Paratiroid dokusundan 3 boyutlu biyo baskılama desteği ile in vitro kalsiyum duyarlı ve hormonoaktif paratiroid doku eşleniği üretimi
Production of in vitro calcium-sensitive and hormonoactive parathyroid tissue with 3D bioprinting
Yazar: SÜMEYRA GÜLER
Danışman: PROF. DR. KERİM BORA YILMAZ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Ankara Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim Ve Araştırma Hastanesi / Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Genel Cerrahi = General Surgery
Dizin: Doku kültürü = Tissue culture ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Hipokalsemi = Hypocalcemia ; Hipoparatiroidizm = Hypoparathyroidism ; Paratiroid bezleri = Parathyroid glands

Özet:
Giriş ve Amaç: Tiroid cerrahisi sonrası en sık gelişen komplikasyon paratiroid bezlerin iatrojenik olarak çıkarılması veya hasarlanması sonucu ortaya çıkan hipoparatiroidiye sekonder gelişen hipokalsemidir. Çoğunlukla geçici daha az sıklıkta da kalıcı olabilen hipokalsemi klinikte artmış nöromusküler irritabiliteye bağlı semptomlar ile ortaya çıkmaktadır. Hipoparatiroidizmde medikal tedavi ile amaç normokalsemi ve normofosfatemiyi sağlamak; hipokalseminin osteomalazi, katarakt gibi uzun dönem sonuçlarını engellemektir. D vitamini ve analogları ile kalsiyum takviyeleri kullanmak tedavinin temel dayanağıdır ancak bu tedavi parathormon eksikliğini tam olarak karşılayamamaktadır ve hiperkalsemiyi ve/veya hiperkalsiüriyi indükleyerek ektopik mineralizasyondan böbrek yetmezliğine varan komplikasyonlara yol açabilmektedir.

Paratiroid bezi hasarlanması nedeniyle yeterli endojen parathormon üretiminin ve sekresyonunun olmadığı hastalar için ön çalışma olarak organize ettiğimiz bu çalışmada primer amacımız; postoperatif hipoparatiroidizmin günümüzde tercih edilen medikal tedavi yöntemlerinden üstün ve küratif bir tedavi yöntemi olabilecek, fonksiyonel minimal paratiroid dokusundan hücre kültürü ile yeterli fonksiyonel doku teminini sağlamak ve 3 boyutlu biyo baskı desteğiyle oluşturulan mikro çevre ile in vitro koşullarda kalsiyum konsantrasyonuna duyarlı ve hormonoaktif doku eşleniği üreterek gelecekteki in vivo modellemelerin temelini oluşturmaktır.

Materyal ve Metod: Paratiroid bezindeki hücrelerin mekanik ve enzimatik izolasyonu sonrasında in vitro kultive edilen hücreler ekstrüzyon tabanlı 3 boyutlu biyo baskılama yöntemiyle katman katman mikro çevre oluşturularak hidrojel yapı iskelelerine ekildi. Hücre proliferasyonu, canlılık oranları ve sitomorfolojik yapı Alamar mavisi ve Phalloidin/DAPI ile floresan, tripan mavisi ile görsel olarak değerlendirildi. CaCl 2 ile çapraz bağları oluşturulan yapı iskeleleri mekanik çekme testine tabi tutuldu. Üretilen paratiroid doku eşleniğinin in vitro koşullarda kalsiyum duyarlılığı ve hormonoaktivitesi hem 2 boyutlu hücre kültüründe hem de 3 boyutlu yapı iskelelerinde farklı ekstraselüler kalsiyum konsantrasyonlarındaki parathormon seviyeleri ELISA PTH kitiyle ölçülerek değerlendirildi.

Sonuç ve Tartışma: Hormonoaktivitelerini değerlendirmek için 3 farklı kalsiyum konsantrasyonunda inkübe edilen doku eşleniklerinin 3.0 mM ekstraselüler kalsiyum ortamı 0.5 mM ekstraselüler kalsiyum konsantrasyonu olan ortam ile karşılaştırıldığında parathormon salınımının anlamlı olarak azaldığı görüldü.

Çalışmada karşılaşılan zorluklardan biri yoğun fibroblast proliferasyonun paratiroid hücre proliferasyonunu ve matürasyonunu baskılamasıydı ki; izolasyon yöntemlerini spesifiye ederek daha saf ve yüksek canlılıkta paratiroid hücre kümeleri elde edildi.

Literatürde ilk defa az miktarda hormon sekresyonu ile homeostazis için oldukça önemli bir sistemik yanıt oluşturan, boyut olarak küçük olması sayesinde hem kısa sürede 3 boyutlu üretim kolaylığının sağlanabileceği hem de doku perfüzyonunun parakrin olarak tolere edilebileceği, sınırlı hücre çeşitliliğine sahip fonksiyonel paratiroid doku eşleniği üretimi ile ön çalışmayı tamamlayarak sonraki aşama olan in vivo hayvan modellemesinin temelini planladık.

Abstract:
Introduction and Aim: The most common complication after thyroid surgery is hypocalcemia secondary to hypoparathyroidism resulting from iatrogenic removal or damage of the parathyroid glands. Hypocalcemia, which may be mostly transient, less often permanent, occurs clinically with symptoms related to increased neuromuscular irritability. The aim of medical treatment in hypoparathyroidism is to provide and maintain normocalcemia and normophosphatemia; to prevent long-term consequences of hypocalcemia such as osteomalacia and cataracts. Using vitamin D and its analogues and calcium supplements is the mainstay of treatment, but this treatment cannot fully compensate for the parathormone deficiency and may cause complications ranging from ectopic mineralization to renal failure by inducing hypercalcemia and/or hypercalciuria.

Our primary aim in this study, which we organized as a preliminary study to form the basis of in vivo modeling for patients who do not have sufficient endogenous parathormone production and secretion due to parathyroid gland damage; to provide adequate functional tissue with cell culture from functional minimal parathyroid tissue, which can be a superior and curative treatment method of postoperative hypoparathyroidism than the currently preferred medical treatment methods, and by producing a hormone-active tissue conjugate that is sensitive to calcium concentration in vitro with the micro-environment created with the support of 3D bioprinting.

Materials and Methods: After the mechanical and enzymatic isolation of the cells in the parathyroid gland, the cells cultured in vitro were planted on the hydrogel scaffolds by creating a layer-by-layer microenvironment with the extrusion-based 3D bioprinting method. Cell proliferation, viability rates and cytomorphological structure were evaluated by Alamar blue and Phalloidin/DAPI for fluorescence, and visually with trypan blue. Scaffolds crosslinked with CaCl2 were subjected to mechanical tensile testing. Calcium sensitivity and hormone activity of the produced parathyroid tissue conjugate in vitro were evaluated by measuring parathormone levels at different extracellular calcium concentrations in both 2D cell culture and 3D scaffolds with the ELISA PTH kit.

Conclusion and Discussion: When the tissue conjugates incubated at 3 different calcium concentrations to evaluate their hormone activity, 3.0 mM extracellular calcium medium was compared to the medium with 0.5 mM extracellular calcium concentration, it was observed that parathormone release was significantly reduced.

One of the important difficulties encountered in the study was that intense fibroblast proliferation suppressed parathyroid cell proliferation and maturation; purified and highly viable parathyroid cell clusters were obtained by specific isolation methods.

For the first time in the literature; we have established the basis for the next step is in vivo animal modeling which is the production of functional parathyroid tissue conjugate with limited cell diversity, which creates a very important systemic response for homeostasis with a small amount of hormone secretion, and thanks to its small size, 3-dimensional production can be achieved in a short time and tissue nutrition can be tolerated paracrinely.