Antibiyotiklerin stafilokok slime tabakasındaki davranış şekillerinin nükleer yöntemle belirlenmesi
Determination of various antibiotics behavior on slime layer of staphylococcus with nuclear methods
Yazar: HASAN DEMİROĞLU
Danışman: DOÇ. DR. UĞUR AVCIBAŞI ; PROF. DR. SARHAN SAKARYA
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Fizikokimya Ana Bilim Dalı / Kimya Eğitimi Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Kimya = Chemistry ; Radyoloji ve Nükleer Tıp = Radiology and Nuclear Medicine

Özet:
Dünya genelinde enfeksiyonlara karşı yeni antibiyotiklerin geliştirilmesi devam etmekle birlikte, bu ilaçlara karşı mikroorganizmaların direnç geliştirdiği rapor edilmektedir ve bu problemin boyutları giderek artmaktadır. Bakteriyel biyofilm üretimi hakkındaki bilimsel çalışmalar son yıllarda artmıştır. Moksifloksasin (MXF) ve Linezolid (LNZ) gram pozitif bakterilere karşı en etkili tedavilerdendir.
Bu çalışmada MXF, LNZ, radyoaktif işaretli MXF, radyoaktif işaretli LNZ ve inaktif işaretli MXF, inaktif işaretli LNZ'nin Metisilin duyarlı S.aureus ATCC 35556 suşları tarafından oluşturulan biyofilm üzerine etkileri araştırılmıştır. İlk aşamada radyoaktif ve inaktif işaretleme gerçekleştirilmiş ve MXF, LNZ'nin 131I ve 127I işaretlenmesi çalışmaları yapılmıştır. MXF ve LNZ'in radyoaktif ve inaktif işaretleme çalışmalarına ait kalite kontrol çalışmaları İnce Tabaka Radyokromatografi (TLRC) ve Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile gerçekleştirildi. MXF, LNZ, radyoaktif ve inaktif işaretli MXF ve LNZ'nin MİK değerleri CLSI kriterlerine göre mikrodilüsyon yöntemi ile belirlendi. 
Başlangıç koloni sayısı 2x105 CFU/mL kullanılarak 24 saat aralığında Time Kill eğrileri çalışması yapılmıştır. MXF, 127I-MXF, 131I-MXF, LNZ, 127I-LNZ ve 131I-LNZ'nin 0.03-64 µg/mL konsantrasyonları biyofilm üzerine inkübasyona bırakılmıştır. Mikroplatelerde oluşturulan biyofilm Kristal viyole ile boyandıktan sonra kurutularak biyofilm miktarı optik dansite (OD630) belirlenmiştir.
MXF ve LNZ, 131I ile iodojen yöntemi ile işaretlenmiştir. 131I-MXF ve 131I-LNZ'ye ait bağlanma verimleri sırasıyla 95±3% ve 91±2% olarak elde edilmiştir. MXF ve LNZ'ye ait MİK değerleri 0.06 ve 1  µg/mL olarak belirlenmiştir. Radyoaktif ile inaktif işaretli MXF ve LNZ'nin MİK değerleri MXF ve LNZ'in MİK değerleri ile aynı bulunmuştur. MXF, 127I-MXF ve 131I-MXF bakterisidal etkiyi 0.25 µg/mL konsantrasyonunda 4. saatte gösterirken, LNZ, 127I-LNZ ve 131I-LNZ ise 2 µg/mL de 12. saatte göstermiştir. MXF ve LNZ'nin radyoaktif ve inaktif işaretli MXF, LNZ MİK değerlerinde biyofilm miktarında anlamlı bir azalma görülmemiştir. Biyofilme ait elde edilen optik dansite (OD) değerlerinde antibiyotiksiz elde edilen biyofilm değerlerine göre artan antibiyotik konsantrasyonuna bağlı olarak anlamlı azalma görülmüştür (P ≤0.05). Biyofilm içindeki bakteri sayısını azaltmada radyoaktif işaretli MXF ve LNZ'nin inaktif işaretli MXF, LNZ ile MXF ve LNZ'den daha etkili olduğu görülmüştür. 24 saat inkübasyon sonrasında 32 µg/mL antibiyotik konsantrasyonunda Log10 (CFU/mL) değerleri kontrol 131MXF ve 131I-LNZ için sırasıyla 9.5, 3.2 ve 3.3 olarak bulunmuştur. 131I ve 127I'nın tek başına S.aureus biyofilm içine penatrasyonu ve herhangi bir zararı olmadığı görülmüştür.
Çalışmanın sonucunda 131I-MXF ve 131I-LNZ'nin biyofilme etkisinin MXF, 127I-MXF, LNZ, 127I-LNZ ve kontrol gurubu ile karşılaştırıldığında daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, 131I ile işaretli antibiyotiklerin biyofilm yapısı üzerinde daha zararlı etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

Abstract:
New antibiotics have been developed worldwide, on the other hand infections formed with microorganisms which gained resistance against these drugs were reported and the scale of the problem increases gradually. Scientific studies about the production of bacterial biofilm were increased in recent years. Moxifloxacine (MXF) and Linezolid (LNZ) are one of the most effective treatments against Gram positive bacteria.
For this purpose, in this study, the activity of MXF and LNZ, radiolabeled with 131I (131I-MXF, 131I-LNZ) and cold iodinated (127I-MXF, 127I-LNZ) against clinical strains of methicillin susceptible Staphylococcus aureus ATCC 35556 (MSSA) biofilms were investigated. In the first stage, radio and cold labelling studies were performed. MXF and LNZ radiolabeled with 131I and cold labelling studies with 127I were performed. Radiolabeling and cold labelling quality-control studies of MXF and LNZ were carried out by using TLRC (Thin Layer Radiochromatography) and HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). The MICs of MXF, LNZ, radio and cold iodinated derivate were determined using the micro dilution broth method according to CLSI criteria. 
Time kill curves were performed over 24 h using an inoculum of 2×105 CFU/mL. Biofilms were incubated MXF, 127I-MXF, 131I-MXF, LNZ, 127I-LNZ and 131I-LNZ at various concentrations (0.03 to 64 µg/mL). Biofilms were grown in micro titre plates, dyed with crystal violet and the mean optical density (OD630) was used for quantification. 
MXF and LNZ were labelled with 131I iodogen method. 131I-MXF and        131I-LNZ were obtained with high a yield of 95±3% and 91±2% respectively. The MIC values for MXF and LNZ were found 0.06 µg/mL and 1 µg/mL, respectively. Radio and cold labeled MXF and LNZ MIC values were found the same MIC values of MXF and LNZ.  Bactericidal activity was demonstrated at 0.25 µg/mL 4 hour for MXF, 127I-MXF and 131I-MXF and for LNZ, 127I-LNZ, 131I-LNZ at 2 µg/mL 12 hour. At MIC levels, MXF, LNZ, radio and cold iodinated MXF, LNZ were not showed a marked reduction of biofilm quantification. The ODs of biofilm after incubation with an increasing antibiotic concentration were significantly lower than the ODs of biofilms without antibiotics P≤005. The radiolabeled MXF and LNZ were most effective than MXF, LNZ and cold iodinated derivates in reducing the number of bacteria in biofilm. After 24 h incubation Log10 CFU/mL values for 32 µg/mL antibiotic concentration: Control, 131IMXF and 131I-LNZ were 9.5, 3.2 and 3.3, respectively. 131I and 127I were used alone there was no penetration of the S. aureus biofilm and no damage. 
Our results demonstrate that the radiolabeled 131I-MXF and 131I-LNZ have potent anti-biofilm activity against S. aureus compare to MXF, 127I-MXF, LNZ, 127I-LNZ and media control. This is suggested that, 131I labelled antibiotic may have harmful effect on biofilm structure.