Astragalus chrysochlorus'da fenilpropanoid metabolik yoluna ilişkin genomik analizler
Genomic analysis on phenylpropanoid pathway of Astragalus chrysochlorus
Yazar: NESLİHAN TURGUT KARA
Danışman: PROF. DR. ŞULE ARI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Astragalus chrysochlorus = Astragalus chrysochlorus

Özet:
Bu çalışmada, stres koşulu olarak seçilen ve bir elisitör olan maya özütünün fenilpropanoid metabolizması, özellikle de bu metabolizma yolunda iş gören P450 genlerinin anlatımı üzerindeki etkileri, hedeflenmiş farklılık gösterimi metodu kullanılarak incelendi. Bu amaçla P450 genlerinin demir bağlanma bölgesine özgü, 3´ uca 250-400 bç uzaklıkta ürünler oluşturan ve korunmuş PFG motifine bağlanabilecek 5´ dejenere primerler kullanıldı.Çalışmada materyal olarak kullanılan hücre süspansiyon kültürlerini elde etmek için aktif bölünme özelliğine sahip kallus kültürleri elde edildi. 0.5 mg/l 2,4-D içeren MS besiyerinde elde edilen 20 günlük kalluslardan 0.5 mg/l 2,4-D içeren sıvı MS besiyerinde öncü hücre süspansiyon kültürleri ve bu kültürlerden de 1 mg/l 2,4-D içeren MS besiyerinde hücre süspansiyon kültürleri kuruldu. Hücre süspansiyon kültürlerinde logaritmik faza giriş zamanı olarak belirlenen kültürlemenin 13. günü elisitör olarak maya özütü uygulandı ve maya özütü ile 0, 3, 6 ve 12 saat inkübe edilmiş hücre süspansiyon kültürlerinden total RNA izole edildi. 6 saat boyunca elisitör uygulanmış kültürler ve kontrollerinden izole edilen total RNA'lar kullanılarak sentez edilen cDNA'lar ile PCR yapıldıktan sonra PCR ürünleri poliakrilamid jelde ayrıştırıldı. Gen anlatımı bakımından farklılık gösterdiği belirlenen cDNA bantları jelden geri alındı. Poliakrilamid jelden geri kazanılan 56 adet cDNA'nın 37 tanesi başarılı bir şekilde PCR ile çoğaltıldı. Korunmuş P450 bölgesine ait motif taşıyan ve farklı anlatım yapan 16 bant klonlanarak dizi analizine gönderildi. Elde edilen dizi bilgilerinin TBLASTX analizi yapılarak hangi organizmada, hangi gen ya da EST (?Express Sequence Tag?)'lere benzerdikleri araştırıldı. Dizi analizleri sonucunda, fenilpropanoid metabolik yolunun ikinci enzimi ve bir P450 olan sinnamat 4-hidroksilaz (C4H), afid infeksiyonu sonucu anlatımı artan fotosistem II P680 klorofil A apoproteini, olası MerR ailesi transkripsiyon faktörü ve hipotetik bir proteinle homoloji gösteren diziler belirlendi.Maya özütü uygulamasını takiben farklı saatlerde izole edilmiş RNA örnekleri ve yukarıda sözü edilen 4 gen dizisine ait prob ile `Dot' melezleme yapıldı. `Dot' melezleme sonuçlarının, C4H, olası MerR transkripsiyon faktörü ve hipotetik protein için farklılık gösterimi metodunda elde edilen verileri doğrular nitelikte olduğu belirlendi.Gelecekte yapılacak işlevsel genomik analizleri sonunda, özellikle C4H olmak üzere MerR transkripsiyon faktör genlerine ait dizilerin tamamının belirlenmesi, A. chrysochlorus'da fenilpropanoid metabolik yolunun aydınlatılması ve fenoliklerinin artırılması yönündeki çalışmalara katkılar sağlayacaktır. Ayrıca, elde edilen sonuçların türler arasında gen homolojilerinin karşılaştırılması açısından temel bilime katkıda bulunacağı düşünülmektedir.

Abstract:
In this study, the effects of yeast extract as an elicitor and stressor on phenylpropanoid pathway especially on P450 gene expression were investigated by using directed differential display. For this purpose, we used 5´ degenerate primers which are complementary to conserved motif of the P450s in the heme-binding region which is located 250-400 bp upstream of the 3´ site.Initially, actively growing callus were obtained to establish the cell suspension cultures which were used as starting material. Actively growing callus, obtained on MS medium including 0.5 mg/l 2,4-D, were used for establishment of primary cell suspension cultures on liquid MS medium.The cell suspension cultures were established from primary cell suspension cultures in 1 mg/l 2,4-D containing MS medium. 13th day of culture was determined as the starting day of the log stage. So, total RNA was isolated from 13 ?day-old cells which were incubated with yeast extract throughout 0, 3, 6, 12 h. cDNAs were sythesised from total RNAs which obtained from 6 h elicitor treated and untreated control cultures. cDNAs were used for subsequent PCR reaction and PCR products were seperated using polyacrylamid gel electrophoresis. Differentially expressed cDNA bands were recovered from gels. 37 of 56 differentially expressed bands, were succesfully amplified by PCR. Differentially expressed and conserved P450 motif contained 16 bands were sequenced after cloning. After sequencing reactions, TBLASTX analysis indicated that these sequences were homologs to a P450 cinnamate 4-hydroxylase (C4H) which catalizes second step reaction of phenylpropanoid pathway, photosystem II P680 chlorophyll A apoprotein which is upregulated after aphid-infection, putative MerR-family transcriptional regulator and hypothetical protein.Dot blotting were performed by using probes complementary to obtained gene sequences, and total RNAs isolated at different hours following yeast extract treatment. As a result, differential display results for C4H, putative MerR-family transcriptional regulator and hypotetical protein were supported by dot blotting.Determination of C4H and MerR transcription factor complete sequences will make contributions towards studies targeting identification of phenylpropanoid metabolisim and improvement of phenolics of A. chrysochlorus. These data may also be considered to provide comparison of the homology of gene sequences between species.