Glioblastoma multiforme hücre hattında metforminin histon modifikasyonları üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi
Evaluating the effect of metformin on histone modifications in glioblastoma multiforme cell line
Yazar: MERT PEKERBAŞ
Danışman: PROF. DR. HALUK AKIN ; DOÇ. DR. MEHMET BURAK DURMAZ
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Epigenetik = Epigenetic ; Tıbbi onkoloji = Medical oncology

Özet:
Amaç: Glioblastoma multiforme (GBM), merkezi sinir sistemi malign tümörlerinin yaklaşık %48'ini oluşturmaktadır ve cerrahi tedavisi oldukça zor bir kanser türüdür. Bu sebeple günümüze kadar pek çok terapötik ajan GBM tedavisi için araştırılmış ve rutin kullanıma girmiştir. Metformin de GBM'de bazı kemoterapötiklere sinerjistik olarak ya da tek başına destek tedavisi olarak araştırılmaktadır. Bazı çalışmalarda metforminin GBM'de antikanser etkileri olduğu ve prognozu iyileştirdiği bildirilmiştir. Ayrıca metformin, kanserleşme sürecinde regülasyonu bozulan bazı temel hücre için yolak ile yakından ilişkili AMPK sinyal yolağı üzerinden etki etmektedir. Bu sebeple metforminin GBM'deki antikanser etkisine AMPK ilişkili ya da ilişkisiz bir takım epigenetik değişikliklerin katkı sağlaması muhtemeldir. Ayrıca histon modifikasyon değişikliklerinin GBM'nin patogenezinde yer aldığı ve prognozla ilişkili olabileceği bilinmektedir. Bu sebeple metforminin GBM hücrelerini temsil eden U87 MG hücre hattında histon modifikasyon değişiklikleri meydana getirip getirmediği ve antikanser etkilerinde bu değişikliklerin katkısı olup olmayacağının ortaya çıkartılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Metformin uygulanan U87 hücre hattında sitotoksisite deneyleri ile IC50 değeri belirlendikten sonra apoptoz ve hücre siklusu deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ardından metformin uygulaması sonrası 21 farklı histon modifikasyondaki değişiklikler ELISA-benzeri bir yöntem ile total H3 ve spesifik histon modifikasyon antikorları kullanılarak araştırılmıştır. Histon modifikasyon analizleri sonucu anlamlı olarak değerlendirilen (p<0.05) verilerin daha iyi yorumlanabilmesi için histon modifikasyonlarında görevli enzimleri kodlayan 86 genin ekspresyon seviyeleri ölçülmüştür.
Bulgular: Metformin uygulaması sonrası U87 MG hücrelerinde kontrol grubuna kıyasla apoptozda 6,16 katlık bir artış olduğu gözlenmiştir. Metformin, GBM hücrelerinde hücre siklusunu G0/G1 ve S fazlarında durdurmuştur. Metformin, GBM hücrelerinde H3S10ph histon modifikasyonunda anlamlı bir artışa sebep olmuştur. Metformin uygulanması sonrası AURKB ve SETD2 genlerinde anlamlı ekspresyon artışları saptanmıştır.
Sonuç: H3S10ph modifikasyonundaki artışın AURKB ekspresyon artışına bağlı olabileceği fakat metforminin antikanser etkilerine katkı sağlamadığı düşünülmüştür. SETD2 transkripsiyonunda meydana gelen artış ise metforminin antikanser etkilerini desteklemektedir. H3S10ph artışı metforminin doza bağımlı bir etkisi olabileceği gibi bu değişikliğin sonuçlarının daha net bir şekilde ortaya çıkartılması için daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Objective: Glioblastoma multiforme (GBM) accounts for about 48% of malignant tumors of the central nervous system and its surgical treatment is limited. Hence, many therapeutic agents have been investigated and some are used routinely in the treatment of GBM. One such agent is metformin, which is studied both as an adjuvant with some chemotherapeutic agents and as a single adjuvant therapy in GBM. Some studies reported that metformin has an anti-cancer effect and improves the prognosis of GBM patients. Metformin has been shown to act through the AMPK signaling pathway; hence, it is closely related to several critical cellular pathways that get dysregulated in carcinogenesis. Therefore, it may be likely that AMPK-related or unrelated epigenetic changes can contribute to the anticancer effects of metformin on GBM. Histone modification changes are well-established in the pathogenesis of GBM and possibly linked to the prognosis. Thus, the present study aimed to investigate whether the metformin-induced histone modification changes in the U87 MG cell line would be involved in its anti-cancer effects.
Materials and Methods: Cytotoxicity tests were carried out to determine the IC50 value for U87 MG cell lines. Apoptosis and cell cycle evaluations were conducted. Afterward, the changes of 21 different histone modifications after metformin treatment were evaluated with an ELISA-like method using the total H3 and specific histone modification antibodies. For a better understanding of the observed data from the histone modification analyses (p<0.05), mRNA expressions of 86 genes encoding enzymes responsible for histone modifications was quantified.
Results: It was observed that metformin was able to increase the apoptosis of U87 MG cells by 6.16 fold compared to the control group. Metformin caused cell cycle arrest at the G0/G1 and S phases in GBM cells. It also led to rapid upregulation of H3S10ph histone modification in the GBM cells. The expression levels of AURKB and SETD2 genes were significantly increased upon treatment with metformin.
Conclusion: The upregulation of the H3S10ph modification may be due to the increased expression of AURKB. Still, it is thought not to contribute to the anticancer effects of metformin on GBM. In contrast, the upregulation of SETD2 transcription is thought to contribute to the anticancer effects of metformin. Although the H3S10ph increase may be a dose-dependent metformin effect, further studies are needed to understand the consequences of this alteration.