Meme kanseri hücrelerine mTOR antisens oligonükleotitlerini hedefleyecek transferrin kaplanmış altın nanopartiküllerin tasarımı sentezi ve uygulanması
Design, synthesis and application of transferrin coated gold nanoparticles for targeting mTOR antisense oligonucleotides to breast cancer cells
Yazar: EZGİ BEKTAŞ
Danışman: PROF. DR. AYŞE KEVSER ÖZDEN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir. Meme kanserinin tipi ve moleküler özellikleri prognozu belirleyip etkin tedavi protokollarinin tasarlanmasını da yönlendirmektedir. mTOR, memelideki Rapamisin hedefi, son yıllarda ilaç tasarlanan hedef moleküllerden birisidir. Hedeflenmiş tedavi gen tedavisini de içermektedir. Antisens oligonükleotit ve benzeri inhibitör nükleik asitlerin hücrelere aktarımı DNA ve RNA'nın polianyonik yapısı nedeniyle zordur. Dolayısıyla, etkin gen aktarımı için çok çeşitli vektörler tasarlanmakta ve kullanılmaktadır. Optoelektronik özellikleri, düşük toksitesi ve geniş yüzey alanıyla altın nanopartiküller (AuNP) potansiyeli olan nanoilaçlar olarak görülmektedirler. Bu çalışma, transferrin ve antisens oligonükleotit (AS-ODN) veya küçük inhibitör RNA (siRNA) ile işlevselleştirilmiş altın nanopartiküllerin oluşturulması ve metastatik potansiyeli yüksek insan meme kanser hücre hattı, MDA-MB-231 hücrelerine gen aktarımında kullanılmasını amaçlamaktadır. Transferrin reseptörlerinin bu hücrelerde aşırı eksprese olduğu göz önüne alınarak, transferrin bağlı altın nanopartiküllerin AS ODN veya siRNA aktarmak üzere özgül reseptör aracılığıyla alınması öngörülmüştür. mTOR'a özgü AS ODN'lerin altın nanopartiküllere indirgenmiş transferrin aracılığıyla bağlandığı poliakrilamid ve agaroz jel elektroforeziyle belirlenmiştir. Meme kanseri hücrelerine uygulanan serbest AS-ODN moleküllerinin hücre çoğalmasını kontrol hücrelerine göre 24 saatte % 24, 48 saatte %14 ve 72 saatte % 0.9 oranında azalttığı;   AuNP bağlı şekilde ise 24 saatte  % 38; 48 saatte % 30 ve 72 saatte % 10 oranında azalttığı ancak bu farkların istatistiksel olarak önemli olmadığı belirlenmiştir. Hücrelere transferrin bağlanıp, AS-ODN ile işlevselleştirilmiş AUNP uygulandığında ise 24 saatte % 85, 48 saatte % 89 ve 72 saatte ise %93 oranında azalttığı saptanmıştır. Sonuçlar kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında sonuç anlamlı bulunmuştur.
Benzer şekilde, meme kanseri hücrelerine uygulanan serbest mTOR'a özgü siRNA moleküllerinin de hücre çoğalmasını 24 saatte % 10, 48 saatte % 23 ve 72 saat sonra %16 oranında azalttığı, ancak bu farkların istatistiksel olarak önemli olmadığı belirlenmiştir. Hücrelere transferrin bağlanıp mTOR'a özgü siRNA ile işlevselleştirilmiş AuNP uygulandığında ise hücre çoğalmasının 24 saatte % 82, 48 saatte % 58 ve 72 saatte % 93 oranında azaldığı saptanmıştır. Sonuçlar kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında sonuç anlamlı bulunmuştur. Uygulama sonrasında mTOR ekspresyonu immünhistokimya yöntemiyle incelenmiş ve ekspresyonun da hücre sayısının da önemli oranda azaldığı belirlenmiştir.
Dolayısıyla, altın nanopartiküllerin hem nükleik asitleri bağlayan hem de reseptör aracılı hücre içine alınmasını sağlayan transferrinle işlevselleştirdiğinde AS-ODN ve siRNA için etkin vektörler oluşturabileceği belirlenmiştir. Sonuç olarak, oluşturulan bu yapıların biyouyumluluğu, in vivo etkinliği ve tedavide kullanım olanaklarını belirleyecek ileri çalışmalar gerekli olduğu düşünülmüştür.

Abstract:
Breast cancer is the most frequent cancer in women. The type and molecular characteristics of breast cancer determines prognosis and helps design effective therapy regimes. mTOR, the mammalian target of Rapamycin is one of the molecular targets to which novel drugs are being designed recently. Targeted breast cancer therapy may take the advantage of gene therapy. Delivery of antisens oligonucleotides or similar inhibitory nucleic acids is hampered by the polianionic nature of DNA or RNA. Therefore, a variety of vectors are used and designed for efficient gene delivery. Gold nanoparticles (AuNP) are potent nanodrugs having optoelectronical properties, low toxicity and wide surface area. This study aims to forming gold nanoparticles functionalized with transferrin and antisense oligonucleotides (ASODN) and small inhibitory RNA (siRNA) for gene delivery to highly metastatic human breast cancer cell line, namely MDA-MB-231. Since transferrin receptors are over expressed in these cells, it is postulated that transferrin attached gold nanorticles will be taken up by specific receptors to deliver the ASODN or siRNA. mTOR specific ASODN was found to bind on gold nanopaticles through reduced transferrin as depicted by polyacrylamide and agarose gel electrophoresis. ASODN molecules reduced cell viability 24%, 14% and 0.9 % in 24h, 48h, 72h respectively as compared to control cells. In AuNP bound form cell viability was 38% , 30% and 10% in 24h, 48h and 72 hours respectively. However, this was not statistically significant. Transferrin bound ASODN functionalized AuNPs  led to a decrease of 85% , 89% and 93% in 24h, 48h and 72 hours respectively. These results were found to be statistically important. Similarly, free mTOR specific siRNA applied to cells led to a decrease of 10 %, 23%and 15.8% in 24h, 48h and 72 hours but this was  not significant. On the other hand, when transferrin bound and mTOR siRNA functionalized AuNPs were applied the cell viability was decreased by 82% , 57 % and 93 % in 24h, 48h and 72 hours significantly. mTOR expression of treated cells were analysed by immunehistochemistry and the expression as well as cell number was found to be significantly decreased. Therefore, gold nanoparticles may be suitable vectors for AS ODN or siRNA when functionalized with transferrin that allowed attachment of nucleic acid agents as well as their receptor mediated delivery. It is concluded that further studies are needed to understand the biocompatibility and in vivo efficiency of these constructs, thus, the feasibility of their use in therapy.