Normal, polikistik ovaryum sendromu, hiperstimüle ve hipostimüle ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde endoplazmik retikulum stres proteinlerinin regülasyonunun araştırılması
Investigation of the differential regulation of endoplasmic reticulum signal proteins in cumulus cells with normal, hyperstimulated, hypostimulated and polycystic ovary syndromes
Yazar: BAHAR KÜÇÜKOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. ÜMİT ALİ KAYIŞLI ; PROF. DR. M. TAHİR HATİPOĞLU
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Hücreler = Cells ; Oositler = Oocytes ; Over = Ovary ; Over hiperstimülasyon sendromu = Ovarian hyperstimulation syndrome ; Polikistik over sendromu = Polycystic ovary syndrome ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques

Özet:
Oositlerde sitoplazmik olgunlaşma ve oosit aktivasyonu ile oosit çekirdeğinin olgunlaşması arasında doğrudan bir ilişki vardır. Kümülüs hücrelerinin bu süreçteki rolü ise oositte protein sentezini uyararak oosit olgunlaşması sürecine katkıda bulunmaktır. Ancak olgun (metafaz II ) bir oositin fertilizasyon kapasitesi olduğu düşünüldüğünde kümülüs hücrelerinin oosit üzerindeki olgunlaştırıcı ve aktifleştirici rolü çok daha iyi açığa çıkmaktadır.Endoplazmik retikulum, hücrenin hayatta kalmasında ve işlevlerini yerine getirmesi için gerekli role sahip bir organeldir. ER hücre içi kalsiyum dengesini ayarlamakta, protein sentezi ve homeostaziyi düzenlemekte ve lipit biyosentezini sağlamaktadır. Hücredeki protein sentezi ve transportundaki rolünden dolayı , 78 kDA GRP78 , GRP94 ve kalretikülin gibi kalsiyum bağımlı moleküler şaperonlardan zengindir. Bu şaperonlar protein katlanmasını sağlayan aracı molekülleri stabilize eder.Birçok faktör katlanamayan proteinlerin ER lümeninde birikmesine neden olur. Bu katlanamayan proteinlerin ER lümeninde birikmesi evrimsel olarak oldukça iyi korunmuş olan katlanmayan proteinlere yanıt yolağını UPR (Unfolding Protein Response) tetikler. Hücrede ER stresiyle tetiklenen UPR' nin etkileri 3 grupta toplanır: Adaptasyon, Uyarı, Apopitoz. Hipoksi ve oksidatif ajanların neden olduğu hücresel redoks yolunun bozulması ER lümenindeki disülfit bağlarının ortadan kalkmasına ve proteinlerin katlanamamasına ya da yanlış katlanmasına neden olur.İn vitro fertilizasyon tekniklerinden yararlanmak üzere başvuran hasta populasyonlarında folikül stimülasyonlarına bağlı olarak yanıt veren 3 farklı hasta grubu gözlenmektedir. Bunlar arasında normal stimülasyon gösterenler birinci grubu, hipostimülasyon gösterenler ikinci grubu, hiperstimülasyon gösterenler üçüncü grubu oluşturmaktadır. 35 yas altı IVF hastalarında folikül sitimülasyonuna yanıt toplanan oosit sayısının 10 ile 20 arasında olması normostimülason olarak kabul edilmektedir. Buna karşılık aynı doz uyarıya 30 ve üzerinde oosit toplanması hiperstimülasyon sendromu olarak kabul edilirken bu grup hastalara polikistik over sendromuda girmektedir. 6 ve daha az oosit toplanması ise hipostimülasyon olarak kabul edilmektedir. Her üç grupta gerek folikül gelişimi açısından gerekse toplanan olgun oosit (MII) sayısı veya olgun olmayan (PI (GV) veya MI) oosit sayısı açısından anlamlı farklılıklar göstermektedir.Bu çalışmada ovulasyon indüksiyonuna farklı yanıt veren hastalarda ortaya çıkabilecek ER stresine bağlı UPR' nin düzenlenmesi incelenmiştir.UPR yolağının başlıca regülatör proteini olan GRP78 in protein seviyesi Western Blot yöntemiyle analiz edilmiştir. GRP78 protein seviyeleri gruplar arasında anlamlı bir değişim gözlenmedi . Diğer taraftan, hiporisponsif hastaların kümülüs hücrelerinde diğer guruplara kıyasla 2 kat daha yüksek GRP78 protein seviyesi saptadık.ER stresini mRNA düzeyinde incelemek için XBP1 ve sXBP1 mRNA seviyeleri RT?PCR yöntemiyle incelenmiştir. Bizim çalışmamızda tüm form XBP1 mRNA' nın içinde XBP1s mRNA 'nın miktarı , diğer gruplarla kıyaslandığında, sadece hiporisponsif hastalarda artış göstermiştir. Bu sonuç GRP78 için bulduğumuz sonuçla benzerlik göstermektedir. Ve bizim hiporisponsif hastalarda saptadığımız artmış ER stresinin veya bozulmuş protein katlanma mekanizmasının bu hastalarda folikülogenez ve oosit olgunlaşmasını önemli derecede etkileyeceği hipotezimizi desteklemektedir.Kümülüs hücreleri hücre kültürüyle çoğaltılıp UPR yolağı inhibitörü olan TUDCA ve ER stresi uyaranı tunikamisin ile muamele edilip proliferasyon ve apopitoz indeksleri MTT ve TUNEL yöntemleriyle belirlendi.Kümülüs hücre kültürü yaptıktan sonra kümülüs hücrelerini UPR yolağı inhibitörü TUDCA ve ER stresi uyaranı tunikamisin ile birlikte 48 saat muamele ettik.Hücre canlılığını saptamak amacıyla MTT analizi yapıldı. MTT proliferasyon analizi bulgularımıza göre tunikamisinle indüklenen ER stresiyle UPR 'nin aktifleşmesi sonucunda kümülüs hücre proliferasyonu baskılanmaktadır. Kümülüs hücrelerine TUDCA ve tunikamisin birlikte uygulayarak ER stresini baskıladığımızda ise hücre proliferasyonunda tunikamisin uygulanan gruba kıyasla bir miktar artış gözledik.MTT analizi sonucunda tunikamisin ile ER stresi uyarılan kümülüs hücrelerinde anlamlı düzeyde azalan hücre proliferasyonuna proliferasyondaki azalma mı yoksa artan apopitozla mı ilişkili olup olmadığını belirlemek amacıyla kümülüs hücrelerinde ER stresini tunikamisin ile indükleyerek apopitoz indeksleri saptanarak kontrol grubu ile kıyaslandı.TUNEL yöntemi sonucunda tunikamisin uygulamasının kümülüs hücrelerinde kontrol grubuna kıyasla apopitozu anlamlı derecede arttırdığı gözlendi. Bu bulguda bize MTT analizinde belirlediğimiz ER stresinin baskıladığı hücre proliferasyonunun büyük olasılıkla azalan proliferasyonla değil artan apopitozdan kaynaklandığını göstermektedir.IVF tedavisine verdikleri yanıta ve klinik bulgularına dayanarak, oosit sayısına bağlı olarak hastalar normostimülasyon , polikistik over sendromu, hiperstimüle ve hipostimüle olarak 4 farklı grupta incelendiler.Hasta grupları yaşlarına göre istatistiksel olarak analiz edildiğinde guruplar arasında anlamlı bir fark bulunamadı .Hasta grupları toplanan ortalama oosit sayısı açısından değerlendirildiğinde PKOS ve hiperstimüle hasta grupları, normal ve hipostimüle hasta gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha fazla oosite sahipti. Ayrıca normal hasta grupları hipostimüle, hasta gruplarına göre anlamlı olarak daha fazla oosit sayısına sahipti.Bu çalışmayla litaretürde ilk kez insan ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde ER aracalı sinyal yolağı ve molekülleri GRP78, XBP1 ve sXBP1 bulunduğunu gösterdik . Kümülüs hücrelerinin ER stres ilişkili sinyal yolağına maruz kaldıklarında hücre proliferasyonunda azalmaya ve/veya apopitozda artışa gidebileceğini gösterdik.IVF tedavisine maruz kalan hastalardan hiporisponsif ( hiperstimüle) grup oluşturan hastaların ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde artmış ER stresinin olduğunu ve bu stresin mRNA düzeyinde sXBP1 ile gösterdik.Son olarakta bu çalışmanın tüm sonuçları sağlıklı bir folikülogenez ve kaliteli bir oosit elde edebilmek için ER stres ve UPR sinyal yolağının fizyolojik sınırlar içerisinde tutulması gerektiğini ve ayrıca hiporisponsif hasta gruplarında patolojik Er stres seviyesini azaltacak ajanların kullanılmasıyla yeni bir tedavi yaklaşımı öngörülebilineceğini önermekteyiz.

Abstract:
There is a direct relationship between the maturation of the nucleus and cytoplasmic maturation and biological activation in oocytes. Cumulus cells contribute to this process by stimulating protein synthesis in oocytes and, therefore, the maturation of oocytes. Moreover, when we consider the fact that only a mature oocyte (in MII [metaphase II]) has the capability of fertilization, it is clear to see responsibility cumulus cells have for the maturation and activation of oocytes. In addition, the fact that oocytes found in PI (prophase I) and MI (metaphase I), which are not mature enough, do not have the capability of fertilization shows another aspect of the importance of cumulus cells. Endoplasmic reticulum is an essential organelle in maintaining cells vital function. ER regulates intracellular calcium concentration,protein synthesis and homeostasis and it also enables the biosynthesis of lipids.Ca dependent molecules like 78kDA GRP78 , GRP94 and calreticulin are chaperon rich molecules due to their role in protein synthesis and its intracellular transport. These chaperons stabilize intermediary proteins which enable protein folding.Several factors may be the basis for the aggregation of unfolding proteins in ER lumen. This aggregation of unfolding proteins in ER lumen induces a reaction called Unfolding Protein Response (UPR), an ER dependent cellular reaction which is evolutionally quite well conserved. The effects of UPR induced by ER stress are categorized into 3 major groups; adaptation, stimulation and apoptosis. Hypoxia and damage to the redox pathway caused by oxidative agents bring about termination of the disulfide bonds within ER lumen and the unfolding or misfolding of the proteins.Of the patients applying for IVF techniques, 3 subtypes of patient groups are distinguished according to their response to follicle stimulations; the first group being composed of those demonstrating normal stimulation, the second group composed of patients demonstrating hypostimulation, and the third group demonstrating hyperstimulation. Normostimulation is considered as retrieval of 10-20 oocytes in IVF patients aged less than 35 years as a response to follicle stimulation. In contrast, retrieval of 30 or more oocytes as a response to the same stimulus is considered to be ovarian hyperstimulation syndrome, which includes polycystic ovary syndrome. Retrieval of 6 or less oocytes is considered to be hypostimulation. There are significant differences among these 3 groups in terms of both follicle development and the number of mature oocytes (MII) or immature (PI [GV] or M I) oocytes retrieved.In this study we examined the regulation of UPR due to ER stress which may occur in patients responding differently to the induction of ovulation.The protein level of GRP78, which is the main regulator protein of UPR pathway, is analysed by the Western Blot method. No significant change is observed between the GRP78 protein levels groups. On the other hand, we have determined that GRP78 protein levels in the cumulus cells of the hyporesponsive patients are two times higher than the other groups.In order to evaluate the ER stress at mRNA level; XBP1 and sXBP1 mRNA levels are examined by the RT?PCR method. In our study, when the quantity of XBP1s mRNA in the whole form XBP1 mRNA is compared to the other groups, it has only shown an increase in the hyporesponsive patients. This result is similar to the result which we have found for GRP78. Also the increased ER stress or the impaired protein doubling mechanism which we have determined in the hyporesponsive patients, support our hypothesis about folliculogenesis and oocyte ripening in these patients in a significant way.Cumulus cells are reproduced with the cell culture and the tunicamycine which is the TUDCA and ER stress stimulus of the UPR pathway inhibitor is processed with tunicamicyne and proliferation and apoptosis indexes are determined with MTT ad TUNEL methods.After the cumulus has performed the cell culture, we have processed the cumulus cells for 48 hours with tunicamicyne which is the TUDCA and ER stress stimulus of the UPR pathway inhibitor.MTT analysis is performed in order to determine the cell activity. According to our findings of MTT proliferation analysis; cumulus cell proliferation is pressurized as a result of the activation of UPR by ER stress which is induced with tunicamycine. When we have pressurized ER stress by applying TUDCA and tunicamycine on the cumulus cells together; we have observed a little increase in the cell proliferation when compared to the tunicamycine treated group.As a result of the MTT analysis, the ER stress in the cumulus cells are induced with tunicamycine and their apoptosis indexes are determined and then they are compared to the control group in order to determine whether the significantly decreased cell proliferation in the cumulus cells stimulated with ER stress and tunicamycine is related to the decrease in proliferation or the increased apoptosis.As a result of the TUNEL method; it is observed that apoptosis in the cumulus cells is increased by the tunicamycine when compared to the control group. This finding shows us that the cell proliferation pressurized by the ER stress in MTT analysis has probably risen from the increased apoptosis, not by the decreased proliferation.Based on the response to the IVF treatment and the clinical findings, the patients are inspected in 4 different groups related to the oocyte quantity as normostimulation, polycystic over syndrome, hyperstimuli and hypostimuli. When the patient groups are analysed statistically according to the ages, no significant difference is observed between the groups.When the patient groups are evaluated according to the collected average oocyte quantities, PKOS and hyperstimuli patient groups have statistically significant more oocyte quantity than the normal and hypostimuli patient groups. Also the normal patient groups have significantly more oocyte quantity than the hypostimuli patient groups.In this study, we have shown in the literature for the first time that ER signal pathway and its molecules GRP78, XBP1 and sXBP1 are present in the cumulus cells of the human ovarian follicle. We have shown that when the cumulus cells are exposed to the signal pathway related to the ER stress; a decrease in the cell proliferation and/or increase in apoptosis can occur. We have demonstrated that an increased ER stress in the cumulus cells of the ovarian follicle of the patients forming the hyporesponsive (hyperstimuli) group from the patients subject to IVF treatment is present and we have shown this stress by sXBP1 at the mRNA level.Finally we recommend that a new treatment approach can be foreseen by keeping the ER stress and UPR signal pathway in the physiological limits in order to obtain a health folliculogenesis and a qualified oocyte and also by using the agents which will decrease the pathological ER stress levels in the hyporesponsive patient groups.