İlaç içeren NIPAAM hidrojellerinin salınım kinetiğinin incelenmesi
Investigation of the in vitro drug release kinetics of PNIPAAM hydrogels
Yazar: CEYDA ŞİMŞEK
Danışman: PROF. DR. CANDAN ERBİL
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Poli(n-izopropilakrilamid) = Poly(n-isopropylacrylamide) ; Uzun etkili ilaçlar = Delayed action preparations

Özet:
Akıllı hidrojeller zincirlerinde birbiriyle etkileşim kurabilecek fonksiyonel gruplar bulundurmaları sayesinde pH, sıcaklık ve elektrik alan gibi çevre uyaranlarının değişimi ile şişme/büzülme davranışı gösterebilen yapılardır. Fizyolojik uyaranlara karşı duyarlı olan bu hidrojeller tıpta, biyomedikal uygulamalarda ve kontrollü ilaç taşıma sistemlerinde biyomalzeme olarak kullanılmaktadır. İnsan vücudunun sabit sıcaklığa (37oC) ve organların mikro ve makro çevrelerinin (kan, mide, bağırsak, lizozom gibi) farklı pH'lara sahip olmaları, hem sıcaklık hemde pH'a karşı duyarlı hidrojelleri kontrollü ilaç taşıma/salım sistemleri için oldukça tercih edilen malzemeler yapmaktadır. Özellikle poli(N-izopropilakrilamid) (PNIPAAm) hidrojelleri fizyolojik sıcaklığa yakın bir sıcaklıkta (32~34oC) alt kritik çözelti sıcaklığına (LCST) sahip olmaları sebebiyle bu sınıftaki hidrojeller içinde önemli bir yer tutarlar. PNIPAAm hidrojellerinin mekanik özellikleri düşüktür ve aynı zamanda, hidrofobik grupların hidrojelin dış yüzeyinde deri benzeri film oluşturabildiğinden salım prosesi esnasında ilacın difüzlenmesi engellenebilir. Fakat vücuda gönderilen ilaç veya biyomoleküllerin salım prosesinden önce vücut içindeki fizyolojik koşullardan korunması gerektiğinden geliştirilen kontrollü ilaç taşıma/salım sisteminin mekanik dayanımının ve yüklenen ilacı salabilmesi açısından da şişme derecesinin yüksek olması gerekmektedir. Bu sebeple PNIPAAm hidrojellerinin hem LCST'sini fizyolojik sıcaklığa (37oC) daha çok yaklaştırmak hem de şişme derecesini ve mekanik dayanımını arttırmak için hidrofilik, hidrofobik ve/veya iyonik/iyonlaşabilir grupları bulunan komonomerlerle değişik bileşimdeki kopolimerleri sentezlenmektedir. Yan zincirlerinde karboksilik asit gibi zayıf asidik ve/veya primer, sekonder ve tersiyer amin gibi zayıf bazik gruplar bulunduran komonomerlerle sentezlenen hidrojeller pH değişimine karşı duyarlı bir davranış gösterirler. PNIPAAm hidrojellerinin hedef odaklı ilaç (veya diğer tedavi edici ajanları) taşıyıcı ve hastalıklı hücre pH'sına duyarlı koşullarda kontrollü salım yapabilecek şekilde değiştirilmesi/iyileştirilmesi son dönemde en yoğun araştırmaların sürdürüldüğü alanların başında gelmektedir.
Bu çalışmada, ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılabilecek dört fonksiyonlu iki farklı çapraz bağlayıcı ile çapraz bağlanmış PNIPAAm homopolimerleri, zayıf katyonik amino propil gruplarına sahip (pKa~8-9) N-[3-(dimetilamino)propil] metakrilamid (DMAPMAAm) ve kuvvetli asidik sulfonik asit gruplarına sahip 2-akrilamido-2-metil-1-propan sülfonik asit (AMPS) ile sıcaklık/pH duyarlı kopolimer ve terpolimer hidrojelleri iki farklı başlatıcı (çifti) varlığında serbest radikal çözelti polimerizasyonu ile sentezlendi. Sentezlenen PNIPAAm, P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) ve P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm-ko-AMPS) hidrojelleri ilaç salım sistemi olarak tasarlandığından, mekanik dayanımlarının ve şişme kapasitelerinin yüksek olması, ve pH'a karşı duyarlı bir davranış göstermeleri gerektiğinden, sentezlenen hidrojellerin mekanik dayanımları ve pH duyarlılıkları incelendi. Çalışmanın başlangıcındaki deneyler ile belirlenen en uygun çapraz bağlayıcı/başlatıcı (çifti) sistemi kullanılarak sentezlenen PNIPAAm ile kopolimer ve terpolimer hidrojellerinin tuzlu fosfat tamponu (PBS, 25oC) ve destile deiyonize su (DDS, 25oC) içerisindeki dinamik şişme ve hidrojellere yüklenmiş anyonik yapıya sahip diklofenak sodyum'un (DFNa) fizyolojik koşullar altında (PBS, 37oC) salım deneyleri yapıldı. 
N,N-metilenbis(akrilamid) (BIS) veya etilen glikol dimetakrilat (EGDMA) ile çapraz bağlanan PNIPAAm ve %5.0 mol DMAPMAAm içeren P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) hidrojelleri, potasyum persülfat (KPS) ve N,N,N',N'-tetrametil etilendiamin (TEMED) redoks çifti veya termal bir başlatıcı olan 2,2'-Azobis(2-metil-propiyonamid) dihidroklorür (V50) varlığında destile deiyonize su (DDS) içerisinde azot atmosferi altında 25oC veya 60oC'de, BIS ile çapraz bağlı terpolimerler ise KPS/TEMED redoks çifti varlığında DDS içerisinde azot atmosferi altında 25oC'de sentezlendiler.
DDS içerisinde 25oC ve 37oC'de gerçekleştirilen mekanik test deneylerinden elde edilen sonuçlarda, EGDMA çapraz bağlayıcısı ve V50 termal başlatıcısı ile sentezlenen PNIPAAm ve P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) hidrojellerinin BIS ile çapraz bağlı ve KPS/TEMED redoks çifti ile sentezlenen hidrojellere kıyasla daha esnek yapıya sahip olmalarına karşın sıkıştırma modüllerinin ve mekanik dayanımlarının oldukça düşük olduğunu gözlendi. 
BIS ile çapraz bağlı ve KPS/TEMED redoks çifti varlığında sentezlenen PNIPAAm, P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) ve P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm-ko-AMPS) hidrojelleri mekanik dayanımları ve esneklikleri kıyaslandığında ise, yapıya ilave edilen DMAPMAAm PNIPAAm'in sıkıştırma modülünü belirgin bir şekilde arttırken, PBS ortamında mekanik testlerde kopolimer hidrojellerinin modül değerlerinin daha yüksek ve daha kırılgan bir yapıya sahip olduğu gözlendi. P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm-ko-AMPS) hidrojellerinin de özellikle PBS ortamındaki mekanik dayanımları PNIPAAm hidrojelinden belirgin bir şekilde yüksektir ve ağ yapı içerisindeki AMPS mol oranına bağlı olarak ağ yapının esnekliği artar.
Nötral, katyonik ve amfoterik hidrojellerin farklı pH bölgelerindeki şişme davranışlarını gözlemek amacıyla, NaOH ve HCl ile hazırlanan pH 2-12 aralığındaki çözeltilere konulan hidrojellerin hacim değişimleri mekanik dayanımlarını desteleyecek niteliktedir. PNIPAAm hidrojeli, beklenildiği gibi, pH'a karşı duyarlılık göstermezken, zayıf katyonik P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) hidrojellerinin çap değişimleri asidik/nötral pH bölgelerinde ve belirli bir DMAPMAAm oranına kadar, yapıdaki dimetilamino propil gruplarından kaynaklanan hidrofobik etkileşimlerden dolayı,  PNIPAAm hidrojeli ile benzerlik gösterdiği ve tüm kopolimer hidrojellerinin pKa'larının üzerinde belirgin bir şekilde büzüldüğü gözlendi. %15 mol oranında DMAPMAAm içeren kopolimer hidrojelinde ise elektrostatik itme kuvvetlerinin artması hemde amid gruplarının hidrofilik karakterinin daha etkin olması sonucunda hidrojel daha fazla şişmektedir. Diğer taraftan,  % 2.5 mol oranında AMPS içeren terpolimer hidrojelinin pH<6 ve pH>9 olduğu durumlarda şiştiği, nötral pH bölgelerinde ise  büzüldüğü gözlendi. 
 P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) hidrojellerin DDS içerisinde 25oC'deki dinamik şişme davranışları kütlece ve hacimce tayin yöntemleri kullanılarak incelendiğinde, her iki yöntemle bulunan şişme değerlerinin birbirine çok yakın olduğu görüldü. Korsmeyer-Peppas, Higuchi, sıfırıncı ve birinci mertebe modellerine ait denklemler çizilen grafiklerin R2 değerleri kıyaslandığında, hemen hemen tüm hidrojellerin Korsmeyer-Peppas modeline uyduğu görüldü. Kopolimer hidrojellerin şişme dereceleri yapıdaki DMAPMAAm mol oranı ile doğru orantılı olarak artarken, Korsmeyer-Peppas denklemi üzerinden hesaplanan n difüzyon üstelleri difüzyon proseslerinin hem difüzyon hemde relaksasyon kontrollü olduğunu gösterdi. Terpolimer hidrojellerin çözücü difüzyon prosesisinde ise, yapıdaki anyonik ve katyonik grupların etkileşimi sonucu, relaksasyon kontolünün baskın olduğu gözlendi.
BIS ile çapraz bağlı ve KPS/TEMED redoks çifti varlığında sentezlenen PNIPAAm, P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) ve P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm-ko-AMPS) hidrojellerinin PBS içerisinde 37oC'deki DFNa salım kinetikleri incelendiğinde, kopolimer hidrojellerinin hız sabitlerinin ve difüzyon katsayılarının homo ve terpolimerlere kıyasla daha yüksek olduğu ve daha fazla ilaç saldıkları görüldü. Dört farklı kinetik modelin R2 değerlerinden Korsmeyer-Peppas modeline uydukları belirlenen hidrojellerin çözücü difüzyon hızlarının DFNa'un difüzyon hızından yüksek olduğu gözlendi. Kopolimer hidrojellerindeki DMAPMAAm mol oranı arttıkça, ağ yapıdaki zayıf katyonik dimetil amino grupları ile DFNa'un anyonik gruplarının fiziksel etkileşiminin artması ile hidrojellerin daha difüzyon kontrollü hale gelebileceği tartışıldı. Terpolimer hidrojellerde ise fiziksel etkileşimler yapıya hapsolmuş DFNa'un difüzyon hızını düşürebileceğinden dolayı salım prosesinin daha  difüzyon kontrollü gerçekleştiği şeklinde yorumlandı.

Elde edilen sonuçlar ışığında, BIS ile çapraz bağlı ve KPS/TEMED redoks çifti varlığında sentezlenen P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) ve P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm-ko-AMPS) hidrojellerinin gelecek çalışmalarda, ilaç salım  sistemleri için potansiyel malzemeler olarak kullanılabileceği  önerilmektedir.

Abstract:
Smart hydrogels have functional groups that can interact with each other on their structures.They respond to environmental stimuli such as temperature, pH, ionic strength, electric and magnetic field by volume changes. The hydrogels, which are sensitive to these physiological stimuli, are usually used as a biomaterials in medicine and biomedical applications such as enzyme immobilization, tissue engineering and controlled drug release systems. Human body's temperature (37oC), and micro and macro environments of organs' (blood, stomach, intestines, lysosome etc.) different pH values makes hydrogels with both temperature and pH sensitivities, suitable vessels for controlled drug delivery systems. 
Especially Poly(N-isopropyl acrylamide) (PNIPAAm) hydrogels pose an important role in living systems due to their lower critical solution temperature (LCST) (32 ~34oC) being close to body temperature. It has hydrophobic isopropyl groups, which provides the temperature sensitivity, on the side chains. At temperatures below its LCST, water molecules surround these groups to form a cage-structure and form hydrogen bonds with the amide groups. At temperatures above LCST, the ordered structure of water molecules around amide groups are disturbed. With increase the entropy of the system and hydrophobic groups become more effective, resulting in deswelling. PNIPAAm hydrogels exhibit weak mechanical properties and during the release process, the hydrophobic groups may form a skin-like layer that prevents the drug from diffusing. However, in order to protect the loaded drugs or biomolecules from physiological conditions before the release process, the developed drug delivery system has to have strong mechanical strength as well as a high swelling ratio for the release of loaded drug. To increase its LCST to physiological temperature, to improve mechanical properties and swelling ratios, copolymers of PNIPAAm hydrogels are synthesized using hydrophilic and/or hydrophobic comonomers. In the case of hydrophillically modified PNIPAAm hydrogels, if the ionizable hydrophilic groups on side chains such as carboxylic acids or primary/secondary/tertiary amines, the hydrogels develop a pH sensitivity as well. Anionic polymers such as poly(acrylic acid) (PAA) stay neutral at low pH values and near their pKa values, carboxyl groups ionize (COO-) and thus swell whereas cationic polymers such as poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate) (DMAEMA) ionize below their pKa values. Hydrogels consisting of both acidic and basic groups such as poly(acrylic acid-co-4-vinylpyridine) swell at high and low pH values and between the pKa values of their respective ionizing groups, they show a deswelling behavior due to intermolecular-ionic interactions. PNIPAAm hydrogels synthesized with ionic/ionizable comonomers may lead to more efficient drug delivery/release systems.  
In this study,  dual-sensitive copolymer and terpolymer hydrogels of PNIPAAm were synthesized. Its homopolymer and copolymer hydrogel containing 5.00 mole % of N- [3- (dimethylamino) propyl] methacrylamide (DMAPMAAm) in the feed crosslinked with two different tetrafunctional crosslinkers in the presence of different initiators. After this part, the most suitable crosslinker/iniators (pair) system was chosen for the continuation of the experiments. Copolymer and terpolymer hydrogels of PNIPAAm were synthesized by free radical solution polymerization using DMAPMAAm (pKa ~8-9)  and 2-acrylamido-2-methyl-1-propane sulfonic acid (AMPS) as weakly and cationic strong anionic comonomers, respectively. The synthesized hydrogels, P(NIPAAm-co-DMAPMAAm) and P(NIPAAm-co-DMAPMAAm-co-AMPS) were designed as a drug delivery system. In addition, it is excepted that their mechanical strength and swelling ratios are higher than that of PNIPAAm. Also, they should be sensitive to pH. Because of that, mechanical strength and pH sensitivity of the synthesized hydrogels were investigated. Dynamic swelling experiments of PNIPAAm crosslinked with N, N-methylenebis (acrylamide) (BIS)  and initated by potassium persulfate/ N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine (KPS/TEMED)  redox pair and its copolymer and terpolymer hydrogels were performed at 25oC  in the phosphate buffer saline (PBS) and distilled deionize water (DDW). Diclofenac sodium salt (DFNa) release from loaded hydrogels were studied under the  physiological conditions (PBS, 37oC). 
PNIPAAm and P(NIPAAm-co-DMAPMAAm) including 5.0 mol % of DMAPMAAm were crosslinked with BIS or ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA). They have been synthesized in the presence of KPS/TEMED redox pair or 2,2'-azobis (2-methyl-propionamide) dihydrochloride (V50) as thermal initiator under a nitrogen gas at 25°C or 60°C in DDW. Moreover, terpolymer hydrogels crosslinked with BIS have been synthesized in the presence of KPS as a initiator and TEMED as accelerator under nitrogen atmosphere at 25°C in DDW.
The obtained results from mechanical testing experiments which are performed at  both 25°C and 37°C in DDW. It was observed that the PNIPAAm and P(NIPAAm-co-DMAPMAAm) hydrogels synthesized by EGDMA as crosslinker or V50 as thermal initiator were more flexible than the ones initated and crosslinked with KPS/TEMED redox pairs and  BIS, respectively. But their compression moduli and the mechanical strength were fairly low. Therefore, BIS was preferred as crosslinker and KPS/TEMED redox pairs as initiator to synthesize copolymer and terpolymer hydrogels containing different mole ratios of NIPAAm:DMAPMAAm and NIPAAm:DMAPMAAm:AMPS. 
When the mechanical strength and flexibility of PNIPAAm, P(NIPAAm-co-DMAPMAAm) and P(NIPAAm-co-DMAPMAAm-co-AMPS) hydrogels were compared with the ones of PNIPAAm, it was seen that the compression moduli of copolymer hydrogels  increased with increase content of  DMAPMAAm. Their compressive moduli in PBS was higher and they exhibited more fragile structure. Further, the mechanical strength of P(NIPAAm-co-DMAPMAAm-co-AMPS) hydrogels were greater than that of the PNIPAAm hydrogel in PBS. Their flexibilities depend on the molar ratio of DMAPMAAm:AMPS in the structure.  
Neutral, cationic and amphoteric hydrogels were put into the prepared pH solutions between pH 2 and pH 12 to observe the swelling behavior at different pH. After this procedure, the pH dependent changes in their diameters were used to discuss the mechanical strength of the hydrogels. The PNIPAAm hydrogels was not sensitive to pH as expected. In acidic pH region and at neutral pH, the change in diameter of weakly cationic P(NIPAAm-co-DMAPMAAm) hydrogels was similar to PNIPAAm hydrogel up to a certain of NIPAAm:DMAPMAAm ratio due to hydrophobic interaction resulting from dimethylaminopropyl group in their structures. Above pKa value of DMAPMAAm, the all copolymer hydrogels were significantly shrank.
For the copolymer hydrogel containing the 15.0 mole % of DMAPMAAm, both the electrostatical repulsion between cationic dimethylamino groups and effectiveness of hydrophilic amide groups increased and so, in the case of highly swollen hydrogel dominated the hydrophobic interactions, resulting from propyl groups. The NIPAAm:DMAPMAAm:AMPS hydrogel containing 2.5 % mole of AMPS was in the swollen state at pH < 6 and pH >9.
Dynamic swelling behaviors of the P(NIPAAm-co-DMAPMAAm) hydrogels were studied, by using gravimetric and volumetric methods at 25°C  in the DDW. For  both of the results of swelling values were found to be very close to each other. Moreover, the degree of swelling of hydrogel increases in directly proportional of the mole ratio of DMAPMAAm in the polymeric network. P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) and P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm-ko-AMPS) hydrogel   containing 15.0 mole% of DMAPMAAm and 2.5 mole % of AMPS ,respectively, had the highest swelling degrees.  Solution diffusion patterns of hydrogels was determined by using dynamic swelling ratios being fitted in Korsmeyer-Peppas, Higuchi, zero and first order models. The method that best fits the swelling data was evaluated by regression coefficient (R2). According to R2 values, the most appropriate model for all the hydrogels was Korsmeyer-Peppas. Also, the determined diffusion exponent (n) from slope of the release fraction (F) vs. time log-log plot shown that solution diffusion to hydrogels followed anomalous transport. The release process were controlled by both diffusion and relaxation. The diffusion processes of PNIPAAm, its copolymer and terpolymer hydrogels were compared to each other. 
When DFNa release experiments of PNIPAAm, P(NIPAAm-co-DMAPMAAm) and P(NIPAAm-co-DMAPMAAm-co-AMPS) hydrogels crosslinked with BIS and initated by KPS/TEMED  redox pair, were carried out at 37oC in PBS, it was observed that the rate constants and diffusion coefficients of copolymer hydrogels were higher that the PNIPAAm and its terpoylmer hydrogels. This means P(NIPAAm-ko-DMAPMAAm) hydrogels release more drug. From the comparison four different kinetic models and their R2 values, it was obtained that Korsmeyer-Peppas model  was the most suitable one, indicating non-Fickian process. As to the values of  n, release the diffusion rate of the solvent was higher than that of DFNa. As the mole ratio of DMAPMAAm increases in the copolymer hydrogels, copolymer hydrogels become more diffusion-controlled due to increasing ionic interactions between the anionic DFNa molecules and protonated dimetyhlamino group in the structure of hydrogels. 
In the case of terpolymer hydrogels diffusion controlled  process was dominant due to the  decrease in the diffusion rates of DFNa due to the trapped in the pores between polymer chains. 
In conclusion, when mechanical, swelling properties and solvent, drug diffusion kinetics of PNIPAAm, P(NIPAAm-co-DMAPMAAm) and P(NIPAAm-co-DMAPMAAm-co-AMPS) hydrogels, which were crosslinked with BIS and synthesized in the presence of KPS/TEMED redox pair, were investigated, these hydrogels may be suggested as a potential materials to be used in future studies.