Tuz stresi altında yetiştirilen arpa (Hordeum vulgare L.) bitkilerinde homobrassinolid etkisi
Effect of homobrassinolide on barley (Hordeum vulgare L.) plants grown under salt stress
Yazar: SEVGİ MARAKLI
Danışman: PROF. DR. NERMİN GÖZÜKIRMIZI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Bitkiler yaşamları süresince biyotik ve abiyotik streslerin etkisi altında kalırlar. Tuz stresi, bitkilerin büyüme ile gelişimini etkileyen ve ürün verimliliğini azaltan abiyotik stres etmenlerinden biridir. Bitkilerin strese toleransında, bitki hormonları önemlidir. BR (brassinosteroid); bitkinin büyüme ve gelişiminde rol oynayan, polihidroksisteroid yapıdaki bitki hormonudur. Bu çalışmada,  48 saat ve 72 saat süresince karanlıkta yetiştirilen arpa (Hordeum vulgare L. cv. Hilal)  köklerindeki tuz stresinin etkileri ve HBL (homobrassinolid) hormonunun bu olumsuz etkileri azaltması, morfolojik, fizyolojik, sitogenetik ve moleküler seviyelerde incelendi. Ayrıca anlatımı incelenen genler ile bu genlerin diğer bitkilerde bulunan dizileri arasındaki evrimsel ilişki, biyoinformatik analizler ile araştırıldı. Bu amaçla, arpa tohumları; sadece tuz (150 mM ve 250 mM), sadece HBL hormonu (0.5 µM ve 1 µM) ve tuz + HBL içeren çözeltilerde 48 saat ve 72 saat süresince fitre kağıtları arasında çimlendirildi. Kontrol grubu için distile su kullanıldı. 

Morfolojik çalışmalar için deney gruplarının çimlenme yüzdeleri hesaplandı, primer ve sekonder kök uzunlukları ölçüldü ve bir tohumdan çıkan kök sayısı belirlendi. Elde edilen sonuçlar, SPSS 16.0 kullanılarak ANOVA (ANalysis Of VAriance) istatistik programı ile değerlendirildi. Kontrol ile karşılaştırıldığında; tuz stresi, çimlenmeyi, kök uzunluklarını ve kök sayısını azalttı. Sadece HBL uygulamaları, kök uzunluklarını ve kök sayısını arttırdı. 
Sadece tuz uygulanan örnekler ile karşılaştırıldığında, tuz + HBL uygulamalarının çimlenmeyi, kök uzunluklarını ve kök sayısını, zamana ve uygulanan konsantasyona bağlı olarak arttırdığı belirlendi.

Fizyolojik çalışmalarda, deney gruplarının çözünebilir protein miktarı belirlendi ve SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile protein bant profilleri karşılaştırıldı. Örneklerin, SOD (süpeoksit dismutaz) ve CAT (katalaz) enzim aktiviteleri de incelendi. Sonuçlar, SPSS 16.0 kullanılarak ANOVA istatistik programı ile değerlendirildi. Kontrol ile karşılaştırıldığında, tuz uygulamaları çözünebilir protein miktarını azalttı ve enzim aktivitelerini hem 48 saatte hem de 72 saatte arttırdı. HBL uygulamaları da protein miktarını azalttı  ve özellikle 48 saatte enzim aktivitelerini arttırdı. SDS-PAGE ile yapılan analizler sonucunda, özellikle 48 saatte, deney gruplarının bant profillerinde farklılık belirlendi. Konsantrasyonlara ve zamana bağlı olarak, tuz + HBL uygulanan örneklerde, protein miktarında ve enzim aktivitelerinde artma ya da azalma görüldü.

Sitogenetik çalışmalarda, örneklerin mitotik indeksi (%) hesaplandı. Herbir örnek için deney üç kere tekrar edildi ve herbir tekrarda 1000 hücre sayıldı. Kontrol ile karşılaştırıldığında, tuz stresi altında yetiştirilmiş örneklerde, mitotik indeks azaldı buna karşın HBL uygulanan örneklerde arttı. Sadece tuz uygulanan örnekler ile karşılaştırıldığında, tuz + HBL uygulamalarında hormon konsantrasyonunun artması ile mitotik indeksin arttığı bulundu. 

Moleküler çalışmalarda, abiyotik stresle ilişkili olan 7 gen (HvPIP1.1, HvPIP1.2, HvPIP1.3, HvPIP1.5, CYCD3, DREB2, WAK) ve brassinosteroid ile ilişkili olan DWARF4 (DWF4) geni olmak üzere 8 farklı genin anlatımı incelendi. Tuz stresi, HvPIP1.2 ve WAK genlerinin anlatımını azalttı ama HvPIP1.3, DREB2 ve DWARF4 anlatımlarını arttırdı. HvPIP1.2, HvPIP1.5 ve CYCD3 anlatımlarında da zamana ve konsantrasyona bağlı olarak artma ya da azalma görüldü. Sadece HBL uygulanan örneklerde, HvPIP1.1, HvPIP1.2, HvPIP1.3, HvPIP1.5 ve DWARF4 anlatımları arttı buna karşın CYCD3, DREB2 ve WAK anlatımlarında farklı sonuçlar (artma ya da azalma) elde edildi. Kontrol ile karşılaştırıldığında, tuz + HBL uygulamaları, HvPIP1.1, DREB2 ve DWARF4 anlatımlarını arttırdı ama HvPIP1.2 anlatımını azalttı. Sadece tuz uygulanan örnekler ile karşılaştırığında ise tuz + HBL ugulamaları sadece HvPIP1.1 anlatımını arttırdı buna karşın diğer genlerin anlatımında zamana ve konsantrasyonlara bağlı olarak artma ya da azalma görüldü.

Biyoinformatik analizler için bu genlerin diğer bitkilerdeki kısmi dizileri, NCBI (National Center for Biotechnology Information) veritabanından bulundu ve diziler arasındaki evrimsel ilişki dizi benzerliği (clustal) ve filogenetik ağaç analizleri ile belirlendi. Oryza sativum bitkisindeki diziler, HvPIP1.5 ile benzerlik gösterdi. CYCD3 dizisi, diğer siklin genlerinden ayrı bir dalda bulunduğu için CYCD3 geninin evrimsel süreçte diğer siklin dizilerinden önce evrimleşmiş olabileceği sonucuna varıldı. DREB2 geni ise Sorghum bicolor ile dizi homolojisi gösterdi. Oryza australiensis ve  DWARF4 dizileri, filogenetik ağaçta aynı dalda yer alan kardeş taksonlar olarak bulundu. WAK dizileri arasında da az sayıda benzerlik olduğu belirlendi. Ayrıca, abiyotik stres altında bu genlerin anlatımlarını inceleyen özellikle benzer dizilere sahip bitkilerde yapılan çalışmalar da araştırıldı ve bu çalışmada elde edilen bulgular ile karşılaştırıldı. Farklı çalışmalarda da benzer bulguların rapor edildiği görüldü. 

Tuz stresi, arpa büyüme ve gelişimini olumsuz etkilemektedir. Bu tez, tuz stresi altında yetiştirilen arpalardaki HBL hormonunun düzeltici etkisinin morfolojik, fizyolojik, sitogenetik, moleküler ve biyoinformatik açıdan araştırıldığı ilk detaylı çalışmadır. Elde edilen sonuçların, arpa ve benzer dizilere sahip bitkilerde, tuz ve hormon uygulamaları arasındaki ilişkinin anlaşılmasına katkı sağlaması beklenmektedir.

Abstract:
Plants are exposed to biotic and abiotic stresses in their lives. Salt stress is one of the abiotic stress factors that affects plant growth with development and reduces crop yield. Plant hormones are important for stress tolerance of plants. BR (brassinosteroid) is polyhydroxy-steroid phytohormone that play roles during plant growth and development. In this study, effects of salt stress and alleviation of homobrassinolid (HBL) hormone on these adverse effects on barley (Hordeum vulgare L. cv. Hilal) roots were investigated in terms of morphological, physiological, cytogenetic and molecular levels during 48 and  72 h at dark. In addition, evolutionary relationships between analysed genes and sequences of these genes in other plants were investigated with bioinformatics analyses. For this purpose,  barley seeds were germinated under solutions containing only salt stress (150 mM and 250 mM); only HBL hormone (0.5 µM and 1 µM) and salt + HBL between filter papers at 48 h and 72 h. Distile water was used for control group.

Germination percent of experimental groups were calculated, primer and seminal root lengths were measured and root  number from  each  seed  were  determined for morphological studies. Obtaining findings  were  evaluated with ANOVA statistical program by using SPSS 16.0. When compared to control, salt stress decreased germination percent, root lengths and root number. 
Only HBL applications enhanced root lengths and root number. As compared to only salt-treated samples, salt + HBL applications increased germination percent, root lengths and root number depending on timing and application concentration. 

Soluble protein content of experimental groups were determined and protein band profiles were compared with SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) in physiological studies. Moreover, SOD (superoxide  dismutase) and  CAT (catalase) enzyme activities of samples were also investigated. Results  were  evaluated with ANOVA statistical program by using SPSS 16.0. Salt applications decreased soluble protein content but increased enzyme activities both at 48 h and 72 h when compared to control. HBL  applications also decreased soluble  protein  content  and  increased  enzyme activities  especially  at  48  h. Difference in band profiles of experimental groups especially  at  48  h  was determined as a result of SDS-PAGE analyses. Increase or decrease was observed in soluble protein content and enzyme activities of salt + HBL-treated samples depending on concentrations and timing.

Mitotic index of samples (%) were calculated in cytogenetics studies. For each sample, experiments were performed at three times and 1000 cells were counted for each times. Although salt stress decreased, mitotic index of HBL-treated samples increased as compared to control. It was found that mitotic index enhanced in salt + HBL applications with increasing hormon concentration as compared to only salt-treated samples. 

Expressions of 8 different genes including abiotic stress related 7 genes (HvPIP1.1, HvPIP1.2, HvPIP1.3, HvPIP1.5, CYCD3, DREB2, WAK) and brassinosteroid related DWARF4 (DWF4) were investigated in molecular studies. Salt stress was decreased HvPIP1.2 and WAK genes' expressions but enhanced HvPIP1.3, DREB2 and DWARF4 expressions. Moreover, increase or decrease was observed in HvPIP1.2, HvPIP1.5 and CYCD3 expressions depending on concentration and timing. HvPIP1.1, HvPIP1.2, HvPIP1.3, HvPIP1.5 and DWARF4 expressions were up-regulated although we obtained different results (increase or decrease) in the expressions of CYCD3, DREB2 and WAK in only HBL-treated samples. As compared to control, salt + HBL treatments were increased HvPIP1.1, DREB2 and DWARF4 expressions but decreased HvPIP1.2. When compared to only salt-treated samples, salt + HBL applications increased only HvPIP1.1 expression although increase or decrease was observed in other genes' expression depending on concentrations and timing.

Partial sequences of these genes found in other plants were obtained from NCBI (National Center for Biotechnology Information)  and evolutionary relationships among these sequences were determined by using sequence similarity (clustal) and phylogenetic tree analyses. Oryza sativum showed similarity with HvPIP1.5. We concluded that CYCD3 could be diverge relatively earlier from cyclin genes during evolution because it was observed in distinct clade. DREB2 indicated sequence homology with Sorghum bicolor. Oryza australiensis and DWARF4 sequences were found in sister taxon located in the same clade in phylogenetic tree. It was determined that there were limited similarity among WAK sequences.  In addition, different studies related to expression of these genes especially carried on plants with similar sequences under abiotic stress were investigated and compared results obtained from this study. It was observed that different studies also reported similar findings.
Salt stress negatively affects barley growth and development. This thesis is the first detailed study related to alleviation  effects  of  HBL  on  salt  stressed  barley  root germination in terms of morphological, physiological, cytogenetics, molecular and bioinformatics. Obtaining results are expected to contribute to find out relationships between salt and hormone applications in barley and plants with similar sequences.