Karışım örneklerinde kan ve tükürük örneklerinin miRNA ile ayırımı
Separation of blood and saliva samples with miRNA in mixed samples
Yazar: REMZİYE ATALAY
Danışman: PROF. DR. EMEL HÜLYA YÜKSELOĞLU
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine
Dizin: Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) = Reverse transcription polimerase chain reaction ; Kan = Blood ; Karışımlar = Mixtures ; Mikro RNA = Micro RNA ; Tükürük = Saliva

Özet:
Adli vakalarda, olay yerinden toplanan biyolojik örnekler olayın aydınlatılması için kanıt olma özelliği taşır. Bu nedenle olay yerinden toplanmaları, uygun koşullarda saklanmaları ve doğru yöntemlerle analiz edilip yorumlanmaları gerekir. Her bir olay yeri kendine özgü olsa da fail ve/veya mağdurun ardında bıraktığı vücut sıvıları (ter, idrar, semen, tükürük, kan vs.) sınırlıdır. Yapılan çalışmalarda, bu vücut sıvılarından güvenilir yorumlar yapabilmek için çeşitli genetik faktörler kullanılmaktadır. Son on yılda, adli amaçla, diğer yöntemlerden farklı olarak mikroRNA'lar (miRNA) kullanılmaya başlanmıştır. Kapsüllü, çevresel değişikliklere dirençli olan miRNA'ların, vücut sıvılarına özgü olmalarının yanı sıra birbirinin aynı Deoksiribo Nükleik Asit (DNA) dizilimine sahip monozigotik ikizlerde farklı biyo belirteçler göstermeleri onları çok önemli ve çalışılmaya değer kılmaktadır. Güncel olarak vücut sıvılarını belirleme, monozigot ikizleri ayırt etme, periferik kan ile menstrual kanı birbirinden ayırma, bozulmuş örneklerde faili belirleme, postmortem interval tayininde kullanılabilirliği çalışılmaktadır. Fakat adaletin sağlanması ve adli olayların aydınlatılmasına olanak sağlayan bu çalışmalar arasında günümüzde sık rastladığımız çok failli cinsel istismar, cinayet ve benzeri (vb.) vakalarda sorun oluşturan karışım örnekleri henüz çalışılmamıştır. Bu çalışma ile karışım örneklerinde, miRNA biyo belirteçleri kullanarak, karışımdaki vücut sıvılarının varlığını göstermek amaçlanmıştır. Bu çalışma için gönüllülerden kan ve tükürük örnekleri toplanmıştır. Toplanan örnekler iki donörlü karışımlar olarak dört farklı grupta hazırlanmıştır. Her bir grup için 1/1, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 dilüsyonlu örnekler hazırlanmıştır. 4 kadın ve 4 erkek bireyden toplanan sıvılarından toplam 36 karışım örneği oluşturulmuştur. Hazırladığımız karışım örneklerinde kan varlığını göstermek için miR-451A biyo belirteci, tükürük varlığını göstermek için miR-203A-3p biyo belirteci tercih edilmiştir. Örnekler ilk olarak santrifüj edilip ardından miRNeasy Mini Kit kullanılarak RNA izolasyonu yapılmıştır. Elde edilen RNA'ların konsantrasyonu ve saflığı spektrofotometre ile tayin edilmiştir. Sonrasında Taqman microRNA Reverse Transcription Kit ile RNA'lardan cDNA (tamamlayıcı DNA) sentezlenmiştir. Referans gen olarak U6 gen bölgesi tercih edilmiş olup analizler RT-PCR ile yapılmıştır. İstatistiksel analizler SPSS programı ile T testi kullanılarak yapılmıştır. Karşılaştırmalar 2- delta delta Ct yöntemi ile hesaplanmıştır. Bu çalışma sonucunda, tükürük varlığını göstermek için miR-203A-3p belirtecinin uygun olmadığı düşünülmektedir. Karışımdaki kan örneklerinin varlığı tüm dilüsyonlarda gösterilmiş, en iyi seviye 1x1 oranında görülmüştür. Tüm gruplar incelendiğinde erkek donörlü karışımların diğer karışımlara oranla daha yüksek oranda eksprese edildiği görülmüştür.

Anahtar Kelimeler: miRNA, karışım örnekleri, kan, tükürük, Real Time PCR

Abstract:
In criminal cases, biological samples collected from the scene of crime serve as evidence for clarification of the event. For this reason, they must be collected from the scene, stored under appropriate conditions, and analyzed and interpreted with the right methods. Although each crime scene is unique, the body fluids (sweat, urine, semen, saliva, blood, etc.) left behind by the perpetrator and/or victim are limited. Various genetic factors are used in studies to make reliable interpretations of these body fluids. In the last decade, different from other methods, microRNAs (miRNA) have been used for forensic purposes. Encapsulated, miRNA's which have resistant to environmental changes, miRNAs are unique to body fluids and show different biomarkers in monozygotic twins with the same DNA sequence, which makes them very important and worthy of study. Currently, its usability is being studied in determining body fluids, distinguishing monozygotic twins, separating peripheral blood from menstrual blood, identifying the perpetrator in impaired samples, and determining the postmortem interval. However, among these studies that allow justice to be provided and to illuminate forensic events, sexual abuse with multiple perpetrators, murder, etc., which we have faced frequently today. Examples of mixtures that cause problems in cases have not been studied yet. In this study, it was aimed to show the presence of body fluids in the mixture by using miRNA biomarkers in the mixture samples. Blood and saliva samples were collected from volunteers for this study. Collected samples were prepared in four different groups as mixtures with two donors. Samples with 1/1, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 dilutions were prepared for each group. A total of 36 mixture samples were created from the fluids collected from 4 female and 4 male individuals. The miR-451A biomarker was preferred to show the presence of blood in the mixture samples we prepared, and the miR-203A-3p biomarker to show the presence of saliva. The samples were first centrifuged and then RNA was isolated using the miRNeasy Mini Kit. The concentration and purity of the obtained RNAs were determined by spectrophotometer. Afterwards, cDNA (complementary DNA) was synthesized from RNAs with Taqman microRNA Reverse Transcription Kit. The U6 gene region was preferred as the reference gene and the analyzes were made by RT-PCR. Statistical analyzes were performed using SPSS program and T test. Comparisons were calculated using the 2-delta delta Ct method. As a result of this study, it is thought that the miR-203A-3p marker is not suitable for showing the presence of saliva. The presence of blood samples in the mixture was demonstrated at all dilutions, with the best level being 1x1. When all groups were examined, it was observed that mixtures with male donors were expressed at a higher rate than other mixtures.

Keywords: miRNA, mix samples, blood, saliva, Real Time PCR