Antiviral direncin yeni nesil dizileme yöntemi ile saptanmasında kullanılacak biyoinformatik iş akışının geliştirilmesi
Development of a bioinformatics workflow to be used in detecting antiviral resistance using the next generation sequencing method
Yazar: NEŞE ARSLAN
Danışman: DOÇ. DR. MERT AHMET KUŞKUCU
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji = Infectious Diseases and Clinical Microbiology
Dizin: HIV = HIV ; HIV I = HIV I ; HIV enfeksiyonları = HIV infections ; HIV seropozitivitesi = HIV seropositivity

Özet:
Arslan, N (2024) Antiviral Direncin Yeni Nesil Dizileme Yöntemi ile Saptanmasında
Kullanılacak Biyoinformatik İş Akışının Geliştirilmesi. İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa
Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, Tıbbi Mikrobiyoloji ABD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul.
İnsan Bağışıklık Eksikliği Virusu (HIV) tedavisinde 1996 yılında uygulanmaya başlanan
kombine antiretroviral ilaç tedavisi (ART) ile HIV pozitif kişilerde yaşam süresi ve kalitesi
büyük ölçüde yükselmiştir. Buna karşın, HIV'da hızla gelişen ilaç direnci, etkin bir tedavi için
engel oluşturmaktadır. HIV ilaç direnci saptanmasında kullanılan Yeni Nesil Dizileme (YND)
ile elde edilen virus genomuna ait veriler, çeşitli ticari veri tabanı ve değerlendirme
programları kullanılarak meydana gelen mutasyonlarla oluşan dirençler saptanır. Kit
üreticileri ve bazı yazılım şirketleri temel olarak değerlendirme başı ücretlendirilen çözümler
sunmaktadır. Bu durum zaten görece pahalı olan yeni nesil dizileme test maliyetlerini
artırmaktadır. Bu çalışmada HIV antiretroviral direnç analizinde kullanılan YND verilerinin ücretsiz ve hızlı bir biçimde analizini mümkün kılan ve ortak dizi çıktısı oluşturabilen bir
biyoinformatik iş akışı oluşturulması ve performansının sınanması amaçlanmıştır.
İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Tıbbı Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda HIV pozitif hasta örneklerinden 2019-2021 yılları arasında
YND ile proteaz, revers transkriptaz ve integraz inhibitörlerine karşı gelişen ilaç dirençleri
rutin olarak çalışılmıştır. Çalışmamıza daha önceden laboratuvar çalışmalarını yapmış ve
arşivlemiş olduğumuz farklı direnç profiline sahip 30 ART direnci saptanmış, 30 ART direnci
saptanmayan 60 HIV pozitif hasta örneği dahil edildi. Sekanslama sonucu elde edilen veriler,
ücretli DeepCheck (ABL, ABD) analiz programı kullanılarak analiz edilmiştir.
Geliştirdiğimiz iş akışında farklı hizalama algoritmaları ilk olarak test edilen, oluşturulan
hizalamalardan varyant tanımlaması, her olgu için %5 varyant içerebilen ortak dizi
oluşturulması, bu verilerin kıyaslaması yapılarak iş akış performansları sınandı. Ayrıca elde
ettiğimiz sonuçlar ile rutin çalışmalarda kullanılan DeepCheck üzerinden elde ettiğimiz analiz
sonuçları karşılaştırılarak yeni bir analiz algoritması geliştirilmesi ve geliştirilen programın
doğruluğu ve kullanılabilirliği irdelendi.
Geliştirilen akış ile yapılan direnç analizi sonucunda BWA ve Bt2 algoritmaları ile yapılan
incelemeler karşılaştırıldığında, direnç saptanan 30 olgunun 25'inde tüm algoritmalar, analiz
yapılan bölge için tek nükleotid değişiklikleri açısından uyumlu bulundu. Bununla birlikte 5
olguda BWA algoritması ile standart rapor sonucu uyumsuz idi.
Bu tez çalışmasında sınanan BWA ve bowtie-2 algoritmalarının Samtools ve Ivar ile
kullanımı ile oluşturulan iş akışını HIV yeni nesil dizi analizi değerlendirmelerinde kullanışlı,
hızlı ve maliyet etkin olarak bulduk.
Bu değerlendirmelerde cihaz çıktı verilerinin kalitesinin mutlaka analiz öncesi gözden
geçirilmesi, minör varyantların saptanmasında özellikle Q30 (%99,9 doğrulukta) seviyesinde
verilerin analize dahil edilerek derinlik analizlerinin de 1000x düzeyinde yapılması önerilebilir.

Abstract:
Arslan, N (2024) Development of the Bioinformatics Workflow to be Used in the Detection of Antiviral Resistance with the Next Generation Sequencing Method. Istanbul University-
Cerrahpaşa Graduate Education Institute, Department of Medical Microbiology. Master's Thesis. Istanbul.
With combined antiretroviral drug therapy (ART), which started to be used in the treatment of
Human Immunodeficiency Virus (HIV) in 1996, the life span and quality of life in HIV-
positive people has increased significantly. On the other hand, the rapidly developing drug
resistance in HIV poses an obstacle to effective treatment. The data of the virus genome
obtained by Next Generation Sequencing (NGS), which is used to detect HIV drug resistance,
is used to detect resistances caused by mutations using various commercial databases and
evaluation programs. Kit manufacturers and some software companies offer solutions that
basically charge per evaluation. This increases the already relatively expensive next-
generation sequencing testing costs. In this study, it was aimed to create and test the
performance of a bioinformatics workflow that enables free and fast analysis of NGS data
used in HIV antiretroviral resistance analysis and can generate common sequence output.
In the Microbiology Laboratory of Istanbul University Cerrahpaşa Faculty of Medicine,
Department of Medical Microbiology, drug resistances against protease, reverse transcriptase
and integrase inhibitors were routinely studied using NGS from HIV-positive patient samples
between 2019 and 2021. The data of 60 HIV-positive patients with different resistance
profiles, 30 with ART resistance and 30 without ART resistance, who had previously applied
to our institution for routine testing, whose studies were completed and whose results we
archived, were included in our study. The data obtained as a result of sequencing during
routine work were analyzed using the paid DeepCheck (ABL, USA) analysis program. In the
workflow we developed, different alignment algorithms were first tested, variant
identification from the created alignments, creation of a common sequence that could contain
5% variants for each case, and the workflow performances were tested by comparing these
data. In addition, by comparing the results we obtained with the analysis results obtained
through DeepCheck, which is used in routine studies, a new analysis algorithm was developed
and the accuracy and usability of the developed program were examined.
When the analyzes made with BWA and Bt2 algorithms were compared as a result of the
resistance analysis performed with the developed flow, all algorithms were found to be
compatible in terms of single nucleotide changes for the analyzed region in 25 of 30 cases in
which resistance was detected. However, in 5 cases, the BWA algorithm and the standard
report result were incompatible.
We found the workflow created by using the BWA and bowtie-2 algorithms tested in this thesis study together with Samtools and Ivar to be useful, fast and cost-effective in HIV next-generation sequence analysis evaluations.
In these evaluations, it may be recommended that the quality of the device output data be
reviewed before analysis, and that data at the Q30 (99.9% accuracy) level be included in the
analysis to detect minor variants, and depth analyzes be performed at the 1000x level.