Wortmannin'e dirençli Schizosaccharomyces pombe mutantlarına Tunikamisin'in etkisi
The effect of Tunicamycin on Wortmannin resistant Schizosaccharomyces pombe mutants
Yazar: MERVE YEMENİCİ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SEMİAN KARAER UZUNER
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Tunikamisin, proteinlerdeki asparagin gruplarının N-glukozilasyonunu inhibe etmesi sonucunda yanlış katlanmış proteinlerin birikimine neden olmaktadır ve endoplazmik retikulum (ER) stresini arttırması nedeniyle hücre biyolojisi çalışmalarında yaygın olarak kullanılan bir antibiyotiktir. Tunikamisin, fosforile edilmiş dolikola N-asetilglukozaminil-1-fosfat transfer eden N-asetilglukozaminfosfotransferazın inhibe edilmesi yoluyla N-glukozilasyonu engelleyerek ER stresine yol açmaktadır. Bu çalışmada, Wortmannin'e dirençli olduğu bilinen koleksiyona yine ER stresine neden olduğu bilinen tunikamisin uygulanıp tek gen bakımındandelesyonlu ilgili genlerin sinyal yolakları, etki mekanizması ve fonksiyonları analiz edildi.
Önceki çalışmalarda Wortmannin'e dirençli olduğu tespit edilen her biri tek bir gen bakımından delesyonlu olan 111 ayrı mutant Schizosaccharomyces pombe ırklarına, yarı öldürücü dozu 0,5 µg/mL olarak belirlenmiş olan tunikamisin uygulandı. Tunikamisine dirençli ve dirençsiz olan 20 mutan ırk belirlendi. Tunikamisin ile muamele edilmiş olan hücrelerle kontrol gruplarının hücre içi oksidasyon (ROT seviyeleri, reaktif oksijen türleri) farklılıkları, DAPI boyama yöntemiyle nukleuslarındaki değişiklikler, akridin orange/etidyum bromür (AO/EtBr) boyama tekniği ile hücrelerdeki canlılık ve apoptoz seviyeleri ölçüldü. Ayrıca spot ekim yöntemi ile hücrelerin canlılık seviyeleri ve dirençlilik oranları ve 20S proteozom aktivite ölçümü ile proteozomal aktivitelerinde meydana gelen değişiklikler, hem kendi kontrol gruplarıyla hem de parental ırk ile karşılaştırmalı olarak gösterildi. Kontrol ve tunikamisinli besi ortamında üreyen gruplar kıyaslandığında, tunikamisin eklenen besi ortamında daha az sayıda ürediği, morfolojik olarak daha büyük oldukları, nukleus yapılarının belirgin ölçüde değiştiği, hücre içi oksidasyon seviyelerinin arttığı, proteozomal aktivitelerinde ciddi miktarlarda değişimlerin olduğu ve hücrelerin apoptoza yöneldiği görüldü. 

Elde edilen sonuçlar bazı insan hastalıklarının moleküler mekanizmasının aydınlatılmasına yardımcı olacaktır.

Abstract:
Tunicamycin causes accumulation of incorrectly-folded proteins by inhibiting N-glycosylation of asparagine groups, and is an antibiotic used extensively in cell biology studies because it increases endoplasmic reticulum (ER) stress. Tunicamycin causes ER stress by blocking N-glycosylation vice inhibiting of N-acetylglucosaminphosphotransferase, the enzyme that transfers N-acetylglucosamin-1-phosphate to phosphorylated dolichol. In this study, tunicamycin, known to cause ER stress, was applied to the collection known to be resistant to Wortmannin and signaling pathway, mechanism of action and functions of related genes with single gene deletions were investigated.
111 haploid strains with different mutations in each, which were found Wortmannin-resistant in our previous study, were treated by a semi-lethal dose of tunicamycin (0.5 µg/mL). Twenty mutant strains were identified as tunicamycin-resistant or sensitive. The differences in intracellular oxidation (ROT levels, reactive oxygen species) of the control groups and tunicamycin-treated cells, the changes in nucleus with DAPI method, the viability and apoptosis levels in the cells with acridine orange/ethidium bromide (AO/EtBr) technique were measured. In addition, the viability and resistance levels of strains with the spot assay method and the changes occurring in proteosomal activities with 20S proteasome activity measurement were shown in comparison with both their control groups and parental strain. When comparing the groups grown in the media with or without tunicamycin, it was observed that the cells grow fewer in tunicamycin-containing media and were morphologically larger size, nucleus structures changed significantly, intracellular oxidation levels increased, proteosomal activities changed significantly and the cells were directed to apoptosis.
The results will help to clarify the molecular mechanism of some human diseases.