Glutatyon peroksidaz aktivite ölçümü için yeni bir spektrofotometrik yöntem geliştirilmesi
Development of a new spectrophotometric method for measurement of glutathione peroxidase activity
Yazar: MELEK UGAR
Danışman: DOÇ. MUSTAFA ÖZYÜREK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidan enzimler = Antioxidant enzymes ; Glütatyon peroksidaz = Glutathione peroxidase

Özet:
Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) hücre içi bir enzim olup aktif merkezinde sellenosistein içerir. Vücutta doğal olarak bulunan bir antioksidan enzim olan GSH-Px çeşitli hastalıkların teşhisi ve tedavisinde önemli rol oynamaktadır. GSH-Px aktivite ölçülmesine dair literatürde mevcut yöntemler olmasına rağmen bu yöntemlerin birçok sakıncası ve uygulamada sınırlamaları vardır. Bu nedenle bu antioksidan enzimlerin aktivitelerinin belirlenebilmesi için basit, duyarlı, tekrarlanabilir ve hızlı analitik yöntemler gereklidir. Tez konusu; biyolojik örneklerde (doku homojenizatları) GSH-Px aktivite ölçümü için yeni bir spektrofotometrik yöntem (mikroplaka esaslı CUPRAC: 'Bakır(II) iyonu indirgeyici antioksidan kapasite' yöntemi) geliştirmek, optimal deney koşullarını (reaktif konsantrasyonu, sıcaklık, reaksiyon süresi vb.) belirlemek, olası girişim etkilerini incelemek ve elde edilen sonuçlar çerçevesinde biyolojik örnekleri GSH-Px enzim aktiviteleri özelliklerine göre değerlendirmektir. 
Tez kapsamında, biyolojik örneklerin GSH-Px enzim aktivitelerinin ölçülmesinde ilk defa mikroplaka okuyucu cihazı kullanılarak; tekrarlanabilir, duyarlı, pratik, hızlı ve kolay bir spektrofotometrik yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemde, bakır(II)-neokuproin, glutatyon varlığında 450 nm'de maksimum absorpsiyona sahip bakır(I)-neokuproin (Cu(I)-Nc) kelatına indirgenmektedir. GSH-Px enzimi tarafından katalizlenen reaksiyonla indirgenmiş-GSH, H2O2 ile reaksiyonu sonucunda yükseltgenmiş-GSH (GSSG) formuna dönüşmekte ve reaksiyon sonunda kalan serbest GSH, geliştirilen yöntemle (Mikroplaka-esaslı GSH-Px yöntemi) dedekte edilerek biyolojik örneklerin GSH-Px enzim aktiviteleri ölçülmüştür. Bu yöntem, mikroplaka okuyucuya uyarlanarak; manuel spektrofotometrik yönteme göre ölçüm duyarlılığı, tekrarlanabilirlik, doğruluk ve ölçüm hızı yönünden üstün bir yöntem olarak standardize edilmiştir. 
GSH-Px aktivite ölçüm yöntemini mikroplaka okuyucuya uyarlayarak geliştirilen Mikroplaka-esaslı GSH-Px yöntemiyle daha fazla sayıda örneği eş zamanlı olarak çalışabilmek mümkün olmaktadır. Geliştirilen yöntemle, bazı doku homojenizatlarının GSH-Px aktiviteleri belirlenerek sonuçlar referans yöntem olarak seçilen GSH-Px-DTNB (5,5'-ditiyobis (2-nitrobenzoik asit)) ve HPLC yöntemleri ile karşılaştırılıp geliştirilen yöntemin kesinliği ve doğruluğu ispatlanmıştır (yöntem valide edilmiştir). Genellikle, karaciğer dokusunun GSH-Px aktivitesi, diğer dokuların GSH-Px aktivitelerine göre daha yüksek bulunmuştur. Geliştirilen yöntemle, güniçi ve günlerarası GSH-Px aktivite değişimi incelenmiş ve doku homojenizatlarına (karaciğer, böbrek ve kalp) standart katkı yöntemi uygulanarak % hata oranlarının 2.13 ile 8.64 arasında olduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
Glutathione peroxidase (GSH-Px) as an intracellular enzyme contains the aminoacid selenocysteine in its active centre. GSH-Px naturally exists in human body and plays important role in diagnosis and treatment of various diseases. There are various methods for GSH-Px acvitity measurement in the literature, but these methods have many drawbacks and limitation of applications. Thus, simple, repeated, sensitive and rapid analytical methods have to be devised to measure antioxidant enzyme activity. The subject of this thesis is to develop of a new spectrophotometric method (microplate based CUPRAC: "Copper (II) ion reducing antioxidant capacity" method) for GSH-Px activity measurement in biological samples such as tissue homogenates, to determine optimal measurement conditions (e.g., reagent concentration, temperature, reaction time),  to investigate possible interference effects, and to evaluate  biological samples with respect to their GSH-Px antioxidant enzyme activities. 
In this thesis, a repeated, sensitive, practical, fast and easy spectrophotometric method was developed by using a microplate reader for the measurement of GSH-Px activity of biological samples for the first time.  In this method, glutathione is oxidized to the GSSG and Cu(II)-Nc is reduced to the highly coloured Cu(I)-Nc chelate showing maximum absorption at 450 nm. The glutathione peroxidase catalyzed oxidation of reduced glutathione (GSH) gives rise to oxidized form of GSH (GSSG), and GSH-Px activity of biological samples was measured by detecting remaining reduced GSH using the recommended method (Microplate-based GSH-Px assay). This developed assay was standardized by adapting to the microplate reader in terms of consistency of the measurements and reaction rate, repeatibility, precision and accuracy in comparison with manuel spectrophotometric method. 
Therefore, greater number of samples were able to assay simultaneously by using the Microplate based-GSH-Px method which developed by adapting microplate reader to the GSH-Px activity measurement test. GSH-Px activities of some tissue homogenates were determined with respect to the modified CUPRAC assay, and the proposed methodolgy was validated (precision and accuracy) by comparison of the results obtained with those of reference methods (GSH-Px-DTNB (5,5'-ditiyobis (2-nitrobenzoic acid) and HPLC assays). Liver homogenates were generally shown to exhibit higher GSH-Px activity than other homogenates. Then, using this method, the intra-day and inter-day variabilities of glutathione peroxidase activity in tissues were examined, and the method of standart additions applied to tissue homogenates (liver, kidney and hearth) gave relative standard errors between 2.13 and 8.64 %.