Amniyotik sıvı kaynaklı kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasının optimizasyonunda adaylar: TGF-ß3, 17ß-estradiol ve osteoprotegerin
Potential canditates on optimization of osteogenic differentiation of amniotic fluid derived stem cells: TGF-ß3, 17ß-estradiol and osteoprotegerin
Yazar: TAYFUN DİKMEN
Danışman: PROF. DR. KORHAN ALTUNBAŞ ; PROF. DR. METİN ERDOĞAN
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Amniotik sıvı = Amniotic fluid ; Kök hücreler = Stem cells ; Osteoprotegerin = Osteoprotegerin ; Transforme edici büyüme faktörü-beta = Transforming growth factor-beta ; Östradiol = Estradiol

Özet:
Kemik doku, organik ve inorganik maddelerden oluşan kompleks bir dokudur. Hormonlar, büyüme faktörleri, sitokinler, iz elementler gibi birçok unsurun etki gösterdiği kemik dokuda 100'ün üzerinde hastalık ve sendrom tanımlanmıştır. Her biri karmaşık ve farklı yaklaşımlar gerektiren bu hastalıklar, kemik rejenerasyonu ile ilgili girişimlere ihtiyaç duyan bireylerde yenilikçi hücresel tedavi yaklaşımlarında problemlere sebep olabilecek potansiyeldedir. Çalışmada osteoblast hücre hattı olan hfOB hücreleri üzerinde TGF-ß3 ve 17ß-estradiol kullanarak kemik metabolizmasında önemli role sahip olan osteoprotegerin (OPG) proteinin üretimi arttırılarak yüksek seviyede OPG içeren koşullandırılmış medyum (KM) elde edildi. Elde edilen yüksek seviyede OPG içeren KM'nin yanı sıra TGF-ß3, 17ß-estradiol ve standart hfOB KM kullanılarak amniyotik sıvı kaynaklı kök hücrelerde (ASKKH) osteojenik farklılaştırma çalışmaları yapıldı. On dört ve yirmi bir günlük farklılaştırma çalışmalarının ardından hücreler real-time PCR yöntemi ile osteojenik belirteçler olan SPP1, RUNX2, COL1 ve DCN gen ifadeleri bakımından incelendi. Hücrelerde ayrıca Alizarin Red S boyamasının sayısal değerlendirmesi yapılarak kalsiyum birikimi seviyeleri belirlendi. Elde edilen veriler 17ß-estradiolün ASKKH'leri hızla osteojenik farklılaşmanın ileri safhalarına taşıdığını ve mineralizasyonu arttırdığını gösterdi. Öte yandan TGF-ß3 ve OPG'nin ise hücrelerin daha uzun süre erken osteoblastogenezis safhasında kalmasına yardımcı olduğu ve hücrelerde mineralizasyon miktarını düşük seviyelerde tuttuğu görüldü. Daha hızlı kemikleşme ve yüksek oranda mineralizasyonun amaçlandığı durumlarda 17ß-estradiol daha başarılı sonuçlar vaat ederken hücrelerin erken osteoblastogenezis safhasında tutulmasının fayda sağlayacağı veya ekstansif mineralizasyonun sorun yaratacağı durumlarda ise TGF-ß3 ve OPG'nin daha yararlı olabileceği düşünülmektedir. Çalışmadan elde edilen veriler diğer erken ve geç osteogenezis belirteçlerinden elde edilecek veriler ile zenginleştirilmeli; belirlenecek farklı zaman aralıkları ile hücrelerin osteogenezisin hangi aşamasında ne kadar süre ile kaldığı belirlenmeli ve elde edilecek sonuçlar in vivo çalışmalar ile test edilmelidir.

Abstract:
Bone is a complex tissue which comprises of both organic and inorganic substances. There are numerous factors known to effect the tissue like hormones, growth factors, cytokins, trace elements, etc. and over 100 diseases and syndroms had been identified related with the the tissue. These pathological states which require comlex and unique treatments, have the potential to stimuate severe adverse effects in innovative cellular therapy approaches. In the study, production of osteoprotegerin (OPG), a very important protein for bone metabolism, is promoted in osteoblast cell line hfOB cells under the influence of TGF-ß3 and 17ß-estradiol and the condition mediums (CM) were collected as OPG rich CM. Amniotic fluid derived stem cells (AFSCs) were differentiated into osteogenic lineage using OPG rich CM, TGF-ß3, 17ß-estradiol and standart hfOB CM. The cells were analysed with real-time PCR after 14 and 21 day differentiations for gene expressions of osteogenic markers SPP1, RUNX2, COL1 and DCN. Furthermore, Alizarin Red S quantification were performed on differentiated cells to determine their calcium deposition levels. The data suggested that, 17ß-estradiol hastens the osteogenic differentiation progress and helps cells to reach late osteogenesis rather quickly while also augmenting the mineralisation of cells. In other respects, TGF-ß3 and OPG assists cells to stay in early osteoblastogenesis stage for a longer period and keeps mineralisation in low levels. In circumstances that enhanced bone formation and greater mineralisation is intended, 17ß-estradiol offers promising results while TGF-ß3 and OPG seems to be more prefferable in situations which extensive mineralisation is undesirable and use of early osteoblastogenic cells would be beneficiary. Data from the study should be further expanded with other early and late osteogenic markers and it also should be determined how long the cells remain in which stage of osteogenesis by setting different time intervals. Finally, the results of those studies should be tested with in vivo studies.