İnterlökin – 1 reseptör antagonisti ve RNA polimeraz inhibitörünün hipokampal hücre hattında nörodejenerasyon üzerine etkilerinin araştırılması
Evaluation of the effects of interleukin – 1  receptor antagonist and RNA polimerase inbitor on neurodegenaration in hippocampal cell line
Yazar: MEHTAP ŞAHİN
Danışman: DOÇ. DR. AHMET KEMAL FİLİZ
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Fizyoloji = Physiology

Özet:
Glutamat, çeşitli nörofizyolojik fonksiyonlarda yer alan merkezi sinir sisteminin (CNS) ana uyarıcı nörotransmitteridir. Hem enfeksiyöz hem de enfeksiyöz olmayan durumlarda, aşırı hücre dışı serebral glutamat tarafından indüklenen eksitotoksisitenin tetiklendiği bilinmektedir. Homeostazın bozulması nöronlara zarar verebilir ve bu da sonunda hücre ölümüne yol açabilir. Eksitotoksisite olarak adlandırılan bu patolojik süreç, spesifik iyonotropik reseptörleri üzerinde glutamatın aşırı uyarılmasını takiben nöral hücrelerin dejenerasyonunu indükleyebilir. Bu reseptörlerin aktivasyonu, serbest radikal üretimi, mitokondriyal disfonksiyon ve normal hücre gelişimi ve fonksiyonunda yer alan çeşitli enzimlerin aktivasyonunu içeren bir dizi olay aracılığıyla eksitotoksisiteye aracılık edebilen nöral Ca2 akışı ile sonuçlanır ve hücrede zar, hücre iskeleti ve DNA da hasara neden olur. 
Glutamata olan aşırı duyarlılığı nedeniyle hipokampal HT22 hücre hattı nörodejeneratif hastalıkları modelleme de kullanılmaktadır. Glutamatla çeşitli hücre hatlarında daha önce sitotoksiteyle ilgili çalışmalar yapılmıştır. İnterlökin-1 reseptör antagonisti (anakinra); birçok otoinflamatuvar hastalıkta inflamasyonun önlenmesinde kullanılmaktadır. Çalışmamızın amacı bir RNA polimeraz inhibitörü; favipravirin ve İnterlökin-1 reseptörü anakinranın, anti-nörodejeneratif etkilerini hipokampal hücrelerde glutamatla oluşturulacak sitotoksisite yanı sıra hücre canlılığı (viabilite) araştırılması amaçlandı. Bu açıdan da glutamata olan aşırı duyarlılığı nedeniyle HT22 hücre hattı kullanıldı.
Hücreler %10'luk fetal sığır serumu, %1'lik penisilin- streptomisin ve %1'lik L-glutamin içeren DMEM'de kültüre edildi. 37 C de % 5 CO2 ile nemlendirilmiş  inkübatörde çoğalması sağlandı. Hücreler % 80-90 yoğunluğa ulaşınca 3 kez pasajlama yapılıp 96'lık platelere her bir kuyucukta 1x104 hücre olacak şekilde ekim yapıldı. Kontrol, glutamat (10 mM), anakinra (1, 10, 25, 50 ve 100 µg), favipravir (1, 10, 25, 50 ve 100 µg) ve anakinra+favipravir hücre grupları oluşturuldu Kontrol grubuna herhangi bir tedavi uygulanmadı. Glutamat ile indüklenen grubun hücrelerine 24 saat boyunca 10 mM glutamat verildi. Anakinra grubundaki hücrelere 24 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlarda (1,10, 25, 50 ve 100 µg) anakinra verildi. Favipravir grubundaki hücrelere 24 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlarda (1, 10, 25, 50 ve 100 µg) favipravir verildi. Anakinra+glutamat grubundaki hücreler, 1 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda (1, 10, 25, 50 ve 100 µg) anakinra ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından 24 saat boyunca 10 mM glutamat uygulandı. Favipiravir+glutamat grubundaki hücreler, 1 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda (1, 10, 25, 50 ve 100 µg) favipiravir ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından 24 saat boyunca 10 mM glutamat uygulandı. Ardından etkili dozlar belirlenerek anakinra+favipiavir+glutamattan oluşan kombinasyonları uygulandı. Hücre canlılığı XTT testi kullanılarak değerlendirildi.
Favipravirin HT22 hücre hattında glutamat uygulaması sonrası hücre canlılığı yani viabilite üzerine etkinliğinin olmadığı gözlendi. Yani yalnızca favipravirin farklı dozlarının uygulanmasınında viabilite üzerinde herhangi bir etkisi gözlenmedi (p< 0.01 kontrole göre). Anakinranın HT22 hücre hattında glutamat uygulaması sonrası hücre canlılığı yani viabilite üzerine etkisine baktığımızda ise 100 µg anakinra uygulanan grupta hücre canlılığının diğer gruplara göre daha fazla olduğu gözlendi (p<0.01 glutamata göre). Yani yalnızca anakinranın farklı dozlarının uygulanmasınında viabilite üzerinde herhangi bir etkisi gözlenmedi (p< 0.01 kontrole göre). Fakat Glutamatla HT22 hücre hattında oluşturulan sitotoksisitenin anakinra 100 µg uygulamasıyla önlendiği gözlendi. Anakinranın bu dozda nörodejenerasyon üzerine koruyucu etkisi izlendi. Anakinra + favipravir+glutamat kombine uygulanan grupta ise anakinranın glutamat toksisitesine karşı koruyucu fakat anakinra+favipravir kombinasyonu bu etkiyi değiştirmediği gözlendi.
Ancak bu etkinin klinik yansımaları için daha kapsamlı hayvan model ve insan çalışmalarına ihtiyaç vardır.
Anahtar Kelimeler: Nörödejenerasyon, Hipokampal hücre hattı, interlökin-1 reseptör antagonisti, RNA polimeraz inhibitörü.

Abstract:
Glutamate is the principal excitatory neurotransmitter in the central nervous system (CNS) involved in various neurophysiological functions. Both in infectious and non-infectious conditions, excessive extracellular cerebral glutamate-induced excitotoxicity is known to be triggered. Disruption of its homeostasis can be detrimental to neurons and ultimately lead to cell death. This pathological process, known as excitotoxicity, can induce neuronal cell degeneration following the overstimulation of glutamate on specific ionotropic receptors. Activation of these receptors results in neural calcium influx, which can mediate excitotoxicity through a cascade of events, including free radical production, mitochondrial dysfunction, and activation of various enzymes involved in normal cell development and function, leading to damage to the cell membrane, cytoskeleton, and DNA.
Due to their heightened sensitivity to glutamate, the hippocampal HT22 cell line is utilized for modeling neurodegenarative diseases. Previous studies have explored cytotoxicity related to glutamate in various cell lines. Interleukin-1 receptor antagonist (anakinra) is used for preventing inflammation in many autoinflammatory diseases. The aim of our study is to investigate the anti-inflammatory and/or anti-neurodegenerative effects of a RNA polymerase inhibitor, favipiravir, and anakinra. For this purpose, the HT22 cell line was employed, and cell cultures were maintained under appropriate conditions.
Five groups of cells were established to examine the effect of anakinra and favipiravir on glutamate-induced cytotoxicity. The control group received no treatment. The group induced with glutamate received 10 mM of glutamate for 24 hours. The anakinra group was exposed to different concentrations (1, 10, 25, 50, and 100 µg) of anakinra for 24 hours. The favipiravir group was exposed to different concentrations (1, 10, 25, 50, and 100 µg) of favipiravir for 24 hours. The anakinra+glutamate group was pre-treated with anakinra at various concentrations (1, 10, 25, 50, and 100 µg) for 1 hour and then exposed to 10 mM of glutamate for 24 hours. The favipiravir+glutamate group was pre-treated with favipiravir at various concentrations (1, 10, 25, 50, and 100 µg) for 1 hour and then exposed to 10 mM of glutamate for 24 hours. Effective doses were subsequently determined, and combinations of anakinra+favipiravir+glutamate were applied. Cell viability was assessed using the XTT test.
The results indicate that favipiravir did not have any effect on cell viability after glutamate application in the HT22 cell line. Viability was not affected by the application of different doses of favipiravir alone (p < 0.01 compared to the control group). When examining the effect of anakinra on cell viability after glutamate application in the HT22 cell line, it was observed that the group treated with 100 µg anakinra showed higher viability compared to other groups (p < 0.01 compared to glutamate). Viability was not affected by the application of different doses of anakinra alone (p< 0.01 compared to the control group). However, anakinra was observed to prevent the cytotoxicity induced by glutamate in the HT22 cell line when applied at 100 µg, exhibiting a protective effect on neurodegeneration at this dose. In the group where anakinra and favipiravir were combined and applied with glutamate, anakinra showed a protective effect against glutamate toxicity, but the combination of anakinra and favipiravir did not alter this effect.
However, for the clinical implications of these findings, more extensive animal models and human studies are required.
Keywords: Neurodegeneration, Hippocampal cell line, interleukin-1 receptor antagonist, RNA polimerase inhibitor.