Farklı somatik hücrelerle kültüre tabi tutulan ve in vitro yöntemle üretilen sığır embriyolarında vitrifikasyon ile derin dondurma
Co-culturing of in vitro-produced cattle embryos with different somatic cells and deep-freezing with vitrification method
Yazar: ŞEYMA AYDEMİR
Danışman: PROF. DR. FATİN CEDDEN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Bu çalışmanın amacı, in vitro koşullarında yüksek kriyotoleransa sahip embriyoları üreterek dondurulmuş embriyo üretmektir. Çalışmada mezbahada kesilen sığırların ovaryumları kullanılmıştır. Aspirasyon yöntemi ile elde edilen oositler (1632 adet) TCM-199'da 24 saat süreyle %5 CO2, %5 O2, %90 N2 gaz atmosferinde 38,5 °C de in vitro olarak olgunlaştırılmışlardır. Bu amaçla sırasıyla 4 grup oluşturulmuştur. Her bir IVM ortamında maturasyonu yapılan KOK'ler rastgele bir biçimde 4 farklı IVF ortamının içine konularak rastgele blok tasarımı oluşturulmuştur. Olgun oositler 24 saat süreyle fertilize edilmişlerdir. Fertilizasyon sonrası 48. saatte cleavage %67,05 (865/1290) saptanmıştır. Embriyolar 7 gün süreyle %5 CO2, %5 O2, %90 N2 gaz karışımında blastosist (%34,91; 302/865) aşamasına kadar inkübe edilmişlerdir. Zigot ve embriyolar taşıma ortamından (TCM199) 500 µL vitrifikasyon solüsyon 1'in (VS1) (5 M etilen glikol içeren taşıma ortamı) içine aktarılıp 3 dk sonra VS2'nin (7 M etilen glikol, %18 fikol 70 ve 0.5 M galaktoz içeren taşıma ortamı) içine aktarılarak payete doldurma zamanı dahil 45 sn'lik süre boyunca bu ortamda tutulmuştur. Erken blastosist-blastosist aşamasına ulaşan 302 adet embriyodan 254 tanesi vitrifikasyon solüsyonunda maruz bırakılarak dondurulmuşlardır. Zigot ve embriyolar open pulled payete yüklendikten sonra sıvı nitrojen içine daldırılıp dondurulmuştur. Verilerin değerlendirilmesinde Z testi kullanılmıştır. Çözdürme sonrası, genişlemiş blastosist-zona pellucida duvarından çıkma safhasında en iyi gelişim %52,2 (35/67) ile Grup 1 de saptanırken, bunu %45,3 (29/64) ile Grup 2, %22,2 (14/63) ile Grup 3 ve %5 (3/60) ile Grup 4 takip etmiştir. Grup 1 ve 2 arasında önemli bir fark bulunmamıştır. Grup 1 ile Grup 3 arasındaki fark P<0,01 düzeyinde, Grup 1 ile Grup 4 arasında ise P<0,001 düzeyinde önemli bulunmuştur. Ovidukt hücreleri ile ko-kültüre tabi tutulan ve dondurulup çözdürülen zigotlarda maturasyon, fertilizasyon, blastosist oluşum oranı ve blastosistlerin diğer kalite özellikleri iyileşmiştir.

Abstract:
The aim of this study is to produce deep-frozen embryos by producing of embryos with high cryotolerance in in-vitro conditions. In this study, slaughtered cattle ovaries were used. Oocytes (n=1632)  obtained  by using aspiration method were matured in their own group in TCM-199 medium for 24 h at a gas atmosphere of 5% CO2, 5% O2, and 90% N2 at 38.5°C. Four different groups were prepared then each of  maturated  COC group in every IVM medium were randomly distributed into 4 different  IVF media for block design. Matured oocytes were fertilized for 24 h. After fertilization cleavage rate was found as 67.05% (865/1290) at 48th h. Embryos were cultured up to early blastocyst-blastocyst stage (34.91%; 302/865)  for 7 days at a gas atmosphere of 5% CO2, 5% O2, and 90% N2 at 38.5 °C. Zygotes and embryos were  transported from TCM199 media into 500 µL  of vitrification solution 1 (VS1) (medium containing 5 M Ethylene glycol) then transferred into straws containing VS2(7 M Ethylene Glycol, %18 ficoll 70 and 0.5 M galactose) after 3 minute. Embryos were embedded into straws and remained in during 45 sec including embedding duration.  Among 302 embryos, 254 embryos at early blastocyst stage were frozen after an exposure to vitrification solution. Zygotes and embryos are immersed into liquid nitrogen after disposing in open pulled straws. Z test was used in this study. Post thaw development to expanded blastocyst stage was highest in Group 1 with 52.2% (35/67) followed by Group 2 with 45.3% (29/64), Group 3 with 22.2% (14/63) and Group 4 with 5% (3/60). No significant difference was observed between Groups 1 and 2. The difference between Group 1 and 3 was found as at the level P<0.01 whereas P<0,001 between Group 1 and 4, respectively.  Frozen-thawed zygotes which were co-cultured primarily with oviductal epithelial cells showed enhanced results regarding maturation, fertilization, blastocyst formation and other quality criteria.