Aydın/Türkiye'de echinococcus granulosus'un mitokondriyal sitokrom c oksidaz subunit 1 gen bölgesinin sekanslanarak moleküler karakterizasyonunun araştırılması
Molecular characterisation of  echinococcus granulosus isolates from Aydin/Turkey BY sequenci̇ng of mitochondrial cytochrome c oxidase I
Yazar: AYLİN BABAOĞLU
Danışman: PROF. DR. HATİCE ERTABAKLAR
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Aydın = Aydın ; Echinococcus = Echinococcus ; Echinococcus granulosus = Echinococcus granulosus ; Elektron nakil kompleksi IV = Electron transport complex IV ; Elektron nakil kompleksi IV = Electron transport complex IV ; Genler = Genes ; Genotip = Genotype ; Kistler = Cysts ; Mitokondriler = Mitochondria

Özet:
Echinococcus granulosus (E. granulosus), insanlarda ve çiftlik hayvanlarında görülen kistik ekinokokkoz (KE)'un etkeni olan yaygın bir zoonotik sestodtur. KE ülkemizde ve birçok ülkede ekonomik kayıplara yol açmaktadır. E. granulosus suşları arasında genetik çeşitliliğin yüksek olduğu bildirilmiştir. Günümüze kadar moleküler yöntemler kullanılarak farklı konaklardan on tane genotipi (G1-G10) belirlenmiştir. Türkiye'de ve dünyada en yaygın genotipin koyun suşu olan G1 olduğu ortaya konulmuştur. Ülkemizde ayrıca G3, G6 ve G7 genotiplerinin görüldüğü de bildirilmiştir. Buna rağmen Aydın da dahil olmak üzere birçok bölgede E. granulosus genotipleri konusunda yeterli bilgiye sahip olduğumuz söylenemez. Bu çalışmanın amacı Aydın'da ki E. granulosus izolatlarının genotiplerinin belirlenmesidir. Çalışma kapsamında Adnan Menderes Üniversitesi, Eğitim ve Araştırma Hastanesi Parazitoloji Laboratuvarı'na rutin parazitolojik inceleme için gönderilen cerrahi sonrası elde edilen kist sıvıları değerlendirilmiştir. Kist sıvılarındaki protoskolekslerden DNA izolasyonları ticari kit ile yapıldıktan sonra mitokondriyal sitokrom oksidaz subunit I (cox1) geni PCR ile çoğaltılmıştır. Amplikonlar sekanslanmış ve BLAST ile Genbank'daki referans sekanslarla karşılaştırılmıştır. İzolatların genotipleri tam veya en yakın benzerliklerine göre belirlenmiştir. Ayrıca, Neighbour Joining Tree kullanılarak filogenetik ağaç oluşturulmuştur. Protoskolekslerden izole edilen 22 DNA örneğinde PCR'da beklenen boyutta bant görülmüş ve sekanslanmıştır. E. granulosus cox1 geni ile benzerlik göstermeyen nonpesifik iki sekansın dışındaki 20 sekans analizlerde kullanılmıştır. Koyun suşu olan G1 izolatların büyük kısmını (15 izolat, %75) oluşturmakta olup bunu deve/domuz suşu G6/7 (5 izolat, %25) izlemektedir. G6/7 olarak tanımlanan 5 izolattan birinde tek nükleotit farkı (T141C) bulunmakta olup benzer şekilde G1 olarak tanımlanan 15 izolattan birinde de tek nükleotit farkı (C234T) görülmüştür. Bulgularımız ülkemizde daha önce yapılan çalışmalarla uyumluluk göstermektedir. Bu çalışmaların birçoğunda G1 en baskın genotip olarak bildirilmiştir. Çalışmamızda G1'in yanı sıra G6/7'ye rastlanması bölgemizde deve ve yaban domuzlarının da KE hastalığında rolünün olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca cox1 E. granulosus genotiplerinin belirlenmesi için uygun bir hedef gen olarak görülmektedir. Ülke genelinde yapılacak benzer ve kapsamlı çalışmalar sonucu elde edilecek epidemiyolojik verilerin KE hastalığının kontrolüne katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: Echinococcus granulosus, kistik ekinokokkoz, genotiplendirme, cox1, Aydın

Abstract:
Echinococcus granulosus (E. granulosus), the aetiological agent of Cystic Echinococcosis (CE) in humans and livestock, is a widely distributed zoonotic pathogen tapeworm that causes significant morbidity and economic loses in many countries, and also in Turkey. A high level of genetic diversity was reported between the isolates of E. granulosus. Up to now, ten genotypes (G1-10) of E. granulosus have been identified from different hosts by molecular genetic analysis. In most of the studies from Turkey and all around the world, G1 (sheep strain) was reported as the prevalent genotype in human and other hosts. Additionally, G3, G6 and G7 were also reported from Turkey. However, we still have limited information about the genotypes of human E. granulosus in Turkey. The aim of the present study was to determine genotypes of E. granulosus isolates in Aydın, Turkey. The study was conducted in Adnan Menderes University, Parasitology Laboratory. Genomic DNA was isolated with a commercially available kit (QIAamp DNA Mini Kit, Germany) from cyst fluids, aspirated during surgery. Mitochondrial, cytochrome oxidase subunit I (cox1) gene, was amplified with a single round PCR and sequenced. The sequences were analysed by using BLAST tool on website of NCBI. Genotypes were determined according to closest or exact matches in comparison with previously deposited reference sequences in Genbank. Additionally, a phylogenetic tree was constructed by using Neighbour Joining Tree. A total of 20 isolates were successfully amplified and sequences were acquired. DNA was isolated from of cyst fluids and 22 isolates were amplified with PCR. However, two of sequences showed little similarity with E. granulosus cox1 gene and they were eliminated. Four different sequences were identified by the alignment of isolate sequences in the present study. Sheep strain G1 was accounted the greatest majority of our isolates (15 isolates, 75%). The other genotype was G 6/7 (5 isolates 25%) which might be pig or camel originated genotypes. Similarly, for the 15 isolates which were identified as G1 there was one base substitution in one of them (C234T). Our study confirms the previous findings in Turkey that have indicated the predominance of sheep strain (G1). Additionally, similar to our findings pig or camel (G6/7) strain was reported less than sheep strain in previous studies from Turkey. It may be concluded that sheep and wild boars and camels in the study area may be the main agent of human CE cases in study area. The research has also shown that cox1 gene is a valuable target for determination of E. granulosus genotypes. It may be concluded that further studies in the field of CE concerning the genotypes of E. granulosus from different regions of Turkey will be important and will contribute the control of CE.
Keywords: Echinococcus granulosus, cystic echinococcosis, genotyping, cox1, Aydin