Koç spermasının dondurulmasında kullanılan gliserolün hücre içine girmeyen bazı kriyoprotektanlarla ikame edilmesinin eritme sonrası spermatolojik özelliklere etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of replacing the glycerol, used in freezing ram semen, with some non-permeable cryoprotectants to post-thaw spermatological parameters
Yazar: CEMAL DAYANIKLI
Danışman: PROF. DR. ZEKARİYA NUR
Bursa Uludağ Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Dekstranlar = Dextrans ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Gliserin = Glycerin ; Koçlar = Rams ; Polietilen glikoller = Polyethylene glycols ; Polivinilpirolidon = Polyvinylpyrrolidone ; Sperm = Spermatozoa ; Sperm kalitesi = Sperm quality ; Sperma özellikleri = Sperm characteristics ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu çalışma, gliserolün koç sperması üzerine olan olumsuz etkisini minimize etmek amacıyla gerçekleştirildi. Bunun için gliserolün sulandırıcıdaki final yoğunluğu sırasıyla (%4, %2 ve %0) düşürerek, yerine DEX (Dekstran), PVP (Polivinilpirolidon), veya PEG (Polietilen glikol) (%2, %4 ve %6) eklendi. Koyunculuk Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü bünyesinde, aynı bakım ve besleme koşullarında barındırılan, 2-3 yaşları arasında 5 baş Karacabey Merinosu ırkı koçtan sperma alındı. Normospermik özellikteki ejkulatlar pooling yapılarak çift aşamalı sulandırma tekniği ile çalışma gruplarını oluşturan (Kontrol (%6 gliserol), DEX2 (%4 gliserol + %2 dekstran), DEX4 (%2 gliserol + %4 dekstran), DEX6 (%6 dekstran), PVP2 (%4 gliserol + %2 polivinilpirolidon) PVP4 (%2 gliserol + %4 polivinilpirolidon) PVP6 (%6 polivinilpirolidon), PEG2 (%4 gliserol + %2 polietilen glikol), PEG4 (%2 gliserol + %4 polietilen glikol) ve PEG6 (%6 polietilen glikol) sulandırıcılardan biri ile sulandırılarak payet metoduna göre otomatik dondurma cihazında donduruldu. Çalışmada; motilite muayenesi CASA, canlılık, plazma ve akrozom membran bütünlüğü ve mitokondriyal membran potansiyeli akış sitometri ve apoptotik indeks (TUNEL) floresan mikroskopta değerlendirildi. Çözüm sonrası aşamada saf kriyoprotektan içeren gruplar değerlendirildiğinde %6 gliserol içeren kontrol grubuna ait bulguları diğerlerine göre daha üstün olduğu belirlendi. Çalışmada kullanılan sulandırıcı içeriğine katılan eksternal kriyoprotektanların (DEX6, PVP6 ve PEG6) hiçbirinin tek başına koç spermasını, dondurmanın zararlı etkilerine karşı koruyamadığı görüldü. Çalışmada kullanılan kriyoprotektanların apoptotik indeksi etkilemediği, DEX ve PEG'nin düşük yoğunluklarda (%2) gliserolün yerine kullanılabileceği değerlendirildi.
Sonuç olarak, DEX ve PEG'nin %2'den daha düşük yoğunluklarda gliserol yerine kullanılabileceği, PVP'nin çalışmada kullanılan oranlarının koç sperması üzerine zararlı olduğu ve çalışma sonuçlarının fertilite ile doğrulanması gerektiği belirlendi.

Abstract:
This study was conducted to minimize the adverse effect of glycerol on the ram semen. For this purpose, glycerol's final density in the extender were decreased (4%, 2%, and 0%) respectively, by replacig with DEX (dextran), PVP (polyvinylpyrrolidone), or PEG (polyethylene glycol) (2%, 4%, and 6%), respectively. Semen was collected from 5 heads of Karacabey Merino ram between the ages of 2-3, breeding season hosted in Sheep Breeding Research Institute. Ejaculates with normospermic quality were pooled and diluted with (Control (6% Glycerol), DEX2 (4% Glycerol + 2% Dextran), DEX4 (2% Glycerol + 4% Dextran), DEX6 (6% Dextran), PVP2 (4% Glycerol + 2% Polyvinilpirolidone) PVP4 (2% Glycerol + 4% Polyvinylpirolidone), PVP6 (6 %Polyvinilpirolidone), PEG2 (4% Glycerol + 2% Polyethylene Glycol), PEG4 (2%Glycerol + 4% Polyethylene Glycol) or PEG6 (6% Polyethylene Glycol) according to two step dilution method and frozen via automatic freezing machine. In the study; sperm motility was evaluated via CASA, vitality, plasma, and acrosome membrane integrity, and mitochondrial membrane potential via flow cytometry, and the apoptotic index (TUNEL) under fluorescent microscopy. At the post-thaw stage; the control group containing 6 %glycerol was superior to the other groups containing pure cryoprotectant. None of the cryoprotectants (DEX6, PVP6, and PEG6) could protect the ram sperm alone against the harmful effects of freezing. It was evaluated that the cryoprotectants used in the study did not affect the apoptotic index. Also DEX and PEG could be used instead of glycerol at low concentration (2%).
Finaly, it was founded that Presence of DEX and PEG lower than 2% is a useful strategy for the partial replacement of glycerol in semen extender. Presence of PVP in freezing extender has a harmful effect ram semen. Also it is recomended that the results of the study to be verified by fertility results.