Ruminant atıklarında brusella türlerinin multipleks PCR ve konvansiyonel yöntemler ile tanısı, yöntemlerin birbirleri ile karşılaştırılması
Diagnosis of Brucella species in ruminant fetuses by multiplex PCR and conventional methods and compare these methods with each other
Yazar: AHMET MURAT SAYTEKİN
Danışman: PROF. DR. SEYYAL AK
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Brusella = Brucella ; Bruselloz = Brucellosis ; Geviş getiriciler = Ruminants ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis teknikleri ve prosedürleri = Diagnostic techniques and procedures ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu çalışmada, ruminant atık örneklerinden, bruselloz etkenlerinin tür ve cins düzeyinde hızlı tanımlanmasını sağlayan direkt PCR yöntemlerinin geliştirilmesi ve uygulanabilirliklerinin saptanması amaçlandı. Bu amaçla 166 ruminant atığına ait 137 akciğer, 137 karaciğer ve 52 fetüs mide sıvısı olmak üzere toplam 326 örnek incelendi. İnceleme örneklerine, ilk aşama olarak etken izolasyonu ve identifikasyonu ile kültürden tür spesifik multipleks PCR (m-PCR) uygulandı. Ayrıca, direkt inceleme örneklerine bu çalışmada modifiye edilen ve ismi "Modifiye Mayer-Scholl" olarak adlandırılan PCR ile ufak değişikliklerle düzenlenen cins spesifik Bcsp31 PCR olmak üzere toplam dört farklı yöntem uygulandı ve elde edilen sonuçlar karşılaştırıldı. Bakteriyolojik izolasyon ve identifikasyon, standart yöntem olarak kabul edilerek moleküler yöntemlerin sensitivite ve spesifiteleri hesaplandı. İnceleme örnekleri atık seviyesinde değerlendirildiğinde (n=166), Modifiye Mayer-Scholl m-PCR yöntemi için sensitivite ve spesifite değerleri sırasıyla %94,11 ve %98,76, direkt cins spesifik Bcsp31 PCR için değerler ise sırasıyla %95,29 ve %98,76 olarak tespit edildi. Tüm organ örnekleri dikkate alındığında ise (n=326), Modifiye Mayer-Scholl m-PCR yöntemi için sensitivite ve spesifite değerleri sırasıyla %85,38 ve %98,06 direkt cins spesifik Bcsp31 PCR yöntemi için sırasıyla %83,62 ve %98,06 olarak hesaplandı. Sonuç olarak, çalışmada kullanılan PCR yöntemlerinin sensitivite ve spesifite değerleri atık düzeyinde değerlendirildiğinde, "testlerin tanısal gücü yüksek", organ düzeyinde değerlendirildiğinde "klinik olarak yararlı" olduğu bulundu. Bu çalışmada yapılan değişikliklerle geliştirilen ve "Modifiye Mayer-Scholl" olarak adlandırılan yöntem ile direkt klinik örneklerden Brucella türlerine ait DNA'ların belirlenerek tür düzeyinde identifikasyonlarının tanısal gücü yüksek düzeyde yapılabileceği ortaya konuldu.

Abstract:
In this study, it was aimed to develop direct PCR methods allowing quick identification of Brucella spp. from aborted fetus samples in genus and species level and to determine the applicability of the methods. For this purpose, a total of 326 specimens consisted of 137 lungs, 137 livers and 52 fetal stomach fluid from 166 aborted ruminant fetuses were examined. In first stage, bacterial isolation and identification method (culture) and species specific m-PCR method from cultures were applied to the test samples. Also two different methods, one of them was modified in this study namely Modified Mayer-Scholl m-PCR (method A) and another one was modified with minor changes called genus spesific Bcsp31 PCR (method B) were applied to clinical samples directly. Totally four different methods were applied and their results were compared. Sensitivities and specificities of the molecular methods were calculated by considering culture as gold standard. Sensitivity and specificity for method A according to the number of fetuses were 94.11% and 98.76%, respectively. For B, sensitivity was 95.29% and specificity was 98.76%. Sensitivity and specificity for method A based on the number of organ samples were 85.38% and 98.06%, respectively. For B, sensitivity was 83.62% and specificity was 98.06%. In conclusion, when the sensitivity and specificity results of the PCR methods used in this study are evaluated based on the fetuses, the diagnostic power of the PCR methods was found to be high. When they are evaluated based on the organs, the methods were found to be clinically useful. It has been shown that direct m-PCR method called modified Mayer-Scholl developed in this study could be used at high diagnostic level for species-level identification.