Atların EHV-1/4 enfeksiyonunun serolojik tanısı için in-House ELISA geliştirilmesi
Development of in-House ELISA for serological diagnosis of EHV-1/4 infection in horses
Yazar: İLKER ŞAHİNKESEN
Danışman: PROF. DR. SEVAL BİLGE DAĞALP
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
EHV-1 ve -4, dünyada atçılık endüstrisinde ekonomik kayıplara neden olan atların önemli viral
etkenleridir. Bu nedenle hastalığın tanısı, hastalığın önlenmesi ve kontrolünde çok önemlidir. Serolojik
metotlar atların kan serumlarında EHV-1/4 spesifik antikor varlığı ve titresinin tespitinde kullanılmakta
ve epidemiyolojik çalışmalarda populasyonun genel durumu hakkında bilgi verebilmektedir. Ayrıca
aşılı hayvanlarda antikor varlığının/titresinin belirlenmesi; hayvanlarda reenfeksiyon oluşumu, virusun
saçılımı, klinik tablonun şiddeti, maternal antikorların geçişinin sorgulanması hakkında bir fikir
verebilmesi açısından oldukça önemlidir.
Bu bilgilerden hareketle bu çalışmada, at Alphaherpesviruslarından dünyada yaygın olarak
gözlenen ve önemli ekonomik kayıplara neden olan EHV-1/4 enfeksiyonlarının serolojik tanısı
amacıyla bir in-house ELISA kitinin geliştirilmesi planlanmıştır. Bu çalışmayla EHV-1/4' e ait in-house
ELISA kitinin üretilmesi ve her iki virus enfeksiyonunun hızlı serolojik tanısının yapılabilmesinin yanı
sıra ticari kitlere bir alternatif olabilecek bir indirekt ELISA geliştirilmesi hedeflenmiştir.
Bu amaçla, her iki virus büyük hacimlerle üretilip, saflaştırıldıktan sonra protein miktarı tayin
edilmiş ve ELISA pleytinin kaplanması amacıyla kullanılmıştır. Virusların titreleri hesaplandıktan
sonra her iki virus yönünden yapılan virus nötralizasyon testinde (VNT) pozitif ve negatif serumlar
belirlenmiş ve daha sonra ELISA kitinin geliştirilmesi aşamasında test edilmiştir.
Söz konusu serumlarla yapılan VNT'de serumların %61,01'i (72/118) EHV-1, %79,66'sı
(94/118) EHV-4 yönünden pozitif olarak tespit edilirken, serumların %60,26'sı (179/297)
değerlendirilememiştir. Pozitif bulunan serumlara yapılan SN50 testleri sonucunda her iki virus için de
ortalama antikor titresi 1/12 olarak hesaplanmıştır.
In-house ELISA kitinin optimizasyonu, VNT ve ticari ELISA ile pozitiflikleri ve negatiflikleri
kanıtlanan serumlarla yapılmıştır. Cut-off değerleri ise negatif kontrollere göre belirlendikten sonra tüm
serumlar geliştirilen in-house ELISA kiti ile test edilmiştir. In-house ELISA ile kontrol edilen
serumların %93,93'ü (279/297) EHV-1, %92,25'i (274/297) EHV-4, %91,91'i (273/297) ise EHV-1 ve
-4'ün birlikte kullanıldığı ELISA için pozitiflik vermiştir. Bu sonuçlar VNT ile karşılaştırıldığında
EHV-1/ELISA ve EHV-1/VNT arasında %57 spesifite, %100 sensitivite, EHV-4 ELISA ve EHV-4
VNT arası: %65 spesifite, %100 sensitivite olarak hesaplanmıştır. Ancak iki virus arasındaki kros
reaksiyon göz önüne alındığında %75 spesifite, %100 sensitivite hesaplanmıştır. In-house ELISA
sonuçları ticari ELISA ile karşılaştırıldığında ise; EHV-1 için %82, EHV-4 için %99 oranında benzerlik
tespit edilmiştir. Aynı zamanda validasyon katsayısı hesaplamak için yapılan çalışmalarda pleyt bazında
ortalama validasyon katsayıları (%C.V); EHV-1 için ilk pleytte %4,19, ikinci pleytte ise %3,75 olarak
hesaplanmıştır. EHV-4 için ise ilk pleytte %3,01 ikinci pleytte %2,87 olarak hesaplanmıştır. Bu sonuçlar
geliştirilen testlerin iyi şekilde valide olduğunu göstermektedir.
Sonuç olarak EHV-1 ve EHV-4 arasındaki serolojik kros reaksiyon, tüm virus kullanılarak
geliştirilen ELISA'ların her iki virusu ayrı ayrı tanıma potansiyelini sınırlamasına rağmen, atlarda
yaygın olarak görülen ve ülkemizde aşılama ile kontrol altına alınmaya çalışılan EHV-1 ve/veya -4'e
karşı oluşmuş antikorları tespit edilebilmesinin yanı sıra, VNT'de karşılaşılan olumsuzlukların
(serumlarda var olan toksik etki, hücre gereksinimi, değerlendirmesinin uzun sürmesi, canlı virusa
ihtiyaç vb. gibi) önüne geçebilmesi ve ticari ELISA ile sonuçların uyumu göz önünde tutularak tüm
virus tespitini gerçekleştiren bu ELISA kitinin kullanılabilirliği ortaya konmuştur. İleride planlanacak
çalışmalarla her iki virusa karşı oluşan antikorların ayrımını sağlayabilecek bir kitin geliştirilmesi de
mümkün olabilecektir.

Abstract:
EHV-1 and -4 are important viral agents of horses that cause economic losses in the horse
industry around the world. Therefore, diagnosis of the disease is very important for preventing and
controlling the disease. Serological methods are used to detect the presence and titer of EHV-1/4
specific antibodies in the blood serum of horses and can provide information about the general status of
the population in epidemiological studies. Additionally, determining the presence/titer of antibodies in
vaccinated animals; could give an idea about the occurrence of reinfection in animals, the shedding of
the virus, the severity of the clinical picture, and the tranmission of maternal antibodies.
Based on this information, in this study, it was planned to develop an in-house ELISA kit for the
serological diagnosis of EHV-1/4 infection, which is one of the equine Alphaherpesviruses that is
widely observed in the world and causes significant economic losses. With this study, it was aimed to
produce an in-house ELISA kit for EHV-1/4 and to perform rapid serological diagnosis of both virus
infections, as well as to develop an ab-ELISA that could be an alternative to commercial kits.
For this purpose, after both viruses were produced in large volumes and purified, the protein
amount was determined and used to coat the ELISA plate. After calculating the titers of the viruses,
positive and negative sera were calculated in the virus neutralization test (VNT) performed for both
viruses, and were then used in the development of the ELISA kit.
As a result of VN assay, 61.01% (72/118) of the sera were detected positive in terms of EHV-1,
and 79.66% (94/118) in terms of EHV-4, while 60.26% (179/297) of the sera could not evaluated. As a
result of SN50 tests performed on positive sera, the average antibody titer for both viruses was
calculated as 1/12.
Optimization of the in-house ELISA kit was made with sera which positivity and negativity were
proven by VNT and commercial ELISA. After the cut-off values were determined according to negative
controls, all sera were tested with the developed in-house ELISA kit. The results of the sera that tested
in-house ELISA; 93.93% (279/297) were EHV-1, 92.25% (274/297) were EHV-4, and 91.91%
(273/297) were EHV-1/4 positive. These results were calculated as 57% specificity, 100% sensitivity
between EHV-1/ELISA and EHV-1/VNT, and 65% specificity, 100% sensitivity between EHV-4
ELISA and EHV-4 VNT when compared to VNT. However, considering the cross-reaction between
the two viruses, 75% specificity and 100% sensitivity were calculated. When in-house ELISA results
are compared with commercial ELISA; A similarity rate of 82% was determined for EHV-1 and 99%
for EHV-4. In studies conducted to calculate the validation coefficient, average validation coefficients
(%C.V) on a plate basis; For EHV-1, it was calculated as 4.19% in the first plate and 3.75% in the
second plate. For EHV-4, it was calculated as 3.01% in the first plate and 2.87% in the second plate.
These results indicate that the developed tests are well validated.
As a result, although the serological cross-reaction between EHV-1 and EHV-4 viruses limits
the potential of ELISA tests developed using the whole virus to recognize both viruses separately, it is
effective to detect antibodies produces against either EHV-1 or EHV-4, which is commonly seen in
horses and is tried to be controlled by vaccination in our country. In addition to being able to detect
formed antibodies, this ELISA kit performs the detection of all viruses by preventing the drawbacks
encountered in VNT (such as the toxic effect in serum, the need for cells, the long duration of evaluation,
the need for live virus, etc.) and the compatibility of the results with commercial ELISA, availability
has been demonstrated. With future studies, it may be possible to develop a kit that can differentiate
antibodies against both viruses.