Radikal prostatektomi spesimenlerinde amacr/p63/hmwck üçlü kokteyli, "double staınıng" ile immünhistokimyasal analiz /
Yazar: SAYNUR İLĞAR BEŞER
Danışman: UZMAN GÜLİSTAN GÜMRÜKÇÜ YILMAZ
Sağlık Bakanlığı / İstanbul Haydarpaşa Numune Eğt. ve Arş. Hastanesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2006
Konu: Patoloji = Pathology

Özet:
Prostat kanseri, erkeklerde en sık görülen neoplazidir. Erkeklerde en sık ölüm
nedeni olan kanserler arasında 2. sıradadır(1,2,4,6,9,11, 13). Dünyada gün geçtikçe
prostat kanseri vaka sayısı arttığından, prostat kanserinin nedeni ve önlenmesi ile ilgili
bilgileri elde edebilmek için yapılan çalışmalara daha fazla ağırlık verilmiştir.
Kliniğe başvuran hastaları değerlendirirken önce normal olmayan rektal muayene
ve transrektal USG, PSA değerleri >4 ng/ml(özellikle 4-10 ng/ml), hasta yaşı
bilgilerinden faydalanılmaktadır. Bu durumlardan herhangi ikisi birarada olduğunda iğne
biyopsi endikasyonu ortaya çıkmaktadır. İğne biyopsisi ilk olarak başvurulan invaziv
yöntemdir. İğne biyopsisi; erken prostat kanseri tanısını koymada tercih edilir çünkü
düşük morbidite ile tümörün grade ve yaygınlığı ile ilgili bilgiler sağlar ve bu biyopsi örneklerinde prostat kanserinin histolojik tanısı patologlar için zorlanılan alanlardan
birisidir.
İğne biyopsilerini değerlendirirken rutinde yardımcı olarak kullanılan
"biomarker" PSA'dır, bizlere prostat kanserinin hem tanı hem de prognozunu tahmin
etmede yardımcı olur(46,47). Ama PSA hem benign hem de malign prostat epitel
hücrelerinde olduğundan kanser spesifik işaretleyici değildir (48). Serum PSA seviyeleri
sıklıkla prostat hipertrofisi ve prostatit gibi benign durumlarda da
artmaktadır.(49,50).Ama serum PSA seviyeleri yüksek olan hastalara prostat kanserini
ekarte etmek için biyopsi yapılmalıdır(45). Bu yüzden PSA seviyelerini destekleyen yeni
serum ve doku biomarker'larına ihtiyaç vardır, bu da moleküler biyolojinin DNA'ı elde
ederek insan genomundaki ekspresyonların değerlendirilmesi ile sağlanmaktadır (95).
İğne biyopsilerinde malignite tanısının konması için bazı histolojik özelliklerin
birlikteliği gereklidir. Bunlar büyüme paterni, nükleer atipi, bazal hücrelerin olmaması,
malign glandlarda ekstraselüler materyal varlığı gibi özelliklerdir (51,52). Morfolojik
özelliklerin hiçbiri tek başına prostat adenokarsinom tanısı koymak için yeterli değildir.
Ayrıca birçok benign durum; benign biyolojik davranışa sahip olmasına rağmen, prostat
karsinomu morfolojisini taklit eder.
Prostat kanserinin patolojik tanısının doğruluğu; daha objektif ve güvenilir tümör
spesifik marker'ın kullanımı ile artırılabilir(45). Biz bu amaçla bugün moleküler
biyolojideki gelişmeler sayesinde "cDNA microarray" yöntemi ile benign ve malign
hücrelerde eksprese edilen gen farklılıklarını tanımaya ve karşılaştırmaya çalışmaktayız
(45). AMACR ya da P504S diye bilinen biomarker yine "cDNA microarray" methodu ile
prostat dokusundan elde edilmiştir ve prostat karsinomunda yüksek sensivite ve spesifite
ile kanser hücrelerini benign hücrelerden ayırtetmeyi sağlayan birkaç biomarker'dan
biridir. Moleküler bulguların klinik pratikte kullanıldığı önemli bir örnektir (45).
Birçok biomarker ; prostat asid fosfataz (PAP) (53,54), prostat spesifik membran
antijen(55,56), prostat inhibin peptid(57), PCA-1(58), PR92 (59), prostat ilişkili
glikoprotein kompleksi (60), PD41 (61), 12-lipoksigenaz (62), p53 (63), p27 (64), hepsin
(65), PIM-1 kinaz (66), EZH2 ( 67,68) prostat karsinomunda eksprese olurlar. Ama bu
marker'ların hiçbiri patologlar tarafından benign, malign gland ayrımının yapılmasında
kullanılmaz çünkü bunların hiçbirinin formalin ile fikse dokuda prostat karsinomu için
sensitivitesi ve spesifitesi yoktur (45). Oysa AMACR hem serumda, hem formalin ile fikse dokuda sensitif ve spesifiktir.
Ayrıca patologların zorlandığı konulardan bir diğeri bireylerin bilinçlenmesi
sonucunda; PSA takibi ile erken evre malign lezyonlar veya maligniteyi taklit eden küçük
benign asinüslerin izlendiği lezyonlar ile kliniğe başvurulmasıdır
(51,71-73,171-172). Örn; Prostat iğne biyopsilerinde tanıda güçlük yaratan lezyonlardan
biri atipik asiner proliferasyon (ASAP) olarak tanımlanan alanlardır.Örneğin bir
çalışmada ASAP denilen olgulara yapılan tekrar biyopsilerde; %60' dan fazlasında
karsinom görülmüştür.
Prostat kanserinin mikroskopik olarak karakteristik özelliği bazal hücrelerin
yokluğudur (68,69,70). Bu özelliği ışık mikroskobisi ile ilk gözlemleyen 1950 yılında
Lewis ve arkadaşları'dır. Sonrasında 1953 yılında Totten ve arkadaşları da bunu tanısal
kriter olarak kullanmışlardır. Normal hematoksilen-eosin boyama ile de göze çarpmayan
bazal hücrelerin varlığının gösterilmesi için ek yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu
aşamada immünhistokimyasal boyanmalar yardımcıdır. Yüksek moleküler ağırlıklı
sitokeratin (HMWCK, 34BE12), P63 bu nedenle kullanılan immünhistokimyasal işaretleyicilerdir. (69,70)
İlk olarak Gown ve Vogel, 1984 yılında monoklonal antikeratin ile prostat bazal
hücrelerinin spesifik olarak boyandığını belirtmişlerdir. HMWCK; prostat kanseri
tanısında yardımcı en yaygın olarak kullanılan bazal hücre işaretleyicisidir. HMWCK;
sitoplazmik bir boya olup , prostat kanserinde asinüslerin etrafında bazal hücreler
bulunmadığından immünreaktivite göstermez (68-70). Nadir karsinom olgularında
boyanma izlenirken, bazı benign olgularda boyanma izlenmeyebilir. Bu yüzden birkaç
kanser için şüpheli glandlardaki bazal hücrelerin negatif boyanması bu glandların malign
olduğunu göstermez (45). Bu gibi durumlarda elimizde bulunan ilgili tüm antijen
ekspresyonlarını elde etmeye çalışıp, birlikte değerlendirerek yorumlamaya çalışmak en
uygun olandır. Bu yüzden bizde bir diğer bazal hücre antikoru olan p63 antikorundan da
faydalanarak sonuçlarımızı değerlendirmek istedik.
P63 geni, p53 gen ailesinin bir üyesidir, prostat bazal hücrelerini boyar ve prostat
karsinomunda immünreaktivite göstermez. Farklı olarak nükleer boyanma yapar. P63'ün,
HMWCK'dan daha sensitif ve spesifik belirleyici olduğu bildirilmiştir (76). HMWCK, p63 bazal hücre işaretleyicilerinin yanında P504S/AMACR (alpha -methyl- coAracemase
) kullanılarak özellikle tanısal zorluğu olan lezyonlarda yararlanılmaya
çalışılmaktadır.(29,81,82) Artmış AMACR ekspresyonu prostat kanseri (tümör
hücrelerinde sitoplazmik boyanma) dışında aynı zamanda; bir prostat kanseri prekürsoru
olan HGPIN, atipik adenomatöz hiperplazi, nefrojenik adenom, atrofide de izlenmiştir
(117-119). Bununla birlikte bazen benign glandler de AMACR ile pozitif boyanabilir
fakat reaktivite genellikle zayıf pozitivite şeklindedir. (32,44,76,117). Tam tersi olan
durumda söz konusu olabilir, yani malignant olmayan lezyonlarda , hem AMACR
negatifliği, hem de bazal hücre işaretleyicileri negatif olabilir (35).Bu yüzden prostat
karsinomu tanısında yardımcı olan pozitif ve negatif immünhistokimyasal boyanmaların
kombinasyonunu kullanmak anlamlı olandır.
Karsinom tanısında negatif işaretleyici kullanmanın sınırlılığı; bazı benign
lezyonlarda bazal hücrelerin kesintili veya yama tarzında immünhistokimyasal
boyanmanın olmasındandır. Kanser şüphesi olan birkaç gland'da HMWCK ile negatif
boyanmanın olması bunların malign olduğunun kanıtı değildir; çünkü benign glandlar bu işaretleyici ile tek tip pozitivite vermemektedir. Ayrıca sınırlı prostat kanserinin tanısal
doğruluğu artırmak, yanlış tanı şansını azaltmak, bir sonraki kesitte atipik glandları
kaybetmemek için bu immün işaretlerini birlikte kullanarak tanıya gidilmesi doğru olur.
Çalışmamızda ; bir kesitte üçlü antikor kokteyli (P504S+ 34BE12+P63) ve iki
farklı kromojen kullanarak immünhistokimyasal inceleme ile en doğru tanıyı elde
edebilmeyi denedik.

Abstract:
Prostate cancer is the most common neoplasia in men. It is the second most common cause of death in men with cancer (1, 2, 4,6,9,11, 13). As the number of prostate cancer cases increases, there is a growing interest in the cause and prevention of prostate cancer. More emphasis has been placed on studies conducted to obtain information.
When evaluating patients admitted to the clinic, abnormal rectal examination
and transrectal USG, PSA values >4 ng/ml (especially 4-10 ng/ml), patient age
information is used. When any of these conditions coexist, the needle
biopsy is indicated. Needle biopsy is the first invasive procedure applied. Needle biopsy is preferred in diagnosing early prostate cancer because it provides information on the grade and extent of the tumor with low morbidity. The histological diagnosis of prostate cancer in these biopsy specimens is one of the challenging areas for pathologists.
PSA is the "biomarker" that is routinely used as an aid when evaluating needle biopsies, helping us predict both the diagnosis and prognosis of prostate cancer(46,47). However, since PSA is in both benign and malignant prostate epithelial cells, it is not a specific marker for cancer (48). Serum PSA levels often increase in benign conditions such as prostatic hypertrophy and prostatitis.(49,50).However, patients with high serum PSA levels should undergo biopsy to rule out prostate cancer(45). Therefore, there is a need for new serum and tissue biomarkers that support PSA levels, which is achieved by obtaining DNA from molecular biology and evaluating their expression in the human genome (95). The combination of some histological features is necessary for the diagnosis of malignancy in needle biopsies such as growth pattern, nuclear atypia, absence of basal cells, presence of extracellular material in malignant glands (51,52). None of the morphological features alone is sufficient to diagnose prostatic adenocarcinoma. Also many benign conditions mimic prostate carcinoma morphology.
The accuracy of pathological diagnosis of prostate cancer can be increased with the use of a more objective and reliable tumor-specific marker (45). For this purpose, we are trying to identify and compare the genetic differences expressed in benign and malignant cells with the "cDNA microarray" method, thanks to the developments in molecular biology today (45). The biomarker known as AMACR or P504S is obtained from the prostate tissue by the "cDNA microarray" method and is one of the few biomarkers that enable to distinguish cancer cells from benign cells with high sensitivity and specificity in prostate carcinoma. It is an important example of  molecular findings that are used in clinical practice (45). Many biomarkers including; prostate acid phosphatase (PAP) (53.54), prostate specific membrane antigen(55.56), prostate inhibin peptide(57), PCA-1(58), PR92(59), prostate-associated glycoprotein complex (60), PD41 (61), 12-lipoxygenase (62), p53 (63), p27 (64), all (65), PIM-1 kinase (66), EZH2 (67,68) are expressed in prostate carcinoma. However, none of these markers are used by pathologists to distinguish between benign and malignant glands, because none of them is sensitive or specific for formalin-fixed prostate carcinoma (45). However, AMACR is sensitive and specific both in serum and in formalin-fixed tissue.
As a result of raising awareness; with the clinical PSA follow-up, early-stage malignant lesions or lesions with small benign acini that mimics malignancy are encountered more in pathology, which poses difficulty (51,71-73,171-172). eg; One of the lesions that creates difficulties in diagnosis in prostate needle biopsies is the areas defined as atypical acinar proliferation (ASAP). In one study, more than 60% of repeating biopsies performed on cases diagnosed as ASAP, had carcinoma. Microscopically, the characteristic feature of prostate cancer is the absence of basal cells (68,69,70). The first ones to observe this feature with light microscopy was Lewis et al. in 1950. Later, in 1953, Totten et al. used it as a diagnostic criterion. To demonstrate the presence of inconspicuous basal cells, additional methods are needed. Immunohistochemical staining with high molecular weight cytokeratin (HMWCK, 34BE12), p63 are used for this purpose(69,70).
In 1984, Gown and Vogel were first to state that the prostate basal cells stain specifically with monoclonal antikeratin. HMWCK is the most widely used basal cell marker to aid in the diagnosis of prostate cancer. HMWCK is a cytoplasmic stain and does not show immunoreactivity in the prostatic adenocarcinoma glands because there are no basal cells around the acini (68-70).  While staining can be observed in rare carcinoma cases, it also may not stain some benign cases. Therefore, negative staining of basal cells in glands suspected for cancer, does not indicate that these glands are in fact malignant (45). In such cases, it is most appropriate to try to obtain all relevant antigen expressions available, evaluate them together and try to interpret them. Therefore, we wanted to evaluate our results by making use of another basal cell antibody, "p63".
The p63 gene, a member of the p53 gene family, stains prostate basal cells and does not show immunoreactivity in prostate carcinoma. It is a nuclear stain, different from that of HMWCK. It has been reported that p63 is a more sensitive and specific marker than HMWCK (76). In addition to p63 and HMWCK basal cell markers, P504S/AMACR (alpha -methyl-coAracemase) can be used  to differentiate lesions with diagnostic difficulties (29,81,82). Increased AMACR expression is also observed in HGPIN (a prostate cancer precursor), atypical adenomatous hyperplasia, nephrogenic adenoma, and atrophy (117-119). However, sometimes benign glands may also stain positive with AMACR, but the reactivity is usually weak (32,44,76,117). The opposite may be the case, that is, in non-malignant lesions, both AMACR negativity and basal cell markers may be negative (35). Therefore, it is meaningful to use a combination of positive and negative immunohistochemical staining that helps in the diagnosis of prostate carcinoma.
The limitation of using negative markers in the diagnosis of carcinoma is because some benign lesions have intermittent or patchy immunohistochemical staining of basal cells. Negative staining with HMWCK in a few glands suspected of cancer is not evidence of malignancy; because benign glands do not show uniform positivity with this marker. In addition, in order to increase the diagnostic accuracy of limited prostate cancer, to reduce the chance of misdiagnosis, and to not lose atypical glands in the next section; it would be wiser to use these immunostains together. In our study, we tried to obtain the most accurate diagnosis by immunohistochemical examination using a triple cocktail of antibodies (P504S + 34BE12 + P63) and two different chromogens in one section.