Fare ovaryumu kök hücrelerinin Real Time-PCR ve immünhistokimyasal yöntemlerle araştırılması
Investigation of stem cells in mouse ovaries by Real Time-PCR and immunohistochemical methods
Yazar: YASHAR ESMAEİLİAN
Danışman: PROF. DR. ESRA ATABENLİ ERDEMLİ
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Günümüze kadar kabul gören insan ovaryumundaki oositlerin oluşumu ve gelişimi ile ilgili bilgiler son yıllarda tamamen değişim göstermektedir. İddia edildiği gibi kök hücrelerden oosit ve granüloza hücresi oluşumunun olası varlığı üreme biyolojisi ve infertilite tedavisi adına büyük değişimlere yol açacaktır. Bu araştırmanın amacı, fare ovaryumlarında olası kök hücre potansiyeline sahip hücrelerin varlığının ve yerleşimlerinin gösterilmesi ve ilerideki araştırmalarda ovaryumla ilgili infertilitenin `'autologous'' tedavisinde kullanılmasıdır. İnfertilite tedavisinin yanı sıra ovaryum kök hücreleri in vitro koşullarda benzersiz `'totipotent'' özellik gösterir. Bu hücreler fibroblastlara, epitelyal hücrelere ve nöral hücrelere farklılaşabilir ve aynı zamanda yeni oosit hücrelerine ve partenogenik embriyoya dönüşebilir. OKH'leri bu özelliklerinden dolayı prematür bozukluğunun otolog tedavisinde ve aynı zamanda nörodejeneratif hastalıkların otolog kök hücre tedavisinde, allogenik embriyonik kök hücrelerine veya çekirdek aktarımı yöntemine ihtiyaç duymadan kullanılabilir.Bu araştırma BALB-C türü iki haftalık (erişkinlik öncesi) ve sekiz haftalık (erişkin) farelerin ovaryumu üzerine yapılmıştır. Histolojik analizi için, İki (iki fare) ve sekiz (iki fare) haftalık ovaryum dokusu Bouin tespit sıvısıyla tespit edildikten sonra bilinen ışık mikroskobu takip yöntemlerinden geçirilip parafine gömülmüş olan dokulardan alınan kesitler Hematoksilin Eozin (HE) ve Periodik Asit Shift (PAS) boyama yöntemiyle boyanıp korteks kısmında yer alan follikül ve oositler, epitelyum germinativum değerlendirilmiştir. Çalışmanın amacına uygun olarak iki (döert fare) ve sekiz (dört fare) haftalık ovaryumlardan alınan kriyo kesitlerde kök hücre işaretleyicilerini (Sox2, Nanog ve Oct-4) araştırmak için immünohistokimyasal yöntem kullanılmıştır. Real Time-PCR ile iki yaş gurubu (dörder fare) örneklerin ovaryum dokusunda Oct4, Nanog ve Sox2 genlerinin ifade varlığı ve aynı zamanda ifade farkı araştırılmıştır.İmmünohistokimyasal boyama yönteminin sonuçlarına göre her iki yaş gurubu ovaryumunda Oct-4 (ovaryum epitel hücrelerinin sitoplazmasında, granüloza hücrelerinin sitoplazmasında, oosit sitoplazmasında ve teka hücrelerinin sitoplazmasında), Nanog (sadece oosit çekirdeğinde) ve Sox2 (ovaryum epitel hücrelerinin sitoplazmasında, granüloza hücrelerinin sitoplazmasında, oosit çekirdeğinin çevresinde ve sitoplazmasında ve teka hücrelerinin sitoplazmasında) proteinleri tespit edilmiştir.RT-PCR yöntemiyle iki ve sekiz haftalık farelerin ovaryumunda Oct-4, Nanog ve Sox2 genlerinin ifade olduğu tespit edilmiş, Real Time-PCR sonuçlarına göre Oct-4 ve Nanog genlerinin ifade düzey farkı iki ve sekiz haftalık yaş grupları arasında anlamlı bulunmuştur. Sox2 geninin ifade düzeyinde ise iki yaş gurubu arasında kayda değer fark gözlenmemiştir. Oct-4 geninin ifade seviyesi iki haftalık örneklerde daha fazlayken Nanog geni sekiz haftalık örneklerde daha fazla ifade olmuştur. Çalışmamız iki yaş gurubu ovaryumda bu genlerin Real Time-PCR'la ifade farkını gösteren ilk çalışmadır.Sonuç olarak EKH belirteçlerini taşıyan bu hücrelerin varlığı ve değişik hücre gruplarındaki dağılımı çalışmamızda gösterilmiştir. Bu hücreler daha çok sitoplazmalarında gösterdikleri pozitif işaretleyicilerle kök hücre özelliklerini taşıdıklarını göstermektedir ancak bu hücrelerin gerçekten kök hücre olduklarını tespit etmek için farklılaşabilme yetenekleri de daha sonraki çalışmalarda gösterilmelidir.

Abstract:
The knowledge of formation and development of human oocyte which was acceptable until recent years has changed completely. As claimed, possible presence of oocyte and granulosa cells formation from stem cells will lead to major changes on reproductive biology and infertility treatments. Purpose of this research is to demonstrate possible existence and location of cells that have a potential of stem cells in mouse ovaries and to be used in autologous treatment of ovarian related infertility in future researches. Together with infertility treatments under in vitro circumstances, ovarian stem cells (OSCs) show unique totipotent features that have not been found in other adult stem cell types. They differentiate into fibroblasts, epithelial, and neural cells, as well as new eggs and parthenogenetic embryos producing embryonic stem cells (ESC). Because of these features, OSCs could be utilized for autologous treatment of premature ovarian failure and also for autologous stem cell therapy of neurodegenerative diseases without use of allogeneic embryonic stem cells or somatic cell nuclear transfer.This research was done on two weeks (pre adulthood) and eight weeks (adult) BALB-C type of mice ovaries. For histological analysis in cortex of ovarian tissue, general structures such as follicles, oocytes and epithelial germinativum after fixation with BOUIN solution and well-known tissue processing methods, were embedded in paraffin. Sections were stained with Hematoxylin Eosin (HE) and Periodic Acid Shift (PAS) for evaluation of follicles. In addition, by taking frozen sections from ovarium, these sections by using of antibody were investigated with stem cell markers (Sox2, Nanog and Oct-4). Possible expression and differences between expression of Oct-4, Nanog and Sox2 genes in two age groups of ovarian tissue samples were determined with Real Time-PCR.According to the results of immunohistochemical staining for both age groups, presence of Oct-4 (cytoplasm of ovarian epithelial cells, granulose cells, oocytes and theca cells), Nanog (nucleus of oocyte) and Sox2 (cytoplasm of ovarian epithelial cells, granulose cells, oocytes and theca cells) proteins have been detected.By using of RT-PCR, expression of Oct-4, Nanog and Sox2 genes were found in two and eight week mice ovaries. Moreover, according to the results of Real Time-PCR, Oct-4 and Nanog genes expression levels between two and eight week groups had significant differences.Remarkable differences in expression levels of Sox2 between two age groups were not observed. Expression level of Oct-4 in two week samples were more than eight week samples, while in case of Nanog expression level was higher in eight week samples. Our research is the first study that shows expression differences of these genes by quantitative RT-PCR.Because of these markers are ESC determiner, we considered that both of prepuberty and adult mice ovaries have had cells that sustain stem cells features.