Kandan izole edilen candida albicans suşlarında biyofilm oluşumunun, antifungal ajanlarla inhibisyonun ve biyofilm duyarlılığının araştırılması
Biofilm production by candida albicans strains isolated from blood cultures and effects of antifungal agents on occured biofilms and biofilm formation
Yazar: HANNİ TURAN
Danışman: DOÇ. DR. MÜGE EKİCİ
Başkent Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Temel Tıp Bilimleri Bölümü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Biyofilmler = Biofilms ; Candida albicans = Candida albicans ; İlaç alerjisi = Drug hypersensitivity ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Son yıllarda artan tıbbi gereç kullanımından dolayı Candida albicans biyofilmine bağlı enfeksiyonların artması ve bu biyofilmlerin antifungal ajanlara yüksek direnç gösterebilmesi nedeni ile yeni tedavi protokollerine ve özellikle riskli hastalarda biyofilm oluşumunu engelleyen profilaktik ilaç rejimlerine ihtiyaç duyulmaktadır.

Bu çalışmada sıklıkla hastane enfeksiyonlarına neden olabilen Candida albicans'ın biyofilm oluşturma oranlarını görmek ve özellikle yoğun biyofilm yapan suşlarda antifungal duyarlılık paternlerini planktonik ve sesil hücre karşılaştırmalı olarak incelemek hedeflenmiş, ayrıca bu suşlarda antifungallerin biyofilm oluşumunu önlemedeki etkinliğini araştırmak amaçlanmıştır. 

Başkent Üniversitesi Ankara, Adana ve İstanbul hastanelerinde yatan hastaların kan kültürlerinden elde edilmiş, germ tüp oluşumu ve Corn Meal Tween 80 besiyerindeki morfolojilerine göre tiplendirilmiş, 162 Candida albicans izolatı çalışmaya dahil edilmiştir. Tüm suşlarda Modifiye Christensen 96 kuyucuklu plak yöntemi ile biyofilm oluşumu araştırılıp derecelendirilmiştir. Randomize seçilen 30 yoğun biyofilm yapan klinik izolat, C.albicans ATCC 10231 ve C.albicans ATCC 90028 standart suşu, toplam 32 suş ayrıca iğne kapaklı mikroplaklarda biyofilm yapma yetenekleri XTT yöntemi ile araştırılmıştır. Bu suşların kaspofungin, mikafungin, anidulafungin flukonazol,voriconazol, posakonazol, itrakonazol, ve amfoterisin B'nin standart toz formları ile CLSI standartlarına uygun olarak mikrodilüsyon yöntemi (M27-A3) ile antifungal duyarlılıkları çalışmıştır. Sesil formların antifungal duyarlılıkları ise aynı antifungal ajanlara karşı Modifiye Calgary biyofilm yöntemi ile minimum biyofilm inhibisyon konsantrasyon (MBİK) değerleri spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Ayrıca iğne kapaklı mikroplaklarda antifungal ilaçların planktonik hücreleri üzerinde biyofilm oluşumunu inhibe etme etkisi spektrofotometrik olarak ve spot ekimler ile araştırılmıştır.

Çalışmamızda Modifiye Christensen yöntemi ile 162 suştan %38'i (n=61) orta düzeyde biyofilm yaparken, %29'unun (n=47) zayıf ve %23'ünün (n=37) ise yüksek düzeyde biyofilm oluşturduğu saptanmıştır. Biyofilm duyarlılık test sonuçlarına göre ekinokandinler en düşük MBİK değerlerine sahip olarak terapötik konsantrasyon aralığında bulunmuştur. Azoller ve amfoterisin B' ye karşı suşların tümü dirençli olarak saptanmıştır. Amfoterisin B'nin en düşük MBİK/ MİK oranı ile sesil hücrelere karşı en etkili olduğu görülse de, MBİK50 ve MBİK 90 değerleri CLSI'ın duyarlılık aralığında bulunmamıştır. Biyofilm oluşumunda inhibisyon etki sonucuna göre itrakonazolün diğer ajanlara göre daha çok suşta inhibisyon (26/32 suş; %81,3) yaptığı saptanmıştır.

Sonuç olarak çalışmamızda ekinokandinler biyofilmlere karşı en etkin grup olarak bulunmuştur. İtrakonazol ise biyofilm oluşumu  inhibisyonunda en etkili antifungal olarak görülmüştür. Biyofilm antifungal duyarlılık testleri için, gerece bağlı enfeksiyonların tedavi ve profilaksisinde, standardize yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
Recently, the infections related to Candida albicans biofilms as well as the resistance of these biofilms to antifungal agents increased as a result of excessive use of medical equipments, and prophylactic medication regimes that inhibit formation of those biofilms are needed, particularly in high risk patients. 

In this study, we aimed to determine the biofilm formation rate of Candida albicans that may frequently cause nosocomial infections, and investigate the antifungal sensitivity patterns in extensively biofilm forming species, comparatively in planktonic and sessile cells. We also aimed to investigate the efficacy of the antifungals for preventing biofilm formation in those species. 

A total of 162 Candida albicans strains isolated from the blood cultures of Başkent University Ankara, Adana and İstanbul Hospitals' inpatients were included in the study. All strains identified by conventional methods; germ tube formation and corn-meal morphologies. The biofilm formation was investigated and graded using modified Christensen's 96 – well plate method. The biofilm forming capacities of randomly chosen 30 klinical isolates from strongly biofilm foming species, C.albicans ATCC 10231 ve C.albicans ATCC 90028 standart strains were investigated using XTT method in microplates with needle lids. The antifungal susceptibilities of those species for standard powder forms of caspofungin, micafungin, anidulafungin fluconazole, voriconazole, posaconazole, itraconazole, and amphotericin B were studied in accordance with CLSI standards, using microdilution method (M27-A3). The sensitivities of the same antifungal agents against sessile cells were studied using Modified Calgary biofilm method, and their minimum biofilm inhibition concentration (MBIC) values were determined  spectrophotometrically. In addition, the inhibitory effects of the antifungal agents on biofilm formation of planktonic cells in mikroplates with needle lids  were investigated spectrophotometrically and by spot inoculations. 

Our study showed that there was moderate biofilm formation in 38% (n=61), weak biofilm formation in 29% (n=47), and extensive biofilm formation in 23% (n=37) of 162 species, as determined with Modified Christensen method. The biofilm sensitivity results indicated that echinocandins had the lowest MBIC values which were within the therapeutic ranges. All species were resistant to azoles and amphotericin B. The lowest MBIC / MIC rate was determined with amphotericin B, but it's MBIC50 and MBIC90 values were over the sensitivity range of CLSI. The inhibitory effect for biofilm formation results showed that itraconazole made inhibition in more species (26/32 species; 81.3%) when compared to the other agents.

In conclusion, echinocandins were found as the most efficient group against biofilms in our study. Itraconazole was the most effective antifungal agent for inhibiting biofilm formation. Standardized methods are needed for biofilm antifungal sensitivity tests in the treatment and prophylaxis of the infections caused by Candida albicans.