Kronik intermittant hipoksinin trombositlerin anjiogenez fonksiyonlarına ve akciğerde multipotent epitelyal kök/ progenitör hücrelerin yerleşimine etkisi
The effect of chronic intermittent hypoxia on angiogenesis functions of platelets and localization of multipotent epithelial stem/progenitor cells in the lung
Yazar: AYŞE DEMİRCİ ŞAHİN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL GÜNEŞ ; PROF. DR. METİN BAŞTUĞ
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Kan trombositleri = Blood platelets

Özet:
Giriş: Trombosit granülleri, neo-alveolarizasyona aracılık eden proanjiyojenik stromal hücre kaynaklı faktör-1 (SDF-1/CXCL12) içerir. Trombosit kaynaklı SDF-1'in kemik iliğinde kök hücrelerin mobilizasyonunun sağlandığı, hemo-vasküler bir niş oluşturarak kök hücreleri topladığı da gösterilmiştir. SDF-1 aynı zamanda kök hücrelerin endotelyal progenitör hücrelere (EPC'ler) dönüşmesi için güçlü bir uyarıcıdır. Trombositler SDF-1'den başka vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) ve matriks metaloproteinazlar gibi molekülleri de serbestleştirerek anjiyogenezi uyarır. Trombositler plazminojen aktivatörü inhibitörü-1 (PAİ-1), endostatin, trombospondin gibi antianjiogenik faktörleri de içerir. Trombositler hem proanjiogenik hem de antianjiyogenik faktörler içerdiği için, trombositlerin anjiyogenezi nasıl uyarabildiği veya inhibe edebildiği ve bu durumun hangi çevresel faktörlerle düzenlendiği kesin olarak bilinmemektedir.
Amaç: Bu çalışmanın amacı kronik aralıklı hipoksinin trombosit kaynaklı proanjiyogenik ve antianjiyogenik moleküller üzerindeki etkisini, akciğer hasarı sonrasında endotelyal progenitör hücrelerin dokuya yerleşimini artırıp artırmadığını ve endotelyal progenitör hücrelerin doku hasarı bölgesine yerleşmesinin trombosit kaynaklı SDF-1 seviyesindeki olası bir değişiklikten etkilenip etkilenmediğini araştırmaktır.
Gereç ve Yöntem: 10 haftalık, erkek Wistar Albino türü sıçanlar Kontrol, Akciğer Hasarı (AH), Kronik Aralıklı Hipoksi (KH), Kronik Aralıklı Hipoksi + Akciğer Hasarı (KH+AH) grupları olarak ayrıldı. Hipoksi uygulaması hipobarik hipoksik kamarada 42 gün boyunca, günde 6 saat, 3.000 metre yüksekliğe karşılık gelen atmosferik basınç (69,3 kPa, 520 mmHg, ≈%14 O2) ortamında yapıldı. Akciğer hasarı oluşturmak için intratrakeal yoldan lipopolisakkarit 100 μg/100g dozunda verildi. Akciğer hasarından 3 gün sonra hayvanlar feda edildi, kan ve akciğer örnekleri alındı. Kan örneklerinden trombositler ayrıldı, sayıldı ve daha önce bildirilmiş üç aşamalı bir prosedür ile yıkandı. Trombositlerin parçalanması ile elde edilen süpernatant örneklerinde VEGF, SDF-1, PDGF, endostatin, trombospondin-1, PAİ-1 konsantrasyonları ölçüldü. Akciğer dokusunda immünofloresan yöntem ile EPC varlığı değerlendirildi.
Bulgular: Sıçanların ağırlığında hipoksi öncesi ve sonrası önemli farklılık yoktu. KH+AH grubunun mililitredeki hücre sayısı (p<0,001) ve toplam elde edilen hücre sayısı (p<0,001) diğer gruplardan yüksek bulundu. KH grubunun SDF-1 konsantrasyonları kontrol (p<0,01) ve AH (p<0,05) gruplarından düşük bulundu. KH grubunda PAİ-1 konsantrasyonu kontrol grubundan (p<0,05) yüksek bulundu. AH grubunun endostatin konsantrasyonu, kontrol (p<0,01) ve KH+AH (p<0,01) gruplarına göre yüksek bulundu. Trombospondin konsantrasyonu KH grubunda kontrol (p<0,01), AH (p<0,01) ve KH+AH (p<0,05) gruplardan yüksek bulundu. Hücre başına düşen SDF-1 konsantrasyonu KH+AH gruplarında kontrol (p<0,001) ve AH (p<0,01) gruplarına göre düşük bulundu. Hücre başına düşen VEGF, PDGF, PAİ-1, endostatin, trombospondin konsantrasyonları KH+AH grubunda kontrol (p<0,001), AH (p<0,001) ve KH (p<0,05) gruplarından düşük bulundu. İmmünfloresan görüntülemelerde EPC'ler kontrol grubuna göre AH grubunda daha yoğun gözlenirken, KH ve KH+AH gruplarında EPC'ler gözlenmedi.
Sonuç: Çalışmamızın sonucunda hipoksiye bağlı olarak proanjiogenik faktörlerden olan SDF-1'in azaldığı ve buna bağlı olarak akciğer hasarı sonrasında hasarlı dokuya EPC'lerin yerleşiminin azaldığı görülmüştür. VEGF ve PDGF konsantrasyonlarında ise hipoksiye bağlı anlamlı bir değişiklik bulunmamıştır. Antianjiogenik faktörlerden olan PAİ ve trombospondin-1 konsantrasyonu ise KH'ye bağlı olarak artarken, endostatin konsantrasyonu AH'na bağlı olarak artmıştır. KH+AH grubunda hücre başına düşen tüm faktör konsantrasyonları diğer gruplara göre oldukça düşük bulundu. Bu durumun KH'nin megakaryositlere olan etkisine bağlı olabileceği düşünüldü. Sonuçlarımız KH'nin trombosit fonksiyonlarını değiştirdiğini göstermektedir, ancak bu alanda daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Abstract:
Introduction: The granules of platelets contain proangiogenic stromal cell-derived factor-1 (SDF-1/CXCL12), which mediates neo-alveolarization. It has also been shown that platelet-derived SDF-1 mobilizes stem cells from the bone marrow and recruits them by forming a hemo-vascular niche. SDF-1 is also a potent stimulator of stem cells to transform into endothelial progenitor cells (EPCs). Platelets promote angiogenesis by releasing molecules besides SDF-1, such as vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and matrix metalloproteinases. Platelets also contain antiangiogenic factors such as plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), endostatin and thrombospondin. Since platelets contain both proangiogenic and antiangiogenic regulatory proteins, it is not known exactly how platelets can stimulate or inhibit angiogenesis and by which environmental factors this is regulated.
Aim: The aim of this study was to investigate the effect of chronic intermittent hypoxia on platelet-derived proangiogenic and antiangiogenic molecules, whether it improves endothelial progenitor cell placement in tissue after lung injury, and whether the placement of endothelial progenitor cells at the tissue damage site is affected by a possible change in platelet-derived SDF-1 level.
Materials and methods: Male Wistar Albino rats of 10 weeks of age were allocated into Control, Lung Injury (AH), Chronic Intermittent Hypoxia (KH), Chronic Intermittent Hypoxia + Lung Injury (KH+AH) groups. Hypoxia was applied in the hypobaric hypoxic chamber for 42 days, 6 hours a day, at an altitude of 3,000 meters, in an atmospheric pressure (69.3 kPa, 520 mmHg, ≈14% O2) environment. Lipopolysaccharide was administered intratracheally at a dose of 100 μg/100g to induce lung injury. Animals were sacrificed 3 days after lung injury and blood and lung samples were taken. Platelets were separated from blood samples, counted and washed via a previously described three-step procedure. VEGF, SDF-1, PDGF, endostatin, thrombospondin-1, PAI-1 concentrations were measured in the supernatant samples obtained after the lysis of platelets. Presence of EPC in lung tissue was evaluated by immunofluorescence method.
Results: There was no significant difference in the weight of the rats before and after hypoxia. The number of cells per milliliter (p<0,001) and the total number of cells obtained in the KH+AH group (p<0,001) were higher than the other groups. SDF-1 concentrations of KH group were lower than the control (p<0,01) and AH (p<0,05) groups. PAI-1 concentration in the KH group was higher than the control group (p<0,05). Endostatin concentration was significantly higher in the AH group than the control (p<0,01) and KH+AH (p<0,01) groups. Thrombospondin concentration was higher in the KH group than control (p<0,01), AH(p<0,01) and KH+AH (p<0,05) groups. SDF-1 concentration per cell was lower in the KH+AH groups compared to the control (p<0,001) and AH (p<0,01) groups. VEGF, PDGF, PAI-1, endostatin, and thrombospondin concentrations per cell were lower in the KH+AH group than control (p<0,001), AH (p<0,001) and KH (p<0,05)  groups. In immunofluorescent imaging, EPCs were observed more intensely in the AH group compared to the control group, while EPCs were not observed in the KH and KH+AH groups.
Conclusions: Our results demonstrated that SDF-1, one of the proangiogenic factors, decreased after to hypoxia, and accordingly, the placement of EPCs to the damaged tissue decreased after lung injury. No significant changes were observed in VEGF and PDGF concentrations after hypoxia. The concentrations of antiangiogenic factors, including PAI-1 and thrombospondin-1, increased due to chronic hypoxia, while the concentration of endostatin increased due to lung injury. In the KH+AH group, all factor concentrations per cell were found to be considerably lower than other groups. This might be related to the effect of chronic hypoxia on megakaryocytes. Our results show that chronic hypoxia may alter platelet functions, however, more studies are needed in this area.