Cystein-S-sulfat'ın sitotoksik ve genototoksik etkilerinin nöronal hücre dizisinde incelenmesi
Examination of cysteine-S-sulfate's cytotoxic and genotoxic effects on neuronal cell line
Yazar: VOLKAN TEKİN
Danışman: PROF. DR. VURAL KÜÇÜKATAY
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Comet tekniği = Comet assay ; Genotoksisite = Genotoxicity ; Hücre dizisi = Cell line ; Nöronlar = Neurons ; Sistein = Cysteine ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Sülfat = Sulfate

Özet:
Sülfit, kükürt içeren amino asit metabolizması sonucu ortaya çıkan toksik bir moleküldür. Sülfit metaboliti olan Cystein-S-Sulfat (SSC), glutamat benzeri eksitotoksik etki göstermektedir. SSC, Sülfit Oksidaz (SOX) Enzim eksikliği olan hastaların idrarında ve plazmasında yoğun miktarda tespit edilmektedir. SSC toksisitesinin, SOX enzim eksikliğindeki ağır nöropatolojinin sebebi olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada, SSC molekülünün sitotoksik ve genototoksik etkilerinin HT-22 fare hipokampüs hücre dizini kullanılarak gösterilmesi amaçlanmıştır. %10 fetal bovin serumu (FBS), %1 L-glutamin, 100IU/ml penisilin/10mg/ml streptomisin ve yüksek glukoz içeren DMEM içerisinde çözdürülerek besi yeri olarak kullanılmıştır. Yöntem olarak; sitotoksite ölçümü için WST-1 testi kullanılmıştır. SSC LD50 dozunu belirlemek için hücrelere çeşitli konsantrasyonlarda SSC (her bir kuyucukta 5-300 µM'larda olacak şekilde) uygulanıp WST-1 çalışılmış ve probit analizi yapılmıştır. SSC (LD50 dozu 125 µM) ile birlikte NMDA reseptör antagonisti olan Memantin (20 µM) molekülü, glutamat metabotropik reseptör antagonisti olan LY341495 (10 µM) molekülü uygulanmıştır. Genototoksite analizi için deney gruplarına bahsedilen tedaviler verildikten sonra Comet Analizi yöntemi çalışılmıştır. Comet analizi için Comet Assay IV programı kullanılmıştır. Apopitotik süreci aydınlatmak için Kaspaz-3 aktivite tayini, ilaç verilen gruplarla ve kontrol grubunda çalışılmıştır. Antioksidan kapasiteyi ölçmek için hücre içi Total Glutatyon Ölçümü gerçekleştirilmiştir. Çalışmamız sonucunda, SSC'nin sitotoksik etkileri olduğu ancak Comet Analizi sonucunda genototoksik etkisinin mevcut dozlarda olmadığı gösterilmiştir. SSC'nin kaspaz-3 aktivitesini artırmadığı gözlenmiştir. SSC'nin hücre içi total glutatyon miktarını artırdığı görülmüş, bu durum oksidan strese karşı gelişen kompanzatuar bir mekanizma olarak değerlendirilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Cystein-S-Sulfat, S-Sulfosistein, Genototoksite, Sitotoksite,
Comet Analizi

Abstract:
Sulfite is a toxic molecule resulting from sulfur-containing amino acid metabolism. The sulfide metabolite Cysteine-S-Sulfate (SSC) shows an excitotoxic effect like glutamate. SSC is detected in the urine and plasma of patients with Sulfite Oxidase (SOX) enzyme deficiency. It is thought that SSC toxicity may be the cause of severe neuropathology in SOX enzyme deficiency. In this study, the cytotoxic and genototoxic effects of the SSC molecule were aimed to be demonstrated using the HT-22 mouse hippocampus cell line. 10% fetal bovine serum (FBS), 1% L-glutamine, 100IU / ml penicillin / 10mg / ml streptomycin and high glucose DMEM were used as medium. As a method; WST-1 test was used for cytotoxicity measurement. In order to determine the dose of SSC LD50, various concentrations of SSC (with 5-300 300M in each well) were applied to the cells and WST-1 was studied and probit analysis was performed. Memantine (20 µM) molecule which is NMDA receptor antagonist and LY341495 (10 µM) molecule which is glutamate metabotropic receptor antagonist has been applied with SSC (LD50 dose 125 µM). After the mentioned treatments were given to the experimental groups for the genototoxicity analysis, Comet Analysis method was studied. Comet Assay IV program was used for Comet analysis. In order to elucidate the apoptotic process, caspase-3 activity was studied in the drug-treated groups and in the control group. Intracellular Total Glutathione Measurement was performed to measure the antioxidant capacity. In our study, it was shown that SSC had cytotoxic effects but the genototoxic effect was not present in the current doses as a result of Comet Analysis. It was observed that SSC did not increase caspase-3 activity. SSC was found to increase the amount of intracellular total glutathione and was evaluated as a compensatory mechanism against oxidant stress.


Keywords: Cysteine-S-Sulfate, Genotoxicity, Cytotoxicity, Comet Assay, SSulfocysteine