Metotreksatın neden olduğu testis hasarında quercetin'in etkilerinin histolojik olarak incelenmesi
Histological investigation of the effect of quercetin on testicular damage caused by methotrexate
Yazar: BURCU BARAN
Danışman: DOÇ. DR. SEDA ÖZBAL
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Kan-testis bariyeri = Blood-testis barrier ; Metotreksat = Methotrexate ; Testis = Testis

Özet:
Çalışmamızın amacı, metotreksat uygulanan sıçanlarda, testis dokusunda meydana gelen hasara karşı güçlü bir antioksidan yapısında olan quercetinin koruyucu etkilerinin histokimyasal, immünohistokimyasal ve biyokimyasal olarak incelemektir.
Çalışmamızda, 35 adet 200-250 gr ağırlığında erkek Wistar albino türü sıçan kullanıldı. Sıçanlar kontrol, sham, QE, MTX, MTX+QE olmak üzere 5 gruba (n=7) ayrıldı. Kontrol grubu: hiçbir şey uygulanmadı normal adlibitum beslendi. Sham grubu: 9 gün günde tek doz oral gavaj yoluyla 2 ml mısır yağı verildi. QE grubu: 9 gün 50 mg/kg/gün QE oral gavaj yoluyla 2 ml mısır yağında çözülerek verildi. MTX grubu: 1. günde tek doz i.p 20 mg/kg MTX enjeksiyonu yapıldı. MTX+QE grubu: 1. günde deneklere i.p 20 mg/kg MTX enjeksiyonu yapıldı ve MTX uygulamasından 30 dk önce olacak şekilde başlanarak, günde tek doz oral gavaj yoluyla 50 mg/kg QE 2 ml mısır yağında çözülerek verildi. 10. günde tüm denekler sakrifikasyon edildi.
Histokimyasal analizler için, Hematoksilen-Eozin (H-E), Periyodik Asit Schiff (PAS) ve Masson Trikrom boyamaları yapıldı. Dokularda Johnsen's skoru, seminifer tübül çapı, seminifer epitel yüksekliği ve bazal membran kalınlığı değerlendirildi. İmmünohistokimyasal yöntemlerle apoptozu değerlendirmek amacıyla TUNEL ve aktive kaspaz-3 boyamaları yapıldı. Hücreler arası sıkı bağlantı komplekslerinin yapısını değerlendirmek için Occludin ve ZO-1 immunohistokimyasal boyama yapıldı. Biyokimyasal analizler için, testis dokularında ve serumda Total Antioksidan Seviyesi (TAS), Total Oksidan Seviyesi (TOS) ve Süperoksit Dismutaz (SOD) düzeyleri değerlendirildi.
Histokimyasal analizlerde, kontrol, sham ve QE gruplarında düzgün yapıda seminifer tübüller ve düzenli sıralanmış spermatogenik seri hücreleri, normal kalınlıkta seminifer tübül çapı, seminifer tübül epitel yüksekliği, bazal membran kalınlığı gözlendi.
MTX grubunda, düzensiz seminifer tübüller, germ hücrekerinin kaybı, vakuolizasyon, tübül epitelinde ve çapında azalma, bazal membran kalınlığında ve interstisyel alanda ise bağ dokusu artışı görüldü. MTX+QE grubunda ise testis yapısının normale benzer bir morfolojide olduğu bulundu.
İmmunohistokimyasal parametrelerde MTX grubunda kontrol grubuna oranla seminifer tübüllerde aktive kaspaz-3 ve TUNEL pozitif boyanan hücre sayısının arttığı, Occludin ve ZO-1 pozitif boyanan hücre sayısının ise azaldığı görüldü. MTX+QE grubunda, TUNEL ve aktive kaspaz-3 immün pozitif hücre sayısının azaldığı, Occludin ve ZO-1 immün pozitif hücre sayısının arttığı görüldü.
Biyokimyasal analizlerde ise, doku ve serumda TAS, TOS ve SOD seviyeleri incelendiğinde, quercetinin serbest radikal dengesini sağlayarak doku stabilizasyonuna yardımcı olduğu saptandı.
Metotreksatın oluşturduğu testis hasarında, quercetinin oksidatif stres ve apoptozu azaltarak koruyucu etki gösterdiği sonucuna varıldı.

Abstract:
The aim of this study is to examine histochemical, immunohistochemically, and biochemically the protective effect of quercetin, which is a strong antioxidant, against damage to testicular tissue in rats treated with methotrexate.
In our study, 35 male Wistar albino rats weighing 200-250 g were used. The rats were divided into 5 groups (n=7) as control, sham, QE, MTX, MTX+QE. 1- No active ingredients were given to the control group; they were fed ad libitum. 2- Oral gavage was applied to the Sham group, once a day for 9 days, with 2 ml of corn oil. 3- Oral gavage was applied to the QE group, once a day for 9 days, with 50 mg/kg QE dissolved in 2 ml of corn oil. 4- The MTX group received an intraperitoneal injection of a single dose of 20 mg/kg MTX, on the first day. 5- Oral gavage with 50 mg/kg QE dissolved in 2 ml of corn oil was applied to the MTX+QE group, following a single intraperitoneal injection with 20 mg/kg MTX, once a day for 9 days. All subjects were sacrificed on day 10.
Histochemical analysis included Hematoxylin-Eosin (H&E), Periodic Acid Schiff (PAS) and Masson Trichrome staining techniques. Evaluations included Johnson's scoring, seminiferous tubule epithelial height, seminiferous tubule diameter and thickness of basement membrane measurements. Active Caspase-3 (caspase-3) and TUNEL staining were used as immunohistochemical techniques to evaluate apoptosis. ZO-1 and Occludin staining were used as immunohistochemical techniques to evaluate intercellular tight junction complexes. Total Antioxidant Capacity (TAC), Total Oxidant Capacity (TOC), Superoxide Dismutase (SOD), and Total Protein Amount (BCA) parameters were evaluated for biochemical analysis, both in tissue and blood homogenates.
In histochemical analysis seminiferous tubules in normal morphology, neatly lined spermatogonia serial cells, normal seminiferous tubule diameter, normal epithelial height in seminiferous tubules, normal basement membrane thickness, and expected Johnson's score were shown across control, sham, and quercetin groups. Whereas, in MTX group, seminiferous tubules in irregular morphology, germ cell loss, vacuolization, decrease in seminiferous tubule epithelium and diameter, increased basement membrane thickness, and connective tissue proliferation in interstitial space were present. MTX+QE group, however, shown a minimally changed morphology. Immunohistochemical analysis MTX group presented increased positive staining for Active Caspase-3 and TUNEL in seminiferous tubules and decreased number of Occludin and ZO-1 positive cells in comparison to the control group. Whereas in MTX+QE group, decrease in TUNEL and Active Caspase-3 positive cell count and increased Occludin and ZO-1 positive cell count were shown.
In biochemical analyzes, when TAS, TOS and SOD levels were examined in tissue and serum, it was determined that quercetin helped tissue stabilization by providing free radical balance.
It was concluded that quercetin has a protective effect by reducing oxidative stress and apoptosis in testicular damage caused by methotrexate.