Arı (Apis mellifera L.) venomunun T98G insan glioblastoma hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisi
Cytotoxic effect of bee (Apis mellifera L.) venom on the T98G human glioblastoma cell line
Yazar: GAMZE AYAZ
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ ONUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Bal arısı = Honey bee ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Bu çalışma kapsamında, doğal yapıdaki bir bileşik olan bal arısı (Apis mellifera L.) venomunun insan glioblastoma hücreleri (T98G) üzerindeki sitotoksik etkileri incelenmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden getirilen bal arılarından (Apis mellifera L.) venom toplandıktan sonra liyofilize edilerek çalışmanın sonraki aşamalarında kullanılmak üzere saklanmıştır. Venomun biyolojik olarak aktifliği sıçan dermisinde gösterilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında ise arılardan izole edilen venom, uygun hücre kültür ortamında üretilen T98G insan glioblastoma hücreleri üzerinde farklı konsantrasyonlarda konularak, venomun artan konsantrasyonunun hücreler üzerindeki zamana bağlı etkisine, canlı hücre sayım yöntemi olan MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) ile bakılmıştır. Ayrıca arı venomunun etkinliğini karşılaştırmak üzere pozitif kontrol grubu olarak staurosporine (0.2 µg/ml) kullanılmıştır. Arı venomunun hücrelerin ölümüne neden olduğu ve bu etkinin zamana ve konsantrasyona bağlı olduğu görülmüştür. Hücrelerin yaklaşık yarısının ölümüne sebep olan doz 9.3 µg/ml (IC50) olarak belirlenmiştir. Benzer deneysel aşamalar L929 hücreleri üzerinde de uygulanarak, kanser hücresi dışındaki bir hücre hattı üzerinde sitotoksik etkisi incelenmiştir. Venomun etkisinin hücre tipine bağlı olmadığı görülmüştür.Bu noktada çekirdekte görülen fragmentasyonlar 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve acridine orange/propidium iodide ikili boyaları ile boyanarak, hücrelerde görülen ölüm şeklinin apoptozis olabileceği düşünülmüştür. 10 µg/ml venom konsantrasyonu hücrelere uygulandıktan 2 saat sonra, hücre çekirdeğinde yoğunlaşmaya ve parçalanmaya sebep olduğu görülmüştür. Elde edilen morfolojik görüntüler, staurosporine uygulanan grup ile benzer çıkmıştır. 24 saat süresince hücrelere uygulanan venomun etkisi, ortama taze besiyeri konulması ile azalmıştır. Taze besiyerine alınan hücrelerin hücre sayıları artmaya başlamış, venomun sitotoksik etkisi ortadan kalkmıştır. 48 saatten daha uzun süre hücrelere uygulanan venomun etkinliği, 72 saatin sonunda azalmaya başlamış ve hücre sayısında artma görülmüştür. Bu durum venomun yarılanma ömrü ile ilişkili olabilir.Tüm bu sonuçlar değerlendirildiğinde, arı venomunun, glioblastoma hücreleri üzerinde sitotoksik etkisi olduğu ve bu etkininin programlı hücre ölüm mekanizması ile gerçekleşebileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Within the scope of this study, the cytotoxic effect of honeybee (Apis mellifera L.) venom which is a natural compound has been investigated on the human glioblastoma cell line (T98G). At the first step venom were extracted from honey bees (Apis mellifera L.) which were collected from the different parts of Turkey, lyophilized and kept in order to using all experiments. In order to determine whether the venom was biologically active, it was injected intradermally to a rat?s back and observed the changes. In the second step, venom which was isolated from the bees were used in different concentrations on the T98G human glioblastoma cell line that have generated in the cell culture. To evaluate the time dependent effect of increasing concentrations of the venom, MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) assay was used. Besides, staurosporine (0.2 µg/ml) was used as a positive control group in order to compare the activity of the bee venom. The half maximal inhibitory concentration (IC50) was decided as a concentration of 9.3 µg/ml. Similar experimental steps were applied to the L929 cells which are not a cancer cell line. Same results were observed. Therefore, it was concluled that the cytotoxic activity of bee venom was not dependent to the cell type. In order to determine whether bee venom induces nucleus fragmentation 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and acridine orange/propidium iodide double staining were performed in this step. It was demonstrated that glioblastoma cells treated with 10 µg/ml for 2 hours exhibited nucleus condensation and DNA fragmentation. Morphologic results were compared with the staurosporine group which was shown similar results. At the end of 24 hours, effects of bee venom on glioblastoma cells were decreased after removing of the venom from medium. The viability of cells have increased and cytotoxic effects of venom have been disappeared. Although viability of cells treated bee venom have decreased until 48 hours, but these effects ended thereafter which may probably have been related with half life of bee venom.Considering all of these results, bee venom has cytotoxic effects on glioblastoma cells and these effects may occured by programmed cell death mechanisms.