Hindi Karaciğerinden NADPH-Sitokrom P450 Redüktaz Enziminin Saflaştırılması, Karakterizasyonu ve Bazı Kimyasal Maddelerin Enzim Aktivitesi Üzerine Etkilerinin İncelenmesi
Purification and Characterization of NADPH Cytochrome P450 Reductase Enzyme from Turkey Liver and Investigation of The Effects of Some Chemical Substances on Enzyme Activity
Yazar: EBRU AKKEMİK
Danışman: PROF. DR. MEHMET ÇİFTCİ
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: İnhibisyon = Inhibition

Özet:
NADPH-Sitokrom P450 redüktaz (CPR; EC 1.6.2.4) enzimi detoksifikasyon metabolizmasında elektron transferini katalizleyen kilit bir enzimdir. Bu tez kapsamında CPR enziminin hindi karaciğer mikrozomlarından saflaştırılması için iki farklı yöntem kullanılmıştır. İlk yöntemde hindi karaciğer dokusundan elde edilen mikrozamal pelet emulgen kullanılarak çözündürülmüş ve 2?, 5?-ADP Sepharose 4B afinite kolonuna yüklenerek enzim %23,43 verimle 114,15 kat saflaştırılmıştır. İkinci yöntemde ise hindi karaciğer dokusundan elde edilen mikrozamal pelet emulgen kullanılarak çözündürülmüş DE52-Selüloz kolonuna ardından da 2?, 5?-ADP Sepharose 4B afinite kolonuna yüklenerek enzim %8 verimle 124 kat saflaştırılmıştır. Enzim saflığı her iki yöntemde de SDS-PAGE ile kontrol edilmiştir. Saflaştırılan enzimin karakteristik ve kinetik özellikleri tespit edilmiştir. Hindi karaciğer mikrozomlarından saflaştırılan NADPH-sitokrom P450 redüktaz enzim aktivitesi üzerine Ag+, Tl+, Cu+2, Zn+2, Cd+2, Hg+2, Co+2, Pb+2, Ni+2, Mn+2, Mg+2, Ca+2, Al+3 ve As+5 metal iyonlarının inhibisyon etkisi in vitro şartlarda araştırılmıştır. Ag+, Hg+2 ve Cu+2 metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerinde inhibisyon etkisi gösterdiği belirlenmiştir. İnhibisyon etkisi gösteren metal iyonları için IC50 değerleri sırasıyla 1,60, 13,52 ve 227 µM Ki sabitleri ve inhibisyon tipleri ise sırasıyla 0,02967±0,0067; yarışmalı, 10,37±2,24350; yarışmalı ve 251±108,6247; yarışmasız olarak tespit edilmiştir. Daha sonra çalışma kapsamında enzim aktivitesi üzerine oksitetrasiklin dihidrat, kanamisin sülfat, gentamisin sülfat, enrofloksasin, tiylosin, kloramfenikol, sefuroksim sodyum, sefazolin sodyum, amikasin sülfat, linkomisin HCl, seftriakson disodyum ve vankomisin HCl antibiyotiklerinin inhibisyon etkisi in vitro şartlarda araştırılmıştır.

Abstract:
NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR; EC 1.6.2.4) is the key enzyme that catalyzes the electron transfer in detoxification metabolism. Within the scope of this thesis, two different methods were used for purification of CPR enzyme from turkey liver microsomes. By the first method, the enzyme was solubilized by detergent from microsomal fraction of turkey liver and was purified 114.15 fold with a yield of 23.43% using 2?, 5?-ADP Sepharose 4B affinity column. By the second method, CPR was solubilized by detergent from microsomal fraction of turkey liver and was purified 124-fold with a yield of 8% using DE52-cellulose column and 2?, 5?-ADP Sepharose 4B affinity column. The purity of the enzyme was verified by SDS-PAGE in both methods. Characteristics and kinetic properties of the purified enzyme were determined. In addition, the effects of metal ions Ag+, Tl+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Hg2+, Co2+, Pb2+, Ni2+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Al3+ and As5+ on NADPH-cytochrome P450 reductase enzyme activities purified from turkey liver microsomes were investigated in in vitro conditions. IC50 value and Ki constants were calculated for the metals which show inhibition effects. It was determined that Ag+, Hg2+ and Cu2+ metal ions showed inhibitory effects on the enzyme activity. IC50 values were determined as 1.60, 13.52 and 227 µM respectively; Ki constants and inhibition types were found as 0.02967±0.0067; competitive, 10.37 ± 2.24350; competitive and 251±108, 6247 µM; noncompetitive for the metals which showed inhibitory effects. Then, in the scope of the study inhibitory effects of some antibiotics; oxytetracycline dihydrate, kanamycin sulfate, gentamicin sulfate, enrofloxacin, tiylosin, chloramphenicol, cefuroxime sodium, cefazolin sodium, amikacin sulfate, linkomisin HCl, disodium ceftriaxone and vancomycin HCl, on the enzyme activity were investigated in in vitro conditions.