Amlodipin besilatın farmasötik preparatlarda ve biyolojik sıvılarda yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile analizi
Determination of amlodipine in biological fluids and pharmaceutical preparations with HPLC
Yazar: SEVGİ TATAR
Danışman: PROF.DR. SEDEF ATMACA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 1999
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Amlodipine = Amlodipine ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid

Özet:
64 6. ÖZET Amlodipin hipertansiyon tedavisinde kullanılan dihidropiridin türevi bir kalsiyum kanal blokeridir. Bu çalışmada amlodipinin tabletlerde ve insan plazmasında tayini için primer ve sekonder aminlerin analizinde spesifik bir belirteç olan 7-kloro-4-nitrobenzodioksazol (NBD-CI) ile türev oluşumuna dayanan yüksek performanslı sıvı kromatografik (HPLC) bir yöntem geliştirildi. Hem tablet hem plazma örneklerinin analizinde amlodipin besilat çözeltisi üzerine 0.1 N NaOH çözeltisi ilave edildi ve amlodipin baz n-heptan-isopropil alkol (99:1) çözücü karışımına ekstre edildi. Bu işlem ile ayrıca plazma proteinleri de çöktürüldü ve plazmadaki girişim yapan maddelerin bir kısmı ayrıldı. Organik fazın azot akımında, 45 °C de uçurulmasından sonra kalıntı türevlendirildi. Amlodipin ile NBD-CI arasındaki reaksiyonun optimum koşulları araştırıldığında, reaksiyonun pH 8.5 da, 70 °C de 30 dakika içerisinde, belirteç amlodipin mol oranı 100 olduğunda kantitatif olarak yürüdüğü saptandı. Reaksiyonun tamamlanmasından sonra türev, asitlendirilmiş reaksiyon ortamından etilasetat ile ekstre edildi. Belirli bir miktar ekstre, susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulduktan sonra, azot akımında 45 °C de yoğunlaştırıldı ve sonra silika jel katı-faz ekstraksiyonu sütunundan geçirildi (Tablet örneklerinin analizinde katı-faz ekstraksiyonu işlemi yapılmadı ). Etilasetat ile elüsyondan sonra, çözücü kuruluğa kadar uçuruldu ve kalıntı mobil fazda çözündürüldü. Sıvı kromatografik analiz, n-Bondapak Cı8 kolon ve 0.8 mL/dak akış hızında metanol- su (80:20) çözücü sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Injeksiyon hacmi 20,uL idi.65 internal standart olarak nortriptilin hidroklorür kullanıldı. Maddeler, fluoresans detektör (^eks = 459 nm, Xem = 528 nm) ile saptandı. Bu koşullar altında amlodipin- ve nortriptilin-NBD türevlerine ait alıkonma zamanları 7 dakika ve 19 dakika olarak belirlendi. ölçü eğrileri, konsantrasyon ve pik alanları oranı (amlodipin/internal standart) arasında hazırlandı. Doğrusallık, sulu standart çözeltilerde 0.04 ile 0.72 ng/20(iL, plazma örneklerinde 0.01 ile 0.72 ng/20^L amlodipin konsantrasyonları arasında iki farklı konsantrasyon aralığında gözlendi. Amlodipinin plazmadan ortalama geri kazanılabilme oranının, 0.12-0.72 ng/20|iL konsantrasyon aralığında, % 89.53 olduğu belirlendi. Üç farklı konsantrasyonda amlodipin katkılı plazma örneklerinin aynı gündeki analiz sonuçlarının (n=6) tekrarlanabilirlikleri % 2.12-7.29 arasında bulundu. Aynı analizlerin farklı günlerde yapılmasıyla elde edilen sonuçların tekrarlanabilirlikleri ise % 2.19-9.46 arasındadır. Geliştirilen yöntem tabletlerde amlodipin besilat miktar tayinine uygulandı. Tabletlerdeki ilaç miktarı 0.12-0.72 ng/20(iL konsantrasyon aralığında, standart amlodipin çözeltileriyle hazırlanan ölçü eğrisinin doğru denkleminden hesaplandı. Sonuçlar UV-spektrofotometrik yöntem ile elde edilen sonuçlarla t- ve F- testleri kullanılarak istatistiksel olarak kıyaslandı, iki yöntem arasında ortalamalar ve standart sapmalar yönünden % 95 olasılık düzeyinde anlamlı bir fark bulunmadı. önerilen HPLC yöntemi ayrıca plazmada amlodipin miktar tayinine uygulandı. İlaç konsantrasyonları plazma örneklerinden hazırlanan her iki ölçü eğrisine ait doğru denklemlerinden hesaplandı. Sağlıklı bir gönüllüye oral olarak 10 mg lık tek bir doz amlodipin verildiğinde 10.60 ng/mL maksimum plazma konsantrasyonuna (Cmaks) 12 saatte (Ws) ulaşıldı. İlacın eliminasyon yanlanma ömrü (tı/2) 40.7 saat ve eğri altında kalan alan (AUC) 258.68 ngxsaat/ml_ olarak belirlendi.

Abstract:
66 7. SUMMARY Amlodipine is a calcium channel blocking agent of the dihidropyridine derivative which is used in treatment of hypertension. In this study, a high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the determination of this drug in tablets and human plasma by means of the derivative formed with 7-chloro-4-nitrobenzodioxazole (NBD-CI) which is a specific reagent in the analysis of primary and secondary aliphatic amines. In the analysis of both tablet and plasma samples, 0.1 N NaOH solution was added to amlodipine besylate solution and the amlodipine base obtained was extracted with n-heptan-isopropil alcohol (99:1) solvent mixture. Furthermore, by this treatment the plasma proteins were also precipitated and some of the interfering substances in plasma were separated. After the organic layer was evaporated to dryness under nitrogen at 45°C, the residue was derivatised. Optimum conditions of the reaction between amlodipine and NBD-CI were investigated. It was found that the reaction proceeds quantitatively at pH 8.5 and 70°C in 30 min. when the mole ratio of the reagent to amlodipine is 100. After completion of the reaction, the derivative was extracted from the acidified reaction medium with ethylacetate. An aliquot of extract was condensed under nitrogen at 45°C after drying on anhydrous sodium sulphite and then passed through silica gel solid-phase extraction column (In the analysis of tablet samples no solid- phase extraction was processed). After elution with ethylacetate, the solvent was evaporated to dryness and the residue was dissolved in mobil phase. The liquid67 chromatographic analysis was performed using ^-Bondapak C-i8 column and methanol-water (80:20) solvent system at 0.8 mL/min flow rate. Nortriptyline hydrochloride was used as as internal standard. The substances were detected by a fluorescence detector (keks=459 nm, A*m= 528 nm). The retention times of amlodipine- and nortriptyline-NBD derivatives were found to be 7 min and 19 min respectively. Calibration curves were obtained by plotting the concentration against the peak area ratio (amlodipine/internal standard). The linearity was observed at two different concentration ranges between 0.04 and 0.72 ng/20^L amlodipine in aqueous standard solutions and between 0.01 and 0.72 ng/20p.L amlodipine in plasma samples. Mean recovery of amlodipine from plasma was determined to be 89.53 % in the concentration range 0.12-0.72 ng/20^iL. The within day reproducibilities were found to be 2.12-7.29 % by analysis of plasma samples spiked with amlodipine at three different concentrations (n=6) on the same day. Day-to-day reproducibilities were found to be 2.19-9.46 % by the same analysis, only on different days. The developed method was applied to the determination of amlodipine besylate in tablets. The drug content in tablets was calculated from the regression equation of the calibration curve prepared from standard amlodipine solutions in concentration range 0.12-0.72 ng/20^L. The results were compared statistically with those obtained by the UV-spectrophotometric method using t- and F-tests. There was no significant difference between the to methods in the respect of mean values and standard deviations at 95 % confidence level. The proposed HPLC method was also applied to the determination of amlodipine in plasma. The drug concentrations were calculated from the regression equations both of the calibrations curves prepared from plasma68 samples. After a single oral dose administration 10 mg of amlodipine to a healthy volunteer, a maximum plasma concentration (Cmax) of 10.60 ng/mL was reached at 12 hours (tmax). The elimination half-life of the drug (t 1/2) and the area under the curve were found to be 40.7 hours and 258.68 ngxh/mL respectively.