Mercimek (Lens culinaris Medik.) bitkisinde nişasta dallandırma enzimlerinin farklı fotoperiyodlardaki ekspresyon analizi
Expression analysis of starch branching enzymes in lentil (Lens culinaris Medik.) under different photoperiods
Yazar: KADİR BOZTAŞ
Danışman: PROF. DR. GÜL CEVAHİR  ÖZ ; DOÇ. DR. İBRAHİM BARIŞ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Botanik = Botany
Dizin: Ekspresyon = Expression ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Lens culinaris = Lens culinaris ; Mercimek = Lentil ; Nişasta = Starch

Özet:
Mercimek, baklagiller (Fabaceae) familyasına ait uzun gün bitkisi olup önemli oranlarda nişasta ve protein ihtiva etmektedir. Bu özelliklerinden dolayı özellikle gelişmekte olan ülkelerde önemli bir besin kaynağıdır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda nişasta enzimlerinin manipülasyonu ile bitkilerdeki verimin arttırılabileceğine dair sonuçlar elde edilmiştir. Bu amaçla nişasta biyosentezinden sorumlu enzimlerin [ADP-glukoz pirofosforilaz (AGPase; EC 2.7.7.23), nişasta dallandırma enzimi (SBE; EC 2.4.1.28) ve çözünür nişasta sentaz (SSS; EC 2.4.1.21)] karakterizasyonu büyük önem taşımaktadır. Grubumuz tarafından mercimek nişasta biyosentezinde görevli ADP-glukoz pirofosforilazın dokuya ve zamana bağlı anlatım profilleri oluşturulmuştur. Ancak nişasta dallandırma enziminin anlatım profili mercimek bitkisinde çalışılmamıştır. Nişasta dallandırma enziminin, amino asit dizileri ve saflaştırılmış proteinlerin in vitro katalitik özelliklerine dayanarak A (SBEII) ve B (SBEI) olmak üzere iki gruba ayrıldığı bilinmektedir. SBEI'i kodlayan genler genel olarak fotosentetik ve vejetatif dokularda, SBEII'yi kodlayan genler ise nişastanın depolandığı bölümlerde ifade edilir.
Bu tez çalışmasında kısa gün (8 saat ışık, 16 saat karanlık) ve uzun gün (16 saat ışık, 8 saat karanlık) fotoperiyotlarında yetiştirilen mercimek bitkisinde SBEI ve SBEII enzimlerini kodlayan genlerin ifade düzeyleri incelenmiştir. Özetle; (1) Her iki fotoperiyottaki büyüme koşullarında SBEI ve SBEII genleri yaprak dokusunda daha fazla ifade edilmektedir. (2) Gen ifadeleri karşılaştırıldığında yaprak ve gövde dokularında SBEII geni  SBEI genine göre daha fazla ifade edilmektedir. (3) Farklı fotoperiyot büyüme koşulları SBEI ve SBEII gen ifadesini etkilemektedir. Total mRNA kopya sayıları karşılaştırıldığında, kısa gün fotoperiyodunda SBEI gen ifadesi gövde dokusunda yaklaşık %30 oranında azalmaktadır. SBEII gen ifadesi ise kısa gün fotoperiyodunda yaprak dokusunda yaklaşık %50 azalmakta, gövde dokusunda ise yaklaşık %50 artmaktadır. (4)  SBEI ve SBEII gen ifade profilleri gün içerisinde her iki dokuda da 4-6 saatlik aralıklarla ritmik dalgalanma göstermektedir. Uzun gün ışık koşullarında görülen 16 saatlik ışık süresince görülen ifade profilleri kısa gün koşulundaki 8 saat ışık süresine adapte olacak şekilde aynen görülmektedir. (5) Grubumuz tarafından SSSI-III (Soluble Starch Synthase) genlerinin ifadelerini inceleyen çalışmanın sonuçları incelendiğinde SBEII ve SSSI genlerinin anlatım profillerinde benzerlik görülmektedir. Benzer gen ifadesi profilinin görülmesi ve SBEII geninin daha fazla ifade edilmesi SBEII ve SSSI enzimlerinin hücre içerisinde trimerik olarak beraber çalıştığını ifade eden çalışmalarla uyumludur.

Yapılan bu analizler sonucunda SBEI ve SBEII genlerinin farklı doku ve foto periyotlardaki gen ifade düzeyleri belirlenmiştir. SBEII gen ifade profilleri ile SSS gen ifadeleri arasında benzerlikler gözlenmiştir. Bu veriler SBE ve SSS enzimlerinin trimerik yapı oluşturarak birlikte çalıştıklarını belirten hipotezi desteklemektedir. Bu çalışma, grubumuz tarafından nişasta biyosentezinde görev alan genlerin karakterizasyon çalışmalarının devamı niteliğindedir. Mevcut çalışma ve önceki araştırmalarla birlikte AGPaseL1-2, AGPaseS1-2, SBEI-II, SSSI-III genlerinin dokuya ve fotoperiyoda bağlı gen ifadeleri tanımlanmıştır. Mevcut bulgular ışığında yapılacak kinetik analizler ile baklagillerin önemli bir üyesi olan Mercimeğin nişasta biyosentez mekanizmasının aydınlatılmasına, doğal olarak baklagillerdeki mekanizmanın anlaşılmasına ve bitki verimini arttırmaya yönelik çalışmalara katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Aralık, 2014, 58.
Anahtar kelimeler: Mercimek, Nişastanın Dallanması, Nişasta Biyosentezi,  Ekspresyon alizi.

Abstract:
Lentil is a long-day plant of Legume (Fabaceae) family and contains a considerable amount of starch and proteins. Due to these characteristics, lentil is an important food source especially in developing countries. Recent studies have shown that plant yields could be improved with the manipulation of starch enzymes. For this purpose, characterisation of the enzymes which are responsible for the starch biosynthesis [ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase; EC 2.7.7.23), starch branching enzyme (SBE; EC 2.4.1.28) and soluble starch synthase (SSS; EC 2.4.1.21)] is very important. The effect of the photoperiyod length on the tissue expression of the genes encoding AGPase subunits and SSSI-III enzymes has been determined previously. However, expression profile of starch branching enzyme has not been studied. It is known that starch branching enzyme is categorized as A (SBEII) and B (SBEI) on the basis of amino acid sequences and in-vitro catalytic characteristics of purified proteins. Genes that are coding SBEI are generally expressed in photosynthetic and vegetative tissues, genes that are coding SBEII are expressed in parts where the starch is stored.

In this thesis, we investigated the transcription profiles of SBEI-II genes in lentil growing under long-day (16-h light/8-h dark) and short-day (8- h light/16-h dark) photoperiod conditions. Briefly, (1) SBEI and SBEII genes show higher expression in leaf tissue. (2) When compared with SBEI, SBEII gene transcripts are more abundant in both tissues. (3) Shortened photoperiod length has effect on the transcription of both genes. Overall transcription of lentil SBEI decreased by approximately 30% in stems under a short-day photoperiyod regime.  Overall transcription of lentil SBEII decreased by approximately 50% in leaves, increased by approximately 50% in stems under a short-day regime. (4) Both SBE genes showed rhytmic fluctuations with gene expression peaks in every 4-6hrs.  SBE gene expression pattern observed in long-day 16 hr light time interval was adapted to short-day 8 hr light time interval. (5) When the expression of SBEII and SSSI (Soluble starch synthase) genes is compared, similar gene expression pattern was observed in both tissues. The findings of similar expression profiles of SBEII and SSSI and abundant expression of SBEII are in consistance with the trimeric structure model of SBEII-SSSI enzymes.  

In the scope of this study, the effect of the photoperiod length on tissue expression profiles of SBEI and SBEII genes has been determined. Similar tissue expression profiles of SBEII and SSSI genes are in consistance with the studies proposing the SBEII and SSSI enzymes trimeric structure in cytosol. This study complements the previous studies carried out by our research group targeting the characterization of genes encoding the enzymes involved in starch biosynthesis. Together with the previous studies, the effect of the photoperiod on tissue expression profiles of AGPaseL1-2, AGPaseS1-2, SBEI-II, SSSI-III genes has been determined. Kinetic analyses of SBEI-II enzymes are needed to complete this study. Expression and kinetic analyses results will help us to undestand the regulation of enzymes involved in starch biosynthesis in Lentile, an important member of Fabaceae family. Understanding the starch biosynhesis mechanism will contribute the studies aiming to increase the plant growth and yield.

December 2014, 58.
Keywords: :  Lentil, Starch branching, Starch Biosynthesis, Expression Analysis.