Embriyo atık kültür sıvısının Raman spektroskopisi ile analizi
Waste liquid embryo samples' measurements analysis with Raman spectroscopy
Yazar: TUĞÇE PINAR ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. GÜNAY BAŞAR
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Fizik Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyofizik = Biophysics

Özet:
Raman spektroskopisi, moleküllerin titreşim spektrumlarını inceleyerek ışığın elastik olmayan saçılma yapmasına dayanan spektroskopik bir yöntemdir. Işık saçılırken büyük bir kısmının enerjisi maddeyle etkileşen ışığın enerjisiyle aynı olmaktadır. Bu saçılma elastik bir saçılmadır ve Rayleigh saçılması olarak bilinmektedir. Işığın çok küçük bir kısmının ise saçılırken edindiği enerji maddeyle etkileşirken sahip olduğu enerjiden farklıdır. Bu durumda ışık elastik olmayan bir saçılma yapmaktadır. Bu saçılmaya Raman Saçılması denir. Gelen ışık ve saçılan ışık arasındaki enerji farkı, molekülün titreşim enerji seviyeleri arasındaki enerji farkına bağlıdır. Bu yüzden Raman saçılma bantları moleküllerin karakteristiğini açıklar ve parmak izi niteliğindedir. Raman spektroskopisi biyolojik sistemler için yapılan ölçümlerde iyi sonuçlar vermektedir.
Bu tez çalışması kapsamında biyolojik moleküler yapıda olan embriyo atık kültür sıvısının içerdiği proteinler, lipitler ve amino asitler hakkında bilgi edinebilmek için Raman spektroskopisi ile ölçümler alınmıştır. Embriyo atık kültür sıvısı örneklerinin Raman spektrumları ölçülerek, Raman bantları literatürdeki bantlarla karşılaştırılarak amino asit bantları ve lipit bantlarının hangileri olduğuna dair tahmini bir belirleme yapılmıştır. Tez çalışmasının bir basamağını oluşturan bilimsel araştırma projesinin genel amacı embriyoyu çevreleyen atık kültür ortamının Raman spektroskopisi ile değerlendirilmesi ve embriyo etrafındaki kültür ortamının spektroskopik yöntemle incelenmesi ile embriyo seçimi yapılmasıdır. Embriyo atık kültür sıvısı örnekleri İstanbul Üniversitesi Çapa Tıp Fakültesi Tüp Bebek Kliniği'nden alınmış ve sıvı azot içerisinde İstanbul Teknik Üniversitesi Lazer Spektroskopi Laboratuvarı'na ulaştırılmıştır. Tüp Bebek Kliniği'nde iki farklı gruba ayrılarak gelişmesini devam ettirme ihtimali yüksek olan örnekler Grade1 (G1), daha az ihtimali olan örnekler de Grade2 (G2) olacak şekilde mikroskobik yöntemlerle sınıflandırılmışlardır. Embriyo atık kültür sıvısı örneklerinin Raman spektrumları 786 nm dalga boyuna sahip bir diyod lazer kullanılarak ölçülmüş ve önişlemler uygulandıktan sonra istatistiksel analizleri yapılmıştır. 
Aynı ölçüm hücresi ile her bir hastaya ait örnek ölçümleri ve arka plan (su) ölçümleri alınmıştır. Her hasta için farklı ölçüm hücresi ile ölçüm alınmıştır. Farklı ölçüm hücreleri ile ölçüm yapmanın etkisini test etmek için embriyo atık kültür sıvısı örneklerini ölçtüğümüz disklerin her birinin boşken spektrumları alınarak farklılıklar incelenmiştir. 
Embriyo atık kültür medyası bileşenlerinin hangi konsantrasyona kadar istatistiksel analizlerde ayrışabilir olduğunu anlamak için model bir çözelti hazırlanmıştır. Bu çözeltiyi oluştururken amino asitlerden histidin ile birkaç amino asit karışımından oluşan ve biyolojik sistemlerle yapılan ölçümlerde protein konsantrasyonu standardizasyonu için kullanılan bovin serum albümin kullanılmıştır. Histidin doymuş sıvı çözeltisinin farklı konsantrasyonları ile bovin serum albümin doymuş sıvı çözeltisinin karıştırmasıyla 3 farklı karışım elde edilmiştir. Bovin serum albümin ve histidin sıvı çözeltilerinin %50, %10 ve %2 konsantrasyondaki karışımları ölçüm hücresi ile ölçülmüştür. Ölçümlere embriyo atık kültür sıvısı örneklerine yapılan  
önişlemler uygulanmıştır. Konsantrasyondaki farklılıkların istatistiksel analizler uygulandıktan sonraki gözle görünür ayrıştırılabilirliği bize embriyo atık kültür sıvısı bileşenlerinden olan amino asit ve lipitlerin çok düşük oranlarda var olduklarında da tespit edilebildikleri fakat daha düşük konsantrasyona sahip olduklarında ayrışamadıkları konusunda yol gösterici olmuştur.
Embriyo atık kültür sıvısının önişlemler uygulanmış Raman ölçümlerine temel bileşenler analizi (PCA) uygulanmıştır. Temel bileşenler analizi (PCA)  skorlarına göre elde edilen grafiğin x ve y eksenleri olan PC1 ve PC2 dataları kullanılarak elde edilen doğrusal ayırt etme analizi (LDA) sonuçlarına göre hassasiyet ve ayırt edilebilirlik oranları elde edilmiştir. Analiz sonuçlarına göre hassasiyet oranı %75, ayırt edilebilirlik oranı ise %73 olmaktadır.
Histidin ve bovin serum albümin çözeltilerine de temel bileşenler analizi (PCA) ve doğrusal ayırt etme analizi (LDA) uygulanmıştır. Doğrusal ayırt etme analizi (LDA) sonuçlarına göre hassasiyet oranları; %50, %10 ve %2 konsantrasyondaki ölçümler için %100 oranındadır. Ayırt edilebilirlik oranları da %50, %10 ve %2 konsantrasyondaki ölçümler için %100 olmaktadır. Konsantrasyon oranlarını bildiğimiz ve embriyo atık kültür sıvısıyla aynı yöntemle ölçüp analiz ettiğimiz çözeltiler başarılı şekilde ayrışmışlardır. Buna göre ölçtüğümüz sıvı içerisinde herhangi bir bileşen %2 oranına kadar bulunduğunda Raman bantları gözlenebilmekte ve ayırt edilebilmektedir.

Abstract:
WASTE LIQUID EMBRYO SAMPLES' MEASUREMENTS AND ANALYSIS OF MEASUREMENT TECHNICS WITH RAMAN SPECTROSCOPY
ABSTRRaman spectroscopy is a spectroscopic method which is based on measuring the scattered light from the molecules of samples. It focuses on the vibrational transitions of the molecules in the sample. Raman spectroscopy is based on the measurement of light scattered from molecules that were exposed by an intense monochromatic light source. A superior property of Raman spectroscopy is, because it does not obstruct the spectra with glass and quartz, water can be used as resolvent. Thus, both qualitative and quantitative examinations of organic and inorganic samples can be measured. Raman spectroscopy provides an intense beam of monochromatic light source to measure the carrying out of the scattered molecules. 
By studying the vibration spectrum of the molecule is based on a spectroscopic method not inelastic scattering of light. This is a scattering of elastic scattering and is known as Rayleigh scattering. A very small portion of the light makes inelastic scattering. This scattering is called Raman scattering. The energy difference between the incident beam and the scattered beam depends on the energy difference between the vibrational energy levels of molecules. This explains why the band Raman scattering characteristics of the molecule and are part of the fingerprint. 
Raman spectroscopy gives very good results in biological systems. Infrared spectroscopy and Raman spectroscopy is one of the vibrational spectroscopic techniques. Were studied to identify differences in profiles with different reproductive potential of embryos. This technique has been implanted with embryos differences in profiles. Datum were used to measure the reproductive potential of embryos after the other.
Evaluation by the Raman spectroscopy of this study surrounds overall objective of embryo for scientific research project, which is a stage of the measurements we did in the culture medium for embryo waste culture medium and maturation for each embryo is the comparison of pregnancy and live birth rates. Embryo culture medium surrounding the embryo is to make the selection by examination with spectroscopic methods.
In this study, we measured Raman spectra of embryo culture liquids and compared Raman spectra of embryo liquids in different grades after spectral analysis. In the spectrum of scattered light, there has been a frequence shift observed with respect to the incoming light. 
This situation has been correlated with the chemical structure of the molecules and accordingly vibrational and rotational frequencies. Embryo culture liquid samples are prepared for the Raman measurements in IVF clinics of Istanbul University Faculty of Medicine. In Laser Spectroscopy Laboratory of Istanbul Technical University embryo culture liquid waste samples' Raman spectras were measured by using discs. In IVF clinics, embryo culture liquid samples are classified as Grade1  ( G1 ) and Grade2 ( G2 ). G1 has a high potential to give birth more succesfully than G2. Components in the samples are compared with the value measured on the Raman spectrum and statistical procedures as principal component analysis (PCA) and linear discriminant analysis (LDA) have been performed. The same measuring cell is used  
for the sample and back ground (water)  measurements of each patient measurements. 
Measurements were taken for each patient with different measuring cell. Taking into account the differences in the spectrum of the disc to test the effect of making measurements with different measuring cells, empty discs were examined. Consisting of a mixture of several amino acid to form a model waste embryo culture media and biological systems with standardized protein concentrations used for the measurements made on the bovine serum albumine was used. Embryo waste follicle test the reliability of the results we obtained from the analysis of the liquid and mix with the lowest measurements in order to determine which models could be observed until the konsantasyo Raman band is made in reducing the amount of amino acids that we prepared.
The amino acid sequence of bovine serum albumine and histidine aqueous solutions at %50, %10, %2 concentrations were measured as a model for the suspectivity of the statistical analysis of embryo culture liquid waste samples by using discs. Individual components in the examples are compared with the value measured on the Raman spectrum and statistical procedures have been performed. 
A data graph is reduced by principal component analysis (PCA) is carried out to the smaller size of data a simple classification. Actions that have made a mathematical analysis of the components is to associate with each other variables with this method to determine priorities and a matrix to calculate the covariance matrix. Then finds the eigenvalues and eigenvectors of the covariance matrix and is the average of the covariance matrix. The average of the covariance matrix with the eigenvectors of the covariance matrix is able to analyze multiplying.
Linear discrimination analysis (LDA) is an analysis method that uses statistical data of objects or events to find the linear combination of two or more classes. The resulting combinations are used as a linear classifier to make size reduction in advance to distinguish objects. Linear discriminant analysis, measurement of linear analysis is a variable that refers to a method of expression, while analysis of variance dependent. However categorical independent variables and the dependent variables are continuous use. The difference between the data classes has been working explicitly modeling the post.
After statistical analysis PCA and LDA, we compared the sensitivity and susceptivity ratios for embryo culture liquid samples. Analysis showed that sensitivity ratio is %75 and susceptivity ratio is %73. This difference is not essential for class G1 and G2.
 As a model of embryo culture liquid waste samples, bovine serum albumine and histidine aqueous solutions at %50, %10 and  %2 concentrations, we also had statistical analysis as PCA and LDA. As a conclution sensitivity ratios for %50 concentration is %100,also for %10 and %2 concentrations is %100. Susceptivity ratios is also %100 for all concentrations. 
When histidine component %2 increase, it can be distinguished according to the statistical analysis of the Raman spectroscopic measurements. Observed after administration of 2% variation in concentration appears, while the separation of the embryos waste follicular fluid analysis measurement. They gave full decomposition concentration measurements up to 2%. PCA and LDA analyse methods could discriminate component comprises a compound of up to 2% concentration for our measurements. It shows that very low concentrations of changes in the components of the waste follicular fluid appears. For Grade1 and Grade2 classes of embryo waste samples, we had difficulties to discriminate with statistical analysis, because they are so similar to each other. The difference was not essential. As a result of our study, the microscobic classification in IVF clinic is not satisfaction, so that it would be investigated with Raman spectroscopy before transferring the samples.