Biyotinidaz enzim aktivite ölçümü için yeni bir florojenik prob geliştirilmesi
Development of a novel fluorogenic probe for the measurement of biotinidase enzyme activity
Yazar: FEYZANUR EKŞİ
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALTUN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Organik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Biyotinidaz enzimi, metabolizmada besinlerde bağlı bulunan biyotin vitaminin salınımını 
sağlar. Bu nedenle biyotinidaz eksikliğinin teşhisi, serum veya plazmada eksik enzim aktivitesi 
tespitine dayanır. Biyotinidaz enzim aktivitesinin doğru ve hızlı tayini için yaygın olarak 
spektrofotometrik ve florometrik yöntemler kullanılmaktadır. Spektrofotometrik yöntemde 
biyotinidaz enziminin aktivitesi tayini için "n-biyotinil-p-aminobenzoat", florometrik 
yöntemde ise "biyotinil-6-aminokinolin" substrat olarak kullanılır. 
Bu tez çalışması kapsamında biyotinidaz enziminin aktivite tayini için Biyotinil-NIR-NH2, 
Biyotin-Aminoantipirin ve Biyotinil-DCMC-NH2 olmak üzere üç prob tasarlandı. BiyotinilNIR-NH2 ve Biyotin-Aminoantipirin sentezleri tamamlanmasına rağmen Biyotinil-DCMCNH2 probuna ait sentezler 2-(2-Metil-4H-kromen-4-iliden)malononitril sentez kademesine kadar tamamlandı.Biyotinil-NIR-NH2, Biyotin-Aminoantipirin problarına ait sentez kademelerin ve elde edilen probların önce spektroskopik karekterizasyonları yapıldı. Ardından bu probların spektrofotometrik, florometrik ve LC-MS/MS yöntemleriyle analitik uygulamaları araştırıldı.Biyotinidaz enzim aktivitesi için optimum çalışma şartları ortaya konulduktan sonra otoanalizör cihazında Biyotin-NIR-NH2 ve Biyotin-Aminoantipirin probları biyotinidaz enzimleriyle reaksiyonu sonucunda ortaya çıkan hidroliz ürünü NIR-NH2 ve kinonimin reaktiflerinin sırasıyla 680 nm ve 505 nm civarında spesifik bir absorbans verdiği tespit edildi. 
Otoanalizör cihazında spektrofotometrik yöntemle iki farklı dalga boyunda Biyotin-NIR-NH2
için (694-751 nm) ve Biyotin-Aminoantipirin için ise oluşan kinonimin bileşiğinin (505-805 
nm) absorbans okumaları yaklaşık 15 dakikalık sürede yapıldı. Biyotin-NIR-NH2 probunun 
hidroliz ürünü olan NIR-NH2 probunun 690 nm'deki epsilon değeri 52350 Lmol-1cm-1 ve 
Biyotin-Aminoantipirin hidroliz ürününü olan 4-aminoantipirinin p-klorofenol kenetlenme 
ürünü olan kinonimin 505 nm'de epsilon değeri 6410 Lmol-1cm-1 olarak hesaplandı. 
Bu tez çalışması kapsamında Biyotin-NIR-NH2 ve Biyotin-Aminoantipirin probları geliştirildi. 
Geliştirilen her iki probun da otoanalizör cihazında 15 dakika gibi çok kısa bir zaman diliminde 
sonuç veren iki yeni biyotinidaz tayin kitine dönüşme potansiyeli bulunmaktadır.

Abstract:
The enzyme Biotinidase provides the release of the vitamin named as biotin, which is bound to 
food in the metabolism. Therefore, the diagnosis of biotinidase deficiency and the detection of 
deficient enzyme activity in serum or plasma are important. Spectrophotometric and 
fluorometric methods are widely used for accurate and rapid determination of biotin enzyme 
activity. In the spectrophotometric method, "n-biotinyl-p-aminobenzoate" is used as a substrate 
for the determination of biotinidase enzyme activity, and in the fluorometric method, "biotinyl6-aminoquinoline" is used as a substrate. 
Within the scope of this thesis, three probes, namely Biotinyl-NIR-NH2, BiotinAminoantipyrine, and Biotinyl-DCMC-NH2 were designed for the activity determination of 
biotinidase. Although the syntheses of Biotinyl-NIR-NH2 and Biotin-Aminoantipyrine were 
completed, the syntheses of the Biotinyl-DCMC-NH2 probe were completed up to the 2-(2-
Methyl-4H-chromen-4-ylidene)malononitrile synthetic step. First, spectroscopic characterization of the synthetic steps of Biotinyl-NIR-NH2, BiotinAminoantipyrine probes, and the obtained probes were performed. Then, analytical applications 
of these probes with spectrophotometric, fluorometric, and LC-MS/MS methods were 
investigated. After determining the optimal operating conditions for biotinidase activity, it was 
determined that the hydrolysis product NIR-NH2 and quinonimine reagents, which are formed 
as a result of the reaction of Biotin-NIR-NH2 and Biotin-Aminoantipyrine probes with 
biotinidase in the autoanalyzer device, giving a specific absorbance of around 680 nm and 505 
nm, respectively. In the autoanalyzer device, absorbance readings of the quinonimine 
compound (505-805 nm) formed for Biotin-NIR-NH2 (694-751 nm) and BiotinAminoantipyrine (505-805 nm) at two different wavelengths were taken in approximately 15 
minutes by spectrophotometric method. 
The molar absorptivity coefficient of the NIR-NH2 probe, which is the hydrolysis product of 
Biotin-NIR-NH2 probe, at 690 nm is 52350 Lmol-1cm-1 and the epsilon value at 505 nm of 
quinonimine, which is the p-chlorophenol coupling product of 4-aminoantipyrine, the 
hydrolysis product of Biotin-Aminoantipyrine, is calculated as 6410 Lmol-1cm-1. 
In this thesis, Biotin-NIR-NH2 and Biotin-Aminoantipyrine probes were developed. Both 
developed probes have the potential to be transformed into two new biotinidase determination 
kits that give results in a very short time like 15 minutes in the autoanalyzer device.