Kalıtsal metabolik hastalıklarda antioksidan yanıt ve otofajinin P62/NRF2/KEAP1 yolağı aracılığıyla araştırılması
Investigation of antioxidant response and autophagy by P62/NRF2/KEAP1 pathway in inherited metabolic diseases
Yazar: NEŞE VARDAR ACAR
Danışman: PROF. DR. EMİNE SİBEL SÜMER ; PROF. DR. RIZA KÖKSAL ÖZGÜL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Metabolik yolaklarda yer alan enzim, enzim kofaktörü, taşıyıcı eksikliği ya da bozukluğu sebebiyle, substratın birikmesi ve/veya son ürün eksikliğine neden olan kalıtsal metabolik hastalıklar (KMH'lar), çocukluk dönemi morbidite ve mortalitenin önemli nedenleri arasında olan tek gen bozukluklarıdır. Patofizyolojik bir bakış açısıyla metabolik bozukluklar, intoksikasyon tipi, enerji eksikliği tipi ve depolama tipi olmak üzere üç ana grupta incelenmektedir.
KMH'ların da dahil olduğu pek çok hastalığın patofizyolojisinde oksidatif stres (OS), önemli bir rol oynamaktadır. KMH'larda, biriken toksik metabolitler kadar, ROS (reaktif oksijen türleri) ve RNS (reaktif nitrojen türleri) de hastalık patofizyolojisine önemli katkıda bulunmaktadır. OS'nin mitokondriyal işlev bozukluğuna, hücresel yolaklardaki metabolitlerin değişimine, proteinlerin, lipitlerin ve DNA'nın da dahil olduğu moleküllerde hasara neden olduğu bilinmektedir. En az OS kadar azaltıcı stres de; hücre büyüme tepkilerini azaltması, proteinlerde disülfür bağlarının oluşumunda değişikliklere yol açması, mitokondriyal fonksiyonu ve hücresel metabolizmayı azaltması ile hücre homeostazının sağlanmasında tehlike arz etmektedir.
Hücresel strese karşı hücresel savunma mekanizmalarının ana düzenleyicisi olarak kabul edilen Nrf2/Keap1 yolağı, hasarlı makromoleküllerin onarımında veya ortadan kaldırılmasında görev alan çeşitli hücre koruyucu protein ağlarına ait gen ekspresyonlarını düzenleyerek, hücrenin stres koşullarında hayatta kalmasını sağlamaktadır. Ayrıca seçici otofaji, Nrf2/Keap1/p62 yoluyla bağlantılıdır. Artan OS ile hücre ölüme yönlendirilmeden önce koruyucu bir alarm sistemi gibi işlev gören p62, otofaji için kargo reseptörü olarak işlev görür.
Bu çalışmanın amacı, KMH'larda OS, mitokondriyal disfonksiyon ve otofaji arasındaki ilişkinin araştırılmasıdır. Bu amaç doğrultusunda, 6 sağlıklı ve 45 KMH sahibi birey (metilmalonik (MMA), propiyonik (PA), izovalerik (İVA) asidemi, mitokondriyal hastalıklar (MİT) ve mukopolisakkaridoz IV (MPS IV)) incelenmiştir. TAS (Total Antioksidan Seviye)/TOS (Total Oksidan Seviye) analizleri; hücre içi ATP, ROS ve mitokondri membran potansiyelinin (MMP) ölçümü ve hücre görüntülemesi; gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) ve Western Blot analizleri olmak üzere periferik kan kullanılarak 6 farklı deney planı oluşturulmuştur.
TAS/TOS analizleri sonucu sağlıklı gruba göre en yüksek antioksidan cevap MMA grubunda saptanmıştır. Hücre deneylerinde MMA ve İVA grubunda sağlıklıya göre yüksek ROS değerleri saptanırken; PA, MİT ve MPS IV gruplarında düşük ROS değerleri tespit edilmiştir. Hücre içi ATP miktarlarının değişimleri KMH gruplarının ROS değişimleri ile uyumludur. KMH gruplarında sağlıklı gruba kıyasla MMP'de büyük değişimler saptanmamakla birlikte mitokondriyal fonksiyonda değişiklikler tespit edilmiştir. Hücre görüntüleme deneyleri, KMH gruplarında yer alan her bir hasta bireyin ayrı olarak değerlendirilmesi gerekliliğini göstermektedir. Tüm KMH gruplarında sağlıklı gruba kıyasla Nrf2/Keap1/p62 yolağında indüksiyon saptanmış, HMOX1'deki artış temel detoksifikasyon enziminin HO-1 olduğuna işaret etmiştir. MİT ve MPS IV gruplarında saptanan LC3B-II ve p62'deki artış, otofajik akışta problem olduğuna işaret etmekle birlikte; MMA, PA ve İVA gruplarında artan LC3B-II ve azalan p62, otofajik akış indüksiyonunu göstermektedir. Tüm KMH'larda gözlenen kısmi Beclin1 ekspresyonu, hücrelerin ölüm yollarına yönlendirilmeden, otofaji aktivasyonunu sağlayan bir adaptasyon olarak karşımıza çıkmaktadır.

Abstract:
Due to the enzyme, enzyme cofactor, carrier deficiency or disorder in the metabolic pathways, Inherited Metabolic Diseases (IMDs) cause the accumulation of the substrate and / or end product deficiency that are the single gene disorders, among the important causes of childhood morbidity and mortality. From a pathophysiological point of view, metabolic disorders are examined in three main groups: intoxication type, energy deficiency type and storage type.
Oxidative stress (OS) plays an important role in the pathophysiology of many diseases, including IMDs. In IMDs, ROS (reactive oxygen species) and RNS (reactive nitrogen species) contribute significantly to disease pathophysiology as well as accumulated toxic metabolites. It is known that OS causes mitochondrial dysfunction, the change of metabolites in cellular pathways, damage to molecules including proteins, lipids and DNA. Reductive stress is dangerous for ensuring cell homeostasis as OS that reduce cell growth responses, cause changes in the formation of disulfide bonds in proteins, decrease mitochondrial function and cellular metabolism.
The Nrf2/Keap1 pathway is considered the main regulator of cellular defense mechanisms against cellular stress that allows the cell to survive in stress conditions by regulating gene expressions of various cell protective protein networks involved in repairing or eliminating damaged macromolecules. Also, selective autophagy is linked via Nrf2/Keap1/p62. Before the cell is directed to death with increased OS, p62 functions as a protective alarm system, as a cargo receptor for autophagy.
The aim of this study is to investigate the relationship between OS, mitochondrial dysfunction and autophagy in IMDs. For this purpose, 6 healthy and 45 individuals with IMD (methylmalonic (MMA), propionic (PA), isovaleric (IVA) acidemia, mitochondrial diseases (MIT) and mucopolysaccharidosis IV (MPS IV) were examined. Six different experimental plans were created using peripheral blood including TAS (Total Antioxidant Status)/TOS (Total Oxidant Status) analysis, intracellular ATP, ROS and mitochondrial membrane potential (MMP) measurement and cell imaging, real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot analysis.
As a result of TAS/TOS analysis, the highest antioxidant response was found in the MMA group compared to the healthy group. In cell experiments, while high ROS values were determined in the MMA and IVA groups compared to healthy ones; low ROS values were detected in PA, MIT and MPS IV groups. In intracellular ATP amounts of alteration are compatible with ROS changes of IMD groups. Although there are no major changes in MMP in IMD groups compared to the healthy group, alteration of mitochondrial function have been detected. Cell imaging experiments demonstrate that each patient in the IMD groups should be evaluated separately. Induction of the Nrf2/Keap1/p62 pathway was detected in all IMD groups compared to the healthy group, and the increase in HMOX1 expression indicated that the main detoxification enzyme was HO-1.
The increase in LC3B-II and p62 protein expression detected in MIT and MPS IV groups indicates that there is a problem in autophagic flux; increased LC3B-II and decreased p62 in the MMA, PA and İVA groups indicate autophagic flux induction. Partial expression of Beclin1 observed in all IMDs is an adaptation that enables autophagy activation without directing the cells to the death pathways.