İnsan meme kanser hücre lizatı ve çeşitli adjuvanları içeren formülasyonlarla indüklenmiş dendritik hücrelerin T lenfositler üzerinde immünostimülan etkinliğinin incelenmesi
Investigation of the immunostimulatory effect of human dendritic cells induced by formulations containing human breast cancer cell lysate and different adjuvants on T lymphocytes
Yazar: GAMZE TARI
Danışman: PROF. DR. ADİL ALLAHVERDİYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Hem gelişmekte olan hem de gelişmiş ülkelerde kadınlarda en sık görülen kanser türü meme kanseridir. Dünya Sağlık Örgütü'nün değerlendirmesine göre, 2018 yılında dünya genelinde kadınlarda görülen kanserlerin %24,2'sini oluşturacağı düşünülen meme kanseri, tüm kanser vakaları arasında ilk sırada bulunmaktadır.
Meme kanserinin tedavisi temel olarak cerrahi, kemoterapi ve radyoterapiden oluşmaktadır. Ancak bu tedaviler hastanın sağlıklı hücrelerine de zarar vermekte, tümör nüksünü engelleyememekte ve sağ kalım süresini yeterli oranda uzatamamaktadır. Son yıllarda immünoterapinin kanser vakalarındaki tedavi edici potansiyelinin anlaşılmasıyla kanser aşılarına verilen önem artmıştır. Peptit temelli aşılar, tüm tümör hücre aşıları ve genetik temelli aşılar gibi farklı kanser aşısı yaklaşımları olsa da hastaların zayıf immün sistemlerini aktifleştiremedikleri için beklenilen sonuçlar elde edilememiştir. Bu nedenle son yıllarda profesyonel antijen sunum hücreleri olan dendritik hücre temelli aşı yaklaşımlarına olan ilgi artmıştır. FDA tarafından onaylanmış ilk kanser aşısı olan Sipuleucel-T (Provenge) aşısı immünoterapide dendritik hücre temelli kanser aşılarının başarısını kanıtlamıştır. Prostat kanserine karşı dendritik hücre temelli aşılar kullanılarak elde edilen bu başarı son yıllarda meme kanserine karşı da bu yöndeki çalışmalara olan ilgiyi artırmıştır.
xii
Meme kanserine karşı dendritik hücre temelli aşıların temelini Her-2, Muc-1 gibi çeşitli antijenlerle yüklenmiş, öldürülmüş ya da dondurulup çözülmüş tümör lizatlarıyla yüklenmiş ve tümör hücreleriyle füzyon yapılmış dendritik hücre temelli aşı çalışmaları oluşturmaktadır. Her-2 peptidinin dendritik hücrelere yüklenerek hazırlandığı Lapuleucel-T aşısı bu alandaki çalışmaların umut verici olduğunu gösterse de, etkinliği yalnızca Her-2 ifade eden kanser türleriyle sınırlıdır. Şimdiye dek meme kanserine karşı yapılmış dendritik hücre temelli aşı çalışmalarında meme kanserinin oldukça heterojen bir antijenik yapıya sahip olması, füzyon tekniğinin immün baskılayıcı ve toksik olması, etkili bir adjuvan ilavesinin yapılmaması gibi sebeplerle beklenilen sonuçlar elde edilemememiştir. Bu nedenle meme kanserine karşı mevcut dezavantajları içermeyen ancak mevcut yaklaşımlar arasında en çok ümit veren dendritik hücre temelli yeni aşı formülasyonlarının geliştirilmesi oldukça önemlidir. Buna göre bu tezin amacı dünyada ve ülkemizde meme kanserine karşı tüm tümör hücre lizatı ve çeşitli adjuvanlarla indüklenmiş dendritik hücre temelli aşı formülasyonlarının geliştirilmesi ve etkinliğinin T lenfositleri üzerinde incelenmesidir.
Bu hedefe ulaşabilmek için, gönüllü kişilerden alınan kandan izole edilen periferal kan mononükleer hücrelerinden GM-CSF ve IL-4 sitokinleri kullanılarak dendritik hücreler farklılaştırılmıştır. Meme kanseri çalışmalarında sıkça kullanılan insan meme kanser hücrelerinin (MCF-7) kültürü yapılmış ve çeşitli yöntemlerle tüm antijenleri izole edilmiştir. Dendritik hücreler antijen ve Saponin, Polioxidonium, CFA ve CpG-ODN adjuvanlarının her biri ile yüklenmiştir. Elde edilen yüklü dendritik hücreler T lenfositler ile inkübe edilip in vitro immünostimülatör etkinlikleri kıyaslanarak incelenmiştir. Yapılan analizler sonucunda PKMH'nin dendritik hücreye farklılaştırılması morfolojik olarak gösterilmiştir. Çeşitli formülasyonlarla indüklenen dendritik hücrelerin immünofenotipik analizleri, adjuvanların CD83 matürasyon ve CD80 yardımcı uyaran moleküllerinin ekspresyonunu artırdığını ancak CD40 ve CD86 yardımcı uyaran moleküllerinin ekspresyonunu az miktarda değiştirdiğini göstermiştir. Buna rağmen indüklenmiş dendritik hücrelerin T lenfositleri ile kokültürü yapıldığında kültür süpernatantında yüksek miktarda sitokin salgılanmış olduğu belirlenmiştir. En yüksek IL-12p70 sitokin salımı 100 μg/ml POX adjuvanın kullanıldığı aşı formülsayonu ile elde edilirken, en yüksek IFN-gamma sitokin salımı 100 μg/ml Saponin adjuvanın kullanıldığı aşı formülsayonu ile elde edilmiştir. Ayrıca 100 μg/ml POX adjuvanın IL-10 ve IL-4 immünsüpresyon sitokinlerini büyük ölçüde azalttığı belirlenmiştir. Buna ek olarak, 100 μg/ml POX adjuvanın kullanıldığı aşı formülsayonu ile indüklenen dendritik hücrelerin T lenfositlerinde CTL dönüşümünü uyardığı ve bu T lenfositlerinin MCF-7 hücrelerini %80 oranında öldürdüğü tespit edilmiştir.
Sonuç olarak Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü tarafından desteklenen FYL-2017-3202 numaralı projesi kapsamında dünyada ve ülkemizde ilk kez olarak meme kanserine karşı çeşitli formülasyonlarla indüklenmiş yeni nesil dendirik hücre temelli aşı geliştirilmiştir. Elde edilen bu sonuçlar, meme kanseri antijenleri ve adjuvanlarla indüklenmiş dendritik hücrelerin T lenfositleri yüksek düzeyde indüklediğini göstermiş ve bu nedenle meme kanserinin immünoterapisinde kombinasyon halinde kullanılmasının uygun olabileceğini ortaya çıkarmıştır.

Abstract:
Breast cancer is the most common cancer among women in both developing and developed countries. According to the World Health Organization, in 2018, breast cancer, which is considered to constitute 24.2% of the cancers in women worldwide, ranks first among all cancer cases.
Treatment of breast cancer mainly consists of surgery, chemotherapy and radiotherapy. However, these treatments also harm the healthy cells of the patient, can not prevent the recurrence of the tumor and can not extend the survival period sufficiently. In recent years, the giving importance to cancer vaccines has increased with the understanding of therapeutic potential of immunotherapy in the cancer cases. There are different cancer vaccine approaches such as peptide-based vaccines all tumor cell vaccines and genetically based vaccines, but the expected results could not be obtained because they could not activate the patients' weak immune systems. For this reason, the interest in dendritic cell-based vaccine approaches, which are the professional antigen presenting cells, has increased in recent years. The first immunotherapeutic vaccine approved by the FDA, the Sipuleucel-T (Provenge) vaccine, has proven the success of dendritic cell-based cancer vaccines in immunotherapy. This
xiv
success, which has been achieved by using dendritic cell based vaccines against prostate cancer, has increased the interest in breast cancer in recent years.
The basis of dendritic cell-based vaccines consist of dendritic cell-based vaccine studies which are loaded with various antigens, such as Her-2, Muc-1, loaded with killed or freeze-thawed tumor lysates or fused with tumor cells. Although the Lapuleucel-T vaccine, which is prepared by loading Her2 peptide on dendritic cells, shows that studies in this area are promising, but its efficacy is limited only on the types of cancer that express Her2. However, until now, the reasons of not gaining expected results of dendritic cell based vaccine studies against breast cancer are that breast cancer's highly heterogeneous antigenic structure, the fusion technique is immunosuppressive and toxic, and no addition of an effective adjuvant. Therefore, it is very important to develop new vaccine formulations that do not have the disadvantages of current vaccines, but using dendritic cell based which are the most promising among the available approaches. The aim of this thesis is the development of whole tumor cell lysates and various adjuvants-induced dendritic cell-based vaccine formulations against breast cancer and investigating the efficancy of them on T lymphocytes.
In order to achieve this goal, autologous dendritic cells were differentiated by using GM-CSF and IL-4 cytokines from peripheral blood mononuclear cells isolated from donors' blood. Human breast cancer cells (MCF-7) were cultured and all antigens were isolated by various methods. Dendritic cells were loaded with antigen and each of the Saponin, Polioxidonium, CFA and CpG-ODN adjuvants. Obtained dendritic cells were incubated with T lymphocytes and in vitro immunostimulatory activities were compared. As a result of the analysis, the differentiation of peripheral blood mononuclear cells into dendritic cells has been shown morphologically. Immunophenotypic analyzes of dendritic cells loaded with various formulations have shown that adjuvants increase the expression of CD83 maturation and CD80 costimulatory molecules, but have less effect on CD40 and CD86 helper molecules. However, it has been determined that when the induced dendritic cells are cocultured with T lymphocytes, a high amount of cytokines is secreted in the culture supernatant. The highest IL-12p70 cytokine release was obtained with the vaccine formulation using 100 μg/ml POX adjuvant, while the highest IFN-gamma cytokine release was achieved with the vaccine formulation using 100 μg/ml Saponin adjuvant. In addition, 100 μg/ml POX adjuvant was found to significantly reduce IL-10 and IL-4 immunosuppression cytokines. Furthermore, it has been found that dendritic cells induced by the vaccine formulation using lysate and 100 μg/ml POX adjuvant stimulate CTL transformation in T lymphocytes and these T lymphocytes kill MCF-7 cells by 80%.
As a result, within the scope of FYL-2017-3202 project supported by YTU BAP Unit, a new generation of dendritic cell-based vaccines induced by various formulations have been developed for the first time in the world and in our country against breast cancer. These results indicate that breast cancer antigens and adjuvant-induced dendritic cells induce T lymphocytes at a high level and therefore combination of adjuvants use may be appropriate for immunotherapy in breast cancer.