Anoxybacillus gonensis oligo-1,4-1,6-alfa-glukosidaz (sukraz-maltaz-izomaltaz) genin klonlanması, gen ürününün saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu
Cloning, purification and biochemical characterization of oligo-1,4-1,6-alpha-glucosidase (sucrase-maltase-isomaltase) from Anoxybacillus gonensis
Yazar: ZEYNEP DENGİZ BALTA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ HAKAN KARAOĞLU
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Fruktoz, sağlık açısından sağladığı faydalar nedeniyle tatlandırıcı olarak en çok tercih edilen şekerlerden biridir. Bu nedenle, güvenli olarak kabul edilen fruktozun alternatif üretim yöntemlerinin araştırılması önemli bir gerekliliktir. Günümüzde Yüksek Fruktoz Şurubu (HFS) üretiminde birçok endüstriyel enzim kullanılmaktadır. Genellikle maltooligosakkaritlerin 𝛼-1,4-glukozit bağları üzerinde hiçbir aktivitesi olmamasına rağmen, izomaltooligosakkaritlerin indirgeyici olmayan uçları 𝛼-1,6-glukozit bağlarını oligo-𝛼-1,6-glukozidaz ile kırarak panoz, palatinoz ve bir a-limit dekstrine hidrolize edilir. Bu çalışmada, termofilik bir bakteri olan A. gonensis G2T'ye ait oligo-𝛼-1,6-glukozidazın sakkaroz hidrolize edici aktivitesinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, A. gonensis G2T'nin oligo-1,4-1,6-alfa-glukosidaz gen bölgesi pET28(a)+ ekspresyon vektörüne klonlanmış, ekspresyon ürünü ısı şok işlemi, iyon değişim kolan kromatografisi, hidrofobik etkileşim kolon kromatografisi teknikleri ile saflaştırıldı. Saflaştırılmış enzim biyokimyasal olarak karakterize edildi. Saflaştırılan enzim 60 °C'de ve pH 7,00'de optimal aktivite gösterdi. Enzim aktivitesinin 60 °C'de 276. saatin sonunda yarıya düştüğü belirlendi. Enzim, 60 °C'de pH 6,00-10,00 aralığında 300 saat sonra bile aktivitesini koruduğu gözlendi. Km, Vmax, kcat ve kcat/Km değerleri sırasıyla 44,69±1,27 mM, 6,28±0,05 µmoL/dk/mg protein, 6,70 1/sn ve 0,15 1/mMsn-1 olarak belirlendi. Enzim aktivitesini Zn+2, Cu+2, Pb+2, Ag+2, Fe+3, Hg+2 ve Al+2 metal iyonları düşük konsantrasyonlarda bile inhibe ederken, Mn+2, Fe+2 ve Mg+2 iyonları enzim üzerinde aktivatör etki gösterdi. Sonuç olarak, A. gonensis G2T oligo-1,4-1,6-alfa-glukosidaz, özellikle Yüksek Fruktoz Şurubu (HFS) üretimi için ilgi çekici özelliklere sahip bir enzimdir.

Anahtar Kelimeler: Anoxybacillus gonensis G2T, oligo-1,4-1,6-alfa-glukosidaz, HFS, sukraz

Abstract:
Fructose is one the most preferred sugar, as fructose are provides the sweetening and health benefits for human. Therefore, it is an important requirement to explore alternative production methods of fructose recognized as safe. Today, many industrial enzymes are used in the production of HFS. Oligo-𝛼-1,6-glucosidase hydrolysis non-reducing ends of isomaltooligosaccharides, panose, palatinose and an a-limit dextrin by breaking 𝛼-1,6-glucoside bonds, although it generally has no activity on 𝛼-1,4-glucoside bonds of maltooligosaccharides. In this study, it was aimed to evaluate sucrose hydrolyzing activity of oligo-𝛼-1,6-glucosidase belonged to A. gonensis G2T, which is a thermophilic bacterium. For this purpose, oligo-𝛼-1,6-glucosidase gene region of A. gonensis G2T was cloned in pET28(a)+ expression vector, the expression product was purified by heat-shock treatment, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction colon chromatography techniques. Purified enzyme was characterized biochemically. The purified enzyme showed optimal activity at 60 °C and pH 7.00. It was determined that the enzyme activity was halved at the end of the 276th hour at 60 °C. The enzyme maintained its activity even after 300 hours in the pH range of 6.00-10.00 at 60 °C. The values of Km, Vmax, kcat and kcat/Km were determined as 44,69±1,27 mM, 6,28±0,05 µmoL/min/mg protein, 6,70 1/sec and 0,15 1/mMsec-1, respectively. While Zn2+, Cu2+, Pb2+, Ag2+, Fe3+, Hg2+ and Al2+ metal ions inhibited the enzyme activity even at low concentrations, Mn2+, Fe2+ and Mg2+ ions behaved as activators on the enzyme. In conclusion, A. gonensis G2T oligo-1,6-glucosidase is an enzyme with interesting properties especially for High Fructose Syrup (HFS) production.

Keywords: Anoxybacillus gonensis G2T, oligo-1,4-1,6-𝛼-glucosidase, HFS, sucrase.