On-line HPLC-karbonik anhidraz enzim tayin yöntemi geliştirilmesi ve protein karışımlarında uygulanması
Development of on-line HPLC-carbonic anhydrase enzyme determination method and its application in protein mixture
Yazar: UĞUR KARDİL
Danışman: PROF. DR. MURAT KÜÇÜK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Analitik kimya = Analytical chemistry ; Biyokimya = Biochemistry ; Biyokimyasal analiz = Biochemical analysis ; Doku ekstreleri = Tissue exraction ; Esterazlar = Esterases ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Yöntem geliştirme = Method developing

Özet:
Aktif proteinlerin karmaşık numunelerden saflaştırılıp ayrılması işlemi oldukça zahmetli ve zaman alan bir süreci içermektedir. Giderek yaygınlaşan on-line HPLC uygulamaları, doğal biyoaktif bileşenlerin tespiti için önemli avantajlar sunmaktadır. Bu çalışmada protein karışımlarında esteraz aktivitesi gösteren proteinlerin on-line olarak belirlenip eş zamanlı karbonik anhidraz enzim tayininin yapılabildiği on-line HPLC-CA enzim tayin yöntemi geliştirilmiştir. Geliştirilen yöntem, akış hızları, tampon çözelti seçimi, konsantrasyonu ve pH' sı, reaksiyon sıcaklığı, tübing boyu ve substrat konsantrasyonu parametreleri üzerinden optimize edilmiştir. pH' sı 8,2 olan 0,15 M fosfat tamponu 0,5 mL/dk akış hızı ile, 5 mM p-nitrofenil asetat 0,3 mL/dk akış hızı ile sisteme gönderilip 210 nm' de protein ayrımı, 400 nm' de esteraz aktivitesi tespitinin 25 °C sıcaklıkta ve 3 m tübing boyunda yapılmasıyla optimum çalışma şartlarına ulaşılmıştır. Optimize edilmiş on-line HPLC-CA enzim tayin yöntemi, doğrusallık, doğrusal aralık, tespit (LOD) sınırı, tayin (LOQ) sınırı, kesinlik ve sağlamlık parametreleri üzerinden valide edilmiştir. Yöntemin, 5 mg/mL BCA seviyelerine kadar doğrusal seyrettiği, LOD' un 0,03 mg/mL ve LOQ' un 0,07 mg/mL olduğu tespit edilmiştir. Tekrarlanabilirlik ve ara kesinlik bakımından %1 altındaki bağıl standart sapma yöntemin kesinliğini, akış hızı, reaksiyon sıcaklığı, hareketli fazın pH' sı ve konsantrasyonunda yapılan küçük değişiklikler sonucunda %5 altındaki bağıl hata ise yöntemin sağlamlığını göstermiştir. Yapılan çalışmalar, geliştirilen yöntemin protein içeriği bilinen ve bilinmeyen tüm çözeltilere rahatlıkla uygulanabileceğini ortaya koymuştur.

Abstract:
The purification and separation of active proteins from complex samples is a very laborious and time-consuming process. On-line HPLC applications becoming icreasingly widespread offer significant advantages for the detection of natural bioactive compounds. In this study, an on-line HPLC-CA enzyme determination method was developed, which enables the on-line determination of proteins with esterase activity in protein mixtures and the simultaneous determination of carbonic anhydrase enzyme. The developed method was optimized over the parameters of flow rates, buffer solution selection, concentration and pH, reaction temperature, tubing length and substrate concentration. The optimum working conditions were obtained by pumping 0.15 M phosphate buffer with a pH of 8.2 to the system at a flow rate of 0.5 mL/min, and injecting 5 mM p-nitrophenyl acetate with a flow rate of 0.3 mL/min, to achieve protein separation detected at 210 nm and esterase activity at 400 nm at 25 °C with 3 m tubing length. The optimized on-line HPLC-CA enzyme determination method has been validated on linearity, linear range, LOD, LOQ, precision, and robustness. It was determined that the method was linear up to 5 mg/mL BCA levels, the LOD was 0.03 mg/mL, and the LOQ was 0.07 mg/mL. The relative standard deviation below 1% revealed the precision of the method, the relative error of less than 5% as a result of small changes in the flow rate, reaction temperature, pH and concentration of the mobile phase demonstrated the robustness of the method. Studies have shown that the developed method can be easily applied to all solutions with known and unknown protein content.