Farklı hasta gruplarında encephalitozoon intestinalis'in 
araştırılması
Investigation of encephalitozoon intestinalis in different patient groups
Yazar: ÜLFET ÇETİNKAYA
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN YAZAR
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Encephalitozoon intestinalis = Encephalitozoon intestinalis ; Gastrointestinal hastalıklar = Gastrointestinal diseases ; Kayseri = Kayseri ; Microsporidia = Microsporidia ; Paraziter hastalıklar = Parasitic diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Bu çalışmada; immun sistemi baskılanmış ve immun sağlıklı kişilerden oluşan değişik hasta gruplarında fırsatçı bir parazit olan Encephalitozoon intestinalis'in farklı tanı yöntemleri ile yaygınlığının araştırılması, tanıda kullanılan yöntemlerin duyarlılık ve özgüllüklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya; 25'i onkolojik tedavi gören ve akut gastrointestinal şikayeti olan, 25'i kemik iliği transplantasyonu yapılmış ve akut gastrointestinal şikayeti olan, 25'i ürtikerli ve 25'i gelişme geriliği olan toplam 100 hasta ile kontrol grubu olarak herhangi bir kronik rahatsızlığı olmayan fakat akut gastrointestinal şikayeti olan 25 hasta ve 25 sağlıklı gönüllüden oluşan toplam 50 kişi dahil edilmiştir. Dışkı örneklerinin mikrosporidian parazitler açısından değerlendirilmesinde modifiye trikrom ve calcofluor white 2MR boyama yöntemleri ile Multiplex Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR), Monoklonal antikorların kullanıldığı Immun Floresan Antikor (IFA-MAbs), Nested PCR ve prob bazlı Real Time PCR olmak üzere toplam altı farklı yöntem kullanılmıştır. Modifiye trikrom boyama, calcofluor white 2MR ve Multiplex Real Time PCR yöntemleri ile intestinal sisteme yerleşen mikrosporidian parazitlerin varlığı tür ayrımı yapılmaksızın araştırılmıştır. Bu üç yöntemden Multiplex Real Time PCR ile elde edilen sonuçlar esas alınarak cinsiyet, yaş, araştırma grupları ve ishal varlığına göre mikrosporidian parazitlerin pozitiflik oranları belirlenmiştir. Aynı zamanda bu yöntem ile elde edilen sonuçlara göre modifiye trikrom ve calcofluor white 2MR boyama yöntemlerinin sensitivite ve spesifite değerleri belirlenmiştir. Onkolojik tedavi gören ve akut gastrointestinal rahatsızlığı olan hastalarda %52, kemik iliği transplantasyonu yapılmış ve akut gastrointestinal şikayetleri olan hastalarda %28, ürtiker şikayeti bulunan hastalarda %36, gelişme geriliği olan çocuklarda %44 ve kronik rahatsızlığı olmayan fakat akut gastrointestinal rahatsızlığı bulunan hastalarda ise %36 oranında pozitiflik tespit edilmiştir. Multiplex Real Time PCR'ı referans test olarak aldığımızda modifiye trikrom boyama yönteminin sensitivitesi %65.4, spesifitesi %90.8; calcofluor white 2MR boyama yönteminin sensitivitesi %71.2, spesifitesi %65.3 olarak belirlenmiştir.
IFA-MAbs, Nested PCR ve prob bazlı Real Time PCR yöntemleri ile ise E.intestinalis araştırılmıştır. Bu yöntemlerden prob bazlı Real Time PCR ile elde edilen sonuçlar esas alınarak, cinsiyet, yaş, araştırma grupları ve ishal varlığına göre E.intestinalis pozitiflik oranları belirlenmiştir. Aynı zamanda bu veriler kullanılarak IFA-MAbs ve Nested PCR yöntemlerinin sensitivite ve spesifite değerleri de hesaplanmıştır. Onkolojik tedavi gören ve akut gastrointestinal rahatsızlığı olan hastalarda %40, kemik iliği transplantasyonu yapılmış ve akut gastrointestinal şikâyetleri olan hastalarda %24, ürtiker şikâyeti bulunan hastalarda%20, gelişme geriliği tespit edilen çocuklarda %40 ve kronik rahatsızlığı olmayan fakat akut gastrointestinal şikayeti bulunan hastalarda %28 oranında pozitiflik tespit edilmiştir. Prob bazlı Real Time PCR referans test olarak alındığında; IFA-MAbs'ın sensitivitesi %56.4, spesifitesi %93.7; Nested PCR'ın sensitivite %30.8, spesifitesi %100 olarak belirlenmiştir.
Sonuç olarak; E.intestinalis ve diğer mikrosporidian parazitler sadece immun sistemi baskılanmış hastalarda değil gelişme geriliği olan çocuklar, ürtikerli ve akut gastrointestinal şikayeti olan hastalarda da yaygın şekilde bulunmuştur. Mikrosporidian parazitler ile ilgili çalışmaların başka hastalık gruplarında da çalışılması gerektiğini düşünmekteyiz. Diğer taraftan; konvansiyonel yöntemlerin düşük sensitivite ve spesifiteye sahip olduğu, yalancı pozitiflik veya yanlış negatiflik verme olasılığının yüksek olduğu gözlemlenmiş ve bu nedenle de mikrosporidian parazitlerin tanısında real-time PCR yönteminin kullanılmasının gerekli olduğu kanaatine varılmıştır.

Anahtar kelimeler: Microsporidia, Encephalitozoon intestinalis, Tanı, Kayseri

Abstract:
In this study; it was aimed to investigated the prevalence of Encephalitozoon intestinalis in different patients group consisting of immunocompromised and immunocompotent individuals with different diagnostic methods and to determine sensitivity and specificity of diagnostic methods used in study. 
100 patient's samples, consist of 25 of oncological treated and acute gastrointestinal complaints, 25 of bone marrow transplant and acute gastrointestinal complaints, 25 of urticaria and 25 of growth retardation, were included to study. As a control group; 25 of without any chronic disease but acute gastrointestinal complaints and 25 of healthy volunteers with a total of 50 people were including in.  Total of six different methods, including modified trichrome and calcofluor white 2MR staining methods, Multiplex Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR), immunofluorescence assay using monoclonal antibodies (IFA-MAbs), Nested PCR and probe based Real Time PCR, for the evaluation of microsporidia parasites of stool samples were used. Presence of microsporidian parasites who settled in the intestinal tract was researched by modified trichrome and calcofluor white 2MR staining methods, Multiplex Real Time were investigated without distinction of species. Positive rate of microsporidian parasites on the basis of the results obtained with Multiplex Real Time PCR were compared by sex, age, research groups and presence of diarrhea. According to the results obtained with this method modified trichrome and calcofluor white 2MR staining the sensitivity and specificity values were determined. 
52% of oncological treated and acute gastrointestinal complaint patients, 28% of bone marrow transplant and acute gastrointestinal complaints patients, 36% of urticaria patiens, 44% of growth retardation patients, 36% of without any chronic disease but acute gastrointestinal complaints patients were determined as positive. When Multiplex Real Time PCR is accepted as reference test, it has been found modified trichrome method's sensitivity 65.4%, specificity 90.8%; calcofluor white 2MR staining method's sensitivity 71.2%, specificity 65.3%.
Presence of E.intestinalis was investigated by IFA-MAbs, Nested PCR and prob based Real Time PCR. Positive rate of E.intestinalis on the basis of the results obtained with prob based Real Time PCR were identified by sex, age, research groups and presence of diarrhea. According to the results obtained with this method, IFA-MAbs and Nested PCR the sensitivity and specificity values were determined. 
40% of oncological treated and acute gastrointestinal complaint patients, 24% of bone marrow transplant and acute gastrointestinal complaints patients, 20% of urticaria patiens, 40% of growth retardation patients, 28% of without any chronic disease but acute gastrointestinal complaints patients were determined as positive. When probe based Real Time PCR test is accepted as reference, it has been found that IFA-MAbs's sensitivity 56.4%, specificity 93.7%; Nested PCR's sensitivity 30.8%, specificity 100%.
As a result; E.intestinalis and other microsporidian parasites were found to be common not only in patients with immunocompromised but also of children with growth failure, urticaria and patients with acute gastrointestinal complaints. We think that microsporidian parasites in other disease groups need to be studied. On the other hand, conventional methods that have low sensitivity and specificity, false positive or false negative result have high possibility, therefore using of real-time PCR method on the diagnosis of microsporian parasites was needed to be necessary.

Key Words: Microsporidia, Encephalitozoon intestinalis, Diagnosis, Kayseri