Dasatinib uygulanan KML hücre serilerinde uyarılmış apoptozunda STAT5A ve STAT5B için ortak hedef olan miRNA' ların ekspresyon profillerinin çıkartılması
Determining expression profiles of miRNAs that potentially regulate STAT5A and STAT5B in dasatinib treated K562 cells with evaluating apoptosis
Yazar: ASU FERGÜN YILMAZ
Danışman: DOÇ. DR. FİLİZ VURAL
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Hematoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Genler = Genes ; Hücre dizisi = Cell line ; Lösemi = Leukemia ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Mikro RNA = Micro RNA ; Tirozin = Tyrosine

Özet:
Kronik myeloid lösemi (KML), myeloid öncül hücrelerin klonal çoğalması ile karakterize kök hücre hastalığıdır. KML'nin patogenezini oluşturan phledelphia kromozomu olarak tanımlanan t(9;22) sonucu oluşan Bcr/Abl füzyon genidir. Bcr/Abl füzyon geni kontrolsüz tirozin kinaz aktivitesi gösterir. Hastalığın patogenezinde birçok sinyal ileti yolağının etkili olduğu bilinmektedir. Bu yolaklardan biri de JAK/STAT yolağı ve özellikle STAT 3 ve 5'tir. Bu nedenle STAT'lar tirozin kinaz inhibitörlerine direnç gösteren KML tedavisinde iyi birer terapötik hedef haline gelmişlerdir. KML hastalarında tirozin kinaz inhibitörlerinin uygulamaya girmesi bir dönüm noktası olmasına rağmen gelişen direnç, halen bir sorun oluşturmaktadır. Bu nedenle bu hastalar için yeni tedavi seçenekleri araştırılmaktadır. Kanser tedavisinde kullanılmak üzere geliştirilen yeni tedavi stratejilerinde patogenez ve direnç mekanizmaları da göz önüne alınarak,  bu yolaklara spesifik küçük sentetik moleküler inhibitörlerin geliştirilmesi önem kazanmıştır. Bu inhibitörlerden biri de miRNA'lardır. Bu küçük RNA dizilerinin birçok hücresel fonksiyonda ve karsinogenezde etkili oldukları düşünülmektedir. Günümüze kadar miRNA biyogenezinin aydınlatılmasına yönelik çalışmalar olmasına karşın, miRNA'ların biyolojik yolakları nasıl düzenledikleri tam olarakbilinmemektedir. Ayrıca KML patogenezinde önemli role sahip STAT5a ve 5b'nin ortak hedefi oldukları, miRNA ve anti-miRNA tedavilerini araştıran yeterli çalışma yoktur. 
Bu çalışmada öncelikle; bir tirozin kinaz inhibitörü olan dasatinib'in KML hücremodeliK562'de, hücre apoptozu üzerine etkilerini belirlenmeyi amaçladık. Sonrasında dasatinib verilmiş hücrelerle, kontrol grubu hücreleri arasında, "in silico" analizle hedef genlerimizSTAT5a ve 5b'ninortak hedefi olabileceği öngörülen miRNA'ların ifadelenme profillerini belirlemeyi amaçladık. Sonuçta, "miRBase release 19 biyoinformatik" veritabanı ile STAT 5a ve 5b'nin ortak hedefi olabileceği23 tane miRNA saptandı. Bu miRNA'ların K562 KML hücre serilerindeki ifadelenmelerine bakıldı.  Hedef miRNA'ların artış ve azalış oranları "ΔΔCT metodu" ile kontrol grubu ve dasatinib uygulanmış örneklerde karşılaştırıldı. Sonuçta, hsa-miR-940, hsa- miR- 527 ve hsa- miR- 518a-5p olmak üzere,3 adet miRNA'nın kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdiği gözlendi. Bunlardan, hsa-miR-940 kontrol grubuna göre 4.4 kat azalırken, hsa- miR- 527 ve hsa- miR- 518a-5p'nın sırasıyla 12.1 ve 8 kat arttığı dikkat çekti.
Sonuç olarak, KML patogenezinde önemi bilinen STAT 5a /5b'nin olası hedefi olduğu miRNA'lar saptanıp; ekspresyon profilleri çıkartıldı. Validasyon basamağı ve sonrasında "mimic"ya da"inhibitör" miRNA transfeksiyon aşamalarından sonra elde edilecek veriler KML'nin tedavi ve patogenezine ışık tutabilecek, yeni ve teröpotik potansiyele sahip miRNA' lar tanımlanabilecektir.

Abstract:
Chronic myeloid leukemia (CML), is a hematopoietic stem cell disorder which is characterized of uncontrolled proliferation of myeloid precursor cells. The additional genetic lesion oft(9;22) named Phledelphia chromosome and its result of bcr/abl fusion gene occupy the pathogenesis of CML. Bcr/Abl fusion gene has a limitless tyrosine kinase propert and induces several signal transduction pathways. Among these pathways, one of the most important one in the pathogenesis of CML is JAK/STAT and STAT 5a and 5b. For this reason, STAT molecules become alternative therapeutic targets for the treatment of CML patientswhich are resistant to thyrosine kinase inhibitors. 
The tyrosine kinase inhibitors were major advance in the treatment of CML. Despite of success of tyrosine kinase inhibitors, the emergence of resistance still constitudes a major problem. So new signal transduction pathway specific small synthetic molecular inhibitors become important for the treatment of CML. One of these molecules is miRNAs. These small RNA chains are responsible for many cellular functions and carsinogenesis. Upto date, although there are increasing data explaining the biogenesis of miRNAs, the mechanism how they can control biologic pathways can not be explained completely. In addition, there is not satisfying data investigating the miRNAs and anti miRNA treatment targeting STAT 5a and 5b molecules which are important in the pathogenesis of CML.
In this study, we first searched the effect of a tyrosine kinase inhibitor, dasatinib, on apoptosis  in CML cell line K562. Then 23 miRNAs which possibly target both STAT5a ve 5b were identified by "in silico"analyses. The expressions of these miRNAs were determined in CML cell line K562. The down and upregulation of the miRNAs were compared with the control group and dasatinib treated group by "ΔΔCT method".  Expression of hsa-miR-940, hsa- miR- 527 and hsa- miR- 518a-5p were statisticaly different in between 23 miRNAs. The level of hsa-miR-940 was decreased 4,4 times and the levels of hsa- miR- 527 and hsa- miR- 518a-5pwere incresed 12,1 and 8 times respectively in the dasatinib treated group compared to control group. 
In conclusion, we determined the expression profiles of miRNAs targeting STAT 5a / 5b which has an important role in the pathogenesis of CML. Obtained datas after the validation and transfection of "mimic"and "inhibitor"miRNAs steps, couldlead to determine the new therapeutic targets in CML patients.