Miyoglobinin elektrokatalitik indirgenmesine dayalı 2.nesil biyosensör geliştirilmesi ve H2O2 tayininde kullanılması
Development of 2. generation biosensor based on electrocatalitic reduction of myoglobin and its usage for H2O2 determination
Yazar: MEHMET TÜREMİŞ
Danışman: DOÇ. DR. EROL AKYILMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tez çalışmasında miyoglobinin elektrokatalitik indirgenmesine dayalı ikinci nesil amperometrik biyosensör geliştirilmesi ve H2O2 tayininde kullanılması amaçlanmıştır. Miyoglobin temelli biyosensör sisteminde sisteaminle elektrot yüzeyinde kendiliğinden oluşan tek tabaka oluşturulup miyoglobinin immobilizasyonundan sonra glutaraldehitle çapraz bağlanmıştır. Oluşturulan biyosensör sistemiyle H2O2 ölçümleri -0,3V'ta amperometrik metod kullanılarak yapılmıştır.Miyoglobin temelli H2O2 biyosensöründe ölçümler amperometrik yöntem kullanılarak H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak artan akım değerlerinin belirlenmesi ile gerçekleştirilmiştir.Hazırlanan biyosensörlerin optimizasyon çalışmalarında öncelikle optimum SAM oluşum süresi, optimum sisteamin konsantrasyonu, optimum miyoglobin konsantrasyonu, optimum glutaraldehitte bekletme süresi gibi parametreler çalışıldı. Çalışma koşullarının optimizasyonunda pH optimizasyonu ve sıcaklık optimizasyonu gerçekleştirildi. Daha sonra karakterizasyon çalışmalarında miyoglobin temelli H2O2 biyosensörü için doğrusal tayin ğrafiği ve tekrarlanabilirlik belirlendi.Optimizasyon çalışmaları sonucunda H2O2 biyosensörü için en uygun protein miktarı, miyoglobinde bekletme süresi, sisteamin ile SAM oluşturma zamanı, sisteamin konsantrasyonu ve glutaraldehitte bekletme süresi sırasıyla 10 mg/ml Mb, 4 saat miyoglobin çözeltisinde bekletme, 16 saat sisteaminde bekletme, 100 mM sisteamin konsantrasyonu ve 1 saat glutaraldehitte bekletme olarak bulunmuştur. Çalışma koşullarının optimizasyonu amacıyla yapılan denemelerde H2O2 biyosensörü için çalışma tamponu olarak 50 mM pH:7 fosfat tamponu ve çalışma sıcaklığı olarak 25oC bulunmuştur. H2O2 biyosensörü için yapılan karakterizasyon çalışmalarında ise 5 ? M - 100 ? M aralığında H2O2 için doğrusal sonuçların alındığı belirlenmiştir. Tekrarlanabilirlik denemelerinde (n=7) 50 mM H2O2 konsantrasyonunda ortalama değer = 52.665 ? M, standart sapma (S.S) = ? 2.375 ve % varyasyon katsayısı (V.K) = 4.51 olarak bulunmuştur.

Abstract:
Development of second generation amperometric biosensör based on elecrotocatalytic reduction of miyoglobine and its usage for H2O2 determination is the ultimate aim of this thesis. In the myoglobin based biosensor system self assembled monolayer was formed on the gold electrode with cysteamine and cross linked with glutaraldhyde after myoglobin immobilization. Measurement of the H2O2 concentration were carried out using the formed biosensor and with the help of amperometric metod at -0,3V working potantial.The measurements on the myoglobin based H2O2 biosensor were carried out with the determination of increasing current values directly proportional with the H2O2 concentration using the amperometric method.In the optimization studies of the biosensör preliminarly optimization of bioactive layer components such as optimum SAM formation time, optimum cysteamine concentration, optimum myoglobin concentration, optimum glutaraldhyde percentage were carried out. Optimization of working conditions; optimum pH and optimum temperature also investigated. Afterwards, in the characterization studies some paramaters such as linearity, reproducibility were determined.As a result of the optimization studies the optimum protein amount, optimum incubation time in myoglobin solution, SAM formation time with cysteamine, optimum cysteamine concentration, and optimum incubation time in glutaraldehyde were discovered respectively 10 mg/ml Mb, 4 hours holding in Mb solution, 16 hours holding in cysteamine , 100 mM cysteamine concentration and 1 hour holding in 5% glutaraldehyde solution. It was discovered at the experiments for the optimization of the working conditions that the buffer at this study as 50 mM, pH 7 phosphate buffer and working temperature as 25oC for the H2O2 biosensor. It was determined at the characterization studies on the H2O2 biosensor that linear results are obtained between the ranges of 5 ? M to 100 ? M H ? O2 concentration. At the repeatability experiment, average value = 52.665 ? M, standard deviation (SD) = ? 2.375 and coefficent of variation (CV) = %4.51 was discovered for the (n=7) 50 ? M H2O2 concentration