Mastitisli inek sütlerinden izole edilen streptokok ve stafilokok etkenlerinde genetik polimorfizmin araştırılması
Investigation of genetic polymorphisms in Streptococcus and Staphylococcus agents isolated from bovine milk samples
Yazar: MURAT KARAHAN
Danışman: DOÇ. DR. BURHAN ÇETİNKAYA
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
1. ÖZET Bu çalışmada, Türkiye'nin doğu ve güneydoğusundaki süt sığırlarından toplanan Kaliforniya Mastitis Testi (CMT) pozitif süt örneklerinden Staphylococcus aureus (S. aureus) ve Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) izolasyon ve identifikasyonu, koagulaz (coa) pozitif S. aureus ve CAMP-faktör (cfb) pozitif S. agalactiae izolatlannın Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ve Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) yöntemleri ile tiplendirilmesi amaçlandı. S.aureus için toplanan ve CMT pozitif olan süt omeWerinin (n = 700) bakteriyolojik kültüründe 367 örnekte üreme tespit edildi. Bunlar arasındaki 200 (% 28.6) örnek tür spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile S. aureus olarak identifiye edildi. Coa geninin PCR amplifikasyonu sonucunda 161 S. aureus izolatı coa pozitif bulundu. Coa PCR' da, izolatlann büyük çoğunluğunda (n = 135, % 83.9) moleküler uzunlukları 500-1400 bp arasında değişen tek bir bant oluşumu gözlenirken, az sayıdaki izolatta (n = 26, % 16.1) çift amplifikasyon ürünü elde edildi. Alul ve Hin61 restriksiyon enzimleriyle gerçekleştirilen coa- RFLP analizinde, sırasıyla 23 ve 22 bant profili gözlemlendi. Primer 786 ve OPS 1 1 primerleri ile yapılan RAPD yönteminde ise sırasıyla 32 ve 30 farklı profil elde edildi. Bu çalışmada ayrıca, beş farklı bölgedeki süt ineklerinden toplanan CMT pozitif süt numuneleri (n = 820) S. agalactiae yönünden incelendi. Bakteriyolojik kültürde toplam 199 örnekte üreme tespit edildi ve bunlardan 85 (%10,4) izolat hem tür spesifik PCR hem de ç/fr-PCR ile S. agalactiae olarak identifiye edildi. 1Amplifîye edilen cfb-PCR ürünlerinin AM ve 7sp509I restriksiyon enzimleriyle muamelesi sonucunda tüm izolatlarda aynı restriksiyon profilleri elde edildi. OPB 18 primeri ile yapılan RAPD yönteminde ise 18 farklı profil gözlendi. Sonuç olarak, Doğu ve Güneydoğu bölgesindeki sığır populasyonlanndan izole edilen S. aureus ve S. agalactiae suşlaraıda yüksek oranda bir genetik heterojenite olduğu tespit edildi. S. agalactiae için RAPD ve S. aureus için coa- RFLP ve RAPD yöntemlerinin, sığır orijinli S. aureus ve S. agalactiae izolatlanmn tiplendirilmesinde konvansiyonel yöntemlere karşı iyi bir alternatif olarak kullanılabileceği kanısına varıldı. Ayrıca bu çalışmadan elde edilen verilerin, Stafilokokal ve Streptokokal mastitislere karşı etkili kontrol ve tedavi stratejilerinin (predominant suşlar kullanılarak yeni aşıların geliştirilmesi ve etkili antibiyotiklerin seçimi gibi) geliştirilmesine ve bunun sonucunda mastitislerin insidensinde azalmalar sağlanmasına yardımcı olacağı düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Sığır, Mastitis, S. aureus, S. agalactiae, PCR, RFLP, RAPD.

Abstract:
2. ABSTRACT The aims of the present study were to isolate and identify Staphylococcus aureus (5. aureus) and Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) from California Mastitis Test (CMT)-positive milk samples of dairy cow populations located in the east and south east of Turkey, and then to characterize the coagulase (coa) positive isolates for S. aureus and CAMP-factor (cfb) positive isolates for S. agalactiae by means of Polymerase Chain Reaction based-Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analysis and Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) assay. In the bacteriological culture of milk samples (n = 700) that were positive in CMT for S.aureus, growth was obtained from 367 samples. Among these, species-specific PCR identified 200 (28.6%) isolates as S. aureus. The PCR amplification of the coa gene showed that 161 of the S. aureus isolates were coa positive. In coa PCR, while most of the isolates (n = 135, 83.9%) were determined to produce a single band with the molecular sizes ranging from 500 to 1400 bp, a small number of isolates (n = 26, 16.1%) yielded two amplification products. Coa-RFLP analysis by restriction enzymes of Alul and Hin61 revealed 23 and 22 band patterns, respectively. RAPD assay based upon Primer 786 and OPS 11 produced 32 and 30 different profiles, respectively. In addition, milk samples collected from 820 dairy cows at five different regions were examined for the presence of S. agalactiae. In the bacteriological culture of milk samples (n =820) that were positive in CMT, growth was obtained from 199 samples. Among these, both species-specific PCR and cfb-PCRidentified 85 (10.4%) isolates as S. agalactiae. After digestion of the amplified cfb-PCR products with the restriction enzymes AM and Tsp5091, all isolates appeared to have identical restriction profiles. RAPD assay based upon OPB 1 8 produced 18 different profiles. In conclusion, it was determined that a high degree of heterogeneity existed in the S. aureus and S. agalactiae strains isolated from dairy cow populations located in the east and south east of Turkey. RAPD assay and coa- RFLP analysis for S. aureus and RAPD assay for S. agalactiae can be used as good alternatives to conventional methods in typing S. aureus and S. agalactiae isolates of bovine origin. It is suggested that the findings of this study will help develop effective control and treatment strategies (e.g. development of new vaccines by using predominant strains, selection of effective antibiotics) against Staphylococcal and Streptococcal mastitis and therefore reduce the incidence of the disease. Keywords: Dairy cattle, Mastitis, S. aureus, S. agalactiae, PCR, RFLP, RAPD. 4