Manyetik nanopartiküllere invertaz immobilizasyonu ve biyokimyasal karakterizasyonu
Invertase immobilization and biochemical characterization of magnetic nanoparticles
Yazar: TUĞÇE DÖZ
Danışman: PROF. DR. GÜLAY BAYRAMOĞLU ; DOÇ. DR. VELİ CENGİZ ÖZALP
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Manyetik nanopartiküller üzerine enzim immobilizasyonu, enzim içeren katı fazı reaksiyon ortamından kolayla ayrılmasını sağlar ve aynı zamanda enzimin immobilizasyonu ve enzimatik reaksiyon için, hacme oranla yüksek yüzey alanı sağlar. Bu çalışmada, manyetik nano-partiküller (Fe3O4), alkali koşullar altında termal birlikte çökeltme reaksiyonu yöntemi ile sentezlendi ve (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) ile yüzeyinde silika temelli amino groupları oluşturuldu (Fe3O4@SiO2)-NH2, ve amine modifiye edilmiş nano partiküllerin amin grupları ATRP reaksiyon başlatıcısını yani bromoasetilbromidi kovalent olarak bağlamak için kullanıldı (Fe3O4@SiO2)-Br. Sonraki basamakta, yüzeyde başlatılan atom transfer radikal polimerizasyon yöntemi ile (SI-ATRP) glisidil metakrilat (GMA) aşılandı. PGMA aşılanmış çekirdek-kabuk nano-partiküller (Fe3O4@SiO2@pGMA) ve uzatıcı kol (SP) bağlanmış formu (heksametilen diamin; Fe3O4@SiO2@pGMA-SP-3), invertazın (EC 3.2.1.26, β -fruktofuranosidaz) kovalent olarak immobilizasyonu için kullanıldı. İmmobilize invertaz miktarları, Fe3O4@SiO2@pGMA ve MNPs-g-pGMA-SP-3 için sırasıyla, yaklaşık 36.1 ve 47.8 mg, ve elde edilen aktiviteler ise %54 ve %73 olarak bulundu. Buna ek olarak, immobilize edilen invertazın, serbest formuna kıyasla, pH ve sıcaklık kararlılıklarını artırdığı ve ilave olarak immobilize invertazın pH ve sıcaklık profillerin de serbest enzime kıyasla bir genişleme gözlendi. Serbest enzime göre yüksek bir ısısal kararlılık ve yeniden kullanılabilirlik göstermiştir. Kinetik sabitler Km ve vmax değerleri belirlenmiş ve serbest enzimin kinetik verileri ile invertaz ile karşılaştırılmıştır. İmmobilize invertazın, Km değeri 39.4 mmol/L ve Vmax değerleri ise 349.5 mmol/L.dak, olarak bulundu ve serbest form ile kıyaslandığında Km değeri 34.3 mmol/L ve Vmax değeri ise 387.2 mmol/L.dak olarak bulundu. Uygulanan immobilizasyon protokolünun immobilize enzim aktivitesi üzerinde çok önemli bir değişikliğe neden olmadığı gözlendi.

Abstract:
Enzyme immobilization on magnetic nanoparticles is useful method to increase efficacy in solid phase micro separation applications. Fibrous polymer grafted magnetic nanoparticles provide easy separation of biocatalyst from reaction medium and also create high surface area to volume ratio for immobilization of enzyme and enzymatic reaction. In this study, magnetic nano-particles (Fe3O4) were first silicate modified (Fe3O4@SiO2) then grafted with glycidyl methacrylate (GMA) via surface initiated atom transfer radical polymerization (SI-ATRP). The Fe3O4 nano-particles were synthesized by thermal co-precipitation reaction method under alkaline conditions. The Fe3O4 nano-particles were modified with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and bromoacetylbromide was used to create ATRP initiation sites on the silanized magnetic nano-particles. The pGMA grafted core-shell nano-particles Fe3O4@SiO2@pGMA and spacer arm (SP) attached form (i.e., hexamethylene diamine; Fe3O4@SiO2@pGMA-SP-3) were used for covalent immobilization of invertase (EC 3.2.1.26, -fructofuranosidase). The amounts of immobilized invertase were about 36.1 and 47.8 mg with retained activity of 54% and 73% on the Fe3O4@SiO2@pGMA and MNPs-g-pGMA-SP-3, respectively. Additionally, the resulting immobilized invertase had better resistance to pH and temperature inactivation in comparison to the free form, the pH and temperature profiles of the immobilized invertase were widened and it exhibited good thermal stability and reusability. Kinetic constants Km and Vmax were measured and compared to those for free invertase. The insignificant change in Km (39.4 mmol/L) and Vmax values (349.5 mmol/L min) of the immobilized invertase compared with free form (34.3 mmol/L) and (387.2 mmol/L min), respectively, revealed that the applied immobilization protocol did not have any detrimental effect on the retained activity of the invertase.