Pamukkale termal sularından izole edilen Bacillus licheniformis'ten katalaz enziminin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Catalase from a local Bacillus licheniformis species isolated from pamukkale hot springs: Cloning, expression, purification and characterization
Yazar: MEHMET ÖZKARSLI
Danışman: PROF. DR. ALAATTİN ŞEN
Pamukkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada Pamukkale termal sularından izole edilen Bacillus licheniformis'ten katalaz enziminin klonlanması, ifade edilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. İzole edilen Bacillus licheniformis suşundan, uygun primer dizileri kullanılarak PZR ile Katalaz gen bölgesinin sentezi gerçekleştirilmiş, elde edilen Katalaz DNA'ları pCR8/GW/TOPO klonlama vektörlerine transfer edilerek rekombinant vektörler sentezlenmiş ve TOP10 Kompetan E. coli'hücrelerine transforme edilmiştir. Sekans analizi yapılarak doğrulanan vektörlerden katalaz gen bölgesi LR Klonaz enizimi kullanılarak pDEST 14 Ekspresyon Vektörü'ne aktarılmıştır ve BL21-AI hücrelerinde katalaz enziminin ifadesi gerçekleştirilmiştir. Katalaz geni 1458 nükleotid ve 485 amino asit içerir. Enzim DEAE iyon değişim ve HTP hidroksiapatit kolon kromatografileri ile saflaştırılmıştır. Saflaştırılan katalaz 60 kDa moleküler ağırlığa sahip dört alt birime sahiptir ve 25- 50 oC ve pH 5-11 arasında aktivite göstermekterdir. Katalaz enzimi Km 21,5 mM Vmax 8,333 mmol/dak/mg protein değerlerine sahiptir. Enzim absorpsiyon spektrumunda monofonksiyonel katalazlar için tipik olan 406 nm'de Soret bandı göstermiş ve ayrıca Sodyum ditiyonit ve potasyum siyanid ile indirgenmemiştir. Enzim yüksek deterjan konsantrasyonlarında bile stabil kalabilmektedir. Sonuç olarak, belirtilen bu özellikler enzimin endüstride kullanılabilme potansiyelinin olduğunu göstermektedir.

Abstract:
In this study; Catalase enzyme was cloned, expressed, purified and characterized from a local Bacillus licheniformis species isolated from Pamukkale hot springs. Firstly; we made PCR with suitable primers from isolated Bacillus lichenformis and followed by cloning this product into pCR8/GW/TOPO cloning vector and transformed into TOP10 competent E. coli cells. Catalase gene was confirmed with sequence analysis and then transfered into pDest expression vector with the ease of LR Clonase enzyme and transformed into BL21-AI cells. Catalase gene has 1,458 nucleotides and 485 amino acids. Subsequently, catalase was purified by applying DEAE and hydroxyapatide colon chromatographies. Purified catalase has four subunits with apparent monomer molecular weight of 60 kDa and exhibited considerable activity over a broad pH and temperature ranges from pH 5.0 to pH 11.0 and from 20oC to 50oC, respectively. Catalase enzyme has Km of 21,5 mM and Vmax of 8,333 mmol/min/mg protein values. The absorption spectrum of catalase exhibited a Soret band at 406 nm, which is typical of a heme-containing catalase. Enzyme was not reduced with sodium dithionite and potasium cyanide. Enzyme protect its stability at high detergent concentrations. As a result, it is suggested that Bacillus licheniformis catalase has a potential to be used as an industrial enzyme.