Sıçan ovaryumlarında farklı üreme dönemlerindeki kök hücre varlığının araştırılması ve farklılıklarının belirlenmesi
The investigation of stem cell presence in di̇fferent reproductive periods rat's ovary and determination of di̇fferences
Yazar: İREM BEKALP YILMAZ
Danışman: PROF. DR. NURCAN ARAS
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Floresan antikor tekniği = Fluorescent antibody technic ; Kök hücreler = Stem cells ; Over = Ovary ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Günümüzde, kadınlarda infertilite giderek artan ve dünya çapında milyonlarca kadını etkileyen bir sağlık sorunu haline gelmiştir. Memeli ovaryumları son derece dinamik organlar olmalarına rağmen erişkin yaşamda yeni oosit üretmemeleri kadın infertilitesi tedavisinde başarı şansını düşürmektedir. Memeli ovaryumlarının bu rejeneratif potansiyeli son yıllarda tartışmalı bir alan olmuş, ovaryumlarda germline kök hücre (GKH) ve oogonial kök hücre (OKH) varlığından söz edilmeye başlanmıştır. Ovaryum dokusundaki OKH'leri araştırmak preovaryan yetmezlik, premature menopoz, polikistik over sendromu ve kanserden kurtulan kadınlarda doğurganlığı sürdürmek ve geri kazandırmak için mevcut oositlerle çalışmak yerine yeni oosit üretme olasılıkları üzerine yapılan çalışmalara zemin hazırlayacaktır. Bu tezin amacı erişkin öncesi (2-3 hafta), erişkin (6-8 hafta) ve yaşlı sıçanlarda (25-30 hafta) memeli ovaryumundaki kök hücre varlığını araştırmak, farklı üreme dönemlerindeki yerleşimi ve dağılımını incelemektir. OCT4 (Octamer-binding transcription factor 4) ve SOX2 (SRY-box transcription factor 2) embriyonik kök hücre belirteçleri (EKB) kullanılarak kök hücre olduğu düşünülen hücrelerin flow sitometri ile belirlenmesi,  gruplar arasındaki sayısal farklılıkların ortaya konması ayrıca bu hücrelerin yerleşim ve dağılımlarının immünfloresan işaretleme ile gösterilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada her grup için 6 adet Wistar cinsi albino dişi sıçan kullanılmıştır. Sıçanların iki overi de çıkarılmış, overlerden biri flow sitometri için diğeri ise immünfloresan işaretleme için kullanılmıştır. Deneyler sonucunda, flow sitometri analizlerine göre gruplar arasında SOX2 (+) hücrelerin yüzdelerine ait medyanlar arasında anlamlı farklılık gözlenmiştir. (p<0,05). Buna göre; Erişkin öncesi sıçanların SOX2 (+) hücrelerinin (medyan değeri: % 9,25)  erişkin sıçanların SOX2 (+) hücrelerinden düşük olduğu görülmüştür (medyan değeri: % 65,10) (p<0,0001). OCT4 (+) hücrelerin yüzdelerine ait ortalamalar arasında anlamlı farklılık gözlenmemiştir (p>0,05). SOX2 ve OCT4 ifade eden hücrelerin yerleşimini incelemek için yaptığımız immünfloresan işaretleme sonucunda pozitif hücrelerin hem stromal hem de foliküler hücrelerde lokalize olduğu gözlenmiştir. Buna göre; SOX2 (+) hücrelerin tüm gruplarda çoğunlukla stromada olmak üzere foliküllerde de lokalize olduğu ancak yaşlı sıçanlarda foliküllerde çok azaldığı görülmüştür. OCT4 (+) hücrelerin ise tüm gruplarda hem stromada hem folikülerde lokalize olduğu ancak yaşlı sıçanlarda foliküllere oranla daha çok stromada lokalize olduğu gözlenmiştir. Pozitiflik gösteren hücrelerin reaksiyon kuvvetleri zayıftan kuvvetliye doğru değişim göstermiştir. Buna göre; SOX2 proteini açısından kuvvetli pozitif (+++) olan hücreler tüm gruplar arasında erişkinlerde daha fazla olduğu görülmüştür (Mean değeri:12) (p=0,043). OCT4 proteini açıcından zayıf pozitif (+) olan hücreler en yüksek yaşlılarda (Mean değeri: 39) (p=0,004), kuvvetli pozitif (+++) hücrelerin ise yine en yüksek erişkinlerde olduğu görülmüştür (Mean değeri:8) (p=0,014). Bu veriler bize memeli ovaryumlarında EKB ifade eden hücrelerin olduğunu ve bu hücrelerin farklı üreme dönemlerinde oranlarının değişebileceğini göstermektedir. EKB ifade eden bu hücrelerin gerçekten kök hücre olup olmadığı farklılaşabilme kapasitelerini gösteren deneylerle kanıtlanmalıdır.

Abstract:
Recently, infertility in women has become a health problem that is increasingly increasing and affecting millions of women worldwide. Although mammary ovaries are highly dynamic organs, they do not produce new oocytes in adulthood, thus reducing the chances of success in the treatment of female infertility. This regenerative potential of mammalian ovaries has been a controversial field in recent years and the presence of germline stem cells (GSC) and oogonial stem cells (OCS)  in ovaries. Investigating OCSs in ovarian tissue will provide the basis for studies on the possibility of producing new oocytes instead of working with existing oocytes to maintain and restore fertility in preovarian insufficiency, premature menopause, polycystic ovary syndrome and cancer survivors. The aim of this thesis is to investigate the presence of stem cells in mammalian ovarium in pre-adult (2-3 weeks), adult (6-8 weeks) and elderly rats (25-30 weeks), and to investigate the location and distribution of different reproductive periods. For this purpose, using OCT4 and SOX2 embryonic stem cell markers, flow cytometry to determine the stem cells that are thought to be stem cells, revealing numerical differences between groups, and it is aimed to demonstrate the location and distribution of these cells by immunofluorescence marking. In this study, 6 Wistar albino female rats were used for each group. both ovaries of the rats were removed, one of which was used for flow cytometry and the other for immunofluorescence marking. As a result of the experiments, according to the flow cytometry analysis, significant differences were observed between the groups for the percentages of SOX2 (+) cells (p<0.05). According to this; Percentage of pre-adult rats SOX2 (+) cells (median value: 9.25%) was significantly lower than the percentages of SOX2 (+) cells in adult rats (median value: 65.10%) (p<0.0001). No significant difference was observed between the mean percentages of OCT4 (+) cells (p> 0.05). As a result of our immunofluorescence labeling to investigate the localization of SOX2 and OCT4 expressing cells, it was observed that positive cells were localized in both stromal and follicular cells. According to this; SOX2 (+) cells were found to be localized in follicles, mostly stroma in all groups, but follicles decreased in elderly rats too. OCT4 (+) cells were found to be localized in both stroma and follicular in all groups but in older rats it was more localized than follicles. Cells showing positivity,  reaction forces varied from weak to strong. According to this; Cells with strong positive (+++) in terms of SOX2 protein were found to be higher in adults among all groups (Mean value: 12) (p=0.043). Cells with weak positive (+) in terms of OCT4 protein were found to be highest in the elderly (Mean value: 39) (p=0.004), while strong positive (+++) cells were also found in the highest adults (Mean value: 8) (p=0.014). These data show us that cells expressing embryonic stem cell marker in mammalian ovariums  and the rates of these cells may vary at different reproductive periods. Whether these embryonic stem cell marker-expressing cells are indeed stem cells should be demonstrated by their ability to differentiate