Corynebacterium pseudotuberculosis fosfolipaz d (PLD) geninin aktarımı ve PLD enziminin aşı olarak kullanılması
Recombination of gene of phospholipase d (PLD) of corynebacterium pseudotuberculosis and using pld enzyme for vaccine
Yazar: ASLI SAKMANOĞLU
Danışman: PROF. DR. OSMAN ERGANİŞ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Aşılar = Vaccines ; Corynebacterium = Corynebacterium ; Corynebacterium pseudotuberculosis = Corynebacterium pseudotuberculosis ; Fosfolipazlar = Phospholipases ; Genler = Genes ; Lenfadenit = Lymphadenitis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Özellikle koyun ve keçilerde Kazeöz Lenfadenitise (KLA) sebep olan Corynebacterium pseudotuberculosis, patojenitesinde önemli rol oynayan fosfolipaz D (PLD) ekzotoksinini sentezlemektedir. Enfeksiyonun kontrolünde ve engellenmesinde aşılama en etkili stratejidir. Yerel saha izolatlarından hazırlanan aşıların diğer ticari aşılardan daha etkin olduğu bilinmektedir. 
Bu çalışmada, labaratuarımızın kültür koleksiyonunda bulunan sahadan izole edilen C. pseudotuberculosis'in PLD geni kullanıldı. PZR ile amplifiye edilen PLD geni pET SUMO ekspresyon vektöre klonlandı ve E. coli BL21(DE3)'e transformasyonu yapıldı. Rekombinant PLD (rPLD) geni kesim enzimi, sekans analizi ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile doğrulandı. Çözünebilir rPLD'nin değerlendirilmesinde SDS-PAGE, Western Blot ve Reverse CAMP reaksiyon testleri kullanıldı. rPLD ve doğal PLD (dPLD) ile hazırlanan aşıların etkinliklerini karşılaştırmak için her bir rPLD ve dPLD; Montanıde ISA 201 VG, Montanıde ISA 206 VG, Complete Freund's Adjuvant, Aluminyum Hidroksit Jel (Al(OH)3 ile kombine edildi ve sekiz farklı toksoid aday aşı elde edildi. Sonuçları ülkemizde yaygın olarak kullanılan ticari aşıyla karşılaştırıldı. Ticari aşı ve sekiz farklı toksoid aday aşının çelınç denemesi farelerde yapıldıktan sonra aşıların etkinliği kuzularda belirlendi. Dokuz farklı aşının etkinliğini ve iki antijenin benzerliğini değerlendirmek için ELISA, agar serum nötralizasyon, hemoliz inhibisyon testleri kullanıldı. 
C. pseudotuberculosis'in PLD geni ile NCBI gen bankasındaki referans C. pseudotuberculosis'in baz dizilimi ile %99.7 oranında uyumlu bulundu. Amino asit dizilimi karşılaştırıldığındaysa 2 amino asitte farklılık gözlendi. Testlerde çapraz antijen uygulamasının değerlerde farklılığa sebep olmasından dolayı, test antijeni olarak aşı antijeninin kullanılmasının daha güvenilir sonuçlar verdiği ve ELISA diğer serolojik testlerle kıyaslandığında, en ayırt edici özelliğe sahip olduğuna karar verildi. Dokuz farklı aşı grubuna ait ELISA değerlerinin ortalamaları istatiksel analiz ile değerlendirildiğinde anlamlı farkın olduğu belirlendi. Çelınç deneme sonuçlarına göre; KLA enfeksiyonuna karşı sekiz aday aşı geliştirildi ve etkinliklerinin ticari aşıdan daha yüksek olduğu belirlendi. DPLD ve rPLD aşı grupları kendi içerisinde karşılaştırıldığında, rPLD aşı gruplarının dPLD aşı gruplarına göre immun sistemi daha kuvvetli uyardığı ve Montanide ISA 201 VG+rPLD aday aşısının çelınca karşı %100 koruma sağladığı belirlendi.
Sonuç olarak; koyunlarda KLA enfeksiyonuna karşı aşı uygulamalarında rekombinant toksoid aşının kullanabileceği, Montanide ISA 201 VG'nin immun yanıtı diğer adjuvanttlardan daha etkili uyardığı ve hedef aşının yerel saha izolatı ile hazırlanmasının önemi ortaya konuldu.

Abstract:
Corynebacterium pseudotuberculosis which is caused by Caseous lymphadenitis (CLA) in the especially sheep and goats is synthesized Phospholipase D (PLD) exotoxin that is played a great role of its pathogenicity. Vaccination is the most cost-effective strategy for controlling and prevention of this infection. The vaccines which is prepared by local field isolates is known to be powerfuler than other commercial vaccine. 
In this study, PLD gene of C. pseudotuberculosis that is isolated from field in our labaratory culture collection was used. PLD gene which was amplified by PCR was cloned into pET SUMO expression vectors and transffered into E. coli BL21(DE3). Recombinant PLD (rPLD) gene was confirmed with restriction enzyme, seguence analyzes and PCR.  İnsoluble rPLD enzyme for analyzing about its solubility, yields and inclusion bodies was used tests of SDS_PAGE, Western Blot and Reverse CAMP Reaction. So that effectives of candidate vaccines prepared with rPLD and naturel PLD (dPLD) were compared in, each one soluble rPLD ve dPLD were combined with Montanıde ISA 201 VG, Montanıde ISA 206 VG, Complete Freund's Adjuvantt, Aluminum Hydroxide Gel (Al(OH)3 and eight different candidade toxoid vaccine was composed. Results were compared with commercial vaccine which is usually used in our country. Challenge assays of commercial vaccine and 8 different vaccine were done in mice, after efficiency of vaccines were detected in lambs. İn order that efficiency of nine different vaccines and similarity of two antigens in serological tests were determined, tests was used iELİSA, agar serum neutralization test, hemolysis inhibition test. 
As a results of seguence analyzes; base of PLD gene of C. pseudotuberculosis with NCBI Gene Bank Reference C. pseudotuberculosis was found to similar rate of 99.7%. When sequences of amino acid were compared with special programme, differences were detected in the two amino acid. When the assays of cross-antigen is caused by differences of value in test, the use of a vaccine antigen as the test antigen was considered to be more reliable results. When ELISA was compared with other serological tests, the test which has the most distinguishing characteristic was decided. While statistical analysis was evaluated with avarage of ELISA values of nine different vaccination, differences of these groups were determined to be significant. According to the results of challenge assays, eight candidate vaccines was formulated against to CLA infection and effective of its were supposed that are higher than other commecial vaccine. When efficiency of vaccines were compared into groups of rPLD and dPLD, results of test were considered that groups of rPLD about stimulate of immunological is a stronger than dPLD vaccine of groups. Montanide ISA 201 VG+rPLD vaccine was protected against CLA infection to rate os 100% was detected in this study. 
Consequently; Recombinant toxoid vaccine could been used against CLA infection in sheeps and Montanide ISA 201 VG was stimulated stronger than other adjuvants in immune response and vaccine have been need to prepare from field isolates.