Mikrodalga uygulanan MIR604 ve MON810 mısır unlarının omik yaklaşım ile karakterizasyonu
Characterization of microwave-treated MIR604 and MON810 maize flours with omics approach
Yazar: BEGÜM ZEYNEP HANÇERLİOĞULLARI
Danışman: PROF. DR. REMZİYE YILMAZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Gıda biliminde omik yaklaşım, günümüzde, araştırmacılara gıda bileşenlerini ve besin maddelerini karakterize etme ve değerlendirme konusunda sağlam, verimli ve hassas analitik araçlar sunmaktadır. Mikrodalga teknolojisi gibi işleme teknolojilerinin uygulanması ve gıda bileşenleri üzerindeki etkileri, gıda bilimi ve endüstrisi tarafından incelenip benimsenmiştir. Bu tez çalışmasında, mikrodalga uygulaması öncesi ve sonrasında, MIR604 ve MON810 mısır unları ile genetik modifiye (GM) olmayan muadillerinin moleküler ve kimyasal karakterizasyonunun, genomik, transkriptomik, metabolomik ve lipidomik gibi omik yaklaşımlar kullanılarak gerçekleştirilmesi ve elde edilen yüksek teknolojiye bağlı verilerin uygun istatistiksel araçlarla değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Çalışmadaki bulgularla, proses etkisine bağlı mısır unu örneklerinde hem moleküler hem de kimyasal bileşenlerin karakterizasyonu için bir arka plan oluşturulmasına yönelik önemli bilgiler sunulmuştur.
 
Genomik kapsamında, DNA'ya dayalı teknikler ile genetik modifiye organizma (GMO) tespiti amacıyla örneklere tarama yöntemleri uygulanmıştır. Örneklerde Karnabahar mozaik virüsü (CaMV) 35S promotörü (P-35S), Figwort mozaik virüsü promotörü (P-FMV) ve T-NOS (nopalin sentaz terminatörü) dizilerinin tespiti için kalitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bazlı tarama yöntemi kullanılmıştır. DNA ekstraksiyonunun etkinliği, bitki spesifik Aktin (ACT) geni için yapılan inhibisyon çalışmasıyla doğrulanmıştır. Tarama analizlerinin doğrulama çalışmaları hem mutlak tespit limiti (LODabs) hem de tip 1 (yanlış pozitif) ve tip 2 (yanlış negatif) hata oranı parametrelerinin belirlenmesiyle gerçekleştirilmiştir. Transkriptomik kapsamında, mikrodalga uygulamasının etkisini incelemek için RNA'ya dayalı analizler ile Argonot (ZmAGO1a) ve Reseptör benzeri protein kinaz (ZmRLK9) enzim genlerinin ekspresyon profili ortaya konmuştur. EvaGreen bazlı revers transkriptaz-kantitatif PCR (RT-qPCR) analizleri ile tüm örneklerde bu iki gen tespit edilip, genlerin mutlak gen ekspresyon profilleri incelenmiştir. RNA ekstraksiyonu yönteminin etkinliği, mısır referans geni (Alkol dehidrogenaz, ZmADH1) için yapılan doğrulama çalışmasıyla belirlenmiştir. İki gen için kalibrasyon eğrileri oluşturulmuş ve her analiz için amplifikasyon verimi, özgüllük, laboratuvar içi tekrar üretilebilirlik standart sapması (SR), bağıl tekrar üretilebilirlik standart sapması (RSDR), tespit limiti (LOD) ve ölçüm limiti (LOQ) gibi doğrulama parametreleri değerlendirilmiştir. 

Metabolomik çalışmalar kapsamında, mikrodalga uygulaması sonrasında mısır ununun kimyasal bileşenleriyle ilgili detaylı bilgiler elde etmek amacıyla, tüm örneklerin birincil metabolit profilleri (yağ asitleri, amino asitler, şekerler, organik asitler vb.) gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) kullanılarak belirlenmiş ve aynı zamanda GC-alev iyonizasyon dedektörü (FID) analizi ile fitosterol bileşikleri tespit edilmiştir. Örneklerin birincil metabolitlerinin tanımlanmasında kütle spektral kütüphanelerinden yararlanılmış, fitosterol bileşikleri ise standartların alıkonma süreleriyle karşılaştırılarak doğrulanmıştır. Birincil metabolitlerin çeşitli metabolik yolaklardaki biyolojik işlevlerini daha iyi anlamak için KEGG yolak analizi gerçekleştirilmiştir. Lipidomik kapsamında ise, mikrodalga uygulamasının örneklerin yağ asidi kompozisyonları üzerindeki etkisini incelemek için GC-FID sistemi kullanılmıştır. Tespit edilen yağ asidi bileşikleri, yağ asidi metil esterleri (FAME) standardındaki bileşiklerin alıkonma süreleriyle karşılaştırılarak doğrulanmıştır. Doymamış yağ asitlerinin (UFA) doymuş yağ asitlerine (SFA) oranı belirlenerek, örneklerin yağ asidi kompozisyonlarının besinsel kalitesi değerlendirilmiştir. Mikrodalga uygulaması öncesinde ve sonrasında, GC teknikleri ile elde edilen veri setlerini yorumlamak ve karşılaştırmak için Hiyerarşik Kümeleme Analizi (HCA) ve Temel Bileşen Analizi (PCA) gerçekleştirilmiştir.

Bulgular, omik teknolojilerin mikrodalga uygulanan GM gıda ürünleri için gıda kompozisyonu açısından risk değerlendirme yaklaşımı oluşturulmasına zemin hazırlayarak, araştırmacılar ve düzenleyici sistemler tarafından yapılacak olan kapsamlı çalışmalara temel sağlaması nedeni ile önem arz etmektedir.

Abstract:
The omics approach in food science provides researchers with robust, efficient, and sensitive analytical tools for characterizing and evaluating food components and nutrients. The application of processing technologies, such as microwave technology, and their effects on food components have been studied and adopted by the food science and industry. In this thesis, the aim was to perform the molecular and chemical characterization of MIR604 and MON810 maize flours, along with their non-genetically modified (GM) counterparts, before and after microwave treatment, using omics approaches (genomics, transcriptomics, metabolomics, and lipidomics), and to evaluate the obtained data with appropriate statistical tools. With the findings, important information has been presented to establish a background for the characterization of molecular and chemical components in maize flour samples, depending on the process effect.

In genomics, screening methods were applied to samples for the detection of GMOs using DNA-based techniques. Qualitative polymerase chain reaction (PCR)-based screening method was used to detect Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (P-35S), Figwort mosaic virus promoter (P-FMV), and T-NOS (nopaline synthase terminator) sequences in the samples. The effectiveness of DNA extraction was confirmed by an inhibition study for Actin (ACT) gene. Verification studies of screening analyses were performed by determining both the absolute limit of detection (LODabs) and the type 1, type 2 error rate parameters. In transcriptomics, the expression profiles of the Argonaute (ZmAGO1a) and Receptor-like protein kinase (ZmRLK9) enzyme genes were revealed by RNA-based analysis to examine the effect of microwave treatment. These two genes were detected with EvaGreen-based reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) analyses, and their absolute gene expression profiles were examined. The effectiveness of RNA extraction method was determined by verification study for Alcohol dehydrogenase (ZmADH1) gene. Calibration curves were constructed, and verification parameters (amplification efficiency, specificity, reproducibility standard deviations, limit of detection (LOD), and quantification (LOQ)) were evaluated.

In metabolomics, to obtain detailed information about the chemical components of samples following microwave treatment, the primary metabolite profiles were determined using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and phytosterol compounds were detected through GC-flame ionization detector (FID) analysis. Mass spectral libraries were used to identify the primary metabolites and phytosterol compounds were confirmed by comparing the retention times of the standards. To better understand the biological functions of primary metabolites in various metabolic pathways, KEGG pathway analysis was performed. In lipidomics, GC-FID system was employed to investigate the effect of microwave treatment on the fatty acid compositions of the samples. The detected compounds were confirmed by comparing them with the retention times of the FAME standard. The nutritional quality of the composition in the samples was assessed by determining the ratio of unsaturated fatty acids (UFA) to saturated fatty acids (SFA). Hierarchical Cluster Analysis (HCA) and Principal Component Analysis (PCA) were conducted to interpret and compare data sets obtained through GC techniques.

The findings are important as they provide a foundation for a risk assessment approach regarding the food composition of microwave-treated GM food products using omics technologies, thereby supporting comprehensive studies to be undertaken by researchers and regulatory systems.