Pseudomonas cinsi bakterilerde hekzavalent krom indirgeme üzerine ağır metallerin etkisi
The effect of heavy metals on hexavalent chromium reduction by Pseudomonas
Yazar: EDA EVGEN
Danışman: DOÇ. DR. NAZİME MERCAN DOĞAN
Pamukkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada kullanılan izolatların 16S rRNA sekans analizi sonuçlarının değerlendirilmesi sonucunda toplam 13 izolat içinde 6 farklı tür olduğu tespit edilmiştir. Bu izolatların 3'ü Enterobacter cancerogenus , 3'ü Pseudomonas mendocina, 1'i Exiuguobacterium aurantiacum , 2'si Pseudomonas stutzeri, 2'si Enterobacter cloacae ve 1 tanesinin de Streptomyces thermocarboxydus olduğu görülmüştür.Bakterilerin krom dirençliliği, Minimum İnhibisyon Konsantrasyonuna (MİK) göre belirlenmiştir. Krom indirgeme deneylerinde çalışılmak üzere krom ve ağır metallerin hücre üzerine olan toksik etkisi nedeniyle 110 ppm ve 25 ppm MİK değerine sahip olan P. mendocina PASS3-P18 ve P. mendocina DS0601-FX-P22 suşları seçilmiştir. Seçilen P. mendocina PASS3-P18 ve P. mendocina DS0601-FX-P22 suşların krom indirgeme deneyleri için gerekli optimum şartlar belirlenmiştir. Her iki bakterinin optimal gelişme sıcaklıkları 37 ºC olup tüm krom indirgeme deneyleri Triptik Soy Broth (TSB)'ta yapılmıştır. Bakterilerin en iyi indirgeme yaptıkları pH dereceleri ise P. mendocina PASS3-P18 bakterisi için pH=7 ve P. mendocina DS0601-FX-P22 bakterisi için pH=6'dır.Farklı metal ve ağır metallerin indirgemeye olan etkisini belirlemek için Mn+2, Cu+2, Fe+2, Ba+2, Al+2, Ni+2, Co+2, Zn+2, Cd+2, Pb+2`nın saf suda çözünebilen konsatrasyonları (Cu+2, Mn+2, Zn+2, Fe+2 52ppm, Ba+2, Al+2, Ni+2, Pb+2 için 100 ppm, Co+2 ve Cd+2 için 20 ppm) dikkate alınmıştır. Son hacim 100 ml olacak şekilde ilgili besi ortamlarına Cr(VI) ile birlikte ilave edilmişlerdir. Krom indirgeme deneyleri difenil karbazid metoduna göre yapılmıştır.Çalışmamız sonunda elde edilen verilere göre kullanılan ağır metallerden Cu+2 ve Fe+2'nin her iki bakteri için krom indirgemeyi teşvik ettiği ortaya çıkmıştır. Ayrıca P. mendocina DS0601-FX-P22 bakterisi ile yapılan 25 ve 15 ppm krom konsantrasyonundaki deneylerde diğer P. mendocina PASS3-P18 bakterisinden farklı olarak Co+2 ve Mn+2 ağır metallerinin krom indirgemesini teşvik ettiği bulunmuştur. Al+2'un, P. mendocina DS0601-FX-P22 bakterisinde 25 ppm krom konsantrasyonunda krom indirgeme üzerinde teşvik edici etkisi bulunurken, 15 ppm krom konsantrasyonunda ise kontrol ile aynı sürede krom indirgemeyi tamamladığı görülmüştür. Çalışmada kullanılan diğer ağır metallerin (Ba+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Pb+2) her iki bakteri için krom indirgeme üzerine olumsuz etkisi olduğu ortaya çıkmıştır. Bu durumu bu ağır metallerin bakteriler için esansiyal olmaması ve yapmış olduğu toksik etkinin bir sonucu olarak açıklayabiliriz.Pseudomonas mendocina PASS3-P18 için yapılan biyosorbsiyon deneylerinde bakterinin hücre yüzeyinde kromu tutmadığı görülmüştür. Bu sonuç, çalışmamızda kullanılan bakterinin kromu indirgediğine dair bir kanıt niteliğindedir.Çalışmamızda yapılan scanning elektron mikroskobu görüntülemesinde kromlu ve kromsuz ortamdaki hücreler karşılaştırıldığında kromlu ortamdaki hücrelerin dejenere olmuş yapıları ortaya çıkmaktadır.SDS-PAGE analizi sonucunda ise P. mendocina DS0601-FX-P22 bakterisinde 31 kDa civarında bir protein bandı, P. mendocina PASS3-P18 de iki ayrı protein bandının indüklendiği gözlenmiştir. Bu protein bantlarından biri yaklaşık olarak 29 kDa büyüklüğünde iken diğer bandın moleküler büyüklüğü yaklaşık olarak 52 kDa'dur.Anahtar kelimeler: Pseudomonas, krom indirgeme, ağır metal, biyoremediasyon

Abstract:
As a result of the16S rRNA sequence analysis of isolates used in the study, it was found out that there are 6 different types, out of totally 13 isolates. 3 of these were Enterobacter cancerogenus, another three are Pseudomonas mendocina, one was Exiuguobacterium aurantiacum, two were Pseudomonas stutzeri, another two were Enterobacter cloacae, and one was Streptomyces thermocarboxydus.The chrome resistance of bacteria was determined by Minimum Inhibition Concentration (MIC). For the purpose of including in the chrome reduction experiments, owing to the toxic effect of chrome and heavy metals on cells, P. Mendocina PASS3-P18 and P. Mendocina DS0601-FX-P22 having 110 ppm ve 25 ppm MIC value were selected. For the selected strains P. Mendocina PASS3-P18 and P. Mendocina DS0601-FX-P22, the optimum conditions necessary for chrome reduction experiments were determined. For both of the bacteria, the optimal evolution temperature was determined as 37 ºC and the chrome reduction experiments were conducted in Triptic Soy Broth (TSB). The best pH degree in which the bacteria indicated high reduction degree for P. Mendocina PASS3-P18 bacteria was 7 while it was 6 for P. Mendocina DS0601-FX-P22.In order to determine the effects of metals and heavy metals on the reduction, Mn+2, Cu+2, Fe+2, Ba+2, Al+2, Ni+2, Co+2, Zn+2, Cd+2, Pb+2? s concentrations that can be dissolved in distilled water, 52 ppm for Cu+2, Mn+2, Zn+2, Fe+2, 100 ppm for Ba+2, Al+2, Ni+2, Pb+2 and 20 ppm for Co+2 and Cd+2 were taken into consideration. Determining the final concentration as 100 ml, Cr(VI) was added to the related medium. Chrome reduction experiments were conducted regarding diphenylcarbazide method.According to the findings that were obtained at the end of the study, it was found that of the heavy materials used in the study, Cu+2 and Fe+2 has stimulated the chrome reduction. In addition, in the experiments with 25 and 15 ppm chrome concentrations which were conducted with the bacteria P. Mendocina DS0601-FX-P22, it is found that the heavy metals Co+2 and Mn+2 had stimulated chrome reduction, different from the other bacteria P. Mendocina PASS3-P18. It has been found that there was a stimulation effect of the bacteria Al+2 P. Mendocina DS0601-FX-P22 on the chrome reduction in the 25 ppm chrome concentration whereas in a medium of 15 ppm chrome concentration it was found that same chrome reduction interval as the control. On the other hand the other heavy metals in the study (Ba+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Pb+2) had negative effect on the chrome reduction of both bacteria. This is possible due to explain this situation as a result of the toxic effect of heavy materials or these heavy metals are not essentials for those bacteria.In the biosorption experiments conducted for P. Mendocina PASS3-P18 bacteria, it was seen that the bacteria did not keep chrome on the surface of cell. This result of the present study is evidence that the bacteria used in the study absolutely reduced chrome.Upon analyzing the scans of electron microscope, when we compare the mediums with and without chrome, we observed that the cells in the medium of chrome have degenerated formsAs a result of SDS-PAGE analysis, ıt was observed that one intensity of one protein band corrspanding to approximately 31 kDa in P. Mendocina DS0601-FX-P22 and two different protein bands in P. Mendocina PASS3-P18 were induced. One of these band was approximately 29 kDa, On the other hand other one was approximately 52 kDa.Keywords: Pseudomonas, Chromium reduction, heavy metal, bioremediation