Kan kültürlerinden izole edilen koagülaz negatif stafilokoklarda sasX, ACME ve çeşitli virulans faktörlerinin araştırılması
Investigation of sasX, ACME and various virulence factors in coagulase negative staphylococci isolated from blood cultures
Yazar: BÜŞRA DÖNMEZ
Danışman: PROF. DR. MELEK DEMİR
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Hastanede uzun süre yatışlara bağlı kateterizasyon işlemlerinin artması ve implante edilebilir tıbbi cihazların yaygın kullanımı nedeniyle koagülaz negatif stafilokokların (KNS) kan dolaşım enfeksiyonlarındaki rolü artmıştır. Bu çalışmada kan kültürlerinden izole edilmiş olan KNS suşlarında virülans ilişkili sasX, arjinin katabolik mobil element (ACME) genlerinin, biyofilm yapımının ve biyofilm ilişkili bazı virülans faktör genlerinin araştırılarak etken ve kontaminant olarak tanımlanmış suşlardaki sıklıklarının belirlenmesi amaçlandı. 
Kan kültürlerinden izole edilen 150 KNS suşu çalışmaya dahil edildi. Klinik ve mikrobiyolojik veriler temel alınarak izole edilen suşların 50'si etken ve 100'ü kontaminasyon izolatı olarak gruplandırıldı. Suşlar otomatize bakteri tanımlama sistemi ile tür düzeyinde tanımlandı. sasX, ACME, MecA ve biyofilm ilişkili virülans faktör genlerinin varlığı inhouse PCR yöntemi ile araştırıldı. Fenotipik olarak biyofilm oluşumu mikroplak yöntemi ile araştırıldı. Çalışmaya alınan KNS suşlarının 95'i (%63,3) S. epidermidis, 25'i (%16,7) S. hominis, 22'si (14,7) S. haemolyticus, 6'sı (%4) S. capitis, 1'i (%0,7) S. intermedius ve 1'i (%0,7) S. warneri olarak tanımlandı. Tüm suşların 125'inde (%83,3) mecA geni pozitif bulunurken etken ve kontaminasyon grupları arasında mecA pozitiflik oranı açısından fark bulunmadı (p=0,877).  sasX varlığı kontaminasyon grubunda 14 (%14) suşta, etken grubunda 5 (%10) suşta olmak üzere toplam 19 suşta pozitif bulundu. sasX pozitiflik oranı açısından etken ve kontaminasyon grubundaki suşlar arasında fark bulunmadı (p=0,327).  ACME ilişkili ArcA, kdpA ve opp3B operonlarının herhangi birinin varlığı kontaminasyon grubundaki suşların 32 (%32)'sinde, etken grubundaki suşların 6 (%12)'sında pozitif olarak saptandı. Gen bölgeleri ayrı olarak değerlendirildiğinde kontaminasyon grubundaki 30 (%30) suşta ArcA pozitif, 7 (%7) suşta kdpA pozitif, 8 (%8) suşta opp3B pozitif iken, etken grubunda ise 6 (%12) suşta ArcA pozitif, 1 (%2) suşta kdpA pozitif ve 3 (%6) suşta opp3B pozitif bulundu. Kontaminasyon grubundaki suşlarda ACME ve ArcA pozitiflik oranı anlamlı düzeyde daha yüksek saptandı (sırasıyla p= 0,008 ve p= 0,015). Fenotipik olarak biyofilm oluşturma özellikleri araştırıldığında tüm suşların 67'si (%44,7) biyofilm oluşturmazken, 39'u (%26) zayıf düzeyde, 15'i (%10) orta düzeyde, 29'u (%19,3) ise güçlü düzeyde biyofilm oluşturdu. Etken grubundaki suşların %52'sinde herhangi bir düzeyde biyofilm oluşumu saptanırken, kontaminasyon grubundaki suşlarda bu oran %57'ydi. Gruplar arasında biyofilm oluşturan suş oranı açısından anlamlı fark bulunmazken (p=0,561), kontaminasyon grubundaki suşların %14'ü , etken grubundaki suşların ise %30'unun güçlü düzeyde biyofilm oluşturduğu bulundu ve biyofilm oluşturma düzeyleri açısından gruplar arasındaki fark anlamlıydı (p=027). Biyofilm ilişkili İcaA, icaD, IS256, aap ve bhp virülans genleri kontaminasyon grubundaki suşlarda sırasıyla %33, %45, %43, %74 ve %6 oranında, etken grubundaki suşlarda %64, %62, %64, %74 ve %8 oranında pozitif olarak bulundu. Etken grubunda İcaA, İcaD ve IS256 pozitiflik oranları kontaminasyon grubuna göre anlamlı düzeyde daha yüksek bulunurken (sırasıyla p<0,001, p=0,050, p=0,015), aap ve bhp pozitiflik oranı açısından iki grup arasında fark bulunmadı. İcaA ve icaD birlikte pozitifliği kontaminasyon grubunda %29, etken grubunda %56 oranında bulundu ve gruplar arasındaki fark anlamıydı (p=0,001). İcaA, icaD ve IS256 birlikte pozitifliği kontaminasyon grubundaki suşlarda %17 iken, etken grubundaki suşların %38'inde pozitifti ve her üç geni birlikte bulundurma oranı açısından fark anlamlıydı (p=0,005). Çalışmaya alınan tüm suşlar içinde icaA ve icaD'nin birlikte pozitif olduğu toplam 57 suşun 46(%80,7)'sında herhangi bir düzeyde biyofilm oluşumu gözlenmiştir. İcaA ve icaD'nin birlikte pozitif olduğu suşlarda herhangi bir düzeyde biyofilm pozitiflik oranı, İcaA veya icaD 'nin tek başına pozitif olduğu veya her ikisinin negatif olduğu suşlara göre anlamlı düzeyde
daha fazlaydı (p<0,001). 
Sonuç olarak bu çalışmada güçlü biyofilm oluşturma, biyofilm ilişkili icaA, icaD, IS256 genlerini tek ya da çoklu bulundurma oranı etken olarak sınıflandırılan suşlarda daha yüksek oranda saptanmışken, özellikle ACME ilişkili ArcA pozitifliği kontaminasyon grubundaki suşlarda daha yüksek oranda bulunmuştur. Bu bulgular KNS suşlarında bazı gen bölgelerinin varlığının etken veya kontaminasyon ayrımında yol gösterici olabileceğini düşündürmüştür.

Abstract:
The role of CoNS in blood stream infections has increased due to prolonged hospitalization, urinary and intravascular catheterization, increased health care services such as widespread use of implantable medical devices, and changes in the patient population (such as increased premature neonates; geriatric patients with multiple morbidity and chronic diseases, immunosuppressive patients). In this study,
it was aimed to investigate virulence-related sasX, arginine catabolic mobile element (ACME) genes, biofilm production and some biofilm-related virulence factor genes in CoNS strains isolated from blood cultures and determine their frequency in strains identified as infectious agent and contaminant. In total, 150 strains of CoNS isolated from blood cultures were included in the study. Based on clinical and microbiological data, 50 of the isolated strains were grouped as infectious agent and 100 as contamination isolates. The strains were
identified at the species level with an automated bacterial identification system. The presence of sasX, ACME, mecA and biofilm-related virulence factor genes was investigated by the in-house PCR method. Phenotypically, biofilm formation was investigated by the micro-plaque method. Of the CoNS strains included in the study, 95 (63.3%) were identified as S. epidermidis, 25 (16.7%) as S. hominis, 22 (14.7) as S. haemolticus, 6 (4%) as S.capitis, 1 (0.7%) as S. intermedius and 1 (0.7%) as S. warneri. Of all strains, 125 (83.3%) had the MecA gene positive, while no differences were found in the MecA positivity ratio between the infectious agent and contamination groups (p=0.877). The presence of sasX was positive in the contamination group with 14 (14%) strains and in the infectious agent group with 5 (10%) strains, i.e. in 19 strains in
total. No differences were found between the strains in the infectious agent and contamination groups in terms of the sasX positivity ratio (p=0.327). The presence of any of the ACME-related ArcA, kdpA, and opp3B operons was found to be positive in 32 (32%) of the strains in the contamination group and 6 (12%) of the strains in the infectious agent group. When the gene regions were evaluated separately, 30 (30%) strains in the contamination group were ArcA positive, 7 (7%) strains were kdpA positive, 8 (8%) were opp3B positive, 6 (12%) were ArcA positive, 1 (2%) was kdpA positive and 3 (6%) were opp3B positive. The ACME and ArcA positivity ratios were significantly higher in the strains in the contamination group (p=0.008 and p=0.015, respectively). An examination of phenotypical biofilm-forming properties showed that 67
(44.7%) of all strains did not form a biofilm, 39 (26%) formed a weak biofilm, 15 (10%) a medium biofilm and 29 (19.3%) formed a strong biofilm. While 52% of the strains in the infectious agent group had any level of biofilm formation, this ratio was 57% in the strains in the contamination group. While there was no significant difference in the ratio of biofilm-forming strains between the groups (p=0.561), 14%
of the strains in the contamination group and 30% of the strains in the infectious agent group were found to be strongly biofilm-forming, and the difference between the groups was significant in terms of their biofilm-forming level (p=027). Biofilm-related IcaA, icaD, IS256, aap and bhp virulence genes were found to be positive in strains in the contamination group at 33%, 45%, 43%, 74% and 6% respectively, and 64%, 62%, 64%, 74% and 8% in strains in the infectious agent group, respectively. IcaA, icaD ve IS256 positivity ratios were significantly higher in
the infectious agent group than in the contamination group (p<0.001, p=0.050, p=0.015, respectively), while no differences were found between the two groups in terms of aap and bhp positivity ratios. IcaA and icaD co-positivity was found to be 29% in the contamination group
and 56% in the infectious agent group, and the difference between the groups was significant (p=0.001). IcaA, icaD ve IS256 co-positivity was 17% in strains in the contamination group, 38% in strains in the infectious agent group, and the difference was significant in terms of the ratio of having all three genes together (p=0.005). Of all the strains in the study, 46 (80.7%) of the total 57 strains in which icaA and icaD
were co-positive presented any level of biofilm formation. Any level of biofilm positivity was significantly higher in the IcaA and icaD co-positive strains than in the strains where IcaA or icaD was positive or both were negative (p<0.001).
In conclusion, strong biofilm generation and single or multiple presence of biofilm-related icaA, icaD and IS256 genes were found to be higher in strains classified as infectious agent, while especially ACME-related ArcA positivity was found to be higher in strains in the contamination group. These findings suggest that the presence of certain gene regions in CoNS strains may guide the distinction of infectious agent and contamination.