Klinik örneklerden izole edilen streptococcus pneumoniae serotiplerinin heterodupleks yöntemiyle serotiplendirilmesi
Serotyping of streptococcus pneumoniae serotypes which were isolated from clinical samples by heteroduplex method
Yazar: DİDEM ÖZTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. AHMET PINAR
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Son yıllarda Streptococcus pneumoniae kökenlerinin antibiyotiklere karşı dirençlerinde artışlar görülmesi, pnömokok enfeksiyonlarının tedavisinde önemli bir sorun haline gelmiştir. Bu nedenle pnömokok enfeksiyonlarından korunmada aşılama önem kazanmıştır. Pnömokokların kapsül sentezinden sorumlu olan cps gen bölgesinde sıklıkla rekombinasyonlar görülmesiyle kökenler arasında serotip değişimleri gözlenmekte ve aşıda bulunmayan serotiplere dönüşümler saptanmaktadır. Geliştirilecek aşıların bu serotipleri kapsaması, aşının etkinliği açısından önemlidir. Yeni kökenlerin yanında dirençli serotiplerin de belirlenmeleri ve prevalanslarındaki değişimlerin saptanması için epidemiyolojik izlemler yapılmalıdır. Pnömokokların epidemiyolojisinde kapsül polisakkaritine bağlı serotiplendirmenin önemli bir yeri olup günümüzde serotiplendirme kapsül şişme reaksiyonu ile yapılmaktadır. Bu çalışmada, pnömokokların cps gen bölgesi hedeflenerek geliştirilmiş heterodupleks analiziyle pnömokokal serotiplerin belirlenmesi yöntemi kullanılarak ülkemizde sıklıkla saptanan serotiplerden 3, 5, 7, 8, 9, 11, 15 ve 23'e ait 71 izolatla çalışılmış ve geliştirilen bu yöntemin güvenilirliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Öncelikle, pnömokok stokları kültürde üretilerek saf koloniler elde edilmiştir. Pnömokokların DNA'ları otomotize nükleik asit izolasyon sistemi ile saflaştırıldıktan sonra serotipler arası heterojenitenin saptandığı korunmuş genlerden cpsA-cpsB'ye özgül primerler kullanılarak PZR yöntemi ile çoğaltılmışlardır. Çoğaltılan ürünler serotip 1 ürünleri ile heterodupleks analizine alınmış ve %8'lik poliakrilamid jel elektroforezinde yürütüldükten sonra görüntülenmişlerdir. Serotip 8 ve 9 yalnızca homodupleks bant görünümü verirken serotip 3, 5, 7 ve 11 heterodupleks ve homodupleks bant görünümleri oluşturmuş ve önceden geliştirilen yöntemdeki serotiplerle bant görünümleri açısından uyumlu bulunmuşlardır. Serotip 15 ve 23 kendilerine özgül bant görünümleri vermesine karşın önceden geliştirilen yöntemdeki serotip 15 ve 23 ile uyumlu gözükmemektedir. Sonuç olarak bu çalışmayla serotip 3, 5, 7 ve 11'in belirlenebildiği, serotip 15 ve 23'ün farklı bant profili vermesi nedeniyle tekrarlanabilir sonuçlar elde edilemeyebileceği, serotip 8 ve 9 izolatlarının bu yöntemle belirlenemeyeceği saptanmıştır.

Abstract:
Recently, increased resistance to antimicrobial agents in Streprococcus pneumoniae strains has became a significiant problem for treatment of pneumococcal infections. Thus, vaccine which is essential for protection from pneumococal infections, has gained importance. However, in cps gen cluster which is capsule gene locus of pneumococci, recombinational events can be occured and as a result serotype switching among strains take place and new serotypes are formed which are not covered by vaccine. It is an important issue to cover these serotypes for efficacy of a vaccine which will be developed in future. Consequent epidemiological studies is essential for determination of these new serotypes as well as variation in prevalance of antibiotic resistant pneumococcus serotypes. Serotyping which depends on capsule polysaccharide has an important method in epidemiology of pneumococci, and currently serotyping is performed by capsule swelling reaction. In this study, 71 clinical isolates of pneumococci serotypes 3, 5, 7, 8, 9, 11, 15 and 23 which are the frequently isolated serotypes in our country have been studied. The aim of the study is to evaluate the reliability of previously developed heteroduplex analysis method for determination of pneumococci serotypes which targeted the cps gene locus. Stock cultures of bacteriae were grown on blood agar plates and pure colonies were obtained. After the pneumococal DNA was extracted by automatic nucleic acid isolation system, cpsA-cpsB genes which are heterogenic and conserved among serotypes were amplified by PCR with specific primers. Heteroduplex analysis were performed by amplicons of different serotypes with amplicons of serotype 1. Homoduplex and heteroduplex band patterns were shown after 8% polyacrylamide gel electrophoresis. Serotypes 8 and 9 showed only homoduplex band pattern while serotypes 3, 5, 7 and 11 showed both homoduplex and heteroduplex band patterns. These results were comparable with the results of previously developed method in terms of band profiles. Serotypes 15 and 23 also showed specific band profile, however these profiles did not matched with the profiles of previously developed method. As a conclusion, serotypes 3, 5, 7 and 11 can be detected with this method. Since the serotypes 23 and 15 showed different band profiles, reproducable results could not be gathered for these serotypes. In addition, serotypes 8 and 9 isolates showed only homoduplex bands and serotype prediction cannot be made by this method.