In vitro alzheimer modelinde CK2 inhibisyonunun nöroprotektif etkisinin araştırılması
Investigation of the neuroprotective effect of CK2 inhibition in the in vitro alzheimer model
Yazar: HAMİYET ECİROĞLU
Danışman: PROF. DR. HAMİYET ALTUNTAŞ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Amiloid = Amyloid ; Hesperidin = Hesperidin ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Kazeinler = Caseins ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; Nöroproteksiyon = Neuroprotection

Özet:
Alzheimer hastalığı (AH), amiloid plaklar, nörofibriler yumaklar, sinaptik işlev kaybı, nöronal atrofi gibi patolojik bulguların görüldüğü ilerleyici bir nörodejeneratif hastalıktır. AH ile ilgili bazı genler ve mekanizmalar tanımlanmış olsa da multifaktöriyel bir hastalık olması sebebi ile hastalığın mekanizması ve tedavi yaklaşımları henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu tez çalışmasında in vitro Alzheimer modelinde kazein kinaz 2 (CK2)'nin rolünün araştırılması, CK2 inhibisyonunun AH için terapötik hedef olarak değerlendirilmesi, ayrıca hesperidinin AH üzerindeki nöroprotektif etkisi ve CK2 ile ilişkisinin araştırılması amaçlanmıştır.
 Çalışmamızda öncelikle SH-SY5Y hücrelerine retinoik asit ve beyin kaynaklı nörotrotrofik faktör muamelesi ile farklılaşma protokolü uygulanmış ve olgun kolinerjik nöron dönüşümü, mikroskobik inceleme, nörit uzunluklarının artışı ve nöronal farklılaşma belirteçlerinin (MAP2, NeuN, ChAT, AChE) gen ekspresyon seviyelerinin değerlendirilmesi ile desteklenmiştir. Farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerine Aβ1-42 uygulanarak in vitro Alzheimer modeli oluşturulmuştur. Daha sonra hesperidin ve 5,6-Dikloro-1-Β- D- Ribofuranosilbenzimidazol (DRB)'nin belirlenen konsantrasyon ve sürelerdeki nöroprotektif etkileri MTT [3-(4,5-Dimetil tiyazol-2) 2,5-difeniltetrazolyum bromür], Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Test (ELISA), kantitatif gerçek zamanlı-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) yöntemleri ile değerlendirilmiştir.
Sonuçlarımıza göre, hesperidin in vitro Alzheimer modelinde hücre canlılığını artırarak nöroprotektif etki göstermiştir (p<0.05). DRB ise artan konsantrasyonlarda hücre ölümünü desteklerken, düşük konsantrasyonlarda hücre canlılığını artırarak koruyucu etki göstermiştir. Hesperidinin 25 µM ve 50 µM konsantrasyonlarda ve DRB'nin 0.2 µM ve 0.5 µM konsantrasyonlarda 24 saat süre ile uygulanması, Aβ1-42 protein seviyesinde azalmaya, beta sekretaz 1 (BACE1) gen ekspresyonunda azalmaya ve alfa sekretaz (ADAM10) gen ekspresyonunda artışa neden olmuştur (p<0.05). Ayrıca, hesperidin ve DRB molekülleri, Bax/Bcl-2 oranında da azalmaya neden olarak nöronal apoptozu inhibe etmiştir (p<0.05). Diğer taraftan, oluşturduğumuz in vitro Alzheimer modelinde artış gösteren CK2 gen ekspresyonunun kontrole göre CK2 inhibitörü DRB ile azaldığı (p<0.05), ancak hesperidinin CK2 gen ekspresyonunda bir değişikliğe neden olmadığı belirlenmiştir (p>0.05).
Sonuç olarak bu çalışmada, hesperidin ve DRB'nin amiloidojenik yolun baskılanması ve amiloidojenik olmayan yolun aktivasyonu ile Aβ üretimini inhibe ettiği ve apoptozu önleyici etkisinin olduğu gösterilmiştir. Ayrıca sonuçlarımız CK2'nin AH patogenezinde rol alabileceğini ve terapötik hedef olarak değerlendirilebileceğine de işaret edebilir. Ancak bu sonuçlar, ileri çalışmalar ile desteklenmelidir.

Anahtar kelimeler: Alzheimer Hastalığı; CK2; DRB; Hesperidin; Nöronal Farklılaşma; SH-SY5Y

Abstract:
Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease with pathological findings such as amyloid plaques, neurofibrillary tangles, loss of synaptic function and neuronal atrophy. Although some genes and mechanisms related with AD have been identified, the mechanism and treatment approaches of the disease have not yet been fully elucidated, since it is a multifactorial disease. In this thesis, it was aimed to investigate the role of casein kinase 2 (CK2) in an in vitro Alzheimer's model, CK2 inhibition as a therapeutic target for AD, the neuroprotective effect of hesperidin on AD and relationship of hesperidin with CK2.
In our study, differentiation protocol was applied to SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor treatment. The mature cholinergic neuron transformation obtained at the end of this application was confirmed by microscopic examination, increased neurite lengths, and evaluation of gene expression levels of neuronal differentiation markers (MAP2, NeuN, ChAT, AChE). An in vitro Alzheimer's model was established by applying Aβ1-42 to differentiated SH-SY5Y cells. Then, experimental groups of hesperidin and 5,6-Dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) were created and its neuroprotective effects at specified concentration and times were evaluated by 3-(4,5-Dimethyl thiazol-2) 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) and quantitative real-time- polymerase chain reaction (RT-qPCR) methods.

According to our results, hesperidin showed a neuroprotective effect by increasing cell viability in the in vitro Alzheimer's model (p<0.05). While DRB promoted cell death at increasing concentrations, it showed a protective effect by increasing cell viability at low concentrations. Pre-treatment applications of hesperidin (25 and 50 µM) and DRB (0.2 and 0.5 µM) at the determined dose and for 24 hours caused a decrease in AB1-42 protein level and beta secretase 1 (BACE1) gene expression and increase in alpha secretase (ADAM10) gene expression (p<0.05). Furthermore, hesperidin and DRB molecules inhibited neuronal apoptosis by causing a decrease in Bax/Bcl-2 ratio (p<0.05). On the other hand, CK2 gene expression, which increased in the in vitro Alzheimer's model we created, was reduced by the CK2 inhibitor DRB compared to the control (p<0.05), but hesperidin did not cause any change (p>0.05).

In conclusion, in this study demonstrated that hesperidin and DRB inhibited Aβ production by suppressing the amyloidogenic pathway and activating the non-amyloidogenic pathway, and also its had an inhibitory effect on apoptosis. In addition, our results may indicate that CK2 may be involved in the pathogenesis of AD and may be considered as a therapeutic target. However, these results should be supported by further studies.

Key words: Alzheimer's Disease; CK2; DRB; Hesperidin, Neuronal Differentiation; SH-SY5Y