Sortaz A enzimine karşı inhibitör peptitlerin geliştirilmesi
Developing of inhibitor peptides against sortase A enzyme
Yazar: MÜCAHİDE KÖKSAL
Danışman: YRD. DOÇ. FAHRİYE CEYDA DUDAK ŞEKER
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Antibiyotik direnci gösteren patojenik bakteri suşları insan sağlığını önemli düzeyde tehdit etmektedir. Bu önemli sorunun üstesinden gelebilmek için, bu bakterilerin gelişimlerini yavaşlatacak veya durduracak yeni antimikrobiyal maddelerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu doğrultuda, mikroorganizmaların yaşamsal faaliyetlerini veya patojenitelerini etkileyecek yeni hedef moleküllerin bulunması etkin bir strateji olarak görülmektedir. Gram-pozitif bakterilerin virülanslıklarına önemli düzeyde katkı sağlayan sortaz enzimleri, antimikrobiyal maddelerin geliştirilmesinde kullanılabilecek yeni bir hedef molekül olarak karşımıza çıkmaktadır. Çoğu Gram-pozitif bakteri farklı sortaz izoformlarına sahipse de, bunlar arasında sortaz A (SrtA) tüm Gram-pozitif bakterilerde korunmuştur. SrtA enziminin inhibisyonunu sağlayan maddelerin, Gram-pozitif patojenlere karşı antimikrobiyal etkiye sahip olma potansiyellerinin yüksek olduğunu göstermektedir. Bu durum, SrtA'ya karşı etkili bir inhibitör geliştirilmesini popüler bir çalışma konusu haline getirmiştir.  
Faj gösterim teknolojisi, herhangi bir hedef moleküle afinite gösteren peptitlerin seçilmesinde ve geliştirilmesinde sıklıkla kullanılmaya başlanmıştır. Faj gösterim peptit kütüphaneleri hedef moleküllere seçici olarak bağlanan yapay tanıyıcı moleküllerin geliştirilmesini sağladığı gibi, protein-protein etkileşimlerinin incelenmesine ve spesifik protein bölgelerinin haritalanmasına da imkan tanımaktadır. Faj gösterim yöntemi ile peptit yapısında enzim inhibitörlerinin başarılı bir şekilde seçilebilmesi, özellikle antibiyotik direncine sahip bakteri suşlarının inhibisyonu için yeni antimikrobiyal peptitlerin geliştirilmesini sağlamıştır.
Çalışmada, rastgele dizilimlerden oluşan ve yüksek çeşitlilik gösteren faj peptit kütüphaneleri kullanılarak SrtA enzimini seçici ve etkin bir şekilde inhibe edecek yeni peptit inhibitörlerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, öncelikle Staphylococcus aureus SrtA geni ekspresyon vektörü aracılığıyla Escherichia coli'ye aktarılmış ve SrtA enziminin rekombinant olarak üretilmesi ve saflaştırılması sağlanmıştır. Saflaştırılan SrtA, faj gösterim yönteminin seçim aşamasında hedef molekül olarak kullanılmıştır. SrtA'ya seçici olarak bağlanan ve inhibe eden peptiti taşıyan faj klonlarının seçimi için 7 amino asit uzunluğunda lineer ve halkalı peptit kütüphaneleri kullanılmıştır. Elüsyon aşamasında serbest SrtA enzimi ve serbest SrtA substratı kullanılmış ve 3 döngü sonunda toplamda 88 faj klonunun izolasyonu gerçekleştirilmiştir. İzole edilen faj klonlarının SrtA aktivitesi üzerindeki etkileri incelenmiş ve 12 faj klonunun enzim aktivitesinde azalışa neden olduğu saptanmıştır. Seçilen faj klonları arasında en yüksek inhibitör etkiye sahip klonun SrtA aktivitesini %30 oranında azalttığı belirlenmiştir. İnhibitör etki gösteren 6 faj klonunun değişken bölge DNA sekansları belirlenmiş ve faj klonlarının taşıdıkları peptit dizilimleri saptanmıştır. 
Çalışmanın sonucunda, patojen bakterilerin virülanslığı üzerinde önemli bir etkisi olan SrtA enzimine karşı inhibitör özellik gösteren peptitleri taşıyan faj klonları seçilmiştir. Belirlenen peptit dizilimlerinin, potansiyel SrtA inhibitörleri olarak  yeni antimikrobiyal ajanlar geliştirilmesinde kullanılabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
The emergence of pathogenic bacterial strains resistant to antibiotics is a major human health threat. In order to overcome this critical problem, it is in urgent need of developing novel antimicrobial agents those either kill or inhibit the growth of bacteria. Accordingly, the discovery of new target molecules, that will affect vital functions or the pathogenicity of the microorganisms, has been considered as an effective strategy for the development of new antimicrobial agents. Sortase enzymes, found in Gram-positive bacteria, appear as a new target molecule which can be used in the development of antimicrobial agents. Although many Gram-positive bacteria possess different isoforms of sortase, among them, sortase A (Srt A) is conserved in all pathogenic species. It has been shown that the infectivity of bacteria decreased for those having SrtA gene mutation. Agents, inhibiting the SrtA enzyme activity, have a great potential of showing antimicrobial activity against Gram-positive pathogens. Hence, the development of effective inhibitors against SrtA has become a popular subject for researchers.
Phage display technology has been used frequently in the selection and development of peptides that show affinity to various target molecules. Phage display peptide libraries not only provide the development of artificial recognition molecules which selectively bind to target molecules, but also used in analysis of protein-protein interactions and mapping specific regions of the protein. Selection of enzyme inhibitors with the phage display method provides the development of new antimicrobial peptides for inhibition of the antibiotic resistant bacterial strains.
In this study, it is aimed to develop novel peptide inhibitors that selectively and effectively inhibit the SrtA enzyme by using high diversity phage displayed peptide libraries. Accordingly, SrtA gene expression vector of Staphylococcus aureus was transferred into Escherichia coli, for the production and the purification of recombinant SrtA enzyme. Purified SrtA was used as the target molecule in the biopanning of phage display method. Linear and cyclic peptide libraries of 7 amino acids in length were used to select phage clones carrying the selectively binding and inhibiting peptide to SrtA. During the elution phase, free SrtA and free SrtA substrate were used and at the end of 3 cycles isolation of 88 phage clones was performed. The effects of the isolated phage clones on SrtA activity were analyzed and it was determined that 12 phage clones cause a decrease in enzyme activity. It was determined that the clone with the highest inhibitory effect among selected phage clones reduced the activity of SrtA by 30%. The variable region DNA sequences of 6 phage clones with inhibitory effect were determined and the peptide sequences of the phage clones were determined.
As a result of the study, phage clones carrying peptides showing inhibitory properties against the enzyme SrtA, a significant effect on the virulence of pathogenic bacteria, were selected. It is thought that the identified peptide sequences may be used as potential SrtA inhibitors in the development of novel antimicrobial agents.