Yerli ve milli tetanoz ve difteri toksoid aşılarıyla oluşan immün cevapların, in vitro ve ex vivo karakterizasyonu
In vitro and ex vivo characterization of immune responses induced by tetanus and diphtheria toxoid vaccines that are produced as domestic and national products
Yazar: NİHAN ÖRÜKLÜ
Danışman: PROF. DR. EMİN ÜMİT BAĞRIAÇIK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İmmünoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology

Özet:
Bu tez çalışmasında Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi İmmünoloji Anabilim Dalı'nda geliştirimiş olan tetanoz ve difteri toksoid aşılarının oluşturduğu immün cevapların in vitro ve ex vivo yöntemler kullanılarak karakterize edilmesi amaçlandı. Bu aşılar alüminyum hidroksit ve kalsiyum fosfat olmak üzere iki farklı adjuvan içermektedir. Aşılar subkütan (SK) ve intraperitoneal (İP) olarak iki farklı yolla uygulandı. Geliştirilen aşılar ve mevcut olarak kullanılan erişkin tip tetanoz difteri aşısı ile elde edilen immün cevaplar karşılaştırılmalı olarak çalışıldı. Aşılama sonrası fare dalak mononükleer hücreleri akım sitometri ile analiz edilerek, CD4+, CD8+ ve CD19+ hücre miktarları saptanarak karşılaştırıldı. İP yolla uygulanan aşı gruplarındaki farelerin kontrol grubuna göre daha yüksek CD4+ T hücre ve CD19+ B hücre sayısına sahip olduğu bulundu. Hem SK hem de İP yolla uygulanan aşılarda, farelerde oluşan İgG tipindeki anti tetanoz toksoid ve anti difteri toksoid antikorlarının varlığı ve konsantrasyonları ELISA metodu ile gösterildi. Alum adjuvanı içeren aşılarla oluşan antikorların koruyuculuğu ve nötralizan özellikleri, tetanoz toksini "challenge" ve difteri toksini in vitro nötralizasyon testleri ile gösterildi. Hem ticari aşıda hem de geliştirilen aşıda tetanoz toksoidi için koruyuculuğun > %99,9 olduğu gösterildi. Anti difteri antikorların nötralizasyon kapasiteleri değerlendirildiğinde ticari aşı ve geliştirilen aşı arasında herhangi bir fark olmadığı bulundu. Aşı antijeni olarak kullanılan toksinlerin total protein miktarları ve Lf değerleri belirlendi. SDS-PAGE Jel elektroforezi ile saflıkları gösterilerek Western Blot ile antijenlerin sağlaması yapıldı. Farelerde tetanoz toksini LD50 ve PD50 dozları ve difteri toksini VERO-E6 hücrelerinde MSD MTT yöntemi ile saptandı.

Abstract:
In this thesis study, it was aimed to characterize the immune responses created by tetanus and diphtheria toxoid vaccines developed in the Gazi University Faculty of Medicine, Department of Immunology by using in vitro and ex vivo methods. These vaccines contain two different adjuvants; alum and calcium phosphate. Vaccines were administered in two different ways: subcutaneous (SC) and intraperitoneal (IP). The immune responses obtained with the  developed and currently used adult type tetanus diphtheria vaccines were studied comparatively. After vaccination, mouse spleen mononuclear cells were analyzed by flow cytometry, and the amount of CD4 +, CD8 + and CD19 + cells were determined. It was found that mice in the IP-administered vaccine groups had higher CD4+ T cell and CD19+ B cell counts than the control group. The presence and concentration of IgG type anti-tetanus toxoid and anti-diphtheria toxoid antibodies were demonstrated by ELISA in vaccine administered mice both by SC and IP route. The protection and neutralizing properties of antibodies formed by vaccines containing alum adjuvant were demonstrated by the tetanus toxin challenge and diphtheria toxin in vitro neutralization tests. It was shown that the protection for tetanus toxoid was >99.9 % in both the commercial vaccine and the developed vaccine. When the neutralization capacity of anti diphtheria antibodies was evaluated, it was found that there was no difference between the commercial and the developed vaccine. Total protein amounts and Lf values of toxins used as vaccine antigen were determined. Antigenic purities were shown by SDS-PAGE and confirmed by Western Blotting. LD50 and PD50 doses for tetanus toxin determined in mice and MCD for diphtheria toxin in VERO-E6 cells were determined by MTT method.