Kimyasal ve fiziksel mutasyonlar ile laktik asit bakteri suşlarında probiyotik özelliklerin geliştirilmesi
Improvement of probiotic properties in lactic acid bacteria strains by chemical and physical mutagenesis
Yazar: ŞEYMA ÇAVUŞOĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MEHMET TOKATLI
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: DNA mutasyon analizi = DNA mutational analysis ; Ethidium = Ethidium ; Etil metan sulfonat = Ethyl methane sulphonate ; Mutasyon = Mutation ; Probiyotikler = Probiotics

Özet:
Laktik asit bakterileri (LAB) gıda endüstrisinde starter ve probiyotik kültür olarak geniş bir kullanım alanına sahiptir. Bu açıdan suşların teknolojik ve probiyotik özelliklerinin geliştirilmesi büyük bir öneme sahiptir. Mutasyon uygulamaları suşların geliştirilmesinde etkin bir rol oynamaktadır. Yapılan tez çalışması kapsamında, zayıf probiyotik (safra tuzu, pH 2.5 ve proteolitik enzim dayanımı) özelliklere sahip olan yerel LAB suşları (Lb. brevis MF105, Lb. plantarum MF239, Lb. plantarum MF376, Lb. plantarum MF556, P. ethanolidurans MF229, P. ethanolidurans MF50) UV radyasyon, etidyum bromür (EtBr) ve etil metan sülfonat (EMS) kullanılarak mutasyon yolu ile probiyotik özellikleri geliştirilmiştir. LAB suşlarının probiyotik özelliklerindeki değişimi belirlemek için pH 2.5 dayanımı, safra tuzu dayanımı, pepsin-pankreatin dayanımı, kolesterol asimilasyonu, antibiyotik direnci ve yüzey hidrofobisitesi gibi özellikler in Vitro olarak belirlenmiştir. Ayrıca probiyotik özelliklerin belirlenmesinden sonra mutant LAB suşlarının genomik DNA'ları RAPD-PCR tekniği ile incelenerek genetik polimorfizm ortaya konulmuştur.
LAB suşlarında EtBr, EMS ve EtBr/EMS (Mix) ile gerçekleştirilen mutasyonlarda EtBr mutasyonların hücre canlılığında meydana getirdiği azalmanın EMS ve Mix'e kıyasla daha düşük olduğu belirlenmiştir. Mutasyonlar sonrası ön seçimde 16 adet Lb. plantarum MF239 mutant suşu, 2 adet Lb. plantarum MF376 mutant suşu, 3 adet Lb. plantarum MF556 mutant suşu, 16 adet P. ethanolidurans MF229 mutant suşu ve 7 adet P. ethanolidurans MF50 mutant suşu seçilmiştir. Seçilen mutant suşların probiyotik özelliklerinde ise gastrik pH dayanım testlerinde en düşük canlılık kaybı MF239 Mix1 mutant suşunda ölçülmüş ve sırasıyla %91,37 canlılık düzeyi ve Ana suşa göre +27,27 birim canlılık düzeyinde artış sağlanmıştır. Safra tuzu dayanımında en yüksek canlılık artışı Lb. plantarum MF376 suşunun MF376 Mix1 mutantında ölçülmüştür ve %51,55 olan Ana suş canlılık düzeyi mutant suşta %76,62 bulunarak +25,07'lik bir canlılık düzeyi artışı sağlanmıştır. Pankreatin enzim dayanımı açısından P. ethanolidurans MF50 suşunun mutant MF50 Mix2 suşunda en yüksek pankreatin enzim dayanım artışı sağlanmış olup +14,07'luk bir değer elde edilmiştir. Kloramfenikol antibiyotik direncinde (C30) Ana suşa kıyasla MF239 KUV1 (0 mm zon) ve MF239 EMS2 (0 mm zon) mutant suşlarında tam bir direnç oluştuğu gözlemlenmiştir. İncelenen probiyotik özelliklerden kolesterol asimilasyon (MF239 UV5, MF229 Mix3) ve yüzey hidrofobisite (MF229 EMS3, MF239 Mix3) değerlerinde bazı mutant suşlardaki artışlar istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. Lb. plantarum MF239 Mix1 ve Lb. plantarum MF376 Mix1 mutant suşlarının RAPD primer bantlarında Ana suşa göre farklılıklar gözlemlenmiştir.

Abstract:
Lactic acid bacteria (LAB) have a wide range of uses in the food industry as starter and probiotic cultures. In this respect, it is of great importance to develop the technological and probiotic properties of strains. Mutation practices play an active role in the development of strains. Within the scope of the thesis study, local LAB strains (Lb. brevis MF105, Lb. plantarum MF239, Lb. plantarum MF376, Lb. plantarum MF556, P. ethanolidurans MF229, P. ethanolidurans MF50) with weak probiotic properties (bile salt, pH 2.5 and proteolytic enzyme resistance) were enhanced by mutation using UV radiation, ethidium bromide (EtBr) and ethyl methane sulfonate (EMS). In order to determine the change in probiotic properties of LAB strains, properties such as pH 2.5 resistance, bile salt resistance, pepsin-pancreatin resistance, cholesterol assimilation, antibiotic resistance and surface hydrophobicity were determined as in Vitro. In addition, after the determination of probiotic properties, genomic DNAs of mutant LAB strains were examined by RAPD-PCR technique and genetic polymorphism was revealed.
It was determined that the decrease in cell viability caused by EtBr mutations in mutations performed with EtBr, EMS and EtBr/EMS (Mix) in LAB strains was lower compared to EMS and Mix. In the preselection after mutations, 16 Lb. plantarum MF239 mutant strain, 2 Lb. plantarum MF376 mutant strain, 3 Lb. plantarum MF556 mutant strains, 16 P. ethanolidurans MF229 mutant strains and 7 P. ethanolidurans MF50 mutant strains were selected. In the probiotic properties of the selected mutant strains, the lowest viability loss in gastric pH resistance tests was measured in the MF239 Mix1 mutant strain, and an increase of 91.37% viability and +27,27-unit viability compared to the parent strain were achieved, respectively. The highest vitality increase in bile salt resistance was Lb. plantarum MF376 strain was measured in the MF376 Mix1 mutant and the main strain viability level was 51.55%, 76.62% in the mutant strain, resulting in a +25.07-viability increase. In terms of pancreatin enzyme resistance, the highest pancreatin enzyme resistance increase was obtained in the mutant MF50 Mix2 strain of P. ethanolidurans MF50 strain and a value of +14.07 was obtained. In chloramphenicol antibiotic resistance (C30), a complete resistance was observed in mutant strains MF239 KUV1 (0 mm zone) and MF239 EMS2 (0 mm zone) compared to the parent strain. The increases in cholesterol assimilation (MF239 UV5, MF229 Mix3) and surface hydrophobicity (MF229 EMS3, MF239 Mix3) values in some mutant strains were found to be statistically significant. Lb. plantarum MF239 Mix1 and Lb. plantarum MF376 Mix1 mutant strains differed in RAPD primary bands compared to the parent strain.