Enginar polifenol oksidazının alginat ve karragenan jellerde immobilizasyonu ve bazı biyokimyasal özelliklerinin incelenmesi
The immobilization of polyphenol oxidase from artichoke in alginate and carrageenan gels and investigation of some biochemical properties
Yazar: SELİN KOCATÜRK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. HÜLYA YAĞAR
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Bölümü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada; enginardan (Cynara scolymus) izole edilen polifenol oksidaz (EC.1.14.18.1) alginat, karragenan ve alginat + karragenan jellere immobilize edildi. Elde edilen immobilize enzimlerin optimum pH ve sıcaklık, Km ve Vmax kinetik sabitleri, termal ve operasyonel kararlılık, yeniden kullanılabilirlik ve depo kararlılığı gibi bazı biyokimyasal özellikleri belirlendi ve serbest enziminkiyle karşılaştırıldı.Antalya Gaziosmanpaşa'dan sağlanan taze enginarların baş kısmından polifenol oksidaz enzimi Tris - HCl tamponu (pH 7.0) varlığında izole edildi, sonrasında % 10-90 'lık (NH4)2SO4 çöktürmesi ve dializ uygulandı. Dializ işlemi +4 oC 'de 1 gün boyunca aynı tampona karşı gerçekleştirildi. Elde edilen dializat enzim kaynağı olarak kullanıldı. Enginar polifenol oksidazı alginat, karragenan ve alginat + karragenan jellerde tutuklandı. Damlatma çözeltisi olarak alginat jeller için CuCl2 ve karragenan jeller için KCl kullanıldı. Protein tayinleri Lowry yöntemi uygulanarak gerçekleştirildi. İmmobilizasyon yüzdeleri alginat boncuklar için % 70, alginat + karragenan boncuklar için % 60 ve karragenan boncuklar için % 37 olarak belirlendi. En yüksek kateşolaz aktivitesi alginat jelde gözlenirken (370 U/gr boncuk dak) en yüksek krezolaz aktivitesi ise alginat+karragenan jelde gözlendi (90 U/gr boncuk dak). Cu - alginat boncuklarda enginar polifenol oksidazının immobilizasyon koşullarının optimizasyonunda; optimum alginat konsantrasyonu % 3, CuCl2 konsantrasyonu % 2, optimum yüklenen enzim miktarı 1/5 D, optimum boncuk boyutu 3 mm ve optimum boncuk miktarı 0.1 gr olarak belirlendi.Alginat ve alginat + karragenan jellerde tutuklanan enginar polifenol oksidazı için; kateşolaz aktivitesinde serbest enzim ve immobilize formlar için optimum pH değeri 7.0, krezolaz aktivitesi için ise 4.0 olarak bulundu. Alginatta tutuklanmış enzim için kateşolaz aktivitesinin optimum sıcaklığı 70 ? C, alginat + karragenanda tutuklanmış enzim için 40 ? C, serbest enzim için ise 5 ? C olarak belirlendi. Alginat boncuklardaki immobilize enzimin krezolaz aktivitesi için en iyi sıcaklık 30 oC olarak, alginat + karragenan boncuklar için ise 20 oC, serbest enzim için ise optiumum sıcaklık değeri 50 oC olarak bulundu. İmmobilize enginar polifenol oksidazının varolan termal kararlığını tutuklama sonrasında da büyük oranda koruduğu gözlendi. Serbest enzim ve alginat boncuklarda tutuklanan enzimin krezolaz aktivitesine ait Km ve Vmax kinetik sabitleri sırasıyla, 1.58 x 10-3 mM ile 142.85 U/mLdak ve 1.92 x 10-3 mM ile 99 U/mLdak, alginat + karragenan boncuklarda 5.0 x 10-3 mM ile 111.1 U/mLdak olarak bulundu. Kateşolaz aktivitesinde Km ve Vmax kinetik sabitleri sırasıyla, 2.32 x 10-3 mM ile 1613 U/mLdak ve 6.66 x 10-3 mM ile 1000 U/mLdak, alginat+karragenan boncuklarda 8.0 x 10-3 mM ile 1282 U/mLdak olarak tespit edildi. Yeniden kullanılabilirlik çalışmasında; alginat ve alginat + karragenan boncukların 8 döngü süresince her iki aktivitesinin yaklaşık tamamını koruduğu gözlendi. Depolama kararlılığı çalışmasında serbest enzim aktivitesini yaklaşık 7 - 9 gün korurken immobilize formlar aktivitelerini yaklaşık 30 gün boyunca koruduğu gözlendi.

Abstract:
In this study, polyphenol oxidase (EC.1.14.18.1) isolated from artichoke (Cynara scolymus) was immobilized in alginate, carrageenan and alginate+carrageenan gels. Some properties of obtained immobilized enzymes such as optimum pH and temperature, kinetic parameters (Km and Vmax), thermal and operational stability, reuse and storage stability were determined and compared to these of free enzyme.Polyphenol oxidase was isolated from fresh artichokes heads obtained from Gaziosmanpaşa-Antalya in the presence of Tris - HCl buffer (pH 7.0), then was applied 10 - 90 % (NH4)2SO4 precipitation and dialysis. Dialysis was carried out in the same buffer changing the buffer at 4 ? C throughout one day. The obtained dialysate was used as enzyme source. Artichoke polyphenol oxidase was entrapped in alginate, carrageenan and alginate+carrageenan gels. CuCl2 and KCl were used for alginate and carrageenan gels as dropping solution, respectively. Protein determinations were done by using Lowry method. Immobilizations percentages were determined to be 70 % , 60 % and 37 % for alginate, alginate+carrageenan and carrageenan beads, respectively. The highest catecholase activity was observed in alginate gel (370 U/g bead min) while the highest cresolase activity was in alginate+carrageenan gel (90 U/g bead min). The optimization of immobilization conditions was done for artichoke polyphenol oxidase immobilized Cu-alginate beads. Optimum alginate and CaCl2 concentration were found to be 3 % and 2 % (w/v), respectively. The loading enzyme concentrations are 1/5 D. Optimum bead diameter is 3 mm. Optimum bead? amount was determined to be of 0.1 g.The optimum pHs of free polyphenol oxidase and polyphenol oxidases entrapped in alginate and alginate+carrageenan gels were determined to be 7.0 and 4.0 for catecholase and cresolase activities, respectively. Optimum temperatures for catecholase activity were determined to be 40 ? C, 70 ? C, and 5 ? C for enzyme entrapped alginate beads, alginate+carrageenan beads, and free enzyme, respectively. These values for cresolase activity were 30 oC, 20 oC, and 50 oC, respectively. It was observed that immobilized artichoke polyphenol oxidases greatly preserved their thermal stability which exists anyway. Km and Vmax values for cresolase activity were determined to be 1.58 x 10-3 mM and 142.85 U/mL min for free enzyme, respectively. These values were 1.92 x 10-3 mM and 99 U/g beads min for immobilized enzyme in alginate beads, 5.0 x 10-3 mM and 111.1 U/g beads min for alginate + carrageenan beads. Km values for catecholase activity were 2.32 x 10-3 mM, 6.66x10-3 mM, and 8.0 x 10-3 mM for free enzyme, alginate beads, and alginate + carrageenan beads, respectively. Vmax values were 1613 U/mLmin, 1000 U/g beads min, and 1282 U/g beads min, respectively. In the reusing study, alginate and alginate + carrageenan beads saved about whole activities during 8 cycles for both activities. It was observed in storage stability study that free enzyme saved its activity during 7 - 9 days whereas immobilized forms saved during 30 days.