Listeria monocytogenes tayinine yönelik DNA hibridizasyonuna dayalı elektrokimyasal genosensör tasarımı ve optimizasyonu
Design and optimization of electrochemical genosensor based on DNA hybridization for the detection of Listeria monocytogenes
Yazar: ZÜMRÜT ÜRKÜT COPCUOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. PINAR KARA KADAYIFCILAR ; PROF. DR. YEKTA GÖKSUNGUR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Cevap yüzey yöntemi = Response surface methodology ; Listeria monocytogenes = Listeria monocytogenes

Özet:
Bu tezde, gerçek gıda örneklerinde, Listeria monocytogenes tayini için, indikatörsüz DNA dizi algılama yöntemine dayalı elektrokimyasal genosensör tasarımı ve optimizasyonu araştırılmıştır.Çalışmada tek kullanımlık grafit elektrotlar kullanılmıştır. DNA düzeyinde algılamaya yönelik tasarlanan genosensörde elektrot yüzeyi, tayini yapılan mikroorganizmanın patojenitesinden sorumlu gen bölgesini simgeleyen tek sarmal prob DNA dizi ile kaplanmıştır. En yüksek biyosensör seçiciliği kovalent bağlama yöntemi ile elde edilmiştir. Elektrot yüzeyini en iyi şekilde kaplayan prob konsantrasyonu 10 ppm olarak belirlenmiştir.Hibridizasyon parametreleri olan hedef konsantrasyonu, hibridizasyon süresi ve tuz konsantrasyonunun biyosensör seçiciliği üzerine etkilerini incelemek için Cevap Yüzey Yöntemi kullanılmıştır. Hibridizasyon sonrası hedef dizi ve tüm bazları hedeften farklı rastgele diziden alınan sinyallerin oranı (H/NC) istatistiksel analizin cevabı olarak değerlendirilmiştir.İstatiksel analiz sonuçları her durum için model uyumunun iyi olduğunu göstermiştir. Hedef konsantrasyonu, hibridizasyon süresi ve tuz konsantrasyonunun biyosensör seçiciliği üzerine güçlü doğrusal bir etkiye sahip olduğu görülmüştür. Biyosensör seçiciliği için belirlenen optimum koşullarda (hedef konsantrasyonu 54.25 ppm, hibridizasyon süresi 30.30 dakika, tuz konsantrasyonu 44.65 mM) maksimum H/NC oranı model tarafından hesaplanan değerden (11.14) biraz daha yüksek (13.22) olarak elde edilmiştir.Optimum koşullarda, farklı gıda örneklerinin analizi farklı metodlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Hibridizasyon derecesi, Diferansiyel Puls Voltametrisi ile elde edilen guanin oksidasyon sinyalleri ve Elektrokimyasal Empedans Spektroskopisi kullanılarak belirlenmiştir. Geliştirilen analiz yöntemiyle gerçek gıda örneklerinde Listeria monocytogenes tayini yapılmış ve elde edilen cevapların klasik yöntemle benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Yapılan çalışmada tespit limiti 1.98 ppm olarak bulunmuştur.Tasarlanan genosensörün Listeria monocytogenes amplikonlarını seçici olarak tespit edebildiği görülmüştür. Biyosensör seçiciliği için hibridizasyon koşulları arasındaki etkileşimleri saptamak ve optimize etmek için cevap yüzey yönteminin kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
In this thesis, design and optimization of electrochemical genosensor based on label free DNA technique for the detection of Listeria monocytogenes in real food samples was investigated.Disposable pencil graphite electrodes (PGE) were used as working electrode. PGE surface was covered by single stranded DNA array that is responsible of pathogenities of microorganism. The highest biosensor selectivity was obtained with covalent attachment technique. Optimum prob concentration was found as 10 ppm.Response Surface Methodology was used to investigate the effects of three hybridization parameters (target concentration, hybridization time and and salt concentration) on the biosensor selectivity. The ratio of electrochemical transduction after hybridization with complementary and noncomplementary targets (H/NC) was the response of the statistical analysis.Results of statistical analysis showed that the fit of the model was good in all cases. Target concentration, hybridization time and salt concentration had a strong linear effect on the biosensor selectivity. The maximum H/NC ratio which was slightly higher (13.22) than the value given by the model (11.14) was obtained at the concentration of the process variables (target concentration 54.25 ppm, hybridization time 30.30 min., salt concentration 44.65 mM).Under the optimized conditions, different food samples were analyzed by using different methods. The extent of hybridization was determined by using guanine oxidation signals obtained with Differential Pulse Voltammetry and Electrochemical Impedance Spectroscopy. Listeria monocytogenes determination was realized for real food samples by using the developed analysis method and the obtained results showed similarities with the classical method. A detection limit of 1.98 ppm of Listeria monocytogenes was estimated.The designed genosensor was able to detect Listeria monocytogenes amplicons specifically obtained from food samples. The response surface methodology was found to be useful in optimizing and determining the interactions among hybridization variables for biosensor selectivity.