Adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin polietilenglikol dimetakrilat hidrojellerde kahverengi ve beyaz adipoz dokuya farklılaşmalarının incelenmesi
Investigation of brown and white adipose tissue differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells on polyethyleneglycole dimethacrylate hydrogels
Yazar: ASLI SENA KARANFİL
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Bu çalışma "Adipoz Kökenli Mezenkimal Kök Hücrelerin 3 Boyutlu Hidrojellerde Kahverengi ve Beyaz Adipoz Dokuya Farklılaşmalarının İncelenmesi" başlıklı Lisansüstü Tez Projesi (FYL-2018-17299) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir.
Sunulan çalışmada amaç; beyaz adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (AKH), iki boyutlu (2B) ve üç boyutlu (3B) in vitro kültür koşullarında kahverengi yağ dokusuna farklılaşma potansiyellerinin incelenmesidir.
Çalışma kapsamında ilk olarak polietilen glikol (PEG) polimeri mikrodalga enerjisi (1100 Watt, 5 dk) kullanılarak, metakrilik anhidrit (MA) ile fonksiyonelleştirilip %99.4 metakrilatlanma derecesine sahip polietilen glikol dimetakrilat (PEGDM) sentezlenmiştir. Sentezlenen ve karakterize edilen PEGDM foto çapraz-bağlayıcı ajan Irgacure2959 (%0.1, w/v) ile çözelti haline getirilip 150 sn UV ışığa maruz tutularak 3B hücre kültürleri için doku iskelesi olarak kullanılacak olan hidrojel yapıları elde edilmiştir.
Tezin sonraki aşamasında ise sıçan kaynaklı AKH'leri 35 gün boyunca, 2B ve 3B in vitro hücre kültür koşullarında, roziglitazone ve triiyodotironin (T3) içeren kahverengi adipogenik farklılaştırma ortamında kültüre edilmiştir. İki boyutlu kültürlerde hücreler çok gözlü hücre kültür kaplarında üretilirken, 3B kültür çalışmalarında PEGDM hidrojellere enkapsüle edilmiştir. Ayrıca kronik soğuk maruziyetinin (2B kültürler için, gün aşırı, 16°C, 15 dk; 3B kültürler için, gün aşırı, 16°C, 1 sa) AKH'lerin in vitro adipogenik farklılaşmalarına olan etkisi de incelenmiştir.
Her 2 kültür koşulunda da farklılaşan hücrelerdeki lipit vakuolleri Oil Red O ile boyanmış ve optik mikroskopla görüntülenmiştir. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) analizleriyle kahverengi adipositlere özgü olan UCP-1, Cidea genleri ve tüm adiposit türlerinden eksprese olan PPAR-γ geninin ekspresyon seviyeleri tespit edilmiştir. Ayrıca immünositokimyasal ve immünohistokimyasal analizlerle farklılaşan hücrelerdeki UCP-1 ve PPAR-γ proteinlerinin varlıkları görüntülenmiştir. Ancak in vitro koşulda uygulanan soğuk indüksiyonunun AKH'lerin kahverengi adipositlere farklılaşmasında belirgin bir etkisinin olmadığı görülmüştür.
Sonuç olarak AKH'ler, 2B ve 3B in vitro hücre kültür koşullarında kahverengi adipositlere farklılaştırılmıştır. Ayrıca AKH'lerin PEGDM hidrojellere enkapsüle edilmesiyle elde edilen 3B hücre kültürleri, in vitro koşullarda kahverengi adiposit elde edilmesi için uygun bir sistem olarak önerilmektedir.

Abstract:
This study was financially supported by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit with a graduate project entitled "Investigation of Brown and White Adipose Tissue Differentiation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells on 3 Dimensional Hydrogels" (FYL-2018-17299).
The aim of the present study is to investigate the differentiation potential of white adipose tissue derived mesenchymal stem cells (AdMSCs) to brown adipose tissue on 2 dimensional (2D) and 3 dimensional (3D) in vitro culture conditions.
In the first part of study, PEG polymer was functionalizated with methacrylic anhydride (MA) by using microwave energy (1100 Watt, 5 min). Therefore, polyethylene glycole dimethacrylate (PEGDM) was synthesized with 99.4% methacrylation degree. Then, PEGDM was brought into solution with photo-cross-linking agent Irgacure2959 (0.1%, w/v) and exposed to 150 s UV light to obtain hydrogel structures to be used as a tissue scaffold for 3D cell cultures.
In the next stage of the thesis, AdMSCs were cultured in brown adipogenic differentiation medium consisting of roziglitazone and triiodothyronine (T3) for 35 days on 2D and 3D culture conditions. While in 2D cultures cells were culturing in multi- well culture dishes, in 3D cultures cells were encapsulated in PEGDM hydrogels. Additionally, the effect of chronic cold exposure (for 2D cultures, every other day, 16°C, 15 min; for 3D cultures, every other day, 16°C, 1h) on in vitro adipogenic differentiation of AdMSCs was also investigated.
In both culture conditions, 2D and 3D, lipid vacuoles in the differentiated cells were observed by optical microscope after staining with Oil Red O. The expression levels of UCP-1 and Cidea genes which are specific for brown adypocytes and PPAR-γ gene which is expressed from all adipocyte species were revealed by real time-polymerase chain reaction (RT-PCR). In addition, the precence of UCP-1 and PPAR-γ proteins in the differentiated cells was visualized with immunocytochemical and immunohistochemical analyzes. However, cold induction on in vitro cell culture conditions did not have a significant effect on the differentiation of AdMSCs to brown adipocytes.
As a result, AdMSCs were differentiated to brown adipocytes on both culture conditions, 2D and 3D. Moreover, 3D cell cultures which obtained by encapsulation of AdMSCs into PEGDM hydrogels are proposed as a suitable system for obtaining brown adipocytes in vitro.