Domates (Solanum lycopersicum) bitkisinde kuraklık stresi ile ilişkili mikrorna'ların analizleri
Analyses of microRNAs related to drought stress in tomato (Solanum lycopersicum) plants
Yazar: BİLGİN CANDAR ÇAKIR
Danışman: PROF. DR. ERCAN ARICAN ; DOÇ. DR. BAOHONG ZHANG
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Kuraklık bitki gelişimi ve verimliliğini olumsuz etkileyerek tarımsal üretimi önemli ölçüde sınırlandıran çevresel stres faktörlerinden biridir. Kuraklık stresine maruz kalan bitkiler transkripsiyonel, post-transkripsiyonel ve post-translasyonel düzeylerde gen anlatımlarını değiştirerek hücresel homeostazlarını yeniden ayarlamak zorundadırlar. MikroRNA'lar (miRNA) hedef mRNA'ların anlatımını degredasyon ve/veya translasyonel baskılama aracılığıyla post-transkripsiyonel düzeyde kontrol etmeleri nedeniyle ökaryotik kodlama yapmayan küçük düzenleyici RNA'ların önemli bir sınıfını oluşturmaktadır. Bitki miRNA'ları büyüme, gelişme, meyve olgunlaşması ve biyotik ve abiyotik stres yanıtlarında aktif rol oynar. Domates (Solanum lycopersicum) dünya genelinde ekonomik değeri yüksek tarla bitkilerinden biri olup genellikle kuraklık stresine karşı hassastır. Ancak domateste genom düzeyinde kuraklık yanıtında rol oynayan miRNA'lar henüz belirlenmemiştir. Bu tez çalışmasının amacı, kuraklık koşulları altında doku-spesifik domates miRNA'larının tanımlanması ve anlatımlarındaki değişimin belirlenmesidir. Bu kapsamda, öncelikle kuraklığa hassas (S. lycopersicum) ve toleranslı (S. lycopersicum var. cerasiforme) domates genotipleri %5 polietilen glikol (PEG) kullanılarak 7 gün süresince in vitro kuraklık stresine maruz bırakıldı. Ardından kök ve topraküstü dokuları kullanılarak küçük RNA (sRNA) ve degradom dizileme işlemleri gerçekleştirildi. Sekiz kitaplığa ait toplamda 192 387 328 temiz okuma elde edildi ve bu etiketlerin %94.78'i 20-24 nt aralığında kategorize edildi. Küçük RNA veri analizinin ardından, 578 aileye ait toplamda 699 bilinen miRNA tanımlandı ve 688 miRNA kuraklık stresine karşılık iki doku ve genotip arasında farklı anlatım yaptı. Ayrıca 189 yeni aday domates DOMATES (Solanum lycopersicum) bitkisinde kuraklık stresiyle ilişkili mikroRNA'ların analizleri  miRNA'sı da yeni nesil dizileme analizi ile tespit edildi. miRNA anlatımları rastgele seçilmiş 8 miRNA kullanılarak qRT-PZR ile valide edildi. Degradom dizileme analizi 64 miRNA'ya ait 59 kesim bölgesi ile 36 miRNA ailesine ait 44 hedef genin varlığını ortaya koydu. Kuraklık ile ilişkili hedef genlerin işlevsel karakterizasyonu amacıyla Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) yolak analizleri gerçekleştirildi. BCP (mavi bakır proteini), CSD (bakır/çinko süperoksit dismutaz, Cu/Zn-SOD), DRP (dehidrasyona yanıt oluşturan protein), HD-ZIP (homeodomain-lösin fermuar) ve SAUR (küçük oksin-uyarıcı RNA) gibi kuraklık yanıtı ve doku gelişimi ile ilişkili 23 gen sly-miR165, sly-miR166, slymiR398, sly-miR408 ve sly-miR9552'nin de dahil olduğu 53 miRNA tarafından düzenlendi. Ayrıca bitki hormonu sinyal iletim yolağında bulunan ABF (absisik asite yanıt oluşturan element bağlama faktörü), DELLA, JAZ (jasmonat ZIM-domain proteini) ve PP2C (protein fosfataz 2C) gibi genler sly-miR169, sly-miR172, sly-miR393 ve sly-miR5641 tarafından hedeflendi. Elde edilen bulguların gelecekteki bitki hormonu sinyal iletişim yolağı ile ilişkili kuraklık araştırmalarında kullanılmak üzere kuraklık yanıt genlerinin miRNA-aracılı düzenlenmesinin daha iyi anlaşılmasına ve kuraklığa toleranslı domates ıslahına katkı sağlaması beklenmektedir.

Anahtar kelimeler: Degradom, domates, kuraklık, mikroRNA, yeni nesil dizileme.

Abstract:
Drought is one of the destructive environmental stress factors that restricts crop yield affecting plant growth and productivity. Plants exposed to drought stress have to readjust cellular homeostasis by altering gene expression programmes at transcriptional, post-transcriptional and post-translational levels. MicroRNAs (miRNAs) are major class of eucaryotic small regulatory non-coding RNAs since they control the expression of their target mRNAs at posttranscriptional level via degradation and/or translational inhibition. Plant miRNAs play an active role in growth, development, fruit ripening and biotic and abiotic stress responses. Tomato (Solanum lycopersicum) is an economically important field crop in worldwide and generally sensitive to drought stress. However, genome-wide drought-responsive miRNAs in tomato has not been identified yet. The goal of this thesis is to identify tissue-specific tomato miRNAs and their expression alterations under drought conditions. Firstly, drought-sensitive (S. lycopersicum) and -tolerant (S. lycopersicum var. cerasiforme) tomato genotypes were exposed to in vitro drought stress with 5% polyethylene glycol (PEG) for 7 days and small RNA (sRNA) and degradome sequencing were carried out using root and upground tissues. Totally 192 387 328 clean reads were obtained from eight libraries and 94.78% of these tags were categorized as 20–24 nt. After small RNA data analyses, a total of 699 known miRNAs belong to 578 families were identified and 688 miRNAs expressed differentially between two genotypes and both tissues in response to drought stress. Also, 189 novel tomato miRNAs were analyses of microRNAS related to drought stress in tomato (Solanum lycopersicum) PLANTS detected. miRNA expressions were validated with qRT-PCR using randomly selected 8 miRNAs. Degradome sequencing analysis revealed 59 cleavage sites belong to 64 miRNAs and 44 target genes of 36 miRNA families. Gene Ontology (GO) enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analyses were carried out for the functional characterization of drought-associated target genes. Twenty-three genes associated with drought response and tissue development such as BCP (Blue copper protein), CSD (Copper/zinc superoxide dismutase, Cu/Zn-SOD), DRP (Dehydration-responsive protein), HDZIP (homeodomain-leucine zipper), SAUR (Small auxin-up RNA) were regulated by 53 miRNAs including sly-miR165, sly-miR166, sly-miR398, sly-miR408 and sly-miR9552. Additionally, genes like ABF (Abscisic acid-responsive element-binding factor), DELLA, JAZ (Jasmonate ZIM-domain protein) and PP2C (Protein phosphatase 2C) from plant hormone signal transduction pathway were targeted by sly-miR169, sly-miR172, sly-miR393 and slymiR5641. These results will contribute to better understanding of miRNA-mediated regulation of drought-responsive genes for future drought tolerance research associated with plant hormone signal transduction pathway as well as drought-tolerant tomato breeding. 

Keywords: Degradome, tomato, drought, microRNA, next generation sequencing.