Rekombinant E.coli soylarından penisilin asilaz üretiminin biyoreaktör koşullarında optimizasyonu
The optimization of penicillin acylase production recombinant E.coli strains by using bioreactor
Yazar: IRMAK ŞAH
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Enzimler, bütün canlı organizmalar tarafından üretilen, bitki, hayvan, insan ve mikroorganizmalarda normalde çok yavaş ilerleyen biyokimyasal süreçlerin reaksiyon hızını arttırmada etkin katalistler olarak rol alan doğal protein molekülleridir. Enzimler günümüzde, deterjan, deri, tekstil, kağıt, gıda ve hayvancılık sektörlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle günümüzde ?-amilaz, alkalen proteaz ve lipazlar gibi endüstriyel enzimlerin yüksek miktarlarda üretimi bir gereksinim haline gelmiştir.Doğal olarak oluşan enzimlerin endüstriyel kullanım için ulaşılabilirlikleri yeterli değildir. Biyoteknolojik yöntemlerle, bir mikroorganizmanın yaşam koşulları optimize edilerek enzim üretim kapasitesi iyileştirilebilmekte ve böylelikle endüstriyel kullanım için uygun hale getirilebilmektedir.Endüstriyel olarak önemli enzimlerden birisi de çok sayıda yarı sentetik antibiyotiğin üretiminde kullanılan penisilin asilaz (PA)'dır. PA, benzil-penisilin (Pen G) veya fenoksimetil-penisilin (Pen V)'i hidroliz ederek yarı sentetik ß-laktam antibiyotiklerinin üretiminde öncül olarak kullanılan 6-aminopenisillanik asit (6-APA) üretir. Penisilin asilaz (E.C 3.5.1.11) enzimi, dünyada en yaygın kullanılan immobilize enzimdir. Peptit sentezi ve kiral bileşiklerin rasemik karışımlarının ayrılması gibi yararlı biyodönüşümlerde de kullanılabilen penisilin asilaz endüstriyel olarak önemli rollere sahiptir.Enzim üretiminde, üretim besiyerinin çeşitli kimyasal bileşenlerine ek olarak, pH, sıcaklık, çalkalama, havalandırma ve inkübasyon zamanı gibi fizikokimyasal değişkenler de, farklı mikroorganizmaların enzim üretimini etkilerler. Bu nedenle, endüstriyel enzimüretiminde anılan parametreleri optimize etmek üzere biyoreaktör kullanılması önem kazanmaktadır.GYTE Biyoloji Bölümü Enzim Moleküler Genetiği Grubu tarafından penisilin asilaz üreticisi rekombinant soylardan gerek gen ekspresyonlarının optimize edilmesi gerekse büyük ölçekli enzim üretimleri sırasında erlen düzeyinde yapılan çalışmalarda karşılaşılan zorlukların (besiyeri pH'sının sabitlenememesi, enzim üretiminin sıcaklık, çalkalama hızı, havalandırma, ölçek büyütme ve hatta erlen tipinden etkilenmesi) üstesinden gelinmesi için çalışmaların tüm değişkenlerin sabitlenebildiği bir fermentörde gerçekleştirilmesinin uygun olacağını düşündürmüştür. Bu tez çalışmasında, mevcut rekombinantlar arasından en üretken olan soydan hareketle PA üretiminin, BIOSTAT Q Çoklu Fermentör Sisteminde (B. Braun Biotech International, Germany) optimize edilmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda yapılan çalışmalarda; fermentasyon sürecini etkilediği bilinen değişkenler (substrat kaynağı, nitrojen kaynağı, pH, sıcaklık, çalkalama, havalandırma vb.) sırasıyla test edilerek, optimal fermentasyon koşulları belirlenmiştir. Gerçekleştirilen fermentasyon denemelerinde bakteriyel kültürlerin enzim üretkenliği SDS/PAGE ve aktivite testleri ile değerlendirilmiştir.Bu tez çalışmasında, Enzim Moleküler Genetiği Grubu tarafından geliştirilen ve kontrol bölgesi mutasyona uğratılmış pac genlerini taşıyan rekombinant E. coli soylarının yanı sıra yaban tipi (pacwt) geni taşıyan hücreler biyolojik materyal olarak kullanılmıştır. P2Spac ve P2Spaclac- pUC19 E. coli JM109 soyları, enzim üretkenliklerinin değerlendirildiği çalışmalar sonucunda en yüksek enzimatik aktiviteyi veren soylardır. Enzim Moleküler Genetiği Grubu'nun daha önceki bir çalışmasında erlen düzeyinde üretilen, P2Spaclac- pUC19 E. coli JM109 soyundan saflaştırılan PA biyokimyasal olarak nitelendirilmiştir. P2Spaclac- pUC19 E. coli JM109 soyu tez çalışması kapsamında penisilin asilaz üretkenliğinin arttırılması amacıyla biyoreaktörde optimizasyon çalışmalarına alınmıştır. Besiyerini optimize etmeye yönelik ilk çalışmalarda, en yüksek enzim aktivitesi, 5 mM glukoz ve 60 mM sukroz içeren Raje besiyerinde belirlenmiş, daha ileri çalışmalar sonucunda 2,5 mM sukroz içeren Raje besiyeriyle alınan aktivite değerleri 60 mM sukroz içeren besiyerinde elde edilen aktivite değerlerine yakın bulunmuştur.Yapılan çalışmalar sonucunda; 5 mM glukozun bazal gen ekspresyonunu baskıladığı ve 25 ?M IPTG'nin bu etkiyi aşabildiği gözlenmiştir. Besiyeri pH'sının optimize edildiği çalışmalar sonucunda en yüksek enzim üretimi pH 7,0'de görülmüştür. Optimal üretim sıcaklığının 24-26 oC olduğu, artan sıcaklıklarda enzim üretiminin düştüğü belirlenmiştir.Sonuç olarak; P2Spaclac- pUC19 E. coli JM109 soyu en iyi penisilin asilaz aktivitesini 5 mM glukoz içeren, sukroz derişimi 2,5 mM'a indirilmiş Raje besiyerinde, 25 ?M IPTG ile uyarılan kültürlerde, pH 7 ve 26 oC sıcaklıkta, %10 çözünmüş oksijen konsantrasyonu varlığında aşılamadan sonraki 20. saatte göstermiştir. Biyoreaktörde optimize edilmiş koşullarda elde edilen aktivite değerleri erlen düzeyinde alınan değerlerden daha yüksek bulunmuştur.

Abstract:
Enzymes are produced by all living organisms and are natural protein molecules which perform as effective catalists in increasing the reaction rate of biochemical process that normally proceeds so slowly in plant, animal, human and microorganisms. Nowadays, enzymes are used in extensively detergent, leather, textile, paper, food industries. Therefore, in these days the overproduction of industrial enzymes, like ?-amylase, alkaline protease and lipase, is an important requirement.These naturally occuring enzymes are quite often not available in sufficient quantities for industrial use. Biotechnology offers the possibility of producing enzymes for industrial use by optimizing the living conditions of a microorganism and, therefore, improving its production capacity.One of the most important industrial enzymes is penicillin acylase. This group of enzymes is involved mainly in the industrial production of the synthesis of semisynthetic ß-lactam antibotics. Penicillin acylases are widely used in the production of 6-aminopenicillinic acid (6-APA) which is used as a starting compound in the production of semi-synthetic penicillins by hydrolysing benzyl-penicillin (Pen G) or phenoxymethyl-penicillin (Pen V). PA is an immobilized enzyme which is used extensively. In addition, penicillin acylases can also be employed in other useful biotransformations, such as peptide synthesis and the resolution of racemic mixtures of chiral compounds. Briefly PA is an important industrial enzyme.In enzyme production, in addition to different chemical constituents of production medium, physiochemical parameters such as; ph, temperature, agitation, aeration and incubation time have an active part in effecting enzyme production by different microorganisms. In this context, optimisation of this parameters has an active part in industrial enzyme production by using bioreactor.GYTE encountered with the difficulties at the optimisation of gene expression from strains which produce recombinant PA and at the flask experiments for large-scaleenzyme production. So all the parameters can be fixed by the experiments which performed in a bioreactor.In this thesis work, the optimization of enzyme production from the most productive recombinant strain which generating penicillin acylase by using BIOSTAT Q Multiple Bioreactor System (B.Braun Biotech International, Germenay) is aimed. In this context, parameters which effect fermentation process (substrat source, nitrogen source, pH, temperature, agitation, aeration etc.) have been tested respectively and so optimum fermentation conditions have been determined. In these fermentation experiments, enzyme productivity of bacterial cultures has been evaluated by using SDS-PAGE and activity tests.In this thesis work, recombinant E. coli strains which are harvesting pac genes carrying mutations within their control regions or pacwt developing by Enzyme Molecular Genetics Group, are used as biological material. Two of these strains (P2Spac and P2Spaclac- pUC19 E.coli JM109) have been the strains showing the highest enzymatic activity by the end of evaluating of enzyme productivities experiments. P2Spaclac- pUC19 E. coli JM109 strain which has been produced in flask, purificated and biochemically characterized by Enzyme Molecular Genetics Group, has been used in optimization experiments within bioreactor for increasing penicillin acylase productivity. At the first experiments of medium optimization, the highest enzyme activity has been determined in Raje medium containing 60 mM sucrose and 5 mM glucose. At the following experiments, the activity values of Raje medium containing 60 mM sucrose have been approached to the activity values of Raje medium containing 2,5 mM sucrose. At the end of these experiments, repression of basal gene expression by 5 mM glucose and exceeding of this repression by 25 ?M IPTG have been observed. At the result of medium pH optimization experiments, the highest enzyme production has been determined at pH 7,0. Optimum production temperature is 24-26 oC and the enzyme production is decreased with increasing temperatures.Consequently; P2Spaclac- pUC19 E. coli JM109 strain has displayed the best penicillin acylase activity in raje medium containing 5 mM glucose and 2,5 mM sucrose, at inducing cultures with 25 ?M IPTG, at pH 7 and 26 oC, with no aeration, twentiethhour after inoculation. The activity values of optimized conditions in bioreactor are higher than the activity values of flask experiments.