Quorum sensing in Escherıcıa coli'de antimikrobiyal direncinden sorumlu mutasyonların oluşumundaki rolünün araştırılması
Investigation of the role of quorum sensing in the development of antimicrobial resistance mutations in Eschericia coli
Yazar: ASLINUR GÜLNAZ ÖZTÜRK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. EVREN DORUK ENGİN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bakterilerde antibiyotik direnci hem tıbbi açıdan ciddi bir sorun teşkil etmekte, hem de
biyoteknoloji alanında dikkatleri üzerine çekmektedir. Bakteriler antibiyotiklere antibiyotiğin kimyasal yapısını bozacak enzimler üreterek, hücreye giren antibiyotikleri aktif bölgelere ulaşmadan hücre dışına çıkararak ve stratejik nokta mutasyonları oluşturup antimikrobiyallerin işleyiş mekanizmalarını engelleyerek direnebilmektedir. Günümüzde kullanılan antibiyotikler bakteriyel enfeksiyonların tedavilerinde yeterli olamamakta ve bakterilerin çoklu ilaç direnci geliştirmelerine neden olmaktadır. Bu nedenle bakterilerin antibiyotik direncini sınırlandırabilmek için biyoteknoloji alnında alternatif yöntemler düşünülmektedir. "Quorum sensing", bakteri hücrelerinin hücreye nüfuz edebilen otoindükleyici (Oİ) adlı küçük sinyal molekülleriyle gerçekleştirdikleri iletişim mekanizmasıdır. Bu mekanizmanın bakterilerin popülasyon yoğunluğunu ve çoğalma, biyofilm oluşturma ve çeşitli sekonder metabolitler oluşturma gibi aktivitelerinin düzenlenmesinde rol aldığı bilinmektedir. Bakterilerin antimikrobiyal direnç geliştirmesi, gerekli
mutasyonları geçirebilecek bakterinin kendi metabolik aktivitelerini azaltarak dış dünyayla
alışverişini sınırlayıp antimikrobiyallerin zararlı etkilerinden korunaklı hale gelmesiyle mümkün olmaktadır. Bu tez kapsamında, Escherichia coli'de "quorum sensing" mekanizmasının
antimikrobiyal stresi altındaki bakteride dirençli fenotipe geçişteki etkisi, E. coli suşlarından "quorum sensing" molekülü S-adenozil homosistein (SAH) üretebilen JM109 ve SAH üretemeyen DH5α ΔluxS kullanılarak incelenmiştir. JM109 ve DH5α ΔluxS suşları Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MİK) testi ile artan değerlerde siprofloksasine maruz bırakılıp gyrA ve parC genlerinde nokta mutasyonların oluşumu tetiklenerek incelenmiştir. JM109 suşunun antimikrobiyal stresi altında daha hızlı nokta mutasyonu yapabildiği gözlemi üzerine "quorum sensing" mekanizmasının antimikrobiyal direnci kazanımındaki rolü, otoindükleyici-2 (Oİ-2) ifadelenmesi ve düzenlenmesinden sorumlu luxS'in DH5α ΔluxS suşuna klonlamayla komplementasyon yapılarak bu izogenik mutantın antimikrobiyal stresi altında dirençli fenotipe geçiş davranışı incelenmiştir. Oluşturulan mutant suşların Oİ-2 üretebilme kapasitesi Photobacterium phosphoreum suşundaki biyolüminesansın baz alındığı biyolojik tayin yöntemiyle de gösterilmiştir. luxS komplementasyonu sonucu mutant DH5α'nın kontrol suşlara göre yüksek dozda siprofloksasin maruziyetinde daha fazla koloni oluşturması, "quorum sensing"in bakterilerde antimikrobiyal stres altında persistan fenotipe geçişte önemli rol oynadığını fizyolojik olarak göstermiştir.

Abstract:
Antibiotic resistance in bacteria is a serious problem in medical area that biotechnology is focusing on lately. Bacteria can show resistance against antimicrobials by secreting enzymes that can destroy the chemical structure of the antibiotics, exporting the antibiotics from the cell before they reach the active sites and generating point mutations in certain genes. Antibiotics that are used widely nowadays are found to be inefficient in the treatment of bacterial infections and also causing certain bacteria to develop multi drug resistance. Therefore it is crucial to develop alternative methods in the biotechnology field in order to control the antibiotic resistance in bacteria. Quorum sensing is a communication mechanism in bacteria that is carried out with small diffusible signal molecules. This mechanism that takes advantage of these molecules with low molecular weight is known to regulate many metabolical activities such as bacterial population density, biofilm formation and production of many secondary metabolites. In this thesis, the role of quorum sensing in inducing the persistant phenotype that can develop antimicrobial resistancein Escherichia coli was investigated by using JM109 that can express autoinducer (AI) molecule S-adenosyl homocysteine (SAH) and DH5α DH5α which is defective of luxS gene. JM109 and DH5α DH5α ΔluxS strains were exposed to ciprofloxacin via Minimum Inhibitory Concentration (MIC) test and mutations in gyrA and parC genes were induced. The ability of JM109 strain to develop these mutations quicker than DH5α
DH5α ΔluxS strain JM109 led us to a conclusion that quorum sensing had a regulatory role on the emergence of persistent strains that can develop antibiotic resistance quickly. Therefore, we cloned luxS gene which is responsible of expression and the regulation of AI-2 molecule to DH5α DH5α ΔluxS strain and observed its transition from ordinary phenotype to persistent phenotype that can develop corresponding mutations quickly under antimicrobial pressure by exposing this isogenic mutant to ciprofloxacin antibiotic. Moreover, mutant strains were cultured in Luria Bertaini (LB) medium and their supernatants were investigated to detect the presence of AI molecules by Photobacterium phosphoreum bioluminescence. The ability of the mutant DH5α to produce more colonies under high ciprofloxacin concentration indicates that quorum sensing has an important
regulatory role in E. coli during the transition to persistent phenotype under antimicrobial stress.