Tetrahymena thermophila glutatyon S-transferaz enzim ailesinden MU alt sınıfı üyelerinden birinin rekombinant olarak üretimi ve enzimatik karakterizasyonu
Recombinant production and enzimatic characterization of one of MU sub-class members from Tetrahymena thermophila glutatyon S-transferase enzyme family
Yazar: HANDAN AÇELYA KAPKAÇ
Danışman: DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
Eskişehir Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Sentetik bir ksenobiyotik olan 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) molekülüne maruz bırakılan sucul tek hücreli protist Tetrahymena thermophila'nın Glutatyon S-transferaz (GST) enzimlerinin kimliklendirilmesi, rekombinant üretimi ve enzimatik karakterizasyonu, bu çalışmanın amacını oluşturmaktadır. CDNB ile 9 saat muamele edilen hücrelerin 3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) test bulgularında, CDNB'nin LD50 değeri 0.079 mM olarak bulunmuştur. Toksik olmayan CDNB dozları ile muamele edilen hücrelerden glutatyon afinitesiyle saflaştırılmış 22 kDa ve 23 kDa'luk GST proteinlerinin TtGSTm19 ve TtGSTm34 genleri tarafından kodlandıkları, 2D-jel elektroforezi ile MALDI-Tof MS/MS analizi ile ispatlanmıştır. CDNB'nin 0.072 mM doz muamelesi altındaki hücrelerden affinitik saflaştırılmış GST'lerin toplam aktivitesi, zamana bağlı artış gösterirken hücre canlılığı azalmıştır.  TtGSTm19 ve TtGSTm34 genlerinin mRNA ekspresyonu, toksik olmayan doz aralığında, kontrol grubuna göre anlamlı oranda artmıştır. TtGSTm34'ün 660 bp cDNA ORF'si, pIGF-1 vektörüne klonlanmış ve T. thermophila'ya elektroporasyon ile transforme edilmiştir. Rekombinant TtGSTm34-8xHis proteininin dual afinite kromatografisi ile saflaştırılması, SDS-PAGE ve Western blot analizi ile teyit edilmiştir.  GSH ve CDNB'ye karşı TtGSTm34-8xHis enzim kinetik analizi, optimum pH'sının 7.0 ve optimum sıcaklığının ise 25°C olduğunu, sırasıyla 0.54 mM ile 0.47 mM Km değerleri ile yüksek enzim aktivitesine sahip göstermiştir. T. thermophila'da toksik olmayan CDNB dozlarının detoksifikasyonda TtGSTm34'ün ve TtGStm19'un görev alabileceği sonucuna varılmıştır

Abstract:
The aim of this study is the identification, recombinant production and enzymatic characterization of Glutathione S-transferase (GST) enzymes of aquatic unicellular protist Tetrahymena thermophila exposed to the synthetic xenobiotic 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) molecule. The LD50 value of CDNB was determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) test as 0.079 mM at 9-hour exposure. 2D-gel electrophoresis and MALDI-Tof MS / MS analysis of 22 kDa and 23 kDa GSTs purified by glutathione affinity from cells under subtoxic CDNB dose treatment showed that they were encoded by the TtGSTm19 and TtGSTm34 genes. The activity of affinitically purified GSTs increased with time under 0.072 mM CDNB dose treatment, while cell viability decreased. The mRNA expression of the TtGSTm19 and TtGSTm34 genes increased significantly in the non-toxic dose range compared to the control group. The 660 bp cDNA ORF of TtGSTm34 was cloned into pIGF-1 vector and transformed into T. thermophila by electroporation. Recombinant TtGSTm34-8xHis was purified by dual affinity chromatography, confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis. TtGSTm34-8XHis enzyme kinetic analysis against GSH and CDNB showed that the optimum pH was 7.0 and the optimum temperature was 25 ° C, and showed high enzyme activity with Km values of 0.54 mM and 0.47 mM, respectively. In view of these findings, it was concluded that TtGSTm34 and TtGSTm19 could be involved in T. thermophila detoxification against subtoxic doses of CDNB.