İmmatür sığır oositlerinin parlak krezil mavisi (BCB) boyasıyla seçiminin embriyo gelişim oranlarına etkisi
The effect of selection of immature bovine oocytes with brillant cresyl blue (BCB) stain on embryo development rates
Yazar: CANSU GÖKTEPE TURHAN
Danışman: PROF. DR. YUNUS ÇETİN
Burdur Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu çalışmanın amacı farklı konsantrasyonlarda kullanılan PKM boyasının
blastosist aşamasına kadar gelişimi destekleyecek immatür sığır oositlerin
seçimindeki etkinliğini ortaya koymaktı. Tez çalışması için mezbahaneden getirilen
ovaryumlar aspire edildikten sonra oositler rastgele iki guba ayrıldı. Morfolojik
kriterlere göre seçilen A ve B kalite oositler kontrol grubu olarak kullanıldı. Kontrol
grubundaki oositler direkt olarak maturasyon işlemine alındı. Boyama gruplarında
ise oositler hiçbir kriter gözetilmeksizin boyama işlemine alındı. Parlak krezil mavisi
boyası (B5388; Sigma) yıkama solüsyonu içerisinde 26, 13 ve 6,5 μM
konsantrasyonlarda hazırlandı. Oositler DPBS ile 12 damlada yıkanarak PKM
boyasında 90 dk inkübatörde bekletildi. Boya alan oositler (PKM+) ile boya almayan
(PKM-) oositler ayrıldıktan sonra PKM+ oositler maturasyon işlemine alındı.
Maturasyon %5 O₂, %5 CO₂ ve %90 N₂ içeren ortamda 21-22 saat sürede gerçekleşti.
Maturasyon solüsyonundan arınan oositler IVF petrisine alındı. Fertilizasyon
droplarına hazırlanan spermadan eklendi. Ardından petri 24 saat inkübatöre
kaldırıldı. İn vitro fertilizasyon petrisinden alınan oositler içerisinde yıkama
solüsyonu bulunan ependorflara alınarak 3 dk boyunca vortekslendi. Oositler 3
damlada kültür medyumunda yıkanarak kültür petrisine alındı. Muhtemel zigotlar 6
gün kültürde tutuldu. Fertilizasyon sonrası 4. günde zigotların klivaj oranları not
edildi. Kültürün 6. ve 7. gününde ise blastosistlerin aşamaları kaydedildi. Boyama
gruplarından PKM 26 цM konsantrasyonda 268 oositten 189 oositin (%70,5), 13 цM
konsantrasyonda 254 oositten 193'ünün (%76) ve 6,5 цM konsantrasyonda 302
oositten 218 oositin (%72,2) boya aldığı tespit edildi. Kontrol grubunda maturasyona
alınan oositlerin %97,3'ünün, boyama gruplarından PKM 26 цM konsantrasyonda
%2,6'sının, 13 цM konsantrasyonda %4,1'nin, 6.5 цM konsantrasyonda ise %5'inin
matür olduğu gözlemlendi. Kontrol grubunda kültüre alınan oositlerin %35,9'u
blastosiste dönüşürken PKM 26 цM, 13 цM ve 6.5 цM konsantrasyonlarda ise bu
oran %0 olarak tespit edildi. Sunulan çalışma sonucunda 26 μM, 13 μM ve 6.5 μM
olmak üzere 3 farklı konsantrasyonda 90 dakika sürede kullanılan PKM boyası ile
seçilen oositlerden blastosist üretimi yapılamamıştır. Literatürde PKM boyasının
oosit seçiminde başarı ile kullanıldığı bildirilmiş olsa da toksite testleri olmayan bir
kimyasal in vitro embriyo üretim prosedüründe kullanımına ihtiyatla yaklaşılmalıdır.

Abstract:
The aim of this study was to determine the effectiveness of Brillant Cresyl Blue
(PKM) dye used at different concentrations in the selection of immature bovine
oocytes to support development until the blastocyst stage. Oocytes were randomly
divided into two groups after aspirating the ovaries brought from the abattoir for the
thesis study. A and B quality oocytes selected according to morphological criteria
were used as control group. Oocytes in the control group were taken directly to
maturation process. In the staining groups, oocytes were stained without any criteria.
Brillant cresyl blue stain (B5388; Sigma) was prepared in washing solution at
concentrations of 26, 13 and 6.5 μM. Oocytes were washed with DPBS in 12 drops
and kept in the incubator for 90 min in PKM stain. After separating the oocytes that
received dye (PKM +) and oocytes that did not receive dye (PKM -), PKM + oocytes
were taken into maturation process. Maturation was performed for 21-22 hours in an
environment containing 5% O₂, 5% CO₂ and 90% N₂. The oocytes were removed
from the maturation solution and placed in the IVF petri dish. Prepared semen was
added to the fertilisation drops. Then the petri was placed in the incubator for 24
hours. Oocytes taken from the in vitro fertilisation petri dish were placed in
ependorfs containing washing solution and vortexed for 3 min. Oocytes were washed
in 3 drops of culture medium and transferred to the culture petri dish. Possible
zygotes were kept in culture for 6 days. The cleavage rates of zygotes were noted on
the 4th day after fertilisation. On the 6th and 7th day of culture, the stages of
blastocysts were recorded. Among the staining groups, 189 oocytes out of 268
oocytes (70.5%) at 26 цM concentration, 193 oocytes out of 254 oocytes (76%) at 13
цM concentration and 218 oocytes out of 302 oocytes (72.2%) at 6.5 цM
concentration were stained. It was observed that 97.3% of the oocytes in the control
group, 2.6% in the PKM 26 цM concentration, 4.1% in the 13 цM concentration and
5% in the 6.5 цM concentration were mature. While 35.9% of the oocytes cultured in
the control group transformed into blastocyst, this rate was 0% in PKM 26 μM, 13
μM and 6.5 μM concentrations. As a result of the present study, blastocysts could not
be produced from oocytes selected with PKM dye used at 3 different concentrations
of 26 μM, 13 μM and 6.5 μM for 90 minutes. Although it has been reported in the
literature that PKM dye has been used successfully in oocyte selection, it is cautious
to use a chemical without toxicity tests in in vitro embryo production procedure.