DNA aşısı adayı leishmania infantum KMP-11 geninin klonlanması
Cloning DNA vaccine candidate KMP-11 gene of leishmania infantum
Yazar: ŞİRİN SAHRA CEYLAN
Danışman: PROF. DR. SALİH KUK
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Aşılama = Vaccination ; Aşılar = Vaccines ; DNA = DNA ; Genler = Genes ; Klonlama = Cloning ; Leishmania = Leishmania ; Leishmania infantum = Leishmania infantum ; Membran proteinleri = Membrane proteins

Özet:
Leishmania spp. mortalite ve morbiditeye sebep bir parazittir. Leishmaniasise sebep olan birçok tür bilinmektedir. Bunlar içerisinde Leishmania infantum özellikle çocuklarda visseral leishmaniasise (VL) sebep olmaktadır. Hastalık tedavi edilebilir olmasına rağmen kullanılan ilaçların etkinliğinin istenen seviyede olmaması, ilaçlara karşı direnç gelişmesi ve ilaçların yan etkilerinin fazla olması nedeniyle yeni ve etkili korunma ve kontrol önlemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Henüz parazite yönelik ticari bir aşı geliştirilememiştir. Aşı adayı olarak kullanılabilecek önemli moleküllerden birisi L. infantum kinetoplastid membran proteini (KMP)'dir. KMP-11, parazitin hem amastigot hem de promastigot evresinde salgılanması ve çalışmalarda leishmaniasise karşı Th1 ve Th2 immun yanıt oluşturması nedeniyle umut verici aşı adayları arasında kabul edilmiştir.
Ülkemizde ilk olarak yapılacak bu çalışma ile L.infantum KMP-11 gen bazlı DNA aşısının geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Çalışma basamaklarında ilk olarak, L.infantum promastigot kültürü yapılmış, kültüründen genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. Genomik DNA'dan gen spesifik primerlerle 276 bp büyüklüğünde KMP-11 DNA'sı PCR ile çoğaltılmıştır. KMP-11 geninin pcDNA3.1 plazmitine klonlama reaksiyonu ile yerleştirilmesiyle oluşan rekombinant plazmit, TOPO E.coli hücrelerine transforme edilmiştir. Transforme kolonilerdeki rekombinant plazmit varlığı PCR tarama ile doğrulanmış ve pozitif kolonilerden miniprep yapılarak rekombinant plazmit saflaştırıldıktan sonra PCR ve restriksiyon enzimleri (Kpn I ve Xpa I enzimi) ile kesilerek klonlama doğrulanmıştır. Sonrasında DNA dizi analizi ile KMP-11 gen dizisi belirlenerek klonlamanın doğruluğu kesinleştirilmiştir.
Bu çalışma sonrasında L.infantum KMP-11 geninin DNA aşısı olarak kullanılacak plazmite yerleştirilmesiyle oluşturulan rekombinant plazmit tek başına veya farklı antijenlerle immun sistemi stimüle edici adjuvantlarla kombine edilerek etkin aşıların elde edilmesine çalışılabilecektir.

Abstract:
Leishmania spp. is a parasite causes mortality and morbidity. Many species in this genus are known which causes leishmaniasis. Among these Leishmania infantum causes visceral leishmaniasis (VL) especially in children. Although leishmaniasis is a treatable disease, due to inadequate efficacy of the drugs used, development of resistance to drugs and side effects of drugs are requires to develop new effective prevention and control measures. There is no commercial vaccine has been developed against Leishmania parasite.
One of the important molecules that can be used as vaccine candidate against L.infantum is kinetoplastid membrane protein (KMP). KMP-11 is released by the parasite both amastigote and promastigote stages and creates Th1 and Th2 immune responses against leishmaniasis so this molecule has been recognized as one of the promising candidates by the vaccine researchers.
The aim of this study to develop L.infantum KMP-11 gene based DNA vaccine candidate and it is the first time in Turkey.
The first two steps in this study were to culture L.infantum promastigotes and to perform genomic DNA isolation from this culture. With gene specific primers 276 bp KMP-11 DNA was amplified from genomic DNA by PCR. KMP-11 gene was cloned into pcDNA3.1 plasmid and obtained recombinant plasmids were transformed into TOPO E.coli cells. Presence of recombinant plasmids in transformed colonies was verified by PCR screening, recombinant plasmids were purified from positive colonies by miniprep and cloning was verified by cutting restriction enzymes (Kpn I and Xpa I). KMP-11 gene sequence was obtained by DNA sequence analysis and cloning was comfirmed.
Produced recombinant plasmid by transformantion of KMP-11 gene into plasmid can be used as a DNA vaccine alone, with different antigens or in combination with immune-stimulating adjuvants. This study could be attempt to obtain effective vaccines.