Pristimerinin servikal kanser hücre hatlarında hücre ölüm yolakları üzerine etkilerinin biyoinformatik araçlar ile değerlendirilmesi
Evaluation of the effects of pristimerin on cell death pathways in cervical cancer cell lines using bioinformatics tools
Yazar: AYŞE MÜGE ALDIRAN
Danışman: PROF. DR. FATMA GÜL ÖZCAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Kanser, günümüzde en sık rastlanılan hastalıklardan biri olup çevresel ve kalıtımsal faktörlerle tetiklenebilmektedir. Mutajenler, kimyasallar, virüsler, radyasyon, genetik faktörler sebebiyle meydana gelebilen kanser; radyoterapi, kemoterapi ve cerrahi müdahale ile tedavi edilebilmektedir. 
Günümüzde, terapötik etkisi olan doğal bileşiklerin kanser tedavisinde kullanımı ön plana çıkmaktadır. Doğal bileşiklerin, kanser tedavisi sırasında meydana gelen yan etkileri minimuma indirmesi ve kanser hücrelerinin tedaviye duyarlılığını artırması terapötik açıdan umut verici olmaktadır. 
Celastraceae ve Hippocrateaceae ailelerinin farklı çeşitlerinden üretilen bir kinonmetit triterpenoid olan pristimerinin, çeşitli kanser hücre hatlarında antiproliferatif, sitotoksik ve apoptotik etkileri olduğu bilinmektedir. Bu bağlamda, çalışmamızda pristimerinin insan servikal kanseri kökenli HeLa ve C-4 I hücre hatlarında oluşturduğu sitotoksisite ve indüklediği ölüm yolaklarının moleküler mekanizmasında rol oynayan molekül ya da molekül gruplarının biyoinformatik araçlar ile araştırılması amaçlanmıştır. 
Çalışmamızda pristimerinin 6 farklı dozu (9 µM, 12 µM, 15 µM, 20 µM, 25 µM, 30 µM) insan servikal kanseri kökenli HeLa ve C-4 I hücre hatlarına 24 saat süre ile uygulanmıştır. Pristimerinin hücre hatlarında meydana getirdiği sitotoksik etkinin ve IC70 dozunun belirlenebilmesi için Mitokondriyal Dehidrogenaz Enzim Aktivitesi (MTT) ve Laktat Dehidrogenaz Enzim Aktivitesi (LDH) analizleri kullanılmıştır. Pristimerinin IC70 dozunun HeLa ve C- 4 I hücre hatlarında indüklediği hücre ölüm yolakları ve bu yolaklarda rol oynayan moleküller mRNA sekanslama biyoinformatik analizler ile değerlendirilmiştir.
Sonuç olarak çalışmamızda pristimerinin farklı dozlarının HeLa ve C-4 I hücre hatlarında istatistiksel olarak anlamlı (p<0.05) sitotoksik bir etkiye sahip olduğu belirlenmiştir. Biyoinformatik analizler neticesinde pristimerinin IC70 dozunun HeLa ve C-4 I hücre hatlarında MAPK, FoxO, TNF, PI3K-AKT, p53 yolakları; ilaveten HeLa hücre hattında mTOR yolağı ile apoptoz ve nekroptozu indüklediği tespit edilmiştir. Pristimerinin IC70 dozunun HeLa hücre hattında TNF, kaspaz 8 ve kaspaz 10 aktivitesi ile ekstrinsik apoptozu; C-4 I hücre hattında kaspaz 12, JNK, CHOP, IRE1 aktivitesi ile endoplazmik retikulum aracılı apoptozu regüle ettiği ortaya konmuştur. Ayrıca, pristimerinin IC70 dozunun HeLa hücre hattında FADD, TNFα, RIPK1, RIPK3, MLKL; C-4 I hücre hattında TNFα, MLKL, CYLD genleri aracılığı ile nekroptozu indüklediği gösterilmiştir. Buna ek olarak, HeLa ve C-4 I hücre hatlarında DNA hasarı ve hücre siklusunun blokajının meydana geldiği belirlenmiştir. Duyarlılık seviyeleri farklı olan insan servikal kanseri kökenli hücre hatları ile gerçekleştirdiğimiz bu çalışmada, pristimerinin çeşitli yolaklar ile farklı hücre ölüm yollarını teşvik etmiş olması tedavi açısından önemli farklılıkların göz önünde bulundurulması gerekliliğini göstermektedir. Çalışmamızda vardığımız sonuçlar ileride yapılması gerekli olan in vivo ve preklinik araştırmaların sonuçları ile beraber pristimerinin servikal kanseri tedavisi için literatürde ilk olacak umut vaat eden doğal bir bileşik olduğunu ortaya koymuştur.

Abstract:
Cancer, one of the most common diseases today, can be triggered by environmental and hereditary factors. Mutagens, chemicals, viruses, radiation, and genetic factors can lead to cancer, which can be treated with radiotherapy, chemotherapy, and surgical operation. 
In recent times, the use of therapeutic natural compounds in cancer treatment has come to the forefront. Natural compounds are promising therapeutically due to their ability to minimize side effects during cancer treatment and increase the sensitivity of cancer cells to therapy. 
Pristimerin, a quinonemethide triterpenoid derived from various species of the Celastraceae and Hippocrateaceae families, is known to have antiproliferative, cytotoxic, and apoptotic effects on various cancer cell lines. In this context, our study aims to investigate the cytotoxicity induced by pristimerin and the molecular mechanisms of the death pathways involved in human cervical cancer-derived HeLa and C-4 I cell lines using bioinformatics tools. 
In our study, six different doses of pristimerin (9 µM, 12 µM, 15 µM, 20 µM, 25 µM, 30 µM) were applied to human cervical cancer-derived HeLa and C-4 I cell lines for 24 hours. To determine the cytotoxic effect of pristimerin on the cell lines and its IC70 dose, Mitochondrial Dehydrogenase Enzyme Activity (MTT) and Lactate Dehydrogenase Enzyme Activity (LDH) assays were used. The cell death pathways and the molecules involved in these pathways induced by the IC70 dose of pristimerin in HeLa and C-4 I cell lines were evaluated using mRNA sequencing bioinformatics analyses.
As a result, our study determined that different doses of pristimerin have a statistically significant (p<0.05) cytotoxic effect on HeLa and C-4 I cell lines. Bioinformatics analyses revealed that the IC70 dose of pristimerin induces the MAPK, FoxO, TNF, PI3K-AKT, and p53 pathways in HeLa and C-4 I cell lines; additionally, in HeLa cell lines, it induces the mTOR pathway along with apoptosis and necroptosis. It was found that the IC70 dose of pristimerin regulates extrinsic apoptosis in HeLa cell lines through TNF, caspase 8, and caspase 10 activity, and endoplasmic reticulum-mediated apoptosis in C-4 I cell lines through caspase 12, JNK, CHOP, and IRE1 activity. Furthermore, it was shown that the IC70 dose of pristimerin induces necroptosis via FADD, TNFα, RIPK1, RIPK3, MLKL in HeLa cell lines, and via TNFα, MLKL, CYLD genes in C-4 I cell lines. Additionally, DNA damage and cell cycle blockade were observed in both HeLa and C-4 I cell lines. This study, conducted with human cervical cancer-derived cell lines with different sensitivity levels, demonstrates the necessity of considering the significant therapeutic differences that pristimerin promotes various cell death pathways through different pathways. The results of our study, together with the outcomes of future necessary in vivo and preclinical studies, reveal that pristimerin is a promising natural compound for cervical cancer treatment, marking a first in the literature.