Halofilik arkeal kaynaklı lipaz üretim koşullarının optimizasyonu ve aktif lipazın saflaştırılması
Optimisation of halophilic archaeal lipase production media and purification of the active lipase
Yazar: MELİS ÖZGEN
Danışman: PROF. DR. SEVİL YÜCEL ; DR. AZADE ATTAR
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Lipazlar, enzim sınıflandırmasında hidrolazlar grubunda yer alan, triaçilgliserollerin serbest yağ asitlerine ve gliserole hidrolizini katalizleyen enzimlerdir. Endüstriyel lipazlar, genellikle hücre dışı lipaz üreten mikroorganizma türlerinden sağlanır. Mikrobiyal lipazlar çoğunlukla sıvı kültür ortamlarında üretilirler ve aktiviteleri karbon/azot kaynaklarının tür ve derişiminden, ortam pH'ından ve sıcaklıktan etkilenir. 
Ekstremofilik organizmalar, moleküler adaptasyonları sayesinde ekstrem koşullar altında stabil ve aktif enzimler (ekstremozimler) sentezleme yeteneğine sahip olduklarından, önemli biyoteknolojik potansiyelleri bulunmaktadır ve bilimsel açıdan büyük ilgi çekmektedirler. Bu çalışmada, lipaz kaynağı olarak Türkiye Tuzköy Madeni'nden izole edilen, ekstrem halofilik arkea olan Haloarcula hispanica 2TK2 suşu kullanılmıştır. Halofilik arkealar, çok yüksek tuz konsantrasyonlarına ve ekstrem koşullara kolayca adapte olabilme özelliğine sahiptirler. 
Bu çalışmada lipaz üretiminde önem taşıyan ortam parametrelerinden karbon kaynakları ve tuz konsantrasyonu incelenmiş, Haloarcula hispanica için en uygun lipaz üretim parametreleri tespit edilmiştir. Karbon kaynağı olarak çeşitli yağların (zeytinyağı, susam yağı, aynısafa yağı, kudret narı, çuha çiçeği yağı, ceviz yağı ve balık yağı), yağ asidi esteri tribütirinin ve yağ asidi esterleri stearik asit ve oleik asidin, yağların farklı derişimlerinin ve tuz konsantrasyonunun (3M, 4M ve 5M NaCl) hücre dışı lipaz aktivitesine etkisi incelenmiştir. Optimum lipaz üretim koşullarını belirlemek amacıyla, bu parametreler kullanılarak farklı besiyerleri (pH=7,5) hazırlanmış, ekim işlemi yapılmış ve 40°C'de 60 gün boyunca inkübe edilmiştir. İki günde bir düzenli olarak numune alınarak, titrasyon yöntemiyle lipaz aktiviteleri takip edilmiştir. Yapılan deneyler sonucunda Haloarcula hispanica'nın hücre dışı lipaz ürettiği, üretim ortamına katılan bazı yağların lipaz üretimini tetiklediği, en uygun karbon kaynaklarının %2 derişimde ceviz yağı ve balık yağı, %1 oranında stearik asit ve tribütirin olduğu, en uygun tuz konsantrasyonunun 4M NaCl olduğu tespit edilmiştir. 
Üretilen lipaz enzimi, amonyum sülfat çöktürmesi ve ultrafiltrasyon işlemleriyle kısmi olarak saflaştırılmış, enzimin optimum çalışma koşullarını belirlemek amacıyla farklı sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonlarında aktivite tayinleri yapılmıştır. Optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 45°C ve 8,0 olarak saptanmıştır. Farklı tuz konsantrasyonlarında enzim aktivitesi ölçülmüş, optimum aktivitenin tuzsuz ortamda gerçekleştiği, tuz konsantrasyonu arttıkça aktivitede bir miktar düşme olduğu ancak 5M tuz konsantrasyonunda aktivitesinin %85'ini koruyarak aşırı tuzlu ortamlarda stabilite gösterdiği belirlenmiştir. Bunu yanı sıra, elde edilen lipaz enziminin Triton X-100 ve SDS yüzey aktif maddelere karşı direnci araştırılmış ve deterjan endüstrisindeki kullanım potansiyeli ortaya konmuştur. Kısmen saflaştırılmış olan lipaz, deterjan katkıları varlığında aktivitesini büyük oranda koruyabildiği için üretilen enzimin deterjanlarda kullanım potansiyeline sahip olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
Lipases belong to the hydrolase family of enzymes, hydrolyze triacylglycerides into fatty acids and glycerol. Industrial lipases are mainly produced from microorganisms that secrete extracellular lipase. Microbial lipasesare usually produced by submerged fermentation and their activities are influenced by the type and concentration of carbon/nitrogen sources, pH and temperature. 
Extremophilic organisms have drawn much scientific interest and have important biotechnological potentials because of their molecular adaptation and their ability to synthesise stable and active macromolecules in extreme environmental conditions. In the present study, an extreme halophilic archaea Haloarcula hispanica 2TK2 strain isolated from Tuzkoy Salt Mine of Turkey is used as lipase source. Halophilic archaea easily adapted to life in extreme salty environments, so that their proteins maintain stability and functionality in extreme habitats.
In this study, important parameters for lipase production, carbon sources and salt concentration are investigated and optimal conditions for lipase production from Haloarcula hispanica are determined. As carbon sources, a variety of oil (olive oil, sesame oil, calendula oil, bitter melon oil, evening primrose oil, walnut oil and trout oil) in different concentrations, tributyrin as a fatty acid ester, stearic acid and oleic acid as fatty acids are examined. The effects of these parameters and salt concentrations (3M, 4M and 5M) on extacellular lipase production are investigated. In order to determine optimal lipase production conditions, these parameters are variated in different Brown media (pH=7,5), cultivated and incubated at 40°C for 2 months. Sampled every second day, titrimetric and spectrophotometric activities are monitored. As a result of the experiments, it has been reported that Haloarcula hispanica produce extracellular lipase enzyme and some of the carbon sources stimulate the lipase production. The highest lipase acitivities performed in presence of 2% walnut and trout oil, 1% stearic acid and tributyrin as carbon sources and 4M NaCl as salt concentration.
Lipase is obtained and partially purified applying ammonium sulfate precipitation and ultrafiltration. In order to determine optimal conditions for lipase activity, activity assays performed at different temperature, pH and salt concentrations. Optimal temperature and pH values are 45°C and 8,0 respectively. Optimal activity was performed at salt free conditions and activity decreased as the salt concentration increased but 85% activity was recovered at 5M NaCl concentration and resulted as stability at high NaCl concentrations. Besides, obtained lipase enzyme tested against surface active agents like Triton X-100 and SDS and potential uses in detergant industry is reported. The partially purified lipase succeeded to recover its activity in the presence of detergentadditives tested; therefore, the enzyme has been considered to have a required potentialfor detergent industry.