Metabolik sendromlu sıçanlarda hipokampusun nörogenezine etkili faktörlerin incelenmesi
Investigation of effective factors on hippocampal neurogenesis in rats with metabolic syndrome
Yazar: PINAR BAYRAM
Danışman: YRD. DOÇ. DENİZ BİLLUR
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hipokampus = Hippocampus ; Metabolik sendrom = Metabolic syndrome ; Nörogenez = Neurogenesis ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Sıçanlar = Rats ; İnsülin = Insulin

Özet:
Metabolik sendrom (MetS); değişen beslenme alışkanlıkları, sedatif yaşam tarzı gibi nedenlerle gittikçe artan sıklıkta görülen, insulin direnci, karın bölgesinde yağlanma, glukoz intoleransı veya Tip2 Diabetes Mellitus (T2DM), dislipidemi, hipertansiyon ve koroner arter hastalığı gibi sistemik bozuklukların birbirine eklendiği bir hastalık tablosudur. Metabolik sendromun ilerleyen aşamalarında T2DM gelişimi ile Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıkların gelişim sıklığı arasında ilişki gösterilmiştir. Yetişkin nörogenezinin devam ettiği yerlerden biri olan hipokampus, hafıza ve bellek olayları ile ilgilidir. T2DM hipokampal bölgede insülin direnci nedeniyle insülin reseptör ve insülin reseptör substratlarının azalmasına yol açar. Bu durum hipokampal bağımlı hafızayı ve yetişkin hipokampal nörogenezini azaltır. Bu bilgiler ışığında T2DM oluşum riskini arttıran MetS deney modeli oluşturduğumuz sıçanlar üzerinde yaptığımız çalışmada, nörogenez oranı, öğrenme ve anksiyete değerlendirmesi ve insülin sinyal yolağında yer alan bazı proteinlerin düzeylerini inceleyerek, aralarındaki ilişkiyi ortaya koymayı amaçladık. 

Çalışmamızda üç grup için toplam 30 adet, başlangıç ağırlıkları 185-200 gr olan iki aylık Wistar Albino türü erkek sıçanlar kullanıldı. MetS deney modeli oluşturulan MetS (n=10) ve MetS+İns (n=10) grupları, % 32 sükroz içeren içme suyuyla beslenirken, kontrol grubu (n=10) normal içme suyuyla beslendi. MetS deney modeli oluşumunun doğrulandığı 16. haftadan sonra MetS+İns grubuna 15 gün süreyle, deri altı, üç ünite insülin enjeksiyonu uygulandı. Bütün gruplarda açık alan testi, yükseltilmiş artı labirent testi, Vanderwolf yüzme testi, aydınlık karanlık kutusu testi ve Harder bezi değerlendirmeleri yapıldıktan sonra sakrifiye edilerek beyin dokuları çıkarıldı. Sol hemisfere ait hipokampusun bir kısmı western blotlama (WB) için donduruldu. Bir kısmı ise gluteraldehit fiksasyonu sonrası araldite gömüldü, toluidin mavisi-azur II ile boyanan yarı ince kesitler ışık mikroskobu ile, uranil asetat/kurşun sitrat ile boyanan ince kesitler ise geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile incelendi. Sağ hemisfer tamponlu formaline alınarak rutin histolojik takip işlemlerine tabi tutuldu. Genel değerlendirme krezil viyole boyalı parafin kesitlerde ışık mikroskobu ile gerçekleştirildi. WB ve immünohistokimya (IHC) analizleri için; DCX, Neuro D1, NeuN, insülin, insülin reseptör, insülin reseptör substratı (IRS)2, GLUT3, GLUT4, Cleaved caspase 3, protein oranları değerlendirildi. Ayrıca IHC analizlerinde Ki67, TUNEL boyanma düzeyleri, WB analizlerinde ise IRS1 ve IGF1Rα protein düzeyleri incelendi. Analiz sonuçları GraphPad Prism 5.0 ve IBM SPSS 22 istatistik programı kullanılarak değerlendirildi. p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Çalışmamızda MetS oluşturulmuş sıçanlara yapılan davranış testleri sonucunda hafıza ve bellekte bozulmalarla anksiyetede artış görüldü. Nörogenez belirteç ekspresyonları azalırken, bu azalmayla uygun biçimde apopitozun arttığı belirlendi. Azalan nörogenez oranıyla beraber nöronlarda insülin sekresyonu ve insülin reseptör düzeyi azaldı. İnsülin sinyal yolağının yeterince aktifleşememesinden dolayı, nöronların enerji ihtiyacını karşılamak için GLUT 3 ve GLUT 4 oranları arttı. İnsulinin nöronlar üzerinde nörotrofik, nöromodülatör, nöroprotektif etkilerinden yararlanabilmek için MetS oluşturulmuş sıçanlara insülin enjekte edildi. İnsülin enjeksiyonundan sonra hafıza ve belleğin geliştiği, anksiyetenin azaldığı, nörogenez belirteci olan protein oranlarının arttığı ve insülin sinyal yolağı protein düzeylerinin kontrol seviyelerine yakın duruma geldiği görüldü. 
Çalışmamızda MetS'de azalan nörogenez ve artan anksiyetenin, insülin reseptör ekspresyonunda azalmayla bağlantılı olabileceği sonucuna varıldı. Ayrıca literatürde ilk defa MetS'de nörogenezin azaldığı WB ve IHC ile gösterildi. MetS oluşturulan hayvanlara insülin enjeksiyonundan sonra davranış testlerinde pozitif yönde değişim görülürken, WB ve IHC analizleriyle de nörogenezin arttığı belirlendi.

Abstract:
Metabolic Syndrome (MetS) is a frequent disease which is caused with reasons such as
changing nutrition habits, sedative lifestyle and prognosed with insulin resistance, increased
abdominal adiposity, glucose intolerance or Type 2 Diabetes Mellitus, dislipidemia,
hypertension and coroner artery disease. In MetS progression, it was shown that there is a
relationship between frequency of TDM2 progression with frequency of progression of some
neurodegenerative diseases such as Alzheimer. Hippocampus where adult neurogenesis
continues, is related to memory. TDM2 causes reduction in insulin receptors and their
substrates in hippocampal area because of insulin resistance. This situation decreases
hippocampal dependent memory and hippocampal neurogenesis of adults. In the light of
these knowledge in the study which we created experimental model of MetS so that it
increase TD2M progression risk and we aimed to evaluate neurogenesis rate, learning and
anxiety degrees, analysis of some proteins levels from insulin signal pathway, then we aim to
introduce the relationship between them.
In our study, totaly 30 two months old Wistar Albino male rats were used for three different
groups starting weights were varying between 185-200 g. MetS (n=10) and MetS+Ins (n=10)
groups which experimental MetS model was set, were fed with tap water containing %32
sucrose while control group (n=10) was fed with normal tap water. After 16th week when
experimental model of MetS formation was confirmed, to MetS+Ins group, three units
insulin subcutaneous injection were administired during 15 days. In all groups, open area
test, elevated plus maze test, Vanderwolf swim test, light-dark box test, Harderian gland
evaluation were performed, then animals were sacrified and brains were dissected. A part of
hippocampus from left hemisphere was frozen for Western Blot (WB) Analysis. The other
part was embedded into araldit after glutaraldehyde fixation, semi-thin sections stained with
Toluidin Blue-Azur II were evaluated with light microscope, while thin sections stained with
uranyl acetate/Lead citrate were analyzed with Transmission Electron Microscope (TEM).
Right hemispheres were fixed in buffered formaline solution and processed with histological
routine. Overall assessment was performed with light microscope on Cresyl Violet stained
paraffin sections. For WB and immunohistochemistry (IHC) analysis; DCX, Neuro D1,
NeuN, insulin, insulin receptors, insulin receptor substrate (IRS) 2, GLUT 3, GLUT 4,
Cleaved caspase 3, protein levels were evaluated. In addition, Ki67, TUNNEL positivity
degrees in IHC analysis; IRS1 and IGF1Rα protein levels in WB analysis were assessed.
Analysis results were evaluated statistically with GraphPad Prism 5.0 and IBM SPSS 22
statistical software and the p values less than 0,05 were considered stastically significant.
As a result of behaviour tests of rats with experimental MetS, an increase in anxiety with
memory deficiency was observed. While neurogenesis marker expressions were decreasing,
in correlation with this decrease, an increase in level of apoptosis was observed. Insulin
secretion and insulin receptor levels decreased in neurons in proportion to decrease in
neurogenesis. Since insulin signal pathway was not activated properly, GLUT 3 and GLUT 4
ratios increased to accomplish enegry requirement of neurons. In order to get benefit from
neurotrophic, neuromodulator, neuroprotective effects of insulin on neurons, insulin was
injected into rats with MetS. After insulin injection, improvement of memory, decrease in anxiety, increase in levels of neurogenesis marker proteins and insulin signal pathway
protein levels were observed as approaching to control levels.
In our study, it was concluded that in MetS; there is a relationship between decreased
neurogenesis, increase anxiety and decreased insulin receptor expression. Besides, it was
shown first time with WB and IHC that there is a decrease in neurogenesis in MetS. Increase
in neurogenesis was determined with WB and IHC analysis while there was a change in
positive way in behaviour tests after insulin injection into rats with MetS.