REPAIRv1 [dPspCas13b-ADAR2DD (E488Q)] ile memeli hücrelerinde gen çeşitlendirilmesi
Gene diversification in mammalian cells with REPAIRv1 [dPspCas13b-ADAR2DD (E488Q)]
Yazar: MUSTAFA ÖZKAN
Danışman: PROF. DR. REYHAN ÇOLAK
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
2018 Nobel Kimya Ödülü, protein mühendisliği alanındaki araştırmalara verilmiştir, var olan bir proteinin veya enzimin genlerini yeniden yazarak, daha etkili veya yeni işlevli protein geliştirmeye dayanan yöntemler geliştirmişlerdir. Protein mühendisliği alanındaki çalışmalarda ortam olarak mikroorganizmalar veya in-vitro sistemler kullanılmıştır. Söz konusu memeli proteinleri geliştirmek olunca, bu tür ortamlarda geliştirilmiş proteinler memeli hücrelerinde ifade edildiğinde yanlış katlanma veya kümelenmeler meydana gelmiştir. Mikroorganizmalar veya in-vitro sistemler, memeli hücrelerine özgü karmaşık sinyal yolaklarının olmaması, moleküller arası etkileşimler, zayıf katlanma, beklenmedik modifikasyonlar, DNA, RNA ve proteinlerin işlenişi, hücresel lokalizasyon sorunları vb. fizyolojik ve biyokimyasal sebeplerden dolayı uygun ortam oluşturmazlar. Bu ve benzeri sorunlar, araştırmacıları memeli hücrelerini doğrudan mühendislik alanı (evrimleşme alanı) olarak kullanmaya itmiştir. Memeli hücrelerinin başlıca zorlukları teknik, ekonomik ve pratik olmayan yöntemleri içerir. Memeli hücrelerindeki en önemli engeller muazzam genom büyüklüğü ve yavaş büyüme hızıdır. Genomun muazzam büyüklüğü bölgeye yönelik stratejilerin gelişmesine yol açmıştır. Bu tekniklerden en önemlilerinden bir tanesi 2020 Nobel Kimya ödülüne konu olan CRISPR teknolojidir. Tezin amacı memeli hücrelerinde çalışmanın zamansal maliyetini ortadan kaldırmaktır. RNA'yı hedef alan CRISPR enzimleri ve lentiviral gen taşıma sistemleri ile memeli hücrelerinde programlanabilen bir yöntem geliştirilmiştir. Bu programlanabilir sistemin en önemli özelliği, memeli hücrelerinin bölünmesinin yavaş olması durumunu ortadan kaldırmasıdır. RNA'yı hedef alan CRISPR enzimleri ile tek bir jenerasyonda (pasajda) hiç durmaksızın sürekli çok çeşitli varyant üretir ve bu varyantları, virüs aracılığı ile paketleyip, (kimerik antijen reseptörü) CAR-T yapıları oluşturur. Mevcut konjonktürde var olan sistemlerden verimli ve geniş varyant aralığına sahip, teknik, pratik ve ekonomik olarak uygun bir hücre içi programlanabilen yöntemi geliştirilmiştir.

Anahtar Kelimeler: CRIPSR, CAR-T, Lentiviral gen taşıma sistemi, Protein mühendisliği, Evrim, Bölgeye yönelik mutagenez

Abstract:
The 2018 Nobel Prize in Chemistry was awarded to research in the field of protein engineering, which developed methods based on developing more effective or new functional proteins by rewriting the genes of an existing protein or enzyme. Microorganisms or in-vitro systems have been used as a platform in studies in the field of protein engineering. When it comes to developing mammalian proteins, misfolding or aggregation occurs when proteins developed in such environments are expressed in mammalian cells. Microorganisms or in vitro systems lack complex signaling pathways specific to mammalian cells, intermolecular interactions, poor folding, unexpected modifications, processing of DNA, RNA and proteins, cellular localization problems, etc. They do not create a suitable platform due to physiological and biochemical reasons. These and similar problems have led researchers to use mammalian cells as a direct engineering platform (evolution platform). Major challenges with mammalian cells include technical, economical, and impractical methods. The major obstacles in mammalian cells are the enormous genome size and slow growth rate. The enormous size of the genome has led to the development of strategies for the site-directed. One of the most important of these techniques is CRISPR technology, which is the subject of the 2020 Nobel Prize in Chemistry. The aim of the thesis is to eliminate the time cost of working in mammalian cells.  A programmable methodology was developed using CRISPR enzymes (targeting RNA) and lentiviral gene delivery in mammalian cells. The most important feature of this programmable system is that it eliminates the slow division of mammalian cells. It constantly produces a wide variety of variants in a single generation (passage) with CRISPR enzymes targeting RNA and packages these variants through the virus and creates CAR-T structures (chimeric antigen receptor). A technically, practically and economically suitable in-cell programmable methodology has been developed that is efficient and has a wide range of variants from existing platform in the current conjuncture. 


Keywords: CRISPR, CAR-T, Lentiviral gene delivery system, Protein engineering, Evolution, Site-directed mutagenesis