Toxoplasma gondii'nin her üç dönemine etkili DNA aşı stratejisinin geliştirilmesi
Development of a DNA vaccine strategy effective against all three stages of Toxoplasma gondii
Yazar: CEREN GÜL
Danışman: PROF. DR. MERT DÖŞKAYA ; DOÇ. DR. AYSU DEĞİRMENCİ DÖŞKAYA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Aşı uygulaması =   ; Rekombinant DNA teknolojisi = Recombinant DNA technology ; Toksoplazmoz = Toxoplasmosis ; Toxoplasma gondii = Toxoplasma gondii

Özet:
Toxoplasma gondii (T. gondii) çeşitli endotermik organizmaları enfekte edebilen üç farklı enfektif formu bulunan hücre içi zorunlu bir parazittir. Dünya nüfusunun üçte birini enfekte ettiği bilinmektedir. Parazitin neden olduğu enfeksiyon toksoplazmozis olarak adlandırılmaktadır ve bu hastalığın, takizoitlerin neden olduğu akut ve doku kistlerinin neden olduğu kronik toksoplazmozis başta olmak üzere farklı çeşitleri bulunmaktadır. Bağışıklığı baskılanmış kişilerde ölümcül beyin lezyonlarına bağlı olarak toksoplazmik ensefalit oluşumu gibi ciddi klinik sonuçlara sebep olmasının yanında bu parazitin hamilelik sırasında düşüklere neden olduğu bilinmektedir. Günümüzde toksoplazmozise karşı koyun ve keçilerde düşükleri engellemek üzere canlı-zayıflatılmış bir aşı mevcuttur. Bu aşının virülan forma geri dönme riski sebebiyle insanlarda kullanımı güvenli bulunmamaktadır. Sonuçta toksoplazmozise karşı koruyucu bir aşıya ihtiyaç duyulmaktadır. Bu sebeplerle bu tezde, T. gondii'nin her üç dönemine etkili DNA aşısının geliştirilmesi, aşının BALB/c fareleri üzerindeki immünojenisitesinin ve koruyuculuğunun belirlenmesi amaçlanmıştır.
T. gondii'nin her üç formunda eksprese edildiği bilinen SRS13 proteini ile ilgili yapılan in silico analizlerde proteinin doğal yapısında kararsız olduğu belirlenmiş ve bu sebeple SRS13 proteini T ve B hücre epitop bölgelerini içerecek şekilde kısaltılarak, protein çözünür, kararlı ve yüksek antijenik hale getirilmiştir. Sonrasında tasarlanan SRS13 geni pVAX1 vektörüne klonlanarak pVAX1-SRS13 DNA aşısı oluşturulmuştur ve aşının protein ekspresyon profili insan embriyonik böbrek (HEK293T) hücrelerinde Western blot ve immünfloresan antikor boyama testi ile belirlenmiştir. Aşının immünojenisitesinin belirlenmesi için BALB/c fareleri intramüsküler (IM) yoldan ve elektroporasyon cihazı kullanılarak intradermal (ID+EP) yoldan üç kez aşılanmıştır. Humoral immün yanıtın belirlenmesi için Western blot ve enzim bağlı immünosorbent analizi (ELISA) testleri gerçekleştirilmiş, hücresel immün yanıt ise akış sitometrisi, sitokin ELISA ve MTT testleri ile belirlenmiştir. Ayrıca aşının koruyuculuğunun belirlenmesi için aşılanmış BALB/c farelerine oral yoldan T. gondii PRU suşuna ait doku kistleri verilmiştir. Sağ kalan farelerin beyinlerindeki doku kisti sayısı mikroskopi yöntemi ile belirlenirken T. gondii DNA konsantrasyonu gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) yöntemi ile belirlenmiştir. 
Elde edilen sonuçlara göre pVAX1-SRS13 aşısı HEK293T hücrelerinde rekombinant SRS13 proteinini (rSRS13) eksprese etmiş ve BALB/c farelerinde antijen spesifik IgG antikorunu indüklemiştir. Antijen olarak TLA ve rSRS13 kullanılan ELISA testinde pVAX1-SRS13 (IM) grubundaki farelerin kontrol grubundakilere göre sırasıyla 6 kat ve 2 kat daha yüksek IgG yanıtı uyardığı belirlenmiştir (p=0,0090, p=0,0019). pVAX1-SRS13 (IM) ve pVAX1-SRS13 (EP) ile grubundaki farelerde IFN-γ salgılayan CD8+ T hücrelerinin yüzdelerinin kontrol gruplarına kıyasla sırasıyla ~2 kat (P=0,0319) ve ~4 kat (P= 0,0005) daha yüksek olduğu, buna ek olarak pVAX1-SRS13 (EP) grubundaki farelerde IFN-γ salgılayan CD8+ T hücrelerinin yüzdelerinin pVAX1-SRS13 (IM) grubundakilere kıyasla ~2 kat daha yüksek olduğu (P=0,0487) saptanmıştır. IFN-γ salgılayan CD4+ T hücrelerinin yüzdesinin pVAX1-SRS13 (EP) grubunda kontrol grubuna kıyasla ~2 kat daha yüksek olduğu saptanmıştır (P=0,0134). Mikroskopi sonrası elde edilen verilere göre doku kisti sayılarının her iki aşı grubunda kontrol gruplarına kıyasla ~2 kat azaldığı saptanmıştır (p=0,0202, p=0,0276). Gerçek zamanlı PZR sonrası elde edilen konsantrasyon değerlerine göre aşı gruplarında kontrol gruplarına kıyasla istatistiksel olarak daha düşük oranda T. gondii DNA konsantrasyonu olduğu saptanmıştır (P= 0,0476, P=0,0159). 
Sonuç olarak pVAX1-SRS13 DNA aşısının tek başına IM yoldan ve ID+EP ile uygulanmasıyla güçlü hücresel ve humoral immün yanıtı uyardığı ve kronik toksoplazmozise karşı koruma sağlamada umut vadeden bir aday olabileceği belirlenmiştir.

Abstract:
Toxoplasma gondii (T. gondii) is an obligate intracellular parasite with three different infectious forms that can infect a variety of endothermic organisms and is known to infect one-third of the world's population because of its complex life cycle. Toxoplasmosis is an infection caused by the parasite. There are different types of the disease, which is chronic toxoplasmosis caused by bradyzoites and acute toxoplasmosis caused by tachyzoites. In addition to causing serious consequences such as the occurrence of toxoplasmic encephalitis due to life-threatening brain lesions in immunocompromised individuals, it can also cause abortions during pregnancy. Though a live-attenuated vaccine against toxoplasmosis has been developed to prevent abortion in sheep and goats, it is not safe for use in humans due to the risk of it converting to the virulent form. This thesis aimed to develop a DNA vaccine effective against all three stages of T. gondii and determine the immunogenicity and protective efficacy of the DNA vaccine in BALB/c mice.
In silico analysis showed that the wild-type SRS13 protein, which is known to be expressed in all three forms of T. gondii, was determined unstable. For this reason, protein was minimized including T and B cell epitope regions to a soluble, stable and highly antigenic protein. The designed SRS13 gene was cloned into the pVAX1 vector to generate the pVAX1-SRS13 DNA vaccine, and the protein expression profile of the vaccine was determined in human embryonic kidney (HEK293T) cells by Western blot and immunofluorescent antibody staining assay. To determine the immunogenicity of the vaccine, BALB/c mice were immunized three times with naked pVAX1-SRS13, either intramuscularly (IM) or intradermally, using an electroporation device (ID+EP). While Western blot, and recombinant ELISA assays were performed to determine the humoral immune response, the cellular immune response was determined by flow cytometry, cytokine ELISA, and MTT tests. In addition, to determine the protective efficacy of the DNA vaccine, BALB/c mice were given orally tissue cysts of the T. gondii PRU strain. The number of tissue cysts in the brains of surviving mice was determined by microscopy, while the T. gondii DNA concentration was determined by the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).
The pVAX1-SRS13 DNA vaccine expressed the SRS13 protein in HEK293T cells and induced antigen-specific IgG antibodies in BALB/c mice. In the ELISA test performed to determine the humoral immune response, it was determined that TLA and rSRS13 proteins formed a complex with IgG antibodies in the serum of mice in the pVAX1-SRS13 (IM) group and stimulated ~6-fold and ~2-fold higher IgG response, respectively (p=0.0090, p=0.0019). The percentage of IFN-γ secreting CD8+ T cells in mice immunized with pVAX1-SRS13 (IM) and pVAX1-SRS13 (EP) were ~2-fold (P=0.0319) and ~4-fold (P= 0.0005) higher compared to control groups, respectively. Furthermore, the percentage of IFN-γ secreting CD8+ T cells in mice immunized with the pVAX1-SRS13 (EP) were ~2-folds higher compared to mice immunized pVAX1-SRS13 (IM) (P=0.0487). The percentage of CD4+ T cells secreting IFN-γ was found to be ~2-folds higher in the pVAX1-SRS13 (EP) group compared to the control group (P=0.0134). According to the data obtained after microscopy, it was determined that the number of tissue cysts decreased ~2-folds in both vaccine groups compared to the control groups (p=0.0202, p=0.0276). Consistent with the concentration values obtained after RT-PCR, a statistically lower T. gondii DNA concentration was found in the vaccine groups compared to the controls (p= 0.0476, p=0.0159).
In conclusion, it has been determined that pVAX1-SRS13 DNA vaccine stimulates strong cellular and humoral immune response when administered by IM or ID+EP.  The pVAX1-SRS13 might be a promising candidate for protection against chronic toxoplasmosis.