Kültür deniz balıklarında stafilokok enfeksiyonlarının çeşitli diyagnostik metotlarla tespiti üzerine bir çalışma
A study on the detection of staphylococcal infections 
in cultured marine fish using various diagnostic 
methods
Yazar: ÖZGÜR ÇANAK
Danışman: PROF. DR. GÜLŞEN TİMUR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı / Hastalıklar Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: Balık hastalıkları = Fish disease ; Histopatoloji = Histopathology

Özet:
Bu doktora tez çalışmasının amacı, yurdumuzun Ege ve Karadeniz bölgelerinde yetiştiriciliği yapılan deniz balıklarında hastalık oluşturup ölümlere ve ekonomik kayıplara neden olan stafilokok türü bakterilerin izolasyonu; fenotipik ve morfolojik özellikllerinin konvansiyonel bakteriyolojik metotlarla tespiti; SDS-PAGE (Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ve çeşitli PCR (Polymerase Chain Reaction) yöntemleriyle konfirmasyonu ve tür içi karakterizasyonunun yapılmasıdır. Ayrıca patojenite testi ile sahadan en sık olarak izole edilen Staphylococcus capitis subsp. capitis izolatı ile balıklarda patojen olduğu bilinen S. epidermidis izolatının saf olarak enjekte edildiği kültür levrek (Dicentrarchus labrax) balıklarında patojenik özelliğinin belirlenmesi ve gerek saha örneklemelerinde incelenen karma olarak enfekte hasta balıkların histopatolojik bulgularıyla, gerekse de deneysel olarak sadece stafilokoklarla enfekte edilen levrek balıklarının dokularına ait histopatolojik bulguların karşılaştırılması da amaçlanmıştır.
Bu amaçla Ekim 2013-Ağustos 2014 ayları arasında İzmir, Aydın, Muğla, Samsun, Ordu ve Trabzon illerinde bulunan 13 farklı işletmenin açık deniz kafesi, deniz kafesi, toprak havuz ve kuluçkahane üniteleri ziyaret edilerek buralarda kültürü yapılan, ağırlıkları 10 g – 2, 5 kg arasında değişen toplamda 63 adet çipura (Sparus aurata), levrek (D. labrax), granyöz (Argyrosomus regius), sivriburun karagöz (Diplodus puntazzo), sinarit (Dentex dentex), gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) ve Karadeniz alabalığı (Salmo labrax) örnekleri incelenmiştir. Bu balıklarda genel olarak renkte koyulaşma ve pul kaybı, yüzgeç diplerinde hemorajiler ve vücut yüzeyinde hemorajik ülserler ile gözlerde hemorajiler ve opaklaşma, karaciğerde anemi, viseral organlarda hemorajiler ve dalakta büyüme gibi klinik bulgular gözlemlenmiştir.
Çalışmada ziyaret edilen 7 işletmedeki hasta çipura, levrek ve sivriburun karagöz balığı örneklerinin iç organlarından yapılan bakteriyolojik ekimler sonucunda, Gram-pozitif bakteriler yanı sıra 6 işletmede Vibrio, 1 işletmede ise hareketli Aeromonas türü ile karma bakteriyel enfeksiyonlar tespit edilmiştir. Gram-pozitif karakterde ve kok şekilli hücrelere sahip olan, sitokrom oksidaz negatif, katalaz pozitif ve fakültatif anaerop özellikteki 12 izolattan 4'ü S. capitis subsp. capitis, 3'ü S. epidermidis, 2'si S. lentus ve diğerleri de S. aureus, S. hominis subsp. hominis ve S. sciuri subsp. sciuri olarak identifiye edilmiştir. Staphylococcus genusuna özgü tuf geninin çoğaltılmasını amaçlayan PCR analizi ile çalışmada izole ve identifiye edilen izolatların, genusa özgü 370 bp'lik tek bant oluşturmaları ile genus düzeyinde identifikasyon konfirme edilmiştir.
Saha çalışmalarında tespit edilen bu karma stafilokok enfeksiyonlarının, hasta balıklarda
histopatolojik olarak genellikle, karaciğer ve böbrek gibi dokularda liquefactive nekroz odakları, nekroz, hemoraji ve hiperemiler, böbrekte peritübüler ve periglomerular ödem, gözlerde hemorajiler, dalak ve böbrekte hemosiderin birikmesi ve melanomakrofaj odakları ve solungaç filamentlerinde hiperplazi gibi histopatolojik bozukluklara neden olduğu gözlemlenmiştir. Doku Gram boyama yöntemleriyle de kalp ve karaciğer gibi dokularda nekrotik doku hücreleri ve eritrositlerin etrafında Gram-pozitif kok şekilli hücrelerin varlığı tespit edilmiştir. S. capitis subs. capitis ile gerçekleştirilen patojenite çalışmasında ise enjeksiyondan sonraki 4. günde ölümler görülmeye başlamış olup deneme boyunca 20. güne kadar bu ölümler devam etmiştir. Enjeksiyondan sonraki 3. günden itibaren renkte koyulaşma, yüzgeç diplerinde hemorajiler ve vücut yüzeyinde ülserler yanı sıra karaciğerde anemi ve karın boşluğunda hemorajik sıvı birikimi gibi bulgulara neden olduğu görülmüştür. Ayrıca bu balıklarda da doğal enfeksiyonlardaki histopatolojik bulgular gözlemlenmiş
olup doku Gram boyama metoduyla da bakterilerin doku içlerine nekrotik hücrelerin arasına yerleşimleri tespit edilmiştir. SDS-PAGE analizi ile çalışmada izole edilen Staphylococcus türlerinin protein profilleri belirlenmiş olup, hasta balıkların iç organlarından izole edilen S. epidermidis ve S. aureus izolatlarının, bu türlerin yüzeylere tutunma ve biyofilm oluşturma özelliğini sağlayan 140 kDa'lık protein yanı sıra transferrin hücreleri için reseptör görevi gören 42 kDa'lık proteinlerinin varlığı tespit edilmiş ve bu sayede patojenik özellikte oldukları konfirme
edilmiştir. Sonuç olarak bu doktora tez çalışması ile ilk defa ülkemiz kültür deniz balığı türlerinde hastalıklara neden olan stafilokok türlerinin tespiti ile ilgili detaylı bir tarama çalışması yürütülmüştür. Hasta kültür balıklarının iç organlarından izole edilen stafilokok bakterilerin konvansiyonel bakteriyolojik metotlar ve API-Staph hızlı tanı kiti ile identifikasyonu yapılmış ve bazı türler ülkemizdeki kültür deniz balıklarında ilk defa tespit edilmiştir. Deneysel enfeksiyon çalışması ile, çalışmada hasta kültür deniz balıklarının iç organlarından izole edilen S. capitis subsp. capitis'in levrek balıklarındaki patojenitesi kanıtlanarak çeşitli histopatolojik boyama metotlarıyla da hastalığın gelişim aşamaları gösterilmiştir. SDS-PAGE yöntemi ile bu bakterilerin bazı patojenik karakterlere sahip oldukları belirlenmiştir.

Abstract:
The aim of this PhD thesis study is the determination of the isolation of staphylococci
which causes diseases, mortalities and economic losses in marine fishes cultured in the
Aegean and Black Sea regions of Turkey; determination of their phenotypic and
morphologic characteristics by using conventional bacteriologic methods; identification
and intraspecies characterization of them by using SDS-PAGE and various PCR methods.
Also, determination of the pathogenicity of the most frequently recovered field isolate
Staphylococcus capitis subsp. capitis and S. epidermidis which was previously known as
a fish pathogen with the pathogenicity test and besides making a comparison of the
histopathologic findings observed in naturally and experimentally infected sea bass
tissues by using histopathologic methods was aimed. In addition, marine cage, off-shore marine cage, inland pool and hatchery units of 13 different fish farms located in İzmir, Aydın, Muğla, Samsun, Ordu and Trabzon was visited between October 2013 and August 2014. A total of 63 fish samples of gilthead sea bream, European sea bass, meagre, sharpsnout sea bream, dentex, rainbow trout and
Blacksea trout weighing between 10 g and 2,5 kg were sampled. Generally various clinical symptoms such as darkening of the skin, loss of scales, haemorrhages at the fin bases, hemorrhagic ulcers on the skin, hemoorhages and opacification in the eyes, anemia in the liver, hemorrhages on the visceral organs and splenomegaly was observed in the diseased fish samples. After the inoculations made from the visceral organs of moribund gilthead sea bream, sea bass and sharpsnout sea bream samples obtained from 7 fish farms, mixed infections with Vibrio spp. in 6 farms and a motile Aeromonas sp. in 1 farm besides the Gram-positive bacteria were detected. Of the 12 Gram-positive bacteria with cocci shaped cells that are cytochrome oxidase negative, catalase positive and facultative anaerobic isolates, 4 isoaltes were identified as S. capitis subsp. capitis, 3 isolates were identified as S. epidermidis, 2 isolates were identified as S. lentus and others were identified as S. aureus, S. hominis subsp. hominis and S. sciuri subsp. sciuri. All isolates were confirmed by the use of Staphylococcus genus-specific tuf based PCR. All isolates generated a single band of 370 bp and hence the identification at the genus level was confirmed. In the field study, it was determined that mixed staphylococcal infections with other bacteria generally causes some histopathologic changes such as liquefactive necrosis, hemorrhages and hyperemia in hearth, liver and kidney, peritubular and periglomerular edema in kidney, hemorrhages in the eye, hemosiderin and melanomacrophage accumulation in the spleen and kidney and hyperplasia in the gill filaments. The presence of Gram-positive cocci shaped cells around the necrotic tissue cells and erythrocytes in
the hearth and liver tissues were also observed with tissue Gram staining methods. In the pathogenicity test that was carried out with S. capitis subsp. capitis, mortalities were observed after the 4th day of injection and it continued untill the 20th day during the whole challenge study. The general clinical symptoms of the disease such as darkening of the skin, fin base haemorrhages and skin ulcers and besides anemia in the liver and accumulation of a bloody fluid in the peritoneal cavity was observed after the 3rd day of injection in the pathogenicity test. Histopathological changes that were observed in the naturally infected fish were also observed in the experimentally infected fish samples too and the colonization of these bacteria was detected in the tissues around the necrotic cells. The protein profiles of the Staphylococcus species that were recovered in the study was determined with SDS-PAGE analyses. The presence of a 140 kDa protein was detected in S. epidermidis and S. aureus recovered from naturally infected samples, which enables
these bacteria to attach surfaces and provide the ability to form a biofilm on surfaces. Also the presence of a 42 kDa protein was detected in these species which acts as a receptor for transferrins and hence the pathogenic status of these isolates was confirmed. In conclusion, a detailed monitoring study on the staphylococci which causes diseases in the cultured marine fishes in Turkey was conducted for the first time. Staphylococci recovered from the visceral organs of moribund fish samples were identified by using conventional bacteriologic methods and some species were recovered from the marine fishes cultured in Turkey for the first time. The pathogenicty of S. capitis subsp. capitis recovered from the visceral organs of cultured marine fishes was confirmed in European
sea bass with the challenge study and the development stages of the disease was demonstrated with various histopathologic staining methods. By using SDS-PAGE method, it was determined that these bacteria have some pathogenic characteristics.