Fitoplazmaların kantitatif tespiti için droplet dijital PZR (DDPZR) tekniğinin geliştirilmesi
Development of droplet digital PCR (DDPZC) technic for quantitative detection of phytoplasmas
Yazar: YİĞİT SABRİ ÜNLÜ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ IŞIL TULUM
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Botanik = Botany ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Fitoplazmalar, zorunlu bitki patojeni olup, Mollicutes sınıfında yer alan hücre duvarı olmayan ve kültüre alınamayan Gram-pozitif bakterilerdir. Dünya genelinde 1000 kadar bitkiyi enfekte ederek önemli ölçüde verim kaybına ve ekonomik zararlara neden olmaktadırlar. Ayrıca fitoplazmalara karşı etkin bir tedavi mekanizması bulunmamakta olup hastalığın yayılmaması adına enfekte bitkiler sahadan uzaklaştırılmaktadır. Ancak fitoplazmaların tespiti hastalığın ileri aşamalarında mümkün olduğundan bu hastalığı erken evrelerinde tespit edebilecek yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Domates (Solanum lycopersicum L.) bitkisinde fitoplazma semptomları 2021 yazında Erzincan bölgesinde gözlemlenmiştir. Bu semptomların fitoplazma ile ilişkisini belirlemek amacıyla 16S rDNA bölgeleri hedef alınarak moleküler analizler gerçekleştirilmiştir. Kısaca, semptomatik domates örneklerinden izole edilen DNA evrensel fitoplazma primerleri (P1/P7 ve R16F2n/R2) ile nested-PCR tekniği ile amplifiye edilmiştir. Elde edilen PCR ürünleri sekanslanarak BLAST ve sanal RFLP analizlerine tabi tutulmuştur. Analiz sonuçlarına göre domates bitkisinin Candidatus Phytoplasma trifolii ile enfekte olduğu tespit edilmiştir. Çalışmamızda Ca. P. trifolii ile enfekte olmuş DNA örnekleri kullanılarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve droplet dijital PCR (ddPCR) analizleri gerçekleştirilerek mutlak miktar tayinleri yapılarak iki yöntem arasındaki farklılıklar ortaya konmuştur. Sonuç olarak 16S rDNA bölgeleri hedef alınarak evrensel fitoplazma primerleri ile ilk defa ddPCR analizleri gerçekleştirilmiş olup fitoplazma gibi bitki içerisinde düşük titrelere sahip organizmalar için ddPCR yönteminin daha ideal bir yöntem olduğu vedaha hassas mutlak miktar tayini yapabildiği belirlenmiştir. Böylece fitoplazma ile enfekte olmuş bitkiler semptom göstermeden tespit edilerek hastalığın yayılmasının engellenmesi ve ekonomik kayıpların önüne geçilmesi hedeflenmektedir.

Abstract:
Phytoplasmas are obligate plant pathogens which belonging to the class Mollicutes that are cell wall-less Gram positive bacteria and cannot be cultured. They infect over 1000 plants world-wide causing significant yield loss and economic losses. Moreover, there is no effective treatment againist phytoplasmas and best countermeasures are removing infected plants to prevent futher spreading of the disease. Unfortunately, phytoplasmas can only be detected in the late stages of the diseases, so there is a need for methods that can detect the disease in its early stages. Phytoplasma symptoms in tomato (Solanum lycopersicum L.) plants were observed in Erzincan region in the summer of 2021. In order to determine the associations of these symptoms with phytoplasma, molecular analyses were performed by targeting 16S rDNA regions. Briefly, DNA isolated from symptomatic tomato samples was amplified by nested-PCR with universal phytoplasma primers (P1/P7 and R16F2n/R2). The PCR products were sequenced and subjected to BLAST and virtual RFLP analysis. Based on the results of the analysis, tomato plants were found to be infected with Candidatus Phytoplasma trifolii. In this study, Ca. P. trifolii-infected DNA samples were quantified using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and droplet digital PCR (ddPCR) and the differences between the two methods were demonstrated. As a result, ddPCR analyses were performed for the first time with universal phytoplasma primers targeting 16S rDNA regions and it was concluded that ddPCR method is a more suitable method for organisms with low titers in the plant such as phytoplasma and can make more precise absolute quantification. By this way, it is aimed to prevent the spread of the disease and prevent economic losses by detecting plants infected with phytoplasma before they show symptoms.