Stearamid bazlı nanopartikül sistemlerin hazırlanması ve fibroblast hücrelerine ın vıtro gen transfeksiyonunda kullanılması
Preparation of stearamide-based nanoparticle systems and using in vitro gene transfection of fibroblast cells
Yazar: FUNDA ALKAN
Danışman: DOÇ. DR. NELİSA TÜRKOĞLU
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics

Özet:
Uyarılmış pluripotent kök hücreler (UPKH); hastalık modellemesi, ilaç taraması gibi amaçlarla rejeneratif tıpta kullanılmak üzere diğer kök hücrelere alternatif olarak tercih edilmektedir. Otolog somatik hücrelerden UPK hücreleri elde edilirken önceki literatür çalışmaları incelendiğinde daha çok viral vektörlerin kullanıldığı gözlemlenmektedir. Viral vektörlerin kullanımıyla elde edilen UPK hücrelerinin klinikte kullanımı immün cevap problemleri ve tümör oluşma riskleri sebebi ile sınırlı kalmaktadır. Yeniden programlama teknolojisindeki gelişmeler sayesinde viral vektörler yerine kullanılabilen non viral vektör sistemleri geliştirilmesi mümkün olacaktır. Bizim bu çalışmada amacımız UPK hücrelerinin elde edilmesi için viral olmayan bir vektör sisteminin geliştirilmesi ve transfeksiyon çalışmalarında verimli bir şekilde kullanılması amacıyla özelliklerinin optimize edilmesidir. 
Bu çalışmada katı lipid nanopartikül sınıfına dahil katyonik stearamid setilpridinyum klorid lipid nanopartiküller (SSLN) çözücü difüzyon yöntemiyle hazırlanmıştır. Sentezlenen nanopartikül sistemi; yeşil floresan proteini (GFP), Oct3/4, Sox2, Klf4 ve v-Myc genlerini kodlayan plazmidin fibroblast hücrelerine aktarılması için kullanılacaktır. Plazmid-stearamid nanopartikül kompleksinin düşük sitotoksisite göstermesi ve makrofaj alımını engelleyecek boyutta olabilmesi için zeta potansiyeli ve partikül boyutu üzerine optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Plazmid stearamid nanopartikül kompleksinin sitotoksisite çalışmaları L929 fare fibroblast hücre hattı üzerinde yapılmıştır. Daha sonra plazmid stearamid nanopartikül kompleksi kullanılarak fibroblast hücrelerinin transfeksiyonu gerçekleştirilmiş ve transfeksiyon verimi floresan ataçmanlı inverted mikroskopu ile 4 gün boyunca GFP ekspresyonunun takip edilmesiyle belirlenmiştir.
UPK hücre belirteçleri arasında yer alan Oct3/4, Sox2, Klf4 ve v-Myc genlerinin ekspresyonu RT-qPCR ile belirlenmiştir.  Elde edilen kök hücreler diyabette yara iyileşmesi, kardiyolojik hastalıklar, sinir doku mühendisliği gibi biyomühendislik ve tıp alanlarında karşılaşılan ciddi problemlere çözüm olabilecektir.  

Anahtar Kelimeler: yeniden programlanmış hücreler, kök hücre, katyonik nanopartikül, stearamid

Abstract:
Induced pluripotent stem cells (IPSC) are preferred as an alternative source in regenerative medicine, disease modeling and drug screening thanks to their unique properties compared to other stem cells. As seen from the previous studies in the literature, most of the vector systems used for transfection of somatic cells to obtain IPSC are viral-based. The application of IPSC derived via viral vector systems, are limited due to immune response and tumor formation. 
The aim of this study is to develop a non viral vector system for transfection of Yamanaka factors and to obtain IPSC.  In this study, SLNP synthesis conditons in order to obtain high transfection efficacy were studied.
In this study, cationic stearamide cetylpyridium chloride lipid nanoparticles (SCLN) which are in solid lipid nanoparticle class are prepared via solvent diffusion method. The obtained NP system is going to be used for the delivery of plasmid encoding Oct3/4, Sox2, Klf4, v-Myc and GFP to fibroblast cell line. Optimization studies on zeta potential and particle size have been performed in order to achieve low cytotoxicity and to eliminate macrophage clearance. Cytotoxicity studies for the plasmid/stearamide nanoparticle conjugate have been performed via L929 cell line. Later, transfection of fibroblast cells has been carried out by using plasmid stearamide nanoparticle complex and the transfection efficiency was observed by following GFP expression with the inverted fluorescent microscope for 4 days.
The expression of the Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and v-Myc genes which are IPS cell markers were determined by RT-qPCR. The stem cells are promisind cells and seem as a solution for serious problems encountered in medical fields and bioengineering such as wound healing in diabetes, cardiological diseases and nerve-tissue engineering.

Keywords: reprogrammed cells, stem cell, cationic nanoparticle, stearamide