Bağışıklık sisteminde rol oynayan bazı gen polimorfizmlerinin hepatit B enfeksiyonuna etkisinin araştırılması
Investigation of the effects of some gene polymorphisms affecting the immune system on hepatitis B infection
Yazar: BURÇİN TUNCEL
Danışman: PROF. DR. SEDAT KAYGUSUZ
Kırıkkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji = Infectious Diseases and Clinical Microbiology
Dizin: Hepatit B = Hepatitis B ; Hepatit B virüsü = Hepatitis B virus ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; Virüs hastalıkları = Virus diseases ; İmmünizasyon = Immunization

Özet:
Hepatit B virüsü enfeksiyonu küresel bir halk sağlığı sorunu olup, dünyanın birçok yerinde endemik olarak görülmektedir. HBV enfeksiyonu akut hepatit, kronik hepatit, siroz, hepatoselüler kanser (HCC) gibi bir dizi karaciğer hastalığına neden olabilmektedir. HBV enfeksiyonunun doğal seyrinde, enfekte bireylerin %90-95'inde enfeksiyon geçirilerek bağışıklık kazanılırken (HBsAg'nin anti-HBs antikorlarına serokonversiyonu), %5-10'unda ise kronik taşıyıcılık gelişmektedir. Taşıyıcıların %20-30'unda karaciğer sirozu, %5'inde ise HCC gelişmektedir. HBV enfeksiyonunun doğal seyrinden sorumlu ana mekanizmalar net olmamakla birlikte, enfekte bireylerin genetik faktörlerinin önemli bir katkısı olduğuna dair güçlü kanıtlar mevcuttur. Son yıllarda genetik yatkınlıklar üzerine yapılan çalışmalar büyük ilgi görmektedir. Yapılan çalışmalarda çeşitli immün sitokinler ve reseptör genlerinde, özellikle tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) bağışıklık, klinik seyir ve HBV enfeksiyonundan iyileşmede ya da kronikleşme de önemli bir rol oynadığını gösteren kanıtlar vardır.
Bu çalışmada amaç, HBV serokonversiyonu gerçekleşen hastalar ile kronik hepatit B hastalığı olup tedavi alan hastalarda, doğal ve kazanılmış bağışıklıkta önemli rol oynadıkları düşünülen CCR5 (CCR5Δ32) ve TLR3 (rs5743313) gen polimorfizmleri ve IFN-ɣ ile HBV enfeksiyonu arasında bağlantı olup olmadığının araştırılmasıdır. 
Çalışma Kırıkkale Üniversitesi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu tarafından 15.04.2021 tarih ve 2021/04 sayılı karar ile onaylandı. Kırıkkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Polikliniği'ne başvuran ve hepatit B enfeksiyonunu geçirip bağışıklık kazanan (anti-HBs ve anti-HBc IgG pozitif) 100 hasta ile kronik hepatit B tanılı olup (>6 ay HBsAg pozitif olan hastalar) tedavi alan 100 hasta bilgilendirilmiş gönüllü onam formu alınarak çalışmaya dahil edildi. Araştırmaya dahil edilen gönüllerden biyokimya ve EDTA'lı tüplere kan alındı. Hastalardan biyokimya tüplerine alınan örnekler, 5000 devir/10 dk santrifüj edildikten sonra serum örnekleri epandorf tüplerinde, EDTA'lı tüplerdeki örnekler ise santrifüj edilmeksizin -20°C'de çalışma yapılana kadar saklandı. Serum örnekleri Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda IFN-gamma araştırmak için ELISA kiti kullanılarak üretici firmanın önerileri doğrultusunda çalışıldı. EDTA'lı tüplerden DNA ekstraksiyonu yapıldı ve CCR5Δ32 polimorfizmi ''konvansiyonel PCR'' ile, TLR3 rs5743313 polimorfizmi ''real-time PCR'' yöntemi ile araştırıldı. Veri analizi için SPSS 20 paket programı, iki grup arasındaki karşılaştırmalarda Mann Whitney U testi, bağımlı grupların karşılaştırılmasında Wilcoxon testi, kategorik değişkenler arası karşılaştırmalarda Ki-kare testi kullanıldı ve sonuçlarda p<0,05 olan durumlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
         CCR5Δ32 polimorfizminin genotip dağılımı incelendiğinde, HBV enfeksiyonundan iyileşenlerde 5 (%5) hastada CCR5Δ32 heterozigot polimorfizm saptandı. Kronik hepatit B grubunda ise 12 (%12) hastada CCR5Δ32 heterozigot, 1 (%1) hastada CCR5Δ32 homozigot polimorfizm tespit edildi. CCR5Δ32 polimorfizmi, kronik hepatit B'li hastalarda anlamlı derecede yüksek idi (p=0.048). TLR3 geni rs5743313 polimorfizminin genotip dağılımı incelendiğinde ise iyileşen hasta grubunda CC genotipi olan 62 hasta, CT genotipi olan 34 hasta, TT genotipi olan 4 hasta, kronik hepatit B grubunda CC genotipi olan 56 hasta, CT genotipi olan 39 hasta, TT genotipi olan 5 hasta saptandı. TLR3 geni rs5743313 polimorfizmi (CT ve TT) görülme sıklığı kronik hepatit B grubunda %44, iyileşen hasta grubunda %38 olarak saptanmış olup, bu fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p=0.388).  Serum IFN-ɣ düzeyi, iyileşen hasta grubunda (75±89 ng/ml), kronik hepatit B grubuna göre (4,35±17,27 ng/ml) anlamlı olarak daha yüksek saptandı (p<0.001).
         Sonuç olarak CCR5Δ32 polimorfizmi kronik hepatite gidişte bir marker olarak düşünülebilir. İncelenen TLR3 geni rs5743313 polimorfizmi gruplar arasında anlamlı fark göstermese de diğer TLR3 geni SNP'leri kronik hepatit B için araştırılmalıdır. IFN-ɣ'nın, akut hepatit B iyileşmesinde virüsün klirensinin sağlanmasına yardımcı bir marker olduğu düşünüldü. CCR5Δ32 ve TLR3 geni rs5743313 polimorfizmleri ile hepatit B enfeksiyonu arasında bağlantı olup olmadığını net şekilde belirlemek için farklı bölgelerde ve daha büyük popülasyonlar üzerinde çalışmaların yapılmasına ihtiyaç vardır.

Anahtar kelimeler: Gen polimorfizmi, CCR5Δ32, TLR3 rs5743313, IFN-ɣ

Abstract:
Hepatitis B virus infection, a global public health problem, is emerging as an endemic in many parts of the world. Hepatitis B virus infection can lead to a series of liver diseases such as acute hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis, hepatocellular cancer (HCC). In the normal progress of hepatitis B virus infection, 90-95% of the infected individuals gain immunity by being infected (Seroconversion of HBsAg to anti-HBs antibodies) while 5-10% become a chronic carrier. 20-30% of the carriers develop cirrhosis of the liver while 5% develop HCC. Even though the main mechanisms responsible of hepatitis B virus infection's natural progress are not clear, there are significant evidence regarding the significant contribution of the genetic factors of infected individuals. In recent years, studies on genetic predispositions have attracted great interest. There is evidence showing that various immune cytokines and receptor genes, especially single nucleotide polymorphisms (SNP), play an important role in immunity, clinical course and recovery from hepatitis B virus infection or becoming chronic.
         The purpose of this study is to reveal whether there are any connections between CCR5 (CCR5Δ32) and TLR3 (rs5743313) gene polymorphisms, thought to play an important role in natural and gained immunity, and IFN-ɣ and hepatitis B virus infection in patients who have hepatitis B virus seroconversion and patients who have chronic hepatitis B disease and receive treatment. 
          The study has been approved by Kırıkkale University Clinic Research Ethic Board with decision dated 15.04.2021, No: 2021/04. 100 patients who applied to Kırıkkale University Faculty of Medicine Infectious Diseases and Clinical Microbiology Outpatient Clinic and had hepatitis B infection and became immune (anti-HBs and anti-HBc IgG positive) and 100 patients diagnosed with chronic hepatitis B (patients HBsAg positive for >6 months) and getting treatment have been included in the study by getting an informed volunteer consent form. Biochemistry was obtained from the volunteers included in the study. Afterwards, blood samples were taken and placed in EDTA tubes. The samples taken from the patients into biochemistry tubes were centrifuged at 5000 cycles/10 minutes, serum samples were stored in epandorf tubes, and the samples in EDTA tubes were stored at -20°C without centrifugation until the study was carried out. Serum samples have been studied at Infectious Diseases and Clinical Microbiology Laboratory, under the instructions of manufacturer, by using ELISA kit to look for IFN-gamma. DNA extraction has been made from EDTA tubes and CCR5Δ32 polymorphism has been studied through "conventional PCR" and TLR3 rs5743313 polymorphism has been studied through "real-time PCR" method. SPSS 20 package program was used for data analysis, Mann Whitney U test was used for making comparisons between groups, Wilcoxon test has been used for comparing dependent groups, Chi-square test was used for comparisons between categorical variables, and cases with p<0.05 were considered statistically significant.
         An analysis of the genotype distribution of CCR5Δ32 polymorphism has revealed that 5 patients (5%) of those recovered from hepatitis B virus infection had CCR5Δ32 heterozygous polymorphism. In chronic hepatitis B group, CCR5Δ32 heterozygote has been observed in 12 (12%) patients and CCR5Δ32 homozygote polymorphism has been observed in 1 (1%) patient. CCR5Δ32 polymorphism was significantly high in patients with chronic hepatitis B (p=0.048). Genotype distribution of TLR3 gene's rs5743313 polymorphism has been studied and it has been revealed that among the recovered patient group, CC genotype was in 62 patients, CT genotype was in 34 patients, TT genotype was in 4 patients, and in chronic hepatitis B group, CC genotype was in 56 patients, CT genotype was in 39 patients, TT genotype was in 5 patients. TLR3 gene rs5743313 polymorphism (CT and TT) incidence in chronic hepatitis B group was 44%, and in recovered patient group it was 38%. This difference was not found to be statistically significant (p=0.388). Serum IFN-ɣ level was found to be significantly higher in recovered patient group (75±89 ng/ml) when compared to chronic hepatitis B group (4,35±17,27 ng/ml) (p<0.001).
         In conclusion, CCR5Δ32 polymorphism can be seen as a marker on the way to chronic hepatitis. The studied TLR3 gene rs5743313 polymorphism did not yield a significant difference between groups but the other TLR3 gene SNPs must be studied for chronic hepatitis B. It has been thought that IFN-ɣ was a helpful marker for the clearance of the virus in acute hepatitis B healing. Studies in different areas and on greater populations need to be made to have a clearer idea about whether there is a connection between CCR5Δ32 and TLR3 gene rs5743313 polymorphisms and IFN-ɣ and hepatitis B infection.     

Keywords: Gene polymorphism, CCR5Δ32, TLR3 rs5743313, IFN- ɣ