Peroksidaz enziminin afinite kromatografisi tekniği ile karaturp (Raphanus sativus L.) ve şalgamdan (Brassica rapa L.) saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of peroxidase enzyme from radish (Raphanus sativus L.) ve black turnip (Brassica rapa L.) by affinity chromatography technique
Yazar: RAMAZAN KALIN
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Peroksidaz = Peroxidase

Özet:
Enzimin inhibitörü olan 4-aminobenzohidrazit molekülü tirozine kenetlendirilerek yeni bir afinite jeli hazırlandı. Karaturp (Raphanus sativus L.) ve şalgam (Brassica rapa L.) bitkilerinden peroksidaz (POD) enzimi Sepharose-4B-L-tirozin-4-aminobenzohidrazit afinite kromatografisi kullanılarak tek basamakta sırasıyla %10,6 verimle 40,3 kat ve %9 verimle 269,3 kat saflaştırıldı. Enzim aktivitesi spektrofotometrik olarak 470 nm'de ölçüldü. Enzimlerin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlelerini belirlemek için SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve tek bant gözlendi. Molekül kütleleri karaturp (Raphanus sativus L.) POD için yaklaşık 67,3 kDa ve şalgam (Brassica rapa L.) POD için yaklaşık 65,8 kDa olarak bulundu. Enzimler üzerinde yapılan kinetik çalışmalar neticesinde optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, stabil pH sırasıyla karaturp (Raphanus sativus L.) için 6,5, 0,1 M, 300C, 6,5 ve şalgam (Brassica rapa L.) için 6,5, 1 M, 300C, 5,0 olarak tespit edildi. Guaiakol substratı için saf enzimlerin KM ve Vmax değerleri hesaplandı ve karaturp (Raphanus sativus L.) için KM 24,88 mM, Vmax 3,23 EÜ/ml, şalgam (Brassica rapa L.) için KM 4,09 mM, Vmax 0,797 EÜ/ml olarak belirlendi. Ayrıca saf peroksidaz enzimleri üzerine 4-aminobenzohidrazit inhibitörünün inhibisyon etkisi in vitro şartlarda ayrı ayrı incelendi. 4-aminobenzohidrazit inhibitörü her iki bitki peroksidazı içinde yarışmasız inhibisyon göstermekte olup, karaturp (Raphanus sativus L.) ve şalgam (Brassica rapa L.) için sırasıyla IC50 değeri 0,726 mM ve 1,167 mM olarak, Ki değerleri ise sırasıyla 0,5947±0,0122 mM ve 1,1033±0,1016 mM olarak tespit edildi.

Abstract:
A novel affinity gel was prepared by joining 4-aminobenzohydrazide, an inhibitor molecule of the enzyme, to tyrosine. Peroxidase (POD) enzymes of black radish (Raphanus sativus L.) and turnip (Brassica rapa L.) plants were purified in a single step by using Sepharose-4B-L-tyrosine-4-aminobenzohydrazide affinity chromatography as 10.6% yield, 40.3-fold and 9% yield, 269.3-fold, respectively. Enzyme activity was measured spectrophotometrically at 470 nm. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed to check the purity and molecular weights of enzymes to determine and the observed single band. Molecular masses of enzymes for POD black radish (Raphanus sativus L.)and turnip (Brassica rapa L.) was found to be approximately 67.3 kDa and 65.8 kDa, respectively. As a result of the kinetic studies on the enzymes; optimum pH, optimum ionic strength, the optimum temperature and stable pH were determined as 6.5, 0.1 M, 300C, 6.5 for black radish (Raphanus sativus L.) and 6.5, 1 M, 300C, 5.0 for turnip (Brassica rapa L.). KM and Vmax values were calculated for the pure enzyme using guaiacol as substrate and for black radish (Raphanus sativus L.) KM and Vmax values were found to be as 24.88 mM and 3.23 EU / ml, for turnip (Brassica rapa L.) they were found to be as 4.09 mM and 0.797 EU / mL. Also, inhibitory effect of 4-aminobenzohydrazide inhibitor on pure peroxidase enzymes were examined in vitro conditions separately. 4-aminobenzohydrazide have shown noncompetitive inhibition in both peroxidase enzymes of black radish (Raphanus sativus L.) and turnip (Brassica rapa L.), IC50 values were calculated as 0.726 mM and 1.167 mM, Ki values were calculated as 0,5947±0,0122 mM and 1,1033±0,1016 mM, respectively.