Kumarin türevlerinin Bacteroides fragilis'in D-LDH enzimi üzerine olan inhibitör etkisinin belirlenmesi
Determination of inhibitory effects of coumarin derivatives on Bacteroides fragilis D-LDH enzyme
Yazar: ERENNUR UĞUREL
Danışman: PROF. DR. DİLEK BALIK ; DR. ÖZKAN DANIŞ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Bacteroides fragilis = Bacteroides fragilis ; Kumarinler = Coumarins

Özet:
Bacteroides fragilis insan kolon florasında doğal olarak bulunan anaerobik bir bakteridir. B. fragilis'in D-laktat dehidrogenazı (BfD-LDH), D-laktatın piruvata dönüşümünü katalize eden çok önemli bir enzimdir ve anaerobik glikolizi düzenler. B. fragilis ile ilgili yapılan son çalışmalar kolon kanseri ile ilişkisini açığa çıkarmıştır. Dünya genelinde B. fragilis'in enterotoksijenik suşunun sebep olduğu enfeksiyonlara karşı antibiyotik direnç geliştiği bildirilmiştir. Bu nedenle, bu enfeksiyonların tedavisi için yeni yaklaşımlar bulunmasına yönelik çalışmaların yapılması zorunludur. Bu tez çalışmasında, B. fragilis'in kolon florasındaki enfeksiyonunun baskılanması için BfD-LDH'ın inhibe edilmesi hedeflenmiştir. Laboratuvar grubumuz tarafından klonlanmış ve protein ekspresyonu gerçekleştirilmiş olan BfD-LDH'ı saflaştırmak için Ni-NTA agaroz kolonları ile afinite kromatografisi yöntemi uygulanmıştır. SDS-PAGE analizi ile enzimin yüksek miktarda ve %95 üzeri saflıkla elde edildiği gösterilmiştir. Daha önce sentezlenmiş olan ve -hidroksi, -asetoksi ve -metoksi grupları taşıyan 29 adet kumarin türevinin BfD-LDH üzerindeki inhibe edici etkileri spektrofotometrik olarak incelenmiştir. Yapılan taramada 15 kumarin türevinin 10 µM ve altında IC50 değeri ile BfD-LDH'ı yüksek seviyede inhibe ettiği bulunmuştur. En düşük IC50 değerini gösteren 3 kumarin türevi için (K5: 0,47 µM, K21: 0,57 µM ve K23: 0,057 µM) enzim inhibisyonu mekanizması ve enzimli reaksiyonun kinetik parametreleri ayrıntılı olarak incelenmiş ve bu bileşikler ile BfD-LDH inhibisyonu mekanizmasının yarışmasız inhibisyon olduğu bulunmuştur (Ki değerleri sırasıyla; 0.4532, 0.5183 ve 0. 3603 µM). In silico analiz için ChemDraw V10 programı ile kumarin türevlerinin kimyasal yapıları çizilmiş ve MarvinSketch V6.2 programı ile konformasyonları gösterilmiştir. Kumarin türevlerinin docking çalışmaları Molegro Virtual Docker programı ile gerçekleştirilmiştir. Yapılan docking çalışmaları sonucunda kumarin türevlerinin enzimin aktif kalıntıları ile etkileşip etkileşmedikleri gösterilmiştir. Bu çalışma BfD-LDH üzerine yapılan ilk inhibisyon çalışmasıdır. Bulunan yüksek inhibisyon sonuçları ve enzimin insanda eşdeğerinin olmaması daha ileri in vivo çalışmalar için ümit vericidir.

Abstract:
Bacteroides fragilis is an anaerobic bacteria naturally hosted in the human colon flora. B. fragilis D-lactate dehydrogenase (BfD-LDH) is an important enzyme which catalyzes the conversion of D-lactate to pyruvate and regulates anaerobic glycolysis. Recent studies show that B. fragilis has been associated with colon cancer. Antibiotic resistance has been reported worldwide against infections caused by enterotoxigenic strains of B. fragilis. Therefore, it is necessary to find new approaches to treating infections caused by resistant bacteria. In this thesis study, BfD-LDH is selected as a target for suppressing of infections caused by B. fragilis in the colon flora. BfD-LDH, that has been cloned and expressed by our laboratory group, is purified with affinity chromatography using Ni-NTA agarose column. SDS-PAGE analysis results show that high amounts of protein was obtained with purity of %95. Inhibitory activities of 29 previously synthetized coumarin derivatives, bearing hydroxyl, acetoxyl and methoxyl substitutions, on BfD-LDH were investigated. In the screening it was found those 15 coumarin derivatives were potently inhibited BfD-LDH with IC50 values lower than 10µM. For the coumarin derivatives with the highest inhibitory activity (K5, K21 and K23) inhibition mechanism and kinetic parameters of the enzymatic reaction were studied in detail. Enzyme inhibition mechanism of these compounds was determined as noncompetitive inhibition (Ki = 0.4532, 0.5108 and 0.3603 µM, respectively). For in silico analysis, chemicals were sketched and confermers were identified by ChemDraw v10 and MarvinSketch v6.2 programs. Docking of the coumarins was carried out using Molegro Virtual Docker program and interaction between the coumarin derivatives and active side residues of the enzyme were demonstrated. This study is a pioneer in the inhibition of BfD-LDH. High inhibitory activity of coumarin derivatives and the absence of the equivalent enzyme in human, give hope for future in vivo studies.