Ketojenik diyet uygulanan sıçanlarda eritrosit antioksidan kapasitesinin değerlendirilmesi
Evaluation of erythrocyte antioxidant capacity in rats on ketogenic diet
Yazar: BURCU DENİZLİOĞLU
Danışman: PROF. DR. GÜLİNNAZ ERCAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Diyet-ketojenik = Diet-ketogenic

Özet:
Eritrositler glukoz bağımlı enerji metabolizmasına sahip hücreler olduklarından, ketojenik diyet uygulamalarının bu hücrelerin yaşamını ve fonksiyonunu etkileyen oksidatif stres ve antioksidan savunma sistemi mekanizmaları üzerine olumsuz bir etkisinin olup olmadığının belirlenmesi oldukça gereklidir. Bu çalışmada in vivo deneysel hayvan modelinde 4 hafta süreyle kalori kısıtlaması olmaksızın ketojenik diyet uygulamasının eritrositlerde süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) gibi antioksidan enzim aktiviteleri ile malondialdehit (MDA) gibi oksidatif stres biyobelirteçleri üzerindeki etkileri ketojenik ve standart diyet uygulanan sıçanların verilerinin karşılaştırılması yoluyla belirlenmiştir.
Çalışmada Sprague-Dawley cinsi erkek sıçanlar rastgele 2 gruba ayrılmıştır. 1. Grup (n=8) standart diyetle beslenirken 2. Gruba (n=8)   4 hafta süreyle ketojenik diyet ad libitum (kalori kısıtlaması olmaksızın) uygulanmıştır. Sıçanlar haftalık vücut ağırlığı ve spot idrarda keton cisimleri ölçümleri yapılarak 4 hafta boyunca izlenmiştir. 4. haftanın sonunda intrakardiyak kan örnekleri alınarak tam kanda keton cisimleri düzeyi (β-Hidroksi Bütirat, β-HB) belirlenmiştir. Ayrıca, sakrifiye edilen sıçanlardan alınan intrakardiyak kan örneklerinden hazırlanan hemolizatlarda CAT, SOD ve GPx aktiviteleri, MDA düzeyi ve Hb miktarı belirlenmiştir.  Tüm veriler Graphpad Prism 8.3.0 istatistik programı üzerinden Mann Whitney-U Testi, Student t-testi, Pearson ve Spearman korelasyon testleri kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. 	
Ketojenik diyet uygulanan grupta grup içi Spearman Korelasyon Testi'nde MDA ve kan keton cisimleri düzeyleri arasında çok güçlü bir pozitif korelasyon saptanmıştır (r=+0.93, p<0.001). Bu, oksidatif stres belirteci MDA ile kan keton cisimleri düzeyi arasında doğrudan bir ilişki olduğunu göstermektedir. Her ne kadar MDA düzeyleri ketojenik diyet grubunda (1767,03 nmol/gHb) standart diyet grubuna kıyasla  (1551,09 nmol/gHb ) artmış bulunsa da gruplar arası istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamıştır. Ancak, ketojenik diyet grubundaki MDA düzeyi ve β-HB düzeylerinin çok kuvvetli pozitif korelasyonu, kanda keton düzeyleri artışının eritrositlerde oksidan strese yol açtığının bir göstergesidir. Eritrositler mutlak glukoza bağımlı hücreler olduklarından, ketojenik diyet uygulaması sırasında karbonhidrat kısıtlaması nedeniyle oksidatif strese maruz kalmaları olasıdır. Bu nedenle ketojenik diyet klinik uygulamalarında hemolizatta MDA ölçümünün (bir oksidan stres belirteci) noninvaziv bir klinik takip parametresi olarak eklenmesi yararlı olacaktır.
Ketojenik diyetle beslenen grubun vücut ağırlığına oranla içtiği su (0.0624 ±0.0151 mL/gr), idrar çıkışı (0.0189 ± 0.0080 mL/gr) ve vücut su kullanımı (0.0439 ± 0.0105 mL/gr) miktarları, standart diyetle beslenen grubun içtiği su (0.1396 ± 0.0341 mL/gr), idrar çıkışı (0.0574 ± 0.0110 mL/gr) ve vücut su kullanımı (0.0821 ± 0.0320 mL/gr) miktarlarına oranla düşük düzeydedir ve istatistiksel olarak oldukça anlamlıdır (sırasıyla p <0.001; p<0.001; p<0.05). Ketojenik diyet klinik uygulamaları sırasında hastaların yeterli düzeyde su tüketmelerinin sağlanması ve renal fonksiyonlarının izlenmesi gereklidir.  
Bulgular, 4 hafta süreli ketojenik diyet uygulamasının, eritrositlerin antioksidan kapasitesi üzerinde belirgin bir olumsuz etkisi olmadığını ortaya koysa da, özellikle uzun dönem ketojenik diyet uygulaması ve ketojenik diyet içeriğinin belirlenmesi sırasında oksidatif stres artışının belirlenmesi açısından hemolizatta MDA ölçümünün gerekliliği aşikardır.  Bu konuda daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Anahtar Kelimeler; ketojenik diyet; eritrositler; antioksidan enzim aktivitesi; oksidatif stres; MDA; keton cisimcikleri

Abstract:
Since erythrocytes are cells having glucose-dependent energy metabolism, it is necessary to determine whether ketogenic diet application have a negative effect on oxidative stress and antioxidant defense system mechanisms of these cells that affect their life and function. In this study, the effects of ketogenic diet application for 4 weeks was evaluated in vivo using an experimental animal model of rats on ketogenic diet without calorie restriction, determining antioxidant enzyme activities such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and oxidative stress biomarkers such as malondialdehyde (MDA) in erythrocytes and comparing their data with the rats on standard diet.
In the study, male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups. While Group 1 (n=8) was fed with a standard diet, Group 2 (n=8) was fed with the ketogenic diet ad libitum (without calorie restriction) for 4 weeks. Rats were monitored for 4 weeks by measuring weekly body weight and urinary ketone bodies in spot urine. At the end of the 4th week, intracardiac blood samples were taken and the level of ketone bodies (β-Hydroxy Butyrate, β-HB) in the whole blood measured. Additionally, in hemolysates prepared from intracardiac blood samples taken from sacrificed rats, CAT, SOD and GPx activities, MDA levels and Hb amount were determined.  All data were evaluated statistically using the Mann Whitney-U Test, Student t-test, Pearson and Spearman correlation tests through the Graphpad Prism 8.3.0 statistical program.
In the ketogenic diet group, a very strong positive correlation was detected between MDA and blood ketone body levels in the intra-group Spearman Correlation Test (r=+0.93, p<0.001). This shows that there is a direct relationship between the oxidative stress marker MDA and the level of blood ketone bodies. Although MDA levels were found to be increased in the ketogenic diet group (1767.03 nmol/gHb) compared to the standard diet group (1551.09 nmol/gHb), no statistically significant difference was detected between the groups. However, the very strong positive correlation of MDA level and β-HB levels in the ketogenic diet group indicates that increased ketone body levels in the blood cause oxidant stress in erythrocytes. Since erythrocytes are absolute glucose-dependent cells, they are likely to be exposed to oxidative stress due to carbohydrate restriction during ketogenic diet application. Therefore, it would be useful to add MDA measurement (a marker of oxidant stress) in hemolysate as a non-invasive clinical follow-up parameter, in ketogenic diet clinical applications.
The amount of water drink (0.0624 ± 0.0151 mL/gr), urine output (0.0189 ± 0.0080 mL/gr) and body water use (0.0439 ± 0.0105 mL/gr) consumed in proportion to body weight in the ketogenic diet-fed group are statistically significantly lower in comparison to the amount of water drink (0.1396 mL/gr). ± 0.0341 mL/g), urine output (0.0574 ± 0.0110 mL/g) and body water use (0.0821 ± 0.0320 mL/g) of the standard diet-fed group (p <0.001; p<0.001; p<0.05; respectively). It is necessary to ensure that patients consume adequate amounts of water and monitor their renal functions during ketogenic diet clinical applications.  
Although the findings reveal that 4-week ketogenic diet application does not have a significant negative effect on the antioxidant capacity of erythrocytes, it is obvious that MDA measurement in hemolysate is necessary, in terms of determining the increase in oxidative stress, especially during long-term ketogenic diet therapy and determination of ketogenic diet content.  Further comprehensive studies are needed in this regard.
Keywords; ketogenic diet; erythrocytes; antioxidant enzyme activity; oxidative stress; MDA; ketone bodies