Sıçan modelinde polikromatik ışık ve yağ dokusu kökenli mezenkimal kök hücre uygulamasının kornea yara iyileşmesi üzerine etkisi
Effect of polychromatic light and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells application on corneal wound healing in a rat model
Yazar: BETÜL SEHER UYSAL
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Göz Hastalıkları = Eye Diseases

Özet:
Sunulan tez çalışmasının amacı kornea yara iyileşmesinde sıçan kornea opasite modeli kullanılarak subkonjonktival enjeksiyon yoluyla adipoz doku kökenli mezenkimal kök hücre (AdMKH) uygulaması ve 600-1200 nm dalga boyu aralığındaki polikromatik ışık kaynağı ile fotobiyomodülasyon (FBM) tedavilerinin tek başına ve birlikte uygulamasının kornea saydamlığı, enflamasyonu ve hücre dışı matriks organizasyonu üzerindeki terapötik etkinliğini ve güvenirliğini değerlendirmektir.
Tez çalışmasının ilk aşamasında sıçan AdMKH'lerin izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu yapılmış ve uygulanacak FBM tedavisinin süresi ve enerji dozu için optimizasyon çalışmaları yapılarak tedavi parametreleri oluşturulmuştur. İkinci aşamada, sıçan kornealarına elmas uçlu tur ile mekanik debridman yapılarak kornea opasite modeli oluşturulmuştur. Kornea skarı oluşturulan sıçanlar 4 tedavi grubuna ayrılmıştır: negatif kontrol (NK), AdMKH tedavisi, FBM tedavisi ve AdMKH + FBM tedavisi (n=12). Son aşamada, yaralanmayı takip eden 10. ve 30. günde kornea opasite skoru (KOS) ve neovaskülarizasyon derecesi (NVD) yarıklı lamba muayenesi ile değerlendirilmiş ve merkezi kornea kalınlığı (MKK) ön segment optik koherens tomografi ile ölçülmüştür. Yaralanma sonrası 30. günde kornealar eksize edilerek geçirimli elektron mikroskopi (TEM), hematoksilen ve eozin (H&E), immünohistokimyasal (İHK) boyama ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile analiz edilmiştir.
Yaralanmayı takip eden 30. günde, tüm tedavi gruplarında KOS ve MKK değeri NK grubuna göre anlamlı olarak azalmıştır. Neovaskülarizasyon derecesi AdMKH ve FBM + AdMKH gruplarında anlamlı azalırken, FBM grubundaki değişim NK grubuna benzer bulunmuştur. Geçirimli elektron mikroskopi ve H&E boyamada, FBM ve AdMKH tedavilerinin tek başına uygulanmasına kıyasla FBM + AdMKH grubu en iyi yara iyileşme yanıtını göstermiştir. Hasar sonrası artan kolajen tip 1 (COL1) ve kollajen tip 3 (COL3) sentezi FBM + AdMKH grubunda NK grubuna göre anlamlı azalmıştır. Negatif kontrol grubuna göre dönüştürücü büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) değerinde anlamlı azalma sadece FBM + AdMKH grubunda izlenmiştir. İnterlökin 1-beta (IL-1β) düzeyi NK, FBM ve AdMKH gruplarına kıyasla FBM + AdMKH grubunda anlamlı olarak daha düşük bulunmuştur. Sonuç olarak enflamasyonu baskılamada en iyi sonuç FBM + AdMKH tedavi grubunda elde edilmiştir. Tüm tedavi gruplarında α-düz kas aktini (α-SMA) düzeyi, NK grubuna kıyasla anlamlı olarak daha düşük bulunmuştur. Keratokan düzeyi AdMKH ve FBM + AdMKH gruplarında pozitif kontrol grubu ile benzer bulunmuştur. Gerçek zamanlı PCR analizinde COL1, COL3, IL-1β ve α-SMA tüm tedavi gruplarında NK grubuna göre anlamlı olarak azalmıştır. Polikromatik ışık, TEM görüntüleme ve H&E boyamaya göre sıçan lensi, retinası ve endotelinde hasara neden olmamıştır.
Bu tez çalışması, in vivo görüntüleme ve in vitro doku analizleri sonucunda subkonjonktival AdMKH enjeksiyonunun ve polikromatik ışıkla FBM tedavisinin (her seansta toplam enerji yoğunluğu 4,6 J/cm2 olmak üzere 3 seans) kornea dokusu rejenerasyonunda etkili ve güvenli olduğunu ve FBM'nin kornea yara iyileşmesi için potansiyel bir tedavi olarak değerlendirilebileceğini göstermiştir. Ayrıca FBM tedavisi, AdMKH'lerle birlikte uygulandığında kök hücrelerin terapötik etkinliği artmıştır.

Abstract:
The aim of the presented thesis was to evaluate the therapeutic efficacy and safety of subconjunctival adipose tissue-derived mesenchymal stem cell (AdMSC) injection and photobiomodulation (PBM) treatment via polychromatic light source in the wavelength range of 600-1200 nm alone and in combination, on corneal opacity, inflammation, and extracellular matrix organization in corneal wound healing using a rat corneal opacity model.
In the first part of the study, the isolation, culture, and characterization of rat AdMSCs were performed and optimization studies were carried out to establish the parameters of the duration and energy dose of the FBM treatment to be applied. In the second part, a corneal opacity model was created by mechanical debridement of rat corneas with a diamond burr. Rats with corneal scar were divided into 4 treatment groups: negative control (NC), AdMSC treatment, PBM treatment and combined (AdMSC + PBM) treatment (n=12 eyes in each group). Finally, on the 10th and 30th days following the injury, corneal opacity score (COS) and degree of neovascularization (NVD) were evaluated by slit lamp examination, and central corneal thickness (CCT) was measured by anterior segment optical coherence tomography. On the 30th day, corneas were harvested and analyzed by transmission electron microscopy (TEM), hematoxylin and eosin (H&E), immunohistochemical (IHC) staining, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).
On day 30, COS and CCT values decreased significantly in all treatment groups compared to the NC group. While the NVD decreased significantly in the AdMSC and combined treatment groups, the change in the PBM group was similar to the NC group. In TEM and H&E staining, the best results in corneal wound healing were observed in the combined treatment compared to the application of PBM and AdMSCs alone. The increased synthesis of collagen type 1 (COL1) and 3 (COL3) after injury was significantly reduced in the combined treatment group compared to the NC group. Compared to the NC group, a significant decrease in transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) value was observed only in the PBM + AdMSC group. With combined treatment, interleukin 1 beta (IL-1β) level was found to be significantly lower compared to the NC, PBM and AdMSC groups. As a result, the best results in suppressing inflammation were obtained in the combined treatment group. In all treatment groups, α-smooth muscle actin (α-SMA) level was found to be significantly lower compared to the corneas in the NC group. Keratocan levels in the combined treatment and AdMSC groups were found to be similar to those in healthy corneas. In the RT-PCR analysis, COL1, COL3, IL-1β and α-SMA were significantly decreased in all treatment groups compared to the NC group. Polychromatic light did not cause any damage to the rat lens, retina and endothelium according to TEM and H&E staining analyses.
In this study, in vivo imaging and in vitro tissue analysis demonstrated that subconjunctival AdMSC injection and PBM treatment with polychromatic light (3 sessions with total energy density of 4.6 J/cm2 in each session) were effective and safe in corneal tissue regeneration and PBM could be considered as a potential treatment for corneal wound healing. Moreover, PBM therapy can enhance the therapeutic efficacy of stem cells when combined with ADMSCs.