Sünger ilişkili bakterilerin izolasyonu, antimikrobiyal aktivitlerinin belirlenmesi ve seçilen suşun metabolitlerinin araştırılması
Isolation of sponge associated bacteria, determination of their antimicrobial activies and an investigation on the metabolities of the selected strain
Yazar: FERHAT CAN ÖZKAYA
Danışman: DOÇ. DR. E. ESİN HAMEŞ KOCABAŞ ; PROF. DR. ERDAL BEDİR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Tez kapsamında, denizel süngerlerden izole edilen bakterilerin biyoaktif metabolit üretim potansiyellerine ve profillerine göre taranarak metabolit izolasyonu amaçlanmıştır.Bu çalışmada Akdenize ve Ege Denzi'nin farklı derinliklerinden (0-35 m) 62 sünger örneği toplanmış ve bunlardan 195 adet mezofilik bakteri izole edilmiştir. İzolatların ilk olarak dik çizgi ekim yöntemi ile antimikrobiyal potansiyelleri taranmış, seçilen suşlar 28 ºC'de 48 saat boyunca iki farklı besiyerinde inkübe edilmiştir. Ardından santrifüj ile hücreler üretim ortamlarından ayrılmış ve fermentasyon sıvıları etil asetat ile özütlenmiştir. Özütlerin antimikrobiyal aktiviteleri Escherichia coli O157:H7 (RSKK 232), metisilin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) (RSKK 95047), vankomisin dirençli Enterococcus faecium (VREF) (DSM 13590), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) bakteriler ve Candida albicans (DSM 5817) mayası kullanılarak disk difüzyon yöntemi ile test edilmiştir. Aktif suşların disk difüzyon ve İTK (ince tabaka kromatografisi) profilleri değerlendirilmiş, içlerinden 4.9.3 kodlu Pseudomonas fluorescens 4.9.3 ileri çalışmalar için seçilmiştir. İlk aşamada 60 litre üretim fermantasyon ve santrifüjle hücreleri ayrılan fermentasyon sıvısı etil asetat ile özütlenerek kromatografik çalışmalara geçilmiştir. Yeni metabolit FC1'in yapısı 1D [(1H and 13C-NMR) (nuclear magnetic resonance)] ve 2D NMR [COSY(correlation spectroscopy), HMQC (heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy), HMBC (heteronuclear single-quantun correlation spectroscopy)] kullanılarak N-(2-(1H-imidazol-4-yl)ethyl)-2-(2-hydroxyphenyl)-5-methyl-4,5-dihydrooxazole-4-carboxamide olarak belirlenmiştir. Diğer metabolit ise bilinen bir molekül olan pre-pseudomonin olarak tanımlanmıştır. Literatürler her iki molekülün de bakteri ve Pseudomanas türleri tarafından üretilen siderofor grubunda yer aldığını göstermektedir. Bu çalışma denizel bakterilerden yeni biyoaktif metabolit izolasyonu için başlamasına rağmen yapı tayinine gidilen metabolitlerde aktivite saptanmamıştır. Bunun sebebinin düşük miktarlarda bulunması veya kromatografik çalışmalar sırasında aktif olmayan forma dönüşmesi olabilir. Sonuç olarak denizel Pseudomonas fluorescens 4.9.3'ten yeni bir metabolit (FC1) ve bilinen bir molekül olan pre-pseudomonin izolasyonu gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
The aim of this thesis is to isolate new bioactive metabolites from sponge-associated bacteria by screening their antibiotic production potential and chemical profiles.In this study, 62 sponge samples were collected from defined locations and depths (0-35 m) of Mediterranean Sea, and 195 bacteria were isolated. Firstly, their antimicrobial potential was screened by cross-streaking. The selected 39 isolates were incubated in two different medium at 28 ºC for 48 hours, and cell-free fermentation broth were extracted by ethyl acetate. Activity of the extracts was tested against to Escherichia coli O157:H7 (RSKK 232), methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) (RSKK 95047), vancomycine resistant Enterococcus faecium (VREF) (DSM 13590), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Candida albicans (DSM 5817) by disc diffusion method. The results of bioactivity and TLC (thin layer chromatography) profiles of the isolates were evaluated, and the isolate 4.9.3 was selected for further studies. The isolate 4.9.3 was cultivated at large-scale (60 L) for isolation of the major metabolites, followed by ethyl acetate extraction and chromatographic studies. Structure of the new metabolite FC1 was established as N-(2-(1H-imidazol-4-yl)ethyl)-2-(2-hydroxyphenyl)-5-methyl-4,5-dihydrooxazole-4-carboxamide by using 1D [(1H and 13C-NMR )(nuclear magnetic resonance)] and 2D NMR [COSY (correlation spectroscopy), HMQC (heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy), HMBC (heteronuclear single-quantun correlation spectroscopy)]. The other metabolite (FC2) was identified as pre-pseudomonin, a known molecule formed via chemical transformation. Based on the literature search, we found out that both molecules were from siderophore class, a well-known metabolite group in bacteria and Pseudomonas genus. Although, this study was started to discover new bioactive metabolites from marine bacteria, we were not able to obtain any active compounds. Overriding reasons for the failure might be i) less quantity of the bioactive compounds in the extract, ii) chemical transformation of the active metabolites into non-active ones during chromatographic studies. Consequently, a new metabolite (FC1) together with a known one (pre-pseudomonin) was isolated from marine derived Pseudomonas fluorescens 4.9.3 strain.