Leishmania tropica promastigotlarında apoptoz üzerine ilaç etkisinin araştırılması
İnvestigation of drug effects on apoptosis in promastigotes of leishmania tropica
Yazar: ERENGÜL BODUÇ
Danışman: PROF. DR. FUNDA KIRAL
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Genler-Bcl-2 = Genes-Bcl-2 ; Hücre ölümü = Cell death ; Leishmania = Leishmania ; Leishmania tropika = Leishmania tropica ; Parazit hastalıkları-hayvan = Parasitic diseases-animal ; Parazitler = Parasites ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Leishmania infeksiyonu ciddi bir halk sağlığı problemi olmaya devam etmektedir. Programlı hücre ölümünün varlığının  çok hücreli canlılardan sonra tek hücrelilerde de keşfedilmesi leishmaniasis etkeni olan Leishmania protozoonu üzerinde ilgi uyandırmıştır. Leishmania türlerinde apoptoz mekanizmasının aydınlatılması leishmaniasis tedavisi için geliştirilecek ilaçlar yönünden önem taşımaktadır. Bu nedenden dolayı bu çalışmada L. tropica promastigotları üzerinde miltefosin ve Glukantim® ilaçlarının programlı hücre ölümü belirteçlerine olan etkisi araştırılmıştır.
Çalışmada NNN besi yerinde üretilmiş Leishmania tropica promastigotları çoğalmaları için %10 fetal buzağı serum ilaveli hücre kültürü besi yerinde 24-26ºC'li etüvde inkübe edildi. Promastigotlar logaritmik faza ulaştıklarında miltefosin ve Glukantim® ilaçları uygulanarak Elektroforez yöntemi ile DNA kırılması, TUNEL yöntemi ile DNA kırılması ve ELİSA yöntemi ile bcl-2 konsantrasyonu şeklindeki üç apoptoz belirteci yönünden  analize alındılar. Bu iki ilacı karşılaştırmak için pozitif kontrol olarak staurosporin ilacı uygulanmıştır. Miltefosin ve staurosporinin promastigotlara uygulama dozları 100 µmol, 50 µmol, 25 µmol, 12.5 µmol ve 6.25 µmol olacak şekilde 24 saat etüvde bekletildi. Glukantim® ise 15mg/ml, 7.5mg/ml, 3.75mg/ml, 1.875 mg/ml ve 0.9375 mg/ml olan dozlarda 72 saat etüvde bekletildi.
Elektroforez yöntemi ile DNA kırılmasının tespitinde pozitif kontrol olan staurosporin ilacında promastigotlarda 50 µmol, 25 µmol, 12.5 µmol ve 6.25 µmol dozları oligonükleozomal DNA kırılması görüntüsü vermiştir. Yine aynı dozlarda TUNEL yöntemi analizinde de promastigotlarda  apoptotik DNA kırılması gözlenmiştir. Miltefosin ilacı için oligonükleosomal DNA kırılması 25 µmol olan dozda görüntülenmiştir. 12.5 µmol  olan dozda ise tam net bir fragmantasyon görüntülenememiştir. Miltefosin ilacı uygulanan promastigotların TUNEL yöntemi ile amaçlanan  DNA kırılması saptanmasında ise 25 µmol ve 12.5 µmol olan dozlarda DNA kırılması gözlenmiştir. Bu iki ilaca karşılık  Glukantim® ilacında  promastigotlarda  oligonükleosomal DNA kırılması gözlenememiştir. Sadece, 0.9375 mg/ml olan dozda belirsiz bir DNA fragmantasyonu benzeri görüntü açığa çıkmıştır. TUNEL analizinde ise yine Glukantimin® 0.9375mg/ml olan dozunda  promastigotlarda, çok hafif bir renkte belli belirsiz bir DNA kırılmasına benzer görüntü oluşmuştur. Diğer dozlarda ise apoptoz bulgusuna rastlanılmamıştır. Böylelikle Leishmania tedavisinde etkin bir oral ilaç olan miltefosinin Leishmania tropica promastigotları üzerindeki apoptotik etkisinin  Glukantim® ilacına göre daha üstün olduğu söylenilebilir.
Bir diğer apoptoz bulgusu olan bcl-2 konsantrasyonuna baktığımızda ise, her ilaç için uygulanan beş ayrı dozdaki konsantrasyon değerleri arasında istatiksel olarak anlamlı bir fark meydana gelmemiştir. Buna karşılık her bir ilacın grafik değerleri en yüksek dozdan en düşük doza doğru birbirleriyle karşılaştırıldığında, Glukantim®'deki bcl-2 konsantrasyonu beş dozda da diğer iki ilaca göre yüksek değerdedir. En düşük değer ise staurosporinde meydana gelmiştir. Bcl-2 konsantrasyonunun Glukantim® ilacında yüksek olması apoptoz yönünde herhangi bir bulgunun meydana gelmemesiyle ilişkilendirilebilir. Bcl-2 konsantrasyonunun yüksek olmasının apoptozu inhibe ettiği düşünülmektedir.
Leishmania tedavisinde ilaç etkisinin çeşitli Leishmania türlerinde  programlı hücre ölümü indüklemesine yönelik çalışmalar halen devam etmektedir. Programlı hücre ölümü indüklemesi Leishmania tedavisi için etkili bir yol olabilir. Fakat Leishmania türlerinin çeşitliliği ve parazitin ilaçlara karşı direnç geliştirmesi Leishmania protozoonunda gözlenecek apoptoz bulgularının netlik kazanmasını zorlaştırmaktadır. Yapılan bu çalışma bulgularının  Leishmania infeksiyonuna  yönelik ilaç tedavisine katkı sağlayacağı ve yapılması planlanan çalışmalara ışık tutacağı düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler; Leishmania tropica, Programlı hücre ölümü, Glukantim®, Miltefosin.

Abstract:
Leishmania infection continues to be a serious public health problem. After the existence of programmed cell death in multicellular organisms discovered in unicellular organisms has sparked interest on leishmania protozoan that is the causative agent of the leishmaniasis. Elucidation of the mechanisms of apoptosis is important in terms of  Leishmania species to develop drugs for the treatment of  leishmaniasis. For this reason in this study the effects of  the drugs which are Glukantim® and miltefosin aganist the programmed cell death markers was investigated on L. tropica promastigotes.
İn the study, L. tropica promastigotes which were produced in NNN were incubated in cell culture medium by addition of 10% fetal calf serum for grow that 24-26ºC. When the promastigotes growth reached logaritmic phase the drugs that were miltefosine and Glucantim® were administrated and they were taken to the analysis for three apoptotic markers that were DNA fragmentation by electrophoresis method, DNA fragmentation by TUNEL method and bcl-2 concentration by ELİSA method. Staurosporine, the drug was administered as a positive control to compare the two drugs. The application  dose of miltefosin and staurosporin was  adjusted as 100 µmol, 50 µmol, 25 µmol, 12.5 µmol and 6.25 µmol then promastigotes were incubated 24 hours .When comes to Glucantime® the application dose was adjusted as 15mg/ml, 7.5mg/ml, 3.75mg/ml, 1.875 mg/ml and  0.9375 mg/ml then promastigotes were incubated 72 hours.
In the determination of DNA fragmentation by electrophoresis method in promastigotes with the drug staurosporine as a positive control yielded DNA fragmentation image in  each dose which were 50 µmol, 25 µmol, 12.5 µmol and 6.25 µmol.At the same doses, apoptotic DNA fragmentation was observed also by TUNEL assay analysis in promastigotes.In the drug which was miltefosine displayed oligonucleosomal DNA fragmentation in 25 µmol dose. The dose which was  12.5 µmol,ıt was not displayed a full clear fragmentation. It was observed DNA fragmentation at 25 µmol and 12.5 µmol doses in also TUNEL assay analysis in promastigotes with miltefosin. Correspond to this two drugs, ıt was not observed oligo nucleosomal DNA fragmentation in promastigotes with  the drug which was Glucantime®. Only at 0.9375 mg / mL dose, a vague image that was similar to DNA fragmentation was exposed. In TUNNEL analysis Glucantime® again at 0.9375mg / ml dose occured a very light color was due to a vague image which was similar to DNA fragmentation. Apoptosis was not observed in the other dose finding. Thus, an effective oral medication of miltefosine for the treatment of Leishmania can be said to be superior compared to Glukantim® on the apoptotic effect that induced by drug in promastigotes of Leishmania tropica.
There was not  a statistically significant difference between the concentration values for each drug that  was administered at five different doses, when we looked at the bcl-2 concentration which was the other apoptotic marker. In contrast, when each drug chart values compared with each other from the highest dose, to the lowest dose of bcl-2 concentration  Glucantime® displayed a high value according to the other two drugs in five doses. The lowest value occurred in staurosporine. The high bcl-2 concentration of Glukantim® drug may be associated with that any finding  of apoptosis does not occur . A high concentration of bcl-2 is thought to inhibit apoptosis.
Efforts to induce programmed cell death in various Leishmania species of Leishmania in the treatment of drug effect is still ongoing. Induction of programmed cell death can be an effective way to treat Leishmania. But diversity and the development of resistance to drugs against parasites of Leishmania species makes it difficult to gain clarity of apoptosis to be observed in Leishmania protozoa. The findings of this study is thought to contribute to the drug treatment for Leishmania infection and to shed light on the work planned.

Keywords: Leishmania tropica, Programmed cell death, Glucantime®, Miltefosine.