Sinop ilinde satışa sunulan gıdalardan izole edilen bakterilerin antibiyotik direnç genlerinin belirlenmesi
Detection of antibiotic resistance genes of isolated bacteria from foods offered for sale in the sinop province
Yazar: SEYHAN CİVEK
Danışman: PROF. DR. İSMET BERBER
Sinop Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
İnsan ve hayvanlarda antimikrobiyallerin yaygın ve yanlış kullanımı dirençli bakteriyal populasyonların seçilimine neden olmaktadır. Bu çalışmada, Sinop ilinden toplanan çeşitli hayvansal gıdalardan izole edilen 38 adet yerel ve 1 referans  Escherichia coli, 12 adet yerel ve 1 referans Bacillus cereus, 14 adet Listeria spp. ve 16 adet Salmonella spp. suşlarının fenotipik ve genotipik özellikleri, antibiyotik duyarlılıkları, antibiyotik direnç genleri, SDS-PAGE toplam hücre protein ve plazmid DNA profilleri belirlendi. Ayrıca, E. coli'de eae ve stx1 virülans genlerinin varlığı araştırılmıştır.
Çalışmada izole edilen E. coli suşlarının tümünün novobiyosin, vankomisin ve penisiline (%100), tetrasikline (%58,97), seftazidime (%17,95), polimiksin B (%10,26), ampisilin/sulbaktama (%30,77), streptomisine (%35,90), piperasilin/tazobaktama (%7,69), sefotaksime (%11), kloramfenikole (%15,38) ve gentamisine (%30,77) dirençli oldukları belirlenmiştir. B. cereus suşlarının tetrasiklin ve sefepime (%100), penisiline (%92,31), rifampisine (%84,62), novobiyosine (%76,92) ve siprofloksasine (%7,69) dirençli oldukları saptanmıştır. Listeria suşlarının oksasilin ve klindamisine (%100), amikasin ve siprofloksasine (%57,14), eritromisin, rifampisin, gentamisin ve amoksisiline (%42,86), penisilin ve tetrasikline (%35,71), vankomisin ve kloramfenikole (%28,57), ampisilin/sulbaktama (%21,43) dirençli oldukları görülmüştür. Son olarak, Salmonella suşları klindamisin, tetrasiklin, rifampisin, vankomisin ve penisilin G antibiyotiklerine (%100), gentamisin, imipenem ve kloramfenikole (%6,25), ampisilin/sulbaktama (%21,43) ve amikasine (%25) dirençli oldukları bulunmuştur. Antibiyotik direncinden sorumlu olan genler (tetA, blaCMY-2, cat1) PCR yöntemiyle belirlenmiştir. Buna göre antibiyotik direnç genleri izole edilen suşlarda; tetA %45, blaCMY-2 %21,25 ve cat1 %6,25 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca izole edilen E. coli suşlarında virülans genleri; eae %13,16 olarak belirlenirken stx1 hiçbir suşta tespit edilememiştir.
SDS-PAGE toplam hücre protein profilleri esas alınarak yapılan nümerik analizi, E. coli, B. cereus, Listeria ve Salmonella suşlarının benzerlik düzeyinin sırasıyla %68, %83, %76, %78 ve üzerinde iki büyük gruba ayrıldığını ortaya koymuştur.
Plazmid DNA analiz sonuçları; E. coli'de 19.500-977,530 bp arasında, B. cereus'ta 10.875-1.761 bp arasında, Listeria spp.'de 20.476-934,424 bp arasında, Salmonella spp.'de 16.364-1.138 bp arasında değişen farklı plazmidlerin varlığını göstermiştir. 
Araştırmada izole edilen 38 E. coli, 12 B. cereus, 14 Listeria ve 16 Salmonella suşları Enterobacterial Repetitive İntergenic Consensus (ERIC-PCR) ve (GTG)5-PCR teknikleri kullanılarak elde edilen bantların UPGMA yöntemine göre nümerik analizleri yapılmıştır. ERIC1/ERIC2 primeri kullanılarak oluşturulan dendrogram, bant üreten toplam 27 E. coli, 13 B. cereus, 14 Listeria ve 16 Salmonella suşunda benzerlik düzeylerinin sırasıyla %52, %61, %55, %53 ve üzerinde 2 major gruba ayrıldığını göstermiştir. (GTG)5 primeri için ise 31 E. coli, 13 B. cereus, 14 Listeria ve 12 Salmonella suşunun sırasıyla %36, %70, %54, %59 ve üzerinde 2 major gruba ayrıldığı saptanmıştır.
Sonuç olarak, SDS-PAGE tekniğinin tür düzeyinde ayrımı sağlayabileceği, fakat tür altı düzeyindeki araştırmalar için ERIC ve (GTG)5-PCR tekniklerinin daha uygun olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, çoklu ilaç dirençliliğine ve virülans genlere sahip izolatların hızlı tespit edilmesinde moleküler tekniklerin yardımcı olabileceğini önerebiliriz. Sonuçta, mikrobiyal enfeksiyonların; yeterince dondurma, pişirme ve uygun depolama ile önlenebileceğini ve ayrıca bakterilerden dolayı gerçekleşecek kontaminasyonlar ile ekonomik kayıpların ve halk sağlığında risklerin ortaya çıkmasına neden olacak besin kalitesindeki düşüşlerin görülebileceğini söylememiz mümkündür.

Abstract:
Widespread and incorrect use of antimicrobials in humans and animals leads to the selection of resistant bacteria populations. In this study was determined genotypic and phenotypic characteristics of the strains, antibiotic susceptibility, antibiotic resistance genes, the SDS-PAGE total cell protein and plasmid DNA profiles of the 38 native and 1 reference Escherichia coli, the 12 native and 1 reference Bacillus cereus, the 14 Listeria spp. and the 16 Salmonella spp. isolated from various animal foods in Sinop province. In addition, the presence of eae and stx1 virulence genes in E. coli was investigated. 
In this study, the E. coli isolates were resistant to novobiocin, vancomycin and penicillin (100%), tetracycline (58.97%), ceftazidime (17.95%), polymyxin B (10.26%), ampicillin/sulbactam (30.77%), streptomycin (35.90%), piperacillin/tazobactam (7.69%), cefotaxime (11%), chloramphenicol (15.38%) and gentamicin (30.77%). The B. cereus isolates were resistant to tetracycline and cefepime (100%), penicillin (%92.31), rifampycine (84.62%), novobiocin (76.92%) and ciprofloxacin (7.69%). The Listeria strains were resistant to oxacillin and clindamycin (100%), amikacin and ciprofloxacin (57.14%), erythromycin, rifampycine, gentamicin and amoxicillin (42.86%), penicillin and tetracycline (35.71%), vancomycin and chloramphenicol (28.57%) and ampicillin/sulbactam (21.43%). Finally, Salmonella strains were resistant to clindamycin, tetracycline, rifampycine, vancomycin and penisillin G (100%), gentamicin, imipenem and chloramphenicol (6.25%), ampicillin/sulbactam (21.43%) and amikacin (25%). The genes that are responsible for antibiotic resistance (tetA, blaCMY-2, cat1) was determined by PCR method, and antibiotic resistance genes for all the strains were determined as tetA 45%, blaCMY-2 21.25% and cat1 6.25%. The virulence genes were also isolated in E. coli strains; the eae gene determined as 13.16%, the stx1 not identified any strains.
The numerical analysis of SDS-PAGE whole cell protein profiles revealed that E. coli, B. cereus, Listeria and Salmonella strains were separated to 2 major groups at similarity levels of 68%, 83%, 76% and 78% or above, respectively.
The results of plasmid DNA analysis were show the presence of different plasmids in E. coli between 19.500 to 977,530 bp, in B. cereus between 10.875 to 1.761 bp, in Listeria spp. between 20.476 to 934,424 bp. and in Salmonella spp. between 16.364 to 1.138 bp.
A numerical analysis of the DNA band profiles obtained by using the ERIC-PCR and (GTG)5-PCR technique of the 38 E. coli, 12 B. cereus, 14 Listeria and 16 Salmonella strains were carried out by using UPGMA method. A dendrogram generated by using ERIC1/ERIC2 primers revealed that 27 E. coli, 13 B. cereus, 14 Listeria and 16 Salmonella strains produced bands divided into 2 major clusters at similarity levels of 52%, 61%, 55% and 53% or above, respectively. In addition, for (GTG)5 primer; the 31 E. coli, 13 B. cereus, 14 Listeria and 12 Salmonella strains were separated to 2 major groups at similarity levels of 36%, 70%, 54% and 59% or above, respectively.
As a result, we can say that SDS-PAGE method may provide discrimination at species level; however surveys at subspecies level demand molecular approaches such as ERIC and (GTG)5-PCR. In addition, we can offer that molecular techniques may be especially helpful in the quick identification of multidrug-resistant and isolates with virulence genes. Finally, it is possible to say that microbial infections can be prevented by adequate freezing and cooking and proper storage and in addition, the contamination due to bacteria leads to quality decline of foods that pose a public health risk and economic loss.