Staphylococcus saprophyticus bakterisinden fosfotransasetilaz (PTA) geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression, and characterization of phosphotransacetylase from staphylococcus saprophyticus
Yazar: İLKNUR AKSOY
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ALİ TÜRKAN
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Fosfotransasetilaz (Pta), asetil-fosfattan asetil grubunun taşınımını geri dönüşümlü olarak katalizler ve bunun sonucunda asetil-CoA ile inorganik fosfat oluşur. Asetat/asetil-CoA hemoastazı tüm hücrelerdeki anabolik proses için önemlidir ve bundan dolayı Pta, biyosentez ve enerji üretimi arasında dengeyi korumada merkezi bir role sahiptir.Bu çalışmada, Staphylococcus saprophyticus SSP2124 bakterisinin genomunda bulunan ve dizisi bilinen Pta'lara büyük benzerlik gösterdiğinden fosfotransasetilaz geni olduğu tahmin edilen ~1000 bp'lik gen, uygun primerler kullanarak PCR yöntemi ile çoğaltılıp, pET28a(+) klonlama vektöründeki NdeI ve BamHI klonlama bölgelerine aktarıldı. Aktarılan gen ilk önce NdeI ve BamHI restriksiyon enzim kesimleri ve PCR ile doğrulandı. Daha sonra, DNA dizisi dizi analizine gönderilerek belirlendi. Tahmini pta genini içeren pET28a(+) vektörü (SspPTA-pET28a) E. coli BL21 (DE3) hücrelerine aktarılıp, IPTG ile indüklenerek rekombinant proteinin fazla miktarda sentezlenmesi sağlandı ve Ni-NTA afinite kolonu kullanılarak saflaştırıldı. SDS-PAGE analizi ile %70-80 saf olduğu gözlendi. Saflaştırılan His-Tag içeren proteinin moleküler ağırlığı, MALDI-TOF spektrometre ile 37349.9 Da olduğu ±0.3 Da hata payı ile belirlendi. Rekombinant enzim yüksek Pta aktivitesi (300-600 ?mol/min.mg protein) gösterdi.Ayrıca, saflaştırılan fosfotransasetilaz enzimin karakterizasyonu yapılarak kinetik parametreleri belirlendi. Asetil-fosfat ve CoA'a karşı Km değerleri sırasıyla 0,159 mM ve 74 ?M olarak hesaplandı. Optimum pH degeri 7.5 ve optimum sıcaklık 30-35°C olarak bulundu. Ayrica, K+ ve NH4+ iyonlarının aktiviteyi büyük oranda arttırdığı tespit edildi.

Abstract:
Phosphotransacetylase (Pta) catalyzes reversible transfer of acetyl group from acetyphosphate to CoASH, and as a result forming Acetyl-CoA and inorganic phosphate. The acetate/acetyl-CoA homeostasis is important for anabolic processes in all cells and therefore Pta has a central key role in the balance between biosynthesis and the energy production.In this study, a putative pta gene in the genome of Staphylococcus sapropphyticus SSP2124 was amplified using PCR with appropriate primers. The PCR product was cloned into the NdeI and BamHI cloning sites of pET28a expression vector. Its DNA sequence was confirmed by DNA sequencing. The pET28a(+) vector containing the pta gene was transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells. The overexpression of the recombinant protein was achieved by IPTG induction and it was purified by using Ni-NTA affinity column. Its purity was determined to be about 70-80% based on SDS-PAGE analysis. The molecular weight of the purified protein including His-Tag has been determined as 37349.9 Da (error, 0.3 Da) by MALDI-TOF spectrometer. The recombinant enzyme showed a high PTA activity (300-600 ?mol/min.mg protein).Furthermore, the kinetic parameters of the recombinant Pta was determined using a spectrophotometric assay at 233 nm. The Km values for acetyl-phosphate and CoA were 0,159 mM and 74 ?M, respectively. The optimum pH and temperature were 7,5 and 30-35 C, respectively. In addition, K+ and NH4+ ions greatly enhanced the activity of recombinant Pta.