Apoptosis marker'ı olan annexina5'e karşı poliklonal antikor gelişimi
Development of polyclonal antibodies against the apoptosis marker annexina5
Yazar: AHMED ALPEREN TUNCER
Danışman: PROF. DR. EMİNE SÜMER ARAS
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis

Özet:
Apoptosis genel olarak, çok hücreli organizmalarda görülür ve genomik DNA'nın

hücre çekirdeği içerisindeki bozulması şeklinde karakterize olur. Apoptotik

sinyal, hücreyi ''ölüme'' sürükleyebilecek bir strese karşı cevap olarak ortaya

çıkar. Bu tip DNA bozulmaları bir çok fizyolojik işleyiş ile olabileceği gibi, bir çok

anti-kanser ajanın sitotoksik etkisi ile de meydana gelebilir.

Bu çalışmada apoptosis, hücre hatlarında Etoposid tarafından tetiklenmiştir ve

AnnexinA5 ile doğrulanmak amaçlı kontrol edilmiştir. AnnexinA5, bütün hücre

ölümlerinde hücre yüzeyinde ifadelenen fosfotidilserinleri tanıma özelliğinden

dolayı, apoptosis tanısı için önemli bir görev teşkil etmektedir. Işık

mikroskobisinde Etoposid'in Apoptosis'i tetiklediğini tespit etmek için hücre

hatlarına belirli konsantrasyonlarda verilen Etoposid, 24 saatlik bir süre

içerisinde aralıklı olarak kontrol edilmiştir. Apoptosis'in bu hücre hatlarında

gerçekleştiğini doğrulamak için, AnnexinA5'in hayvan immünizasyonu için

saflaştırılma ve poliklonal antikor üretim çalışmaları yapılmıştır. AnnexinA5'in

saflaştırma işleminin ardından, Balb/C dişi fareler üzerinde immünizasyon

gerçekleştirilmiştir. Balb/C dişi farenin karnında oluşan ''ascites'' sıvısı

toplanmış, hedef antijenik bölgeye spesifik antikor üretildiğini göstermek için

ascites sıvısı ve hücre hatlarından alınan örnekler western blot deneylerinde

primer antikor olarak kullanılmıştır. Western blot sonuçlarında ascites sıvısı

içerisindeki antikorların, Etoposid ile muamele edilmiş hücre hatlarından alınan

antijen örneklerine etkili bir şekilde bağlandığı görülmüştür. Sonuçlar dahilinde

biyoteknolojik yaklaşımlar kullanılarak poliklonal antikor üretim teknolojisi

başarılı olarak uygulanmış ve üretilen antikorlar ile hücre hatlarında Etoposid'in

Apoptosis'i etkin bir şekilde tetiklediği gösterilmiştir.

Abstract:
Apoptosis is general pathway of cell death in eukaryotes, characterized by

internucleosomal digestion of genomic DNA. Apoptotic signal is produced

against a stress condition which may lead the cell to ''death''. Such DNA

digestion can be induced by both physiological stimuli and cytotoxic treatment

with many anticancer agents.

In these studies, apoptosis was induced in cell cultures by Etoposide and

AnnexinA5 is used to detect apoptotic cells. Hence AnnexinA5 can be used as

a sensitive probe for phosphatidylserine exposure upon the cell membrane in all

of the cell death mechanisms, this protein plays a central role to understand

apoptosis. By treating cell cultures with certain concentrations of Etoposide in a

24h period, we aimed to detect if Etoposide induces Apoptosis or not. To prove

that Apoptosis was triggered in these cell cultures, we performed purification

and polyclonal antibody production assays for immunization of AnnexinA5 on

mice. After purificiation of AnnexinA5, we performed immunization of Balb/C

female mice. After harvesting ascites from female Balb/C mice' abdomen, we

used samples from cell cultures and ascites from mice as primer antibody in

Western Blot assay to show the production of spesific antibody for antigenic

target site. According to the Western Blot results, antibodies from the ascites

successfully bind to antigenic samples from cell cultures treated with Etoposide.

These results demonstrate the involvement of AnnexinA5 in Etoposide treated

apoptotic cells and suggest mechanisms of annexin family via production of

polyclonal antibodies by biotechnology techniques.