Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile farklı vücut sıvılarında, hassas bir malondialdehid (MDA) ölçüm yönteminin kurulması ve rutin kullanıma geçirilmesi
Building up a high pressure liquid chromatografic (HPLC) sensitive method for determination of malondialdehide (MDA) in various human body fluids and installing it as a routin assay
Yazar: SAAD AL-FAWAIER
Danışman: DOÇ. DR. HALİL YAMAN
GATA / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Malondialdehit = Malondialdehyde

Özet:
Lipid peroksidatif doku hasarını indükleyen reaktif oksijen türleri (ROS) ve serbest radikaller, çeşitli hastalıkların patogenezinde yer almaktadırlar. Lipid peroksidasyonu, malondialdehid (MDA) gibi sekonder ürünlerin ölçümü ile indirekt olarak değerlendirilmektedir. MDA, serbest radikallerin çoklu doymamış yağ asitlerine (ÇDYA) atağı sonucu oluşan peroksitlerin kendiliğinden yıkımı sonucu meydana gelen üç karbonlu, düşük moleküler ağırlıklı bir üründür.Tiyobarbitürik asit (TBA) ile MDA analizi, biyolojik sistemlerde lipid peroksidasyonunun değerlendirilmesinde yıllardır yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem, asidik koşullar altında örneğin ısıtılması sonucu MDA-TBA kompleksi oluşumu prensibine dayanan spektrofotometrik bir yöntemdir. Bu reaksiyon, basit ve tekrarlanabilir olmasına karşın TBA'nın karbonil içeren diğer bileşiklerle de reaksiyona girebilmesinden dolayı MDA ölçümleri için spesifik bir reaksiyon değildir. Plazma yağ asitleri de TBA ile 95 -1000C' de ısıtma basamağında okside olarak yanlış yüksek sonuçların ortaya çıkmasına neden olabilir. Bu zorlukların üstesinden gelebilmek için, MDA düzeyini belirlemede doğru ve spesifik olan direkt bir kromatografik yöntem geliştirilmiştir. TBA sadece MDA ile değil diğer birçok bileşikle reaksiyona girdiği için MDA'nın 2,4-dinitrofenilhidrazin (DNPH)'le türevlendirilerek pirazol ve hidrazin türevlerine çevrilmesinin, bu bileşiklerin daha spesifik ölçümlerine izin verdiği bulunmuştur. Biyolojik örneklerde yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi kullanılarak bu türevlerin ayrımı gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, insan serumunda DNPH ile MDA'nın türevlendirilmesi sonrası HPLC-DAD dedektörü ve TBA testi ile MDA düzeyinin ölçülmesi amaçlanmıştır. Ayrıca HPLC ve spektrofotometrik yöntemleri karşılaştırdık.

Abstract:
Reactive oxygen species (ROS) and particularly free radicals induced lipid peroxidative tissue damage have been implicated in the pathogenesis of various diseases. Lipid peroxidation is assessed indirectly by the measurement of the secondary products such as malondialdehyde (MDA). MDA has three-carbon atoms and low molecular weight and spontaneous breakdown product of peroxides that can be produced from free radicals attack on polyunsaturated fatty acids (PUFAs).The analysis of MDA by the thiobarbituric acid(TBA) assay has been widely employed over the many years in biological systems for the assessment of lipid peroxidation. It is a spectrophotometric assay, based upon heating of the sample under acidic conditions to form the adduct of MDA-TBA. This reaction, although simple and reproducible, is unfortunately rather non-specific as TBA reacts with many other carbonyl-containing compounds. Plasma fatty acids can also be oxidized during the 95 -100 oC heating step with TBA, generating artificially high results. In an attempt to over come these difficulties, in a direct chromatographic assay suitable to be applied for accurate and specific quantification of MDA have been developed. However, TBA reacts not only MDA but also with many other compounds. Therefore, derivatization of MDA with 2,4 dinitrophenylhydrazine (DNPH) and conversion into pyrazol and hydrazine derivatives has since been found to allow a more specific estimation of these compounds, especially if combined with their separation using high pressure liquid chromatography (HPLC) in the biological samples. In this study, our purpose is to measure the levels of MDA with TBA test and HPLC-DAD after derivatisation of MDA with DNPH in human serum. Furthermore, we compared HPLC and spectrophotometric methods.