Kolorektal karsinomalarda DNA yanlış eşleşme onarım genlerinin immünohistokimyasal yolla analizi
Immunohistochemical analysis of dna mismatch repair genes in colorectal carcinomas
Yazar: MÜMİNE GÖRMEZ
Danışman: PROF. DR. REŞİT DOĞAN KÖSEOĞLU
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: DNA = DNA ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Karsinoma = Carcinoma ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Polipler = Polyps ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Kolorektal kanserler (KRCa'lar) bugün için bildiğimiz üç farklı majör moleküler yolaktan gelişmektedir. Bu yolaklardan biri olan mikrosatellit instabilite (MSI) yolağı, DNA yanlış eşleşme tamir genlerinin (MSH2, MSH6, MLH1, PMS2) defektiyle karakterize olup tüm KRCa'ların yaklaşık %15'inden sorumludur. MSI gelişen KRCa'ların klinikopatolojik özellikleri, prognozu ve tedavisi mikrosatellit stabil tümörlerden farklıdır. MSI, serrated neoplazi yolağı ve Lynch sendromu olgularındaki kolorektal prekürsör lezyonlarda da tanımlanmıştır. Çalışmamızın amacı, kendi KRCa ve kolorektal polip olgularımızda DNA yanlış eşleşme tamir (MMR) gen ekspresyonlarını immünohistokimyasal yolla analiz etmek ve KRCa olgularında gen ekspresyon durumlarının klinikopatolojik parametreler ile olası ilişkilerini ortaya çıkarmaktı.  
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı arşivinde yer alan toplam 75 KRCa olgusu ile 20 hiperplastik polip (HP), 20 serrated polip (SP), 20 düşük dereceli displazili adenomatöz polip (DDAP) ve 20 yüksek dereceli displazili adenomatöz polip (YDAP) olgusu çalışmaya dâhil edildi. Tümör dışı nedenlerle kolonoskopi yapılmış 15 olguya ait normal sınırlarda kolon mukoza örneği kontrol grubu (KG) olarak belirlendi. KRCa grubu kendi içinde gruplara ayrıldı. Buna göre; 15 olguluk desendan kolon nonmüsinöz adenokarsinoma (DKNMCa), 14 olguluk desendan kolon müsin depozisyonlu adenokarsinoma (DKMCa), 15 olguluk asendan kolon nonmüsinöz adenokarsinoma (AKNMCa), 15 olguluk asendan kolon müsin depozisyonlu adenokarsinoma (AKMCa) ve 16 olguluk neoadjuvan tedavi almış adenokarsinoma (ATCa) grupları oluşturuldu. Çalışma toplam 170 olgu üzerinde gerçekleştirildi. KRCa olgularının klinikopatolojik verileri patoloji rapor arşivimiz ve hastane otomasyon sisteminden elde edildi. KRCa olgularında standart olarak raporladığımız klinikopatolojik verilere ek olarak Crohn benzeri reaksiyon, müsinöz komponent yüzdesi ve taşlı yüzük hücre komponenti de değerlendirilerek analizlere alındı. Tüm KRCa ve polip olgularının arşivden elde edilen parafin blok ve boyalı preperatları tekrar gözden geçirildi. Seçilen bloklardan hazırlanan kesitlere, tam otomatik immünohistokimya cihazında MSH2, MSH6, MLH1 ve PMS2 immünohistokimyasal analizleri uygulandı. İstatistiksel analizde iki ortalama arasındaki farkın önemlilik testi, tek yönlü varyans analizi ve ki-kare testlerinden yararlanıldı. İstatistiksel anlamlı korelasyon p<0,05 durumunda kabul edildi. Hesaplamalarda hazır istatistik yazılım programı kullanıldı (SPSS 22.0 Chicago, IL, USA).
Genel KRCa grubunda erkek/kadın oranı 1,5, ortalama yaş 65,1 ve ortalama tümör çapı 49,1 mm olarak saptandı. KRCa grubumuzda MSH2, MSH6, MLH1 ve PMS2 ekspresyon kayıpları sırasıyla %11,8, %9,6, %40,9 ve %33,9 oranlarında izlendi. MSH2/MSH6 ve MLH1/PMS2 birlikte ekspresyon kayıpları sırasıyla %8,8 ve %31 oranlarında görüldü. MMR proteinlerinin büyük kısmı için (MSH2, MSH6, PMS2 ve MSH2/MSH6), sağ kolon müsinöz komponentli tümörlerde (AKMCa) en yüksek oranda ekspresyon kaybı (sırasıyla %35,7, %35,7, %66,7 ve %35,7) izlendi (p<0,05). PMS2, MSH2/MSH6 ve MLH1/PMS2 ekspresyon kaybı anlamlı şekilde daha sık sağ kolon tümörlerinde görüldü (p<0,05). MSH6 ekspresyon kayıplı tümörler daha büyük ortalama çapa (64,4 mm'ye karşın 47 mm) sahipti (p<0,05). PMS2 ve MLH1/PMS2 ekspresyon kaybı gösteren tümörler düşük dereceli diferansiyasyon göstermeye daha eğilimli idi (p<0,05). MMR ekspresyon kayıplı tümörlerde ekstrasellüler müsin, Crohn benzeri reaksiyon ve taşlı yüzük hücre komponenti içeren olguların oranı daha yüksekti. Tüm MMR proteinleri için ekspresyon kaybı, gruplar arasında anlamlı farka sahipti (hepsi için; p<0,05). En yüksek MSH2, MSH6, PMS2, MSH2/MSH6 ve MLH1/PMS2 ekspresyon kayıpları AKMCa grubunda (sırasıyla; %35,7, %35,7, %66,7, %35,7 ve %66,7), en yüksek MLH1 ekspresyon kaybı ATCa grubunda (%60) görüldü. Polipler içinde en yüksek MSH2 ve MSH6 ekspresyon kaybı SP grubunda (her ikisi için de %10) izlenirken en yüksek MLH1, PMS2 ve MLH1/PMS2 ekspresyon kayıpları YDAP grubunda (sırasıyla; %15,8, %10 ve %5,9) saptandı. En yüksek MSH2/MSH6 ekspresyon kaybı ise %5,6 ile SP ve YDAP gruplarında saptandı. Kontrol grubumuzda da ekspresyon kayıpları dikkat çekiciydi (MSH6, MLH1 ve PMS2 için sırasıyla; %6,7, %7,1, %9,1). 
Çalışmamızın sonuçları genel olarak kolorektal neoplazmlarda MMR protein ekspresyon kaybı açısından literatürle uyumlu olmakla beraber bazı farklılıklar da göstermekteydi. Öncelikli olarak, özellikle MLH1 ve PMS2 ekspresyon kayıp oranlarımız literatüre göre çok yüksek değerlerde idi. Sağ kolon müsinöz komponentli tümörlerde en yüksek oranda MMR protein ekspresyon kaybı görülürken, tümör çapı artışı, müsin içeriği, taşlı yüzük hücre komponenti ve Crohn benzeri reaksiyon daha sıklıkla MMR ekspresyon kaybı gösteren tümörlerde sık saptanan bulgulardı. Buna karşın histolojik diferansiyasyon derecesinin, literatürün aksine, MMR kayıplı tümörlerimizde daha düşük dereceli olduğu görüldü. Serimizde polip gruplarındaki MMR ekspresyon kayıpları, literatürle uyumlu şekilde, genel olarak karsinomlara göre (özellikle sağ kolon müsinöz komponentli tümör grubu için geçerli) daha düşük oranlarda izlendi. Literatürdeki MSI-H tümörler ile ilişkili histopatolojik özelliklerin genel olarak bizim olgularımız için de geçerli olduğunu söyleyebiliriz. Ayrıca serimizde (kontrol grubu dâhil) MMR ekspresyon kayıplarının daha yüksek oranlarda olmasının teknik nedenlerden kaynaklandığı görülmektedir. Özellikle doku fiksasyonundaki daha iyi standardizasyonun literatürle daha tutarlı sonuçlar verebileceği anlaşılmaktadır.

Anahtar kelimeler: kolorektal karsinoma, polip, MSI, MMR protein ekspresyonu, immünohistokimya.

Abstract:
Colorectal cancer/cancers (CRCa/CRCas) develop through three different major molecular pathways that we know today. One of these pathways, the microsatellite instability (MSI) pathway, is characterized by defects in DNA mismatch repair genes (MSH2, MSH6, MLH1, PMS2) and is responsible for approximately 15% of all CRCas. Clinicopathological features, prognosis and treatment of CRCas developing via by MSI are different from microsatellite stable tumors. MSI has also been described in serrated neoplasia pathway and colorectal precursor lesions in Lynch syndrome cases. The aim of our study was to analyze immunohistochemically DNA mismatch repair (MMR) gene expressions in our cases of CRCa and polpy and to reveal possible relationships between the gene expression statuses and clinicopathological parameters in CRCa cases.
From the archive of Tokat Gaziosmanpaşa University Faculty of Medicine, Department of Pathology, 75 CRCas, 20 hyperplastic polyps (HP), 20 serrated polyps (SP), 20 low-grade dysplasia adenomatous polyps (LDAP), and 20 high-grade dysplasia adenomatous polyps (HDAP) cases were included in the study. Colonic mucosa samples within normal limits of 15 patients who underwent colonoscopy for non-tumor reasons was determined as the control group (CG). The CRCa group was divided into groups within itself. According to this; 15 cases of descending colon nonmucinous adenocarcinoma (DCNMCa), 14 cases of descending colon adenocarcinoma with mucin deposition (DCMCa), 15 cases of ascending colon nonmucinous adenocarcinoma (ACNMCa), 15 cases of ascending colon adenocarcinoma with mucin deposition (ACMCa), and 16 cases of neoadjuvant treated adenocarcinoma (ATCa) ) groups were created. The study was carried out on a total of 170 cases. Clinicopathological data of CRCa cases were obtained from our pathology report archive and hospital automation system. In addition to the clinicopathological data we reported as standard in CRCa cases, Crohn's-like reaction, mucinous component percentage and signet ring cell component were also evaluated and included in the analysis. Paraffin blocks and stained preparations obtained from the archive of all KRCa and polyp cases were reviewed. MSH2, MSH6, MLH1 and PMS2 immunohistochemical analyzes were performed on the sections prepared from the selected blocks in a fully automatic immunohistochemistry device. Significance test of the difference between two means, one-way analysis of variance and chi-square tests were used in statistical analysis. Statistically significant correlation was accepted at p<0.05. A ready-made statistical software program was used for the calculations (SPSS 22.0 Chicago, IL, USA).
In the general CRCa group, the male/female ratio was 1.5, the mean age was 65.1 years, and the mean tumor diameter was 49.1 mm. In our CRCa group, MSH2, MSH6, MLH1 and PMS2 expression losses were observed at the rates of 11.8%, 9.6%, 40.9% and 33.9%, respectively. Co-expression losses of MSH2/MSH6 and MLH1/PMS2 were seen at rates of 8.8% and 31%, respectively. For the majority of MMR proteins (MSH2, MSH6, PMS2 and MSH2/MSH6), the highest rates of expression losses in tumors with a right colon mucinous component (ACMCa) (35.7%, 35.7%, 66.7% and 35.7%, respectively) were observed (p<0.05). Losses of PMS2, MSH2/MSH6 and MLH1/PMS2 expressions were seen significantly more frequently in right colon tumors (p<0.05). Tumors with loss of MSH6 expression had a larger mean diameter (64.4 mm vs. 47 mm) (p<0.05). Tumors showing loss of PMS2 and MLH1/PMS2 expression were more prone to low-grade differentiation (p<0.05). The rates of cases with extracellular mucin, Crohn's-like reaction and signet ring cell component were higher in tumors with loss of MMR expression. The losses rates of all MMR expressions were significantly different between groups (for all; p<0.05). The highest MSH2, MSH6, PMS2, MSH2/MSH6 and MLH1/PMS2 expression losses were in the ACMCa group (35.7%, 35.7%, 66.7%, 35.7% and 66.7%, respectively) while the highest MLH1 expression loss was seen in the ATCa group (60%). Among polyps, the highest losses of MSH2 and MSH6 expression were observed in the SP group (10% for both), while the highest expression losses of MLH1, PMS2 and MLH1/PMS2 were found in the HDAP group (15.8%, 10% and 5.9%, respectively). The highest loss of MSH2/MSH6 expression was found in the SP and HDAP groups with 5.6%. The expression losses were also remarkable in our control group (6.7%, 7.1%, 9.1% for MSH6, MLH1 and PMS2, respectively).
The results of our study were generally compatible with the literature in terms of loss of MMR protein expression in colorectal neoplasms, but also showed some differences. First of all, our rates of MLH1 and PMS2 expression losses were very high compared to the literature. The highest rate of loss of MMR protein expression was observed in right colon tumors with mucinous component, while increased tumor diameter, mucin content, signet ring cell component, and Crohn's-like reaction were observed in higher rates in tumors with MMR expression loss. On the other hand, the degree of histological differentiation was found to be lower in our tumors with MMR loss, contrary to the literature. In our series, MMR expression losses in polyp groups were generally lower than carcinomas (especially in the right colon tumors with mucinous component) consistent with the literature. We can say that the histopathological features associated with MSI-H tumors in the literature are generally valid for our cases as well. In addition, the higher rates of MMR expression losses in our series (including the control group) seem to be due to technical reasons. In particular, it is understood that better standardization of tissue fixation can yield more consistent results with the literature.

Key words: colorectal carcinoma, polyp, MSI, MMR protein expression, immunohistochemistry.