Rhodococcus equi vapa geninin rekombinasyonu, proteinin saflaştırılması ve aşı hazırlanması
Recombination of rhodococcus equi vapa gene, purification of protein and vaccine preparation
Yazar: GÖKÇENUR SANİOĞLU GÖLEN
Danışman: PROF. DR. OSMAN ERGANİŞ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ASLI SAKMANOĞLU
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Atlar = Horses ; Aşılar = Vaccines ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic ; Rhodococcus equi = Rhodococcus equi ; Taylar = Colts ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Rhodococcus equi (R. equi), yenidoğan taylarda ağır pyogranülomatoz pnömoniyle seyreden ve dünyada da yaygın olarak önemli kayıplara neden olan önemli bir patojendir. Etkenin bağırsak florasında bulunması, fekal-oral-solunum yollarından bulaşması ile taylarda başta solunum sistemi olmak üzere tüm iç organlarda ve eklemlerde piyojenik enfeksiyonlara sebep olmaktadır. Hücre içi üremesinden dolayı da antibiyotiklerle gerçekçi bir sağaltım yapılamamaktadır. R. equi'nin immunosupresif insanlarda zoonoz olduğu bilinmektedir. 
Taylarda R. equi' nin teşhisi mikrobiyolojik ve serolojik yapılmaktadır. Serolojik teşhis ise enfeksiyondan ziyade geçirilen veya devam eden enfeksiyonu tanımlamaktadır. Neonatal taylarda bağışıklık sistemi yeterince gelişmediğinden genellikle aşılama başarısızlıkla sonuçlanmaktadır. Patojenite için VapA' nın bulunması önemli bir kriter kabul edilmektedir. 
Bu çalışma, Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi (SÜVF) Mikrobiyoloji Anabilim Dalında daha önce yapılan çalışmalarda; bakterin+VapA' lı aşının bakterin aşıdan daha etkin olması dikkate alınarak planlandı. Çalışmada SÜVF kültür koleksiyonundaki R. equi suşu/suşları kullanıldı. CAMP testiyle en etkili hemolize neden olan suş belirlendi.
R. equi'nin VapA geni Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile amplifiye edildikten sonra pET SUMO ekspresyon vektörüne klonlanarak E. coli BL21 (DE3) hücresine aktarıldı. Vektöre aktarılan rekombinant VapA (rVapA) geninin doğrulanması, PZR ve dizi analizleri ile yapıldı. Doğal VapA'nın (dVapA) ile rVapA antijenleri IMS 3012 veya Petgel A adjuvantları ile formüle edilerek dört farklı aday aşı hazırlandı. Aşıların seropotens fare gruplarındaki antikor titreleri, dVapA ve rVapA antijenleriyle tasarlanan ELISA kitleri hazırlanıp, ölçülerek karşılaştırıldı. Aşıların koruyuculuğunu ve antijenik yapılarını karşılaştırmak için çelınç grubu farelere ikinci aşılamadan 10 gün sonra patojen R. equi intraperitonal yolla enjekte edildi. Aşılı ve aşısız gruplardaki fareler bir hafta arayla dekapitasyon uygulanarak iç organlarından geri izolasyon yapıldı. Sonuçlarının değerlendirilmesinde eşleştirilmiş T-testi istatistik analizi kullanıldı.
Dizi analizi sonuçlarına göre; çalışmada kullanılan R. equi' nin VapA geni ile NCBI Gen Bankasındaki referans R. equi'nin VapA geninin baz dizilimi ile %99.4 oranında uyumlu bulundu. ELISA sonuçlarına göre; i) aşı antijeninin test antijeni olarak kullanılması ile daha güvenilir sonuçlar elde edileceği, ii) dört farklı aşı grubuna ait ELISA değerlerinin ortalamalarının istatiksel olarak değerlendirildiğinde sonucun kontrol grubuna göre anlamlı olduğu, iii) PetgelA adjuvantı ile formüle edilen rVapA antijeninin immun sistemi nispeten daha güçlü uyardığı ve çelınç grubu fare iç organlarından geri izolasyonun daha az olduğu belirlendi

Abstract:
Rhodococcus equi (R. equi) is an important pathogen in neonatal foals with severe pyogranulomatous pneumonia and causes widespread loss in the world. The presence of the causative agent in the intestinal flora, transmission through the fecal -oral-respiratory tract, leads to pyogenic infections in all internal organs and joints, especially the respiratory system in foals. Because of the intracellular growth of R. equi, a realistic treatment with antibiotics is not possible. R. equi is known to be zoonosis for immunosuppressive humans.
The diagnosis of R. equi in the foals is microbiological and serological.The serological diagnosis refers to the infection that is passed or ongoing rather than the infection. The presence of VapA for pathogenicity is considered an important criterion.
This study was planned to produce a more effective VapA bacterial vaccine than the bacterial vaccine previously produced in Selcuk University Faculty of Veterinary Medicine, Microbiology Department. In this study, R. equi strains were obtained from Selcuk University Veterinary Faculty culture collection, and the most effective hemolysis strain was determined by the CAMP test.
The VapA gene of R. equi was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) and transferred to E. coli BL21 (DE3) cell by cloning it into the pET SUMO expression vector. The transformation of the recombinant VapA (rVapA) gene into vector was confirmed by PCR and sequence analysis. Four different candidate vaccines were prepared by formulating natural VapA (nVapA) with rVapA antigens IMS 3012 or Petgel A adjuvants. The antibody titers of vaccines in the seropotence mouse groups were measured and compared by preparing ELISA kits designed with nVapA and rVapA antigens. To compare the protective and antigenic structures of the vaccines, the challenging group of mice was injected intraperitoneally with the pathogenic R. equi 10 days after the second vaccination. The mice in the vaccinated and unvaccinated groups were decapitated after one week to isolate the microorganism again from the internal organs. A paired T-test statistical analysis was used to evaluate the results.
According to the results of sequence analysis; The VapA gene of R. equi which used in this study was 99.4% compatible with the base sequence of the VapA gene of reference R. equi in the NCBI Gene Bank. According to the results of ELISA; i) more reliable results can be obtained by using the vaccine antigen as a test antigen, ii) When the average of ELISA values of four different vaccine groups were evaluated statistically, the result was significant compared to the control group, iii) The rVapA antigen formulated with the PetgelA adjuvant was found to stimulate the immune system relatively strongly and less back-isolation from the internal organs of mice in challenging group.