Steril vücut sıvılarının akım sitometri yöntemiyle taranması ve direkt örnekten MALDI-TOF MS ile mikroorganizma saptanması
Screening of sterile body fluids by flow cytometry and microorganism identification from direct sample with MALDI-TOF MS
Yazar: ESRA BARAN
Danışman: PROF. DR. ZEYNEP ARZU İLKİ
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Beyin omurilik sıvısı =   ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Vücut sıvıları = Body fluids

Özet:
Amaç: Çalışmamızın amacı Steril vücut sıvısı (SVS) örneklerini akım sitometrik bir yöntemle lökosit ve bakteri miktarı açısından değerlendirmek ve muhtemel patojenleri MALDI TOF MS (VITEK MS, bioMérieux, Fransa) ile örnekten hızla tanımlamaktır.
Gereç ve Yöntem: Steril bölge enfeksiyonu şüphesiyle Kasım 2018-Ocak 2020 tarihleri arasında laboratuvarımıza gönderilen SVS örnekleri çalışmaya dahil edildi. Çalışmanın ilk bölümünde akım sitometrik yöntem olan Sysmex UF-5000 (Co., Kobe Japonya) ile örneklerde lökosit miktarı saptanıp, aynı örnekte referans yöntem olan Thoma lamıyla lökosit sayımı yapılarak sonuçlar karşılaştırılmıştır. İkinci kısmında kültür sonuçları ile UF-5000 bakteri sayımları arasındaki ilişki değerlendirilmiş, üçüncü aşamada ise kültür pozitif örnekler 8 saat beyin-kalp infüzyon buyyonda inkübe edildikten sonra MALDI-TOF MS ile tanımlanmıştır.
Bulgular: Çalışmamıza 498 beyin omurilik sıvısı (BOS), 109 periton ve 109 plevra sıvısı dahil edilmiştir. Örneklerin lökosit sayısı açısından akım sitometri ile manuel mikroskobi (MM) sonuçlarının kategorik uyumları Spearman korelasyonu ile analiz edilmiştir. Bunun sonucunda BOS için, yüksek düzeyde uyum (0,717), plevra ve periton örnekleri için ise sırasıyla 0,604, 0,659 şeklinde orta düzeyde uyum saptanmıştır (p<0,05). Ayrıca pozitif kültüre sahip numuneler, negatiflere göre; gram boyalı preparatta bakteri görülen örnekler, görülmeyenlere göre yüksek bakteri sayımları gösterdi (p<0,05). Kültürde üreme saptanan örneklerin kısa inkübasyon sonrası %64,2'si MALDI-TOF MS ile doğru tanımlanırken, polimikrobiyal örneklerde patojen bakterilerden herhangi biri %46 oranında doğru tanımlanmıştır.
Sonuç: Sonuçlarımız akım sitometrik yöntemin BOS örneklerinde MM'ye alternatif olabileceğini düşündürmektedir. Periton ve plevra örneklerinde ise saptanan %100 duyarlılık, hastaların gereksiz yere antibiyotik almasını ve olası direnç gelişimini engelleyecektir. Örnekten kısa inkübasyon sonrası direkt MALDI-TOF MS prosedürü ise SVS enfeksiyonlarına neden olan bakterilerin tanımlanmasını 8,5 saate düşürerek örneğin laboratuvara ulaştığı gün içinde tanımlanabileceğini göstermekte, bu da ciddi bir zaman kazancı sağlamaktadır.

Abstract:
Objectives: The aim of our study is to evaluate bacteria and white blood cell (WBC) analysis by flow cytometric method in sterile body fluids (BF) and to provide rapid identification possible pathogens of samples with MALDI TOF MS (VITEK MS, bioMérieux, Fransa).
Materials/methods: BF samples submitted to our laboratory with suspected sterile body fluid infection between November 2018 and January 2020 were included in the study. In the first part of the study WBC counts of samples were analyzed with Sysmex UF-5000 (Co., Kobe Japan) based on the principle of flow cytometry and the results were then compared with the reference method (i.e., manual microscopy), by counting in a Thoma chamber. In the second part, the relationship between culture results and UF-5000 bacterial count was evaluated, and in the third stage, culture positive samples were identified by MALDI-TOF MS after incubating in brain-heart infusion broth for 8 hours.
Results: In our study 498 cerebrospinal fluid (CSF), 109 peritoneal and 109 pleural fluids were included. The categorical agreement of flow cytometry and manual microscopy (MM) results was assessed by Spearman correlation for WBC. As a result, a high agreement (0.717) was detected for CSF, and a moderate agreement was found for pleural and peritoneual samples with 0.604 and 0.659, respectively (p <0.05). In addition bacterial counting with flow cytometry was higher among culture positive samples and samples with a positive direct gram stain than culture negative samples and negative direct gram stain. Correct identification rate of MALDI-TOF MS after a short-term incubation, was 64.2% in monomicrobial samples and 46% in one of the pathogens of polymicrobial samples.
Conclusion: Our results show that the flow cytometric method can be an alternative to MM in CSF samples. Detection of 100% sensitivity in peritoneal and pleural samples will prevent unnecessary antibiotic treatment and possible resistance development. Direct identification procedure with MALDI-TOF MS after short-term incubation reduces the identification of pathogen bacteria of BF infections to 8.5 hours. Thus, identification of the sample on the day it arrives at the laboratory saves a considerable amount of time.