Deneysel spinal kord yaralanmasında Oleuropein'in High Mobility Group Box-1 aracılığıyla apoptoz ve oksidatif stres üzerine etkisinin araştırılması
The effect of Oleuropein via High Mobility Group Box-1 protein on apoptosis and oxidative stress in experimental spinal cord injury
Yazar: FATİH ÇALIŞ
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA AZİZ HATİBOĞLU
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery

Özet:
Amaç: Spinal kord yaralanması travmatik yaralanmaların morbidite ve mortaliteye sebep olan önemli sonuçlarından biridir. Geri dönüşümsüz etkiler bırakan primer hasarlanma ve tedaviye dönük çalışmaların esas hedefi olan sekonder hasarlanma olarak sınıflandırılabilir. HMGB-1, sekonder hasara sebep olan enflamasyonun önemli medyatörlerinden biridir. Redoksun aktive ettiği transkripsiyon faktörü Nrf2'nin birçok organ ve hücre tipini toksik hasara karşı koruduğu gösterilmiştir. Oleuropein'in anti-inflammatuar özelliği bilinmektedir. Çalışmamızda Oleuropein'in deneysel spinal kord yaralanması modelinde HMGB-1, Nrf2, apoptoz ve oksidatif stres üzerine etkilerini araştırdık.
Metod: 250-300 gr, 8-10 haftalık, dişi 24 adet Sprague-Dawley sıçan kullanıldı. Laminektomi grubunda T9-T10 laminektomi, travma grubunda T9-T10 laminektomi sonrası Yaşargil geçici anevrizma klibiyle 30 saniye ekstradural kompresyon, Oleuropein grubunda ekstradural kompresyon sonrası 20 mg/kg Oleuropein 0 ve 1. saatte intraperitoneal uygulandı. 24. saatte sakrifiye edilen sıçanların serum ve spinal kord örneklerinde immünohistokimya ve western blot yöntemleriyle HMGB-1, TLR-4, RAGE, Nrf-2, NF-κß ekspresyonları incelendi. TUNEL yöntemi ile apoptoz ve western blot yöntemiyle Bax, Bcl-2, p53, Aktif Kaspaz-3 düzeyleri bakıldı. Okdisatif stres ve antioksidan mekanizmalar da TAS, TOS, OSI ile değerlendirildi. Bulgular: Travma grubunda, laminektomi grubuna göre HMGB-1 (P<0.001), TLR4 (P<0.001), RAGE (P<0.001) ve NF-κB (P<0.001) düzeylerinin anlamlı derecede arttığı belirlendi. OLE grubunda ise HMGB-1 (P<0.001), TLR4 (P<0.001) ve RAGE (P<0.001) düzeylerinin travma grubuna göre anlamlı derecede azaldığı gözlendi. Nrf2 antioksidan mekanizmaların önemli bir parçasıdır ve Nrf2 düzeylerinin travma grubunda arttığı (P<0.01), OLE grubunda travma grubuna göre daha da yükseldiği belirlendi (P<0.001). TUNEL metodu ile değerlendirilen apoptotik hücre sayısının, travma grubunda laminektomi grubuna göre artarken, OLE grubunda travma grubuna göre anlamlı miktarda azaldığı belirlendi (P<0.001).
Sonuç: Bu çalışmada, oleuropein'in HMGB-1 üzerinden anti-enflammatuar Nrf2 üzerinden antioksidan etki göstererek apoptoz ve sekonder hasarı azalttığı spinal kord ve serum örnekleri incelenerek gösterilmiştir. Bu sonuçlar klinik çalışmalara ışık tutacaktır. Anahtar Kelimeler: Spinal Kord Yaralanması, Oleuropein, HMGB-1, Nrf2, Apoptoz

Abstract:
Objective: Spinal cord injury is an important result of traumatic injuries which cause morbidity and mortality. It can classify as a primary injury which cause irreversible effects and secondary injury which is the main target of medication studies. Inflammation cause secondary injury and HMGB-1 is an important mediator of inflammation. Protective effect of redox activated transcription factor Nrf2 against toxic injury has shown in many organ and cell type. Oleuropein has known anti-inflammatory features. In our study we investigate the effects of Oleuropein on HMGB-1, Nrf2, apoptosis and oxidative stress in experimental spinal cord injury model.
Materials and Methods: Weighing 250-300 g, 8-10 weeks, a total of 24 adult female Sprague-Dawley rats were used for the experiment. T9-T10 laminectomy were made in laminectomy group, after T9-T10 laminectomy 30 second extradural compression with Yasargil temporary aneurysm clip were made in trauma group, after extradural compression 20 mg/kg Oleuropein immediately and first hour of trauma were done intraperitoneally in Oleuropein group. 24 hour after procedure rats were sacrified. Serum and spinal cord samples HMGB-1, TLR-4, RAGE, Nrf2, NF-κß expression levels analysed by western blot and immunohistochemistry examinations. Apoptosis was evaluated with TUNEL method and Bax, Bcl-2, p53, Aktive Caspase-3 levels analysed by western blot. Oxidative stress and antioxidant mechanisms were evaluated with TAS, TOS, OSI tests.
Results: We compared trauma group with laminectomy group and detected HMGB-1 (P<0.001), TLR4 (P<0.001), RAGE (P<0.001) and NF-κB (P<0.001) levels increased significantly after trauma. OLE group HMGB-1 (P<0.001), TLR4 (P<0.001), RAGE (P<0.001) and NF-κB (P<0.001) levels decreased significantly according to trauma group. Nrf2 is an important part of antioxidant mechanisms and Nrf2 levels increased in trauma group (P<0.01). OLE group Nrf2 levels also increased according to trauma group (P<0.001). Apoptotic cell number which evaluated with TUNEL method increased in trauma group according to laminectomy group and it decreased significantly in OLE group according to trauma group (P<0.001).
Conclusion : In this study with the investigation of spinal cord and serum samples we have shown Oleuropein has anti-inflammatory effect via HMGB-1 and antioxidant effect via Nrf2
3
and these result decrease in apoptosis and secondary injury. These results throw light on to clinical studies.
Key words: Spinal Cord Injury, Oleuropein, HMGB-1, Nrf2, Apoptosis