Hypericum pseudolaeve Robson ve Verbascum stachydifolium Boiss. & Heldr. var. stachydifolium bitki ekstrelerinin yara iyileştirme üzerine etkilerinin in vitro çalışmalar ile değerlendirilmesi
Evaluation of the wound healing effects of Hypericum pseudolaeve Robson and Verbascum stachydifolium Boiss. & Heldr. var. stachydifolium plant extracts by in vitro studies
Yazar: BAHAR KAPTANER İĞCİ
Danışman: PROF. DR. ZEKİ AYTAÇ
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışma, Hypericum pseudolaeve Robson (HP) ve Verbascum stachydifolium Boiss & Heldr. var. stachydifolium'un (VS) maserasyon ve soxhlet yöntemleriyle elde edilmiş metanollü ve sulu ekstrelerinin in vitro yara iyileştirici etkilerini ve bunların sitotoksisiteleri, antioksidan aktiviteleri ve fenolik bileşenlerini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Toplam fenolik ve flavonoid içerikleri, spektrofotometri bazlı yöntemler kullanılarak ölçülmüştür. Bitki ekstrelerinin antioksidan aktivitesi DPPH ve total antioksidan kapasite (fosfomolibden) yöntemleri ile belirlenmiştir. Ekstrelerin L929 fare fibroblast hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri MTT yöntemi ile belirlenmiş ve ayrıca in vitro yara modeli olarak ekstre uygulanmış fibroblast hücrelerinin göçü hücre çizik testi ile değerlendirilmiştir. Türlerin kimyasal içeriği Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (YBSK) ile analiz edilmiştir. Ek olarak, yara iyileşmesinde önemli olduğu bilinen kollajen tip I, FGF-7, TGF-β1 ve VEGF gen ifadeleri RNA ve protein seviyesinde sırasıyla qRT-PCR ve ELISA yöntemleri ile değerlendirilmiştir. HP ekstrelerinde VSʼye göre daha fazla total fenolik (HP: 123,03-177,21; VS: 41,41-104,48 mg/g GAE) ve total flavonoit (HP: 21,79-123,40; VS: 13,22-52,65 mg/g RUE) bulunmuştur. Antioksidan aktivite DPPH yöntemiyle HP için 13,04-14,68, VS için 31,08-113,83 µg/ml IC50 değerleri arasında belirlenmiştir. Toplam antioksidan kapasite ise HP ekstrelerinde 243,91-318,67, VSʼde 119,27-215,46 mg/g AAE olarak bulunmuştur. YBSK sonuçlarına göre, bakılan bileşikler arasında HP ekstrelerinde epikateşin en bol olarak bulunmuştur ve kayda değer ölçüde hiperosit, kersetin, kersitrin ve gallik asit bulunduğu belirlenmiştir. VSʼde ise gallik asit, rutin ve kersetin diğer bileşiklerden daha fazla miktarda bulunmuştur. Ekstreler 31,25-500 µg/ml konsantrasyon aralığında kullanıldığında 18, 24 ve 48 saatte fibroblast hücreleri üzerinde belirgin bir toksik etki göstermemiştir. İstisnai olarak maserasyon ile elde edilmiş VS metanol ekstresi 500 µg/ml konsantrasyonda tüm saatlerde toksik etki gösterirken, VS sulu ekstresi aynı dozda 48 saatte toksik etki göstermiştir. Hücre çizik testindeki en iyi etki, her iki türün de maserasyon yöntemiyle elde edilen sulu ekstrelerinde görülmüştür. HP ve VS sırasıyla %76,7 ve %60,4 hücre kapatma değerleri ile kayda değer aktivite göstermiştir. İfade seviyelerine qRT-PCR ile bakılan sitokinler ve kollajen her iki bitkinin sulu ekstresi uygulandıktan sonra artış göstermiştir. VEGF ve TGF-β1 ifadesi HP uygulamasında daha fazla artış gösterirken, FGF-7 ise VS grubunda daha fazla artmıştır. ELISA yöntemi ile de benzer sonuçlar elde edilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, HP ve VSʼnin yara iyileştirici özelliklerini in vitro yöntemler ile ortaya koymuş, fibroblastlarda yara iyileşmesinde önemli sitokinlerin ekspresyonunu arttırdığını ve çeşitli fenolik bileşikleri içerdiğini göstermiştir.

Abstract:
This study aimed to investigate the in vitro wound healing effects of the methanolic and aqueous extracts of Hypericum pseudolaeve (HP) Robson and Verbascum stachydifolium Boiss & Heldr. var. stachydifolium (VS) obtained by maceration and soxhlet methods as well as their cytotoxicity, antioxidant activity and phenolic constituents. Total phenolic and flavonoid contents were measured using spectrophotometry-based methods. Antioxidant activities of the extracts were determined using DPPH and total antioxidant capacity (phosphomolybdenum) methods. Cytotoxic effects of the extracts on L929 mouse fibroblast cells were evaluated by MTT assay. Moreover, migration of the treated fibroblast cells was assessed by cell scratch assay as an in vitro wound healing model. Phytochemical content was analyzed by using High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). Additionally, the expressions of collagen type I, FGF-7, TGF-β1 and VEGF, which are important genes in wound healing, were evaluated at RNA and protein level by using qRT-PCR and ELISA methods, respectively. HP extracts were found to contain more phenolics (HP: 123,03-177,21; VS: 41,41-104,48 mg/g GAE) and flavonoids (HP: 21,79-123,40; VS: 13,22-52,65 mg/g RUE) compared to VS. Antioxidant activity of HP and VS extracts were determined between 13,04-14,68 and 31,08-113,83 µg/ml IC50, respectively by using DPPH method. Total antioxidant capacity of HP and VS extracts were calculated to be between 243,91-318,67 and 119,27-215,46 mg/g AAE, respectively. According to HPLC results, the most abundant compound in HP was epicatechin. Hyperoside, quercetin, quercitrin and gallic acid were also found in higher amounts in HP than the other compounds analyzed. The amounts of gallic acid, rutin and quercetin were relatively higher in VS. All extracts did not show significant cytotoxic effect on fibroblast cells at between 31,25-500 µg/ml concentration after 18, 24 and 48 h treatment. As an exception, methanolic extracts of VS were cytotoxic at 500 µg/ml whereas aqueous extracts of VS showed toxic effect after 48 h at 500 µg/ml. Aqueous extracts of both species obtained by maceration were found the most potent based on the cell scratch assay. HP and VS showed significant activity with the cell closure rates of 76.7% and 60.4%, respectively. The mRNA levels of collagen and cytokines increased after treatment with aqueous extracts. VEGF and TGF-β1 expression increased more after HP treatment whereas FGF-7 was more after VS treatment. Similar results were also obtained at protein level by ELISA method. The results of this study showed that HP and VS have wound healing potential as determined by in vitro methods, the expression of some cytokines important in wound healing in fibroblasts increased after treatment with the extracts of HP and VS, and these plants contain various phenolic compounds.