Akut lenfoblastik lösemi tedavisinde kullanılan L-Asparjinaz'ın kromatografik yöntemlerle analizi
Analysis of L-Asparaginase which is used in the treatment of acute lemfoblastic leukemia with chromatographic methods
Yazar: CEM KAPLAN
Danışman: PROF. DR. DURİ ŞEHVAR ÜNAL
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Amino asitler = Amino acids ; Kromatografi = Chromatography ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; L-Asparjinaz = L-Asparaginase ; Prekürsör hücreli lenfoblastik lösemi-lenfoma = Precursor cell lymphoblastic leukemia-lymphoma ; Terapötik yöntemler = Therapeutics

Özet:
L-asparjinaz (L-ASPZ) akut lenfoblastik lösemi (ALL) tedavisinde 1961 yılından itibaren kullanılan kemoterapötiktir. ALL tedavisinde ilaç olarak kullanılan bir enzimdir. ALL'deki etkisini L-Asparajinin (L-Asn) plazmada düzeyini düşürerek gerçekleştirir. Bu tez çalışmasında kromatografik yöntemlerle asparajin (Asn), glutamin (Gln), aspartik asit (Asp) ve glutamik asit (Glu) düzeylerinin yanı sıra, tedavide L- asparajinazın aktivitesi üzerine çalışılmıştır.
Asparjinaz, asparajini, aspartik asit ve amonyağı indirgeyerek tümör hücrelerini asparajinden yoksun bırakır. L-Asparjinazla yüklenen tümör hücresi besinsiz kalır ve çoğalamaz. L-asparjinazın hangi dozda, hangi türünün, kime faydalı veya zararlı olduğunu anlamamız için terapötik ilaç izlenimi önem kazanmaktadır. Böylece hem etkili doz bulunacak hem de tedavi süresinin kısaltılması katkı sağlayacaktır. İmmunoassay yöntemlerindeki çapraz reaksiyonlar ve spektrofotometrik yöntemlerdeki girişimler nedeniyle güvenilirlik ve hassasiyet sorunları ile karşılaşılmaktadır.
Bu tez çalışmasında, L-ASPZ'ın aktivitesi için plazmada dört farklı amino asit tayini, yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrofotometrisi (HPLC-MS/MS) yöntemi ile geliştirilmiştir. Yöntem HILIC kolonda; asetonitril ve amonyum asetat çözeltisi hareketli fazı ile gradient olarak 0.4 mL/dk akış hızında geliştirilmiştir. Amino asitlerin doğrusal aralığı Asn, Asp ve Glu için sırasıyla 500-5000 ng/mL, Gln için 5-50 μg/mL olarak bulunmuştur. Gözlenebilme (LOD) ve tayin sınırları (LOQ) ise Asn, Asp ve Glu için sırasıyla 100-500 ng/mL, Gln için 1-5 μg/mL olarak bulunmuştur. Yöntem valide edilerek plazmada analizlere başarıyla uygulanmıştır. Bu yöntem seçici ve tekrarlanabilir, plazma analizlerinde güvenle kullanılabilir niteliktedir.

Abstract:
L-asparaginase (L-ASPZ) is chemotherapeutic used since 1961 in treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). It is an enzyme used as medicine in treatment of ALL. It performs its effect in ALL by reducing level of L-Asparagine (L-Asn) in plasma. In thesis, aspargine(Asn), glutamine (Gln), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu) levels as well as the activity of L-asparaginase in treatment were studied by chromatographic methods.
Asparaginase degrades asparagine to aspartic acid and ammonia, depriving tumor cells of asparagine. Tumor cell loaded with L-Asparaginase lacks nutrients and can't proliferate. TDM becomes important for us to understand at what dose, type, and who is beneficial or harmful to L-asparaginase. Thus, both effective dose will be found and the shortening of treatment period will contribute. Reliability and sensitivity problems are encountered due to cross reactions in immunoassay methods and interventions in spectrophotometric methods.
Determination amino acids in plasma for activity of L-ASPZ was developed by HPLC-MS/MS method. Method was developed with HILIC column and as a mobile phase gradient acetonitrile and ammonium acetate solution used at 0.4 mL/min flow. Linear range of amino acids was found to be 500-5000 ng/mL for Asn, Asp and Glu, and 5-50 μg/mL for Gln, respectively. LOD, LOQ were found as 100-500 ng/mL for Asn, Asp and Glu, and 1-5 μg/mL for Gln, respectively. Method has been validated and successfully applied to plasma analyzes. Method is selective, reproducible and can be used safely in plasma analysis.