Aeribacillus pallidus PI8 suşuna ait proteaz enzim genin klonlanmasi ve protein üretimi
Cloning and protein production of protease enzyme from Aeribacillus pallidus PI8 strain
Yazar: MAHDIYEH SAADATI
Danışman: PROF. DR. ORHAN ERDOĞAN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Amaç: Aeribacillus pallidus PI8 suşuna ait proteaz enzim geninin klonlanması ve protein üretimi üzerine yapılan bu çalışmada, E. coli BL21 suşunda rekombinant protein üretimi ve saflaştırılması hedeflenmiştir.
Yöntem: Aeriacillus pallidus PI8 suşuna ait proteaz enzim geni izole edip ve proteaz geni PCR yöntemiyle çoğaltıldı. PCR ürünü, SUMO ekspresyon vektörüne aktarıldı ve vektör kompetent One Shot® Mach1TM-T1R bakterisine transfer edilerek çoğaltıldı ve koloni PCR yapıldı.Pozitif kolon seçimi sonrası plazmid izolasyonu gerçekleştirildi. Genin doğru şekilde vektöre entegre olduğunu doğrulamak için genin forward ve vektörün reverse ile  çapraz PCR yapıldı.Ekspression için kompetent E. coli BL21 hücrelerine aktarıldı. Protein üretimi için kültürlerden biri 0,5 mM, diğeri ise 1 mM IPTG ile indüklenerek IPTG miktarı belirlendi. Sonuçlar için bakteri hücreleri öncelikle parçalandı ve ardından SDS-PAGE analizi yapıldı.Sonra saflaştırma işlemine geçildi.Bu amaçla hücre lizatı hazırlandı. ProbondTM kolonuna yüklenerek saflaştırma gerçekleştirildi. Saflaştırma sonrası, SDS-PAGE analizi ve Commassie brilliant blue G-250 boya ile sonuçlar analiz edildi. Saflaştırmanın başarıyla gerçekleştirildiği doğrulandı.
Bulgular: Araştırmada alınan sonuçlara göre, protein üretiminde en iyi üretimin son konsantrasyon 1 mM olacak şekilde IPTG ile indüklenen kültürde olduğu görüldü. Saflaştırma sonrasında SDS-PAGE Commassie brillant blue G-250 ile boyanan jel sonucuna göre üretilen proteinin ağırlığı ⁓37 kDa olarak bulundu.
Sonuçlar: : Bu tez çalışmasında Aeribacillus pallidus PI8 suşuna ait proteaz enzim geni başarıyla pET-SUMO vektörüne klonlanmış ve saflaştırma işlemi gerçekleştirilerek hedeflenen protein üretimi elde edilmiştir.

Abstract:
Purpose: This study aimed to clone the protease enzyme gene from the Aeribacillus Pallidus PI8 strain into the SUMO vector and produce recombinant protein in E. coli BL21 strain for protein production.
Method: The protease enzyme gene from Aeribacillus pallidus PI8 strain was isolated and amplified by using PCR. The PCR product was transferred to the SUMO expression vector and amplified in One Shot® Mach1TM-T1R bacteria, followed by colony PCR. Plasmid isolation was performed after positive colony selection. Gene integration was confirmed by cross-PCR using the gene forward and vector reverse primers.
For expression, the plasmid was transferred to E. coli BL21 cells. Two cultures were induced with different IPTG concentrations (0.5 mM and 1 mM) to optimize protein production. Bacterial cells were lysed, and SDS-PAGE analysis was conducted. Purification involved cell lysate preparation and purification using a ProbondTM column. SDS-PAGE and Coomassie Brilliant Blue G-250 staining confirmed successful purification.
Findings: According to the results obtained in the study, it was observed that the best product in protein production was in the culture induced with IPTG with a final concentration of 1 mM. At the end of SDS-PAGE, the weight of the protein produced was found to be ⁓37 kDa according to the result of the gel stained with Coomassie brilliant blue G-250.
Results: This thesis study successfully cloned the protease enzyme gene from Aeriacillus pallidus PI8 strain using the pET-SUMO vector, performed purification, and achieved the targeted result of protein production.