İnfluenza A virüsü yüzey antijen proteini hemaglutininin mikroorganizmalarda çözünür halde üretilmesi
İnfluenza A virüsü yüzey antijen proteini hemaglutininin mikroorganizmalarda çözünür halde üretilmesi
Yazar: AYŞE ARZU GÜL
Danışman: PROF. DR. KADİR TURAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Aşılama = Vaccination ; Aşılar = Vaccines ; Hemaglutinin = Hemaglutinin ; RNA = RNA ; RNA virüsleri = RNA viruses ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production ; İnfluenza = Influenza ; İnfluenza A virüsü = Influenza A virus ; İnfluenza aşısı = Influenza vaccine ; İnfluenza virüs = Influenza virus

Özet:
İnsanlarda grip salgınlarına neden olan influenza A virüsleri membranlı virüslerdir. Virüs membranında taşınan hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) proteinleri bu virüslerin immün sistemde tanınmasında önemlidir. Bu nedenle inaktif saf virüs partikülleri veya saflaştırılmış HA ve NA proteinleri aşı çalışmalarında kullanılmaktadır. Çalışmamızda influenza A virüsü yüzey antijen proteinlerinden HA'nın  Escherichia coli ve Pichia pastoris hücrelerinde rekombinant olarak çözünür halde üretilmesi amaçlandı.
İnfluenza A/WSN/33 (H1N1) tipi virüsüne ait HA tam boyutta (HA0) veya HA1 domainini kodlayacak şekilde özgün oligonükleotid primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonuyla (PZR) çoğaltılıp insan IgG1 antikorlarının sabit bölgelerini kodlayan diziyle kaynaşmış halde bir ara vektöre klonlandı. Kaynaşmış genler (HA0-Fc/HA1-Fc) ara vektör üzerinden PZR ile çoğaltılıp E. coli ve P. pastoris'te ekspresyon yapan vektörlere aktarıldı. Edinilen plazmit vektörler E. coli ve P. pastoris'e transforme edilip hücrelerin üreme profilleri belirlendi. Sonrasında hücrelerde sentezlenen rekombinant proteinler SDS-PAGE/Gümüş boyama teknikleriyle incelendi. E. coli hücrelerinde protein ekspresyonu için, HA0-Fc kontrolünde T7 promotörü (pET-14b-HA0-Fc/pET-14b-HA1-Fc) veya Lac promotörü (pLacI-HA0-Fc/pLacI-HA1-Fc) taşıyan plazmit vektörler oluşturulup transformasyon sonrası üreme profilleri incelendi. HA1-Fc kodlayan plazmit taşıyan bakterilerde bu protein yüksek seviyede üretilirken HA0-Fc füzyon protein ekspresyonu belirlenemedi. Maya hücreleri için oluşturulan pPinkα-HA0.Fc/pPinkα-HA1.Fc plazmitlerinin transformasyon sonrasında  P. pastoris genomunda taşındığı PZR ile belirlendi ancak  rekombinant proteinlerin ekspresyonu, SDS-PAGE/Gümüş boyama tekniğiyle saptanmadı. Edinilen veriler, influenza A virüsü membran proteini, HA proteininin bütün olarak E. coli hücrelerinde sentezinin konak için ileri düzeyde toksiktir. Dolayısıyla, bu proteinin rekombinant olarak üretilmesini dizginleyen ekspresyon sistemlerinin uygun olduğu anlaşıldı. Ayrıca çalışmada  P. pastoris hücrelerinde HA proteini ekspresyonunda kullanılan sistem uygun değildir.

Abstract:
Influenza A viruses that cause influenza epidemics in humans are membrane viruses. The hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) proteins carried on the virus membrane are important in the recognition of these viruses in the immune system. Therefore, inactivated pure virus particles or purified HA and NA proteins are used in vaccine studies. In our study, it was aimed to recombinantly produce soluble HA, one of the influenza A virus surface antigen proteins, in Escherichia coli and Pichia pastoris cells.
The HA of influenza A/WSN/33 (H1N1) type virus was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers encoding the full size (HA0) or HA1 domain, and fused with the sequence encoding the constant regions of human IgG1 antibodies into an intermediate vector was cloned. The fused genes (HA0-Fc/HA1-Fc) were amplified by PCR over the intermediate vector and transferred to vectors expressing E. coli and P. pastoris. Obtained plasmid vectors were transformed into E. coli and P. pastoris to determine the growth profiles of the cells. Afterward, recombinant proteins synthesized in cells were examined by SDS-PAGE/Silver staining techniques. For protein expression in E. coli cells, carrying T7 promoter (pET-14b-HA0-Fc/pET-14b-HA1-Fc) or Lac promoter (pLacI-HA0-Fc/pLacI-HA1-Fc) under HA0-Fc control plasmid vectors were created and growth profiles were examined after transformation. In bacteria carrying HA1-Fc coding plasmid, this protein was produced at high levels, but HA0.Fc fusion protein expression could not be determined. It was determined by PCR that the pPinkα-HA0.Fc/pPinkα-HA1.Fc plasmids created for yeast cells were transported in the P. pastoris genome after transformation, but the expression of recombinant proteins was not detected by SDS-PAGE/Silver staining technique. The obtained data indicate that the synthesis of the influenza A virus membrane protein, HA protein, in E. coli cells as a whole is highly toxic to the host. Thus, expression systems that restrain the recombinant production of this protein were found to be suitable. In addition, the system used in the expression of HA protein in P. pastoris cells is not suitable.