Poli(akrilamit-ko-akrilik asit) hidrojellerine lakkaz enzimi immobilizasyonu
Immobilization of laccase onto poly(acrylamide-co-acrylic acid) hydrogels
Yazar: GÖKNİL ŞAHİN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ HAYDAR ALTINOK
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada, Lakkaz enzimi (EC 1.10.3.2), poli(akrilamit-ko-akrilik asit) hidrojellerine, epiklorhidrin (ECH), N-hidroksisüksinimit (NHS) ve karbodiimit (CDI) ile aktifleştirilerek kovalent bağlanma yöntemiyle (P(AAm-ko-AAc)/ECH, P(AAm-ko-AAc)/CDI ve P(AAm-ko-AAc)/NHS) şeklinde immobilize edilmiştir. Serbest enzim için Michaelis-Menten sabiti (Km) ve maksimum tepkime hızı (Vmak) değerleri sırası ile 8,69x10-3 mM, 7,19x10-3 mM.dak-1 olarak bulundu. İmmobilize enzimler (P(AAm-ko-AAc)/ECH, P(AAm-ko-AAc)/NHS ve P(AAm-ko-AAc)/CDI için ise Km değerleri 0,50x10-3 mM, 1,17x10-3 mM ve 7,35x10-3 mM, Vmak değerleri 0,85 x10-3 mM.dak-1,1,43x10-3 mM.dak-1, 4,65x10-3 mM.dak-1 olarak bulundu. Serbest enzim ve immobilize enzimler (P(AAm-ko-AAc)/ECH, P(AAm-ko-AAc)/CDI ve P(AAm-ko-AAc)/NHS) için optimum pH değerleri sırasıyla 5,0-5,0-5,5 ve 5,5 ve optimum sıcaklık değerleri serbest enzim ve immobilize enzimler (P(AAm-ko-AAc)/ECH, P(AAm-ko-AAc)/CDI ve P(AAm-ko-AAc)/NHS) için sırasıyla 40ºC ve 45ºC olarak bulundu. Serbest enzim 64 gün sonunda 4 0C' da aktifliğinin %29' unu koruduğu gözlendi. P(AAm-ko-AAc)/ECH, P(AAm-ko-AAc)/CDI ve P(AAm-ko-AAc)/NHS hidrojellerine immobilize edilen lakkaz için sırasıyla 35. günde %51' ini, 38. günde %66' sını, 37. günde %69' unu koruduğu gözlendi. İmmobilize enzimlerin 5 kez kullanım sonunda ve enzim aktifliklerini %17-52 aralığında koruduğu bulundu. P(AAm-ko-AAc)/CDI ve P(AAm-ko-AAc)/NHS hidrojellerine immobilize edilen lakkazlar için 40˚C ve 50˚C' da inaktivasyon sabitleri sırasıyla 0,0108-0,0165, 0,0190-0,0252 olarak bulundu. Serbest lakkazın 30˚C' da 6 saat sonunda metil oranjın başlangıç rengini %31 oranında giderdiği gözlendi. P(AAm-ko-AAc)/ECH, P(AAm-ko-AAc)/CDI, P(AAm-ko-AAc)/NHS hidrojellerine immobilize edilen lakkazın ise sırasıyla %21, %29 ve %32 oranında giderdiği gözlendi.

Abstract:
In this study, Laccase (E.C 1.10.3.2) was covalently immobilized onto poly(acrylamide-co-acrylic acid) hydrogels by activating with epichlorohydrin (ECH), N-hydroxysuccinimide (NHS) and carbodiimide (CDI). Michaelis-Menten constant (Km) and maximum reaction rate (Vmax) values were found as 8,69x10-3 mM, 7,19x10-3 mM.dak-1 for free enzyme, respectively. Km and Vmax values were found as 0,50x10-3 mM, 1,17x10-3 mM, 7,35x10-3 mM and 0,85 x10-3 mM.dak-1,1,43x10-3 mM.dak-1, 4,65x10-3 mM.dak-1 for immobilized enzymes, respectively. Optimum pH were observed as 5,0 for free enzyme and 5,0-5,5 and 5,5 for P(AAm-co-AAc)/ECH, P(AAm-co-AAc)/CDI, P(AAm-co-AAc)/NHS immobilized enzymes. Optimum temperature were observed as 40oC and 45oC for free enzyme and immobilized enzymes, respectively. After 64 days of storage at 4oC free enzyme retained 29% of its original activity and immobilized enzymes, P(AAm-co-AAc)/ECH, P(AAm-co-AAc)/CDI, P(AAm-co-AAc)/NHS, were retained 51-69% of their original activities, after 35-37 days of storage at 4oC. İmmobilized enzymes were used repeatedly 5 times, were retained 17-52% of their original activities. Inactivation rate constants (ki) of immobilized enzymes, P(AAm-co-AAc)/CDI and P(AAm-co-AAc)/NHS, 0,0108-0,0165 min-1, 0,0190-0,0252 min-1. Percent decolorization of methyl orange by free enyzme and enyzmes immobilized in P(AAm-co-AAc)/ECH, P(AAm-co-AAc)/CDI, P(AAm-co-AAc)/NHS were found as 31% and 21%, 29%, 32%.