Sıçanlarda kimyasal peritonite bağlı periton fibrozisinde darbepoetin'in peritoneal fibrozis ile peritoneal doku MMP?2 Ve TIMP?2 üzerine etkisinin incelenmesi
The effects of darbepoetin on peritoneal fibrosis induced by chemical peritonitis and on peritoneal tissue MMP?2 and TIMP?2 levels at rats
Yazar: ALİ BORAZAN
Danışman: PROF. DR. TANER ÇAMSARI
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Nefroloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2008
Konu: Nefroloji = Nephrology
Dizin: Eritropoietin = Erythropoietin

Özet:
Uzun süreli periton diyaliz (PD) tedavisi sonrası periton zarında meydana gelen patolojik değişiklikler sonucu enkapsüle periton sklerozu (EPS) gelişebilir. EPS, PD'nin ciddi bir komplikasyonu olup PD yetersizliğine ve ölüme neden olabilir. Günümüzde henüz tam olarak tedavisi mümkün değildir. Darbepoetin; bir hemopoetik büyüme faktörü olup anemi tedavisinde kullanılır. Darbepoetin'in peritoneal fibrozisteki etkinliğini gösteren henüz bir çalışma yoktur. Bazı çalışmalarda kalp, beyin ve böbrekte gelişen fibroziste, fibrozisi azalttığı gösterilmiştir.Amaç: Bu çalışmada darbepoetin'in; sıçanlarda tuzlu su içinde erimiş %15 etil alkol ve %0,1 klorheksidin glukonat bulunan solusyon ile peritoneal fibrozis gelişimi ve peritoneal fibrosis gelişimi ile ilgili olabilecek peritoneal doku MMP?2 ve TIMP?2 üzerine etkisini araştırmayı amaçladık.Gereç ve Yöntem: Yirmi dört adet dişi Wistar albino sıçan üç gruba bölündü. Grup1 (KH grubu): Kimyasal peritonit oluşturmak için tuzlu su içinde erimiş %15 etil alkol ve %0,1 KH bulunan karışımı 3 ml / gün karın içine, grup 2 (KH+Epo grubu): tuzlu su içinde erimiş %15 etil alkol ve %0,1 KH bulunan karışımı 3 ml / gün karın içine + ilk gün ve yedinci günde darbepoetin 12.5 mcg/kg dozunda iki kez ciltaltına, grup 3 (SF grubu): %0,9'luk serum fizyolojikten 3 ml / gün karın içine uygulandı. Karın içine tüm uygulamalar karnın sağ alt kadranından 21 gauge iğne ile yapıldı. Çalışma süresi 14 gün olarak belirlendi. 15.günde sıçanlar sakrifiye edildi ve paryetal periton için karın sol ön duvarından visseral periton için karaciğer üzerinden örnekler alındı. Patolojik inceleme için Hematoksilen & Eosin (HE) ve Von Gieson (VG) boyası kullanıldı. Işık mikroskopisi ile paryetal ve visseral peritonun kalınlığı, damar çoğalması, fibrozis ve yangı değerlendirildi. İmmünohistokimyasal olarak MMP?2 ve TIMP?2 antikor boyaları kullanılarak ışık mikroskopisi ile değerlendirildi. Biyokimyasal olarak paryetal periton doku örneklerinde MMP?2 ve TIMP?2 çalışıldı. MMP'lerin çalışılmasında jelatin zimografi, TIMP'ler için ELİSA yöntemi kullanıldı.Bulgular: Histopatolojik değerlendirmede HE ve VG ile KH+Epo grubunda KH grubuna göre paryetal ve visseral peritonda kalınlık azalması istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.05). Yangı skorlaması, damarlanma skorlaması ve fibrotik alan yüzdesi açısından anlamlı fark bulunmadı (P>0,05) İmmünohistokimyasal olarak Darbepoetin paryetal ve visseral peritonda MMP-2'yi KH grubuna göre baskılarken (p<0,05), TIMP?2 üzerine etkili bulunmamıştır (p>0,05). Biyokimyasal olarak ise paryetal peritonda aktif MMP-2'nin proMMP-2'ye oranı KH+Epo grubunda KH grubuna göre artırması anlamlı bulunurken (p<0,001), Hem KH grubunda hemde KH+Epo grubunda TIMP?2 düzeylerinin kontrol grubuna göre baskılandığı (p<0,05) görüldü.Sonuç: Darbepoetin; KH ile oluşturulan kimyasal peritonit sonrasında histopatolojik olarak peritoneal fibrozis gelişimini azaltmaktadır. Darbepoetin'in periton fibrozisine neden olmadığı ve periton fibrozisini engelleyebileceği söylenebilir. Ancak bu konuda gerek doz ile ilgili gerekse süre ile ilgili geniş çaplı deneysel ve klinik araştırmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Encapsulating peritoneal sclerosis (EPS) may develop as a result of pathological changes occuring at peritoneal membrane after long-term peritoneal dialysis (PD). EPS is regarded as a serious complication of peritoneal dialysis, and may lead to inadequate dialysis and death. Currently, no validated guidelines for management of EPS exist. Darbepoetin, a hematopoietic growth factor, is a synthetic analogue of erythropoietin and used as an erythropoiesis stimulating agent. The study showing effectiveness of darbepoetin on peritoneal fibrosis is not available yet. However, there are some studies showing that it can decrease fibrosis in heart, brain, and kidneys.Objective: To assess the influence of darbepoetin on development of peritoneal fibrosis on rats induced by daily injections of chlorhexidine gluconate (0,1%) and ethanol (15%) dissolved in saline, and on peritoneal tissue levels of MMP?2 and TIMP?2 that may be regarded as factors playing role on development of peritoneal fibrosis.Subjects and Methods: Twenty-four female Wistar albino rats were divided into three groups. The first group received 3 ml daily injections of chlorhexidine gluconate (0,1%) and ethanol (15%) dissolved in saline intraperitoneally to induce chemical peritonitis; group 2 (Chlorhexidine gluconate and Epo group) received 3 ml daily injections of chlorhexidine gluconate (0,1%) and ethanol (15%) dissolved in saline and also darbepoetin 12.5 microgr/ per kilogram/ day subcutaneously on the first and seventh days; group 3 (saline group) received 0.9% saline (3 ml/d) intraperitoneally through right lower quadrant by 21 gauge needle. The study duration was fourteen days. On the fifteenth day rats were sacrificed, parietal and visceral peritoneum samples were obtained from left anterior abdominal wall and liver, respectively. Pathological samples were examined using Hematoxyline & Eosin (HE), and Von Gieson (VG) stains. The thickness, vascular proliferation, and inflammation were determined by light microscopy. MMP?2 and TIMP?2 were studied immunohistochemically by monoclonal antibody staining. The expression of MMP?2 on parietal peritoneum were studied biochemically by using gelatin zymography, and of TIMP?2 by ELISA.Results: The decrease in thickness of parietal and visceral peritoneum in group 2 was statistically significant when compared to group 1 (p<0.05). Inflammation scores, vascularization scores, and the percentages of fibrotic surfaces were not statistically different between these groups (p>0.05). Immunohistochemically darbepoetin was shown to decrease MMP?2 expression on parietal and visceral peritoneum than group 2 (p<0.05), but has no effect on TIMP?2 (p>0.05). Biochemically the ratio of active MMP?2 to proMMP?2 was significantly increased in group 2 than group 1 (p<0.001), however, TIMP- 2 levels in both groups were decreased compared to control group (p<0.05).Discussion: Darbepoetin histopathologically reduces peritoneal fibrosis induced by chlorhexidine gluconate. We can suggest that Darbepoetin does not cause peritoneal fibrosis and may prevent peritoneal fibrosis. But from dosage and duration points of view we need extended further clinical and experimental studies.