Antiretroviral tedavi almamış HIV-1 ile enfekte hastalarda tedavi öncesi ilaç direncinin ultra-derin ve konvansiyonel dizi analizi yöntemleri ile incelenmesi
Evaluation of pretreatment drug resistance in treatment naïve patients infected with HIV-1 using ultra-deep pyrosequencing and conventional sequencing methods
Yazar: AYSUN TEKİN
Danışman: DOÇ. DR. ULUHAN SİLİ
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases
Dizin: Antiretroviral ajanlar = Anti-retroviral agents ; Dizi analizi = Sequence analysis ; HIV I = HIV I ; Mutasyon = Mutation ; Tedavi = Treatment ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Giriş ve Amaç:
Antiretroviral tedavi Human immunodeficiency virus (HIV) enfeksiyonuna bağlı morbidite ve mortaliteyi azaltmıştır; ancak ilaca dirençli suşların ortaya çıkması tedavi başarısının önünde önemli bir engel oluşturmaktadır. Antiretroviral direncin belirlenmesinde kullanılan konvansiyonel yöntemlerle türümsülerin ≥%20'sindeki mutasyonlar saptanabilmektedir; ancak minör varyantların tedavi altında baskın hale gelerek virolojik başarısızlığa yol açabileceği gösterilmiştir. Bununla birlikte ülkemizden minör varyant düzeyinde antiretroviral direnci saptamaya yönelik henüz bildirilmiş bir çalışma yoktur. Bu çalışmada öncelikli olarak kliniğimizce takip edilen HIV ile enfekte hastalarda aktarılmış ilaç direnci sürveyansının saptanması amaçlandı. Ayrıca, kliniğimizin hasta popülasyonundaki minör varyantların ultra-derin dizi analizi (UDDA) yöntemi ile değerlendirilmesi ve bu mutasyonların öne çıktığı hasta grubunun saptanması hedeflendi.  
Yöntem:
Prospektif, gözlemsel nitelikli olan bu çalışmaya; Ocak 2013 – Ocak 2016 tarihleri arasında polikliniğimizde HIV-1 ile enfeksiyon tanısı konulan, bu tanı ile izlenen veya direnç testi çalışılması amacıyla dış merkezlerden kliniğimize yönlendirilmiş olan; tedavi öyküsü olmayan, 18 yaşın üzerindeki hastalar dahil edildi. Hastaların demografik, klinik ve laboratuvar verileri kaydedildi. Çalışmaya Ocak 2013 – Aralık 2013 tarihleri arasında alınan hastaların örnekleri merkezimizde UDDA yöntemi ile çalışıldı, belirlenen transmitted drug resistance mutations (TDRM'ler) ≥%20 ve minör varyant düzeyinde olarak sınıflandırıldı. Ocak 2014'ten sonra çalışmaya dahil edilen hastaların örnekleri, popülasyon sekanslama yöntemi ile direnç çalışılması için Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Referans Laboratuvarı'na yönlendirildi. Popülasyon sekanslama yöntemi ile değerlendirilmiş olan mutasyon sonuçları ile UDDA yöntemi ile çalışılmış olan örneklerde ≥%20 düzeyinde saptanmış olan mutasyonlar bir arada incelenerek hastalardaki TDRM sürveyansı saptandı. Elde edilen tüm mutasyonlar kullanılarak hastalardaki ilaç direnci bilgisine ulaşıldı.

Bulgular:
Çalışmaya 125 hasta dahil edildi. Direnç analizi UDDA yöntemi ile yapılmış olan 36 hastada türümsülerin ≥%20'si incelendiğinde, hastaların %8,3'ünde nükleoz(t)id revers transkriptaz inhibitörü (NRTI) ile ilişkili TDRM saptanırken; diğer ilaç grupları ile ilişkili TDRM saptanmadı. Minör varyantlar analize dahil edildiğinde NRTI, non-nükleozid revers transkriptaz inhibitörü (NNRTI) ve proteaz inhibitörü (PI)  ilişkili TDRM'ler hastaların sırası ile %16,7; %8,3 ve %8,3'ünde bulundu. Değerlendirilmiş olan 125 hastanın tamamındaki TDRM oranı %5,6 olarak hesaplandı; NRTI için TDRM %4,8 bulunurken, NNRTI'lar için %0,8 oranındaydı. En sık saptanan mutasyonlar revers transkriptaz geninin 215. pozisyondaki reversiyon mutasyonlarıydı. Çalışmaya katılan tüm hasta grubunda TDRM için anlamlı bir risk faktörü saptanmadı. Hastalar tedavi öncesi ilaç direnç mutasyonları açısından değerlendirildiklerinde NNRTI kombinasyonlu tedavilerin, özellikle rilpivirinin etkinliğinin önemli ölçüde azaldığı görüldü. 
Sonuç:
Konvansiyonel yöntemlerle değerlendirildiğinde, özellikle bazı düşük genetik bariyerli tedavi rejimlerinde tedavi yanıtını olumsuz etkileyebilecek minör varyantlardaki TDRM gözden kaçabilmektedir. Bu durum daha hassas yöntemlerin önemini vurgulamaktadır. Bizim çalışmamızda UDDA; minör varyantlar hakkında bilgi vererek, direnç profilinin daha ayrıntılı şekilde belirlenmesini sağlamıştır. Çalışmamızda saptanan TDRM oranı ülkemizden bildirilen çalışmalara kıyasla düşüktür. Hasta sayısı kısıtlı olmakla birlikte, çalışmamızın diğer çalışmalara göre daha güncel bir periyotta gerçekleştirilmiş olması ülkemizdeki TDRM sıklığının azalma eğiliminde olduğunu düşündürebilir; ancak bu konu ile ilgili net bir sonuca varabilmek için daha geniş hasta grubu ile yapılacak güncel çalışmalara gereksinim vardır.

Abstract:
Background:
Antiretroviral treatment reduced morbidity and mortality caused by Human immunodeficiency virus (HIV) infection; however, emergence of drug resistant strains poses an important obstacle to success of treatment. Using conventional sequencing methods to determine antiretroviral resistance, only mutations present in ≥20% of quasispecies can be identified; however, minority variants were shown to become dominant under treatment and consequently, lead to virological failure. To the best of our knowledge, there are no studies published investigating minority variants in Turkish HIV-infected patients. In this study, the primary objective was to determine the prevalence of transmitted drug resistance in HIV-infected patients followed by our clinic. The secondary objectives were to assess minority variants in this population using ultra-deep pyrosequencing analysis (UDPS), and to determine the group of patients who harbored these mutations.
Method:
Treatment-naïve patients older than 18 years of age, who were diagnosed and/or followed with HIV-1 infection in our outpatient clinic or referred from other institutions for the purpose of antiretroviral resistance assessment between January 2013 and January 2016, were included in this prospective observational study. Demographic, clinical, and laboratory data were recorded. Samples of the patients who were included in the study between January 2013 and December 2013 were analyzed at our center using UDPS; transmitted drug resistance mutations (TDRMs) were classified as ≥20% or at minority variant level. The samples of the patients who were enrolled in the study after January 2014 were referred to the reference laboratory of Turkish Public Health Agency for resistance analysis. The results of the population sequencing analysis and the mutations detected at ≥20% level with UDPS were assessed together for surveillance of TDRM. Pre-treatment drug resistance evaluation was done using all of the mutations.

Results:
We enrolled 125 patients in the study. Evaluation of  ≥20% of quasispecies in the subgroup of 36 patients with resistance analysis using UDPS revealed that TDRM associated with nucleos(t)ide reverse transcriptase inhibitors (NRTI) was detected in 8.3% of the patients, whereas no TDRM was identified for the other drug classes. After including the minority variants into analysis, TDRM prevalence associated with NRTIs, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) and protease inhibitors (PIs) increased to 16.7%, 8.3% and 8.3% of patients, respectively. Of all the 125 patients, any TDRM prevalence  was identified as 5.6%; whereas the frequency of TDRMs for NRTIs and NNRTIs was 4.8% and 0.8%, respectively. The most common mutations were reversion mutations in the 215th amino acid position of reverse transcriptase gene. There were no significant risk factors associated with TDRMs in the whole patient group. When the patients were evaluated with regard to pretreatment drug resistance mutations, the efficacy of treatment regimens including NNRTIs, especially rilpivirine, was found to be remarkably diminished. 
Conclusion:
Using conventional methods, some minority variant TDRMs may go unnoticed, particularly those that might negatively influence response to low genetic barrier treatment regimens. This concept emphasizes the importance of more sensitive sequencing methods. In our study, UDPS enabled a more detailed assessment of resistance profile by providing information about minority variants. The frequency of TDRMs found in our study was lower compared to other studies from our country. Our study was performed in a relatively more recent timeframe than the other studies, which might suggest that the TDRM frequency in our country has a trend to decrease, although the sample size of our study is a limitation. However, further large-scale studies are required to assess recent TDRM frequency in Turkey.