Kolelitiazisli hastaların safra kesesi dokusu, safra sıvısı ve safra taşlarında Helicobacter pylori ve diğer mikroorganizmaların varlığının araştırılması
Evaluation of the presence of Helicobacter pylori and other microorganisms in gallbladder tissue, bile and gallstones with cholelithiasis
Yazar: EBRU BOSTANOĞLU
Danışman: PROF.DR. MEHMET KIYAN
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2005
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
ÖZET Kolelitiazisli Hastalann Safra Kesesi Dokusu, Safra Sıvısı ve Safra Taşlarında Helicobacter pylori ve Diğer Mikroorganizmaların Varlığının Araştırılması Akut ve kronik iltihabi safra kesesi hastalıklarının en önemli nedeni, safra taşlarıdır. Ülkemizde gerçek insidans bilinmemekle beraber genel cerrahi kliniklerinde en çok yapılan ameliyat türlerinden biri safra taşlan ve meydana getirdikleri komplikasyonlarla ilgili ameliyatlardır. İltihabi safra kesesi hastalıklarının etyolojisinde bakteriler önemli bir yere sahiptir. Gram negatif enterik bakteriler, özellikle Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp., Proteus spp. izole edilmektedir. Streptococcus faecalis, Beta hemolitik streptokoklar, Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus gibi gram pozitif koklarda da kolesistit etkeni olarak karşımıza çıkabilmektedir. Anaerop bakteriler genellikle polimikrobiyal infeksiyonlann bir parçası olarak ortaya çıkmakta ve sıklıkla diğer anaeroplar ve gram negatif basiller ile birlikte bulunmaktadırlar (Bacteroides, Clostridia, Fusobacterium spp). Gram negatif, mikroaerofilik, hareketli bir bakteri olan Helicobacter pylori (H. pylori); duodenum ve mide kanseri, gastrik adenokarsinoma ve midenin non-hodgkin lenfoması gibi üst gastrointestinal sistemde çeşitli hastalıkların etyopatogenezinde rol oynamaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda safra kesesi taşı bulunan hastalann safra kesesi epitelinde, safra sıvısında ve safra taşlarında çeşitli Helicobacter türleri ile safraya dirençli Helicobacter pylori varlığı, bakterinin hepatobiliyer sistem hastalıklannda rolünün olbileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmada, safra kesesinde taş bulunan hastalann safra kese dokusu, safra sıvısı ve safra taşlarında H. pylori ve diğer mikroorganizmalann varlığının araştınlması amaçlanmış, bu bakterilerin safra kesesi dokusunda epitelyal hücre proliferasyonu üzerine etkisinin ortaya konması hedeflenmiştir. Bu çalışma, Türkiye Yüksek İhtisas Hastanesi'ne başvuran, yaşlan 22 ile 76 arasında değişen 14'ü erkek, 37'si kadm olmak üzere toplam 51 hasta üzerinde yürütülmüştür. Çalışmaya dahil edilen hastalann 47 'sinde kronik taşlı kolesistit bulunmaktadır. Kontrol grubundaki 3 olguda periampuller bölge tümörü, bir olguda safra kesesi polibi bulunmaktadır. Klinik örnekler (kese, sıvı, taş) steril şartlarda alındıktan sonra parazit ve kist açısından makroskobik incelemeleri yapılmıştır. Kültür ile ilgili işlemler tamamlandıktan sonra direkt preparatlan hazırlanarak epitel hücresi, bakteri, parazit ve mantar varlığı ışık mikroskobunda değerlendirilmiştir. Örneklerin anaerop kültürleri Vitamin Kİ ve Hemin ile zenginleştirilmiş %5 koyun kanlı Brucella Agar, Brain Heart Infusion Broth ve Thiogllycolate sıvı besiyerlerine yapılmıştır. Brucella Agar, içerisinde Anaerob gas pack bulunan kavanoza konarak, diğer besiyeleri ile birlikte 37 °C de 48 saat inkübe edilmiştir. Örneklerin aerop kültürleri için %5 koyun kanlı agar, Mac Conkey Agar, Brain Heart Infusion Broth' a ekimleri yapılmış ve 37 °C'de 24-48 saat inkübe edilmiştir. Mantar incelemesi için örnekler Sabauroud 57Dextroz Ağara ekilerek 7 gün 37 °C'de inkübe edilmiştir. Klinik örneklerde H. pylori varlığının araştırılması için örnekler Helicobacter selektif besiyerine ekilerek içerisinde karbon dioksit ve nem bulunan kavanoza kaldırılarak 3-7 gün 37 °C'de inkübe edilmiştir. Örneklerin aerop ekimlerinde üreyen bakteriler API sistemi kullanılarak tanımlanmış ve antibiyogramlan yapılmıştır. Klinik örneklerde H. pylori DNA varlığının değerlendirilmesi, bakterinin ureA gen bölgesini hedef alan primerler kullanılarak Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Safra kesesi epitelinde H. pylori varlığı patolojik kesitlerin Hematoksilen-Eozin ve Giemsa boyaması ile değerlendirilmiştir. Bakterinin epitelyal hücre proliferasyonu üzerine olan etkisi Ki-67 antikoru ile immünhistokimyasal olarak tammlanmıştır. İstatistiksel analiz, Mann-Whitney U testi ile değerlendirilmiştir. Klinik örneklerden yapılan kültürlerde 47 hastanın 10'unda (%21.2) üreme tespit edilmiştir, üreyen mikroorganizmalar sırasıyla E.coli (%10.6), Enterobacter amnigenus (%6.3), Klebsiella plantolica (%2.1), Klebsiella ozonea (%2.1) olarak tespit edilmiştir. Anaerop bakteri ve mantar üremesi tespit edilmemiştir. H. pylori açısından yapılan incelemelerde seçici H.pylori besiyerinde H. pylori izole edilmemiş, PZR' da bakteri DNA' sı saptanmamıştır. Histolojik kesitlerin incelenmesinde H. pylori ile uyumlu olabilecek mikroorganizmaya rastlanmamıştır. Çalışmanın başlangıcında H. pylorfmn epitelyal hücre proliferasyonu üzerine olan etkisinin araştırılması hedeflenmiştir. Ancak klinik örneklerde H. pylori üremediği ve PZR' da H. pylori DNA' sı saptanmadığı için H. pylorfmn epitelyal hücre proliferasyonu üzerine olan etkisi araştınlamamıştır. Klinik örneklerde diğer mikroorganizmaların üremesi ile epitelyal hücre proliferasyonu arasında ilişki olup olmadığı araştırılmış ve bakteri üremesi ile epitelyal hücre proliferasyonu arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark olmadığı (p > 0.05) sonucuna varılmıştır. Daha önceden yapılmış olan bazı çalışmalarda H. pylori ile hepatobiliyer sistem hastalıkları arasında ilişki tespit edildiği halde bizim çalışmamızın sonuçlan böyle bir ilişkiyi desteklememektedir. Toplumlar arası genetik farklar ve coğrafi farklılıklar, bu hastalıkların gelişiminde önemli rol oynayabilir. Böyle bir ilişkinin varlığım tam olarak ortaya koyabilmek için konu ile ilgili daha ileri çalışmaların yapılması gerekmektedir. Anahtar Sözcükler: H. pylori, Ki-67, Kolesistit, PZR, Safra bakteriyolojisi 58

Abstract:
SUMMARY Evaluation of the Presence of Helicobacter pylori and Other Microorganisms in Gallbladder Tissue, Bile and Gallstones with Cholelithiasis Gallstones are the most important cause of acute and chronic inflammatory gallbladder diseases. The incidence of gallstones is not certainly known, but operations deu to gallstones and related complications is not rare. Bacteria are important in the etiolgy of inflammatory gallbladder diseases. Gram negative enteric bacilli, especially Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp., Proteus spp. and gram pozitive bacteria such as Streptococcus faecalis, Beta hemolytic streptococcus, Streptococcus viridans and Staphylococcus aureus can be the cause of cholecystitis. Anaerobes (Bacteroides, Closridia, Fusobacterium spp) also take part in polymicrobial infections along with other anaerobes or gram negative bacilles. Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram negative, microaerofilic and motile bacteria. It is known to be associated with dudenal and gastric cancer, gastric adenocarcinoma and gastric non-hodgkin lymphoma. In recent years, Helicobacter genus and bile resistant H pylori are reported to be found in gallbladder epithelium, bile and stones of patients with cholelithiasis, suggesting that it may influence gallstone formation. The pathogenesis of biliary tract cancer remains unclear, although it is known that gallstones are an important risk factor. Since H. pylori can be found in bile and gallstones, it may also take role in the development of biliary tract cancers. Affinity to gastric epithelium and development of gastric cancer shed light about the effect of bacteria on hepatobiliary epithelium proliferation. The aim of this study was to evaluate the presence of H pylori and other microorganisms in gallbladder tissue, bile and gallstones of patients with cholelithiasis and to determine the association between bacteria and epithelial cell proliferation. The study was carried out on patients who were referred to Ankara Türkiye Yüksek ihtisas Education and Investigation Hospital for cholecystectomy. A total of 51 subjects (14 male, 37 female) were enrolled to this study, 47 of them were in the patient group and had chronic calculous cholecystitis. The control group consisted of 3 patients with periampullary carcinoma and one with gallbladder polip. The samples (gallbladder tissue, bile and stone) were taken under sterile conditions. Following macroscopic and microscopic examination, the samples were inoculated onto plates containing Brucella Agar with %5 sheep blood (vitaminKl+Hemin), Brain Heart Infusion Broth, Thiogllycolate Broth and were put into anaerobic jar. At the same time, the samples were also inoculated onto plates containing %5 sheep blood agar, Mac Conkey Agar, Brain Heart Infusion Broth for aerobic culture and Sabauroud 59Dextrose Agar for yeast isolation. Meanwhile samples were inoculated on Helicobacter pylori Selective Medium for H. pylori recovery and put into a humid jar containing carbon dioxide. The plates used for isolation of anaerobic bacteria were incubated at 37°C for seven days, and evaluated after every 48 hours. The plates used for aerobic bacteria were incubated at 37°C for 24-48 hours under aerobic conditions. The plates for H. pylori were incubated at 37°C for 7 days, and checked after 72 hours. The identification and antibiotic susceptibility test of the bacteria recovered from aerobic plates were done by API system. The ureA gene of H. pylori was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR). Gallbladder tissue specimens for histological examination were stained with Hematoxylin-Eosin and Giemsa. The monoclonal antibody Ki-67 was used to evaluate epithelial cell proliferation. Microorganisms were found in 10 of 47 (%2 1.2) samples. The recovered bacteria were; Escherichia coli (%10.6), Enterobacter amnigenus (%6.3), Klebsiella plantolica (%2.1) and Klebsiella ozonea (%2.1). There was no growth on Helicobacter pylori selective medium. H. pylori DNA was not detected in gallbladder tissue, bile or stones by PCR. On histologic sections there were no microorganisms resembling H. pylori. Since there was no growth on Helicobacter pylori selective medium, we only evaluated the association of the above mentioned bacteria with epithelial cell proliferation. Associations were calculated by Mann- Whitney U test and no statistically significant difference was found (p>0.05). Although there are studies revealing an association between H. pylori and hepatobiliary diseases, we failed to find such an association in our patients. Genetic factors, and geographic differences may also be important in the development of these diseases. Larger and multicenter studies may be carried out to exactly determine the presence of such an association. Key Words: Bile bacteriology, Cholesystitis, H. pylori, Ki-67, PCR 60