Biyodizel atığı ham gliserolden rekombinant Pichia pastoris mayası ile laktik asit üretimi
Lactic acid production from biodiesel by-product crude glycerol by recombinant Pichia pastoris
Yazar: LENA MAHMOUDI AZAR
Danışman: PROF. DR. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Laktik asit petrol menşeli plastiklerin yerine geçen önemli bir alternatif olarak bilinmektedir. Laktik asit gıda, kozmetik, ilaç ve tekstil sanayinde kullanım nedeniyle değerli ve yüksek talep gören bir ürün haline gelmektedir. Diğer yandan biyobozunur ve çevre dostu bir polimer olan polilaktik asit gibi değerli kimyasal maddelere dönüştürülebilen bir ürün olarak önem kazanmaktadır. 
Laktik asidin endüstriyel boyutta üretimi ise kimyasal sentez veya karbonhidratların fermantasyonu ile gerçekleştirilmektedir. Laktik asidin büyük ölçek üretimi ise ucuz karbon kaynakları ve fermantasyon yöntemi ile yapılmaktadır. Ham maddenin maliyetinin düşük olmasından dolayı biyodizel yan ürünü olan ham gliserol gibi ucuz substratların kullanımı sayesinde laktik asit üretiminin maliyetini büyük miktarda düşürmektedir. 
Pichia pastoris rekombinant protein üretimlerinde başarılı bir ekspresyon sistemi olarak tercih edilmiştir.  
Çalışma kapsamında, GUT1 promotorunun kontrolü altında Bos taurus laktat dehidrogenaz enzim üretimi  P. pastoris suşları üzerinde yapılan moleküler ve genetik çalışmaları ile gerçekleştirilmiştir. Oluşan klonlar biyodizel atığı olan ham gliserolü kullanarak l-laktik asit üretimi için tercih edilmiştir. 
Fermentörde gerçekleşen çalışmalarda, ürün miktarı; farklı suşlar, pH değerleri, gliserol kaynağı ve konsantrasyonu göz önünde bulundurularak incelenmiştir. 
Çalışma boyunca üretimin istatiksel analizleri, fermantasyon koşullarında Pichia ekspresyon sisteminde gerçekleştirilmiştir. 
Gliserol metabolik yolunda; GUT1 promotoru, gliserol kinaz enziminin üretiminden sorumlu olan geni kodlayarak gliserolun, 1-gliserol-3-fosfata dönüşmesini sağlamaktadır. 
Bu promotor altına Bos taurus LDH geni yerleştirerek laktik asit üretimi gerçekleştirilmiştir. pGUT1-Bt-LDH plazmidleri P. pastoris X33 ve FA115 konakçı hücrelerine elektroporasyon tekniği ile aktarılmıştır.
Transformantlar 100 μg/mL ve 500 μg/mL zeosin içeren YPD agar plakalarda 28°C' de 3 gün boyunca inkübe edilmiştir. Plakalardan seçilen bazı koloniler erlenmayerde BSM, FM22 ve BMGY gibi besiyeriler içinde geliştirilerek HPLC yöntemi ile laktik asit üretimi ve gliserol kullanım miktarı ölçülmüştür. Böylece besi ortamı karşılaştırılması yapılmış ve en yüksek laktik asit üretimi ticari saf gliserol ve ham gliserol içeren BMGY ve BMCY medyalarında görülmüştür. Bu sonuçla ham gliserol diğer karbon kaynakları arasında uygun bir alternatif olarak kabul edilmiştir. 
L-laktik asit fermantasyon prosesleri ham gliserol kullanımı ile araştırılmıştır. Birinci kesikli faz (Batch I Phase) %4 ham gliserol içeren 2 litrelik BMGY besiyerinde 100 ml kültür ilavesi ile yaklaşık 18 saat boyunca gerçekleştirilmiştir. İkinci kesikli fermantasyon 75g/L veya 100g/L ham gliserol kullanarak 5.0 veya 7.0 iki farklı pH değeri ile devam edilmiştir. Tüm fermentör prosesi yaklaşık 48 saat boyunca ve gliserol tamamen bitene kadar sürdürülmüştür. L-laktik asit üretiminin optimizasyonu BMCY besiyerinde 100g/L ham gliserol ve 5.0 pH değerinde 61.1 g/L konsantrasyon ile gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
Lactic acid has been known as important alternatives to petroleum-derived plastics. Considering the high potential of lactic acid applications in the food, cosmetic, pharmaceutical and textile industries, has turned it into a significant and desired product to make it quickly convertible to other important chemicals such as polylactic acid, a biodegradable polymer used as environmental friendly plastic. Lactic acid generally is produced at industrial scale by chemical synthesis or fermentation of carbohydrates. 
Industrial scale production of lactic acid can be feasible with cheap carbon sources by fermentation. The cost of raw material is very significant in lactic acid production. The use of inexpensive substrates such as crude glycerol as by-product of biodiesel has a potential to reduce cost of lactic acid production.
Some of industrial microorganisms such as Pichia pastoris are responsible for large scale production of lactic acid by fermentation procedure.
In this study we used molecular approaches to create a new Pichia pastoris transformant strains which express lactate dehydrogenase enzyme under the control of pGUT1 promoter. These clones were used for l-lactic acid production from biodiesel by-product crude glycerol. Amount of product investigated in this study, depends on the variations of strains, pH, concentration and source of glycerol in fermenter. Statistical analysis of production was assayed under fermentation conditions in Pichia expression system. 
The GUT1 promoter coding the gene for glycerol kinase converts glycerol to 1-glycerol-3-phosphate in glycerol metabolism pathway and the LDH (L-lactate dehydrogenase) gene from Bos taurus used for producing lactic acid in this research. pGUT1-Bt-LDH plasmids were created and transfected into X33 and FA115 hosts by electoporation. Transformants were selected on YPD plates containing 100 μg/mL and 500 μg/mL of zeocin after 3 days incubation at 28°C. Several clones were selected and the quantity of l-lactic acid and glycerol consumption obtained in BSM, FM22 and BMGY cultures were measured by HPLC.
The l-lactic acid fermentation process using crude glycerol as the feedstock has been investigated.  The batch I phase was carried out in 2liter BMGY Media containing 4% Crude glycerol about 18 hours, using 100ml of overnight BMGY-culture as inoculum. Batch II fermentation was started with 75g/L or 100g/L crude-glycerol at two different pH of 5.0 or 7.0 without maintaining dissolved oxygen concentration. Whole production process in fermenter condition was continued for about 48 hours until crude glycerol was totaly consumed.