Hypericum retusum aucher'in kallus ve hücre süspansiyon kültürlerinde hiperisin türevlerinin üretilmesi
Production of hypericin derivates from callus and cell suspension culture of Hypericum retusum aucher
Yazar: HİLAL SURMUŞ ASAN
Danışman: PROF. DR. HASAN ÇETİN ÖZEN
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Doku kültürü = Tissue culture

Özet:
Bu çalışmada, tıbbi bitki olarak potansiyel önemi olan Hypericum retusum Aucher'in kallus ve süspansiyon kültürleri ile çoğaltımı için uygun bir çalışma prosedürü tanımlanması ve bu kallus ve süspansiyon kültürlerinde bu bitkinin farmakolojik olarak önemli altı fenolik bileşiğinin (hiperisin, hiperosid, klorogenik asit, psödohiperisin kuersetin ve rutin) içeriklerinin araştırılması amaçlanmıştır. Fenolik bileşen miktarlarının belirlenmesi LC-MS/MS aracılığı ile yapılmıştır. 
İlk olarak kallus kültürünün oluşturulması için en uygun eksplant belirlendi. Bunun için doğal yetişme ortamından toplanan H. retusum'un yaprak, gövde ve kök kısımlarının fenolik bileşen içerikleri araştırılmıştır. H. retusum'un farklı kısımları arasında en yüksek fenolik bileşen içerikleri bitkinin yaprak kısmından elde edilirken en düşük miktarlar da köklerden elde edilmiştir. H. retusum'un tohumları, bitki büyüme düzenleyicisi (BBD) içermeyen MS besi ortamında çimlendirildi ve 0.5 mg/L BAP içeren MS besi ortamında prolifere edildiler. Bu sürgünlerin yaprakları kallus oluşumu için kullanılmıştır. 
Kallus üretimi ve hücre süspansiyon kültürlerinin kurulmasında en iyi kültür gelişimi ve en yüksek fenolik bileşen miktarlarını elde etmek amacıyla farklı şeker ve kombinasyonları ( 15, 30 ve 50 g/L sukroz ve glukoz ), farklı pH değerleri (pH 4.5, 5.8, 6.5) ve farklı ışık uygulamalarının (sürekli aydınlık, kontrol (16 saat aydınlık 8 saat karanlık) ve sürekli karanlık) etkileri araştırılmıştır.
Yapılan çalışmalar sonucunda en iyi kallus oluşum yüzdesi (%70) 0.5 mg/L KİN + 1.0 mg/L 2,4-D ilaveli ortamdan elde edilmiştir. Kallus gelişiminde 30 g/L sukroz, pH 5.8 ortamı ve kontrol grubundaki ışık koşullarının (16 saat aydınlık, 8 saat karanlık) kullanıldığı MS ortamlarının pozitif etkiye sahip olduğu görülmüştür. Işık uygulamalarında kontrol grubunun en yüksek fenolik bileşen içeriğine sahip olduğu bulunmuştur. Farklı pH değerleri ve şekerlerin kullanıldığı uygulamalarda fenolik bileşen içerikleri uygulama grupları arasında değişkenlik göstermiştir. En iyi süspansiyon kültürleri 0.1 mg/L BAP+0.5 mg/L 2,4-D ve 0.5 mg/L KİN+1.0 mg/L 2,4-D içeren MS besin ortamında gelişen kalluslardan elde edilmiş ve süspansiyon kültürlerinin başlatılmasında bu ortamlar kullanılmıştır. Süspansiyon kültürleri üzerine yapılan uygulamalar sonucunda en iyi kültür gelişimi gösteren ortamların, 0.5 mg/L KİN+1.0 mg/L 2,4-D, pH 5.8, karanlık koşullarındaki ve 30 g/L sukroz içeren MS ortamları olmuştur. En yüksek fenolik bileşen miktarlarının, 0.1 mg/L BAP+0.5 mg/L 2,4-D hormon ilaveli, pH 4.5 (hiperisin ve hiperosid hariç) ve 15 g/L sukroz içeren kültürlerden elde edilmiştir. Işık uygulamalarında ise fenolik bileşen içerikleri uygulanan gruplar arasında değişkenlik göstermiştir. 
Bu tez çalışmasıyla elde edilen bulguların, H. retusum 'daki sekonder metabolitlerin ayrıntılı analizleri ve üretimlerinin artırılmasına yönelik ileri iyileştirme çalışmalarına temel oluşturabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
In this study, it has been aimed to describe a working procedure for callus and suspension culture of H. retusum which has a potential value as a medicinal plant, and to study the contents of seven pharmacologically important phenolic constituents (pseudohypericin, hypericin, hyperforin, rutin, hyperoside and quercetin) in callus and suspension culture. The determination of phenolic compounds was performed by LC-MS/MS.
To start with, the most convenient explant type was determined for the establishment of callogenesis. To do this, the phenolic compounds of leaves, stems and roots H. retusum Aucher grown in nature were investigated. Among the different parts of H. retusum, the least phenolic compound was obtained from the roots, while the leaf showed the highest phenolic compounds. Seeds of H. retusum were germinated in plant growth regulators (PGR) free Murashige and Skoog (MS) medium, and axenic apical tips were proliferated in MS medium containing 0.5 mg/L BAP. Leaves of these shoots were used for callus induction. 
Effect of different sugar combinations ( 15, 30 ve 50 g/L sucrose and glucose ), effect of medium pH (pH 4.5, 5.8, 6.5) and different light applications (constant light, control (16 h light 8 h dark) and constant dark) were investigated on the callus production and the establishment of suspension cultures in order to obtain the optimum culture condition and the highest amount of phenolic contents. 
In this study, the best percentage of callus formation (%70) was obtained from 0.5 mg/L KİN + 1.0 mg/L 2,4-D supplemented MS medium. The MS medium containing a 30 g/L sucrose with, pH 5.8 and under 16 h light 8 h dark of light conditions was found to have a positive effect on the callus growth. The highest phenolic compounds of the light applications was found on the control group (16 h light 8 h dark). Phenolic compounds of callus grown in MS medium with different pH value and sugars varied among the treatments.
The better suspension cultures were obtained from callus grown on a MS medium supplemented with 0.1 mg/L BAP+0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/l KİN+1.0 mg/L 2,4-D and these media were used for the initiation of suspension cultures. As a result of the treatments applied the best growth of suspension cultures was on MS medium supplemented with 30 g/L sucrose 0.5 mg/L KİN+1.0 mg/L 2,4-D at pH 5.8 under constant dark conditions. The highest phenolic compounds obtained from a MS medium containing 0.1 mg/L BAP+0.5 mg/L 2,4-D at pH 4.5 (except hypericin and hyperoside) and 15 g/L sucrose. The phenolic compounds of suspension culture under the different light conditions varied among the treatments.
The results reported from this study are thought to provide a basic knowledge for detailed analysis and the production of secondary metabolites of H.retusum Aucher.