Aşırı aktif mesane sendromu olan kadın hastalarda mesane mikrobiyotasının araştırılması
Investigation of bladder microbiota in female patients with overactive bladder syndrome
Yazar: ESRA KAYA
Danışman: PROF. DR. MURAT ARAL
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Kadınlar = Women ; Kültür teknikleri = Culture techniques ; Mesane = Urinary bladder ; Mesane hastalıkları = Urinary bladder diseases ; Mikrobiyota = Microbiota

Özet:
Uzun yıllar boyunca standart idrar kültürü yönteminin yetersiz olması nedeni ile idrarın steril olduğu kabul edilmiştir. Kültürden bağımsız 16S rRNA sekanslama yöntemleri ile anaerop ve zor üreyen bakterilerin üremesini kolaylaştıran kültür yöntemlerinin geliştirilmesi sayesinde 2010 yılından bu yana aslında mesanenin steril olmadığı anlaşılmıştır. Bununla birlikte idrar yolu enfeksiyonu (İYE) varlığının dışlandığı alt üriner sistem semptomları (AÜSS) olan aşırı aktif mesane sendromu (AAM), üriner inkontinans, interstisyel sistit gibi hastalıkları olan hastalarda özellikle mesane mikrobiyotasının araştırılması etyolojiyi belirlemek adına gün geçtikçe daha çok önem kazanmaktadır. Çalışmamızda AAM tanısı alan hastalar ile üriner sistemi ilgilendirmeyen sebeplerle hastanede yatmakta olup rutin uygulamada transüretral kateter takılacak olan AAM tanısı dışlanmış kontrol grubu arasında mesane mikrobiyotasındaki bakteri dağılımı açısından anlamlı bir farklılık olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır.
Çalışma grubu; Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi S. U. A. Hastanesi Üroloji kliniği tarafından Kasım-Aralık 2021 tarihleri arasında aktif İYE olmayan, ürolojik ya da pelvik cerrahi geçirmemiş, AAM ayırıcı tanısı yapılmış 18-65 yaş arası kadın hastalardan oluşmaktadır. Kontrol grubu idrar yollarını ilgilendirmeyen sebepler nedeniyle hastanede yatmakta olan rutinde sonda takılması gereken aşırı aktif mesane sendromu olmayan 18-65 yaş arası kadın gönüllülerden oluşmaktadır. Toplamda 20 hasta ve 20 kontrol çalışmaya dahil edilmiştir. Tüm katılımcılardan orta akım idrar kültürü alındı. Tüm katılımcılardan transüretral kateter ve steril enjektör yardımı ile idrar örneği alınıp hasta başında anaerop kan kültür şişesine ve tiyoglikolatlı besiyerine ekimleri yapıldı. Steril enjektördeki idrar örneğinden 0,1 ml KKA, çikolata besiyerine ve EMB besiyerine ekim yapılıp aerop ortamda 35-37℃'de 48 saat inkübe edildi. Tiyoglikolatlı besiyeri 35-37℃'de 24 saat inkübe edildikten sonra 0,1 ml alınıp KKA ve çikolatamsı agara ekim yapılıp 35-37℃'de CO2'li etüvde 48 saat inkübe edildi. Tiyoglikolatlı besiyeri 35-37℃'de 24 saat inkübe edildikten sonra 0,1 ml alınıp BD BBL™ CDC Anaerobe %5 koyun kanlı agara (BD, ABD) ekimi yapılıp BD BBL™ GasPak™ anaerobik indikatör (BD, ABD) ile inkübe edildi. Tiyoglikolatlı besiyeri 35-37℃'de 24 saat inkübe edildikten sonra 0,1 ml alınıp KKA'a ekim yapılıp 35-37℃'de aerop ortamda 48 saat inkübe edildi. Pozitif sinyal veren anaerop kan kültür şişesinden 0,1 ml alınıp BD BBL™ CDC Anaerobe %5 koyun kanlı agara (BD, ABD) ekim yapılıp gaspack içerisinde BD BBL™ GasPak™ anaerobik indikatör (BD, ABD) ile 35-37℃'de 5 gün inkübe edildi. Üreyen tüm bakteri kolonilerinin Gram boyaması yapıldı. Üreyen bakterilerin tanımlanmasında BD Phoenix otomatize sistemi, BBD BBL Kristal Panel ve MALDI-TOF MS sistemi kullanıldı.
Katılımcıların hiçbirinde orta akım idrar kültürlerinde üreme olmamıştır. Transüretral kateterden steril enjektör ile alınan ilk örnekten yapılan ekimlerde üreme olmazken, tiyoglikolatlı besiyerinden ve kan kültür şişesinden yapılan ekimlerde hasta grubunda 10 (%50), kontrol grubunda 6 (%30) örnekte üreme saptanmıştır. Sadece kan kültür şişesine alınan idrarlarda üreme saptanan dört numune vardır. Sadece tiyoglikolatlı besiyerinden yapılan ekimlerde üreme olan numune yoktur. Araştırmaya dahil edilen hasta grubunda 35 bakteri, kontrol grubunda ise 30 bakteri tanımlanmıştır. Yapılan ekimler sonucunda 16 farklı cinste ve 29 farklı türde bakteri tanımlanmıştır. Hasta grubunda en sık saptanan bakteri cinsi Staphylococcus (%25.7) olup, onu Streptococcus (%17.1) ve Lactobacillus (%14.3) cinsi bakteriler takip etmektedir. Kontrol grubunda en sık saptanan bakteri cinsi Lactobacillus (%26.7) olup, onu Streptococcus (%13.3) ve Enterococcus (%13.3) takip etmektedir. Hasta grubunda tanımlanan 35 bakteri arasında en sık görülen bakteri türü Staphylococcus epidermidis (n=8, %22.9) iken onu Streptococcus anginosus (n=4, %11.4) ve E. faecalis (n=3, %8.6) takip etmektedir. Hasta grubunda tanımlanan anaerop bakteri Actinomyces urogenitalis (n=1) olup, kontrol grubunda rastlanmamıştır.
Hasta grubunda 5 örnekte Lactobacillus tanımlanmıştır. L. jensenii tanımlanan örnekte başka bir bakteri üremesi olmamıştır. Lactobacillus fermentum tanımlanan örnekte Arcanobacterium haemolyticum ve C. glabrata, Lactobacillus crispatus tanımlanan örnekte Cellulomonas turbata ve S. anginosus, Lactobacillus rhamnosus tanımlanan örnekte S. epidermidis, L. gasseri tanımlanan örnekte E. faecalis de saptanmıştır.
Kontrol grubunda tanımlanan 30 bakteri arasında en sık görülen bakteri türü L. gasseri (n=6, %20) iken onu E. faecalis (n=4, %13.3) ve E. coli (n=3, %10) takip etmektedir. Kontrol grubunda tanımlanan anaerop bakteriler Actinomyces neui, Finegoldia magna, Mobiluncus mulieris olup, hasta grubunda hiç saptanmamıştır. A. neui tanımlanan örnekte aynı zamanda Lactobacillus gasseri ve S. hominis de saptanmıştır. F. magna tanımlanan örnekte E. faecalis de saptanmıştır. M. mulieris tanımlanan örnekte L. gasseri de saptanmıştır. Lactobacillus jensenii tanımlanan örneklerden birinde S. agalactiae ve B. cepacia, diğerinde Streptococcus salivarus da saptanmıştır. L. gasseri tanımlanan örneklerden ikisinde başka bakteri saptanmazken, diğer iki örnekte E. faecalis saptanmıştır.
Hasta ve kontrol grupları arasında görülen bakteri türlerinin sıklıkları arasında anlamlı bir farklılık olup olmadığı Ki kare/Fisher's Exact test ile incelenmiş ve hasta grubunda ‗S. epidermidis'in görülme oranı (%22.9), kontrol grubuna göre (%0) anlamlı olarak daha yüksek bulunmuştur (p=.006).
Hasta grubunda L. gasseri'nin görülme oranı (%2.9) kontrol grubuna göre (%20.0) anlamlı olarak daha düşük bulunmuştur (p=.042).
BD Phoenix otomatize sistem ve MALDI-TOF MS karşılaştırılmasına göre her iki sistemle toplam 57 bakteri çalışılmış ve 2'si (%3.5) MALDI-TOF MS ile tanımlanamamıştır. 34 (%59.6) bakteri her iki sistem tarafından tür düzeyinde aynı tanımlanmıştır. 8 (%14.0) bakteri cins düzeyinde aynı tanımlanmış, 13 (%22.8) izolat ise tamamen farklı bakteriler olarak tanımlanmıştır.
BD BBL Kristal panel ve MALDI-TOF MS karşılaştırılmasına göre iki sistemle 12 bakteri çalışılmış ve biri (%8.3) MALDI-TOF MS tarafından tanımlanamamıştır. Geriye kalan 7 (%58.3) bakteri her iki sistem tarafından cins düzeyinde aynı tanımlanmıştır. 4 (%33.3) izolat ise tamamen farklı bakteriler olarak tanımlanmıştır. Tür düzeyinde aynı tanımlanan bakteri olmamıştır.
Çalışmamızda Hilt ve arkadaşlarının geliştirmiş oldukları EQUC yöntemi modifiye edilerek ayrıca anaerop kan kültür şişesine de ekim yapıldı. Toplamda alınan 40 idrar örneğinin 4'ünde (%10) sadece anaerop kan kültür şişesine yapılan ekimlerde üreme saptanmıştır. Geliştirilmiş bu yönteme anaerop kan kültür şişesinin de dahil edilmesinin mikrobiyatadaki bakterilerin saptanmasını arttıracağını düşünmekteyiz. Bizim çalışmamızda olduğu gibi başka çalışmaların yapılmasıyla da bu yöntem geliştirilerek mikrobiyatanın incelenmesi için optimal bir yöntemin ortaya koyulabileceği gösterilmiştir.
Sonuç olarak yapılan tüm çalışmalarla beraber idrarın steril olduğu bilgisi artık geçerli değildir. Mesanenin de kendine ait bir mikrobiyatası vardır. Mikrobiyatada var olan bakteri çeşitliliğinin yaş, cinsiyet, etnik köken, vücut kitle indeksi, hastalık durumu ve kullanılan ilaçlarla değişebileceği gösterilmiştir. Aynı zaman da var olan mikrobiyotanın üriner sistem hastalığının ortaya çıkmasını, hastalığın derecesini ve alınan tedaviye verilen yanıtı etkileyeceği gösterilmiştir. Farklı şartlardaki mikrobiyatanın tanımlanması, çekirdek bir mikrobiyotanın net bir şekilde ortaya koyulabilmesi için çok sayıda katılımcının dahil edileceği çok merkezli-uluslu çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
For many years, urine was considered sterile due to the inadequacy of the standard urine culture method. Thanks to the development of culture-independent 16S rRNA sequencing methods and culture methods that facilitate the growth of anaerobic and fastidious bacteria, it has been realized since 2010 that the bladder is actually not sterile. However, in patients with lower urinary tract symptoms (LUTS), overactive bladder syndrome (OAB), urinary incontinence, interstitial cystitis, in which the presence of urinary tract infection (UTI) is excluded, investigation of the bladder microbiota is gaining more and more importance day by day in order to determine the etiology. In our study, it was aimed to investigate whether there is a significant difference in bacterial distribution in the bladder microbiota between the patients diagnosed with OAB and the control group who were hospitalized for reasons not related to the urinary system and were excluded from the diagnosis of OAB, who will be routinely inserted a transurethral catheter.
Working group; Kahramanmaraş Sütçü İmam University S. U. A. Hospital Urology Clinic consists of female patients aged 18-65 years, who did not have active UTI, did not have urological or pelvic surgery, and were diagnosed with OAB between November and December 2021. The control group consisted of female volunteers between the ages of 18-65 who were hospitalized for reasons unrelated to the urinary tract and did not have overactive bladder syndrome, which should be routinely inserteda transurethral catheter. A total of 20 patients and 20 controls were included in the study.
Midstream urine cultures were obtained from all participants. Urine samples were taken from all participants with the a transurethral catheter and sterile injector, and inoculated into anaerobic blood culture bottle and thioglycolate medium at the bedside. From the urine sample in a sterile syringe, 0.1 ml of urine was inoculated into chocolate medium and EMB medium and incubated in an aerobic environment at 35-37°C for 48 hours. After incubating the thioglycolate medium at 35-37°C for 24 hours, 0.1 ml was taken and inoculated on sheep blood agar and chocolate agar and incubated in a %5 CO2 atmosphere at 35-37°C for 48 hours. After incubating the thioglycolate medium for 24 hours at 35-37°C, another 0.1 ml is taken and seeded on BD BBL™ CDC Anaerobe 5% sheep blood agar (BD, USA) and incubated with the BD BBL™ GasPak™ anaerobic indicator (BD, USA). After incubating at 35-37°C for 24 hours, 0.1 ml was taken from the thioglycolate medium, and inoculated into sheep blood agar and incubated at 35-37°C for 48 hours in an aerobic environment. 0.1 ml is taken from anaerobic blood culture bottle and inoculated on BD BBL™ CDC Anaerobe 5% sheep blood agar (BD, USA) with BD BBL™ GasPak™ anaerobic indicator (BD, USA) for 5 days at 35-37°C. Gram staining of all bacterial colonies was performed. BD Phoenix automated system, BBD BBL Crystal Panel and MALDI-TOF MS system were used for bacterial identification.
There was no growth in midstream urine cultures in any of the participants. While there was no growth in the cultivations made from the transurethral catheter samples directly inoculated into the agars, growth was detected in 10 (50%) samples in the patient group and 6 (30%) samples in the control group in the cultivations made from the thioglycolate medium and blood culture bottle. There were only four specimens in which growth was detected in the urine collected in the blood culture bottle. There is no specimen with growth in the cultivations made only from the thioglycolate medium. 35 bacteria were identified in the patient group included in the study and 30 bacteria were identified in the control group. As a result of sowing, 16 different genera and 29 different types of bacteria were identified. Staphylococcus (25.7%) was the most common bacterial genus in the patient group, followed by Streptococcus (17.1%) and Lactobacillus (14.3%). Lactobacillus (26.7%) was the most frequently detected bacterial genus in the control group, followed by Streptococcus (13.3%) and Enterococcus (13.3%). Staphylococcus epidermidis (n=8, 22.9%) was the most common bacterial species among the 35 bacteria identified in the patient group,
followed by Streptococcus anginosus (n=4, 11.4%) and E. faecalis (n=3, 8.6%). The anaerobic bacterium identified in the patient group was Actinomyces urogenitalis (n=1), but it was not found in the control group.
Lactobacillus was identified in 5 samples in the patient group. There was no other bacterial growth in Arcanobacterium haemolyticum and C. glabrata were isolated in the sample in which Lactobacillus fermentum was also detected. Cellulomonas turbata ve S. anginosus were identified in the sample in which Lactobacillus crispatus was also detected. S. epidermidis was isolated in the sample in which Lactobacillus rhamnosus was also detected. E. faecalis was identified in the sample in which L. gasseri was also detected.
L. gasseri (n=6, 20%) was the most common bacterial strain among the 30 bacteria identified in the control group, followed by E. faecalis (n=4, 13.3%) and E. coli (n=3, 10%). Anaerobic bacteria identified in the control group were Actinomyces neui, F. magna, M. mulieris, and they were never detected in the patient group. In the sample where A. neui was identified, L. gasseri and S. hominis were also detected. In the sample where F. magna was isolated, E. faecalis was also identified. In the sample where M. mulieris was isolated, L. gasseri was also identified. In samples where L. jensenii identified; S. agalactiae and B. cepacia were found in one, and Streptococcus salivarius in the other. While no other bacteria were detected in two of the L. gasseri identified samples, E. faecalis was detected in the other two samples.
Chi-square/Fisher's Exact test was used to determine whether there was a significant difference between the frequencies of bacterial species seen between the patient and control groups. The rate of S. epidermidis in the patient group (22.9%) was found to be significantly higher than the control group (0%) (p=.006).
In the patient group, L. gasseri's incidence (2.9%) was found to be significantly lower than the control group (20.0%) (p=.042).
According to the comparison of the BD Phoenix automated system and MALDI-TOF MS, a total of 57 bacteria were studied with both systems and 2 (3.5%) could not be identified by MALDI-TOF MS. 34 (59.6%) bacteria were identified at the species level by both systems. 8 (14.0%) bacteria were defined as the same at the genus level, and 13 (22.8%) bacteria were defined as completely different bacteria.
Based on the BD BBL Crystal panel and MALDI-TOF MS comparison, 12 bacteria were studied with the two systems and 1 (8.3%) could not be identified by MALDI-TOF MS. The remaining 7 (58.3%) bacteria were defined at the same genus level by both systems. 4 (33.3%) bacteria were defined as completely different bacteria. There were no bacteria identified at the species level.
In our study, we used a modified version of the EQUC method developed by Hilt et al. and the sample were also inoculated into an anaerobic blood culture bottles. In 4 (10%) of 40 urine samples taken in total, growth was detected only in the anaerobic blood culture bottles. We think that the inclusion of an anaerobic blood culture bottle in this improved method will increase the detection rate of bacteria in the microbiota. As seen in our study, it has been shown that an optimal method for the examination of microbiota can be revealed by developing this method by conducting other studies.
As a result, the knowledge that urine is sterile is no longer valid with all the studies done. The bladder also has its own microbiome. It has been shown that the bacterial diversity in the microbiota can change with age, gender, ethnicity, body mass index, disease status and drugs used. At the same time, it has been shown that the existing microbiota will affect the emergence of urinary system disease, the degree of the disease and the response to the treatment received. In order to define the microbiota under different conditions and to reveal a core microbiota clearly, multicenter-national studies with a large number of participants are needed.