Selinexor ve docetaxel'in tek başına ve kombine kullanımlarının meme kanseri hücre hatları üzerine etkilerinin belirlenmesi
Determination of the effects of selinexor and docetaxel alone and combined uses on breast cancer cell lines
Yazar: İREM KARACAN
Danışman: DOÇ. DR. BUKET KOSOVA
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Meme kanseri, kadınlarda en sık görülen malignitedir ve oldukça heterojen bir olgudur. Meme kanserinin farklı alt tipleri bulunmaktadır. Üçlü negatif meme kanseri (triple negative breast cancer; TNBC), meme kanserinin agresif bir alt tipidir. TNBC olguları, invazivlik, yüksek metastatik potansiyel, nüksetme eğilimi ve kötü prognoz ile yakından ilişkilidir. TNBC tümörleri, meme kanserlerinin östrojen reseptörleri (ER), progesteron reseptörleri (PR) ve insan epidermal büyüme faktörü resptörü 2 (HER2) eksprese edilmeyen türüdür. Bu çalışmada, üçlü negatif meme kanseri MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri ve HER2 (-) Luminal A (LA) MCF-7 meme kanseri hücreleri kullanılmıştır. Güncel literatürde, selinexor ve docetaxel'in tekli ve kombine kullanımları TNBC meme kanseri MDA-MB-231 hücrelerinde üzerine etkilerini araştıran çeşitli çalışmalar mevcuttur; ancak, Luminal A meme kanseri MCF-7 hücre hattının selinexor ve docetaxel'in kombine etkilerini araştıran herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Çalışmamızda, ilk olarak selinexor ve docetaxel'in tek başına ve kombine kullanımlarının MDA-MB-231 ve MCF-7 meme kanseri hücre hatlarındaki sitotoksik ve apoptotik etkileri ile gen ekspresyonunda meydana getirdiği değişiklikleri saptamak amaçlanmıştır. Meme kanseri hücre hatlarına, selinexor,docetaxel ve kombinasyonu uygulandığında sinerjistik ve/veya antagonist ve apoptotik etki, APC, BRCA1 ve BRCA2 genlerin ekspresyon seviyelerinde anlamlı bir artış ya da azalış incelenmiştir. Öncelikli olarak MCF-7 ve MDA-MB-231 hatları için kuyucuk başına uygun hücre sayısı, xCellinge RTCA-SP ile belirlenmiştir. Etken maddelerin, IC50 değerlerini belirlemek için sitotoksisite deneyi gerçekleştirilmiştir. Bulunan IC50 değerleri ile etken maddelerin kombinasyon analizi yapılmıştır. Bu deneyler de xCellinge RTCA-SP ile gerçekleştirilmiştir. Annexin V-FITC yöntemi ile ilaçların tekli ve kombine kullanımlarının apoptotik etkileri belinlemiştir. Hücre hatlarına uygulanmış etken maddelerin, BRCA1,BRCA2,APC ve Beta Aktin genleri üzerindeki ekspresyon seviyeleri, LightCycler 480 ile gerçekleştirilmiştir.

MCF-7 hücre hattı için selinexor IC50 değeri 8.28 µM( 48.saat); docetaxel IC50 değeri 6.41 nM (48.saat), MDA-MD-231 hücre hattı için selinexor IC50 değeri 40.54 nM (48.saat); docetaxel IC50 değeri 115.74 nM (48.saat) olarak belirlenmiştir. MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre hatlarında, selinexor, docetaxel ve kombine uygulanımlarının kontrole göre apoptozu indüklediği belirlenmiştir. Selinexor uygulanmış MCF-7 hücre

hattında, kontrole kıyasla BRCA2 geninin ekspresyonunda anlamlı azalış olurken, APC gen ekspresyonunda anlamlı bir artış gözlemlenmiştir. Docetaxel uygulanmış MCF-7 hücre hattında, kontrole kıyasla BRCA2 ve APC genlerinin ekspresyon seviyelerinde anlamlı bir azalış gözlemlenmiştir. Selinexor ve docetaxel'in birlikte uygulandığı MCF-7 hücre hattında da benzer şekilde BRCA2 ve APC genlerinin ekspresyonlarında anlamlı bir azalış gözlemlenmiştir. Tekli ve kombine ilaç uygulanan ilaç gruplarının BRCA1 gen ekspresyonlarında anlamlı bir değişiklik olmadığı gözlemlenmiştir. Selinexor uygulanmış MDA-MB-231 hücre hattında, kontrole kıyasla BRCA1 ve APC genlerinin ekspresyonlarında anlamlı azalış olurken, BRCA2 gen ekspresyonunda anlamlı bir artış gözlemlenirken docetaxel uygulanmış MDA-MB-231 hücre hattında, kontrole kıyasla APC geninin ekspresyon seviyesinde anlamlı bir azalış gözlemlenmiştir. Selinexor ve docetaxel'in birlikte uygulandığı MDA-MB-231 hücre hattında BRCA2 ve APC genlerinin ekspresyonlarında anlamlı bir azalış gözlemlenirken sadece docetaxel uygulanmış MDA-MB-231 hücre hattında BRCA1 ve BRCA2 genlerin ekspresyonlarında ve selinexor ve docetaxel'in beraber uygulandığı MDA-MB-231 hücre hattında BRCA1 geninin ekspresyonunda anlamlı bir değişiklik gözlemlenmemiştir.

Farklı meme kanseri türlerinde yapılan çalışmalarda elde edilen bulgulara göre, meme kanseri tedavisinde mevcut tedavilere ek oluşacak yeni tedavi seçenekleri olabilmesi için yapılacak ileri çalışmalarda ön veri olarak kullanılabilecektir.

Abstract:
Breast carcinoma is the most common form of cancer in women and is characterized by its significant diversity. Within its subtype categorizations, triple-negative breast cancer (TNBC) emerges as a highly aggressive phenotype intricately linked to invasiveness, heightened metastatic propensity, susceptibility to relapse, and an unfavorable prognostic outlook. TNBC neoplasms exhibit a deficiency in the manifestation of estrogen receptors (ER), progesterone receptors (PR), and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). Several studies have investigated the effects of selinexor and docetaxel, either individually or in combination, on TNBC MDA-MB-231 breast cancer cells. However, there is limited research on the combined effects of selinexor and docetaxel on the Luminal A breast cancer MCF-7 cell line. This study aims to assess the cytotoxic and apoptotic effects of selinexor and docetaxel alone and in combination, as well as changes in gene expression in MDA-MB-231 and MCF-7 breast cancer cell lines. The study also explores potential synergistic and/or antagonistic effects and investigates alterations in the expression levels of APC, BRCA1, and BRCA2 genes when selinexor, docetaxel, or their combination are applied to breast cancer cell lines.

To begin, we determined the appropriate number of cells per well for MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines using xCellinge RTCA-SP. Subsequently, a cytotoxicity test was conducted to determine the IC50 values of selinexor and docetaxel. The combination analysis of the active substances with their respective IC50 values was also performed using xCellinge RTCA-SP. The apoptotic effects of the single and combined drugs were assessed using the Annexin V-FITC method. Moreover, we conducted gene expression analysis of BRCA1, BRCA2, APC, and Beta Actin genes in response to the application of active substances on cell lines using LightCycler 480.

The IC50 values for the MCF-7 cell line were determined as follows: 8.28 µM for selinexor (48h) and 6.41 nM for docetaxel (48h). In contrast, the MDA-MB-231 cell line exhibited IC50 values of 40.54 nM for selinexor (48h) and 115.74 nM for docetaxel (48h). Both cell lines which is, MCF-7 and MDA-MB-231 demonstrated apoptosis induction in response to selinexor, docetaxel, and their combination,

compared to the control group. In the MCF-7 cell line, treatment with selinexor led to a significant decrease in BRCA2 gene expression, while APC gene expression significantly increased. Docetaxel treatment also resulted in significant reductions of both BRCA2 and APC gene expressions in the MCF-7 cell line. A similar pattern was observed when combining selinexor and docetaxel in the MCF-7 cell line, with significant decreases in BRCA2 and APC gene expressions. However, there were no significant changes in the expression of the BRCA1 gene among the different drug groups in the MCF-7 cell line.

In the MDA-MB-231 cell line, selinexor treatment significantly decreased the expressions of BRCA1 and APC genes, while significantly increasing BRCA2 gene expression. On the other hand, docetaxel treatment led to a significant decrease in the expression of the APC gene. The combined treatment of selinexor and docetaxel also resulted in significant reductions in the expressions of BRCA2 and APC genes in the MDA-MB-231 cell line.

The findings from various breast cancer studies can serve as valuable preliminary data for future research, potentially contributing to the development of new treatment options in addition to the existing therapies.

Keywords; Breast cancer, nuclear export, selinexor, docetaxel