Sklerodermada triptofan/kinürenin yolağı metabolitlerinin moleküler ve biyokimyasal açıdan araştırılması
Molecular and biochemical investigation of tryptophan/kynurenine pathway metabolites in scleroderma
Yazar: MERVE İLHAN
Danışman: PROF. DR. FATMA HÜMEYRA YERLİKAYA AYDEMİR
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biyokimya = Biochemistry ; Kinürenin = Kynurenine ; Metabolitler = Metabolites ; Mikro RNA = Micro RNA ; Neopterine = Neopterine ; Skleroderma-sistemik = Scleroderma-systemic ; Triptofan = Tryptophan

Özet:
Skleroderma, deri ve çeşitli iç organların yaygın fibrozu ile seyreden inflamatuar ve kronik otoimmün bir hastalıktır. Sklerodermanın kesin patogenezi hala tam olarak anlaşılamamış olsa da, bağışıklık sistemi düzensizliğinin ve vaskülopatinin önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bu bağlamda tez çalışmamızda, otoimmüniteye bağlı gelişen skleroderma için, triptofan yolağındaki metabolitlerin moleküler ve biyokimyasal açıdan immünomodülatör rollerinin araştırılması amaçlanmıştır.
	Çalışmaya Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Romatoloji polikliniğine başvuran 18-65 yaş aralığındaki ACR/EULAR 2013 skleroderma sınıflama kriterlerini karşılayan yeni tanı alan 45 hasta dâhil edildi. Kontrol grubuna Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi'ne başvuran, herhangi bir romatolojik ya da diğer tıbbi hastalık tanısı almayan, 18-65 yaş arasındaki 44 gönüllü seçildi.
Çalışmaya alınan bütün hastaların tıbbi öyküsü, fiziksel muayenesi, biyokimya analizleri incelenerek dâhil edilmeme ölçütlerini karşılayıp karşılamadığı değerlendirildi. Tüm katılımcıların çalışmaya katılım için yazılı onamları alındı.
	Katılımcıların serum örneklerinde triptofan/kinürenin yolağındaki metabolitlerden triptofan, kinürenin, kinürenik asit, 3-OH kinürenin, 3-OH antranilik asit ve kuinolinik asit seviyeleri LC-MS/MS metoduyla analiz edildi. IDO-1 enzimi ve neopterinin düzeyleri ELİSA yöntemiyle belirlendi. IDO-1 enzimini hedeflediğini TargetScan veritabanından bulduğumuz miR-586, miR-153-3p ve miR-593-3p plazma seviyeleri real time-PCR yöntemiyle tespit edildi. Referans gen olarak U6 kullanıldı ve sonuçlar 2-Δct formülüne göre hesaplandı. 
Elde edilen verilerin istatistiki analizleri SPSS 21.0 programı kullanarak gerçekleştirildi. Verilerin normal dağılıma uygunluğu Kolmogorov-Smirnov testi ile değerlendirildi. Kontrol ve hasta grubunu karşılaştırmak amacıyla Mann-Whitney U testi yapıldı. Laboratuvar ve klinik parametrelerin korelasyonu Spearman korelasyon analizi ile gerçekleştirildi. Çalışılan parametrelerin hastalığı ön görme gücü için ROC eğrisi kullanıldı. Tüm analizlerde p<0,05 değeri istatistiksel anlamlılık olarak kabul edildi.
Sonuçlarımıza göre triptofan seviyeleri hasta grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak düşük bulundu (p=0,008). IDO1 enzimi (p=0,020), kinürenin/triptofan oranı (p=0,007), 3-OH kinürenin (p<0,0001), kuinolinik asit (p=0,041) ve neopterin (p<0,0001) seviyeleri ise hasta grubunda önemli ölçüde yüksek tespit edildi. Kinürenin seviyeleri hasta grubunda yüksek bulundu ancak istatistiki açıdan anlamlı değildi. Biyokimyasal paramatrelerden lökosit, nötrofil, lenfosit platelet, CRP ve ESR seviyeleri hasta grubunda kontrol grubuna göre istatistiki açıdan anlamlı ve yüksek tespit edildi (p<0,0001). miRNA'lardan sadece miR-593-3p hasta grubunda istatistiki açıdan anlamlı olarak yüksek olarak belirlendi (p=0,003). Hasta grubunda sadece miR-153-3p ile IDO-1 arasında istatistiki açıdan anlamlı negatif bir korelasyon bulundu (p=0,041). ROC analizine göre triptofan, 3-OH kinürenin, IDO1, kinürenin/triptofan, miR-593-3p ve neopterin düzeyleri hastalığı istatistiki açıdan anlamlı öngörme gücüne sahipti.
Skleroderma hastalığının erken aşamasında triptofan metabolizması bozulmaktadır. Elde ettiğimiz veriler, triptofan yolağındaki metabolitlerin hastalığın prognozunda biyobelirteç olabileceğini göstermiştir. Sklerodermada rol alan moleküler ve biyokimyasal mekanizmaların anlaşılması, hastalık için yeni, etkili ve güvenli tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunacaktır.
Anahtar sözcükler: triptofan/kinürenin yolağı, miRNA, neopterin, skleroderma.

Abstract:
Scleroderma is an inflammatory and chronic autoimmune disease with extensive skin fibrosis and various internal organs. Although the precise pathogenesis of scleroderma is still not fully understood, vasculopathy and dysregulation of the immune system are thought to play an important role. In this context, our thesis aimed to investigate the molecular and biochemical immunomodulatory roles of tryptophan pathway metabolites in scleroderma due to autoimmunity.
Forty-five patients, aged 18-65 years, who applied to the Rheumatology clinic of Selcuk University Medical Faculty and complied with the ACR/EULAR 2013 scleroderma classification criteria, were included. The control group consisted of 44 volunteers aged 18-65 who applied to Selçuk University Medical Faculty Hospital and were not diagnosed with any rheumatological or another medical disease. Written informed consent was obtained from all participants before participating in the study.
In the serum samples of the participants, the levels of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, 3-OH kynurenine, 3-OH anthranilic acid and quinolinic acid were analyzed by LC-MS/MS. IDO-1 enzyme and neopterin levels were determined by the ELISA method. The plasma levels of miR-586, miR-153-3p and miR-593-3p, which we found in the TargetScan database to target the IDO-1 enzyme, were determined by real time-PCR. U6 was used as the reference gene, and the results were calculated according to the formula 2-Δct.
The obtained data were evaluated using the SPSS 21.0 program. The conformity of the data to the normal distribution was determined with the Kolmogorov-Smirnov test. Mann Whitney U test was performed to compare the control and patient groups. The correlation of laboratory and clinical parameters was performed with Spearman correlation analysis. The predictive power ROC curve of the studied parameters was used. p<0.05 was accepted as statistical significance in all analyses.
According to our results, tryptophan levels in the patient group were significantly lower than in the control group (p=0.008). IDO-1 enzyme (p=0.020), kynurenine/tryptophan ratio (p=0.007), 3-OH kynurenine (p<0.0001), quinolinic acid (p=0.041) and neopterin (p<0.0001) levels were significantly higher in the patient group. The kynurenine levels were found to be high in the patient group but were not statistically significant. Among the biochemical parameters, leukocyte, neutrophil, lymphocyte platelet, CRP and ESR levels were statistically significant and higher in the patient group compared to the control group (p<0.0001). Of the miRNAs, only miR-593-3p was significantly higher in the patient group (p=0.003). A statistically significant negative correlation was found only between miR-153-3p and IDO-1 in the patient group (p=0.041). According to ROC analysis, tryptophan, 3-OH kynurenine, IDO-1, kynurenine/tryptophan, miR-593-3p, and neopterin levels had statistically significant predictive power for the disease.
Tryptophan metabolism is impaired in the early stage of scleroderma disease. Our data showed that metabolites in the tryptophan pathway might be a biomarker in the prognosis of the disease. Understanding the molecular and biochemical mechanisms involved in scleroderma will contribute to developing new, effective, safe treatments for the disease.
Keywords: tryptophan/kynurenine pathway, miRNA, neopterin, scleroderma.