Trametes versicolor beyaz çürükçül fungusundan lakkaz enziminin saflaştırılması ve kısmi nitelendirilmesi
Purification and partial characterization of laccase from white rot fungus Trametes versicolor
Yazar: MELTEM GÖKSEL
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ALİ TÜRKAN
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Beyaz çürükçül mantarlar = White rot fungus ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Karakterizasyon = Characterization ; Lakkaz = Laccase

Özet:
Beyaz çürükçül fungus Trametes versicolor, ağaç gövdesinde yaşamakta olupkarbon kaynağı ihtiyacını karşılamak için ağaç kabuğunu degrade edebilmektedir.Bunun için lignin peroksidaz, mangan peroksidaz ve lakkaz enzimlerinisalgılamaktadır. Bu enzimlerin fonksiyonları lignin, hemi-selüloz ve selülozdanoluşan ağaç kabuğunu parçalamaktır. Bu özelliklerinden dolayı bu enzimler,endüstriyel alanda da yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, lignin, fenol vetürevleri gibi yıkımı güç (recalcitrant) maddelerin yıkımında etkili olan ligninperoksidaz, mangan peroksidaz ve lakkaz enzimlerini sekonder metabolit olaraküreten beyaz çürükçül fungus Trametes versicolor'dan lakkaz enzimi optimumşartlarda üretilerek kısmi saflaştırılmış ve nitelendirilmiştir.Trametes versicolor lakkaz'ın optimum üretim şartlarının belirlenmesi içinortamın pH değeri, glikoz miktarı ile iz elementler ve farklı indükleyicilerin (fenol,bakır sülfat, guaikol ve veratril alkol) etkisi incelenmiştir. Sonuç olarak en yükseklakkaz enzimi üretimi pH değerinin 5 ve glikoz konsantrasyonunun 10 gL-1 olduğudeğerlerde elde edilmiştir. İndükleyici madde kullanılmadığı durumda optimizasyonuyapılan besiyerinde aktivite 200 ila 250 UL-1 arasında iken indükleyici olarak fenolkullanıldığı zaman (5 gL-1) aktivitenin 400 UL-1 değerine ulaştığı görülmüştür.Lakkaz enzimi, optimizasyonu yapılmış ve indüklenmiş ortamda maksimumüretimin gerçekleştiği zamanda inkübasyon durdurularak saflaştırma işlemlerine tabitutulmuştur. Saflaştırma işlemlerinde enzimin yük dengesi kullanılarak anyondeğişim kromatografi kullanılmış ve elde edilen örnekler SDS-PAGE ilebelirlenmiştir. Saflaştırılmış lakkaz enziminin molekül ağırlığı SDS-PAGE ile 80kDa ve kinetik çalışması sonucu ABTS için Km ile Vmax değerleri sırasıyla 0.366 ?Mve 1652 UL-1 olarak bulunmuştur.

Abstract:
White rot fungus Trametes versicolor, which lives on boles, can degradebarks as a source for carbon necessity. Therefore it secretes lignin peroxidase,mangan peroxidase and laccase. The functions of these enzymes degrade the barkwhich consists of lignin, hemi-cellulose and cellulose. Hence, due to these properties,these enzymes are widely used in industrial areas. In this study, the laccase enzymewas produced in optimum conditions from white rot fungus Trametes versicolor,which produces lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase that areeffective in the destruction of recalcitran materials e.g. lignin, phenol and derivative,and it was partially purified and characterized.The effects of pH value, the amount of glucose, trace elements and differentinducers (phenol, cupper sulphate, guaiacol and veratril alcohol) were studied inorder to determine the optimum produce conditions of Trametes versicolor laccase.As a result, the highest laccase enzyme was produced at pH and glucoseconcentration 5 and 10 gL-1, respectively. In optimized medium, the enzyme activitywas between 200-250 UL-1 when inducer was absent. It was seen that the activityreached 400 UL-1 when phenol used as an inducer. When the maximum enzymeproduction was occurred at optimized and induced medium, the incubation wasstopped and the laccase was subjected to purification procedure. Anion exchangechromatography was used in the purification steps using charge balance andmaintained sample was determined by SDS-PAGE. The molecular weight of thepurified laccase was found 80 kDa with SDS-PAGE and kinetic constant Km andVmax values for ABTS were determined 3.66x10-4 ?M and 1652 UL-1, respectively.