Deglikolize kolisin M ve K formlarının bitkide ın vıvoüretimi, saflaştırılması, karakterizasyonu ve doğal gıda katkı maddesi olarak kullanım olanakları
In vivo production, purification, characterization ofdeglycolysed colicine M and K forms in plant and usage asnatural food additives
Yazar: MERVE ILGIN BÜYÜKSINDIR
Danışman: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Agrobacterium tumefaciens = Agrobacterium tumefaciens ; Antimikrobiyal peptidler = Antimicrobial peptides ; Koloni sayısı-mikrobiyal = Colony count-microbial ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
Günümüzde gıdalarda yaygın olarak bulunan bakteriyel patojenlere karşı artan 
direnç, küresel halk sağlığı ve gıda güvenliği için kritik bir tehdit oluşturmaktadır. Ayrıca 
tüketicilerin kimyasal katkı maddesi içermeyen doğal gıdalara olan talebinin artması 
bilim insanlarını alternatif gıda koruyucuları bulmaya yöneltmiştir. Kolisinler, belirli 
Escherichia coli (E. coli) suşları tarafından üretilen, konakçı olmayan E. coli suşlarını 
öldüren ve diğer bakteri suşları ile rekabeti azaltmak için çevreye salınan antimikrobiyal 
proteinlerdir. Kolisin-M, dış hücre zarını tahrip ederek yakından ilişkili diğer bakteri 
suşlarına etki eden bu grubun bir üyesidir ve FDA tarafından güvenli (GRAS) olarak 
kabul edilmiştir, bu nedenle güçlü bir antimikrobiyal madde olarak büyük bir potansiyele 
sahiptir.
Kolisin M (CM), geçici ekspresyon sistemi kullanılarak bitkilerde rekombinant 
olarak eksprese edilmiş ve antimikrobiyal aktivitesi gösterilmiştir. Bakteriyel protein 
olarak kolisin M, doğal konakçılarda glikozile edilmez ve bu nedenle bitkiler dahil 
herhangi bir ökaryotik sistemde anormal şekilde glikozile edilir. Bakteriyel Endo H 
deglikozilasyon enzimi ile ortak ifade yoluyla hedef proteinleri glikozile edilmemiş 
bitkiler de dahil olmak üzere ökaryotik sistemde proteinler üretmek için sağlam bir 
teknoloji geliştirilmiştir. Bu teknoloji, şarbona, sıtmaya, Covid-19'a, kuduza karşı aşı 
üretmek ve bazı terapötikler için başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışmanın amacı, Nicotiana 
benthamiana (N. benthamiana)'da N-glikozile edilmemiş, doğal benzeri formda Endo H 
deglikozilasyon teknolojisi kullanılarak rekombinant Kolisin-M üretmektir.
Bu çalışmada, enzimatik Endo H deglikozilasyon teknolojisi kullanılarak, N. 
benthamiana bitkisinde hem glikozile edilmiş (gCM) hem de-glikozile edilmiş (dCM) 
formda rekombinant kolisin M ürettik ve bunların antimikrobiyal aktivitesi ve stabilitesi 
karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Kolektif bulgularımız, dCM'nin glikozile edilmiş 
formuyla karşılaştırıldığında stabilitesinin ve aktivitesinin daha yüksek olduğunu
gösterdi.
Karşılaştırma için Kolisin K (CK), N. benthamiana'da hem Endo H ile hem de
Endo H olmadan ifade yoluyla üretildi. CK'nin birkaç potansiyel N-glikozile edilmiş 
bölgesi olmasına rağmen, sonuçlarımız CK'nin N. benthamiana bitkisinde eksprese 
edildiğinde glikozile olmadığını doğruladı. Rekombinant bitki tarafından üretilen 
proteinler (hem Endo H ile ortak ifade ile hem de olmadan), Ni-kolon afinite 
kromatografisi kullanılarak kısmen saflaştırıldı ve stabilite ve aktivite açısından karakterize ettiğimiz kısmi saflaştırılmış CK proteinlerinde Endo H ile ifade edilen veya 
edilmeyen CK'ler arasında anlamlı bir fark gözlenmedi.
Tez çalışmasından elde edilen sonuçlar; bitkide üretimi gerçekleştirilen gCM ve 
dCM proteinlerinin SDS-PAGE ve Western-Blot analizine göre, moleküler kütleleri 
sırasıyla ~29 ve 26 kDa olarak bulunmuştur. Hem gCM hem de dCM'nin stabilite analizi, 
+4 °C, +25 °C ve +37 °C'de uzun süre (sırasıyla 4 ay, 12 gün ve 6 gün) incelenmiş ve
dCM, glikozile edilmiş muadilleriyle karşılaştırmada tüm sıcaklıklarda üstün stabilite 
göstermiştir. Bitkide üretilen CM proteinlerinin antimikrobiyal aktivite testleri, seçilen E. 
coli DH5α ve ATCC 25322, Salmonella ATCC 17028 ve Staphylococcus aureus (S.
aureus) ATCC25923 suşları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tüm aktivite testlerinde dCM 
proteini, glikozile edilmiş muadilinden daha aktif sonuçlar vermiştir. Sırasıyla aralarında, 
3,8, 1,7, 4,4 ve 2,4 katlık bir oran çıkmıştır. Ek olarak, dCM'nin ekspresyon seviyesi ve 
saflaştırma verimi, glikozile edilmiş muadili ile karşılaştırıldığında 2 kat daha yüksek
çıkmıştır. 
Sonuç olarak, sonuçlarımız, deglikozile edilmiş Endo H teknolojisinin, glikozile 
edilmemiş diğer kolisinleri, doğal benzeri formlarında üretmek için kullanılabileceğini 
göstermektedir; bu, bu kolisinlerin bir gıda katkı maddesi olarak ticarileşme potansiyelini 
artırmak için önemli olacaktır

Abstract:
Today, increasing resistance of bacterial pathogens common in food poses a 
critical threat to global public health and food security. In addition, the increase in 
consumers' demand for natural food without chemical additives has led scientists to find 
alternative food preservatives. Colicins are antimicrobial proteins produced by certain 
strains of Escherichia coli (E. coli), which kill non-host E. coli strains and are released 
into the environment to reduce competition with other bacterial strains. Colicin-M is one 
member of this group that acts on other closely related bacterial strains by destroying their 
outer cell membrane and is recognized as safe (GRAS) by the FDA, therefore, it has great 
potential as a potent antimicrobial agent.
Colicin M has been recombinantly expressed in plants using the transient 
expression system and its antimicrobial activity was demonstrated. Colicin M as bacterial 
protein is not glycosylated in native hosts, and therefore, aberrantly glycosylated in any 
eukaryotic system including plants. A robust technology to produce proteins in eukaryotic 
system including plants in non-glycosylated, in their native-like form by co-expression 
target proteins with bacterial Endo H deglycosylation enzyme was developed. This 
technology has been successfully applied to produce vaccines against, malaria, Covid-19, 
rabies, and some therapeutics. The goal of this study is to produce recombinant ColicinM in Nicotiana benthamiana (N.benthamiana) in non-N-glycosylated, native-like form 
using Endo H deglycosylation technology. 
In this study, using enzymatic Endo H deglycosylation technology, we produced 
recombinant colicin M in the N. benthamiana plant in both glycosylated (gCM) and 
deglycosylated (dCM) forms, and their antimicrobial activity and stability were 
comparatively studied. Our collective findings demonstrated superipor stability and 
activity of dCM compare with that of glycosylated form. 
For comparison, Colicin K (CK) was also produced in N. benthamiana with or 
without Endo H by co-expression. Although, CK has several potential N-glycosylated 
sites, but our results confirmed that CK is not glycosylated when expresses in N. 
benthamiana plant. Both (with or without co-expression by Endo H) recombinant plant 
produced proteins were partially purified using Ni-column affinity chromatography and 
partial purified CK protein we characterized for stability and activity. No significant 
differences were observed between CKs, which were produced with or without coexpression with Endo H. In conclusion, our results demonstrate that the deglycosylated Endo H technology 
can be used to produce other colicins in non-glycosylated, in their native-like form, which 
would be important to increase the commercialization potential of these colicins as a food 
additive.