İnsan bağırsak mikrobiyotasının farklı DNA izolasyon yöntemleri kullanılarak incelenmesi
Investigation of human gut microbiota using different DNA isolation methods
Yazar: EMRE AVCI
Danışman: PROF. DR. MÜGE SAYİTOĞLU ; DR. DİLEK SEVER KAYA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Bacteroides = Bacteroides ; Bağırsak florası = Intestinal flora ; Bağırsaklar = Intestines ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Gastrointestinal mikrobiyom = Gastrointestinal microbiome ; Mikrobiyota = Microbiota ; RNA = RNA

Özet:
İnsan mikrobiyotası en yoğun olarak bağırsakta bulunur. İnsan bağırsak mikrobiyatasının (İBM) homeostatik yapısının insan sağlığını olumsuz etkileyebilecek yönde değişimi bağırsak disbiyozisi olarak adlandırılır. Çalışmalarda son yıllarda yeni nesil dizileme (YND) yöntemleri, özellikle 16S rRNA amplikon dizileme hassas, düşük maliyetli ve yüksek çıktılı veri sunmasıyla oldukça yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bu tez çalışmasında gönüllülerden (n=3) alınan dışkı örneklerinden üç farklı (Fenol-Kloroform, QIAamp Powerfecal DNA Kit, ZymoBIOMICS Miniprep Kit) yöntem ile bakteriyel genomik DNA izolasyonları gerçekleştirilip ürünlerinin 16S rRNA geni V3-V4 bölgeleri PZR işlemi ile çoğaltılarak Illumina Miseq cihazında dizilendi. 16S amplikon dizileme sonucunda ortalama 83.633 okuma başarısı sağlandı. Ancak taksonomik olarak sınıflandırılabilen ortalama okuma sayısı ise 40.603 olarak belirlendi ve bu okuma derinliğinde elde edilen en anlamlı veri filum düzeyinde gerçekleştirildi. En kapsamlı veri filtreli ticari kitlerle Qiagen (7 filum) ve Zymo (6 filum) elde edilen örnekler ile sağlanmıştır. Fenol klorofom (5 filum) ile elde edilen DNA miktarları çok olmasına rağmen bakteri temsiliyeti bakımından filtreli kitlere göre daha başarısız olduğu görüldü. Örnekler arası karşılaştırmalarda Bacteroidetes filumunun tespitinin filtreli (Qiagen) izolasyonlarda daha etkin olduğu görülmüştür. 
Bu çalışmanın sonuçlarına göre bakteriyel genomik DNA izolasyon yönteminin bakterilerin tümünün DNA izolasyonunu gerçekleştirmedeki başarısı, biyolojik parametrelerden bağımsız olarak doğrudan mikrobiyal kompozisyonu etkilemektedir.

Abstract:
The human microbiota is most dense in the gut. The change in the homeostatic structure of the human gut microbiota in a way that may adversely affect human health is called intestinal dysbiosis. In recent years, next-generation sequencing methods, especially 16S rRNA amplicon sequencing, have been widely used in studies because they provide sensitive, low-cost and high-throughput data. In this thesis study, bacterial genomic DNA isolations were performed from stool samples taken from volunteers(n=3) with three different methods(Phenol-Chloroform, QIAamp Powerfecal DNA Kit, ZymoBIOMICS Miniprep Kit) and 16S rRNA gene V3-V4 regions of their products were amplified by PCR and analyzed in Illumina Miseq device. As a result of 16S amplicon sequencing, an average of 83,633 read successes was achieved. However, the average number of taxonomically classified reads was determined as 40,603, and the most meaningful data obtained at this reading depth was performed at the phylum level. The most comprehensive data is provided with samples obtained from commercial kits with filters, Qiagen(7 phyla) and Zymo(6 phyla). Although the amount of DNA obtained with Phenol-Chloroform(5 phyla) was high, it was seen that it was more unsuccessful in terms of bacterial representation compared to the filter kits. In the comparisons between samples, it was observed that the detection of the Bacteroidetes phylum was more effective in filtered(Qiagen) isolations.
According to the results of this study, the success of bacterial genomic DNA isolation method in performing DNA isolation of all bacteria directly affects the microbial composition regardless of biological parameters.