İshalli olgularda Microsporidia sıklığının calcofluor beyazı ve Uvitex 2B kemilüminesans boyama yöntemleriyle araştırılması ve moleküler tiplendirilmesi
Researching Frequency of Microsporidia on diarrheic patients with Calcofluor white and Uvitex 2B Chemiluminescence painting methods and molecular typing of Microsporidia
Yazar: İLKİZ OĞUZ
Danışman: DOÇ. DR. FUNDA DOĞRUMAN AL
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Boyama ve işaretleme = Stains and staining ; Diyare = Diarrhea ; Luminesan ölçümler = Luminescent measurements ; Microsporidia = Microsporidia ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Zorunlu hücre içi paraziti olan Microsporidia, ilk kez 1857? de Nageli tarafından tanımlanmıştır.  Microsporidia şubesinde 170 cins ve 1.400 tür bulunmaktadır. Microsporidia? nın böcekler, balıklar ve memeliler gibi geniş bir konak yelpazesi vardır. Hayvanlar dışında insanları da enfekte edebildiği ve insanlarda hem semptomatik hemde asemptomatik olarak bulunabildiği gösterilmiştir. İnsanı enfekte eden sekiz cins bulunmaktadır. Bu cinsler; Anncaliia (Brachiola, Nosema), Encephalitozoon, Entrocytozoon, Microsporidium, Nosema, Pleistophora, Trachipleistophora ve Vittaforma? dır. Yapılan çalışmalarda HIV pozitif, immün süpresif,  homoseksüel olan bireyler, seyahat edenler ve sağlıklı bireyler araştırma grubunu oluşturmaktadırlar. İnsanlarda en sık enfeksiyon oluşturan türler Encephalitozoon intestinalis ve Enterocytozoon bieneusi  ` dir.
Çalışmada iki farklı kemilüminesans boya olan Uvitex 2B ve Calcofluor ile Microsporidia sıklığının belirlenmesi ve moleküler olarak tiplendirilmesi amaçlanmıştır.
Bu çalışmada 2011- 2012 yılları arasında Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı? na ve Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Labaratuvarı? na gönderilen  200 hastanın ishalli dışkı örnekleri ile çalışılmıştır. Dışkı örnekleri kemilüminesan boya olan Uvitex 2B ve Calcofluor yöntemleri ile boyanmış ve microsporidia sıklığı %38.5 (77/ 200) olarak saptanmıştır.
Kemilüminesans boya olan Uvitex 2B ve Calcofluor  arasında Microsporidia saptanma açısından istatistiksel olarak mükemmel bir uyum olduğu belirlenmiştir (Kappa= 0.881)
Uvitex 2B ile Calcofluor? un mikroskop sahasındaki Microsporidia sporların sayısal yoğunluğuna ( az, çok) ve sporların parlaklıklarına ( soluk, parlak ) göre uyumlulukları istatistiksel olarak belirtilmiştir. İki boya arasında sayısal yoğunluğu açısından orta düzeyde uyum belirlenirken (Kappa= 0.354), sporların parlakları açısından herhangi bir uyuma saptanmamıştır (Kappa= 0.001).
Çalışmada microsporidia sıklığının yaş grupları ve kliniklere göre anlamlı bir fark saptanmamıştır (p > 0.05). Cinsiyete göre microsporidia sıklığının kadınlarda (%50) erkeklere (%30.8) göre daha fazla olduğu saptanmıştır (p ? 0.05).
Çalışmamızda Uvitex 2B ve Calcofluor ile pozitif saptanan 77 örnekte multipleks nested PZR yapılmış ve ilk basamakta cins ayrımı yapabilmek için E. bieneusi ve Encephalitozoon spp. olarak sınıflandırılmıştır ve yedi (%9.1) tane E. bieneusi, 70 (%90.9) tane Encephalitozoon spp.olarak belirlenmiştir. Microsporidia cinsleri göz önüne alındığında yaş, cinsiyet ve gönderilen kliniklere göre Microsporidia sıklığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p ? 0.05)
Çalışmamızda saptanan 70 adet Encephalitozoon spp. cinsi  tür ayrımı yapabilmek için ikinci tur multipleks nested PZR ile E. intestinalis, E. cuniculi ve E. hellem olarak tiplendirilmiştir. Buna göre 70 adet Encephalitozoon spp.? de; 44? ü (%62.9) E. intestinalis, 22? si (%31.4) E. cuniculi, ve dördü ise (%5.7) E. hellem olarak belirlenmiştir. Encephalitozoon türlerinin yaş, cinsiyet ve kliniklerine göre sıklığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p ? 0.05)
Dışkı örneklerin Microsporidia tanısında kemilüminesans boya olan Uvitex 2B ve/ veya Calcofluor boyama yöntemlerinin ilk tarama testi olarak kullanılmasının yararlı olacağı sonucuna varılmış ve multipleks nested PZR yönteminin cins ve tür tayininde yararlı olduğu belirlenmiştir. 
Ülkemizde Microsporidia ile ilgili az sayıda çalışma bulunmaktadır. Yapılan çalışmalarda mikroskobik yöntemler kullanılmıştır. Bu çalışma ülkemizde multipleks nested PZR ile microsporidia tanısı tür tayininin yapıldığı ilk çalışmadır. Tedavi seçeneklerinin belirlenmesi ve Microsporidia epidemiyolojisi açısından türlerinin tespiti için moleküler yöntemlerin yaygınlaşması gerekmektedir.

Anahtar sözcükler: Microsporidia, kemilüminesans boya, multipleks nested PZR

Abstract:
Microsporidia, imperative intracellular parasite, was first defined by Nageli in 1857. In microsporidia phylum; there are 170 genuses and 1.400 species. There is a wide range of host scope such as insects, fishes and mammals. It is shown that it can infect both animals and humans and it can be symptomatically and asymptomatically found in humans. There are 8 genuses which infect humans. These genuses are; Anncaliia ( Brachhiola Nosema), Encephalitozoon, Entrocytozoon, Microsporidium, Nosema, Pleistophora, Trachipleistophora and Vittaforma. In the studies, the research group is individuals who are HIV positive, immune suppressive, homosexuals; people who travel and healthy individuals. The species that develop infection in humans are Encephalitozoon intestinalis and Enterocytozoon bieneusi.
In the study, it was aimed to identify Microporidia frequency and type it as molecular by means of Uvitex 2B and Calcofluor, two different chemiluminescence strain.
In this study; 200 patients? diarrhea stool samples, sent to Gazi University Medical Faculty Hospital Microbiology Laboratory and Ankara Numune Education and Research Hospital Microbiology Laboratory between the years 2011-2012, were studied. Stool samples were strained by means of Uvitex 2B and Calcofluor methods which are chemiluminescence strain and microsporidia frequency was confirmed as %38.5 (77/200).
It was understood that in terms of Microsporidia characterization, there is a statistically perfect compatibility between Uvitex 2B and Calcofluor which are chemiluminescence strain. (Kappa=0,881)
With regard to Microsporidia spore?s quantitative concentration( low, high) and spore brightness (colourless, bright) on microscope field, Uvitex 2B and Calcofluor compatibilities were statistically pointed out. While there is a medium level compatibility between tow dyes in terms of quantitative concentration (Kappa=0,354), there is no compatibility in spore brightness (Kappa=0,001).
In the study; it was determined that microsporidia frequency has no meaningful difference with regard to the age groups and clinics (p > 0,05). It was confirmed that microsporidia frequency is %50 for women and %30,8 for men (p < 0,05).
In our study; 77  samples, confirmed as positive by means of Uvitex 2B and Calcofluor, were applied to multiplex nested PCR and they were classified as E.bieneusi and Encephalitozoon spp. in order to distinguish genuses in the first stage and it was confirmed as 7(%91) E.bieneusi and 70(%90,9)  Encephalitozoon spp. When microporidia genuses are considered, there is no statistically meaningful difference in Micropodia with regard to age, gender, clinics (p >0,05).
To distinguish species, 70 Encephalitozoon spp. genus, confirmed in our study, were typed as E. intestinalis, E.cuniculi and E. hellem by means of second stage multiplex nested PCR. According to this, it was confirmed that there are 44 (62,9) E. intestinalis, 22 (%31,4) E. cuniculi, 4(%5,7) E. hellem in 70 Encephalitozoon spp. . Encephalitozoon species statistically has no meaningful microsporidia frequency difference with regard to age, gender and clinic.
It was resulted that Uvitex 2B and Calcofluor straining methods,  chemiluminescence strains, are beneficial to be used as first scanning test and it was concluded that multiplex nested PCR method is beneficial for genus and species characterization.
There are few studies addressing to Microsporidia in our country. Microscopic methods were used in the studies. This is the first study that microsporidia diagnose and species characterization have ever been done. It is required that molecular method applications must become widespread to determine treatment options and to epidemiologically determine Microsporidia species.

Key Words: Microsporidia, chemiluminescence strain, multiplex nested PCR