Normal ve alkol ile uyarılmış piliç embriyosu nöral tüp gelişiminde glikozaminoglikanların (GAG)histokimyasal olarak belirlenmesi
Histochemical determination of glycosaminoglycans (GAGs)during normal and alochol-induced neural tube development
Yazar: IŞIL AYDEMİR
Danışman: ÖĞR. GÖR. BEYHAN GÜRCÜ
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Nöral tüp defektleri (NTD) erken embriyonik dönemde nöral tüp (NT) kapanmasındakibaşarısızlığa bağlı oluşan ve insan doğumsal malformasyonlarının en sık nedeni olan bir grupgelişim bozukluğudur. NTD diğer birçok merkezi sinir sistemi (MSS) bozuklukları ile de ilişkilidir.Hücreler arası maddede yaygın olarak bulunan proteoglikanlar (PG) merkezi bir protein ve bunabağlı karbonhidrat zincirlerinden oluşur, karbonhidrat kısımları glikozaminoglikan (GAG) olarakadlandırılır. GAG oluşumu NT gelişiminde önemlidir. Doğum öncesi dönemde deneyhayvanlarına alkol uygulaması NTD ve gelişme geriliği yapmaktadır. Alkol, folat yetmezliği veoksidatif stres oluşturmaktadır. Bu ilişkiler nedeniyle, erken gelişim sırasında ılımlı alkoluygulamasının NT oluşumu üzerine etkileri, GAG' ları koruyan ve gözlemini sağlayan bir yöntemolan kritik elektrolit konsantrasyonu (KEK) ile araştırıldı.Bu çalışmada Manisa Tavuk Hastalıkları Araştırma ve Aşı Üretim Merkezi (VeterinerKontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü)' den temin edilen Spesifik Patojen Free (SPF) tavukyumurtaları kullanıldı. Yumurtalar; kontrol ve uygulama olmak üzere iki gruba ayrılarak inkübeedildi. İnkübasyonun 33. saatinde (Hamburger ve Hamilton (HH)-evre-9-10) uygulama grubuyumurtalara 100 ÂµL % 10, 15 ve 20' lik etanol enjekte edildi. Kontrol grubuna ise hiçbir işlemyapılmadı. Uygulama grubu yumurtalar, uygulamadan 24 saat sonra açılarak embriyolar Saint-Marie's tespit solüsyonunda fikse edildi. Kontrol grubuna ait örnekler de uygulama grubu ile aynıanda açılarak tespit edildi. Embriyoların bir kısmı, kontrol ve uygulama grubu arasındaki farkıbelirlemek amacı ile total olarak görüntülendi ve NT genel yapısını görüntülemek içinHematoksilen-Eosin (HE) ile boyanmış örneklerde çalışıldı. GAG' ların varlığı, dağılımı veçeşitleri KEK ile hazırlanmış Alcian-Blue 8 GX (AB) ve Periodik asid- Schiff (PAS) ilehistokimyasal olarak ışık mikroskobu düzeyinde incelendi.Yapılan total incelemede, kontrol grubu embriyolar, HH kriterlerine göre gelişimin 14. ile15. safhaları arasında bulundu ve organogenez normal seyrinde devam etti. % 10, 15 ve 20' liketanol uygulanmış deney gruplarında ise genel bir gelişim geriliği tespit edildi. Işık mikroskobuile genel yapı incelemesi sonucunda; nöral tüp kapanmasının tamamlandığı, yüzey ektodermiile nöroepitelin iki farklı epiteli oluşturacak şekilde birleştiği ve bu safhaya eşlik eden nöral krestgöçü belirlendi.GAG çeşitlerinin belirlendiği AB ile en koyu boyanan bölgeler bazal tabakalardır. kontrolgrubu NT bazal tabakasında ağırlıklı olarak kondroidin sülfat (Ch-S) ve dermatan sülfat (DS)olmak üzere sülfatlanmış glikozaminoglikanlar (S-GAG)' ların tümü, notokord bazal tabakasındaCh-S, nöral tübün lümene bakan yüzey kısmı ile nöral tüpten göç eden hücrelerin çevresindekialanda ise Ch-S ve DS fazladır. % 10' luk alkol uygulanmış embriyolarda; nöral tüp bazaltabakasında HA, nöral tübün lümene bakan yüzey kısmında ise özellikle GP' in baskın haldedir.% 15' lik alkol uygulanmış embriyolarda; NT bazal tabakasında HA' in azaldığı, DS ile Ch-S' ınbaskın olduğu, NT lümene bakan yüzey kısmında HA' in, nöral tüpten göç eden hücrelerinçevresindeki alanda ise heparin (HP) ve heparan sülfat (HS) bulunmuştur. % 20' lik alkoluygulanmış embriyolarda; notokord bazal tabakasında ise HP ile HS baskındır ve notokordbazal tabakasında Ch-S' ın bariz bir şekilde azalmıştır. Nöral tübün lümene bakan yüzeykısmında ise tüm GAG' lar yok denecek kadar azalmıştır.NT gelişimi sırasında alkole bağlı oluşan GAG değişiklikleri normal beyin ve medullaspinalis gelişimi için önemli rol oynar. NT oluşumu sırasında ılımlı alkol uygulaması, gebedeembriyonun etkilenmesine benzer şekilde, GAG' ların hem dağılımında değişikliklere hem degenel olarak azalmasına neden olmuştur. Bu sonuçların ileri çalışmalarla oluşan etkilerin geçdönem embriyolarında yapacağı bozukluklar araştırılarak NTD mekanizmalarındaki önemianlaşılmalıdır.Anahtar kelimeler: Nöral tüp gelişimi, etanol, glikozaminoglikanlar, piliç.CELAL BAYAR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜNORMAL VE ALKOL İLE UYARILMIŞ PİLİÇ EMBRİYOSU NÖRAL TÜP GELİŞİMİNDEGLİKOZAMİNOGLİKANLARIN (GAG) HİSTOKİMYASAL OLARAK BELİRLENMESİYÜKSEK LİSANS TEZİIşıl AYDEMİRAnabilim Dalı : BiyolojiProgramı : Moleküler BiyolojiMANİSA 2006CELAL BAYAR ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜNORMAL VE ALKOL İLE UYARILMIŞ PİLİÇ EMBRİYOSU NÖRAL TÜP GELİŞİMİNDEGLİKOZAMİNOGLİKANLARIN (GAG) HİSTOKİMYASAL OLARAK BELİRLENMESİYÜKSEK LİSANS TEZİIşıl AYDEMİRTezin Enstitüye Verildiği Tarih : 07.09.2006Tezin Savunulduğu Tarih : 15.09.2006Tez Danışmanı : Öğr. Gör. Dr. Beyhan GÜRCÜDiğer Jüri Üyeleri : Yrd. Doç. Dr. Selim UZUNOĞLUYrd. Doç. Dr. M. İbrahim TUĞLUMANİSA 2006

Abstract:
Neural tube defects (NTD) are a group of malformations that result from the failure ofthe neural tube to close early in embryonic development and among the most commoncongenital malformations in humans. NTD are associated with a number of other centralnervous system (CNS) and non-neural malformations. Proteoglycans (PG) that are common inthe extracelular matrix (ECM), are formed a core protein and related to carbohydrate chains,which that is termed glycosaminoglycan (GAG). GAG formation is important for the NTdevelopment. Prenatal ethanol exposure produces NTD and growth retardation in experimentalanimals. Alcohol is known to induce folate deficiency and produce oxidative stress. Therefore,we investigated the effect of moderate alcohol exposure on the GAGs during development NTby critical electrolyte concentration (CEC) principle which allows GAG to be properly preservedand visualized.In this study, SPF chicken eggs that were obtained from Manisa Chicken Diseases andvaccine Production Center (Veterinary Control and Research Institute Administration) wereused. Eggs were divided into two groups, control and expose, and incubated. 33. hours ofincubation (HH-stage-9-10), eggs were injected with 100 ÂµL % 10 ethanol. The control goupwas injected serum physiologic. Ethanol injected eggs were opened after exposition 24 and 48hours later and embryos were fixed in Saint-Marie?s solution. The control group was openedand fixed at the same time with injected embryos. A part of total embryos were photographedto determine difference between control and exposed group. Haematoxylin- Eosine (HE)stained slides were studied to observe general structure of NT. Entity, distribution andalterations of GAGs were examined histochemically by stainig Alcian-Blue 8 GX within CriticalElectrolyte Concentrations and Periodic acid- Schiff (PAS) staining with light microscope.Ectoderm cells in the midline became columnar epithelia by elongation at induction ofnotocord. The nuclei of the cells were located in the basal. After neural plate formation,neuroepithelia formed neural folds by performing elevator-like movement. The NT formed byconjuction of neural folds.Staining of KEK showed that basal layers were densely stained and the dominant GAGalteration was hyaluronic acid (HA). With the progress of development, amount of GAGs inalcohol group were reduced compared to those of control group. In addition, all sulphated GAGs(sGAG) including chondroitin sulphate (Ch-S) and dermatan sulphate (DS) particularly in theneural basal layer, Ch-S in the basal layer of notocord and Ch-S with DS in the lumen face ofNT including migrating cells getting away from NT were increased compared to those of at otherregions. Application of %10 alcohol produced more HA in the basal layer of NT and moreglycoprotein (GP) in the lumen face of NT. Increasing alcohol by application of %15 producedless HA and more DS and Ch-S in the basal layer of NT and more DS and Ch-S in the lumenface of NT, more heparin (HP) and heparan sulphate (HS) in the migrating cells getting awayfrom NT. Application of %20 alcohol produced more HP and HS, and siginificantly less Ch-S inthe basal layer of notochord, more HA in the basal layer of NT and clearly less even none GAGin the lumen face of NT.Alterations of GAG during development of NT play important role for normal productionof brain and medulla spinalis. Moderate exposure of alcohol during NT formation which mimicsthe effect of alcohol on the embryo in pregnant women, caused decrease and topographicalalterations of GAG. These results require further investigation of these effects on the laterstages of embryos which may be of significance in the etiology of NTD.Key words: Neural tube development, ethanol, glycosaminoglycans, chick.