Bir yıldan uzun süreli antiviral ilaç kullanan kronik hepatit b hastalarında direnç mutasyonlarının saptanması
Detection of resistance mutations in chronic hepatitis b patients who were receiving antiviral therapy for over one year.
Yazar: SİBEL AYDOĞAN
Danışman: PROF. DR. A. DÜRDAL US
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antiviral ajanlar = Antiviral agents ; DNA = DNA ; Enfeksiyonlar = Infections ; Hepatit B = Hepatitis B ; Mutasyon = Mutation ; İlaç kullanımı = Drug utilization ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Hepatit B virusu (HBV), tüm dünyada yaygın olarak görülen önemli bir viral hepatit etkenidir. HBV taşıyıcıları kronik hepatit, siroz ve hepatoselüler karsinoma gibi ciddi komplikasyonlar nedeniyle risk altındadırlar. Kronik hepatit B (KHB) enfeksiyonunun tedavisi etkin antiviral ilaçlarla mümkündür; ancak viral genomda ortaya çıkan ve ilaç direncine neden olan mutasyonlar, tedavinin klinik etkinliğini olumsuz yönde etkilemektedir. Bu nedenle ilaca dirençli mutantların erken dönemde tespiti, tedavinin yönlendirilmesi açısından önemlidir. Bu çalışmada, tedavi uygulanan KHB olgularında, ilaç direncinden sorumlu ana mutasyonların, genotipik yöntemler olan DNA dizi analizi (DA) ve ters hibridizasyon temeline dayalı ?Line Prob? yöntemi (LiPA) (Inno-Lipa HBV DRv2, Innogenetics, Belçika) ile araştırılması ve mutasyonların saptanmasında bu iki yöntemin performanslarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları Anabilim Dalı Gastroenteroloji Ünitesi'nde KHB tanısı ile takip edilen ve bir yıl ve/veya daha uzun süre lamivudin (LVD) tedavisi alan 38 hastaya ait serum örneği, bilgilendirilmiş onam alınarak dahil edilmiştir. Hastaların kadın erkek oranı 14/24, yaş ortalamaları ise 39.7±2.51 yıl (13-65) olarak belirlenmiştir. On hasta örneği, düşük DNA düzeyi (<1000 kopya/ml) nedeniyle DA çalışmasına alınamamış; altı örnek ise, tekrarlayan uygulamalarda sonuçların değerlendirilememesi nedeniyle çalışma dışı bırakılmıştır. LiPA yönteminde ise, test kapsamında tüm hasta örneklerine uygulanan konsensus PCR pozitif örnekler değerlendirilmiştir. Buna göre çalışmada, toplam 38 hastanın 22'sinde DA yöntemi ile, 25'inde ise LiPA yöntemi ile mutasyon analizi yapılmıştır. DA ile değerlendirilen 22 örneğin 7'sinde, antiviral ilaç direnci ile ilişkili mutasyonlar saptanmıştır. Tekli mutasyon saptanan örnekler; 2 olguda Q215S (adefovir [ADV]-sekonder), 1 olguda N236T (ADV-primer) ve 1 olguda M204I (LVD-primer) şeklindedir. İki ve daha fazla mutasyon belirlenen örnekler ise; 2 olguda L180M+M204I (LVD primer ve onarıcı mutasyonları) ve 1 olguda L180M+M204V+ S202G (LVD+entekavir [ECV] primer ve onarıcı mutasyon) olarak gözlenmiştir. LiPA testi ile, çalışılan 25 olgunun 6'sında LVD'e direnç oluşturduğu bilinen primer ve onarıcı mutasyonlar (2 örnekte L80V/I+M204I, 2 örnekte L80I+L180M+M204I, 1 örnekte L180M+M204I ve 1 örnekte L80I+M204I) birarada saptanırken, 1 olguda LVD direnciyle ilişkili bir primer mutasyon (M204V) belirlenmiştir. Hiçbir hasta örneğinde ADV direncine neden olan mutasyon izlenmemiştir. DA yönteminde LiPA testinde saptanan dirençle ilişkili tüm primer mutasyonlar saptanmış; ek olarak LiPA testinde yer verilmeyen ECV direnci ile ilişkili bir mutasyon (S202G) daha gözlenmiştir. DA testi ile N236T mutasyonu saptanan bir örnekte ise LiPA testinde M204V mutasyonu izlenmiştir. Sonuç olarak, HBV antiviral ilaç direnci ile ilgili mutasyonların saptanmasında DA ve LiPA yöntemleri ile, bir hasta örneği dışında uyumlu sonuçlar alınmıştır. LiPA testi uygulama ve değerlendirme aşamalarında daha pratik bir yöntem olarak değerlendirilmiştir. Saptananan ilaç direnci mutasyon profillerinin literatür sonuçları ile benzerlik gösterdiği de izlenmiştir. Çalışmamız, üniversitemizde bu konuda yapılan ilk çalışma olup, elde edilen bulguların bundan sonraki çalışmalar için bir temel oluşturacağı düşünülmektedir.Anahtar kelimeler: Hepatit B virus, antiviral ilaç direnci, DNA dizi analizi, Inno-Lipa testi.

Abstract:
Hepatitis B virus (HBV) is a frequent and globally-distributed cause of viral hepatitis and infected individuals are under increased risk for chronic hepatitis B (CHB), cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The suppression of HBV replication can be achieved via antiviral therapy but the efficacy of such treatment is significantly affected by the emergence of resistant HBV strains due to point mutations in the viral genome. Therefore, the early identification of resistant strains is crucial for optimal antiviral therapy. In this study, primary mutations conferring HBV antiviral resistance and associated secondary/compensatory mutations have been investigated by DNA sequencing (SEQ) and a commercial Line Probe Assay (LiPA) (Inno-Lipa HBV DRv2, Innogenetics, Belgium). A total of 38 subjects under follow-up for CHB and receiving lamivudine (LVD) therapy for one year or longer at the Hacettepe University Faculty of Medicine, Department of Internal Medicine, Gastroenterology Unit have been included in the study with informed consent. Male to female ratio and mean age was noted as 24/14 and 39.7±2.51 (13-65) years, respectively. Ten samples were excluded from SEQ due to low viral load (<1000 copies/ml) and 6 samples could not be interpreted due to insufficient results. All samples with a positive consensus PCR were further analysed via LiPA, as directed by the manufacturer. Therefore a total of 22 and 25 samples could be evaluated via SEQ and LiPA assays, respectively. In 7 of the 22 samples evaluated via SEQ, primary and secondary mutations associated with resistance were identified. Single point mutations observed in SEQ comprise Q215S (adefovir [ADV]-secondary) in 2, N236T (ADV-primary) in 1 and M204I (LVD-primary) in 1 sample(s). Multiple mutations that comprise L180M+M204I (LVD primary + compensatory) in 2 and L180M+M204V+S202G (LVD + entecavir [ECV] primary + compensatory) in 1 samples have also been identified via SEQ. In LiPA, LVD resistance-associated primary and secondary mutations (L80I+L180M+M204I in 2, L80V/I+M204I in 2, L180M+M204I in 1 and L80I+M204I in 1) have been observed in 6 out of 25 samples. In one sample, a primary mutation associated with LVD resistance (M204V) was also identified in LiPA. No specific mutation for ADV resistance have been recognized by LiPA assay. SEQ further revealed another mutation associated with ECV resistance (S202G) which is not included in the LiPA method. Discordant results were identified in a single sample, where SEQ revealed a N236T mutation and LiPA result interpreted as M204V mutation. As a result, SEQ and LiPA displayed comparable performances for the detection of HBV drug resistance mutations and LiPA was interpreted as being more practical for the diagnostic laboratory. Being the pilot study for our institution, the results from this work will surely provide a basis for future diagnostic and research surveys.Keywords: Hepatitis B virus, antiviral drug resistance, DNA sequencing, Inno-Lipa assay.