Çiğ et ve et ürünlerinden bakteriyosinojenik koagülaz-negatif stafilokokların ve laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve starter kültür olarak kullanım potansiyellerinin belirlenmesi
Isolation of bacteriocinogenic coagulase-negative staphylococci and lactic acid bacteria from raw meat and meat products and detection of their potential use as starter culture
Yazar: BURAK GENİŞ
Danışman: PROF. DR. YASİN TUNCER
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Bakteriyosinler = Bacteriocins ; Enterococcus = Enterococcus ; Gıda mikrobiyolojisi = Food microbiology ; Pastırma = Pastrami ; Starter kültür = Starter culture ; Sucuk = Sausage ; Teknolojik özellikler = Technological properties ; Çiğ et = Raw meat

Özet:
Bu çalışmada, çiğ et (kuzu/koyun, oğlak/keçi, dana) ve et ürünlerinden (sucuk ve pastırma) bakteriyosinojenik KNS ve LAB'nin izolasyonu ve starter kültür olarak kullanım potansiyellerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda 60 çiğ et, 60 et ürünü olmak üzere toplam 120 örnekten izole edilen 26 izolattan 8'inin bakteriyosin üreticisi olduğu tespit edilmiştir. İzolatların indikatör olarak kullanılan LAB'nin yanı sıra L. monocytogenes, S. aureus ve B. cereus gibi gıda patojenlerine karşı da aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Bakteriyosin üreticisi 8 izolatın tamamının muhtemel LAB olduğu belirlenmiştir. Moleküler tanı yöntemleri kullanılarak 8 izolattan 5'i E. faecium, 3'ü E. mundtii olarak tanımlanmıştır. Enterococcus izolatları tarafından üretilen bakteriyosinlerin proteolitik enzimler ve α-amilaz enziminden etkilendiği, geniş pH aralığında aktivite gösterdiği ve ısıya dirençli oldukları saptanmıştır. E. faecium suşlarında entA ve entB geni varlığı tespit edilirken, E. mundtii suşlarında yalnız munKS varlığı belirlenmiştir. Trisin-SDS-PAGE analizleri ile E. faecium suşlarında yaklaşık 5.5 kDa ağırlığında bir aktif protein bandı, E. mundtii suşlarında ise yaklaşık 5.0 kDa ağırlığında bir aktif protein bandı tespit edilmiştir. E. faecium suşları enterosin B, E. mundtii suşları ise mundtisin KS üreticisi olarak tanımlanmıştır. E. faecium suşlarının MRS broth ortamında inkübasyonun 6. saati sonunda hızlı asit üreticisi, E. mundtii suşlarının ise orta düzeyde asit üreticisi olduğu tespit edilmiştir. İzolatların tamamı inkübasyonun 24. saati sonunda hızlı asit üreticisi olarak tanımlanmıştır. Enterococcus suşlarının hiçbirinin hücre dışı proteolitik ve lipolitik aktivite göstermediği saptanmıştır. Tüm izolatların esteraz, esteraz lipaz, lösin arilamidaz, asit fosfataz ve naftol-AS-BI-fosfohidrolaz aktivitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Ayrıca E. faecium B7.2, B7.3, B8.1, B8.2 ve B9.1 suşları valin arilamidaz ve sistin arilamidaz aktivitesine sahipken, E. mundtii B20.2, B31.2 ve B33.1 şuşlarının bu enzimleri üretmediği saptanmıştır. E. mundtii suşlarının nitrat redüktaz aktivitesi gösterdiği, E. faecium suşlarının ise nitrat redüktaz aktivitesi göstermediği belirlenmiştir. Enterococcus suşları klinik olarak önem taşıyan antibiyotiklere duyarlı bulunmuştur. En yüksek sayıda antibiyotik direnç geni E. faecium B8.2 suşunda tespit edilmiştir. Enterococcus suşlarında en sık rastlanılan (4/8, % 50) antibiyotik direnç genlerinin tetL, aph(3ʹ)-IIIa ve ant(4ʹ)-Ia olduğu belirlenmiştir. Enterococcus izolatlarının tamamının γ-hemolitik aktivite gösterdiği saptanmıştır. Bunun yanı sıra suşlarının hiçbirinde jelatinaz aktivitesi belirlenmemiştir. Enterococcus suşlarının düşük sıklıkta virülens faktör geni içerdiği saptanmıştır. Yalnız E. mundtii B33.1 suşunun tez çalışması kapsamında varlığı araştırılan virülens faktör genlerinden hiçbirini içermediği tespit edilmiştir. Buna karşın E. faecium B8.1, B8.2 ve B9.1 suşlarında efaAfm ve acm genleri, E. faecium B7.2 ve B7.3 suşlarında efaAfm geni, E. mundtii B20.2 ve B31.2 suşlarında ise acm geni varlığı saptanmıştır. İzolatların hiçbirinin histidini, ornitini ve lizini dekarboksile etmediği, diğer taraftan E. faecium suşlarının tirozini dekarboksile ettiği, E. mundtii suşlarının ise zayıf dekarboksile ettikleri tespit edilmiştir. İzolatların hiçbirinde hdc, odc ve ldc geni varlığı tespit edilmezken, tamamında tdc geni varlığı saptanmıştır. Sonuç olarak çiğ et ve et ürünlerinden izole edilen bakteriyosinojenik 8 Enterococcus suşunun starter kültür kombinasyonlarında yer alabilme potansiyellerinin olduğu belirlenmiştir. Güvenlik değerlendirmesi testleri sonucu elde edilen bulgular ışığında E. faecium B7.2, E. faecium B7.3 ve E. mundtii B33.1 suşlarının gıda proseslerinde starter veya yardımcı starter kültür olarak kullanılmasının güvenli olduğu tespit edilmiştir. Diğer taraftan kalan 5 suşun ise canlı kültür olarak gıda üretim proseslerinde kullanılması tüketici sağlığı için risk teşkil edebileceği, bu nedenle bu suşlar tarafından üretilen bakteriyosinlerin saflaştırılmış preparatlarının gıda muhafazası amacıyla kullanım potansiyeli bulunduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
In this study, it was aimed to isolate bacteriocinogenic CNS and LAB from raw meat (lamb/sheep, kid/goat, calf) and meat products (dry fermented sausages (sucuk), pastırma) and to determine their potential for use as starter cultures. In this context, it was determined that 8 of 26 isolates isolated from a total of 120 samples, 60 of which were raw meat and 60 meat products, were bacteriocin producers. It was determined that the isolates indicated activity against food pathogens such as L. monocytogenes, S. aureus and B. cereus as well as LAB used as an indicator. All 8 bacteriocin producing isolates were determined to be probable LAB. The 5 of 8 isolates were identified as E. faecium and 3 as E. mundtii using by molecular diagnostic methods. It was determined that bacteriocins produced by Enterococcus isolates were affected by proteolytic enzymes and α-amylase enzyme, showed activity in a wide pH range and were heat resistant. The presence of entA and entB genes were detected in E. faecium strains, while the presence of only munKS was determined in E. mundtii strains. With Tricine-SDS-PAGE analysis detected an active protein band of about 5.5 kDa in E. faecium species and an active protein band of about 5.0 kDa in E. mundtii species. E. faecium strains were found to be fast acid producers at the end of the 6th hour of incubation in MRS broth medium, while E. mundtii strains were found to be moderate acid producers. All of the isolates were identified as fast acid producers at the end of the 24th hour of incubation. It was determined that none of the Enterococcus strains showed extracellular proteolytic and lipolytic activity. It was determined that all isolates had esterase, esterase lipase, leucine arylamidase, acid phosphatase and naphthol-AS-BI-phosphohydrolase activities. Also, E. faecium B7.2, B7.3, B8.1, B8.2 and B9.1 strains had valine arylamidase and cystine arylamidase activities, while E. mundtii B20.2, B31.2 and B33.1 strains did not produce these enzymes. It was determined that E. mundtii strains showed nitrate reductase activity, while E. faecium strains did not show nitrate reductase activity. Enterococcus strains were found to be sensitive to clinically important antibiotics. The highest number of antibiotic resistance genes were detected in E. faecium B8.2 strain. It was determined that the most common (4/8, 50%) antibiotic resistance genes in Enterococcus strains were tetL, aph(3ʹ)-IIIa and ant(4ʹ)-Ia. It was determined that all Enterococcus isolates showed γ-hemolytic activity. In addition, gelatinase activity was not detected in any of the strains. It was determined that Enterococcus strains contained a low often of virulence factor gene. It was determined that E. mundtii B33.1 strain does not contain any of the virulence factor genes. On the contrary, efaAfm and acm genes were found in E. faecium B8.1, B8.2 and B9.1 strains, efaAfm gene was found in E. faecium B7.2 and B7.3 strains, and acm gene was found in E. mundtii B20.2 and B31.2 strains. It was determined that none of the isolates decarboxylated histidine, ornithine and lysine, on the other hand E. faecium strains decarboxylated tyrosine, while E. mundtii strains decarboxylated weakly. While hdc, odc and ldc genes were not detected in any of the isolates, the presence of tdc gene was detected in all of them. As a result, it was determined that bacteriocinogenic 8 Enterococcus strains isolated from raw meat and meat products have the potential to be included in starter culture combinations. In the light of the findings obtained as a result of the safety assessment tests, it has been determined that E. faecium B7.2, E. faecium B7.3 and E. mundtii B33.1 strains are safe to be used as starter or auxiliary starter cultures in food processes. On the other hand, it has been determined that the use of the remaining 5 strain as live cultures in food production processes may pose a risk to consumer health, therefore purified preparations of bacteriocins produced by these strains have the potential to be used for food preservation.