İnsan adenovirus DNA'sının mutlak kantitasyonu için dijital PCR yöntemine dayalı bir test formatının geliştirilmesi
Development of digital PCR based test method for absolute quantification of human adenovirus dna
Yazar: YAĞMUR EYLÜL DOĞANTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. MERT AHMET KUŞKUCU
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Adenovirüsler = Adenoviridae ; DNA = DNA ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis testleri = Diagnostic tests ; Virüs hastalıkları = Virus diseases ; Virüsler = Viruses

Özet:
Giriş ve Amaç: İnsan adenovirusu (HAdV) çeşitli hastalıklara, dissemine hastalığa ve primer infeksiyonu takşben çeşitli doku ve organlarda persistans göstererek latent infeksiyona neden olmaktadır. Adenovirus infeksiyonları morbidite ve mortalite ile seyredebilmektedir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknolojilerinde en güncel tekniklerden biri çeşitli patojenlerin eş zamanlı tanısı ve mutlak kantitasyonuna olanak sağlayan dijital PCR (dPCR) yöntemidir. Yapılan literatür taramaları sonucunda insan adenovirusunun tüm serotiplerini saptayabilecek ticari bir dPCR kiti bulunmadığı anlaşılmıştır. Bu tez çalışmasında HAdV'nin tüm seroptiplerini düşük kopya sayılarında yüksek duyarlılıkta ve kantitatif bir şekilde saptayabilecek dPCR tabanlı bir test formatı geliştirilmesi hedeflenmiştir.  

Gereç ve Yöntem: Çalışmada kullanılan primer ve prob dizileri literatür taramaları sonucunda tüm adenovirus türlerini tek seansta saptayabilecek şekilde seçildi. Seçilen diziler nBLAST ile doğrulandı ve BioEdit yazılımı aracılığı ile hedef dizi belirlendi. Çalışmada kullanılan standart HAdV DNA'sı, adenovirus pozitif olduğu bilinen arşivlenmiş ekstraksiyonların hekzon gen bölgesinin real-time PCR yöntemi ile klonlanarak manyetik boncuklarla izole edilmesiyle elde edilmiştir. İzole edilen bölgeler master stok solüsyonu olarak kullanılmak üzere havuzlanarak çalışılmıştır. Stok solüsyondaki DNA konsantrasyonu qubit florometre ile ölçülmüştür. Deneyde kullanılmak üzere insan adenovirusu hekzon bölgesine ait hedef bölge izole edilerek çoğaltıldı. Çoğaltılan bölgeden stok oluşturularak DNA konsantrasyonu qubit florometre ile ölçüldü ve ana stok olarak arşivlendi. Florometrede ölçülen DNA konsantrasyonu ve çoğaltılan baz dizisinin uzunluğundan yararlanılarak, ana stoğun olarak mililitredeki kopya sayısı tahmini olarak 7,634x1011 kopya/ml olarak hesaplandı. DNA miktarı belirlenen stok onar kat sulandırılarak ardışık 10 dilüsyon serisi hazırlandı. Bu dilüsyonlar içinde DNA kopya sayılarının yaklaşık 76.340 kopya/ml, 7.634 kopya/ml, 763,4 kopya/ml ve 76,34 kopya/ml olduğu tahmin edilen ardışık son 4 dilüsyon seçildi ve çalışıldıTestin dinamik aralığını, saptama sınırını (LoD), ölçüm limitini (LoQ), kesinlik ve tekrarlanabilirliğini tayin edebilmek amacı ile ardışık dört dilüsyon, birbirinden bağımsız üç oturumda, üçer tekrarlı olarak çalışıldı.

Sonuç: Testin dinamik aralığı 770,4 - 0,9476 kopya/µl, saptama sınırı (LoD) ve kantifikasyon sınırı (LoQ) eşit 0,9476 kopya/µl ve R2 değeri %99,44 olarak belirlendi.

Tartışma: Elde edilen sonuçlar, insan adenovirusunun dPCR yöntemi ile tanısı ve mutlak kantitasyonu için iyi bir araç olabileceğini göstermektedir. Yöntemin tekrar üretilebilirliğinin belirlenmesi ve sahaya valide edilebilmesi için testin farklı laboratuvatalara adapte edilmesi ve klinik çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir.

Abstract:
Background and objective: Human adenovirus (HAdV) cause various infections, disseminated disease and also causes latent infection by persisting various tissues and organs following primer infection. HAdV infections can be resulted with morbidity and mortality. One of the up-to-date techniques in Polymerase Chain Reaction (PCR) technology is digital PCR (dPCR) assay which enables detection and absolute quantification of diverse pathogens simultaneously. As a result of literature review, we noticed that there is no commercial kit detecting HAdV for dPCR system. The aim of the present study was to develop a highly sensitive test format based on dPCR that able to quantitative detection of all serotypes of HAdV in low copy numbers.

Materials and method: The primer and probe sequences used in the study were designated through the literature review so that they could detect all HAdV serotypes in a single run. The selected primers were verified with nBLAST and the target sequence was determined using the BioEdit software. The standardized HAdV DNA to be used in the experiment was prepared from HAdV positive extractions archived in our laboratory and hexon gene region was cloned by real-time PCR, isolated using magnetic beads. Isolated gene regions were pooled as a master stock solution for later use. DNA concentration of the stock solution was measured by qubit fluorometer. The estimated copy number of the stock solution per milliliter was calculated as 7,634x1011 copies/ml based on the length of the amplified base sequence and fluorometer measurement. Ten consecutive tenfold dilution was prepared by diluting the master stock and the out of ten dilutions, the last four dilutions were selected which contains estimated 76.340 cp/ml, 7.634 cp/ml, 763,4 cp/ml and 76,34 cp/ml HAdV DNA. In order to determine the dynamic range, limit of detection (LoD), limit of quantification (LoQ), precision and reproducibility of the test, four consecutive dilutions were studied in triplicate in three independent runs.

Results: The dynamic range of the test was found from 770,4 to 0,9476 cp/µl, limit of detection (LoD) and limit of quantification (LoQ) values were the same 0,9476 cp/µl. R2 value was %99,44.

Conclusion: The results show that digital PCR method can be a good tool for the diagnosis and absolute quantification of human adenoviruses. In order to determine reproducibility of the test and validate the method in the field, it needs to be developed and adapted in laboratories and supported by clinical studies.