Seçilmiş yerel buğday çeşitlerinin karşılaştırmalı transkriptomik analizi ve çinko uygulamasının bazı enzim genlerinin ifade düzeyine olan etkisi
Comparative transcriptome analysis of selected local wheat varieties and effects of zinc treatment on expression levels of some enzyme genes
Yazar: AYŞEGÜL BİLGE UĞUZ
Danışman: PROF. DR. REMZİYE YILMAZ ; DR. AYTEN SALANTUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Antioksidan enzimler = Antioxidant enzymes ; Buğday = Wheat ; Flavonoidler = Flavonoids ; Gen ifadesi = Gene expression ; Transkriptomlar = Transcriptomics

Özet:
Buğday, tarımı kolay, verimi yüksek bir tahıl ürünüdür ve değişik iklim ve toprak şartlarına uyum sağlayabilmesi nedeni ile dünyada pek çok yerde yetiştirilmektedir. Artan nüfus talebini karşılamak için diğer bitkisel ürünlerde olduğu gibi buğday üretimi de artmak durumundadır. Bununla birlikte, son yıllarda "sağlıklı gıda" eğiliminin oluşması nedeniyle buğday çeşitlerinde antioksidan ve flavonoid biyosentezinin moleküler temelinin anlaşılması önem arz etmektedir. İlgili biyosentez mekanizmasını anlamak için genomik, transkriptomik gibi omik teknolojiler kullanılarak araştırma yaklaşımı desteklenmektedir.Dünya genelinde iki milyardan fazla insanda "gizli açlık" görülmektedir. Gizli açlık için önemli olan mikro gıda bileşenleri, hem bitki hem de insan gelişimi için gerekli olan temel mineral elementlerdir. Günümüzde özellikle gelişmekte olan ülkelerde görülen gizli açlıkla mücadele edebilmek için, kolay erişilebilir olan ve günlük diyetin büyük çoğunluğunu oluşturan pirinç, buğday ve mısır gibi temel gıdaların üretimi sırasında fortifikasyon ve/veya biyofortifikasyon uygulamaları yapılmaktadır. Çinko (Zn) eksikliği, bitkilerde verim ve besin kalitesinin düşmesine neden olan iyi bilinen bir sorundur. Zn arzında bir kıtlıkla karşı karşıya kalındığında, bitkiler Zn alımını artırarak iklime uyum sağlar. Son yıllarda, Zn eksikliğine karşı bitki direncinin daha iyi anlaşılması söz konusu olmakla birlikte, bitkilerin Zn kullanım verimliliğindeki genotipik varyasyonlar ve antioksidan ve flavonoid biyosentezine etkisi konusu önemli görünmektedir. Bu tez çalışması ile seçilen yerel buğday genotiplerinde antioksidan enzim genleri Süperoksit Dismutaz (SOD) ve Katalaz (CAT) ve flavonoid biyosentez enzim genleri Fenilalanin Amonyum Liyaz (PAL) ve Kalkon Sentaz (CHS)'ın ifade düzeyleri ve ayrıca bu anahtar enzim genlerinin aynı örneklerde yapraktan çinko biyofortifikasyonu ile ifade düzeylerindeki değişimin araştırılması amaçlanmıştır.  Bu amaç doğrultusunda öncelikle yerel buğday genotipleri belirlenmiş ve bu genotiplerin antioksidan kapasiteleri daha önceki çalışmalarda QUENCER (QUick, Easy, New, CHEap ve Reproducible) hızlı antioksidan testlerinden olan ABTS testi ile belirlenmiştir.  Daha sonra yerel buğday genotipleri çimlendirilerek iki farklı saksı denemesi kurulmuş, bir saksı denemesinde yapraktan çinko biyofortifikasyonu uygulanmıştır. Buğday yaprakları yirmi günlük yetişkinliğe ulaştıklarında hasat edilerek ivedilikle RNA izolasyonu ve cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen cDNA örnekleri ileri gen ifade analizlerinde kullanılmıştır. Bunun için öncelikle ticari buğday çeşitleri (Demir 2000 ve Eminbey)'den elde edilen cDNA örnekleri ve antioksidan enzim genleri (SOD ve CAT) ve flavonoid biyosentez enzim genleri (PAL ve CHS) kullanılarak RT-PCR analizleri için optimizasyon gerçekleştirilmiş ve standart eğriler elde edilmiştir. Bu aşamanın ardından seçilen bütün buğday genotiplerinde RT-PCR analizleri ile gen ifade düzeyleri ölçülmüştür. Bundan sonra istatiksel analizler ile karşılaştırmalı değerlendirmeler verilmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada transkriptomik analiz yaklaşımı ile yerel çeşit buğday genotiplerinde antioksidan enzim ve flavonoid biyosentez enzim genlerinde genotip farklılığına bağlı olarak aktivite değişiklikleri ilk kez ortaya çıkarılmıştır. Ayrıca, yapraktan Zn uygulaması ile söz konusu genlerin ifade profilindeki değişimin dağılımı ortaya konmuştur. Çalışma, daha önce antioksidan kapasitesi ve ilgili genlerin ifade düzeyleri üzerine sıklıkla çalışmalar yapılmış olan Triticum aestivum genotiplerinin yanı sıra yerel Triticum monococcum, Triticum dicoccum, Triticum durum ve Triticum  spelta genotiplerini de içermesi sebebiyle önem taşımakta ve belirtilen genotiplerde yapılacak ileri çalışmalar için kaynak oluşturmaktadır.

Abstract:
Wheat is an easy-to-cultivate, high-yielding cereal product and is grown in many places in the world due to its adaptability to different climatic and soil conditions. In order to meet the increasing population demand, wheat production has to increase as in other plant products. However, it is important to understand the molecular basis of antioxidant and flavonoid biosynthesis in wheat varieties due to the "healthy food" trend in recent years. The research approach is supported by using omics technologies such as genomics and transcriptomics to understand the relevant biosynthesis mechanism. More than two billion people worldwide suffer from "hidden hunger". Micronutrient components which are important for hidden hunger are essential mineral elements necessary for both plant and human development. Fortification and/or biofortification applications are made during the production of basic foods such as rice, wheat and corn, which are easily accessible and make up the majority of the daily diet, in order to combat the hidden hunger seen especially in developing countries today. Zinc (Zn) deficiency is a well-known problem that causes reduced yield and nutritional quality in plants. When faced with a shortage of Zn supply, plants adapt to the climate by increasing their Zn uptake. In recent years, although there has been a better understanding of plant resistance to Zn deficiency, genotypic variations in plants' Zn utilization efficiency and its effect on antioxidant and flavonoid biosynthesis seem important. In this study, it was aimed to investigate the expression levels of the antioxidant enzyme genes Superoxide Dismutase (SOD) and Catalase (CAT) and the flavonoid biosynthesis enzyme genes Phenylalanine Ammonium Lyase (PAL) and Chalcone Synthase (CHS) in the local wheat genotypes selected. In addition, it was aimed to investigate the changes in the expression levels of these key enzyme genes in the same samples by foliar zinc biofortification. For this purpose, first of all, local wheat genotypes were determined and the antioxidant capacities of these genotypes were analyzed by ABTS test, which is one of the rapid antioxidant tests of QUENCER (Quick, Easy, New, CHEap and Reproducible). Then, local wheat genotypes were germinated and two different pot trials were established, and foliar zinc biofortification was applied in one pot trial. Wheat leaves were harvested 20 days after planting, and RNA isolation and cDNA synthesis were performed immediately. Obtained cDNA samples were used in further gene expression analysis. For this, first of all, cDNA samples obtained from commercial wheat varieties (Demir 2000 and Eminbey) and antioxidant enzyme genes (SOD and CAT) and flavonoid biosynthesis enzyme genes (PAL and CHS) were used for optimization for RT-PCR analyzes and standard curves were obtained. After this step, gene expression levels were analyzed by RT-PCR analyzes in all selected wheat genotypes. After that, statistical analyzes and comparative evaluations are given. As a result, in this study, activity changes in antioxidant enzyme and flavonoid biosynthesis enzyme genes in local wheat genotypes were revealed for the first time with the transcriptomic analysis approach, depending on the genotype difference. In addition, the distribution of the change in the expression profile of these genes with foliar Zn application was revealed. The study is important because it includes the local Triticum monococcum, Triticum dicoccum, Triticum durum and Triticum spelta genotypes, as well as the Triticum aestivum genotypes, which have been frequently studied on the antioxidant capacity and expression levels of the related genes, and constitutes a source for further studies to be made in the specified genotypes.