Mitokondriyal miRNA'ların (mitomiR) Meme Kanseri Hücre Hatlarında Araştırılması
Searching for Mitochondrial miRNA's in Breast Cancer Cell Lines
Yazar: PERVİN ELVAN TOKGÜN
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE GAYE TOMATIR
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Kadınlarda en sık görülen meme kanseri %5 genetik yatkınlıkla ilişkilidir ve
otozomal dominant kalıtımlıdır. Mitokondri; metabolizma, hücre ölümü ve inflamasyon
gibi önemli hücresel olaylarda rol almaktadır. Bu hücresel olayların basamaklarında,
küçük RNA'ların (sRNA), özellikle miRNA'ların önemli rol oynadıkları mRNA ve protein
seviyelerini kontrol ettikleri bilinmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar olgun
miRNA'ların yanı sıra pre-miRNA'ların da mitokondride yer aldıklarını ve proteinlerin
bölgeye özgü regülasyonlarını belirlemede mitokondrinin önemini vurgulamaktadır. Bu
çalışmada meme kanseri hücre hatlarında, mitokondriyal miRNA'ların muhtemel
rollerinin belirlenmesi amaçlandı.Araştırmada, MCF-10A, MCF-7 ve MDA-MB-231
meme kanseri hücre hatlarından 'Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)' yöntemi ile
mitokondriyal fraksiyonlar hazırlandı. Bu fraksiyonlar RNAse A ile yıkanarak sitozolik
kontaminasyonun uzaklaştırılması sağlandı. Mitokondriyal DNA tarafından kodlanan
genlerin ekspresyonlarının değerlendirildiği mtRNA örneklerinde ekspresyon
değişimleri qRT-PCR ve yeni nesil dizileme yöntemleri ile teyit edildi. Küçük RNA
dizileme analizi sonucu belirlediğimiz miRNA'ların fonksiyonlarını analiz etmek
amacıyla web tabanlı DIANA biyoinformatik analiz programı kullanıldı ve anlamlı
bulunan miRNA'ların hangi biyolojik süreç, moleküler işlev ve biyokimyasal yolakta yer
aldığını belirlemek için Gen Ontoloji (GO) ve Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes (KEGG) yolak analizleri Fischer's exact testi metoduyla değerlendirildi.
Mitokondriyal genom tarafından kodlanan miRNA'ların mitokondriyal genomdaki
pozisyonları SerialCloner 2-6-1 programı kullanılarak belirlendi. Araştırmada,
mitokondri ile ilişkili en sık belirlenen miRNA hsa-miR-6087-5p, hsa-miR-3960-3p, hsamiR-
7641-5p, hsa-miR-3648-3p, hsa-miR-4488-5p, hsa-miR-4485-5p, hsa-miR-4449-
3p, hsa-miR-4484, let-7 ailesi üyeleri (let-7a,b,c,d,e,f,g,i), hsa-miR-1290-3p, hsa-miR-
423-5p olmakla birlikte miR-221-3p, miR-92a-3p, hsa-miR-1246-5p, hsa-miR-1275-5p,
hsa-miR-663a-5p, miR-25-3p, miR-23a-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-320a-3p'da
mitokondri ile ilişkili bulundu. Analiz sonucuna göre; hsa-miR-4461, hsa-miR-4484 ve
hsa-miR-4485'nın mitokondriyal genom tarafından sırasıyla ND4L, L-ORF ve 16S
rRNA genleri ile homoloji gösteren ve mitokondriyal genomdaki pozisyonlarının
(10689–10711) , (5747–5763) ve (2539–2554) olduğu belirlendi.
Tanımlı miRNA'ların yanısıra ilk kez mitokondriyal gen bölgeleri ile homoloji
gösteren novel miRNA dizileri de saptandı. Mitokondride lokalize olan veya ilişkili olan
miRNA'ların insan sağlığı ve hastalıklar üzerine etkilerinin ve biyolojik önemlerinin
aydınlatılabilmesi için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Abstract:
Breast cancer which is the most common cancer type among women have an
autosomal dominant inheritance pattern, as well as 5% of them are being associated
with genetic predisposition. The cellular processes are controlled at mRNA and
proteins levels in mitochondria, where small RNAs (sRNAs) especially miRNAs play
critical roles. The recent studies have led the understanding that mitochondria are one
of the destinations of pre-miRNAs besides mature miRNAs. The newly destination of
miRNAs suggest the role of mitochondria in following-up site specific regulations of
proteins as well as the function of mitochondria. In this study we aimed to identify
possible roles of mitochondrial miRNAs in breast cancer cell lines. Therefore,
mitochondrial fractions were prepared from MCF-10A, MCF-7 and MDA-MB-231 cells
by using 'Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)' methodology. Fractions were
treated with RNase A in order to remove cytosolic contaminants. In mtRNA samples
expression changes were evaluated both qRT-PCR and next generation sequencing.
As a result of small RNA sequencing, in order to identify the functions of miRNAs, a
web based tool was used. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes (KEGG) pathway analysis were evalutated by Fisher's exact test method.
Genomic positions of mitochondrial encoded miRNAs were detected by using
SerialCloner 2-6-1 programme. hsa-miR-6087-5p, hsa-miR-3960-3p, hsa-miR-7641-5p,
hsa-miR-3648-3p, hsa-miR-4488-5p, hsa-miR-4485-5p, hsa-miR-4449-3p, hsa-miR-
4484, let-7 family members, hsa-miR-1290-3p and hsa-miR-423-5p was found to be
most relevant with mitochondria as well as miR-221-3p, miR-92a-3p, hsa-miR-1246-5p,
hsa-miR-1275-5p, hsa-miR-663a-5p, miR-25-3p, miR-23a-3p, hsa-miR-423-5p, hsamiR-
320a-3p. hsa-miR-4461, hsa-miR-4484 and hsa-miR-4485 aligned to
mitochondrial genome at positions (10689–10711), (5747–5763) and (2539–2554)
corresponding to ND4L, L-ORF and 16S rRNA genes respectively.
In this study besides known miRNAs, novel miRNAs which are shown to have
homology with mitochondrial genes were also identified. Further studies are required
for enlighting the biological importance and effects on human heealth of mitochondrialocalized
or related miRNAs.