Yüksek yoğunluklu tedavi edici ultrason'un (HITU) invitro glial tümör hücre kültür ortamında etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of high intensity therapy ultrasound (HİTU) on invitro glial tumor cell cultural environment
Yazar: KAAN TUĞBERK ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. GIYAS AYBERK ; DOÇ. DR. ATİLLA KAZANCI
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery ; Radyoloji ve Nükleer Tıp = Radiology and Nuclear Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Beyin hastalıkları = Brain diseases ; Beyin neoplazmları = Brain neoplasms ; Glioma = Glioma ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Ultrasonik dalgalar = Ultrasonic waves ; Ultrasonik tedavi = Ultrasonic therapy ; İn vitro = In vitro

Özet:
Amaç:
	Beyin tümörleri, toplumda sık görülen, cerrahi girişim, radyoterapi ve kemoterapinin uygulanmasına rağmen hastanın yaşam süresinin fazla uzatılamadığı patolojilerdir.  Yüksek risk barındıran ve hastanın yaşam kalitesini etkileyen radyoterapi gibi tedavi yöntemleri, ciddi komplikasyonlara hatta hayati risklerin ortaya çıkmasına neden olabilir. Bu olumsuz etkiler hem hastanın yaşam konforunu düşürmekte hem de sosyal çevresinde ciddi sorunlar yaratmaktadır. Ayrıca oluşan komplikasyonların tedavisi de ciddi bir maliyete yol açmakta ve kısıtlı bütçe imkanlarına sahip ülkelerdeki kurumların, bu mali yükün altından kalkmasını güçleştirmektedir.
Radyoterapi gibi uygulama sonrası komplikasyonları yüksek olan tedavi yöntemlerine alternatif geliştirilmesi, bahsedilen sorunların kısmen azalmasına neden olacaktır. Bu çalışmada, non-invaziv yeni bir tedavi yöntemi olan ve radyoterapi gibi erken ve geç komplikasyonlara yol açmayan Yüksek Yoğunluklu Tedavi Edici Ultrason'un (HITU), laboratuvar ortamında  uygulamadan sonra bu hücrelerin yapısal bütünlüğüne ve bunda rol alan olası moleküler yollara etkisini inceledik.
	Gereç ve Yöntem:
Glioblastoma hücreleri kültür yoluyla çoğaltıldıktan sonra, eşit miktarda 6 gruba ayrıldı. Birinci, ikinci ve üçüncü gruplara herhangi bir tedavi verilmedi. Bu üç grup inkübatörden  hemen sonra,  4-6 saat ve 24 saat geçtikten sonra üç farklı aşamada sırasıyla mikroskobik inceleme, flow sitometri ile hücre sayımı ve ATP proliferasyon kiti ile ATP aktivitesi ve hücre canlılığı incelemelerine tabi tutuldu. Dört, beş ve altıncı gruplara ise HITU uygulaması sonrasında yine inkübatörden  hemen sonra,  4-6 saat ve 24 saat geçtikten sonra üç farklı aşamada sırasıyla mikroskobik inceleme, flow sitometri ile hücre sayımı ve ATP proliferasyon kiti ile ATP aktivitesi ve hücre canlılığı incelemelerine tabi tutuldu. HITU uygulanan ve hiçbir tedavi uygulanmayan gruplar karşılaştırıldı.
	

Bulgular:
	HITU uygulanan hücre gruplarında uygulamanın hemen sonrasında anlamlı bir değişiklik izlenmezken 4-6 saat ve 24 saat sonrasındaki yapılan faz kontrast mikroskobu incelemesinde tümör hücrelerinin yüzeye tutunmadığı ve hücrelerin sayısında anlamlı bir azalma olduğu gözlemlendi. Tedavi uygulanan ve uygulanmayan gruplar karşılaştırıldığında, tedavi uygulanan grupta flow sitometri ile hücre sayımı yapılarak canlı hücre sayısının zamanla azaldığı görüldü. ATP proliferasyon kiti ile ATP aktivitesi ve hücre canlılığı incelemesi yaptığımzı gruplarda ATP florasans yoğunluğunun zamanla hücre sayısıyla birlikte anlamlı bir şekilde azaldığı gözlemlendi.
 Sonuç:
	HITU uyguladığımız 3 grupta da yapılan mikroskobik inceleme, flow sitometri ile hücre sayımı ve ATP aktivitesi incelemeleri sonucunda, hücrelerin canlılıklarını devam ettirmedikleri gözlemlenmiştir. Kontrol gruplarıında ise hücre canlılığının devam ettiği mikroskobik inceleme, flow sitometri ve ATP aktivitesiyle gözlendi. Bu çalışma HITU'nun, noninvaziv bir tedavi yöntemi olarak Glioblastom hücrelerine  lethal etkisi mikroskobik ve moleküler düzeyde gösterilmiştir.

Abstract:
Purpose: 
Brain tumors are common pathologies in the society, in which the life expectancy of the patient cannot be extended despite the application of surgical intervention, radiotherapy and chemotherapy. Radiotherapy-like treatment methods, which have high risks and affect the quality of life of the patient, may cause serious complications and even life risks. These negative effects both reduce the life comfort of the patient and cause serious distress in his social environment. In addition, the treatment of complications causes a serious cost and makes it difficult for institutions in countries with limited budgetary resources to cope with this financial burden.
Developing alternatives to treatment methods with high post-application complications such as radiotherapy will partially reduce the mentioned problems. In this study, we examined the effect of High Intensity Area Ultrasound (HIFU), which is a new non-invasive treatment method and does not cause early and late complications such as radiotherapy, on the structural integrity of these cells and the possible molecular pathways involved in this after laboratory application.

Equipment and Methods:

After the glioblastoma cells were grown by culture, they were divided into 6 groups in equal amounts. No treatment was given to the first, second and third groups. These three groups were subjected to microscopic examination, cell count by flow cytometry and ATP activity and cell viability by ATP proliferation kit, respectively, at three different stages, immediately after the incubator, after 4-6 hours and finally after 24 hours. In groups four, five, and six, after HIFU application, it was followed by microscopic examination, cell count with flow cytometry and ATP proliferation kit in three different stages: immediately after the incubator, after 4-6 hours and finally after 24 hours. vitality was subjected to examinations. HIFU and no treatment groups were compared.




Results:

While no significant change was observed in the cell groups treated with HITU immediately after 4-6 hours and 24 hours after the phase contrast microscopy examination, it was observed that the tumor cells did not adhere to the surface and there was a significant decrease in the number of cells. When the treated and untreated groups were compared, it was observed that the number of viable cells decreased over time by counting cells with flow cytometry in the treated group. It was observed that the ATP fluorescence density decreased significantly with the number of cells over time in the groups where ATP activity and cell viability were analyzed with the ATP proliferation kit.

Conclusion:

As a result of microscopic examination, flow cytometry cell count and ATP activity studies in all 3 groups where we applied HITU, it was observed that the cells did not maintain their vitality. In the control groups, continued cell viability was observed by microscopic examination, flow cytometry and ATP activity. In this study, the lethal effect of HITU on Glioblastoma cells as a noninvasive treatment method has been demonstrated at microscopic and molecular level.