Kanser terapisinde kullanılan nitroredüktaz/ilaç-öncü (prodrug) sistemlerinin geliştirilmesi
Developing nitroreductase prodrug system for cancer therapy
Yazar: GÜLDEN AŞÇI
Danışman: DOÇ. DR. AYHAN ÇELİK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Protein mühendisliği = Protein engineering

Özet:
Bakteriyal nitroredüktazlar (NTR) flavoenzimlerdir, nitroaromatik ve nitroheterosiklik bileşiklerdeki nitro gruplarının indirgenmesi reaksiyonlarını NAD(P)H kofaktörü yardımıyla katalizlerler. Nitroredüktazlar, diğer uygulamalarının yanında iki önemli uygulamasıyla büyük ilgi uyandırmaktadır. Birincisi, pro-ilaç aktivasyonu ile kanser terapilerinde kullanılması ve ikincisi toprak kirliliklerinin biyolojik olarak giderilmesindeki uygulamalarıdır.Bu çalışmada, Staphylococcus saprophyticus (ATCC 15305) ve Geobacillus kaustophilus HTA426 bakterilerinde varsayılan nitroredüktaz genleri uygun primerler dizayn edilerek PCR yöntemiyle çoğaltılıp, pET14b klonlama vektöründeki NdeI ve XhoI klonlama bölgelerine aktarılmıştır. Elde edilen plazmid çeşitli restriksiyon enzimleri (NdeI, XhoI, EcoRI, NcoI ve BamHI) ile kesilerek ligasyon kontrolu yapılmıştır. Aktarılan gen DNA dizi analizi ile de doğrulanmıştır. ntr geni içeren pET14b plazmidi (pET14b-Ss-NTR ve pET14b-Gk-NTR) E.coli BL21 (DE3) hücresine aktarılıp IPTG ile indüklenerek Ss-NTR ve Gk-NTR enzimlerinin ekpresyonu sağlanmıştır. Rekombinant proteinler Ni-NTA afinite kolonu kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan His-Tag içeren rekombinant Ss-NTR ve Gk-NTR'nin moleküler ağırlığı MALDI-TOF kütle spektrometresi ile sırasıyla 25441,7 ve 30455,2 Da olduğu belirlenmiştir. Gk-NTR oksijen hassasiyeti olan nitroredüktaz olarak belirlenmiştir. Anaerobik koşulların sağlanamaması sebebiyle ayrıntılı karakterizasyonu yapılamamıştır. Ss-NTR enziminin karakterizasyonu yapılarak kinetik parametreleri belirlenmiştir. Optimum pH aralığı pH 7.5-8.0 ve optimum sıcaklık aralığı 15-20°C olarak bulunmuştur. Kinetik çalışmalar iki farklı substrat olan CB1954 ve nitrofurazon kullanılarak yapılmıştır. CB 1954 için KM 1065.7±53 µM, spesifik aktivitesi 5.34±0.11 µmol dk-1mg protein-1 olarak, nitrofurazon için KM 46.57±4.56 µM, spesifik aktivitesi 4.66±0.18 µmol dk-1mg protein-1 olarak hesaplanmıştır.

Abstract:
Bacterial nitroreductases (NTR) are flavoenzymes that catalyze the NAD(P)H-dependent reduction of the nitro groups on nitroaromatic and nitroheterocyclic compounds. Nitroreductases have raised a great interest due to their potential applications in bioremediation, biocatalysis, and biomedicine, especially in prodrug activation for chemotherapeutic cancer treatments.In this study, a putative ntr gene in the genome of Staphylococcus sapropphyticus (ATCC 15305) and Geobacillus kaustophilus HTA426 were amplified using PCR with appropriate primers. The PCR product was cloned into the NdeI and XhoI cloning sites of pET14b expression vector. Its DNA sequence was confirmed by DNA sequencing. pET14b vector containing the ntr gene was transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells. The overexpression of the recombinant protein was achieved by IPTG induction and it was purified by using Ni-NTA affinity column. The molecular weight of the recombinant Ss-NTR and Gk-NTR including His-Tag were found to be 25441,7 and 30455,2 Da, respectively by MALDI-TOF mass spectrometer. Gk-NTR was identified as oxygen sensitive nitroreductase and lack of anaerobic conditions it couldn?t characterized. The kinetic parameters of the recombinant Ss-NTR was determined. The optimum pH and temperature were 7.5-8.0 and 15-20°C respectively. The KM for CB 1954 and nitrofurazone are estimated to be 1065.7±53 µM and 46.57±4.56 µM. The specific activities of CB 1954 and nitrofurazone of Ss-NTR are measured 5.34±0.11 and 4.66±0.18 µmol dk-1mg protein-1.