Revers transkriptaz-PCR tekniği (mRNA analizi) ile talasemiye neden olan mutasyonların alfa ve beta gen ekspresyonları üzerine etkilerinin incelenmesi
An Investigation on the relative expressional levels of alpha and beta mRNA allels by the reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) technique
Yazar: MUSTAFA MERT SÖZEN
Danışman: PROF.DR. CİHAN ÖNER
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2000
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: DNA = DNA ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA ; RNA-haberci = RNA-messenger ; Talasemi = Thalassemia

Özet:
Ill ÖZET Revers transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile mRNA analizi bir çok globin geninin ifsdesinin ölçülmesinde çok önemli işlevi olan bir tekniktir. Bu tekniğin, Gyve Ay genlerinin mRNA ürünlerinin oranlarının ölçülmesinde, (5 talasemi durumunda P ve y genlerinin, orak hücre anemide ps ve pA mRNA'larımn oranlarının ölçülmesinde, kararlı olmayan hemoglobin hastalıklarında ve HbE heterozigotlarmda da uygulanması ile de önemli sonuçlar elde edilmiştir. Benzer sonuçlar alfa globin varyantlarına ve bazı alfa talasemilere yapılan uygulamalarla da elde edilmiştir. Bu çalışmada; a) beta talasemiye neden olan çeşitli intron, ekson, promotor ve 3TJTR bölge mutasyonlannın, b) moleküler gen organizasyonları delesyonal a-thal-1 (--/ ) ile birlikte ya a-thal-2 (3.7 ve 4.2 kb delesyon) ya da delesyonal olmayan (nokta mutasyonu taşıyan) alellerin oluşturduğu hastaların durumu, c) trizomi-8 (47 XY+8) genotipine sahip miyelodisplastik sendromlu bir hastada Hb F miktarındaki yükselmenin moleküler temeli, a/p, y/p mRNA oranları ile mRNA'larının sentez düzeyleri belirlenerek genetik ifade özellikleri araştırılmıştır. Bu çalışmanın sonuçlan ile talasemiye neden olan mutasyonların meydana getirdiği çeşitli gen yapılarındaki a2 ve al genlerinin ifadelerin göreceli olarak normal P geninin ifadesi ile etkileşimleri kıyaslanarak a/p run 1 : 1 oranlarındaki değişimlerinin moleküler mekanizması, mRNA düzeyindeki bilgilerle gösterilmiştir. Aynı zamanda, embriyonik ve fötal dönemde aktif olan, fakat yetişkin dönemde ifade edilmeyen y genlerinin farklı mutasyon tiplerindeki ifade düzeylerinin, mRNA sentez oranlan belirlenerek doğrudan ölçülmesi hedeflenmiştir. Diğer yandan (a2+al)/p- mRNA oranlannın bu genlerin ifadelerinin ölçülmesi ile elde edilen bulgular çeşitli hastalarda gözlenen farklı tipteki fenotipik özellikleri yönünden kıyaslanarak fenotip- genotip ilişkisi araştırılmıştır.IV Sonuç olarak, RT-PCR tekniği kullanılarak a ve P globin genlerinin mRNA düzeyindeki gen ifadelerinin incelenmesinin, hem talasemi hastalığının teşhisi, hem de mutasyonun etki mekanizmasının belirlenmesi için bir çok yönden avantajlı bir yöntem olduğu gösterilmiştir. 1. RT-PCR ekonomik, hızlı ve etkin bir yöntem olmasından ötürü, a- ve P- talasemi taramalarında DNA analizleri yerine kullanılabilecek bir yöntemdir. 2. Bu yöntem kullanılarak, P-talasemiye neden olan çeşitli mutasyonların ne şekilde etkili olduğu gösterilebilmiştir. 3. RT-PCR tekniğinin, ökaryotik gen ifadesinin düzenlenmesi konusunda en iyi çalışılmış olan ve fenotip-genotip korelesyonu belirlenmiş mutasyonu bilinmiş ve mutasyonu bilinen (promoter, başlama kodonu, intron, ekson, poly A...) 200'den fazla hemoglobin a ve p genlerine uygulanması ile yeni bilgilere ulaşmak mümkün olmuştur. Teknik, bu bakımdan da ayrı bir öneme sahiptir.

Abstract:
ABSTRACT Messenger RNA ( mRNA analysis by reverse transcriptase-polymrase chain reaction (RT-PCR) is a powerful technique for measuring of several globin gene expressions. Previously, some important results have been obtained by determinating the relative quantities in P thalassemia major with spesific genotypes.This technique was applied also measuring the relative levels of ps to pA in sickle cell anemia and mRNA ratio of several unstable abnormal P globin chains and Hb E to pA Similar studies have been applied for alpha gene transcripts in alpha thalassemias and abnormal chain variants. In this study, the level of mRNA synthesis were determined by measuring the mRNA ratio of a/p and y/p globin genes and thus the differences in the globin gene expression level were investigated in a group of thalassemia patient with the following abnormal genotype; a) Beta thalassemia patients who carry the mutations within the intron, exon, promoter and 3' UTR region of the P globin genes, b) Patients bearing the deletional form of a-thal-1 (- / ) associated with a-thal-2 (With 3.7 and 4.2 kb deletion) or non-deletional a-thalassemia (with a point mutation), c) A myelodisplastic patient with a trisomy in chromosome 8 (47 XY+8) associated with increased level of hemoglobin F. In this study, the molecular mechanism of deviation from 1:1 ratios of a/p globin chains was evaluated at mRNA level by comparing the expressions of all al and a2 genes to P gene in various gene structures caused by thalasemic mutations. At the same time, it was aimed to measure the expressional levels of y genes which are active in embriyonic and fetal life but not in adult stage by determining the mRNA synthesis ratios in different course of P-thalassemia. On the other hand, phenotype-VI genotype correlation has been investigated by comparing the (al+a2)/ P mRNA ratios in thalassemia patients carrying the different types of mutations. This study has shown that the investigation of the expression of a- and p- globin genes at mRNA level by RT-PCR techniqueis very anvantageous for both the diagnosis of thalassemia and the determination of molecular mechanism of different mutations. As conclusion 1. Since the RT-PCR is an economic, fast and efficient method, it can be used for screening of the a- and P- thalassemia allels instead of conventional DNA analysis methods. 2. It is possible to show the molecular mechanism of various type of mutations cousing P-thalassemia using this technique. 3. Informational knowledge of the RT-PCR results obtained from the comparasional analysis between the well documented a- and P-globin gene mutations (including the promoter, iniciation codons, intron, exon, poly A regions) and phenotypical aspects of their clinical picture may be applied to study the expressional analysis of another specific gene. Therefore, this technique has another importance in this respect too.