Zeytin (Olea europaea L. cv Gemlik) bitkisinde korunmuş miRNA'ların analizi
Analyze of some conserved miRNA in olive (Olea europaea L. cv Gemlik)
Yazar: SULTAN CANSU GÖNENÇ
Danışman: DOÇ. DR. NEHİR ÖZDEMİR ÖZGENTÜRK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Zeytin (Olea europaea), zeytingiller (Oleaceae) ailesinden meyvesi yenen Akdeniz iklimine ait bir ağaç türüdür. Zeytin meyvesi fosfor, potasyum, kalsiyum, magnezyum mineralleriyle birlikte, A,D,E,K vitaminlerini içermektedir. Zeytinyağının kanser oluşumunu engellediği ve radyoaktiviteye karşı hücreleri koruduğu tespit edilmiştir. Zeytinyağı, önemli ölçüde antioksidan içermesi ve yüksek sıcaklıklara dayanıklı olması açısından da önem teşkil etmektedir. Doymamış yağ asitlerince zengin olan, şeker ve kalp-tansiyon hastaların diyeti için oldukça önemli olduğu bilinen zeytinin daha iyi anlaşılabilmesi için üzerinde moleküler düzeyde çalışma yapılması gerekmektedir. Bu çalışmada, zeytin bitkisinde mikro RNA'ların incelenmesi amaçlanmıştır. MikroRNA'lar (miRNAlar), endojen ifade edilen, tek-zincirli ve protein kodlamayan kısa (21-23 nükleotid uzunluğunda) RNA dizileridir. Transkripsiyon sonrası (post-transcriptional) seviyede, gen translasyonunu baskılayarak veya mRNA degradasyonunu (bozunmasını) indükleyerek gen ifadesini düzenlerler.   miRNA'lar bitki ve hayvanların her ikisinde de oldukça iyi korunmuş dizilerdir ve miRNA'ların evrimsel olarak gen düzenlenmesinin çok eski bir parçası olduğu ve oldukça hayati bir öneme sahip olduğu düşünülmektedir. 
Bu çalışmanın amacı zeytin bitkisinde bazı korunmuş mikro RNA'ların tanımlanmasıdır. Daha önce EST kütüphanesi kurulmuş olan G-20 zeytin hattından (Olea europea) belirli korunmuş miRNA'ların analizi gerçekleştirildi. miRNA'ların ayrışmasını sağlamak üzere RNA izolasyon kiti (miRCURY™ RNA Isolation Kit– Cell & Plant) kullanıldı. Ayrıştırılan toplam RNA miktarı Nanodrop® ND-100 spektrofotometre (Nanodrop Technologies, USA) cihazında ölçüldü. Reverse transkripsiyon (RT) ile miRNA'ların cDNA ya sentezi (miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR) gerçekleştirildi. Korunmuş miRNA lara (miR-159, miR-160, miR-171, miR-396, miR-2919 ve miR-8123) özgü 6 primer çifti kullanılarak Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve Real Time PCR; miRNA QPCR master mix'i kullanılarak AriaMX Real-Time PCR Sistem (Agilent Technologies, Inc.) ile gerçekleştirildi.
Olea europaea yaprağından PCR ve Real Time PCR tekniği ile bitkilerde korunmuş olan  miR-159, miR-160, miR-171, miR-396, miR-2919 ve miR-8123 miRNA'ları çoğaltıldı.
cDNA'lar ilk çoğaltımda miRNA'ya özgü primerler kullanılarak standart PCR ile yapıldı ve yüksek dimerizasyon ile kısa PCR ürünleri verdi. Agaroz jele yüklenen ürünlerin bantları 50 bç uzunluğun altında olduğu için primer dimer mi yoksa PCR ürünü mü olduğu ayırt edilemedi.
Real Time PCR reaksiyonunda evrensel primerler kullanılarak, daha uzun PCR ürünleri veren örnekler amplifikasyon grafiği ve erime eğrisi analiziyle başarıyla tespit edildi.
Bu çalışmada Real Time PCR ile agaroz jel elektroforezine gerek kalmadan, PCR ile eş zamanlı bir şekilde çıkan ürünlere bakıldı. Böylece korunmuş miRNA'ların zeytinde tespiti daha güvenilir verilerle sağlandı.

Abstract:
Olive (Olea europaea) is from the family Oleaceae is a species of tree which's fruits are eaten, belongs to the Mediterranean climate. Olive fruit contains phosphorus, potassium, calcium and magnesium minerals along with A, D, E,K vitamins. It has been found that olive oil prevents the formation of cancer and protects cells against radioactivity. Olive oil has an importance of containing high levels of antioxidants and being resistant to high temperatures. For a better understanding of Olive, which is rich in unsaturated fatty acids and important for diabetic and cardiac- high blood pressure patients' diet , it is required to do studies on it at the molecular level.
In this study, we aimed to investigate the micro RNAs in olive plants. MicroRNAs (miRNAs) are short, non-protein- coding RNA sequences which are single-stranded and endogenously expressed. They regulate gene expression at the post-transcriptional level, by inhibiting gene traslation or inducing mRNA degredation. miRNAs are well conserved in both plants and animals, and are thought to be a vital and evolutionarily ancient component of gene regulation. 
The aim of this study was to identify some conserved microRNAs in olive plants.
Previously EST library established by the G-20 line of olive (Olea europea) young leaf samples were collected. Total RNAs including miRNAs were isolated by using miRCURY™ RNA Isolation Kit– Cell & Plant. Extracted total RNA were quantified by Nanodrop® ND-100 spectrophotometer (Nanodrop Technologies, USA).
Reverse transcription (RT) of miRNAs was done by miRNA 1st-Strand cDNA Synthesis Kit (miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR kit). Then with 6 miRNA specific primer pairs Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed. Real-Time PCR amplification was performed by using miRNA QPCR Master Mix on an AriaMX Real-Time PCR System (Agilent Technologies, Inc.).
miR-159, miR-160, miR-171, miR-396, miR-2919 and miR-8123 which are conserved in plants were amplified from leaf tissues of Olea europaea by PCR and real-time PCR.
cDNAs were first amplified with standard PCR by using miRNA specific primers, which have high dimerization property and give short length PCR products. The bands generated in the agarose gel were lower than 50bp and it could not be distinguished whether they are dimers or PCR products. In real-time PCR, the amplifications were done by using universal reverse primer that results in longer PCR products, which could be detected by amplification plots and verified by melt curve analysis.
In this study by using universal reverse primers miRNA presence could be detected with real-time PCR, without the need for agarose gel electrophoresis. Thus detection of conserved miRNAs in olive were provided with more reliable data.