Salmonella enterica türlerinin CRISPR interference (CRISPRi) sisteminin yapısal analizi
Structural analysis of CRISPR interference (CRISPRi) system of Salmonella enterica species
Yazar: NAZENİN EFTEKHARİ
Danışman: PROF. DR. İHSAN YAŞA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Patojenik bakterilerin sınıflandırılması ve moleküler tiplendirmesi modern mikrobiyolojide önemli bir konudur. Mikrobiyal tiplendirmenin temel amacı, mikrobiyal izolatlar arasındaki ilişkileri değerlendirmektir. Bu teknikler, enfeksiyonların kökeni ve yollarını belirlemek, salgınları doğrulamak veya önlemek, sağlıkla ilgili patojenlerin çapraz geçişini değerlendirmek, özellikle virülansı tanımlamak ve son olarak kontrol önlemlerinin etkinliğini belirlemek için büyük bir rol oynamaktadır. Geleneksel yöntemlerin daha uygun ve doğru tipleme için bakteri popülasyonu genetiği, evrimi ve moleküler epidemiyolojisini anlamalarına izin vermeyen kısıtlamaları vardır. Sene 2000'den bu yana, yüksek verimli ve yüksek çözünürlüklü moleküler tipleme yöntemleri, çoğu DNA bazlı ve PZR tabanlı yöntemler olan epidemiyolojik moleküler çalışmalarla derinlemesine bütünleşmiştir. CRISPR bölgeleri analizi, bakteriyel suşların moleküler tiplemesi ve genetik karşılaştırmalı analizleri için yeni ve güçlü bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Prokaryotlar çok sayıda virüs çeşitliliğine rağmen gelişirler. Bu kısmen, eksojen DNA'nın etkisiz hale getirilmesi veya susturulması için çeşitli mekanizmaların gelişmesinden kaynaklanmaktadır. Bunlar arasında, Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kesişen Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR), daha önce enfekte edici ajanların genomuna yüksek lokal benzerliği olan elementlere karşı adaptif bağışıklık sağlamada benzersizdir.
Bu çalışmada, 81 Salmonella enterica'nın farklı serovarların tüm genomun CRISPR lokuslarını PZR ile analiz edilmiştir. Salmonella enterica türlerine spesifik CRISPR I ve CRISPR II bölgelerini hedef alan iki çift primer kullanılmıştır. CRISPR, Salmonella'da iki çift tipte olup, her bir çift benzer bir devir oranı, tekrarlama dizisi ve ortak bir Cas gen seti için varsayılan bağlantıyı göstermektedir. CRISPR lokuslarının spacer lokus analizi, NCBI-Blast ve CRISPRFinder veritabanları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu analizlere göre, bakterileri enfekte eden ve Salmonella enterica serovarlarının özel patojenleri olmayan çok çeşitli eksojen DNA göstermektedir. 2013 ve 2014 yıllarında Ege bölgesinde aynı yerden izole edilen farklı izolat serovarları, aynı aralayıcı (spacer) kazanımını göstermiştir.
Çalışmamızın sonuçları, bakterileri fajlardan korumayı ve CRISPR'nin alternatif evrimsel rollerini göstermeyi amaçlayan bağışıklık sisteminde yüksek, hassas ve dinamik bir aralayıcı çeşitliliği göstermektedir. Bu çalışmada CRISPR bölge analizinin doğası, tarihçesi ve epidemiyolojik uygulamalarını açıklamak amaçlanmıştır.

Anahtar kelimeler: Salmonella enterica, CRISPR, PZR, Moleküler tiplendirme, İmmün sistem

Abstract:
The classification and molecular typing of pathogenic bacteria is an important issue in modern microbiology. The main objective of microbial typing is to evaluate the relationships between microbial isolates. These techniques play a major role to determine the origin and routes of infections, confirm or exclude outbreaks, assess the cross-over of health-related pathogens especially identify virulence, and finally to determine the effectiveness of control measures. Conventional methods have limitations which do not allow for the more appropriate and accurate typing of the bacterial population to understand genetics, evolution and molecular epidemiology. Since 2000, high-throughput and high-resolution molecular typing methods have been deeply integrated into epidemiological molecular studies, most of which are DNA-based and PCR-based methods. CRISPR regions analysis is used as a new and powerful method for molecular typing and genetic comparative analysis of bacterial strains. Prokaryotes develop in spite of a large number and variety of viruses. This is partly due to the development of mechanisms for inactivating or silencing the effect of exogenous DNA. Among them, Clustered Regular Short Palindromic Repeats (CRISPR) is unique in providing adaptive immunity to elements of high local similarity to the genome of previously infected agents.
In this study, we analyzed the CRISPR loci of different genotypes of 81 Salmonella enterica with PCR. Two pairs of primers were used to target the regions of CRISPR I and CRISPR II which were specific to Salmonella enterica species were used. CRISPR is a single pair in Salmonella, each pair showing a similar rate of rotation, repetition sequence, and a default connection for a common Cas gene set.
The spacer locus analysis of CRISPR loci was performed using the NCBI-Blast and CRISPRFinder databases. According to these analyzes, they show a wide variety of exogenous DNA that infects bacteria and is not specific pathogens of Salmonella enterica serovars. Different isolate serovars isolated from the same location in the Aegean region in 2013 and 2014 showed the same spacer gain.
All these results demonstrate high, sensitive and dynamic spacers in the immune system, which aims to protect bacteria from phages, and show the alternative evolutionary roles of CRISPR. In this study, we aimed to explain the nature, history and epidemiological applications of CRISPR region analysis.

Key words: Salmonella enterica, CRISPR, PCR, Molecular typing, Immune system