Ekstrakorporeal yaşam desteğindeki hastalarda optimum biyokimyasal takip: hemoliz kriterleri ve anaerobik metabolizma
Optimal biochemical follow up on patients in extracorporeal life support: hemolysis criteria and anaerobic metabolism
Yazar: METİN GENÇ
Danışman: PROF. DR. ASLIHAN AVCI
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biyokimyasal özellikler = Biochemical properties ; C reaktif protein = C reactive protein ; Ekstrakorporeal membran oksijenasyonu = Extracorporeal membrane oxygenation ; Hemoglobinler = Hemoglobins ; Hemoliz = Hemolysis ; Laktatlar = Lactates ; Metabolizma = Metabolism ; Nitrik oksit = Nitric oxide

Özet:
Amaç: Bu çalışmada, mg/dL seviyesinde hemoglobin ölçümü yapabilen bir yöntemle, EKMO uygulanan hastaların serbest plazma hemoglobin seviyelerini belirlemek ve elde edilen bu serbest plazma hemoglobin seviyeleriyle, hastaların nitrik oksit, laktat, laktat dehidrogenaz ve haptoglobin miktarları arasındaki ilişkiyi değerlendirmek, amaçlanmıştır. 
Gereç ve Yöntem: Bu çalışma, toplam 18 hastanın, EKMO'ya bağlı olduğu süre boyunca alınan toplam 100 örneğiyle yapıldı. Hastalardan, EDTA'lı kan örneği alınarak, santrifüjle plazması ayrıldı ve 1250, 350 ve 300 µL hacimlerde üç parçaya bölündü. İlk kısımda sHb ölçümü ve biyokimyasal analizler (LDH, CRP, TG, TB, DB) yapıldı. Diğer iki kısımda, sırasıyla Hp ve NO testleri çalışıldı. Hastaların günlük laktat sonuçlarının ise verileri kullanıldı. Oksihemoglobin izolasyonu için EDTA'lı kan örneği santrifüj edilerek alttaki hücresel kısım alındı. 3 defa soğuk FTS ile yıkanarak daha sonra distile su ile hemolize edildi. Elde edilen oksihemoglobin çözeltisiyle öncelikle değişen konsantrasyonlarda (1, 4, 10, 20, 30, 50, 75, 115, 160 ve 200 mg/dL), FTS'de ve plazmada, standart eğrileri oluşturuldu. Daha sonra farklı bilirubin (yaklaşık 0, 0,2, 1, 4, 10 mg/dL TB) ve lipit (yaklaşık 0, 100, 200 mg/dL TG) konsantrasyonlarının, yaklaşık 10 ve 50 mg/dL' sHb seviyeleri üzerindeki etkileri değerlendirildi.
Bulgular: FTS'de ve plazmada, konsantrasyonlarına göre absorbans grafikleri çizilen oksihemoglobin standart eğrilerinden, sırasıyla 178,6 ve 181,8 faktör değerleri elde edildi. Daha sonra plazmada yaklaşık 10 mg/dL'lik sHb standardının artan bilirubin (0, 0,2, 1, 4, 10 mg/dL TB) ve lipit konsantrasyonlarında (0, 100, 200 mg/dL TG) sırasıyla 10,92, 11,01, 10,77, 10,69, 10,53 ve 11,03, 11,54, 11,40 olarak değiştiği görüldü. Plazmada yaklaşık 50 mg/dL'lik sHb standardının ise benzer bilirubin ve lipit konsantrasyonlarında sırasıyla 48,75, 48,41, 49,00, 48,56, 48,80 ve 47,88, 47,95, 46,10 olarak değiştiği görüldü. EKMO hastalarının sHb, LDH, laktat ve CRP seviyelerinin anlamlı yüksek (p≤ 0,000), NO metabolitlerinin ve Hp seviyelerinin anlamlı düşük (p≤ 0,000) olduğu görüldü. sHb konsantrasyonlarıyla, plazma NO (R= 0,308, p= 0,002), laktat (R= 0,634, p≤ 0,000), LDH (R= 0,405, p≤ 0,000) ve CRP (R= 0,219, p=0,029) seviyeleri arasında anlamlı korelasyon bulundu. Ayrıca NO miktarlarıyla laktat seviyeleri arasında (R= 0,247, p= 0,034) ve laktat miktarlarıyla CRP seviyeleri arasında (R= 0,430, p≤ 0,000) da anlamlı ilişki bulundu.
Sonuçlar: Kimyasal eklemeli tekniklere göre, Cripps yöntemi, daha güvenli, kullanımı kolay, daha pratik ve doğrudur. Bu yöntemle plazmada oluşturulan standart eğrisinden elde edilen faktör değeri, 200 mg/dL sHb seviyelerine kadar güvenle kullanılabilir. 10 mg/dL TB ve 200 mg/dL lipit konsantrasyonlarına kadar girişim düzeyi düşüktür. EKMO hastalarının, referans değerinin orta noktalarına göre, sHb ve LDH seviyelerinin anlamlı yüksek, NO ve Hp seviyelerinin ise düşük olduğu görüldü. Ayrıca bu hastalarda, doku oksijenasyonu (laktat) ve enflamasyon (CRP) belirteçleri de referans değerlerinin orta noktalarına göre anlamlı yüksek bulundu. Korelasyon analizine göre, sHb seviyeleriyle ilişkisi incelendiğinde, hastaların LDH düzeylerine bakılarak, hastaların hemoliz düzeyi hakkında orta düzeyde fikir sahibi olunabilir. Ancak hastaların Hp seviyelerine bakılarak hemoliz düzeyleri hakkında yorum yapmak uygun olmayabilir. Hemoliz,  özellikle O2Hb'nin direkt NO ile tepkimesiyle veya arginaz-1 salınımıyla NO biyoyararlanımında azalmaya neden olabilmektedir. sHb etkisiyle azalan NO özellikle mikrovasküler dolaşımda bozulmaya neden olarak doku kanlanmasında ve dolayısıyla doku oksijenasyonunda bozulmaya ve sonuç olarak da hastaların laktat seviyelerinde yükselmeye neden olabilir.

Abstract:
Aim: In this study, it was aimed that determine the free plasma hemoglobin levels of ECMO applied patients with a method capable of measuring mg/dL levels of hemoglobin and with the obtained free plasma hemoglobin levels, assess the relationship between patients' nitric oxide, lactate, lactate dehydrogenase and haptoglobin amounts.
Materials and Methods: This study, was conducted with a total of 18 patients' 100 samples taken during ECMO was connected. A blood sample was taken from the patient, plasma was separated by centrifugation and divided into three parts in 1250, 350 ve 300 µL volumes. In the first part, fHb measurement and biochemical analysis (LDH, CRP, TG, TB, DB) was performed. In the other two part NO and Hp tests were studied respectively. The data of patients' daily lactate results were used. For oxyhemoglobin isolation, blood samples with EDTA were centrifuged, bottom cellular part was taken and it was washed three times with cold PBS then hemolyzed with distilled water. First standards at varying concentrations (1, 4, 10, 20, 30, 50, 75, 115, 160 and 200 mg/dL) was prepared with obtained oxyhemoglobin solution, standard curve was created in the PBS and plasma. Then it was evaluated that different bilirubin (about 0, 0.2, 1, 4, 10 mg/dL TB) and lipids concentrations' (about 0, 100, 200 mg/dL TG) effects on about 10 and 50 mg/dL fHb containing in thesolutions.
Results: In PBS and plasma, the oxyhemoglobin standards' graph was plotted according to the absorbance to concentration, respectively 178.6 and 181.8 factor values were obtained. Then in plasma, it has been shown to vary that about 10 mg/dL sHb standard's at increased bilirubin (0, 0.2, 1, 4, 10 mg/dL TB) and lipid concentrations (0, 100, 200 mg/dL, TG) 10.92, 11.01, 10.77, 10.69, 10.53 and 11.03, 11.54, 11.40 respectively. In plasma, it has been shown to vary that about 50 mg/dL sHb standard's at the same bilirubin and lipid concentrations 48.75, 48.41, 49.00, 48.56, 48.80 and 47.88, 47.95, 46.10 respectively. SHb It has been seen that ECMO patients' sHb, LDH, lactate and CRP levels were significantly higher (p≤ 0,000), NO metabolites and Hp levels were significantly lower (p≤ 0,000). It was found that there were significant correlation with SHb concentrations between plasma NO (R= 0.308, p= 0.002), lactate (R= 0.634, p≤ 0,000), LDH (R= 0.405, p≤ 0,000) and CRP (R= 0.219, p= 0.029) levels. Also it was found that there were significant relationship between the NO amounts and lactate levels (R= 0.247, p= 0.034) and between CRP levels and the amount of lactate (R= 0.430, p≤ 0,000).

Conclusions: According to the chemical additive technique, Cripps method is more secure, easier to use, more practical and accurate. Factor value which was generated in the plasma, obtained from the standard curve by this method, can be safely used up to the 200 mg/dL levels of fHb. Up to the 10 mg/dL TB and 200 mg/dL lipid concentrations level of interference is low. Hemolytic indicators of ECMO patients (SHB, NO, LDH, and HP) were significantly different. In addition, tissue oxygenation (lactate) and inflammation (CRP) markers were found significantly elevated. According to correlation analysis, examining the relationship between fHb levels, looking at patients LDH may be had moderate level an idea about patients hemolysis levels. However, looking at patients Hp level may not be suitable to comment on the hemolysis levels. Particularly a direct reaction of O2Hb with NO or arginase-1 release, hemolysis may lead to reduction of bioavailability of the NO. By effect of fHb, NO reduction, particularly as microvascular circulation, may cause the deterioration of tissue perfusion and tissue oxygenation and as a result, the increase in lactate levels of patients.