Bitkisel yağ içeren yemlerle beslenen juvenil çipura balığının (Sparus aurata) yağ asidi metabolizmasının incelenmesi
Investigation of fatty acid metabolism of juvenile gilthead sea bream (Sparus aurata) fed diets containing vegetable oil
Yazar: SAMUEL OFORI-MENSAH
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA YILDIZ ; PROF. DR. MURAT ARSLAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: Su ürünleri = Aquatic products

Özet:
Bu araştırmada, balık yağının (FO) tamamı (kamelina tohumu yağı, CSO ve çiya yağı, CO) ve bir kısmı (%60CSO ve %60CO) yerine kullanılan farklı bitkisel yağların juvenil çipuranın (Sparus aurata, 61,5±4,9 g) büyüme performansına ve yağ asidi metabolizmasına olan etkileri incelenmiştir. Farklı yağ kaynakları içeren beş izo-nitrojenik (%48 ham protein) ve izo-lipidik (%18 ham lipit) yem hazırlanmış ve balıklar bu diyetlerle 90 gün süresince beslenmişlerdir. Balıklardaki yağ asidi metabolizmasını ortaya koymak amacıyla 'Tüm Vücut Yağ Asidi Denge Yöntemi' ile birlikte yağ asidi metabolizmasında görev yapan bazı temel genlerin nasıl etkilendiğini belirlemek amacıyla gen ekspresyonu analizleri yapılmıştır. Araştırmada kullanılan diyetlerin balıkların sağlık ve refahı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için sindirim sisteminin histolojik analizleri yapılmıştır.
 
Deney diyetleriyle beslenen balıkların büyümelerinde istatistiki olarak herhangi bir fark görülmemiştir (P > 0,05). Benzer şekilde, balıkların kondüsyon faktörü, hepatosomatik indeks ve viserosomatik indeks değerleri arasındaki fark önemsiz bulunmuştur (P > 0,05). Bununla birlikte, sadece CSO ve CO içeren diyetlerle beslenen balıkların yem tüketim miktarları ile yemden yararlanma oranları diğer deney gruplarından daha düşük bulunmuştur (P < 0,05). Balıkların tüm vücutlarında yapılan besin maddeleri analizlerinde önemli bir farklılık görülmemiştir (P > 0,05).
 
Deney başlangıcıyla kıyaslandığında, bitkisel yağ tabanlı diyetlerle beslenen balıkların vücutlarındaki linoleik asit (LA, 18:2n-6) düzeyi azalırken karaciğerdeki miktar artmıştır. Aynı balıkların vücut ve karaciğer linolenik asit (ALA, 18:3n-3) ve n-3/n-6 yağ asidi oranları artmıştır. Buna karşın, bitkisel yağ bazlı diyetlerle beslenen balıkların vücut ve karaciğerindeki n-3 HUFA'lardan (çok doymamış yağ asitleri) eikosapentaenoik asit (EPA, 20:5n-3) ve dokosaheksaenoik asit (DHA, 22:6n-3) ile n-6 HUFA'lardan araşidonik asit (ARA, 20:4n-6) düzeyleri sadece balık yağı ile beslenen balıklarınkinden daha düşük bulunmuştur (P < 0,05).

CSO diyeti ile beslenen balıklarda β-oksidasyon en yüksek düzeyde kaydedilmiştir. Elongaz, ∆6 desaturaz ve ∆9 desaturaz aktiviteleri CO diyetiyle beslenen balıklarda en yüksek düzeyde hesaplanmıştır (P < 0,05). Ancak, 'Tüm Vücut Yağ Asidi Denge Yöntemi' hesaplamalarına göre ∆5 desaturaz aktivitesi belirlenemedi. CSO ve CO bazlı diyetlerle beslenen balıklarda LA'nın 18:3n-6, 20:2n-6 ve 20:3n-6 yağ asitlerine dönüşümü diğer deney gruplarından daha yüksek düzeyde gerçekleşmiştir. Aynı balıklarda, ALA'nın 18:4n-3, 20:3n-3 ve 20:4n-3 yağ asitlerine dönüşümü diğer deney gruplarından daha yüksek olmuştur (P < 0,05).

Yemleme deneylerinin tamamlanmasından sonra alınan balık örneklerindeki yağ asitlerinin sentezi, oksidasyonu, lipolizi, elongasyonu ve desaturasyonunu (∆6 ve ∆9) belirlemek amacıyla farklı genlerde yapılan gen ekspresyonu sonucunda CSO, CO ve 60CO gruplarındaki balıklarda, yağ açil desaturaz 2 (FADS2, ∆-6 desaturaz) düzeyi diğer deney gruplarından daha yüksek bulunmuştur (P < 0,05). Stearoil-CoA desaturaz 1b (SCD1b, ∆-9 desaturaz) gen ekspresyonu, CSO ve CO gruplarındaki balıklarda daha yüksek düzeylerde gerçekleşmiştir (P < 0,05). ELOVL 6, ELOVL 5, ELOVL 4 ve ELOVL 1b'nin gen ekspresyonu, FO diyetiyle beslenen balıklarda en düşük düzeyde kaydedilmiştir. Karboksil Ester Lipaz (CEL) ekspresyonu CO ile beslenen balıklarda en yüksek düzeyde bulunmuştur. Ancak, diğer bitkisel yağ bazlı diyetlerle beslenen balıklar arasında önemli bir fark kaydedilmemiştir (P > 0,05). Hepatik lipaz (HL)  gen ekspresyonu, 60CSO diyeti ile beslenen balıklarda en yüksek düzeyde (P <0,05) iken, CO diyeti ile beslenen balıklarda ise lipoprotein lipaz (LPL) gen ekspresyonu en yüksek düzeyde (P < 0,05) kaydedilmiştir. Hormon duyarlı lipaz (HSL), karnitin palmitoiltransferaz (CPT) 1a ve sitokrom C oksidaz 2 (COX2) için yapılan gen ekspresyonu analizlerinde, CO diyeti ile beslenen balıklarda en yüksek düzey (P < 0,05) elde edilmiştir. CPT 1b gen ekspresyonu, CO ve 60CSO diyetleri ile beslenen balıklarda diğer gruplardaki balıklardan daha yüksek düzeyde kaydedilmiştir. Peroksizom proliferatoraktivedilen reseptörler (PPAR) için yapılan analizlerde, PPARα ekspresyon düzeyi 60CSO, CO ve 60CO diyetleri ile beslenen balıklarda diğer gruplara göre daha yüksek düzeyde kaydedilmiştir (P < 0,05). CSO ve CO bazlı diyetlerle beslenen balıkların PPARβ ekspresyonu diğer deney gruplarından  daha yüksek düzeyde kaydedilmiştir (P < 0,05). PPARγ ekspresyonu ise 60CO diyeti ile beslenen balıklarda en yüksek düzeyde kaydedilmiştir (P < 0,05). Yağ asidi sentaz (FAS) ve lizofosfatidilkolin açiltransferaz 1 (LPCAT1) ekspresyonu, sırasıyla 60CO ve 60CSO diyetleri ile beslenen balıklarda en yüksek düzeylerde bulunmuştur (P <0.05).
 
Araştırmada elde edilen sonuçlara göre diyetlerde balık yağı yerine tamamen (CO ve CSO) yada kısmen (60CO ve 60CSO) kullanılan kamelina tohumu ve çiya yağlarının juvenil çipuranın büyüme performansını olumsuz olarak etkilenmediği görülmüştür. Bununla birlikte balık yağı içermeyen diyetlerle beslenen balıklarda yem tüketimi ve yemden yararlanma oranı düşmüştür. Bu durum, balıkların FO içermeyen diyetleri de etkili bir şekilde kullandıkları sonucunu ortaya koymaktadır. CSO ve CO bazlı diyetlerle yapılan beslenme sonucunda, balıklardaki β-oksidasyon düzeyleri artmış ve sözü edilen diyet gruplarındaki β-oksidasyon için ALA  tercih edilen substrat olmuştur. n-3 ve n-6 HUFA'ları düşük miktarda içeren diyetlerle (CO ve CSO bazlı diyetler) beslenen juvenil çipuradaki elongaz ve desaturaz (∆-6 ve ∆-9) aktiviteleri FO grubuna göre daha yüksek düzeyde bulunmuştur. Bu durum, balıkların tüm vücut ve karaciğerindeki elongasyon ve desaturasyon aktiviteleri sonucunda daha çok doymamış yağ asitlerinin üretildiğini göstermiştir. Yapılan bu doktora tezi araştırması sonucunda, yağ asidi metabolizmasında görev yapan genlerin ekspresyon düzeyleri 'Tüm Vücut Yağ Asidi Denge Metodu' ile yapılan hesaplamalar ile elde edilen  sonuçları desteklediği görülmüştür. Çok düşük düzeylerde n-3 ve n-6 HUFA içeren CO ve CSO diyetleri ile beslenen balıklarda gerçekleşen elongasyon ve desaturasyon aktiviteleri, balıkların EFA ihtiyaçlarını hafifletme yönünde bir etki gösterdiği sonucu ortaya çıkmıştır. Ancak bu durumun balıkların HUFA'lara olan ihtiyacını tamamen ortadan kaldırmak için yeterli olmadığını göstermiştir.

Abstract:
This study evaluated the effects of total (camelina seed oil, CSO and chia oil, CO) or partial (60%, 60CSO and 60CO) replacement of fish oil with different vegetable oils on growth performance and fatty acid metabolism in juvenile gilthead sea bream (Sparus aurata, 61.5 ± 4.9 g).  Five iso-nitrogenous (48% crude protein) and iso-lipidic (18% crude lipid) experimental diets were prepared with different oils and fed to juvenile gilthead sea bream for 90 days. The Whole Body Fatty Acid Balance Method was used to investigate the in vivo fatty acid metabolism in fish. Further, gene expression studies was carried out to determine the effects of the diets on some of the major genes involved in fatty acid metabolism in sea bream. Histological examination of digestive system was performed to assess the effects of the dietary treatments on welfare and health of gilthead sea bream.
  
Growth did not differ (P > 0.05) when juvenile gilthead sea bream were fed the experimental diets. Similarly, condition factor, hepatosomatic index and viscerosomatic index did not differ among experimental groups (P > 0.05). In addition, fish fed CSO and CO diets recorded lower feed intake and feed conversion ratios (P < 0.05). Slight variations in proximate composition of whole body of juvenile gilthead sea bream were recorded.
 
Feeding vegetable oil-based diets reduced body content of linoleic acid (LA, 18:2n-6) whereas this fatty acid increased in liver in comparison to the initial fish. Body and liver contents of linolenic acid (ALA, 18:3n-3) fatty acid and n-3/n-6 ratio were increased when fish were fed CSO and CO-based diets. However, reduced (P < 0.05) body and liver contents of the highly unsaturated fatty acids (HUFA) eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3), docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) and arachidonic acid (ARA, 20:4n-6) were associated with feeding CSO and CO-based diets.
  
Fish fed CSO diets recorded the highest β-oxidation (P < 0.05). Elongase, ∆-6 desaturase and ∆-9 desaturase activities were highest in CO fed fish (P < 0.05). However, ∆-5 desaturase activity could not be determined when the whole body fatty acid balance method was applied. Bioconversion of dietary LA to 18:3n-6, 20:2n-6 and 20:3n-6 and ALA to 18:4n-3, 20:3n-3 and 20:4n-3 fatty acids was recorded in fish fed CSO and CO-based diets.
 
Expression of the various genes involved in fatty acid synthesis, oxidation, lipolysis, elongation and desaturation (∆6 and ∆9) were analyzed at the end of the experimental feeding. Fish fed CSO, CO and 60CO diets recorded higher expression (P < 0.05) of fatty acyl desaturase 2 (FADS2, ∆-6 desaturase). For stearoyl-CoA desaturase 1b (SCD1b, ∆-9 desaturase), all fish fed CSO and CO-based diets had higher expression (P < 0.05). FO fed fish expressed the lowest expression of the elongases, ELOVL 6, ELOVL 5, ELOVL 4 and ELOVL 1b genes (P < 0.05). CO fed fish had the highest expression for carboxyl ester lipase (CEL), although it did not differ from the levels of expression observed in fish fed the other VO-based diets. Expression of hepatic lipase (HL) gene was highest (P < 0.05) in 60CSO fed fish whereas CO fed fish exhibited the highest (P < 0.05) expression in lipoprotein lipase (LPL) gene. Gene expressions for hormone sensitive lipase (HSL), carnitine palmitoyltransferases (CPT) 1a and cytochrome C oxidase 2 (COX2) were highest in CO fed fish (P < 0.05). Higher expression for CPT 1b gene was observed in fish fed CO and 60CSO diets. For the peroxisome proliferatoractivated receptors (PPARs), PPARα expression was comparatively higher (P < 0.05) in 60CSO, CO and 60CO fed fish. Fish fed CSO and CO-based diets showed higher (P < 0.05) levels of PPARβ expression. For PPARγ, highest level (P < 0.05) of expression was recorded in 60CO fed fish. Gene expression for fatty acid synthase (FAS) and lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 (LPCAT1) were highest (P < 0.05) in fish fed 60CO and 60CSO diets, respectively. 

Based on our results, the total (CSO and CO) or partial (60CSO and 60CO) replacement of dietary FO with CSO or CO did not negatively affect growth in juvenile gilthead sea bream.  Further, feed intake and feed conversion ratio decreased when fish were fed FO-devoid diets. This suggests that fish were able to use such diets efficiently. Feeding CSO and CO-based diets led to increased β-oxidation, with dietary ALA being the preferential substrate for β-oxidation. Feeding sea bream diets low in HUFA led to increased in vivo elongase and desaturase (∆-6 and ∆-9) activities. Consequently, this resulted in the appearance of products associated with elongase and desaturase activities in whole body and liver of fish. The expression of genes involved in fatty acid metabolism was higher in fish fed CSO and CO-based diets, corroborating the results of the whole body fatty acid balance method. With limited supply in HUFA, the presence of products of elongation and desaturation of dietary ALA and LA signify attempts by the juvenile gilthead sea bream to alleviate EFA deficiencies in their diets. However, this was not enough to alleviate these deficiencies.