Aşı geliştirilmesinde kullanılmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilen L. infantum antijenlerinin in vivo oluşturduğu immün yanıtın karşılaştırmalı olarak incelenmesi
Comparative investigation of in vivo immune response induced by various L. infantum antigens, obtained that are with different techniques, for vaccine development
Yazar: ÖZLEM AYŞE ÖZYILMAZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MELAHAT BAĞIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Dünya'nın ve Türkiye'nin en önemli halk sağlığı problemlerinden birisi olan Leishmaniasis, Leishmania türündeki zorunlu hücre içi parazitlerin neden olduğu tropikal bir hastalıktır. Dünyada 350 milyon kişi Leishmaniasis'e yakalanma riski altındadır. Hastalık Türkiye'nin de içinde olduğu 98 ülkede endemik olup, enfekte kişilerin sayısı ise 12 milyondur. Hastalığın farklı klinik formlarından Visseral Leishmaniasis (VL), tedavi edilmediği durumlarda ölümlere neden olmaktadır. Hastalığın yaygın olarak görülmesinin nedenlerinin başında Leishmaniasis'e karşı henüz tam olarak etkin ve güvenilir bir aşı formülasyonunun geliştirilememiş olması gelmektedir. Günümüze kadar üç jenerasyonda aşı adayları geliştirilse de, her birinin farklı dezavantajları bulunmaktadır. Leishmaniasis'e karşı mevcut aşı çalışmaları rekombinant antijenlerin kullanımına dayalı olsa da tüm parazit antijeni kullanımına yönelik çalışmalar maliyet, güvenlik, antijenik özellik ve antijenin biyokimyasal bileşiminin stabilitesi açısından hala gündemdedir. Dondurup/ çözme yöntemiyle elde edilmiş çözünür tüm leishmania antijenlerinin (D/Ç Ag ve ya SLA) hastalığa karşı koruyucu çeşitli epitopları içermesi ve farklı MHC molekülleriyle etkileşime girebilmeleri aşı geliştirilmesinde önemli bir rol oynayabilir. Ancak bu tür aşı formülasyonlarının en büyük dezavantajı, elde edilen antijenlerin tek başına veya kullanılan çeşitli adjuvanlarla birlikte yeterli immün yanıt oluşturamamasıdır. Buna göre günümüzde öldürülmüş parazit antijenlerinin oluşturduğu immün yanıtı arttırabilmek için daha uygun adjuvanların araştırılması oldukça önemlidir. FDA onaylı ve suda çözünebilir bir polimer olan polioksidonyum (PO)  insanlarda hem akut hem de kronik enfeksiyonlarının tedavisinde etkili bir immünostimülan (bağışıklık uyarıcı) etkiye sahip, güvenli bir immüno-düzenleyici olarak kabul edilmektedir. Bu durum PO'nun diğer bulaşıcı hastalıklara karşı aşı geliştirilmesinde de kullanılmasına olanak sağlamaktadır.  Ancak literatürde PO'nun öldürülmüş Leishmania antijenleriyle kombinasyonlarının immünojenik özellikleriyle ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı, Visseral leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde dondurup/çözme ve otoklavlama yöntemleriyle elde edilen öldürülmüş Leishmania infantum antijenlerinin PO adjuvanı ile aşı formülasyonlarının oluşturulması ve elde edilen formülasyonların immünojenik etkinliğinin in vitro ve in vivo  olarak  ilk kez incelenmesidir. 
Bu amaç doğrultusunda, öncelikle dondurup çözme ve otoklavlama yöntemleriyle öldürülmüş Leishmania antijenleri elde edilmiş ve PO adjuvanı ile birlikte farklı konsantrasyonlardaki formülasyonları elde edilmiştir. Daha sonra elde edilen formülasyonların toksisitesi J774 makrofaj ve L929 fibroblast hücre kültüründe MTT yöntemi ile incelenmiştir. Bunu takiben toksik olmadığı belirlenen formülasyonların makrofaj hücre kültüründe Nitrik Oksit (NO) üretme potansiyeli ve enfekte makrofajlardaki parazitleri öldürme konusundaki etkinliği incelenmiştir. In vitro sonuçlara göre hem dondurup/çözme hem de otoklavlama yöntemleriyle elde edilen antijenler için PO adjuvanıyla oluşturdukları en uygun formülasyon seçilmiş ve bu formülasyonların etkinliği in vivo hayvan modellerinde incelenmiştir. Balb/C fareler üzerinde yapılan 4 immünizasyon işleminin her ikisinde bir farelerin kan serumları alınmış ve oluşan antikor miktarı ELISA yöntemiyle belirlenmiştir. Ayrıca immünizasyonların tamamlanmasının ardından sakrifiye edilen farelerden dalak lenfositleri izole edilmiş ve lenfositlerden salgılanan IL-4, IL-10, IL-12 ve TNF-α sitokinleri ticari bir kit yardımıyla tayin edilmiştir. 
Elde edilen sonuçlara göre, incelenen farklı antijen konsantrasyonlarının J774 makrofaj ve L929 fare fibroblast hücre kültüründe kontrole kıyasla anlamlı bir toksik etki göstermediği saptandı. Formülasyonların, makrofajların NO üretmeleri üzerindeki etkinliği incelendiğinde ise, makrofaj hücrelerinde NO üretimine en fazla etkiyi kontrole kıyasla NO üretimini 4 kat arttıran PO-D/Ç Ag  kombinasyonu (250 µg/ml:100 µg/ml) ve PO-Otoklavlanmış Ag kombinasyonunun (250 µg/ml:100 µg/ml) gösterdiği saptandı. Böylece yapılan in vitro çalışmalar sonucunda en uygun aşı formülasyonunun PO-D/Ç Ag kombinasyonu (250 µg/ml:100 µg/ml) ve PO-Otoklavlanmış Ag (250 µg/ml:100 µg/ml) kombinasyonu olduğu belirlendi. Daha sonra belirlenen bu formülasyonlar Balb/c fareler üzerinde denendi. Farelerden alınan serum örneklerinde hem PO-D/Ç Ag kombinasyonunun hem de PO-Otoklavlanmış Ag kombinasyonunun antikor seviyesininin tek başına antijen ve adjuvan uygulanmış gruplara göre anlamlı şekilde arttığı tespit edilmiştir. Ancak en yüksek antikor seviyesi, PO-D/Ç Ag kombinasyonunun uygulanan gruplarda gözlenmiştir. Ayrıca farelerin sakrifikasyonunun ardından elde edilen dalak lenfosit kültürlerinde PO-D/Ç Ag kombinasyonunun ve PO-Otoklavlanmış Ag kombinasyonunun IL-12 ve TNF-α sitokin seviyelerini anlamlı bir miktarda arttırdığı, diğer yandan IL-4 ve IL-10 seviyelerinde ise herhangi bir değişikliğin olmadığı belirlenmiştir.  Elde edilen sonuçlara göre, farklı yöntemlerle elde edilen öldürülmüş Leishmania antijenlerinin PO ile kombinasyonlarının farelerde gerek antikor seviyesini gerekse de TH1 immün yanıtı indükleyen IL-12 ve TNF-α sitokin seviyelerini arttırması, bu aşı formülasyonlarının immünojenik özelliklerini net bir şekilde ortaya koymuştur. Böylece bu çalışmada ilk kez olarak, farklı yöntemlerle elde edilen öldürülmüş parazit antijenlerinin PO ile hazırlanan formülasyonlarının, aşı adayı olarak önemli bir potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Öldürülmüş Leishmania antijenleri ve PO'dan oluşan formülasyonların gelecekte Leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde önemli bir rol oynayabileceği düşünülmektedir. Böylece bu tez çalışması kapsamında ilk kez olarak visseral leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinede PO'a dayalı tüm L. İnfantum antijenlerini içeren aşı adayı formülasyonları elde edilmiştir. Ayrıca leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinede ilk kez olarak makrofaj hücre sisteminin aşı adaylarının seçilmesinde uygun olduğu gösterilmiştir. Geliştirilmiş yeni aşı adaylarının ileride birinci jenerasyon aşı adayları arasında yer alabileceği düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: L.infantum, PO, MTT, hücre kültürü, nitrik oksit, aşı, sitokin

Abstract:
Leishmaniasis is one of the most important public health problem both of world and Turkey which is a tropical disease caused by the obligate intracellular parasites Leishmania species. 350 millions people are under the risk of this disease in the world. The disease is endemic in 98 countries including Turkey that is the number of infected people is 12 million.  Visceral leishmaniasis (VL) which is the different clinical forms of the disease can cause death if not treated. Widely seen as the leading cause of disease against Leishmaniasis yet fully developed lack of a safe and effective vaccine formulation comes. There are three generations vaccines developed up to day. Each of three generation vaccines have distinct disadvantages. Although the current strategy for vaccination against leishmaniasis is based on the use of recombinant antigens, whole parasite vaccines are still attractive in terms of cost, safety, and stability of their biochemical composition and antigenicity. Whole soluble Leishmania antigens obtained with freeze/thawed method contain several epitopes to protect against disease and can interact with different MHC molecules play an important role in the development of vaccines. But, the biggest disadvantage of this type of vaccine formulation is using antigen alone or together with adjuvant which can not generate an adequate immune response.  For increasing the immune response generated from killed parasites antigens is very important to investigate appropriate adjuvants in the present. 
Polyoxidonium (PO) is FDA approved and water soluble polymer that has an effective immunostimulating (immune stimulating) activity for the complex treatment of both acute and chronic infections in humans and has been recognized as an effective, safe immunomodulator. This situation can allow opportunity to use of PO in the further vaccines development against the other infectious diseases. However, there are no studies about immunogenic properties of combinations with PO and killed Leishmania antigen in the literature.  
Accordingly this thesis purpose of visceral leishmaniasis vaccine against development of freeze/thawed and autoclaving obtained by killed Leishmania infantum antigens PO with adjuvant vaccine formulations created and the resulting formulations immunogenic activity in vitro and in vivo, for the first time to investigate. For this purpose, firstly, Leishmania antigens were obtained which killed by freeze / thawed and using autoclave and formulations were obtained that have different consantration with PO adjuvant. Then, toxixity of formulation was examined with MTT assay on J774 macrophage and L929 fibroblast cell culture. And then, nontoxic formulations, that are determined to be, were imvestigated product potential of NO (nitric oxide) in macrophage cell culture and ability to killing parasites on infected macrophages cells.
According to results of in vitro, to choose the best formulation with PO adjuvant for antigens, were obtained by both freeze/thawed  and autoclaved, and the efficacy of these formulations was investigated on in vivo animal models.  Both two of four immunization on Balb/C mice, was taken blood serum of mice and amount of the antibody has been identified by ELISA. Also, spleen lenfosites were isolated from mice, that killed after completion of immunizations, and IL-4, IL-10, IL-12 and TFN- α cytokines, secretion from lenfosites, are  were identified by a commercial kit. According to the results, examined antigens and polymers concenrations did not show toxic effect compared to control on J774 macrophage and L929 mice fibroblast cell culture. When determined to efficacy of formulations on NO products of macrophages, PO-D/Ç Ag combination (250 µg/ml:100 µg/ml) and PO-autoclaved Ag combination (250 µg/ml:100 µg/ml), are 4 fold increase NO product,  were determined to show a maximum affect of NO product of macrophage cells compared control.  
Thus, results of studying on in vitro, its found that, the most appropriate vaccine formulation is PO-D/Ç Ag combination (250 µg/ml:100 µg/ml) and PO-autoclaved Ag combination (250 µg/ml:100 µg/ml). Then, determined formulations were tested on Balb/c mice. Antibody levels of both PO-D/Ç Ag combination and PO-autoclaved Ag combination have been identified to increase compared to just antigens or adjuvant applied groups, on serum samples taken from mice.  But the highest antibody level, it was shown applied PO-D/Ç Ag combination groups.  Moreover, IL-12 and TNF- α  cytokine levels were increased by PO-D/Ç Ag combination and PO-autoclaved Ag combination, on the other hand, levels of IL-4 and IL-10 were not change on obtained spleen lenfosite culture after the killing of mice. The obtained results clearly demostrate that combination of killed Leishmania antigens with PO, are obtained different way, induced both antibody level and TH1 immune response which induced by IL-12 and TNF-α cytokine in mice. Thus for the first time in this study, derived from different methods formulations prepared  killed parasites with PO adjuvants, vaccine candidates have been shown to have significant potential.  Killed Leishmania antigens and their formulations with PO has comprising  future  thought to play an important role in the development of vaccines against leishmaniasis. Thus for the first time in  this thesis   vaccine candidate formulations containing the  whole L. infantum antigens with PO were obtained against the development of a vaccine for visceral leishmaniasis. Also for the first time in the development of vaccines against leishmaniasis macrophage cell system has been shown to be suitable for the selection of vaccine candidates. Developed  new vaccine candidate may  include first generation vaccine candidates are  in the future.

Keywords: L.infantum, PO, MTT, cell culture, nitric oxide, vaccine, cytokine