Koruyucu yeni nesil peptid aşı modelleri: Viral kuduz hastalığı peptidlerinin çeşitli adjuvantlarla biyokonjugatlarının geliştirilmesi
New generation protective peptide vaccine models: Development of bioconjugates of rabies viral peptides with various adjuvants
Yazar: PELİN PELİT ARAYICI
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ZEYNEP AKDESTE ; YRD. DOÇ. DR. MESUT KARAHAN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Polifonksiyonel polimer sistemlerdeki yapılan araştırmalar temel bilim ve biyomühendislik alanlarında yeni fırsatlara imkan sağlamaktadır. Bu çalışmada sentetik polielektrolitlerin peptidlerle etkileşim mekanizması ve fonksiyonel biyopolimer sistemlerin oluşmasındaki fizikokimyasal kriterleri incelenmiştir. Pastör aşı yöntemine alternatif aşı olarak geliştirilen yeni yaklaşımların ve yöntemlerin temelinde, hastalık etkeni mikrop ve virüslerin yapısındaki antijenleri (peptid, lipopolisakkarit vb.) elde etme, onları sentetik olarak üretme ve bu yolla aşı geliştirme anlayışı yatmaktadır. 
Bu tez çalışmasında kuduz hastalık virüsü (Rabies virus) proteininin antijenik özellik gösteren peptid epitoplarından 31D (WAVYTRIMMNGGRLKRC) dizisi mikrodalga enerjisi kullanılarak katı faz peptid sentez yöntemiyle peptid sentez cihazında (Liberty Mikrodalga Destekli Katı Faz Peptid Sentez Cihazı) sentezlenmiştir. Saflaştırma ve  karakterizasyonu yapılan peptidin "1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorid (EDC)" çapraz bağlayıcısı varlığında Poliakrilik asid (PAA) ve Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasit) [P(VP-ko-AA)] ile suda çözünebilen polimer-peptid biyokonjugatları sentezlenmiştir. Bu çalışmada taşıyıcı molekül olarak kullanılacak olan Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasit) kopolimeri sentezlenmiş ve yapı işlev analizleri yapılmıştır. Biyokonjugatlar PAA polimerinin sabit, peptidin farklı oranlarında (npep/nPAA) ve peptidin sabit, polimerin farklı oranlarında (nPAA/npep) olacak şekilde sentezlenmiştir. Hazırlanan biyokonjugatların karakterizasyonları HPLC, GPC ( UV, Krılma İndisi, İşık Saçilması dedektörleri) , Zetasizer ve FTIR ile yapılmıştır. Kuduz hastalığı virüs proteininin 31D dizisinin P(VP-ko-AA) polimerinin sabit, peptidin farklı oranlarında (npep/nPAA) EDC aktivasyonu metoduna göre 2 farklı yöntem kullanılarak konjugatları sentezlenmiş ve karakterizasyonları HPLC, GPC ( UV, Krılma İndisi, İşık Saçilması dedektörleri) , Zetasizer ve FTIR ile yapılmıştır ve konjugatların sitotoksik etkileri MTT MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) yöntemi ile insan epitel hücreleri kullanılarak incelenmiştir.
Kuduz hastalık virüsü 31D dizisinin Poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) polimeri ile boş ve peptid yüklü nanopartikülleri oluşturulmuştur. Boyut analizi için Zeta Sizer cihazı, morfolojik incelemler için ise AFM ve SEM cihazları kullanılmıştır. Peptid yüklü nanopartiküllerin biyouyumluluğunun incelenmesi amacıyla MTT sitotoksisite testi ile yapılmıştır. Nanopartiküllerin bozunmasını floresan mikroskobunda görmek amacıyla FITC boya yüklü PLGA nanopartikülü ve hem FITC hem de peptid yüklü PLGA nanopartikülleri üretilmiştir. 
Son yılların en gündemde olan bilim dallarından biri olan nanoteknolojiyi de kullanılarak kuduz hastalığına karşı yeni türde nanopartiküller oluşturulması, ileriki çalışmalarımızda aşı prototiplerinin geliştirilmesi için ümit vadetmektedir. Bu çalışmadan alınan sonuçlar ile, yeni nesil hem düz zincirli hem de nano yapılı Peptid-Polimer aşı prototiplerinin oluşturulmasına ışık tutulacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Researches which conducted in polyfunctional polymer systems provide new opportunities in the basic science and bioengineering fields. In this study, mechanism of interaction between synthetic polyelectrolytes and peptides, and physicochemical criterias for the occurence of functional biopolymer systems were investigated. To obtain disease germ and virus antigens (peptide, liopolysaccharide, etc.), produce them synthetically and thus develop vaccine lies on the basis of the new approaches and methods which are alternative for Pastor vaccine method. 
In this thesis, rabies virus protein's peptid epitope 31D (WAVYTRIMMNGGRLKRC) sequence which shows antigenic properties was synthesized with solid phase peptide synthesis methods using microwave energy in the peptide synthesizer (Liberty Microwave Assisted Solid Phase Peptide Synthesis Tool). Purified and characterizeid peptide's water-soluble polymer-peptide bioconjugates were synthesized in the presence of crosslinker '1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) with Polyacrilic acid (PAA) and Poly(N-vinyl-2-pyrrolidone-co-acrylic acid) [P(VP -co-AA)]. In this study, poly(N-vinyl-2-pyrrolidone-co-acrylic acid) copolymers which will be used as carrier molecule were synthesized and it's structure-function analysis were performed.  Bioconjugates were synthesized as PAA polymer is constant, peptide has different rates (npep/nPAA), and peptide is constant, polymer has different rates (nPAA/npep), respectively.  The characterization of prepared bioconjugates  are made with HPLC, GPC (UV, refractive index, light scattering detectors), Zetasizer and FTIR.  Rabies virus protein of 31D peptide epitope sequence's bioconjugates which P(VP-co-AA) is constant and peptide has different rates (npep / NPAA) were synthesized with two methods according to EDC activation method and its characterization were made with HPLC, GPC (UV, refractive index, light scattering detectors), Zetasizer and FTIR. Conjugates' cytotoxic effects are examined using MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) method.
Peptid loaded nanoparticles were formed with rabies virus of 31D sequence and Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA). Zeta Sizer equepment was used for dimensional analysis and AFM and SEM equepments were used for morphological  analysis. MTT cytotoxicity assay was performed for the examination bioavailability of peptide-loaded nanoparticles.  FITC-loaded PLGA nanoparticles and both FITC and peptide loaded nanoparticles were synthesized to see the degredation of nanoparticles in florescence microscopy.  
Formation of new generation nanoparticles against rabies virus using nanotechnology which is one of the disciplines in the agenda of the last years holds promise for the development of vaccine prototypes in our future works. The results from this study are expected to be helped for formation of both straight chain and nano-structured peptide-polymer vaccine prototypes.