APC mutant fare intestinal organoidlerinde WNT yolak modülasyonunun kök hücreler üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of WNT signaling modulation on intestinal stem cell dynamics in APC mutant intestinal organoids
Yazar: SİNEM BAKIR
Danışman: PROF. DR. AYTEKİN AKYOL
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Fareler = Mice ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Kök hücreler = Stem cells ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Organoidler = Organoids ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Kolorektal kanser (KRK) gelişiminin en önemli nedenlerinden bir tanesi WNT sinyal yolağında rol alan genlerin mutasyonlarıdır. Vakaların büyük çoğunluğunda WNT sinyal yolağı yıkım kompleksinde negatif düzenleyici olarak görev almakta olan APC tümör baskılayıcı gen mutasyonlarına rastlanmaktadır. Çok hızlı bir çoğalma ve yenilenme sürecine sahip olan intestinal epitel hücrelerde WNT sinyal yolağı yüksek aktivite göstererek intestinal kök hücrelerin ve doku homeostazının düzenlenmesinde aktif görev almaktadır. APC genine ait mutasyonların çoğunluğu yıkım kompleksinin bir diğer elemanı olan AXIN bağlanma bölgesinde gerçekleşmektedir. Yıkım kompleksi elemanlarında oluşan çeşitli mutasyonlar nedeniyle görevini tam olarak yerine getirememektedir. Β-catenin proteini yıkım kompleksi tarafından sitoplazmik bölgede proteozomal degradasyona uğrayamadığında çekirdeğe translokasyonu gerçekleşmekte ve böylece TCF/LEF transkripsiyon faktörünün düzenlenmesinde görev aldığı WNT hedef genlerinin transkripsiyonel aktivitesini arttırmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında laboratuvarıma özgü mutant ApcΔ750 fare ince bağırsak dokularından üretilen olan intestinal organoidlerde WNT ilişkili genlerden Ctnnb1, Axin2 ve Lgr5 RNA düzeyinde incelenmiştir. Analizlerin sonucunda bu genlerin ifadelerinin ApcΔ750 intestinal organoidlerde yüksek olduğu ispatlanmıştır. Tez çalışmasının birincil amacı olarak, anti-kanser etkisi olduğu bilinen XAV939 ve Niklozamit ilaçlarının ApcΔ750 organoidlere uygulandığında Ctnnb1, Axin2 ve Lgr5 gen ifadelerinin RNA düzeyinde azaldığı gösterilmiştir. Ayrıca immünfloresan boyama tekniği uygulanarak kript ve villus domeynlerindeki Ctnnb1 protein seviyesi incelenmiştir. Böylece XAV939 ve Niklozamitin KRK oluşumu öncülü organoidlerdeki Wnt sinyal yolağını inhibe ettiği ve bununla ilişkili olarak İKH aktivasyonunu baskıladığı gözlenmiştir. Çalışmanın ikincil bir amacı ise laboratuvarımızda üretilen ApcΔ750 fare modelinin in vitro çalışmalarda da başarı sağladığını gösterebilmektir.

Abstract:
One of the most important causes of colorectal cancer development is mutations of genes involved in the WNT signaling pathway. In the vast majority of cases, APC tumor suppressor gene mutations, which act as negative regulators of the WNT signaling pathway degradation complex, are encountered. In intestinal epithelial cells, which have a very rapid proliferation and regeneration process, the WNT signaling pathway shows high activity and takes an active role in the regulation of intestinal stem cells and tissue homeostasis. Most of the mutations of the APC gene occur at the AXIN binding site, which is another element of the degradation complex. Due to various mutations in the components of the destruction complex, it cannot fully function its task. When the β-catenin protein cannot be proteosomally degraded in the cytoplasmic region by the degradation complex, it translocates to the nucleus and thus increases the transcriptional activity of WNT target genes, which are involved in the regulation of the TCF/LEF transcription factor. In this thesis study, intestinal organoids produced from mutant ApcΔ750 mouse small intestine tissues specific to our laboratory were investigated at the RNA level of WNT-related genes Ctnnb1, Axin2 and Lgr5. As a result of the analysis, it was proved that the expression of these genes is high in ApcΔ750 intestinal organoids. As the primary aim of the thesis study, it has been shown that Ctnnb1, Axin2 and Lgr5 gene expressions are decreased at the RNA level when XAV939 and Niclosamide drugs, which are known to have anti-cancer effects, are applied to ApcΔ750 organoids. In addition, the level of Ctnnb1 protein in the crypt and villus domains was examined by applying the immunofluorescent staining technique. Thus, it was observed that XAV939 and niclosamide inhibited the Wnt signaling pathway in organoids that are precursors of CRC formation, and thus suppressed ICH activation. A secondary aim of the study is to show that the ApcΔ750 mouse model produced in our laboratory is also successful in in vitro studies.