Endoplazmik retikulum-golgi veziküler trafiğinin stıng aktivasyonu üzerine etkileri
The effects of endoplasmic reticulum-golgi vesicular traffic on sting activation
Yazar: EDA DOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. VİLDAN BOZOK ÇETİNTAŞ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Sitoplazmadaki DNA'nın bağışıklık uyarıcı bir molekül olarak tanınması, patojenlere karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkisini başlatmak üzere evrimsel olarak korunmuş bir mekanizmadır. Sitozolik DNA, siklik GMP-AMP sentaz (cGAS) tarafından tespit edilir ve ikinci mesajcı siklik GMP-AMP (cGAMP) sentezlenir. cGAMP bağlandıktan sonra endoplazmik retikulumda bulunan STING aktive edilir ve endoplazmik retikulumdan ayrılarak golgiye yer değiştirir. Golgide TANK-bağlayıcı kinaz 1 (TBK1)'in aktivasyonunu sağlar ve interferon düzenleyici transkripsiyon faktörü IRF3'ü fosforile eder. Fosforile olmuş IRF3 dimerize olur ve nükleusa taşınır, burada tip-I interferon (IFN) ve IFN ile uyarılan genler dâhil olmak üzere inflamatuar genlerin ekspresyonunu indükler. Bu tez çalışmasında endoplazmik retikulum-golgi veziküler trafiğinin STING aktivasyonundaki rolünün aydınlatılması amaçlanmıştır.
Çalışmada, Calu-1 hücrelerinde cGAS-STING yolağı aktive edildikten sonra tüm transkriptom analizi yapıldı. Transkriptom analizi sonucunda ifadesi anlamlı olarak artan RNF149 aday gen olarak belirlendi ve CRISPR/Cas9 yöntemi ile knock-out edilerek STING aktivasyonundaki rolü araştırıldı. cGAS-STING yolağında görevli genlerin ifadesi western blot analizi, interferon ve interferon ile uyarılan genlerin ifadesi qRT-PCR analizi ile incelendi.
Western blot analiz sonucunda, 30 dakika agonist uygulanan RNF149 knock-out hücrelerde (RNF149-KO) wild type Calu-1 (WT) hücrelerine göre STING, TBK1, IRF3 ifadelerinde artış, p-STING, p-TBK1, p-IRF3 ifadelerinde azalma olduğu görüldü. Bir saat agonist uygulandığında STING, p-TBK1, p-IRF3 ifadelerinde anlamlı bir değişiklik görülmedi ancak p-STING, TBK1 ve IRF3 ifadelerinde bir artış olduğu belirlendi. Dört saat agonist uygulandığında p-STING, p-TBK1, TBK1, IRF3 ifadelerinde artış görüldü, STING ve p-IRF3 ifadelerinde değişiklik görülmedi. RNF149-KO hücrelerinde cis-Golgi matris proteini GM130 ifadesinde artış olduğu belirlendi. qRT-PCR analiz sonucunda, RNF149-KO hücrelerinde wild type Calu-1 hücreleri ile karşılaştırıldığında, bir saat agonist uygulandıktan sonra IFI44 ve IL6 mRNA ifadelerinde anlamlı bir azalma olduğu, IFNB1, IFIT2 ve ISG15 ifadelerinde ise anlamlı bir değişiklik olmadığı belirlendi. Dört saat agonist uygulandıktan sonra IFNB1 ve IL6 mRNA ifadelerinde anlamlı bir azalma olduğu, IFIT2, IFI44 ve ISG15 ifadelerinde ise anlamlı bir değişiklik olmadığı belirlendi. Sekiz saat agonist uygulandıktan sonra IFIT2 mRNA ifadesinde anlamlı bir artış olduğu, IFNB1, IFI44, ISG15 ve IL6 ifadelerinde ise anlamlı bir değişiklik olmadığı belirlendi.

Abstract:
Recognition of DNA in the cytoplasm as an immunostimulatory molecule is an evolutionarily conserved mechanism to initiate the innate immune response against pathogens. Cytosolic DNA is detected by cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) and the second messenger cyclic GMP-AMP (cGAMP) is synthesized. After cGAMP binding, STING in the endoplasmic reticulum membrane is activated and leaves the endoplasmic reticulum to the Golgi. It activates TANK-binding kinase 1 (TBK1) in the Golgi and phosphorylates the interferon regulatory transcription factor IRF3. Phosphorylated IRF3 dimerizes and translocates to the nucleus, where it induces the expression of inflammatory genes, including type-I interferon (IFN) and IFN-stimulated genes. This thesis aims to elucidate the role of endoplasmic reticulum-golgi vesicular traffic in the STING activation.
In this study, whole transcriptome analysis was performed after activation of the cGAS-STING pathway in Calu-1 cells. As a result of transcriptome analysis, RNF149, whose expression increased significantly, was determined as a candidate gene and its role in STING activation was investigated by knocking it out using the CRISPR/Cas9 method. The expression of genes involved in the cGAS-STING pathway was examined by western blot, and the expression of interferon and interferon-stimulated genes was examined by qRT-PCR analysis.
As a result of western blot analysis, an increase in STING, TBK1, and IRF3 expression and a decrease in p-STING, p-TBK1, and p-IRF3 expression were observed in RNF149 knock-out (RNF149-KO) cells treated with agonist for 30 minutes compared to wild-type Calu-1 (WT) cells. When agonist was applied for 1 hour, no significant change was observed in the expressions of STING, p-TBK1, p-IRF3; however an increase in the expressions of p-STING, TBK1 and IRF3 was determined. When agonist was applied for 4 hours, an increase was observed in the expressions of p-STING, p-TBK1, TBK1, IRF3; but no change was observed in the expressions of STING and p-IRF3. It was determined that there was an increase in the expression of cis-Golgi matrix protein GM130 in RNF149-KO cells. When RNF149-KO and wild type Calu-1 cells were compared according to the qRT-PCR results, a significant decrease in IFI44 and IL6 mRNA expressions was determined after 1 hour of agonist application whereas there was no significant change in IFNB1, IFIT2 and ISG15 expressions. After 4 hours agonist application, there was a significant decrease in IFNB1 and IL6 mRNA expressions, while there was no significant change in IFIT2, IFI44 and ISG15 expressions. After 8 hours of agonist application, there was a significant increase in IFIT2 mRNA expression, while there was no significant change in IFNB1, IFI44, ISG15 and IL6 expressions.