Karbonik anhidraz 9 geninin transkripsiyonel kontrolünün moleküler analizi
Molecular analysis of transcriptional regulation of carbonic anhydrase 9 gene
Yazar: HATİCE YILDIRIM
Danışman: DOÇ. DR. FERAY KÖÇKAR
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Transmembran karbonik anhidraz enzimlerinden olan CAIX, tümör metabolizması ile ilişkili olarak bilinen en önemli enzimlerden biridir. CAIX tümörlü hücrelerin hücre içi ve hücre dışı pH düzenlenmesini sağlayarak hipoksik ve asidik koşullara adaptasyonunu sağlar. Özellikle katı tümörlerdeki CAIX ekspresyonu, tümörün tanısı ve prognozu hakkında bilgi vermesi nedeniyle bu enzimin biyobelirteç olarak kullanılmasına izin vermektedir.Bu nedenle tümör biyolojisinde önemli olan CA9 geninin regülasyonun aydınlatılması oldukça önemlidir. Bu çalışmada, insan CA9 geninin promotor bölgesi [-1251/+38] klonlanmış ve dizi analizi ile doğrulanmıştır. Transkripsiyonel aktivitenin detaylı analizi için dört farklı uzunlukta [-935/+38, -466/+38, -266/+38 ve -116/+38] kısaltılarak yapılan promotor parçaları hazırlanmış ve lusiferaz vektörüne klonlanmıştır. Transkripsiyonel aktivitenin belirlenmesi için, hazırlanan promotor mutantlarının hepatoma (Hep3B) hücrelerinde geçici transfeksiyon analizleri yapılmıştır. Sonuç olarak en küçük promotor parçasının [-116/+38] bazal aktivite için yeterli olduğu bulunmuştur. [-266/38] ve [-1251/+38] bölgelerini kapsayan promotor parçaları en yüksek transkripsiyonel aktiviteyi gösterirken, [-466/+38] bölgesini kapsayan promotor parçası ise en düşük aktivite göstermiştir.Ayrıca Hep3B hücrelerinde TGF-ß ve IL-6 sitokinlerinin CA9 mRNA seviyesine etkileri belirlenmiştir. RT-PZR çalışmaları sonucunda, TGF-ß uygulamasının 72 saatte CA9 mRNA seviyesinde yükselmeye sebep olduğu gözlemiştir. IL-6 uygulamasının ise 24, 48 ve 72 saatte CA9 mRNA seviyesinde anlamlı bir etkisi bulunmamıştır. Yine TGF-ß sitokinin CAIX protein seviyesindeki etkisi akış sitometri analizi ile belirlenmiştir. mRNA seviyesindeki artış ile bağlantılı olarak CAIX protein ifadesinde 72 saatte artış bulunmuştur. Son olarak TGF-ß'nın CA9 geninin transkripsiyonel aktivitesini arttırdığı, beş farklı uzunluktaki promotor parçalarının transfekte edildiği hücrelere TGF-ß uygulanması ile belirlenmiştir.ANAHTAR SÖZCÜKLER: CAIX, transkripsiyonel kontrol, kanser, Hep3B, sitokin, klonlama, TGF-ß.

Abstract:
Membrane-associated carbonic anhydrase CAIX is one of the most important enzyme, that is related to tumor metabolism. CAIX exerts its biological effects to adaptation of hypoxia and asidification in tumor cells, via its influence on regulation of intracellular and extracellular pH. Specifically the expression pattern of CAIX in solid tumors has led to the use of CAIX as a biomarker, since it can provide evidence about tumor identification and prognosis.Therefore, it is so important to evaluate the regulation of CA9 gene that it is so crucial in tumor biology. In this work, the promoter region [-1251/+38] of CA9 gene was cloned and confirmed by sequence analyzer. Four truncated constructs were prepared for detailed analysis of transcriptional activation and subcloned to lucifease reporter vector. Transient transfection analysis has performed in hepatoma cell line Hep3B using promoter mutants for determination of transcriptional activity. As a result, the smallest construct [-116/+38] was enough to exhibit the basal transcriptional activity. while [-266/38] and ([1251/+38] promoter constructs have the maximum transcriptional activity, [-466/+38] promoter construct has the minimum activity.Furthermore, we have determined the effects of TGF-ß and IL-6 on mRNA levels of CA9 expression in Hep3B cells. As a result of RT-PCR analysis, TGF-ß has increased the CA9 mRNA levels at 72 hours after stimulation, while IL-6 has no statistically important effect on CA9 mRNA levels at any time. We have also determined the the effect of TGF-ß on protein levels of CAIX by flow cytometry. In concordance with the increase at mRNA level, CAIX protein level was increased by TGF-ß at 72h. Finally, the increase of transcriptional activity of CA9 by TGF-ß was also evaluated by transfecting all truncated constructs to Hep3B cells and then stimulating by TGF-ß.KEYWORDS: CAIX, transcriptional regulation, cancer, Hep3B, cytokine, cloning, TGF-ß.