Kırım kongo kanamalı ateşi hastalığı (KKKAH) virüsü yapısal olmayan S proteininin (NSs) prokaryotik sistemde açıklatılması ve NSs'in KKKAH virüsünün replikasyonundaki rolü
Expression of nonstructural S protein (NSS) of crimean-congo hemorrhagic fever (CCHF) virus in prokaryotic system and the role of NSS in CCHF virus replication
Yazar: GÜNSU AYDIN
Danışman: PROF. DR. AYKUT ÖZDARENDELİ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Hemorajik ateş-Kırım = Hemorrhagic fever-Crimean ; Hemorajik ateş-viral = Hemorrhagic fevers-viral ; Protein S = Protein S ; RNA = RNA

Özet:
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı (KKKAH), Çin'nin batısından Güney Asya'ya; Orta Doğu'dan Güneydoğu Avrupa'ya ve Afrika'ya kadar geniş bir alanda yayılım gösteren, çoğunlukla insanlarda görülen kene kaynaklı viral bir enfeksiyondur. KKKAH virüs genomu, sırasıyla nükleokapsit proteinini, Gn ve Gc glikoproteinlerini ve RNA-bağımlı RNA polimerazını kodlayan küçük (S), orta (M) ve büyük (L) üç negatif-polariteli RNA segmenti içerir. Ek olarak, Bunyavirales takımının bazı üyeleri M segmentinde (NSm olarak adlandırılan) veya S segmentinde (NSs olarak adlandırılan) yapısal olmayan proteinleri kodlar. KKKAH virüsü NSs'i, S segmentinin pozitif polariteli kısmından kodlanır. Hemen hemen tüm KKKAH virüsü suşlarında NSs'e ait bir açık okuma çerçevesi bulunur ve bu durum, NSs'lerin korunmuş bir biyolojik fonksiyona sahip olabileceğini göstermektedir. Bu çalışmanın amacı, KKKAH virüsü ile enfekte olmuş hücrelerde viral yapısal olmayan S proteininin varlığını ve proteinin replikasyon üzerine etkilerini araştırmaktır. Bu amaçla, NSs geni çoğaltıldı ve pCOLD TF-NSs olarak adlandırılan pCOLD TF plazmidine klonlandı. Rekombinant protein, E. coli C43 (DE3) hücrelerinde eksprese edilip pürifiye edildi. Enfeksiyon sırasında NSs'in ekspresyon seviyelerini incelemek için hücreler, KKKAH virüsü ile enfekte edildi ve rekombinant NSs proteinine karşı oluşmuş hiperimmun serumlar kullanılarak IFA testi yapıldı. IFA sonuçları, NSs ekspresyonunun enfekte olmuş hücrelerde, erken dönemde, enfeksiyondan 6 saat sonra belirlendiğini gösterdi. NSs'in varlığı, KKKAH pozitif insan serumları ile problanarak immünoblotlama ile doğrulandı. Ayrıca hedef hücrelerin proteazom inhibitörü olan MG132 ile muamele edilmesi NSs proteininin ekspresyonunu arttırdığını gösterdi. Bu şekilde, NSs'in proteazom tarafından degredasyonu, KKKAH virüs enfeksiyonuna karşı erken bir hücre içi savunmayı temsil etmektedir. Küçük interferans RNA (siRNA), RNA interferans (RNAi) yolağında bir rol oynamakta ve spesifik viral genlerin ekspresyonunu azaltmaktadır. Bu çalışmada NSs'e karşı spesifik siRNA'ların KKKAH virüs üretimini güçlü şekilde inhibe ettiğini belirlenmiştir. Bu veriler, siRNA'nın uygulanmasının, KKKAH'nın antiviral tedavisi için ümit verici olabileceğini göstermiştir. Son olarak, indirekt ELISA geliştirmek için rekombinant NSs antijeninin kullanımı araştırıldı; ancak serum numuneleri paneli kullanarak KKKAH enfeksiyonunun tespiti sağlanamadı.
Anahtar Kelimeler: KKKAH virüsü, Yapısal olmayan S proteini (NSs), küçük interferans RNA (siRNA)

Abstract:
Crimean–Congo hemorrhagic fever (CCHF) is the most widespread tick-borne viral infection of humans, occurring across a vast area from western China through southern Asia and the Middle East to southeastern Europe and throughout most of Africa. The CCHFV genome contains three negative-sense RNA segments, small (S), medium (M), and large (L), encoding the nucleocapsid protein, Gn and Gc glycoproteins, and the RNA-dependent RNA polymerase, respectively. In addition, several Bunyavirales members encode nonstructural proteins, either on the M (termed NSm) or S segment (termed NSs) of the genome. The NSs of CCHFV is encoded by the positive-sense of the S segment genome. The ORF of NSs is conserved in almost all strains of CCHFV, indicating that NSs might have a conserved biological function. The aim of this study is to investigate the presence of NSs in CCHFV-infected cells and to investigate its effects on replication. For this purpose, the gene encoding NSs was amplified and cloned into pCOLD TF plasmid, called pCOLD TF-NSs. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 C43(DE3) and was purified. To examine the expression of NSs during infection, cells were infected with CCHFV and were subjected to immunofluorescence assay (IFA) with the hyperimmune sera against the recombinant NSs protein. IFA results indicated that the expression of NSs was determined as early as 6 hours post infection. The presence of NSs which was probed with CCHF positive human sera was also confirmed by immunoblotting.  We also showed that treatment of target cells with the proteasome inhibitor MG132 increased the expression of NSs protein. Thus, degradation of NSs by the proteasome represents an early intracellular defense against CCHF virus infection. Short interfering RNA (siRNA) plays a roles in the RNA interference (RNAi) pathway and decreases the expression of specific viral genes. Here we determined that specific siRNAs against the NSs potently inhibited CCHF virus production. This data showed that the application of siRNA might be promising for antiviral treatment of CCHF. Lastly, we examined the utility of recombinant NSs antigen for developing indirect ELISA but we were not able to achieve the detection of CCHF infection using a panel of serum samples.
Key Words: CCHFV, Non structural S protein (NSs), small interfering RNA