Granülomatöz lezyonla seyreden sarkoidoz ve tüberkülozun ayırıcı tanısında miRNA'ların rolü
The role of miRNAs in the differential diagnosis of granulomatous lesions associated with sarcoidosis and tuberculosis
Yazar: AYGUN GARAYEVA
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ERELEL
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göğüs Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Göğüs Hastalıkları = Chest Diseases
Dizin: Mikobakterium tüberkülozis =   ; Mikro RNA = Micro RNA ; Sarkoidoz = Sarcoidosis

Özet:
Amaç: Sarkoidozlu ve tüberkülozlu bireylerin kan plazmalarındaki miRNA anlatım düzeylerini belirlemek için biyoinformatik analizlerle tespit edilen 10 miRNA ve 2 referans miRNA üzerinden qRT-PCR yöntemini kullanarak sarkoidoz ve tüberkülozun ayırıcı tanısında miRNA'ların potansiyel biyobelirteçler olarak kullanılması amaçlanmaktadır. 

Gereç ve Yöntemler: 2021-2022 tarihleri arasında, İstanbul Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları Anabilim dalına başvuran hastalar öğretim üyesi ve tıpta uzmanlık öğrencisi ile beraber tanısal doğruluk açısından değerlendirildikten ve hasta onam formları alındıktan sonra kan örnekleri alındı. 
Biyoinformatik analizlerle tespit edilen 10 miRNA'nın (hsa-miR-124-3p, hsa-miR-1273e, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-3622b-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, hsa-miR-9-5) ve 2 referans miRNA'nın (hsa-miR-22-3p ve hsa-miR-93-5p) sarkoidoz ve tüberküloz ayırıcı tanısında değerini araştırmak için sarkoidozlu ve tüberkülozlu bireylerin kan plazma örneklerinin anlatım düzeyleri qRT-PZR yöntemi ile belirlendi. (Etik Kurul Dosya No: 2021/364086)

Bulgular: Çalışmaya 18 TBC, 15 Sarkoidoz ve 20 kişilik kontrol grubu dahil edildi. hsa-miR-22-3p housekeeping referans genine göre TBC ve kontrol grubunda ΔCt değerleri; hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-568'de istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). hsa-miR-22-3p housekeeping referans genine göre sarkoidoz ve kontrol grubunda ΔCt değerleri; hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568  ve hsa-miR-9-5p'de istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). hsa-miR-93-5p housekeeping referans genine göre sarkoidoz ve kontrol grubunda ΔCt değerleri hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-568 ve hsa-miR-9-5p'de istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,005). Hsa-miR-93-5p housekeeping referans genine göre sarkoidoz ve kontrol grubunda ΔCt değerleri; hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568'de istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). 
Çalışmamızda qRT-PCR yöntemiyle yapılan analizler neticesinde, Sarkoidoz hastalarında hsa-miR-22-3p referans miRNA'sına göre dört plazma miRNA'sı (hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, hsa-miR-9-5p) arasında anlamlı fark gösterirken, hsa-miR-93-5p referans miRNA'sına göre ise üç plazma miRNA'sı (hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568) anlamlı fark göstermiştir. ROC analiz sonuçlarına göre; sarkoidozlu hastalarda (hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568 hsa-miR-9-5p miRNA'ların downregüle (aşağı regüle) olduğu tespit edilmiştir. İki referans miRNA'sına göre hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568 miRNA'ları ortak olarak anlamlı bulunmuştur.
Tüberküloz hastalarında ise, ROC analiziyle, hsa-miR-22-3p referans miRNA'sına göre iki plazma miRNA'sı (hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-568) anlamlı fark göstermektedir. hsa-miR-93-5p referans miRNA'sına göre ise dört plazma miRNA'sı (hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, hsa-miR-9-5p) anlamlı bulunmuştur. ROC analiz sonuçlarına göre; tüberkülozlu hastalarda hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, hsa-miR-9-5p miRNA'ların upregüle (yukarı regüle) olduğu tespit edilmiştir. İki referans miRNA'sına göre hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-568 miRNA'ları ortak olarak anlamlı olarak belirlenmiştir.
Plazmadan elde edilen 10 miRNA arasından hsa-miR-375 ve hsa-miR-568 miRNA'ların, deneysel olarak seçilen sarkoidozlu bireylerde ekspresyon düzeylerinde azalma gözlenirken tüberkülozlu bireylerin ekspresyon düzeylerinden artış gösterdiği tespit edilmiştir.
Çalışmaya dahil edilen sarkoidoz ve tüberküloz hasta gruplarında ortak olarak anlamlı olduğu tespit edilen hsa-miR-375 ve hsa-miR-568 miRNA'ları sarkoidoz ve tüberküloz ayırıcı tanısında kullanılabilir. 

Sonuç:
Bu çalışma, tüberküloz ve sarkoidozda farklı düzeylerde etkili olan miRNA'ların biyobelirteç olarak kullanımını planlamak için önemli bir adım oluştururken, bu hastalıkların mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ve daha etkili tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

Abstract:
Background: It is aimed to use miRNAs as potential biomarkers in the differential diagnosis of sarcoidosis and tuberculosis by using the qRT-PCR method on 10 miRNAs and 2 reference miRNAs detected by bioinformatics analysis to determine the miRNA expression levels in the blood plasma of individuals with sarcoidosis and tuberculosis.

Materials and Methods: Between 2021 and 2022, patients who applied to the Department of Chest Diseases at the Istanbul Faculty of Medicine were evaluated in terms of diagnostic accuracy together with faculty members and medical specialization students, and after obtaining patient consent forms, blood samples were collected.
The expression levels of 10 miRNAs (hsa-miR-124-3p, hsa-miR-1273e, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-3622b-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, hsa-miR-9-5) identified through bioinformatics analysis, along with 2 reference miRNAs (hsa-miR-22-3p and hsa-miR-93-5p), were investigated for their value in the differential diagnosis of sarcoidosis and tuberculosis. These expression levels were determined from blood plasma samples of individuals with sarcoidosis and tuberculosis using the qRT-PCR method. (Ethics Committee File No: 2021/364086)

Results: The study included 18 patients with tuberculosis (TB), 15 patients with sarcoidosis, and a control group of 20 individuals. The ΔCt values between TB and the control group, based on the housekeeping reference gene hsa-miR-22-3p, showed statistical significance for hsa-miR-26b-5p and hsa-miR-568 (p<0.05). Similarly, when comparing sarcoidosis and the control group based on hsa-miR-22-3p as the housekeeping reference gene, the ΔCt values were statistically significant for hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, and hsa-miR-9-5p (p<0.05). Moreover, the ΔCt values between sarcoidosis and the control group, considering hsa-miR-93-5p as the housekeeping reference gene, were statistically significant for hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, and hsa-miR-9-5p (p<0.005). Additionally, when using hsa-miR-93-5p as the housekeeping reference gene, the ΔCt values between sarcoidosis and the control group were statistically significant for hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, and hsa-miR-568 (p<0.05).
Our analysis using the qRT-PCR method revealed significant differences among four plasma miRNAs (hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, hsa-miR-9-5p) in sarcoidosis patients when compared to the reference miRNA hsa-miR-22-3p. Similarly, based on the reference miRNA hsa-miR-93-5p, three plasma miRNAs (hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568) showed significant differences. According to the ROC analysis results, it was determined that in sarcoidosis patients, the miRNAs hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, and hsa-miR-9-5p were downregulated. Furthermore, hsa-miR-124-3p, hsa-miR-375, and hsa-miR-568 were found to be significantly different using two reference miRNAs.
In tuberculosis patients, the ROC analysis revealed significant differences in two plasma miRNAs (hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-568) compared to the reference miRNA hsa-miR-22-3p. Similarly, based on the reference miRNA hsa-miR-93-5p, four plasma miRNAs (hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, hsa-miR-9-5p) showed significant differences. According to the ROC analysis results, it was determined that in tuberculosis patients, the miRNAs hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-568, and hsa-miR-9-5p were upregulated. Furthermore, hsa-miR-26b-5p and hsa-miR-568 were identified as significant miRNAs using two reference miRNAs.
Among the 10 miRNAs obtained from plasma samples, it was observed that hsa-miR-375 and hsa-miR-568 exhibited decreased expression levels in experimentally selected individuals with sarcoidosis, while their expression levels were increased in individuals with tuberculosis. These findings suggest that hsa-miR-375 and hsa-miR-568 may serve as potential biomarkers for differentiating between sarcoidosis and tuberculosis. In both the sarcoidosis and tuberculosis patient groups included in the study, hsa-miR-375 and hsa-miR-568 were found to be significantly associated, indicating their potential utility in the differential diagnosis of sarcoidosis and tuberculosis.

Conclusion: This study constitutes an important step towards planning the use of miRNAs, which are effective at different levels in tuberculosis and sarcoidosis, as biomarkers. It will contribute to a better understanding of the mechanisms underlying these diseases and the development of more effective treatment methods.