B12 vitamini ölçümünde makroproteinlerin etkisi; yüksek b12 vitamini düzeylerinin polietilen glikol (PEG) ve heterofil antikor blokan tüp ile çalışılması
Macroproteins effect on the measurement of vitamin B12; measurement of HİGH vitamin B12 levels with polyethylene glycol (PEG) and heterophile antibody blocking tube
Yazar: TUĞBA ÖNCEL VAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ LEYLA DEMİR
İzmir Katip Çelebi Üniversitesi / İzmir Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antikorlar-heterofil = Antibodies-heterophile ; Polietilen glikoller = Polyethylene glycols ; Proteinler = Proteins ; Vitamin B 12 = Vitamin B 12 ; İnterferans = Interference

Özet:
B12 vitamini, vücudumuzdaki birçok metabolik süreçte görev alan esansiyel bir vitamindir. Eksikliğinin yanı sıra yüksek B12 vitamini düzeyleri de sıkça karşımıza çıkmaktadır. Ancak yüksek B12 vitamini düzeylerinin sebebi, yönetimi çok fazla bilinmemektedir. B12 vitamini düzeylerinin ölçümünde immun yöntemler sıklıkla kullanılmaktadır. İmmun yöntemler interferanslardan etkilenebilen ölçüm sistemleridir. Analitik interferans; numunede bulunan bir maddenin, sonucun gerçek değerini pozitif veya negatif yönde değiştiren etkisidir. İnterferans yapan maddeler endojen immunglobulinler, antikorlar, analit-antikor kompleksleri ve heterofil antikorlar olabilir. Çalışmamızda immun yöntemle ölçülen yüksek B12 vitamini düzeylerinde makroproteinlerin etkisini araştırmayı amaçladık. B12 ölçümünde makroprotein etkisini, pelietilen glikol (PEG) ile çöktürme, heterofil antikor blokan tüp (HBT) ve seri dilusyon yöntemlerini kullanarak araştırdık.
Olgu grubu, B12 vitamini düzeyleri 914 pg/mL'nin üzerinde olan, 145 bireye ait serum numunesinden (20-87 yaş aralığında 105 kadın, 40 erkek) kontrol grubu ise B12 vitamini düzeyleri 180-914 pg/mL aralığında olan 50 sağlıklı bireye ait serum numunesinden (22-83 yaş aralığında 34 kadın 16 erkek) oluşturuldu. Serumlar ependorflara ayrılarak çalışma gününe kadar -80 ºC'de saklandı. Çalışma günü her iki grubun serum örneklerinde PEG işlemi öncesi ve sonrası B12 düzeyleri Beckmann Coulter Unicel DXL 800 cihazında immunokimyasal yöntemle çalışıldı. PEG işleminin sonuçları geri kazanım ve modifiye referans aralık yöntemine göre değerlendirildi. Olgu grubundan seçilen 50 bireye ait serumun, HBT ile inkübasyon sonrası B12 vitamini düzeyi ölçüldü. Linearite değerlendirmesi için olgu grubundaki tüm serumlar 1/2, 1/4, 1/8 oranlarında dilüe edilerek her oran için B12 vitamini çalışıldı. PEG yöntemi, HBT ve dilusyon çalışması ile elde edilen veriler makrovitamin B12 açısından değerlendirildi.
 Olgu grubunun geri kazanım değerleri, kontrol grubunun geri kazanım değerlerinden istatistiksel olarak düşüktü. Olgu grubunun PEG sonrası B12 vitamini değerleri, PEG öncesine göre istatistiksel olarak düşüktü. Kontrol grubundaki değişim ise istatistiksel olarak anlamlı değildi. Geri kazanım değerlendirmesine göre, 145 bireyden 58(%40)'inde makrovitamin B12 olduğu görüldü. Modifiye referans aralık değerlendirmesine göre 145 bireyden 65(%44.8)'inde makrovitamin B12 olduğu görüldü. HBT ile çalışma sonrası B12 vitamini değerlerinde azalma saptanmadı. Seri dilusyonla linearite değerlendirmesinde 123 olgunun 23'ünde (%18.7) linearitede sapma vardı.
Yüksek B12 vitamini düzeylerinde makroproteinlere bağlı analitik interferans sık görülmektedir. Laboratuvarımızdaki 1 yıllık yüksek B12 vitamini prevalansı %4.6'dır. Yüksek B12 vitamini düzeyine sahip 145 olgu PEG işlemi sonrası geri kazanım yüzdelerine göre değerlendirildiğinde %40, modifiye referans aralığa göre değerlendirildiğinde %44.8 oranında makrovitamin B12 saptandı. HBT ile inkübasyon sonrası B12 düzeylerinde düşme gözlenmedi. Seri dilusyon çalışması ile 123 olgunun %18.7'sinde linearitede sapma bulundu. Ancak, interferansların %40'ında linearitede bir sapma meydana gelmeyebilir. Anlamlandırılamayan yüksek B12 vitamini düzeylerinde ayırıcı tanı olarak makrovitamin B12 düşünülmelidir. Çalışmamızın sonuçlarına göre makrovitamin B12 şüphesi olduğunda ilk olarak PEG ile çöktürme işleminin yapılmasının uygun olacağını düşünmekteyiz. Klinik ve laboratuvar işbirliği çerçevesinde, hastanın klinik durumu ve ek laboratuvar bulgularının incelenmesini, hastaya ait örneğin biyokimya uzmanı tarafından uygun interferans tespit yöntemi seçilerek değerlendirilmesini ve yorumlanmasını önermekteyiz.

Abstract:
Vitamin B12 is an essential vitamin that plays a role in many metabolic processes in our body. In addition to its deficiency, high vitamin B12 levels are also frequently observed. However, the cause and management of high levels of vitamin B12 is not well known. Immune methods are frequently used in the measurement of vitamin B12 levels. Immune methods are measurement systems that can be affected by interference. Analytical interference; the effect of a substance in the sample which changes the correct value of the result, either positively or negatively. The interfering substance may be endogenous immunoglobulins, antibodies, analyte-antibody complexes and heterophile antibodies. In our study, we aimed to investigate the effect of macroproteins on high vitamin B12 levels measured by the immune method. We investigated the effect of macroprotein on B12 measurement by using polyethylene glycol (PEG) precipitation, heterophile antibody blocking tube (HBT) and serial dilution methods.
The case group was formed from serum samples of 145 individuals (105 females and 40 males, aged between 20-87 years) with vitamin B12 levels above 914 pg/mL, and the control group from serum samples of 50 individuals (34 females and 16 males, aged between 22-83 years) with vitamin B12 levels in the range of 180-914 pg/mL. Serum samples were separated into eppendorfs and stored at -80 ºC until the working day. Vitamin B12 levels in serum samples of both groups pre-PEG and post-PEG process were studied by immunochemical method in Beckmann Coulter Unicel DXL 800 autoanalyzer. The results of the PEG treatment were evaluated in accordance with the recovery and modified reference interval method. Vitamin B12 levels were measured after incubation with HBT in the serum of 50 individuals from the case group. For the linearity evaluation, all sera in the case group were diluted in 1/2, 1/4, 1/8 ratios and vitamin B12 was studied for each ratio. The data obtained as a result of PEG method, HBT and dilution study were evaluated for macrovitamin B12.
The recovery values of the case group were statistically lower than the recovery values of the control group. Post-PEG vitamin B12 values were statistically lower than the pre-PEG in the case group. The change in the control group was not statistically significant. According to the recovery evaluation, the macrovitamin B12 ratio in the case group was 58 (40%) in the serum of 145 individuals. According to the modified reference range evaluation, the macrovitamin B12 ratio in the case group was 65 (44.8%) in the serum of 145 individuals. There was no decrease in vitamin B12 values after the study with HBT. The lack of linearity was observed on 23 (18.7%) of 123 serums  in the linearity evaluation by the serial dilution method.
Analytical interference due to the macroproteins is common on high vitamin B12 levels. The prevalence of high vitamin B12 in our laboratory was 4.6%. When 145 cases with high vitamin B12 levels were evaluated in accordance with the recovery rates of the post-PEG procedure, the macrovitamin B12 was found in 40%, and when evaluated in accordance with the modified reference range, the macrovitamin B12 was found in 44.8%. No decrease in serum vitamin B12 concentrations was observed after incubation with heterophile blocking tubes. There was lack of the linearity in 18.7% of 123 cases with serial dilution study method. However, in the 40% of interferences, a lack of the linearity may not occur. Macrovitamin B12 should be considered as a differential diagnosis on unexplained high vitamin B12 levels. According to the results of our study, we think that it would be appropriate to precipitate with PEG first when there is a suspicion of macrovitamin B12. In collaboration with clinical and laboratory; we recommend that the patient's clinical status and additional laboratory findings be examined, the patient's sample should be evaluated and interpreted by a specialist of biochemistry by selecting the appropriate interference detection method.