Karbapenemaz üreten enterobacteriaceae türlerinin hızlı tespitinde akım sitometri ile polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) etkinliğinin değerlendirilmesi
Evaluation of the effectiveness of polymerase chain reaction (PCR) with flow cytometry in the fast detection of carbapenemas-producing enterobacteriacae
Yazar: İPEK KOÇER
Danışman: PROF. TEKİN KARSLIGİL
Gaziantep Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Enterobacteriaceae = Enterobacteriaceae ; Karbapenemaz = Carbapenemase ; Meropenem = Meropenem ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis = Diagnosis ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Son yıllarda dünya çapında artan karbapeneme dirençli Enterobacterales'e bağlı gelişen enfeksiyonlar endişe yaratmaktadır. Özellikle karbapenemaz üretimi, Enterobacterales ailesinde görülen karbapenem direncinin en önemli mekanizmasını oluşturmaktadır. Birçok fenotipik ve genotipik yöntem karbapenemazların tespitinde laboratuvarlarda kullanılmaktadır. Bu çalışmada Enterobacterales ailesi izolatlarında, akım sitometri kullanılarak karbapenemaz gen bölgesi varlığının hızlı tespiti ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile karşılaştırılarak etkinliğinin ve duyarlılığının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya Temmuz 2019-Temmuz 2020 tarihleri arasında Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi hastanesi yoğun bakım ünitelerinde yatmakta olan hastaların kan kültürlerinden elde edilen ve otomatize sistemde en az bir karbapeneme karşı az duyarlı veya dirençli olarak saptanan 45 Enterobacterales ailesine ait izolat ve karbapenem duyarlı 14 Enterobacterales ailesine ait izolat alındı. Negatif kontrol olarak Escherichia coli ATCC 25922 ve pozitif kontrol grubu olarak 18 izolat (KPC, NDM, IMP, VIM, OXA-48 gen bölgeleri içeren suşlar) kullanıldı. Disk diffüzyon yöntemi ile de duyarlılıkları saptandıktan sonra PCR ile karbapenemaz gen bölgeleri araştırıldı. Daha sonra akım sitometri yönteminde; hasta grubundan PCR ile OXA-48 saptanmış ve rastgele seçilmiş olan 8 izolat, kontrol grubundan 18 izolat (8'i KPC, 7'si NDM, birer izolat da VIM, IMP ve OXA-48 gen bölgelerini içeren) ve karbapenem duyarlı 14 izolat çalışıldı. Bakteri süspasiyonları meropenem+spesifik karbapenemaz inhibitörleri (EDTA yada APBA) ve temosilin ile muamele edilerek ölü/canlı hücre ayrımını göstermek için thiazole orange (TO) ve propidium iodide (PI) ile boyandı ve ölen hücre yüzdeleri hesaplandı. Akım sitometri yönteminin ROC analizinde; meropenem için PI ile boyanma oranları (%) cut-off değeri %14,37 olarak, spesifitesi %100 olarak ve sensitivitesi %65 olarak bulundu. Akım sitometri yönteminin karbapenemaz gen bölgesini tespitinde PCR ile iyi düzeyde uyumlu olduğu saptandı. Birçok hücreyi çok yönlü hızlı analiz etmesi, PCR sonuçlarıyla uyumunun yüksek olması nedeniyle akım sitometri antimikrobiyal duyarlıkları ve dirençlerinin tespitinde geliştirilmeye açık bir yöntem olmaya devam edecektir.

Abstract:
Infections due to carbapenem-resistant Enterobacterales, which have increased worldwide in recent years, are a cause for concern. Especially carbapenemase production is the most important mechanism of carbapenem resistance seen in the Enterobacterales family. Lots of phenotypic and genotypic methods are used in laboratories to detect carbapenemases. In this study, it was aimed to rapidly detect the presence of the carbapenemase gene using flow cytometry in Enterobacterales family isolates and to evaluate its efficacy and sensitivity by comparing it with polymerase chain reaction (PCR). 45 isolates belonging to Enterobacteriales family detected low susceptable or resistant at least one carbapenem group antibody and 14 carbapenem susceptible isolates belong to Enterobacteriales in automatized system from blood cultures of hospitalized patients in intensive care units of Gaziantep University Faculty of Medicine Hospital between July 2019 and July 2020. Escherichia coli ATCC 25922 used as negative control and 18 isolates (strains include KPC, NDM, IMP, VIM, OXA-48 gene regions) as positive control. Carbapenemase gene regions were investigated by PCR after their susceptiblity was determined by the disk diffusion method. Then in flow cytometry method; eight isolates of OXA-48 detected by PCR randomly selected from the patient group and 18 isolates from the control group (8 KPC, 7 NDM, one isolate each VIM, IMP and OXA-48) carbapenem susceptible 14 isolates were studied. Bacterial suspensions were treated with meropenem + specific carbapenemase inhibitors  (EDTA or APBA) and temocillin, stained with thiazole orange (TO) and propidium iodide (PI) to demonstrate dead/alive separation, and the percentage of dead cells was calculated. In the ROC analysis of flow cytometry method, PI staining rate (%) for meropenem was found to have a cut-off value of 14.37%, specificity as 100% and sensitivity as 65%. It was found that the results of flow cytometry method well compatible with PCR in determining of the carbapenemase gene region. Flow cytometry will continue to be a method open to improvement in the detection of antimicrobial susceptibility and resistance due to its versatile rapid analysis of many cells and its high compatibility with PCR results