Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak üzere mezenkimal kök hücreler ile poli (ɛ-kaprolakton) scaffold arasındaki etkileşimin incelenmesi ve 3d doku modelinin geliştirilmesi
Investigation of interactions between mesenchymal stem cells-polycaprolactone (ɛ-caprolactone) scaffolds and improvement of 3d tissue model for the use of cartilage tissue engineering
Yazar: HİLAL TOPTAŞ
Danışman: PROF. DR. ADİL ALLAHVERDİYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
İnsanlarda kıkırdak hasarı, Dünyada ve Türkiye'de görülme sıklığı gün geçtikçe artan sağlık problemlerinden biridir. Sağlık Bakanlığı tarafından 2010 yılında 15 yaş üstü bireylerde yapılan bir araştırmaya göre; ülkemizde 4,7 milyon kişinin kıkırdak dejenerasyonu hastası olduğu rapor edilmiştir. Kıkırdak tedavisinde çeşitli yöntemler (konservatif ve cerrahi) uygulanmasına rağmen, problemlerin giderilmesinde halen ciddi sorunlar mevcuttur. Bu nedenle son yıllarda kıkırdak doku mühendisliğine yönelik çalışmalar oldukça önem kazanmıştır. Özellikle doku mühendisliğinde kök hücre (KH) ve biyomalzeme alanındaki gelişmeler kıkırdak hasarlarının giderilmesinde yeni umutlara yol açmıştır. Biyomalzemeler arasında kıkırdak doku mühendisliğinde en çok kullanılan scaffoldlardan (doku iskelesi) bir tanesi poli epsilon kaprolakton (PCL)'dur. Son yıllarda PCL ve mezenkimal kök hücreler (MKH) arasında yapılan çeşitli çalışmalar bulunmasına rağmen, şimdiye kadar PCL'nin hangi doku kaynağından elde edilen mezenkimal kök hücreler ile daha iyi etkileşime girdiğini gösteren çalışmalar oldukça yetersizdir. Bununla birlikte PCL scaffold ile mezenkimal kök hücrelerden oluşan üç boyutlu kültürlerin kondrosit farklılaşması üzerindeki etkisi ile ilgili çalışmalar da az sayıdadır. Ayrıca, kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak amacıyla; PCL scaffold ile olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücreler arasındaki etkileşimle ilgili literatürde herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; adipoz, kordon matrisi ve olfaktör bulb gibi farklı kaynaklardan elde edilen mezenkimal kök hücreler ile PCL scaffold arasındaki etkileşimi karşılaştırmalı olarak incelemek, sonrasında oluşturulan üç boyutlu kültürler üzerinde kondrogenezisin gerçekleştirilmesi sonucunda hangi mezenkimal kök hücre kaynağının kondrosite daha iyi farklılaştığını belirlemek ve bu sonuçlar doğrultusunda kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak üzere mezenkimal kök hüre kaynağı olarak en uygun kök hücre kaynağını önermektir. 
Tez kapsamında amaca ulaşmak için; adipoz, kordon matrisi ve olfaktör bulb dokularından elde edilmiş mezenkimal kök hücrelerin PCL scaffold yüzeyinde üç boyutlu hücre kültür modelleri 12 gün boyunca MTT (3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid) ve Canlı/Ölü boyaması ile canlılık analizleri, CM-DiI boyaması ve SEM (Taramalı Elektron Mikroskop) görüntüleri takip edilerek optimize edilmiştir. Hazırlanan üç boyutlu hücre kültür modellerinde ki kondrojenik farklılaşma; MTT, Canlı/Ölü boyaması, NO (Nitrik Oksit) analizi, SEM görüntüleri, RNA izolasyonu ve cDNA eldesini takiben yapılan PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ve Eş zamanlı PZR ve histolojik analizler ile 26 gün boyunca takip edilmiştir. 
Yapılan tüm bu çalışmalar sonucunda; kordon matrisi ve PCL scaffold ile hazırlanan üç boyutlu hücre kültür modelinin kondrojenik farklılaşmasının, adipoz doku ve olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücreler ile hazırlanan hücre kültür modelinin kondrojenik farklılaşmasına göre daha hızlı gerçekleştiği tespit edilmiştir. Ayrıca yapılan eş zamanlı PZR ön çalışması sonucuna göre; olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücre ve PCL scaffold ile hazırlanan üç boyutlu hücre kültür modelinde hiyalin kıkırdak gen ekspresyon özelliklerine benzer en yakın yapının elde edildiği görülmüştür. MTT ve NO analizi sonuçları istatistiksel olarak parametrik yöntemler olan ANOVA ve student t test ile belirlenmiştir. Tüm veriler Statistical Packages of Social Sciences (SPSS, version 19.0 for Windows) programı ile çalışılarak ve p<0,05 değeri istatistiki olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Sonuç olarak bu tez çalışması kapsamında ilk kez olarak;  kondrogenez aşamasında adipoz, kordon matrisi ve olfaktör bulb gibi farklı kaynaklardan elde edilen mezenkimal kök hücreler ile PCL scaffold arasındaki etkileşim karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre; PCL'nin her üç kaynaktan elde edilen mezenkimal kök hücreler ile etkileşime girdiği, fakat en etkin sonucun olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücreler ile olduğu belirlenmiştir. Ayrıca ilk defa olarak; kıkırdak doku mühendisliğinde, olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin PCL scaffold ile hazırlanan üç boyutlu kültür üzerinde kondrositlere farklılaştığı saptanmıştır. Bu sonuçlar; gelecekte kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak üzere yeni bir mezenkimal kök hücre kaynağının kullanım potansiyelini ortaya çıkarmıştır. 
 

Anahtar Kelimeler: Scaffold, kıkırdak doku mühendisliği, mezenkimal kök hücreler

Abstract:
Human cartilage damage is one of the most important health problems that increasing with each passing day in the world and Turkey. According to a study conducted by Turkish ministry of health in 2010, there are 4.7 million people who are above 15 have the cartilage degeneration illness. Although, wide variety of treatments (conservative and surgery) are being applied, crucial problems in the field are still waiting to be solved. For this, the importance of cartilage tissue based studies have been grown in recent years. Especially, stem cell and biomaterial based technology development in tissue engineering field has caused to open new horizons and hopes to solve these problems. Poly-epsilon captolactone (PCL) is one of the scaffolds that is being used widely among the biomaterials in tissue engineering. Although there are some researches has been studied with poly-epsilon caprolactone (PCL) and mesenchymal stem cells (MSC), these studies are not enough to explain  which stem cell source better interacting with PCL scaffold. Besides, there are only a few research studied the effect of three dimensional culture (which is formed from PCl and mesenchymal stem cells)  on the chondrocyte differentiation. Furthermore, we couldn't find any research about the PCL scaffold and olfactory bulb sourced mesenchymal stem cell interactions to use in cartilage tissue engineering. According to the information above, the goal of this thesis study is investigation of the interaction between PCL scaffold and different sourced mesenchymal stem cells (such as adipose, umbilical cord matrix, and olfactory bulb), identification of which mesenchymal stem cell source better for differentiation to cartilage tissue on the three dimensional tissue cultures and suggestion of optimum stem cell source to use in cartilage tissue engineering according to these studies.
To reach the goal in the scope of this thesis; three dimensional culture models of adipose, umbilical matrix and olfactory bulb tissue sourced mesenchymal stem cells on  PCL scaffold have been optimized along 12 days with the MTT (3-(4,5-dimethyltriazol-2-il)-2,5- diphenyltetrazolium bromide), aliveness analyzes with alive/death dying, CM-DiI dying and SEM (Scanning Electron Microscope) analyzes. The chondrogenic differentiation in three dimensional culture models has been investigated along 26 days with; MTT, alive/death dying, NO (Nitric Oxide) analyzes, SEM images, real-time PCR analyzes following RNA isolation and cDNA obtainment and histological analyzes.
As results of all these studies, chondrogenic differentiation of umbilical matrix-PCL scaffold based three dimensional culture model is faster than the adipose tissue and olfactory bulb sourced mesenchymal stem cell-PCL based cell culture models. According to real time-PCR results, olfactory bulb sourced mesenchymal stem cell-PCL scaffold based three dimensional culture model showed the most closest expression pattern of the hyaline cartilage tissue gene expression pattern. ANOVA and Student T tests are applied to MTT and NO analyse results to determine their statistical significance. All data satistics conducted with Statistical Packages of Social Sciences (SPSS, version 19.0 for Windows) program and p<0,05 value assumed as significance threshold.
As a result, in the scope of this thesis for the first time; the interaction between PCL scaffolds and different sourced mesenchymal stem cells (such as adipose umbilical matrix and olfactory bulb tissue) has been investigated comparatively. According to obtained results; it is determined that the PCL can interact with all three different sourced mesenchymal stem cells but the most optimal result has been obtained from the olfactory bulb sourced mesenchymal stem cell-PCL interaction model. Furthermore, for the first time in cartilage tissue engineering, it is searched out that olfactory bulb sourced mesenchymal stem cells can differentiate into chondrocytes on the three dimensional culture model prepared with the PCL scaffolds. These results indicate that usage potential of a new mesenchymal stem cell source in cartilage tissue engineering has been risen.

Keywords: Scaffold, cartilage tissue engineering, mesenchymal stem cells