Mekanik olarak dayanıklı tek-, çift- ve üç-ağ yapılı fibroin kriyojellerinin sentezi ve karakterizasyonu
Synthesis and characterization of mechanically durable single-, double- and triple-network fibroin cryogels
Yazar: BERKANT YETİŞKİN
Danışman: PROF. DR. OĞUZ OKAY
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Biyomalzemeler = Biomaterials ; Biyopolimerler = Biopolymers ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Fizikokimya = Physical chemistry ; Hidrojeller = Hydrogels ; Polimer jel = Polymer gel ; Polimer malzemeler = Polymer materials ; İpek fibroini = Silk fibroin

Özet:
Doku mühendisliği, mühendislik ve doğa bilimlerinin prensiplerini kullanarak organ geliştirmeyi, bir dokunun işlevini arttırmayı ya da iyileştirmeyi amaçlayan bir bilim dalıdır. Doku mühendisliği disiplinlerarası bir dal olup sadece biyoloji ve medikal alanlarla ilgili değil; aynı zamanda kimya, kimya mühendisliği, biyomühendislik ve malzeme bilimleri gibi bilim dallarıyla da yakından ilişkilidir. Doku mühendisliği, klasik yöntemlerle tedavi edilemeyen hastalarda hasarlı dokuların yenilenmesi ve iyileştirilmesi için oldukça önemlidir. Doku mühendisliğinin en önemli uğraş alanlarından bir tanesi, hücrelerin biyolojik dokuyu oluşturabileceği, büyüyüp farklılaşabileceği, geçici bir kalıp görevi gören iskelet malzemeler geliştirmektir. Bu malzemeler, biyouyumlu ve biyobozunur olmalı, gözenekli bir üç boyut mimarisine sahip olmalı ve aynı zamanda geliştirilecek dokuya uygun mekanik özelliklere sahip olmalıdır.
Doğal malzemeler, biyolojik yapılarından dolayı biyouyumluluğu ve hücrelerle etkileşimi daha iyi olduğundan doku mühendisliğinde biyomalzeme olarak kullanılabilirler. Buna en uygun örneklerden bir tanesi ipektir. İpek, ipek böceği ve bazı örümcek türleri tarafından epitel hücreler içinde sentezlenen bir biyopolimerdir. İpeğin yapısında büyük oranda fibroin bulunmaktadır. Fibroin, ağırlıklı olarak glisin ve alanin aminoasitlerinden oluşan, büyük hidrofobik bloklar ve bu blokların arasında ve zincir uçlarındaki hidrofilik bloklardan oluşan bir kopolimerdir. Hidrofobik kısımlar arası asosiyasyonlar fibroinin rastgele yumak yapısından β-tabaka yapısına geçmesine neden olur. Fibroinin jelleşmesinin temeli de hidrofobik kısımlar arasında meydana gelen bu β-tabaka yapılarıdır. β-tabakalar malzemeye dayanıklılık ve sertlik kazandırır. Diğer yandan hidrofilik kısımlar ise suda çözünmeyi sağlar. Ayrıca tokluğu ve elastisiteyi arttırır. Fibroin ipekteki yapısal proteindir ve serisin adı verilen başka bir protein ile kaplıdır. Serisin, ipeği işleme sürecinde yumuşak ve parlak bir yapı elde etmek için yüksek alkali çözeltilerde uzaklaştırılır. Fibroin ve serisinin dışında ipeğin yapısında waks, karbonhidratlar, inorganik maddeler ve pigmentler bulunur. İpek lifleri, çok iyi tokluk ve sertlik özelliklerinin yanında düşük yoğunluk ve kendine özgü çekme dayanımı, biyouyumluluğu, biyobozunurluğu ve kolay işlenebilir olmasından dolayı malzeme bilimlerinde öne çıkan doğal polimerlerden biri haline gelmiştir.
Fibroinin jelleşmesi, diğer proteinlere kıyasla yavaş gerçekleşen bir süreçtir. Araştırma grubumuz tarafından geliştirilen bir yöntemle bu süreç hızlandırılmıştır. Fibroin çözeltilerine diepoksitlerin ilave edilmesiyle kısa sürede jelleşmenin meydana geldiği gözlenmiştir. Diepoksit molekülleri yardımıyla fibroin zincirlerindeki hidrofilik gruplar birbirine bağlanır. Bunun sonucunda fibroin molekülünün hareketliliğinin azalmasıyla birlikte hidrofobik kısımlar arasında β-tabakaların oluşması kolaylaşır. Böylece, kısa sürede fibroinin jelleşmesi gerçekleşmiş olur. 
Biyolojik dokulara benzerlikleri nedeniyle doku mühendisliğinde iskelet malzeme olarak kullanılabilecek en uygun malzemelerden birisi hidrojellerdir. Hidrojeller, hidrofilik polimer ağyapısıyla bu ağyapı içindeki çözücüden (su veya sulu çözelti) oluşan iki fazlı, üç boyutlu bir polimerik malzemedir. Klasik hidrojellerin pratik uygulamalarını kısıtlayan iki dezavantajı vardır. Bunlardan birisi hidrojellerin hacim değişiminin yavaş olması; ya da diğer bir değişle uyarılara hızlı cevap verememesi; diğeri ise mekanik olarak dayanıksız olmalarıdır. Hidrojellerin uyarılara hızlı cevap verebilmesi için jel boyutlarının küçültülmesi, jel yüzeyine doğrusal zincirlerin bağlanması ve makrogözenekli jellerin tasarımı; mekanik özelliklerinin iyileştirilmesi içinse çift-ağyapılı jeller, topolojik jeller, nanokompozit jeller ve kriyojeller gibi teknikler geliştirilmiştir.
Kriyojelleşme prosesinde, reaksiyon çözeltisi donma noktası altındaki bir sıcaklığa getirilerek dondurulur ve reaksiyonlar donmuş reaksiyon sisteminin donmamış mikrobölgelerinde ilerler. Reaksiyonlar donma noktası altında gerçekleştiğinden dolayı ortamdaki buz kristalleri kalıp görevi yapar ve birbirine bağlı gözenekleri olan bir yapı oluşur. Reaksiyonların reaktif konsantrasyonunun yüksek olduğu donmamış mikrobölgelerde ilerlemesinden dolayı, oluşan gözenek duvarlarındaki polimer konsantrasyonu fazla olmakta ve böylece malzemenin mekanik özellikleri klasik hidrojellere göre daha iyi olmaktadır.
Çift-ağyapılı jel sentez tekniğinde ise sentezlenen ilk ağyapı, içinde monomer bulunan başka bir çözelti içinde şişirilir ve ilk ağyapının içine bu çözeltinin dolması sağlanır. Ardından yeniden polimerizasyon işlemiyle çift-ağyapılı jel üretilmiş olur. İç içe geçmiş ağyapılardan oluşan çift-ağyapılı jellerde, malzemeye uygulanan kuvvetin ikinci ağyapı tarafından dağıtılmasıyla üstün mekanik özellikler elde edilebilmektedir.
Bu çalışmanın amacı, doku mühendisliğinde kullanıma uygun makrogözenekli, mekanik olarak dayanıklı, biyouyumlu ve biyobozunur polimerik iskeletler üretmektir. Bu amaçla, Bombyx Mori ipek böceği kozasından elde edilen fibroinin sulu çözeltisinden, N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin (TEMED) katalizörü ve 1,4-bütandiol diglisidil eter (BDDE) çapraz bağlayıcısı varlığında -18 °C'de fibroin kriyojelleri üretilmiştir. Bu yöntemle geçtiğimiz yıllarda araştırma grubumuz tarafından literatürde ilk kez fibroinin kriyojelleşmesiyle tek-ağyapılı fibroin kriyojelleri elde edilmişti. Bu tez çalışmasında ise; tek-ağyapılı fibroin kriyojelinden yola çıkarak mekanik dayanımı arttırmak amacıyla çift-ağyapılı ve üç-ağyapılı fibroin kriyojelleri üretilmiştir. Sentezlenen tek-ağyapılı fibroin kriyojelleri, farklı fibroin konsantrasyonlarındaki çözeltilerde şişirilip kriyojelleştirilerek ikinci ağyapıda farklı konsantrasyonlarda fibroin içeren çift-ağyapılı fibroin kriyojelleri üretilmiştir. Aynı şekilde, çift-ağyapılı fibroin kriyojeli de belli bir konsantrasyonda fibroin içeren bir çözeltide şişirilip kriyojelleştirilmesiyle üç-ağyapılı fibroin kriyojeli elde edilmiştir. Bu çalışmada, mekanik olarak dayanıklı hidrojel elde etme yöntemlerinden olan çift-ağyapılı jel yöntemiyle kriyojelasyon yöntemi ilk kez birleştirilerek üstün mekanik özelliklere sahip makrogözenekli fibroin iskeletleri üretilmiştir. Elde edilen tüm kriyojellerin şişme davranışları, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile morfolojik özellikleri, Zwick-Roell ve Devotrans Mekanik Test Cihazları ile mekanik davranışları incelenmiş ve ATR- FTIR spektrumları ile de fibroin yapısı aydınlatılmıştır.

Abstract:
Tissue engineering is a branch of science aiming to develop a whole organ, improve or recover the functions of a tissue using principles of engineering and life sciences. Tissue engineering is an interdisciplinary field and it is related to not only biology and medical sciences but also chemistry, chemical engineering, bioengineering and material sciences. Tissue engineering is feasible for patients who can't be cured with conventional methods. In tissue engineering concept, it is important to develop scaffold materials acting as a temporary 3D environment where cells can produce new biological tissue. Scaffolds provide cell organization, growth and differentiation. A scaffold must be biocompatible and biodegradable; also it must have 3D morphology and suitable mechanical properties.
A scaffold can be produced from different types of materials such as natural and synthetic polymers and inorganic substances. Natural materials can be more suitable than the others because of their biocompability and biological structure which provide better interaction with cells. For instance, silk is an important natural polymer for tissue engineering applications owing to its good biocompability, biodegradability, high strenght and toughness. Silk is a biopolymer which is synthesized in epithelial cells by silkworms such as Bombyx Mori and some spiders such as Nephila Calavipes and Araneus Diadematus. There are two important proteins in silk; namely, fibroin and sericin. Except fibroin and sericin, silk also contains carbonhydrates, wax, inorganic substances and pigments. Fibroin is structural protein in silk and it is covered by sericin. Sericin can be removed from fibroin during silk manufacturing process to make silk soft and lustrous. 
Fibroin is the main component in silk and it consists of hydrophilic and hydrophobic blocks. Hydrophilic blocks provide solubility in water and are responsible for fibroin elasticity and toughness. On the other hand, hyrophobic blocks form intermoleculer structures, which is called β-sheet, leading to insolubility and high strenght of fibroin. β-sheet structures are also responsible for fibroin gelation process. Normally, gelation of fibroin occurs slowly by comparison other proteins. By introducing a new technique developed in our research group, we were able to accelerate the gelation process of fibroin significantly. This technique involves the addition of diepoxide molecules such as 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) as a chemical cross-linker in aqueous fibroin solution, which induce gelation of fibroin in a short period of time. With BDDE, hydrophilic blocks of fibroin link with each other so that the mobility of the fibroin chains decreases and β-sheet structure forms between hydrophobic blocks, finally fibroin gel forms. BDDE contains epoxide groups on both ends that can react with nucleophiles like hydroxyls, amino groups and sulfhydryls. BDDE has been widely used for cross-linking of DNA, proteins, polysaccharides and organic molecules. 
Seeking artificial soft biomaterials for tissue engineering has been challenging task for scientists and engineers. If we consider structure of biological tissue in an organism, hydrogels are one of the best candidates as scaffold material because of their tissue-like structure. Hydrogels are soft and wet materials that composed of 3D polymer network structure and large amount of water inside the network as solvent. The polymer network serves as a matrix to hold the solvent together, while the solvent inside the polymer network allows free diffusion of some solute molecules. 
Although hydrogels have potential applications in many fields such as tissue engineering, drug delivery system and superabsorbants; they have some inadequacies. Firstly, traditional hydrogels have a slow response rate to the external stimuli. To increase the response rate of hydrogels, several techniques have been developed including decrease of the gel dimensions (microgel preparation), attachment of dangling chains on the gel surfaces and preparation of macroporous gels. Secondly, they have poor mechanical properties. Traditional hydrogels are usually composed of single polymer network which cause hydrogels to have a weak and brittle structure. There are also several techniques such as double-network gels, topological gels, nanocomposite gels and cryogels, which have been developed to enhance mechanical properties of hydrogels.
The cryogelation technique allows preparation of gels possessing a macroporous structure and exhibiting good mechanically performances. By cryogelation, polymerization is conducted in apparently frozen reaction solutions. The reaction solution containing gel forming agents is frozen at a temperature a few degrees centigrade below the crystalization point of solvent. In this frozen system, there are unfrozen liquid microphase along with the crystals of the frozen solvent. Gel forming agents are concentrated in unfrozen liquid microphase (cryoconcentration). Cross-linking reactions occur in this phase and in the mean time, crystals of solvent combine with each other and after melting, crystals leave large interconnected pores. Because of cryoconcentration, cryogels become mechanically stronger than the traditional hydrogels.
Double-network (DN) technique provides to fabricate hydrogels with high toughness. DN gels possess interpenetrating polymer network (IPN) structure which are cross-linked polymer networks in which at least one network is synthesized and/or cross-linked in the presence of the other. First of all, first network is prepared and then first network is immersed in another reaction mixture until equilibrium. By polymerizing the second component, DN gel is formed. DN gels are comprised of two independently cross-linked networks that are physically entangled with each other. That means, there is no other interaction between the two polymer networks. There are two important parameters about DN technique. The first one is n21 ratio, which is molar ratio of second network to the first network units and the second one is the amount of cross-linker of the second network. DN gels usually become mechanically stronger with increasing n21 ratio and/or decreasing amount of the second network cross-linker.
The aim of this study is the preparation of macroporous, biodegradable, biocompatible and mechanically strong and durable polymeric scaffolds useful for tissue engineering applications. For this purpose, we prepared single-network (SN), double-network (DN) and triple-network (TN) silk fibroin (SF) scaffolds from aqueous solutions of silk fibroin which is obtained from Bombyx Mori silkworm cocoons. 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) and N, N, N', N'–tetramethylethylenediamine (TEMED) were used as a chemical cross-linker and pH tuner/catalyst respectively, during the cryogelation reactions at -18 °C. Fibroin cryogels were characterized by swelling tests, ATR-FTIR and SEM measurements, as well as by mechanical tests conducted on Zwick Roell and Devotrans mechanical testing machines.
Firstly, we produced SN fibroin cryogels in the presence of BDDE and TEMED. The gels were prepared according to the following scheme: Aqueous fibroin solution of 4,2 % concentration was mixed with BDDE (20 mmol epoxy/g fibroin) and  TEMED (0,25 v/v %). Then, the homogeneous reaction mixture was transferred into plastic syringes of 4 mm internal diameters and 1 ml volume, and they were placed in a freezer at  -18 °C for 24 h. Finally, SN fibroin cryogels were obtained after the 24 h of cryogelation process. The SN cryogel scaffolds formed at a temperature Tprep = -18 °C and fibroin concentration Csf = 4,2 % exhibit a compressive modulus E of 7 ± 1 MPa with a compressive nominal stress σcomp of 0,16 ± 0,03 MPa and fracture stress σfract of 15 ± 3 MPa in dry state. To enhance further the mechanical performance of SN gels, DN and TN gels were prepared.
DN gels were fabricated by swelling freeze-dried SN hydrogels in fibroin solutions of various concentrations between 7,2 and 28,6 w/v %, containing BDDE and TEMED. Amount of TEMED was fixed at 0,25 v/v % while the amount of BDDE was decreased from 20 to 1,5 mmol/g with increasing silk fibroin concentration to prevent sudden gelation of fibroin. DN fibroin scaffolds thus produced possess compressive modulus E of 58 ± 15 MPa with a compressive nominal stress σcomp of 2,8 ± 0,8 MPa and fracture stress σfract of 240 ± 24 MPa in dry state.
To investigate the effect of the amount of BDDE in the second network solution, DN fibroin cryogels were prepared in 28,6 % fibroin solution containing BDDE at three different amounts, namely 0,375, 0,75 and 1,5 mmol/g. Results showed that porous fibroin scaffolds become mechanically stronger as the amount of BDDE in the second network solution is increased. 
TN fibroin cryogels were prepared from a DN cryogel possessing fibroin concentrations of  4,2 % and 7,2 % in its first and second networks, denoted as 4,2- 7,2 % DN. 4,2- 7,2 % DN cryogel sample was first immersed in an aqueous solution containing fibroin  (20 %), BDDE and TEMED. After equilibrium swelling, the system was transferred into a plastic syringe of 5 ml in volume and it was placed in freezer at  -18 °C for 24 h. After the cryogelation process, obtained TN scaffolds were mechanically stronger than the corresponding 4,2-7,2 % DN and 4,2 % SN fibroin scaffolds. TN gels exhibit a compressive modulus E of 48 ± 11 MPa with a compressive nominal stress σcomp of 1,5 ± 0,7 MPa and fracture stress σfract of 190 ± 12 MPa while 4,2- 7,2 % DN gels exhibit 11,2 ± 0,1 MPa, 0,24 ± 0,05 MPa and 28 ± 5 MPa respectively. 
The reaction between fibroin and BDDE was assessed by the ATR-FTIR spectra of freeze-dried fibroin scaffolds. With gelation, in addition to a shift of the Amide I absorption band to lower wavenumbers, new band at 1040- 1100 cm-1 appear which were assigned to the ether stretching bands of BDDE. Before gelation, ATR- FTIR spectrum of fibroin was characterized by a peak at 1640 cm-1 indicating the presence of primarily random coil and/or α-helix conformations. After cryogelation, all samples display a main peak at 1620 cm-1 which was assigned to β-sheet conformation and except the main peak, shoulders at 1660 and 1698 cm-1 appeared which can be assigned to α-helix and β-turn conformations, respectively. To estimate the conformation of the fibroin chains, seperation of Amide I band was carried out after base line correction by selecting a Gaussian model for curve fitting. The peak positions were fixed at 1620, 1640, 1660 and 1698 cm-1, representing β-sheet, random coil, α-helix and β-turn conformations, respectively. Before gelation fibroin chains have 12 ± 2 % β-sheet structures, while after gelation SN fibroin cryogels, for instance, have 28 ± 1 % β-sheet structures.
Pore structures of fibroin scaffolds were assessed by the SEM images. It was found that the average pore size decreases with increasing fibroin or BDDE concentration. For instance, the pore size of SN fibroin cryogels is 33 ± 7 µm while that of TN fibroin cryogels is 6 ± 3 µm. These results show that the pore size of the cryogel scaffolds can be regulated depending on the cryogelation conditions, which is very important feature for this kind of scaffold materials in their tissue enginnering applications. 
Swelling behavior of cryogels in water was also investigated. The volume swelling ratio of fibroin scaffolds was found to be close to unity, independent on the concentrations of fibroin and BDDE at the gel preparation. However, the weight swelling ratio was much larger than the unity and dependent on the concentrations of fibroin and BDDE. The porosity of the scaffolds estimated from the difference between weight and volume swelling ratios was found to be 95 % for SN cryogels. For DN and TN cryogels, porosity decrased to 75 % and 79 %, respectively.
In concluding, we combined two different techniques, namely cryogelation and double-network techniques for the first time to obtain mechanically strong fibroin scaffolds. By simultaneous application of these two technique, we were able to enhance the mechanical performance of traditional single-network fibroin scaffolds. Fibroin scaffolds reported in this thesis exhibit larger moduli and mechanical strenght as compared to those reported in the literature, thus making them a good candidate as bone scaffold materials.