Tau agregasyon inhibitörü 'metilen mavisi'nin öğrenme ve hafıza üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of tau aggregation inhibitor methylene blue on learning and memory
Yazar: NURBANU YILDIZ
Danışman: PROF. DR. NURCAN DURSUN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Bellek = Memory ; Fosforilasyon = Phosphorylation ; Hipokampus = Hippocampus ; Metilen mavisi = Methylene blue ; Sinapslar = Synapses ; Tau proteinleri = Tau proteins ; Öğrenme = Learning

Özet:
Amaç: Siklik guanozin monofosfat'ın (cGMP), öğrenme ve hafıza süreçlerinin temelinde yer alan Uzun Dönemli Güçlenme (UDG) ve Uzun Dönemli Baskılanma (UDB) mekanizmalarında rol aldığı netleşmiştir. Mikrotübül stabilize eden protein Tau'nun, sinaptik fonksiyon ve plastisite modülasyonuna katıldığını gösteren çalışmalar vardır. Bununla birlikte, UDG ve UDB ile ilgili Tau fosforilasyonunda cGMP'nin rolü henüz belirlenmemiştir. Çalışmamızda bir guanilat siklaz (GC) inhibitörü olan Metilen Mavisi'nin (MM), sinaptik plastisite ile ilişkili Tau fosforilasyonunu değiştirip değiştirmediği araştırılmıştır.
Yöntem ve Gereçler: Çalışmada 40 adet Wistar albino genç erkek sıçan kullanıldı. Anestezi altında stereotaksik çatıya yerleştirilen sıçanlara perforant yoldan uyarı verilirken, dentat girustan (DG) hücre dışı alan potansiyelleri olan eksitatör postsinaptik potansiyel (EPSP) ve populasyon spike (PS) kaydedildi. UDG'yi indüklemek için güçlü bir tetanik stimülasyon (100 Hz/sn×4 tekrar) kullanılırken, UDB için düşük frekanslı stimülasyon (1 Hz-15 dk) uygulandı. İndüksiyon protokollerinin uygulanması esnasında DG'a 1 saat boyunca serum fizyolojik (SF) veya MM (50 µM) infüzyonu yapıldı. Kaydın son 5 dakikasındaki EPSP eğimlerinin ve PS genliklerinin ortalamaları, UDG veya UDB'nin büyüklüğünün bir ölçüsü olarak kullanıldı. İndüksiyondan 1 saat sonra çıkartılan hipokampüs dokusunda, Tau proteininin 4 farklı epitopunun (thr231, thr181, ser396, ser416) fosforillenmiş formları Western-blot yöntemi ile ölçüldü. 
Bulgular: Deney sonuçları, MM'nin perforan yol–dentat girus sinapslarında, UDB indüksiyonunu arttırırken, UDG'nin indüksiyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterdi. MM'nin UDB protokolünde var olan EPSP/PS disosiasyonunu önlediği gözlemlendi. MM infüze edilen sıçanlarda UDG ilişkili Tau fosforilasyonu değişmedi. UDB indüksiyonu, Tau'nun thr181 ve thr231 epitoplarında fosforilasyon oluşturmazken, ser396 ve ser416 epitoplarında artmış fosforilasyon ile sonuçlandı. 
Sonuç: Elde edilen veriler, MM infüzyonunun, UDB cevabını arttırması ve UDB ile ilişkili Tau epitoplarında fosforilasyonu değiştirmesi nedeniyle, cGMP düzeylerinin öğrenme-hafıza oluşumunda önemli rolü olduğunu gösterir. MM, UDG-UDB arasındaki dengenin stabilizasyonunda ve Alzheimer hastalığında görülen Tau fosforilasyonunun deregülasyonununda etkin olmasına rağmen, bu hastalıkta MM kullanımında daha kesin kanıtlar ortaya çıkarmak için ayrıntılı çalışmalara ihtiyaç vardır.
Anahtar kelimeler: Hipokampüs, Metilen Mavisi, Sinaptik Plastisite, Tau

Abstract:
Propose: It has become clear that cGMP is involved in neuronal signal transduction and mechanism of the long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) suggesting its participation in learning and memory processes. There are studies showing that the microtubule-stabilizing protein Tau is involved in modulation of synaptic function and plasticity. However, the exact role of cGMP in LTP- and LTD-related tau phosphorylation has not been yet clearly established. To address this issue, we sought to determine whether the administration of methylene blue (MB), an inhibitor of guanylate cyclase (GC), alters the relationship between synaptic plasticity and related tau phosphorylation.
Methods: A total of 40 young, male Wistar albino rats were enrolled in the study. Extracellular field potentials were recorded form the dentate gyrus, stimulating perforant pathways as excitatory postsynaptic potential (EPSP) slope and population spike (PS) in anesthetized rats placed stereotaxic roof.  To induce LTP, a strong tetanic stimulation (100 Hz/second×4 time) was used, while, for LTD, low-frequency stimulation (1 Hz-15 min) was applied. Infusions of saline or MB (50 μM) were made for 1 hour starting from the application of induction protocols. The averages of EPSP slopes and PS amplitudes in the last 5 minutes of recording were used as a measure of the size of the LTD or LTP. Phosphorylated tau levels (thr231, thr181, ser396, ser416) were measured in the hippocampus at least 60 min after induction protocols by Western-blot method.
Results: The results of the experiment showed that MB had no effect on the induction of LTP, while increasing the induction of LTD at perforant pathway–dentate gyrus synapses. Methylene blue was observed to prevent EPSP/PS dissociation existing in the LTD protocol. LTP-associated tau phosphorylation was unchanged in MB infused rats. LTD induction did not alter phosphorylation in the thr181 and thr231 epitopes of Tau, but resulted in increased tau phosphorylation at ser396 and ser416 epitopes. 
Conclussion: The data obtained indicates that cGMP levels have an important role in learning-memory formation, as MB infusion increases LTD response and alters phosphorylation in LTD-associated tau epitopes. Although MB is effective in stabilizing the balance between LTP-LTD and deregulation of Tau phosphorylation seen in Alzheimer's disease, detailed studies are needed to uncover more conclusive evidence in the use of MB in this disease.
Key words: Hippocampus, Methylene Blue, Synaptic Plasticity, Tau