Oksijen endükte retinopiati in vivo fare modelinde intravitreal astaksantin enjeksiyonunun retinal endotelyal hücre proliferasyonuna, retina morfolojisine ve apoptotik hücre ölümüne etkisi
The effects of intravitreal astaxanthin on retinal endothelial cell proliferation, retinal morphological structure and apoptotic cell death in in vivo oxygen-induced retinopathy (OİR) mouse model
Yazar: ALİ KÜÇÜKÖDÜK
Danışman: PROF. DR. İMREN AKKOYUN
Başkent Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Astaksantin = Astaxanthin ; Endotelyum = Endothelium ; Fareler = Mice ; Göz hastalıkları = Eye diseases ; Mikroskopi-elektron = Microscopy-electron ; Retina hastalıkları = Retinal diseases ; Vitreus = Vitreous

Özet:
Bu çalışmada in vivo oksijen endükte retinopati (OER) fare modelinde intravitreal astaksantin enjeksiyonunun farklı konsantrasyonlarda retinal endotelyal hücre proliferasyonuna, retina morfolojisine ve apoptotik hücre ölümüne etkisi incelendi.
Çalışmada toplam 30 adet C57BLJ/6 ırkı fare kullanılmıştır. 20 adet C57BL/J6 fare postnatal 7-12. günler arasında %75 2 oksijene tabi tutuldu. Fareler analiz için 6 gruba ayrıldı. Beş tane yaş uyumlu işlem görmemiş, oda ortamında tutulmuş fare (Grup-A) negatif kontrol grubunu oluşturdu. Grup-B kontrol grubunu, 1µl intravitreal steril DMSO solüsyon enjeksiyonu, oksijene tabi tutulmamış (n=5 göz); Grup-C kontrol grubunu, oksijene tabi tutulmuş, işlem görmemiş (n=5 göz); Grup-D kontrol grubunu, 1µl intravitreal steril DMSO solüsyon enjeksiyonu, oksijene tabi tutulmuş (n=5 göz); Grup-E 10µg/ml intravitreal astaksantin enjeksiyonu (n=5 göz); Grup-F 100µg/ml intravitreal astaksantin enjeksiyonu (n=5 göz) oluşturdu. Onikinci gün 5 farenin bir gözüne (Grup-D) 1µl intravitreal steril DMSO, 5 farenin bir gözüne (Grup-E) 10 µg/ml intrvitreal astaksantin, 5 farenin sağ gözüne (Grup-F) 100 µg/ml intravitreal astaksantin enjekte edildi. . Postnatal 17. gün fareler sakrifiye edildi ve gözler preretinal neovaskülarizasyonun kantitatif analizi, apoptotik hücre ölümü ve morfolojik yapı incelenmesi için enüklee edildi. Neovaskülarizasyon internal limitan membranın vitreusa bakan yüzeyindeki vasküler hücre çekirdeklerinin sayımıyla kantifiye edildi. Histolojik ve ultrastrüktürel bulgular ışık ve elektron mikroskopi, apoptotik aktivite terminal deoxynucleotidyl transferase deoxy-UPT-nick end labeling (TUNEL) yöntemi ile incelendi.
Grup-A ve Grup-B karşılaştırıldığında endotel hücre çekirdeği sayısında istatistiksel anlamlı fark bulunmadı (p=0,9). Grup-C ve Grup-D karşılaştırıldığında endotel hücre çekirdeği sayısında istatistiksel anlamlı fark bulunmadı (p=0,3). Grup A ve C karşılaştırıldığında endotel hücre çekirdeği sayısında istatistiksel anlamlı fark bulundu (p<0.0001). Grup-B ve -D karşılaştırıldığında endotel hücre çekirdeği sayısında istatistiksel anlamlı fark bulundu (p<0.0001). Grup-D ile karşılaştırıldığında Grup-E'de endotelyal hücre çekirdeği sayısının %77,49 ve Grup-F'de %76,61 azaldığı tespit edildi. Grup-E ve -F karşılaştırıldığında endotel hücre çekirdeği sayısında istatistiksel anlamlı fark bulunmadı (p=0,9). Histolojik incelemede astaksantin enjekte edilmiş olan gözlerde kistik dejenerasyon, hücre kaybı tespit edilmedi.
Ultrastrüktürel mitokondriyal değişiklikler astaksantin enjekte edilen gruplarda (Grup-E, -F) Grup-C ve-D'ye göre daha az yoğun olarak tespit edildi. İncelemede negatif kontrol grubu (Grup-A) Grup-B ile karşılaştırıldığında anlamlı fark bulunmadı (p=1.0). Negatif kontrol grubu (Grup-A) ve Grup-B, -C ve -D karşılaştırıldığında anlamlı fark bulundu (p<0.0001). Grup-C ve -D, Grup-E ve -F ile karşılaştırıdığında anlamlı fark bulundu (p<0.0001). Grup-E ve -F arasında anlamlı fark tespit edilmedi.
TUNEL tekniği ile apoptozis analizinde Grup-A ve Grup-B'de dış nükleer tabakada ve iç nükleer tabakada benzer düzeyde apoptotik TUNEL-pozitif hücre tespit edildi. Grup-C ve –D'de dış nükleer tabakada ve iç nükleer tabakada benzer düzeyde apoptotik TUNEL-pozitif hücre tespit edildi. Grup A (p=0.3, 0.5) ve –B (p=0.5, 0.7), Grup-C ve –D ile karşılaştırıldığında anlamlı fark görülmedi. Grup-E ile –F (p=0.3) arasında anlamlı fark bulunmadı. Grup-E ile Grup-C ve –D arasında anlamlı fark bulunmadı (p=0.09, p=0.2). Grup-F ile Grup-C ve –D arasında anlamlı fark bulundu (p=0.01, p=0.02).
Sonuç olarak astaksantin OER modelinde neovaskülarizasyonu anlamlı oranda baskılamaktadır. Histolojik incelemede toksik etki izlenmemiş, ultrastrüktürel incelemede mitokondriler üzerine koruyucu etkileri olduğu ve TUNEL çalışmasında apoptotik aktiviteyi azalttığı tespit edilmiştir. Bununla ilgili ilaç etkisi ve doz etkisi ile ilgili prospektif randomize kliniğe yönelik deneysel çalışmalar gerekmektedir.

Abstract:
The aim of the study was to investigate the effects of astaxanthin, at different concentrations, on retinal endothelial cell proliferation, retinal morphological structure and apoptotic cell death in an in vivo oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model.
A total of 30 C57BLJ/6 mice were used in this study. Twenty C57BL/J6 mice were exposed to %75 2 oxygen between postnatal 7-12 days. Mice were investigated in six groups. Group-A (n=5 eyes) contained negative control group, Group-B (n=5 eyes) contained control group without exposition to high oxygen and injection of 1µl intravitreal DMSO solution. Group-C (n=5 eyes) contained control group exposed to high oxygen without any injection. Group-D (n=5 eyes) contained control group exposed to high oxygen with injection of 1µl intravitreal DMSO solution (n= 5 göz), Group-E contained 10µg/ml intravitreal astaxanthin injected group and Group-F contained 100µg/ml intravitreal astaxanthin injected group. On postnatal day 12 1µl sterile DMSO solution was administered intravitreally to the right eye of 5 mice (Group-D), 10µg/ml to the right eye of 5 mice (Group-E) and 100µg/ml to the right eye of 5 mice (Group-F). Five mice of the same age that had been kept in room air without any exposition to high oxygen, were used as negative control group (Group-A). On day 17, mice were sacrificed and eyes enucleated for quantitative analysis of preretinal neovascularization, apoptotic cell death and morphological structure analyses. Neovascularization was quantified by counting the endothelial cell nuclei on the vitreal side of the inner limiting membrane of the retina. Histological and ultrastructural changes were examined by using light and electron microskopy. Apoptotic activity was analysed by using terminal deoxynucleotidyl transferase deoxy-UPT-nick end labeling (TUNEL) technique.
The number of neovascular cell nuclei per histological section was not found statistically significant different between Group-A and –B (p=0,9). There was no statistically significant difference between Group-C and -D (p=0,3). There was significant difference between Group-A and Group-C and Group-B and –D (p<0.0001) (p<0,0001) . Compared with Group-D, the number of endothelial cell nuclei were decreased %77,49 in Group-E and %76,61 in Group-F. The number of neovascular cell nuclei per histological section was not found statistically significant different between Group-E and –F (p=0,9). In all groups histologic evaluation revealed, no cystic degeneration or cell loss.
Compared with Group-C and -D, the number of atypical mitochondria detected by electron microscopy was lesser in astaxanthin injected groups (Group-E, -F). There was no significant difference between negative control group (Group-A) and Group-B. Statistically significant difference was seen when Group-A and Group-B compared with Group-C and –D (p<0.0001). There was also statistically significant difference when Group-C and –D compared with Group-E and –F (p<0.0001). No significant difference was detected between Group-E and-F.
Analysis of apoptosis by TUNEL technique showed that in Group-A and Group-B apoptotic TUNEL-positive cells were at similar levels in the outer nuclear layer and inner nuclear layer. Similar levels in apoptotic TUNEL-positive cells were also detected between Group-C and –D. Comparing with group-C and -D, Group-A (p=0.3, 0.5) and –B (p=0.5, 0.7) showed no significant difference. There was no significant difference between Group-E and -F (p=0,3). Also no significant difference was seen when Group-E compared with Group-C and –D (p=0.09, p=0.2). Statistically significant difference was found when Group-F was compared with Group-C and –D (p=0.01, p=0.02).
In conclusion astaxanthin supresses endothelial cell proliferationin in OIR mouse model. On morphological examination, astaxanthin did not show any toxic effect, on ultrastructural evaluation mitochondrial protective effect was observed and on TUNEL study antiapoptotoic activity was seen. Further studies are needed to determine the safety and efficacy of astaxanthin in neovascular ocular diseases.