Brassica juncea var. P78 bitkisine bazı ağır metallerin uygulanmasıyla anlatımı değişen genlerin tanımlanması ve belirlenmesi
The identification and characterization of heavy metal stress responsive genes in Brassica juncea var. P78
Yazar: EDA DALYAN
Danışman: DR. BAYRAM YÜKSEL ; PROF. DR. MUAMMER ÜNAL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoloji = Biology ; Botanik = Botany ; Genetik = Genetics
Dizin: Arabidopsis thaliana = Arabidopsis thaliana ; Ağır metaller = Heavy metals ; Brassicaceae = Brassicaceae ; Genler = Genes ; Kadmiyum = Cadmium ; Kurşun = Lead ; Lahana = Cabbage ; Mikrodizilim analizi = Microarray analysis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Brassica juncea (kahverengi hardal), belli ağır metalleri hiperakümüle ettiği bilinen ve gelişmiş kök sistemine sahip bir kara bitkisidir. Bu çalışmada B. juncea var. P78 bitkisine, Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı tarafından açıklanan en tehlikeli 10 kirletici arasında bulunan kurşun (50 µM Pb(NO3)2) ya da kadmiyum (25 µM CdSO4) 24 saat boyunca uygulanmıştır. Pb uygulamasıyla anlatımı değişen genlerin tanımlanması ile ilgili çalışmaların çok sınırlı bulunması ve Pb'nin akümülasyonunda bitkideki en önemli kısmın kökler olması nedeniyle bu metalin uygulandığı B. juncea bitkisinin köklerinde mikroarray analiz yapılmıştır. B. juncea bitkisinin mikroarray platformunda ticari temsilcisi bulunmadığı için yapılan analizde aynı familyaya üye Arabidopsis bitkisine ait gen çipler kullanılmış ve türler arası hibridizasyon (TAH) denenmiştir. Ayrıca, TAH'ın gen ekspresyon profillemesi çalışmalarında kullanılabilirliği, Arabidopsis ve Brassica türleri öznelinde yapılan biyoenformatik çalışmayla irdelenmiştir. Mikroarray analiz sonucunda ağır metal metabolizmasında etkin olduğu düşünülen bazı genlerin mRNA düzeyindeki ekspresyon seviyeleri, Pb ya da Cd uygulamaları yapılan B. juncea bitkisinin kök, gövde ve yapraklarında RT-PCR yöntemiyle belirlenmiştir. Böylece bu genlerin metal homeostazisindeki rollerinin moleküler seviyede anlaşılması ve buna bağlı olarak türler arası hibridizasyonun kullanılabilirliğinin ortaya konması amaçlanmıştır.Bu çalışmada, B. juncea var. P78 bitkisinin farklı kısımlarında ağır metal içeriklerinin belirlenmesi sonucunda bu bitkinin iyi bir Pb akümülatörü ve Cd hiperakümülatörü olduğu tespit edilmiştir. Pb uygulanmış bitkilerin kök kısmında yapılan mikroarray analiz sonucunda çoğunlukla türler arası düzeyde korunmuş az sayıda gen tanımlanmış ve buna bağlı olarak türler arası hibridizasyonun geniş ölçekte gen ekspresyonu profillemesinde kullanılabilirliğinin başarılı olmadığı ortaya konmuştur. Bu sonuç ayrıca, Arabidopsis ve Brassica türleri öznelinde yapılan biyoenformatik çalışmayla desteklenmiştir. Mikroarray analiz verilerinin güvenilirliği, ağır metal metabolizmasında rol oynadığı düşünülen birbirinden bağımsız 6 adet genin RT-PCR'de çalışılmasıyla doğrulanmıştır. Ağır metal alımı ve taşınmasıyla ilişkili olarak bu genlerin, Pb ve Cd uygulamaları yapılan bitkilerin kök, gövde ve yapraklarında mRNA düzeyindeki ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi ile her iki ağır metale özgü anlatım gösteren genler bulunmuştur.

Abstract:
Brassica juncea (brown mustard) is a land plant that is known that it hyper-accumulates certain heavy metals and has a developed root system. In this study, lead (50 µM Pb(NO3)2) or cadmium (25 µM CdSO4), which are among 10 most hazardous pollutants that have been declared by United States of America Environmental Protection Agency, were administered to the plant of B. juncea var. P78 for 24 hours. Because the studies on identification of genes, whose expression has been changed through Pb administration, are very restricted and the most important part in plants in Pb accumulation is roots, microarray analysis was conducted on roots of B. juncea plant, which had been made expose to the metal. Because commercial representative of B. juncea plant is not available on microarray platform, gene chips of Arabidopsis plant, which is a member of the same family, were used in the conducted analysis and hybridization between species (TAH) was tested. Furthermore, usability of TAH in gene expression profiling studies was searched through the bioinformatics study conducted on the subject of Arabidopsis and Brassica species. mRNA expression levels of certain genes, which are believed to be effective in heavy metal metabolism, as a result of the microarray analysis, were identified in root, stem and leaves of B. juncea plant treated with Pb and Cd with the help of RT-PCR method. Thus, the objective has been to discover these genes? roles in metal homeostasis at molecular level and accordingly, to evidence usability of hybridization between species.It was understood as a result of identification of heavy metal contents in different parts of B. juncea var. P78 in the present study that this plant is a good Pb accumulator and Cd hyper-accumulator. Genes, which had mostly been protected at interspecies level, were identified in low number as a result of the microarray analysis conducted on root section of Pb-treated plants and thus, it was evidenced that usability of hybridization between species has failed in wide scale gene expression profiling. This result was supported by a bioinformatics study conducted on subject of Arabidopsis and Brassica species. Reliability of data from microarray analysis was verified by studying 6 independent genes, which are believed that they have a role in heavy metal metabolism, in RT-PCR. Genes displaying expression specific to both of the heavy metals were identified upon identification of mRNA expression levels in root, stems and leaves of the plants treated with Pb and Cd with respect to heavy metal intake and carrying.