Alzheimer hastalarının fibroblast kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden farklılaştırılan mikroglia hücrelerinin karakterizasyonu
Characterization of microglia cells differentiated from induced pluripotent stem cells derived from fibroblasts of alzheimer's disease patients
Yazar: ASLI ERDOĞAN
Danışman: PROF. DR. SEYHUN SOLAKOĞLU
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Amiloid beta protein = Amyloid beta protein ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Kök hücreler = Stem cells ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases

Özet:
Alzheimer hastalığı geri dönüşümsüz ve ilerleyici bir nörodejeneratif hastalıktır. Hastalığın patogenezine, amiloid beta ve tau'nun oluşturduğu birikimlerin yanısıra, inflamasyon da katkı sağlar. Nöroinflamasyonda etkili hücrelerden mikrogliada NLRP3 inflamazom aktivasyonunun, Alzheimer hastalığıyla ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Alzheimer hastalığının araştırılmasında kullanılan hayvan modelleri, insandaki patolojiyi doğru biçimde yansıtamamaktadır. İnsan kaynaklı mikroglia kullanımı ise beyinden kolayca örnek alınamaması nedeniyle kısıtlıdır. Çalışmamızda insan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler (İPKH) mikrogliaya farklılaştırılıp karakterize edilerek, Alzheimer hastalığında NLRP3 yolağıyla ilişkili çalışmalardaki kullanım potansiyeli araştırılmıştır.
Alzheimer hastası (AH) ve izogenik (İZO) veya kontrol (KTL) genotipli İPKH hücre hatları mikrogliaya farklılaştırılmış ve karakterizasyonu için Flow Sitometri, immünositokimya ve RT-qPCR yapılmıştır. NLRP3 yolağıyla ilişkili protein ekspresyonu Western Blot ile araştırılmıştır. İşlevsel analiz için, NLRP3 inflamazom aktivatörleri (LPS, amiloid beta) ve inhibitörü (CRID3) uygulanarak, sitokin salımı ELISA ile değerlendirilmiştir. pHrodo partiküllerini ve amiloid betayı fagositozu Flow Sitometri, floresan mikroskobu ve canlı hücre görüntüleme sistemiyle değerlendirilmiştir.
İPKH'den farklılaştırılan mikroglia hücrelerinin Flow Sitometri ile CD43, CD45, CD11b, CD14, TREM2, TMEM119, CX3CR1, P2RY12; immünositokimyayla IBA1, TMEM119, TREM2, PU.1; Western Blot ile IBA1, TREM2, NLRP3, ASC, MyD88 ve GSK3beta eksprese ettiği belirlenmiştir. RT-qPCR ile IBA1, CD14, CSF1, CX3CR1, TREM2, CCR5, TLR2, TLR4, P2RY12 ekspresyonları gösterilmiştir. Hücrelerin LPS ve amiloid beta ile uyarılması, IL-1beta ve IL-18 sitokinlerinin salımıyla sonuçlanmış, CRID3 ise bu etkiyi tersine çevirmiştir. Ayrıca, pHrodo partiküllerini ve amiloid betayı fagosite edebildikleri ve AH grubunun İZO grubuna göre bir miktar daha fagositik olduğu gözlenmiştir.
Çalışmamız, İPKH'den farklılaştırılan mikroglianın işlevsel olduğunu, Alzheimer hastalığıyla ilişkili mekanizmaların ve tedaviye ilişkin ilaçların çalışılabileceği elverişli bir model olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Alzheimer's disease (AD) is an irreversible and progressive neurodegenerative disease. Besides amyloid beta and tau accumulations, inflammation also contributes to AD pathogenesis. NLRP3 inflammasome activation in microglia is thought to be associated with AD. Animal models of AD do not accurately reflect human pathology. In our study, human induced pluripotent stem cells (iPSCs) were differentiated into microglia, and their potential to be used in NLRP3 pathway related mechanisms in AD was investigated.
iPSC cell lines of AD, isogenic (ISO) or control (CTL) genotypes were differentiated into microglia and Flow Cytometry, immunocytochemistry and RT-qPCR were performed. Protein expressions associated with the NLRP3 pathway was investigated by Western Blot. For functional analysis, cytokine release was assessed by ELISA after NLRP3 inflammasome activators (LPS, amyloid beta) and inhibitor (CRID3) treatments. Phagocytosis of pHrodo particles and amyloid beta were evaluated by Flow Cytometry, fluorescence microscopy, and live cell imaging system.
iPSCs derived microglia expressed CD43, CD45, CD11b, CD14, TREM2, TMEM119, CX3CR1, P2RY12, IBA1, PU.1, NLRP3, ASC, MyD88 and GSK3beta, detected by immunocytochemistry, Flow Cytometry and Western Blot. IBA1, CD14, CSF1, CX3CR1, TREM2, CCR5, TLR2, TLR4, P2RY12 expressions were shown by RT-qPCR. LPS and amyloid beta stimulation caused IL-1beta and IL-18 release, while CRID3 reversed this effect. Cells were able to phagocytose pHrodo particles and amyloid beta, and AD genotype was slightly more phagocytic than ISO genotype.
Our study shows that microglia differentiated from iPSCs are functional and may be an eligible tool to investigate new mechanisms and treatment opportunities in AD