Ponatinib ve VS-5584 terapötik ajanlarının kronik miyeloid lösemi lökomogenezine etkileri
The effects of the therapeutic agents ponatinib and VS-5584 on chronic myeloid leukemia leukemogenesis
Yazar: ÇAĞLA KAYABAŞI
Danışman: PROF. DR. CUMHUR GÜNDÜZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Hematoloji = Hematology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; ErbB reseptörleri = ErbB receptors ; Fosfoinositid 3-kinaz = Phosphoinositide 3-kinase ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Mammalian target of rapamycin = Mammalian target of rapamycin ; Ponatinib = Ponatinib ; İlaç kombinasyonları = Drug combinations

Özet:
Kronik miyeloid lösemi (KML), sürekli tirozin kinaz aktivitesi sergileyen BCR-ABL1 füzyon proteinine sahip hücrelerle karakterize miyeloproliferatif bir hastalıktır. Bu nedenle hastalığın tedavisinde tirozin kinaz inhibitörleri kullanılmaktadır. Ponatinib, T315I dahil olmak üzere birçok BCR-ABL1 otofosforilasyonunu inhibe edebilen ATP-yarışmalı tirozin kinaz inhibitörüdür. Lösemi kök hücreleri, normal hematopoietik kök hücrelerle benzer özelliklere sahip malignant hücrelerdir. Tirozin kinaz inhibitörleri, primitif lösemi kök hücreleri üzerinde etkili olmadıkları için tedavinin etkinliği düşük olabilmektedir. Ayrıca, ciddi yan etkilerin önlenmesi için kullanılan düşük tirozin kinaz inhibitörü dozları, KML hücrelerinde aktif halde bulunan alternatif sağkalım yolaklarının baskılanmasını sağlayamamaktadır. Tirozin kinaz inhibitörü tedavisinin başarısının düşük olduğu KML olgularında ponatinibin tek ilaç olarak kullanımından ziyade çoklu hedefli tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine ihtiyaç olduğu açıktır. KML'de aktif olduğu bilinen PI3K/Akt/mTOR yolağının inhibitörlerinden VS-5584,  tercihen kanser kök hücrelerini öldüren, potent, seçici bir dual inhibitördür.
Bu tez çalışmasında KML tedavisindeki eksikliklerin üstesinden gelebilecek in vitro kombinasyon terapisinin belirlenebilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla VS-5584 ile ponatinibin kombinasyonlarıyla BCR-ABL1 ve PI3K/Akt/mTOR yolaklarının eş zamanlı inhibe edilmesinin KML ve lösemi kök hücrelerinin eliminasyonundaki etkisi ve rolü moleküler düzeyde araştırılmıştır.
KML hücre modeli K562,  lösemi kök hücre modeli LSC ve normal hematopoietik kök hücre modeli HSC hücre hatlarında, VS-5584'ün, ponatinibin ve kombinasyonlarının sitotoksik etkileri WST-8 testi ile belirlendi. Kombinasyon indeksleri CalcuSyn izobologram analiziyle değerlendirildi. Belirlenen IC50, IC75, ED50 ve ED75 dozlarının apoptotik etkileri Anneksin V ve aktif kaspaz-3 analizleri ile hücre döngüsüne etkileri PI analizi ile akım sitometride ve siklin D1, p27 antikorlarıyla western blotma ile değerlendirildi. PI3K/Akt/mTOR yolağındaki proteinlerin aktivitelerindeki değişimler, antikor array ile fosforile protein seviyelerinin kantitasyonu yapılarak, ölçüldü. Transkripsiyon faktörlerinin aktivelerindeki değişimler uygun vektörlerin transfeksiyonu sonrasında dual lusiferaz aktivitesi ile kantite edildi. Aktivitesi değişen transkripsiyon faktörlerinin hedef genlerinin mRNA seviyelerindeki değişimleri saptamak için qRT-PCR gerçekleştirildi.
Ponatinib ve VS-5584'ün K562 ve LSC hücrelerinde doza ve zamana bağlı artan sitotoksik etkiye sahip olduğu saptandı. Ponatinibden farklı olarak, VS-5584'ün sağlıklı HSC hücre hattında belirgin şekilde daha az sitotoksik olduğu gösterildi. Kombinasyon dozlarından ED50 additif, ED75 ve ED90 sinerjistik etkili olarak belirlendi. Ponatinibin indüklediği apoptoza ek olarak, VS-5584'ün hücre döngüsünde belirgin G0/G1 duraklamasına neden olduğu gösterildi. Özellikle LSC hücre hattında, ponatinib Akt yolağını baskılamada yetersiz kalırken, ponatinibin VS-5584 ile kombinasyonunun başta S6, S6K, BAD olmak üzere birçok proteinin fosforilasyonu inhibe ederek PI3K/Akt/mTOR yolağını baskıladığı belirlendi. Elk-1/SRF, AP-1 ve NFkB transkripsiyon faktörlerinin lösemi hücre ve lösemi kök hücre modellerinde belirgin şekilde yüksek aktivite sergiledikleri saptandı. Kombinasyon uygulaması sonrasında K562 ve LSC hücrelerinde, seçici bir müdahale noktası olabilecek bu transkripsiyon faktörlerine ek olarak Myc/Max, CREB, STAT3 ve E2F/DP1 transkripsiyon faktörlerinin aktivitelerinde de baskılanma gözlendi. K562 hücrelerinde C/EBP ve FOXO1 transkripsiyon faktörlerinin, LSC hücrelerinde ise C/EBP ve p53 transkripsiyon faktörlerinin aktivitelerinde kombinasyon uygulamasını takiben artış olduğu gösterildi. Ekspresyonları bu transkripsiyon faktörleri tarafından kontrol edilen birçok genin mRNA seviyelerinde değişiklik meydana geldiği belirlendi. Sonuçlar, ponatinib ve VS-5584 ile sağkalım yolaklarında görevli transkripsiyon faktörlerinin regülasyonlarının anti-proliferatif ve apoptotik süreçlere katkı sağladığını gösterdi.
Ponatinib ile VS-5584'ün kombinasyonunun, KML blastlarının ve kök hücrelerinin kontrolsüz proliferasyonunu selektif olarak önleyebilecek ve ponatinibin bilinen ciddi yan etkilerini azaltabilecek umut verici bir tedavi stratejisi olabileceğini düşünmekteyiz.

Anahtar Kelimeler: Kronik Miyeloid Lösemi; PI3K/Akt/mTOR yolağı; Ponatinib

Abstract:
Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder characterized by cells with the BCR-ABL1 fusion protein, which exhibits continuous tyrosine kinase activity. Therefore, tyrosine kinase inhibitors are used in the treatment of CML. Ponatinib is an ATP-competitive tyrosine kinase inhibitor capable of inhibiting BCR-ABL1 autophosphorylation, including T315I-mutant. Leukemia stem cells are malignant cells with similar properties to normal hematopoietic stem cells. Since tyrosine kinase inhibitors are not effective on primitive leukemia stem cells, the efficacy of treatment may be low. In addition, low tyrosine kinase inhibitor doses that use to prevent severe side effects, do not suppress alternative survival pathways that are active in CML cells. It is clear that there is a need to develop multi-targeted treatment approaches instead of single drug ponatinib therapies for patients with CML who exhibit sub-optimal response to tyrosine kinase inhibitor treatment. VS-5584, an inhibitor of the PI3K/Akt/mTOR pathway known to be active in CML, is a potent, selective dual inhibitor that preferably kills cancer stem cells.
In this thesis study, it was aimed to determine an in vitro combination therapy which could overcome the main causes of failure of CML therapy. For this purpose, the effects and roles of simultaneous inhibition of BCR-ABL1 and PI3K/Akt/mTOR pathways by combination of ponatinib and VS-5584 on elimination of CML and leukemic stem cells has been investigated at the molecular level. 
Cytotoxic effects of ponatinib, VS-5584, and their combinations on CML cell model K562, leukemia stem cell model LSC, and normal hematopoietic stem cell model HSC were measured with WST-8 test. Combination indices were evaluated by CalcuSyn isobologram analysis. Apoptotic effects of IC50, IC75, ED50, ED75 doses were evaluated with Annexin V and active caspase-3 assays by using flow cytometry, effects on cell cycle were evaluated by using PI assay with flow cytometry and by cyclinD1, p27 antibodies with western blot. Changes in the activities of the PI3K/Akt/mTOR pathway proteins were measured by quantitation of the phosphoprotein levels with the antibody array. Changes in the activity of transcription factors were quantified by dual luciferase activity after transfection of appropriate vectors. qRT-PCR was performed to detect changes in mRNA levels of the target genes of the altered transcription factors.
Ponatinib and VS-5584 were found cytotoxic for K562 and LSC cells in time and dose dependent manner. Unlike ponatinib, VS-5584 was shown to be significantly less cytotoxic in the healthy HSC cell line. ED50 doses were additive, ED75 and ED90 showed synergistic effect. In addition to ponatinib-induced apoptosis, VS-5584 was shown to cause significant G0/G1 arrest. Especially in LSC cell line it was shown that while ponatinib was insufficient to suppress Akt pathway, combination of ponatinib and VS-5584 inhibited PI3K/Akt/mTOR pathway through inhibiting the phosphorylation of several proteins, particularly S6, S6K, BAD. It was found that the Elk-1/SRF, AP-1 and NFkB transcription factors displayed markedly elevated activity in leukemia and leukemia stem cell models. In addition to these transcription factors which may be a selective intervention point, suppression of Myc/Max, CREB, STAT3 and E2F/DP1 transcription factors was also observed in K562 and LSC cells after the combination treatment. It was determined that the activities of C/EBP and FOXO1 transcription factors in K562 cells and of C/EBP and p53 transcription factors in LSC cells increase following the application of the combination. Many genes whose expressions are regulated by these transcription factors have also been shown altered mRNA levels. The results showed that regulation of transcription factors involved in survival pathway with ponatinib and VS-5584 contributed to anti-proliferative and apoptotic processes.
We believe that the combination of ponatinib and VS-5584 can be a promising treatment strategy that can selectively inhibit the uncontrolled proliferation of CML blasts and stem cells and reduce the known serious side effects of ponatinib.

Keywords: Chronic Myeloid Leukemia; PI3K/Akt/mTOR pathway; Ponatinib