Meme kanseri hücre hatlarında karşılaştırmalı yüzey proteom analizi
Comparative surface proteome analysis in breast cancer cell lines
Yazar: MEHMET SARIHAN
Danışman: PROF. DR. MURAT KASAP
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre zarı = Cell membrane ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms

Özet:
Amaç: Günümüzde yaygın olarak görülen kanser türlerinden meme kanseri (MK), dünya genelinde yüksek insidansa ve ölüm oranına sahiptir. Yıllardır süren çalışmalara ve kaydedilen önemli bilimsel gelişmelere rağmen, MK'nin teşhisi ve tedavisi için henüz özgün bir biyobelirteç bulunamamıştır. Tez çalışması kapsamında sağlıklı (MCF-10A) ve kanserli meme hücre hatlarının (MCF-7 ve MDA-MB-231), karşılaştırmalı hücre yüzey proteom analizleri yapılarak meme kanseri teşhis ve tedavisinde kullanılma potansiyeli olabilecek biyobelirteç adayları saptandı. Tez kapsamında analizler gerçekleştirilirken hücre proteomunun deneysel şartlardan etkilenmemesi ve hücre yüzey proteomundaki gerçek değişimlerin saptanabilmesi için literatürde sıkça kullanılan ancak problemli bir yaklaşım olan kimyasal biyotinilasyon yerine tez kapsamında geliştirdiğimiz yeni bir yaklaşım olan enzimatik biyotinilasyon metodu kullanıldı. 
Yöntem: Çalışma kapsamında hücre yüzey proteinlerini (HYP) biyotin ile etiketlemek için TurboID enzimi Escherichia coli (E. coli) hücrelerinde üretilip saflaştırıldı ve ardından saf enzim hücrelerin bulunduğu kültür ortamına eklenerek HYP'lerin biyotin ile etiketlenmesi sağlandı. Etiketlenen proteinler streptavidin kaplı manyetik boncuklar yardımıyla zenginleştirildi ve ve triptik kesim sonrası nLC-MS/MS sistemi üzerinden analizleri yapıldı. Elde edilen MS-MS sonuçları Proteom Discoverer 2.5, String ve g-Profiler araçları kullanılarak analiz edildi. Sonuçların doğrulanması için ifade düzeyi değişen 2 protein seçilerek (VDAC1 ve N-Cadherin) Western Blot (WB) analizleri yapıldı. WB analizlerinde gözlemlenen bant yoğunluklarındaki değişimler Quantity One yazılımı ile değerlendirildi. 
Bulgular: Yapılan çalışmalar sonucunda toplamda 1112 adet protein tanımlanmış ve analiz edilmiştir. Bu proteinlerin 425 tanesi plazma membranı (PM) lokalize olurken, 217'sinin hücre dışı matriks, salgı proteinleri ve hücre-hücre bağlantı proteinlerinden oluştuğu görüldü. Kalan 470 adet protein analiz edildiğinde ise bu proteinlerin ağırılıklı olarak mitokondri, endoplazmik retikulum, golgi ve diğer hücresel membranlarda lokalize olduğu belirlendi. nLC-MS/MS verileri kullanılarak yapılan karşılaştırmalı analizler sonucunda 194 plazma proteinin hücre grupları arasında anlamlı farklılıklar gösterdiği saptandı.  VDAC1 ve N-Cadherin antikorları kullanılarak doğrulama amaçlı yapılan analizler, nHPLC LC-MS/MS analizleri ile benzer sonuç verdiği ve tasarlanan yaklaşımın güvenilir bir şekilde çalıştığı görüldü.
Sonuç: Tez kapsamında geliştirdiğimiz yeni ve özgün yaklaşımla yapılan HYP'lerin biyotin ile etiketlenmesi ve sonrasında streptavidin boncuklar ile zenginleştirilmesi başarılı bir şekilde gerçekleştirildi. Elde edilen sonuçlar hücreler grupları arasında ifade farklılıklarının olduğunu gösteren 194 adet proteinin varlığını ortaya koydu ve bu proteinlerin potansiyel biyobelirteç adayı olduğunu gösterdi.  Aynı zamanda literatürde yapılmış olan çalışmaların sonuçlarımızı büyük çoğunlukta doğrulandığı görüldü. Tez kapsamında belirlediğimiz aday biyobelirteçlerin büyük bir çoğunluğu son 5 yıl içerisinde farklı kanser hastalıkları ile ilişkilendirilmiş olup, bunlar ile alakalı kısıtlı sayıda çalışmanın yapıldığı anlaşılmıştır. Bazı proteinlerin ifade düzeylerindeki değişim ise çalışmamız kapsamında ilk defa meme kanseri hücre hatlarında gösterilmiştir. Bu proteinlerin meme kanseri oluşumunda veya metastazındaki etkileri ve muhtemel ilaç hedefi olup olamayacakları gelecekte yapılacak çalışmalarla irdelenmelidir.  Gelecekte elde edilecek veriler meme kanserinin erken tanısına dair ipuçlarını içerisinde barındıracaktır.

Abstract:
Background: Breast cancer (BC) is one of the most common cancers with a high incidence and mortality rates worldwide. Despite years of research and development, no specific biomarker for the diagnosis and treatment of BC has yet to be found. In this study, we attempted to detect candidate cell surface biomarker proteins from cell lines of healthy and cancerous breast tissue. In our study, an enzymatic biotinylation method was used rather than the commonly-used chemical biotinylation method to prevent off-target affects on the cell metabolism.
Method: In this study a promiscuous biotin ligase enzyme, TurbolD, was produced in E. coli and purified to homogeneity. The pure enzyme was then added to the cell culture medium and cell surface proteins (CSP's) were biotinylated. The cells were washed and protein isolation were carried out. The biotin-labelled proteins were enriched using streptavidin-coated magnetic beads and nLC-MS/MS analyses were performed after performing tryptic digestions. Results were analysed using Proteom Discoverer 2.5, String and g-Profiler tools and confirmed by Western blot analysis.
Result: A total of 1112 proteins were identified. 642 proteins of these proteins that constituted approximately 60%, belonged to plasma membrane and extracellular space. Of the 673 proteins, 425 localized the plasma membrane, while the rest 217 proteinwere found to be localized in the extracellular matrix and cell-cell junction proteins. When the remaining 470 proteins were analysed, their localizations differed and they were found to be localized to the mitochondria, endoplasmic reticulum, golgi and other organelle membranes. Upon comparative analyses of the nLC-MS/MS data, 194 plasma proteins were determined to be differentially regulated among the cell lines. For confirmation of differential regulations determined by label-free comparative nLC-MS/MS analysis and effect of biotinylation, western blot experiments were performed with antibodies against VDAC1 and N-Cadherin proteins. The western blot results were in agreement with nLC-MS/MS results indicating that the designed approach was efficient and reliable. 
Conclusion: We designed a novel approach in which the labelling of CSP's with biotin and their enrichment with streptavidin beads were successfully carried out. A total of 194, differentially regulated were identified which were potential biomarker candidates. Additionally, our results were highly supported and confirmed by previous studies and it has been observed that most of the candidate biomarkers have been associated with cancer in the last 5 years and It has been understood that a limited number of studies have been perfromed about these proteins. At the same time, some of the proteins have been comparatively analysed in breast cancer cell lines for the first time with this study. In the future, these proteins will be scrutinized to evaluate their potential biomarker properties.