Krisinin immunmodulatör etki yoluyla meme kanseri hücreleri üzerine olan anti-tümör etkisinin araştırılması
Investigation of the anti-tumor effect of chrysin on breast cancer cells through immunomodulatory pathways
Yazar: EZGİ BALKAN
Danışman: PROF. DR. ABDÜRRAHİM KOÇYİĞİT
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Katil hücreler-lenfokin aktive = Killer cells-lymphokine activated ; Krisin = Chrysin ; Lenfoma-T hücreli = Lymphoma-T cell ; Meme kanseri =   ; Sitotoksisite-immünolojik = Cytotoxicity-immunologic

Özet:
Krisin (5,7-dihidroksiflavon), doğal olarak bitki ve arı ürünlerinde bulunan bir flavonoiddir ve önemli biyolojik aktiviteleriyle, özellikle de anti-kanser etkileriyle bilinir. Faydalı özellikleri kısmen bağışıklık hücrelerini aktive etme yeteneğine atfedilmiştir. Bu çalışmanın ilk amacı; krisinin doğal öldürücü (NK) NK-92 hücreleri, Jurkat T hücreleri ve RAW 264.7 makrofaj hücrelerinin aktivitelerini ve bu hücrelerin MCF-7 ve MDA-MB-231 gibi iki farklı tipte meme kanseri hücre hattına karşı olan anti-tümöral potansiyellerini nasıl değiştirdiğini araştırmaktır. İkinci olarak krisin etken maddesinin MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerindeki immün kaçış mekanizmalarında önemli rol oynayan programlı hücre ölümü ligand-1 (PD-L1) protein ekspresyonuna ve yine kanser hücrelerinin hayatta kalım proteinlerinden olan p-akt ve p-mTOR protein ekspresyonları üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. 
İlk olarak, krisinin meme kanseri ve normal meme hücre hatlarındaki anti-proliferatif etkisi, reaktif oksijen türleri (ROS) üretim aktivitesi ve apoptotik etkisi sırasıyla MTT testi, DCF-DA floresan probu kullanılarak immünofloresan (IF) boyama ve akış sitometri testi, ve akridin oranj ve etidyum bromür (AO/EB) çift boyaması ile Annexin V/PI boyaması kullanılarak IF boyaması ve akış sitometri analizleri ile ölçüldü. NK-92, Jurkat T hücreleri ve RAW 264.7 makrofaj hücrelerinin proliferasyonları WST-1 testi ile analiz edildi. NK-92 hücrelerinin etkinliği, IL-2 varlığında akış sitometri ile CD56+ yüzey protein ekspresyonunun analizi ve IFN-γ üretiminin enzim bağlı immünosorbent test (ELISA) ile spektrofotmetrik olarak ölçülmesiyle değerlendirildi. PHA-M ile indüklenen Jurkat T hücrelerinin aktivitesindeki değişiklik, ELISA yöntemiyle belirlendi. Makrofaj hücre hattında ise TNF-α ve nitrik oksit (NO) düzeylerinin ELISA ve Griess reaktifi ile ölçülmesiyle aktivasyon analizleri yapıldı.  Krisin uygulanan NK-92 hücreleri doğrudan meme kanseri hücreleri ile birlikte kültüre edildi; meme kanseri hücrelerinin canlılığı MTT testi ile ölçüldü, süpernatantlardaki sitokinler ve granzim-B miktarları ELISA ile, NO miktarı ise Griess reaktifi ile ölçüldü. Krisine maruz bırakılmış meme kanseri hücreleri, PHA-M ile stimüle edilen Jurkat T hücreleri ile doğrudan ko-kültüre edildi; süpernatantlardaki sitokin düzeyleri ELISA testi ile belirlendi. Krisin uygulanan makrofaj hücrelerinin büyüme ortamları ile meme kanseri hücre süpernatantları birlikte kültüre edildi; meme kanseri hücrelerindeki apoptoz düzeyi AO/EB çift boyaması ve Aleksa-fluor-488 bağlı kaspaz-3 ölçümü IF yöntem ile gösterildi.  PD-L1 protein düzeyleri EGF ile indüklenen meme kanseri hücrelerinde IF boyama ve western-blot yöntemleri ile analiz edildi. Yine meme kanseri hücrelerindeki p-akt ve p-mTOR protein ekspresyonları western-blot yöntemi ile değerlendirildi. 
Krisin, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde artan intraselüler ROS üretimi ile sitotoksik ve apoptotik aktivite gösterdi. Ayrıca, NK-92 ve T hücrelerinin her iki meme kanseri hücre hattına karşı sitotoksisitesini önemli ölçüde artırdı ve en belirgin etki MCF-7 hücrelerinde (%20) gözlendi. Bu sitotoksik etki IL-2 ve PHA-M varlığında daha da artarken, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile tedavi edilen meme kanseri hücrelerinde azaldı. NK-92 hücrelerinin meme kanseri hücre hatlarına karşı anti-tümöral yanıtı, granzim-B, TNF-α ve NO üretimindeki artışla ilişkili bulundu. Benzer şekilde, Jurkat T hücrelerinin meme kanseri hücre hatlarına karşı aktivasyonu, granzime-B, IL-2 ve IFN-γ üretimindeki artışla karakterize edildi. Makrofaj hücrelerinin anti-kanser yanıtı ise, meme kanseri hücrelerinde artan apoptoz ile ilişkilendirildi. Ayrıca, NK-92 hücrelerinin krisin ile uyarılması artmış IFN-γ üretimi ve CD56 ekspresyonu ile, Jurkat T hücrelerinin uyarılması IL-2 üretimi ile, RAW 264.7 makrofaj hücrelerinin uyarılması ise NO üretiminin artışıyla karakterize edildi. İki farklı meme kanseri hücre hattında EGF ile artan PD-L1 ve p-akt protein düzeyleri krisin ile inhibe olurken, p-mTOR protein ekspresyonunda anlamlı ir artış gözlenmedi. 
Bulgular, krisinin iki farklı meme kanseri hücre hattına karşı NK-92, T ve makrofaj hücrelerinin aktivasyonuna ve fonksiyonel artışına önemli ölçüde katkıda bulunduğunu, immün yanıttan kaçış mekanizmasında öneme sahip olan PD-L1 proteinini ve kanser progresyonunda rol oynayan p-akt düzeylerini azaltarak kanser tedavisinde hem terapötik hem de kanserin ilerlemesini önlemede kemo-preventif bir ajan olarak kullanılma potansiyelini desteklemektedir.
Anahtar Kelimeler: Krisin, NK hücresi, T hücresi, Makrofaj, Meme Kanseri, İmmün Kontrol Noktası Proteinleri

Abstract:
Chrysin (5,7-dihydroxyflavone) is a flavonoid naturally found in plants and bee products, recognized for its significant biological activities, particularly its anti-cancer properties. These beneficial effects are partly attributed to its ability to activate immune cells. The primary aim of this study is to investigate how chrysin modulates the activities of natural killer (NK-92) cells, Jurkat T cells, and RAW 264.7 macrophages, and their anti-tumoral potentials against two different breast cancer cell lines, MCF-7 and MDA-MB-231. The second objective is to assess the effects of chrysin on the expression of programmed death-ligand 1 (PD-L1), a protein involved in immune evasion, as well as the expression of survival proteins p-akt and p-mTOR in breast cancer cells.
Firstly, the anti-proliferative effects of chrysin on breast cancer and normal breast cell lines, its reactive oxygen species (ROS) production activity, and apoptotic effects were measured using MTT assay, DCF-DA fluorescent probe with immunofluorescence (IF) staining, flow cytometry, and acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) double staining, as well as Annexin V/PI staining for IF staining and flow cytometry analyses. Proliferation of NK-92, Jurkat T cells, and RAW 264.7 macrophages was analyzed by WST-1 assay. The activity of NK-92 cells was evaluated through CD56+ surface protein expression analysis via flow cytometry in the presence of IL-2, and IFN-γ production was measured spectrophotometrically by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Changes in the activity of PHA-M-induced Jurkat T cells were determined by ELISA. Activation of the macrophage cell line was analyzed through measurements of TNF-α and nitric oxide (NO) levels using ELISA and Griess reagent. Chrysin-treated NK-92 cells were directly co-cultured with breast cancer cells; cancer cell viability was measured by MTT assay, and the amounts of cytokines and granzyme-B in supernatants were measured using ELISA, while NO levels were measured using Griess reagent. Chrysin-exposed breast cancer cells were co-cultured directly with PHA-M-stimulated Jurkat T cells; cytokine levels in the supernatants were determined by ELISA. Macrophage cells treated with chrysin were co-cultured with breast cancer cell supernatants; the apoptosis level in breast cancer cells was demonstrated using AO/EB double staining and Alexa-fluor-488-coupled caspase-3 measurement by IF method. PD-L1 protein levels in EGF-induced breast cancer cells were analyzed by IF staining and western blotting, while the expression of p-Akt and p-mTOR proteins in breast cancer cells was evaluated by western blotting.
Chrysin exhibited cytotoxic and apoptotic activity in MCF-7 and MDA-MB-231 cells by increasing intracellular ROS production. Moreover, it significantly enhanced the cytotoxicity of NK-92 and T cells against both breast cancer cell lines, with the most prominent effect observed in MCF-7 cells (20%). This cytotoxic effect was further increased in the presence of IL-2 and PHA-M but decreased in EGF-treated breast cancer cells. The anti-tumoral response of NK-92 cells against breast cancer cell lines was associated with increased production of granzyme-B, TNF-α, and NO. Similarly, the activation of Jurkat T cells against breast cancer cell lines was characterized by increased production of granzyme-B, IL-2, and IFN-γ. The anti-cancer response of macrophage cells was related to increased apoptosis in breast cancer cells. Furthermore, chrysin-stimulated NK-92 cells were characterized by increased IFN-γ production and CD56 expression, Jurkat T cells by increased IL-2 production, and RAW 264.7 macrophages by increased NO production. In two different breast cancer cell lines, the PD-L1 and p-Akt protein levels elevated by EGF were inhibited by chrysin, while no significant increase in p-mTOR protein expression was observed.
The findings suggest that chrysin significantly contributes to the activation and functional enhancement of NK-92, T, and macrophage cells against two different breast cancer cell lines. It also supports the potential use of chrysin as both a therapeutic and chemopreventive agent in cancer treatment by reducing PD-L1and p-Akt levels, which play a role in cancer progression.
Keywords: Chrysin, NK cell, T cell, Macrophage, Breast Cancer, Immune Checkpoint Proteins