Plum pox virus-türkiye izolatlarının tüm genom analizleri ve filogenetik ilişkilerinin belirlenmesi
Complete genome analysis and phylogenetic relationship of turkish isolates of Plum pox virus
Yazar: AHMET CEYLAN
Danışman: DOÇ. DR. MİKAİL AKBULUT ; YRD. DOÇ. DR. KAHRAMAN GÜRCAN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Sharka hastalığı = Sharka disease

Özet:
Şarka hastalığı etmeni olan Plum pox virüs (PPV), Potyviridae familyasının bir üyesidir. PPV, sert çekirdekli meyve endüstrisini etkileyen oldukça zararlı bir virüstür. Avrupa, Kuzey Afrika, Kuzey ve Güney Amerika ve Asya'da yayılış göstermektedir. Türkiye'de bölgesel düzeydeki enfeksiyonları oldukça yoğundur. PPV'nin şimdiye kadar 9 ırkı (D, M, T, EA, Rec, W, C, CR ve An) tanımlanmış olup, pozitif anlamlı tek zincirli RNA içermektedir. PPV-T (Türkiye) ırkı Türkiye'ye endemiktir. Bu çalışmada DAS-ELISA ve RT-PCR yöntemleri ile PPV açısından pozitif örnekler tespit edilmiş, yoğun mutasyon gösteren virüslerin kısmi dizi analizleri gerçekleştirilerek, en farklı 20 PPV-T izolatı seçilmiştir. Bu izolatlar için kurulan cDNA kütüphaneleri 20 primer çifti ile ortalama 500 baz çifti (bç) uzunluğunda parçalar üretecek şekilde çoğaltılmış ve parçalar sanger yöntemi ile dizilenmiştir. Diziler birleştirilerek PPV-T izolatlarının tüm genomları elde edilmiştir. Genom dizi analizlerimiz sonucunda, PPV-T izolatlarının diğer PPV izolatları ile benzer genomik yapı gösterdiği belirlenmiştir. PPV-T ırklarının RNA genomu 3'-terminal bölgesindeki poly(A) kuyruğu hariç 9786 nt uzunluğunda olup, 3140 amino asit kodlamaktadır. Başlama kodonu 147-149. nt pozisyonunda, bitiş kodonu ise 9567-9569. nt pozisyonunda bulunmaktadır. Büyük bir poliprotein olarak ifade edilen genom, proteolitik süreçle en az 10 farklı proteine (P1, HcPro, P3,  6K1, CI, 6K2, NIa, NIb, ve CP) dönüştürülür. Buna ek olarak PİPO olarak adlandırılan P3 gen bölgesi içinden kodlanan küçük bir ORF'de bulunmaktadır. Bu genom organizasyonunun tüm PPV ırklarında olduğu gibi PPV-T izolatlarında da korunmuş olduğu gözlenmiştir. PPV-T izolatlarının tüm genom dizilerinin diğer 9 PPV ırkı ile karşılaştırıldığında benzerlik oranlarının % 78.1 ile % 94.8 arasında değiştiği belirlenmiştir. Filogenetik analizlerde iki ana grup belirlenmiş, I. ana grupta PPV-T, PPV-An, PPV-M, PPV-Rec, PPV-D ve PPV-EA ırkları yer almıştır. II.grupta ise PPV-W, PPV-CR ve PPV-C ırkları bulunmaktadır. Filogenetik analizde Türkiye'deki PPV-T izolatlarının iki ana gruba (Ta ve Tb) ayrıldığı görülmektedir. PPV-Tb grubuna giren izolatların diğer PPV ırkları ile olan tüm genom benzerliği PPV-Ta grubu izolatlarından daha fazla olduğu saptanmıştır. Rekombinasyon analizlerimiz sonucu PPV-T ırklarına ait izolatların hepsinde genomun 5'ucunda mozaik yapıda rekombinasyon olduğu tespit edilmiştir. Rekombinant PPV-T ırklarında, PPV-D ve  PPV-An ırklarından gelen iki kırılma noktası belirlenmiştir.

Abstract:
Plum pox virus (PPV), causal agent of sharka disease, is a member of Potyviridae family. Sharka is the most destructive disease of stone fruit industry. It is widely spread throughout Europe, North Africa, South and North America, and Asia. It is locally distributed in Turkey and some regions are heavily infected. Up to date, nine strains of the PPV (D, M, T, EA, Rec, W, C, CR and An) have been identified. The virus contains positive sense single stranded RNA and PPV-Turkey (T) strain is endemic to Turkey. In this study, PPV infected samples were verified by DAS-ELISA and RT-PCR methods and highly variable strains were partially sequenced and the most diverse 20 PPV-T isolates were selected. Average 500 bp fragment of cDNA library of those isolates were constructed by using 20 primers and sequenced by sanger sequencing method. Whole genome sequence of PPV-T isolates were obtained by assembling the  fragments. Sequence analysis indicated that genomes of PPV-T isolates were highly similar to other PPV isolates. Excluding Poly(A) tail at the 3' end of the genome, genomic RNA consist of 9786 nucleotide and codes for 3140 amino acid. Initiation and termination codons are located at 147-149 positions and 9567-9569, respectively. The genome is expressed as a large polyprotein precursor which is proteolytically processed to in at least ten final products (P1, HCPro, P3, 6K1, CI, 6K2, VPg, NIapro, NIb and CP). In addition, a small overlapping ORF, called PIPO, is encoded within the P3 cistron. As it is observed in all PPV strains, the genome organization is conserved among the studied PPV-T isolates. The similarity index of whole genome sequence with other 9 strains of PPV have found to be in the range of 78.1 % and 94.8 %. Phylogenetic analysis indicated two major subgroup. While PPV-T, PPV-An, PPV-M, PPV-Rec, PPV-D and PPV-EA strains were placed in subgroup I, PPV-W, PPV-C and PPV-CR strains were placed in subgroup II. PPV-T isolates were clustered into two major groups (PPV-Ta and PPV-Tb) in Turkey. Whole genome sequence similarity of PPV-Tb isolates to other PPV strains were considerably higher than PPV-Ta isolates. Recombination analysis indicated a mosaic structure recombination in the genome of 5'terminal of all PPV-T strains. It was identified two break point in recombinant PPV-T strains drived from PPV-D and PPV-An.