Gıda örneklerinde aflatoksin (G1, G2, B1, B2) ve okratoksin a'nın HPLC metot validasyonu ve miktar tayinleri
Method validation and determination of aflatoxin (G1, G2, B1, B2) and ochratoxin a in food samples by HPLC
Yazar: IŞIL HACİBEKİROĞLU
Danışman: PROF. DR. UFUK KOLAK
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Besin Hijyeni ve Teknolojisi = Food Hygiene and Technology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Aflatoksinler = Aflatoxins ; Besin kirlenmesi = Food contamination ; Besinler = Foods ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Mikotoksinler = Mycotoxins ; Okratoksin-A = Ochratoxin-A ; Okratoksinler = Ochratoxins

Özet:
Bu tez çalışmasının amacı, toplam aflatoksin (G2, G1, B2, B1) ve okratoksin A için HPLC metodu geliştirip valide etmek ve bu metotlarla 82 adet işlenmiş tahıl örneğinde aflatoksin ve okratoksin A tayini yapmaktır. Modifiye edilen metotlarla 0,5 µg/kg kadar düşük seviyelerde toplam aflatoksin ve okratoksin A içeren örneklerin analizi mümkün oldu. Örnek hazırlık aşamasında metanol:su ile yapılan ekstraksiyonda % 80?in üzerinde geri kazanım elde edildi. Modifiye metotların temel metotlardan daha hassas oldukları saptandı. Toplam aflatoksin, aflatoksin B1 ve okratoksin A için teşhis limitleri sırasıyla, 0,4 µg/kg, 0,117 µg/kg ve 1,477 µg/kg olarak bulundu.  Geri kazanım çalışmaları toplam aflatoksin analizinde 8 µg/kg and 5 µg/kg olarak iki seviyede yapıldı, ortalama geri kazanım değeri %98 olarak bulundu. Okratoksin A analizinde 8 µg/kg and 3 µg/kg olarak iki seviyede yapıldı, ortalama geri kazanım değeri %91 olarak bulundu. Modifiye edilen metotların tekrarlanabilirlik çalışmalarında relatif standart sapma değerleri toplam aflatoksin metodunda % 2,83-3,90 arasında, okratoksin A metodunda % 11,15-12,48 arasında bulundu. Sonuç olarak, modifiye metotlar, aynı laboratuvarda ve farklı analistlerle yapılan çalışmalarda bütün seviyelerde kabul edilebilir sonuçlar verdi. Bu nedenle, modifiye edilen bu metotlarla, Avrupa Birliği?nin düzenlediği işlenmiş tahıl ürünlerinde aflatoksin ve okratoksin A limitlerine göre analiz yapılabileceği ve çok düşük seviyelerde bile bu mikotoksinlerin analizine olanak sağlayacakları kanıtlandı. Sonuç olarak, floresans dedektör ve KOBRA-cell kombinasyonlu HPLC kullanılarak aflatoksin ve okratoksin A tayini için modifiye ve valide edilen yöntemler analiz örneği için seçici ve iyi bir kromatografik ayrımın kısa sürede yapılmasını sağlamıştır.

Anahtar Kelimeler: Mikotoksin, Toplam Aflatoksin, Aflatoksin B1, Okratoksin A, Metot Validasyon

Abstract:
Regulatory limits for mycotoxines have been established in many countries, and reliable testing methodology is needed to implement and enforce the regulatory limits. The aim of this thesis is to develop and validate the HPLC methods for the determination of the total aflatoxin (G2, G1, B1, B2) and ochratoxin A in 82 processed cereal samples. The methods with all tested variations were found to be fit-for-purpose for the determination of total aflatoxin, aflatoxin B1 and ochratoxin A in processed cereal samples at levels of 0.5 µg/kg and above with mean recoveries 80% for the extraction with methanol-water. The LOQs of total aflatoxin, aflatoxin B1 and ochratoxin A were 0.117 µg/kg, 0.4 µg/kg and 1.477 µg/kg, respectively. For total aflatoxin, the mean recovery at 8 µg/kg and 5 µg/kg was 98 % and for ochratoxin A, the mean recovery at 8 µg/kg and 3 µg/kg was 91 %. The relative standard deviation for repeatability was found to be 1.03 ? 9.34 % for modified method of total aflatoxin and 11.15 ? 15.05 % for modified method of ochratoxin A. In conclusion, the modified methods showed acceptable results at the same laboratory with different analysts for cereals products at all levels. Therefore, the newly modified methods allow the enforcement of EU legislative limits for aflatoxins and ochratoxin A in processed cereal products. Finally, the modified and validated  methods for determination of aflatoxins and ochratoxin A using high performance liquid chromatography in combination with a fluorescence detector and KOBRA-cell, resulted in a selective and good chromatographic and analyte selective separation within a shorter time.

Keywords: Mycotoxin, Total Aflatoxin, Aflatoxin B1, Ochratoxin A, Method Validation