Olası bir RNA bağlayıcı protein olan coiled-coil domain containing protein 124 (CCDC 124)'ün etkileştiği RNA hedeflerinin belirlenmesi ve insan kanser doku örneklerinde ifade seviyelerinin incelenmesi
Identifying the RNA targets of coiled-coil domain contaning protein 124 (CCDC 124) and it's expression level in human cancer tissues
Yazar: ÖZGE ARSLAN
Danışman: PROF. DR. UYGAR HALİS TAZEBAY
Gebze Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Patoloji = Pathology
Dizin: Hücre boyama = Cell staining ; Hücre görüntüleme = Cell imaging ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; İmmün boyama = Immunoblotting ; İmmünopresipitasyon = Immunoprecipitation

Özet:
CCDC124 (Coiled-coil-Domain-Containing protein124) geni DNA dizisi verilerinin analizine dayalı yapılmış olan daha önceki biyoinformatik çalışmalar bu proteinin RNA bağlayan bir protein olabileceğini göstermiştir. Yapılmış olan bu tez çalışmasıyla ise Ccdc124'in RNA bağlayan bir protein olduğu immunopresipitasyon ve sekanslama yöntemleri kullanılarak deneysel olarak gösterilmiş ve ilk defa olası RNA hedefleri listelenmiştir. Bu hedefler arasından seçilen HERC2 ve GCN1 RNA' ları ise Q-PCR yöntemi kullanılarak doğrulanmıştır. Ccdc124 proteininin bağlandığı olası RNA hedeflerinin belirlenmesinin ardından, proteinin yoğun RNA içeriğine sahip hücre altı yapılarda konumlanıyor olabileceği düşünülerek nükleer benekler ve stres granülleri incelenmiştir. İncelemeler için immunofloresan yöntemi kullanılmış, SC35 ile işaretlenmiş nükleer beneklerle Ccdc124 proteininin ortak konumlanma gösterdiği belirlenmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Ccdc124'ün hedeflendiği hücrelerde ise böyle bir konumlanmaya rastlanmadığı tespit edilmiştir. Stres granülü oluşumuyla Ccdc124 proteini arasındaki ilişkinin tespiti için ise stres granülü işaretleyicisi olarak G3BP1, TIA-1, HNRNPA1, PABPC1 kullanılmış ve sıcaklık stresi (42°C ve 46°C) ile oksidatif stres (sodyum arsenit ile tetiklenmiş) durumları çalışılmıştır. Bu deneyler sonucunda Ccdc124 proteini bazı stres granülü işaretleyicileriyle ortak konumlanma göstermesine rağmen, tüm stres granüllerinde benzer konumlanmadığı tespit edilmiştir. Bu nedenle Ccdc124'ün genel olarak tüm stres granüllerinde bulunan bir protein olmadığını ancak bazı hücrelere ve bazı özel koşullara bağlı olarak stres granüllerinde konumlandığını düşünülmektedir. Kanser dokularına ait örneklerle normal doku örnekleri kullanılarak Ccdc124'ün mRNA ifade seviyeleri karşılaştırılmıştır ve mesane, özofagus, tiroid bezi, adrenal bez, over, endometriyum  kanserlerinde artış gösterdiği tespit edilmiştir. Daha sonra bu dokular arasından seçilen mesane, over ve endometriyum dokuları immunohistokimyasal yöntemler kullanılarak analiz edilmiş, endometriyum ve over dokularında Ccdc124 protein ifade artışının olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Bioinformatics studies based on analysis of CCDC124 (Coiled-coil-Domain-Containing protein124) gene DNA sequence indicated that this protein has RNA binding potential. This thesis aimed to show that Ccdc124 is a RNA-binding protein by using immunoprecipitation and sequencing methods, and possible RNA targets were listed for the first time.  HERC2 and GCN1 RNAs, presented in the target list, were validated through the Q-PCR method. After determining the possible RNA targets of Ccdc124 protein, nuclear speckles and stress granules were examined considering the protein's potential localization of subcellular structures with dense RNA content. With immunofluorescence method, it was determined that Ccdc124 protein was colocalization with nuclear speckles marked with SC35. However, such positioning was not detected when Ccdc124 targeted the CRISPR/Cas9 system was used. Moreover, to determine the relationship between stress granule formation and Ccdc124 protein, G3BP1, TIA-1, HNRNPA1, PABPC1 were used as markers of stress granule. Heat stress (42°C and 46°C) and oxidative stress (triggered by sodium arsenite) conditions were examined. The results indicated that although Ccdc124 protein colocalized with some stress granule markers, it was not observed for all stress granules. Therefore, it was thought that Ccdc124 is not a protein found in all stress granules in general; yet, it located in stress granules depending on the cell types and special conditions. Also, the results showed that Ccdc124 mRNA expression levels remarkably increased in bladder, esophagus, thyroid gland, adrenal gland, ovarium and endometrium cancers in comparison between cancer tissue samples and normal tissue samples. Furthermore, immunohistochemical methods were used in the selected tissues (endometrium, ovary, and urinary bladder), and Ccdc124 protein expression was identified as high in endometrium and ovarian cancer tissues as compared to normal tissue samples.