Arginaz enziminin immobilizasyonu ve uygulamalarına yönelik nanofiber membran platformlarının hazırlanması
Preparation of nanofiber membrane platforms for immobilization and applications of arginase enzyme
Yazar: CEYHUN IŞIK
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA TEKE
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Elektroeğirme yöntemi, elektrostatik kuvvetler kullanılarak nanometre ile mikrometre arasında değişen çaplarda polimer fiberlerin üretimi için en etkin, kolay uygulanabilen, ekonomik, hızlı ve çok yönlü bir fiber üretim tekniğidir. Bu yöntem homojen çap, yüksek yüzey/hacim oranına sahip, ayarlanabilir gözeneklilik ve tercih edilen özelliklere ulaşmak için nanofiber boyutunu ve morfolojisini kontrol etme kabiliyeti gibi sayısız avantajlar sunmaktadır. Bu avantajlarından dolayı elektroeğirme yöntemi ile üretilmiş nanofiberler özellikle enzim immobilizasyonu uygulamalarında yüksek kullanım potansiyeline sahiptirler.
Son yıllarda biyoteknoloji alanındaki gelişmeler sayesinde enzim immobilizasyonu başta gıda, eczacılık, deterjan ve tekstil olmak üzere pek çok endüstriyel alanda geniş uygulama alanına sahiptir. İmmobilize enzimler tekrar tekrar kullanımları, enzimin reaksiyon ortamından kolayca uzaklaşması, sıcaklık ve pH gibi dış etkenlere karşı dayanıklı olmaları ve enzimatik reaksiyonu herhangi bir zamanda başlatmak, devam ettirmek ve istenildiği anda durdurmak gibi özellikleri ile serbest enzimlere göre pek çok avantaj sunarlar. 
Bu doktora tez çalışması kapsamında yapılan çalışmalar üç aşamadan oluşmaktadır. Birinci aşamada elektroeğirme yöntemi ile selüloz asetat (CA)/poli vinil prolidon (PVP), CA/PVP/Mn+2, poli vinil alkol (PVA)/kitosan (CH), PVA/CH/Mn+2, poli kaprulakton (PCL)/CH, PCL/CH/Mn+2, PVA/β-siklo dekstirin (β-CD) ve PVA/β-CD/Mn+2 olmak üzere sekiz farklı nanofiber membran platformun sentezi, sentez parametrelerinin optimizasyonu ve hazırlanan nanofiberlerin karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Bu kısımda her bir nanofiber membran için sentez optimizasyonu sırasında, % polimer derişimleri, % Mn+2 derişimi, uygulanan voltaj, iğne-toplayıcı arası uzaklık ve polimer çözeltisinin enjeksiyon hızı parametreleri belirlendi. Karakterizasyon çalışmaları kapsamında ise SEM, FTIR, TGA ve XRD analizleri yapıldı. İkinci aşamada optimum koşullarda sentezlenen ve en uygun nanofiber oluşumu gözlenen sekiz nanofiber membranada arginaz enziminin immobilizasyonu gerçekleştirildi. Arginaz immobilizasyonunun optimizasyonu için arginaz miktarı, taşıyıcı miktarı, adsorpsiyon süresi ve glutaraldehit miktarı gibi temel parametreler araştırıldı. Optimum koşullarda hazırlanan arginaz immobilize nanofiberlerin karakterizasyon çalışmalarında ise optimum sıcaklık, optimum pH, pH kararlılığı, termal kararlılık, kinetik parametreler ve tekrar kullanılabilirlik parametreleri araştırıldı. Üçüncü aşamada ise aktivite ve kararlılık açısından en uygun olan arginaz immobilize PVA/β-CD/Mn+2 nanofiber membranlar ile hazırlanan geri döngülü kolon sistemiyle protein biyosentezinde rol alan, poliaminlerin biyosentezi için öncül olan L-ornitin oluşturma performansı incelendi.
Elektroeğirme yöntemi ile sentezlenen sekiz farklı nanofiber membran aktivite ve kararlılık açısından değerlendirildiğinde en iyi sonuçları arginaz immobilize PVA/β-CD/Mn+2 nanofiber membranlar göstermiştir. Serbest arginaz enzimi için optimum sıcaklık 35oC iken arginaz immobilize PVA/β-CD/Mn+2 nanofiber membranlar için bu değer 45-55oC aralığındadır. Serbest arginaz enzimi için optimum pH değeri 10 iken bu değer arginaz immobilize PVA/β-CD/Mn+2 nanofiber membranlar için azalarak 8 olarak bulunmuştur. pH kararlılık ve termal kararlılık açısından arginaz immobilize PVA/β-CD/Mn+2 nanofiber membranlar serbest enzime göre çok daha geniş aralıklarda daha yüksek aktivite göstermiştir. Ayrıca yapılan tekrar kullanılabilirlik deneylerinde 20 kullanım sonucunda arginaz immobilize PVA/β-CD/Mn+2 nanofiber membranların aktivitelerinin %50'nin altına düştüğü bulunmuştur.


Anahtar Kelimeler: Elektroeğirme, Nanofiber, Arginaz, İmmobilizasyon, L-ornitin

Abstract:
Electrospinning is the most efficient, easy to apply, economical, fast and versatile fiber production technique for the production of polymer fibers with diameters ranging from nanometers to micrometers using electrostatic forces. This method offers numerous advantages such as homogeneous diameter, high surface/volume ratio, adjustable porosity and the ability to control nanofiber size and morphology to achieve preferred properties. Due to these advantages, nanofibers produced by electrospinning method have high potential for use especially in enzyme immobilization applications.
Thanks to advances in biotechnology in recent years, enzyme immobilization has a wide range of applications in many industrial fields, particularly in food, pharmaceutical, detergent and textile industries. Immobilized enzymes offer many advantages over free enzymes because of their repeated use, easy removal of the enzyme from the reaction medium, resistance to external factors such as temperature and pH, and initiating, continuing and stopping the enzymatic reaction at any time.
This doctoral thesis which is presented consists of three parts. The first part is the synthesis of CA/PVP, CA/PVP/Mn+2, PVA/CH, PVA/CH/Mn+2, PCL/CH, PCL/CH/Mn+2, PVA/β-CD ve PVA/β-CD/Mn+2 nanofiber structures by electrospinning method, optimization of synthesis parameters and characterization of prepared nanofibres.
In this part, polymer concentrations %, Mn2+ concentration %, applied voltage, needle-collector distance and polymer injection rate were determined during the synthesis optimization for each nanofibers. For the characterization of the nanofibers, SEM, FTIR, TGA and XRD analyzes were performed. In the second part, arginase immobilization was carried out eight nanofibers membranes which were synthesized under optimum conditions and optimal nanofiber formation was observed. For the optimization of arginase immobilization, the amount of arginase, the amount of nanofibers, the adsorption time and the amount of glutaraldehyde were investigated as basic parameters. The optimum temperature, optimum pH, pH stability, thermal stability, kinetic parameters and reusability parameters were investigated in the characterization of arginase immobilized nanofibers prepared under optimum conditions. In the third part, L-ornithine formation performance, which is the precursor for the biosynthesis of polyamines and involved in protein biosynthesis, was investigated with the recycled column system of arginase immobilized PVA/β-CD/Mn2+ nanofibers, which is suitable for activity and stability.
Among the eight different nanofiber membranes synthesized by electrospinning, arginase immobilized PVA/β-CD/Mn2+ nanofiber membranes showed the best results when evaluated in terms of activity and stability. The optimum temperature for the free arginase enzyme was 35°C, while for arginase immobilized PVA/β-CD/Mn2+ nanofiber membranes, this value was in the range of 45 to 55°C. The optimum pH value for free arginase enzyme was 10 while this value was found to be 8 for arginase immobilized PVA/β-CD/Mn2+ nanofiber membranes. In terms of pH stability and thermal stability, arginase immobilized PVA/β-CD/Mn2+ nanofiber membranes showed higher activity in a much wider range than the free enzyme. In addition, in the reusability experiments, it was found that the activity of arginase immobilized PVA/β-CD/Mn2+ nanofiber membranes decreased below 50% after 20 reuse.

Keywords: Electrospinning, Nanofiber, Arginase, Immobilization, L-ornithine