Hippokampal HT22 hücre serilerinde klotho proteininin P38 MAPK ifadesi üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effects of klotho protein on P38 MAPK expression in hippocampal HT22 cell series
Yazar: SADEGÜL TUNCER
Danışman: DOÇ. DR. AYDIN RÜSTEMOĞLU
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Fareler = Mice ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hipokampus = Hippocampus ; Hücre kültürü = Cell culture ; Klotho = Klotho ; MAP kinaz = MAP kinase ; Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Protein kinazlar = Protein kinases ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Fare, sıçan ve insan klotho proteinini kodlayan Klotho sırasıyla kromozom 5 (5; 5 G3), 12
(12p12) ve 13 ( 13q13.1) lokalizedir. Klotho geni insanlar, fareler ve sıçanlarda büyük oranda
korunur. Klotho proteini, biri transmembran formunu (sırasıyla insan ve farede sırasıyla 1012
ve 1014 aa, -130 kDa) ve ikincisi kısa çözülebilir formunu (550 aa, ∼70 kDa) kodlayan iki
mRNA türü tarafından kodlanır. Faredeki klotho gen ekspresyonundaki bir kusur insan
yaşlanmasına benzer şekilde mutant farelerde kısa bir ömür ve nöronal dejenerasyon,
arterioskleroz, vasküler kalsifikasyonlar, doku kalsifikasyonları amfizem, gonadal displazi,
infertilite, cilt atrofisi, ataksi, hipoglisemi ve ciddi hiperfosfatemi gibi birçok hastalığa neden
olduğu belirlenmiştir. Mitojenle aktive olan protein kinazlar (MAPK'ler) büyüme faktörleriyle
ve diğer sinyalleşme molekülleriyle aktifleşen ve çekirdeğe transloke olan, çeşitli hücresel
faaliyetlerin hücre içi sinyal iletimine aracılık eden serin-treonin protein kinazlardır. Memeli
MAPK ailesi, hücre dışı sinyal düzenleyici kinazlar (ERK), c-Jun NH2-terminal kinazlar
(JNK; ayrıca stresle aktive olan protein kinaz veya SAPK olarak da bilinir) ve p38 ailesini
kapsar. p38 geni, insanlarda 6. Kromozomun p kolu üzerinde (6p21.31) lokalizedir ve 22
eksondan oluşur. İnsanlarda ve farelerde p38 proteini 360 aminoasitten oluşur ve molekül
ağırlığı 38 kDA' dır. P38 MAPK'lar başlangıçta hiperosmolarite ve pro-enflamatuar sitokinler
gibi hücresel streslere yanıt olarak aktifleşmiş proteinler olarak tanımlandı. P38 MAPK'lar
dört gen tarafından kodlanır. p38 MAPK'ler: MAPK14 (p38a'yı kodlayan), MAPK11 (p38β'yi
kodlayan), MAPK12 (p38γ'yi kodlayan) ve MAPK13 (p38δ'yi kodlayan) olarak rapor
edilmiştir. P38 MAP kinazlar öncelikle MAPKK izoformları, MKK3 ve MKK6 tarafından
fosforillenmek suretiyle aktive edilir. Hücre dışı uyaranlarla aktifleşen MAPK'lar çekirdeğe
giderek çeşitli transkripsiyon faktörlerinin DNA'ya bağlanmasını uyarır. HT22 hippokampal
hücre hattı kullanılarak Klotho proteininin p38 MAPK ifadesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu
çalışmada hücre kültürü, cDNA eldesi, Real Time PCR, protein izolasyonu ve western blot
yöntemi çalışılmıştır. Elde ettiğimiz Real Time Pcr ve Western Blot sonuçları baz alındığında
klotho proteinin p38 MAPK sinyal yolağını inhibe ettiği ve nöron hücreleri üzerinde
koruyucu etkisi olduğu söylenebilir ancak bunun net bir şekilde belirlenebilmesi için
fosforillenerek aktifleşen p38'in fosfo-p38 protein miktarının da çalışılması gereklidir.
Anahtar kelimeler: Nörodejenerasyon, Klotho, Map Kinaz, p38 Map Kinaz, Hücre kültürü

Abstract:
Klotho protein is a highly conserved protein encoded by the Klotho gene localized in
chromosome 5 (5; 5 G3), 12 (12p12) and 13 (13q13.1), respectively, in mouse, rat and human.
The Klotho gene is alternatively transcribed into at least two mRNAs, one encoding the large
transmembrane (1012 and 1014 aa, -130 kDa, respectively in human and mouse), and the
other in short soluble form (550 aa, ∼70 kDa). A defect in Klotho gene expression in the
mouse were caused the short life and the many diseases in mutant mice, as similar to human
aging.
Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are serine-threonine protein kinases, which are
activated by growth factors and other signaling molecules and are translocated into the
nucleus, mediating intracellular signal transduction of various cellular activities. The
mammalian MAPK family includes extracellular signal regulatory kinases (ERK), c-Jun
NH2-terminal kinases (JNK; also known as stress-activated protein kinase or SAPK) and the
p38 family. The p38 gene is located on the p arm of chromosome 6 in humans (6p21.31) and
consists of 22 exons. In humans and mice, the p38 protein consists of 360 amino acids and has
a molecular weight of 38 kDA. P38 MAPKs were initially identified as activated proteins in
response to cellular stresses such as hyperosmolarity and pro-inflammatory cytokines. P38
MAP kinases are activated primarily by phosphorylation by MAPKK isoforms, MKK3 and
MKK6. Studies have shown that p38MAPK also has role in to responding to DNA damage
and redox imbalance, which plays an important role in cellular aging.
In this study, the effect of Klotho protein on p38 MAPK expression in HT22 hippocampal cell
line where DNA double chain fracture was produced by endusulfan, was investigated. When
the Real Time PCR and Western Blot results were examined, it was observed that p38MAPK
expression, which increased approximately 100 times only in Endosulfan treated cells, was
limited in cells using Klotho protein. This is probably due to the suppression of the negative
effects of Endosulfan by the Klotho protein. However, in order to be able to say this clearly, it
is necessary to determine the level of double chain breakage in DNA and also to study the
phospho-p38 protein amount of p38 which is activated by phosphorylation.
Key worlds: Aging, Klotho, p38 MAPK, Cell culture