Aydın ili ve çevresindeki sıcak su kaynaklarında arke çeşitliliğinin belirlenmesi
Determination of archaeal diversity of hot water sources inAydin
Yazar: RÜMEYSA GÜLSU ÖZKAN
Danışman: PROF. DR. GAMZE BAŞBÜLBÜL
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyoçeşitlilik = Biodiversity ; Gen klonlama = Gene cloning ; Halofilik archaea = Halophilic archaea

Özet:
Canlıların üç büyük domaininden birini oluşturan arkeler gerek biyokimyasal özellikleri gerekse yapısal özellikleri bakımından hem ökaryotlar hem de bakterilerden ayrılan prokaryotik hücre tipinde canlılardır. Arkelerin büyük çoğunluğu ekstrem ortam koşullarında metabolik ve moleküler adaptasyonları sayesinde hayatta kalabilmektedirler. Arke türlerinin saf kültürlerinin izole edildiği tipik ortamlar; kaplıcalar, hidrotermal bacalar, solfataralar, tuz gölleri, soda gölleri gibi habitatlardır. Son yıllarda, çevresel örneklerdeki 16S rRNA genlerinin PCR-bazlı amplifikasyonunu içeren moleküler tekniklerin kullanılması, kültürden bağımsız bir mikrobiyal çeşitlilik değerlendirmesine izin vermiştir. Bu çalışmada Aydın ili ve çevresindeki sıcak su kaynaklarındaki arkeal çeşitliliğinin kültürden bağımsız yöntemler kullanılarak araştırılması amaçlanmıştır. Su, çamur ve birikinti örneklerinden total DNA izolasyonu yapılmış ve sonrasında, arke domainine spesifik primerler kullanılarak PCR yöntemi ile 16S rRNA gen bölgesi çoğaltılmıştır. Amplikonlar puc19 plazmidine yerleştirildikten sonra E.coli DH10B suşuna transformasyon yoluyla aktarılmıştır. Beyaz koloniler seçilerek, M13 primerleriyle PCR reaksiyonları kurulmuş ve elde edilen 16S rDNA amplikonlarının dizileri belirlenerek veri tabanındaki diğer prokaryotlarla olan benzerlik oranları saptanmıştır. Çalışmamızda bir tanesi kesim bölgeli olmak üzere 3 farklı primer çifti (751F/1406R- 25F/1492R- 1F/1000R) ve 2 farklı klonlama yöntemi (TA klonlama ve restriksiyon enzimi ile klonlama) kullanılmıştır. Elde edilen 112 klondan 45 tanesi bakteri (%40) ve 67 tanesi arke (%60) olmak üzere geniş bir çeşitlilik yelpazesi ortaya konulmuştur. Tespit edilen arkeleri ağırlıklı olarak hipertermofilik Ignisphaera aggregans ve Thermofilum türleri oluştururken, örneklerde Methanocaldococcus ve Methanospirillum cinslerine ait metanojenik üyelere de rastlanmıştır. Bakteri domainine ait klonlar ise Thermus türleri, siyanobakteriler ve Proteobakteri filumuna ait üyelerden oluşmaktadır. Ülkemizde sıcak su kaynaklarında arke çeşitliğinin belirlenmesi ile ilgili araştırmalar oldukça kısıtlıdır. Tez çalışmamız ekstrem mikroorganizmaların biyoteknoloji başta olmak üzere pek çok alanda popüler olduğu günümüzde ülkemiz biyoçeşitliliğine önemli katkı sağlayacaktır. Farklı PCR ve klonlama yöntemlerinin karşılaştırılması bu konuda çalışan araştırmacılar için yol gösterici olacaktır.

Abstract:
Archaea, which constitute one of the three major domains of living things, in terms of both biochemical properties and structural features, are prokaryotic cell types that are separated from eukaryotes and bacteria. The vast majority of members of Archea survive in extreme ambient conditions thanks to their metabolic and molecular adaptations. Typical environments in which pure cultures of archaea species isolated; are hot springs, hydrothermal vents, solfataras, salt lakes, soda lakes. In recent years, the use of molecular techniques involving PCR-based amplification of 16S rRNA genes in environmental samples has allowed a culture-independent microbial diversity assessment. In this study, it was aimed to investigate the archeal diversity of hot water sources in Aydın and its surroundings using culture independent methods. Total DNA isolation was performed from water, sludge and debris samples and then 16S rRNA gene region was amplified by PCR method using domain-specific primers. After the amplicons were ligated into the puc19 plasmid, E.coli DH10B cells was transformed by recombinant plasmid. By selecting white colonies, PCR reactions were established with M13 primers, and the sequences of the 16S rDNA amplicons obtained were determined to find the similarity rates with other prokaryotes in the database. In addition, three different primer sets (751F/1406R- 25F/1492R- 1F/1000R) and two different cloning methods (TA cloning and cloning with restriction enzyme) were compared. Among the 112 clones obtained in the study 45 of them were found to be belong to domain Bacteria, while 67 of the clones were belong to the domain Bacteria and a wide biodiversity were determined. The sequences of archeal clones were found to be mostly similar to Ignisphaera aggregans and Thermofilum spp., also some methanogenic members of Archea like Methanocaldococcus spp. and Methanospirillum spp. On the other hand, bacterial lineages were found to be mostly similar with some species of genus Thermus, members of Cyanobacteria and Proteobacteria phyla in the samples. In our country, researches on determining archeal diversity in hot water resources are very limited. Our thesis study will make an important contribution to the biodiversity of our country today, where extreme microorganisms are popular in many fields, especially in biotechnology. Comparison of different PCR and cloning methods will be a guide for the researchers working on this subject.