Chlamydomonas reinhardtii'de SEC24B insersiyonel mutantlarının genetik bağlantı ve fenotipik analizleri
Genetic linkage and phenotypic analysis of Chlamydomonas reinhardtii SEC24B insertional mutants
Yazar: SİBEL KALA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MÜNEVVER AKSOY
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Arilsülfataz = Arylsulfatases ; Genetik =   ; Mikroalgler = Microalgae ; Mutasyon = Mutation ; Protein transportu = Protein transport

Özet:
COPII, endoplazmik retikulumun (ER) membranında oluşan küçük membran veziküllerinin oluşturulmasından sorumlu olan yüksek oranda korunmuş bir protein grubudur. Bu protein grubunun bileşenlerinden biri olan SEC24 proteini COPII vezikül oluşumunda yer alan, ER membranında bulunan taşınacak kargo proteinine bağlanmadan sorumlu birincil alt bileşen olarak kabul edilmektedir.  Chlamydomonas reinhardtii (C. reinhardtii) genomunda COPII vezikül oluşumunda rol alması olasılığı olan iki SEC24 gen modeli (SEC24A- SEC24B) mevcuttur. Bu tez çalışmasında henüz literatürde çalışılmamış bir konu olan C. reinhardtii'de SEC24B genin mutasyon analizi yapılarak, bu genin fonksiyonunun belirlenmesi amaçlanmıştır. C. reinhardtii'nin sec24b mutant suşu bu çalışmada kullanılmıştır. İnsersiyon bölgesinin varlığını belirlemek için sec24b mutant suşu klonlarından   genomik DNA izole edilmiş ve insersiyonun bulunduğu bölge PZR ile çoğaltılmıştır. Genetik bağlantının belirlenmesi için mutant suş yabanıl tiple çaprazlanmış ve projenide paromomisin dayanıklılık fenotipi testi yapılmıştır.  SEC24B mRNA'sının bulunup bulunmadığı RT-PZR yapılarak belirlenmiştir. sec24b mutant suşu klonlarında sekresyon işlevinin olup olmadığını belirlemek için arilsülfataz ve alkalen fosfataz aktivitelerinin kolorimetrik olarak testi yapılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda sec24b mutant suşunun genomunda tek bir insersiyon varlığı tespit edilmiştir ve projeninin %50'si paromomisine dayanıklıdır.  Paromomisine dayanıklı projenilerde gendeki insersiyonun varlığı tespit edilmiştir. SEC24B proteininde mutasyon olan projenilerde ER'dan Golgi'ye protein transferinde problem olduğundan projenide normal hücrelere oranla daha yavaş büyüyen hücrelerin olduğu görülmüştür. Yapılan bu tez çalışması ile elde edilen veriler C. reinhardtii' nin SEC24B genin fonksiyonu üzerine literatüre bilgi kaynağı sağlandığı düşünülmektedir.

Abstract:
COPII is a highly conserved protein group which is responsible for small membrane vesicles formation in the membrane of the endoplasmic reticulum. SEC24 gene is one of the components of COPII protein group and involved in the formation of COPII vesicles. SEC24 gene ise considered as the primary subcomponent responsible for binding to the cargo protein which is located in ER membrane. There are two SEC24 gene models in the Chlamydomonas reinhardtii genome that are possible to play a role in the formation of COPII vesicles. These gene models are: SEC24A and SEC24B. In this thesis we aimed to determine the function of SEC24B gene in C. reinhardtii with genetic linkage and phenotypic characterization which is not studied in literature before. sec24b mutant strain of C. reinhardtii was used in this study. To determine the region of the insertion site, genomic DNA from the sec24b mutant strain clones was isolated and the site where the insertion was located was amplified by PCR. To determine the genetic linkage, the mutant strain was crossed with the wild type and the progeny were tested for paromomycin resistance phenotype. Presence of SEC24B mRNA is determined by RT-PCR. Arylsulfatase and alkaline phosphatase activities tested colorimetrically determine whether there is a secretion function in sec24b mutant strain clones. As a result of these studies, a single insertion was detected in the genome of the sec24b mutant strain and 50% of the progeny was resistant to paromomycin. The presence of insertion in the gene has been determined in the progeny which are resistant to paromomycin. We hypothesize that in the mutant progeny, due to a problem in the transfer of proteins from ER to Golgi cells grow slower than normal cells. The data obtained in this thesis is aimed to provide information about the function of C. reinhardtii SEC24B gene to the literature.