Farklı formlardaki nanohidroksiapatitlerin sitotoksik ve genotoksik etkilerinin araştırılması
Investigation of the cytotoxic and genotoxic effects of different forms of nanohydroxyapatites
Yazar: MERVE GÜNEŞ
Danışman: PROF. DR. BÜLENT KAYA
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Genotoksik etki = Genotoxic effect ; Kaspazlar = Caspases ; Meyve sineği = Fruit flies ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Sitotoksik etki = Cytotoxic effect ; Somatik mutasyon = Somatic mutation

Özet:
Biyomalzemeler, ortopedik uygulamalarda, yüz ve çene cerrahisinde, yapay kalp parçalarında, metal parçalarda ve vücuda yerleştirilebilir cihazlarda kullanılmaktadır. Bu malzemeler organizmaya uyumlu olması, alerjik olmaması, fiziksel ve kimyasal etkenlere karşı dayanıklı olması sebebiyle tıp alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Hidroksiapatit (HA) doku ile uyumluluk gösteren biyoaktif kalsiyum fosfat seramiklerindendir. Bu çalışmada  nano boyutlu HA (nHA)'ların küre ve çubuk formlarının etkileri in vivo ortamda Drosophila melanogaster'da ve in vitro ortamda iki farklı hücrelerinde (insan embriyonik böbrek epitel (293T) ve insan vasküler endotel (HUVEC) hücre hatları) araştırılmıştır. in vivo çalışmalarda Drosophila Kanat Somatik Mutasyon ve Rekombinasyon Testi (SMART) ve Tek Hücre Jel Elektroforezi (KOMET) yöntemleri ile nHA'ların potansiyel genotoksisitesi araştırılmıştır. Hücre ölüm yolaklarındaki aktivasyonun incelenmesi amacıyla Drosophila hemositlerinde kaspaz aktiviteleri değerlendirilmiştir. Drosophila'da gen ifadelerinin araştırılması amacıyla Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT2-PCR) yöntemi ile DNA tamirinde görevli 36 adet genin ifadeleri araştırılmıştır. in vitro çalışmalar kapsamında 293T ve HUVEC hücre hatlarında WST-1 hücre canlılık testi ve tripan mavisi testi ile sitotoksisite ve KOMET ile genotoksisite potansiyeli değerlendirilmiştir.
Elde edilen sonuçlara göre nHA küre ve çubuk formlarının potansiyel genotoksik etkileri D. melanogaster somatik hücrelerle ile yapılan SMART testinde küre formda küçük tek tip, toplam mwh klonlar ve toplam klonlar bakımından 50, 100 ve 200 ppm'lik konsantrasyonlarda genotoksisite tespit edilmiştir. Çubuk formlu nHA uygulamalarında çalışılan hiçbir dozda genotoksik etki gözlenmemiştir. Drosophila hemositleri ile yapılan KOMET testinde 100 ppm konsantrasyonundaki küre ve çubuk formlu nHA'lar Drosophila hemositlerinde kuyruk yoğunluğu bakımından genotoksisiteye sebep olmuştur. Yapılan kaspaz aktiviteleri çalışmalarında küre formda 200 ppm'lik konsantrasyonun kaspaz-3/7, kaspaz-8 ve kaspaz-9 aktivitesini arttırdığı belirlenmiştir. Çubuk formlu nHA  25 ve 50 ppm'lik dozlarda içsel yolak sinyal kaskadlarını (kaspaz9 ve kapaz3/7) aktive ederken, yüksek konsantrasyonlarda dışsal apoptotik yolağı (kaspaz8) aktive ettiği belirlenmiştir. Gen aktivasyonun incelendiği RT2-PCR analizinde küre formda 25 ppm'lik uygulamada Mlh1 ve Brca2 genlerinde artış gözlenirken spel1, Rad51C, dap, MCPH1, Rad51D, Rad1, Pms2, mu2, Sir2 genlerinde azalma meydana gelmiştir. 200 ppm'lik konsantrasyonda ise Mlh1 geninin ifadesinde artış gözlenirken Fen1, Rad9, Fancd2, Rad51C, Hus1-like, dap, DNA-ligl, MCPH1, Rad51D, Ercc1, Rev1, Pms2, tefu, RpLP2 genlerinin ifadesinde ise azalma meydana gelmiştir. Çubuk formda 25 ppm'lik konsantrasyonda azalma, Mlh1 ve Brca2 gen ifadelerinde artış gözlenmiştir. Bunun yanında CG9601/PNKP, Rev1, Dap, mu2, RpLP2, Pms2, spel1, Sir2, Rad51C, PCNA, stg, Rad51D, Fen1, MCPH1 genlerinde azalma meydana gelmiştir. 200 ppm'lik konsantrasyonda çalışan genlerin ifadelerinde artış meydana gelmemiş olup Xpac, spel1, Fen1, Rad9, Tbp, Cdk7, DNApol-eta, Fancd2, XRCC1, Rad51C, Hus1-like, Ogg1, dap, DNA-ligl, CG9601, mei-41, MCPH1, put, Rad51D, Rev1, Rad17, Rad1, Pms2, mu2, tefu, RpL32, Sir2, RpLP2, stg, SdhA genlerinde azalma tespit edilmiştir.
Tez çalışması kapsamında 293T hücrelerinde WST-1 testi ile yapılan değerlendirmede hem küre hem de çubuk formlu nHA uygulamalarında 24, 48 ve 72 saatlik inkübasyon sürelerinde doza bağlı olarak hücre canlılığının arttığı gözlenmiştir. Tripan mavisi ile yapılan testte küre formda doza bağlı olarak azalan sitotoksik etki gözlenmiştir. Çubuk formda ise sitotoksik etki saptanmamıştır. HUVEC hücre hattında WST-1 testinde hücre canlılığının hem küre hem de çubuk formda doza bağlı olarak arttığı gözlenmiştir. Tripan mavisi ile yapılan değerlendirmede sadece 24 saatlik inkübasyonda küre formda 1000, 800, ve 600 ppm'lik konsantrasyonlarda sitotoksik etki gözlenmiştir. Çubuk formda ise 48 ve 72 saatlik inkübasyon sürelerinde sitotoksik etki gözlenmiştir. in vitro komet sonuçlarına göre küre formlu nHA 293T hücrelerinde kuyruk yoğunluğu parametresinde genotoksik etkinin her üç inkübasyon süresinde de düşük dozlarda daha fazla olduğu gözlenmiştir. Çubuk formlu nHA'nın 293T hücrelerindeki genotoksik etkileri kuyruk yoğunluğunda 24 saatlik inkübasyon süresinde 200 ppm haricindeki dozlarda genotoksik etki gözlenirken 48 saatlik inkübasyon süresinde 400 ppm'lik dozda 72 saatlik inkübasyon süresinde 200 ve 400 ppm'de DNA hasarı gözlenmiştir. Küre formlu nHA'nın HUVEC hücrelerindeki genotoksik etkisi kuyruk yoğunluğu parametresinde 24 saatlik inkübasyon süresinde 200 ppm, 48 saatlik inkübasyon süresinde 800 ppm ve 72 saatlik inkübasyon süresinde 1000 ppm haricindeki tüm dozlarda DNA hasarı gözlenmiştir. Çubuk formlu nHA HUVEC hücrelerinde kuyruk yoğunluğu parametresinde 24 saatlik inkübasyon süresinde 200 ve 400 ppm, 48 saatlik inkübasyon süresinde 400 ve 800 ppm dozlarında genotoksik etki gözlenmiştir. Bunun yanında 72 saatlik inkübasyon süresinde çalışan dozların hiçbirinde DNA hasarı gözlenmemiştir.
Çalışmadan elde edilen sonuçlara göre çubuk formun hem D. melanogaster'da yapılan hem de 293T ve HUVEC hücre hatları ile gerçekleştirilen deneylerde küre forma göre daha az toksik etkiye neden olduğu gözlenmiştir. Küre form hem morfolojik yapısı hem de boyutsal olarak çubuk forma göre daha küçük olması sebebiyle hücrelerdeki toksisite yanıtlarını indüklemiş olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Biomaterials are used in orthopedic applications, facial and maxillofacial surgery, artificial heart parts, metal parts and implantable devices. These materials are widely used in the field of medicine because they are compatible with the organism, not allergic, and resistant to physical and chemical factors. Hydroxyapatite (HA) is bioactive calcium phosphate ceramics that is compatible with tissue. In this study, the effects of spherical and rod forms of nano sizded Has (nHA) were investigated in Drosophila melanogaster in vivo and in two different cell lines (human embryonic kidney epithelium (293T) and human vascular endothelial (HUVEC) cell lines in vitro). Potential genotoxicity of nHAs was investigated with Drosophila Wing Somatic Mutation and Recombination Assay (SMART) and Single Cell Gel Electrophoresis (COMET) methods in in vivo studies. Caspase activities were evaluated in Drosophila hemocytes to examine the activation in cell death pathways. In order to investigate gene expressions in Drosophila, the expressions of 36 genes involved in DNA repair were investigated with the Real Time Polymerase Chain Reaction (RT2-PCR) method. Within the scope of in vitro studies, cytotoxicity with WST-1 cell viability test and trypan blue test and genotoxicity potential with KOMET were evaluated in 293T and HUVEC cell lines.
According to the results obtained, the potential genotoxic effects of nHA sphere and rod forms In the SMART test with D. melanogaster somatic cells, genotoxicity was detected in spherical form in small single-type, total mwh clones and total clones at concentrations of 50, 100 and 200 ppm. No genotoxic effect was observed at any dose studied in rod-form nHA applications. In the KOMET test with Drosophila hemocytes, spherical and rod-shaped nHAs at 100 ppm concentration caused genotoxicity in Drosophila hemocytes in terms of tail density. In the caspase activities studies, it was determined that 200 ppm concentration in spherical form increased the caspase-3/7, caspase-8 and caspase-9 activities. It has been determined that rod-formed nHA activates the intrinsic pathway signal cascades (caspase-9 and caspase-3/7) at 25 and 50 ppm doses, while it activates the extrinsic apoptotic pathway (caspase-8) at high concentrations. In the RT2-PCR analysis in which gene activation was examined, an increase in Mlh1 and Brca2 genes was observed, while a decrease in spel1, Rad51C, dap, MCPH1, Rad51D, Rad1, Pms2, mu2, Sir2 genes were observed in the application of 25 ppm in spherical form. At 200 ppm concentration, an increase was observed in the expression of only the Mlh1 gene, while the expression of the Fen1, Rad9, Fancd2, Rad51C, Hus1-like, dap, DNA-ligl, MCPH1, Rad51D, Ercc1, Rev1, Pms2, tefu, RpLP2 genes decreased. A decrease in 25 ppm concentration and an increase in Mlh1 and Brca2 gene expressions were observed in rod form. In addition, there was a decrease in CG9601/PNKP, Rev1, Dap, mu2, RpLP2, Pms2, spel1, Sir2, Rad51C, PCNA, stg, Rad51D, Fen1, MCPH1 genes. There was no increase in the expression of genes operating at 200 ppm concentration, but a decrease was detected in Xpac, spel1, Fen1, Rad9, Tbp, Cdk7, DNApol-eta, Fancd2, XRCC1, Rad51C, Hus1-like, Ogg1, dap, DNA-ligl, CG9601, mei-41, MCPH1, put, Rad51D, Rev1, Rad17, Rad1, Pms2, mu2, tefu, RpL32, Sir2, RpLP2, stg, SdhA genes.
Within the scope of the thesis study, in the evaluation made with the WST-1 test on the 293T cell line, it was observed that the cell viability increased in both spherical and rod form nHA applications in 24, 48 and 72 hours incubation periods depending on the dose. In the test performed with trypan blue, a dose-dependent decreased cytotoxic effect was observed in spherical form. In stick form, however, no cytotoxic effect was detected. In the HUVEC cell line WST-1 test, it was observed that cell viability increased in both spherical and rod form in a dose-dependent manner. In the evaluation made with trypan blue, cytotoxic effects were observed only at concentrations of 1000, 800, and 600 ppm in spherical form in 24 hours of incubation. In stick form, cytotoxic effect was observed in 48 and 72 hour incubation periods. According to in vitro comet results, it was observed that the genotoxic effect on tail density parameter in spherical nHA 293T cell line was higher at low doses in all three incubation periods. The genotoxic effects of rod-form nHA in 293T cell line were observed at tail density at doses other than 200 ppm in the 24-hour incubation period, while DNA damage was observed at 200 and 400 ppm in the 72-hour incubation period at a dose of 400 ppm in the 48-hour incubation period. The genotoxic effect of spherical nHA on the HUVEC cell line was observed at all doses except 200 ppm in the 24-hour incubation period, 800 ppm in the 48-hour incubation period, and 1000 ppm in the 72-hour incubation period in the tail density parameter. Genotoxic effects were observed in the rod-formed nHA HUVEC cell line at doses of 200 and 400 ppm in the 24-hour incubation period, and 400 and 800 ppm in the 48-hour incubation period in the tail density parameter. In addition, DNA damage was not observed in any of the working doses during the 72 hour incubation period.,
According to the results obtained from the study, it was observed that the rod form caused less toxic effects than the spherical form in both D. melanogaster and experiments with 293T and HUVEC cell lines. It is thought that the spherical form may have induced toxicity responses in the cells due to its morphological structure and its smaller size compared to the rod form.