Sodyum florür (NAF) uygulanan renal ve osteoblast hücre hatlarında bazı vitaminlerin apoptozis ve DNA hasarı üzerine etkileri
The effects of some vitamine supplements on apoptosis and dna damage on sodium fluoride (NAF) treated renal and osteoblast cell lines
Yazar: VEYSEL YÜKSEK
Danışman: PROF. DR. SEMİHA DEDE ; DOÇ. DR. MEHMET TAŞPINAR
Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre kültürü = Cell culture ; Osteoblastlar = Osteoblasts ; Sodyum florür = Sodium fluoride ; Vitaminler = Vitamins

Özet:
Bu çalışma, antioksidan ve koruyucu özellikleri olan vitaminlerin (A, D, E, C), 24 saatlik IC50 oranında NaF uygulanan NRK-52E ve hFOB 1.19 hücre hatlarında, bazı apoptotik belirteçlerinin ekpresyonu ve translasyonu üzerine etkilerinin araştırılması amacıyla planlandı. Hücreler in vitro koşullarda haftada iki-üç kez düzenli pasajları yapılarak çoğaltıldı. MTT ile NaF'ün IC50 değeri ve vitaminlerin toksik olmayan dozları belirlendi. Hücreler 96'lık kültür plaklarına 104, flasklara ise 106 olacak şekilde ekimi yapıldı. Hücre hatlarında gruplar ELISA ve real time-PCR için kontrol, NaF ve NaF+ vitaminler olarak belirlendi. MTT % proliferasyon için ise dozlar kontrol, NaF ve NaF+vitaminler olarak belirlendi. Biyokimyasal analizler için hücreler 24 saat inkübasyonu takiben tripsinasyon ile toplanıldı ve dondur/çöz yöntemiyle parçalanarak analize hazırlandı. mRNA izolasyonu için 12 saat takiben hücreler tripsinasyon yöntemiyle toplandı ve manuel yöntemiyle mRNA izole edildi. Kaspaz 3, 8 ve 9, 8-OHdG ve M30 miktarları ELISA yöntemiyle belirlendi. Kaspaz 3, 8 ve 9 Revers transkriptaz-PCR yöntemiyle cDNA elde edildi. Real time-PCR yöntemiyle hedef gen DNA'ları çoğaltıldı. MTT çalışmalarında NaF+vitamin verilen gruplardaki hücre proliferasyonun NaF verilen tüm gruplardan daha fazla olduğu tespit edildi, NRK- 52E hattı çalışması sonucunda; NaF IC50 değeri olarak belirlenmesine rağmen, apoptozisi yeterince tetiklemediği düşündürmektedir. Bunun için görülen hücre ölümünde apoptotik yolaklardan daha başka mekanizmaların da etkin hale geldiği düşünülmektedir. ELISA ile tespit edilen apoptozis parametrelerinden olan kaspaz enzim konsantrasyonlarının, gen ekspresyonu ile uyumlu olmadığı görüldü. hFOB 1.19 hücre hattında IC50 düzeyinde hücre ölümüne yol açan NaF düzeyinin tespitinden sonra, ortaya çıkan hücre ölümünün NaF ve vitamin A tek başına verildiğinde apoptozisi arttırdığı, her ikisinin birlikte verilmesi ile de azaldığı tespit edildi. Sonuç olarak apoptotik kaspaz 3 ve 8 enzimlerinin arttığı, apoptotik M30 proteinin ise NaF+vitamin D ve vitamin C gruplarında arttığı, NaF grubunda ise ilginç bir şekilde azaldığı tespit edildi. Bu verilerin ışığında, NaF'e bağlı hücre ölümünde en geçerli ve etkili mekanizma ve bu mekanizma üzerinde vitaminlerin inhibe-aktive edici etkilerinin aydınlatılmasında, farklı doz, süre ve analiz metotları kullanılarak araştırmalar yapılması düşünülmektedir.

Abstract:
This study was planned to investigate the effects of antioxidant and preservative vitamins (A, D, E, C) on the expression and translasyon of some apoptotic markers in the NRK-52E and hFOB 1.19 cell lines treated with NaF. NRK-52E and hFOB 1.19 cells were cultured in vitro by conducting regular pasage twice or three times weekly. IC50 values of NaF and non-toxic doses of vitamins were determined by which MTT method. Cells were subcultured in 96-multi-well microtiter plateses (1×104cells) and flasks (1×106cells). For ELISA and real time-PCR working groups were identified as NaF (5000 μM for hFOB 1.19, 6000 μM for NRK-52E) and NaF+vitamins in the cell lines. For biochemical analyzes, the cells were harvested by trypsinization followed by incubation for 24 hours and lysed by freeze/thaw method. The cells were collected by trypsinization following 12 hours for RNA isolation. Quantity of Caspase 3, Caspase 8 and Caspase 9, 8-OHdG and M30 were determined by ELISA. Caspase 3, Caspase 8 and Caspase 9 cDNA was obtained by revers transkriptaz-PCR method. Targets gene DNAs were amplified by real time- PCR. In MTT studies, it was determined that the cell proliferation in the NaF+vitamints treated groups was greater than in all NaF-treated groups. As a result of the NRK-52E cells, although determined as the NaF IC50 value, it suggests that apoptosis is not triggered adequately. This suggests that other mechanisms have become effective in cell death, but apoptotic pathways. Caspase enzyme concentrations determined by ELISA were found to be incompatible with Real Time-PCR outcome. After detection of the NaF level leading to cell death at the IC50 level in the hFOB 1.19 cell line. It was found that the resulting cell death increasing apoptosis when administered to NaF and vitamine A alone, both of which decreased with co-administration. As a result, apoptotic caspase 3 and 8 enzymes were increased and apoptotic M30 protein was increased in NaF + vitamin D and vitamin C groups and interestingly decreased in NaF group. In the light of this data, it is considered to investigate the most valid and effective mechanism of NaF-induced cell death and the inhibitory-activating effects of vitamins on this mechanism, using different doses, time and analysis methods