Combined effects of antibiotics on the anaerobic microbial community structure, investigation of metabolites and antibiotic resistance genes
Antibiyotiklerin anaerobik mikrobiyal komunite üzerindeki etkisinin belirlenip,  metabolit oluşumu ve antibyotik direnç gelişiminin incelenmesi
Yazar: SEVCAN AYDIN
Danışman: PROF. DR. ORHAN İNCE
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering

Özet:
Antibiyotikler, insan ve veterinerlik alanında en yaygın olarak kullanılan ilaçlardır. Canlılar tarafından alınan bu aktif bileşikler, canlı metabolizmasında ya hiç değişmeden ya da çok az dönüştürülmüş halde metabolizmadan atılmaktadırlar. Atılan bu aktif antibiyotik kalıntıları arıtma tesislerinden arıtılamadan deşarj oldukları için doğrudan alıcı ortama girmekte, toprak ve sudaki konsantrasyonları günden güne artmaktadır. Geleneksel olarak atıksu arıtma sistemleri, aşırı nutrient, mikrobiyal kirlilik problemleri, azot ve fosfor giderimi hedef alınarak geliştirilmiştir. Bu yüzden farmasötikler gibi doğal ve sentetik bileşiklerin birçoğu klasik arıtım sistemlerde tam olarak giderilemeyip nehirler, yeraltı suları ve içme suları gibi sucul ortamlara deşarj edilmektedir. Ekosistem üzerinde önemli etkileri olan antibiyotikler, insan sağlığı ve çevre için ileri derece risk oluşturmaktadır. Ayrıca bu maddeler, patojen bakterilerin antibiyotiğe direnç geliştirmesine neden olarak, öncelikle halk sağlığı, ardından da tarım ve hayvancılıkta önemli problemler ortaya çıkartmaktadır.
Gerçekleştirilen tezde, insanlarda sıklıkla görülen enfeksiyonel hastalıkların tedavisinde kullanılan eritromisin, sülfonamid ve tetrasiklin antibakteriyel ve antibiyotik etken maddeleri, anaerobik ardışık kesikli reaktörlerde, kolay ayrışan organik maddeler ile beslenmiş ve bu maddelerin davranışları ve diğer organik maddelerin giderimi üzerindeki kronik etkileri konvansiyonel ve spesifik parametreler ile tespit edilmiştir. Bu kapsamda ET (Eritromisin-Tetrasiklin), ST (Sülfametoksazol-Tetrasiklin), ES (Eritromisin- Sülfametoksazol), ETS (Eritromisin-Tetrasiklin-Sülfametoksazol) ve kontrol olmak üzere 5 adet anaerobik ardışık kesikli reaktör (AKR) bir yıl süresince işletilmiştir. Antibiyotiklerin üçlü ve ikili kombinasyonlarının miktarları reaktörler çökene kadar kademeli olarak arttırılmış ve anerobik AKRlerdeki mikrobiyal kominite, antibiyotik direnç gelişimi ve antibioyotik biyodegredasyon potansiyelleri ve transformasyon ürünlerinin oluşumu   13 ay boyunca gözlenmiştir. Ayrıca antibiotiklere karşı mikroorganizmaların çeşitli gen transfer yöntemleri ile kazandığı bilinilen 'Antibiyotik Direnç Genleri (ADG)'nin oluşumu ve kantifikasyonu DNA ve RNA bazında, qPCR (gerçek zamanlı kantitatif PCR) ve İllumina HiSeq 2000 yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sistemde antibakteriyel ve antibiyotiklerin giderimi ve çamurda birikimini Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) ve LC/MS/MS (QTRAP) ile ölçülmüş olup bu etken maddelerin bilinen metabolitleri de ORBİTRAP sistemi (Micromass, Manchester, UK) ile tespit edilmiştir. Son olarak, bu etken maddelerin varlığında ortamda bulunan organik maddelerin ve seçilmiş farmasötiklerin gideriminden sorumlu mikrobiyal komünite ve aktif gruplar/türler kurulacak olan 16S rDNA/rRNA klon kütüphaneleri ile tanımlanmıştır. Mikrobiyal komünitenin profilindeki değişimleri izlemek için Denaturan gradyan jel elektorfarezi (DGGE) ve Ion Torrent PGM analizleri kullanılmıştır. Seçilen antibiyotik kombinasyonlarının anaerobik proseslerde yer alan Bakteri, Arke, Metanojenik Arkelere ve homoasetojenik ve metanojenik metabolizmada yer alan enzimlere spesifik etkisi qPCR kantifikasyonu ile belirlenmiştir.
Antibiyotik içeren suların arıtımında anaerobik arıtma sistemlerindeki arıtım performansı esas olarak mikroorganizma topluluğunun birbiri ile ilişkilerine ve bu aktif maddeleri biyokimyasal döngüleri yoluyla parçalama potansiyellerinin etkilenmesine bağlıdır. Tezin gerçekleştirilmesi sonucunda görülmüştür ki her antibiyotik kombinasyonu anaerobik arıtıma farklı şeklilerde etki etmektedir. Tüm reaktörlerde antibiyotik konsantrasyonundaki artışına bağlı olarak KOİ gideriminde, biyogaz ve metan üretiminde düşüş gözlenmesine rağmen, ETS ve ET antibiyotik kombinasyonlarının ST ve ES kombinasyonlarına göre daha iyi bir arıtım performansı gözlenmiş olup, bunun da sülfametoksazol antibiyotiğinin antibiyotik kombinasyonları üzerinde gösterdiği antagonistik etkiden kaynaklandığı düşünülmektedir. Proje sonucunda tüm antibiyotik kombinasyonlarının arıtım performansları incelendiğinde, en az %70 KOI gideriminin sağlandığı 10 + 1 mg/L (ST), 1 + 10 mg/L (ES), 2 + 2 mg/L (ET), 20 + 2 + 2 mg/L (ETS)  kombinasyonlarına kadar anaerobik arıtımın uygun olduğu görülmektedir.  
mRNA düzeyinde kantifikayonu yapılan metil koenzim redüktaz ve asetil koA sentaz enzimi sayesinde, antibiyotik kombinasyonlarının anaerobik sistemin bu son iki aşamasından en çok asetoklastik metanojenlerin yer aldığı basamağın etkilendiğini göstermektedir. Bu sonuçlar reakörlerdeki VFA birikimi ile de doğrulanmaktadır. Tüm reaktörler incelediğinde hepsinde en çok biriken VFA'nin asetat olduğu görülmektedir. Bu da kullanan antibiyotik kombinasyonlarının ortak olarak tüm reaktörlerde en çok asetoklastik metanojenleri etkilediğini göstermektedir. 16S rRNA qPCR sonuçları tüm işletme boyunca farklı anaerobik reaktörlerin performansını  birebir yansıtmaktadır. Ayrıca mikrobiyal ve aktif türlerin qPCR ve DGGE sonuçları göstermektedir ki antibiyotikler anaerobik mikrobiyal topluluğu etkileme potansiyeline sahiptir ve bu mikrobiyal popülasyonun inhibisyonu VFA sonuçlarındanda görüldüğü gibi, ciddi olarak organik madde parçalamasını etkilemektedir. Ayrıca elde edilen veriler sonucunda moleküler ve metagenomik analiz sonuçlarının antibiyotiklerin artan konsantrasyonlarının arıtımı boyunca değişen anaerobik reaktörlerin performansını yansıttığı görülmektedir. Bu da reaktör işletilmesinde ve özellikle antibiyotik gibi toksik maddelerin giderilmesi sırasında giderim verimini arttırmak için moleküler ve metagenomik anazlilerin kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca anaerobik arıtım sırasında antibiyotik direnç genlerinin oluştuğu gözlenmiş olup bu direnç genlerinin miktarının da artım boyunca arttığı gözlemiştir, arıtım sonucunda oluşan bu direnç genleri insan sağlığı için bir tehdit oluşturmaktadır. 
ADG ile qPCR sonuçları değerlendirildiğinde bakterilerin direnç kazanmasının sonucunda bunların sayılarının arttığı ve sistemin tekrar eden antibiyotik konsantrasyonlarında daha verimli bir arıtım gerçekleştiğini göstermektedir. Aynı zamanda antibakteriyel ve antibiyotiklere karşı mikrobiyal komünitenin kazandığı direnç genlerinin anaerobik sistemlerdeki davranışı incelenmiş olup bunların çeşidinin ve miktarlarının bu artım sürecinde ne kadar fazla artığı gözlenmiştir. Bu artış ekosisteme ve insan sağlığı üzerine gerçek bir tehdit oluşturmaktadır. Ayrıca, tespit edilen antibiyotik transformasyon ürünleri sayesinde de antibiyotiklerin arıtımda giderilmiş olarak görülmesine rağmen biyolojik olarak daha aktif yapılara dönüşerek inhibisyon etkilerini arttırdıkları gözlenmektedir. 
Projenin gerçekleşmesiyle, antibiyotik içeren atıksu kompozisyonu-mühendislik parametreleri-mikrobiyal komünite-metabolik yol izleri ilişkisi detaylı olarak incelenmiş olup bu maddelerin anaerobik proseslere etkisi mikro ve makro seviyede ortaya konmuştur. Elde edilen sonuçlar göstermektedir ki anaerobik arıtımda antibiyotikler yüksek oranda arıtılsa bile, atıksularda bu antibiyotik kalıntılarının varlığı, antibiyotiğe dayanıklı türlerin yayılmasına ve gelişmesine katkı sağlamaktadır. Ayrıca bu proje ile çevrede yüksek konsantrasyonlarda bulunan ve tüm canlıları olumsuz yönde etkileyen antibiyotik kalıntıları ve metabolitlerin, atıksularda yer alan antibiyotiklerin yetersiz arıtımından da kaynaklandığı görülmektedir. Bu aktif maddelerin etkilerinin en aza indirilmesi için antibiyotik içeren sularda sadece antibiyotik kalıntılarının değil aynı zamanda metabolitlerinin de tespit edilip, bunların deşarjı ile ilgili bir yasal düzenleme yapılması gerektiğini düşündürmektedir.

Abstract:
Antibiotics which are one of the most commonly used pharmaceutical products have a wide range of uses in both human and veterinary medicine.  These unfamiliar substances to existing enzyme systems are discharged to receiving bodies without or a little mineralization from treatment plants and accumulated in soil and sediment day by day. In this thesis, aims to develop an understanding of triple effects of sulfamethoxazole-erythromycin-tetracycline (ETS) and dual effects of sulfamethoxazole-tetracycline (ST), erythromycin-sulfamethoxazole (ES) and erythromycin-tetracycline (ET) on the microbial community structure, development of antibiotic resistance genes (ARGs), and how this relates to anaerobic sequencing batch reactors (SBRs) performance throughout  a year operation. This study also evaluated understanding the link between anaerobic microbial diversity and biodegradation of antibiotic combination and the occurrence of transformation products (TPs) in anaerobic reactors by amendments of different antibiotics combination and stepwise increasing concentrations. Concentrations of the antibiotics in the influent were gradually increased until metabolic collapse of the SBRs, which corresponded to ETS (40+ 3+ 3 mg/L), ES (2.5 + 25 mg/L), ET (4+ 4 mg/L) and ST (25 + 2.5 mg/L). Although COD removal efficiency and biogas/methane generation for ETS, ES, ET and ST fed SBRs decreased with increases of antibiotic concentrations, ETS and ET batch reactor showed a better performance compared to ST and ES batch reactors; this could be due to antagonistic effects of sulfamethoxazole. Anaerobic pre-treatment of these antibiotics can be a suitable alternative for concentrations at 10 + 1 mg/L, 1 + 10 mg/L, 2 + 2 mg/L, 20 + 2 + 2 mg/L for ST, ES, ET and ETS reactor respectively which corresponds to min 70% COD removal efficiency. Antibiotic measurement and TPs formed results of this study also indicated that the anaerobic process eliminated 1 mg/L, 15 mg/L, and  0.5 mg/L for ERY, SMX and TET antibiotics respectively which corresponds to average of 80% antibiotic degradation efficiency during SBRs operation. 16S rRNA quantification and Ion Torrent result could reflect the anaerobic SBRs performance. The results of this research support the idea that molecular and metagenomic analysis could be used for providing of the control and the improvements on the anaerobic system treating pharmaceutical wastewater. Additionally, evaluation of molecular data is useful for suggesting the potential to control ultimate microbial community composition via bioagmentation to successful for antibiotic biodegradation. Overall, the results reveal a valuable information about effect of antibiotic combinations on the development of ARGs in the anaerobic SBRs, even after anaerobic treatment, contribute to the spread of these genes in aquatic environment, which may increase the risk of ARGs to public health.