Schizosaccharomyces pombe'de git1 geninin oksidatif stres yanıtındaki rolü
Role of Schizosaccharomyces pombe git1 gene in oxidative stress response
Yazar: SEDEF AKÇAALAN
Danışman: DOÇ. DR. BEDİA PALABIYIK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Glukoz birçok organizma için tercih edilen bir enerji ve karbon kaynağıdır. Ayrıca glukoz birçok biyolojik sürecin regülasyonunda bir sinyal molekülü olarak rol oynar. Glukoz metabolizması glukozun algılanması, sinyal iletinin oluşturulması, glukoz baskılaması, glikolizis ve glukoneogenez süreçlerini kapsar. Mayalarda glukozun algılanması ve sinyal ileti oluşturulması, genel olarak heterotrimerik G proteini ile G proteinine bağlı hücre yüzey reseptörlerinden oluşan bir sistem aracılığıyla yapılır. Glukozun algılanmasıyla birlikte cAMP/protein kinaz A sinyal iletim yolu aktif hale geçirilir. Bu yolakta Git1 adenilat siklaza doğrudan bağlanan C2 domen proteindir ve adenilat siklazın aktive olması için gerekli 6 proteinden biridir. 
Bu tezde, glukoz sinyalizasyonuna katılan genlerden biri olan git1 geninin ve git1 geninin özellikle 3′ ucunun oksidatif stres yanıtında rolü olup olmadığının ortaya çıkarılması amaçlandı. Bu kapsamda, Schizosaccharomyces pombe yabani ırkı (972h-) ve git1- mutantı (git1Δ) ile Escherichia coli DH5α ırkı kullanıldı. S. pombe 972h- genomik DNA'sı kalıp olarak kullanılarak tam boyda 3297 bç git1 geni (git1T) ve 3′ delesyonlu 2986 bç git1D geni elde edildi. Bu genler klonlama bölgesinde GFP raportör genini içeren pSGP572 plazmidine klonlandı. Elde edilen rekombinant vektörler süper yeterli E. coli DH5α'da klonlandı. İzole edilen rekombinant plazmidler S. pombe git1Δ mutantına transfer edildi. Seçici besi ortamında üreyen transformantların hücre morfolojileri çift iplikli DNA'yı boyayan DAPI boyası ile boyandıktan sonra konfokal mikroskopta incelendi. Konak ve transformantlar ile yabani tip arasında bir fark gözlenmedi. Aynı zamanda, yine konfokal mikroskopta transformasyonun gerçekleştiği, sadece rekombinant plazmidleri taşıyan transformantlarda tespit edilen GFP ışıması ile doğrulandı.  
Glukoz sinyalizasyonu bozuk S. pombe git1Δ mutantında ve mutasyonun geri döndürüldüğü S. pombe rekombinantlarında H2O2 ile indüklenen oksidatif stres koşulunda, SOD ve katalaz enzim aktivitelerinde istatistiki olarak anlamlı bir fark gözlenmedi. S. pombe yabani ırkı ve git1Δ mutantı ile rekombinatlar arasında fark gözlenememesi, git1'in bu süreçte rol oynamadığını; rol oynuyorsa da mevcut deney düzeneğinde ölçülemediğini düşündürmektedir.

Abstract:
Glucose is the preferred energy and carbon source for many organisms. In addition, glucose acts as a signaling molecule in the regulation of many biological processes. Glucose metabolism involves glucose sensing, signal transduction, glucose suppression, glycolysis, and gluconeogenesis processes. Glucose sensing and signal transduction in yeast is generally accomplished through a system of heterotrimeric G-protein and G protein-coupled cell surface receptors. Signal transduction pathway to cAMP/protein kinase is activated with glucose sensing. In this pathway, Git1 is a C2 domain protein that is directly linked to adenylate cyclase and it is one of the 6 proteins required for the activation of adenylate cyclase.
In this thesis, it was aimed to find out whether the git1 gene, which is one of the genes involved in glucose signaling, and especially the 3' end of the git1 gene, are related to oxidative stress response. In this study, Schizosaccharomyces pombe wild type (972h-) and S. pombe git1- (git1Δ) mutant with Escherichia coli DH5α were used. Genomic DNA of S. pombe 972h- was used as a template to obtain full length 3297 bp git1 and 3' deletion 2988 bp git1D genes. These genes were cloned into plasmid pSGP572 containing the GFP reporter gene in the cloning site. The resulting recombinant vectors were transfected into süper efficient E. coli DH5α. These isolated vectors were transformed into the S. pombe git1Δ mutant. Cell morphologies of transfected transformants in the selective media were stained double stranded DNA with DAPI staining and then examined under confocal microscope. There was no difference between host and transformants and wild type. At the same time, only transformants carrying recombinant plasmids were confirmed by GFP luminescence detected in a confocal microscope. 
There was no statistically significant difference in SOD and catalase enzyme activities in H2O2 induced oxidative stress conditions in S. pombe recombinants and S. pombe git1Δ mutant. The difference was not observed between S. pombe wild type and git1Δ mutant and recombinants suggests that git1 does not play a role in this process; if git1 is take part, it makes our think that it can not be measured in the current experimental setup.