Spermden model membranlara lipit asimetrisinin kaybı
The loss of lipid asymmetry: from sperm to lipid bilayers
Yazar: GÜLÇİN PEKKURNAZ
Danışman: PROF. DR. ASUMAN SUNGUROĞLU ; PROF. DR. JOSHUA ZIMMERBERG
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Membranlar = Membranes

Özet:
Fertilizasyon, birkaç aşamadan oluşan membran füzyon sürecidir. İlk olarak, bir akrozomal vezikül, sperm plazma membranı ile füzyona girer ve bu aşama akrozomal vezikül ekzositozu olarak adlandırılır. Ekzositoz neticesinde sperm plazma membranının lipit ve protein içeriğinde meydana gelen değişiklikler, sperm ve yumurta plazma membranlarının füzyonuna izin verir. Bu tez çalışmasında denizkestanesi sperm hücreleri kullanılmış ve akrozomal vezikül ekzositozu sonrasında negatif yüklü Fosfatidilserin (PS) 'in spermin dışa bakan membran yüzeyine transfer olduğu gösterilmiştir. 4.5 collidal gold ile hazırlanmış ve PS'e spesifik bağlanan AnnexinV ile, bu lipidin özellikle sperm membranının yumurta membranı ile füzyona girecek bölgesinde yoğunlaştığı elektron mikroskobu yardımı ile belirlenmiştir. PS'in baş kısmına bağlanan proteinlerin sperm-yumurta füzyonunu inhibe ettiği gösterilmiş ve fertilizasyondaki önemli rolü aydınlatılmıştır.Plazma membran asimetrisinin nasıl çok hızlı şekilde bozulabildiği ( spermde 15 saniye) , bunu sağlayan mekanizmanın ne olduğu hücre biyolojisinde hala aydınlığa kavuşmamış sorulardan birisidir. Hızlı asimetri kaybından sorumlu veya bu mekanizmayı düzenleyen protein adayı mevcut değildir. Membran lipitlerinin non-bilayer yapılanmalar olarak da adlandırılabilen, porlar aracılığı ile çok çabuk transferinin gerçekleşebileceği hipotez olarak ortaya atılsa da, kantitatif olarak ölçülememiştir. Por aracılı membran asimetri kaybını modellemek amacıyla Montal-Mueller tekniği ile oluşturulmuş asimetrik lipit bilayer' lar kullanılmış, asimetrik membran dinamiklerinin daha detaylı olarak izlenip özellikle por aracılı lipit transfer hızının saptanmasını sağlayacak yeni bir ölçüm sistemi geliştirilmiştir. Negatif yüklü PS'in, por oluşumunu takiben her iki monolayer da değişen miktarının zamana bağımlı ölçümü sonucu lipit por aracılı membran asimetri kaybı ilk kez kantitatif olarak gösterilmiştir. Yeni geliştirdiğimiz bu yöntem ile ölçülen lipit transfer hızı hücrelerde saptanan hıza uyum göstermektedir.

Abstract:
Fertilization is a dual level membrane fusion process. In the first, acrosomal vesicle fuses with the sperm plasma membrane, which is called acrosomal vesicle exocytosis. The resulting changes in the lipid and protein content of the sperm plasma membrane allow sperm and egg fusion. We have studied the loss of membrane asymmetry and surface exposure of phosphatidylserine (PS) in viable sea urchin sperm cells before and during acrosomal vesicle exocytosis. We demonstrated that PS is localized on the sperm head in less than 15sec following acrosome reaction by using fluorescent and 4, 5 colloidal gold conjugated Annexin V. Our results further indicate that blocking of PS inhibits sperm and egg membrane fusion.Understanding how membrane lipids lose their asymmetric transmembrane distribution and achieve their nonrandom distribution in cells is a key challenge in cell biology. We hypothesized that the formation of a transient hydrophilic lipidic pore in the membrane leads to rapid diffusive translocation of negatively charged lipids through the pore to the opposite membrane leaflet. To test this hypothesis, we used asymmetric model membranes and established a variation of the inner field compensation technique for the time resolved measurements of membrane boundary potentials. External application of electric fields across the bilayer induced transient conductive states. We observed fast transitions between these different conductance levels, reflecting opening and closing of meta-stable lipidic pores. Comparison of the capacitance minimization potential for different asymmetric membranes before and after pore formation confirmed negatively charged lipids transfer across the bilayer. We also constructed a model governing lipid flow rate based on pore analysis and lipid lateral diffusion rate. This rate was matching with the PS exposure time in the sperm cells. Together, our study provides a new tool to monitor loss of membrane asymmetry and our results indicate that lipid transfer can occur through lipidic pores.