Cinsel yolla bulaşan enfeksiyon etkenlerinin tanısında kullanılan konvansiyonel yöntemler ve DPO TM (dual priming oligonükleotid) tabanlı multipleks PCR yönteminin karşılaştırılması
Comparison of conventional methods used in the diagnosis of sexually transmitted infectionsand DPO TM (Dual priming oligonükletid) based multiplex PCR method
Yazar: DEMET FURKAN SEVİNDİ
Danışman: DOÇ. DR. BERRİN ESEN
Sağlık Bakanlığı / Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Cinsel temasla bulaşan hastalıklar = Sexually transmitted diseases ; Cinsellik = Sexuality ; Enfeksiyon = Infection ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar (CYBE); sık görülmeleri, ciddi komplikasyon ve sekellere neden olmaları, önemli ekonomik kayıplara yol açmaları nedeniyle, gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde önemli halk sağlığı problemleri arasında sayılmaktadır. Gelişmekte olan ülkelerde, cinsel yolla bulaşan enfeksiyon etkenleri (CYBE) ve komplikasyonları, yetişkin sağlık hizmetlerinde en sık rastlanan ilk 5 hastalık kategorisi içinde yer almaktadır. Çalışmamızda; CYBE etkenleri içinde dünyada da sık karşılaşılan ve önemli sayılan Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, ve Trichomonas vaginalis'in tanımlanmasında kullanılan, konvansiyonel yöntemler ve yeni bir yöntem olan DPOTM (Dual priming oligonükleotid) tabanlı multipleks PCR yönteminin karşılaştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca bu yöntemin, non-invaziv olarak elde edilen idrar örneklerinde de benzer çalışmanın yapılmasına olanak tanıması sebebi ile invaziv servikal/üretral örneklerle alınan sonuçların karşılaştırılması da hedeflenmiştir.
	Metodolojik tipte olan çalışmamıza, Şubat- Mayıs 2013 döneminde T.C. Sağlık Bakanlığı Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi (AEAH) Üroloji Polikliniği ve Kadın Hastalıkları ve Doğum Polikliniği'ne başvuran semptomatik 46 erkek ve 50 kadın hasta olmak üzere toplam 96 hasta dahil edilmiştir. Konvansiyonel yöntemler olarak;  N. gonorrhoeae tanısı için kültür ve direkt mikroskopi (DM), C. trachomatis için ticari Direkt Floresan Antikor Testi (DFA) (Fluorotect® Chlamydia, Omega Diagnostics, İngiltere), T. vaginalis için direkt bakı ve Modifiye Diamond kültür ekimi uygulandı. M. hominis ve U. urealyticum için kültür tabanlı ticari identifikasyon kiti (MYCOFAST® EvolutioN 3) kullanıldı. DPOTM Multipleks PCR yöntemi için nükleik asit izolasyonu;  GeneAll® Ribospin™ vRD ekstraksiyon kiti (GeneAll BiotechnologyCo., LTD, Seoul, Kore) ve DNA amplifikasyonu, Seeplex ® STD6 ACE Detection kiti (Seegene, Seoul, Kore) ile üreticinin talimatlarına göre yapılmıştır. N. gonorrhoeae, C.trachomatis, T. vaginalis ve M. genitalium etkenleri için sürüntü örneklerinde pozitif çıkan 22 hasta, multipleks PCR ile idrar örneklerinden de çalışılmıştır. 
	Çalışmamıza katılan 96 hastanın 38'inde (%39,6) çalışılan tüm yöntemler ile her hangi bir etken saptanmamıştır. Pozitiflik saptanan 58 hastanın 10'unda sadece Candida spp.üremesi görülmüştür. Çalışma kapsamındaki etkenler araştırıldığında, 48 hastanın 32'sinde (%66,7) tek etken pozitifliği mevcutken, 16'sında (%33,3) çoklu etken pozitifliği saptanmıştır. Etkenlerin görülme sıklığına baktığımızda; N. gonorrhoeae %7,3 (7/96), C.trachomatis %8,3 (8/96), T. vaginalis %4,2 (4/96), M. genitalium %6,3 (6/96), M. hominis %11,5 (11/96), U. urealyticum %33,3 (32/96) oranlarında kullanılan bir veya iki yöntem ile pozitif olarak bulunmuştur. En sık görülen etken U. urealyticum iken ikinci sırayı M. hominis takip etmiştir. Multipleks PCR'ın gonokok kültürü, gonokok DM'si ve klamidya DFA testine göre duyarlılık, özgüllük, PPD ve NPD'i hepsi için %100 olarak bulunmuştur. Multipleks PCR'ın Mycofast kiti ile karşılaştırıldığında duyarlılık, özgüllük, PPD ve NPD'i sırasıyla mycoplasma için %88,9, %97,7, %80, %98,8 ve ureaplasma için %77,8, %82,1, %50 ve %94,1 olarak saptanmıştır. Trichomonas kültür ve DM'si ile karşılaştırıldığında multipleks PCR'ın duyarlılık, özgüllük, PPD ve NPD'i sırasıyla kültür için %100, %97,9, %50,0, %100 ve DM için %100, %96,8, %25,0, %100 olarak bulunmuştur. Sadece multipleks PCR çalışılan M. genitalium için hastaların 6'sında (%6,3) akıntı örneğinde, 5'inde idrarda pozitiflik saptanmıştır. Pozitif 22 hastanın idrar ve sürüntü örneğinde çalışılan multipleks PCR bulgularına bakıldığında, çok ve tek etken pozitifliği görülen 16 hastanın (%72,7) sonuçlarının tam olarak uyumlu olduğu gözlenmiştir. 
	Kullanılan DPO TM Multipleks PCR'ın yüksek duyarlılığa sahip olduğu ve bazı etkenlerin tespitinde artışa neden olduğu gözlenmiştir. Aynı anda birden fazla etkenin hızlı tanısını sağlaması nedeniyle CYBE etkenlerinin taraması veya sürveyansında kullanılabilecek başarılı bir yöntem olduğu düşünülmüştür. Bulaşmayı en aza indirmek için hızlı tanı ve tedavi önemli olduğundan multipleks PCR avantajlı görünmektedir. Ayrıca non-invaziv idrar örnekleri ile invaziv örnekler arasında multipleks PCR'ın rölatif uyumlu olması dikkat çekmiştir.
Anahtar Kelimeler: Cinsel yolla bulaşan enfeksiyon etkenleri, konvansiyonel yöntemler, multipleks PCR

Abstract:
Sexually transmitted diseases (STDs) are accepted as one of the major public health problems in developed and developing countries due to that they are encountered frequently, cause serious complications and sequelae, give rise to significant economic losses. In developing countries, the pathogens of sexually transmitted diseases (STDs) and its complications are included in the first five diseases categories which are the most common in adult health services. The aim of this study was to compare the conventional methods and a new method, DPOTM (Dual Priming Oligonucleotide)-based multiplex PCR method, that are used to identify Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, and Trichomonas vaginalis which are the most common pathogens of STDs in the world and regarded as important microorganisms. In addition, due to that this method enables to carry out the similar study on urethral samples obtained as non-invasive, it was also aimed to compare the results of invasive samples such as cervical / urethral.
	Totally 96 patients, 46 male and 50 female patients with symptoms, attended to Turkey Ministry of Health, Ankara Training and Research Hospital (AEAH) Department of Urology and Obstetrics and Gynecology were included in our methodological type study. As conventional methods; culture and direct microscopy for determination of N. gonorrhoeae, trade Direct Fluorescent Antibody Test (DFA) (Fluorotect® Chlamydia, Omega Diagnostics, İngiltere) for C. trachomatis, direct microscopy and Modified Diamond culture were performed for T. vaginalis. Culture based trade identification kit (MYCOFAST® EvolutioN 3) was used for M. hominis and U. urealyticum. In DPOTM Multiplex PCR method GeneAll® Ribospin™ vRD extraction kit (GeneAll Biotechnology Co., LTD, Seoul, Kore) is used, for nucleic acid isolation and for DNA amplification Seeplex ® STD6 ACE Detection kit (Seegene, Seoul, Kore) is used in accordance with manufacturer's instruction. Urine samples of totally 22 patients who were found to be positive in swab samples for pathogens of N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis and M. genitalium were also studied with multiplex PCR. 
	No pathogen was identified in 38 of 96 patients ( 39.6%) by any of the methods. Candida spp. was the only pathogen isolated in the 10 of 58 patients who were detected as positive. When the pathogens were investigated within the scope of study, while a single pathogen was detected in 32 of 48 patients (66.7%), multiple pathogens were detected in 16 of 48 patients (33.3 %). The prevalence of pathogens were; 7.3% (7/96) for N. gonorrhoeae, 8.3% (8/96) for C. trachomatis, 4.2% (4/96) for T. vaginalis, 6.3% (6/96) for M. genitalium, 11.5% (11/96) for M. hominis, 33.3% (32/96) for U. urealyticum by either one or two test methods. While the most prevalent pathogen was U. urealyticum, M. hominis was detected as second pathogen. The sensitivity, specifity, Positive Predictive Value (PPV), Negative Predictive Value (NPV) of Multiplex PCR were found as 100% for all of the tests applied; N. gonorrhoeae culture, N. gonorrhoeae DM, chlamydial DFA. When multiplex PCR was compared with Mycofast kit, sensitivity, specificity, PPV, and NPV were detected as 88.9%, 97.7%, 80%, 98.8% for mycoplasma and 77.8%, 82.1%, 50% and 94.1% for ureaplasma, respectively. When multiplex PCR was compared with Trichomonas culture and Trichomonas DM, sensitivity, specificity, PPV, and NPV were detected as 100%, 97.9%, 50%, 100% for culture and 100%, 96.8%, 25% and 100% for DM, respectively. M. genitalium was detected in swab samples of 6 (6.3%) and in urine samples of 5 patients by multiplex PCR which is the only method studied for the detection of this patogen. When the findings of multiplex PCR studied on urine and swab samples of 22 patients detected as positive were analyzed, it was observed that the result of 16 (72.7%) patients in whom single and multiple pathogens detected positive, were fully compatible with mutiplex PCR.
It was observed that DPO TM Multiplex PCR has high sensitivity and cause an increase for detection of some of the pathogens. It was considered to be a convenient method for screening or surveillance of STD providing the rapid detection of multiple pathogens at the same time. As rapid detection and treatment of an infection is important to minimize the contagion, multiplex PCR seems to be advantageous. It was also noted that multiplex PCR is relatively compatible for invasive and non-invasive urine samples.
Keywords: Sexually transmitted infectious pathogens, conventional methods, multiplex PCR