Trombositten zengin plazma mezoterapisinin botulinum toksin tip-A ile oluşturulan çizgili kas paralizisine inhibitör etkisi
The inhibitory effect of platelet rich plasma mesotheraphy on botulinum toxin type-A induced skeletal muscle paralysis
Yazar: MEHMET HAKAN BULAM
Danışman: PROF. DR. SÜHAN AYHAN
Gazi Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Botulinum toksinleri = Botulinum toxins ; Kan trombositleri = Blood platelets ; Kaslar = Muscles ; Metalloproteinazlar = Metalloproteinases ; Paralizi = Paralysis ; Tavşanlar = Rabbits ; Trombosit aktivasyonu = Platelet activation ; Trombosit kaynaklı büyüme faktörü = Platelet-derived growth factor ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Trombositten Zengin Plazma (TZP) otolog kanın santrifüj edilmesiyle oluşturulan trombosit konsantresidir. Günümüzde yara iyileşmesine üzerine olumlu etkileri ve hücre proliferasyonuna neden olması nedeniyle bir çok alanda kullanılmaktadır. Bu etkilerini ?-granülleri içindeki büyüme faktörleri ile sağlamaktadır. Bu granüller aynı zamanda pıhtılaşma faktörleri, proteinler ve bazı enzimler içemektedir. Botulinum toksin tip-A (BTxA) metalloproteinaz aktivitesi olan bir nörotoksindir. Kas-sinir terminalinde SNAP-25 proteinini kırarak asetil kolin salınımını önler ve kas paralizisi oluşturur. Bu çalışmanın amacı TZP'nin BTxA ile oluşan çizgili kas paralizisine etkisini araştırmaktır.u çalışmada 24 adet Yeni Zelanda tavşanı kullanıldı. Tavşan Anterior Auricular kas (AAK) modelinde çalışıldı. Denekler 4 gruba ayrıldı ve sağ ve sol kulak AAK ve kas üzerindeki deriye enjeksiyonlar yapıldı. ACR Regenkit® kullanılarak her denekten otolog TZP hazırlandı. BTxA için Botox® kullanıldı. Grup I'de (n=6) deneklerin sağ ve sol kulak AAK'larına 2,5 U BTxA ve sağ kulak AAK üzerindeki deriye TZP mezoterapi yoluyla (intradermal) uygulandı. Grup II (n=6) bu grubun kontrolü grubu olarak tasarlandı ve deneklerin sağ ve sol kulak AAK'larına 2,5 U BTxA ve sağ kulak AAK üzerindeki deriye TZP yerine serum fizyolojik ile santrifüj edilmiş ACR Regenkit AAK üzerindeki deriye mezoterapi yoluyla uygulandı. Grup III (n=6) in-vitro karşılaşma grubu olarak tasarlandı. Grup III sağ kulak AAK'ya TZP ile birebir karıştırılmış 2,5 U (0,05cc) BTxA, sol kulak AAK'ya serum fizyolojik ile bir daha bire bir dilue edilmiş BTxA uygulandı. Grup IV (n=6) bu grubun kontrol grubu olarak tasarlandı ve sağ AAK'ya serum fizyolojik ile santrifüj edilmiş ACR Regenkit sıvısı ile BTxA karıştırılıp yapıldı. Sol kulak AAK'ya Serum fizyolojik ile bir daha bire bir dilue edilmiş BTxA uygulandı Uygulamalar öncesinde tüm deneklerin bilateral AAK Aksiyon potansiyeli ölçümleri için elektronöromyografi yapıldı. Uygulamalar sonrası 14. günde deneklerin kulak pozisyonlarındeki değişim fotoğrafik olarak kaydedildi ve derecelendirildi. Kas aksiyon potansiyeli ölçümleri 14. günde tekrarlandı. Daha sonra AAK biyopsileri alındı ve SNAP-25 m-RNA kantitatif PCR yöntemi ile belirlendi. Görsel ve elektronöromyografik bulgular incelendiğinde TZP mezoterapisi uygulanan grupta (Grup I) sağ taraftaki kulağın (TZP mezoterapisi uygulanan taraf) pozisyonu daha dik ve kas aksiyon potansiyeli amplitüdü daha yüksek olduğu saptandı. Bu farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu tespit edildi. Grup II'de sağ ve sol kulakların değerlendirme yöntemleri bulguları açısında anlamlı fark bulunamadı. Grup III'te (TZP ve BTxA'nın in vitro karıştırıldığı grup) görsel bulgularda fark saptanmadı ancak sağ taraftaki kulağın (TZP ve BTxA'nın in vitro karıştırıldığı taraf) kas aksiyon potansiyeli amplitüdünün daha yüksek olduğu saptandı. Bu farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu tespit edildi. Grup IV'te sağ ve sol kulakların değerlendirme yöntemleri bulguları açısında anlamlı fark bulunamadı. SNAP-25 proteinin m-RNA kantitatif PCR ile değerlendirlmesi sonucunda SNAP-25 proteinine ait genlerin m-RNA düzeyinde tüm kas biyopsilerinde ifade edildiği görüldü. Sağ ve sol kulak anterior auricular kaslarından alınan biyopsilerde SNAP-25 proteini m-RNA ekspresyonu açısından fark bulunmadı. Ancak posttransyasyonel modifikasyonlar seviyesinde fark bulunabileceği düşünüldü. Botulinum toksinin metalloproteaz aktivitesindeki azalmayı belirleyebilecek olan kırılmamış SNAP-25 proteini miktarının gösterilmesi gerektiği düşünüldü. Elde edilen veriler ile TZP'nin BTxA'nın kas paralize edici etkisini azalttığı saptandı. Bu etkileşimi hem kas üzerinde mezoterapi yoluyla uyguladığımızda hem de tüp içinde karıştırıldığında yarattığı tespit edildi. TZP'nin bu etkisinin hem trombosit ?-granülü içinde hem de serumda bulunan bir genel proteaz inhibitörü olan ?-2 makroglobulinden kaynaklanabileceği tartışıldı ve moleküler düzeyde bu etkileşimi kanıtlayabilecek başka çalışmaların önü açıldı ve planlandı.

Abstract:
The Inhibitory Effect of Platelet Rich Plasma Mesotheraphy on Botulinum Toxin Type-A induced Skeletal Muscle Paralysis Platelet Rich Plasma (PRP) is a platelet concentrate that is produced from autologous blood by centrifugation. PRP is used in various areas of medicine because of its wound healing and cell proliferation effects. These effects depend on growth factors in ? granules of platelets. They also have various coagulation factors, proteins and enzymes. Botulinum toxin type-A (BTxA) is a neurotoxin which have a metalloproteinase activity. BTxA causes muscle paralysis as it breaks SNAP-25 perotein in nerve terminal and prevents acetyl-choline release to neuromuscular juction. Aim of this study is to investigate the effect of PRP on BTxA induced skeletal muscle paralysis. Anterior auricular muscle (AAM) model was used in twenty-four New Zeland Rabbit which had been studied in 4 groups. Right and left AAM and skin over the AAM?s were used for injection procedures. Autologous PRP was prepared with ACR Regenkit® for all rabbits. BOTOX was used for botulinum toxin type-A injections. 2,5U BTxA was injected to bilateral AAM intramuscularly and 1cc autologous PRP intradermally (PRP mesotheraphy) in Group I (n=6). Group II (n=6) was designed as control group of group I and 2,5U BTxA was injected to bilateral AAM intramuscularly and 1cc %0.9 NaCl that was centrifuged in ACR Regenkit was injected intradermally. Group III (n=6) was designed as in-vitro mixture group. 2,5 U BTxA (0,05ml) and 0,05ml PRP was mixed in laboratory tube and then was given intramuscularly to right AAM of rabbits. 2,5 UBTxA (0,05ml) and equal volume %0.9 NaCl was mixed and injected to left AAM. Same procedure was done in Group IV (n=6) except 2,5 U BTxA and 0,05ml %0.9 NaCl that was centrifuged in ACR Regenkit was mixed and used on right side. Electroneuromyolographic (ENMG) study was done before all procedures. Right and left AAM action potantial amplitude was noted. Fourteen days after the procedures visual study according to position of rabbits was done. Then ENGM study was repeated. Also genetical evaluation was done in muscle samples on 14th day. for SNAP-25 protein m-RNA was evaluated with Quantitative Real-Time PCR. In visual and ENGM studies it is observed that there was less BTxA activity on right side muscles of Group I (PRP mesotherapy group). These differences were statistically significant. No significant differences were found in Group II. When the findings of Group III (PRP in-vitro mixture group) were evaluated it was seen that the reduction rate of action potential amplitude of right AAM was significantly lower than left side. There was no significant differences in Group IV. SNAP-25 mRNA expression was observed in all muscle samples. No significant difference was found between groups and right/left side AAM?s of rabbits. It is tought that maybe there was a difference in posttranslational modification level. But we could not use the technique that unbroken SNAP-25 proteins could be detected. In the light of these findings we found that PRP have an inhibitory effect on BTxA activity. We observed this effect after PRP mesotheraphy and also in-vitro PRP/BTxA mixture. We could not explain the exact mechanism underlying this interaction but we assumed that the ?-2 macroglobuline in platelet?s ?-granüle and serum may have some inhibitory effect on BTxA because ?-2 macroglobuline had a general protease inhibitör activity. New studies are designed to investigate this interaction between PRP and BTxA.