Kadmiyum, kurşun ve cıvanın inek luteal hücre kültüründe progesteron sentezi üzerine etkileri
Effects of cadmium, lead and mercury on progesterone synthesis in cultured bovine luteal cells
Yazar: FATİH SULTAN BİLMEN
Danışman: PROF. DR. ŞEVKET ARIKAN
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Ağır metaller = Heavy metals ; Cıva = Mercury ; Fizyoloji = Physiology ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kadmiyum = Cadmium ; Kurşun = Lead ; Progesteron = Progesterone

Özet:
Günümüzde çevre kirliliği problemi, yüzleşmek zorunda kaldığımız en önemli küresel meselelerden biridir. Canlılar üzerinde oluşturdukları zararlı etkilerinden dolayı ağır metaller, çevre kirliliğine yol açan maddeler arasında zikredilmektedir. Kadmiyum, kurşun ve cıva, insan ve hayvan sağlığı için tehdit oluşturan en önemli ağır metallerdir. Mevcut çalışma, inek korpus luteum dokusundan izole edilen luteal hücrelerin in vitro inkübasyonu sırasında sentezledikleri progesteron üzerine kadmiyum, kurşun ve cıvanın etkilerinin araştırılması amacıyla gerçekleştirilmiştir.
Mezbahada kesilen hayvanlardan toplanan ve üzerinde midluteal dönem korpus luteum bulunduran ovaryumlar, soğuk zincir şartlarında laboratuvara ulaştırıldı. Luteal doku aseptik şartlar korunarak ovaryumlardan diseke edildi. Küçük parçalara dilimlenmiş luteal dokular, içerisine bovine serum albumin (2,5 mg/ml), DNA'az (0,04 mg/ml), kollejenaz (0,2 mg/ml) ve antibiyotik/antimikotik (%1) ilavesi yapılmış ve oksijene doyurulmuş medyum (DMEM/F12, 1:1) içerisinde, 37 °C'ye sabitlenmiş çalkalamalı su banyosunda inkübasyona tabi tutuldu. Steroidojenik aktiviteye sahip hücrelerin belirlenmesi, 3β-hydroxysteroid degydrogenase (3β-HSD) enzimi aktivitesine bağlı olarak hücrelerin boyanmasıyla gerçekleştirildi. 3β-HSD aktivitesi bakımından pozitif hücreler (2x10⁴ hücre/kuyucuk) kültür medyumu         (2 ml/kuyucuk) içerisinde 5 gün süreyle inkübasyona bırakıldı. İlk 24 saat hücreler, %8 oranında newborn calf serum (NCS) içeren medyumda, herhangi bir uygulamaya tabi tutulmaksızın inkübe edildi. Ardından hücreler, içinde serum bulundurmayan ancak belirli miktarlarda kadmiyum klorür (0,1 µM; 0,25 µM; 0,5 µM, 1 µM), kurşun asetat trihidrat (0,1 µM; 1 µM, 10 µM, 50 µM) ve cıva klorür (1 µM; 2,5 µM, 5 µM, 10 µM) bulunduran kültür medyumu içinde, toplamda 96 saat daha inkübe edildi. Her 48 saatte bir kullanılmış medyum toplanarak -20 °C saklandı ve yerine yenisi dağıtıldı. Kullanılmış medyumdaki progesteron miktarının tayini radioimmunoassay (RIA) yöntemiyle gerçekleştirildi.
İnkübasyon medyumuna kadmiyum klorür (0,1 µM; 0,25 µM; 0,5 µM, 1 µM), kurşun asetat trihidrat (1 µM, 10 µM, 50 µM) ve cıva klorür (2,5 µM, 5 µM, 10 µM) ilave edildiğinde, luteal progesteron sentezinin önemli derecede (P<0,01) düştüğü belirlendi. Hücrelerin 1 µM kadmiyum klorür ile inkübasyonunda, 5. gün ölçümlerinde, progesteron sentezinin %55 oranında azaldığı tespit edildi. Hücrelere 50 µM kurşun asetat trihidrat uygulandığında inkübasyonun 3. gününde %43 ve 5. gününde %61 oranında progesteron miktarında düşüş gözlendi. Hücreler 10 µM cıva klorür ile inkübe edildiğinde ise, inkübasyonun 3. gününde %42 ve 5. gününde %54 oranında steroid sentezinin azaldığı belirlendi.
Luteal hücre kaynaklı progesteron sentezi üzerine ağır metal etkilerinin araştırıldığı çalışmalar yok denecek kadar az sayıdadır. Mevcut bilgilerimize göre bu çalışma kadmiyum, kurşun ve cıvanın inek luteal hücre steroidogenezisi üzerine etkilerinin araştırıldığı ilk çalışma olma niteliği taşımaktadır. Bu tez çalışması, luteal hücrelerin çok düşük dozlarda bile kadmiyum (0,1 µM), kurşun (1 µM) ve cıva (2,5 µM) gibi ağır metallere maruziyetinde, luteal steroidogenezisin olumsuz yönde etkilendiğini göstermiştir.

Abstract:
Environmental pollution is one of the most important issues that world is facing today. Heavy metals are mentioned among the environmental pollutants due to their harmful effects on living organism. Cadmium, lead and mercury are the most important heavy metals threatening animals and human health. The present study was carried out to investigate in vitro effects of cadmium, lead and mercury on progesterone synthesis by luteal cells isolated from bovine corpora luteal.
Midluteal corpora lutea were collected from a local abattoir and transported to the laboratory in a cold chain. Luteal tissues were dissected from ovary in aseptic condition. After mincing into small pieces, minced tissues were dissociated into cells in aerated (O₂) culture media (DMEM/F12, 1:1) containing bovine serum albumin (2.5 mg/ml), collagenase (0.2 mg/ml), DNase (0.04 mg/ml) and antibiotic/antimycotic mixture (1%) on a shaking water bath at 37 °C. Cells having steroidojenik activity were determined by staining cells for 3β-hydroxysteroid degydrogenase (3β-HSD) activity. Certain number of cells having steroidojenik activity (2x10⁴/well) was incubated in 6 well culture media (2 ml/well) containing newborn calf serum (8%) and antibiotic/antimycotic mixture (%1) for 24 h. After that, luteal cells were incubated with serum free media containing cadmium chloride (0.1 µM, 0.25 µM, 0.5 µM, and 1 µM), lead acetate trihydrate (0.1 µM, 1 µM, 10 µM and 50 µM) and mercury chloride (1 µM, 2.5 µM, 5 µM and 10 µM) for additional 96 hours. Every 48 hours, used media was replaced and stored frozen at    -20 °C. Progesterone content in used media was determined by radioimmunoassay (RIA). 
The treatment of cells with cadmium chloride (0.1 µM, 0.25 µM, 0.5 µM and 1 µM), lead acetate trihydrate (1 µM, 10 µM and 50 µM) and mercury chloride (2.5 µM, 5 µM and 10 µM) resulted in significant (P < 0.01) inhibition of luteal progesterone synthesis. Incubation of cells with 1 µM cadmium chloride lead to 55% decrease in progesterone production on day 5. Treatment of cells with 50 µM lead acetate trihydrate induced 43% and 61% decrease in progesterone synthesis on day 3 and 5 respectively. When cells were treated with 10 µM mercury chloride, it resulted in 42% and 54% inhibition in progesterone synthesis on day 3 and 5 respectively. 
There is lack of studies focused on the effect of heavy metals on luteal steroidogenesis. This is the first study, to our knowledge, to test the effects of cadmium, lead and mercury on progesterone biosynthesis by bovine luteal cells. The results of the present thesis demonstrated that luteal steroidogenesis is greatly influenced by exposure of cells to heavy metals as low as 0.1 µM, 1 µM and 2.5 µM cadmium, lead and mercury respectively.