Termofilik bakterilerden lipaz üreticisi suşların belirlenmesi, enzimin saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulanabilirliğinin araştırılması
Determination of lipase producer from thermophilic bacteria and purification of enzyme, characterization and investigation of biotechnological applicability
Yazar: İKRA ÖZKAN
Danışman: PROF. DR. AHMET ADIGÜZEL
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Amaç: Termofilik koşullardan sıcak su kaynaklarından temin edilen su ve çamur örneklerinde gelişim gösteren bakteri suşlarının izolasyonun yapılması; bu suşlar içerisinden yüksek derecede lipaz üretimini yapan suşun belirlenip, bu test suşunun identifikasyon ve moleküler karakterizasyonun yapılması lipaz üreten suşun belirlenip, lipaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyoteknoloji alanında uygulanabilirliği amaçlanmıştır.
Yöntem: Erzurum Ilıca termal kaplıcasından alınan su ve çamur örneklerinden 11 adet termofilik bakterinin izolasyonu gerçekleştirildi. Daha sonra bu suşlardan en iyi lipolitik aktivite gösteren IO3 izolatı seçilerek, identifikasyon aşamasına geçildi. Yapılan konvensiyonel analizler sonucunda, test suşunun %2-4 tuz konsantrasyonunda, pH: 7,0-9,0'da ve 45-55°C sıcaklık değerlerinde iyi gelişebildiği, katalaz, endospor, gram, oksidaz pozitif, hareketli ve çubuk hücre morfolojisine sahip olduğu tespit edildi. 16S rRNA sekans analizi sonucunda test izolatının, %99 oranında Aeribacillus pallidus'a benzerlik gösterdiği belirlendi. Daha sonra IO3 suşundan, ekstraselüler olarak sentezlenen lipaz enzimi iki farklı strateji ile saflaştırıldı ve biyokimyasal karakterizasyonu yapıldı.
Bulgular: İlk aşamada enzim, geleneksel saflaştırma metotları olan amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değişim ve jel filtrasyon kromatografisi yöntemleri ile %3,18 verimle 9,3 kat saflaştırıldı. İkinci aşamada ise, biyomoleküllerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için kullanılan yeni bir yöntem olan üçlü faz ayırma (TPP) sistemi ile %38,79 verimle, 1,54 kat saflaştırıldı. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile yaklaşık 33,88 kDa, optimum pH'sı 8,0 ve sıcaklık değeri ise, 50°C olarak belirlendi. Enzimin 20-80°C'lik sıcaklık değerleri arasında ve 120 dakikalık inkübasyon süresi sonunda, özellikle 70 ve 80°C sıcaklık değerlerinde kararlılığını sırasıyla; %69 ve %45 oranında muhafaza ettiği tespit edildi. A. pallidus IO3'ten saflaştırılan lipaz enziminin aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde; Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+ iyonları varlığında enzimin aktivitesini artırdığı gözlemlenirken; Li+ ve Cu2+ iyonları varlığında ise, enzimin kararlılık sergilediği gözlemlendi. Enzimin aktivitesini yüzey aktif maddelerin varlığında yüksek oranda artırdığı, organik çözücülerden kloroform varlığında ise, aktivitesinde %22 ve %338 oranında artış gösterdiği tespit edildi. Enzim, en yüksek aktiviteyi paranitrofenol palmitat subsratı için gösterdi. Lipaz enziminin DNTB, IAA ve EDTA ile tamamen inhibe olduğu belirlendi. β-Merkaptaetanol varlığında ise enzimin aktivitesini düşük seviyede koruduğu gözlemlendi. Bu enzim için Km ve Vmax değerleri sırasıyla 2,75 mM ve 30,77 µmol.mL-1.dk-1 olarak hesaplandı.
Sonuç: Elde edilen enzimin sıvı ticari deterjanlarda aktivitesini koruduğu ve bitkisel kaynaklı lekeleri tamamen, hayvansal nitelikli yağlarla kontamine olmuş kumaş yüzeylerini ise, kısmen temizlediği gözlemlendi.
Anahtar Kelimeler: Termofilik Bakteri, İzolasyon, İdentifikasyon, Lipaz, Saflaştırma, Enzim Karakterizasyonu.

Abstract:
Purpose: Isolation of bacterial strains developing in water and mud samples obtained from hot water sources from thermophilic conditions; The purpose of this study was to determine the strain producing high levels of lipase from these strains, identification and molecular characterization of this test strain.
Method: In this thesis study; isolation of 11 thermophilic bacteria from the water and sludge samples obtained from the Erzurum Ilıca thermal spring were performed. Then, the IO3 isolate showing the best lipolytic activity among these strains was selected and the identification stage was started. As a result of conventional analyzes performed, it was determined that the test strain can develop well at 2-4% salt concentration, pH: 7.0-9.0 and 45-55 °C temperature values, it is catalase, endospore, gram and oxidase positive and it has mobile and rod cell morphology. As a result of 16S rRNA sequence analysis, it was designated that the test isolate was 99% similar to Aeribacillus pallidus. Afterwards, lipase enzyme synthesized extracellularly from strain IO3 was purified by two different strategies and biochemical characterization was performed.
Findings: In the first stage, the enzyme was purified 9.3 fold with 3.18% yield by traditional purification methods, which are ammonium sulfate precipitation, ion exchange and gel filtration chromatography. In the second stage, it was purified 1.54 fold with 38.79% yield by a three-phase separation (TPP) system, which is a new method used for extraction and purification of biomolecules. It was found that the molecular mass of the enzyme determined with SDS-PAGE is approximately 33.88 kDa, optimum pH of the enzyme is 8.0 and optimum temperature of the enzyme is 50°C. It was determined that the stability of the enzyme at temperatures between 20-80°C and at the end of the 120 minute incubation period was preserved especially at 70 and 80°C with 69% and 45%, respectively. When the effect of metal ions on the activity of lipase enzyme purified from A. pallidus IO3 was examined, it was observed that while the enzyme increased its activity in the presence of Fe2+, Fe3+, Cu2+ and Zn2+ ions, the enzyme exhibited stability in the presence of Li+ and Cu2+ ions. It was found that the enzyme increased its activity in the presence of surface active agents and increased its activity by 22% and 338% in the presence of chloroform which is a organic solvent. The enzyme showed the highest activity for the paranitrophenol palmitate substrate. It was determined that the lipase enzyme was completely inhibited by DNTB, IAA and EDTA. In the presence of β-mercaptaethanol, it was observed that the enzyme maintained its activity at a low level. Km and Vmax values for this enzyme were calculated as 2.75 mM and 30.77 µmol.mL-1.min-1, respectively.
Results: It was observed that the enzyme obtained retains its activity in liquid commercial detergents and partially cleans the fabric surfaces that are contaminated with vegetable oils and partially contaminated with animal oils.
KeyWords: Thermophilic Bacteria, Identification, Isolation, Lipase, Purification, Characterization of Enzyme.