Farklı semen konsantrasyonlarında yapılan sperm kriyoprezervasyonunun sperm canlılığı ve DNA fragmantasyonuna etkisi
The effect of sperm cryoprezervation in different semen concentrations on sperm vivity and DNA fragmentation
Yazar: ZEYNEP ÖNER
Danışman: PROF. DR. MURAT AKKUŞ
Biruni Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Klinik Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Akridinler = Acridines ; DNA = DNA ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Meni = Semen ; Sperm = Spermatozoa

Özet:
Erkek faktörü infertil çiftlerin yaklaşık %20'sinde esas neden olarak geçmektedir. Her iki tarafın birlikteliği dahil edildiğinde ise bu oran %30-%40'lara çıkmaktadır. Günümüzde, erkek infertilitesinin testinde rutin semen analizi kullanılmaktadır. Fakat infertil erkeklerin dahi yaklaşık olarak yüzde 15'inde semen analizinin sonuçlarına bakılarak infertilitenin kesin tanısı yapılamamaktadır. Dolayısıyla fertil ve infertil erkeği semen analizi haricinde kesin olarak birbirinden ayıracak, gebe kalınıp kalınmadığını anlayabilmek için farklı deneylere ihtiyaç artmıştır ve konuyla ilgili sperm DNA bütünlüğü üzerine yoğunlaşmıştır.
Sperm DNA hasarlarıının infertil erkeklerde fertil erkeklere nazaran daha çok olduğu ve spermlerdeki DNA hasarının bu bireylerde fertilite oranını eksi yönde etkilediği çalışmalar sonucu belirlenmiştir. Sayının düşük olması, motilite ve normal olmayan yapı gibi bozuk semen etkenleri, çoğunlukla yüksek sperm DNA hasarı ile varlık göstermekte olup sadece normal semen özelliklerine mahsup bireylerin yüzde 8'inde sperm DNA hasarı olduğu da kanıtlanmıştır. Tüm bunlara ilaveten, hasar görmüş DNA'ya sahip spermlerin intrastoplazmik sperm enjeksiyonunda (ICSI) kullanımına bağlı olası sonuçları noktasında tereddütler mevcuttur.
Farklı iç veya dış sebeplerden ötürü DNA yapısında farklı düzeyde hasarlar ortaya çıkmaktadır. DNA yapısında meydana gelen bu hasarların bazıları şunlardır; kromatin içyapısının bozulması, DNA bazlarının oksidasyonu, yanlış eşleşmesi ve tubulin polimerizasyonun baskılanması, bazların kimyasal olarak değişmesi, kromatin yapısındaki anomaliler, DNA zincirinin kırılması, DNA-DNA ve DNA-protein çaprazlaşmaları, DNA da mutasyonlar gibi bir takım yapısal değişimlerdir.
Sperm kriyoprezervasyonu olarak adlandırılan bu yöntem üreme bozuklukları sonucu yardımcı tedavilerde sıklıkla kullanılan bir metoddur. Dondurma ve tekrar çözdürme aşamalarının ardından hedeflenen nokta spermlerinin en az şekilde zarar görmesidir. Çalışmamızda Biruni Üniversite Hastanesi Üroloji Polikliniğine 2018-2019 tarihleri arasında başvuran 18-50 yaş arası 33 erkek hastadan rutin semen analizi sonrası atık numune ile çalışma yapılması planlandı. Farklı semen konsantrasyonlarda sperm kriyoprezervasyonunun sperm canlılığı ve sperm DNA fragmantasyonu üzerine etkisini araştırmak amacıyla, öncelikle çalışmaya dahil edilecek tüm hastalara Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ-WHO) kriterlerine göre standart semen analizi yapılarak sperm konsantrasyonu, motilite ve morfoloji değerlendirildi. Sperm canlılık oranı tespiti için eozin boyama yapılarak ışık mikroskobunda değerlendirildi. Sperm DNA fragmantasyonu üzerine etkisini araştırmak için yayma preparat hazırlanarak 1/3 asetik asit methanol karışımında 30 dakika oda sıcaklığına veya -40 derecede (buzdolabında) fikse edilerek akridin oranj boyama yapıldı ve immunofloresans mikroskobuyla Biruni Üniversitesi tarafından desteklenendi.

Abstract:
In about 20% of infertile couples, the male factor is the main cause. If the combination of male and female factors is included, this rate is reached to 30% -40%. Nowadays, routine semen analysis is used to evaluate male infertility, but in 15% of infertile men, despite the results of normal semen analysis, the definitive diagnosis of infertility cannot be established by routine semen analysis. Therefore, the need for new markers to differentiate between fertile and infertile men and predict the outcome of pregnancy has increased and attention has been focused on sperm DNA integrity.
It has been proven that sperm DNA damage is more common in infertile men than fertile men and that sperm DNA damage negatively affects fertility potential in these patients. Impaired semen parameters such as low number, motility, and abnormal morphology are often associated with high sperm DNA damage, but in patients with normal semen parameters In addition, there are concerns about the potential consequences of the use of sperm with damaged DNA in intrastoplasmic sperm injection (ICSI).
There are different levels of damage to DNA due to various internal and external causes. The main damages in DNA are; degradation of chromatin structure, oxidation of DNA bases, mismatch and suppression of tubulin polymerization, chemical change of bases, anomalies in chromatin structure, breakage of DNA chain, DNA-DNA and DNA-protein crossings, DNA and DNA mutations.
Sperm cryopreservation is a frequently used method in assisted reproductive therapy. After thawing, it is the target that sperms are damaged at least. In our study; The aim of this study is to investigate whether there is a change in sperm DNA condensation after sperm freezing thawing process, to determine whether this change is correlated with decreasing motility, and also to investigate whether semen raw state or post-wash ice cream has an effect on motility, morphology and DNA condensation.
In our study, 33 male patients aged between 18-50 years who applied to Biruni University Hospital Urology Outpatient Clinic were planned to work with waste sample after routine semen analysis. In order to investigate the effect of sperm cryopreservation at different semen concentrations on sperm viability and sperm DNA fragmentation, first semen analysis was performed according to World Health Organization (WHO) criteria for all patients to be included in the study and sperm concentration, motility and morphology were evaluated. For the determination of sperm viability, eosin staining was performed and evaluated under light microscope. In order to investigate the effect on sperm DNA fragmentation, smear was prepared by fixing 1/3 acetic acid in methanol mixture for 30 minutes at room temperature or -40 degrees (refrigerated) and stained with acridine ratio and supported by Biruni University with immunofluorescence microscope.