Biyomimetik apatit kaplı ve heparin fonksiyonalitesine sahip kitosan doku iskelelerinde kondrosit ve osteoblast aktivitelerinin incelenmesi
Investigation of chondrocyte and osteoblast activities on biomimetic apatite-coated and heparin-functionalized chitosan scaffolds
Yazar: SEZİN ADAY
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Kitosan = Chitosan

Özet:
Sunulan çalışmanın amacı, doğal bir polimer olan kitosandan hazırlanan ve biyomimetik apatit ile kaplanan ya da heparin ile işlevsel hale getirilen doku iskelelerinin karakterizasyonunun yapılarak, bu yapıların kemik ve kıkırdak hücrelerinin aktiviteleri üzerindeki etkilerinin belirlenebilmesidir.Çalışma kapsamında kitosan doku iskeleleri, > % 85 deasetilasyon derecesine (DD) sahip kitosan kullanılarak dondurarak-kurutma tekniğiyle hazırlanmıştır. % 2'lik kitosan çözeltilerinden hazırlanan bu iskelelerin gözenek boyutu ~ 100 ?m'dir. Hazırlanan doku iskeleleri daha sonra 10 kat konsantrasyondaki sentetik vücut sıvısı (10X SBF) çözeltisi kullanılarak apatit ile kaplanmış ya da heparinin yapıya kovalent veya elektrostatik olarak bağlanmasıyla fonksiyonel hale getirilmiştir.Hazırlanan kitosan doku iskelelerinde osteoblast ve kondrositlerin davranışları (yapışma, yayılma, üreme ve farklılaşma) hücre kültürü testleriyle incelenmiştir. Bu çalışmalarda, pre-osteoblast hücre hattı MC3T3-E1 ve kondrojenik hücre hattı ATDC5 kullanılmıştır. Hücre üremesi MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) ile değerlendirilirken, morfolojik gözlemler SEM (taramalı elektron mikroskobu) ve CLSM (konfokal lazer taramalı mikroskobu) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Hücre farklılaşmasının belirlenmesi amacıyla kemik hücreleri için osteokalsin testi, ALP (alkalen fosfataz) aktivitesi ölçümü ve von Kossa boyaması yapılırken; kıkırdak hücrelerinin farklılaşması, GAG (glikozaminoglikan) miktarlarının ölçümüyle değerlendirilmiştir.MC3T3-E1 hücreleri ile gerçekleştirilen çalışmalar, kaplama içermeyen iskelelerle karşılaştırıldığında, apatit kaplı doku iskelelerinin hücre üremesini uyardığını göstermiştir. Özellikle 24 sa SBF muamelesi görmüş doku iskelelerindeki hücrelerin farklılaşma değerlerinin (ALP ve osteokalsin miktarları), kültürün ilerleyen günlerinde arttığı gözlemlenmiştir. Heparin bağlı yüzeylerde ise MC3T3-E1 hücrelerinin gerek üremesi, gerekse farklılaşması uyarılmıştır. ATDC5 hücreleriyle yapılan çalışmalarda, heparinin özellikle kültürün 2. haftasından sonra hücre üremesini arttırdığı ortaya konmuştur. ATDC5 hücre kültür çalışmalarında kullanılan tüm doku iskelelerinin farklılaşmayı desteklediği; ancak serbest heparinin diğer gruplara göre çok daha yüksek GAG değerleri verdiği görülmüştür.Çalışmalardan elde edilen sonuçlar, kitosan doku iskelelerinin kemik ve kıkırdak doku mühendisliği çalışmaları için uygun malzemeler olabileceğini ortaya koymuştur.Anahtar Kelimeler: Kitosan, dondurarak kurutma, heparin, SBF (simulated body fluid), doku mühendisliği.

Abstract:
The purposes of the present study are to characterize the scaffolds which are prepared using a natural polymer, chitosan, and coated with biomimetic apatite or functionalized with heparin and to identify the effects of these structures on the activity of bone and cartilage cells.In this study, chitosan scaffolds were prepared by freeze-drying technique using chitosan with the deacetylation degree (DD) of >85 %. The pore size of these scaffolds which were prepared by 2 % (w/v) chitosan solution was ~ 100 ?m. The scaffolds were then coated with apatite by using 10X synthetic body fluid (SBF) solution or functionalized with covalently or electrostatically bound heparin.The behaviours (attachment, spreading, proliferation and differentiation) of osteoblasts and chondrocytes were investigated with cell culture tests. In these studies, pre-osteoblast MC3T3-E1 and chondrogenic ATDC5 cell lines were used. Cell proliferation was evaluated by MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) and morphological observations were carried out using SEM (scanning electron microscope) and CLSM (confocal laser scanning microscope). In order to detect cellular differentiation, osteocalcin test, ALP (alkaline phosphatase) activity measurement and von Kossa staining were performed for bone cells and GAG (glycoseaminoglycans) measurement was used for cartilage cells.The studies carried out using MC3T3-E1 cells showed that apatite-coated scaffolds stimulated cell proliferation compared to non-coated scaffolds. Especially, cell differentiation values (ALP and osteocalcin) of the cells on 24h SBF-treated scaffolds increased in the following days of the culture. Both proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells were stimulated on heparin-immobilized surfaces. In the studies carried out using ATDC5 cells, it was shown that heparin induced cell proliferation particularly after the second week of the culture. It was seen that all the scaffolds used in ATDC5 cell culture studies were supported differentiation, however, free-heparin indicated higher GAG values compared to other groups.The results of these studies were indicated that chitosan scaffolds may be suitable materials for bone and cartilage tissue engineering studies.Keywords: Chitosan, freeze-drying, heparin, SBF (simulated body fluid), tissue engineering.