Fenolik bileşiklerin seçimli ayrımı ve tayininde yeni malzemelerden yararlanılması
Utilization of new materials in specific separation and determination of phenolic compounds
Yazar: ŞEYDA KARAMAN ERSOY
Danışman: PROF. DR. ESMA TÜTEM ; PROF. DR. CEVDET NERGİZ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Kuersetin = Quercetin

Özet:
Moleküler baskılı polimerler (Molecular imprinted polymers, MIPs), belirli molekülleri (veya türevlerini) kimyasal olarak tanıma özelliğine sahip kalıplar içeren polimerik katı malzemelerdir. MIP'ler doğal proteinli reseptörlere kıyasla hazırlama kolaylığı, düşük maliyet, uç sıcaklık ve kimyasal koşullara dayanım, uzun raf ömrü, deneysel tasarımda gelişmiş çok yönlülük gibi belirgin üstünlükler gösterir. 
Kuersetin, pek çok bitkinin yaprak, meyve ve çiçeğinde yaygın olarak bulunan flavon ailesinin en aktif bileşenidir. Kuersetin antioksidan, antiviral, antiinflamatuar ve antitümör özellikleri nedeniyle artan bir ilgi konusu olmuştur. Bu nedenle, kuersetinin çeşitli bitki matrikslerinden ayrımı önemli bir araştırma alanı olmaktadır. Ayrıca kuersetinin önderişiklendirmesi (zenginleştirmesi) ve/veya ayrımı, biyolojik maddelerde olduğu gibi çok bileşenli karmaşık gıda ürünlerinde de kuersetin tayini için gerekli bir basamaktır. Kafeik asit birçok bitki ve içecekte bulunan bir hidroksisinnamik asit türevidir. Meyvelerdeki toplam hidroksisinnamik içeriğinin %70 ini oluşturmaktadır. Kafeik asit, iltihabı (inflamasyon) hafifleterek serbest radikallerin zararlı etkilerine ve endotelyal hasar vb.'ne karşı koruma sağlar.
Bu çalışmada, yukarıda bahsedilen sebeplerden dolayı kafeik asit ve kuersetinin ayrımı ve önderişiklendirilmesi için ayrı ayrı baskılı polimerler sentezlendi. Kuersetin baskılı polimerler gözenek oluşturucu çözücü olan asetonun içinde kalıp molekül olarak kuersetin, fonksiyonel monomerler olarak 4-vinil piridin (4-VP), metakrilik asit (MAA), akrilamid (AA), çapraz bağlayıcı olarak etilen glikol dimetakrilat (EDMA) ve başlatıcı olarak 3,3'-azobisizobutironitril kullanılmasıyla farklı mol oranlarında (kalıp:monomer:çapraz bağlayıcı: 1:4:20, 1:5:30, 1:8:40, 1:10:50) hazırlandı. Ayrıca baskısız polimerler (non-imprinted polymers, NIPs) kalıp molekül olmadan sentezlendi. Bunların tanıma ve seçimlilik özellikleri, farklı oranlarda asetonitril (ACN)-dimetilsülfoksit (DMSO) karışımları ve metanoldeki kuersetin çözeltileri ile denge bağla(n)ma denemeleriyle 370 nm'de absorbansları izlenerek incelendi. Kuersetin:4-VP:EDMA'nın 1:4:20 mol oranındaki MIP'i, kuersetin tanıma için en uygun polimer olarak belirlendi. Bahsedilen bu polimerin yapısal olarak ilişkili diğer bileşiklere (rutin, kateşin, vb.) göre kuersetin için büyük ölçüde seçimli olduğu görüldü. MIP ve NIP'lerin adsorpsiyon özellikleri, ACN:DMSO (98:2, v/v) karışımında hazırlanan kuersetin çözeltileriyle Freundlich ve Langmuir adsorpsiyon izotermleri kullanılarak hesaplandı.
Bu çalışmada ayrıca, farklı mol oranlarında (1:4:12, 1:4:16, 1:4:20, 1:5:30, 1:6:30, 1:8:40) bir seri kafeik asit baskılı polimer, gözenek oluşturucu çözücü olarak THF'da hazırlandı. Kafeik asit-MIP'lerin hazırlanması için kalıp molekül olarak kafeik asit, monomer olarak 4-VP, MAA, AA ve 1-vinil imidazol (1-VI), çapraz bağlayıcı olarak EDMA ve başlatıcı olarak AIBN kullanıldı. Ayrıca baskısız polimerler (NIPs) kalıp molekül olmadan sentezlendi. Bunların tanıma ve seçimlilik özellikleri denge bağla(n)ma denemeleri ile 320 nm'de absorbansları izlenerek incelendi. Kafeik asit:4-VP:EDMA'nın 1:4:16 mol oranındaki MIP'i, kafeik asit tanıma için en uygun polimer olarak belirlendi. Bahsedilen bu polimerin yapısal olarak ilişkili diğer bileşiklere (gallik asit, klorojenik asit, vb.) göre kafeik asit için büyük ölçüde seçimli olduğu görüldü. MIP ve NIP'lerin adsorpsiyon özellikleri ACN'deki kafeik asit çözeltileriyle Freundlich ve Langmuir izotermleri kullanılarak hesaplandı. 
Kafeik asit ve kuersetin baskılı polimerlerin yapı analizleri Fourier Dönüşümlü İnfrared Spektrokopisi (Fourier Transform Infrared, FTIR)-Zayıflatılmış Toplam Yansıma (Attenuated Total Reflection, ATR) spektrumları kullanılarak gerçekleştirildi. Polimer morfolojileri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelendi.
Hazırlanan moleküler baskılı polimerler kullanılarak moleküler baskılı katı faz ekstraksiyon (MISPE) uygulamaları yapıldı. Böylece sentetik karışımlar ve doğal ürünlerden (kuersetin için; ısırgan ekstraktı hidrolizatı, kırmızı soğan kabuğu ekstraktı ve ekstrakt hidrolizatı ve siyah çay ekstraktı hidrolizatı, klorojenik asit ve kuersetinin her ikisi için de yeşil kahve çekirdeği ekstraktı) kafeik asit (ve/veya kafeik asit türevi klorojenik asit) ve kuersetin (ve/veya kuersetin türevi kamferol, mirisetin, rutin) geri kazanımı gerçekleştirildi.
Anahtar kelimeler: moleküler baskılı polimer (MIP), moleküler baskılı katı faz ekstraksiyonu (MISPE), kafeik asit baskılı polimer, kuersetin baskılı polimer.

Abstract:
Molecular imprinted polymers (MIPs) are solid polymeric materials containing templates which have recognizing abilities chemically of specific molecules (or their derivatives). MIPs offer distinct advantages such as ease of preparation, low cost, tolerance to extreme thermal and chemical conditions, long shelf life, and enhanced versatility in experimental design compared to natural proteinaceuous receptors. 
Quercetin is the most active compound in flavone family, widely occurring in leaves, fruits, and flowers of many plants. Quercetin has become the topic of increasing interest based on its antioxidant, antiviral and antitumor properties. So, the isolation of quercetin from various plant matrices is becoming an important research area. Moreover, preconcentration and/or separation is a required stage for determining quercetin in complex multicomponent food products as well as in biological objects. Caffeic acid is a hydroxycinnamic acid derivative which is present in many plants and beverages. It accounts for up to 70% of the total hydroxycinnamic acid content in fruits. Caffeic acid can slow down the process of inflammation, thereby providing protection from the hazardous effects of free radicals and against endothelial damage, etc. 
In this work, because of the above mentioned reasons, imprinted polymers for the isolation and preconcentration of quercetin and caffeic acid were synthesized separately. Quercetin imprinted polymers in different molar ratios (template:monomer:cross-linker: 1:4:20, 1:5:30, 1:8:40, 1:10:50) were prepared by using quercetin as the template molecule, 4-vinylpyridine (4VP), methacrylic acid (MAA), acrylamide (AA) as the functional monomers, ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) as the cross-linker and 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) as initiator in the porogen of acetone. Non-imprinted polymers (NIPs) were also synthesized without template. Their recognition and selectivity properties were investigated by equilibrium binding experiments with QC solutions in different proportions of acetonitrile (ACN)-dimethylsulfoxide (DMSO) mixtures and methanol (MeOH) monitoring the absorbances at 370 nm. The MIP with 1:4:20 molar ratio of quercetin-4VP-EDMA was established as the most suitable for recognition of quercetin. The mentioned MIP was found to be highly selective for quercetin according to the other structurally related compounds (rutin, catechin, etc). Sorption parameters of the MIP and the NIP were calculated by using Freundlich and Langmuir isotherms with quercetin solutions in ACN: DMSO (98:2, v/v).
Also in this study, a series with different molar ratios of caffeic acid imprinted polymers (1:4:12, 1:4:16, 1:4:20, 1:5:30, 1:6:30, 1:8:40) were prepared in tetrahydrofuran as porogen. Caffeic acid as template molecule, 4-vinylpyridine (4VP), methacrylic acid (MAA), acrylamide (AA), 1-vinylimidazole as functional monomers, ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) as cross-linking agent and 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) as initiator were used for the preparation of caffeic acid-MIPs. Non-imprinted polymers (NIPs) were also synthesized without template. Their recognition and selectivity properties were investigated by equilibrium binding experiments monitoring the absorbances at 320 nm. The MIP with 1:4:16 molar ratio of caffeic acid-4VP-EDMA was established as the most suitable for recognition of caffeic acid. The mentioned MIP was found to be highly selective for caffeic acid according to the other structurally related compounds (gallic acid, chlorogenic acid, etc). Sorption parameters of the MIPs and the NIPs were calculated by using Freundlich and Langmuir isotherms with caffeic acid solutions in ACN. 
Structure analysis of caffeic acid and quercetin imprinted polymers was carried out by using fourier transform infrared (FTIR)- attenuated total reflection (ATR) spectrum. Morphologies of these polymers were investigated with scanning electron microscopy (SEM).
Molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE) applications were performed by using prepared imprinted polymers. Thus, recoveries of caffeic acid (anad/or caffeic acid derivative chlorogenic acid) and quercetin (and/or quercetin derivative kaempferol, miricetin, rutin) were carried out from synthetic mixtures and natural products (nettle extract hydrolizate, red onion peel extract and extract hydrolizate, and black tea extract hydrolizate for quercetin;  green coffee bean extract for both quercetin and chlorogenic acid).
Keywords: Molecularly imprinted polymer (MIP), molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE), caffeic acid imprinted polymer, quercetin imprinted polymer.