İn vivo sıçan dunning prostat kanser hücreleri ve diyabet modelinde metforminin etkileri
The effects of metformin in vivo rat dunning prostate cancer cells and diabetes model
Yazar: PINAR KÖROĞLU
Danışman: PROF. DR. NİHAL ÖMÜR BULAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Radyobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Patoloji = Pathology

Özet:
Kanser tüm dünyada olduğu gibi, ülkemizde de insidansı sürekli artış gösteren ve meydana gelen ölümlerin önemli bir kısmından sorumlu multifaktöriyel bir hastalıktır. Günümüzde, medikal yöntemler kanseri etkin bir şekilde tedavi etmekte hala yetersiz kalmakta ve son yıllarda yapılan pek çok araştırmada kansere neden olan ortak sistemler üzerinde durulmaktadır. Diyabet ise hayat boyunca devam eden ve tedavi gerektiren, akut ve kronik komplikasyonları sebebiyle kişinin yaşam kalitesini bozan, mortalitesi yüksek, metabolik, kronik bir hastalıktır. Diyabetin etkisiyle daha hızlı ilerleyen bir hastalık olarak kanser, ciddi bir sağlık sorununu oluşturmaktadır. Prostat kanseri, prostat bezindeki hücre çoğalması ve ölümü arasındaki dengenin bozulması ve organın hacimce büyümesi sonucu ortaya çıkmaktadır. Dünyadaki erkek nüfusunun giderek yaşlanması ve endüstriyelleşme düzeyinin artmasına bağlı olarak prostat kanseri insidansı da artış göstermektedir. Copenhagen ırkı sıçanlara Mat-LyLu hücrelerinin deri altı enjeksiyonuyla oluşturulan Dunning adenokarsinoma modeli deneysel prostat kanser modelleri arasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Diyabet modeli olarak en fazla tercih edilen model ise sıçanlara tek doz streptozotosin (STZ) enjeksiyonu ile oluşturulmaktadır. 
Metformin, diyabet tedavisinde öncelikli olarak tercih edilen bir ilaçtır. Metforminin,  diyabette kullanımının yanısıra, kanser tedavisinde de etkili olabileceğine yönelik bulgular son yıllarda dikkati çekmeye başlamıştır. Literatürde metforminin diyabetle olan ilişkisini vurgulayan çalışmaların yanı sıra diyabet-metformin-insülin direnci-yaşlanma ilişkisini gösteren çalışmalar da yer almaktadır. Buna karşın deneysel olarak kanser ve diyabet+kanser oluşturulmuş modeller üzerinde metforminin etkisi ile ilgili in vivo çalışmalara rastlanmamıştır. Bu çalışmanın amacı, anti-hiperglisemik, anti-hiperinsülinemik etkilere sahip olduğu bilinen metforminin, kanser ve diyabet+kanser modelinde ortaya çıkan hasara karşı bir etkisinin olup olmadığını histolojik, immünohistokimyasal ve biyokimyasal parametrelerin ışığı altında değerlendirmektir. 
Çalışmamızda, Copenhagen ırkı erişkin erkek sıçanlar altı gruba ayrıldı. 1. Kontrol grubu, 2. Diyabet grubu, 3. Kanser grubu, 4. Diyabet+kanser grubu, 5. Diyabet+ kanser+metformin grubu,  6. Kanser+metformin grubu. Diyabet oluşturmak amacıyla 65 mg/kg tek doz STZ intraperitonal olarak sıçanlara enjekte edildi. 72. saatin sonunda kan glukoz ölçümü sonucu diyabet tayini yapıldıktan bir gün sonra sıçanlara primer tümör oluşturmak amacıyla 2x104 MAT-LyLu hücresi sağ ekstremite üst bölgesinden deri altı olarak enjekte edildi. Bu enjeksiyondan bir gün sonra 5. ve 6. gruptaki sıçanlara tedavi amaçlı olarak deney süresince her gün 250 mg/kg metformin gavaj yoluyla verildi. MAT-LyLu hücresi enjeksiyonunu takip eden 14. günde deney sonlandırıldı.
Deney sürecinin sonunda sıçanlar disekte edilerek, tümör büyüme kinetiği değerlendirmesi için primer tümörleri çıkarıldı ve tartıldı. Akciğerde oluşan sekonder tümör yani metastazların sayım yoluyla değerlendirilmesi amacıyla tüm akciğer dokusu,  prostat ile yakın ilişkisi nedeniyle testis dokusu ve metforminin hepatik glukoz üretimi ile olan ilişkisinden dolayı karaciğer dokusu alındı. Histolojik değerlendirmeler için testis ve karaciğer doku örnekleri, Bouin fiksatifi ile fikse edildi. Parafin bloklardan alınan doku kesitlerine Hematoksilen-Eosin (HE), Masson'un üçlü boyası ve Periyodik asit-Schiff (PAS) reaksiyonu uygulandı. % 10 formalin ile tespit edilen testis doku kesitlerine immünohistokimyasal olarak terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) aracılı deoksiribo nükleik asit (DNA) kırık uç işaretleme (TUNEL) yöntemi uygulanarak, DNA kırık uçları taşıyan apoptotik hücreler işaretlendi. Biyokimyasal olarak serum malondialdehid (MDA), glutatyon (GSH), prostat spesifik antijen (PSA) değerleri Enzime Bağlı İmmünosorban (ELISA) yöntemiyle tayin edildi. Ayrıca testis ve karaciğer doku örneklerinde süperoksid dismutaz (SOD), katalaz (KAT) ve glutatyon-S-transferaz (GST) enzim aktiviteleri spektrofotometrik olarak tayin edildi.
Değerlendirmelerimizin sonucunda, kanser ve diyabet+kanser gruplarında ortaya çıkan histopatolojik ve biyokimyasal hasarın, metformin uygulanan gruplarda anlamlı olarak azaldığı belirlendi. Ayrıca kanserli gruplarda gelişen akciğer metastazlarının, metformin verilmesi ile daha az sayıda oluştuğu veya hiç oluşmadığı belirlenmiştir. Bu sonuçlara dayanarak, çalışmamızın çağımızın en önemli ölüm sebeplerinden biri haline gelen ve özellikle diyabetle birlikte mortalite ve morbiditesi daha da yükselen kanser tedavisi ile ilgili yapılan klinik çalışmalara önemli bir katkı sağlayacağını ve metforminin kanser tedavisinde alternatif bir ilaç seçeneği olabileceğini söyleyebiliriz.

Abstract:
Cancer is a multifactorial disease that is responsible for a significant part of the deaths occurring in our country as well as the incidence of which is increasing all over the world. Nowadays, medical methods to treat cancer are inadequately efficient and many studies which begin to be built in recent years sign the common systems which cause cancer. Diabetes is a metabolic and chronic disease which lasts for the whole life, requiring therapy. Diabetes with its acute and chronic complications decreases patients lifespan and the quality of life, causes a high morbidity and mortality rate and is a high-cost disease. Cancer that is a more growing disease with association of diabetes is a major health concern. Prostate cancer can be determined as the alteration of the balance between cell proliferation and cell death in the prostate bladder which causes a increase of the organ volume. 
The incidence of prostate cancer also increases due to the gradual aging of the male population in the world and the rising level of industrialization. Prostate cancer can be modelled in Copenhagen rats by subcutaneous injection of MAT-Lylu cells. This is the Dunning Adenocarcinoma Model. A model of diabetes in rats is formed with the injection of a single dose of streptozotocin (STZ). 
Metformin is the preferred drug of choice for the treatment of diabetes. In the current study, the effect of metformin in diabetes than reduce the treatment of cancer that takes place in the findings. The role of metformin in diabetes has been studied in detail and additionally there are some studies linking diabetes-metformin-insulin resistance-aging in the literature. On the other hand, effects of metformin in experimental cancer and diabetes+cancer models in experimental cancer and diabetes+cancer models in vivo have not been investigated in the literature. In this research, it was aimed to evaluate the effects of metformin which is known to be antihyperglisemic, antihyperinsulinemic whether any impact against the damage caused by cancer diabetic+cancer model via histological, immunohistochemical, and biochemical parameters.
In the study, male Copenhagen rats were divided into six groups. 1. Control group, 2. Diabetic group, 3.Cancer group, 4.Diabetic+cancer group, 5. Diabetic+cancer+metformin group, 6. Cancer+metformin group. A model of diabetes in rats is formed with the intraperitoneal injection of streptozotocin as a single dose, 65 mg/kg. After 72nd hour of STZ injection, blood glucose levels were determined and the day after 2x104 Mat-LyLu cells were inoculated to rats for bearing primary tumor. 250 mg/kg metformin treatment was applied by gavage every day following inocculation of the Mat- Lylu cells to fifth and sixth group. The experiment was terminated on the 14th day following MAT-LyLu cell injection.
At the end of the experimental period, the rats were sacrificed, primary tumors were taken and weighed for the tumor growth kinetic. All pulmonary tissues were taken to evaluate secondary tumors that occur in pulmonary metastases by counting method. The testicular tissues were taken, the reason for studying testicular tissue was its close functional association to the prostate. The liver was taken, because metformin is associated with hepatic glucose production. Tissue samples from the testes and the liver were fixed with Bouin's solution for histological examinations. Tissue sections from paraffin blocks stained with Hematoxylin-Eosin (HE), Masson's trichrome and enforced Periodic acid-Schiff (PAS) reaction. Testicular tissue sections were fixed with 10 % formalin and were prepared for immunohistochemical examinations of terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) method. Apoptotic cells in testicular tissue were detected with TUNEL reaction. In biochemical methods, serum glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA), prostate-specific antigen (PSA) levels were determined by applying Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) method. In addition, antioxidant enzyme activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione-S-transferase (GST) were determined spectrophotometrically in testicular and hepatic tissue specimens.
As a result of our evaluations, it was determined that histopathological and biochemical damage in cancer and diabetes +cancer groups decreased significantly in the groups that received metformin. It has also been determined that lung metastases developed in cancerous groups are less frequent or not at all with metformin administration.Based on these results, one of the most important cause of death has become and especially in diabetes morbidity and mortality rise further, we can say that in cancer treatment implementation will provide an important contribution in clinical trials and metformin may be an alternative drug choice for cancer treatment.