Denizel canlı kaynaklardan izole edilen glikozaminoglikanların insan glioblastoma U87MG hücreleri üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of glycosaminoglycans isolated from marine living resources on human glioblastoma U87MG cells
Yazar: NEBAHAT BUŞRA AKSOY
Danışman: DOÇ. DR. MURAT PEKMEZ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Endoplazmik retikulum stresi = Endoplasmic reticulum stress ; Glikozaminoglikanlar = Glycosaminoglycans ; Glioblastoma = Glioblastoma

Özet:
Kanser, yüksek mortalite oranlarıyla dünyada yaşanan ölümlerin nedenleri arasında ikinci sırada bulunan bir halk sağlığı sorunudur. Hücre bölünmesi, çoğalması ve apoptozu arasındaki homeostazinin bozulup, kontrolsüz hücre bölünmesi gibi mekanizmalarla ortaya çıkan kanser, bulunduğu dokuya göre akciğer, meme, beyin kanseri olarak isimlendirilir. Glioblastoma, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından belirlenen kriterlere göre yapılan sınıflandırılmada IV. derece astrositom olarak adlandırılmış dünya genelinde en hızlı ölüm oranına sahip beyin tümörleridir. Hızlı büyümesi, invazyon yapma yeteneği ve teşhis edildikten sonra yaklaşık 15 ay süre içerisinde ölüme sebebiyet vermeleri nedeniyle en agresif ve merkezi sinir sisteminin en yaygın malign beyin tümörü olarak bilinirler. 
Kanser gelişimi, metastazı, tümör büyümesi ve invazyon süreçleri boyunca kanser hücreleri ve tümör mikroçevresi arasında önemli etkileşimler gerçekleşmektedir. Tümör mikroçevresinin önemli bileşenlerinden olan ve kanser patagonezinde önemli rol oynayan hücre dışı matriste bulunan glikozaminoglikanlar (GAG), uzun ve dallanmamış tekrar eden disakkarit zincirlerinden oluşan doğrusal polisakkaritlerdir. Tekrar eden disakkarit birimlerini oluşturan monosakkaritlerin sülfatlanma durumuna göre negatif yüke sahip olan glikozaminoglikanlar, omurgalı ve omurgasızlarda hemen hemen her dokuda bulunurlar. Glikozaminoglikanların yapılarında bulunan disakkarit birimleri, N-asetil heksozamin ve bir üronik asit grubundan veya galaktozdan oluşur. 
Tekrar eden disakkarit birimin tipi ve ayrı sülfatlama modelleri gibi disakkarit birimlerinin posttranslasyonel modifikasyonları, GAG'ların heparan sülfat (HS)/heparin, kondroitin sülfat (CS), dermatan sülfat (DS), keratan sülfat (KS) ve hyalüronik asit (HA) olarak da bilinen hyalüronan olarak sınıflandırılmasına neden olur. 
Glikozaminoglikanlar kovalent olarak bağlandıkları proteinlerle oluşturdukları proteoglikan yapılar nedeniyle birçok biyolojik sürece katılan önemli heteropolisakkarit bileşikleridir. Büyüme faktörleri, kemokinler, proteinler, enzimler, enzim inhibitörleri ile etkileşimde bulunarak proliferasyon, hücre adezyonu, hücre migrasyonu, enflamasyon, koagülasyon, anjiyogenez gibi birçok biyolojik ve patolojik süreçte düzenleyici rol oynamaktadır. Buna ek olarak, glikozaminoglikanlar, metastaz, invazyon, tümör büyümesi, karsinogenez gibi kanserle ilişkili patolojik olaylarla kritik öneme sahiptir. Birçok patolojik ve fizyolojik süreçte etkileşimde bulunduğu moleküller ve proteinlere bağlanarak oluşturduğu proteoglikan yapılar sebebiyle glikozaminoglikanların, hastalıkların teşhisi için biyobelirteç veya tedavisi için terapötik olarak kullanılabileceği çeşitli araştırmalar sonunda ortaya konulmuştur.
Bu tez çalışmasının hedefi, denizel canlı kaynaklardan izole edilen glikozaminoglikanların insan glioblastoma hücreleri olan U-87MG hücre hattı üzerindeki etkilerinin apoptoz ve endoplazmik retikulum stresi (ER stress) açısından araştırılmasıdır. Tez kapsamında yapılan çalışmanın ilk basamağında, levrek balığı (Dicentrarchus labrax) pullarından izole edilen glikozaminoglikanların hesaplanan farklı konsantrasyonlarda U-87MG insan glioblastoma hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkileri incelenmiştir. Uygulanan glikozaminoglikanların uygulama dozu ve süresi arttıkça sitotoksik etkinin de arttığı bulunmuştur. MTT testi sonucu hücre canlılığı üzerinde %19.60 ve %52.35 oranında etkiye sahip olduğu belirlenen 600 µg/mL ve 1000 µg/mL dozlarının hücre migrasyonu üzerindeki etkilerinin araştırılması için in vitro çizik deneyleri uygulanmıştır. Migrasyon testi analizi sonuçları, GAG'ın glioblastoma hücre hattı U-87MG hücrelerinde önemli ölçüde migrasyonu azalttığını gösterdi.
Uygulanan maddenin apoptotik etkisini belirlemek için Hoechst-33342/Propidium iyodür (HO/PI) floresan boyaması yapılmıştır. Apoptoz belirteci ve endoplazmik retikulum stresi (ER stres) marker proteinlerinin anlatım seviyeleri bir immünoblotlama metodu olan Western blot yöntemi uygulanarak belirlenmiştir. Floresan mikroskop altında glikozaminoglikanlar uygulandıktan sonra yapılan analizler ile apoptotik hücre sayısının maddenin artan dozlarında daha fazla olduğu ortaya konulmuştur. Western blot analizi yapıldıktan sonra, apoptoz ve ER stresi ile ilişkilendirilen proteinlerin anlatım seviyelerine ait veriler analiz edilmiştir. Elde edilen veriler sonucunda, apoptoz, DNA onarımı ve ER stres ile ilişkilendirilen proteinlerin anlatım seviyelerinin doz arttıkça arttığı bulunmuştur. Buna bağlı olarak, denizel canlı kaynaklardan elde edilen glikozaminoglikanların artan dozlarının U-87MG glioblastoma hücrelerinde apoptoz ve ER stresi indüklediği tespit edilmiştir. Bu çalışmanın sonucunun, glioblastoma tedavisi için glikozaminoglikanların geliştirilebilecek doğal terapötiklerden biri olabilmeleri için literatüre katkı sağlaması beklenmektedir.

Abstract:
Cancer is a public health problem that ranks second among the causes of death in the world with its high mortality rates. Cancer that arises through mechanisms such as uncontrolled cell division, where the homeostasis between cell division, proliferation and apoptosis is disrupted, is called lung, breast, and brain cancer depending on the tissue it is found in. Glioblastoma is classified according to the criteria set by the World Health Organization (WHO), Grade IV astrocytoma is the brain tumor with the fastest death rate worldwide. They are known as the most aggressive and the most common malignant brain tumor of the central nervous system due to their rapid growth, ability to invade and cause death within about 15 months after diagnosis.
Important interactions occur between cancer cells and the tumor microenvironment during the processes of cancer development, metastasis, tumor growth, and invasion. The glycosaminoglycans (GAGs) in the extracellular matrix, which are important components of the tumor microenvironment and play an important role in cancer pathogenesis, are linear polysaccharides consisting of long and unbranched repeating disaccharide chains. Glycosaminoglycans, which have a negative charge according to the sulfation state of the monosaccharides that make up the repeating disaccharide units, are found in almost every tissue in vertebrates and invertebrates. The disaccharide units found in the structures of glycosaminoglycans consist of N-acetyl hexosamine and a uronic acid group or galactose.
Posttranslational modifications of disaccharide units, such as the type of repeating disaccharide unit and discrete sulfation patterns, suggest GAGs as heparan sulfate (HS)/heparin, chondroitin sulfate (CS), dermatan sulfate (DS), keratan sulfate (KS), and hyaluronic acid (HA) also known as hyaluronan.
Glycosaminoglycans are important heteropolysaccharide compounds that participate in many biological processes due to the proteoglycan structures they form with the proteins to which they are covalently bound. It plays a regulatory role in many biological and pathological processes such as proliferation, cell adhesion, cell migration, inflammation, coagulation, angiogenesis by interacting with growth factors, chemokines, proteins, enzymes, enzyme inhibitors. In addition, glycosaminoglycans are critical with cancer-related pathological events such as metastasis, invasion, tumor growth, carcinogenesis. Various studies have revealed that glycosaminoglycans can be used as biomarkers for the diagnosis of diseases or therapeutically for the treatment of diseases due to the proteoglycan structures formed by binding to the molecules and proteins with which they interact in many pathological and physiological processes.
The aim of this thesis study is to investigate the effects of glycosaminoglycans isolated from marine living resources on human glioblastoma cells, the U-87MG cell line, in terms of apoptosis and endoplasmic reticulum stress (ER stress). In the first step of the study conducted within the scope of the thesis, the effects of glycosaminoglycans isolated from sea bass fish (Dicentrarchus labrax) scales on the viability of U-87MG human glioblastoma cells at different calculated concentrations were investigated. It was found that the cytotoxic effect of the applied glycosaminoglycans increased as the application dose and duration increased.  Migration assay analysis showed that GAG significantly reduced migration in glioblastoma cell line U-87MG cells.
Hoechst-33342/Propidium iodide (HO/PI) fluorescent staining was performed to determine the apoptotic effect of the applied substance. Expression levels of apoptosis marker and endoplasmic reticulum stress (ER stress) marker proteins were determined by applying Western blot method, which is an immunoblotting method. The analyzes performed after the application of glycosaminoglycans under a fluorescent microscope revealed that the number of apoptotic cells was higher at increasing doses of the substance. After western blot analysis, data on expression levels of proteins associated with apoptosis and ER stress were analyzed. As a result of the obtained data, it was found that expression levels of proteins associated with apoptosis, DNA repair and ER stress increased as the dose increased. Accordingly, increasing doses of glycosaminoglycans obtained from marine living resources were found to induce apoptosis and ER stress in U-87MG glioblastoma cells. The result of this study is expected to contribute to the literature so that glycosaminoglycans can be one of the natural therapeutics that can be developed for the treatment of glioblastoma.