Flukonazol dirençli Candida albicans suşlarında atım pompalarını kodlayan genlerin ekspresyon düzeylerinin gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi ile araştırılması
Investigation of the expression levels of efflux pumps encoding genes in fluconazole resistant Candida albicans strains by real-time polymerase chain reaction
Yazar: SİNEM GÜLAT
Danışman: PROF. DR. MİNE DOLUCA
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Candida albicans = Candida albicans ; Flukonazol = Fluconazole ; Gen ifadesi = Gene expression ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Flukonazol Dirençli Candida albicans Suşlarında Atım Pompalarını Kodlayan Genlerin Ekspresyon Düzeylerinin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Tepkimesi ile Araştırılması

ÖZET
Flukonazolün profilaksi ve sağaltımda yaygın ve tekrarlayan kullanımı, Candida albicans suşlarında direnç gelişimine yol açmıştır. Çalışmamızda, flukonazole dirençli ve duyarlı C. albicans izolatlarında atım pompalarını kodlayan CDR1, CDR2 ve MDR1 genlerinin ekspresyonu araştırılarak flukonazol direncinde bu mekanizmanın rolünün belirlenmesi amaçlanmıştır. 
Türkiye?de üç üniversite hastanesinde çeşitli klinik örneklerden soyutlanan beş flukonazol dirençli, altı duyarlı ve dört kısmi inhibisyon etkisi gösteren duyarlı C. albicans suşu çalışmaya dahil edildi. Suşların flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, vorikonazol, mikonazol, klotrimazol, 5-flusitozin ve amfoterisin B MİK değerleri CLSI M27-A3 standartlarına göre uygulanan mikrodilüsyon yöntemi ile belirlendi. Flukonazole dirençli suşların duyarlılıkları siklosporin A içeren ve içermeyen ?yeast extract peptone dextrose? agarda flukonazol E-test ile de incelendi.
CDR1, CDR2 and MDR1 genlerinin ekspresyonu gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi ile belirlendi. Bu genlerin ekspresyonu ?housekeeping? gen (ACT1) seviyeleri ile normalize edildi ve duyarlı C. albicans ATCC 14053 kontrol suşu ile karşılaştırıldı. Gruplardaki gen ekspresyonu verileri SPSS versiyon 15.0 yazılımı kullanılarak ?Mann-Whitney U? testi ile karşılaştırıldı. 
Flukonazole dirençli/kısmi inhibisyon etkisi gösteren duyarlı, dokuz suşun altısı 5-flusitozine dirençli ve duyarlı suşların ise biri hariç tümü 5-flusitozine orta duyarlı olarak bulunmuştur. Tüm suşların amfoterisin B?ye duyarlı ve bir izolat hariç tümünün klotrimazole de duyarlı olduğu görülmüştür. Flukonazole dirençli/kısmi inhibisyon etkisi gösteren duyarlı dokuz suşun yedisinin itrakonazol ve ketokonazole dirençli, mikonazol için ise ?64µg/ml MİK değerlerine sahip oldukları belirlenmiştir. Flukonazole duyarlı tüm suşlar ketokonazole duyarlı, itrakonazole doza bağımlı duyarlı bulunmuştur. Flukonazole dirençli ve duyarlı suşların vorikonazole duyarlı olduğu belirlenmiştir. 
C. albicans ATCC 14053 kontrol suşuna göre, flukonazole dirençli beş suşun ikisi yüksek, üçü ılımlı düzeylerde CDR1/2; biri yüksek, üçü ise düşük düzeylerde MDR1?i fazla eksprese etmiştir. Kısmi inhibisyon etkisi gösteren duyarlı suşlardan birinde görülen yüksek MDR1 ekspresyonu dışında, ılımlı düzeylerde CDR1, CDR2 ve MDR1 fazla ekspresyonu gözlenirken, duyarlı izolatlar üç suş dışında atım pompalarını düşük düzeylerde eksprese etmiştir. CDR1 ve CDR2 ekspresyon düzeylerinin aynı suş için tüm izolatlarda paralel olduğu belirlenmiştir. 
Çalışmamızda atım pompa genlerinin ekspresyonlarının flukonazole dirençli, kısmi inhibisyon etkisi gösteren ve duyarlı C. albicans suşları arasında farklı olduğu gözlenmesine rağmen, yapılan istatistik analizine göre gruplar arasında anlamlı bir fark saptanmamıştır (p>0.05).
Sonuç olarak, çalışmamıza alınan flukonazole dirençli C. albicans suşlarında ERG11 mutasyonları ile birlikte atım pompalarının fazla ekspresyonunun dirençten sorumlu önemli mekanizmalar olduğu belirlenmiştir.

Anahtar kelimeler: C. albicans, flukonazol direnci, atım pompaları

Abstract:
Investigation of the expression levels of efflux pumps encoding genes in fluconazole resistant Candida albicans strains by real-time polymerase chain reaction

ABSTRACT
Widespread and repeated use of fluconazole in the prophylaxis and therapy resulted in resistance development in Candida albicans strains. In our study, investigation of the expression of efflux pump encoding genes CDR1, CDR2, and MDR1 in fluconazole resistant and susceptible C. albicans isolates was aimed in order to determine the role of this mechanism in fluconazole resistance.
Five fluconazole resistant, six sensitive and four trailing effect showing sensitive C. albicans strains, isolated from various clinical specimens in three hospitals in Turkey were included in our study. MIC values of fluconazole itraconazole, ketoconazole, voriconazole, miconazole, clotrimazole, 5-flucytosine and amphotericin B were determined by microdilution method performed according to CLSI M27-A3 standards. The susceptibilities of fluconazole resistant strains were also studied by fluconazole E-test performed on yeast extract peptone dextrose agar with and without cyclosporin A. 
The expression of CDR1, CDR2 and MDR1 genes were determined by real-time polymerase chain reaction. The expression of these genes was normalized with their housekeeping gene (ACT1) levels and compared with the drug susceptible C. albicans ATCC 14053 control strain. Gene expression data of the groups were compared by Mann-Whitney U test via using SPSS version 15.0 software.
Six out of nine fluconazole resistant/trailing effect showing sensitive strains were resistant to 5-flucytosine, and all except one sensitive strains had found as intermediate to 5-flucytosine. It was seen that all strains were susceptible to amphotericin B and all except one strain were also sensitive to clotrimazole. Seven out of nine fluconazole resistant?trailing isolates were determined as resistant to itraconazole and ketoconazole, and had miconazole MIC values of ?64 µg ml-1. All fluconazole sensitive isolates were found as sensitive to ketoconazole and dose dependent sensitive to itraconazole. Fluconazole resistant and sensitive strains were determined as sensitive to voriconazole.
Out of five fluconazole resistant isolates, two strains overexpressed high levels and three strains overexpressed mild levels of CDR1/2; one strain overexpressed high levels and three strains overexpressed low levels of MDR1 according to C. albicans ATCC 14053 control strain. It was observed that CDR1, CDR2 and MDR1 gene expression levels were mild in trailing effect showing strains except one which highly expressed MDR1, while sensitive isolates except three expressed efflux pump genes at low levels. It was determined that the expression levels of CDR1 and CDR2 genes for the same strain were in parallel for all isolates. 
In our study, although it was observed that the expressions of efflux pump genes were different between fluconazole resistant, trailing and sensitive C. albicans isolates, no statistically significant difference was detected between the groups according to statical analysis (p>0.05).
As a result, it can be concluded that overexpression of efflux pumps and ERG11 mutations are important mechanisms responsible for resistance in our fluconazole resistant C. albicans isolates.

Key words: C. albicans, fluconazole resistance, efflux pumps