Epilepside ağrı duyarlılığının genetik absans epilepsili sıçanlar kullanılarak in-vivo ve in-vitro incelenmesi
An in vivo and in vitro investigation of pain sensitivity in epilepsy using genetic absence epileptic rats
Yazar: SİBEL VELİOĞLU
Danışman: PROF. DR. AHMET AYAR
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Nöroloji = Neurology
Dizin: Analjezi = Analgesia ; Ağrı = Pain ; Ağrı eşiği = Pain threshold ; Epilepsi = Epilepsy ; Ganglion = Ganglia ; Hiperestezi = Hyperesthesia ; Kalsiyum kanalları = Calcium channels ; Monitörizasyon-fizyolojik = Monitoring-physiologic ; Nörofizyoloji = Neurophysiology

Özet:
Epilepsiyi karakterize eden spontan nöbetleri oluşturan fizyopatolojik süreç nöronların uyarılabilme eşiğindeki çoğu kez nedeni bilinmeyen düşmedir. Ancak nöronları aniden anormal aşırı elektirksel deşarja yönelten patofizyolojik mekanizmalar halen net olarak anlaşılamamıştır.  İnteriktal dönemde sakin görülen bu nöronların aslında normal nöronlardan farklı olması akla uygun görünmektedir. Epilepsilerin sıklıkla birlikte bulunduğu komorbid durum başağrıları ve ağrılı sendromlardır. Bu komorbiditenin sebebi ise henüz bilinmemektedir. Diğer taraftan epilepside interiktal dönemde ağrıya duyarlılık konusunda bilimsel bir araştırma olmadığı görülmektedir. Eğer epilepsili hayvanlarda kontrollerine oranla fizyolojik ağrı algılanmasında farklılıklar saptanırsa, interiktal dönemde sakin gözüken kortiko-talamik ağlarda aslında canlının bazı fizyolojik yanıtlarının normalden sapmasına yol açan bir değişimin de olduğu öne sürülebilecektir. Bu doktora tezinde genetic absans epilepsili sıçanlar kullanılarak epilepside interiktal ağrı eşiğinin kontrolleri ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Deneyler için 2 grup oluşturulmuştur. Bağımsız grupta 8 adet erkek  epilepsi gelişmiş 8 aylık WAG/Rij sıçanın ağrı eşik değerleri, 8 adet yaş ve cins aynı olan epilepsisi olmayan Wistar sıçanlarınki ile karşılaştırılmıştır. Bağımlı grupta ise deneylere sıçanlar epilepsi gelişmeden once 2 aylıklarken başlanıp, aynı hayvanlarda epilepsi geliştikten sonraki dönemde (8 aylık) ölçümler tekrarlanmıştır. Bağımlı grupta 12 adet erkek WAG/Rij ve 11 adet yaş ve cins aynı olan kontrol Wistar sıçanlar kullanılmıştır. Tüm sıçanlara genel anestezi sonrası stereotaksik cihaz ile epidural olarak 2  adet aktif tripolar EEG elektrodu sol hemisfer frontal ve pariyetal kortekslere ve referans elektrod  ise orta hat serebellumun üzerine yerleştirilerek  en az 10 gün iyileşmeleri beklendikten sonra interiktal ağrı eşiği ölçümleri yapılmıştır. Ağrı eşiği değerleri uyanık hareketli sıçanlarda senkronize video-EEG monitorizasyon sistemi kullanılarak interiktal evre belirlenerek ölçülmüştür.  Ağrı eşiği ölçümü ise in vivo termal plantar analjezimetre ile yapılmıştır. Sağ ve sol arka ayaklardan, en az 15 dk aralıklı 2 şer kez alınan eşik değerlerinin ortalamaları alınarak ağrı eşiği latansları belirlenmiştir. WAG Rij ve Wistar sıçanlar arasında ağrı duyarlılığı arasındaki olası farka, peripheral nosiseptörlerin olası katkısını irdelemek üzere dorsal kök gangliyon (DKG) nöronları, enzimatik işlem ve mekanik uygulamalarla ayrıştırılarak cam lamellere ekilerek ve kalsiyuma duyarlı flüoresan boya olan fura-2 AM (1 uM) ile yüklenerek bakılmıştır. Her bir nöronun hücre içi kalsiyum yanıtları oransal esaslı standart flüoresan kalsiyum görüntüleme tekniği ile  hesaplanmıştır. Kalsiyum yanıtları membran depolarizasyonu (hücre dışına 30 mM KCl ekleyerek)  ile uyarılmıştır. Bağımsız gruplardaki latans değerleri, 8 aylık epilepsili sıçanların interiktal ağrı eşiğinin kontrollerine oranla anlamlı düzeyde düşük olduğunu göstermiştir [sırası ile 3, 0 ve 4, 5 sn (P=0,001)].  Bağımlı gruplarda  ağrı eşiği değerleri, sıçanlar hem epilepsinin henüz gelişmediği 2 aylıklarken [sırası ile epilepside ve kontrolde,  2,7 ve 3,1 sn (P=0,036) ] hem de epilepsi  geliştikten sonra 8 aylıklarken  [sırası ile epilepside ve kontrolde,  2,8 ve 3,9 sn (P=0.00014)] epilepsisiz kontrollerine oranla anlamlı düzeyde düşük bulunmuştur. KCl ile membrane depolarizasyonu hücre içi serbest kalsiyum düzeyinde anlamlı artışa yol açmış ancak, Wistar ve WAG/Rij sıçanlardan izole edilen DKG hücrelerinin membrane depolarizasyonuna cevaben bu kalsiyum artışları arasında anlamlı bir farklılık bulunmamıştır. Bu bulgular genetik absans epilepsili sıçanların nöbetsiz dönemde ağrıya karşı aşırı uyarılabilir olduklarını ve aşırı uyarılabilirliğin DKG düzeyinde olmadığını göstermesi açısından önemli görülmektedir.

Abstract:
The physiological process that constitute the characteristic spontaneous seizures of epilepsy is due to lowering of excitability threshold of the neurons often without any obvious cause. The pathophysiological mechanisms that leads to the sudden onset of excess neuronal electrical discharge is still not fully understood. It is conceivable that these neurons that seems silent during interictal period are actually different than normal neurons. Headaches and painful syndromes are common co-morbidities with epilepsy. The reasons for these co-morbidities are still not known. On the other hand there is no study addressing interictal pain sensitivity in epilepsy. If the epileptic experimental animals has an altered pain sensitivity, it can be proposed that there could be a change in normally silent cortico-thalamic circuits causing deflection of some physiological responses. In this PhD thesis it was aimed to investigate the interictal pain sensitivity in epilepsy by using genetic absence epilepsy rats in comparison with the controls. Two experimental groups were formed. Independent group was consisted of 8 male epileptic 8 month WAG/Rij rats while 8-age and gender-matched Wistar without epilepsy served as control. In the dependent group, experiments were started before epileptic seizure manifestation when the rats were 2 months old and the measurements were repeated when they were epileptic at (8 months old). In the dependent group there were 12 male WAG/Rij and 11 age and gender-matched control Wistar rats. Permanent cortical electrodes, 2 active EEG electrodes to left frontal and the reference electrode to mid-line cerebellum was implanted under general anesthesia using stereotaxic frame and interictal pain threshold measurements were performed following 10 days recovery from electrode surgery. Interictal, as confirmed by synchronized video EEG monitorization, pain threshold measurements were performed when the animals were awake and freely moving. In vivo pain threshold values were determined by using thermal plantar analgesiameter. Pain threshold values were determined by averaging the 2 measurements from right and left hind-paw by 15 minutes intervals. For assessment of possible contribution of peripheral nociceptors in pain sensitivity among WAG/Rij and Wistar rats, dorsal root ganglion (DRG) neurons were cultured on glass coverslips following enzymatic digestion and mechanical agitation, and loaded with the calcium sensitive dye fura-2 AM (1 uM). Intracellular calcium responses in individual DRG neurons were quantified by using standard fura-based ratiometric calcium imaging technique. Ca2+ responses to membrane depolarisation (stimulation with 30 mM extracellular KCl) were assessed. The pain latency values of 8 month-old epileptic rats in the independent group significantly lower than their respective controls [3,0 vs 4,5 sec (P=0,001), respectively].  In the dependent group of rats, pain threshold values of WAG/Rij rats were significantly lower than controls at both when they were non-epileptic at 2 months [epileptic vs. control: 2,7 and 3,1 sec (P=0,036) ] and at 8 months when they were epileptic [[epileptic vs. control,  2,8 and 3,9 sec (P=0.00014)]. Membrane depolarisation with KCl caused significant increases in free intracellular calcium; there was no significant difference between depolarisation-induced intracellular calcium changes of DRG neurons from Wistar and WAG Rij rats. These results are of importance to demonstrate that pain sensitivity of genetic absence epileptic rats is higher but the sensitivity  is not caused  by  DRG neurons.