Meme kanseri tedavisinde 14-dena monoklonal antikorunun apoptotik etkisinin incelenmesi
Investigation of the apoptotic effect of 14-dena monoclonal antibody in breast cancer treatment
Yazar: AYŞEGÜL TAŞKIRAN
Danışman: PROF. DR. GÜLPERİ ÖKTEM
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Apoptozis = Apoptosis ; Deaminonöraminik asit = Deaminonuraminic acid ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Meme kanseri, dünya çapında kadınları en çok etkileyen kanser türü olmakla beraber görülme sıklığı açısından kanser türleri arasında ikinci sırada yer almaktadır. Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre her geçen yıl meme kanseri tanısı alan ve bu sebepten ölen kişi sayısı önemli ölçüde artmaktadır. Bu artış, meme kanserinin erken tanı ve tedavisinde yetersiz kalındığının göstergesidir. Tanı anındaki evre ve tümörün biyolojik özellikleri prognozu belirler. Moleküler olarak oldukça heterojen olan meme kanseri, potansiyel olarak agresif ve karmaşık biyolojik özelliklere sahiptir. Modern tedaviler ameliyat, radyasyon ve ilaç tedavisini içerir. Semptomların hafifletilmesi ve yaşam süresinin uzatılması ilk amaçtır. Bu amaç doğrultusunda kişiye özel ve hedefe yönelik tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi çok büyük önem arz etmektedir.
Kanser hücrelerinin oluşumunu, devamlılığını ve ölümünü tetikleyen moleküler mekanizmaların aydınlatılması yeni tedavi stratejileri geliştirmek ve mevcut yöntemleri optimize etmek için gereklidir. Moleküler hedefli tedaviler, kanser büyümesini, ilerlemesini ve metastazını engellemek için spesifik moleküller ile etkileşen devrim niteliğindeki terapötiklerdir. Meme, lösemi, kolorektal, akciğer ve yumurtalık kanserleri gibi sayısız kanser türünün tedavisinde FDA onaylı, moleküler hedefli tedaviler kullanılmaktadır. Bu tedaviler dikkate değer bir klinik başarı göstermiştir.
Sialik asit, memeli hücrelerinde hücre yüzeyi glikanlarını oluşturan monosakkarit yapı taşlarından biridir. Sialik asitler fizyolojik koşullarda sentezlenir, ekprese edilir ve hücre-hücre etkileşimi, hücre adezyonu gibi birçok proseste yer alır. Değişmiş glikozilasyon motifleri, birçok kanser türünün fenotipik özelliği ve metastatik potansiyeli ile ilişkilidir. Çeşitli tümör hücrelerinin membran glikoproteinleri ve glikolipidleri üzerinde ve tümör mikroçevresinde ifadesi artmış olarak gözlemlenen bir tümör işaretidir. Tümör büyümesi ve ilerlemesi tümörle ilişkili glikanlar tarafından yönlendirilmektedir.
Deaminonöraminik asit (KDN), sialik asit ailesinin farklı bir üyesidir. KDN molekülü ekspresyon seviyesi, normal insan dokularında yok denecek kadar minimal düzeylerde
iken kanser hücrelerinde bu oranda ciddi bir artış bulunmaktadır. Tümör dokularında artan ifadesi bu molekülü "onkogelişimsel antijen" olarak karakterize etmiştir.
Araştırma grubumuz tarafından daha önce yapılan çalışmalarda deaminonöraminik asit antijenine karşı bir monoklonal antikor (mAb) üretilmiştir: 14-DENA. Bu antikorun meme kanser hücreleri üzerinde sitotoksik bir etkiye sahip olduğu gözlemlenmiştir. Bu sitotoksisitenin hücre ölüm mekanizmaları üzerindeki etkileri yapılan bu çalışmada aydınlatılmıştır. Çalışma kapsamında, 14-DENA mAb'ının; 1) moleküler açıdan farklı iki meme kanseri üzerindeki sitotoksik dozun WST-1 Testi ile belirlenmesi, 2) belirlenen dozun Annexin V yöntemi ile hücre ölüm mekanizmalarından biri olan apoptoz üzerindeki etkilerinin incelenmesi, 3) immünofloresan yöntemi ile kaspaz-8, kaspaz-3 ve Bcl-2 gibi yaygın kullanılan apoptotik belirteçlerin ifadelerinin incelenmesi, 4) indüklenen apoptotik etkinin Taramalı Elektron Mikroskobu ile hücre morfolojisi üzerindeki sonuçlarının görüntülenmesi ve 5) çeşitli genlerin ekspresyon değişimlerinin analiz edilmesi hedeflenmiştir.
Elde edilen sonuçlar, 14-DENA mAb'ının meme kanser hücreleri üzerinde sitotoksik etkisinin olduğunu ve meme epitel hücreleri üzerinde bu etkinin olmadığını göstermiştir. Sitotoksisite, kanser hücrelerinde apoptoz yolaklarının indüksiyonu ile gerçekleşmiştir. 14-DENA mAb uygulaması sonrası, bu yolaklarda merkezi rol oynayan apoptotik proteinlerin ifadelerinde artış; anti-apoptotik protein ifadelerinde azalış gözlemlenmiştir. Kanser hücrelerinde, mAb uygulaması ile tipik apoptotik morfolojik değişimler oluşmuştur. Hücre metabolizması ve apoptozda etkili olan birtakım gen ifadelerinde regülasyon değişiklikleri olduğu bulunmuştur.

Abstract:
Breast cancer is the most common type of cancer affecting women worldwide, in terms of incidence it ranks second among all cancer types. According to World Health Organization data, every year, the number of people diagnosed with breast cancer and died because of it increases significantly. This increase indicates that the early diagnosis and treatment of breast cancer is inadequate. The stage at the time of diagnosis and the biological characteristics of the tumor determine the prognosis. Being highly molecularly heterogeneous, breast cancer has potentially aggressive and complex biological properties. Modern treatments include surgery, radiation, and drug therapy. The main and primary goal is to alleviate the symptoms and to prolonge the life span. For this purpose, it is very important to develop personalized and targeted treatment methods.
It is necessary to elucidate the molecular mechanisms that trigger the formation, maintenance and death of cancer cells in order to develop new treatment strategies and to optimize existing methods. Molecular targeted therapies are revolutionary therapeutics that interact with specific molecules to inhibit cancer growth, progression, and metastasis. FDA approved molecular targeted therapies are used in the treatment of numerous cancer types such as breast, leukemia, colorectal, lung and ovarian cancers. These treatments have shown remarkable clinical success.
Sialic acid is one of the monosaccharide building blocks that form cell surface glycans in mammalian cells. Sialic acids are synthesized under physiological conditions, expressed and involved in many processes such as cell-cell interaction and cell adhesion. Altered glycosylation patterns are associated with phenotypic trait and metastatic potential of many cancers. It is a tumor marker with increased expression on membrane glycoproteins and glycolipids of various tumor cells and in tumor microenvironment. Tumor growth and progression is driven by tumor-associated glycans.
Deaminoneuroraminic acid (KDN) is a different member of the sialic acid family. While the expression levels of KDN molecule is almost negligible in normal human
VI
tissues, there is a serious increase in this rate in cancer cells. Its increased expression in tumor tissues has characterized this molecule as "oncodevelopmental antigen".
A monoclonal antibody (mAb) against deaminoneuroraminic acid antigen was produced by our research group in previous studies: 14-DENA. It has been observed that this antibody has a cytotoxic effect on breast cancer cells. The effects of this cytotoxicity on cell death mechanisms were elucidated in this study. Within the scope of this study, it is aimed: 1) To determine the cytotoxic dose of 14-DENA mAb on two molecularly distinct breast cancer models by WST-1 Test, 2) To examine the effects of the determined dose on apoptosis, one of the cell death mechanisms, by Annexin V method, 3) To examine the expression of commonly used apoptotic markers such as Caspase-8, Caspase-3 and Bcl-2 by immunofluorescence method, 4) To visualize the results of the induced apoptotic effect on cell morphology by Scanning Electron Microscopy, and 5) To analyze the expression changes of various genes.
The results obtained showed that 14-DENA mAb has a cytotoxic effect on breast cancer cells and not on breast epithelial cells. Cytotoxicity occurred by induction of apoptosis pathways in cancer cells. After 14-DENA mAb application, an increase in the expression of apoptotic proteins that play a central role in these pathways and a decrease in in the expression of anti-apoptotic protein were observed. Typical apoptotic morphological changes occurred in cancer cells with mAb application. It has been found that there are regulatory changes in some gene expressions that are implicated in cell metabolism and apoptosis.