Erzurum çevresinden toplanan peynir örneklerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin biyojen amin degrede etme özelliklerinin araştırılması
Investigation of the biogen amines degree properties of lactic acid bacteria isolated from cheese samples collected from Erzurum and its surroundings
Yazar: ELİFNUR MERAL
Danışman: PROF. DR. AHMET ADIGÜZEL
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: Tez çalışmasında, laktik asit bakteri (LAB) mikroflorası bakımından oldukça zengin içerikli bir kaynak olan peynir örneklerinden, LAB'nin izolasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen izolatların fenotipik özellikleri ortaya konuldu. Fenotipik olarak karakterize edilen bakteri izolatlarının; biyojen aminleri (BA) degrede edebilme potansiyelleri, gen seviyesinde biyokimyasal açıdan ve LC-MS analizi ile kantitatif olarak araştırıldı.
Yöntem: Tez çalışmasında, Erzurum ili ve ilçelerinden toplananan peynir örneklerinden bakteri izolasyonu gerçekleştirildi ve elde edilen izolatların LAB olup olmadığını belirlemek amacıyla, çeşitli fenotipik testler uygulandı. Potansiyel LAB olduğu tahmin edilen izolatların BA'ları degrede edebilme potansiyellerini araştırmak amacıyla, çeşitli genomik ve biyokimyasal metodlara başvuruldu. Bu amaçla öncelikle BA'ların oluşumunu sağlayan dekarboksilaz enzimine ait profili belirlemek amacıyla API 20E Sistem kullanılarak, biyokimyasal analiz yapıldı. API 20E Sisteme göre dekarboksilaz enzimi açısından negatif profile sahip olan izolatlar seçildi. Sonrasında belirlenen bu izolatların, BA'ları degrede etme özelliğine sahip olan multikopper oksidaz (MCO) enzimi açısından profilleri, hem genomik olarak hem de LC-MS analizi ile kantitatif olarak belirlendi. İlgili tüm enzim profilleri açısından istenilen tabloya sahip olan izolat, son aşamada moleküler olarak tür bazında tanılandı.
Bulgular: Tez çalışması kapsamında; fenotipik karakterizasyon işlemleri sonucunda 12 adet izolatın LAB olabileceği kanısına varıldı. Öncelikle 12 adet izolatın, API 20E Sistem aracılığıyla dekarboksilaz enzim aktivitesi biyokimyasal olarak belirlendi. Analiz sonucunda; yalnızca 4 adet izolatın dekarboksilaz negatif özellik taşıdığı görüldü. 4 adet izolatın daha sonra MCO enzim aktiviteleri, bu enzime ait spesifik primerler aracılığıyla gen seviyesinde araştırıldı. 4 adet izolat içerisinden yalnızca EM4 kodlu izolatın bu enzime ait gene sahip olduğu belirlendi. Tüm analizler açısından istenilen verilere sahip olan EM4 kodlu izolatın, bir sonraki aşamada; MCO enzim optimizasyonu yapıldı. Son aşamada; kadaverin, histamin, putresin ve tiramin aminlerinin olduğu ortama eklenen EM4 kodlu izolatın, bu ortamda aminleri parçalama yeteneği, LC-MS analizi ile kantitatif olarak belirlendi ve elde edilen grafikler yorumlanarak; en yüksek parçalanma yüzdesinin %83 oranında histamine, en düşük parçalanma yüzdesinin ise %26 oranında tiramine ait olduğu sonucuna varıldı. Son olarak; moleküler seviyede tanılanan EM4 kodlu izolatın, %99 oranında Levilactobacillus brevis'e benzerlik gösterdiği tespit edildi.
Sonuçlar: Elde edilen verilerden yola çıkılarak; tüm parametreler açısından pozitif sonuç elde edilen EM4 kodlu Levilactobacillus brevis'in BA'ları parçalama noktasında oldukça önemli bir izolat olduğu görüldü. Bu izolatın hem gen, hem biyokimyasal seviyede hem de LC-MS analizlerine göre kantitatif olarak belirlenen yüzde hesaplarına bakıldığında, özellikle gıdalarda oluşan ve insan sağlığını tehdit eden BA gruplarını degrede ediyor olması, bu izolatı hem teknolojik olarak hem de gıda güvenliği açısından oldukça önemli bir noktaya taşımıştır. İzolatın; GRAS (Generally Recognized as Safe) mikroorganizma olarak kullanılabilmesi teknolojik özellikler açısından gıdalara eklenebilmesine BA'ları degrede etmesinden dolayı gıdaları iyileştirebilme potansiyeline sahip olabilmesinin kanıtlanması için, uygulama noktasında daha ileri boyutlu çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
Purpose: In the thesis study, LAB was isolated from cheese samples, which is a rich source of lactic acid bacteria (LAB) microflora. The phenotypic characteristics of the obtained isolates were determined. Phenotypically characterized bacterial isolates; Their potential to degrade biogenic amines (BA) was investigated biochemically at the gene level and quantitatively by LC-MS analysis. 
Method: In the thesis study, bacterial isolation was performed from cheese samples collected from Erzurum province and its districts, and various phenotypic tests were applied to determine whether the obtained isolates were LAB. Various genomic and biochemical methods were used to investigate the potential of isolates presumed to be potential LAB to degrade BAs. For this purpose, biochemical analysis was performed using API 20E System in order to determine the profile of the decarboxylase enzyme, which provides the formation of BAs. According to the API 20E System, isolates with a negative profile for decarboxylase enzyme were selected. The profiles of these isolates in terms of the multicopper oxidase (MCO) enzyme, which has the ability to degrade BAs, were determined both genomically and quantitatively by LC-MS analysis. The isolate, which had the desired picture in terms of all relevant enzyme profiles, was molecularly identified on the basis of species in the final stage. Findings: Within the scope of the thesis; As a result of phenotypic characterization processes, it was concluded that 12 isolates could be LAB. First of all, decarboxylase enzyme activity of 12 isolates was determined biochemically by API 20E System. As a result of the analysis; only 4 isolates were found to be decarboxylase negative. The MCO enzyme activities of 4 isolates were then investigated at the gene level by means of specific primers of this enzyme. It was determined that only the EM4 coded isolate among 4 isolates had the gene for this enzyme. In the next step, the EM4 coded isolate, which has the desired data in terms of all analyzes; MCO enzyme optimization was performed. In the last stage; The ability of the EM4 coded isolate added to the medium containing cadaverine, histamine, putrescine and tyramine amines to degrade amines in this medium was determined quantitatively by LC-MS analysis and by interpreting the graphs obtained; It was concluded that the highest degradation percentage belonged to histamine at the rate of 83%, and the lowest percentage of degradation belonged to tyramine at the rate of 26%. Finally; It was determined that the EM4 coded isolate, which was identified at the molecular level, was 99% similar to Levilactobacillus brevis.
Results: Based on the data obtained; It was seen that EM4 coded Levilactobacillus brevis, which had positive results in terms of all parameters, was a very important isolate at the point of decomposition of BAs. Considering the percentage calculations of this isolate, determined both at the gene and biochemical level and quantitatively according to LC-MS analysis, the fact that it degrades BA groups that occur in foods and threaten human health, makes this isolate a very important point both technologically and in terms of food safety. has carried. Isolate; Further studies are needed at the point of application in order to prove that GRAS (Generally Recognized as Safe) can be used as a microorganism, can be added to foods in terms of technological properties, and has the potential to improve foods because it degrades BAs.