Sıçan over dokusu vitrifikasyonunda plateletten zengin plazma (PRP) eklenmiş dondurma solüsyonunun etkilerinin histolojik olarak incelenmesi
Histological study of platelet rich plasma (PRP) added freezing solution in rat ovarian tissue vitrification
Yazar: AYLİN GÖKHAN
Danışman: PROF. DR. MERAL BAKA
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Fertilite = Fertility ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Histoloji = Histology ; Over = Ovary ; Sıçanlar = Rats ; Trombositten zengin plazma = Platelet rich plasma

Özet:
Kanser veya kanser dışı nedenlerle gonadotoksik tedavi alacak özellikle prepubertal çağdaki hastalar ve fertilite arzusunu ertelemek isteyenlerde doğurganlığın korunabilmesi günümüz şartlarında mümkündür. Gelişen tedavi protokolleri ile bazı kanserlerde kür sağlanmakta ancak alınan kemoterapötik ilaçlar ve/veya radyoterapi sonrası ovaryan disfonksiyon kaçınılmaz olmaktadır. Fertilitenin korunması için oosit ve embriyo kriyoprezervasyonu gibi yöntemler seçenekler arasında bulunmaktadır ancak bu işlemlerde önceden stimülasyon protokollerine ihtiyaç duyulmaktadır. Hızlıca kemoradyoterapi başlanması gereken hastalarda ovaryan stimülasyon işlemlerine vakit kalmamaktadır. Söz konusu durumlarda ovaryan kriyoprezervasyon alternatif bir tedavi seçeneği sunmaktadır. 
Günümüzde over doku kriyoprezervasyonu sonucu sağlıklı gebelikler bildirilmiştir.  Over doku kriyoprezervasyonu işleminin başarılı örnekleri literatürde mevcut olmakla birlikte hala deneysel çalışma olarak nitelendirilmekte ve prosedürlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Kriyoprezervasyon ve kriyoprotektan ajanlardan kaynaklanan hücresel hasarın azaltılmasında çeşitli maddeler denenmiş ve olumlu sonuçlar elde edilmiştir. Kriyohasarı azaltmak amacıyla plateletten zengin plazmanın kullanılabilirliği çalışmamıza konu olmuştur.
Plateletten zengin plazma (PRP), plateletlerin yoğunlaştırılmasıyla elde edilen bir kan ürünüdür. İçeriğindeki zengin büyüme faktörleri sayesinde rejeneratif tıpta oldukça fazla kullanım alanı bulmuştur. Besiyerlerine eklenen hücresel fonksiyonlarda destekleyici görev gören fetal sığır serumunun (FBS) alternatifi olarak PRP kullanılması ile hayvansal maddelerin veya enfeksiyöz patojenlerin geçişi elimine edilmektedir. Ayrıca PRP'nin otolog kullanılması nedeniyle immün reaksiyon ihtimali azalmaktadır.
Kriyoprezervasyon tekniklerinin geliştirilmesi adına literatürde ilk defa sıçan bütün over doku kriyoprezervasyon işleminde vitrifikasyon solüsyonuna PRP eklenerek dokular dondurulmuştur. Dokular kontrol (Grup 1), vitrifikasyon solüsyonuna PRP eklenerek dondurulan PRP eklenmiş (Grup 2) ve vitrifikasyon solüsyonuna FBS eklenerek dondurulan PRP eklenmemiş (Grup3) olarak gruplandırıldı. Çözme sonrası dokular histokimyasal, immünhistokimyasal ve immünfloresan boyama yöntemleri ile boyanarak incelendi. Histokimyasal boyama yöntemi ile HE, PAS ve Mallory Trikrom boyamaları yapıldı. İmmünfloresan boyama yötemiyle kaspaz 3 ekspresyonuna ve TUNEL analizine bakıldı. İmmünhistokimyasal boyama yöntemiyle konneksin 43, Bax, Bcl-2 ve kaspaz 3 ekspresyonu incelendi ve TUNEL analizi yapıldı.
  Sonuçta kontrol grubu ile karşılaştırıldığında gerek Grup 2'de gerekse Grup 3'te vitrifikasyona bağlı dejenerasyonların olduğu görülmüştür. Ancak Grup 2'de PRP'yi aktive etmek için kullanılan CaCl2'ün vitrifikasyonun zararlı etkilerini agreve ederek over dokusunda görülen dejenerasyonu arttırdığı ve PRP'nin muhtemel olumlu etkilerini önlediği tespit edilmiştir. Her iki deney grubunda da primordiyal foliküllerin korunmuş olduğu ancak foliküler gelişimin ileri aşamasındaki foliküllerde dejenerasyonun artmış olduğu dikkati çekti. Elde edilen bulgular ışığında sıçan over dokusu kriyoprezervasyonunun bütün over dokusu yerine kortikal parçalar halinde yapılması, PRP aktivasyonu için CaCl2 yerine başka metodların uygulanması, vitrifikasyon solusyonlarına CaCl2 eklenmemesi, PRP'nin kriyoprezervasyondaki muhtemel yararlı etkilerinin gösterilmesi ve standardizasyonunun sağlanması için CaCl2 ile aktive edilmemiş PRP'nin hem vitrifikasyon hem de yavaş dondurma yönteminde uygulanarak sonuçlarının analiz edilmesi gerektiği kanaatine vardık.

Abstract:
It is possible to preserve fertility especially in the prepubertal age and those who want to postpone the desire for fertility in today's conditions. The cure is provided in some cancers with improved treatment protocols, but ovarian dysfunction is inevitable after chemotherapeutic drugs and/or radiotherapy. Methods such as oocyte and embryo cryopreservation to protect fertility are among the treatment options, but these require pre-stimulation protocols. There is no time for ovarian stimulation procedures in patients who should undergo rapid chemoradiotherapy. Ovarian cryopreservation provides an alternative treatment option in these cases.
Today, healthy pregnancies have been reported due to ovarian tissue cryopreservation. Successful specimens of ovarian cryopreservation are still available in the literature but are still considered to be experimental studies and need to be developed. Several substances have been tried and positive results have been obtained for cryopreservation and reduction of cellular damage caused by cryoprotectant agents. The availability of platelet-rich plasma in order to reduce cryodamages has been the subject of our study.
Platelet-rich plasma (PRP) is a blood product obtained by condensation of platelets. It is frequently used in regenerative medicine because of its rich growth factors. The risk of animal substances or infectious pathogens transmission is eliminated by the use of PRP in the mediums as an alternative to fetal bovine serum (FBS) for supporting cellular functions. Moreover, the possibility of an immune reaction is reduced due to the autologous use of PRP.
In order to develop cryopreservation techniques, tissues were frozen by adding PRP to the vitrification solution in whole ovarian tissue cryopreservation procedure. Tissues are grouped as control (Group 1), vitrification group treated with PRP added freezing solution (Group 2), and vitrification group treated with FBS added freezing solution (Group 3). After thawing, tissues were stained by histochemical, immunohistochemical and immunofluorescent staining methods. HE, PAS and Mallory Trichrome stainings were performed by histochemically. The expression of caspase 3 and TUNEL analysis were investigated by immunofluorescence staining methods. The expressions of connexin 43, Bax, Bcl-2 and caspase 3 were investigated by immunohistochemical staining methods and TUNEL analysis was also performed. 
In conclusion, degenerations due to vitrification were observed both in Group 2 and Group 3 compared to the control group. However, CaCl2 used to activate PRP in Group 2 was found to aggregate the harmful effects of vitrification and increase the degeneration of ovarian tissue and prevent the possible positive effects of PRP. In both experimental groups, it was noted that the primordial follicles were preserved, but degeneration of the follicles at the advanced stages of follicular development was increased. In the light of the findings, it was concluded that the rat ovarian cryopreservation should be performed as cortical parts instead of whole ovarian tissue. We concluded that the results should be analyzed by applying both vitrification and slow freezing methods.