Endemik bitki rizosferlerinden izole edilen lokal aktinomisetlerde mikrobiyal sekonder metabolitlerin sentezinden sorumlu genlerin taranması
The screening of genes responsible for biosynthesis of the secondary metabolites from actinomycetes isolated from rhizospheric soils of endemic plants
Yazar: İSMAİL ACER
Danışman: DOÇ. DR. EBRU İNCE YILMAZ
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Biyoaktif sekonder metabolitler; antibiyotikler, antitümör ajanlar, toksinler ve sideroforları içeren ve işlevsel olarak birbirinden oldukça farklı biyokimyasal sınıflara dahil olan bileşiklerdir. Mikrobiyal sekonder metabolitler, potansiyel olarak sahip oldukları özel yapıları ve biyolojik aktiviteleri ile doğal bileşiklerin zengin kaynaklarından birini teşkil ederler. Aktinomisetler yeni biyoaktif metabolitlerin keşfi için en önemli kaynaklardan birini teşkil etmektedirler. Bu bileşiklerin çoğu Poliketid Sentazlar (PKS) ve Ribozomal Olmayan Peptid Sentetazlar (NRPS) tarafından sentezlenen biyoaktif moleküllerdir. Son yıllarda, bu metabolitlerin sentezinde metabolik potansiyeli yüksek olan mikroorganizmaların biyosentetik genlerinin karakterizasyonuna yönelik çalışmalar yapılmaktadır. Bu yaklaşım her türlü kaynaktan izole edilen aktinomisetlerin biyoaktif metabolit üretme kapasitesini belirlemek ve yeni biyosentetik genleri keşfetmek için başarıyla uygulanmaktadır.Çalışmamızda, daha önce 3 farklı endemik bitkinin kök çevresi topraklarından izole edilmiş, moleküler teşhisleri yapılmış ve antimikrobiyal aktiviteleri belirlenmiş olan 15 farklı Streptomyces türünün NRPS ve tip I PKS genlerinin PCR yöntemi ile taranması amaçlandı. İzolatların genomlarında yapılan taramada; 15 izolatın tamamında NRPS, 14 tanesinde de tip I PKS geni tespit edildi. Streptomyces sp. AAH61, Streptomyces sp. AR24, Streptomyces sp. CA14 ve Streptomyces sp. BAH46 izolatları için NRPS genlerinin adenilasyon (A) domainleri klonlanarak bu izolatlar için mini gen kütüphaneleri kuruldu. Streptomyces sp. CA3 ve Streptomyces sp. AS31 izolatlarının ise tip I PKS genlerinin Ketosentaz (KS) domainleri klonlanarak mini gen kütüphaneleri kuruldu. Streptomyces sp. AAH61 ve Streptomyces sp. AR24'ün NRPS Streptomyces sp. AS31 ve Streptomyces sp. CA3 izolatlarının ve tip I PKS mini gen kütüphanelerinden seçilen klonların DNA dizi analizleri yapıldı. Elde edilen sekanslar NCBI (Amerikan Ulusal Biyoteknoloji Enformasyon Merkezi) web sitesindeki BLAST programı kullanılarak analizleri yapıldı. Yapılan analizler sonucunda; Streptomyces sp. AAH61 ve Streptomyces sp. AR24'ün her birinin birbirinden farklı üç NRPS genine ait A domaini taşıdığı tespit edildi. Bunun yanı sıra Streptomyces sp. AS31'in iki farklı, Streptomyces sp. CA3'ün ise yalnızca bir adet tip I PKS geni içerdiği bulundu. Elde edilen bu genlerden büyük bir kısmının şimdiye kadar bulunmuş olan NRPS ve tip I PKS genleriyle düşük homolojilere sahip olması bu genlerin yeni genler olabileceği izlenimi uyandırmaktadır. Yapılacak hibridizasyon deneyleri ile bunu kesinliğe kavuşturmak mümkün olacaktır.

Abstract:
Bioactive secondary metabolites are a functionally diverse class of biochemically synthesized compounds, which include antibiotics, antitumor agents, toxins, and siderophores. Microbial secondary metabolites represent a large source of compounds endowed with ingenious structure and potent biological activites. The actinomycetes traditionally represent one of the most impotant sources for the discovery of new metabolites with biological activity; and many of this are describe being produced by polyketide syntahases (PKS) and nonribosomal peptide synthetases (NRPS). The last decade, these biosyntetic genes (NRPSs, PKSs) are studied present a strain characterization system based on the metabolic potential of microbial strains by targeting. This method was applied to study the distribution of PKS and NRPS biosynthethetic systems in a collection of wild-type actinomycetes isolated from different habitats samples that were evaluated for the production of antimicrobial activites.In the present study, it was used 15 Streptomyces strain that were previously isolated from rhizospheric soil of endemic plants. The molecular characterization and antimicrobial activites of these strains were also previously determined. Nonribosomal Peptide Synthetase (NRPS) and type I Polyketide Synthase (PKS) genes were screened by polymerase chain reaction (PCR) in these strain. NRPS genes were amplified from all of 15 Streptomyces strains and type I PKS genes were detected in 14 out of 15 Streptomyces strain. PCR products of NRPS genes were cloned and constituted mini libraries from Stretomyces spp. AAH61, AR24, CA14 and BAH46. PCR products of type I PKS genes were cloned and constituted mini libraries from Streptomyces spp. CA3 and AS31. Sequence analyses of chosen clones were compared to the published sequences by performing BLAST search in the GenBank databases.According to BLAST analysis, three A domains belong to different NRPS genes were detected in both Streptomyces sp. AAH61 and Streptomyces sp. AR24. Furthermore, two different KS domains of type I PKS genes were detected in Streptomyces sp. AS31 and only one type I PKS gene was found in Streptomyces sp. CA3. It was observed that the sequences obtained from mini libraries have low homology when compared to the genes reported so far. Therefore, these genes may be candidate novel genes that are responsible for new bioactive compounds. This hypothesize will be approved by hybridization studies in the genome of isolates.