Glioblastom teşhis ve tedavisi i̇çin tümöre hedeflendirilmiş nano i̇laç taşiyici si̇stemler üzerinde i̇n vitro çalişmalar
In vitro studies on tumor targeted nano drug delivery systems for diagnostic and treatment of glioblastoma
Yazar: ARZU CEYLAN HAS
Danışman: DOÇ. DR. SUNA ERDOĞAN ; PROF. DR. SÜHEYLA ÖZBEY
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Fizik ve Fizik Mühendisliği = Physics and Physics Engineering ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Glioblastom, beyin primer kötü huylu beyin tümörüdür, beyin tümörleri arasında görülme sıklığı en yüksek olan ve tedavi edilmesi en zor olan tümörler arasında yer almaktadır. Kansere bağlı ölümler açısından değerlendirildiğinde erişkinlerde üçüncü veya dördüncü, çocuklarda ise ikinci sırada yer almaktadır. Tedavide kemoterapi, radyoterapi, cerrahi yöntemler tek başlarına veya birlikte uygulanmaktadır. 
Mevcut kemoterapötik ilaçların kullanımını ve tedavideki başarısını sınırlayan en önemli etkenler; kemoterapötik ilaçların hemen hemen hepsinin herhangi bir tümör hücresine karşı seçiciliğinin olmaması ve tedavi sürecinde ilaca karşı direnç gelişmesidir. Bileşiklerin kandan merkez sinir sistemine (MSS) geçişinde bir filtre görevi gören kan beyin bariyeri (KBB) de beyne ilaç taşınmasında karşılaşılan bir diğer önemli sorundur. Tedavi amacıyla kullanılan ilaçlar için anlatılan sınırlamalar ve dezavantajlar benzer şekilde diyagnostik amaçla kullanılan radyoaktif işaretli bileşikler/kontrast maddeler için de geçerlidir.  Bu nedenle diğer tümör türlerinde olduğu gibi beyin tümörlerinde de teşhis ve tedavisinde kullanılabilecek daha güvenli, daha etkin kontrast bileşik/ilaç geliştirmeye yönelik çalışmalar aralıksız devam etmektedir. 
Son yıllarda beyne ilaç taşınmasında pasif ve/veya aktif hedeflendirme yöntemlerinin kullanıldığı nanotaşıyıcı sistemlerin kullanımı giderek artan bir önem kazanmaya başlamıştır.  Bu sistemler nanometre boyutundaki büyüklükleri ile Artmış Geçirgenlik ve Tutulum (Enhanced Permeability and Retention=EPR) etkisini kullanarak vaskülaritesi bozulmuş olan tümör dokusunda daha fazla tutulurken, taşıyıcı sistemin yüzeyine bağlanan hedefe özgü bileşiklerle spesifik olarak tümör dokusuna yönlendirilebilmektedir. 
Bu çalışmada glioblastom türlerinin teşhis ve tedavisinde kullanılacak nanoboyutta, Polietilen Glikol (PEG) kaplı klasik ve yüzeyi glioblastom tümör hücresine spesifik antikor olan CD133 antikoru ile modifiye edilmiş lipozom ve niozom dispersiyonlarının geliştirilmesi amaçlanmıştır. Tedavi amacıyla doksorubisin, teşhis amacıyla ise manyetik rezonans görüntülemede kullanılan süper paramanyetik demir oksit nanopartikülleri (SPDO) kullanılmıştır. Suda çözünen doksorubisin lipozom/niozomun sulu iç tabakasında hapsedilirken hidrofobik özellikteki SPDO lipit çifte tabakada hapsedilmiştir. Çalışma kapsamında hazırlanan lipozom/niozomların karakterizasyon çalışmaları yapılmış, doksorubisinin lipozom/niozomlardan salımı incelenmiştir. Manyetik rezonans görüntülemede kullanılacak olan lipozom ve niozomların T2 relaksasyon düzeyleri ölçülmüş ve kontrol grupları ile karşılaştırılarak T2 değerindeki düşüş incelenmiştir. Yüzeyi glioblastom tümör hücresine spesifik antikor olan CD133 antikoru ile modifiye edilmiş immuno lipozom ve niozom dispersiyonlarının tümör hücrelerindeki tedavi etkinliğini izlemek için MTT testi ile sitotoksisiteleri incelenmiştir. 
Hazırlanan lipozom ve niozom dispersiyonlarında etkin madde ve SPDO enkapsülasyonu ve yüzeyin antikor ile modifikasyonu ile partikül boyutunun arttığı görülmüştür. Yüzeyi spesifik CD133 antikoru ile modifiye edilmiş ve PEG kaplı lipozom ve niozom dispersiyonlarının partikül büyüklükleri sırasıyla 298.4  11.45 ve 546.6  89.25 nm olarak ölçülmüştür. Doksorubisinin lipozomlarda %14.63 ± 0.60, niozomlarda %12.78 ± 0.06 enkapsülasyon verimi ile hapsedildiği gözlenmiştir. Lipozom ve niozom dispersiyonlarından doksorubisinin salımı incelendiğinde her iki dispersiyondan da etkin maddenin 0. Derece kinetiği ile salındığı ve 48. saatin sonunda lipozom ve niozomlardan sırasıyla % 36,84  1,31 ve % 23,46  2,45 etkin madde salındığı bulunmuştur. SPDO nanopartiküllerinin lipozom ve niozom dispersiyonlarına hapsedilmesi ile T2 relaksasyon değerlerinin sırasıyla 27.1 ms'den 1.7 ms'e ve 18.3 ms'den 1.95 ms'e düştüğü gözlenmiştir.  Hazırlanan lipozom ve niozom dispersiyonlarının tümör hücreleri üzerindeki sitotoksisiteleri incelendiğinde, boş lipozomların ve SPDO içeren lipozom dispersiyonlarının sitotoksik etkilerinin benzer olduğu buna karşılık doksorubisin içeren lipozom dispersiyonlarında sitotoksik etkinin daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Niozom içeren dispersiyonlarda ise tüm formülasyonlarda sitotoksik etkinin yüksek olduğu gözlenmiştir. Ancak boş niozom dispersiyonlarında da hücre canlılığının düşük olması, bu sitotoksik etkinin doksorubisinden çok niozom yapısındaki non-iyonik sürfaktandan kaynaklandığını düşündürmektedir. 
Kısaca, tüm sonuçlar incelendiğinde yüzeyi glioblastom hücrelerine spesifik CD133 antikoru ile modifiye edilmiş Doksorubisin ve SPDO içeren DPPC: Chol: PEG2000-DSPE (1.85:1:0.5 molar oranı) Ab-DOX-DO-L formülasyonunun glioblastom teşhis ve tedavisi için umut vaat eden bir taşıyıcı sistem olduğu görülmüştür. Bu çalışmanın, ileriki çalışmalara temel teşkil edeceği düşünülmektedir.

Anahtar Sözcükler: Glioblastom, Nanolipozom, Süper Paramanyetik Demir Oksit, Doksorubisin, Manyetik Rezonans Görüntüleme, Teragnostik.

Abstract:
Glioblastoma is a malign tumors which is the most common form of all primary brain tumors and has one of the most difficult treatment options. Among the cause of malignant tumor-related death is seen taking in the third or fourth part in adults and second part in children. Treatment can be applied by surgery, chemotherapy and radiotherapy individually or by combination of them. 
Development of drug resistance by the cancer cells and the lack of selectivity of chemotherapeutic drugs towards to tumor cells remains a significant impediment to successful chemotherapy. Blood brain barrier (BBB) is the other important obstacle in transferring the drugs to the brain which is a physical barrier for the compound handling to central nervous system (CNS). The limitations and the disadvantages for the chemotherapeutics drugs are also valid for the radioactive-labelled compounds/contrast agents that uses for diagnostic purposes in a similar manner.  Therefore, the researches that about development of more delicate and efficient contrast compounds/drugs for brain tumors are in progress continuously. 

In last years, the usage of the nanocarriers systems with passive and/or active targeting methods for the transferring the drugs to brain have been gaining importance increasingly. These systems have more retention to tumor tissue with disturbed vascularity by using Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect with nanometer scale and furthermore, they can be specifically targeted to the tumor tissue by conjugation of some compounds to the surface of nanocarriers. 

The aim of this study was to develop multifunctional liposome and niosomes used for diagnosis and therapy of glioblastom forms. For this purpose, nanosized, PEGylated, doksorubisin and super paramagnetic iron oxide (SPIO) encapsulated conventional and immunoliposomes modified with glioblastoma-specific antibody, CD133, were prepared. Doxorubicin is used for therapy and also super paramagnetic iron oxide (SPIO) which is a contrast agent for magnetic resonance imaging (MRI) is used for diagnosis. Water soluble doxorubicin encapsulated into aqeous phase of liposomes/niosomes and hydrophobic SPIO is encapsulated in lipid bilayer.  Characterizations of the liposomes/niosomes were performed and drug relasing of doxorubisin from the liposomes/niosomes were investigated in the scope of the study. T2 relaxation time of liposomes/niosome were measured and the significant decrease in T2 relaxation compared to control group were investigated.  To investigate therapy efficiency of immune liposome and niosome dispersions surface modified with CD133 specific antibody, MTT assay was applied.

It is observed that preparation of liposome and niosome dispersions enlarges the particle size with doxorubicin and SPIO encapsulation and modification of the surface with the antibody. Zeta sizes of liposome and niosome dispersions surface modified with CD133 specific antibody and PEGligated were measured as 298.4 ± 11.45 and 546.6 ± 89.25 nm respectively. Entrapment efficiency of liposomes and niosomes were found as %14.63 ± 0.60 and %12.78 ± 0.06, respectively. When release of doxorubicin from liposome and niosome dispersions are analyzed, both dispersions release doxorubicin with zero-order kinetic furthermore, at the end of the 48 hours percentage of doxorubicin release from liposomes and niosomes were % 36,84 ± 1,31 and % 23,46 ± 2,45, respectively. By the encapsulation of SPIO nanoparticles into liposome and niosome dispersions, T2 relaxation values are decreased from 27.1 ms to 1.7 ms and 18.3 ms to 1.95 ms respectively. 
When examined cytotoxicity on tumor cells of prepared liposome and niosome dispersions, It is observed that empty and SPIO encapsulated liposome dispersions have similar cytotoxic effects whereas doxorubicin encapsulated liposome dispersions have higher cytotoxic effect.  High cytotoxic effect was observed in all niosome dispersions. However, the low cell viability in empty niosome dispersions was suggested that non-ionic surfactant caused this cytotoxic effect rather than doxorubicin.
In summary, when all the results are examined, it is found that Ab-DOX-DO-L formulation that including DPPC: Chol: PEG2000-DSPE (1.85:1:0.5 molar ratio), doksorubisin and SPIO encapsulated and surface modified with glioblastom-specific antibody (CD 133) is a promising delivery systems for the diagnosis and treatment of glioblastoma. It is considered that this study will be the basis of further studies.

Key words: Glioblastoma, Nanoliposomes, Super Paramagnetic Iron Oxide, Doxorubicin, Magnetic Resonance Imaging, Theranostic