Rizosfer izolatı streptomyces violaceusniger klad üyesi Streptomyces sp.'lerin moleküler taksonomisi
Molecular taxonomy of streptomyces spp. which are members of Streptomyces violaceusniger clade of rhizosphere isolate
Yazar: ANİL SAZAK
Danışman: DOÇ. DR. NEVZAT ŞAHİN
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
RİZOSFER İZOLATI Streptomyces violaceusniger KLAD ÜYESİStreptomyces sp.'lerin MOLEKÜLER TAKSONOMİSİÖZETBu çalışmada, Doğramacı (2005) tarafından ağaç ve çalı formundaki farklı baklagil rizosferinden izole edilen ve Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gen kladına ait türlerin morfolojik ve kültürel özelliklerine göre seçilerek ilgili tip türleri ile birlikte nümerik taksonomileri gerçekleştirilmiş olan 58 rizosfer izolatının polifazik taksonomileri yapılmıştır.Farklı besi ortamlarındaki morfolojik, kültürel ve pigmentasyon özellikleri ile hücre duvarı diaminopimelik (DAP) ve yağ asiti kompozisyonuna göre karakterize edilen test organizmalarının Gram (+), Gram (?) bakterilerle küf ve mayalardan oluşan 17 patojene karşı antimikrobiyal aktiviteleri belirlenmiştir. Morfolojik ve pigmentasyon özelliklerine göre izolasyon plaklarından klad üyesi olarak seçilen izolatlar Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gen kladı için dizayn edilmiş klad spesifik S-S-Svio-66-A-S-18 ve A-S-Svio-1274-A-A-20 primerleri ile PCR amplifikasyonu bakımından test edilmiş ve bunlardan 37'sinin klad üyesi 21'inin ise klad üyesi olmadığı belirlenmiştir. Spor zincir ve spor yüzey şeklinin belirlenmesi için klad üyesi ve klad üyesi olmayan seçili bazı test organizmalarının Scanning Elektron Mikroskobu (SEM) araştırmasında klad üyesi izolatların, Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gen kladının karakteristik spor şekli olan spiral zincirli ve spor yüzeyleri rugoz ornomentasyonlu olduğu halde klad üyesi olmayan izolatların farklı spor morfolojileri gösterdikleri bulunmuştur.Klad üyesi tip türleri ile birlikte PCR amplifikasyonları yapılan test izolatlarının 16S rRNA'ları restriksiyon endonükleaz enzimleriyle kesilerek agaroz jelde elektroforez edildi. EcoR I, Pst I ve Sau3 AI restriksiyon endonükleaz enzimleri amplifiye edilen 16S rRNA'ları keserken BamH I ve Sal I restriksiyon endonükleaz enzimlerinde kesim gerçekleşmemiştir. Kesimi gerçekleştiren enzimler aynı sayıda ve eşit büyüklükte fragmentler oluşturduğundan suşlar arasında herhangi bir farklılaşma oluşmamıştır.RAPD-PCR fragmentleri bakımından M13f üniversal primeri ile PCR amplifikasyonları gerçekleştirilen test organizmalarında çalışılan tip türlerinin tamamı filogenetik analizlerle tam bir uyum göstererek birbirinden farklılaştığı halde izolat suşlarda önemli derecede farklılaşma olmasına rağmen filogenetik analizlerle aynı derecede tam bir uyum görülememiştir.NCBI, RDP-II RDP, DDBJ ve EMBL gibi databanklardan elde edilen Streptomyces tip örneği 16S rRNA nükleotid baz dizileri ile izolatların baz dizileri PHYDIT programında karşılaştırmalı olarak dizilenmiştir. 16S rRNA sekans analizi flogenetik dendogramları, least-squares, maximum-parsimony ve neighbour-joining algorithmleri ile oluşturulmuştur.Seçilmiş bazı test izolatlarının kendi aralarında ve nükleotid benzerliği en yüksek olan Streptomyces malaysiensis türü arasında florometrik yöntemle termal denatürasyon sıcaklığına bağlı olarak DNA-DNA ilişkisi belirlenmiş, rpo B, tuf A ve rec A gen bölgelerinin PCR amplifikasyon ürünleri ilgili forward ve reverse primerler ile sekansları gerçekleştirilerek MLST analizleri yapılmıştır.Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gen kladı izolat suşlar arasında yüksek oranda 16S rRNA nükleotid benzerliğine rağmen elde edilen fenotipik, kimyasal ve moleküler taksonomik sonuçlardan, yüksek antimikrobiyal aktiviteli çok sayıda yeni türlerin literatüre kazandırılacağı anlaşılmaktadır.Anahtar Kelimeler: Streptomyces violaceusniger, polifazik taksonomi, moleküler sistematik.

Abstract:
MOLECULAR TAXONOMY OF Streptomyces spp. WHICH ARE MEMBERSOF Streptomyces violaceusniger CLADE OF RHIZOSPHERE ISOLATEABSTRACTIn this study, 58 rhizosphere organisms were the subject of polyphasic classification isolated from different legumens in the form of tree or shurb, which were chosen according to cultural and morphological features of Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gene clade, and numerical taxonomy with the related type species were done by Doğramacı (2005).The test organisms which were characterised according to cultural, morphological and pigmentation features on different agars and cell wall diaminopimelic (DAP) and fatty acids were determined to have antimicrobial activities against 17 patogen organisms like Gram (?) and (+), which consists of bacteria, fungi and yeast. The test organisms which were selected as a member of the clade on the isolation plates according to morphological and pigmentation features were tested with Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gene clade specific S-S-Svio-66-A-S-18 and A-S-Svio-1274-A-A-20 primers, and 37 out of 58 isolates turned out to be S. violaceusniger clade members, whereas the 21 of them were not members of this clade. Spore chain morphology and spore surface ornamentation of representative strains were examined by scanning electron microscope. According to the results of these studies, although all of the members of the S. violaceusniger 16S rRNA gene clade isolates had characteristic rugose ornamented spores in spiral chains, the isolates out of this clade had different spore ornamentation.PCR amplification 16S rRNA genes from the strains were examined for RFLP profiles. PCR products were digested by using restriction endonuclease enzymes and electrophoresed on agarose gels. EcoR I, Pst I and Sau3 AI restriction endonucleases digested amplified 16S rRNA, but no BamH I and Sal I did. As the digesting three enzymes gave same number and size of RFLP fragments, there was no differentiation among strains.RAPD-PCR fingerprints of the test organisms were carried out by PCR amplification using the universal primer M13f and although all of the type strains differentiated significantly from each other in accord with phylogenetic analysis, although there was significant differentation among isolate strains, there was a poor correlation with phylogenetic analysis.16S rRNA nucleotid base sequences of Streptomyces type strains obtained from databanks such as NCBI, RDP-II RDP, DDBJ and EMBL and base sequences of isolates were aligned comparatively by using the PHYDIT program. Phylogenetic dendograms of 16S rRNA sequence analysis were made using the least-squares, maximum-parsimony and neighbour-joining algorithms.The simple flourometric method was used for the estimation of the DNA-DNA relatedness, based on the denaturation tempature between each of the chosen test isolates and their nearest phylogenetic neighbour type strain S. malaysiensis. The MLST analysis of the locations of rpo B, rec A, tuf A genes related to PCR amplification products was carried out by sequencing them, using appropriate forward and revers primers.In spite of the highest 16S rRNA gene nucleotide similarity among the organisms which belonged to the S. violaceusniger 16S rRNA gene clade, it is evident from the phenotipic, molecular and chemical results obtained that many new species with high antimicrobial activities will emerge.Key words: Streptomyces violaceusniger, polyphasic taxaonomy, molecular systematic.