Potansiyel MPGES-1 inhibitörlerinin antikanserojen etkilerinin A549 hücrelerinde araştırılması
Investigating anticancerogenic effects of the potential MPGES-1 inhibitors in A549 cancer cell line
Yazar: EREN DEMİRPOLAT
Danışman: DOÇ. DR. MÜKERREM BETÜL AYCAN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Gingerol = Gingerol ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Kurkumin = Curcumin ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prostaglandinler = Prostaglandins ; Shogaol = Shogaol ; Zingiber officinale = Zingiber officinale ; İnterlökin 1 = Interleukin 1

Özet:
Çalışmamızda A549 küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücrelerinde Zingiber officinale'de bulunan 6-gingerol ile 6-shogaolün antikanser etkileri ve bu etkilerinin mPGES-1 (mikrozomal prostaglandin E2 sentaz 1), β-catenin, GSK3β (glikojen sentaz kinaz 3 β) yolağı üzerinden oluşup oluşmadığı araştırıldı. A549 hücrelerine 24 saat boyunca IL-1β (interlökin 1 β) uygulanarak mPGES-1 enzimi indüklendi. Deneyler hem IL-1β' ya maruz kalan hem de maruz kalmayan hücrelerde yürütüldü. Kurkumin bilinen doğal bir mPGES-1 inhibitörü olduğundan çalışmada pozitif kontrol olarak kullanıldı ve 6-gingerol ile 6-shogaolün etkileri kurkuminle kıyaslandı. Öncelikle A549 hücrelerinin büyüme profili çıkarıldı. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) ve gerçek zamanlı hücre analizi (GZHA) deneyleriyle moleküllerin sitotoksik etkileri araştırıldı. Büyüme profili deneyi sonucunda IL-1β uygulanan hücrelerde uygulanmayanlara göre hücre proliferasyon hızının arttığı tespit edildi. Bu deneylere göre kurkumin ile 6-shogaolün sitotoksik etkili olduğu görüldü. 6-shogaol için 24 sa IC50 değeri 62 μM bulundu. IC50 değeri etrafında belirlenen dozlarda ise moleküllerle 24 sa inkübasyondan sonra western blot ile mPGES-1, GSK3β, p-GSK3β, β-catenin protein düzeyleri ve RT-PCR (real time polimeraz zincir reaksiyonu) ile aynı parametreler için mRNA düzeyleri ölçüldü. Bunlar sonucunda IL-1β' lı hücrelerde mPGES-1, p-GSK3β, β-catenin protein ve mRNA düzeylerinin yükseldiği, GSK3β düzeylerinin ise düştüğü görüldü (p<0,05/p<0,001). Ayrıca kurkumin ve 6-shogaol için IL-1β' nın ilgili protein-lerin düzeyinde yapmış olduğu değişimlerin geriye çevrildiği gözlenirken; 6-gingerol bu açıdan etkisiz bulundu. Meydana gelen değişimlerin PGE2 düzeyleri ile ilişkili olup olmadığının anlaşılması için PGE2 düzeyleri, hücrelerin indüklenmesinden başlayarak farklı zamanlarda alınan örneklerde ölçüldü. Buna göre PGE2 düzeyinin IL-1β uygulanan hücrelerde uygulanmayanlara göre yükseldiği; ancak bu etkinin zamanla azaldığı gözlendi. 6-shogaol ve kurkuminin antikanser etkilerinin PGE2 düzeyini düşürerek gösterdiği düşünüldü. Buna dayanarak 6-shogaolün özellikle 240 μM, kurkuminin ise 100 μM konsantrasyonda etkili olduğu ve 6-shogaolün mPGES-1 ile β-catenin inhibisyonu özellikleri açısından küçük hücreli akciğer kanseri tedavisi için potansiyel bir aday olabileceği gözlendi.

Abstract:
In our study we investigated the anticancer effects of 6-gingerol and 6-shogaol from Zingiber officinale. Also we aimed to see the anticancer effect is dependent on whether mPGES-1 (microsomal prostaglandine E2 synthase 1), β-catenin and GSK3β (glycogen synthase kinase 3 β) pathway or not. A549 cells are incubated with IL-1β (interleukin 1 β) for 24 hours in order to make cell's mPGES-1 enzyme induced. Experiments are performed both on IL-1β and non IL-1β group. Curcumin from Curcuma longa, a natural compound that is known for its mPGES-1 inhibitory effect, is used as a positive control. Effects of 6-gingerol and 6-shogaol is compared with that of curcumin. Firstly, cell proliferation assay for A549 profiling was carried out. Then, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) and RTCA (real time cell analysis) assay were performed to determine the cytotoxicity of molecules. As a result of cell profile assay, cells exposed to IL-1β proliferate faster than non IL-1β ones and 24 hrs IC50 for 6-shogaol was determined as 60 μM. Concentration around this IC50 value were used to perform western blot protein and RT-PCR mRNA analyses. Measurement was performed after 24 hrs incubation with molecules to determine mPGES-1, GSK3β, p-GSK3β, β-catenin protein and mRNA levels. Protein and mRNA levels of mPGES-1, p-GSK3β, β-catenin were higher and GSK3β was lower in IL-1β group (p<0,05/p<0,001). While the effects of curcumin and 6-shogaol on these parameters were against the IL-1β's effect, 6-gingerol was not effective. To see the relationship of these changes with PGE2, levels of PGE2 was measured in samples which were taken in different time points from the beginning of incubation process. According to the assay, PGE2 was higher in IL-1β group but this effect was time dependent and decreased in a while. It is observed that 6-shogaol and curcumin showed their anticancer effect via lowering PGE2 levels. As a result of the assays, we saw that 6-shogaol showed as much anticancer effect as curcumin and it is thought that 6-shogaol might be a potential candidate in non small cell lung cancer treatment because of its mPGES-1 and β-catenin inhibitory effects.