Ateşi yüksek olan hastalarda kanda bakteri varlığının 
üniversal primerler kullanılarak  hızlı saptanması
The role of universal primers for rapid detection of bacterial pathogens in blood samples of patients with fever
Yazar: HAVVA ÖZLEM ALTAY AKIŞOĞLU
Danışman: PROF. DR. CUMHUR ÖZKUYUMCU
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bakteriyemi ve sepsis hayatı tehdit eden koşullardır ve hızlı tanı gereklidir. Uygunsuz antibiyotik tedavisi, yüksek mortalite oranları ile ilişkili olmanın yanı sıra, antibiyotik direnci ve uzun süre hastanede yatışa bağlı ekonomik kayba neden olmaktadır. Kandaki mikroorganizmaların saptanmasında, günümüzde altın standart tanı yöntemi kan kültürüdür. Pozitif sinyal elde edilmesi için gereken süre yaklaşık 12-48 saattir. Bu süreye altkültür ve tanımlama için geçen zaman da eklendiğinde ortalama 48-72 saat sonra sonuç verilebilmekte bu nedenle hasta ampirik tedavi almak zorunda kalmaktadır. Kültür amacıyla gönderilen örneklerde pozitiflik oranı %10-15 civarındadır. Bu nedenle hastaların büyük bir kısmına ampirik tedavi uygulanması, gereksiz antibiyotik kullanımı ve buna bağlı direncin en önemli nedenlerinden birini oluşturmaktadır. 16S rRNA geninin korunmuş bölgelerini hedef alan üniversal primerler ile Real-time PCR birçok çalışmada kullanılan moleküler ve modern bir yaklaşımdır. Bu çalışmada ilk aşama olarak, kandan en sık izole edilen 13 bakterinin üniversal primerler ve Gram ayırıcı floresan problar ile duyarlılık sınırları saptanmıştır. İkinci aşamada, yoğun bakımda yatmakta olan hastalardan kan kültürü ile eş zamanlı alınan kan örneğinde bakteri varlığı ve Gram özellikleri üniversal primerler ve Gram ayırıcı floresan problar ile kullanılarak multipleks Real-time PCR ile saptanmıştır.(Duyarlılık %100, özgüllük % 97) Kan örneğinin laboratuvara ulaşmasından itibaren 2 saat içinde örnekte bakterinin varlığı/yokluğu ve varsa Gram özelliği ile ilgili sonuç elde edilmiştir. Kanda mikroorganizma varlığının erken ve doğru tespiti yoğun bakım ünitesinde yatan hastaların optimal yönetimi için gereklidir. Çalışmada kullanılan yöntemle pozitiflik saptanan hastalarda ileri moleküler tanımlama yöntemlerinin kombine kullanımı, saatler içinde klinisyenin hedefe yönelik antimikrobiyal seçimini kolaylaştıracak ve gereksiz antibiyotik kullanımının önlenmesini sağlayacaktır.

Abstract:
Bacteraemia and sepsis are associated with high mortality.  Whereas blood culture is the gold standard for determination of the bacterial pathogens in sepsis, approximately 10-15% of the samples are tested positive. For that reason, empirical therapy received by the most of patients results in unnecessary antibiotic use and antimicrobial resistance. Universal primers targeting conserved region of the 16S rRNA gene and multiplex Real-time PCR are one of the methods which provides rapid, specific and sensitive process for identifying microbial causes without the need for blood culture. This study aims to investigate diagnosis of bacterial organisms in blood samples by Real-time PCR using universal primers and Gram stain specific fluorescent probes. As a first step of this study, blood specimens drawn from adult volunteers were incubated with serial dilutions of 13 of the most frequently isolated bacteria from patients with sepsis and diagnostic sensitivity was identified by using universal primers and Gram stain specific fluorescent probes.  Then, 202 adult patients hospitalized in Hacettepe University, Intensive Care Units within February-May 2014 were included in the research. When blood culture specimens were taken from this patient group to identify causative microorganisms, blood specimens were simultaneously sampled on EDTA tubes and the detection of bacterial pathogens in blood along with Gram species were tested and identified by multiplex Real-time PCR using universal primers and Gram stain specific fluorescent probes. Blood cultures were used as a standard method in the study. Among 202 blood samples tested, 167 samples (82. 6%) didn't exhibit bacteraemia or fungemia following 5 days of incubation whereas 12 samples (5.9%) and 18 (8.9%) indicated respectively Gram-negative bacterial growth and Gram-positive bacterial growth; fungemia was seen in 5 samples (%2.4). Polymicrobial growth was determined in 3 samples (1.5%). The positive rate of blood culture method for bacterial growth was estimated as 14.8% (n=30). Considering the duration for bacterial growth in blood samples, it was found that minimum 10 hours 21 minutes and maximum 32 hours 10 minutes (average of 19 hours and 48 minutes) was required. From 202 blood specimens analysed in the study, 167 samples (82.6%) were found as negative by multiplex Real-time PCR. 14 (6.9%) and 21 (10.4%) out of total specimens signalled respectively the DNA of Gram-negative bacteria and Gram-positive bacteria. Fungemia found in the samples via blood culture was diagnosed as negative by Real-time PCR. The positive rate of multiplex Real-time PCR method used in the study was estimated as 17.3% (n=35) and the total testing process time was about two hours. As blood culture with a multiplex Real-time PCR results was comparatively evaluated, the sensitivity for bacterial growth was found 100%, specificity was 97%, positive and negative predictive values were calculated as 100%. The use of advanced molecular techniques for diagnosis infections in parallel with the method applied in this study may facilitate the selection of targeted antimicrobial therapy and ensure the prevention of unnecessary use of antibiotics.