Lokal Streptomyces türlerinin sekonder metabolitlerinin izolasyonu, yapılarının aydınlatılması ve biyolojik aktivitelerinin araştırılması
The isolation and structure elucidation of secondary metabolites from local Streptomyces species and investigation on their biological activities
Yazar: MURAT YAVUZ
Danışman: DOÇ. DR. EBRU İNCE YILMAZ ; DOÇ. DR. MURAT KIZIL
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Antimikrobiyal aktivite = Antimicrobial activity ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Streptomyces = Streptomyces

Özet:
Son yıllarda yeni hastalıkların gelişmesi ve mevcut antibiyotiklere karşı dirençli mikroorganizma türlerinin ortaya çıkması nedeniyle, bakteriyel ve fungal enfeksiyonlar insan sağlığını küresel ölçekte tehdit etmektedir. Bu durum yeni biyolojik aktif metabolitlerin keşfini zorunlu kılmaktadır. Mikrobiyal sekonder metabolitler, potansiyel olarak sahip oldukları özel yapıları ve biyolojik aktiviteleri ile doğal bileşiklerin zengin kaynaklarından birini teşkil ederler. Actinomycetales ordusuna dahil olan Streptomyces türleri, çoğu biyolojik olarak aktif olan sekonder metabolitleri üretebilme özelliğine sahip yetenekli mikroorganizmalardır. Bu mikroorganizmalardan izole edilen ve ticari öneme sahip sekonder metabolitlerden başlıcaları antibakteriyel, antifungal ve antitümör ajanlardır. Yeni biyoaktif metabolitlerin keşfi için Streptomyces gibi iyi bilinen ve yetenekli mikroorganizmalarda yeni bileşiklerin taranması temel stratejilerden biridir.Bu amaçlar doğrultusunda, endemik bitkilerin kök çevresi topraklarından izole edilip 16S rRNA genleri kullanılarak teşhisleri yapılmış olan 67 Streptomyces ve 1 Nocardiopsis türünün ham ve farklı organik çözücülerdeki ekstraktlarının Gram-pozitif, Gram-negatif bakterilerin ve Candida albicans mayasının üremesi üzerine etkisi in vitro olarak test edildi. Biyolojik aktivite temelli ön-tarama işlemleri sırasında denenen bu 68 türden 25 kadarının test mikroorganizmalarının üremeleri üzerinde engelleyici etkiye sahip olduğu belirlendi. Biyolojik olarak aktif olan bu türlerin ham ekstraktlarının, İTK kromatogramlarının çeşitli renklendirici reaktiflerden yararlanılarak belirlendiği kimyasal taramalar sonucunda ilgi çekici türler belirlendi. Optimum üretim koşullarında yeteri miktarda sekonder metabolit elde etmek için biyolojik ve kimyasal taramalar sonucu tespit edilen Streptomyces sp. BA2, Streptomyces sp. AA50, Streptomyces sp. BS40 ve Streptomyces sp. AS42 kodlu ilgi çekici türlerden büyük ölçekte üretildi. Elde edilen metabolit ekstraktlara, kolon kromatografisi, İTK, PİTK, moleküler elek kromatografisi ve HPLC gibi çeşitli kromatografik teknikler uygulanarak saf bileşikler izole edildi. 1H NMR ve 13C NMR teknikleri başta olmak üzere 2D NMR (COSY, HSQC, HMBC gibi) ile UV, IR ve MS gibi spektroskopik tekniklerin yanında AntiBase, Doğal Ürünler Sözlüğü ve Chemical Abstract gibi veri bankaları kullanılarak saflaştırılan sekonder metabolitlerin yapıları aydınlatıldı.Streptomyces sp. BA2'den bilinen bileşikler olan, aktinomisin D (170), monensin B (171) ve monensin A (172) karışımı ile bis(2-etilhegzil)ftalat (173) saflaştırılıp yapıları aydınlatıldı. Klinik olarak bazı kanser türlerinin tedavisinde kullanılan aktinomisin D (170) ile doğal polieter iyonofor antibiyotikler olduğu bilinen monensin B (171) ve A (172) karışımının test mikroorganizmalarının üremesi üzerine antimikrobiyal aktivitesi test edildi. Aktinomisin D (170) ve monensin B (171) ve A (172) karışımının yüksek antimikrobiyal aktivite sergilediği belirlendi.Streptomyces sp. AA50'den, daha önce bazı Streptomyces türlerinden izole edildiği rapor edilmiş olan chrysophanol (175) ile 2-acetylchrysophanol (178) ve daha önce çeşitli bitkilerden izole edilmiş olan fakat ilk kez bu çalışmada bir mikrorganizmadan izole edilen chrysophanol-10,10'-bianthron (174) bileşikleri saflaştırıldı. Ayrıca endotelin reseptör antagonisti oldukları bilinen siklik pentapeptit A (179) ve siklik pentapeptit B (180) bileşikleri karışım halinde izole edildi. İzole edilen bu bileşiklerden chrysophanol-10,10'-bianthron (174) ve chrysophanol (175)'un DPPH radikal söndürme aktivitesi, indirgeme gücü gibi antioksidan özelliklerinin yanında ayrıca agaroz jel elektroforezi kullanılarak bu bileşiklerin DNA'yı OH radikaline karşı koruma aktivitesi ile DNA'yı prooksidan olarak kesim aktivitesi araştırıldı.Streptomyces sp. BS40'tan ise carbazomycin G (182) ile bilinen bileşik olan teleocidin B2 (183) ve izomer (184) karışımı ile iki yeni teleocidin türevi olan 14-O-acetylteleocidin B2 (195) ve 14-O-acetylteleocidin B2 izomer (196) karışımı izole edildi. Çalışmalar esnasında, ciltte güçlü iritasyona ve vezikül oluşumuna neden olduğu görülen 14-O-acetylteleocidin B2 (195) ve izomer (196) karışımının Artemia salina L. larvaları üzerine 0,1-10 µg/mL konsantarasyon aralığında % 100 sitotoksik aktivite sergilediği tespit edildi.Streptomyces sp. AS42'den ise, endotelin reseptör antagonisti oldukları bilinen ve bu çalışmada ayrıca AA50 suşundan da izole edilmiş olan siklik pentapeptit A (179) (siklo(-D-Glu-L-Ala-D-Val-L-Leu-D-Trp-) ve siklik pentapeptit B (180) (siklo(-D-Glu-L-Ala-allo-D-Ile-L-Leu-D-Trp-) bileşikleri izole edilerek yapıları 1D ve 2D NMR tekniklerinin yanında HPLC-ESI-MS2/MS3 tekniği kullanılarak aydınlatıldı.

Abstract:
In recent years, bacterial and fungal infections threat human health worldwide, due to the development of new diseases and evidence of microorganisms resistant against to the presently used antibiotics. This situation requires discovery of new biologically active metabolites. Microbial secondary metabolites, having special structures and biological activities represent one of the productive sources of natural compounds. Streptomyces species, which is included in Actinomycetales order, are talented microorganisms having property of producing secondary metabolites most of which are biologically active. The main secondary metabolites isolated from these microorganisms which have commercial value are antibacterial, antifungal and antitumor agents. Screening of new compounds from well known and talented microorganisms such as Streptomyces, is one of the basic strategies for discovery of novel biologically active metabolites.For this purpose, effects of crude and different organic extracts which were obtained previously from 67 Streptomyces and one Nocardiopsis species that isolated from soil around root of endemic plants and identified by using 16S rRNA genes were tested in vitro on growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria and that of Candida albicans yeast. It was determined that 25 of the 68 species tested during pre-screening processes based on biological activity have a preventive effect on the growth of test microorganisms. The interesting species were selected from these biologically active species according to the results obtained from chemical screening in which crude extracts of species were estimated by using TLC stained with different staining reagents. In order to obtain sufficient amount of pure secondary metabolites under optimum culture conditions, the interesting species encoded Streptomyces sp. BA2, Streptomyces sp. AA50, Streptomyces sp. BS40 and Streptomyces sp. AS42 that determined by biological and chemical screening, were cultured on a large-scale. Different chromatographic methods such as column chromatography, TLC, PTLC, molecular exclusion chromatography and HPLC were applied to purify these extracts. The structures of pure secondary metabolites were elucidated by 1H NMR and 13C NMR spectroscopic method and 2D NMR (COSY, HSQC, HMBC) and UV, IR and MS as well as several database such as AntiBase, Dictionary of Natural Products and Chemical Abstract.From the terrestrial Streptomyces sp. BA2, mixture of known compounds monensin B (171) and monensin A (172) and actinomycin D (170) and bis(2-ethylhexyl)phthalate (173) were isolated and their structure were elucidated. Antimicrobial activity of actinomycin D (170), which is used clinically for the treatment of some cancer types, and monensin B (171) and monensin A (172) mixture, which is a well-known representative of naturally polyether ionophore antibiotics, were investigated for their antimicrobial activity on proliferation of test microorganisms. It was shown that actinomycin D (170) and the mixture of monensin B (171) and monensin A (172) exhibited high antimicrobial activity.Chrysophanol (175) and 2-acetylchrysophanol (178) which were previously isolated from some Streptomyces species, and chrysophanol-10,10'-bianthron (174) which was formerly isolated from several plants but firstly isolated from microorganisms in this study are purified. Moreover, cyclic pentapeptide A (179) and cyclic pentapeptide B (180), which are known as endothelin-binding inhibitors, were isolated as a mixture. DNA cleavage protection activity of the chrysophanol-10,10'-bianthron (174) and chrysophanol (175) and DNA cleavage activity against OH radicals were studied by using Agarose Gel Electrophoresis. The antioxidant properties such as DPPH radical scavenging activity and reducing power of these compounds were also studied.Carbazomycin G (182) and mixture of teleocidin B2 (183) and isomer of teleocidin B2 (184) and mixture of novel teleocidin derivatives 14-O-acetylteleocidin B2 (195) and 14-O-acetylteleocidin B2 isomer (196) were also isolated from Streptomyces sp. BS40. Mixture of 14-O-acetylteleocidin B2 (195) and 14-O-acetylteleocidin B2 isomer (196) showed 100 % cytotoxic activity in the concentration range of 0.1 to 10 µg/mL on brine shrimp (Artemia salina L.). It was observed that this mixture cause strong skin irritation and vesication.Cyclic pentapeptide A (siklo(-D-Glu-L-Ala-D-Val-L-Leu-D-Trp-) (179) and cyclic pentapeptide B (siklo(-D-Glu-L-Ala-allo-D-Ile-L-Leu-D-Trp-) (180), which are endothelin receptor antagonists, were isolated as a mixture from the terrestrial Streptomyces sp. AS42 and characterized by 1D NMR and 2D NMR and HPLC-ESI-MS2/MS3 techniques. This mixture of cyclic pentapeptide A and B were also isolated from Streptomyces sp. AA50 in the beginning.