Sıçanda miyokardiyal iskemi sonrası doku onarımında insan göbek kordonu stroması kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin  
tedavi edici etkisinin  araştırılması
Investigating the therapeutic effects of human umbilical cord derived mesenchymal stromal stem cells in tissue repair after myocardial ischemia in rats
Yazar: ZEYNEP YIĞMAN
Danışman: PROF. DR. ALP CAN
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi = Thoracic and Cardiovascular Surgery ; Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Kalp hastalıkları = Heart diseases ; Kök hücreler = Stem cells ; Miyokardial reperfüzyon = Myocardial reperfusion ; Miyokardial reperfüzyon lezyonu = Myocardial reperfusion injury ; Stroma = Stroma ; Sıçanlar = Rats ; Tedavi = Treatment

Özet:
Miyokard infarktüsü (Mİ) mortalitesi ve morbiditesi oldukça yüksek olan yaygın bir sağlık problemidir. Güncel farmakolojik ve girişimsel tedavi yaklaşımları sağ kalımı ve hastanın yaşam kalitesini artırmakla birlikte temel sorun olan kardiyak doku kaybını düzeltememektedir. Bu temel sorunun çözümüne yönelik Mİ tedavi uygulamalarında, rejeneratif özellikleri nedeniyle, kök hücreler hedef haline gelmiştir. Mİ tedavisinde kemik iliği mezenkimal kök hücreleri başta olmak üzere, iskelet kası miyoblastları, adipoz doku mezenkimal kök hücreleri, embriyonik kök hücreler, uyarılmış pluripotent kök hücreler, kardiyak kök hücreler gibi çok sayıda farklı kök hücre tipi denenmiştir ve denenmektedir. 
Bir tür multipotent kök hücre olan göbek kordonu stroması mezenkimal kök hücrelerinin, farklılaşma potensileri, elde edilmelerindeki ve kullanımlarındaki kolaylıklar, immün modülasyon gibi,  tedavide diğer kök hücrelere göre üstün kabul edilebilecek özellikleri nedeniyle bu çalışmamızda sıçan Mİ modellerinde insan göbek kordonu stroması mezenkimal kök hücrelerinin tedavi edici etkisi araştırıldı. 
Deney modeli oluşturmak için sağlıklı 32 adet sekiz haftalık, 200-250 g ağırlığında, erkek, Wistar türü albino sıçanlar kullanıldı. Mİ oluşturmak üzere LAD koroner arteri orta kısmından kalıcı olarak bağlanan sıçanlar rastgele, PBS ve iGKS-MKH tedavisi verilen deney grupları olmak üzere iki gruba ayrıldı. Mİ, miyokardiyumdaki bölgesel soluklaşma ve hareket bozukluğu ile görsel olarak teyit edilir edilmez, PBS grubu sıçanlara sadece 250 L PBS, iGKS-MKH grubuna ise yeşil flüoresan etkinliğe sahip calcein AM ile işaretlenerek 250 L PBS içerisinde süspanse edilmiş 2,2 × 106 iGKS-MKH intramiyokardiyal enjeksiyon yapılarak uygulandı. 
PBS grubundan yaşayan 8 adet sıçan ve iGKS-MKH grubundan yaşayan 8 adet sıçan, Mİ ve PBS ya da hücre uygulamasını takip eden 3. haftada sakrifiye edildi. Sakrifikasyondan önce PBS grubundan 6, iGKS-MKH grubundan 3 sıçana EKO değerlendirmesi yapıldı.  Kalp fonksiyonlarının değerlendirilmesi için yapılan EKO incelemesinde LVEDD, LVEF parametreleri ölçüldü ve duvar hareket anormallikleri değerlendirildi. Sakrifikasyonu takiben PBS grubundan 4, iGKS-MKH grubundan 7 sıçanın kalbi TTC ile boyandıktan sonra dilimlenerek fotoğraflandı ve Image J bilgisayar programı yardımı ile 100 × infarkt alan/tüm alan eşitliği ile infarkt alanları oransal olarak hesaplandı. Toplanan tüm kalp dokularının seri frozen kesitleri alındıktan sonra, belli aralıklarla bu kesitlerden bir kısmına trikrom boyaması yapıldı ve ardından ışık mikroskobu altında fibrotik alanlar değerlendirildi. Ayrıca hücre tedavisi uygulanan gruptan hayvanların kalp dokusu seri frozen kesitlerinde, nakilden önce calcein AM ile işaretlenmiş iGKS-MKH'nin varlığı, yeşil calcein sinyali ya da insana özgü antijenlerle etkileşen anti-lamin A+C antikoru kullanılarak araştırıldı. Bunun yanı sıra kardiyomiyojenik farklılaşmayı tespit edebilmek için yine seri frozen kesitlerde alfa sarkomerik aktin ve sadece insana özgü antijenlerle etkileşen kardiyak troponin I antikorlarıyla işaretlemeler yapılarak kesitler konfokal mikroskopta incelendi. 
EKO değerlendirmesi sonucunda, PBS grubuyla karşılaştırıldığında, iGKS-MKH grubunun LVEF değerinin belirgin olarak iyileştiğinin (p=0,037) tespit edilmesi; yine PBS grubunun sol ventrikülünde akinezi izlenirken iGKS-MKH grubunda ise hipokinezi tespit edilmesi hücresel tedaviyle sağlanan fonksiyonel iyileşme lehine bulgulardır. 
İnfarkt alanı ölçümlerine göre, Mİ ve hücre uygulamasından 3 hafta sonra yapılan değerlendirmede, iGKS-MKH grubunda infarkt alanının PBS grubununkine göre belirgin olarak azaldığı ve bu azalmanın anlamlı olduğu tespit edildi (p=0,006). 
Kalp kesitlerinin TK boyalı preparasyonlarında, PBS kontrol grubunda fibrotik alanların daha yaygın olduğu ve bu alanların da yoğun kollajen ağı içerdiği gözlendi. Hücre ile tedavi edilen gruplarda ise, fibrotik alanların daha sınırlı olduğu ve PBS kontrol grubu ile karşılaştırıldığında bu alanların kollajen liflerin yanı sıra hücreden ve vasküler yapılardan daha zengin olduğu tespit edildi. TK prosedürü uygulanan kesitlerin diğer serileri konfokal mikroskopta incelendiğinde ise, çoğunlukla fibrotik alanda olmak üzere yer yer de fibrozise komşu alanlarda yeşil sinyal pozitifliği gösteren hücreler tespit edildi. Nakil öncesinde calcein AM ile işaretlenen hücreler olduğu düşünülen bu hücreler ileri analiz edildiğinde, bir kısmının insana özgü antijenlerle etkileşen kardiyak troponin I pozitifliği gösterdiği ve yine bu hücrelerin alfa sarkomerik aktin açısından da pozitif olduğu tespit edildi. 
Tüm bu veriler birlikte ele alındığında, iGKS-MKH ile tedavinin, Mİ sonrasında infarkt boyutlarını azalttığı, miyokardiyal faklılaşma göstererek onarım sürecine katıldığı ve kalp fonksiyonlarında iyileşmeye katkıda bulunduğu söylenebilir.

Abstract:
Myocardial infarction (MI) is a worlwide health problem with a high mortality and morbidity. Current pharmacological and interventional treatment approaches increases survey and improves life quality of patient, but fails to prevent cardiac tissue loss that constitute essential problem of MI. In the treatment applications of MI as an approach for solution of this essential problem, stem cells have been under the focus because of their regenerative characteristics. In treatment of MI, primarily bone marrow mesenchymal stem cells and number of various stem cell types have been experienced such as skeleton muscles myoblasts, adipose tissue mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells and cardiac stem cells. 
In the present study, due to their characteristics, which can be considered as superiority in treatment compared to the other stems cells such as convenience in their isolation and usage, differentiation potency and immune modulation, we investigated the therapeutic effects of human umbilical cord stroma derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC), a kind of multipotent stem cell, in the rat MI model. 
In order to create an experimental MI model, 32 healthy, 8-week old, weighing 200-250 g, male Wistar albino rats were used in this study. MI is carried out by a permanent ligation of LAD coronary artery at middle portion and confirmed visually by direct observation of regional myocardial paleness and disruption in contractility. Then, rats were randomly assigned to two groups as PBS group and hUC-MSC treatment group. PBS group was injected only with 250 L PBS into the infarct border zone, whereas the hUC-MSC group was injected with 2,2 × 106 hUC-MSC suspended in 250 L PBS, intramyocardially into the infarct border zone. Before transplantation, hUC-MSC was labeled with calcein AM, a green fluorescent molecule.
 Eight surviving rats from each PBS and the hUC-MSC groups were sacrificed at 3rd weeks after MI and PBS or cell transplantation. Before the rats were sacrificed, 6 rats from the PBS group and 3 rats from the hUC-MSC group were taken into echocardiographic examination for the evaluation of heart functions. By the echocardiographic examination, left ventricle end diastolic diameter (LVEDD) and left ventricle ejection fraction (LVEF) was calculated and wall motion abnormalities were evaluated. After the rats were sacrificed, hearts of 4 rats from the PBS group and 7 rats from the hUC-MSC group were stained with triphenyl tetrazolium chloride (TTC), and sliced to be observed microscopically. By using Image J Software, infarcted areas were calculated proportionally based on 100 × infarcted area/all areas on photographed heart slice. After getting frozen cross-sections series of all harvested heart tissues, some of these sections with a determined interval were stained with trichrome for evaluation of fibrotic areas using light microscope. Moreover, in serial frozen cross-sections of heart tissues of animals from the cell treatment group, existence of the hUC-MSC transplanted after the incubation with calcein AM was investigated by either using green calcein signal or using human-specific anti-lamin A+C antibody. Additionally, to identify the cardiomyogenic differentiation of these cells, serial frozen cross-sections were incubated with α-sarcomeric actin and human-specific cardiac troponin I antibodies and then examined in the confocal microscope. 
As a result of the echocardiographic evaluation, it was determined that the hUC-MSC group's LVEF value has improved remarkably in comparison with the PBS group (p=0,037); whereas akinesia of the PBS group persisted on the left ventricles. Hypokinesia was determined in the hUC-MSC group; these observations suggest that there has been functional recovery through cellular treatment. 
According to the measurements of the infarcted area, evaluated 3 weeks after the MI induction and cell transplantation, it was determined that infarct area in the hUC-MSC group was notably reduced in comparison with the PBS group and this reduction was found statistically significant (p=0,006). 
By the evaluation of trichrome stained preparations of the heart cross-sections, it was observed that fibrotic areas in the PBS control group were more extensive, and these areas were found containing dense collagen network. Concerning the group administered cell treatment, it was determined that fibrotic areas were more limited; and when it is compared with the PBS control group, these areas were found rich in cell and vascular structures as well as collagen fibers. When other cross-sections that consecutive series of trichrome stained sections, are examined on the confocal microscope, there were cells, exhibiting green-signal positivity, determined in mostly fibrotic areas as well as partly in the fibrosis-neighboring areas. When these cells, that are considered as the ones labeled with the calcein AM before the transplantation, are further analyzed, it was determined that a part of them were expressing human specific cardiac troponin I; and again that these cells were positive for α-sarcomeric actin too. 
Taken together, it can be concluded that the treatment of hUC-MSC has reduced infarct size after the MI, contributed in regenerative process by exhibiting myocardial differentiation and contributed in improvement of heart functions.