Azitromisinin sub-minimum inhibitör konsantrasyonlarınınBordetella pertussis tohama-I üzerindeki in vitro etkileri
In vitro effects of sub-minimum inhibitory concentrations of azithromycin on Bordetella pertussis tohama-I
Yazar: EDA DELİK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ BURCU EMİNE TEFON ÖZTÜRK
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bordetella pertussis boğmaca hastalığının ana etkenidir ve bilindiği kadarıyla 
insandan başka konağı yoktur. Bu bakteri enfekte ettiği konağın akciğerleri ve hava 
yollarına yerleşir ve yüksek bulaşıcılığa sahiptir. Hastalığın neden olduğu oksijen
eksikliği beyinde hasara yol açabilir ve özellikle bir yaşın altındaki bebeklerde bu durum
ölümcül olabilmektedir. Genel olarak çocukluk çağı hastalığı olarak tanımlanır ancak
ergen ve yetişkinlerde de hafif semptomlarla sürekli olan öksürük belirtileriyle yaygın 
olarak ortaya çıkabilmektedir. Dünya Sağlık Örgütü'nün (DSÖ) verilerine göre 2018 
yılında dünya çapında 151,000'den fazla boğmaca vakası olduğu kaydedilmiştir. 1974 
yılında başlatılan Genişletilmiş Bağışıklama Programı (GBP) ve 1980'li yıllarda başlayan 
Ulusal Aşı Kampanyası ile hastalığın sıklığı önemli ölçüde azaltılmıştır. Ancak son 
yıllarda yapılan çalışmalar yaygın aşılamaya rağmen boğmaca vakalarının yeniden 
arttığını göstermektedir. 
Boğmacayla mücadelede antibiyotikler yaygın olarak kullanılır ve klinikte 
makrolid tipi antibiyotikler en çok tercih edilen antibiyotik grubu olmaktadır. Bu tez 
çalışmasında da makrolid grubu antibiyotiklerden olan azitromisinin B. pertussis
Tohama-I suşuna karşı sub-MİK dozları belirlenmiştir ve bu dozların bakterinin büyüme
hızına, biyofilm oluşturma kabiliyetine ve iki önemli virülans faktörlerinden olan ptxS1
ve prn genlerinin ekspresyonuna olan etkisi araştırılmıştır. Azitromisinin MİK değeri sıvı 
dilüsyon yöntemiyle 0.08 μg/ml olarak belirlenmiştir ve MİK'in 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 
ve 1/64 oranlarının bakterinin büyüme hızına olan etkisi araştırılmıştır. Bakteri hücreleri 
antibiyotiğin 1/2, 1/4 ve 1/8 sub-MİK dozlarını tolere edemediğinden hücre büyümesi 
deneyler için yetersiz kalmıştır. Bu nedenle Tohama-I için azitromisinin sub-MİK dozları 
1/16, 1/32 ve 1/64 olarak belirlenmiştir. Bu dozların bakterinin biyofilm oluşturabilme 
yeteneğine olan etkisi 96'lı hücre kültürü plağı kullanılarak belirlenmiştir. Gen 
ekspresyonlarına olan etkisi ise gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)
ile analiz edilmiştir. Bakterilerin antibiyotik dozunun artmasına paralel olarak biyofilm 
oluşturabilme yetenekleri azalmıştır. Ancak ptxS1 ve prn ekspresyon seviyelerinin artışı 
veya azalışı antibiyotik dozunun artışıyla paralellik göstermemiştir. MİK/32 azitromisin 
konsantrasyonunda her iki genin de ekspresyon seviyelerinin kontrole göre arttığı 
görülmüştür. MİK/16 ve MİK/64 ise ptxS1 ekspresyonunu kontrole göre azaltırken prn
ekspresyonunu arttırmıştır. Fakat antibiyotik dozlarının genlerin ekspresyonu üzerindeki etkilerinin kontrolle kıyaslandığında istatiksel olarak önemli olmadığı bulunmuştur
(p>0.05). Literatürde sub-MİK antibiyotik dozlarının B. pertussis hücrelerine olan 
etkileriyle ilgili yeterli ve yaygın çalışmalar mevcut değildir. Bu çalışma sub-MİK 
antibiyotik dozlarının B. pertussis'e karşı etkilerinin belirlenmesi açısından azitromisin 
özelinde gerçekleştirilen ilk çalışmadır. Ayrıca azitromisinin boğmaca tedavisinde yaygın 
olarak kullanılması göz önüne alındığında, bu çalışmadan elde edilen sonuçlar 
antibiyotiğin bakteri hücresine olan etkilerinin belirlenmesi ve bakteri-konak hücre 
ilişkisindeki rolünün anlaşılabilmesi açısından daha sonra yapılacak olan çalışmalar için 
önem arz etmektedir.

Abstract:
Bordetella pertussis is the primary causative agent of whooping cough (pertussis)
and is known to infect only humans. This bacterium colonizes the lungs and respiratory 
tract of the infected host and exhibits high contagiousness. The lack of oxygen caused by 
the disease can lead to brain damage that can be fatal, especially in infants under one year 
of age. Although whooping cough is primarily known as a childhood disease, it can also 
occur in adolescents and adults with mild symptoms such as a persistent cough. 
According to the World Health Organization (WHO), there were over 151,000 reported 
cases of pertussis worldwide in 2018. Despite widespread vaccination efforts, recent 
studies indicate a resurgence in pertussis cases.
Antibiotics, particularly macrolide antibiotics, are commonly used in the clinic to 
control pertussis. This thesis study focused on azithromycin, a macrolide antibiotic, and 
aimed to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) dose against the B. 
pertussis Tohama-I strain. Additionally, the study investigated the effects of the sub-MIC
doses on bacterial growth rate, biofilm formation capacity, and expression of two critical
virulence factors: ptxS1 and prn genes. The minimum inhibitory concentration (MIC) of 
azithromycin was determined to be 0.08 μg/ml using the broth dilution method. 
Subsequently, the effects of MIC ratios of 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, and 1/64 on bacterial 
growth rate were investigated. However, due to insufficent cell growth, the experiments 
could not be performed for sub-MIC doses of 1/2, 1/4, and 1/8. Therefore, the sub-MIC 
doses of azithromycin against the Tohama-I strain were set at 1/16, 1/32, and 1/64. To 
evaluate the effects of these doses on bacterial biofilm formation, a 96-well cell culture 
plate was used. In addition, gene expression was analyzed using real-time polymerase 
chain reaction (RT-PCR). The ability of bacteria to form biofilms decreased 
proportionally with increasing antibiotic dose. However, the expression levels of ptxS1
and prn genes did not exhibit a direct correlation with the escalating antibiotic dose. 
Specifically, it was observed that the expression levels of both genes increased at 
azithromycin concentration of MIC/32 compared with control. Conversely, at MIC/16 
and MIC/64, the expression of ptxS1 decreased, whereas the expression of prn increased 
compared with the control. Nevertheless, the effects of antibiotic doses on gene 
expression were statistically insignificant compared to control (p>0.05).
There are not adequate and widespread studies on the effects of sub-MIC 
antibiotic doses on B. pertussis in the literature. The present study is the first to 
specifically address the effects of sub-MIC antibiotic doses using azithromycin against B. 
pertussis. Considering the widespread use of azithromycin for pertussis treatment, the 
results of this study will provide valuable insight into the effects of the antibiotic on 
bacterial cells and improve our understanding of the relationship between bacteria and 
host cells.