Farklı tür, karışım ve çözücü ortamlarına uygulanabilen modifiye CUPRAC antioksidan kapasite ölçümleri
Modified CUPRAC antioxidant capacity measurements applicable to different species, mixtures and solvent media
Yazar: SALİHA ESİN ÇELİK
Danışman: PROF. DR. REŞAT APAK ; YRD. DOÇ. DR. KUBİLAY GÜÇLÜ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Radikaller = Radicals ; Spektroskopik yöntemler = Spectroscopic methods

Özet:
Biyolojik sıvılarda, gıda maddelerinde ve bitki ekstrelerinde (özütlerinde) bulunan lipofilik ve hidrofilik antioksidanların kapasite tayinine olanak sağlayan pek çok yöntem geliştirilmiş olmasına rağmen bu yöntemlerin birçok sakıncası veya uygulama kısıtları vardır. Bu tez çalışmasında; farklı antioksidan türlerine, karışımlarına ve çözücü ortamlarına uygulanabilecek, dünyada yaygın kullanım alanına sahip CUPRAC: `Bakır(II) iyonu indirgeyici antioksidan kapasite' yöntemi esaslı, basit, tekrarlanabilir, ucuz ve duyarlı yöntemlerin bilimsel çevrelerce yaygın bir şekilde kullanılabilecek referans yöntemler olarak geliştirilmesi ve antioksidan bileşiklerin farklı karışım ve çözücü ortamlarında antioksidan kapasitelerindeki değişimlerin bu yöntemlerle incelenmesi amaçlanmıştır.Çözücü etkisi, antioksidan bileşiklerin kimyasal davranışları üzerinde çok önemli bir parametredir. Bu çalışmanın ilk kısmında bazı lipofilik ve hidrofilik antioksidanların farklı çözücü ortamlarındaki (%100 EtOH (etanol), %100 MeOH (metanol), MeOH/H2O (4:1, v/v), MeOH/H2O (1:1, v/v) ve DCM (diklorometan)/EtOH (9:1, v/v)) toplam antioksidan kapasiteleri (TAC) incelenmiştir. Seçilen antioksidanların CUPRAC değerleri deneysel olarak troloks eşdeğeri antioksidan kapasite (TEAC) cinsinden belirlenmiştir ve diğer referans yöntemlerle (örn. (2,2'-azinobis(3-etil-benzotiazolin-6-sülfonik asid)/persülfat (ABTS/persülfat) ve demir(III) indirgeyici antioksidan gücü (FRAP) yöntemleri) bulunan değerlerle karşılaştırılmıştır. Antioksidanların sentetik karışımlarının TAC değerleri troloks eşdeğeri cinsinden deneysel olarak ölçülmüştür ve absorbansların toplamsallığı ilkesinden yararlanılarak teorik olarak bulunan değerlerle karşılaştırılmıştır. Bu sentetik karışımların çözücü seçimine bağlı olarak olası sinerjik (örn. DCM/EtOH ortamında BHT ve BHA) veya antagonistik davranışları incelenmiştir.Karmaşık bitki matrikslerinde polifenollerin (flavonoidler, basit fenolik ve hidroksisinnamik asidler) seçimli tayini için yeni bir hat-üstü HPLC-CUPRAC yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntem bitki ekstrelerindeki antioksidanların kromatografik ayrımını, bileşen analizini ve kolon-sonrası tanımlanmasını eş zamanlı gerçekleştirmektedir. Polifenollerin ayrılması iki farklı mobil faz çözeltili (metanol ve %0.2 o-fosforik asid) gradient elüsyon kullanılarak C18 kolonunda gerçekleşmiştir. HPLC kolonunda ayrılan antioksidan bileşenler, türevlendirilmiş ürün oluşturmak için bir kolon-sonrası reaksiyon sarmalı içinde bakır(II)-neokuproin (Cu(II)-Nc) reaktifi ile reaksiyona girmektedir. CUPRAC reaktifi, antioksidanlar tarafından 450 nm'de maksimum absorpsiyona sahip bakır(I)-neokuproin (Cu(I)-Nc) kelatına indirgenmektedir. Cu(I)-Nc'den kaynaklanan absorbans artışı ölçülerek antioksidan bileşiklerin negatif pikleri izlenip değerlendirilmiştir. Polifenollerin kolon-sonrası türevlendirmeyi takiben 450 nm'deki belirtme sınırları (0.17-3.46 µM aralığında), türevlendirme yapılmadan 280 nm'de UV yöntemiyle saptanan belirtme sınırlarıyla kıyaslanabilir düzeydedir. Geliştirilen yöntem Camellia sinensis, Origanum marjorana ve Mentha bitki ekstrelerindeki antioksidan bileşiklerin belirlenmesine başarıyla uygulanmıştır. Bu yöntem, hızlı, çok yönlü, geniş kapsamlı ve zahmetsiz olup kararlı reaktifler kullanmakta ve kompleks bitki örneklerindeki antioksidan bileşenlerin hat-üstü kalitatif ve kantitatif tayinine olanak sağlamaktadır.Polifenollerin TAC değerlerinin ölçümü, antioksidanları suda çözünebilir kılmak amacıyla siklodekstrinlerin (CD) kullanımını gerektirmektedir. Bu çalışmanın son kısmında sudaki çözünürlükleri az olan antioksidanlardan rozmarinik asid (RA), klorojenik asid (CA), kuersetin (QR) ve rutinin (RT); doğal (a-CD, ß-CD) ve modifiye (hidroksi-propil-ß-CD, hidroksi-etil-ß-CD, metil-ß-CD) siklodekstrinler ile içerme (inklüzyon) kompleksleri incelenmiştir. Bu polifenollerin spektral özellikleri üzerinde siklodekstrinlerin etkisi, UV-Vis ve kararlı-hal floresans yöntemleri kullanılarak CD derişimlerinin değiştirilmesiyle sulu ortamda ölçülmüştür. Bu içerme komplekslerinin oluşum sabitleri floresans spektroskopik veriler kullanılarak Benesi-Hildebrand denklemine göre belirlenmiştir. Siklodekstrinler arasında maksimum içerme kabiliyeti M-ß-CD'de gözlenmekte olup HP-ß-CD, HE-ß-CD, ß-CD ve ?-CD sırasıyla devam etmektedir. Katı içerme kompleksleri dondurarak kurutma yöntemiyle hazırlanmıştır ve fonksiyonel gruplar IR-spektroskopisi kullanılarak analiz edilmiştir. Siklodekstrinlerle kompleksleşmiş polifenollerin CUPRAC yöntemine göre antioksidan kapasitesi, yalnız haldeki polifenollere göre daha yüksek ölçülmüştür. TAC değerlerindeki artış, siklodekstrinler (özellikle M-ß-CD) tarafından sağlanan hidrofobik bir çevrede artan molekül içi H- bağlanmasıyla polifenollerin 1 e- yükseltgenmiş o-kateşol yapılarının stabilizasyonu ile açıklanmaktadır.

Abstract:
Although many methods have been developed for the antioxidant capacity determination of lipophilic and hydrophilic antioxidants present in biological fluids, food and plant extracts, these methods have various disadvantages and restrictions of application. Thus the aim of this thesis work is to develop widely used CUPRAC (CUPric ion Reducing Antioxidant Capacity)-oriented, simple, reproducible, cost-efficient and sensitive assays, to apply these methods to divergent matrices of complex materials so that they may be accepted by scientists of different origins as reference methods of antioxidant assay, and to examine the changes in the antioxidant capacities of compounds in different species, mixture and solvent media with the aid of these methods.Solvent effect is a crucial parameter on the chemical behaviour of antioxidant compounds. The first part of this study was undertaken to investigate the total antioxidant capacity (TAC) of certain lipophilic and hydrophilic antioxidants, measured in different solvent media such as ethanol (EtOH) (100%), methanol (MeOH) (100%), methanol/water (4:1, v/v), methanol/water (1:1, v/v), dichloromethane (DCM)/EtOH (9:1, v/v)). CUPRAC values of selected antioxidants were experimentally reported in this work as trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), and compared to those found by reference TAC assays, i.e., 2,2?-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)/persulphate (ABTS/persulphate) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) methods. The TAC values of synthetic mixtures of antioxidants were experimentally measured as trolox equivalents and compared to those theoretically found by making use of the principle of additivity of absorbances. Possible synergistic (e.g., BHT and BHA in DCM/EtOH) or antagonistic behaviours of these synthetic mixtures were investigated in relation to solvent selection.A novel on-line HPLC-CUPric Reducing Antioxidant Capacity (CUPRAC) method was developed for the selective determination of polyphenols (flavonoids, simple phenolic and hydroxycinnamic acids) in complex plant matrices. The method carries out chromatographic separation, constituent analysis, and post-column identification of antioxidants simultaneously in plant extracts. The separation of polyphenols was performed on a C18 column using gradient elution with two different mobile phase solutions, i.e., MeOH and 0.2% o-phosphoric acid. The HPLC?separated antioxidant polyphenols in the extracts react with copper(II)-neocuproine (Cu(II)-Nc) reagent in a post-column reaction coil to form a derivative. The CUPRAC reagent is reduced by antioxidants to the copper(I)-neocuproine (Cu(I)-Nc) chelate having maximum absorption at 450 nm. The negative peaks of antioxidant constituents were monitored by measuring the increase in absorbance due to Cu(I)-Nc. The detection limits of polyphenols at 450 nm (in the range of 0.17-3.46 µM) after post-column derivatization were comparable to those at 280 nm UV-detection without derivatization. The developed method was successfully applied to the identification of antioxidant compounds in crude extracts of Camellia sinensis, Origanum marjorana and Mentha. The method is rapid, inexpensive, versatile, nonlaborious, uses stable reagents, and enables the on-line qualitative and quantitative estimation of antioxidant constituents of complex plant samples.Measurement of TAC of polyphenols necessitates the use of cyclodextrins (CD) to solubilize antioxidants of poor aqueous solubility. The inclusion complexes of the slightly water soluble antioxidants, rosmarinic acid (RA), chlorogenic acid (CA), quercetin (QR) and rutin (RT) with native (?-cyclodextrin (?-CD), ß-cyclodextrin (ß-CD)) and modified (2-hydroxypropyl-ß-cyclodextrin (HP-ß-CD), 2-hydroxyethyl-ß-cyclodextrin (HE-ß-CD), and methyl-ß-cyclodextrin (M-ß-CD)) cyclodextrins were investigated in the last part of study. The effect of cyclodextrins on the spectral features of polyphenols was measured in aqueous medium using UV-Vis and steady-state fluorescence techniques by varying the concentrations of CDs. The formation constants of the inclusion complexes were determined from Benesi-Hildebrand equation using fluorescence spectroscopic data. Among the CDs, maximum inclusion ability was measured in the case of M-ß-CD followed by HP-ß-CD, HE-ß-CD, ß-CD and ?-CD. Solid inclusion complexes were prepared by freeze drying, and their functional groups were analyzed by IR spectroscopy. Antioxidant capacity of CD-complexed polyphenols were measured to be higher than that of the lone polyphenols by the CUPRAC method. The mechanism of the TAC increase was interpreted as the stabilization of the 1-e oxidized o-catechol moiety of polyphenols by enhanced intramolecular H-bonding in a hydrophobic environment provided by CDs, mostly by M-ß-CD.