Sıvı kromatografisi kütle spektrometresi ile serum metilmalonik asit tayini ve serum B12 vitamini, serum homosistein düzeyleriyle karşılaştırılması
Analysis of methylmalonic acid in serum by liquid chromatography-mass spectrometry and comparison of serum vitamin B12 levels with serum methylmalonic acid and homocysteine
Yazar: EMRE İSPİR
Danışman: DOÇ. DR. MUHİTTİN ABDÜLKADİR SERDAR
GATA / Tıp Fakültesi / Temel Tıp Bilimleri Bölümü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Homosistin = Homocystine ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Metilmalonik asit = Methylmalonic acid ; Vitamin B 12 = Vitamin B 12 ; Vitamin B 12 eksikliği = Vitamin B 12 deficiency

Özet:
B12 vitamini suda eriyen, mikroorganizmalar tarafından sentezlenen, 1355 Dalton ağırlığında bir vitamindir. B12 vitamin eksikliği kendini özellikle nörolojik ve hematolojik sisteme ait belirti ve bulgularla göstermektedir. Anemi, pansitopeni, makrositoz, hipersegmente nötrofiller ve inefektif eritropoez ile karakterize hiperselüler kemik iliği, B12 eksikliğinde görülen hematolojik bulgulara örnek olarak gösterilebilir. Hematolojik bulgulara ek olarak parestezi, ataksi, kuvvet kaybı ve pozisyon duygusunun bozulması gibi nörolojik bulgularda B12 vitamin eksikliğinde görülmektedir. Endüstrileşmiş toplumlarda B12 vitamini eksikliği prevalansının yaklaşık %20 civarında olduğu tahmin edilmektedir.B12 vitamin eksikliğinin henüz altın standart bir tanı testi yoktur. Tanısı daha çok serum B12 vitamin düzeylerinin ölçümüyle konulmaktadır. 200 pg/mL seviyelerinin altı B12 vitamin eksikliği olarak kabul edilmektedir. Ancak serum B12 vitamini seviyesi ölçümü tek başına B12 vitamin eksikliği tanısı konulmasında yeterli bulunmamaktadır. Halihazırda kullanılan ölçüm metotlarında referans materyal ve referans metot olmayışından dolayı standardizasyon sağlanamamıştır. Bu nedenle serum B12 eksikliği tanısının konulmasında serum B12 vitamin düzeyleri ölçümünün serum metilmalonik asit ve homosistein ölçümüyle beraber değerlendirilmesi önerilmektedir.Bizde çalışmamızda sıvı kromatografisi kütle spektrometresi (LC-MS) ile metilmalonik asit (MMA) ölçüm yönteminin kurulmasını, optimize edilmesini ve serum B12 vitamin seviyeleriyle metilmalonik asit ve homosistein seviyelerinin karşılaştırılmasını amaçladık.Bu nedenle kan alım salonuna başvuran 340 hasta ile görüşüldü. Hastaların serum örneklerine ait ölçümler yapıldıktan sonra sonuçları incelenerek 69 tane serum örneği, B12 düzeylerine göre düşük, orta ve yüksek olarak gruplandırıldı. Bu serum örneklerinden LC-MS ile MMA seviyeleri, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile homosistein düzeyleri, paramagnetik kemilüminesans immünolojik metotlarla (ADVIA Centaur, USA) da serum B12 vitamini ve folat düzeylerinin ölçümleri yapıldı.Metilmalonik asit ölçümü için farklı metotlar olmasına karşın biz olanaklarımız doğrultusunda, metilmalonik asiti LC-MS ile ölçmeye ve bu metodu optimize etmeye çalıştık. Optimize ettiğimiz metodun gün içi tekrarlanabilirliği %6.53- 9.89, günler arası tekrarlanabilirliği %8.6-12.49 olarak saptandı. Ölçümler 0.1-2.0 µmol/L değer aralığında lineerdi. Tayin limiti (LOD) 0.05 µmol/L, ölçüm limiti (LOQ) 0.08 µmol/L, geri kazanımını %101-108 olarak hesaplandı.Çalışmada serum metilmalonik asit sınır değeri, B12 vitamini (>211 pg/mL) ve folik asit (>5.38 ng/mL) düzeyleri düşük olmayan vakalardan, MMA düzeyleri LC-MS ile ölçülerek belirlenmeye çalışıldı. Metilmalonik asit için sınır değer 3 µmol/L olarak belirlendi.Çalışmamızda serum B12 vitamin seviyeleriyle metilmalonik asit ve homosistein seviyeleri arasında anlamlı negatif korelasyon saptandı. Metilmalonik asit sonuçlarıyla homosistein sonuçları arasında da anlamlı korelasyon bulundu. Özellikle düşük serum B12 vitamin seviyelerinin %63,6'sında artmış metilmalonik asit, %72.7'sinde artmış homosistein düzeylerine rastlandı. Bununla birlikte serum B12 vitamini düşük olmayan vakalar arasında %13 oranında metilmalonik asit ve %19 oranında homosistein seviyelerinin yüksek olduğu belirlendi.Sonuç olarak serum B12 vitamin seviyelerinin düşük olduğu durumlarda veya serum B12 vitamin seviyeleri normal olsa dahi klinik olarak B12 eksikliğinden şüphelenilen durumlarda, serum MMA ve homosistein ölçümlerinin yapılmasının ve hastaların bu sonuçlara göre değerlendirilmesinin uygun olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Vitamin B12 is a water-soluble vitamin that is synthesized by microorganisms and has a molecular weight of 1355 Dalton. Vitamin B12 deficiency manifests itself with signs and symptoms of neurological and hematological system. Anemia, pancytopenia, macrocytosis, hipersegmente neutrophils and hypercellularity in bone marrow characterized by ineffective erythropoiesis, are examples of common hematologic findings seen with vitamin B12 deficiency. In addition to hematologic findings, neurologic signs such as paresthesia, ataxia, weakness, and impaired sense of position is seen in vitamin B12 deficiency. In industrialized societies, estimated prevalence of vitamin B12 deficiency is approximately 20%.There is no gold standard diagnostic test yet for vitamin B12 deficiency. Diagnosis is usually made by measuring serum vitamin B12 levels. A level below 200 pg/mL is considered to be vitamin B12 deficiency. However, measurement of serum vitamin B12 levels alone is not enough to diagnose vitamin B12 deficiency alone. The standardization of measurement methods currently used couldn't be achieved due to the lack of reference materials and reference methods. therefore the measurement of serum methylmalonic acid and homocysteine combined with serum vitamin B12 is recommended to evaluate the diagnosis of vitamin B12 deficiencyIn our study we aimed to establishment and optimisation of methylmalonic acid measurement with liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) and to compare the serum vitamin B12 levels with the serum methylmalonic acid and homocysteine levels.For this purpose, 340 patients admitted to blood draw service was interviewed. After the measurements of serum samples, the results were examined and 69 serum samples were classified according to serum B12 levels as low, medium and high. From these serum samples, serum MMA, homocysteine, serum folate and vitamin B12 levels were measured by the methods of LC-MS, high pressure liquid chromatography (HPLC) and paramagnetic chemiluminescence immunoassay (ADVIA Centaur, USA) respectively.Although the there are different methods for MMA measurement, we tried to establish and optimize the LC-MS method. Intra- and interassay CVs of optimized method were 6.53?9.89%and 8.6?12.49%, respectively. The assay was linear between 0.1-2.0 µmol/L. The estimated limits of MMA detection and quantification were 0.05 µmol/L and 0.08 µmol/L respectively. Recoveries were 101%?108%.In the study, threshold value of serum methylmalonic acid was determined with the measurement of MMA concentrations by LC-MS from the serum samples value of which serum vitamin B12 (>211 pg/mL) and folate (5.38 ng/mL) is not low. The threshold value for methylmalonic acid was determined as 3 µmol/L.In our study, serum vitamin B12 levels were significantly negatively correlated between methylmalonic acid and homocysteine ??levels. Methylmalonic acid levels were significantly correlated with homocysteine ??levels. Especially, elevated methylmalonic acid and homocysteine ??levels were found in 63.6%and 72.7%of serum samples with low vitamin B12 levels, respectively. However, methylmalonic acid and homocysteine ??levels were higher at 13%and 19%of cases without low serum vitamin B12, respectively.As a result, serum MMA and homocystein levels should be measured in the patients with normal serum vitamin B12 levels or the patients clinically suspected of vitamin B12 deficiency even if serum vitamin B12 levels are normal and evaluation of the patients should be made according to the these levels.