İnsan plazmasından afinite kromatografisi yöntemiyle saflaştırılan anjiotensin konverting enzim üzerine  
nigella sativa l. ekstraktından kolon kromatografisi ile izole edilen bazı etken maddelerin etkisinin araştırılması
The research of effect of some active substances  
isolated with column chromatography from Nigella sativa L.  
extract on angiotensin converting enzyme purified by affinity chromatography method from human plasma
Yazar: ZEHRA BAŞI
Danışman: PROF. DR. VEDAT TÜRKOĞLU
Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Doğal bitkiler = Natural plants ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method

Özet:
Kan basıncının düzenlenmesinde görev alan anjiotensin konverting enzim (ACE, EC 3.4.15.1) insan plazmasından afinite kolon kromatografisi yöntemi ile saflaştırıldı ve plazma anjiotensin konverting enziminin saflaştırma oranı 12860 kat olarak hesaplandı. Plazma ACE için optimum sıcaklık ve pH sırasıyla 35-40 oC ve 7.4 olarak bulundu. SDS-PAGE ile ACE'in 60 ve 70 kDa molekül ağırlığında iki alt birime sahip olduğu görüldü. Aynı zamanda, bu çalışmada Nativ-PAGE ile ACE'in doğal yapısı korumak için uygulandı ve tek bant elde edildi. Daha sonra jel filtrasyon kromatografisi ile enzimin molekül ağırlığı belirlendi ve ACE'in molekül ağırlığı grafiğin eğimi kullanılarak 260 kDa olarak hesaplandı. Buna dayanarak ACE'in bir heterodimer yapısına sahip olduğu belirlendi.
Nigella sativa (çörek otu) bitkisinin doğal yağ asitleri kolon kromatografisi yöntemi ile izole edildi. İzolasyon için art arda 4 kolon hazırlandı ve 6 fraksiyon CHCI3:MeOH oranları ayarlanarak elde edildi. İkinci kolondan 1. ve 2. fraksiyon alındı ve TLC plakaları üzerinde tek bant gözlendi. Üçüncü kolondan 3. ve 4. fraksiyon alındı ve TLC plakalarında tek bant ortaya çıktı. Dördüncü kolondan ise 5. ve 6. fraksiyon elde edildi ve TLC plakalarında tek bant görüldü. Bu fraksiyonların NMR ve GC-MS ile analizleri yapıldı ve grafikler alındı. GC-MS grafiklerinden izole edilen fraksiyonların doğal yağ asitleri olduğu belirlendi ve fraksiyonlarda yüksek miktarda linoleik asit ve oleik asit olduğu tespit edildi. Nigella sativa bitkisinden izole edilen 1., 2., 3., 4., 5. ve 6. fraksiyonların ACE aktiviteleri incelendi. 3. fraksiyon ACE aktivitesini artırdı. 1., 2., 4., 5. ve 6. fraksiyonlar ise ACE aktivitesi üzerine yarışmasız inhibisyon gösterdi ve grafikleri çizildi. Grafik denkleminden bu fraksiyonların I50 değerleri hesaplandı. İnsan plazması ACE aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi gösteren 1., 2., 4., 5. ve 6. fraksiyonlar için I50 değerleri sırasıyla 1.597 mg/mL, 0.053 mg/mL, 0.527 mg/mL, 0.044 mg/mL ve 0.136 mg/mL olarak hesaplandı. 5. fraksiyon 0.044 mg/mL I50 değeri ile en yüksek inhibitör aktivitesini gösterdi.

Abstract:
Angiotensin converting enzyme (ACE, EC 3.4.15.1) responsible from regulation of blood pressure was purified from human plasma by affinity column chromatography method and purification ratio of plasma angiotensin converting enzyme was calculated as 12860 fold. Optimum temperature and pH for purified ACE were determined. For plasma ACE, optimum temperature and pH were found as 35-40 °C and pH 7.4 respectively. By means of SDS-PAGE was seen to have two subunits at 60 and 70 kDa molecular weight of ACE. Also, in this study, native-PAGE was applied to protect the natural structure of the ACE and single band was obtained. Then, the molecular weight of the enzyme was determined with gel filtration chromatography and the molecular weight of ACE was calculated as 260 kDa with using slope of graph. Consequently, ACE was determined to have a heterodimer structure.
Natural fatty acids of Nigella sativa plant were isolated with column chromatography method. Successively 4 columns for isolation were prepared and 6 fractions were got with adjusting CHCl3: MeOH ratios. 1. and 2. fraction from second column were obtained and single band was observed on TLC plates. 3. and 4. fraction from third column were got and single band were detected on TLC plates. 5. and 6. fraction from fourth column were obtained and single band was seen on TLC plates. NMR and GC-MS analyses of these fractions were performed and graphs were received. Natural fatty acids of isolated fractions obtained from GC-MS graphs were determined. Isolated fractions got from GC-MS graphs were determined as natural fatty acids and high amounts of linoleic acid and oleic acid were detected in the fractions. ACE activities of 1., 2., 3., 4., 5., and 6. fractions isolated from Nigella sativa were examined and 3. fraction increased ACE activity. 1., 2., 4., 5., and 6. fractions showed noncompetitive effect on ACE activity and graphs were drawn. I50 values of these fractions were calculated from the graph equations. I50 values for 1., 2., 4., 5., and 6. fractions showing inhibition effect on human plasma ACE activity were calculated as 1.597 mg/mL, 0.053 mg/mL, 0.527 mg/mL, 0.044 mg/mL, and 0.136 mg/mL respectively. 5. fraction showed the highest inhibitory activity on ACE with I50 value 0.044 mg/mL.