Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile plazma homosistein ölçüm yöntemlerinin karşılaştırılması /
Yazar: EMİN ÖZGÜR AKGÜL
Danışman: PROF. DR. KEMAL ERBİL
GATA / Tıp Fakültesi / Biyokimya ve Klinik Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2003
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
VI. ÖZET Homosistein aminoasidinin kardiyovasküler, serebrovasküler ve periferal damar hastalıkları için bağımsız bir risk faktörü olduğunun ortaya çıkmasından sonra, günümüzde homosistein hastanemiz dahil bir çok merkezde rutin olarak ölçülmeye başlamıştır. Halen laboratuarımızda homosistein ölçümleri kesinliği, duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek olarak bilinen Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) tekniği kullanılarak, hazır kit ile yapılmaktadır. Metod olarak çok iyi, kararlı, kolay ve hızlı olmasının yanında maliyeti yüksek bir testtir. Her geçen gün homosisteinin öneminin kavranmasına paralel olarak, istenen analiz sayısı artmakta ve böylece test maliyeti önemli bir parametre olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu yüzden hazır kitin avantajlarını taşıyan fakat daha ucuz olan iki metodu kullandık ve referans olarak belirlenen ticari kit (chromsystems) ile karşılaştırmalar yapıldı. Metodlardan ilk yöntemde 9.2 mmol/L TCEP ile indirgenip, 7-flouro-2,1,3- benzoxa sulfonamide (ABD-F) ile türevlendirildi. Daha sonra perklorik asit (600ml_/l_) ile deproteinize edildi ve süpematantı sisteme uygulandı. Ters faz elusyon kullanılarak tiyollerin ayrıldığı bu yöntemde 30ml_/L asetonitril ve isopropil alkol içeren 5 mmol/L KH2Po4 tamponu (pH 1.9) mobil faz olarak kullanıldı. Kolon olarak C 18 (ODS) (150 x 4.6 mm, 5um) kolonu kullanılan bu yöntemde eksitasyon dalga boyu 385, emisyon dalga boyu ise 515 nm'ye ayarlandı. 4.7 dakikada homosistein piki alındı ve analiz 7 dakikada tamamlandı. İkinci yöntemde TCEP (100g/L) ile indirgenip, TCA (100g/L) ile deproteinize edildi. Ardından 7-Flourobenzo-2-oxa-1,3-diazoIe-4-sulfonik asit (SBD-F) ile türevlendirdik ve sisteme uygulandı. Mobil faz olarak 30mL/L metanol içeren 0.1mol/L asetik asit-asetat tamponu (pH 5.0) ve kolon olarakta C 18 (ODS) (150 x 4.6 mm, 5um) kolonu kullanıldı. Eksitasyon dalga ve emisyon dalga boyları 385, boyu ise 515 nrrvye ayarlandı. 2.9 dakikada homosistein piki alındı ve analiz 5 dakikada tamamlandı. Yöntemlerin kesinlik çalışmalarında SBD-F ve ABD-F metodlan için gün içi tekrarlanabilirlik sırası ile %0.98, %1,83 ve günler arası ise %2.49, 2.22 idi. İki yöntem de 200 umol/L'ye kadar lineerdi. 7-14 umol/L homosistein standartı eklenmiş SBD-F metodunda verimi sırası ile % 99.37 ve % 98.10 bulduk. 6.7-13.4 umol/L homosistein standartı eklenmiş ABD-F metodunda ise verim sırası ile % 99.7 ve % 100.07 bulundu. Her iki yöntemle referans metod arasında korelasyon katsayısı 0.995 bulundu (p<0.001). SBD-F metodu ile referans metodu karşılaştırıldığında 20 umol/L konsantrasyona kadar standart sapma % 2.54, üzerindeki değerlerde ise % 6.11 bulundu. ABD-F metodunda ise referans metodla karşılaştırıldığında 20 umol/L konsantrasyona kadar standart sapma % 5.50, üzerindeki değerlerde ise % 5.20 bulundu. Sonuç olarak hem maliyet hemde yüksek analitik performans göstermesi açısından SBD-F türevlendirilmesiyle yapılan yöntemin en uygun yöntem olduğuna karar verildi. Bu yöntemle tekrarlanabilir, doğru, güvenilir, hızlı, kolay hazırlanabilir, pediatrik, klinik uygulamalara ve büyük çaplı çalımalara uygun bir testi laboratuarımıza kazandırmış olduk. 54

Abstract:
VII.SUMMARY Homocysteine has been in routine use in many centers after this amino acid is reported as an indepedent risk factor for cardiovascular, cerebrovascular and peripheral vascular diseases. Measurement of homocysteine is performed by commercially available kit via HPLC which has high precision, sensitivity and accuracy. This method is highly cost one although it is a practical and fast method. As long as the clinical significancy of this test becomes popular, the number of requested tests are increased, and analysts are faced with the coast of this analysis as an important parameter. Therefore, in this study, two different low-cost methods which had similar advantages like commercial kit were used and comparisons were made with respect to the references of commercial one. In the first method we used, the sample was derivatized with 7-flouro-2,1,3- benzoxa sulfonamide (ABD-F) following the reduction with 9.2 mmol/L TCEP. After deproteinization with perchloric acid (600 mL/L), supernatant was applied on the system. Mobile phase consisting 30 ml/L acetonitrile and isopropyl alcohol in 5 mmol/L KH2P04 buffer (pH 1.9) was used in this method in which thiol groups were separated by reverse phase elution. Homocysteine peak was obtained at 4.7 min and total run time was 7 min in this method where C18 (ODS) (150X4.6 mm, 5 urn) column was used and excitation and emission wavelengths were 385 and 515 nm, respectively. In second method, deproteinization was made with TCA (100g/L) after the reduction with TCEP (100 g/L). Then, we applied to the system after derivatization with 7-Flourobenzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulfonik asit (SBD-F). Mobile phase was 0.1 mmol/L acetic acid-acetate buffer (pH 5.0) consisting 30 mL/L methanol and column used was C18 (ODS) (150X4.6 mm, 5pm). Homocysteine peak was obtained at 2.9 min and total run time was 5 min in this method where excitation 385 nm. and emission 515 nm. was used. In accuracy studies, intraassay CV's of SBD-F and ABD-F methods was 0.98% and 1.83 %, respectively. Interassay CV values were 2.49 % and 2.22 %, respectively. Both methods show linearity up to 200 umol /L. Recovery was 99.37 % and 98.10 % in SBD-F method after additions of 7-14 umol / L homocysteine standard. Similarly, for ABD-F method, recovery was 99.7 % and 100.7 % following the addition of homocysteine standard (6.7-13.4 umol/L). A significant correlation was found between both methods and reference method (p<0.001). In the comparison of SBD-F method with reference method, standard deviation was 2.54 up to the concentrations of 20 umol /L, but 6.1 1 for more than this concentration. But for ABD-F method, standard deviations were 5.50 % and 5.20 %, respectively. As a consequence, it was determined that the method using SBD-F derivatization was the apprepriate method with respect to cost- effectivity and high analytical performance. By this study, we supposed that a practical, accurate, rapid method, available for pediatric and clinical applications would be in use in our laboratory. 55