Solid tümörlerdeki farklı hücre populasyon kinetiklerinin in vitro tümör heterojenite modelinde incelenmesi
Investigating different cell population kinetics in solid tumors on an in vitro tumor heterogeneity model
Yazar: ÖYKÜ GÖNÜL GEYİK
Danışman: DOÇ. DR. ZEYNEP YÜCE
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Heterojen = Heterogeneous ; Hücre dizisi = Cell line ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Amaç ve Hipotez: Bu çalışmada, aynı tümörden türemiş, farklı genetik profillere sahip altklonların fluoresan ile işaretlenerek bir arada üretildiği ve değişik koşullara maruziyet sonrasında bu klonların kinetik davranışlarının araştırıldığı tümör heterojenitesinin in vitro bir modelinin oluşturulması hedeflenmektedir. Tez çalışmasının hipotezi, intratümöral anöploidi farklanmalarının kanser progresyonunu farklı düzeylerde etkilemekte olduğudur.
Yöntem: İlk olarak DLD-1 kolon kanseri hücre hattından izogenik near-diploid ve near-tetraploid altklonlar, akım sitometrisi yöntemiyle ayrıştırılmıştır. Bu altklonlar önce farklı renkteki fluoresan proteinlerle işaretli vektörlerle enfekte edilerek işaretlenmiş; sonra eşit oranlarda bir arada üretilerek bir in vitro tümör heterojenite modeli oluşturulmuştur. Genetik profilleri tanımlanan bu klonların, yaratılan farklı mikroçevre koşulları karşısında (kemoterapötikler, radyasyon ve hipoksi), aralarındaki davranış farklılıkları karşılaştırılarak, hangi koşulda hangi varyasyonun avantaj sağladığı ve farklı koşullardaki dirençten sorumlu olabilecek genetik varyasyonlar belirlenmiştir.
Bulgular: DLD-1 altklonlarının karakterizasyonu ve stabil fluoresan işaretlemeleri başarıyla gerçekleştirilmiştir. Oluşturulan in vitro intratümöral heterojenite modelleri zamana bağlı olarak ve çeşitli terapi etkileri altında izlenmiştir. Altklonlar üzerinde gerçekleştirilen populasyon davranışlarının belirlenmesine yönelik olarak gerçekleştirilen deney sonuçları, NIH Ried Lab'da gerçekleştirilen genomik analizlerle karşılaştırılarak kanserde ilaç direncine neden olabilecek moleküler düzeydeki mekanizmalar işaret edilmiştir.
Sonuç: Kanser terapi direncinin altında yatan temel nedenlerden biri de tümör içi hücresel heterojenitedir. Özellikle uygulanan tedavi yöntemlerinin yarattığı değişik mikroortam koşullarına uyumda avantaja yol açabilecek mutasyon ve epigenetik desenleri barındıran klonal kanser hücre populasyonlarının, tedaviye dirençten sorumlu olduğu bilinmektedir. Bu nedenle bu altklonların tanımlanması ve bu kanser hücrelerine karşı etkili tedavi yöntemlerini geliştirmesi elzemdir. Bu çalışma ile, kanserde ilaç direncine neden olabilecek mekanizmaların aydınlatılmasına yönelik büyük adımlar atılması sağlanmıştır.

Abstract:
Aim and Hypothesis: In this study, we aimed to generate an in vitro intratumoral heterogeneity model by florescent tagging isogenic subclones derived from the same cancer cell line. Hypothesis of this thesis is that intratumoral aneuploidy alterations affect cancer progression at different levels.
Methods: Isogenic near-diploid and near-tetraploid cell lines were established from the colon cancer DLD-1 cell line via FACS-sorting and confirmed by genetic analyses. We tagged these subclones with different fluorescent labeled vectors. Correlation between individual genetic profiles and functional assays under different microenvironmental conditions (chemotherapy, radiation, and hypoxia) were examined. We have identified cellular kinetics and genetic variations that could possibly lead to drug resistance in tumors.
Results: DLD-1 subclones were characterized and stable fluorescence-tagged successfully. Generated in vitro intratumoral heterogeneity models were monitored time-wise and under the effects of various therapeutics. Results obtained from the experiments performed in order to determine population behaviours of subclones were compared to genomic analyses data performed at Ried Lab in NIH to designate cancer drug resistance mechanisms at molecular level.
Conclusion: One of the major underlying reasons for cancer therapy resistance is intratumoral cellular heterogeneity. It is now known that clones that harbour mutations and/or epigenetic patterns that provide a survival advantage under changing microenvironment conditions are the main culprits of therapy resistance. Therefore it is very important to define the genotype of these clones to overcome the problem of resistance. By means of this study, a big step towards illuminating mechanisms related to cancer drug resistance was taken.