Monoamin oksidaz enzimleri için önerilen hidrür mekanizmasının enzim aktif bölgesinde modellenmesi
Computational modeling of proposed hydride transfer mechanism in the active site of monoamine oxidase enzymes
Yazar: MEHMET ALİ AKYÜZ
Danışman: PROF. DR. SAFİYE (SAĞ)  ERDEM
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Organik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Biyokimya = Biochemistry ; Fizikokimya = Physical chemistry ; Kuantum kimyası = Quantum chemistry ; Organik kimya = Organic chemistry

Özet:
Monoaminoksidazlar (MAO-A ve MAO-B), nörotransmitteraminlerin oksitlenmesinde görevli önemli flavoenzimlerdir. Depresyon, Parkinson, Alzeimer gibi hastalıkların tedavisinde MAO inhibitörleri kullanıldığından mekanizmaları merak konusudur. MAO mekanizmasıyla ilgili çeşitli önerilere hem destekleyici hem de karşıt deliller bulunduğundan hiçbiri tam olarak kanıtlanamamıştır. 
Bu tezde kuantum mekanik (QM) yöntemlerle MAO reaksiyon mekanizmasını aydınlatmak hedeflenmiştir. Önerilen direk hidrür transferi mekanizması benzilamin ve fenetilamin substratlarıyla MAO-A ve MAO-B aktif bölgelerinin yaklaşık 300 atomluk bölümü kullanılarak modellenmiştir. ONIOM yaklaşımı ile birinci katmanda yoğunluk fonksiyoneli teorisi (DFT), ikinci katmanda yarı-deneysel PM6 yöntemi uygulanarak QM/QM optimizasyonları yapılmış ve reaksiyon koordinatları oluşturulmuştur. Sonuçlar 3 bölümde özetlenebilir:
1-	Yöntemlerin karşılaştırılması: Birinci katmana uygulanan 4 farklı DFT fonksiyoneli (B3LYP, B97X-D, CAM-B3LYP, M06-2X) kullanılarak elde edilen ONIOM Gibbs serbest aktivasyon enerjileri ve reaksiyon enerjileri karşılaştırılmıştır. Dispersiyon etkisini hesaplamalara katan M06-2X ve B97X-D ile B3LYP arasında önemli bir farklılık gözlenmemiştir. Ancak, ONIOM (M06-2X/6-31+G**: PM6) hesaplamaları MAO-A'nın tek basamaklı, MAO-B'nin ise çok basamak içeren farklı mekanizmalara sahip olabileceğini göstermiştir. 
2-	Su moleküllerinin etkisi: Aktif bölge kristal suları substrat, flavin ve aminoasitlerle çok sayıda hidrojen bağı yaparak aktif bölge aminoasitlerinin konumunu belirlemektedir. Ayrıca ara ürün kararlılığını etkileyerek reaksiyon mekanizmasının basamak sayısını da değiştirebildikleri görülmüştür. Hesaplamalara temsili olarak ilave edilen solvent etkisi aktivasyon enerjisini önemli ölçüde etkilemediğinden hesaplamalara dahil edilen aktif bölge aminoasitlerinin ve suların enzimi modellemede yeterli olduğu sonucuna varılmıştır. 
3-	Hidrür/ proton transferi karşılaştırılması: Reaksiyon sırasında substrattan flavine göç eden hidrojenin hidrür mü yoksa proton mu olduğu elektron yoğunlukları ve yapı-aktivite ilişkileri incelenerek araştırılmıştır. Ancak, ikisi arasında kesin ayrım yapılamadığından ileride daha detaylı araştırmaların yapılması ihtiyacı doğmuştur.

Abstract:
Monoamine oxidases (MAO-A and MAO-B) are important flavoenzymes which are responsible for the oxidation of neurotransmitter amines. Understanding the catalytic mechanism of MAO is of great interest because MAO inhibitors are used in the treatment of depression, Parkinson and Alzheimer diseases. Various MAO mechanisms have been proposed so far but none of them has proven yet.
The aim of this thesis is to enlighten the reaction mechanism of MAO by using quantum mechanics (QM) methods. The direct hydride transfer mechanism was modeled with benzylamine and phenethylamine substrates in the active site of MAO-A and MAO-B which consist of about 300 atoms. Reaction coordinate structures were optimized using QM/QM calculations via ONIOM approach. Density functional theory (DFT) and semiemprical PM6 methods were employed for the high-layer and low-layer, respectively. Results can be summarized in 3 sections: 
1.	Comparison of methods: ONIOM Gibbs free activation and reaction energies obtained from 4 different DFT functionals (B3LYP, B97X-D, CAM-B3LYP, M06-2X) for high-layer were compared. No significant difference was observed between B3LYP and dispersion-corrected methods (B97X-D, M06-2X). However, ONIOM(M06-2X/6-31+G**: PM6) calculations revealed that MAO-A and MAO-B may follow one-step and multi-step mechanisms, respectively; suggesting that different mechanisms might be possible for MAO-A and MAO-B.
2.	Effect of water molecules: Crystal water molecules in the active site determine the location of active site amino acids by numerous hydrogen bonding interactions. Additionally, they can alter reaction mechanism by influencing the stability of transition state, intermediates and products. Activation energy was not influenced significantly by the implicit solvent effect which indicated that the size of the system and the number of water molecules used were sufficient for modeling the catalytic reaction.
3.	Comparison of hydride and proton transfer: Electron densities and structure-activity relationships were examined in order to determine whether the transferred hydrogen (from substrate to flavin) migrates as a proton or as a hydride. However, clear distinction of the two mechanisms could only be possible by more detailed calculations in the future.