Normal ve yüksek glukoz ile indüklenmiş diyabetik retinal pigment epitel (ARPE-19) hücrelerinde gemsitabin ve 5-FU kombinasyonunun oksidatif stres ve mitokondriyal apoptoz yolağı üzerine etkisi
The effect of gemcitabine and 5-fu combination on oxidative stress and mitochondrial apoptosis pathway in normal and high glucose-induced diabetic retinal pigment epithelium (ARPE-19) cells
Yazar: ESMA SEBEN OK
Danışman: PROF. DR. ZEYNEP BANU DOĞANLAR
Trakya Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Diabetik retinopati = Diabetic retinopathy ; Flüorourasil = Fluorouracil ; Gemsitabin = Gemcitabine ; Retinal pigment epiteli = Retinal pigment epithelium

Özet:
Diyabetik retinopati, erişkinlerde diyabetin önemli bir komplikasyonu olarak görme kaybının önde gelen nedenidir. Retina, kan-retina bariyeri olarak görme fonksiyonunun devamlılığını sağlamaktadır. Diyabetik hastalarda, retinanın uzun süre hiperglisemik ortama maruziyeti retinaya hasar vermektedir. Retina pigment epitel hücrelerinde meydana gelen hasar hücre kaybına, retinal dejenerasyona ve körlüğe neden olabilmektedir. 
	5-Florourasil+Gemsitabin kombinasyon tedavisi baş, boyun, meme gibi çeşitli kanser türlerinin tedavisinde kullanılmaktadır. 5-Florourasil, DNA ve RNA'ya, Gemsitabin ise DNA zincirine dahil olarak makromoleküllerin fonksiyonlarını bozmaktadır. Böylelikle 5-Florourasil+Gemsitabin, DNA zincirinin sentezlenmesine ve uzamasına hasar vermektedir. Çeşitli kanser türlerinde kullanılan 5-Florourasil+Gemsitabin kombine tedavisinin retinal pigment epitel hücrelerinde önemli hücresel sinyal yolaklarına etkisi belirlenmemiştir. 
	Bu çalışmada, 5-Florourasil ve Gemsitabin kombinasyonunun normal ve diyabetik insan retinal pigment epitel (ARPE-19) hücrelerinde hücre canlılığı, yara iyileşmesi, DNA hasarı, oksidatif stres ve apoptoz üzerindeki etkilerinin belirlenmesi ve normal ve diyabetik hücrelerin kemoterapi ilaçlarına verdikleri hücresel ve moleküler tepkilerin karşılaştırılması amaçlandı. 
5-Florourasil ve Gemsitabin kombinasyonunun normal ve diyabetik ARPE-19 hücrelerindeki hücre canlılığına olan etkileri MTT ve Tali görüntü temelli sitometre ile, genomik kalıp kararlılığına olan etkileri rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA analizi ile belirlendi. Ayrıca DNA hasar yanıtı EXO1 ve NEIL genlerinin ifadesi ile, oksidatif stres tepkisi reaktif oksijen türlerinin CM-H2-DCFDA moleküler floresan boyaması ve antioksidan enzimlerin gen ifadeleri ile, hücresel apoptoz yolağındaki gen/protein ifadeleri ve floresan mikroskobik boyama ile belirlendi.  
	Çalışma sonuçlarına göre, 5-Florourasil+Gemsitabin uygulamasının diyabetik hücrelerde IC50 değerinin daha düşük konsantrasyonda olduğu belirlendi. Kombine kemoterapi uygulamasının diyabetik hücrelerde yüksek DNA hasarı ile genomik kalıp kararlılığının daha düşük olmasına ve DNA tamir genlerinin daha yüksek ifade olmasına neden olduğu saptandı. Buna ilaveten hem normal hem diyabetik hücrelerde artan reaktif oksijen türlerinin düzeyi ile oksidatif stres meydana geldiği ve diyabetik hücrelerde antioksidan enzimlerin gen ifadelerinde daha belirgin artış olduğu belirlendi. Kemoterapi toksisitesinin hücrelerde içsel ve dışsal apoptoz yolağını aktive ettiği ve diyabetik hücrelerde apoptozun daha yüksek olduğu saptandı. 
	Retinal pigment epitel hücrelerinin görme için birçok vital ve koruyucu rolü vardır. Bu nedenle bu hücrelerde uzun süreli hiperglisemik ortam ve kemoterapi sitotoksisitesi sonucu meydana gelen hasar görme bozukluklarına neden olabilmektedir. Çalışmamızda 5-Florourasil ve Gemsitabin uygulamasının hem hücresel hem de moleküler düzeyde sitotoksik ve genotoksik etkilerinin diyabetik hücrelerde daha belirgin olması nedeni ile diyabetik hastalarda bu yan etkilerin göz önünde bulundurulması gerektiği düşünüldü.

Abstract:
Diabetic retinopathy is a leading cause of vision loss in adults as a major complication of diabetes. The retina provides the continuity of visual function as a blood-retinal barrier. In diabetic patients, prolonged exposure to hyperglycemic environment damages to the retina. Damage to retinal pigment epithelial cells can cause cell loss, retinal degeneration and blindness. 
5-Fluorouracil+Gemcitabine combination therapy is used in the treatment of various types of cancer such as head, neck and breast. 5-Fluorouracil is incorporated into DNA and RNA, and Gemcitabine also, incorporated into the DNA and damage functions of macromolecules. Thus, 5-Fluorouracil+Gemcitabine damages the synthesis and elongation of the DNA chain. The effect of 5-Fluorouracil+Gemcitabine combine therapy, used in various cancer types, on important cellular signaling pathways in retinal pigment epithelial cells has not been determined.
In this study, we aimed to determine the effects of 5-Fluorouracil and Gemcitabine combination on cell viability, wound healing, DNA damage, oxidative stress and apoptosis in normal and diabetic human retinal pigment epithelium (ARPE-19) cells, and compare the cellular and molecular responses of normal and diabetic cells to chemotherapy drugs. 
The effects of 5-Fluorouracil and Gemcitabine combination on cell viability in normal and diabetic ARPE-19 cells were determined by MTT and Tali image-based cytometers, and the effects on genomic template stability by random amplified polymorphic DNA analysis. In addition, DNA damage response was determined by expression of EXO1 and NEIL genes, oxidative stress response by CM-H2-DCFDA molecular fluorescent staining of reactive oxygen species and gene expression of antioxidant enzymes, gene/protein expressions in the cellular apoptosis pathway and fluorescence microscopic staining.
According to the results of the study, it was determined that diabetic cells had a lower IC50 value response to 5-Fluorouracil+Gemcitabine treatment. It was determined that combined chemotherapy administration caused higher DNA damage, lower genomic template stability and higher expression of DNA repair genes in diabetic cells. In addition, it was determined that oxidative stress through the increased reactive oxygen species in both normal and diabetic cells and higher increase in the gene expression of antioxidant enzymes in diabetic cells. It was determined that chemotherapy toxicity activates the intrinsic and extrinsic apoptosis pathway in cells and apoptosis was higher in diabetic cells.
Retinal pigment epithelial cells have many vital and protective roles for vision. Therefore, damage to these cells as a result of long-term hyperglycemic environment and chemotherapy cytotoxicity can cause vision disturbances. In our study, due to the cytotoxic and genotoxic effects of 5-Fluorouracil and Gemcitabine at both cellular and molecular levels were more pronounced on diabetic cells, it was thought that these side effects should be considered in diabetic patients.