Sıçanlarda steroidin indüklediği femur başı osteonekrozu üzerine apelin-13'ün kemoprofilaktik etkisi
Chemoprophylactic effect of apelin-13 on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rats
Yazar: OZANCAN BİÇER
Danışman: PROF. DR. OZAN BEYTEMÜR ; DR. MUSTAFA FATİH DAŞCI
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Bağcılar Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında, sıçanlarda steroidle indüklenen femur başı osteonekroz (FBON) modelinde Apelin-13 tedavisinin antioksidan, anti-apopitotik, osteoblastik, osteoprotektif ve hipolipidemik etkilerinin radyolojik, biyokimyasal, histopatolojik, histomorfometrik ve immunohistokimyasal açıdan değerlendirilmesi hedeflenmektedir.
Gereç ve Yöntem: Toplam 32 adet Sprague-Dawley cinsi genç-erişkin dişi sıçan, randomize olarak dört gruba ayrıldı. Kontrol grubuna dört hafta boyunca intraperitoneal yoldan salin solüsyonu verildi. Apelin-13 grubuna dört hafta boyunca intraperitoneal Apelin-13 (30 µg/kg/gün) uygulandı. AVN ve AVN+Apelin-13 gruplarına FBON modeli oluşturmak için Lipopolisakkarit (LPS) (20 μg/kg) ve Metilprednizolon (MPS) (40 mg/kg) enjeksiyonları yapıldı. AVN+Apelin-13 grubunda FBON indüksiyonu ile birlikte her gün ve günde bir kez intraperitoneal Apelin-13 (30 µg/kg/gün) uygulandı. Tüm sıçanlar dördüncü haftanın sonunda genel anestezi altında intrakardiyak kan alma ve sakrifikasyon işlemine tabi tutuldu, sağ femurları cerrahi olarak çıkartıldı. Alınan serumlar ELISA yöntemi ile biyokimyasal inceleme için kullanıldı. Tüm kemik dokuları mikro-BT görüntülemesi için tarandı ve ardından femur başı dokuları histopatolojik, histomorfometrik ve immünohistokimyasal açıdan incelendi.
Bulgular: FBON modelinde Apelin-13'ün radyolojik etkilerini ölçmek amacıyla femur başında yapılan taramalar sonrasında elde edilen radyolojik görüntülerde BMD, BV/TV, Tb. Th, Tb. N, Tb.Pf ve BS/BV oranları AVN grubunda kontrol grubuna kıyasla düşüş göstermesine rağmen gruplar arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir farka rastlanmadı. Histopatolojik bulgularda ise AVN+AP-13 grubunda, AVN grubuna kıyasla femur başında osteonekrozun ve anomalilerin azaldığı, hayvanların yarısında kemik trabeküllerinin kontrol grubuna benzer şekilde bütün ve düzenli yapısını koruduğu, boşlukların ve aralıkların yok olduğu görüldü. Trabeküllerde osteosit sayısının normale döndüğü, piknotik hücrelerin ve boş lakünlerin sayısının azaldığı tespit edildi. İmmünohistokimyassal bulgularda ise BMP7 immünoreaktivitesi incelendiğinde AVN grubunun adipositlerinde, kemik iliğinde ve trabeküllerinde BMP7 düzeylerinin kontrol grubuna kıyasla anlamlı derecede düştüğü ve buna karşın AVN+AP-13 grubunda, AP-13 grubuna kıyasla anlamlı düzeyde arttığı belirlendi (sırasıyla P =0,0009, 0,004 ve 0,036). Proapoptotik protein olan caspase-3 immunoreaktiviteleri incelendiğinde adipositlerde gruplar arasında istatistiksel açıdan farka rastlanmadı fakat AVN grubunun kemik iliği ve trabeküllerinde caspase-3 düzeylerinin kontrol grubuna kıyasla anlamlı düzeyde arttığı tespit edildi (P <0,05). AVN+AP-13 grubunda ise bu düzeylerin kontrol seviyelerine gerilediği belirlendi. AP-13 grubunda da caspase-3 düzeyleri kontrol grubuna benzerlik gösterdi (P <0,05).
FBON modelinde femur başı dokusunda endotel hücrelerinin primer regülatörü olan anjiyogenik faktör VEGF immunoreaktiviteleri incelendi . AVN grubunda endotellerde VEGF düzeyi ortalamalarının anlamlı derecede düştüğü ancak AVN+AP-13 grubunda VEGF düzeyi ortalamalarının anlamlı derecede arttığı tespit edildi (P = 0,046). AVN grubunda serum MDA düzeylerinin diğer gruplara kıyasla anlamlı derecede arttığı (P<0,05) fakat AP-13 uygulanan AVN grubunda düştüğü tespit edildi (P=0,0002). AVN grubunda serum LDL ve TG düzeylerinin kontrol grubuna kıyasla anlamlı düzeyde arttığı ancak AVN-AP-13 grubunun düzeylerinin kontrol grubu düzeylerine yaklaştığı tespit edildi (P=0,0143 ve 0,0394). 
Sonuç: Tüm verilerimiz, sıçanlarda oluşturulan FBON modelinde lipopolisakkarit ve steroid kaynaklı DNA oksidatif ve lipit peroksidatif hasarın bir sonucu olarak ortaya çıkan kemik, vasküler ve hematopoetik hücre hasarlarının Apelin-13 uygulanmasıyla başarılı bir şekilde azaltılabileceğini göstermektedir. Bu antioksidan ve apopitoz önleyici etki, erken evre osteonekroz için umut verici bir tedavi olabilir.

Abstract:
Aim: In this thesis study, the evaluation of Apelin-13 treatment's antioxidant, anti-apoptotic, osteoblastic, osteoprotective, and hypolipidemic effects in the steroid-induced femoral head osteonecrosis (ONFH) model in rats is aimed to be conducted radiologically, biochemically, histopathologically, histomorphometrically, and immunohistochemically.
Materials and Methods: A total of 32 young-adult female Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups. The control group received intraperitoneal saline solution for four weeks. The Apelin-13 group was treated with intraperitoneal Apelin-13 (30 µg/kg/day) for four weeks. The AVN and AVN+Apelin-13 groups were induced with Lipopolysaccharide (LPS) (20 μg/kg) and Methylprednisolone (MPS) (40 mg/kg) injections to create the femoral head osteonecrosis (ONFH) model. In the AVN+Apelin-13 group, intraperitoneal Apelin-13 (30 µg/kg/day) was administered once daily along with ONFH induction. At the end of the fourth week, all rats underwent general anesthesia for intracardiac blood collection and sacrifice, and their right femurs were surgically removed. The collected sera were used for biochemical analysis using the ELISA method. All bone tissues were scanned for micro-CT imaging, followed by histopathological, histomorphometric, and immunohistochemical examination of the femoral head tissues.
Results: In the ONFH model, following scans conducted on the femoral head to measure the radiological effects of Apelin-13, although the BMD, BV/TV, Tb. Th, Tb. N, Tb. Pf, and BS/BV ratios showed a decrease in the AVN group compared to the control group, no statistically significant difference was found between the groups. However, histopathological findings revealed that in the AVN+AP-13 group, compared to the AVN group, there was a reduction in osteonecrosis and anomalies in the femoral head, with trabeculae in half of the animals maintaining a structure similar to the control group, devoid of voids and gaps. It was observed that osteocyte counts returned to normal in the trabeculae, and the number of pyknotic cells and empty lacunae decreased. Immunohistochemical findings indicated that when BMP7 immunoreactivity was examined, the levels of BMP7 in adipocytes, bone marrow, and trabeculae were significantly decreased in the AVN group compared to the control group, whereas in the AVN+AP-13 group, it was significantly increased compared to the AP-13 group (P=0.0009, 0.004, and 0.036, respectively). When the immunoreactivities of the proapoptotic protein caspase-3 were examined, no statistically significant difference was found between the groups in adipocytes, but it was found that the levels of caspase-3 in the bone marrow and trabeculae of the AVN group were significantly increased compared to the control group (P<0.05). In the AVN+AP-13 group, however, these levels were found to regress to control levels, while in the AP-13 group, caspase-3 levels were similar to those of the control group (P<0.05).
In the ONFH model, the immunoreactivities of the angiogenic factor VEGF, the primary regulator of endothelial cells in femoral head tissue, were examined. It was found that in the AVN group, the mean levels of VEGF in endothelial cells decreased significantly, but in the AVN+AP-13 group, the mean levels of VEGF increased significantly (P=0.046). Serum MDA levels were found to be significantly increased in the AVN group compared to other groups (P<0.05), but it was observed that they decreased in the AVN group treated with AP-13 (P=0.0002). Serum LDL and TG levels were found to be significantly increased in the AVN group compared to the control group, but the levels in the AVN-AP-13 group approached those of the control group (P=0.0143 and 0.0394).
Conclusion: All our data demonstrate that vascular and hematopoietic cell damage resulting from oxidative DNA and lipid peroxidative damage induced by lipopolysaccharide and steroid in the ONFH model created in rats can be successfully reduced by the administration of Apelin-13. This antioxidant and anti-apoptotic effect could be a promising treatment for early-stage osteonecrosis.