Glioblastom ve nöroblastom invitro hücre kültürlerinde antiepileptiklerin mitotik proliferasyon üzerine etkileri
Effects of antiepileptics on mitotic proliferation at in vitro cell cultures of glioblastoma and neuroblastoma
Yazar: ŞEYDA ÇEVİK
Danışman: PROF. DR. ERTUĞRUL BOLAYIR
Cumhuriyet Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Nöroloji = Neurology
Dizin: Antikonvülsanlar = Anticonvulsants ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Mitoz = Mitosis ; Nöroblastom = Neuroblastoma

Özet:
Beyin tümörleri ameliyat öncesi, ameliyat sonrası ve ameliyatın mümkün olmadığı durumlarda hastalarda epileptik nöbetlere neden olabilir. Bu nöbetler tümör nedeniyle ve tedavi için kullanılan kemoterapi ve radyoterapiye ikincil olabileceği gibi metabolik bozukluğa ikincil gelişen ensefalopati nedeniyle de olabilir. Ayrıca nöbetlerin sıklığı tümör tiplerine ve tümörün lokalizasyonuna göre de değişiklik göstermektedir. Beyin tümörlü hastaların epileptik nöbet sıklığı tümörün cinsine göre değişiklik gösterse de bu oranın yüksek olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Malign karakterli beyin tümörleri başta olmak üzere tümörlü hücrelerde atipik mitotik proliferasyon mevcuttur.Daha önce ki çalışmalara bakıldığında bazı antiepileptik ilaçların mitotik proliferasyon üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Benzer çalışmalarda da görüldüğü gibi antiepileptiklerin mitotik proliferasyon üzerinde direkt veya indirekt etkileri olmaktadır. Beyin tümörlü hastalarda ise büyük çoğunluğu antiepileptik kullanmasına rağmen bütün antiepileptik ilaçların mitotik proliferasyon üzerindeki etkileri karşılaştırılmalı olarak araştırılmamıştır.Bu çalışmada ki amacımız glioblastoma ve nöroblastoma hücre kültüründe invitro şartlarda antiepileptiklerin mitotik proliferasyon üzerindeki etkilerini karşılaştırmalı olarak göstererek tedavideki önceliğini belirlemekti.Çalışmamızda kullanılan antiepileptiklerden gabapentin, pregabalin, valproik asit, levetirasetam, zonisamid, fenitoin, karbamazepinin in-vitro antitümoral etkinlikleri gerçek zamanlı hücre analiz sistemi ile değerlendirildi. Çalışmada E-plate 16 isimli, herbir kuyucuğu 250 µL hacminde, zemin çapı 5mm olan ve 16 kuyucuktan oluşan plateler kullanıldı. İlk olarak her bir kuyucuğa hücre içermeyen, 100 µL besiyeri karışımı konularak cihazda bir baseline okuma yaptırılarak ardından flasklardan tripsinizasyon ve santrifüjasyon (800 RPM, 10 dakika) yoluyla toplanan hücreler kuyucuklara 100 µL hacim içerisinde ekildi.Kanser hücre hatları laminer flow içerisinde kuyucuklara ekildikten sonra plate inkübatörün içerisine yerleştirildi ve 1?er saatlik zaman aralıkları ile hücre büyümeleri takip edildi. Kuyucuklara ekilen tümör hücreleri kuyucuk tabanına yapıştı ve burada uygun besin ve O2/CO2 ortamında büyümeleri sağlandı. Kuyucuk tabanına yerleştirilmiş olan altın plak elektrik akımını kullanarak bölünen hücrelerin elektrik yük empedanslarını ölçerek ve hücrelerin büyüme indekslerini tespit etmemizi sağladı. Hücrelerin hızlı büyüme fazına girmelerinin ardından (Log fazı), deney grubu olarak belirlenen kuyucuklara antitümör etkinliği değerlendirilecek ajanlar 10 µL hacim içerisinde, değişen konsantrasyonlarda uygulandı. Bu uygulamayı takiben plate yeniden inkübatörün içerisine yerleştirildi. İlaç uygulamasının ardından 1?er saatlik ölçümlere devam edildi.Ve takip 24-48 saat boyunca sürdü.Gruplar arasındaki fark varyans analizini (ANOVA testi) takiben, post hoc TUKEY testi ile araştırıldı. Sonuç olarak bu çalışmada xCELLigence yönteminin antiepileptiklerin mitotik proliferasyonunu belirlemede kolay ve hızlı bir yöntem olduğunu ve antiepileptiklerin tümör hücreleri üzerine farklı sitotoksik etkinliklerini göstermiştir. Antiepileptiklerin antitümöral etkisini daha iyi anlamak için, antiepileptiklerin mitotik proliferasyona etkileriyle ilgili daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir.

Abstract:
Brain tumors may cause seizures in patients before and after surgery, and in conditions where surgery isn?t feasible. These seizures are not only secondary to tumor and chemotherapy or radiotherapy used in management but they can be also due to encephalopathy caused by metabolic disorder. Moreover, seizure frequency varies depending on tumor type and localization. Although frequency of epileptic seizures varies depending on tumor type in patients with brain tumor, it was shown to be high in previous studies. There is atypical mitotic proliferation in tumor cells, particularly in malignant brain tumors.Effects of some antiepileptic agents on mitotic proliferation have been demonstrated in previous studies. As seen in similar studies, antiepileptic agents have direct or indirect effects on mitotic proliferation. In patients with brain tumor, not all antiepileptic agents have been evaluated for their effects on mitotic proliferation in a comparative manner, although many of the patients with brain tumor use antiepileptic agent.The aim of this study was to identify the priority of antiepileptic agents in the management by comparatively demonstrating effects of these agents on mitotic proliferation in glioblastoma and neuroblastoma cell cultures in vitro.The in vitro anti-tumoral activities of antiepileptic agents used in our study including gabapentin, pregabalin, valproic acid, levetiracetam, zonisamide, phenytoin and carbamazepine were assessed by a real-time cell analysis system. In our study, we used E-plate 16 which had 16 wells with a volume of 250 µL and bottom diameter of 5 mm. Initially, 100 µL of culture media containing no cell was added to each wells and a baseline reading was performed in the device; then, cells harvested from flasks by trypsinization and centrifugation (800 rpm for 10 minutes) were inoculated to wells, as being 100 µL in volume. After inoculation of cancer cell lineages into wells, plate was placed into incubator and cell proliferation was monitored at every one hour. Tumor cells adhered to the bottom of wells and proliferated in appropriate nutrient and O2/CO2 conditions. The golden plate placed to the bottom of wells measured electric impedance of dividing cells by using electric current and allowed to determine growth index of cells. When cells entered to rapid proliferation phase (log phase), agents which would be evaluated for anti-tumoral activity was added to the wells predefined as experiment group in different concentration with a volume of 10 µL. Again, plates were placed into incubator. Measurements were maintained at every hour after adding agents. Monitorization was maintained for 24-48 hours.The differences among groups were evaluated by using analysis of variance (ANOVA) followed by post hoc Tukey test. In conclusion, the present study showed that xCELLigence is a convenient and rapid method to determine effects of antiepileptic agents on mitotic proliferation and antiepileptic agents have diverse cytotoxic activities on tumor cells. Further studies regarding effects of antiepileptic agents on mitotic proliferation are needed to better understand antitumoral effects of antiepileptic agents.