Çoklu doymamış yağ asitlerinin insan SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinde Aβ1-42 toksisitesiyle oluşturulan alzheimer modelindeki etkilerinin in vitro yöntemlerle araştırılması
Investigation of the effects of polyunsaturated fatty acids on the alzheimer model caused by Aβ1-42 toxicity in human SH-SY5Y cells by in vitro methods
Yazar: MUALLA PINAR ELÇİ
Danışman: PROF. DR. SEVGİ AKAYDIN
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Alzheimer hastalığı (AH), bilişsel fonksiyonlarda bozulma ile karakterize ilerleyici, kronik bir hastalıktır. Günümüzde AH'nin tam tedavisi bulunmamaktadır, mevcut tedaviler belirtileri azaltmak ve hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak şeklindedir. Yağ asitlerinin tüketim miktarları ve aralarındaki dengenin nörolojik hastalıklardan koruyucu olabileceği düşünülmektedir. Bu tez çalışmasında, Ω3/Ω6 çoklu doymamış yağ asitlerinin (ÇDYA) oranlarının, Aβ1-42 ile SH-SY5Y hücrelerinde oluşturulan AH modelindeki hücre canlılığı, hücre içi ROT miktarı, apoptoz oranları, azalan mitokondriyal membran potansiyeli üzerine koruyucu etkileri, asetilkolin esteraz (AChE) enzim aktivitesi üzerine inhibitör etkileri ve pro/antiinflamatuvar sitokinler üzerine etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Ω6 ve Ω3 yağ asitleri uygulanan hücrelerin canlılığı MTT testi ile belirlendi. Apoptotik hücrelerin yüzdesi, FITC-konjuge Annexin-V/PI ile tespit edildi. TNF-α, COX-2, IL-6, NFκB ve TGFβ1 genlerinin ekspresyon seviyeleri Real-Time PCR ile sitokin salınımları ise Enzime Bağlı İmmün Sorbent Tahlili (ELISA) yöntemi kullanılarak belirlendi. ROT, MMP ve Hücre döngü analizleri akış sitometrisi ile yapıldı. Çalışma sonuçlarımıza göre, 48 saat Ω3/Ω6 oranları uygulaması sonucu MTT testinde, 1/1, 1/2 ve 1/8 dozlarında istatistiksel olarak anlamlı düşüş, 1/4 ve 1/16 gruplarında ise artış gözlenmiştir. Apoptoz sonuçlarına göre, 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 ve 1/16 dozlarının 48 saat uygulamadan sonra kontrol grubunda %95,7 olan hücre canlılığının sırasıyla, %95,6, %81,4, %86,2, %32,2 ve %19,8'e düştüğü, Ω6 dozu arttıkça yüzde canlılığının azaldığı bulunmuştur. ROT ve MMP düzeylerinin, kontrol grubuna göre tüm gruplarda azaldığı tespit edilmiştir. Oksidatif strese karşı en yüksek nörokoruyucu etki 1/1 dozunda gözlenmiştir. Aβ1-42' nin neden olduğu hücre döngüsündeki blokajı ise 1/8 dozunun kısmi de olsa düzeltilebildiği gözlenmiştir. AChE enzim aktivitesinde, 1/4, 1/8 ve 1/16 dozlarında istatistiksel olarak anlamlı düşüş gözlenmiştir. TNF-α ve IL-6 mRNA ekpresyon seviyesi; en düşük 1/4 dozunda, en yüksek ise 1/16 dozunda bulunmuştur. COX-2 mRNA ekpresyon seviyesinin en yüksek 1/4, 1/8 ve 1/16 dozlarında Ω6 oranı arttıkça anlamlı olarak arttığı, en düşük seviyenin ise 1/1 dozunda olduğu gözlenmiştir. TGFβ1 mRNA ekpresyon seviyesi; 1/4 ve 1/8 dozlarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış göstermiştir. TNF-α ve IL-6' nın protein seviyeleri en düşük 1/2 ve 1/4 dozlarında görülmüştür. COX-2 protein seviyesinin 1/8 dozunda istatistiksel olarak anlamlı artış bulunmuştur. TGFβ1 protein seviyelerinde istatistiksel anlamlı artış 1/4 ve 1/16 dozlarında bulunmuştur. Sonuç olarak, Ω6 ve Ω3 yağ asitleri 1/4 ve 1/8 dozlarında kullanıldığında nöroinflamasyonu azaltabileceği ve Alzheimer hastalığına karşı koruyucu etki sağlayabileceği söylenebilir.

Abstract:
Alzheimer's disease (AD) is a progressive, chronic disease characterized by impaired cognitive function. Currently, there is no complete cure for AD; current treatments are aimed at reducing symptoms and slowing the progression of the disease. It is thought that the amount of fatty acid consumption and the balance between them may be protective against neurological diseases. In this thesis, it was aimed to determine the protective effects of Ω3/Ω6 polyunsaturated fatty acids (PUFA) ratios on cell viability, intracellular ROS, apoptosis rates, decreased mitochondrial membrane potential, inhibitory effects on acetylcholine esterase (AChE) enzyme activity and pro/anti-inflammatory cytokines in Aβ1-42-induced AD model in SH-SY5Y cells. The viability of cells treated with Ω6 and Ω3 fatty acids was determined by MTT assay. The percentage of apoptotic cells was determined by FITC-conjugated Annexin-V/PI. Expression levels of TNF-α, COX-2, IL-6, NFκB and TGFβ1 genes were determined by Real-Time PCR and cytokine release was determined by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). ROS, MMP and cell cycle analysis were performed by flow cytometry. According to our study results, a statistically significant decrease was observed in the MTT test after 48 hours of Ω3/Ω6 ratios application in 1/1, 1/2 and 1/8 groups, and an increase was observed in 1/4 and 1/16 groups. According to the apoptosis results, it was found that the cell viability of 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 and 1/16 doses decreased from 95.7% in the control group to 95.6%, 81.4%, 86.2%, 32.2% and 19.8%, respectively, after 48 hours of application, and the percentage viability decreased as the Ω6 dose increased. ROS and MMP levels were detected to decrease in all groups compared to the control group. The highest neuroprotective effect against oxidative stress was observed at 1/1 dose. Aβ1-42 induced blockade of the cell cycle was observed to be partially corrected by 1/8 dose. A statistically significant decrease in AChE enzyme activity was observed at 1/4, 1/8 and 1/16 doses. TNF-α and IL-6 mRNA expression levels were lowest at 1/4 dose and highest at 1/16 dose. COX-2 mRNA expression level increased significantly with increasing Ω6 ratio at the highest 1/4, 1/8 and 1/16 doses, and the lowest was observed at the 1/1 dose. TGFβ1 mRNA expression level showed a statistically significant increase at 1/4 and 1/8 doses.  Protein levels of TNF-α and IL-6 were lowest at 1/2 and 
1/4 doses. COX-2 protein levels were statistically significant at 1/8 dose. TGFβ1 protein levels were statistically significant at 1/4 and 1/16 doses. As a result, it can be said that Ω6 and Ω3 fatty acids, when used in 1/4 and 1/8 doses, can reduce neuroinflammation and provide a protective effect against Alzheimer's disease.