Bazı nanopartiküllerin in vitro ortamda yetiştirilen Hypericum perforatum L. ve Hypericum retusum Aucher'in hiperisin bileşiklerinin miktarı üzerine etkileri
The effects of some nanoparticles on the amount of hyperisin compounds of Hypericum perforatum L. and Hypericum retusum Aucher grown under in vitro medium
Yazar: ÖMER FARUK AKDEMİR
Danışman: PROF. DR. AHMET ONAY
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Botanik = Botany
Dizin: Hiperisin = Hypericin ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Sarı kantaron = Hypericum perforatum

Özet:
Bu çalışmada, in vitro koşullarda yetiştirilen Hypericum perforatum L. ve Hypericum retusum Aucher sürgünlerinde, 4 farklı nanopartikül uygulamasının, hiperisin ve türevi bileşikleri üzerindeki etkisi ile HpPKS1 ve HpPKS2 genlerinin ekspresyonları üzerindeki etkisi incelenmiştir.  
Bu amaçla öncelikle, H. perforatum ve H. retusum'un tohumları bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen, Murashige ve Skoog (MS) besi ortamında çimlendirilmiştir. Çimlenme ortamından elde edilen sürgünler 0.5 mgL-1 BA içeren MS besi ortamında belirli periyotlarda alt kültüre alınıp çoğaltılmış ve nanopartikül denemelerinde kullanılmıştır. Tez önerisi kapsamında gerçekleştirilen ilk denemelerde, farklı konsantrasyonlarda (25, 75 ve 200 mgL-1) demir (III) oksit (Fe2O3), titanyum dioksit (TiO2), çinko oksit (ZnO) ve alüminyum oksit (Al2O3) nanopartikülleri in vitro ortamda yetişen sürgünlere uygulanmıştır. 200 mgL-1 ZnO veya 75 mgL-1 Al2O3, Fe2O3 ve TiO2 içeren besi ortamında büyütülen H. perforatum sürgünlerindeki hiperisin ve türevi bileşiklerin miktarında artış gözlenmiştir. H. retusum sürgünlerinde ise artan hiperisin ve türevleri, 200 mgL-1 ZnO veya 25 mgL-1 Al2O3, Fe2O3 ve TiO2 içeren besi ortamında gözlenmiştir. İlk denemelerin ardından, H. perforatum sürgünleri ise 200, 250 ve 300 mgL-1 ZnO, Fe2O3 ve Al2O3 ya da 15, 25 ve 75 mgL-1 TiO2 içeren besi ortamında kültüre alınmıştır. H. retusum sürgünleri, 10, 15 ve 25 mgL-1 oranında Al2O3, ZnO, Fe2O3 ve TiO2 nanopartikülleri içeren besi ortamında büyütülmüştür. H. perforatum'un yapraklarındaki hiperisin ve türevi bileşiklerin miktarı, kontrol grubuna göre 250 mgL-1 Al2O3 veya Fe2O3, 200 mgL-1 ZnO veya 75 mgL-1 TiO2 nanopartiküllerini içeren ortamda artış göstermiştir. H. perforatum gövdelerindeki hiperisin ve türevi bileşiklerin oranı ise, 300 mgL-1 Fe2O3 veya ZnO nanopartiküllerini içeren ortamda artış göstermiştir. H. retusum yapraklarında, Al2O3 ve ZnO nanopartiküllerinin ilgili bileşiklerin konsantrasyonu üzerinde olumlu bir etkisi olmazken, 15 mgL-1 Fe2O3 veya 10 mgL-1 TiO2 içeren besi ortamında ise hiperisin ve türevi bileşiklerin miktarında artış gözlenmiştir. H. retusum gövdelerinde ise hiperisin ve türevi bileşiklerin miktarı ise 25 mgL-1 Al2O3 veya Fe2O3 ya da 10 mgL-1 ZnO ve TiO2 varlığında artış göstermiştir. 
H. perforatum'un qPCR analizi ile yaprak dokusunda Al2O3 ve TiO2 nanopartikül uygulamalarının, HpPKS1 gen anlatımı üzerinde saptanabilir bir etkisi olmadığını, Fe2O3 nanopartikül uygulamasında ise, nanopartikül konsantrasyonunun artımı ile paralel artış gösterdiği belirlenmiştir. Gövde dokusunda ise, farklı nanopartikül uygulamaları HpPKS2 gen anlatımı üzerine etki göstermiş ancak kontrol grubuna göre farklı uygulama gruplarında gen anlatımının daha düşük olduğu belirlenmiştir. Alüminyum nanopartiküllerinin HpPKS2 geninin yaprak dokusunda anlatımını nanopartikül konsantrasyonuna ters orantılı bir şekilde etkilediği gözlenmiştir. Gövde dokusunda ise HpPKS2 gen anlatım miktarı saptanabilir sınırlar içinde bulunmadığı belirlenmiştir. H. retusum Aucher'de ise farklı nanopartikül uygulamaları sonucu HpPKS2 gen ekspresyon analizi, Fe2O3 200 mgL-1 deney grubu hariç tüm örneklerde saptanabilmiştir. Bu deney grupları arasında 300 mgL-1 ZnO uygulaması HpPKS2 gen anlatımını, gövdede arttırmıştır. HpPKS1 için ise yaprak kontrol örneğinde gen anlatımı ölçülebilir sınırlarda değildir.
H. perforatum ve H. retusum türlerine uygulanan Al2O3, Fe2O3, ZnO ve TiO2 nanopartikülleri hiperisin ve türevi bileşiklerin miktarını artırma konusunda başarılı olmuştur. Denenen nanoartiküller içerisinde en küçük boyuta sahip olan TiO2 nanopartikülünü diğer üç nanopartiküle göre daha başarılı sonuçlar vermiştir. Elde edilen sonuçları denenen nanopartikülün türü, boyutu, ve konsantrasyonu etkilemiştir.

Abstract:
In this study, the effect of 4 different nanoparticle applications on hypericin and its derivatives, and on the expression of HpPKS1 and HpPKS2 genes were investigated in the shoots of Hypericum retusum Aucher and H. perforatum L. grown under in vitro conditions.
For this purpose, the seeds of H. retusum and H. perforatum were germinated in Murashige and Skoog (MS) nutrient medium lacking plant growth regulator. The shoots obtained from germination medium were taken into subculture and replicated periodically in MS nutrient medium containing 0.5 mg-1 BA, and were used in nanoparticle experiments. In the first experiments conducted within the scope of the thesis proposal, iron (III) oxide (Fe2O3), titanium dioxide (TiO2), zinc oxide (ZnO) and aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles in different concentrations (25, 75 and 200 mgL-1) were applied to shoots grown under in vitro medium. An increase was observed in the amount of hypericin and derivative compounds in H. perforatum shoots grown in nutrient medium containing 200 mgL-1 ZnO or 75 mgL-1 Al2O3, Fe2O3 and TiO2. Also, in H. retusum shoots; increased hypericin and its derivatives were observed in nutrient medium containing 200 mgL-1 ZnO or 25 mgL-1 Al2O3, Fe2O3 and TiO2. After the first experiments, the H. retusum shoots were grown in nutrient medium containing Al2O3, ZnO, Fe2O3 and TiO2 nanoparticles at 10, 15 and 25 mgL-1 ratio. H. perforatum shoots were cultured in nutrient medium containing 200, 250 and 300 mgL-1 ZnO, Fe2O3 and Al2O3 or 15, 25 and 75 mgL-1 TiO2. The amount of hypericin and derivative compounds in the leaves of H. perforatum increased in medium containing 250 mgL-1 Al2O3 or Fe2O3, 200 mgL-1 ZnO or 75 mgL-1 TiO2 nanoparticles, compared to the control group. The rate of hypericin and derivative compounds in H. perforatum bodies also increased in medium containing 300 mgL-1 Fe2O3 and ZnO nanoparticles. In H. retusum leaves, while Al2O3 and ZnO nanoparticles did not have a positive effect on the concentration of related compounds, the amount of hypericin and derivative compounds increased in the nutrient medium containing 15 mgL-1 Fe2O3 or 10 mgL-1 TiO2. In addition, in H. retusum shoots, the amount of hypericin and derivative compounds increased in the presence of 25 mgL-1 Al2O3 or Fe2O3 or 10 mgL-1 ZnO and TiO2.
	It has been determined that the application of Al2O3 and TiO2 nanoparticles in leaf tissue by qPCR analysis of H. perforatum had no detectable effect on HpPKS1 gene expression; on the other hand, it indicated parallel increase with increase in nanoparticle concentration for Fe2O3 nanoparticle application. In shoot tissue, different nanoparticle applications had an effect on HpPKS2 gene expression but it was determined that gene expression was lower in different experiment groups compared to control group. It has been observed that aluminum nanoparticles affect expression of HpPKS2 gene in leaf tissue in inversely proportional to nanoparticle concentration. It was determined that the amount of HpPKS2 gene expression in the body tissue was not within detectable limits. In H. retusum Aucher, HpPKS2 gene expression analysis was detected in all samples except Fe2O3 200 mgL-1 experimental group due to different nanoparticle applications. Among these experimental groups, application of 300 mgL-1 ZnO increased HpPKS2 gene expression in the stem. For HpPKS1 gene expression in the leaf control sample is not within measurable limits.
	Al2O3, Fe2O3, ZnO and TiO2 nanoparticles applied to H. perforatum and H. retusum species have been successful in increasing the amount of hypericin and derivative compounds. The TiO2 nanoparticle having the smallest size among the tested nanoarticles has given more successful results than the other three nanoparticles. The obtained results have affected the type, size, and concentration of the nanoparticle tested.