Keçi (Capra aegagrus Hircus) böbreğinden aldoz redüktaz ve sorbitol dehidrogenaz enzimlerinin saflaştırılması, 
karakterizasyonu ile bazı ilaç ve metallerin enzim  
aktiviteleri üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification, characterization of aldose reductase and sorbitol dehydrogenase enzymes from goat (Capra aegagrus Hircus) kidney and investigation of some drugs'and metals effects on enzymes activity
Yazar: MAHİNUR KIRICI
Danışman: PROF. DR. ŞÜKRÜ BEYDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Hiperglisemi durumunda aktif olabilen poliol yolağı enzimleri Aldoz redüktaz (AR) (Alditol: NADP+ 1- oksidoredüktaz, E.C. 1.1.1.21) ve Sorbitol dehidrogenaz (SDH) (L-İditol: NAD+ oksidoredüktaz, EC 1.1.1.14) keçi (Capra aegagrus hircus) böbreğinden saflaştrıldı, karakterize edildi, bazı ilaç ve metallerin enzim aktiviteleri üzerine etkileri incelendi. AR enziminin saflaştırması; homojenat hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sephadex iyon değişim kromatografisi, Sephadex G-100 jel filtrasyon kromatografisi ve 2', 5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi olmak üzere 5 basamakta gerçekleştirildi. SDH enziminin saflaştırma işlemi ise homojenatın hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sephadex iyon değişim kromatografisi ve CM-Selüloz C-50 iyon değişim kromatografisi olmak üzere 4 basamakta gerçekleştirildi. AR enzimi 2,73 EÜ/mg protein spesifik aktivite ile %0,14 verimle, yaklaşık 35 kat saflaştırıldı. SDH enzimi ise 19,6 EÜ/mg protein spesifik aktivite ile %0,05 verimle, yaklaşık 124,05 kat saflaştırıldı. Enzimlerin saflık kontrollerini yapmak ve alt birim molekül kütlelerini tespit etmek için SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı. Her iki enzimin optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, stabil pH'ları belirlendi. AR ve SDH enzimlerinin alt birimlerinin mol kütleleri ise SDS-PAGE ile sırasıyla 47 kDa ve 48,11 kDa olarak bulundu. Ayrıca iki enziminde substratları için KM ve Vmax değerleri belirlendi. Daha sonra keçi (Capra aegagrus hircus) böbrek AR enzimi ve SDH enzimi aktivitesi üzerine bazı ilaç ve metallerin inhibisyon etkileri incelendi. İnhibisyon gösteren ilaç ve metaller için Lineweaver-Burk grafikleri yardımıyla Ki sabitleri ve inhibisyon tipleri tespit edildi.

Abstract:
In case of the polyol pathway hyperglycemia can be active enzymes; Aldose reductase (Alditol: NADP+ 1- oxidoreductase, E.C. 1.1.1.21) and sorbitol dehydrogenase (L-iditol: NAD+ oxidoreductase, EC. 1.1.1.14). The both enzyme were purified from goat (Capra aegagrus hircus) kidney, characterized and effects of some drugs and metals on these enzymes activities were investigated. The purification of AR consists of five steps; They were preparation of homogenate, ammonium sulphate precipitation, DEAE-Sephadex ion exchange chromatography, Sephadex G-100 gel filtration chromatography and 2',5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography. The four steps of purification of SDH are preparation of homogenate, ammonium sulphate precipitation, DEAE-Sephadex ion exchange chromatography and CM-Cellulose C-50 ion exchange chromatography. AR enzyme was obtained having a specific activity of 2.73 EU/mg proteins with a yield of 0.14% and approximately 35 fold. SDH enzyme was obtained having a specific activity of 19.6 EU/mg proteins with a yield of 0.05%and approximately 124.05 fold. SDS-PAGE was carried out to check the purity of both enzymes and to determine molecular weight of subunits. Optimal pH, optimal ionic strength, optimal temperature and stable pH were determined for both enzymes. The molecular weight of subunits determined by SDS-PAGE were calculated as; 47 kDa and 48,11 kDa respectively. Besides, KM and Vmax values for each substrates of two enzymes were calculated. Then the effects of some antibiotics and metas on goat (Capra aegagrus hircus) kidney AR and SDH activities were examined. For drugs and metals that exhibit inhibitory effect, Ki constants were calculated and inhibition types were determined by using Lineweaver-Burk curves.