Farklı Aspergillus türü funguslarda selüloz ve hemiselüloz parçalayıcı enzim aktivitelerinin incelenmesi
Screening of cellulose and hemicellulose enzyme activities in different A456160spergillus species
Yazar: ASLI TANGÜNÜ
Danışman: PROF. DR. AYŞE DİLEK AZAZ
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada, Katı Substrat Fermentasyon (KSF) yöntemiyle yetiştirilmiş, Aspergillus caelatus NRRL 26107 ve Aspergillus oryzae NRRL 5590' dan β-glukosidaz enzimi saflaştırılmış ve biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. 
Birçok biyoteknolojik uygulamalarda ticari öneme sahip, β-glukosidaz enzimi, öncelikli olarak buğday samanının KSF ortamında kullanılmasıyla yetiştirilen A.caelatus (KSF ortamının nemlendirme sıvısı pH 7,0 NaH2PO4, optimum sıcaklık 30oC ve inkübasyon süresi 7 gün) ve A.oryzae (KSF ortamının nemlendirme sıvısı pH 6,5 NaH2PO4 tamponu ile nemlendirilerek, optimum sıcaklık 25oC ve inkübasyon süresi 7 gün) suşlarından elde edilmiştir. β-glukosidaz enzimi, amonuyum sülfat çöktürmesi ve Sepharose-4B-L-Tyrosine-1-Napthylamine kullanılarak Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi ile iki basamakta saflaştırılmıştır. 
Çalışmamızda, β-glukosidaz enzim aktivitesi, p-nitrofenil-β-D-glukopiranosit (pNPG) substratı kullanılarak belirlenmiştir. A.caelatus β-glukosidaz (Acβ) enzimi %6,330 verimle 31,196 kat; A.oryzae β-glukosidaz enzimi (Aoβ) ise %4,350 verimle 5,855 kat saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ve Native-PAGE ile Acβ ve Aoβ enzimlerinin molekül ağırlıkları sırasıyla 30 kDa ve 31 kDa olarak belirlenmiş olup monomerik yapıda oldukları tespit edilmiştir. Acβ ve Aoβ enzimlerin optimum pH değerleri sırasıyla 6,00 ve 5,25; optimum sıcaklık değerleri ise 65°C olarak saptanmıştır. 
Acβ enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,19 mM ve 322,58 EU; Aoβ enziminin ise 0,363 mM ve 454,54 EU olarak belirlenmiştir. Ayrıca β-glukosidaz inhibitörlerinden olan D(+)glukoz ve δ-glukonolaktonun enzimler üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Acβ enzimi D(+)glukoz ve δ-glukonolakton inhibitörü sırasıyla yarışmasız ve yarışmalı olarak,  Aoβ enzimini ise yarışmalı olarak inhibe ettikleri belirlenmiştir.  Acβ enzimin D(+)glukoz inhibitörü ile IC50 ve  Ki değerleri 7,65x10-2mM ve 1,42x10-1±7,31x10-2;δ-glukonolakton inhibitörü ile 7,31x10-4 mM ve 2,98x10-5±1,35x10-5 olarak; Aoβ enziminin IC50 ve Ki değerleri ise D(+)glukoz inhibitörü ile 8,80x10-2mM ve 9,58x10-4±8,02x10-5; δ-glukonolakton inhibitörü ile 4,00x10-4 mM ve 2,99x10-5±9,00x10-8, olarak hesaplanmıştır.

Abstract:
In this study, purification and biochemical characterization of β-glucosidase enzyme purified from Aspergillus caelatus NRRL26107 and Aspergillus oryzae NRRL5590 growth in solid state fermentation (SSF) was performed. 
β-glucosidase enzyme that has many biotechnological applications, was primarily obtained from A.caelatus (SSF conditions moistening NaH2PO4 pH 7.0, temperature 30°C and incubated 7 days) and  A.oryzae (SSF conditions moistening NaH2PO4 pH 6.5, temperature 25°C and 7 days) grown in SSF using wheat straw. β-glucosidase enzyme was purified using two-step procedures, namely ammonium sulfate precipitation and Sepharose-4B-L-Tyrosine-1-Napthylamine Hydrophobic Interaction Chromatography.
In our study, activity of β-glucosidase enzyme was determined by using para-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside (pNPG) substrate. The purification rate was found 31.196 fold with yield of 6.330% for the obtained β-glucosidase from A.caelatus (Acβ) and 5.5855, 4.350% yield for the obtained β-glucosidase from A.oryzae (Aoβ). Molecular weights of Acβ and Aoβ enzymes were determined 30kDa and 31kDa, respectively, using SDS and Native PAGE analysis, and found to be in monomeric structure. Optimum pH values of Acβ and Aoβ enzymes were 6.00 and 5.25, respectively, optimum temprature values were determined as 65°C. 
The Km and Vmax values of Acβ enzyme were determined as 0.19mM and 322.58EU, respectively; while for the Aoβ enzyme 0.363mM and 454.545EU. The effect of the D(+)glucose and δ-glukonolactone which is a  β-glukosidaz inhibitors on enzymes were  also investigated by using  pNPG. While D(+)glucose and δ-gluconalactone inhibitors were inhibited Acβ enzyme noncompetitively and competatitively,  inhibited Aoβ enzyme competitively. The IC50 and Ki values of Acβ enzyme for D(+)glucose inhibitor were determined 7.65x10-2mM and 1.42x10-1±7.31x10-2, for the δ-gluconalactone 7.31x10-4mM and 2.98x10-5±1.35x10-5 respectively. The IC50 and Ki values of Aoβ enzyme for D(+)glucose were determined as 8,80.10-2mM and 9.58x10-4±8.02x10-5, whereas for the δ-gluconalactone 4.00x10-4mM and 2.99x10-5±9.00x10-8, respectively.