Fare miyoblast hücre hattında (C2C12 hücre hattı) klf5 geni üzerinde hedefli insersiyon gerçekleştirilmesi
Generation of targeted insertion in the klf5 gene of mouse myoblasts (C2C12 cells)
Yazar: DUYGU AKÇAY
Danışman: PROF. DR. YUSUF ÇETİN KOCAEFE
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Fareler = Mice ; Genetik mühendisliği = Genetic engineering ; Genler = Genes ; Genom = Genome ; Hücre dizisi = Cell line ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Klf5, embryonik kök hücreler ve erişkin epitel dokuda yaygın ifadesi olan, doku ve hücre tipine göre farklı işlevler sergileyen çinko parmak yapısında bir transkripsiyon faktörüdür. KLF5, gelişim sürecinde, embriyonik kök hücrelerin kök hücre özelliklerinin sürdürülmesinde görev almaktadır. Ayrıca somatik hücrelerde farklılaşmanın kontrolü, mitoz, apoptoz, hücre göçü, enflamasyon, anjiyogenez ve farklılaşma gibi çok çeşitli temel hücresel işlevleri düzenlediği bilinmektedir. Daha önce yapılan çalışmalar Klf5 transkripsiyon faktörünün, iskelet kası kök hücrelerinin çoğalma ve farklılaşma süreçlerini doğrudan düzenlediğini göstermiştir. Bu çalışmaların devamında yürütülecek olan işlevsel genombilim çalışmaları için alınan ticari antikorların büyük kısmının özgüllüğünün sınırlı, afinitesinin düşük olduğu ve Klf5'in işlevselliğinin gerektirdiği "post-translasyonel" modifikasyonları tanımadığı anlaşılmıştır. Western blot, protein immünçöktürme, kromatin immünçöktürme gibi işlevsel protein çalışmalarında karşılaşılan soruna çözüm oluşturabilecek yaklaşımlardan biri de genom düzenleme araçları yardımı ile hücre genomunda yer alan ve Klf5 proteinini kodlayan genin N-terminaline karşılık gelen kısmına, proteinin tanınmasını kolaylaştıracak yeni bir epitop dizisi yerleştirilmesidir. Bu tezin amacı genom düzenleme araçları aracılığı ile KLF5 proteininin N-terminal kısmına yerleştirilen V5-epitop dizisini ifade eden  "engineered" bir fare miyoblast hücre hattı oluşturmaktır. V5 epitop dizisi yardımı ile KLF5 proteininin hücre içinde tanınması ve takibi sağlanarak yukarıda bahsedilen sorunlara alternatif bir çözüm oluşturulmuştur.Bu çalışma sonucunda elde edilen model hücre hattı ile işlevsel protein çalışmaları mümkün hale gelmiştir.

Abstract:
Klf5 is a zinc finger transcription factor that is expressed in early embryonic stem cells as well as adult somatic epithelial tissue. The function of Klf5 is diverging in a context dependent manner in cells and tissues. During development, Klf5 has a role in the maintenance of undifferentiated state in embryonic stem cells. Moreover, Klf5 is also acting on cellular processes such as cell migration, apoptosis, inflammation, angiogenesis and differentiation. Previous studies showed a novel role for Klf5 as a regulator of proliferation and differentiation in skeletal muscle stem cells. Detection of Klf5 at the protein level harbor technical obstacles. Commercially available antibodies exhibit low affinity, low specificity and fail to recognize post-translationally modified forms that is directly relevant to the function. Since these obstacles prevent further functional protein studies such as western blots, protein co-immunoprecipitation and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays, genome editing applications such as CRISPR/Cas9 system provide solution opportunities. This thesis is conceptuated to establish a stable cell line that express a V5-epitope tag within the N-terminal of Klf5 protein. Targetted insertion via CRISPR/Cas9 system is suggested to overcome the above mentioned obstacles. An N-terminal V5 epitope tag would not interfere with the Klf5 function and enable the use of an anti-V5 antibody in the established C2C12 mouse myoblast cells to identify endogeneous Klf5. This tool will aid in for the advancement of the current functional protein studies.