Bacillus thuringiensis ekzopolifosfataz genine (ppx) ait olası promotorun aktivitesinin lusiferaz haberci geni aracılığıyla ölçülmesi
Measurement of putative promoter activity of Bacillus thuringiensis exopolyphosphatase gene (ppx) by using luciferase reporter gene
Yazar: ŞERİF YILMAZ
Danışman: DOÇ. DR. SEDEF TUNCA GEDİK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bacillus thuringiensis var. israelensisin = Bacillus thuringiensis var. israelensisin ; Polifosfatlar = Polyphosphates

Özet:
Tüm bakteri, mantar, bitki ve hayvan hücrelerinde bulunan polifosfat (poliP); ortofosfat birimlerinin fosfoanhidrit bağlarıyla birbirine bağlanmasıyla oluŞan düz yapılı bir polimerdir. Bu polimer, hücre içinde önemli fizyolojik ve metabolik olayların gerçekleŞmesinde rol oynar. PoliP metabolizmasında, ATP`den dönüŞümlü olarak poliP sentezleyen -poliP kinaz? (PPK), poliP`ı inorganik fosfata hidroliz eden -ekzopolifosfataz? (PPX), poliP`dan aldığı fosfatı kullanarak AMP`ı ADP`a dönüŞtüren -poliP:AMP fosfotransferaz? (PAP) enzimleri görev almaktadır.Bütün zararlarına rağmen, kimyasal pestisitler ormancılık, tarım ve ziraatte önemli yer tutmaktadırlar. Günümüzde çevre dostu biyolojik pestisitler, kimyasal pestisitlere alternatif olarak kullanılmaktadır. Biyolojik pestisit üretiminde ise en çok yararlanılan mikroorganizmalardan birisi Bacillus thuringiensis (Bt)`dir.Literatürde özellikle Bacillus grubu bakterilerde poliP ile ilgili bilimsel boŞluk vardır. Bu polimer ile ilgili olarak bilgimiz dahilinde Bacillus grubu bakterilerde 2004 yılında yayınlanmıŞ tek bir çalıŞma bulunmaktadır (Shi ve. ark., 2004). Bu çalıŞmada, PoliP`nin B. cereus`un hareketliliği, biyofilm oluŞturması ve sporulasyonu için önemli olduğu gösterilmiŞtir. PoliP`nin B. thuringiensis`in biyoinsektisit biyosentezini de etkilediği TBAG-107T812 numaralı Tübitak projesi kapsamında grubumuzca gösterilmiŞtir. Bu tez kapsamında, çalıŞılan mikroorganizmalarda çok önemli görevleri gerçekleŞtiren poliP polimerinin yıkımından sorumlu olan PPX enzimini kodlayan gene ait pütatif promotorun farklı fosfat konsantrasyonlarındaki aktivitisenin ölçülmesi amaçlanmıŞtır. Bu amaçla, içinde ppx baŞlama kodonu bulunan ve vbulunmayan iki ayrı ppx promotor bölgesi PCR ile çoğaltılmıŞ ve promotoru olmayan lusiferaz haberci geninin üst bölgesine klonlanmıŞtır. Fakat denenen farklı yöntemlere rağmen rekombinant Bacillus suŞlarında lusiferaz aktivitesi gözlenememiŞtir. Bunun üzerine, ppx geninin farklı fosfat konsantrasyonlarında nasıl ifade edildiğini bulmak için RT-PCR deneyi yapılmıŞtır. Bunun için, DSM besiyerinde 0 mM, 20 mM, 40 mM, 60 mM ve 80 mM fosfat konsantrasyonlarında 6 saat inkübe edilen örneklerden izole edilen RNA`lar kullanılarak cDNA sentezlenmiŞtir. Bu cDNA`lar kalıp olarak kullanılarak ppx genlerine uygun primerlerle PCR yapılmıŞtır. ppx geninin ifadesinin en fazla 0 mM ve 20 mM fosfat varlığında gerçekleŞtiği görülmüŞtür. Diğer fosfat konsantrasyonlarında ise ppxgeninin, 40 mM fosfat yoğunluğunun 80 mM fosfat yoğunluğundan daha fazla ifade edildiği bulunmuŞtur.Anahtar kelimeler: ekzopolifosfataz, ppx, polifosfat (poliP), Bacillus thuringiensis

Abstract:
Polyphosphate (polyP), which is found in every living cell, is a linear polymer consisting of orthophosphate molecules joined together by high-energy anhydride bonds. This polymer play role in important physiological and metabolic events inside the cell. PolyP kinase (PPK), which synthesizes polyP reversibly from ATP, exopolyphosphatase (PPX), which hydrolyzes polyP to inorganic phosphate and poly-P AMP phosphotransferase (PAP), which convert AMP to ADP by using polyP as a phosphate donor, are the enzymes involved in polyP metabolism.Although they are harmful, chemical pesticides play important role in commercial agriculture, forest management and mosquito control. Nowadays, biological pesticides are used as an alternative to synthetic chemical pesticides. In the biological pesticide production, Bacillus thuringiensis (Bt) is the most useful microorganism.To our knowledge there is only one study about the role of this polymer, which has very important functions in the microorganisms studied, in Bacillus (Shi ve. ark., 2004). In this study, it has been shown that polyP is necessary for the motility, biofilm formation and sporulation in Bacillus cereus. With our TÜBİTAK project (TBAG-107T812), we showed that polyP also affects bioinsecticide production by B. thuringiensis.In this thesis, it is aimed to measure activity of the putative promoter of the gene encoding PPX enzyme, which is responsible from degradation of polyP polymer, in different phosphate concentrations. For this purpose, two separate promoter regions, one with and the other without start codon of ppx gene, were amplified by PCR and cloned to the upper site of luciferase reporter gene. No lusiferase activity was seen in recombinant Bacillus strains, although different methods were used. Then RT-PCR was carried out in order to find how the ppx gene is expressed under different phosphate concentrations. cDNA was synthesized by using RNAs isolated from samples of Bti cells which were grown for 6 hour in DSM medium having 0 mM, 20 mM, 40 mM, 60 mM ve 80 mM phosphate concentration. By using these cDNAs as template, PCR was carried out with primers spesific for ppx gene. The highest expression of ppx gene was obtained at 0 mM and 20 mM phosphate concentrations. In the other phosphate concentrations, the expression of ppx gene was found to be higher in 40 mM phosphate concentration than 80 mM phosphate concentration.