Kas invaziv olmayan BCG refrakter mesane karsinomlarında mikrosatellit instabilitesi ve PD-l1 ekspresyonunun araştırılması
Investigation of microsatellite instability and PDl-1 expression in non-muscle invasive BCG refractory bladder carcinomas
Yazar: FADİME GÜL SALMAN
Danışman: DOÇ. DR. DUYGU KANKAYA
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: BCG aşısı = BCG vaccine ; DNA = DNA ; Gen ifadesi = Gene expression ; Karsinoma = Carcinoma ; Mesane = Urinary bladder ; Mesane neoplazmları = Urinary bladder neoplasms ; Mikrosatelitler = Microsatellites ; PD-L1 = PD-L1

Özet:
Amaç: Yüksek dereceli kas invaziv olmayan mesane karsinomalarında transüretral rezeksiyon sonrası intravezikal Bacillus Calmette-Guerin (BCG) uygulaması altın standart tedavi yaklaşımıdır. Ancak hastaların %30-45'inde BCG tedavisi başarısız olmakta ve radikal cerrahiye alternatif konservatif tedavilere ihtiyaç duyulmaktadır. PD-1/PD-L1 etkileşimini hedefleyen immün kontrol nokta inhibitörleri, antitümör konak immün yanıtının düzenlenmesinde etkili ve pek çok kanser tipinde gündemde olan umut verici bir tedavi yaklaşımıdır. DNA "mismatch" onarım (MMR) sisteminde defekt sonucunda mikrosatellit instabilitesi (MSI) gösteren tümörlerde immün kontrol noktasını hedef alan tedavilerin daha etkili olduğu saptanmıştır. Çalışmamızda BCG tedavi yanıtı ile PD-L1 ifadesinin rolü ve MSI durumunun ilişkisi incelenerek, immün kontrol nokta inhibitörlerinin BCG dirençli olgularda tedavi seçeneği olma olasılığının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Ayrıca mesane karsinomlarında MSI araştırılmasında immünohistokimya ile PCR yönteminin karşılaştırılması ve MSI-H vakaları gösterecek immünohistokimyasal bulguların belirlenebilmesi planlanmıştır.  
Materyal ve Metod: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji AD'nda incelenmiş, yüksek dereceli, Ta/T1 evresinde ürotelyal karsinom tanısı alıp, intravezikal BCG tedavisi uygulanmış hastalardan tedavi yanıtı alınmış 30 hasta ve BCG refrakter kabul edilmiş 29 hasta olmak üzere toplam 59 hasta çalışma grubumuzu oluşturmuştur. İmmünohistokimyasal olarak PD-L1 (SP263), MSH2, MSH6, PMS2 ve MLH1 ekspresyonu araştırılmıştır. PD-L1 ekspresyonu, tümör hücrelerinde ve tümör ilişkili iltihap hücrelerinde (TİİH) değerlendirilmiştir. Tüm immünboyalı kesitler dijital ortamda değerlendirilerek boyanma yüzdeleri hesaplanmıştır. DNA MMR proteinlerinde ayrıca boyanma şiddeti de derecelendirilmiş ve boyanma yüzdesi (%0-100) ile şiddeti (1-3) çarpılarak boyanma skoru hesaplanmıştır. Mikrosatellit analizi için 5 poli-A mononükleotid marker (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 ve MONO-27) içeren Promega (MD1641 MSI Analysis System, Version 1.2) paneli kullanılmış, normal doku ile tümör dokusu arasında mikrosatellit bölge uzunlukları karşılaştırılmıştır. İstatistiksel olarak 0,05'in altındaki p değerleri anlamlı kabul edilmiştir. 
Sonuçlar: BCG refrakter grup ve BCG tedavisine iyi yanıt veren grup arasında yaş, cinsiyet dağılımı ve tümör evresi açısından anlamlı fark izlenmemiştir; ancak l. propria invazyon derinliği açısından bakıldığında derin l.propria invazyonu gösteren olgularda BCG refrakterliğinin daha yüksek oranda olduğu izlenmiştir (p=0,038). T1 tümörlerde, Ta tümörlere göre TİİH yüksek PD-L1 ifadesi daha sıktır (p=0.008). TİİH'de yüksek PD-L1 ifadesi ile TİİH oranı arasında pozitif korelasyon saptanmıştır (Pearson korelasyonu: 0,428). BCG refrakter grupta tedavi öncesi ve sonrası biyopsiler arasında, BCG refrakter grup ile BCG tedavisine iyi yanıt veren grup arasında TİİH oranı, TİİH'de ve tümör hücrelerinde PD-L1 ifadesi açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır. Olguların hiçbirinde DNA MMR proteinleri ile total kayıp izlenmemiş; %40,7'sinde en az bir DNA MMR proteininde parsiyel kayıp izlenmiş, bunların büyük kısmının (%70,8) BCG tedavisine iyi yanıt veren grupta olduğu saptanmıştır (p=0,022). En az bir DNA MMR proteininde parsiyel kayıp olması ile yüksek TİİH oranı veya TİİH'de yüksek PD-L1 ifadesi görülmesi arasında bir ilişki saptanmamıştır. 57 olguda DNA fragman analizi ile MSI değerlendirilmiş, tüm olgular mikrosatellit stabil bulunmuştur. 
Tartışma: Çalışmamız, kas invaziv olmayan mesane kanserlerinin BCG tedavisine yanıtsızlığında, DNA MMR ifadesi, mikrosatellit instabilite durumu ve PD-L1 ifadesi rolünü birlikte araştıran ilk çalışma olma özelliğindedir. Çalışmamızın sonuçları BCG tedavisi direncinde PD-1/ PD-L1 aracılı immün sistemden kaçış mekanizmasının rolü olmadığını düşündürmektedir. Azalmış DNA MMR protein ifadesi BCG tedavisine yanıt verecek olguları belirlemede yol gösterici olabilir, ancak bu sonucun daha geniş vaka serileri ile desteklenmesi gerekmektedir. Mesane karsinomlarında immünohistokimyasal DNA MMR parsiyel ifade kaybı, MSI ile ilişkisizdir ve fokal de olsa DNA MMR ifadesinin görülmesi tümörün MSI olmadığını yüksek olasılıkla göstermektedir.

Abstract:
Aim: Instillation of intravesical Bacillus Calmette-Guerin (BCG) following transurethral resection is the gold standard treatment approach for high grade nonmuscle invasive urothelial carcinoma of the bladder (NMIBC). However, in 30-45% of patients, BCG treatment fails, and requirements of new conservative treatment occurs for these patients. Immune checkpoint inhibitor therapy (anti-PD1, anti-PD-L1) is a new therapy option that regulates the antitumoral immune response and has been found to be more effective in the microsatellite instable (MSI-H) / deficient mismatch repair (dMMR) cases. In our study, it was aimed to evaluate the role of PD-L1 expression and MSI status in BCG therapy response and the possibility of immune control point inhibitors as a treatment option in BCG refractory cases. In addition, it was planned to determine the immunohistochemical findings that will show MSI-H cases in NMIBC by comparing the PCR method and the immunohistochemistry method.
Material and Methods: This study consist of 59 patients (29 BCG refractory and 30 BCG responsive) who were examined in Ankara University School of Medicine, Department of Pathology and diagnosed as NMIBC with high grade and then intravesical BCG treatment was applied. Expression of PD-L1 (SP263), MSH2, MSH6, PMS2 and MLH1 were investigated by immunohistochemistry. PD-L1 expression was evaluated in tumor cells and tumor associated immune cells (IC).  The percentage of staining was calculated on the digitally scanned slides. For DNA MMR proteins, the staining intensity was also graded, and the staining score was calculated by multiplying the percentage of staining (0-100%) and the intensity (1-3).  For microsatellite analysis, 5 poly-A mononucleotide markers (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 and MONO-27) were used and microsatellite region lengths were compared between normal tissue and tumor tissue. P values of <0.05 were considered statistically significant. 
Results: No significant difference was observed between the BCG refractory group and BCG responsive group in terms of age, gender distribution and tumor stage. BCG refractory cases were found to be more frequent in tumors with deep lamina propria invasion (p = 0.038). In T1 tumors, high PD-L1 expression in IC is more common than Ta tumors (p = 0.008). A positive correlation was found between IC percentage and high PD-L1 expression in IC (Pearson correlation: 0.428). There was no statistically significant difference in terms of IC percentage, PD-L1 expression in IC or tumor cells between neither the pre-and post-treatment biopsies in the BCG refractory group, nor the BCG refractory group and the BCG responsive group. None of the cases had total loss with DNA MMR proteins; reduced expression of DNA MMR protein was observed in 40.7% of total cases, and most of them (70.8%) were found to be in the BCG responsive group (p = 0.022). No relation was found between reduced expression of DNA MMR protein and high IC percentage or high PD-L1 expression in IC. MSI was evaluated by DNA fragment analysis in 57 cases, and all cases were microsatellite stable.
Conclusion: Our study is the first study to investigate the role of DNA MMR expression, microsatellite instability and PD-L1 expression in the BCG refractory NMIBC cases. The results of our study suggest that PD-1/PD-L1 mediated immune system escape mechanism has no role in BCG treatment resistance. Reduced expression of DNA MMR protein may be a sign to identify cases that will respond to BCG therapy, but this result should be supported by larger case series. Immunohistochemically reduced expression of DNA MMR expression is unrelated to MSI in bladder carcinomas and the presence of DNA MMR expression, even focal, most likely indicates that the tumor is not MSI.