Konjenital septal defektlerin onarımına yönelik perikard bazlı rejeneratif kardiyak yamaların doku mühendisliği yöntemi ile geliştirilmesi
Development of pericardium based regenerative cardiac patches by tissue engineering approach to repair congenital septal defects
Yazar: ŞÜKRÜ ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. KEZBAN ULUBAYRAM
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kardiyak yamalar konjenital kalp hastalıklarının ve miyokardiyal enfarktüs (MI) tedavisinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte henüz ideal bir kalp yaması geliştirilmemiştir. Bu tez kapsamında konjenital septal defektler, MI onarımı gibi çeşitli kardiyak doku hasarlarında kullanılmak üzere rejeneratif kardiyak yamaların doku mühendisliği yöntemi ile geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla tez çalışmasının birinci bölümünde sıçan kemik iliğinden izole edilmiş mezenkimal kök hücreler (rt-MKH) aselüler perikard dokusuna ekilerek 10 µM 5-Azasitidine (5-Aza) maruz bırakılmış ve kalp atımının mekanik ve elektriksel uyarımlarla taklit edildiği biyomimetik biyoreaktör sisteminde kültür edilmiştir. Uygulanan biyofiziksel uyarımların kardiyomiyosit faklılaşması üzerine etkileri incelenmiştir. qPCR analiz sonuçları kök hücrelerin elektromekaniksel uyarımlar altında kardiyak spesifik belirteçlerini (GATA-4, MEF2C, NKX2.5 ve CACNA1C) ifade ettiğini göstermiştir. Elektromekaniksel uyarım uygulanarak geliştirilmiş kardiyak yamaların in vivo etkinlikleri MI modelinde test edilmiştir. İmplantasyondan 21 gün sonra denekler sakrifiye edilerek histolojik analizler yapılmıştır. Sonuçlar, MI modelinin başarılı bir biçimde oluşturulduğunu, yara bölgesinde yama kaynaklı kalsifikasyonunun görülmediğini, elektromekaniksel olarak uyarılmış yamaların kullanıldığı grupta daha fazla hücrelerin yamadan yara bölgesine göç ettiği ve daha düşük düzeyde inflamasyonun geliştiğini göstermiştir. Ayrıca hem yara bölgesinde hem de yara bölgesinden çıkarılan yamada temel kasılma birimi olan sarkomer yapısı ile ilişkili proteinleri (kardiyak troponin T (cTroT), miyozin ağır zinciri (MHC), sarkomerik alfa aktinin (SAC)) ve hücreler arasındaki mekanik bağlantı birimi olan N-kaderini (nCAD)) ifade eden hücrelerin olduğu görülmüştür. Çalışmanın ilk bölümünde umut vaden sonuçlar elde edilmiş olmakla birlikte biyofiziksel uyarımların kök hücrelerin kardiyomiyojenik farklılaşmasında yeterli olmadığı ve yeni stratejilerin geliştirilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. 
Bu nedenle tez çalışmasının ikinci bölümünde ise rt-MKH'lerde kimyasal (5-Aza ve dimetilsülfoksit (DMSO)) ve biyolojik stimülatörlerin (TGF-β1, FGF-2 ve BMP-2) birlikte kullanılarak çeşitli farklılaştırma prosedürleri test edilmiştir. 7. günün sonunda 5-Aza (10 µM) ve DMSO'nun (%1) birlikte kullanıldığı grupta yüksek hücre canlılığı ve en yüksek kardiyak spesifik belirteçlerin elde edildiği gözlenmiştir. 5-Aza ve DMSO'ya maruz bırakılan hücrelerin kardiyak spesifik proteinleri (cTroT, SAC, konneksin 43 (Cnx43) ve α-düz kas aktini (α-SMA)) ifade ederek kardiyomiyositlere farklılaştıkları, ancak organize olmayan bir sarkomer yapısı ve protein paterni bakımından fetal dönem kardiyomiyosit yapısı gösterdikleri gözlemlenmiştir. Organize sarkomer yapısı ve yetişkin dönem fonksiyonel kardiyomiyositler elde etmek için  insan ve sıçan kaynaklı kemik iliği MKH'leri (h-MKH ve rt-MKH) epigenetik yeniden programlama (asetilasyon aktivasyonu ve metilasyon inhibisyonu) ve biyolojik yolak manipülasyonlarını (WNT ve TGFβ sinyal yolaklarının inhibisyonu) sağlayacak küçük moleküllere (valproik asit (Va), 5-Aza, DMSO, IWP-2 (WNT inhibitörü), repsox (TGFβ inhibitörü)) maruz bırakılmış ve hücre morfolojisi, hücre canlılığı, kardiyak spesifik belirteçlerin gen ve protein düzeyindeki ifadesi incelenmiştir. Sonuçlar, hücre kaynağına ve küçük molekül kombinasyonuna bağlı olarak farklı hücre morfolojisi ve kardiyak spesifik gen ifadesinin elde edildiğini göstermiştir. h-MKH'lerde yüksek hücre canlılığı ile birlikte kardiyomiyosit benzeri homojen bir morfoloji (uzamış iğsi bir görünüm) ve GATA-4, NKX2.5 ve MEF2C ifadelerinde rt-MKH'lerine göre anlamlı düzeyde artış meydana geldiği izlenmiştir. 14 gün sonunda yapılan immünfloresan boyama analiz sonuçları uygulanan farklılaştırma prosedürüne ve hücre kaynağına bağlı olarak protein ifade paterni ve sarkomer organizasyounun değiştiğini göstermiştir. Her iki hücre tipinin uygulanan tüm farklılaştırma prosedürleri ile translasyonel düzeyde kardiyomiyositlere farklılaştığı ancak rt-MKH'lere kıyasla h-MKH'lerin Cnx43, cTroT ve α-SMA ifadesi bakımından yetişkin kardiyomiyositlere daha çok benzediği ve daha organize sarkomer yapısına sahip olduğu görülmüştür. 
Sonuç olarak kardiyak doku mühendisliği uygulamalarında çeşitli küçük molekül kombinasyonları kullanılarak MKH'lerin daha yüksek verimle kardiyomiyosit hücrelerine farklılaştırılabildiği gösterilmiştir. Ayrıca yetişkin kardiyomiyositlerin elde edilmesinde h-MKH'lerin daha uygun hücre kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Cardiac patch has been used in the treatment of congenital heart disease and myocardial infarction (MI) while an ideal cardiac patch has not been developed yet. This study aimed to engineer regenerative cardiac patches by cardiac tissue engineering strategies to be used in various cardiac tissue damage such as congenital heart defect and MI repair. In the first part, rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (rt-BMSCs) were seeded into acellular bovine pericardium-based 3-dimensional (3D) tissue scaffolds and differentiated into cardiomyocytes using a biomimetic bioreactor system that mimics excitation-contraction coupling in the heart following 10 µM 5-azacytidine (5-Azc) treatment. The effect of applied biophysical stimulations on cardiomyogenic differentiation was investigated. qPCR analysis showed that cardiac-specific markers (GATA-4, MEF2C, NKX2.5 and CACNA1C) were upregulated in electromechanically stimulated stem cells. The performance of electromechanically stimulated cardiac patches was assessed in a rat MI model and histological stainings were performed after 21 days of post-implantation. Results showed that MI was induced successfully and patch-related calcification was not observed in all tested groups. Moreover, a higher number of BrdU-labelled cells and a low level of CD68 positive cells were observed in the infarct region under electromechanically stimulated conditions compared to static conditions. In addition, cTroT, MHC, SAC, and nCAD positive cells were observed in both infarct region and retrieved patch after 3 weeks. Although promising results were obtained in the first part of the study, it was concluded that biophysical stimulations are not sufficient for cardiomyogenic differentiation of stem cells and novel strategies should be unveiled to enable more effective cardiomyogenic differentiation.  
Within this scope, we tested several protocols in which chemical (5-Aza and Dimethylsulfoxide (DMSO)) and biological stimulators (TGF-β1, FGF-2 and BMP-2) were used in different combinations to increase cardiomyogenic differentiation of rt-BMSCs in the second part of this study. qPCR results indicated that the highest cardiac-specific marker expressions were measured in the combination of 5-Aza (10 µM) and DMSO (1%) after 7 days. Immunofluorescence analysis results demonstrated that rt-BMSCs expressed cardiac-specific proteins (cTroT, SAC, Cnx43, and α-SMA) and differentiated into cardiomyocytes in 5-Aza and DMSO induction while rt-BMSCs-derived cardiomyocytes showed fetal cardiomyocyte-like proteins expression patterns and disorganized sarcomere structure. Both rt-BMSCs and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (h-BMSCs) were exposed to a variety of small-molecules (valproic acid (Va), 5-Aza, DMSO, IWP-2 (WNT inhibitor) and RepSox (TGF-β inhibitor)] combinations to manipulate epigenetic profile (acetylation activation and methylation inhibition) and signaling pathways (WNT and TGFβ signaling pathway inhibition) to develop adult-like contractile cardiomyocytes with highly organized sarcomere structure. Cell morphology, cell viability, cardiac specific gene and protein expressions were evaluated. Results showed that cell morphology and cardiac-specific gene expression level were highly dependent on small molecule combination and stem cell resources. It was observed that h-BMSCs had a homogeneous morphology (elongated spindle-shaped) with high cell viability and GATA-4, NKX2.5, and MEF2C genes were significantly higher expressed in these cells compared to rt-BMSCs. Immunofluorescence analysis was also performed after 14 days and results clearly showed that protein expression pattern and sarcomere organization were highly dependent on stem cell source and differentiation protocol. Both rt-BMSCs and h-BMSCs were successfully differentiated into cardiomyocytes at the translational level and expressed cardiac-specific proteins including cTroT, SAC, Cnx43, and α-SMA. However, adult-like protein expression patterns and more organized sarcomere structure were observed in h-BMSCs-derived cardiomyocytes compared to rt-BMSCs-derived cardiomyocytes. 
In conclusion, mesenchymal stem cells showed higher cellular differentiation into cardiomyocytes in the presence of small molecules and h-BMSCs were more convenient cell type to derive adult-like cardiomyocytes for cardiac tissue engineering applications.