Klinik örneklerden izole edilen candida suşlarının PCR-RFLP yöntemiyle identifikasyonu
Identification of candida strains isolated from clinical samples by using PCR-RFLP method
Yazar: HAMDULLAH SUPHİ BAYRAKTAR
Danışman: DOÇ. DR. NİZAMİ DURAN
Mustafa Kemal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Enzimler = Enzymes ; Kandida = Candida ; Kimliklendirme = Identification ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
ÖZET
Klinik Örneklerden İzole Edilen Candida Suşlarının PCR-RFLP Yöntemiyle İdentifikasyonu
Bu çalışmadaki amaç Candida türlerinin fenotipik dağılımlarını otomatize sistem kullanarak yapmak ve aynı zamanda Candida türlerinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve Msp I ve Bln I enzimleri kullanılarak restriksiyon fragment uzunluğu polimorfizmi (RFLP) yöntemleriyle identifiye etmekti.
Çeşitli klinik örneklerden izole edilen 150 Candida türü çalışmaya dahil edildi. Klinik izolatların fenotipik değerlendirmesi VITEK-2 otomatize identifikasyon sistemiyle yapıldı. Candida türlerinin genomik DNA ekstraksiyonları cam boncuklu kit kullanılarak yapıldı. Daha sonra amplifikasyon ürünleri Msp I ve Bln I restriksiyon enzimleriyle kesildi ve kesilen ürünler %3?lük agaroz jelde yürütüldü. Sonuçlar standart Candida suşları ile karşılaştırılarak değerlendirildi.
Candida türlerinin büyük bir çoğunluğu idrar örneklerinden izole edildi (%78.6). Diğer klinik örneklerin oranları; vajinal sürüntü örnekleri %11.3 (17/150), yara örnekleri %3.3, kan örnekleri %2 ve diğer klinik örnekler %4.7 şeklindeydi. Fenotipik yöntemle yapılan identifikasyonda Candida türleri ve oranları; C. albicans %48.6, C. tropicalis %17.3, C. glabrata %17.3, C. parapsilosis %4.0, C. krusei %4.0, C. lusitaniae %0.6, C. kefyr %0.6, C. famata %0.6, C. lypolitica %0.6 ve diğer türler %6 olarak bulundu. Msp I ve Bln I restriksiyon enzimleri kullanılarak yapılan RFLP yöntemine göre ise oranlar; C. albicans %45.3, C. glabrata %19.3, C. tropicalis %.14.6, C. parapsilosis %5.3, C. krusei %5.3, C. lusitaniae %0.6 ve diğer türler %9.3 olarak belirlendi.
Msp I ve Bln I restriksiyon enzimleri kullanılarak yapılan PCR-RFLP yöntemi C. albicans, C. glabrata, C.tropicalis, C. parapsilosis ve C. krusei türlerinin identifikasyonunda başarıyla kullanıldı. Candida türlerinin identifikasyonunda restriksiyon fragment ürünleri ilgili daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. PCR-RFLP yöntemi, DNA sekans analizi gibi diğer sık kullanılan DNA bazlı yöntemlere göre ucuz ve daha az zaman alıcı bir yöntemdir. Bu avantajı sayesinde yöntemin kullanılabilirliği ve tanısal değeri artmaktadır.
Anahtar kelimeler: Candida, PCR, RFLP, Msp I ve Bln I

Abstract:
ABSTRACT
Identification of Candida Strains Isolated From Clinical Samples by PCR-RFLP method
It was aimed to determine the phenotypic type distribution of Candida species by the automated system phenotypically. Also it was aimed to determine the identification of Candida species with a method of Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism by using Msp I and Bln I restriction enzymes.
A total of 150 Candida species isolated from various clinical samples were included to the study. For phenotypic evaluation of clinical isolates was made using the VITEK-2 automated identification systems. Genomic DNA extraction of Candida species was performed by using glass bead extraction kits. Later, the amplification products were digested by Msp I and Bln I restriction enzymes and the digested products were separated on a 3% agarose gel. The results were evaluated in comparison with the standard Candida strains.
The majority of Candida spp. was isolated from urinary samples (78.6%). The isolation rates in other clinical samples was as follow: For vaginal samples: 11.3% (17/150); for wound samples: 3.3%; for blood samples: 2% and for the other clinical sample: 4.7%. The distribution of Candida species was determined as follows by phenotypic methods; C.albicans: 48.6%, C. tropicalis: 17.3%, C. glabrata: 17.3%, C. parapsilosis: 4.0%, C. krusei: 4.0%, C. lusitaniae: 0.6%, C. kefyr: 0.6%, C. famata: 0.6%, C. lypolitica: 0.6 and the other Candida species: 6.0%. The species distribution of Candida was determined as follows by the RFLP technique that used MspI and BlnI restriction enzymes; C.albicans: 45.3%, C. glabrata: 19.3%, C. tropicalis: 14.6%, C. parapsilosis: 5.3%, C. krusei: 5.3%, C. lusitaniae: 0.6%, and other Candida species: 9.3%.
PCR-RFLP method used Msp I and Bln I restriction enzymes could be used successfully the identification of C. albicans, C. glabrata, C.tropicalis, C.parapsilosis and C.krusei. There is also a need for further well-designed studies on the restriction fragment products for using for identification of Candida species. PCR-RFLP method is cheaper and less time consuming compared to the other common DNA testing method such as DNA sequencing. This feature increases its usability and diagnostic value.
Key words: Candida, PCR, RFLP, Msp I and Bln I.