Meme hücre hatlarında GGT1, GGT5 ve GGT7 genlerinin susturulmasının gama glutamil transferaz enziminin fonksiyonları üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of silencing of GGT1, GGT5 and GGT7 genes on the functions of gamma glutamyl transferase enzyme in breast cell lines
Yazar: SÜMEYYE RAMAZANOĞLU
Danışman: PROF. DR. SEVGİ AKAYDIN
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Ecz) Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Gama glutamil transferaz = Gamma glutamyl transferase ; Gen susması = Gene silencing ; Glütatyon = Glutathione ; Lökotrienler = Leukotrienes ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Kanser dünya genelinde, ikinci ölüm nedenidir. Meme kanserinde GGT enzim aktivitesinin arttığı gösterilmiştir. GGT ailesinde GGT1'e nükleotit veya amino asit dizisi benzerliği olan olası aktif genlerin GGT5 ve GGT7 olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmanın amacı siRNA uygulanan MCF 10A ve MDA-MB-231 hücre hatlarında gen susturmasının takiben GGT1, GGT5 ve GGT7'nin mRNA ve protein ekspresyon seviyelerinin sırasıyla qRT-PCR ve RAMAN spektroskopisi ile ölçülmesi; elde edilen sonuçları GGT aktivitesi, GSH ve LTD4 seviyeleri arasındaki ilişkileri araştırmaktadır. Her iki hücre hatlarında kontrole kıyasla si-GGT1 ile transfekte edilen hücrelerde tripan mavisi testi ile canlılık oranı anlamlı bir azalma saptanırken, MTT testi kullanıldığında anlamlı bir fark elde edilmemiştir. mRNA sonuçları ile benzer bir şekilde siRNA ile transfekte edilen hücrelerde protein miktarları transfekte edilmemiş hücrelere göre belirgin bir şekilde azalmıştır. Her iki hücre hatlarında da si-GGT1 ve si-GGT5 ile transfeksiyonu takiben GGT aktivitesinde azalma olmadığı ve GSH seviyesinin değişmediği gösterilmiştir. si-GGT7 ile transfekte edilen hücre hatlarında ise GGT aktivitesinin artığı belirlenmiş, MCF 10A hücre hattında GSH seviyesinin arttığı; MDA-MB-231 hücre hattında GSH seviyesinin azaldığı saptanmıştır. si-GGT5 ile transfekte edilen MDA-MB-231 hücre hattında LTD4 seviyesinin azaldığı görülmüştür, fakat MCF 10A normal hücrelerdeki LTD4 seviyesi MDA-MB-231 kanserli hürelerindeki ile kıyaslandığında daha düşük olup susturma etkisi görülmemiştir. Parametreler arasındaki ilişki incelendiğinde, MCF 10A hücre hattında GGT aktivitesi ile tripan mavisi ile elde edilen canlılık oranları ve GGT aktivitesi ile LTD4 seviyesi arasında pozitif yönde orta düzeyde istatistiksel olarak anlamlı korelasyon olduğu, MDA-MB-231 hücre hattında ise GSH seviyesi ve LTD4 seviyesi, negatif yönde orta düzeyde istatistiksel olarak anlamlı korelasyon olduğu,  LTD4 seviyesi ve tripan mavisi ile elde edilen canlılık oranları, pozitif yönde orta düzeyde istatistiksel olarak anlamlı korelasyon olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak, GGT5 ve GGT-7 hücre metabolizmasında önemli rol aldıklarını düşünülmektedir.

Abstract:
Cancer is the second leading cause of death worldwide. GGT enzyme activity has been shown to be increased in breast cancer. Possible active genes with nucleotide or amino acid sequence similarity to GGT1 in the GGT family were identified as GGT5 and GGT7. The aim of this study was to measure mRNA expression levels of GGT1, GGT5 and GGT7 by qRT-PCR and protein expression levels by RAMAN method after gene silencing using siRNA in MCF 10A and MDA-MB-231 lines and examines the effects of silencing on the GGT activity, GSH and LTD4 levels. There was a significant decrease in viability in cells transfected with si-GGT1 compared to the control when using trypan blue test in both cell lines, but no significant difference was detected when using MTT test. Similar to the mRNA results, the protein levels were significantly reduced in cells transfected with siRNA compared to untransfected cells. It was shown that there was no decrease in GGT activity and GSH level did not change in both cell lines transfected with si-GGT1 and si-GGT5. It was observed that GGT activity increased in both cell lines transfected with si-GGT7 and the GSH level increased in the MCF 10A cell line, while the GSH level in the MDA-MB-231 cell line decreased. The level of LTD4 in MDA-MB-231 cell line transfected with si-GGT5 was decreased, but the level of LTD4 in MCF 10A normal cells was lower compared to that in cancer cells and no silencing effect was observed. When relationship between the parameters was examined, a moderately statistically significant positive correlation was found between GGT activity and viability when using trypan blue and between GGT activity and LTD4 level in MCF 10A cell line, a moderately statistically significant negative correlation was found between GSH level and LTD4 level and a positive correlation was found between LTD4 level and viability when using trypan blue in MDA-MB-231 cell line. In conclusion, GGT5 and GGT-7 are thought to play an important role in cell metabolism.