Bir bitki patojen adayı olan curtobacterium cinsine ait bakteri izolatlarında genomik kütüphane oluşturma çalışmaları
The studies towards constructing genomic libraries of bacterial isolates of a candidate plant pathogen belonging to curtobacterium genus
Yazar: SEDA KANLIKAYA
Danışman: PROF. BETÜL BÜRÜN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bor, dünya ve özellikle de ülkemiz için stratejik olarak önemlidir. Ülkemiz, dünyanın en büyük ve en iyi kalitede bor rezervine sahiptir. Bor; cam ve seramik sektörü, tarım sektörü, kimya, metalurji, malzeme ve demir-çelik sektörleri, orman ürünleri, mobilya ve kağıt sektörleri, sağlık sektörü, enerji sektörü, savunma, havacılık ve uzay sektörleri, tekstil sektörü, çimento ve yapı malzemeleri sektörü, madencilik sektörü gibi birçok alanda yaygın olarak kullanılmaktadır. 
Bor ile biyokimyasal ve moleküler çalışmaları yapabilmek için kullanılacak en uygun organizmalardan biri bakterilerdir. Bu çalışmada, Türkiye'deki Bor madenlerinden izole edilmiş olan Curtobacterium cinsine ait bazı bakteri izolatları model organizmalar olarak kullanılmıştır. Bu izolatlar laboratuvarımızda 150–200 mM borik asit içeren besiortamında çoğaltılmıştır. Yüksek konsanstrasyonlarda bor içeren madenlerden izole edilen Curtobacterium izolatlarının, bu ortamda yaşayabilmek için kullandıkları gen veya genleri, proteinleri öğrenebilmek mümkündür. 
Bu tez çalışmasında, Curtobacterium cinsine ait BB872Y ve BB62b2Y olarak kodlanan izolatlarının genomik kütüphaneleri oluşturulmuştur. İlk olarak uygun yöntemler ile bakteri DNA'ları elde edilerek, MboI enzimi ile kısmi kesime uğratılan genom parçalara ayrılmıştır. Bu genom parçaları plazmid olarak kullanılan pACYCDuet-1 içerisine klonlanarak Escherichia coli içerisinde genomik kütüphaneleri oluşturulmuştur. BB62b2Y-1 izolatının genomik kütüphanesi için 1800 koloni, BB62b2Y-2 izolatı için yaklaşık 2400 koloni ve BB872Y izolatı içinse 14000 koloni elde edilmiş ve herbir genomik kütüphane gliserol stoklar halinde dondurucuda saklanmıştır. Ayrıca bu tez kapsamında genomik kütüphane kolonileri bor seleksiyonuna tabii tutulmuştur. Farklı konsantrasyonlar denenerek, bor tolerans seviyeleri araştırılmıştır.

Tolerant olan kolonilerde, BB872Y izolatına ait olan pSKB1h, pSKB3a, pSKB3c ve pSKB3d plazmidleri; BB62b2Y-1 izolatına ait olan p106 ve p107 ve BB62b2Y-2 izolatına ait olan pCf1 ve pCf3 plazmidleri izole edilmiş ve stokları alınmıştır. Rekombinant plazmidlerin insertlerinde yer alan gen bölgeleri, DNA dizi analizleri sonucunda; hipotetikal protein, sinyal iletim histidin kinaz senX3, nitrat redüktaz, ABC taşıyıcı permeaz, klorür kanal proteini, alfa-galaktosidaz, peptit ABC taşıyıcı permeaz, peptidil-prolil cis-trans izomeraz, tip I pantotenat kinaz, pantotenat kinaz proteinleri olarak belirlenmiştir.

Abstract:
Boron has a strategic importance for the world and particularly our country, which possesses the largest and the best quality boron reserves in the world. Boron is commonly used in many areas such as glass and ceramics industry, agriculture sector, chemistry, metallurgy, materials and iron-steel sectors, forest products, furniture and paper sectors, health sector, energy sector, defense, aviation and space sectors, textile sector, cement and building materials and mining sectors.  
Bacteria are one of the most suitable model organisms to investigate the relationship between boron and biochemical and molecular mechanisms. In this study, some bacterial isolates obtained from the boron mines in Turkey and belonging to the Curtobacterium genus were used as the model organisms. These isolates were grown in the medium containing 150-200 mM boric acid in our laboratory. It is possible to find out the genes or proteins that are needed by the Curtobacterium isolates in order to survive in the environments containing high concentrations of boron.  
In this thesis study, genomic libraries of the BB872Y and BB62b2Y isolates belonging to Curtobacterium genus were constructed.  First, bacterial genomic DNAs were obtained using the appropriate methods and the genomes were fragmented by the partial digestion with MboI enzyme. The genome fragments were then cloned into the plasmid pACYCDuet-1 to construct the genomic libraries. For the genomic libraries of BB62b2Y, BB62b2Y-2 and BB872Y, a number of 1800, 2400 and 14000 colonies were obtained, respectively and each genomic library was saved as glycerol stocks in the freezer. Also, the colonies of genomic libraries were subject to boron selection and the levels of boron tolerance for the selected clones were determined by testing under various boron concentrations. 
The plasmids pSKB1h, pSKB3a, pSKB3c and pSKB3d from the genomic library of BB872Y and the plasmids p106, p107, pCf1 and pCf3 from the genomic libraries of BB62b2Y and BB62b2Y-2 were isolated from the tolerant clones and the strains carrying these plasmids were made into the glycerol stocks. 
As a result of DNA sequence analyzes, gene regions within the inserts of the recombinant plasmids were found to be possibly closely related to the following activities: hypothetical protein, signal-transduction histidine kinase senX3, nitrate reductase, ABC transporter permease, chloride channel protein, alpha-galactosidase, peptide ABC transporter permease, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, type I pantothenate kinase and pantothenate kinase.