin süpürme yüzdelerinin tayini için DMPD probu ile reaksiyona sokularak zamandan bağımsız bir yöntem geliştirilmiş ve bu yöntem hem standart antioksidan çözeltilerine hem de çay infüzyonlarına uygulanmıştır. Böylece antioksidan kapasitesinin hızlı, kolay ve ucuz bir şekilde tayini için yöntem geliştirilerek tez çalışması tamamlanmıştır.

Abstract:
The reactivity of molecular oxygen is limited when another structure that donates electrons to oxygen has a reverse spin electron pair. Spin limitation is removed if the necessary electron and energy are supplied from the reacting substance to the oxygen. Thus uncoupled electrons in oxygen turn into highly energetic forms generally called as reactive oxygen species (ROS) due to consecutive reductions. ROS are one of the main reasons of the oxidative stress in biological systems.  ROS are produced with the catalytic affect of metal ions during cellular respiration in cells or in vitro studies. Free radicals are a class of ROS and it is important to investigate the free radical mechanism to understand certain diseases such as cancer. These radicals are generally produced with the redox reaction of iron(II) to iron(III) that is usually called as fenton or Haber-Weiss mechanism.  
Fenton chemistry explains a series of chain reactions that is used for the oxidation of organic pollutants, pesticites and industrial products. The method is commonly used for its easy and stable reagents but it has limited applications in biological systems due to the acidic working pH range. Recently, fenton like heterogenous mechanisms are used to eliminate the disadvantages of the original reaction. Although magnetite and magnetite based composite structures are the most popular materials in the heterogeneous synthesis, these mechanisms have their drawback such as the need of filtration or centrifuge. Different nanomaterials and composites are used to mimic the fenton behahivour of iron oxide particles. Nanoceria is one of those materials that can act like a fenton reagent since it's the only lanthanide that has two oxidation states. More over unlike iron, cerium's redox reaction between its cerium(III) and cerium(IV) forms can work in various pH ranges. The production of these particles starts with the Ce(III) stage. In literature it has been reported that the produced nanoparticles are actually a form of mix valence oxide where Ce(III) and Ce(IV) ratio is changing depending on the conditions of synthesis, particle size and pH. Therefore the terms "cerium oxide nanoparticles-nanoceria-CeONP" are used frequently to explain them. It has been further explained in some sources that the structure can even have xCeO2.yCe2O3 formula to represent its oxygen buffer behaviour.  The easy redox reaction between its oxidation states allows cerium to act like an ideal fenton reagent. 
The aim of this work is the colorimetric detection of reactive species that are produced in a fenton-like system using nanoceria as the catalyst. For that purpose the thesis consists of four main sections. In the first section, nano sized CeO2 (nanoceria) particles are produced in the infusion of Zahter, a type of thyme that is specific to south east of Turkey and Middle East. Co-precipitation method is applied to a mixture of 10.0 g/ 100 mL of zahter infusion and 4.5 µM of Ce(NO3)3. 1 M sodium carbonate solution is added dropwise to the suspension at 80°C and at pH 9. The mixture is then mixed for 4-6 hours at constant temperature and washed using acetone/water solution three times. The pH value of 9 at this point is important for the nucleation and formation of nanoparticles in Zahter infusion. It has been found that the flavonoids and phenolic compunds, together with other large molecules in these herbal solutions, helps the reduction of metals and prevent the aggregation of particles. Synthesized particles were then dried in air and mechanically grinded using agate mortar. For size comparison purposes starch and ammonia synthesis were also performed. The main difference between the Zahter mediated reaction and starch is the use of ammonia in the latter to obtain a basic medium. In the classical synthesis the use of ammonia mediates the production of nanoparticles without the further addition of a stabilizing agent. Characterization of the particles was made using scanning electron microscope (SEM) and results showed that nanoparticles produced in zahter infusion has an average of 30 nm particle size whereas in ammonia synthesis the average value is between 30-60 nm and in starch the value is 51 nm. 
The phenolic, flavonoid and antioxidant content of Zahter infusion are investigated respectively using the following methods; classical total phenolic content (TPC), modified Folin-Cicoalteu method, Cerium(IV) based antioxidant capacity method (CERAC) and aluminium assay. Other than the aluminium assay all calculations were made as the gallic acid equivalent. Aluminium assay is expressed as the catechin equivalent. Results showed that zahter's phenolic content is 0.107 M and 0.0814 M respectively in TPC and modified Folin-Cicoalteu methods. Total antioxidant capacity is 0.1057M and the flavonoid content is 0.0178 M. It is known that different results can be obtained for the same tea in phenolic methods due to the synergistic and antogonistic affects. The reason for the higher molar concentration in TPC than CERAC is perhaps because of the interference and side reactions of phenolic methods with antioxidants. Other than TPC the results obtained with other methods are meaningful and correlated to each other. 
In the third section of the work, synthesized nanoparticles were used to produce reactive species in the presence of DMPD as the prob substance. A heterogeneous nanoceria and hydrogen peroxide, fenton-like medium is used to produce reactive species and these species are expected to react with DMPD to produce the colored DMPD cation. A colorimetric method is then devised according to the difference of the absorbance value of red-violet DMPD cation at 515 nm. Percent scavenging activity of synthetic antioxidants and herbal infusions is investigated using a competing reaction between these substances and the DMPD probe. In the presence of a scavenging substance, reactive species are quenched therefore a decrease in the concentration of the DMPD+ cation is observed. The optimization of the method was made according to the suspension, hydrogen peroxide and DMPD concentration, temperature, time and pH value.  The optimum reaction mixture was found to have 2.14 mM hydrogen peroxide, 1.14x10-4 M DMPD, 228 ppm nanoceria at pH 7 and room temperature. But the reaction time can be flexible since the system is reaching a similar (almost constant) absorbance value at any time interval after 15 minutes. 
A disadvantage of the heterogeneous Fenton like reactions is the interference of the particles in the UV spectrophotometer. To avoid such limitations centrifuge or filtration of the system is advised once the reaction is completed. A stock reactive species solution is prepared to eliminate this disadvantage. A reactive species stock solution is prepared by mixing 0.2 g of nanoceria, 1 M hydrogen peroxide and 804 U/mL catalase at room temperature. 0.9 mL of this fresh daily-prepared stock solution is used for every trial. As a result % scavenging activity of standard antioxidant solutions and tea infusions was calculated according to the changes and difference in 515 nm. The decreasing order in the percent scavenging activity of antioxidant solutions in DMPD method was; quercetin, gallic acid, caffeic acid, rutin, ferrulic acid, catechin and trolox. The decreasing order for the tea infusions was rosehip, hibiscus, thyme, green tea, mint, sage tea, linden and Spanish thyme. 
Cupric ion reducing antioxidant capacity (CUPRAC) assay was applied to the same solution in order to compare the accuracy of DMDP method and the production of reactive species using nanoceria. CUPRAC method depends on the decrease in absorbance of neocupraine reagent at 450 nm in the presence of scavenging substances. For that purpose a 0.9 mL of a radical sample is mixed with 5x10-4 M antioxidant solution. % scavenging activity is calculated according to the absorbance decrease of this reaction medium. The decreasing order in the percent scavenging activity of antioxidant solutions in CUPRAC method was; quercetin, caffeic acid, rutin, gallic acid, ferrulic acid, catechin and trolox. Same order for the tea infusions was thyme, green tea, mint, Spanish thyme, sage tea, rosehip tea and linden. 
The highest value obtained in the DMPD method for the rosehip tea is related to its original pink color. It has been found that generally the results obtained are consistent in both methods. Moreover the need to add an excess amount of antioxidant substance in the CUPRAC assay and the time dependence of the assay should be emphasized. The results obtained in CUPRAC assay are reliable only after 30 minutes of incubation time. The devised DMPD method on the other hand does not require any excess of scavenging substances or an incubation period. Results show that there is no difference in the absorbance change between 0-30 minutes. DMPD method also works at room temperature and at pH 7 value, which makes the application in biological systems reliable. The only drawback of the method is the reactivity of the DMPD reagent and the need to prepare daily, fresh solutions before each trial. 
As a result, % scavaneging acitivity of synthetic and herbal samples are investigated in an easy and fast nanoceria/hydrogen peroxide fenton-like system that is independent from pH. Produced reactive species were reacted with DMPD probe to develop a method that is independent from reaction time and this method is applied to standard antioxidant solutions and tea infusions. Thus, the research is completed with the development of a fast, easy and cheap method for the determination of antioxidant capacity.