Farklı primerler ve DNA izolasyon yöntemleri kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle dışkı örneklerinde helicobacter pylori varlığının araştırılması ve sonuçların immünokromatografik yöntemle karşılaştırılması
Investigation of presence of helicobacter pylori in fecal samples, by various primers and DNA isolation methods using polymerase chain reaction method and comparison of results with immunochromatographic detection method
Yazar: SEVİL DİLEK KÖKÜM
Danışman: YRD. DOÇ. CELAL KURTULUŞ BURUK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Dışkı = Feces ; Helicobacter pylori = Helicobacter pylori ; Kromatografi = Chromatography ; Kromatografi = Chromatography ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
H. pylori, kronik gastrite, gastroduodenal ülsere, gastrik adenokarsinoma ve lenfomaya neden olabilen karsinojenik bir bakteri olarak değerlendirilmektedir. Helicobacter pylori tanısında kesin olarak belirlenmiş altın standart bir test olmayışı nedeniyle günümüzde hala tanıda ve tedavi başarısının izlenmesinde endoskopi gerektiren testler referans olarak kullanılmaktadır.Bu çalışmada hastalardan Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Hasta Hizmetleri Laboratuvarı'na gönderilen ve antijen aranması esasına dayalı bir immunokromatografik yöntemle H. pylori açısından incelenen gaita örneklerinde, farklı primerler ve DNA izolasyon metotları kullanarak, konvansiyonel PCR ve real time PCR yöntemleriyle H. pylori varlığının araştırılması ve sonuçların karşılaştırılması amaçlandı.DNA izolasyonunda, fekal DNA izolasyon kiti (Epicentre) ve fenol kloroform ekstraksiyonu ve etanol presipitasyon yöntemi kullanıldı. Fekal DNA izolasyon kiti ile DNA izolasyonunda başarı sağlanamadı. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol presipitasyonu yöntemiyle başarılı bir şekilde DNA izole edildi.vacA, ureA, ureC gen bölgelerine özgül primerler ile yapılan konvansiyonel PCR çalışmalarında, ureA geninin 411 bp uzunluğundaki fragmentini hedef alan HPU1-HPU2 primer çiftinin başarılı olduğu belirlendi.Çalışmaya dahil edilen 54 örnekten 43'ü HpSA testi ile, 42'si ureA PCR ile, 34'ü real time PCR ile H. pylori pozitif olarak belirlendi.Mide biyopsi örneğinin mikrobiyolojik inceleme sonuçlarını standart olarak kabul ettiğimizde duyarlılık ve özgüllükleri sırasıyla HpSA testinin %100 ve %46.15, ureA PCR'ın %92.86 ve %53.85, real time PCR'ın ise %92.86 ve %46.15 olarak hesaplanıştır.HpSA ile ureA PCR sonuçları arasındaki uyum %76, HpSA ile real time PCR sonuçları arasındaki uyum ise %80 olarak bulunmuştur.Çalışma sonucunda, H. pylori tanısında noninvaziv yöntem olarak gaita örneklerinde H. pylori DNA'sının gösterilmesinin antijen testi kadar tanı değerine sahip olduğu görülmüştür. Bununla birlikte avantajları nedeniyle HpSA testinin kullanılmasının daha mantıklı olduğu yargısına varılmıştır

Abstract:
Helicobacter pylori is a carcinogenic bacterium which causes chronic gastric, gastroduodenal ulcers, gastric adenocarcinoma and lymphoma in human being. There is no gold standard test available for diagnosis of H. pylori therefore tests that require endoscopy for diagnosis and monitoring of treatment success are still being used as a reference.This study analyzed the presence of H. pylori in stool samples sent by Department of Medical Microbiology Laboratories by an immunochromatography method, using various DNA isolation protocols and primers, conventional PCR and real time PCR, finally the results were compared.Stool DNA isolation kit (Epicentre), phenol-chloroform extraction method and ethanol precipitation method were used to isolate DNA from stool samples.DNA was isolated successfully by phenol?chloroform extraction and ethanol precipitation methods while fecal DNA isolation kit failed.Among conventional PCR protocols with specific primers targeted to vacA, ureA, ureC gene regions of H. pylori, only 411 bp yield was obtained with HPU1-HPU2 primers on ureA gene successfully in samples.From 54 samples involved in this study, 43 by HpSA, 42 by ureA PCR and 34 by real time PCR were determined as H. pylori positive.If we accept the microbiological examination results of gastric biopsy specimen as a standard, then sensitivity and specificity of the methods used are as below: HpSA test 100%, 46%, ure A PCR 92.86%, 53.85% and 92.86%, 46.15% for real time PCR, respectively.Results agreement between HpSA and ureA PCR was 76% while this was 80% between HpSA and real time PCR.As a result assessing H. pylori?s DNA by a noninvasive method in stool samples has as diagnostic value as an antigen test. However, because of the advantages of using the HpSA test, it was suggested to be more logical.