Hepatit C virusunun "core" proteinin prokaryotik hücrede ifade ettirilip saflaştırılması
The expression and purification of hepatitis C virus core protein in prokaryotic cells
Yazar: ERTAN ÇAKMAK
Danışman: PROF.DR. Y. HAKAN ABACIOĞLU ; Y.DOÇ.DR. İ. MEHMET ALİ ÖKTEM
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Ekspresyon = Expression ; Hepatit C virüsü = Hepatitis C virus ; Klonlama = Cloning ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Hepatit C virusu (HCV) zarflı, tek iplikli bir RNA virusudur. Dünya Saglık Örgütününtahminlerine göre dünyada 170 milyon kisinin HCV ile infekte oldugu tahmin edilmektedir.HCV ciddi morbidite ve mortalitesi yanı sıra, tedavi maliyetlerinin yüksekligi ile de önemlibir saglık sorunudur.HCV poliproteininden kodlanan ilk protein özyapı (core) proteinidir. Bu proteinvirusun yapısına katılması dısında, hücresel islevleri de virus lehine düzenleyebildigigözlenmistir. Bu nedenle bu proteinin virusun patogenezinde rol aldıgı düsünülmektedir.Çalısmada, özyapı proteinin ilk 178 aminoasidini kodlayan DNA dizisi PZT ileçogaltıldı. PZT ürünü önce pGEM-T Easy TA vektörüne klonlandı. Ardından bu vektördenBamHI ve HindIII ile kesilip pQE-30'a klonlandı. Ekspresyon, E. coli M15 (prep4) susundaOD600=0.7'de 1mM IPTG ile uyarılarak 3 saat süre ile yapıldı ve bakteriler santrifüj ile pellethaline getirip 8M ürede çözündü. Protein saflastırılması afinite kromotografisi (Ni-NTAmatriks) ile yapıldı. Ekspresyon ve saflastırılmıs protein, ?Western Blot? ile ECL substratkullanılarak saptandı. Ekspresyon ve saflastırma sonrasında beklenen 21kDa'luk bantbüyüklügü elde edildi.Çalısmada, özyapı proteinin ilk 178 aminoasidi E. coli'de eksprese edilmistir. Busaflastırılmıs protein patogenez çalısmalarında, serolojik test hazırlanmasındakullanılabilecektir. Ayrıca klonlanan vektörler PZT'de pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Buçalısmada ile elde edilen bilgiler, gelecekte yapılacak prokayotik ekpresyon çalısmaları içinzemin olusturacaktır.

Abstract:
Hepatitis C virus (HCV) is an enveloped, positive stranded RNA virus. The WorldHealth Organization estimates that there are more than 170 million HCV infected individualsworldwide. Aside from the high morbidity and mortality of the HCV infection, the treatmentcosts can be a burden on health economics.Core protein is the structural unit of the viral capsid. It also seems to be important forthe viral pathogenesis by interfering with various cellular processes.In this study, the first 178 amino acids coding sequence of the core protein wasamplified using polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the pGEM-T Easy TAcloning vector. Following digestion with BamHI and HindIII, the insert was subcloned intothe pQE-30 vector. The protein expression was carried out in the E. coli M15 (prep4) usingIPTG as inducer. The bacterium was pelleted with centrifugation and resuspended in 8M urea.The purification of the recombinant protein was made with affinity chromatography (Ni-NTA). The detection of the expressed and purified protein was made with western blottingusing chemiluminescent substrate. The expected 21kDA protein band was detected after theexpression and purification.In this study, the core protein was expressed in E. coli. The purified protein can beused in pathogenesis studies and in serologic tests as antigen. The cloned vector can be usedas a positive control in PCR experiments.