Astım tedavisinde kullanılan montelukastın safsızlıklarının tayini ve olası genotoksik etkilerinin in vitro değerlendirilmesi
Determination of impurities of montelukast which is used in asthma therapy and in vitro evaluation of their probable genotoxic effects
Yazar: ESRA EMERCE GÜRSEL
Danışman: PROF. DR. İSMET ÇOK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Eczacılık Bölümü / Farmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Genetik = Genetics
Dizin: Ames testi = Ames test ; Astım = Asthma ; Genotoksisite = Genotoxicity ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Kromozomlar = Chromosomes ; Montelukast = Montelucast ; Regülasyon = Regulation ; İlaç depolama = Drug storage ; İlaçlar = Drugs

Özet:
Astım tedavisinde kronik olarak kullanılan montelukast içeren ilaçların üretimi ve saklanması sırasında çeşitli safsızlıklar oluşabilmektedir. Bu safsızlıklar ilacın güvenliği, etkinliği ve kalitesini etkilemekte özellikle genotoksik etki göstermeleri durumunda ciddi sorunlara neden olmaktadırlar. Çalışmada, son yıllarda düzenleyici kuruluşların safsızlıkların kontrolü için geliştirdiği yaklaşımlar dikkate alınarak montelukast safsızlıklarının analizi ve toksikolojik değerlendirmesi amaçlanmıştır.
Piyasadaki çocuk ve yetişkin montelukast ilaç ürünlerinde, USP'de belirtilen safsızlıklar için (sülfoksit, cis izomer, michael katımları I ve II, metilketon, metilstiren) RP-HPLC yöntemiyle miktar tayini yapılmıştır. Analitik yöntemin validasyonu ICH rehberine göre gerçekleştirilmiştir. Safsızlık rehberlerine göre kalifikasyon sınır değerini aşan sülfoksit safsızlığının literatürde toksikolojik verisinin bulunmaması nedeni ile in silico QSAR yöntemi ile mutajenite tahmin analizi, S.typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537, E.coli wp2[pKM101] ve wp2uvrA suşlarında bakteride gen mutasyon testi, sitotoksisite ve genotoksisite değerlendirmesi için mitotik indeks analizi ve in vitro kromozomal aberasyon yöntemi uygulanmıştır.
On bir ayrı firmanın 4 mg ve 10 mg dozdaki 20 ilaç ürününün farklı partilerdeki analizlerinde, michael katımları I ve II, cis izomer, metilketon ve metilstiren safsızlıkları kalifikasyon limitlerin altında bulunmuştur. Sülfoksit safsızlığı, çocuk ilaçlarında 2, yetişkin ilaçlarında ise 7 firmada limitlerin üzerinde bulunmuştur. Sülfoksit safsızlığının Leadscope QSAR analizinde ve metabolik aktivasyon varlığı/yokluğunda bakteride gen mutasyon analizinde (Ames MPF Penta I) mutajenik olmadığı görülmüştür. Safsızlığın insan periferal lenfositlerinde metabolik aktivasyon varlığı/yokluğunda doz artışına bağlı olarak sitotoksik olduğu fakat in vitro kromozomal aberasyon testinde genotoksik olmadığı bulunmuştur. Değerlendirmeler, sülfoksit safsızlığının günümüzdeki ilgili rehberlere göre genotoksik olmayan safsızlık olarak sınıflandırılabileceğini göstermektedir.

Anahtar Kelimeler: genotoksik safsızlıklar, QSAR analizi, Ames testi, kromozomal aberasyon test, hplc, regülasyonlar139

Abstract:
During manufacturing and storage of drugs that include montelukast used chronically in asthma theraphy, various impurities can form. Impurities affect safety, efficacy, quality of drugs, particularly when they pose genotoxic effects, causing serious health problems. Current study aims analysis of montelukast impurities and toxicological assessment via considering the regulatory approaches regarding control of impurities. 
Quantitation of impurities (sulfoxide, cis-isomer, Michael adducts I&II, methylketone, methylstyrene), already indicated in USP was conducted using RP-HPLC analysis on pediatric and adult drug products on market. Validation of analytical method was conducted according to ICH guideline. For sulfoxide impurity that was above qualification limits, having no report of toxicity data,  prediction analysis in in silico QSAR method, bacterial gene mutation test in S.typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537, E.coli wp2[pKM101] and wp2uvrA were performed. The cytotoxicity and genotoxicity assessment was investigated respectively by determining mitotic index and using in vitro chromosomal aberration (CA) test. 	
Impurities except sulfoxide were under qualification limits in the analysis of different batches of 20 products at 4 mg/10 mg doses for 11 companies. The sulfoxide exceeds limits in 2 companies for pediatric chewable tablets and in 7 companies for adult tablets. Sulfoxide impurity was not mutagenic in Leadscope QSAR analysis and bacterial gene mutation assay (Ames MPF Penta I) w/wo metabolic activation system. Sulfoxide impurity was dose-dependent cytotoxic in human peripheral lymphocytes w/wo metabolic activation system, however, it was nongenotoxic in CA test. Results have shown sulfoxide impurity as nonmutagenic/nongenotoxic and to be classified as an ordinary impurity according to guidelines.


Keywords: genotoxic impurities, QSAR analysis, Ames test,chromosomal aberration test, hplc, regulations