Oksidatif DNA hasarının göstergesi olan 8-Hidroksi Deoksiguanozin'in analiz yöntemi ve STZ diabetik sıçanlara uygulanması
Oxidative DNA damage (8OHdG) in streptozotocin induced diabetic rats
Yazar: ZEYNEP GÜLNUR ANDİCAN
Danışman: PROF.DR. GÜLDEN BURÇAK
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2000
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
ROS / RNS oluşumundaki artış yada antioksidan savunmanın veya DNA onarım mekanizmalarının defektif olması, oksidatif DNA hasarının artması ile sonuçlanır. Fizyolojik koşullarda dahi steady-state düzeyde oksidatif DNA hasarı bulunduğu bilinmektedir. Oksidatif hasara bağlı olarak DNA'da tek ve çift dal kırıkları, abazik alanlar, protein-DNA çapraz bağlanmaları ve oksidatif baz hasarı gibi lezyonlar meydana gelir. Halen 20 kadar oksidatif DNA baz hasarı bilinmektedir. Guanin en fazla oksidatif hasara maruz kalan DNA bazıdır. Guanin'in oksidatif modifikasyonu ile oluşan 80HdG ( 8-hidroksi deoksiguanozin ), GC -> AT mutajenisitesine yol açmaktadır. Floyd ve ark.'nın 1986'da nukleosid baz hasarının saptanması için duyarlı bir yöntem geliştirmesinden sonra, en çok çalışılan baz hasarı 80HdG'dir. 80HdG çok yüksek özgünlükte ve duyarlılıkta HPLC-ECD ile kantite edilebilmektedir. Birçok araştırıcı tarafından da 80HdG, oksidatif DNA baz hasarının biomarkerı olarak kabul edilmektedir. Diabet'te oksidatif stresin arttığını gösteren çok sayıda deneysel ve klinik araştırma olduğu halde, oksidatif doku hasarının DNA molekülü düzeyinde 80HdG ölçümü ile saptandığı az sayıda araştırma bildirilmiştir. Bu tez çalışmasının öncelikli amacı 80HdG düzeyinin, STZ diabetik ve kontrol deney hayvanlarının karaciğer dokularının nuklear DNA'sında, HPLC-ECD sistemi ile analizlenmesidir. Bu amaçla önce HPLC DAD-ECD sistemi optimize ve standardize edildi ve sonra Shigenaga ve ark. tarafından önerilen yöntem modifiye edilerek dokudan DNA izolasyonu, hidrolizi ve nüklear DNA'da 80HdG analizi yapıldı. Bu tez çalışmasında ad libitum beslenen 39 erkek, genç erişkin, Wistar albino sıçan kullanıldı. 21 sıçana 65mg/kg STZ verilerek diabet oluşturuldu. 18 sıçan kontrol grubu olarak kullanıldı. STZ uygulamasının 21. gününde, eter anestezisi altında, kalpten heparinize kan örnekleri alındıktan sonra sıçanlar sakrifiye edildi, karaciğer dokuları çıkarıldı, azot gazında donduruldu ve analizleninceye kadar -80° C'de saklandı. Kan örnekleri bekletilmeden spektrofotometrik yöntemle glukoz ve afinite kromatografisi ile GHb değerleri analizlendi. STZ uygulanan deney grubunda kontrollere göre yüksek olarak saptanan glukoz ve GHb değerleri diabet oluştuğunu kanıtladı (p < 0.001 ). 80HdG / 105dG değerleri STZ diabetik grupta 3,209,kontrol grubunda 2,198 bulundu (p < 0.001 ). 80HdG değerleri ile GHb değerleri arasında STZ diabetik (r = 0.468, 0.02< p<0.05) ve kontrol grubunda ( r = 0.756, p< 0.001 ) korelasyon bulunduğu saptandı. Bu bulgular, karaciğer nüklear DNA'sındaki oksidatif hasarın STZ diabetik grupta daha yüksek olduğunu göstermektedir. Diabetteki oksidatif hasar artışının glikatif stres ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Increased oxidative stress due to enhanced ROS / RNS production and / or deficient antioxidant defence together with impaired repair mechanisms lead to an increase in oxidative damage to DNA. Oxidative damage occurs at steady state levels, physiologically. Single and double strand breaks, abasic sites, protein-DNA cross-linking and oxidative base damage are the assessed lesions. More than 20 kinds of oxidative base damage products have been identified. Guanin is the base that is most susceptible to oxidative attack. 8-hydroxy deoxyguanosine (80HdG) produced on oxidation of guanine causes GC -» AT mutagenicity. Since the development of a highly specific and sensitive HPLC-ECD method for 80HdG analysis by Floyd et al. 80HdG has been the most intensively studied base damage product in DNA. Many investigators regard 80HdG as a biomarker of oxidative DNA base damage. Despite the presence of numerous experimental and clinical studies reporting the increase of oxidative stress in diabetes mellitus, very few studies have been done in relation to oxidative DNA damage. This study is performed to measure 80HdG content of nuclear DNA by using HPLC-ECD technology, in the liver tissues of STZ- diabetic and control rats. Firstly, HPLC-DAD-ECD system has been optimized and standardized and secondly the tissue samples analyzed using the method of Shigenega et al. modified as stated in the "methods" section. 39 ad-libitum fed, male Wistar albino rats were used. 21 rats were administered streptozotocin (65mg/ kg, ip) and 18 rats served as controls. On the 21st day of STZ administration, after withdrawal of heparinized blood samples by cardiac puncture, the rats were sacrificed and the liver tissues were removed and frozen under ether anestesia, nitrogen to be stored at " 80° C until the analysis. Blood samples were analysed promptly for plasma glucose by spectrophotometry and glycated hemoglobin by affinity chromatography. Significantly increased values for both glucose and glycated hemoglobin in STZ-administered rats in comparison to controls revealed the establishment of diabetes(p < 0.001 ). 80HdG /105dG values were found to be 3,209±0,934 in the STZ diabetic rats and 2,198±0,915 in the controls (p < 0.001 ). 80HdG values were correlated with glycated hemoglobin values in both STZ diabetic (r = 0.468, 0.02< p<0.05) and control ( r = 0.756, p< 0.001 ) rats. These data demonstrate that oxidative damage to nuclear DNA in the liver tissue is at higher extent in STZ diabetic rats than controls and imply the contribution of glycative stress to the oxidative damage.