Pseudomonas spp.'de lipaz enzimi üzerine çalışmalar
Studies on lipase enzymes from Pseudomonas spp.
Yazar: RUKİYE BORAN
Danışman: DOÇ. DR. AYSEL UĞUR
Muğla Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Lipaz = Lipase ; Palm yağı = Palm oil ; Pastörizasyon = Pasteurization ; Pseudomonas fluorescens = Pseudomonas fluorescens ; Pseudomonas putida = Pseudomonas putida ; Saflaştırma = Purification ; Süt = Milk

Özet:
Bu çalışmada; Pseudomonas CFC Agar kullanılarak bozulmakta olan çiğ ve pastörize süt örneklerinden 85 izolat elde edilmiştir. Bütün izolatların lipolitik aktiviteleri Tribütirin Agar ve Rhodamin B Agar'da kalitatif olarak belirlenmiştir.İzolatlara Gram boyama yapılmış ve Gram negatif izolatlar seçilmiştir. Ayrıca izolatlara katalaz ve oksidaz testleri, Mac Conkey Agarda gelişme durumları ve O/F testleri yapılmıştır. Gram negatif, katalaz ve oksidaz pozitif, laktoz negatif ve oksidatif metabolizma gösteren izolatlar API 20NE identifikasyon testi aracılığı ile tür seviyesinde identifiye edilmiştir. Toplam 37 izolat karakterize edilmiş ve 36 tanesi (97.30%) P. fluorescens, 1 (2.70%) P. putida olarak identifiye edilmiştir. Lipaz aktivitesi substrat olarak p-nitrofenil palmitatın kullanılmasıyla spektrofotometre ile kantitatif olarak ölçülmüştür. Suşların tamamı lipaz aktivitesi göstermiştir. Bu suşların lipaz aktivitesinin 10.03 U/ml ve 22.16 U/ml aralığında olduğu bulunmuş ve en yüksek lipaz aktivitesinin P. fluorescens RB02?3 suşuna ait olduğu belirlenmiştir. P. fluorescens RB02?3'ün zamana bağlı enzim üretimi bazal mediumda gözlenmiş ve maksimum aktiviteyi 40 saat sonra geç logaritmik fazda üretmiştir ve durağan faza ulaşınca azalmıştır. P. fluorescens RB02?3 suşunun ekstraselüler lipazı amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve Sephadex G?100'ün kullanıldığı jel filtrasyon kolon kromatografisi kombinasyonu kullanılarak homojen olarak saflaştırılmıştır. P. fluorescens RB02?3 suşundan ekstraselüler lipaz % 20.3 verim ile 2.97 kat saflaştırılmıştır. Saf enzimin moleküler ağırlığı SDS-PAGE ile yaklaşık 57 kDa olarak belirlenmiştir.Ardından, bu enzim karakterize edilmiş ve maksimum aktiviteyi pH 7.0 ve 50 ºC `de göstermiştir. Hekzan, etil asetat ve butanol gibi çeşitli organik solventlerin varlığında yüksek stabilite sergilemiş, izopropanol ve etanol lipaz aktivitesini arttırmıştır. Bu lipaz MnCl2, FeCl3, ZnCl2, CoCl2, CuCl2, NiCl2 ve EDTA varlığında biraz inhibe olmuştur fakat SDS ve Tween 80 aktiviteyi etkilememiştir.

Abstract:
In this study; 85 isolates from spoilage raw milk and pasteurized milk samples were obtained by using Pseudomonas CFC Agar. The lipolytic activities of all the isolates were qualitatively determined in Tributyrin Agar and Rhodamine B Agar.These isolates were tested for Gram stain and selected Gram negative isolates. Additionally, catalase and oxidase tests, growth on Mac Conkey Agar and O/F tests were employed. Isolates determined as Gram-negative, catalase and oxidase positive, lactose negative and oxidative metabolism were identified at species level by means of API 20NE identification test. A total 37 isolates characterized and 36 (97.30%) of the isolates were identified as P. fluorescens, 1 (2.70%) was identified as P. putida. Lipase activity was quantitatively measured through a spectrophotometer using p-nitrophenyl palmitate as substrate. All strains displayed lipase activity. This strains of lipase activity between 10.03 U/ml and 22.16 U/ml was found and P. fluorescens RB02?3 was determined to give the highest lipase activity. Time course of enzyme production by P. fluorescens RB02?3 was obserwed in basal medium and maximum activity was produced in the late logarithmic phase after 40h and levels increased once the stationary phase was reached. The extracellular lipase of P. fluorescens RB02?3 strain was homogeneously purified using a combination of ammonium sulfate precipitation, dialyze and gel filtration column chromatography with Sephadex G?100. An extracellular lipase from P. fluorescens RB02?3 strain was purified 2.97 fold with 20.3% recovery. The molecular mass of the purified enzyme was determined to be approximately 57 kDa by SDS-PAGE.After that, the enzyme was characterized and enzyme exhibited maximum activity at pH 7.0 and 50 ºC, respectively. The enzyme exhibited the highest stability in the presence of various organic solvents such as hexane, ethyl acetate and butanol, but isopropanol and ethanol enhanced lipase activity. The lipase was slightly inhibited in the presence of MnCl2, FeCl3, ZnCl2, CoCl2, CuCl2, NiCl2 and EDTA whereas SDS and Tween 80 had no effect on its activity.