Salmonella'da strese yanıt gen ifadelerinin elektroforetik tiplendirilmesi
Electrophoretyping of stress response gene expression in Salmonella
Yazar: DEMİRHAN GÜVEN
Danışman: DOÇ. DR. NEŞE AKIŞ
Trakya Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Bakteriler = Bacteria ; Salmonella = Salmonella ; Salmonella enteritidis = Salmonella enteritidis ; Stres = Stress ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Çalışmada Salmonella enteritidis için standart suş (ATCC 13076) ve hastadan izole edilen sekiz suş toplam dokuz suşda ampisilin ve siprofloksasine karşı stres yanıtı araştırıldı.Metodoloji olarak önce iki optimizasyon çalışması yapıldı. Birincide, yanıt sonrası dış membrandan izole edilecek proteinler için ekstraksiyon yöntemi geliştirildi. Bakterilerin asetonla muamele sonrası Triton X-100 ve N-Lauryl sarkosin'li Tris tampon içinde ektraksiyonunun uygun olduğu bulundu. İkincide, stres sağlayan uygun antibiyotikkonsantrasyonu ve maruziyet süresi belirlendi. Sıvı besiyerinde çoğalan bakterilerin sayısıyla orantılı minimum inhibitör konsantrasyonunda antibiyotiğe 5 saat maruziyetin uygun olduğu bulundu. Deney aşamasında suşlara uygun antibiyotik stresi uygulandı, proteinler izole edildi ve %12'lik sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jelde koşturuldu. Elde edilen strese yanıt bantları, bakteri genom bilgisi kullanılarak protein düzeyinde tahmin edildi.Biyoinformatik analiz sonucu stres yanıtıyla ilgili olabilecek 43 adet protein saptandı. Bunların %59'nın membran tamiri ve transportunda; %26'nun direnç, stres ve virülans yönetiminde rol aldığı tespit edildi. Siprofloksasine yanıt olarak LamB porin ifadesinin, ampisiline yanıt olarak Ferrioksamin B reseptör öncüsü ve invH ve/veya rscF gen ürün ifadelerinin seçici arttığı gösterildi.Bu çalışmanın sonuçları pratikte uygulanabilirlik açısından ümit vaad edicidir. Çünkü, antibiyotiğe karşı savunmaya geçerek adaptasyon veya direnç geliştirmeye çalışan bakteride aktiflenen stres genlerini inhibe edecek drug tasarımı önermektedir. Bu yönde ilerleyecek çalışmalar antibiyotiklerle kombine tedavi için yeni ilaç üretimine yol açabilir ve sağlık problemleri nedeniyle uygun dozda antibiyotik verilemeyen hastaların tedavisi için kullanılabilir. Bu tip ilaçlar bakterinin sadece etkinliğini azaltmakla kalmayacak, düşük doz antibiyotik kullanımını mümkün kılacak ve belki dirençli suşlarda dirençli olunan antibiyotiğin kullanımını sağlayacak değerdedir.

Abstract:
We investigated stress response of Salmonella enteritidis against ampicillin andciprofloxacin antibiotics. The data set is composed by a standard strain (ATCC 13076) and eight strains isolated from patient materials.Two optimization studies were run at the beginning of the study. First, an outermembrane isolation procedure was developed. We have found that Triton X-100 and N-Lauryl sarcosine containing Tris buffer provided highest yield following acetone treatment of the cells. Second, optimal antibiotics concentration and exposition period were investigated to obtain detectable level of stress response. We have found that exposing bacteria in suspension to antibiotics at minimum inhibitory concentration (at population corrected ratio) for 5 hours provided best result. In the experiment, bacteria were exposed to stres and their stress response were measured after running their isolated membrane proteins on 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel. The electrophoretic bands were analyzed against data bank proteins and assigned into predicted proteins.Bioinformatics analysis provided 43 possible proteins. 59% of them were responsible from membrane transport and repairment, and 26% from resistance, stress and virulence management. The results revealed that LamB porin against ciprofloxacin, and Ferroxamine B receptor precursor and invH and/or rscF gene products against ampicillin were selectively expressed.The result of the study was promising to translate the findings to therapeuticapplications. An inhibitory drug against bacterial stress genes can be designed and used in combination to control adaptive and mutative behavior of bacteria, particularly in care of patients who were suffering from an infectious disease but could not take proper dose of antibiotics due to their other health problems. These type of drugs may not decrease bacterial virulence only, but support low dose antibiotics use and use of same antibiotics against the resistant strains.