Meme karsinomlarında CTLA-4, PD-1 ve LAG-3 ekspresyonları ile tümör içi lenfosit skorunun prognoza etkisi
Prognostic significance of tumor infiltrating lymphocytes with CTLA-4, PD-1, and LAG-3  expression in breast carcinomas
Yazar: SİDAR BAĞBUDAR
Danışman: DOÇ. DR. SEMEN ÖNDER
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Onkoloji = Oncology ; Patoloji = Pathology
Dizin: Antijenler = Antigens ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Gen ifadesi = Gene expression ; Karsinoma = Carcinoma ; Lenfositler = Lymphocytes ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; PD-L1 = PD-L1 ; Prognoz = Prognosis

Özet:
Amaç: İnvaziv meme karsinomu tüm dünyada kadınlarda en sık görülen kanser olup kansere bağlı ölümlerde 4. sırada yer almaktadır. Bu sebeple hastalığın klinik gidişinin belirlenmesi son derece önemlidir. Klinik gidişin ve hastaya uygun tedavinin belirlenmesi amacıyla her meme karsinomu olgusunda histolojik grad, hastalık evresi, histolojik ve moleküler alt tip tayini yapılmaktadır. Günümüzde tedaviye yön verecek alternatif seçenekler aranmaya çalışılmaktadır. Bu seçeneklerden biri de tümöre yanıt olabilecek immün sistem üzerinden yürümektedir. İmmün yanıtı oluşturan elemanlar -tümör içi lenfositler (TİL) başta olmak üzere- hastalık prognozunu ve immünoterapi için hasta uygunluğunu belirlemede önemli biyobelirteçlerdir. Bu sebeple TİL skorlaması, rutin histopatolojik raporlamanın bir parçası olmalıdır. İmmün kontrol noktası moleküllerinden biri olan sitotoksik T lenfosit antijen 4'ün (CTLA-4) meme kanserinde ekspresyonunun fazla olması kötü prognoz belirteci olarak tespit edilmiştir. Tümör mikroçevresindeki lenfositlerde CTLA-4 ekspresyonunun fazla olması ise, eğer tümörde ekspresyon düşükse iyi prognozla ilişkili bulunmuştur. B7/CD28 ko-faktör ailesinin üyesi bir transmembran proteini olan programlı hücre ölüm proteini-1 (PD-1), ligandları PD-L1ve PD-L2 ile etkileşime geçtiğinde anti-tümör T hücre aktivitesini baskılar ve tümörün immün sistemden kaçışını kolaylaştırır. Yapılan çalışmaların çoğunda meme kanserinde lenfositlerdeki PD-1 pozitivitesi -bazı çelişkili çalışmalar olmakla birlikte- iyi klinik gidiş ile ilişkilendirilmiştir. Hatta bazı çalışmalarda lenfositlerdeki PD-1 pozitivitesinin bağımsız prognostik faktör olduğu gösterilmiştir. Diğer bir immün kontrol noktası moleküllerinden biri olan lenfosit aktivasyon geni 3 (LAG-3) eksprese eden hücreleri azaltmayı hedefleyen anti-LAG-3 antagonistleri, otoimmün hastalıkların tedavisinde kullanılmasının yanı sıra sonraki klinik gelişmeler kanser immünoterapisinde de kullanılabileceğinin anlaşılmasını sağlamıştır. Yapılan çalışmalarda meme kanserindeki LAG-3 pozitivitesinin genel ve hastalıksız sağ kalımı arttırdığı tespit edilmiştir. 
Çalışmamızda geçmişte host defans faktörü (HDF) pozitif bulunmuş olgularda TİL skoru oluşturarak, TİL skoru, CTLA-4, PD-1 ve LAG-3 ekspresyonlarının prognoz ile ilişkisini belirlemeyi ve bu belirteçleri kullanarak prognozu öngörmeyi amaçlamaktayız.
Gereç ve Yöntem: İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Genel Cerrahi Anabilim Dalı ve İstanbul Üniversitesi Onkoloji Enstitüsü Genel Cerrahi servisi arşiv kayıtlarından, Ocak 2009-Aralık 2013 tarihleri arasında meme tümörü nedeniyle opere olmuş hasta kayıtlarına ulaşıldı. Oluşturulan listeler İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı'na ait bilgisayar ortamında oluşturulmuş arşiv kayıtları ile karşılaştırıldı. Bu kayıtlar içerisinden düzenli klinik takipleri olan ve HDF'si 1, 2 ve 3 pozitif bulunmuş olgular seçilerek çalışma grubu oluşturuldu ve bu olgularda TİL skoru belirlendi. Bloklarına ulaşılan 238 adet hastaya ait tümörden elde edilen dokulardan 62 adet doku microarray bloğu oluşturuldu. Bu bloklardan hazırlanan kesitler üzerinde CTLA-4, PD-1 ve LAG-3 antikorları ile immünhistokimyasal incelemeler gerçekleştirildi. Çalışma grubuna dahil edilen olgulara ait klinikopatolojik özellikler, arşiv kayıtları üzerinden kaydedildi. Hastaların şikayetleri, evreleri, nüks ve metastaz durumları, aldıkları tedaviler ve sağ kalımlarıyla ilgili güncel bilgiler elde edildi.
Bulgular: Takip süresi minimum 7 ay, maksimum 130 ay olup ortalama takip süresi 75,44±31,86 (medyan 79) ay olan hasta grubunda, hastaların 200'ünün (%84) sağ, 38'inin (%16) ölü olduğu belirlendi. Takip süresinde 36 (%15,1) hastada meme kanserine bağlı ölüm görüldü. Kırk (%16,8) olguda lokal nüks ya da sistemik metastaz ile prezante olan hastalık nüksü saptandı. Tüm olgularda 5 ve 10 yıllık genel sağ kalım (GS) oranı ve standart hatası sırasıyla, %90,1±0,02 ve %79,2±0,03 olarak hesaplandı. Olguların 5 ve 10 yıllık hastalıksız sağ kalım (HS) oranı ve standart hatası sırasıyla, %83,3±0,03 ve %79,3±0,03 olarak hesaplandı. Olguların 12'sinde (%5) lokal nüks görülmüş olup lokal nükssüz sağ kalım (LNS) oranı %94,4 ve standart hatası 0,16'ydı. LNS, HS ve hastalık spesifik sağ kalım (HSS) değerleri multifokal tümörlerde, tek odaklı tümörlere göre daha düşük saptandı. LNS, HS ve HSS değerleri lenf nodu metastazı saptanan olgularda, saptanmayanlara göre daha düşük olarak belirlendi. TNM evresi sağ kalımla ilişkili bulundu, evre arttıkça sağ kalımın azaldığı tespit edildi. TİL yüksekliği, kötü prognostik belirteçlerle (reseptör negatifliği, grad III tümörler, yüksek proliferatif kapasite) ilintili bulunmakla birlikte, HS ve HSS değerleri, TİL skoru yüksek olgularda, düşük olgulara göre daha yüksek olarak belirlendi. Çok değişkenli analizde TİL yüzdesinin LNS ve HS'yi belirlemede bağımsız prognostik faktör olduğu gösterildi. Tümör hücrelerinde CTLA-4 pozitifliğinin demografik, klinik ve histopatolojik özellikler ile ilişkisi saptanmadı. CTLA-4 ile boyanan lenfositlerin oranı ile lenfovasküler invazyon (LVİ) arasında istatistiksel olarak anlamlı ters ilinti bulundu. Proliferatif kapasitesi yüksek olan tümörlerde, lenfositlerde CTLA-4 pozitivitesinin daha fazla olduğu saptandı. Lenfositlerde CTLA-4 pozitiflik yüzdesinin fazla oluşunun LNS, HS ve HSS'yi azalttığı tespit edildi.  Çok değişkenli analizde lenfositlerde CTLA-4 pozitiflik yüzdesinin HS ve HSS'yi öngörmede bağımsız faktör olduğu belirlendi. Lenfositlerde PD-1 pozitivitesinin kötü prognostik belirteçlerle (östrojen reseptörü negatifliği, grad III tümörler, yüksek proliferatif kapasite) doğru ilintili olduğu saptandı. Lenfositlerde şiddetli PD-1 boyanması olan olguların HSS değeri diğerlerine kıyasla istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek bulundu. LAG-3 pozitivitesinin tümör çapı ile doğru ilintili, LVİ ile ters ilintili olduğu saptandı. LAG-3 pozitivitesinin, grad III, progesteron reseptörü negatif veya proliferatif kapasitesi yüksek tümörlerde istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha fazla olduğu belirlendi. LAG-3 yüzdesi %20 ve üzerinde olan olgularda HS ve HSS değerleri, %20'nin altında olan olgulara göre anlamlı derecede daha yüksek saptandı. TİL yüzdesi ile lenfositlerdeki CTLA-4, LAG-3 ve PD-1 yüzdesi arasında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde doğru ilinti bulundu. Lenfositlerdeki CTLA-4, LAG-3 ve PD-1 yüzdesinin birbirleri ile olan ilişkisine bakıldığında, her birinin diğeri ile doğru ilintide olduğu tespit edildi.
Sonuç: HDF'si pozitif olgulardan oluşan çalışma grubumuzda genel anlamda sağ kalım yüksektir. Hem LNS hem de HS'yi öngörmede bağımsız prognostik faktör olması nedeniyle TİL skorlamasının HDF skorlamasına göre daha belirleyici olduğu ve rutin histopatolojik raporlamanın bir parçası olması gerektiği düşünülmektedir. Lenfositlerde CTLA-4 pozitiflik yüzdesi HS ve HSS'yi öngörmede bağımsız prognostik faktör saptanmasına karşın literatür verilerinin aksine sağ kalımı azalttığı ortaya çıkmıştır. Lenfositlerde şiddetli PD-1 boyanması olan olguların HSS değerinin diğerlerine kıyasla istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek olduğu görülmektedir. LAG-3 yüzdesi %20 ve üzerinde olan olgularda HS ve HSS değerlerinin, %20'nin altında olan olgulara göre istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek olduğu anlaşılmıştır. Ayrıca CTLA-4, PD-1 ve LAG-3 ekspresyonları birbirleriyle ve TİL yüzdesiyle doğru ilintili olduğu görülmektedir. Meme karsinomlarında TİL skoru yüksek olgularda, hem sağ kalıma etkilerinin olması hem de tedavide antagonistlerinin bir seçenek olması nedeniyle bu üç immün belirtecin kullanılabileceğini öne sürebiliriz.

Abstract:
Objective: Invasive breast carcinoma is the most frequent malignancy in women and it is also the 4th cause of cancer-related deaths worldwide. Therefore, determining the course of the disease is extremely important. Routine histopathologic reporting of breast carcinomas includes histological grade, stage, histological and molecular subtype so as to predict the clinical course and determine a properly personalized treatment. Based on current genetic studies and emerging molecular classification, new biomarkers that are both expressed in tumor cells and tumor microenvironment and have a potential role in prognosis and treatment, have been identified, and targeted therapies have been suggested. The assessment of immune inﬁltrate in tumors, most commonly referred to as tumor inﬁltrating lymphocytes (TILs), is also gaining importance in the current quest for optimal biomarkers to select patients with the highest likelihood of responding to immunotherapeutic agents. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) that is one of the immune checkpoint molecules, has a possible poor prognostic value in breast carcinomas. High CTLA-4 positive lymphocyte density was significantly correlated with good prognosis only when tumor CTLA-4 expression was low. Programmed death protein 1 (PD-1), as a member of B7/CD28 co-regulatory factor family, interracts with its ligands -programmed death ligand 1 (PD-L1) and 2 (PD-L2)- which leads to supression of anti-tumor T cell activity and immune escape of tumor cells. PD-1 expression in TILs -there were some conflicting studies- was associated with better outcome in breast carcinomas. Even some studies showed that PD-1 positivity in TILs was an independent prognostic factor. Lymphocyte activation gene 3 (LAG-3) represents another example of a new immune checkpoint target. LAG-3 inhibitors were intended as a treatment for autoimmune diseases but its clinical development has more recently been re-focused on its use as anti-cancer therapeutics. In some studies, LAG-3 had signiﬁcantly improved breast cancer-speciﬁc survival.
In our study, we aimed to determine the relationship between expression of CTLA-4, PD-1 and LAG-3 and prognosis in a group of host defense factor (HDF) positive breast carcinomas and tried to predict prognosis using these biomarkers.
Materials and Methods: Archive records between January 2009-December 2013 were retrieved from Istanbul University Istanbul Faculty of Medicine Department of General Surgery and Istanbul University Oncology Institute. The records were compared to computer-based archive records in Department of Pathology, Istanbul Faculty of Medicine. HDF-positive breast carcinoma cases were chosen among these records to constitute the study group. Tumor blocks of 238 patients were available and 62 tissue microarray blocks were prepared. Immunohistochemical analyses were performed on these blocks using antibodies against CTLA-4, PD-1 and LAG-3. Clinicopathological characteristics of the study group were retrieved from archive records. Some patient records were completed over telephone calls. Information on the patients' medical history, tumor stage, recurrence or metastasis, treatment regimens and survival data were updated.
Results: Average follow-up time was 75.44 (7-130, median: 79) months. A total of 36 (15.1%) patients died of disease, whereas 200 (84%) patients were alive. Forty patients (16.8%) showed progression, either as local recurrence or systemic metastasis. The 10-year-local recurrence free survival (LRFS) was 94.4%; 5-year-disease free survival (DFS) and 10-year-DFS were 83.3% and 79.3%; 5-year-overall survival (OS) and 10-year-OS were 90.1% and 79.2%, respectively. LRFS, DFS and disease-spesific survival (DSS) rates were lower in multifocal tumors compared to unifocal tumors. LRFS, DFS, and DSS were also lower in cases with lymph node metastases compared to those without. TNM-stage were correlated with survival and survival rates decreased as TNM-stages increased. Although high TIL expression was significantly associated with hormone receptor negativity, high proliferation rate and histological grade 3 tumors, the increase in TILs was also associated with longer survival. Multivariate analysis confirmed that high TIL score was an independent prognostic marker for LRFS and DFS. HDF scoring system, that is based on ordinal scale (1+, 2+, 3+), was an independent prognostic marker for only DFS. No correlation was shown between CTLA-4 expression in tumor cells and demographic, clinical and histopathological features. Patients with CTLA-4 immunoexpression in immune cells exhibited significantly less lymphovascular invasion. Tumors with high proliferation rate showed significantly more CTLA-4 positivity in immune cells. LRFS, DFS and DSS rates were lower in cases with high rates of CTLA-4 positivity in TILs that was shown to be an independent factor in predicting DFS and DSS, in multivariate analysis. PD-1 positivity in TILs were more likely to appear in estrogen receptor-negative tumors, tumors with higher Ki-67 index, and histological grade 3 tumors. Cases with strong PD-1 immunolabeling in TILs showed statistically longer DSS. LAG-3 positivity in TILs were inversely correlated with lymphovascular invasion but positively correlated with tumor size. LAG-3 positive TILs were significantly associated with negative prognostic factors: progesterone receptor-negative tumors, high proliferation, and histological grade 3 tumors. DFS and DSS rates were higher in cases that had ≥20% lymphocytes expressing LAG-3. Correlation between percentage of TILs and percentages of CTLA-4, LAG-3 and PD-1 were investigated and statistically significant relationship was shown. Also these immunomarkers were significantly associated with each other.
Conclusion: For the percentage of TILs predicts survival better than HDF scoring system, the assessment of TILs is preferable for evaluation of the immune microenvironment and should be a routine parameter in pathology reports with regard to breast carcinoma. Based on the results of our study, we may suggest that high rates of CTLA-4 positivity in TILs adversely affects rates of LRFS, DFS, and DSS, while no correlation exists between CTLA-4 expression in tumor cells and survival rates. We think that further studies are needed to confirm our result about strong PD-1 immunolabeling in TILs is related to longer DSS, due to well-known variation in the strength of immunostaining depending on the method used. We also suggest that high expression of LAG-3 (≥20% lymphocytes) is related to high rates of DFS and DSS. Furthermore, expressions of CTLA-4, LAG-3 and PD-1 are strongly associated with each other and also with the percentage of TILs. Finally, these three immune markers can not only predict prognosis but may also be used in determination of proper treatment. Therefore, immunohistochemical analysis of CTLA-4, LAG-3, and PD-1 can be conceivable, notedly in tumors with high levels of TILs.