Damar içi implant materyal yüzeylerinde antitrombojenik ve antibakteriyel aktiviteyi artırmaya yönelik heparin immobilizasyonu
Heparin immobilization on the intravascular catheter surfaces for improving antithrombogenicity and antibacterial activity
Yazar: HATİCE FERDA ÖZGÜZAR
Danışman: PROF. DR. OSMAN EROĞUL ; DOÇ. DR. EBRU EVREN
TOBB Ekonomi ve Teknoloji Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
Geçici ya da kalıcı, dahili ya da harici olarak, tedavi ve/veya onarım gibi amaçlarla 
vücuda dahil edilen malzemeler implant materyalleri olarak adlandırılmaktadırlar. 
Günümüzde artan popülasyon ve uzun yaşam süreleri göz önüne alındığında, implant 
materyallerin kullanım sıklığı, miktarı ve süreleri giderek artmaktadır. Bu nedenle 
kullanılan implantların, kullanıldıkları bölgeye uyum sağlamaları, transplantasyon 
sonrası herhangi bir komplikasyon oluşmasını önleyecek şekilde tasarlanmaları 
gerektiği sonucuna ulaşılmaktadır. Tez kapsamında polimerik ve metalik alttaşlar 
olmak üzere iki farklı malzemede heparin adı verilen, klinikte güncel olarak 
antikoagülan ilaç olarak kullanılan biyomolekül ile yüzey modifikasyon stratejilerinin 
geliştirilmesi üzerine çalışılmıştır. Polipropilen (PP) tez kapsamında model polimerik 
malzeme olarak seçilmiş ve iki basamakta plazma polimerizasyon (PlzP) destekli 
yüzey modifikasyonu gerçekleştirilmiştir; (i) oksijen ile aşındırma ve (ii) amincezengin fonksiyonel grup oluşturma. PlzP tekniği ile geliştirilen yüzey modifikasyon 
parametreleri, temas açısı ölçüm, serbest yüzey enerji hesaplamaları, yüzeyde 
maksimum azot miktarını elde etme, yüzey pürüzlük değerinin artırılması kriterleri 
kapsamında değerlendirilmiş ve optimize parametre tespit edilmiştir. Heparin 
immobilizasyon işlemi, saf heparin (hep) ve kovalent bağ ajanları ile destekli (hep*) 
çözeltiler kullanılarak 3 farklı konsantrasyon üzerinden test edilmiştir. Yüzeye 
tutunumu sağlanan heparin miktarı Toluidine Mavi (TB) boya ile tespit edilmiş ve 
maksimum heparin tutunumunun sağlandığı konsantrasyon, optimize parametre olarak 
belirlenmiştir. Kovalent bağ ajanları ile destekli heparin çözeltisinin iki basamakta 
modifiye edilen PP yüzeyler ile kovalent bağ oluşturduğu, FTIR-ATR analizinde 
saptanan amid I ve II pikleri ile kanıtlanmıştır. Heparin immobilizasyonu protein 
tutunum miktarını referans yüzeylere göre oldukça azaltmış, hemokompatibilite 
testleri kapsamında (platelet tutunum, hemoliz, kinetik-kan pıhtılaşma oranı) da 
oldukça etkili sonuçlar vermiştir. Ayrıca heparin immobilizasyonunun PP yüzeylerde 
antiadherent karakteristiği gram pozitif ve gram negatif bakteriler ile test edilmiş ve 
heparinin antibakteriyel mekanizmasının "temas ile öldürme" olduğu sonucuna 
ulaşılmıştır. Son olarak BJ insan fibroblast hücreleri ile gerçekleştirilen testler 
sonucunda, geliştirilen yüzeylerin biyouyumlu oldukları ispatlanmıştır. Titanyum (Ti) 
tez kapsamında model metalik malzeme olarak seçilmiş ve tek basamakta alternatif 
akım elektroforetik depozisyon (AC-EPD) tekniği ile heparin modifikasyonu 
gerçekleştirilmiştir. Saf halde heparin depozisyonu, temas açısı ölçüm, serbest yüzey 
enerji hesaplamaları ve yüzey pürüzlülük değerleri kapsamında incelenmiş ve 
optimize parametre tespit edilmiştir. Başlangıçta yüzeye depozite edilen heparin 
miktarı TB boya ile takip edilmiş olmakla birlikte, ilerleyen deney basamaklarında söz 
konusu yaklaşımın, AC-EPD tekniği ile kaplanan heparin miktarını saptamada yetersiz 
olduğu saptanmıştır. Ti yüzeylerde heparin depozisyonunun etkisi, PP yüzeylerde 
olduğu gibi, protein tutunum miktarı, hemokompatibilite testleri, antiadherent 
karakteristik ve biyouyumluluk testleri kapsamında detaylı olarak araştırılmıştır. 
Özetle, tez kapsamında gerçekleştirilen çalışmalar ile hem PP hem de Ti yüzeylerde 
farklı stratejilerle yüzey modifikasyonları gerçekleştirilerek heparinin mevcut 
antikoagülan karakteristiğinden yararlanmakla birlikte, antibakteriyel, antiadherent ve 
biyouyumluluk karakteristikleri de detaylı olarak çalışılmış ve literatüre 
kazandırılmıştır.

Abstract:
Implantable materials are tools that are used in the human body for temporary or 
permanent, internal or external, treatment or repair, and so on. Nowadays, due to the 
growing population and long lifetime, the rate, quantity, and duration of these 
materials are also increasing. Therefore, implantable materials should be 
biocompatible with the environment in their usage area and be designed to prevent any 
complications after the transplant. Within the scope of this thesis, two different 
materials were used as polymeric and metallic substrates for surface modification with 
an anticoagulation drug that is used in clinics, heparin. Polypropylene (PP) was 
selected as a model polymeric substrate and plasma-assisted surface modification was 
applied in two steps: (i) oxygen etching and (ii) amine-rich functional group creation. 
Surface modification parameters that were held with the plasma polymerization (PlzP) 
technique were analyzed with contact angle measurements, surface free energy 
calculations, obtaining the maximum nitrogen amount on the surfaces and increasing
the surface roughness values, etc., and the parameters were optimized accordingly. 
Immobilization of heparin applied as pure heparin (hep) and covalent bond agent 
assisted (hep*) with 3 different concentration values. The amount of immobilized 
heparin detected with toluidine blue (TB) dye and the parameter that produces the 
maximum amount of immobilized heparin were selected as optimal. Covalent bond 
formation between hep* and PP substrates was proven with amide I and II peaks, 
which were detected with FTIR-ATR analysis. Compared to the bare PP substrates, 
heparin immobilization provided a lower amount of adhered protein and much more 
efficient hemocompatibility testing (platelet adhesion, hemolysis, and kinetic blood 
coagulation rate) results. Also, the antiadhesive characteristics of heparin-immobilized 
PP surfaces were tested against both gram-positive and gram-negative bacteria strains, 
and the antibacterial mechanism of heparin was revealed as "contact killing". Lastly, 
the biocompatibility of produced surfaces was tested with the BJ human fibroblast cell 
line.
On the other hand, titanium (Ti) was selected as the model metallic substrate, and 
heparin immobilization onto the surfaces was held in one step with the alternative 
current electrophoretic deposition (AC-EPD) technique. Parameter optimization was 
achieved with contact angle measurements, free surface energy calculations, and the 
surface roughness values of purely deposited heparin. In the beginning, the deposited 
heparin amount was detected with TB dye, but according to further analysis, this 
procedure is not appropriate to detect the heparin amount that was deposited with the 
AC-EPD technique. The effect of heparin deposition on Ti substrates was examined
detailedly with adhered protein amount, hemocompatibility tests, antiadhesive 
characteristics, and biocompatibility, respectively. In brief, within the scope of the 
thesis, different surface modification techniques with heparin on both PP and Ti 
surfaces were examined. With the help of the anticoagulant characteristic of heparin, 
which is already known, also its antibacterial, antiadherent, and biocompatibility 
characteristics were examined in detail and brought to the literature.