Farklı tür bitki ekstraktlarının insan kolon kanser hücrelerinde sitotoksik etkilerinin araştırılması
Investigation the cytotoxic effect of different plant extracts on human colon cancer cells
Yazar: FATMA SALİHA ÖZEN
Danışman: PROF. DR. ZAFER BULUT
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Bitki özütü = Plant extract ; Epigallokateşin gallat = Epigallokatechin gallate ; Kanabinoidler = Cannabinoids ; Kolon hastalıkları = Colonic diseases ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Proantosiyanidin = Proanthocyanidin ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Canlıların biyolojik yapılarının desteklenmesi ve hastalıkların tedavisinde bitkisel bileşenleri içeren terapötiklerin araştırılmasına ihtiyaç vardır. Bitkisel bileşenlerden olan proantosiyanidin, prosiyanidin, epigallokateşin galat (EGCG) ve kannabidiol (CBD) tamamlayıcı tıpta alternatif tedavi olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bunlar birçok eczane ve besin desteği satan mağazalardan kapsül, tablet veya damla formunda kolaylıkla temin edilmektedirler. Fakat fazla miktarda alımının in vitro ve in vivo ortamlarda hücrelere etkisi tam olarak bilinmemektedir. 
Sunulan çalışma, kızılcık proantosiyanidin tip A, prosiyanidin tip B1, EGCG ve CBD'nin değişen konsantrasyonlarının insan kolon kanser hücrelerinde (HT-29) 3. ve 7. gün inkübasyonunun hücre canlılığına etkisini belirlemek ve hücre morfolojisinde meydana getirdiği değişiklikleri gözlemek amacıyla yapılmıştır.
Bitkisel ekstraktların konsantrasyonlarının hücrelere etkileri, insan kolon kanser (HT-29) monolayer hücre kültüründe çalışılarak 3. ve 7. gün inkübasyonlarının hücre canlılığına etkisi Toxilight® Non-Destructive Cytotoxicitiy BioAssay (Lonza) ile belirlenmiştir. Bitkisel ekstraktların konsantrasyonlarının hücreler üzerindeki morfolojik etkileri Olympus Phase Contrast Inverted (ULWCD 0.30) mikroskobunda gözlemlenmiştir.
Kızılcık proantosiyanidin tip A'nın 7. gün inkübasyonunun 25 µg/ml'sinde % 27.5, 50 µg/ml'sinde %16.6 ve 100 µg/ml'sinde %12.7 oranında hücrelerde kayıp meydana gelmiştir. Prosiyanidin tip B1 ve EGCG'nin çalışılan konsantrasyonlarının HT-29 hücrelerinde 3. ve 7. gün inkübasyonlarının PBS hücre kontrol grubuna göre hücre kaybı meydana getirmediği belirlenmiştir. CBD'nin 3. gündeki inkübasyonu 125 µg/ml'sinde %48.4, 250 µg/ml'sinde %50.7 ve 500 µg/ml'sinde %54.9 oranında hücre kaybı meydana getirmiştir. 
Mikroskobik incelemelerde, kızılcık proantosiyanidin tip A'nın inkübasyonunun 7. gününde 10000 µg/ml konsantrasyonu, prosiyanidin tip B1'in inkübasyonunun 7. gününde 4000 µg/ml konsantrasyonu, EGCG'nin inkübasyonunun 3. ve 7. gününde 4000 µg/ml konsantrasyonu, CBD'nin inkübasyonunun 3. gününde 500 µg/ml konsantrasyonu ve inkübasyonunun 7. gününde ise 63 µg/ml konsantrasyonunun monolayer hücre bütünlüğünde bozulma ve hücre morfolojisinde değişimler meydana getirdiği gözlenmiştir. 
Sonuç olarak uygulanan bitkisel ekstraktların zamana ve konsantrasyon miktarının artmasına bağlı olarak hücrelerin canlılığında ve morfolojilerinde değişim meydana getirdiği, düşük konsantrasyonlarda ve 3 gün inkübasyon süresinin HT-29 hücrelerinde daha güvenli olduğu tespit edilmiştir. 
İnkübasyon süresi ve bitkisel ekstraktların konsantrasyonları HT-29 hücrelerinde canlılığını ve monolayer hücre bütünlüğünü etkileyen önemli faktör olduğu görülmektedir. İnkübasyon süresi ve bitkisel ekstraktların konsantrasyon miktarının artması HT-29 hücrelerinin canlılığını ve monolayer hücre bütünlüğünün kaybı ile bağlantılı olarak görünsede, bitkisel ekstraktların hücresel toksisiteye ve monolayer hücre bütünlüğünün morfolojisindeki değişikliklerine etkilerinde kimyasal özelliklerinin tanımlanmasına ihtiyaç vardır.

Abstract:
Widespread use of antimicrobial agents in livestock poses the threat of drug resistance. A need exists to investigate the effect(s) of non-conventional therapeutics on the health and well-being of such animal groups. Herbal products consisting of proanthocyanidine, procyanidin, epigallacatechin galate (EGCG), and cannabidiol (CBD) have been widely used and have been proven efficacious as anti-viral and antibacterial therapeutics both in vitro and in vivo. Such herbal products are commercially available as capsules, tablets, or drops. Problematically, cytotoxicity remains an issue in the administration of these flavonoids, denoting a need to further investigate the safety of such nutraceutical supplements in the diet. 
Here, we performed experiments to determine the cytotoxicity effects of varying concentration of cranberry proanthocyanidin type A, procyanidin type B1, EGGC, and CBD on the viability and morphology of human colon cancer cell type (HT-29) after the 3rd and 7th days of incubation. Cellular viability was determined using the Toxilight® Non-Destructive Cytotoxicitiy BioAssay (Lonza) and morphologic changes in monolayer integrity sing an Olympus Phase Contrast Inverted microscope (model No. ULWCD 0.30).
The data from this study show that a cranberry proanthocyanidin type A incubation in HT-29 cell culture monolayers after 7 days resulted in a loss of culture viability to 27.5% in 100 µg/ml, 16.6% in 50 µg/ml, and 12.7% in 25 µg/ml. It was determined that an incubation of HT-29 cells grown in monolayer culture with procyanidin type B1 and EGCG on 3rd and 7th days on did not cause a loss of cell viability integrity, compared to the PBS control. Incubation of cannabidiol (CBD) on 3 day increased the loss of cellular viability to 48.4% in 125 µg/ml, 50.7% in 250 µg/ml, and 54.9% in 500 µg/ml.
Under light microscopy, it was observed that a 10000 µg/ml concentration of proanthocyanidin type A resulted in a loss of monolayer morphology at 4000 µg/ml.  Procyanidin type B after 7 days in culture showed a loss of monolayer integrity and morphology at a cell culture treatment of 4000 µg/ml. Treatment of HT-29 cells in monolayer culture with EGCG after days 3 and 7 days at a concentration of 500 µg/ml affect a loss of couture morphology at 63 µg/ml. At the same concentration, and after 7 days in culture, CBD deteriorated monolayer cell morphology and affected a loss of cellular integrity.  
In conclusion, due to the increase in the amount of time and concentration of the applied herbal extracts, the vitality of the cells decreases and their morphology changes. It has been determined that at low concentrations and 3 days incubation application is safer in HT-29 cells.