Yerel ekosistemlerden izole edilen ve endüstriyel önemi olan proteinleri üreten bakterilerin izolasyonu, tanımlanması ve ilgili proteinlerin taranması
Isolated and identified, bacterial cultures were screened in order to estimate their ability for production of industrially important enzymes form local ecosystems
Yazar: HÜLYA BAL
Danışman: PROF.DR. DİLEK KAZAN
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
ÖZETYerel Ekosistemlerden İzole edilen ve Endüstriyel Önemi olanProteinleri Üreten Bakterilerin İzolasyonu, Tanımlanması ve İlgiliProteinlerin TaranmasıBu çalışmada, Marmara Bölgesinde bulunan sıcak su kaynaklarından vekomposttan izole edilen 146 bakteri kültürü, endüstriyel önemi olan proteaz,endoglukonaz, amilaz ve lipaz gibi enzimleri üretebilirlikleri açısından taranmıştır.Toplam izolatlar içerisinde alkalen proteaz, endoglukonaz, amilaz ve lipaz üretebilenizolatlar sırası ile %80.3, %45.26, %16.06, %16.06 olarak bulunmuştur. Fenotipiközelliklerine göre 146 bakteri kültüründen 19 izolat seçilmiştir. 17 proteaz üreticisiBacillus cinsi alkalofilik türü bakterilere % 80 benzerlik göstermektedir. Moleküleryöntemle tanılanan Bacillus clausii GMBAE 22 en iyi alkalen proteaz üreticisi olarakbulunmuştur.Bu tez kapsamında, yeni izole edilmiş Bacillus clausii GMBAE 22' nin ürettiğiserin alkalen proteazın saflaştırılması ve karakterizasyonu da çalışılmıştır. Bacillusclausii GMBAE 22' den elde edilen enzim; protein bakımından zengin ortamda pH10.5' da 2 gün 37ºC' de çalkalayıcı inkübatörde üretilmiştir. En yüksek alkalenproteaz enzim aktivitesi hücre kültivasyonunun geç durağan fazında belirlenmiştir.Kültürden filtre edilen enzim; (NH4)2SO4 çöktürmesini takiben, DEAE-Selülozkromatografisi ile kısmen saflaştırılmıştır. Enzimin saflaştırma katsayısı 2.66, verimiise %14.69 olarak elde edilmiştir. Enzimin moleküler ağırlığı; SDS-PAGE analizikullanılarak 25.4 kDa olarak belirlenmiştir. Enzimin optimum sıcaklığı 60ºCbulunmuştur; bununla beraber ortama 5 mM konsantrasyonda Ca+2 iyonları ilaveedildiğinde optimum sıcaklık 70ºC' ye değişmektedir. Enzimin, pH 10.5' da 30-40ºC arasında 2 saat kararlı olduğu, 50ºC' de ise aktivitesinin %35' ini kaybettiğibelirlenmiştir. Enzimin optimum pH' sı 12 olarak bulunmuştur. Enzim; 30ºC' de pH9.0-11.0 arasında 24 saat boyunca kararlıdır. Enzim aynı koşullarda pH 12.0' de%96.70 ve 12.5' de ise %20.14 oranında aktivitesini koruyabilmiştir. Enzim; PMSFvarlığında tamamen inhibe olduğu için bir serin alkalin proteazdır. Km ve kcatdeğerleri sırasıyla 1.32 mg ml-1, 469.51 dak-1 olarak bulunmuştur.Bu çalışma BSE-073/1311 numaralı Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu(BAPKO) tarafından desteklenmiştir.Anahtar Kelimeler: Fenotipik ve Genotipik Karakterizasyon, Endüstriyel ÖnemiOlan Enzimler, Bacillus clausii, Serine Alkalen Proteaz, Enzim Saflaştırılması,Enzim Karakterizasyonu.KASIM, 2005 Hülya BAL

Abstract:
ABSTRACTIsolated and Identified, Bacterial Cultures were Screened inOrder to Estimate Their Ability for Production of IndustriallyImportant Enzymes From Local Ecosystems.In this study, 146 bacterial cultures were isolated from the composts and hotspring waters located in Marmara Region of Turkey. Isolated cultures were screenedin order to estimate their ability for production of industrially important enzymessuch as alkaline protease, endoglucanase, amylase and lipase. The isolates that areable to produce alkaline protease, amylase, endoglucanase, lipase were found to be80.3%, 45.26%, 16.06%, 16.06% of the total isolates respectively. 19 of the 146bacterial cultures were selected for further phenotypic characterisation. 17 alkalineprotease producers were shown 80% similarity with the alkaliphilic type species ofBacillus genus. The isolate Bacillus clausii GMBAE 22 was found to be as bestalkaline protease producer. It is identified with chemotaxonomic and molecularmethods.The purification and characterization of a serine alkaline protease producedby newly isolated Bacillus clausii GMBAE 22 was also studied. The enzyme wasproduced in protein rich medium by shaking of B. clausii GMBAE 22 cultures for 2days at pH 10.5 and 37ºC. The highest alkaline protease activity was observed at thelate stationary phase of cell cultivation. The enzyme in culture filtrate was partiallypurified by DEAE-cellulose chromatography following the (NH4)2SO4 precipitationstep. 2.66-fold purification of enzyme was succeeded with 14.69% yield. Themolecular weight of enzyme was found to be 25.4 kDa by SDS-PAGE analysis.Optimum temperature of enzyme was estimated as 60ºC, however it is shifted to70ºC after addition of Ca2+ ions in 5 mM concentration. The enzyme was stablebetween 30-40ºC for 2 h at pH 10.5. Only 35% activity loss was observed at 50ºC.Optimal pH of the enzyme was found to be 12. Enzyme was also stable in pH 9.0 -11.0 range for 24 h at 30ºC, however, 96.70 and 20.14% activity protections wereobserved at pH values 12.0 and 12.5 respectively. The strong inhibition of enzymeby PMSF treatment suggested that enzyme is a serine alkaline protease. Km and kcatvalues were found to be 1.32 mg ml-1, 469.51 dak-1 respectively.This work was supported by The Scientific Research Projects Council (BAPKO)of Marmara Üniversity, with BSE-073/1311.Key Words: Phenotypic and Genotypic Characterisation, Industrially ImportantEnzymes, Bacillus clausii, Serine Alkaline Protease, Enzyme Purification, EnzymeCharacterisation.November, 2005 Hülya BAL