HEK293 hücre hattında aşırı ifade ettirilen FOXO3 geninin etkilerinin incelenmesi
Examination of the effects of overexpressed FOXO3 gene in hek293 cell line
Yazar: BURAK KARABEY
Danışman: PROF. DR. HAKKI OGÜN SERCAN ; PROF. DR. GÜL HÜRAY İŞLEKEL
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Apoptozis = Apoptosis ; Elektroforez-agar jel = Electrophoresis-agar gel ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Hücre dizisi = Cell line ; Poli (ADP-riboz) polimerazlar = Poly (ADP-ribose) polymerases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Amaç: FOXO proteinleri hücre homeostazı, oksidatif stres yanıtı ve apoptoz gibi fonksiyonların regülasyonunda görev yapan önemli transkripsiyon faktörleridir. Ayrıca FOXO proteinleri tümör baskılayıcılar olarak tanımlanmalarına rağmen, FOXO genlerinin yaptığı translokasyonların kanser oluşumunu desteklediği de gösterilmiştir. FOXO3 geninin MLL geni ile yaptığı translokasyon, ikincil akut lösemi ile ilişkilendirilmiştir. FOXO proteinlerinin kanser oluşumunda rol alması ve belirli hücre tiplerinde FOXO3'ün apoptoz sürecini başlatması nedeniyle bu genin HEK293 hücre hattında yapay olarak aşırı ifade ettirildiğinde, apoptoz mekanizması üzerine etkisi incelenecektir.
 
Yöntem: Çalışmada FOXO3 geni mRNA kodlayıcı dizileri, yüksek gen ifadesi sağlayan aktif promotör barındıran pcDNA3.1 ekspresyon vektörüne PCR klonlama stratejileri kullanılarak takılmıştır. Elde edilen FOXO3/pcDNA3.1 vektörü ile HEK293 hücreleri geçici transfekte edilmiştir. Transfekte hücrelerden protein izolasyonu yapılarak western blot yöntemiyle FOXO3, beta-aktin ve PARP proteinlerine bakılmıştır.

Bulgular: HEK293 hücre hattı ile gerçekleştirilen geçici transfeksiyon sonrasında, oluşturduğumuz pcDNA3.1/FOXO3 vektörü barındıran hücre hattının, kontrol hücre hattına göre 1.5 katlık bir FOXO3 ifade artışı gösterdiğini saptadık. Aynı transfeksiyon sonrasında hücre kültürüne herhangi bir apoptotik uyarı vermeden, kendiliğinden bir apoptotik uyarısı oluşturup oluşturmadığını test ettiğimizde ise FOXO3 ile transfekte hücrelerde apoptotik uyarının kontrol hücre hattına göre gerçekleştiğini PARP analizi ile saptadık.

Sonuç: Gerçekleştirdiğimiz deneyler sonrasında FOXO3 geninin vektör yardımı ile aşırı ifade ettirilmesinin hücrede apoptozu uyardığını gösterdik.

Abstract:
Objective: FOXO proteins are important transcription factors involved in the regulation of functions such as cell homeostasis, oxidative stress response and apoptosis. Also, FOXO proteins have been identified as tumor suppressors and translocations of FOXO genes have been linked to carcinogenesis. The translocation of FOXO3 gene with MLL gene has been associated with secondary acute leukemia. FOXO proteins are involved in carcinogenesis and FOXO3 initiates apoptosis in certain cell types. Hence apoptosis process will be examined by overexpression of FOXO3 gene in HEK293 cell line.

Method: In this study, FOXO3 gene were inserted into the expression vector pcDNA3.1 with using PCR cloning strategies. mRNA coding sequences of pcDNA3.1 vector contains active promoter providing high gene expression. HEK293 cells were transiently transfected with the FOXO3 / pcDNA3.1 vector. The protein isolates obtained from the transfected cells therefore analyzed for FOXO3, beta-actin and PARP proteins by western blotting.

Results: Hek293 cell line transfected with pcDNA3.1 / FOXO3 vector. We showed 1.5-fold increase in FOXO3 expression in transfected cells against to the control cells. When we exaimed spontaneous apoptosis without giving any apoptotic stimulation to the cell culture after the same transfection, we found apoptotic stimulation occurs in FOXO3 transfected cells by PARP analysis.
 
Conclusion: Our experiments showed that overexpression of FOXO3 gene induces apoptosis in the cell.