Theileria annulata laktat dehidrogenazının in vitro ve in silicoanalizler ile inhibisyonunun sağlanması
Evaluation of bacterial enzymes for drug design
Yazar: SELCAN AKAR
Danışman: PROF. DR. DİLEK BALIK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Keneler yaşam döngülerinin doğası gereği iklime duyarlıdır. Kene kaynaklı hastalıklar iklimsel değişikliklerden yüksek oranda etkilenecek hastalıklar arasında bulunmaktadır. Theileria parazitleri farklı kene türleri aracılığıyla yayılmakta ve iklim koşulları parazitlerin coğrafi dağılımında belirleyici rol oynamaktadır. Tropikal theileriosise neden olan T. annulata besicilik sektöründe büyük ekonomik kayıplara ve üretimsel verimin düşmesine neden olmaktadır. T. annulata'nın tedavi amaçlı kullanılan buparvaquone'a karşı direnç geliştirdiği rapor edilmektedir. Bu nedenle, var olan etki mekanizmalarından farklı yeni bir ilaca olan ihtiyaç artmaktadır. Theileriosis tedavisinde yeni ilaç hedefi olarak T. annulata laktat dehidrogenaz belirlenmiştir. Tez kapsamında in silico ve in vitro çalışmalar eş zamanlı olarak yürütülerek, TaLDH'ı inhibe edecek potansiyel bileşiklerin bulunması amaçlanmaktadır. İnhibisyon deneylerinde kullanılmak üzere TaLDH'ın ifadesi ve %95 saflıkta eldesi sağlanmıştır. TaLDH'ın stabilizasyon çalışması gerçekleştirilmiş ve 24 saat sonrasında saf TaLDH'a 1 M sükroz eklendiğinde aktivitesini koruduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada TaLDH'ın bilinen bir inhibitörü olmamasından dolayı 21 adet FDA onaylı ilaç etken maddeleri içeren bileşik kütüphanesinin saf TaLDH üzerindeki %inhibisyon kapasiteleri test edilmiştir. Bu etken maddeler TaLDH üzerinde literatürde ilk defa test edilmiş olup, TaLDH aktivitesini %73,36 oranla inhibe eden ilaç etken maddenin Omeprazol olduğu belirlenmiştir. In silico çalışmaların ilk basamağında TaLDH'ın açık, yarı açık ve AlphaFold olmak üzere üç adet homoloji modeli tasarlanmıştır. Modellenen üç yapının katalitik bölgelerine yaklaşık 650000 bileşiğin moleküler yanaştırması yapılmıştır. Moleküler yanaştırma sonucu 37 bileşiğin moleküler dinamik simülasyon analizleri 100 sn'de gerçekleştirilmiş olup MM/GBSA serbest bağlanma enerjileri hesaplanmıştır. Simülasyon sonucu en iyi 3 bileşiğin (2962711, 12004532, 256622) 100 ns'de katalitik bölgede kurdukları etkileşimler tespit edilmiştir. Yapıya dayalı ilaç tasarımı methodları kullanılarak belirlenen bileşikler litaratürde ilk defa TaLDH potansiyel inhibitör adayı olup, mevcut tedavi yöntemi olan buparvaquone'a direnci rapor edilen T. annulata'ya yönelik yeni ilaç arayışları için umut vaad etmektedir.

Abstract:
Ticks are sensitive to climate due to the nature of their life cycles. Tick-borne diseases are highly affected by climatic changes. Theileria parasites are spread by tick species and climatic conditions play a decisive role in the distribution of parasites. T. annulata causes tropical theileriosis in cattle and further leads to huge economic losses and decreased production efficiency in the livestock sector. T. annulata has developed resistance to Buparvaquone, which is used for treatment, hence the demand for a new drug that differs from the current mechanism of action is increasing. T. annulata lactate dehydrogenase has been identified as a new drug target. Within the scope of the thesis, in silico and in vitro studies are performed simultaneously to find potential compounds that will inhibit TaLDH. The expression and 95% purity of TaLDH were obtained for use in inhibition experiments. Stabilization analysis of TaLDH was performed and it was determined that when 1 M sucrose was added to pure TaLDH, it maintained its activity after 24 hours. Since no known inhibitor of TaLDH exists, 21 FDA approved drug active ingredients were tested for their inhibition% capacity on pure TaLDH. This compound library was tested on TaLDH for the first time in the literature and it was determined that the drug active ingredient that inhibited TaLDH activity by 73.36% was Omeprazole. Three homology models of TaLDH were designed. Molecular docking of approximately 650000 compounds to catalytic sites of models was performed. As a result of molecular docking, molecular dynamics simulation analyses of 37 compounds were performed in 100 ns, and MM/GBSA free binding energies were calculated. The best 3 compounds (2962711, 12004532, 256622) identified using structure-based drug design methods are the first TaLDH potential inhibitor candidates in the literature. They are promising in the search for new drugs for T. annulata that develop resistance.