MiR-155, let-7c ve miR-433 mikro-RNA ekspresyonlarının down sendromlu bireylerde konjenital kalp hastalıklarına etkisinin araştırılması
Investigation of the effects of miR-155, let-7c, and miR-433 microRNA expressions on congenital heart diseases in individuals with down syndrome
Yazar: TUBA MARAŞ
Danışman: DOÇ. DR. SİNEM YALÇINTEPE
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Down sendromu (DS), 21. Kromozomun tam veya kısmi bir kopyasının fazlalığından kaynaklanan bir durumdur (Trizomi 21). DS, bilişsel bozuklukların en yaygın genetik nedenidir ve kraniyofasiyal anomaliler, konjenital kalp hastalığı, gelişimsel gecikmeler, immun yetmezlik, kısa boy, hipotoni gibi geniş bir yelpaze ile karakterizedir. Ayrıca, otoimmün hastalıklar, epilepsi, işitme ve görme problemleri, hematolojik bozukluklar, hipotiroidizm ve Alzheimer gibi çeşitli tıbbi durumların artmış riski de mevcuttur. DS yaygınlığı, çalışma popülasyonuna ve kullanılan tanısal yöntemlere bağlı olarak yaklaşık 800 doğumda bir olarak tahmin edilmektedir. DS riski anne yaşıyla artar ve ileri anne yaşı yaklaşık %10 oranında DS gebeliklerinden sorumludur. Trizomi 21 gebeliklerinin çoğu düşük veya ölü doğumla sonuçlanır ve etkilenen fetüslerin yaklaşık %80'i doğum zamanına kadar hayatta kalamaz. DS'nin moleküler patogenezi karmaşıktır ve tam olarak anlaşılmamaktadır, ancak "gen dozu" hipotezi en yaygın kabul edilen teoridir. Bu hipotez, ekstra kromozom 21'in gen ekspresyon seviyelerinde %50'lik bir artışa neden olduğunu ve DS fenotipi ile ilişkili genlerin dengesini bozduğunu öne sürmektedir. Kromozom 21'de 400'den fazla gen bulunmaktadır ve bu genlerin aşırı ifadesi, DS'nin karakteristik özelliklerinden sorumlu olabilir.
Kodlamayan RNA'lar (ncRNA'lar), protein kodlamayan RNA molekülleri olup, gen ekspresyonu ve hücresel süreçlerde önemli düzenleyici roller oynarlar. Mikro-RNA'lar, gen ekspresyonunu düzenlemede önemli bir rol oynayan protein kodlamayan RNA molekülleridir. İnsan genomunun sadece %3'ünü oluşturmalarına rağmen, yüzlerce mRNA'yı hedefleyebilirler. İnsan 21. Kromozomundan ifade edilen beş miRNA bulunmaktadır ve DS fenotipi ile ilişkili dokularda miR-99a, let-7c ve miR-125b-2'nin aşırı eksprese olduğu gösterilmiştir.
Çalışmamızda DS'lu bireylerin en yaygın fenotipi olan konjenital kalp hastalığının oluşmasında etkili olduğu varsayılan 3 mikro-RNA'nın (miR-155, miR-433 ve let-7c) Real-Time PCR yöntemi kullanılarak ekspresyonlarının araştırılması amaçlanmıştır. Trakya Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Çocuk Kardiyoloji Bilim Dalı'ndan ve Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı'ndan DS'lu konjenital kalp hastalığı olan (Grup A) ve DS'lu ancak konjenital kalp hastalığı olmayan (Grup B) hastalardan ve kontrol grubu (Grup C) olarak sağlıklı bireyler çalışmamıza dahil edilmiştir. Çalışmamız sonucunda istatistiksel analizler, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyoistatistik ve Tıbbi Bilişim Anabilim Dalı'nda SPSS 20.0 (Lisans No: 10240642) paket programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık sınır değeri olarak p<0.05 kabul edilmiştir.
miR-155 ve let-7c'nin plazma ifade düzeyleri Δct değerleri kullanılarak hesaplandı. Ancak, miR-433'ün plazmada yeterli miktarda ifade edilmediği gözlemlendi. İstatistiksel analiz sonuçlarına göre, miR-155 ekspresyonu açısından gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı (p=0,392). Aynı şekilde, let-7c'nin ifadesi de gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermedi (p=0,248). Bu nedenle, A grubu ile B ve C grupları arasında mikro-RNA'ların ifade düzeyleri açısından anlamlı bir fark tespit edilmedi.
Çalışmamızda, miR-433'ün Δct değerlerinin hesaplanamamasının, bu mikro-RNA'nın plazmada yeterli miktarda ifade edilmediği olasılığını gösterdiğini düşünüyoruz. miR-433'ün kalp gelişimini etkileyebileceği ve kalp dokusunda ifade edildiği literatürde bildirilmiştir. Ancak, plazmada ifade edilmediği veya çok düşük düzeyde ifade edildiği tahmin edilmektedir. Çalışmamızda, DS'lu bireylerin konjenital kalp hastalığı gelişiminde etkili olduğu düşünülen miR-155 ve let-7c'ye odaklandık.
Ancak, bu mikro-RNA'ların ifade düzeylerinde çalışma gruplarımız arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı. Bu bulgular, çalışmamıza dahil edilen 
mikro- RNA'ların DS'lu bireylerde kalp gelişimi üzerinde doğrudan etkisinin önemini vurgulamak için yeterli olmamakla birlikte daha ileri ve kapsamlı çalışmalar gerekmektedir.

Abstract:
Down syndrome (DS), also known as Trisomy 21, is a condition resulting from the complete or partial duplication of chromosome 21. DS is the most common genetic cause of cognitive impairments and is characterized by a broad spectrum of features, including craniofacial anomalies, congenital heart disease, developmental delays, immunodeficiency, short stature, and hypotonia. Additionally, there is an increased risk of various medical conditions such as autoimmune diseases, epilepsy, hearing and vision problems, hematological disorders, hypothyroidism, and Alzheimer's disease. The prevalence of DS is estimated to be approximately one in 800 live births, depending on the study population and diagnostic methods. The risk of DS increases with maternal age, and advanced maternal age accounts for about 10% of DS pregnancies. Most Trisomy 21 pregnancies result in miscarriage or stillbirth, with approximately 80% of affected fetuses not surviving until birth. The molecular pathogenesis of DS is complex and not fully understood, but the "gene dosage" hypothesis is the most widely accepted theory. This hypothesis suggests that the extra copy of chromosome 21 leads to a 50% increase in gene expression levels, disrupting the balance of genes associated with the DS phenotype. Chromosome 21 contains over 400 genes, and the overexpression of these genes may be responsible for the characteristic features of DS.
Non-coding RNAs (ncRNAs) are non-protein-coding RNA molecules that play important regulatory roles in gene expression and cellular processes. MicroRNAs  
(miRNAs) are a class of ncRNAs that play a crucial role in regulating gene expression. Despite constituting only 3% of the human genome, miRNAs can target hundreds of mRNAs. Five miRNAs are expressed from human chromosome 21, and overexpression of miR-99a, let-7c, and miR-125b-2 has been shown in tissues associated with the DS phenotype.
In our study, we aimed to investigate the expressions of three miRNAs (miR-155, miR-433, and let-7c), assumed to be effective in the development of congenital heart disease, the most common phenotype in individuals with DS, using the Real-Time PCR method. Participants included individuals with DS and congenital heart disease (Group A), individuals with DS without congenital heart disease (Group B), and a control group of healthy individuals (Group C) from the Department of Pediatric Cardiology and the Department of Medical Genetics at Trakya University Faculty of Medicine. Statistical analyses were performed using the SPSS 20.0 package program from the Biostatistics and Medical Informatics Department at Trakya University Faculty of Medicine, with a significance threshold set at p<0.05.
Plasma expression levels of miR-155 and let-7c were calculated using Δct values. However, it was observed that miR-433 was not adequately expressed in plasma. According to the statistical analysis results, there was no statistically significant difference in miR-155 expression among the groups (p=0.392). Similarly, the expression of let-7c did not show a statistically significant difference among the groups (p=0.248). Therefore, no significant difference in the expression levels of miRNAs was detected between Group A and Groups B and C.
In our study, the inability to calculate Δct values for miR-433 suggests that this miRNA may not be sufficiently expressed in plasma. Literature reports indicate that miR-433 may influence heart development and is expressed in cardiac tissue. However, it is hypothesized that it is either not expressed or expressed at very low levels in plasma. Our study focused on miR-155 and let-7c, believed to be influential in the development of congenital heart disease in individuals with DS.
However, there was no statistically significant difference in the expression levels of these miRNAs among our study groups. While these findings may not be sufficient to emphasize the direct impact of the included miRNAs on heart development in individuals with DS, further and more comprehensive studies are needed.