Acanthamoeba castellanii'den HSP70 geninin izolasyonu ve karakterizasyonu
The isolation and characterisation of acanthamoeba castellanii HSP70 gene
Yazar: KÜBRA AÇIKALIN COŞKUN
Danışman: PROF. DR. SEMRA ÖZÇELİK
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı / Parazitoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Acanthamoeba = Acanthamoeba

Özet:
Miktarı genellikle stres stres altında artan ve moleküler şaperon olarak da adlandırılan proteinlere ısı şok proteinleri deni. Isı şok proteinleri yeni sentezlenen proteinlerin doğru katlanmasını, membranlar arası protein translokasyonunu, proteinlerin agregasyonuun önlenmesini ve zarar görmüş proteinlerin degradasyon için hedef eklenmesini sağlarlar. Organizmalar arasında yüksek oranda korumuşlardır. Hsp'ler moleküler ağırlıklarına göre adlandırılırlar ve hücresel strese yanıtta Hsp 70 biyokimyasal mekanizmasının kalbidir.
    Acanthamoeba castellanii insanlarda çoğunlukla Granülomatöz Amfibik Ensefalit (GAE) ve keratite sebep olan amip türüdür. Parazit ve konak etkileşimleri sırasında konak strese girmekte ve bu stresle baş edebilmek için kenti Hsp'lerini kullanmaktadır. Hsp 70 konak-parazit ilişkisi sırasında çok önemlidir. Literatürde Plasmodium falciparum ile yapılan çalışmalara göre parazit Hsp70'i konak hsp70'lerine benzediği için konak immün sistemi tarafından ayırt edilememektedir. Bu nedenle AcHsp70'in özelliklerinin bilinmesi, parazit-konak immün sistemini modifiye etmek açısından önemlidir. İmmün sistemin modifiye edilmesi çalışmalarına bir başlangıç olması amacıyla bu çalışmada AcHsp70 izolasyonunu ve biyokimyasal karakterizasyonu gerçekleştirdik.
   Yaptığımız çalışmada Pubmed  veritabanından yararlanarak biyoinformatik yollarla primerler dizayn edilip PCR ile AcHsp70 açık okuma penceresi elde edilmiştir. Bu pencere ekspresyon vektörüne klonlanarak E. coli hücrelerine transforme edilip AcHsp70 rekombinant proteini elde edildi. Elde edilen protein kolon kromatografisi ile saflaştırıldı. AcHsp70'in fonksiyonunu belirlemeye yönelik olarak hidrofobik özellikleri, farklı nükleotidler ve peptitler varlığında davranışları, farklı pH ve sıcaklıktaki çözünürlüğü, Gibbs serbest enerjisinin belirlenmesi, protein agregasyonu, ATP hidrolizi ve sıcaklık stresi altında diğer Hsp'ler ile etkileşimi incelendi. 
   Sonuç olarak AcHsp70 diğer homolog ve ortologlarına benzer özellikler göstermiştir. AcHsp70'in nükleotit dizisi oldukça universaldir ve biyoinformatik yollarla tahmin edilen yapıda diğer Hsp70'lere benzemektedir. Dolayısı ile parazit Hsp70' leri genel bir mekanizma ile etki etmekte olup immün sistem çalışmalarında benzer yollarla ayırt edilebileceği düşünülmektedir.

Abstract:
The proteins that are expressed and augmented under stress conditions and called molecular chaperones are Heat shock proteins help folding of nascent peptides, translocation of proteins through membranes, inhibits protein aggregation and send the misfolded proteins for degradation. Hsps are universally protected in organisms. Hsps are at the middle of stress response.
        Acanthamoeba castellanii is a common parasite that cause infections. During parasite-host interaction, host is stressed and use it's Hsps to overcome the stres. Acanthamoeba Hsp70 (AcHsp70) is essential for host-parasite interaction. According to the research in the literature with Plasmodium falciparum parasite Hsp70 can not be distinguish by the host due to similarities between host and parasite Hsp70s. For this reason, a knowledge of AcHsp70 properties is important in terms of modifying parasite-host immune system. We isolated and biochemically characterized AcHsp70 as a start to immune system modification research. 
      In this study primers are designed by employing bioinformatics from PubMed database and AcHsp70 open reading frame is isolated by PCR method. This frame is cloned into an expression vector and transformed into E. coli competent cells and AcHsp70 recombinant protein was obtained. This AcHsp70 protein was purified by colon chromatography. To determine AcHsp70 function: hydrophobic properties, behavior under different nucleotides and peptides, solubility under different pH and temperatures, Gibbs Free energy determination, protein aggregation, ATP hydrolysis and interaction with other Hsps under temperature stress were examined.
   As a result, AcHsp70 showed similarities to its homologs and orthologs. Nucleotide sequence of AcHsp70 is universal and it is similar to the structure that was predicted by bioinformatic methods. Therefore, parasite infect host through a general mechanism and immune system research must be performed in similar action for distinction between host and parasite.