Gastroözofajiyal reflü hastalığında distal özofagus mikrobiyotası
Distal esophagus microbiota in gastroesophageal reflux disease
Yazar: ESRA KAYAR DOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM ABACI GÜNYAR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmanın amacı; reflü hastalığı tanısı olan kişiler ile reflü olmayan bireyler arasında mikrobiyal yük ve seçilmiş mikroorganizma türlerinin varlığının karşılaştırılmasıdır. Bu çalışma kapsamında haftada iki veya daha fazla ağıza acı ekşi su gelmesi, göğüste yanma varlığı ile reflü tanısı almış hastalar ile anemi nedeni ile araştırılan kontrol grubundan oluşan hastalara üst gastrointestinal sistem endoskopisi yapılmıştır. İzmir Katip Çelebi Üniversitesi Atatürk Eğitim Araştırma Hastanesine Şubat-Haziran 2015 ayları arasında başvuran 50 hasta (30' u reflü, 20' si kontrol) çalışmaya dahil edilmiştir. Çalışmaya dahil olanların tamamından işlem ve çalışma için bilgilendirilmiş onam alınmıştır.
Anestezi eşliğinde yapılan endoskopik işlem sırasında distal özofagus gastroözofajiyalbileşkenin 5 cm üzerinden forseps kullanılarak iki adet biyopsi örneği alınmıştır. Biyopsilerin biri histolojik inceleme için formaldehit içinde patoloji laboratuvarına gönderilmiştir. Diğer biyopsi materyali ise, planlanan moleküler çalışmalarda kullanılmak üzere  -80 °C'de ependorf tüplerinde gliserol içinde saklanmıştır. Tüm biyopsi örnekleri toplandıktan sonra total DNA izolasyonu yapılmıştır. Bakterilerde universal olarak bulunan 16S rDNA bölgesi spesifik primerler ile çoğaltılıp, gruplar arasındaki bacterial yük farklılığını saptamak için en uygun yöntem olan klonlama tekniği ile amplifiye edilen hedef gen bölgemiz Promega T Easy vektörüne klonlanmıştır. 
Sonrasında rekombinant plazmit E.coli JM109 komponent hücresine aktarılmıştır ve plazmit izolasyonu yapılmıştır. Real time PCR işleminde standart eğri oluşturmak için hedef gen kopya sayısı hesaplanmış ve 8,27x109 gen kopya sayısı/ µl olarak bulunmuştur. Yapılan seyreltmelerin ardından  5 konsantasyon alınarak yapılan Real time PCR' ın sonucunda bir  standart eğri grafiği elde edilmiştir. Klonlama sonrasında bakılan hedef gen kopya miktarları yaklaşık olarak gastroözofajiyalreflü hastalarında  104- 105  kopya sayısı ve kontrol gruplarında 104 -105  kopya sayısı olarak saptanmıştır. İstatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır (p<0,005).Araştırmada bakteriyel Prevotella intermedia, Streptococcus pyogenes, Veillonella parvula, Enterocooccus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis, Bacteroides fragilis, Lactobacillus acidophilus türlerinin ve fungal Canida albicans türünün varlığı ise tür spesifik pirmerlerin kullanıldığı Real time PCR yöntemi ile araştırılmıştır. Çalışmaya dahil edilen 30 reflü hastasında, real time PCR ile saptanan mikroorganizmalar yüzde oranları sırasıyla; Provetalla intermedia (%23), Veillonella parvula (%17), Fusobacterium nucleatum (%17), Neisseria meningitidis (%17), Bacteroides fragilis (%6), Lactobacillus acidophilus (%3), Streptococcus pyogenes (%27) şeklinde bulunmuştur.  20 kontrol grubunda ise; Provetalla intermedia (%20), Veillonella parvula (%15), Fusobacterium nucleatum (%10), Neisseria meningitidis (%10), Bacteroides fragilis (%20), Lactobacillus acidophilus(%15), Streptococcus pyogenes (%35) oranlarında saptanmıştır. 
Çalışmaya katılan tüm bireylere çeşitli sorular sorularak form oluşturulmuştur. Bu formdaki sorulara verilen yanıtlar ile gastroözofajiyalreflü hastalarında Vücut Kitle İndeksi yükseldikçe Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis, Helicobacter pylori  miktarlarında anlamlı olarak artış göstermiştir (p<0,005). Sigara ve alkol kullanan reflü hastalarında ise Helicobacter pylori türü kontrol grubuna göre daha fazla olup istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p <0,005). Sorgulama formuna göre safra kesesi ameliyatı olan reflü grubunda;  Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis türleri baskın olup; kontrol grubunda ise  Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis, Bacteroides fragilis türleri baskın ve istatistiksel olarak anlamlı çıkmıştır (p <0,005). Proton pompa inhibitörü kullanan bireylerde her iki grupta da saptanan türler açısından anlamlı bir veri elde edilmemiştir. Uzun süredir ağrı kesici kullanımı ile reflü hastalarında Helicobacter pylori, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis ve Streptococcus pyogenes miktarları yüksek olup istatistiksel olarak anlamlıdır (p <0,005). Grade A özefajiti olan reflü hastalarında ise Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis ve Streptococcus pyogenes miktarları anlamlı olarak artmıştır (p<0.005). Helicobacter pylori pozitif çıkan reflü hastalarında da Veilonella parvula, Fusobacterium nucleatum ve Neisseria meningitidis türlerinin bulunma sıklığı yüksek bulunmuştur (p<0,005).
Çıkan sonuçlara göre çoğu Gr(-) ve  ağızda patojen olan bu mikroroganizmalar, gastroözofajiyalreflü hastalığında distal özofagusta bulunmaktadır. Distal özofagusta reflü hastalığı ile birlikte iki grup arasında toplam mikroorganizma sayısı arasında fark saptanmamışken, mikroorganizma çeşitliliğinin değiştiği görülmüştür. Bu hastalara medikal tedavilerinin yanında probiyotik ilaçlar, uygun beslenme önerileri vermek yararlı olabilir.

Anahtar Kelimeler: Gastroözofajiyalreflü hastalığı, Mikrobiyota, Real time PCR, Klonlama

Abstract:
The purpose of this study is to compare persons with and without reflux in terms of microbial load and presence of selected microorganism species. Within the scope of this study, patients diagnosed with reflux due to regurgitation of sour liquid two or more times a week and a burning sensation in the chest, and control group patients investigated for anemia underwent upper gastrointestinal tract endoscopy. Fifty patients who presented to İzmir Katip Çelebi University Atatürk Education Research Hospital between February 2015 and June 2015 were included in the study. Of them, 30 were assigned to the reflux group and 20 to the control group. Informed consent was obtained from all those involved in the study.
During the endoscopic procedure performed under anesthesia, two biopsy specimens were taken from the distal 5 cm of esophagus gastroesophageal junction using forceps. One of the biopsies was sent to the pathology laboratory in formaldehyde for histological examination. The other biopsy material was stored in glycerol in Eppendorf tubes at -80°C to use in planned molecular studies. After all the biopsy specimens were collected, total DNA isolation was performed. The 16s rDNA region, which is universally found in bacteria, was amplified with specific primers and the ampfied target gene cloned into the Promega T Easy vector, because the cloning method is the most suitable method for detecting the bacterial load differences between the groups. 
Subsequently, recombinant plasmid was transferred to the E.coli JM109 component cell and then plasmid isolation was performed. In order to generate a standard curve in real time PCR, the number of copies of the target gene was calculated and found to be 8.27 x 109 gene copy number/µl. A standard curve was obtained as a result of the real time PCR performed by taking five concentrations after the dilutions.  The number of the copies of the target gene observed after cloning was approximately 104- 105copy number in the gastroesophageal reflux patients and 104- 105copy number in the control group patients. The difference was not statistically significant (p <0,005).
In the study, the presence of bacterial Prevotella intermedia, Streptococcus pyogenes, Veillonella parvula, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis, Bacteroides fragilis, Lactobacillus acidophilus and fungal Candida albicans species was investigated using the real time PCR method in which the species-specific primers were used.  In the 30 reflux patients included in the study, the percentages of the species determined conducted with the real time PCR were as follows: Prevotella intermedia (23%), Veillonella parvula (17%), Fusobacterium nucleatum (17%), Neisseria meningitidis (17%), Bacteroides fragilis (10%), Lactobacillus acidophilus (3%) and Streptococcus pyogenes (27%). In the 20 control group patients the percentages were as follows: Prevotella intermedia (20%), Veillonella parvula (15%), Fusobacterium nucleatum (10%), Neisseria meningitidis (10%), Bacteroides fragilis (20%), Lactobacillus acidophilus (15%) and Streptococcus pyogenes (35%). 

	A informed volunteer form was developed by asking all the participants various questions. The responses given to the questions in the form revealed that as the gastroesophageal reflux patients' Body Mass Index increased so did the number of Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis and Helicobacter pylori significantly (p <0.005). The Helicobacter pylori species was statistically significantly higher in the reflux patients who smoked or took alcohol than in the control group patients (p <0.005). According to the responses, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum and Neisseria meningitidis species were dominant in the reflux group patients having undergone cholecystectomy (gallbladder surgery) while Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis and Bacteroides fragilis species were statistically significantly high in the control group patients (p <0.005). No significant data were obtained in the patients using the proton pump inhibitor in both groups in terms of the species detected. The amounts of Helicobacter pylori, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis and Streptococcus pyogenes species were statistically significantly high in the reflux patients taking pain relievers for a long time (p <0.005). The amounts of Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Neisseria meningitidis and Streptococcus pyogenes were significantly high in reflux patients with Grade A esophagitis (p <0.005). Veilonella parvula, Fusobacterium nucleatum and Neisseria meningitidis species were higher in the Helicobacter pylori-positive reflux patients (p <0.005).
According to the results, these microorganism most of which are Gr (-) and reside in the mouth are present in the distal esophagus in patients with gastroesophageal reflux disease. There was no difference between the number of total bacteria in the two groups with distal esophageal reflux disease, but the types of bacterial varied. In addition to medical treatments, provision of probiotic medicines and giving appropriate nutritional advice can help these patients.

Key words: Gastroesophageal reflux disease, Microbiota, Real time PCR, Cloning