Tavşan gözlerinde metisilin dirençli staphylococcus aureus keratit modelinde intrastromal vankomisinin farklı tedavi dozlarının etkinliğinin karşılaştırılması
Comparison of the efficacy of different treatment doses of intrastromal vancomycin in A model of methicillin-resistant staphylococcus aureus keratitis in rabbit eyes
Yazar: ABDULLAH BAYRAK
Danışman: PROF. DR. SERDAL ÇELEBİ
Bolu Abant İzzet Baysal Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Göz = Eye ; Keratit = Keratitis ; Kornea = Cornea ; Metisilin = Methicillin ; Staphylococcus aureus = Staphylococcus aureus ; Tavşanlar = Rabbits ; Tedavi = Treatment ; Vankomisin = Vancomycin

Özet:
Bu çalışmada, metisilin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) etkenli bakteriyel keratit tedavisinde, korneal intrastromal vankomisinin farklı tedavi dozlarının etkinliklerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Bu amaçla 24 tavşanın sol göz kornea santraline 103 CFU içeren 0,1 mL MRSA suşları, 30 gauge enjektör ile intrastromal ekimi yapıldıktan sonra, her grupta altı adet olacak şekilde, tavşanlar 4 gruba ayrılmıştır. Keratit modeli oluşması için 24 saat beklenilmiştir ve tüm gruplarda keratit modeli oluştuğu gözlendikten sonra ikinci aşamaya geçilmiştir. Birinci gruptaki 6 göz kontrol grubu olarak kabul edilmiş ve intrastromal dengeli tuz solüsyonu uygulanmıştır. İkinci grup tavşanların sol kornealarına tek doz 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin; üçüncü grup tavşanların sol kornealarına tek doz 1 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin; dördüncü grup tavşanların sol kornealarına tek doz 2 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin enjeksiyonu yapılmıştır. Bu enjeksiyonlardan sonra 24 saat beklenilmiştir ve tavşanların hiçbirinde olası komplikasyon görülmemiştir. Sonrasında son safha olan ötenaziyi takiben vakumlu trepan yardımıyla kornealar çıkarılıp, mikrobiyoloji laboratuvarına gönderilmiştir.
Bakteriyel yük en fazladan en aza doğru şu şekilde sıralanmıştır; kontrol grubu (7,13±1,27 log10 CFU/g), 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin grubu (4,54±0.57 log10 CFU/g), 2 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin grubu (4,49±0.85 log10 CFU/g) ve 1 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin grubu (4,21±0.83 log10 CFU/g).
Çalışmamızdaki her bir kornea morfolojik olarak da incelenmiştir. Bu işlemi yaparken sekiz farklı parametre (kemozis, konjonktival injeksiyon, iritis, fibrin, hipopiyon, epitel erazyonu, korneal infiltrat, korneal ödem) klinik bir puanlama sistemi (0:yok; 1:minimal; 2: hafif; 3:orta; 4:ciddi) kullanılarak iki farklı gözlemci tarafından (A.B. ve Y.A.) değerlendirilmiştir. Puanlama işlemi sırasında hem dışarıdan morfolojik gözlem yolu hem de biyomikroskopi kullanılmıştır. Bu amaçla keratit modellemesi yapıldıktan sonraki 24.saatte (tedavi öncesi) ve 48.saatte (tedavi sonrası) sonuçları değerlendirilip kaydedilmiştir.
Bu skorlar, hem üç farklı intrastromal vankomisin dozlarını kendi aralarında hem de kontrol grubuyla karşılaştırılarak değerlendirilmiştir.
iii
Korneanın morfolojik inceleme sonuçları şu şekildedir; tedavi öncesi ve sonrası toplam klinik skorlar, dört farklı grup için ayrı ayrı değerlendirildiğinde; kontrol grubunun (tedavisiz grup) 48.saat toplam klinik skoru, 24.saat skoruna kıyasla, anlamlı şekilde artış göstermektedir.
Üç farklı tedavi grubunda ise tedavi sonrası toplam skor, tedavi öncesi toplam skorla karşılaştırılıp incelendiğinde sonuçlar şu şekildedir;
1) 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin tedavi grubu ile 1 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin grubunda anlamlı fark saptanmamıştır.
2) 2 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin tedavi grubunda ise 48.saat toplam klinik skoru, 24.saat toplam klinik skora göre anlamlı olarak artış göstermiştir fakat bu sonuçların 24. ve 48. saat bulguları yani erken dönem bulguları olduğu unutulmamalıdır.
Bunlara ek olarak, üç farklı tedavi dozunun, konjonktiva, kornea, iris ve ön kamara üzerindeki güvenliliğini sorgulamak için, yukarıda bahsedilen sekiz farklı parametreyi üç farklı tedavi grubu arasında ayrı ayrı değerlendirdik. Anlamlı sonuç şu şekildedir: 0,5 mg/0,1 mL, 1 mg/0,1 mL olmak üzere iki farklı intrastromal vankomisin dozu; iritis, ön kamarada fibrin, korneal ödeme neden olmazken, 2 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin dozu, iritis, ön kamarada fibrin, korneal ödem gibi durumlara diğer iki doza kıyasla anlamlı olarak daha fazla neden olmuştur. Burada vurgulamak istediğimiz nokta şudur ki; vankomisin etken maddesinin halihazırda korneal epitel, endotel hücrelerine ve ön kamarada fibrin, iritis gibi yan etkileri bilinmektedir. 2 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin dozu, bakteriyel yükü azaltması istatistiksel olarak anlamlı olsa da, korneal yan etkiler ortaya çıkardığı gösterilmiştir.
Sonuç olarak, tek doz 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin, tek doz 1 mg/0,1mL intrastromal vankomisin ve tek doz 2 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin olmak üzere bu üç farklı tedavi dozu, kontrol keratit grubuna kıyasla bakteriyel yükü anlamlı şekilde azalttığı ve tedavi edici gücü ortaya konulmuştur. Fakat korneaya olası yan etki açısından değerlendirildiğinde, tek doz 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin ve tek doz 1 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin uygulamalarının; tek doz 2 mg/0,1 mL vankomisin uygulamasına kıyasla istatistiksel olarak daha güvenli olduğu ortaya konulmuştur.
iv
Bu çalışmayla, 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin dozunun, 1 mg/0,1 mL vankomisine kıyasla daha az kimyasal etken madde ile istatistiksel olarak aynı etkinlik ve güvenlilik sağlanmasıyla, gelecek tedavilerde 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vankomisin dozunun kullanılmasının daha uygun olduğunu düşünmekteyiz.
Bu çalışma, MRSA etkenli bakteriyel keratit tedavisinde, korneal intrastromal vankomisin etkin dozaj karşılaştırma çalışması literatürdeki ilk deneysel çalışmadır. Mevcut kısıtlılıkları ile birlikte korneal intrastromal uygulama metodunun etkinlik ve güvenlik seviyelerinin gelecekte insan çalışmaları ile desteklenmesine ihtiyaç vardır.

Abstract:
In this study it has been aimed to compare the efficiencies of different treatment doses of corneal intrastromal vancomycin on keratitis treatment which is caused by Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)
For this purpose, rabbits have been divided into four groups, there are six rabbits in each group, after 0,1 mL MRSA strains which consist of 103 CFU are administered into left 24 eye santral corneas via 30 gauge enjector. It had been waited for emerging of keratitis model for 24 hours. After it is seen that the keratitis model are emerged in all the four groups. It has been passed the second stage. It has been accepted six eyes in first group as control group and balanced salt solution administered into these eyes. Single dose of 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vancomysin is administered into the left eye corneas in the second group. Single dose of 1 mg/0,1 mL intrastromal vancomysin is administered into the left eye corneas in the third group. Single dose of 2 mg /0,1 mL intrastromal vancomysin is administered into the left eye corneas in the fourth group. After these injecitons, it has been waited for twenty four hours and than none of these eyes are seen any possible complications. After following euthanasia that is last stage, the corneas have been sent to microbiology laboratuary by removing rabbit corneas with the help of vacuum trephine punch.
The bacterial load is listed as follows from most to least; control group (7,13±1,27 log10 CFU/g), 2 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin group (4,49±0.85 log10 CFU/g), 0,5mg/0,1 mL intrastromal vancomycin group (4,54±0.57 log10 CFU/g), 1 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin group (4,21±0.83 log10 CFU/g).
Every cornea has been evaluated also according to morphological in this study. While doing that, eight parameters (chemosis, conjunctival injection, iritis, fibrin, hypopyon, epithelial erosion, corneal infiltrate, corneal oedema) have been scored with the help of the clinical score system (0:absent 1:trace 2:mild 3:modarate 4:severe) by two different clinical observer (A.B. and Y.A.). While scoring these parameters, both morphological observation and biomicroscope have been used. For this purpose, the results of both twenty fourth (before treatment) and fourty eighth (after treatment) hours after keratitis modellings had been emerged have been evaluated and recorded
These scores have been evaluated by comparing both three different treatment doses in each other and with the control group.
vi
The results of the morphlogical assessments of the corneas are as follows; as the total clinical scores of both before and after treatment are evaluated separately for the four groups; the total clinical score of the fourty eighth hour of the control group (without any treatment group) have increased significantly in contrast to the twenty fourth hour of the control group
As the total clinical score which is after treatment is evaluated in the three different treatment groups by comparing with the total score which is before treatment, the results are as follows;
1) There were not found any significant result between 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin treatment group with 1 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin treatment group
2) The 48th hour total clinical score has increased in the 2 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin treatment group significantly in contrast to the 24th hour total clinical score. However, it should not be forgotten that these results which are the 24th hour and 48th hour are early period results
In addition to these, in order to examine safety of the three different treatment doses which are on the conjunctiva, cornea, iris and anterior chamber, we have evaluated separately the different eight parameters which are mentioned above among the three different treatment doses. The significant result is so that; the different two treatment doses such as 0,5 mg/0,1 mL, 1 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin have not caused significantly 'iritis', 'fibrin in anterior chamber', 'corneal oedema', but on the other hand, 2 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin has caused significantly 'iritis', 'fibrin in anterior chamber', 'corneal oedema' in contrast to the different two doses. At this point, we want to emphasize that it is already known about the side effects of the vancomycin active ingredient such as damage to corneal epithelial, endothelial cells and iritis, fibrin in the anterior chamber so on. Hence, it has been shown that 2 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin has caused corneal side effects, althought the reducing of the bacterial load of 2 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin is statistically significant.
As a result, it has been proved that the three different treatment doses which are single dose of 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin, single dose of 1 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin and single dose of 2 mg/0,1 mL intrastromal vankomycin have been reduced the bacterial load significantly and have been had the therapeutic effect comparing to control
vii
keratitis group. However, as it is evaluated according to the possible side effects on the cornea, the two different treatment single doses such as 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin and 1 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin have been proved that these two treament doses are significantly much more safer than 2 mg/0,1 mL vancomycin.
With the help of this study, we assume that the use of 0,5 mg/0,1 mL intrastromal vancomycin can be more appropriate for the following treatment models by providing be significantly same level of safety and efficiency with the much lower chemical drug ingredient in contrast to 1 mg/0,1 mL vancomycin.
This study of the comparing of the efficiency of the different treatment doses of the corneal intrastromal vancomycin on the MRSA strains related with bacteriel keratitis treatment is the first experimentel study in the literatüre. The efficiency and the safety of the corneal intrastromal administering method with its current limitations are needed to be supported by further human studies.