2,4,6-trinitrotoluen'in bakteriler aracılığıyla parçalanması
Degradation of 2,4,6-trinitrotoluene with bacteria
Yazar: ZEHRA GÜN GÖK
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA YİĞİTOĞLU ; YRD. DOÇ. DR. MURAT İNAL
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: 2,4,6-trinitrotoluen = 2,4,6-trinitrotoluene ; Bakteri izolasyonu = Bacterial isolation ; Biyolojik parçalanma = Biodegradation ; Biyoremediasyon = Bioremediation ; Sucul bakteriler = Aquatic bacteria ; Toprak bakterileri = Soil bacteria

Özet:
2,4,6-trinitrotoluen (TNT) şok ve sürtünmeye karşı kısmen duyarsız olması nedeniyle en yaygın kullanılan askeri yüksek patlayıcılardan biridir. Birçok aktif ve eski askeri tesislerdeki patlayıcı kirliliğinin büyük bir kısmı TNT'den kaynaklanmaktadır. Askeri bölgelerde toprak ve yeraltı sularındaki TNT kirliliğinin biyolojik temelli teknolojiler ile remediasyonu insan sağlığı ve ekosistem açısından oldukça önemlidir, çünkü bu teknolojiler doğal yollarla gerçekleşen, düşük maliyetli ve çevre dostu yaklaşımlardır. 

Bu çalışmada, TNT'yi azot kaynağı olarak kullanabilen ve yüksek TNT parçalama kapasitesine sahip bakteri suşları mikrobiyolojik yöntemlerle yıllardır TNT kirliliğine maruz kaldığı bilinen Kırıkkale'nin bir bölgesinden alınan toprak ve su örneklerinden izole edilmiştir. Alınan toprak ve su örneklerindeki TNT miktarının spektrofotometrik analizlerle 49-346 mg/kg arasında olduğu belirlenmiştir. Toprak örneklerinden 19, su örneğinden 5 toplamda 24 bakteri suşu elde edilmiştir. İzole edilen bakteriler azot kaynağı olarak sadece TNT bulunan besiyerinde kültür edilmiş ve izolatların TNT yıkım kapasiteleri besiyerinden belirli aralıklarla alınan örneklerin spektrofotometrik analizleri ile tespit edilmiştir. Yapılan analizlerin sonucuna göre, izolatlar arasında yüksek TNT parçalama kapasitesine sahip 6 bakteri izolatı seçilmiş ve seçilen izolatlar önce Gram-boyama sonrasında 16S rRNA dizi analizi yöntemi ile tanımlanmıştır. 16S rRNA dizi bölgelerine göre, toprak izolatları Klebsiella pneumoniae, Raoultella planticola,  Pseudomonas putida olarak ve su izolatları ise Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella pneumoniae, Raoultella planticola olarak tanımlanmıştır. Bu suşlarla yapılan TNT parçalama çalışmalarında, 24 saatlik inkübasyon süresi sonunda 100 mg/L TNT içeren besiyerinde TNT'nin parçalanma oranı toprak izolatları SÇ1 K1, SÇ1 K4 ve SÇ1 K5 için sırasıyla % 90, % 95 ve % 84, su izolatları SU K2, SU K3 ve SU K4 için sırasıyla % 70, % 96 ve % 93 olarak belirlenmiştir. İzolatlar tarafından TNT'nin parçalanması sırasında oluşan ara ürünler HPLC analizleri ile tespit edilmiştir. Bütün bakteri izolatlarının kültürlerinde 4-aminodinitrotoluen ve 2-aminodinitrotoluen birikimleri tespit edilmiş, hiçbir kültürde 2,4-dinitrotoluen veya 2,6-dinitrotoluen birikimlerine rastlanmamıştır. Ayıca, bütün izolatların kültür ortamında nitrit birikimi tespit edilmiştir. Bu çalışmada, izolatlar tarafından TNT'nin parçalanmasına sıcaklık ve pH'ın etkisi de araştırılmıştır. SÇ1 K1 ve SU K2 izolatlarının 35 °C'de, diğer izolatların 30 °C'de, en yüksek TNT parçalama kapasitesine sahip olduğu ve bütün izolatların pH 7'de TNT'yi en hızlı parçaladıkları, daha asidik veya daha bazik kültür ortamlarında bütün izolatların TNT parçalama kapasitelerinin azaldığı belirlenmiştir. Yapılan araştırma sonucunda izole edilen bakteri türlerinin, yüksek TNT parçalama kapasitesine sahip oldukları ve TNT ile kirlenmiş bölgelerin arıtılmasında güvenli ve etkili bir şekilde kullanılabilecekleri sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
2,4,6-trinitrotoluene (TNT) is one of the most widely used military high explosives because of its relatively insensitive against shock and friction. A large part of explosive contaminations at many active and former military plants has been arisen from TNT. Remediation of TNT contaminations in soil and groundwater at military sites with biologically based technologies is very important in terms of human health and ecosystem, because these technologies are cost-effective and environmentally friendly approaches that occur naturally.

In this study, bacterial strains that can use TNT as nitrogen source and have high TNT degradation capacity were isolated with microbiological methods from soil and water samples collected from a region in Kırıkkale that has been known to be exposed TNT contamination for years. The amounts of TNT in collected samples were determined to be between 49-346 mg/kg by spectrophotometric analysis. 19 from soil samples, 5 from water sample, totally 24 bacterial strains were obtained. Isolated bacteria were cultured in medium containing TNT as a sole nitrogen source and TNT degradation capacities of isolates were determined by spectrophotometric analysis of samples taken at regular intervals from the medium. According to the results of the analysis that have done, 6 bacterial isolates that have high TNT degradation capacity were selected between isolates and selected isolates have been identified with firstly Gram-staining then with 16S rRNA sequence analysis method. According to the sequence of 16S rRNA, soil isolates were identified as Klebsiella pneumoniae, Raoultella planticola, Pseudomonas putida and water isolates were identified as Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella pneumoniae, Raoultella planticola. During the TNT degradation studies with these strains, at the end of 24 h incubation time, in the medium containing 100 mg/L TNT, TNT degradation rate for soil isolates SÇ1 K1, SÇ1 K4 and SÇ1 K5 were determined 90 %, 95 % and 84 % respectively, TNT degradation rate for water isolates SU K2, SU K3 and SU K4 were determined 70 %, 96 % and 93 % respectively. Intermediate products formed during the degradation of TNT by the isolates were determined by HPLC analysis. 4-aminodinitrotoluene and 2-aminodinitrotoluene accumulations were detected in the culture medium of all bacterial isolates, but 2,4-dinitrotoluene or 2,6-dinitrotoluene accumulations were not found in any culture. Additionally, nitrite accumulation was detected in the culture medium of all isolates. In this study, the influence of temperature and pH on the degradation of TNT by the isolates was also investigated. It was determined that SÇ1 K1 and SU K2 isolates have the highest TNT degradation capacity at 35 °C, the others have at 30 °C and all isolates degraded TNT fastest at pH 7, toward to more acidic or more basic culture mediums the TNT degradation capacity of all isolates decreased. At the end of the research, it was concluded that the isolated strains have high TNT degradation capacity and they can be used safely and effectively in the remediation of contaminated areas with TNT.