Sepsis ön tanılı hastalarda tam kandan multipleks real time PCR ile hızlı etken tayininin konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırılması
The comparison of the multiplex real time PCR method directly from whole blood with the conventional method for the etiological diagnosis in patients with pre-diagnosis of sepsis
Yazar: GİZEM ERDOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE ESRA KARAKOÇ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Kan kültürü = Blood culture ; Kan sayımı = Blood cell count ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sepsis = Sepsis ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis testleri = Diagnostic tests

Özet:
Amaç: Bu çalışmada sepsis ön tanılı yoğun bakım ünitesi hastalarında sepsise yol açan etkeni erken saptayabilmek ve etkene yönelik tedaviye erken başlanmasını sağlayabilmek için tam kandan direkt multipleks real time (RT) PCR yöntemi ile etken tayininin konvansiyonel yöntemler ile kıyaslaması yapılarak erken tanı koyma sürecine olan katkısının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. 
Gereç ve Yöntem: Çalışma Kasım 2019- Ağustos 2020 tarihleri arasında Ankara Sağlık Uygulama ve Araştırma Merkezi, Anesteziyoloji ve Reanimasyon Yoğun Bakım Ünitesi (ARYBÜ) ve Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü'nde prospektif olarak gerçekleştirildi. Sepsis ön tanısı ile yatan 90 hasta çalışmaya dahil edildi. Sepsis tanı kriterlerine uyan hastalardan tam kan (mor kapaklı tüp-Vacusera K2EDTA (Disera, Türkiye)) ve en az iki set (ayrı venlerden) olacak şekilde aerob kan kültürü şişelerine asepsi şartlarına uyularak örnekler alındı. BACT/ALERT 3D (bioMerieux, Fransa) cihazına yüklenen kan kültür şişeleri pozitif/negatif sinyal verdikten sonra sepsis patojenleri panel kiti v1 (Anatolia, Türkiye) ile multipleks RT PCR ve konvansiyonel yöntemlerle çalışıldı. Kan kültürü şişelerinden ve tam kandan çalışılan multipleks RT PCR yöntemleri ile konvansiyonel yöntemlerin etken tanımlama ve raporlama süreleri istatistiksel olarak karşılaştırıldı. 
Bulgular: Çalışmaya dahil edilen 90 hastanın 41'i (%46) kadın, 49'u (%54) erkek ve yaş ortalaması 66,38 idi. Hastalardan 90 tam kan örneği ve 280 kan kültürü şişesi alındı. Hastaların 48'inde (%53) kaynağı belli olmayan sepsis ve 28'inde (%31) altta yatan en sık enfeksiyon kaynağının pnömoni olduğu saptandı. Sepsis ön tanılı hastalardan kan örneği alımı esnasında 73 hastanın (%81) antibiyotik tedavisi altında olduğu tespit edildi. Cilt flora bakterilerinin etken-kontaminant ayrımında KLİMUD Kan Dolaşımı Örnekleri Rehberi'ne göre değerlendirme yapıldı. Kan kültürü, sepsis etkenlerini saptamada altın standart yöntem olduğu için RT PCR yönteminin değerlendirilmesi kan kültürü referans alınarak yapıldı. Kan kültürü şişelerinden çalışılan RT PCR yönteminin duyarlılığı %89,58; özgüllüğü % 57,14; pozitif prediktif değeri % 70,49; negatif prediktif değeri %82,76 ve doğruluğu %74.44 bulundu (p=0,019). Kan kültürü RT PCR yönteminin etken bazında duyarlılıkları % 66,7 -100 ve özgüllükleri % 80,9– 100 arasında bulundu. Tam kan pcr yönteminin duyarlılığı %11,67; özgüllüğü %96,67; pozitif prediktif değeri % 87,50; negatif prediktif değeri % 35,37 ve doğruluğu % 40 bulundu (p=1,684). Çalışmada p değerinin <0,05 olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Çalışmada kan kültürü sonucunun raporlanma süresi ortalama 116:50:00 saat, kan kültürü-PCR sonucunun raporlanma süresi ortalama 80:57:00 saat ve tam kan- PCR sonucunun raporlanma süresi ortalama 15:38:00 saat olarak tespit edildi (p değeri <0,001). 
Sonuç: Sepsiste etkenin kanda saptanması tanı koydurucu olduğu için mikrobiyoji laboratuvarına büyük sorumluluk düşmektedir. Çalışmamızda tam kandan çalışılan sepsis patojenleri panel kiti v1 (Anatolia, Türkiye)'nin etkenleri saptamada duyarlılığının düşük olduğu görüldü. Sepsis kiti (Anatolia, Türkiye)'nin kan kültür şişelerinden çalışılmasıyla elde edilen sonuçlar konvansiyonel yöntemlerle kıyaslandığında geçerli ve üstün bulunmakla birlikte, direkt tam kandan kullanımında iyileştirilmesine ihtiyaç olduğu tespit edildi. Tam kan PCR yönteminin raporlama süresini konvansiyonel yöntemlere kıyasla ortalama 101:12 (yaklaşık 4 gün) saat; kan kültürü PCR yönteminin ise ortalama 35:53 (1,5 gün) saat kısalttığı tespit edildi. Tam kan-PCR yönteminin raporlama süresi en hızlı yöntem olmasına rağmen etkeni belirlemede aynı performansı gösteremediği görüldü. Sepsis düşünülen hastaların kan örneği alımı sırasında antibiyotik kullanım oranlarının oldukça yüksek olduğu (%81) tespit edildi. 
Çalışmamızda, kan kültür şişelerinden çalışılan RT PCR yöntemi ile konvansiyonel yöntemlere göre, etkenin daha erken saptanması sağlandı. Sepsis kiti (Anatolia, Türkiye)'nin kullanılmasıyla kan kültürünün negatif sonuçlandığı 16 hastada etkenlere ait amplifkasyon eğrileri saptandı. Bunun hastalarda yüksek antibiyotik kullanım oranlarına (%81) bağlı olabileceği düşünüldü. Kan kültüründe saptanıp, PCR'da saptanamayan türler yönünden ise sepsis patojenleri panel kitinin mikroorganizma içeriğinin zenginleştirilmesine ihtiyaç olduğu düşünüldü.

Abstract:
Aim: In this study, it was aimed to evaluate the use of multiplex real time (RT) PCR method, which is directly studied from whole blood in intensive care unit patients with a pre-diagnosis of sepsis for the determination of the causative agent by comparing it with the conventional methods. 
Materials and Methods: The study was carried out prospectively in Ankara Health Practice and Research Center's, Anesthesiology and Reanimation Intensive Care Unit and the Department of Medical Microbiology between November 2019 and August 2020. Ninety patients hospitalized with a pre-diagnosis of sepsis were included in the study. Samples were collected as whole blood (purple cap tubes-Vacusera K2 EDTA (Disera, Turkey)) and at least two sets (from separate veins) of blood culture in aerobic blood culture bottles in accordance with aseptic conditions. After a positive / negative signal of the blood culture bottles loaded on the BACT / ALERT 3D (bioMerieux, France) system, all the bottles were studied with sepsis pathogens panel kit v1 (Anatolia, Turkey) by the multiplex RT-PCR method and were studied by conventional methods. The detection and reporting times of the multiplex RT PCR methods, which were run from blood culture bottles and whole blood, were statistically compared with the conventional methods.
Results: In this study, 41 (46%) of the 90 patients were female, 49 (54%) were male and the mean age was 66,38. A total of 90 whole blood samples and 280 blood culture bottles were collected from the patients. Sepsis of unknown origin in 48 (53%) patients and in 28 of the patients (31%), pneumonia as the most common underlying infection source were determined. It was found that 73 patients (81%) were under antibiotic treatment at the time of blood sampling. An evaluation was made according to the KLIMUD Guideline for Blood Culture Samples for the determination of the results as the causative agent or as a contaminant of the skin flora. Since blood culture is the gold standard method for detecting sepsis pathogens, the RT PCR method was evaluated with reference to blood culture. The RT PCR method, which was run from blood culture bottles, was found to have a sensitivity as 89,58%; specificity 57,14%; positive predictive value 70,49%; negative predictive value 82,76% and accuracy 74,44% (p = 0,019). On the basis of the bacterial species, the sensitivity of blood culture RT PCR method was detected to be between 66,7 and 100% and the specificity between 80,9 and 100%. The RT PCR method, which was run from whole blood, was found to have a sensitivity of 11,67% and a specificity of 96,67%; positive predictive value 87,50%; negative predictive value 35,37% and accuracy 40% (p = 1,684).  p value of <0,05 was considered to be statistically significant. In this study, the average reporting time of blood culture results was 116: 50: 00 hours, the average reporting time of blood culture-PCR results was 80:57:00 hours, and the average reporting time of whole blood-PCR results was 15:38:00 hours (p value < 0,001).
Conclusion: The detection of the causative agent in blood is vital in the diagnosis of sepsis; therefore the microbiology laboratory has a major responsibility. In this study; sepsis pathogens panel kit v1 (Anatolia, Turkey), which was run from whole blood, was found to have a low sensitivity in detecting the causative agents. Results achieved with the sepsis pathogens panel kit v1 (Anatolia, Turkey), which was run from blood culture bottles, were valid and superior compared to conventional methods. It is obvious that improvement is required for the sepsis pathogens panel kit v1 (Anatolia, Turkey) for its use directly from whole blood. It was determined that the whole blood PCR method shortened the reporting time by an average of 101:12 (approximately 4 days), and the blood culture PCR method shortened an average of 35:53 (1.5 days) hours compared to the conventional methods. Although the reporting period of whole blood-PCR method was the fastest, it was observed that it could not show sufficient performance in determining the agent. In patients with suspected sepsis it was detected that the use of antimicrobials was 81%. 
In this study early detection of the agent was achieved with the RT PCR method, which was studied from blood culture bottles compared to the conventional method. The sepsis pathogens panel kit v1 (Anatolia, Turkey) detected 16 agents which were not detected by blood culture. This was considered to be due to the high rate of antimicrobial use (81%) at the time of sample collection. On the other hand, considering the species detected by the blood culture and not by RT PCR, the species range detected by the sepsis kit (Anatolia, Turkey) needed to be improved.