Kolorektal kanserli hastalarda p16 tümör supressor genindeki promotor metilasyonu ve H3Lys9 metilasyonunun araştırılması
Investigation of p16 tumor supprssor gene promoter methylation and H3Lys9 metylation in colorectal cancer patients
Yazar: EBRU ESİN YÖRÜKER
Danışman: PROF. DR. NEJAT DALAY
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Metilasyon = Methylation

Özet:
DNA metillenmesi ile histon modifikasyonları (asetillenme, metillenme, fosforillenme gibi) gen ifadesini etkileyen epigenetik mekanizmalardır ve geri dönüşümlüdür. DNA metillenmesi ve histon metillenmesinin gen baskılanmasında birlikte rol aldıkları konusunda bilgiler artmaktadır. Ancak bu etkileşim mekanizması tam olarak aydınlatılmamıştır. Genomun geniş çaplı hipometillenmesi genom kararsızlığına yol açarken, belli kanserle ilişkili genlerin promotor bölgelerinde CpG adacıkları olarak adlandırılan noktalarda meydana gelen hipermetillenme bu genlerin susturulmasına yol açar. Hücre döngüsünün kontrolünde önemli rol oynayan siklin-bağımlı kinaz (CDK) engelleyici p16 bu genlerden biridir. Kromatinin yapısı gen ifadesi kontrolünde önemlidir. Kromatinin temel tekrarlayan yapısını oluşturan nukleozomların bileşenleri olan histonların metillenmesi gen ifadesini pozitif veya negatif yönde etkileyebilir. Çalışmamız kolorektal kanseri konu almıştır. Çalışmaya 71 hasta dahil edilmiş, sözkonusu parametreler normal ve tümörlü dokularda karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. DNA metillenmesi kantitatif olarak belirlenirken; histon metillenmesi kromatin immun çöktürme yöntemi ile tayin edilmiştir. DNA metillenmesinin belirlenmesinde öncelikle tümör ve normal dokudan izole edilen DNA'lar sodyum bisülfit yöntemiyle modifiye edilmiş daha sonra uygun tasarlanmış primer ve problar kullanılarak metillenme nicel olarak saptanmıştır. Histon metillenmesinin belirlenmesinde ise tümör ve normal dokudan, H3Lys9'un mono, -di ve trimetillenmiş türlerine özgü antikorlar kullanılarak çöktürülen kromatin fragmentleri PCR ile analiz edilmiştir. Hastaların 38'inde, tümör dokusunda normal dokuya göre daha yüksek oranda p16 promotör metillenmesi saptanmıştır. Ortanca metillenme değeri tümör dokusu için 24, normal doku için 3,5 olarak bulunmuş ancak tümör dokusu ile normal doku metillenme değerleri karşılaştırıldığında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark gözlenmemiştir. H3K9'da mono, -di ve tri metillenme düzeylerinin normal doku ve tümor dokusunda benzer olduğu saptanmıştır. H3Lys9 monometillenmesi için ortanca değer tümör ve normal doku için sırasıyla 0,112 ve 0,08'dir. Dimetillenme için ortanca değer aynı sırayla 0,187 ve 0,325; trimetillenme için ise 0,257 ve 0,234 olarak hesaplanmıştır. İstatistiksel olarak tümör ve normal doku H3Lys9 metillenme değerleri arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır.

Abstract:
DNA methylation and histone modifications are major epigenetic mechanisms that can affect gene expression. Epigenetic changes are reversible, and provide attractive targets for therapeutic intervention. New findings indicate that DNA and histone methylation act in concert in gene silencing, but the mechanism of this interaction is not fully elucidated. Aberrations in methylation contribute to carcinogenesis. Genome-wide hypomethylation can lead to genomic instability whereas in cancer cells methylation of the promoter regions of tumor suppressor genes inactivate these genes. Inactivation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 by hypermethylation has been observed in many cancers, leading to disruption of cell cycle regulation and providing a growth advantage to affected cells. Chromatin structure plays an integral role in the control of the gene expression. Methylation of histones modulates chromatin structure by stimulating or inhibiting binding of specific proteins. In this study we investigated DNA and histone methylation of the p16 tumor suppressor gene in colorectal cancer. 71 patients were included the study. DNA methylation by real-time PCR and histone methylation was detected by chromatin immunoprecipitation. DNA samples from tumor and normal tissue were modified using sodium-bisulphide and methylation was analyzed quantitatively using appropriate probes and primers. In the chromatin immunoprecipitation assay, DNA-associated proteins were incubated with specific antibodies (for ?mono, -di and trimethylation) and the antibody-antigen complexes were captured. The protein complement of the immune complexes was digested away and the DNA was analyzed by PCR. Promoter methylation levels were higher in the tumor tissue compared to normal tissue in 38 patients. For tumor and normal tissues, the median values were 24 and 3,5 respectively. No statistical difference was observed between tumor and normal tissue samples. H3K9 ?mono, -di, and trimethylation levels were similar in the normal and tumor tissues. The median values for mono-, di- and trimethylation were 0,112, 0,08; 0,187, 0,325 and 0,257, 0,234 for tumor and normal tissue samples respectively. No difference was found between tumor and normal tissues H3Lys9 methylation.