SARS-COV-2'nin nükleokapsid gen analizi
Nucleocapside gene analysis of SARS-COV-2
Yazar: MERVE ÇİLBURUNOĞLU
Danışman: PROF. DR. KEZBAN TÜLAY YALÇINKAYA
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: COVID 19 = COVID 19 ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Genetik = Genetics ; Korona virüs enfeksiyonları = Coronavirus enfections ; Korona virüsler = Coronaviridae ; Nükleotidler = Nucleotides ; SARS virüsü = SARS virus

Özet:
Giriş ve Amaç: Aralık 2019 tarihinde, Çin'in Wuhan şehrinde SARS-CoV-2 olarak adlandırılan yeni bir koronavirüs ortaya çıktı ve olağandışı bir viral pnömoni salgınına neden oldu. SARS-CoV-2'nin dünyaya yayılırken birkaç ay içinde hem yapısal hem de yapısal olmayan proteinlerinde mutasyonların geliştiği gösterilmiştir. Bu yapısal proteinlerden nükleokapsid proteininin viral RNA sentezinde ve dolayısıyla koronavirus yaşam döngüsünde kritik rol oynadığı bilinmektedir. Nükleokapsid proteini yüksek oranda immünojeniktir ve enfeksiyon sırasında bol miktarda eksprese edilir. Ayrıca, nükleokapsid proteini aşı geliştirmede ve serolojik testlerde sıklıkla kullanılır. Halen SARS-CoV-2 nükleokapsid proteinine odaklanan az sayıda çalışma bulunmaktadır ve güncel bilgilere ihtiyaç vardır. Genetik varyans analizleri, salgını kontrol altına almak için bu yeni virüs hakkındaki bilgileri genişletmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Mutasyonların sürekli izlenmesi, virüsün bireyler ve coğrafi alanlar arasındaki hareketini izlemede de çok önemli olacaktır. Bu faydaları göz önünde bulundurarak yaptığımız çalışmamızda; SARS-CoV-2 nükleokapsid geninde meydana gelen genetik değişiklikleri saptamayı ve bu konuda ileride yapılacak olan çalışmalara katkı sağlamayı amaçladık.
Materyal ve Metot: 2021 Ağustos ayında, KSÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı'na gönderilen kombine burun-boğaz sürüntü örneklerinden SARS-COV-2 Real-time PCR testi pozitif bulunan 112 örnek çalışmaya dahil edildi. Örnekten viral RNA izolasyonu HibriGen Genel RNA İzolasyon Kiti ile yapıldı. İzolasyonla elde edilen RNA örnekleri, revers transkripsiyonla RNA'dan cDNA sentezi için abmgood OneScript® Plus cDNA Sentez Kiti kullanıldı. cDNA örneklerine Solis Biodyne HOT FIREPol® DNA Polimeraz Kiti kullanılarak PCR işlemi uygulandı. Nükleotid dizi analizi KSÜ ÜSKİM Merkez Sekans Laboratuvar'ında Sanger yöntemiyle yapıldı. Elde edilen nükleotid dizileri, Sequencher 5.4.6 programı aracılığı ile SARS-CoV-2 Wuhan izolatı (NC_045512.2) referans alınarak birleştirildi ve konsensus dizileri çıkarıldı. Konsensus dizilerin mutasyon analizinde, soy belirlenmesinde ve dendrogram oluşturulmasında Nextclade v1.7.1 platformu kullanıldı.
Bulgular: Çalışmamıza alınan 112 SARS-CoV-2 izolatının N gen bölgesi, referans Wuhan (NC 045512.1) N dizisi ile karşılaştırıldığında izolatların tamamında çeşitli mutasyonlar tespit edildi. Saptanan mutasyonlardan 18'i nonsinonim (yanlış anlamlı), 14'ü sinonim (sessiz) mutasyonlardı. Nonsinonim mutasyonlar D63G (n=112), R203M (n=112), G215C (n=112), D377Y (n=112), S232G (n=9), E253D (n=9), L139S (n=2), A308S (n=2), R319H (n=2), R41Q (n=2), T24I (n=2), L139F (n=1), T205I (n=1), A119S (n=1), G243C (n=1), A359S (n=1), P364L (n=1), P46S (n=1) olarak saptandı. Sinonim mutasyonlar ise T29164C(n=6), C28312T(n=5), G29422T(n=5), G29179A(n=4), C28744T (n=3), C29200T (n=2), A29113G (n=2), G28396A (n=2), G29260T (n=1), A28699T (n=1), G29332T (n=1), G29227A (n=1), C29167T (n=1), C28585A(n=1) olarak saptandı. En sık saptanan nükleotid mutasyonu G>T (n=12), ikinci sıklıkta C>T(n=8) idi. D63G, R203M, G215C, D377Y mutasyonları tüm izolatlarda saptandı. Ayrıca 9 izolatın her birinde mevcut mutasyonlara ek olarak S232G ve E253D mutasyonları bir arada saptandı. Nextclade v1.7.1 ile referans izolatlarla karşılaştırılıp dendogram oluşturulduğunda 112 örneğin tamamı 21A(Delta) soyu ile gruplanmıştır.
Sonuç: SARS-CoV-2'nin nükleokapsid gen bölgesini hedefleyen çalışmamız az sayıda örnekle ve kısa bir zaman diliminde yapılmasına karşın yüksek oranda ve farklılıkta nükleokapsid mutasyonları ortaya çıkarmış ve varyant tayinine olanak sağlamıştır. Yerel ölçekte (il düzeyinde) yapılacak benzer çalışmaların ulusal sürveyansa katkı sağlayacağı düşünülmektedir. Farklı bölgelerde, salgının epidemiyolojik yayılımının izlenmesi, patojenin evrimini ve ilerlemesini takip etmek ve tanı, tedavi, aşı çalışmalarına katkı sağlamak için gen analizlerinin yapılması son derece önemlidir. Nükleokapsid geni ile ilgili daha çok araştırmaya ihtiyaç vardır. Çalışmamız nükleokapsid geni araştırmalarına katkı sağlamakta ve nükleokapsid geni analizlerine dikkat çekmektedir. Devam eden COVID-19 pandemisinin ciddiyeti göz önüne alındığında, SARS-CoV-2 araştırmalarının artarak devam etmesi gerekmektedir.

Abstract:
Introduction and Purpose: In December 2019, a new coronavirus named SARS-CoV-2 emerged in Wuhan, China, causing an unusual viral pneumonia outbreak. SARS-CoV-2 has been shown to develop mutations in both structural and nonstructural proteins within a few months as it spreads around the world. It is known that the nucleocapsid protein, one of these structural proteins, plays a critical role in viral RNA synthesis and therefore in the coronavirus life cycle. The nucleocapsid protein is highly immunogenic and abundantly expressed during infection. In addition, the nucleocapsid protein is frequently used in vaccine development and serological testing. Currently, there are few studies focusing on the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein, and up-to-date information on the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein is needed. Genetic variance analyzes play a crucial role in expanding knowledge about this new virus to contain the epidemic. Continuous monitoring of mutations will also be crucial in tracking the movement of the virus between individuals and between geographic areas. Considering these benefits, in our study; we aimed to detect genetic changes in the SARS-CoV-2 nucleocapsid gene and to contribute to future studies on this subject.
Material and Method: In August 2021, 112 samples with positive SARS-COV-2 Real-time PCR test from combined nose-throat swab samples sent to KSU Medical Faculty Medical Microbiology Laboratory were included in the study. Viral RNA isolation from the sample was done with HibriGen General RNA Isolation Kit. Abmgood OneScript® Plus cDNA Synthesis Kit was used for cDNA synthesis from RNA samples obtained by isolation, reverse transcription. cDNA samples were amplified with PCR using Solis Biodyne HOT FIREPol® DNA Polymerase Kit. Nucleotide sequence analysis was performed in KSÜ ÜSKİM Central Sequence Laboratory using Sanger method. The obtained nucleotide sequences were assembled with reference to the SARS-CoV-2 Wuhan isolate (NC_045512.2) via the Sequencher 5.4.6 program and consensus sequences were generated. Nextclade v1.7.1 platform was used for mutation analysis of consensus sequences, lineage determination and dendrogram creation.
Results: When the nucleocapsid gene regions of 112 SARS-CoV-2 isolates were compared with the reference Wuhan (NC 045512.1) Nucleocapsid sequence, various mutations were detected in all isolates. Of the mutations detected, 18 were nonsynonymous (missense) and 14 were synonymous (silent) mutations. Nonsynonymous mutations were D63G(n=112), R203M(n=112), G215C(n=112), D377Y(n=112), S232G(n=9), E253D(n=9), L139S(n=2), A308S(n=2), R319H (n=2), R41Q(n=2), T24I (n=2), L139F(n=1) , T205I(n=1), A119S(n=1), G243C(n=1), A359S(n=1), P364L(n=1), P46S(n=1). Synonymous mutations were T29164C(n=6), C28312T(n=5), G29422T(n=5), G29179A(n=4), C28744T(n=3), C29200T(n=2), A29113G(n=2), G28396A(n=2), G29260T(n=1), A28699T(n=1), G29332T(n=1), G29227A(n=1), C29167T(n=1), C28585A(n=1). The most common nucleotide mutation was G>T (n=12) and, the second most common was C>T(n=8). D63G, R203M, G215C, D377Y mutations were detected in all isolates. In addition to the mutations present in each of the 9 isolates, S232G and E253D mutations were detected together. All 112 samples were grouped with 21A (Delta) clade when a dendogram was created by comparing them with reference isolates with Nextclade v1.7.1.
Conclusions: Although our study targeting the nucleocapsid gene region of SARS-CoV-2 was performed with a small number of samples and in a short period of time, it revealed a high rate and diversity of nucleocapsid mutations and enabled variant determination. It is thought that similar studies to be carried out at the local (provincial level) will contribute to national surveillance. It is extremely important to carry out gene analyzes to monitor the epidemiological spread of the epidemic in different regions, to follow the evolution and progression of the pathogen, and to contribute to the diagnosis, treatment, and vaccine studies. More research is needed on the N gene. Our study contributes to nucleocapsid gene research and draws attention to nucleocapsid gene analysis. Considering the seriousness of the ongoing COVID-19 pandemic, SARS-CoV-2 research needs to be escalated.