Pankreas duktal adenokarsinomunda (PDAC) yeni tümör baskılayıcı genlerin araştırılması
Investigation of new tumor suppressor genes in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC)
Yazar: HİLAL KABADAYI ENSARİOĞLU
Danışman: PROF. DR. ELGİN TÜRKÖZ ULUER
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Genler-tümör baskılayıcı = Genes-suppressor-tumor ; Metilasyon = Methylation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Pankreas hastalıkları = Pancreatic diseases ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms

Özet:
Amaç: Metilasyon reaksiyonları için ana metil donörünü sağlayan endositoz ve metiyonin yolağı, kanser patogenezinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu yolaklarda yer alan genler insanlarda sporadik mutasyonlara sahiptir ve in silico analizlere göre bu genlerin bazıları tümör baskılayıcı olarak rol oynayabilir. Bu çalışmanın temel amacı endositoz ve metiyonin döngüsünde rol alan Metiyonin Adenoziltransferaz 2A (Mat2a), Protein arjinine metiltransferaz 6 (Prmt6), Protein arjinin metiltransferaz 5 (Prmt5), Protein arjinin metiltransferaz 7 (Prmt7), SET ve MYND domeinini içeren protein 4 (Smyd4), DNA metiltransferaz 1 (Dnmt1) Ras ilişkili protein 11b (Rab11b), Ras ilişkili protein 4b (Rab4b),  Selenoprotein I (SelenoI), Selenoprotein N (SelenoN) genlerinin hangilerinin, in vivo Kras kaynaklı PDAC gelişimi için tümör baskılayıcı gen olduğunu belirlemektir. Bunun yanında ikinci bir amaç ise, listelenen genlerden Smyd 4'ün PDAC gelişiminde tümör baskılayıcı olarak davrandığını in vitro ve in vivo olarak ortaya koymaktır. 
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda, bahsedilen yolaklarda yer alan 10 gen arasından tümör baskılayıcıları taramak için somatik CRISPR/Cas9 genom mühendisliği yönteminden yararlanıldı. 
Bulgular: Bu gen setlerinde tanımlanan tümör baskılayıcılardan biri, meme kanserinde lizin metiltransferaz Smyd4'tür. Çalışmamızda fare pankreas hücre hatlarında CRISPR/Cas9 aracılı Smyd4 delesyonu ortotopik fare modelinde hücre proliferasyonunu, yumuşak agarda koloni oluşumunu ve tümör oluşumunu arttırmıştır. 
Sonuçlar: Mekanizma olarak SMYD4 delesyonu, histon H3K9m2'nin spesifik bir aşağı yolak regülasyonuna yol açmıştır. Bu durum histon H3K9me3'ün SMYD4 demetilaz aktivitesi için spesifik bir substrat olduğunu düşündürdü. Ayrıca, in silico analizler ve hücre kültürü deneyleri ile Smyd4 delesyonu glikoz metabolizmasındaki değişikliklerle ilişkilendirildi. Sonuç olarak, lizin metiltransferaz Smyd4, PDAC için yeni bir tümör baskılayıcı olarak bu çalışmada tanımlanmıştır. Bunun yanında SMYD4'ün histon H3K9me3'ü spesifik olarak demetile ettiği ve glikoz metabolizmasını düzenlediği altta yatan bir mekanizma ortaya konulmuştur.

Abstract:
Aim: The endocytic and the methionine pathway which provides the main methyl donor for methylation reactions play a pivotal role in cancer pathogenesis. The genes involved in these pathways have sporadic mutations in humans and based on in silico analyses some of these genes may play a role as tumor-suppressors. The main purpose of this study is to investigate the genes that involved in endocytosis and methionine cycle which are Methionine Adenosyltransferase 2A (Mat2a), Protein arginine methyltransferase 6 (Prmt6), Protein arginine methyltransferase 5 (Prmt5), Protein arginine methyltransferase 7 (Prmt7), protein 4 (Prmt7) SET and MYND4 domain containing protein (Smyd4), DNA methyltransferase 1 (Dnmt1), Ras-related protein 11b (Rab11b), Ras-related protein 4b (Rab4b), Selenoprotein I (SelenoI), Selenoprotein N (SelenoN) as a candidate tumor suppressor genes for the in vivo KRAS induced PDAC. In addition, a second aim is to demonstrate in vitro and in vivo that Smyd 4, one of the listed genes, acts as a tumor suppressor in the development of PDAC.
Material and methods: We took advantage of a somatic CRISPR/Cas9 genome engineering method to screen for tumor-suppressors between a set of 10 genes involved in the above mentioned pathways. 
Results: In these sets of genes one of the identified tumor-suppressors is the lysine methyltransferase Smyd4 in breast cancer. In our study CRISPR/Cas9 mediated Smyd4 deletion in mouse pancreatic cell lines increased cell proliferation, colony formation in soft agar and tumor formation in an orthotopic mouse model. 
Discussion: Mechanistically Smyd4 deletion led to a specific downregulation of the histone H3K9m2, suggesting the histone H3K9me3 to be the specific substrate for the Smyd4 demethylase activity. Furthermore, in silico analyses and cell culture experiments link the deletion of Smyd4 with changes in glucose metabolism. Together, we identify the lysine methyltransferase Smyd4 as a novel tumor-suppressor for PDAC and suggest an underlying mechanism by which Smyd4 specifically demethylates the histone H3K9me3 and regulates glucose metabolism.