HIV ile enfekte olmuş hastalarda M41L direnç mutasyonunun ' Real- Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu ' ile saptanması
Detection of M41L resistance mutation in patients infected with HIV by Real-Time Polymerase Chain ??Reaction
Yazar: ZUHAL TEKKANAT TAZEGÜN
Danışman: PROF. DR. GÜLDEN ÇELİK
Yeditepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antiviral ajanlar = Antiviral agents ; HIV = HIV ; HIV I = HIV I ; HIV enfeksiyonları = HIV infections ; Mutasyon = Mutation ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İlaç alerjisi = Drug hypersensitivity ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
HIV/AIDS, Sahra-altı Afrika'da birinci, dünyada ise dördüncü sıradaki ölüm nedeni olarak bildirilmektedir. AIDS'in tedavisindeki en önemli sorunlardan birisi, antiretroviral ilaçlara karşı dirençli mutantlardır. Günümüzde rutin veya epidemiyolojik amaçlı HIV antiviral direnç testleri, yaygın olarak konvansiyonel dizi analizi yöntemi ile yapılmaktadır. Oysa, son yıllarda tedavi başarısını olumsuz etkileyebilen ve total viral popülasyon içinde azınlıkta olan ilaç dirençli mutant varyantları, konvansiyonel dizi analizine kıyasla, daha duyarlı saptayan yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmada, HIV tedavisinde ilk ve halen en önemli ilaç olan zidovudine ve stavudine direncinde en sık karşılaşılan mutasyonlardan biri olması ve gerçek zamanlı PZR yöntemiyle bu direncin daha önce ülkemizde araştırılmaması nedeniyle M41L direnç mutasyonu Nokta-Mutasyon Spesifik Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (NMS-GZ-PZR) yöntemi ile araştırıldı.Çalışmada Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Moleküler Mikrobiyoloji Laboratuarı'nda daha önce konvansiyonel dizi analizi ile (ABI Prism 310, Foster City, A.B.D.) incelenmiş, enfekte olduğu tarih bilinmeyen, 60 HIV?1 genotip B pozitif örnek kullanıldı. Center for Diseases Control'den (A.B.D.) Heneine ve arkadaşları tarafından HIV?1 genotip B'de oluşabilen dokuz ana ilaç mutasyonunu saptamak üzere geliştirilerek valide edilmiş olduğu ve konvansiyonel dizi analizine göre duyarlığının daha yüksek ve yorumunun daha kolay olduğu bildirilen NMS-GZ-PZR yöntemi, LightCycler 2.0 (Roche Applied Science, Almanya) aygıt sisteminde, M41L direnç mutasyonunu saptamak üzere önerilen primerler ve TaqMan probu kullanılarak uygulandı. RNA kalitesinin bozuk olduğuna karar verilen 3 örnek çalışma dışı bırakıldı. Öneriye uygun olarak, vahşi tip ve mutant varyantları ayırt edebilmek için, pozitiflik ölçütünü belirlemek amacıyla, total viral kopya reaksiyonu ile mutant varyant reaksiyonunun Ct değerleri (?threshold cycle?) arasındaki fark (?Ct) değerlendirildi.57 HIV?1 genotip B örnek arasından, NMS-GZ-PZR sonuçlarına göre, total viral kopya amplifikasyonunun Ct değeri 10'dan küçük olan ( yüksek kopya sayısı nedeni dilüsyon ile tekrar gerekliliği) ve 26'dan büyük olan ( düşük kopya sayısı nedeni ile belirsiz sonuç) 25 örnek, öneriye uygun olarak, pozitiflik ölçütü olarak kullanılacak ?Ct eşik değerini belirlemek için yapılan çalışmanın dışında bırakıldı. Eşik değer hesaplamasında kullanılan 32 örnek, merkezi eğilim dağılımına göre ?Ct ortanca değeri (5.81) eşik değer olarak belirlendi. Buna göre, ?Ct değeri, eşik değerin üzerinde olan olgu örnekleri, M41L mutasyonu açısından negatif kabul edildi. Bu eşik değer ölçütü ile değerlendirilen NMS-GZ-PZR sonuçlarına göre, 32 örneğin 16'sında M41L direnç mutasyonu pozitifliği saptandı. Bu örneklerin 6'sında, konvansiyonel dizi analizi sonuçlarına göre de, M41L direnç mutasyonu pozitifti. Çalışmaya alınan toplam 57 örnek arasında, konvansiyonel dizi analizi ile pozitif olduğu bildirilen 13 örnekten 7'sinin sonuçları, NMS-GZ-PZR sonuçlarına göre total viral kopya Ct'si 26'nın üzerinde olduğu için, belirsiz kabul edildi. Bu örneklerde, düşük viral yüklerine bağlı olarak yanlış sonuç verme riski nedeniyle, ön amplifikasyon aşamasından sonra, testin tekrar edilmesi önerilmektedir. Ancak daha önceki saklama koşullarında dondurulup çözünme çok olduğu için, RNA kalitesi bozulan bu örnekler tekrar edilmedi. Konvansiyonel dizi analizi ve NMS-GZ-PZR yöntemlerinden birisinin referans yöntem statüsü olmadığı için, iki yöntem arasındaki karşılaştırmalı uyuşmanın güvenirliği, kapa istatistiği ile ölçüldü. Kapa istatistiğine göre, iki yöntem arasında, orta düzeyde uyuşma (k=0.375;P<0.007) saptandı.Bilgimize göre, bu çalışma, Türkiye'de, HIV enfeksiyonunun tedavisinde kullanılan antiviral ilaçlara karşı azınlık direnç mutasyonlarını, konvansiyonel dizi analizine kıyasla daha duyarlı ve uygulaması daha kolay bir yöntemle araştırarak bildiren ilk çalışmadır. NMS-GZ-PZR yöntemi, şimdilik, bilinen tüm direnç mutasyonları arasında yalnızca bir grubunu test etmek için geliştirilmiş durumdadır. NMS-GZ-PZR yöntemi, ultra derin dizi analizi düzeyindeki duyarlılıkta, minor azınlık direnç mutantlarının önemli bir grubunun araştırılmasını sağlayabilmekte ve böylece HIV enfeksiyonu olgularında gelişen antiviral dirence ilişkin epidemiyojik dinamiklerin daha iyi anlaşılmasına ve tedavi başarısının artmasına katkıda bulunmaktadır.

Abstract:
HIV / AIDS, has been reported as most frequent cause of death in sub-Saharan Africa, and ranks fourth on the the world wide list. One of the most important problems in the treatment of AIDS is the resistant mutants for antiretroviral drugs. Currently, routine or epidemiological HIV antiviral resistance tests are commonly performed by conventional sequence assays. However in recent years, more sensitive methods have been developed, to detect drug resistant mutant variants in the minority of the total viral population which adversely affect the success of the treatment, compared to the conventional sequence assays. In this study, we investigate M41L mutations, for zidovudine, the first and still an important drug in HIV treatment and for Stavudine, which is for one of the common mutations, and has not been previously investigated by real-time PCR method. Point-mutation-specific Real-Time Polymerase Chain Reaction (PMS-RT-PCR) method which is more sensitive than conventional sequence analysis method is performed in this study. Sixty HIV?1 genotype B positive samples which were examined by conventional sequence analysis (ABI Prism 310, Foster City, USA) in the Laboratory of Molecular Microbiology, Cerrahpaşa Faculty of Medicine. Point mutation spesific Real- time PCR method (PMS-RT-PCR; which was reported as a more sensivite and easy to interpret test compared to conventional sequence assays, developed and validated by Heneine et al. to detect HIV-1 genotype B, consisting nine major drug mutations; was performed on LightCycler 2.0 (Roche Applied Science, Germany) system. Recommended primers and TaqMan probe for detection of M41L mutation for resistance were used. Three samples were excluded due to poor quality of the RNA quality. To distinguish between wild type and mutant variants, in order to determine the criteria for positivity, difference between Ct values (?threshold cycle?) of the mutant variant and the Ct values of viral copies of total reaction were evaluated.According to the results of the PMS-RT-PCR; for 57 samples of HIV-1genotype B, when Ct value of the amplification of the total viral copies less than 10 (reexamination with the need for dilution due to the high number of copies), and higher than 26 (low copy number due to uncertain results ) were applied, a total of 25 samples which would be used as measure of positivity were exculeded from the study to determine the value of ?Ct threshold. 32 samples, used to calculate the threshold. The threshold was determined according to the distribution of central tendency and median ?Ct value (5.81). When ?Ct value was at threshold level, samples were considered negative for the mutation M41L. M41L resistance mutation were detected in 16 of 32 samples which were evaluated by this threshold according to the PMS-RT-PZR. Six of these samples, were M41L resistance mutations which were positive according to the results of conventional sequence analysis. Results of the seven of 13 samples which were reported to be positive by conventional sequence analysis, were accepted uncertain as the total viral copy Ct's were above 26 according to the results of the PMS-RT-PCR assay. In these examples, because of low viral loads, after pre-amplification stage, to minimize the risk of false results, the test was performed. However, as the storage conditions were not proper (too much freeze- thaw) and since the quality of RNA were unacceptable, these samples were not examined again. Since both conventional sequence analysis and PMS-RT-PCR method were not at the status of a reference method, the reliability of comparison between the two methods, was measured by Kappa Statistics. According to Kappa statistics, between the two methods, a fair agreement (k = 0,375, P <0.007) was found. To our knowledge, this is the first study in Turkey which investigated the minority resistance mutations to antiviral drugs used to treat HIV infection with a more sensitive and easier method than conventional sequence assay. PMS-RT-PCR method, presently has been developed for testing only one group of mutations for HIV. PMS- RT-PCR method provides near to ultra-deep sequencing sensitivity for exploring an important group of minor resistance mutations. Therefore, testing with this method is expected to contribute to better understanding of epidemiologic dynamics related to antiviral resistance in HIV infections and increase the success of treatment.