Siyez (Triticum monococcum) ve Gernik (Triticum dicoccum) buğdaylarından ekstrakte edilen ferulik asidin fonksiyonel gıda bileşeni olarak kullanım olanaklarının belirlenmesi
Determination of the possibilities of using ferulic acid extracted from einkorn (Triticum monococcum) and emmer (Triticum dicoccum) wheat as functional food component
Yazar: ÜMİT BABACAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET FATİH CENGİZ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bitkilerde yaygın olarak bulunan bir fenolik asit olan ferulik asit (C10H10O4) hidroksisinnamik asit ailesinin bir üyesidir ve antioksidan, antimikrobiyal anti inflamatuar, antikarsinojenik, Uv koruyucu ve antidiyabetik aktivitelere sahip olduğu literatür çalışmalarında sıklıkla yer almaktadır. Fonksiyonel özellikleri ile ön plana çıkan ve ithalat kalemlerimiz arasında geçen bu önemli bileşiğin özellikle tahılların kepek fraksiyonlarında yüksek miktarda bulunduğu ve bununla birlikte ülkemizde tarihsel buğday çeşitleri olarak bilinen Siyez (Triticum monococcum) ve Gernik (Triticum dicoccum) buğday çeşitlerinin kepek fraksiyonlarında modern buğdaylara kıyasla önemli ölçüde yüksek oranda varlığı rapor edilmektedir. Bu doktora tezinin amacı, Siyez ve Gernik buğday çeşitlerinin farklı fraksiyonlarında analizler gerçekleştirilerek ferulik asitçe zengin çeşit ve fraksiyonun belirlenmesi, tespit edilen çeşit ve fraksiyondan ferulik asidin ekstrakte edilerek saflaştırılması, saflaştırılan materyalin yapısal analizlerinin gerçekleştirilmesi, ilgili materyalde antioksidan aktivite, serbest radikal analizleri, toplam fenolik içerik, antimikrobiyal aktivite ve Antikarsinojenik aktivite testlerinin gerçekleştirilmesi ve ferulik asit açısından zengin olarak belirlenen çeşit kullanılarak üretilen bazı gıda ürünlerinin ferulik asit düzeyleri açısından karşılaştırılmasıdır.
Çalışmalar kapsamında, Siyez ve Gernik buğday numuneleri Tübitak 214O401 numaralı projeden temin edilerek laboratuvar ortamına getirilmiş kavuzlarından ayrılmış ve un ve kepek fraksiyonları elde edilmiştir. Numunelerdeki ferulik asit miktarları yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) cihazı kullanılarak tespit edilmiştir. Analizler sonucunda, ferulik asidin Siyez 6 çeşidinin kepek fraksiyonunda yüksek miktarda bulunması nedeniyle saflaştırma işlemleri bu fraksiyon kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma çalışmalarında, kolon kromatografisi, solvent ekstraksiyonu, süper kritik karbondioksit ekstraksiyonu yöntemleri ve ayrıca enzimatik yöntem (ferüloil esteraz) kullanılmıştır. Saflaştırma sonucu elde edilen materyal kütle spektrometri, NMR ve FTIR cihazları kullanılarak yapısal analizlere tabii tutulmuş ve ardından saf materyal ve ferulik asit analitik standardı kullanılarak ABTS, DPPH ve Folin Ciocalteu yöntemleri ile antioksidan kapasite, MTT yöntemi ile hücre canlılığı, hücre göçü testleri, kuyucuk yöntemi ile antimikrobiyal ve insan melanoma (SK MEL 30) hücre hattında Antikarsinojenik etkinlik deneyleri yapılmıştır. Fonksiyonel gıda bileşeni olarak değerlendirilebilme imkanları kapsamında ise Siyez ve Gernik buğday çeşitlerinden normal ekmek, kepekli ekmek, bulgur, erişte ve irmik üretilerek ürünlerdeki ferulik asit düzeyleri ticari ürünlerle karşılaştırılmıştır.
Elde edilen bulgulara göre, Siyez ve Gernik buğdaylarının kepek fraksiyonlarında sırasıyla 1323,70±667,55 ppm (n=15) ve 1629,87±456,72 ppm (n=15) olarak tespit edilmiştir. Bununla birlikte en yüksek oranda ferulik asit Siyez grubunda Siyez 6 buğday çeşidinden elde edilen kepek fraksiyonunda 2953,93±3,16 ppm ve Gernik grubunda ise Gernik 25 kepek fraksiyonunda 2232,28±2,15 ppm olarak belirlenmiştir. Saflaştırma çalışmaları ferulik asidin en yüksek oranda tespit edildiği Siyez 6 buğday kepeği fraksiyonu kullanılarak gerçekleştirilmiş ve bu çalışmalarda süper kritik karbondioksit ekstraksiyonu yöntemi ile %22, solvent ekstraksiyonu yöntemi ile %28 ve enzimatik yöntem kullanılarak ise %68 oranında ferulik asidin saflaştırıldığı sonucuna varılmıştır. Saflaştırılan materyal ile gerçekleştirilen biyoaktivite çalışmalarında ABTS DPPH ve Folin Ciocalteu deneylerinde sırasıyla 1007,81 µg/100 g, 128,9 µg/100 g ve 138,35 µg / 100 g olarak bulunmuş olup elde edilen değerler analitik standardının eşdeğer konsantrasyonu ile uyumlu bulunmuştur. Antimikrobiyal duyarlılık testinde ise ferulik asidin Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve Escherichia coli ATCC 25922 bakterileri üzerinde EUCAST kılavuzundaki veriler ile kıyaslandığında düşük derecede etkinliğinin olduğu sonucuna varılmıştır. Antikarsinojenik etkinlik testler kapsamında SK MEL 30 hücre hattında yapılan hücre canlılığı testi soncuna göre, 1500 µM konsantrasyondaki ferulik asidin 72 saat sonunda melanoma hücrelerinin aktivitesini %30'un altına düşürdüğü belirlenmiştir. Hücre göçü testinde ise 72 saat sonunda SK MEL 30 hücrelerinin 2 mM ferulik asit dozu uygulandığında hücreler arasındaki mesafenin kapanmadığı böylelikle melanoma hücrelerinin arasındaki etkileşimi azalttığı sonucuna varılmıştır. Ferulik asitçe zengin fonksiyonel gıda üretiminde en yüksek oranda ferulik asit içeren Siyez 6 buğday çeşidi kullanılmış ve ferulik asit düzeyleri normal ekmekte 97,74±8,01 ppm, kepekli ekmekte 528,12±26,43 ppm, bulgurda 831,01±309,47 ppm, eriştede 84,05±7,02 ve irmikte 694,16±278,25 ppm olarak belirlenmiştir.
Sonuç olarak, ferulik asit tarihsel buğday çeşitlerimizden olan Siyez buğdayından elde edilen kepek fraksiyonunda yüksek oranda tespit edilmiş ve antioksidan kapasite ve antikarsinojenik testlerde biyolojik etkinlikleri yüksek oranda tespit edilmiştir.  Bu nedenle ilgili buğday çeşidinin ve fraksiyonunun fonksiyonel bir gıda bileşeni olarak kullanılabilme potansiyeli bulunmakta olup, tez çalışmasında elde edilen verilerin bu kapsamdaki çalışmalara ışık tutması ümit edilmektedir.

Abstract:
Ferulic acid (C10H10O4), a phenolic acid commonly found in plants, is a member of the hydroxycinnamic acid family and has antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory, anticarcinogenic, UV protective and antidiabetic activities. It is reported that this important compound, which stands out with its functional properties and is among our import items, is found in high amounts especially in the bran fractions of cereals, and in addition, Einkorn (Triticum monococcum) and Emmer (Triticum dicoccum) wheat varieties, which are known as historical wheat varieties in our country, are reported to be significantly higher in the bran fractions compared to modern wheat. The aim of this doctoral thesis is to determine the ferulic acid rich variety and fraction by analyzing different fractions of Einkorn and Emmer wheat varieties, to extract and purify ferulic acid from the identified variety and fraction, to perform structural analysis of the purified material, to perform antioxidant activity, free radical analysis, total phenolic content, antimicrobial activity and Anticarcinogenic activity tests on the related material and to compare some food products produced using the variety determined as rich in ferulic acid in terms of ferulic acid levels.
Within the scope of the studies, Einkorn and Emmer wheat samples were obtained from Tübitak 214O401 project and brought to the laboratory environment, separated from the husks and flour and bran fractions were obtained. Ferulic acid amounts in the samples were determined using high performance liquid chromatography (HPLC). As a result of the analysis, since ferulic acid was found in high amounts in the bran fraction of Einkorn 6 variety, purification processes were carried out using this fraction. Column chromatography, solvent extraction, supercritical carbon dioxide extraction and enzymatic method (feruloyl esterase) were used in purification studies. The material obtained as a result of purification was subjected to structural analysis using mass spectrometry, NMR and FTIR devices and then antioxidant capacity by ABTS, DPPH and Folin Ciocalteu methods, cell viability by MTT method, cell migration tests, antimicrobial by well method and Anticarcinogenic activity experiments in human melanoma (SK-MEL-30) cell line were performed using pure material and ferulic acid analytical standard. Within the scope of their evaluation as functional food components, normal bread, whole wheat bread, bulgur, noodles, and semolina were produced from Einkorn and Emmer wheat varieties and ferulic acid levels in the products were compared with commercial products.
According to the results obtained, 1323,70±667,55 ppm (n=15) and 1629,87±456,72 ppm (n=15) was determined in the bran fractions of Einkorn and Emmer wheat varieties, respectively. However, the highest level of ferulic acid was determined as 2953,93±3,16 ppm in the bran fraction obtained from Einkorn 6 wheat variety in Einkorn group and 2232,28±2,15 ppm in the bran fraction of Emmer 25 in Emmer group. Purification studies were carried out using Einkorn 6 wheat bran fraction in which ferulic acid was detected at the highest rate and it was concluded that 22% ferulic acid was purified by supercritical carbon dioxide extraction method, 28% by solvent extraction method and 68% by enzymatic method. In the bioactivity studies performed with the purified material, 1007.81 µg/100 g, 128.9 µg/100 g and 138.35 µg/100 g were found in ABTS DPPH and Folin Ciocalteu assays, respectively, and the values obtained were found to be compatible with the equivalent concentration of the analytical standard. In the antimicrobial susceptibility test, it was concluded that ferulic acid had low activity on Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Escherichia coli ATCC 25922 bacteria compared to the data in the EUCAST guidelines. According to the results of the cell viability test performed in SK MEL 30 cell line within the scope of anticarcinogenic activity tests, it was determined that ferulic acid at a concentration of 1500 µM reduced the activity of melanoma cells below 30% after 72 hours. In the cell migration test, it was concluded that SK-MEL-30 cells at the end of 72 hours did not close the distance between the cells when 2 mM ferulic acid dose was applied, thus reducing the interaction between melanoma cells. Einkorn 6 wheat variety with the highest ferulic acid content was used in the production of functional food rich in ferulic acid and ferulic acid levels were determined as 97.74±8.01 ppm in normal bread, 528.12±26.43 ppm in whole wheat bread, 831.01±309.47 ppm in bulgur, 84.05±7.02 in noodles and 694.16±278.25 ppm in semolina.
In conclusion, ferulic acid was highly detected in the bran fraction of Einkorn, one of our historical wheat varieties, and its biological activities were highly detected in antioxidant capacity and anticarcinogenic tests.  Therefore, the related wheat variety and its fraction have the potential to be used as a functional food component and it is hoped that the data obtained in this thesis will shed light on the studies in this context.