İnsan adipoz dokusu ve adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere kriyoprezervasyonunun optimizasyonu
Ortimization of cryopreservation protocols for adipose tissue and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and their potential use in tissue engineering
Yazar: NECATİ FINDIKLI
Danışman: PROF. DR. ADIL ALLAHVERDIYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Amerikan Plastik Cerrahi Derneği verilerine göre, Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) 2012 yılı içerisinde yaklaşık 300.000 civarında yumuşak doku defekti tamiri amacı ile mastektomi sonrası meme, el ve yüz gençleştirme işlemlerini de kapsayan cerrahi işlem gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın her yıl giderek arttığı bilinmektedir. Ülkemizde ise bu alanda çalışmalar yapılsa da rakamsal bir bilgi bulunmamaktadır. Son yıllarda yumuşak doku mühendisliği ve klinik doku tamiri uygulamalarında kök/progenitör hücrelerin kullanılması ve bu yolla elde edilmiş yapay dokuların oluşturulması gibi yeni yaklaşımlar ve çalışmalar, yer almaktadır. Bu bağlamda lipoaspirasyon metodu ile elde edilebilen otolog adipoz doku, içerdiği zengin kök/progenitör hücre popülasyonu sayesinde adı geçen yumuşak doku defektlerinin giderilmesinde ve iyileştirilmesinde yüksek potansiyele sahiptir. Dünya genelinde yılda milyonlarca lipoaspirasyon ve kozmetik amaçlı adipoz doku rezeksiyonu uygulaması yapılmaktadır. Bu uygulamalardan elde edilen adipoz dokuların etkin ve verimli olarak yakın gelecekte yumuşak doku travmaları dışında pek çok farklı doku mühendisliği veya rekonstrüktif cerrahi uygulaması için doğal otolog doku kaynağı olabileceği düşünülmektedir. 
Elde edilen adipoz dokunun veya içerdiği progenitör hücrelerin daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezervasiyonunun yapılması, kriyopbankta uzun sure  saklanması ve gerektiğinde biyolojik özelliklerini kaybetmeden kriyobanktan çıkarılarak çözülmesi, ve alıcının ihtiyaç duyulan bölgesine nakli sonrasında iyi sonuçların elde edilmesi oldukça önemli olup, yumuşak doku mühendisliği ve plastik/rekonstrüktif cerrahinin esas hedeflerinden biridir.  Ancak kriyobiyolojinin bu alanında hücre ve dokuların dondurulma/çözülmeleri sonrası klinik kullanımlarıyla ilgili varolan ciddi problemler (insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, çözme sonrası düşük viabilite, nakledilen bölgede yüksek re-absorbsiyon vb.) halen giderilememiştir. Şimdiye kadar dünyada bu alanda çeşitli çalışmalar yapılsa da halen verimli bir adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon yöntemi  geliştirilememiştir.  Bunun nedenlerinden biri, şimdiye kadar uygun kriyoprotektanların, kriyoprotektan konsantrasyonlarının, karışımlarının, vitrifikasiyon gibi önemli kriyoprezervasiyon yönteminin adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücrelerde yeterince incelenmemiş olmasıdır. Ayrıca mevcut yaklaşımların doku yenileme ve uygulanan bölgede mevcut hasarın tamirindeki etkinliği konusunda bugüne kadar gerçekleştirilen az sayıda klinik-öncesi ve klinik çalışmada, kök hücre ve içinde bulunduğu niş özellikleri dikkate alınmadığından çalışmalar  her zaman olumlu  sonuçlar vermemektedir.
Mevcut bilgilere dayanarak bu tez çalışmasının amacı, yumuşak doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, mevcut konvansiyonel yöntemler ile kriyoprezervasyonundaki yapısal ve fonksiyonel  düzeydeki etkinliklerinin belirlenmesi, adipoz doku ve içerdiği kök hücrelerin kriyoprezervasyonu ile ilgili mevcut problemlerin giderilmesinde vitrifikasyon metodu ile kriyoprezervasyon rejimlerinin ve yaklaşımlarının etkinliğinin incelenmesi, elde edilen verilere dayanarak insan adipoz doku/adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon protokollerinin  optimize edilmesi ile klinik kullanıma uygun doku ve hücre saklama amaçlı kriyobank oluşturulmasıdır.
Belirlenen amaç doğrultusunda çalışma genelinde 10 farklı donörden lipoaspirasyon (n=8) ve cerrahi eksizyon (n=2) uygulamaları sonrası elde edilen adipoz doku örnekleri kullanıldı. Örneklerin 6'sına adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücre izolasyonu amacı ile enzimatik ayrıştırma tekniği uygulandı. Hücre izolasyonu aşamasında ayrıca manyetik tabanlı hücre ayrıştırılması tekniği de kullanıldı. İzole edilen hücrelerin kök hücre olma özellikleri in vitro kültürdeki morfolojik analiz, akış sitometrisi (CD90, CD105, CD29, CD34, CD45) ve in vitro ekspansiyon/farklılaşma testleri kullanılarak ölçüldü. Doku ve hücre kriyoprezervasyonu için, içerisinde kriyoprotektan olarak DMSO, etilen glikol ve sükroz'un farklı konsantrasyonları veya kokteylleri bulunan aşamalı yavaş dondurma (%10 DMSO; %10DMSO+0,2M sükroz; 0,5M sükroz) ve vitrifikasyon teknikleri (%15 DMSO+%15 etilen glikol+0,5M sükroz; %30DMSO+%30 etilen glikol+0,5M sükroz) kullanıldı. Kriyoprezervasyon sonrası dokuların yapısal durumları immünohistokimya tekniği ile, hücrelerin yapısal ve fonksiyonel durumları ise Tripan mavisi boya dışlama testi, TUNEL testi ile DNA fragmantasyon analizi ve in vitro farklılaşma analizi kullanılarak ölçüldü. Çözme sonrası doğrudan dondurulan veya dondurulmuş dokudan izole edilen hücreler ayrıca morfolojik ve in vitro ekspansiyon özellikleri bakımından incelendi. İncelemeler ve ölçümler sırasında elde edilen kantitatif veriler SPSS versiyon 10.0 for windows programı ile değerlendirildi ve değerlendirme sırasında p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Deney üç aşamada gerçekleştirildi. İlk aşamada elde edilen örneklerden 6'sında (4 örnek lipoaspirasyon ve 2 örnek cerrahi eksizyon yöntemi) enzimatik ayrıştırma metodu uygulanarak hücre izolasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen bu hücrelerin in vitro kültürdeki gelişim ve morfolojik özellikleri, akış sitometrisinde elde edilen kök hücre işaretçikleri sonuçları ve in vitro farklılaşma sonrası mezoderm kaynaklı farklı hücrelere dönüşüm özellikleri gösterildi ve mezenkimal kök hücre oldukları konfirme edildi. İkinci aşamada bu hücreler kullanılarak mevcut konvansiyonel kriyoprezervasyon ve vitrifikasyon protokollerinde kullanılan DMSO ve etilen glikol (EG) kriyoprotektanlarının farklı konsantrasyonları (%1 - %30), farklı kombinasyonları ve hücre ile farklı inkübasyon süreleri (10 – 40 dakika) bakımından sitotoksik ve genotoksik etkileri incelendi. DMSO ve etilen glikolün %10'dan yüksek konsantrasyonlarında ve 20 dakika'dan uzun inkübasyon sürelerinde hücresel canlılık düzeylerinde anlamlı azalma gözlendi (p<0,05). Hücre viabilite incelemesi ile eş zamanlı gerçekleştirilen DNA fragmantasyon testlerinde ise adı geçen parametreler yönünden istatistiksel olarak anlamlı bir artış görülmedi (p>0,05). Çalışmanın üçüncü aşamasında, deney kapsamında elde edilen insan adipoz dokuları (n=4) ve adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücreleri (n=4), mevcut konvansiyonel ve vitrifikasyon protokolleri kullanılarak doku ve hücre dondurma programlarına alındı. Her iki grup, ayrı ayrı olarak iki farklı metod (aşamalı yavaş dondurma ve vitrifikasyon), farklı inkübasyon süreleri ve kriyoprezervasyon sonrası farklı saklama sıcaklıkları yönünden test edildi. Hücre düzeyinde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon uygulamalarında, aşamalı yavaş dondurma gerçekleştirilen %10 DMSO ve %10DMSO+0,2M sükroz grubu ile, vitrifikasyon uygulanan VS1 ve VS2 gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek canlılık oranları elde edildi (sırasıyla %80,2,  %88,9, %85,4, %68,2 ve %12,2; p<0,01). Doku düzeyinde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon uygulamalarında ise vitrifikasyon uygulanan VS1 ve VS2 grubunda, aşamalı yavaş dondurma uygulanan %10 DMSO ve %10 DMSO+0,2M sükroz gruplarındaki dokulara ve kontrol grubuna kıyasla daha yüksek canlılık oranları elde edildi (sırasıyla %90,2, %82,0,  %50,0, %62,8 ve %10,2; p<0,01). Aşamalı yavaş dondurma grubunda dondurulan doku örneklerinin ve içerdikleri kök hücrelerin +4°C 'de ve -20°C'de uzun süreli saklanmaları sonrası canlılık ve fonksiyonelliklerini kaybettikleri gözlendi. Gerek hücre, gerekse doku düzeyinde gerçekleştirilen dondurma ve çözme işlemleri sonrası canlı olarak tespit edilerek kültüre edilen hücrelerin, yapılan in vitro ekspansiyon ve in vitro farklılaşma testlerinde, hücre gelişim hızlarında ve adipojenik, kondrojenik ve osteojenik farklılaşma potansiyelleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmedi. 
Sonuç olarak bu tez çalışması kapsamında, günümüzde kullanılmakta olan farklı konvansiyonel doku ve hücre kriyoprezervasyon protokollerinin ve mevcut literatürde ilk kez olarak farklı vitrfikasyon protokollerinin adipoz doku ve içerdiği mezenkimal kök hücreler üzerindeki etkinlikleri eş zamanlı olarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, aşamalı yavaş dondurma ve vitrifikasyon yöntemi kapsamında kullanılan kriyoprotektanların ve uzatılmış inkübasyon sürelerinin insan adipoz dokusu ve içerdiği mezenkimal kök hücrelerinin viabilitesi ve fonksiyonelliği üzerinde ciddi ve olumsuz etkiler oluşturabildiğini göstermiştir. Sonuçlar ayrıca kriyoprezervasyon işlemlerinin klinik etkinliğinin arttırılması amacı ile doku ve hücre dondurma işlemlerinin ayrı ayrı optimize edilmesi ve uygulanması gerektiğini de doğrulamıştır. Bu bulgulara ilave olarak, mevcut güncel çalışmalarda raporlanmış konvansiyonel saklama sıcaklıklarının (+4°, - 20°C ) adipoz doku ve içerdikleri ADK-MKH  popülasyonunun uzun vadeli etkin ve verimli saklanması için yeterli olmadığı görülmüştür. 
Sonuç olarak tez kapsamında bir adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyonunda en uygun dondurma rejiminin doku için vitrifikasyon, ADK-MKH'ler için ise aşamalı yavaş dondurma olduğu saptanmıştır. Bu bilgiye dayanarak  adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücrelerin kriyoprezervasiyon protokolları geliştirilmiş ve optimize edilmiştir.
Çalışmamız sırasında elde edilen sonuçlar doğrultusunda ayrıca etkin bir doku ve hücre kriyobankı oluşturulmuştur. Sonuçlarımızın, yakın gelecekte kök hücre ve doku mühendisliği alanında gerçekleştirilecek yeni araştırma, klinik öncesi veya klinik kullanım amaçlı üretim teknikleri, hücre karakterizasyonu ve farklılaştırma çalışmalarında kullanılmak üzere önemli bir kaynak oluşturacağı düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: Adipoz doku, ADK-MKH, Yumuşak doku mühendisliği, Kriyoprezervasyon, Aşamalı yavaş dondurma, Vitrifikasyon.

Abstract:
According to American Society of Plastic Surgeons, in 2012, approximately 300.000 procedures have been performed for soft tissue repairs including breast and nipple reconstruction (after mastectomy), hand and face rejuvenation and this number continues to increase annualy. In Turkey, although the application of these procedures have usually been performed in many clinics, such information is not available for the public yet. Contemporary research in soft tissue engineering indicates that, numerous soft tissue defects can be efficiently repaired when appropriate biomaterials, cells and growth factors can be delivered together to the wounded location. For this reason, novel approaches and works are currently directed to the creation of artificial tissues by integrating stem/progenitor cells in natural scaffolds. Adipose tissue, which can be obtained after lipoaspiration, has a high poteintial in repairing and healing of soft tissue defects via its rich content of adipose mesenchymal stem cell (AD-MSC)/progenitor cell populations. Every year, milions of lipoaspirations and adipose tissue resections for cosmetic purposes are performed  worldwide.  Effective cryopreservation of these tissues can be very important natural autologus tissue sources for tissue engineering aplications other than soft tissue defects or reconstructive surgery applications.
Successful cryopreservation of adipose tissue, which is mostly obtained during lipoaspiration procedures with the aim of using in the near future, and effective warming and transplanting it into the defective site when needed has often been applied in soft tissue engieering and plastic/reconstructive surgery. Although cryopreservation of fat tissue have long been a preferred approach in several clinics undergoing liposuction procedures, problems associated with their clinical use after warming (low cellular viability upon warming, high reabsorbtion rates on recipient sites etc.) have not been fully resolved. There is still a lack of successful and efficient adipose tissue/AD-MSC cryopreservation protocol in the world. Moreover, the number of studies on the ability and effectiveness of cryopreserved adipose tissue or AD-MSCs in repairing a defect in the required site are scarce and the results are conflicting.
Based on current knowledge, our aim in this study is, to analyze the structural and functional integrity of human adipose tissues and adipose tissue-derived mesechymal stem cells during conventional cryopreservation procedures, to investigate the potential role of vitrification regimes and approaches in solving current problems associated with adipose tissue/ stem cell cryopreservation, and by optimizing the human adipose tissue and adipose tissue-derived mesenchymal stem cell cryopreservation protocols, to establish a tissue and cell cryobank that is suitable or compatible for clinical use. 
In accordance with the objectives set our study, 10 different tissue samples that were obtained from different donors after lipoaspiration (n=8) and surgical excision (n=2) were used in the study. In 6 of these samples, enzymatic dissociation method was used in order to isolate mesenchymal stem cells. At this stage, magnetic-based cell separation technique was also applied. Stem cell properties of these freshly isolated cells were measured by in vitro culture and morphological analysis, flow cytometry (CD90, CD105, CD29, CD34, CD45) and in vitro expansion/differentation tests. For tissue and cell cyryopreservation, staged slow freezing (10% DMSO; 10% DMSO+0.2M sucrose; 0.5M sucrose) and vitrfication (15% DMSO+15% Ethylene glycol+0.5M sucrose; 30% DMSO+30% ehylene glycol+0.5M sucrose) techniques that consists of DMSO, ehylene glycol (EG) and sucrose in different concentrations and coctails were used. Upon warming, tissue integrity was measured by immunohistochemistry and structural and functional integrity of cells were measured by trypan blue dye exclusion test, TUNEL test for DNA fragmentation and in vitro differentiation. Cryopreserved cells and cells that were isolated upon warming of tissues were also investigated according to their in vitro morphologies and in vitro expansion characteristics. Quantitative data obtained during these investigations were evaluated by SPSS 10.0 for windows software programme and the p value of <0.05 was taken as statistically significant.
According to the study plan, the experiment had been performed in three parts. In the first phase of the study, cell isolation by enzymatic dissociation method was performed on 6 of the tissue samples (4 samples after lipoaspiration and 2 samples after surgical excision). Their stem cell properties were confirmed by their in vitro culture behaviours, morphologies, results of flow cytometry analysis and in vitro differention tests that shown their potential of differentiating in a variety of different mesodermal cells.  In the second phase of the study, by using the cells that were isolated and characterized in the previous phase, cytotoxic or genotoxic effects of different cryoprotectant concentrations (1% - 30%), different combinations and different incubation durations (10 -40 minutes) of DMSO and ethylene glycol were investigated. In the presence of 10% and higher concentrations of DMSO and EG and upon more than 20 minutes of incubation durations significant decrease in cellular survival was observed (p<0.05). On the other hand, simultaneous analysis of DNA fragmentation on the same cell populations did not show any statistically significant increase.  In the third phase of the study, adipose tissue samples obtained (n=4) and adipose tissue-derived stem cells (n=4) were cryopreserved by conventional slow freezing and vitrification techniques. In both cryopreservation groups, samples were subgrouped according to different incubation durations as well as different storage temperatures.  In the cellular-level cryopreservation experiments, the groups of 10% DMSO and 10% DMSO+0.2M sucrose in the conventional slow freezing arm and VS1 and VS2 in the vitrification arm shown significantly higher viability compared to control groups (80.2%, 88.9%, 85.4% and 68.2% vs. 12.2% respectively; p<0.01). In the tissue-level cryopreservation experiments, significantly higher cellular survival values were observed in VS1 and VS2 vitrification groups as compared to 10% DMSO and 10%DMSO+0.2M sucrose groups in the conventional slow freezing arm and controls (90.2%, 82.0% vs. 50.0%, 62,8% and 10.2% respectively). It was observed that, samples that were cryopreserved and stored at +4°C and -20°C in the conventional slow freezing  group did not show any signs of viability after long term storage conditions. In groups showing comparable survival rates upon warming in   both cellular and tissue-level experiments, no significant differences were observed in in vitro expansion and in vitro differentiation results.
As a result, in this study, both the conventional staged slow freezing protocols and, to our knowledge for the first time in the literature, vitrification protocols were simultaneously investigated for their effectivity on human adipose tissue and adipose tissue-derived mesenchymal stem cell cryopreservation. Our results have shown that, both the high concentration and longer incubation periods of cryoprotectants negatively and dramatically affect the survival and functions of the adipose tissue as well as mesenchymal stem cells in the same tissue. The results also confirmed that, in order to set up a clinically acceptable cryopreservation programme, one needs to optimize the cellular and tissue-level cryopreservation programmes separately. In addition to the above results, our data also clarified and confirmed that conventional storage temperatures (4°C and -20°C) are clearly ineffective in storing the functionality of the tissue and the cells. 
In conclusion, this study showed that, staged slow freezing is the most optimal route for cryopreservation of AD-MSCs whereas vitrification protocol is the most convenient for cryopreservation of adipose tissues. Based on this information, simultaneous cryopreservation of adipose tissue and AD-MSCs has been developed and optimized for future use. The findings of this study also helped us to generate a tissue and a mesenchymal stem cell cryobank from the donated materials. Therefore the resuls obtained in this study can be considered as a valuable source for experimental, preclinical or clinical studies that can potentially be involved in stem cells and tissue engineering.
  
Keywords: Adipose tissue, AD-MSC, Soft tissue engineering, Cryopreservation, Slow freezing, Vitrification.