Fare miyoblast hücre hattında KLF5 geninin farklılaşma sürecine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of KLF5 gene on differentiation in mouse myoblast cell line
Yazar: UĞUR AKPULAT
Danışman: DOÇ. DR. YUSUF ÇETİN KOCAEFE
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Fareler = Mice ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Kas gelişimi = Muscle development ; Kaslar = Muscles ; Miyoblast = Myoblast ; Rejenerasyon = Regeneration ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries

Özet:
İskelet kasının embriyonik gelişimi ve hasar sonrası tamiri, miyojenik düzenleyici faktörler (MRF'ler) ve paired-homeobox transkripsiyon faktörleri gibi benzer moleküler düzenleyiciler tarafından kontrol edilmektedir. Miyogenez sıkı bir şekilde kontrol edilen karmaşık bir işlemdir ve bu süreçte miyoblastların aktivasyonunu, proliferasyonunu, miyojenik yolağa adanmışlığını, göçünü ve füzyonunu kontrol eden diğer proteinler ve mekaznizmalar yoğun bir şekilde incelenmektedir.
Çinko parmak yapısı içeren bir transkripsiyon faktörü olan Klf5'in kas farklılaşması sürecinde rol oynadığını önceki çalışmalarımız ortaya koymuştur. Klf5'in bazal ifadesi in vitro koşullarda miyoblastların farklılaşması ve miyotüp oluşumu sırasında artmaktadır. Benzer şekilde in vivo akut kas hasarı tamiri sürecinde yeni kas liflerinin gözlendiği rejenerasyon sırasında ifadesi artmakta ve doku mimarisinin tekrar kurulmasıyla ilk seviyelerine dönmektedir. Klf5 ifadesi kalıtsal miyopatiler ve hayvan modellerinde de artış göstermektedir. Klf5 in vivo rejenerasyon ve in vitro farklılaşma süreçlerinde SUMOlanarak çekirdeğe göç etmektedir. 
Bu tez çalışması sürecinde yapılan çalışmalar ile Klf5 ifadesinin shRNA aracılıklı kalıcı ve uyarılır koşullarda sustutulması sağlanarak miyoblastlarda proliferasyon hızını ve farklılaşma süreçlerinde füzyon ve miyotüp oluşumu aşamalarını düzenlediği anlaşılmıştır. Diğer yandan Klf5 ifadesinin artırılması miyoblast hücre döngüsünün durmasına neden olmaktadır. Bu bulgular dominant negatif Klf5 aracılığı ile işlevinin ortadan kaldırılması yoluyla da doğrulanmıştır. Kas farklılaşma programının M-cadherin, NCAM ve Desmin gibi belirteçlerinin ifade analizleri ve hücre çoğalma analizleri yapılarak miyoblast proliferasyon hızının ortaya koyulması ile bu bulgular desteklenmiştir. Klf5'in miyoblast proliferasyonu ve farklılaşması dışında hücre hareketi üzerine de bir rolü olduğunu ortaya koyacak sonuçlar da elde edilmiştir. Klf5 ve kas farklılaşma programının diğer düzenleyicileri arasındaki etkileşimin ortaya koyulması amacıyla yapılan çalışmalar, Klf5'in Myogeninin üzerinde düzenleyici etkisi bulunduğunu ortaya koyarken, ana düzenleyicilerden biri olan MyoD'nin etkisi altında inhibitör etkilerini kaybettiği yönünde bulgular elde edilmiştir. Bu veriler Klf5'in iskelet kası öncül hücrelerinin çoğalma ve farklılaşmasında rol oynayan ve kas dokusu tamirinde etkin, yeni bir düzenleyici transkripsiyon faktörü olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Embryonic development of the skeletal muscle and injury repair share several molecular events such as the myogenic regulatory factors (MRFs) and paired-homeobox transcription factors. Myogenesis is a highly regulated complex process and several other regulatory proteins and mechanisms that control  activation, proliferation, commitment, migration and fusion of the myoblasts are studying hardly.
Our previous studies shown a zinc finger protein, Klf5 interplays in muscle differentiation. Basal expression of Klf5 in myoblasts is upregulated in the course of differentiation and myotube formation in vitro. Similarly, Klf5 is also upregulated in vivo during acute injury regeneration concomitantly with the formation of young myofibers and returns to the baseline upon restoration of the tissue architecture. Likewise, Klf5 expression is also induced in chronic degenerative conditions such as the inherited myopathies and representative animal models. Klf5 was sumoylated and translocated to the nucleus with differentiation in vitro and regeneration in vivo.  
Experimental studies that are conceived for this thesis work that included shRNA mediated conditional silencing Klf5 showed that Klf5 regulated the proliferation rate of myoblasts but as well as the fusion and myotube maturation stages of differentiation. On the other hand, overexpression of Klf5 was shown to induce cell cycle arrest. These findings are also confirmed by the disruption of Klf5 function using a dominant negative Klf5 isoform. The expression analysis of myogenic differentiation markers such as M-cadherin, NCAM, Desmin as well as DNA quantitation based proliferation rate analysis of myoblasts further supported  these findings. In vitro studies also revealed that Klf5 also exerted a role in motility of the myoblasts beside proliferation and differentiation. Studies were conducted to reveal the plausible interactions between Klf5 and other MRFs. Results suggest that Klf5 implies a regulatory function over Myogenin. However, the master regulator MyoD is apparently counteracting the inhibitor functions of Klf5. This data provide evidence that Klf5 is a novel modulator of the proliferation and differentiation of myoblasts, impacting skeletal muscle regeneration.