Fasulye bitkisinde (Phaseolus vulgaris L.) partikül bombardımanı (biyolistik) yöntemiyle gen aktarımının optimizasyonu
Optimization of regeneration and transformation conditions for common bean (Phaseolus vulgaris)
Yazar: MUSTAFA ÇEVRİM
Danışman: Y.DOÇ.DR. MİKAİL AKBULUT
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmanın temel amacı, OBİTEK ve ODTÜ ortaklığıyla üretilen YELEPE 03Partikül Bombardıman sistemi kullanılarak fasulyede (Phaseolus vulgaris) partikülbombardımanı metoduyla transformasyon ve rejenerasyon şartlarının optimizeedilmesidir.Rejenerasyon şartlarının optimizasyonu bitkilerde genetik transformasyonun başarısıiçin gereklidir. Bununla birlikte baklagillerin rejenerasyonu hala zordur ve özellikledane baklagillerin inatçı olduğu düşünülmektedir.Rejenerasyona en yi cevap veren genotipi tespit etmek amacıyla doku kültürüçalışmalarında, 9 farklı Türk fasulye kültüvarı (Eskişehir-855, Şahin-90, Yunus 90,Önceler, Aras, Akdağ, Göynük 98, Zülbiye ve Akman-98) kullanılmıştır. Doku kültürüçalışmalarında Standart MS-Gamborg ortamı kullanılmıştır. Kazein, glutamin ve STSAgNO3'ün doku kültürü ortamına eklenmesi rejenerasyon şartlarını önemli derecedeiyileştirmiştir. Çeşitli sitokininlerin farklı konsantrasyonları (benzylaminopurine,thidiazuron, kinetin ve zeatin ribozid) ve onların çeşitli kombinasyonları embriyonikuçlardan çoklu sürgün uyarımı için kullanılmıştır. Test edilen sitokininler arasında 5mg/L BAP , 0,5 mg/L TDZ, 1 mg/L Kinetin, 0,5 mg/L zeatin ribosid kombinasyonuçoklu sürgün uyarımı için (eksplant başına 12 sürgün) en iyi bulunmuştur.Direk transformasyon metotları inatçı bitkilerin Agrobacterium yoluylatransformasyonuna nazaran daha avantajlıdır. Partikül bombardımanı fasulyede şimdiyekadar uygulanmış gen aktarım metotları arasında yegane başarı sağlamış yöntemdir.Türkiye'de yaygın tarımı yapılan fasulye kültüvarlarında transformasyon etkinliğinioptimize etmek amacıyla üç farklı basınçla atış (30,35,40 bar), üç farklı negatif çemberbasıncı (-720,760,800 mmHg), iki farklı mikroprojektil uçuş mesafesi (9 ve 12 cm), ikifarklı transfeksiyon ve DNA sarıcı ajan (spermidine ve lipofektamin), iki farklımikroprojektil (altın, tungsten) ve iki farklı DNA konsantrasyonu (1 ve 2 mg/ml)denenmiştir. Akman kültüvarı rejenerasyona en iyi cevabı verdiğinden dolayıtransformasyon çalışmaları boyunca kullanılmıştır. Transformasyonun etkinliği geçiciGUS aktivitesine bakılarak belirlenmiştir. GUS ifadesinin odakları her muamele için 10embriyoda sayılmıştır. Denemeler arasındaki önemlilik farklarını belirlemek içinANOVA uygulanmıştır.Transformasyon etkinliği aşağıdaki parametreler uygulandığında en iyi bulunmuştur:1. 35 bar atış basıncı2. -760 mmHg kabin basıncı3. 9 cm atış mesafesi4. 2 ?g/ ?l DNA konsantrasyonu5. Mikroprojektil olarak tungsten6. DNA çöktürücü ajan olarak spermidin7. Petri başına 6 atışAnahtar Kelimeler: Fasulye, Partikül Bombardımanı, Doku kültürü, Gen Aktarımı,GUS .

Abstract:
Main purpose of this study was to optimize regeneration and particle bombardmentbased transformation conditions for common bean (Phaseouls vulgaris L.) by usingYELEPE 03 particle bombardment system produced by OBİTEK and ODTÜconsortium.Optimization of regeneration conditions is important for successful transformation ofplants. Regeneration of grain legumes is still difficult and especially grain legumes areconsidered to be recalcitrant.In tissue culture studies, nine different Turkish common bean cultivars (Eskişehir-855,Şahin-90, Yunus-90, Önceler, Aras, Akdağ, Göynük-98, Zülbiye ve Akman-98) wereused to determine the best responding genotypes. Standart MS-Gamborg medium wasused throughout the tissue culture study. Use of casein, glutamine and STS-AgNO3dramatically improved the regeneration conditions. Different concentrations of variouscytokinins and their combinations (benzylaminopurine, thidiazuron kinetin and zeatinriboside) were used for multiple shoot induction from embryo axes. Among the testedcytokinins, 5 mg/L BAP, 0,5 mg/L TDZ, 1 mg/L Kinetin, 0.5 mg/L zeatin ribosidecombination was found to be optimum (12 shoot per embryo axes) for multiple shootinduction.Direct transformation methods have advantage over Agrobacterium mediatedtransformation of recalcitrant plants. Particle bombardment is the only successfulmethod which has been applied to genetic transformation of common bean so far. Toimprove transformation efficiency in Turkish common bean cultivars, three differentshooting pressure (30, 35, 40 bar), three different negative chamber pressure (-720,-760,-800 mmHg), two different microprojectile flying distance (9, 12 cm), two differenttransfection and DNA precipitating agent (spermidine and lipofectamine), two differentmicroprojectile (gold and tungsten) and two different DNA concentrations (1 and 2mg/l) have been utilized to optimize the transformation efficiency. Since Akmancultivar was the best responding genotypes for regeneration, it was used throughout thetransformation studies. Transformation efficiency was determined according to numberof transient GUS expressing foci. ANOVA was carried out to determine the significanceof difference among the means of treatments.Transformation efficiency was best when the following parameters were used:1. 35 bar shooting pressure2. -760 mmHg chamber pressure3. 9 cm shooting distance4. 2 ?g/ ?l DNA concentration5. Tungsten as a microprojectile6. Spermidine as a DNA precipitating agent7. 6 shoot per plateKeywords: Common bean, particle bombardment, tissue culture, hygromycin, GUS.