Miyeloproliferatif neoplazilerde trombotik yolağın araştırılması
Miyeloproliferatif neoplazilerde trombotik yolağin araştirilmasi
Yazar: İLDENİZ USLU BIÇAK
Danışman: DOÇ. DR. SELÇUK SÖZER TOKDEMİR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Amaç: BCR-ABL negatif Miyeloproliferatif neoplaziler (MPN) hematopoietik kök hücreden kaynaklanan, miyeloid hücre hatlarının kontrolsüz çoğalması sonucu oluşan, yüksek tromboz riski içeren, mortalitesi ve morbiditesi yüksek bir grup hastalıktır. MPN' de sıklıkla görülen JAK2V617F mutasyonu ile trombin reseptörü PAR1 (proteaz- aktive reseptör 1) arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak amaçtır. Bu doğrultuda; hasta hematopoietik kök hücreleri ve mononükleer hücrelerinde, PAR1 inhibitörü ve aktivatörü, JAK2 inhibitörüyle beraber analiz edilip, fonksiyonel etkileri araştırılmıştır. 
Yöntem; JAK2V617F homozigot HEL hücre hattında, PAR inhibitörü-aktivatörü ve JAK inhibitörü etkisi analiz edilip çalışmalarda kullanılacak konsantrasyon ve süreler optimize edilmiştir. MPN hastaları ve sağlıklı gönüllü kontrollerde bu moleküllerin etkileri, PAR1 gen anlatımı ile PAR1 ve p-STAT5 protein anlatımı bakımından analiz edilmiştir. PAR1 etkisi hematopoietik kök hücre düzeyinde de araştırılmıştır ve kök hücrelerde PAR aktivatörü ve PAR inhibitörünün etkileri değerlendirilmiştir. Son olarak JAK2V617F mutasyonuna bağlı veya PAR inhibitör varlığında, PAR yolağında etkilenen gen anlatımları ve sinyal yolakları HEL- K562 hücre hatları ile MPN hastalarında analiz edilmiştir. 
Bulgular: HEL hücre hattında PAR1 inhibisyonu, aktivasyonu ve JAK2 inhibisyonu için gereken ajanların konsantrasyonu belirlenmiştir. Bu ajanlar ile kombine kültürü sonucunda aktivatör varlığında aktive olan PAR1, PAR inhibitörü vorapaksar varlığında inhibe olduğu, ancak ruksolitinibin PAR1 üzerinde bir etkisinin olmadığı benzer şekilde PAR inhibitörünün de JAK/STAT yolağı üzerinde etkisinin olmadığı, ve p-STAT5 analizi ile saptanmıştır. Bu sonuç hasta hücrelerinde yapılan çalışmada da benzer şekildedir. 11 MPN hasta mononükleer hücrelerinden izole edilen kök hücre kompartmanında PAR1 gen anlatım analizinde CD34+ ve CD133+CD34- primitif hücre grubunda kordon kanına kıyasla arttığı tespit edilmiştir. CD34+ ve CD34- kök hücrelere PAR inhibitörü (vorapaksarSCH79797) uygulandığında mononükleer hücrelere benzer şekilde sonuçlanmıştır. JAK2V617F mutasyonunu homozigot olarak taşıyan HEL hücre hattı ile MPN hastalarında, PAR yolağının trombin/PAR1 sinyal yolağının aktive olduğu, PAR inhibitörü varlığında ise bu yolağın ve ilgili sitokin, adhezyon moleküllerinin inhibe olduğu görülmüştür. 
Sonuç: MPN' de özellikle hematopoietik kök hücre grubunda aktive olduğu tespit edilen PAR1, inhibitör varlığında inhibe edilebilmiştir. JAK2V617F ile PAR1 arasında bir ilişki mevcuttur, ancak ve bu ilişkinin direkt olarak JAK-STAT yolağı üzerinden olmadığı görülmüştür. MPN' lerde sıklıkla görülen enflamatuar olaylar ile trombotik komplikasyonlar arasında bağlantı olduğu ve bunun JAK2 ve PAR1 üzerinden olabileceği çalışmanın sonuçlarından biridir. Ayrıca inhibitör varlığında özellikle primitif hücre grubundaki PAR1 etkisi de düşünüldüğünde MPN' ler için son derece umut vaadedici olabilir. Çalışma sonuçları, halihazırda FDA( Food and Drug Administration) onayı olan Vorapaksar' ın da tedavi sürecine dahil edilmesinin hastalık prognozunda etkili olabileceğini düşündürmektedir.
Anahtar Kelimeler: Miyeloproliferatif Neoplazi(MPN), JAK2, PAR1, Tromboz             
Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 38358

Abstract:
Objective; BCR-ABL negative Myeloproliferative neoplasia (MPN) is a group of diseases with high risk of thrombosis, high mortality and morbidity, originating from hematopoietic stem cells, resulting from proliferation of myeloid cell lines. The aim of this study to reveal the relationship between the JAK2V617F mutation, which is frequently seen in MPN, and the thrombin receptor PAR1 (protease-activated receptor 1). In accordance with this purpose; PAR1 inhibitor and activator were analyzed together with JAK2 inhibitor and their functional effects were investigated in patient hematopoietic stem cells and mononuclear cells.
Method; The effect of PAR inhibitor-activator-JAK inhibitor on the JAK2V617F homozygous HEL cell line was analyzed and the concentration to be used and the application times were optimized. The effects of these molecules were analyzed for PAR1 gene expression and protein expression in 11 MPN patients and 11 healthy volunteer controls. In addition, the effect of PAR1 was investigated at the level of hematopoietic stem cells, and the effects of PAR activator and PAR inhibitor in hematopoietic stem cells were evaluated. Finally, gene expressions and signaling pathways affected in the PAR pathway due to JAK2V617F mutation or in the presence of PAR inhibitor were analyzed in HEL-K562 cell lines and MPN patients.
Findings; The concentration of agents required for PAR1 inhibition, activation and JAK2 inhibition in the HEL cell line was determined. As a result of the combined culture of these agents, PAR1, which was activated in the presence of activator, was inhibited in the presence of the PAR inhibitor vorapaxar. It was determined by p-STAT5 analysis that ruxolitinib had no effect on PAR1, and similarly, the PAR inhibitor had no effect on the JAK/STAT pathway. This result is similar to the study conducted in patient cells. In the hematopoietic stem cell compartment isolated from 11 MPN patient mononuclear cells, PAR1 gene expression analysis was found to be increased in CD34+ and CD133+CD34- primitive cell groups compared to cord blood. When a PAR inhibitor (vorapaksar,SCH79797) was administered to CD34+ and CD34- stem cells, results were similar to mononuclear cells. It was observed that the thrombin/PAR1 signaling pathway of the PAR pathway was activated in HEL cell line and MPN patients homozygous for the JAK2V617F mutation, and this pathway and related cytokine and adhesion molecules were inhibited in the presence of PAR inhibitor.
Results; PAR1, which was found to be activated in MPN, especially in the hematopoietic stem cell group, could be inhibited in the presence of inhibitor. There is a relationship between JAK2V617F and PAR1 and it was seen that this relationship is not directly through the JAK-STAT pathway. It is one of the results of the study that there is a connection between inflammatory events and thrombotic complications, which are frequently seen in MPNs, and that this may be via JAK2 and PAR1. In addition, considering its effect in the presence of inhibitor, especially in the primitive cell group, it can be extremely promising for MPNs. Vorapaksar, which is currently approved by the FDA (Food and Drug Administration), suggests that including it in the treatment process may be effective in the prognosis of the disease.
Key Words: Myeloproliferative Neoplasia(MPN), JAK2, PAR1, Thrombosis
The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project No. 38358