Polimerik yüzey aktif maddeler ile plazmid saflaştırılmasının araştırılması
The investigation of plasmid purification by using polymeric surfactants
Yazar: NEŞE ATACI
Danışman: PROF.DR. İNCİ ARISAN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Gen tedavisi = Gene therapy

Özet:
Non viral gen tedavileri ve infeksiyöz hastalıklara yönelik DNA aşıları gibi moleküler tedaviyöntemlerinin son yıllarda gelişimi çok miktarda ve yüksek saflıkta plazmid DNA üretimiihtiyacını arttırmıştır. Plazmid DNA saflaştırılması için standart moleküler biyolojiprotokolleri mevcuttur ancak bu protokollerde kullanılan çözeltiler uygun değildir. Tedaviamaçlı ürünlerde kullanılacak protokollerde kullanılan çözeltilerin toksik olmaması ve fazlamiktarda üretim için uygun olmaları gerekmektedir.Bu tez çalışmasında plazmid DNA'sının polimerik maddelerin kullanımı ile saflaştırılmasıamaçlandı. Birinci yöntemde N,N',N'- Polioksietilen (10)-N tallow- 1,3-di amin propan(Peg-10 tallow) katyonik yüzey aktif madde kullanılarak plazmid DNA'nın çöktürülereksaflaştırıldı. Peg-10 tallow bileşiğinin yapısal analizi, elementel analizi, FT-IR, UV-VIS,NMR (1H, 13C) alınarak yapıldı. pDNA'nın peg-10 tallow yüzey aktif maddesi ile çöktürmeişleminin çalışma koşullarının iletkenlik değerleri belirlendi. Geliştirilen Alkali liziz metoduile plazmid DNA ve RNA'dan oluşan lizat örneği elde edildi. Bu aşamada Peg-10 tallowyüzey aktif maddesi ile plazmid DNA'nın lizat örneğinden çöktürülerek saflaştırılmasınafarklı asid (HCl), farklı tuz (NaCl) ve farklı lizat konsantrasyonlarının etkisi incelendi. DNAsaflığı %1'lik agaroz jel elektroforeziyle kontrol edildi.İkinci yöntem olarak biyomoleküllerin ve partiküllerin ayrılmasında kullanılan ?AqueousTwo Phase? (ATPS) iki fazlı ayırma sistemi kullanıldı. PEG 600 ile Amonyum Sülfattuzunun sulu ortamda karışımından oluşan ATPS sisteminin bileşimi %35 PEG 600 ve %6(NH4)2SO4'dir. Geliştirilen alkali liziz işlemi ile plazmid DNA ve RNA'dan oluşan lizatörneği elde edildi. %35 PEG 600 ve %6 (NH4)2SO4 bileşimli ATPS sisteme %100(v/v)oranında lizat örneği uygulandı. Ayırma işleminin daha iyi olması için lizat örneği ATPSsisteme uygulandıktan sonra isopropanol çöktürülmesi işlemi ile integre edildi. p(DNA)saflığı %1'lik agaroz jel elektroforeziyle kontrol edildi.Sonuç olarak PEG 600 ile yapılan saflaştırmanın daha başarılı olduğu saptandı.Anahtar Kelimeler: Gen Tedavisi,DNA Aşıları,p(DNA) Saflaştırma,Peg-10 tallow,PEG 600

Abstract:
The development of molecular therapies such as non-viral gene therapy and DNA vaccinationfor infectious diseases have increased the need for high quantities of highly purified plazmidDNA (pDNA). Although standard molecular biology protocols are available ,these are notsuitable. In addition they frequently use toxic reagents that should not be used in thepurification of therapeutic products.In this study, the polymer compounds were used to develop purification methods for pDNA.In the fırst method N,N?,N?- Polyoksietylen (10)-N tallow- 1,3-di amine propane ( Peg-10tallow) surfactant was used as a precipitation agent . Stuctural analysis of Peg-10 tallow wasdetermined by Elementar analysis, FT-IR, UV-VIS, NMR (1H, 13C ).The conductivity ofconditions of precipitation method was determined. A modified alkaline lysis method wasused for cell lysis to obtain pDNA and RNA solution. Precipitaion of the pDNA by Peg-10tallow cationic surfactant was determinated in different acid, different salt and different lysateconcentrations. The results were realized by 1% agarose gel analysis.Aqueous two phase systems (ATPS) is used as a system for seperation of biomolecules andparticles. In the second method was presented partitioning of the plasmid DNA in polyetyleneglycol(PEG) / salt (NH4)2SO4 aqueous two phase systems (ATPS). %35 PEG 600 - %6(NH4)2SO4 ATPS system was selected .A modified alkaline lysis method was used for celllysis to obtain pDNA and RNA solution.100% mass of lysate was loaded to the system. Inaddition the bottom phase of ATPS systems was integrated with isopropanol precipitationstep. The results were realized by %1 agarose gel analysis.Finally PEG 600 system provides plazmid purification better than peg-10 tallow precipitationsystem.Key Words:Gene Therapy, DNA Vaccination, p(DNA) purification, Peg-10 tallow, PEG 600