Hindi (Meleagris gallopavo) karaciğer dokusundan tiyoredoksin redüktaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine inhibisyon etkilerinin incelenmesi
Purification and characterization of thioredoxin reductase enzyme from Turkey (Meleagris gallopavo) liver tissue and investigation of the inhibition effects of some metals on enzyme activity
Yazar: YUSUF TEMEL
Danışman: PROF. DR. ÖMER İRFAN KÜFREVİOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada hindi karaciğer dokularından mitokondriyal tiyoredoksin redüktaz (TrxR) enzimi 3,07 EU x mg-1 spesifik aktiviteyle ve %2,05 verimle gradientli santrifügasyon ile homojenizasyon ve 2',5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Hindi karaciğer dokularından saflaştırılan TrxR enzimi için saflaştırma kat sayısı 990 olarak bulundu. Enzimin saflığını kontrol etmek ve alt birim molekül kütlelerini tespit etme kamacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve tek bant gözlendi. Alt birim molekül kütlesi yaklaşık 45,5 kDa olarak belirlendi. Karaciğer dokularından saflaştırılan enzimin doğal halinin molekül kütlesi Sephadex-G 150 jel filtrasyon kolonu kullanılarak 88kDa olarak belirlendi. Enzim için optimum iyonik şiddet 600 mM potasyum fosfat tamponu olarak belirlendi. Optimum pH potasyum fosfat tamponu pH 7,5 ve stabil pH potasyum fosfat tamponu pH 7,2 olarak hesaplandı. TrxR için, optimum sıcaklık 50°C olarak hesaplandı. Aktivasyon enerjisi (Ea),  aktivasyon entalpisi (ΔH) ve Q10 değerleri Arrhenius grafiğinden elde edildi. Saf enzimin KM ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk grafiklerinden hesaplandı. kcat değerleri sırasıyla, DTNB için 87,8s-1, NADPH için 109,75 s-1olarak bulundu. Daha sonra hindi karaciğeri TrxR enziminin aktivitesi üzerine bazı ağır metallerin (Cu+2, Cd+2, Ag+, Zn+2, Fe+3 ve Pb+2) inhibitör etkileri DTNB metodu kullanılarak in vitro şartlarda incelendi. Karaciğer dokusu TrxR enziminin aktivitesinin %50'sinin inhibe edildiği ağır metal konsantrasyonları bulundu. Son olarak, bu maddeler için Ki değerleri Lineweaver-Burk grafiklerinden hesaplandı.

Abstract:
In this study,mitochondrial thioredoxin reductase enzyme was purified from turkey (Meleagris gallopavo) liver,with a specificactivity of 3.07 EU x mg-1 and a yield of 2,05%  using with gradiation santrifügation homojenization and2',5'-ADP Sepharose 4B affinity column chromatography, respectively. The overall purifications from turkey liver TrxR enzyme,  was approximately 990-fold respectively. To check the purity and determine subunit and molecular weights of enzyme, SDS-polyacrylamide gel electrophores is was performed and showed a single band and molecular weight of approximately 45.5kDa. The molecular weight of native enzyme purity of liver TrxR enzyme was estimated to be approximately 88 kDa bySephadex-G 150 gel filtration chromatography. Optimum ionic strengths for enzyme was obtain as 600 mM potassium phosphatebuffer. Optimum pH was determined in potassium phosphate pH 7.5 and stable pH was determined in potassium phosphate pH 7.2 buffers. For TrxR optimum tempereture was determined as 50°C. Activation energy (Ea ), activationenthalpy (ΔH ) and Q10 values were from Arrhenius plot obtained. An apparent KM and Vmax for DTNB of the purified enzyme were calculated from Lineweaver-Burk graphs. kcat values of the DTNB and NADPH were found as 87,8 s-1 and 109,75 s-1, respectively. Then the inhibitory effects of different heavy metals (Cu+2, Cd+2, Ag+, Zn+2, Fe+3 and Pb+2) on TrxR activities was investigated using the DTNB method under in vitro conditions.The heavy metal concentrations, inhibitedin vitro 50% of tissue TrxR enzyme activity, were obtained. Finally, Ki values for these ions were also calculated from Lineweawer-Burk graphs.