HT22 hücrelerinde oluşturulan glutamat nörotoksisite modelinde gebe serumu uygulamasının olası nöroprotektif etkilerinin In vVitro analizi
In Vitro analysis of possible neuroprotective effects of pregnancy serum administration in a glutamate neurotoxicity model established in HT22 cells
Yazar: DENİZ KİBAR
Danışman: PROF. DR. ŞAKİR NECAT YILMAZ
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Glutamat konsantrasyonlarındaki artış, memeli merkezi sinir sisteminde nöronal apoptoza ve bilişsel eksikliklere neden olabilen iskemi, felç, demans gibi patolojilerde anahtar bir risk faktörü olarak kabul edilmektedir. Gebelik sürecinde fetüsün özellikle beyin gelişimi açısından kritik olan bütün faktörler anneden kaynaklanır ve plasenta aracılığıyla fetüse geçer. Gebeliğin glutamat aracılı nöronal sitotoksisitedeki rolü tam olarak aydınlatılmamıştır. Bu bağlamda sunulan çalışma fare hipokampal HT22 hücre hattında glutamat toksisitesi modeli kullanılarak gebe serumunun olası nöroprotektif etkilerini göstermeyi hedefledi. Bu amaçla kontrol ve deney olmak üzere başlıca iki grup oluşturuldu. Kontrol grubunda hiçbir işleme tabi tutulmamış HT22 hücreleri varken, deney gruplarımız iki alt gruba ayrıldı. Bunlardan bir tanesine sadece glutamat uygulandı. Diğerine ise glutamat uygulamasının yanı sıra tedavi amaçlı gebeliğin son döneminde Wistar sıçanlardan elde edilen serum uygulandı. Glutamat ve gebe serumunun ayrı ayrı etkin veya sitotoksik konsantrasyonlarını hesaplarken MTT analizinden yararlanıldı ve sonuçta glutamat nörotoksisite modeli olarak 80 mM L-glutamik asit (p<0,01) nöroprotektif tedavi grubu olarak % 10 gebe serumu (p=0,036) uygulanmasına karar verildi. Gebe serumunun HT22 hücrelerinde glutamat kaynaklı nörotoksisite üzerindeki olası koruyucu etkilerini araştırmak için öncelikle nöral apoptoz ve nekrozu gösteren APC-Anneksin V/PI floresan işaretlemesi ve akım sitometri analizleri yapıldı. Sadece 80 mM L-glutamik asit uygulanan grupta apoptozda istatistiksel olarak anlamlı bir artış (p=0,012) gözlenirken, % 10 gebe serumu uygulaması sonucu apoptozda istatistiksel olarak anlamlı bir azalma vardı (p<0,001). Ayrıca intraselüler kalsiyum alımının ölçülmesi için Fluo-4-AM boyaması ve reaktif oksijen türevlerinin gösteriminde DHE boyamasıyla akım sitometrik analiz yöntemi kullanıldı. Intraselüler kalsiyum seviyelerinde anlamlı bir değişim gözlenmezken gebe serumunun glutamat aracılı artan reaktif oksijen türevleri oranını kayda değer seviyede azalttığı bulundu (p<0,001). Dahası hücrelerdeki apoptotik yolakla ilişkili genlerin protein ekspresyon seviyelerinin ölçümünde qRT-PCR analizi yapıldı ve glutamatın yol açtığı apoptotik protein ekspresyonlarındaki artışı gebe serumunun büyük oranda önlediği gözlendi (p<0,001). Özetle HT22 hücrelerinde gebe serumunun glutamat toksisitesine karşı nöroprotektif olduğu saptandı.

Abstract:
The increase in glutamate concentrations is known to be a key risk factor in pathologies such as ischemia, stroke and dementia, which can cause neuronal apoptosis and cognitive deficits. During pregnancy, all factors that are critical for the development of the fetus. The role of pregnancy in glutamate-mediated neuronal cytotoxicity has not been fully elucidated. The presented study aimed to demonstrate the possible neuroprotective effects of pregnant serum using a glutamate toxicity model in the mouse hippocampal HT22 cell line. For this purpose, two main groups were created: control and experimental. Our experimental groups were divided into two subgroups, while the control group was not subjected to any treatment. Only glutamate was applied to one of them. Serum obtained from Wistar rats in the last period of pregnancy was applied to the other. MTT analysis was used to calculate the cytotoxic concentrations of glutamate and pregnant serum separately. As a result, it was decided to apply 80 mM L-glutamic acid (p<0.001) as the glutamate neurotoxicity model and 10% pregnant serum (p=0.036) as the treatment group. APC-Annexin V/PI labeling were performed to indicate neural apoptosis. While a statistically significant increase in apoptosis was observed in the 80 mM L-glutamic acid group (p=0.012), there was a significant decrease in apoptosis after 10% pregnant serum application (p<0.001). Fluo-4-AM staining was used to measure intracellular calcium uptake and DHE staining for reactive oxygen derivatives. While no significant change was observed in intracellular calcium levels, pregnant serum significantly reduced the rate of reactive oxygen species (p<0.001). Moreover, qRT-PCR analysis was performed to measure the protein expression levels of genes related to the apoptotic pathway in cells, and it was observed pregnant serum largely prevented the increase in apoptotic protein expressions (p<0.001). In summary, pregnant serum was found to be neuroprotective against glutamate toxicity.