Trombosit kaynaklı eksozomların kanser terapisinde kullanımına yeni bir yaklaşım
A new approach to the use of platelet-derived exosomes in cancer therapy
Yazar: DİLARA USLU
Danışman: PROF. DR. ÖZGE ÇEVİK
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Eksozomlar = Exosomes ; Kan trombositleri = Blood platelets

Özet:
Amaç: Meme kanserinin dünyada hızla artış sergilemesi tedavisinde yeni ilaçların geliştirilmesi ihtiyacını doğurmaktadır. Her ne kadar meme kanseri için lokal yada sistemik tedaviler uygulansa da son yıllarda kişiye özgü tedaviler ve özel taşıyıcı sistemlerle ilaç tasarımları bu alanda yeni çalışmaların ortaya çıkmasını sağlamıştır. Eksozomlar biyolojik temelli ve immüniteyi baskılayan özellikleri nedeniyle ilaç taşıma sistemleri konusunda son yıllarda ön plana çıkmaktadır. Bu tez çalışmasında trombositlerden izole edilen eksozomların doksorubisin yüklemesi ile MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri üzerindeki etkisi araştırılmıştır.
Gereç ve Yöntem: İnsan kan hücreleri alınarak trombosit izolasyonu yapıldı. Trombositler ADP ile aktifleştirilerek aktivasyon CD62p ve PAC-1 ile flow sitometride ölçüldü. Aktifleşen trombositlerden salınan eksozomlar ultrasantrifüj yöntemi ile izole edildi, zeta-sizer ile boyut ve yükü ölçüldü. Eksozomların karakterizasyonları CD62 ve CD9 kullanılarak western blot ile kontrol edildi. Eksozomlara doksorubisin yüklemesi elektroporasyon ile yapıldı. İnsan üçlü negatif kanser hücresi olan MDA-MB-231 hücreleri üzerinde sitotoksisite, annexin V bağlanma, Bax ve Bcl-2 gen ekspresyon değişiklikleri analiz edildi.
Bulgular: Eksozomların karakterizasyonlarında trombosit pelletlerinde CD62 pozitifliği daha yüksekken, salınan eksozomlarda CD9 pozitifliğinin daha yüksek olduğu görüldü. Eksozomların boyutlarının Exo: 82,02±5,21nm,  Exo-Dox: 116±3,73 nm olduğu, yük dağılımlarında ise Exo: -16,45 mV Exo-Dox: -24,07mV olarak bulundu. MDA-MB-231 hücrelerinde Exo hücre canlılığını arttırırken Exo-Dox'un hücre canlılığını 24 saatte azalttığı görüldü. Exo-Dox grubunda kontrol grubuna göre Annexin-V bağlanma düzeyi daha fazla olarak apoptoz hızında anlamlı bir artış saptandı. Exo-Dox grubunda anlamlı derecede BAX gen ekspresyonunun arttığı ve Bcl-2 gen ekspresyonunun azaldığı tespit edildi. 
Sonuç: Trombositler kanser hücrelerine daha fazla bağlanma eğilimi gösteren hücreler olup, trombositlerden izole edilen eksozomlar doksorubisin ile fonksiyonel hale getirilerek meme kanseri tedavisinde kullanılabilir. Kişiye özgü tedavilerin geliştirilmesinde hücrelerin saldıkları eksozomlar kullanılarak kemoterapik ajanlarla etkili olabilecek salım sistemlerinin geliştirilmesi konusunda bu çalışmanın sonuçları klinik araştırmalar için ışık tutacaktır.

Anahtar kelimeler: Apoptoz, Doksorubisin, Eksozom, Kanser Tedavisi, Trombosit

Abstract:
Objective: The rapid increase in breast cancer in the world necessitates the development of new drugs in its treatment. Although local or systemic treatments are applied for breast cancer, personalized treatments and drug designs with unique delivery systems have led to new studies in this field in recent years. In recent years, exosomes have come to the fore in drug delivery systems due to their biological-based and immune-suppressing properties. This thesis investigated the effect of doxorubicin loading of exosomes isolated from platelets on MDA-MB-231 breast cancer cells.
Material and Methods: Platelets were isolated from human blood cells. Platelets were activated with ADP, and activation was measured with CD62p and PAC-1 in flow cytometry. Exosomes released from activated platelets were isolated by the ultracentrifugation method, and their size and charge were measured with a zeta-sizer. Characterizations of exosomes were checked by western blot using CD62 and CD9. Then doxorubicin loading into exosomes was done by electroporation. Cytotoxicity, annexin V binding, Bax, and Bcl-2 gene expression changes were analyzed on MDA-MB-231 cells, human triple-negative cancer cells.
Results: In exosome characterization, CD62 positivity was higher in platelet pellets, while CD9 positivity was higher in released exosomes. The dimensions of the exosomes were found to be Exo: 82.02±5.21nm, Exo-Doc: 116±3.73 nm, and in the charge distributions, Exo: -16.45 mV Exo-Doc: 24.07mV. In MDA-MB-231 cells, Exo increased cell viability, while Exo-Dox decreased cell viability in 24 hours. The Annexin-V binding level was higher than the control group in the Exo-Doc group, and a significant apoptosis rate was detected. In addition, it was determined that BAX gene expression was significantly increased, and Bcl-2 gene expression was decreased in the Exo-Dox group.
Conclusion: Platelets are cells that tend to bind more to cancer cells, and exosomes isolated from platelets can be functionalized with doxorubicin and used in the treatment of breast cancer. The results of this study will shed light on the development of release systems that can be effective with chemotherapeutic agents by using exosomes released by cells in the development of personalized treatments.

Keywords: Apoptosis, Cancer therapy, Doxorubicin, Exosome, Platelet