Doğal antioksidanların cinsiyeti değiştirilmiş dişi gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss) spermatolojik parametreler üzerine etkileri
The effect of natural antioxidants on spermatogical parameters of sex-reversed female rainbow trout (Oncorhynchus mykiss))
Yazar: BURAK EVREN İNANAN
Danışman: PROF. DR. FEVZİ YILMAZ ; DOÇ. DR. FATİH ÖĞRETMEN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Tüm dünya ülkelerinde ve ülkemizde en çok kültürü yapılan ve avlanan türlerden biri olan gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792), önemli bir besin ve ekonomik kaynak teşkil etmektedir. Gökkuşağı alabalığı üretiminde popülasyonun dişi bireylerden oluşması özellikle dişiler daha hızlı geliştiğinden son derece önemlidir ve bu konu balık üreme biyolojisi araştırmalarında geniş yer tutmaktadır. Dişi bireyler, erkeklerden bir yıl sonra cinsel olgunluğa gelirler ve cinsel olgunlaşmadan önce satış boyuna ulaşırlar. Erkekler bu süreçte gonad oluşturmak için enerji harcarken dişiler aynı enerjiyi büyümede kullanırlar. Bu sebeple tamamı dişi olan bireylerden oluşmuş popülasyonların üretimi ticari gökkuşağı alabalığı kültüründe önemli ekonomik faydalar sağlamaktadır. Cinsiyeti değiştirilmiş (Erkekleştirilmiş) dişi (Fonksiyonel Erkek) gökkuşağı alabalıklarının anaç olarak kullanılması, tümü dişi olan popülasyonların elde edilmesine imkân sağlamaktadır. Bu bireyler, en yaygın olarak yumurtadan çıktıktan sonra yeme ilave edilen hormon uygulaması ile elde edilirler. Bunlar erkek fenotipine sahiplerdir ancak dişi genotiplerini (XX) korurlar, böylece bunların işlevsel testislerinde üretilen tüm spermatozoa X kromozomu taşır ve dolayısıyla döllenmeleri sonucu elde edilen yavrular tamamı dişi bir popülasyon oluşturur. Cinsiyeti değiştirilmiş (CD) dişi gökkuşağı alabalıkları, normal erkekler ile benzer dış morfolojiye sahiptir, ancak sperm kanalları yoktur, bu durum dolayısıyla bu bireylerden sağım yoluyla balık spermi alınamaması, gonadın diseksiyon ile alınarak spermin elde edilebilmesi manasına da gelmektedir. Ancak testiküler sperm genellikle, dölleme yeteneği açısından kısıtlı motilite özelliklerine sahiptir. Bu motilite özelikleri, spermin bir suni seminal plazma ile sulandırılarak bir olgunlaştırma süreci sonucunda daha iyi hale getirilmesi, kısa ve uzun süre muhafaza edilebilmeleri son derece önemli bir konudur.
Bu tez çalışması, testiküler semende seminal plazma parametrelerini tanımlayıp CD dişi bireylerden elde edilen sperm hücrelerinin motilite karakteristiklerini belirleyerek 25, 50 ve 100 mg/L derişimlerindeki doğal antioksidanlar (kuersetin, kurkumin, rosmarinik asit, rutin, resveratrol ve salisilik asit) ilave edilmiş suni seminal plazma kullanılarak gerçekleştirilen uzun ve kısa süreli muhafazalara ait motilite verilerini sunmaktadır. Ayrıca, muhafaza çalışmalarının motilite karakteristiklerine etkileri, akuakültür pratiğindeki en önemli parametrelerinden yumurtayı dölleme ve yumurtadan çıkış oranları ile desteklenmektedir. 
Tez çalışması, 2012-2013 (Aralık, Ocak ve Şubat), 2013-2014 (Aralık, Ocak ve Şubat) ve 2014-2015 (Aralık, Ocak ve Şubat) üreme sezonları boyunca, Fethiye-Muğla'da bulunan ticari bir alabalık üretim işletmesinde gerçekleştirilmiştir. İlk iki üreme sezonunda, seminal plazma biyokimyasal analizleri ve kısa süreli muhafaza çalışmaları gerçekleştirilmiş iken 3. üreme sezonunda sperm hücreleri DNA hasarları ve uzun süreli muhafaza çalışmaları tamamlanmıştır. İlk iki sezonda, toplamda 102 normal (N) erkek bireyin ve 88 CD dişi bireyin semen özellikleri incelenmiştir. İlk sezonda 2-3 yaşında CD bireyler, ikinci sezonda 3-4 yaşındaki CD bireyler, her iki sezonda da 2-3 yaşındaki N erkek bireyler değerlendirilmiştir. 
Tez çalışması sonuçlarına göre, CD dişi bireylerden elde edilen testiküler semen, N erkek semenine kıyasla daha yoğun sperm hücresine, seminal plazması daha düşük pH seviyesine, daha yüksek ozmolarite ve protein değerlerine, toplam antioksidan kapasitesine sahip olması ile nitelendirilebilmektedir. CD dişi testiküler seminal plazması,  daha yüksek Na+, K+ ve Cl- derişimlerine sahip iken, Ca2+ derişimleri açısından N erkek seminal plazması ile farklılık göstermemektedir (P<0,05). 2-3 yaşındaki CD dişi bireylerin Mg2+ derişimleri, N erkeklerden daha yüksek iken 3-4 yaşındakilerde istatistiksel olarak farklı değildir. Ayrıca, CD dişi testiküler seminal plazması daha yüksek ortalama lipit peroksidasyonu ve katalaz aktivite değerlerine sahiptir. 
Tez çalışmasında, hem kısa hem de uzun süreli muhafazada antioksidan maddelerin kullanılmasının, sperm motilite karakteristikleri ve yumurtaları dölleme oranları üzerine pozitif etkilerini saptamıştır. Kısa süreli muhafazada kuersetin ve kurkumin, uzun süreli muhafazada rosmarinik asit ve salisilik asit motilite karakteristiklerinin korunmasında daha etkili bulunmuştur.

Abstract:
Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) is one of the most common wild-caught and cultured fish species as providing nutritional and economic sources both worldwide and Turkey. Production of mono-sex female population of rainbow trout is very important, and takes an important place on fish reproductive biology studies. Females reach their marketable size before maturation, becoming sexually mature 1 year later than males. For the very reason, the reproduction all female populations in the aquaculture of rainbow trout has important economic benefits compared to all male and mix populations. The production of sex reversed (masculinized) females (functional males) and then using of them as breeders allow spawning all female populations. These breeders commonly are obtained with adding hormones to their diets during their larval stages.  When they grow up, they become phenotypically males but genotypically females (XX), and in this way spermatozoa produced in their functional testis carry X chromosome. Therefore, all fry which develop from zygote fertilized by these spermatozoa would be female. Sex reversed (SR) females are looked like males morphologically but lack of sperm ducts. Thus, abdominal stripping is useless and the breeders should be sacrificed to obtain sperm samples. Testicular spermatozoa have limited motility characteristics for fertilization. To improve the motility of testicular spermatozoa, the samples should be diluted with artificial seminal plasma and incubated for maturation, thus samples could be used for short and long term preservations.
In this study, the parameters of testicular seminal plasma have been determined, the motility characteristics of their spermatozoa are evaluated, the data of short and long term preservations using medium with 25, 50 ve 100 mg/L of natural antioxidants (quercetin, curcumin, rosmarinic asid, rutin, resveratrol, and salicylic acid) are presented. Besides the effects of the preservation techniques on motility characteristics, fertilization and hatching rates as the most important parameters are represented.
The study carried out during 2012-2013 (December, January and February), 2013-2014 (December, January and February), and 2014-2015 (December, January and February) spawning seasons at the commercial fish farm in Muğla-Turkey. The biochemical analysis of seminal plasma and the application of short term preservation are conducted during the first two spawning seasons, while long term preservation and DNA damages are determined during the third spawning season. The sum of 102 normal (N) males and 88 SR females are examined during the first two spawning seasons. 2-3 year old SR females in the first spawning season, 3-4 year old SR females in the first spawning season, and 2-3 year old N males in both spawning seasons are evaluated. 
According to the results of the study, testicular seminal plasma of SR females has higher spermatozoa concentration than N males', and also testicular seminal plasma has been characterized lower pH level, higher osmolality, protein and total antioxidant capacity compared to the seminal plasma of N males. Testicular seminal plasma of SR females has higher concentrations of Na+, K+ and Cl- while there was no significant differences between  the seminal plasma of SR females and N males in terms of Ca2+ concentration (P<0.05).The seminal plasma of 2-3 year old females has higher Mg2+ concentrations than seminal plasma of N males', Mg2+ concentrations  of 3-4 year old females are not different from N males'. the seminal plasma of SR females has more lipit peroxidation and catalase activity than N males'.
The thesis study reveals that the antioxidants has positive effects on sperm moility characteristics and fertilization rates during both short and long term preservations. Quercetin and curcumin for short term preservation, rosmarinic asid and salicylic acid for long term preservation have found as more effective than the other antioxidants used in the study.