İnsan eritrositlerinden saflaştırılan karbonik anhidraz I ve II izoenzimlerinin aktiviteleri üzerine antiülser, glukokortikoid ve ürolojik ilaçların etkilerinin incelenmesi
Investigation of antiulcer, glucocorticoids and urological drugs? effects on activity of carbonic anhydrase I and carbonic anhydrase II purified from human erytrocites
Yazar: UĞUR GÜLLER
Danışman: PROF. DR. Ö. İRFAN KÜFREVİOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada hCA-I ve hCA-II izoenzimlerinin insan eritrositlerinden saflaştırılması ve bazı antiülser, glukokortikoid ve ürolojik sınıfı ilaçların enzimlerin hidrataz ve esteraz aktiviteleri üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla hemolizat hazırlanarak Sepharose 4B L-tirozin sülfanilamid afinite kolonu kullanılarak hCA-I ve II aynı kolondan tek basamakta saflaştırıldı. İnsan eritrositlerinden CA I izoenzimi 2531,65 EÜ/mg protein spesifik aktivite, 353,58 kat ve %41,94 verimle, CA II izoenzimi 4927,01 EÜ/mg protein spesifik aktivite, 688,13 kat ve %56,62 verimle elde edildi. Daha sonra SDS-PAGE yöntemi ile saflaştırılan izoenzimlerin saflığı kontrol edilerek inhibisyon çalışmaları yapıldı. İzoenzimlerin aktiviteleri üzerinde inhibisyon etkisi gösteren ilaçlar için %Aktivite-[I] grafikleri çizilerek IC50 değerleri hesaplandı. Famotidin, hiyosin-N-butil bromür, nizatidin, omeprazol sodyum, pantoprazol sodyum, ranitidin HCl ve esomeprazol sodyum antiülser ilaçlarının hCA I'in hidrataz aktivitesinde IC50 değerleri sırasıyla 0,09; 3,15; 1,85; 0,65; 0,24; 2,02 ve 1,125 mM olarak hCA II'nin ise famotidin 0,292; nizatidin 4,17; ranitidin HCl 3,15 ve esomeprazol sodyum 2,26 mM olarak bulundu. Hiyosin-N-butil bromür, omeprazol sodyum ve pantoprazol sodyumun ise hidrataz aktivitesinde hCA II üzerine inhibisyon etkisi olmadığı belirlendi. Hidrataz metodunda glukokortikoidlerin hCA I için IC50 değerleri budesonid 0,08; deksametazon sodyum fosfat 0,344; metilprednizolon sodyum süksinat 0,998 ve prednizolon 3,24 mM olarak bulunmasına karşın flutikazon propiyonat ve metilprednizolon asetata düzenli inhibisyon göstermediği gözlendi. hCA II için sadece metilprednizolon sodyum süksinatın 1,82 mM IC50 değerine sahip olduğu, diğer glukokortikoidlerin ise düzenli inhibisyonu olmadığı belirlendi. Ürolojik ilaçlardan levofloksasinin hidrataz metodunda hCA I ve hCA II için sırasıyla 0,52 ve 0,886 mM IC50 değerine sahip olduğu, neostigmin metil sülfatın ise ne hidrataz nede esteraz metodunda düzenli inhibisyonu olmadığı belirlendi. Esteraz aktivitesinde antiülser ilaçlardan famotidinin ve hiyosin N-butil bromürün hCA I için IC50 değeri 0,29 ve 7,7 mM ve Ki değerleri 0,177±0,04 ve 2,19±0,302 mM olarak ve hCA II için famotidinin IC50 değeri 0,93 mM ve Ki 0,431±0,10 mM olarak bulundu. Esomeprazol sodyumun esteraz metodunda her iki enzimi de aktive ettiği diğer antiülserlerin ise düzenli inhibisyonu olmadığı tespit edildi. İnhibisyon gösteren antiülserlerin inhibisyon türleri ise yarışmalı olarak belirlendi. Glukokortikoidlerden budesonid, flutikazon propiyonat ve metilprednizolon sodyum süksinatın hCA I için IC50 değerleri sırasıyla 0,133; 0,03 ve 1,22 mM ve Ki değerleri 0,093±0,022; 0,0365±0,016 ve 1,149±0,35 mM olarak ve hCA II için IC50 değerleri 0,155; 0,054 ve 18,73 mM ve Ki değerleri 0,295±0,04; 0,054±0,018 ve 11,09±5,02 mM olarak bulundu. Deksametazon sodyum fosfatın ise her iki enzimide aktive ettiği diğer glukokortikoidlerin ise düzenli inhibisyonu olmadığı tespit edildi. İnhibisyon türleri ise budesonidin yarışmasız, metilprednizolon sodyum süksinatın yarışmalı ve flutikazon propiyonatın hCA I'e yarışmalı hCA II'ye yarışmasız olarak belirlendi.

Abstract:
In this study purification of hCA I and hCA II isozymes and investigation effects of some antiulcer, glucocorticoids and urological drugs on hydrates and esterase activity of these isozymes were aimed. For this purpose hemolysate was prepared, hCA I and hCA II were purified together on single step by using Sepharose 4B L-tyrosine sulfanylamide affinity chromatography. hCA I was obtained 353.58 fold with specific activity of 2531.65 EU/mg protein and 41.94% yield, hCA II was obtained 688.13 fold with a specific activity of 4927.01 EU/mg protein and 56.62% yield. Afterwards purity of isozymes was controlled by SDS-PAGE and inhibition studies were performed. For drugs, which inhibited activities of enzymes % Activity-[inhibitor] graphs were drawn and I50 values were calculated. For hCA I hydrates activity I50 values of famotidine, hyoscine N-butyl bromide, nizatidine, omeprazole sodium, pantoprazole sodium, ranitidine HCl and esomeprazole sodium drugs were obtained as; 0.09; 3.15; 1.85; 0.65; 0.24; 2.02 and 1.125 mM and for hCA II hydrates activity I50 values of famotidine 0.292, nizatidine 4.17, ranitidine HCl 3.15 and esomeprazole sodium 2.26 mM had found respectively. It was determined that hyoscine N-butyl bromide, omeprazole sodium and pantoprazole sodium did not show inhibition effects on hydrates activity of hCA II. By hydrates activity, I50 values on hCA I of glucocorticoids were found as 0.08 for budesonide, 0.344 for dexametazon sodium phosphate, 0.998 for metylprednisolon sodium suksinate, and 3.24 mM for prednisolone. But fluticasone propionate and metilprednisolone acetate did not show regular inhibition. It was determined that for hCA II only metilprednisolone acetate had I50 as 1.82 mM and other glucocorticoids did not have regular inhibition effects too. It was seen that in urological drugs levofloxacine had I50 as 0.52 for hCA I and 0.86 mM for hCA II and neostigmine methyl sulphate did not show any inhibition effect on isozymes. It was found that I50 values of antiulcer drugs famotidine and hyoscine N-butyl bromide on esterase activity for CA I were 0.29 and 7.7 mM, Ki values were 0.177±0.04 mM and 2.19±0.302 mM, for hCA II I50 was 0.93 mM and Ki was 0.431±0.10 mM. esomeprazole sodium activated two enzyme in esterase activity and other antiulcers did not have inhibition. Inhibition types of antiulcers were determined as competitive. Budesonide, fluticasone propionat and metylprednisolone sodium suksinat had I50 values for hCA I 0.133, 0.03 and 1.22 mM, Ki values 0.093±0.022, 0.0365±0.016 and 1.149±0.35 mM and for hCA II I50 values 0.155, 0.054 and 18.73 mM, Ki values 0.295±0.04, 0.054±0.018 and 11.09±5.02 mM. It was found that dexametazon sodium phosphate activated both isozymes and other glucucorticoids did not have regular inhibition. Inhibition type of budesonide was uncompetitive, methylprednisolone sodium süksinat was competitive and fluticasone propionat was competitive for hCA I and uncompetitive for hCA II.