Allojenik epinöral kılıftan oluşturulmuş sinir iletkeni içerisine yağ dokusu ve mezenkimal kök hücre ile indüklenmiş lateral aksonal tomurcuklanma yoluyla sinir greft prefabrikasyonu
Nerve graft prefabrication by lateral axonal sprouting induced by mesenchymal stem cells and fat tissue into nerve conduit derived from allogeneic epineural sheath
Yazar: CEYHUN CESUR
Danışman: DOÇ. DR. HÜSEYİN KARAGÖZ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Sultan Abdülhamid Eğt. ve Arş. Hast. / Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Kök hücreler = Stem cells ; Periferik sinir hasarları = Peripheral nerve injuries ; Sinir dokusu = Nerve tissue ; Sinir lifleri = Nerve fibers ; Transplantlar = Transplants

Özet:
Günümüz kaynaklarında altın standart tedavi yöntemi olarak otolog sinir grefti ile onarım önerilen, ancak bu prosedürün ek donör saha morbiditeleri nedeniyle alternatif yaklaşım arayışları yoğun bir şekilde devam eden, klinik olarak insan yaşamını ileri düzeyde etkileyen ağır fonksiyonel kayıplara neden olan segmental periferik sinir hasarı onarımında sinir epinöral kılıfının etkinliği ile epinöral kılıfın aksonal rejenerasyon üzerine etkilerinin; daha spesifik bir yöntemle ortaya koyulması ve eş zamanlı olarak epinöral kılıfın sinir prefabrikasyonundaki yerinin ilk defa gösterilmesi amacıyla bu çalışma yapılmıştır.
İngilizce literatürde yayınlanmış deneysel makalelerde epinöral kılıf; sinir defekti onarımlarında bir otolog sinir iletkeni olarak kullanılmış ve araştırmalar bu çatı üzerine dizayn edilmiştir. Çalışmamızda ise epinöral kılıflardan ürettiğimiz motor sinir kaynaklı prefabrike sinir greftleri ile otolog sinir grefti alternatifi yeni bir ürün ortaya koyarken; epinöral kılıfın, lateral aksonal rejenerasyon penceresinden, sinir iyileşmesine olan olumlu etkilerini göstermeyi hedefledik. Sinir iyileşmesindeki etkileri kanıtlanmış kök hücrelerin, gelecek vadeden bu yöntem ile birleştirilmesinin anlamlı olacağını öngörerek deneysel çalışmamızı şekillendirdik.
Çalışmada; immünsüpresyona ihtiyaç duyulmaksızın allojen uygulamalara olanak tanıyan inbred Lewis türü dişi sıçanlar (n=27) kullanıldı. Sıçanlardan 9 tanesi donör olarak ayrıldı. Donör hayvanlarının her iki taraf siyatik sinirlerinden 15mm uzunluğunda 18 adet epinöral kılıf ile inguinal yağ dokularından yağ greftleri elde edildi. Yağ greflerinin bir kısmı, yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücre (adipose tissue derived mesenchymal stem cell=ADMSC) üretilmesi amacıyla kök hücre laboratuvarına gönderildi. Kök hücre elde etme prosedürü zaman gerektirdiğinden bu süre zarfında epinöral kılıflar ve kalan yağ greftleri çalışmanın ileri safhalarında kullanılmak üzere -800C'de muhafaza edildi. Kök hücre üretimi tamamlandığındakalan denekler; kök hücre grubu (n=6), boş epinöral kılıf grubu (n=6) ve yağ grefti grubu (n=6) şeklinde 3 eşit gruba ayrıldı. Deneklerin sağ siyatik sinirlerinde 15mm ara ile açılan epinöral pencereler arasına donörlerden elde edilmiş epinöral kılıflar paralel bir yol olacak şekilde mikrocerrahi yöntemler ile koapte edildi. İlk grupta epinöral kılıflar içerisine ADMSC enjekte edildi. İkinci grupta ek bir işlem yapılmadı. Üçüncü grupta ise emülsifiye edilmiş yağ greftleri epinöral kılıflar içerisine enjekte edildi. On iki haftalık iyileşme dönemi sonrasında tüm deneklere prosedürün fonksiyonel etkilerinin gösterilmesi için elektromiyografi (EMG) yapıldı. EMG sonrasında sadece koapte edilmiş epinöral kılıflar cerrahi olarak çıkarılarak histomorfolojik örnekler hazırlandı. Örneklerden akson sayımı ve yeni rejenere olmuş akson karakterlerinin değerlendirmesi yapıldı.
Tüm denek gruplarında, makroskopik olarak, normal bir sinirden ayırt edilemeyecek görüntüde otolog sinir greftleri prefabrike etmeyi başardık. Yine tüm gruplarda, histomorfolojik incelemelerle, lateral aksonal tomurcuklanmanın epinöral kılıflar içerisinde ilerlemiş olduğunu gözledik. Akson sayımı sonuçlarının istatistiksel analizinde gruplar arasında anlamlı bir fark bulunamaması (p>0,05) bize epinöral kılıfın tek başına lateral aksonal tomurcuklanma oluşturabilecek kadar etkin nörotrofik ve nörotropik faktör salınımı yaparak sinir rejenerasyonunu yönlendirebileceği sonucuna ulaştırdı. Akson sayımı ortalama değerleri göz önüne alındığında; kök hücre grubunda en az 1,5 kat fazla akson oluştuğunu, histomorfolojik incelemelerde ise yine bu grupta çok daha kaliteli akson rejenerasyonu olduğunu gözlemledik. Diğer iki grupta, ortalama akson sayıları yakın olarak bulunsa da histomorfolojide yağ grefti grubunun üç deneğinde aksonal ilerleyişin yoğun skar nedeniyle sekteye uğradığını tespit ettik. Bu durum bize emülsifiye yağ greftinin, kök hücre kaynağından çok mekanik bir bariyer olarak epinöral kılıfın başlattığı lateral aksonal rejenerasyonu engellediği kanısına ulaştırmıştır.
Yüksek nörojenik, proanjiyojenik özellikleri ve düşük antijenik karakteri ile allojen sinir grefti şeklinde kullanılabileceği önceki çalışmalarda gösterilmiş olan epinöral kılıftan otolog sinir grefti prefabrikasyonu yapılabileceğini ve etkinliğinin ADMSC ile daha da arttırılabileceğini gösterdik. Bu bulgulardan yola çıkarak;epinöral kılıfın, transplantasyon ve rejeneratif tıp alanlarında kullanılabileceği; gelecekte kornea gibi, insan doku bankalarında muhafaza edilebileceği ve kadavralardan elde edilecek epinöral kılıfların allojenik sinir iletkeni olarak kullanılabileceği sonuçlarına ulaştık. Epinöral kılıfın; elektif onarım planlanan periferik sinir hasarlı hastaların sinir grefti prefabrikasyonunda, bugün dahi, kullanılabilme potansiyeli olduğunu gözlemledik. Devam edecek deney modelleriyle prefabrike ettiğimiz otolog sinir greftlerinin, güncel olarak kullanılmakta olan alternatif metotlar ve altın standart teknik olan otolog sinir grefti ile karşılaştırmalı çalışmalarının yapılmasına ihtiyaç vardır.

Abstract:
For the segmental peripheral nerve defect repair, current resources suggest repair with autologous nerve graft as the gold standard treatment method; however, alternate approaches are sought for this procedure due to additional donor field morbidities. Hence, the aim of this study was to demonstrate more specifically the effectiveness of the nerve epineural sheath in segmental peripheral nerve defect repair, which cause serious functional losses that have clinically severe impacts on human life and also to demonstrate the impacts of epineural sheath on axonal regeneration, while, in the meantime, showing for the first time the place of the epineural sheath in nerve prefabrication procedure.
All the experimental studies in the English literature have tried to demonstrate the effectiveness of the epineural sheath as an autologous nerve conduit in segmental nerve defect repair. In our study; with the perspective of lateral axonal sprouting, we aimed to introduce the positive effects of epineural sheath on nerve healing when offering a new alternative, as a prefabricated nerve graft originated from motor nerve, to autologous nerve graft. Combining the stem cells which are proved to be effective in nerve healing with this promising method, we have developed our experimental study accordingly.
Inbred Lewis female rats (n=27) that allow for allogeneic applications without immunosuppression were used in our study. Nine of the rats were chosen as donors. From the donor animals; 18 epineural sheaths, each of 15mm length, were obtained from their sciatic nerves at both sides, and fat grafts were obtained from their inguinal fat pads. Some of the fat grafts were sent to the stem cell laboratory to obtain adipose tissue derived mesenchymal stem cell (ADMSC). Since stem cell obtaining procedure takes certain time, meanwhile epineural sheaths and remaining fat grafts were kept at -800C to be used in further steps of the study. When the stem cell generating procedure is complete, rest of the animals were divided into 3 groups in equal quantities: stem cell group (n=6), empty epineural sheath group (n=6) and fat graft group (n=6). Between the epineural apertures opened on the right sciaticnerves of the subjects with intervals of 15mm, the epineural sheaths obtained from the donors were coapted through microsurgical methods so that they form a parallel path. In the first group, ADMSC was injected into the epineural sheaths. In the second group, no additional procedure was performed. And in the third group, emulsified fat grafts were injected into the epineural sheaths. Following the recovery period of twelve weeks, electromyography (EMG) was performed on all subjects to demonstrate the functional impacts of the procedure. After this EMG procedure, only the coapted epineural sheaths were removed surgically and histomorphologic samples were prepared. Based on these samples, axon counting and evaluation of the newly regenerated axon characters were performed.
In all subject groups, we managed to prefabricate autologous nerve grafts which cannot be distinguished macroscopically from a normal nerve. After the histomorphological studies, in all groups we observed that lateral axonal sprouting was advanced in the epineural sheaths. Statistical analysis of the axon counting results showed no significant different between the groups (p>0,05), which demonstrated to us that epineural sheath can direct the nerve regeneration through making neurotropic and neurotrophic factor release which is effective enough to form axonal sprouting on its own. Considering the mean values of the axon counting, we concluded that in stem cell group, axon formation was at least 1,5 times more than the other groups; and the histomorphological studies showed that again in this group, axon regeneration was much more of good quality. In other two groups, mean axon counts were close; however, in histomorphological studies, we detected that axon progression in three subjects in the fat graft group was interrupted due to intense scar. This showed to us that the emulsified fat graft may interrupt the lateral axonal regeneration started by the epineural sheath as a mechanic barrier rather than a stem cell source.
Autologous nerve graft prefabrication can be performed with epineural sheath, for which previous studies demonstrated that it can be used as allogenic nerve graft with its highly neurogenic and proangiogenic features and low antigenic character, and that its effectiveness could be even improved with ADMSC. Therefore; it can be used in transplantation and regenerative medicine fields. In future, we project that it can be stored in human tissue banks such as cornea, andepineural sheaths to be obtained from cadavers can be used as allogenic nerve conduits. Even today, epineural sheath can be used in autologous nerve graft prefabrication in patients with nerve defects for whom elective peripheral nerve repair is planned. In our ongoing experiment models, we will be studying the comparison of the prefabricated autogenous nerve grafts by epineural sheaths with the currently availably alternate methods and the autologous nerve graft which is accepted as the gold standard technique for now.