Hiperimmun serumlarda mycoplasma SP.'nin PCR, LAMP ve bakteriyolojik kültür ile belirlenmesi
Detection of mycoplasma SP. in hyperimmune sera by bacteriological culture, PCR and LAMP (methods)
Yazar: UFUK YAVUZ
Danışman: PROF. DR. KADİR SERDAR DİKER
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bakteriler = Bacteria ; Hiperimmun serum = Hyperimmune serum ; LAMP = LAMP ; Mikoplazma = Mycoplasma ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sığırlar = Cattles ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Amaç: Bu araştırmada yenidoğanların tedavi ve koruması amacıyla üretilen hiperimmun sığır serumlarında mikoplazmaların belirlenmesi için bakteriyolojik kültür, PCR ve LAMP yöntemlerinin karşılaştırılması amaçlandı.
Gereç ve Yöntem: Araştırmada bakteriyel antijenlerle immunize edilen donör sığırlardan elde edilen ham serumlar, bunların çeşitli işlemlerden geçirilen final ürünleri ve deneysel kontamine edilmiş serum örnekleri kullanıldı. Mikoplazma tanısı için bakteriyolojik kültür, DNA ekstraksiyon, PCR ve LAMP yöntemleri deneysel olarak kontamine edilen serum örneklerinde optimize edildi ve karşılaştırıldı.
Bulgular: Deneysel olarak kontamine edilen sığır hiperimmun serum örneklerinde bakteriyolojik kültür ve PCR en az 103, LAMP ise en az 104 mikoplazmayı tespit etti. Örneklerden DNA ekstraksiyonunda fenol-kloroform-izoamilalkol yöntemi diğer ticari kitlere göre daha üstün bulundu. Donör hayvanlardan alınan ham serum örneklerinin %41.6'sı PCR ile, %25'i LAMP ile mikoplazmalar yönünden pozitif bulundu. Bakteriyolojik kültür yönteminde ise örneklerin hiçbirisinden mikoplazma izole edilemedi. Filtrasyon sonrası örneklerin hiçbirinde hiçbir yöntemle etken saptanmadı.
Sonuç: PCR ve bakteriyolojik kültürün hiperimmun serumlardaki Mikoplazma kontaminasyonunu saptamada en duyarlı yöntemler olduğu sonucuna varıldı. LAMP yönteminin duyarlılığının ve tekrarlanabilirliğinin diğer iki yönteme göre düşük olduğu anlaşıldı. Çalışma sonuçları ayrıca, ticari serum üretiminde mikoplazma kontaminasyonunun göz önünde bulundurulması ve son ürüne filtrasyon uygulanması gerektiğini gösterdi.

Abstract:
Objective: This study was performed to compare culture, PCR and LAMP methods for detection of Mycoplasmas in hyperimmune bovine sera produced to use in prophylaxis and treatment of neonatal diseases.
Material and Methods: Hyperimmune sera from donor cattle immunized with bacterial antigens,  their processed-final products and experimentally contaminated serum samples  were used in the study. Bacteriological culture, DNA extraction, PCR and LAMP methods for detection of Mycoplasmas were optimized and compared by using experimentally contaminated serum samples.
Results: In experimentally contaminated hyperimmune bovine serum samples, bacteriological culture and PCR methods detected as low as 103 Mycoplasma, and LAMP method 104 Mycoplasma. Phenol-chloroform-isoamylalcohol method was found superior to other commercial kits in the DNA extraction from samples. Mycoplasmas contamination were found in %41.6 and %25 of unproccesed hyperimmune bovine sera from donor animals with PCR and LAMP, respectively. In bacteriologic culture, Mycoplasma could not be isolated from any sample. Filter-processed samples were found negative for mycoplasmas by all three methods.
Conclusion: PCR and bacteriological culture were found to be the most sensitive methods for detection of Mycoplasma contamination in hyperimmune sera. Sensitivity and repeatability of LAMP was lower when comparing with other two methods. Results also showed that Mycoplasma contamination should be considered in commercial serum production and filtration should be applied to final product.