Plazmine karşı peptit inhibitörlerinin geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterization of peptide inhibitors against plasmin
Yazar: NURDAN ERSÖZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. FAHRİYE CEYDA DUDAK ŞEKER
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Faj gösterim peptit kütüphaneleri proteinler, inorganik yüzeyler ve küçük organik moleküller gibi çeşitli hedeflere seçici olarak ve yüksek afiniteyle bağlanan peptitlerin geliştirilmesinde önemli bir araç haline gelmiştir. Bu teknikteki başarılı gelişmelerle birlikte enzimlerin aktif bölgelerine bağlanan ve enzim aktivitesini düzenleyen peptitlerin geliştirilmesi sağlanmıştır. Özellikle, tıp ve biyoteknoloji alanında kritik öneme sahip proteazların enzim aktivitelerini inhibe eden peptitlerin geliştirilmesinde faj gösterim tekniğinin başarıyla kullanılması büyük ilgi uyandırmıştır.
Gerçekleştirilen çalışmada, faj gösterim yöntemi kullanılarak süt ve süt ürünlerinde kaliteyi olumsuz yönde etkileyen plazmin enzimine karşı peptit inhibitörlerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, faj gösterim kütüphanesi kullanılarak, plazmine yüksek afiniteyle bağlanan faj klonları iki farklı geri kazanım yöntemi kullanılarak seçilmiştir. Seçilen faj klonlarından inhibisyon etkisine sahip olanların değişken bölge DNA sekansları ve kodladıkları peptit dizilimleri belirlenmiştir. Plazminin spesifik kesim noktaları çıkartılarak modifiye edilen peptitlerin inhibitör özelliklerinin arttığı görülmüştür. İnhibisyon etkisine sahip PI-S14M ve PI-24M peptitlerinin, inhibisyon kinetikleri incelendiğinde PI-S14M peptitinin karışık tip inhibisyon özelliği gösterirken, PI-24M peptitinin yarışmalı tip inhibisyona uyum gösterdiği belirlenmiştir. Bununla birlikte PI-S14M peptitinin inhibisyon sabiti (Ki: 216 µM) PI-24M'in değerinden (Ki: 551 µM) daha düşük bulunmuştur. Bu PI-S14M peptitinin inhibisyon yeteneğinin daha yüksek olduğunu göstermiştir. İzotermal titrasyon kalorimetresi ile enzim-inhibitör etkileşiminin termodinamik özellikleri ve bağlanma katsayıları saptanmıştır. Termodinamik parametreler PI-S14M peptitinin plazmine karşı daha yüksek affinite, desolvasyon etkisi ile daha sıkı bağlanma eğilimi olduğunu göstermiştir. Peptitlerin plazmine karşı seçiciliklerinin belirlenmesi için inhibitörlerin insan sindirim proteazlarından olan pepsin ve tripsin aktiviteleri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Her iki peptit de diğer proteazların aktivitelerini önemli düzeyde etkilememiştir. PI-S14M inhibitör peptiti gıda denemelerinde de kullanılmış ve süt örneği gibi yoğun ve karmaşık bir ortamda plazmin aktivitesini gözle görülür şekilde engellemiştir. 
Çalışmanın sonucunda, faj gösterim tekniği kullanılarak gıda alanında önemli bir enzim olan plazmine karşı inhibitör peptitler geliştirilmiştir. Ayrıca, peptit dizilimleri üzerinde yapılan modifikasyonlarla peptitlerin inhibitör özelliklerinin arttırılabileceği ortaya konmuştur. Elde edilen sonuçlar, gıda kalitesinde ve proseslerinde kritik öneme sahip enzimlerin aktivitelerinin düzenlenmesinde faj gösterim yöntemi kullanılarak seçilen peptitlerin kullanılabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Phage display technology has become an important tool for developing peptides that bind to various targets, like proteins, inorganic surfaces and small organic molecules, with a high affinity and selectivity. The success of this technique allows the development of peptides binding to the active sides of enzymes and modulating their activity. Utilization of phage display technique in the design of peptides that inhibit the enzyme activity of proteases, especially the ones having a critical importance in the field of medicine and biotechnology, has aroused great interest.
In this project, phage display technique was used to develop peptide inhibitors against plasmin enzyme which adversely affects the quality of milk and dairy products. The phage clones binding to plasmin with high affinity were selected via phage display by two different elution methods. The DNA sequence of phage clones having inhibition effect and the amino acid sequence of encoded peptides were determined. The peptides were modified by deleting the plasmin specific cleavage sides from their sequences. Enzyme activity measurements revealed that the modified peptides sustained their inhibitory properties. On the next step, the peptides PI-S14M and PI-24M were characterized. The inhibition mechanism and inhibition constants of peptides were determined to reveal the inhibitory activities. PI-S14M showed mixed type inhibition, while the results obtained for PI-24M were conherent with competitive inhibition. The inhibition constant (Ki: 216 µM) of PI-S14M was found to be lower when compared with that of PI-24M (Ki: 551 µM), revealing that the inhibitory activity of PI-S14M is better. The thermodynamic properties and the affinity constant of enzyme-inhibitor interaction were examined by isothermal titration calorimetry. The thermodynamic values showed that PI-S14M has desolvation effect and higher affinity to plasmin compared with PI-24M. The effects of peptides on trypsin and pepsin were investigated to state the selectivities of inhibitors. The peptides did not affect the activity of proteases significantly. Plasmin activity in complicated food matrix such as milk was perceptibly inhibited by using PI-S14M. 
As a result, inhibitor peptides were developed against plasmin, an important enzyme for food industry, using phage display technique. In addition, it is revealed that the inhibition capacity of peptides can be enhanced by modifying their amino acid sequences. The results showed that, phage display derived peptides can be used in modulating the activity of enzymes which have critical roles in food quality and processing.