Farklı besiyeri bileşimleri ve fermentasyon stratejileri kullanılarak mikrobiyal poligalakturonaz üretiminin optimizasyonu
Optimizatıon of microbial polygalacturonase production using different media compositions and fermentation strategies
Yazar: ERCAN KARAHALİL
Danışman: DOÇ. DR. İRFAN TURHAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Üretim maliyetlerini düşürmek amacıyla fermentasyon ortamında düşük maliyetli materyallerin kullanımı son yıllarda araştırmacılar tarafından benimsenen bir yaklaşım olmuştur. Bu çalışmada Aspergillus sojae ile poligalakturonaz enzimi üretiminde 11 farklı karbon kaynağı ve 9 farklı azot kaynağı denenmiş olup en verimli seçilenler ile biyoreaktör denemeleri gerçekleştirilmiştir. Fermentasyon ortamındaki aşırı fungal gelişimin kontrolü için mikropartikül tekniği kullanılmış ve tüm denemelerde tekrar edilebilir sonuçlar elde edilmiştir. Küçük ölçekli (5-L) biyoreaktörde substrat miktarı ile hava akış hızı Merkezi Kompozit Tasarımı kullanılarak en yüksek enzim aktivitesi için optimize edilmiştir. Bu amaçla, optimum koşullarda (54.14 g/L substrat miktarı, 0.25 vvm havalandırma hızı) gerçekleştirilen fermentasyonlar için en yüksek enzim aktivitesi ultrafiltrasyon sonrasında 126.91 U/ml olarak tespit edilmiştir. Belirlenen optimum koşullar kullanılarak küçük ve büyük ölçekli (30-L) biyoreaktörlerde gerçekleştirilen enzim üretimlerine ait deneysel sonuçların 10 farklı matematiksel model ile uyumu incelenmiştir. Küçük ölçekli biyoreaktör denemeleri için deneysel veriler ile en uyumlu modeller Modifiye Gompertz, Modifiye Richards, Modifiye Lojistik ve Huang modelleri olarak tespit edilmiştir. Büyük ölçekli üretim için ise deneysel verilere en yakın aktivite tahminleri Modifiye Richards ve Modifiye Lojistik modelleri ile sağlanmıştır. 

Fermentasyonlardan elde edilen fermente sıvı örnekleri enzimin kısmi saflaştırması için 10 ve 100 kDa'lık ayırma sınırlarında ultrafiltrasyon kullanılmıştır. Ultrafiltrasyon öncesi ve sonrasına ait örneklerde protein miktar tayini yapılmış ve böylece spesifik aktivite değerleri belirlenmiştir. Ayırma sınırının 100 kDa olduğu ultrafiltrasyonda spesifik enzim aktivitesinde 2.45 kat artış sağlanmış ve 278.90 U/mg olarak belirlenmiştir. Ultrafiltrasyon sonrasında elde edilen permeat ve retentat örnekleri, enzimin toz formda ticari bir preparat olarak üretilebilme potansiyelini belirlemek amacıyla liyofilizasyon (dondurarak kurutma) işlemine tabi tutulmuş ve saflaştırma katsayıları tespit edilmiştir. Üretilen poligalakturonazın pektin, karboksimetil selüloz ve poligalakturonik asite olan ilgisi incelenmiş ve Km değerleri sırasıyla 21.2, 10.8 ve 4.1 mg/ml olarak bulunmuştur. Bununla birlikte, enzimin pektin, karboksimetil selüloz ve poligalakturonik asit substratlarında Vmax değerleri sırasıyla 101.7, 33.7 ve 40.2 µmol dk−1 mg−1 olarak belirlenmiştir. Üretilen poligalakturonaz Ag+, K+ ve Na+ iyonları ile etkileşime geçtiğinde aktivitesi stabil kalırken EDTA ajanı, Ba2+, Fe3+, Mn2+, Co2+ ve Sr2+ iyonlarının enzim üzerinde inhibitör etki gösterdiği tespit edilmiştir. Son olarak, fermentasyon öncesi, fermentasyon süreci ve fermentasyon sonrası aşamalarda kullanılmış olan hammadde, sarf ve enerji giderlerinin güncel birim fiyatları esas alınarak temel bir maliyet analizi hazırlanmıştır. 

Tez sonucunda; fermentör ortamında aşırı küf gelişimi ile kontrolü zorlaşan çalışma koşulları mikropartikül kullanımı ile iyileştirilerek standart-tekrar edilebilir üretimler gerçekleştirilmiş, üretim verilerinin matematiksel modellerle uyumlulukları belirlenmiş, üretilen poligalakturonaz başarılı bir şekilde karakterize edilmiş, kısmi olarak saflaştırılmış ve liyofilizasyon ile toz formda elde edilmiştir. Ayrıca doğal karbon kaynaklarının kullanımı için temel bir maliyet analizi yapılarak poligalakturonazın düşük maliyet ile üretim potansiyeli ortaya konmuştur.

Abstract:
In recent years, the evaluation of low-cost materials in fermentation media to reduce production costs has been an approach adopted by researchers. In this study, 11 different carbon sources and 9 different nitrogen sources were used in the production of polygalacturonase enzyme from Aspergillus sojae, and bioreactor experiments were carried out with the most efficient ones. To control excessive fungal growth in fermentation media, microparticle technique was used and thus repeatable results were obtained in all trials. In a small-scale bioreactor, the concentration of substrate and aeration rate are optimized using the Central Composite Design for the highest enzyme activity. For this purpose, after ultrafiltration, the highest enzyme activity was determined as 126.91 U/ml for the fermentations performed under optimum conditions (54.14 g/L substrate concentration, 0.25 vvm aeration rate). Enzyme production was performed in small (5-L) and large-scale (30-L) bioreactors using the determined optimum conditions and the compatibility of the experimental results with 10 different mathematical models was investigated. The most compatible models with experimental data for small-scale bioreactor trials were determined to be Modified Gompertz, Modified Richards, Modified Logistics and Huang models. For large-scale production, activity estimates closest to experimental data were calculated with Modified Richards and Modified Logistics models.

Broth samples obtained from fermentations were passed through an ultrafiltration system using the membranes of 10 and 100 kDa as cut-off value for partial purification of the enzyme. Crude enzyme and ultrafiltered solutions were analyzed for quantification of total protein, and thus specific activity values were determined. Lyophilization (freeze-drying) process was implemented to the permeate and retentate samples obtained from ultrafiltration to determine the potential of the enzyme to be produced as a commercial preparation, and its purification coefficients were calculated. The affinity of the produced polygalacturonase to the substrates of pectin, carboxymethyl cellulose, and polygalacturonic acid was examined, and Km values were calculated as 21.2, 10.8 and 4.1 mg/ml, respectively. Further, Vmax values of the enzyme in the substrates of pectin, carboxymethyl cellulose, and polygalacturonic acid were determined as 101.7, 33.7 and 40.2 µmol min−1 mg−1, respectively. It was found that EDTA agent, Ba2+, Fe3+, Mn2+, Co2+ and Sr2+ ions have an inhibitory effect on the enzyme, although the produced polygalacturonase was stabile during interaction of the enzyme with Ag+, K+ and Na+ ions. Finally, basic a cost analysis was prepared based on the current unit prices of raw materials, consumables and energy expenditures for upstream and downstream processing.

In the fermenter, operation conditions that are difficult to control due to excessive fungal growth were improved with the use of microparticles and standard-repeatable productions were achieved. The compatibility of production data with the mathematical models was determined. Polygalacturonase was successfully characterized, partially purified and lyophilized. In addition, an economic analysis was prepared for the fermentation performed with natural carbon sources to show the low-cost production potential of the polygalacturonase.