Domates (Lycopersicon esculentum) bitkisinde endoplazmik retikulum (ER) stresi koşullarında gen anlatım analizleri
Gene expression analysis in tomato (Lycopersicon esculentum) under endoplasmic reticulum (ER) stress
Yazar: ELİF PULAT
Danışman: PROF. DR. ÖZGÜR ÇAKIR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Domates = Tomato ; Endoplazmik retikulum stresi = Endoplasmic reticulum stress ; Transkriptomlar = Transcriptomics

Özet:
ER stresi, mayalar ve hayvanlarda tanımlanmış, ardından bitkilerde de aydınlatılmaya başlanan hücresel bir süreçtir. Çevresel stres koşullarına veya çeşitli kimyasal ajanlara maruz kalan hücrede protein katlanma süreci sekteye uğrar ve hücrenin protein fabrikası olan ER lümeninde katlanmamış veya yanlış katlanmış proteinler birikir. Biriken proteinler ER homeostazisini bozarak ER stresine neden olur.
UPR, protein katlanma ve yıkım kapasitesini ihtiyaca uygun hale getirerek, ER'deki katlanmamış protein yoğunluğunu azaltmak için çalışan yanıt mekanizmasıdır. ER stresiyle başa çıkabilmek için nükleusa sinyal iletimini sağlayarak çeşitli hedef genlerin anlatımını düzenler ve bir stres yanıtı meydana getirir. UPR, bitkilerde bir süredir moleküler imzaları olan, protein katlanmasıyla ilişkili genlerin anlatımının indüksiyonu ve ERAD (ER ile ilişkili degradasyon) mekanizmalarıyla tanınmaktadır. Hücrenin uzayan ER stresiyle başa çıkamaması ve protein işleme kapasitesinin uzun süreli aşılması durumunda ER stresi aynı zamanda otofajiyi de tetikleyebilir, bunun sonucu olarak ağır ER stresi koşullarında programlı hücre ölümü (PCD) meydana gelebilir. 
UPR, laboratuvar koşullarında bitkilere, protein katlanmasını bozabilecek ER stres ajanları uygulanarak indüklenebilir. Bu ajanların en yaygın olarak kullanılanı salgı glikoproteinlerinin N-bağlı glikozilasyonlarını engelleyerek protein katlanmasını önleyen, sonuç olarak da katlanmamış proteinlerin ER lümeninde birikmesiyle ER stresine yol açan tunikamisin ajanıdır. 
ER stresinin önemli bir tarımsal bitki olan domateste işlev mekanizmalarının aydınlatılması ve diğer hücresel süreçler ve metabolik yolaklarla etkileşimlerinin ortaya konulması, bitkilerde çeşitli stres koşullarına dayanıklılık ve ıslah çalışmaları için faydalı olabilecek yeni bilgilerin ortaya konulmasını sağlayabilecektir. 
Bu fikirden yola çıkılarak bu tez çalışmasında, 14 günlük domates bitkilerinde, tunikamisin ajanı ile 2 saat ve 6 saat boyunca ER stresi indüklenmiştir. Uygulama ve kontrol bitkilerinin yapraklarından RNA izolasyonları gerçekleştirilmiş ve kalite ve miktar tayinleri yapılmıştır. RNA dizileme aşamasına geçilmek için uygun görülen RNA'lardan cDNA kitaplıkları sentezlenmiş ve RNA dizileme reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. Dizileme verileri filtrelenerek istatistiksel analizler ve değişmiş anlatım gösteren genlerin (DEG) analizleri yapılmıştır. Farklı zaman uygulamaları ile bitkinin ER stresine erken ve geç yanıtlarıyla ilgili yorum yapılabilmesi amaçlanmıştır. 
Yapılan analizlerde 2 saat tunikamisin uygulanmış domates yapraklarında kontrole göre anlatımı değişmiş 817 tane, 6 saatlik uygulamada kontrole göre 124 tane, 6 saat uygulamada 2 saat uygulamaya göre ise 1141 tane DEG tespit edilmiştir. Bulgular, ER stresiyle ilişkili olduğu bilinen genlerin çoğunun anlatımının 2 saat ER stresinde anlamlı şekilde arttığını gösterirken, 6 saat uygulama sonunda belirlenen DEG'lerin çoğunda anlatımların azaldığı tespit edilmiştir. Bu durumun, ER stresinin 2. saatte domates yapraklarında UPR yolaklarını tetiklediği ve hücrenin biriken katlanmamış proteinlerle baş etmeye çalıştığını gösterdiği düşünülmüştür. ER stresinin 6. saatinde tespit edilen DEG'lerin çoğunda anlatımların baskılandığının görülmesi, hücrenin protein üretimini yavaşlatmasının bir sonucu olarak düşünülmektedir.

Abstract:
ER stress, is a cellular condition first described in yeast and animals, though it was also elucidated recently in plants. In a cell exposed to environmental stress conditions and various chemical agents, protein folding process is disrupted, therefore, unfolded or misfolded proteins accumulate and form aggregates in the ER lumen, which is the protein processing factory of cells. Protein aggregates damage ER homeostasis and consequently, cause ER stress.
UPR is a response mechanism working to lessen the load of unfolded proteins in the ER by adjusting the protein folding and degradation capacity of ER. To be able to cope with ER stress, UPR regulates the expression of various target genes by allowing the signal transduction into the nucleus, resulting in a stress response. UPR is represented in plants by its molecular markers, which are ERAD (ER-associated degradation) and the induction of the gene expressions related to protein folding. When the cell can not deal with the prolonged ER stress and the capacity of protein processing is exceeded for a long time, ER stress can also trigger autophagy, leading to PCD (programmed cell death) under adverse ER stress conditions. 
UPR can be induced in plants, in vitro, by treatment with ER stress agents which will disrupt the protein folding process in the ER. The.most widely used chemical for such purpose is the tunicamycin reagent, which acts to prevent N-linked glycosylations of secretory glycoproteins resulting in the accumulation of unfolded protein in the ER, causing ER stress.
Clarifying the functional mechanisms of ER stress in tomato, which is an important agricultural plant, and revealing its interactions with other cellular processes and metabolic pathways will provide new information that may be useful for studies involving plant breeding and the resistance of plants to various stress conditions.
Based on these ideas, in this thesis study, tomato plants were grown in tissue culture for 14 days, then ER stress was induced in plants for 2 hours and 6 hours with tunicamycin ER stress agent. RNA isolations were performed from the leaves of both treatment and control plants, and their quality and quantity determinations were made. cDNA libraries were synthesized from the RNAs deemed suitable to proceed to the RNA sequencing stage. After the RNA-seq reactions are carried out, statistical analyzes and analyzes of genes showing altered expression (DEG) were performed by filtering the sequencing data. Different time points were chosen to be able to comment on the earlier and later responses of the plant to ER stress. 
Expression analysis resulted in 817 DEGs detected in 2 hours of treatment compared to control samples and 124 DEGs in 6 hours of ER stress. 1141 DEGs were detected in 6 hours compared to 2 hours of treatment with tunicamycin. The findings showed that the expression of most of the genes known to be associated with ER stress increased significantly at 2 hours treatment, while the expression of most of the DEGs determined at the end of 6 hours of treatment decreased. These results could indicate that ER stress triggered the UPR pathways in the 2nd hour of treatment and the cells were trying to cope with the fast accumulating unfolded proteins. However, the downregulation of the majority of DEGs in the 6th hour of treatment, is thought to be a result of the cells slowing down the protein synthesis to lessen the load of ER.