Ratlarda deneysel kontrollü non-heart-beating donör (NHBD) modelinde ghrelinin karaciğer hasarını önleyici etkisi
Preventive effect of ghrelin on liver injury in non-heart-beating donor (NHBD)model with experimental control in rats
Yazar: MURAT MERT
Danışman: PROF. DR. A. ZEKİ YILMAZ
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Genel Cerrahi = General Surgery
Dizin: Ghrelin = Ghrelin ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer nakli = Liver transplantation ; Organ nakli = Organ transplantation ; Sıçanlar = Rats ; Transplantlar = Transplants ; İskemi = Ischemia

Özet:
Amaç: Bu çalışmada amaç, ratlarda deneysel kontrollü non?heart beating donör (NHBD) modelinde, kardiyak arrest öncesi, ghrelin kullanılarak sıcak iskemi süresini uzatmak, sıcak iskeminin oluşturduğu etkileri azaltmak ve iskemi-reperfüzyon hasarından karaciğeri koruyarak NHBD organlarının kullanılabilirliğini artırmak.Materyal ve Metod: Bu deneysel çalışma Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Hakan Çetinsaya Deneysel ve Klinik Araştırma Merkezinde (DEKAM), Ocak-Eylül 2011 tarihleri arasında yapıldı. Çalışmada 225-290 gram ağırlığında 48 Erkek Wistar-Albino rat (28-32 haftalık) kullanıldı. Ratlardan , Kontrol I-II-III (15,30,60 dakika sıcak iskemi süresi), Çalışma I-II-III (15,30,60 dakika sıcak iskemi süresi) grubu şeklinde herbiri 8 sıçan içeren toplam 6 grup oluşturuldu. Sıçanlara intraperitoneal ketamin-HCl (10 mg/kg) ve xylazin (3 mg/kg) ile anestezi altında servikal dislokasyon yapıldı. Bu işlemden önce sıçanlara 0,1 ml heparin subkütan olarak uygulandı. Kontrol grubunda , anestezi altında servikal dislokasyon yapılan ratlara 15 dakika, 30 dakika, 60 dakika sıcak iskemi süreleri beklendikten sonra orta hat insizyon ile laparatomi yapıldı. Karaciğer manipule edilerek portal vene 3,5 french kateter yerleştirildi, hepatik arter pedikülün proksimalinden bağlandı. Karaciğere portal venden 50 ml soğuk (+4 derece) euro collins solüsyonu verilerek yıkandı. Daha sonra hepatektomi yapılarak karaciğerler Wisconsın solusyonu ile perfüze edildikten sonra 4 saat soğukta saklama yapıldı. Çalışma grubunda, ghrelin 12 nmol/kg intravenöz olarak verilerek, 30 dakika sonra anestezi altında servikal dislokasyon yapılan ratlara 15 dakika, 30 dakika, 60 dakika sıcak iskemi süreleri beklendikten sonra orta hat insizyon ile laparatomi yapıldı. Karaciğer manipule edilerek portal vene 3,5 french kateter yerleştirilerek, hepatik arter pedikülün proksimalinden bağlandı. Karaciğere portal venden 50 ml soğuk (+4 derece) euro collins solüsyonu verilerek yıkandı. Daha sonra hepatektomi yapılarak karaciğerler Wisconsın solusyonu ile perfüze edildikten sonra 4 saat soğukta saklama yapıldı. Kontrol ve çalışma grubundaki sıçanların perfüzatları biyokimyasal parametrelerden AST, ALT, IL-6, TNF-? ve Laktat çalışılmak üzere çalışma gününe kadar -80 derecede saklandı. İmmunohistokimyasal olarak karaciğerler PCNA ve bcl-2 pozitifliği yönünden değerlendirilmek üzere uygun koşullarda saklandı.Bulgular: Aynı sıcak iskemi sürelerine sahip Kontrol ve çalışma (ghrelin) grupları karşılaştırıldı. AST değerleri tüm sıcak iskemi sürelerinde çalışma grubunda, kontrol grubuna kıyasla istatistiki olarak anlamlı şekilde daha düşüktü (15. dakikada P = 0.041, 30. dakikada P=0.047, 60. dakikada P=0.016). 15 dakika sıcak iskemi ALT değeri çalışma grubunda, kontrol grubuna göre istatistiki olarak anlamlı şekilde daha düşüktü (P = 0.021). 30 ve 60 dakika sıcak iskemi ALT değerleri kontrol ve çalışma grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmasada çalışma grubu kontrol grubuna göre daha düşük değerlere sahipti (30. dakika P= 0.234 , 60. dakika P = 0.610). IL-6 değerleri 15. , 30. ve 60. dakika sıcak iskemi kontrol ve çalışma grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmasada çalışma grubu kontrol grubuna göre daha düşük değerlere sahipti (15. dakika P=0.362, 30. dakika P=0.077 , 60. dakika P=0.065 ). TNF-? değerleri tüm sıcak iskemi sürelerinde çalışma grubunda kontrol grubuna göre istatistiki olarak anlamlı şekilde daha düşüktü (15. dakikada P= <0.001, 30. dakikada P=<0.001, 60. dakikada P=<0.008). Laktat değerleri tüm sıcak iskemi sürelerinde çalışma grubunda kontrol grubuna göre istatistiki olarak anlamlı şekilde daha düşüktü (15. dakikada P =< 0.001, 30. dakikada P=<0.001, 60. dakikada P=<0.001). PCNA işaretlenme oranları 15. , 30. dakika sıcak iskemi süreleri karşılaştırıldıklarında, kontrol ve çalışma grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı (sırası ile P=0.503, P=0.265 ). 60. dakika sıcak iskemi süresinde PCNA işaretlenme oranı çalışma grubunda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde daha düşük değere sahipti ( P=<0.001 ). Bcl-2 boyanma şiddeti ve boyanma yüzdeleri açısından 15. , 30. ve 60. dakika sıcak iskemi sürelerinde kontrol ve çalışma grupları karşılaştırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmasada çalışma grubu kontrol grubuna göre daha düşük değerlere sahipti (Boyanma şiddetinde 15. dakikada P=0.315, 30. dakika P=1.000 , 60. dakika P=0.000. Boyanma yüzdesinde 15. dakikada P=0.184, 30. dakika P=0.619 , 60. dakika P=0.076 ).Sonuç: Ghrelin, ratlarda deneysel kontrollü non?heart beating donör modelinde, uzamış sıcak iskemiye rağmen, iskemi reperfüzyonun zararlı etkilerinden karaciğeri biyokimyasal ve morfolojik olarak koruyarak, greft disfonksiyonu ve primer greft nonfonksiyonunu (PNF) önlemektedir.Anahtar Kelimeler: Non-heart-beating donör (NHBD), sıcak iskemi (Sİ), primer greft nonfonksiyonu (PNF), ghrelin.

Abstract:
Objective: In the present study the aim was to prolong warm ischemia time; to mitigate the effects of warm ischemia; to protect liver from ischemia-reperfusion injury by using ghrelin before exposed to cardiac arrest in a non-heart beating donor (NHBD) model with experimental control in rats; thereby, to increase usability of these organs.Material and method: This experimental study was performed at Hakan Çetinsaya Experimental and Clinical Research Center of Erciyes University, Medicine School between January 2011 and September 2011. Forty-eight male Wistar-Albino rats (28-32 week old, 225-290 g weight) were used in the present study. Rats were assigned into 6 group (n=8) including Control I-II-III (15, 30, 60 min warm ischemia time, respectively) and Study I-II-III (15, 30, 60 min warm ischemia time, respectively). Cervical dislocation was performed under ketamine (10 mg/kg) and xylazine (3 mg/kg) anesthesia following 0.1 ml SC heparin injection. In the control group, a laparotomy with midline incision was done after 15, 30 and 60 min warm ischemia period in the rats underwent cervical dislocation. A 3.5 Fr catheter was inserted to portal vein and hepatic artery ligation was done from proximal to its pedicle. Liver was flushed by giving 50 ml cold (+4 ºC) Euro Collins solution from portal vein. Then, liver was removed by hepatectomy and liver perfusion was achieved by Wisconsın solution; followed by cold storage for 4 hours. In the study group, cervical dislocation was performed 30 minutes after 12 nmol/kg IV ghrelin administration. Then, a laparotomy with midline incision was done after 15, 30 and 60 min warm ischemia period in the rats underwent cervical dislocation. A 3.5 Fr catheter was inserted to portal vein and hepatic artery ligation was done from proximal to its pedicle. Liver was flushed by giving 50 ml cold (+4 ºC) Euro Collins solution from portal vein. Then, liver was removed by hepatectomy and liver perfusion was achieved by Wisconsın solution; followed by cold storage for 4 hours. Perfusate of rats both in study and control groups were stored at -80 ºC to evaluate AST, ALT, IL-6, TNF-? and lactate. Livers were stored in appropriate condition to assess PCNA and Bcl-2 by immunohistochemistry.Findings: Control and study groups with same warm ischemia period were compared. When AST values were compared, it was statistically significant lower in study group than control group for all warm ischemia periods (p=0.041 for 15 min; p=0.047 for 30 min; p=0.016 for 60 min). When ALT values were compared, ALT value for 15 minute was statistically significant lower in study group than control group (p=0.021); however, ALT value for 30 and 60 min was lower in study group, but didn?t reach statistically significance (p=0.234 for 15 min and p=0.610 for 60 min). When IL-6 values were compared, it was found that study group had lower values than control group, although difference for 15, 30 and 60 min didn?t reach statistically significance (p=0.362 for 15 min; p=0.77 for 30 min; p=0.065 for 60 min). When TNF-? values were compared, it was significantlly lower in study group than control group for all warm ischemia periods (p<0.001 for 15 min; p<0.001 for 30 min; p<0.008 for 60 min). When lactate values were compared it was significantlly lower in study group than control group for all warm ischemia periods (p<0.001 for 15 min; p<0.001 for 30 min; p<0.001 for 60 min). When PCNA labeling percentage was compared, no significant difference was found between groups for 15, 30 min warm ischemia periods (p=0.503 for 15 min; p=0.265 for 30 min.). PCNA labeling percentage was statistically significantly lower in study group than control group for 60 min warm ischemia period (p<0.001). When Bcl-2 staining intensity and percentage were compared, study groups had lower values than control groups, although difference for 15, 30 and 60 min didn?t reach statistically significance (Staining intensity: p=0.315 for 15 min; p=1.00 for 30 min; p=0.000 for 60 min; Staining percentage: p=0.184 for 15 min; p=0.619 for 30 min; p=0.076 for 60 min).Conclusion: Ghrelin prevents graft dysfunction and primary graft non-function (PNF) by biochemically and morphologically protecting liver from harmful effects of ischemia-reperfusion in the setting of prolonged warm ischemia in non-heart beating donor (NHBD) model with experimental control in rats.Keywords: Non-heart beating donor (NHBD), warm ischemia (WI), primary graft non-function (PNF), ghrelin.