Farklı gıdalardan izole edilen mayaların probiyotik özelliklerinin değerlendirilmesi ve fonksiyonel gıda geliştirilmesi
Evaluation of probiotic properties of yeasts isolated from different foods and development of functional foods
Yazar: EDA KILIÇ KANAK
Danışman: PROF. DR. SUZAN ÖZTÜRK YILMAZ
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Fonksiyonel besinler = Functional foods ; Probiyotikler = Probiotics

Özet:
Bu doktora tez çalışmasında, 19 ev yapımı doğal çökelek peyniri, karın kaymağı peyniri, tereyağ, kefir, yoğurt, tel peyniri, mantar turşusu, salatalık turşusu, lahana turşusu, fasulye turşusu, taflan turşusu, yabandağı alıcı sirkesi, Trabzon hurması sirkesi, ekşidağ elması sirkesi, kırmızı pancar lahana havuç biber sirkesi, elma sirkesi, üzüm sirkesi, çiçek balı sirkesi ve dağ kızılcığı sirkesi örneklerinden izole edilen 85 maya suşunun probiyotik potansiyeli araştırılmıştır. Elde edilen maya suşlarının tamamı, mide ve bağırsak geçişi sırasında simüle edilmiş koşullara maruz kaldıktan sonra gastrointestinal koşullarda hayatta kalma potansiyeli göstermiştir. İzolatların %10,58'i orta, %34,11'i zayıf biyofilm üreticisi olarak tanımlanırken, %55,29'unun biyofilm oluşturma özelliğinin olmadığı belirlenmiştir. Tüm izolatlarda katalaz enzim üretimi tespit edilmiştir. İzolatlardan %83,52'sinin orta, %16,47'sinin ise güçlü prtoteaz aktivitesine sahip olduğu tespit edilmiştir. İzolatların %2,35'sinde esteraz aktivitesi görülmeyip, %95,29'unda orta düzeyde, %2,35'inde güçlü esteraz aktivitesi tespit edilmiştir. Elde edilen izolatların %95,29'unda orta düzeyde amilaz aktivitesi, %2,35'inde güçlü amilaz aktivitesi tespit edilirken %2,35'inde ise amilaz aktivitesi tespit edilmemiştir. İzolatların %50,58'inde güçlü β-glikozidaz aktivitesi görülürken %49,41'inde aktivite görülmemiştir. Hidrokarbonlara yapışma yeteneğinin ise cinse ve türe özgü olduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıca hidrofobisiteninin hidrokarbonlara göre değiştiği belirlenmiştir. Çalışmamızda tüm suşlar için inkübasyon süresinin uzamasıyla otoagregasyon yüzdelerinin arttığı belirlenmiştir. 24 saaatin sonunda tüm izolatlarda % otoagregasyon değeri %60'ın üzerinde tespit edilmiştir. Maya suşlarının E.coli ATCC 25922 suşu ile koagregasyon yetenekleri %0,0- 95,7 arasında bulunmuştur. Maya suşlarının S. Typhimurium ATCC 14028 ile % koagregasyon değerlerleri %0,0 -%91,9 arasında tespit edilmiştir. Maya suşlarının; S. aureus ATCC 25923 ile % koagregasyon yetenekleri %0,0-95,1 arasında bulunmuştur. Maya suşlarının L. monocytogenes ATCC 7644 suşu ile koagregasyon yetenekleri %0,0- 88,7 arasında bulunmuştur. Bu araştırmada; koagregasyon yeteneğinin, inkübasyon süresine ve suşuna bağlı olduğu sonucuna varılmıştır. Elde edilen mayaların çoğunun E. coli ATCC 25922,	E. coli O157:H7, B. cereus, C. sakazakii ATCC 29544,  L. monocytogenes ATCC 7644, S. aureus ATCC 25923, S. Typhimurium ATCC 140828'e karşı antimikrobiyal etki gösterdiği tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlardan, mayaların test edilen tüm antibiyotiklere karşı ise direnç gösterdiği doğrulanmıştır. Hücrelerin 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical  süpürme aktivitesi, test edilen tüm maya suşlarında hücrelerin antioksidan aktivitesi hücre içi ekstraktlarından daha yüksek olarak tespit edilmiştir.
MALDITOF ile tanımlaması yapılan mayalar daha sonra 18S-28S rRNA analizi ile tanımlanmıştır. En yüksek probiyotik potansiyeli bulunan mayalardan birisi olan Saccharomyces boulardii %39,76 kakao kütlesi, %41,85 kakao yağı, %14,80 inülin, %1,60 steviosid ve %0,15 soya lesitini içeren şekersiz prebiyotik ve probiyotik özellikli çikolata enkapsülasyon yöntemi ile üretilmiştir. Bu çalışmada S. boulardii kakao tozu: Na-aljinat: fruktooligosakkaritler sırasıyla (10:1:1) oranında karışım dondurarak kurutucu ile kapsüllenmiştir. Kapsülleyici karışım %93,57 ± 1,02 kapsülleme verimliliği göstermiştir. Nihai ürünlerde en az 107 log kob/g canlı probiyotik sayısı sağlanmıştır. Çikolata örneklerinin kristal morfolojileri incelendiği zaman hacim artırıcı maddelerin (inülin) pürüzlü bir yapıya neden olduğu tespit edilmiştir. Bu durum viskozite farkından dolayı kaynaklanmıştır. 25 ˚C'de 120 gün depolamadan sonra çikolata numunelerinin nem ve sertliğinde önemli bir değişiklik (P ≥ 0.05) olmamıştır. Ayrıca örneklerin hiçbirinde depolama boyunca çiçeklenme gözlenmemiştir. Çikolata örneklerinde probiyotiklerin varlığında, 25 ˚C'de 120 gün boyunca depolama sırasında pH değerlerinde önemli (P < 0.05) artış, su aktivitesi değerlerinde ise düşüş olduğu tespit edilmiştir (P < 0.05). Taramalı elektron mikroskobunda kapsüllü mayaların çikolata içinde hapsedildiği görülmüştür. Yuvarlak şekildeki mayalar homojen bir şekilde dağılmış ve kapsüllenmiş probiyotiklerin hücre görünümü, tüm örneklerde aynı olmuştur. SEM görüntüleri, kapsülleyici karışımla dondurarak kurutma sırasında ve ayrıca kapsüllenmiş çikolatalarda; probiyotik bakterilerin, normal boyutunun ve şeklinin değişmediğini göstermiştir. Depolamanın ilk gününde tüm çikolata uygulamalarında başlangıç probiyotik sayılarının benzer (>11 log) olduğu görülmüştür. En önemlisi, kapsüllenmiş probiyotiklerle zenginleştirilmiş çikolatada, 25 ˚C'de 120 günlük depolama boyunca probiyotik sayısı 8,08 log kob/g'nin üzerinde kalmıştır. Kapsüllenmemiş probiyotiklerle zenginleştirilmiş çikolatalarda depolama sırasında probiyotik sayılarında önemli (P < 0.05) ve yaklaşık 5,97 logluk kademeli bir düşüş ortaya çıkmıştır. Kapsüllemelerin koruyucu etkileri çikolatalarda karşılaştırıldığında, kapsüllenmemiş probiyotiklere kıyasla kapsüllenmiş çikolatalarda 120 gün sonunda daha fazla sayıda (2,51 log) probiyotik tespit edilmiştir ve bu da enkapsülanların koruyucu etkileri olduğunu kanıtlamıştır. 25 ˚C'de bir günlük saklamanın ardından yapılan in vitro analizde, 2 saatlik mide sindirimine (pH 3) maruz bırakıldığında kapsüllenmemiş probiyotiklerle takviye edilmiş çikolatada 6,42 ± 0,0 log'luk önemli (P< 0,05) bir azalma olduğu tespit edilmiştir. Ancak kapsüllenmiş probiyotik çikolata içeren numunede yalnızca 3,99 ± 0,2 log azalma olmuştur. Çikolatalarda probiyotiklerin daha düşük log azalması; hem kapsüllemenin hem de çikolatanın taşıyıcı olarak kullanılmasının, in vitro sindirim sırasında probiyotikler üzerinde koruyucu bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Zorlu gastrik koşullara sahip olan midedeki pH 3 değeri ile karşılaştırıldığında bağırsaktaki; pH 7 değerinin probiyotik büyümesi için daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Bu sonuçlar; kapsüllenmiş probiyotiklerle zenginleştirilmiş probiyotik çikolatanın, uzun süreli depolama sırasında minimum terapötik limitleri koruyabildiğini açıkça göstermiştir. Ayrıca çikolata bileşenlerinin kompleks karışımının gastrointestinal kanalda, probiyotik büyümesi için iyi bir besin kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır. Çikolata örneklerinde yağ asidi analizi GC-FID kullanılarak belirlenmiştir. Tüm örneklerde en fazla stearik asit tespit edilmiştir. Sonuçlar incelendiğinde kapsüllü çikolatalarda depolamaya bağlı olarak Kaproik (C6:0), Palmitik (C16:0), Stearik (C18:0), Oleik (C18:1n9c), Linoleik (C18:2n6c), Araşidonik (C20:0), cis-15-Tetrakozenoik asit  (C24:1n9) yağ asitlerinde önemli bir değişim görülmemiştir (P>0,05), fakat depolamanın 120. gününde farklı olarak Laurik (C12:0) yağ asiti %1,649 oranında tespit edilmiştir. Kapsülsüz çikolatalarda Palmitik (C16:0), Stearik (C18:0), Oleik (C18:1n9c), Linoleik (C18:2n6c), Araşidonik (C20:0), Lignoserik (C24:0), cis-15-Tetrakozenoik asit (C24:1n9) yağ asitlerinde önemli bir değişim tespit edilmemiştir (P>0,05). Depolamanın 120. gününde farklı olarak Behenik (C22:0) yağ asitleri %0,955 oranında belirlenmiştir. Kapsüllü çikolatalarda kapsülsüz çikolatalardan farklı olarak Kaproik asit (C6:0) %0,714 oranında tespit edilmiştir. 
Sonuç olarak bu doktora tez çalışmasında, maya suşlarının umut verici probiyotik potansiyele sahip olduğu gösterilmiş olup geleneksel olarak üretilen ürünlerde bulunan probiyotiklerin fonksiyonel özellikleri hakkında önemli bilgiler elde edilmiştir. Bu çalışmanın bulgularına göre, S. boulardii ile zenginleştirilmiş probiyotik çikolatanın iyi bir besin kaynağı ve insan sağlığı açısından potansiyel prebiyotik özelliği olan fonksiyonel bir atıştırmalık olarak değerlendirilebileceği sonucuna varılmıştır

Abstract:
This PhD thesis investigated the probiotic potential of 85 yeast strains isolated from 19 homemade natural cottage cheese, belly cream cheese, butter, kefir, yoghurt, string cheese, pickled mushrooms, pickled cucumbers, sauerkraut, bean pickles, taflan pickles, wilddag buyer vinegar, persimmon vinegar, Ekşidağ apple vinegar, red beet, cabbage, carrot pepper vinegar. , apple cider vinegar, grape vinegar, flower honey vinegar and mountain cranberry vinegar samples. The obtained yeast strains demonstrated the potential to survive gastrointestinal conditions after being exposed to simulated conditions during stomach and intestinal transit. It was determined that 10.58% of the isolates were moderate biofilm producers, 34.11% were weak biofilm producers, and 55.29% did not have biofilm formation capability. Catalase enzyme production was detected in all isolates. It was found that 83.52% of the isolates exhibited moderate protease activity, while 16.47% exhibited strong protease activity. Esterase activity was not observed in 2.35% of the isolates, 95.29% had moderate esterase activity, and 2.35% showed strong esterase activity. Moderate amylase activity was detected in 95.29% of the isolates, strong amylase activity in 2.35%, and no amylase activity in 2.35%. Strong β-glucosidase activity was observed in 50.58% of the isolates, while no activity was observed in 49.41%. It was concluded that the adhesion ability to hydrocarbons was species and strain-specific. Additionally, hydrophobicity varied depending on the type of hydrocarbon. Our study determined that the autoaggregation percentages increased with the extension of the incubation period for all strains. After 24 hours, the autoaggregation percentage was over 60% in all isolates. The coaggregation abilities of the yeast strains with E. coli ATCC 25922 ranged from 0.0% to 95.7%. The coaggregation values with S. Typhimurium ATCC 14028 ranged from 0.0% to 91.9%, with S. aureus ATCC 25923 from 0.0% to 95.1%, and with L. monocytogenes ATCC 7644 from 0.0% to 88.7%. It was concluded that the coaggregation ability depended on the incubation time and strain. Most of the obtained yeasts exhibited antimicrobial effects against E. coli ATCC 25922, E. coli O157H7, B. cereus, C. sakazakii ATCC 29544, L. monocytogenes ATCC 7644, S. aureus ATCC 25923, and S. Typhimurium ATCC 140828. The results confirmed resistance to all tested antibiotics. The 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical  scavenging activity indicated that the antioxidant activity of the cells was higher than that of the intracellular extracts in all tested yeast strains.
Yeasts identified by MALDITOF were subsequently determined by 18S-28S rRNA analysis. One of the yeast strains with the highest probiotic potential, Saccharomyces boulardii, was used to produce sugar-free prebiotic and probiotic chocolate containing 62.2% cocoa mass, 7% cocoa butter, 30% inulin, 0.50% stevioside, and 0.30% soy lecithin using the encapsulation method. In this study, the mixture of S. boulardii cocoa powder: Na-alginate: fructooligosaccharides in the ratio (10:1:1) was encapsulated by freeze dryer. The encapsulating mixture showed an encapsulation efficiency of 93.57 ± 1.02%. At least 107 log CFU/g of live probiotic count was achieved in the final products. When the crystal morphologies of the chocolate samples were examined, it was found that bulking agents (inulin) caused a rough texture, which was attributed to differences in viscosity. There was no significant change (P ≥ 0.05) in the moisture and hardness of the chocolate samples after 120 days of storage at 25 ˚C. Additionally, no blooming was observed in any of the samples during storage. It was determined that in the presence of probiotics in chocolate samples, a significant (P < 0.05) increase in pH values and a decrease in water activity values (P < 0.05) were observed during storage at 25 ˚C for 120 days. Scanning electron microscopy revealed that encapsulated yeasts were trapped within the chocolate. The round-shaped yeasts were uniformly distributed, and the appearance of the encapsulated probiotic cells was consistent across all samples. SEM images showed that probiotic bacteria's average size and shape did not change during freeze-drying with the encapsulating mixture or in encapsulated chocolates. On the first day of storage, all chocolate applications had similar initial probiotic counts (>11 log). Notably, the probiotic count remained above 8.08 log CFU/g throughout the 120-day storage period at 25 °C in the chocolate enriched with encapsulated probiotics. In contrast, chocolates enriched with non-encapsulated probiotics showed a significant (P < 0.05) and gradual decrease in probiotic counts by approximately 5.97 logs during storage. When the protective effects of encapsulations in chocolates were compared, a higher number of probiotics (2.51 log) were detected at the end of 120 days in encapsulated chocolates compared to non-encapsulated probiotics, demonstrating the protective effects of encapsulants. In vitro analysis, after one day of storage at 25°C, revealed a significant reduction (6.42 ± 0.0 log, P < 0.05) in chocolates supplemented with non-encapsulated probiotics when exposed to 2-hour gastric digestion (pH 3). However, only a 3.99 ± 0.2 log reduction was observed in samples containing encapsulated probiotics. The lower log reduction of probiotics in chocolates indicated that encapsulation and using chocolate as a carrier protected probiotics during in vitro digestion. It was concluded that pH 7 in the intestine was more suitable for probiotic growth compared to pH 3 in the stomach, which has harsh gastric conditions. These results demonstrated that probiotic chocolate enriched with encapsulated probiotics could maintain minimum therapeutic limits during long-term storage. Additionally, it was concluded that the complex mixture of chocolate components served as a good nutrient source for probiotic growth in the gastrointestinal tract. Fatty acid analysis of the chocolate samples was determined using GC-FID, with stearic acid being the most abundant in all samples. When the results are examined, depending on storage in encapsulated chocolates, Caproic (C6:0), Palmitic (C16:0), Stearic (C18:0), Oleic (C18:1n9c), Linoleic (C18:2n6c), Arachidonic (C20:0), cis -15-Tetracosenoic acid (C24:1n9) fatty acids showed no significant change (P>0.05), but unlike the 120th age of storage, Lauric (C12:0) fatty acid was detected at a rate of 1.649%. In non-encapsulated chocolates, Palmitic (C16:0), Stearic (C18:0), Oleic (C18:1n9c), Linoleic (C18:2n6c), Arachidonic (C20:0), Lignoceric (C24:0), cis-15-Tetracosenoic acid. No significant change was detected in (C24:1n9) fatty acids (P>0.05). On the 120th day of storage, Behenik (C22:0) fatty acids were detected at a different rate of 0.955%. Unlike unencapsulated chocolates, caproic acid (C6:0) was detected at a rate of 0.714% in encapsulated chocolates.
In conclusion, this PhD thesis demonstrated that yeast strains possess promising probiotic potential and provided significant insights into the functional properties of probiotics found in traditionally produced products. Based on the findings of this study, it was concluded that probiotic chocolate enriched with S. boulardii could be considered a functional snack with potential prebiotic functions and a good nutrient source for human health.