Mannanaz üretimi ve saflaştırılmasında yeni teknik ve stratejilerin denenmesi üzerine bir araştırma
Different techniques and strategies to produce and partial purificaton of mannanase
Yazar: ERCAN YATMAZ
Danışman: DOÇ. DR. İRFAN TURHAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Galaktomannanlardaki β-1,4 mannoz bağlarını parçalayan β-mannanaz enziminin ana üreticisi farklı Aspergillus türlerinden oluşan filamentli fungus grubunun üyeleridir. Enzim rahatlıkla katı kültür besiyerinde veya erlenmayerlerde üretilebilmektedir. Ancak bu tekniklerle üretim sınırlı kalmaktadır. Üstelik mikroorganizma katma değeri yüksek bu ürünleri üretirken havalandırmaya da ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle de biyoreaktörlerin Aspergillus fermentasyonlarında kullanılması gerekmektedir. Ancak küflerin aşırı hif gelişimine bağlı olarak biyoreaktörlerde kontrolü oldukça zordur. 

Bu çalışmada, magnezyum silikat ve alüminyum oksit mikropartikülleri kullanılarak rekombinant Aspergillus sojae'nin hücre gelişiminin keçiboynuzu ekstraktı besiyerinde kontrolünün sağlanması ve β-mannanaz enzimi üretiminin arttırılması amaçlanmıştır. Her iki mikropartikül de erlenmayer ve biyoreaktör fermentasyonlarında hücre gelişimini arttırmış ve kontrolünü sağlamıştır. Ayrıca β-mannanaz enziminin fermentasyon sıvısından kısmi saflaştırılması, liyofilizasyonu ve enzim karakterizasyonu (enzimin çalışma şartları, farklı substratlar varlığında Km ve Vmax değerleri, iyon inhibisyonu vs) da gerçekleştirilmiştir.

Öncelikle farklı oranlarda alüminyum oksit ve magnezyum silikat içeren besiyerleri ile çalkalamalı inkübatör denemeleri gerçekleştirilmiştir. En yüksek β-mannanaz aktivitesi değeri 568,72 U/ml olarak 5 g/L magnezyum silikat ilave edilen erlenmayer denemesinde elde edilmiştir. Besiyerine ilave edilen mikropartikül konsantrasyonu arttıkça hücre pellet çapı değerleri düşmüştür. Ayrıca 10 g/L'den daha fazla magnezyum silikat ilavesi durumunda hücre gelişimi pellet yapı yerine pellet/miselyum karışık tipte gerçekleşmiştir.

Biyoreaktör denemelerinde ise en yüksek β-mannanaz aktivitesi değeri 643,16 U/ml olarak 3 g/L magnezyum silikat ilave edilen besiyerinde hesaplanmıştır. Mikropartikülle gerçekleştirilen tüm biyoreaktör denemeleri ise kontrol fermentasyonundan daha yüksek sonuçlar vermiştir. Ayrıca kontrol fermentasyonu hariç tüm mikropartiküllü biyoreaktör denemelerinde fermentasyon sonlandırılıncaya kadar hif gelişimi kolaylıkla kontrol edilmiştir. Biyoreaktörde gerçekleştirilen denemelerde hiçbir mikropartikül konsantrasyonunda hücre gelişim tipi pellet yapıdan pellet/miselyum karışık tipine dönüşmemiştir.

Kısmi saflaştırma işlemi ise ultrafiltrasyon ile gerçekleştirilmiş ve enzim solüsyonu başarıyla liyofilize edilmiştir. Enzim karakterizasyonu da başarıyla gerçekleştirilmiş ve optimum çalışma pH ve sıcaklık aralığı sırasıyla pH 5-6 ve 50-60°C olarak belirlenmiştir. Keçiboynuzu gamı da β-mannanaz enzimi için en iyi substrat olarak belirlenmiştir. Keçiboynuzu gamının substrat olarak kullanıldığı denemede Vmax ve Km değerleri sırasıyla 2719 U/mg ve 2,26 µmol/ml olarak hesaplanmıştır. Son olarak farklı reaktiflerin enzim çalışmasına etkisi belirlenmiştir. 

Bu çalışma sonucunda β-mannanaz enzimi üretiminde karıştırmalı tip tank biyoreaktör, kısmi saflaştırma işlemlerinde ise ultrafiltrasyon sisteminin kullanılabileceği açıkça gösterilmiştir. Dolayısıyla sonuçlar rekombinant Aspergillus sojae ile biyoreaktörde β-mannanaz enziminin üretiminde farklı mikropartikül ajanlarını içeren keçiboynuzu ekstraktının substrat olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Bu tekniğin diğer filamentli küflerin büyük ölçekli biyoreaktör sistemlerinde gerçekleştirilecek fermentasyonlarda da kullanılabileceği ve katma değeri yüksek enzimlerin üretilebileceği düşünülmektedir.

Abstract:
β-mannanases are mainly products of filamentous fungi including different Aspergillus species, and can degrade the β-1,4-mannose linkages of galactomannans. It could be easily produced by solid-state fermentation or flask fermentation. However amount of the products are limited. Moreover these microorganisms need air to produce these value-added products. So bioreactors must be used for Aspergillus fermentation. However controlling of the filamentous fungi in a broth is very difficult because of high hyphae development.

This study was undertaken to enhance β-mannanase production using magnesium silicate and aluminum oxide as the microparticles, which control cell morphology of recombinant Aspergillus sojae in carob extract medium. Both microparticles improved and controlled fungal growth in carob pod extract medium in shake flask and stirred tank bioreactor fermentations. It was also carried out that the partial purification of β-mannanase from fermentation broth, lyophilization, and characterization of the enzyme (working conditions, Km and Vmax values of some substrates, reagent inhibition etc.). 

First of all, shake flask fermentations were performed by different amounts of aluminum oxide or magnesium silicate in the fermentation media. The highest β-mannanase activity was found as 568,7 U/ml with 5 g/L of magnesium silicate for shake flask fermentations. Increase in microparticle concentration resulted in decrease at the pellet size diameter. Furthermore, more than 10 g/L of magnesium silicate addition changed the filamentous fungi growth type from pellet to pellet/mycelium mixture. 

The highest β-mannanase activity for bioreactor fermentations was 643,16 U/ml for 3 g/L of magnesium silicate. And all of the microparticle bioreactor assays were resulted higher β-mannanase activity than control fermentation. All of the fermentation assays except control fermentation could easily control the hyphae development until the end of the fermentation. None of the microparticle concentration changed the microorganism growth type from pellet to pellet/mycelium mix type for bioreactor assays.

Partial purification was completed by ultrafiltration system, and carefully lyophilized. Enzyme characterization was carefully done, and optimum working pH and temperature range were determined to be from pH 5 to pH 6, and 50°C to 60°C respectively. It was also found that locust bean gum was the best substrate for β-mannanase, Vmax and Km values for locust bean gum was calculated to be 2719 U/mg, and 2,26 µmole/ml. Finally effects of reagents on working on β-mannanase enzyme were determined. 

As the result, this research was clearly showed that β-mannanase enzyme could be produced in a stirred tank bioreactor with microparticle addition and partial purification could be performed by ultrafiltration system. So results showed that carob pod extract medium with different microparticle agents was a good substrate for recombinant Aspergillus sojae to produce β-mannanase enzyme. This technique can also be used for the other filamentous fungi microorganisms to produce the valuable enzymes in higher bioreactor plant systems.