Dextranomer hyaluronik asit kopolimer enjeksiyonunun, mesane üreter orifisi düzeyinde oluşturduğu histolojik etkilerin değerlendirilmesi
Effects of dextranomer hyaluronic acid copolymer injection in to the different histologic layers of vesical bladder at the ureteric orifice level
Yazar: DENİZ MUBARİS ABDULLAHOĞLU
Danışman: PROF. DR. OĞUZ ATEŞ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Çocuk Cerrahisi = Pediatric Surgery
Dizin: Endoskopi = Endoscopy ; Hyalüronik asit = Hyaluronic acid ; Kopolimerler = Copolymers ; Tedavi = Treatment ; Vezikoüreteral reflü = Vesico ureteral reflux ; Üriner sistem enfeksiyonları = Urinary tract infections

Özet:
Giriş ve Amaç: Vezikoüreteral reflü (VÜR), idrarın mesaneden üretere ve/veya böbreğe geri kaçışıdır. VÜR'ün en önemli sebebi üreterovezikal bileşkenin (ÜVB) anormal anatomisi ve/veya disfonksiyonudur. VÜR, üriner sistem enfeksiyonu, renal skar oluşumu, hipertansiyon ve reflü nefropatisine sekonder kronik böbrek yetmezliğine neden olabilmektedir (1). 
Endoskopik subüreterik implant enjeksiyon (ESİE) tedavisi başarısının yüksek olması, minimal invaziv yöntem olması ve komplikasyonlarının düşük olması sebebi ile yaygın olarak uygulanmaya başlanmıştır. Endoskopik subüreterik enjeksiyon tedavisinin sonuçları yayınlanmaya başlandıkça enjeksiyon materyallerinin başarılı olduğu kadar konplikasyonlara da sebep olduğu anlaşılmıştır (3, 4). 
Son 30 yılda komplikasyon oranı düşük ideal enjeksiyon materyalinin keşfine yönelik araştırmalar yapılmıştır (3, 4, 5).
VÜR'ün endoskopik tedavisinde yaygın olarak kullanılan Dextranomer/ hyaluronik asit kopolimer (Dx/HA) ile yapılan deneylerde bu enjeksiyon materyallerinin güvenli olduğu ve migrasyonun olmadığını rapor edilmiştir (5, 9, 10). Ancak ilerleyen klinik araştırmalarda Dx/HA kopolimer ile yapılan subüreterik enjeksiyon sonrası hidronefroz gelişen olgular bildirilmiştir (6, 7, 8).
Dx/HA kopolimer'in hidronefroza neden olan ilerleyici enflamatuar cevabın enjeksiyon materyalinin üreterovezikal bölgede adventisya tabakasına yapılmış olması veya taşmış olması sebebi ile gelişmiş olabileceği vurgulanmıştır (6). Dx/HA kopolimer'in enjekte edildiği üreterovezikal bileşkeyi oluşturan farklı histolojik katmanlarında yaptığı histopatolojik değişiklikler araştırılmamıştır.
Bu çalışmada deneysel rat modelinde Dx/HA kopolimer'in mesane üreter orifisi düzeyinde ÜVB'de submukoza, düz kas (detrusor) ve adventisya tabakalarında oluşturduğu etkilerin histolojik değerlendirilmesi planlandı.
Gereç ve yöntem: Wistar-Albino tipi 35 adet rat 5 gruba ayrıldı. Orta hatt insizyon ile steril şartlarda laparatomi uygulanıp mesanenin histolojik katmanlarına enjeksiyon yapıldı. 
1. Kontrol grubu (n:7): Herhangi işlem yapılmadan mesane ve üreterler bütün olarak çıkarılıp, sol üreter orifisi düzeyinde ÜVB'nin histolojik değerlendirilmesi yapıldı. 
2. Sham grubu (n:7): Sol üreter orifisi düzeyinde ÜVB submukozasına 0,05 ml serum fizyolojik (SF) enjeksiyonu yapıldı. 
3. Submokoza-Dx/HA grubu (n:7): Sol ürter orifisi düzeyinde ÜVB submukozasına 0,05 ml Dx/HA kopolimer enjeksiyonu yapıldı.
4. Kas içi-Dx/HA grubu (n:7): Sol üreter orifisi düzeyinde ÜVB kası içine 0,05 ml Dx/HA kopolimer enjeksiyonu yapıldı. 
5. Adventisya-Dx/HA grubu (n:7): Sol üreter orifisi düzeyinde ÜVB adventisyasına 0,05 ml Dx/HA kopolimer enjeksiyonu yapıldı.
Cerrahi işlem sonrası birinci ayın (30 gün) sonunda eter anestezisi altında servikal dislokasyon ile ratlar sakrifiye edildi. Dokular %10 formaldehit ile fikse edilip, parafin bloklara gömüldü. Hematoksilen-Eozin (H&E) ve Masson trikrom ile boyama yapıldı. Hazırlanan preparatlar fibroblast yoğunluğu, kollajen oluşumu, kapiller artışı ve enflamatuar reaksiyon düzeyi açısından ışık mikroskopu altında değerlendirildi. Elde edilen veriler istatistiksel olarak Kruskal Wallis varyans analizi, Mann - Whitney U testi ve Ki – kare testi ile değerlendirildi.
Bulgular: Çalışmamızda mononüklear hücreler, adventisya-Dx/HA kopolimer grubunda kas içi-Dx/HA kopolimer grubundan belirgin olarak fazla saptanmış olup, submukoza-Dx/HA kopolimer grubunda ise diğer gruplardan daha az sayıda saptanmıştır.
Dev hücre sayısının submukoza-Dx/HA kopolimer grubunda kas içi-Dx/HA kopolimer grubundan az tespit edilmiş olup adventisya Dx/HA-kopolimer grubunda ise kas içi-Dx/HA kopolimer grubunda belirgin fazla sayıda saptanmıştır.
	Granülom kalınlıkları açısından tüm gruplar arasında anlamlı fark tespit edilmiştir. Submukoza-Dx/HA kopolimer grubunda granülom kalınlığı kas içi-Dx/HA grubundan ince tespit edilirken, granülom kalınlığı en kalın olarak adventisya Dx/HA-kopolimer grubunda tespit edilmiştir.
	Kapiller artış, fibroblast hücre sayısı, kollajen miktarı açısından gruplar arasında kantitatif değerlendirme yapılamamasına rağmen bu parametrelerde en belirgin artış adventisya-Dx/HA kopolimer grubunda izlenmiştir. Kas içi Dx/HA-kopolimer grubunda ise submukoza-Dx/HA kopolimer grubundan daha fazla artış gözlenmiştir.
	Makrofaj hücre sayıları gruplar arasında karşılaştırıldığında, adeventisya-Dx/HA kopolimer grubunda makrofaj sayısı kas içi-Dx/HA kopolimer grubundan daha fazla tespit edilirken, kas içi-Dx/HA kopolimer grubunda makrofaj sayısı submukoza-Dx/HA kopolimer grubundan belirgin olarak fazla izlenmiştir. Submukoza-Dx/HA kopolimer grubunda makrofaj sayısı eser miktarda izlenmiş olup, kas içi ve adventisya katmanlarına enjeksiyon yapılan deneklerde kronik enflamatuvar sürece uzamış akut enflamatuvar sürecin eşlik ettiği çalışmamızda gözlenmiştir. Çalışmamızda mast hücresi ve eozinofil artışı hiçbir denekte izlenmemiştir.		
Sonuç:	 ESİE tedavisinde seçilen implant maddenin özellikleri kadar enjeksiyon yapılan dokunun özelliklerinin de önemli olduğu görülmektedir. Çalışmamızda mesane kas içi ve adventisya dokularında Dx/HA kopolimer maddesinin mesane submukoza dokusu ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede fazla inflamatuar yanıta neden olduğu tespit edildi.
	Elde ettiğimiz bulgular VÜR tedavisinde Dx/HA kopolimer enjeksiyonu sonrası gelişen obstrüksiyon gelişimine enjeksiyon matreyelinin submukoza dışında kas içine veya adventisya tabakasına yapılması ile oluştuğunu düşündürmektedir.
	Bu çalışmada ESİE yapılırken enjeksiyonun submukozal alan dışına yapılmamasının önemi açıkça görülmektedir. ESİE başarı oranının arttırılması ve üreter obstrüksiyon gibi ciddi komplikasyon risklerinin azaltılması için de ESİE tekniğinin geliştirilmesi/ modifiye edilmesi gerekmektedir. Hastaların yaşlarına ve/veya eşlik eden komorbiditelerine göre mesane kalınlıkları standardize edilip enjeksiyon iğnesinin derinlik işaretleri çeşitlendirilerek üretilmesi ESİE başarı oranının artırılmasında ve komplikasyon oranlarının azaltılmasında yararlı olacaktır.

Abstract:
Introduction and aim: Vesicoureteral reflux is abnormal flow of urine from bladder back up to the ureters and kidneys. The leading cause of VUR is anomalous anatomy of ureterovesical junction (UVJ) and it's disfunction. VUR may cause chronic renal failure secondary to urinary tract infection, renal scarring, hypertension and reflux nephropaty (1).
Endoscopic subureteric implant injection is widely accepted minimally invasive, effective and safe treatment of VUR.  As well as high efficiency, outcomes of endoscopic treatment of VUR using different tissue bulking substances may cause complications as well (3, 4). 
Many ivestigations have been done for 30 years to find out an ideal tissue bulking substance with low rate of complications (3, 4, 5). The most widely used agent for endoscopic treatment of VUR currently is dextranomer/hyaluronic acid copolymer (Dx/HA). Results of the experiments with Dx/HA copolymer injection found to be safe and no migration of particules has been reported yet (5, 9, 10). However some clinical researches mentioned hydronephrosis after subureteric Dx/HA copolymer  injection (6, 7, 8).  
Reported progressive inflammatory changes resulting with hydronephrosis after Dx/HA copolymer  injection, considered to be caused beacuse of the material injected that might have been implanted into the ureteral adventitia or that extravasation occurred during the injection (6). It has not been searched, what kind of histologic changes occurs after injected Dx/HA copolymer in to the different histologic layers of ureterovesical junction.
The aim of this study is to evaluate histological effects of Dx/HA copolymer, injected in to the submucosa, smooth muscule (detrusor) and adventitia layers of UVJ at ureteric orifice level in an experimental rat model.  
Material and method:
Wistar – Albino type 35 rats were divided into 5 groups. 
Injections in to the tissue layers of vesical bladder made with midline incision laparatomies under sterile conditions.
 Control group (n: 7): Histologic evaluation of left UVJ at ureteric orifice level without any intervention.
 Sham Group (n: 7): 0,05 ml saline injection in to the submucosa of UVJ at the left ureteric orifice.
 Submucosa-Dx/HA group (n: 7): 0,05 ml Dx/HA copolymer injection in to the submucosa of UVJ at the left ureteric orifice.
Itramuscular-Dx/HA group (n: 7): 0,05 ml Dx/HA copolymer injection in to the muscular layer of UVJ at the left ureteric orifice.
 Adventitia-Dx/HA group (n: 7): 0,05 ml Dx/HA copolymer injection in to the adventitia layer of UVJ at the left ureteric orifice.
 A month (30 days) after sugery rats were sacrified under ether anesthesia by cervical dislocation. Tissues are fixed in 10% formaldehyde, embedded in paraffin and stained with Hemotoxyline - Eosin and Masson's Trichrome. The specimens were examined under light microscope to evaluate the degree of inflammatory rection,  fibroblast intensity, number of capillaries and  collagen formation.  Data were evaluated with Kruskal Wallis variance analysis, Mann - Whitney U test and Chi- square test.
Results: In our study mononuclear cells in adventitia–Dx/HA group was found greater than in Intramuscular-Dx/HA group, number of cells in Submucosa-Dx/HA group identified less than in other all groups.  
Giant cells in adventitia–Dx/HA group was found greater than in Intramuscular-Dx/HA group, number of giant cells in Submucosa-Dx/HA group were identified less than in all other groups.  
Significant difference determined in granuloma thickness between all the groups. Granuloma thickness in adventitia–Dx/HA group was found greater than in Intramuscular-Dx/HA group, Thickness of granuloma in Submucosa-Dx/HA group were identified finest.
Although quantitative assessment of capillary growth, number of fibroblast cells and amount of collagen formation could not be done, most significant increase in this parameter observed in adventitia-Dx/HA copolymer group. Number of above mentioned cells in Submucosa-Dx/HA group was identified less than in all other groups.
Macrophage cells in adventitia–Dx/HA group was found greater than in Intramuscular-Dx/HA group, number of cells in Submucosa-Dx/HA group identified less than in Intramuscular-Dx/HA group. In our study we found that injection of Dx/HA copolymer in to the muscular and adventitial tissue of bladder causes chronic inflammation process acompanied with acute inflammatory reaction.
	Increase in mast and eosinophil cells was not detected in any group. 
Conclusion: Characteristics of implantation tissue seems to be important as well as properties of the implant agent in Endoscopic Subureteric Implant Injection (ESII) treatment. In our study we determined that injection of Dx/HA copolymer into the muscular and adventitia layers of urine bladder causes significantly higher inflammatory response compared with Submucosa-Dx/HA group. 
	Our findings supports the hypothesis that the injection of Dx/HA copolymer deeper than the submucosal layer (injection in to the muscular or adventitial layer) of bladder may cause urethral obstruction after ESII treatment for VUR.
	In this study it is obviously seen how important not to make injection out of the submucosal layer in ESII treatment. To increase success rate of ESII and to reduce serious complications such as uretheral obstruction, ESII technique should be improved/ modified. Standardisation of bladder wall thickness by ages of patients and comorbidities effecting bladder wall thickness and diversifying production of marked needles with various depths can be usefull in increasing success rates of ESII as well as reducing complication rates.