Aptamer temelli afinite kromatografisiyle protein C saflaştırılmasının araştırılması
Investigation of protein C purification by aptamer based affinity chromatography
Yazar: NILUFAR ALIYEVA
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; Aptamerler = Aptamers ; Kriyojeller = Cryogels ; Protein C = Protein C ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
Protein C (PC), K vitaminine bağımlı bir plazma proteinidir. Aktive Protein C (APC) protein C'den türeyen bir glikoproteindir. Trombin bağlı trombomodulin (T-TM) kompleksi tarafından bir aktivasyon peptitinin kırılmasıyla oluşur. Aktive Protein C güçlü bir antikoagülanttır ve kan pıhtısının parçalanmasını kolaylaştırır. Aktive Protein C pıhtılaşma kaskadında kofaktörlerini (FVa ve FVIIIa) inhibe ederek antikoagülant özelliği gösterir. PC kanda 4 μg/mL derişime sahip eser bir proteindir. Kandaki PC seviyesi azaldığında ciddi problemler gözlenir. Protein C eksikliği hastaları DVT (derin damar trombozu) riskine ve hayati tehdit oluşturabilecek doku oksijeninde azalmaya neden olan pıhtılaşma komplikasyonları riski altındadır. Bu kan pıhtıları kan akışına karışırsa kalp krizi, inme ve pulmoner emboliyi tetikler. Protein C'nin etkin ve ekonomik bir yöntemle saflaştırılması son derece önemlidir. Kriyojeller, monomer veya polimer başlatıcıların kısmi olarak dondurulmuş çözeltilerde hazırlanmış jel matrisleridir. Birbirleri ile bağlantılı makro gözeneklerden oluşurlar ve ozmotik, kimyasal ve mekanik özellikleri sayesinde birçok biyolojik uygulamada kullanılırlar. Kriyojellerin uygulama alanları; doku iskelesi olarak, biyomoleküllerin, hücrelerin vb. immobilizasyonunda taşıyıcı olarak, proteinlerin, mikroorganizmaların, hücrelerin vb. kromatografik ayırma işlemlerinde kullanılır. 
Bu tez çalışmasında, afinite tekniğinden faydalanarak farklı oranlarda Aktive Protein C (APC) spesifik DNA aptamer temelli kriyojel membranlar sentezlenmiştir. Aptamer temelli kriyojeller protein C saflaştırma ve ayırma işlemleri için uygulanmıştır. Üç farklı oranda DNA aptamer takılı kriyojel membranlar hazırlanmıştır. Sentezlenen APC spesifik DNA aptamer kriyojeller Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi (FTIR), tarama elektron mikroskobu (SEM), şişme testi ve yüzey alanı analizi ile karakterize edilmiştir. Kriyojellerin makrogözenekli yapıları SEM analizi görüntüleri ile verilmiştir. Protein C adsorpsiyonuna pH'nın, Protein C derişiminin, sıcaklığın, iyonik şiddetin etkileri ve tekrar kullanılabilirlikleri incelenmiştir.  Maksimum PC adsorpsiyonu en yüksek oranda DNA aptamer takılı kriyojel membran ile 89.02 g/mg olarak bulunmuştur. Kriyojellere ardarda on defa adsorpsiyon-desorpsiyon çalışması uygulandığında adsorpsiyon kapasitesindeki kararlılık %96.11 olarak hesaplanmıştır. Ayrıca aptamer temelli kriyojel membranların farklı proteinlere karşı olan seçiciliği araştırılmıştır. Sonuç olarak PC'ye karşı yüksek seçicilik gösterdiği belirlenmiştir. Tez çalışmasının son kısmında yapay plazma ortamından Protein C saflaştırılması sodyum-dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak saflaştırıldığı analiz edilmiştir.

Abstract:
Protein C (PC) is a vitamin K-dependent plasma protein. Activated Protein C (APC) is a glycoprotein derived from protein C. It is formed by cleavage of an activation peptide by the thrombin-linked thrombomodulin (T-TM) complex. Activated Protein C (APC) is a powerful anticoagulant and facilitates the breakdown of blood clots. Activated Protein C (APC) shows anticoagulant properties by inhibiting cofactors (FVa and FVIIIa) in the coagulation cascade. PC is a trace protein with a concentration of 4 μg/mL in blood. Serious problems are observed when the PC level in the blood decreases. Patients with protein C deficiency are at risk of DVT (deep vein thrombosis) and clotting complications that cause a life-threatening decrease in tissue oxygen. If these blood clots get into the bloodstream, they trigger a heart attack, stroke, and pulmonary embolism. The purification of protein C by an effective and economical method is highly important. Cryogels, are gel matrices of monomer or polymer initiators prepared in partially frozen solutions. They consist of interconnected macropores and are used in many biological applications thanks to their osmotic, chemical and mechanical properties. Application areas of cryogenic; As a tissue scaffold, biomolecules, cells, etc. As a carrier in the immobilization of proteins, microorganisms, cells and so on. Used in chromatographic separation processes.
In this thesis, Activated Protein C (APC) specific DNA aptamer-based cryogels at different rates were synthesized using the affinity technique and applied for Protein C purification and separation processes. Cryogel membranes with DNA aptamer in three different ratios were prepared. The synthesized APC-specific DNA aptamer cryogels were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), scanning electron microscopy (SEM), swelling test, surface area, and contact angle analysis. The macroporous structures of the cryogels are given by SEM analysis images. The effects of pH, protein C concentration, temperature, ionic strength on Protein C adsorption and their reusability were investigated. Maximum PC adsorption was found to be 89.02 mg/g with the DNA aptamer attached cryogel membrane at the highest rate. When adsorption-desorption studies were applied to cryogels ten times in succession, the stability in adsorption capacity was calculated as 96.11%. In addition, the selectivity of aptamer-based cryogel membranes against different proteins was investigated. As a result, it was determined that it showed high selectivity against PC. In the last part of the thesis, Protein C purification from an artificial plasma medium was analyzed using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).