Hıyar (Cucumis sativus l.) genotiplerinin önemli hastalıklara dayanıklılık durumlarının moleküler yöntemlerle belirlenmesi ve double haploid tekniğinin optimizasyonu
Determination of resistance to important diseases of some cucumber (Cucumis sativus l.) genotypes by molecular methods and optimization of double haploid technique
Yazar: MAMOUDOU ZONON
Danışman: DOÇ. DR. HATİCE İKTEN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Hibrit tohum üretiminde kullanılan saf ebeveyn hatlarının elde edilmesi çok zaman alıcı (6-8 yıl), zahmetli ve masraflıdır. Hıyar ıslah çalışmalarının etkili bir şekilde hızlandırılması için biyoteknolojik teknikleri yeni çözümler sunmaktadır. Bu tekniklerden biri olan doku kültürü (double haploid) yöntemiyle kısa sürede (1-2 yıl) 100% homozigot ebeveyn hatlar elde edilebilmektedir. Double haploid bitki elde etmesinde kullanılan yöntemler parthenogenesis (ışınlanmış polen ile tozlanma ve embriyo kurtarması), androgenesis (Anter veya mikrospor kültürü), ve gynogenesis (ovul veya yumurtalık kültürü)'dür. Yapılan çalışmalara göre hıyardaki haploit bitki elde etme yöntemlerinden gynogenesis daha etkili fakat genotipe bağlıdır. Dolaysıyla her genotip için protokol optimizasyonu gerekmektedir. Bu çalışmada kullandığımız 28 tane genotipte (14 F1 ve 14 saf hat) ovul kültürü yoluyla haploid bitki elde etme protokolünün optimizasyonu ve bu genotiplerin ZYMV, CMV, PRSV hastalıklarına dayanıklılık durumlarını moleküler markırlarla belirlenmesi amaçlanmıştır. Ovül kültürü çalışmalarında üç protokol kullanılmıştır (P1, P2 ve P2K3). 
P1 protokolünde en yüksek embriyo oluşum oranı %71 (22 nolu genotip), en düşük embriyo oluşum oranı %3 (15 nolu genotip) ve ortalama embriyo oluşum oranı %20'dir. Rejenerasyon (sürgün oluşumu) bakımından en yüksek oran 18 nolu genotiple %140 (ortalama 1.4 sürgün/eksplant), en düşük oran ise 25 nolu genotiple %0,5 bulunmuştur. Ortalama sürgün oluşum oranı %6 bulunmuştur. P1 protokolünde rejenerasyon olmasına rağmen bitki elde edilememiştir.P2 ortamı ile yaptığımız çalışmada en yüksek embriyo oluşum oranı (%75) 3 nolu genotipte bulunmuştur. En düşük embriyo oluşum oranı (%5,8) ise 6 nolu genotipte bulunmuştur. Ortalama embriyo oluşum oranı %20'dir. Sürgün oluşumu bakımından en yüksek oran %4,6 olarak 18 nolu genotipte, en düşük oran ise %0,5 olup 7 nolu genotipte elde edilmiştir. Ortalama rejenerasyon oranı %6'dır. P2 ortamında rejenerasyon elde edilmesine rağmen bitki gelişimi gerçekleşmemiştir. Rejenerantların gelişmesi için optimizasyon gerekmektedir. P2K3 ortamı P2 ortamını modifiye ederek elde edilmiştir. P2K3 protokolünde en yüksek embriyo oluşum oranı %104 (yani 1.04 embriyo/eksplant) olup 4 nolu genotiple elde edilirken en düşük embriyo oluşum oranı % 2,5 olup 2 nolu genotipte bulunmuştur. P2K3 protokolü ile yaptığımız çalışmada ortalama embriyo oluşum oranı %20'dir. Sürgün rejenerasyonu için en yüksek oran %470 (4.7 sürgün/explant) ile 14 nolu genotipte bulunmuştur. En düşük rejenerasyon oranı %1 olarak 12 nolu genotipte elde edilmiştir. Bu rejenerantlardan bitki elde edilebilmiştir. 7 nolu genotipten 3 tane diploid, 11 nolu genotipten 4 tane (hepsi haploid) ve 14 nolu genotipten 11 tane (hepsi diploid) ve 12 nolu genotipten 1 tane (diploid) bitki olmak üzere toplam 19 bitki elde edilmiştir. Kısacası P2K3 protokolüyle 4 haploid ve 15 diploid olmak üzere toplam 19 tane bitki elde edilmiştir. P2K3 protokolünün hıyarda double haploid bitki geliştirme programlarında başarılı bir şekilde uygulamabileceği görülmüştür. 
Yapılan moleküler testleme çalışmalarında ise kabak sarı mozaik virüsü hastalığı (ZYMV) için CAPS-T86C, hıyar mozaik virüsü hastalığı (CMV) için SSR9-56 ve SSR11-1 papaya halkalı leke virüsü (PRSV) için SSR11-177) markırları kullanarak 28 genotipte optimizasyon yapılarak dayanıklı ve hassas genotipler belirlenmiştir.

Abstract:
The development of pure lines used in hybrid seed production is tedious, costly and time consuming (6-8 years). Tissue culture (doubled haploid technique) seems to be an alternative to speed up the process. Using doubled haploid technique 100% homozygous parental lines can be obtained in a time relatively sort (1-2 years). Among the techniques used in doubled haploid plants production, there are parthenogenesis (pollination with irradiated pollen followed by embryo rescue), androgenesis (anther or microspore culture) and gynogenesis (ovul or ovary culture). Among these techniques, gynogenesis seems to be more efficient but depends on genotypes. Therefore, protocol optimization is required for genotypes.In this study, the purpose was to optimize protocols for doubled haploid plants production in 28 genotype by ovule culture and determine the resistance status of these genotypes to Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV), Cucumber Mosaic Virus (CMV) and Papaya Ring Spot Virus (PRSV) using molecular markers previously developed. For doubled haploid optimization, three main protocols (P1, P2 and P2K3) were used.
According to P1 protocol, the highest embryo induction rate was 71% with genotype 22, the lowest rate was 3% with genotype 15. The average embryo induction rate was 20%. The highest regeneration (shoot induction) rate was 140% (Average of 1.4 shoot/eksplant) with genotype 18. The lowest rate was 0.5% with genotype 25. The average shoot induction rate was 6%. Despite regeneration, regenerants could not develop in planlets.In the P2 medium, the highest embryo induction rate (75%) was found in genotype 3. The lowest embryo rate which is 5.8% was found in genotype 6. The average embryo induction rate was 20%. In terms of rejenerasyon the highest rate was 4.6% obtained in genotype 18. The lowest regeneration rate was 0.5% with genotype 7. The average regeneration rate was 6%. Although regeneration was observed in some genotypes, plantlets could not be obtained. Optimization may be required for the development of regenerants.P2K3 medium is a protocol developed by modifying P2 protocol. In P2K3 medium the highest embryo induction rate was 104% (an average of 1.04 embryo/explant) obtained with genotype 4. The lowest embryo induction rate was 2.5% (genotype 2) and the average embryo induction rate was 20%. For regeneration rates, the highest one obtained in genotype 14 was 470% (an average of 4.7 shoot/explant). The lowest regeneration rate was 1% (genotype 12). In P2K3 medium, some of regenerants developed to give plantlets. Including 3 diploid plants from genotype 7, 4 haploid plants from genotype 11 and 11diploid plants from genotype 14, 19 plants were obtained in total. In short, including 4 haploid and 15 diploid plants, 19 plants were obtained totally. In doubled haploid optimization study, 19 plants are obtained in total with modified P2K3 protocol. Among these plants, 4 are haploid and 15 are diploid. This developed new protocol is promising for cucumber doubled haploid lines development programs.
In the molecular analysis studies the molecular markers developed previously for Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV), Cucumber Mosaic Virus (CMV), Papaya Ring Spot Virus (PRSV) resistance were optimized and the resistance status of 28 cucumber genotypes to ZYMV, CMV, PRSV were determined. As markers, CAPS-T86C was used for ZYMV resistance screening and SSR11-177 was used for PRSV resistance screening. For CMV disease screening, two flanking markers were used (SSR9-56 and SSR11-1).