Glutatyon-S-transferaz enziminin epiklorohidrin ara kolu üzerinden magnetik demir nanopartiküllere kovalent immobilizasyonu ve karakterizasyonu
Covalent immobilization and characterization of glutathi̇one-S-transferaze enzymes on to magneti̇c i̇ron nanoparti̇cles vi̇a epichlorohydrin i̇ntermedi̇ate spacer arm
Yazar: MUSTAFA KEMAL ÇAĞLAR
Danışman: PROF. DR. RAMAZAN BİLGİN
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada, Fe3O4 magnetik nanopartiküllerin sentezi ve glutatyon-S-transferaz enziminin Fe3O4 magnetik nanopartiküllere epikolorohidrin ara kolu üzerinden kovalent olarak immobilizasyonunun araştırılması, serbest ve immobilize enzimlerin maksimum aktivite gösterdiği koşulların (pH ve sıcaklık), kinetik parametrelerinin (Km, Vmax, Termal ve Depolama kararlılıkları) ve immobilize edilen glutatyon-S-transferazın (GST) tekrar kullanılabilirlikleri araştırılmıştır. Serbest ve immobilize enzimler için optimum pH değerleri sırasıyla 7,0 ve 6,0 olduğu belirlenmiştir. Ayrıca serbest ve immobilize enzimlerin optimum sıcaklıkları sırasıyla 37 ve  40 °C olarak ölçülmüştür. Optimum koşullarda, serbest GST enziminin glutatyon(GSH) substratı için Vmax değeri 204,8 U/mg prot ., CDNB substratı için Vmax değeri 194,3 U/mg prot. olarak ölçülmüştür. İmmobilize GST enziminin glutatyon(GSH) substratı için Vmax değeri  33,08 U/mg prot ., CDNB substratı için Vmax değeri 33,29 U/mg prot. olarak  ölçülmüştür. Serbest GST enziminin glutatyon(GSH) substratı için Km değerleri sırasıyla 0,1873 mM , CDNB substratı için 0,201 mM olarak, immobilize edilen GST enziminin glutatyon(GSH) substratı için Km değerleri 0,3042 mM, CDNB substratı için 0,2523  mM olarak hesaplanmıştır. Serbest ve immobilize GST enziminin farklı sıcaklıklarda belirlenen termal kararlılıkları karşılaştırılmıştır. Tekrar kullanılabilirliği araştırılmış ve 20 kullanımdan sonra immobilize enzimler için aktivitesinin %50 (ECH)'ini koruduğu belirlenmiştir. Serbest GST enzimi, 4 °C'de ve 25 °C'de 30 gün depolanma süresi sonunda başlangıç aktivitelerinin  sırasıyla  %32 ve %18'ini koruduğu belirlenmiştir. İmmobilize enzimler için 4°C'de ve 25 °C'de 30 gün depolanma süresi sonunda sırasıyla başlangıç aktivitesinin %41 ve %20'sini  koruduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
In this study ,the synthesis of Fe3O4 magnetic nanoparticles and covalent immobilization of glutathione-S-transferase onto Fe3O4 magnetic nanoparticles via epikolorohydrin spacer arm, the determination of optimal reaction conditions of free and immobilized enzymes and the reusability of immobilized enzyme were investigated.  The optimum pH values for free and immobilized enzymes  were  determined to be 7.0 and 6.0 , respectively. Also the optimum temperature of free and immobilized enzyme were measured as 37 and 40 °C , respectively. Under the optimum conditions, the values of Vmax for glutathione (GSH) and CDNB substrates  of free GST enzyme that were measured as 204,8 U/mg prot., and 194,3 U/mg prot.  The values of  Vmax for the glutathione (GSH) and CDNB substrates of immobilized GST enzyme that were measured as 33,08 U/mg prot., and 33,29 U/mg prot. For the Km values of glutathione and CDNB substrates of free GST enzyme were 0,1873 mM and 0,201 mM, respectively. Similarly, we also measured the values of Km for the substares of immobilized GST enzyme.  Km values of glutathione and CDNB were 0,3042 mM and 0,2523 mM, respectively. We compared the thermal stability of free and immobilized GST enzyme at different temperatures. The availability of immobilized GST enzyme  was investigated again. After 20 times used, it was reusability that immobilized GST enzyme saved the 50 % activity of itself. It was found that 32 % and 18 % of free GST enzyme activity were saved after 30 days of storage period at 4 °C and 25 °C respectively. For the immobilized enzyme, saved enzyme levels were 41 % and 20 % after 30 days of storage period at 4 °C and 25 °C, respectively.