Diyabetik yara tedavisinde kullanılmak üzere nanopartiküler statin ve kök hücre içeren doku iskelelerinin formülasyonu ve in vitro/in vivo değerlendirilmesi
Formulation of tissue scaffolds containing nanoparticulate statin and stem cells for diabetic wound healing and in vitro/in vivo evaluation
Yazar: DİLARA ÖRGÜL
Danışman: PROF. DR. SÜEDA HEKİMOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antikolesteremik ajanlar = Anticholesteremic agents ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Hücre iskeleti = Cytoskeleton ; Kök hücreler = Stem cells ; Lipidler = Lipids ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Simvastatin = Simvastatin ; Yara iyileşmesi = Wound healing ; İlaçlar = Drugs ; İskelet = Skeleton

Özet:
Son yıllarda yapılan çalışmalarla simvastatinin kolesterol düşürücü etki mekanizmasından bağımsız olarak yara iyileşmesini ve kök hücre tedavi etkinliğini desteklediği gösterilmiştir. Bu bilgilerden yola çıkılarak diyabetik yara tedavisinde yeni bir tedavi yaklaşımının sunulması amacıyla simvastatin yüklü nanoyapılı lipit taşıyıcı (NLT) partiküller ve/veya mezenkimal kök hücre içeren, biyolojik polimerlerle hazırlanmış, doku iskelesi formülasyonları hazırlanarak 3 boyutlu ve biyolojik olarak parçalanabilen yeni bir yara iyileştirici sistem geliştirilmiştir. Simvastatin içeren NLT formülasyonları lipit matriksin %10 veya %20'si kadar simvastatin ile yüklenmiş olarak 50:50 veya 70:30 sıvı:katı lipit oranlarında yüksek basınçlı homojenizasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. Formülasyonlarda, katı lipit olarak Precirol ATO 5, sıvı lipit Maisine, hidrofilik yüzey etkin madde Tween 80 ve lipofilik yüzey etkin madde olarak da Lipoid S100 kullanılmıştır. Simvastatin içeren NLT formülasyonları 158 nm boyutlarında, 0.17 altında PDI değerleri ile homojen dağılım gösteren ve %99'un üzerinde yükleme kapasitesine sahip küresel partiküllerden oluşmaktadır. İn vitro salım çalışmaları sonucunda, NLT formülasyonlarından salımın başlangıçta simvastatinin patlama salımı nedeniyle hızlı gerçekleştiği daha sonra ise yavaş bir salım hızı ile devam ederek yaklaşık 12-24 saatte platoya ulaştığı gözlenmiştir. Simvastatin içeren NLT formülasyonları ile 25°C ve 4°C'de gerçekleştirilen stabilite çalışmalarında ise formülasyonların 4°C'de 90 gün boyunca 200 nm altında monodispers dağılımlarını korudukları ve simvastatinin 4°C'de 15 gün boyunca stabil olduğu bulunmuştur. NLT içine hapsedilmiş simvastatin içeren doku iskelesi formülasyonları konsantre edilmemiş veya 2 kat konsantre NLT formülasyonlarından hareketle 1:1 veya 2:1 kitosan:kollajen polimer kombinasyonlarında dondurarak kurutma yöntemi ile hazırlanmışlardır. Hazırlanan formülasyonlar arasında %74.38 porozite değeri ve 20 µm-200 µm arasında değişen uygun por büyüklüğü dağılımı ile üç boyutlu poröz bir yapı, %710.88 yüksek su absorplama kapasitesi, %57.7 düşük kütle kaybı ve iyi bir mekanik dayanıklılık gösteren 2:1 kitosan:kollajen polimer oranında, 2 kat konsantre NLT formülasyonu ile hazırlanmış çapraz bağlı doku iskelesi formülasyonu in vivo çalışmalar için uygun bulunmuştur. Doku iskelelerine NLT formülasyonlarının eklenmesi simvastatin patlama salımını azaltarak daha kontrollü salım profilinin elde edilmesini sağlamıştır. L929 fare fibroblast hücre hattı üzerinde yapılan hücre kültürü çalışmaları ile doku iskelelerinin sitotoksik etki göstermediği sonucuna varılmıştır. Sıçanlar üzerinde yapılan in vivo çalışmalar sonucunda lipit nanopartiküler simvastatin içeren doku isekelelerinin kontrol gruplarına göre yara kapanma hızını artırdıkları ve yaralı dokuda vaskülarizasyonu destekledikleri gözlenmiştir. Patolojik incelemelerde simvastatinin kök hücrelerin canlılığını ve proliferasyonunu artırdığı gösterilmiştir. Bunun sonucu olarak lipit nanopartiküler simvastatin ve kök hücreyi birlikte içeren doku iskelelerinde artmış epitelizasyon, proliferasyon ve vaskülerizasyon gözlenerek etkin yara iyileşmesi sağlanmıştır.

Abstract:
Simvastatin has been shown to support wound healing and stem cell treatment efficacy independent of cholesterol-lowering mechanism in recent studies. Under the light of these facts, in order to provide a new treatment approach in diabetic wound care, novel three dimensional and biodegradable wound healing system has been formulated by preparing tissue scaffolds consisting of biological polimers, simvastatin loaded nanostructured lipid carriers (NLCs) and mesenchimal stem cells. NLC formulations containing simvastatin at the concentrations of 10% or 20% of lipid phase were prepared by high pressure homogenization technique at 50:50 or 70:30 liquid:solid lipid ratio. Precirol ATO 5 as solid lipid, Maisine as liquid lipid, Tween 80 as hydrophilic surfacactant and Lipoid S100 as lipophilic surfactant were used in the formulations. Simvastatin loaded NLC formulations are prepared having 158 nm particle size, homogeneous spherical particles with PDI values below 0.17 and encapsulation efficiency above 99%. As a result of in vitro release studies, release of simvastatin from the NLC formulations has been characterized by a high burst release tendency that was followed by a slow release rate and finally reaching plateau at about 12-24 hours. In stability studies carried out at 25°C and 4°C, the formulations were found to maintain monodisperse distributions below 200 nm for 90 days at 4°C and simvastatin was observed to be stable for 15 days at 4°C. Tissue scaffold formulations containing simvastatin loaded NLCs were prepared by freeze drying method in a combination of 1:1 or 2:1 chitosan:collagen polymers with unconcentrated or 2-fold concentrated NLC formulations. The cross-linked tissue scaffold formulation prepared with 2:1 chitosan:collagen polymer ratio and 2-fold concentrated NLC formulation, having a three-dimensional high porous structure with a porosity value of 74.38% and sufficient large pore size distribution from 20 μm to 200 μm and with 710.88% high water absorption capacity, 57.7% low weight loss and good mechanical strength was found to be suitable for in vivo studies. Incorporation of NLCs into tissue scaffolds decreased the initial simvastatin burst release ratio and maintained a more controlled release profile. Cytotoxic effect of tissue scaffolds was not observed on L929 mouse fibroblast cells in cell culture studies. In vivo studies have indicated that tissue scaffolds containing simvastatin lipid nanoparticles increased wound closure rate and promoted the vascularization of injured tissue when compared to control groups. In pathological investigations, simvastatin has been shown to enhance viability and proliferation of stem cells. Thereupon, tissue scaffold formulation containing simvastatin lipid nanoparticles and stem cells together provided effective wound healing with increased epithelialization, proliferation and vascularization.