Tomato brown rugose fruit virus  (ToBRFV) İzolatlarının Moleküler Karakterizasyonu ve Bazı Domates Savunma Genlerinin Virüs Enfeksiyonuna Karşı Tepkilerinin Belirlenmesi
Molecular Characterization of tomato brown rugose fruit virus Isolates and Expression Analysis of Some Tomato Defense Genes against Virus Infection
Yazar: GÖZDE ERKIŞ GÜNGÖR
Danışman: PROF. DR. BAYRAM ÇEVİK
Isparta Uygulamalı Bilimler Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) 2019 yılından bu yana ülkemizde bulunan ve önemli ekonomik kayıplara neden olan bir virüstür. Tezin ilk aşamasında ülkemizin en önemli domates üretim bölgesi Antalya'da ToBRFV'nin tespiti yapılarak elde edilen izolatların moleküler karakterizasyonları yapılmıştır. Bu amaçla Antalya ilinde önemli domates üretim bölgelerinden 172 örnek toplanmış ve real-time RT-PCR yöntemleriyle virüsün varlığı ve yaygınlığı tespit edilmiştir. İzolatlardan 10 tanesi seçilerek kılıf protein (CP) geni RT-PCR ile çoğaltılarak klonlanmıştır. Klonlanan CP genlerinin dizilimi belirlenerek nükleotid ve amino asit dizileri birbirleriyle ve uluslararası izolatlarla karşılaştırılıp ToBRFV izolatları arasındaki genetik çeşitlilik ve filogenetik ilişkiler belirlenmiştir. Bu izolatlardan biri seçilerek tüm genomu 6 parça şeklinde çoğaltılıp klonlandıktan sonra tüm genomu dizilenerek analiz edilmiştir. Tezin ikinci aşamasında ToBRFV enfeksiyonu sırasında domates savunma genlerinin ekspresyon analizleri yapılarak ToBRFV-domates etkileşimleri moleküler düzeyde araştırılmıştır. Öncelikle beş tane Tm-2² geni içeren Torry ve içermeyen Ofri domates çeşidinin fidelerine ToBRFV enfekte edilmiş ve beş tanesi ise virüs içermeyen yalancı inokülasyon yapılarak kontrol olarak kullanılmıştır. Bu bitkilerden enfeksiyondan 1, 7, 14 ve 21 gün sonra yaprak örnekleri alınmıştır. Seçilen 12 domates savunma geninin ekspresyonu enfekteli ve kontrol bitkilerinde analiz edilerek ToBRFV enfeksiyonu sırasında uyarılan ve/veya baskılanan savunma genleri belirlenmiştir. Analizler sonucunda ROS eliminasyonunda görev alan CAT ve POX genleri, patogenezle ilgili PR5 ve PR6 genleri ile salisilik asitle uyarılan NPR1 geni ve jasmonik asit ile uyarılan JAZ geninin ve ARF8 ve SCL genlerinin ekspresyonlarının uyarıldığı belirlenmiştir. ToBRFV enfeksiyonu sırasında savunma genlerinin ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyon faktörlerini kodlayan ve gen susturmada görev alan AGO1 geninin ekspresyonu önemli ölçüde artmıştır.

Abstract:
Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) is a virus that causes very significant economic losses in tomato cultivation and this virus has been in our country since 2019. In the first stage of the study, ToBRFV was determined in Antalya, where the most important greenhouse tomato production region in the country, and the molecular characterization of the obtained isolates was performed. In this regard, a total of 172 samples were collected from major tomato production areas in province of Antalya and the presence and spread of the virus were determined by real-time RT- PCR methods. From the isolates obtained, 10 were selected and the coat protein (CP) gene was amplified by RT-PCR method and cloned. The sequencing of the cloned CP genes was determined, and the nucleotide and amino acid sequences were compared with each other and with international isolates to determine the genetic diversity and phylogenetic relationships among ToBRFV isolates. One of these isolates was selected and its whole genome was amplified in 6 pieces, cloned and then sequenced and analyzed. In the second phase of the project, the expression of tomato defense genes during ToBRFV infection was analyzed and ToBRFV-tomato interactions were investigated at the molecular level. For this purpose, five Torry tomato seedlings containing the Tm-2² gene and Ofri tomato seedlings without the gene were infected with ToBRFV and others five were used with a virus-free mock inoculation as a control. RNA isolation was performed with Trizol solution from the leaf samples were taken from these plants at 1, 7, 14 and 21 days post inoculation. The expression of 12 selected tomato defense genes was analyzed to determine the genes  induced and/or repressed  in response to ToBRFV infection. As a result of analyses, the expression of CAT and POX, which are genes involved in elimination of  ROS and, pathogenesis related PR5 and PR6  genes and salicylic acid induced NPR1 gene,  and jasmonic acid induced JAZ gene,  as well as ARF8 and SCL genes encoding transcription factors that regulate the expression of defense genes, and the AGO1 gene, which is involved in gene silencing, increased significantly during ToBRFV infection. The results indicated that ToBRFV infection has an impact on different pathways of the general defense mechanism of tomato.