Kafes kuşlarında tüberküloza neden olan etkenlerin kültür ve moleküler yöntemlerle teşhisi
Diagnosis of avian tuberculosis in cage birds by culture and molecular techniques
Yazar: NİHAN ALTINSOY DUYGU
Danışman: DOÇ. DR. BARIŞ SAREYYUPOĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Hayvan hastalıkları = Animal diseases ; Kuşlar = Birds ; Mycobacterium = Mycobacterium ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Tüberküloz = Tuberculosis

Özet:
Kanatlı mikobakteriyozisi dünya çapında önemli bir hastalık olmakla birlikte, hastalığın tanısı oldukça zahmetli ve zordur. Bu çalışmada, farklı cins kuşlardan alınan organ ve dışkı örnekleri kültür ve Ziehl Neelsen boyama (Z-N) ve moleküler teknikler ile tüberküloz yönünden değerlendirildi. Kültür için 4 farklı besiyeri (Gliserollü Löwenstein-Jensen, ADC ile zenginleştirilmiş Middlebrook 7H9 buyyon, OADC içeren Middlebrook 7H10 ve 7H11 agar) kullanılarak M. avium subsp. avium için deteksiyon limiti tespit edildi ve tez materyalleri etken izolasyonu bakımından değerlendirildi. Tüm örneklere aside-dirençli boyama metodu olarak Z-N tekniği uygulandı. Moleküler çalışmalar kapsamında mikobakteriler için deteksiyon limiti belirlendi, hazırlanan yapay kontamine örnekler ve tez materyalleri internal kontrol primerleri ve nested PCR ile incelendi.Bu çalışma kapsamında 19 farklı cinse ait 214 kuştan elde edilen toplam 197 dışkı ile 51 organ kanatlı mikobakteriyozisi yönünden incelendi. Tüberküloz yönünden incelenen 22 kuşun nekropsisinde herhangi bir lezyona rastlanmadı. Toplam 248 materyalde, Ziehl-Neelsen boyama ile aside dirençli bakteri saptanmazken, dört farklı besiyerine yapılan ekimler sonucunda herhangi bir mikobakteri izolasyonu yapılmadı. Deteksiyon limiti tayini için yapılan çalışmada limit 10-100 bakteri olarak belirlendi. Moleküler çalışmalar öncesi gerçekleştirilen optimizasyonda, inhibitörlerin test sonuçlarına etkisi araştırıldı. Tez materyallerinden yapılan ilk PCR sonucunda mikobakteri DNA'sı saptanmazken, nested primerleri ile gerçekleştirilen prosedür sonucunda 5 örnek (farklı ispinozlara ait 1 dışkı ve 4 karaciğer) Mycobacterium spp. yönünden pozitif bulundu. M. avium subsp. avium primerleri ile yapılan bir diğer nested PCR ile 4 örneğin (farklı ispinozlara ait 1 dışkı ve 3 karaciğer) M. avium subsp. avium, 1 örneğin (ispinoz karaciğeri) ise M. avium subsp. avium'dan farklı bir mikobakteri türü olduğu tespit edildi.Sonuç olarak, kanatlı mikobakteriyozisi yönünden incelenen örneklerden boyama ve kültür çalışmaları ile tüberküloz etkenleri tespiti yapılamazken, aynı örneklerden beş tanesinde PCR ve nested PCR ile mikobakteriyel DNA tespit edildi. Uygun ekstraksiyon yöntemi seçiminin klinik ve nekropsi örneklerinde bulunan inhibitörlerin elimine edilmesi bakımından önemli olduğu ve internal kontrol kullanımının yanlış negatif sonuçların önüne geçtiği belirlendi. Tüberkülozun özellikle antemortem teşhisi için, moleküler tekniklerin özgüllük ve duyarlılığı optimizasyon çalışmaları ile gösterildi. Ayrıca hastalığın hem hayvan hem de insan sağlığı açısından zoonotik potansiyeli değerlendirilerek kuş üretici, yetiştirici ve bakıcılarının hastalık hakkında bilgilendirilmesi gerektiği sonucuna varıldı.

Abstract:
Avian mycobacteriosis is a worldwide important disease and diagnosis of the disease is very laborious and difficult. In this study, tissue and fecal samples obtained from different genuses of birds were investigated for the presence of tuberculosis by culture, Ziehl-Neelsen stain (Z-N) and molecular techniques. Four different culture media (Löwentein-Jensen [L-J] with glycerol, Middlebrook 7H9 broth supplemented with ADC, Middlebrook 7H10 agar with OADC and Middlebrook 7H11 with OADC) were used to determine the detection limit for M. avium subsp. avium, and thesis materials were investigated with these culture media in terms of mycobacteria isolation. All samples were investigated with Ziehl-Neelsen (Z-N) technique as acid-fast staining method. Detection limit for mycobacteria was determined within molecular studies. Artifically contaminated samples and thesis materials were investigated with internal control primers and nested PCR.Within the scope of this study 197 stool and 51 organ samples obtained from 214 birds belonging to 19 different genuses were examined for avian tuberculosis. No evidence of any lesions in necropsy of 22 birds was examined in terms of tuberculosis. Acid fast bacteria have not been identified with Ziehl-Neelsen stain, and mycobacterial isolations have not been made in any of the four different culture media from a total of 248 materials. Detection limit was identified as 10-100 bacteria. The effect of the inhibitors was investigated in the optimization studies carried out before the molecular tests. While no mycobacterial DNA was detected after the initial PCR, by the help of the nested primers included to the procedure, 4 samples were detected to be positive for Mycobacterium spp. Another nested PCR made with M. avium subsp. avium primers, detect 5 (1 stool and 4 liver from different finches) sample as M. avium subsp. avium and 1 (finch liver) sample detected as a mycobacterium other than M. avium subsp. avium.As a conclusion, while no mycobacterium was identifed with stain and culture studies from samples those have been surveyed for avian mycobacteriosis, mycobacterial DNA was detected from 5 samples with nested PCR. It has been determined that selection of appropriate extraction method is important for the elimination of inhibitors in clinical and necropsy samples and inclusion of internal controls to the overall investigation procedure could prevent the false negative results. The specificity and sensitivity of moleculer techniques used especially for antemortem diagnosis were determined in the optimization studies. It is concluded that, manufacturers, bird breeders and bird sitters should be informed about the disease and its zoonotic potential threating of both animal and human health.