Vulpinik asitle farklı kemoterapotik ilaçların meme kanseri hücre hatları üzerinde sinerjik antikanser etkilerinin gen ve protein seviyesinde araştırılması
Investigation of synergistic anticancer effects of vulpinic acid and different chemotherapeutic drugs on breast cancer cell lines at gene and protein levels
Yazar: ESMA KÜBRA KAĞAN YENİÇERİ
Danışman: DOÇ. DR. AHMET ALTAY ; PROF. DR. HARUN BUDAK
Erzincan Binali Yıldırım Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Antikanser = Anticancer ; Meme = Breast ; Meme kanseri =   ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Sinerjizm = Synergism

Özet:
Bu tez çalışmasında vulpinik asit ile farklı kemoterapötik ilaçların (sisplatin, dosetaksel, doksorubisin ve mitoksantron) insan meme kanseri hücre hatları (MCF-7, MDA-MB-231 ve MDA-MB-453) üzerindeki sinerjik antikanser etkilerinin gen ve protein seviyelerinde araştırılması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, ilk aşamada vulpinik asit ile her bir kemoterapötik ilacın yukarıda bahsi geçen hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkileri doz ve zaman bağımlı olarak XTT yöntemiyle incelendi ve buradan elde edilen absorbans değerleri CompSyn programına işlenerek vulpink asidin her bir kemoterapötik ilaç ile kombinasyon indeks (CI) değeri belirlendi. CI değerleri, vulpinik asidin doksorubisin ve mitoksantron ile MDA-MB-231 ve MDA-MB-453 hücreleri üzerinde sinerjik etki, MCF-7 hücrelerinde ise antagonist etki sergilediğini gösterdi. İkinci aşamada, sinerjik etki görülen hücre hatlarındaki ROS miktarı, mitokondriyal membran potansiyeli, multikaspaz aktivitesi, hücre döngüsü, apoptosis ve PI3K/AKT sinyal yolağındaki değişimler flow sitometrik analizler ile incelendi. Sonuçlar, her iki hücre hattında da ROS miktarında, mitokondriyal membrane depolarizasyonunda ve multikaspaz aktivitesinde artış olduğunu, hücre döngülerini G0/G1 fazında yakaladığını, hücreleri apotoza yönlendirdiğini ve ayrıca PI3K/AKT sinyal yolağını bloke ettiğini gösterdi. Üçüncü aşamada, flow sitometri analiz sonuçlarını moleküler seviyede doğrulamak için apoptotik yolak markır proteinleri BAX, BCL2, P53, Kaspaz-3, Kleaved kaspaz-3, Sitokrom-c'nin, ve PI3K/AKT sinyal yolağının markır proteinleri olan PI3K, mTOR ve AKT'nin protein ve gen seviyelerindeki kantitatif değişimleri Western blot ve Real Time PCR (qPCR) analizleri ile incelendi. Elde edilen veriler hücrelerde apoptotik etkilerin hem gen hem de protein seviyesinde gerçekleştiğini, PI3K/AKT sinyal yolağındaki baskılanmanın ise protein seviyesinde olduğunu gösterdi. Son aşamada, yara iyileştirme yöntemiyle gerçekleştirilen migrasyon testleri sonucunda her iki hücre hattında da uygulanan kombinasyonların önemli derecede antimigratif etki sergilediğini göstermiştir. Sonuç olarak, tüm bu veriler vulpinik asit ile doksorubisin ve mitoksantron'un meme kanseri hücre hatlarında in vitro sinerjik etki gösteren kombinasyonlarının meme kanseri tedavisinde bir sonraki aşama olan in vivo çalışmalara kapı aralamıştır.

Abstract:
This thesis was conducted to analyze the synergistic anticancer effect of different chemotherapeutic drugs (cisplatin, docetaxel, doxorubicin, and mitoxantrone) on human breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, and MDA-MB-453) at the gene and protein levels. In the first step, the cytotoxic effects of vulpinic acid and each of the chemotherapeutic drugs on the above-mentioned cell lines were investigated in a dose- and time-dependent manner. The absorbance values obtained here were then processed in the CompSyn program and the combination index (CI) value of vulpinic acid with each chemotherapeutic drug was determined. The CI values showed that vulpinic acid had a synergistic effect with doxorubicin and mitoxantrone on MDA-MB-231 and MDA-MB-453 cells, and an antagonistic effect on MCF-7 cells. In the second phase, changes in ROS levels, mitochondrial membrane potential, multi-caspase activity, cell cycle, apoptosis and PI3K/AKT signalling pathway were examined by flow cytometric analysis in cell lines in which the compounds showed synergistic effects. The results showed that there was an increase in the amount of ROS, mitochondrial membrane depolarization, multicaspase activity and apoptotic cell rate in both cell lines, as well as G0/G1 cell cycle arrest and PI3K/AKT pathway blockade. In the third step, to confirm the results of the flow cytometry analysis at the molecular level, quantitative changes in marker proteins of the apoptotic pathway (BAX, BCL2, P53, Caspase-3, Cleaved caspase-3, Cytochrome-c) and the PI3K/AKT signaling pathway (PI3K, mTOR and AKT) were examined at the protein and gene levels by Western blot and real-time PCR (qPCR). The data obtained showed that apoptotic effects in cells occurred at both the gene and protein levels, while the suppression of the PI3K/AKT signaling pathway occurred at the protein levels. Finally, as a result of migration tests using the wound healing method, it was found that the combinations of compounds applied to both cell lines had significant anti-migratory effects. As a result, these data have opened the door to in vivo studies of combinations of vulpinic acid with doxorubicin and mitoxantrone, which show synergistic effects in vitro on breast cancer cell lines.