Zeytinyağından azelaik asit eldesi ve geliştirilecek krem formülasyonlarının biyolojik aktivitelerinin in-vitro koşullarda değerlendirilmesi
Azelaic acid production from olive oil and in-vitro evaluation of the biological activities of cream formulations to be developed
Yazar: SİBEL CARI
Danışman: DOÇ. DR. HAMİDE FİLİZ AYYILDIZ
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Antibakteriyel aktivite = Antibacterial activity ; Infrared spektroskopi =   ; Kimya = Chemistry ; Kozmetikler = Cosmetics ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; NMR =   ; Oksitlenme = Oxidation ; Oleik asit = Oleic acid ; Ozonlama = Ozonation ; Zeytinyağı = Olive oil

Özet:
Sağlıklı ve sürdürülebilir bir yaşamın her geçen gün daha da önem kazanmaya başladığı dünyamızda, daha sağlıklı, daha güzel ve daha uzun yaşamın simgesi olarak "İyi Yaşam" teması öne çıkmaktadır. Bu temayı sağlamaya yönelik son zamanlarda gelişen davranışlardan biri de, doğal kaynakların ve bu kaynaklardan elde edilen ürünlerin kullanımına olan ilginin artmasıdır. Doğal kaynakların/ürünlerin kullanımının ön plana çıktığı alanların başında gıda, ilaç ve kozmetik sektörleri gelmektedir.
Sunulan bu tez çalışmasında; fonksiyonel bir gıda olarak hayatımızda önemli bir yer teşkil eden zeytinyağından, birçok farmasötik ve kozmesötik etkiye sahip olduğu bilinen azelaik asidin (AA) elde edilmesi, saflaştırılması ve topikal krem formülasyonlarının geliştirilerek, antibakteriyel özelliklerinin in-vitro koşullarda incelenmesi amaçlanmıştır.
AA; anti-bakteriyel, anti-enflamatuar ve komedolitik özelliklere sahip bir ajan olup, akne başta olmak üzere birçok cilt probleminin tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Hiperpigmentasyon bozukluklarının (rozasea, solar lentigo ve melazma gibi) iyileştirilmesinde son derece etkin olduğu bilinen AA`nın; yara, yanık, hatta bazı kanser tümörleri üzerinde terapötik etkisinin bulunduğunu gösteren in-vitro ve in-vivo çalışmalar mevcuttur. Teratojenik, mutajenik ve toksik etkilerinin bulunmaması sebebiyle AA, benzer etkilere sahip birçok bileşiğe kıyasla daha güvenli ve tereddütsüz bir kullanıma da sahiptir.
Doymuş bir dikarboksilik asit olan AA; buğday, çavdar, arpa gibi tahıllardan ve bazı hayvansal ürünlerden doğal olarak elde edilebilmektedir. AA`nın endüstriyel skaladaki üretimi ise, oleik asidin (OA) ozonizasyonu ile sağlanmaktadır.
Sunulan tez çalışması (i) zeytinyağı numunelerinden serbest yağ asitlerinin eldesi, (ii) serbest yağ asidi karışımlarından OA eldesi ve saflaştırılması, (iii) OA`dan AA eldesi ve saflaştırılması, (iv)  saflaştırılan AA bileşiklerinin antibakteriyel aktivitelerinin in-vitro koşullarda incelenmesi, (v) saflaştırılan AA bileşiklerinin kullanılmasıyla farklı içeriklere sahip topikal krem formülasyonlarının geliştirilmesi ve (vi) geliştirilen krem formülasyonlarının antibakteriyel aktivitelerinin in-vitro koşullarda incelenmesi olmak üzere 6 aşamada gerçekleştirilmiş olup, çalışma kapsamında elde edilen önemli sonuçları şöyle sıralamak mümkündür:
Naturel sızma ve riviera zeytinyağı numunelerinden sabunlaştırma işlemi ile elde edilen ve OA eldesinde çıkış maddesi olarak kullanılan serbest yağ asitleri için işlem verimi % 79-86 olarak hesaplanmıştır.
Serbest yağ asidi karışımlarından OA eldesi için, çalışma prensipleri farklı 3 metot kullanılmış olup (düşük sıcaklıkta direk kristalizasyon, üre fraksiyonlama ve düşük sıcaklıkta çözücü kristalizasyonu); bunlar arasında OA eldesi için en uygun ve verimli metodun, % 83,04 saflık dercesine ulaşılmasını sağlayan ve diğer metotlara kıyasla basit, kolay uygulanabilir ve çevre dostu (çözücülerin geri kazanılabilmesi sebebiyle) bir yöntem olan, düşük sıcaklıkta çoklu çözücü kristalizasyonu metodu olduğu belirlenmiştir. Deneyler sırasında elde edilen katı ve sıvı kısımlar içinde bulunan OA ve diğer temel yağ asitlerinin miktar ve saflık derecelerinin tespitinde RP-HPLC yöntemi kullanılmıştır. 
Tez kapsamında elde edilen OA`dan AA eldesi için, 2 farklı metot kullanılmış olup (ozon jeneratörü yardımıyla ozonizasyon/parçalama ve H2O2/bir katalizör varlığında oksidasyon/parçalama); bunlar arasında AA eldesi için en uygun ve verimli metodun, OA`nın H2O2/H2WO4 varlığında oksidasyonu/parçalanması ve reaksiyon karışımı içerindeki AA`nın X/sıcak su ile saflaştırılması basamaklarını içeren ve yüksek bir saflık derecesi (% 83,03 - % 98,73) ve verim düzeyine (% 9,28 - % 12,50) ulaşılmasını sağlayan prosedür olduğu sonucuna varılmıştır. Deneyler sırasında elde edilen reaksiyon karışımları içerisindeki AA, OA ve pelargonik asit (PA) gibi ana türlerin miktarlarının belirlenmesinde GC-MS yönteminden faydalanılmış, elde edilen AA bileşiklerinin yapısal kimliğinin aydınlatılmasında ise, 1H-NMR ve ATR-FTIR yöntemleri kullanılmıştır.
Tez kapsamında saf olarak elde edilen AA bileşiklerinin antibakteriyel aktivite tayinleri; disk difüzyon ve Mikrodilüsyon Broth yöntemlerinin kullanılması ile gerçekleştirilmiştir. Disk difüzyon yöntemi ile antibakteriyel aktivite tayini deneyleri sonunda; elde edilen herbir AA bileşiğinin, incelenen bakteri türlerine karşı inhibisyon bölgesi oluşturduğu ve bu etkinin cilt pH`sı aralığında daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, tez kapsamında elde edilen tüm AA türlerinin, standart AA`dan daha fazla antibakteriyel aktiviteye sahip oldukları da görülmüştür. Mikrodilüsyon Broth yöntemi ile antibakteriyel aktivite tayini deneyleri sonunda ise; tez kapsamında elde edilen AA bileşikleri için hesaplanan MİK değerlerinin (1000 µg/mL), standart AA için bulunan MİK değeri ile aynı olduğu görülmüş, pozitif kontrol olarak kullanılan Klaritromisin`in (CLR) MİK değeri ise; dirençli bakteriler için >128 µg/mL, duyarlı bakteriler için ise <0,25 µg/mL olarak bulunmuştur.
Tez çalışması kapsamında; etkin madde içeriği bakımından; (i) sadece AA içeren (ii) sadece salisilik asit (SA) içeren (iii) AA ve SA kombinasyonunu içeren formülasyonlar olmak üzere değişik şekillerde hazırlanan 6 farklı krem formülasyonu geliştirilmiştir. Hazırlanan krem formülasyonlarının organoleptik ve fiziksel/kimyasal özellikleri; oda şartlarında (25 °C ± 2 sıcaklık ve doğal oda nemi) ve stabilite dolabında (40 °C ± 5 sıcaklık, % 65 ±3 nem ve floresan ışıkta) yürütülen 3 aylık hızlandırılmış stabilite testleri ile belirlenmiş, elde edilen stabilite verilerinin kabul kriterleri ile karşılaştırılması neticesinde herbir ürün için maksimum bir raf ömrü öngörülmüştür.
Geliştirilen farklı içeriklere sahip krem formülasyonlarının disk difüzyon yöntemi ile antibakteriyel aktivite tayini deneyleri sonunda; % 10 AA içeren krem formülasyonunun en fazla antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu görülmüştür. Mikrodilüsyon Broth yöntemi ile antibakteriyel aktivite tayini deneyleri sonunda ise; sadece % 10 ve % 1 AA içeriğine sahip olan ticari krem numunelerinin 16000 µg/mL MİK değerinden düşük bir antibakteriyel aktivite değerine sahip olduğu (< 62,5 μg/mL), tez kapsamında hazırlanan diğer krem formülasyonlarına ait MİK değerlerinin ise >16000 olduğu tespit edilmiştir.
Hayatımızdaki önemli doğal kaynaklardan biri olan zeytinyağından, birçok terapötik ve fizyolojik etkiye sahip olduğu bilinen azelaik asidin eldesi ve yeni topikal krem formülasyonlarının geliştirilmesi amacıyla gerçekleştirilen bu tez çalışmasının; ilaç, kozmetik gibi sektörlerde hammadde açısından dışa bağımlı bir ülke oluşumuz göz önünde bulundurulduğunda, oldukça kıymetli bir çalışma olduğu düşünülmekte ve doğal kaynaklardan etkin madde ve/veya ürün eldesine yönelik çalışan bilim insanları ve araştırmacılar için teşvik edici ve yol gösterici olacağına inanılmaktadır.

Abstract:
In our world where a healthy and sustainable life becomes more and more important, the theme of "Good Life" stands out as the symbol of a healthier, more beautiful and longer life. One of the recent behaviors to provide this theme is the increasing interest in the use of natural resources and products obtained from these sources. Food, pharmaceutical and cosmetic sectors are among the areas where the use of natural resources / products come to the fore.
In this thesis presented; it is aimed to obtain and purify azelaic acid (AA), which is known to have many pharmaceutical and cosmeceutical effects, from olive oil, which has an important place in our lives as a functional food, and to examine its antibacterial properties in-vitro.
AA; It is an agent with anti-bacterial, anti-inflammatory and comedolytic properties and is widely used in the treatment of many skin problems, especially acne. AA known to be extremely effective in the treatment of hyperpigmentation disorders (such as rosacea, solar lentigo and melasma); There are in-vitro and in-vivo studies showing that it has a therapeutic effect on wounds, burns and even some cancer tumors. Due to its lack of teratogenic, mutagenic and toxic effects, AA has a safer and unwavering use compared to many compounds with similar effects.
AA, a saturated dicarboxylic acid; It can be obtained naturally from grains such as wheat, rye, barley and some animal products. The production of AA in industrial scale is provided by the ozonization of oleic acid (OA).
The presented thesis study (i) obtaining free fatty acids from olive oil samples, (ii) obtaining and purifying OA from free fatty acid mixtures, (iii) obtaining and purifying AA from OA, (iv) investigating the antibacterial activities of the purified AA compounds in-vitro, (v) The development of cream formulations with different contents by using purified AA compounds, and (vi) the in-vitro examination of the antibacterial activities of the cream formulations developed, and the important results obtained within the scope of the study can be listed as follows:
The processing efficiency for free fatty acids obtained by saponification process from natural extra virgin and riviera olive oil samples and used as starting material in OA production was calculated as 79-86%.
In order to obtain OA from free fatty acid mixtures, 3 methods with different operating principles have been used (direct crystallization at low temperature, urea fractionation and solvent crystallization at low temperature); Among these, it has been determined that the most suitable and efficient method for obtaining OA is the low temperature multi-solvent crystallization method, which provides a purity level of 83.04% and is a simple, easily applicable and environmentally friendly method (due to the ability to recover solvents) compared to other methods. RP-HPLC method was used to determine the amount and purity levels of OA and other essential fatty acids in the solid and liquid parts obtained during the experiments.
Two different methods have been used to obtain AA from the OA obtained within the scope of the thesis (ozonization / decomposition with the help of an ozone generator and H2O2 / oxidation / disintegration in the presence of a catalyst); Among these, the most suitable and efficient method for AA recovery includes oxidation / decomposition of OA in the presence of H2O2 / H2WO4 and purification of AA in the reaction mixture with X/hot water and a high purity (83.03% - 98%, 73) and the efficiency level (9.28% - 12.50%). GC-MS method was used to determine the amounts of main species such as AA, OA and pelargonic acid (PA) in the reaction mixtures obtained during the experiments, and 1H-NMR and ATR-FTIR methods were used to clarify the structural identity of the AA compounds.
Antibacterial activity determinations of pure AA compounds within the scope of the thesis; Disk diffusion and Microdilution Broth methods were used. At the end of antibacterial activity determination experiments by disk diffusion method; It was determined that each AA compound obtained formed an inhibition zone against the bacterial species examined and this effect was higher in the skin pH range. In addition, it has been observed that all AA species obtained within the scope of the thesis have higher antibacterial activity than standard AA. At the end of antibacterial activity determination experiments with Microdilution Broth method; The MIC values (1000 µg / mL) calculated for the AA compounds obtained within the scope of the thesis were found to be the same as the MIC values found for the standard AA, and the MIC value of Clarithromycin (CLR) used as positive control; It was found to be> 128 µg / mL for resistant bacteria and <0.25 µg / mL for sensitive bacteria.
Within the scope of thesis work; In terms of active substance content; Six different cream formulations prepared in different ways were developed: (i) formulations containing only AA (ii) containing only salicylic acid (SA) (iii) containing a combination of AA and SA. Organoleptic and physical / chemical properties of cream formulations prepared; Determined by 3-month accelerated stability tests conducted in room conditions (25 ° C ± 2 temperature and natural room humidity) and stability cabinet (at 40 ° C ± 5 temperature, 65% ± 3 humidity and fluorescent light), with the acceptance criteria of the stability data obtained. As a result of the comparison, a maximum shelf life is predicted for each product.
At the end of the antibacterial activity determination experiments of the cream formulations with different contents developed by the disk diffusion method; It was observed that the cream formulation containing 10% AA had the highest antibacterial activity. At the end of antibacterial activity determination experiments with Microdilution Broth method; It was determined that commercial cream samples with only 10% and 1% AA content had an antibacterial activity value lower than 16000 µg / mL MIC value (<62.5 μg / mL), and MIC values of other cream formulations prepared within the scope of the thesis were> 16000. has been.
This thesis study, which was carried out with the aim of obtaining azelaic acid, which is known to have many therapeutic and physiological effects from olive oil, which is one of the important natural resources in our lives, and the development of new topical cream formulations; when thinking the fact that we are a foreign-dependent country in terms of raw materials in sectors such as pharmaceuticals and cosmetics, it is a precious study and is believed to be an encouraging and guiding for scientists and researchers working on obtaining active ingredients and products from natural resources.