Olgun yağ hücrelerinin rekombinant protein ifade kapasitelerinin incelenmesi
Investigation of recombinant protein expression capacity of mature adipocytes
Yazar: PARİSA SHARAFİ
Danışman: DOÇ. DR. ÇETİN KOCAEFE
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Gen ifadesi = Gene expression ; Gen teknolojisi = Gene technology ; Protein mühendisliği = Protein engineering ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic

Özet:
Olgun yağ hücreleri, çok sayıda adipokin ve sitokin salgılayan, protein yapımı yönünden zengin hücrelerdir. Tez kapsamında, yağ hücrelerinin protein salgı mekanizmasının rekombinant protein ifadesi ve salgısı amacıyla kullanım imkanlarının araştırılması amaçlanmıştır. İlk olarak, yağ hücrelerine özgü hücre içi salgısal proteinlere ait 7 farklı adipokinin sinyal dizilerinin salgı etkinliği bakımından karşılaştırılması yapılmıştır. Bu karşılaştırma, yeşil floresan protein (GFP) bildirici geninin bu öncü  sinyal dizilerinin ?N? terminaline füzyon ile ekleyip hücre içi ve dışında takibi gerçekleşmiştir.  Farklılaşmış, olgun yağ hücreleri G1 evresinde olup bölünmemektedir. Bu nedenle aktarılan vektörlerin gen ifade sürecinin bölünen hücrelere göre daha kalıcı olması beklenmektedir. Ancak, gen ifadesinin koruması ve ifade süresinin daha da uzatabilmesi amacıyla hazırlanan vektörlere scaffold/matrix bağlanma bölgesi (S/MAR) dizilerinin eklenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla, İnterferon beta (IFNß) ve Apolipoprotein B (APOB) genlerinin S/MAR dizileri, hazırlanan vektöre yerleştirilerek bildirici gen ifadesi sürecinin takibi yapılmış olunup en uzun süre gen ifadesi sağlayan S/MAR dizisi karşılaştırmalı olarak ortaya konmuştur.  Olgun yağ hücrelerinde rekombinant gen ekspresyonu ve salgısını  sağlayan yaklaşımın etkinliğinin dominant-negatif etkili miyostatin (MSTNdn) aracılığı ile hücre kültüründe gösterilmesi amaçlanmıştır. Bu çalışma sonucunda en etkin öncü dizisi olarak Retinol bağlama proteini (RBP4) genine ait öncü dizisi seçilmiştir. S/MAR dizileri arasında bir fark görünmemiştir. Çalışmanın son basamağında yukarıda sıralanan deneysel yaklaşımlarla belirlenen en uygun salgı sinyali (RBP4), S/MAR dizisi ve  MSTNdn içeren vektör omurgasının etkinliğinin gösterilebilmesi amacıyla olgun yağ hücrelerince salgısı sağlanarak etkinliği in vitro deneylerle gösterilmiştir.

Anahtar kelime: Yağ dokusu, Rekombinant protein ifadesi, Protein mühendisliği, viral olmayan gen transferi.

Abstract:
This study postulates that the extracellular transport of the secretory proteins of the adipocytes (adipokines) can be utilized to achieve recombinant protein expression. Adipokines are exported outside of the adipocytes by the help of leader sequences which deduce the extracellular export traffic. It is aimed to achieve the expression of a recombinant protein extracellularly by using the leader sequences of the 7 selected adipokines. This approach will aid in production and extracellular secretion of the protein of interest by mature adipocytes. The efficiency and intracellular- extracellular follow-up of these export signals will be done by fusing these export signals to N- terminal of Green Fluorescence Protein (GFP). The S/MAR sequences increase the episomal persistence of the transgenic vector where it is located to and prolong its expression in mammalian cells. In this study, it is aimed to use this property of S/MAR sequences by adding it to the vector construct to increase the episomal expression of the transgenes in mature adipocytes (non-dividing cells). It is proposed to compare the efficacy of two different S/MARs in this study, the S/MAR sequences of Apolipoprotein B (APO-B) and Interferon B (IFN-B) genes. The efficiency of this designed recombinant gene expression construct will be shown by expressing the dominant-negative form of myostatin (MSTNdn), as a model of gene of interest, in adipocytes and observing its effect on myoblast cells. As a result of this study, export signal of Retinol Binding Protein (RBP4) has been selected as the most efficient export signal. No differences have been observed between the selected S/MAR sequences. At the end of this study, the in vitro efficiency of the designed vector construct containing selected export signal (RBP4), S/MAR sequences, and MSTNdn was shown by implementing the secretion of this model recombinant protein from the transfected mature adipocytes.

Anahtar kelime: Yağ dokusu, Rekombinant protein ifadesi, Protein mühendisliği, viral olmayan gen transferi.