Polimeraz zincirleme tepkimesi (PCR) ve floresans rezonans enerji transferi (FRET) ile mutasyon saptanması ve yöntemin tüberküloz basillerinin rifamisin türevlerine direncinin araştırlmasında kullanılması
Identification of mutations by polymerase chain reaction (PCR) and fluorescence resonance energy transfer (FRET) and application of the method to determination of resistance to rifamycin derivatives in tuberculosis bacilli
Yazar: Z. TANIL KOCAGÖZ
Danışman: DOÇ.DR. N. LEYLA AÇAN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2001
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Polimeraz zincirleme tepkimesi (PCR) ve floresans rezonans enerji transferi (FRET) ile mutasyon saptanması ve yöntemin tüberküloz basillerinin rifamisin türevlerine direncinin araştırılmasmda kullanılması. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyokimya Programı Doktora Tezi, Ankara, 2001. Günümüzde önemli bir sağlık sorunu olmaya devam eden tübekülozdan toplumu korumanın en etkili yolu, erken tanı ve tedavidir. Antitüberküloz ilaçlara karşı direnç oranının giderek artması, etkili tedavi için tüberküloz basillerinin bu ilaçlara duyarlılığının bilinmesini önemli hale getirmiştir. Kültür yöntemleri ile tüberküloz basillerinin duyarlılığının saptanması aylar sürebildiğinden, ilaç direncini erken saptayacak moleküler yöntemler geliştirilmiş ancak bunlar uygulama zorluğu nedeniyle günlük kullanıma girememiştir. Bu çalışmada PCR ile çoğaltılan Mycobacteriwn luberculosis'in rpoB genindeki rifampisin direncinden sorumlu mutasyonlar, floresans rezonans enerji transferi proplan ile araştırıldı. Tek PCR karışım tüpünde, mutasyonlann en sık görüldüğü bölgelere uygun, farklı floresan boyalarla işaretli iki prop yardımı ile, rifampisin dirençli suşların %92.7'si saptanabildi. Bu yöntemle, rpoB'deki mutasyonlann yerlerininin de büyük ölçüde ayırt edilebilmesi, direncin hangi rifamisin türevlerine karşı olduğu konusunda fikir edinilmesini sağladı. Uygulaması kolay ve birkaç saat içerisinde tamamlanabilen bu yöntemin, klinik patoloji laboratuvannda günlük kullanıma girebileceği ve tüberküloz basillerinde rifampisin direncinin kısa sürede saptanmasında çok yararlı olacağı sonucuna varıldı. Anahtar Kelimeler: M. tuberculosis, rifampisin direnci, PCR, FRET.

Abstract:
Identification of mutations by polymerase chain reaction (PCR) and fluorescence resonance energy transfer (FRET) and application of the method to detemination of resistance to rifamycin derivatives in tuberculosis bacilli Hacettepe University Health Sciences Institute Ph. D. Thesis in Biochemistry. Ankara, 2001. The most efficient way of protecting community from tuberculosis is early diagnosis and treatment. The increase in antituberculosis drug resistance, made susceptibility determination to these drugs more important. Since it often takes months to obtain the results of culture based susceptibiliy tests, many rapid methods based on molecular techniques have been developed but have not been used routinely due to their cumbersome methods. In this study, rifampin resistance due to mutations in rpoB gene of M tuberculosis strains, was investigated by fluorescence resonance energy transfer probes. It was possible to identify 92.7% of rifampin resistant strains, in a single tube PCR assay, by two probes labeled with two different fluorescent dyes. The capability of the method in also identification of mutation regions, provided the means for a good estimation of, which rifamycin derivatives the bacteria were resistant to. It was concluded that, this method which takes only a few hours and which is very easy to perform, may be very beneficial in rapid determination of rifampin resistance, in routine clinical pathology laboratories. ^SSKSSS» msb^