Erkek sıçan (Rattus norvegicus) böbrek prolaktin reseptör mRNA çeşitliliğinin belirlenmesi
Determination of male rat (rattus norvegicus) kidney prolactin receptor mRNA  diversity
Yazar: MESUT CİHAN AYDEMİR
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET AKİF KILIÇ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Prolaktin reseptörü (PRLR) ve onunla ilişkili prolaktin hormonu (PRL), çoğunlukla laktasyon ve üreme ile ilgili fonksiyonları ile tanınmakla birlikte,  omurgalılarda; ozmoregülasyon, proliferasyon, immünoregülasyon ve davranışında içinde bulunduğu 300'den fazla fonksiyon ile ilişkilendirilmiştir. 

Sıçan PRLR geni (s-prlr) yaklaşık 190 kbç büyüklüğünde olup, en az iki farklı mRNA ve bunların ürünleri olan uzun ve kısa form (UF ve KF) olarak adlandırılmış iki farklı protein kodlamaktadır. PRLR'nin insanda 11, farede 4, domuz ve sıçanda ise 2 varyantı bilinmektedir. Bu varyantlar, ya mRNA'nın 3' ucunun farklı ekzonlar ile sonlanması (ekzon 10 veya 11, sıçan UF ve KF'de olduğu gibi) ya da 'iç ekzonların' (ekzon 3 ile 9 arası) bir ya da bir kaçının çıkarılması sonucu oluşmaktadır. Fare prlr geni ve ürünü olan mRNA'ları 3' ucu ekzonları ile farklılık gösteren bir uzun (ekzon 10) ve üç kısa form (ekzon 11, 12 ve 13) prolaktin reseptörü kodlamaktadır.

Bu çalışmanın amacı sık kullanılan bir model organizma olan sıçanda (Rattus norvegicus) olası yeni PRLR varyantlarının araştırılması ve 3' UTR bölgelerinin aydınlatılması olmuştur. Bu amaç doğrultusunda, ilk olarak 'iç ekzon' ve '3' ucu' varyantları aranmıştır. Bunu takiben, farede varlığı bilinen (ekzon 11 ve 12) ancak sıçanda ifade edilip edilmediği bilinmeyen ekzon varyantlarının varlığı araştırılmıştır. Son olarak da, sıçan PRLR UF ve KF'nin 3' ifade edilmeyen bölgelerinin (3' UTR) dizilerinin açığa çıkarılması hedeflenmiştir.

İç ekzon ve 3' ucu varyantlarının aranması için protein kodlayan ekzonları hedef alan primer çiftleri sıçan prlr geni referans alınarak tasarlanmıştır. Farede ifade edilen (ekzon 11 ve 12) ancak sıçanda bilinmeyen bu ekzonların homologları sıçan ve diğer kemirgen prlr genlerinde araştırılmış ve sıçanda yüksek bir homoloji ile korunduğu bulunmuştur. Bu bilgi doğrultusunda, yine sıçan prlr gen dizisi referans alınarak bu olası ekzonlara özgü primerler tasarlanmıştır. Sıçan PRLR varyantlarının 3' UTR dizilerinin aydınlatılması içinde, hem 3' UTR bölgelerini 1hem de bu mRNA'ların poli (A) kuyruklarını hedef alan primer setleri tasarlanmıştır. 

Bu amaçların gerçekleştirilmesi için erkek ve dişi sıçan böbrek, karaciğer ve testislerinden toplam RNA ve mRNA izolasyonları yapılmıştır. Bu RNA'lardan rivörz transkriptaz reaksiyonu (RT-PCR) ile ilk iplik cDNA sentezi gerçekleştirilmiş ve devamında da çeşitli PCR yaklaşımları ile (3' RACE, Nested PCR ve Stepdown PCR) istenen bölgenin çoğaltılması hedeflenmiştir.  Elde edilen amplifikasyon ürünlerinin baz dizilemesi hizmet alımı ile gerçekleştirilmiştir.

3' ve iç ekzon varyantlarının aranması için gerçekleştirilen reaksiyonlar sonucunda sıçan PRLR UF ve KF'nin çoğaltılması gerçekleştirilmiş ancak bu formların ekzon 10 veya 11 varyantlarına ya da ekzon 3 ile 9 arası varyantlarına rastlanmamıştır. Farede protein kodlayan (ekzon 11 ve 12) ve sıçanda da yüksek homoloji ile korunduğu ortaya konan bu ekzonlara yönelik tasarlanan primerler ile PCR reaksiyonları gerçekleştirilmiş ancak bu bölgelerin ifade edildiğine yönelik bir bulguya rastlanmamıştır. Analiz edilen sıçan böbrek, karaciğer ve testislerinde; sıçan PRLR 3' ve iç ekzon varyantlarının bulunmadığını göstermektedir. Bu bilgiler ışığında daha önceki yapılan çalışmalarda Northen Blot yöntemi ile farklı boyutlarda elde edilen sıçan PRLR mRNA'larının hepsinin uzun ve kısa forma ait olduğu ve bu yüksek boyut farkının önemli bir kısmının 3' UTR'lerinden kaynaklandığı sonucuna varılmıştır.

Sıçan PRLR varyantlarının 3' UTR'lerin aydınlatılmasına yönelik gerçekleştirilen reaksiyonlar, kısa formun yaklaşık 501-505 bç'lik bir 3' UTR bölgesine sahip olduğunu ve uzun formunda iki farklı 3' UTR bölgesine sahip olabileceğini işaret etmiştir. Bu formun 3' UTR bölgelerinden birinin yaklaşık 2000 bç'lik dizisi aydınlatılmıştır. 

Sunulan tez projesinin kapsamı, sıçan erkek böbreği ile sınırlandırılmış olsa da, bu tez çalışmasında erkek ve dişi sıçanların böbrek, karaciğer ve testisleri yeni PRLR varyantlarının tanımlanması için kullanılmıştır. Çalışılan her iki cinsiyet ve tüm organlarda PRLR uzun ve kısa formun varlığı başarı ile gösterilmiş ancak bunların yeni 3' veya iç ekzon varyantlarına rastlanmamıştır. Fareye özgü varyantları kodlayan ekzonların bazı kemirgenlerde, özellikle sıçanda iyi korunmuş olduğu görülmüşse de, bu ekzonların sıçan karaciğer, böbrek ya da testisinde ifade edildiğine dair bir ip ucuna rastlanmamıştır.

Abstract:
Prolactin receptor (PRLR) and its cognate hormone (prolactin, PRL) involve in over 300 different functions, including osmoregulation, immunoregulation, fat store regulation, proliferation, tumorigenesis and behaviour as well as its well known role in lactation and reproduction.

Rat prolactin gene (r-prlr) is about 190 kb and codes at least two different isoforms, named Long and Short forms (LF and SF). So far, 11 variants in human, 4 variants in mouse and 2 variants in pig and rat were identified. Some of these variants are formed either by substitution of exons in 3' ends of mRNAs (such as exons 10 and 11, in the LF and SF, respectively) or exclusion of one or few internal exons of 'the core exons', namely between exons 3 to 9. 

The aim of this project was to investigate possibility of new rat PRLR variants and also to identify the 3' UTR of PRLR mRNAs. In order to this, first the 'internal exon' and the 3' end variants were searched and  then, the possibility of expression of mouse SF exon variants (exons 11 and 12), their expression in rats are not known, in rat organs were investigated. Finally, the 3' UTR sequences of rat L- and SF PRLRs were tried to be revealed.

PCR primer sets, were used to investigate the  'internal exon' and the 3' end variants, were designed using rat prlr genome and its mRNA sequences. It is known that mouse prlr gene contains extra two more exons (exons 11 and 12) and their expression is not known in rats. A homology search were performed in rat and other available rodent prlr genes and it is found that these mouse exons (11 and 12) are highly conserved in the rat and some rodents. Therefore, primer sets, targeting the potential exons, were designed using rat prlr sequence. For determination of 3' UTR regions of rat PRLR mRNAs, primers were designed, targeting 3' UTR regions and poly A ends of the mRNAs.

Organs (kidney, liver and testis) were collected from 22-24 weeks-old male and female rats and they were used for total RNA and mRNA isolations. Single strand cDNAs were synthesised by a reverse transcription reaction (RT-PCR) using either poly T or poly T Adaptor primers and then target PRLR regions were amplified using specific primers by either Standard PCR and/or other PCR applications (3' RACE, Nested PCR and Stepdown PCR). PCR products were run on 1-1.5% agarose gels and bands corresponding to expected amplicon sizes were sent for sequencing and provided sequences were analysed using appropriate programs.

Amplification products of agarose gels showed that all organs express the core region of PRLR gene (exons 3 to 9) as well as known rat PRLR variants (e.i L- and SFs). On the other hand, no specific amplification products were obtained for 3' (exons 10 and 11) and internal exon variants. In order to find out whether mouse exons (11 and 12, expressed in mouse but not known in rat) were also expressed in rats, PCR reactions were performed using specific primers but no rat prlr gene specific products were observed in both sexes and all organs. Using gene specific primers or gene specific and adaptor primer sets, it was found that SF PRLR mRNA has a 3' UTR region, about 500 bp, and LF PRLR mRNA contains a 3' UTR region, longer than 2 kbp as its about 2000 bp were successfully amplified and sequenced. 

Although the thesis project is on male rat kidney, in this study both sexes (male and female) and their organs (kidneys, livers and testis) were studied for identification of new PRLR variants. In both sexes and all organs, rat PRLR L- and SFs were successfully amplified but no new PRLR variants (3' end or internal exon) were observed. It also seems that highly conserved mouse exons were not expressed in rat kidney, liver or testis.