ß-estradiol yüklü doku iskeleleri ile in-vitro kemik doku mühendisliği
In-vitro bone tissue engineering with ß-estradiol loaded scaffolds
Yazar: GÜLSEREN IRMAK
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, kemik doku rejenerasyonuna yönelik olarak 17-ß estradiol (E2) yüklü poli (laktik-ko-glikolik asit) PLGA nanopartikül-kitosan/HA doku iskelesi sistemi geliştirilmesi ve oluşturulan sistemin in-vitro etkinliğinin adipoz kökenli mezenkimal kök hücre (AdMSC) kültürlerinde araştırılması amaçlanmıştır.Tez çalışmasının ilk aşamasında farklı poli-laktik asit/poli-glikolik asit (PLA/PGA) (50:50 ve 65:35) bileşimlerine sahip PLGA kopolimerlerinden, boş ve 17-ß estradiol yüklü nanopartiküller, emülsiyon-çözücü-buharlaştırma yöntemi ile hazırlanmıştır. Nanopartiküllerin karakterizasyonu sonucu, boş ve E2 yüklü partikül büyüklüklerinin sırasıyla yaklaşık 200 ve 241 nm olduğu saptanmıştır. Üretilen nanopartiküllerin E2 enkapsülasyon verimlerinin, 50:50 PLGA için %29 ve 65:35 PLGA için ise % 52 olduğu HPLC ve UV spektrofotometre ölçümlerinden hesaplanmış ve en uygun taşıyıcı sistemin 65:35 PLGA nanopartiküllerle oluşturulabildiği belirlenmiştir. Nanopartiküllerden salım çalışması 40 gün sürdürülmüş ve nanopartiküllere yüklenen E2'nin % 45'inin salındığı saptanmıştır.İçsel bağlantılı ve makrogözenekli kitosan/hidroksiapatit (HA) süpergözenekli doku iskeleleri, gaz köpükleştirme tekniği ve mikrodalga ışıma ile çapraz-bağlama yöntemi bir araya getirilerek sentezlenmiştir. Sulu fazda bulunan E2 yüklü PLGA nanopartiküller, kitosan/HA doku iskelelerine, önceden hazırlanmış iskelelere emdirilerek ve iskele üretimi sırasında kitosan çözeltisine katılarak olmak üzere iki şekilde yüklenmiştir. Ticari olarak bulunan suda çözünür E2 de doku iskelelerine emdirilerek yüklenmiştir. SEM (taramalı elektron mikroskobu) ve FTIR (Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi) analizleri ile PLGA nanopartiküllerin her iki yöntemle de doku iskelesi yapısına başarıyla katıldıkları gözlenmiştir.Nanopartiküllerin emdirilmesiyle hazırlanan doku iskelelerinden salım çalışması 55 gün sürmüş ve 17-ß estradiol'ün %100'ünün salındığı kümülatif salım profilinden belirlenmiştir. Nanopartiküllerin doku iskelesi üretimi aşamasında yüklendiği durumda ise salım 135 gün sürmüştür ve sistemden 17-ß estradiol'ün % 92'sinin salındığı belirlenmiştir. Suda çözünür E2 yüklü doku iskelesinden yapılan salım çalışmasında E2'nin 8 günde % 80'i salınmıştır.Tezin son aşamasında, E2 içeren PLGA nanopartikül-kitosan/HA doku iskelesi sisteminin osteojenik aktivitesi AdMSC'ler kullanılarak in-vitro koşullarda hücre kültürü çalışmaları ile incelenmiştir. Doku iskelelerinde hücre üremesi MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analizi ile hücrelerin doku iskelesi içerisindeki morfolojileri ise SEM ile belirlenmiştir. Erken dönem osteojenik farklılaşma, ALP(alkalen fosfataz) aktivitesinin ölçümü ile belirlenmiştir. RT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) ile AdMSC'lerin kollajen I, osteokalsin, ve ß-aktin ekspresyon seviyeleri tespit edilmiştir. Analiz sonuçlarına göre nanopartikül yüklü grupların, AdMSC hücrelerinin osteojenik farklılaşmasını ve matris mineralizasyonunu diğer gruplara göre daha fazla desteklediği görülmüştür.Sonuçlar 17-ß estradiol yüklü PLGA nanopartikül-kitosan/HA doku iskelesi sisteminin 17-ß estradiol'ün kontrollü ve uzun dönemde salımını sağladığını göstermektedir. Ayrıca, hazırlanan sistem, AdMSC'lerin üremesini ve osteojenik farklılaşmasını önemli ölçüde arttırdığı için kemik doku rejenerasyonu için değerlendirilebilir.Anahtar Kelimeler: 17-ß estradiol, poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA), nanopartikül, kontrollü salım, adipoz kökenli kök hücre (AdMSC), kemik doku mühendisliği.

Abstract:
The aim of the present study was to develop a system of 17-ß estradiol (E2) loaded poly (lactic-co-glycolic acid) PLGA nanoparticles-chitosan/hydroxyapatite (HA) tissue scaffold and to investigate the in-vitro effectiveness of this system in adipose derived mesenchymal stem cell (AdMSC) cultures for bone tissue regeneration.In the first part of the study, free and 17-ß estradiol loaded PLGA nanoparticles were prepared from different compositions of PLA/PGA (50:50 and 65:35) by using emulsion-solvent evaporation technique. Characterization studies showed that free and 17-ß estradiol loaded particle sizes were approximately 200 nm and 240 nm, respectively. Encapsulation efficiency of nanoparticles was calculated as 29% and 52% for 50:50 PLGA and 65:35 PLGA, respectively by using UV spectrophotometer and HPLC. Accordingly, 65:35 PLGA nanoparticles were selected as optimum carrier system. Release study from nanoparticles was continued up to 40 days and cumulative release (%) of 17-ß estradiol from nanoparticles was determined as 45 %.Interconnected and macroporous chitosan/ HA superporous tissue scaffolds were synthesized by combining microwave irradiation and gas foaming techniques. PLGA nanoparticles in the aqueous phase were loaded into the chitosan/HA scaffolds by two ways i.e. during manufacturing by stirring and after manufacturing by embedding. In addition, water soluble E2 that available as commercial was loaded into the chitosan/HA scaffolds by embedding. SEM (scanning electron microscope) and FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy) analysis observed that PLGA nanoparticles were successfully loaded into the chitosan/HA scaffolds.In-vitro release studies indicated that 100 % of 17-ß estradiol was released from the scaffolds loaded with PLGA nanoparticles by embedding, during 55 days. While the 92 % of the 17-ß estradiol was releasing during 135 days from chitosan/HA scaffolds that was containing PLGA nanoparticles loaded by scaffold fabrication, 80 % of water-soluable E2 was released from scaffolds in 8 days.In the last part of the study, osteogenic activities of E2 loaded PLGA nanoparticles-chitosan/HA tissue scaffold were determined in-vitro cell culture studies by using AdMSCs. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT (3-[4,5-dimethylthiazoyl-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay and morphological examination was performed with SEM. Early cell differentiation was quantified by the determination of ALP (alkalene phosphatase) activity. Collagen I, osteocalcin and ß-actin expression levels were determined using RT-PCR (real time polymerase chain reaction). According to the results, it was observed that nanoparticle loaded systems supported the osteogenic differentiation of AdMSCs and extracellular matrix mineralization much more than other scaffolds.The results indicate that the system of 17-ß estradiol loaded PLGA nanoparticles-chitosan/HA tissue scaffolds provides controlled and long term release of 17-ß estradiol. Also this system significantly enhanced proliferation and osteogenic differentiation of AdMSCs.Keywords: 17-ß estradiol, poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), nanoparticle, controlled release, adipose derived mesenchymal stem cell, bone tissue engineering.