Tetrahymena thermophila programlı çekirdek ölümünde rol alan dnaz enzimlerinin kimliklendirilmesi ve moleküler karakterizasyonu
Identification and molecular characterizaton of dnase enzymes involved in programmed nuclear death of Tetrahymena thermophila
Yazar: ERHAN ASLAN
Danışman: PROF. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
Eskişehir Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Tek hücreli ökaryotik model organizma olan Tetrahymena thermophila'da yapı-görevce farklılaşmış iki çekirdek bulunur ve eşeysel gelişim evresinde çeşitli düzenlemeler geçirirler. Bu süreçte diploid mikro çekirdekten (MİK) yeni poliploid makro çekirdek (MAK) ve yeni MİK gelişirken eski MAK programlı çekirdek ölümü (PÇÖ) adı verilen ve apoptotik-otofajik mekanizmalar içeren yolak tarafından yok edilir. Eski MAK parçalanmasında çeşitli deoksiribonükleaz (DNaz) enzimlerinin görev aldığı bilinmesine rağmen araştırmalar yeterli değildir. Bu tez kapsamında biyoinformatik, biyokimyasal ve genetik yaklaşımlar ile Tetrahymena çekirdek gelişiminde en yüksek DNaz aktivitesi gösteren enzimler kimliklendirilmiş ve Dnz22 ile Dnz23 olarak isimlendirilen DNaz II ailesine ait iki protein tanımlanmıştır. Afinitik saflaştırma tekniği ile her iki enzim saflaştırılmış ve in vitro analizler sonucunda bu enzimlerin memeli DNaz II enzimleri ile benzer özellikler taşıdıkları bulunmuştur. Bu proteinlerin PÇÖ esnasındaki görevlerini belirlemek için gen hedefleme, RNAi ve CRISPR-Cas9 gibi yöntemler ile mutant ırklar üretilmiş ve in vivo karakterizasyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen bulgular Tetrahymena DNaz II enzimlerinin yeni çekirdek gelişiminde ve apoptotik DNA parçalarının tamamen yok edilmesinde görev aldıklarını göstermiştir. Ayrıca yüksek ökaryotlarda çeşitli DNaz'lar ile etkileşime giren AIF proteininin Tetrahymena'da herhangi bir DNaz ile fiziki etkileşimde bulunmadığı Co-IP ve aktivite deneyleri ile gösterilmiştir. Tez kapsamında sunulan veriler apoptotik DNA parçalamasında yüksek ökaryotlarda görev alan DNaz II enzimlerinin Tetrahymena'da benzer görev üstlendiklerini, yani evrimsel olarak korunduklarını göstermiştir.

Abstract:
Tetrahymena thermophila, a single-celled eukaryotic model organism, possesses functionally and structurally different two nuclei in the same cytoplasm and these nuclei undergo several rearrangements during its sexual developmental stage. During this process, diploid micro nucleus (MIC) produces new MICs and new poliploid macro nucleus (MAC) while parental MAC is expelled from the cytoplasm by apoptotic and autophagic-like events known as Programmed Nuclear Death (PND). Although it is known that many deoxyribonucleases (DNase) are involved during PND, there are not enough studies characterizing DNases. In this dissertation, two DNases named Dnz22 and Dnz23 from DNase II family, which display highest DNase activities during PND, were identified and characterized through bioinformatics, biochemical and genetics approaches. Both enzymes were purified by affinity purification and in vitro activity assays showed that Dnz22 and Dnz23 display similar enzymatic properties with mammalian DNase II. In order to determine the role of these proteins during PND, mutant strains were generated with gene targeting, RNAi and CRISPR-Cas9. In vivo experiments revealed that DNase II activity is required for new nucleus development and degradation of apoptotic DNA fragments. Additionally, Co-IP and activity assays showed that unlike in higher eukaryotes, AIF in Tetrahymena does not physically interact with any DNases. Data presented in this study revealed that DNase II operates similar functions in higher eukaryotes and Tetrahymena, implying an evolutionary conservation among eukaryotes.