Tütün (Nicotiana tabacum)'de kaetosinin kallus oluşumu üzerindeki etkisinin moleküler analizi
The molecular analysis of Chaetocin effects on callus induction in tobacco (Nicotiana tabacum)
Yazar: NAGİHAN TOMBUL
Danışman: PROF. DR. ŞULE ARI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Çok hücreli organizmaların farklılaşma (diferansiasyon) ve farklılaşmanın geriye dönüşümü (dediferansiasyon) süreçlerinde hala açıklığa kavuşturulamamış pek çok bilinmez mevcuttur. Bu süreçlerde DNA, hücre tipine bağlı olarak farklı genlerin anlatım yapabilmesi için kontrol sistemleri tarafından yönetilir. Seçimli gen anlatımı adı verilen bu kontrol sistemi, birçok mekanizmanın etkisi ile işlev görür. Bunlardan birisi olan epigenetik mekanizmalar, DNA'da dizi değişikliği olmaksızın gen anlatımında meydana gelen değişikliklerden sorumludur. Epigenetik mekanizmalar hayvansal ve bitkisel sistemde yüksek derecede homolojiye sahiptir. Hayvansal ve bitkisel organizmalarda diferansiyasyon ve dediferansiyasyon süreçleri ile ilişkili elemanlar arasında analoji bulunmaktadır. Bitkisel organizmalarda hayvansal kök hücrelere benzer bir hücre grubu olan kalluslar, diferansiasyon ve dediferansiasyon süreçlerinin aydınlatılması için temel bir çıkış noktasını oluşturmaktadır. Bu nedenle kalluslar, gelişim ve kanser gibi temel bilim çalışmaları için eşsiz bir materyal olmalarının yanısıra, bitki doku kültürü çalışmaları ve endüstriyel ölçekte tıbbi sekonder metabolitlerin üretiminde kullanımları ile de bitki biyoteknolojisi alanında büyük bir öneme sahiptir.  
Bu tez çalışmasında, memelilerde bir kimyasal yeniden programlama ajanı olarak kullanılan kaetosinin (Chaetosin, Ch) bitkilerde diferansiasyon ve dediferansiasyon süreçlerinde hayvanlardaki etkisine benzer bir etki gösterip göstermeyeceği hipotezi test edildi. Bu amaçla, bir mantar toksini olan Ch de, çimlenmiş Nicotiana tabacum bitkiciklerinin bitki gelişimi elde etmek üzere yetiştirildiği besiyerlerine eklenerek, bitki gelişimi izlendi. Daha önce memeli fibroblastlarından kök hücre oluşturma çalışmalarında uygulanan kaetosinin kök hücre verimini iki kat arttırdığı gözlenmiştir. Bu etkiyi Histon 3'ün 9. lizininin (H3K9) metillenmesinden sorumlu olan SUV39H1 histon metiltransferazını inhibe ederek gerçekleştirir. Bu enzimin mayalar ve bitkiler gibi diğer canlılardaki homoloğu enzimler, yüksek derecede korunmuş SET domenleri içermektedir. Kaetosinin bitkilerde de hayvansal sistemdekine benzer bir etki gösterip göstermediğinin ilk kez araştırıldığı bu tez çalışmasında, kaetosinin kallus oluşumunu %10 ve kallus boyutunu da %20 oranında arttırdığı gözlendi. Bitki gelişim aşamasında Ch uygulamasının muhtemelen H3K9 metilasyon düzeyindeki azalmaya neden olmasıyla, Ch uygulama grubuna ait bitkilerin kontrol grubunda yetiştirilen bitkilere göre daha küçük ve sararmış yapraklara sahip olduğu gözlendi. Buna ek olarak, Ch'in diferansiasyon sürecindeki etkisini belirlemek amacıyla, yaprak oluşumunda işlev gören AS1, YAB3, FIL, KAN1 genlerinin gen anlatımı analizi, qRT-PZR ile test edildi. Bu genlerin, Ch uygulaması yapılan grupta Ch uygulaması yapılmamış kontrol grubuna göre anlatımlarının sırasıyla %70, %45, %80 ve %25 oranında azaldığı saptandı. Farklılaşma ile ilişkili genlerin anlatımlarının azalması, dediferansiasyona gidişte bariyer görevi olabilecek genlerin etkisinin Ch uygulaması ile azaldığını göstermektedir. Bitki gelişiminden sorumlu ve aynı zamanda bitki kök hücrelerini barındıran bir yapı olan sürgün uç meristeminde kök hücrelerin oluşturulmasını ve devamlılığını kontrol eden WUS ve CLV3 genlerinin qRT-PZR ile gen anlatımı analizi Ch uygulaması yapılmış grupta kallus materyalinden gerçekleştirildi. Bu analiz sonucunda her iki genin Ch uygulaması sonucu anlatımlarının sırasıyla %85 ve %80 oranında azaldığı gözlendi. Kök hücre oluşumunda etkili olduğu düşünülen WUS ve CLV3 genlerinin anlatımlarının azalması ise, diferansiasyon sırasında H3K9 metillenmesi Ch ile baskılanmış olan bitki yapraklarından kallus gelişimi şeklindeki yeniden programlama sürecinde DNA metilasyonu ve küçük RNA'lar gibi diğer faktörlerin de etkili olabileceğini düşündürmüştür. 
Gerek hayvansal hücrelerde kök hücrelerin eş değeri olarak kabul edilen kallus verimini arttırması (dediferansiasyonu teşvik etmesi), gerek organ gelişiminin fizyolojik olarak gerilemesine yol açması (diferansiasyonu baskılaması), gerekse yaprak oluşum genlerinin anlatımında azalmaya neden olması, kaetosinin tütün bitkisinde hayvansal sistemdekine benzer etki gösterdiğini düşündürmüş ve bu sonuçlar tezin hipotezini önemli ölçüde doğrulamıştır. Ch'nin bu etkiyi memelilerdeki gibi H3K9 metillenmesini baskılayarak yaptığının gösterilmesi için ek deneylere gereksinim vardır. 
Hayvansal sistemde yeniden programlamada etkili epigenetik düzenleyicisi olan H3K9 metiltransferaz inhibitörü kaetosinin ilk kez bitkilerde uygulandığı bu tez çalışmasından elde edilen veriler, tütün bitkisinde genom dinamiği ve heterokromatin oluşumu mekanizmalarının anlaşılmasına katkı sağlayabilir.

Abstract:
There are many unknowns which" have not yet been revealed in the processes of differentiation and dedifferentiation of multicellular organisms. In these processes, DNA is governed by control systems so that different genes can be expressed depending on the cell type. One of these systems is the epigenetic mechanisms which is responsible for the changes that occur in gene expression patterns without sequence variation in DNA. Epigenetic mechanisms have a high degree of homology in animal and plant systems. There is an analogy between the elements associated with differentiation and dedifferentiation processes in animal and plant organisms. Calli, which are a cell group similar to animal stem cells in plant organisms, constitute a fundamental starting point for elucidation of differentiation and dedifferentiation processes. For this reason, calli are a unique material for basic scientific studies such as development and cancer, as well as plant tissue culture studies and their use in industrial scale for the production of medical secondary metabolites.
In this thesis, the hypothesis that whether chaetosin, used as an agent in mammals for chemical reprogramming, has an effect similar to that of animals in the differentiation and dedifferentiation processes in plants was tested. For this purpose, plant growth was monitored by adding a fungal toxin, chaaetosin, to germinated Nicotiana tabacum plantlets to obtain plant growth. Previously, it has been observed that chaetocin which is used in stem cell generation studies from mammalian fibroblasts increased the stem cell yield in 2 folds. This effect is achieved by inhibiting histone methyltransferase, SUV39H1, which is responsible for methylation of Histone 3 Lysine 9 (H3K9). Enzymes that are homologous to other living organisms such as yeasts and plants contain highly conserved SET dominants. In this thesis in which it is first investigated whether or not chaetosin has an effect similar to that of the animal system, it was observed that chaetosin increased callus formation by 10% and callus size by 20%. It was observed that the plants of the Ch threated group had smaller and yellowish leaves than the plants grown in the control group, as Ch threatment probably caused a decrease in the H3K9 methylation level during the plant developmental stage. In addition, gene expression analysis of AS1, YAB3, FIL1, and KAN1 genes functioning in leaf formation was tested with qRT-PCR to determine the effect of Ch in the differentiation process. According to the control group with no treatment of Ch, the expression of these genes decreased by 70%, 45%, 80% and 25%, respectively. Down regulation of genes associated with differentiation suggests that the effect of genes, which may be a barrier to dedifferentiation, is reduced by the treatment of Ch. In the shoot end meristem, which is responsible for plant development and as well as contains plant stem cells, gene expression analysis of WUS and CLV3 genes which control the formation and persistence of stem cells was performed from the callus material in the Ch treated group. As a result of this analysis, with Ch treatment, the expression of both genes decreased by 85% and 80%, respectively. Down regulation of WUS and CLV3 genes which is important factors in stem cell formation suggests that H3K9 methylation is not the only factor that affect differentiation and there is other factors such as DNA methylation and small RNAs which may also be effective in the reprogramming process of callus development from plant leaves suppressed by Ch.
The idea that chaetosin has an additive effect similar to that of the animal system suggests callus induction (promoting dedifferentiation), physiological regression of organ development (suppression of differentiation), or reduction of expression of leaf forming genes which confirm the thesis hypothesis to a significant extent. Additional experiments are needed to demonstrate that Ch exerts this effect by suppressing the methylation of H3K9 as in mammals.
The data obtained from the thesis study of chaetosin, which is applied for the first time in plants, as an effective inhibitors of H3K9 methyltransferase in reprogramming in the animal system, may contribute to understanding the mechanisms of genomic dynamics and heterochromatin formation in tobacco plants.