Endoplazmik retikulum stres modeli oluşturulan fare ovaryumlarında katlanmamış protein yanıtının araştırılması
Investigation of unfolded protein response in mouse ovaries created with an endoplasmic reticulum stress model
Yazar: GİZEM ÖZTAŞ
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL UYSAL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Endoplazmik retikulum stresi = Endoplasmic reticulum stress ; Fareler = Mice ; Katlanmış proteinler = Folded proteins ; Otofaji = Autophagy ; Over = Ovary ; Tunikamisin = Tunicamycin

Özet:
Endoplazmik Retikulum stresi, nörodejeneratif hastalıklar, metabolik hastalıklar, diyabet ve obezite, kanser ve farklı hastalıklar ile ilişkilendirilmiştir. ER stresinin uyaran ve bu hastalıkların ortaya çıkmasını sağlayan birçok etken bulunmaktadır. Hipoksi, reperfüzyon, oksidatif stres, metabolik değişiklikler, hücre içi kalsiyum iyonu konsantrasyon değişiklikleri, protein sentezinin artısı, protein glukozilasyonunun veya disülfid bağı oluşumunun bozulması ER stresini uyaran etkenler arasındadır. Tüm bu etkenlerin haricinde deneysel etkileri olduğu kanıtlanan Tunikamisin ve Thapsigargin gibi çeşitli kimyasal antibiyotiklerde ER stresini uyaran ve deneysel veriler elde edilmesinin sağlandığı etkenler arasındadır. Stres döneminde ER, hatalı protein katlanmasına karşın katlanmamış protein yanıtını (UPR) başlatır. UPR, üç trans-membran ER proteinin aktivasyonu gerçekleşir. Bu proteinler; Endoplazmik retikulum kinaz benzeri protein (PERK), ER-çekirdeğe sinyal kinaz 1 (IRE-1) ile etkileşen inositol ve transkripsiyon faktörü 6 (ATF6)'dır. ATF6, miyoblast farklılaşması sırasında apoptotik miyoblastlarda spesifik olarak aktive edilir. Aktif IRE1a ve eIF2- apoptoza aracılık eden proteinlerdir. Apoptoz CHOP, Jun N-terminal kinaz (JNK) ve kaspaz 12 aktivasyonuyla indüklenir ve kaspaz kaskadı aktive hale gelmiş olur.
Tunikamisin, proteinlerdeki asparagin gruplarının n-glikozilasyonunu inhibe eden bir çeşit antibiyotik olup etkisini fosfat üzerinden gösterir ve gliokoprotein sentezini bozar. Tunikamisin, in vitro ve in vivo deneysel düzeylerde sık bir şekilde tercih edilmektedir. Deney hayvanlarına uygulanan Tunikamisin ile oluşturulan ER stresi modellemesi bugüne kadar böbrek ve karaciğer gibi fonksiyonel organlar üzerinde oldukça etkili bir mekanizmaya sahiptir. Bunun birlikte ovaryumda folikülogenezin fizyolojik sürecinde primordiyal, primer, sekonder, tertier ve corpus luteumda etkileri olduğu bilinmekte ancak ilişkili moleküler mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır. Oosit ve erken dönem embriyo gelişiminde ER stresine ilişkin çeşitli in vitro çalışmalar bildirilmektedir. Ancak doğrudan geliştirilen bir ER stres modeli üzerinden gonodal etkileri ovaryumdaki foliküler gelişime ilişkin bir çalışma bulunmamaktadır. 
ER stres aktivatörü olan Tunikamisin ile deneysel olarak akut ER stres modeli oluşturulan yetişkin farelerin ovaryumlarında folikülogenez temelinde ovaryumdaki histolojik değişiklikler ve ER stresine bağlı olarak UPR'ye bağlı yolaklardan GRP78, EIF2a ve IRE1 yolağı üzerinden apoptoz ilişkili Caspase-3 ve otofaji ilişkili Beclin-1'in immünohistokimyasal olarak araştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmamızda Balb-c türü fareler n=7 olacak biçimde; SF kontrol, DMSO kontrol ve TM deney grubu olmak üzere 3 grup şeklinde belirlendi. TM aracılığı ile ER stresi oluşturulan gruba intraperitoneal olarak 1 μg/g oranında Tunikamisin uygulaması yapılıp 24 saat sonra deneklerin sakrifikasyonu gerçekleştirildi. Ovaryum dokusunda, Tunikamisin etken maddesi aracılığıyla ER stres sebebi ile gelişmiş olan UPR mekanizmasının aracılık ettiği apoptotik yolaklar ve otofaji yolağını incelemek amacı ile histokimyasal olarak Hematoksilen-Eozin ve Masson Trikrom boyamaları ve immünohistokimyasal olarak GRP78, eIF2-, IRE1-, Caspase-3 ve Beclin-1 boyamaları yapıldı. 
Sonuç olarak çalışmamızda, protein katlanması için önemli N-glikosilasyonu inhibe ederek ER stresi oluşturmak için kullanılan kimyasal bir reaktif olan Tunikamisin ile bir ER stres modeli oluşturulmuştur. Ovaryumda ileri foliküler yapılarında ve Corpus luteumunda GRP78 aktivasyonuna yol açan Tunikamisinin ER stresini tetikleyerek GRP78'in sekonder, tertier foliküllerde ve corpus luteumunda anlamlı artışı ile ortaya konulmuştur. ER stresinde otofaji mekanizmasına ilişkin Beclin-1 primordiyal foliküler yapılarda değiştiği ancak anlamlı bulunmamıştır.  Sekonder foliküllerde ise SF kontrol grubunda daha yüksektir deney grubunda azalması otofaji regülasyonunun Beclin-1 yönünde değişebileceği şeklinde açıklanabilir. Tunikamisin uygulamasına bağlı olarak apoptoz yolağına ilişkin Caspase-3 artışı corpus luteumda anlamlı bulunmuştur.     
Anahtar Kelimeler; ER stres; Tunikamisin; Ovaryum; Apoptoz; Otofaji

Abstract:
Endoplasmic Reticulum stress has been associated with neurodegenerative diseases, metabolic diseases, diabetes and obesity, cancer and different diseases. There are many factors that stimulate ER stress and cause these diseases to occur. Hypoxia, reperfusion, oxidative stress, metabolic changes, intracellular calcium ion concentration changes, increased protein synthesis, disruption of protein glucosylation or disulfide bond formation are among the factors that stimulate ER stress. Apart from all these factors, various chemical antibiotics such as Tunikamycin and Thapsigargin, which have proven to have experimental effects, are among the factors that stimulate ER stress and provide experimental data. During the stress period, the ER initiates the protein misfold versus unfolded protein response (UPR). Activation of the UPR, three trans-membrane ER proteins occurs. These proteins are; Endoplasmic reticulum kinase-like protein (PERK) is inositol and transcription factor 6 (ATF6) that interact with ER-core signal kinase 1 (IRE-1). ATF6 is specifically activated in apoptotic myoblasts during myoblast differentiation. Active IRE1a and eIF2- are proteins that mediate apoptosis. Apoptosis is induced by activation of CHOP, Jun N-terminal kinase (JNK) and caspase 12, and the caspase cascade is activated.
Tunicamycin is a kind of antibiotic that inhibits the N-glycosylation of asparagine groups in proteins and shows its effect through phosphate and impairs glycoprotein synthesis. Tunicamycin is frequently preferred at in vitro and in vivo experiments. ER stress modeling created with Tunicamycin applied to experimental animals has a very effective mechanism on functional organs such as kidney and liver to date. However, it is known that it has effects on primordial, primary, secondary, tertiary and corpus luteum in the physiological process of folliculogenesis in the ovary, but its related molecular mechanisms have not been fully elucidated. Various in vitro studies on ER stress in oocyte and early embryo development have been reported. However, there is no study on the gonadal effects of follicular development in the ovary through a directly developed ER stress model.
It was aimed to investigate histological changes immunohistochemically on the basis of folliculogenesis in the ovaries of adult mice experimentally created an acute ER stress model with tunicamycin, an ER stress activator, by apoptosis-associated Caspase-3 and autophagy-related Beclin-1 via GRP78, EIF2a and IRE1 pathways due to unfolded protein response (UPR) due to ER stress.
In our study, Balb-c mice were n=7; they were determined as 3 groups as SF control, DMSO control and TM experimental group. Tunicamycin at the rate of 1 μg/g was administered intraperitoneally to the group in which ER stress was created through TM, and the mice were sacrificed after 24 hours. Hematoxylin-Eosin and Masson Trichrome stainings were histochemically and immunohistochemically GRP78, eIF2-, IRE1-, Caspase-3 and Beclin-1 in ovarian tissue to examine the autophagy pathway and apoptotic pathways mediated by the UPR mechanism developed due to ER stress through the active substance Tunicamycin.
In conclusion, in our study, an ER stress model was created with Tunicamycin, a chemical reagent used to create ER stress by inhibiting N-glycosylation, which is important for protein folding. Tunicamycin, which causes GRP78 activation in the advanced follicular structures of the ovary and Corpus luteum, has been demonstrated by the significant increase of GRP78 in secondary, tertiary follicles and corpus luteum by triggering ER stress. Beclin-1 related to autophagy mechanism in ER stress was changed in primordial follicular structures, but it was not found significant. In secondary follicles, SF is higher in the control group, and its decrease in the experimental group can be explained as the regulation of autophagy may change in the direction of Beclin-1. Caspase-3 increase related to apoptosis pathway was found significant in corpus luteum due to tunicamycin administration.

Keywords; ER Stress; Tunicamycin; Ovary; Apoptosis; Autophagy