Sülfonamidleri içeren farmasötik preparatlardaki etkin maddelerin cevap yüzey metodolojisine dayanan aşırı performanslı sıvı kromatografisi ile miktar tayinleri
Quantitative analysis of active ingredients in pharmaceutical preparations containing sulfonamides with ultra performance liquid chromatography based on response surface methodology
Yazar: ZEHRA CEREN ERTEKİN ÖZKAN
Danışman: PROF. DR. ERDAL DİNÇ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Farmasötikler = Pharmaceuticals ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Miktar tayini = Determination ; Sülfonamitler = Sulfonamides ; Ters faz kromatografisi = Reverse phase chromatography ; Çok kriterli optimizasyon = Multi criteria optimization ; İlaçlar = Drugs ; İstatistiksel deney tasarımı = Statistical experimental design

Özet:
Bu doktora tezinde, trimetoprim ve sülfonamidleri içeren veteriner preparatların kantitatif analizi için yeni aşırı performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) yöntemleri geliştirilmiştir. Bu kapsamda sülfadiazin-trimetoprim, sülfadoksin-trimetoprim ve sülfadimidin-trimetoprim kombinasyonları araştırma konusu olarak seçilmiştir. UPLC yöntemlerinin geliştirilmesinde cevap yüzey metodolojisinden yararlanılmıştır. Optimizasyon süreçlerinde dar taban genişliğini ve etkin kromatografik ayrımı en kısa sürede sağlayan deneysel koşulların belirlenmesi için tam faktöriyel, Box-Behnken ve merkezi bileşenli olmak üzere farklı deney tasarımları kullanılmıştır. Bu amaçla, cevap yüzey metodolojisindeki bağımlı değişken olarak literatürde daha önce tanımlanmış bir kromatografik cevap fonksiyonu seçilmiştir. Cevap yüzey metodolojisi gerçek optimal koşulların belirlenmesinin yanı sıra, faktörlerin ve faktör etkileşimlerinin cevap üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesini sağlamıştır. 

Sülfadiyazin ve trimetoprimin analizi için yöntem geliştirme basamağında optimize edilecek üç kromatografik parametre seçilmiştir: kolon sıcaklığı, hareketli fazdaki tampon oranı ve akış hızı. Faktörlerin ve faktör etkileşimlerinin cevap üzerindeki etkilerini incelemek ve optimal kromatografik şartların belirlenmesi için tam faktöriyel, Box-Behnken ve merkezi bileşenli tasarımlar kullanılmıştır. Tam faktöriyel ve Box-Behnken tasarımlarla hesaplanan optimal faktör seviyeleri kolon sıcaklığı için 38,9 °C, sodyum format tamponunun hareketli fazdaki oranı için %69,8 ve akış hızı için 0,26 mL/dk'dır. Diğer yandan, merkezi bileşenli tasarım ile belirlenen optimal kromatografik koşullar 44,9 °C kolon sıcaklığı, hareketli fazda %70,6 sodyum format tamponu ve 0,30 mL/dk akış hızıdır. Sülfadiyazin ve trimetoprim içeren tabletlerin analizi için bu optimal koşullar kullanılarak her ikisi de 2 dakikalık analiz süresine sahip olan iki farklı UPLC yöntemi geliştirilmiştir. Optimize edilen bu UPLC yöntemleri, validasyon ve sitem uygunluk parametrelerinin değerlendirilmesinden sonra, veteriner amaçlı tabletlerdeki sülfadiyazin ve trimetoprimin miktar tayinleri için başarıyla uygulanmışlardır.  

Sülfadoksin ve trimetoprimin miktar tayini için UPLC yönteminin geliştirilmesi sırasında bağımsız değişken olarak kolon sıcaklığı, tamponun pH değeri, hareketli fazdaki tampon yüzdesi ve akış hızı olmak üzere dört kromatografik parametre seçilmiştir. Bu parametrelerin optimal değerlerinin tayini için Box-Behnken ve merkezi bileşenli tasarımlar kullanılmıştır. Box-Behnken tasarımla elde edilen optimal koşullar kolon sıcaklığı için 56,8°C, sodyum asetat tamponunun pH değeri için 4,48, hareketli fazdaki sodyum asetat tamponunun yüzdesi için %55,6 ve akış hızı için 0,20 mL/dk olmuştur. Merkezi bileşenli tasarım ise farklı koşulların optimal olarak belirlenmesini sağlamıştır: 31,2 °C kolon sıcaklığı, %49,3 sodyum asetat tamponu (pH 3,89) ve 0,23 mL/dk akış hızı. Bu koşullar kullanılarak geliştirilen UPLC yöntemleri, 1,8 dakika içinde sülfadoksin ve trimetoprimin kromatografik ayrımını sağlamışlardır. Optimal olarak saptanan kromatografik koşullar birbirinden farklı olsa da, her iki yöntemle de birbirine benzer kromatogramlar elde edilmiştir. Optimize edilen bu yöntemlerin geçerlilikleri, sistem uygunluk parametreleri ve analitik validasyon testleri ile kanıtlanmıştır. Valide edilmiş bu optimal yöntemler, sülfadoksin ve trimetoprim içeren veteriner amaçlı enjeksiyonluk çözelti preparatlarının analizine başarıyla uygulanmışlarıdır. 

Sülfadimidin ve trimetoprimin analizinde optimize edilecek üç kromatografik faktör seçilmiştir: kolon sıcaklığı, hareketli fazdaki inorganik bileşenin yüzdesi ve akış hızı. Faktörlerin cevap üzerindeki etkisinin yorumlanması ve her bir faktörün optimal değerinin belirlenmesi için tam faktöriyel, Box-Behnken ve merkezi bileşenli tasarımlardan yararlanılmıştır. Tam faktöriyel, Box-Behnken ve merkezi bileşenli tasarımlarla sırasıyla kolon sıcaklığı için 48,5 °C, 43,0 °C, 60,8 °C, hareketli fazdaki amonyum karbonat oranı için %53,6, %55,4, %52,0 ve akış hızı için 0,27 mL/dk, 0,27 mL/dk, 0,26 mL/dk değerleri optimal olarak saptanmıştır. Bu optimal kromatografik koşullar kullanılarak geliştirilen üç farklı UPLC yöntemi ile sülfadimidin ve trimetoprimin analizi 1,5 dakika içinde gerçekleştirilmiştir. Tayin edilen kromatografik koşulların sayısal değerleri birbirinden farklı olsa da, her üç yöntemle de benzer kromatogramlar elde edilmiştir. Sistem uygunluk ve analitik validasyon parametrelerinin değerlendirilmesinden sonra, geliştirilen UPLC yöntemleri, veteriner amaçlı enjeksiyonluk çözeltilerdeki sülfadimidin ve trimetoprimin miktar tayinleri için başarıyla uygulanmışlardır. 

Bu doktora tez çalışması, cevap yüzey metodolojisinin UPLC yöntemlerinin optimizasyonu için etkin bir yaklaşım olduğunu göstermiştir. Deney tasarımının seçimi, her bir parametre için optimal olarak saptanan değerleri etkilese de, bu optimal koşulların birlikte kullanımıyla elde edilen kromatografik çıktıyı kayda değer biçimde etkilememiştir. Bunun yanında, deney tasarımının seçimi deney sayısı ve deneysel çalışmaların süreci üzerinde oldukça etkili olmuştur. Bu çalışmada geliştirilen tüm yöntemlerin, seçilmiş veteriner preparatların analizi için uygun olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this Ph.D. thesis, new ultra-performance liquid chromatography (UPLC) methods were developed for the quantitative analysis of sulfonamides and trimethoprim in their combined pharmaceutical preparations for animal use. The selected combination of active substances to be investigated were sulfadiazine-trimethoprim, sulfadoxine-trimethoprim, and sulfadimidine-trimethoprim. The development of the UPLC methods was performed by response surface methodology. In the optimization procedures, different experimental designs, namely full factorial, Box-Behnken, and central composite designs, were used for the determination of chromatographic conditions which provide efficient resolution in the shortest period of analysis, while ensuring narrow peak widths. A chromatographic response function, which was previously described in the literature, was used as a dependent variable in the response surface methodology to reach this aim. The response surface methodology provided the determination of real optimal conditions, as well as the evaluation of factor and factor interaction effects on the response.

In the method development step for the analysis of sulfadiazine and trimethoprim, three chromatographic parameters were chosen to be optimized: column temperature, buffer ratio in mobile phase, and flow rate. Full factorial design, Box-Behnken design, and central composite design were used to evaluate the effects of factors and factor interactions and to determine the optimal chromatographic conditions. The optimal factor levels determined by the use of full factorial and Box-Behnken designs were 38.9 °C for column temperature, 69.8% for sodium formate buffer, and 0.26 mL/min for flow rate. On the other hand, the optimal chromatographic conditions estimated by central composite design were a column temperature of 44.9 °C, 70.6% sodium formate buffer, and a flow rate of 0.30 mL/min. These optimal conditions were used to develop two different UPLC methods with a run time of 2 minutes for the analysis of tablets containing sulfadiazine and trimethoprim. After validation and evaluation of the system suitability parameters, the optimized UPLC methods were successfully applied to the quantitative determination of sulfadiazine and trimethoprim in tablets for animal use.

In order to develop a UPLC method for the quantitative determination of sulfadoxine and trimethoprim, four chromatographic parameters, namely column temperature, pH of the buffer, buffer ratio in mobile phase, and flow rate were chosen as independent factors. Box-Behnken design, and central composite design were used to determine the optimal factor values. The optimal chromatographic conditions determined by the use of Box-Behnken design were 56.8 °C for column temperature, pH 4.84 sodium acetate buffer, 55.6% of sodium acetate buffer in mobile phase, and 0.20 mL/min for flow rate. The use of central composite design yielded a different set of conditions as following: column temperature of 31.2 °C, 49.3% sodium acetate buffer with a pH value of 3.89, and a flow rate of 0.23 mL/min. These conditions were used in two different UPLC methods with a run time of 1.8 minutes for the quantitative analysis of sulfadoxine and trimethoprim. Although chromatographic conditions were different from each other, similar chromatograms were recorded with the application of both methods. The optimized methods were evaluated based on system suitability parameters and results of analytical validation tests. As the validity of the methods was confirmed, they were successfully implemented to analyze the veterinary solution for injection, containing sulfadoxine and trimethoprim.

Three chromatographic factors were chosen to be optimized for the analysis of sulfadimidine and trimethoprim: column temperature, percentage of inorganic modifier in mobile phase, and flow rate. Full factorial, Box-Behnken, and central composite designs were used to assess factor effects on the response and to calculate the optimal value for each factor. The optimal values, determined by the use of full factorial, Box-Behnken, and central composite designs, were 48.5, 43.0, and 60.8 °C for column temperature, 53.6%, 55.4%, and 52.0% for ammonium carbonate percentage in mobile phase, and 0.27, 0.27, and 0.26 mL/min for flow rate, respectively. These optimal values were applied for the development of three different UPLC methods with a run time less than 1.5 minutes for the quantification of sulfadimidine and trimethoprim. Even though the value for each chromatographic condition was different from each other, similar chromatograms were recorded with all three methods. After evaluation of system suitability and analytical validation parameters, the optimized UPLC methods were successfully applied to the quantitative determination of sulfadimidine and trimethoprim in solution for injection dosage forms for animal use.

This study indicated that the response surface methodology was an efficient way for the optimization of UPLC methods. While the choice of the experimental design affected the values of optimal conditions, it had little effect on the chromatographic outcome achieved in the end. Besides, the number of experiments and the period of experimental work highly depended on the selected design. All methods developed in this study were found to be suitable for the analysis of selected pharmaceutical preparations.