Reg ailesine ait REG1A, REG3A, REG3G' nın jurkat hücrelerinin biyolojisi üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of reg family members REG1A, REG3A and REG3G and on the biology of jurkat cells
Yazar: ZEHRA BÜŞRA AZİZOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. AHMET EKEN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Reg ailesi üyesi proteinleri önemli antimikrobiyal peptitler olup doğuştan gelen bağışıklığın temel bileşenleridir. Çalışmamızda Reg ailesi üyelerinden REG1A, REG3A ve REG3G'nın ve potansiyel reseptörlerinin (Ext ailesi üyeleri EXTL3) doğrudan primer fare/insan T hücrelerinin polarizasyon, sitokin üretimi, proliferasyon vs. gibi fonksiyonlarını nasıl etkilediğini ve REG1A proteininin hidrodinamik overekspresyon yöntemi ile fareye verilmesinin deneysel otoimmün ensefalomiyelit (DOE) patogenezine etkilerini ve terapötik potansiyelini karakterize etmeyi amaçladık. 
Rekombinant insan REG1A, REG3A, REG3G proteinlerinin farklı konsantrasyonlarının S. aureus üzerine anti-mikrobiyal etkisi teyit edildi ve her üç reg proteininin farklı konsatrasyonlarında koloni sayılarında azalma belirlendi.  REG1A, REG3A ve REG3G' nin Jurkat hücrelerinde ve PBMC'lerde ex vivo ortamda proliferasyon, apoptoz, IL-2 üretimi ve aktivasyon markırlarına (CD69, CD25, CD127) baktığımızda reg proteinleri doğrudan bu parametrelerin hiçbirini etkilemedi.
Rekombinant insan REG1A ile ex vivo ortamda yaptığımız farklılaşma deneylerinde REG1A'nın yüksek dozlarda Th17 farklılaşmasını azalttığı görülmüştür. Ayrıca dendritik hücre olgunlaşmasına etkileri incelenmiş ve REG1A'nın CD11c ifadesini arttırdığı gözlenmiştir.
T hücrelerinde yapılan tranfeksiyon ile susturma sonrası, REG1A/REG3A reseptörü olduğu düşünülen EXTL3 ifadesi başarılı biçimde azalmış ancak EXTL3 reseptörünün susturulması proliferasyon, IL-2 üretimi ve CD69 ifadesini etkilememiştir.
REG1A plazmidinin in vivo hidrodinamik overekspresyonu DOE klinik skorları ile eğri altında kalan alan değerlerini azaltıp ve demiyelinasyonu sınırlamıştır.
REG1A overekspresyonu inflamasyon durumunda DOE farelerde lenf nodda CD4+ T hücre sayısını azaltmış, Treg hücrelerinin sayısını ve aktivasyon belirteci olan CD25 ifadesini arttırmıştır. Öte yandan patojenik olan konvansiyonel T hücrelerinin sayısını ve CD25 ifadesini azaltmıştır. Ayrıca periferde lenf nodunda otoimmünitenin baskılanmasında görevli regülatör T hücrelerinin sayısını artırmıştır. Beyinde ise T hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını uyaran önemli bir sitokin olan IL-2 miktarı ile proinflamatuar sitokin olan TNF-a miktarını azalttığı ve supresif sitokin olan IL-10 miktarını ise arttırdığı gözlenmiştir.
Bu sonuçlar REG1A'nın fare MS modelinde koruyucu etkilerinn olduğunu göstermiş ve REG1A'nın profilaktik etkinkinliği konusunda umut vaat etmektedir.
Anahtar Sözcükler: EAE;  EXTL3; Jurkat hücre hattı; REG1A; REG3A; REG3G

Abstract:
Reg family member proteins are important antimicrobial peptides and are essential components of innate immunity. In our study, we investigated the impact of Reg family members human REG1A, REG3A and REG3G and their potential receptors (Ext family members EXTL3) on the polarization, cytokine production, proliferation, etc. of primary mouse/human T cells. We aimed to characterize the effects and therapeutic potential of administering REG1A plasmid to mice by hydrodynamic overexpression method on the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis (DOE).
The antimicrobial effect of different concentrations of recombinant human REG1A, REG3A, REG3G proteins on S. aureus was confirmed, and a decrease in colony numbers was determined at different concentrations of all three reg proteins. Reg proteins did not directly affect proliferation, apoptosis, IL-2 production and activation markers (CD69, CD25, CD127) in Jurkat cells and PBMCs ex vivo. 
In our ex vivo differentiation experiments, recombinant human REG1A, at high doses reduced Th17 differentiation. Additionally, its effects on dendritic cell maturation were examined and REG1A increased CD11c expression.
After silencing by transfection in T cells, the expression of EXTL3, which is thought to be the REG1A/REG3A receptor, was reduced, but knockdown of the EXTL3 receptor did not affect proliferation, IL-2 production and CD69 expression.
Overexpression of REG1A plasmid reduced DOE clinical scores and area under the curve values and limited the demyelination.
During DOE, REG1A overexpression decreased the number of CD4+ T cells and increased the number of Treg cells and the expression of the activation marker CD25 in the lymph node in mice. On the other hand, it reduced the number of pathogenic conventional T cells and CD25 expression. It also increased the number of regulatory T cells responsible for suppressing autoimmunity in the peripheral lymph node. In the brain, systemic REG1A overexpression decreased the amount of IL-2, which is an important cytokine that stimulates T cell proliferation and differentiation, and the amount of TNF-α, which is a pro-inflammatory cytokine, and increased the amount of IL-10, which is a suppressive cytokine.
These results show that REG1A has protective effects in the mouse MS model and suggest that it may be a promising target for the MS prophylaxis or treatment.
Keywords: EAE;  EXTL3; Jurkat cell line; REG1A; REG3A; REG3G.