Visseral leishmaniasis etmeni Leishmania infantum antijenine karşı hibridoma tekniği ile monoklonal antikor elde edilmesi
Monoclonal antibody production with hybridoma technique against the antigen of Leishmania infantum, causative agent of visceral leishmaniasis
Yazar: SERKAN YAMAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MELAHAT BAĞIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Hibridoma teknolojisi = Hybridoma technology ; Leishmaniasis = Leishmaniasis

Özet:
Leishmaniasis, enfekte kum sineklerinin (Phlebotomus) kan emme esnasında memeli konaklara bulaştırdıkları hücre içi Leishmania protozoonlarının oluşturduğu bir hastalık grubudur. Hastalığın Visseral (VL), Kütanöz (KL) ve Mukokütanöz (MKL) olmak üzere 3 klinik formu mevcuttur. Dünyada her yıl 1,0-1,5 milyon kişi KL'e, 500.000 kişi ise VL'e yakalanmaktadır. Ayrıca son yıllarda hastalığın etkenlerinde kullanılan antileishmanial ilaçlara, vektörlerinde ise insektisitlere karşı dirençliliğin gelişmesi ve küresel ısınmanın dünya üzerindeki etkisini arttırması nedeniyle hastalığın dünyada giderek yayılması beklenmektedir. Leishmaniasis aynı zamanda Türkiye'nin de ciddi halk sağlığı problemlerinden biri olup Ege, Akdeniz, Orta Anadolu ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde görülmektedir. Hastalığın visseral formu tedavi edilmediğinde ölüme neden olmaktadır. Hastalığın tanısında çeşitli yöntemler (mikroskobik, kültür, moleküler ve serolojik) kullanılmaktadır. Bu yöntemler içerisinde parazite özel antijenleri hedefleyen monoklonal antikorların temel alındığı serolojik teknikler, yüksek duyarlılıkları ve spesifiklikleri ile leishmaniasis tanısının koyulabilmesi adına büyük bir avantaj sağlamaktadır. Ancak leishmaniasis'in tanısında kullanılmak üzere geliştirilen serolojik tanı kitleri genellikle yurt dışından ithal edilmekte ve bu da ülke ekonomisine fazladan bir külfet oluşturmaktadır. Ülkemizde ise konu ile ilgili yeterince çalışma bulunmamaktadır. Şu ana kadar yapılan tek çalışmada KL'e (Leishmania tropica) karşı monoklonal antikor geliştirme çalışması yapılmıştır. Ancak literatürden de bilindiği gibi KL için serolojik yöntemlerin duyarlılığı yüksek değildir. Diğer yandan ülkemizde, erken teşhisine daha çok ihtiyaç duyulan ve zamanında tanısı konulup tedavi edilmediğinde ölümcül olduğu bilinen VL'e karşı monoklonal antikor geliştirilmesine yönelik ülkemizde yapılan hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Ayrıca hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin tamamen in vitro hale getirilmesinde sorunların yaşandığı da bilinmektedir. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; ilk kez olarak ülkemizde VL'nin tanısında kullanılan L. infantum antijenlerine karşı monoklonal antikorun üretilmesi ve L. infantum antijenlerine karşı monoklonal antikorun üretilmesi için hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin in vitro hale getirilmesi ile mevcut yöntemin optimize edilmesi olmuştur. Tez çalışması kapsamında, Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği Laboratuvarı'nda hücre kültürü, ELISA, western blot, hibridoma, saflaştırma tekniklerine dayalı çeşitli yöntemler kullanıldı. Deneylerde L. infantum tüm parazit antijenleri 6-8 haftalık BALB/c farelere Freund adjuvanı ile birlikte enjekte edildi. Yüksek antikor yanıtı veren fareler ile füzyon çalışmaları gerçekleştirildi. Füzyon deneylerinde immünize farelerden izole edilen ve B lenfosit kaynağı olan dalak hücreleri, fare myeloma hücreleri (P3-X63-Ag8.653) ile polietilen glikol (MW 4000) varlığında birleştirildi. Füzyon sonrası hibridoma hücrelerinin gelişimini desteklemek amacıyla fare periton makrofajlarının yanı sıra, J774 fare monosit makrofaj hücre hattı metaboliti de kullanıldı. Deney sonuçlarına göre, incelenen 456 kuyunun 233'unda hibridoma hücrelerinin oluştuğu tespit edildi. ELISA testi ile incelenen 233 kuyunun 46'sında pozitiflik görüldü. Çapraz reaksiyon testlerinde en yüksek absorbans alınan 3 kuyunun kültürü büyük çapta üretildi. Sınırlayıcı sulandırımlar sonucu elde edilen 1C3 kuyusundaki hibridoma hücre hattının ürettiği monoklonal antikorlar western blot yöntemi ile 15kDa ağırlığında olan L. infantum antijenine karşı spesifik olduğu saptandı. Çalışmanın son aşamasında elde edilen süpernatant dializ ve protein G afinite kromatografi yöntemleri ile saflaştırıldı ve böylece L. infantumun 15 kDa antijenine karşı spesifik olan monoklonal antikor elde edildi.Sonuç olarak bu çalışmada, ilk kez olarak ülkemizde L. infantum'a karşı monoklonal antikor üreten hücre hattı elde edildi ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirilerek kriyobankı oluşturuldu. Ayrıca leishmaniasise karşı hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin in vitro hale getirilmesi için ilk kez olarak fare periton makrofajları yerine J774 metabolitlerinin kullanılmasının uygun olabileceği gösterildi ve hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin tamamen in vitro hale getirilmesi amacıyla mevcut yöntem optimize edildi. Bu tez kapsamında elde edilen sonuçlar, ülkemizin ciddi halk sağlığı problemlerinden birisi olan VL'nin tanısında monoklonal antikorlara dayalı yerli tanı kitlerinin geliştirilmesine yol açacaktır. Ayrıca bu hastalığa karşı üretilen monoklonal antikorların ileride farklı enzimatik, kemilüminesan ve manyetik ajanlarla konjuge edilmesi sonucunda çeşitli tanı sistemlerinde (Western Blot (WB), Enzim bağlı immunosorbent test (ELISA), İndirekt floresan Antikor testi (IFAT),İmmünokromatografik test (ICT) gibi) kullanılabileceğini göstermesi açısından oldukça önemli olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Leishmaniasis is a parasitic disease which is transmitted to mammalian hosts by the bites of sand flies (phlebotomus) with infected intracellular Leishmania protozoon during bloodsucking. Different Leishmania species cause to the various important forms of the disease such as; visceral (VL), cutaneous (CL) and mucocutaneous (MCL) leishmaniasis depending on the parasite types and the host factors. In every year 1-1,5 million people suffer from Cutaneous Leishmaniasis (CL) and 500.000 people from visceral leishmaniasis (VL) all around the world. Furthermore impact area of the disease is expected to extend over the world as a result of developing resistance to antileishmanial drugs in parasites and to insecticides in vectors, also by virtue of global warming. Therewithal leishmaniasis is one of the serious public health problems that occurs prevalently in Aegean, Mediterranean, Middle Anatolian and Southeast Anatolian regions of Turkey. Untreated VL form of the disease ends up with deaths. A variety of techniques (microscopic, culture, molecular and serological) are used in the diagnosis of the disease. Among these techniques, monoclonal antibody based serological techniques provide a great advantage with high sensitivity and specificity for diagnosis that is special to the parasite antigens. However, diagnostic kits used in the diagnosis of leishmaniasis are generally imported products and make a great expense to the economy of the country. The studies about the issue to overcome these kinds of problems are inadequate in our country. Up to now, only one medical specialization thesis has been completed about this issue and in that study monoclonal antibody has been produced against Leishmania tropica which is a factor of Cutaneous Leishmaniasis. However as it is known in literature serological techniques are not sensitive techniques for diagnosis of CL. On the other hand, in our country there is no study about development of monoclonal antibody against VL which is known as fatal if doesn?t diagnose in time and to be treated. Furthermore, it is known that there are some problems in hybridoma techniques for providing in vitro whole processes. According to this, the aim of this thesis study as a first time in our country is to produce monoclonal antibody against L. infantum antigen which was used in the diagnosis of VL and to optimize the present method by optimizing the hybridoma technology process into in vitro stage. Within the scope of the thesis, in Cell Culture and Tissue Engineering Laboratory, cell culture, ELISA, western blot, hybridoma and purification techniques were used. In the experiments; L. infantum whole parasite antigens were injected to 6-8 week old BalB/c mice with adjuvant. Then the fusion studies were started with the mice which gave response of high antibody. In the fusion experiments the spleen cells which are the source of B lymphocyte were fused with the mouse myeloma cells (P3-X63-Ag8.653) in the existence of polyethylene glycol (MV 4000). After the fusion, in order to support hybridoma cells besides mouse peritoneal macrophages, J774 mouse monocyte-macrophage cell line metabolite was also used. According to the experimental results, it was detected that hybridoma cells were formed in examined 233 of 456 wells. It was seen that the 46 of 233 wells were positive according to ELISA test. The culture of three wells which showed the highest absorbance in cross-reaction tests, was largely produced. The monoclonal antibodies, the products of 1C3 hybridoma cell line which was obtained as a result of limiting dilutions. It was detected that the antibodies which were examined with western blot method, are specific to the L. infantum antigen which weights 15kda. At the end-stage of the study, supernatant which are obtained from culture were purified with dialysis and protein G affinity chromatography methods, so the monoclonal antibody which is specific to 15 kDa antigen of L. infantum was obtained.As a result of this study for the first time in Turkey monoclonal antibody producing hybridoma cell line have been obtained against L. infantum and cryopreserved in cryobank. Additionally, in order to render whole in vitro processes of hybridoma technology, hybridomas were firstly supported with J774 macrophages cell line metabolites and in vitro current processes of hybridoma technique was optimized. Furthermore we showed that J774 metabolites provide the appropriate supporting environment. Obtained results within this thesis can lead to development of diagnostic kits to VL that is one of the important public health problems of Turkey. Furthermore the obtained monoclonal antibodies in this study is important in terms of showing that they can be also used in various diagnosis systems (such as; Western blot (WB), Enzyme Linked Immune Sorbent Assay (ELISA), Immune Fluorescein Assay (IFAT)and Immuno chromatographic test ICT)) by conjugating with enzymatic, chemiluminescence and magnetic agents.