Memantinin tayini için yeni bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi yöntemi
A new high performance liquid chromatography method for the determination of memantine
Yazar: ŞERİFE EVRİM TEKKELİ
Danışman: DOÇ. DR. SIDIKA TOKER
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Plazma = Plasma

Özet:
Memantin alzheimer hastalığının tedavisinde N-metil-D-aspartat (NMDA) antagonisti olarak kullanılan yeni bir ilaç etken maddesidir. Bu çalışmada, trisiklik doymuş halka yapısı nedeniyle yeterli ışık absorbsiyonu göstermeyen memantin hidroklorürün (ME) tabletlerde ve plazmada tayini için spektrofluorimetrik dedektörün kullanıldığı basit ve hassas bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi geliştirilmiştir. Yöntem, ME'nin içerdiği primer amin grubunun 9-fluorenilmetil kloroformat (FMOC) belirteci ile verdiği reaksiyona dayanmaktadır. ME ile FMOC arasındaki reaksiyonunun optimum koşulları; pH: 8,5, ısı ve bekletme süresi: 40 C de 20 dakika, FMOC/ME mol oranı: 1000, organik/sulu faz oranı: 4,5 olarak bulunmuştur. Kromatografik ayırma C18 kolonda, 1,5 mL/dak akış hızında asetonitril/10 mM ortofosforik asit (pH 2,4)-%0,1 trietilamin karışımının gradient uygulanması ile gerçekleştirilmiştir. İç standart (İS) olarak nortriptilin seçilmiş ve dedeksiyon 260 nm uyarma 315 nm emisyon dalga boylarında yapılmıştır. Plazmadan analizlerde örnekler hekzan-izoamil alkol (98:2) karışımı ile ekstre edilmiş ve ekstraksiyon geri kazanımı % 73,27 olarak bulunmuştur. Standart sulu çözeltilerde ve katkılı plazma örneklerinde konsantrasyona karşılık pik alan oranları kullanılarak elde edilen ölçü eğrileri 1-50 ng/mL konsantrasyon aralığında hazırlanmış, plazmadan yapılan analizlerde gün-içi ve günler-arası bağıl standart sapma (RSD) değerleri sırasıyla %1,35-2,70 ve % 0,29-3,39 olarak bulunmuştur. ME'nin tabletlerdeki miktar tayini sulu standart çözeltilere ait doğru denklemi ile hesaplanmış ve sonuçlar firma yöntemi ile elde edilenlerle %95 olasılık düzeyinde kıyaslanmıştır. Yöntemin klinik uygulanabilirliğini test etmek amacıyla, sağlıklı bir gönüllünün 20 mg ilaç almasının ardından ME'nin farmakokinetiği incelenmiş ve ilacın maksimum plazma konsantrasyonu (Cmaks), bu konsantrasyona ulaşma süresi (tmaks) ve eliminasyon yarılanma ömrü (t1/2,el) sırasıyla 41,6 ng/mL, 7,5 ve 69,4 saat olarak bulunmuştur.Anahtar Kelimeler: Memantin, 9-fluorenilmetil kloroformat, yüksek performanslı sıvı kromatografisi, türetim, plazma

Abstract:
Memantine, N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist is a new drug and used for the treatment of Alzheimer?s disease. The molecule can not be quantified by spectrophotometric detection therefore it has no adequate light absorption because of tricyclic saturated ring structure. In this study a new, simple and sensitive high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the determination of memantine hydrochloride (ME) in tablets and plasma using spectrofluorimetric detector. The method based on derivatization reaction of the primary amino group of ME with 9-fluorenylmethyl chloroformat (FMOC). Optimum conditions of the reaction between ME and FMOC were found to be pH: 8.5; temperature and reaction time: 40 C in 20 minutes, the mol ratio of FMOC/ME: 1000, the ratio of the organic/aqueous phases is 4.5. Chromatographic separation was carried out using a C18 column at flow rate of 1.5 mL/min by gradient elution with acetonitrile-10 mM ortophosphoric acid (pH 2.4)-%0.1 triethyl amine. Nortriptilin was chosen as an internal standart (IS) and detection was carried out at 260 nm excitation and 315 nm emission wavelengths. Liquid-liquid extraction with hexane-isoamylalcohol (98:2) was used for the analyses of plasma samples by 73.27 % recovery. Calibration curves were prepared in the concentration range of 1-50 ng/mL from the aqueous standards and spiked plasma samples, separately and obtained by plotting the concentration against the peak area ratio. Relative standard deviations (RSD) for the within-day and between-day analyses were found to be 1.35-2.70 and 0.29-3.39 % respectively. The drug content in tablets was calculated from the regression equation constructed with aqueous standard solutions. The tablets were also analysed by the company method. The results obtained from two methods were compared statistically at 95 % confidence level. To check the clinical applicability of the developed method, the pharmacokinetics of ME was investigated in a healthy volunteer after a single oral administration of 20 mg of the drug. Maximum plasma concentration (Cmax), reached period of Cmax (tmax) and the elimination half-life (t1/2,el) were found to be 41.6 ng/mL, 7.5 and 69.4 h respectively.Key Words: Memantine, 9-fluorenylmethyl chloroformat, high performance liquid chromatography, derivatization, plasmaThe present work was supported by the Research Fund of Istanbul University.