Siyanobakteriden elde edilen fikosiyaninin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of phycocyanin obtained from cyanobacteria
Yazar: AYLİN AKOĞLU
Danışman: PROF. M. LÜTFÜ ÇAKMAKÇI
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada yüksek fikosiyanin verimine sahip siyanobakteri suşunun seçimi, suşun fikosiyanin veriminin artırılması, ekstrakte edilen fikosiyaninin stabilitesinin belirlenmesi, saflaştırılması ve karakterize edilmesi amaçlanmıştır.Çalışmanın ilk aşamasında çeşitli siyanobakteri suşları fikosiyanin verimleri açısından karşılaştırılmış ve Anabaena affinis suşu 110 mg/g fikosiyanin miktarı ile en verimli suş olarak belirlenmiştir. Bu suşun üretim ve ekstraksiyon koşullarında optimizasyon yapılarak fikosiyanin verimi % 10.9'dan, % 14.1'e yükseltilmiştir.Çalışmanın ikinci aşamasında kısmi olarak saflaştırılan fikosiyaninin gıdalarda kullanım potansiyelini belirlemek amacıyla sıcaklık, pH, ışık gibi faktörlerin fikosiyanin stabilitesi üzerine etkileri araştırılmış ve doğal koruyucular (sakkaroz, sitrik asit, NaCl, CaCl2) ilave edilerek fikosiyanin stabilitesi artırılmaya çalışılmıştır. Aynı amaçla fikosiyaninin Daphnia magna organizması üzerinde toksik etkisi olup olmadığı araştırılmıştır. Buna göre gıdaya uygun saflıkta elde edilen fikosiyaninin 4°C'de ve pH 6'da stabilitesini 1 ay boyunca koruyabildiği, daha yüksek sıcaklıklarda ve asidik pH'larda stabilitesini kaybettiği ayrıca 1 mg/mL düzeyinde fikosiyaninin Daphnia magna organizmasına karşı toksik bir etki göstermediği belirlenmiştir.Çalışmanın üçüncü aşamasında çeşitli saflaştırma teknikleri kullanılarak farklı verimlerde ve saflıklarda fikosiyanin elde edilmiştir. Elde edilen bulgular doğrultusunda amonyum sülfatla çöktürme/diyaliz, ultrafiltrasyon ve iyon değişim kromatografisi basamaklarından oluşan üç aşamalı saflaştırma yönteminin fikosiyanin saflığını 6.93 kat artırdığı ve 4.02 saflık oranı ile analitik saflıkta ürün elde edilebildiği belirlenmiştir.Çalışmanın son aşamasında saf fikosiyaninin; SDS-PAGE ve HPLC jel filtrasyon yöntemleriyle molekül ağırlığı ve yapısı belirlenmiş, MALDI-TOF kütle spektrometrisi ile elde edilen protein bantlarının fikosiyanine ait olduğu doğrulanmış, UV-VIS ve floresan spektrofotometrisi ile en yüksek absorbans ve floresan yayınımını, sırasıyla 620 ve 646 nm'de verdiği tespit edilmiştir. Anabaena affinis suşunundan elde edilen saf fikosiyaninin, sırasıyla 17.1 ve 18.6 kDa'luk ? ve ß alt ünitelerinden oluşan 35.7 kDa büyüklüğünde monomerlerden oluştuğu ve % 21'lik kısmının 198.0 kDa (hegzamer yapı), % 79'luk kısmının ise 156.2 kDa (tetramer veya 2 adet bağlayıcı polipeptid zinciri içeren trimer yapı) moleküler ağırlığına sahip olduğu belirlenmiştir. Ayrıca fikosiyanin antimikrobiyel ve antioksidan aktivite açısından incelenmiş, antimikrobiyel etkisinin olmadığı ancak ?480 µM troloks/mg? düzeyinde oldukça yüksek bir antioksidan aktivite gösterdiği belirlenmiştir.

Abstract:
This study aimed to selection cyanobacteria strain with high phycocyanin yield, enhancing phycocyanin yield of this strain, determination of the stability, purification and characterization of phycocyanin extracted.The first stage of the study, various cyanobacteria strains were compared in terms of phycocyanin yield and Anabaena affinis strain was determined as the most productive strain with amount of 110 mg/g phycocyanin. Production and extraction conditions of this strain were optimized and phycocyanin yield increased from 10.9 % to 14.1 %.In the second stage of the study to determine the potential use of partially purified phycocyanin in food, effects of factors such as temperature, pH, light on stability phycocyanin were investigated and natural preservatives (sucrose, citric acid, NaCl, CaCl2) were added to increase the stability. For the same purpose, effect of phycocyanin on organism Daphnia magna was investigated to find out whether it has toxic effect on this organism or not. Accordingly food grade phycocyanin protecting the stability at 4°C and pH 6 for 1 month loses stability at higher temperatures and acidic pH. Addition of 1 mg/mL phycocyanin was determined that non-toxic effect to organism Daphnia magna.The third stage of the study by using various purification techniques, pure phycocyanin was obtained at different yield and purity. In the line with the findings, three purification including ammonium sulfate precipitation/dialysis, ultrafiltration and ion exchange chromatography resulted in 6.93-fold increase in phycocyanin purity and purity ratio of 4.02 indicates that analytical grade product can be obtained.The final stage of the study, molecular weight and structure of pure phycocyanin were determined by using SDS-PAGE and HPLC gel filtration methods, MALDI-TOF mass spectrometry was used to confirm which protein bands belong to phycocyanin. By using UV-VIS and fluorescence spectrophotometry, the highest absorbance and fluorescence were determined as 620 and 646 nm, respectively. Pure phycocyanin obtained from Anabaena affinis formed 35.7 kDa monomer consisting ? (17.1 kDa) and ß (18.6 kDa) sub-units, 21% of the protein is hexamer having 198.0 kDa, 79 % is tetramer or trimer structure containing two binding polypeptide chain having 156.2 kDa molecular weight. Phycocyanin was also examined in terms of antimicrobial and antioxidant activity and no antimicrobial activity was detected. But quite high antioxidant activity was determined at 480 µM troloks / mg phycocyanin.