Tuz gölünden izole edilen mikrofungusların tanımlanması, alkol dehidrogenaz enzimi açısından taranması ve klonlama çalışmaları
Isolated salt lake microfungi identification, screening of alcohol dehydrogenase enzyme and cloning studies
Yazar: BÜKAY YENİCE GÜRSU
Danışman: PROF. DR. SEMRA İLHAN
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Genel Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada hipersalin çevrelerden mikrofungus izolasyonu ve bu fungusların Alkol Dehidrogenaz (ADH) enzimi açısından taranması amaçlanmıştır.  İlaveten seçilen verimli izolatlardan klonlama çalışmaları yapılarak endüstriyel üretime geçişi sağlayacak verilerin ortaya konması hedeflenmiştir.
Bu amaçla, Tuz Gölü?nden alınan su örneklerinden mikrofungus izolasyonu gerçekleştirilmiştir.  Mikrofunguslar diagnostik literatürler kullanılarak geleneksel yöntemler ile cins seviyesinde tanımlanmıştır.  Dokuz cinse (Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Emericella, Eurotium, Penicillium, Scopulariopsis, Stemphylium ve Ulocladium) ait toplam 51 mikrofungus izole edilmiştir.  İzolatların büyük bir kısmının sırasıyla Cladosporium, Penicillium, Alternaria ve Aspergillus cinslerine ait olduğu belirlenmiştir.  
38 izolat için ADH enzim aktivitesi taraması yapılmıştır.  En yüksek aktivite saptanan 8 izolatın ITS (içsel transkrip ayırıcı)  bölgeleri dizilenerek moleküler yöntemlerle tanımlamaları yapılmıştır.  En yüksek spesifik aktivite sırasıyla Cladosporium macrocarpum (5776), Eurotium niveoglacum (5778), Aspergillus versicolor (T55), A. niger (5800), C. sphaerospermum (5821), C. cladosporioides (5794), Penicillium chrysogenum (5797) ve E. amstelodami (5810) türlerinde saptanmıştır.  Bu türler için spesifik enzim aktivitesi 3,21-5,93 U/mg arasında değişmektedir. 
Alkol dehidrogenaz gen bölgesi klonlama çalışmaları için E. amstelodami, P. chrysogenum ve A. niger seçilmiştir.  pJET1.2/blunt vektör klonlama plazmidi olarak kullanılmış ve bakteryal transformansyon için E. coli EZ kompotent hücreleri ile çalışılmıştır.  Söz konusu gen bölgesinden farklı gen bölgelerinin klonlanması üzerine enzim varlığını ortaya koymak için A. niger (5800) izolat özütüne amonyum sülfatla çöktürme ve diyaliz yöntemleri uygulanmıştır.  Enzim spesifik aktivitesi ham özüte göre yaklaşık 20 kat artmıştır.  Hücre özütü diyalizatında proteinlerin varlığının ve profillerinin ortaya konması için SDS-PAGE ve HPLC yönteminden faydalanılmıştır.

Abstract:
In this study, focused on isolation of microfungi from hipersaline environment and screening of their ADH activity.  In addition, intended to reveal of the data for provide the progression to the industrial production by cloning studies on selected active isolates.
For this purpose, microfungi were isolated from Tuz Gölü water samples.  The microfungi were identified at genus level according to traditional identification literatures.  Totally 51 microfungi was isolated relating to nine genera (Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Emericella, Eurotium, Penicillium, Scopulariopsis, Stemphylium and Ulocladium).  Respectively isolates determined belonged to genera order of Cladosporium, Penicillium, Alternaria ve Aspergillus.
ADH enzyme activity screening was carried out for 38 isolates.  Eight isolates with the highest activity were identified by molecular methods with sequencing of internal transcribe spacer (ITS) regions.  The highest specific activity determined on the following species; Cladosporium macrocarpum (5776), Eurotium niveoglacum (5778), Eurotium niveoglacum (5778), Aspergillus versicolor (t55), A. niger (5800), C. sphaerospermum (5821), C. cladosporioides (5794), ), Penicillium chrysogenum (5797) ve E. amstelodami (5810).  Specific enzyme activity of these species ranged from 3.21 to 5.93 U / mg.
E. amstelodami, P. chrysogenum ve A. niger were selected for cloning studies. pJET1.2/blunt vector was used as a cloning plasmid and for bacterial transformation were studied with E. coli EZ competent cells.  Due to cloning of different gene regions instead of interested gene, ammonium sulfate precipitation and dialysis methods applied to extract of A. niger (5800) for establish the presence of the enzyme.  Enzyme specific activity increased approximately 20-fold compared to the crude extract.  SDS-PAGE ve HPLC method was used to indicate the presence of proteins and protein profiles in dialyzed cell extract