Kayseri yöresinde yaygınlık gösteren hamam böceklerinin (ınsecta: blattarıa) filogenetik karakterizasyonu ve medikal önemi olan parazitler yönünden vektörlük potansiyellerinin belirlenmesi
The phylogenetic characterization of cockroaches (insecta: blattaria) in Kayseri region and determination of their vector potential for medically important parasites
Yazar: FATMA CEVAHİR
Danışman: DOÇ. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Barkod = Barcode ; DNA = DNA ; Filogenetik = Phylogenetic ; Hamam böcekleri = Cockroaches ; Insecta = Insecta ; Kayseri = Kayseri ; Parazitler = Parasites ; Vektör böcekler = Insect vectors

Özet:
Bu çalışma, Kayseri yöresinde yaygınlık gösteren hamam böceği türlerinin mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (mt-COI), mt-COII ve internal transcribed spacer-2 (ITS-2) gen bölgeleri bazında filogenetik karakterlerinin ortaya konulması ve medikal öneme sahip paraziter etkenler yönünden mekanik vektörlük potansiyellerinin belirlenmesi amacıyla gerçekleştirilmiştir. Çalışmada hastane, çeşitli gıda işletmeleri ve evlerden toplanan hamam böceği örnekleri uygun koşullarda laboratuvara intikal ettirilmiştir. Genotiplendirme ve filogenetik analizler için toplam 220 hamam böceği örneğinden bireysel genomik DNA (gDNA) izolasyonu yapılmıştır. DNA ekstraksiyonunu takiben izolatların moleküler tür identifikasyonları için small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) geninin 1,775 bp kısmı PCR'da amplifiye edilmiş ve AvaI ile EciI enzimleriyle RFLP analizleri gerçekleştirilmiştir. PCR-RFLP sonuçlarına göre tür bazında gruplandırılan hamam böceği örneklerinin filogenetik analizleri için mt-COI, mt-COII ve ITS-2 DNA barkod bölgeleri standart primerlerle amplifiye edilmiştir. Elde edilen amplikonlar saflaştırıldıktan sonra PCR primerleri ile çift yönlü olarak sekanslanmıştır. Sekans kromotogramları De Novo Assemble üzerinden işlenerek izolatlara ait konsensüs sekanslar elde edilmiştir. İlgili sekanslar GenBank veri tabanında Blastn analizlerine tabii tutularak moleküler identifikasyonları sağlanmış ve filogenetik analizler için elde edilen izolatlara ait sekansla birlikte dünyanın farklı ülkelerinden GenBank veri tabanına kaydedilmiş izolatları içeren data setleri oluşturulmuştur. Data setler içerisinde haplotip çeşitliliği, inter ve intra spesifik nükleotid farklılıkları DNAsp ve Mega 7 üzerinden Kimura Two Parameter modeli ile analiz edilmiştir. Filogenetik ağaç oluşturulmasında maximum likelihood (ML) analizleri 1000 tekrarlı bootstrap kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmaya dahil edilen 220 hamam böceğinin 105 (%47,7), 86 (%39,1) ve 29'unun (%13,2) PCR-RFLP sonuçlarına göre sırasıyla Blattella germanica, Blatta orientalis ve Periplaneta americana türlerine ait oldukları saptanmıştır. İlgili türlerin mt-COI, mt-COII ve ITS-2 gen bölgeleri için sırasıyla beş, üç ve beş olmak üzere toplam 13 haplotip belirlenmiştir. Ortalama haplotip diversiteleri sırasıyla 0,962±0,017, 0,842±0,047 ve 0.810±0,080 olarak saptanmıştır. B. germanica, Bl. orientalis ve P. americana türlerine ait data setler içerisindeki intraspesifik nükleotid farklılıkları sırasıyla; mt-COI için %1,0±0,2, %0,4±0,1, %2,4±0,5, mt-COII için %0,1±0,1, %0,1±0,1, %0,3±0,1 ve ITS-2 için %0, %0,7±0,3 ve %0,8±0,3 bulunmuştur. İnterspesifik nükleotid farklılıkları ise mt-COI, mt-COII ve ITS-2 için sırasıyla; B. germanica ve Bl. orientalis arasında %22,7±2,5, %26,0±2,9, %45,7±6,1; B. germanica ve P. americana arasında %24,6±2,5, %29,5±3,3, %43,6±5,8 ve Bl. orientalis ve P. americana arasında ise %14,5±1,8, %15,7±2,1 ve %17,9±2,7 belirlenmiştir. Maximum likelihood (ML) analizlerinde üç gen bölgesi için her üç türe ait sekansların monofiletik yapılanma gösterdiği tespit edilmiştir. Her üç hamam böceği türüne ait izolatların filogenetik analizlerinde dünyadaki benzer izolatlarla türlere ve gen bölgesine göre değişmekle birlikte %98,6-100 arasında identiklik oranları tespit edilmiştir.
Sonuç olarak bu çalışmayla Türkiye'de ilk kez hamam böceklerinin mt-COI, mt-COII ve ITS-2 gen bölgelerinin moleküler karakterleri ortaya çıkarılmış, dünyadan benzer izolatlarla filogenetik yakınlıkları belirlenmiş, Türkiye'nin biyolojik varlıkları olarak Genbank kayıtları gerçekleştirilmiş, her üç gen bölgesinin de hamam böceklerinin DNA barkodlamasında belirleyici markırlar oldukları teyit edilmiş ve hamam böceklerinin paraziter etkenlerin mekanik vektörlüklerini yapmaları açısından risk faktörleri ortaya çıkarılmıştır. 
Anahtar Kelimeler: DNA barkodlama, hamam böceği, mt-COI, mt-COII, ITS-2, Türkiye, vektörlük potansiyeli

Abstract:
This study was performed to investigate the phylogenetic characters of the cockroaches in Kayseri region for mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (mt-COI), mt-COII and internal transcribed spacer-2 (ITS-2) gene regions, and to determine their mechanical vector potentials for medically important parasitic agents. In this study, cockroach samples were collected from hospitals, various food establishments and houses and were transferred to the laboratory under appropriate conditions. Individual genomic DNA (gDNA) was extracted from 220 cockroach samples for genotyping and phylogenetic analysis. Following DNA extraction, 1.775 bp of the small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene was amplified in PCR, and RFLP analysis was performed with AvaI and EciI enzymes for molecular species identification of the isolates. According to PCR-RFLP results, mt-COI, mt-COII, and ITS-2 DNA barcode regions were amplified with standard primers for phylogenetic analysis of cockroach samples grouped on a species basis. The obtained amplicons were sequenced in both directions with PCR primers after purification. Sequence chromatograms were processed via De Novo Assemble to obtain consensus sequences for the isolates. The related sequences were subjected to Blastn analysis in the GenBank database to detect their molecular identifications, and the data sets containing the isolates obtained in this study and available in Genbank recorded from different countries were created. Haplotype diversity, inter and intra-specific nucleotide differences in data sets were analyzed by DNAsp and Mega 7 with the Kimura Two Parameter model. Maximum likelihood (ML) analysis in phylogenetic tree creation was performed using 1000 replicated bootstrap. According to PCR-RFLP results, 105 (47.7%), 86 (39.1%) and 29 (13.2%) of 220 cockroaches were identified as Blattella germanica, Blatta orientalis, and Periplaneta americana, respectively. A total of 13 haplotypes, five, three and five were identified for the species for mt-COI, mt-COII and ITS-2 gene regions, respectively. The mean haplotype diversities were detected as 0.962±0.017, 0.842±0.047, and 0.810±0.080, respectively. Intraspecific nucleotide divergences in the data sets for B. germanica, Bl. orientalis and P. americana species were found as 1.0±0.2%, 0.4±0.1%, 2.4±0.5% for mt-COI, 0.1±0.1%, 0.1±0.1%, 0,3±0,1% for mt-COII, and 0%, 0.7±0.3% and 0.8±0.3% for ITS-2. Interspecific nucleotide divergences for mt-COI, mt-COII and ITS-2 were determined as 22.7±2.5%, 26.0±2.9%, 45.7±6.1% between B. germanica and Bl. orientalis, 24.6±2.5%, 29.5±3.3%, 43.6±5.8% between B. germanica and P. americana, and  14.5±1.8%, 15.7±2.1% and 17.9±2.7% between Bl. orientalis and P. americana, respectively. In maximum likelihood (ML) analysis, it was determined that the sequences belonging to all three species were clustered in monophyletic clades for three gene regions. The phylogenetic analysis of isolates belonging to all three cockroach species showed 98.6-100% identity with similar isolates in the world-changing according to the species and gene regions.
In conclusion, molecular characteristics of cockroaches for mt-COI, mt-COII and ITS-2 gene regions were revealed for the first time in Turkey, phylogenetic relationships were determined with the similar isolates from the world, Genbank records were performed as biological organisms in Turkey, all three genes were identified as valuable genetic markers in DNA barcoding for cockroaches, and the risk factors for cockroaches' mechanical vectors were revealed with this study.
Keywords: Cockroach, DNA barcoding, mt-COI, mt-COII, ITS-2, Turkey, vector potential