Kanatlı orijinli Salmonella ınfantis suşlarında CRISPR analizi
CRISPR analysis in Salmonella infantis strains of poultry origin
Yazar: ÖZGE ERDOĞAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET AKAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Salmonella enfeksiyonları dünyada yaygın olup gıda kaynaklı enfeksiyonlar arasında ilk sıralarda yer almaktadır. Bu nedenle hızlı ve doğru teşhisi önem kazanmaktadır. Bu tez çalışması ile Salmonella Infantis suşlarının CRISPR bölge analizinin yapılıp coğrafi ve yetiştirme tipine göre farklılıkların ortaya konularak bu dizilerin tiplendirmede kullanılabilirliği ile ilgili bilgi sağlamak amaçlanmıştır.

Çalışma için Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Kültür Koleksiyonu'nda bulunan Marmara, Ege ve Doğu Karadeniz bölgesindeki işletmelerden 2018-2020 yıllarında izole ve identifiye edilmiş 60 adet broiler, 30 adet yumurtacı, 10 adet hindi kaynaklı olmak üzere toplamda 100 adet Salmonella Infantis suşu kullanıldı. Uygun primerler kullanılarak CRISPR dizileri PCR ile çoğaltılıp bant elde edilen suşlar dizi analizine gönderildi. CRISPR bölge analizi, NCBI-Blast ve CRISPRCasFinder veritabanları kullanılarak gerçekleştirildi.
CRISPRCasFinder programına CRISPR1 ve CRISPR2 gen bölgelerinin analizi için yüklenen dizilerden 17 adet CRISPR1 ve 12 adet CRISPR2 bölgesi tespit edildi. Broiler izolatlara ait CRISPR1 gen bölgesinde 118 aralık dizisi, yumurtacı izolatlara ait CRISPR1 gen bölgesinde 44 aralık dizisi mevcut olup toplamda bu tez çalışmasında CRISPR1'de 162 aralık tespit edildi. CRISPR2 gen bölgesinde ise broiler izolatlarda toplamda 43, yumurtacı izolatlarda ise 27 olmak üzere toplam 70 adet aralık dizisi belirlendi. CRISPR dizileri orantısal olarak karşılaştırıldığında broilerlerde CRISPR1 bulunma oranı %21,6, yumurtacılarda ise CRISPR1 %13,3 iken broilerlerde CRISPR2 bulunma oranı ise %11,6 oranında bulunurken yumurtacı izolatlarda %16,6 oranında bulundu. Hindi suşlarında CRISPR dizisi saptanamadı. Çoğu CRISPR1 gen bölgelerinde korunmuş tekrar dizisi 5'-CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3' olarak 29 bp uzunluğunda belirlendi. CRISPR1 içeren 6 suştae tek nükleotid farklılığı mevcut olduğu saptandı. CRISPR2 de ise korunmuş tekrar dizisi 5'-CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3' içeren tek izolat olup diğerleri 23 ile 31 bp arasında değişti. Yapılan bu tez çalışmasında faj ve plazmid ile uyumlu çok sayıda aralık dizisi tespit edildi. 
Bu çalışma sonucunda elde edilen veriler ışığında S. Infantis CRISPR dizilerinde görülen polimorfizmlerin değerlendirilerek tiplendirme çalışmalarında kullanılabileceği ayrıca aralık dizisi analiz sonuçlarına göre bakterilerin maruz kaldıkları faj, plazmid ve diğer genetik elementler hakkında bilgi sahibi olunabileceği görülmüştür. S. Infantis izolatların CRISPR bölgelerinin daha iyi anlaşılabilmesi amacıyla farklı coğrafik bölgelerden ve farklı yetiştirme tipine dayalı daha fazla örnekle çeşitliliğe devam edilerek izlenmesi yararlı olacaktır. Ayrıca Salmonella CRISPR dizilerinin Cas genleriyle birlikte değerlendirilmesi daha iyi anlaşılabilmesini sağlayacaktır.
Anahtar Sözcükler: CRISPR, Kanatlı, Moleküler Tiplendirme, PCR, Salmonella Infantis

Abstract:
Salmonella species are widespread in the world while remaining one of the top reasons for food sourced infections. Therefore, fast and accurate diagnosis becomes crucial. With this thesis study, CRISPR region analysis of S. Infantis strains was done to provide information on usability of these sequences by pointing out differences according to regional and breeding type factors.
For the study, a total of 100 S. Infantis strains were used consisting of 60 sourced from broilers, 30 sourced from laying hens and 10 sourced from turkeys that were isolated and identified between 2018 and 2020 from Marmara, Aegean and Eastern Black Sea based corporations belonging to the Culture Collection of Ankara University Faculty of Veterinary Medicine, Department of Microbiology. CRISPR sequences were amplified by PCR using appropriate primers, and the strains resulting from the band were sent for sequence analysis. CRISPR region analysis was performed using NCBI-Blast and CRISPRCasFinder databases.
From the sequences uploaded to the CRISPRCasFinder program for analysis of CRISPR1 and CRISPR2 gene regions, 17 CRISPR1 and 12 CRISPR2 regions were identified. There are 118 spacers in the CRISPR1 gene region of broiler isolates, 44 spacers in the CRISPR1 gene region of laying hens isolates and in total, 162 spacers in CRISPR1 were detected in this thesis study. In the CRISPR2 gene region, a total of 70 spacers were detected, 43 in broiler isolates and 27 in laying hen isolates. When CRISPR sequences are compared proportionally, the rate of CRISPR1 in broiler isolates is 21.6% and CRISPR1 is 13.3% in laying hen isolates while the rate of CRISPR2 in broilers is 11.6% and 16.6% in laying hen isolates. CRISPR sequence was not detected in turkey strains. The conserved repeat sequence in most CRISPR1 gene regions is determined as 5'- CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3' and is 29 bp long. There is a single nucleotide difference in 6 samples containing CRISPR1. In CRISPR2, it is the only isolate containing the conserved repeat sequence 5'-CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3', while the others vary between 23 and 31 bp. In this thesis study, many spacer sequences compatible with phage and plasmid were identified. 
In the light of the data obtained as a result of this study, it has been observed that the polymorphisms seen in S. Infantis CRISPR sequences can be evaluated and used in typing studies, and according to the spacer analysis results, information can be obtained about the phages, plasmids and other genetic elements to which the bacteria are exposed. In order to better understand the CRISPR regions of S. Infantis isolates, it would be useful to continue diversifying and monitoring them with more samples from different geographical regions and based on different breeding types. Additionally, evaluating Salmonella CRISPR sequences together with Cas genes will provide a better understanding.
Keywords: CRISPR, Molecular Typing, PCR, Poultry, Salmonella Infantis