Ateş yanıklığı hastalık etmeni Erwinia amylovora' nın LNA probe kullanılarak kantitatif real-time PCR ile tanısı ve tespiti
Identification and detection by quantitative real-time PCR of erwinia amylovora, causal agent of the fire blight disease
Yazar: GÖZDE BOZAN
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN BASIM
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Ateş yanıklığı hastalığı = Fire blight ; Erwinia amylovora = Erwinia amylovora ; LNA = Locked nucleic acid ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Yumuşak çekirdekli meyve ağaçlarında önemli kayıplara neden olan Ateş Yanıklığı Hastalık etmeni Erwinia amylovora' nın LNA prob kullanılarak Kantitatif Real-Time PCR ile hassas ve kısa sürede tanısı ve tespiti yapılmıştır. Bakteriyel patojen, Erwinia amylovora' nın Real-Time PCR yöntemiyle tanısı için, patojenik bakterinin polisakkarit üretiminden sorumlu ve kromozomal ams gen' inin 1,6 kb' lik internal diziliminden prob ve primerler dizayn edilmiştir. Geliştirilen prob ve primerler ile Erwinia amylovora genomundan, planlandığı gibi 63 bp' lik PCR ürünü çoğaltılmıştır. Prob ve primerlerin spesifikliğinin belirlenmesi amacıyla farklı Erwinia amylovora strainleri ve farklı türlere ait bakteriyel izolatlar kullanılmıştır. Farklı bitki patojeni bakterilerin genomlarından hiçbir amplifikasyon tespit edilememesine rağmen, test edilen tüm yerli ve yabancı farklı Erwinia amylovora strainlerinden 63 bp' lik amplifikasyon elde edilmiştir. Geliştirilen primer ve probun hassasiyet limiti direkt bakteriyel süspansiyondan 6 cfu/2 ? , genomik DNA' dan 10 pg olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada geliştirilen prob ve primer kullanılarak gerçekleştirilen Kantitatif Real-Time PCR metoduyla, hastalıklı ve sağlıklı yaprak, sürgün ve çiçeği içeren bitki materyallerinden E. amylovora' nın tespiti yapılarak, hastalık etmeninin çiçeklenme döneminden üretim sezonunun sonuna kadar epifitik populasyonlarının değişimlerinin tespit edilmesine olanak sağlanmıştır.

Abstract:
Erwinia amylovora, causal agent of Fire Blight Disease which causes significant losses in pomaceous plants, was sensitively identified and detected in short time by Quantitative Real-Time PCR method using LNA probe. Probe and primers for identification of the bacterium by Real-Time PCR were designed from internal sequence of chromosomal 1.6 kb-ams gene which is responsible for the polysaccharide production of the pathogenic bacteria. 63 bp PCR product from genome of Erwinia amylovora was amplified by the primer and probe as designed. Different Erwinia amylovora strains and bacterial species were used to determine the specificity of the probe and primers. Although no amplication was detected from genome of different species of pathogenic bacteria, the 63 bp-amplifications were detected from different strains of E. amylovora. While sensitivity limit of the prob and primers from direct bacterial suspension was found to be 6 cfu/2 ? , the genomic DNA detection limit was 10 pg. Quantitative Real-Time PCR method using probe and primers developed in this study gave an oppurtunity for detection of epiphytic population of E. amylovora on diseased and healthy plant materials including leaf, shoot and flower in early stage.