Meropenem ile kaplı altın nanopartiküllerin antimikrobiyal ve sitotoksik etkisinin in vitro olarak araştırılması
Investigation of in vitro antimicrobial and cytotoxic effect of gold nanoparticles capped with meropenem
Yazar: NURULLAH ÇİFTÇİ
Danışman: PROF. DR. UĞUR ARSLAN
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Altın = Gold ; Hücre kültürü = Cell culture ; Karbapenemler = Carbapenems ; Meropenem = Meropenem ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Sitotoksinler = Cytotoxins ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; İn vitro = In vitro

Özet:
Karbapenemler en geniş spektrumlu B- laktam grubu antibiyotiklerdendir ve çoklu ilaç direncine sahip Gram negatif/pozitif aerob/anaerob bakterilere karşı etkili bir şekilde kullanılmaktadır. Bu antibiyotikler klinisyenler tarafında son çare ilaç olarak kullanılmaktadır. Antimikrobiyal ajanların biyolojik olarak çözünen ve biyo uyumlu nanoparçacıklar ile kapsüllenmesi, zamana bağlı kontrollü ilaç salınımına imkan sağlayabilir. Böylece, ilacın hem dolaşımdaki yarı ömrü arttırabilir hem de ilacın daha yüksek konsantrasyonlarda enfeksiyon bölgesinde bulunmasını sağlayabilir. Bu çalışmada karbapenem grubu antibiyotiklerden meropenemi altın nanopartiküllerin yüzeyine bağlayarak karbapenem direncine sahip Acinetobacter baumanii ve Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus spp, S. marcessens ve Pseudomonas aeruginosa suşlarına karşı in vitro ortamda etkinliğini ve yapacağımız hücre kültürü çalışması ile de sitotoksik etkisinin araştırılması amaçlanmaktadır. 
	Altın nanopartiküllerin sentezi Turkevic yöntemine göre indirgeyici ajan olarak trisodyum sitrat kullanılarak yapıldı. Trisodyum sitrat oranına bağlı olarak farklı boyutlarda nanopartikül sentezi gerçekleştirildi. Sentezlenen nanopartiküllerin karakterizasyonu Uv-vis Spektrofotometre ve TEM mikroskobu kullanılarak yapıldı. Meropenem ile kaplı altın nanopartiküllerin antimikrobiyal etkileri sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile yapıldı. Hücre kültürü çalışmaları Alamar Blue ile Sitotoksisite Tayini yöntemine göre yapılmıştır. Çalışmamız CCD18Co (ATCC CRL-1459) insan sağlıklı kolon epitel hücre hatları kullanılarak yapıldı.
Bu çalışmada, 1 Ocak 2020-31 Aralık 2021 tarihleri arasında Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji laboratuvarına gönderilen kültür örneklerinden izole edilen 20 A. baumannii, 20 K. pneumoniae, 20 P. aeruginosa, 20 E. coli, 20 Proteus spp.  ve iki Serratia spp suşları ve ATCC 700603 K. penumoniae ve ATCC 25922 E. coli suşları dahil toplam 104 suş çalışmaya dahil edilmiştir. 2,5 ml tri sodyum sitrat ile sentezlenen altın nanopartiküllerin boyutu 10,92 nm, 5 ml trisodyum sitrat ile hazırlanan altın nanopartiküllerin boyutu 25,98 nm ve 10 ml trisodyum sitrat ile hazırlanan altın nanopartiküllerin boyutu 36 nm olarak hesaplandı. Meropenem bağlanma konsantrasyonu 2,5 ml trisodyum sitrat ile hazırlanan örnekte meropenem konsantrasyonu 0,964 (%73,5) 5 ml trisodyum sitrat ile hazırlanan örnekte 0,938 (%71) ve 10 ml trisodyum sitrat ile hazırlanan örnekte bağlanma konsantrasyonu 0,804 (%61) olarak hesaplanmıştır. İncelediğimiz çoklu ilaç direncine sahip 20 A. baumannii, 20 K. pneumoniae ve 20 P. aeruginosa suşlarında hem saf meropenemlere karşı hemde mem+AuNP kombinasyonlarına karşı herhangi bir antimikrobiyal etki saptanmadı. İncelediğimiz E. coli ve Proteus spp. ve S. marcessens suşlarında mem+NPS kombinasyonunun meropeneme göre daha etkili olduğu ve 10-20 nm boyutundaki nanopartiküllerin diğerlerine kıyasla daha etkili olduğu saptandı. Yaptığımız çalışmadan da anlaşılacağı üzere altın nanopartiküllerin meropenem ile kaplanmasının hücre canlılığı üzerine olumsuz etkilerinin olmadığı, ancak yüksek konsantrasyonlarda hücreler üzerinde sitotoksik etki yarattığı saptandı.
Sonuç olarak, nanopartiküllerin antibiyotikler ile kaplanarak etkinliğinin arttırılması bakteriyel enfeksiyonların tedavisi açısından önem arz etmektedir. Ancak, bizim çalışmamız ve literatürdeki diğer çalışmalar in vitro koşullarda nanopartiküllerin etkinliklerini incelemek üzere hazırlanmıştır. İn vitro ve in vivo etki farklı olabilmektedir. Bu nedenle bu etkinin hayvan deneyleri veya insanlar üzerinde in vivo çalışmaları yapılarak etkinliklerinin değerlendirilmesi önem arzetmektedir.

Abstract:
Carbapenems are among the broad-spectrum B-lactam group antibiotics and are used effectively against Gram-negative/positive aerobic/anaerobic bacteria with multi-drug resistance. These antibiotics are used by clinicians as drugs of last resort. Encapsulation of antimicrobial agents with biodegradable and compatible nanoparticles may allow time-dependent controlled drug release. Thus, it can both increase the circulating half-life of the drug and provide higher concentrations of the drug at the site of infection. In this study, meropenem, which is one of the carbapenem group antibiotics, binds to the surface of gold nanoparticles, and its efficacy in vitro against carbapenem resistant Acinetobacter baumanii and Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus spp, S. marcessens and Pseudomonas aeruginosa strains.
	The synthesis of gold nanoparticles was carried out according to the Turkevic method using trisodium citrate as a reducing agent. Depending on the trisodium citrate ratio, different sizes of nanoparticles were synthesized. The characterization of the synthesized nanoparticles was performed using UV-vis Spectrophotometer and TEM microscope. Antimicrobial effects of gold nanoparticles coated with meropenem were performed by broth microdilution method. Cell culture studies were performed according to the Cytotoxicity Assay method with Alamar Blue. Our study was performed using CCD18Co (ATCC CRL-1459) human healthy colon epithelial cell lines.
	In this study, 20 A. baumannii, 20 K. pneumoniae, 20 P. aeruginosa, 20 E. coli, 20 Proteus spp. and two Serratia spp strains and ATCC 700603 K. penumoniae and ATCC 25922 E. coli strains were included in the study. The size of gold nanoparticles synthesized with 2.5 ml of tri sodium citrate was calculated as 10.92 nm, the size of gold nanoparticles prepared with 5 ml of trisodium citrate was calculated as 25.98 nm and the size of gold nanoparticles prepared with 10 ml of trisodium citrate was calculated as 36 nm. Meropenem binding concentration was calculated as 0.964 (73.5%) in the sample prepared with 2.5 ml trisodium citrate, 0.938 (71%) in the sample prepared with 5 ml trisodium citrate and 0.804 (61%) in the sample prepared with 10 ml trisodium citrate. . No antimicrobial effect was detected against both pure meropenems and meme+AuNP combinations in 20 A. baumannii, 20 K. pneumoniae and 20 P. aeruginosa strains with multidrug resistance. The E. coli and Proteus spp. and S. marcessens strains, the combination of mem+NPS was found to be more effective than meropenem, and nanoparticles with a size of 10-20 nm were more effective than the others. As it can be understood from our study, it was determined that the coating of gold nanoparticles with meropenem did not have negative effects on cell viability, but it had a cytotoxic effect on cells at high concentrations.
	As a result, increasing the efficiency of nanoparticles by coating them with antibiotics is important for the treatment of bacterial infections. However, our study and other studies in the literature were prepared to examine the activities of nanoparticles in vitro. The in vitro and in vivo effect may be different. For this reason, it is important to evaluate the effectiveness of this effect by performing animal experiments or in vivo studies on humans.