Rosmarinik asidin ehrlich asit karsinoma üzerine etkisinin in vitro ve in vivo olarak incelenmesi
In vitro and in vivo investigation of the effect of rosmarinic acid on ehrlich ascites carcinoma
Yazar: DENİZ EROL KUTUCU
Danışman: PROF. DR. EBRU GÜREL GÜREVİN ; PROF. DR. ENGİN ULUKAYA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kanser, günümüzün en önemli sağlık sorunlarından biridir ve meme kanseri dünya çapında kadınlarda en sık görülen kanser türüdür. Kanser tedavisinde, kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi yöntemler kullanılmaktadır. Kanser hücrelerinin kemoterapide kullanılan ilaçlara karşı gösterdiği direnç, kanser tedavisi sürecinde ve sonrasında karşılaşılan en önemli sorunlardan biridir. Son yıllarda, çeşitli bileşiklerin kemoterapötik ilaçlar ile kombine edilerek aktivitelerinin arttırılması ve toksik etkilerinin azaltılması yeni bir yaklaşım olmuştur (kombine tedavi). Fenolik bileşiklerin kombine tedavide kanser hücrelerinin duyarlılığını arttırabileceği bildirilmiştir. Fenolik bir bileşik olan rosmarinik asidin antikanser, antioksidan, antibakteriyel, antienflamatuvar etkilere sahip olduğu ve bu özelliklerinden dolayı farklı kanser türlerine karşı potansiyel bir terapötik ajan olabileceği düşünülmektedir. Bu tez çalışmasında, MDA-MB-231 üçlü negatif meme kanseri hücre hattında in vitro ve Ehrlich Asit Karsinoma (EAC) hücrelerinde in vivo olarak rosmarinik asidin sitotoksik ve antikanser etki gösteren en etkin dozu belirlenmiş, ayrıca antikanser ilaçlar olan Doksorubisin, Paklitaksel ve Sisplatin ile kombinasyonlarının proliferasyon, apoptoz, otofaji ve hücre sağkalım yolakları üzerine etkisi araştırılmıştır.
Rosmarinik asit (1,56-100 µg/ml), Doksorubisin (0,01-0,92 µM), Paklitaksel (0,2-15,94 µM), Sisplatin (0,19-12,66 µM) ve kombinasyonlarının MDA-MB-231 ve MCF10F hücre hatlarında hücre canlılığı üzerine etkileri Sulforhodamine B (SRB) canlılık testiyle değerlendirildi. SRB testi sonuçlarına göre, rosmarinik asit ve Paklitaksel kombinasyonunun sinerjistik etki gösterdiği dozlar seçilerek 48 saatlik tedavinin MDA-MB-231 ve MCF10F hücre hatlarında hücre canlılığı üzerine etkileri ATP canlılık testi ile doğrulandı. Rosmarinik asit, Paklitaksel ve kombinasyonlarında apoptoz, otofaji, sağkalım ve oksidatif stres belirteçleri western blot yöntemi ile belirlendi. Çalışmanın in vivo kısmı iki aşamalı olarak gerçekleştirildi. İlk kısımda, 48 adet dişi Balb-c farelerde EAC solid tümör oluşturularak, rosmarinik asidin 25, 50, 100 mg/kg dozları gavaj ile uygulanıp, rosmarinik asidin en etkin dozu belirlendi. Çalışmanın ikinci kısmında ise EAC solid tümörü oluşturulan 60 adet dişi balb-c fareye Doksorubisin, Paklitaksel ve Sisplatin tek başına ve en etkin doz olan 50 mg/kg rosmarinik asit ile kombinasyonlar şeklinde uygulandı. Deney sonu olan 14. günde alınan tümör dokularında proliferasyon, apoptoz, otofaji, sağkalım ve oksidatif stres belirteçleri immünohistokimyasal olarak incelendi, ayrıca serum örneklerinde total antioksidan seviye (TAS) ile total oksidan seviye (TOS) düzeyleri biyokimyasal olarak belirlendi ve sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi.
SRB ve ATP canlılık testi sonuçlarından kombine tedavide en etkili olan ilaç grupları belirlendi. Rosmarinik asit ve Paklitaksel kombinasyonunun etkisinin doza ve hücre çeşidine bağlı olarak sinerjistik biçimde arttığı görüldü. Rosmarinik asit ve Paklitaksel kombinasyonunun MDA-MB-231 ve MCF10F hücre hatlarında hücre canlılığı üzerine etkileri ATP canlılık testi kullanılarak da doğrulandı. Western blot sonuçlarına göre, 3,12 µg/ml rosmarinik asit & 0,4 µM Paklitaksel ve 6,25 µg/ml rosmarinik asit & 0,9 µM Paklitaksel kombinasyonları FAS ve FAS ilişkili ölüm domaini FADD'ın, 6,25 µg/ml rosmarinik asit & 0,9 µM Paklitaksel kombinasyonu kırılmış-kaspaz-3'ün, her iki kombinasyon ise kırılmış-kaspaz-8'in ifadelerini arttırdı. Otofaji belirteçleri incelendiğinde, 3,12 µg/ml rosmarinik asit & 0,4 µM Paklitaksel ve 6,25 µg/ml rosmarinik asit & 0,9 µM Paklitaksel kombinasyonları p-Beclin-1 ifadesini azalttı, ATG5 ifadesinde herhangi bir değişikliğe neden olmadı, LC3B ve p62 ifadelerini ise arttırdı. Tüm tedavi konsantrasyonları kontrole kıyasla p-JNK ifadesinde belirgin bir değişime neden olmadı. Özellikle 3,12 µg/ml rosmarinik asit & 0,4 µM Paklitaksel ve 6,25 µg/ml rosmarinik asit & 0,9 µM Paklitaksel kombinasyonları p-c-Jun ifadesini kontrole, tek başına rosmarinik asit ve Paklitaksel uygulamasına göre önemli derecede arttırdı. 3,12 µg/ml rosmarinik asit & 0,4 µM Paklitaksel kombinasyonunda PTEN seviyesi azalırken, 6,25 µg/ml rosmarinik asit & 0,9 µM Paklitaksel kombinasyonunda bir değişiklik görülmedi, ancak her iki kombinasyon da p-AKT'yi arttırdı.
İn vivo EAC modelinde Rosmarinik asit, Doksorubisin, Paklitaksel ve Sisplatin'in tek başına ve birlikte uygulanması PCNA'yı azalttı ve bunun tümör hacmi sonuçları ile paralel olduğu görüldü. Rosmarinik asit ve ilaç kombinasyonları aktif kaspaz-3, PARP ve LC3B'nin artışına neden oldu, p62 düzeyi ise rosmarinik asit hariç tüm gruplarda azaldı. Rosmarinik asit ve ilaç kombinasyonları p-AKT, eNOS ve iNOS düzeylerini azaltırken, PTEN düzeylerini arttırdı. Rosmarinik asit ve ilaç kombinasyonları kontrol grubuna göre TAS düzeylerinde artışa yol açarken, TOS seviyelerinde ve oksidatif stres indeksi değerlerinde azalma görüldü.
İn vitro rosmarinik asit ve Paklitaksel kombinasyonuyla apoptozun MDA-MB-231 hücre hattında dış yolak üzerinden ölüm reseptörleri aracılı gerçekleştiği ve bu kombinasyonun oksidatif stres modülasyonu ile otofaji varlığında hücreleri apoptoza götürdüğü belirlendi. Rosmarinik asit ile Paklitaksel kombinasyonunun sinerjistik etkisini gösteren bu çalışmayla, bu ikilinin metastatik meme kanseri tedavisinde umut verici bir kombine tedavi olabileceği öngörüldü. İn vivo EAC modelinde rosmarinik asidin etkilerinin ilk defa incelendiği tez çalışmamızda, rosmarinik asidin en etkili dozunun 50 mg/kg olduğu belirlendi. Doksorubisin 3 mg/kg, Paklitaksel 12,5 mg/kg ve Sisplatin 4 mg/kg dozlarında hem 50 mg/kg rosmarinik asit ile birlikte hem de tek başlarına farelere uygulandığında, tüm gruplarda kontrol grubuna göre tümör hacimlerinde belirgin bir azalma olduğu belirlendi. Ancak rosmarinik asit ilaçlar ile kombine edildiğinde, rosmarinik asidin EAC tümörü üzerinde bu ilaçların duyarlılığını arttırmadığı görüldü. Bütün bu sonuçlar ışığında, rosmarinik asidin sinerjistik etkisini hücre ve kemoterapötik ilaç çeşidine göre seçici bir biçimde gösterdiği düşünülmektedir.

Abstract:
Cancer is one of the most important health problems, and breast cancer is the most common type of cancer in women worldwide. Chemotherapy, radiotherapy and surgical methods are used in cancer treatment. The resistance of cancer cells to drugs used in chemotherapy is one of the most important problems encountered during and after cancer treatment. In recent years, it has been a new approach to increase and decrease the activity and toxic effects of chemotherapeutic drugs, respectively, by combining them with various compounds (combined therapy). Studies report that phenolic compounds can increase the sensitivity of cancer cells in combined therapy. It is thought that rosmarinic acid, a phenolic compound, has anticancer, antioxidant, antibacterial, anti-inflammatory effects, and may be a potential therapeutic agent against different types of cancer due to these properties. In this thesis study, the most effective cytotoxic and anticancer dose of rosmarinic acid was in vitro and in vivo determined in MDA-MB-231 cell line and Ehrlich Acid Carcinoma (EAC) cells, respectively, and the effect of the anticancer drugs Doxorubicin, Paclitaxel and Cisplatin, and their combinations with rosmarinic acid on proliferation, apoptosis, autophagy and cell survival pathways was investigated.
Sulforhodamine B (SRB) viability test was performed to assess the effects of rosmarinic acid (1.56-100 µg/ml), Doxorubicin (0.01-0.92 µM), Paclitaxel (0.2-15.94 µM), Cisplatin (0.19-12.66 µM) and their combinations on cell viability in MDA-MB-231 and MCF10F cell lines. By selecting the doses of the combination of rosmarinic acid and Paclitaxel that showed synergistic effect according to the results of the SRB test, the effects of 48-hour treatment on cell viability in MDA-MB-231 and MCF10F cell lines were confirmed by the ATP viability test. For rosmarinic acid, Paclitaxel and their combinations, apoptosis, autophagy, cell survival and oxidative stress markers were determined by western blot method. The in vivo part of the study consists of two stages. In the first stage, after EAC solid tumor was formed in 48 female balb-c mice, 25, 50, 100 mg/kg doses of rosmarinic acid were administered by gavage, and thus the most effective dose of rosmarinic acid was determined. In the second stage, Doxorubicin, Paclitaxel and Cisplatin were administered alone and in combination with the most effective dose of 50 mg/kg rosmarinic acid to 60 female balb-c mice with in EAC solid tumors. Proliferation, apoptosis, autophagy, cell survival and oxidative stress markers were examined immunohistochemically in tumor tissues taken at the end of the experiment, on the 14th day, the levels of total antioxidant status (TAS) and total oxidant status (TOS) were determined biochemically in serum samples, and the results were statistically evaluated.
The drug groups that were most effective in combined therapy were determined from the results of SRB and ATP vitality tests. The effect of rosmarinic acid and Paclitaxel combination was observed to increase synergistically depending on the dose and cell type. The effects of rosmarinic acid and Paclitaxel combination on cell viability in MDA-MB-231 and MCF10F cell lines were also confirmed using the ATP viability test. According to the results of the Western blot, combinations of 3.12 µg/ml rosmarinic acid & 0.4 µM Paclitaxel and 6.25 µg/ml rosmarinic acid & 0.9 µM Paclitaxel increased the expression of FAS and FAS-associated death domain FADD, whereas the latter raised the expression of cleaved caspase-3, and both combinations led to increased expression of cleaved caspase-8. When autophagy markers were examined, combinations of 3.12 µg/ml rosmarinic acid & 0.4 µM Paclitaxel and 6.25 µg/ml rosmarinic acid & 0.9 µM Paclitaxel decreased p-Beclin-1 expression, but did not cause any change in ATG5 expression, while increased the expressions of LC3B and p62. All treatment concentrations did not cause a significant change in p-JNK expression compared to control. Especially the combinations of 3.12 µg/ml rosmarinic acid & 0.4 µM Paclitaxel, and 6.25 µg/ml rosmarinic acid & 0.9 µM Paclitaxel significantly increased p-c-Jun expression as compared to the control, and the administration of rosmarinic acid and Paclitaxel alone. While the PTEN level decreased in combination of 3.12 µg/ml rosmarinic acid & 0.4 µM Paclitaxel, there was no change in combination of 6.25 µg/ml rosmarinic acid & 0.9 µM Paclitaxel, but both combinations increased p-AKT.
In the in vivo EAC model, administration of rosmarinic acid, Doxorubicin, Paclitaxel and Cisplatin alone and in combination decreased PCNA, being parallel with the results of tumor volume. Rosmarinic acid and drug combinations caused an increase in the active caspase-3, PARP and LC3B, and p62 level decreased in all the groups except the rosmarinic acid group. The levels of p-AKT, eNOS and iNOS were decreased by rosmarinic acid and drug combinations that increased PTEN levels. Compared to the control group, rosmarinic acid and drug combinations increased TAS levels, while TOS levels and values of oxidative stress index decreased.
It was determined that with the combination of rosmarinic acid and Paclitaxel in vitro apoptosis is mediated by death receptors through the outer pathway in the MDA-MB-231 cell line, and this combination leads to apoptosis of the cells in the presence of autophagy via oxidative stress modulation. With this study revealing the synergistic effect of the combination of rosmarinic acid and Paclitaxel, it was predicted that this couple could be a promising combined therapy in the treatment of metastatic breast cancer. In our thesis study in which the effects of rosmarinic acid were examined for the first time in an in vivo model of EAC, the most effective dose of rosmarinic acid was determined as 50 mg/kg. When doxorubicin at 3 mg/kg, Paclitaxel at 12.5 mg/kg and Cisplatin at 4 mg/kg were administered to mice both alone and in combination with 50 mg/kg rosmarinic acid, a significant decrease was seen in tumor volumes in all the groups compared to the control group. However, when rosmarinic acid was combined with those drugs, it did not increase the sensitivity of the drugs on EAC tumor. In the light of these results, one concludes that rosmarinic acid exerts synergistic effect in a selective manner based on cell and chemotherapeutic drug types.