Bazı bitki ekstrelerinin antioksidan aktivitesi ve rozmarinik asit içeriği üzerine çalışmalar
Studies on antioxidant activity and rosmarinic acid content of some plant extracts
Yazar: OMAR HAKUM SAID
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Glycyrrhiza glabra = Glycyrrhiza glabra ; Pinus nigra = Pinus nigra ; Punica granatum = Punica granatum ; Rozmarinik asit = Rosmarinic acid

Özet:
Bitkiler sağlık, gıda ve kozmetik alanlarında kullanılma potansiyeline sahip çok değerli sekonder metabolitler içerirler. Bu potansiyellerini ortaya koymak için biyoaktivitelerini ve kimyasal içeriklerini araştırmak gerekir. 
Bu çalışmada Anadolu karaçamı [Pinus nigra Arn. subsp. pallasiana (Lamb.) Holmboe], nar (Punica granatum L.) ve meyan (Glycyrrhiza glabra L. var. glabra) bitkilerinin farklı kısımlarından hazırlanan metanol ve %30 etanol ekstrelerinin  sırasıyla antioksidan aktivitesi ve rozmarinik asit içeriği araştırıldı. 
Çamın kozalak, yaprak ve odun; narın meyve, yaprak, çiçek ve odun; meyanın yaprak, odun ve meyve tohumu örneklerinden hızlı Soxhlet ekstraksiyonu ile hazırlanan ve kuruluğa kadar buharlaştırılan ham metanol ekstreleri, çözünürlüklerine göre metanol ve dimetilsülfoksit (DMSO) fraksiyonlarına ayrıldı. Metanol ve DMSO fraksiyonları DPPH serbest radikal süpürme ve bakır indirgeyici antioksidan kapasite (CUPRAC) testleri gibi iki tamamlayıcı yöntemle potansiyel antioksidan aktiviteleri için tarandı. Ayrıca her iki fraksiyonun toplam fenolik madde içerikleri Folin-Ciocalteu yöntemi ile belirlendi. 
DPPH testinde örneklerin IC50 değerleri 0.03-5.279 mg/mL arasında değişkenlik gösterdi. En yüksek akiviteyi nar-meyve ekstresinin metanol fraksiyonu gösterdi (IC50 = 0.030±0.007 mg/mL). CUPRAC testinde örneklerin troloks eşdeğeri antioksidan kapasiteleri (TEAC) 0.124-2.323 mmol TEAC/g kuru ağırlık arasında değişti. En yüksek kapasite 2.323±0.401 mmol TEAC/g kuru ağırlık değerine sahip nar-meyve ekstresinin metanol fraksiyonunda saptandı.
Çalışılan örneklerin gallik asit eşdeğeri (GAE) toplam fenolik madde içeriklerinin 26.60-526.85 µg GAE/mg kuru ağırlık arasında değiştiği bulundu. Nar-meyve ekstresinin metanol fraksiyonu 526.85±2.128 µg GAE/mg kuru ağırlık değeri ile en yüksek toplam fenolik madde içeriğine sahipti.
Ek olarak metanol fraksiyonlarının balık patojenlerinden Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Lactococcus garviae, Vibrio anguillarum ve Yersinia ruckeri üzerinde antimikrobiyal etki gösterip göstermedikleri disk difüzyon agar testi ile araştırıldı ve etkili olanlarda mikrodilüsyon plaka yöntemiyle minimum inhibe edici konsantrasyon (MİK) tayinleri yapıldı.
Nar-meyve ekstresinin metanol fraksiyonu çalışmada kullanılan tüm bakterilere karşı antimikrobiyal aktivite gösterdi. Bu ekstrenin oluşturduğu en yüksek inhibisyon zon çapı (16±1 mm) L. garviea'da gözlenirken, MİK değeri 138 µg/mL olarak hesaplandı. Nar-yaprak ve nar-çiçek örnekleri de A. hydrophila hariç tüm bakterilerin üremesini belli oranlarda inhibe etti. 
Son olarak, bitkisel materyallerden ultrasonikasyon tekniğiyle hazırlanan %30 etanol ekstrelerinin rozmarinik asit içeriği yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile araştırıldı.
Meyan-yaprak örneğinin tüm örnekler içinde 2.925±0.039 mg/g kuru ağırlık değeri ile en yüksek rozmarinik asit içeriğine sahip olduğu bulundu. Çalışmada elde edilen sonuçlar, aynı bitkinin farklı organlarında farklı miktarda rozmarinik asit bulunduğunu gösterdi.
Sonuç olarak, nar meyvesinin çok yüksek bir antioksidan kapasiteye sahip olduğu ve balık patojenlerine karşı etkili antimikrobiyal metabolitler içerdiği, meyan yapraklarının alternatif bir rozmarinik asit kaynağı olarak kabul edilebileceği ve bu bitki kısımlarının nar çiçekleri ve çam kozalakları ile birlikte daha ileri fitokimyasal araştırmalar için önemli adaylar oldukları anlaşıldı. 
Bu tez, Türkiye'de yetişen karaçam, nar ve meyan bitkilerinin rozmarinik asit içeriğini ve Anadolu karaçamının antioksidan aktivitesini ilk rapor eden çalışma niteliğini taşımakta ve bitkilerin, koruyucu ve tedavi edici yeni doğal bileşiklerin keşfinde çok değerli kaynaklar olduğunu bir kez daha ortaya koymaktadır.

Abstract:
Plants contain valuable secondary metabolites that have the potential to be used in health, food and cosmetics fields. In order to exhibit these potential, their bioactivities and chemical constituents should be investigated.
In this study antioxidant activity and rosmarinic acid content of the extracts prepared from the different parts of Anatolian black pine [Pinus nigra Arn. subsp. pallasiana (Lamb.) Holmboe], pomegranate (Punica granatum L.) and licorice (Glycyrrhiza glabra L. var. glabra)  plants  were investigated.
The crude methanolic extracts were prepared with the samples of cone, leaf and wood from pines;  fruit, leaf, flower and wood from pomegranate; leaf, wood and fruit seed from licorice by Soxhlet extraction and evaporated to dryness. These extracts were separated into two fractions according to their methanol and dimethylsulphoxide-solubility. These fractions were screened for their potential antioxidant activities by two complementary methods; DPPH free radical-scavenging and copper reducing power antioxidant capacity (CUPRAC) assays. The total phenolic contents of the extracts were also determined using Folin-Ciocalteu method.
The IC50 values in DPPH test ranged between 0.03-5.279 mg/mL. The methanolic fraction of the pomegranate fruit extract possessed the highest activity (IC50 = 0.030±0.007 mg/mL). The trolox equivalent antioxidant capacities of the samples, in the CUPRAC test, varied from 0.124-2.323 mmol TEAC/g of dry weight. The highest activity was detected in methanol fraction of pomegranate fruit extract with a value of 2.323±0.401 mmol TEAC/g dry weight.
Total phenolic contents equivalent to gallic acid (GAE) of the studied samples were found to vary between 26.60-526.85 µg GAE/mg dry weight. The methanolic fraction of pomegranate fruit extract possessed the highest total phenolic content with a value of 526.85±2.128 µg GAE/mg dry weight.
In addition, it was investigated whether the methanolic fractions show antimicrobial activity on fish pathogens, namely Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Lactococcus garviae, Vibrio anguillarum and Yersinia ruckeri with disc diffusion agar test and minimum inhibition concentration (MIC) was determined with microdilution plate method on the effective ones. The methanolic fraction of pomegranate fruit extract  exhibited antimicrobial activity against all tested bacteria. The highest inhibition zone in diameter (16±1 mm) of this extract was recorded for  Lactococcus garviea  and the MIC value was calculated as 138µg/mL. Pomegranate-leaf and pomegranate-flower samples also inhibited the growth of all bacteria except for Aeromona hydrophila to a certain extent.
Finally,  rosmarinic acid contents of the 30% ethanol extracts prepared from the plant materials using ultrasonication technique were investigated by high performance liquid chromatography (HPLC) method. The licorice-leaf sample containing 2.925±0.039 mg rosmarinic acid per gram dry weight was detected to have the highest rosmarinic acid content. Results obtained from this study showed that, rosmarinic acid content varied at different parts of the same plant.
As a conclusion, it appears that the pomegranate fruit has significant antioxidant capacity and contains effective antimicrobial metabolites against the fish pathogenes, the licorice leaves may be accepted as alternative rosmarinic acid source and these parts of plants, along with the pomegranate flowers and pine cones, may be crucial candidates for further phytochemical studies.
This thesis is the first report on the rosmarinic acid content of black pine, pomegranate and licorice grown in Turkey and the antioxidant activity of Anatolian black pine, and revealed that plants are undoubtedly valuable resources for the discovery of new protective and therapeautic natural compounds once more.