Tüberküloz tanısı ve ilaç direncinin gösterilmesine yönelik moleküler beacon esaslı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon kiti geliştirilmesi
Development of a molecular beacon-based real-time polymerase chain reaction kit for the diagnosis of tuberculosis and drug resistance
Yazar: OĞUZ ARI
Danışman: PROF. DR. RIZA DURMAZ
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Epidemiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji = Infectious Diseases and Clinical Microbiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Tüberküloz (TB), Mycobacterium tuberculosis bakterisinin neden olduğu antik çağlardan beri halk sağlığını tehdit eden ölümcül salgın hastalıklardan biridir. TB'nin tedavisi, M. tuberculosis bakterisinin ilaçlara direnç kazanarak Çok İlaca Dirençli (ÇİD) ve Yaygın İlaç Dirençli (YİD) suşlarının ortaya çıkmasıyla daha da zor bir hal almıştır. Hastalığın kontrol altına alınması için hızlıca tanı koyulması ve ilaç direncinin tespit edilmesi gerekmektedir. Bu tez çalışmasının amacı, klinik örneklerde M. tuberculosis varlığının gösterilmesi yanında RİF, INH ve linezolid direncine yol açan mutasyonların tespiti ile ÇİD-TB suşlarına tanı koyabilecek bir multipleks qPCR tanı kiti geliştirmektir.
Geliştirilen kit, birinci PCR miksinde M. tuberculosis tespiti ile RİF direncini, ikinci PCR miksinde ise INH ve linezolid direncini tespit edecek şekilde tasarlanmıştır. Optimizasyon çalışmalarını takiben, kitin analitik duyarlılık/Limit of Detection (LOD), analitik özgüllük, tekrarlanabilirlik, doğruluk ve klinik örnekler üzerindeki etkinliği analiz edilmiştir.
TB tanısında kitin LOD değeri 124 cfu/mL olarak saptanmıştır. Klinik örneklerle ile yapılan çalışmalarda RİF, INH ve linezolid direnci ≥ %99 duyarlılık ve özgüllükte tespit edilebilmiştir. Kitin doğruluk çalışmalarında hatalı pozitif ve negatif sonuç alınmamıştır. Deney içi, deney arası ve lotlar arası tekrarlanabilirlik çalışmalarında kitin varyasyon katsayısı %1'in altında hesaplanmıştır. Kullanılan primer/probların M. tuberculosis kompleks dışındaki mikroorganizmalarla çapraz reaksiyon vermediği tespit edilmiştir.
Sonuç olarak geliştirilmiş olan kit, tüberkülozun erken tanısını sağlamakla beraber anti-TB ilaç direncini 2 saatten az bir sürede saptayarak TB'nin tedavi ve kontrolüne önemli katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Tuberculosis (TB) caused by Mycobacterium tuberculosis is one of the fatal epidemic diseases that has threatened global public health since ancient times. Treatment of TB has become even more difficult with the emergence of Multidrug Resistant (MDR) and Extensively Drug Resistant (XDR) strains of M. tuberculosis. In order to control the disease, a rapid diagnosis and drug resistance must be determined. The aim of this thesis is to develop a multiplex qPCR diagnostic kit that can diagnose MDR-TB strains by detecting the presence of M. tuberculosis in clinical samples as well as mutations that cause RIF, INH and linezolid resistance.
The kit was designed to detect M. tuberculosis and RIF resistance in the first PCR mix, and to detect INH and linezolid resistance in the second PCR mix. Following the optimization studies, kit's Analytical Sensitivity/Limit of Detection (LOD), Analytical Specificity, Reproducibility, Robustness and Effectiveness on clinical samples were analyzed.
The LOD value of the kit in the diagnosis of TB was determined as 124 cfu/mL. In studies conducted with clinical samples, RIF, INH and linezolid resistance was detected with ≥ 99% sensitivity and specificity. No false positive or negative results were obtained in the kit's robustness studies. In intra-experiment, inter-experiment and inter-lot repeatability studies, the coefficient of variation of the kit was calculated as below 1%. It was also determined that the primers/probes used in the kit did not cross-react with microorganisms other than M. tuberculosis complex.
As a result, the developed kit will make a significant contribution to the treatment and control of TB by detecting anti-TB drug resistance in less than 2 hours, as well as the early diagnosis of tuberculosis.