Fusarium'da pigment üretiminin moleküler analizi
Molecular analysis of pigment production in Fusarium
Yazar: AYLİN GAZDAĞLI
Danışman: PROF. DR. GÜLRUH ALBAYRAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Fusarium = Fusarium ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; İstatistiksel analiz = Statistical analysis

Özet:
Doktora tezinde Fusarium graminearum ve F. culmorum'da aurofusarin biyosentez gen kümesinin miselyum pigmentasyonundaki rolü ile birlikte aurofusarin ve öncül metabolitlerini içeren ekstrenin antibakteriyal ve biyofilm oluşumu üzerindeki etkisi moleküler düzeyde araştırıldı. Bu kapsamda, çalışılan 47 F. graminearum, 24 F. culmorum izolatından 3F, 7F ve
Fg174 (F. graminearum) ile 9F, 11F, F1 ve F14'ün (F. culmorum) kararlı pigment ürettiği morfolojik ve ince tabaka kromatografisi ile belirlendi. Biyosentetik yolakta yer alan Pks12, Gip6, Gip7, Gip4 ile genel transkripsiyon faktörünü kodlayan StuAp geninin, F. graminearum 88-1 ve H-11 referansları ile bu izolatların genomik DNA'larındaki varlığı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) aracılı gösterildi. Sanger dizileme, çoğaltılan Gip6 ve StuAp kısmi gen bölgelerinde transisyon ve transversiyon tipi tek nukleotid değişimlerinin olduğunu, Pks12, Gip7 ve Gip4 genlerinde ise bu tek nukleotid değişimleri ile birlikte tekli, ikili ve üçlü in-del bölgeleri bulunduğunu gösterdi. Miselyum renklenmesinde farklı ortam koşullarının beş genin anlatım seviye değişimi üzerindeki etkisi 15 °C ve 25 °C sıcaklık ile 5,6 ve 7,0 pH değişkenleri bakımından gerçek zamanlı PZR ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile incelendi. Tüm genler için en
yüksek anlatım seviyeleri pH 5,6 besi ortamı ve 15 °C inkübasyonda belirlendi. Spearman korelasyon analizi, pH 5,6 ve 25 °C ortam koşulunda Pks12 anlatım değişimi ile aurofusarin biyosentezi; pH 5,6 ve 15 °C'de Pks12, Gip7 ve StuAp anlatım değişimleri ile aurofusarin biyosentezi; pH 7,0 ve 15 °C'de Gip4 anlatımı değişimi ile aurofusarin biyosentezi arasında
Fusarium'da PİGMENT ÜRETİMİNİN MOLEKÜLER ANALİZİ anlamlı ilişkiliyi belirlemeyi sağladı. Çoklu regresyon ve temel bileşenler analizi, pH ve sıcaklık parametrelerinin tek başına miselunyum renklenmesini etkilemediğini ortaya koydu.
Asidik pH'da (3,0) miselyum renklenmesi gerçekleşmedi. Fusarium izolatına (9F) ait 0,72 ng/µl aurofusarin içeren ekstre P. aeruginosa PAO1'in (ATCC 15692) üremesini %38,89; 0,36 ng/µl aurofusarin içeren ekstre biyofilm tabakasını yaklaşık
%116 azalttı. Korelasyon analizi 0,36 ng/µl aurofusarinin, hücrelerin metabolik aktivitesi ile quorum-sensing (QS) ile ilişkili LasI, LasB ve LasR anlatım düzeylerinde azalmaya neden olarak biyofilm oluşumu inhibe ettiğini gösterdi. Çalışmadan elde edilen bulgular aurofusarin biyosentezinin ve miselyum pigmentasyonunun moleküler mekanizması hakkında bilgi sağlamakla kalmamış, aynı zamanda çevresel koşulların Fusarium'da sekonder metabolit biyosentezi üzerindeki etkileri hakkında da önemli veriler sunmuştur. Aurofusarinin antibakteriyel etkisi ile birlikte biyofilm oluşumunu engelleyici etkisi olduğu da bu çalışma ile gösterilmiştir. Doktora tezi, genomda manipülasyon yapılmaksızın laboratuvar koşullarında yüksek ölçekte aurofusarin üretimine zemin hazırlaması açısından büyük önem taşımaktadır.

Abstract:
In this doctoral thesis, the role of the aurofusarin biosynthesis gene cluster in Fusarium graminearum and F. culmorum on mycelium pigmentation and the effect of the extract containing aurofusarin and its precursor's on antibacterial and biofilm formation were investigated at the molecular level. In this context, 3F, 7F and Fg174 (F. graminearum) and 9F,
11F, F1 and F14 (F. culmorum) were investigated by morphological and thin layer chromatography in terms of stable pigments production in 47 F. graminearum, 24 F. culmorum isolates. The presence of Pks12, Gip6, Gip7, Gip4, which are involved in the biosynthetic pathway, and the StuAp gene, which encodes the general transcription factor, in the genomic
DNA of these isolates with references of F. graminearum 88-1 and H-11 were amplified via polymerase chain reaction (PCR). Sanger sequencing showed that there were transition and transversion type single nucleotide changes in the amplified Gip6 and StuAp partial gene regions, and single, double and triple in-del regions with these single nucleotide changes in Pks12, Gip7 and Gip4 genes. The effect of different environmental conditions on the expression level alterations of five genes on mycelium pigmentation was investigated by real-time PCR and high performance liquid
chromatography in terms of temperature of 15 °C and 25 °C and pH variables of 5.6 and 7.0. The highest expression levels for all genes were determined in pH 5.6 medium at 15 °C. Spearman correlation analysis identified a significant correlation between aurofusarin MOLECULAR ANALYSIS OF PIGMENT PRODUCTION IN Fusarium biosynthesis with Pks12 expression at pH 5.6 and 25 °C; with Pks12, Gip7 and StuAp expressions at pH 5.6 and 15 °C; with Gip4 expression at pH 7.0 and 15 °C. Multiple regression and principal component analysis revealed that pH and temperature parameters alone did not
affect mycelium coloration. Mycelium coloration did not occur at acidic pH (3.0). The extract of Fusarium isolate (9F) containing 0.72 ng/µl aurofusarin decreased the growth of P. aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) by 38.89%; the extract containing 0.36 ng/µl aurofusarin reduced the biofilm layer by approximately 116%. Correlation analysis showed that 0.36 ng/µl aurofusarin inhibited biofilm formation by causing a decrease in the metabolic activity of cells and the expression levels of LasI, LasB and LasR associated with quorum-sensing (QS). Findings from the study not only provided information about the molecular mechanism of aurofusarin biosynthesis and mycelium pigmentation, but also provided important data on the effects of environmental conditions on secondary metabolite biosynthesis in Fusarium. In this
study, it has been shown that aurofusarin has an antibacterial effect as well as an inhibitory effect on biofilm formation. The doctoral thesis has great importance in terms of laying the groundwork for the high-scale production of aurofusarin under laboratory conditions without any manipulation of the genome.