Doku iskelesi-destekli perfüzyon biyoreaktör işletim parametrelerinin preosteoblastların üreme ve osteojenik farklılaşma potansiyelleri üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of effects of scaffold-supported perfusion bioreactors process parameters on the proliferation and osteoblastic differentiation of preosteoblasts
Yazar: GİZEM AYDIN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Tez çalışması 014 D02 602 001-509 numaralı Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi projesi ve Tübitak 214M100 numaralı proje ile desteklenmiştir.    Sunulan tez çalışması kapsamında, perfüzyon biyoreaktörlerde dinamik yaklaşımla gerçekleştirilen hücre ekimi ve hücre kültürü çalışmalarının MC3T3-E1 preosteoblast hücreleri üzerindeki üreme ve osteojenik farklılaşma potansiyellerinin incelenmesi amaçlanmıştır. 
Bu amaç doğrultusunda gerçekleştirilen deneysel çalışmaların ilk basamağında kitosan-hidroksiapatit süper gözenekli hidrojel (kitosan-HA SPHC) doku iskeleleri çapraz bağlayıcı ajan olarak glioksal ve köpükleştirici ajan olarak sodyum bikarbonat (NaHCO3) kullanılarak hazırlanmıştır. Mikrodalga destekli gaz köpükleştirme tekniği ile kısa zamanda, verimi yüksek ve in vitro çalışmalarda daha başarılı sonuçlar veren doku iskeleleri üretilmiştir. 

İkinci basamakta uzun süreli dinamik kültür çalışmalarının yürütüleceği sürdürülebilir sterilite sağlayan, sızıntıyı önleyen ve besin/atık madde difüzyon problemlerinin çözülebildiği perfüzyon biyoreaktör sisteminin kurulumu tamamlanmıştır. Çalışmanın bir sonraki aşamasında kurulumu yapılan düzenekte, MC3T3-E1 preosteoblast hücreleri kullanılarak farklı akış hızlarında ve farklı akış yönlerinde (tek yönlü akış: 0.1 mL/dk, tek yönlü akış: 1 mL/dk; iki yönlü akış: 0.1 mL/dk, iki yönlü akış: 1 mL/dk)  dinamik hücre ekimi çalışmaları durgun ekim çalışmaları ile karşılaştırmalı olarak tamamlanmıştır. Hücre ekimi çalışmalarının sonunda hücre canlılığı ve çoğalması MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazolyum bromür) analizi ile takip edilmiş, hücre morfolojileri ve penetrasyonu ise SEM (taramalı elektron mikroskobu) analizi ile görüntülenmiştir. Analizler sonucunda en etkin hücre ekim yönteminin durgun koşullarda gerçekleştiği sonucuna ulaşılmıştır. 
Hücre ekiminden elde edilen bulgular sonucunda durgun koşullar ile karşılaştırmalı olarak dinamik hücre kültürü (iki yönlü akış: 0.1 mL/dk) çalışmaları 21 gün süreyle yürütülmüş ve kültürün belirli günlerinde (7. ve 14. günlerinde) ortam değişimi yapılmıştır. Hücre kültürü çalışmalarının belirli günlerinde (7, 14, 21. günlerinde) hücre aktivitelerinin gözlenmesi amacıyla MTT, hücre morfolojilerinin gözlenmesi amacıyla da SEM analizleri gerçekleştirilmiştir. Hücre kültürü çalışmalarının sonunda ise RT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) analizleri gerçekleştirilerek MC3T3-E1 hücrelerinin Kollajen1 (Col1), Runt İlişkili Transkripsiyon Faktörü 2 (RUNX2), Osteokalsin (OCN) ve Osteopontin (OPN) gen ifade düzeyleri tespit edilmiştir. Yapılan tüm analizler sonucunda en yüksek hücre yoğunluğuna durgun koşullarda hücre ekimi sonrası perfüzyon biyoreaktörde gerçekleşen dinamik kültür (iki yönlü akış ve akış hızı: 0.1mL/dk) sisteminde ulaşıldığı gözlenmiştir.
Çalışmalardan elde edilen bulgular ışığında, durgun koşullarda gerçekleştirilen hücre ekimi sonrasında perfüzyon biyoreaktör destekli 21 günlük dinamik hücre kültürü (iki yönlü akış: 0.1 mL/dk) çalışmasının MC3T3-E1 preosteoblast hücrelerinin osteojenik farklılaşmasını desteklediği görülmüştür.

Anahtar Kelimeler: perfüzyon biyoreaktör; dinamik hücre ekimi; MC3T3-E1 hücreleri; kitosan-hidroksiapatit süper gözenekli hidrojeller; mikrodalga destekli gaz köpükleştirme yöntemi.

Abstract:
This study was financially supported by Hacettepe University, Scientific Research Project number: 014 D02 602 001-509 and Turkish Scientific and Research Council (Tübitak) Project no: 214M100. The aim of this study is to investigate the growth and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 preosteoblasts in perfusion bioreactor performed with dynamic cell seeding and following cell culture studies. 
At the first step of this study chitosan-hydroxyapatite (HA) superporous hydrogel composites (SPHCs) were synthesized by combining microwave irradiation and gas foaming techniques in the presence of crosslinking agent, glyoxal, and gas blowing agent, sodium bicarbonate (NaHCO3). Thus, composites hydrogels, showing better performance in vitro studies, were produced rapidly and efficiently.

In the second step of this study, for using in long term in vitro dynamic culture installation of a perfusion bioreactor system that provides sustainable sterility, prevents leak and solves nutrient/waste mass transport problems were completed. In the next step, MC3T3-E1 cells were dynamically seeded in perfusion bioreactor under different flow ways and flow rates (one-way flow, 0.1 mL/min, one-way flow, 1 mL/min; two-way flow, 0.1 mL/min, two-way flow, 1 mL/min) in comparison with static conditions. At the end of the cell seeding studies, cellular activity and cell proliferation were followed by MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-il]-2,5 diphenyltetrazolium bromide) assay, cell morphology and penetration was monitorized by scanning electron microscope (SEM) analysis and the results demonstrated that the most efficient cell seeding was realized at static conditions. 
As a result of findings obtained from the cell seeding and dynamic cell culture studies carried out in perfusion bioreactor (two-way flow, 0.1 mL/min), cultures were performed for 21 days in comparison with static conditions and cell culture media were refreshed on certain days (7th and 14th). In certain days of cell culture studies (1st, 7th, 14th and 21st days) cell viability and proliferation were analyzed by MTT and morphological examination was done with SEM. At the end of the culture studies Collagen 1 (Col1), Runt Related Transcription Factor 2 (RUNX2), Osteocalcin (OCN) and Osteopontin (OPN) expression levels were determined using real time-reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). As a result, it was understood that, the highest cell density and osteogenic differentiation were observed in static cell seeding-dynamic cell culture (two-flow way, 0.1 mL/min) system. 
In the light of these studies, it was concluded that dynamic cell culture which carried out in perfusion bioreactor for 21 days after static cell seeding could be evaluated to use in bone tissue engineering.

Keywords: perfusion bioreactor; dynamic cell seeding; MC3T3-E1 cells; chitosan-hydroxyapatite superporous hydrogels; microwave assisted gas foaming technique.