Endokrin pankreas organoid yaşlanma modelinde mitokondri hasarının incelenmesi
Investigation of mitochondrial damage in endocrine pancreatic organoid aging model
Yazar: DEREN ASLAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. GÖKHAN DURUKSU
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre ve (Rejeneratif) Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases
Dizin: Endokrin sistem = Endocrine system ; Kök hücreler = Stem cells ; Mitokondrial hastalıklar = Mitochondrial diseases ; Mitokondriler = Mitochondria ; Organoidler = Organoids ; Pankreas = Pancreas ; Yaşlanma = Aging

Özet:
Amaç: In vitro koşullarda senesens (hücre yaşlanması) uyarılmış Pax4 ve MafA pozitif sıçan pankreatik adacık mezenkimal kök hücrelerin (MafA+/Pax4+ sPA-MKH) kullanılmasıyla geliştirilen organoid modelinde mitokondri hasarının incelenmesi bu tez çalışmasında amaçlanmıştır.
Yöntem: In vitro koşullarda MafA+/Pax4+ sPA-MKH 'ler için üç farklı hücre yaşlanma modeli (konjugatif yaşlanma, replikatif yaşlanma ve oksidatif yaşlanma) kullanılarak hücrelerde senesens fenotipini en iyi geliştiren model uygulanmıştır. Hücreler matrijel içerisine gömülerek başarılı bir şekilde pankreas adacık organoidleri geliştirilmiştir. Organoid modelindeki hücreler pankreatik adacık hücrelerine farklılaştırılarak alfa-, beta-, delta- ve polipeptit hücre belirteçleri sitokimya, immün floresan, gen ekspresyonu ve ELISA yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. Model sonrası hücrelerdeki mitokondri sayıları ve mitokondri hasarının belirlenebilmesi için MitoTracker ve TMRM boyamaları gerçekleştirilmiştir.
Bulgular: Hücre proliferasyonundaki azalma ve beta-galaktosidaz aktivitesindeki artışa göre konjugatif yaşlanma modelinin kök hücreler için en uygun model olduğu belirlenmiştir. Organoid yaşlılık modeli yaşlandırma süreci sonrasında MafA+/Pax4+ sPA-MKH 'leri kullanılarak geliştirilmiştir. Senesens fenotipinin organoidlerde validasyonu ve endokrin hücre farklılaşmasının uyarılması sonrasında organoid modeli ile 2-boyutlu kültürü karşılaştırılmış ve insülin gen ekspresyonu ve hücre dışına sekresyonunda artış gözlemlenmiştir. Dithizone boyaması sonucunda organoidler pozitif boyanarak pankreas adacık karakterinde olduğu görülmüştür. Glut-2 ve Glukokinaz gibi beta hücrelerinin glukoz taşıma mekanizmasının önemli molekülleri incelenmiş ve yaşlılık organoid modelinde daha zayıf ifade edildikleri gözlemlenmiştir. Organoid yaşlanma modelinde ise kontrole göre insülin salınımı gibi beta hücre belirteçlerinde de azalma olduğu gözlemlenmiştir. Organoid kültürlerinde senesens fenotipinin devam ettiği ve kontrolle karşılaştırıldığında organoid modelinde mitokondri hasarının daha yüksek olduğu belirlenmiştir. 
Sonuç: Kök hücre için konjugatif yaşlandırmanın yaşlandırma modelleri içerisinde en iyisinin olduğu ve ileri kültür aşamalarında bu fenotipin değişmediği gösterilmiştir. MafA+/Pax4+ sPA-MKH 'lerinden pankreas adacık organoidleri geliştirilmiş ve adacık hücre belirteçlerini ifade ettiği belirlenmiştir. Organoid kültürlerinde senesens hücrelerinin terminal farklılaşmaya daha hızlı gitmesinin yanında insülini daha az salgıladığı, mitokondri membran potansiyelinin bozulduğu ve hücrelerde oksidatif stresin arttığı gözlemlenmiştir. Yaşlılık fenotipi gösteren organoidlerin tip 2 diyabetin erken dönemindeki süreçlerinde gözlemlenen belirteçleri taşıdığı belirlenmiştir. Erişkin kök hücreler kullanılarak pankreas adacık organoidleri bu çalışmada geliştirilmiş olup bu modelin kullanılmasıyla tip 2 diyabetin erken dönemindeki süreçlerin daha iyi anlaşılması sağlanabilir.
Anahtar Kelimeler: 
Mezenkimal kök hücre, organoid, endokrin pankreas, mitokondri hasarı, yaşlanma

Abstract:
Objective: The aim of this thesis study was to investigate mitochondrial damage in an organoid model developed in vitro using Pax4 and MafA positive rat pancreatic islet mesenchymal stem cells (MafA+/ Pax4+ rPI-MSCs) induced senescence (cell aging).
Method: Using three different cell aging models (conjugative aging, replicative aging and oxidative aging) for MafA+/ Pax4+ rPI-MSCs under in vitro conditions, the model that best developes the senescence phenotype in cells was applied. Pancreatic islet organoids have been successfully generated by embedding cells in matrigel. The cells in the organoid model were differentiated into pancreatic islet cells and alpha-, beta-, delta- and polypeptide cell markers were examined using cytochemistry, immune fluorescence, gene expression and ELISA methods. After generating the model, MitoTracker and TMRM stainings were performed to determine the number of mitochondria and mitochondrial damage in the cells.
Results: With respect to the significant decrease in cell proliferation and the increased beta-galactosidase activity, it was determined that the conjugative aging model is the most applicable model for stem cells. The aging organoid model was developed using MafA+/ Pax4+ rPI-MSCs after the aging process. After the validation of senescence phenotype in organoids and the induction of endocrine cell differentiation, the improvment in both insulin gene expression and its extracellular secretion was observed in the organoid model compared to the 2-dimensional culture. As a result of dithizone staining, organoids were stained positively, which indicates that the organoids possess pancreatic islet character. Critical molecules of glucose transport mechanism in beta cells, such as Glut-2 and Glucokinase, were examined and it was found that they were expressed more weakly in the organoid aging model. In the organoid aging model, it was also observed that there was a decrease in beta cell markers, like insulin secretion, compared to the control. The senescence phenotype was observed to continue still in organoid cultures and the eleveted level of mitochondrial damage was detected in the organoid model compared to the control.
Conclusions: The conjugative aging for stem cells was proven to be the best aging model, and this phenotype does not altered in the later stages of the culture. Pancreatic islet organoids were developed from MafA+/ Pax4+ rPI-MSCs and it was determined that they express islet cell markers. Besides the senescence cells underwent terminal differentiation in higher number in organoid cultures, it has been observed that insulin is secreted less, mitochondrial membrane potential was impaired, and oxidative stress increased in cells. The organoids showing senescence phenotype carry the markers observed in the early stages of type 2 diabetes. Pancreatic islet organoids using adult stem cells were developed in this study, by using this model, a better understanding of the early stages of type 2 diabetes might be achieved.
Keywords: 
Mesenchymal stem cell, organoid, endocrine pancreas, mitochondrial damage, aging