Proteomik yöntemlerle proteozom inhibisyonun meme kanseri hücre hatlarındaki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of proteasome inhibition in breast cancer cell lines by proteomic methods
Yazar: EMRAH OKUR
Danışman: PROF. DR. AZMİ YERLİKAYA
Kütahya Dumlupınar Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells

Özet:
Hücre içi birçok süreçte önemli roller oynayan 26S proteozomun inhibisyonu kanser tedavisi açısından son derece önemlidir. Ayrıca spesifik bir hücrede belirli şartlarda genom tarafından kodlanan neredeyse tüm proteinlerin analiz edilmesini sağlayan proteomik teknolojisi son zamanlarda oldukça değer kazanmıştır. Çalışmalarımızda ilk olarak 4T1 meme kanseri hücreleri 24 saat süreyle proteozom inhibitörü bortezomib ile muamele edildikten sonra iki boyutlu (2D) jel elektroforezi ile ayrıştırılmış ve label-free nLC-MS/MS proteomik teknikleriyle analiz edilmiştir. Analizler özellikle anti-apoptotik GRP78 proteininin aşırı ifade edildiğini göstermiştir. Daha sonra proteozom inhibitörlerinin apoptotik etkilerini arttırmak ve hücre ölüm mekanizmasını belirlemek için 4T1 hücreleri bortezomib ve GRP78 inhibitörü BAPTA-AM kombinasyonu ile 24 saat muamele edilmiştir. Muamele sonrasında gerçekleştirilen label-free nLC-MS/MS analizleri 1266 adet protein ekspresyonunun deney grupları arasında önemli ölçüde değiştiğini göstermiştir. Cdc5L ve DBNL proteinleri bu proteinler arasındadır. Bortezomib ve BAPTA-AM kombinasyonu ile muamele sonrasında artan Cdc5L ve DBNL ekspresyon düzeyleri Western blot yöntemiyle teyit edilmiştir. DBNL ekspresyonundaki artış Dot blot yöntemi ile de doğrulanmıştır. 4T1 hücrelerinde Cdc5L inhibitörü CVT-313, DBNL inhibitörü OTSSP167 ve BAPTA-AM'in IC50 değerleri sırasıyla 20,1 nM, 43 nM ve 19,9 μM olarak bulunmuştur. WST-1 analizleri, 24 saat uygulanan bortezomib + CVT-313 ve bortezomib + OTSSP167 kombinasyonlarının 4T1 hücrelerinde oldukça sitotoksik etkiler yapabileceklerini göstermiştir. 4T1 hücreleri ile gerçekleştirilen ve 14 gün boyunca takip edilen üç boyutlu (3D) spheroid hücre çalışmaları; bortezomib + OTSSP167 kombine terapisinin monoterapilerden, bortezomib + CVT-313 ve bortezomib + BAPTA-AM kombinasyonlarından daha etkili olduğunu kanıtlamıştır. MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinde de bortezomib + OTSSP167 kombine terapisinin 3D spheroid oluşumunu engellediği gösterilmiştir. Burada sunulan sonuçlar OTSSP167'nin nanomolar seviyesinde etkili olduğunu gösterdiğinden dolayı, bortezomib ve OTSSP167 kombinasyonunun meme kanseri tedavisinde yeni bir yaklaşım sunabileceğine ve in vivo ve klinik olarak test edilmeye değer olduğuna inanılmaktadır.

Abstract:
Inhibition of the 26S proteasome, which plays important roles in many intracellular processes, is extremely important in terms of cancer treatment. Also, the proteomics techniques, making the analysis of almost all proteins possible encoded by the genome under certain conditions in a specific cell, has gained considerable value recently. In our studies, firstly 4T1 breast cancer cells were treated with the proteasome inhibitor bortezomib for 24 hours, and the proteins were then separated by two-dimensional (2D) gel electrophoresis and analyzed by label-free nLC-MS/MS proteomic techniques. The analyzes showed that especially anti-apoptotic GRP78 protein was overexpressed. To increase the apoptotic effects of the proteasome inhibitors as well as to determine the cell death mechanism, 4T1 cells were then treated with bortezomib and the GRP78 inhibitor BAPTA-AM combination for 24 hours. Following the treatment, label-free nLC-MS/MS analyzes showed that the expression of 1266 proteins varied significantly among the experimental groups. Cdc5L and DBNL proteins were among these proteins. The increased expression levels of Cdc5L and DBNL were confirmed by Western blot method after treatment with bortezomib and BAPTA-AM combination. The increase in DBNL expression was also confirmed by the Dot blot method. IC50 values of Cdc5L inhibitor CVT-313, DBNL inhibitor OTSSP167 and BAPTA-AM in 4T1 cells were found as 20,1 nM, 43 nM and 19,9 μM, respectively. WST-1 analyzes showed that bortezomib + CVT-313 and bortezomib + OTSSP167 combinations for 24 hours can have highly cytotoxic effects on 4T1 cells. The three-dimensional (3D) spheroid cell model, carried out with 4T1 cells and followed for 14 days; also proved that bortezomib + OTSSP167 combined therapy was more effective than monotherapies, bortezomib + CVT-313 as well as bortezomib + BAPTA-AM combinations. Bortezomib + OTSSP167 combined therapy has also been shown to inhibit the 3D spheroid formation in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Since altogether the results presented here show that OTSSP167 is effective at nanomolar range, it is believed that the combination of bortezomib and OTSSP167 may offer a novel approach in breast cancer treatment and is therefore worthwhile to be tested in vivo and clinically.