Toxocara canis ile deneysel enfekte farelerde visceral larva migrans'ın PCR ile teşhisi
PCR detection of visceral larvae migrans in mice experimentally infected with toxocara canis
Yazar: GÖKBEN ÖZBAKIŞ
Danışman: PROF. DR. AHMET DOĞANAY
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Enfeksiyon = Infection ; Fareler = Mice ; Larva migrans = Larva migrans ; Larva migrans-visceral = Larva migrans-visceral ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis = Diagnosis ; Toxocara = Toxocara ; Toxocara canis = Toxocara canis

Özet:
Çalışmada 6-8 haftalık 36 adet dişi BALB/c fare kullanıldı. Enfekte edilen (pozitif kontrol) grup farelere 1000 adet enfektif dönem larvalı yumurta verilirken, enfekte olmayan (negatif kontrol) grup farelere % 0,9'luk izotonik NaCl solüsyonu verildi. Nekropsi günleri, larvaların organlara ulaştıkları ve göçün tamamlandığı günler dikkate alınarak enfeksiyonun 2., 4., 7. ve 14. günleri olarak seçildi. Çalışmada farelerin karaciğer, akciğer, beyin, ön bacak ve arka bacak kasları kullanıldı. Larvaların tespiti için örneklerin bir kısmı pepsin enzimi yardımıyla organ sindirilmesine tabi tutulurken, kalan kısımdaki organlar Toxocara canis'in mitokondrial DNA ATP sentetaz alt ünite 6 gen bölgesini çoğaltmak süretiyle moleküler yöntemler kullanıldı. Araştırmada kullanılan dizinler çalışma kapsamında tasarlandı. Tasarlanan primerlerin kontrolü amaçlı erişkin Toxocara cati ve Toxascaris leonina ve köpek, kedi, insan genomu ile reaksiyona sokuldu ancak, herhangi bir amplifikasyon elde edilmedi. PCR'ın çalışabildiği en alt düzeydeki larva/yumurta sayısı ise 2 olarak saptandı. PCR sonrası pozitif bulunan amplikonların spesifikliğini tespit etmek amacıyla Bbs-I enzimi ile kesim yapıldı. Enzim, amplikonu bir yerinden kesti (170 bp ve 47 bp iki ürün oluştu).  
Polymerase Chain Reaction ile nekropsi 2. gün karaciğer dokusunda tüm enfekte grup örnekleri pozitif bulunurken, akciğer dokusunda 4 örnek pozitif, ön bacak kasında ise sadece 1 örnek pozitif saptandı. Nekropsi 4. günde karaciğer, akciğer, beyin ve arka bacak kaslarındaki tüm enfekte gruplar pozitif, ön bacak kas örneklerinden sadece biri negatifti. 7. gün nekropsisinde; akciğer, beyin, ön bacak ve arka bacak kasları enfekte grupları pozitif bulunurken, karaciğer dokusunda sedece 1 örnek negatif saptandı. Nekropsi 14. gün, enfekte grupların karaciğer dokusunda 3 örnek pozitif bulunurken, akciğer dokusunda ise 5 örnek pozitif kaydedildi. Beyin, ön bacak ve arka bacak kası enfekte gruplarının hepsinde pozitif bantlar görüldü. Tüm nekropsi günlerinin kontrol grupları ise negatif saptandı.
Doku türüne göre PCR sonuçlarının karşılaştırılmasında Mann-Whitney U testi, dokular arasında larva sayıları arasındaki farklılık ve farklı nekropsi günlerinde aynı dokunun bağımsız günlerindeki larva sayılarının değişimi Kruskal-Wallis testi, tüm grupların farklı dokularındaki PCR sonucu ile larva görülme sıklıkları arasındaki farklılık Ki-kare testi ile incelendi.

Abstract:
Thirty six, 6-8 weeks old female BALB/c mice were used in the study. Infection was performanced by oral administration of 1000 embryonated eggs per mouse, the uninfected mice received oral administration of isotonic sodium chloride saline solution 0,9 %. Infected and uninfected group were euthanized post infection 2.,4.,7. and 14. days. Toxocara canis larvae were recovered from liver, lungs, brain and muscles of front and hind limbs with pepsin-HCl digestion method and PCR. A new set of primer was design to mtDNA of ATPase synthase subunit 6. The primer sets were checked with Toxocara cati, Toxascaris leonina and dog, cat, human gDNA and no product was amplified. The detection limit of DNA detectable for each specific PCR assay were 2 embryonated eggs. Purified ATPase 6 PCR products were digested with Bbs-I restriction endonuclease enzyme (170 bp and 47 bp).  
Using Polymerase Chain Reaction; second day post infection, liver of all groups were positive at necropsy. In 4 of them lungs were positive and only in one mouse muscles of front limbs were positive. In the necropsies of fourth day post infection, liver, lungs, brain and muscles of hind limbs were positive in all groups; muscles of front limbs were negative in only one mouse. In necropsies done seven days after infection; lungs, brain and muscles of front and hind limbs were found positive in all infected groups, but liver was negative in only one case. In necropsies done 14 days after infection, while liver was found negative in only one mouse; lungs were positive in 5 mice. Brain and muscles of front and hind limbs were positive in all infected groups. All uninfected groups were negative.

PCR and pepsin-HCl techniques results were analysed with Mann-Whitney U, Kruskal-Wallis and Chi-square tests.