Lacticaseibacillus paracaseı ad22'nin moleküler karakterizasyonu ile salamura beyaz peynir matriksinde stres yanıtı, kompozisyonel etkisi
Molecular characterization of lacticaseibacillus paracasei ad22 and stress response, compositional effect in brined white cheese matrix
Yazar: ADALET DIŞHAN
Danışman: PROF. DR. ZAFER GÖNÜLALAN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veteriner Besin Hijyeni ve Teknolojisi Ana Bilim dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Gıdaların fonksiyonel ürüne dönüştürülmesi, sağlık gelişimini teşvik eden yeni aday bakterilerin keşfedilmesi ve gıda matriksine entegre edilmesi ile gerçekleştirilmektedir. Bu çalışmada (i) saha suşu olan Lacticaseibacillus paracasei AD22'nin probiyotik potansiyellerinin ortaya konulması, (ii) Türkiye'de en yaygın peynir türü olan salamura beyaz peynir matriksine uygulamasının hayatta kalma, stres yanıtı ve kompozisyonel etkisi yönüyle değerlendirilmesi amaçlandı. Probiyotik özelliklerinin ortaya konulması amacıyla düşük pH, safra tuzuna, simule mide ve intestinal sıvılarına, yüksek tuz konsantrasyonuna toleransı, agregasyon ve adezyon ilgili özellikleri, antimikrobiyal, hemoliz kapasitesi, antibiyotik duyarlılık özellikleri araştırıldı. L. paracasei AD22'un salamura beyaz peynir matriksine entegre edilmesi amacıyla pilot ölçekli üretim gerçekleştirildi. Olgunlaşma sırasındaki transkripsiyonel stres yanıtını belirlemek için çalışmada dizayn edilen stres ilgili genlerin ekspresyon düzeyleri Revers-Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile belirlendi. Suşun tüm genom sekans analizi ile stres ilgili proteinleri kodlayan genlerin varlığı altsistem yaklaşımı ile; antibiyotik direnç ve virulens genleri varlığı içerme durumu ResFinder4.1 ve VirulenceFinder 2.0 veritabanları ile ortaya konuldu. Bakteriyosin kümeleri varlığı Bagel 4 veritabanı ile belirlendi. Suşun peynire kompozisyonel etkileri; genel bileşim analizleri, organik asit tayini (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi), yağ asidi bileşimi analizi (Gaz Kromatografi Alev İyonlaşmalı Dedektör), uçucu bileşen analizi (Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi) ile belirlendi. Peynirin duyusal özellikleri panelistlerce değerlendirildi. L. paracasei AD22'nin pH 2 ve %12 lik tuz ortamında gelişim gösterdiği, hemoliz negatif olduğu tespit edildi. Caco2 epitel hücrelerine adezyonu %76.26 ± 4.81 olduğu ve koagregasyon/otoagregasyon oluşturma özellikleri barındırdığı belirlendi. L. paracasei AD22'nin peynir matriksinde olgunlaşma periyodu sonunda 7 log kob/g'ı geçtiği sonucu elde edildi. dnaK, groES, ftsH, argH, hsp20 genlerinin ekspresyon düzeylerini gösteren kat değişimleri olgunlaşma süresince istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0.05). Tüm genom sekans profiline göre antibiyotik, virulens genleri içermediği, bakteriyosin kümeleri içerdiği belirlendi. Olgunlaşma sonunda incelenen organik asit düzeylerinin kontrol ve L. paracasei AD22 inoküle edilen gruplar arasında farklılıkların anlamlı olduğu gözlemlendi (p<0.05). Miristik asit, palmitik asit, nervonik asit ve sterarik asit değerlerinin zamanla istatistiksel değişimi kontrol grubunda; miristoleik asit, palmitoleik asit, eikosatrienoik asit değerlerinin zamanla değişimi L. paracasei AD22 içeren peynirde anlamlı olarak bulundu (p<0.05). Belirlenen uçucu bileşen gruplarının olgunlaşma süresince değiştiği tespit edildi. Gruplar arasında lezzet ve genel beğeni yönünden istatistiksel fark olduğu belirlendi (p<0.05). Çalışma bulguları, L. paracasei AD22'nin yeni fonksiyonel gıdaların üretimi için tolerans faktörleri ve probiyotik özellikler içermesi nedeniyle probiyotik yardımcı kültür olarak biyoteknolojik yenilik sağlayacağını ortaya koymuştur. 

Anahtar Kelimeler: L. paracasei; Peynir; Probiyotik; Stres faktörleri; Tüm genom sekans

Abstract:
Functionalization of foods is the discovery and integration of new candidate health-promoting bacteria into the food matrix. In this study, it was aimed to (i) demonstrate the probiotic potential of a wild-type Lacticaseibacillus paracasei AD22 and (ii) evaluate its addition to the matrix of brined white cheese, the most common type of cheese in Türkiye, in terms of survival, stress response and compositional effects. In order to reveal the probiotic properties of L. paracasei AD22, its tolerance to low pH, bile salt, simulated gastric and intestinal fluids, high salt concentration, aggregation and adhesion related properties, antimicrobial effect, hemolysis capacity, antibiotic susceptibility properties were investigated. Pilot scale production was carried out to integrate L. paracasei AD22 into brined white cheese matrix. To determine the transcriptional stress response during ripening, the expression levels of stress-related genes designed in the study were determined by Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction. The presence of genes encoding stress-related proteins was determined by whole genome sequence analysis using subsystem approach; the presence of antibiotic resistance and virulence genes was determined by ResFinder4.1 and VirulenceFinder 2.0 databases. The presence of bacteriocin clusters was determined by Bagel 4 database. Compositional effects of the strain on cheese were determined by general composition analysis, organic acid determination (High Performance Liquid Chromatography), fatty acid composition analysis (Gas Chromatography Flame Ionization Detector), volatile component analysis (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Sensory properties of the cheese were evaluated by panelists. It was revealed that L. paracasei AD22 grew in pH 2 and 12% salt medium and did not have the ability to cause hemolysis. It was determined that its adhesion to Caco2 cells was 76.26 ± 4.81% and it had coaggregation/autocoaggregation properties. It was determined that L. paracasei AD22 exceeded 7 log cfu/g at the end of the ripening period in the cheese matrix. Fold changes indicating the expression levels of dnaK, groES, ftsH, argH, hsp20 genes were not statistically significant during ripening (p>0.05). According to the Whole Genome Sequence profiles, it was revealed that the strain did not contain antibiotic and virulence genes, but bacteriocin clusters. Organic acid levels examined during ripening were significantly different between the control and L. paracasei AD22 inoculated groups (p<0.05). The changes of myristic acid, palmitic acid, nervonic acid and stearic acid values over time were significant in the control group (p<0.05); the changes in myristoleic acid, palmitoleic acid, eicosatrienoic acid values over time were found to be significant in cheese containing L. paracasei AD22 (p<0.05). The number of volatile component groups determined varied during ripening. There was a statistical difference between the groups in terms of flavor and general appreciation. The study findings highlight that L. paracasei AD22 will provide biotechnological innovation as a probiotic adjunct because it contains tolerance factors and probiotic characteristics for the production of new functional foods.

Keywords: Cheese; L. paracasei; Probiotic; Stress factors; Whole genome sequence.