Gestasyonel diyabette mitokondriyal disfonksiyonun araştırılması
Investigation of mitochondrial dysfunction on gestational diabetes
Yazar: UMUT KEREM KOLAÇ
Danışman: PROF. ABDULLAH YALÇIN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Diabet-gebelik sırasında = Diabetes-gestational ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Mitokondrial hastalıklar = Mitochondrial diseases ; Mitokondriler = Mitochondria

Özet:
Amaç: Çalışmada ilk olarak gestasyonel diyabetli (GDM) kadınların plasentalarında, füzyon belirteçlerinin ve mitokondriyal katlanmamış protein cevabından (mtUPR) sorumlu belirteçlerin ekspresyonlarının, sağlıklı plasentalar (kontrol) ve doğumdan önce diyabete sahip (Pre-DM) kadınların plasentaları ile karşılaştırılması amaçlandı. Daha sonra yüksek glukoz ortamındaki plasenta trofoblast hücrelerinde fisyonun kimyasal olarak inhibisyonunun, mitokondri fonksiyonlarına, apoptoza, otofajiye, inflamazom ekspresyonlarına ve insülin sinyallemesi üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: İlk aşamada, kontrol (n=17), GDM (n=20) ve Pre-DM (n=10) gruplarındaki plasentalarda füzyon dinamikleri ve mitokondriyal biyogenezde görevli mRNA ekspresyonları qPCR ile karşılaştırıldı. Sonra bu gruplarda vücut kitle indekslerine göre bir alt gruplandırma yapılarak gruplar "obez ve zayıf" olarak tekrar ayrıldı. Bu gruplarda yine füzyon dinamikleri ve mitokondriyal biyogenezde görevli mRNA ekspresyonları qPCR ile saptandı. Ardından füzyon belirteçleri ile mtUPR' de görevli protein ekspresyonları western blot ile tespit edildi. İkinci aşamada trofoblast hücreleri normal (5mM) ve yüksek glukoz (25mM) ortamında 24 saat ve 48 saat kültüre edildi. Bu uygulamada hücrelerdeki fisyon ve füzyon belirteçleri western blot ile saptandı. Ardından hücrelere fisyon inhibitörleri mdivi-1, dynasore ve P-110 iki farklı dozda uygulanarak fisyonun inhibe edilmesi sağlandı. Fisyon inhibisyonuyla birlikte insülin sinyali ve otofaji yolunda görülen değişiklikler western blot ile saptandı. Daha sonra qPCR ile füzyon belirteçleri, mitokondriyal antioksidan enzim kapasiteleri, otofajide, apoptozda ve mtUPR' de görevli mRNA ekspresyonları ile inflamazom mRNA ekspresyonları tespit edildi. Akabinde hücrelere canlılık testi uygulandı. Son olarak akış sitometrisiyle mitokondri potansiyeli ve hücredeki reaktif oksijen türevleri (ROS) durumları belirlendi.
Bulgular: İlk kısımda GDM ve Pre-DM gruplarında kontrol grubuna kıyasla füzyon belirteçlerinde anlamlı bir azalma tespit edildi. Obez ve zayıf olarak ayrılan alt gruplarda obezitenin füzyon üzerine etkisi vardı. Fakat hastalar obez olsun ya da olmasın diyabet, mitokondri füzyonunun, mitokondri biyogenezinin ve mtUPR cevabının azalmasına neden oldu. İkinci kısımda yüksek glukoz ortamında trofoblast hücrelerinde fisyon anlamlı olarak artarken füzyon azaldı. Bu artış inhibitörlerle bloke edildiğinde insülin sinyalinde bir düzelme saptandı. Ayrıca mitokondriyal fisyonun engellenmesi ROS' un anlamlı derecede azalmasını ve mitokondriyal antioksidan enzim mRNA ekspresyonlarının artmasını sağladı. mtUPR' de görevli protein ekspresyonları fisyonun inhibe edilmesine yanıt olarak anlamlı derecede azaldı. Dahası fisyon inbisiyonu hücrelerde apoptozun önüne geçilmesine katkıda bulunurken, inflamazom mRNA ekspresyonlarını anlamlı derecede azalttı. Son olarak yüksek glukoz nedeniyle düşen mitokondri potansiyeli, fisyonun inhibisyonuyla anlamlı derecede arttı.
Sonuç: GDM ve Pre-DM plasentada mitokondri füzyonunda ve biyogenezinde bir azalmaya yol açmaktadır. Obezite bu azalmaya katkıda bulunurken diyabet etkeni bu azalmanın ana nedenidir. Benzer şekilde füzyon ve mtUPR protein seviyeleri GDM ve Pre-DM plasentalarında azalmıştır. Trofoblast hücrelerinde fisyonun inhibe edilmesini sağlayan kimyasallar, hamilelikte görülen diyabet tablolarında potansiyel terapötikler olarak; başta mitokondri fonksiyonunda iyileşmeye olanak sağlamış, insülin sinyalini düzenlemiş, apoptozun, otofajinin ve inflamazom ekspresyonlarının önüne geçilmesini sağlamıştır.

Abstract:
Objective: In this study, the expressions of fusion markers and markers responsible for mitochondrial unfolded protein response (mtUPR) in the placentas of women with gestational diabetes (GDM) were compared with those of healthy placentas (control) and placentas of women with pregestational diabetes (Pre-DM). After, the effects of chemical inhibition of fission in placental trophoblast cells in high glucose environment on mitochondrial functions, apoptosis, autophagy, inflammasome expressions and insulin signaling were investigated.
Material and Methods: In the first stage, mRNAs involved in mitochondrial biogenesis and fusion dynamics in placentas of the control (n=17), GDM (n=20) and Pre-DM (n=10) groups were compared with qPCR analyses. According to body mass indexes groups were then divided into "obese and lean" subgroups again. In these subgroups, mRNA expressions of fusion dynamics and mitochondrial biogenesis were determined by qPCR. Protein expressions involved in fusion and mtUPR were detected by western blot. Following stage of the study, trophoblast cells were cultured in normal (5mM) and high glucose (25mM) media for 24 hours and 48 hours. Fission and fusion proteins in cells were then detected by western blot. Fission inhibitors mdivi-1, dynasore and P-110 were applied to the cells in two different doses to inhibit the fission. Changes in insulin signaling and autophagy pathway with inhibition of fission were detected by western blot. mRNA expressions involved in autophagy, apoptosis and mtUPR and inflammasome were detected by qPCR. The MTT cell viability test was then permormed. Finally, mitochondrial potential and reactive oxygen derivatives (ROS) status in the cell were determined by flow cytometry.
Results: A significant decrease in fusion markers was detected in the GDM and Pre-DM groups compared to the control group. Obesity had an effect on fusion in obese and lean subgroups. But whether the patients were obese or not, diabetes resulted in decreased mitochondrial fusion, mitochondrial biogenesis, and mtUPR response. An improvement in insulin signal was detected by blocking the increased fission due to high glucose. In addition, inhibition of mitochondrial fission significantly decreased ROS and increased mitochondrial antioxidant enzyme mRNA expressions. Protein expressions involved in MtUPR were significantly reduced in response to inhibition of fission. Moreover, fission inhibition contributed to the prevention of apoptosis in cells, while significantly reducing their inflammasome mRNA expression. Finally, the mitochondrial potential, which was reduced due to high glucose, was significantly increased by inhibition of fission.
Conclusion: GDM and Pre-DM cause a decrease in mitochondrial fusion and biogenesis in the placenta. While obesity contributes to this decrease, diabetes is the main reason. Similarly, fusion and mtUPR protein levels were decreased in GDM and Pre-DM placentas. Chemicals that inhibit fission in trophoblast cells as potential therapeutics in gestational diabetes, allowed improvement in mitochondrial function, regulated insulin signaling, and prevented apoptosis, autophagy and inflammasome expressions.