Lizozim, laktoferrin ve taşıyıcı olarak poloksamer 407 içeren yeni formulasyonların biyouyumluluklarının in vitro koşullarda değerlendirilmesi
In vitro evaluation of the biocompatibility of new formulations containing lysozyme, lactoferrin and drug delivery system poloxamer 407
Yazar: DİLŞAD ŞENÖZ
Danışman: PROF. DR. NÜKET SANDALLI
Yeditepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Pedodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Biyouyumluluk = Biocompatibility ; Klorheksidin = Chlorhexidine ; Laktoferrin = Lactoferrin ; Muramidases = Muramidases ; Poloksalen = Poloxalene ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Çocuklar = Children ; İn vitro = In vitro

Özet:
Üç yaşın altındaki çocuklarda, gelişmekte olan sürekli dişlerde fluorozis riski
oluşturması nedeniyle fluoridli diş macunu ve uzun süre kullanımındaki yan etkileri ve
sitotoksisitesi nedeniyle klorheksidinin kullanımı önerilmemektedir. Tükürük
proteinlerinden Lizozim ve Laktoferrin içeren bir preparatın küçük çocuklarda diş
çürüklerinin önlenmesi için bir çözüm getirebileceği düşünülmüş, poloksamer taşıyıcı
sistemler kullanılarak geliştirilen yeni bir formulasyonun topikal uygulamalarının ağız
hastalıklarının tedavisinde etkili olduğu görülmüştür.
Bu nedenle, Lizozim, Laktoferrin ve taşıyıcı sistem olarak Pluronic F-127 isimli
Poloksamer kullanılan, diş çürüğüne neden olduğu bilinen Streptococcus sobrinus,
Streptococcus mutans ve Lactobacillus acidophilus bakteri suşları üzerindeki
antibakteriyel etkileri kanıtlanmış farklı formulasyonlar geliştirilmiştir. Bu çalışmanın
amacı, yeni geliştirilmiş bu formulasyonların biyouyumluluklarının klorheksidin jel ile
karşılaştırmalı olarak in vitro koşullarda değerlendirilmesidir.
Çalışmamızda kullanılan formulasyonlar: (1) pH:5.0 Sorensen's Tampon
Çözeltisi, (2) %20 a/h Poloksamer 407 jel, (3) %10 a/h Poloksamer 407 jel, (4) Lizozim
ve Laktoferrinin %20 konsantrasyondaki poloksamer 407 ile birleştirilmesiyle, (5) 4.
grubun MİK değeri olacak şekilde Lizozim ve Laktoferrinin %10 konsantrasyondaki
poloksamer 407 ile birleştirilmesiyle, (6) Sorensen's Çözeltisi (pH:7.0) negatif kontrol
olarak, (7) Lizozim ve Laktoferrin tamponda (Sorensen's Çözeltisi pH:5.0)
çözdürülerek yedi grup olarak hazırlanmıştır. Kontrol grubu olarak % 0.2'lik
klorheksidin gargara kullanılmıştır. Mukozal membran iritasyonunun değerlendirildiği
birinci bölümde, HET-CAM yöntemi kullanılarak tavuk embriyosu içeren yumurtalar
üzerinde formulasyonların iritasyon skorları belirlenmiştir. İkinci bölümde ise, MTT
test yöntemi kullanılarak formulasyonların L 929 hücre kültürü üzerine sitotoksik
etkileri değerlendirilmiştir.
Mukozal iritasyon testi iki farklı deney şeklinde yürütülmüş, her iki deneyde de
gruplar zayıf ve orta derecede iritasyon göstermiş, grupların hiç birinde mukoza üzerine
III
ciddi derecede iritasyon gözlenmemiştir. Kontrol grubu olan klorheksidin gargaranın
iritasyon seviyesi ile diğer gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farka
rastlanmamıştır.
Sitotoksisite deneyinde ise, klorheksidin gargara en düşük hücre canlılık
oranlarının görüldüğü grup olarak saptanmıştır. pH değeri 7.0 olan Sorensen's Çözeltisi
en düşük sitotoksisite değerlerini gösteren, biyouyumluluk seviyesi en yüksek grup
olarak belirlenirken, diğer gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farka
rastlanmamıştır.
Bu çalışmada, deney gruplarından hiç biri ciddi derecede sitotoksisite veya
mukozal iritasyon göstermemiştir. Ancak, maddelerin daha uzun süreli etkilerinin
anlaşılabilmesi için, ileriki çalışmalarda bu maddelerin etkinliğinin kinetik olarak
değerlendirilmesi ve hayvan deneylerinin yapılması gerektiği düşünülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Lizozim, Laktoferrin, Poloksamer 407, HET-CAM, sitotoksisite

Abstract:
In children that under three years old are not suggested to use fluoridated
toothpaste because of the risk of fluorosis in developing permanent teeth or
chlorhexidine for a long period resulting adverse effects and cytotoxicity. New
formulations containing saliva proteins such as lysozyme and lactoferrin might be
effective on preventing tooth decay in younger children. Topical application of
antimicrobial agents with the drug delivery system poloxamer is thought to be effective
in the treatment of oral diseases.
Therefore, formulations containing lysozyme, lactoferrin and drug delivery
system poloxamer 407 with the trade name of Pluronic F-127 were produced and it has
been proven that these formulations are effective on cariogenic bacteria such as
Streptococcus sobrinus, Streptococcus mutans and Lactobacillus acidophilus. The aim
of this study was to determine the biocompatibility of these new formulations in
comparison with 0.2 % chlorhexidine in vitro conditions.
Formulations for our study were prepared and divided into seven different
groups as follows: (1) Sorensen's solution (pH: 5.0) as buffer, (2) %20 gel formulation
containing only poloxamer 407, (3) %10 gel formulation containing only poloxamer
407, (4) Lysozyme and Lactoferrin with %20 concentration of poloxamer 407, (5)
Lysozyme and Lactoferrin with %10 concentration of poloxamer 407 as MIC value of
group 4, (6) Sorensen's Solution (pH:7.0) as negative control group and (7) dissolved
Lysozyme and Lactoferrin in buffer (Sorensen's Solution pH:5.0). %0.2 chlorhexidine
mouthwash was used as the control group. In mucosal irritation study, irritation levels
of formulations were identified using HET-CAM test method on eggs containing
chicken embriyos. In the cytotoxicity test, the MTT test method was used on L 929 cell
culture in order to access the cytotoxic effects of the formulations.
Mucosal irritation test was performed as two different experiments. Both test
groups showed low and moderate irritation levels, none of them showed serious
irritation levels. There was no statistical significance between the chlorhexidine control
group and other groups.
The cytotoxicitiy experiment (MTT), chlorhexidine mouthwash showed lowest
cell viability rates. Sorensen's Solution pH:7.0 group showed lowest cytotoxicitiy and
highest biocompatibility levels. There is no statistical significance between other
groups.
In this study, none of the experimental groups showed severe cytotoxicitiy or
mucosal irritation. However, more in vitro studies should be carried out to test these
materials' kinetic efficiency and also animal studies should be conducted.
Keywords: Lysozyme, Lactoferrin, Poloxamer 407, HET-CAM, cytotoxicitiy