Biyotiyol sensör uygulamaları hedefli çalışmalar olarak: Boranil bileşikleri sentezi
Bio-thiol sensor applications: Synthesis of Boranil compounds
Yazar: SİBEL KAYA
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE ÖZDEMİR
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Biyolojik sıvılardaki tiyol konsantrasyonunun pek çok hastalıkla ilişkilendirildiği bilinmektedir. Bunlardan başlıcaları: karaciğer hasarı, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları, kardiyovasküler hastalıklardır.  Bu yüzden bu tiyollerin potansiyel biyolojik etkileri düşünüldüğünde günümüzde biyolojik ve farmakolojik olarak vücut sıvısındaki tayinleri bir hayli önem taşımaktadır. İlgili tiyol bileşiklerinin tanınmaları ve ölçümleri ile ilgili çalışmalarda yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ve kapiler elektroforez (CE) en sık rastlanılan teknikler olmuşlardır. Ancak son yıllarda hücre-içi tiyollerin görüntülenebilmelerine olanak sağlayan sensör geliştirme konusu üzerinde çok yoğunlaşılmıştır. 
Biyotiyollerin insan vücudundaki konsantrasyonunun hesaplanması bu hastalıkların önlenmesi ve erken teşhisine olanak sağlayacaktır. Bunun sonucu olarak, biyo-tiyollerin belirlenmesi ilgili hastalıkların teşhisine büyük katkıda bulunacaktır.
Bir araştırma konusu olarak, optik analiz yöntemlerin in vivo çalışmalarda kolay uygulanabilirliği, hassasiyeti ve bulunabilirliği nedeniyle artan önemi ve yeri vardır. Zira özellikle yakın-infrared bölgesi (NIR) emisyonuna sahip olacak sulu ortamda çözünebilecek sensörlerin sentezinin, biyolojik sistemlerde biyotiyoller üzerine çalışan araştırmacıların özellikle in vivo çalışmalarına önemli şekilde ışık tutacağına inancımız yüksektir.
Hedef çalışma basamakları ilk olarak imin sentezi; pH 3-4'teki salisilaldehit ve 2,4-dihidroksibenzaldehitin anilin, hidrazin, p-aminofenol ve p-metoksianilin ile reaksiyonundan çeşitli imin türevleri elde edildi. Takiben boranil bileşiği sentezi; boranil bileşiklerini elde etmek için imin bileşiğinin bazik ortamda boron triflorür dietil eter (BF3OEt2) ile reaksiyonu gerçekleştirildi. Bazik ortamı sağlamak için trietil amin (NEt3) kullanıldı. Reaksiyonlar 80-90° C arasında yapıldı. Ardından bu boranil bileşiğinin biyotiyol algılayıcı bileşik hedefine yönelik olarak uygun fonksiyonel grup ile türevlendirildi. Sözü edilen biyotiyoller ile reaksiyonları gerçekleştirildi. Çözeltiler spektrofotometrik ölçümleri yapılmış ve diğer bazı aminoasit çözeltileri ile karşılaştırılmıştır. Her sentez basamağı yapı aydınlatması çalışmaları NMR, IR, MS ölçümleri gibi teknikler ile yapılmıştır.
İmin reaksiyonlarının verimleri yüksek olup, verimlerin ayrıca türevlerdeki fonksiyonel gruba da bağlı olarak değiştiği görülmüştür. İmin türevleri katı olarak elde edilmiştir. Ürünün kristal yapıya yakın olması saflaştırma aşamalarının daha kolay ve kısa sürmesini sağlamıştır.
Boranil bileşiklerinin verimleri daha düşüktür. Özellikle fonksiyonel grupların elektron çekici olarak seçildiği reaksiyonlarda verim oldukça düşmektedir.
Sentezlenen tüm bileşiklerin karakterizasyon çalışmalarında 1H-NMR ve 13C-NMR kullanılmıştır. İmin bileşiklerin de ayrıca kütle spektrumdan da yararlanılmıştır.
Boranil bileşiklerinin sensör seçiciliğine uygun fonksiyonel grup olarak iki türev seçilmiştir. İlk türev olarak, aldehitler ile halkalaşma mekanizması için aldehit fonksiyonu, ikinci türev olarak ise, sülfonat ve/veya sülfonamit ayrılma mekanizması için hidroksil fonksiyonu boranil iskeletine katılmıştır.
Optimize edilmiş koşullar altında fonksiyonlandırılmış boranil bileşiğinin (DMSO'da) UV-Vis ölçümleri yapılmış ve maksimum absorbans yaptıkları dalga boyu belirlenmiştir. Daha sonra değişen sistein miktarına göre UV titrasyonları yapılmıştır.
Sisteine olan seçiciliğini tespit edebilmek için farklı aminoasitler ile karşılaştırmaları UV-Vis ölçümleri ile yapılmıştır. Seçiciliğin en yüksek değeri beklenildiği üzere sistein çözeltisinde olmuştur.

Abstract:
Thiol concentration in biological fluids is known to be related with many diseases. Majority of these are liver damage, Alzheimer's and Parkinson's disease, cardiovascular diseases. Therefore,  their biological and pharmacological determination in body fluid appears to have great importance considering the potential biological effects of these thiols nowadays. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) and capillary electrophoresis (CE) were the most common techniques in the studies used to identification and measurement of thiol compounds. However, sensitive and selective detection of these bio-thiols has received growing attention in recent years.
The amount of GSH, Hcy and Cys in blood plasma is an important factor in the diagnosis of most diseases. Although only in small quantities, Cys is a naturally occuring sulphur containing amino acid. Like most thiols (sulfhydryl groups), cysteine undergoes a variety of redox reactions. The cysteine thiol group is also nucleophilic and thus can undergo addition and substitution reactions. 
Cys appears to have particular importance because it is the basic amino acid frequently used in the synthesis of other amino acids and has importance in protein folding. On the other hand, it is known that its excess amount in plasma level causes neurological toxicity. Mediclinical studies show that, abnormal blood level of Cys is linked to Alzheimer's and Parkinson's diseases.
Homocysteine is a sulfur-containing amino acid. It is synthesized from methionine by the removal of its terminal methyl group. Epidemiological studies indicate that high total homocysteine concentration in the blood is a risk factor for the formation of cardiovascular diseases. 
Hyperhomocysteinemia has also been associated with increased risk of Alzheimer's disease, complications during pregnancy, inflammatory bowel disease and osteoporosis. The synthesis of Hcy takes place in the folic acid mechanism, which is important in DNA synthesis, and the decrease in its amount directly affects this process.
Glutathione is a tripeptide antioxidant made up of three amino acids; cysteine, glycine and glutamate. GSH plays an important role in the removal of many reactive species and also participates in the regulation of the cell cycle. GSH is also an important antioxidant in the immune system and inhibits oxygen or oxygen radicals, which is caused by oxidants in the body. In the studies it has been reported that excess amount of GSH may be associated with diseases that cause immune system deficiency, such as AIDS and autoimmune diseases.
The analysis of bio-thiols concentration in the human body will allow the prevention and early detection of these diseases. As a result, the identification of biothiols will greatly contribute to the diagnosis of related diseases. 
Today the common procedure of both qualitative and quantitative detection in Mediclinic studies based on chromatographic methods such as, HPLC analysis which requires time, investment and depends highly on experience. Thus as a research topic, optical analysis methods have increased importance due to the easy applicability, sensitivity, and availability in vivo studies. 
We believe that the synthesis of the sensors that will dissolve in the aqueous environment, which will have an especially near-infrared region (NIR) emission, in biological systems, it will provide guidance to researchers working on biothiols.
The target study steps are followed by the synthesis of the imine, the synthesis of the boranil compound and its derivatization with the appropriate functional group for the bio-thiols sensing. Synthesized compounds were characterized by techniques such as NMR, infrared and mass spectrometer.
In this thesis, imine derivatives were obtained from the reaction of salicylaldehyde and 2,4-dihydroxybenzaldehyde in pH 3-4 with aniline, hydrazine, p-aminophenol, and p-methoxyaniline. Imines are obtained as solid with high yields, which makes the purification steps easier and shorter.
The reaction of the imine compound with boron trifluoride diethylether (BF3OEt2) in basic medium was performed to obtain the boranil compounds. Triethyl amine (NEt3) was used to provide the basicity of the medium. The reactions were carried out between 80-90° C. Yields of the boranil compounds are lower than the imine's. The yields were particularly low in the reactions where functional groups were selected as electron acceptors. Addition to that, required column chromatography decreases overall yields of the related reactions. 
1H-NMR, 13C-NMR and mass spectroscopy are used in the characterization studies of all synthesized compounds. 
Two functional group were chosen to derivatized boranil compounds for the detection of bio-thiols. As the first derivative, the aldehyde function for the formation of thiazolidine or thiazine, and the second derivative, the hydroxyl function for the sulfonate and/or the sulfonamide cleavage mechanism were incorporated into the boranil skeleton.
Formyl function was added to the synthesized chromophore group for the thiazolidine or thiazine ring closure which was selected as the biothiols sensor mechanism. One of the methods used for this purpose, is the addition of formyl group to the aromatic ring with Vilsmaer - Haack reaction. In this way, the synthesized chromophore is formylated to form a thiazolidine or thiazine ring by formylating the β - position. 
Other method used is the addition of 3, 4-dihydroxybenzaldehyde to the structure with AlCl3 catalyst to form the dioxyboron formyl group. Flourines of boranil compounds were replaced by hydroxyl groups of 3, 4-dihydroxybenzaldehyde and yields with dioxyboron derivate. The structure will be suitable for thiazolidine or thiazine ring closure.
UV-Vis measurements of functionalized boranil compounds (in DMSO) under optimized conditions were taken and the maximum absorbance wavelength was determined (compound (3b) λmax 310 nm, compound (3a) λmax 370 nm). UV titrations were taken only against changing Cys concentrations. It is found to be, chromophore synthesized can bond Cys and selectively detect with limit equal to the 100 equivalents of the chromophore.
In order to determine the sensing selectivity to cysteine, UV-Vis measurements were taken with several different amino acids. The highest value of selectivity was in the cysteine solution as expected.
Sensor was then treated with various amino acid solutions with HEPES buffer in aqueous media. To avoid absorbance change due to dilution, prepared amino acid solution treated with 2 times concentrated sensor solution, before UV-Vis titration. 
Bio-thiols can affect the body in a harmful and beneficial manner, with the reasons and methods listed above. Therefore, detection of bio-thiol compounds at body temperature is important in medical sciences.
We hope that the sensor in this study will be helpful for those working on the determination of cysteine in the biomedical field, especially in living systems.