Hücre kültürü psoriasis modelinde keratinosit miRNA'larının hastalığın başlangıç evresinde araştırılması
Investigation of keratinocyte miRNA in the initial stage of the disease at psoriasis cell culture model
Yazar: AYŞEN BUKET ER URGANCI
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM AÇIKBAŞ
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Deri hastalıkları = Skin diseases ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre kültürü = Cell culture ; Keratinler = Keratins ; Keratinositler = Keratinocytes ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Mikro RNA = Micro RNA ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Psoriyazis = Psoriasis ; Sitokinler = Cytokines

Özet:
Psoriasis T hücre aracılı keratinosit hiperproliferasyonuyla ve keskin sınırlı, eritemli plak veya papüller üzerinde yerleşmiş, parlak sedefi-beyaz skuamlarla karakterize kronik, multifaktöryel inflamatuar bir deri hastalığıdır. MikroRNA'lar intron veya ekzonlardan ve protein kodlamayan genlerden transkribe olan; fakat proteine translasyonu gerçekleşmeyen, transkripsiyonel ve posttranskripsiyonel düzeyde negatif gen düzenleyiciler olarak görev alan, ~19-24 nükleotid uzunluğunda, tek zincirli, endojen, kısa RNA dizileridir. Psoriazis patogenezinde miRNA'lar keratinosit farklılaşması, proliferasyonu, inflamasyon, anjiyogenez de görev almalarının yanı sıra regülatör T hücrelerinin regülasyonu ve miRISC kompleksi üzerinden mRNA ve miRNA biyogenezinde görev almaktadır.
Çalışmamızda, psoriazis patogenezinde keratinosit hücre hatlarında zamana bağlı miRNA profillendirilmesini yaparak patogenezin başlangıç-tetiklenme aşamasındaki miRNA ekspresyon değişimlerini bulmayı amaçladık.
HaCaT keratinosit hücre hattı 1,2,4,8,12,24,48 ve 72 saat 200 ng/ml LPS ile muamele edildi ve ELISA ile IL-1β, IL-17, TNF-α ve LL-37 miktarları tayin edildi. Bu hücrelerden keratinosit spresifik miR-203 ekspresyonu qRT-PCR ile teyit edildi. ELISA sonucu ve miR203 ekspresyon sonucuna göre 1,5 ve 8. saatler seçilerek miRNA'lar ve mRNA'lar arraye gönderildi, profillendirildi, listelendi ve ekspresyonu değişen m/miRNAların psoriazis oluşumundaki rolleri belirlendi. 
Ekspresyonu değişen miRNA'ların ekstrasellüler matriks reseptör yolağı, Hippo sinyal yolağı, yağ asidi metabolizması, TGF-β sinyal yolağı ve kök hücrelerin pluripotensisini düzenleyen sinyal yolakları ile ilişkili olduğu KEGG yolak analizi ile saptandı. Ayrıca psoriasis patogenezinde immün yanıt, keratinosit proliferasyonu ve farklılaşması, apoptoz inhibisyonu ve ROS oluşumunda görev alan miR-128-3p, miR-597-5p, miR-30c-1-3p, miR-769-5p, miR-486-3p, 1226-5p, miR-574-5p, miR-22-3p, miR-941, miR-301a-3p, miR-148b-5p, miR-146a-5p, miR-148a-3p, miR-148b-3p, miR-221, miR-181c-5p ve miR-224'ün bu saatlerde ekspresyonlarının anlamlı olarak değiştiği görüldü.
Bu bilgiler ışığında psoriasis hastalığını başlangıç aşamasındaki değişikliklerin bir kısmı aydınlatılmış oldu. Başlangıç aşamasının tam olarak ortaya konması için 8. saatten sonraki sürelerde de hücresel ve miRNA analizlerinin devam ettirilmesinin faydalı olacağını düşünmekteyiz.


Anahtar Kelimeler: Psoriasis, Patogenez, HaCaT, miRNA, Sitokin, LPS

Abstract:
Psoriasis is a chronic, multifactorial inflammatory skin disease characterized by T cell-mediated keratinocyte hyperproliferation and shiny, marginal plaques or papules with bright, pearlescent white scales. MicroRNAs, are single-chain, endogenous, ~ 19-24 nucleotides length RNA sequence, transcribed from introns or exons and from genes that do not encode proteins; which serve as negative regulators of transcriptional and posttranscriptional levels. In the pathogenesis of psoriasis, miRNAs are involved in keratinocyte differentiation, proliferation, inflammation, angiogenesis, as well as regulation of regulatory T cells and mRNA and miRNA biogenesis via miRISC complex.
In our study, we aimed to find miRNA expression changes in the initiation-triggering stage of pathogenesis by profiling miRNAs in keratinocyte cell lines at time-dependent manner.
The HaCaT keratinocyte cell line was treated with 200 ng / ml LPS for 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 and 72 hours and IL-1β, IL-17, TNF-α and LL-37 secretion quantified by ELISA. Expression of keratinocyte-specific miR-203 from these cells was confirmed by qRT-PCR. According to the ELISA and miR203 expression results. 1,5th and 8th hours were selected for array. miRNAs and mRNAs isolated from LPS stimulated cell lines and arrayed by private company and array outputs were analysed. The roles of altered expression of the m/miRNAs in the pathogenesis of psoriasis were figured out. 
Expression-altered miRNAs have been associated with extracellular matrix receptor pathway, Hippo signaling pathway, fatty acid metabolism, TGF-β signaling pathway, and signaling pathways regulating pluripotency of stem cells by KEGG pathway analysis. In addition, the miRNAs whose expression significantly changed at the time points, miR-128-3p, miR-597-5p, miR-30c-1-3p, miR-769-5p, miR-486-3p, MiR-148a-3p, miR-148b-3p, miR-148b-5p, miR-146a-5p, miR- miR-221, miR-181c-5p and miR-224, are involved in the immune response, keratinocyte proliferation and differentiation, apoptosis inhibition and ROS formation.
According to these results, some of the changes in the initiation stage of psoriasis disease have been clarified. We think it would be useful to continue cellular and miRNA analyses after the 8th hour to ensure that the baseline stage is fully established.


Keywords : Psoriasis, Pathogenesis, HaCaT, miRNA, Cytokine, LPS