Doğal Bacillus thuringiensis izolatlarında vejetatif insektisit protein genlerinin araştırılması
Investigation of vegetative inspiration protein genes in natural Bacillus thuringiensis strains
Yazar: ÖZLEM KADIOĞLU YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Entomopatojenik Bacillus thuringiensis (Bt) dünyada en başarılı olarak kullanılan bir biyopestisittir. Bt, büyüme döngüsünün hem vejetatif evresinde hem de durağan fazı sırasında insektisidal proteinler üreterek pek çok böcek ordosuna karşı biyolojik mücadelede önemli rol oynamaktadır. Bakteriye toksik etkiyi kazandıran cry, cyt ve vip genleri genelde plasmidler üzerinde taşınmakta ve bakteriler arasındaki plasmid transferleri suş/toksin gen çeşitliliğini sağlamaktadır. Bu nedenle, farklı coğrafyalardan Bt örnekleri elde edilerek bunların karakterizasyonu ve biyoaktivite denemeleri yapılmakta, genetik farklılıkları ve toksik etkileri araştırılmaktadır. Ayrıca, uygulanan toksinlere karşı gelişen böcek direnç mekanizmasını geciktirmek veya önlemek için yeni toksik etkili farklı Bt suşlarının keşfi önemlidir. Dolayısıyla bu çalışmada, Aydın bölgesinden toplanan ve koleksiyonumuzda bulunan 90 adet Bt suşunun vip gen profillerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bt suşlarının vip1,vip2 ve vip3 genlerini içerip içermedikleri her bir gene özgü spesifik primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile araştırılmıştır. İzolatların hiç birinde vip1 ve vip2 genlerine rastlanmazken, 7 adet Bt suşunun vip3 geni içerdiği bulunmuştur. Elde edilen 1621 bç'lik vip3 geni PCR ürünü AluI ve Sau3AI enzimleriyle kesilerek PCR-RFLP analizi yapılmıştır. Ayrıca, vip3 geni PCR ürünü kısmi DNA sekansının NCBI blast analizleriyle veri tabanındaki vip3Aa genleriyle nükleotid hizalamaları (alignment) ve biyoinformatik analizleri yapılmıştır. Bu analizler Bt suşlarının taşıdığı vip3 genlerinin vip3Aa alt grubuna ait olduklarını göstermiştir. Buna ilave olarak, vip3 geni PCR ürünü (1621 bç) plasmid vektörüne klonlanmıştır. DNA sekans analizleriyle rekombinant plasmidlerin aktarılan vip3Aa genini taşıdıkları teyit edilmiştir. Son olarak, vip3Aa geni pozitif Bt suşlarının protein profilleri SDS-PAGE ile araştırılmış olup her bir Bt Cry1 (130 kDa) ve Cry2 (60 kDa) proteinlerine ait bantlar tespit edilmiştir. Literatürde de belirtildiği gibi Cry protein genleri ve Vip3Aa protein geni aynı Bt suşunda birlikte bulunmaktadırlar. Sonuç olarak, Aydın ilinden toplanan Bt suşlarında vip1 ve vip2 genleri bulunmazken vip3 genlerinin bulunma sıklığı % 7,7 olduğu tespit edilmiştir. Gelecek çalışmalarda, vip3 geni pozitif olan 7 adet Bt suşunun Lepidoptera'ya ait çeşitli böcek türleri üzerinde biyoaktiviteleri araştırılacaktır.

Abstract:
Entomopathogenic Bacillus thuringiensis (Bt) is the most successful biopesticide in the world. Bt plays an important role in the biological control of many insecticides by producing insecticidal proteins during both the vegetative phase and the stationary phase of the growth cycle. cry, cyt and vip genes, which provide toxic effects on bacteria, are usually carried on plasmids and the plasmid transfers between bacteria provide strain / toxin gene diversity. For this reason, Bt samples are obtained from different geographies and their characterization and bioactivity experiments are made and their genetic differences and toxic effects are investigated. Furthermore, the discovery of different Bt strains is important in delaying or preventing the insect resistance mechanism that develops against toxins administered. In this study, it was aimed to determine the vip gene profiles of 90 Bt strains collected from Aydın region. The Bt strains were investigated by polymerase chain reaction (PCR) using specific gene primers specific for each gene containing the vip1, vip2 and vip3 genes. While none of the isolates were vip1 and vip2, 7 Bt strains were found to contain the vip3 gene. PCR-RFLP analysis was performed by using 1621 bp vip3 gene PCR product AluI and Sau3AI enzymes. In addition, nucleotide alignments and bioinformatics analyzes of the vip3 gene PCR product partial DNA sequence with the vip3Aa genes in the database were performed by NCBI blast analysis. These analyzes showed that the vip3 genes of the Bt strains belong to the subgroup vip3Aa. In addition, the vip3 gene PCR product (1621 bp) was cloned into the plasmid vector. The DNA sequence assays have confirmed that the recombinant plasmids carry the transfected vip3Aa gene. Finally, protein profiles of the vip3Aa gene positive Bt strains were investigated by SDS-PAGE and the bands of each Bt Cry1 (130 kDa) and Cry2 (60 kDa) proteins were detected. Finally, protein profiles of the vip3Aa gene positive Bt strains were investigated by SDS-PAGE and the bands of each Bt Cry1 (130 kDa) and Cry2 (60 kDa) proteins were detected. As mentioned in the literature, the Cry protein genes and the Vip3Aa protein gene co-exist in the same Bt strain. As a result, vip1 and vip2 genes were not found in the Bt strains collected from the province of Aydın and the frequency of vip3 genes was found to be 7,7 %. In future studies, bioactivity of 7 Bt strains with positive vip3 gene on Lepidoptera's various insect species will be investigated.