Tuz stresi altındaki domates in vitro kültürlerinde epibrassinolidin etkisi
The effect of epibrassinolide in tomato in vitro culture under salt stress
Yazar: EMEL YILMAZ GÖKDOĞAN
Danışman: PROF. DR. BETÜL BÜRÜN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Botanik = Botany

Özet:
Tez çalışmasında domates (Lycopersicon esculentum Mill.) in vitro kültürlerinde tuz stresi ve tuz stresine karşı 24-epibrassinolid (24-epiBL)'in etkisi araştırılmıştır. Tez kapsamında tohum çimlendirme, sürgün ucu ve kallus kültürleri ile sürgün rejenerasyonu çalışmaları yapılmıştır. İn vitro çalışmalarında tohum, sürgün ucu, kotiledon ve hipokotil eksplantları kullanılmıştır. Tohum ve eksplantlar (sürgün ucu, kotiledon ve hipokotil), epiBL çözeltilerinde farklı sürelerde  bekletilmiş ve ekzojen epiBL uygulaması yapılmıştır. NaCl konsantrasyonları 20, 40, 50, 60, 80, 100, 150 mM ve NaCl stresine karşı epiBL uygulama konsantrasyonları 0.5, 1, 1.5, 2 µM'dır.
Tohum çimlendirmede, epiBL uygulaması kültür öncesi tohumlara uzun süreli (24 saat) ve kısa süreli (10 saniye) yapılmıştır. Uzun  süreli epiBL uygulamalı tohumlar petri kaplarında filtre kağıdı üzerinde kültüre alınmıştır ve artan konsantrasyonlarda NaCl (0, 50, 100 ve 150 mM) çözeltileri ile ıslatılmıştır. 150 mM NaCl konsantrasyonunda çimlenme olmadığı için ve uzun süreli uygulamanın bir etkisi görülmediği için sonraki çalışmalarda NaCl konsantrasyonları 20, 40, 60, 80 ve 100 mM olarak belirlenmiş ve kısa süreli uygulama yapılmıştır. Kısa süreli epiBL uygulaması yapılan tohumlar artan konsantrasyonlarda NaCl içeren ½ MS ortamında kültüre alınmıştır. 40, 80 ve 100 mM NaCl konsantrasyonlarına karşı 1 ve 2 µM epiBL uygulaması çimlenme yüzdesini arttırmıştır. Kültürden gelişen 17 günlük bitkilerin boyu, yaş ağırlığı, kuru ağırlığı, yaprak sayısı ve kök gelişimi üzerine farklı tuz konsantrasyonlarına karşı epiBL uygulamasının iyileştirici etkisi belirlenmiştir.  
İn vitro sürgün ucu kültürlerinde 2 mg/l K+0.4 mg/l NAA ilaveli MS ortamında sürgünler geliştirilmiş ve akabinde 12 günlük sürgünlere epiBL uygulaması yapıldıktan sonra artan konsantrasyonlarda NaCl içeren MS ortamında kültüre alınmıştır. 30 günlük kültür sonunda, 20 mM NaCl konsantrasyonunda bitki yaş ve kuru ağırlığı üzerine 2 µM epiBL uygulamasının; 100 mM NaCl konsantrasyonunda bitki boyu, bitki yaş ağırlığı ve kök kuru ağırlığı üzerine aynı epiBL uygulamasının etkisi önemli bulunmuştur. 1 µM epiBL uygulaması, 100 mM NaCl stresi altındaki bitkiciklerde klorofil a, klorofil b ve toplam klorofil içeriğini arttırmıştır. Diğer yandan malondialdehit (MDA) artan NaCl konsantrasyonu ile artmış, 1 µM epiBL uygulaması, lipit peroksidasyon ürünü olan MDA içeriğini azaltmıştır. NaCl stresi altında bitkiciklerin prolin kapsamları genel olarak artmakla birlikte, 40 mM NaCl konsantrasyonunda 1 ve 2 µM epiBL uygulamalılarda prolin içeriği önemli oranda azalmıştır. Toplam çözülebilir protein içeriği NaCl stresine bağlı olarak azalmış, 40 mM NaCl konsantrasyonunda 2 µM epiBL uygulaması çözülebilir protein içeriğinde istatistiki önemli artışa neden olmuştur. Antioksidan enzimlerden SOD ve POX aktivitesi NaCl stresi ile artış göstermiştir. SOD aktivitesi, gerek 1 µM epiBL uygulaması (20, 40, 80 mM NaCl) ve gerek 2µM epiBL uygulaması (60 ve 100 mM NaCl) ile daha fazla artış göstermiştir. POX aktivitesi, 60, 80 ve 100 mM NaCl konsantrasyonlarında 1 ve 2 µM epiBL uygulaması ile önemli oranda artmıştır. Bitkilerin bazı gelişimsel ve biyokimyasal parametreleri değerlendirildiğinde, NaCl stresine karşı epiBL uygulamasının, bitkinin tuza toleransını arttırmasındaki önemi görülmektedir.
Bu çalışmada 1 mg/l BAP+1 mg/l 2,4-D ilaveli MS ortamında kotiledon ve hipokotil eksplantlarının kültürü ile kallus üretilmiştir. EpiBL, 80 mg'lık kallus kitlesine uygulanmış, uygulamalı kalluslar alt kültürlere alınmış ve ayrıca epiBL uygulaması yapılmış eksplantlar kültüre alınmıştır. 30 günlük kültürde kallusların yaş ağırlığı, kuru ağırlığı ve kallus çapı belirlenerek epiBL uygulamasının etkisi araştırılmış ve epiBL'nin tuz stresine karşı olumlu etkisi belirlenmiştir. EpiBL uygulamalı eksplantların kültüründe ise, bazı NaCl konsantrasyonlarında 1 µM epiBL uygulamasının olumlu etkisi görülmüştür. 
NaCl stresi altında sürgün rejenerasyonu ve adventif sürgünlerin gelişimleri üzerine epiBL'nin etkisi de değerlendirilmiştir. 2 mg/l BAP ilaveli MS ortamında yapılan epiBL uygulamalı kotiledon eksplantlarından 20, 40 ve 80 mM NaCl stresine karşı 1 µM epiBL uygulamasının, hipokotil eksplantında ise 60 ve 80 mM NaCl stresine kaşı 1 µM epiBL uygulamasının rejenerasyon yüzdesi üzerine olumlu etkisi belirlenmiştir. Kotiledon eksplantında sadece 80 mM NaCl konsantrasyonunda 2 µM epiBL uygulamasının eksplant başına düşen sürgün sayısı üzerine olumlu etkisi belirlenmiştir. Hipokotil eksplantlarında ise rejenere sürgün sayısı üzerine 60 mM NaCl stresine karşı 1 µM epiBL uygulaması, sürgün boyu üzerine 100 mM NaCl stresine karşı 1 µM epiBL uygulaması ve sürgündeki yaprak sayısı üzerine 20 mM NaCl stresine karşı 2 µM epiBL uygulamasının olumlu etkisi bulunmuştur. 
Bu tez çalışması ile domates in vitro kültürlerinde tuz stresine karşı epiBL'nin etkisi ilk kez çalışılmış ve tuz stresine karşı epiBL'nin olumlu etkisi tespit edilmiştir. Sonuç olarak epiBL'nin tuz stresi altındaki domates bitkisinde tuza toleransı arttırmada önemli rol oynayabileceği yargısına varılmıştır.

Abstract:
In this thesis study, the effect of 24-epibrassinolide (24-epiBL) against salt stress and the effect of salt stress in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) in vitro culture was investigated. In the scope of thesis, seed germination, shoot tip and callus culture and shoot regeneration studies were conducted. Seeds, shoot tips, cotyledon and hypocotyl explants were used in the in vitro studies. Seeds and explants (shoot tip, cotyledons and hypocotyl) were incubated for varying periods of epiBL solution (exogenous application). NaCl concentrations were 20, 40, 50, 60, 80, 100, 150 mM and epiBL concentrations against NaCl stress were 0.5, 1, 1.5, 2 µM.
In seed germination, epiBL application to the seeds prior to culture was performed long-term (24 hours) and short-term (10 seconds). Long-term epiBL applied seeds were cultured on filter paper in petri dishes and they were soaked with a solution containing NaCl in the increasing concentrations (0, 50, 100 and 150 mM NaCl). NaCl concentrations were determined as 20, 40, 60, 80 and 100 mM besides epiBL applicatons was short-term because the seeds didn't germinate at 150 mM NaCl and the long-term application of epiBL wasn't an effect. Short-term epiBL applied seeds were cultured on ½ MS containing NaCl in the increasing concentrations. 1 and 2 µM epiBL applications against 40, 80 and 100 mM salt concentrations increased the germination percentage. Positive effect of epiBL applications against different salt concentrations was observed on length, fresh weight, dry weight, the leaf number of plants and root growth of 17-day-old plants growing in culture.
In vitro shoot tip culture, shoots developed on MS medium supplemented with 2 mg/l K+0.4 mg/l NAA and 12-day-old shoot after epiBL application were cultured on MS medium containing NaCl in the increasing concentrations. At the end of the 30-day cultures the effect of 2 µM epiBL application at 20 mM NaCl concentration was significant on plant fresh and dry weight, the effect of same epiBL application at 100 mM NaCl concentration was significant on plant length, plant fresh weight and dry weight of roots. 1 μM epiBL application to plants under 100 mM NaCl stress increased chlorophyll a, chlorophyll b and total chlorophyll content. On the other hand, MDA increased with increasing NaCl concentration, MDA content which was lipid peroxidation product decreased with 1 μM epiBL application. While proline content of plantlets under salt stress increased generally, prolin content decreased significantly with 1 μM and 2 μM epiBL application at 40 mM NaCl concentration. Total soluble protein content was reduced due to NaCl stress, 2 μM epiBL application under 40 mM salt concentration caused a statistically significant increase in the soluble protein content. The activity of SOD and POX from antioxidant enzymes increased with NaCl stress. The activity of SOD further increased with 1 μM epiBL application (20, 40, 80 mM NaCl) and 2 μM epiBL application (60 and 100 mM NaCl). The activity of POX increased significantly with 1 μM and 2 μM epiBL applications under 60, 80 and 100 mM NaCl concentrations. When some developmental and biochemical parameters of plants were evaluated, it was determined that epiBL application against NaCl stress was important to increase salt tolerance of plant.
In the study, callus was produced by culture of cotyledon and hypocotyl explants on MS medium supplemented with 1 mg/l BAP+1 mg/l 2,4-D. EpiBL applied 80 mg of callus mass, epiBL applied calli were subcultured and also the epiBL applied explants were cultured. At 30-day-old culture, the effect of epiBL application was investigated by determining callus fresh weight, callus dry weight and callus diameter and the positive effect of epiBL against salt stress was found. In culture of epiBL applied explants, 1 μM epiBL application in some NaCl concentrations yielded a positive effect. As a result, it was determined that epiBL  application to callus gave a better response against salt stress than epiBL application to explant in in vitro callus cultures.
The effect of epiBL on shoot regeneration and development of adventitious shoots under NaCl stress was evaluated. Positive effect of 1 μm epiBL application against 20, 40 and 80 mM NaCl stress in epiBL applied cotyledon explants and 1 μm epiBL application against 60 and 80 mM NaCl stress in hypocotyl explants on MS medium supplemented with 2 mg/l BAP on the regeneration percentage was observed. Positive effect of 1 μM epiBL application on the number of shoots per explant at the only 80 mM NaCl concentration was determined in cotyledon explants. The positive effects of 1 μm epiBL application against 60 mM NaCl stress on the number of regenerated shoots in hypocotyl explants, 1 μm epiBL application against 100 mM NaCl stress on shoot length and 2 μm epiBL applications against 20 mM NaCl stress on the number of leaves in shoots were found.
In this thesis study, the effects of epiBL against salt stress were studied for the first time in vitro culture of tomato and the positive effect of epiBL against salt stress was determined. As a result it was reached the judgment that epiBL at tomato plant under salt stress might play important role in enhancing salt tolerance.