Madımak bitkisindeki fenolik asit ve flavonoidlerin HPLC-DAD yöntemiyle tayini, biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi
Determination of phenolic acid and flavonoids in madimak plant by HPLC-DAD, determination of biological activity
Yazar: REYHAN AKPINAR
Danışman: PROF. DR. SABRİYE PERÇİN ÖZKORUCUKLU
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antimikrobiyal aktivite = Antimicrobial activity ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Kromatografi = Chromatography ; Madımak = Polygonum cognatum Meissn. ; Sitotoksik etki = Cytotoxic effect

Özet:
Polygonaceae ailesine ait Madımak (Polygonum cognatum Meissn.) ülkemizde kendiliğinden yetişen çok yıllık bir bitkidir. Bu bitki fenolik içerik bakımından zengindir. Fenolik bileşikler, bitkilerin en önemli sekonder metabolit grubunu oluştururlar ve bu bileşiklerin antioksidan, antimikrobiyal ve antikanserojen aktivitelerinin olduğu bilinmektedir. Hassasiyeti, doğruluğu ve kısa analiz süresinden dolayı yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC), fenolik bileşiklerin kalitatif ve kantitatif tayininde kullanılan en popüler analitik yöntemlerdendir.
Bu tez çalışmasında farklı zamanda ve farklı bölgelerden hasat edilen madımak bitkisinin antioksidan, antimikrobiyal ve sitotoksik aktiviteleri incelenmiştir. Bitkideki 10 fenolik bileşiğin (protokateşik asit, kateşin, gentisik asit, kafeik asit, p-kumarik asit, polidatin, kumarin, resveratrol, ellajik asit, kuersetin) eş zamanlı kalitatif ve kantitatif tayini için yeni bir HPLC-DAD yöntemi geliştirilmiş ve valide edilmiştir.
Sivas (A bitkisi) ve Ordu (B bitkisi) illerinden toplanan ve soxhlet yöntemiyle ekstrakte edilen madımak bitkilerinin antioksidan aktivitesi DPPH yöntemiyle belirlenmiştir. Bitki ekstraktların IC50 değerleri A ve B bitkisi için sırasıyla, 0,781 mg/mL ve 0,657 mg/mL olarak saptanmıştır. Antimikrobiyal aktivite difüzyon ve dilüsyon yöntemiyle araştırılmıştır. Nokta-damlatma ekim yönteminde ham ekstrakt mikroorganizmalara karşı inhibisyon zonu oluşturmamıştır. Metanol ekstraktı en güçlü antibakteriyal aktiviteyi Gram negatif bakterilerden 23 mm inhibisyon zonu ile Escherichia coli bakterisine; 20 mm inhibisyon zonu ile Gram pozitif bakterilerden Vankomisin dirençli Enterococcus faecium (VRE) bakterisine; en güçlü antimikrobiyal aktiviteyi 25 mm inhibisyon zonu ile Candida albicans mantarına karşı göstermiştir. Ham ekstraktın tüm derişimlerinde üreme görülmüş, metanol ekstraktında MİK değerleri tüm mikroorganizmalar için 4,75 mg/mL olarak saptanmıştır. MBK değeri Vankomisin dirençli Enterococcus faecium (VRE) bakterisi için 5,00 mg/mL, diğer tüm mikroorganizmalar için için 4,75 mg/mL olarak belirlenmiştir. Sitotoksik aktivitenin tayinini L929 ve SAOS-2 hücre hatları üzerinde MTT yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. L929 hücre hattında A ve B bitkisinin % hücre canlılığı sırasıyla, %160,182-%121,992 ve %156,997-135,546 aralığında tespit edilmiştir. A ve B bitki ekstraktlarının negatif kontrole göre proliferatif etkisi gözlemlenmiştir. SAOS-2 hücre hattında A ve B bitkisinin % hücre canlılığı sırasıyla, %111,341-63,492 ve %137,141-%99,483 aralığında saptanmıştır. A bitki ekstraktının negatif kontrole göre antiproliferatif etkisi gözlemlenirken; B bitki ekstraktının ise sadece 10 mg/mL derişimde antiproliferatif etkisi gözlemlenmiştir. 
Fenolik bileşiklerin eş zamanlı tayini için yeni bir HPLC-DAD yöntemi geliştirilmiştir. Kromatografik tayinler SUPELCOSIL LC-18 (25cm x 4,6mm, 5µm) kolonunda gradient program ile gerçekleştirilmiştir. Mobil faz, akış hızı ve kolon sıcaklığı optimize edilmiştir.  Geliştirilen yöntemin validasyonunda sistem uygunluğu araştırılmış ve geliştirilen yöntemin önerilen değerlere uygun olduğu saptanmıştır. LOD ve LOQ değerleri sırasıyla, 0,051- 0,188 µg/mL ve 0,169- 0,628 µg/mL aralığında hesaplanmıştır. Gün içi analizlerde % geri kazanım 99,273-101,032 ve %RSD 0,090-0,652; günler arası analizlerde % geri kazanım 99,017-101,983 ve %RSD 0,059-0,697 aralığında tespit edilmiştir. A ve B bitkilerinde en yüksek miktarda resveratrol; en düşük miktarda kafeik asit tayin edilmiştir. Her iki bitki ekstraktında gentisik asit bileşiğine rastlanmamıştır.

Abstract:
Madımak (Polygonum cognatum Meissn.), belonging to the Polygonaceae family, is a perennial plant that grows spontaneously in our country. This plant is rich in phenolic content. Phenolic compounds constitute the most important secondary metabolite group of plants and are known to have antioxidant, antimicrobial and anticarcinogenic activities. Due to its sensitivity, accuracy and short analysis time, high performance liquid chromatography (HPLC) is one of the most popular analytical methods used for the qualitative and quantitative determination of phenolic compounds. 
In this thesis study, the antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of the madimak plant, which was harvested from different regions at different times, were investigated. A new HPLC-DAD method has been developed and validated for the simultaneous qualitative and quantitative determination of 10 phenolic compounds (protocatechuic acid, catechin, gentisic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, polydatin, coumarin, resveratrol, ellagic acid, quercetin) in the plant.
Antioxidant activity of madimak plants which are collected from Sivas (plant A) and Ordu (plant B) and extracted by soxhlet method was determined by DPPH method. The IC50 values of the plant extracts were determined as 0.781 mg/mL and 0.657 mg/mL for plant A and plant B, respectively. Antimicrobial activity was investigated by diffusion and dilution method. In the Spot-on-Lawn method, the crude extract did not form an inhibition zone against microorganisms. Methanol extract has the strongest antibacterial activity from Gram negative bacteria to Escherichia coli bacteria with a 23 mm inhibition zone; From Gram positive bacteria to Vancomycin resistant Enterococcus faecium (VRE) bacteria with a 20 mm inhibition zone; on the other hand, it has showed the strongest antimicrobial activity against Candida albicans with a 25 mm inhibition zone. An increase was observed in all concentrations of the crude extract, and MIC values in the methanol extract determined as 4.75 mg/mL for all microorganisms. MBC and MFC values were determined as 5.00 mg/mL for Vancomycin resistant Enterococcus faecium (VRE) bacteria and 4.75 mg/mL for all other microorganisms. The determination of cytotoxic activity was performed on L929 and SAOS-2 cell lines by MTT method. Cell viability % of plant A and plant B in L929 cell line was determined as 160.182-121.992% and 156.997-135.546%, respectively. A and B plant extracts showed a proliferative effect compared to the negative control. In SAOS-2 cell line, cell viability % of plant A and B was determined in the range of 111.341-63.492% and 137.141- 99.483%, respectively. While the antiproliferative effect of plant A extract was observed compared to the negative control; the antiproliferative effect of plant B extract was observed only at 10 mg/mL concentration.
A new HPLC-DAD method has been developed for the simultaneous determination of phenolic compounds. Chromatographic determination was performed with the gradient program on the SUPELCOSIL LC-18 (25cm x 4.6mm, 5µm) column. The mobile phase, flow rate and column temperature are optimized. In the validation of the developed method, the system suitability was investigated, and it was determined that the developed method was in accordance with the recommended values. LOD and LOQ values were calculated in the range of 0.051- 0.188 µg/mL and 0.169- 0.628 µg/mL, respectively. In intra-day analyzes, recovery % was determined in the range of 99.273-101.032 and RSD% 0.090-0.652; in inter-day analyzes, recovery % was determined in the range of 99.017-101.983 and RSD% 0.059-0.697. The highest amount of resveratrol; the lowest amount of caffeic acid was determined in plants A and B. Gentisic acid compound was not found in both plant extracts.