PID-PC'lerden izole edilen eksozomların pankreas kanseri üzeine etkisi
Effects of exosomes isolated from PID-PCs on pankreatic cancer
Yazar: İMREN HASOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE KARATUĞ KAÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Eksozomlar = Exosomes ; Nöroendokrin tümörler = Neuroendocrine tumors ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms

Özet:
Pankreas ekzokrin ve endokrin salgı yapan iki kısımdan oluşur. Ekzokrin pankreas asinar ve 
kanal hücrelerinden oluşurken, endokrin pankreas beş farklı hücre tipine sahip Langerhans 
adacıklarından oluşur. Pankreas kanseri en ölümcül malign neoplazmalardan biridir ve kanser 
ölümlerinin önde gelen nedenlerindendir. Yıllık sağ kalım oranı %5'ten az olan pankreas 
kanserin de semptomların ileri evrede ortaya çıkmasından ve ayırt edici olmamasından dolayı 
tanısında geç kalınmaktadır. Kök hücreler kendi kendini yenileme, klonalite ve farklılaşma 
yeteneğine sahip embriyonik ve fetal dönemlerinde doku ve organların oluşumunda rol 
oynayan, yetişkin dönemlerinde ise hasar onarımda etkili olan farklılaşmamış hücrelerdir. 
Yetişkin dönem kök hücrelerinden biri olan mezenkimal kök hücreler antiinflamatuar, 
immünoregülatör ve immünosupresif kapasiteye sahiptirler. Pankreatik ada türevli progenitör 
hücreler (PID-PC) ise tipik bir mezankimal kök hücre özelliğine sahiptir. Eksozomlar 50-150 
nm çapında, lipit çift katman ile kaplı veziküllerdir. Hücreler arası etkileşimde etkili olan bu 
vezikülleri diğer veziküllerden ayıran ve onları önemli kılan taşıdıkları RNA kargolarıdır. 
Salgılandıkları hücrelerden miRNA ve mRNA taşıyarak hedef hücrede değişikliğe sebep 
olabilmeleri, kanser dahil birçok farklı hastalığın tanı ve tedavisinde eksozomların rol 
alabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızın amacı PID-PC, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre 
soylarından izole edilen eksozomları karakterize etmek ve ilk defa karşılaştırılmalı olarak boyut 
analizi yapmaktır. Ayrıca, çalışmanın ikinci amacı olarak, ilk defa PID-PC'lerden izole 
ettiğimiz eksozomların insülinoma beta hücre tümörü olan INS-1 ve pankreas kanseri olan 
MiaPaca-2 hücre soyları üzerindeki etkisini araştırmaktır.
PID-PC'LERDEN İZOLE EDİLEN EKSOZOMLARIN PANKREAS KANSERİ 
ÜZERİNE ETKİSİ
xvi
Eksozomlar her üç hücre soyundan eksozom izolasyon kitleri ile izole edilmiştir. Hem izole 
edilen eksozomlar da hem de her üç hücre soyundan elde edilen lizatlarda eksozom belirteci 
olarak bilinen Alix, TSG101, CD9 ve CD81 proteinleri Simple Wes ile analiz edilmiştir. Üç 
farklı hücre soyundan elde edilen eksozomların boyutları ve konsantrasyonları Nano Partikül 
İzleme Analizi (NTA) ile belirlenmiştir. Karakterize edilen PID-PC'lerden izole edilen 
eksozomlar 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5 ve 10 µg/ml konsantrasyonlarda hem INS-1 hem de 
MiaPaCa-2 hücre soylarına 24 ve 72 saat uygulandıktan sonra hücre canlılık testi (MTT) 
yapılmıştır ve IC50 değerleri belirlenmiştir. Belirlenen IC50 değerlerindeki eksozomlar INS-1 
ve MiaPaca-2 hücre soylarına 72 saat uygulandıktan sonra hücreler fikse edilip 
immünohistokimyasal olarak HSP90, HSF-1, Nestin, Endoglin, Kaspaz-8, Aktif Kaspaz-3, 
Beclin ve p-Bcl-2 antikorları ile işaretlenmiştir. Işık mikroskobunda bilgisayar destekli görüntü 
analiz programı NIS-Element D 3.1 programı kullanılarak proteinlerin işaretlenme 
yoğunlukları hesaplanmıştır. Belirlenen IC50 değerindeki eksozomlar MiaPaca-2 hücre soyuna 
72 saat uygulandıktan sonra LDH kiti ile hücre sitotoksisitesi ölçülmüştür. Ayrıca eksozomun 
INS-1 hücre soyunda fonksiyonel olarak etkisini araştırmak için belirlenen IC50 değerindeki 
eksozomlar 72 saat INS-1 hücrelerine uygulandıktan sonra hücre sekresyonu toplanmış ve 
hücre lizatı elde edilmiştir. Elde edilen hücre lizatında ve sekresyonunda İnsülin ELİSA kiti ile 
insülin seviyelerine bakılmıştır. 
Simple Wes analizlerine göre PID-PC, Miapaca-2 ve INS-1 hücre soylarından izole edilen 
eksozomlarda, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre lizatlarında Alix proteini tespit edilmiştir. TSG101 
proteini PID-PC, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre lizatlarında bulunurken, izole edilen 
eksozomlarında görülmemiştir. CD9 proteini PID-PC, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre lizatlarında 
ve INS-1 hücre soyundan elde edilen eksozomlarda gözlemlenmiştir. CD81 proteini ise sadece 
MiaPaca-2 hücre soyundan elde edilen lizatta çok az miktarda görülmüştür.
NTA sonuçlarına göre PID-PC'lerden izole edilen eksozomların 103.6 ± 28.6 nm, MiaPaca-2
hücre soyundan izole edilen eksozomların 100.7 ± 10 nm, INS-1 hücre soyundan izole edilen 
eksozomların 147.2 ± 12.3 nm olarak boyutları analiz edildi.
Hücre canlılık analizine göre, PID-PC'lerden izole edilen eksozomlar ile MiaPaca-2 hücreleri 
24 saat inkübe edilmesi sonucu düşük konsantrasyonlardaki eksozom uygulaması sonucu hücre 
canlılığında anlamlı bir değişiklik olmamaktadır. MiaPaca-2 hücrelerinin 72 saat izole edilen 
eksozomlar ile inkübasyonu sonucu düşük dozlardan itibaren hücre canlılığında anlamlı bir
azalma meydana gelmektedir. INS-1 hücre soyunun ise eksozom ile 24 saat inkübe edilmesi 
sonucu 5 µg/ml konsantrasyonda eksozom uygulamasına kadar hücre canlılığında kontrole 
kıyasla farklılık görülmemiştir. INS-1 hücrelerinin eksozomlar ile 72 saat inkübe edilmesi 
sonucunda 2,5 µg/ml konsantrasyonda eksozom uygulamasına kadar değişiklik gözlenmezken, 
ileri dozlarda eksozom uygulaması sonucu hücre canlılığı anlamlı bir şekilde azalmaya 
başlamıştır. 
İmmünohistokimyasal işaretlenme sonuçlarına göre, INS-1 hücre soyuna eksozom 
uygulandığında HSP90 immünboyama yoğunluğu kontrol grubuna göre istatistiksel olarak 
anlamlılık göstermezken, eksozom uygulanan MiaPaca-2 hücre soyunda HSP90'nın 
immünboyama yoğunluğu kontrol grubuna göre anlamlı derecede artmıştır. Ayrıca her iki hücre 
soyunun da eksozom uygulanan gruplarında MiaPaca-2 hücre soyunun HSP90 immünboyama 
yoğunluğu INS-1 hücre soyuna göre anlamlı derecede yüksektir. HSF-1 immünboyama 
yoğunluğunda eksozom uygulanan INS-1 ve MiaPaca-2 hücre soylarında kendi kontrol 
gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlılık yokken, MiaPaca-2 hücre soyunun kontrol 
grubunun INS-1 hücre soyunun kontrol grubuna göre ve eksozom uygulanan MiaPaca-2 hücre 
xvii
soyunun eksozom uygulanan INS-1 hücre soyuna göre HSF-1 immünboyama yoğunlukları 
anlamlı derecede fazladır. Eksozom uygulanan ve uygulanmayan INS-1 ve MiaPaca-2 hücre 
soylarında Nestin ve Endoglin immünboyama yoğunluğunda anlamlı bir farklılık yoktur. 
Nestin'in immünboyanması sonucunda, her iki hücre soyunun kontrol grubunda Nestin 
proteinine ait hiç işaretlenme yoktur. Benzer bir şekilde Endoglin'in immünboyanması 
sonucunda, INS-1 hücre soyunun hem kontrol grubunda hem de eksozom uygulanan grubunda, 
MiaPaca-2 hücre soyunda ise sadece kontrol grubunda Endoglin proteinine ait hiç işaretlenme 
olmamıştır. 
Miapaca-2 hücre soyunda Kaspaz-8 ve Aktif Kaspaz-3 immünboyama yoğunluklarında 
eksozom uygulanan grupta kontrol gruba göre farklılık görülmemiştir. Beclin ve p-Bcl-2 
immünboyama yoğunluklarında eksozom uygulanan MiaPaca-2 hücre soyunda kontrol 
grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir azalma vardır. 
MiaPaca-2 hücre soyuna eksozom uygulaması sonrasında MiaPaca-2 hücre soyundan salınan 
LDH seviyesi %13,98 ± 3,361 olarak analiz edilmiş ve hücre sitotoksititesi belirlenmiştir. 
Eksozom uygulanan INS-1 hücrelerine ait hücre sekresyonu ve lizatında ELİSA kiti ile ölçülen 
insülin seviyelerine göre hücre lizatlarında insülin seviyesi kontrol grubuna göre istatistiksel 
olarak anlamlı derecede artmıştır. Ancak hücre sekresyonunda insülin seviyesi kontrol gruba 
göre farklılık göstermemiştir. Ayrıca eksozom uygulanan INS-1 hücre lizatlarında insülin 
seviyesi hücre sekresyonuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir derecede artış göstermiştir. 
Sonuç olarak, PID-PC, MiPaca-2 ve INS-1 hücre soylarından ilk defa tarafımızca izole edilen 
ve boyut analizi gerçekleştirilen eksozomların literatürde yer alan farklı kaynaklardan izole 
edilen eksozom boyutlarına göre benzer olduğunu gördük. Alix proteininin üç hücre soyundan 
izole edilen eksozomlar için ve CD9 proteininin sadece INS-1'den izole edilen eksozomlar için 
spesifik bir belirteç olabileceğini gözlemledik. PID-PC soyundan izole edilen eksozomların 
MiaPaca-2 hücrelerini zamana ve doza bağlı olarak hücre ölümüne götürdüğünü hücre canlılık 
analizinde tespit ettik. Bunun yanı sıra MiaPaca-2 hücreleri için belirlenen IC50 değerinin
pankreatik beta hücrelerini en iyi şekilde taklit eden ve bazı çalışmalarda sağlıklı pankreatik 
beta hücreleri yerine de kullanılabilen INS-1 hücrelerinde hücre canlılığı üzerine etkili 
olmaması, izole edilen eksozomların sağlıklı hücrelere zarar vermeden kanser hücrelerini 
öldürebileceğini düşündürmektedir. İmmünboyama sonucunda MiaPaca-2 hücre soyunda 
HSP90'nın anlamlı bir şekilde artışı, pankreas kanserinde olası eksozom ile tedavi durumunda 
bu proteinin artışının bir belirteç olabileceğini düşündürmektedir. p-Bcl-2 seviyesinin MiaPaca2 hücre soyunda anlamlı azalışı hücrelerin apoptotik yolla ölebileceğini gösterirken, Aktif 
Kaspaz-3 seviyesinde anlamlı bir değişiklik olmaması apoptotik hücre ölümünün çok fazla 
olmadığını göstermektedir. Beclin-1'deki anlamlı azalış hücrelerin otofojik yolla 
ölmeyebileceğini gösterirken, MiaPaca-2 hücrelerinde ölçülen LDH seviyesi ile ölen hücrelerin 
bir kısmının da nekroz ile öldüğünü göstermektedir. INS-1 hücrelerinde eksozom uygulaması 
sonrası insülin seviyesinin anlamlı bir şekilde artması eksozomların insülin mekanizmasına etki 
ederek üretimini artıdığını gösterirken, insülin sekresyonunda bir değişiklik olmaması 
eksozomların insülin salınımına etki etmediğini ya da fazla üretilen insülinin salınımı sırasında 
sorunlar olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
The pancreas consists of two parts, endocrine and exocrine. While the exocrine pancreas 
includes acinar and canal cells, the endocrine pancreas consists of the Langerhans islet which 
has five different types of cells. Pancreas cancer is one of the deadliest malignant neoplasms 
and the leading cause of death because of cancer. The annual survival rate is less than 5% for 
pancreatic cancer, which is also late in its diagnosis due to the fact that the symptoms occur at 
the advanced stage and are not distinguishing. A stem cell has the capability of sellperpetuation, clonality, and differentiation and it plays a role constitution of tissue and organ in 
the embryonic and fetal period, it is also effective in regeneration in the adult period. 
Mesenchymal stem cell which is one of the adult period stem cells has the capability of 
antiinflammatory, immunoregulatory, and immunosuppressive. Pancreatic islet-derived 
progenitor cells (PID-PC) has also properties of typically mesenchymal stem cells. The size of 
exosomes is 50- 150 nm, and are vesicles encased in a lipid bilayer. These vesicles that its 
effective cell-to-cell communication differs from other vesicles due to their RNA cargo 
contents. The fact that they can cause changes in the target cell by carrying miRNA and mRNA 
from the cells they are secreted suggests that exosomes may play a role in the diagnosis and 
treatment of many different diseases, especially cancer. The purpose of our study is to 
characterize exosomes isolated from the PID-PC, MiaPaca-2, and INS-1 cell lines and make an 
analysis comparatively of the size of this exosome for the first time. Besides, the second aim of 
this study is to research the effects of exosomes which were first time isolated from PID-PC on 
the INS-1 cells, which is a beta cell tumor, and MiaPaca-2 cells which is a pancreatic cancer 
EFFECTS OF EXOSOMES ISOLATED FROM PID-PCs ON PANCREATİC 
CANCER
xx
cell line. Exosomes were isolated from all three cell lines with exosome isolation kits. Alix, 
TSG101, CD9, and CD81 proteins which are known as markers for exosomes were analyzed 
with Simple Wes in cell lysates which were obtained from the three cell lines and also exosomes 
isolated from cell lines. The size and concentration of exosomes that were isolated from three 
different cell lines were detected with Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The cell viability 
test (MTT) was done and IC50 values were detected after exosomes were isolated from PIDPC and characterized and also applied to INS-1 and MiaPaca-2 cell lines in which 
concentrations of 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5 and 10 µg/ml for 24 and 72 hour. The cells were 
fixed and were marked immunohistochemically with HSP90, HSF-1, Nestin, Endoglin, 
Kaspaz-8, Active Kaspaz-3, Beclin, and p-Bcl-2 antibodies after exosomes were applied with 
determined IC50 value in INS-1 and MiaPaca-2 cell lines for 72 hours. The labeling intensities 
of the proteins were calculated using the computer-aided image analysis program NIS-Element 
D 3.1 under the light microscope. The cell cytotoxicity was measured by using an LDH kit after 
exosomes were applied with a determined IC50 value in the MiaPaca-2 cell line for 72 hours. 
Moreover, to investigate the functional effect of exosomes on the INS-1 cell line, cell secretion 
was collected, and cell lysates were obtained after exosomes were applied with a determined 
IC50 value in INS-1 for 72 hours. Insulin levels were analysed at by using an Insulin ELİSA 
kit in the obtained cell lysates and secretion. 
As a result of Simple Wes analysis, Alix protein was detected in exosomes isolated from PIDPC, MiaPaca-2, INS-1, and cell lysates obtained from MiaPaca-2, INS-1. TSG101 proteins 
were detected in cell lysates obtained from PID-PC, MiaPaca-2, and INS-1, but not isolated 
exosomes. CD9 protein was shown in PID-PC, MiaPaca-2, and INS-1 cell lysates and exosomes 
isolated from INS-1. On the other hand, CD81 protein was detected only in lysate obtained 
from the MiaPaca-2 cell line.
As a result of NTA, the dimensions of exosomes isolated from PID-PCs as 103.6 ± 28.6 nm, 
exosomes isolated from MiaPaca-2 cell line as 100.7 ± 10 nm, and exosomes isolated from 
INS-1 cell line as 147.2 ± 12.3 nm were analyzed.
According to cell viability analysis, incubation of MiaPaca-2 cells with exosomes isolated from 
PID-PCs for 24 hours was not statistically significant compared to the control group at low 
concentrations of exosome application. As a result of the incubation of MiaPaca-2 cells with 
isolated exosomes for 72 hours, a decrease in cell viability occurred beginning from low doses. 
In the INS-1 cell line, there was no difference in cell viability compared to the control until the 
application of the exosome at a concentration of 5 µg/ml after 24 hours of incubation with the 
exosome. As a result of incubation of INS-1 cells with exosomes for 72 hours, no change was 
observed until the application of exosomes at a concentration of 2.5 µg/ml, while cell viability 
began to decrease as a result of exosome application at higher doses.
According to the results of immunohistochemical staining, the immunostaining intensity of 
HSP90 when exosome was applied to the INS-1 cell line was not statistically significant 
compared to the control group, while the immunostaining intensity of HSP90 increased 
significantly in MiaPaca-2 cell line, which was applied to the exosome, compared to the control 
group. In addition, the HSP90 immunostaining intensity of the MiaPaca-2 cell line was 
significantly higher than the INS-1 cell line in the exosome-treated groups of both cell lines.
While there was no statistically significant difference in HSF-1 immunostaining intensity in the 
exosome-treated INS-1 and MiaPaca-2 cell lines compared to the control group, the HSF-1 
immunostaining intensities were significantly higher in the control group of MiaPaca-2 cell line 
xxi
compared to the control group of the INS-1 cell line, and also the exosome-treated MiaPaca-2 
cell line compared to the exosome-treated INS-1 cell line. There was no significant difference 
in Nestin and Endoglin immunostaining intensity in INS-1 and MiaPaca-2 cell lines treated 
with and without exosomes. As a result of Nestin immunostaining, there is no labeling of Nestin 
protein in the control group of both cell lines. Similarly, as a result of Endoglin immunostaining, 
there was no labeling of Endoglin protein in the INS-1 cell line both in the control group and 
in the exosome treated group, and in the MiaPaca-2 cell line only in the control group.
In the Miapaca-2 cell line, Caspase-8 and Active Caspase-3 immunostaining intensities were 
not different in the exosome-treated group compared to the control group. There was a
statistically significant decrease in Beclin and p-Bcl-2 immunostaining intensities in the 
exosome-treated MiaPaca-2 cell line compared to the control group.
After exosome application to the MiaPaca-2 cell line, the level of LDH released from the 
MiaPaca-2 cell line was analyzed as 13.98 ± 3.361% and cell cytotoxicity was determined.
According to the insulin levels measured with the ELISA kit in the cell secretion and lysate of 
the exosome-treated INS-1 cells, the insulin level in the cell lysates increased statistically 
significantly compared to the control group. However, the level of insulin in cell secretion did 
not differ compared to the control group. In addition, insulin levels in exosome-treated INS-1 
cell lysates showed a statistically significant increase compared to cell secretion.
As a result, we saw that the exosomes isolated from PID-PC, MiPaca-2, and INS-1 cell lines 
for the first time by us and whose size analyses were performed, were similar according to the 
exosome sizes isolated from different sources in the literature. We observed that the Alix 
protein may be a specific marker for exosomes isolated from the three cell lines and the CD9 
protein may be a specific marker only for INS-1 isolated exosomes. In cell viability analysis, 
we detected that exosome isolated from the PID-PC cell line caused cell death in the MiaPaca2 cells in a time- and dose-dependent manner. In addition, the IC50 value determined for 
MiaPaca-2 cells has no effect on cell viability in INS-1 cells, which best mimics pancreatic beta 
cells and can be used instead of healthy pancreatic beta cells in some studies, suggesting that 
isolated exosomes can kill cancer cells without damaging healthy cells. The significant increase 
of HSP90 in the MiaPaca-2 cell line as a result of immunostaining suggests that the increase of 
this protein may be a marker in the case of possible exosome treatment in pancreatic cancer. A 
significant decrease in the p-Bcl-2 level in the MiaPaca-2 cell line indicates that cells can die 
in an apoptotic way, while a significant change in the Active Caspase-3 level indicates that 
apoptotic cell death is not too much. While the significant decrease in Beclin-1 indicates that 
the cells may not die autophagically, the LDH level measured in MiaPaca-2 cells indicates that 
some of the cells that die also die by necrosis. A significant increase in insulin level after 
exosome administration in INS-1 cells indicates that exosomes increase their production by 
affecting the insulin mechanism, while the absence of a change in insulin secretion indicates 
that exosomes do not affect insulin secretion or that there may be problems during the release 
of excess insulin.