Asetilkolinesterazın iletken tiyol-en'e kürlenebilen filmler üzerine immobilizasyonu ve ache biyosensörünün geliştirilmesi
Immobilization of acetylcholinesterase on films curable to conductive thiol-en and development of ache biosensor
Yazar: BUSE AKGÜL
Danışman: PROF. DR. AYŞE OGAN ; DR. ÖĞR. ÜYESİ EFE BATURHAN ORMAN
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Asetilkolinesteraz (AChE, EC 3.1.1.7), böcekler, kemiriciler ve insanların merkezi sinir sistemlerinde çok önemli bir nörotransmitter olan asetilkolin'i (ACh) asetat ve koline hidrolizlerler. AChE inhibitörleri bu işlevi engelleyeceği için merkezi sinir sisteminde asetil kolin sinapslarda birikir ve sürekli olarak parasempatik sinir sitemini uyarır. Bu aşırı uyarı sonucu diyare, kusma, pulmoner ödem, solunum güçlüğü ve tonik kasılma gibi belirtilerle başlayan zehirlenme, maruz kalmanın şiddetine bağlı olarak ölümle sonuçlanabilir. Pestisitlerin çoğunluğu geri dönüşümsüz (orgonofosfatlar) veya yarı geri dönüşümlü (karbamatlar) AChE inhibitörleridir. Pestisitlerin bilinçli ve yerinde kullanımı, hedeflenen zararlıların yok edilmesini sağlarken, öneriler doğrultusunda kullanılmadığı zaman gıdalarda yüksek oranda kalıntıya sebep olur. Bu gıdalarla beslenen insanlarda ve zehirlere maruz kalan çevredeki diğer canlılarda akut veya kronik zehirlenmeler görülür.  
Pestisitlerin saptanması için kullanılan enzim sensörlerinin çoğunluğunda AChE aktivitesindeki azalma ölçülmektedir. Örnek hazırlama basamağı içermemeleri, yüksek hassasiyetleri ve düşük maliyetlerinden dolayı biyosensörler önem kazanmışlardır. AChE aktivitesi ölçümü için biyosensör tasarımının ilk ve en kritik basamağını, enzimin bir sensör yüzeyine immobilizasyonu oluşturmaktadır. 
Çalışmamızda AChE enzimini kovalant olarak immobilize etmek için tiyol-en'e kürlenebilen tiyofen, destek materyali hazırlandı. Destek materyalinin immobilizasyon öncesi ve sonrası karakterizasyonu yapıldı. Enzimin %83.51 verimle yüzeye bağlandığı, serbest enzimin pH 6.5 ve 37ºC'de maksimum aktivite gösterdiği,  immobilize enzimin ise pH 7.5 ve 75ºC'de maksimum aktivite gösterdiği saptanmıştır. İmmobilize enzimin tekrar kullanımı incelendiğinde bağıl aktivitesinin 11. kullanımdan sonra yaklaşık %34 civarında sabit kaldığı, depolanma kararlılığının ise yüksek olduğu 60. gün sonunda enzimin aktivitesinin %59.49 'unu koruduğu görülmüştür.  Bu işlemlerin ardından, elektrokimyasal sensör uygulamasında kullanılmak üzere modifiye elektrotlarının geliştirilmesi aşaması gerçekleştirilmiştir. Modifiye elektrot yüzeyinde alınan elektrokimyasal sinyal sonucunda biyoalgılama ünitesi ve AChE'nin substratı arasında bir etkileşim olduğu gözlenmiştir.

Abstract:
Acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) hydrolyzes acetylcholine (ACh), a very important neurotransmitter into acetate and choline, in central nervous systems of insects, rodents and humans. As AChE inhibitors inhibit this function, acetyl choline accumulates in the synapses of the central nervous system and continuously stimulates the parasympathetic nervous system. Consequence of this excessive stimulation, intoxication, which starts with symptoms such as diarrhea, vomiting, pulmonary edema, respiratory distress and tonic spasm, may result in death depending on the severity of the exposure. The majority of pesticides are irreversible (orgonophosphates) or semi-reversible (carbamates) AChE inhibitors. Conscious and proper use of pesticides ensures the destruction of targeted pests but, when not used in accordance with the recommendations, foods are highly contaminated with pesticides. Acute or chronic poisoning is seen in people who eat these foods and other living things in the environment prone to these poisons are highly distracted.
The decrease in the AChE activity is measured in most of the enzyme sensors used to detect pesticides. Biosensors have gained importance due to lack of their sample preparation step, high sensitivity and low cost. The first and most critical step of the biosensor design for AChE activity measurement is the immobilization of the enzyme to an electrode surface.
In our study, a thiophene, curable to thiol-ene, support material was prepared to immobilize AChE enzyme by covalent attachment. The supporting material was characterized before and after immobilization. It was determined that the enzyme bound to the surface with 83.51% efficiency, the free enzyme showed maximum activity at pH 6.5 and 37ºC, while the immobilized enzyme showed maximum activity at pH 7.5 and 75ºC. Reusability of the immobilized enzyme was examined, it was observed that its relative activity remained constant around 34% after the 11th use, and its storage stability was high, and at the end of the 60th day, retained 59.49% of its activity. Following these processes, the stage of developing modified electrodes for use in electrochemical sensor application was carried out. As a result of the electrochemical signal received on the modified electrode surface, it was observed that there was an interaction between the biosensing unit and the substrate of the AChE.