Osseintegrasyonu arttıracak hidroksiapatit/siklodekstrin kompozit taşıyıcıların geliştirilmesi
Development of hydroxyapatite/cyclodextrin composite carriers to enhance osseointegration
Yazar: MERYEM SÜMEYYE AKDEMİR
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasının amacı, sert doku implantı olarak yaygın bir şekilde kullanılan titanyumun (Ti) osseointegrasyonunu arttırmak üzere Hidroksipropil-β-siklodekstrin (HPβCD)/Melatonin inklüzyon kompleksinin oluşumuna olanak sağlayacak hidroksiapatit (HA)/HPβCD kompozit taşıyıcıların geliştirilmesi ve in vitro koşullarda osseointegrasyon üzerindeki etkilerinin araştırılmasıdır.
Tez çalışmasının ilk aşamasında, HA oluşumunu hızlandırmak ve kaplama kararlılığını arttırmak için yüzeyde titanyum oksit (TiO2) tabakası oluşumu hedeflenmiştir. Bu kapsamda %99 saflıktaki titanyum plakalar farklı boyutlara sahip silisyum karbür (SiC) zımpara çeşitleriyle zımparalanarak yüzey alanı arttırılmıştır. Yüzeyde mikro boyutta pürüzlülük oluşturulduktan sonra, istenen oksit tabakasının oluşumu için bazik ve anodik ortamda oksidasyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. Bazik oksidasyonla oluşan oksit tabakasının kararlılığının ve biyouyumluluğunun arttırılması için bazik oksidasyon sonrası yüzey 600oC'de ısıl işleme maruz bırakılmıştır Ayrıca anodik oksidasyon yöntemi ile titanyum plakaların yüzeyinde nano boyutta pürüzlülüğün ve oksit tabakasının oluşumu sağlanmıştır. Anodik oksidasyon ile en uygun morfolojiye sahip olan Ti yüzeylerin üretilebilmeleri için optimum koşullar belirlenmiştir. Anodizasyon yönteminde seçilen optimum parametreler ile (20 V gerilim, 1 cm anot/katot arası mesafe, 45 dk işlem süresi) yaklaşık 75 nm çapında nanotübüler yapıya benzer tepelerden oluşan TiO2 tabakası elde edilmiştir. Atomik Kuvvet Mikroskopu (AFM) analizinden elde edilen verilere göre yüzey pürüzlülüğünde (Ra) bazik oksidasyon sonrası 1.5 kat, anodik oksidasyon sonrası ise 4 kata varan bir artış sağlanmıştır. Ayrıca her iki oksidasyon yöntemi sonrası gerçekleştirilen su temas açısı tayini ile yüzey ıslatılabirliğinde artış sağlandığı tespit edilmiştir. Enerji Dağılımlı X-ışını (EDX) analizi ile yüzeyde %100'e varan TiO2 kaplamanın oluşturulduğu bulunmuştur.
Çalışmanın ikinci aşamasında, mekaniksel, kimyasal ve elektrokimyasal işlemler uygulanarak modifiye edilen Ti plakalar 10 kat derişik yapay vücut sıvısı (10xSBF) çözeltisi kullanılarak biyomimetik çöktürme yöntemi ile oda koşullarında HA ile kaplanmıştır. Bu kapsamda oluşturulan HA kaplamanın kimyasal yapısı Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) ve EDX analizleriyle belirlenirken, kalınlığı ve morfolojik özellikleri Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) analizi ile, yüzeye tutunma kararlılığı ise mikro çizik analiziyle saptanmıştır. Bazik oksidasyon ile oksitlendirilmiş yüzeylerdeki HA kaplamanın fiziksel olarak daha kararlı olduğu bulunmuştur.
Çalışmanın üçüncü aşamasında HA tabakasının üzerine suda çözünür/çözünmez (çapraz bağlı) HPβCD temelli, kontrollü salıma olanak sağlayacak bir taşıyıcı yüzey oluşturulmuştur. Suda çözünmez HPβCD taşıyıcılar 1,2,3,4-bütantetrakarboksilik asit ile çapraz bağlanarak elde edilmiştir. Elde edilen yapının özellikleri FTIR, SEM ve termogravimetrik analiz (TGA) ile tespit edilmiştir. HA kaplı Ti plakalar üzerinde kararlı bir HPβCD tabakasının elde edilebilmesi için çapraz bağlama basamağında pH değeri optimize edilmiş ve en uygun pH değeri 4 olarak tespit edilmiştir. Suda çözünür özellikteki HPβCD/Melatonin kompleksinin üretimi için grubumuz tarafından optimize edilen mikrodalga yöntemi kullanılmıştır.
Çalışmanın sonraki aşamasında HPβCD'nin inklüzyon kompleksi yapma özelliğinden faydalanılarak, kemik metabolizması üzerinde etkileri olduğu bilinen melatonin hormonu ile kompleks oluşturması sağlanmıştır. HPβCD/Melatonin inklüzyon kompleksinin oluşumunun tespiti için gerçekleştirilen FTIR analizinde etanol/su karışımı içinde çözülen melatonin ile HPβCD'nin (pH:1 ve 4) kompleks oluşturduğu tespit edilmiştir. HPβCD/Melatonin kompleksinin oluşturulması esnasında pipetleme ve daldırma olmak üzere iki farklı yükleme yöntemi kullanılmıştır. Oluşturulan HA/HPβCD (suda çözünür/çözünmez) kompozit taşıyıcının melatonin salım kinetiğinin belirlenebilmesi için in vitro salım çalışmaları gerçekleştirilmiş ve çapraz bağlı HPβCD membranlarda uzatılmış salım, suda çözünür mebranlarda ise ani salım profilleri tespit edilmiştir.
Ti/HA/HPβCD/Melatonin kompozit sistemin osseointegrasyon potansiyeli, preosteoblastik MC3T3-E1 hücre hattı ile yürütülen in vitro kültür çalışmaları ile incelenmiştir. Hücre canlılık analizi (MTT) sonuçları, HA katkısının hücre yapışmasını desteklediğini göstermiştir. Bunla birlikte çapraz bağlanmış HPβCD membranların hücre yapışmasını desteklemediği dolayısıyla hücre yapışmasının istenmediği durumlar için kontrollü salıma izin veren oldukça uygun yüzeyler olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca HPβCD'nin varlığının hücre tutunması ve çoğalmasını baskıladığı belirlenmiştir. Farmosötik açıdan birçok uygulama alanı olmasına rağmen çapraz bağlanmış HPβCD'nin hücreler üzerindeki etkisinin araştırıldığı bir çalışmaya literatürde rastlanmamıştır Bu nedenle çalışmadan elde edilen bulgular HPβCD'nin yeni uygulamalarının ortaya koyulması açısından önem taşımaktadır.

Abstract:
The aim of this thesis was to prepare hydroxyapatite (HA)/hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) composite carriers that will allow the formation of  HPβCD/Melatonin inclusion complex to improve osseointegration of titanium (Ti) which is commonly used in hard tissue implants, and to investigate the effects of it on osseointegration in vitro. 
In the first stage of this study, formation of a titanium oxide (TiO2) layer on the surface was aimed to improve the speed of HA formation and to enhance the stability of the coating. In this context, Ti of 99% purity was used and the surface area of Ti was increased by grinding with silicone carbide (SiC) sandpapers of different grit sizes. After creating a micro roughness on Ti surface by grinding, alkaline and anodic oxidation treatments were applied to achieve the desired oxide layer. Following alkaline oxidation, the samples were heat treated at 600oC to improve the biocompatibility and stability of the oxide layer. In anodic oxidation method, an oxide layer with nano-sized roughness was generated on the titanium plates. Optimum anodic oxidation conditions were determined to obtain a TiO2 layer with the most suitable surface morphology. By applying the optimum parameters in anodic oxidation (20 V, 1 cm distance between anode and cathode, 45 min processing time) TiO2 layers consisting of hills of nanotubules, which are approximately 75 nm in diameter, were formed. According to atomic force microscopy (AFM) results, surface roughness (Ra) was increased by 150% and 400% after alkaline and anodic oxidation treatments, respectively. In addition, contact angle measurements showed that both oxidation methods increased the wettability of the samples. Energy dispersive X-ray (EDX) analysis demonstrated that surface coating was consisting of 100% TiO2.
In the second stage of the thesis, the Ti plates that were modified with mechanical, chemical and electrochemical processes were coated with HA in room conditions via biomimetic methods using 10xSynthetic Body Fluid (SBF). While the chemical structure of the HA coating was analysed with Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and EDX analyses, its thickness and morphological properties were visualized with Scanning Electron Microscopy (SEM). The binding stability of HA coating on modified Ti surfaces was determined via micro scratching analysis. It was found that HA coating exhibited better physical stability when Ti was modified with alkaline oxidation method. 
In the third stage of the thesis, water-soluble or insoluble (crosslinked) HPβCD based carrier surfaces that would enable controlled release of melatonin were formed on HA layer. Water insoluble HPβCD carrier was obtained via crosslinking with 1,2,3,4-butanetetracarboxylic acid (BTCA). While the properties of this structure were obtained via FTIR, SEM and thermogravimetric (TGA) analysis. To obtain stable HPβCD layers on HA coated Ti plates, 2 different pH values, pH 1 and pH 4, were adjusted during crosslinking process, and it was seen that pH 4 resulted to the formation of better stability. To prepare water-soluble HPβCD/Melatonin complexes, microwave irradiation method, which was developed and optimized by our research group, was used.
In the next stage of the study, HPβCD was complexed with melatonin that has effects on bone metabolism, depending on inclusion complex forming property of HPβCD. FTIR analysis was conducted to determine the formation of HPβCD/Melatonin inclusion complexes and it was found that the melatonin and HPβCD, which were solved in an ethanol/water solution (pH 1 and 4), had formed a complex. Two different loading methods were used while forming the HPβCD/Melatonin complexes, which were pipetting and immersing. In vitro release studies were performed to determine the melatonin release kinetics of the HA/HPβCD composite carrier, and it was found that cross-linked HPβCD membranes had extended release profiles, while water-soluble membranes had burst release profiles.
Osseointegration potential of Ti/HA/HPβCD/Melatonin composite systems was determined with in vitro culture studies conducted with preosteoblastic MC3T3-El cell line. Cell viability analysis had shown that HA inclusion had supported cell adhesion. Furthermore, it was determined that cross-linked HPβCD membranes had not supported cell adhesion, and this had shown that they are suitable surfaces that support controlled release of biosignals when cell adhesion is not desired. It was also found in the studies conducted with water-soluble complexes that the existence of HPβCD hinders cell adhesion and suppresses cell proliferation. While HPβCD has many pharmaceutical applications, cell surface interactions of crosslinked HPβCD have not been investigated in the related literature. For this reason, the findings of this study carry importance to seek new applications of HPβCD systems.