İnsan spermatogonyal kök hücrelerinin devamlılığının ve ekspansiyonunun in vitro koşullarda sağlanması
Maintenance and expansion of human spermatogonial stem cells in culture
Yazar: PINAR ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. ÇİLER ÇELİK ÖZENCİ
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Embriyoloji = Embryology ; Genitalia-erkek = Genitalia-male ; Kollajen = Collagen ; Kök hücreler = Stem cells ; Kısırlık-erkek = Infertility-male ; Sperm = Spermatozoa ; Tedavi = Treatment ; İn vitro = In vitro ; İnsan = Human

Özet:
Amaç: Spermatogonyal kök hücreler (SKH) spermatogenezin devamlılığını sağlarlar ve bu kök hücrelerin kaybı erkeklerde infertiliteye sebep olmaktadır. Bu nedenle bu hücrelerin elde edilip çoğaltılarak kök hücre terapisinde kullanımı büyük önem taşımaktadır. Literatürde insan spermatogonyal kök hücrelerinin (iSKH) tanımlanması ve in vitro koşullarda çoğaltılması ile ilgili kısıtlı çalışma bulunmaktadır. Çalışmamızda iSKH'lerinin farklı yöntemler ile izolasyonları ve çeşitli in vitro koşullarda kültüre edilmeleri sonrasında hayatta kalma ve çoğalma kapasitelerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Yöntem: Bu çalışmada FACS ile izole edilen SSEA4 ve THY1 belirtecini ekspre eden hücrelerin kök hücre fonksiyonlarının değerlendirilmesi amacı ile ksenotransplantasyon yapılmıştır. Ardından FACS ve MACS yöntemi ile izole edilen THY1+ destekleyici hücreleri varlığında MACS ile izole edilen ITGA6+ iSKH'leri kültüre edilmiştir. Kültür sonunda elde edilen UTF1+ hücre sayıları değerlendirilmiştir. Ayrıca iSKH'leri, tip I kollajen ile kültüre edilerek, sayıları ve bu hücrelerin in vitro hayatta kalmaları değerlendirilmiştir. 
Bulgular: FACS ile izole edilen SSEA4+/THY1- hücrelerin koloni oluşturma kapasitelerinin yüksek olduğu ve SSEA4-/THY1+ ve SSEA4-/THY1- hücrelerin koloni oluşturma kapasitelerinin düşük olduğu gözlenmiştir. FACS ve MACS yöntemleri ile izole edilen THY1+ hücrelerinin, ITGA6+ iSKH'lerinin in vitro hayatta kalımlarını desteklediği gösterilmiştir. Tip I kollajen ile kök hücre zenginleştirme yönteminin iSKH sayısını ve çoğalmasını arttırdığı gözlenmiştir. 
Sonuç: Çalışmamızda tip I kollajen ile zenginleştirilen iSKH'lerinin THY1+ destekleyici hücreleri ile kültüre edilmelerinin, bu hücrelerin in vitro hayatta kalımlarını desteklediği ilk kez gösterilmiştir. Bulgularımız, iSKH'lerinin ileride infertilite olgularında kök hücre terapisinde kullanılmaları açısından destekleyici sonuçlar ortaya koymuştur.

Anahtar Kelimeler: İnsan spermatogonyal kök hücre, in vitro kültür, THY1, Tip I Kollajen

Abstract:
Objective: Spermatogonial stem cells (SSC) maintain spermatogenesis. When the stem cell pool is depleted this can lead to infertility and successful isolation and expansion of human spermatogonial stem cells (hSSC) are important factors for stem cell therapy. Studies about identification of human spermatogonial stem cells and their culture conditions for successful in vitro expansion of them are limited in the literature. In this study, we aimed to evaluate the success of different methods of stem cell isolation and culture conditions on in vitro expansion of hSSCs.
Method: We isolated stem cells that express SSEA4 and THY1 markers by FACS method. Then we performed xenotransplantation to mice in order to evaluate the stem cell function of the isolated cells. We cultured ITGA6+ spermatogonial stem cells on THY1+ cells isolated by MACS and FACS methods. After culture, we determined the number of UTF1+ stem cells for all conditions. We also analyzed the efficiency of type I collagen on stem cell enrichment and proliferation of hSSCs in culture.
Results: We observed that colonizing activity of SSEA4+/THY1- cells is higher whereas colonizing activity of SSEA4-/THY1+ and SSEA4-/THY1- cells is lower when compared to other groups. We also observed that THY1+ cells isolated by MACS and FACS can support the maintanence of ITGA6+ hSSCs. Culturing ITGA6+ cells with type I collagen increases hSSC number and proliferation of ITGA6+ spermatogonial stem cells in in vitro culture. 
Conclusion: In our study, it was shown for the first time that culturing of hSSCs enriched with type I collagen with THY1+ feeder cells support the maintanence of hSSCs in in vitro culture. Our study suggest supportive information for future studies that will enable to use hSSCs for stem cell therapy in infertility.

Key words: Human spermatogonial stem cell, in vitro culture, THY1, Type I collagen