Deneysel ülseratif kolitte bazı histon deasetilaz inhibitörlerinin etkileri
Effects of some histone deacetylase inhibitors in experimental ulcerative colitis
Yazar: CANSU ÖZAL COŞKUN
Danışman: DOÇ. DR. BAHRİYE PELİN ARDA PİRİNÇÇİ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Histon deasetilaz = Histone deacetylases ; Kolit-ülseratif = Colitis-ulcerative

Özet:
Ülseratif kolit, genetik ve çevresel faktörler arasındaki etkileşime bağlı olarak gelişen, kolon dokusunda artmış pro-inflamatuvar aracılar ve oksidatif stres ile karakterize edilen bir inflamatuvar bağırsak hastalığıdır. Histon deasetilaz inhibitörleri (HDACi), histonların asetile formda kalmasına ve böylece gen ifadesinin değişmesine yol açan ve hücre büyümesi, proliferasyon, hücre farklılaşması ve apoptoz gibi pek çok biyolojik olayda rol oynayan moleküllerdir. Sodyum fenilbütirat (PBA), HDAC I ve IIA sınıfı enzimleri inhibe eden; suramin ise HDAC enzimlerinin III. sınıfını oluşturan sirtuin (SIRT)'lerin deasetilaz aktivitelerini baskılayıcı özelliği olan bir histon deasetilaz inhibitörüdür.

Bu çalışmadaki amacımız, farelerde dekstran sülfat sodyum (DSS) ile oluşturulan deneysel akut kolit modelinde PBA ve Suramin'in hastalık aktivite indeksi (HAİ), kolon morfolojisi, hücre proliferasyonu, apoptoz, oksidatif stres ve antioksidan sistem, inflamatuvar aracılar ile COX-2 seviyeleri üzerindeki etkilerini ortaya çıkartmak, bu etkileri karşılaştırmalı olarak inceleyerek farklı HDACi'lerin ülseratif kolit üzerindeki etki mekanizmalarını aydınlatabilmektir.

Çalışmamızda kullanılan 48 adet erkek C57BL/6 fareler altı gruba ayrıldı. I. grup kontrol hayvanlardan, II. grup 7 gün boyunca intraperitoneal yolla günde bir kez 150 mg/kg PBA enjeksiyonu yapılan hayvanlardan, III. grup 7 gün boyunca intraperitoneal yolla günde bir kez 25 mg/kg suramin enjeksiyonu yapılan hayvanlardan, IV. grup 5 gün boyunca oral olarak %3 DSS verilerek akut kolit oluşturulan farelerden, V. grup hem PBA enjeksiyonu yapılan hem de DSS verilen farelerden, VI. grup ise hem suramin enjeksiyonu yapılan hem de DSS verilen farelerden oluşturuldu. Deney sırasında hayvanların hastalık aktivite indeksleri (HAİ) günlük olarak belirlendi. PBA ve suraminin DSS ile oluşturulan ülseratif kolit hasarı üzerindeki etkileri makroskobik ve mikroskobik incelemelerle, kolit skorlaması yapılarak analiz edildi. HDACi'nin hücre proliferasyonu üzerindeki rolleri Ki-67 immunohistokimyası ile gösterildi. Antioksidan sistem parametrelerinden glutatyon (GSH) seviyeleri, glutatyon peroksidaz (GSH-Px), süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) aktiviteleri ve oksidatif stres göstergesi olarak lipid peroksidasyon düzeyleri spektrofotometrik olarak tespit edildi. Kolon dokusunda lökosit infiltrasyonu belirteci olan miyeloperoksidaz (MPO) düzeyi ELISA yöntemi ile; aktif kaspaz-3 ve siklooksijenaz-2 (COX-2) seviyeleri ile pro-inflamatuvar sitokinlerden tümör nekroz faktör-α (TNF-α) ve interökin-1β (IL-1β) ekspresyonları western blot yöntemi ile belirlendi.
  
Dekstran sülfat sodyum uygulaması farelerin kolon dokularında dejeneratif hasara, HAİ, MDA, MPO, TNF-α, IL-1β, kaspaz-3 ve COX-2 seviyelerinde artışa neden olmuştur. Bunun yanı sıra, DSS uygulaması farelerde ağırlık kaybına, kolon uzunluğunda, hücre proliferasyon indeksinde, GSH seviyelerinde, GSH-Px, CAT ve SOD aktivitelerinde azalmaya yol açarak kolit hasarı oluşturmuştur. PBA ve suramin enjeksiyonu, HAİ, MDA, MPO, TNF-α, IL-1β, kaspaz-3 ve COX-2 seviyelerinde azalmaya; vücut ağırlığında, kolon uzunluğunda, hücre proliferasyon indeksinde, GSH seviyelerinde, GSH-Px, CAT ve SOD aktivitelerinde artışa yol açarak DSS ile oluşturulan kolitin neden olduğu hasarı önlemiştir. Sonuç olarak bu çalışma, farelerde DSS ile oluşturulan kolit modelinde, histon deasetilaz inhibitörleri olan PBA ve suraminin hücre proliferasyonu üzerinde uyarıcı rol oynadıkları, anti-apoptotik, anti-inflamatuvar, anti-oksidan ve koruyucu etkilere sahip olduklarını göstermiştir. Çalışmamızdan elde edilen sonuçların, kolit gibi inflamatuvar bağırsak hastalıklarında PBA ve suraminin terapötik ajanlar olarak değerlendirilmesine katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Ulcerative colitis is an inflammatory bowel disease, which is caused by an interaction between genetic and environmental factors, characterized by increased pro-inflammatory mediators and oxidative stress in colonic tissue. Histone deacetylase inhibitors (HDACi) are molecules that play a role in many biological processes such as cell growth, proliferation, cell differentiation, and apoptosis, which lead to keep histones in acetylated form and thus leads to altered gene expression. Sodium phenylbutyrate (PBA) inhibits HDAC class I and IIA enzymes; suramin, HDAC enzymes III (SIRT) proteins that constitute the class of proteins and their ability to suppress deacetylase activities. 

The aim of this project, is to reveal the effects of PBA and suramin on disease activity index (HAI), colon morphology, cell proliferation, apoptosis, oxidative stress/antioxidant systems, pro-inflammatory agents, COX-2 levels and histone modifications in mouse model of acute ulcerative colitis, and is to elucidate the mechanisms of action of different HDACis in ulcerative colitis by examining the results comparatively.

Forty-eight male C57BL/6 mice used in our study were divided into six groups. I. group, control animals; II. group animals injected with 150 mg/kg PBA once a day intraperitoneally for 7 days; III. group animals injected with 25 mg/kg suramin once a day intraperitoneally for 7 days; IV. group mice administered orally 3% DSS for 5 to induce acute colitis; V. group mice both injected PBA and administered orally DSS; VI. group mice both injected suramin and administered orally DSS. During the experiment, disease activity index (HAI) was determined in a daily manner. The effects of PBA and suraminin on DSS-induced ulcerative colitis damage were assessed by colitis scoring; the degree of damage in the colon tissue was determined by examining macroscopically and microscopically. The effects of HDACis on the cell proliferation index will be done with Ki-67 immunohistochemistry. Lipid peroxidation levels as an indicator of oxidative stress, and the antioxidant system parameters such as glutathione (GSH) levels, glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities will be determined by spectrophotometry. In colonic tissue, myeloperoxidase (MPO) levels which is leukocyte infiltration marker will be detected with the ELISA method; active caspase 3 and (cyclooxygenase-2) COX -2 levels, expressions of proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor- α (TNF- α), interleukin- 1β (IL-1β) will be detected by western blot method.

Dextran sulfate sodium administration caused damage to the colon tissues of mice, resulting in an increase in HAI, MDA, MPO, TNF-α, IL-1β, caspase-3 and COX-2 levels. In addition, DSS administration resulted in a decrease in weight loss, colon length, cell proliferation index, GSH levels, GSH-Px, CAT and SOD activities in mice. PBA and suramin injection reduction in HAI, MDA, MPO, TNF-α, IL-1β, caspase-3 and COX-2 levels; increase in body weight, colon length, cell proliferation index, GSH levels, GSH-Px, CAT and SOD activities and damage caused by DSS-induced colitis. In conclusion, our study showed that PBA and suramin administration in the DSS-induced colitis model in mice has stimulatory effects on cell proliferation, suppression of apoptosis, anti-inflammatory, anti-oxidant and protective effects. The results from our study are thought to contribute to the evaluation of inflammatory bowel diseases, especially colitis, PBA and suramin as therapeutic agents.