İnsan rinovirüslerinden HRV-14 suşunda CIM212240 (C25H32N6O) bileşiğinin antiviral etkisinin HeLa RH hücreleri kullanılarak incelenmesi
Investigation of the antiviral effect using HeLa RH cells of  CIM212240 (C25H32N6O)  compound in strain HRV-14 of human rhinoviruses
Yazar: AYTUĞ MERİÇ
Danışman: PROF. DR. ZEHRANUR YÜKSEKDAĞ
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Antiviral etki = Antiviral effect ; DNA dizileme = DNA sequencing ; RNA virüsleri = RNA viruses ; Rinovirüs = Rhinovirus

Özet:
İnsan rinovirüsleri (HRV), Picornaviridae ailesinin Enterovirus cinsine ait soğuk algınlığı ve solunum yolu enfeksiyonlarına sebebiyet veren RNA virüsleridir. Bu çalışmada, insan rinovirüslerinden HRV-14 suşunda İlaç Tasarım ve Keşif Merkezi (CD3, Leuven, Belçika) Laboratuvarında geliştirilen CIM212240 (moleküler formül: C25H32N6O) bileşiğinin antiviral etkisi HeLa Rh hücreleri kullanılarak incelenmiştir. İlk olarak, potansiyel ilaç özelliği taşıyan bu antiviral bileşiğin farklı derişimleri ve HRV-14 suşu MOI [Multiplicity of infection; Enfeksiyon oranı (virüs sayısı: hücre sayısı)] 1:10000, 1:1000, 1:100 oranlarında kokültüre edilmiş; hücre canlılıkları kolorimetrik 5- (3-karboksimetoksifenil) -2- (4,5-dimetil-tiyazol) -3- (4-sülfofenil) tetrazolyum (MTS) sitotoksisite testi ile ölçülmüştür. Optik yoğunluk değerleri kullanılarak %50 etkili derişim (EC50) hesaplanmış; hücrelerin %50'sini virüs kaynaklı sitopatik etkiden koruyan bileşik derişimleri belirlenmiştir. İkinci olarak, beş aşamalı bir klonal seçim prosedürü ile CIM212240'a fenotipik olarak dirençli HRV-14 varyantlarının varlığı gözlenmiş; viral RNA'lar, Nucleospin© RNA virüsü (Macherey-Nagel) kullanılarak izole edilmiştir. Tüm HRV-14 kodlama dizisini kapsayan cDNA fragmanları, tek adımlı bir RT-PCR kiti ve HRV-14'e özgü primerler tasarlanarak sentezlenmiştir. Elde edilen cDNA fragmanlarını saflaştırmak için Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System kullanılarak DNA dizileri Sanger dizileme yöntemiyle analiz edilmiştir. Fenotipik olarak gözlemlenen dirençli varyantlar virüs kontrolü, stok suşu ve Protein Blast ile karşılaştırılarak CIM212240 bileşiğine bağlı mutasyonlar gözlenmiştir. Özellikle, VP1 kapsid proteininde C199W amino asit yer değiştirmesi taşıyan fenotipik ilaca dirençli virüs varyantların varlığı mutant genotip ile ilaca dirençli fenotip arasındaki bağlantıyı doğrulamıştır. Sonuç olarak, CIM212240 bileşiğinin HRV-14 replikasyonunun seçici bir inhibitörü olduğu kanıtlanmış ve rinovirüse karşı antiviral etkinliği ortaya koyulmuştur.

Abstract:
Human rhinoviruses (HRVs) are RNA viruses that cause common cold and respiratory tract infections belonging to the Enterovirus genus of the Picornaviridae family. In this study, the antiviral effect of the compound CIM212240 (molecular formula: C25H32N6O) developed in the Centre for Drug Design and Discovery (CD3, Leuven, Belgium) Laboratory, in the HRV-14 strain of human rhinoviruses were performed using HeLa Rh cells. Firstly, different concentrations of this antiviral compound of the potential drug and HRV-14 strain MOI [Multiplicity of infection; Infection multiplier (number of viruses: number of cells)] cocultured at 10000:1, 1000:1, 100:1 ratio; cell viability was measured by the colorimetric MTS cytotoxicity test. 50% effective concentration (EC50) was calculated using optical density values (OD); compound concentrations that protect 50% of cells from virus-induced cytopathic effect were determined. Second, the presence of HRV-14 variants phenotypically resistant to CIM212240 was observed by a five-step clonal selection procedure; viral RNAs were isolated using Nucleospin© RNA virus (Macherey-Nagel). The cDNA fragments covering the entire HRV-14 coding sequence were synthesized by using a one-step RT-PCR kit and designing specific primers for HRV-14. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System were used to purify the resulting cDNA fragments; DNA sequences were analysed using Sanger sequencing. The phenotypically observed resistant variants were compared with the virus control, stock strain and Protein Blast, and mutations due to compound CIM212240 were observed. In particular, the presence of phenotypic drug-resistant virus variants carrying the C199W amino acid substitution in the VP1 capsid protein confirmed the link between the mutant genotype and the drug-resistant phenotype. In conclusion, the compound CIM212240 proved to be a selective inhibitor of HRV-14 replication and its antiviral activity against rhinovirus was demonstrated.