Mısır patojeni fusarıum vertıcıllıoıdes fungusunun kontrolünde konak kaynaklı gen susturma yönteminin nıcotıana benthamıana'da araştırılması
Investigation of the host-induced gene silencing method in the control of fusarium verticillioides in nicotiana benthamiana
Yazar: ŞÜHEDA EBRAR YILMAZ
Danışman: DOÇ. DR. FATMA AYDINOĞLU
Gebze Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Moleküler genetik = Molecular genetic ; RNA-antisense = RNA-antisense

Özet:
Fusarium verticillioides, pek çok bitkide çürüklük hastalığına neden olarak bitki büyüme ve verimini azaltan başlıca mısır (Zea mays L.) bitkisi patojenidir. Bu tez çalışması, F. verticillioides sitokrom P450 lanosterol C-14α-demetilaz (CYP51C) geni üzerinden, RNAi tabanlı Konak Kaynaklı Gen Susturma (HIGS) yönteminin, patojen kontrolündeki potansiyelinin araştırılmasını amaçlamıştır. 
Bu çalışmada, brom mozaik virüs tabanlı vektör (BMV1/BMV3)'e fungal CYP51C geni klonlanarak Nicotina benthamiana yapraklarına agroinfiltrasyonuyla aktarılmıştır.  Bu doğrultuda, bitkinin F. verticillioides ile enfeksiyonu sırasında ektopik olarak ifade olan CYP51C geninin RNAi mekanizması ile işlenerek, endojen fungus CYP51C'nin hedeflemesi sonucu, fungusta olası büyüme inhibisyonu araştırıldı. Bunun için N. benthamiana yapraklarına agroinfiltrasyonun ardından 10⁴ konidi/ml F. verticillioides infiltre edildi. İnfiltrasyonun 72. saatinde yaprak örneklerinde gen ifadesi qRT-PCR ile belirlendi. Sonuçlar kontrole kıyasla endojen CYP51C ifadesinin yaklaşık 300 kat azaldığını gösterdi. Bununla birlikte klonlanan vektörün fungusa doğrudan agrotransformasyonunun gerçekleştirilmesiyle, fungusta meydana gelen büyüme inhibisyonunun radyal ölçümü, qRT-PCR ile gen ifadesi ve ergosterol inhibisyonuna bağlı olarak hücre içi ROS üretimi DCF-DA boyama yöntemi ile belirlendi. Fungusun doğrudan BMV1/BMV3:CYP51C ile agrotransformasyonu sonucu mock grubuna kıyasla, radyal büyümede %21 oranında azalma, hücre içi ROS miktarında yaklaşık 1,5 kat artış saptandı.
Sonuçlarımız, HIGS metodunun F. verticillioides patojeninin kontrolünde etkili bir yöntem olabileceğini ortaya koymuştur.
Fusarium verticillioides, pek çok bitkide çürüklük hastalığına neden olarak bitki büyüme ve verimini azaltan başlıca mısır (Zea mays L.) bitkisi patojenidir. Bu tez çalışması, F. verticillioides sitokrom P450 lanosterol C-14α-demetilaz (CYP51C) geni üzerinden, RNAi tabanlı Konak Kaynaklı Gen Susturma (HIGS) yönteminin, patojen kontrolündeki potansiyelinin araştırılmasını amaçlamıştır. 
Bu çalışmada, brom mozaik virüs tabanlı vektör (BMV1/BMV3)'e fungal CYP51C geni klonlanarak Nicotina benthamiana yapraklarına agroinfiltrasyonuyla aktarılmıştır.  Bu doğrultuda, bitkinin F. verticillioides ile enfeksiyonu sırasında ektopik olarak ifade olan CYP51C geninin RNAi mekanizması ile işlenerek, endojen fungus CYP51C'nin hedeflemesi sonucu, fungusta olası büyüme inhibisyonu araştırıldı. Bunun için N. benthamiana yapraklarına agroinfiltrasyonun ardından 10⁴ konidi/ml F. verticillioides infiltre edildi. İnfiltrasyonun 72. saatinde yaprak örneklerinde gen ifadesi qRT-PCR ile belirlendi. Sonuçlar kontrole kıyasla endojen CYP51C ifadesinin yaklaşık 300 kat azaldığını gösterdi. Bununla birlikte klonlanan vektörün fungusa doğrudan agrotransformasyonunun gerçekleştirilmesiyle, fungusta meydana gelen büyüme inhibisyonunun radyal ölçümü, qRT-PCR ile gen ifadesi ve ergosterol inhibisyonuna bağlı olarak hücre içi ROS üretimi DCF-DA boyama yöntemi ile belirlendi. Fungusun doğrudan BMV1/BMV3:CYP51C ile agrotransformasyonu sonucu mock grubuna kıyasla, radyal büyümede %21 oranında azalma, hücre içi ROS miktarında yaklaşık 1,5 kat artış saptandı.
Sonuçlarımız, HIGS metodunun F. verticillioides patojeninin kontrolünde etkili bir yöntem olabileceğini ortaya koymuştur.

Abstract:
Fusarium verticillioides is a major maize (Zea mays L.) plant pathogen that causes rot disease in many plants, reducing plant growth and yield. This thesis study aimed to investigate the potential of the RNAi-based Host-Induced Gene Silencing (HIGS) method in pathogen control through the F. verticillioides cytochrome P450 lanosterol C-14α-demethylase (CYP51C) gene.
In this study, the fungal CYP51C gene was cloned into the brome mosaic virus-based vector (BMV1/BMV3) and transferred to Nicotiana benthamiana by agroinfiltration. In this direction, the CYP51C gene, which is ectopically expressed during the infection of the plant with F. verticillioides, was processed with the RNAi mechanism, and possible growth inhibition in the fungus was investigated as a result of targeting the endogenous fungus CYP51C. For this purpose, N. benthamiana leaves were infiltrated with 10⁴ conidia/ml F.verticillioides after agroinfiltration. Gene expression in leaf samples was determined by qRT-PCR at 72. hour of infiltration. The results showed that endogenous CYP51C expression was reduced approximately 300-fold compared to control. However, by direct agrotransformation of the cloned vector into the fungus, radial measurement of growth inhibition in the fungus, gene expression by qRT-PCR, and intracellular ROS production due to ergosterol inhibition were determined by the DCF-DA staining method. As a result of direct agrotransformation of the fungus with BMV1/BMV3:CYP51C, 21% decrease in radial growth and an approximately 1.5-fold increase in the amount of intracellular ROS were detected compared to the mock group.
Our results revealed that the HIGS method may be effective in the control of the F. verticillioides pathogen.