TNBS ile deneysel kolit oluşturulmuş sıçanlarda T lenfositlerin ve bazı sitokinlerin immunohistokimyasal ve western blot yöntemleriyle incelenmesi
Examination of T lymphocytes and some cytokines by immunohistochemical and western blot techniques on tnbs-induced rat colitis
Yazar: İHSAN KARABOĞA
Danışman: PROF. DR. TURAN KARACA
Trakya Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Morfoloji (Histoloji ve Embriyoloji) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Blotting-western = Blotting-western ; Gastrointestinal hastalıklar = Gastrointestinal diseases ; Kolit-ülseratif = Colitis-ulcerative ; Lenfositler = Lymphocytes ; Sitokinler = Cytokines ; Sıçanlar = Rats ; Trinitrobenzensulfonik asit = Trinitrobenzenesulfonic acid ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Bu çalışmada, TNBS ile indüklenen kolit modelinde kolon mukozasında meydana gelen immün aktivasyonların immünohistokimyasal ve Western blot yöntemleriyle incelenmesi amaçlanmıştır. 
Çalışmada 16 adet Wistar albino dişi sıçan kullanılmıştır. Denekler rastgele iki gruba ayrılmıştır; Kontrol (n=8) ve Kolit (n=8). Deneysel kolit modeli intrakolonik 2,4,6 Trinitrobenzen Sülfonik Asit (TNBS) uygulamasıyla indüklenmiştir. 25 mg/sıçan TNBS (toplam 1 ml hacimde, %50'lik etanol içerisinde) 60 saniye süre boyunca anestezi altında uygulanmıştır (ketamin; 50 mg/kg, ksilazin; 10 mg/kg, im).  Kontrol grubu hayvanlarına ise aynı süre boyunca rektal serum fizyolojik uygulanmıştır. Deney süresi boyunca vücut ağırlıkları ve feçes durumları takip edilerek kaydedilmiştir. Hayvanlar TNBS uygulamasından sonra 15. günde sakrifiye edilmiştir. Kolon dokusu alınarak morfolojik incelemesi yapılmıştır. Elde edilen kolon dokusu hematoksilen-eozin ile boyanarak meydana gelen mikroskobik değişiklikler incelenmiştir. Kolon kesitleri farklı antikorlar kullanılarak (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5, anti-CD8, anti-CD11b, anti-CD45, anti-TNF-α, anti-IL-17, anti-IL-22, anti-IL-23) indirekt immünohistokimyasal yöntem kullanılarak işaretlenmiştir. Kolon dokusunda IL-17 ve IL-22 ekspresyonları Western blot yöntemi ile de incelenmiştir. 
Deney sonunda kolit grubunda deney başlangıcına göre önemli derecede kilo kaybı ve kolon ağırlıklarında artış tespit edilmiştir. Mikroskobik inceleme sonucunda kolit grubu kolon dokusunda ülserasyon, inflamasyon, kript kaybı, Goblet hücre azalması gibi histopatolojiler gözlenmiştir. İmmünohistokimyasal olarak işaretlenen kesitlerde birim alandaki (mm2) pozitif boyanan hücre sayıları analiz edildiğinde; kolit grubunda, tüm immün parametreler bakımından kontrol grubuna göre istatiksel olarak anlamlı bir artış olduğu tespit edilmiştir. Kolit grubu kolon mukozasında artan IL-17 ve IL-22 ekspresyonları Western blot yöntemi ile de gösterilmiştir.
Sonuç olarak TNBS uyarımlı kolit modelinde T lenfositler ve alt gruplarının kolon mukozasındaki immünreaktivitelerinde önemli değişimlerin meydana geldiği immünohistokimyasal olarak gösterilmiştir. Yeni keşfedilen Th17/IL-23 yolağı ve IL-22'nin ülseratif kolit patogenezi ve tedavisindeki rolü, konu ile ilgili yapılacak ileri çalışmalarla daha iyi anlaşılabilecektir.

Abstract:
This study was aimed to investigate immun activations of TNBS-induced colitis model occured in colonic mucosa by immunohistochemical and Western blot methods. 
For this purpose, sixteen female Wistar albino rats were used. Rats divided two groups ramdomly; Control (n=8) and Colitis (n=8). Experimental colitis model was induced by intracolonic administration of 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS). 25 mg/rat of TNBS (diluted %50 v/v ethanol, totally 1 ml) under anaesthesia with ketamine (50 mg/kg, im) and xylazine (10 mg/kg, im) for sixty seconds was applied. Control animals received only rectal saline for same time. During the study, the weights and feces status of animals were recorded. The animals were sacrified fifteenth day after TNBS administration under anaesthesia. Colon tissue were removed and examined morphologically. Microscopic alterations were examined in stained with Hematoxylin-eosin slides from removed colon tissues. Colon slides were marking by indirect immunohistochemical method used with different antibodies (Anti-CD3, Anti-CD4, Anti-cd5, Anti-CD8, Anti-CD11b, Anti-CD45, Anti-TNF-α, Anti-IL-17, Anti-IL-22, Anti-IL-23). Also, the colonic tissue IL-17 and IL-22 expressions were examined by Western blot method.
 In the experimental results, it was determined significant decrease in body weight and increase in colon weight in colitis group when comparing initial experiments. Some histopathological changes such as ulcerations, inflammation, cyrpt loss and Goblet cell loss were observed in colitis group in microscopic examinations. When analyzed positive stained cell number in per unit area (mm2) as immunohistochemical,  a significant increase as statisticically in colitis group compared with control group. Also, increased IL-17 and IL-23 expressions in colitis colon mucosa were shown by Western blot method.
Consequently, important immunactivations occuring in T lymphoctes and subgroups in TNBS-induced colitis model was detected by immunohistochemical method. The role of newly investigated Th17/IL-23 pathway and IL-22 in the pathogenesis and treatment of ulcerative colitis will be clear up by further studies.