Schizosaccharomyces pombe'de endoplazmik retikulum stresinin hücresel etkilerinin araştırılması
Investigation of cellular effects of endoplasmic reticulum stress in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: NEZAHAT GÖKÇE ÖZSAMUR
Danışman: DOÇ. DR. BEDİA PALABIYIK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Hücre ölümü = Cell death ; Schizosaccharomyces pombe = Schizosaccharomyces pombe ; Stresle başetme = Coping with stress

Özet:
Endoplazmik retikulum (ER) bütün ökaryotlarda bulunan ve protein sentezi ve taşınması, lipit sentezi ve kalsiyum depolanmasında görevli hücre içi bir organeldir. ER hücre içi ve hücre dışı çeşitli faktörlere karşı duyarlıdır. Strese maruz kalan ER'de homeostazinin bozulması sonucunda katlanmamış veya yanlış katlanmış protein birikimi meydana gelir. Bu durum ER stresi olarak adlandırılır. ER stresinde hücre, homeostazisini yeniden sağlamak için öncelikle katlanmamış/yanlış katlanmış protein yanıtı (UPR) yolağı oluşturur. UPR yolağı olarak insanda PERK (protein kinaz RNA benzeri ER kinaz), ATF6 (aktive edici transkripsiyon faktörü 6) ve Ire1 (inositol gerekli enzim 1) olmak üzere üç bağımsız yolak tespit edilmiştir. Mayada ise bu yolaklardan sadece Ire1 (inositol gerekli enzim 1) yüksek oranda korunmuş olarak bulunmaktadır. ER stresini azaltmak için aktifleşen UPR yolağı proteinlerin doğru katlanmasını destekler, katlanmamış veya yanlış katlanmış protein birikimini azaltmak için protein yıkım mekanizmalarını çalıştırır. Fakat uzun süreli veya şiddetli strese maruz kalan hücrelerde, homoeostaz sağlanmaz ve UPR yolağı, apoptoz ve otofaji dahil olmak üzere programlanmış hücre ölümünü tetikler. 
Bu çalışmanın birinci kısmında Schizosaccharomyces pombe'nin yabani ırkında ER stresi ajanı olarak tunikamisin (TN) antibiyotiğinin farklı dozları (1 μg/mL ve 5 μg/mL) 1, 4 ve 24 saat uygulanarak ER stresinin hücresel etkileri araştırıldı. İkinci kısımda ise, UPR (ire1 ve gpt1), otofaji (atg8, atg15 ve trs85), apoptoz (aif1), sinyal iletimi (prz1) ve hücre iskeleti (myo51 ve myo52) süreçlerinde rol alan genlerin delesyonlu olduğu mutant ırklar kullanılarak tunikamisinin (1 μg/mL; 1, 4 ve 24 saat) hücre canlılığı ve hücre içi oksidasyon düzeyine etkisi araştırıldı.
S. pombe yabani ırkında TN'nin tetiklediği ER stresine bağlı gelişen hücre canlılığının düzenlenmesinde apoptozdan ziyade otofajinin etkin olabileceği sonucuna varıldı. Artan TN dozu ve süresine bağlı olarak artan aktin yama organizasyonunun fagozom oluşumu ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Diğer taraftan, mutant ırklarda yapılan deneyler sonucunda, ire1Δ, gpt1Δ, atg8Δ, myo51Δ ve myo52Δ mutantlarının doz bağımlı olmaksızın tunikamisine duyarlı, atg15Δ ve trs85Δ mutantlarının ise dirençli olduğu, ancak aif1Δ ve prz1Δ mutantlarının doz bağımlı olarak duyarlı olduğu belirlendi. Sonuç olarak, ER stresine karşı oluşan hücresel yanıtın apoptoz yerine otofaji olduğunu öneren hipotezi sonuçlarımız desteklemektedir.

Abstract:
The endoplasmic reticulum (ER) is an intracellular organelle in all eukaryotes and is responsible for protein synthesis and transport, lipid synthesis, and calcium storage. ER is sensitive to a variety of intracellular and extracellular factors. When ER exposed to stress, unfolded protein accumulation occurs as a result of disruption of homeostasis. This condition is called ER stress. Primarily the cell effectuates an unfolded protein response (UPR) pathway to restore homeostasis under ER stress. Three independent UPR pathways have been discovered in humans: PERK (protein kinase RNA-like ER kinase), ATF6 (activating transcription factor 6), and Ire1 (inositol essential enzyme 1). In yeast, only Ire1 (inositol essential enzyme 1) is highly conserved among these pathways. The UPR pathway, which is activated to reduce ER stress, supports the correct folding of proteins and utilizes protein degradation mechanisms to reduce unfolded protein accumulation. However, the cells, exposed to prolonged or severe stress, do not achieve homeostasis, and UPR pathway trigger the programmed cell death including apoptosis and autophagy.
In the first part of this study, the cellular effects of ER stress were investigated by applying different doses of tunicamycin (TN) antibiotics (1 μg/mL and 5 μg/mL) as an ER stress agent for 1, 4 and 24 hours in Schizosaccharomyces pombe wild type strain. In the second part, the effect of tunicamycin (1 μg/mL; 1, 4 ve 24 hours) on cell viability and intracellular oxidation level was investigated by deleting the genes which are they not to involve in UPR (ire1 and gpt1), autophagy (atg8, atg15 and trs85), apoptosis (aif1), signal transduction (prz1) and cytoskeleton (myo51 and myo52) processes. 
It was concluded that autophagy rather than apoptosis may be effective in the regulation of cell viability under ER stress triggered by TN in S. pombe wild type strain. Also, it suggests that increased actin patch organization due to increased TN dosage and duration may be associated with phagosome formation. On the other hand, ire1Δ, gpt1Δ, atg8Δ, myo51Δ and myo52Δ mutants were found tunicamysin-sensitive in a dose-independent manner. atg15Δ and trs85Δ mutants were found tunicamysin-resistant. But, aif1Δ and prz1Δ mutans were found tunicamysin-sentitive in a dose-dependent manner. In conclusion our results fully support that the hypothesis that suggest that the cellular response to ER stress was autophagy instead of apoptosis.