Termofilik sulardan izole edilen anoxybacillus gonensis'e ait glukoz izomerazın ısıl kararlılığının geliştirilmesi
Increasing thermal stability of glucose isomerase anoxybacillus gonensis isolated hot springs
Yazar: OSMAN RAMOĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ HAKAN KARAOĞLU
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Su Ürünleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: DNA mutasyon analizi = DNA mutational analysis ; Mikrobiyal enzimler = Microbial enzymes

Özet:
Ksiloz izomeraz (D-xylose ketol-isomerase) (E.C 5.3.1.5) birçok organizmada D-ksilozu D-ksiluloza izomerize eden bir enzimdir. Enzim bu özelliği nedeniyle biyoetanol üretiminde kullanılma potansiyeline sahipse de, enzimi dünyada ticari olarak en çok üretilen üç endüstriyel enzimden biri yapan aktivitesi glukozu fruktoza izomerize etme yeteneğidir. Enzim glukozu izomerize etme yeteneğine atfen yaygın olarak glukoz izomeraz (GI) olarak adlandırılır ve Yüksek Fruktoz İçerikli Mısır Şurubu [High Fructose Corn Syrup (HFCS)] üretiminde kullanılır. Günümüz değişen beslenme alışkanlıkları nedeniyle, artan HFCS kullanımına bağlı olarak GI enziminin önemi hala artarak devam etmektedir. Bu nedenle yeni GI kaynakları araştırmanın yanısıra, hali hazırda keşfedilmiş GI enzimlerinin çeşitli biyokimyasal özelliklerini mutasyon çalışmaları ile geliştirmek te birçok çalışmanın konusu olmuştur. Bu çalışmada, daha önce tüm biyokimyasal ve kinetik parametreleri açığa çıkarılmış A. gonensis G2T glukoz izomerazının bölge spesifik mutasyonu yöntemi ile kritik bir nokta olduğu düşünülen 252. amino asidindeki lösinin amino asidi 'L252R mutasyonu' ile arjinine dönüştürülmüştür. Daha sonra. rekombinant olarak üretilen mutant enzimin (AgoG2GI-L252R) sahip olduğu biyokimyasal ve kinetik parametreler yabanıl enzim ile karşılaştırılmıştır. Çalışma sonuçlarına göre, AgoG2GI-L252R'ın optimum çalışma sıcaklığı 85 ºC, optimum çalışma pH'sı 6.50, kinetik parametreleri glukoz için Km değeri 143.86 ± 9.58 mM ve Vmax değeri ise 39.48 ± 0.92 μmoL/dk/mg protein olarak belirlenmiştir. A. gönensis GI'sının optimum çalışma sıcaklığının 85 ºC, optimum çalışma pH'sının 6.50, kinetik parametrelerinin ise glukoz için Km değerinin 138.37 ± 7.63 mM ve Vmax değerinin 40.51 ± 0.81 μmoL/dk/mg protein olduğu göz önüne alınırsa, 252. amino asidindeki lösinin amino asidinin arjinine dönüştürülmesinin enzimin biyokimyasal ve kinetik parametreleri üzerine herhangi bir etkisi olmamıştır. Ayrıca 85 ºC' de gerçekleştirilen ısıl kararlılık deneyi sonuçlarına göre A. gonensis GI'sının 4.9 saat olan yarılanma ömrü, 4.23 saate düşmüş; L252R mutasyonu AgoG2GI'nin ısıl kararlılığını geliştirmek yerine % 7.8 oranında bozmuştur. Sonuç olarak, ısıl kararlılık için etkili olduğu belirlenen 252. amino asitte farklı aminoasitlerle gerçekleştirilecek mutasyonların etkisinin araştırılması planlanmaktadır.

Abstract:
Xylose isomerase (D- xylose ketol-isomerase, E.C 5.3.1.5) isomerizes D-xylose to D-xylulose in various organisms. While the enzyme has the potential for use in bioethanol production due to its activity, the other primary function that makes it one of the three most produced industrial enzymes is the isomerization of glucose to fructose. The enzyme is widely named glucose isomerase (GI) due to its isomerization ability of glucose to fructose and is used in the production of High Fructose Corn Syrup (HFCS). Given today's changing nutritional habits and the increasing use of HFCS, the importance of the GI enzyme continues to grow. Therefore, in addition to searching for new GI sources, improving various biochemical properties of already discovered GI enzymes through mutation studies has also been the subject of many studies. In this study, the leucine at the 252. position considered a critical point, was converted to arginine through the L252R mutation using the site-specific mutation method on glucose isomerase, for which all biochemical and kinetic parameters had been previously established. The biochemical and kinetic parameters of the recombinant mutant enzyme (AgoG2GI-L252R) were then compared to those of the wild-type enzyme (AgoGI). According to the results, the optimum temperature and pH of AgoG2GI-L252R were 85 ºC and pH 6.50. The kinetic parameters for glucose were 143.86 ± 9.58 mM and 39.48 ± 0.92 μmoL/min/mg protein for values of Km and Vmax, respectively. Considering that the optimal working temperature of A. gonensis GI is 85 ºC, the optimal working pH is 6.50, and the kinetic parameters include a Km value of 138.37 ± 7.63 mM for glucose and a Vmax value of 40.51 ± 0.81 μmoL/min/mg protein, the conversion of the 252nd amino acid from leucine to arginine did not affect the biochemical and kinetic parameters of the enzyme. Additionally, according to the results of the thermal stability experiment conducted at 85 ºC, the half-life of A. gonensis GI decreased from 4.9 hours to 4.23 hours. The L252R mutation impaired the thermal stability of AgoG2GI by 7.8 % rather than improving it. Consequently, it is planned to investigate the effects of different amino acid mutations at the 252nd position, which has been identified as significant for thermal stability.