Sığırlarda in vitro maturasyon ortamına ilave edilen putresinin embriyo gelişimi ve kalitesine etkisi
Effect of putrescine supplementation to in vitro maturation medium on embryo development and quality in cattle
Yazar: ESRA BİÇİCİ
Danışman: DOÇ. DR. HASAN ALKAN
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Embriyo = Embryo ; Embriyo gelişimi = Embryonic development ; Olgunlaşma = Maturation ; Putresin = Putrescine ; Sığırlar = Cattles ; İn vitro = In vitro

Özet:
Sığırlarda in vitro embriyo üretimi giderek yaygınlaşan biyoteknolojik bir yöntemdir. Bu yöntemin başarısını etkileyen birçok faktör bulunması nedeniyle embriyo gelişimi ve kalitesini artırmak amacıyla birçok araştırma yapılmaktadır. Sunulan bu çalışmanın da amacı, sığırlarda in vitro embriyo üretimi sırasında maturasyon medyumuna ilave edilen putresinin maturasyon ve embriyo gelişimi/kalitesi üzerine etkisinin araştırılmasıdır.
Çalışmada; Holstein ırkı sığırlara ait ovaryumlardan elde edilen oositler kullanıldı. Elde edilen kumulus oosit kompleksleri; morfolojik yapı, sitoplazmik özelliği ve kumulus hücre sayısına göre değerlendirildi ve çalışmada yalnızca kategori I (A kalite) olanlar kullanıldı. İn vitro maturasyon aşamasından önce oositler iki gruba ayrıldı. Birinci gruba (Putresin grubu, n=159) in vitro maturasyona alınmadan önce maturasyon medyumuna 0.5 mM olacak şekilde putresin ilavesi yapıldı. İkinci grubun (Kontrol grubu, n=149) maturasyon medyumuna ise herhangi bir ilave uygulanmadı. Maturasyon medyumuna aktarılan oositler, 38,5 °C ve %5,5 CO2 21-24 saat inkübasyona bırakıldı. Maturasyon sonrası oositlerin kumulus ekspansiyon dereceleri (Grade I: poor, Grade II: kısmi ve Grade III: tam) belirlendi. Ayrıca maturasyon sonrası oositlerin mayoz bölünmeleri diferansiyel boyama yapılarak değerlendirildi. Telofaz I veya daha sonraki mayoz bölünme aşamaları belirlenen oositlerde mayoz bölünmelerin yeniden başladığı kabul edildi. Daha sonra oositler sperma ile fertilizasyona bırakıldı ve son olarak muhtemel zigotlar kültür medyumuna aktarıldı. Kültür sonrası elde edilen embriyolar IETS kriterlerine göre değerlendirildi. İn vitro kültür sonrası embriyoların gelişim dönemleri belirlendikten sonra sadece blastosist aşamasındaki embriyolar diferansiyel boyama yöntemi ile hücre sayılarının belirlenmesi amacıyla boyandı. Grupların kumulus ekspansiyon dereceleri değerlendirildiğinde, putresin grubunda Grade III kumulus ekspansiyon oranı kontrol grubuna göre daha yüksek (%74,21 ve %60,4; sırasıyla) ve Grade I ekspansiyon oranı (%11,95 ve %26,17; sırasıyla) ise istatistiksel olarak daha düşük bulundu. Kumulus ekspansiyon derecelerine göre mayoz bölünmelerin yeniden başlaması değerlendirildiğinde, kumulus ekspansiyonu arttıkça mayoz bölünmelerin yeniden başlama oranının arttığı tespit edildi. Ayrıca putresin grubunda oositlerin bölünme ve blastosiste ulaşma oranları kontrol grubuna göre istatiksel olarak daha yüksek bulundu. Bununla birlikte maturasyon medyumuna putresin ilavesi sonrası elde edilen blastosistlerde iç hücre kümesi, trofektoderm ve toplam hücre sayıları kontrol grubuna göre istatiksel olarak daha yüksek bulundu. 
Sonuç olarak sığırlarda in vitro embriyo üretimi sırasında maturasyon medyumuna putresin ilavesi yapılmasının kumulus ekspansiyon derecesini ve mayoz bölünmelerin yeniden başlama oranını artırdığı belirlendi. Ayrıca putresin ilavesinin hücre gelişimlerinin daha iyi gerçekleşmesine sebep olarak oositlerin blastosiste ulaşma oranını artırdığı düşünülmektedir.

Abstract:
In vitro embryo production in cattle is an increasingly common biotechnological method. Since there are many factors affecting the success of this method, much research is carried out to improve embryo development and quality. The aim of this study was to investigate the effect of putrescine supplementation to maturation medium during in vitro embryo production in cattle on maturation and embryo development/quality.
Oocytes obtained from the ovaries of Holstein cattle were used in the study. Obtained cumulus oocyte complexes were evaluated according to morphological structure, cytoplasmic features and cumulus cell number, and only category I (A quality) ones were used in the study. Before the in vitro maturation stage, oocytes were divided into two groups. In the first group (Putrescine group, n=159), 0.5 mM putrescine was added to the maturation medium before in vitro maturation. No addition was applied to the maturation medium of the second group (Control group, n=149). Oocytes transferred to maturation medium were incubated for 21-24 hours at 38.5 °C and 5.5% CO2. Cumulus expansion degrees of oocytes after maturation (Grade I: poor, Grade II: partial and Grade III: complete) were determined. In addition, meiosis of oocytes after maturation was evaluated by differential staining. It was accepted that meiosis resumption in oocytes whose telophase I or later meiosis stages were determined. Then the oocytes were left for fertilization with sperm and finally possible zygotes were transferred to the culture medium. Embryos obtained after culture were evaluated according to IETS criteria. After determining the developmental stages of the embryos after in vitro culture, only the embryos at the blastocyst stage were stained with the differential staining method to determine the cell numbers. When the cumulus expansion degrees of the groups were evaluated, the Grade III cumulus expansion rate in the putrescine group was higher than the control group (74.21% and 60.4%; respectively) and the Grade I expansion rate (11.95% and 26.17%; respectively) was found statistically lower. When the resumption of meiosis was evaluated according to the cumulus expansion degrees, it was determined that the rate of resumption of meiosis increased as the cumulus expansion increased. In addition, the cleavage rates of oocytes and reaching the blastocyst in the putrescine group were found to be statistically higher than in the control group. However, inner cell mass, trophectoderm and total cell counts were found to be statistically higher in blastocysts obtained after the putrescine supplementation to the maturation medium compared to the control group.
As a result, it was determined that the putrescine supplementation to the maturation medium during in vitro embryo production in cattle increased the degree of cumulus expansion and the rate of resumption of meiosis. In addition, it is thought that putrescine supplementation increases the rate of reaching the blastocyst of oocytes due to better cell development in embryos.