Makrofajlarda interferon stimülatör genleri (STING) sinyal yolağının indüklenmesinin Leishmania infantum'a karşı gelişen immun yanıta etkilerinin In vitro incelenmesi
Induction of interferon stimulator genes (STING) signaling pathway in macrophages In vitro examination of the effects on the immune response to Leishmania infantum
Yazar: NESRİN DELİBAŞI
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH İNCİ ; DOÇ. DR. AHMET EKEN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Parazitoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Parazitoloji = Parasitology

Özet:
MAKROFAJLARDA İNTERFERON STİMÜLATÖR GENLERİ (STING) SİNYAL YOLAĞININ BASKILANMASININ LEISHMANIA INFANTUM'A KARŞI GELİŞEN İMMUN YANITA ETKİLERİNİN İN VİTRO İNCELENMESİ

Nesrin DELİBAŞI

T.C. Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Veteriner Parazitoloji Anabilim Dalı
Doktora Tezi, Nisan 2024
Danışman: Prof. Dr. Abdullah İNCİ

ÖZET
Leishmaniasis'in klinik formlarının arasında en ağır seyreden formu visceral leishmaniasis (VL) olup tüm dünyada insanlarda ve hayvanlarda yüksek mortalite ve morbidite ile kendini göstermektedir. Leishmania türleri konak immun mekanizmalarından kaçınmak için geniş ölçekte stratejiler geliştirmişlerdir. Leishmania parazitleri ile enfekte olguların yaklaşık %90'ı subklinik VL semptomları gösterirler ve Leishmania antijenleri ve immunregülatör mekanizmalara karşı TH1-aracılı immun yanıtın gelişmesi ile ilgili efektör mekanizmalar arasında bir balans sağladıkları için asemptomatik olarak nitelenirler. İn vitro deney modelleri konak-parazit etkileşiminde immün sistemin regülasyonu araştırmalarında kullanılmaktadır. Biyoteknolojideki gelişmeler ışığında çeşitli patojenlerin yol açtığı enfeksiyonlarda sitozolik DNA duyarlı sinyalin bir birleşen noktası olarak interferon genlerinin stimülatörü (STING) konak-patojen etkileşimine katıldığı belirlenmiştir. Sitozolik DNA veya cyclic dinükleotidlerin cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) gibi DNA reseptörleriyle tanınmasıyla, STING uyarılır, fosforile olur, ER'den perinükleer alana translokalize olur ve tip 1 interferonların transkripsiyonuna yol açar. Günümüze kadar yapılan araştırmalar STING'in çeşitli patojen enfeksiyonlarında konak yanıtlarının modülasyonuna dahil olduğunu ve patojene bağlı olarak farklı fonksiyonlara yol açtığını göstermiştir. Günümüze kadar L. infantum enfeksiyonuyla ilgili olarak STING aracılı immun yanıtların in vitro değerlendirildiği bir araştırma yapılmamıştır. Bu çalışma in vitro zeminde Raw 264.7 fare makrofaj hücre hattı kullanılarak L. infantum enfeksiyonunda STING aracılı immun yanıtların ve ilgili yangısal sitokin sekresyonlarının araştırılması sonucu enfeksiyonun 12. saatinden itibaren IFN-β, IFN-γ, IL-12, IL-6 ve TNF-α ekspresyonlarında artış gözlenmiştir. Ligand ile stimüle edilmeyen makrofajlarda ve 2,3 cGAMP ligand ile stimüle edilen makrofajlarda kontrol grubuna göre 3., 6., 12 ve 24 saat gerçekleştirilen enfeksiyon grupları kendi aralarında değerlendirilmiş olup bu değerlendirme sonucunda enfeksiyon saati arttıkça, enfeksiyon oranı ve parazitemi oranlarında artış tespit edilmiştir. Protein düzeyinde yapılan analizlerde ise cGAS ve STING'in ekspresyonlarında kontrol makrofaja göre, saat dilimleri arasında bir artış gözlense de bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0,05). NFKB proteinlerinin ekspresyonunda ise 2,3 cGAMP ligand ile stimüle edilen makrofajlarda kontrol grubuna göre, p ≤0.05 düzeyinde bir azalış bulunmuştur. Sonuç olarak bu tez çalışmasında STING sinyal yolağının uyarılması saatlere bağlı olarak enfeksiyon ve parazit alımını artırmış, genel olarak da enfeksiyonun 12. saatinden itibaren immün yanıtlarda bir artışa sebebiyet vermiştir. Parazitin konak makrofaj hücreleri içindeki gelişim süreci ve immunopatolojisi de göz önüne alındığında enfeksiyonun ilerleyen dönemlerini içeren hem in vitro hem de in vivo araştırmalarla STİNG'in L. infantum enfeksiyonundaki rolünün ayrıntılı olarak araştırılmasına ihtiyaç bulunmaktadır.

Anahtar kelimeler: L. infantum, Visseral leishmaniasis, STING, RAW 264.7

Abstract:
IN VITRO EXAMINATION OF THE EFFECTS OF SUPPRESSION OF THE INTERFERON STIMULATOR GENES (STING) SIGNAL PATHWAY IN MACROPHAGES ON THE IMMUNE RESPONSE AGAINST LEISHMANIA INFANTUM

Nesrin DELİBAŞI
Erciyes University, Graduate School of Health Science
Department of Veterinary Parasitology
PhD Thesis, Nisan 2024
Supervisor: Prof. Dr. Abdullah İNCİ


ABSTRACT
Among the clinical forms of leishmaniasis, visceral leishmaniasis (VL) is the most severe form, with high mortality and morbidity in humans and animals worldwide. Leishmania species have evolved strategies to evade host immune mechanisms on a large scale. Approximately 90% of cases infected with Leishmania parasites show subclinical VL symptoms and are characterized as asymptomatic because they maintain a balance between Leishmania antigens and effector mechanisms involved in the development of a TH1-mediated immune response against immunoregulatory mechanisms. In vitro experimental models have been used to study the regulation of the immune system in host-parasite interactions. In the light of advances in biotechnology, it has been determined that the stimulator of interferon genes (STING) participates in host-pathogen interaction as a junction of cytosolic DNA-sensitive signaling in infections caused by various pathogens. Upon recognition of cytosolic DNA or cyclic dinucleotides by DNA receptors such as cyclic GMP-AMP synthase (cGAS), STING is stimulated, phosphorylated, translocalized from the ER to the perinuclear space and leads to the transcription of type 1 Interferons. To date, studies have shown that STING is involved in the modulation of host responses to various pathogen infections and functions differently depending on the pathogen. To date, there has been no in vitro evaluation of STING-mediated immune responses to L. infantum infection. In this study, STING-mediated immune responses and related inflammatory cytokine secretions were investigated in L. infantum infection using Raw 264.7 mouse macrophage cell line in vitro and an increase in IFN-β, IFN-γ, IL-12, IL-6, TNF-α expression was observed from the 12th hour of infection. In macrophages not stimulated with ligand and macrophages stimulated with 2,3 cGAMP ligand, the infection groups performed at 3, 6, 12 and 24 hours were evaluated among themselves compared to the control group and as a result of this evaluation, as the infection time increased, the infection rate and parasitemia rates increased. In protein level analyses, although an increase in the expression of cGAS and STING was observed between the time periods compared to control macrophages, this increase was not statistically significant (p>0.05). In the expression of NFKB proteins in macrophages stimulated with 2,3 cGAMP ligand a decrease was found at the p ≤0.05 level compared to the control group.  In conclusion, in this thesis, stimulation of the STING signaling pathway increased infection and parasite uptake in a time-dependent manner and generally caused an increase in immune responses from the 12th hour of infection. Considering the developmental process and immunopathology of the parasite in host macrophage cells, there is a need to further investigate the role of STING in L. infantum infection with both in vitro and in vivo studies involving later stages of infection.

Key words: L. infantum, Visceral leishmaniasis, STING, RAW 264.7