İnsan serebral mikrovasküler endotel hücrelerinin T hücre ko-inhibisyonuna etkisi
The effect of human cerebral microvascular endothelial cells on T cell co-inhibition
Yazar: NAZİRE PINAR ACAR ÖZEN
Danışman: PROF. DR. GÜNEŞ ESENDAĞLI
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı / Temel İmmünoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Endotelyum-vasküler = Endothelium-vascular ; Lenfositler = Lymphocytes ; Serebrovasküler dolaşım = Cerebrovascular circulation ; T lenfositleri = T lymphocytes ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Naif yardımcı T (Th) lenfositlerin sürekli uyarı ile ilk önce efektör hale geldiği, geç dönemlerde ise sitokin üretimi ve çoğalma kapsitesi düşük olan yorulmuş/hafıza Th hücrelere dönüştüğü bilinmektedir. Ayrıca bu farklılaşma sürecinde T lenfositlerin üzerlerindeki kostimulatuvar ve koinhibitör molekkülerde değişiklikler olmaktadır. Serebral endotel hücreleri T lenfositlerle karşılaştıklarında yapısal değişiklikler gösterir. Ancak farklı yapısal ve fonksiyonel özellik taşıyan T hücrelerinin kan beyin bariyeri endotel yapısının nasıl değiştirdiği net değildir. Bu tez çalışması ile serebral mikrovasküler endotel hücrelerinin ve farklı aktivasyon durumlarındaki T hücrelerle etkileşimi ve süregelen inflamasyon durumunda genotipik ve fenotipik değişikliklerinin araştırılması planlanmıştır. Çalışmada ticari olarak elde edilen insan serebral mikrovasküler endotel hücre (hCMEC/D3), akut myeloid lösemi (THP-1) hücre hatları ve sağlıklı bireylerin periferik kan polimorfonükleer hücrelerinden saflaştırılmış CD4+ T lenfositler kullanılmıştır. hCMEC/D3 hücreleri inflamatuvar sitokinler (TNF-α, IFN-γ) ile kültür ortamına alındıktan sonra hücreler üzerinde ifade olan çeşitli yüzey molekülleri (CD40, CD80, CD86, HLA-DR, CD14, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM3 gibi) akım sitometri ile; farklı transkript varyantları RT-PCR ile analiz edilmiştir. CD4+ T lenfositler, THP-1 hücreleri ile ko-kültür edilerek farklı fenotip ve fonksiyonel özelliklere ulaştırılmıştır (0, 24, 72 ve 120. saatler). Sonrasında FACS yöntemi ile tekrar saflaştırılan CD4+ T hücreler h-CMEC/D3'ler ile ko-kültür edilmiş ve seçilmiş yüzey belirteçlerinin ifadesi, hücrelerin proliferasyonu ve supernatanlardaki çeşitli sitokinlerin düzeyi akım sitometri yöntemi ile değerlendirilmiştir. IFN-γ olmak üzere inflamatuvar sitokinler, h-CMEC/D3 hücrelerinin CD40 ve CD86 kostimutaltör moleküllerinin ifade yüzdesini arttırmaktadır. IFN-γ h-CMEC/D3 hücrelerinin HLA-DR ifadesini arttırmıştır. Naif ve aktif CD4+ T hücrelerin ko-kültürler sonrasında değerlendirilen h-CMEC/D3'lerdeki HLA-DR ifade yüzdesi kontrol ile karşılaştırıldığında artmıştır. Ko-stimulauvar CD40 molekülünin ifadesini en belirgin oranda naif ve 24.saatteki efektör T hücreler arttırmış, 120.saat sonrasındaki yorgun/hafıza T hücreler CD40 ifadesini etkilememiştir. Ko-inhibitör moleküllerden PD-L1 ve PD-L2 h-CMEC/D3'lerde kontrol durumda da yüksek oranda bulunmaktadır. PD-L1 ifade yoğunluğu en belirgin olarak 0 ve 24. saatlerde artmıştır.120. saatteki yorulmuş T hücreler PD-L1 ve PD-L2 ortalama floresan yoğunluğunu etkilememiştir. Serebral mikrovasküler endotel hücreleri Th hücrelerle karşılaştıklarında antijen sunma kapasiteleri artmaktadır. Naif ve aktive Th hücreler h-CMEC/D3'lerin hem kostimulasyonunu hem ko-inhibisyonunu yorgun Th lenfositlere göre daha fazla uyarmaktadır.

Abstract:
With continuous stimulation, naive T helper cells (Th) convert into effector and exhausted Th cells with low cytokine production and proliferation capacity. In addition, during this differentiation process, there are changes in the costimulatory and co-inhibitory molecules on T lymphocytes. Cerebral endothelial cells show structural changes when they encounter T lymphocytes. However, it is not clear how T cells with different structural and functional properties change the endothelial structure of the blood brain barrier. In this thesis study, we planned to investigate the interaction of cerebral microvascular endothelial cells and T cells in different activation states and their genotypic and phenotypic changes in the case of ongoing inflammation. Human cerebral microvascular endothelial cell (hCMEC/D3) and acute myeloid leukemia (THP-1) cell lines and CD4+ T lymphocytes purified from peripheral blood polymorphonuclear cells of healthy individuals were used in the study. After hCMEC/D3 cells are cultured with inflammatory cytokines (TNF-α, IFN-γ), various surface molecules (CD40, CD80, CD86, HLA-DR, CD14, PD-L1, PD-L2, CTLA- 4, LAG3, TIM3) by flow cytometry; different transcript variants were analyzed by RT-PCR. CD4+ T lymphocytes were co-cultured with THP-1 cells to achieve different phenotypes and functional properties (0, 24, 72 and 120 hours). Afterwards, CD4+ T cells purified again by FACS method were co-cultured with h-CMEC/D3s and expression of selected surface markers, proliferation of cells and levels of various cytokines in supernatants were evaluated by flow cytometry method. Inflammatory cytokines, including IFN-γ, increase the expression percentages of CD40 and CD86 costimulatory molecules of h-CMEC/D3 cells. IFN-γ increased HLA-DR expression of h-CMEC/D3 cells. The percentage of HLA-DR expression in h-CMEC/D3s evaluated after co-cultures of naïve and active CD4+ T cells was increased compared to control. The expression of the co-stimulatory CD40 molecule was most markedly increased by the naive T cells, followed by the effector T cells at the 24th hour, while the tired/memory T cells at the 72nd hour did not affect the CD40 expression. PD-L1 and PD-L2, which are co-inhibitory molecules, are also found at high rates in h-CMEC/D3 in the control condition. PD-L1 expression intensity increased most significantly at 0 and 24 hours.120. Fatigue T cells at 1 hour did not affect PD-L1 and PD-L2 MFY. When cerebral microvascular endothelial cells encounter Th cells, their antigen-presenting capacity increases. Naive and activated Th cells stimulate both costimulation and co-inhibition of h-CMEC/D3 more than exhausted Th cells.