Mikromanipülasyon ile izole edilen tek sperm hücresinden MTDNA tiplenmesi ile kimliklendirme /
Yazar: ESRA BAYHAN
Danışman: DOÇ. DR. EMEL HÜLYA YÜKSELOĞLU
İstanbul Üniversitesi / Adli Tıp Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Adli olaylarda bazı cinsel saldırı vakalarında nükleer DNA miktarının sınırlı olması ya da yüksek derecede degrede olmasından ötürü standart genetik tiplendirme tekniklerinde istenen başarılı sonuçlar elde edilememektedir. Ayrıca cinsel saldırı suçlarında bazen şüphelinin kimliklendirilmesinin diğer vücut sıvıları ve vajinal hücreler ile karışık semenden yapılması gerekmekte ancak sperm hücrelerinde genomik DNA da meydana gelen degredasyon ve mağdurun epitel hücrelerinin çok fazla olması sperm hücrelerinin başarılı genetik tiplendirilmesini de riske atmaktadır. Bu gibi durumlarda diğer hücresel kaynakların ya da vajinal hücrelerin DNA'sından sperm DNA'sının izole edilmesi son derece önemli olmaktadır. Ayrıca aynı erkek soyundan birden fazla erkeğin karıştığı cinsel saldırı olaylarında gerçek zanlı Y-STR analizi ile kesin olarak tespit edilememektedir. Bu gibi durumlarda mtDNA analizlerinin önemi ortaya çıkmaktadır ve mtDNA' dan yararlanılmaktadır.  
Bu çalışmanın amacı sürüntü yardımıyla toplanan örneklerden mikromanipülasyon tekniği kullanılarak mağdurun epitel hücreleri arasından faile ait spermatozoaların fiziksel olarak ayrımı yapılmakla beraber tek tek toplanan sperm hücrelerinden mtDNA tiplendirme ile erkek mitotipinin karakterizasyonunu yapmaktır. Mikromanipülasyon ile yapılan fiziksel ayrımın yanı sıra erkek mitotipinin karakterizasyonu için çiftler kendi içinde teker teker incelenerek erkeği kadından ayıran SNP noktaları tespit edilerek bu SNP noktaları üzerinden erkeğe özgü SSP' ler tasarlanarak kullanılmaktadır. Tez çalışması için 10 kişiden (5 gönüllü çiftten) birinci basamak için ağız içi sürüntü örnekleri, ikinci basamak için cinsel ilişki sonrası kadınlardan vajinal sürüntü örnekleri toplandı. Birinci basamakta ağız içi sürüntü örnekleri çalışılarak kadın ve erkeğin mtDNA profilleri çıkarıldı. Bu profiller revize Cambrige Referans dizisi ile karşılaştırıldı. Bu işlem yapılırken SNP noktaları üzerinde duruldu ve her çift kendi içinde incelendi. Her çift için erkekte var olan kadında görülmeyen SNP noktaları tespit edildi. Bu tespit edilen SNP noktaları üzerinden her bir çiftin erkeğine özgü SSP' ler tasarlandı. İkinci basamakta cinsel ilişki sonrası kadınlardan alınan vajinal sürüntü örneklerinden öncelikle mikromanipülasyon tekniği kullanılarak sperm hücreleri teker teker toplandı ve DNA izolasyonu yapıldı. Birinci basamakta tasarlanan SSP' ler kullanılarak PCR işlemi yapılıp erkeklerin mtDNA profilleri elde edildi. Ancak bu, çalışmaya katılan her çift için yapılamadı. Çünkü birinci basamakta SSP tasarlamak için çiftlerin SNP noktalarının karşılaştırılması sırasında; çiftlerden ikisinin taşıdığı tüm SNP noktalarının çakıştığı kadınında erkeğinde aynı SNP noktalarına sahip olduğu tespit edildi. Bu yüzden çalışmadaki beş çiftten üçü için kullanılabildi. Sonuçlara göre çalışmada kullanılan mtDNA dizinlemenin zaman alıcı olması, anne tarafından akraba kişilerde SNP noktalarının çakışmasından ötürü SSP tasarlanamadığı için anne tarafından akraba erkeklerin karıştığı vakalarda kullanılamaması yöntemin dez avantajlarıdır. Ancak çalışmada kullanılan mikromanipülasyon tekniği sayesinde kontaminasyon riskini azaltarak karışık örneklerde tek tek sperm izolasyonu ve kişiye özgü tasarlanan SSP' ler ile dizinleme yapılabiliyor olması bu yöntemin adli laboratuvarlarda rutinde sürekli kullanılamasa bile aynı erkek soyundan birden fazla kişinin olaya karıştığı toplu tecavüz suçları gibi hassas vakalarda tercih edilebilecek bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Due to the limited or high degree of nuclear DNA content in cases of sexual assault during forensic events, expected successful results can not be achieved in standard genetic typing techniques. Also, in cases of sexual assault, sometimes the identification of the suspect needs to be done in the same way as other body fluids and vaginal cells, but the genomic DNA in the sperm cells also causes the genetic typing of the sperm cells because of the degradation and the excessive number of the epithelial cells of the victim. In such cases, it is extremely important to isolate sperm of DNA from DNA of other cellular sources or vaginal cells. Moreover, in the case of sexual assaults, involving more than one man from the same family, the true suspect can not be determined with Y-STR analysis. In such cases, the importance of mtDNA analysis arises and mtDNA is used.
The purpose of this study is to physically seperate the culprit's spermatozoa from the epithelial cells of the victim by using micromanipulation technique from the samples collected with the aimed swab, and also characterization of male mitotipine by typing MTDNA from individual collected sperm cells. In addition to the physical separation by micromanipulation, male pairs are examined one by one for the characterization of male mitotipine, and SNP points separating male and female are identified and SSPs specific to men are designed and used on these SNP points. For the thesis study, for first step, oral swabs, then for second step, vaginal swabs from the women after the sexual intercourse are collected from 10 people (5 volunteer couples). In the first step, by the study of oral swabs, mtDNA profiling of the female and male was created. These profiles were compared with the revised Cambrige Reference knee. When this was done, the SNPs were focused on the spots and each pair was examined in it. For each pair, SNP points that were not present in man were detected. Based on these detected SNP points, each pair of male specific SSPs was designed. Sperm cells were collected one by one by using micromanipulation technique and DNA was isolated from vaginal swabs taken from women after sexual intercourse in the second step. PCR was performed using SSPs designed in the first step and mtDNA profiles of males were obtained. However, this could not be done for every couple involved in the study. Because during the comparison of pairs of SNP points to design SSP in the first step, all SNP spots carried by two of the couples were found to have the same SNP spots in the male of the coincident woman. So it could be used for three of the five couple volunteers in the study. According to the results, the mtDNA index used in the study is time-consuming, and because SSPs can not be designed due to the overlap of the SNP points in the relatives of the mother, the disadvantages of the method that the mother can not use in the confused situations. However, this method shows that can be preferred in crime laboratories such as collective rape crimes which are involved more than one person in same family, eventhough the micromanipulation technique used in the study, the risk of contamination can be reduced and individual samples can be isolated with sperm isolation and individualized SSPs can be indexed.