Timolün glioblastoma hücre hattında Aβ25-35 ile oluşturulan Alzheimer modeli üzerindeki nöroprotektif etkisinin araştırılması
Investigation of the neuroprotective potential of thymol on an Alzheimer's model created with Aβ25-35 in glioblastoma cell line
Yazar: BESTE BALBAL
Danışman: PROF. DR. SEFA KIZILDAĞ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease

Özet:
Nörodejeneratif hastalıklar, nöronal ölüm ile karakterizedir ve ilerlemiş yaş riskine bağlı hastalık grubunda bulunmaktadır. Yıllar içerisinde nüfusun yaşlanmasına bağlı olarak nörodejeneratif hastalıklardan etkilenen kişi sayısı artmakta olup tedavi edilmesinde güçlükler yaşanmaktadır. Nörodejeneratif hastalık olarak tanımlanan Alzheimer hastalığı (AH); dünyada yaklaşık 45 milyonu etkileyen demansın ve ölümün birincil sebebidir. AH, hücre dışı amiloid beta (Aβ) fibrillerinin beyin parankim ve damar duvarlarında toplanması sonucunda nöronlarda fosforile edilmiş Tau proteininin anormal birikmesiyle ilişkilidir. Beyinde apoptoz, intrinsik ve ekstrinsik yolak üzerinden tetiklenebilmekte olup birçok gen ailesinin aktivasyonu veya inhibisyonuyla ilişkilidir.
AH'li kişilerin beyinlerindeki birikimlere benzer şekilde sentetik Aβ25-35, in vitro ortamda agregatların oluşmasına-toksik etki göstermesine neden olmaktadır.
Timol, renksiz kristal monoterpen fenoldür. Kekik türleri içerisindeki sekonder metabolitlerden birisidir. Yüzyıllardır geleneksel tıpta kullanılmıştır ve antioksidan, anti-inflamatuar, antibakteriyel, antitümör, serbest radikal süpürücü gibi farmakolojik özelliklere sahiptir. Lipofilik yapıya sahip olması sebebiyle kan beyin bariyerini geçip beyin dokusunda biriktiğinden iyon kanallarının ve nöronların işlevini olumlu yönde etkilemektedir. 
Bu çalışmada Aβ25-35 ile oluşturulan AH modelinde Timol'ün potansiyel nörokoruyucu etkisinin kolinerik nöron karakteri kazandırılmış U-87 hücresinde (D-U-87 hücresi) araştırılması amaçlandı. 
Çalışma kapsamında U-87 hücresine Sodyum Bütirat (SB) ile kolinerjik nöron karakteri kazandırıldığının doğrulanması amacıyla kolinerjik nöron biyobelirteci olan ChAT' ın protein düzeyindeki ifade değişimi Western blot deneyi ile belirlendi. Protein seviyesinde, 2mM SB uygulaması, kontrol grubuna kıyasla ChAT oranında anlamlı kat değişimi göstererek kolinerjik nöron karakteri kazandırıldığı gözlemlendi (p <0,0001). Kolinerik nöron karakteri kazandırılmış U-87 hücresinde (D-U-87 hücresi) oluşturulan AH modelinde intrinsik apoptoz yolağında görevli genlerdeki mRNA ve protein seviyesindeki ifade değişimleri incelendi. Bcl-2, Bax ve Cyt-c' nin mRNA seviyesindeki ifade değişimleri RT-qPCR deneyi ile belirlendi. mRNA seviyesinde 1µM Aβ25-35 uygulaması, kontrol grubuna kıyasla anti-apoptotik Bcl-2/Bax oranında anlamlı kat değişimi göstererek apoptozu tetiklediği gözlemlendi (p<0,0001). mRNA seviyesinde 1µM Aβ25-35 + 200µM Timol uygulaması, 1µM Aβ25-35 grubuna kıyasla anti-apoptotik Bcl-2/Bax oranında anlamlı kat değişimi göstererek apoptozdan koruduğu gözlemlendi (p value 0,0014). mRNA seviyesinde 1µM Aβ25-35 uygulaması, kontrol grubuna kıyasla apoptotik Cyt-c ekspresyonunda anlamlı kat değişimi göstererek apoptozu tetiklediği gözlemlendi (p<0,0001). Bax ve Cyt-c' nin protein düzeyindeki ifade değişimleri Western blot deneyi ile belirlendi. Protein seviyesinde 1µM Aβ25-35 + 200µM Timol uygulaması, kontrol grubuna kıyasla pro-apoptotik Bax ekspresyonunda anlamlı kat değişimi göstererek Timol'ün anti-apoptotik etkisi belirlendi (p value 0,0004). Protein seviyesinde 1µM Aβ25-35 + 200µM Timol uygulaması, 1µM Aβ25-35 grubuna kıyasla pro-apoptotik Bax ekspresyonunda anlamlı kat değişimi göstererek Timol'ün anti-apoptotik etkisi belirlendi (p value 0,0070). Protein seviyesinde 200µM Timol uygulaması, kontrol grubuna kıyasla apoptotik Cyt-c ekspresyonunda anlamlı kat değişimi göstererek D-U-87 hücresini apoptozdan koruduğu saptandı (p <0,0001).
Yapılan çalışmalar sonrasında D-U-87 hücresinde Aβ25-35' in intrinsik apoptoz yolağı üzerinden hücre canlılığını azalttığını gösterdik. Aβ25-35' in doza bağlı olarak hücre canlılığını azalttığını ve devamında Timol uygulanmasıyla hücre canlılığında artış sağlayarak apoptozdan koruduğunu saptadık.

Abstract:
Neurodegenerative diseases are characterized by neuronal death and are found in the disease group associated with advanced age risk. Over the years, due to the aging population, the number of individuals affected by neurodegenerative diseases is increasing, posing difficulties in treatment. Alzheimer's disease (AD), defined as a neurodegenerative disease, is the primary cause of dementia affecting approximately 45 million people worldwide and leading to death. AD is associated with abnormal accumulation of extracellular amyloid beta (Aβ) fibrils in brain parenchyma and vascular walls, resulting in phosphorylated Tau protein aggregation in neurons. Apoptosis in the brain can be triggered through intrinsic and extrinsic pathways and is associated with activation or inhibition of many gene families.
Similarly to accumulations in the brains of AD patients, synthetic Aβ25-35 induces aggregation and exerts toxic effects in vitro.
Thymol is a colorless crystalline monoterpenoid phenol. It is one of the secondary metabolites found in thyme species. It has been used in traditional medicine for centuries and possesses pharmacological properties such as antioxidant, anti-inflammatory, antibacterial, antitumor, and free radical scavenging effects. Due to its lipophilic nature, it crosses the blood-brain barrier and accumulates in brain tissue, positively affecting the function of ion channels and neurons.
The aim of this study was to investigate the potential neuroprotective effect of Thymol in a model of Alzheimer's disease induced by Aβ25-35 using differentiated U-87 cells (D-U-87 cells) with cholinergic neuron characteristics.
Within the scope of the study, confirmation of the acquisition of cholinergic neuron characteristics in U-87 cells through Sodium Butyrate (SB) was achieved by assessing the expression changes of the cholinergic neuron biomarker ChAT at the protein level using Western blot experiment. 2mM SB treathment significantly increased the protein level of ChAT ratio compared to the control, indicating the acquisition of cholinergic neuron characteristics (p < 0.0001). In differentiated U-87 cells with cholinergic neuron characteristics (D-U-87 cells), alterations in the expression of genes involved in the intrinsic apoptotic pathway were examined in the model of Alzheimer's disease (AD) induced in these cells. The expression changes of Bcl-2, Bax, and Cyt-c at the mRNA level were determined using RT-qPCR experiment. mRNA level, treatment of 1 µM Aβ25-35 showed a significant increase in the anti-apoptotic Bcl-2/Bax ratio compared to the control group, indicating induction of apoptosis (p < 0.0001). Treatment of 1 µM Aβ25-35 + 200 µM Thymol at the mRNA level showed a significant increase in the anti-apoptotic Bcl-2/Bax ratio compared to the 1 µM Aβ25-35 group, indicating protection against apoptosis (p value 0.0014). Application of 1 µM Aβ25-35 showed a significant increase in apoptotic Cyt-c expression compared to the control group at the mRNA level, indicating induction of apoptosis (p < 0.0001). The expression changes of Bax and Cyt-c at the protein level were determined using Western Blot experiment. Protein level, treatment of 1 µM Aβ25-35 + 200 µM Thymol showed a significant decrease in pro-apoptotic Bax expression compared to the control group, confirming the anti-apoptotic effect of Thymol (p value 0.0004). Treatment of 1 µM Aβ25-35 + 200 µM Thymol showed a significant decrease in pro-apoptotic Bax expression compared to the 1 µM Aβ25-35 group, further confirming the anti-apoptotic effect of Thymol (p value 0.0070). Treatment of 200 µM Thymol at the protein level showed a significant decrease in apoptotic Cyt-c expression compared to the control group, indicating protection of D-U-87 cells from apoptosis (p < 0.0001).
After conducting the studies, we demonstrated that Aβ25-35 reduces cell viability through the intrinsic apoptotic pathway in D-U-87 cells. We found that Aβ25-35 decreases cell viability in a dose-dependent manner and subsequently observed that treatment with Thymol increases cell viability and protects against apoptosis.