Drosophila melanogaster'de Deltamethrin ve Thiamethoxam 'a karşı oluşturulan insektisit direncinde  P450, GST ve ABC sinyal yolaklarının rolü
The role of  P450, GST and ABC signaling pathways in the insecticide resistance against to Deltamethrin and Thiamethoxam in Drosophila melanogaster
Yazar: FERAH YAMAÇ
Danışman: PROF. DR. OĞUZHAN DOĞANLAR
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
İnsektisitler, insan ve çevre sağlığını olumsuz yönde etkileyen zararlılarla mücadelede kullanılan kimyasal savaş etmenleridir. İnsektisitlere karşı direnç, pestisitlerin etkili dozunun ya da daha yüksek dozlarınının kullanılması sonucu hedef zararlı popülasyonunun genetik değişikliklerle kullanılan insektisite karşı duyarlılığında azalma oluşturarak tarım zararlıları, hastalık vektörleri ve halk sağlığı zararlılarıyla mücadeleyi zorlaştırmaktadır. Direnç gelişimi, entegre zararlı mücadele yönetimi stratejilerini olumsuz etkileyerek, dirençli böceklerle mücadelede daha fazla miktarlarda pestisit kullanımını gerektirmekte ve bu da su, toprak ve hava kirliliğine neden olmaktadır. Piretroid sınıfı, Deltamethrin ve Neonikotinoid insektisit sınıfından Thiamethoxam, çeşitli ev, çevre ve tarımsal zararlılara karşı yoğun olarak kullanılmakta olan insektisitlerdir. İnsektisit uygulaması yapılan zararlı böcek popülasyonlarının büyük bir kısmı birkaç gün içinde ölürken detoksifikasyon yeteneği geliştirebilen dirençli böcekler hayatta kalabilmektedir. Çalışmalar, zararlı böcek popülasyonlarının güçlü bir ilaç direnç mekanizması geliştirebildiğini göstermiş olmasına rağmen direnç mekanizmaları hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bununla birlikte, yapılan çalışmalar insektisitlere uzun süreli ve tekrarlayan subletal dozlarda yaşam boyu maruziyetin çoklu ilaç direncinin gelişmesinde hücresel mikro çevrenin, transkripsiyonel düzenlemenin, metabolik aktivite ve bu gibi hücresel değişikliklerin bir cevap oluşturabileceğini göstermiştir. Son çalışmalar, böceklerdeki çoklu ilaç direnç mekanizmalarında Sitokrom P-450 Monooksijenaz, Glutatyon S-Transferaz enzimleri ve ABC (ATP bağlayıcı kaset) taşıyıcı proteinlerinin önemli bir rol oynadığını göstermiştir.
Bu tezin amacı Deltamethrin ve Thiamethoxam'ın tekli ve kombine olarak uygulamalarının normal ve dirençli Drosophila melanogaster bireylerinde çoklu ilaç direncine neden olan moleküler mekanizmaları açıklamak ve pestisit uygulamalarının antioksidan, ısı şok proteinleri ve apoptoz gibi önemli hayati sinyal yolları üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Bu kapsamda, her iki insektisitin dirençli ve normal Drosophila melanogaster bireylerinde çoklu ilaç direnci, böcek canlılığı, oksidatif stres, ısı şoku ve apoptozun tepkisini qRT-PCR analiz yöntemi ile, morfolojik analizler ise stereo mikroskop ile görüntülenerek analiz edilmiştir..
Deltamethrin ve Thiamethoxam'ın tekli ve kombine olarak uygulamalarının multijenerasyonel sonucu olarak, Drosophila melanogaster dirençli bireylerinde kontrollere kıyasla LD50 seviyeleri Deltamethrin'de 1.92 kat, Thiamethoxam'da 9.2 kat ve Deltamethrin+Thiamethoam'da 2.4 kat artış oluştuğu belirlenmiştir. Sonuçlarımız, CYP6A2, GSTE1 ve SUR genlerinin LD50 dozlarındaki Deltamethrin ve Thimethoxamın tekli ve kombine olarak uygulamalarında Drosophila melanogaster erginlerinde gelişen çoklu ilaç direncinde, sırasıyla P450 detoksifikasyon mekanizması, S-transferaz ve ABC kaset protein pompalarını aktif hale geçirerek önemli bir rol oynadığını göstermiştir. İlave olarak, kontrollere kıyasla dirençli sineklerde güçlü antioksidan savunma sinyalleri, ısı şoku tepkisi ve apoptoz regülasyonu belirlenmiştir.
Sonuç olarak, tez bulgularımızın Drosophila melanogaster sineklerinin çoklu ilaç direnci ve altında yatan moleküler mekanizmalarının daha derinden anlaşılması için temel teşkil edeceğini ve önemli zararlı böceklerde çoklu ilaç direnci konusunda daha ileri araştırmalar yapmak ve yeni ve etkili pestisit geliştirme stratejilerini geliştirmek için kullanılacağını düşündük.

Abstract:
Insecticides are an indispensable pest control agents and well known environmental pollutant which is lethally affect several biological live form as well as human. Resistance to insecticides is a heritable genetic change in the sensitivity of a target insect population that is responses in the repeated failure of effective dose of pesticides, and is main reason in collapse of control strategies for insect pests, plant diseases vector  and household insect pests. Resistance development, as it adversely affects the all pest management strategies, pesticides used in large amounts to control resistant widely insects lead to water, soil and air pollution. Deltamethrin is one of used synthetic pyretroid and Thiamethoxam, main member of neonicotinoids are intensively used against various household, environmental and agricultural pests. In this sprayed area, the vast majority of pest population die within a few days, but remain insects with detoxification capable can survive. Studies indicated that these pest populations can develop a strong drug resistance mechanism. And yet, the cause of this resistance-mechanism has not been clearly understood. However, the latest studies showed that as well as exposure to contact with insecticides, long-term treatments, and repetitive subletal doses of pesticide applications during a lifespan may change the conditions of cellular microenvironment, transcriptional regulation, metabolic activity and these alterations might create a cellular condition responsible for the development of multidrug resistance. Recent studies have shown that cytochrome P-450 monooxygenase, glutathione S-transferase enzymes and ABC (ATP binding cassette) carrier proteins play an important role in multiple drug resistance mechanisms in insects.
The aim of this thesis to explain the possible molecular mechanisms by which single and combined application of Deltamethrin and Thiamethoxam results in multi drug resistance and to investigate the effects of pesticide applications on important vital signalling pathways such as antioxidant, heat shock proteins and apoptosis in both normal and drug resistance Drosophila melanogaster populations. We analysed the cellular and molecular effects of both insecticides on multidrug resistance, insect viability, oxidative stress, heat shock response, and induction of apoptosis in resistance and normal Drosophila melanogaster population using stereo microscope, morphometric analysis and qRT-PCR assays.
As a result of multigeneration single and combined applications of Deltamethrin and Thiamethoxam, the LD50 level increased 1.92 fold for Deltamethrin, 9.2 fold for Thiamethoxam and 2.4 times for Deltamethrin + Thiamethoxam compared to their respective control of Drosophila flies. Our result indicated that the CYP6A2, GSTE1 and SUR genes played major role of multidrug resistance mechanisms to Deltamethrin and Thiamethoxam in Drosophila melanogaster flies via activating P450 detoxification pathway, cellular S-transferase and cassette protein pumps. Additionally, the strong antioxidant defence signals, heat shock response and regulation of apoptosis were clearly determined particularly in resistance flies compared to controls.
In conclusion we thought that, our result will form the baseline for a deeper understanding of the multidrug resistance and underlying molecular mechanisms of Drosophila melanogaster flies and will be used to further studies on multidrug resistance in important insect pests and improve new and effective pesticide development strategies.