Irak'ın Thi-Qar eyaletindeki hastalardan izole edilen escherichia coli'de shigatoxin geninin moleküler tespiti
Molecular detection of shigatoxin gene in escherichia coliisolated from patients in Thi-Qar province, Iraq
Yazar: TALAL HASAN JABER ALFKAWI
Danışman: PROF. DR. SEÇİL AKILLI ŞİMŞEK
Çankırı Karatekin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Escherichia coli, hem avantajlı hem de dezavantajlı olabilen bir üne sahip bir bakteridir. 
Bazı türleri bağırsak sağlığını korumak için çok önemliyken, diğerleri ciddi hastalıklara 
neden olma potansiyeline sahiptir. Patojenik Escherichia coli'nin endişe verici bir 
özelliği, antibiyotiklere karşı artan dirençleri ve biyofilm oluşturma konusundaki güçlü 
eğilimleridir. Escherichia coli bakterileri sık kullanılan antibiyotiklere karşı giderek 
artan bir direnç göstermektedir. Bu sorunun ana nedeni esasen hem insanlarda hem de 
hayvanlarda aşırı ve yanlış antibiyotik kullanımıdır. Escherichia coli, toplanma ve 
biyofilm olarak bilinen yapışkan, mukoza benzeri kaplamalar oluşturma yeteneğine 
sahiptir. Biyofilmler, mikropları yok etmek için antibiyotiklerin ve bağışıklık sisteminin 
erişimini engelleyen kaleler olarak hizmet eder. Biyofilmler antibiyotik direnci 
sorununu daha da kötüleştirir. Bir biyofilmin kompakt yapısı, antibiyotiklere dirençli 
bakterilerin hayatta kalması için elverişli bir ortam sağlayarak onları bu ilaçların 
etkisinden korur. Escherichia coli bakterisinin bazı türleri tarafından sentezlenen Shiga 
toksini, gıda kaynaklı hastalıklar alanında çok güçlü bir antagonisttir. Shiga toksin ailesi 
iki ana varyanttan oluşmaktadır: Stx1 ve Stx2, her ikisi de insan vücuduna önemli 
ölçüde zarar verme potansiyeline sahiptir. Shiga toksini üreten Escherichia coli olarak 
bilinen spesifik varyantlar, O157 gibi bu zararlı toksinleri üretebilir. H7, hastalığa neden 
olma eğilimi ile iyi bilinmektedir. Bazı Escherichia coli suşları, hastalığa neden olmaya 
yardımcı olan zararlı virülans faktörleri, proteinler ve yapılar koleksiyonuna sahiptir. 
Bunlar arasında hareket için kullanılan kıl benzeri yapılar olan flagella üreten, bağışıklık 
sisteminden kaçan ve biyofilm oluşumuna katkıda bulunan flic genleri yer almaktadır. 
Biyofilmler tedaviye karşı direnci artırabilir. HlyA geni, kırmızı kan hücrelerini 
parçalama yeteneğine sahip olan hemolizin A olarak bilinen bir toksinin üretilmesinden 
sorumludur. Bu süreç, bir enfeksiyon oluştuğunda doku hasarına ve iltihaplanmaya yol 
açar. Ek olarak, konağın immünolojik tepkisini bozma potansiyeline sahiptir. Dahası, 
rfb-o157 genleri, dış zarın bir bileşenini oluşturan ve konakçı bağışıklık sistemiyle 
etkileşim de dahil olmak üzere birçok role hizmet eden farklı bir lipopolisakkarit 
formunun sentezlenmesinden sorumludur. Bu çalışmada, Nasiriye Eğitim Hastanesi'nde 
ishal ve idrar yolu enfeksiyonu olan hastalardan 250 klinik örnek, tek kullanımlık steril 
idrar ve dışkı kapları kullanılarak toplanmıştır. Tüm örnekler zengin besiyerinde (Kanlı 
ii
agar) üretilmiş, daha sonra sadece Gram-negatif bakterileri üretmek için diferansiyel ve 
seçici besiyerinde (MacConkey agar) kültürlenmiş ve ardından tüm Gram-negatif 
pozitif kültürler, sadece E. coli izolatlarını izole etmek için bir dizi biyokimyasal test 
kullanılarak değerlendirilmiştir. Tanımlamanın doğrulanması ve antibiyotik direnç 
profilinin incelenmesinin ardından otomatik VITEK Kompakt-2 sistemi kullanılmıştır. 
E. coli O157:H7 izolatını diğer E. coli izolatlarından ayırmak için tüm izolatlar 
diferansiyel besiyerinde (Sorbitol agar) kültüre alınmıştır. Saccharomyces bulradii
sabouraud dekstroz üzerinde büyütülmüş ve daha sonra E. coli genlerinin ekspresyonu 
üzerindeki etkilerini değerlendirmek amacıyla bakteriyel besiyerine eklenmiştir. 
Bakterilerin biyofilm oluşturma kapasitesi mikrotiter plaka yöntemleri kullanılarak 
belirlenmiştir. Tüm virülans genleri geleneksel bir polimeraz zincir reaksiyonu 
kullanılarak tespit edilmiş ve daha sonra jel elektroforezi ile tespit edilmiştir. Shiga 
toksinleri genlerinin ekspresyonu, niceliksel bir gerçek zamanlı polimeraz zincir 
reaksiyonu kullanılarak tahmin edilmiştir. E. coli filogenisi, 16S rRNA çıkarıldıktan 
sonra analiz edilmiştir. En yüksek E. coli O157:H7 ile enfekte hasta sayısı 6 (%46,20) 
21-30 yaş grubuyla ilişkilendirilirken, (11-20 ve 41-50 yaş gruplarında daha düşük 
enfeksiyonlu hastalar tespit edilmiştir. O157:H7 olmayan hastaların aksine, en yüksek 
sayı 11-20 yaş grubunda 11 (%91,7) iken, <=10 ve 31-40 yaş grupları daha düşüktür. E. 
coli H7 ile enfekte ve enfekte olmayan hastalarda kadın sayısı sırasıyla 15 (%40,5) ve 
22 (%59,5), erkeklerde ise 5 (%25) ve 15 (%75) olaeak tespit edilmiştir. 250 idrar ve 
dışkı örneğinden yalnızca 29'unda (%50,88) idrar ve 28'inde (%49,12) E. coli pozitifliği 
saptanmış ve 37'sinde (%64,90) sorbitol fermente edilmiş, 20'sinde (%35,10) ise 
sorbitol fermente edilmemiştir. Hemoliz yeteneğine göre, 19 (%33,30) ve 11 (%19,30) 
örnek hemoliz yeteneğinin alfa ve beta modellerine sahipken, 27 örnek (%47,40) 
hemoliz yeteneğinin gama modeline sahiptir. STX1, STX2, rfo157 ve hylA gen 
frekansları 19'unda (%33,30) pozitif, 38'inde (%66,70) negatiftir. fliC geni 37'sinde 
(%64,90) pozitif ve 20'sinde (%35,10) negatif iken, izolatların çoğunluğu, 48'i 
(%54,21), biyofilm oluşturma yeteneğine sahiptir ve 11'i (%19,30) zayıf, 16'sı (%28,07) 
güçlü ve 21'i (%36,84) orta derecede olarak sınıflandırılmıştır. En yüksek direnç 
seviyesi amikasine karşı iken, en düşük direnç seviyeleri piprasilin, tazobaktam ve 
tobramisine karşıdır. STX1 gen ifadesinin kat değişimi Saccharomyces bulradii
eklendikten sonra daha düşüktür (3.96) ve STX2 gen ifadesinde Saccharomyces 
bulradii eklendikten sonra iki kat daha düşük bir değişim (0.11) belirlenmiştir. 
Filogeniye göre, tüm E. coli 16S rRNA dizilerimiz tamamen aynıdır (%100). NCBI 
referanslarıyla karşılaştırıldığında ise %99,63 ile %100 arasında değişen yüksek bir 
özdeş dizi oranı tespit edilmiştir. Sonuç olarak, E. coli yüksek düzeyde virülans ve 
antibiyotik direnci göstermiştir; ancak Saccharomyces bulradii, Shiga-toksin gen 
ekspresyonunu etkilemede önemli bir role sahiptir ve bu maya farklı kronik ve akut E. 
coli enfeksiyon hastalıklarına dahil edilebilir.

Abstract:
Escherichia coli is a bacterium that has a reputation that may be both advantageous and 
disadvantageous. Certain types are crucial for maintaining gut health, while others have 
the potential to cause severe illnesses. An alarming characteristic of these pathogenic 
Escherichia coli is their increasing resistance to antibiotics and their strong inclination 
to build biofilms. Escherichia coli bacteria have shown a growing resistance to 
frequently used antibiotics. The main cause of this issue is essentially the excessive and 
incorrect use of antibiotics in both people and animals. Escherichia coli can aggregate 
and create cohesive, mucous-like coatings known as biofilms. Biofilms serve as 
strongholds, impeding the access of antibiotics and the immune system to eradicate the 
germs. Biofilms exacerbate the problem of antibiotic resistance. The compact nature of 
a biofilm provides a conducive environment for the survival of bacteria that are resistant 
to antibiotics, shielding them from the impact of these drugs. Shiga toxin, which is 
synthesized by some strains of Escherichia coli bacteria, is a very powerful antagonist 
in the realm of foodborne diseases. The Shiga toxin family consists of two primary 
variants: Stx1 and Stx2, both of which have the potential to cause significant harm to 
the human body. Specific variants, known as Shiga toxin-producing Escherichia coli, 
can generate these detrimental toxins, such as O157. H7 is well known for its propensity 
to induce sickness. Some strains of Escherichia coli possess a harmful collection of 
virulence factors, proteins, and structures that aid in causing disease. These include flic 
genes that produce flagella, which are hair-like structures used for movement, evading 
the immune system, and contributing to the formation of biofilms. Biofilms can increase 
resistance to treatment. The hlyA gene is responsible for producing a toxin known as 
hemolysin A, which can break down red blood cells. This process leads to tissue 
damage and inflammation when an infection occurs. Additionally, it has the potential to 
impair the immunological response of the host. Moreover, the rfb-o157 genes are 
accountable for synthesizing a distinct form of lipopolysaccharide, which constitutes a 
component of the outer membrane and serves many roles, including engagement with 
the host immune system. During this cross-sectional study, 250 clinical samples from 
patients at Nasiriyah Teaching Hospital with diarrhea and urinary tract infections were 
collected using disposable sterile urine and stool containers. All samples were grown on 
iv
rich media (Blood agar), then cultured on differential and selective media (MacConkey 
agar) to grow only Gram-negative bacteria, and then all Gram-negative positive cultures 
were evaluated by using a series of biochemical tests to isolate only E. coli isolates. 
Following confirmed identification and investigation of the antibiotic resistance profile, 
the automated VITEK compact-2 system was used. To differentiate the E. coli O157:H7 
isolate from other E. coli isolates, all isolates were cultured on differential media 
(Sorbitol agar). The Saccharomyces bulradii were growing on sabouraud dextrose and 
then added to the bacterial broth in order to evaluate their effects on the expression of E. 
coli genes. The biofilm formation capacity of bacteria was determined using microtiter 
plate methods. All virulence genes were detected using a conventional polymerase chain 
reaction and then detected by gel electrophoresis. T The expression of Shiga toxins 
genes was estimated using a quantitative real-time polymerase chain reaction. The E. 
coli phylogeny was analyzed after extracting 16S rRNA and sent to a determined 
sequencing Microgene company in Korea. The highest number of E. coli O157:H7-
infected patients 6 (46.20%) was associated with the age group 21–30 years, while both 
age groups (11–20 and 41–50 years) were associated with lower-infected patients (8.3% 
and 14.3%, respectively). In contrast to the non-O157:H7 patients, the highest number 
was 11 (91.7%) in the age group 11–20 years, while the age groups <=10 and 31–40 
years were associated with a lower number of 4 (50% and 44.4%), respectively. The 
female numbers were higher 15 (40.5%) and 22 (59.5%) among E. coli H7-infected and 
E. coli NON-infected patients, respectively, compared to male numbers of 5 (25%) and 
15 (75%), among the same groups. Among 250 urine and stool samples, only 29 
(50.88%) urine and 28 (49.12%) stool samples were positive for E. coli, and only 37 
(64.90%) had the ability to sorbitol ferment, while 20 (35.10%) did not. According to 
hemolysis ability, 19 (33.30%) and 11 (19.30%) had alpha and beta patterns of 
hemolysis ability, while 27 (47.40%) had a gamma pattern of hemolysis ability. The 
STX1, STX2, rfo157, and hylA gene frequencies were positive among 19 (33.30%) and 
negative among 38 (66.70%). While the fliC gene was positive among 37 (64.90%) and 
negative among 20 (35.10%), Most isolates, 48 (54.21%), had the ability to form 
biofilm, categorized as follows: 11 (19.30%) of isolates had weak ability, 16 (28.07%) 
had strong ability, and 21 (36.84%) had moderate ability to form biofilm. The highest 
resistance level was against amikacin, while the lowest resistance levels were against 
pipracillin, tazobactam, and tobramycin. The fold change of STX1 gene expression was 
lower (3.96) after adding saccharomyces bulradii, and there was a two-fold lower 
change in STX2 gene expression (0.11) after adding saccharomyces bulradii. According 
to phylogeny, all our E. coli 16S rRNA sequences were completely identical (100%). 
While, when compared with NCBI references, there was a high identical sequence rate 
ranging from 99.63% to 100%. In conclusion, E. coli showed high levels of virulence 
and antibiotic resistance; however, Saccharomyces bulradii has a crucial role in 
influencing Shiga-toxin gene expression, and this yeast may be incorporated in different 
chronic and acute E. coli infection diseases