Fenilalanin hidroksilaz enzim eksikliğine moleküler gen analizleri metoduyla tanı konulması
To diagnose the phenylalanine hydroxylase enzyme deficiency with the method of molecular gene analysis
Yazar: DEMET ALGAN
Danışman: PROF.DR. MUNİS DÜNDAR
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Fenilalanin hidroksilaz = Phenylalanine hydroxylases ; Fenilketonüri = Phenylketonuria ; Mutasyon = Mutation

Özet:
Fenilalanin hidroksilaz (FAH) enzimi fenilalaninin tirozine hidroksilasyonunu katalizleyen hepatikbir enzimdir. FAH enzimi eksikligi sonucunda kanda, idrarda, beyinde ve diger vücut sıvılarındayüksek konsantrasyonda fenilalaninin ve metabolitleri (fenil pirüvik asit, fenil laktik asit, fenilasetik asit) birikir. Bu durum hiperfenilalaninemi (HFA) olarak bilinir. Normalin üzerindekifenilalanin seviyeleri sinir sistemi hücrelerine toksiktir ve fenilketonüri (FKÜ) hastalarında beyingelisimi ve fonksiyonunda geri dönüsümsüz anormalliklere neden olur. FKÜ, amino asitmetabolizmasının en yaygın dogumsal hatalarından biridir.nsan genomunda FAH enzimi kodlayan gen 12q22-q24.1 kromozomunda yerlesir. Bu gen yaklasıkolarak 90 kb uzunlugunda olup ve 13 ekzon içerir. HFA' ya neden olan FAH geninde su ana kadar420' nin üzerinde mutasyon belirlenmistir. Gen dizisinde küçük degisimlere neden olan 31 farklıpolimorfizm tanımlanmıstır. FAH geninde meydana gelen mutasyonlar; yanlıs anlamlı (missense),splice-site ve anlamsız (nonsense) mutasyonlar ile küçük delesyonlar ve insersiyonlardır.Çok sayıdaki mutasyonlar yüzünden hastaların çogu bilesik heterozigottur (compoundheterozygosity). Bu durum hastalıkla ilgili fenotipik çesitliligi açıklar. FAH eksikligi çevrenin vegenotipin etkili oldugu multifaktöriyel bir hastalıktır. Bu yüzden FAH genotipi, fenotipin saglam birgöstergesi olmayabilir. Bu mutasyonların sıklıgı ve dagılımı farklı populasyonlarda analiz edilmistirve belirli etnik gruplar haricinde genel populasyonda baskın ya da yaygın FKÜ iliskili mutasyonlaryoktur. Bu çalısma, FKÜ tanısı konmus 11 hastada R261Q mutasyonunu belirlemek için yapılanRestriksiyon Fragmentinin Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism;RFLP) analizlerini ve bu hastaların kardeslerinde tasıyıcılık tespiti için yapılan Degisken SayıdakiArdısık Tekrarlar (Variable Number of Tandem Repeats; VNTR) analizlerini içermektedir. R261Qmutasyonuna yönelik olarak çogaltılan Fenilalanin Hidroksilaz (FAH) geni PCR ürünü Hinf Irestriksiyon enzimi ile direkt mutasyon analizine tabi tutulmustur. 11 ailenin hiçbirinde R261Qmutasyonuna rastlanmamıstır. VNTR dizileri Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase ChainReaction; PCR) kullanılarak çogaltılmıs ve PCR ürünü jelde yürütülmüstür. 11 aileden 4 tanesiinformatif, 7 tanesi ise noninformatif bulunmustur. Ancak yaptıgımız çalısmada RFLP ve VNTRsonuçları uyum göstermedigi için kardeslerin tasıyıcı olup olmadıkları konusunda herhangi biryorum yapılamamıstır.

Abstract:
Phenylalanine hydroxylase (PAH) is a hepatic enzyme that catalyses the hydroxylation ofphenylalanine to tyrosine. The result of PAH deficiency phenylalanine and its metabolits (phenylpyrivuc acid, phenyl lactic acid, phenyl acetic acid) increase in the blood, urine, brain and otherbody fluids. This is known hyperphenylalaninemia (HPA). The abnormal levels of phenylalanineare toxic for nervous system cells and cause irreversible anomalies in brain development andfunction. PKU is a general inborn error of amino acid metabolism.In teh human genome the gene that codes PAH enzyme places chromosome 12q22-q24.1. This genespans about 90 kb and contains 13 exons. More than 420 PKU mutations that cause HPA have beenidentified until now. Thirty-one different polymorphisms causing minor changes in the genesequence have been identified. Mutations observed in the PAH gene iclude missense, splice-site andnonsense mutations, small deletions and insertions.Due to the large number of mutations most of the patients are compound heterozygotes. Thisexplains phenotypic variability observed in this disease. Phenylalanine hydroxylase deficiency is a`multifactorial disorder? in that both environment and genotype are necessary causal components ofdisease. For this reason PAH genotype may not be a robust predictor of phenotype. The frequencyand distribution of these mutations have been analyzed in different populations and there are nopredominant or common PKU-associated mutations in the general population with the exception ofcertain ethnic groups.This study contains the Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analysis to determineR261Q mutation in PKU patients and Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) analysis todetermine carrier detecting. The Phenylalanine Hydroxylase (PAH) gene which was amplified byPCR to determine R261Q mutation was performed direct mutation analysis with Hinf I restrictionenzyme. We didn?t coincide R261Q mutation in any of the 11 patients. VNTR sequences wereamplified using PCR and PCR product was run on the gel. With this method 4 families were foundto be informative and 7 families were found to be noninformative out of 11. But in this study wecouldn?t comment whether the siblings are carrier because the result of VNTR and RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) analysis are not accord each other.