PC-3 prostat kanser hücre hattında mutant TP53 geninin crıspr-cas9 aracılıklı restorasyonu
Crispr-cas9 directed TP53 gene restoration in human prostate cancer cell line PC-3
Yazar: MUHAMMET BURAK BATIR
Danışman: PROF. DR. FETHİ SIRRI ÇAM
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Genetik = Genetics ; Genler = Genes ; Genler-P53 = Genes-P53 ; Hücre dizisi = Cell line ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prostat hastalıkları = Prostatic diseases ; Prostat neoplazmları = Prostatic neoplasms

Özet:
daha sonra dolduAmaç:Prostat kanseri, dünya çapında erkekler arasında yaygın bir sağlık sorunudur ve bu prostat kanseri vakalarının çoğu, disfonksiyonel mutant TP53 geni ile ilişkilidir. Bununla birlikte, disfonksiyonel mutant TP53 geni CRISPR/Cas9 sistemi ve tek iplikli oligodeoksinükleotid tamir kalıbı yardımıyla hücrelerin sahip olduğu homoloji aracılıklı tamir mekanizması aracılığıyla tamir edilebilir. Bu çalışmada, insan kanser PC-3 hücre hattı TP53 gen bölgesi üzerinde bulunan TP53 414delC (p.K139fs*31) null mutasyonunun CRISPR/Cas9 sistemi ve donör tek iplikli oligodeoksinükleotid yardımıyla tamir verimliliğinin incelenmesi amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada iskelet yapısında CRISPR/Cas9 sistemini taşıyan px459V2.0 plazmidi ve tamir kalıbı olarakda iki farklı kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 sistemiyle düzenlenen TP53 gen bölgesi yeni nesil sekans sistemi ile analiz edilmiştir. Düzenlemiş PC-3 hücrelerinde p53 ekspresyonunun varlığının tespiti için qPCR ve immünofloresan analizi yapılmıştır. Ayrıca, TP53 gen düzenlenmesine bağlı olarak apoptotik hücrelerin tespiti için flow sitometri analizi yapılmıştır.
Bulgular: YNS sonuçlarına göre, sgRNA2 rehberliğindeki CRISPR/Cas9 sistemine eşlik eden iki ayrı tek iplikli oligodeoksinükleotid 1 ve tek iplikli oligodeoksinükleotid 2 varlığında TP53 414delC mutasyonu sırası ile %19,95 ve %26,0 oranında tamir edilmiştir. qPCR ve immünofloresan analizleri TP53 414delCmutasyonunun tamir olduğu PC-3 hücrelerinde p53 ekspresyonunu göstermiş ve ayrıca, yapılan flow sitometri analizi apoptotik hücre oranında belirgin bir artış olduğunu göstermiştir.
Sonuçlar: Sonuç olarak, CRISPR/Cas9 sistemi aracılığıyla TP53 414delC mutasyonunun başarılı olarak tamir edildiği görülmüştür.
rulacaktır

Abstract:
daha sonra Aim:Prostate cancer is a common health problem among men worldwide and most of these prostate cancer cases are related to a dysfunctional mutant Tumor Protein p53 (TP53) gene. However, the CRISPR/Cas9 system can be used for repairing of a dysfunctional mutant TP53 gene in combination with donor single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) via cells' own homology-directed repair (HDR) mechanism. In this study, we aimed to evaluate the CRISPR/Cas9 repairing efficiency on TP53 414delC (p.K139fs*31) null mutation, located in the TP53 gene, of human prostate cancer cell line PC-3 in combination with ssODNs.
Material and method:CRISPR/Cas9 backbone carier px459 plasmids were used in this study.  Edited TP53 414delC gene region were analysed with next-generation sequencing system. qPCR and immunofluorescence analysis was performed for detection of p53 expression from the edited PC-3 cells. Flow cytometry analysis was also performed for the detection of apoptotic cells.
Results:According to the next-generation sequencing results, TP53 414delC mutation was repaired with an efficiency of 19,95% and 26,0% at the TP53 414delC position with ssODN1and ssODN2 accompanied by sgRNA2 guided CRISPR/Cas9, respectively. Besides, qPCR and immunofluorescence analysis showed that PC-3 cells, the TP53 414delC mutation of which were repaired, expressed wild type p53 again. Also, significantly increased number of apoptotic cells, driven by the repaired TP53 gene weredetected compared to the control cells by flow cytometry analysis.
Discussion: As a result, CRISPR/Cas9 system accompanied by ssODN was shown to effectively repair the TP53 414delC gene region
doldurulacaktır