Çölyak hastalığında kullanılmak üzere anti-gliadin antikorunun tayini için sensör ve assay sistemlerinin geliştirilmesi
Development of sensor and assay systems for the determination of anti-gliadin antibodies for use in celiac disease
Yazar: HUSSEIN AWNI ALI
Danışman: PROF. DR. DERYA KOYUNCU ZEYBEK
Kütahya Dumlupınar Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tezde, sentetik serum kullanılarak, Çölyak hastalığında bir belirteç olan anti-gliadin antikorunun (AGA) tespiti için immünosensör ve immünoassay (ELISA) sistemleri geliştirildi. İlk kısımda, camsı karbon elektrot (GCE), grafen nanotabaka (GNP), Fe3O4 ve kitosan (CHI) ile modifiye edildi. Bu elektroda, gliadin immobilize edildi ve bağlanmayan bölgeler BSA ile bloke edildi. GCE/GNP-Fe3O4-CHI/Gliadin/BSA immünosensör, farklı derişimlerde AGA ile inkübe edildi ve redoks probu içerisinde cevaplar kaydedildi. Etiketsiz immünosensörün, Taramalı Elektron Mikroskobi (SEM) tekniği ile yüzey ve dönüşümlü voltametri (CV), elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) ve diferansiyel puls voltametrisi (DPV) teknikleri ile elektrokimyasal özellikleri karakterize edildi. Çalışma koşulları çalışıldı ve tekrar kullanılabilirliği araştırıldı. Çalışma aralığı 0,01-10000 ng mL-1 olarak belirlendi. Tezin ikinci kısmında ise enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) tekniğine dayanan bir immünoassay formatı hazırlandı.  Mikroplakalar, gliadin ile kaplandı. İnkübasyon sonrasında, BSA ile blokasyon uygulandı. Bir saat sonunda belli derişimlerde AGA eklendi ve inkübasyona bırakıldı. Horseradish peroksidaz etiketli ikincil antikor (HRP-Anti-gliadin Ab) ilave edildi ve bir saat inkübasyona bırakıldı. Bu aşamaların her birinin sonunda üçer kez yıkama adımı uygulandı. HRP substratı, 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidin (TMB) kuyucuklara ilave edildi ve renk değişimi için yaklaşık 15 beklenildi. Son işlem olarak, yıkama uygulanmadan, sonlandırma çözeltisi eklendi ve FLUOstar Omega cihazı ile 450 nm de absorbans değerleri kaydedildi. Doğrusal çalışma aralığı 0,01-1000 ng mL-1   olarak belirlendi. Hazırlanan tayin sistemleri kullanılarak sentetik serumda anti-gliadin antikorunun tayini yapıldı ve % geri kazanım değerleri belirlendi.
Anahtar Kelimeler: Anti-gliadin Antikoru, Çölyak hastalığı, ELISA, Gliadin, İmmünosensör, Sentetik Serum

Abstract:
In this thesis, immunosensor and immunoassay (ELISA) systems were developed for the detection of anti-gliadin antibody (AGA), a marker in Celiac disease, using synthetic serum. In the first part, the glassy carbon electrode (GCE) was modified with graphene nanosheet (GNP), Fe3O4, and chitosan (CHI). Gliadin was immobilized on this electrode and unbound regions were blocked with BSA. The GCE/GNP-Fe3O4-CHI/Gliadin/BSA immunosensor was incubated with different concentrations of AGA, and responses were recorded in the redox probe. The surface of the label-free immunosensor was characterized by the Scanning Electron Microscopy (SEM) technique and its electrochemical properties by cyclic voltammetry (CV), electrochemical impedance spectroscopy (EIS), and differential pulse voltammetry (DPV) techniques. Working conditions were studied, and reusability was investigated. The working range was determined as 0.01-10000 ng mL-1. In the second part of the thesis, an immunoassay format based on the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique was prepared. Microplates were coated with gliadin. After incubation, blockade was applied with BSA. After one-hour, certain concentrations of AGA were added and incubated. Horseradish peroxidase labeled secondary antibody (HRP-Anti-gliadin Ab) was added and incubated for one hour. At the end of each of these steps, three washing steps were performed. HRP substrate, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) was added to the wells and waited for approximately 15 minutes for color change. As a final step, a stop solution was added without washing, and absorbance values were recorded at 450 nm with the FLUOstar Omega device. The linear working range was determined as 0.01-1000 ng mL-1. Anti-gliadin antibody was determined in synthetic serum using the prepared detection systems, and % recovery values were determined.
Keywords: Anti-gliadin Antibody, Celiac disease, ELISA, Gliadin, Immunosensor, Synthetic Serum