Kocaeli ilinden toplanan bazı tıbbi bitkilerde polifenol oksidaz enziminin taranması ve biyokimyasal karakterizasyonu
Screening and biochemical characterization of polyphenol oxidase enzyme in some medical plants collected from Kocaeli
Yazar: BÜŞRA KAHVECİ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ YONCA YÜZÜGÜLLÜ KARAKUŞ
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Polifenol oksidaz = Polyphenol oxidase ; Rosmarinus officinalis = Rosmarinus officinalis ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Ülkemiz yenilenebilir enerji kaynakları açısından büyük bir potansiyele sahip olmasına karşın, bu kaynakların endüstriyel kullanımdaki payı oldukça düşük gözükmektedir. Bu çalışmada fenolik madde içeriği açısından zengin olan mantara alternatif olarak kullanılabilecek ekonomik bir bitkisel polifenol oksidaz kaynağının/kaynaklarının bulunması ve enzimin olası uygulama alanlarının bulunması için karakterizasyonu hedeflenmiştir. Bu hedefle, Kocaeli ili yerel pazarlarda ve aktarlarda yaygın olarak satılan ve tıbbi özelliğe sahip bazı bitki (biberiye (Rosmarinus officinalis), Trabzon hurması (Diospyros kaki), incir (Ficus carica), töngel (Mespilus germanica), böğürtlen (Rubus canescens), koyunkıran (Hypericum calycinum), dağ çileği (Fragaria vesca), ebegümeci (Malva sylvestris), adaçayı (Salvia forskahlei) ve kıvırcık nane (Mentha spicata) yaprakları polifenol oksidaz aktiviteleri açısından taranmıştır. Çalışılan bitki örnekleri arasından sadece biberiye yapraklarının katekol substratı ile mantarla karşılaştırılabilecek düzeyde yüksek polifenol oksidaz aktivitesine sahip olduğu saptanmıştır. Daha sonra biberiyeden enzim Üçlü-Faz Ayırma (TPP, Three Phase Partitioning) sistemi ile ilk defa bu çalışmada saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Buna göre, %50 (w/w) (NH4)2SO4, 1:1 oranında enzim/t-bütanol içeren pH 6,5'da (25˚C) hazırlanmış sistemden polifenol oksidaz enzimi orta fazda toplanmış ve yaklaşık %59 geri kazanım ile 15 kat saflaştırılmıştır. Enzim molekül ağırlığı SDS-PAGE ile yaklaşık 53 kDa olarak, optimum pH ve sıcaklık değerleri ise sırasıyla 7,0 ve 40°C olarak belirlenmiştir. Substrat spesifite sonuçları enzimin katekol oksidaz özelliği gösterdiğine işaret etmektedir. Enzim dayanıklılığının sıcaklığa bağlı olarak azaldığı gözlenirken pH 6,0-9,0 arasında aktivitesinin yaklaşık %80 ila %99'unun korunduğu gözlenmiştir. Ayrıca, enzimin Dimetilsülfoksitten (DMSO) olumsuz yönde etkilenmediği görülürken test edilen çözücülere karşı ilgisi DMSO > Metanol > Aseton > Etanol şeklinde bulunmuştur. Sonuç olarak biberiye yapraklarının polifenol oksidaz kaynağı olarak kullanılabileceği ön görülmekte ve bu bitkiden tek adımda gerçekleştirilen ekstraksiyon metodunun basit, güvenilir, ekonomik ve etkili bir metot olarak enzim preparatı hazırlamada kullanımı önerilmektedir.

Abstract:
Although our country has abundant renewable energy sources, the ratio of industrial usage of these sources is surprisingly quite low. In this study, it was aimed to determine an alternative source(s) to mushroom, which has been known as potential phenol source, for poliphenol oxidase production and characterize the enzyme for investigation of its possible application areas. Towards this aim, the some medicinal plant leaves (rosemary (Rosmarinus officinalis), kaki persimmon (Diospyros kaki), fig (Ficus carica), medlar (Mespilus germanica), blackberry (Rubus canescens), Rose-of-Sharon (Hypericum calycinum), wild strawberry (Fragaria vesca), common mallow (Malva sylvestris), garden sage (Salvia forskahlei) ve spearmint (Mentha spicata) which are widely used in local markets and herb shops in Kocaeli were screened in terms of their poliphenol oxidase activities. Among them, the rosemary leaves have been found to possess the highest poliphenol oxidase activity against catechol among the other plants tested and mushroom (known as a rich source of phenol oxidases). Then, the enzyme has been purified by Three-Phase Partitioning (TPP) from the rosemary leaves and characterized for the first time. Accordingly, the polyphenol oxidase enzyme has been partitioned to the interphase in the system prepared at pH 6.5 (25°C) by addition of t-butanol with the ratio of 1:1 (v/v) to the mixture containing crude extract saturated with 50% (w/w) (NH4)2SO4. Under these conditions, the enzyme has been 15-fold purified with a 59% activity recovery. The molecular weight of the enzyme has been determined as 53 kDa by SDS-PAGE. The optimum pH and tepmerature values have been estimated as 7.0 and 40°C, respectively. Enzyme stability has been observed to decrease with respect to temperature, while 80-99% of its initial activity has been remained at a pH range from 6.0 to 9.0. In addition, while the enzyme has not been adversely affected by Dimethylsulfoxide (DMSO), its affinity for the tested solvents has been found in DMSO> Methanol> Acetone> Ethanol. As a result, it has been suggested that the rosemary leaves can be used as a source of polyphenol oxidase and the single-step extraction method tested here provides a simple, reliable, economical and efficient way for enzyme preparation.