Çocukluk çağı akut lenfoblastik lösemilerinde apoptoz ve bax gen polimorfizminin araştırılması
Evaluation of apoptosis by bax gene polymorphism and conventional dose prednisolone treatment in childhood acute lymphoblastic leukemia
Yazar: ELİF GÜLER KAZANCI
Danışman: DOÇ. DR. CANAN VERGİN
Sağlık Bakanlığı / İzmir Dr.Behçet Uz Çocuk Hastalıkları Ve Cerrahisi Eğt. ve Arş. Hast. / Çocuk Hematolojisi Bilim Dalı
Derece: Tıpta Yan Dal Uzmanlık, 2007
Konu: Hematoloji = Hematology

Özet:
ÇOCUKLUK ÇAĞI AKUT LENFOBLASTİK LÖSEMİLERİNDE APOPTOZ VE BAX GEN POLİMORFİZMİ
Amaç: ALL tedavisinde önemli gelişmeler sağlanmış çocukluk çağının en sık görülen maliyn bir hastalığıdır. Risk kriterlerinin, özellikle sitogenetik ve moleküler genetik değişikliklerin tanımlanması ile uygun tedavi seçimleri sonucu kür oranları artmaya başlamıştır. Son yıllarda kanser tedavisinde kullanılan ajanların apoptozisi arttırarak hücre ölümüne yol açtığı görülmektedir. Glukokortikoidlerin indüklediği apoptoz klinik ve biyolojik öneme sahiptir. İnvitro ve invivo GC sensitivitesi ALL'li çocuklarda major prognostik faktördür. GC' lerin induklediği apoptoza karşı dirençte apoptozun modulasyonunda yer alan genlerdeki mutasyonlardan bahsedilmektedir. Bu çalışmada yeni tanı almış ALL'li hastalarda tedavi öncesi  spontan apoptozun  ve konvansiyonel dozda prednisolon tedavisi sonrası apoptoz oranının belirlenmesi, GC'lerin apoptoz oranına  etkisinin risk sınıflandırılmasında ve tedavi yanıtının değerlendirilmesindeki öneminin gösterilmesi amaçlandı. Ayrıca apoptoz yolağında regülatör genlerden olan Bax' ın ekspresyonunu etkileyen G-248 A  nukleotid polimorfizmini araştırmak  hedeflendi.
Hastalar ve yöntem:  Lösemide apoptoz indeksi çalışması Mayıs 2006 – Şubat 2007  tarihleri arasında 0-11 yaş grubu yeni tanı almış 25 ALL'li hastanın kemik iliği aspirasyon örneklerinde yapıldı. Apoptoz çalışması akım sitometride Annexin V – FITC Kiti ile gerçekleştirildi.  Bax gen polimorfizmi çalışması ise apoptoz çalışmasına alınan ALL'li olguların 22'sinde ve hematoloji polikliniğimiz izleminde olan 38 ALL'li olgunun (n= 60) periferik kan örneklerinde yapıldı. Bax geni, G-248A  polimorfizmini içeren PCR ürünleri WAVE Denatüran Yüksek Performanslı Likit Kromatografisi (DHPLC) sistemine yüklenerek analiz edildi. Hastaların hepsi TRALL 2000 protokolüne göre tedavi edildiğinden sınıflamaları, klinik, biyolojik özellikleri ve tedaviye yanıtları bu protokole göre değerlendirildi.
Bulgular:  Hastaların çoğunluğu (%60) kız ve 2-4 yaş grubundan (%60) idi. Tanıda lökosit sayıları %68'inde protokole göre iyi prognoz kriteri olarak belirtilen değerdeydi (< 20x109/L). Morfolojik ve immünfenotipik incelemelerinde %88'i L1, %12'si L2 ve %80'i pre-B, %8'i pro-B,%4'ü transisyonel pre-B ve %8'i T hücreliydi. Moleküler genetik çalışma tüm hastalarda yapılabildi, bunların %28'inde t (12:21) ve %6'sında t(1:19) saptandı. Konvansiyonel sitogenetik incelemede hastaların  %95'inde metafaz elde edilebildi ve diploid olarak değerlendirildi. Akım sitometrik AI indekslerine göre spontan, 3. ve 8. gün arasında anlamlı fark bulunmadı (p>0.05).  PreB ALL'li olgularda diğer immunfenotiplere göre 0., 3. ve 8. gün AI anlamlı olarak  yüksek saptandı. CD45 ekspresyonu düşük olan olgularda ortalama apoptoz indeksinin yüksek olduğu görüldü. Risk gruplarına göre apoptoz oranları değerlendirildiğinde 0. ve 3.günlerde gruplar arasında fark yokken, 8.günde HRG grubunda AI anlamlı olarak yüksek belirlendi. Yüksek risk grubundaki AI'nin yüksekliğinin hastalardaki mevcut blast yüküyle ilişkili olduğu düşünüldü. Olgularımızda 0., 3. ve 8. gün apoptoz indeksleri arasında istatistiksel olarak pozitif bir korelasyon saptandı. Bu  bulgu apoptoz indeksinin  konvansiyonel dozda steroidle değişmemekle birlikte  spontan apoptoz oranının; genetik, çevresel, konjenital ya da akkiz birçok faktörden etkilenen, hastalığın ve hastanın bir özelliği olduğunu düşündürdü.
Spontan apoptoz indeksi;  tanıda lökosit sayısı 20 000 /mm3 altıda olan olgularda  % 20.8±16, 20 000/mm3 üzerinde olan olgularda %13.5±5.4 saptandı, bu sonuç istatistiksel olarak anlamlı bulunmasa da lökosit sayısının artışının spontan AI'nin düşük oluşu ile ilişkili olabileceği düşünüldü. 
Apoptoz indeksinin erken dönem steroid yanıtı ve remisyon özellikleri üzerine etkisi değerlendirildiğinde, istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmadı. Tedavinin 33. günü yapılan değerlendirmelerinde %92'sinin remisyonda olduğu görüldü. Bax gen polimorfizminin hasta ve kontrol grubunda değişiklik göstermediği, apoptoz indeksi, tanıda lökosit ve blast sayısı ile genotip ve alel sıklığı açısından açısından farklılık görülmediği saptandı.
Sonuç: Sonuç olarak bu çalışmada konvansiyonel dozda prednisolon tedavisinin  apoptozu indüklemediği, ancak PreB ALL' li ve CD45 ekspresyonu düşük olgularda  ortalama apoptoz oranının anlamlı şekilde yüksek olduğu görüldü. PreB ALL'de iyi prognozun apoptoz oranındaki yükseklikle ilişkili olduğu ve CD45 ekspresyonu düşük bulunan olgularda apoptoz oranındaki anlamlı artışın iyi prognoz göstergesi sayılabileceği düşünüldü. Ayrıca Bax polimorfizminin çocukluk çağı ALL'nin  patogenezinde, klinik seyir ve prognozunda rol oynamadığı sonucuna varıldı. Çalışmanın daha fazla olgu sayısı ile tekrarlanması ve apoptoz yolağında rol oynayan diğer proteinlerin de araştırılmasının gerekli olduğu düşünüldü.

Abstract:
Aim: It is known that the agents used in cancer treatment increase apoptosis and cause cell death. This study was conducted to evaluate the apoptosis index (AI) in the acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients on the spontaneous apoptosis (0 day) and 3rd and 8th days of the conventional dose-prednisolone treatment, and to establish its importance for the evaluation of treatment response and AI risk stratification, and G-248 A nucleotide polymorphism affecting BAX gene expression.
Method: Apoptosis index (AI) was performed by Annexin V- FITC kit for bone marrow aspiration (BMA) samples of 25 newly-diagnosed 0-11 years old ALL patients on 0th, 3rd and 8th day. Bax gene polymorphism was studied on peripheral blood samples of 60 ALL patients and 96 healthy control group, and DNA isolation was studied by FUJİ QuickGene 810 automatic nucleic acid purification system. 
Results: The mean age of the patients was 4.9, and %28 had a standard risk, %44 had a moderate risk, %28 had high risk. No significant difference was found between 0th day AI and 3rd and 8th day AI.  8th day AI was significantly high in high risk leukemia group (P<0.05). Apoptosis index; was significantly high on 0th, 3rd and 8th day for PreB ALL cases. 34 of patients had (%56.7) GG, 23 had (%38.3) GA, 3 had (%5) AA genotype. It was observed that G-248 A polymorphism was not different between patient and control groups.
Discussion: In our study, a statistically significant difference was not found by spontaneous AI and  number of diagnostic leukocytes but it was suggested that the high leukocyte count may be associated with low spontaneous AI. It was suggested that prednisolone-induced 8th day AI increase on the cases with high risk leukemia may be associated with blast load, and that a large study showing the prognostic importance of AI was required.  It was shown that good prognosis for PreB ALL was associated with the extent of apoptosis rate. It was suggested that BAX gene polymorphism does not have an effective role for pathogenesis, clinical course and prognosis of childhood ALL and that the study should be repeated with more cases and the other proteins in the apoptosis pathway should be investigated.