Reaksiyon mühendisliği prensipleriyle rekombinant L-fenilalanin üretimi için biyoproses geliştirilmesi
Bioprocess development for recombınant L-phenylalanine production by reaction engineering principles
Yazar: YASEMİN DEMİRCİ
Danışman: PROF.DR. TUNÇER ÖZDAMAR
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Aromatik amino asit yolizinde DAHP sentetaz (gen: aroA) enziminin katalizlediği ilk tepkime ilekorizmat mutaz (gen: aroH) enziminin katalizlediği korizmat'tan prefenat oluşum tepkimelerirekombinant L-fenilalanin üretiminde iki kısıtlayıcı tepkime olarak belirlendiğinden, bu iki konumayönelik olarak rekombinant-Bacillus subtilis ve biyoproses geliştirilmesi araştırma programınıntemel amacıdır. Beş alt-programdan oluşan araştırma programının ilk alt-programındabiyokimyasal reaksiyon mühendisliği teknikleri kullanılarak DAHP sentetaz enziminden sorumluaroA geni, aroH geni içeren ve içermeyen pUC19 E.coli plasmidlerine paralel olarak yapışkan-uçligasyon tepkimesi ile klonlanmış, ardından pMK4 ve pMK4::aroH E.coli-Bacillus shuttleplasmidlerine sub-klonlama yapılmış ve geliştirilen pMK4::aroA::aroH ve pMK4::aroAplasmidleri ayrı ayrı Bacillus subtilis A-263'e aktarılarak iki r-B.subtilis geliştirilmiştir. İkinci alt-programda, geliştirilen r-Bacillus subtilis A-263 ve doğal Bacillus subtilis A-263 ile VR=0.11 dm3çalışma hacimli biyoreaktörlerde, T=37 ºC, N=200 dk-1 ve pH0=6.8 işletme koşullarında glukozunkarbon kaynağı olarak kullanıldığı tanımlanmış üretim ortamında L-fenilalanin üretimperformansları karşılaştırılmıştır. Bu koşullarda en yüksek L-fenilalanin derişimine (Cphe=1.38 kgm-3) pMK4::aroA::aroH taşıyan r-Bacillus subtilis A-263 ile ulaşılmıştır. Üçüncü alt-programda,laboratuvar ölçekte geliştirilen koşullarda, VR=0.55 dm3 hacimli, mekanik karıştırmalı, pH,sıcaklık, çözünmüş oksijen ve karıştırma hızı kontrollü pilot-ölçek kesikli biyoreaktörlerde L-fenilalanin üretimine oksijen aktarımının etkisi sistematik bir programla; QO/VR=0.2, 0.35, ve 0.5vvm hava giriş hızlarında, N=500 ve 750 dk-1 karıştırma hızlarında oluşturulan oksijen-aktarımkoşullarında araştırılmıştır. Glukoz, hücre, L-fenilalanin, amino asit ve organik asit derişimleriölçülmüştür. En yüksek L-fenilalanin üretimi (Cphe=1.5 kgm-3) Q0/VR=0.5 vvm, N=500 dk-1 oksijenaktarım koşullunda elde edilmiştir. Dördüncü alt-programda belirlenen periyotlarda oksijen aktarımkoşullarında elde edilen veriler kullanılarak, 150 tepkime ve 110 metabolit içeren hücreiçibiyokimyasal-tepkime sistemi için kurulan matematik model çözülmüş ve, tepkime akıları vedağılımı bulunarak sonuçlar yorumlanarak değerlendirilmiştirAnahtar Kelimeler: L-fenilalanin, reaksiyon mühendisliği, metabolik mühendislik, aroA, aroH,rekombinant Bacillus subtilis, biyoreaktör, oksijen aktarımı, hücreiçi tepkimeler

Abstract:
The reactions catalysed by DAHP sentetase (EC 2.5.1.54) and chorismate mutase (EC 5.4.99.5) inthe L-phenylalanine pathway of Bacillus subtilis were predicted as the rate-limiting steps. Toovercome the limitation of the reactions and to increase the yield and selectivity in L-phenylalanineproduction, by metabolic engineering design and research program, aroA and aroH genesencoding, respectively, DAHP sentetase and chorismate mutase were cloned one by one first ontoan E.coli plasmid. aroA gene was cloned first onto the pUC19 and pUC19::aroH with the sticky-end reactions, and then sub-cloned onto a multicopy Bacillus-E.coli shuttle vectors pMK4 andpMK4::aroH for developing two r-Bacillus subtilis A-263 carrying pMK4::aroA::aroH andpMK4::aroA strains, were transfered into Bacillus subtilis A-263. L-phenylalanine productionperformance of r-Bacillus subtilis A-263 and wild type Bacillus subtilis A-263 were compared on adefined medium with sole carbon source glucose at T=37 ºC, N=200 dk-1 ve pH0=6.8 operationconditions in VR=0.11 dm3 laboratory scale bioreactors. The highest L-phenylalanine concentrationwas obtained (Cphe=1.38 kgm-3) by r-Bacillus subtilis A-263 carriyng pMK4::aroA::aroH.Thereafter, the effects of oxygen transfer on L-phenylalanine production were investigated atpHo=6.8 and T=37ºC at five different oxygen transfer conditions in VR=0.55 dm3 pilot-scale batch-bioreactors consisted of systems having temperature, pH, foam, dissolved oxygen, air inlet, stirringcontrols. L-phenylalanine, cell, amino acids and organic acids were measured. The oxygen transfercontion Qo/VR=0.5 vvm, N=500 min-1 (MOT1 condition) produced maximum L-phenylalanine asCphe=1.5 kgm-3. Lastly in order to generate a deep understanding, metabolic flux analysis for thefive oxygen transfer condition , moreover, the fluxes at MOT1 conditions for the three r-B.subtilis,i.e., r-B. subtilis carrying pMK4::aroH, r-B. subtilis carrying pMK4::aroA, and r-B. subtiliscarrying pMK4::aroA::aroH, were calculated using the data obtained in pilot-scale bioreactorexperiments. The results shows the successful pathway flux amplification achieved by themetabolic engineering design in the aromatic amino acid pathway toward L-phenylalanine.Key Words: L-phenylalanine, reaction engineering, metabolic engineering, aroA, aroH,recombinant Bacillus subtilis, bioreactor, oxygen transfer intracellular reactions,