Beta-laktam antibiyotiklerle sinerjik etkiye sahip bor katkılı doku iskelelerinin geliştirilmesi
Development of boron doped tissue scaffolds which have synergistic effects with beta-lactame antibiotics
Yazar: DEMET ÇAKIR
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Amoksisilin = Amoxicillin ; Bakteriyel enfeksiyonlar = Bacterial infections ; Beta laktamazlar = Beta lactamases ; Kemik dokusu = Bone tissue ; Kontrollü ilaç salımı = Controlled drug release

Özet:
Sunulan tez çalışmasında herhangi bir kemik hasarında enfeksiyonu önleyici ve tedavi sürecini hızlandırıcı sistemler olarak, beta-laktam antibiyotikleri ile sinerjik etkiye sahip bor katkılı hidroksiapatit (B-HAp)/kitosan doku iskelelerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, MC3T3-E1 fare öncül kemik hücre hattı ile hücre kültür çalışmaları yapılarak hücre proliferasyonu incelenmiştir. Ayrıca, seçilen çeşitli bakteri suşları ile çalışılarak bir beta-laktam antibiyotiği olan amoksisilin (AMX) ve biyomimetik yöntem ile üretilen B-HAp arasındaki sinerjik etki incelenmiştir. 
İkili-emülsiyon hazırlama-çözücü buharlaştırma (w/o/w) yöntemi kullanılarak AMX yüklü poli(laktik-ko-gikolik asit) (PLGA) nanopartiküller üretilmiştir. AMX'in, PLGA nanopartiküllere enkapsülasyon verimi %36 olarak bulunmuştur.  Boş ve AMX yüklü PLGA nanopartiküllerin çapları sırasıyla, 187 nm ve 182 nm olarak belirlenmiştir. PLGA nanopartiküller ile gerçekleştirilen 85 günlük salım çalışması sonucunda, ilk saatte ani patlama etkisi ile AMX'in %20'sinin salındığı ve AMX salımının uzun dönemli olarak kontrollü bir şekilde gerçekleştiği belirlenerek salım mekanizmasının "Higuchi modeli" ne uygun olarak difüzyon mekanizması ile gerçekleştiği kanıtlanmıştır. 
Tez çalışmasının devamında AMX yüklü PLGA nanopartiküllerin varlığında dondurarak-kurutma yöntemiyle B-HAp/kitosan nanokompozit doku iskeleleri hazırlanmış ve karakteristik özellikleri belirlenmiştir. AMX salımının partiküllerden salıma nazaran daha yavaş ve daha kontrollu biçimde difüzyon mekanizmasıyla gerçekleştiği görülmüştür.
AMX yüklü PLGA nanopartikül içeren B-HAp/kitosan doku iskelelerinin hücre proliferasyonuna etkisini incelemek için MC3T3-E1 hücre hattı ile 7 gün süren in-vitro hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir. B-HAp ile birlikte kullanılan düşük AMX miktarlarının hücre proliferasyonu üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisinin olmadığı gözlenmiştir. 
Beta-laktam antibiyotiği AMX ile B-HAp arasındaki sinerjik etkinin incelenebilmesi için beta-laktamaz enzimi üreten 4 farklı bakteri suşu (Staphylococcus aureus ATCC®25923, Escherichia coli ATCC®25922, Klebsiella pneumoniae ATCC®BAA-1144 ve Klebsiella pneumoniae ATCC®700603) ve 3 faklı yöntem ile (çift disk sinerji yöntemi, agar difüzyon yöntemi ve gradiyent testi) bakteriyel çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Test sonuçları AMX ile B-HAp arasındaki sinerjik etkinin varlığını kanıtlamıştır.  
Tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlar ışığında, beta-laktam antibiyotiği salan ve bor içeren doku iskelelerinin kemik dokusunun yenilenmesinde hücresel ve antibakteriyel özellikleri ile etkin bir biçimde kullanılabilecekleri gösterilmiştir.

Abstract:
In the presented study, it was aimed to develop boron-doped hydroxyapatite (B-HAp)/chitosan tissue scaffolds which have synergistic effect with beta-lactame antibiotics as systems to prevent infection and speed up the treatment of any bone damage. For this purpose, cell proliferation was investigated by cell culture studies with MC3T3-E1 mouse precursor bone cell line. In addition, the synergistic effect between amoxicillin (AMX), a beta-lactam antibiotic, and B-HAp, produced by the biomimetic method, was studied with selected bacterial strains.
AMX loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles were produced using the double-emulsion preparation-solvent evaporation (w/o/w) method. Encapsulation yield of AMX to PLGA nanoparticles was found to be 36%. The diameters of empty and AMX loaded PLGA nanoparticles were determined to be 187 nm and 182 nm, respectively. It has been proven through the 85-day release study with PLGA nanoparticles that 20% of AMX is released by a burst effect in the first hour and the AMX release is carried out in a long-term and controlled manner, proving that the release is achieved by the diffusion mechanism according to the "Higuchi model".
In the on-going study B-HAp/chitosan nanocomposite tissue scaffolds were prepared by freeze-drying method in the presence of AMX loaded PLGA nanoparticles and their characteristics were determined. It has been observed that the AMX release is achieved by a slower and more controlled diffusion mechanism than that of the particles. 
In-vitro cell culture studies were performed with the MC3T3-E1 cell line for 7-day to examine the effect of AMX loaded PLGA nanoparticle containing B-HAp/chitosan tissue scaffolds on cell proliferation. There was no statistically significant effect of low AMX doses used with B-HAp on cell proliferation.
Four different bacterial strains (Staphylococcus aureus ATCC®25923, Escherichia coli ATCC®25922, Klebsiella pneumoniae ATCC®BAA-1144 and Klebsiella pneumoniae ATCC®700603), which produce the beta-lactamase enzyme, and  three different methods (double disk synergy method, agar diffusion method and gradient test) were used to examine the synergistic effect between the beta-lactame antibiotic, AMX, and B-HAp. Test results proved the synergistic effect between AMX and B-HAp.
The results obtained within the scope of the study indicated that beta-lactam antibiotic releasing and boron containing tissue scaffolds could be used effectively with their cellular and antibacterial properties in bone tissue regeneration.