Anoxybacillus gonensis G2t glukoz izomerazının ısıl kararlılığının K111R-L313I-V101R-A353G/F/W VE T428E/S bölge spesifik mutasyonları ile geliştirilmesi
Improvement thermal stability of glucose isomerase from Anoxybacillus gonensis g2t by site directed mutagenesis K111R-L313I-V101R-A353G/F/W and T428E/S
Yazar: SEYHAN RAKICI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ HAKAN KARAOĞLU
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: Glükoz izomeraz = Glucose isomerase ; Mutasyon = Mutation

Özet:
Glukoz izomeraz hücre içi bir enzim olup birçok  ermofilik ve mezofilik bakteri ve çeşitli mantarlar tarafından üretilebilen bir enzimdir. Asıl ismi ksiloz izomeraz olmasına rağmen, D-Glukozu D-Fruktoza çevirebilme yeteneği sebebiyle özellikle endüstriyel alanda HFCS üretiminde yoğun olarak kullanıldığı için, yaygın ismi glukoz izomeraz olarak bilinmektedir. Bu enzim, hem hemisellülozdan etanol üretimine yardımcı olduğu için hem de fruktoz şurubu diğer adıyla HFCS (High Fructose Corn Syrup) üretiminde kullanıldığı için büyük endüstriyel öneme sahiptir. Bu çalışma kapsamında ekibimiz, daha önce genetik manipülasyonlarla kinetik özellikleri geliştirilmiş olan A. Gonensis G2T glukoz izomerazının yine aynı yöntemler ile ısıl kararlılığını arttırmayı amaçlamaktadır. Bu amaçla yaban tip enzim üzerinde V101R, K111R, L313I, A353G, A353F, A353W, T428S ve T428E bölge özgün mutasyonları ile enzimin ısıl kararlılığının arttırılması çalışılmıştır. V101R ve K111R mutasyonları yaban tip enzimin yarılanma ömrünü 19 günden sırasıyla 31 ve 37 güne çıkarmıştır. Enzimin yarılanma ömründe artışa yol açan bu mutasyonlar ikili olarak birlikte uygulanmış ve bu amaçla V101R- K111R, çiftli mutasyonu gerçekleştirilmiştir. İki mutasyon birlikte uygulandığında enzimin ısıl kararlılığı 19 günden 11,5 güne düşmüştür.  Ayrıca V101R ve K111R, mutasyonları katalitik etkinliği yaklaşık 9 kat arttırılmış olan W137F –V184S mutant enziminde de tekrarlanmıştır. Bu çalışmalardan W137F – V184S – K111R üçlü mutasyonları ile düşük Km, yüksek Vmax ve katalitik etkinliğe sahip mutant enzim elde edilmiştir.

Abstract:
Glucose isomerase is an intracellular enzyme that can be produced by thermophilic and mesophilic bacteria and various fungus. Even though the enzyme is named as xylose isomerase it is commonly known as glucose isomerase since it can catalyze the isomerization of glucose to fructose and it is mainly used in the production of fructose syrup or HFCS. This enzyme has great industrial importance for both ethanol production from hemicellulose and for being used in the production of fructose syrup or HFCS (high fructose corn syrup).  In this study, we aim to improve the thermal stability of A.gonensis G2T glucose isomerase with previously improved kinetic properties by genetic manipulations. To this end, we tried to improve the thermal stability of the wild-type enzyme by using V101R, K111R, L313I, A353G, A353F, A353W, T428S and T428E site-specific mutations. V101R, K111R mutations increased the half-life of the wild-type to 31 and 37 days respectively from 19 days. These mutations were used together to create V101R – K111R double mutation.  The double mutation decreased thermal stability of the enzyme to 11,5 days from 19 days.  Moreover, V101R, K111R mutations were repeated in W137F –V184S mutant enzyme that has 9 times more catalytic efficiency. These trials resulted in an enzyme with W137F – V184S – K111R triple mutation which have low Km, high Vmax and catalytic efficiency.