Mikrodalga destekli çapraz bağlanma/çökeltme reaksiyonları ile kitosan-HA doku iskelelerinin hazırlanması ve kemik doku mühendisliğinde kullanımının araştırılması
Preparation of chitosan-HA scaffolds by microwave-assisted crosslinking/ precipitation reactions and investigation of their usages in bone tissue engineering
Yazar: GÖKÇE KAYNAK
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Hidroksiapatit seramik = Hydroxyapatite ceramic ; Kalsiyum hidroksiapatit = Calcium hydroxyapatite ; Kitosan = Chitosan ; Mikrodalga enerjisi = Microwave energy

Özet:
Sunulan tez çalışmasında 10xSBF benzeri çözelti ve farklı mikrodalga enerjileri (90W, 360W, 600W, 1200W) kullanılarak `'kemik benzeri hidroksiapatit'' yapısının dolgu maddesi olarak kullanılmak üzere eldesi ve bu yöntemle kemik dokusunun rejenerasyonunu destekleyecek kitosan hidrojel doku iskelelerinin hızlı ve etkin bir şekilde hidroksiapatit (HA) ile kaplanması amaçlanmıştır.Tez kapsamında yapılan çalışmanın ilk aşamasında, mikrodalga enerjisi ile yapay vücut sıvısı (SBF) içerisindeki iyonların etkileşiminden yararlanılarak biyomimetik HA yapısı üretilmiştir. Farklı mikrodalga güçleri ve uygulama süreleri ile denemeler yapılarak doğal kemik yapısında bulunan HA'e en yakın apatitin üretildiği optimum koşullar belirlenmiştir. Sonuçta 600 W gücün kullanıldığı koşulda 40-50 nm uzunluğunda, %1.61 (w/w) Ca/P oranına ve % 9.22 (w/w) karbonat içeriğine sahip, iğne benzeri morfolojide ve kemik benzeri amorf yapıda hidroksiapatit üretilmiştir.Tez kapsamında kullanılacak süper gözenekli hidrojel (SPH) doku iskelelerinin üretiminde mikrodalga ışıma ve gaz köpükleştirme teknikleri birlikte kullanılmıştır. Böylece eş zamanlı olarak jelleşme ve köpükleşme gerçekleştirilmiştir. Kitosan doku iskelesi, biyoaktivitesinin ve mekanik özelliklerinin arttırılması için mikrodalga ışımasının etkisi ve SBF kullanılarak HA ile kaplanmıştır. Yapılan X ışını kırınımı (XRD), Fourier dönüşümlü toplam yansıması azaltılmış kızılötesi spektroskopisi (ATR-FTIR) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizleri ile kompozitteki karbonatlı HA varlığı gösterilmiştir. Kaplamanın % Ca/P (w/w) oranı EDX analizi ile 1.62±0.93 olarak belirlenmiştir.Tez çalışmasında mikrodalgayla kaplamanın, kimyasal muamele sonrası kaplama ile karşılaştırılması ve mikrodalga etkisi ile kaplamanın etkinliğinin artırılması için çekirdeklendirici ajan tetraetil orto-silikat (TEOS) kullanılarak da kaplama çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Yapılan XRD ve SEM incelemeleri sonucunda kimyasal modifikasyonun mikrodalga ışıması ile kaplama çalışmalarını olumlu yönde etkilemediği gözlenmiştir. Bu nedenle daha sonraki çalışmalara TEOS ile muamele edilmeyen örnekler ile devam edilmiştir. Kitosan/HA kaplama SPH'ler ile karşılaştırma yapmak amacıyla ticari toz formda HA kullanılarak kitosan/HA toz SPH'lerin üretimi de gerçekleştirilmiştir. Karakterizasyon çalışmaları sonrasında en yüksek su tutma özelliği ve mekanik dayanım HA toz içeren iskelelerde görülmüştür. Mikrodalga ışıması ile yapılan HA kaplamanın iskelenin şişme özelliğini, boşluk kesrini ve mekanik dayanımını artırdığı belirlenmiştir. Kitosan/HA kaplama SPH için şişme oranı 21.94±5.26, dengeye ulaşma süresi 180 s olarak bulunmuş, boşluk kesri ve yoğunluğu ise sırasıyla 0.69±0.09 mL/g ve 0.046±0.007 g/mL olarak hesaplanmıştır. Kitosan SPH, kitosan/HA kaplama SPH ve kitosan/HA toz SPH'lerin elastik modül değerleri ise sırası ile 23.4±4.10 kPa, 41.1±8.49 kPa ve 220.5±4.95 kPa olarak bulunmuştur.Tezin son aşamasında ise kitosan bazlı doku iskelelerinin osteoindüktif özellikleri, MC3T3-E1 preosteoblastik hücre hattı ile durgun koşullarda gerçekleştirilen hücre kültürü çalışmaları ile belirlenmiştir. Hücre canlılığı ve üremesi MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analizi ile takip edilmiş ve hücre morfolojileri SEM (taramalı elektron mikroskobu) ile incelenmiştir. Hücrelerin en yüksek üreme hızını kitosan/HA kaplama SPH üzerinde gösterdiği belirlenmiştir. Hücre farklılaşması ise alkalen fosfataz (ALP) aktivitesinin ölçümü ve Von Kossa boyama ile belirlenmiştir. RT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) ile MC3T3-E1 hücrelerinin osteojenik farklılaşma belirteçleri olan ALP, osteokalsin, kollajen I ve RunX2 ekspresyon seviyeleri tespit edilmiştir. Analiz sonuçlarına göre, kitosan/HA kaplama SPH'in MC3T3 preosteoblast hücrelerinin farklılaşmasını ve ekstraselüler matris mineralizasyonunu diğer iskelelere göre çok daha fazla desteklediği görülmüştür.Sonuç olarak mikrodalga-desteği ile hazırlanan kitosan/HA kaplama SPH'lerin osteoindüktif özellikleri ile kemik doku mühendisliği uygulamaları için uygun malzemeler olabileceği belirlenmiştir.

Abstract:
The aim of the present study is to produce ''bone-like hydroxyapatite'' by using 10xSBF (synthetic body fluid)-like solution and different microwave energies (90W, 360W, 600W, 1200W) and to use this process as an efficient method for rapid coating of chitosan scaffolds which support the regeneration of bone tissue.In the first part of the study, biomimetic HA structure was produced by means of the interaction of the ions within the simulated body fluid (SBF) and microwave energy. Experiments were carried out in different microwave powers and exposure times, and optimum conditions for the production of bone-like HA were determined by evaluating the results of characterization studies. As a result, under the condition that used 600 W power, hydroxyapatite structure which has 40-50 nm length, 1.61% (w/w) Ca/P ratio, 9.22 % (w/w) carbonate content, needle-like morphology and bone-like amorphous structure was produced.Chitosan superporous hydrogel (SPH) scaffolds were produced by combining microwave irradiation and gas foaming. Then, these scaffolds were coated with HA in the presence of SBF and microwave radiation in order to improve their bioactivities and mechanical properties. The presence of carbonated HA in the composite was shown by X-ray diffraction (XRD), attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and scanning electron microscopy (SEM) analysis. The Ca/P (w/w) ratio of the coating was determined as 1.62±0.93 by energy dispersive X-ray (EDX) analysis.Hydroxyapatite coating was also done by using nucleating agent, tetraethyl ortho-silicate (TEOS), to compare the effectiveness of microwave energy and chemical treatment. XRD and SEM results showed that chemical modification had no positive effects on the coating. For comparison, chitosan/HA powder SPHs were also produced by using commercial powder. It was observed that, HA coating with microwave radiation increased the swelling properties, space fraction and mechanical strength of the chitosan scaffolds. However, scaffolds containing HA powder have the highest water content and mechanical strength. For chitosan/HA (coating) SPH; swelling ratio and the time to reach equilibrium were found to be 21.94±5.26 and 180 s, respectively. Its void fraction and density were calculated as 0.69±0.09 mL/g and 0.046±0.007 g/mL, respectively. Elastic modulus values of chitosan SPH, chitosan/HA (coating) SPH and chitosan/HA powder SPH were found to be 23.4±4.10 kPa, 41.1±8.49 kPa and 220.5±4.95 kPa, respectively.In the final part of the study, osteoinductive properites of chitosan-based scaffolds were examined with cell-culture studies performed under static conditions by using preosteoblastic MC3T3-E1 cell line. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT (3-[4,5-dimethylthiazoyl-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide) assay and morphological examination was done with SEM (scanning electron microscope). The highest proliferation rate of the cells was determined on chitosan/HA coating SPH. Cell differentiation was quantified by determination of alkaline phosphatase (ALP) activities and Von Kossa staining. Osteogenic differentiation markers ALP, osteocalcin, collagen I and RunX2 expression levels of MC3T3-E1 cells were determined using RT-PCR (real time polymerase chain reaction). According to the results, it was observed that chitosan/HA (coating) SPH supported the differentiation of MC3T3 preosteoblast cells and extracellular matrix mineralization much more than other scaffolds.As a result, it was determined that microwave-assisted chitosan/HA (coating) composite scaffolds could be considered as suitable materials for bone tissue engineering applications with their osteoinductive properties.