Anoxybacillus gonensis ksiloz izomeraz H99E mutantının saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of Anoxybacillus gonensiz xylose isomerase H99E mutant
Yazar: ESRA ERBAŞ
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
D-ksiloz izomeraz (D-ksiloz ketol-izomeraz, E.C. 5.3.1.5) yaygın olarak D-glukoz izomeraz olarak da adlandırılır. Ksiloz izomeraz (KI) hücre içinde D-ksilozun D-ksiluloza izomerizasyonunu, hücre dışında D-glukozun D-fruktoza izomerizasyonunu katalizler. KI/GI endüstriyel olarak oldukça önemli bir enzimdir. Çünkü enzim hem D-glukozu D-fruktoza izomerize ederek HFCS üretiminde kullanılır hem de D-ksilozu alkole fermente olabilen D-ksiluloza izomerize etmesi nedeniyle önemlidir. Sahip olduğu yüksek ticari önem nedeniyle enzimin mikroorganizma kaynakları, özellikleri, çalışma mekanizması, özelliklerinin iyileştirilmesi ve immobilizasyonu gibi konular yoğun bir şekilde çalışılmaktadır. Bu çalışma Aoxybacillus gönensis ksiloz H99E mutantının saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu içermektedir. Bu çalışmada mutant tip gen ürünü ışı şoku, iyon değişimi kolon kromatografisi ve hidrofobik etkileşim kolon kromatografisi uygulamalarıyla saflaştırıldı ve elde edilen saf enzim karakterize edildi. KI H99E mutantının glukoz izomeraz ve ksiloz izomeraz aktivitesi için optimum sıcaklıkları 85°C olarak ölçüldü. KI H99E mutantının glukoz izomeraz ve ksiloz izomeraz aktivitesi için optimum pH'larıda 6,5 olarak ölçüldü. KI H99E mutantının glukoz aktivitesi için Km'si 589,97 ± 10 mM, Vmax 5,92 ± 2 µmol/dk/mg hesaplandı. KI H99E mutantının ksiloz aktivitesi için Km değeri 31,88 ± 10mM, Vmax değeri 6,52 ± 2 µmol/dk/mg olarak hesaplandı. KI H99E mutantının optimum çalışma sıcaklığı olan (85°C) ve optimum pH'da (pH 6,5), glukoz izomeraz aktivitesinin yarısını 2 saatte kaybettiği belirlendi. Ksiloz izomeraz aktivitesinin ise 3,5-4 saat sonunda yarıya düştüğü belirlendi. Ayrıca pH 6 ve 6,5'da (4°C) 10 saat sonunda KI H99E mutantının glukoz izomeraz ve ksiloz izomeraz aktivitesini kaybetmediği belirlendi.Anahtar kelimeler: D-ksiloz izomeraz, D-glukoz izomeraz,enzim, saflaştırma, mutasyon, enzim karakterizasyonu

Abstract:
D-xylose isomerase (D-xylose ketol isomerase; E.C. 5.3.1.5) is commonly referred to as D-glucose isomerase. It catalyzes isomerization of D-xylose to D-xylulose intracellular and D-glucose to D-fructose extracellular. XI is an industrially important enzyme since it has capacity to produce a high-fructose corn-enriched syrup (HFCS) by the isomerization of D-glucose to D-fructose. XI has also been examining for the isomerization of D-xylose to D-xylulose, which can be fermented to ethanol. Because of the industrial value of this enzyme, microbial sources of the enzyme, biochemical properties, mechanism of action, improvement of properties, and immobilization have been extensively studying.In the present work, Anoxybacillus gönensis xylose isomerase H99E mutant was purified and characterized. In this work, mutant type gen production purified by classical purification methods such as heat treatment, ion-exchange chromatography and hydrophobic-interaction chromatography. The XI H99E mutant was characterized. The optimum temperature for XI mutant?s glucose and xylose activity was 85 °C, the optimum pH was 6,5. Km and Vmax values for XI H99E mutant?s glucose activity were 589,97 ± 10mM and 5,92 ± 2 µmol/dk/mg. Km and Vmax values for XI H99E mutant?s xylose activity were 31,88 ± 10mM and 6,52 ± 2 µmol/dk/mg. It was found that at the end of 2 hours at 85 °C (pH 6,5) reduced activity of XI H99E mutant?s xylose activity to half and also it was found that at the end of 3,5-4 hours at 85 °C (pH 6,5) reduced activity of XI H99E mutant?s xylose activity to half and the enzyme was stable in pH 6 and 6,5 at 4 °C.Key Words: Anoxybacillus gonensis, D-xylose isomerase, prufication of enzyme, characterization of enzyme, mutation.