Bazı fenolik doğal bileşiklerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi ve insan karbonik anhidraz izoenzimleri(hCA-I ve hCA-II üzerine inhibisyon etkilerinin incelenmesi
Determinaton of antioxidant capacity of some fenolic naturel compounds and investigation of their inhibiton effects on human carbonic anhydrase isoenzymes (hCA-I and hCA-II)
Yazar: MÜŞERREF HİLAL ŞEHİTOĞLU
Danışman: PROF. DR. İLHAMİ GÜLÇİN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Fenolik bileşikler = Phenolic compounds ; Karbonik anhidraz = Carbonic anhydrases ; Karbonik anhidraz inhibitörleri = Carbonic anhydrase inhibitors

Özet:
Bu çalışmada apomorfin, timol ve humik asitin fenolik doğal bileşiklerin muhtemel antioksidan ve radikal giderme aktiviteleri değerlendirildi. Ayrıca bu fenolik doğal bileşiklerin insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (hCA-I ve hCA-II) üzerine inhibisyon etkileri de incelendi.Fenolik doğal bileşiklerin antioksidan kapasitelerini değerlendirmek için ferrik tiyosiyanat metoduna göre total antioksidan aktivitesi, 2,2´-azino-bis(3-etilbenztiyoazolin-6-sülfonik asit) radikal (ABTS?+) giderme aktivitesi, 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil serbest radikal (DPPH·) giderme aktivitesi, N,N-dimetil-p-fenilendiamin radikal (DMPD?+) giderme aktivitesi, süperoksit anyon radikali (O2?-) giderme aktivitesi, potasyum ferriksiyanit indirgeme metodu ile indirgeme kuvveti, Kuprak metodu ile kuprik iyonları (Cu2+) indirgeme kapasitesi, FRAP metoduna göre indirgeme kapasitesi ve ferröz iyonları (Fe2+) şelatlama aktivitesi çalışıldı. Ayrıca BHA, BHT, ?-tokoferol ve troloks gibi referans antioksidanlar kullanıldı. Kullanılan fenolik bileşikler bütün metotlarda kuvvetli antioksidan ve radikal giderme aktivitesi sergilediler.Ayrıca çalışmanın ikinci kısmında ise fenolik doğal bileşiklerin insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (hCA-I ve hCA-II) üzerine in vitro inhibisyon etkileri araştırıldı. Öncelikle hCA-I ve hCA-II izoenzimleri sırasıyla Sepharose-4B-L-tirozin afinite kolon kromatografisi ile %59,4, %65,9 verimle 194,5 ve 832,4 kat saflaştırıldı. Enzim saflığını belirlemek için, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapıldı ve tek bant gözlendi. Bundan sonra I50 değerlerini bulmak için, hidrataz aktivitesi kullanılarak fenolik doğal bileşiklerin hCA-I ve hCA-II üzerine inhibisyon etkileri araştırıldı. Ayrıca fenolik doğal bileşiklerin hCA-I ve hCA-II üzerine inhibisyon etkileri 4-nitrofenil asetat substratı ile esteraz aktivite metodu kullanılarak da araştırıldı. Apomorfin, timol ve humik asitin hCA-I için 20,5-457,0 ?M ve hCA-II için de 61,0?584,0 ?M arasında Ki değerlerine sahip oldukları gözlendi. Hümik asit hCA-I için yarışmalı inhibisyon gösterirken, hCA-II için yarışmasız inhibisyon gösterdi. Diğer fenolik bileşikler apomorfin ve timol (hCA-I, II için) 4-nitrofenil asetat substratı ile yarışmasız inhibisyon gösterdiler. Çalışmada kullanılan fenolik doğal bileşikler klinik olarak kullanılan süfanilamit ve asetazolamide benzer inhibisyon etkisi gösterdiler. Bu inhibitörler antioksidan özelliklerinden dolayı hCA-I ve hCA-II için daha güvenli olarak kullanılabilir.Anahtar kelimeler: Antioksidan aktivite, karbonik anhidraz, fenolik doğal bileşik, hCA-I, hCA-II, enzim inhibisyonu

Abstract:
In the present study, some phenolic naturel compounds such as apomorphine, thymol and humic acid were evaluated for possible antioxidant and radical scavenging activity. Also the inhibitory effects of these phenolic compounds were determined on human erythrocyte izoenzymes I and II (hCA-I and hCA-II).In order to evaluate antioxidant capacity of phenolic compounds, different in vitro methods such as total antioxidant activity by ferric thiocyanate method, 2,2´-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) radical (ABTS?+) scavenging activity, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl free radical (DPPH·) scavenging activity, N,N-dimethyl-p-phenylenediamine radical (DMPD?+) scavenging activity, superoxide anion radical (O2?-) scavenging activity, reducing power by potassium ferricyanide reduction method, cupric ion (Cu2+) reduction capacity by Cuprac method, reducing capacity by FRAP method and ferrous ions (Fe2+) chelating activities were performed separately. Also, BHA, BHT, ?-tocopherol and trolox, a water-soluble analogue of ?-Tocopherol, were used as the reference antioxidant compounds. The phenolic compounds exhibited powerfull antioxidant and radical scavenging effects in used all methods.Also in the second part of this study, the in vitro inhibition effects of these phenolic compounds on erythrocyte carbonic anhydrase isoenzymes (hCA-I and hCA-II) from human blood were investigated. Firstly, hCA-I and hCA-II were purified by Sepharose-4B-L-tyrosine affinity chromatography column with a yield of 59.4, 65.9%, 194.5 and 832.4-fold purification of each isoenzyme, respectively. For determination of enzyme purity, SDS-PAGE was performed and single band was observed. For determination of I50 values of these phenolic compounds were investigated by using hidratase assay.The inhibition of hCA-I and hCA-II, with a series of phenolic compounds was investigated by using the esterase assay with 4-nitrophenyl acetate as substrate. These phenolic compounds showed Ki values in the range of 20.5-457.0 ?M for hCA I and of 61.0-584.0 ?M against hCA-II. Humic acid exhibited competitive inhibitory effect for hCA-I, but for hCA II, exhibited non-competitive inhibitory effect. Apomorphine and thymol were found as non-competitive inhibitors with 4-nitrophenylacetate as substrate for hCA I and hCA II. These phenolic compounds demonstrated effective hCA-I and hCA II inhibition in the same range as the clinically used sulfonamide and acetazolamide and can be used safer for hCA I and hCA II izoenzymes due to their antioxidant properties.Keywords: Antioxidant activity, Carbonic anhydrase, phenolic naturel compound, hCA-I, hCA-II, enzyme inhibition