Semaforin 3F nin altın nanopartiküllere bağlanması, karakterizasyonu, HUVEC ve A549 hücre hatlarında anti-proliferatif etkisinin incelenmesi
Attachment of Semaphorin 3F onto gold nanoparticles its characterization, investigation of its anti-proliferative effect on HUVEC and A549 cell lines
Yazar: GAMZE TAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ ONUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Genel Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada anti-anjiyogenik ve anti-tümöral etkileri olan Semaforin 3F ile fonksiyonelleştirilen altın nanopartikülleri kullanarak normal hücrelere zarar vermeden tümör mikroçevresindeki anormal vasküler oluşumun durdurulması ve tümöral gelişimin baskılanması hedeflenmiştir.
İlaç taşıma sistemleri için çok sayıda materyal kullanılmasına rağmen altın nanopartiküllerin özel bir yeri vardır. Altın toksik olmayan çekirdeği, yük ve hidrofobisite gibi yüzey özelliklerinin tek katmanda ayarlanabilmesi, birçok terapötik ajan ve biyomolekülü kararlı bir şekilde bağlayıp biyouyumlu kompleks yapılar oluşturabilmesi gibi özelliklerinden dolayı son zamanlarda öne çıkan ilaç ve gen taşıyıcısıdır. Bu nedenle çalışmada Semaforin 3F'nin hücresel hedeflere yönlendirilmesinde altın nanopartiküller kullanılmıştır. 
Altın nanopartikül sentezi yaklaşık 20 nm boyutunda küresel ve tekil dağılımlı partiküllerin hazırlanmasına olanak sağlayacak şekilde optimize edilmiştir. Kolloidal stabilitenin arttırılması için sentezlenen altın partiküller polietilen glikol heterobifonksiyonel polimer zincirleriyle modifiye edilmiştir. Modifiye edilen partiküllerin boyut, şekil ve yüzey özellikleri geçirimli elektron mikroskopisi, dinamik ışık saçılımı, UV-Vis spektroskopi aracılığıyla karakterize edilmiştir. Hücre kültürü çalışmalarında temel hücre tipi olarak HUVEC kullanılmıştır. Anjiyogenez oluşumunun başlatılması için uygun VEGF miktarı ve endotel hücre proliferasyonunu inhibe eden en etkin Semaforin 3F miktarı tespit edilmiştir. Ayrıca A549 hücre hattı kullanılarak Semaforin 3F'nin anti-tümöral etkisi gösterilmiştir. PEG modifiyeli altın nanopartiküller kovalent olarak Semaforin 3F ve Bovin Serum Albumin ile fonksiyonelleştirilip, TAMRA floresan boyayla etiketlenmiştir. Biokonjugasyonun başarıyla gerçekleştirildiği geçirimli elektron mikroskobu, dinamik ışık saçılımı, agaroz jel elektroforezi, UV-Vis ve floresans spektroskopi gibi teknikler kullanılarak doğrulanmıştır. Biyokonjugatların hücre içerisine alımı incelendiğinde reseptör ligand etkileşimi sonucunda biyokonjugatların başarılı bir şekilde hücre içerisinde lokalize olduğu görülmüştür. Hazırlanan biyokonjugatların ve Semaforin 3F'nin VEGF uyarımlı endotel hücre proliferasyonu üzerine etkileri MTT yöntemi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Semaforin 3F ile fonksiyonelleştirilen altın nanopartiküller sadece Semaforin 3F ile karşılaştırıldığında endotel hücre proliferasyonunu daha etkin bir şekilde azaltmıştır. PEG ile modifiye edilen altın nanopartiküller ve biyokonjugatlar önemli bir toksik etkiye yol açmamıştır.
Bu sonuçlar, VEGF blokajının yanında anti-tümöral etkisi olan Semaforin 3F'nin altın nanopartiküllerle taşınması halinde oluşturacağı terapötik etkinin geliştirilebileceğini göstermektedir.

Abstract:
In this study, it is aimed to inhibit abnormal vascularization around tumor microenvironment and to suppress tumor growth using gold nanoparticles functionalized with anti-angiogenic and anti-tumoral Semaphorin 3F without damaging the normal cells.
While many materials are widely used for drug delivery systems, gold nanoparticles have a special place. Gold has recently become prominent as a drug and gene carrier due to its non-toxic core, its ability to form bio-compatible complex structures by binding various therapeutic agents and biomolecules in a stable way and since its surface features such as charge and hydrophobicity can be adjusted in monolayer. Thus, in this study, gold nanoparticles were used for directing the Semaphorin 3F molecules to cellular targets. 
The synthesis process of gold nanoparticles was optimized to enable the preparation of 20 nm sized spherical and monodisperse particles. Gold nanoparticles were modified with polyethylene glycol heterobifunctional polymer chains to enhance colloidal stability. Modified particles then characterized in respect of size, shape and surface properties by Transmission Electron Microscopy, Dynamic Light Scattering and UV-Vis Spectroscopy. HUVEC was used as the primary cell type in cell culture studies. It is determined the optimum amount of VEGF for the initiation of angiogenesis formation, and the amount of the most effectively Semaphorin 3F, which inhibit the endothelial cell proliferation. Also anti-tumoral effect of Sema 3F was also observed on A549 cell line. Polyethylene glycol-modified gold nanoparticles were covalently functionalized with Semaphorin 3F and Bovine Serum Albumin and then labeled with TAMRA florescent dye. The accomplishment of bioconjugation process was confirmed by multifaceted techniques including transmission electron microscopy, dynamic light scattering and UV-Vis and fluorescence spectroscopy and agarose gel electrophoresis. Cellular uptakes of bioconjugates were examined and they had been shown to be successfully localized in the cell as a result of receptor-ligand interaction. The effects of bioconjugates on VEGF-induced endothelial cell proliferation were evaluated comparatively by means of MTT method. Gold nanoparticles functionalized with Semaphorin 3F were observed to reduce endothelial cell proliferation more effectively compared to Semaphorin 3F only. PEG modified gold nanoparticles and bioconjugates did not cause any significant cytotoxicity.
This results shows therapeutic effect of Semaphorin 3F, which has anti-tumoral effect addition to its capable of VEGF blockage, can be improved in case of carrying it by Gold Nanoparticles.