Meme kanseri hücrelerinde bag-1 ve hsp-70 etkileşiminin incelenmesi
Investigation of bag-1 and hsp-70 interaction in breast cancer cells
Yazar: TUĞBA KIZILBOĞA AKGÜN
Danışman: DOÇ. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology

Özet:
BAG-1 proteini dört farklı izoformu ile hücre sağkalım ve apoptoz sinyal yolaklarında etkili adaptör bir proteindir. BAG-1 ve diğer şaperon protein ağının etkileşim detaylarının bilinmesi ile protein homeostazisinin kanserde nasıl bir regülasyona tabi olduğu anlaşılabilecektir. Bu tez HER-2 pozitif (BT-474) ve HER-2 negatif (MCF-7) hücre hatlarında, BAG-1 aşırı anlatımının HSF-1 ve Hsp-70 üzerindeki etkilerini belirlemek üzere tasarlanmıştır. Daha önce yaptığımız çalışmalar BAG-1 aşırı anlatımının hücrelerin sağkalımını tercih edecek şekilde yolağı değiştirdiğini ortaya koymuştur. Bu bağlamda yapılan çalışmada, bilinen BAG-1 ve HSP/HSC-70 interaksiyonunun meme kanseri hücrelerindeki HER-2 bağımlı sağkalımı nasıl yönlendirdiği araştırılmıştır. BAG-1 etkileşim partneri olarak kabul edilen HSP-70'in tümörigenez başta olmak üzere pek çok mekanizmada BAG-1 ile birlikte görev aldığı düşünülmektedir. Bu çalışma kapsamında ilk kez, BAG-1 ile HER-2 (Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü) ve HSF-1 ("Heat shock factor-1") arasındaki etkileşimler değerlendirilerek bu etkileşimlerin hücrenin sağkalım veya ölüm mekanizmalarının seçiminde herhangi bir rolünün olup olmadığı belirlenmiştir. Bu doğrultuda BAG-1 anlatımı arttırılmış ve azaltılmış MCF-7 ve BT-474 meme kanseri hücrelerinde BAG-1 izoformlarının varlığı immünoblotlama yöntemi ile gösterilmiştir. Ardından BAG-1 anlatımındaki değişimin, HSP-70 ve diğer HSP'lerin protein anlatım düzeyinde herhangi bir değişikliğe neden olup olmadığı incelenmiştir. BAG-1'in HER-2 ilişkili sinyal yolakları üzerindeki etkisini göstermek amacıyla mTOR yolağı hedef alınmıştır. HSF-1 transkripsiyon faktörü üzerinde herhangi bir etkisinin olup olmadığını gösterebilmek amacı ile BAG-1 anlatım düzeyi arttırılmış ve azaltılmış MCF-7 ve BT-474 meme kanseri hücrelerinde bu yolak ile ilişkili bazı proteinlerin anlatım düzeyleri kontrol edilmiştir. BAG-1 ve HSP-70 (aynı zamanda HSP-27 ve HSF-1) etkileşimleri immün çöktürme ile gösterilmiş ve etkileşimlerin BAG-1'in hangi domeni üzerinden gerçekleştiğini tespit etmek için PRISM arayüzü kullanılmıştır. Aynı zamanda, BAG-1 ilişkili bazı proteinlerin hücresel lokalizasyonları immünboyama yapılarak tespit edilmiştir. 
Çalışmamız sonucunda, BAG-1 anlatımına bağlı olarak meme kanserinde hücre sağkalımının arttığı gözlenmiştir. Özellikle HER-2 anlatımına bakıldığı zaman, BAG-1 ile dolaylı veya dolaylı olmayan yollardan anlatımının arttığı ve sonuçta alt yolak üzerinden HSF-1 transkripsiyon faktörünü etkileyerek HSP'lerin anlatım seviyelerinde değişikliğe neden olarak hücreyi strese karşı koruduğu görülmüştür. Bu çalışma hücre sinyalizasyonunda hücrenin apoptoz ve/veya sağkalım davranışı için önemli olabilecek yeni hedef moleküllerin belirlenmesi adına literatüre katkı sağlayacaktır.

Abstract:
BAG-1 is an adaptor protein expressed as four different isoforms that modulate cell survival and apoptosis pathways. By knowing the details of interaction networks of BAG-1 and other chaperone proteins, it is possible to understand how protein homeostasis is regulated in cancer. Our study was designed to determine the effects of BAG-1 overexpression on HSF-1 and HSP-70 in HER-2 positive (BT-474) and HER-2 negative (MCF-7) cell lines. Previous studies have shown that BAG-1 overexpression changes the pathway in order to induce the cell survival. In this study, it was investigated how the known BAG-1 and HSP / HSC-70 interactions lead to HER-2 dependent survival in breast cancer cells. Hsp70 is a putative interaction partner of Bag-1 and thought to work together primarily in tumorigenesis and other cellular processes. In this study, the interactions between HER-2 (Epidermal Growth Factor Receptor) and HSF-1 (Heat shock factor-1) first evaluated and then checked if they play a role in selection between cell survival or apoptosis mechanisms. In this purpose, the presence of Bag-1 isoforms is shown in BAG-1 upregulated and downregulated MCF-7 and BT-474 breast cancer cells by using immunoblotting. Afterwards, the prospective changes in expression levels of HSP-70 and other HSP proteins caused by differential BAG-1 expression is analyzed. The m-TOR pathway was targeted to demonstrate the effect of BAG-1 on HER-2-associated signaling pathways. Expression levels of some of the proteins involved in this pathway were checked in MCF-7 and BT-474 breast cancer cells. BAG-1 and HSP-70 (also HSP-27 and HSF-1) interactions were demonstrated by immunoprecipitation and the PRISM interface was used to determine which domains BAG-1 interacts. At the same time, cellular localizations of some BAG-1 related proteins were detected by immuno-staining. 
As a result of our study, it was observed that cell survival was increased in breast cancer due to BAG-1 expression. Especially when the HER-2 expression is examined, it has been shown that the expression of BAG-1 directly or indirectly increases the expression of HSPs by affecting the HSF-1 transcription factor on the downstream pathway, thereby protecting the cell against stress. This study will promote to the literature in the new target molecules that may be important for cell apoptosis or survival behavior in cell signaling.