Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının özelliklerinin belirlenmesi
Determination of the specifications of the alkaline proteases of some extremely thermophilic anaerobic bacteria
Yazar: LEİLA GHEORGHİU ALPAN
Danışman: PROF. DR. SEDAT DÖNMEZ
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Alkali proteaz = Alkaline protease ; Anaerobik bakteriler = Anaerobic bacteria ; Ekstrem = Extreme ; Proteolitik aktivite = Proteolytic activity ; Termofilik bakteriler = Thermophilic bacteria

Özet:
Bu çalışmada çeşitli sıcak su, çamur ve toprak örneklerinden izole edilmiş olan bazı ekstrem termofil anaerobik bakteriler alkali proteaz aktiviteleri bakımından incelenmiştir. Test edilen 36 suş arasından Raman (Batman, Türkiye) petrol kuyusundan izole edilen, Ç olarak kodlanan ve Techirgiol (Köstence, Romanya) çamur banyosundan izole edilen, RÇ3 olarak kodlanan iki bakterinin ekstraselüler alkali proteaz enzimi üretikleri saptanmıştır. Bu enzimlerin üretim koşulları ile karakteristik özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Ç ve RÇ3 logaritmik gelişimlerini sırasıyla 32 ve 42. saatte tamamlamışlardır. Yapılan çalışmada Ç ve RÇ3'ün optimum gelişme sıcaklığı ve pH'ları sırasıyla 65°C, 55°C ve 9.0, 9.5 olarak belirlenmiştir. Gelişme sırasında maksimum alkali proteaz aktivitesi Ç için 42. satte 91.3 U/ml, RÇ3 için ise 46. saatte 78.5 U/ml olarak belirlenmiştir. Enzimlerin optimum sıcaklığı ve pH değeri; Ç için 70°C ve pH 9.5, RÇ3 için 65°C ve pH 9.0 olarak bulunmuştur. 70°C'de 2 saat inkübasyondan sonra Ç izolatı enzim aktivitesinin %20'sini, 65°C'de RÇ3 ise %45'ini kaybetmişlerdir. Bakteriler, Ç izolatı için, karbon kaynağı olarak maltoz, azot kaynağı olarak pepton ve kazein karışımı; RÇ3 izolatı için ise, laktoz ve soya unu içeren besiyerlerinde maksimum gelişme göstermişlerdir. Maksimum alkali proteaz üretimi Ç için, maltoz, pepton ve kazein karışımında, RÇ3 için ise laktoz ve kazein hidrolizat içeren besiyerlerinde meydana gelmiştir. Alkali proteaz aktivitesi, besiyerine 2 mM CaCl2 ilavesi ile, sırasıyla Ç için %136 ve RÇ3 %142 oranla artmıştır. Kaba enzim sıvısına, Ç için Ca2+ ve Mn2+ , RÇ3 için Fe3+ ve Co2+ iyonları ilavesi ile enzim aktivitesi artmıştır. Ç için Co2+ ve Cu2+, RÇ3 için ise Zn2+ ve Mn2+ iyonları ilavesi enzim aktivitesini azaltmıştır. EDTA ilavesi ile Ç ve RÇ3 izolatları için enzim aktivitesi sırasıyla %51 ve %45 oranına düşmüş, PMSF ilavesi ile her iki enzim aktivitesi de %90'dan daha büyük oranda inhibe olmuştur.

Abstract:
In this study some extremely thermophilic anaerobic bacteria isolated from various hot water, mud and soil samples were examined for alkaline proteolitic activity. It has been determined that among the 36 strains tested, the isolates coded as Ç from an oil well in Raman region (Batman, Turkey) and RÇ3 from a mud bath in Techirgiol (Constanta, Romania) produced extracellular alkaline protease enzymes. The purpose of this study is to determine the production conditions and properties of the enzymes. Ç and RÇ3 isolates have completed their logarithmic growth in 32nd and 42nd hours of incubation, respectively. According to the results, the optimum growth temperature and pH values for isolates Ç and RÇ3 were 65°C, 55°C and pH 9.0, 9.5, respectively. The maximum alkaline protease activities during the growth were established as 91.3 U/ml at 42nd hour for the isolate Ç and 78.5 U/ml at 46th hour for the isolate RÇ3. The optimum temperature and pH values for enzymes have been found as 70°C, pH 9.5 for the isolate Ç and 65°C, pH 9.0 for the isolate RÇ3. After 2 hours of incubation at 70°C, isolate Ç has lost 20% of its enzyme activity, and similarly RÇ3 has lost %45 of its enzyme activity at 65°C. The isolate Ç exhibited maximum growth in the medium that contains maltose as the carbon source, peptone and casein mixture as the nitrogen source, while the isolate RÇ3 exhibited maximum growh in the medium that contains lactose and soy bean meal. The maximum alkaline protease production took place in a medium containing maltose, peptone and casein for the isolate Ç, and in a medium containing lactose with casein hydrolysate for the isolate RÇ3. Alkaline protease activity was increased to %136 and %142 levels by addition of 2 mM CaCl2 in to the growth medium for the isolates Ç and RÇ3 respectively. Enzyme activity was increased by addition of Ca2+ and Mn2+ ions to the enzyme solution for the Ç isolate, and Fe3+ and Co2+ ions for the RÇ3 isolate . Addition of Co2+ ve Cu2+ ions for Ç isolate and Zn2+ ve Mn2+ ions for the isolate RÇ3, decreased the enzyme activiy. Enzyme activities for the isolates Ç and RÇ3 were decreased to %51 and 45% respectively by addition of EDTA, while addition of PMSF inhibited the enzyme activity up to %90 for both isolates.