Elipsometre temelli oligonükleotid ve oligopeptid probları taşıyan tekli ve çoklu sensör yüzeylerinin hazırlanması
Preparation and use of single and multichannel ellipsometry based sensor surfaces carrying oligonucleotide and oligopeptide probes
Yazar: BORA GARİPCAN
Danışman: PROF. DR. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Elipsometri = Ellipsometry ; Kadmiyum = Cadmium ; Litografi = Lithography ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; Oligonükleotid asitler = Oligonucletides acids ; Sensörler = Sensors

Özet:
Sunulan çalışmanın amacı, elipsometre temelli tekli-çoklu DNA ve oligopeptid sensörlerin hazırlanması ve elipsometre temelli sensörlerde kullanılabilecek TiO2 yüzeyinde, iletken AFM nanolitografi ile nano-desenlerin oluşturulmasıdır. Tez çalışması üç ana grupta toplanmıştır. İlk bölümde, cam slayt yüzeyi MPTS molekülü ile modifiye edilmiş, MPTS daldırma zamanı ve derişiminin film oluşuma etkisi incelenmiştir. GOR oligonükleotid prob immobilizasyon çalışmalarında, daldırma süresi olarak 1 saat, MPTS derişimi olarak da %1`lik MPTS çözeltisi kullanılmıştır. GOR oligonükleotid prob immobilizasyonu optimize edilimiş, GOR prob derişimi 2 µmol ve daldırma süresi 2 saat olarak belirlenmiştir. Hibridizasyon çalışmaları, M. gordonae (GOR) patojenine özgü oligonükleotid probunun 5'?GA CAG CAC CCG AGG GTG?3' hedef dizisi (0.05-2.0 µM) ile elipsometre akış hücresinde incelenmiştir. M. gordonae ve M. tuberculosis Kompleks'ine (MTB) özgü prob oligonükleotidler (2µM, pH 7.4 fosfat tamponu içerisinde), MPTS ile modifiye edilmiş cam slayt üzerine, aralarında 500 µm olacak şekilde manual spotlama sistemi kullanılarak spotlanmıştır. GOR ve MTB hedef oligonükleotidlerle hibridizasyon 25?C'de elipsometrenin akış hücresine incelenmiştir. Bu çalışmalardan sonra, elipsometrik cam slayt yüzeylerinin tekli ve çoklu DNA sensörü olarak kullanılabileceği görülmüştür. İkinci bölümde, cam slayt yüzeyi APTS molekülü ile modifiye edilmiş, APTS daldırma zamanı ve derişiminin film oluşuma etkisi incelenmiştir. Thionein immobilizasyon çalışmalarında, daldırma süresi olarak 1 saat, APTS derişimi olarak da %3`lük APTS çözeltisi kullanılmıştır. APTS modifiye yüzeylere, thionein immobilizasyonu karbodiimid reaksiyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Thionein immobilize cam slayt yüzeyleri ile Cd(II) iyonlarının etkileşimi görüntülemeli elipsometre ile incelenmiştir. Cd(II) derişimi (20-100µM), adsorpsiyon zamanı, ortam pH'ı (3.0-7.0), ve cam slayt yüzeyine immobilize edilen thionein miktarının (0.1-0.5 mg/ml) elipsometrik sensör cevabına etkisi incelenmiştir. Maksimum Cd(II) adsorpsiyonu pH 4`te gerçekleşmiştir. Thionein immobilize edilmiş cam slayt yüzeylerinin, yarışmalı olmayan adsorpsiyon koşullarında Cd(II), Ca(II) ve Zn(II) iyonları ile etkileşimi incelendiğinde, en fazla delta değişimi Cd(II) iyonunda görülmüştür. Sensörün tekrar kullanılabilirliği, desorpsiyon ajanı olarak 25 mM pH 4.9 EDTA`nın kullanılmasıyla araştırılmıştır. Sensörün raf ömrünü belirlemek için, hazırlanan sensör yüzeyi üç hafta sonra Cd(II) iyonları ile etkileştirilmiştir. 3 hafta sonunda sensör cevabında, önemli bir değişiklik olmamıştır. Bu sonuçlardan, thionein immobilize edilmiş cam slayt yüzeylerinin Cd(II) iyonu için sensör olarak kullanılabileceğine karar verilmiştir. Tez çalışmasının son bölümünde, çift bağlı sonlanmış silan (5-hegzeniltriklorosilan, HTCS) molekülleri ile modifiye edilmiş TiO2 yüzeylerin üzerinde iletken Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) nanolitografisi uygulanarak nano-desenler elde edilmiştir. AFM tipinin, elektrostatik potansiyeli ve tarama hızı, bağıl nem ve tekrarlanan uygulamalarda gerilimin; topoğrafik yükseklik, genişlik ile hidrofobik-hidrofilik karakterde desen oluşumu üzerine etkisi araştırılmıştır. Tip gerilimi ve hızı (v) litografi sırasında adımların herbirinde sırasıyla -10V ? Vtip ? +10V ve 100 nm/s ? v ? 2 µm/s olarak uygulanmıştır. Ortalama yükseklik ve Yanal Kuvvet Modu (LFM) desenleme görüntüleri (?10V ? Vtip ? -7V) ve v (100 nm/s ? v ? 2 µm/s) değerleri arasında elde edilmiştir. Tekrarlanan yada tek litografi adımlarında tip geriliminin -5V ? Vtip ? +10V arasındaki değerlerinde nano desen oluşumu gözlenmemiştir. Bu iletken AFM litografi tekniği sonuçları HTCS molekülleri ile nano-boyutta fizikokimyasal değişiklillerle, farklı kimyasal özellik gösteren, desenlenmiş ve desenlenmemiş alanlarda kontrollü adımlarda yüksekliğin yaklaşık 1-15 nm arasında değiştiği gösterilmiştir.

Abstract:
The aim of the thesis is preparation of ellipsometry based single-multiple DNA and oligopeptided sensors and formation of nano patterns on the TiO2 surface which could be used in ellipsometer based sensors. Thesis consists of 3 main parts. In the first part of the thesis, glass slide surface was modified with MPTS molecules and effect of dipping time and concentration on film formation were investigated. In the GOR oligonucleotide immobilization studies, MPTS concentration and dipping time were used as 1h and 1%. GOR prob immobilization was optimized by using GOR concentration and dipping time as 2h and 2µmoles. Hybridization studies were done by using GOR oligonucleotide target 5??GA CAG CAC CCG AGG GTG?3? (0.05-2.0 µM) in ellipsometer flow cell. M. gordonae ve M. tuberculosis Compleks (MTB) prob oligonucleotides (2µM, in pH 7.4 phosphate buffer), were spotted by using a manual spotting system within 500 µm distance. Hybridization of spotted probs oligonucleotides with target GOR and MTB was monitored in ellipsometer flow cell at 25?C. After these studies, it was concluded that ellipsometric glass slide surfaces could be used as single-multiple DNA sensors. In the second part of the thesis, glass slide surface was modified with APTS molecules and effect of dipping time and concentration on film formation were investigated. In the thionein immobilization studies, the dipping time and concentration of APTS were selected as 1h and 3%. Thionein was immobilized to the APTS modified surface by carbodiimide activation method. Thionein fuctionalized glass slide surface interaction with Cd(II) was monitored by imaging ellipsometer. Effect of Cd(II) concentration, adsorption rate, pH (3.0-7.0), and thionein content (0.1-0.5 mg/ml) on ellipsometric sensor response were investigated. Maximum Cd(II) ion adsorption was observed at pH 4. Non-competitive adsorption on thionein modified glass surface was investigated by using Cd(II), Ca(II) ve Zn(II) ions and maximum delta change observed by Cd(II) solutions. 25 mM pH 4.9 EDTA was used as a desorption agent to investigate the reusability of the sensor. For the evaluation of the shelf life of the sensor, thionein immobilized glass surface was interacted by Cd(II) ions after 3 week storage. After 3 weeks, there was no significant change in the sensor response. After these results, we considered that, thionein immobilized glass surfaces could be used as ellipsometric sensor for Cd(II) ions. In the last part of the thesis, nano-patterning of double-bond-terminated silane (5-Hexenyltrichlorosilane, HTCS) molecules on titania (TiO2) using conductive atomic force microscopy (AFM) was reported. The influence of tip electrostatic potential and scanning velocity, of relative humidity and of the repeated application of voltage on the topographic height, width, and hydrophilic and hydrophobic contrast of the resultant patterns was investigated. Tip voltage and tip velocity (v) were applied between -10V ? Vtip ? +10V and 100 nm/s ? v ? 2 µm/s during the lithography step(s), respectively. Average height and Lateral Force Mode (LFM) images of patterns obtained with different values of (?10V ? Vtip ? -7V) and v (100 nm/s ? v ? 2 µm/s). The average height of the patterns is seen to decrease for increasing v and decreasing Vtip in both a single or repeated lithography step with. No patterns were observed following a single or repeated lithography step for -5V ? Vtip ? +10V. This conductive lithography technique results in nano-scale physiochemical manipulations of the HTCS molecules that are manifested as controllable step heights ranging from ~1-15 nm possessing different chemistries on the patterned and unpatterned areas.