İnsan umblikal ven endotel hücre kültüründe TNF-? ile oluşturulmuş in vitro greft versus host hastalığı modelinde adrenomedullinin sitoprotektif etkisi
Cytoprotective effect of adrenomedullin in in vitro graft versus host disease model induced by TNF-?
Yazar: FATİH KURNAZ
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ÇETİN
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Hematoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Adrenomedüllin = Adrenomedullin ; Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Greft versus host hastalığı = Graft versus host disease ; Hücre kültürü = Cell culture ; Mikroparçacıklar = Microparticles ; Tümör nekroz faktörleri = Tumor necrosis factors

Özet:
Giriş: Allojeneik kök hücre nakli (KHN) özellikle hematolojik malignitelerin tedavisinde önemli bir yer tutmaktadır. Greft versus host hastalığı (GVHH) allojeneik KHN'nin en sık görülen komplikasyonlarından biridir. Nakil sonrası GVHH'da temel patolojik mekanizmalardan birinin endotel hücre hasarı olduğu düşünülmektedir. Akut GVHH'da TNF-?, IL-1, IL-6 gibi proinflamatuar sitokin salınımı olmakta ve inflamatuar cevap meydana gelmektedir. Mikropartiküller trombositler başta olmak üzere, eritrositlerden, lökositlerden ve endotelyal hücrelerden kaynaklanan membran vezikülleridir. Mikropartikül (MP) oluşumu apopitozis ve hücre aktivasyonu ile tetiklenmektedir. TNF-?, IL-1 gibi sitokinlerle veya lipopolisakkarit ile uyarı sonucu endotelyal hücrelerden MP salınımı olmaktadır. Yapılan çalışmada akut GVHH gelişen nakil hastalarında endotelyal MP düzeyinin arttığı gösterilmiş ve artmış endotelyal MP düzeyinin ciddi endotel hasarı ile ilişkili olabileceği öne sürülmüştür. İnflamatuar cevapta pro-inflamtuar ve anti-inflamatuar sitokinler arası ?feedback? mekanizmasının bir parçası olarak adrenomedullin (AM) önemli rol oynamaktadır. TNF-? endotel hücrelerinden MP salınımında önemli mediatörlerden biridir ve akut GVHH gelişiminde önemli rol oynamaktadır. AM, proinflamatuar (TNF-? ve IL-1ß gibi) sitokinlerin aşırı üretimine engel olarak ve reaktif oksijen metabolitlerinin oluşumunu azaltarak sitoprotektif etki göstermektedir.Materyal ve Metod: Çalışmamızda TNF-? ile oluşturulmuş endotel hücre hasarı üzerine AM'nin sitoprotektif etkisinin incelenmesi amaçlandı. TNF-? ile oluşturulmuş endotel hasarı sonrası oluşan MP düzeyine ve TNF-? ile birlikte AM verilmesi sonrası oluşan MP düzeyine bakıldı. Ortaya çıkan MP miktarı akım-sitometri cihazı ile ölçüldü. Çalışmada kullanılan endotel hücreleri insan göbek kordon veninden elde edildi. Elde edilen hücreler labaratuar ortamında çoğaltıldı ve kültür vasatları oluşturuldu.Bulgular: İki saatlik 10ng/ml TNF-? ile inkübasyon sonrası ve TNF-? ve 10-6M AM birlikte inkübasyon sonarsı oluşan MP düzeylerinin değerlendirilmesi için 5 ayrı endotel hücre kültür ortamı hazırlandı. Her bir ortamda oluşan MP'ler CD62, CD31, CD51/61 ve CD146 ile işaretlenmiş antikorlar kullanılarak akım sitometrik yöntemlerle ölçüldü. Endotel hücrelerinin 10ng/ml TNF-? ile inkübe edildikten sonra ortaya çıkan MP düzeyi ile 10ng/ml TNF-? ve 10-6M AM birlikte inkübe edildiğinde ortaya çıkan MP düzeyleri farklılık gösterdi. MP düzeyi bazı ölçümlerde TNF-? ile inkübasyon sonrası daha yüksek iken bazı ölçümlerde TNF-?+AM sonrası yüksek tespit edildi. 24 saatlik inkübasyon sonrası her iki gruba ait ölçümde de sadece Annexin-V ile pozitif olan apopitotik MP grubun iki saatlik inkübasyon sonrası yapılan ölçümlere göre daha yüksek olduğu görüldü. Apopitotik MP miktarı CD62, CD146 ve CD51/61 ile yapılan ölçümlerde TNF-?+AM ile inkübasyon sonarsı daha yüksek iken CD31 grubunda sadece TNF-? ile inkübasyon sonrası daha yüksek bulundu. İki saatlik ölçümler sonrası yapılan değerlendirmede ölçümler arası fark tespit edilmedi.Sonuç: Sonuçta TNF-? ile oluşturulmuş yapay GVHH modelinde AM'nin sitoprotektif etkisi gösterilememiştir.

Abstract:
Introduction: Allogeneic stem cell transplantation (SCT) is an intensive therapy used to treat high-risk hematological malignant disorders and other life-threatening hematological and genetic diseases. Graft-versus-host disease (GVHD) is the main complication after allogeneic SCT. Conditioning regimens, previous infections and underlying disease make a demage to host tissue. Damaged host tissue secretes proinflammatory cytokines, such as TNF-?, IL-1 and these cytokines play a role in development of GVHD. In recent studies it is suggested that endothelial cell demage plays an important role in development of GVHD after allogeneic SCT. Circulating microparticles are membrane vesicles mainly derived from platelets, but also from erythrocytes, leukocytes, and endothelial cells. Cellular activation and apopitosis trigger microparticul (MP) secretion. Endothelial cells secrete MPs when stimulated with lipopolisaccaride or with cytokines like TNF-?, IL-1. Adrenomedullin (AM) plays an important role as a part of feed-back mechanism between pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in inflammatory response. AM has a cytoprotective effect by inhibiting over production of proinflammatory cytokines like TNF-?, IL-1ß. TNF-? is one of the major mediators that stimulates MP secretion from endothelial cells and plays an important role in the development acute GVHD.Material and Method: In this study we aimed to investigate the cytoprotective effect of AM on the endothelial cells that were stimulated with TNF-?. We measured the MP levels occured after administration of TNF-? and TNF-?+AM on endothelial cells. Endothelial cells used in the study were obtained from human umblical cord ven and proliferated in the labaratory.Results: Endothelial MP levels were measured after incubation of cell mediums with 10ng/ml TNF-? for 2 hours and with 10ng/ml TNF-? plus 10-6M AM for 2 hours. All the MPs were measured/analyzed with flow-cytometry by using anti-CD62E, anti-CD31, antiCD51/61, anti-CD146 antantibodies and annexin-V. MP levels were measured in both groups and found different levels. MP levels were detected high in some measurements after incubation with only TNF-? and in some measurements after incubation with TNF-?+AM. Endotheliail MPs who were also positive with Annexin-V were accepted as apoptotic group and seen that there were different levels after incubation with TNF-? and TNF-?+AM.Conclusion: As a conclusion; in this study artificial acute GVHD was induced by TNF-? and AM did not show protective effect on endothelial cells against acute GVHD