Sıçanlarda allogreft rejeksiyonunun yağ doku kökenli mezenkimal kök hücre ile immun modülasyonu
Immun modulation of allograft rejection BY adipose derivated mesencymal stem cells in rats
Yazar: BİLGE ANIL TOSYALIOĞLU
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA YILMAZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Gref reddi = Graft rejection ; Kök hücreler = Stem cells ; Sıçanlar = Rats ; Transplantasyon = Transplantation ; Transplantasyon-otolog = Transplantation-autologous ; Transplantlar = Transplants

Özet:
Amaç ve Hipotez
Doku kaybı ile oluşan fonksiyonel ve estetik deformiteler için ilk rekonstrüksiyon seçeneği otolog rekonstrüksiyonlardır. Otolog rekonstrüksiyon seçenekleri tükendiğinde, yüz ve ekstremitelerde oluşan defektlere yönelik protez ve epitez uygulamaları kullanılmaktadır. İnsanlarda kompozit içerikli allogreft transplantasyonu fonksiyonel ve estetik rekonstrüksiyon için alternatif bir yöntem olarak değerlendirilmektedir. Uygun endikasyonlar sağlandığında, sınırlı sayıda ve seçilmiş vakalarda alternatif rekonstrüksiyon seçeneği olarak vaskülarize kompozit doku nakli (VCA) insanlarda tüm dünyada uygulanmaya başlamıştır. Hayat boyu idame immunsüpresif tedavi gerektirmesi ve immunsüpresif ilaçların yan etkileri nedeni ile etkili bir rekonstrüksiyon seçeneği olarak kullanılamamaktadır. Split tolereans VCA'nın farklı içerikte dokularının farklı zamanlarda ve hızlarda rejekte edilmesidir. Deri VCA'nın en antijenik yapısı olmakla beraber deriye yönelik yüksek antijenik alloimmun yanıt mevcuttur. VCA'larda önemli bir bariyerdir. Deriye yönelik split tolerans kavramı ile ilgili deneysel çalışmalarının başladığı 1950'li yıllardan bu yana çok sayıda çalışma yapılmış olmasına rağmen split tolerans kavramı halen aşılamamıştır. Günümüzde bu nedenle allogreft rejeksiyonunu önlemeyi amaçlayan, immunsüpresif ajanların dozunu minimize eden immun modülasyon yöntemleri ve tolerans indüksiyon stratejileri üzerinde deneysel çalışmalar yapılmaktadır. 
Bu çalışmada yağ doku kökenli mezenkimal kök hücre (ADAS), immun modülatuar özelliklerinin etkin olduğu yönünde yayınların yapılması, kemik iliği kökenli MSC (BMSC) ile aynı immun modülatuar özelliklerinin olduğunun deneysel olarak gösterilmesi, daha kolay ve çabuk elde edilebilmesi nedeni ile bir tolerans indüksiyon stratejisi ve immun modülasyon yöntemi olarak kemik iliği kökenli MSC'ye alternatif olarak düşünülmüştür. Donör kökenli ADAS'ların intravenöz (IV), lokal subkutan (SC), IV ve SC uygulamasının allogreft rejeksiyon sürecine ve allogreft yaşam süresine olan in vivo immun modülatuar etkileri araştırılmıştır. Deriye yönelik split tolerans kavramına immun modülatuar strateji oluşturmak amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem
Deney modelimizde n= 21 Lewis (inbred) sıçan ve n=14 Brown Norway (inbred) sıçan, ortalama 8-12 haftalık, 300-350 gram (gr.), alıcı ve donör olarak kullanıldı. Hayvanlar beş gruba ayrıldı.
Kontrol grupları:
Grup 1: Otogreft (negatif kontrol) 
Grup 2: Allogreft (pozitif kontrol) 
Tedavi grupları:
Grup 3: Allogreft ve SC ADAS tedavisi
Grup 4: Allogreft ve IV ADAS tedavisi
Grup 5: Allogreft ve IV ve SC ADAS tedavisi
Grup II- IV-V'ten ADAS üretimi için yağ grefti alındı. ADAS eldesini takiben greft cerrahisine geçildi. Grup I'de otogreft uygulaması, Grup II-III-IV-V'te allogreft uygulaması yapıldı. Tedavi gruplarında alıcıya, IV ve allogreft yatağına lokal SC donör kökenli ADAS tedavisi uygulandı. Grup III'te sadece SC, Grup IV'te IV (intravenöz) ve Grup V'te IV (intravenöz) ve SC ADAS tedavisi yapıldı. Tüm denekler greft cerrahisinin yapıldığı günden itibaren günlük takibe alındı. Greft rejeksiyonu görsel takipleri günlük yapıldı. Tüm deneklerden yedinci günde patolojik örnekler alındı. Patolojik örneklerde Banff skorlamasına göre rejeksiyon patolojisi ve derecesi bakıldı. Dil boyası ile immunfluoresan altında kök hücre görüntülemesi için patolojik kesitlerde inceleme yapıldı.
Bulgular ve Sonuç
Donör kökenli ADAS tedavisi immun defisiti olmayan sıçanlarda, immunsüpresif ajan kullanılmadan yapılan deri allogrefti uygulamasında allogreft yaşam süresini lokal SC uygulama, IV uygulama ve SC+IV uygulamayla anlamlı olarak uzatmış, tüm gruplarda rejeksiyon süresini geciktirmiştir. Tek başına donör kökenli SC ADAS tedavisi alan grupta en yüksek ortalama allogreft yaşam süresi saptanmıştır. Tek başına donör kökenli IV ADAS tedavisi erken dönemde allogreft yaşam süresini anlamlı olarak uzatmıştır. Fakat tek başına IV donör kökenli ADAS tedavisi alan grupta geç dönemde allogreft rejeksiyonu sadece SC ve IV+ SC donör kökenli ADAS tedavisi alan gruplara göre anlamlı olarak daha erken gerçekleşmiştir. IV ADAS tedavisi geç dönemde allogreft yaşam süresini sadece SC ve IV+SC ADAS tedavisi alan gruplara göre anlamlı şekilde azaltmıştır.
Anahtar Kelimeler: Allogreft rejeksiyonu, yağ doku kökenli mezenkimal kök hücre, immun modülasyon, sıçan.

Abstract:
Project Title
Immun modulation of Allograft Rejection by Adipose Derivated Mesencymal Stem Cells in Rats
Background and Hypothesis
The first reconstructive option for functional and aesthetic deformities that occur with tissue loss is autologous reconstruction. When autologous reconstruction options limited, prostheses and epitheses are used for the defects that occur in the face and extremities. Vascularized composite tissue allotransplantation (VCA) in humans is considered to be an alternative reconstruction method for functional and aesthetic deformities. VCA can be used in selected cases despite lifelong immunosuppressive treatment and side effects. When appropriate indications are provided, in a limited number of cases in humans, VCA is a new treatment option and is performed by surgeons all over the world. VCA requires lifelong immunosuppressive therapy and these immunosuppressive drugs have side effects. Therefore VCA can not be used as an effective alternative reconstruction option. 'Split rejection' suggests that various tissues in VCA will reject at different times and rates. Skin component of VCA is highly antigenic. Antigenic response to skin is an important barrier for VCA. Experimental studies about split tolerance to skin began in the 1950s. There are many experimental studies in this regard. Nevertheless, split tolerance is still not preventable. Therefore, immune modulation and various tolerance induction strategies are performed to prevent allograft rejection in experimental studies. The purpose of these studies is to prevent and modulate alloimmune rejection, to minimize immune suppressive drugs and side effects with various tolerance induction strategies.
Mesenchymal stem cells (MSCs) posses immunomodulatory properties demonstrated in vivo and in vitro studies. On the basis of these studies MSCs therapy is used to prolong the allograft survival as a tolerance induction strategy in experimental animal studies. In vitro and in vivo studies demonstrated that ADASs has immunomodulatory properties seems like bone morrow derivated MSC (BMCS). It is easy and quick to obtain ADAS instead of BMSC. ADAS can be an alternative immunmodulatory therapy.
In this study we evaluated in vivo immunomodulatory effects of donor derivated IV and SC ADAS therapy on allograft rejection episode and allograft survival. The purpose of the study is to suggest an immunomodulatory strategy for split tolerance to skin allograft.

Materials and Methods
In this experiment; n = 21 Lewis (inbreed) and n = 14 Brown Norway rats, (inbreed) meanly 8-12 week, 300-350 gr, were used as recipients and donors. Animals divided into five groups.
Control Groups:
Group 1: Autograft (negative control) 
Group 2: Allograft (positive control)
Treatment Groups:
Group 3: Allografts and SC ADAS therapy
Group 4: Allograft and IV ADAS therapy
Group 5: Allograft IV and SC ADAS therapy
Fat graft was obtained from Group II-IV-V to derivate ADAS. After we started autograft and allograft surgery. Autograft surgery was performed to Group I. Allograft surgery was performed to Group II-III-VI-V. We treated the recipient with IV and locally administered SC ADAS therapy. We treated Group III with SC ADAS, Group IV with IV ADAS, Group V with IV and SC ADAS. All the grafts were taken postoperative care and were daily observed. We obtained pathology samples from all the groups at the day of seven. We evaluated grade of rejection pathology (The Banff 2007). We observed ADAS under the immune fluorescent dye with the labeled cell detection method on pathologic sections on the day of seven.

Results and Conclusion
According to the results, IV and locally SC administered donor derivated ADAS therapy significantly prolonged allograft survival as a tolerance induction strategy without using immunosuppressive therapy in immunocompetence rats. Group III that we only used locally administered SC ADAS therapy alone for immune modulation has the longest graft survival time. IV (intravenous) administered ADAS therapy prolonged the allograft survival although allorejection occurred significantly earlier in Group IV that we administered IV ADAS therapy when we compared to the Group III-V that we administered SC and IV+SC ADAS therapy. IV ADAS therapy significantly decreased the allograft survival in later phases of allotransplantation when we compared to the Group III-V that we administered SC and IV+SC ADAS therapy.

Keywords: Allograft rejection, adipose derivated mesencymal stem cell, immun modulation, rat