4-amino benzohidrazid türevleri kullanılarak karaturp ve şalgamdan peroksidaz enziminin saflaştırılması
Purification of black radish and turnip pod enzymes using with 4-amino benzohydrazide derivates
Yazar: AYKUT ÖZTEKİN
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidan enzimler = Antioxidant enzymes ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification

Özet:
Bu tez kapsamında amino benzohidrazid molekülleri kullanılarak bitki peroksidaz enzimlerinin tek basamakta saflaştırılması için en etkili ve yeni afinite ligantlarının belirlenmesi hedeflendi. Bu amaçla, literatürde 4-amino benzohidrazid ile yapılan bitki peroksidaz enzimlerinin saflaştırma çalışmalarına katkı sağlamak için ilk defa 4-amino 2-metil benzohidrazid, 4-amino 3-metil benzohidrazid, 4-amino 2-metoksi benzohidrazid, 4-amino 3-metoksi benzohidrazid türev molekülleri sentezlenerek POD enzimlerinin saflaştırılmasında kullanıldı. Türev moleküllerin metilbenzoat formlarından hidrazin sentezleri yapılarak, karaturp ve şalgam POD enzimleri üzerine inhibisyon etkileri incelendi ve dönüşümlü inhibisyon gösteren moleküller Sepharose-4B-L-Tirozin jel materyaline bağlanarak elde edilen afinite jelleri ile tek kademede karaturp ve şalgam POD enzimlerinin saflaştırılması gerçekleştirildi. 4-amino 2-metil benzohidrazid molekülü kullanıldığında POD enzimi, karaturptan %14,1 verimle 211,4 kat, şalgamdan %11,7 verimle 444,6 kat, 4-amino 3-metil benzohidrazid ile karaturptan %14,2 verimle 191,6 kat, şalgamdan %10,2 verimle 234 kat, 4-amino 2-metoksi benzohidrazid ile karaturptan %33,6 verimle 676,4 kat, şalgamdan %20,1 verimle 806,7 kat, 4-amino 3-metoksi benzohidrazid ile karaturptan %10,1 verimle 244,3 kat ve şalgamdan %12,2 verimle 653,9 kat saflaştırma yapıldı. Tüm kolonlardan saflaştırılan enzimlerin molekül ağırlığı ve enzim saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi. Karaturp POD enzimi için 43-47 kDa'da tek bant, şalgam POD enzimi için ise 47 kDa'da tek bant gözlendi. Tüm kolonların saflaştırma sonuçları karşılaştırıldı ve en iyi kolon olan Sepharose-4B-L-Tirozin-4-amino-2-metoksi benzohidrazid kolonu için kolon tutma kapasitesi, karaturp ve şalgam POD enzimleri için değişik pH, sıcaklık, iyonik şiddetlerde (I) çalışıldı. Karaturp POD enzimi için optimum şartlar: pH 8,0, sıcaklık 15°C, I 0,35 M, şalgam POD enzimi için ise pH 8,0, sıcaklık 15°C, I 0,3 M olarak hesaplandı.

Abstract:
In this thesis, it was aimed to determine the most effective and novel affinity ligands for purification of plant peroxidase enzymes in one step using amino benzohydrazide molecules. For this purpose, in order to contribute to the purification studies of plant peroxidase enzymes made with 4-amino benzohydrazide in the literature, 4-amino 2-methyl benzohydrazide, 4-amino 3-methyl benzohydrazide, 4-amino 2-methoxy benzohydrazide, 4-amino 3-methoxy benzohydrazide derivative molecules were used for the purification of POD enzymes for the first time. The inhibition effects on the POD enzymes of black radish and turnip were investigated by carrying out the hydrazine synthesis from the methyl benzoate forms of the derivative molecules and the purification of black radish and turnip POD enzymes in one step was performed with affinity gels obtained by binding alternating inhibitory molecules to Sepharose-4B-L-Tyrosine gel material. When 4-amino 2-methyl benzohydrazide was used as ligand, POD enzyme was purified 211.4 fold with a yield of 14.1% from the black radish, 444.6 fold with a yield of 11.7% from the turnip, 191.6 fold with a yield of 14.2% from the black radish with 4-amino 3-methyl benzohydrazide, 234 fold with a yield of % 10.2 from the turnip with 4-amino 3-methyl benzohydrazide, 676.4 fold with a yield of % 33.6 from the black radish with 4-amino 2-methoxy benzohydrazide, 806.7 fold with a yield of 20.1% from the turnip with 4-amino 2-methoxy benzohydrazide, 244.3 fold with a yield of % 10.1 from the black radish with 4-amino 3-methoxy benzohydrazide and 653.9 fold with a yield of 12.2% from the turnip with 4-amino 3-methoxy benzohydrazide. The molecular weight and enzyme purity of the enzymes purified from all the columns were controlled by SDS-PAGE. Single band at 43-47 kDa for black radish POD enzyme and single band at 47 kDa for turnip POD enzyme were observed. The purification results of all the columns were compared and the column holding capacity for Sepharose-4B-L-Tyrosine-4-amino-2-methoxy benzohydrazide column, which is the best column, different pH, temperature, ionic strengths (I) for the black radish and turnip POD enzymes were studied. The optimum conditions for the black radish POD enzyme were calculated as pH 8.0, temperature 15°C, I 0.35 M and the optimum conditions for the turnip POD enzyme were calculated as pH 8.0, temperature 15°C, I 0.3 M.