Hepatosellülar karsinoma'da regorafenib etkilerinin incelenmesi
Identification of the effect of regorafenib in hepatocellular carcinoma
Yazar: MUSTAFA KARABİÇİCİ
Danışman: PROF. DR. ŞERİFE ESRA ERDAL BAĞRIYANIK
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Karaciğer neoplazmları = Liver neoplasms ; Karsinoma = Carcinoma ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Regorafenib = Regorafenib ; Sorafenib = Sorafenib ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Karaciğer kanseri dünya çapında en sık görülen beşinci kanser olup kansere bağlı ölümlerde ikinci sırada yer almaktadır. Uzun bir süre boyunca, Hepatosellüler Karsinoma (HCC)'nın tedavisinde FDA onaylı tek ilaç olarak bilinen Sorafenib'in, hasta ömrünü plaseboya karşı sadece 3 ay uzatılabildiği yine hastaların büyük bir çoğunluğunda zamana bağlı ya da başlangıçtan itibaren sırasıyla ilaca direnç geliştirdikleri ya da başlangıçtan itibaren dirençli oldukları bildirilmiştir. Floro-sorafenib olarak da bilinen ve yapısal olarak Sorafenib'den yalnızca bir flor eki farkı olan Regorafenib ise, 2017 Nisan ayında, yalnızca Sorafenib'e direnç gösteren hastalarda kullanılmak üzere FDA onayı almıştır. Ancak bu yeni ilacın etki mekanizmaları ve ilintili sinyal yolakları henüz tam olarak bilinmemektedir.
Bu tez kapsamında, ilk olarak, MTT ve Xcelligence analizleri kullanılarak, 9 farklı HCC hücre hattında Regorafenib'in hücre proliferasyonu üzerine etkileri araştırıldı. Buna göre, mezenkimal fenotip gösteren SNU398, SKHep1, SNU182, MV, SNU387 ve SNU449 HCC hücre hatlarında Regorafenib IC50 değerlerinin 10 uM ve üzerinde olmasına rağmen, epitelyal fenotip gösteren HepG2, Hep3B ve HuH-7 HCC hücre hatlarında IC50 değerinin 5 uM'ın altında olduğu bulunmuştur. Destekleyici şekilde, mezenkimal karakter kazandığı hali hazırda grubumuza ait önceki çalışmalarda (Fırtına Karagonlar, 2016) gösterilmiş olan sorafenib dirençli HuH-7 SorR hücrelerinin, atasal HuH-7'a göre, Regorafenib IC50 değerinin 10 uM üzerine çıktığı belirlenmiştir. Daha sonra, ikincil olarak, HuH-7 atasal ve Sorafenib dirençli hücrelerde Regorafenib'in kanser kök hücre altgrupları üzerine etkisi incelendiğinde atasal HuH-7 hücrelerine 48 saatlik Regorafenib uygulamasının EpCAM+ hücre popülasyonunu anlamlı oranda arttırdığı, buna karşın, CD44+ ve CD133+ hücre popülasyonlarında anlamlı bir değişikliğe neden olmadığı gösterilmiştir. Son olarak, HuH-7 hücrelerinde, Regorafenib'e bağlı EpCAM+ hücre popülasyonundaki artışda, Wnt/b-katenin sinyal yolağının etkisi incelenmiştir. Buna göre, Regorafenib'in tek başına bazal Tcf/Lef aktivitesini etkilemediği, buna karşın Wnt3a/R-spondin ile indüklendiğinde yalnızca yüksek doz Regorafenib uygulamasında Tcf/Lef aktivitesini artırdığı bulunmuştur. Yine Wnt3a/R-spondin indüksiyonunun atasal HuH-7 hücrelerinde, Regorafenib bağımlı apoptoza karşı hücreleri koruduğu gösterilmiştir.
Sonuç olarak, epitelyal fenotipe sahip, EpCAM+ KKH içeren HCC hücre hatlarının Regorafenib'e daha duyarlı oldukları ve bu hücrelerde Wnt/b-katenin sinyal yolağının ilaç bağımlı apoptoza direnci, bunun yanısıra EpCAM+ KKH'lerin popülasyonda baskın hale geçmelerini sağladığı gösterilmiştir.

Abstract:
Liver cancer is the fifth most common cancer worldwide and is the second most common cause of cancer-related deaths. Over a long period of time, with the treatment of Sorafenib, the only FDA-approved drug in the treatment of Hepatocellular Carcinoma (HCC), patient life can be extended by only 3 months versus placebo. Many of the patients either have the drug resistance from the onset of the disease or they are devolop drug resistance over time. Regorafenib, also known as fluoro-sorafenib, structurally different from Sorafenib only in one fluoride, and received FDA approval in April 2017 for use in patients with only Sorafenib resistance. However, the mechanisms of action and associated signaling pathways are not yet fully understood.
In this thesis, firstly the effects of Regorafenib on cell proliferation were investigated in 9 different HCC cell lines using MTT and Xcelliganence analyzes. Accordingly, it was found that the IC50 value was lower than 5 μM in the HepG2, Hep3B and HuH-7 HCC cell lines showing the epithelial phenotype even though Regorafenib IC50 values were 10 μM or higher in the SNU398, SKHep1, SNU182, MV, SNU387 and SNU449 HCC cell lines showing the mesenchymal phenotype. Supportingly, sorafenib-resistant HuH-7 SorR cells, which have already been shown in previous studies of our group to gained mesenchymal phenotype (Fırtına Karagonlar, 2016), it was determined that Regorafenib IC50 value exceeded 10 uM according to parental HuH-7. Secondly, when the effect of Regorafenib on cancer stem cell subpopulations in HuH-7 parental and Sorafenib-resistant cells was examined, it was found that administration of Regorafenib 48 hours to parental HuH-7 cells significantly increased the EpCAM+ cell population, whereas CD44+, CD133+ cell population does not change significantly. Finally, the effect of Wnt/b-catenin signaling pathway on the enhancement of EpCAM+ cell population after Regorafenib treatment was analysed. As a result, treatment of Regorafenib only was shown not to effect on the basal level of tcf/lef transcriptional activity while this activity was  increased significantly after Wnt3a / R-spondin induction in paralel to high doses of Regorafenib. Also, we showed that Wnt3a / R-spondin induction protects cells against Regorafenib-dependent apoptosis in parental HuH-7 cells.
In conclusion, it has been shown that HCC cell lines including EpCAM+ CSC (cancer stem cell) with epithelial phenotype are more sensitive to Regorafenib and that the Wnt / b-catenin signaling pathway makes cells to resistant against drug-dependent apoptosis as well as provides EpCAM+ CSC to become dominant in the populations.