Toprak kökenli mikrofunguslarda lipaz üreten suşların araştırılması, lipaz saflaştırılması ve karakterizasyonu
Investigating of lipase producing strains of microfungi with origin soil, purification and characterization of lipase
Yazar: SERDAR ÜLKER
Danışman: DOÇ. DR. ŞENGÜL ALPAY KARAOĞLU
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology
Dizin: Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Karakterizasyon = Characterization ; Lipaz = Lipase ; Mikrofunguslar = Microfungus ; Mucor = Mucor ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Bu çalışmada, Rize ilinde çay yetiştirilen topraklardan izole edilen 15 cinse ait 213 mikrofungusun ekstraselülar lipaz aktiviteleri kalitatif olarak test edildi. Bu mikrofunguslar arasında en yüksek aktiviteye sahip olan tür Mucor hiemalis f. corticola IDM11B olarak belirlendi. Bu suşun üretmiş olduğu lipaz saflaştırılarak karakterize edildi.M. hiemalis f. corticola IDM11B suşuna ait ekstraselular lipaz, amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz, Sephadex G-75'in kullanıldığı jel filtrasyon ve Q-Sepharose Fast Flow iyon değişim kromatografileri kullanılarak saflaştırıldı. Saflaştırma basamaklarında fraksiyonlardaki toplam protein miktarları ve lipaz aktiviteleri spektrofotometrik yöntemle belirlendi. Enzim, %27.7 verimle 12.63 kat saflaştırıldı. Saflaştırma basamaklarında elde edilen protein örnekleri SDS-PAGE'te yürütüldü ve moleküler ağırlıklarına göre ayrımları yapıldı. Ayrıca analitik jel filtrasyon yapılarak, enzimin moleküler ağırlığının 46 kDa olduğu belirlendi. Saflaştırılmış enzimin optimum pH'sı, optimum sıcaklığı, sıcaklık ve pH stabilitesi, Km ve Vmaks değerleri hesaplandı. Enzim aktivitesi üzerine bazı metal iyonlarının etkisi incelendi. Enzimin optiumum pH'sı 7.0, optimum sıcaklığı 40 °C olarak belirlendi. pH 7.0- 9.0 aralığında, 4 °C'de 72 saat inkübasyondan sonra enzimin oldukça kararlı olduğu gözlendi. Isıl kararlılık eğrisi incelendiğinde, 90 dakikalık inkübasyon sonunda enzimin 30 °C'de kararlı olduğu, 50 °C'ye kadar aktivitesini % 50 civarında koruduğu tespit edildi. p-NPP varlığında M. hiemalis f. corticola IDM11B lipazının Km ve Vmaks değerleri, Hanes-Woolf grafiği yardımıyla sırasıyla, 1.327 mM ve 91.11 µmol/dk olarak belirlendi. Farklı son konsantrasyonlardaki bazı metal iyonlarının aktiviteyi önemli oranda etkilemediği belirlendi.

Abstract:
In this study, extracellular lipolytic activities of 213 microfungal strains belonging to 15 genera isolated from tea growing soil in Rize were investigated. Among these microfungi, Mucor hiemalis f. corticola IDM11B was found as a strain with the highest lipolytic activity. The extracellular lipase of Mucor hiemalis f. corticola IDM11B was homogeously purified using a combination of ammonium sulphate precipitation, dialyze, gel filtration coloumn chromatography with Sephadex G-75 and ion exchange chromatography with Q-Sepharose Fast Flow. The total protein quantities and lipase activities in the fractions through purification steps were determined by spectrophotometric method. Enzyme was purified 12.63 folds with a yield of 27.7%. Protein samples collected at the purification steps were run with SDS-PAGE, and seperated in terms of molecular weights. In addition, molecular weight of enzyme was deteminated to be 46 kDa by analytical gel filtration. Optimum pH, optimum temperature, stability of both temperature and pH, Km, and Vmaks of purified enzyme were calculated and effects of some metal ions on enzyme activity were investigated. Optimum pH and optimum temperature of enzyme were determined as 7.0 and 40°C, respectively. The enzyme activity was observed to be quite stable at the pH range of 7.0?9.0, after 72 hours incubation at 4 °C. When thermostability data were evaluated, it was seen that the enzyme was stable at 30 °C after 90 minutes incubation and nearly retained 50% of its original activity until 50 °C. In the presence of p-NPP as substrate, Km and Vmaks values of M. hiemalis f. corticola IDM11B lipase were calculated by Hanes-Woolf plot as 1.327 mM and 91.11 µmol/dk, respectively. It was determined that different final concentrations of some metal ions did not significantly affect enzyme activity.