Ozon yağı nanopartiküllerinin kanser tedavisinde  ın vıtro radyoduyarlılık potansiyellerinin araştırılması
Investigation of in vitro radiosensitivity potential of ozonated oil nanoparticles for cancer treatment
Yazar: YELİZ YALÇIN
Danışman: PROF. DR. RAHİME SEDA TIĞLI AYDIN
Zonguldak Bülent Ecevit Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Radyasyon Onkolojisi = Radiation Oncology

Özet:
Sunulan tez çalışması kapsamında, ozon yağı nanoemülsiyonu kullanılarak radyaduyarlılığı artırmak amaçlanmıştır. Çalışmada, ozon ve nanoemülsiyon yapılar beraber kullanılarak radyoduyarlaştırıcı olarak kullanılabilecek olan ozon yağı nanoemülsiyon formu in vitro deneyler ile test edilmiştir.
Tez çalışmasının ilk aşamasında, ozon yağı nanoemülsiyonunun EIP yöntemi ile elde edilmesi ve hücre kültür çalışmalarında kullanılacak olan B-16 melanoma ve OV-90 over kanseri hücrelerinin ekimi ve çoğaltılması gerçekleştirilmiştir. 3 günlük inkübasyon sonrasında hücreler farklı konsantrasyonlarda ozon yağı nanoemülsiyonlarına maruz bırakılmışlardır. Ardından yalnızca B-16 melanom hücreleri kullanılarak ozon yağı nanoemülsiyonunun hücre morfolojisi, hücre döngüsü, DNA miktarı ve hücresel apoptoza olan etkisi belirlenmiştir.  Hücre morfolojisindeki değişim, kontrol ile kıyaslandığında tüm konsantrasyonlarda oluşmuştur. Düşük konsantrasyonlarda bile belirgin hücre parçalanmaları oluşmuştur. Ayrıca, 100 µl nanoemülsiyonun konsantrasyonunda hücre kolonileri kaybolmuş ve parçalanmıştır ve hücresel canlılılığın azaldığı belirlenmiştir.
Ozon yağı nanoemülsiyonunun hücre döngüsüne olan etkisini incelemek için, hücreler PI ile boyanmıştır. Hücre döngüsü analizi, ozon yağı nanoemülsiyonun hücre döngüsünün kontrol ile kıyaslandığında (%57.7 ve %22.8),  G0-1 fazında (%76.4) artış, S fazında(%7.4) ise kısalmaya sebep olduğunu göstermiştir. Ayrıca, ozon yağı nanoemülsiyonun konsantrasyon artışına bağlı olarak DNA sentezini inhibe ettiği belirlenmiştir. Annexin V apoptos analizi, 100 µl konsantrasyonda, erken apoptozun kontrole göre 8.5 kat, geç apoptozun ise 5 kat arttığını göstermiştir. 
Sonrasında, B-16 melanoma ve OV-90 over hücreleri kullanılarak ozon yağı nanoemülsiyonunun ROS ve ɣ-H2AX pozitifliği üretim potansiyeli belirlenmiştir. OV-90 over hücreleri, farklı hücre tipinin ROS ve ɣ-H2AX pozitifliğine olan etkisini belirlemek amacı ile kullanılmıştır. B-16 melanom hücrelerinin ROS seviyeleri nanoemülsiyon konsantrasyon artışı ile kontrolde %0.85'den 100 µl'de %14.88'e yükselmiştir. OV-90 hücrelerinde ise %1.94'den 100 µl'de %58.58'e yükselmiştir. Sonuçlar, ozon yağı nanoemülsiyonun B-16 melanom ve 0V-90 hücrelerinde ROS üretimini desteklediğini göstermiştir. Ayrıca, yüksek ozon yağı nanoemülsiyon konsantrasyonlarının ROS üretimini daha fazla artırdığı belirlenmiştir. B-16 melanom ve OV-90 over hücreleri kıyaslandığında, OV-90 ROS seviyesi 50 µl konsantrasyonda B-16 melanomun yaklaşık 6 katı, 100 µl konsantrasyonda ise 4 katıdır. Ozon yağı nanoemulsiyonunun DNA çift sarmal kırığı oluşturma etkisini belirlemek için H2AX testi yapılmıştır. Kontrolde %0.52 olan B-16 melanom ɣ-H2AX seviyesi 50 µl konsantrasyonda %12.55, 100 µl konsantrasyonda ise %17.06'ya yükselmiştir. OV-90 hücrelerinde de kontrolde %3.52olan ɣ-H2AX seviyesi 50 µl %66.74'e, 100 µl ise %71.89'a yükselmiştir. Her iki hücre hattında, ɣ-H2AX pozitif hücrelerin konsantrasyon artışı ile arttığı belirlenmiştir. Sonuçlar, OV-90 ɣ-H2AX seviyesindeki artışın B-16 melanoma kıyasla 50 µl konsantrasyonda yaklaşık 5 kat, 100 µl konsantrasyonda ise 4 kat fazla olduğunu göstermiştir.
Çalışmanın ikinci aşamasında, ozon yağı nanoemülsiyonunun radyoduyarlılık potansiyelini araştırmak için hücreler farklı radyasyon dozlarında ışınlanmıştır. İnvert mikroskopgörüntülerinden, radyasyonun tüm kontrol grubu hücrelerinin morfolojisini inhibe ettiği gözlenmiştir. Bununla beraber, ozon yağı nanoemülsiyonu maruziyeti ile hücre kümelerinin önemli ölçüde hasar gördüğü ve radyasyon dozu ve nanoemulsiyon konsantrasyon artışı ile koloni oluşumunun azaldığı belirlenmiştir. 2 Gy ve 8 Gy radyasyon dozlarında 20 µl ve 50 µl konsantrasyonlarda zayıf hücresel yapışma ve yayılım oluşmuştur. Özellikle 15 Gy radyasyon dozu 5 µl nanoemülsiyon konsantrasyonunda hücresel etkileşim azalmıştır. Elde edilen sonuçlar, ozon yağı nanoemulsiyonunun radyasyonun etkisini büyük ölçüde artırdığını göstermiştir. Sonrasında, hücreler 2 Gy, 8 Gy ve 15 Gy radyasyon dozlarına maruz bıraklarakr akış sitometride hücre döngüsü fazları için analiz edilmiştir. Tüm radyasyon dozlarında G0-1 fazı yüzdesinin nanoemülsiyon konsantrasyon artışı ile arttığı belirlenmiştir. Ancak, radyasyon dozu ve konsantrasyon artışı ile S fazında önemli bir değişiklik olmamıştır. Ayrıca, Annexin V apoptoz analizi, radyasyon dozu artışı ile B-16 melanom hücrelerinde geç apoptozun arttığını, 100 µl konsantrasyonda ise erken apoptozun arttığını göstermiştir.
B-16 melanom ve OV-90 over hücrelerinde ROS ve ɣ-H2AX seviyelerini belirlemek için, hücreler farklı konsantrasyonlarda nanoemülsiyon ile 2 Gy ve 8 Gy radyasyon dozlarında ışınlanmıştır. Elde edilen sonuçlar radyasyon dozu ve nanoemülsiyon konsantrasyon artışı ile hem B-16 melanom hemde OV-90 over hücrelerinde ROS ve ɣ-H2AX seviyelerinin arttığını göstermiştir. Özellikle OV-90 over hücrelerindeki artış B-16 melanomdan daha yüksek bulunmuştur. 100 µl konsantrasyonda 2 Gy ve 8 Gy radyasyon dozlarında OV-90 ROS artışı B-16 melanomun yaklaşık 5 ve 6 katı, ɣ-H2AX artışı ise 5 ve 3 katıdır.
Tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde, B-16 melanoma ve OV-90 over hücreleri üzerinde etkisi incelenen ozon yağı nanoemülsiyonunun kanser hücrelerinde hasar oluşturduğu ve potansiyel bir radyoduyarlaştırıcı olabileceği belirlenmiştir. Bu nedenle ozon yağı nanoemülsiyonunun kanser tedavisinde etkin olarak kullanılabilecek bir in vitro model olabileceği değerlendirilmiştir.

Abstract:
The aim of this thesis is increased the radiosensivity with ozonized oil nanoemulsion. In the study, ozone and nanoemulsion were combined which can be used for radiosensitizer form of ozonized oil nanoemulsion, has been tested with in vitro experiments.
In the first step of the thesis study, ozonized oil nanoemulsion was prepared using the EIP method and B-16 melanoma and OV-90 ovarian cells were seeded and proliferated. After 3 days of incubation, cells were exposed to various ozonized nanoemulsion concentration. Then, ozonized oil nanoemulsion effect on cellular morphlogy, apoptosis cell cycle and DNA content were determined using only B-16 melanoma cell line. The morphologies of cells, exposed to all concentration, started to change compared to control cells. Severe fractures were observed even at low concentration.  Moreover, at 100 µl concentration, it has been determined that clustered cells geratly disappeared and destructed and cell viability decreased.In order to determine the effect of ozonized oil nanoemulsion on cell cycle progression, cells were stained with PI. Cell cycle analysis showed that, ozonized oil nanoemulsion increased cells arrested in the G0-1 phase (76.4%) and decreased cells arrested in the S phase (7.4% ) compared to control data (57.7%-22.8%). Additionally, it has been determined that ozonized oil nanoemulsion inhibited DNA synthesis due to the increase concentration.
Annexin V apoptosis analysis showed that, compare the control data, early apoptosis increased 8.5 fold and late apoptosis increased 5 fold at 100 µl concentration. Then, it has been determined that potential of ROS production and ɣ-H2AX positivity with using B-16 melanoma cell line and OV-90 ovarian cell line. OV-90 ovarian cells were used in order to investigate the effect of ozonized oil nanoemulsion regarding different cancerous cell types by exploring ROS derivatives and ɣ-H2AX positivity. ROS levels in B-16 melanoma cells were gradually increased from 0.85% in control cells to 14.88% at 100 µl concentration due to the increase in nanoemulsion concentration. An increase in ROS levels from 1.94% (control) to 58.58% (100 µl) due to the increase of nanoemulsion concentration within OV-90 cells. Results showed that ozonized oil nanoemulsion contributed to ROS production in both B-16 melanoma and OV-90 cells. Moreover, it has been determined that high concentration of ozonized oil nanoemulsion strongly supported ROS production. Approximately 6- and 4-fold higher ROS production was determined in OV-90 cells compared to B-16 melanoma cells treated with 50 µl and 100 µl concentrations, respectively. To determine the effect of ozonized oil nanoemülsion on DNA double strand breaks, H2AX experiments were performed.  ɣ-H2AX positive  B-16 cell was 0.52 % in control, positive cells increased to a value of  12.55% and 17.06% at 50 µl and 100 µl concentrations. An increase in ɣ-H2AX levels of OV-90 cells was determined 66.74% ( at 50 µl) and 71.89% (at 100 µl) compared to control (3.52%). It has been determined that for both cell line, ɣ-H2AX positive cells gradually increased with increasing concentration. Results showed that, approximately 5- and 4-fold higher ɣH2AX levels were determined in OV-90 cells compared to B-16 melanoma cells treated with 50 µl and 100 µl concantrations.
 The second step of the thesis study, to explore the radiosensivity potential of ozonied oil nanoemulsion, cell were exposed with different radiation doses. According to inverted microscope images, radiaition slightly inhibited the morphologies of cells in all control groups. However, under ozonized oil nanoemulsion exposure, it has been determined that cell clusters significantly damaged and colony formation was reduced with increasing radiation doses and nanoemulsion concentrations. Poor cell adhesion and spreading significantly occurred under 2 Gy and 8 Gy of radiation doses with 20 µl and 50 µl nanoemulsion concantrations. Cellular interaction between each other decreased especially for cells exposed under the radiation dose of 15 Gy and 5 µl nanoemulsion concentration.  Results showed that radiation effect greatly triggered by ozonized oil nanoemulsion treatment. Then, cells were exposure with 2 Gy, 8Gy and 15 Gy radiation doses and analyzed by flow cytometry. It was obtained that the percentage of cells in the G0-1 phase increased slightly with regard to the increase in nanoemulsion concentration under all radiation doses. However, there is not any significant change in the percentage of cells in the S phase due to the increase in nanoemulsion concentration for all radiation doses. Moreover, Annexin V-apoptos analysis showed that, with increasing radiation doses, the late apoptosis was increased and when the B-16 melanoma cells incubated with nanoemulsions, early apoptosis was increased at 100 µl concentration. 
 In order to determined ROS and ɣ-H2AX levels on both B-16 melanoma and OV-90 cells, cells treated with variaous nanoemulsion concantration under 2 Gy and 8 Gy of radiation doses. Results showed that both B-16 melanoma and OV-90 ovarian cells ROS and ɣ-H2AX levels was increased with increasing nanoemulsion concantration and radiation doses. Especially that levels of OV-90 cell line was more higher compare the B-16 cell line. Approximately 5 and 6 fold higher ROS production and 5 fold and 3 fold higher ɣ-H2AX levels were determined in OV-90 cells compare to B-16 melanoma cells treated with 100 µl concentration for 2 Gy and 8 Gy radiation doses. It has been determined that B-16 melanoma and OV-90 ovarian cells exhibited different ɣ-H2AX levels and ROS production.
As a result of obtained data from this thesis, it was determined that ozonized oil nanoemulsion increased the cell damage and it can be a potential radiosensitizer on B-16 melanoma and OV-90 ovarian cell lines. It has been defined as an in vitro model that can be effectively used in cancer treatment.