Ratlarda deneysel serebral iskemi sonrası riociguat ve resveratrol kombine tedavinin nöroprotektif etkilerinin araştırılması
İnvastigation of the neuroprotective effects of combined treatment of riociguat and resveratrol after experimental cerebral ischemia i̇n rats
Yazar: BARIŞ ASLANOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. YAHYA TURAN
Dicle Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Resveratrol = Resveratrol ; Riociguat = Riociguat ; Sıçanlar = Rats ; İskemi = Ischemia

Özet:
Giriş ve Amaç: Vasküler patolojiler dışında başka bir neden olmadan meydana gelen beynin işlevsel fonksiyon bozukluğu olarak tanımlanan inme en önemli mortalite ve morbidite nedenleri arasındadır. Hemorajik ve iskemik olmak üzere iki grupta incelenir. İnmelerin yaklaşık %88'ini oluşturan iskemik inmelerin büyük çoğunluğu MCA'nın beslediği bölgelerde görülür. Günümüzde iskemik inme tedavisinde 2 tedavi yaklaşımı ön plana çıkmaktadır. Bunlar nöroproteksiyon ve rekanalizasyondur. Rekanalizasyonda onaylanan tek medikal tedavi rtPA'dır. İskemik inmeden sonraki ilk 4,5 saatte kullanılabilmesi nedeniyle kullanımı oldukça sınırlıdır. Bu nedenle daha geniş kullanımı olabilen tedaviler için çalışmalar devam etmektedir. 
	İskemik inmede birçok karmaşık mekanizma rol almaktadır. Nöroproteksiyon bu moleküler ve biyokimyasal olayların engellenip veya yavaşlatılmasıyla iskemiye karşı beyni koruma çabasıdır. Bu amaçla anti eksitotoksisite, antioksidan, anti inflamatuvar, anti apoptotik ajanlar kullanılmıştır. 
	Başlıca üzümde, kırmızı şarapta, yer fıstığında bulunan resveratrol nöroprotektif, antiinflamatuvar, antikanserojenik, kardioprotektif olmak üzere birçok etkisi olan bir fitoaleksindir.
	Vasküler düz kasların gevşemesine neden olan bir guanilatsiklaz stimulatörü olan riociguat kardiak çalışmalarda iskemik alanı küçülttüğü gösterilmesine rağmen serebral iskemide henüz çalışılmamış bir vazodilatatördür.
	Bu iki ilaç kombinasyonunun serebral iskemi sonrası etkilerini araştırdık.
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda rastgele seçilmiş ağırlıkları 328,53 ± 47,20 olan 35 adet Wistar albino cinsi dişi ratlar kullanıldı. 80 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin ile anestezi verildikten sonra sağ external karotid arterden girilerek internal karotid artere yönlendirilen sütur ilerletilerek MCA oklüzyonu sağlandı. 2 saat bekletilip iskemi oluşturuduktan sonra sütur geri çekilerek reperfüzyon sağlandı. Ratlar 7'li 5 gruba ayrıldı. 1. grup hiçbir işlem yapılmayan grup, 2. Grup iskemi oluşturulan grup, 3. Grup iskemi sonrası riociguat verilen grup, 4. Grup iskemi sonrası resveratrol verilen grup ve son olarak 5. Grup iskemi sonrası resveratrol + riociguat verilen grup olarak ayrıldı. Resveratrol (p.o.) 30 mg/kğ/gün dozunda riociguat(i.p.) ise 10 mg/kğ/gün dozunda 2 gün verildi. Tedavilerden sonra tekrar anestezi verilen ratlar sakrifikasyondan önce torakotomi yöntemiyle intrakardiyak kanları alındı. Sağ hemisferler %10'luk formaldehit içerisinde oda sıcaklığında fikse edildi.
	Alınan kesitler hemtatoksilen & eosin ile boyandı. Kesitlerde hücre çekirdeklerinde piknozis, perivasküler ve perinöral ödem, vasküler dilatasyon, konjesyon, reperfüzyon sonrası kanama odakları değerlendirildi. Ayrıca alınan kesitler parafin bloklarına gömülüp üzerlerine bax ve bcl-2 antikorları damlatılarak sinyal oluşumları gözlendi.
Bulgular:  Çalışmamızda beyin dokusunda hemoraji alanları, nöron ve glial hücre çekirdeklerinde piknozis, perinöral ve perivasküler ödem, damar lümenlerindeki konjesyon, bax ve bcl-2 ekspresyonlarına bakıldı. İskemi grubunda fokal ve diffuz hemoraji alanları, nöron ve glial hücrelerde piknotik çekirdekli hücrelerde artış, perinöral ödem, damar lümeninde konjesyon, aşırı bax ekspresyonu ve bcl-2 immunpozivitesinde kontrol grubuna göre azalma gözlendi. İskemi sonrası riociguat verilen grupta ise hemorajik alanların kaybolduğu, nöron ve glial hücrelerde piknotik çekirdekli hücrelerin oldukça azaldığı, damarların dilate olduğu, konjesyonun görülmediği, perivasküler ödemin oldukça azaldığı, bax immunopozivitesi azalıp kontrol grubuyla benzer olduğu, bcl-2 immunopozivitesi ise özellikle aksonlarda arttığı gözlendi. İskemi sonrası resveratrol verilen grupta ise hemorajik alanların önemli oranda azaldığı, konjesyon, perinöral ödem, nöron ve glial hücrelerde piknozis görülse de iskemi grubuna göre oldukça azaldığı görüldü. Bax immunopozivitesi kontrol grubuyla benzerlik gösterirken bcl-2 immunopozitifliği kontrol ve iskemi gruplarına benzer lokalize olmuştu ancak pozitifliğin özellikle sinir liflerinde kontrol grubuna daha yakın olduğu görüldü. İskemi sonrası riociguat ve resveratrol verilen grupta ise damarların dilate olduğu, nöron ve glial hücrelerde piknotik çekirdekli hücrelerin azaldığı perinöral ve perivasküler ödemin kaybolduğu gözlemlendi. Kombine tedavi verilen grupta bax immunopozivitesi yok denecek kadar az iken bcl-2 immunopozivitesi iskemi gruplarına göre oldukça yoğun olduğu görüldü.
Sonuç: İskemik inmede riociguat ve resveratrol kombine tedavisinin nöroprotektif olduğu, apoptozu önlediği ve reperfüzyon sonrası kanamayı azalttığı görülmüş olup iskemik inme tedavi protokollerinde kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: İskemi, Riociguat, Resveratrol, Nöroprotektif, Apoptoz

Abstract:
Introduction and Aim: Stroke, which is defined as functional dysfunction of the brain that occurs without any cause other than vascular pathologies, is among the most important causes of mortality and morbidity. It is divided into two groups as hemorrhagic and ischemic. The majority of ischemic strokes, which account for approximately 88% of strokes, occur in areas fed by MCA. Today, two treatment approaches come to the fore in the treatment of ischemic stroke. These are neuroprotection and recanalization. The only medical therapy approved in recanalization is rtPA. Since it can be used in the first 4.5 hours after ischemic stroke, its usage is quite limited. Therefore, studies are continuing for treatments that may have wider use.
Many complex mechanisms play a role in ischemic stroke. Neuroprotection is the effort to protect the brain against ischemia by inhibiting or slowing down these molecular and biochemical events. For this purpose, anti-excitotoxicity, antioxidant, anti-inflammatory and anti-apoptotic agents were used in the treatment.
Resveratrol, which is mainly found in grapes, red wine, and peanuts, is a phytoalexin with many effects such as neuroprotective, anti-inflammatory, anticarcinogenic, cardioprotective.
Riociguat, a guanylatecyclase stimulator that causes relaxation of vascular smooth muscle, is a vasodilator that has not yet been studied in cerebral ischemia, which reduces the ischemic area in cardiac ischemia studies.
We investigated the effects of these two drug combinations after cerebral ischemia.
Materials and Methods: In our study, 35 Wistar albino female rats with randomly selected weights of 328.53 ± 47.20 were used. After anesthesia with 80 mg/kg ketamine and 10 mg/kg xylazine, MCA occlusion was created by advancing the suture directed to the internal carotid artery by entering through the right external carotid artery. After waiting for 2 hours and creating ischemia, the suture was withdrawn and reperfusion was provided. Rats were divided into 5 and each group involves 7 rats. Group 1 was the group had no procedure, Group 2 was the ischemia group, Group 3 was the group given riociguat after ischemia, Group 4 was the group given resveratrol after ischemia, and finally Group 5 was the group given resveratrol + riociguat after ischemia. Resveratrol (p.o.) was given at a dose of 30 mg/kg/day and riociguat (i.p.) was given at a dose of 10 mg/kg/day for 2 days. Intracardiac blood was taken by thoracotomy method before sacrification of the rats which were re-anesthetized after the treatments. Right hemispheres were fixed in 10% formaldehyde at room temperature.
Sections taken were stained with hematoxylin & eosin. Pycnosis in the cell nuclei, perivascular and perineural edema, vascular dilatation, congestion, and bleeding foci after reperfusion were evaluated in the sections. In addition, the sections taken were embedded in paraffin blocks and bax and bcl-2 antibodies were dripped on them to observe signal formation. 
Results: In our study, hemorrhagic areas in brain tissue, pycnosis in neuron and glial cell nuclei, perineural and perivascular edema, congestion in vessel lumens, bax and bcl-2 expressions were examined. In the ischemia group, focal and diffuse hemorrhagic areas, increase in pycnotic nucleated cells in neuron and glial cells, perineural edema, congestion in the vessel lumen, over-expression of bax and increase in bcl-2 immunopositivity were observed. In the group given riociguat after ischemia, it was observed that hemorrhagic areas disappeared, pycnotic cells in neurons and glial cells were considerably reduced, vessels were dilated, congestion was not observed, perivascular edema was considerably reduced, bax immunopositivity was reduced and was similar to the control group, and bcl-2 immunopositivity increased especially in axons. In the group given resveratrol after ischemia, although hemorrhagic areas decreased significantly, congestion, perineural edema, and pycnosis in neurons and glial cells were observed, it was considerably reduced compared to the ischemia group. Bax immunopositivity was similar to the control group, while bcl-2 immunopositivity was localized similar to the control and ischemia groups, but positivity was found to be closer to the control group, especially in nerve fibers. In the group given riociguat and resveratrol after ischemia, it was observed that the vessels were dilated, the cells with pycnotic nuclei in neurons and glial cells decreased, and the perineural and perivascular areas disappeared. While bax immunopositivity was negligible in the combined treatment group, bcl-2 immunopositivity was found to be quite intense compared to the ischemia groups.
Conclusion: It has been seen that riociguat and resveratrol combined treatment in ischemic stroke is neuroprotective, prevents apoptosis and reduces post-reperfusion bleeding, and it has been concluded that it can be used in ischemic stroke treatment protocols.
Keywords: Ischemia, Riociguat, Resveratrol, Neuroprotective, Apoptosis