Kriyoprezervasyonun yardımcı üreme teknikleri ile elde edilen büyükbaş hayvan embriyoları üzerine etkilerinin histolojik yöntemlerle incelenmesi
Research of cryopreservation effect on cattle embryos produced by assisted reproductive technics via histological methods
Yazar: TÜRKER ÇAVUŞOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. UTKU ATEŞ
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Temel Tıp Bilimleri Bölümü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Vitrifikasyon yöntemi = Vitrification method ; Üreme biyolojisi = Reproductive biology ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques

Özet:
Amaç: Bu çalışmada yardımcı üreme teknikleri ile elde edilen büyükbaş hayvan embriyolarına uygulanan kriyoprezervasyon yöntemlerinin embriyolar üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.Yöntem: Mezbahaya kesime getirilen Holstein Cinsi 4-8 yaş aralığındaki sağlıklı ineklerden toplanan overlerden laboratuar ortamında folikül aspirasyon yöntemi ile elde edilen oositlerden; 3 tabakalı granüloza hücrelerine sahip olanlarına in vitro maturasyon işlemini takiben; ticari olarak satın alınan dondurulmuş boğa spermleri ile in IVF işlemi uygulandı. Slow freezing ve Vitrifikasyon gruplarındaki embriyolar dondurma işlemini takiben, -196 °C'deki sıvı azot içinde 1 gün süreyle saklandı. Kriyoprezervasyonun olası etkilerini histolojik yöntemlerle incelemek amacıyla 1gün sonra çözdürülen embriyolar; histoojik takip prosedürlerinden sonra ışık mikroskop, transmisyon elektron mikroskop, konfokal mikroskop ve floresan mikroskop ile incelendi.Bulgular: Slow freezing ve vitrifikasyon grubundaki embriyolarda çözdürme sonrası ZP'da incelme ve kırılma, hücre iskeleti hasarları ve blastomerler içerisinde yer alan organellerde meydana gelen dejenerasyonlara bağlı olduğu düşünülen hücre ölümleri gözlemlenmiştir. Mikroskobik incelemeler sonucunda hücre ölümlerinin nekroza bağlı geliştiği saptanmış, apoptotik bir sürece bağlı olacağını düşündüren bulgulara rastlanmamıştır. Kriyoprezervasyon ZP kalınlığında azalmaya neden olmaktadır. Blastosist gelişim oranları açısından kontrol grubu ile karşılaştırıldığında slow freezing ve vitrifikasyon yöntemiyle dondurulan embriyolarda çözdürme sonrası blastosist gelişiminin daha düşük olduğu, her iki grup arasında ise anlamlı bir fark bulunmadığı belirlenmiştir.Sonuç: Embriyo kriyoprezervasyonunun başlıca hedefi dondurma işleminden sonra çözdürülen embriyolarda yüksek canlılık oranlarının sağlanmasıdır. Dondurma-çözündürme sonrası canlılık oranları, uygulanan yönteme, embriyoların büyüklükleri ve gelişim evrelerine, hücrelerin geçirgenlik özelliklerine, kullanılan kriyoprotektanların toksisiteleri ve ozmotik özelliklerine bağlı olarak değişiklik göstermektedir. Büyükbaş hayvanlarda in vitro şartlarda elde edilmiş, 4 hücreli aşamadaki erken evre embriyolarda slow freezing ve vitrifikasyon uygulamaları sonrası sağkalım oranlarının düşük olduğu görülmüştür. Elde edilen bulgulara göre 4 hücreli inek embriyolarında kriyoprezervasyon sonrası görülen hücre ölümlerinin nekroza bağlı geliştiği düşünülmüştür. Uygulanan yönteme ve döneme özgü özelliklere bağlı kriyoprezervasyonun zararlı etkilerin anlaşılması ve azaltılması amacıyla daha geniş kapsamlı araştırmaların yapılması gerekmektedir.

Abstract:
Purpose: Searching the effects of cryopreservation method that apply to the embryos derived with helping reproduction techniques, is aimed in this study.Method: The over taking out 4-8 aged healty Holstein bovine brought from butchery and the oosits derived with folicule aspiration method at labrotory from this over that have the 3 layers granulosa cells following IVF maturation with the frozen bull sperm bought commercially are implemented IVF. The embryos belong to slow freezing and vitrification groups, following the frozen process, saved 1 day in the fluid nitrogen at -196°C. The embryos melted after 1 day, aimed determing cryopreservation effects with histologic methods, examined light microscopy, transmission electron microscopy, confocal microscopy and flourasan microscopy after histologic following procedure.Findings: The cell death connected with dejeneration in organels, been in blastomers, cell skeleton damages, slimming and breaking in ZP in embryos of vitrification and slow freezing, after melting, observed. As result of microskobic examines, the cell death development connected with necrosis, not determined anything about apoptotic process. Criyopreservation cause decreasing at thickness of ZP. When comparasion the control group with the embryos frozen with slow freezing and vitrification methods as blastosist development rates, observed less blastosist development in frozen embryos with slow freezing and vitrification group and determined no meaning differencess between two groups.Result: The aim of embryo cryopreservation is providing high viabilite rates melted embryos after frozen process. The viabilite rates after freezing-melting show changes up to size of embryos and development phase, permeability species of cells, toxicities of used cryoprotectans and osmotic species. In the embryos in 4 cell stage early phase, derived from bovines in vitro conditions, survival rates are seemed low after slow freezing and vitrification applications. According to findings, the cell death seen in the 4 cell bovine embryos after cryopreservation, thought developt up to necrosis. Aiming of understanding and decreasing the damaged effects of cryopreservation up to applying method and species special to term, more wide searchs should be entailed.