Kanser tedavisi için rekombinant protein temelli aday ilaçların geliştirilmesi
Development of recombinant protein based drug candidates for cancer therapy
Yazar: AYBİKE ERDOĞAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antikorlar = Antibodies ; Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Genler = Genes ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Onkogenler = Oncogenes ; İmmünoglobülinler = Immunoglobulins

Özet:
Biyoterapötik ilaçların kanser tedavisinde en çok ilgi gören alanı hedefe özgünlükleri nedeniyle monoklonal antikorlardır (mAb). Projemizin amacı, meme kanseri tedavisinde kullanılabilecek mAb-temelli ilaç adayları geliştirmektir. Meme kanseri, dünya çapında yaygın görülmesi ve gelişmekte olan ülkelerde kadınların ölüm nedenlerinde ikinci sırada yer alması sebebiyle önemlidir. 
Meme kanserinde %20-25 HER2 geninin aşırı ifadesi görülmektedir. Bu gen, HER2 (ErbB2) tirozin kinaz reseptörünü kodlar. HER/ErbB ailesine ait diğer reseptörler gibi homodimerizasyon veya heterodimerizasyon ile aktive olur. Aktif hale gelen protein kinazlar ilgili sinyal iletiminin aşağı basamaklarında yer alan aracı molekülleri uyararak zincir reaksiyonları başlatırlar. Böylece, proliferasyon, sağ kalım, hücre farklılaşması, anjiyogenez ve apoptoz engellenmesi gibi sonuçlar doğuran farklı sinyal yolakları etkinleşir. Çoğalması kontrol edilemeyen hücreler zamanla tümör hücreleri haline gelir. 
HER2 hedefli meme kanseri tedavisine alternatif olması amacıyla var olan monoklonal antikorlardan farklı bir HER2 hücre dışı bölgesi tanıyan beş özgün antikor üreten fare hibridoma klonları grubumuz tarafından önceden geliştirilmiştir. Bu araştırmada üretilen monoklonal antikorların hedefi özgün olarak tanımada rol oynayan amino asit dizilimleri (CDR)  belirlenerek,  antikorun insanlaştırılması için ilk adımların atılması hedeflenmiştir. 
Hibridoma klonlarından dördünün HER2'yi özgün olarak tanıdıkları immünofloresans deneyi ile gösterilmiştir. Bu hücrelerden RNA izole edildikten sonra immünoglobulin ağır ve hafif zincirlerinin değişken bölgeleri RT-PCR ve PCR yöntemi ile çoğaltılmıştır. Sanger sekanslaması yöntemiyle elde edilen DNA dizilimlerinin dönüştürülmesi sonucunda ağır ve hafif zincir değişken bölge amino asit dizilimleri dört farklı antikor için elde edilmiştir. Bir klonda sadece füzyon partneri olan myeloma hücresinden gelen endojen hafif zincir yapısına rastlanmıştır. Hedefi özgün olarak tanıdığı bilinen bir antikor için ise hafif zincir dizlimi açığa çıkarılamamıştır. Hedefi HER2 hala özgün olarak tanıdığı gösterilen iki monoklonal antikorun antijeni tanınmasında rol oynayan CDR alanları bulunmuştur. Geliştirilen fare antikorları ile aynı izotipe sahip IgG1/kappa insan immünoglobulini ifade eden vektörün modifiye edilecek yerleri belirlenmiştir. Modifikasyon sonrası vektör, fare tarafından üretilen antikorlar ile aynı CDR dizilimlerine sahip olacaktır. Böylece memeli hücrelerinde ifade edilebilecek HER2'yi hedef alan insanlaştırılmış antikor için moleküler temeller atılmıştır.

Abstract:
Monoclonal antibodies (mAbs) are the most demanded field of biotherapeutic drugs in cancer therapies because of their specificity to target. Aim of our project is to develop mAb-based drug candidates for the treatment of breast cancer. Breast cancer is significant since it is commonly observed worldwide and it takes second place in the causes of women death in developing countries.
About 20-25% of breast cancer, HER2 gene overexpression was observed. This gene encodes HER2 (ErbB2) tyrosine kinase receptor. It is activated by homodimerization or heterodimerization like other receptors in the HER/ErbB family. Activated tyrosine kinases initialize signaling cascade by inducing downstream intermediary elements involved in signal transduction. Hence, multiple signaling pathways leading proliferation, survival, cell differentiation, angiogenesis and prevention of apoptosis were triggered. Uncontrolled growth of cells eventually results in tumor formation.
In order to be an alternative to HER2-targeted breast cancer treatment, mouse hybridoma clones producing five specific antibodies recognizing a different HER2 extracellular domain from existing mAbs have been previously developed by our group. The aim of this study was to identify the amino acid sequences (CDR) that specifically recognize the target of monoclonal antibodies and to take the first steps towards humanization of monoclonal antibody.
Four of hybridoma clones, specifically identify HER2, were shown by immunofluorescence. After isolation of RNA from these cells, immunoglobulin heavy and light chain variable regions were amplified through RT-PCR and PCR.  Amino acid sequences of heavy and light chain variable regions were acquired for four different antibodies in the result of translation of DNA sequence obtained by Sanger sequencing. Only endogen light chain molecule belongs to fusion partner, myeloma cells was encountered for one clone. A clear light chain sequence result could not be exposed for one antibody which was known to specifically recognize the target. Complementarity determining regions (CDRs) which play a role in the antigen recognition were found for two monoclonal antibodies specific to HER2. The modified regions of IgG1 / kappa human immunoglobulin expression vector having the same isotype as the murine antibodies developed were identified. After modification, the vector will have the same CDR sequences with the antibodies produced by the mouse. Thus, the molecular basis for the humanized HER2 targeted antibody that can be expressed in mammalian cells has been established.