Svıp adlı proteinin adrenal bezdeki rolünün hücre kültür modelinde incelenmesi
Investigating the role of svip in adrenal gland using cell culture models
Yazar: RECEP İLHAN
Danışman: PROF. DR. PETEK BALLAR KIRMIZIBAYRAK
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Ecz) Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology
Dizin: Adrenal bezler = Adrenal glands ; Adrenal korteks = Adrenal cortex ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Steroidler = Steroids

Özet:
Endoplazmik retikulum (ER), lipid tabaka ile kaplanmış birbiri ile sürekli bağlantı halinde bulunan tübül ya da keseler içeren sitoplazma boyunca dağılım gösteren hücresel süreçlerde önemli roller üstlenmiş bir organeldir. Bu hücresel süreçlere; lipid ve steroid sentezlenmesi, protein sentezlenmesi ve katlanması örnek olarak verilebilmektedir. Yeni sentezlenen proteinlerin üçte birinin yanlış katlandığı tahmin edilmektedir, ancak bu rakam bazı durumlarda artmaktadır. Hücre içerisinde ER stresini tetikleyen bu istenmeyen proteinleri uzaklaştırmada yer alan mekanizmalardan biri ER-aracılı protein yıkımı (ERAD)' dır. ERAD, sadece yanlış katlanmış bu proteinlerin yıkımından değil aynı zamanda  steroid hormon sentezinin anahtar enzimlerinden olan HMG-KoA redüktaz enzimi gibi çeşitli proteinlerin regülasyonundan da sorumludur. 
ERAD komponentlerinden olan p97/VCP proteininin olası adaptör proteinlerinin arandığı maya iki hibrid sistemi ile yapılan bir çalışmada  76 aminoasitten oluşan SVIP adı verilen protein keşfedilmiştir. 2007 yılında SVIP'in Derlin1-gp78-p97/VCP etkileşimini bozarak etki eden endojen bir ERAD inhibitörü olduğu gösterilmiştir. SVIP'in p97/VCP'nin lokalizasyonunu, LC3 prosesini, p62 ekspresyonunu ve poliubikitinlenmiş proteinlerin otofagazomlara sekestrasyonunu modüle ederek otofaji regülatörü olabileceği de rapor edilmiştir. SVIP'in androjen yanıt genlerinden biri olduğu ve sentetik androjen R1881 uygulanması ile SVIP mRNA'sında anlamlı bir azalmanın olduğu bildirilmiştir. SVIP'in ayrıca hücre içerisinde vakuolleşmeyi indüklediği ve   oluşan bu vakuollere p97/VCP yanı sıra  LAMP1 (Lizozomal membran proteini) ve LC3 adlı proteinleri çektiği gözlenmiştir.
SVIP'in dokulardaki ifadesini incelediğimiz ön çalışmalarımızda SVIP'in serebrum, serebellum, omurilik, siyatik sinir ve adrenal bezde güçlü bir şekilde ifade olduğu ve gelişimsel olarak en baştan itibaren yalnızca adrenal bezde  sentezlendiği bulunmuştur. Bu veriler ışığında SVIP'in adrenal bezdeki olası rolünün hücre kültür modelinde araştırılması tez önerisi olarak sunulmuştur. Tez çalışması kapsamında yaptığımız çalışmalar ile öncelikle sıçan adrenal bez dokusunda SVIP'in lokalizasyonu incelenmiş ve adrenal kortekste yoğun SVIP ifadesi gözlenmiş ve tez çalışmalarımızın devamı kapsamında literatürde yoğun olarak kullanılan adrenal korteks hücre kültür modeli kullanılmıştır.
H295R hücrelerinde öncelikle SVIP'in bazal ve steroidojenez indüklenen koşullarda ifade seviyesi ve hücre içi lokalizasyonu incelenmiştir. Daha sonra SVIP'in H295R hücrelerinde otofaji ve hücre proliferasyonuna etkisi değerlendirilmiş; otofaji üzerinde anlamlı bir etkisi belirlenmez iken hücre proliferasyonunu azalttığı belirlenmiştir. SVIP'in adrenal korteksteki fonksiyonel etkisinin belirlenmesi için SVIP ifade seviyesi manipüle edilmiş H295R hücrelerinde streoidojenezde görev yapan kritik proteinlerin mRNA ve protein seviyeleri ile sekresyona uğrayan hormon düzeyleri incelenmiştir. SVIP'in adrenal kortekste seviyesinin artması bazı proteinlerin ve bu proteinlerle ilişkili olan hormonların miktarını azaltmıştır. Tez çalışmamızın sonuçları, SVIP'in adrenal korteksde steroidojenezi düzenleyici etkisi olduğunu ve bu etkinin ERAD inhibitör fonksiyonundan bağımsız olabileceğini önermektedir.

Abstract:
Endoplasmic reticulum (ER) is an organelle containing tubules or sacs that covered with lipid layer and in continuous connection with each other. ER distributes throughout the cytoplasm and take impartant role in cells such as lipid and steroid synthesis and folding. It is estimated that one third of newly synthesized proteins are misfolded, but this ratio increases in some casesOne of the mechanisms involved in removing these unwanted proteins that trigger ER stress inside the cell is ER-mediated protein degradation (ERAD). ERAD is not only responsible for the destruction of these misfolded proteins, but is also responsible for the regulation of various proteins such as HMG-CoA reductase enzyme, which is one of the key enzymes of steroid hormone synthesis. 
A protein called SVIP consisting of 76 amino acids was discovered in the study conducted with yeast two hybrid systems which aim to found possible adapter proteins of the p97/VCP protein, one of the components of ERAD. In a study (2007), it was shown that SVIP is an endogenous ERAD inhibitor that acts by disrupting the interaction Derlin1-gp78-p97/VCP. It has also been reported that SVIP can be an autophagy regulator by modulating the localization of p97 / VCP, LC3 process, p62 expression, and the sequestration of polyubiquitinated proteins to autophagasomes. It has been reported that SVIP is one of the androgen response genes and there is a significant decrease in SVIP mRNA with the application of synthetic androgen R1881. It has been observed that SVIP also induces vacuolization in the cell and attracts proteins named LAMP1 (Lysosomal membrane protein) and LC3 as well as p97 / VCP to these vacuoles. 
In our preliminary studies, which we examined the expression of SVIP in tissues, it was found that SVIP was strongly expressed in the cerebrum, cerebellum, spinal cord, sciatic nerve and adrenal gland and was synthesized developmentally from the very beginning only in the adrenal gland. In the light of these data, investigating the possible role of SVIP in the adrenal gland in a cell culture model is presented as a thesis proposal. Within the scope of the thesis study, first of all, the localization of SVIP expression in the rat adrenal gland tissue was examined and intense SVIP expression was observed in the adrenal cortex and the adrenal cortex cell culture model, which is used extensively in the literature, was used for our thesis studies. Firstly the expression level and intracellular localization of SVIP in cells under basal and steroidogenesis-induced conditions were examined in H295R cells. Afterwards,the effect of SVIP on autophagy and cell proliferation in H295R cells was evaluated;no significant effect on autophagy but decrease in cell proliferation via SVIP were detected. In order to determine the functional effect of SVIP on adrenal cortex, mRNA and protein levels of critical proteins involved in stereoidogenesis as well as secreted hormone levels were examined in H295R cells which SVIP expression is manipulated. Increasing the level of SVIP in the adrenal cortex cause decrease in level of the some proteins and also hormones which associated with these proteins. The results of our thesis study suggest that SVIP regulate steroidogenesis in adrenal cortex and this effect may be independent of ERAD inhibitory function.