Kütle spektrometrisi uygulamalarında fosfopeptitlerin hassas tayini için yeni stratejilerin geliştirilmesi
Development of new strategies for sensitive detection of phosphopeptide in mass spectrometry applications
Yazar: ESİN YILMAZ
Danışman: DOÇ. DR. ÖMÜR ÇELİKBIÇAK
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Proteinlerin çoğu belli bir zamanda, belli bir fonksiyonu yerine getirirken serin, treonin veya tirozin aminoasitleri üzeriden fosfatlanmış olabilirler. Yapısında fosfat grubu bulunduran proteinlere fosfoprotein; fosfat grubunun bulunduğu daha küçük aminoasit dizilerine fosfopeptit denilmektedir. Hayati önem taşıyan birçok biyolojik fonksiyon, proteinlerin fosforolizasyonu ve defosforilizasyonu gibi post translasyonel modifikasyonlar (post translational modifications, PTMs) ile açıklanabilmektedir. Serin (Ser), treonin (Thr) ve tirozin (Tyr) aminoasitlerinin hidroksil gruplarında meydana gelen bu modifikasyonlar esnasında, kinaz enzimleri aminoasitlere fosfat grupları bağlarken, fosfataz enzimleri ise fosfat gruplarını kesmektedir. Birçok post-translasyonel modifikasyonun hücresel aktivite, tepki verme ve gelişim mekanizmalarındaki rolleri, hala tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu yüzden post-translasyonel modifikasyonları incelemek ve mekanizmalarını aydınlatmak önemlidir. 
Bu tez kapsamında, insan vücudunda bulunan demir ve kalsiyumun kullanım oranını arttırırken, yağ asitlerinin yıkımını engelleyen fosfopeptitlere karşı ilgi (afinite) gösterdiği bilinen organik ve/veya anorganik moleküller içeren malzemeler üretilerek, fosfopeptitlerin zenginleştirilmesi sağlanmış ve sonrasında ESI (electrospray ionization) kütle spektrometrisi yöntemi ile etkin bir şekilde incelenmiştir. Sol-jel malzemeler ağırlıklı olarak C6H6MgO7 (Magnezyum sitrat) tuzu ile TEOS (tetraetilortosilikat) kimyasal bileşenleri kullanarak sentezlenmiştir. Magnezyum elementi metabolizma içerisinde en fazla bulunan dördüncü mineral olarak, vücut içerisinde 300 farklı tepkimede rol oynamaktadır. Protein sentezi gibi faaliyetlerdeki görevlerine ek olarak Pearson'ın sert-yumuşak asit ve bazlar teorisine göre sert bir asit olan Mg2+ katyonunun, sert bir baz olan PO-4 anyonuyla daha kuvvetli etkileşime girmesi beklenmektedir. Bu nedenle magnezyum iyonu içeren farklı tipte sol-jel malzemeler sentezlenmiştir. Üretilen malzemelerden H3PO4 (fosforik asit) katılarak sentezlenen C6H6MgO7-H3PO4@TEOS sol-jelinin fosfopeptit zenginleştirme çalışmalarında en yüksek performansı gösterdiği görülmüştür. ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection-Fourier Transform Infrared) spektroskopisi ve TGA (Thermo Gravimetric Analysis) ile gerçekleştirilen karakterizasyon çalışmalarında C6H6MgO7-H3PO4@TEOS sol-jel yapısının diğer sol-jel yapılarına göre daha çok su barındırdığı ve bu sayede çözeltideki fosfopeptitlerin sol-jel yapısına difüzyonunu hızlandırarak adsorpsiyon kapasitesini artırdığı anlaşılmıştır. Bu sayede 13 pmol/mL (13 fmol/µL) derişime sahip fosfopeptitler başarılı bir şekilde zenginleştirilmiştir. Sol-jel malzemelerin yüzeylerinde XPS (X-Ray Photoelectron Spectroscopy) ile gerçekleştirilen analizlerde, sentez esnasında malzemeye eklenen kimyasallardan TEOS (tetraetilortosilikat) ve fosforik asit ile fosfopeptitlerin başarılı bir şekilde zenginleştirilmesinde etkili olan C6H6MgO7 maddelerinin yapıda bulundukları gözlenmiştir. Zenginleştirme çalışmaları sonucunda elde edilen ESI kütle spektrumları açık kaynak kodlu mMass yazılımı (www.mmass.org) kullanılarak incelenmiş, fosfopeptit yakalama oranları matematiksel ve bilimsel olarak ortaya konulmuştur.

Abstract:
Most of the proteins may at some time be phosphorylated on serine, threonine or tyrosine aminoacids when they perform a certain function. Phosphoprotein is protein that contain phosphate group in structure. The smaller amino acid sequences found in the phosphate group are called phosphopeptides. Many vital biological functions can be explained by post translational modifications (PTMs), such as phosphorylation and dephosphorylation of proteins. During these modifications that occur in the hydroxyl groups of serine (Ser), threonine (Thr) and tyrosine (Tyr) amino acids, kinase enzymes bind phosphate groups to amino acids while phosphatase enzymes block phosphate groups. The role of many post-translational modifications in cellular activity, response, and development mechanisms remains unclear. Therefore, it is important to examine post-translational modifications and clarify their mechanisms.
In this thesis, phosphopeptides in peptide mixtures are enriched by sol-gels which are containing cationic moieties, expected to show affinity for phosphopeptides. Sol-gel materials were synthesized predominantly by using C6H6MgO7 (Magnesium citrate) salt and TEOS (tetraethylorthosilicate) chemical components. Magnesium is the fourth most abundant mineral in metabolism and plays a role in 300 different reactions within the metabolism. In addition to its role in activities such as protein synthesis, the Mg2+ cation, which is a hard acid according to Pearson's hard-soft acid and bases theory is expected to interact more strongly with a hard base, PO-4 anion. For this reason, different types of sol-gel materials which containing magnesium ions were synthesized. The C6H6MgO7-H3PO4@TEOS sol-gel, which was synthesized using H3PO4 (phosphoric acid) showed the highest performance in phosphopeptide enrichment studies. In the characterization studies carried out by ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection-Fourier Transform Infrared) spectroscopy and TGA (Thermo Gravimetric Analysis), The C6H6MgO7-H3PO4@TEOS sol-gel structure contained more water than the other sol-gel structures and increased adsorption capacity of phosphopeptides by accelerating the diffusion rate into the sol-gel structure. Thus, the phosphopeptides at a concentration of 13 pmol/mL (13 fmol/μL) were successfully enriched from the solution. The surfaces of the sol-gel materials analyzed by XPS (X-Ray Photoelectron spectroscopy) technique and it was observed that TEOS (tetraethylorthosilicate), and Magnesium, which is effective for the successful enrichment of phosphopeptides, embedded into the structure. ESI mass spectra, obtained after the phosphopeptide enrichment studies, were investigated by open-source mMass software (www.mmass.org), and phosphopeptide enrichment rates were mathematically and scientifically demonstrated.