Hepatit C virüs zarf glikoproteininin saflaştırılarak elde edilmesi
Obtaining of purified hepatitis C virus envelope glycoprotein
Yazar: ÖZGE ÖZTUNA
Danışman: DOÇ. DR. İ. M. ALİ ÖKTEM
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Escherichia coli = Escherichia coli ; Glikoproteinler = Glycoproteins ; Hepatit B yüzey antijenleri = Hepatitis B surface antigens ; Hepatit C = Hepatitis C ; Hepatit C virüsü = Hepatitis C virus ; Protein ekspresyonu = Protein expression ; Proteinler = Proteins ; Virüsler = Viruses

Özet:
Hepatit C Virüsü (HCV) enfeksiyonu önemli bir halk sağlığı sorunudur. HCV kronikleşmeye eğilim gösterir ve ilerleyen dönemde siroz ile hepatosellüler karsinoma gibi ağır klinik tablolar gelişebilir. Virüs populasyonunun türümsü oluşumuna yatkın doğası sayesinde konak bağışık yanıtından kaçabilen varyantların seçilmesi kronik enfeksiyona gidişin göstergelerinden biridir. Zarf glikoproteinlerinin (E1 ve E2) sürekli şeçilim baskısı altında olması antikor yanıtından kaçabilen seçilmiş viral varyantların ortaya çıkmasıyla sonuçlanır. E1 proteini, hedef hücrelere virüsün bağlanması ve girişi yanı sıra konak immün yanıtının modülasyonunda da önemli rol oynar. Bu çalışmada, genotip 1b'ye ait bir HCV E1 molekülünün klonlanması ve prokaryotik sistemde ifade ettirilmesini raporladık.HCV E1 proteininin E. coli içinde ifadesi için, 1b genotipindeki bir klinik izolattan tam uzunlukta ve C-terminali kesilmiş E1 dizileri PZT yoluyla amplifiye edilmiştir. Elde edilen ürünler pQE30 vektörüne takılıp klonlandıktan sonra His-etiketlenmiş proteinler olarak E. coli içinde ifade edilmiştir. E1 proteinleri SDS-PAGE ile karakterize edildikten sonra proteinlerin immün reaktivitesi anti-HCV pozitif serum örnekleri kullanarak Western Blot (WB) analizi ile değerlendirilmiştir. Tam uzunlukta ve kesilmiş C-terminal E1 hexa-histidin-etiketli rekombinant füzyon proteinleri olarak prokaryotik sistemde başarıyla ifade edilmiştir. Rekombinant E1 proteinlerinde, HCV ile enfekte hastaların poliklonal serumLarı kullanılarak immünolojik reaksiyon belirlenmiştir.Tam uzunlukta viral zarf proteinlerinin prokaryotik ifadesi zor olabilir. Bu çalışmada Türkiye'de ilk kez, immünolojik reaktif olan tam uzunlukta ve kesilmiş E1 proteinlerin başarılı ifadesi raporlanmıştır. Bu çalışmada elde edilen rE1 proteinleri tanısal ve immünolojik ileri çalışmalarda önemli araçlardan olabilir.Anahtar kelimeler : HCV zarf proteini 1; Rekombinant proteinler; Escherichia coli

Abstract:
Hepatitis C Virus (HCV) infection is a major public health issue. HCV has a propensity to develop chronic infections which may proceed to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. One of the hallmarks of the chronic infection is the quasispecies nature of the viral population which favors the selection of variants that may escape the host immune responses. Envelope glycoproteins (E1 and E2) are constantly under selective pressures resulting in the selection of viral variants that can escape antibody responses. E1 protein also plays important roles in viral attachment and entry into target cells as well as in the modulation of host immune responses. In this study, we report the cloning and prokaryotic expression of a genotype 1b HCV E1 molecule.For the expression of HCV E1 protein in E. coli, full-length and C-terminally truncated E1 sequences from a clinical isolate of subtype 1b virus were amplified by PCR. Resulting fragments were cloned into pQE30 vector and subsequently expressed in E. coli as His-tagged proteins. The E1 proteins were characterized by SDS-PAGE. The immunologic reactivity of the proteins were evaluated by western blot (WB) analysis using anti-HCV positive serum samples.Full-length and C- terminally truncated E1 were successfully expressed in prokaryotic system as hexa-histidine-tagged recombinant fusion proteins. The proteins self-assembled into dimers and trimers as shown by PAGE and WB PAGE analyses. Recombinant E1 proteins were also immunologically reactive using polyclonal sera from HCV infected patients.Prokaryotic expression of full-length viral membrane proteins can be difficult. We report here the successful expression of the immunologically reactive full-length and truncated E1 proteins for the first time in Turkey. The rE1 proteins can be important tools fur further diagnostic and immunological studies.Key words : HCV envelope protein 1; Recombinant proteins; Escherichia coli