Hematopoetik kök hücre gen tedavi kültür koşulları ve engrafman optimizasyonu
Optimization of hematopoietic stem cell gene therapy culture conditions and engraftment
Yazar: MEHMET EMİN ŞEKER
Danışman: DOÇ. DR. FATİMA SUSANNA FAUSTİNA AERTS KAYA
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı / Kök Hücre Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Genetik = Genetics
Dizin: Engrafman = Engraftment ; Gen tedavisi = Gene therapy ; Granülosit koloni stimülan faktör = Granulocyte colony stimulating factor ; Hematopoetik kök hücre transplantasyonu = Hematopoietic stem cell transplantation ; Hematopoetik kök hücreler = Hematopoietic stem cells ; RAG2 = RAG2 ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic

Özet:
RAG2, ağır kombine immün yetmezliği (AKİY), nadir görülen, T-/B-/NK+ kalıtsal bir primer immün yetmezliktir (PİY) ve hematopoetik kök hücre (HKH) nakli ile tedavi edilmektedir. Uygun donör bulunmadığında bu hastaların başka tedavi seçeneği olmadığından otolog hücreler kullanılarak gen tedavisi (GT) geliştirilmesine gerek duyulmaktadır. AKİY'lere yapılan nakillerde, HKH'lerin kemik iliği (Kİ)'ne yerleşmesi ve uzun ömürlü engraftman sağlanması için hafif hazırlık rejimleri uygulanmaktadır. RIC'e bağlı toksisite ve yan etkileri önlemek amacıyla alternatif hazırlık rejimi protokollerinin geliştirilmesine de gerek duyulmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında; 1) ex vivo fare HKH kültür koşullarının optimizasyonu yapılmıştır, 2) Busulfan (BU) yerine, zararsız granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) ve very late antigen 4 inhibitörünün (VLA-4I) HKH engraftmanı destekleyebilmesi araştırılmıştır, 3) RAG2 fareler, LV-SF-RAG2co veya LV-UCOE-RAG2co devamlı aktivasyonu sağlayan promotör içeren lentiviral konstraktlar ile transdüse edilmiş HKH'lerle nakledilmiştir. Bu çalışmada kısa dönem ex vivo HKH kültürlerinde sadece mTpo'nun eklenmesi yeterli olduğu gösterilmiştir ve bu koşullar LV transdüksiyonlarda kullanılmıştır. Metilasyona dirençli UCOE promotörü, daha güçlü SF promotörüne göre RAG2 farelerde GT 6 ay sonrası periferik kan ve dalakta daha yüksek CD3 ve CD19 oranları vermiştir. G-CSF veya VLA-4I hazırlık rejimi uygulanan RAG2 farelerin HKH nakli ve HKH GT'den sonra engraftman kinetikleri BU grubundan farklı olmasına rağmen 6 ayda immün hücreleri değerlendirildiğinde hem G-CSF hem de VLA-4I'nin kullanımının BU kadar etkili olduğu gösterilmiştir. Bu tez çalışması ile sadece RAG2 için değil, aynı zamanda diğer AKİY hastalıklarında uygulanabilecek yeni bir hazırlık ve tedavi süreci geliştirilmiştir ve ileride klinikte hastaların tedavi veya tedavi desteği olarak kullanılabilmesi için bir alt yapı oluşturulmuştur.

Abstract:
RAG2 severe combined immunodeficiency (SCID) is a rare, inherited primary immunodeficiency (PID), characterized by a T-/B-/NK+ phenotype and is treated with hematopoietic stem cell (HSC) transplantation. When no suitable donor is available, these patients have no other treatment options. Therefore, it is important to develop gene therapy (GT) strategies, where patient-derived autologous cells can be used. For SCID patients, usually reduced conditioning regimens (RIC) are used to support homing and long-term engraftment of the HSCs in the bone marrow (BM). In order to prevent RIC -related toxicity, alternative conditioning regimen protocols should be developed. In this thesis, we aimed to 1) optimize ex vivo mouse HSC culture conditions, 2) compared the effects of the harmless granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) and very late antigen 4 inhibitor (VLA-4I) on HSC engraftment, with Busulfan (BU), and 3) transplanted RAG2 mice with HSCs genetically modified with LV-SF-RAG2co or LV-UCOE RAG2co. Here we showed that during short-term ex vivo HSC cultures, addition of mTpo alone is sufficient, and therefore we used these conditions during LV transductions. The methylation-resistant UCOE promoter displayed better results than the stronger SF promoter at 6 months after GT in transplanted RAG2 mice in terms of peripheral blood and spleen CD3 and CD19 numbers. Although the engraftment kinetics after HSC transplantation and HSC GT of mice treated with G-CSF or VLA-4I were different from the mice treated with BU, use of both G-CSF and VLA-4I was at least as effective as BU in terms of immune recovery at 6 months after transplantation. With this thesis, we developed a new conditioning and treatment protocol that can be applied to not only RAG2 SCID, but also to other SCIDs and can serve as the basis for future clinical research and treatment/support of SCID patients.