MALDI-MS ile etkin fosfopeptit analizleri için sol-jel yüzeylerin geliştirilmesi
Development of sol-gel surfaces for effective phosphopeptide analysis by MALDI-MS
Yazar: MEHMET ATAKAY
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Fosforilasyon = Phosphorylation

Özet:
Fosforilasyon, yapıya fosfat grubunun katılması sonucunda hücresel proteinlerde en sık karşılaşılan post-translasyonel modifikasyondur. Hücresel faaliyetlerde görev alan fosfoproteinlerin yapılarının aydınlatılması için günümüzde en etkin teknik olarak kütle spektrometrisi kullanılmaktadır. Fakat fosfopeptitlerin kütle spektrometrik analizler için oldukça önemli bir parametre olan iyonlaşma verimleri düşüktür. Ayrıca hücre içerisindeki proteinlerin fosfatlanma yüzdelerinin genelde düşük olması nedeniyle oluşacak fosfopeptitlerin derişimleri, kullanılan kütle spektrometrik tekniklerin tayin sınırlarının altında kalmaktadır. Bu sorunların çözülmesi amacıyla fosfopeptitlerin kütle spektrometresi ile analiz edilmeden önce bulundukları ortam içerisinden seçimli olarak ayrılıp belli bir yerde toplanarak miktarlarının arttırıldığı zenginleştirme çalışmaları yapılmaktadır.Bu tez kapsamında MALDI-MS yöntemi ile yapılan fosfopeptit analizlerinin etkinliğinin arttırılabilmesi amacıyla fosfopeptitler üzerindeki fosfat gruplarına seçimli olmaları amaçlanan farklı metal (Ti, Zr, Ta) içerikli ve amin fonksiyonel gruplu sol-jeller sentezlenmiş ve etkili fosfopeptit zenginleştirme yöntemleri geliştirilmiştir. Örnek hazırlama sırasında 2,5-dihidroksibenzoik asit matriksinin çözeltisine yapılan fosforik asit katkısının fosfopeptitlerin MALDI-MS sonuçlarını iyileştirdiği gözlenmiştir. Sentezlenen farklı metal içerikli ve amin fonksiyonel gruplu sol-jeller kullanılarak geliştirilen fosfopeptit zenginleştirme yöntemleri için adsorpsiyon, yıkama ve elüsyon basamaklarında ortamda bulunan türler ve ortamın pH değeri gibi parametrelerin oldukça önemli olduğu sonucuna varılmıştır. Bunun yanı sıra, poli(etilen glikol) polimerinin sol-jel yapılarına dahil olmasıyla malzemenin gözenekliliğinin ve sol-jelin fosfopeptit zenginleştirilmesindeki verimliliğinin arttığı gözlenmiştir. Elde edilen tekrarlanabilir sonuçlara göre, sentezlenmiş olan farklı metal içerikli ve amin fonksiyonel gruplu sol-jel malzemelerin koşulları en uygun hale getirilmiş yöntemlerle birlikte fosfopeptit zenginleştirme çalışmalarında başarıyla kullanılabilecekleri gösterilmiştir.

Abstract:
Phosphorylation is the covalent attachment of phosphate group to the structure which is the most common post-translational modification on cellular proteins. Mass spectrometry is used as the most efficient technique for characterizing phosphoproteins taking charge in cellular processes. However, phoshopeptides have low ionization efficiency which is a very important parameter for mass spectrometry. Furthermore, the concentration of phosphopeptides is usually lower than the detection limit of mass spectrometric techniques because of the substoichiometric phosphorylation. Enrichment studies, which is the selective separation of phosphopeptides from the respective environment for concentrating them before mass spectrometric analysis, are performed for solving these problems.In this dissertation, for enhancing the effectiveness of phosphopeptide analysis using MALDI-MS, sol-gels with different metals (Ti, Zr, Ta) and amino functional groups proposed as specific materials for phosphate groups onto phosphopeptides were synthesized and efficient phosphopeptide enrichment methods were developed. It has been observed that phosphoric acid addition into 2,5-dihydroxybenzoic acid matrix solution during sample preparation improves the phosphopeptide analysis results in MALDI-MS. It was concluded that using synthesized sol-gels with different metals and the amino functional groups for phosphopeptide enrichment methods, the species present in the medium and pH parameters are very important during adsorption, washing and elution steps. In addition, the porosity of the sol-gel materials was increased by incorporation of poly(ethylene glycol) polymers with sol-gel structures. Therefore the efficiency of sol-gels increased for phosphopeptide enrichment. According to the reproducible results, it has been shown that the synthesized sol-gel materials with different metals and amino functional groups can be used succesfully with optimized methods in phosphopeptide enrichment studies.