Katalazın çapraz bağlı enzim agregatlarını (CLEA) oluşturma yöntemiyle immobilizasyonu ve karakterizasyonu
Preparation of cross-linked enzyme aggregates (CLEA) of catalase and its characterization
Yazar: FİTNET HÜRREM
Danışman: PROF. DR. S. SEYHAN TÜKEL
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada sığır karaciğer katalazı, amonyum sülfatla çöktürme ve glutaraldehitle çapraz bağlama yoluyla çapraz bağlı katalaz agregatları (CLEA-CAT) oluşturularak immobilize edilmiştir. En yüksek CLEA-CAT aktivitesinin görüldüğü; amonyum sülfat derişimi % 70 (w/v) glutaraldehit derişimi 140 mM, immobilizasyon pH'sı 7,0, immobilizasyon süresi 6 saat olarak belirlenmiştir. CLEA-CAT örneklerinin hazırlanmasında ortamdaki enzim+protein miktarının CLEA-CAT aktivitesi üzerine etkisinin incelenmesi sonucunda, en yüksek aktivite 10 mg/ml CAT + 10 mg/ ml sığır serum albumini (BSA) kullanılarak hazırlanan CLEA-CAT' dan elde edilmiştir. CLEA-CAT örneklerinin termal kararlılıkları, depolama kararlılıkları ve kesikli reaktörde kullanımları araştırılmıştır. Ayrıca, CLEA-CAT örneklerinin taramalı elektron mikroskobunda görüntüleri incelenmiştir.Serbest katalazın ve CLEA-CAT örneklerinin maksimum aktivite gösterdiği pH, tampon derişimi, sıcaklık gibi koşullar serbest katalaz ve CLEA-CAT için sırasıyla, 7,5, 50 mM, 25°C ve 7,5, 75 mM, 35°C olarak belirlenmiştir. Belirlenen optimum koşullarda serbest katalaz için Km, Vmax, kcat ve kcat/Km değerleri sırasıyla, 50 mM, 1,98x104 U/mg prot., 7,92x104 s-1 ve 1,58x106 s-1M-1, CLEA-CAT için ise sırasıyla, Km = 43 mM H2O2, Vmax=2,0x103 U/g CLEA-CAT olarak hesaplanmıştır. 50ºC' de 15 saat inkübe edilen CLEA-CAT' ın başlangıç aktivitesinin % 30' unu, serbest katalazın ise aynı koşullarda başlangıç aktivitesinin % 4' ünü koruduğu belirlenmiştir. Serbest katalaz 5°C' de 19 gün saklandığında başlangıç aktivitesinin % 11' ini korurken, CLEA-CAT örnekleri 5°C' de yaklaşık iki ay sonunda başlangıç aktivitesinin % 10' unu koruyabildiği belirlenmiştir. CLEA-CAT örneklerinin kesikli reaktörde 32 kullanım sonunda başlangıç aktivitesinin % 29'unu koruyabildiği saptanmıştır.Yapılan çalışma sonucunda CLEA-CAT' ın termal ve depolama kararlılıklarının serbest enzimden daha yüksek olduğu ve ekstrem koşullarda daha uzun süre kullanılabileceği gösterilmiştir.Anahtar kelimeler: İmmobilizasyon, Çapraz Bağlı Enzim Agregatları, Katalaz, Glutaraldehit.

Abstract:
In this study, bovine liver catalase was immobilized as cross-linked catalase aggregates (CLEA-CAT) via precipitation with ammonium sulfate and cross-linking with glutaraldehyde. CLEA-CAT with the highest activity was obtained for the immobilization conditions as ammonium sulfate concentration % 70 (w/v), glutaraldehyde concentration 140 mM, pH 7.0 and immobilization duration 6 hours. The highest activity was obtained from CLEA-CAT prepared with 10 mg/ml CAT + 10 mg/ml Bovine serum albumin (BSA). The thermal stabilities, storage stabilities and usage in a batch type reactor of CLEA-CAT preparations were determined. Also, the images of CLEA-CAT preparations were investigated at scanning electron microscope.The conditions as pH, buffer concentration, temperature in which free catalase and CLEA-CAT preparations showed their maximum activities were determined as 7.5, 50 mM, 25°C for the free CAT and 7.5, 75 mM, 35°C for the CLEA-CAT, respectively. For free catalase at optimum defined conditions, Km, Vmax, kcat and kcat/Km values were calculated as 50 mM, 1.98x104 U/mg prot., 7.92x104 s-1 and 1.58x106 s-1M-1 and Km and Vmax values of CLEA-CAT were calculated as 43 mM and 2.0x103 U/g CLEA-CAT, respectively. It was determined that CLEA-CAT saved 30 % of its initial activity for 15 hours preincubation at 50ºC. However, free catalase saved 4 % of its initial activity at the same conditions. Free catalase was stored for 19 days at 5°C and saved 11 % of its initial activity, CLEA-CAT was stored for 2 months at 5°C and saved 10 % of its initial activity. CLEA-CAT preparations saved 29 % of their initial activities in a batch type reactor at the end of 32 usages.As a result of study, it was concluded that CLEA-CAT?s thermal and storage stabilities were higher than that of free catalase and CLEA-CAT can be used for longer at extreme conditions.Keywords: Immobilization, Cross-linked enzyme aggregates, Catalase, Glutaraldehyde.