Kolon adenokarsinomlarında tümör/stroma oranı, tümör kök hücreleri ile entropinin ilişkisi ve prognostik önemi
The relation and prognostic importance of proportion of tumor-stroma, tumor stem cells and entropy in colon adenocarcinoma
Yazar: YASEMİN ÇAKIR
Danışman: PROF. DR. SÜLEN SARIOĞLU
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Entropi = Entropy ; Kolon hastalıkları = Colonic diseases ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prognoz = Prognosis ; Stroma = Stroma

Özet:
Amaç/Hipotez: Bu araştırmada kolon tümörlerinde bir kısmı önceki çalışmalarda prognostik belirteç olarak tanımlanan, tümörde ve tümör invaziv kenarındaki tümör stroma heterojenitesinin belirteçleri olabilecek matematiksel öznitelikler olan tümör/stroma oranı, entropi ve karmaşıklığın tümöral kök hücreler, histopatolojik ve klinik prognostik belirteçler ile ilişkisinin ortaya konulması hedeflenmiştir. 
Yöntem: 
Radikal cerrahi ile tedavi edilmiş 248 hastanın hematoksilen ve eozin boyalı doku kesitlerinden, mikroskopik digital görüntüler alınmış ve çalışma grubumuz tarafından geliştirilen görüntü analizi programı ile tümör, stroma ve lümen işaretlenerek kaydedilmiştir. Daha sonra bu işaretlenmiş görüntülerde; oran, entropi ve karmaşıklık öznitelikleri ve her bir özniteliğe ait ortalama, en büyük, en küçük ve varyans değerleri tüm görüntülerde ve invaziv kenarı temsil eden son görüntülerde ayrı ayrı matematiksel olarak hesaplanmıştır. Ayrıca ana görüntüler içerisinde 8x8 ve 16x16 piksellik boyutlarda alt görüntüler oluşturularak tüm hesaplamalar bu alanlarda da gerçekleştirilmiştir. 
Kök hücreleri belirlemek üzere yüzey belirteçleri olduğu bildirilen CD133 ve Lgr5 antikorları ile immünhistokimyasal inceleme yapılmış ve semikantitatif olarak skorlanmıştır. 
Klinik, histopatolojik prognostik faktörler ve hesaplanan özniteliklerden elde edilen tüm veriler dahil edilerek elde edilen 80 ayrı parametre ile istatistiksel inceleme yapılmıştır. 

Bulgular: 
Cox regresyon analizinde ölüm riskinin; yaş ile 1,07; pN evresi ile 2,5; perinöral invazyon varlığı ile 2,2 kat; 8x8 piksellik alt görüntülerde maksimum Tümör/Stroma oranı ile 1,02 kat; 16x16 piksellik alt görüntülerde ortalama Tümör/Stroma oranı ile 1,2 kat ve invaziv kenarda hesaplanan entropi ile 1,9 kat arttığı saptanmıştır. 
Nüks riskinin ise pT evresi ile 2,4 kat, pN evresi ile 4,211 kat, 16x16'lık alt görüntülerde varyans Tümör/Stroma oranı ile 1,002 kat arttığı görülmüştür.
Uzak metastaz riskinin ise pT evresi ile 3,357 kat ve pN evresi ile 9,479 kat arttığı saptanmıştır. Yukarıda belirtilen tüm belirteçlerin, çok değişkenli analiz ile bağımsız değişken oldukları belirlenmiştir.
Tümör kök hücresi belirteçleri ile prognoz arasında ilişki saptanmamıştır. CD133 ekspresyonu ile tüm tümör ve invaziv kenar entropileri, Lgr5 ekspresyonu ile tümör/stroma oranı ve entropi öznitelik değerlerinde istatistiksel anlamlı farklılık olduğu ancak bu değerlerin skorlarla paralel olarak değişmediği görülmüştür.
Sonuçlar: 
Tümör/stroma oranı öznitelik hesaplamaları, birçok çalışmada belirtilenin aksine, tümör miktarındaki artış ile ölüm, nüks ve metastaz gelişimi arasında anlamlı ilişki bulunduğu ve tümör miktarındaki artışın ölüm  ve nüks gelişimi için bağımsız değişken olduğu bununla birlikte invaziv kenardaki entropi öznitelik değerindeki artışın çok değişkenli analizlerde de anlamlılığını koruyarak ölüm riskini artırdığı belirlenmiştir.
Kök hücre belirteçleri ile genel sağkalım, nüks ve metastaz gelişimi arasında istatistiksel anlamlı ilişki bulunmadığı bununla birlikte,  CD133 alt grupları arasında entropi ve karmaşıklık öznitelik ortalamaları, Lgr5 alt grupları arasında ise oran ve entropi öznitelik ortalamaları arasında anlamlı fark bulunduğu ancak bu değerlerin skorlarla paralel olarak değişmediği saptanmıştır.
Bu çalışmanın özgün bulgusu tümörlerde entropi, karmaşıklık özniteliklerinin tanımlanması ve  kolon tümörü invaziv kenarındaki tümör/stroma ilişkili entropinin hesaplanabilir bir bağımsız prognostik öznitelik olarak tanımlanmasıdır. Önceki çalışmalarda kantitatif değerlendirmeye dayanmayan stroma artışının prognostik önemli olma verisi, bu çalışmada kullanılan kantitatif yöntemle anlamlı bulunmamıştır. Kök hücre belirteçleri olarak kabul edilen LGR5 ve CD133 de prognostik ya da hesaplanabilir öznitelikler olarak bu seride anlamlı bulunmamışlardır.

Abstract:
Aim: In this study, the relationship and prognostic value of the tumor stem cells and  mathematical features including tumor/stroma proportion, entropy and complexity were evaluated. 
Method:
Microscopic digital images were captured from tissue slides stained with hematoxylin-eosin from 248 patients which was treated with radical surgery and tumor, stroma and lumen were manually marked and recorded by using an image analysis programme which was developed by our study group.  Mathematical calculation of  features proportion, entropy and complexity and mean, maksimum, minimum and variance values for each feature were calculated for the whole analysed tumor area and on images representing invasive side seperately. Also, sub-images with different sizes were formed in main images and all calculations were done for these sub-images of 8x8 and 16x16 pixels. 
Immunohistochemical examination with CD133 and Lgr5 antibodies, which are reported to be stem cell markers were scored semi quantitatively. 
Statistical analysis was done with 80 parameters including clinic, histopathologic prognostic and all data acquired by calculated features.
Results:
Cox regression analysis revealed an increase of death risk of, 1.07 fold for age, 2,5 fold for pN stage, 2,2 fold for perineural invasion, 1,02 fold for tumor stroma proportion at the maximum group of 8x8 pixel images, 1,2 fold for tumor stroma proportion at the mean group of 16x16 pixel images and 1,9 fold for entropy at the invasive tumor border. 
Recurrence risk increased 2,4 fold for pT, 4,21 fold for pN and 1,002 times for variance of tumor stroma proportion at 16x16 pixel images.
The risk of distant metastasis increased 3,357 times with pT stage, 9,479 times for pN stage.
There was no  relation with stem cell markers and prognosis. Statistically significant difference was identified for  entropy  feture values calculated in all tumor area and invasive side between CD133 subgroups and statistically significant difference was identified for entropy feature values and tumor/stroma proportion calculated in all tumor area between Lgr5 subgroups but these values did not change parallel to the scores.
Conclusions: 
In contrast to reports of many studies, calculations for tumor/stroma proportion showed that  statistical significance exists between tumor mass increase and death, recurrance and metastasis.  Also, it was determined that increase in tumor/stroma proportion increased the risk of death and recurrance;  increase in entropy fetaure value on invasive side increased the risk of death, as an independent prognostic factor in multivariant analysis.
No statistical significance was found between stem cell markers and overall survival, recurrance and metastasis. In CD133 subgroups, there is a significant difference between the mean of entropy and complexity features, in Lgr5 subgroups there is a significant difference between the mean of entropy and tumor/stroma proportion fetures but these values did not change parallel to the scores.
The original finding of this study is defining entropy and complexity features in tumors and  defining entropy related to tumor/stroma on invasive side of colon tumor as an independant prognostic feature. The prognostically important data acquired in previous studies showing an increase in stroma not related to quantitative evaluation was not found to be significant by the quantitative method used in this study.  Lgr5 and CD133, accepted as stem cell markers, were not found significant in this series as prognostic or  computable features.