shRNA ile HBV replikasyonunun in vitro olarak baskılanması
İnhibition of hepatitis B virus replication by shRNAs: A new strategy in HBV treatment
Yazar: HANDAN KAYHAN
Danışman: PROF. DR. MİTHAT BOZDAYI
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Hematoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2005
Konu: Gastroenteroloji = Gastroenterology

Özet:
RNAi (RNA interference: RNA çatışması) kısaca sekans spesifik mRNA degradasyonu olarak tanımlanabilir. RNAi işlemi siRNA'larla (small interfering RNA: küçük engelleyici RNA molekülleri) başlar ve aktif bir gen transkriptinin (mRNA) susturulması (gene silencing) ile sonuçlanır. Bu moleküller çok spesifik olduklarından hedef mRNA dışında başka mRNA'ları yıkıma uğratmazlar. RNAi teknolojisi sadece virüslere ve diğer hastalıklara karşı potansiyel bir tedavi aracı olarak değil aynı zamanda genlerin fonksiyonunu anlamada da yeni ve güçlü bir araçtır. Bu çalışmanın amacı RNAi mekanizmasını HBV'ye karşı kullanmak yoluyla HBV replikasyonunun in-vitro ortamda baskılanmasıdır. MATERYAL VE YÖNTEM: HBV mRNA sekanslarına spesifik, 21 nükleotid uzunluğunda, X, kor ve yüzey genlerini hedef alan üç siRNA tasarlandı. Bu siRNA'lar shRNA ("small hairpin RNA") ekspresyonu sağlamak için klonlandı. İlk olarak siRNA'ların pENTR/U6 vektörüne ligasyonu yapıldı. Elde edilen bu vektör kompetent E. Coli'ye transforme edildi. Klonlama sekans analizi ile onaylandı. shRNA'ların HBV üzerindeki etkisini görmek için stabil HBV ekspresyonu ve replikasyonunun yapıldığı insan hepatoma hücre hattı HepG.2.2.15 kullanıldı. Transfeksiyon katyonik lipozomlarla gerçekleştirildi. Transfekte edilen shRNA'ların HBV replikasyon düzeyine etkisi kantitatif "real-time PCR" yöntemi ile değerlendirildi. BULGULAR: Viral DNA düzeyine 2., 3., 4., 5., 6. ve 7. günlerde bakıldı. Bunun sonucunda viral DNA replikasyonunun 6 gün boyunca baskılandığı görüldü. HBV DNA düzeyi, yüzey bölgesini hedef alan plazmidle 81%, kor bölgesini hedef alan plazmidle 76% ve X bölgesini hedef alan plazmidle 75 % baskılandı. SONUÇ: Bu çalışma ile HBV replikasyonun shRNA'lar kullanılarak baskılanabildiği gösterilmiştir. Bu baskılama RNAi'nin HBV'ye karşı potansiyel bir tedavi aracı olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Anahtar sözcükler: RNAi, siRNA, shRNA, HBV, HepG2.2.15 hücre hattı. 77

Abstract:
RNA interference (RNAi) can be defined as sequence- spesific mRNA degradation. RNAi mechanism is initiated by small interfering RNA (siRNA) and results in silencing of an active gene transcript. siRNAs are spesific for only target mRNAs. So no mRNA other than target one can be degraded with RNAi mechanism. Our purpose in this study is to investigate effects of shRNAs targeting three different sites of hepatitis B virus mRNAs on the viral replication in HepG2.2.15cells. MATERIAL- METHOD: Three HBV-specific siRNAs were designed targeting X (1686- 1705), Core (2228- 2247) and S (765-784 nt.) transcripts. These siRNAs were cloned to PENTRY/U6 vector for expression of shRNAs (small hairpin RNAs). HepG2.2.15, a stable HBV producing cell line, was used to see the effects of shRNAs on HBV. The cells were transfected with shRNA expressing plasmids (P765, P2228 and P1686 targeting X, core and S region respectively) or a mock plasmid targeting lacZ gene. Transfection efficiency was determined by using green flourescent protein expressing plasmid. After transfection viral DNA levels were detected. RESULTS: The culture media was collected in the days 2, 3, 4, 5, 6, 7 posttransfection and analyzed by Real-time PCR. Viral DNA production suppressed for 7 days. The HBV DNA levels were decreased by 81 %, 76 %, 75 % with P765, P2228 and P1686 vectors respectively. Whereas viral DNA level was increased with mock plasmid (PlacZ). DISCUSSION: In conclusion, the siRNAs designed for X, core and S regions, spesifically and significantly suppressed HBV DNA. Our results support the potential use of this treatment strategy in hepatitis B. Keywords: RNAi, siRNA, shRNA, HBV, HepG2.2.15 cell line. 78