Farklı hidroliz yöntemleriyle nohuttan elde edilen fitoöstrojenlerin HPLC ve GC-MS ile belirlenmesi
HPLC and GC-MS identificaton of chickpea?s phytoestrogens obtained by using different hydralization methods
Yazar: DERYACAN AYGÜNEŞ
Danışman: PROF. DR. NEVZAT ARTIK
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmada nohut materyalinin içermekte olduğu serbest isoflavon (biochanin A, formononetin, genistein, daidzein ve glycitein), konjuge isoflavon (sissotrin, ononin, genistin, daidzin ve glycitin), lignan (secoisolariciresinol ve matairesinol), coumestan (coumestrol) ve diğer flavonoidler (apigenin, quercetine ve rutin) gibi fitoöstrojenik aktiviteye sahip bileşik konsantrasyonları farklı örnek hazırlama yöntemleri uygulanması sonrasında çeşitli kromatografik teknikler kullanılarak belirlenmiştir. Çalışma kapsamında uygulanan örnek hazırlama yöntemleri metanol ve seyreltik HCl ile direkt ekstraksiyon, derişik HCl ve inkübasyon ile asit hidrolizi, selülaz, ß-glucosidase ve ß-glucuronidase enzimleri ve inkübasyon ile enzimatik hidroliz ve enzimatik ve asit hidrolizlerinin birlikte uygulandığı çoklu hidroliz olmuştur. Kromatografik tekniklerden ise HPLC (HPLC-DAD ve LC-MS/MS) ile GC-MS kullanılmıştır. Tekrarlanabilirlik ve hassasiyet gibi faktörler (tayin limiti aralığı 0.9-3.0 ppb) nedeni ile en etkin yöntem LC-MS/MS olarak belirlenmiştir. Nohut örneklerine uygulanan çoklu hidroliz sonucunda tespit edilen başlıca isoflavan bileşiğinin be secoisolariciresinol olduğu belirlenmiştir. Çoklu hidroliz uygulanan örnekler 967.9 ppb ile en yüksek isoflavon konsantrasyonuna sahip olmuşlardır. Ayrıca direkt hidroliz uygulanan örneklerdeki rutin en yüksek diğer flavonoid konsantrasyonuna (55.8 ppb). Nohut örneklerinde toplam fitoöstrojenik madde düzeyleri 484.3 ? 3844.8 ppb aralığında değişiklik göstermektedir. Örneklerin hiç birinde coumestrol, daidzin ve quercetin tespit edilememiştir. Araştırma verileri, toplam isoflavon ve toplam lignan tayinleri için nohut enzimatik hidroliz, toplam diğer flavonoid tayini için ise direkt hidroliz yöntemlerinin etkili olduğunu ortaya koymuş olmakla birlikte bileşikler bazında bu küçük değişiklikler gösterebilmektedir.

Abstract:
This study identified concentrations of phytoestrogenic compounds such as free isoflavones (biochanin A, formononetin, genistein, daidzein and glycitein), conjugated isoflavones (sissotrin, ononin, genistin, daidzin and glycitin), lignan (secoisolariciresinol and matairesinol), coumestan (coumestrol) and other flavonoids (apigenin, quercetine and rutin) contained by chickpea, using different chromatographic methods after different sample preparation methods. Sample preparation methods used in the study included simple extraction with methanol and diluted HCl, acid hydrolysis with concentrated HCl and incubation, enzymatic hydrolysis with cellulose, ß-glucosidase and ß-glucuronidase enzymes and incubation and multiple hydrolysis with collective use of enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis. Among chromatographic methods, HPLC (HPLC-DAD and LC-MS/MS) and GC-MS were used in the study. The most effective method was found to be LC-MS/MS due to factors of repeatability and sensitivity (range of identification limit 0.9-3.0 ppb). Major phytoestrogenic compound was found to be secoisolariciresinol in all chickpea samples with the highest concentration (2860.8 ppb) by multiple hydroyslis . The samples that treated by multiple hydrolysis have highest isoflavone concentration with 967.9 ppb. On the other hand, rutin treated by direct hydrolysis has the highest other flavonoid concentration with 55.8 ppb. Total phytoestrogenic substance amounts of chickpea samples varied between 484.3 ? 3844.8 ppb according to the hydrolysis methods. Although study data revealed that multiple hydrolysis was effective for total isoflavone and total lignin identification and direct hydrolysis method was effective for identification of total other flavonoid, compounds can show small variations.