Mycobacterium tuberculosis klinik izolatlarında kinolon direncinin klasik ve moleküler yöntemlerle saptanması
Detection of fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by classical and molecular methods
Yazar: EMRAH RUH
Danışman: YRD. DOÇ. ALPASLAN ALP
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; Siprofloksasin = Ciprofloxacin ; Tüberküloz = Tuberculosis

Özet:
Tüberküloz hastalığı, tedavide kullanılan birincil ilaçlara karşı gelişen dirençten dolayı günümüzde önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Dünya Sağlık Örgütü, özellikle çok ilaca dirençli olgularda umut vaad eden kinolon grubu antibiyotiklerin kullanılmasını önermektedir. Bu çalışmaya, 59'u çok ilaca dirençli, 41'i birincil ilaçlardan en az birine dirençli olan 100 Mycobacterium tuberculosis klinik izolatı dahil edilerek, siprofloksasin, sparfloksasin ve moksifloksasinin bu izolatlara olan etkinliği test edilmiştir. Agar dilüsyon yöntemi sonucunda üç kinolon birlikte değerlendirildiğinde, 100 izolatın 6'sının dirençli, 35'inin orta derecede dirençli, 59'unun ise duyarlı olduğu belirlenmiştir. MİK değerleri ile dirençli izolatlar ve orta derecede dirençli izolatların sayıları dikkate alındığında, sparfloksasin ve moksifloksasinin, siprofloksasine göre daha etkili olduğu görülmüştür. Mycobacterium tuberculosis'de kinolon direncine en sık neden olan gyrA genindeki mutasyonların saptanması için DNA dizi analizi yapılmış ve 6 dirençli izolatın birinde Ala90Glu ve Asp94Gly, diğerinde ise Met81Leu mutasyonu saptanmıştır. Orta derecede dirençli olan izolatların ise birinde Tyr84Asp, diğerinde His87Asn mutasyonu saptanmıştır. Ser95Thr polimorfizmi, DNA dizi analizi yapılan izolatların %80'inde saptanmıştır. Ayrıca, bu izolatların % 73'ünde saptanan Asp120Gly dönüşümünün 4 duyarlı izolatın 3'ünde de görülmesi, bunun da bir polimorfizm olduğunu düşündürmektedir. Dirençli ve orta derecede dirençli izolatların çoğunda, sadece bu polimorfizmlerin oluşması, özellikle düşük düzey dirençli izolatlarda kinolon direncinin, ilacın hücre içinde birikimini engelleyen başka bir mutasyon sonucu oluştuğu fikrini vermektedir. Bu çalışmada ayrıca, kısa sürede sonuç verebilen floresans rezonans enerji transferi teknolojisinin uygulandığı real-time PCR yönteminin Mycobacterium tuberculosis'de kinolon direncini belirlemedeki etkinliği araştırılmıştır. Dirençli, orta derecede dirençli ve duyarlı izolatların EST değerlerinin benzer oranlarda dağılım göstermesinden dolayı bu yöntemin kinolon direncini saptama konusunda tek başına yeterli olmadığı sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Tuberculosis continues to be a serious health issue due to the resistance of the infecting organism against the first line drugs being used in the therapy. World Health Organisation recommends the fluoroquinolones as alternative optimising drugs especially in the treatment of multi-drug resistant cases. One hundred Mycobacterium tuberculosis clinical isolates, of which 59 were multi-drug resistant and 41 were resistant to at least one of the first line drugs, were included in this study and the activity of ciprofloxacin, sparfloxacin and moxifloxacin against these isolates was studied. By the agar proportion method, 6 isolates were determined as resistant, and 35 were classified as moderately resistant. The remaining 59 isolates were susceptible against the fluoroquinolones tested. According to the MIC results and the number of resistant and moderately resistant isolates, sparfloxacin and moxifloxacin were found to be more active than ciprofloxacin. In order to detect the mutations in the gyrA gene, which remains as the major cause of the fluoroquinolone resistane, DNA sequencing procedure was performed. Among the 6 resistant isolates, Ala90Glu and Asp94Gly were detected in one isolate and Met81Leu in the other. Tyr84Asp was detected in one isolate and His87Asn was detected in the other among the moderately resistant isolates. The natural Ser95Thr polymorphism was detected in 80% of the isolates sequenced. Moreover, Asp120Gly which was detected in 73% of these isolates, was also detected in 3 of 4 susceptible isolates, suggesting that this is another polymorphism. The detection of these polymorphisms as the most common mutations also suggests that, fluoroquinolone resistance may possibly develop due to another mechanism which prevents the accumulation of the drug in the cell. In this study, the ability of real-time PCR- fluorescence resonance energy transfer technology in detection of fluoroquinolone resistance of Mycobacterium tuberculosis was also examined. Since the melting temperatures of resistant, moderately resistant and susceptible isolates were similar to each other, this method alone was not able to detect the fluoroquinolone resistance.