Nano yapılı destek materyalleri üzerine lipaz enziminin tutuklanması ve tutuklanmış enzimin aktivite ile enantiyoseçimliliğe etkisinin incelenmesi
Immobilization of lipase enzyme on nanosize materials and investigation of the effect of immobilized enzyme  on enzymatic activity and enantioselectivity
Yazar: GÜLCAN COŞKUN
Danışman: PROF. DR. ÜLKÜ MEHMETOĞLU
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında Candida antarctica lipaz enzimini nanoparçacıklara tutuklayarak enzimatik aktiviteyi ve enantiyoseçimliliği arttırmak hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda öncelikle nanoparçacıklar üretilmiş; daha sonra üretilen nanoparçacıklara Candida antarctica lipazı kovalent bağlama yöntemi ile tutuklanmış ve son olarak tutuklanmış enzimler (R,S)-1-feniletanolün enantiyseçimli transesterleşme tepkimesinde kullanılmıştır. 
Birinci kısımda, grafen oksit (GO), demir oksit (Fe3O4), grafen oksit/demir oksit nanokompoziti (GO/Fe3O4), manyetik kitosan (Fe3O4/KT) ve grafen oksit/demir oksit/kitosan nanokompoziti (GO/Fe3O4/KT) üretilmiştir. 
İkinci kısımda, üretilen nanoparçacıklar öncelikle TritonX-100 ve Tween 80 yüzey aktif maddeleri ile aktive edilmiş; çapraz bağlayıcılar olan glutaraldehit (GA) ve epiklorohidrin (EPH) eşliğinde Candida antarctica lipazı kovalent bağlama yöntemi ile bu nanoparçacıklara tutuklanmıştır. Saf ve enzim yüklü nanoparçacıların yapısı taramalı elektron mikroskobu
(SEM) ile karakterize edilmiştir. Tutuklanmış ve serbest enzim aktivitesinin sıcaklık, pH, tutuklama süresi, yüzey aktif madde derişimi ve çapraz bağlayıcı derişiminden nasıl etkilendiği incelenmiştir. Serbest enzimin 30 ℃ ve pH 6'da max. aktivitesi 35 U bulunmuştur.  GO, Fe3O4  ve GO/Fe3O4 üzerine tutuklanmış enzimlerin sırasıyla uygun koşullardaki aktiviteleri 28.98 U (T=40℃, pH=6, tutuklama süresi=16 saat), 26.95 U (T=40℃, pH=7, tutuklama süresi=16 saat) ve 24.8 U (T=40℃, pH=8, tutuklama süresi=12 saat) bulunmuştur. Bu değerler tutuklama esnasında 250 mM GA kulanıldığında elde edilmiştir. Yapılan deneyler sonucu çapraz bağlayıcı GA'nın EPH'den daha iyi aktivite sonuçları verdiği görülmüş ve daha sonraki deneylerde GA ile çalışılmıştır. Tween 80 ve Triton X-100 aktiviteye önemli bir katkıda bulunmamış, bazı durumlarda enzimin konformasyonel yapısını etkileyerek aktivite kaybına sebep olmuştur. 
Son kısımda ise, uygun koşullarda üretilen tutuklanmış enzimler (R,S)-1-feniletanolün saf enantiyomerlerini elde etmek için kullanılmıştır. En iyi sonuçları GO ve GO/Fe3O4 üzerine tutuklanan enzimler vermiştir. GO-GA-Lİ enzimi 4 saat sonunda % 50.73 dönüşüm ile %>99 enantiyo aşırılık (ee) ve 507.74 enantiyomerik oran (E) değeri göstermiştir. GO/Fe3O4–GA-Lİ ise 6 saat sonunda % 49.02 oranında dönüşüme ulaşmış; sırasıyla %94.32 ee% ve 375.77 E değerleri elde edilmiştir. Tutuklanmış enzimler enantiyoseçimli transesterleşme tepkimesinde 5 kez kullanılmış; enantiyoseçimlilik ve enantiyomerik oran değerinde azda olsa bir azalma görülmüştür.

Abstract:
In this thesis, it was aimed to immobilize Candida Antarctica lipase onto nanoparticles and to increase enzymatic activity and enantioselectivity. For this purpose, firstly nanoparticles were produced; subsequently, Candida Antarctica lipase was immobilized onto produced nanoparticles by the covalent binding method and finally immobilized enzymes were used in the enantioselective transesterification reaction of (R, S) -1-phenyl ethanol.

In the first part, graphene oxide (GO), iron oxide (Fe3O4), graphene oxide/iron oxide nanocomposite (GO/Fe3O4), magnetic chitosan (Fe3O4/KT) and graphene oxide/iron oxide/chitosan nanocomposite (GO/Fe3O4/KT) were produced. 

In the second part, produced nanoparticles were first activated with Triton X-100 and Tween 80 surfactants and then Candida antarctica lipase immobilized onto these activated nanoparticles by the covalent binding method in the presence of glutaraldehyde (GA) and epichlorohydrin (EPH) which are cross-linkers. The structure of the produced nanoparticles was characterized using scanning electron microscopy (SEM). The influence of temperature, pH, immobilization time, surfactant concentration and crosslinker concentration for immobilized and free enzyme was investigated. Free enzyme's max. activity was found 35 U (30 °C, pH=6). In the optimum conditions, the activities of the enzymes immobilized onto GO, Fe3O4  ve GO/Fe3O4 were 28.98 U (T=40℃, pH=6, t immobilization =16 h), 26.95 U (T=40℃, pH=7, t immobilization =16 h) and  24.8 U (T=40℃, pH=8, t immobilization =12 h), respectively. These values were obtained when 250 mM GA was used during immobilization. The results showed that the cross-linker GA gave better activity than EPH and the experiment was run entirely with GA. Tween 80 and Triton X-100 did not make a significant contribution to the activity, but in some cases caused the loss of activity by affecting the conformational structure of the enzyme.

In the latter part, the immobilized enzymes which produced in the optimum conditions were used to obtain pure enantiomers of (R, S)-1-phenyl ethanol. The best results were obtained by enzymes that immobilized onto GO and GO/Fe3O4 nanoparticles. After 4 and 6 hours of the reaction the values of enantiomeric excess (ee₌99%, 94.32%), the enantiomeric ratio (E₌507.74, 375.77) and conversion (c₌50.73%, 49.02%) were observed with the use of GO-GA-LI and GO/Fe3O4-GA-LI enzyme, respectively. The immobilized enzymes were used 5 times in the enantioselective transesterification reaction and a small decrease was observed in enantioselectivity and enantiomeric ratio.