Bir maya izolatından proteaz üretimi, saflaştırılması ve kısmi karakterizasyonu
Production, purification and partial characterization of protease from a yeast isolates
Yazar: SEVGİ YAVUZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BİRNUR AKKAYA
Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada geleneksel bir yoğurt örneğinden izole edilen Saccharomyces cerevisiae?den proteaz enzimi üretildi, saflaştırıldı ve kısmi olarak karakterize edildi. Proteaz enzimi; etanol çöktürmesi ve afinite kromatografisiyle, sırasıyla %80 ve %60 verimle saflaştırıldı. Saflaştırma katsayısı ise her bir yöntem için sırasıyla 4 ve 18 olarak tespit edildi. Enzimin molekül kütlesi; SDS-PAGE ile 43 kDa olarak bulundu. Enzimin optimum aktivite sıcaklığının ve pH? nın sırasıyla 105 oC ve 7.0 olduğu tespit edildi. Enzim; pH 8?de 4 oC?de ve 25 oC?de bir saatlik inkübasyon sonrasında aktivitesinin sırasıyla %85 ve %75? ini korudu. pH 6? da ise 4 oC?de ve 25 oC?de aktivitesinin sırasıyla %80 ve %110?u korudu. Enzimin 25-70 oC aralığında 1 saatlik inkübasyon sonunda aktivitesinin yaklaşık olarak %10? unu kaybettiği ancak 70 oC? den daha yüksek sıcaklıklarda ise koruduğu gözlendi. Enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde Mn2+ iyonu enzim aktivitesini %40 artırırken, Ca2+ iyonunun %10 artırdığı bulundu. Hg2+, Fe2+, Fe3+, K1+, Na1+ve Mg2+ varlığında aktivite kaybı gözlenirken, Zn2+, Cu2+ ve Mg2+ iyonlarının varlığında enzim aktivitesinde bir değişiklik olmadı. Enzim üzerine organik çözücülerin etkisi incelendiğinde gliserol varlığında %5; asetonitril ve metanol varlığında %10? luk düşüşler gözlendi. Aseton, toluen, kloroform, benzen varlığında ise enzim aktivitesinin yaklaşık olarak %65? i korundu. Enzimin yüzey aktif bir madde olan SDS varlığında aktivitesinin %20 arttığı görüldü. Ortamda Triton X 100 ve Tween (80-40-20) bulunduğunda ise sırasıyla %20 ve %45? lik düşüşler görüldü. Enzimin; kazein, jelatin, ovalbumin veya BSA gibi doğal substratlar varlığında en yüksek aktiviteyi jelatine karşı gösterdiği görüldü. Enzimin, metallo-spesifik inhibitör olan EDTA ile neredeyse tamamen inhibe olduğu bulundu. Bu inhibisyon profili, bu proteazın metallo-proteaz sınıflandırılması ile tutarlı olduğunu gösterdi. Artan tuz konsantrasyonunun enzim aktivitesini azalttığı bulundu. Enzimin 20. gün sonunda aktivitesinin hala %80? ini koruduğu görüldü. Enzimin Lineweaver-Burk grafiğinden yararlanılarak tespit edilen Vmax değerleri kazein ve jelatin için sırası ile 4,4 ve 6,1 olarak hesaplandı. Michaelis-Menten sabiti (Km) ise sırası ile 3,5 ve 1,65 olarak hesaplandı.

Abstract:
In this work, production, purification and partial characterization of a protease produced by a yeast strain Saccharomyces cerevisiae was performed. The protease was purified by ethanol precipitation and affinity chromatography with a yield of 80% and 60%, respectively. Purification fold obtained by using each method were 4 and 18, respectively. The molecular mass of the purified enzyme, determined by using SDS?PAGE, was approximately 43 kDa. The optimum pH and temperature of the protease were 7,0 and 105 oC, respectively. The purified enzyme retained 85% and 75% of its activity at pH 8 after incubation for 1 h at temperatures 4 °C and 25 °C, respectively. The enzyme retained 80%, and 110% of its original activity at pH 6,0 at temperatures of 4 °C and 25 °C, respectively. The enzyme lost 10% its activity at the end of 1 h incubation in the range of 25-70 °C, but the activity was maintained at temperatures higher than 70 °C. The effect of various metal ions on protease activity was tested. While Mn2+ ions  increased enzyme activity for 40%, Ca2+ increased %10. Hg2+, Fe2+, Fe3+, K1+, Na1+ and Mg2+ inactivated enzyme completely,whereas Zn2+, Cu2+ and Mg2+ showed no effect on the activity. The enzyme activity decreased 5% in the presence of glycerol, and 10% in the presence of acetonitrile or methanol, respectively. In the presence of acetone, toluene, chloroform, or benzene preserved approximately 65% of the its activity. The purified protease activity increased 20% in the presence of surfactants such as SDS. Triton X 100 and Tween medium (80-40-20) reduced 20% and 45% of the enzyme activity, respectively. The proteases showed highest activity towards gelatin. The protease was almost completely inhibited by the metallo protease inhibitor EDTA (up to 95%). This inhibition profile was consistent with the classification of this protease as metallo-proteases. Increasing salt concentrations were found to reduce the activity. The enzyme kept 80% of its activity after 20 d. The kinetic parameters, Vmax and Km, of the purified protease were determined by using Lineweaver-Burk. Vmax values for kasein and gelatin were 4.4 and 6.1 and Km 3.5 and 1.65, respectively.