Benzohidrazid türevleri kullanılarak horseradısh peroksidaz (HRP) enziminin tek basamakta saflaştırılması
One step purification of horseradish peroxidase (HRP) enzyme using benzohydrazide derivatives
Yazar: ZÜLEYHA ALMAZ
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada Horseradish Peroksidaz (HRP) enziminin inhibitörleri olan 4-Amino benzohidrazid ve türevi moleküller kullanılarak bu enziminin tek basamakta saflaştırması hedeflendi. Literatürde bulunan Horseradish Peroksidaz (HRP) enziminin saflaştırma çalışmalarına katkı sağlamak amacıyla ilk defa 4-Amino benzohidrazid ve türevleri olan 4-Amino 2-bromo benzohidrazid, 4-Amino 3-kloro benzohidrazid, 4-Amino 2-kloro benzohidrazid moleküller ligand olarak kullanılıp, bu enziminin saflaştırılması çalışmasına uygulandı. Kullandığımız 4-Amino benzohidrazid türevi moleküllerin metilbenzoat formlarından hidrazin sentezleri yapılarak Horseradish Peroksidaz (HRP) enzimi üzerine inhibisyon etkileri incelendi ve dönüşümlü inhibisyon gösteren moleküller Sepharose-4B-L-Tirozin jel materyaline bağlanarak elde edilen afinite jelleri ile tek kademede Horseradish Peroksidaz (HRP) enziminin saflaştırılması gerçekleştirildi.
4-Amino benzohidrazid molekülü kullanıldığında Horseradish POD enzimi, %1,8 verimle 45,4 kat, 4-Amino 2-kloro benzohidrazid molekülü kullanıldığında Horseradish POD enzimi, %4,46 verimle 149 kat, 4-Amino 3-kloro benzohidrazid ile %4,7 verimle 102,3 kat, 4-Amino 2-bromo benzohidrazid ile %3,2 verimle 129 kat, saflaştırma yapıldı. Bu  kolonlardan saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı ve saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi. Horseradish Peroksidaz (HRP) enzimi için 44 kDa'da tek bant gözlendi. Tüm kolonların saflaştırma sonuçları karşılaştırıldı ve en iyi kolon olan Sepharose-4B-L-Tirozin-4-Amino-2-kloro benzohidrazid kolonu için kolon tutma kapasitesi, Horseradish Peroksidaz (HRP)enzimi için değişik pH, sıcaklık, iyonik şiddetlerde çalışıldı. Bu sonuçlara göre, 4-Amino 2-kloro benzohidrazid için 20°C'de pH 9,0'da 0,35 M iyonik şiddet konsantrasyonunda optimum bağlanma 2,99 mg/g jel olarak tespit edildi. Guaiakol substratı için KM ve Vmax değerlerinin bulunmasına yönelik yapılan çalışma sonuçlarında Horseradish (Armoracia rusticana)  POD enzimi için KM değeri 4,34 mM ve Vmax değeri 0,97 EÜ/mL.dk olarak tespit edildi.

Abstract:
In this thesis study, it was aimed to establish a purification procedure in one step for Horseradish Peroxidase (HRP) enzymes by using 4-Amino benzohydrazide and its derivative molecules which are the inhibitors of the HRP enzymes.In order to contribute to the purification studies in the literature of HRP enzyme, 4-Amino benzohydrazide and its derivatives which are 4-Amino 2-bromo benzohydrazide, 4-Amino 3-chloro benzohydrazide, and 4-Amino 2-chloro benzohydrazide molecules were used as ligands and first applied to the study of purification of HRP enzyme.The inhibition effects on the Horseradish Peroxidase (HRP) enzyme were investigated by hydrazine synthesis from the methyl benzoate forms of the 4-amino benzohydrazide derivative molecules we used and the purification of the single-stranded Horseradish Peroxidase (HRP) enzyme was performed by affinity gels obtained by binding molecules with alternating inhibition to Sepharose-4B-L-Tyrosine gel material.
Using a 4-Aminobenzohydrazide molecule, the Horseradish POD enzyme is purified with a yield of 1.8%, 45.4 fold, when the 4-amino 2-chloro benzohydrazide molecule is used the purification result is with a yield of 4.46%, 149 fold, with the 4-amino 3-chloro benzohydrazide the enzyme is purified with a yield of 4.7%, 102.3 fold, finally using a 4-amino 2-bromo benzohydrazide the enzyme purification is 129 fold with a yield of 3.2%. The molecular weight and enzyme purity of the enzymes purified from all the columns were controlled by SDS-PAGE. Single band at 44 kDa for the Horseradish peroxidase enzyme were observed. The purification results of all the columns were compared and the column holding capacity for Sepharose-4B-L-Tyrosine-4-amino-2-methoxy benzohydrazide showing the result of being the best column, for the Horseradish peroxidase enzymes were studied different pH, temperature and ionic strengths. According to these results, the optimum binding of Horseradish peroxidase enzyme for 4-amino 2-chloro benzohydrazide molecule was determined as 2.99 mg/g gel at 20°C, pH 9.0 and at 0.35 ionic intensity concentration. In the results of the studies aimed at finding the KM and Vmax values for the Guaiakol substrate, The KM and the Vmax values were found as 4.34 mM and 0.97 EU / mL.min respectively for the Horseradish (Armoracia rusticana)  POD enzyme.