Fitaz enziminin sulu ikili-faz ekstraksiyon sistemleri ile saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of phytase by aqueous two phase extraction system
Yazar: YASEMİN ÖZÇELİK
Danışman: PROF. DR. SEÇİL ÖNAL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzimler = Enzymes ; Fitat = Phytate ; Fitaz = Phytase ; Karakterizasyon = Characterization ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Sulu ikili-faz sistemleri (ATPS) bir sıvı-sıvı ekstraksiyon tekniğidir. Proteinlerin, virüslerin, enzimlerin ve diğer biyomoleküllerin ekstraksiyonunda ve saflaştırılmasında kullanımı açısından yüksek potansiyele sahiptir. Bu nedenle endüstride ve bilimsel çalışmalarda büyük ilgi görmektedir. Sulu ikili-faz sistemleri kolay hazırlanması, hızlı ve yüksek verimle bir saflaştırma sağlaması, maliyetinin düşük olması gibi avantajlara sahiptir.
Fitazlar (myo-inositol hekzakisfosfat fosfohidrolazlar), fitik asidi myo-inositol ve inorganik fosfatlara hidrolize ederek beslenme karşıtı etkilerinin ortadan kaldırılmasına yol açan enzimlerdir. Tek mideli hayvanların sindirim sistemlerinde fitaz aktivitesi eksikliği olduğundan, diyetlerine fitaz eklenmesi kalsiyum, magnezyum, fosfor ve proteinlerin temin edilebilirliğini arttırır. Fitazlar hem yem sanayi hem de gıda sanayinde uygulama bulan enzimlerdir.
Bu tezde soya unundan izole edilen fitaz enziminin, Polimer/Tuz sulu ikili-faz ekstraksiyon sistemi kullanılarak saflaştırılması ve enzimin karakterizasyonu amaçlanmıştır. Sulu ikili faz sisteminin optimizasyonu gerçekleştirilmiş, enzim aktivitesine etki eden bazı parametreler incelenmiş ve enzimin kararlılığı çalışmaları yapılmıştır. %15 (w/v) PEG-4000, %15 (w/v) sodyum sitrat (pH 5,5; 25 ⁰C) kullanılarak hazırlanan sulu ikili-faz sisteminde fitaz enzimi tuzca zengin alt fazda toplandı ve 4,1 kat saflaştırıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklığı ise sırasıyla pH 4,5 ve 55 ⁰C olarak belirlendi. Enzimin KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,608 mM ve 0,06 U olarak belirlendi. Polimer-tuz tabanlı ATPS ile saflaştırılan soya fitazı geniş bir pH ve sıcaklık aralığında oldukça kararlı bir enzimdir. Geleneksel metodlara kıyasla, fitazın saflaştırılmasında kullanılan bu tek adımlı ekstraksiyon metodu basit, ekonomik ve etkili bir metod olup hazırlanan enzim preparatı ise sahip olduğu katalitik özellikleri bakımından gıda ve yem sanayindeki uygulamalarında kullanılabilecek uygun bir preparattır.

Abstract:
Aqueous two phase systems (ATPS) is a liquid-liquid extraction technique. It has high potential for use in the extraction and purification of proteins, viruses, enzymes and other biomolecules. For this reason, it is of great interest in industry and scientific studies. Aqueous binary phase systems have advantages such as easy preparation, fast and high efficiency purification, and low cost. 
Phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases) are enzymes hydrolyzing phytic acid to myo-inositol and inorganic phosphates leading to the elimination of its anti-nutritional effects. Since there is a lack of intrinsic phytase activity in the digestive tracts of monogastric animals, phytase addition to their diet results in increased availability of calcium, magnesium, phosphorus and proteins; which would be otherwise unavailable as bound to phytate. Phytases are enzymes that find applications in both the feed industry and the food industry
In this thesis, it is aimed to purify and characterize the phytase enzyme isolated from soy flour by using Polymer/Salt aqueous two-phase extraction system. Optimization of the aqueous two phase system and some parameters affecting to the enzyme activity were investigated and enzyme stability studies were realized. The phytase enzyme was partitioned in the salt-rich bottom phase of % 15 (w/v) PEG-4000, % 15 (w/v) sodium citrate (pH 5,5; 25⁰C) aqueous two-phase system and purified with 4,1 fold. The optimum pH and temperature were determined as to be pH 4,5 and 55 ⁰C, respectively. The KM ve Vmax values were found as 0,608 mM and 0,06 U, respectively. The soybean phytase purified with a polymer-salt based ATPS is a very stable enzyme over a wide range of pH and temperature. Compared to the traditional methods this single-step extraction method used in purification of phytase is a simple, economical and effective method. The enzyme is a suitable preparation that can be used in food and feed applications due to its catalytic properties.