Dolaşım sistemi enfeksiyonu etkeni olarak izole edilen metisiline dirençli staphylococcus aureus (MRSA) izolatlarında makro e-test yöntemi ile vankomisine azalmış duyarlı s. aureus (VISA) ve vankomisine heterojen dirençli (HVISA) sıklığının ve bu suşların moleküler genetik özelliklerinin araştırılması
Investigation of the frequency of vancomycin intermediate staphylococcus aureus (VISA) and heterogeneous vancomycin resistant s. aureus (HVİSA) among methicillin resistant s. aureus (MRSA) strains isolated from bloodstream by using the macro e-test method and characterization of molecular genetic features of these strains
Yazar: BÜŞRA BETÜL ÖZMEN ÇAPIN
Danışman: PROF. DR. ZEYNEP CEREN KARAHAN
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Antibakteriyel ajanlar = Anti-bacterial agents ; Antibiyotikler = Antibiotics ; Enterotoksinler = Enterotoxins ; Metisilin = Methicillin ; Stafilokok enfeksiyonları = Staphylococcal infections ; Staphylococcus aureus = Staphylococcus aureus ; Vankomisin = Vancomycin ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) kökenlerinin etken olduğu enfeksiyonların tedavisinde ilk seçenek antimikrobiyal vankomisindir. Günümüzde MRSA suşları içerisinde vankomisine dirençli (VRSA), azalmış duyarlı (VISA) ve heterojen dirençli (hVISA) kökenler bulunmaktadır. Bunlar arasında, rutin antimikrobiyal duyarlılık testleri ile değerlendirildiğinde glikopeptidler için minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri "duyarlı" kategorisinde bulunan hVISA kökenleriyle gelişen enfeksiyonlarda, popülasyon içinde duyarlılığı azalmış alt popülasyonlar bulunması nedeniyle tedavi başarısızlıkları görülebilmektedir. Bu çalışmada kan kültürlerinden dolaşım sistemi enfeksiyonu etkeni olarak izole edilen MRSA izolatları arasında VISA ve hVISA varlığının araştırılması ve bu kökenlerin diğer antimikrobiyallere duyarlılık profillerinin ve moleküler epidemiyolojik özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
2001-2014 yılları arasında İbni Sina Hastanesi Merkez Mikrobiyoloji Laboratuvarına gönderilen kan kültürlerinden üretilen, konvansiyonel yöntemler ve otomatize sistemler [BD Phoenix System (Becton Dickinson, ABD) Bruker Microflex MALDI-TOF MS Maldi Biotyper (Bruker Daltonics, Bremen, Almanya)] kullanılarak tanımlanan ve sefoksitin diski tarama yöntemiyle metisilin direnci belirlenen 127 MRSA suşu çalışmaya alınmıştır. İzolatların vankomisin ve teikoplanin için MİK değerleri sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle belirlenmiş, diğer antimikrobiyallere (seftarolin, gentamisin, amikasin, eritromisin, tetrasiklin, siprofloksasin, levofloksasin, klindamisin, trimetoprim-sulfametaksazol, kloramfenikol rifampin, kinupristin-dalfopristin ve linezolid) duyarlılıkları ise Kirby-Bauer disk difüzyon testi yöntemiyle çalışılarak sonuçlar EUCAST (v 6.0, 2016) kriterleri ile değerlendirilmiştir. hVISA şüpheli izolat varlığı makro E-test yöntemi ile taranmıştır. Çalışmada, Mu3 (ATCC 700698) ve ATCC 29213 Staphylococcus aureus kökenleri sırasıyla hVISA ve MSSA kontrolleri olarak kullanılmıştır. 
İzolatların tümü glikopeptidlere duyarlı olarak değerlendirilmiş, MİK değerleri vankomisin için 0,25-1 µg/ml, teikoplanin için ise 0,06-2 µg/ml arasında bulunmuştur. Kirby-Bauer disk difüzyon testi yöntemi ile izolatların tamamı linezolid ve kinupristin-dalfopristine duyarlı bulunmuştur. İzolatların tamamı tetrasikline dirençli ve tamamına yakını ( > % 96) aminoglikozidlere, florokinolonlara ve rifampisine dirençlidir. Trimetoprim-sülfametoksazole direnç %3,94'tür. İzolatların %62,2'si klindamisine dirençlidir ve bunların %40'ı (n=30) indüklenebilir dirence sahiptir (D-test pozitif). S. aureus izolatlarının, özellikle MRSA gibi çoklu dirençli gram-pozitif bakterilere yüksek etkinlik gösteren ve ülkemizde henüz kullanıma giren yeni kuşak bir sefalosporin olan seftaroline duyarlılığı %58,3 olarak bulunmuştur. VRSA tespit edilmemiştir. Makro E-test yöntemi ile 2004 ve 2005 yılına ait birer, 2009 ve 2014 yıllarına ait ikişer adet olmak üzere toplam altı izolat (%4,7) hVISA şüpheli olarak bulunmuştur. hVISA izolatlarının tespitinde altın standart olarak kabul edilen "eğri altında kalan alanın popülasyon analizi profili (PAP-AUC)" yöntemi ile hVISA tespit edilmemiştir. İzolatların tamamı SCCmec tip-III, %96,9'u sea geni bulundurmakta, %93,7'si agr tip-1 lokusu taşımaktadır.

Abstract:
Vancomycin is the drug of choice for the treatment of infections caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Vancomycin resistant (VRSA), vancomycin intermediate (VISA) and heterogeneous vancomycin resistant (hVISA) isolates are now reported among MRSA strains. hVISA isolates can be interpreted as "susceptible" when routine susceptibility testing procedures are performed since their minimum inhibitory concentration (MIC) value of glycopeptides is in-between the susceptible intervals. As they contain subpopulations with reduced susceptibility to glycopeptides, therapeutic failures can be seen. In this study the frequency of hVISA isolates among MRSA strains isolated from blood stream infections was investigated, antimicrobial susceptibility profiles and molecular genetic characteristics of the isolates were determined.
127 MRSA strains isolated from blood cultures between 2001-2014 at the Central Microbiology Laboratory of İbni Sina Hospital and were identified by conventional methods and automatized systems [BD Phoenix System (Becton Dickinson, USA) Bruker Microflex MALDI-TOF MS Maldi Biotyper (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)] and methicillin-resistance of the isolates were screened by using cefoxitin disc diffusion method. Vancomycin and teicoplanin MIC values were detected by microbroth dilution method. Susceptibility determination of other antimicrobials (ceftaroline, gentamicin, amikacin, erythromycin, tetracycline, ciprofloxacin, levofloxacin, clindamycin, trimethoprim-sulfamethoxazole, chloramphenicol, rifampicin, quinupristin-dalfopristin, and linezolid) were detected by the Kirby-Bauer disc diffusion method and interpreted by EUCAST v 6.0 criteria. Macro E-test method is used to search suspicious hVISA strains among MRSA isolates. ATCC 29213 and Mu3 (ATCC 700698), were used as positive controls of MSSA and hVISA, respectively.
All of the isolates were susceptible to glycopeptides with vancomycin and teicoplanin MIC values of 0,25-1 µg/ml and 0,06-2 µg/ml, respectively. All isolates were susceptible to linezolid and quinupristin/dalfopristin. All isolates were resistant to tetracycline and as nearly all isolates ( > 96%) were resistant to aminoglycosides, fluoroquinolones, and rifampicin. Resistance to trimethoprim-sulphamethoxasole was 3,49%. While 62,2% of isolates were resistant to clindamycin, inducible resistance to clindamycin (D-test positivity) was 40% (n=30). 58,3% of all MRSA isolates were susceptible to the new generation cephalosporin that has recently been started to be used in Turkey, ceftaroline, which has strong activity against multi-drug resistant gram-positive bacteria such as MRSA. No VRSA strain was detected. Although all isolates were susceptible to vancomycin and teicoplanin, six isolates (4,7%) were found to be suspicious hVISA by the macro E-test method: one isolate each from 2004 and 2005; and two isolates each from 2009 and 2014. We found no heteroresistance by reference "population analysis profile-area under the curve" (PAP-AUC) method among MRSA isolates. SCCmec typing of all isolates revealed type-III SCCmec, sea was the most frequently (%96,9) detected enterotoxin gene and agr typing of the isolates showed that agr type-1 locus was dominant (%93,7).