Kolon kanser hücre hattında Dianthus orientalis ekstraktının olası antikanser etkilerinin araştırılması
Investigation of possible anticancer effects of Dianthus orientalis extract on colon cancer cell line
Yazar: SAMET PAYDAŞ
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET AYKUT YILDIRIM
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Genel Cerrahi = General Surgery

Özet:
Amaç: Kolon kanserinde adjuvan ve neoadjuvan yeni ajanların ortaya çıkması hastalara sunulacak tedaviler açısından önemlidir. Klinik kullanımda olan ilaçların çoğunluğu bitkisel kaynaklıdır. Dianthus türleride içerdiği fenolik bileşikler ile antikanser ajan olabilecek potansiyelde olmakla birlikte literatürde az sayıda veri bulunmaktadır. Bu noktadan hareketle çalışmada Dianthus orientalis ekstraktının kolon kanser hücre hattındaki olası antikanser etkilerinin değerlendirilmesi amaçlandı. Bu amaçla apopitoz ve kaspaz yolağında rol oynayan gen ekspresyonlarındaki değişikliklerin belirlenmesi amaçlandı.
Materyal ve Metod: Dianthus orientalis ekstraktı hazır toz halinde temin edildi. Ekstraktlar hekzan, diklorometan (DCM), etil asetat (EA), ethanol (EtOH), ethanol/su (%70) ve su gibi farklı çözücülerde hazırlandı. Bitki ekstraktlarının kimyasal kompozisyon analizleri HPLC-MS tekniği kullanılarak belirlendi. Bu analiz hizmet alımı şeklinde gerçekleştirildi. Çalışmada HT-29 kolon kanser hücre hattı ve kontrol grubu olarak da HEK-293 sağlıklı embriyonik böbrek hücre hattı ile CCD sağlıklı kolon hücre hattı kullanıldı. HT-29 ve HEK-293 hücre hattı temin edilen bu hücreler, %10 FBS (Fetal Bovine Serum) ve %1 penisilin/streptomisin (100 U/ml penisilin ve 100 μg/ml streptomisin) içeren RPMI kültür ortamında flasklarda kültüre ekildi. Hücreler kültür ortamında yeterli sayıya ulaştıktan sonra PBS ile yıkanarak % 0,25 Trypsin-EDTA aracılığıyla enzimatik olarak kültür ortamında kaldırılıp FBS içeren besiyeri ile inaktive edildi. Çalışma için yeterli miktardaki hücreler ile çalışmaya devam edilen diğer hücrelerin %10 dimethyl sulfoxide (DMSO) protokolü ile kriyoprezervasyonu yapılarak -80°C de stoklandı. Çalışmaya devam edilen hücrelerin 37°C ve %5'lik CO2'li ortamda kültüre ekilen, besiyerleri iki günde bir yenilenerek ve yeterli sayıya ulaşana kadar bu işlem tekrar edildi. Yeterli hücre sayısına ulaşılan hücreler yeni kültür ortamlarına alınıp hücre sayımı yapıldı. Sonrasında sitotoksisite analizi, real time
polimeraz zincir reaksiyonu ve flow sitometrik analizler yapılarak veriler istatistiksel analize alındı.
Bulgular: DiO22 uygulanılan grupta antiapoptotik genler olan Bcl-XL ve Bcl-2 ekspresyonlarında anlamlı olarak azalma tespit edildi. Proapoptotik gen ekspresyonlarında ise Apaf-1, Bax, Bak, p53 ve ATM gen ekspresyonlarında istatistiksel olarak anlamlı artış tespit edildi.
DiO23 uygulanılan grupta antiapoptotik genler olan Bcl-XL ve Bcl-2 ekspresyonlarında anlamlı olarak azalma tespit edildi. Proapoptotik gen ekspresyonlarında ise Apaf-1, Bax, Bak, p53 ve ATM gen ekspresyonlarında istatistiksel olarak anlamlı artış tespit edildi.
Sonuç: Çalışmamız Dianthus orientalis bitkisine ait iki farklı şekilde hazırlanmış olan DiO22 ve DiO23 ekstraktlarının kolon kanser hücre hattında antiapoptotik genleri baskıladığı görüldü. Proapototik ile kaspaz yolağındaki başlatıcı ve efektör kaspaz gen ekspresyonlarını aktive ettiğini gösterdi. İlave olarak flow sitometrik apopitoz analizindeki DiO22 grubunda erken apopitozda, DiO23 grubunda geç apopitoz oranındaki kontrole göre artmış apopitoz oranı gen ekspresyon sonuçlarını da destekler nitelikteydi.

Abstract:
Objective: The emergence of new adjuvant and neoadjuvant agents in colon cancer is important for the treatments offered to patients. The majority of drugs in clinical use are of plant origin. Although Dianthus species have the potential to be anticancer agents with the phenolic compounds they contain, there is little data in the literature. Starting from this point, the study aimed to evaluate the possible anticancer effects of Dianthus orientalis extract on the colon cancer cell line. For this purpose, it was aimed to determine the changes in gene expressions that play a role in apoptosis and caspase pathway. Material and Method: Dianthus orientalis extract will be supplied in ready powder form. Extracts will be prepared in different solvents such as hexane, dichloromethane (DCM), ethyl acetate (EA), ethanol (EtOH), ethanol/water (70%) and water. Chemical composition analyzes of plant extracts will be determined using the HPLC-MS technique. This analysis will be carried out in the form of service procurement. In the study, HT-29 colon cancer cell line and HEK-293 healthy embryonic kidney cell line and CCD healthy colon cell line will be used as control groups. HT-29 and HEK-293 cell lines will be obtained and these cells will be cultured in flasks in RPMI culture medium containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum) and 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin). After the cells reach a sufficient number in the culture medium, they will be washed with PBS, enzymatically removed from the culture medium by 0.25% Trypsin-EDTA, and inactivated with the medium containing FBS. Sufficient cells for the study and other cells that will continue to be used will be cryopreserved with a 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) protocol and stored at -80°C. The cells that continue to be studied will be cultured in an
environment of 37°C and 5% CO2, the media will be renewed every two days, and this process will be repeated until the sufficient number is reached. Cells with sufficient cell numbers will be transferred to new culture media and cell counts will be performed. Afterwards, cytotoxicity analysis, real time polymerase chain reaction and flow cytometric analyzes will be performed and the data will be obtained and taken into statistical analysis. Findings: A significant decrease in the expressions of Bcl-XL and Bcl-2, which are antiapoptotic genes, was detected in the DiO22 applied group. As for pro-apoptotic gene expressions, a statistically significant increase was detected in Apaf-1, Bax, Bak, p53 and ATM gene expressions. A significant decrease in the expressions of Bcl-XL and Bcl-2, which are antiapoptotic genes, was detected in the DiO23 applied group. As for pro-apoptotic gene expressions, a statistically significant increase was detected in Apaf-1, Bax, Bak, p53 and ATM gene expressions. Results: Our study showed that DiO22 and DiO23 extracts of the Dianthus orientalis plant, prepared in two different ways, activated the apoptosis pathway in the colon cancer cell line by suppressing antiapoptotic genes and activating the initiator and effector caspase gene expressions in the proapototic and caspase pathway. In addition, in the flow cytometric apoptosis analysis, the increased early apoptosis rate in the DiO22 group and late apoptosis rate in the DiO23 group compared to the control also supported the gene expression results.