Peroksidaz aktivitesine sahip nanopartikül/mikroküre kompozitlerinin sentezi ve glutatyon tayininde kullanılması
Synthesis of nanoparticle/ microsphere composites with peroxidase activity and their use in the determination of glutathione
Yazar: SELEN YAĞMUR GÜNGÖR
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN ALİ TUNCEL ; DR. FATOŞ ÇİĞDEM KİP
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Destek materyali olarak kullanılan monodispers gözenekli formda silika ve manyetik silika mikroküreler çok basamaklı hidroliz-kondenzasyon yöntemi ile sentezlenmiştir. Manyetik mikrokürelerin yüzeyi tekrar silika kabuk yapısıyla kaplanmıştır. Silika ve yüzeyi silika kaplanmış manyetik silika mikrokürelere Türkevich metodu ile sentezlenen altın nanopartiküller immobilize edilmiştir. Mikrokürelerin yüzey morfolojileri ve boy dağılımı taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir. Mikrokürelerin yüzeylerindeki atomik bileşim enerji saçılımlı X-ışını spektroskopisi (EDX)  ile ve kimyasal yapıları X ışını kırınım yöntemi (XRD) ile  incelenmiştir. Mikrokürelerin yüzey alanları ve gözenek boyutu (BET/Brunauer-Emmett-Teller) azot adsorpsiyon ve desorpsiyon yöntemi kullanılarak, manyetik özelliğe sahip mikrokürelerin manyetizasyon özellikleri ise titreşimli örnek manyetometresi (VSM) kullanılarak belirlenmiştir. Sentezlenen mikrokürelerin peroksidaz benzeri aktivitesi değişen pH, substrat konsantrasyonu ve nanozim miktarı için incelenmiştir. Peroksidaz aktivitesi ölçümlerinde substrat olarak o-fenilendiamin (OPD) kullanılmıştır. Ölçümler UV-görünür bölge spektrofotometresi ile gerçekleştirilmiştir. Nanozim yapıları için OPD tüketim hızı ve substrat derişimi kullanılarak Lineweaver-Burk grafikleri çizilmiş, enzimlerde enzim ve substrat arasındaki afiniteyi gösteren Michaelis Menten sabiti (Km) değeri hesaplanmıştır. Yüzeyine altın nanopartikül immobilize edilmiş ve silika ile kaplanmış manyetik silika mikroküreler için Km değeri 522,47 µM,  yüzeyine altın nanopartikül immobilize edilmiş silika mikroküreler için  816,48 µM olarak hesaplanmıştır. Glutatyon tayini için geliştirilen sensörde, glutatyonun mikroküre yüzeyine bağlanmasıyla, mikrokürenin peroksidaz aktivitesinde glutatyon derişimine bağlı olarak ortaya çıkan değişim incelenmiştir. Glutatyonunun mikroküre yüzeyine adsorbsiyonu Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) kullanılarak analiz edilmiştir.  Sentezlenen nanozimler ile peroksidaz aktivitesi için uygun koşullar seçilerek çözelti ortamında ve insan serumunda glutatyon tayini yapılmıştır. Glutatyon derişimine karşılık gelen adsorbans değerlerininin lineer değişimi gösterilmiş, altın nanopartikül immobilize edilmiş silika ve silika ile kaplanmış manyetik silika mikroküreler ile çözelti ortamında 325 - 3253 µM glutatyon tayini yapılmıştır. İnsan serumunda ise 2,5-50 µM arasındaki derişim değerlerinde glutatyon tayininin yapılabildiği gösterilmiştir.

Abstract:
Silica and magnetic microspheres in the monodisperse porous form used as a supporting material are synthesized using the multi-step hydrolysis-condensation method. The surface of magnetic silica microspheres was coated with silica shell. The gold nanoparticles synthesized by the Turkevich method were immobilized onto the silica-coated magnetic silica and bare silica microspheres. Surface morphology and size distribution of the microspheres were analyzed by scanning electron microscopy (SEM).  The surface atomic composition and the chemical structure were investigated by energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) and X-ray diffraction method (XRD), respectively. The surface area and the pore size distribution  were determined by using the nitrogen adsorption and desorption method (BET / Brunauer-Emmett-Teller). The magnetization properties of magnetic microsphere were investigated using vibrating sample magnetometry (VSM). The peroxidase-like activity of the synthesized microspheres was investigated by varying pH, substrate concentration, and the nanozyme concentration. OPD was used as substrate in the peroxidase-like activity measurements. Measurements were made with UV-visible spectrophotometry. Lineweaver-Burk graphs were plotted using OPD utilization rate and substrate concentration values and Michaelis Menten constant (Km) demostrating the affinity between enzyme and substrate was calculated for nanozym structure. Km values of gold nanoparticle immobilized silica coated magnetic silica microspheres and gold nanoparticle immobilized silica microsphere were calculated as 522,47 µM  and 816,48 µM. A biosensor was developed for glutathione determination based on the variation of peroxidase-like activity of microsphere depends on glutathione concentation by adsorption glutathione to the surface of the microsphere. Adsorption of glutathione onto the microsphere surface was analyzed using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Glutathione in buffer solution and in human serum were determined using the synthesized nanozymes under appropriate conditions. The linear change of adsorbance values corresponding to glutathione concentration was shown, and the determination of glutathione between 325 - 3253 µM concentration in buffer medium was performed with gold nanoparticle immobilized silica and silica coated magnetic silica microspheres. It has been shown that glutathione can be determined in human serum at concentrations between 2.5-50 µM.