Termofilik Anoxybacillus genensis G2 suşunun fruktoz-1,6-bisfosfat aldolaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of the fructose-1,6-bisphosphate aldolase gene from thermophilic Anoxybacillus genensis G2 strain
Yazar: NAGİHAN SAĞLAM ERTUNGA
Danışman: DOÇ.DR. AHMET ÇOLAK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada, yeni bir termofilik tür olan Anoxybacillus gonensis G2 {A. gonensis G2) suşundan fruktoz-l,6-bisfosfat aldolaz (FBA) geni klonlandı ve protein Escherichia colV de (E. colî) ekspres edilerek bazı biyokimyasal özellikleri incelendi. Genomik DNA kütüphanesi oluşturularak ve invers polimeraz zincir reaksiyonu ile FBA geninin 861 bp'lik tam DNA sırası elde edildi. Bu sıra, amino asit sırasına (286 aa) çevrildikten sonra BLAST programı ile karşılaştırma yapıldı. Karşılaştırma sonuçlarına göre amino asit sırasının, özellikle Bacillus türü sınıf II FBA'lar ile yaklaşık % 80-90 oranında benzerlik gösterdiği tespit edildi. Gen pET28a(+) vektörüne klonlandı ve protein, E.coli BL21(DE3)pLysS suşunda N- ucunda bir histidin kuyruğu ile ekspres edildi. Ekspres edilen protein, nikel kolonu ile saflaştırıldı. Saf protein kullanılarak gerçekleştirilen doğal elektroforez ve FBA'lara spesifik olan aktivite boyaması sonrası kağıt üzerinde mor renkli bir bant oluşumu gözlendi. Sodyum dodesil sülfat (SDS) jel elektroforezi ile enzimin ya tersiyer yapılı olduğu ya da aynı molekül ağırlığına sahip birden fazla alt birim içerdiği tespit edildi. Histidin kuyruğu içeren proteinin alt birim ağırlığı 33,3 kDa, histidin kuyruğu içermeyen orijinal proteinin alt birim ağırlığı ise 30,9 kDa olarak hesaplandı. Rekombinant proteinin bazı biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi için aktivite testleri gerçekleştirildi. Bu testler sonucunda enzim aktivitesinin optimum sıcaklığının 60 °C, optimum pH' sının ise 8,5 (Tris-HCl, 50 mM) olduğu tespit edildi. Isıl kararlılık eğrisi incelendiğinde enzimin 30 ve 40 °C'deki inkubasyonlarda aktivitesini 3 saatlik bir zaman diliminde koruduğu, 50 °C'de ise, aktivitesini ilk yarım saatten sonra kaybetmeye başladığı tespit edildi. Fruktoz-l,6-bisfosfat (FBF) substratı varlığında Vmaks ve Km değerleri sırası ile 2,4 uM/dak.mg protein ve 567 uM olarak belirlendi. Metal iyonlarının aktivite üzerine etkisi incelendiğinde 1 mM'lık nihai iyon konsantrasyonunda Zn+2'nin aktiviteyi 3 kat kadar artırdığı gözlendi. Sınıf II aldolazların genel inhibitörü olan etilendiamin tetraasetik asitin (EDTA) 1 mM'lık nihai konsantrasyonu varlığında aldolaz aktivitesinin tamamen kaybolduğu gözlemlendi. Elde edilen sonuçlar A. gonensis G2 suşundan klonlanan FBA'nın sınıf II aldolaz grubuna dahil, ısıl kararlı bir enzim olduğunu ortaya koymaktadır.Anahtar Kelimeler: Anoxybacillus gonensis, Klonlama, Fruktoz-l,6-bisfosfat Aldolaz, His-Tag, Metaloenzim

Abstract:
Cloning, Expression and Characterization of the Fructose-l,6-Bisphosphate Aldolase Gene from Thermophilic Anoxybacillus gonensis G2 Strain In this study, the fructose- 1,6-bisphosphate aldolase (FBA) gene of a novel thermophilic bacteria, Anoxybacillus gonensis G2 (A. gonensis G2) strain, was cloned and overexpressed in Escherichia coli (E. coli), and then some biochemical properties of the protein were investigated. The whole DNA sequence of the gene was determined by constructing genomic DNA library and performing inverse polimerase chain reaction. Nucleotide-sequence analysis revealed an open reading frame consisting of 861 bp and 286 amino acids. Sequence alignments were done by using BLAST programme. The results showed that amino acid sequence of FBA was similar to the amino acid sequences of FBAs belonging to Bacillus species in the ratio of 80-90%. The gene was cloned into pET28a(+) vector and overexpressed with His-tag in E.coli BL21(DE3)pLysS strain. The enzyme was purified with nickel cloumn. The native gel electrophoresis was done using the purified protein, and after the activity staining, the purple band was formed on the paper. SDS gel electrophoresis showed that the enzyme was composed of either one subunit or more than one subunit that have the same molecular weight. The calculated subunit molecular weight of the protein with and without his-tag end were 33.3 and 30.9 kDa, respectively. Activity tests were performed for the characterization of the recombinant protein. The optimum temperature and pH were found 60 °C and 8.5 (in the Tris-HCl buffer, 50 mM), respectively. When the thermal stability graphic was investigated, the enzyme protected its activity at 30 and 40 °C for 3 hours. However, it was determined that the enzyme started to lose its activity at 50 °C after 30 minutes. Vmax and Km values in the presence of fructose- 1,6-bisphosphate (FBP) substrate were calculated as 2,4 |aM/min.mg protein and 567 uM respectively. It was showed that the concentration of 1 mM Zn+2 increased the activity three times. In case of 1 mM emylenediaminetetraacetic acid (EDTA), the activity was lost completely. These results showed that the FBA enzyme cloned from A gonensis G2 strain belongs to the class II aldolase group. Key Words: Anoxybacillus gonensis, Cloning, Fructose- 1,6-Bisphosphate Aldolase, His-Tag, Metalloenzyme