Malacosoma neustria orjinli Bacillus thuringiensis'e ait cry2Ab geninin karakterizasyonu, ekspresyonu ve insektisidal aktivitesinin araştırılması
Characterization, expression and investigation of the insecticidal activities of cry2Ab gene which belongs to Bacillus thuringiensis bacteria origin malacosoma neustria
Yazar: EMİNE ERYÜZLÜ
Danışman: DOÇ. DR. İSMAİL DEMİR
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Bacillus thuringiensis = Bacillus thuringiensis

Özet:
Bacillus thuringiensis, Gram-pozitif, sporlanabilen, fakültatif anaerop bir toprak bakterisidir. Sporlanma esnasında üretilen, parasporal kristal yapıdaki ?-endotoksinler, bunların çok sayıda tarım zararlılarıyla mücadelede etkili ve yaygın bir şekilde kullanılmalarını sağlamaktadır. Bu potansiyelleri nedeniyle bugün, tüm dünyada en çok üretilen ve en fazla market satışlarına sahip ticari mikrobiyal mücadele preparatları B. thuringiensis'lerden geliştirilmiştir.Bu çalışmada kullanılan Bacillus thuringiensis MnD izolatı, doğal olarak ölmüş Malacosoma neustria larvalarından izole edildi. Bu izolata ait cry2Ab geni, dejenerat primerler kullanılarak PZR yöntemiyle çoğaltıldı. Çoğaltılan genlerin nükleotid sıralarının belirlenmesi için PZR ürünleri pGEM-T Easy vektörüne klonlandı ve dizin analizine gönderildi. Dizin analizi yapılan cry2Ab geninin DNA ve aminoasit sıraları literatürdeki mevcut cry2Ab genlerinin DNA ve aminoasit sıraları ile karşılaştırıldı.Analiz sonuçları, çalışmada kullanılan yerel Bacillus thuringiensis izolatına ait cry2Ab geninin 1902 bp uzunluğunda olduğunu, 633 aminoasit dizisi kodladığını ve literatürdeki B. thuringiensis ly30 bakterisinin cry2Ab genine %99 oranında benzerlik gösterdiğini ortaya koydu. Dizin analizi yapılan bu cry2Ab geni, pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanarak Escherichia coli'de ekspres edildi. Ekspresyon sonucu, SDS-PAGE analizine tabi tutuldu ve cry2Ab proteininin 70 kDa büyüklüğünde olduğu belirlendi. Üretimi yapılan cry2Ab proteinin insektisidal aktivitesi, Malacosoma neustria (Lepidoptera: Lasiocampidae) ve Rhagoletis cerasi L. (Diptera: Tephritidae) zararlıları üzerinde test edildi. Yüz ?g konsantrasyonundaki cry2Ab proteinin M. neustria larvaları üzerinde %73 ve R. cerasi larvalarında ise %75'lik insektisidal etki gösterdiği belirlendi.

Abstract:
Bacillus thuringiensis is a gram-positive, facultative anaerob soil bacterium can be sporulated. During sporulation, it produces different ?-endotoxins that have a parasporal crystal structure because of the B. thuringiensis, an important insect pathogen, is effectively and widely used in combating pests. Because of their potential, B. thuringiensis is the most produced and most marketed commercial microbial control preparate around the world today.B. thuringiensis MnD isolate used in this study was isolated from a naturally dead M. neustria larvae. cry2Ab gene belonging to that isolate was amplified with the PCR method by using degenerate primers. The amplified gene was cloned to pGEM-T Easy Vector and its sequence analysis was performed in order to identify the nucleotide sequence. DNA and aminoacid sequence of cry2Ab gene that underwent a sequence analysis, was compared with the DNA and aminoacid sequences of existent cry2Ab gene in literature.The results of anaysis show that cry2Ab gene belonging to the local B. thuringiensis isolates used in this study has a length of 1902 bp and 633 aminoacid sequence. Besides, it has %99 homology with the cry2Ab gene of B. thuringiensis ly30 bacterium in literature. The sequenced cry2Ab gene was cloned to the pET-28a(+) expression vector and their proteins were expressed in Escherichia coli. The result was exposed to SDS-PAGE analysis and it was found that cry2Ab protein had the size of 70 kDa. The insecticidal activity of the cry2Ab protein produced was tested on Malacosoma neustria L. (Diptera: Lasiocampidae) and Rhagoletis cerasi L. (Diptera: Tephritidae). It was found that cry2Ab protein in 100 ?g concentration showed 73% insecticidal effect on M. neustria larvae and 75% insecticidal effect on R. cerasi larvae.