İnsan prostat kanser PC-3 hücre hattında TRPM2 iyon kanalının otofajik yolaklardaki rolünün araştırılması
The investigation of TRPM2 ion channel's role on autophagic pathways in human prostate cancer PC-3 cell line
Yazar: AHMET TEKTEMUR
Danışman: PROF. DR. HALİT MOHAMMED ELYAS
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Gen ifadesi = Gene expression ; Melastatin = Melastatin ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Otofaji = Autophagy ; Prostat = Prostate ; Prostat neoplazmları = Prostatic neoplasms

Özet:
Prostat kanseri, dünyada erkekler arasında önde gelen sağlık problemlerinden biridir. Son zamanlarda etyopatogenezine otofajik yolakların da katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Otofajinin kilit düzenleyicisi olarak tanımlanan hücre içi kalsiyum düzeyleri kalsiyum kanalları tarafından düzenlenmektedir. Bir kalsiyum kanalı olan TRPM2'nin oksidatif stres aracılı apoptozda görevlidir. Reaktif oksijen türlerinden biri olan H2O2'in hem TRPM2'yi hem de otofajiyi aktive ettiği gösterilmesine rağmen oksidatif stress aracılı otofajik yolaklarda TRPM2'nin rolünün olup olmadığı bilinmemektedir. Bu çalışmada, prostat kanseri PC-3 hücre hattında, otofajik yolaklarda TRPM2'nin rolünün araştırılması amaçlanmıştır.
PC-3 hücre hattında, otofajik ve apoptotik yolaklar ve TRPM2'nin aktivasyonu için H2O2 uygulandı. TRPM2, otofajik ve apoptotik aktiviteler sırasıyla; siRNA, 3-MA ve z-VAD-fmk uygulamalarıyla engellendi. Yapılan her uygulama sonucunda TRPM2, otofaji ve apoptoz ile ilişkili genlerin mRNA ekspresyon profilleri kantitatif RT-PZR ile ortaya konuldu. Otofajik aktiviteyi belirlemek amacıyla AO-EB boyaması yapıldı.
H2O2 uygulamasının hücre canlılığını azalttığı ve z-VAD-fmk+H2O2 uygulamasının, 3-MA+H2O2 uygulamasına kıyasla daha fazla hücre ölümüne neden olduğu belirlendi. H2O2 uygulaması kaynaklı hücre ölümünün TRPM2-siRNA+H2O2 uygulamasından az da olsa fazla olduğu tespit edildi. BAX ve TP73 gibi apoptotik genlerin ekspresyonlarının H2O2, TRPM2-siRNA+H2O2, 3-MA+H2O2 ve TRPM2-siRNA+3-MA+H2O2 uygulamalarında kontrole kıyasla arttığı belirlendi. z-VAD-fmk+H2O2 uygulamasının otofajik süreçlerde yer alan genlerin ekspresyonlarını arttırdığı bulundu. TRPM2-siRNA+z-VAD-fmk+H2O2 uygulaması sonucu, otofajik gen ekspresyonlarının kontrole benzer olduğu belirlendi. 
Verilerimiz, H2O2'in genel olarak hem otofajik hem de apoptotik yolaklar için aktivatör olduğunu ve bu etkisini TRPM2 aracılı olarak gerçekleştirdiğini göstermektedir. Ayrıca TRPM2-siRNA uygulamasının H2O2 indüklü otofajik yolakları baskılarken apoptotik yolakları aktive ettiğini vurgulamaktadır. Sonuç olarak; TRPM2'nin, otofajik yolaklardaki rolünün tam olarak aydınlatılabilmesi için daha detaylı moleküler genetik çalışmalar yapılmalıdır.

Abstract:
Prostate cancer is one of the leading health problems among men in the world. Recently, it has been shown that also autophagic pathways are contribute to its ethiopathogenesis. Intracellular calcium levels described as key regulator of autophagy is regulated by calcium channels. TRPM2, a calcium channel, has function in oxidative stress mediated apoptosis. Although, it has been shown H2O2, one of reactive oxygen species, activates both TRPM2 and  autophagy, it is not known whether TRPM2 has a role in oxidative stress-mediated autophagic pathways. In this study, it is aimed to investigate the role of TRPM2 on autophagic pathways in prostate cancer PC-3 cell line.
In PC-3 cell line,  H2O2 was applied for activation of apoptotic and autophagic pathways and TRPM2. TRPM2, autophagic and apoptotic activites were blocked through siRNA, 3-MA and z-VAD-fmk, respectively. mRNA expression profiles of genes related with TRPM2, autophagy and apoptosis was demonstrated by quantitative RT-PCR. AO-EB staining was performed to determine the autophagic activity.
It was determined that H2O2 application led to decreased the cell viability and application of z-VAD-fmk+H2O2 caused more cell death compared to                    3-MA+H2O2 application. It was detected that H2O2 application-induced cell death was slightly more than application of TRPM2-siRNA+H2O2. It was determined that the expressions of BAX and TP73 apoptotic genes were significantly increased the exposure to H2O2, TRPM2-siRNA+H2O2, 3-MA+H2O2, TRPM2-siRNA+3-MA+H2O2 applications compared to control. It was found that the exposure to z-VAD-fmk+H2O2 was increased expression of genes, involving in the autophagic process. It was detected that autophagic gene expressions in TRPM2-siRNA+z-VAD-fmk+H2O2 application were similar to the control. 
Our data suggest that, H2O2, generally, is activator for both autophagic and apoptotic pathways and performs this effect as the TRPM2 mediated. Furthermore it emphasizes that while TRPM2-siRNA application suppressing H2O2-induced autophagic pathways, activates apoptotic pathways. Consequently; in order to clarify the fully role of TRPM2 in the autophagic pathways, more detailed molecular genetic studies should be done.