Serumdan NAD+ glikohidrolazın saflaştırılması
Purfication of NAD+ glycohydrolase from serum
Yazar: ÖZLEM COŞKUN
Danışman: PROF. DR. RÜSTEM NURTEN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Biyofizik = Biophysics

Özet:
Serumdan NAD+ glikohidrolaz enzimini saflaştırılması amacıyla sağlıklı bireylerden elde edilen serum; sırasıyla amonyum sülfat çöktürmesi, Cibacron Mavisi 3GA, Sephadex G-1 00(moleküler-elek kromatografisi), elektro odaklama işlemlerine tabi tutularak saflaştırı İmaya çalışıldı. Saflaştırma işlemi sonrası elede edilen kesimlerin SDS-PAGE analizi -39.000 Da molekül ağırlıklı bir proteinin saf olarak elde edilmiş olduğunu ortaya çıkardı. Saflaştırma sonrası NAD+ glikohidrolaz enziminin başlangıç serum kesimine oranla 483 kat artmış ve saflaşmanın %1 verimle gerçekleşmiş olduğu bulundu. Serum enziminin saflaşmasına koşut olarak eritrosit membranına bağlı NAD+ hidrolaz enziminin saflaştırılması amacıyla eritrosit posasından çözündürülen protein kesimi sırasıyla Hidroksilapatit, Sephadex G-1 00 (moleküler-elek kromatografisi), IDA(çökeltmeli yıkama işlemi), oktil agaroz, DEAE selüloz kolon kromatografisi ve ikinci kez yinelenen Sephadex G-1 00 aşamalarından geçirilerek saflaştırılmaya çalışıldı. Saflaştırma sonrası yapılan SDS-PAGE analizinde yaklaşık 45.000 Da molekül ağırlığına sahip bir protein bandı elde edildi. İnsan lenfosit yüzey antijeni CD38'e özgü tek klon antikoru OKT 10 ile yapılan Western emdirim işlemiyle 45.000 Da'luk protein bandının CD38'e karşılık geldiği bulundu. Membrana bağlı NAD+ glikohidrolaz etkinliği, saflaştırma işlemleri sonrası başlangıç membran posası kesimine oranla 257 kat artmış olarak bulundu. Saflaştırmanın %1,4 verimle gerçekleşmiş olduğu belirlendi. NAD+ glikohidrolaz eritrosit membranına bağlı (CD38'e karşılık gelen) türü ile serumda çözünmüş türü arasındaki molekül ağırlık farkı çözünmüş türün, CD38'in, eritrosit yaşlanması sürecinde proteolitik kırpılması sonucu açığa çıkmış türevi olabileceğini düşündürmüştür. 72

Abstract:
Serum NAD+ glycohydrolase was purified from serum samples collected from healthy individuals by use of a procedure which involved (NHU^SC^ fractionation, Cibacron Blue 3GA and Sephadex G-100 column choromatography and electro focusing steps. The final step was followed by a second Sephadex G- 100 column choromatography in order to remove ampholines from electro focusing step. NAD+ glycohydrolase protein thus purified was 483 fold enriched in comparison to serum fraction and its purification yield was %1. It appear to be homogenous and to have a molecular weight of 39 kDa, as revealed by SDS- PAGE analysis. In paralllel to the purification of serum enzyme, NAD+ glycohydrolase was also purified from erythrocytes. The membrane protein fraction solubilized from erythrocyte ghosts was subjected to purification by successive steps of hydroxyiapatite fractions, Sephadex G-100 column choromatography, batch fractionation on IDA, octyl agarose and DEAE-cellulose choromatography and followed finaly by a second gel filtration Sephadex G-100 column. SDS-PAGE analysis indicated that purified membrane enzyme had molecular weight of 45 kDa and subsequent Western blot analysis using monoclonal antibody OKT10 verified that it corresponded to human CD38. The difference in molecular weight values found for the membrane bound versus solubilized forms of NAD+ glycohydrolase is probably due to the release of the latter by a proteolytic cleavage of CD38 in the course of erythrocyte aging and.respectively turnover. 73