Ağız mikrobiyotasında bulunan canlı fakat kültür edilmeyen bakterilerin üretilmesinde quorum sensing inhibitörlerinin kullanılması
Cultivation of viable but non-culturable bacteria present in the oral microbiota using quorum sensing inhibitors
Yazar: ENİS FUAT TÜFEKCİ
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN KILIÇ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Ağız florası = Mouth flora ; Bakteri kültürü = Bacteria culture ; Bakteriler = Bacteria ; Mikrobiyota = Microbiota ; Quorum sensing = Quorum sensing ; RNA = RNA ; Ribozomlar = Ribosomes

Özet:
Quorum sensing (QS), bakterilerin çeşitli sinyal moleküllerini kullanarak hem kendi türleri arasında hem de farklı türler arasında iletişim kurması olayıdır. İnsanların ağız boşluğunda bulunan 700'e yakın bakteri türünün yaklaşık 220 tanesi moleküler teknikler ile gösterilmesine rağmen henüz kültür edilememiştir. Bunların kültür edilememesinde bakterilerin doğal ortamlarında QS mekanizması ile popülasyon yoğunluklarını kontrol altında tutmaları ve laboratuvar koşullarında da bu kontrolü devam ettiriyor olmaları neden olarak düşünülmektedir. Bu çalışmada ağız mikrobiyotasında bulunan canlı fakat kültür edilmeyen bakterilerin QS sinyal moleküllerini QS inhibitörü olduğu bilinen maddeler ile keserek popülasyon yoğunluklarını kontrol etme yeteneklerinin ortadan kaldırılması ve kültür edilmeleri amaçlandı. Çalışmaya dahil edilen QS inhibitörlerinin kombinasyonu ile beş ana grup oluşturuldu. Grupların QS inhibitör etkileri biyoindikatör suşlara karşı test edildi. Sağlıklı altı bireyden alınan ağız boşluğu örneklerinden QS inhibitörlü ve inhibitörsüz (kontrol) agar besiyerlerine ekimler yapıldı. Kültürler 35 gün inkübe edildi ve periyodik olarak incelendi. Sadece QS inhibitörlü besiyerlerinde üreyen suşlar potansiyel ilk defa kültürü gerçekleşmiş suşlar olarak değerlendirildi. Sadece inhibitörlü besiyerlerinde izole olan 121 suş inhibitörlü ve kontrol besiyerlerinde subkültür edildi. İçlerinden seçilen 28 suşun tanımlanmak üzere 16S rRNA dizilemesi yapıldı. 16S rRNA dizi analizlerine göre bu suşların Actinobacteria, Firmicutes ve Proteobacteria şubelerine ait taksonlar ile homoloji gösterdikleri tespit edildi. Üç suşun kültür edilmiş fakat adlandırılmamış Streptococcus türleri ile homoloji gösterdikleri, bunlardan birisinin de kültür statüsünün gen bankasında kayıp olarak geçtiği görüldü. Diğer 25 suşun resmi olarak adlandırıldığı ve daha önce kültür edilmiş oldukları tespit edildi. Ancak sonuçlar, QS inhibitörlerinin ağız mikrobiyotasının popülasyon yoğunluğunu değiştirdiğini gösterdi. QS inhibitörlü ve kontrol besiyerlerinin birlikte kullanıldığında tek başına kontrol besiyerine göre izole olan bakteri çeşitliliğinde artışa olanak sağladığını gösterdi. Sonuçlar, bu yöntemin herhangi bir ekosistemden ve farklı vücut bölgelerinden yapılacak bakteri izolasyonu çalışmalarında bakteri tür çeşitliliğini  artırmak adına uygulanabilir olduğunu ortaya koymuştur.

Abstract:
Quorum sensing (QS) is a phenomenon by which bacteria communicate between intra- and interspecies. In the human oral cavity, nearly 700 species are found. Although approximately 220 species were identified using molecular techniques, they have not yet been cultured. This is thought to be caused by the fact that they cannot be cultured because of bacterial QS mechanism which controls their population density in their natural environment, and they also continue this process under laboratory conditions. In this study, it was aimed to cultivate viable but non-culturable bacteria in oral microbiota by interrupting their QS signal molecules, which are capable of controlling their population densities, with known QS inhibitor substances. Five groups of QS inhibitors were formed and tested on the bioindicator strains. Oral cavity samples from six healthy individuals were seeded on agar media with and without QS inhibitors. The cultures were incubated up to 35 days and examined periodically for growth. The strains grown only in media containing QS inhibitors were evaluated as potential cultivated strains for the first time. Among the strains which appeared only on the QS inhibitors containing medium, 121 strains were picked and subcultured on media without inhibitors.These strains were then grouped by standard bacteriological methods, 28 representative strains were further identified by 16S rRNA sequence analysis. According to the 16S rRNA sequence analysis, 28 strains were found to be homologous with taxa belonging to phyla of Actinobacteria, Firmicutes and Proteobacteria. Three strains showed homology with unnamed and cultured Streptococcus species. One of these was found to show high homology with Streptococcus species with a culture lost status according to the gene bank. The other 25 strains were found to be officially named and have been cultured before. However, the results showed that QS inhibitors used in this study altered the population density of oral microbiota. The co-cultures with QS inhibitors allow to isolate more variety of bacteria compared to cultures on control media. The results show that this method is applicable to increase diverse species of bacteria from any ecosystems, and from different regions of human body.