Kondrosit hücrelerinin elektrospinleme yöntemi ile elde edilmiş biyomalzeme üzerinde kültürü ve karakterizasyonu
Culture and characterization of chondrocyte cells on electrospinned biomaterials
Yazar: ÖZLEM ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA TÜRK
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kıkırdak dokusu sınırlı iyileşme kapasitesi sahiptir. Bu çalışmada; HEMA ile aminoasit monomerleri ile birleştirilerek elektroeğirme yöntemiyle nanofiber üretilmesi, nanofiberler üzerinde kondrositleri kültürü, karakterizasyonu ve kıkırdak doku mühendisliği açısından değerlendirilmesi amaçlandı. Isıl polimerizasyon ile PHEMA'dan üretilen nanofiberler düşük molekül ağırlıklı kitosan polimeri ile kaplandı ve 4S-PEG polimeri ile çapraz bağlandı. Antikor ve aminoasit immobilizasyonuyla her ikisinin de nanofibere bağlanıp bağlanmadığı FTIR ile belirlendi. SEM ile 260nm-390nm fiber çapları, FTIR ile antikor ve aminoasitlerin polimerler üzerindeki bağ titreşimleri gözlemlendi. Kültüre edilen tavşan kondrositleri CD44 antikoru kullanılarak flow sitometri ile belirlendi. Hem nanofiber üzerine hem de düz hücre kültüründe ekimi yapılan kondrositlerin Anexin V FITC yöntemiyle 5.,10. ve 15.günler sırasıyla; %12.72 apoptoz ile %9.09 nekroz, %10.81 apoptoz ile %6.75 nekroz , %6.25 apotoz ile %7,81 nekroz olarak belirlendi. Kondrositlerin metabolik aktiviteleri Alamar mavisi ile hücrenin 5.Gün %78.95; 10.Gün %74.93, 15.Gün %81.58 oranlarında gün sayısı ile hücrelerde olan artışa bağlı arttığı belirlendi. Kollajene bağlanan ekstraselüler matriksi düzenleyen GAG miktarı 5,10 ve 15.günlerde sırasıyla; 12,45μg/ml, 18,09μg/ml, 24,16μg/ml belirlendi ve GAG/DNA oranı ile DNA miktar tayini yapıldı. Matriks gelişim proteini olan COMP miktarı hücre canlılığına bağlı olarak 5,10 ve 15.günler sırasıyla 10,13; 16,94; 13,19 olarak ifade edildi. Kollajen tip II immünohistokimyasal boyamalarla üç boyutlu kültür ortamında 5.gün %4.81, 10.gün.%13,90 ve 15.gün%17.51 oranlarında iki boyutlu kültür ortamına göre boyanma oranı fazla olduğu gözlemlendi. CD44 immünofloresan tekniği ile kondrositlerin nanofiber üzerinde düz hücre kültürüne göre biraz daha fazla ışıma yaptığı belirlendi. Toluidin mavisi ve hematoksilen-eozin boyaması ile iki ve üç boyutlu kültür ortamında çekirdek ve sitoplazma boyanmaları belirlendi. RT-PCR relatif değerlerinin Mann Whitney U testi ile anlamlı farklılık bulunmadığından kollagen tipI, kollajenTipII, sox9, agrecann genlerinin ekspresyonlarının referans gene göre cp değerleri karşılaştırıldı ve az da olsa artığı ifade edildi.Sonuç olarak; 4S-PEG çapraz bağlı PHEMA-Kitosan nanofiberlerin kondrojenik potansiyeli korumada faydalı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Cartilage tissue has limited capacity of healing. In this study; it was aimed to produce nanofibers by electrospinning by combining with HEMA and amino acid monomers, culture chondrocytes on nanofibers, characterize, and evaluate by with respect to cartilage tissue engineering.With thermopolymerization,the nanofibers produced from PHEMA were coated with low molecular weight chitosan polymer and cross-linked with 4S-PEG polymer.Antibody and amino acid immobilization were determined by FTIR, which resulted in being linked to the nanoporous.Binding of antibodies and amino acids on polymers were observed with SEM (260nm-390 nm fiber diameters) and FTIR. Cultured rabbit chondrocytes were characterized by flow cytometry using CD44 antibody.Chondrocytes seeded on nanofibers as well as on regular cell culture were analyzed by Anexin V FITC method at the 5th, 10th, and 15th days: %9.19 necrosis with %12.72 apoptosis, %6.75 necrosis with %10.81 apoptosis and %7.81 necrosis with %6.25 apoptosis, respectively.Alamar blue cell metabolic activity of chondrocytes were %78.95 at Day 5, %74.93 at 10th day, and 81.58% at 15th days that indicates the metabolic activity rates increases over the time. The amount of GAG regulating the collagenous extracellular matrix were 12.45 μg/ml, 18.09 μg/ml, and 24.16 μg/ml at the 5th, 10th and 15th days, respectively. The DNA amount was determined and the GAG/DNA ratio was also determined. The amount of COMP, the matrix development protein, were %10.13, %16.94, and %13.19 at the 5th, 10th and 15th days, respectively.  Immunostaining intensity ratios of type II collagen were %4.81, %13.90, and %17.51 at the 5th day, 10th and 15th days. The intensity was higher in three dimensional culture compared to two dimensional culture. In immunofluorescence technique, chondrocytes were slightly more immunoreactive for CD44 on nanofibers than on the flat-cell culture. Toluidine blue and hematoxylen-eosin staining revealed nuclear and cytoplasmic staining in two- and three-dimensional culture media. In RT-PCR analyses, except that of type I collagen the expressions of collagen type II, Sox9, and Agrecann genes increased but the by the Mann Whitney U test did not reveal statistical significance.As a result; 4S-PEG cross-linked PHEMA-chitosan nanofibers are thought to be useful in chondrogenic potential protection to some degree.