Array-CGH analizlerinde saptanan de novo değişimlerin konfirmasyonunda kullanılan tekniklerin standardizasyonu
Standardization of techniques used in the confirmations of the de novo changes which was detected in array-CGH analysis
Yazar: GÖKÇE KUMBASAR
Danışman: DOÇ. DR. BİRSEN KARAMAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: FISH = FISH ; Genetik = Genetics ; Kromozom düzensizlikleri = Chromosome aberrations ; Kromozomlar = Chromosomes ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sitogenetik = Cytogenetics

Özet:
Pre/postnatal dönemde kromozom anomalileri için artmış risk taşıyan popülasyonlarda sayısal ve yapısal kromozom anomalilerinin tanısında klasik sitogenetik teknikler "Gold Standard" olarak kabul edilmekle birlikte; <5 Mb'ın altındaki anomalilerin tanısında yetersiz kalmaktadır. Çeşitli probların kullanımıyla hedefe yönelik uygulanan FISH tekniği ile kromozom anomalilerinin tanısında aşama kaydedilmiş ancak, non-spesifik bulgularla başvuran olgularda bu teknik de bekleneni verememiştir. Son yıllarda, klasik sitogenetik yöntemler ve FISH ile tespit edilemeyen 3-5 Mb'dan daha küçük submikroskobik değişimlerin araştırılmasında a-CGH yöntemi kullanılmaktadır. a-CGH, genomik dengesizliklerin DNA düzeyinde araştırılabilmesine olanak sağlayan bir tekniktir. Hücre kültürüne gerek duyulmaması, az miktarda DNA örneği ile çalışılabilmesi, genomdaki değişiklikleri kilobaz düzeyinde saptayabilmesi açısından diğer tekniklere üstünlük sağlamaktadır. Tekniğin bu avantajlarının yanı sıra saptanan her değişimin teknikten kaynaklı bir hataya bağlı olup olmadığının ya da fenotipik etkisinin kesin olarak bilinmemesi gibi dezavantajları bulunmaktadır. Veritabanlarından yararlanılarak daha önce tanımlanmış hastalık ilişkili veya varyant olduğu kesinleşmiş değişimlerin analizi kolaylıkla yapılabilirken, de novo değişimlerin ek testlerle doğrulanması gerekmektedir. Bu amaçla, değişimin ne olduğuna bağlı olarak FISH, gerçek zamanlı kantitatif PZR ve MLPA gibi teknikler kullanılmaktadır.
Bu tez kapsamında, a-CGH çalışmalarında de novo değişim saptanan 10 olguda (9 postnatal, 1 prenatal) değişim bölgesine göre FISH, gerçek zamanlı kantitatif PZR veya ikinci bir array platformu ile konfirmasyon çalışmaları yapılmıştır (4 olguda gerçek zamanlı kantitatif PZR, 4 olguda FISH, 1 olguda ikinci bir array platformu, 1 olguda ise hem gerçek zamanlı kantitatif PZR hem de ikinci bir array platformu). Çalışmalarda; 8 olgunun değişimi doğrulanarak fenotiple ilişkisi kesinleştirilmiş, 2 olguda ise değişimin tekniğe bağlı hibridizasyon hatalarından kaynaklandığı sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Although conventional cytogenetic techniques are regarded as  "Gold standard" for pre/postnatal diagnosis of chromosomal abnormalities,  these are limited to a resolution of 5-10 Mb. Application of target-specific FISH techniques, the diagnostic ratio of chromosomal abnormalites has increased, but it's inadequate for non-specific findings. Recently, a-CGH technique overcomes those limitations and is used to detect submicroscopic changes and provides a locus by locus measure of DNA copy-number variations.  Array-CGH technique has advantages such as: 1) no need for dividing cells, 2) a small amount of DNA template is sufficient and 3) can detect changes in the range of kilobase unit in DNA. There are also some disadvantages that it is not known whether the origin of each change due to a technical error, or precisely determined for each change of the phenotypic effect. There will be a correlation between genotype and phenotype with using a variety of databases that has some changes associated with the known previously identified disease or variant. However,  de novo changes have to be ascertained whether the clinical effect of the change. So, the detected change has to be confirmed with using techniques such as FISH, Real-Time qPCR and MLPA.
The scope of the thesis is confirmation of de novo changes detected in 10 cases by a-CGH technique by using techniques such as FISH, Real-Time qPCR or second array platform. At the end of the studies, changes of the 8 cases were confirmed, but changes in the remaining 2 were not confirmed.