Ağaç kabuklarından izole edilen aspergillus niger küfünden βeta glikozidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of beta glucosidase from aspergillus niger strain that isolated on tree barks
Yazar: CEREN BAYBAŞ
Danışman: DOÇ. DR. TÜLİN AŞKUN ; YRD. DOÇ. DR. HATİBE KARA
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, ağaç kabuklarından izole edilen Aspergillus niger küfü kullanılmıştır. İzolasyon işleminden önce ağaç kabuğu örnekleri sodyum hipoklorür çözeltisiyle yıkanmıştır. İzolasyon için, ağaç kabukları örneklerine çift seri dilüsyon işlemi uygulandıktan sonra dikloran rose bengal kloramfenikol (DRBC) besiyeri kullanılarak yayma plak yöntemi yapılmıştır. Örnekler 7 gün boyunca 27°C' de inkübasyona bırakılmıştır. İzole edilen örnekler yatık malt ekstrat besiyerinde saf kültür halinde, tanılama işlemi için -20°C saklanmıştır. Tanılama işlemi için Malt ekstrat (MEA), czapeck-dox (CZA) ve czapeck-dox yeast (CYA) besiyerleri hazırlanmıştır ve Aspergillus niger MEA, CZA, CYA içeren petri kaplarına ekim yapıldıktan sonra 27°C inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra mikroskobik ve makroskobik incelemeleri yapılmıştır. A. niger hifleri ve sporları malt broth besiyerine inoküle edilmiştir. 27°C' de 180 rpm' de çalkamalı inkübatörde inkübasyona bırakılmıştır. 10 gün sonra hücreler santrifüjle uzaklaştırılarak supernatant ham ekstrat olarak kullanılmıştır.

Ağaç kabuklarından izole edilen Aspergillus niger  β-glukosidazı amonyum sülfat çöktürme ve hidrofobik etkileşim kromatografisi yöntemi kullanılarak saflaştırılmıştır. İşlem sonunda enzimin %19,34 verimle 2.18 kat saflaştırıldığı hesaplanmıştır. Enzim saflığının kontrolü için SDS-PAGE yapılarak tek bant gözlenmiş ve enzimin molekül ağırlığı yaklaşık 70 kDa bulunmuştur. Enzimin  p-NPG ve o-NPG substratlarına karşı ilgisi araştırıldığında, 5,122 mM Km değeri ve  2,71 EU Vmax değeri ile p-NPG substratına ilgisinin daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Optimum sıcaklık ve pH değerlerinin sırasıyla 60°C ve 5.0 olduğu bulunmuştur.  Enzim aktivitesi üzerine Fe+3, Cu+2, Zn+2, Ag+2 ve Pb+2 ağır metallerinin etkisi incelendiğinde Fe+3 'ün enzimi aktive ettiği, diğer ağır metallerin ise inhibisyona neden olduğu belirlenmiştir. Enzimin genel inhibitörlerinden glukoz ve δ-glukonolaktonun inhibisyon etkisi araştırılmış ve her iki inihibitörün de enzimi yarışmalı olarak inhibe ettiği bulunmuştur.





ANAHTAR KELİMELER: Aspergillus niger, β-glukosidaz, hidrofobik etkileşim kromatografisi

Abstract:
In this study, we studied with Aspergillus niger which was isolated from tree barks. Tree barks' samples were washed with sodium hypochloride solution before the isolation process. For the isolation, after double dilution process applied to the tree barks' samples, spread plate technique was used with-using dichloran rose bengal chloramphenicol medium. Samples were incubated for seven days at 27°C. Isolated samples were stored as pure cultures at -20°C for identification. Malt extract agar (MEA), czapeck-dox agar (CZA), czapeck-dox yeast agar (CYA) were prepared for identification and then Aspergillus niger was inoculated in the petri dishes containing MEA, CZA, CYA and incubated at 27°C. After the incubation the microscopic and macroscopic characteristics were observed. The A.niger strain was incubated at 27°C with shaking at 180 rpm in the malt broth. After 10 days of incubation, the cells were removed by centrifugation and the supernatant was used in the enzyme purification procedure.
β-glucosidase enzyme was purified from Aspergillus niger which was isolated from tree barks by using ammonium sulfate precipitation and hydrophobic interaction chromatography. β-glucosidase enzyme was purified 2.18 fold with %19,34 yield by this method. The purified beta-glucosidase enzyme, was observed as a single band as approximately 70 kDa molecular weight with SDS-PAGE. The specificity of fungus beta-glucosidase enzyme was determined used pNPG, oNPG substrates. It was determined that the enzyme had more affinity to pNPG substrate with Km value of 5,122 mM and Vmax value of 2,71 EU. Relative activities of Fe+3, Cu+2, Zn+2, Ag+2 and Pb+2 metals were investigated. Metal Fe+3 has affected as activation on ezyme activity. Optimum pH and temperature  were found to be 5.0 and 60°C . The effects of general inhibitors of β-glucosidase enzme which are glucose and δ-gluconoolactone, were investigated on fungus β -glucosidase enzyme. It was determined that both compound have competitive inhibition effect on purified enzyme activity.




 KEYWORDS: Aspergillus niger, β-glucosidase, hydrofobic interaction chromatography