Polimerik nanopartikül floresan problarla bakteriyal filmlerin in-vivo görüntülenmesi
In vivo imaging of bacterial films with polymeric nanoparticle fluorescence probes
Yazar: ARAZ NOROUZ DIZAJI
Danışman: PROF. DR. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Bakteriyel enfeksiyonlar = Bacterial infections ; Floresan = Fluorescence ; Görüntüleme = Imaging ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; İn vivo = In vivo

Özet:
Bu tezin amacı floresan özelliği gösteren konjüge polimer problarını kullanarak, gram pozitif olan Staphylococcus aureus bakterilerinin ve bu bakteri tarafından üretilmiş olan biyofilmlerin in-vitro ve in-vivo olarak görüntülenmesidir. Bu amaç için maleimid fonksiyonel grubuna sahip olan DSPE-PEG2000 kullanılmış, 60 saniye 12W güçünde olan mikro uçlu prob sonikatör ile 9 ml su ortamında 1 ml THF çözeltisi varlığında sonike edilmiş, gece boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır. Böylece konjüge polimerlerin paketlenmesi gerçekleştirilmiş, CPDP-Mal nanokapsüllerin (NK) sentezi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen NK'ler Uv-vis spektrofotometre ile karakterize edilmiş, PFBT'ye ait olan karakteristik pik 470 nm'den 480 nm'ye bir kayma göstermiştir. Oluşan bu pik kayması, PFBT probların DSPE-PEG2000-Mal tarafından paketlenme sonucunda ortaya çıkmıştır. Zeta-sizer ve TEM ile analiz sonucunda, bu NK'lerin dar bir boy dağılımı şeklinde 80nm çapına sahip oldukları tesbit edilmiştir. 
Hazırlanan NK'lere spesifik hedeflendirilme özelliği kazandırılması vankomisin ligandının immobilizasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Bu amaç için vankomisin molekülleri SH grubu ile fonksiyonelleştirlmiştir. 100 mg satın alınmış vankomisin belli oranlarda DMSO, DMF, HBTU ve DIEA ile 0°C'da reaksiyona girerek di-tiyol bağına sahip bis-vankomisin elde edilmiş, HPLC ile saflaştırılarak üç gün kuru döndürücüde bekletilmiştir. LC-MS ile karakterizasyon sonuçları, bis-vankomisinin sentezlendiğini kanıtlamıştır. TCEP kullanarak di-tiyol bağları koparılmış, elde edilen HS-Van molekülleri sulu bir ortamda CPDP-Mal NK'lerine immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. FTIR analizi ile alınan sonuçlar, vankomisin moleküllerin başarılıyla NK'lere bağlandığını göstermiştir. Sentezlenen HS-Van ve CPDP-S-Van Nk'lerin antibakteriyal özellikleri MİK, MBK ve DDM ile araştırılmıştır. Hazırlanmış olan CPDP-S-Van NK'lerin spesifik hedeflendirilme özellikleri in-vitro koşullarında S. aureus ve E. coli üzerinde araştırılmış, bu NK'lerin başarılı bir şekilde sadece gram pozitif olan S. aureus'a bağlanması görüntülenmiş/belirlenmiştir. Lab koşullarında S. aureus tarafından üretilmiş biyofilmlerin görüntülenebilmesini araştırmak için hazırlanmış CPDP-S-Van NK'ler kullanılmıştır, biyofilmlerin görüntülenmesini gerçekleştirmiştir. NK'lerin sitotoksisite özellikleri MTT testi ile araştırılmış, elde edilen sonuçlara göre kullanılabilecek en yüksek dozda dahi, %90 üzeri hücre canlılığı tesbit edilmiştir. Apoptoz ve nekroz testlerinden alınan sonuçlar ise hücrelerde her hangi bir toksik etki göstermemiştir. Elde edilen sonuçlar, hazırlanmış NK'lerin in-vivo ortamında kullanılabileceğinin bir güvencesidir. CPDP-S-Van NK'lerin in-vivo olarak S. aureus'u spesifik olarak görüntülebilmesini araştırmak için ICR fare hayvan modeli kullanılmıştr. S. aureus ve E. coli bakterileri subkütan olarak fare sırtının sağ ve sol bölgelerine enjekte edilerek, infekte hayvan modeli elde edilmiştir. İnfekte hayvan modeline kuyruk damarından verilmiş NK'lerin hedeflendirilebilme özellikleri non-invazif canlı hayvan floresan görüntülenme tekniğini kullanarak Maestro EX floresan sistem cihazı ile araştırılmıştır. Sonuçlara göre hazırlanmış olan NK'lerin hedeflendirilmesi başarılıyla gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
The aim of this theses is to synthesize polymeric nanoparticle fluorescence probes in order to be used in in-vitro and in-vivo imaging of Staphylococcus aureus and the biofilms produced by these bacteria. 1ml THF solution containing certain amounts of PFBT "[poly(9,9-dioctylfluorene-2,7-diyl-co-benzothiadiazole)]" and DSPE-PEG2000-Maleimid were added to 9ml of DW. The ultra-sonication of this mixture was applied with 12W micro-tip probe sonication for 60s and steered overnight at the room temperature. At the end of this step, packaging of PFBT was done and CPDP-Mal nanocapsules (NCs) were synthetized successfully. Uv-vis spectrophotometery of the NCs was carried out and the results showed the characteristic peak shifting of PFBT from 470nm to 480nm that's related to successful packaging of PFBT with DSPE-PEG2000-Mals. Zeta-sizer and TEM analysis showed that the prepared NCs have a diameter of 80nm in a narrow distribution.
To gain specific targeting properties for obtained NCs, the immobilization of vancomycin (as a ligand) has been carried out in accordance with the protocol. For this purpose, bis-vancomycin molecules containing di-thiol bond were synthetized and Purification of bis-vancomycin was carried out by implementing HPLC and keeping it for three days at freeze-dryer. The LC-MS analysis of bis-vancomycin showed the related characteristic peaks. The di-thiol bonds of bis-vancomycin were cleaved using TCEP in aqueous environment and obtained SH-Van ligands have successfully immobilized onto CPDP-Mal NCs in accordance with the protocol, which was confirmed by the FTIR spectra of the ligands. Antibacterial properties of prepared SH-Van and CPDP-S-Van NCs were investigated by MIC, MBC and DDM. The in-vitro specific targeting properties of the CPDP-S-Van NCs were investigated on S. aureus and E. coli by confocal microscopy. Results showed that the NCs were targeted only to S. aureus. The NCs imaging abilities were examined on the biofilm which was produced in laboratory condition by S. aureus. The results manifested that the CPDP-S-Van NCs demonstrate high-level performance in the imaging of S. aureus biofilms. Cytotoxicity and apoptosis properties of NCs were investigated by MTT/WST-1 and caspase-3 antibody imaging assay. According to the results, cell viability was determined to be over 85% even at the highest dose and no apoptotic properties were detected for NCs. The results manifestly indicate that the prepared NCs can be used for the in-vivo studies. The ICR mouse animal model was used to inspect the specific imaging ability of CPDP-S-Van NCs against S. aureus in in-vivo conditions. Infected animal model was prepared by injecting S. aureus and E. coli bacteria subcutaneously into the right and left backside of the ICR mouse. Specific targeting abilities of NCs were investigated by using non-invasive live animal fluorescence imaging technique by the injection of CPDP-S-Van NCs from tail vein of infected animal model. According to the results the targeting of the prepared NCs has been done successfully.