Farklı su kaynaklarından izole edilen acanthamoeba türlerinin moleküler prevalansı ve genotiplerinin belirlenmesi
Molecular prevalance and genotyping of acantahamoeba species isolated from different water supplies
Yazar: BURCU CENİKLİOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Acanthamoeba = Acanthamoeba ; Genotip = Genotype ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Ordu = Ordu ; Prevalans = Prevalence ; RNA = RNA ; Sinop = Sinop ; Su kaynakları = Water resources

Özet:
Bu çalışma, Sinop ve Ordu yörelerindeki çeşitli su kaynaklarından izole edilmiş Acanthamoeba türlerinin moleküler prevalansının belirlenmesi ve 18S rRNA gen bölgesi yönünden moleküler karakterlerinin ortaya konulması amacıyla yapılmıştır. Çalışmada Sinop'un Merkez ve Gerze ilçeleriyle Ordu'nun Fatsa ve Kumru ilçelerindeki çeşme suyu, havuz suları, kaplıca ve göllerden toplanmış toplam 80 örnek steril kaplar içerisine alınarak uygun koşullarda laboratuvara intikal ettirilmiştir. Sahadan toplanan su örneklerinin kültür ortamında üretilmesi için besi yeri hazırlanmış ve katı besiyerinde üreme gözlenen bölgelerden agar kesilerek çözünmesi beklenmiştir. Çözündükten sonra santrifüj edilen örneklerin üst sıvısı atılarak dipteki kısım DNA izolasyonu amacıyla kullanılmıştır. DNA ekstraksiyonunu takiben izolatların moleküler karakterlerinin ortaya konulması için 18S rRNA gen bölgesininin yaklaşık 450 bp'lik kısmını amplifiye eden primerlerle PCR analizleri gerçekleştirilmiştir. 18S rRNA gen bölgesi yönünden PCR analizlerinde pozitif belirlenen ve uygun konsantrasyonda olan izolatlardan seçilmiş amplikonlar ilgili gen bölgelerinin kayıpsız sekansının elde edilebilmesi amacıyla klonlanmış ve plazmid pürifikasyonu yapılmıştır. Elde edilen plazmidler vektör spesifik primerlerle sekans analizine tabii tutulmuş ve hedef gen bölgesi dizilimleri elde edilmiştir. Sekans kromotogramları De Novo Assemble üzerinden işlenerek izolatlara ait konsensüs sekanslar elde edilmiştir. İlgili sekanslar GenBank veri tabanında Blastn analizlerine tabii tutularak moleküler identifikasyonları sağlanmış ve filogenetik analizler için elde edilen izolatlara ait sekansla birlikte Türkiye'den ve Dünyanın farklı ülkelerinden GenBank veri tabanına kaydedilmiş izolatları içeren ve toplam 31 sekanstan oluşan 18S rRNA data seti oluşturulmuştur. Data set içerisinde haplotip çeşitliliği, inter ve intra spesifik nükleotid farklılıkları DNAsp ve Mega 7 üzerinden Kimura Two Parameter modeli ile analiz edilmiştir. Filogenetik ağaç oluşturulmasında maximum likelihood (ML) analizleri 1000 tekrarlı bootstrap kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmada, Sinop yöresinden toplanan 35 örneğin 6'sında (%17,1), Ordu yöresinden toplanan 45 örneğin ise 9'unda (%20) Acanthamoeba pozitifliği tespit edilmiştir. Her iki bölgeden toplanan su örneklerinde toplam pozitiflik %18,8 (15/80) olarak belirlenmiştir. Filogenetik analizlerde Sinop ve Ordu yörelerinden toplanmış su örneklerinden izole edilen Acanthamoeba izolatlarının Türkiye'den ve dünyadan bildirilen T4 genotipine ait izolatlarla aynı kümede yer aldıkları belirlenmiştir. Pozitif izolatlar arasında TRERUAcantha1 (Sinop) ve TRERUAcantha2 (Ordu) olmak üzere 2 haplotip tespit edilmiş ve ortalama haplotip diversitesi 0,682±0,084 olarak belirlenmiştir. 18S rRNA data set içerisinde TRERUAcantha1 ve TRERUAcantha2 izolatlarının da yer aldığı T4 genotipi içerisindeki tüm izolatların %100 identik oldukları belirlenmiştir. Genotip bazında gruplama yapıldığında ise T4 genotipindeki izolatlarla T5, T15, T13, T2, T3, T9, T11 ve T12 genotipleri arasındaki nükleotid farklılıkları sırasıyla %0,051±0,015, %0,029±0,011, %0,012±0,007, %0,033±0,012, %0,020±0,009, %0,034±0,013, %0,020±0,009 ve %0,047±0,015 olarak tespit edilmiştir. 18S rRNA data setinin ML analizlerinde T4 genotipindeki izolatların monofiletik yapılanma gösterdiği saptanmıştır. Çalışmada elde edilen iki izolatın da yer aldığı T4 genotipindeki izolatların en yakın benzerliği %99,9 ile T13 genotipinde bulunan ve Almanya'da kontakt lensten izole edilen KaBo (KJ476522) izolatıyla gösterdiği görülmüştür. 
Sonuç olarak bu çalışmayla Sinop ve Ordu yörelerindeki farklı su kaynaklarından izole edilen Acanthamoeba türlerinin 18S rRNA gen bölgesi yönünden moleküler karakterleri ortaya çıkarılmış, Türkiye'den ve Dünyadan benzer izolatlarla filogenetik yakınlıkları belirlenmiş, Türkiye'nin biyolojik varlıkları olarak Genbank kayıtları gerçekleştirilmiş (MN648628-29) ve 18S rRNA gen bölgesinin Acanthamoeba türlerinin genotiplendirilmesinde etkin bir gen bölgesi olduğu teyit edilmiştir.  
Anahtar Kelimeler: 18S rRNA, Acanthamoeba, genotiplendirme, moleküler prevalans, Ordu, Sinop, su

Abstract:
This study was conducted to determine the molecular prevalence of Acanthamoeba species isolated from various water sources in Sinop and Ordu regions and to determine their molecular characteristics for the 18S rRNA gene region. In this study, a total of 80 samples collected from fountain water, pool water, hot springs and lakes in the Central and Gerze districts of Sinop, and Fatsa and Kumru districts of Ordu provinces were transferred to the laboratory under appropriate conditions. The broth was prepared to produce water samples collected from the field in culture medium and the agar was dissected from the regions where growth was observed in solid medium. After thawing, the supernatant of the centrifuged samples was discarded, and the bottom was used for DNA isolation. Following DNA extraction, PCR analysis was performed with primers amplifying approximately 450 bp of the 18S rRNA gene region to determine the molecular characters of the isolates. Positive amplicons determined with analysis for 18S rRNA gene region were cloned, and plasmid purification was performed to obtain the complete sequence of the relevant gene regions. The plasmids were subjected to sequence analysis with vector-specific primers and the target gene region sequences were obtained. Sequence chromatograms were processed via De Novo Assemble to obtain consensus sequences for the isolates. The related sequences were subjected to Blastn analysis in the GenBank database to detect their molecular identifications, and the data sets containing a total of 31 sequences obtained in this study and available in Genbank recorded from Turkey and different countries were created. Haplotype diversity, inter and intra-specific nucleotide differences in the data set were analyzed using DNAsp and Mega 7 with the Kimura Two Parameter model. Maximum likelihood (ML) analysis in phylogenetic tree creation was performed using 1000 replicated bootstrap. Acanthamoeba positivity was detected in 6 (17.1%) of 35 samples collected from Sinop region and 9 (20%) of 45 samples collected from Ordu region. Total positivity of water samples collected from both regions was determined as 18.8% (15/80). In the phylogenetic analyses, Acanthamoeba isolates obtained from the water samples collected from Sinop and Ordu regions were determined to belong in the same cluster with the isolates in T4 genotype reported from Turkey and the world. Among the positive isolates, 2 haplotypes were identified as TRERUAcantha1 (Sinop) and TRERUAcantha2 (Ordu), and the mean haplotype diversity was found as 0.682±0.084. In the 18S rRNA data set, all isolates in the T4 genotype including TRERUAcantha1 and TRERUAcantha2 isolates were determined as 100% identical. When genotype-based grouping is performed, nucleotide differences between isolates of T4 genotype and the other T5, T15, T13, T2, T3, T9, T11, T12 genotypes were detected as 0.051%±0.015, 0.029%±0.011, 0.012%±0.007, 0.033%±0.012, 0.020%±0.009, 0.034%± 0.013, 0.020%±0.009, 0.047%±0.015, respectively. In ML analysis of 18S rRNA data set, it was determined that isolates of T4 genotype exhibited monophyletic structure. The closest similarity of the isolates in the T4 genotype, including the two isolates obtained in the study, was determined as 99.9% identity with KaBo (KJ476522) isolate obtained from the contact lens in Germany and clustered in T13 genotype.
In conclusion, molecular characteristics of Acanthamoeba species isolated from different water supplies in Sinop and Ordu regions for 18S rRNA gene region were revealed, phylogenetic relationships were determined with the similar isolates from Turkey and the world, Genbank records (MN648628-29) were performed as biological organisms in Turkey, and 18S rRNA gene was confirmed as valuable genetic marker in DNA barcoding for Acanthamoeba species with this study.
Keywords: 18S rRNA, Acanthamoeba, genotyping, molecular prevalence, Ordu, Sinop, water