Genotoksik stres indüklü otofaji ilişkili sekretom'un doğal öldürücü hücre aracılı antitümör immün yanıt üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of genotoxic stress-induced autophagy-associated secretome on natural killer cell-mediated antitumor immune response
Yazar: AYFER KARLITEPE
Danışman: PROF. DR. MEHTAP KILIÇ EREN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Amaç: Bu tezin amacı, kemoterapi ajanı etoposid ile indüklenen genotoksik stres  aracılı otofajiye bağlı oluşan otofajik sekretomun karakterize edilmesi ve bu sekretom içeriğinin MCF-7 meme kanseri hücrelerine yönelik NK aracılı immün cevabı etkileyip etkilemediğinin araştırılmasıdır. 
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada MCF-7,  kontrol-NK92 ve DNAM1-NK92 hücre dizileri kullanılmıştır. Etoposid aracılı otofaji indüksiyonu, LC3I/II ve p62 western blot ve immünfluoresan analizleriyle ölçülmüştür. Hücrelerde apoptoz oranı Annexin V/7AAD analizi ile ölçülmüştür.  Otofajik sekretom karakterizasyonu LC/MS-MS ve sitokin array analizleri ile yapılmıştır. Sitokinlerin validasyonu da ELISA analizi ile yapılmıştır. Kontrol-NK92 ve DNAM1-NK92 hücrelerinin MCF-7 hücrelerini hedefleme kapasitesi degranülasyon analizi ile belirlenmiştir.
Bulgular: 24 saat süre ile 150 μM Etoposid ile MCF-7 hücrelerinde otofajinin indüklendiği LC3I/II ve p62 gibi otofaji belirteçleri ile gösterilmiştir ve kemoterapi indüklü otofajinin apoptoza neden olmadığı tespit edilmiştir. LC/MS-MS sonuçları ile kemoterapi indüklü otofaji sırasında metabolik enzimlerin, tümör antijenlerinin, şaperonlar ve metastazla ilişkili proteinlerin salgılandığı tespit edilmiştir. Ayrıca, sitokin array analizi ile de sekretom içerisinde 41 farklı sitokin/kemokin ve büyüme faktörü tespit edilmiştir ve CCL5, TGFβ ve IL10 gibi bazı sitokin, kemokin ve büyüme faktörü için ELISA analizleri ile validasyon yapılmıştır. Son olarak, kontrol NK-92 ve DNAM1-NK92 hücrelerinin otofajik sekretomlarla muamele edilmesinin ardından, MCF-7 hücrelerini hedefleme kapasitesinde gruplar arasında farklılıklar olduğu görülmüştür. 
Sonuç: Tez kapsamında ilk kez kemoterapi ile indülenen otofajik sekretomun içeriği tümüye karakterize edilmiştir. İn vitro şartlarda, kemoterapiye bağlı otofaji indüksiyonunun NK hücre efektör fonksiyonlarını uyarıp uyarmadığını ve antikanser aktivitesine katkıda bulunan ilaç kaynaklı stres türlerini nasıl algıladığını ve bunlara nasıl tepki verdiğini belirlemede önemli veriler elde edilmiştir.

Abstract:
Objective: The aim of this project was to characterize the genotoxic stress induced autophagic secretome and to investigate whether autophagic secretome affects the NK-mediated immune response to MCF-7 breast cancer cells. 
Material and Methods: Etoposide was used to induce genotoxic stress mediated autophagy in MCF-7 cells. Analysis of autophagy induction was  tested by using autophagy markers including LC3I/II and p62 degreadation by western blot and immunfluoresence. Annexin V/7AAD analysis used to measure the rate of apoptosis in MCF-7 cells. LC/MS-MS analysis and cytokine array analyses were used to charatacterize the the chemotherapy-induced autophagic secretome content. Finally, how the chemotherapy-induced autophagic secretome affects the capacity of DNAM1-NK-92 cells to target MCF-7 cells was determined by degranulation analysis.
Results: Autophagy markers such as LC3I/II and p62 showed that autophagy was induced in MCF-7 cells by 150 μM Etoposide for 24 hours and it was determined that chemotherapy-induced autophagy did not cause apoptosis. LC/MS-MS results showed that metabolic enzymes, tumor antigens, chaperones and metastasis-related proteins were secreted during chemotherapy-induced autophagy. In addition, 41 different cytokines/chemokines and growth factors were detected in the secretome by cytokine array analysis and validated by ELISA analysis for some cytokines, chemokines and growth factors such as CCL5, TGFβ and IL10. Finally, after treatment of control NK-92 and genetically modified DNAM1-NK92 cells with autophagic secretomes, differences in the capacity to target MCF-7 cells were observed between the groups. 
Conclusion: In this thesis, for the first time, the contents of the chemotherapy-induced autophagic secretome were fully characterized. Under in vitro conditions, important data were obtained to determine whether chemotherapy-induced autophagy induction stimulates NK cell effector functions and how they detect and respond to the types of drug-induced stresses that contribute to anticancer activity.