Doğrudan pozitif kan kültür şişelerinden matriks aracılı lazer dezorpsiyon iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) ile hızlı mikrobiyal tanımlamada farklı yöntemlerin araştırılması
Investigation of different methods in rapid microbial identification from directly positive blood culture bottles by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
Yazar: DİLAN KARADAĞ
Danışman: DOÇ. DR. MAHMUT CEM ERGON
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: Kan kültürü, sepsis tanısında altın standart olup mikroorganizmaları hızlı ve doğru tanımlama mortaliteyi düşürmekte ve uygun antibiyotik kullanımı ile sağaltım sağlanabilmektedir. Bu çalışmada, kan kültüründe üreyen mikroorganizmaları doğrudan kan kültür şişesinden MALDI-TOF MS ile kısa sürede tanımlamada kullanılan hızlı tanımlama yöntemlerini iki farklı okuma modülünde karşılaştırarak laboratuvar için en uygulanabilir ve maliyet etkin olan yöntemi belirlemeyi amaçladık. 
Gereç ve Yöntem: Araştırmada, Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Merkez Laboratuvarı Bakteriyoloji Laboratuvarına Aralık 2022-Mart 2023 tarihleri arasında dolaşım sistemi enfeksiyonu şüphesiyle gönderilen ve BACTEC FX (Becton Dickinson, ABD) kan kültürü cihazında inkübe edildikten sonra pozitif sinyal veren BD BACTEC FX Plus Aerobic, Plus Anaerobic, Lytic/10 Anaerob/F ve Peds Plus/F kan kültür şişelerinden oluşan 245 adet kan kültürü örneği yer aldı. Polimikrobiyal üreme tespit edilen beş örnek ve aynı hastaya ait bir hafta içinde tekrar eden üremeler çalışma dışı bırakıldı. MBT Sepsityper IVD kiti (Bruker Daltonik, Almanya), Sodyum dodesil sülfat (SDS) ile lizis ve diferansiyel santrifüj ve protein ekstraksiyonu (PE) yöntemleri ile elde edilen sonuçlar, Bruker Biotyper MBT smart MALDI-TOF MS cihazının standart ve Sepsityper modülünde okutularak rutin koloniden MALDI-TOF MS tanımlama sonuçlarıyla karşılaştırıldı. 
Bulgular:
Sepsityper kiti ile standart modülde, ≥1.7 tanımlama skoru ile %57.9 oranında örnek doğru tanımlanmışken Sepsityper modülünde ise ≥1.6 tanımlama skoru ile bu oran %74.2'ye yükseldi. Standart modülden Sepsityper modülüne geçiş ile doğru tanımlama oranları SDS ile lizis metoduyla %81.3'ten %90.4'a, Santrifüj + PE metoduyla %75.4'ten %84.2'ye yükseldi. Standart modülde, SDS ile lizis ile Sepsityper kiti ve Santrifüj + PE yöntemi ile Sepsityper kiti arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı (p<0.001). Sepsityper modülünde ise üç yöntem arasında da istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı. 
Standart modül ve Sepsityper modülünde, Gram negatif bakterilerin sırasıyla Sepsityper kitiyle %63.7'si ve %75.8'i, SDS ile lizis metoduyla %86.3'ü ve %91.9'u, Santrifüj + PE metoduyla %87.9'u ve %89.5'i tür düzeyinde doğru tanımlandı. Gram negatif bakterilerin tür düzeyinde doğru tanımlanmasında, SDS ile lizis metodu ve Sepsityper kitinde modüller arasındaki fark, istatistiksel olarak anlamlı bulundu (sırasıyla p=0.039 ve p<0.001). 
Standart modül ve Sepsityper modülünde, Gram pozitif bakterilerin sırasıyla Sepsityper kitiyle %51.7'si ve %70.7'si, SDS ile lizis metoduyla %75.9'u ve %87.1'i, Santrifüj + PE metoduyla %62.1'i ve %78.4'ü tür düzeyinde doğru tanımlandı. Gram pozitif bakterilerin tür düzeyinde doğru tanımlanmasında, karşılaştırılan üç yöntemde de modüller arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.001). 
Sadece Sepsityper modülünde, sekiz adet cins düzeyinde ve dört adet tür düzeyinde yanlış tanımlama Sepsityper kiti ve SDS ile lizis yöntemiyle yapılan çalışmalarda saptandı. 
Sonuç: Karşılaştırılan üç yöntem arasında en iyi performans SDS ile lizis metodunda elde edildi. Karşılaştırılan iki okuma modülünden Sepsityper yazılım modülüyle daha iyi performans gerçekleşmiş olsa da bu modüldeki yanlış tanımlama riski göz ardı edilmemelidir. 

Anahtar kelimeler: MALDI-TOF MS, doğrudan tanımlama, kan kültürü, Sepsityper, SDS, santrifüj yöntemi

Abstract:
Aim: Blood culture is the gold standard in the diagnosis of sepsis, and rapid and accurate identification of microorganisms reduces mortality and sepsis can be treated with appropriate antibiotic administration. The aim of the present study was to analyse the performance of three different preparation methods and determine the most applicable and cost-effective method for the laboratory by comparing in two different analysis modules for direct identification of bacteria from positive blood culture bottles with MALDI-TOF MS.
Materials and methods: In present study, 245 blood culture bottles of BD BACTEC FX Plus Aerobic, Plus Anaerobic, Lytic/10 Anaerob/F and Peds Plus/F, which were sent to Dokuz Eylül University Hospital Central Laboratory Bacteriology Laboratory with the suspicion of bloodstream infection between December 2022 and March 2023, and tagged a positive signal after incubation in the BACTEC FX (Becton Dickinson, USA) blood culture system, were evaluated. Five samples with polymicrobial growth and repetitive growths within a week of the same patient were excluded from the study. The results obtained by MBT Sepsityper IVD kit (Bruker Daltonics, Germany), lysis with Sodium dodecyl sulfate (SDS) and differential centrifugation and protein extraction (PE) methods were compared with the routine MALDI-TOF MS identification results obtained from colonies by analyzing in the standard and Sepsityper module of the Bruker Biotyper MBT smart MALDI-TOF MS.
Results: 
By using the standard module with the Sepsityper kit, 57.9% of the samples were correctly identified with acceptable identification score of ≥1.7, while this rate increased to 74.2% with an identification score of ≥1.6 by using the Sepsityper module. With the alteration from the standard module to the Sepsityper module, the correct identification rates increased from 81.3% to 90.4% by the SDS lysis method and from 75.4% to 84.2% by the Centrifugation + PE method. By using the standard module, statistically significant difference was found between SDS lysis method and Sepsityper kit and Centrifugation + PE method and Sepsityper kit (p<0.001). A statistically significant difference was found between the three methods by using the Sepsityper module.
In the standard module and Sepsityper module, 63.7% and 75.8%, 86.3% and 91.9%, 87.9% and 89.5% of Gram-negative bacteria were correctly identified at the species level by Sepsityper kit, SDS lysis method and Centrifugation + PE method, respectively. The difference between the modules in the correct identification of Gram-negative bacteria at the species level was found to be statistically significant in both SDS lysis method and Sepsityper kit (p=0.039 and p<0.001, respectively).
In the standard module and Sepsityper module, 51.7% and 70.7%, 75.9% and 87.1%, 62.1% and 78.4% of Gram-positive bacteria were correctly identified at the species level by Sepsityper kit, SDS lysis method and Centrifugation + PE method, respectively. The difference between the modules in the correct identification of Gram-positive bacteria at the species level was found to be statistically significant in all three methods compared (p<0.001). 
Only by using the Sepsityper module, eight genus-level and four species-level misidentifications were detected in studies performed with the Sepsityper kit and SDS lysis method.
Conclusion: Among the three methods compared, the best performance was obtained with SDS lysis method. Although better performance was achieved by using the Sepsityper software module from the two compared analysis modules, the risk of misidentification by using this module should not be ignored.
Keywords: MALDI-TOF MS, direct identification, blood culture, Sepsityper, SDS, centrifugation method