Yeni bir yaklaşımla kuantum nokta esaslı immünofloresan in vitro diagnostik testlerin tasarımı, geliştirilmesi ve biyomedikal uygulamaları
Design, development and biomedical applications of quantum dot based immunofluorescence in vitro diagnostic tests with a new approach
Yazar: ÖZLET AKÇA ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. PERİHAN ÜNAK ; PROF. DR. SUNA TİMUR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nükleer Bilimler Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Tez çalışması ile HIV, HCV, HbsAg gibi enfeksiyonel hastalıkların, Troponin I, NT-proBNP, h-FABP gibi kardiyak belirteçlerin insan serum ve plazmasında yüksek hassasiyet ve seçicilik ile kalitatif olarak tespitinde  kullanılacak kuantum nokta esaslı, tek aşamalı, immünofloresan hızlı tanı test kitlerinin tasarlanması amaçlanmıştır. Tasarlanan tanı kitleri uygun negatif/pozitif serum/plazma örnekleri ile in vitro olarak test edilmiştir. Elde edilen sonuçlar kolloidal gold temelli mevcut testler ile karşılaştırılmıştır.
Suda çözünebilen, etkin fonksiyonel gruplara sahip, biyokonjugasyona uyumlu, yüksek floresans kararlılığa sahip, kuantum verimi yüksek  CdTe/CdS-TGA  kuantum noktalar (Qdot) azot gazı altında geri soğutuculu sentez düzeneği içerisinde kimyasal yöntem ile sentezlenmiştir. Kuantum  noktaların optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları Uv-Vis Absorbsiyon Spektroskopisi, Floresan Spektroskopisi, DLS, SEM, TEM, STEM, AFM, XRD ve EDX ile gerçekleştirilmiştir. Karakterizasyonu gerçekleştirilen kuantum noktalar tasarlanacak teste uygun monoklonal/poliklonal antikor veya rekombinant antijenler ile EDC-NHS kimyası kullanılarak konjuge edilmiştir. Elde edilen antikor/antijen konjuge Qdot' ların karakterizasyonu Bradford protein tayini, Agaroz jel elektroforezi, Uv-Vis Absorbsiyon ve Floresan Spektroskopisi, DLS, HPLC, TEM ve Aglütinasyon test çalışması ile gerçekleştirilmiştir. Ayrıca  rHCV-Qdot konjugatlar 131I ile iodojen yöntemine göre radyoiyotlanmış ve radyoiyodinasyonun kalite kontrolü TLRC ile yapılmıştır. Bu yöntem konjugasyonun karakterizasyonu için  alternatif bir yöntem olarak kullanılmıştır.
Testler immünokromatografi yöntemi ile çalışan tek aşamalı hızlı tanı kitleri örnek alınarak tasarlanmıştır. Test kiti temel olarak sırtlık üzerine lamine edilmiş örnek uygulama pedi, konjugat ped, nitroselüloz membran ve emici ped olmak üzere 4 komponentden oluşmuştur. Antikor/antijen konjuge Qdot ların konjugat ped yüzeyine immobilizasyonu dispenser ile spreyleme yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Nitroselüloz membrana, test çizgisini (T)  ve kontrol çizgisini (C) oluşturabilmek için konjugat pede emdirilen antijen/antikor ile konjuge kuantum noktaların tutunabileceği spesifik rekombinant antijenler veya monoklonal antikorlar emdirilmiştir. Testler negatif/pozitif serum/plazma örnekleri ile denenmiştir.
Elde edilen sonuçlar  Qdot temelli HIV, HCV, HbsAg, Troponin I, NT-proBNP ve h-FABP testlerinin mevcut koloidal gold temelli tanı testlerinden hassasiyet ve özgüllüğünün daha yüksek olduğunu göstermiştir. Farklı hastalıkların  testlere hatalı girişimleri için yapılan denemeler de negatif yanıt vermiş ve herhangi bir çapraz reaksiyonun olmadığı tespit edilmiştir. Bu da hastalığın erken teşhis ve tedavisi için çok büyük önem taşımaktadır. Ayrıca tasarlanan testlerin kolloidal gold temelli mevcut testlerle karşılaştırıldığında çok daha düşük maliyetlere elde edildiği görülmüştür. Hem etkinlik hem de maliyet açısından bir adım önde olan bu testler yakın gelecekte hastalıkların erken tanısında önemli rol oynayacaktır.

Abstract:
In this thesis project, our aim is to develop single-stage, highly sensitive and selective quantum dot-based-immunofluorescence rapid diagnostic test kits which will be used for the qualitative and quantitative determination of infectious diseases, such as HIV, HCV, HBsAg etc. and  cardiac markers, such as Troponin I, NT-proBNP, h-FABP in human whole blood, serum and plasma. The designed diagnostic kits were tested in vitro with appropriate negative/positive serum/ plasma samples. The results were compared with the existing on colloidal gold based tests.
Water-soluble, effective that group, bioconjugation compatible, high resolution fluorescence and high quantum yield CdTe/ CdS quantum dots-TGA (Qdot) was synthesized by chemical method for recycling in NH3 atmosphere. Optimization and characterization studies of quantum dots were carried out with Uv-Vis Absorption Spectroscopy, Fluorescence Spectroscopy, DLS, SEM, TEM, STEM, AFM, XRD and EDX. Characterization of the quantum dots to be designed was designed to produce EDC-NHS chemistry with monoclonal/ polyclonal antibodies or recombinant antigens suitable for the test. Characterization of the obtained antibody/antigen conjugated Qdots was performed by Bradford protein assay, Agarose gel electrophoresis, Uv-Vis Absorption and Fluorescence Spectroscopy, DLS, HPLC, TEM and Agglutination test. In addition, the nanoconjugates were radiolabeled with 131I according to the iodogen method. Alternatively Radioiodination quality control was done with TLRC. 
The tests were designed by using immunochromatography as a single-step rapid diagnostic kits. The test kit consists of 4 components mainly consisting of sample pad, conjugate pad, nitrocellulose membrane and absorbent pad laminated on the back. Immobilization of the antibody/antigen conjugate Qdots to the conjugate pad surface was performed using the dispenser spray method. In order to form the test line (T) and the control line (C), the nitrocellulose membrane is impregnated with conjugated antigens or specific recombinant antigens or monoclonal antibodies to which conjugated quantum dots can be attached with the antigen / antibody adsorbed on the conjugated pad. Tests were run with negative / positive serum / plasma samples.
The results have shown that Qdot-based HIV, HCV, HbsAg, Troponin I, NT-proBNP and h-FABP tests have higher sensitivity and specificity than current colloidal gold-based diagnostic tests. Experiments for erroneous attempts at different diseases have also been negative. No cross-reaction has been detected. It is very important for the early diagnosis and treatment of the disease. Furthermore, the designed tests were obtained at much lower costs compared to the existing tests based on colloidal gold. These tests will play an important role in the early diagnosis of diseases in the near future.