Deltametrin ve thiakloprid karışımının insan akciğer hücrelerindeki sitotoksisitesi ve DNA çift zincir kırıkları üzerindeki etkileri
Effects of mixture of deltametrin and thiacloprid on DNA double strand breaks and cytotoxicity on human lung cells
Yazar: BARBAROS ERTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. VEDAT ŞEKEROĞLU
Ordu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Deltametrin = Deltamethrin ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Çeşitli insektisitlerin, akciğer kanserinin gelişiminde potansiyel moleküler biyogöstergelerden olan düzensiz promotor gen metilasyonu gibi moleküler değişimlere yol açabildiği ileri sürülmektedir. Deltametrin ve thiakloprid karışım halinde tarımda yaygın olarak kullanılan insektisitlerdir. Ancak bu insektisitlerin karışım halde kullanıldığında, insan akciğer hücrelerindeki sitotoksik ve DNA hasarı ve tamiri üzerindeki etkilerinin araştırıldığı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle bu insektisitlerin insan akciğer hücrelerindeki (BEAS-2B) sitotoksisitesi, DNA çift zincir kırıkları ve tamiri üzerindeki etkileri ilk kez bu çalışma ile ortaya konulmuştur. Deltametrin ve thiakloprid karışımının Sitotoksisitesi; MTT ve klonojenik testleri ile, DNA çift zincir kırıkları ve tamiri üzerindeki etkileri ise tümör baskılayıcı protein olan p53 bağlayıcı protein-1 (53BP1) ve H2AX tipi histonun fosforilasyonu ile oluşan γ-H2AX proteinlerinin oluşturdukları odakların immünofloresan yöntemi ile belirlenmiştir.
Sitotoksisite deneylerinde akciğer epitel hücreleri 0.001 + 0.016 mM ve 0.166 + 2.5 mM (deltametrin + thiakloprid) arasında toplam 10 farklı konsantrasyonda insektisit karışımı ile 24 ve 120 saatliğine muamele edilmiştir. Klonojenik test sonuçları, doz artışına bağlı olarak hem 24 hem de 120 saatlik maruziyetlerin hücre canlılığını azalttığını ve deltametrin ile thiakloprid karışımının özellikle yüksek dozlarda sitotoksik olduğunu göstermiştir. Klonojenik test ile uyumlu olarak MTT testinin sonuçları da bu insektisitlerin karışımlarının özellikle yüksek dozlarda oldukça sitotoksik olduğunu ortaya koymuştur.
DNA çift zincir kırık hasarı oluşturma potansiyelini belirlemek için hücreler 0.011 + 0.160, 0.022 + 0.333 ve 0.044 + 0.666 mM konsantrasyonlarda deltametrin ve thiakloprid karışımı ile muamele edilmiş ve γ-H2AX ile 53BP1 proteinlerinin oluşturduğu odaklar tespit edilmiştir. 24 saat sonunda orta ve yüksek konsantrasyonlarda, γ-H2AX odak oluşumunda kontrole göre istatistiksel olarak önemli artışlar tespit edilmiştir. 53BP1 ve kolokalizasyon odakları ise sadece en yüksek konsantrasyonda kontrolden önemli derecede farklı bulunmuştur. 120 saatlik muamelede ise, hem γ-H2AX hem 53BP1, hem de kolokalizasyon odaklarının çözücü kontrolle karşılaştırıldığında orta ve yüksek konsantrasyonlarda istatistiksel olarak önemli ölçüde arttığı belirlenmiştir.
24 saatlik muamele sonrası etken maddelerin uzaklaştırılması ve hasarın onarımı için ekstra 24 saatlik iyileşme süresi tanınan hücrelerde tüm odaklar istatistiksel anlamda önemli olacak şekilde düşüş göstermiştir. Ancak, 120 saatlik muamele sonrası tanınan 24 saatlik iyileşme süresi en yüksek konsantrasyon için etkili olmamıştır. Çünkü en yüksek konsantrasyonda tüm odaklar, çözücü kontrol ile kıyaslandığında istatistiksel olarak önemli ölçüde yüksek bulunmuştur.

Abstract:
It has been stated that some insecticides can cause irregular gene promoter methylation which is the potential molecular biomarkers in the development of lung cancer. Deltamethrin and thiacloprid are widely used insecticides as mixture in agriculture. However, there is no report about effects of these insecticides on cytotoxicity and DNA damage and repair in human lung cells. Effects of these insecticides on cytotoxicity, DNA double-chain breaks and repair in human lung epithelial cells (BEAS-2B) were demonstrated for the first time in this study. The cytotoxicity of the mixture of deltamethrin and thiacloprid was determined by MTT and clonogenic assays, while their effects on DNA double strand breaks and repair were determined by immunofluorescence method by counting the foci of tumor suppressor protein p53-binding protein-1 (53BP1) and γ-H2AX proteins formed by phosphorylation of H2AX histone.
The lung epithelial cells were treated with mixtures of insecticides at 10 different concentrations between 0.001 + 0.016 mM and 0.166 + 2.5 mM (deltamethrin + thiacloprid) for 24 and 120 hours in cytotoxicity experiments. Clonogenic assay results have shown that both 24- and 120-hour treatments decreased the cell viability in a concentration-dependent manner and mixture of deltamethrin and thiacloprid was cytotoxic, especially at the higher concentrations. Consistent with the clonogenic test, the results of the MTT assay also showed that the mixture of these insecticides were highly cytotoxic at higher concentrations.
The cells were treated with mixture of deltamethrin and thiacloprid at concentrations of 0.011 + 0.160, 0.022 + 0.333 and 0.044 + 0.666 mM to determine the DNA double-chain breaks, and foci formed by γ-H2AX and 53BP1 proteins were detected. Statistically significant increases were observed in γ-H2AX foci formation at medium and high concentrations compared to control after 24 hours' treatment. 53BP1 and colocalization foci were only significant at the highest concentration. All foci of γ-H2AX and 53BP1 and colocalization increased statistically significantly at medium and high concentrations in 120 hours' treatment compared to control.
After 24 hours of treatment, all foci decreased statistically significant in cells that were given an extra 24-hour recovery period for removal of the insecticides and repair of the damage. However, the 24-hour recovery period after 120 hours of treatment was not effective for the highest concentration. Because all foci at the highest concentration were statistically significantly higher compared to control.