Bakteriyel gastorenterit etkenlerinin tespitinde BD mx enterik bakteriyel panel ile rutin kültür yönteminin karşılaştırılması
Comparison of routine culture methods with bd MAX enteric bacterial panel for the detection of causative agents of bacterial gastroenteritis
Yazar: VİLDAN YAVUZ ÖZER
Danışman: DOÇ. DR. ELİF AKTAŞ SEPETCİ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Şişli Hamidiye Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bakteriyel enfeksiyonlar = Bacterial infections ; Gastroenterit = Gastroenteritis ; Kültür ortamı = Culture media ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis teknikleri ve prosedürleri = Diagnostic techniques and procedures ; Teşhis testleri = Diagnostic tests

Özet:
Bakteriyel gastroenterit etkenleri, yüksek morbidite ve mortalite oranları ile seyreden, dünya çapında önemli sağlık sorunlarına neden olmaktadırlar. Bu etkenlerin zamanında tespit edilememesi ampirik antibiyotik tedavilerinde artışa yol açmakta, uygunsuz antibiyotik kullanımıyla dirençli etkenler oluşmakta ve dünya çapında ciddi ekonomik kayıplar ortaya çıkmaktadır. Bu çalışmada amaç; bakteriyel gastroenterit etkenlerinin tespitinde, hızlı tanı amacıyla kullanıma sunulan, moleküler yöntem prensibi ile çalışan BD MAX enterik bakteriyel panel (BD MAX EBP) ile standart yöntem olan kültürün etkinliğini karşılaştırmaktır.

Bu amaca yönelik olarak; Ağustos 2016-Şubat 2017 tarihleri arasında T.C. Sağlık Bilimleri Üniversitesi Şişli Hamidiye Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı'na gastroenterit ön tanısıyla kültür için gönderilen 292 dışkı örneği değerlendirilmiştir. Bu örneklerin 220'si, korumasız dışkı kaplarına konularak,  72'si ise Cary-Blair taşıma besiyerinin ve korumasız dışkı kaplarının her ikisine de konularak laboratuvara ulaştırılmıştır. Örnekler, BD MAX EBP ile üretici talimatları doğrultusunda çalışılmış ve eş zamanlı olarak örneklerin Campylobacter, Salmonella ve Shigella için kültürü yapılmıştır. Bakteri tanımlanmasında; biyokimyasal testler, serotiplendirme, antimikrobiyal duyarlılık testleri ve matriks aracılı lazer dezorbsiyon/iyonizasyon uçuş zamanlı kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) kullanılmıştır. Ayrıca dışkı havuzlama çalışması yapılmıştır. Bu amaçla enterik patojenler açısından negatif olduğu bilinen dışkı örnekleri kullanılmıştır. Bu dışkı örnekleri ile bilinen Campylobacter, Salmonella ve Shigella suşları karıştırılarak 1x1000000 CFU/mL (koloni oluşturan birim/mililitre)'den 1x10 CFU/mL'ye kadar azalan konsantrasyonlarda bakteri içeren dışkı havuzları oluşturulmuştur. Bu örneklerin her biri hem kültürde hem BD MAX EBP ile çalışılmıştır. Böylece bu yöntemlerin saptayabildiği en düşük bakteri konsantrasyonları tespit edilmiştir.

Dışkı havuzlama çalışmasında, Campylobacter için, kültürde 100000 CFU/mL, BD MAX EBP'de ise 1000 CFU/mL konsantrasyona kadar pozitiflik saptanmıştır. Salmonella için, kültür ve BD MAX EBP'nin her ikisinde de 10000 CFU/mL konsantrasyona kadar pozitiflik saptanmıştır. Shigella için ise, kültürde 105 CFU/mL, BD MAX EBP'de ise 1000 CFU/mL konsantrasyona kadar  pozitiflik saptanmıştır.

Korumasız dışkı kaplarında laboratuvara ulaştırılan  örneklerde; Campylobacter için kültür pozitifliği ile BD MAX EBP sonucu arasında anlamlı bir fark olduğu tespit edilmiştir (p<0,05). Kültürde bir (% 0,5), BD MAX EBP'de dokuz (% 4,1) Campylobacter  saptanmıştır. Kültürde Salmonella pozitifliği görülmezken; BD MAX EBP'de üç (% 1,4) Salmonella  saptanmıştır.  Shigella için kültür pozitifliği ile BD MAX EBP sonucu arasında da anlamlı bir fark olduğu tespit edilmiştir (p<0,05). Kültürde bir ( % 0,5), BD MAX EBP'de 19 (% 8,6) Shigella saptanmıştır. Laboratuvara taşıma besiyerinde gelen örneklerde, Campylobacter için kültür pozitifliği ile BD MAX EBP sonucu arasında anlamlı bir fark olduğu tespit edilmiştir (p<0,05). Kültürde beş (% 6,9), BD MAX EBP'de 13 (% 18,1) Campylobacter saptanmıştır. Salmonella için kültür pozitifliği ile BD MAX EBP sonucu arasında anlamlı bir fark olmadığı tespit edilmiştir (p>0,05). Hem kültür sonucunda hem de BD MAX EBP sonucunda iki (% 2,8) Salmonella tespit edilmiştir. Hem kültür hem de BD MAX EBP sonucunda Shigella pozitifliği görülmemiştir. Örnek gelme şekline göre, taşıma besiyerinde gelen örneklerde kültür sayısı (yedi) ve pozitiflik oranı (% 9,7), korumasız dışkı kabında gelen örneklerin sayısından (iki) ve pozitiflik oranından  (% 0,9) anlamlı düzeyde yüksektir (p<0,05).

Sonuç olarak; çalışmamızda elde edilen tüm veriler birlikte değerlendirildiğinde, moleküler temelli hızlı tespit sistemi olan BD MAX EBP sisteminin, çalışma kapsamındaki gastroenterit etkeni bakterileri tespit etme oranı, geleneksel kültür yöntemlerine göre daha yüksek bulunmuştur. Moleküler yöntemler etkenin nükleik asidinin gösterilmesi prensibine dayanan, duyarlılıkları ve özgüllükleri yüksek yöntemlerdir. Bu yöntemlerin en önemli avantajı, dışkıda bulunan etken mikroorganizmanın canlı ya da ölü olmasından etkilenmemeleridir. Buna rağmen kültür temelli yöntemler, örneğin laboratuvara gönderme süreçlerinden örnek taşıma yöntemine kadar, etken mikroorganizmanın canlılığını etkileyecek birçok değişkenden etkilenebilmektedir. Çalışmamızdan elde ettiğimiz bulgular, dışkı örnek taşıma ortamlarının geleneksel kültür yöntemlerinin sonuçlarını önemli oranda etkilediğini göstermektedir. Buna rağmen moleküler temelli yöntem taşıma ortam değişikliğinden etkilenmemiştir. Ek olarak azalan konsantrasyonlarda bakteri yoğunluğuna sahip dışkı örneklerinde, BD MAX EBP'nin tespit oranlarının kültüre göre yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu sonuçların, BD MAX EBP'nin rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanımının uygunluğu adına daha fazla çalışmanın yapılması yönünde teşvik edici olduğu ve konu hakkında çalışma yapmak isteyeceklere katkılar sağlayacağı öngörülmektedir.

Abstract:
Bacteriel gastroenteritis causes important global health problems with high morbidity and mortality rates. Delays in identification of these infectious agents causes inappropiate empiric antibiotic use which leads to increase in antibiotic rezistance and serious global economic costs. In this study we aimed to compare the efficiency of standard culture method with BD MAX enteric bacterial panel (BD MAX EBP) that uses molecular testing method for the rapid identification. 

A total of 292 stool samples which were obtained from T.C. Sağlık Bilimleri University Sisli Hamidiye Etfal Training and Research Hospital Clinical Microbiology Laboratory with a diagnosis of gastroenteritis between August 2016 and February 2017 were examined in this study. 220 of these 292 samples were taken in unpreserved stool sample container and the remain 72 samples were taken both in Cary-Blair transport medium and unpreserved stool sample container. Samples were tested with the BD Max EBP assay as directed in the manifacturer's instructions and simultaneously cultures from the samples for Campylobacter, Salmonella ve Shigella were also performed. Biochemical tests, serotyping, antimicrobial susceptibility testing, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) were used for bacterial identification. Also pooling the stool samples was performed. For this aim the stool samples which were negative for enteric pathogen bacteria, were used. Stool sample pooling was performed by mixing these negative stool samples with Campylobacter, Salmonella and Shigella strains. These pools contains bacteria concentration between 1x1000000 CFU/mL(colony forming unit/mililiter) and 1x10 CFU/mL. Both bacterial culture and BD MAX enteric bacterial panel results from each of these samples were obtained. Thereby the lowest concentrations of bacteria in samples which can be detected by these two methods, were determinated. 
By stool sample pooling for Campylobacter in culture, a concentration of 100000 CFU/mL or more and in BD MAX EBP a concentration of 1000 CFU/mL or more provided positive results. For Salmonella in both culture and BD MAX EBP a concentration of 10000 CFU/mL or more provided positive results. For Shigella in culture a concentration of 100000 CFU/mL or more and in BD MAX EBP a concentration of 1000 CFU/mL or more provided positive results.
 
There was a statistically significant difference for Campylobacter between positive culture results and BD MAX EBP positive results from samples in unpreserved stool sample container (p<0.05). Campylobacter was detected in one culture (0.5 %), and nine BD MAX EBP tests (4.1 %). Salmonella was not detected in culture but three (1.3 %) BD MAX EBP tests were positive for Salmonella. There was also a statistically significant difference for Shigella between positive culture results and BD MAX EBP positive results (p<0.05). Shigella was detected in one culture (0.5 %), and 19 BD MAX EBP tests (8.6 %). There was a statistically significant difference for Campylobacter between positive culture results and BD MAX EBP positive results from samples in transport medium (p<0.05). Campylobacter was detected in five culture (6.9 %), and 13 BD MAX EBP tests (18.1 %). There was not a statistically significant difference for Salmonella between positive culture results and BD MAX EBP positive results (p>0.05). Two (2.8 %) Salmonella positive results were detected on both culture results and BD MAX EBP tests. No any Shigella positive results were detected on both culture results and BD MAX EBP tests. Regarding transport materiel of samples, culture positive samples rate (9.7 %) (n:7) of samples which were transported in transport media was significantly higher than culture positive samples rate (0.9 %) (n:2) of samples which were transported in unpreserved stool sample container (p<0.05). 

As a result; BD MAX EBP, that uses molecular testing method for the rapid identification, was found to be has a higher sensitivity rate for the detection of bacteria causing gastroenteritis when compared with conventional culture methods. Molecular methods has higher sensitivity and spesifity rates which detects the infectious agent's nucleic acide. The most important advantage of these molecular methods is that, dead or alive infectious agents do not change the results. However culture methods can be affected by many processes as obtaining samples and transportation of samples to laboratory which affects the viability of infectious agent. Our findings also show that the stool sample transport methods can significantly affect conventional culture method results. But molecular based system was not influenced by such transport process changes. Besides this, detection rates of BD MAX EBP are found to be higher than the detection rates of culture methods in the samples which contain relative lower concentrations of bacteria. These findings suggest that BD MAX EBP comprises for routine microbiology laboratory use and further investigations about this issues is needed.