Sıçanlarda L-name ile oluşturulmuş hipertansiyonun kan TNF-α, eritropoein düzeyleri ile böbrek dokusu harabiyeti arasındaki ilişkinin araştırılması
Investigation of erythropoietin, TNF-α and kidney tissue 
injury connections in L-name induced hypertensive rats
Yazar: METE ÖZKURT
Danışman: PROF. DR. KUBİLAY UZUNER
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Böbrek = Kidney ; Darbepoetin = Darbepoetin ; Eritropoietin = Erythropoietin ; Hipertansiyon = Hypertension ; Sıçanlar = Rats ; Tümör nekroz faktörleri = Tumor necrosis factors

Özet:
Amaç: Çalışmamızda Epo'nun böbreklerden sentezlenmesinin nedeninin Epo'nun böbrekler için yaşamsal bir doku koruyucu olduğunu öne sürdük ve hipertansiyonda oluşan böbrek hasarının başlıca nedeni olan TNF-α'nın blokajı ve TNF-α tarafından sentezi baskılanan Epo'nun L-NAME modeli ile hipertansiyon oluşturulmuş dişi sıçanlarda böbrek dokusu harabiyeti üzerindeki etkilerini sistemik, moleküler ve histolojik düzeyde araştırmayı amaçladık.
Materyal Metod: a) Doz çalışması: yetişkin dişi sıçanlara 20 mg/kg/gün L-NAME ile birlikte 10, 2,5, 0,5, 0,25, 0,1 µg/kg dozlarında Depo'yu 3 günde 1  vererek gerçekleştridiğimiz doz çalışmasında kan parametrelerini değiştirmeyen en yüksek doz olarak 0,25 µg/kg Depo'yu tedavi dozu olarak belirledik.
b) Tedavi grupları için altmış adet dişi sıçan rastgele 6 gruba ayrıldı, enjeksiyonlar otuz gün boyunca devam etti; Kontrol: günlük intraperitoneal (i.p.) 1 ml/kg serum fizyolojik (SF) enjeksiyonu yapıldı; L: günlük yirmi mg/kg ip L-NAME enjeksiyonu yapıldı; L+Depo: aynı dozda yapılan L-NAME ile birlikte 3 günde 1 ip 0,25 µg/kg Depo enjeksiyonu yapıldı; L+Rem: aynı dozda yapılan L-NAME ile birlikte TNF-α antikoru olan Remicade 5 mg/kg dozunda ip enjeksiyonu yapıldı; L+Depo+Rem: aynı dozlarda hem L-NAME hem Depo hem de Remicade yapıldı; Depo: aynı dozda Depo tek başına yapıldı. 30 günlük enjeksiyonların ardından yapılan femoral arter kateterizasyonu ile kardiyovasküler parametreler ölçüldü ve arteryel kandan kan sayım cihazı kullanılarak kan değerleri ve plazma Epo ve TNF-α miktarları ELISA yöntemi kullanılarak ölçüldü. Sağ böbrek çıkartılarak ağırlığı ölçüldü, sol böbrek çıkartılarak uzun hattan ikiye bölündü, yarısı immunhistokimya tekniği ile TUNEL, ED-1 ve NfKappaB boyamalarının yapılması için formolde diğer yarısı ise PCR tekniği ile TNF-α, TNF-α reseptörleri olan TNFR1 ve TNFR2, Epo reseptörü olan EpoR mRNA ölçümleri için tripure solüsyonu içinde saklandı. 
Bulgular: L-NAME verilen tüm gruplarda sistolik kan basıncı, diyastolik kan basıncı, nabız basıncı ve ortalama arter basıncı artmıştır. L-NAME ile yükselen apoptotik hücre oranı tüm tedavi gruplarında kontrol grubu seviyesine düşmüştür. ED-1 ile ölçülen makrofaj birikimi L ve L+Rem gruplarda yükselmiştir. NfKappaB L+Rem grubu hariç tüm gruplarda kontrole göre artmıştır. ELISA sonuçlarına göre ise, gruplar arasında istatistiksel bir farklılık görülmese de Epo seviyeleri, L grubunda kontrole göre yarı yarıya düşmüş fakat L+Rem grubunda TNF-α'nın blokajı Epo seviyesini tekrar kontrol düzeyine yükseltmiştir. Kan plazma TNF-α miktarı ve TNF-α mRNA değerleri L grubunda kontrole göre yaklaşık 3 kat artarken, L+Depo grubunda kontrol değerlerinin bile altına düşmüştür. TNF-α'nın apoptotik etkilerine aracılık eden TNFR1'in mRNA miktarı gruplar arasında istatistiksel bir farklılık göstermese de, L+Depo grubunda kontrole göre yarıyarıya düşmüştür. Diğer yandan TNF-α'nın antiapoptotik etkilerine aracılık eden TNFR2'nin mRNA miktarı ise L+Depo grubunda kontrole göre anlamlı derecede yükselmiştir. EpoR mRNA miktarları istatistiksel olarak anlamlı olmasa da L grubunda kısmen artarken, Depo erilen gruplarda düşmüştür.
 Sonuç: Depo injeksiyonu, L-NAME ile oluşturulmuş kronik hipertansiyonda böbrekte oluşan apoptozisi, yükselmiş kan basıncı düzeyini ve kontrol değeri düzeyindeki kan parametrelerini etkilemeden engellemiştir. Bulgularımız Depo'nun bu etkisini makrofaj birikimini engelleyerek, apoptotik plazma TNF-α seviyesini ve TNF-α mRNA düzeyini ve TNFR1 reseptörünü azaltarak fakat antiapoptotik TNFR2 ifadelenmesini uyararak gerçekleştirdiğini göstermektedir.
Sunulan çalışmanın sonuçları ve son yıllarda yayınlanan çalışmaların ışığında Epo ve vücutta hematopoetik bir organ olmasa da majör Epo üreticisi böbrek dokusu ile Epo arasında şu hipotezi ileri sürüyoruz: L-NAME verilerek sıçanlarda oluşturulan kronik hipertansiyonda ortaya çıkan böbrek dokusu hasarı (apoptozis), artan TNF-α aktivitesine bağlı olarak kritik doku koruyucu seviyelerinin altına düşen endojen Epo yetersizliğindendir. Epo'nun hematopoetik etkisi çok düşük konsantrasyonlarda bile gerçekleşirken, doku koruyucu etkisi Epo'ya daha düşük affiniteli bir sitokin reseptörü ile Epo reseptörü arasında heterodimerik bir bağlantı yolağının aktivasyonunu gerektirmektedir. Böbrek dokusunun fizyolojik koşullarda fonksiyonlarının sürdürebilmesi doku koruyucu ve hematopoetik etki seviyelerinin üzerinde Epo varlığına bağlıdır. Böbrek dokusunda üretildiği için böbreklerde doku koruyucu düzeyinde Epo sağlanabilirken kan yoluyla kemik iliğine ulaşabilen pikomolar seviyelerine düşmüş Epo hematopoietik etki için yeterli olabilmektedir. Sunulan çalışmada dışarıdan takviye edilen Epo hipertansiyonda azalan endojen Epo'nun azalan doku koruyucu etkisini telafi ederek böbrek dokusunda hipertansiyonun yol açtığı TNF-α aktivitesine bağlı apoptozisi engellemiştir.

Abstract:
Aim: We hypothesis that Epo is secreted by kidneys because it has an important protector role for kidneys and we aimed to study the effect of TNF-alpha blockage that is the main cause of kidney damage in hypertension and effect of Epo treatment which the synthesis of it is depressed by TNF-alpha on kidney tissue damages by using histological, and molecular techniques in L-NAME induced hypertensive female rats.
Material Method: a) Dose study: To detect the dose of Darbepoetin-alpha (Depo), a long acting Epo analog, we randomly divided 60 female adult rats into six groups; L-NAME alone, L-NAME+10 µg/kg Depo, L-NAME+2,5 µg/kg Depo, L-NAME + 0,5 µg/kg Depo, LNAME+0,25 µg/kg Depo, L-NAME+0,1 µg/kg Depo. According to survival and blood parameters we detected 0,25 µg/kg Depo dose as the highest dose that is not changing the blood parameters and used it as treatment dose. 
b) Treatment study: We randomly separated 60 female adult rats into 6 groups and we injected drugs for 30 days, according to the group protocol; Control: Daily i.p. (intra-peritoneal) 1ml/kg/day physiologic serum injected; L-NAME: daily IP 20 mg/kg/day L-NAME injected; L-NAME +Depo: the same dose of L-NAME and 0,25 µg/kg dose of Depo injected once in 3 days i.p; L-NAME+REM: the same dose of L-NAME and Daily 5 mg/kg/day dose of Remicade (REM, TNF-alpha antibody) i.p injected; L-NAME+Depo+REM: the same doses of each agent in the same way injected; Depo: the same dose of Depo alone injected. After 30 days of injection period, rat cardiovascular parameters were recorded under anesthesia (50mg/kg Ketamine HCl+10 mg/kg Xylazine HCl) via PE 50 tip intra-femoral catheterization and at the end of the experiment, arterial blood samples were taken from CBC (all blood cell parameters) via cell counter system and to measure TNF-alpha and Epo levels in the plasma via ELISA technique. We removed right kidney and weighted. Then we removed the left kidney, divided longitudinally into two pieces, half of it was stored in formaldehyde for TUNEL, ED-1 and NfKappaB staining, , the other half was stored in Tri pure solution for TNFalpha, TNFR1, TNFR2 and EpoR MRNA detection. 
The results: Systolic, diastolic, mean arterial and pulse pressures increased in all the LNAME given groups and heart rate decreased in only Depo treated with L-NAME groups. Apoptotic index increased in the L - NAME group but decreased in all the treatment groups. Macrophage accumulation, as measured by ED-1 staining, that causes TNF-alpha increase, increased in L and L+ REM groups. NfKappaB increased in all groups except L+REM group. Although ELISA results show no significant difference among the groups, Epo decreased in half in the L group compared with that of the control. However, TNF-alpha blockade in the L REM group increased endogenous Epo up to the control level. The lack of Epo increase in Depo treated groups may be because of the insensitivity of the Epo antibody used to Depo. TNF-alpha in the blood plasm value detected by ELISA and the TNF-alpha MRNA amount detected by PCR increased up to 3 folds in the L group compared with that of the control and decreased even below the control level in the L Depo group. MRNA amount of TNFR1 that stimulates apoptosis decreased to half in L-NAME treated with Depo groups compared with that of the control group but this result is not statistically significant. On the other hand MRNA amount of TNFR2 that stimulates antiapoptotic pathways, increased significantly in LNAME treated with Depo group. Apr MRNA amount increased partly in the L group may due to increased Epo demand, but this demand was not seen in Depo treated groups that EPOR MRNA also decreased although it is not statistically significant. 
Our results suggest that Epo shows its tissue protective activity by blocking the accumulation of macrophages, depressing plasma TNF-alpha level and kidney TNF-alpha mRNA amount, suppressing TNFR1, and stimulating antiapoptotic TNFR2 expression. Apoptosis in the kidney tissue resulted in L-NAME induced hypertension decreased endogenous EPO levels below to the is induced by rising TNF-alpha activity and decreasing below critical tissue protective levels of endogenous Epo during chronic tissue injury.
Conclusion: The presented study is the first in-vivo data indicating that the depo injection or TNF-alpha inhibition prevented apoptosis in rat kidney occurred in L-NAME induced chronic hypertension without affecting rat blood pressures and rat blood cell counts. We suggest that given exogenous DEPO substituted TNF-alpha induced decrease in endogenous renal tissue alpha production below of the critical tissue protective concentrations even it may still enough for the hematopoietic actions. Since Epo can show its hematopoietic influences, even in very low concentrations via the homo dimeric Epo receptors, however its tissue protective effects may depend on tissue-protective  erythropoietin receptor (EPOR– common receptor (CR) a currently defined another receptor that requires higher Epo concentrations to activate heterodimeric tissue protective receptor pathways that is a lower affinity to Epo.