Fare testisinde ve leydig hücre hatlarında endoplazmik retikulum ile ilişkili protein yıkımının (ERAD) steroidogenez ile ilişkisinin belirlenmesi
The determination of the relationship between endoplasmic reticulumassociated protein degradation (ERAD) with steroidogenesis in mouse testis and leydig cell lines
Yazar: EBRU ALİMOĞULLARI
Danışman: PROF. DR. SEVİL ÇAYLI
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Fareler = Mice ; Hücre dizisi = Cell line ; Leydig hücreleri = Leydig cells ; Steroidler = Steroids ; Testis = Testis

Özet:
ERAD ve steroidogenez ile yapılan son çalışmalarda ERAD'ın androjenlerce
regüle edildiği ortaya konulmuştur. Özellikle ERAD proteinlerden SVIP'in, ERAD
inhibitörü olduğu literatüre geçmiştir. Fakat bu zamana kadar ERAD proteinlerinin
steroidogenez basamaklarında yer alan proteinlerle etkileşimleri ve ya onların
ekspresyonlarını nasıl etkiledikleri konusunda bir çalışma yapılmamıştır. Bu bilgiler
ışığında tezimde fare testis dokusunda ve Leydig hücrelerinde, ERAD proteinlerinin
steroidogenez sürecindeki rollerine açıklık getirmek amacı ile SVIP, p97/VCP,
StAR, CYP17A1 ve 3β-HSD'nin ekspresyonları immünfloresan, immünohistokimya,
ko-immünopresipitasyon, Western blot, Gen Ekspresyonu Analizi/QRT- PCR ve
ELISA yöntemleriyle analiz edilmiştir.
StAR'ın, CYP17A1'in ve 3β-HSD'nin, SVIP ve p97/VCP ile Leydig
hücrelerinde kolokalize olduğu belirlendi. MA10, TM3 ve HLC Leydig hücrelerinde
SVIP siRNA'ler ve p97/VCP siRNA'ler ile protein ekspresyonlarının baskılanması
sonucunda CYP17A1, 3β-HSD ve StAR ekspresyonlarında azalma gözlenmiştir.
İnsan Leydig hücrelerinde SVIP siRNA ile transfeksiyon ve hücrelerin hCG ile
muamelesi sonrasında SVIP protein ekspresyonunda anlamlı artış gözlenirken,
CYP17A1, 3β-HSD ve StAR ekspresyonlarında anlamlı bir değişiklik
saptanmamıştır. p97/VCP siRNA ile transfeksiyon ve hücrelerin hCG ile muamelesi
sonrasında ise p97/VCP, CYP17A1, 3β-HSD ve StAR protein ekspresyonlarında
anlamlı bir değişiklik saptanmamıştır. Kontrol siRNA, SVIP siRNA ve p97/VCP
siRNA ile transfekte edilmiş İnsan Leydig hücrelerinde SVIP ve p97/VCP gen
ekspresyonlarında anlamlı düşüş gözlenirken, CYP17A1, 3β-HSD ve StAR gen
ekspresyonlarında anlamlı değişiklik gözlenmemiştir. p97/VCP proteini çöktürülen
HLC Leydig hücrelerinde StAR, CYP17A1 ve 3β-HSD ile bu proteinlerin p97/VCP
ile etkileşimde oldukları belirlenmiştir. İnsan Leydig hücrelerinde Kontrol siRNA,
SVIP siRNA ve p97/VCP siRNA ile transfekte edilmiş hücre medyumlarındaki
testosteron düzeyleri karşılaştırıldığında, SVIP siRNA ve p97/VCP siRNA ile
transfekte grupta testosteron düzeylerinde anlamlı derecede azalma görülmüştür.
SVIP siRNA ile transfeksiyon ve hCG ile muamele sonrası testosteron düzeyleri
SVIP siRNA ile transfekte grupla karşılaştırıldığında anlamlı derecede artış
belirlenmiştir.
Sonuç olarak diyebiliriz ki; ERAD'a ait proteinlerden SVIP ve p97/VCP
Leydig hücrelerinde steroidogenezi etkiler, SVIP ve ve p97/VCP testosteron sentez
sürecinde rol oynamaktadır.

Abstract:
In recent studies with ERAD and steroidogenesis, it has shown that ERAD is regulated by androgens. It has reported that SVIP is ERAD inhibitor. There was no study conducted on interactions of ERAD proteins with proteins involved in steroidogenesis. We investigated expressions of SVIP, p97/VCP, StAR, CYP17A1 and 3β-HSD in mouse testicular tissue and Leydig cells to determine roles of ERAD proteins in steroidogenesis by immunofluorescence, immunohistochemistry, co-immunoprecipitation, Western blot, qRT-PCR and ELISA.
We found StAR, CYP17A1 and 3β-HSD were colocalized with SVIP and p97/VCP in Leydig cells. A decrease in CYP17A1, 3β-HSD and StAR expressions was observed as a result of suppression of SVIP siRNAs and p97/VCP siRNAs expressions in MA10, TM3 and HLC in Leydig cells. While significant increase in SVIP expression was observed after transfection with SVIP siRNA and treatment of cells with hCG, there was no significant change in CYP17A1, 3β-HSD and StAR protein expressions after transfection with p97/VCP siRNA and treatment of cells with hCG in human Leydig cells. While significant decrease in gene expressions of SVIP and p97/VCP was observed in human Leydig cells transfected with control siRNA, SVIP siRNA and p97/VCP siRNA, no significant changes were observed in CYP17A1, 3β-HSD and StAR. StAR, CYP17A1 and 3β-HSD in HLC cells that were precipitated with p97/VCP, and it has determined that these proteins interact with p97/VCP. When testosterone levels were compared in cell media of transfected with control siRNA, SVIP siRNA and p97/VCP siRNA in human Leydig cells,  significant decrease in testosterone levels was observed in SVIP siRNA and p97/VCP siRNA transfected groups. Testosteron levels were significantly increased after transfection with SVIP siRNA and treatment with hCG compared to transfected group with SVIP siRNA.
We can say that; SVIP and p97/VCP, affect steroidogenesis in Leydig cells and SVIP and p97/VCP play role in testosterone synthesis.