Protein esaslı biyoterapötik ilaçların iyon hareketliliği kütle spektrometresi ile karaterizasyonları
Characterization of protein based biotherapeutic drugs by ion mobility mass spectrometry
Yazar: İZZET AVCI
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Glikozilasyon = Glycosylation ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry

Özet:
Son yıllarda protein temelli tedavi edici ilaçların önemi ciddi oranda artmıştır. Bu ilaçlar hücre kültürü ortamlarından veya belirli canlılar üzerinden üretilerek elde edilmesi bu tarz ilaçların kimyasal olarak sentezlenmiş ilaçlardan ayırmaktadır. Bu ilaçlar kanser, diyabet gibi hastalıkların tedavisinde kullanılan tedavi edici özelliğe sahip ilaçlardır. Bu ilaçların hastalıklara karşı efektif bir şekilde tedavi edici rol oynaması için yapısının hastalığa etki edecek şekilde özgün olması gerekmektedir. Bu ilaçlar üretim ve onaylanması sırasında birçok önemli aşamadan geçmektedir. Bu tarz ilaçlar protein esaslı oldukları için üretimleri ve üretim sonrasındaki aşamalarında meydana gelen enzimatik ve kimyasal modifikasyonlar bu ilaçların işlevlerinde ve yapılarında çeşitlilik gösterebilmektedir. Yapılarında meydana gelen bu tarz modifikasyonlara Post-Translasyonel Modifikasyon adı verilir. Bu modifikasyonlar arasında glikozilasyon en önemlilerinden bir tanesidir. 
  Kütle Spektrometrisi protein esaslı tedavi edici özelliğe sahip ilaçların dizilim, bileşim, yapı, konformasyon ve kütle gibi birçok özelliğinin aydınlatılmasında kullanılan güçlü bir analitik yöntemdir. Kütle Spektrometrisi protein esaslı biyoterapötik ilaçların analizlerinde yoğun bir şekilde kullanılmaktadır. Fakat bu analitik teknikler özellikle aynı kütle/yük oranına sahip farklı konformasyonel özellikleri taşıyan formlarda analizlerde genellikle ayrım sağlayamamaktadır. Yumuşak iyonlaştırma tekniğine sahip İyon Hareketliliği Kütle Spektrometrisi özellikle aynı kütle/yük oranına sahip farklı konformasyonel özellikleri olan türlerin analizlerinde önemli rol oynamaktadır. Yumuşak iyonlaştırma tekniği sayesinde iyonlar hareketlilik tünelinin içine girerek şekil, boyut ve yük gibi özelliklerine göre ayrımları sağlanıp konformasyonel özellikleri hakkında bilgi elde edilebilir. Bu tez kapsamında insan serumunda yer alan immunglobulin g (IgG) ve ilaç olarak kullanılan, trastuzumab ve bevacizumab monoklonal antikorların N-glikan profillerinin konformasyonel düzeyde analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu analizlerde iyon hareketliliği kütle spektrometrik yöntemlerden olan tuzaklamalı iyon hareketliliği kütle spektrometrisi kullanılmıştır. Glikan analizleri için kütle spektrometrik cihazlarda iyonlaşmadaki avantajı sebebiyle prokainamid etiketi kullanılmıştır. Bu analizlerde eş zamanlı olarak hidrofilik etkileşim kromatografisi temelli floresans ve iyon hareketliliği kütle spektrometrik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yapılan analizlerde IgG ve mAb'ların glikan formları elde edilmiş ve konformasyonel açıdan glikan yapıları tespit edilmiştir. Yapılardaki her bir glikan formunun etkin çarpışma kesiti hesaplanıp birbirleriyle karşılaştırılması gerçekleştirilmiştir. Özellikle glikan formlarının CCS değerlerinin, esas olarak yapılarındaki galaktoz ve fukoz birimlerinin varlığı ve bağlanma durumlarındaki farklılıklara göre değişiklik gösterdikleri tespit edilmiştir.. Bu tez çalışmasında tuzaklamalı iyon hareketliliği kütle spektrometrisi cihazı ile ilk kez IgG ve monoklonal antikorların glikan formlarının konformasyonları hakkında bilgi elde edinilmiş olup ve eş zamanlı olarak floresans dedektör kullanılarak analizler gerçekleştirilmiştir. Literatüre güçlü bir analitik yöntem kazandırılmıştır.

Abstract:
In recent years, the importance of protein-based therapeutic drugs has increased significantly. The fact that these drugs are produced from cell culture media or certain living things distinguishes these drugs from chemically synthesized drugs. These are drugs with therapeutic properties used to treat diseases such as cancer and diabetes. The structure must be unique for these drugs to play an effective therapeutic role against diseases. These drugs go through many critical stages during production and approval. Since such drugs are protein-based, the enzymatic and chemical modifications that occur during their production and post-production stages can vary in the functions and structures of these drugs. Such modifications that arise in their structures following protein synthesis are called post-translational modifications. Among these modifications, glycosylation is one of the most important ones. Mass spectrometry is a powerful analytical method used to elucidate many properties of protein-based therapeutic drugs such as sequence, composition, structure, conformation, and mass. Mass spectrometry is intensely used in the analysis of protein-based biotherapeutic drugs. However, these analytical techniques cannot discriminate species in analysis, especially in forms with the same mass/charge ratio and different conformational features. Ion mobility-mass spectrometry with soft ionization techniques plays an essential role in analyzing species with different conformational properties, especially with the same mass/charge ratio. Due to the soft ionization technique, ions can enter the mobility tunnel separated according to their shape, size, and charge characteristics. Thus, information about their conformational properties can be obtained. In this thesis, conformational N-glycan profile analyses of immunoglobulin G (IgG) in human serum, trastuzumab, and bevacizumab monoclonal antibodies (mAbs) were performed. In these analyses, the trapped ion mobility spectrometry (TIMS) technique was used as one of the ion mobility techniques highly compatible with mass spectrometers. The procainamide label was chosen for glycan analysis due to its advantage in ionization in mass spectrometric devices. In these analyzes, hydrophilic interaction chromatography was carried out with fluorescence and ion mobility-mass spectrometry detection techniques simultaneously. In the analyzes, glycan forms of mAbs were obtained and their conformational glycan structures were determined. The collision cross-section (CCS) values of each glycan form in the structures were calculated and compared. Especially, it was determined that the variation of CCS values of the glycan forms mainly arises due to the presence and binding formations of galactose and fucose units in their structures. In this thesis, information about the conformation of the glycan forms of mAbs was obtained using a TIMS device and a fluorescence detector simultaneously for the first time. A robust analytical method has been introduced to the literature.