Kornea doku mühendisliği için hibrit biyomateryal geliştirilmesi
Development of a hybrid biomateral for corneal tissue engineering
Yazar: MERVE UYANIKLAR
Danışman: PROF. DR. HALİL MURAT AYDIN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kornea gözün 1/6'sını kaplayan, konveks biçimli, ışığı odaklama ve gözü dış etkilerden koruma görevine sahip, görme işlevinde büyük rol olayan transparan bir yapıdır. Korneal körlük; kornea travmaları, bakteriyel ve viral enfeksiyonlar, genetik rahatsızlıklar gibi sebeplerle dokunun hasar görmesine bağlı olarak ortaya çıkar. Özellikle ileri derecede travmalarda, dokunun uygun bir eşleniğiyle değiştirilmesi gerekebilir. Bu tarz cerrahi uygulamalar, allojenik kornea transplantasyonu veya yapay korneanın (keratoprotez) hasarlı dokuyla değiştirilmesi şeklinde yapılmaktadır. Araştırmacılar, doku mühendisliği uygulamalarının kazandırdığı yenilikçi bakış açılarıyla, patolojik kornea dokusunu hastadan uzaklaştırmak ve hasarlı bölgenin doku eşlenikleri ile transplantasyonu için doku eşdeğerlerini üretmeye çalışmaktadır. Son yıllarda, kornea doku mühendisliği korneal rahatsızlıklarının ve hasarlarının tedavisinde karşılaşılan sorunların çözümüne yönelik bazı stratejiler uygulamaktadır. Bu stratejiler; hidrojel tekniği, prefabrik matriksler ve hücresizleştirilmiş korneal dokular gibi korneal doku eşlenikleri için biyomimetik matriks sistemlerinin tasarlanmasıdır. Ancak hidrojel sistemlerinin yetersiz mekanik mukavemeti ve sürdürülebilirliğinin zor olması gibi bazı sınırlamalar vardır. Deselülerize matriksler, uygun bir hidrojelle desteklenmeden, yetersiz mekanik dayanıma sahip olduklarından ötürü ideal bir kornea replasmanı görevi göremezler. Bu nedenle deselülerize matrikslerin mekanik dayanım ve transparanlık özelliklerini iyileştirecek bir polimerin kullanılması gerekmektedir. Bu tez çalışması kapsamında, Jelatin Metakrilat (GelMA) polimeriyle desteklenen deselülerize matriksleri UV altında uygun süre ve enerjide çapraz bağlanmasıyla üstün mekanik dayanımda ve saydamlıkta olan hibrit matrikslerin üretimi amaçlanmıştır.
Çalışmanın ilk aşamasında, sığır kaynaklı kornea dokularının diseksiyonunu takiben Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) tabanlı bir deselülerizasyon protokolü uygulanmıştır. Deselülerizasyon işleminin başarısının tayini için karakterizasyon testleri yapılmıştır. Bunun için Taramalı Elektron Mikroskop analizi (SEM), Toplam Reflektansı Azaltılmış Fourier Dönüşüm Kızılötesi Spektrofotometresi analizi (ATR-FTIR), deselülerize ve doğal dokunun yapısal özelliklerinin karşılaştırmalı olarak incelenmesi için kullanılmıştır. Deselülerizasyon başarısının tespiti için hematoksilen ve eozin (HE); artık nükleusların tespiti için DAPI boyama gibi histolojik analizler gerçekleştirilmiştir. Deselülerizasyon işlemi sonrası dokuda kalan artık DNA miktarının sayısal olarak belirlenmesi için PicoGreen testi; dokuda kalan glikozaminoglikan miktarının sayısal olarak belirlenmesi amacıyla dimetil metilen mavisi testi (DMMB) yapıdaki kolajen miktarının tespiti için Hidroksiprolin testi gerçekleştirilmiştir. PicoGreen test sonucuna göre, doğal dokudan %70.1 DNA uzaklaştırılarak başarılı bir deselülerize matriks elde edilmiştir. DMMB test sonucuna göre, doğal kornea ile deselülerize kornea mukayese edildiğinde  deselülerize korneanın doğal korneaya göre sGAG içeriğinde %40'lık bir azalmaya sahip olduğu görülmüştür. Hidroksiprolin test sonucuna göre, doğal dokunun ve deselülerize dokunun hidroksiprolin miktarı 0.65 ± 0.01 mg ve 0.74 ± 0.01 mg olarak tespit edilmiştir. Elde edilen bulgular, literatür bilgisi ile kıyaslandığında deselülerizasyon işleminin üstünlüğü ortaya konulmuştur.
Tezin ikinci aşamasında, deselülerize edilen kornealar ile %8 konsantrasyonda üretilen jelatin metakrilat polimeri (GelMA), UV altında farklı enerji (3200 μJ/cm2, 6210 μJ/cm2 ve 6900 μJ/cm2) ve farklı sürelerde (hemen, 5 dakika ve 24 saat) çapraz bağlanmasıyla karakterize edilmiştir. Doğal korneanın ve elde edilen hibrit ve deselülerize korneaların çap ve kalınlıkları ölçülmüştür. Hibrit yapıların ve GelMA polimerinin kimyasal yapısının ayrıntılı incelenmesi amacıyla, FTIR analizi yapılmıştır. Hibrit matriks, deselülerize matriks ve doğal kornea yapısı; enzimatik degradasyon, su tutma kapasitesi ve fosfat tamponlu salin (PBS) içerisinde degradasyon oranı açısından test edilmiştir. Şişme testi sonuçlarına göre, doğal korneanın su tutma kapasitesi %85.7 ± 0.22 bulunurken, deselülerize korneanın su tutma kapasitesi %85.2 ± 3.09, hibrit matriksin su tutma kapasitesi ise %74.2 ± 1.03 olarak tespit edilmiştir. 28 gün boyunca sürdürülen PBS içerisinde degradasyon testinin sonuçlarına göre, doğal korneada %24.73 ± 6.55, deselülerize korneada %51.37 ± 4.29 ve hibrit korneada %50.9 ± 10.34 oranında kütle kaybı görülmüştür. Kolajenaz A ile gerçekleştirilen enzimatik bozunma testinin sonuçlarına göre, dört saatin sonunda hibrit yapı %44.68 ± 5.99, doğal kornea %15.56 ± 2.84 ve deselülerize doku %19.98 ± 2.56 oranlarında kütle kaybına uğramıştır. Mekanik teste tabi tutulan hibrit matriksler içerisinde 24 saat GelMA polimeri emdirildikten sonra 6210 µJ/cm2 enerji ile çapraz bağlanan grup, diğer gruplara kıyasla ön plana çıkmıştır. 
Son olarak in vitro yöntemle, stromal keratosit hücreleri elde edilen hibrit matriksler içerisine, GelMA ile ışıkla çapraz bağlanarak enkapsüle edilmiş ve nihai olarak proliferasyon analizleri yapılmıştır. Ekim için kullanılan hücreler, primer kültür yöntemi ile sığır korneasından elde edilerek çoğaltılmıştır. Deney gruplarına, uygun sayılarda hücre ekilmiş ve bu grupların 14 günlük süreçte hücre kültüründeki davranışları incelenmiştir. Hücre kültürü çalışmalarında, hücre canlılık testleri yapılmıştır. Hücre kültürünün son aşamasında, DAPI boyama yöntemi ve canlı ölü testi kullanılarak hücreler incelenmiştir. Çalışma neticesinde, hem optik hem de mekanik özelliklerin iyileştirildiği yönünde sonuçlar elde edilmiştir.
Tez çalışması kapsamında, geliştirilen hibrit matriks yapılarının, kornea nakillerinin başarılı bir şekilde geliştirilmesine yönelik, umut verici bir yaklaşım olarak önerilmektedir.

Anahtar kelimeler: GelMA, deselülerizasyon, kornea doku mühendisliği, kimyasal deselülerizasyon yöntemi, fotopolimerizasyon, transparanlık

Abstract:
The cornea is a transparent structure that covers 1/6 of the eye, has a convex shape, has the task of focusing light and protecting the eye from external influences, and has a major role in vision. Corneal blindness; It occurs due to damage to the tissue due to corneal traumas, bacterial and viral infections, genetic disorders. Especially in severe trauma, the tissue may need to be replaced with a suitable equivalent. Such surgical applications are performed in the form of allogeneic cornea transplantation or replacement of the artificial cornea (keratoprosthesis) with damaged tissue. Researchers are trying to produce tissue equivalents for removing pathological corneal tissue from the patient and transplanting the damaged area with tissue conjugates, with innovative perspectives provided by tissue engineering applications. In recent years, corneal tissue engineering has been applying some strategies to solve the problems encountered in the treatment of corneal ailments and injuries. These strategies are to design biomimetic matrix systems for corneal tissue conjugates such as hydrogel technique, prefabricated matrices and decellularized corneal tissues. However, there are some limitations such as insufficient mechanical strength of hydrogel systems and difficulty of sustainability. Decellularized matrices cannot serve as an ideal corneal replacement without being supported with a suitable hydrogel, due to their insufficient mechanical strength. For this reason, it is necessary to use a polymer that will improve the mechanical strength and transparency properties of the decellularized matrix.
Within the scope of this thesis, it is aimed to produce hybrid matrixes with superior mechanical strength and transparency by crosslinking deselularized matrices supported with Gelatin Methacrylate (GelMA) polymer at appropriate time and energy under UV. In the first stage of the study, a Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) based decelularization protocol was applied following dissection of bovine corneal tissues. Characterization tests were performed to determine the success of the decellularization process. For this, Scanning Electron Microscopy analysis (SEM), Total Reflectance Reduced Fourier Transform Infrared Spectrophotometer analysis (ATR-FTIR) were used to comparatively study the structural properties of decelularized and natural tissue. Hematoxylin and eosin (HE) for the determination of decellularization success; Histological analyzes such as DAPI staining were performed to detect residual nuclei. PicoGreen test to numerically determine the amount of residual DNA remaining in the tissue after the decellularization process; dimethyl methylene blue test (DMMB) to numerically determine the amount of glycosaminoglycan remaining in tissue; Hydroxyproline test was performed to determine the amount of collagen in the structure. According to the PicoGreen test result, a successful decellularized matrix was obtained by removing 70.1% DNA from natural tissue. According to the DMMB test result, when compared with the natural cornea and the decellularized cornea was found to have a 40% decrease in sGAG content compared to the natural cornea. According to the hydroxyproline test result, the amount of hydroxyproline of natural tissue and decellularized tissue was determined as 0.65 ± 0.01 mg and 0.74 ± 0.01 mg. Comparing the findings with the literature knowledge, the superiority of the decelularization process has been revealed.
In the second stage of the thesis, gelatin methacrylate polymer (GelMA) produced at 8% concentration with decellularized corneas, different energy under UV (3200 μJ/cm2, 6210 μJ/cm2 and 6900 μJ/cm2) and at different times (immediately, 5 minutes and 24 hours) is characterized by cross-linking. The diameter and thickness of the natural cornea and the hybrid and decellularized corneas obtained were measured FTIR was performed in order to examine the chemical structure of hybrid structures and GelMA polymer in detail. Hybrid matrix, decellularized matrix and natural corneal structure; tested for enzymatic degradation, water holding capacity and rate of degradation in phosphate buffer saline (PBS). According to the results of the swelling test, the water holding capacity of the natural cornea was found to be 85.7 ± 0.22%, while the water holding capacity of the decellularized cornea was 85.2 ± 3.09%, and the water holding capacity of the hybrid matrix was found to be 74.2 ± 1.03%. According to the results of the degradation test in PBS, which was maintained for 28 days, mass loss was 24.73 ± 6.55% in the natural cornea, 51.37 ± 4.29% in the decellularized cornea, and 50.9 ± 10.34% in the hybrid cornea. According to the results of the enzymatic degradation test performed with collagenase A, at the end of four hours, the hybrid structure lost 44.68 ± 5.99%, natural cornea 15.56 ± 2.84% and decelularized tissue 19.98 ± 2.56% mass. In the hybrid matrices subjected to mechanical testing, the group that was cross-linked with an energy of 6210 µJ/cm2 after 24 hours after impregnation of GelMA polymer came to the fore compared to the other groups.
Finally, by the in vitro method, stromal keratocyte cells were encapsulated into the hybrid matrix obtained by cross-linking with GelMA, and finally proliferation analyzes were performed. Cells used for sowing were reproduced from bovine cornea by primary culture method. Appropriate number of cells were sowed in the experimental groups and the behavior of these groups in cell culture was observed over a period of 14 days. Cell viability tests were performed in cell culture studies. At the last stage of cell culture, cells were examined using the DAPI staining method and the living dead test. As a result of the study, results were obtained that both optical and mechanical properties were improved.
Within the scope of the thesis, it is recommended as a promising approach for the successful development of hybrid matrix structures and corneal transplants.

Keywords: GelMA, decellularization, corneal tissue engineering, chemical decellularization method, photopolymerization, tranparency