Ozonun biyofilm üzerindeki antibakteriyel etkisinin değerlendirilmesi
Assessment of  antibacterial efficiency of the ozone on biofilm
Yazar: BURCU NAMAZOĞLU
Danışman: PROF. DR. FİRDEVS TULGA-ÖZ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Diş Hekimliği Bölümü / Pedodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Biyofilmler = Biofilms ; Flüor = Fluorine ; Klorheksidin = Chlorhexidine ; Mikroskopi-elektron taramalı = Microscopy-electron scanning ; Ozon = Ozone

Özet:
Bu çalışmada OzonyTronX® cihazı ile 60 s. ozon gazı uygulaması, Cervitec®Plus, Duraphat® cila ve ozon ile diğer ajanların birlikte kullanılmasının, diş çürüklerine neden olduğu bilinen biyofilm yapısının kalınlığı ve canlılığı üzerindeki etkinliğinin in-situ koşullarda konfokal lazer tarama mikroskobu ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmamız, kliniğimize başvuran yaşları 11- 14 arasında değişen, üst çenesinde diş eksikliği bulunmayan tamamen sağlıklı 5'i yüksek çürük aktiviteli 5'i çürüksüz olmak üzere toplam 10 çocuk üzerinde gerçekleştirilmiştir. İn-situ koşullarda biyofilm elde etmek için çocukların üst çenelerine, üzerinde sığır dişlerinden elde edilmiş 6 adet örneğin yer aldığı, özel akrilik plaklar hazırlanmıştır. Bir sığır dişinden hassas kesit alma cihazı yardımı ile ~2mm genişliğinde ~3mm yüksekliğinde kesitler alınmış otaklavda steril edilmiştir. Örnekler, plak üzerinde hazırlanmış bukkal çıkıntı içine gömülmüş bu sayede biyofilm yapısı çevreden gelebilecek zararlı etkilere karşı korunmuştur. Örneklerin plaklara yerleştirilmesini takiben katılımcılara plakları 6, 24 ve 48 saat süreyle taşımaları gerektiği anlatılmıştır. Her bir saatin sonunda örnekler plaktan dikkatli bir şekilde alınmış aynı sığır dişinden elde edilmiş diğer 6 örnek ise plaklara yerleştirilmiştir. Örneklerin plaklardan uzaklaştırılmasını takiben laboratuar işlemlerine geçilmiştir. Çürüksüz 5 kişinin yer aldığı grup Grup-1, yüksek çürük aktivitesine sahip 5 kişinin bulunduğu grup ise Grup- 2 olacak şekilde ayrılmıştır. 6. saatin sonunda grup-1'e ait örneklerden rastgele seçilmiş 1 örnek 1 dk boyunca fizyolojik salin ile yıkanmış, ardından OzonyTronX® cihazı kullanılarak 60s boyunca 3. seviyede ozon tedavisi uygulanmıştır. 2. Örnek 1dk fizyolojik salin ile yıkanmış ardından 1 dk boyunca Cervitec®Plus cila uygulanmıştır. Örnekler fizyolojik salin ile tekrar yıkandıktan sonra ozon tedavisi uygulanmıştır. 3. örnek 1dk fizyolojik salin ile yıkanmış sonrasında 1dk boyunca Duraphat® cila uygulanmıştır. Tekrardan fizyolojik salin ile yıkanan örneklere ozon tedavisi uygulanmıştır. 4.örnek 1dk boyunca fizyolojik salin ile yıkanmış ardından 1dk boyunca Cervitec®Plus cila uygulanmıştır. 5. örnek 1dk boyunca fizyolojik salin ile yıkanmış ardından 1dk boyunca Duraphat® cila uygulanmıştır. 6.örnek sadece 1dk boyunca fizyolojik salin ile yıkanmıştır.  Bu tedavi prosedürünün aynısı tüm katılımcılar için 24 ve 48 saat plak taşıdıktan sonrada da uygulanmıştır. Grup-2 ye ait katılımcılardan 6, 24 ve 48 saat sonunda elde edilen örnekler de rastgele olacak şekilde seçilmiş ve Grup-1' e uygulanan tedavi prosedürleri aynı şekilde uygulanmıştır. Örneklere uygulanan tedavi prosedürü sonrası tüm örnekler ethidum bromide ve floresan diacetate boyaları ile boyanmıştır. Boyama işlemini takiben konfokal lazer tarama mikroskobunda değerlendirilmiştir.
Çalışmamızda gruplar arasında canlı mikroorganizma sayısı ve cansız hücre oranları yönünden farkın önemliliği Kruskal Wallis testiyle incelenirken, gruplar içindeki farkın önemliliği ise Mann Whitney U testiyle değerlendirilmiş, p<0.05 için sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilmiştir.
Konfokal lazer mikroskobu kullanılarak elde edilen biyofilm kalınlık değerlerinin istatistiksel analizi sonucu, yüksek çürük aktiviteli grupta biyofilm kalınlık değerlerinin çürüksüz gruptan istatistiksel olarak anlamlı şekilde daha fazla olduğu bulunmuştur (p<0.05). Zaman geçtikçe biyofilm kalınlık değerleri istatistiksel olarak anlamlı şekilde artmıştır (p<0.05). Uygulanan antimikrobiyal ajanlar biyofilm kalınlık değerlerinde azalmaya neden olmuştur ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bir fark yaratmamıştır (p>0.05). Başarı sıralaması 6. saat için yüksek çürük aktiviteli ve çürüksüz iki grupta da; ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması > ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması > ozon gazının tek başına uygulanması > Chx' in tek başına uygulanması > fluorun tek başına uygulanması > salin; 24. saatte yüksek çürük aktiviteli grupta; ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması = ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması > ozon gazının tek başına uygulanması = Chx' in tek başına uygulanması > fluorun tek başına uygulanması > salin; 24. saatte çürüksüz grupta; ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması > ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması > ozon gazının tek başına uygulanması > Chx' in tek başına uygulanması = fluorun tek başına uygulanması > salin şeklindedir. 48. saatte yüksek çürük aktiviteli grupta; ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması > ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması > ozon gazının tek başına uygulanması > Chx' in tek başına uygulanması > fluorun tek başına uygulanması > salin şeklindedir. 48. saatte çürüksüz grupta; ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması = ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması > ozon gazının tek başına uygulanması = Chx' in tek başına uygulanması > fluorun tek başına uygulanması > salin şeklindedir.
Konfokal lazer mikroskobu kullanılarak elde edilen biyofilm canlılık değerlerinin istatistiksel analizi sonucu, zaman geçtikçe biyofilm canlılık oranlarının arttığı ancak bu artışın istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık yaratmadığı bulunmuştur (p>0.05). Antimikrobiyal ajanlar ise her bir zaman diliminde canlı bakteri yüzdelerini istatistiksel olarak anlamlı şekilde düşürmüştür (p<0.05). Başarı sıralaması 6. saat için yüksek çürük aktiviteli ve çürüksüz grupta; ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması > ozon gazının tek başına uygulanması > ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması > Chx' in tek başına uygulanması > fluorun tek başına uygulanması > salin şeklindedir. 24 .saatte yüksek çürük aktiviteli grupta; ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması > ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması > ozon gazının tek başına uygulanması > Chx' in tek başına uygulanması > fluorun tek başına uygulanması > salin, çürüksüz grupta; ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması = ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması > ozon gazının tek başına uygulanması > Chx' in tek başına uygulanması > fluorun tek başına uygulanması > salin şeklindedir. 48. saatte ise yüksek çürük aktiviteli grupta; ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması > ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması = ozon gazının tek başına uygulanması > Chx' in tek başına uygulanması > fluorun tek başına uygulanması > salin; çürüksüz grupta, ozon gazının Chx ile birlikte uygulanması > ozon gazının fluor ile birlikte uygulanması > ozon gazının tek başına uygulanması > Chx' in tek başına uygulanması > fluorun tek başına uygulanması > salin şeklindedir.
Çalışmamızdan elde edilen bulgulara dayanarak, ozon gazının biyofilm bakterileri üzerine etkili bir ajan olması nedeniyle özellikle klinikte rutin olarak kullanılan fluor cilaya alternatif olarak kullanılabileceği bununla birlikte antimikrobiyal etkisini artırmak adına fluor cila ve Chx cila ile kombine kullanımının daha etkili sonuçlar verebileceğini düşünmekteyiz. Ayrıca ozon gazı ile etkin bir antimikrobiyal etki sonrası, fluor cila kullanımının fluorun remineralize edici özelliğinden dolayı oluşabilecek çürük lezyonlarının gelişimini de daha iyi durdurulabileceği kanısındayız. Ancak biyofilm bakterilerinin sahip olduğu avantajlar nedeni ile antimikrobiyal ajanların etkilerinin zaman geçtikçe azaldığı ve bu nedenle biyofilm yapısının doğasının daha iyi anlaşılabilmesi ve ozon gibi etkili ajanların dirençli biyofilm üzerine etkinliğinin nasıl daha da fazla artırılabileceğiyle ilgili klinik çalışmaların yapılması gerektiği düşüncesindeyiz.

Abstract:
The purpose of this study is to make a comparative assessment of the efficiency of ozone gas application with OzonyTronX® device for 60 s and use of Cervitec®Plus, Duraphat® polish and ozone and other agents on thickness and vitality of the biyofilm structure known to cause tooth decays using a confocal laser scanning microscope on in-situ conditions.

Our study was applied to 10 children applying to our clinic, 5 of whom being with active decays and 5 without any decays, who are in completely healthy condition without any missing teeth on the maxilla and whose ages vary between 11-14. Special acrylic plaques, on which 6 samples obtained from cattle teeth are located, were arranged for the maxillae of the children to obtain the biyofilm on in-situ conditions. With the help of the sectioning device, sections at ~2mm width and ~3mm height were taken from a cattle tooth and sterilized in the autoclave. The samples were embedded in the buccal protrusion prepared on the plaque, thus the biyofilm structure was protected against external harmful effects. Following the positioning of the samples on the plaques, the participants were told to carry the plaques for 6, 24 and 48 hours. At the end of every hour, the samples were carefully taken from the plaque and other 6 samples obtained from the same cattle tooth were positioned on the plaques. After the samples were removed from the plaques, laboratory studies began. They were separated as Group 1 made of 5 participants with without any decays and Group 2 of 5 participants with high decay activity. At the end of six hours, 1 sample randomly selected among the samples from Group 1 was washed with physiologic salin for 1 minute, then 3rd level ozone treatment was applied for 60 s using OzonyTronX® device.  The second sample was washed with physiologic salin and Cervitec®Plus polish was applied for 1 minute. After the samples were washed again with physiologic salin, ozone treatment was applied. The third sample was washed with physiologic salin and Duraphat® polish was applied for 1 minute. After the samples were washed with physiologic salin, ozone treatment was applied again. The fourth sample was washed with physiologic salin and Cervitec®Plus polish was applied for 1 minute. The fifth sample was washed with physiologic salin and Duraphat®polish was applied for 1 minute. The sixth sample was only washed with physiologic salin for 1 minute.  The same treatment procedure was applied for all participants after they have carried the plaques for 24 and 48 hours. Samples obtained from participants in Group 2 at the end of 6, 24 and 48 hours were selected randomly and the same treatment procedure applied to Group1 was applied to Group 2. Following the treatment procedure applied to samples, all samples were colored with ethidum bromide and fluorescent diacetate dyes.  After coloring, the samples were evaluated at the confocal laser scanning microscope.

While the significance of difference between the groups in our study in terms of number of viable microorganisms and the dead cell rates was reviewed with the Kruskal Wallis test, the significant of difference between the groups was evaluated with the Mann Whitney U test, results for p<0.05 was considered statistically significant.

As a result of the statistical analysis of the biyofilm thickness values obtained by using the confocal laser microscope, the biyofilm thickness values in the group with active decays were obtained to be statistically significantly higher than that of the group with not decays (p<0.05). The biyofilm thickness values increased statistically significantly in time (p<0.05). The applied antimicrobial agents caused a decrease in the biyofilm thickness values, but this decrease did not result in a statistically significant difference (p>0.05). The success rating for the 6th hour in both of the group with active decays and the group without decay is application of the ozone gas with Chx > application of the ozone gas with fluorine > application of the ozone gas solely > application of Chx solely > application of fluorine solely > salin; for the 24th hour in the group with decays, application of the ozone gas with Chx = application of the ozone gas with fluorine > application of the ozone gas solely = application of Chx solely > application of fluorine solely > application of the ozone gas with fluorine > application of the ozone gas solely > application of Chx solely = application of fluorine solely > salin. For the 48th hour in the group with active decays, it is application of the ozone gas with Chx > application of the ozone gas with fluorine > application of the ozone gas solely > application of Chx solely > application of fluorine solely > salin. For the 48th hour in the group with no decays, it is application of the ozone gas with Chx = application of the ozone gas with fluorine > application of the ozone gas solely = application of Chx solely > application of fluorine solely > salin.

As a result of the statistical analysis of the biyofilm viability values obtained by using the confocal laser microscope, it was determined that the biyofilm viability rates increased in time but this increase did not cause a statistically significant difference was found (p<0.05). Antimicrobial agents decreased the viable bacteria percentages statistically significantly in every time period (p<0.05). The success rating for the 6th hour in the groups with active decays and with no decays, is application of the ozone gas with Chx > application of the ozone gas solely > application of the ozone gas with fluorine > application of Chx solely > application of fluorine solely > salin. For the 24th hour in the group with active decays, it is application of the ozone gas with Chx > application of the ozone gas with fluorine > application of the ozone gas solely > application of Chx solely > application of fluorine solely > salin; and for the group without decays, it is application of the ozone gas with Chx = application of the ozone gas with fluorine > application of the ozone gas solely > application of Chx solely > application of fluorine solely > salin. For the 48th hour in the group with active decays, it is application of the ozone gas with Chx > application of the ozone gas with fluorine = application of the ozone gas solely > application of Chx solely > application of fluorine solely > salin; and for the group without decays, it is application of the ozone gas with Chx > application of the ozone gas with fluorine > application of the ozone gas solely > application of Chx solely > application of fluorine solely > salin.

Basing on the findings of our study, we suggest that the ozone gas, for being an efficient agent on biyofilm bacteria, can be used as an alternative to fluorine polish used especially in clinic on routine basis, and use in combination with fluorine polish and Chx polish to increase the antimicrobial effects can provide more efficient results. Furthermore, we believe use of fluorine polish after an efficient antimicrobial effect with the ozone gas can better prevent development of decay lesions possibly to occur due to remineralizing character of fluorine. We believe, however, further clinical studies are required with regard to decreased amount of antimicrobial agents in time due to advantages of biyofilm bacteria, better understanding of the biyofilm nature and how the efficiency of agents like ozone on the enduring biyofilm can be enhanced.