Lokal olarak izole edilen Anoxybacillus gonensins UF7 ile lipaz enzim üretimi
Lipase enzyme production by locally isolated Anoxybacillus gonensins UF7
Yazar: FATMA ALTINOK
Danışman: PROF. DR. AHMET ADIGÜZEL
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Amonyum sülfat = Ammonium sulfate ; Bakteriler = Bacteria ; Enzim üretimi = Enzyme production ; Lipaz = Lipase ; İyon değişimi = Ion exchange

Özet:
Amaç: Lipazlar, geniş bir substrat özgüllüğü bulunan, çeşitli uygulama potansiyeline sahip olan enzimlerdir. Bu enzim; ilaç, kozmetik, deri, deterjan, gıda, parfüm, tıbbi teşhis, biyopolimer-biyosensör yapımı, biyoremediasyon, biyodizel ve diğer organik sentetik malzemelerin üretiminde kullanılmaktadır. Tez çalışmasında, farklı illerden toplanan kaplıca örneklerinden; bakteriler izole edilerek, lipaz enzim aktivitesine sahip suş/suşlar belirlenmiş ve en yüksek aktivite veren izolattan lipaz enzimi saflaştırılarak, karakterizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir.
Yöntem: Kaplıcalardan alınan numuneler, termoslarda laboratuvar ortamına getirilerek termofilik bakterilerin izolasyonu gerçekleştirilmiştir. İzole edilen bakteriler lipaz besiyerine inoküle edilerek, enzim aktiviteleri incelenmiştir. En yüksek lipaz aktivitesine sahip izolat alınmış, 16S rRNA sekans analizi ile tür düzeyinde tanılanması gerçekleştirilmiştir. Daha sonra lipaz üretimine geçilmiş, 2 farklı yöntem ile enzim saflaştırılmıştır. Amonyum sülfat ve iyon değişim sonucu saflaştırılan enzimin biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır.
Bulgular: Bu çalışmada; toplam 64 adet termofilik bakteri izole edilmiştir. Elde edilen izolatlardan 14 tanesinin tribütirin agar besiyerinde şeffaf zon oluşturduğu gözlenmiş ve bu bakterilerin sıvı lipaz besiyerinde aktiviteleri hesaplanmıştır. En yüksek aktiviteye sahip UF7 kodlu izolat klonlanmış; Anoxybacillus gonensis türüne ait bir suş olduğu tespit edilmiştir. Ardından sıvı lipaz besiyerinde enzim üretilmiş, TPP yöntemi ile %70 amonyum sülfat doygunluğu, 1:1 homojenat:t-bütanol oranında %79,91 verim ve 6,01 kat; amonyum sülfat ve iyon değişim kromotografisi yöntemi ile de, %80 amoyum sülfat doygunluğunda 13,10 kat ve %40,65 verim ile saflaştırılma gerçekleştirilmiş, SDS-PAGE ile molekül kütlesinin ~73 kDa olduğu tespit edilmiştir.
Sonuç: Bu çalışmada, A. gonensis UF7 kodlu suş tarafından üretilen lipaz enzimi ilk kez saflaştırılıp karakterize edilmiştir. Enzim hem TPP hem amonyum sülfat ve iyon değişim kromotografisi olmak üzere 2 farklı yöntem ile saflaştırılmıştır. Saflaştırılan enzimin optimum pH ve sıcaklığı sırasıyla; 8,0 ve 60oC olarak belirlenmiştir. Ayrıca saflaştırılan lipaz enziminin metanol, etanol gibi organik çözücülerde ve Ca+2, Mg+2 gibi metal iyonları varlığında aktivesi artarken; DMSO, kloroform ve Cu+2'ın enzim aktivitesini azalttığı tespit edilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Lipaz, Anoxybacillus gonensis, TPP, amonyum sülfat, iyon değişim kromotagrafisi

Abstract:
Objective: Lipases are enzymes with a wide substrate specificity, having potential for various applications. This enzyme is used in the production of pharmaceuticals, cosmetics, leather, detergents, food, perfumes, medical diagnostics, biopolymer-biosensor construction, bioremediation, biodiesel and other organic synthetic materials. In the thesis study, the bacteria were isolated from hot spring samples collected from different provinces, the strain/strains with lipase enzyme activity were determined, the lipase enzyme was purified from the isolate with the highest activity and the characterization process was carried out.
Method: The samples taken from the hot springs were brought to the laboratory in thermos and isolation of thermophilic bacteria was performed. The isolated bacteria were inoculated on lipase medium and their enzyme activities were investigated. The isolate with the highest lipase activity was selected and identification of the isolate was performed at the species level by 16S rRNA sequence analysis. Then, lipase production was carried out and the enzyme was purified by 2 different methods. Biochemical characterization of the enzyme purified by ammonium sulfate and ion exchange was performed.
Results: In this study, a total of 64 thermophilic bacteria were isolated. It was observed that 14 of the obtained isolates formed a transparent zone on tributyrin agar medium and the activities of these bacteria in liquid lipase medium were calculated. The UF7-coded isolate showing the highest activity was cloned, it was determined that the strain belongs to the Anoxybacillus gonensis. Then, the enzyme was produced in liquid lipase medium. With the TPP method at 70% ammonium sulfate saturation and 1:1 homogenate:t-butanol ratio, purification was achieved with 79.91% yield and 6.01 times, with ammonium sulfate and ion exchange chromatography method at 80% ammonium sulfate saturation, purification was carried out with 40.65% yield and13.10 times and molecular mass of the enzyme was determined to be ~73 kDa by SDS-PAGE.
Conclusion: In this study, the lipase enzyme produced by the A. gonensis UF7 strain was purified and characterized for the first time. The enzyme was purified by 2 different methods, both TPP and ammonium sulfate-ion exchange chromatography. It was designated that the optimum pH and temperature of the purified enzyme are 8.0 and 60 ⁰C, respectively. In addition, it was observed that while the activity of the purified lipase enzyme increased in organic solvents such as methanol and ethanol and in the presence of metal ions such as Ca2+ and Mg2+, the enzyme activity decreased in DMSO, chloroform and Cu2+.

Keywords: Lipase, Anoxybacillus gonensis, TPP, ammonium sulfate, ion exchange chromatography