Türkiye'de infeksiyöz bronşitis viruslarının RT-PCR ile saptanması ve moleküler karakterizasyonu
Molecular detection and characterization of avian infectious bronchitis viruses in turkey by RT-PCR
Yazar: ELİF MACİDE ARAL
Danışman: PROF. DR. BARIŞ SAREYYÜPOĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Bronşit = Bronchitis ; Bronşiyal hastalıklar = Bronchial diseases ; Genler = Genes ; Kümes hayvanları hastalıkları = Poultry diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Tavuklar = Chickens ; Türkiye = Turkey ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Virüsler = Viruses

Özet:
Çalışmada, Türkiye'nin farklı bölgelerindeki işletmelerde solunum sistemi problemi görülen tavuk sürülerinde İnfeksiyöz Bronşitis'in(IB) teşhisi ve S1 geninin dizilendirilmesine dayalı karakterizasyonu amaçlandı.
Türkiye'de solunum sistemi problemleri görülen farklı işletmelerden teşhis amacıyla Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Kanatlı Teşhis Laboratuvarı'na 2011-2014 yılları arasında gönderilen materyallerden (trakeal svap,trake, akciğerler, ileo-sekal tonsiller) guanidinium-thiocyanatefenol-kloroformekstraksiyon yöntemi ile RNA ekstraksiyonu gerçekleştirildi. Çalışmada incelenen 200 örneğin 125 tanesi 2011-2012 yılları arasında örneklendi ve -70°C'de donduruldu. Dondurulmuş olan bu örnekler RNA izolasyonu öncesinde embriyolu tavuk yumurtasına (ETY) ekildi, geriye kalan 75 örneğin RNA'sı direkt olarak izole edildi.Örneklerde IBV varlığının ortaya konması için ekstrakte RNA'lar S1 genine spesifik primer çiftlerinin kullanıldığı tek basamaklı nested reverse transcriptase polymerase chain reaction (nested-RT-PCR) tekniği ile araştırıldı. IBV yönünden pozitif örneklerin moleküler karakterizasyonu S1 geninin dizi analizi ile gerçekleştirildi. İncelenen 200 sürüden 41 (%20,5)'inde virüs genetik materyali saptandı, ancak 159 (%79,5) sürüde IBV saptanamadı. Pozitif örnekler dideoksi zincir sonlanma reaksiyonu yöntemiyle dizilendirildi. DNA dizileri NCBI'da bulunan GenBank veritabanında erişimleri olan infeksiyöz bronşitis virüslerinin tümüyle kıyaslanmak için BLAST programıyla incelendi. IBV izolatları arasındaki genetik ilişkiyi ortaya koymak için S1 genine ait nükleotid dizileri kullanılarak filogenetik ağaç oluşturuldu. İzolatlar %82 benzerlikle 2 ana gruba ayrıldı veörneklerin 14 tanesi %98-99 oranında (KP259312.1) TR8, 8 tanesi %98-99 oranında (EU780077.2) IS/1494/06, 11 tanesi %94-100 oranında (HM131453.1) isolate attenuated IS/1494/06, 2 tanesi %98 oranında (JX173488.1) Eg/CLEVB-2/IBV/012, 6 tanesi %99-100 oranında Mass aşı suşu (HM540074.1) GX-NN1 ile benzer bulundu.
Türkiye'de infeksiyöz bronşitis virus suşlarının nested-RT-PCR ile saptanması ve sonrasında S1 geninin dizi analizine dayanan bu tekniğin ülkemizde tavuklarda görülen infeksiyöz bronşitis hastalığının teşhis ve karakterizasyonu ile moleküler epidemiyolojisine yönelik çalışmalarda ve aşı programlarının geliştirilmesinde faydalı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
The aim of the research was identification of infectious bronchitis virus in poultry flocks showing respiratory signs raised in different locations in Turkey and characterize the IBV detected strains by sequencing of S1 gene.
Samples from different commercial poultry flocks showing respiratory signs and suspected of respiratory infection from all around Turkey were sent to Poultry Diagnostic Laboratories, Department of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, Ankara University between 2011-2014. One hundred twenty-five of 200 materials were sampled between 2011-2012 and freezed at -70 °C. These frozen samples were inoculated at 9-11 days old embryonated chicken eggs (ECE) via allantoic route as described in OIE (2008). The rest of  the materials (n.75) were directly processed. RNA extractions from all materials were performed from organ samples and tracheal swaps (trachea, lungs, ileo-cecal tonsils) with guanidinium thiocyanate phenol-chloroform extraction method. One step nested-RT-PCR was carried out with spesific primers for S1 gene to screen IBV. Molecular characterization of IBV detected 41 (%20,5) out of 200 samples were analyzed by sequencing of S1 gene. Sequenced samples were analyzed with BLAST by comparison of sequences in GenBank database.
It was found that 6 of 41 isolates were vaccine related variants which was %99-100 identical to (HM540074.1) GX-NN1 and the rest were field strains which belong to neighbour countries, respectively; 19 of 41 isolates were %94-100 identical to Israil variants (EU780077.2) IS/1494/06, and (HM131453.1) isolate attenuated IS/1494/06, 2 of 41 were %98 identical to (JX173488.1) Eg/CLEVB-2/IBV/012. Fourteen of 41 isolates were %98-99 identical to (KP259312.1) TR8 Turkish variants which were circulating in Turkey since 2013.
Nested RT-PCR detection and molecular characterization of IBV is thought to be an useful method for the futher molecular epidemiological studies of IBV and to evaluate and perform more effective vaccine programs in Turkey.