Yemlik soyada GDO analizi ve tuz stresi altında genomik analizler
GMO analysis and genomic analysis under salinity stress in feeder soybean
Yazar: OLCAY ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. ŞULE ARI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Küresel nüfusun hızlı artışıyla beraber değişen iklim koşullarındaki olumsuzluklar, su kaynaklarının ve tarımı yapılabilecek arazilerin azalması, artan nüfusun güvenilir ve sürdürülebilir şekilde beslenmesini zorlaştırmıştır. Birim alandan elde edilen verimin artırılması gerekliliği, modern biyoteknoloji yöntemleri sayesinde ürün bitkilerine böceklere, herbisit ve pestisitlere direnç, çevresel stres koşullarına karşı tolerans gibi özelliklerinin kazandırılmasıyla büyük oranda karşılanmıştır. 1996'da ilk defa ticarileştirildiklerinden günümüze kadar ekim alanları ve kullanımları hızlı bir şekilde artan genetiği değiştirilmiş (GD, transgenik) bitkilerin, ürün verimini %22 ve çiftçi kârını %68 artırdığı, kimyasal böcek ilacı kullanımını %37 azalttığı belirlenmiştir. Genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) ın insan, hayvan ve bitki sağlığı açısından güvenlik değerlendirmelerine tabi tutulmaları zorunludur. Ancak mevcut risk değerlendirme yöntemleri, genetik transformasyona bağlı olarak GD organizmaların genomlarında meydana gelen ya da gelebilecek "beklenmeyen etkiler"in belirlenebilmesi için yeterince ayrıntılı bilgi vermemektedir. Genom analizlerine dayalı araştırmalar tarımı yapılan GD bitkilerde biyotik ve abiyotik stres gibi belirli koşulların "beklenmeyen etkiler"in sıklığını artırabileceği göstermiştir.

 
Bu tez çalışmasında GD organizmaların genomunda "beklenmeyen etkiler"in araştırılması amacıyla yemlik GD soyaların tuz stresi koşullarında gen anlatımı ve transpozon hareketliliği analizleri gerçekleştirildi. Türkiye Yem Sanayicileri Birliği'nden temin edilen ithal yemlik soyalarda 35S promotor ve Nos terminatör bölgelerinin belirlenmesine yönelik bulk Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) analizi ile GDO taraması yapıldı. GD oldukları saptanan soyaların transgen çeşidinin belirlenmesi için, ilk ticari transgenik soya çeşidi olan ve halen günümüzde dünya genelinde en yaygın ekimi yapılan Roundup Ready Soya (RRS) nın içerdiği EPSPS gen bölgesine özgü primerler kullanılarak PZR analizi yapıldı, %20 sinin Roundup Ready diğer adıyla GTS-40-3-2 olduğu belirlendi. İthal yemlik soyalar ve İstanbul Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik GDO laboratuvar stoğunda bulunan, tez çalışmasında kontrol olarak kullanılan yerli soyalar 14 gün boyunca tuz stresine (80mM, 120mM, 160mM, 200mM) maruz bırakıldı. Süre sonunda denenen farklı tuz konsantrasyonlarından 120mM'ın, her iki gruptaki bitkilerin görünümünde yarattığı etkiler bakımından eşik değer olduğu tespit edildi. Kontrol ve tuzlulukta yetiştirilen 14 günlük bitkilerin yapraklarından EPSPS geninin anlatım analizi Gerçek Zamanlı (RT) PZR ile yapıldı. Analiz sonucunda, sadece 120mM tuz konsantrasyonuna maruz kalmış iki bitki RR soya olarak belirlendi. Bu nedenle kontrol ile farklı tuz konsantrasyonlarında yetiştirilen bitkilerde EPSPS geninin anlatım farklılığı karşılaştırılamadı. Tuzluluğun, GD organizmaların genomunda meydana getirebileceği "beklenmedik etkiler"den, transpozon hareketliliğinin analizine yönelik olarak 14 gün tuz stresine maruz bırakılan yerli ve 120mM tuz stresinde yetişmiş GD soyalarda SIRE1 retrotranspozonu için IRAP (Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism) PZR yapıldı. SIRE1 için tuz stresi altında yetiştirilen bitkiler arasındaki polimorfizm oranı %0-90 oranında bulundu. Bu sonuçlara göre SIRE1 retrotranspozonunun tuzluluk stresi altında hareket ettiği düşünüldü. GD soyada ise kontrole göre SIRE1 retrotranspozonunun hareketliliğine bağlı olarak %33 polimorfizm artışı gözlendi. 
Bu tez çalışmasından elde edilen sonuçlar, çevresel stres koşullardan biri olan tuzluluğun transpozon hareketliliğini artırmak yoluyla GD bitkilerin genom organizasyonlarını etkileyebileceğini gösterdi. Bu durum, GD organizmaların genomlarında meydana gelen "beklenmedik etkiler"in daha ayrıntılı bir biçimde araştırılmasının, ticari GD'lerin tarımda sürdürülebilirlikleri bakımından önemli olduğunu düşündürmüştür.

Abstract:
With the rapid increase in the global population, the negativities in the changing climate conditions, the decrease of water supplies and the agricultural terrains have made difficult to feed the growing population reliably and sustainably. By means of biotechnology methods, the necessity to increase the efficiency obtained from the unit area have been met by transferring some traits such as resistance to insects, herbicides and pesticides and tolerance to environmental stress conditions to crop plants. It is determined that transgenic plants whose cultivation areas and uses have been increased rapidly because they have been commercialized for the first time in 1996, have decreased the use of insecticides by 37% and increased the yield by 22% and profit of farmers by 68%.  Genetically modified organisms (GMOs) are subject to safety assessments for human, animal and plant health. However, current risk assessment methods cannot provide detailed information to determine the "unexpected effects" that occurred in genomes of GD organisms due to genetic transformation. Genome-based studies have shown that under certain conditions such as biotic and abiotic stress, the frequency of "unexpected effects" may increase.
In this thesis, so as to study the unexpected effects on the genome of GD organisms, gene expression, and transposon mobility analyzes were carried out under the conditions of salt stress in feed GM soybeans. First, GMO screening was performed with bulk Polymerase Chain Reaction (PCR) for the determination of 35S promoter and Nos terminator regions of imported feeding soybeans supplied by Feed Industrialists Association of Turkey. In order to determine the transgene events of the soybeans identified as GM, PCR analysis was performed by using primers specific to the EPSPS gene region which was the first commercial transgenic soybean event and still present today, the most common commercial event, Roundup Ready soybean (RRS). It was determined that 20% of feed soybeans were Roundup Ready (GTS-40-3-2). Domestic (as control) and imported feed soybeans that are found in the stock of Istanbul University Molecular Biology and Genetic GMO laboratory, were subjected to salt stress for 14 days. At the end of this period, it was determined that 120mM from different salt concentrations tested was the threshold value in the appearance of the plants in both groups. Expression analysis of EPSPS gene which is included in RR soybean event was performed by using qPCR on the 14th day of salt stress or control. As a result of the analysis, two out of these plants exposed to the salt strees (120 mM concentration) were determined as RR event soybean. Therefore, the expression differences of plants exposed to different concentration of salt stress could not be compared with the control group which relies on the differences on EPSPS gene. 
In order to analyze the transposon mobility from the unexpected effects of salinity on the genome of GMOs, IRAP (Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism) PCR was performed for SIRE1 retrotransposon in domestic and transgenic soybean (Both of them were exposed to 120mM salt stress for 14 days). For SIRE1 the ratio of polymorphism among the plants which are grown under salt stress found to be 0-90%. Compared to control, depending on the mobility of SIRE1 retrotransposon on GM plants, 33% increase in polymorphisim was observed. These results showed that salinity as an environmental stress condition can affect commercial GM plants. The results from this study revealed the importance of investigating the unexpected effects of the genomes of GMOs in more detail in terms of their sustainability in agriculture.