Hayvanlardan izole edilen Bordetella bronchiseptica suşlarının virulens faktörleri ve bağışıklama gücünün saptanması
Virulence factors of bordetella bronchiseptica strains isolated from animals and detection of immunogenicity
Yazar: ÖZLEM BÜYÜKTANIR
Danışman: PROF. DR. MEHMET AKAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2003
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
72 ÖZET Hayvanlardan İzole Edilmiş Bordetella bronchiseptîca Stışlarının Virulens Faktörleri ve Bağışıklama Gücünün Saptanması Bu çalışmada, köpek, kedi, domuz ve deney hayvanları gibi evcil ve vahşi memeli hayvanlarda ağır seyidi solunum yolu infeksiyonlan oluşturan Bordetella bronchiseptîca suşlannın sahip olduğu virulens aktörleri, bu suşlardaki bazı antijenlerin bakteri tarafindan sentezlenme durundan ve bu antijenlerin bağışıklıktaki rolleri araştırıldı. Farklı kaynaklardan sağlanan 15 adet Bordetella bronchiseptîca susunda, adenilat siklaz-hemolizin (AC-Hly)'in üremenin erken döneminde sentezlenmeye başladığı ve genel olarak suşlarda yüksek değerlere (9,2-17,8 AC ünitesi) ulaştığı, filamentöz hemaglutinin (FHA) proteini sentezinin ise daha geç dönemde ortaya çıktığı ve düşük düzeyde üretildiği (1/2-1/8) belirlendi. B. bronchiseptîca suşlannın çoğunda gözlenen güçlü letal etki ile AC- Hly sentezi arasmda ilişki olduğu görüldü. B. bronchiseptîca suşlannın bakteri lizatı ve üre-ısı-ekstrakte proteini profilleri SDS- PAGE analizinde karşılaştırmalı olarak incelendiğinde, suşlann çoğunda patojenitede önemli olan FHA, AC-Hly, pertaktin, Fim D, 35 kDa protein ve fimbriya proteinlerinin ana bantlar olarak yer aldığı gözlendi. Farelerde tüm hücre aşısı ile yapılan bağışıklaması sonucu oluşan antikor yanıtının üre-ısı ekstrakte proteinleri ile yapılan western-blotting analizinde, FHA, AC-Hly, pertaktin, Fim D, 35 kDa protein ve fimbriya proteinlerine karşı genel olarak belirgin derecede antikor yanıtı oluştuğu belirlendi. Bu bulguların, bütün suşlara ait inaktif hücre aşılan ile bağışıklanan farelerde oluşan yüksek ve çapraz aglutinin düzeyi (1:512- 1:8192) ile virulent suş F415 eprüvasyonuna karşı iyi düzeyde (% 80-100) sağlanan korunma ile de uyumlu olduğu belirlendi. Üre-ısı-ekstrakte proteinden yüksek basınç altında Superdex 75 jel filtrasyon kolonunda tek aşamada saflaştınlan FimD-35 kDa protein-Fim üçlü protein grubunun B. bronchiseptîca suşlannın bağışık yanıt oluşturmasında önemli olduğu belirlendi. Bu protein grubu ile farelerde yapılan bağışıklama sonrasında, serum mikroaglutinasyon türelerinin 1/32-1/256 gibi düşük değerlerde olmasına karşın, 4 LD50 periton içi eprüvasyona karşı bazı suşlarda yüksek oranda (% 100) koruma sağladığı görüldü. Sonuçta, incelenen B. bronchiseptica suşlan arasında önemli antijenik farklılıkların bulunduğu, suşlardan hazırlanan tüm hücre aşılarının iyi bir koruma sağlamalarına karşın, özellikle saflaştınlan fimbriya grubu ile yapılan bağışıklama çalışmalan sonrasında korunma düzeylerinin susa ve doza bağlı değiştiği saptandı. Anahtar Sözcükler: Adenilat siklaz-hemolizin, bağışık yanıt, B. bronchiseptica, filamentöz hemaglutinin, fimbriya proteinleri,

Abstract:
73 SUMMARY Virulence Factors of Bordetella bronchiseptica Strains Isolated from Animals and Detection of Immunogenicity In this study, virulence factors of different strains of B. bronchiseptica which is the causative agent of important respiratory diseases in domestic and wild mammalian animals such as dogs, cats, pigs and experimental animals, the synthesis level of some of the antigens by the bacteria and the roles of these antigens in immunity were investigated. Generally FHA was synthesized in later stages and continued at low levels (1/2-1/8) throughout the culture, however, AC-Hly secretion was initiated at early stages of the liquid culture and reached high levels (9.2-17.8 AC unit) at 15 strains of Bordetella bronchiseptica from different origins. Besides, a correlation between the strong letality of most strains in mice and AC-Hly production was determined. When bacteria lysates and urea-heat-extracted protein profiles of B. bronchiseptica strains were analysed by SDS-PAGE, FHA, AC-Hly, pertactin, Fim D, 38 kDa porin protein and fimbriae proteins were shown as major bands at most of the strains. The profile of the antibody response of the mice after immunization with whole-cell bacteria was analysed by western-blotting with urea-heat-extracted proteins and significantly similar antibody response to FHA, AC-Hly, pertactin, Fim D, 35 kDa porin protein and fimbriae proteins occurred at most of the strains. This situation was compatible with the high-cross microaglutination titreş (1:512-1:8192) of the sera from mice immunized with inactive whole cell of all strains and also the high level (80-100%) protection against challenge with the virulent strain F415. The triple protein group consisting of Fim D-35kDa protein-Fimbriae which was purified from those urea-heat-extracted proteins of the strains in a single step by using Superdex 75 gel filtration column under high pressure was determined to be important in the immune response of B. bronchiseptica. Although the serum microaglutination titreş after immunization with this triple protein group were at low values (1:32-1:256), this protein group of some of the strains provided a high protection (100%) against intraperitoneal challenge in mice with 4 LD50 of the virulent strain F415. This protective immune response was found to be associated with the sufficient quantity of each protein present in FimD-35 kDa protein-Fimbriae group. In conclusion, whole-cell vaccines prepared from the strains provided high level protection, however, protection levels after immunization with the purified fimbriae group were determined to be related with the strain and the dose of the vaccine because of the major antigenic differences observed among B. bronchiseptica strains. Key Words: Adenylate cyclase-hemolysin, immune response, B. bronchiseptica, filamentous hemagglutinin, fimbriae proteins.