Sığır mastitisi ve çevresel kaynaklı klebsiella pneumoniae suşlarının virulans faktörlerinin belirlenmesi
Determination of virulence factors of bovine mastitis and environmentally originated klebsiella pneumoniae strains
Yazar: MEVLÜT ATALAY
Danışman: PROF. DR. UÇKUN SAİT UÇAN
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
K.pneumoniae, doğada yaygın olarak rastlanan fırsatçı bir patojendir.   Bu mikroorganizma, dünya çapında süt ekonomisine ve hayvan refahına büyük zarar veren, süt çiftliklerindeki çoğunlukla en yaygın görülen mastitis hastalığının oluşmasını sağlayan bakteriyel etkenlerden biridir. Mastitise neden olan diğer bakteriyel etkenlerle kıyaslandığına, K.pneumoniae'nin daha erken ve şiddetli semptomlara sebep olabilmesi, daha uzun seyir izlemesi ve tedaviye yeterince cevap vermeyebilmesi gibi özelliklerinden dolayı bu etken önem kazanmaktadır. K.pneumoniae insan enfeksiyonlarında birçok araştırmaya konu olmasına rağmen süt çiftliklerinde mastitise neden olan K.pneumoniae nispeten az araştırılmıştır. Bu çalışmada Konya ilinde çiftlik bazında inek mastitisleri içerisinde Klebsiella mastitislerinin sıklığı ve izolatların fenotipik ve genotipik bazı özelliklerinin belirlenmesi, çiftliklerdeki sağım sistemleri ve altlık yapılarıyla K.pneumoniae izolasyonu arasındaki ilişkinin araştırılması amaçlandı. 

Bu çalışmada Konya merkez ve civarındaki farklı fiziksel ve sağım sistemlerinin bulunduğu çiftliklerdeki 1206 süt ineğini tarandı. Çiftliklerdeki mastitise neden olan klinik ve subklinik mastitisli sütlerden ve aynı zamanda aynı hayvanlara ait rektal ve nazal sıvap örneklerinden izole edilen Klebsilla izolatlarının tespiti ve izole edilen suşların fenotipik olarak 14 farklı antibiyotiğe karşı duyarlılık profilleri belirlendi. Suşların ayrıca fenotipik olarak Genişlemiş Spektrumlu β-Laktamaz (GSBL) üretimi çift disk sinerji yöntemi kullanılarak araştırıldı. Klebsiella spp. pozitif izolatların tespitinin hayvanların sağım günü sayısı, süt verimi ve laktasyon sayısı özellikleri arasındaki ilişki korelasyon analizleriyle belirlendi. Aynı zamanda izolatların patojenitelerine katkı sağlayan fim H-1, mrkD, ycfM, entB, fyuA, hlyA, iroN, kpn, trat, irp-1, iutA, rmpA, magA ve cnf-1 virulans genleri spesifik primerler kullanılarak ve multipleks PZR yardımı ile belirlendi. Bölgemizdeki, sütlerden elde edilen izolatlarda invazyondan sorumlu virülans genlerinden trat geni %65,91 oranında en yüksek tespit edilen gen iken sideroforlardan sorumlu genlerden olan iroN geni ise sadece klinik mastitisli sütlerden izole edilen suşlarda rastlandı. İroN geni klinik mastitisli meme lobu ile subklinik mastitisli meme lobundan ayırt edici gen olarak tespit edildi. İzolatların taşıdığı karbapenem direnç genlerinden IMP, VIM, NDM, OXA ve KPC mPZR ile araştırıldı ve bölgemizde süt örneklerinde en yüksek OXA geni tespit edildi. Elde edilen suşların ERIC, OPA11, OPA3 primerleri kullanılarak gerçekleştirilen RAPD-PZR sonucunda genotiplendirilmesi yapıldı ve SPSS istatistik programı kullanılarak dendogram grafiği oluşturuldu. Genotiplendirme sonucunda bazı izolatlar aynı RAPD modeline sahip olmasına rağmen aynı izolatlar benzer fenotiplere, karbapenem ve antibiyotik dirençliliklerine sahip olmadığı görüldü.

Sonuç olarak Konya ilinde incelenen çiftliklerde klinik ve subklinik mastitis etkeni olarak K.pneumonia sırasıyla % 29,41 ve % 9,67 oranlarında sorumlu olduğu ve bazı mastitis izolatlarının çevresel, rektal ve nazal izolatlarla genotip olarak benzer olduğu belirlendi. Kesin ayrımın daha farklı ve detaylı analiz metotları ile Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) ve Multilocus Sequence Typing (MLST) gibi metotlar kullanılarak doğrulanması durumunda bu izolat dağılımı hakkında daha kesin yargıya ulaşılabileceği sonucuna varıldı. Araştırma sonucunda süt ineklerinden izole edilen suşların virulans genlerinin ve karbapenem direnç genlerinin ortaya çıkarılması bölgemizde bulunan süt çiftliklerindeki yaygınlığının araştırması ülkemizdeki epidemiyolojik verilere önemli katkıda bulunacaktır.

Abstract:
K.pneumoniae is an opportunistic pathogen commonly found in nature. This microorganism is one of the bacterial agents that causes mastitis, the most common disease in dairy farms, which causes great damages to the dairy economy and animal welfare worldwide. Compared to other bacterial factors that cause mastitis, this factor is becoming important due to the characteristics of K.pneumoniae like causing earlier and more severe symptoms, having a longer course, and not responding well to treatment. Although K. pneumoniae has been the subject of many studies in human infections, mastitis caused by the agent on dairy farms has been relatively researched. It was aimed to determine the frequency of Klebsiella mastitis among cow mastitis at the farm level in Konya province, to determine some of the phenotypic and genotypic characteristics of the isolates, and to investigate the relationship between milking systems and litter structures with K. pneumoniae isolation.

In this study, 1206 dairy cows in farms with different physical and milking systems in Konya center and surrounding districts were screened. Klebsiella isolates isolated from milk with clinical and subclinical mastitis from rectal and nasal swab samples of the same animals, were identified and the sensitivity profiles of the against 14 different antibiotics were determined phenotypically. The strains were also phenotypically investigated for Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL) production using the double disc synergy method. The relationships between the detection of positive isolates and the number of milking days, milk yields, and lactation numbers were determined by correlation analysis. At the same time, virulence genes fim H-1, mrkD, ycfM, entB, fyuA, hlyA, iroN, kpn, trat, irp-1, iutA, rmpA, magA and cnf-1, which contribute to the pathogenicity of the isolates, were detected using specific primers and multiplex PCR. While the trat gene, one of the virulence genes that is responsible for invasion, was the highest detected gene with a ratio of 65.91% in isolates obtained from milk, the iroN gene, one of the genes responsible for siderophores, was found only in strains isolated from milk samples with clinical mastitis. The ıroN gene was detected as the gene that distinguishes the mammary lobe with clinical mastitis from the mammary lobe with subclinical mastitis. Among the carbapenem resistance genes carried by the isolates, IMP, VIM, NDM, OXA, and KPC were investigated with mPCR, and the highest OXA gene was detected in milk samples in this region. The obtained strains were genotyped as a result of RAPD-PCR using ERIC, OPA11, and OPA3 primers, and a dendrogram chart was created using the SPSS statistical program. As a result of genotyping analysis, although some isolates have had the same pattern by RAPD, the same isolates did not have similar phenotypes and carbapenem and antibiotic resistance.

As a result, K.pneumonia was responsible for clinical and subclinical mastitis at rates of 29.41% and 9.67%, respectively, in the farms located in Konya province, and some mastitis isolates were genotypically similar to environmental, rectal and nasal isolates. It was concluded that a more precise judgment about the distribution of this isolate can be reached if the exact distinction is confirmed using different and detailed analysis methods such as Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) or Multilocus Sequence Typing (MLST). It is also concluded that, revealing the virulence genes and carbapenem resistance genes of the strains isolated from dairy cows and investigating their prevalence in dairy farms in this region will contribute significantly to the epidemiological data in the Country.