LZTR1'in Hep3B hepatoselüler karsinom hücre hattındaki transkripsiyonel etkilerinin araştırılması
Investigation of the transcriptional effects of LZTR1 in the Hep3B hepatocellular carcinoma cell line
Yazar: SONER KARABULUT
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ GÖKHAN YILDIZ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: CRISPR = CRISPR ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular

Özet:
Karaciğer kanseri, dünyada en sık teşhis edilen kanser tipleri arasında yedinci, kansere bağlı ölüm nedenleri arasında üçüncü sıradadır. Primer karaciğer kanserlerinin, %85'ini hepatoselüler karsinom (HCC) oluşturmaktadır.  Leucine zipper like post translational regulator 1 (LZTR1) geni tarafından kodlanan LZTR1 proteini, hücre içinde kanonik RAS ve kanonik olmayan RIT1 proteinlerini poliubikitinleyerek RAS/ mitogen activated protein kinase (RAS/MAPK) sinyalininin azalmasında rol oynar. LZTR1'in HCC'de sıklıkla mutasyona uğradığı ve tümör baskılayıcı olduğu tespit edilmiştir. LZTR1'in nakavt edilmesinin HCC hücrelerinde neden olduğu transkripsiyonel değişiklikler araştırılmamıştır. Bu tez çalışmasında, Hep3B hücre hattında LZTR1'in nakavt edilmesinin ekspresyonel değişiklikler üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda CRISPR/Cas9 yöntemiyle LZTR1 geninin nakavt edilmesi, LZTR1 nakavt ve kontrol hücrelerin RNA örnekleriyle karşılaştırmalı transkriptomik analizler yaparak Hep3B hücrelerinde LZTR1 geninin yol açtığı ekspresyon değişikliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu hedef doğrultusunda, CRISPR/Cas9 yöntemi kullanılarak LZTR1'in nakavt edildiği ve edilmediği Hep3B kolonileri hazırlandı. LZTR1 protein seviyeleri western blotlama yöntemiyle ve genomik DNA dizileri Sanger yöntemiyle analiz edilerek, LZTR1 nakavtı doğrulanmıştır. RNA dizileme analizlerinin sonucunda, LZTR1'in nakavt edilmesi 20'si LncRNA olmak üzere 117 genin ifadesini >1.5 kat (p<0.05) değiştirdiğini ortaya koymuştur. Gen seti zenginleşme analizleri (GSEA), LZTR1 ifade edildiğinde gelişim ve farklılaşma, transkripsiyon düzenleme ve hücre sinyal iletimi biyolojik süreçleriyle ilişkili Gene Ontology (GO) terimlerinin zenginleştiğini ortaya çıkardı. qRT-PCR yöntemiyle yaptığımız validasyon deneylerinin sonuçları, RNA dizileme sonuçlarıyla uyumlu olarak (R2: 0.96) cadherin 11 (CDH11), tribbles pseudokinase 2 (TRIB2) ve KLF transcription factor 5 (KLF5) gen ekspresyonlarının LZTR1 nakavt hücrelerde arttığını, vimentin (VIM), angiomotin like 1 (AMOTL1), bone morphogenetic protein 7 (BMP7) ve reelin (RELN) gen ekspresyonlarının ise azaldığını gösterdi. Bu tez çalışmasının sonucunda LZTR1'in HCC'deki transkripsiyonel düzenleyici işlevlerinin aydınlatılmasına katkı sağlayacak veriler elde edilmiş olup, bu bulguların LZTR1'in HCC'deki rolünün daha iyi anlaşılmasına fayda sağlayabileceği öngörülmektedir.

Abstract:
Liver cancer is the seventh most frequently diagnosed cancer type in the world and the third leading cause of cancer-related deaths. Hepatocellular carcinoma (HCC) accounts for 85% of primary liver cancers. The LZTR1 protein, encoded by the leucine zipper-like post-translational regulator 1 (LZTR1) gene, plays a role in the reduction of RAS/mitogen-activated protein kinase (RAS/MAPK) signaling by polyubiquitinating canonical RAS and non-canonical-RIT1 proteins in the cell. LZTR1 is frequently mutated in HCC and has been found to be a tumor suppressor. Transcriptional changes induced by LZTR1 knockdown in HCC cells have not been investigated. In this thesis, we aimed to investigate the effects of LZTR1 knockout on expression changes in the Hep3B cell line. For this purpose, the LZTR1 gene was knockout by the CRISPR/Cas9 method. Comparative transcriptomic analysis of RNA samples of LZTR1 knockout and control cells aimed to determine the expression changes caused by the LZTR1 gene in Hep3B cells. For this purpose, Hep3B colonies with and without LZTR1 knockout were prepared using the CRISPR/Cas9 method. LZTR1 protein levels were analyzed using western blotting, and genomic DNA sequences were analyzed using the Sanger method to confirm LZTR1 knockout. RNA sequencing analyses revealed that knockout of LZTR1 altered the expression of 117 genes, including 20 LncRNAs, by >1.5-fold (p<0.05). Gene set enrichment analyses (GSEA) revealed that Gene Ontology (GO) terms associated with the biological processes of development and differentiation, transcription regulation, and cell signaling were enriched when the LZTR1 gene was expressed. Our validation experiments using qRT-PCR showed that the gene expressions of cadherin 11 (CDH11), tribbles pseudokinase 2 (TRIB2), and KLF transcription factor 5 (KLF5) were increased in LZTR1 knockout cells. Conversely, the gene expressions of vimentin (VIM), angiomotin-like 1 (AMOTL1), bone morphogenetic protein 7 (BMP7), and reelin (RELN) were found to be decreased. These findings are in line with the RNA sequencing results (R2= 0.96). As a result of this thesis study, data that will contribute to the elucidation of the transcriptional regulatory functions of LZTR1 in HCC were obtained and it is predicted that these findings may contribute to a better understanding of the role of LZTR1 in HCC.