M13mp18 iskele ipliğinden DNA origami nanodemetlerin geliştirilmesi ve ilaç taşıyıcı olarak  kullanımının incelenmesi
Development of DNA origami nanobundles from m13mp18 scaffold strand and investigation of their use as drug carrier
Yazar: AYKUT BİLİR
Danışman: PROF. DR. NECDET SAĞLAM ; PROF. DR. CELAL ÜLGER
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya = Chemistry ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antikanser = Anticancer ; Nisin = Nisin ; Patojenler = Pathogens ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers

Özet:
Günümüzde nanoteknoloji ve biyomedikal alanınında DNA nanoteknolojisinin konvansiyonel yöntemlerin yerini almakta olduğu ve bu konuda önemli çalışmaların yapıldığı görülmektedir. DNA'nın yapısı gereği  komplementerlik arz eden baz çiftlerinde görülen etkileşim özgüllüğü, genomik çalışmalarda DNA'yı bir üst seviyeye taşımıştır.  DNA origami multidisipliner bir alandır ve bu alanda üstün nanomalzemeler geliştirilmektedir. DNA nanoyapılar, polimer ve lipid bazlı ilaç taşıyıcı ajanlara kıyasla modülerlik, immün cevabı tetiklememek, biyouyumluluk, biyobozunurluk gibi avantajlar bulundurmaktadırlar. Yaygın olarak kullanılan DNA origami yöntemiyle uzun tek zincirli iskele DNA, yüzden fazla eşlenik kısa 'zımba' zincirle termal tavlama ile katlanarak 2 ve 3 boyutlu DNA nanoyapılar oluşturulmaktadır. 

Nanotıp ve biyomedikal alanında DNA origami nanoyapılardan antimikrobiyal dirence karşı çözüm üretmede yararlanılmaktadır. Bilindiği gibi enfeksiyon hastalıklarına ve cerrahi müdahale sonrası enfeksiyona neden olan patojen ajanlara karşı çeşitli antibiyotikler kullanılmaktadır. Ancak patojen ajanların antibiyotiklere karşı  direnç  geliştirmeleri, tedavide ve cerrahi müdahale sonrası enfeksiyonların sağıtımında zorluklar yaratmasının yanında ekonomik yönden de sağlık sistemini sıkıntıya sokmaktadır. Kanser hastalıkları tedavisinde kullanılan ilaç, ameliyat, kemo, radyo ve foto terapiler gibi konvansiyonel yöntemler sağlıklı hücrelere de zarar vermektedir. Ayrıca kanser hastalıkları başta olmak üzere bir çok hastalıkta çeşitli tedavi yöntemleri sonrası hastanın immün sistemi zayıflamakta ve hastanın mikrobiyal enfeksiyonlara karşı direnci düşmektedir. Bu tür hastalarda enfeksiyonları engellemek için etkin antibiyotiğin kullanılması uygulanan kemoterapinin de başarısını arttırmaktadır. 

Antibiyotik grubundan olan Lantibiyotikler, translasyon sonrası modifiye edilmiş polisiklik peptit antibiyotiklerdir. Lantibiyotiklerden özellikle nisinin FDA onayına sahip olması, etkinliğinin yüksek fakat düşük sitotoksisite göstermesi ve bakteriyel direnç oluşturma olasılığının düşük olması antimikrobiyal direnç kazanmış hastane kaynaklı ve epidemik özellikteki patojenlere karşı diğer antibiyotiklere kıyasla avantajlar sağlamaktadır. Çünkü nisinin çift etki mekanizması göstererek hem mikrorganizmaların  hücre duvarı sentezinde  lipid-II'ye bağlanarak sentezini inhibe etmekte, hem de hücre zarında porlar oluşturarak hücreyi  lizize uğratmaktadır. 
Bu veriler ışığında yapılan  tez çalışmasının ilk aşamasında, 

a) sadece nisin, 
b) m13mp18 iskele ipliği kullanılarak üretilen DNA Nano-Yapılara  elektrostatik olarak nisin yüklenmiş, 
c) sadece m13mp18 iskele ipliği kullanılarak DNA Nanoyapılar sentezlenmiş ve bu üç farklı örneğin belli başlı patojen ajan olan metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA ATCC 43300) ve vankomisine dirençli Enterococcus faecalis (VRE ATCC 51299)'e karşı antimikrobiyal etkileri incelenmiştir.  Bu bağlamda, a) Sadece nisin lantibiyotiğinin faklı konsantrasyonlarındaki denemeleri sonucunda,  2500 nM nisin derişiminde, metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA ATCC 43300) suşunda inhibisyonun %97, b) Nisin yüklü DNA nanoyapıda  %95  olduğu; vankomisine dirençli Enterococcus faecalis (VRE ATCC 51299) suşunda ise a) sadece nisinli örnekte inhisyon oranının %96, b) nisin yüklü DNA nanoyapıda %91 olduğu, c) her iki patojenin  sadece DNA nanoyapı bulunan örneklerinde herhangi bir inhibisyon olmadığı saptanmıştır. 

Çalışmanın ikinci aşamasında  bu patojenlerin  IC50 değerleri, metisiline dirençli  Staphylococcus aureus (MRSA)'ya karşı sadece nisin için 1051 nM, nisin yüklü DNA nanoyapı için de 1567 nM olarak bulunmuştur. Vankomisine dirençli Enterococcus faecalis (VRE)'ye karşı ise IC50 değerleri incelendiğinde de yine  sadece nisin için 1303 nM, nisin yüklü DNA-NY için de 1387 nM olarak bulunmuştur. Nisin kullanılarak MRSA ve VRE'ye karşı elde edilen en yüksek inhibisyon oranları sırasıyla %97 ve %96, literatürdeki %100'ünü inhibe eden miminum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) değerleri ile karşılaştırılmış ve yakın değerler bulunmuştur. 

Çalışmamızın son aşamasında da in-vitro çalışmalar bağlamında, elde edilen nano yapıların  hücre kültüründe etkinliğinin araştırılması için iki farklı hücre hattı; insan meme kanseri hücreleri (MCF-7) ve fare fibroblast hücreleri (L929)'ne karşı sitotoksik etkileri incelenmiştir. 2.5 µM konsantrasyonundaki sadece nisin ile MCF-7 hücrelerinin ölüm oranı  %45, nisin yüklü DNA-NY ile ise %43'dür. L929 hücrelerine karşı ise 2.5 µM konsantrasyonda nisin hücrelerinin ölüm oranı %8, nisin yüklü DNA-NY'ların ise %17 dir.

Çalışmalar sonucunda, geliştirilen nisin yüklü DNA-nanoyapılar antimikrobiyal etkileri ile gerek hastane kaynaklı ve epidemik boyutlarda çoklu ilaca direnç kazanmış patojenlerle mücadelede, gerekse de kanser hücrelerine karşı seçici olarak antikanser özellikleri ile kanser tedavisinde kullanım alanına sahip olacağı saptanmıştır.

Abstract:
Currently, in nanotechnology and biomedical field DNA nanotechnology is more and more used instead of conventional methods and important studies are carried out. Complementary base pairing of DNA has taken it to the next level in genomic studies. DNA origami is a multidisciplinary field and advanced nanomaterials are developed. DNA nanostructures have many advantages such as being modular, biocompatible, biodegredable and giving low immune response over polymer and lipid based drug delivery agents. In the common technique DNA origami, long single stranded DNA is folded by over hundreds of 'staple' strands via thermal annealing and 2D and 3D DNA nanostructures are created. 

In nanomedicine and biomedical field, utilized from DNA origami nanostructures in generating solutions for antimicrobial resistance. Various antibiotics are used against infectious diseases and the pathogens cause infections after surgeries. However pathogen agents develop resistance to antibiotics, it cause many challenges in therapy, after surgery and leads to financial burden in healthcare system. In cancer therapy conventional methods such as drug, surgery, chemotherapy, radiotherapy and phototherapy can kill normal cells as well. Moreover, particularly in cancer therapy many therapy methods weakens the patients' immune system and patient's resistance to infections. In this type of patients, effective antibiotic use improve the success of chemotheraphy too. 

Lantibiotics are post translational modified polycyclic peptite antibiotics. A member of lantibiotics class, nisin is FDA approved, shows high activity, low cytotoxicity, low possibility to develop bacterial resistance and has many advantages over other antibiotics against antimicrobial resisted epidemic nosocomial pathogens. Because nisin shows double mode of action, by binding one of cell wall initiators lipid II, it disrupts cell wall formation and it forms pores in cell membrane and leads cell to lysis. 

In the first part of the thesis, 
a) bare nisin,
b) DNA nanostructures were built by m13mp18 scaffold strand and electrostatically loaded with nisin,
c) bare DNA nanostructures were built by m13mp18 scaffold strand.
 
Antimicrobial activities of these 3 samples against pathogen agents methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA ATCC 43300) and vancomycin resistant Enterococcus faecalis (VRE ATCC 51299) were  investigated. In the concentration of 2500 nM, a) by bare nisin 97% of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA ATCC 43300) bacteria was inhibited and by loading onto DNA nanoparticles (DNA-NP) 95% of inhibition achieved. In 2500 nM concentration a) bare nisin inhibited up to 96% and b) by loading nisin onto DNA nanoparticles up to 91% of vancomycin resistant Enterococcus faecalis (VRE ATCC 51299), c) for both pathogens bare DNA nanoparticles (DNA-NP) has not exhibited any inhibition. 

In the second part of the study, IC50 values calculated against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) for nisin as 1051 nM and for nisin loaded DNA-NP as 1567 nM. And against vancomycin resistant Enterococcus faecalis (VRE), IC50 values found for nisin and nisin loaded DNA NP are 1303 nM and 1387 nM, respectively. By using nisin against MRSA and VRE, highest inhibition values obtained as 97% and 96% compared with minimum inhibition concentration (MIC) values in the literature and found compatible. 

In the last part of the thesis, in vitro cytotoxic activity of nisin loaded DNA based drug delivery system investigated against human breast cancer cells (MCF-7) and mouse fibroblast cells (L929). Bare nisin in 2.5 µM concentration and nisin loaded DNA nanostructures showed cytotoxic effect in 45% and 43% of MCF-7 cells, respectively. And against L929 cells in 2.5 µM concentration, bare nisin and nisin loaded DNA nanostructures showed cytotoxic effect in only 8% and 17% of the cells, respectively. 

Furthermore as a result of the study, it is believed that the developed nisin loaded DNA nanostructures will be used in both against nosocomial multi resistant pathogens thanks to their antimicrobial effects and in cancer therapy with their selective anticancer activity.