Yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopisi kullanılarak yüksek hassasiyette DNA analizine yönelik dönen çember amplifikasyonu yönteminin geliştirilmesi
Development of rolling circle amplification method for high sensitivity DNA analysis using surface enhanced Raman spectroscopy
Yazar: BURCU GÜVEN
Danışman: PROF. DR. İSMAİL HAKKI BOYACI
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Raman spektroskopisi = Raman spectroscopy

Özet:
Bu çalışma kapsamında; hızlı, hassas ve seçici genetiği değiştirilmiş organizma (GDO) analizini sağlamak amacıyla polimeraz zincir reaksiyonuna (PZR) alternatif bir yöntem olan dönen çember amplifikasyonu (DÇA) ile yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopisi (YGRS) temelli yeni bir sandviç yöntemi geliştirilmiş ve elde edilen sonuçlar geleneksel (DÇA uygulanmayan) YGRS sandviç yöntemiyle kıyaslanmıştır. Bu bağlamda, altın (Au) yüzey, Au kaplı manyetik nanoküre ve Au nanoçubuk partiküllerden yararlanılmıştır. Öncelikle Au kaplı manyetik nanoküre ve Au nanoçubuk partiküller sentezlenmiş, gerekli karakterizasyon ölçümleri yapılmıştır. Nanopartiküllerin üretim ve karakterizasyon aşamalarının ardından yüzey modifikasyonu, immobilizasyon, hibridizasyon, seçici olmayan bağlanmaların engellenmesi, yıkama aşamaları, güçlendirme faktörlerinin belirlenmesi gibi her bir parametre optimize edilmiştir.  
Diğer taraftan DÇA reaksiyonuna yönelik çalışmalar yapılmıştır. İlk olarak lineer DÇA şablonunun T4 DNA ligaz ve Circligaz II ss-DNA ligaz enzimleri ile sirküler forma dönüştürülmesi üzerine çalışılmıştır. Fakat yetersiz enzim aktivitesi nedeniyle hedeflenen DÇA şablonu bandı jel elektroforezinde gösterilememiştir. Bu nedenle sirküler DÇA şablonu ticari olarak satın alınmıştır. Sirküler DÇA şablonunun eldesinin ardından DÇA reaksiyonunu tamamlamak için primer prob dizilimi, φ29 DNA polimeraz enzimi, DÇA şablonu ve dNTP konsantrasyonu ve etkileşim süreleri optimize edilmiştir.   
Nanopartikül yüzey modifikasyonları ve DÇA optimizasyon çalışmalarının ardından hedef dizilime (35S promotör) özgü olan oligonükleotit probu Au yüzey üzerine immobilize edilmiş ve DÇA reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Au nanoçubuklar üzerinde 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) kullanılarak yüzeyde tekli tabaka oluşturulmuş ve 35S DNA promotörünün ikinci probu aktive edilmiş Au yüzey üzerine immobilize edilmiştir. Bu sayede, nanopartikül ve yüzey üzerindeki problar hedef dizilim ile hibridize edilmiştir. Hedef dizilim konsantrasyonlarının miktar tayini Au nanoçubuklar üzerindeki DTNB'nin YGRS spektrumları ile yapılmıştır. Hedef dizilimin YGRS spekturumu DÇA reaksiyonu ile güçlendirilmiş ve tayin limiti 6,3 fM olarak bulunmuştur. Geliştirilen DÇA-YGRS metodunun hassasiyeti geleneksel yöntem ile kıyaslanmış ve geleneksel yöntemin tayin limiti 0,1 pM olarak bulunmuştur. Hedef dizilim konsantrasyonu ile YGRS sinyalinin doğrusal olduğu aralık geleneksel yöntemde; 1 pM-10 nM ve DÇA-YGRS yönteminde 100 fM-100 nM olarak bulunmuştur. Ayrıca Bt-176 mısır geninin 35S bölgesi PZR ile çoğaltılarak, geliştirilen DÇA-YGRS yönteminin gerçek sistemlerdeki etkinliği incelenmiştir. Geliştirilen DÇA-YGRS sandviç yönteminin model ve gerçek sistemlerde oldukça hassas, seçici ve hedef dizilim için özgün olduğu gösterilmiştir.

Abstract:
Within the scope of this study, a novel sandwich method based on rolling circle amplification (RCA) and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) have been developed as an alternative to polymerase chain reaction (PCR) for a rapid, sensitive and selective analysis of genetically modified organism (GDO). The obtained results were compared with traditional (without RCA) SERS sandwich method. In this regard, gold (Au) surface, Au coated magnetic nanosphere and Au nanorod particles were used. First of all, Au coated magnetic nanosphere and Au coated nanorod particles were synthesized, and essential characterization measurements were performed. After nanoparticle fabrication and characterization steps, significant parameters namely surface modification, immobilization, hybridization, prevention of nonspecific binding, washing steps and determination of enhancement factor were optimized. 
RCA studies were also performed in the present study. Initially, the experiments were centered on conversion of linear RCA template to a circular shape by using T4 DNA ligase and Circligaz II ss-DNA ligase enzymes. However, the expected RCA template band couldn't be obtained with gel electrophoresis due to the insufficient enzyme activity. For this reason, circular RCA template was purchased commercially; and primer probe sequence, φ29 DNA polymerase enzyme, RCA template and dNTP concentration and interaction time were optimized in order to complete the RCA reaction.
Following the optimization of nanoparticle surface modification and RCA parameters, an oligonucleotide probe which is specific to target sequence (35S DNA promoter) was immobilized onto the Au slide, and RCA reaction was performed successfully. A self-assembled monolayer was formed on Au nanorods by using 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), and the second probe of the 35S DNA promoter was immobilized on the activated Au slide surfaces. Through this process, the probes both on the nanoparticles and slide were hybridized with the target sequence. Quantification of the target sequence concentrations was performed via SERS spectra of DTNB on the Au nanorods. SERS spectra of target molecules were enhanced with the RCA reaction, and the detection limit was found to be 6.3 fM. The sensitivity of the developed RCA-SERS method was compared with the traditional method, and the detection limit was found to be 0.1 pM. The correlation between the target concentration and the SERS signal was found to be linear, within the range of 1 pM-10 nM for the traditional method and 100 fM-100 nM for the RCA-YGRS method. Efficiency of the developed RCA-SERS method was analyzed in real system by amplifying the 35S promoter of Bt-176 maize gene with PCR. The results has shown that the developed RCA-SERS sandwich assay method is quite sensitive, selective and specific for target sequences in model and real systems.