Hemofili A hastalarında regulatuvar T hücre fonksiyonlarının inhibitör gelişimi üzerine etkileri: İmmün tolerans gelişiminde sitokinlerin etkisi /
Yazar: EMRE AKKAYA
Danışman: PROF. DR. NİLGÜN SEMA GENÇ
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Hematoloji = Hematology ; Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Antikorlar = Antibodies ; Hemofili = Hemophilia ; Hemofili A = Hemophilia A ; Sitokinler = Cytokines ; T lenfositleri = T lymphocytes ; T lenfositleri-düzenleyici = T lymphocytes-regulatory ; İmmün tolerans = Immune tolerance ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Amaç: Hemofili A olgularında tedavide kullanılan FVIII preparatlarının yarı ömürlerinin kısa olması ve tekrarlayan infüzyonların gerekliliği % 25-30 hastada inhibitör gelişimine sebep olur. Bu inhibitörler efektif tedaviyi komplike eder, morbiditeyi arttırarak yaşam kalitesini etkiler. Yapılan çalışmalarda aktive T (CD4+CD25+ T) hücreleri aracılığıyla FVIII'e karşı tolerans geliştiği ve regulatuvar T / Treg (CD4+CD25+CD127- T) hücrelerinin uzun süreli toleranstaki rolü gösterilmiştir. Ancak inhibitör gelişimi, karışık süreci nedeniyle tam olarak açıklanamamıştır. Bu çalışmada, inhibitör gelişmiş (İNH(+)) ve inhibitör gelişmemiş (İNH(-)) Hemofili A hastalarında, rFVIII'le uyarılmış T hücre alt grupları ve bu hücrelerden sekrete edilen sitokinlerin inhibitör gelişme patogenezindeki rollerinin ortaya konulmasıyla inhibitör gelişen hastalara uygulanacak immün tedaviye katkıda bulunmayı amaçladık.
Yöntem: Çalışma grubu, 10 İNH(+) ve 10 İNH(-) hemofili hastası ile benzer yaş grubunda 10 sağlıklı kontrolden oluşturuldu. Periferik kan mononükleer hücre (PKMH) izolasyonu için; heparinli tüpe (Vacuette tube, BD, Plymouth, UK) alınan 10 ml kan örnekleri laboratuvara ulaştırılıp 0. gün T hücre oranlarına Akan Hücre Ölçer (Acea Biosystems Novocyte, San Diego, ABD) ile bakıldı. Daha sonra zenginleştirilmiş RPMI-1640 kültür medyumunda 1x106/mL PKMH olacak şekilde 3 koşulda inkübasyon yapıldı; 1) Unstimüle (Uyarılmamış/US), 2) rFVIII ile uyarılmış (1 mg/mL), 3) Fitohemaglutinin (PHA) ile uyarılmış (5 μg/mL). Kültür sonrası T hücre proliferasyon yüzdelerine Akan Hücre Ölçer ile, süpernatantlardaki sitokin düzeylerine ELISA (Diaclone Research, Besançon, Fransa) ile bakıldı.
Bulgular: Aktive T hücre proliferasyon yüzdeleri İNH(+) grupta İNH(-) gruba göre, hem US hem rFVIII'le uyarılmış koşulda anlamlı düşük bulundu (p < 0,05). Kültür ortamına rFVIII eklenmesi İNH(+) grupta aktive T hücre oranını anlamlı azaltırken, Treg hücre oranını anlamlı arttırdı (p < 0,05); diğer gruplarda ise değişim olmadı. TGF-β sitokin düzeyleri İNH(+) grupta, İNH(-) gruba göre anlamlı düşük bulundu (p < 0,05). Kültür ortamına rFVIII eklenmesi TNF-α sitokin düzeyini İNH(+) grupta anlamlı azaltırken (p < 0,001) İNH(-) grupta değiştirmedi; TGF-β sitokin düzeyini İNH(+) grupta değiştirmezken İNH(-) grupta anlamlı azalttı (p < 0,001).
Sonuç: Bulgularımız inhibitör gelişiminde özellikle aktive T hücre oranlarının FVIII'e karşı toleranstaki önemini göstermiştir. TGF-β sitokin düzeylerinin iki hasta grubunda anlamlı farklılığı antiinflamatuvar karakterdeki bu sitokinin inhibitör gelişimindeki rolünü düşündürmüştür. Ayrıca bu çalışma, FVIII'in kültür ortamına eklenmesinin İNH(+) grup için T hücre alt gruplarında ve sitokin düzeylerinde farklı sonuçlar doğurduğunu ortaya koymuştur.
Anahtar Kelimeler: Hemofili A, inhibitör antikor gelişimi, rFVIII, Treg hücre, sitokin

Abstract:
Aim: The most prevalent clinical complication observed after repeated FVIII administration in Hemophilia A patients is the development of anti-FVIII inhibitory antibodies that affect approximately 25-30% of HA patients. The effects of inhibitory antibodies to neutralize the procoagulant activity of FVIII result in increased morbidity and mortality. Studies have showen that initial immunotolerance to FVIII is mediated by activated T cells (CD4+CD25+ T), but prolonged immune response is mediated by regulatory T cells/Tregs (CD4+CD25+CD127- T). In this study, it was aimed to investigate the role of T cell subgroups and cytokines secreted from these cells in the development of inhibitory antibodies in hemophilia A patients with inhibitor positive (INH(+)) and negative (INH(-)).
Methods: The study group consisted of 10 INH(+) and 10 INH(-) hemophilia patients and 10 healthy controls in the similar age group. Heparinized blood samples collected in vacutainer tubes (Vacuette tube, BD, Plymouth, UK) were used for the isolation of peripheral blood mononuclear cell (PBMC), and the percentages of T cell groups were determined using flow cytometric method (Acea Biosystems Novocyte, San Diego, USA). Then, PBMC were incubated in RPMI-1640 medium being 1x106 cell per mL in three conditions; 1) unstimulated 2) stimulated with rFVIII (1 mg/mL) 3) stimulated phytohemaglutinin (PHA) (5 μg/mL). T cell proliferation percentages after culture were measured by flow cytometric method, and cytokine levels in supernatants were measured by ELISA assay (Diaclone Research, Besançon, France).
Results: Activated T cell proliferation percentages were found to be significantly lower in the INH(+) group compared to the INH(-) group in both US and rFVIII stimulated conditions (p < 0.05). In the INH(+) group, a significant decrease was observed in the activated T cells by the addition of rFVIII to the culture medium, while Tregs were significantly increased (p < 0.05). There was no significant changes in the activated T cells and Tregs of the other groups. TGF-β levels were lower in the INH(+) group than in the INH(-) group (p < 0.05). Addition of rFVIII to the culture medium caused a decrease in TGF-β concentration in the INH(-) hemophilia group (p < 0.001), while no change was detected in the INH(+) group. However, with the addition of rFVIII in the INH(+) group, TNF-α levels decreased significantly (p < 0.001), while there was no change in the INH(-) group.
Conclusion: The results of our study showed that activated T cells have important roles in the emergence of immunotolerance in inhibitor development. The differences in TGF-β concentrations in both INH(+) and INH(-) groups reveal the important role of the anti-inflammatory property of this cytokine in the pathogenesis. At the same time, changes in the concentrations of some cytokines such as TGF-β, TNF-alpha depending on the addition of FVIII also show the contribution of these cytokines in the development of inhibitors.
Keywords: Hemophilia A, inhibitory antibody development, rFVIII, Treg cell, cytokine