Zoledronik asidin kanser kök hücrelerine apoptotik etkileri
The apoptotic effects of zoledronic acid on cancer stem cells
Yazar: HADI ROUHRAZI
Danışman: PROF. DR. NEVBAHAR TURGAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Bifosfonatlar = Biphosphonates ; Kök hücreler = Stem cells ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Zoledronik asit = Zoledronic acid ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
AMAÇ: Kanser kök hücreleri (KKH) kendi kendini yenileyebilme ve farklı tümör alt tiplerine dönüşebilme özelliğine sahip küçük bir hücre popülasyonu olarak, tümör yığınını oluşturan diğer daha düşük tümör oluşturma potansiyeline sahip hücrelerden (non-KKH) ayrılmaktadırlar. Tümörün tekrarlamasından, uzak metastazdan, anjiyogenezden ve ilaç direncinden kanser kök hücrelerinin sorumlu olduğu düşünülmektedir. Apoptoza direnç, KKH'lerinin en önemli özelliklerinden biridir. Bisfosfonatlar, osteoporoz ve iskelet ile ilgili malignitelerin tedavisinde kullanılan bir bileşik sınıfıdır. Üçüncü nesil ve en etkili bifosfonatlardan biri olan Zoledronik asid (ZA) 'in hücre proliferasyonunu azalttığı gösterilmiş olup bazı malignitelerde hücre ölümünün indüksiyonu yoluyla anti-tümör etkileri vardır. Ancak, ZA'in KKH'leri üzerindeki etkileri bugüne kadar araştırılmamıştır. Bu projenin amacı, prostat ve meme KKH'leri model sistem olarak kullanılarak ZA'in KKH'leri üzerindeki apoptotik etkisini ve bu etkinin mekanizmalarını belirlemektir.
YÖNTEM: Prostat DU-145 hücrelerinden CD 133+high/CD44+high yüzey belirteçlerine sahip KKH'leri ve meme MCF-7 hücrelerinden CD 44+high/CD24-low yüzey belirteçlerine sahip KKH'leri flow sitometri metoduyla FACSAria flow sitometri kullanılarak izole edildiler. KKH ve non-KKH'leri 24, 48 ve 72 saat boyunca artan konsantrasyonlarda (0-140 μM) ZA ile muamele edildi ve IC50 dozunu belirlemek için canlılık deneyleri yapıldı. Muse ™ Cell Analyzer kullanılarak hücre ölümü tespiti için hücre döngüsü ve Annexin-V analizleri gerçekleştirildi. Hücre gruplarında apoptoz ile ilişkili 84 anahtar genin tespiti için qRT-PCR array kullanıldı. İfadesi anlamlı ölçüde değişmiş genlerin protein seviyesinin doğrulaması immünofloresan mikroskopi ile gerçekleştirildi
BULGULAR: ZA, hücre canlılığında doz ve zamana bağlı düşüşe neden oldu. IC50 dozu, prostat DU-145 hücrelerinde KKH'leri ve non-KKH'leri arasında anlamlı farklı bulunurken, meme MCF-7 hücrelerinde KKH'leri ve non-KKH'leri arasında fark bulunmadı. ZA ile muamele, hücre döngüsünün S fazında duraklamasına ve apoptoz artışına neden oldu. ZA ile muamele edilen DU-145 KKH'lerinde incelediğimiz apoptoz ile ilişkili genlerin yedisinin ifadesinde anlamlı artış/azalış tespit edildi. CASP9, CASP4, BAX ve BAD genlerinin ifadeleri artarken, BIRC3, BIRC2 ve BCL2 genlerinin ifadeleri azaldı. DU-145 non-KKH'lerinde, 5 genin ifadesinde ZA muamelesinden sonra değişiklik görüldü; 2'si aşırı ekspresyon (CASP7 ve BAD), 3'ü düşük ekspresyon (BIRC3, BIRC2 veBCL2) gösterdi.
SONUÇ: Verilerimiz ZA'in bazı pro-apoptotik genlerin aşırı ekspresyonu ve bazı anti-apoptotik genlerin düşük ekspresyonu yoluyla apoptozu indükleyerek prostat KKH'lerindeki apoptoza direncin üstesinden gelme potansiyeline sahip olduğunu ortaya koydu. Bulgularımız, KKH'lerinde saptadığımız bu apoptotik indüksiyonun altında yatan mekanizmanın mevalonat yolağının ZA tarafindan inhibisyonu olabileceğini göstermektedir. Bu veriler, ZA'in KKH'lerinde apoptoz direncini hedef alan etkili bir terapötik yaklaşım oluşturabileceğini düşündürmektedir.

Anahtar Kelimeler: Kanser Kök Hücresi; Apoptoz; İlaç direnci; Bifosfonat; Zoledronik asid

Abstract:
Objective: In contrast to low-tumorigenic bulk tumor cells (non-CSCs), cancer stem cells (CSCs) are a subset of tumor cells with the potential to self-renew and differentiate into different cancer subtypes. CSCs are thought to be responsible for tumor recurrence, distant metastasis, angiogenesis, and drug/radiation resistance. Resistance to apoptosis is one of the most important features of CSCs. Bisphosphonates are a class of compounds designed to treat osteoporosis and skeletal related malignancies. Zoledronic acid (ZA), a third generation and one of the most potent bisphosphonates, has been shown to reduce cell proliferation and has anti-tumor effects through cell death induction in some malignancies. However, the effects of ZA on CSCs remain unclear. The present study aimed to determine the apoptotic effect of ZA on CSCs using prostate and breast CSCs as a model system.
Material and Method: Cluster of differentiation (CD) 133+high/CD44+high prostate CSCs were isolated from the DU-145 human prostate cancer cell line and CD 44+high/CD24-low breast CSCs were isolated from the MCF-7 human breast cancer cell line through FACSAria flow cytometry cell sorting. CSCs and non-CSCs were exposed to increasing concentrations of ZA (0-140 μM) for 24, 48 and 72 hours and the viability was examined to determine the IC50 dose. Cell cycle and Annexin-V analyses were performed for the detection of cell death using Muse™ Cell Analyzer. Cell groups was assayed by qRT-PCR array for the detection of 84 key apoptosis related genes and immunofluorescence microscopy performed to validate protein expression of related significantly altered gene experience.
Results: Zoledronic acid caused a dose- and time-dependent decrease in cell viability. Interestingly, the half maximal inhibitory concentration (IC50) was significantly different between CSCs and non-CSCs in DU-145 cells but there was not find significant differences between CSCs and non-CSCs in MCF-7 cells. Treatment with ZA caused a concomitant increase in apoptosis and S phase cell cycle arrest. Significant over/under-expressions were detected in seven of the studied genes of ZA-treated DU-145 CSCs cells.  Expressions of CASP9, CASP4, BAX and BAD genes increased while the expressions of BIRC3, BIRC2 and BCL2 genes decreased. In the DU-145 non-CSCs, 5 genes showed changes in gene expression after ZA treatment, with 2 showing increased expression (CASP7 and BAD) and 3 showing decreased expression (BIRC3, BIRC2 andBCL2).
Conclusion: Our data revealed that ZA has the potential to overcome apoptosis resistance in prostate CSCs by induction of apoptosis through up-regulation of some pro-apoptotic and down-regulation of some anti-apoptotic genes. Inhibition of the mevalonate pathway by ZA seems to be the probable underlying mechanism of the apoptotic induction in prostate CSCs. These data suggest that, ZA may be an effective therapeutic approach for targeting apoptosis resistance in CSCs.

Keywords: Cancer stem cell; Apoptosis; Drug resistance; Biphosphonate; Zoledronic acid