Karbapeneme dirençli klebsiella pneumoniae suşlarında kolistin direncinin flow sitometri yöntemi ile araştırılması
Carbapenem resistant klebsiella pneumoniae strains' investigation of colistin resistance by flow cytometry
Yazar: ŞAFAK CEREN UÇAK
Danışman: PROF. DR. BETİGÜL ÖNGEN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı /  Tıbbi Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae

Özet:
Çalışmamızda, karbapeneme dirençli Klebsiella pneumoniae (KRKP) gibi dirençli bakteri enfeksiyonu olan hastaların tedavisine doğru antibiyotikle ve en kısa sürede başlanmasına olanak sağlamak üzere KRKP izolatlarında kolistin direncinin flow sitometri (FCM) yöntemiyle doğru ve hızlı bir şekilde saptanıp saptanamadığı ve bu yöntemin klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında rutin kullanıma uygun olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bakteriyoloji laboratuvarına rutin inceleme amacı ile gönderilen klinik hasta örneklerinden izole edilmiş ve rutin yöntemlerle karbapeneme dirençli olduğu belirlenmiş 85 K.  pneumoniae suşu çalışma kapsamına alınmıştır. Çalışmada K. pneumoniae suşlarının tür düzeyinde tanımlanması ayrıca karbapenem ve diğer antibiyotiklere direncinin saptanması için VITEK 2 otomatize sistemi kullanılmıştır. Karbapeneme dirençli olduğu doğrulanan 85 K. pneumoniae suşunun kolistin için MİK değerleri, referans yöntem olan sıvı mikrodilüsyon (SMD) yöntemiyle saptanmıştır. SMD yönteminde pozitif ve negatif kontrol olarak sırasıyla Escherichia coli NCTC 13846 (mcr-1 +) ve Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 suşları kullanılmıştır. Kolistin duyarlılığının saptanması için ayrıca flow sitometri (FCM) yöntemi uygulanmış ve hücreler canlı/ölü olarak katagorize edilmiştir.  Canlı/ölü hücre ayrımı için, antibiyotik muamelesinin neden olduğu bakteriyel membran potansiyel değişikliklerini saptayabilen DiBAC₄(3) floresan boyası kullanılmıştır. KRKP suşlarının tamamı sefazolin, sefuroksim, seftazidim ve piperasilin/tazobaktama, %98,8'i siprofloksasine, %88,2'si amikasine, %87'si trimetoprim/sülfametoksazole ve %83,5'i gentamisine dirençli bulunmuştur. SMD yöntemi ile 68'i (%80) kolistine dirençli, 17'si (%20) kolistine duyarlı bulunan suşların MİK₅₀ değerinin 16 μg/ml, MİK₉₀ değerinin ise 32 μg/ml olduğu saptanmıştır.  FCM yöntemi referans yöntemle karşılaştırıldığında her iki yöntem arasındaki kategorik uyumun %98,8 olduğu ayrıca FCM yönteminin özgüllüğünün %94, duyarlılığının %100, pozitif prediktif değerinin %98,5 ve negatif prediktif değerinin ise %100 olduğu belirlenmiştir. FCM yöntemi ile kolistin duyarlılık sonuçları ortalama 2 saatte elde edilmiştir. Sonuç olarak, FCM yönteminin K. pneumoniae suşlarında kolistin direncinin saptanmasında hızlı ve güvenilir bir yöntem olduğu ve klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında alternatif bir duyarlılık testi olarak kullanılabileceği görülmüştür.

Abstract:
In our study, it was aimed to investigate whether colistin resistance in carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) isolates can be detected accurately and quickly by flow cytometry (FCM) to allow the treatment of patients to be started with the right antibiotic and as soon as possible, and whether this method is suitable for routine use in clinical microbiology laboratories. Eighty five K. pneumoniae strains isolated from clinical patient samples sent to Istanbul Medical Faculty, Department of Medical Microbiology, Bacteriology laboratory for routine examination and determined to be resistant to carbapenem by routine methods were included in the study. In the study, the VITEK 2 automated system was used to identify K. pneumoniae strains at the species level and to determine their resistance to carbapenems and other antibiotics. MIC values for colistin of 85 K. pneumoniae strains confirmed to be carbapenem resistant were determined by the reference method, broth microdilution (BMD). Escherichia coli NCTC 13846 (mcr-1 +) and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 strains were used as positive and negative controls in the BMD method, respectively. Flow cytometry (FCM) method was also applied to determine colistin sensitivity and cells were categorized as live/dead. DiBAC₄(3) fluorescent dye, which can detect bacterial membrane potential changes induced by antibiotic treatment, was used for live/dead cell differentiation. All CRKP strains were resistant to cefazolin, cefuroxime, ceftazidime and piperacillin/tazobactam, 98.8% to ciprofloxacin, 88.2% to amikacin, 87% to trimethoprim/sulfamethoxazole and 83.5% to gentamicin. According to the BMD method, 68 (80%) colistin-resistant strains, 17 (20%) colistin-sensitive strains were found. The MIC₅₀ value of 16 µg/ml and the MIC₉₀ value was 32 µg/ml. When the FCM method was compared with the reference method, it was determined that the categorical agreement between the two methods was 98.8%, and the specificity of the FCM method was 94%, the sensitivity was 100%, the positive predictive value was 98.5%, and the negative predictive value was 100%. Colistin susceptibility results were obtained in an average of 2 hours with the FCM method. In conclusion, it was seen that the FCM method is a fast and reliable method for detecting colistin resistance in K. pneumoniae strains and can be used as an alternative susceptibility test in clinical microbiology laboratories.