Doğal ve sentetik biyouyumlu polimerik nanopartiküler gen taşıyıcı sistemlerin elde edilmesi ve transfeksiyon etkinliğinin incelenmesi
Preparation of natural and synthetic biocompatible polymeric nanoparticular gene delivery systems and investigation of transfection effect
Yazar: MEHMET KORAY GÖK
Danışman: PROF. DR. SAADET KEVSER PABUCCUOĞLU ; DOÇ. DR. ERDAL CEVHER
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kimyasal Teknolojiler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Biyopolimerler = Biopolymers ; Farmasötik teknoloji = Technology-pharmaceutical ; Gen aktarımı = Gene transfer ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Polimerik partiküller = Polymeric particles

Özet:
Bu tezle sunulan çalışmanın başlıca amacı, bilhassa son yıllarda nanoteknolojinin biyoteknoloji alanındaki önemli bir uygulaması olan gen transferinde kullanılabilecek biyolojik olarak uyumlu (biyouyumlu) yapıdaki nanopartiküler taşıyıcı sistemlerin sentezlenmesi, yapılarının aydınlatılarak, transfeksiyon etkinliğinin incelenmesidir.Gen transferinde iki yaklaşım ortaya koyulmuştur. Bunlardan birincisi gen transferinde oldukça yüksek etkiye sahip viral taşıyıcıların kullanılmasıdır, fakat bu alanda kullanılan virüslerin yan etkilerinin oldukça fazla olmasından dolayı ikinci bir yaklaşım olan viral olmayan taşıyıcı sistemler (polimer, lipid veya lipozomlar vb.) geliştirilmiştir. Bu tez kapsamında sentezlenen viral olmayan biyouyumlu polimer taşıyıcı sistemlere ?transjenik polimerler? denilmektedir. Bu tip polimerik taşıyıcı sistemlerin bir kısmı doğal polimer esaslı oldukları gibi bir kısmı da sentetik polimer esaslıdırlar. Bu çalışmada, ilk defa sentetik grupta biyobozunabilen yeni transjenik polimerler olan poli(ß-aminoesterler) (PBAE), modifiye doğal polimer grubunda ise kitosan esaslı modifiye polimerler sentezlendi.Bütün sentetik ve modifiye doğal polimerlerin karakterizasyonu Fourier Infrared Spektroskopisi ile gerçekleştirildi. Bununla beraber PBAE'in ve kitosan esaslı polimerlerin nanopartikülleri sırasıyla nanoçöktürme ve iyonik jelasyon yöntemi ile elde edildi. Tüm nanopartiküler sistemlerin zeta potansiyeli, polidisperslik indeksi ve partikül boyutu analizleri gerçekleştirildi. PBAE'in ve kitosan esaslı modifiye polimerlerin plasmid DNA (pDNA) ile nanopartiküler sistemleri, PBAE'de iyonik etkileşim ve enkapsülasyon yöntemi kitosan bazlı modifiye polimerlerde ise iyonik etkileşim yöntemi metodu ile hazırlandı. Bu katyonik polimerlerin pDNA bağlama kabiliyeti jel elektroforez ile incelendi. PBAE'in hücre içine alımı ve dağılım çalışmaları, primer koyun embriyonik fibroblast hücrelerinde (POEF), bir model boyarmadde olarak Rodamin-B kullanılarak gerçekleştirildi. PBAE ve modifiye kitosan polimerlerin sitotoksisitesi insan embriyonik hücrelerinde (HEK293) ve primer koyun fibroblast (POF) hücrelerinde xCELLigence RTCA cihazında incelendi. Negatif ve pozitif kontrol grupları olarak sırasıyla polietilenimin (PEI) ve kitosan kullanıldı. PBAE ve modifiye kitosan polimerlerin transfeksiyon etkinliği HEK293, POF ve POEF hücrelerinde floresans mikroskopta incelendi.Sonuç olarak, bu tezde sentezlenen PBAE ve modifiye kitosan polimerleri esaslı nanopartiküllerin HEK293, POF ve POEF hücrelerinde yüksek transfeksiyon etkinliğine sahip, toksik olmayan ve viral olmayan gen taşıyıcı polimerik nanopartiküler sistemler olduğu saptandı.

Abstract:
The main aim of the study presented in this thesis is the synthesis, characterization and the investigation of the transfection efficiency of the biocompatible nanoparticular carrier systems to be used gene transfer which is the important application of the nanotechnology on the biotechnology field, especially in the recent years.In gene transfer, two approaches are put forward. The first approach is the use of the viral vectors which have a high effect in gene transfer, but the second approach which is non-viral vectors (polymer, lipid and liposome etc.), are improved because of the side effects of these viruses used in this area are rather than others. The non-viral biocompatible polymer vector systems which are synthesized in content of this thesis are called as ?transgenic polymers?. As the one part of these polymeric vector systems are based on natural polymers, the other part is based on synthetic polymers. In tis study, first time, poly(ß-aminoester)s (PBAEs) which are the biodegradable novel transgenic polymers in the synthetic group,, chitosan based modified polymers in the modified natural group are synthesized.All synthetic and modified natural polymers were characterized by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). Moreover, the nanoparticles of PBAEs and chitosan based polymers are prepared by the nanoprecipitation method and ionic gelation method, respectively. Zeta potential, polydispersity index and particle size analysis of the all nanoparticle systems were carried out. The nanoparticle systems of PBAEs and modified chitosan polymers were combined with plasmid DNA via ionic interaction and encapsulation method for PBAEs and ionic interaction method for modified chitosan polymers. The pDNA combining ability of these cationic polymers were examined by using gel electrophoresis. For the cell uptake and distribution studies of PBAEs nanoparticles in primer ovine embryonic fibroblast (POEF were carried out using Rhodamine-B as a model dyestuff. The cytotoxicity of PBAEs and modified chitosan polymers were investigated in human embryonic kidney (HEK293) and primer ovine fibroblast (POF) using xCELLigence RTCA system. Polyethyleneimine (PEI) and chitosan were used as the negative and positive control groups, respectively. The transfection efficiency of PBAEs and modified chitosan polymers were investigated in HEK293, POF and POEF with florescent microscopy.Consequently, it was determined that PBAEs and modified chitosan polymers based nanoparticles which are synthesized in this thesis, have high transfection efficiency, nontoxic and non-viral gen carrier polymeric nanoparticular vectors in HEK293, POF and POEF.