Gα proteini susturulmuş arpa bitkilerinde fizyolojik ve moleküler analizler
Physiological and molecular analyses of plants silenced for Gα protein in barley
Yazar: BURCU KARAHALİL
Danışman: PROF. DR. AYŞE FİLİZ GÜREL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
G proteinleri (Guanin Nükleotit Bağlanma Proteinleri) yüksek organizmalarda korunmuş ve hücrede sinyal iletiminde önemli rolü olan moleküllerdir. Heterotrimerik G-proteinleri, Gα, Gβ ve Gγ olmak üzere üç alt birimden oluşmaktadır. G proteinlerinin biyotik ve abiyotik stres koşullarına yanıtta, senesenste, fide, kök gelişiminde, stoma işlev ve yoğunluğunda etkili oldukları bilinmekle birlikte bu proteinlerin bitkilerdeki stres yanıtındaki kesin rolü halen araştırılmaktadır. Son yıllarda, arpada Gα alt biriminin agronomik açıdan önemli olan ve sap uzunluğunu belirleyen Brh1 lokusu ile ilişkisi ortaya konmuştur. Bu tez çalışmasında arpada Gα alt biriminin bitkilerde stres ve kök-sürgün gelişimine olan etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla öncelikle VAGS (Virüs Aracılı Gen Susturma) yöntemi kullanılarak Gα alt biriminin antioksidan mekanizma, hidrojen peroksit (H2O2) üretimi, stoma yoğunluğu ile olan ilişkisi araştırılmıştır. Gα sinyal iletimi engellenmiş arpa bitkilerinin fizyolojisi, kontrol bitkileri ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Ek olarak Gα sinyal iletimi engellenmemiş arpa bitkilerinde tuz stresi altında HvGα anlatımı ile bitki gelişiminde rol oynayan bazı genlerin anlatım profilleri ve ilişkileri araştırılmıştır. 
Fizyolojik analizlerde H2O2 miktarı, ozmolit birikimi ve stoma yoğunluğu incelenmiştir. Arpa bitkilerinin yaprak dokuları BSMV ('Barley Stripe Mosaic Virus') genomunu temsil eden in vitro transkribe edilen RNA'lar ile enfekte edildikten sonra H2O2 miktarı kontrole (0. gün) göre 10. ve 20. günde anlamlı bir artış göstermiştir. Yaprak dokularındaki stoma sayıları ise enfeksiyon sonrası 10. günde % 38, 20. günde ise % 48 oranında azalmıştır. Gα sinyal iletimi engellenmiş bitkilerde antioksidan ilişkili genlerin (HvCAT2, HvAPX, HvCu/ZnSOD) anlatımlarında önemli bir değişiklik olmamıştır.
Gα alt biriminin gelişimde rol oynayan bazı genlerle olan (HvLOX1, HvSAG12, HvS40, HvSBT6, HvWRKY12, HvLHCB) ilişkisini araştırmak amacıyla arpa bitkilerine 160 mM NaCl uygulanmıştır. Zamana bağlı olarak (0, 2, 24, 36, 48, 60 ve 72 saat) genlerin dokuya özgü anlatımları incelenmiştir. Kontrol bitkilerinde HvGα, kök dokularına göre yapraklarda daha fazla anlatım yapmaktadır. Stres uygulaması yapılan bitkilerde ise kök ve yaprak dokularında HvGα'nın anlatımı kontrole göre 24. saatte anlamlı bir artış göstermiştir. Ayrıca kök dokularında HvLOX1 anlatımı stres uygulamasının 2. saatinden itibaren artmış, senesens ilişkili (HvSAG12, HvS40, HvSBT6) genlerin anlatımları ise 24. saatte artış göstermiştir. Tuz stresi altında, HvGα gen anlatımının kökte HvLOX1, yaprak dokularında senesens ilişkili (HvSAG12, HvS40, HvSBT6) genlerin anlatımı ile pozitif ilişkisi olduğu belirlenmiştir. Diğer yandan, HvWRKY12 ve HvLHCB genleri ile HvGα'nın anlatımları arasında bir ilişki saptanmamıştır.
Çalışmada ayrıca, arpa bitkilerine dışarıdan uygulanan bazı moleküllerin (homoserin lakton ve absisik asit) Gα sinyal iletimini etkilediği belirlenmiştir. Farklı konsantrasyonlarda uygulanan QS ('Quorum sensing') sinyal molekülü olan homoserin lakton, 200 µM derişimde kök uzunluğunu arttırmıştır. Bu bitkilerde HvGα'nın anlatımının da kontrole göre yaklaşık 3 kat arttığı belirlenmiştir. Diğer bir çalışmada absisik asit (ABA) uygulamasının hem kök hem de sürgün gelişimini baskıladığı, HvGα mRNA seviyelerinin her iki dokuda da farklılaşmış bir anlatım profili sergilediği görülmüştür.
Bu tez çalışmasında VAGS yöntemi başarılı bir şekilde uygulanarak arpada Gα alt biriminin H2O2 üretimi ve stoma sayısına etkisi gösterilmiştir. Gα sinyal iletimi engellenmiş arpa bitkilerinde H2O2 miktarının artışı, bu bitkilerde strese benzer bir durumun meydana geldiğini göstermektedir. Ayrıca ilk kez arpa Gα alt biriminin senesens genleri ile ilişkisi gösterilmiştir. Tez bulguları literatürde Gα sinyal iletiminin senesens ile bağlantılı olduğuna dair bazı bilgileri güçlendirmektedir. Elde edilen fizyolojik ve moleküler bulgular heterotrimerik G-proteinlerinin işlevlerinin daha detaylı çalışılabilmesi için öncü niteliktedir.

Abstract:
G proteins (Guanine Nucleotide Binding Proteins) are molecules that are conserved in high organisms and play an important role in cell signaling. Heterotrimeric G-proteins consist of three subunits, Gα, Gβ and Gγ. While it is well known that G proteins are effective in response to biotic and abiotic stress conditions, senescence, seedling- root development, stoma function and density, the exact role of these proteins in stress response in plants is still under investigation. Recent studies have demostrated the association between the Gα subunit and the Brh1 locus that determines the culm-length and has significant agronomic aspect. In this thesis, the effect of the Gα subunit on the stress and development of root-shoot in plants has been investigated. For this purpose, primarily, the relationship between antioxidant mechanism, hydrogen peroxide (H2O2) production and stoma density of G protein α subunit were examined using VIGS ('Virus- Induced Gene Silencing') method. The physiological changes in barley plants with Gα signal inhibition have been compared with control.  Additionally, the expression profiles of HvGα and genes that play a role in plant development under salt stress and their relationship have been studied in barley plants with no inhibiton of signal transduction of Gα. 
Physiological analyzes included the investigation of the amount of H2O2, osmolyte accumulation and stoma density. After the leaf tissues of barley plants were infected with in vitro transcribed RNAs representing the BSMV ('Barley Stripe Mosaic Virus') genome, the amount of H2O2 showed a significant increase at 10th and 20th days compared to the control (day 0). The number of stoma in leaf tissues decreased by 38% on the 10th day after infection and by 48% on the 20th day after infection. There was no significant change in expression of antioxidant related genes (HvCAT2, HvAPX, HvCu/ZnSOD) in plants with inhibited Gα signaling.
In order to investigate the relationship between Gα and some of the genes involved in development (HvLOX1, HvSAG12, HvS40, HvSBT6, HvWRKY12, HvLHCB), 160 mM NaCl was applied to the barley plants. Tissue specific gene expression was examined based on the time course (0, 2, 24, 36, 48, 60 and 72 hours). In control plants, HvGα showed greater expression in the leaves compared to the root tissues. In stressed plants, HvGα expression in root and leaf tissues showed significant increase at 24 hours compared to the control. Moreover, expression of HvLOX1 in root tissues have increased at the second hour of stress application, and the expression of senescence-related genes (HvSAG12, HvS40, HvSBT6) increased at the 24th hour. Under salt stress, the expression of HvGα gene was shown to have a positive correlation with HvLOX1 gene expression in root, and with senescence-related  (HvSAG12, HvS40, HvSBT6) gene expression in leaves. On the other hand, no relationship was found between HvGα expression and two specific genes, HvWRKY12 and HvLHCB, respectively. 
It has also been revealed that Gα signaling was affected by some molecules (homoserine lactone and abscisic acid) that were externally applied to barley plants. Homoserine lactone, a QS ('Quorum sensing') signaling molecule applied at different concentrations, increased the root length at a concentration of 200 μM. The expression of HvGα in these plants increased approximately three times compared to the control.  In a different study, the abscisic acid (ABA) application suppressed both root and shoot development and the HvGα mRNA levels exhibited differential expression profiles in both tissues.
In this thesis, the VIGS method has been successfully applied and the effect of the Gα subunit on the number of stoma and H2O2 production has been shown. The increase in the amount of H2O2 in barley plants with inhibited Gα signaling suggests emergence of a stress like condition in these plants. This is the first study that shows the association between the barley Gα subunit and senescence genes. The main findings presented here support the previous studies showing the relationship between Gα signaling and senescence. The physiological and molecular findings presented here will guide future studies for more comprehensive investigation of the functions of heterotrimeric G-proteins.