Stres ve nikotinin nöronal nitrik oksit sentaz ekspresyonu ve beyin nitrit/nitrat seviyelerine etkisi
Modulation of neuronal nitric oxide synthase and nitrite/nitrate levels by nicotine and forced swim test
Yazar: AYŞEGÜL KESER
Danışman: PROF. DR. LÜTFİYE KANIT
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Cinsiyet farkları = Gender differences ; Nikotin = Nicotine ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Stres = Stress

Özet:
Nitrik oksit (NO) stres hormonlarının salımını düzenler. Stresörlerle hipotalamus hipofiz adrenal eksende NO sentaz (NOS) aktivitesi artar. Nikotin, NO içeren mekanizmalarla bazı etkilerini oluşturmaktadır. Strese yanıtta, beyin NO düzeylerinde ve nikotinin santral etkilerinde cinsiyet farklılıkları vardır. Çalışmamızda kronik nikotin uygulamasının davranışsal ümitsizlik ve sıçan beyninde nöronal NOS (nNOS) düzeyleri ve NO metabolitleri (nitrit/nitrat) üzerine etkilerinin değerlendirilmesi ve cinsiyet farklılıklarının ortaya konması amaçlanmıştır.Her grupta 2x2x2 faktöriyel düzende (cinsiyet [dişi, erkek], stres uygulaması [zorlu yüzme testi (ZYT), ele alıştırma], nikotin uygulaması [nikotin, serum fizyolojik (SF)]) 8-10 erişkin Sprague- Dawley sıçan kullanılmıştır. Sıçanlara 15 gün nikotin (0.4 mg/kg, ciltaltı) ya da SF uygulanmıştır. 14. ve 15. günlerde stres gruplarına ZYT uygulanmıştır. ZYT sırasındaki davranış örüntüsü mücadele, donma, dalma ve yüzme olarak izlenmiş ve süreleri kaydedilmiştir. ZYT'nin 2. gününde sıçanlar dekapite edilip, frontal korteks, hipokampus ve amigdala diseke edilerek dondurulmuştur. Western blot ile integral protein kontrol olarak beta-aktin kullanılarak nNOS ekspresyonu saptanmıştır. Doku protein konsantrasyonları Lowry tekniğiyle ölçülmüş ve elde edilen bantlar NIH İmage J programıyla alan ve yoğunluk açısından değerlendirilmiştir. Western blot'ta her gruptan bir örnek tek bir jel üzerinde yürütülmüş ve her grubun sonuçları ilgili kontrollerinin yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Nitrit/nitrat düzeylerine Griess reaksiyonu ile bakılmıştır. Veriler multifaktöriyel ANOVA ve t-testlerle analiz edilmiştir.ZYT'nin davranışsal ümitsizliğin göstergesi olan donma parametresinde donma süresi tüm gruplarda ikinci gün daha uzun saptanmıştır. SF uygulanan hayvanlarda birinci ve ikinci günlerde erkeklerin donma süreleri dişilerden daha kısa bulunmuştur. Nikotin uygulanan sıçanların birinci günde, erkeklerin donma süreleri dişilerden kısa bulunmuştur. Mücadele parametresinde SF uygulanan hayvanlarda birinci ve ikinci günlerde erkekler dişilerden daha fazla mücadele etmişlerdir.Hipokampusta dişi sıçanlarda nikotin ve/veya Z.Y.T. ile nNOS ekspresyonunda artış saptanmıştır. SF uygulanan sıçanlarda nitrit/nitrat düzeylerinde amigdalada yüksek olmak üzere bölgeler arası anlamlı farklılık bulunmuştur. SF uygulanan erkeklerde frontal kortekste nitrit/nitrat düzeylerinin dişilerdekinden anlamlı derecede yüksek olduğu saptanmıştır.Anahtar sözcükler: Nitrik oksit sentaz, nikotin, stres, cinsiyet farkı, nitrik oksit metabolitleriaysegul.keser@ege.edu.tr

Abstract:
Nitric okside (NO) modulates secretion of stress hormones and exposure to stressors increases activity of NO synthase (NOS) in hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Nicotine generates some of its effects with mechanisms which involve NO. There are sex differences in stress response, brain NO levels and central effects of nicotine. Our aim was to determine effects of chronic nicotine administration on behavioral despair, neural NOS (nNOS) levels and NO metabolites (nitrite/nitrate) in rat brain and elucidate sex differences in these effects.8-10 adult Sprague Dawley rats were used in each group in a 2x2x2 factorial design with sex (male, female), stress exposure (forced swim test (FST), handling) and nicotine treatments (nicotine, saline) factors. Rats received nicotine (0.4 mg/kg, s.c.) or saline injections for 15 days. On 14th and 15th days, stress groups were subjected to FST. Behavior during FST was monitored: Struggle, freeze, diving and swimming. Durations for each behavior was recorded. After 2nd day of FST rats were decapitated, frontal cortex, hippocampus and amygdala were dissected on ice and frozen. NOS expression was determined by Western blotting, using beta-actin as internal protein control. Tissue protein concentrations were determined with Lowry technique. Bands obtained, were evaluated with Image J program of NIH (density and area). In Western blotting, one sample from each group was run on a single gel and results were expressed for each group as percentage of respective controls. Nitrite/nitrate levels were determined with Griess reaction. Data was analyzed by multifactorial ANOVAs, followed by t-tests.In FST, freezing parameter which is measure of behavioral despair is determined longer on second day. Saline treated males had shorter freeze durations than saline treated females on first and second day. Nicotin treated males had shorter freeze than females on first day. Saline treated females struggled less than males.In Western blotting female hippocampus showed significant increases in nNOS expression levels with nicotine treatment and/or FST. Nitrite/nitrate levels were significantly different among brain regions having high levels in amygdala in control amimals. Saline treated females had significantly lower nitrite/nitrate levels than males in the frontal cortex.Keywords: Nitric oxide synthase, nicotine, stress, gender difference, nitric oxide metabolitesaysegul.keser@ege.edu.tr