SiRNA tedavisinde biyokimyasal değerlendirmeler
Biochemical evaluations of siRNA therapy
Yazar: GÖKNUR KARA
Danışman: PROF. DR. EMİR BAKİ DENKBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
siRNA'ya dayalı RNAi mekanizması kullanılarak gen ifadelenmesinin baskılanması sadece spesifik genlerin işleyişini araştırmada değil aynı zamanda viral enfeksiyonlar, genetik ve kardiyovasküler rahatsızlıklar ve kanser gibi hastalıklar için gelecek vaat eden bir gen terapisi tekniğidir. Kanser tedavisinde tek bir geni bloke etmek, hastalığı yok etmede çoğu zaman yeterli gelmez, bunun için birden fazla yolağın eş zamanlı inhibisyonu veya gen susturma stratejisinin başka tedavi yöntemleriyle kombine edilmesi gerekmektedir. Geleneksel kanser tedavisi yaklaşımlarından olan kemoterapi, sağlıklı hücrelere de zararı nedeniyle yerini, bu etkiyi bertaraf edecek yeni nesil tedavilere bırakmaktadır. Son yıllarda geleneksel kemoterapi ve yeni geliştirilen siRNA'ya dayalı tedavilerin kombinasyonu araştırmacıların dikkatini çekmiştir. Böylece kemoterapötik ilaçların ve siRNA tedavisinin birlikte uygulanması, düşük doz ilaç kullanımını sağlayarak kemoterapinin yan etkilerinin azalmasına izin verir.
Sunulan tez çalışmasında ABCE1 spesifik siRNA, 5-FU ve irinotecan antikanser ajanlarıyla beraber kanser hücreleriyle etkileştirilerek, kanser tedavisinde kombine terapinin etkinliğini ve ABCE1 siRNA'nın potansiyel klinik kullanımını araştırmak ve kanser hücrelerinin ilaç hassasiyetlerini arttırmak hedeflenmiştir. Çalışmanın ilk bölümünde 5-FU ve irinotecan ilaçlarının A 549 akciğer kanseri hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri belirlenmiştir. Daha sonra bu ilaçların düşük dozları ve ABCE1 siRNA birlikte ve ayrı şekilde kanser hücrelerine verilmiştir. siRNA transfeksiyon reaktifi olarak ticari taşıyıcı kullanılmıştır. ABCE1 siRNA'nın, düşük derişimlerdeki antikanser ilaçlarının etkinliğini arttırıp arttırmadığını incelemek amacıyla hücre proliferasyonu RTCA ile analiz edilmiştir. MTT testi yapılarak kombine tedavinin hücreler üzerindeki sitotoksik etkileri incelenmiştir. Ölen hücreleri morfolojik açıdan incelemek amacıyla apoptoz/nekroz ikili boyaması yapılmıştır. Çalışmanın ikinci kısmında hücrelerde ABCE1'in spesifik siRNA ile inhibe edildiği eş zamanlı RT-PCR analiziyle gösterilmiştir. Ayrıca ABCE1 siRNA'nın ilaçlarla beraber kombine tedavi şeklinin, kanser yolaklarında apoptozu ve hücre döngüsünü ya da hücre büyümesini regüle eden yolaklarda BCL-2 ve mTOR genlerinin hücresel düzeydeki seviyesine etkisini incelemek amacıyla eş zamanlı RT-PCR analizleri yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar, ABCE1 siRNA ve kemoterapötik ajanların kombinasyonunun kanser tedavisinde etkin bir terapötik seçenek olduğunu göstermiştir.

Anahtar sözcükler: ABCE1, 5-FU, irinotecan, siRNA tedavisi, kombine kanser tedavisi.

Abstract:
Inhibition of gene expression by using RNAi is a promising gene therapy technique due to it's use for not only investigation of spesific gene functions, at the same time for therapies of various diseases such as viral infections, genetic diseases, cardiovascular disorders and cancer. In cancer therapy blocking of one single gene isn't sufficient many times to suppress the disease for that reason simultaneously inhibition of multiple pathways or combination of gene silencing strategy with other therapies are necessary. Chemotherapy, one of the conventional approach of cancer treatment, due to it's harm to also healthy cells leaves it's place to new generation therapies that eliminate this effect. In recent years combination of conventional chemotherapy and siRNA based new developed therapies drew attention of researchers. Thus, combined application of chemodrugs and siRNA therapy allows usage of low dose drugs and reduction the side effects of chemotherapy. 
The aim of the presented study is to investigate the effect of combined therapy for cancer treatment and the potential clinical utility of ABCE1 spesific siRNA and to enhance chemodrug sensitivity of cancer cells via co-delivery of ABCE1 siRNA with anticancer agents, 5-FU and irinotecan, together to cancer cells. In first part of the study the cytotoxic effects of 5-FU and irinotecan on A 549 lung cancer cells were determined. Furthermore, the combined administration of both ABCE1 siRNA and low doses of chemodrugs into cancer cells was examined. A commercial carrier was used as siRNA transfection reagent. Cell proliferation was determined by RTCA whether ABCE1 siRNA increased the activity of chemodrugs with low doses. MTT test was carried out to examine cytotoxic effects of combined administration. Moreover, apoptosis/necrosis double staining was performed to investigate the morphology of dead cells. In the second part of the study the inhibition of ABCE1 by spesific siRNA was demonstrated by Real Time RT-PCR analysis. Besides Real Time RT-PCR analysis was also carried out to investigate the effect of combination therapy on BCL-2 and mTOR genes that regulate cancer apoptosis and cell cycle or growth pathways. Our results suggest that combination treatment using ABCE1 siRNA and chemotherapeutic agents may be an effective therapeutic option for lung cancer.

Keywords: ABCE1, 5-FU, irinotecan, siRNA therapy, combined cancer therapy.