Sarkozin tayini için yeni bir biyosensör geliştirilmesi
Development of a novel biosensor for determination of sarcosine
Yazar: DUYGU KILIÇ
Danışman: PROF. DR. ERHAN DİNÇKAYA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tezde sarkozin oksidaz (SOX) enziminin camımsı karbon elektrot yüzeyine çok duvarlı 
karbon nanotüp (MWCNT) kullanılarak immobilize edilmesiyle yeni bir biyosensör 
tasarlanmıştır. Sarkozin oksidaz enzimi kullanılarak prostat kanser biyobelirteci olan sarkozinin 
tayinine yönelik yeni bir biyosensör geliştirilmiştir. İlk olarak MWCNT 
fonksiyonelleştirilmiştir. Bu amaçla asit ile muamele edilerek fonksiyonelleştirilen MWCNT, 
asetik asit içerisinde çözünmüş olan kitosan ile karıştırılır. Ardından temizlenmiş olan camımsı 
karbon elektrot üzerine immobilize edilir. Daha sonra yüzeye (GCE/f-MWCNT) sarkozin 
oksidaz enzimi ilave edilir. Tam olarak kuruma sağlandıktan sonra bifonksiyonel çapraz 
bağlama ajanı olan glutaraldehit ile muamele edilir. Böylece biyosensör hazırlanmış olur. 
(GCE/f-MWCNT/SOX/Glutaraldehit) Geliştirilen biyosensör ile sarkozin tayinine yönelik
ölçümler -0.7 V'ta amperometrik yöntem ile yapılmıştır. Hazırlanan biyosensörlerin 
optimizasyon çalışmalarında optimum enzim miktarı, MWCNT miktarı gibi parametreler 
çalışılmıştır. Çalışma koşullarının optimizasyonunda pH ve sıcaklık optimizasyonu 
gerçekleştirilmiştir. Daha sonra karakterizasyon çalışmaları içinde doğrusal tayin aralığı, 
tekrarlanabilirlik, tekrar üretilebilirlik, girişim etkisi gibi bazı parametreler çalışılmıştır. 
Optimizasyon çalışmalarından GCE/f-MWCNT/SOX/Glutaraldehit modifiye biyosensör için 
enzim miktarı, f-MWCNT miktarı sırasıyla 187,5 U/ml ve 0,03 mg/µl olarak tespit edilmiştir. 
Potasyum fosfat tamponu (100 mM, pH: 7,5) ve 25°C sıcaklığın optimum çalışma koşullarını 
sağladığı belirlenmiştir. Modifiye biyosensör için karakterizasyon çalışmalarında 25 µM-1000 
µM sarkozin konsantrasyon aralığı doğrusal tayin aralığı olarak belirlenmiştir. Tekrar 
üretilebilirlik çalışması kapsamında n=10 olacak şekilde her ölçüm için yeni bir biyosensör 
hazırlanıp seçilen konsantrasyonda (250 µM) tekrarlı ölçümler alınmıştır. Alınan cevaplar 
arasında anlamlı düzeyde bir farklanma bulunamamıştır. Tekrarlanabilirlik çalışmaları 
kapsamında 250 µM sarkozin konsantrasyonunda (n=7) olmak üzere ( ) = 249,62 µM, standart 
sapma (S.S) = ± 3,76 ve varyasyon katsayısı (% V.K.) = % 1,5 olarak bulunmuştur. Yapılan 
ölçümlerden hesaplanan konsantrasyonlar arasındaki az olmasından dolayı standart sapma 
değeri de düşüktür. Dolayısıyla elde edilen varyasyon katsayısı da oldukça düşük bulunmuştur.
Substrat spesifikliğini incelemek için sarkozine yapıca benzeyen moleküller ile çalışılmıştır. 
Ancak elde edilen biyosensör cevapları sarkozin oksidaz enzimi için girişimci etkisinin önemli 
düzeyde olmadığını ortaya koymuştur

Abstract:
In this thesis, a new biosensor was designed by immobilizing the sarcosine oxidase (SOX) 
enzyme on the glassy carbon electrode surface using a multi-walled carbon nanotube 
(MWCNT). A new biosensor has been developed for the determination of sarcosine, a prostate 
cancer biomarker, using the sarcosine oxidase enzyme. First, the MWCNT was functionalized. 
For this purpose, MWCNT functionalized by treatment with acid is mixed with chitosan 
dissolved in acetic acid. Then, the cleaned glassy carbon is immobilized on the electrode. Then, 
sarcosine oxidase enzyme is added to the surface (GCE/f-MWCNT). After complete drying, it 
is treated with glutaraldehyde, a bifunctional crosslinking agent. Thus, the biosensor is 
prepared. (GCE/f-MWCNT/SOX/Glutaraldehyde) Measurements for the determination of 
sarcosine with the developed biosensor were made by amperometric method at -0.7 V. In the 
optimization studies of the prepared biosensors, parameters such as optimum enzyme amount 
and MWCNT amount were studied. Optimization of pH and temperature was carried out in the 
optimization of working conditions. After that, some parameters such as linear detection range, 
repeatability, reproducibility, interference effect were studied in characterization studies. From 
the optimization studies, the enzyme and f-MWCNT amount for GCE/f-MWCNT/Sarcosine 
oxidase/glutaraldehyde modified biosensor were determined as 187.5 U/ml and 0.03 mg/µl, 
respectively. It was determined that potassium phosphate buffer (100 mM, pH: 7.5) and 25°C 
temperature provided optimum working conditions. In the characterization studies for the 
modified biosensor, the sarcosine concentration range of 25 µM-1000 µM was determined as 
the linear detection range. Within the scope of the reproducibility study, a new biosensor was 
prepared for each measurement with n=10 and repeated measurements were taken at the 
selected concentration (250 µM). There was no significant difference between the answers 
received. Within the scope of reproducibility studies, at a sarcosine concentration of 250 µM 
(n=7), (𝑥̅) = 249.62 µM, standard deviation (S.D) = ± 3.76 and coefficient of variation (C.V %) 
x
= 1.5%. The standard deviation value is also low due to the small difference between the 
concentrations calculated from the measurements. Therefore, the coefficient of variation 
obtained was also found to be quite low. Molecules similar in structure to sarcosine were studied 
to examine substrate specificity. However, the obtained biosensor responses revealed that the 
interference effect for the sarcosine oxidase enzyme was not significant.