Toxoplasmosıs tanılı gebelerden alınan amniyon sıvılarından Toxoplasma gondii GRA4 geninin tanı ve immünizasyonda kullanılmak üzere izole edilmesi, klonlanması ve moleküler karakterizasyonu
Isolation, clonning and molecular characterisation GRA4 gene of Toxoplasma gondii obtained by amnion maies of pregnants who have toxoplasmosis
Yazar: BEKİR TARTICI
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH İNCİ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Parazitoloji = Parasitology

Özet:
Sıcakkanlı omurgalılarda enfeksiyon oluşturabilen Toxoplasma gondii, hücre içi zorunlu bir protozoon parazittir. bu çalışmada, Toxoplasma gondii'nin GRA4 geninin klonlanması, sekanslanması ve moleküler karakterizasyonunun yapılması  amaçlanmıştır. Bu amaçla, ERÜ tıp fakültesi hastanesi kadın ve doğum hastalıkları polikliniğine başvuran, amniyosentez yapılıp toxoplasmosis tanısı konulan toplam 4 hastadan alınan amniyon sıvılarından Genomik DNA izolasyonu yapılarak Toxoplasma gondii GRA4 geninin açık okuma çerçevesini (ORF) bütün olarak amplifiye eden (1038 bç) spesifik primer ile PCR kurulmuştur. Elde edilen PCR ürünleri saflaştırılarak pJET1.2/blunt Cloning vektörüne klonlanmış, klonlamanın doğrulanması için koloni tarama yapılarak miniprep ile saflaştırılan plasmid DNA sekans analizine gönderilmiştir. 1038 bç uzunluğundaki sekans dizisi yüksek kalite skoru ile elde edilen T. gondii GRA4 geni DNA dizi analiz sonuçlarının Geneious 2020.1.1 yazılımı üzerinden çoklu hizalamaları yapılmış ve 4 izolatın GRA4 sekans dizilerinin homolog olduğu görülmüştür. Blast analizlerinde, TRTOXGRA4 olarak isimlendirilen sekansın Genbank veri tabanında T. gondii'ye ait Avustralya'dan bildirilen (M76432) izolat ile %100; Hindistan'dan rapor edilen EU660037 kodlu izolat ile %99,9,  Suudi Arabistan'dan (LN714501.1) ve ABD'den bildirilen (XM_002364283) izolatlarla ise %97,8 oranında benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. İlgili izolatların ikili hizalama analiz sonuçlarına göre nükleotid farklıkları tespit edilmiştir. ORF sekansının, 346 amino asit uzunluğunda bir zinciri kodladığı ve in-silico analiz sonuçlarına göre GRA4 proteininin 36.284 kDa ağırlığında olduğu belirlenmiştir. GRA4 amino asit zincirinin, uzunluğu 7-43 aa arasında değişen, en düşük skoru 1,03 en yüksek skoru ise 1,243 olan 12 antijenik bölge içerdiği belirlenmiştir. Ayrıca ilgili amino asit zincirinin 20 aa uzunluğunda bir sinyal peptid içerdiği, ikincil yapısının non-sitoplazmik domain özellikte olduğu ve iki adet potansiyel transmembran bölgeye sahip olduğu görülmüştür. Ayrıca ikincil yapı analizinde % 22,25 alfa-heliks, % 26,3 beta-strand ve %28,03 oranında random coil yapısı tespit edilmiştir. Sonuç olarak bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez amniyotik sıvılardan elde edilen T. gondii izolatlarında önemli immunojenik bir antijen olan GRA4 proteinini kodlayan gen üzerine karakterizasyon verileri elde edilmiştir. Çalışma ile rekombinant olarak elde edilen GRA4'ün biyoinformatik analizlerle genetik ve proteomik yapısı ortaya çıkarılmış olup, toxoplasmosise karşı başta aşı çalışmaları olmak üzere biyoteknolojik mücadele çerçevesinde yeni projeler için öncül sonuçlar sağlanmıştır. Ayrıca elde edilen sonuçlar gen bazında parazitin moleküler epidemiyolojisi noktasında da katkı sağlamıştır.
Anahtar Kelimeler: 	Toxoplasma gondii, Toxoplasmosis, Gebelerde Toxoplasmosis, GRA4

Abstract:
Toxoplasma gondii, which can infect warm-blooded vertebrates, is an intracellular obligate protozoan parasite. In this study, the cloning, sequencing and molecular characterization of Toxoplasma gondii's GRA4 gene was aimed. For this purpose, Genomic DNA isolation from amniotic fluids taken from 4 patients who were admitted to the ERÜ medical faculty hospital obstetrics outpatient clinic and diagnosed with toxoplasmosis undergoing amniocentesis, and PCR was established with a specific primer (1038 bp) that amplifies the open reading frame (ORF) of T. gondii GRA4 gene as a whole. The PCR products obtained were purified and cloned into pJET1.2 / blunt Cloning vector. To confirm the cloning, the colony was scanned and the plasmid DNA purified by miniprep was sent for sequence analysis. Multiple alignments of the DNA sequence analysis results of T.gondii GRA4 gene, which were obtained with a high quality score of 1038 bp sequence, were performed on Geneious 2020.1.1 software and it was observed that the GRA4 sequence sequences of 4 isolates were homologous. In blast analysis, the sequence named TRTOXGRA4 is 100% similar to the isolate (M76432) reported from Australia belonging to Tgondii in Genbank database; 99.9% similar to the isolate coded EU660037 reported from India; It was determined that it was 97.8% similar to the isolates reported from Saudi Arabia (LN714501.1) and the USA (XM_002364283). Nucleotide differences were determined according to the binary alignment analysis results of the respective isolates. It was determined that the ORF sequence encodes a chain of 346 amino acids in length and according to the in-silico analysis results, the GRA4 protein weighs 36.284 kDa. It was determined that the GRA4 amino acid chain contains 12 antigenic regions varying between 7-43 aa with the lowest score of 1.03 and the highest score of 1.243. It was also observed that the related amino acid chain contains a 20 aa signal peptide, its secondary structure is non-cytoplasmic domain and has two potential transmembrane regions. In addition, in the secondary structure analysis, 22.25% alpha-helix, 26.3% beta-strand and 28.03% random coil structure were detected. In conclusion, this study for the first time in amniotic important data on the characterization of the gene encoding the immunogenic protein in T. gondii antigens that GRA4 isolates were obtained from liquids in Turkey. The genetic and proteomic structure of GRA4, which was obtained recombinantly with the study, was revealed by bioinformatic analysis, and preliminary results were obtained for new projects within the framework of biotechnological struggle, especially vaccine studies against toxoplasmosis. In addition, the results obtained have contributed to the molecular epidemiology of the parasite on a gene basis.
Key Words: Toxoplasma gondii, Toxoplasmosis, Toxoplasmosis at pregnant, GRA4