Bisfenol-a tayini için alternatif bir yöntem: Alkantiyol/altın nanopartikül/3-merkaptopropiyonik asit modifiye enzim temelli biyosensör sistemi
An alternative method for the determination of bisfenol-a: Alcanthiole/gold nanoparticle/3-mercaptopropionic acid modified enzyme based biosensor system
Yazar: HATİCE CANSU TEMEL
Danışman: PROF. DR. EROL AKYILMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Altın = Gold ; Bisfenol A = Bisphenol A ; Biyosensörler = Biosensors ; Katalaz = Catalase ; Sisteamin = Cysteamine

Özet:
Çalışmanın amacı, hidrojen peroksit içeren çalışma ortamında önemli bir kanserojen olarak değerlendirilen Bisfenol A'nın katalaz enzimi üzerindeki inhibisyon etkisini dikkate alarak, BPA'nın spesifik tayini amacıyla katalaz enzim temelli yeni bir biyosensör geliştirmektir.
Bu amaç dahilinde hazırlanan karbon pasta elektrot yüzeyine ilk olarak 10 mM'lık sisteamin çözeltisi damlatıldı. Bu sayede elektrot yüzeyinde tiyol grupları oluşturuldu ve ardından damlatılan 5 nm altın nanopartiküllerin tiyol grupları üzerinden immobilizasyonu sağlandı. Modifiye elektrot üzerine 10 mM'lık 3-merkaptopropiyonik asit damlatıldı ve karboksil gruplarını aktive etmek için elektrot 50 mM'lık EDC-NHS (1:1) çözeltisine daldırıldı. Son aşamada 10 mg/ml'lik katalaz enzim çözeltisi damlatılarak biyosensör hazırlandı.Çalışmanın amacı, hidrojen peroksit içeren çalışma ortamında önemli bir kanserojen olarak değerlendirilen Bisfenol A'nın katalaz enzimi üzerindeki inhibisyon etkisini dikkate alarak, BPA'nın spesifik tayini amacıyla katalaz enzim temelli yeni bir biyosensör geliştirmektir.
Bu amaç dahilinde hazırlanan karbon pasta elektrot yüzeyine ilk olarak 10 mM'lık sisteamin çözeltisi damlatıldı. Bu sayede elektrot yüzeyinde tiyol grupları oluşturuldu ve ardından damlatılan 5 nm altın nanopartiküllerin tiyol grupları üzerinden immobilizasyonu sağlandı. Modifiye elektrot üzerine 10 mM'lık 3-merkaptopropiyonik asit damlatıldı ve karboksil gruplarını aktive etmek için elektrot 50 mM'lık EDC-NHS (1:1) çözeltisine daldırıldı. Son aşamada 10 mg/ml'lik katalaz enzim çözeltisi damlatılarak biyosensör hazırlandı. tayin aralığı, tekrarlanabilirlik, susbstrat spesifikliği, kronoamperometrik ölçümler ve örnek uygulaması amacı ile damacana suda BPA tayini ile ilgili sonuçlar elde edilmiştir.
Tasarlanan biyosensör ile diferansiyel puls voltametirisi (DPV) metodu kullanılarak -0,15 V & +0,95 V potansiyel aralıkta ve K4[Fe(CN)6] içeren ortamda ölçümler alınmıştır. H2O2 konsantrasyonu (500 μM) sabit tutulurken BPA konsantrasyonu arttırılarak ölçümler yapılmıştır. BPA'nın katalaz enzimi üzerindeki inhibisyon etkisi ile artan BPA konsantrasyonu ile orantılı akım değerleri elde edilmiştir ve standart grafiği çizilmiştir.
Deneysel çalışmalardan elde edilen sonuçlar incelenerek en iyi çalışma ortamı koşullarının 25 ºC'de 50 mM, pH 7,0 potasyum fosfat tamponu olduğu belirlenmiştir. BPA'nın doğrusal tayin aralığı 0,25 - 2,5 μM olarak bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik çalışmaları ile 0,75 μM BPA için yapılan (n=10) ölçüm ile ortalama değer (x̄)= 0, 756 μM, standart sapma (S.S.)= ± 0,769 μM ve % varyasyon katsayısı (%V.K.)= % 1,31 olarak bulunmuştur. Biyosensörün cevap süresi 22 saniyedir. Diferansiyel puls voltammetrisi ile yapılan çalışmanın tayin limiti 0,16 μM ve amperometri çalışmasının tayin limiti 0,45 μM 'dir. Son olarak 6 ay boyunca bekletilmiş damaca suda BPA tayini için hazırlanan enzim temelli elektrotla ölçümler yapılmıştır.

Abstract:
The aim of the study is to develop a new catalase enzyme-based biosensor for the specific determination of Bisphenol A, which is considered an important carcinogen based on the inhibition effect of Bisphenol A on the catalase enzyme in a working environment containing hydrogen peroxide.
For this purpose, 10 mM cysteamine solution was first dripped onto the prepared carbon paste electrode surface. In this way, thiol groups were formed on the electrode surface and then immobilization of the dripped 5 nm gold nanoparticles over the thiol groups was achieved. 3-mercaptopropionic acid of 10 mM was dripped onto the modified electrode and the electrode was immersed in a 50 mM EDC-NHS (1:1) solution to activate the carboxyl groups. At the final stage, a 10 mg/ml catalase enzyme solution was dripped and a biosensor was prepared.
By optimizing the pH, temperature and buffer system of the Cys/AuNP/3-MPA/Cat enzyme-based biosensor, the operating conditions were determined; the amount of enzymes and the size of AuNP were optimized, and the parameters related to the bioactive layer components were determined. In the studies aimed at characterizing the biosensor, results were obtained regarding the determination of BPA in the water of the vessel for the purpose of linear range of determination, repeatability, substrate specificity, chronoamperometric measurements and sample application.
Measurements were taken using the differential pulse voltammetry (DPV) method in the potential range of -0,15 V & +0,95 V and in the medium containing K4[Fe(CN)6] with the designed biosensor. While the H2O2 concentration (500 μM) was kept constant, measurements were made by increasing the BPA concentration. Due to the inhibition effect of BPA on the catalase enzyme, current values proportional to the increased BPA concentration were obtained and the standart graph was plotted.
When the results obtained from experimental studies were examined, it was determined that the best working environment conditions were 50 mM at 25 ºC and pH 7,0 potassium phosphate buffer. The linear range of determination of BPA was found to be 0,25 – 2,5 μM. After the repeatability studies, the mean value (x)= 0,756 μM with the measurement (n=10) made for 0.75 μM BPA, the standard deviation (S.S.)= ± 0,769 μM and % coefficient of variation (% V.K.)= 1,31%. The response time of the biosensor is 22 seconds. The limit of detection of the study with differential pulse voltammetry is 0,16 μM and the limit of detection of the amperometry study is 0,45 μM. Finally, measurements were made with an enzyme-based electrode prepared for the determination of BPA in the water of the vessel, which was kept for 6 months.