Fare gözünde deneysel olarak endotoksinle oluşturulan üveit modelinde endotelin peptidlerin rolü
The role of endothelin peptides in endotoxine induced experimetal uveitis model in mice eye
Yazar: HASAN ALİ TUFAN
Danışman: PROF. DR. MERAL OR
Gazi Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2008
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases

Özet:
Endotelin 1 (ET-1), endojen vazoaktif peptid olup bilinen en potent vazokonstrüktör maddedir. Endotelinlerin ve reseptörlerinin oküler dokularda varlığı gösterilmiş olup aköz protein konsantrasyonu (APK) üzerinde etkilerinin olduğu ve üveit etyopatogenezinde rol aldığı belirtilmiştir.Bu çalışmada, endotoksinle üveit modeli oluşturulan farelerde serum ve humör aköz (HA) ET-1 düzeyindeki ve APK'deki değişiklikler araştırılmıştır. Aynı zamanda intraperitoneal olarak uygulanan ETA reseptör antagonistinin(BQ123), non-selektif ET-1 atagonistinin (bosentan), non-selektif nitrik oksit sentaz inhibitörünün (L-NAME) ve non-selektif siklooksijenaz enzim inhibitörünün (indometazin) bu parametrelere olan etkileri değerlendirilmiştir. Bunlara ek olarak, üveal enflamasyonun şiddeti histopatolojik olarak değerlendirilmiştir.Çalışmamızda, 48 farenin (8 haftalık, 25 gr) 96 gözü değerlendirilmiştir. Fareler sekiz grupta incelenmiştir. Herhangi bir işlem yapılmayan birinci grup, kontrol grubunu oluşturmaktadır. İkinci gruba, intraperitoneal lipopolisakkarit (LPS, S. Thphmirium, 50?g/0.1ml) enjeksiyonu uygulanarak deneysel üveit modeli oluşturulmuştur. Üçüncü gruba, eş zamanlı olarak intraperitoneal LPS ve BQ123 (25?gr/0.05ml) enjeksiyonu yapılmıştır. Dördüncü gruba, benzer uygulama ile LPS ve Bosentan (100?gr/0.2ml) enjeksiyonu yapılmıştır. Beşinci gruba, benzer uygulama ile LPS ve L-NAME (10mg/kg/0.2ml) enjeksiyonu yapılmıştır. Altıncı gruba, benzer uygulama ve dozda LPS, bosentan ve L-NAME enjeksiyonu yapılmıştır. Yedinci gruba, benzer uygulama ile LPS ve indometazinin (10mg/kg/0.2ml) enjeksiyonu yapılmıştır. Sekizinci gruba, benzer uygulama ve dozda LPS, indometazin ve bosentan enjeksiyonu yapılmıştır. Enjeksiyonlardan 24 saat sonra, serum ve HA (sağ gözler) örnekleri alınmıştır. Serum ve HA ET-1 düzeyleri kantitatif sandviç enzim immünassay yöntemi ile ölçülmüştür. APK, modifiye Lowry metodu ile ölçülmüştür. Örneklerin toplanmasını takiben hayvanlar sakrifiye edilmiş ve histopatolojik değerlendirme için sol gözleri enüklee edilmiştir.Kontrol grubunda ortalama serum ve HA ET-1 düzeyi sırasıyla 95,90±32,53 pg/ml ve 144,03±44,71 pg/ml'idi. Kontrol grubunda ortalama APK 270,87±149,09 pg/ml düzeyindeydi. LPS ejeksiyonu, serum, HA ET-1 düzeyinde ve APK'de belirgin bir artışa neden olmuş olup bu değerler sırasıyla 291,94±74,97 pg/ml (p=0.004), 565,67±376,29 pg/ml (p=0,037) ve 783,40±74,43 pg/ml'idi (p=0,004). Aynı zamanda, LPS enjeksiyonu yapılan farelerde histopatolojik olarak şiddetli üveit tablosu izlenmiştir. BQ123 enjeksiyonu, LPS'nin neden olduğu serum ve HA ET-1 düzeyindeki ve APK'deki artışı engellemiştir; bu parametreler sırasıyla, 83,33±37,56 pg/ml (p=0.004), 138,91±63,70 pg/ml (p=0,037) and 525,01±49,23 pg/ml (p=0,037) olarak ölçülmüştür. Benzer şekilde, BQ123, LPS'nin neden oldu üveit tablosunu histopatolojik olarak engellemiştir. Bosentan enjeksiyonu, LPS'nin bu parametrelerde neden olduğu artışı engelleyememekte hatta arttırmaktadır; bu parametreler sırasıyla 386,23±176,78 pg/ml (p>0.05), 540,33±214,18 pg/ml (p>0.05) and 1107,10±117,67 pg/ml (p=0,055) olarak ölçülmüştür. L-NAME enjeksiyonu, tek başına LPS ejeksiyonu ile karşılaştırıldığında serum ET-1 düzeyinde ve APK'de düşüş sağlamıştır, bu değerler sırasıyla 76,09±23,32 pg/ml (p=0.004) ve 544,13±75,52 pg/ml (p=0,004) olarak ölçülmüştür. L-NAME enjeksiyonu sonrası, HA ET-1 düzeyi 232,38±114,53 pg/ml olup sağlanan düşüş düşüş istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0.109). Bu bulgularla uyumlu şekilde histopatolojik olarak L-NAME enjeksiyonu ile LPS ile uyarılan üveiti engellemiştir. L-NAME ve bosentan kombinasyonu, hem serum hem de HA'da LPS'nin neden olduğu ET-1 artışını değiştirmemiş ancak APK'de azalmasağlamıştır, bu parametreler sırasıyla 256,30±109,68 pg/ml (p>0.05), 469,65±124,80 (p>0.05) ve 569,57±81,11 pg/ml (p=0,006) idi. İndometazin enjeksiyonu, sadece LPS uygulamasına göre serum ve HA ET-1 seviyesinde, sırasıyla 171,31±121,61 pg/ml ve 375,00±243,98 pg/ml azalma sağlamış; ancak bu değer istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0.05). İndometazin enjeksiyonu sonrası, ortalama APK 322,08±13,05 pg/ml olup bu değer LPS'nin neden olduğu APK artışından anlamlı olarak daha az bulunmuştur (p=0,004). Benzer şekilde, indometazinin, LPS'nin indüklediği üveit tablosunu histopatolojik olarak gerilettiği izlenmiştir. İndometazin ve bosentan kombinasyonu uygulamasında ortalama serum ve HA ET-1 düzeyleri sırasıyla 99,94±80,11 pg/ml ve 394,95±355,72 pg/ml olup tek başına indometazin uygulamasına göre istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0.05). Bu gruplar arasında histopatolojik bulgular da benzerdir. Sekizinci grupta ortalama APK düzeyi 760,41±86,97 pg/ml olup yedinci gruptan anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (p=0,004).ET-1 üveit etyopatogenezinde önemli bir mediatördür. ETA reseptörünün blokajı, hem serum hem de HA'da ET-1 düzeyini düşürmektedir. ETA reseptör antagonistleri aynı zamanda LPS'nin neden olduğu üveitte düzelme sağlamaktadır. ETB reseptör blokajı hem serum hem de HA'da ET-1 düzeyini arttırmakta ve üveit tablosunu şiddetlendirmektedir. ET-1 sentez ve salınımını engelleyen veya ETA reseptör antagonizması sağlayan tedavi modaliteleri ile ilgili daha ileri çalışmalar yapıldığı takdirde, bu modalitelerin üveit tedavisinde kullanılabileceği düşüncesindeyiz.

Abstract:
Endothelin-1 (ET-1) is an endogenous vasoactive peptide that is considered among the most potent vasoconstrictor substances known. Endothelins and their receptors have been shown to be present in the eye and it is reported that they influence aqueous protein concentration (APC) and play role in etiopathogenesis of uveitis.In this study, we investigated the serum and humor aqueous (HA) ET-1 levels and APC changes in an endotoxin-induced experimental uveitis model in mice. The influence of intraperitoneally injected ETA receptor antagonist (BQ123), non-selective ET-1 antagonist (Bosentan), non-selective nitric oxide sentase inhibitor (L-NAME) and non-selective cyclooxygenase inhibitor (indomethacin) on those parameters were also assessed. In addition, the severity of uveal inflammation were examined histopathologically.In this study, 96 eyes of 48 mice (8-week-old, 25 g) were examined. The mice were evaluated in eight groups. The 1st group was the control group and no procedure was done. In the 2nd group, experimental uveitis model was induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS, S. Thphmirium, 50?g/0.1ml). In the 3rd group, both LPS and BQ123 (25?gr/0.05ml) was injected intraperitoneally in the same time. In the 4th group, both LPS and bosentan (100?gr/0.2ml) were injected in the same manner. In the 5th group, both LPS and L-NAME (10mg/kg/0.2ml) were injected in the same manner. In the 6th group, LPS, Bosentan and L-NAME were injected in the same manner. In the 7th group,both LPS and indomethacin (10mg/kg/0.2ml) were injected in the same manner. In the 8th group, LPS, indomethacin and bosentan were injected in the same manner. 24 hours after injections, serum and HA samples (right eyes) were drawn. Serum and HA ET-1 levels were measured by quantitative sandwich enzyme immunassay technique. APC was measured by modified Lowry method. The animals were sacrified after the collection of samples and than the left eyes were enucleated and histopathological changes were examined.The control group, mean levels of serum and HA ET-1 were 95,90±32,53 pg/ml and 144,03±44,71 pg/ml respectively. Mean levels of APC were 270,87±149,09 pg/ml in the control group. LPS injection, inceased the levels of serum, HA ET-1 and APC significantly.These levels were, 291,94±74,97 pg/ml (p=0.004), 565,67±376,29 pg/ml (p=0,037) and 783,40±74,43 pg/ml (p=0,004) respectively. Also, severe uveitis was seen histopathologically in the LPS injected mice. Injecting BQ123 inhibited the LPS induced elevation in serum, HA ET-1 levels and APC. Those parameters were, 83,33±37,56 pg/ml (p=0.004), 138,91±63,70 pg/ml (p=0,037) and 525,01±49,23 pg/ml (p=0,037) respectively. Similarly, BQ123 inhibited LPS induced uveitis histopathologically. Bosentan injection could not inhibit, on the contrary, it augmented those parameters, which were, 386,23±176,78 pg/ml (p>0.05), 540,33±214,18 pg/ml (p>0.05) and 1107,10±117,67 pg/ml (p=0,055) respectively. It was also seen that bosentan aggravated the uveitis histopathologically. Injection of L-NAME, decreased the serum ET-1 levels and APK when compared with LPS alone. Those levels were 76,09±23,32 pg/ml (p=0.004) and 544,13±75,52 pg/ml (p=0,004) respectively. L-NAME injection decreased HA ET-1 level which was measured 232,38±114,53 pg/ml (p=0.109) and had no statistical value. LPS induced uveitis was inhibited histopathologically with L-NAME injection coherent with those findings. The combination of L-NAME and bosentan did not alter the LPS induced ET-1 elevation both serum and HA but decreased APC. Those parameters were 256,30±109,68 pg/ml (p>0.05), 469,65±124,80 (p>0.05) and 569,57±81,11 pg/ml (p=0,006) respectively. Indomethacin injection inhibited serum and HA ET-1 levels, 171,31±121,61 pg/ml (p=0.109) and 375,00±243,98 pg/ml (p=0.15) respectively, when compared with those treated LPS alone but those had no statistical value. Mean APC was 322,08±13,05 pg/ml (p=0,004). This parameter and histopathologically LPS induced uveitis were inhibited in idomethacin injected mice. In indomethacin and bosentan combination, mean serum and HA ET-1 levels were 99,94±80,11 pg/ml and 394,95±355,72 pg/ml respectively and had no stastistical value when compared with those treated with indomethacin alone (p>0.05). Histopathologic findings are similar between those groups. In the 8th group mean APC level was 760,41±86,97 pg/ml and higher than 7th (p=0,004)ET-1 is an important mediator in uveitis etiopathogenesis. ETA receptor blockage decreases both serum and HA ET-1 levels and ameliorate LPS induced uveitis. ETB receptor blockage increases both serum and HA ET-1 levels and aggravate uveitis. We think that ET-1 synthesis inhibitors or ETA receptor antagonists may play role in the treatment of uveitis if more studies are done concerning these modalities.