Lipit birikiminde rol alan seipin proteinin kolesterol ile indüklenen yağlı karaciğer modelinde endoplazmik retikulum stres ve otofaji üzerine etkisi
Effect of seipin involved in lipid accumulation on endopasmic reticulum stress and autophagy in cholesterol induced fatty liver model
Yazar: TUĞÇE DEMİREL YALÇINER
Danışman: PROF. DR. NESRİN KARTAL ÖZER
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Tıp) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Endoplazmik retikulum stresi = Endoplasmic reticulum stress ; Hepatositler = Hepatocytes ; Hücre dizisi = Cell line ; Kolesterol = Cholesterol ; Lipidler = Lipids ; Otofaji = Autophagy

Özet:
Amaç: AML12 hepatosit hücre hattında kolesterol ile indüklenen lipit birikiminde  Seipin proteinin  ER stres ve lipofaji üzerine etkisinin detaylı araştırılmasıdır. Kolesterol ile indüklediğimiz yağlı karaciğer hastalığı in vivo modelinde lipit birikimi, inflammasyon ve Seipin protein düzeylerinin belirlenmesidir. 
Gereç ve Yöntem: In vivo deneylerde 2-4 aylık erkek albino tavşanlar kontrol (normal yem ile beslenen) ve kolesterol (%2 kolesterol içeren yem ile beslenen) olmak üzere iki gruba ayrıldı. Elde edilen gruplardan sekiz haftanın sonunda kan örnekleri ile karaciğer dokuları toplandı ve dokular makroskopik olarak incelenirken TGF-β, IL1β mRNA ekspresyonları qPCR tekniği ile Seipin protein düzeyleri ise immunblotlama tekniği ile belirlendi. Çalışmamızın ikinci aşamasında hepatosit hücrelerine Seipin siRNA transfeksiyonu takiben Lipozom-Kolesterol uygulanması gerçekleştirildi ve qPCR tekniği ile ER stres ile ilişkili GRP78, GRP94 ve ATF4 belirteçlerinin mRNA seviyeleri, Bodipy boyama ile LD sayı/boyut farklılıkları ve immünfloresans yöntemi ile LD-LAMP1 kolokalizasyonu belirlendi
Bulgular: Kolesterol ile beslenen tavşanların karaciğer dokularında nodüler yapılar gözlenirken lipit birikiminin, IL1 β mRNA ve Seipin protein seviyelerinin arttığı TGF-β mRNA seviyelerinin azaldığı ise tespit edildi. Bununla birlikte, AML12 hücrelerine 8 saat boyunca Lipozom-Kolesterol uygulamasının kolestrol brikimi, Seipin protein aktivasyonu ve büyük LD sayısını arttırdığı gözlendi. Seipin siRNA uygulamasının hem taşıyıcı hemde Lipozom-Kolesterol grubunda büyük LD saysını ve GRP78 mRNA seviyelerini azalttığı tespit edildi. 
Sonuç: In vivo da yüksek kolesterolün lipit birikimine bağlı olarak inflammasyonu ve Seipin düzeylerini arttırdığı bulundu. In vitro çalışmalarımız ise hem normal koşullarda hemde yüksek kolesterol ile Seipin proteinin hepatositlerde ER strese karşı verilen ilk cevapta rolü olan GRP78 şaperon proteinin düzenlenmesinde rolü olduğunu belirledi.

Abstract:
Objective: A detailed investigation of  the effect of Seipin  protein on ER stress and lipophagy in cholesterol-induced lipid accumulation in AML12 hepatocyte cell line. Determination of lipid accumulation, inflammation and Seipin protein levels in an in vivo model of cholesterol-induced fatty liver disease.
Material and Methods: In the in vivo experiments, 2-4 months old male albino rabbits were divided into two groups as control (fed chow diet) and cholesterol (fed 2% cholesterol containing diet). Eight weeks later, liver tissues and blood samples were collected. The results of the effect of hypercholestrolemic diet in liver tissues were investigated macroscopically and also defined by western blotting (Seipin protein levels) and qPCR methods. (TGF-β, IL1β mRNA levels). In the second part of our study, Liposome-Cholesterol application was performed to hepatocyte cells following Seipin siRNA transfection and mRNA levels of ER stress-related GRP78, GRP94 and ATF4 markers were determined by qPCR, while LD number/size differences by Bodipy staining and LD-LAMP1 colocalization by immunofluorescence method. 
Results: Lipid accumulation and nodular structures were observed in the liver tissues of the rabbits fed with cholesterol, while seipin protein levels and IL1 β mRNA levels were increased and TGF-β mRNA levels were decreased. However it was observed that Lipzoom-Cholesterol application to AML12 cells for 8 h increased cholesterol accumulation, Seipin protein activation and large LD number. It was determined that Seipin siRNA application decreased the large LD number and GRP78 mRNA levels in both the vector and Liposome-Cholesterol groups.
Conclusion : According to in vivo findings, high cholesterol was found to increase inflammation and Seipin levels due to lipid accumulation. However, in vitro studies were determined that both under both normal and with high cholesterol conditions, Seipin protein has the ability to regulate GRP78 chaperone protein, which has a role in the first response to ER stress in hepatocytes.