Kantitatif real-time PCR ile karpuz bakteriyel meyve leke hastalık etmeni Acidovorax citrulli (Schaad vd. 2008)'nin tanısı, tespiti ve karpuz ve kavun çeşitlerinin hastalık etmenine karşı duyarlılık reaksiyonlarının araştırılması
Identification and detection of Acidovorax citrulli (Schaad vd. 2008), a causal agent of watermelon bacterial fruit blotch disease by quantitative real-time PCR, and investigation of susceptibility reactions of watermelon and melon varieties against the disease pathogen
Yazar: NURHAN ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN BASIM
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Bu çalışmada, Karpuz Bakteriyel Meyve Leke hastalık etmeni Acidovorax citrulli
(Acidovorax avenae subsp. citrulli)' nin Real-Time PCR ile hassas tanısı ve bitki
dokularından tespiti için primer ve prob setleri geliştirilmiştir. Karpuz ve kavun
çeşitlerinin hastalığa karşı duyarlılık reaksiyonları araştırılmıştır. Acidovorax citrulli'nin
Real-Time PCR ile tanısı ve tespiti için hrpB2 gen dizisini ve ITS (Internally Transcribed
Spacer) bölgesini kullanarak her iki bölgeye özel primer dizayn edilmiştir. 8 bazdan
oluşan LNA (Locked Nucleic Acid) probe geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob
setlerinin spesifikliği; farklı Acidovorax citrulli strainleri, farklı bitki patojeni bakteriler
ve karpuz genomik DNA'sı kullanılarak test edilmiştir. Test edilen tüm yerli ve yabancı
Acidovorax citrulli izolatlarında her iki primer-prob seti 88 bp'lik amplifikasyon
gerçekleşirken, farklı bitki patojeni bakterilerde ve karpuz genomik DNA'sında hiçbir
amplifikasyon tespit edilmemiştir. Bu çalışmada bakteriyel hücre hassasiyet sınırı 2
bakteriyel hücre ve DNA düzeyindeki hassasiyet sınırı ise 12 fg'dır.
Hastalığa etki eden bakteri popülasyonlarının sayısını belirlemek için Kantitatif
Real-Time PCR ve hastalıklı bitki materyali üzerinde yaşayan bakterilerin saptanması
için Bio-PCR gerçekleştirilmiştir. Kantitatif Real-Time PCR sonucunda her iki primerprob
seti için standart eğri elde edilmiştir. Kantitatif Real-Time PCR yönteminde
kullanılan hrpB2 ve ITS primer-prob setlerinin etkinlikleri sırasıyla % 97.941 ve %
98.215 oranlarında yüksek güvenirlikte bulunmuştur. Bu çalışmada geliştirilen Real-
Time PCR metotları bakteriyel patojenin varlığı açısından karpuz ve kavun tohumlarının
taranmasına yardımcı olabilecektir. Ayrıca bu metot bakteriyel patojenin direkt hastalıklı
bitki materyalinden ve direkt bakteriyel hücreden tanı ve tespitine yardımcı olabilecektir.
Bu güvenilir, hassas ve tekrarlanabilir gerçek zamanlı PCR yöntemi, potansiyel inokulum
kaynaklarının kontrol edilmesine ve alandaki bakteriyel patojenlerin yayılmasının
önlenmesine yardımcı olabilecektir.
Karpuz ve kavun çeşitlerinin Acidovorax citrulli'ye karşı duyarlılık reaksiyonları,
dokuz farklı ölçeklendirmeye göre değerlendirilmiştir. Test edilen bitkilerin duyarlılık
reaksiyonları istatistiki olarak anlamlı bulunmamıştır.

Abstract:
on from both the diseased plant tissue and cell of Acidovorax citrulli (Acidovorax
avenae subsp. citrulli), a causal agent of bacterial fruit blotch disease by Real-Time PCR.
The susceptibility reactions of the watermelon and melon varieties to the bacterial
pathogen have been investigated. The specific primer pairs for identification and
detection of Acidovorax citrulli using Real-Time PCR were designed from both regions
of the internal sequence of hrpB2 and the Internal Transcribed Spacer (ITS) region. A
LNA (Locked Nucleic Acid) probe with 8 bases was developed. The specificity of the
primer and probe sets was determined by testing different plant pathogenic bacteria,
different Acidovorax citrulli isolates and watermelon genomic DNA. No amplification
was detected in the genomes of different plant pathogenic bacteria and watermelon
genomic DNA while both primer-probe sets showed a 88 bp- PCR product in all the tested
national and foreign Acidovorax citrulli isolates. In this study, bacterial cell sensitivity
limit was 2 bacterial cell, and DNA sensitivity limit was 12 fg.
Quantitative Real-Time PCR was performed to determine the number of diseaseaffecting
bacterial populations and for detection of living bacteria on the disease plant
material using Bio-PCR. Quantitative Real-Time PCR resulted a standard curve for both
the developed primer-probe sets in this study. The efficiency of the quantitative Real-
Time PCR using primer-probe sets for hrpB2 and ITS was found to be highly reliable
with 97.941% and 98.215%, respectively. These Real-Time PCR methods developed in
this study may help to screening of watermelon and melon seeds in terms of the presence
of the bacterial pathogen. The method may also help to detection and identification of the
bacterial pathogen from directly the diseased plant materials and bacterial cells. This
developed dependable, sensitive and repeatable Real-Time PCR method can help to
controlling potential sources of inoculum and prevent to spreading of bacterial pathogen
in field.
The susceptibility reactions of watermelon and melon varieties to Acidovorax
citrulli, were evaluated based on the nine different scales. The susceptibility reactions of
tested plants were not statistically important.