Brachypodium distachyon (L.) P. Beauv.'da morfolojik 
ve moleküler karakterizasyon
Morphologic and molecular characterization in Brachypodium distachyon (L.)P. Beauv.
Yazar: GÜLSEMİN SAVAŞ TUNA
Danışman: PROF. DR. İSMET BAŞER
Namık Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Brachypodium distachyon, serin mevsim buğdaygilleri için yeni bir model bitkidir. Bu çalışmada Namık Kemal Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri  Bölümü Brachypodium koleksiyonunda bulunan ülkemizin farklı bölgelerinden toplanmış 59 aksesyon materyal olarak kullanılmıştır. Flow sitometri ile yapılan çekirdek DNA analizleri sonucunda 48 aksesyonun B. distachyon, 11 aksesyonun ise B. hybridum olduğu belirlenmiştir. Çalışmada, koleksiyonu oluşturan aksesyonlar morfolojik ve moleküler yöntemler ile analiz edilerek mevcut genetik çeşitlilik belirlenmeye çalışılmıştır. Bu amaçla yapılan morfolojik karakterizasyonda 17 morfolojik özellik incelenmiştir. Bu inceleme sonucunda; aksesyonların bitki boylarının 24,7 cm, bayrak yaprak ayası  boyunun 5,6 cm, bayrak yaprak ayası eninin 4,5 mm, biyokütlenin (kök hariç) 4,5, g başaklı sap sayısının 34 adet, başaksız sap sayısının 4 adet, bitki başına başakçık sayısının 111 adet, bitki başına tohum sayısının 372 tohum/bitki, bitkilerin sahip olduğu tohum ağırlığının 1,95 g ve bin tane ağırlığının 5,12 g olduğu belirlenmiştir. Ayrıca tohumların çimlenme süresinin 15 gün, bitkilerin başak çıkarma süresinin 125 gün ve çiçeklenme süresinin 136 gün olduğu tespit edilmiştir. Bitkilerin  genel olarak yeşil renkte, tüylü yapıda ve dik formda olduğu, ancak bazı aksesyonlarda yatık ve yarı dik formların da bulunduğu belirlenmiştir. 
Flow sitometri ile yapılan çekirdek DNA analizlerinde B. distachyon ve B. hybridum aksesyonları için ortalama çekirdek DNA içeriklerinin sırasıyla 0,743 pg/2C,  ve 1,431 pg/2C olduğu belirlenmiştir. Yapılan analizler sonucunda B. distachyon aksesyonlarının sahip olduğu çekirdek DNA içeriklerinin bitkilerin toplandığı coğrafi bölgeden etkilendiği, B. hybridum aksesyonlarının ise etkilenmediği tespit edilmiştir. Çekirdek DNA içerikleri dikkate alınarak hazırlanan dendogramda aksesyonların 2 gruba ayrıldığı, ilk grupta sadece bir aksesyon yer alırken diğerlerinin ikinci grupta toplandığı görülmüştür. Gruplar incelendiğinde aynı alt gruplarda yer alan aksesyonların birçok morfolojik özelliklerinin ortak olduğu belirlenmiştir. 
32 B. distachyon aksesyonuna ait 142 birey ile 11 SSR primeri kullanılarak yapılan çalışmada 99 allel saptanmıştır. Primer başına allel sayısının 3-15 arasında değiştiği, belirlenen bölgelere göre ortalama allel sayısının 1.Bölge'de 13,67 allel/bölge , 2.Bölge'de ise 11 allel/bölge olduğu görülmüştür. Çalışmada polimorfizm oranının %100, allelik zenginliğin (NA) 6,302, gen çeşitliliğinin 0,645, gözlenen (H0) ve beklenen (He) heterozigotluk düzeylerinin ise sırası ile 0,0116-0,0366 ve 0,4111–0,8645 değerleri arasında değiştiği hesaplanmıştır. 
Bu çalışmada ayrıca 9'u 1.Bölge'ye, 7'si 2.Bölge'ye özgü 16 özgün allel belirlenmiştir. Bölgeler için hesaplanan genetik farklılık (FST) değeri 0,19324, ortalama PIC değeri 0,60 (0,35-0,84) ve genetik uzaklık 0,590 olarak hesaplanmıştır. Genetik uzaklık sonuçlarına göre hazırlanan dendogramda örneklerin genetik çeşitlilik bakımından 2 grup oluşturduğu, aynı aksesyona ait örneklerin farklı alt gruplarda, farklı bölgelerden toplanan örneklerin aynı alt grupta yer alabildiği görülmüştür. Dendogramdan elde edilen sonuçlara göre BL14, BL13, BL15, BL17, BL19  ile ED1 ve AD1 bireylerinin en uzak akraba, bu bireylerin ait olduğu aksesyonlara bakıldığında Bd94 ile Bd3 ve Kah aksesyonlarının genetik açıdan birbirine uzak, Bd3 ile Kah aksesyonlarının birbirine yakın akraba olduğu görülmektedir. Bu durum aksesyonlar arasında ve aksesyon içinde genetik çeşitlilik olduğunu, ancak görülen genetik çeşitlilik ile örneklerin toplandığı coğrafi bölge arasında 11 markörün kullanıldığı bu çalışmada anlamlı bir ilişkinin bulunmadığını göstermektedir. Yapılan Faktöriyel Benzerlik Analizi Grafiği incelendiğinde, aksesyonların iki gruba ayrıldığı, ancak gruplar arasında tam olarak kesin bir sınırın bulunmadığı, arada her iki gruba ait bireylerden oluşan bir ara  grup bulunduğu görülmüştür. Farklı genetik yapıda olan bireyleri belirlemek için yapılan model-based Bayesian analizinde de genotipler iki gruba ayrılmış ancak gruplara diğer gruptan yabancı katılımlar ve her iki grubun genetik özelliklerini taşıyan genotipler belirlenmiştir. Buna göre aynı coğrafik bölgeden toplanan örneklerin genetik benzerlik bakımından farklı gruplarda yer alabileceği, örneklerin toplandığı coğrafi bölge ile genetik çeşitlilik arasında anlamlı bir ilişki bulunmadığı belirlenmiştir. Aynı zamanda coğrafi bölge içerisinde de genetik çeşitliliğin önemli düzeyde olduğu tespit edilmiştir 
Rakım, çekirdek DNA içeriği ve morfolojik özellikler arasında korelasyon analizi yapılmış çok sayıda negatif ve pozitif korelasyonlar tespit edilmiştir. Ayrıca çekirdek DNA içeriği ile rakımın morfolojik özellikler üzerindeki etkilerini belirleyebilmek için çoklu doğrusal regresyon analizi yapılmıştır. Bu analize göre; DNA miktarı arttıkça bayrak yaprak ayası eni ve boyu, tohum ağırlığı, bin tane ağırlığı, bitkideki tüylülük derecesi azalırken; çimlenme, başaklanma ve çiçeklenme sürelerinin arttığı görülmüştür. Rakım arttıkça başaklı sap sayısının arttığı, çekirdek DNA içeriğinin ise azaldığı  belirlenmiştir. 
Yapılan bu çalışmada, serin mevsim buğdaygilleri için yeni bir model sistem olarak kabul edilmiş olan B.distachyon'a ait ülkemizin farklı coğrafik bölgelerinden toplanarak oluşturulmuş olan genetik kaynak koleksiyonunun sahip olduğu genetik çeşitlilik incelenmiştir. Morfolojik ve moleküler yöntemler ile yapılan incelemelerde koleksiyonun büyük bir varyasyona sahip olduğu saptanmıştır., 
Namık Kemal Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarla Bitkileri Bölümünde oluşturulmuş olan Brachypodium distachyon genetik kaynak koleksiyonu yüksek bir morfolojik ve genetik varyasyona sahiptir. Bu yüzden ülkemizde kültürü yapılan ve en önemli bitki guruplarını oluşturan tahıllar ile buğdaygil yem bitkilerinin önemli bazı tarımsal karakterlerinin (hastalık ve zararlılara dayanıklılık, verim ve kalite gibi) incelenmesi, bu karakterleri kontrol eden gen bölgelerinin haritalanması, moleküler markörlerin geliştirilmesi ve genlerin klonlanması gibi çalışmalarda son derece yararlı olacaktır. Oluşturulan B. distachyon kolleksiyonunun buğdayın orijinlendiği coğrafi bölgeden olması koleksiyonun önemini daha da arttırmaktadır. 
Anahtar kelimeler: Brachypodium distachyon, flow sitometri, çekirdek DNA içeriği, SSR, Genetik çeşitlilik, genetik kaynak

Abstract:
Brachypodium distachyon is  a model plant species for cool season grasses. In this study, 59 Brachypodium accessions collected from different geographic regions of our country which are in the collection at Namık Kemal University Field Crops Department  are used as plant material. Based on the results of nuclear DNA content analysis which were  made using  Flow cytometry, 48 of the accessions were determined to be B. distachyon while 11 of the accessions were  determined to be B. hybridum. In order to determine genetic diversity within B. distachyon collection which is the important one as model species, accessions further characterized morphologically and  by using  molecular techniques.
In the study which is conducted, 17 morphologic features are analysed. As a result of this analyse; it is determined that plant length of accessions are 24,7 cm, length of flag leaf  is 5,6 cm, width of flag leaf is 4,5 mm, biomass (except the root) is 4,5 g, number of stem with anther  is 34, number of stem without anther is 4, number of spikelet for each plant is 111, number of seed for each plant is 372 seed/plant , weight of seed that the plants have are 1,95 g. and the weight of one thousand is 5,12 g. Also, it is monitored that the duration of seed germination is 15 days, the duration of plants to have anther is 125 days and the duration of blossom is 136 days. It is stated that the plants are generally green, with wooly structure and have an upright form but in some accessions leaning and half upright forms are also found. 
Based on the results of nuclear DNA content analysis made using flow cytometry, mean nuclear DNA contents of B. distachyon and B. hybridium were determined as   0,743 pg/2C and 1,431 pg/2C respectively. Differences among mean DNA content of the accessions of B. distachyon were statistically important. It was also determined that the differences were correlated with elevation. However, differences among nuclear DNA content of accessions of B. hybridium were not statistically important. In the dendrogram prepared based on results of nuclear DNA content of accessions, it is observed that, accessions are separated into two groups, while there is only one accession in the first group, the others are gathered in the second group. When the groups are examined, it is determined that, accessions in the same subgroups have several common morphologic features. 
In SSR analysis, 99 alleles were ascertained in the study using 142 individuals belonging to 32 B. distachyon accession and 11 primer. It's seen that number of allele ranges from 3-15 for each primer, average number of allele according to stated regions is 13,67 allele/region in 1. Region  and it is 11 allele/region in 2. Region. In the study, it is assessed that polymorphism rate is 100%, allele productivity (Na) 6,302,  variety of gene is 0,645, observed ( H0) and supposed ( He) heterozygosity level  respectively ranges from 0,0116- 0,0366 and 0,4111-0,8645. 
Also, in this study, 16 original allele, 9 special to 1. Region and 7 special to 2. Region, are determined.  It's calculated that genetic diversity value ( Fst) calculated for the regions is 0,19324, average PIC value is 0,60 ( 0,35- 0,84) and genetic distance is 0,590. In the dendrogram prepared in respect of the results of genetic distance, it's seen that, samples are separated into two groups in terms of genetic diversity, samples belonging to same accessions can take part in different subgroups and samples collected from different regions can take part in different subgroups. According to the results taken from dendrogram, BL14, BL13, BL15, BL17, BL19 are the most distant relatives with ED1 and AD1 individuals, when we look at the the accessions that these individuals belong to, Bd94 is distant in terms of genetics with Bd3 and Kah., Bd3 is close relative with Kah accession. 
This situation shows that there is a genetic diversity between and within accessions , and there isn't a meaningful relation between the observed genetic diversity and geographic region that the samples are collected from. When the Factorial Similarity Analyse Graphic is examined, it is seen that, accessions are separated into two groups, but there is no exact borders between two groups, and there is a middle group in between which is formed by the individuals belonging to both groups. 
Also in the model-based Bayesian analyse to determine the individuals that have different genetic structure, genotypes are separated into two groups but outsider participation to the groups from the other group and genotypes that has the genetic features of both groups are determined. Findings support each other. According to this, it is determined that the samples which are collected from the same geographic regions can take part in different groups in terms of genetic similarity, there isn't a meaningful relation between the geographic region and the genetic diversity. At the same time, genetic diversity is abundant in the same region.
Correlation analysis between altitude, nuclear DNA content and morphological traits was made and high correlation were found. Multiple linear regression analysis was also made in order to determine the effects of nuclear DNA content and altitude on morphological features. According to this analysis, with the increasing of DNA the durations of germination, heading and flowering increase whereas width and length of flag leaf, the weight of seed, hairiness of plant increase. As the altitude gets higher the number of spiked stalks increases and nuclear  DNA content decreases. 
Brachypodium distachyon genetic resource collection in Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Namık Kemal University has a high morphologic and genetic variation. Therefore, the collection will be very usefull to study some agriculturally important traits of cultivated temperate grasses in Turkey such as cereals and forage grasses, mapping of genes controling these traits,  developing markörs, and cloning of these genes. 
Key words : Brachypodium distachyon, nuclear DNA content, morphological characters, SSR, genetic diversity, flow cytometer , gecetic resources