Baş-boyun skuamöz hücre karsinomlarında sitokinler ve ilgili yolakta rol alan bazı genlerin ekspresyonlarının araştırılması
Evaluation of cytokines and certain genes take part in related pathway in head and neck squamous cell carcinoma
Yazar: AYSEL KALAYCI YİĞİN
Danışman: PROF. DR. TÜLÜN ÇORA
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Kafa ve boyun neoplazmları = Head and neck neoplasms ; Karsinoma-yassı hücreli = Carcinoma-squamous cell ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Reseptörler = Receptors ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Sitokinler = Cytokines

Özet:
Baş-boyun skuamöz hücre karsinomaları (BBSHK) baş-boyun kanserleri içinde en sık rastlanılan, agresif seyirli, erken tekrarlama (rekürrens) ve metastaz ile karakterize bir tümör tipidir. Hastalığın oluşumunda sigara ve alkol kullanımı önemli rol alırken bazı sinyal iletim yolaklarının ve bu yolaklarla bağlantılı genlerin regülasyonlarının bozulmasının BBSHK'lerinin gelişiminde önemli olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle mevcut çalışmada öncelikle hücre sinyal iletiminin ilk basamağında yer alan sitokinlerin belirlenmesi ve bu sitokinlerle ilgili yolakta yer alan genlerin ekspresyonlarının mRNA ve protein seviyesinde ortaya konarak sitokin temelli sinyal yolağının araştırılması amaçlanmıştır.
Bu çalışmada BBSHK'li hastaların ve sağlıklı kontrollerin serum örneklerinde, sitokin seviyelerini belirlemek için ilk olarak antikor sıra analizi yapıldı. Antikor sıra analizi sonucunda, EGF, IGF-1, PDGFBB ve IGFBP-1 sitokin seviyelerinin kontrollere göre arttığı belirlendi. Daha sonra sitokinlerin ve ilişkili olduğu düşünülen genlerin mRNA gen ekpresyon seviyeleri, qRT-PZR ile incelendi. mRNA gen ekspreyon analizleri; BBSHK'li 16 hastanın tümörlü-normal dokuları, larinkse ait tümörlü-normal dokuları, dile ait tümörlü-normal dokuları, yine bu grupların erken evre ile ileri evreleri ve cinsiyet parametreleri arasında karşılaştırıldı.  Ayrıca BBSHK tümör hücre hattı olan SCCL-MT1 ile normal dokular; normal hücre hattı olan HEK-293 ile tümörlü dokular gen ekspresyonlarındaki kat artışları yönünden değerlendirildi. mRNA gen ekspresyon sonuçları,  BBSHK'lerinde tümörlü dokularla normal dokular karşılaştırıldığında, tümör dokularında PDGFBB gen ekspresyonlarının arttığını, PTEN ekspresyonlarının ise azaldığını gösterdi (sırasıyla p=0,006, p>0,001,). Larinks ve dil dokuları ayrı ayrı değerlendirildiğinde ise, PDGFBB gen ekspresyonu sadece larinks dokularında (p=0,002); PTEN gen ekspresyonu her iki grupta da istatistiksel olarak anlamlı bulundu ((larinks dokuları p değeri=0,041; dil dokuları p değeri= 0,006). Hücre hatları ve dokular karşılaştırıldığında en anlamlı değişiklik tümör dokularında 15 kat azalma ile PTEN geninde oldu. Tümörlü grubun erken evre ile ileri evreleri arasındaki karşılaştırmasında, IGFBP-1'in mRNA gen ekspresyonu, istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,010). BBSHK'li hastaların cinsiyetleri ile mRNA gen ekspresyonları arasındaki ilişki araştırıldığında istatistiksel olarak fark bulunmadı. mRNA gen ekspresyon analizlerini protein düzeyinde konfirme etmek amacıyla, protein düzeyleri ve en sık fosforillenen bölgelerinin fosfo-protein ekspresyon düzeyleri western blot yöntemiyle incelendi.  Western blot analizleri sonucunda, BBSHK'lerinin tümörlü dokularda aşırı eksprese olan hücre yüzey reseptörleri EGFR, PDGFRB ve IGF-1R olarak belirlendi.
Çalışmanın bulguları, BBSHK'lerinde EGFR dışında, diğer hücre yüzey reseptörlerinin aşırı ifadesini göstermiştir. Böylece, BBSHK'lerinde aşırı eksprese hücre yüzey reseptörleri belirlenerek potansiyel sinyal yolağ(lar)ı tanımlanmıştır. Bu veriler birbirlerini destekleyici nitelikte olup, BBSHK'lerinin patogenezinde önemli olduğu düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: Baş-boyun skuamöz hücre karsinomaları; hücre yüzey reseptörleri; sinyal yolakları; sitokinler.

Abstract:
Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a primer tumor type in head and neck cancers, characterized by aggressiveness, early recurrence and metastasis. While alcohol and smoking play an important role at pathogenesis of disease, deregulation of some signaling pathways and genes related to these pathways are considered as important at contribution of development of HNSCC. For this reason, the aim of the present work is to evaluate the cytokine based signalling pathways by defining the cytokines take part in the starting step of cell signal transduction and revealing mRNA and protein expression levels of the genes at pathway related to this cytokines.
In this study, an antibody array analysis was performed primarily to define the cytokine levels at serum samples in patients with HNSCC and healthy controls. As a result of antibody array analysis, an increase was observed at EGF, IGF-1, PDGFBB and IGFBP-1 cytokines compared to controls. Then, mRNA gene expression levels of cytokines and genes that were considered related to these cytokines have been examined with qRT-PCR. mRNA gene expression analysis of tumor-adjacent normal tissues, laryngeal tumor-adjacent normal tissues, tongue tumor-adjacent normal tissues have been compared in 16 HNSCC patients. Moreover, advance and early stages of these groups and gender parameters were compared. Additionally, normal tissues and SCCL-MT1that is a HNSCC tumor cell line and tumor tissues and HEK-293 that is a normal cell line were evaluated in terms of gene expression level increase. mRNA gene expression results demonstrated that PDGFBB expressions had been increased and PTEN expression levels had been decreased at HNSCC tumor tissues compared to normal tissues (respectively p=0,006, p>0,001). When laryngeal and tongue tissues were compared statistically as separate, only PTEN gene expression was found statistically significant at the both groups (laryngeal tissue p value = 0,041; tongue tissue p value = 0,006).  PDGFBB gene expression was only found significant at laryngeal tissue group (p=0,002). In cell lines and tissue comparisons, most significant difference found at PTEN gene as 15 times decrease in tumor tissues. mRNA gene expression of IGFBP-1 was found statistically significant when compared the early stage to advanced stage tumor group (p=0,010). However, no significant difference was found statistically when the relationship between gender of HNSCC patients and mRNA gene expressions was investigated. Protein and phospho-protein expression levels of the frequently phosphorylated sites were investigated by using a western blot to confirm the expression of mRNA in the context of protein levels. As a result of western blot analysis; EGFR, PDGFRB and IGF-1R were detected as highly overexpressed cell surface receptors in tumor tissues of HNSCC.
The findings of this study revealed the overexpression of other cell surface receptors as well as EGFR in HNSCC. Thereby, potential pathways were identified by determining the cell surface receptors overexpressed in HNSCC. These data support each other and may be important in pathogenesis of HNSCC.

Key Words: Cell surface receptors; cytokines; head and neck squamose cell carcinoma; signal pathways.