Escherichia coli ekspresyon sistemine dayalı rekombinant viral hemorajik septisemi virusu glikoprotein G'nin üretilmesi ve immünolojik etkinliğinin araştırılması
The production of recombinant viral hemorrhagic septisemi viral glycoproteine that is based on the escherichia coli expression system and investigation of immunological effectiveness
Yazar: CÜNEYT TAMER
Danışman: PROF. DR. SEMRA GÜMÜŞOVA
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Alabalıklar = Trouts ; Aşılama = Vaccination ; Aşılar = Vaccines ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Glikoproteinler = Glycoproteins ; Gökkuşağı alabalığı = Rainbow trout ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic ; Sepsis = Sepsis ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Amaç: Son yıllarda, su ürünleri yetiştiriciliği sektörü dünya çapında sürekli bir büyüme içindedir. Yabani balık popülasyonlarında genelde sporadik olarak ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar, intansif balık yetiştiriciliğinde ise yüksek ölüm oranlarına neden olmaktadır. Bununla birlikte, balık yetiştiriciliği endüstrisinin geleceği için, antibiyotik tüketiminin azaltılması ve balık aşılarının yaygın kullanıma sunulması önemlidir. Viral hemorajik septisemi virusu (VHSV), deniz ve çiftlik balıklarında yüksek ölüm oranına (%70) neden olan Rhabdoviridae ailesininde, zarflı, tek iplikçikli bir RNA içeren virusudur. Bu tez ile, balıklarda VHSV nedeniyle oluşan mortalitenin azaltılabilmesi için Escherichia coli ekspresyon sistemine dayalı rekombinant subunit bir aşı geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Materyal ve Metot: VHSV'ye karşı rekombinant aşı geliştirmek amacıyla VHSV'nin gG geni polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemiyle çoğaltılarak rekombinant protein ürünleri elde etmek için bir Escherichia coli (E. coli) ekspresyon vektörüne (pET-28a) klonlandı. Diğer yandan formol ile inaktive edilmiş tam partikül aşı hazırlanarak ekspres edilmiş gG proteinini içeren rekombinant aşının antikor cevabını ve koruyucu etkinliğini belirlemek için bir deneme tasarlandı. Bu amaçla, 17-60 gram ağırlığındaki gökkuşağı alabalıkları, adjuvantlı (montanit) saflaştırılmış rekombinant VHSV gG proteinleri ve adjuvantlı inaktif tam partikül aşı ile intraperitonal yolla aşılandı. Ardından gökkuşağı alabalığında orta derecede virülent VHSV (%30-35 mortalite oranına sahip) ile eprüvasyon yapıldı. Deneme boyunca belirli günlerde balıklardaki viral yük ve serum antikor titresi hesaplanarak aşıların etkinlikleri değerlendirildi.
Bulgular: Rekombinant E. coli ekspresyon sisteminde üretilmiş gG proteini ile aşılama yapılan balıkların serum örneklerinde, kontrol grubunda yer alan balıkların serum örneklerine kıyasla önemli ölçüde (P <0.05) yüksek oranda IgG antikor yanıtı oluşturduğu tespit edildi. Çalışma sonunda rekombinant aşı grubunda intraperitonal aşılamadan sonra ölüm oranının %15'ten %10'a düştüğü belirlendi. Ayrıca inaktif tam partikül aşı grubunda mortalite görülmedi (%0). Aşılı alabalıklarda belirgin şekilde düşen viral yükler rRT-PZR ile doğrulandı. 
Sonuç: Yerli izolattan üretilen rekombinant aşının koruyuculuk düzeyi kabul edilebilir olarak tespit edilmesine karşın, inaktif tam partikül aşı kadar etkili olmadığı belirlendi. Ayrıca 42. gün sonunda rekombinant aşılı alabalıklarında viral yükte yaklaşık 1000 kat düşüş oluşturduğu da tespit edildi.

Abstract:
Aim: During the last decades, there has been a continuous growth in the aquaculture industry all over the world. Infectious diseases that occur as a sporadic event in wild fish populations may cause high mortality when present in intensive fish farming. However, for the future of the fish farming industry it is also important that vaccination contributes to a sustainable biological production with negligible consumption of antibiotics. Viral heamorrhagic septicemia (VHS), a significant disease cause high mortalty (70%) especially in fry of farmed fish worldwide, is caused by infectious viral heamorrhagic septicemia virus (VHSV), a member of the family Rhabdoviridae, a family of enveloped, single-stranded RNA viruses with a non-segmented genome encoding six proteins. In this thesis, it was aimed to develop a recombinant subunit vaccine based on Escherichia coli expression system in order to reduce mortality caused by VHSV in fish.
Material and Method: To develop a recombinant vaccine for VHSV, the gG gene of VHSV produced by polymerase chain reaction (PCR) method, was cloned into an Escherichia coli (E. coli) expression vector (pET-28a) to produce recombinant protein products. Besides, formol-inactivated whole particle vaccine was prepared and a trial was designed to determine the antibody responses and protective capacity of the gG expressed recombinant vaccine. Subsequently, rainbow trout weighing between 17-60 grams were inoculated by injecting purified recombinant VHSV gG proteins with adjuvant (montanide) and whole particle inactive vaccine with adjuvant, followed by challenge with moderate virulent VHSV (30-35% mortality rate) in rainbow trout. The efficacy of the vaccines was evaluated by calculating the viral load and serum antibody titer in fish on certain days during the trial.
Results: It was found that recombinant E. coli derived gG protein induced significantly (P < 0.05) higher IgG antibody response in serum samples compared to control groups. At the end of the study, it was determined that the mortality rate decreased from 15% to 10% after intraperitoneal vaccination. In addition, no mortality was observed in the inactive whole particle vaccine group (0%). The viral loads significantly decreased in grafted trout were verified by rRT-PCR.
Conclusion: It was found that recombinant vaccine that produce from local isolates were not more effective in rainbow trout as inactivated whole particul vaccine despite of the recombinant vaccine produced more neutralizing antibodies. In addition, at the end of Day 42, approximately 1000 times decreasing at the viral load was found in the recombinant vaccinated trout.