Hepatosellüler karsinomada kemik morfojenik protein 9 (BMP9)'un siRNA ile baskılanarak fonksiyonel analizi
Functional analysis of siRNA-mediated knock-down of bone morphogenetic protein 9 (BMP9) in hepatocellular carcinoma
Yazar: TUĞÇE YAŞAR
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ÖMER FARUK HATİPOĞLU
Turgut Özal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Karaciğer neoplazmları = Liver neoplasms ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Kemik morfojenik proteinleri = Bone morphogenic proteins ; Neoplazmlar = Neoplasms ; RNA = RNA

Özet:
Hepatosellüler karsinoma (HSK) genelde kronik karaciğer zemininde gelişen
karaciğerin primer bir tümörüdür. Kronik karaciğer hastalığı zemininde gelişen HSK
on yıllar boyunca mevcut cerrahi ve cerrahi uygulanamayan vakalarda
kemoembolizasyon, kemoterapi, alkol enjeksiyonu, radyofrekans ablasyonu gibi
yöntemlerdeki gelişmelere rağmen sağkalım oranlarında önemli bir değişim
olmamıştır. Mevcut tedavilerin yetersiz kalmasında en büyük etken, kanserin
başlangıç ve sonraki büyüme mekanizmalarının bilinememesi, erken teşhisin
yapılamamasıdır.
Son yıllarda en heyecan verici buluş küçük engelleyici RNA (siRNA)'ların
gen sessizleştirilmesinde kullanılabiliyor olmasıdır. Mekanizma olarak RNAi (RNA
interferans), gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli rol oynayan bir sistemdir.
Kemik Morfojenik Protein (BMP), büyüme faktörlerinin geniş bir ailesi olan
Transforme edici büyüme faktörü beta ailesinin (TGF-β) bir üyesidir. BMP ailesinin
alt üyesi olan BMP9, hücre farklılaşmasında, çoğalmasında, büyümesinde, apoptozda
önemli rol oynamaktadır. BMP9 ekspresyon analizi, BMP9 proteininin hepatositler
ve intrahepatik safra yolu epitel hücreleri tarafından üretildiğini göstermektedir. 
Bu çalışmada; HepG2 insan hepatosellüler karsinoma hücre hattı, BMP9
genine özgü siRNA ile transfekte edilerek BMP9 geninin ne kadar sessizleştirildiği
ve gen ekspresyon düzeyi total RNA kullanılarak qRT-PCR'da belirlenmiştir. Aynı
şekilde BMP9 sinyal yol alt bileşenleri olan SMAD1/5/8, SMAD4 ve hedef
genlerden p21, Id1 ve Id2 genlerinin ekspresyonları bu genlere özgü mRNA
primerleri tasarlanarak bloke edilip edilmediği ortaya konuldu. Bununla beraber
protein seviyesindeki değişiklikleri gözlemleyebilmek için de BMP9 ve alakalı diğer
proteinler Western Blotting yapılarak teyit edilmesi sağlanmıştır. Bu sessizleştirmenin hücre çoğalmasını nasıl etkilediği xCELLigence Gerçek Zamanlı
Hücre Analiz Sistemi ile ortaya konmuştur. 
Elde edilen sonuçlar incelendiğinde, HepG2 insan hepatosellüler karsinoma
hücre hattında BMP9-siRNA kullanımı sonucu en etkili susturmanın 48.saatte 25nM
konsantrasyonda (%64) olarak belirlendi. Aynı zamanda BMP9, HepG2 hücrelerinde
hücre proliferasyonunu susturduğu (baskıladığı) da ortaya konmuştur. Sonuç olarak
hepatosellüler karsinomada önemli rol olan BMP-9 geninin siRNA yöntemi
kullanılarak sessizleştirilmesi ve hepatosellüler karsinoma oluşum mekanizmalarında
en önemli aşamalardan biri olan bu sürecin tedavisinin mümkün kılınacağını ve
kanser tedavisinde oldukça faydalı bir araç olabileceği belirlendi. 

Anahtar Sözcükler
1. Kanser
2. Hepatosellüler karsinoma
3. BMP9
4. RNAi
5. siRNA

Abstract:
Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary tumor of the liver that generally
develops as a result of chronic liver disease. Available treatments include surgery, or
in cases in which surgery is not a viable option, treatment methods such as
chemoembolization, chemotherapy, alcohol injection and radiofrequency ablation are
used. Despite decades of developments in these treatments for HCC, there has been
no significant change in the survival rate for patients with this disease. The major
factors that contribute to the insufficiency of treatment is the fact that early diagnosis
is not possible, there is insufficient understanding of how this cancer develops, and
little knowledge of subsequent growth mechanisms.
In recent years, the most exciting finding has been the possible use of smallinterfering
RNA (siRNA) for gene silencing. The mechanism involved, RNA
interference, plays an important role in regulation of gene expression. 
Bone morphogenetic proteins (BMP) makes up a large family of growth
factors and is a member of the TGF beta (TGF-β) family. One of the members of the
BMP family, BMP9, plays an important role in cell differentiation, proliferation,
growth and apoptosis. Expression analysis has shown that BMP9 is produced by
hepatocytes and intrahepatic and biliary tract epithelial cells.
In this study, using transfection of BMP9-specific siRNA to a human
hepatocellular carcinoma cell line (HepG2), we show gene knock-down using qRTPCR.
We analyze the expression of genes in the BMP9 pathway including SMAD
1/5/8, SMAD4 and target genes p21, Id1 and Id2. In addition, we also analyzed
changes in protein expression of these genes using Western Blot. To determine the
effect of BMP9 siRNA-mediated knock-down on cell proliferation, we used the
xCELLigence real-time cell analysis system. 
The most significant level of BMP9 knock-down (64%) was seen with a dose
of 25 nM at 48 hours after transfection of HepG2 cells. It is also shown that BMP9
reduces proliferation in HepG2 cells. In conclusion, using siRNA silencing of BMP9,
which is known to play an important role in HCC, we show that this gene plays an
important role in development of HCC and that suppression of this gene could be
used in cancer treatment. 

 Keywords
1. Cancer
2. Hepatocelluler carcinoma
3. BMP9
4. RNAi
5. SiRNA