Fitazın izolasyonu, karakterizasyonu ve nanofibere immobilizasyonu
Isolation of the phytase, its characterization and immobilization into nanofiber
Yazar: ÜMRAN DURU KAMACI
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL PEKSEL
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Börülce = Cowpeas ; Fitaz = Phytase ; Kitosan = Chitosan ; Nanobiyoteknoloji = Nanobiotechnology ; Nanolif = Nanofiber ; Polivinil alkol = Polyvinyl alcohol ; Sodyum aljinat = Sodyum alginate ; İmmobilize enzimler = Immobilized enzyme

Özet:
Bu çalışma kapsamında fitazın kararlılığını arttırmak amacıyla farklı destek malzemelerine immobilizasyonu gerçekleştirildi. Bunun için öncelikle uygun fitaz kaynağının belirlemek amacıyla farklı tahıl, kuruyemiş ve baklagil çeşitlerindeki fitaz miktarları araştırıldı. Elde edilen sonuçlara göre en fazla enzim miktarına sahip bitkisel fitaz kaynağının börülce olduğu belirlendi ve fitaz izolasyonu için börülce bitkisi kullanıldı. Bitkiden izole edilen fitazın, daha sonra elektro-eğirme (electrospinning) yöntemi kullanılarak üretilen polivinil alkol (PVA), polivinil alkol-kitosan (PVA-CS) ve polivinil alkol-sodyum aljinat (PVA-SA) nanofiberlerine immobilizasyonu gerçekleştirildi.   
Hazırlanan nanofiberlerin karakterizasyonu için Fourier Dönüşümlü-Infrared Spektroskopisi (FT-IR), Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), X-Işını Kırınımı (XRD), Termogravimetrik Analiz (TGA) ve Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) teknikleri kullanıldı. Ayrıca, hazırlanan fiberlerin optimizasyonu; akış hızı ve enzim miktarı gibi elektrospinning parametreleri kullanılarak gerçekleştirildi. Elde edilen sonuçları karşılaştırabilmek amacıyla nanofiberlerin üretimi enzim içerecek ve içermeyecek şekilde gerçekleştirildi. Elde edilen boyut dağılımı sonuçlarına göre nanofiberlerin yarıçapı enzim ilavesi sonrasında artmıştır. 
Fitazın karakterizasyonu için serbest ve immobilize enzimin katalitik aktivitesi üzerine pH, sıcaklık, metal iyonu, asit, baz, organik bileşen, organik çözücü ve deterjan etkisi incelenerek gerçekleştirildi. Ayrıca, serbest ve nanofiberlere immobilize edilen fitazın termal kararlılığı incelendi ve kinetik sabitleri (Km ve Vmax) hesaplandı. Nanofiberlere (PVA (pH 5,0, T= 65oC), PVA-CS (pH 6,0, T= 65oC) ve PVA-SA (pH 6,0, T= 55oC)) immobilize edilen fitazın optimum pH ve sıcaklık değerleri serbest enzim (pH 5,0, T= 45oC) ile kıyaslandığında immobilizasyon sonrasında artmıştır. Serbest enzim, PVA, PVA-CS ve PVA-SA nanofiberlerine immobilize edilen enzimin Km değeri sırasıyla 0,46, 1,17, 13,43 ve 4,66 mM olarak belirlenirken Vmax değerleri ise sırasıyla 53,6, 5,67, 31,25 ve 18,38 U/mg protein olarak hesaplandı. Elde edilen sonuçlara göre nanofibere immobilize edilen enzim daha fazla kararlılık göstermektedir ve bu özelliklerinden dolayı immobilize enzim hayvan yemi, tarım, ilaç ve gıda endüstrisi gibi farklı alanlarda kullanılabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Within the scope of this study, immobilization of phytase on different support materials was carried out to increase its stability. For this purpose, firstly, phytase amounts in different cereals, nuts, and legumes were investigated in order to determine the appropriate phytase source. According to the obtained results, it was determined that the vegetable phytase source with the highest amount of phytase was cowpea seeds, and cowpea seeds were used for phytase isolation. Then, the obtained phytase was immobilized into nanofibers obtained by using polyvinyl alcohol (PVA), polyvinyl alcohol-chitosan (PVA-CS), and polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) via the electrospinning method.
Fourier Transform-Infrared Spectroscopy (FT-IR), Scanning Electron Microscopy (SEM), X-Ray Diffraction (XRD), thermogravimetric analysis (TGA), and Differential Scanning Calorimetry (DSC) techniques were used for the characterization of the fabricated nanofibers. In addition, the optimization of the fabricated nanofibers was performed using electrospinning parameters such as flow rate and enzyme amount. The prepared nanofibers were produced with/without enzymes in order to compare the obtained results. According to the obtained size distribution results, the radius of the nanofibers increased after the enzyme addition.
The characterization of phytase was carried out by examining the effects of pH, temperature, metal ions, acid, base, organic component, organic solvent, and detergent on the catalytic activity of the free and immobilized enzyme. In addition, the thermal stability of free and immobilized phytase into nanofibers was investigated and their kinetic constants (Km and Vmax) were calculated. The optimum pH and temperature values of immobilized enzyme into the PVA (pH 5, T= 65 oC), PVA-CS (pH 6, T= 65 oC) and PVA-SA (pH 6, T= 55 oC) nanofibers were increased after immobilization compared to the free enzyme (pH 5, T= 45 oC). The Km value of the free enzyme, and immobilized enzymes into the PVA, PVA-CS, and PVA-SA nanofibers was determined as 0.46, 1.17, 13.43, and 4.66 mM, respectively, while Vmax values were also calculated as 53.6, 5.67, 31.25, and 18.38 U/mg protein, respectively. These results revealed that the immobilized enzymes into the nanofibers were exhibited more stable performance and it was thought that the immobilized enzyme could be used in different fields such as animal feed, agriculture, medicine, and food industry due to these properties.