Zeytin (Olea europaea L.) yaprağından ß-glukozidaz enzimini kodlayan genin klonlanması
Cloning of gene encoding ß-glucosidase enzyme from olive (Olea europaea) leaves
Yazar: GİZEM ÇAVUŞOĞLU DOLMA
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ŞENAY VURAL KORKUT ; DOÇ. DR. NEHİR ÖZDEMİR ÖZGENTÜRK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Beta glükosidaz = Beta glucosidase

Özet:
Aile 1 enzim sınıfına ait olan ß-glukozidazlar, ß glikozidik bağların hidrolizini kataliz ederler. Bitkilerde hücre duvarı lignifikasyonu, fitohormonların aktivasyonu ve kimyasal savunma bileşiklerinin aktivasyonu gibi pek çok önemli görevde rol alırlar.Daha önceki bir çalışmada, zeytin (Olea europaea L.) bitkisinden yaprak örnekleri kullanılarak 2.4X106 bağımsız klon içeren bir cDNA kütüphanesi kurulmuştur. Bu çalışma sonucunda elde edilen gen dizileri Phrap ve CAP3 programları kullanılarak kontig ve singletler oluşturulmuştur. Biyoteknolojik uygulamalara uygun olan genlerin araştırılması sonucunda bitkilerde ß-glukozidaz enzimini kodlayan genle homoloji gösteren bir kontig dizisi tanımlanmıştır. Bu çalışmada, daha önce elde edilen contig dizi bilgisinden yola çıkarak zeytin yapraklarından tam uzunlukta ß-glukozidaz cDNAsı izole etmek ve klonlamak amaçlanmıştır.ß-glukozidaz homologlarını kodlayan genlerin soğuğa bağlı olarak fazla ekspresyon gösterdikleri bilinmektedir, bu nedenle soğuk stresine maruz kalmış zeytin yapraklarından total RNA izole edildi. Elimizdeki kontig dizin bilgisinden yararlanılarak ileri ve geri primerler tasarlandı. Tam uzunlukta cDNA elde etmek için bu primerler kullanılarak RT-PCR uygulandı ve 1700 bp uzunluğunda bir fragment elde edildi. Fragment klonlandı ve dizin analizine gönderildi. Dizinimizin BLASTN ve BLASTP analizleri sonucunda, zeytin ß-glukozidaz dizinine %98 benzerlik gösterdiği sonucuna varıldı.Tam uzunlukta cDNA elde edildiğinde, devam etmekte olan bir projenin sonraki aşamalarında cDNA'lar Pichia ekspresyon vektörüne klonlanacak ve Pichia pastoriste eksprese edilecektir.

Abstract:
ß-glucosidases that belong to the family 1 glycoside hydrolyses catalyze the hydrolysis of the ß-glucosidic bond. In plants ß-glucosidases play important roles in diverse aspects of plant physiology including formation of intermediates in cell wall lignification, activation of phytohormones and activation of metabolites related to chemical defense.In a previous study in our laboratory, a cDNA library was constructed which containing 2.4X106 independent clones from leaves of olive (Olea europaea L.) and contigs and singlets were generated using both Phrap and CAP3 bioinformatic programmes. The candidate genes were searched which can be amenable for biotechnological applications and was identified a contig sequence that shows homology to genes encoding ß-glucosidases in plants. The aim of this study is to isolate and clone full length ß-glucosidase cDNA from leaves of olive.Expression of genes encoding ß-glucosidase homologs are differentially upregulated in response to cold therefore total RNA isolated from olive leaves of exposed to cold stress. Forward and reverse primers were designed using sequence information of the contig. RT-PCR reactions were performed to clone full lenght cDNA and a fragment about 1700 bp was obtained. The fragment was cloned and sequenced. The sequence showed more than 98% similarity to olive beta glucosidase in BLASTN and BLASTP analysis.In later stages of an ongoing research project, full length cDNA was obtained coding region will be inserted into Pichia expression vector and the protein will be expressed in Pichia pastoris.