Kronik hepatit deltalı hastaların interferon tedavisi süresince, yeni nesil dizileme teknolojisiyle viral genom çeşitliliği ve tedavi yanıtının araştırılması
Viral genome diversity and treatment response during interferon treatment of patients with chronic hepatitis delta: deep sequencing by next generation sequencing technology
Yazar: AYŞE NUR MİDİLLİ
Danışman: PROF. DR. ABDURRAHMAN MİTHAT BOZDAYI
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Viral hepatit =

Özet:
Hepatit Delta virüsü (HDV), sağlıklı karaciğer hücrelerinde (hepatosit) enfeksiyona neden olur. Kronik HDV enfeksiyonunun tedavi olanağı sınırlıdır ve çoğunlukla ilerleyen siroz ve artan mortalite oranlarıyla karakterizedir. Bu enfeksiyonun birincil tedavi seçeneği olarak en az 1 sene süreyle uygulanan "peg-interferon" kullanılmaktadır. Tedaviye devam edilip edilmeyeceğine ise tedavinin 6.ayında HDV RNA değerlendirilmesi ile karar verilmektedir. Çalışmamızda HDV ile enfekte hastaların interferon tedavilerinin 0., 24., 48., 96, ve 200. haftalarında alınan farklı serum örneklerinden elde edilen Hepatit Delta virüs havuzundaki viral varyantların yüksek duyarlılıkla tespit edilmesi ve tedavi yanıtının tedaviye yanıt veren, nüks eden ve tedaviye yanıt vermeyen hastalar arası incelenmesi amaçlanmıştır. Ortaya çıkan varyasyon profilleri ile hastalardaki klinik seyirin karşılaştırılması ile varyasyonlarla hastalık arasında ilişkiyi araştırmak çalışmanın amacıdır. Tedavi öncesi, sırası ve/veya sonrasındaki viral varyasyon profillerinin belirlenmesi, ve viral tedavi altındaki evrimsel sürecin araştırılması amaçlanmıştır. Yeni nesil dizileme platformları, klonal amplifikasyon ile derin dizileme yaparak minör allelleri bile kaçırmadığı için virüs bazlı çalışmalarda önemlidir. Bu sebeple çalışmamızda "Illumina, Miseq" yeni nesil dizileme platformu kullanılmıştır. Çalışma süresince toplam 13 hastanın farklı tarihlerdeki 40 adet serum örneğinde dizileme yapılmıştır. HDV viral genomu her serum numunesinde 5 farklı amplifikasyonla tüm genom olarak çoğaltılmış, toplamda 200 farklı amplifikasyon yapılmıştır. Tedaviye yanıt verenler ile yanıt vermeyen veya nüks eden hastalardaki varyasyonlar karşılaştırıldığında; 266, 268, 319, 927 ve 928 nolu nükleotitlerde belirgin farklılıklar gözlenmiştir. 927. ve 928. nükleotitlerin S-HDAg ve L-HDAg üzerinde bulunmasından ötürü kodlanan amino asitlerde de tedaviye yanıt veren hastalar, nüks eden ve yanıt vermeyen ile karşılaştırıldığında belirgin farklılıklar bulunmaktadır. Tedaviye yanıt verenler ile nüks edenler tek başına karşılaştırıldığında ise bu nükleotidlere ek olarak 269, 749. nükleotidde anlamlı farklılıklar gözlenmiştir. Dolayısıyla bu nükleotitler tedavi seyrini anlamak için önemli olabilir. Ayrıca her 3 grup karşılaştırıldığında viral genomun 426-429 numaralı bazlarını içeren hiper değişken bölge üzerinde bulunup, otokatalitik kırılma bölgesinin hemen başlangıcında bulunan bölgede 3 farklı hasta grubunda farklı paternler gözlenmiştir.

Abstract:
Chronic Delta Hepatitis (CDH) is defined as the most aggressive and progressive viral hepatitis, which is caused by the Hepatitis Delta Virus (HDV) which leads to infection in healthy liver cells. The success of treatment for CDH infection is usually limited. CDH is characterized by the growing cirrhosis and enhanced rate of mortality. The main established management of CDH consists of peg-interferon which has to be administered for a duration of at least 1 year. On treatment, 6 month HDV RNA assessment may give clues as to whether to stop treatment at 1 year or continue beyond 1 year. We investigated the viral genome diversity and treatment response during interferon treatment among responders, relapsers, and non-responder patients. By this means, it is aimed to detect viral variation profile prior to, during, and after the treatment and to investigate the evolutionary process under viral treatment. Another purpose of the present study is to investigate the relationship between variation patterns and the disease by comparing the variation profiles and clinical course of the disease in patients. The next-generation sequencing technologies is crucial on the viral-based studies due to the performing clonal amplification and deep sequencing. Departing from that reasoning, we made use of "Illumina, Miseq" next-generation sequencing. In this research, a total of 40 distinct serum samples of interferon treated 13 CDH patients at weeks -0, 24, 48, 96, 200, were obtained and the viral variants in hepatitis delta virus pool were analyzed with high precision. At each serum sample, the HDV viral genome was multiplied as a whole with 5 distinct amplifications, amounting to 200 distinctive amplifications. Differences were observed in positions 266, 268, 269, 568, 927 and 928, when variations in responders, non-responders and relapsers patients. Also, variations occurring on nucleotide sites of 927 and 928 which stand in S-HDAg and L- HDAg were observed different amino acids compared with responders and non-responder or relapser CDH patients. An additional significant difference in position 749 was observed when responder vs. relapser patients were compared. Furthermore, in the region covering 426-429 positions on the HDV genome, located at the beginning of the autocatalytic break zone, and stand above the hypervariable region, distinct patterns are detected in the 3 patient groups. Thus, these nucleotides might be decisive so as to understand the course of the infection.