Bazı YopM-protein etkileşimlerinin floresans protein komplementasyon stratejisi ile incelenmesi
Detecting of some YopM-protein interactions using fluorescence complementation assay
Yazar: ÖZGE UĞURLU
Danışman: DOÇ. DR. SERAP EVRAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
İnsanlar için patojen özellik gösteren sadece üç farklı Yersinia spp. bulunmaktadır: Y. pestis, Y. enterocolitica ve Y. pseudotuberculosis. Bu suşlar, konakçının fagositoz gibi bazı savunma mekanizmalarını inhibe etmektedir. Yersiniapatojen suşları, efektör proteinlerini salgılayarak konakçının immün sisteminden kaçabilmektedir. Yersinia efektör proteinleri tip III sekresyon sistemi aracılığıyla etkileşime geçilen hücrelere salgılanmaktadır. Bu efektör proteinlerden biri olan YopM, lösince zengin tekrar motiflerini içeren ve asidik bir proteindir. Bu proteinin hücre bariyerini aştığı, nükleusa ulaşabildiği ve protein transportunu sağladığı gösterilmiştir. 
Bu tez kapsamında, Yersinia spp. Tip III sekresyon sisteminin regülasyonunda görevli LcrV ve LcrG proteinleri ile YopM arasındaki protein-protein etkileşimi yeşil floresans proteininin (GFP) komplementasyonuna dayanan bir yöntem ile incelendi. N-terminal GFP fragmenti (1-157. amino asitler) ile LcrV veya LcrG proteinlerini kodlayan genler füzyon PCR ile birleştirildi. Benzer şekilde, C-terminal GFP (158-238. amino asitler) ve YopM geninden oluşan bir füzyon genfragmenti elde edildi. NGFP-LcrG (veya NGFP-LcrV) ile YopM-CGFP kodlayan iki plazmidin E. coli hücresinde ko-transformasyonu gereçekleştirildi ve floresans görüntüleme yapıldı. Bunun yanında, füzyon proteini saflaştırıldı ve GFP floresans spektrumu incelendi. YopM ve LcrG proteinlerinin etkileşimi sonucu NGFP ve CGFP parçalarının komplementasyonu ile GFP floresansı oluşturduğu gözlendi. Bununla birlikte, YopM ve LcrV proteinleri için benzer bir GFP floresansı elde edilemedi.

Abstract:
There are only three human pathogenic species of the genus Yersinia: Y.pestis, Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis. These strains inhibit some of the host defense mechanisms, such as phagocytosis. Pathogenic strains of Yersinia has the ability to escape from the immune defense is by secreting effector proteins. YopM including leucine-rich repeating motifs is one of these effector proteins, and it is an acidic protein. It has been shown that this protein is able to penetrate the cell barrier, localize in nucleus and transport the protein. 
          In this thesis study, protein-protein interaction between YopM and Yersinia spp. Type III secretion regulator proteins LcrV and LcrG was investigated based on the complementation of green fluorescent protein (GFP). Fusion PCR was used to fuse genes coding for N-terminal GFP fragment (1-157.amino acids) and LcrV/LcrG proteins. Similarly, the fusion gene fragment of C-terminal GFP (158-238. amino acids) and YopM was obtained. The two plasmids coding for NGFP-LcrG (or NGFP-LcrV) and YopM-CGFP were co-transformed into E. coli cells and the fluorecsence was monitored. Moreover, the fusion protein was purified and GFP fluorescence spectrum was monitored. As a result of interaction between YopM and LcrG, complementation of NGFP and CGFP enabled formation of GFP fluorescence. However, the similar GFP fluorescence was not monitored for YopM and LcrV.