Hypogymnıa cinsi iki liken türünde (H. tubulosa ve H. physodes) analitik (CAP LC-ESI-MS/MS) ve mikroskobik (ışık ve elektron) yöntemlerle sialik asitlerin belirlenmesi
Determination of sialic acids in two lichen species of hypogymnia genus (H. tubulosa and H. physodes) by analytical (CAP LC-ESI-MS/MS) and microscopic (light and electron) methods
Yazar: DİDEM ERKAN
Danışman: DOÇ. DR. REMZİYE DEVECİ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Glikokonjugatlar, bütün hücrelerde bulunurlar ve birçok biyolojik olayda iş görürler. Glikokonjugatların yapısındaki glikan zincirlerinin uç şeker molekülü genellikle sialik asittir (Sia). Bu nedenle glikokonjugatların rolleri doğrudan Sia tarafından kontrol edilir, yönlendirilir. Virüsten insana kadar hemen tüm canlılarda yayılış gösteren Sia'nın bitkilerde bulunduğuna ilişkin son bilgiler halen tartışmalıdır. Likenlerde ise böyle bir çalışma bulunmamaktadır.Bu çalışmada, Hypogymnia cinsine ait iki liken türünde (H.tubulosa ve H.physodes) öncelikle Sia'nın belirlenmesi hedeflenmiştir. Bulunması durumunda ardından tipleri, miktarları, kimyasal bağ özelliklerini saptamak amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, incelenecek liken türlerinin öncelikle histolojik yapıları, epon bloklardan alınan yarı ince kesitlerin toluidin mavisi ile boyanmasıyla ışık mikroskobunda incelenmiştir. Sia'nın ve özelliklerinin belirlenmesi için analitik (Cap LC-ESI-MS/MS) ve mikroskobik (ışık mikroskobunda HRP işaretli, transmisyon elektron mikroskobunda altın işaretli lektin uygulamaları ile) yöntemlerden yararlanılmıştır.İncelenen her iki liken türü de heteromerik tallus yapısına sahiptir. Yani, belirgin bir tabakalaşma görülür. Bunlar, dıştan içe doğru epikorteks, korteks, algsi tabaka, medulla ve alt korteks şeklinde sıralanırlar. İki tür arasındaki en önemli fark, korteks tabakasındaki mantar hücrelerinin yapısı ve dağılımındadır. H.tubulosa'da gevşek dağılmış hücreler uzun çıkıntılarla birbirlerine tutunurken, H.physodes'de yoğun hücrelerarası matriks elemanlarıyla birbirlerine yapışmış gibidirler.Sia belirlemeleri için öncelikle Cap LC-ESI-MS/MS ile çalışılmıştır. Neu5Ac ve Neu5Gc standartlarının alıkonma zamanları ile karşılaştırılan liken örneklerinde sadece Neu5Ac saptanmıştır. Miktar hesaplamaları ile de H.tubulosa'nın (1,36 ng/mg) H.physodes'den (0,25 ng/mg) daha fazla Sia içerdiği bulunmuştur. Bu nedenle lektin histokimyası/sitokimyası ile Sia incelemeleri sadece H.tubulosa'da gerçekleştirilmiştir. 0,75µm'lik lowicryl kesitlere HRP işaretli LFA (Limax flavus agglutinin, tüm Sia'lara özgün), MAA (Maackia amurensis agglutinin, ?2-3 bağına özgün) ve SNA (Sambucus nigra agglutinin, ?2-6 bağına özgün) lektinlerin uygulanmasıyla; Sia'lar korteks bölgesi mantar hücrelerinin hücre yüzeyleri ve nukleuslarında en fazla bulunmuştur. ?-2,3 bağlı Sia'lar ?-2,6 bağlı Sia'lardan -özellikle nukleusta- biraz daha fazladır. Lektin sitokimyası için ince lowicryl kesitlere altın işaretli LFA ve LPA (Limulus polyphemus agglutinin, tüm Sia'lara özgün) lektinlerin uygulanmasıyla, Sia'lar mantar hücrelerinin hücre duvarı, hücre zarı, sitoplazma ve özellikle nukleusunda saptanmıştır. Alg hücrelerinde, hücre duvarı ve elektronca yoğun sitoplazmik bölgede az, nukleusta fazladır.Sonuç olarak; bu çalışma analitik ve mikroskobik yöntemlerle, incelenen liken türlerinde Sialik asit (Neu5Ac) bulunduğunu tartışmasız olarak kanıtlamaktadır. Ayrıca Sia bağ tipleri (?-2,3 ve ?-2,6) ve yoğunlukları da belirlenmiştir. Likenlerde bu konudaki ilk çalışma olması bakımından önemlidir.

Abstract:
Glycoconjugates are found in all cells and they operate in many biological events. The terminal sugar molecule of glycan chains in glycoconjugates structure is generaly sialic acid (Sia). Therefore the roles of glycoconjugates are directly controlled or regulated by Sia. Sialic acids are found widely spreading in all organism from virus to human however the presence of Sia in plants is stil questionable. There is not any such study in lichens.In this study, firstly determination of Sia in two lichen species (H.tubulosa and H.physodes) is targeted. In case of determining, investigating types, quantities, the properties of the chemical bond is intended. Accordingly, first of all the histological structures of lichen species are examined by staining with tolidin blue in semi thin sections from epon blocks in light microscope. In order to elucidate the properties of Sia, analytical (Cap LC-ESI-MS/MS) and microscopic (labeled with HRP lectin in light microscopy , -gold labeled lectin in transmission electron microscopy ) methods were used.Both lichen species being investigated have heteromerous tallus structure. Namely, a clear stratification is observed. These are arranged inwards as epicortex, cortex, algal layer, medulla and lower cortex. The major difference among two species is the structure and distribution of mycobiont cells in cortex layer. While in H.tubulosa loosely scattered cells hold each other with long projections, in H.physodes they are like dense intercellular matrix elements that are stuck to each other.Cap LC-ESI-MS/MS was used to determine Sia types. When compared retention-times of Neu5Ac and Neu5Gc among the standards and samples, only Neu5Ac was found in lichens. Amount of Sia (1.36 ng / mg) in H.tubulosa contained more than that of (0.25 ng / mg) H.physodes. Therefore, lectin histochemistry/cytochemistry investigations were carried out only with H.tubulosa. Sialic acids were mostly found cell surfaces and nuclei of fungal cell in the cortex area by using lectin applications that lowicryl sections (0.75 µm) with HRP-conjugated LFA (Limax flavus agglutinin, specific for all Sia types) , MAA (Maackia amurensis agglutinin, specific for ?2-3) and SNA (Sambucus nigra agglutinin, specific for ?2-6). ?-2,3 linked Sia's are a little more than ?-2,6 linked Sia's -especially in nucleus. In lectin cytochemistry application, Gold-conjugated LFA and LPA (Limulus Polyphemus agglutinin, all Sia types) lectins were used to thin sections of lowicryl. Sialic acides were determined in fungal cell wall, cell membrane and particularly in nucleus. Sialic acids in cell wall and electron dense cytoplasmic region of algal cells were less found than in the nucleus.As a result, this study proves uncontroversially presence of Sialic acid (Neu5Ac) in lichen species by analytic and microscopic methods. Also, bond types (?-2,3 and ?-2,6) and intensity of Sia were determined. . This study is important due to be first study on this issue for lichens.