Üçlü negatif meme kanseri konvansiyonel tedavisinde epigenetik ajan ile adjuvan immunoterapi kombine kullanımının etkinliğinin araştırılması
Evaluation of the effectiveness of adjuvant immunotherapy combined use with epigenetic agent in conventional treatment of triple negative breast cancer
Yazar: FAZİLET ESRA DÜZDAĞ
Danışman: DOÇ. DR. BURÇİN KAYMAZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Üçlü negatif meme kanseri (ÜNMK), yüksek metastaz oranı ve kötü prognozu ile bilinen, tedaviye direnç gösteren bir meme kanseri türüdür. PD-L1 inhibitörü Atezolizumab ve albumin bağlı paklitaksel nanopartiküllerinden oluşan Nab-paklitaksel kombinasyonu, mevcut tedavi protokollerinde kullanılmasına rağmen, çoğu hastada beklenen faydayı sağlamamaktadır. Epigenetik ajanlar, kanser hücrelerinde apoptoz ve hücre döngüsü durmasına neden olarak ve immünmodülatör etkileri sayesinde potansiyel kanser tedavi ajanları olarak değerlendirilmektedir. Meme kanseri progresyonunda HDAC 1, 6 ve 8 genlerinin rol oynaması nedeniyle, HDAC 3, 6 ve 8 inhibitörü olan Droxinostat'ın, kemoterapötik ve immünoterapötik direnci aşmada etkili bir yaklaşım olabileceği düşünülmektedir.
Bu çalışmada, Droxinostat'ın etkileri Nab-paklitaksel ve Atezolizumab ile karşılaştırılmıştır. Droxinostat, Atezolizumab ve Nab-paklitaksel'in tekli dozlarının yanı sıra ikili ve üçlü kombinasyonlarının MDA-MB-231 üçlü negatif meme kanseri hücreleri ve MCF-10A sağlıklı meme hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri XTT yöntemi ile değerlendirilmiş ve IC50 ile ED50 dozları hesaplanmıştır. Apoptotik etkiler Annexin V yöntemi ile analiz edilmiş, apoptoz ve hücre döngüsü analizleri akış sitometrisi ile gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, yara iyileşme ve invazyon analizleri yapılmış, Ki-67 proteininin ekspresyonu immünofloresan yöntemi ile belirlenmiş, oksidatif stres belirteçleri ölçülmüş ve karsinogenez sürecinde rol oynayan 26 genin transkripsiyonel ifadeleri q-RT-PCR ile analiz edilmiştir.
Sonuçlar, Droxinostat'ın MDA-MB-231 hücrelerinde 72. saatte IC50 dozunun 60 µM, MCF-10A hücrelerinde ise 190 µM olarak belirlendiğini göstermektedir. Nab-paklitasel'in MDA-MB-231 hücrelerinde IC50 dozu 0,58 µM, MCF-10A hücrelerinde ise 0,16 µM olup, kombinasyon dozlarında Droxinostat için 48 µM, Nab-paklitaksel için 0,28 µM dozlarının CI indeksi 0,808 ile ılımlı sinerjistik etki gösterdiği bulunmuştur. Atezolizumab'ın toksik etkiler göstermemesi nedeniyle tüm deneylerde 100 nM doz kullanılmıştır. Droxinostat'ın mono ve kombinasyon dozlarının MDA-MB-231 hücrelerinde apoptozu ve nekroptozu 5-6 kat artırırken, MCF-10A hücrelerinde sadece nekroptozu artırdığı gözlemlenmiştir. Droxinostat, hem apoptoz hem de nekroptoz yolaklarını aktive ederek hücre ölümüne neden olmuştur. Ayrıca, Droxinostat'ın hücre döngüsünü S ve M fazında daha fazla durdurduğu, Nab-paklitaksel'in ise daha fazla M fazında hücre tutulması sağladığı belirlenmiştir. Sağlıklı hücrelerde ajanlar anlamlı değişikliğe neden olmamıştır.
Ki-67 ifadesinde azalma gözlemlenmiş, özellikle MDA-MB-231 hücrelerinde bu düşüş belirgin olmuştur. Ajanlar hem invazif hücre sayısını hem de hücre migrasyonunu azaltmıştır. Droxinostat'ın antioksidan biyomarkerlar üzerindeki etkisinin minimal olduğu, ancak Nab-paklitaksel ile kombinasyon halinde ROS'u indüklediği saptanmıştır. Gen ekspresyonu analizleri, Atezolizumab'ın MDA-MB-231 hücrelerinde PD-L1 ifadesini 6,33 kat azalttığını, Droxinostat'ın bu ifadeyi artırdığını ve MCF-10A hücrelerinde değişiklik göstermediğini ortaya koymuştur. Ayrıca, Atezolizumab ve Nab-paklitaksel'in MDA-MB-231 hücrelerinde PD-1 ifadesini yaklaşık 2 kat artırdığı bulunmuştur. Droxinostat'ın en fazla HDAC 8'i inhibe ettiği tespit edilmiştir. Droxinostat'ın hem tekli hem de kombinasyon dozları, kaspaz-3 ve kaspaz-8'in ekspresyon seviyelerini artırmıştır. Nab-paklitaksel de bu genlerin ekspresyonunu artırmış, ancak bu artış Droxinostat'a kıyasla daha sınırlı kalmıştır.
Droxinostat'ın sağlıklı hücrelerdeki IC50 dozunun kanser hücrelerinden 3 kat fazla olması, apoptozu ve nekroptozu Nab-paklitaksel ve Atezolizumab'a kıyasla daha fazla artırması ve etkili molekül olarak potansiyeli, ÜNMK tedavisinde kullanılabileceğini göstermektedir.

Anahtar Kelimeler; Üçlü Negatif Meme Kanseri; Histon Deasetilaz İnhibitörleri; İmmunoterapi; İmmun Kontrol Noktası İnhibisyonu; Kanser İmmunolojisi

Abstract:
Triple-negative breast cancer (T