Bazı Salvia türlerinin sekonder metabolitlerinin analizi, genomik karakterizasyonu ve biyolojik aktivitelerinin incelenmesi
Analysis, genomic characteristics and biological activities of secondary metabolites of some Salvia species
Yazar: SEDA DAMLA HATIPOĞLU
Danışman: PROF. DR. TURAN ÖZTÜRK ; PROF. DR. GÜLAÇTI TOPÇU
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Organik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Botanik = Botany ; Genetik = Genetics ; Kimya = Chemistry
Dizin: Ada çayı = Sage ; Bitki fenolikleri = Plant phenolics ; Biyolojik aktivite = Biological activity ; DNA = DNA

Özet:
Salvia (adaçayı) türleri terpenik bitkilerce zengin olan Lamiaceae (Labiatae) familyası bitkileridir. Dünyada 900'ü aşkın Salvia türü vardır, başlıca yaygın olarak bulunduğu ülkeler Çin, Brezilya, Meksika ve çoğunlukla Akdeniz bölgesinde yer alan Avrupa ülkeleridir. Türkiye'de ise 96 tür ve 105'i aşkın takson ile temsil edilen Salvia türlerinin sekonder metabolitleri başlıca terpenoit, steroit, flavonoit ve diğer fenolik bileşiklerden ibarettir. Özellikle taşıdıkları di- ve triterpenler nedeniyle antienflamatuvar, antiviral, hepatotoksik, sitosoksik/antitümör aktivitelerinin yanı sıra taşıdıkları flavonların antioksidan, antimikrobiyal, sitotoksik vb. pek çok aktiviteye sahip olduğu bilinen bir gerçektir. Salvia divinorum bitkisi ise Avrupa ve Asya kıtasındaki türlerin aksine neo-klerodan yapısındaki diterpenoid bileşikler ve özellikle salvinorin A ve salvinorin B'ce zengindir ve kappa-opioid reseptörlerine (KOR) karşı seçicilik gösterir ve halusinojenik özellikler taşıması bakımından bitkinin diğer türlerinden ayrılır. Ülkemizde halk arasında adaçayı olarak tüketilen bitkinin türleri içerisinde halusinojenik etken madde içeriklerinin taranması son derece önemlidir. Çünkü neo-klerodan diterpen yapıdaki bileşikler Salvia türlerinde yaygın olarak bulunmaktadır. 50 yılı aşkın süredir Lamiaceae, Verbenaceae, Euphorbiaceae, Compositae (Asteraceae) gibi familyalardan bir çok neo-klerodan bileşikleri izole edilmiştir. Yapılarındaki ilave furan halkası taşımalarıyla neo-klerodan diterpenler, diterpenler içerisinde taksonomik marker olarak bilinirler. Salvinorin A bileşiği çok güçlü halusinojenik bir bileşiktir ve salvinorin B bileşiği ile birlikte beynin Kappa-Opioid reseptörlerine karşı seçicilik gösterir. Kappa-Opioid reseptör ligandları bağımlılık, depresyon, ruhsal denge bozukluğu ve şizofren gibi akıl hastalıkları rahatsızlıklarında rol oynamaktadır. 
Salvia türleri üzerindeki çalışmalarımızın devamı niteliğinde olan bu tez çalışmasında, ülkemizin farklı bölgelerinden toplanmış 40-45 adet Salvia türünün;
i.	Başlıca sekonder metabolitlerinden fenolik ve salvinorin bileşik içeriklerinin, güvenilirliği sağlanmış bir metot ile sıvı kromatografi/tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) kullanılarak tayin edilmesi,
ii.	Diğer sekonder metabolitlerinden olan uçucu organik bileşik içeriklerinin termal desorpsiyon gaz kromatografi kütle spektrometresi (TD-GC-MS) tekniği ile incelenmesi,
iii.	Salvia türlerinin genomik DNA dizi analizlerinin yapılarak gen haritalarının çıkarılması, türler arasında filogenetik benzerlik durumlarının ortaya konulması,
iv.	Salvia türlerinin farklı yöntemler kullanılarak antioksidan ve antimikrobiyal aktivitelerinin incelenmesi, içerdikleri sekonder metabolitler ile yapı-aktivite ilişkisinin kurulması amaçlanmıştır.

Bu tez çalışmasında, Salvia türlerinin toprak üstü kısımlarının metanol ekstreleri hazırlanmıştır. Bu ekstrelerin fenolik bileşik içerikleri [7 adet fenolik asit (kafeik, klorojenik, p-kumarik, salisilik, sirinjik, rosmarinik ve t-ferulik asit), 8 adet flavonoit (apigenin, izoramnetin, kamferol, luteolin, penduletin, kersetagetin-3,6-dimetileter, kersetin ve salvigenin), 5 adet flavonoit glikozit (izokersetin, kamferol-3-rutinozit, luteolin-7-O-glikozit, kersitrin ve rutin hidrat), pirogallol, vanillin ve fumarik asit] LC-MS/MS metodu ile kantitatif olarak belirlenmiştir. Salvia türlerinde çoğunlukla kafeik asit (7,11-185,03 µg/g), fumarik asit (8,32-2119,85 µg/g), luteolin (12,92-344,68 µg/g), penduletin (3,35-740,57 µg/g), rosmarinik asit (134,6-4420 µg/g) ve rutin hidrat (5,23-7522,31 µg/g) bileşenleri tespit edilmiştir.  Bu ekstrelerin salvinorin içerikleri de yine LC-MS/MS metodu ile belirlenmiştir. Salvinorin A bileşeni en fazla S. recognita, S. cryptantha ve S. glutinosa (212,86±20,46 µg/g, 51,50±4,95 µg/g ve 38,92±3,74 µg/g) bitki türlerinde olduğu tespit edilmiştir. Salvinorin B bileşiğinin ise en fazla S. potentillifolia, S. adenocaulon ve S. cryptantha (2351,99±232,22 µg/g, 768,78±75,90 µg/g ve 402,24±39,71 µg/g) türlerinde bulunduğu belirlenmiştir. Bitkilerin uçucu organik bileşikleri termal desorpsiyon gaz kromatografisi kütle spektrometresi yöntemi ile tespit edilmiştir. Uçucu organik bileşenlerin içerikleri türler arasında farklılık göstermekle birlikte başlıca borneol (%0,09-37,4), β-karyofillen (%0,23-10,27), spathulenol (%0,03-14,07), karyofillen oksit (%0,03-11,25), β-bisabolon (%0,21-7,96), bisiklogermakren (%0,06-33,31), 1,8-sineol (ökaliptol) (%0,04-23,1) ve kamfor (%0,05-13) bileşikleri tespit edilmiştir. Genomik DNA analizleri için, bitki türlerinin 5S rRNA kodlayıcı gen dizileri aydınlatılmış ve türler arasındaki evrensel akrabalık ilişkileri, benzerlikleri belirlenmiştir. Salvia bitkilerinin DNA dizileri ile GenBank'dan alınan Salvia divinorum bitkisinin DNA dizisi, çoklu sekans hizalama programları ile hizalanmış ve türlerin halusinatif etkili Salvia divinorum bitkisine olan benzerlikleri ortaya konulmuştur. Salvia türlerinin DNA dizilerinin çoğunlukla 300 bp ile 500 bp baz çifti arasında olduğu tespit edilmiştir. Ancak Salvia nemorosa (467 bp), Salvia glutinosa (466 bp), Salvia russellii (424 bp) ve Salvia verticillata (269 bp) türlerinin diğer Salvia türlerinde çoğunlukla 300 bp baz çifti uzunluğundan farklı oldukları tespit edilmiştir. Salvia divinorum bitkisinin literatürde 487 bp baz çifti uzunluğuna sahip olduğu kayıt edilmiştir. Türlerin baz dizilimleri Clusteal W çoklu sekans hizalayıcı program ile düzenlenmiştir. Böylece Salvia divinorum bitkisine benzerlikleri kemometrik ve genomik olarak incelenmiştir. Antioksidan aktivite analizleri için ekstrelerin Folin-Ciocalteu ayıracı ile toplam fenolik miktarları pirokateşole ve aluminyum nitrat yöntemi ile toplam flavonoit miktarları kersetine eşdeğer olarak tayin edilmiştir. Ekstrelerin toplam fenolik içerikleri 13,90±0,56-164,06±2,82 µg/mg aralığında,  toplam flavonoit içerikleri ise 14,15±0,11-58,57±0,00 µg/mg aralığında değiştiği belirlenmiştir. ABTS katyon radikali giderme aktivitesi ve Bakır (II) iyonu indirgeme antioksidan kapasitesi (CUPRAC) ise Trolox'a eşdeğer olarak belirlenmiştir. Ekstrelerin gram ekstre başına mmol Trolox'a eşdeğer; ABTS katyon radikali giderme aktivite kapasitesi 0,16±0,00-1,55±0,00 mmol TR/g aralığında, CUPRAC aktivite kapasitesi 0,25±0,00-2,47±0,00 mmol TR/g aralığında tespit edilmiştir. DPPH serbest radikal giderimi ve lipid peroksidasyon inhibisyonu aktivitesi (β-karoten renk açılımı) % inhibisyon cinsinden 4 farklı derişimde (10, 25, 50 ve 100 µg/mL) incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar 
α-tokoferol, BHT ve BHA standart maddeleriyle mukayese edilerek değerlendirilmiştir. Antimikrobiyal aktiviteleri ise sırasıyla Gram negatif bakteri E. Coli, Gram pozitif bakteri S. aureus, maya C. albicans ve mikobakteri M. Smegmatis'e karşı disk difüzyon yöntemi ile incelenmiştir. Standart olarak negatif kontrol DMSO, pozitif kontrol Gentamisin, Oxacillin, Ketoconazole ve Streptomisin antibiyotikleri kullanılmıştır. Salvia blepharochlaena ve Salvia modesta türleri M. smegmatis'e, Salvia kronenburgii ve Salvia poculata türleri ise S. aureus'e karşı aktivite göstermişlerdir. Bunun yanı sıra S. aureus'a karşı Salvia heldreichiana iyi, Salvia aucheri, Salvia hypargeia, Salvia modesta ve Salvia trichoclada orta, Salvia bracteata, Salvia euphratica, Salvia huberi, Salvia glutinosa ve Salvia nemorosa az, Salvia pachystachys ise çok az antimikrobiyal aktivite göstermiştir.

Abstract:
Salvia (Sage) species belong to the families of the Lamiaceae (Labiatae) family, rich in terpenic plants. There are more than 900 Salvia species in the world, the main countries of which are China, Brazil, Mexico and mostly European countries in the Mediterranean region. Secondary metabolites of Salvia species in Turkey, represented by more than 105 taxa and 96 species, are mainly terpenoids, steroids, flavonoids and other phenolic compounds. Due to the presence of di- and triterpenes, they have anti-inflammatory, antiviral, hepatotoxic and cytotoxic/antitumor activities along with antioxidant, antimicrobial, cytotoxic, etc. properties of flavonoids. Salvia divinorum plant, in contrary to European and Asian species, is rich in diterpenoid compounds having neo-clerodane structure, especially salvinorin A and salvinorin B. It shows selectivity toward Kappa-opioid receptors (KOR) and is distinguished from other species due to its hallucinogenic properties. Screening the hallucinogenic active ingredients in plant species consumed by people in our Country is extreamly important since neo-clarodane diterpenoid compounds are common in Salvia species. Over 50 years, many neo-clerodane compounds have been isolated from species such as Lamiaceae, Verbenaceae, Euphorbiaceae, and Compositae (Asteraceae). Neo-clerodane diterpenes are known to be taxonomic markers in diterpenes due to the additional furan ring in their structure. Salvinorin A is a very strong hallucinogenic compound and, in combination with salvinorin B, displays selectivity toward Kappa-Opioid receptors of brain. The kappa-opioid receptor ligands play a role in mental disorders such as addiction, depression, mental disorder and schizophrenia. In this thesis, which is the continuation of our studies on Salvia species, 40-45 Salvia species collected from different regions of our country, and they were subjected to;
i. Determination of the phenolic and salvinorin content of major secondary metabolites by a reliable method, using liquid chromatography / tandem mass spectrometry (LC-MS / MS).
ii. Investigation of volatile organic compounds from other secondary metabolites by thermal desorption gas chromatography mass spectrometry (TD-GC-MS)
iii. Analyses of genomic DNA sequences of Salvia species to generate genomic maps, identification of phylogenetic similarities between species,
iv. Investigation of antioxidant and antimicrobial activities using different methods and establishment of their structure-activity relationship with the secondary metabolites they contain.
In this PhD study, methanol extracts of arial parts of some Salvia species, collected from different regions of Turkey, were prepared. The phenolic contents of these extracts, found to be 7 phenolic acids (caffeic, chlorogenic, p-coumaric, salicylic, syringic, rosmarinic and t-ferulic acids), 8 flavonoids (apigenin, isorhamnetin, kaempferol, luteolin, penduletin, quercetin-3,6-dimethylether, quercetin and salvigenin), 5 flavonoid glycosides (isoquercetin, kaempferol-3-rutinoside, luteolin-7-O-glycoside, quercitrin and rutin hydrate), pyrogallol, vanillin and fumaric acid were quantitatively determined by LC-MS/MS method. In Salvia species, in general, caffeic acid (7.11-185.03 μg/g), fumaric acid (8.32-2119.85 μg/g), luteolin (12.92-344.68 μg/g), penduletin (35-740.57 μg/g), rosmarinic acid (134.6-4420 μg/g) and rutin hydrate (5.23-7522.31 μg/g) were detected. The salvinorin contents of these extracts was also determined by LC-MS/MS method. While salvinorin A was found to be the most abundant in S. recognita, S. cryptantha and S. glutinosa 
(212.86 ± 20.46 μg/g, 51.50 ± 4.95 μg/g and 38.92 ± 3.74 μg/g), salvinorin B was found to be rich in S. potentillifolia, S. adenoculon and S. cryptantha (2351.99±232.22 μg/g, 768.78±75.90 μg/g and 402.24±39.71 μg/g), respectively. The volatile organic compounds of the plants were determined by thermal desorption gas chromatography mass spectrometry method. Although the contents of the volatile organic compounds differed among the species, mainly borneol (0.09-37.4%), 
β-caryophyllene (0.23-10.27%), spathulenol (0.03-14.07%), caryophyllene oxide (0.03-11.25%),  β-bisabolon (0.21-7.96%), bicyclohexane (0.06-33.31%), 1,8-cineole (eucalyptol) (0.04-23.1%) and camphor (0.05-13%) were determined.
For genomic DNA analysis, the 5S rRNA coding gene sequences of the plant species were elucidated, and similarities and universal kinship between species were identified. The DNA sequences of the Salvia plants and the DNA sequence of the Salvia divinorum plant from GenBank were aligned with the multiple sequence alignment programs and the similarities of the species to the hallucinogenic Salvia divinorum plant were revealed. It has been determined that the DNA sequences of Salvia species usually are between 300 bp and 500 bp. But Salvia nemorosa 
(467 bp), Salvia glutinosa (466 bp), Salvia russellii (424 bp) and Salvia verticillata (269 bp) were, in general, found to differ from other Salvia species by 300 bp base length. In the literature, the Salvia divinorum plant was reported to have a base length of 487 bp. The base sequences of the species were arranged by Clusteal W multiple sequence alignment program. Thus, similarities to the Salvia divinorum plant were investigated chemometrically and genomically. The total phenolic and flavonoid contents of the extracts were determined to be equivalent to pyrocatechol and quercetin, using Folin-Ciocalteu and aluminum nitrate method, respectively. The total phenolic and the total flavonoid contents of the extracts were found to be between 13.90±0.56-164.06±2.82 μg/mg and 14.15±0.11-58.57±0.00 μg/mg, respectively. ABTS cation radical scavenging activity and Copper (II) ion antioxidant capacity (CUPRAC) were determined to be equivalent to Trolox. Radical scavenging capacity toward ABST cation and CUPRAC activity capacity were determined to be between 0.16±0.00-1.55±0.00 mmol TR/g and 0.25±0.00-2.47±0.00 mmol TR/g, respectively. DPPH free radical scavenging and lipid peroxidation inhibition (β-carotene-linoleic acid assay) were studied at 4 different concentrations (10, 25, 50 and 100 μg/mL) in % inhibition. The results were concluded comparing with α-tocopherol, BHT and BHA standards. Antimicrobial activities were examined, applying disc diffusion method, against Gram negative bacteria E. coli, Gram positive bacteria S. aureus, yeast C. albicans and mycobacteria M. smegmatis. As standard, negative control DMSO, positive control Gentamycin, Oxacillin, Ketoconazole and Streptomycin antibiotics were used. While Salvia blepharochlaena and Salvia modesta species demonstrated activity toward M. smegmatis, Salvia kronenburgii and Salvia poculata species showed activity against S. aureus. Moreover, toward S. aureus, Salvia heldreichiana good, Salvia aucheri, Salvia hypargeia, Salvia modesta and Salvia trichoclada modest, Salvia bracteata, Salvia euphratica, Salvia huberi, Salvia glutinosa and Salvia nemorosa little antimicrobial activities they showed.