Laktik asit bakterilerinde düşük pH ile uyarılabilen promotor: rcfB
Low pH inducible promotor: rcfB in lactic acid bacteria
Yazar: ŞEBNEM NADİME GÜLTEKİN
Danışman: DOÇ. DR. EMİN ÖZKÖSE
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria

Özet:
Bu çalışmada, Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 bakterisinde bulunan katabolit aktivatör protein (CRP) benzeri RcfB proteinini kodlayan rcfB geninin promotor bölgesinin karakterizasyonu yapılmıştır.IL1403 suşunun kromozomal DNA'sında bulunan rcfB geninin promotor bölgesinin çoğaltılabilmesi için primerler tasarlanmıştır. rcfB promotor bölgesi polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmış ve pCT vektöre klonlanmıştır. Oluşturulan rcfB içeren pBGML4 plazmiti E. coli DH5? hücresine transfer edilmiş ve X-gal ile amfisilin içeren LB besiyerine ekilmiştir. Elde edilen beyaz koloniler PCR ile teyit edilmiştir. rcfB genini içeren plazmit, koloni PZR ile kontrol edilmiş tek koloniden izole edilmiştir. İzole edilen ve rcfB genini içeren pBGML4 plazmiti HindIII ve BamHI enzimleri ile kesilerek promotor bölgesi yapışkan kesim uçlarını içerecek şekilde agoroz jelden izole edilmiştir. Laktik asit bakterilerinde çalışabilecek pAK80 plazmiti HindIII ve BamHI enzimleri kesilmiş ve jelden izole edilen parça pAK80 plazmitine aktarılmış, sonuçta rcfB promotoru içeren pAK80 plazmiti oluşturulmuştur ve pBGML5 olarak numaralandırılmıştır. Oluşturulan plazmit PCR ve kesme enzimi ile teyitinden sonra, pBGML5 plazmiti elektroporasyon ile IL1403 suşuna aktarılmıştır ve BGML115 suşu oluşturulmuştur. rcfB geninin ekspresiyon seviyesi yedi farklı karbonhidrat ve iki farklı pH ortamında araştırılmıştır. Deney sonuçları farklı karbonhidrat ve asit şartlarında farklı ekspresiyonun seviyesinin gerçekleştiğini göstermiştir sonuç olarak rcfB gen regülasyonu karbonhidrat kaynağı ve ortamın pH'sına bağlıdır.Anahtar kelimeler; IL1403 suşu, rcfB geni, CRP, uyarılabilen promotor

Abstract:
In this study, rcfB gene, encode catabolite activator protein (CRP) like RcfB protein, promoter region characterization was carried out in Lactoccocus lactis subsp. lactis IL1403.Primers were designed to amplified rcfB gene promoter region on IL1403 strain chromosomal DNA. rcfB promoter region was amplified using polymerase chain reaction (PCR) and amplified region cloned into pCT vector. Constructed rcfB containing pCT plasmid (pBGML4) transferred into E. coli DH5? cell and colonies are plated on X-gal and ampicillin containing LB agar. Observed white colonies were confirmed with PCR. rcfB gene containing plasmids were isolated from a single PCR checked colony. Isolated pBGML4 plasmid digested with HindIII and BamHI restriction enzyme and sticky end containing fragment was isolated from agorose gel. Lactic acid bacteria compatible plasmid pAK80 was digested with HindIII and BamHI enzymes and gel isolated fragment ligated to pAK80 so rcfB promoter containing pAK80 plasmid constructed and numbered pBGML5. Following PCR and restriction enzyme confirmation, pBGML5 plasmid electroporated into IL1403 strain and numbered BGML115. The expression level of rcfB gene under seven different carbohydrate source and two different pH condition was carried out. Experiment results concluded that different expression level were observed under different carbohydrate and acid conditions so rcfB gene regulation was depend on carbohydrate source and pH.Key words: IL1403 strain, rcfB gene, CRP, inducible promoter