Acı çiğdem (Colchicum umbrosum S. ve Colchicum baytopiorum C.D.) ekstrelerinin hela hücreleri üzerine anti-tümöral etkilerinin araştırılması
Research of anti-tumoral effects of autumn crocus (Colchicum umbrosum S. and Colchicum baytopiorum C.D.) extracts on hela cells
Yazar: ÖZLEM DAĞDEVİREN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. GÜL ÖZCAN ARICAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu tez çalışmasında, Acı Çiğdem (Colchicum) bitkisinden hazırlanan ekstrelerin insan serviks karsinomu kökenli HeLa hücre soyu üzerindeki anti-tümöral etkisi incelendi. Bu bağlamda Bolu (Abant)'da yetişen Colchicum umbrosum Steven (S.) ve Antalya (Termessos)'da yetişen Colchicum baytopiorum C.D. Brickell (C.D.) bitkilerinin yumrularından elde edilen ekstrelerin 5 farklı konsantrasyonu (0.001, 0.05, 0.1, 0.5, 1 mg/ml) 24, 48 ve 72 saat süresince HeLa hücreleri üzerine uygulanarak 3-[4,5-dimetil-2-tiazolil]-2,5-difenil tetrazolyum bromid (MTT) yöntemi ile öncelikle sitotoksik aktiviteleri incelendi. Colchicum cinsine ait 2 farklı tür ekstresinin HeLa hücrelerinde meydana getirdikleri sitotoksisitenin uygulanan konsantrasyona bağlı olarak kontrole göre anlamlı olarak arttığı saptandı (p<0,05). Colchicum umbrosum S. bitkisine ait ekstrenin 0.001 mg/ml konsantrasyonunun kontrole göre anlamlı sitotoksik etkisi ise sadece 72 saatte ortaya çıktı (p<0,01). Ayrıca, 4?-6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile apoptotik indeks değerleri belirlenerek maksimum apoptotik indeks değerleri Colchicum baytopiorum C.D. ekstresinin 48 saat uygulanmasında saptandı.Colchicum baytopiorum C.D. bitkisinden hazırlanan ekstrenin en etkili 0.1 mg/ml'lik konsantrasyonunun 48 saat uygulandığı deney grubunda apoptoza özgü morfolojik değişimler faz-kontrast, ışık ve floresan mikroskopta gösterildi.Apoptozun moleküler düzeyde saptanması amacıyla bcl-2 gen ailesine üye bax, bak, bik, mcl-1, bfl-1, bcl-2, bcl-x genlerinin anlatım seviyeleri Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) yöntemi ile araştırıldı. Ayrıca agaroz jel elektroforezi yöntemi kullanılarak apoptoza özgü DNA fragmentasyonu incelendi. Colchicum baytopiorum C.D. bitkisinden hazırlanan ekstrenin 0.1 mg/ml konsantrasyonunun HeLa hücrelerine 48 saat uygulandığı deney grubunda mcl-1 ve bcl-x genlerinin anlatımlarında kontrole göre artış olduğu, bax, bak, bik, bfl-1 genlerinin anlatımlarının yapıldığı, bcl-2 gen anlatımının ise yapılmadığı saptandı.Sonuç olarak değerlendirilen parametreler doğrultusunda, her iki ekstrenin de farklı konsantrasyonlarının sitotoksik etkiye sahip oldukları ve HeLa hücrelerinin Colchicum bitkisinin baytopiorum türüne karşı daha duyarlı olduğu belirlendi. Bu etki ile beraber Colchicum baytopiorum C.D. bitki ekstresinin en etkin konsantrasyonunun 0.1 mg/ml olduğu ve apoptoza yol açarak HeLa hücrelerinde anti-tümöral etki gösterdiği ilk kez buçalışma ile ortaya kondu.

Abstract:
This thesis presents a research on the anti-tumoral effect of the Autumn Crocus (Colchicum) extracts on HeLa cell line originated from human cervical carsinoma. The HeLa cells have been treated with extracts taken from corms of Colchicum umbrosum Steven (S.) of Bolu (Abant) and Colchicum baytopiorum C.D. Brickell (C.D.) of Antalya (Termessos). In this research, 5 different concentrations (0.001, 0.05, 0.1, 0.5, 1 mg/ml) have been used at 24, 48 and 72 hours. The 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) method has been applied in order to observe the cytotoxic activities. Accordingly it has been determined that the cytotoxicity in HeLa cells, treated with the extracts from the two species of Colchicum plant is being increased in concentration compared to the control group (p<0,05). The meaningful cytotoxic effect of the 0.001 mg/ml concentration extracted from C.umbrosum S. have been occurred in only 72 hours, compared to the control group (p<0,01). Additionally, apoptotic index have been determined by 4?-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) respectively. The maximum parameters of the apoptotic index have been detected in the application of the C.baytopiorum C.D. extract, in 48 hours.The extract of C.baytopiorum C.D. has been treated with the most effective concentration of 0.1 mg/ml in the 48 hours experiment group. The morphological changes belong to the apoptosis have been shown through phase-contrast, light and the flouroscent microscopies.In order to determine the apoptosis at the molecular level, the expression rates of the genes of the bax, bak, bik, mcl-1, bfl-1, bcl-2, bcl-x which are members of the bcl-2 gene family, have been searched through the Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) method. In addition, the DNA fragmentation specific to apoptosis has also been examined using the agarose gel electrophoresis method. In the 48 hours experiment group of the HeLa cells that was treated with the 0.1 mg/ml concentration of the C.baytopiorum C.D. extract, an increasing have seen in expressions mcl-1 and bfl-1 genes compared to control group, there is some increase have been determined in the bax, bak, bik and bfl-1 genes expressions, on the other hand no expression observed in the bcl-2 genes.Based on the evaluation of this parameters, different concentrations of the both extracts from the two Colchicum species have cytotoxic effects and it has been understood that HeLa cells are more sensitive to the species of C.baytopiorum. For the first time, this research proves that the most effective concentration of the C.baytopiorum C.D. extract is 0.1 mg/ml and it shows anti-tumoral effects by causing apoptosis.