Ağrı yöresinde köpeklerde echinococcus granulosus yumurtaları ile koyun ve sığırlardan elde edilen kistik ekinokokkoz izolatlarının NAD5 gen bölgesinin moleküler yöntemlerle araştırılması
Investigation of NAD5 gene region of echinococcus granulosus EGGS in DOGS and cystic echinococcosis isolates obtained from sheep and cattle by molecular methods in ağri province
Yazar: MILAD TORKAMANIANAFSHAR
Danışman: PROF. DR. HASAN YILMAZ
Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı / Parazitoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Parazitoloji = Parasitology

Özet:
Bu çalışmanın amacı, Ağrı yöresindeki köpeklerden elde edilen dışkı örneklerinde saptanan E. granulosus yumurtaları ile koyun ve sığırlardan elde edilen kistik ekinokok örneklerinin mitokondrial NAD5 gen bölgesini karakterize ederek genotipleri ve meydana gelen mutasyonları belirlemektir. Çalışma, Ağrı merkez ve ilçeleri ile Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuvarında 10.04.2021-20.12.2022 tarihleri arasında yürütüldü. Çalışmaya, kesimi yapılan 100 sığır ve 100 koyuna ait hidatik kist sıvısı örnekleri ile 100 adet sahipsiz köpeğe ait dışkı örnekleri dahil edildi. Toplanan kist sıvısı örnekleri, protoskoleks ve germinal membranların varlığı, dışkı örnekleri ise sestod yumurtalarının varlığı yönünden ışık mikroskobu altında incelendi. Daha sonra, kistlerin germinal membranından ve dışkı örneklerinden DNA izolasyonu yapıldı. Bu amaçla parazitin mitokondriyal NAD5 gen bölgesi, NAD5F ve NAD5R primerleri kullanılarak PCR yöntemi ile çoğaltıldı. Çoğaltılan DNA örnekleri agaroz jelde yürütüldü ve 680 bp'lik bölgede bant veren örneklerin sekans analizleri yaptırıldı. Elde edilen genomik dizilimler Gen Bank'taki referans genotipler ile karşılaştırıldı. Kistlerin koyun (%57.1) ve sığırlarda (%59.1) en çok akciğerlere yerleştiği ve kalsifikasyon görülmeyen koyunlara ait 42 (%48.3) ve sığırlara ait 22 (%28.9) kist örneğinin fertil olduğu belirlendi. Köpeklere ait dışkı örneklerinin mikroskobik incelemesinde 100 dışkı örneğinin yedisinde (%7) Echinococcus spp. yumurtası saptandı. PCR yöntemi kullanılarak bu yedi örneğin ikisinde (%28.6), ayrıca mikroskopi ile yumurta görülmeyen ve rastgele seçilen 30 dışkı örneğinin ikisinde (%10.8) E. granulosus yumurtası saptandı. Köpek dışkısında saptanan dört yumurtanın, parazitin G1 genotipi olduğu belirlendi. DNA dizi analizi sonuçlarına göre koyun kökenli kist izolatlarının sekizinin G1, birinin G3 ve aynı şekilde sığır kökenli kist izolatlarının sekizinin G1, birinin G3 genotipi olduğu belirlendi. Ayrıca sekans analizi yapılan koyun kökenli G1 genotipe sahip üç ve G3 genotipe sahip bir örnek ile sığır kökenli G1 genotipe sahip bir ve G3 genotipe sahip bir örnekte mutasyon belirlendi. Hastalığın eradikasyonu için, kaçak ve kontrolsüz hayvan kesimlerinin önlenmesi, kist hidatikli organların ara konaklar tarafından tüketilmesi engellenerek uygun şekilde imha edilmesi ile toplumun konuyla ilgili
bilgilendirilmesi gerekmektedir.

Abstract:
The aim of this study was to characterize the mitochondrial NAD5 gene region of E. granulosus eggs and cystic echinococcus samples obtained from sheep and cattle, and to determine the genotypes and mutations in the stool samples obtained from dogs in the Ağrı region. The study was carried out between 10.04.2021 and 20.12.2022 in the center of Ağrı and its districts and in the Research Laboratory of Van Yüzüncü Yıl University Faculty of Medicine, Department of Medical Parasitology. Hydatid cyst fluid samples from 100 slaughtered cattle and 100 sheep and stool samples from 100 stray dogs were included in the study. Collected cyst fluid samples were examined under a light microscope for the presence of protoscolex and germinal membranes, and stool samples for the presence of cestode eggs. DNA was then isolated from the germinal membrane of the cysts and stool samples. For this purpose, the mitochondrial NAD5 gene region of the parasite was amplified by PCR method using NAD5F and NAD5R primers. The amplified DNA samples were run on agarose gel and sequence analyzes of the samples showing bands in the 680 bp region were performed. The obtained genomic sequences were compared with the reference genotypes in the Gen Bank. It was determined that the cysts were mostly located in the lungs in sheep (57.1%) and cattle (59.1%), and 42 (48.3%) cyst samples from sheep without calcification and 22 (28.9%) cyst samples from cattle were fertile. In the microscopic examination of stool samples of dogs, cestode eggs were detected in 7 (7%) of 100 stool samples. E. granulosus eggs were detected in two of seven stool samples (28.6%) that were positive by PCR and in two (10.8%) of 30 randomly selected stool samples that were not positive by PCR. It was determined that four eggs detected in dog feces were G1 genotype of the parasite. According to the results of DNA sequence analysis, eight of the sheep isolates were G1, one was G3 and eight of the bovine cyst isolates were G1, one was G3 genotype. In addition, mutations were determined in three sheep with G1 genotype and one sample with G3 genotype, and one sample with bovine G1 genotype and one with G3 genotype, which were sequenced. For the eradication of the disease, it is necessary to prevent illegal and uncontrolled animal slaughter, to prevent hydatid organs from being consumed by intermediate hosts and to destroy them properly, and to inform the society about the subject.