Yeni türler oldukları öngörülen amilaz üreticisi termofilik Anoxybacillus izolatlarının fenotipik, kemotaksonomik ve moleküler taksonomik yaklaşımlar kullanılarak teşhisi
Identification of thermophilic amylase producing Anoxybacillus isolates proposed as novel bacterial species by using phenotypic, chemotaxonomic and molecular taxonomic approaches
Yazar: EMİNE DEREBAY YILDIZ
Danışman: DOÇ. DR. ARZU ÇÖLERİ CİHAN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Anoxybacillus sp. E184aa ve E208a izolatlarının tür teşhisi çalışmaları neticesinde termofilik, Gram (+), fakültatif anaerobik, endosporlu, hareketli ve yüksek kantitatif amilolitik aktiviteye sahip basiller oldukları belirlenmiştir. 16S rRNA gen dizilerine dayalı filogenetik analizler, izolatların en çok birbirlerine (% 99.4) ve A. kamchatkensis subsp. asaccharedens, A. salavatliensis, A. kamchatkensis, A. ayderensis ve A. gonensis (% 97.9-98.7) referans suşlarına benzediklerini göstermiştir. E184aa (55°C, pH 7.5, % 1.0-1.5 NaCl) ve E208a (55°C, pH 7.0, % 0.5-1.0 NaCl) izolatlarının optimum üreme parametreleri belirlenmiştir. Hücre zarlarındaki temel melakinonun MK-7, yağ asitlerinin iso-C15:0 ve iso-C17:0 ve hücre duvarlarındaki tanılayıcı diamino asitin meso-Dpm olduğu belirlenmiştir. E184aa ve E208a izolatlarının genomik DNA G+C içerikleri sırasıyla 41.9 ile 42.2 % mol'dür. Morfolojik, fizyolojik ve kemotaksonomik testler, HaeIII-ARDRA, ITS-PCR, (GTG)5-PCR ve filogenetik analizler sonucunda en yakın akraba oldukları türlerle aralarındaki farklılıklar saptanmıştır. DNA-DNA hibridizasyon analizlerine göre, izolatlar birbirlerine ve yakın akraba oldukları A. gonensis, A. kamchatkensis, A. salavatliensis ve A. kamchatkensis subsp. asaccharedens türlerine % 70'den fazla DNA homolojisi göstermişlerdir. Tüm hibridizasyon analizleri neticesinde, izolatların ve bu referans türlerin tek bir türe ait bakteriler oldukları kesinlik kazanmıştır. Ayrıca, amilolitik aktivite gösteren Anoxybacillus cinsi 17 bakterinin, GH13 familyası enzimlerini kodlayan 15 α-amilaz ve 2 CGTaz genleri dizilenerek, annotasyon çalışmaları yapılmış ve GenBank veri tabanına kaydedilmiştir. Bu enzimlerin olası amino asit dizilerinin filogenetik ve in siliko analizleri de gerçekleştirilmiştir. Bu tez çalışması ile Anoxybacillus cinsinin taksonomik revizyonuna önemli katkılar sağlayacak veriler elde edilmiş, özellikle endüstriyel anlamda katma değeri olabilecek ve yeni araştırmalara kaynak oluşturabilecek Anoxybacillus cinsi termostabil α-amilaz ve CGTaz üreticisi suşlara ait gen kaynakları belirlenerek literatüre kazandırılmıştır.

Abstract:
As a result of species identification studies, Anoxybacillus sp. isolates, E184aa and E208a were identified as thermophilic, Gram (+), facultative anaerobic, endospore-forming, motile bacilli with high quantitative amylolytic activity. Phylogenetic analyses based on the 16S rRNA gene sequences revealed that isolates showed the greatest sequence similarity to each other (99.4%) and the type strains of A. kamchatkensis subsp. asaccharedens, A. salavatliensis, A. kamchatkensis, A. ayderensis ve A. gonensis (97.9-98.7%). The optimum growth parametres were determined of E184aa (55°C, pH 7.5, 1.0-1.5% NaCl) and E208a (55°C, pH 7.0, 0.5-1.0% NaCl) isolates. It was found that the major menaquinone was MK-7, the dominant cellular fatty acids were iso-C15:0 and iso-C17:0 in their cell membranes, and the diagnostic diamino acid was meso-Dpm in their cell walls. The genomic DNA G+C contents of E184aa and E208a isolates were 41.9 and 42.2 mol %, respectively. Their differences between closely related species were determined with morphological, physiological, chemotaxonomical tests and HaeIII-ARDRA, ITS-PCR, (GTG)5-PCR and phylogenetic analyses. According to the results of DNA-DNA hybridization analyses, the isolates showed DNA homologies higher than 70% with each other and A. gonensis, A. kamchatkensis, A. salavatliensis ve A. kamchatkensis subsp. asaccharedens, the closest relatives of isolates. As a result of all hybridization analyzes, it became clear that the isolates and these reference strains were bacterial strains of a single species. Also, 15 α-amylase and 2 CGTase genes encoding GH13 family enzymes of 17 Anoxybacillus strains having amylolytic activity were sequenced, annotation studies were performed, and were recorded in the GenBank database. Phylogenetic and in silico analyzes of probable amino acid sequences of these enzymes have also been carried out. In conclusion, data were obtained to provide significant contribution to the taxonomic revision of genus Anoxybacillus and the genetic resources of strains producing thermostable α-amylase and CGTase genes of genus Anoxybacillus, that could be especially important in terms of industry and a source for new researches, have been included in the literature.