Serratia marcescens kitinaz B ve C genlerinin ekspresyonu ve Galleria mellonella'ya karşı insektisidal aktivitelerinin belirlenmesi
Expression of chitinase B and C genes of Serratia marcescens and determining their insecticidal activities against Galleria mellonella
Yazar: ARZU ÖZGEN
Danışman: DOÇ. DR. REMZİYE NALÇACIOĞLU
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Böceklerde kutikula ve bağırsağı çevreleyen peritrofik membranın yapısında önemli miktarda kitin bulunmaktadır. Kutikula ve peritrofik membranın yapısında bulunan kitinin kitinaz enzimleri tarafından parçalanması, böceğin beslenmesini ve korunmasını düşürmekte ve böylece böceği zayıf duruma getirmektedir. Bu nedenle kitinaz enzimleri, zararlı böceklere karşı biyolojik mücadele materyali olarak kullanılma potansiyeline sahip önemli enzimlerdir.Bu çalışmada, Xyleborus dispar'dan izole edilmiş Serratia marcescens bakterisi kullanıldı. Bu bakteriden kitinaz B ve C enzimlerini kodlayan genler (chiB ve chiC) dejenerat primerler kullanılarak PCR ile çoğaltıldı. Çoğaltılan genlerin nükleotid dizilimini belirlemek için PCR ürünleri dizin analizine gönderildi. Dizin analizi yapılan chiB ve chiC genlerinin DNA sıraları literatürdeki mevcut kitinaz genlerinin DNA sıraları ile karşılaştırıldı.Analiz sonuçları, bu çalışmada kullanılan S. marcescens bakterisine ait chiB geninin literatürde ki, S. marcescens (BJL200) chiB genine %96 oranında ve chiC geninin de, literatürde ki S. marcescens chiC (AJ630582.1) genine %96 oranında benzer olduğunu gösterdi. Dizin analizi yapılan bu kitinaz genleri pHY300PLK shuttle vektörüne klonlandı ve elde edilen rekombinant plazmitler çeşitli B. thuringiensis suşlarına ve E. coli DH10ß'ya elektroporasyonla aktarıldı.Rekombinant plazmit içeren B. thuringiensis suşlarına ve E. coli DH10ß hücrelerine plazmit stabilite testi uygulandı. Test sonucuna göre konak hücrelerin rekombinant plazmiti muhafaza edemedikleri tespit edildi.Rekombinant plazmit içeren B. thuringiensis suşlarının Galleria mellonella (Lepidoptera) larvaları üzerindeki insektisidal aktivitesi araştırıldı. Sonuç olarak, rekombinant plazmiti taşıyan B. thuringiensis suşlarının, plazmit taşımayan suşlara ve kitinaz kaynağımız olan S. marcescens bakterisine göre daha yüksek bir insektisidal aktivite gösterdikleri tespit edildi.Anahtar Kelimeler: Bacillus thuringiensis, Kitinaz, Serratia marcescens, İnsektisidal aktivite

Abstract:
There are significant amount of chitin in the structure of peritrophic membrane which surround cuticle and gut in insects. Degradation of the chitin, found in the structure of cuticle and peritrophic membrane by the chitinase enzymes, decreases the feeding and the defence of the insect and thus makes the insect weak. Therefore chitinases are important enzymes which have potential as being use biological control agent against harmful insects.In this study, the genes encoding chitinase B (chiB) and chitinase C (chiC) from Serratiamarcescensthat isolated fromXyleborusdispar, amplified with dejenerate primers by PCR.For identifying the nucleotide sequence of the amplified genes, PCR products were sequenced. Nucleotide sequences of chiB and chiC genes were determined and compared with other chiB and chiC genes.Analysis results showed that chiB and chiC genes belong to S. marcescens have96% homology with S.marcescens(BJL200) chiB gene for chitinaseB and 96% homology with S. marcescenschiC (AJ630582.1) for chitinaseC. Chitinase genes from S. marcescenswere cloned into the pHY300PLK shuttle vector and these recombinant plasmids were introduced into E. coli DH10ß and various strains of Bt by electroporation.Plasmid stability test was performed to the B. thuringiensisstrains and E. coli DH10ß cells including recombinant strains. According to the test results it is determined that host cells could not save the recombinant plasmids.Insecticidal activity of B. thuringiensisstrains containing recombinant plasmids were tested on G. mellonellalarvae. As a result Bt strains harboring recombinant plasmids showed higher insecticidal activity than parental Bt strains and S. marcescens.KeyWords:Bacillusthuringiensis,Chitinase, Serratiamarcescens,İnsecticida lactivity