Toksoplazmoza karşı sentetik peptit bazlı subunit aşı formülasyonunun etkinliğinin ın vıvo çalışmalarda gösterilmesi
Demonstration of the effectiveness of synthetic peptide-based subunit vaccine formulation against toxoplasmosis in vivo studies
Yazar: ESLİN ÜSTÜN
Danışman: DOÇ. DR. RABİA ÇAKIR KOÇ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Toxoplasma gondii is a parasite that causes serious health problems in the world. It causes miscarriages in pregnancy, various abnormalities such as hydrocephalus in infants and congenital diseases. Since the clinical indication of the disease is non-specific, it is confused with many diseases and has no specific treatment. Although immunization with the vaccine is an important approach in preventing the disease, an effective vaccine against this disease has not been found yet.
Vaccines are substances containing antigens from living or dead microorganisms and provide specific and effective immunity in the living organism. In recent years, synthetic peptide vaccines have been used widely against diseases caused by parasites. It is not possible for the active substance contained in synthetic peptide vaccines to grow, spread, infect in the body. It can produce a high immune response and maintain its long-term efficacy in the living system.
Adjuvants are needed to increase the immune response of synthetic vaccines. Microparticles are used as adjuvants. Antigen carrier systems that can generate high immune response can be developed by making microencapsulation with polymers that adjuvant properties. Biodegradable polymers are used in the production of the carrier system of microparticles. Polyphosphazenes which can be used in microparticle production are containing phosphate and nitrogen molecules and organic side groups. Poly[di(carboxylateophenoxy)phosphazene] (PCPP) is formed by coupling the sodium salt to the phosphazene side group. Despite its biodegradability, biocompatibility, adjuvant efficacy and its ability to carry antigens in microparticle form, there is no study based on PCPP polymer in developing vaccines against T. gondii.
The aim of this study; characterization and effectiveness of the vaccine formulation obtained using PCPP encapsulated T. gondii's T-cell epitope peptide sequence. In this way, this study will contribute to the against T. gondii infection, which is frequently seen in the world.
The peptide was encapsulated in the PCPP polymer by the microencapsulation method. In this method, conservative microdroplets were formed by adding sodium chloride to the aqueous solution of PCPP polymer and peptide. These microdroplets were then stabilized by cross-linking with the polymer together with the aid of added calcium ions. The method allowed microcapsule formation.
The size of the microcapsules is shown by DLS, the potential of microparticles with zeta, chemical bond effects are shown by FTIR, morphology is imaged of SEM. Size range was found to be in desired dimensions. Also, the toxic effect of microparticles and PCPP polymer was examined on cells, and it was determined that there were no toxic effects. According to the results obtained, it was determined that IgG and IgM responses occurred against the T. gondii peptide in mice, but this response was higher in peptide-loaded PCPP microparticles.
As a result of this, non-toxic microparticles which can be used in vaccine studies against toxoplasmosis, produce specific IgG and IgM antibody responses in mice were produced.

Abstract:
Toksoplazma gondii, dünyada ciddi sağlık sorunlarına neden olan bir parazittir. Bu paraziter hastalık, immün yetmezlik, transplantasyon durumundaki kişilerde ve kanser hastalarında mortaliteye; hamilelikte düşüğe, bebeklerde hidrosefali gibi doğuştan gelen çeşitli anomalilere neden olur. Hastalığın klinik endikasyonu spesifik olmadığı için birçok hastalıkla karıştırılır ve spesifik bir tedavisi de bulunmamaktır. Hastalığın önlenmesinde aşı ile bağışıklama önemli bir yaklaşım olmakla beraber, bu hastalığa karşı etkili bir aşı henüz bulunamamıştır.
Aşı; canlı veya ölü mikroorganizmalardan alınmış olan antijenleri içeren, uygulandıkları biyolojik canlıda özgül ve etkin bağışıklık sağlayan maddelerdir. Son yıllarda parazitlerin yol açtığı  hastalıklara karşı sentetik peptit aşı çalışmaları yaygın olarak kullanılmaktadır. Sentetik peptit aşılar mikroorganizma içermediği için vücutta üremesi, yayılması, enfeksiyon oluşturması gibi riskleri yoktur. Yüksek immün yanıt oluşturabilir ve uygun formülasyonlarda canlı sisteminde uzun süreli olarak etkinliğini koruyabilir.
Sentetik peptit aşıların bağışıklık yanıtının arttırılabilmesi için adjuvanlara gereksinim duyulmaktadır. Adjuvan özelliklere sahip polimerler ile mikrokapsülasyon yapılarak yüksek immün yanıt oluşturabilecek antijen taşıyıcı sistemler geliştirilebilmektedir. Taşıyıcı sistem olan mikropartiküllerin üretiminde biyobozunur polimerler kullanılmaktadır. Polifosfazenler, mikropartikül üretiminde kullanılabilen fosfat ve azot molekülleri ve organik yan grupları içeren ve son yıllarda adjuvan etkinliği olduğu gösterilen polimerlerdir. Fosfazen yan grubuna sodyum tuzu bağlanması ile oluşan polifosfazen ise Poli[di(karboksilatofenoksi)fosfazen] (PCPP)'dir. Biyobozunur olması, biyouyumluluğu, adjuvan etkinliği ve mikropartikül formda antijen taşıyabilme kapasitesine rağmen T. gondii'ye karşı aşı geliştirilmesinde PCPP polimerine dayalı bir çalışma yoktur.
Bu çalışmanın amacı; PCPP ile enkapsüle edilmiş T. gondii'ye ait T-hücre epitopu olan peptit dizisi kullanarak elde edilen aşı formülasyonunun karakterizasyonunun yapılması ve etkinliğinin in vivo ortamda gösterilmesidir. Bu sayede  dünyada ve ülkemizde görülme sıklığı yüksek oranda olan T. gondii enfeksiyonu ile mücadeleye katkıda bulunulacaktır.
Mikroenkapsülasyon yöntemi ile peptit PCPP polimerinin içerisine enkapsüle edilerek mikropartikül formuna getirilmiştir. Bu yöntemde, PCPP polimeri ve peptitinden oluşan sulu çözeltinin içerisine sodyum klorür ilave edilerek koaservatif mikrodamlacıklar oluşturulmuştur. Bu mikrodamlacıklar, daha sonra eklenen kalsiyum iyonlarının yardımıyla polimerle çapraz bağlanarak stabilize edilmiştir. Yöntem, mikrokapsül  oluşturmaya olanak sağlamıştır.
Elde edilen mikrokapsüllerin boyutu DLS, potansiyeli ZETA, kimyasal bağ etkileri FTIR, morfolojisi SEM ile gösterilmiştir. Mikropartiküllerin boyut aralığının istenilen boyutlarda olduğu görülmüştür. Ayrıca mikropartiküllerin ve PCPP polimerinin hücrelerdeki toksik etkisi incelenmiştir ve toksik etkilerinin olmadığı tespit edilmiştir. En son aşama olarak deney hayvanlarında T. gondii peptitine karşı oluşan IgM ve IgG antikor yanıtları ELISA yöntemi ile incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda peptit yüklü PCPP mikropartikülleri ve sadece peptit ile immünize edilen hayvanlarda T. gondii peptitine karşı IgG ve IgM yanıtı oluştuğu ancak bu yanıtın peptit yüklü PCPP mikropartiküllerinde daha yüksek olduğu belirlenmiştir. 
Bulunan sonuçlar doğrultusunda da toksoplazmoza karşı aşı çalışmalarında kullanılabilmek üzere istenilen boyutlarda ve toksik etki göstermeyen farelerde spesifik IgG ve IgM antikor yanıtı oluşturan mikropartiküller üretilmiştir.