Segmental periferik sinir defektlerinin onarımında otolog sinir grefti, epinöral kılıf ve kök hücre ile indüklenmiş prefabrike sinir grefti kullanımının karşılaştırılması
Comparison of results of autogenous nerve graft, epineural sheath and prefabricated nerve graft induced by stem cell in repair of segmental peripheral nerve defects
Yazar: GAMZE KURDAL
Danışman: DOÇ. DR. OĞUZ KAYIRAN
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Sultan Abdülhamid Eğt. ve Arş. Hast. / Plastik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Kök hücreler = Stem cells ; Periferik sinir hasarları = Peripheral nerve injuries ; Periferik sinirler = Peripheral nerves ; Sinir nakli = Nerve transfer ; Transplantlar = Transplants

Özet:
Segmental Periferik Sinir Defektlerinin Onarımında Otolog Sinir Grefti, Epinöral Kılıf ve Kök Hücre İle İndüklenmiş Prefabrike Sinir Grefti Kullanımının Karşılaştırılması 
 
   Günümüz kaynaklarında altın standart tedavi yöntemi olarak otolog sinir grefti ile onarım önerilen, ancak bu prosedürün ek donör saha morbiditeleri nedeniyle alternatif yaklaşım arayışları yoğun bir şekilde devam eden, klinik olarak insan yaşamını ileri düzeyde etkileyen ağır fonksiyonel kayıplara neden olan segmental periferik sinir hasarı onarımında adipoz kökenli kök hücre ile indüklenmiş prefabrike sinir greftinin altın standart yöntem olan otolog sinir grefti ile karşılaştırılması amacıyla bu çalışma yapılmıştır. 
Literatürde alternatif yöntem arayışıyla yapılmış deneysel çalışmalarda epinöral kılıf; sinir defekti onarımlarında otolog sinir iletkeni olarak kullanılmıştır. Araştırmamıza yön veren ön çalışmalar sinir iyileşmesindeki etkileri kanıtlanmış kök hücrelerle muamele edilmiş epinöral kılıflardan üretilen motor sinir kaynaklı prefabrike sinir greftleri ile otolog sinir grefti alternatifi yeni bir ürün ortaya koyarken; bu yöntemi altın standart yöntemle karşılaştırma amacıyla deneysel çalışmamızı şekillendirdik. 
Çalışmada; immünsüpresyona ihtiyaç duyulmaksızın allojen uygulamalara olanak tanıyan inbred Lewis türü erkek sıçanlar (n=30) kullanıldı. Sıçanlardan 4 tanesi donör olarak ayrıldı. Donör hayvanlarının her iki taraf siyatik sinirlerinden 20 mm uzunluğunda 8 adet epinöral kılıf ile inguinal yağ dokularından yağ greftleri elde edildi. Yağ greftleri, yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücre (adipose tissue derived mesenchymal stem cell=ADMSC) üretilmesi amacıyla kök hücre laboratuvarına gönderildi. Kök hücre elde etme prosedürü zaman gerektirdiğinden bu süre zarfında epinöral kılıflar çalışmanın ileri safhalarında kullanılmak üzere -800C'de muhafaza edildi. Kök hücre üretimi tamamlandığında kalan denekler; kök hücre grubu (n=8), boş epinöral kılıf grubu (n=8) ve kontrol grubu (n=8) şeklinde 3 eşit gruba ayrıldı. Çalışmanın ilk aşamasında kök hücre grubu deneklerinin sağ siyatik sinirlerinde 15 mm ara ile açılan epinöral pencereler arasına donörlerden elde edilmiş epinöral kılıflar paralel bir yol olacak şekilde mikrocerrahi yöntemler ile koapte edildi. Epinöral kılıflar içerisine ADMSC enjekte edildi. Sekiz haftalık iyileşme dönemi sonrasında prefabrike edilmiş greftler cerrahi olarak çıkarıldı. Çalışmanın ikinci aşamasında tüm deneklerin sol siyatik sinirlerinde 15 mm uzunlukta sinir defekti oluşturuldu. Sinir defekti 1. grupta çalışmanın ilk aşamasında elde edilen prefabrike sinir greftleri ile, 2. grupta epinöral kılıfın konduit olarak kullanılması ile, 3. grupta ise otolog sinir grefti ile onarıldı. Sekiz haftalık iyileşme dönemi sonrasında tüm deneklere prosedürün fonksiyonel etkilerinin gösterilmesi için elektromiyografi (EMG) yapıldı. EMG sonrasında onarım yapılan sinir segmenti cerrahi olarak çıkarılarak histomorfolojik örnekler hazırlandı. Örneklerden akson sayımı ve yeni rejenere olmuş sinirde skar oluşumu değerlendirmesi yapıldı. 
Tüm denek gruplarında, histomorfolojik incelemelerle, sinir rejenerasyonu olduğunu gözledik. EMG ve miyelinli akson sayımı sonuçlarının istatistiksel analizinde prefabrike greft grubu ile otolog sinir grefti grubu arasında anlamlı bir fark bulunmaması (p>0,05) bizi kök hücre ile indüklenmiş prefabrike edilmiş sinir greftinin; segmental sinir defekti onarımında altın standart yöntem olan otolog sinir grefti kadar etkili olduğu sonucuna götürmektedir. Yine akson sayımı ve EMG sonuçları açısından epinöral kılıf grubu diğer gruplarla karşılaştırıldığında epinöral kılıf grubunda miyelinli akson sayısının diğer gruplara gore daha az olduğu; elektromiyografik incelemede genliğin düşük ve latansın uzun olduğu; bu farkların istatistiksel olarak anlamlı olduğu görüldü. Bu sonuçlar epinöral kılıf kullanımının tek başına sinir rejenerasyonuna uygun ortam sağlayabileceğini; ancak halihazırda kullanılan ve altın standart yöntem olan otolog sinir grefti kadar başarılı olmadığını göstermektedir. 
Tek başına kullanıldığında nörojenik özelliği sınırlı olan epinöral kılıf, kök hücre ile indüklenerek lateral aksonal tomurcuklanma yoluyla otolog sinir prefabrikasyonunda kullanıldığında elde edilen prefabrike sinir greftinin, segmental sinir defekti onarımında etkili bir yöntem olduğunu histolojik ve elektrofizyolojik olarak gösterdik. Literatürde sinir liflerine zarar vermeksizin epinöral kılıf eksize edildiğinde; donor dokunun kendini rejenere etme kapasitesine sahip olduğu gösterilmiştir. Bu bilgi ile sinir prefabrikasyonu için gerekli olan epinöral kılıf ve adipoz kökenli mezenkimal kök hücrenin hastadan sınırsız elde edilebileceğini; allojen doku kullanımına ve dolayısıyla immunsupresyona gerek kalmayacağı sonucuna ulaştık. Elektif onarım planlanan periferik sinir hasarı olan hastaların sinir grefti prefabrikasyonunda, bu bu avantajın kullanılabileceği ve kök hücre ile indüklenmiş prefabrike sinir greftinin elektrofizyolojik açıdan değerlendirildiğinde mevcut yöntem kadar etkin bir potansiyeli olduğunu gözlemledik. Elde ettiğimiz bu sonuçları desteklemek ve karşılaştırmak adına; daha geniş çalışma gruplarında kök hücre ile indüklenmiş prefabrike sinir greftlerinin, güncel olarak kullanılmakta olan alternatif metotlar ve altın standart teknik olan otolog sinir grefti ile karşılaştırmalı çalışmalarının yapılması, geliştirilen tekniğin klinik kullanıma geçmesini hızlandıracaktır.

Abstract:
Comparison of results of autogenous nerve graft, epineural sheath and prefabricated nerve graft induced by stem cell in repair of segmental peripheral nerve defects 
 
   For the segmental peripheral nerve defect repair, current resources suggest repair with autologous nerve graft as the gold standard treatment method; however, alternate approaches are sought for this procedure due to additional donor field morbidities. According to preliminary studies it was demonstrated the effectiveness of the nerve epineural sheath implemented with adipose tissue derived mesenchymal stem cell in segmental peripheral nerve defect repair, which cause serious functional losses that have clinically severe impacts on human life, while, in the meantime, showing for the first time the place of the epineural sheath in nerve prefabrication procedure. Hence, the aim of this study was to compare more specifically the effectiveness of the prefabricated nerve graft and autolog nerve graft in segmental peripheral nerve defect repair. 
All the experimental studies in the English literature have tried to demonstrate the effectiveness of the epineural sheath as an autologous nerve conduit in segmental nerve defect repair. In our study; with the perspective of preliminary studies which demonstrated the positive effects of adipose tissue derived stem cells on nerve prefabrication, we aimed to compare the functional and histological results of adipose tissue derived stem cell induced prefabricated nerve graft originated from motor nerve and autolog nerve graft on nerve healing. 

Inbred Lewis male rats (n=30) that allow for allogeneic applications without immunosuppression were used in our study. Four of the rats were chosen as donors. From the donor animals; 8 epineural sheaths, each of 20 mm length, were obtained from their sciatic nerves at both sides, and fat grafts were obtained from their inguinal fat pads. Fat grafts were sent to the stem cell laboratory to obtain adipose tissue derived mesenchymal stem cell (ADMSC). Since stem cell obtaining procedure takes certain time, meanwhile epineural sheaths were kept at -800C to be used in further steps of the study. When the stem cell generating procedure is completed , rest of the animals were divided into 3 groups in equal quantities: prefabricated nerve graft group (n=8), empty epineural sheath group (n=8) and autolog nerve graft group (n=8). First part of the study involved nerve prefabrication procedure. In the prefabricated nerve graft group, between the epineural apertures opened on the right sciatic nerves of the subjects with intervals of 15mm, the epineural sheaths obtained from the donors were coapted through microsurgical methods so that they form a parallel path. ADMSC was injected into the epineural sheaths. Following the recovery period of eight weeks prefabricated nerve grafts were excised. In the second part of the study, left sciatic nerves of all groups were dissected and 15 mm defects were created. Nerve defects were reconstructed via prefabricated nerve grafts in group 1, empty epineural sheath in group 2, and autolog nerve grafts which were derived from dissection procedure in group 3.  Following the recovery period of eight weeks,  electromyography (EMG) was performed on all subjects to demonstrate the functional impacts of the procedure. After this EMG procedure, only the coapted nerve segments were removed surgically and histomorphologic samples were prepared. Based on these samples, axon counting and evaluation of the newly regenerated axon characters were performed. 
In all subject groups, with the histomorphological studies we observed nerve regeneration. Statistical analysis of the axon counting and EMG results showed no significant different between the prefabricated nerve group and autologous nerve group (p>0,05), which demonstrated to us that prefabricated nerve graft is as effective and reliable as autologous nerve graft which is gold standard in segmental nerve defect repair. On the other hand, the epineural sheath group had significantly less amount of myelinated axon and less favourable electromyographic results; which are statistically significant from other two groups. This data indicates that epineural sheath can direct the nerve regeneration, meanwhile it is not effective autologous nerve graft. 
As we used epineural sheath for nerve prefabrication with the aid of adipose derived stem cells, we obtained a quite effective autologous nerve graft for the reconstruction of segmental nerve defects; and this is approved with the histological and electrophysiologic studies. In the literature, it is proved that donor tissue regenerates itself when epineural sheath is excised without given harm to nerve fascicles. This data denotes that epineural sheath and adipose derived mesenchimal stem cells can be obtained unlimited from a patient, moreover there will be no need to use to allogenous tissue and subsequent immunosuppression.
Therefore we defined the advantage of the prefabricated nerve graft; which induced by adipose derived  stem cells; in segmental peripheral nerve defect reconstruction as reliable and effective as autologous nerve graft for whom elective peripheral nerve repair is planned. Repetition of the study in larger experimental groups will support the conclusion and our findings, and compare our discovery with the ongoing nerve reconstruction methods. Therefore it will be faster to use the developing technic in clinical trial.