Mesobuthus gibbosus türü akrep venomunun enzimatik etkili bileşenlerinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile araştırılması
Investigation of the enzymatically active components of mesobuthus gibbosus scorpion venoms by high performance liquid chromotography (HPLC)
Yazar: SEBAHAT OLUÇAY
Danışman: DOÇ. DR. FİGEN ÇALIŞKAN
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Biyogüvenlik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Hayvansal kaynaklı venomlar farmakolojik etkinlikleri bakımından çok büyük farklılıklar göstermeleri nedeniyle ilaç keşif araştırmalarında kullanılan değerli ve özgün moleküllerdir. Ülkemizde geniş bir alana dağılım gösteren Mesobuthus gibbosus türü akrepler halk sağlığını tehdit eden en önemli akrep türlerinden birisi olarak bilinmektedir. Bu çalışmada M. gibbosus'un venomunun ana bileşeni olan peptid toksinlerin enzimatik aktiviteleri araştırılmıştır.

M. gibbosus türü akreplerden elde edilen peptid karışımı jel elektroforezinde yürütülerek pH 4,2'de aktif olarak çalışan kazeinolitik aktiviteli 84 kDa. molekül ağırlığında bir bant ve pH 7,2'de çalışan fibrinojenolitik aktiviteli 45 kDa. molekül ağırlığında bir bant ve hyaluronidaz aktiviteli 36 kDa. molekül ağırlığında bir bant ile proteolitik aktiviteler tespit edilmiştir. Ham venomun kromotografik olarak ayrımı Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi'nde (HPLC) gerçekleştirilmiş ve en az 41 farklı fraksiyon elde edilmiştir. Ham venomda elde edilen hyaluronidaz aktivitenin HPLC ile saflaştırılması için ters-faz kromotografide önce 4'er dakikalık daha sonra 1'er dakikalık fraksiyonlar alınmış ve en etkin pikin 44,5 alıkonma zamanlı fraksiyon olduğu belirlenmiştir. Elde edilen peptidin Kütle Spektrometre analiz sonucuna göre 4208 Da. molekül ağırlığına sahip olduğu tespit edilmiştir. Peptid bileşeninin PPSQ-Edman Degradasyon metodu uygulaması ile NEEDCTNDQCILS(L)CLMEGSI amino asit dizilimine sahip olduğu belirlenmiş fakat BLAST analiz sonucu diğer Hyaluronidazlar ile bir benzerlik göstermediği tespit edilmiştir. 

Bu çalışma ile M. gibbosus'un ham venomunda bulunan enzimatik etkinlikteki peptidlerin varlığı ortaya çıkartılmıştır. Proteazların dokularda dağılma faktörleri olarak çalıştıkları bilinmektedir bu nedenle proteolitik enzimlerin neden olduğu süreçler ve venom aktivasyon mekanizması üzerindeki etkilerinin de araştırılması gerekmektedir. Çalışma sonuçlarımız M. gibbosus proteazlarının farmöstetik, biyoteknolojik ve biyokimyasal endüstrilerde gelecek araştırmalar için yararlı araçlar olabileceğini göstermektedir.

Anahtar kelimeler: Mesobuthus gibbosus, enzimatik aktivite, proteolitik aktivite, hyaluronidaz aktivite

Abstract:
Animal-derived venoms are valuable and unic molecules used in drug discovery researches because of their different pharmacological activities. Mesobuthus gibbosus scorpions that have a wide distribution in our country are known as one of the most important scorpion types threatening the public health. In this study the enzymatic activities of the peptide toxins which are the main component of M. gibbosus venom has been researched. 

The electrophoretic profile that obtained from M. gibbosus scorpions has revealed. In this study, a caseinolytic activated band of 97-64 kDa. molecular weight at pH 4,2 and a fibrinogenolitic activated band of 55-45 kDa. molecular weight at 7,2 and a hyaluronidase activated band of 45-36 kDa. molecular weight has been detected. Chromatographic seperation of crude venom were carried out by High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) and at least 41 different fractions were obtained. HPLC purification of hyaluronidase activated peptide has carried out by reverse phase chromatography and the fraction with 44,5 retention time was determined.  It was also determined by Mass Spectrometry analysis that the purrified peptide is 3861 Da. molecular weight. The first 20 amino acid sequance of the peptide component was identified as NEEDCTNDQCILXCLMEGSI with the PPSQ-Edman Degradation method. Studies of antivenom inhibition detection with hyaluronidase activated venom peptide has been carried out, and it has been observed that the antivenom of The Ministry of Health has reduced the hyaluronidase activated peptides in a certain rate, and the antivenom of Acsera company does not have any effects on the hyaluronidase activated peptides.

By this study, the biochemical and enzymatic effects of peptides with the enzymatic activity that found in the crude venom of M. gibbosus has been revealed. The molecular weight and the amino acid sequence of a hyaluronidase activated peptide has been determined. Our study results showed that M. gibbosus proteases might be useful tools for future reseaches in the pharmaceutical, biotechnological ve biochemical industries. 
Keywords: Mesobuthus gibbosus, Enzymatic Activity, Proteolytic Activity, Hyaluronidase Activity