Bazı Bacillus türlerinden lipaz enziminin rekombinant olarak üretimi, karakterize edilmesi ve immobilizasyonu
Production, characterization and immobilization of lipase enzymes as reacombinant from some Bacillus species
Yazar: KEZBAN YILDIZ DALGINLI
Danışman: PROF. DR. ONUR ATAKİŞİ
Kafkas Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Bacillus = Bacillus ; Karakterizasyon = Characterization ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production ; İmmobilize enzimler = Immobilized enzyme

Özet:
Lipazlar (triaçilgliserol açilhidrolaz, EC 3.1.1.3),  hidroliz ve sentez reaksiyonlarını katalizleyen ve birçok endüstriyel sürecin yanı sıra biyoteknolojik uygulamalarda önemli bir role sahip enzimlerdir.  Bu çalışmada, Bacillus thermocatenulatus (BTL-2)  ve Bacillus pumilus MBB03'te bulunan lipazın rekombinant olarak üretimi, karakterizasyonu ve immobilize edilmesi hedeflendi. Bu amaçla BTL2 ve B.pumilus MBB03'te bulunan lipaz geni ekspresyon vektörlerine klonlandı. Bu vektörler,  E.coli BL21(DE3) kompetan hücrelerine transforme edilerek Ni-NTA afinite kolonu ile saflaştırıldı. Üretilen enzimlerin alginat+jelatin jel karışımında immobilizasyonu, immobilizasyon optimizasyonu ve hem serbest hem de immobilize enzimin karakterizasyon ölçümleri yapıldı. SDS-PAGE analizi ile BTL2 ve B. pumilus MBB03 lipazlarının molekül ağırlığı sırasıyla yaklaşık 43 kDa ve 22 kDa saptandı. BTL2' den elde edilen serbest ve immobilize enzimin özgül aktivitesi sırasıyla 10.9 U/mg ve 6.9 U/mg B. pumilus MBB03 serbest ve immobilize enzimin özgül aktivitesi sırasıyla 4.6 U/mg ve 3.3 U/mg olarak tespit edildi. Optimum sıcaklık ve pH değerleri BTL2 ve B. pumilus MBB03 serbest (60 oC, 50 oC ve pH 9.0, pH 8.0) ve immobilize enzimler için (60-70 oC, 55 oC ve pH 9.5, pH 8.5) belirlendi. Km ve Vmaks değerleri, BTL2 ve B. pumilus MBB03 sırasıyla serbest enzimler için (0.146 mM, 2.504 U/mL ve 0.055 mM, 0.636 U/mL) ve immobilize enzimler için (0.123 mM, 0,220 U/mL ve 0.128 mM, 0.119 U/mL) saptandı. Isıl kararlılık, BTL2 ve B.pumilus MBB03 serbest ve immobilize enzimlerin sırasıyla 40 ile 65 °C ve 40 ile 60 °C arasında, pH kararlılık ise +4 °C' de pH 7.0-11.0, +4 °C' de pH 8.0-10.0 aralığında saptandı.
Elde edilen serbest ve immobilize lipazların geniş ısıl ve pH kararlılığı, çeşitli metal iyonları, organik çözücü deterjan formülasyonları içinde stabilitesini koruması ve diğer önemli özelliklerinden dolayı çeşitli endüstriyel uygulamalarda potansiyel olarak kullanımının uygun olabileceği sonucuna varıldı.

Abstract:
Lipases (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) are enzymes which act as catalysts during hydrolysis and synthesis of reactions and have significant roles in biotechnical applications as well as many industrial processes. This study aims to the recombinant production, characterization and immobilization of the lipase which exists in the Bacillus thermocatenulatus (BTL2) and Bacillus pumilus MBB03. In this respect, the lipase gene in BTL2 and B.pumilus MBB03 were cloned into expression vector. These vectors were transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells and purified by Ni-NTA affinity column. The produced enzymes were immobilized in the alginate and gelatin mixture, and the optimization of immobilization process was carried out and characterization measurements of both free and immobilized enzymes were performed. The molecular weights of BTL2 and B.pumilus MBB03 lipases were calculated approximately 43 kDa and 22 kDa, respectively on SDS-PAGE analysis. The specific activities of free and immobilized BTL2 enzyme were detected as 10.9 U/mg and 6.9 U/mg U/g, respectively. The specific activities of free and immobilized B.pumilus MBB03 were determined as 4.6 U/mg and 3.3 U/g, respectively. The optimum temperature and pH values for BTL2 ve B. pumilus MBB03 were recorded as (60 oC, 50 oC and pH 9.0, pH 8.0) for free enzymes and (60-70 oC, 55 oC ve pH 9.5, pH 8.5) for immobilized enzymes. Km and Vmax values for free BTL2 were 0.146 mM and 2.504 U/mL, respectively; and these values for B. pumilus MBB03 were calculated as 0.055 mM and 0.636 U/mL, respectively. Km and Vmax values for immobilized enzymes were detected as 0.146 mM and 2.504 U/mL for BTL2; and 0.055 mM, 0.636 U/mL for B. pumilus MBB03, respectively. Thermal stability for both BTL2 and B. pumilus MBB03 for free and immobilized enzymes were recorded between 40-65 °C and 40-60 °C, respectively.  pH stability for BTL2 was pH 7.0-11.0 at +4 °C for both free and immobilized enzymes, and it was pH 8.0-10.0 at +4 °C for B. pumilus MBB03 for both free and immobilized enzymes.
In this study, we concluded that wide ranges of thermal and pH stabilities of free and immobilized lipases, and their abilities to protect their stabilities in various metal ions and organic solvent detergent formulas and other significant qualities make them potentially suitable for many industrial applications