Bir bitki alkaloidi olan kolşisinin cilt fleplerindeki iskemi-reperfüzyon hasarına etkisi (Deneysel çalışma)
The effect of colchicine, a plant alkaloid, on skin flaps exposed to ischemia-reperfusion injury
Yazar: ALİ KILIÇ
Danışman: DOÇ.DR. AKIN YÜCEL
İstanbul Üniversitesi / Cerrahpaşa Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2005
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery

Özet:
VII. ÖZET Özellikle serbest flep cerrahisinde karşılaşılan en önemli sorunlardan birisi de iskemi-reperfüzyon hasarıdır. Flebin kaldırılmasını takiben, vasküler pedikül kesildiği anda primer iskemi peryodu başlar. Anastomoz bittiğinde ve mikrovasküler klempler kaldırıldığında reperfüzyon evresi başlar. Eğer flebin kaldırılması ve primer iskemi evresinde problem yoksa reperfüzyon ile dokulara ulaşan kan primer iskeminin geçici etkilerini düzelterek dokuyu yeniden besler. Eğer tekrar kan akımında bir durma olursa sekonder iskemi peryodu başlar. Ve eğer tekrar kan akımı sağlanabilirse tekrar bir reperfüzyon evresi başlar. Eğer bütün bu olaylarda bir problem olursa reperfüzyon flep için öldürücü olabilir. Flep kaybının yüzdesi sekonder iskemi peryodunun süresi ile doğru orantılıdır. Nötrofiller postiskemik organ hasarının patogenezinden sorumlu tutulmuşlardır. Çeşitli çalışmalarda kas ve cilt fleplerindeki iskemi-reperfüzyon hasarının nötrofillerin cevabım regüle ederek azaltılabileceği gösterilmiştir. Fakat bu çalışmalarda kullanılan maddeler pahalı olmakla birlikte ve ciddi yan etkilere de sahip olabilirler. Bu nedenler ile ucuz, klinik olarak uygulanımı kolay bir maddenin kullanımı çok yararlı olacaktır. Bu çalışmada L-arjinin aminoasiti ve bir bitki alkaloidi olan kolşisin'in iskemi- reperfüzyon hasarına etkileri araştırıldı. Çalışmada denek olarak ağırlıkları 200-250 gram olan 55 adet dişi Sprague- Dawley cinsi sıçan kullanıldı. Bütün hayvanlarda Petry ve Wortham tarafından tanımlandığı şekilde 3x5 cm boyutlarında epigastrik ada flepleri kaldırıldı. 25Epigastrik pedikülün proksimal ve distalinde femoral arter ve ven diseke edilerek bütün kas perforanları kesildi. Distal femoral arter ve ven 6/0 trofîlen dikiş ile bağlandı. Proksimal femoral arter ve vene Vascu-statt marka 20-25 gram basınç uygulayan mikrovasküler klemp iskemi başlangıcında yerleştirildi ve reperfuzyon başlangıcında çıkarıldı. Flepler 5/0 trofilen dikişler ile verici alana tekrar sürüre edildi. 10 saatlik iskemi sonrası hayvanlara tekrar anestezi uygulandı ve klempler çıkarıldı. Pediküller cerrahi lup altında incelenerek flep reperfuzyonu acland kritelerine göre değerlendirildi64. Hayvanlar 5 gruba ayrıldı; 1. Sham grubu, n=7 2. Kontrol grubu(l mi normal izotonik % 0.9 NaCl), n=12 3. L-arjinin (300 mg/kg=1.7 mM/kg), n=12 4. Kolşisin(l mg/kg= 1.7 mM/kg), n=12 5. L-arjinin(300 mg/kg)+Kolşisin(l mg/kg), n=12 Reperfüzyondan 30 dakika önce, normal salin(l mi), L-arjinin(300 mg/kg), kolşisin (lmg/kg), ve L-arjinin +kolşisin intraperitoneal olarak enjekte edildi.. Sham grubunda flepler kaldınldı ve iskemi uygulanmadan yerlerine tekrar adapte edildi. Reperfuzyon sonrası 12. saatte fleplerin ortasından 3 mm lik tam kalınlıkta punch biyopsi alındı. Biyopsi materyalleri %10'luk formalin içinde saklandı ve hematoksilen ve eosin boyalan ile boyandı. 4 mikron kalınlığındaki kesitler 400 'lük büyültmede incelendi. Random ve kör değerlendirme ile 20 random sahadaki nötrofîl miktarı sayıldı. Flepler 7 gün takip edildi. Flebin 26nekroz olan alanı flebin total alanına bölünerek nekroz olan alan yüzdesi hesaplandı. Beklendiği üzere sham gurubunda nekroz oranı % 0 idi. Öte yandan konrol grubundaki ortalama flep nekroz oram % 51.0 idi. Sadece L-arjinin verilmiş hayvanların Heplerinde ortalama nekroz oranı %12.4 idi. Sadece kolçisin uygulanan hayvanların fleplerindeki ortalama nekroz oranı %11.1 idi. Kolçisin+L-arjinin uygulanan hayvanların fleplerindeki ortalama nekroz oram %6.5 idi. Sadece L-arjinin verilen grupta nekroz oranı kontrol grubuna göre istatiktiksel olarak azalmış bulundu( p<0.001). Sadece Kolşisin verilen grupta nekroz oranı kontrol grubuna göre istatistiksel olarak azalamış bulundu(p<0.001). Sadece Kolşisin verilen grupta nekroz oram sadece L-arjinin verilen gruba göre azalmış bulundu fakat bu azalma istatistiksel olarak anlamlı değildi(p>0.05). L-arjinin+Kolşisin verilen grupta nekroz oram kontrol grubuna göre istatistiksel olarak azalmış bulundu(p<0.001). L-arjinin+Kolşisin verilen grupta nekroz oranı sadece L-arjinin verilen gruba göre istatistiksel olarak azalamış bulundu(p<0.05). L-arjinin+Kolşisin grubunda nekroz oranı sadece Kolşisin verilen gruba göre azalmış bulundu fakat bu azalma istatistiksel olarak anlamlı değildi(p>0.05). 27Sham grubunda ortalama nötrofil sayısı 4.6, kontrol grubunda 19.3, sadece L- arjinin verilen grupta 7.08, sadece Kolşisin verilen grupta 7.33, L- arjinin+Kolşisin grubunda 3.5 olarak bulundu. Sadece L-arjinin verilen grupta ortalama nötrofil sayısı kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmış bulundu(p<0.001). Sadece L-arjinin verilen grupta ortalama nötrofil sayısı sadece kolşisin verilen gruba göre azalmış bulundu fakat bu azalma istatistiksel olarak anlamlı değildi(p>0.05). Sadece kolşisin verilen grupta ortalama nötrofil sayısı kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmış bulundu(p<0.001). L-arjinin+Kolşisin verilen grupta ortalama nötrofil sayısı kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmış bulundu(p<0.001). L- arjinin+Kolşisin verilen grupta ortalama nötrofil sayısı sadece L-arjinin verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmış bulundu(p=0.005). L- arjinin+Kolşisin verilen grupta ortalama nötrofil sayısı sadece Kolşisin verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmış bulundu(p<0.005). Bu sonuçlar ışığında kolşisin nötrofîllerin iskemi-reperfuzyon hasarmdaki fonksiyonlarım inhibe ederek kendi basma veya L-arjinin ile birlikte kullanıldığında iskemi-reperfuzyon hasarım azalttığı bulunmuştur. 28

Abstract:
VIII. SUMMARY One of the most important problems encountered in free flap surgery is ischemia-reperfiision injury. Following flap elevation, primary ischemia begins whenever the surgeon transects the vascular pedicle. When the anastomosis is finished and the microvascular clamps are removed, the period of flap reperfusion starts. If the events during flap elevation and primary ischemia were not problematic, the blood reflow after anastomosis will be nutritive and will reverse the transient derangement of primary ischemia. If a second interruption in blood flow occurs, the flap will enter a phase of secondary ischemia; if reestablishement is successful, the flap will also enter another reperfusion phase. If events are problematic, reperfusion may be lethal for the flap. Rates of the flap failure increase with greater duration of secondary ischemia. Neutrophils have been implicated in the pathogenesis of postischemic organ injury. Several studies have demonstrated that modulating the neutrophil response to ischemia-reperfusion injury in muscle and skin flaps can decrease the extend of the injury. Many of the substances used in this studies are expensive and may have significant side effects. For this reason a nontoxic, inexpensive, clinically applicable substance that can protect against neutrophil- mediated ischemia-reperfusion injury would be useful for surgical procedures that may be affected by reperfusion injury. In this study the effect of L-arginine which is an aminoacide and cholchicine which is a plant alcaloid on ischemia-reperfusion injury is studied. 29In the study 55 Sprague-Dawley rats weighting 200-250 gram were used. In all animals an epigastric island flap defined by Petry and Wortham measuring 3x5 cm is harvested. All muscle perforators are transected and femoral artery and vein proximal and distal to pedicle are disected. Then distal femoral artery and vein are ligated by 6/0 prolene suture. A microvascular clamp applying 20-25 gram pressure is applied to the proximal femoral artery and vein at the beginning of ischemia and removed at the beginning of reperfusion. Flaps are resutured to their place with 5/0 prolene suture. After 10 hours of ischemia the rats are reanesthesized and microvascular clamps are removed. Pedicles are examined under the loop magnification and evaluated according the Acland criterias. Tha animals are divided to 5 groups; 1. Sham group, n=7 2. Control group(l ml normal isotonic % 0.9 NaCl), n=12 3. L-arginine (300 mg/kg=1.7 mM/kg), n=12 4. Colchicine^ mg/kg= 1.7 mM/kg), n=12 5. L-arginine(300 mg/kg)+colchicine(l mg/kg), n=12 30 minutes before reperfusion 1 ml of normal saline, 300mg/kg L-arginine, 1 mg/kg Colchicine and L-arginine+Colchicine combination is injected intraperitoneally. In group of Sham the flaps are harvested and readapted to its place again without applying ischemia. 12 hours after the onset of reperfusion a punch biopsy measuring approximately 3x3 mm is taken from the center of each flap. They are preserved in 10% formalin solution, dyed with hematoxylen and 30eosin dyes. 4 micron sections of biopsy specimens are examined under 400 times magnification. Neutrophil counts in 20 random field are calculated in a random and blinded fashion. The flaps are followed for 7 days. The percentage of necrotic area is calculated by dividing the necrotic area to total area of flap. As expected, the average percentage of flap necrotic area in sham group was 0%. On the other hands, the average percentage of flap necrotic area in control group was 51%. In L-arginine group, the average percentage of flap necrotic area was 12.4%. In colchicine group, average percentage of flap necrotic area was 11.1%. The average percentage of flap necrotic area in colchicine+L- arginine group was 6.5%. Compared to control group, the average percentage of flap necrotic area in L- arginine group was decreased statistically(p<0.001). Compared to control group, the average percentage of flap necrotic area in Colchicine group was decreased statistically(p<0.001). Compared to L-arginine group, the average percentage of flap necrotic area in Colchicine group was decreased but this was not statistically significant(p>0.05). Compared to control group, the average percentage of flap necrotic area in L- arginine+Colchicine group was decreased statistically(p<0.001). Compared to L-arginine group, the average percentage of flap necrotic area in L- arginine+colchicine group was decreased statistically(p<0.05). Compared to colchicine group, the average percentage of flap necrotic area in L- 31arginine+colchicine group was decreased but this was not statistically significant(p>0.05). The mean neutrophil count(MNC) was 4.6 in sham group, 19.3 in control group, 7.08 in L-arginine group, 7.33 in colchicine group and 3.5 in L- arginine+Colchicine group. Compared to control group, MNC in L-arginine group was decreased statistically(p<0.001). Compared to Colchicine group, MNC in L-arginine group was decreased but this was not significant statistically(p>0.05). Compared to control group, MNC in Colchicine group was decreased statistically(p<0.001). Compared to control group, MNC in L-arginine+Colchicine group was decreased statistically(p<0.001). Compared to L-arginine group, MNC in L- arginine+Colchicine group was decreased statisticaHy(p=0.005). Compared to Colchicine group, MNC in L-arginine+Colchicine group was decreased statistically(p<0.005). According to these results, Colchicine decreases the consequences of ischemia- reperfusion injury itself or in combination with L-arginine by inhibiting functions of neutrophils in ischemia-reperfusion injury. 32