Mikrokriyojeller ile transferrin saflaştırılması
Purification of transferrin by microcryogels
Yazar: KEMAL ÇETİN
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
Sunulan tez kapsamında, plazmadan transferrin saflaştırılması amacıyla afinite kromatografisini temel alan, immünoafinite ve moleküler baskılanmış olmak üzere 2 farklı mikrokriyojel hazırlandı. İmmünoafinite mikrokriyojel için poli(2-hidroksietil metakrilat-glisidil metakrilat) P(HEMA-GMA) taşıyıcı matris olarak seçildi ve mikrokriyojel yapısındaki epoksi grupları sayesinde herhangi bir aktivasyon ajanı kullanımına ihtiyaç olmadan anti-transferrin (anti-Tf) antibadiler çeşitli başlangıç derişimlerinde mikrokriyojellere immobilize edildi. Moleküler baskılanmış mikrokriyojel için ise poli(2-hidroksietil metakrilat-N-metakriloil-(L)-triptofan) P(HEMA-MATrp) matris olarak seçildi. Bunun için hidrofobik ligand olarak kullanılan L-triptofan amino asidinin polimerleşebilen türevi olan N-metakriloil-L-triptofan (MATrp) monomeri sentezlendi. Sentezlenen monomer nükleer manyetik rezonans, Fourier dönüşümlü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi, Raman spektroskopi çalışmaları ile karakterize edildi. Ardından [P(HEMA-MATrp)] mikrokriyojeller 2-hidroksietil metakrilat (HEMA) ve MATrp monomerlerinin N,N'-metilenbis(akrilamid) çapraz bağlayıcı ile insan serum transferrin (hsTf) varlığında (baskılanmış mikrokriyojel) ve yokluğunda (baskılanmamış mikrokriyojel) -16°C'da serbest radikal polimerizasyonu ile üretildi. Mikrokriyojeller şişme testleri, Brunauer–Emmett–Teller yöntemi ile yüzey alanı ölçümleri, FTIR spektroskopisi, Raman Spektroskopi, helyum piknometre, optik mikroskop ve taramalı elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Ardından mikrokriyojellerin optimum çalışma koşullarını saptamak amacıyla optimizasyon çalışmaları yürütüldü. Bu çalışmalar sonucunda her iki mikrokriyojel için en uygun pH değerinin 6.0 olduğu saptandı ve immünoafinite ve baskılanmış mikrokriyojel için bu pH değerinde maksimum adsorpsiyon kapasitesi sırasıyla 9.82 mg/g ve 2.11 mg/g olarak bulundu. Hem immünoafinite hem de baskılanmış mikrokriyojeller için Langmuir adsorpsiyon izotermi ve pseudo-ikinci-derece kinetik modelinin adsorpsiyon süreci ile uyumlu olduğu gözlendi, bu adsorpsiyonun tek tabakalı ve kimyasal kontrollü olduğu anlamına gelmektedir. Baskılanmamış mikrokriyojel ile kıyaslandığında baskılanmış mikrokriyojelin seçiciliğinin insan serum albümin (HSA) ve miyoglobin (MYB) için sırasıyla 2.10 ve 2.24 kat daha fazla olduğu bulundu. İmmünoafinite P(HEMA-GMA) mikrokriyojel ve baskılanmış P(HEMA-MATrp) mikrokriyojel ile ayrı ayrı yapay plazmadan saflaştırılan hsTf'in saflığı sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile incelendi. Mikrokriyojellerin tekrar kullanılabilirliklerinin incelendiği çalışma sonucu aynı mikrokriyojelin onuncu kullanımından sonra, maksimum hsTf adsorpsiyon kapasitelerinin immünoafinite mikrokriyojel ve baskılanmış mikrokriyojel için sırasıyla yaklaşık %20 ve %10 azaldığı hesaplandı.

Abstract:
Within the scope of the thesis, two different, immunoaffinity and molecularly imprinted, microcryogels based on affinity chromatography in order to purify transferrin from plasma were prepared. Poly(2-hydroxyethyl methacrylate-glycidyl methacrylate) [P(HEMA-GMA)] was selected as a matrix for immunoaffinity microcryogel, and anti-transferrin (anti-Tf) antibodies were immobilized to microcryogels at various initial concentrations through the epoxy groups in the microcryogel structure without the need for any activating agents. For the molecularly imprinted microcryogel, poly(2-hydroxyethyl methacrylate-N-methacryloyl-(L)-tryptophan) [P(HEMA-MATrp)] was chosen as a matrix. The N-methacryloyl-L-tryptophan (MATrp) monomer, the polymerizable derivative of the L-tryptophan amino acid used as a hydrophobic ligand, was synthesized. The synthesized monomer was characterized by nuclear magnetic resonance, Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy, Raman spectroscopy studies. Subsequently, P(HEMA-MATrp) microcryogels were produced by free radical polymerization of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and MATrp monomers at       -16°C in the presence (imprinted microcryogel) and absence (non-imprinted microcryogel) of human serum transferrin (hsTf) using N,N′-methylenebis(acrylamide) as a cross-linker. Microcryogels were characterized with swelling tests, surface area measurements with Brunauer–Emmett–Teller method, FTIR, Raman spectroscopy, helium pycnometer, optical microscope and scanning electron microscope. Optimization studies were then carried out to determine the optimal adsorption conditions of microcryogels. As a result of these studies, it was found that the optimum pH value for both microcryogels was 6.0 and the maximum adsorption capacities at this pH value for immunoaffinity and imprinted microcryogels were found to be 9.82 mg/g and 2.11 mg/g, respectively. Langmuir adsorption isotherms and pseudo-second-order kinetic models for both immunoaffinity and imprinted microcryogels are consistent with the adsorption process, which means that the favorable adsorption is monolayer and chemically controlled. The selectivity of imprinted microcryogel was found to be 2.10 and 2.24-fold higher for human serum albumin and myoglobin, respectively, when compared to non-imprinted microcryogel. The purities of hSTf purified from the artificial plasma with the immunoaffinity P(HEMA-GMA) microcryogel and the imprinted P(HEMA-MATrp) microcryogel were examined by Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). According to the results of reusability studies of the microcryogels, after the tenth use of the same microcryogel, the maximum hsTf adsorption capacities of immunoaffinity microcryogel and imprinted microcryogel have been calculated a decrease about 20% and 10%, respectively.