Üç-boyutlu, biyobozunur/biyobozunur olmayan polimerik taşıyıcıların biyosinyallerle plazma modifikasyonu ve hücre kültür uygulamaları
Plasma modification of 3D, biodegradable/nondegradable polymeric carriers by biosignals and their applications in cell culture
Yazar: HİLAL TÜRKOĞLU ŞAŞMAZEL
Danışman: PROF.DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan çalışmada, iki farklı polimerik doku iskelesinin (biyobozunur, poli-?-kaprolakton, PCL; 3-boyutlu, biyobozunur olmayan dokunmamış poliester fabrik,NWPF) yüzeyinde düşük basınç su/O2 ve atmosferik basınç su/hava plazmamodifikasyonu ile karboksil gruplarının eldesi/zenginleştirilmesi amaçlanmıştır.Düşük basınç su/O2 plazma modifikasyonu ve ardından oksalil klorür muamelesiile karboksil gruplarınca zenginleştirilen PCL ve NWPF doku iskeleleri insülin veheparin biyosinyal molekülleriyle biyolojik olarak aktive edilmişlerdir. Bu dokuiskelelerinin L929 fare fibroblast hücre kültürlerinde kullanımı araştırılmıştır.Tez kapsamındaki çalışmaların ilk aşamasında, iki farklı gözenek yapıcı (PEG4000ve sakkaroz) varlığında, gözenekli PCL doku iskeleleri hazırlanmıştır. Bu dokuiskelelerinin yüzey ve yığın özellikleri SEM, DSC ve FTIR analizleri ile karakterizeedilmiştir. SEM fotoğrafları, gözenek yapıcı olarak PEG4000 molekülükullanıldığında mikrogözenekli PCL yapılar elde edilirken, gözenek yapıcı olaraksakkaroz kristalleri kullanıldığında makrogözenekli PCL yapılara ulaşıldığınıgöstermiştir. Ayrıca SEM fotoğraflarından doku iskelelerinin ortalama gözenekçapları hesaplanmış ve bu değerler % 40 PEG4000/PCL ve % 10 Sakkaroz/PCLdoku iskeleleri için sırasıyla 40.1 ?m ve 191.2 ?m olarak bulunmuştur. DSC veFTIR sonuçları doku iskelesi oluşumu sırasında PEG4000-PCL ya da sakkaroz-PCLmolekülleri arasında herhangi bir kimyasal etkileşim olmadığını göstermiştir. L929fare fibroblast hücreleri PCL doku iskeleleri üzerine ekilmiş ve hücre üremesi 7gün boyunca takip edilmiştir. Hücre kültür sonuçları, % 10 Sakkaroz/PCL dokuiskelesinin sahip olduğu 3-boyutlu yapısı ve makrogözenekliliği sayesinde L929hücrelerinin üremesi için en uygun doku iskelesi olduğunu göstermiştir.Çalışmanın ikinci kısmında, PCL ve NWPF doku iskelelerinin atmosferik basınçsu/hava ve düşük basınç su/O2 plazma ile modifikasyonları gerçekleştirilmiştir.Patentli AER (Array Electrode Reactor) reaktörü örneklerin atmosferik basınçta vetek basamakta su/hava plazmayla modifikasyonunda kullanılmıştır. Örneklerindüşük basınç su/O2 plazmayla modifikasyonu ise üç basamakta ve silindirik,kapasitörle çalışan RF plazma reaktöründe gerçekleştirilmiştir. Modifikasyonbasamakları şunlardır; su/O2 plazma muamelesi, in situ veya ex situ gaz-katıreaksiyonu (oksalil klorür buharı, 500 mTorr, örneğin türüne göre belirlenensürede) ve hidroliz (açık laboratuvar koşulları, 1 saat). Plazma proseslerininoptimizasyonu DoE (Design Expert 7, Amerika) yazılım programı ile yapılmıştır.Modifiye edilmiş yüzeylerdeki COOH ve OH fonksiyonaliteleri miktarsal olarakfloresan işaretleme tekniği ve UVX 300G sensör kullanılarak tayin edilmiştir. PirolizGC/MS analizi ile modifiye edilmemiş, plazmayla modifiye edilmiş ve oksalilklorürle fonksiyonalize edilmiş % 100 PCl yapıların kimyasal yapıları hakkında bilgiedinilmiştir. Plazma modifikasyonu öncesi ve sonrası polimerik yüzeylerin bağılyüzey atomik bileşimlerinin belirlenmesi için ESCA analizi yapılmıştır. ESCAsonuçları polimerik yüzeylerde atmosferik basınç su/hava plazma modifikasyonusonucu, düşük basınç su/O2 plazma modifikasyonuna göre daha fazla C ?OHyoğunluğu elde edildiğini, fakat prosesin NWPF yüzeyler için daha fazladekarboksilasyona neden olduğunu göstermiştir. Modifikasyon öncesi, su/O2plazma modifikasyonu ve oksalil klorür fonksiyonalizasyonu sonrası PCLyüzeylerin mikro ve nano topografisini gözlemlemek için AFM analizleri yapılmıştır.PCL yüzeylerden alınan yüksek çözünürlük AFM görüntüleri (1?m × 1?m), nanodesenlerin plazma modifikasyonundan daha çok etkilendiğini göstermiştir. Oksalilklorür fonksiyonalizasyonu sonrası HZD fonksiyonalize tiple alınan AFMgörüntüleri, modifikasyon sonrası yüzeyde oluşan karboksil gruplarının matrisinmerkezinden uzaklaştıkça yoğunlaştığını ortaya çıkarmıştır.Karakterizasyon çalışmalarının ardından, düşük basınç su/O2 plazmayla modifiyeedilip oksalil klorürle fonksiyonalize edilmiş örnekler insülin ve heparin biyosinyalmolekülleriyle biyolojik olarak aktive edilmiştir. Bu biyosinyallerin immobilizasyonuuzatıcı kol PEO (polioksietilen bis amin) varlığında gerçekleştirilmiştir.İmmobilizasyon işlemi ESCA analizi ile nitel olarak, floresan işaretlemeteknikleriyle miktarsal olarak kanıtlanmıştır.PCL ve NWPF doku iskelelerinin hücre kültür çalışmaları L929 fare fibroblasthücreleriyle (HÜKÜK NO: 92123004) gerçekleştirilmiştir. Hücre üremesi MTTmetoduyla tayin edilmiştir. PCL yapılarla gerçekleştirilen kültürün sonunda, L929hücrelerinin üremesi için en iyi yüzeyin heparin immobilize edilmiş doku iskeleleriolduğu gözlenmiştir. NWPF doku iskeleleri ile yürütülen hücre kültürçalışmalarında H2 plazmayla modifiye edilmiş NWPF yapılarda en yüksek hücreverimine ulaşılmıştır. Bunun nedeninin H2 plazmayla NWPF yüzeylerde oluşturulanfonksiyonel gruplar ve nanotopografi olduğu düşünülmektedir. Hücrelerinmorfolojisi ve doku iskeleleri üzerindeki üremesi ışık mikroskobu ile gözlenmiştir.Ayrıca, CLSM (konfokal lazer taramalı mikroskop) analizi ile hücrelerin dokuiskeleleri üzerindeki yayılma ve üremesi incelenmiştir.Tüm çalışmaların sonucunda, düşük basınç su/O2 plazma modifikasyonununözellikle PCL yüzeyler için karboksil fonksiyonalitesinin zenginleştirilmesiaçısından daha uygun olduğu bulunmuştur. Hücre kültür çalışmalarının sonuçlarıise doku iskelelerine biyolojik molekül immobilizasyonunun hücre yapışma veüremesi açısından etkin olduğunu, özellikle heparin varlığının hücre üremesinipozitif yönde etkilediğini göstermiştir.Anahtar Kelimeler: Poli(?-kaprolakton), NWPF, düşük basınç plazma, atmosferikbasınç plazma, insulin, heparin, L929 fare fibroblast hücreleri, doku mühendisliği.

Abstract:
The main purpose of this study was to obtain/enhance COOH functionalities onsurface of two diffferent polymeric tissue scaffolds (biodegradable, poly-?-caprolactone, PCL; 3D, nondegradable non-woven polyester fabric, NWPF) byusing atmospheric pressure water/air and low pressure water/O2 plasmatreatments. After low pressure water/O2 plasma treatment and oxalyl chloridefunctionalization, COOH functionalized PCL and NWPF tissue scaffolds werebiologically activated with insulin and heparin biosignal molecules. Then suitabilityof these scaffolds for L929 mouse fibroblast cell growth was investigated.In the first part of study, porous PCL scaffolds were prepared by solventcasting/particle-leaching technique in the presence of two pore formers (PEG4000molecules and sucrose crystals). The surface and bulk properties of the resultingscaffolds were studied by SEM, DSC and FTIR. SEM photographs showed that,macroporosity was obtained in the PCL structures prepared with sucrose crystalswhile microporous structure was obtained in the presence of PEG4000 molecules.Average pore diameters calculated from SEM photographs were 40.1 ?m and191.2 ?m for 40 % PEG4000/PCL and 10 % Sucrose/PCL scaffolds, respectively.The DSC and FTIR results confirmed that there is no any interaction between poreformers and PCL during structural formation, and both pore formers, PEG4000 andsucrose, remained independently in the scaffolds. L929 mouse fibroblast cellswere seeded onto PCL structures and maintained during 7 days to evaluate cellproliferation. Cell culture results showed that, 10 % Sucrose/PCL scaffold was themost promising substrate for L929 cell growth due to 3-D architecture andmacroporous structure of the scaffold.In the second part of study, atmospheric pressure water/air and low pressurewater/O2 plasma treatments of PCL and NWPF scaffolds were realized. Theunique, patented array electrode reactor (AER) reactor was employed foratmospheric pressure water/air plasma treatment of the sample in one step. Lowpressure water/O2 plasma treatment of samples were carried out in a cylindrical,capacitively coupled RF-plasma-reactor in three steps: H2O/O2-plasma treatment;in situ or ex situ (oxalyl chloride vapors; pressure 500 mTorr; time 10-30 minaccording to the type of samples) gas/solid reaction to convert ?OH functionalitiesinto ?COCl groups; and hydrolysis (open laboratory condition; 1 hour) for final ?COOH functionalities. Optimization of plasma modification processes was done byusing DoE (Design Expert 7, USA) software programme. COOH and OHfunctionalities on modified surfaces were detected quantitatively by usingfluorescent labelling technique and an UVX 300G sensor. Chemical structuralinformation of untreated, plasma treated and oxalyl chloride functionalized 100 %PCL samples were acquired using pyrolysis GC/MS analysis. ESCA analysis wasused to evaluate the relative surface atomic compositions and the carbon andoxygen linkages located in non-equivalent atomic positions. ESCA results showedthat atmospheric pressure plasma treatment increases much more C ? OHfunctionalities than vacuum water/O2 plasma treatment, but causes moredecarboxylation for NWPF samples. AFM analysis were carried out on untreated,water/O2 plasma treated and oxalyl choloride functionalized PCL samples in orderto observe micro and/or nano topography of surfaces. Higher resolution images(1?m × 1?m) revealed that nano patterns were more affected than micro patternsby plasma treatments. AFM images recorded with HZD functionalized tipspresented that increased density of carboxylic groups at the edge of features onthe carboxylic functionalized samples.After characterization studies, low pressure water/O2 plasma treated and oxalylchloride functionalized samples were biologically activated with insulin and heparinbiosignal molecules. Immobilization of these biosignals was realized by usingspacer PEO (polyoxyethylene bis (amine). Immobilization procedure was checkedqualitatively with ESCA analysis. In addition, fluorescent labelling techniques wereused for determination of immobilized biomolecules quantitatively.The cell culture studies were carried out with L929 mouse fibroblasts [HUKUK(Cell Culture Collection) 92123004)] for both PCL and NWPF scaffolds. MTTmethod was used for evaluation of cell growth. At the end of the culture, whichwas performed with PCL structures, it was observed that heparin-immobilized PCLstructures were the most promising substrates for L929 cell growth. According tothe results of cell culture studies carried out with NWPF structures, highest cellyield was obtained on the H2 plasma treated NWPF samples. It was consideredthat functional groups and nanotopography created by H2 plasma were effectiveon this achievement. Cell morphology and cell growth on these scaffolds wereobserved with light microscope. In addition CLSM (confocal laser scanningmicroscope) analysis was done for observing cell spreading and cell growth.All these studies indicated the suitability of low pressure water/O2 plasmamodification for carboxylic functionalization of PCL surfaces. The results of cellculture experiments showed that biological molecule immobilization onto tissuescaffolds was effective on cell adhesion and cell growth, specially, the presence ofheparin affected cell growth positively.Keywords: Poly(?-caprolactone), NWPF, low pressure plasma, atmosphericpressure plasma, insulin, heparin, L929 mouse fibroblast cells, tissue engineering.