All-trans retinoik asit, metotreksat ve aktinomisin D kemoterapilerinin farklı koryokarsinom hücre kültür modelleri üzerindeki etkilerinin karşılaştırılması
The comparison of the effect of all-trans retinoic acid, methotrexate, actinomycin D and combined chemotherapy on the different choriocarcinoma  cell culture models
Yazar: GÖRKER SEL
Danışman: PROF. DR. MÜGE HARMA
Bülent Ecevit Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Hücre kültürü = Cell culture ; Karsinoma = Carcinoma ; Koryokarsinom = Choriocarcinoma ; Metotreksat = Methotrexate ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Tretinoin = Tretinoin

Özet:
All-trans retinoik asit, Metotreksat ve Aktinomisin D kemoterapilerinin farklı koryokarsinom hücre kültür modelleri üzerindeki etkilerinin karşılaştırılması
Amaç: All-trans retinoik asit (ATRA) trans formu yapısıyla A vitamininin doğal bir derivesi olup, hayvansal (retinoidler) ve bitkisel (karetenoid provitamin) gıdalarla vücuda alınır. ATRA, immatür hücrelerin farklılaşmasını uyarır ve yüksek bölünme potansiyeline sahip tümör hücrelerinin fonksiyonel hücrelere dönüşmesini sağlar. Bu etkisiyle özellikle Akut Promyelositik Lösemi'nin tedavisinde başarıyla kullanılmaktadır. Hücre kültürü çalışmalarında ATRA'nın apopitozu uyarıcı, hücre çoğalmasını azaltıcı ve invazyonu inhibe edici etkileri olduğu bildirilmiştir.
Gestasyonel Trofoblastik Hastalıklar, insanda plasentadan gelişen bir grup hastalıktır ve koryokarsinom bunların malign formudur. Bu hastalıkların etyolojisinde, retinoik asit eksikliği ve A vitamini alımının azlığının, hastalık riskini arttırdığı çeşitli çalışmalarda saptanmıştır. Literatürde ATRA'nın diğer kemoterapötikler ile karşılaştırıldığı çalışmaların sayısı çok kısıtlıdır.
Çalışmamızın amacı, farklı hücre kültürü modelleri (JAR, JEG-3) kullanılarak ATRA'nın tek başına veya MTX, Act-D ile kombine kullanıldığında, koryokarsinom tedavisindeki etkinliğinin araştırılması ve bu konuda çok sınırlı olan literatür bilgisine ek yeni bir veri sağlamaktır.
Gereç ve Yöntem: İnsan koryokarsinom benzeri JAR ve JEG-3 hücreleri kültüre edildi. ATRA, MTX ve ACTD'nin uygulama grupları aşağıdaki gibi belirlendi;
Tek ilaç uygulaması için MTX'in 2 μM, 4 μM, 8 μM; ATRA'nın 0.1 μM, 1 μM, 10 μM; Act-D'nin 0.05 μM, 0.1 μM, 0.2 μM olması sağlanarak hazırlanmıştır.
ATRA ve MTX kombinasyonunda; ATRA'nın 0.1 μM, 1 μM ve 10 μM dozları ile MTX'in 2 μM, 4 μM ve 8 μM'lık dozu kullanılmıştır.
ATRA ve Act-D kombinasyonunda; ATRA'nın 0.1 μM, 1 μM ve 10 μM dozları ile Act-D'nin 0.05 μM, 0.1 μM ve 0.2 μM dozları kullanılmıştır.
ATRA ve MTX ve ACT-D kombinasyonunda ATRA'nın 0.1 μM, 1 μM ve 10 μM; MTX'in 2 μM'lık dozu ve ACT-D'nin 0.05 μM, 0.1 ve 0.2 μM'lık dozları kombine edilmiştir. Maddeler hücrelere aynı anda verilmiştir. İlaç uygulamasını izleyen 72. saatte hücreler Tripsin-Etilen Diamin Tetraasetik Asit (EDTA) solüsyonu ile kaldırılıp, apopitoz çalışmasına alınmıştır. Bu çalışmada JAR ve JEG-3 hücrelerinde apopitozun derecesi Flowsitometri (FCM) ile belirlendi. Sadece bir set için tripsin öncesi süpernatan toplanıp, β-hCG ölçümü için derin dondurucuda saklanmıştır. İmmünoenzimatik yöntemle β-hCG ölçümü yapılmıştır. SPSS 19.0 ve Minitab 17 istatistik programları kullanılarak istatistiksel analiz yapılmıştır.
Bulgular: 0.1 µM, 1 µM ve 10µM ATRA JEG-3 ve JAR hücre hattına tek başına uygulandığında sırasıyla %15, %19, %30 ve %14, %17, %24'lük bir apopitoz oranı saptanırken, 2 µM, 4 µM ve 8 µM MTX JEG-3 ve JAR hücre hattına tek başına uygulandığında sırasıyla %40, %48, %53 ve %40, %45, %49'luk apopitoz oranı saptandı. 0.05 µM, 0.1 µM ve 0.2 µM Act-D JEG-3 ve JAR hücre hattına tek başına uygulandığında sırasıyla %17, %23, %36 ve %14, %15, %24'lük bir apopitoz oranı saptandı. İstatistiksel olarak kontrol grubuna göre saptanan apopitoz anlamlıydı.
Ancak çalışmamızın asıl önemli çıkarımı olan bulgu ise kombine dozlarda MTX, Act-D ve ATRA'nın apopitoz oranlarına etkisiydi. Üç ilacın da düşük dozlarının kombinasyonu ile elde edilen apopitoz oranı JEG-3 ve JAR hücre hatlarında sırasıyla %54 ve %43 idi ve bu oranlar MTX'in 2 µM dozunda elde edilen apopitoz oranları olan %40'tan fazlaydı. İstatistiksel olarak anlamlıydı.
Sonuç: İnsan Koryokarsinom hücre hattı modelleri olan JAR ve JEG-3 üzerinde ATRA, MTX ve Act-D kombinasyon uygulaması her iki hücre hattında birden literatürde ilk kez yapılmıştır. Elde edilen bu sinerjistik apopitotik veriler, ATRA, MTX ve Act-D kombinasyonunun Koryokarsinom tedavisinde karşılaşılan çoklu ilaç direnciyle mücadelede kullanılabilecek seçeneklerden biri olabileceğini göstermektedir. Ancak ilaçların etkileri ve kombinasyonlarındaki etkilerin in vivo sistemlerde farklı olabileceğinden, veriler ilk olarak hayvan deneyleri ve sonra klinik araştırmalarla da desteklenmelidir.

Anahtar kelimeler: ATRA, koryokarsinom, kemoterapi, hücre kültürü

Abstract:
The comparison of the effect of All-trans retinoic acid, Methotrexate, Actinomycin D and combined chemotherapy on the different choriocarcinoma cell culture models
Aim: All-trans retinoic acid (ATRA) is the natural derivative of vitamin with the trans form, which can be obtained from animal sources (retinoids) and from plant sources as provitamin carotenoids. ATRA induces the differentiation of immature cells and high pluripotent tumor cells to gain function. Especially with the help of this effect ATRA treatment is used in Acute Promyelocytic leukemia with succes. Previous cell culture studies have shown that ATRA has the effect of inducing apoptosis, decreasing cell proliferation and inhibating cell invasion.
Gestational trophoblastic diseases are the group of diseases that originates from human placenta and choriocarcinoma is the malignant form. In several studies it is showed that retionic acid and vitamin A deficiency increase the risk of this disease at the etiology of these diseases. In literature the comparement of ATRA with other chemotherapeutics is scarce.
Our aim is to investigate the ATRA's efficiency in single usage and combined chemotherapy with MTX, Act-D in choriocarcinoma on cell culture models (JAR, JEG-3) and add new data to the literature that is insufficient in this topic .
Materials and Methods: Human choriocarcinoma like JAR and JEG-3 cells were cultured. ATRA, MTX and Act-D trial groups are determined as shown below;
For single drug trial; MTX 2 μM, 4 μM, 8 μM; ATRA 0.1 μM, 1 μM, 10 μM; Act-D 0.05 μM, 0.1 μM, 0.2 μM dosages were maintained.
For the combination of ATRA and MTX; ATRA 0.1 μM, 1 μM and 10 μM dosages with MTX 2 μM, 4 μM and 8 μM dosages were maintained.
For the combination of ATRA and Act-D; ATRA 0.1 μM, 1 μM and 10 μM dosages with Act-D 0.05 μM, 0.1 μM and 0.2 μM dosages were maintained.
For the combination of ATRA, MTX and Act-D; ATRA 0.1 μM, 1 μM and 10 μM dosages with MTX 2 μM and with Act-D 0.05 μM, 0.1 μM and 0.2 μM dosages were maintained. Drugs were given to the cells at the same time. Following drug administration at the 72nd hour the cells were detached by the Trypsine- Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) solution. The degree of apoptosis was obtained by flow cytometry (FCM). Supernatant was collected before trypsine application for only one set, and stored in deep-freeze to investigate β-hCG levels. β-hCG levels were investigated by immunoenzymatic method. SPSS 19.0 and Minitab 17 programmes were used to make statistical analysis.

Findings: With the single application of 0.1 µM, 1 µM and 10 µM ATRA to the JEG-3 and JAR cell line, 15%, 19%, 30% and 14%, 17%, 24% apoptosis were determined, respectively, with the single application of 2 µM, 4 µM and 8 µM MTX to the JEG-3 and JAR cell line, 40%, 48%, 53% and 40%, 45%, 49% apoptosis were determined, respectively. With the single application of 0.05 µM, 0.1 µM and 0.2 µM Act-D to the JEG-3 and JAR cell line, 17%, 23%, 36% and 14%, 15%, 24% apoptosis were determined, respectively. Statistically significant comparing with the control group.
Nevertheless, the more important finding of our trial is the effect on apoptosis ratios of MTX, Act-D and ATRA in combined dosages. The apoptosis ratio on JEG-3 and JAR cell lines obtained with the low dosages of the three drug were 54% and 43%, respectively and those ratios were more than the ratios obtained with the 2 µM dosage of the MTX, which were 40% and statistically significant.
Result: The application of ATRA, MTX and Act-D combination on the JAR and JEG-3, human choriocarcinoma cell line models, is made in both cell lines for the first time in the literature. The obtained synergistic apoptotic data indicated that; the combination of ATRA, MTX and Act-D could be used as one of the options in the struggle against multi-drug resistance encountered in the treatment of choriocarcinoma. However, the effect of the drugs and the effect in the combination of drugs may be different in vivo systems, therefor the data should be supported initially by animal experiments and then clinical trials.


Key words: ATRA, choriocarcinoma, chemotherapy, cell culture