İnsan kaynaklı ekzopolisakkarid üreticisi bazı probiyotik ve sinbiyotik uygulamalarının kolon kanseri hücre hattında antikanser ve apoptoz yolağındaki bazı genlerin ekspresyon düzeylerine etkileri
The effects of anticancer and some genes expression levels on the apoptosis pathway of human-derived exopolysaccharide producer some probiotic and synbiotic applications on colon cancer cell line
Yazar: ÜMMÜGÜLSÜM TÜKENMEZ
Danışman: PROF. DR. BELMA ASLIM
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu doktora tez çalışmasında, probiyotik canlı bakterilerin (Lactobacillus plantarum GD2, Lactobacillus rhamnosus E9, Lactobacillus brevis LB63, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus B3), bu bakterilerden elde edilen liyofilize ekzopolisakkaridlerin (L-EPS) ve probiyotik canlı bakteri ile L-EPS kombinasyonlarının (sinbiyotik) kolorektal adenokarsinoma hücre hattı (HT-29) üzerine antikanser etkileri araştırılmıştır. Öncelikli olarak, probiyotik suşların EPS üretim kapasiteleri, L-EPS miktarları, L-EPS'lerin monomer kompozisyonları, probiyotiklerin ve sinbiyotiklerin HT-29 hücrelerine adezyon özellikleri araştırılmıştır. Ayrıca, probiyotik canlı bakteri, L-EPS ve sinbiyotiklerin hidrojen peroksit (H2O2) ve sodyum azid (NaN3) pozitif mutajenlerine karşı antimutajenik etkileri ve HT-29 hücre hattı üzerine antiproliferatif aktiviteleri belirlenmiştir. Antiproliferatif etkisi yüksek bulunan probiyotik canlı bakterilerin ve sinbiyotiklerin apoptotik etkileri hem ELISA ile hem de Bax, Bcl-2, kaspaz-3, kaspaz-9 genlerinin mRNA ve protein düzeyindeki ifadeleri değerlendirilerek belirlenmiştir. Yüksek EPS üreticisi suşlardan (224-257 mg/L, L-EPS; 298-449 mg/L) elde edilen tüm L-EPS'lerde mannoz, glukoz ve N-asetil glukozamin varlığı belirlenmiş ve baskın monomerin mannoz olduğu tespit edilmiştir (%70,74-88,25). Çalışmada, tüm suşların sinbiyotik uygulamasının probiyotik uygulamasına göre HT-29 hücrelerine daha iyi adezyon özelliği gösterdiği belirlenmiştir. Hem canlı bakteri uygulamasında hemde sinbiyotik uygulamasında HT-29 hücrelerine en iyi adezyonu L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3 suşunun gösterdiği tespit edilmiş (%88-90) ve EPS üretim miktarı ile bakteriyel adezyon arasında pozitif korelasyon olduğu bulunmuştur (p<0,01). NaN3 mutajenine karşı en yüksek antimutajenik etki L. brevis LB63 suşunun sinbiyotik uygulamasında belirlenmiştir (%61). H2O2 pozitif mutajenine karşı tüm uygulamaların güçlü antimutajenik etki gösterdiği tespit edilmiş ve en yüksek antimutajenik etkiyi L. rhamnosus E9 suşunun sinbiyotik uygulamasının gösterdiği belirlenmiştir (%100). Gen ekspresyonu düzeyinde apoptozis hem probiyotik canlı bakteri hem de sinbiyotik uygulamalarında belirlenmiştir. HT-29 hücrelerindeki apoptozisin indüksiyonunda, uygulama sürelerine göre farklılık gözlenmiştir. Canlı bakteri uygulamasında L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3 suşunun, sinbiyotik uygulamasında ise, L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3 ve L. plantarum GD2 sinbiyotiklerinin HT-29 hücrelerinde yüksek oranda apoptozisi indüklediği tespit edilmiştir (p<0,05).

Abstract:
In this doctorate thesis study, the anticancer effects of probiotic viable bacteria (Lactobacillus plantarum GD2, Lactobacillus rhamnosus E9, Lactobacillus brevis LB63, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus B3), lyophilized exopolysaccharides (L-EPS) obtained from these bacteria, and the combinations of probiotic viable bacteria and L-EPSs (synbiotic) on a colorectal cancer cell line (HT-29) were investigated. Primarily, EPS production capacities of these probiotic strains, L-EPS amounts, monomer compositions of the L-EPSs, and adhesion properties of the probiotics and synbiotics to HT-29 cells were investigated. Additionally, the antimutagenic effects of probiotic viable bacteria, L-EPSs, and synbiotics against hydrogen peroxide (H2O2) and sodium azide (NaN3) positive mutagens and their antiproliferative activities on the HT-29 cell line were also determined. The apoptotic effects of the probiotic viable bacteria and synbiotics with strong antiproliferative activity were determined by both ELISA test and by evaluating the expression of the Bax, Bcl-2, caspase-3, and caspase-9 genes at the mRNA and protein level. The presence of mannose, glucose, and N-acetyl glucosamine were detected in all L-EPSs obtained from high EPS producer strains (224-257 mg/L, L-EPS; 298-449 mg/L), with the dominant monomer as mannose (70.74-88.25%). In the study, synbiotic application of all strains showed better adhesion properties to HT-29 cells compared to their probiotic application. L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3 strain showed the best adhesion (88-90%) to the HT-29 cells with the application of both viable bacteria and synbiotic, and there was a positive correlation between EPS production and bacterial adhesion (p<0.01). The highest antimutagenic effect against NaN3 mutagen was determined in the synbiotic application of L. brevis LB63 strain (61%). All applications showed strong antimutagenic effect against H2O2 positive mutagen, and the highest antimutagenic effect was determined in the synbiotic application of L. rhamnosus E9 strain (100%). Apoptosis at the level of gene expression was determined by application of both probiotic viable bacteria and synbiotics. Induction of apoptosis in the HT-29 cells showed variability according to application periods. It was detected that both L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3 strain in the application of viable bacteria, and L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3 and L. plantarum GD2 strains  in the application of synbiotic induced a high rate of apoptosis (p<0.05).