Doğal Bacillus thuringiensis suşlarının bakteriyosin benzeri peptid üretim potansiyellerinin araştırılması
Investigation of bacteriocin-like peptide production potentials of natural Bacillus thuringiensis strains
Yazar: SARAH BASIM JAWAD AL- BAGHDADI
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Antimikrobiyal aktivite = Antimicrobial activity ; Bacillus thuringiensis = Bacillus thuringiensis ; Bakteriyosinler = Bacteriocins ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Bacillus thuringiensis (Bt) gram pozitif bir bakteridir ve Cry, Cyt ve Vip proteinleri gibi metabolit üretimi için model bir organizma olduğu düşünülmektedir. Buna ilaveten, Bt'nin antimikrobiyal proteinler de sentezlediği bilinmektedir. Bt'nin biyopestisit ile ilgili proteinleri hakkında çok fazla bilgi olmasına rağmen, Bt bakteriyosinleri hakkında çalışmalar kısmen sınırlıdır. Dolayısıyla bu tez çalışmasında, Bt koleksiyonumuzda bulunan ve zeytin alanlarından toplanıp karakterize edilen yaklaşık 100 adet Bt suşunun bakteriyosin üretme potansiyelleri araştırılmıştır. Bunun için Bt suşları tekrar canlandırılıp, agar spot assay ile indikatör bakteri B.cereus 11778 (ATCC)'e karşı bakteriyosin aktiviteleri taranmıştır. Antimikrobiyal aktivite gösteren suşlardan elde edilen süpernatantların (CFS) antimikrobiyal etkisi kuyu difüzyon assay ile teyit edilmiş ve sadece 9 tanesinin B. cereus'a karşı antimikrobiyal etki gösterdiği saptanmıştır. Bunlar arasından en yüksek inhibisyon zonu gösteren 28Q1 suşu diğer analizlerde kullanılmak üzere seçilmiştir. Bu suşun büyüme eğrisi ve bakteriyosin üretim kinetiği araştırıldığında, büyüme eğrisinin logaritmik fazının başlarında primer metabolit olarak bakteriyosin benzeri peptid (BBP) sentezlendiği, maksimum antimikrobiyal aktivitenin (180 AU/ml) ilk 8 saatte gözlendiği ve 30 saatte aktivitenin tamamen kaybolduğu tespit edilmiştir. CFS çeşitli enzimlerle muamele edildiğinde, Proteinaz K (PK) ve lipazda aktivitenin tamamen kaybolması BPP'nin bir çeşit lipoprotein olduğunu göstermektedir. İlk 30 dakikada CFS'nin antimikrobiyal aktivitesi 300C ve 400C'de maksimumken, 500C'de yarıya inmekte ve 600C'de tamamen yok olmaktadır. Ayrıca, CFS'nin pH aralığının geniş olduğu (pH4-pH10) bulunmuştur.  Bt 28Q1 suşu farklı besi ortamlarında büyütüldüğünde, B. cereus'a karşı en yüksek anti mikrobiyal aktivite triptik soy broth'da (TSB) gözlenmiştir. İlaveten, çeşitli organik çözücülerin antimikrobiyal aktiviteyi etkilemediği fakat Triton x-100'ın aktiviteyi arttırdığı kaydedilmiştir. Amonyum sülfat (%80) ile çöktürülen ve diyaliz edilen BBP preparasyonun (BBPP) ve CFS'nin antimikrobiyal etki spektrumu çeşitli bakteriler üzerinde incelendiğinde, sadece B. cereus dahil incelenen tüm Bacillus türleri üzerinde etkili olduğu; buna karşın, diğer Gram+ ve Gram- bakteriler ve Candida albicans üzerinde antimikrobiyal aktivite göstermediği tespit edilmiştir. Ayrıca, kısmi olarak saflaştırılan ve antimikrobiyal aktivite gösteren proteinin moleküler ağırlığının SDS-PAGE ve jel overlay assay yöntemiyle yaklaşık 12 kDa olduğu bulunmuştur. İlaveten, Bt 28Q1 suşunun 16SrDNA ve flagellin hag geni PCR analizlerine göre Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, B. thuringiensis 28Q1 suşundan elde edilen ve geniş pH aralığı ve belirli sıcaklık toleransına sahip olan bakteriyosin benzeri protein (BBPP) besin paketlenmesinde, B. cereus gibi besinlerde toksin üreten ve ishale yol açan bakterilerin büyümesini engellemek için koruyucu veya biyoaktif molekül olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Gelecekte yapılacak protein sekans analizleri ve proteomik çalışmalar BBPP'nin detaylı karakterizasyonuna önemli katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Gram-positive Bacillus thuringiensis (Bt) is regarded as a model organism for the production of metabolites like Cry, Cyt, and VIP proteins. Bt is also known to produce antibacterial proteins. The investigations on Bt bacteriocins are somewhat constrained, despite the fact that the biopesticide-related proteins of Bt are well understood. Therefore, in this thesis, the bacteriocin production potentials of approximately 100 Bt strains in our Bt collection, which were collected and characterized from olive fields, were investigated. For this, Bt strains were revived and their bacteriocin activities were screened against the indicator bacterium B.cereus 11778 (ATCC) with agar spot assay. The antimicrobial effect of supernatants (CFS) obtained from strains with antimicrobial activity was confirmed by the well diffusion assay and it was determined that only 9 of them showed antimicrobial activity against B. cereus. Among these, the 28Q1 strain showing the highest inhibition zone was selected for use in other analyses. When the growth curve and bacteriocin production kinetics of this strain were investigated, it was found that bacteriocin-like peptide (BLP) was synthesized as the primary metabolite at the beginning of the logarithmic phase of the growth curve, the maximum antimicrobial activity (180 AU/ml) was observed in the first 8 hours and the activity was completely lost in 30 hours. When CFS is treated with various enzymes, complete loss of activity in Proteinase K (PK) and lipase indicates that BLP is a type of lipoprotein.  In the first 30 minutes, the antimicrobial activity of CFS is maximum at 30 ˚C and 40 ˚C, halved at 50 ˚C and completely destroyed at 60˚C. Also, the pH range of CFS was found to be wide (pH4-pH10). When the Bt 28Q1 strain was grown on different media, the highest antimicrobial activity against B. cereus was observed in tryptic line broth (TSB). In addition, it was noted that various organic solvents did not affect the antimicrobial activity, but Triton x-100 increased the activity. When the antimicrobial effect spectrum of BLP and CFS precipitated with ammonium sulfate (80%) and dialyzed was examined on various bacteria, it was found that they were effective only on all Bacillus species, including B. cereus ; however, it was found that it did not show antimicrobial activity on other Gram+ and Gram- bacteria and Candida albicans. In addition, the molecular weight of the partially purified protein showing antimicrobial activity was found to be approximately 12 kDa by SDS-PAGE and gel overlay assay method. In addition, according to PCR analysis of 16SrDNA and flagellin hag gene of Bt 28Q1 strain Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis has been shown to be. As a result, bacteriocin-like protein (BLP) obtained from B. thuringiensis 28Q1 strain, which has a wide pH range and certain temperature tolerance, can be used as a preservative or bioactive molecule in food packaging to prevent the growth of bacteria that produce toxins and cause diarrhea in foods such as B. cereus. has potential. Future protein sequence analyzes and proteomic studies will contribute significantly to the detailed characterization of BLP.