Sıçanlarda indirekt bilirubinin kontrast ilişkili nefropati üzerine etkisi
Effect of indirect bilirubin on contrast-induced nephropathy in rats
Yazar: FATİH ÜNAL
Danışman: PROF. DR. MEHMET TİMUR SELÇUK
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Ankara Bilkent Şehir Hastanesi / Kardiyoloji Ana Bilim Dalı / Kardiyoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Kardiyoloji = Cardiology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Bilirubin = Bilirubin ; Kontrast maddeler = Contrast media ; Nekroz = Necrosis ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Giriş: Kontrast ilişkili nefropati tanım olarak; herhangi bir sebeple kontrast maruziyeti (Kontrastlı Bilgisayarlı Tomografi (BT); Koroner Anjiyografi, Periferik Anjiyografi) sonrası ilk 48-72 saat içerisinde, özellikle de maruziyetten 24 saat sonra kreatinin seviyesinde 0,5 mg/dl artış ya da GFR değerinde %25-30 oranında kayıp olmasıdır. Özellikle hastalarda hipotansiyon, kalp yetmezliği (KY), diyabetes mellitus (DM) gibi patolojilerin varlığında kontrast ilişkili nefropati olma olasılığı artmaktadır. Oluşan bu nefropati hastalarda mortalite ve morbidite artışlarına sebebiyet vermektedir. Kontrast ilişkili nefropatinin patogenezinde; temel olarak medüller vazokontriksüyon; apoptoz; nekroz patolojileri; inflamasyon yatmaktadır. Bu çalışmadaki amacımız indirekt bilirubinin kanıtlanmış anti-apoptotik; anti-oksidan özelliklerinden faydalanarak kontrast ilişkili nefropatinin modellendiği Wistar Albino cinsi sıçanlarda patolojinin gerilemesinde; buna ikincil olarak böbrek fonksiyonlarının iyileşmesinde faydasının olup olmadığını değerlendirmektir. Literatürde daha önce indirekt bilirubin ile ilgili diyabetik nefropati üzerine yapılmış deneysel çalışma mevcut olup, kontrast ilişkili nefropati üzerine bilirubin düzeyi ile istatiksel ilişkisini gösteren klinik çalışmalar incelenmiş; ancak herhangi bir deneysel-hayvan çalışmasına rastlanmamıştır. Bu anlamda yapmış olduğumuz bu çalışma kontrast ilişkili nefropati ve bilirubin ilişkisi konusunda ilk deneysel-hayvan çalışması özelliğini taşımaktadır.
Gereç ve Yöntem: Çalışmamız deneysel-hayvan çalışmasıdır. Çalışmada toplamda 24 adet erkek 8 haftalık Wistar Albino cinsi sıçan kullanılmıştır. Sıçanlar 8'er adetten oluşan üç adet gruba ayrılmıştır. İlk iki grupta 10mg/kg indometazin; 10 mg/kg L-nitro arjinin metil ester (L-NAME) intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonundan 15 dk sonra intravenöz (i.v.) yolla 3 mg/kg iyoheksol enjekte edilerek kontrast ilişkili nefropati indüklenmiştir. Üçüncü grup sham grubu olarak kullanılmıştır. Kontrast ilişkili nefropati oluşturulan iki gruptan birine 30 mg/kg indirekt bilirubin, di- metil sulfoksit'te (DMSO) çözülerek i.p. yoldan kontrast enjeksiyonundan sonraki 48 saat süresince 24 saatte bir enjekte edilmiştir. Diğer kontrast nefropati indüklenen gruba kontrol olarak DMSO çözücüsü enjekte edilmiştir. Her üç gruptan metabolik kafes vasıtası ile 24 saatlik idrar örnekleri toplanmıştır. Kontrast enjeksiyonundan 48 saat sonra sıçanlara ötenazi işlemi uygulanmış olup serum ve böbrek doku örnekleri alınmıştır. Her sıçandan alınan böbrek dokularından biri %10'luk formalin solüsyonuna gömülerek patolojiye; diğer böbrek ve serum örnekleri kuru buz vasıtası ile moleküler ve biyokimyasal analiz yapılmak üzere -80 C'ye transfer edilmiştir. Histopatolojik inceleme hemotoksilen-eozin boyası vasıtasıyla nefron ve glomerüler hasar incelenmek üzere yapılmıştır. Moleküler araştırmada ise böbrek dokusunda TNF-α, IL-1, IL-6 ve sitokrom-c gen ekspresyon analizi yapılmıştır. İdrar örneklerinde üre, kreatinin, 24 saatlik toplam kreatinin, idrar/serum kreatinin oranı ölçümü; serum örneklerinde ise üre, kreatinin ölçümleri yapılmıştır.
Bulgular: Biyokimyasal analizde kontrol grubunda ve indirekt bilirubin verilen grupta, serum kreatinin değerleri sham grubuna kıyasla anlamlı olarak daha yüksek (p<0,05) bulundu. 24 saatlik idrarda total kreatinin değerleri ve idrar/serum kreatinin oranları kontrol grubu ve indirekt bilirubin grubunda, sham grubuna kıyasla anlamlı daha düşük olduğu görüldü (p<0,05). Serumda saptanan kreatinin değerleri indirekt bilirubin grubunda kontrol grubuna göre sayısal olarak daha düşük; idrarda ise (kreatinin düzeyi, total kreatinin, idrar/serum kreatinin oranı) daha yüksek görüldü ancak farklılık istatiksel açıdan anlamlı bulunmadı (p>0,05). Serum ve idrardaki üre değerlerine bakıldığında; serumdaki üre değeri indirekt bilirubin grubunda sayısal veri açısından kontrol gruba göre düşük görülse de istatiksel analiz neticesinde kontrol ve indirekt bilirubin grupları arasında serum ve idrar üre değerleri açısından anlamlı farklılık bulunmadı (p>0,05). Metabolik kafes ile 24 saatlik sıvı alımı ve idrar miktarı hesaplandığında; çıkardıkları idrar miktarları açısından her üç grup arasında hem grup analizinde hem de post-hoc analizlerde anlamlı farklılık tespit edilmedi (p>0,05); ancak kontrol ve indirekt bilirubin grubunda alınan sıvı miktarları sham grubuyla ayrı ayrı kıyaslandığında anlamlı olarak daha düşük olduğu tespit edildi (p>0,05). Alınan sıvı miktraları açısından kontrol ve indirekt bilirubin grupları arasında anlamlı farklılık bulunmadı (p>0,05).
Böbrek dokusundaki histopatolojik verilerin kategorik olması ve çapraz tabloda 5'ten küçük değerlerin olduğu hücre oranı toplam hücrelerin %20' sinden fazlasını oluşturması nedeniyle, istatistiksel analiz Fisher's Exact yöntemi ile yapıldı. Tübüler dejenerasyon açısından gruplar ile böbrek tübüler dejenerasyon şiddeti arasındaki ilişki, istatistiksel açıdan anlamlı kabul edildi (Fisher's Exact p<0,001). 
Moleküler analizlerde; gerçek zamanlı PCR ile böbrek dokularında TNF-α, IL-1β, IL-6 ve sitokrom C gen ekspresyonlarına bakıldı. IL-6 ekspresyonu açısından üç grup arasında istatiksel açıdan anlamlı farklılık bulunmadı (p>0,05). TNF-α, IL-1β ve sitokrom C gen ekspresyonları ise beklenilenin aksine kontrol kontrast nefropati grubunda indirekt bilirubin grubuna göre istatiksel açıdan anlamlı daha düşük olduğu bulundu (p<0,05).
Sonuç: Kontrast nefropatiyi modellediğimiz invivo deneysel hayvan çalışmamızda; indirekt bilirubin molekülünün verildiği sıçanların histopatolojik analizlerinde, tübüler dejenerasyon düzeyinin sham grubuyla benzer olduğu, kontrol grubuna göre ise tübüler hasar şiddetinin daha az olduğu saptanmıştır. Biyokimyasal analizde istatiksel anlamlı farklılık olmasa da, indirekt bilirubin verilen grupta kontrol gruba göre sayısal olarak serum kreatinin ve üre değerleri daha düşük bulunmuştur. Bununla birlikte, indirekt bilirubin verilen grupta idrar kreatinin değerleri daha yüksektir. Bu sonuçlar, indirekt bilirubinin kontrast nefropatisi üzerine olumlu etkisinin olabileceğini göstermektedir. Yaptığımız bu invivo hayvan çalışması, gelecekte yapılacak klinik/deneysel çalışmalara öncülük edebilir.

Anahtar Kelimeler: Apoptoz, akut böbrek hasarı, indirekt bilirubin, iyoheksol, kontrast ilişkili nefropati, nekroz

Abstract:
Aim: Contrast-related nephropathy by definition; after contrast exposure for any reason (Contrast Computed Tomography (CT); Coronary Angiography, Peripheral Angiography) within the first 48-72 hours, especially 24 hours after exposure, 0.5 mg/dl increase in creatinine level or 25-30% GFR value rate of loss. Especially in the presence of pathologies such as hypertension, heart failure, and diabetes mellitus, the possibility of contrast-related nephropathy increases. This nephropathy causes increased mortality and morbidity in patients. In the pathogenesis of contrast-associated nephropathy; there are medullary vasoconstriction; apoptosis in proximal tubules and  necrosis in distal tubules. Our aim in this study is using indirect bilirubin for regression of pathology in Wistar Albino rats, in which contrast-associated nephropathy is modeled; secondly, to evaluate whether it is beneficial in improving kidney functions. In the literature, there is an experimental study on diabetic nephropathy related to indirect bilirubin, and clinical studies showing the statistical relationship between bilirubin level and contrast-related nephropathy have been examined; however there was no experimental-animal studies on contrast related nephropathy. In this sense, our study is the first experimental-animal study on the relationship between contrast-related nephropathy and indirect bilirubin.
Materials and methods: Our study is an experimental-animal study. A total of 24 male 8-week-old Wistar Albino rats were used in the study. The rats were divided into three groups of 8 each.; Contrast-related nephropathy was induced by intravenous injection of 3 mg/kg iohexol 15 minutes after the intraperitoneal (i.p.) injection of 10 mg/kg L-nitro arginine methyl ester (L-NAME) and 10mg/kg indomethacin in the first two groups. The third group was used as the sham group. 30 mg/kg indirect bilirubin dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) was administered to one of the two groups with contrast-related nephropathy i.p. was injected every 24 hours for 48 hours after intravenous contrast injection. The other contrast nephropathy induced group was injected with DMSO solvent as a control. 24-hour urine samples were collected from all three groups via metabolic cage. The rats were euthanized 48 hours after the contrast injection and serum and kidney tissue samples were taken. One of the kidney tissues taken from each rat was embedded in 10% formalin solution for histopathological analysis; other kidney and serum samples were transferred to -80 °C for molecular and biochemical analysis by means of dry ice. Histopathological examination was performed to examine nephron and glomerular damage by means of Hemotoxylin-Eosin stain. In molecular research, TNF-α, IL-1, IL-6 and cytochrome-c gene expression analyzes were performed in kidney tissue. 
Results: In the biochemical analysis, serum creatinine values of the control and indirect bilirubin groups were significantly higher than the sham group (p<0.05); Total creatinine values in 24-hour urine and urine/serum creatinine ratios were found to be significantly lower in the control and indirect bilirubin groups compared to the sham group (p<0.05). The serum creatinine values were numerically lower in the indirect bilirubin group than in the control group; although creatinine level was higher in urine (creatinine level, total creatinine [24 hour], urine/serum creatinine ratio), the difference was not statistically significant (p>0.05). Considering the urea levels in serum and urine; although the urea value in the serum was numerically low in the indirect bilirubin group; according to the statistical analysis, no significant difference was found between the control and indirect bilirubin groups in terms of serum and urine urea values (p>0.05). When the 24-hour fluid intake and urine amount are calculated with the metabolic cage; there was no significant difference between the three groups in terms of urine amount in both group and post-hoc analysis (p>0.05); however, the amount of fluid intake in the control and indirect bilirubin groups was found to be significantly lower when compared with the sham group separately (p>0.05). There was no significant difference between the control and indirect bilirubin groups in terms of the amount of fluid intake (p>0.05).
In the histopathological analysis of kidney tissue, the analysis was performed by Fisher's Exact method, since the data were categorical and values less than 5 per cell in the crosstab which comprised more than 20%. In terms of tubular degeneration, the relationship between the groups and the severity of renal tubular degeneration was considered statistically significant (Fisher's Exact p<0.001).
In molecular analysis, TNF-α, IL-1β, IL-6 and cytochrome C gene expressions in kidney tissues were examined by real-time PCR. There was no statistically significant difference between the three groups in terms of IL-6 expression (p>0.05). Contrary to expectations, TNF-α, IL-1β and cytochrome C gene expressions were found to be statistically significantly lower in the control contrast nephropathy group than in the indirect bilirubin group (p<0.05).
Conclusion: In our in vivo animal study, in which we modeled contrast nephropathy, according to the histopathological analysis, in rats given indirect bilirubin molecule, it was observed that the level of tubular degeneration was almost similar to the sham group and the severity of tubular damage was less than the control group. At the same time, although there is no statistically significant difference in biochemical analysis, the fact that serum creatinine and urea values are numerically lower and urinary creatinine values are higher in the group given indirect bilirubin may shed light on future experimental/clinical studies on the effect of indirect bilirubin on contrast nephropathy treatment, and shows us that indirect bilirubin may have a place in the treatment of CIN.

Key words: Apoptosis, acute kidney injury, indirect bilirubin, iohexol, contrast-induced nephropathy nephropathy, necrosis