Monoklonal antikor (MAb) saflaştırma prosesinin optimizasyonu
Optimization of monoclonal antibody (MAb) purification process
Yazar: ÖZNUR ÖZASLAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SULTAN GÜLÇE İZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Monoklonal antikorlar (mAb), son yıllarda biyofarmasötik endüstrisinin en değerli ürünleri haline gelmiştir. Patent sürelerinin dolması ile Dünya'da ve Türkiye'de biyobenzer mAb üretimleri teşvik edilmektedir. Buna karşın, biyobenzer üretimi, proses değişkenlerine oldukça bağlı olup, alt akım işlemleri üretim maliyetinin % 60-80'ini oluşturmaktadır. Ayrıca saflaştırma basamakları her farklı ürün için adapte ve optimize edilmelidir. Bu çalışmada amaç, terapötik bir protein olan, anti TNF- α mAb'ın saflaştırma prosesinin optimizasyonudur.
Bu çalışmada öncelikli olarak, Protein-A kromatografisi için kullanılan Hi Trap mAb Select Sure Protein-A kolonunda yürütülen saflaştırma prosesi optimize edildi. Bağlama tamponu, elüsyon tamponu, pH, akış hızı ve inkübasyon zamanı gibi parametrelerin saflaştırma verimi üzerine etkileri belirlendi. Bu amaçla öncelikle farklı pH'lardaki farklı bağlama tamponları ile tampon değişim işlemi yapıldı. Tampon değişim ve saflaştırma işlemlerinin ardından bu basamağın küçük ölçek üretimler için verimli olmadığı belirlendi. Yeni deneme planında süpernatant, bağlama tamponu ile 1:1 oranında seyreltilerek kolona verildi. Kolon için uygun bağlama tamponunun belirlenmesinin ardından farklı elüsyon tamponu, akış hızı ve inkübasyon zamanı denemeleri, tampon değişim işlemi uygulanmadan yapıldı. Protein-A kolonunda yapılan optimizasyon çalışması sonunda uygun bağlama tamponunun 25 mM di-sodyum hidrojen fosfat di-hidrat, 300 mM sodyum klorür pH 7,5 olduğu ve uygun elüsyon tamponunun 10 mM glisin, 300 mM sodyum klorür, pH 3,0 olduğu belirlendi. Kolona, seyreltilmiş süpernatant yüklenmesinin ardından inkübasyona gerek olmadığı ve 1 mL/dk akış hızının mAb saflaştırması için uygun olduğu belirlendi. Optimize edilmiş çalışma şartları ile uygulanan saflaştırma işlemi sonucunda % 53,4'lük mAb geri kazanımı sağlandı.
Protein-A kolonunda saflaştırma optimizasyonunun ardından ileri saflaştırma teknikleri olarak katyon ve anyon değişim kromatografileri uygulandı. Art arda uygulanan yöntemler arasında diyaliz işlemi gerçekleştirildi. Toplam proses verimi ve saflaştırılan örneklerdeki kirlilikler (safsızlıklar) ELISA ile saptandı. Afinite kromatografisi sonrası anyon değişim kromatografisi uygulanmasının anti TNF-alfa mAb saflaştırılmasında en uygun proses olduğu belirlendi.

Abstract:
In recent years, monoclonal antibodies (mAbs) have become the most valuable products of the biopharmaceutical industry. Due to the patent expiration, biosimilar mAb production is encouraged in the world and in Turkey. However, biosimilar production is highly dependent on process variables. And also, downstream processes constitute 60 to 80% of production costs. Moreover, further purification steps should be adapted and optimized for each different product. The aim of this study is the optimization of the purification process of anti TNF-α monoclonal antibody (mAb) which is the member of therapeutic proteins.
In this study, the Protein-A chromatography purification process which was carried out with Hi Trap mAb Select Sure Protein-A column was optimized. The effect of some parameters on the purification yield was determined. These parameters were determined as binding and elution buffer content, pH, incubation time and flow rate. For this purpose, buffer exchange was carried out with different binding buffers at different pH. After purification step, for small scale production, buffer exchange was found inefficient. In the new test plan, the supernatant and binding buffer were loaded onto the column with the 1:1 dilution ratio. After the determination of the appropriate binding buffer content, the experiments such as elution buffer type, flow rate and incubation time were performed without applying the buffer exchange process. At the end of the optimization study, 25 mM disodium hydrogen phosphate dihydrate, 300 mM sodium chloride at pH 7,5 was determined as an appropriate binding buffer content. And also, 10 mM glycine, 300 mM sodium chloride at pH 3,0 was determined as an appropriate elution buffer content. 1 mL/min of flow rate was determined to be suitable for mAb purification. Also there's no need to perform incubation time after loading supernatant which was diluted with binding buffer. At the end of the purification process that consisting of optimized working conditions, 53,4 % mAb recovery was achieved. 
After the optimization of the purification with Protein-A column, cation and anion exchange chromatographic methods were performed as further purification techniques. Dialysis procedure was applied between two chromatographic steps. Total process efficiency and impurities in purified samples were determined by performing ELISA. After affinity chromatography step, the most suitable process was determined as anion exchange chromatography.