Cancur eriğinden (Prunus domestica L.) polifenol oksidazın saflaştırılması ve eriğin antioksidan özelliğinin incelenmesi
Purification of polyphenol oxidase from cancur plum (Prunus domestica L.) and investigation of plum' s antoxidant properties
Yazar: HAVVA ATASEVER
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BARBAROS DİNÇER
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification

Özet:
Polifenol oksidazlar (PFO), bakır içeren metaloenzimler olup oksijen varlığında, monofenollerin o-difenollere hidroksilasyonunu ve o-difenollerin de o-kinonlara yükseltgenmesini katalizler. Bu çalışmada, Ardahan İli Posof İlçesi Türkgözü Köyü' nden toplanmış olan Cancur Eriğinden (Prunus domestica L.) PFO, Sepharose-4B-L-tirosin-p-aminobenzoik asit afinite jeli kullanılarak saflaştırıldı. PFO, doğal ve SDS-poliakrilamid jel elektroforez ile biyokimyasal özellikleri bakımından karakterize edildi. Cancur eriği PFO' sunun elektroforez kromatogramında iki izoenzime sahip olduğu belirlendi. Cancur eriği PFO' sunun  L-tirozin, 3,4-dihidroksihidrosinnamik asit, 3,4-dihidroksifenil propanoik asit,  p-kumarik asit,  katekol ve 4-metil katekol substratları varlığında en yüksek aktiviteyi 30-40 °C ve pH 5.0-7.0 arasında gösterdiği tespit edildi.  Cancur eriği PFO' sunun her bir substratının Michaelis-Menten kinetiğine uyduğu tespit edildi. Kinetik veriler olan Michaelis-Menten sabiti (Km) ve maksimum hız (Vmaks) çizilen Lineaweaver-Burk grafiği yardımıyla hesaplandı. Cancur PFO' sunun hem monofenolaz hem de difenolaz aktivitesine sahip olduğu belirlendi. En fazla katekol substratına ilgi duyduğu ve bunu sırasıyla 4-metil katekol,  DHHSA, L-tirozin, DHPPA, p-kumarik asitin izlediği belirlendi. Cancur eriği PFO' sunun 4-metil katekol substratı varlığında askorbik asit, sodyum metabisülfit, benzoik asit ve sodyum azid tarafından inhibe edildiği tespit edildi. Bu inhibitörler için Ki değerleri sırasıyla 0.02, 0.12, 6.0 ve 18.3 mM olarak tespit edildi. Cancur eriğinin sulu özütünde toplam fenol miktarı 114.6±5.0 mg GAE/100 g olarak tespit edildi. Özütte yapılan antioksidan aktivitesi CUPRAC yöntemiyle 30.19±0.96 (mg TEAK/g), DPPH yöntemiyle 1.98±0.02 (mg/mL) ve ABTS yöntemiyle 2.17±0.01 (mg/mL) olarak belirlendi.

Abstract:
Polyphenol oxidases (PPO) are copper-containing metalloenzymes that catalyze the hydroxylation of monophenols to o-diphenols and the oxidation of o-diphenols to o-quinones in the presence of oxygen. In this study, PFO was purified from Cancur plums (Prunus domestica L.), collected from Türkgözü village in Posof, Ardahan, Turkey, using Sepharose-4B-L-tyrosine-p-aminobenzoic acid affinity gel. The PPO was characterized with natural and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and in terms of biochemical properties. It was determined to have two isoenzymes by electrophoresis chromatogram on Cancur plum PPO. It was detected that the enzyme showed the highest activity at between 30-40 °C and pH 5.0-7.0 in the presence of L-tyrosine, 3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid, 3,4-propanoic acid, p-coumaric acid, catechol and 4-methyl catechol as substrates. Each substrate of cancur plum PPO was found to comply with Michaelis-Menten kinetics. Kinetic data as a Michaelis-Menten constant (Km) and a maximum velocity (Vmax) calculated via the drawn-Lineaweaver Burk plot. Cancur PPO was found to have both monophenolase and diphenolase activity.  It was determined that catechol is most interested in as substrate and followed by 4-methylcatechol, DHHSA,  L-tyrosine, DHPPA and p-coumaric acid as substrates, respectively. The PPO was inhibited by ascorbic acid, sodium metabisulfite, benzoic acid and sodium azide in the presence of 4-methyl catechol as a substrate. The Ki values for these inhibitors were found as 0.02, 0.12, 6.0 and 18.3 mM, respectively. The total amount of phenol in aqueous extracts of  Cancur plum was determined as 114.6 ± 5.0 mg GAE / 100 g. The antioxidant activity of the extract was found  as 30.19 ± 0.96 (mg TEAC / g) with CUPRAC method, as1.98 ± 0.02 (mg / mL) wih DPPH method and as 2.17 ± 0.01 (mg / mL)  with  ABTS method.