Sarkozine spesifik dna aptamerlerinin geliştirilmesi ve aptamer temelli impedimetrik sarkozin biyosensörünün tasarlanması
Development of sarcosin specific dna aptamers and construction of aptamer-based impedimetric sarcosine biosensor
Yazar: ZEYNEP ÇELİK
Danışman: PROF. DR. ERHAN DİNÇKAYA ; DOÇ. DR. SERAP EVRAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tez projesinde Sarkozine spesifik DNA aptamerinin geliştirilmesi ve aptamer temelli impedimetrik sarkozin biyosensörünün tasarlanması konuları incelenmiştir. Tez projesi kapsamında SELEX yöntemi kullanılarak sarkozin hedef molekülüne özgü yüksek afiniteli aptamer tasarlanması, tasarlanan aptamer ile sarkozinin hassas ve seçici olarak belirlenmesine olanak sağlayan impedimetrik temelli yeni bir biyosensör geliştirilmesi hedeflenmiştir.
Sarkozine spesifik DNA aptamer dizileri SELEX yöntemi ile elde edilmiştir. Aptamerlerin dizi ve yapı analizleri için MEME suit, Clustal omega ve M FOLD programları kullanılmıştır. Elde edilen aday aptamerlerin floresans ölçümleri yapılmış, sarkozine bağlanma ilgileri (Kd) karşılaştırılmış ve biyosensörde kullanılacak aptamer dizisi seçilmiştir. Altın disk elektroda, 3' ve 5' uçlarında oligotimidin (T6) veya hekzametilen [-(CH2)6-]) içerecek şekilde tiyollenmiş aptamerler ile biyosensör tabakaları geliştirilmiş ve karşılaştırılmıştır. Sarkozine en iyi cevabı veren 5' uçlarında oligotimidin (T6) içerecek şekilde tiyollenmiş aptamer ile SAM yüzeyi oluşturularak optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları yürütülmüştür. 
En iyi yanıtın alındığı biyotabakanın belirlenmesi açısından, öncelikle SAM yüzeyinin oluşma süresinin ve MCH inkübasyon süresinin optimizasyonu değerlendirilmiştir. 1, 3 ve 19 saatlik inkübasyon sürelerinin SAM yüzeyinin oluşması bakımından, 30 dk ve 90 dk'lik MCH inkübasyon sürelerininde biyotabakanın çalışması bakımından uygun koşullar olmadığı belirlenmiştir. EIS ölçümlerinin yapıldığı tampon sistemine ait parametrelerin optimizasyon çalışmaları sonucunda en uygun çalışma tamponu pH 7,5 fosfat tamponu olarak seçilmiştir. En iyi yanıtın alındığı ölçüm koşullarının belirlenmesi açısından, ölçüm tamponu ve tampon içeriklerinin optimizasyonu detaylıca değerlendirilmiştir. En uygun çalışma tamponu 5mM ferri/ferro-siyanür ([Fe(CN)6]-3/-4) redoks çifti ve 0,1 M KCl içeren pH 7,5 0,01 M fosfat tampon sistemi olarak seçilmiştir. Ayrıca biyotabakanın oluşturulması basamağının optimizasyonu sonucunda 1µM aptamer, 10mM TCEP, 1mM MCH konsantrasyonu optimum seçilmiştir. SAM yüzeyinin inkübasyon optimizasyonu çalışmaları sonucunda da aptamer inkübasyonu için optimum inkübasyon süresi 17 saat, MCH inkübasyonu için 1 saat bulunmuştur.
Karekterizasyon çalışması altında öncelikle SELEX yöntemi ile geliştirilen, floresans ölçümler sonucunda seçilen 9 numaralı aptemerin optimum koşullarda modifikasyon kıyaslaması yapılmıştır. SELEX yöntemi ile seçilen 9 numaralı aptemerin 3' ve 5' uçlarında oligotimidin (T6) veya hekzametilen [-(CH2)6-]) içerecek şekilde tiyollenmiş aptamerler ile biyosensör tabakaları hazırlanarak sarkozine verdikleri cevaplar kıyaslanmıştır. 5' ve 3' ucundan oligotimidin ve hegzametilen içerecek şekilde tiyollenmiş aptamerler ile dört farklı biyosensör tabakası oluşturulmuştur. Artan sarkozin konsantrasyona karşı çizilen grafikler incelendiğinde iyi cevap 5' ucundan oligotimidin içerecek şekilde tiyollenmiş aptamer ile alınmıştır. 5' ucundan oligotimidin içerecek şekilde 5' ucundan tiyollenmiş aptamer ile hazırlanan biyosensörün doğrusal çalışma aralığı 5x10-12 M - 55,5x10-9 M olarak belirlenmiştir. Bunun yanında seçimlilik çalışması sonucunda glisin, alanin, HSA, lizozim ve trombin konsantrasyonlarına verdiği cevap yüzdeleri sırasıyla %25, %77, %47, %25 ve %13'dür. Örnek analizi çalışması için 555 pM sarkozin çözeltisine ait ölçüm ve hesaplamalar sonucunda geri kazanım yüzdesi %103,8 olarak belirlenmiştir.

Abstract:
In this project, the development of Sarcosine-specific DNA aptamer and the design of an aptamer-based impedimetric sarcosine biosensor were investigated. In the project, it is planned to design a high-affinity aptamer specific to the sarcosine target molecule using the SELEX method. In addition, it is aimed to develop a new impedimetric-based biosensor that allows the sensitive and selective determination of the amount of sarcosine with the designed aptamer.
Sarcosine-specific DNA aptamer sequences were obtained by the SELEX method. MEME suit, Clustal omega and M FOLD programs were used for sequence and structure analysis of aptamers. Fluorescence measurements of candidate aptamers were made and their binding affinity (Kd) to sarcosine was compared. Accordingly, the aptamer sequence to be used in the biosensor was selected. Using a gold disc electrode, thiolated aptamers containing oligothymidine (T6) or hexamethylene [-(CH2)6-] at their 3' and 5' ends and biosensor layers were developed and compared. The SAM surface was formed with the thiolated aptamer containing oligothymidine (T6) from the 5' end which response best for sarcosine. In this way, optimization and characterization studies were carried out. 
First, the optimization of the SAM surface formation time and the MCH incubation time was evaluated for determining the biolayer with the best response. It has been determined that the incubation times of 1, 3 and 19 hours are not suitable conditions for the formation of the SAM surface. In addition, it was determined that 30 min and 90 min were not suitable for MCH incubation times. As a result of optimization studies of the parameters of the buffer system in which EIS measurements were made, the most suitable working buffer was selected as pH 7.5 phosphate buffer. The optimization of the measurement buffer and buffer contents for the best operating conditions has been evaluated in detail. The most suitable working buffer was chosen as pH 7.5 0.01 M phosphate buffer system containing 5 mM ferri/ferrocyanide ([Fe(CN)6]-3/-4) redox couple and 0.1 M KCl. In addition, as a result of the optimization of the biolayer formation step, 1µM aptamer, 10 mM TCEP and 1mM MCH were selected to be optimum concentration. As a result of the incubation optimization studies of the SAM surface, the optimum incubation time for aptamer and MCH were detected to be 17h and 1h,respectively.
Under the characterization study, a modification comparison of the 9th aptamer, which was developed by the SELEX method and selected as a result of fluorescence measurements, was made under optimum conditions. Biosensor layers were prepared with thiolated aptamers containing oligothymidine (T6) or hexamethylene [-(CH2)6-]) at the 3' and 5' ends of aptemer 9 selected by the SELEX method and their responses to sarcosine were compared. So, four different biosensor layers were formed with thiolated aptamers. When the graphs plotted against increasing sarcosine concentration were examined, the best response was obtained with the thiolated aptamer containing oligothymidine at the 5' end. The linear operation of the prepared biosensor was determined as 5x10-12 M - 55.5x10-9 M. In addition, as a result of the selectivity study, the response percentages of glycine, alanine, HSA, lysozyme and thrombin concentrations were 25%, 77%, 47%, 25% and 13%, respectively. For the sample analysis study, the recovery percentage was determined as 103.8% as a result of the measurements and calculations of the 555 pM sarcosine solution.