İmmün yeterli ve immün yetmezlikli ishalli olgularda gözden kaçan protozoonların konvansiyonel ve moleküler yöntemlerle araştırılması
The investigation of neglected protozoans in immunocompetent and immunodeficient diarrheal patients using by both conventional and molecular methods
Yazar: FAKHRIDDIN SARZHANOV
Danışman: PROF. DR. FUNDA DOĞRUMAN AL
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Blastocystis = Blastocystis ; Dientamoeba fragilis = Dientamoeba fragilis ; Diyare = Diarrhea ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Protozoa = Protozoa ; Teşhis = Diagnosis ; İmmün sistem = Immune system ; İmmün yetmezlik = Immun deficiency ; İmmünite = Immunity

Özet:
Gastrointestinal semptomları olan olgularda Blastocystis ve Dientamoeba fragilis (D.fragillis)'in klinik önemi tartışmalı konulardan birisidir. Bu protozoonların patojenitesi tam olarak aydınlatılamadığı için çoğu rutin laboratuvar ve klinisyen tarafından ihmal edilen bir yaklaşım bulunmaktadır. Bu çalışmada immün yeterli (kadın: 99, erkek: 94, yaş ortalaması-standart sapma:43,88+17,53) ve immün yetmezlikli (kadın:136, erkek:109, yaş ortalaması-standart sapma:52,58+16,05) ishalli hastaların dışkı örneklerinde Blastocystis ve D. fragilis'in görülme sıklığının konvansiyonel ve moleküler yöntemlerle belirlenmesi, Blastocystis alt türlerinin Yeni Nesil Dizi analizi (NGS) yöntemi kullanılarak saptanması amaçlanmıştır. Çalışmamıza toplam 245 immün yetmezlikli ve 193 immün yeterli hastaya ait toplam 438 örnek dahil edilmiştir. Tüm dışkı örnekleri direkt mikroskobik (Serum fizyolojik, Lugol) Formol-eter konsantrasyon tekniği, Trikrom boyama, kültür ve moleküler yöntemlerle incelenmiştir. Çalışmamızda Blastocystis prevalansı %15,5, D. fragilis prevalansı ise %11,9 olarak saptanmıştır. Blastocystis ve D. fragilis prevalansı immün yetmezlikli hastalarda (sırasıyla %11,4 ve %10,6) immün yeterli olan hastalara (%20,7 ve %13,5) göre daha düşük bulunmuştur. Blastocystis prevalansı için her iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark (χ2=7,07, p=0,008) saptanırken D. fragilis için istatiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır. Blastocystis enfeksiyonu iki grup arasında erkeklerde kadınlara göre anlamlı olarak yüksek tespit edilmiştir (χ2=6,83, p=0,01). Toplam 68 Blastocystis izolatının NGS analiziyle alt tür analizi yapılmış ve alt tür dağılımı: ST3 %54,4 (n=37), ST2 %16,2 (n=11), ST1 %4,4 (n=3), ST6 %2,9 (n=2), ST4 %1,5 (n=1), ST2/ST3 %11,8 (n=8) ve ST1/ST3 %8,8 (n=6) şeklinde bulunmuştur. İki grup arasında Blastocystis alt tür dağılımında istatistiksel olarak anlamlı fark sadece miks alt türlerde saptanmış (χ2=4,43, p=0,04) ve immün yeterlilerde daha yüksek sıklıkta belirlenmiştir. İmmün yetmezlikli kadınlarda Blastocystis döngü eşiği (Ct) ortalaması immün yeterli kadınlara göre daha düşük bulunmuş dolayısıyla parazit yükü daha yüksek tespit edilmiştir (p=0,04). Her iki hasta grubunda da Blastocystis ve D. fragilis enfeksiyonunun yüksek prevalansta saptanması ishalli olgularda bu etkenlerin gözönünde bulundurulması gerektiğini göstermektedir.

Abstract:
The clinical significance of Blastocystis and Dientamoeba fragilis in patients with gastrointestinal symptoms is a controversial issue. Since the pathogenicity of these protozoans cannot be fully elucidated, there is an approach neglected by most routine laboratories and clinicians. This study aimed to determine the prevalence of Blastocystis and D. fragilis using conventional and molecular methods and identify Blastocystis subtypes using the next-generation sequencing (NGS) method in the diarrheic stool samples of immunodeficient and immunocompetent patients. A total of 438 samples of 245 immunodeficient (female: 136, male: 109, mean age-standard deviation: 52,58±16,05 years) and 193 immunocompetent (female: 99, male: 94, mean age-standard deviation: 43,88±17,53 years) patients were included. All stool samples were examined by direct microscopy (serum physiologic, Lugol's staining), formalin-ether concentration technique, and trichrome staining, culture and molecular methods. In our study, the prevalence of Blastocystis was detected as 15,5%, and that of D. fragilis was 11,9%. The prevalence of Blastocystis and D. fragilis was lower in immunodeficient patients (11,4% and 10,6%, respectively) compared to the immunocompetent patients (20,7% and 13,5%, respectively). While there was a statistically significant difference (χ2=7,07, p=0,008) between the two groups for the Blastocystis prevalence, no statistically significant difference was found for D. fragilis. The rate of Blastocystis infection was significantly higher among males than females in both groups (χ2=6,83, p=0,01). A subtype analysis was performed by NGS on 68 Blastocystis isolates, which revealed the subtype distribution as follows: ST3 54,4% (n=37), ST2 16,2% (n=11), ST1 4,4% (n=3), ST6 2,9% (n=2), ST4 1,5% (n=1), ST2/ST3 11,8% (n=8) and ST1/ST3 8,8% (n=6). There was a statistically significant difference in the distribution of Blastocystis subtypes between the two groups only for mixed subtypes (χ2=4,43, p=0,04), which was determined at a higher rate among the immunocompetent patients. The mean of Blastocystis cycle threshold (Ct) was found to be lower in women with immunodeficiency compared to immunocompetent women; thus, the parasite load was higher in the former (p=0,04). The detection of Blastocystis and D. fragilis infection at high prevalence in both patient groups shows that these factors should be considered in cases with diarrhea.