Amsacta moorei entomopoxvirus muhtemel glikozil transferaz geninin (AMV248) yapısal ve fonksiyonel analizi
Functional and structural analysis of amsacta moorei entomopoxvirus putative glycosyl transferase gene (AMV248)
Yazar: CİHAN İNAN
Danışman: PROF. DR. ZİHNİ DEMİRBAĞ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Amsacta moorei entomopoxvirus (AMEV), gen terapi, ifade vektörü ve biyopestisit
olarak kullanılma potansiyeli olan önemli bir böcek virüsüdür. DNA dizi ve biyoinformatik
analizler sonucu genomunda belirlenen amv248 kodlu ORF'nin muhtemel bir glikozil
transferaz kodladığı önerilmiştir. Böylece amv248'in konak seçiciliğinde rol oynayan,
virüs replikasyonunun için zorunlu bir yapısal protein kodladığı düşünülmektedir.
Tez çalışmasında AMEV glikozil transferaz geninin yapısı ve virusün konağa
tutunmasındaki rolünün aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda amv248'in
transkripsiyonunun AMEV enfeksiyonunu takiben 3 ila 6 saatler arasında başlayan ara gen
sınıfına ait bir gen olduğu; 126 baz 5' ve 50-84 baz aralığında 3' translasyona uğramayan
bölge içerdiği belirlenmiştir. AMV248 proteininin 3 boyutlu yapısı tahmin edilerek
muhtemel konak bağlanma aminoasitleri belirlenmiş ve 30 kDa'luk rekombinant protein
üretilip heparine bağlandığı gösterilmiştir. Proteine özgü antikor hizmet alımı ile
ürettirilmiş ve bu antikor ile virüsün immün nötralizasyonu gösterilmiştir. Ayrıca virüsün
hücre yüzey matriks bileşenlerinden heparine bağlandığı, enfeksiyonun çözülebilir
glikozaminoglikanlar ile inhibe edilebildiği ve yüzey GAG'ları çıkarılan hücrelerin
enfeksiyonunda azalma görüldüğü belirlenmiştir. Son olarak amv248 genini içermeyen
rekombinant virüs üretilmiş ve kontrol virüs ile replikasyon, enfeksiyon özellikleri, protein
profili ve yavru virüs üretimi bakımından fark gözlenmezken, gen ifade seviyesinde fark
olduğu qPCR metodu ile belirlenmiştir. Sonuç olarak virüsün konak hücreye tutunma ve
enfeksiyon başlama mekanizmasıyla ilgili önemli bulgular elde edilmiştir.

Abstract:
Amsacta moorei entomopoxvirus (AMEV) is an important insect virus which has
potential usage as gene expression and therapy vectors and biopesticide. Based on DNA
sequencing and bioinformatics analysis, it was suggested that amv248 encodes a putative
glycosyltransferase. This suggests that amv248 encodes a structural protein which may
play a role at host specificity of the virus and essential for initiation of virus replication.
In this thesis, it was aimed to identify the function and structure of amv248 gene.
Within the scope of these studies, it was concluded that transcription of amv248 started
between 3 and 6 hours post infection, and it belongs to intermediate class of virus gene
expression; the 5' and 3' untranslated regions of gene were determined as 126 bases and
between 50-84 bases, respectively. The 3D structure of the protein was generated by
bioinformatics analysis, and putative host cell binding aminoacids were determined. A 30
kDa recombinant protein of the gene was expressed and shown that it binds to heparine.
Specific antibody against protein was produced and virus was immunoneutralized using
this antibody. Also it was shown that virus binds to a cellular matrix compound, heparine,
viral infection was inhibited by glycoseaminoglycans (GAGs) and viral infection reduced
after digestion of GAGs from cell surface. Finally, amv248 knocked-out virus was
constructed, and while no differences was found between control and recombinant virus
regarding virus replication, infection, protein profile and progeny virus yield; significant
change was detected at transcriptional level. In conclusion, important findings regarding to
virus-host cell attachment and infection mechanism were determined in this study.