Serbest sistein bakiyelerinin gossypium hirsutum format dehidrogenaz stabilitesine etkilerinin araştırılması
Engineering of selected cysteine residues of nad+ dependent formate dehydrogenase to investigate their role in stability
Yazar: ŞEBNEM PERİHAN GÖK
Danışman: DOÇ. DR. EMEL ORDU
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Gossypium hirsutum = Gossypium hirsutum ; Kararlılık = Stability ; Nikotinamid = Nicotinamide ; Sistein = Cysteine

Özet:
Endüstriyel enzimlerde aranan en önemli özellik, endüstriyel sentezin zorlu koşulları altında stabil kalabilmeleridir. Bu nedenle, gelişmiş aktivite veya stabiliteye sahip yeni enzimlerin tasarlanması için protein stabilitesinin kapsamlı bir şekilde araştırılması kritik bir öneme sahiptir. NAD+ -bağımlı format dehidrogenazlar(EC 1.2.1.2, FDH) endüstriyel öneme sahip enzimlerdir; optik olarak saf olması istenen kiral moleküllerin sentezinde kullanılan ve  pahalı bir koenzim olan NAD(P)H'nin rejenerasyonunda ve CO₂'in hidrojen yakıtının stabilize bir formu olan formata indirgenmesinde kullanılmaktadır. Bunun nedeni NAD+'nın NADH'ye indirgenmesiyle birlikte formatın CO₂'e oksidasyonunu katalize ederken aynızamanda CO₂'in uygun koşullar altında formata indirgenmesini de kataliz edebilmeleridir. Bitki FDH'leri ayrıca oksidatif stresle mücadele etmede indirgeyici bir ortamın korunmasında önemli bir rol oynar. Gossypium hirsutum rekombinant FDH'i C22, C51, C185, C218, C267 bakiyelerinde 5 sistein aminoasidi içerir. Cys bakiyelerinin sülfoksit formlarına oksidasyonunun protein yapısındaki konumlarına bağlı olarak stabiliteyi ve aktiviteyi azalttığı gösterilmiştir. Bu çalışmada, GhFDH enziminin serbest sistein bakiyelerinin enzim stabilitesine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Arabidopsis thalinana FDH'nin kristal yapısı şablon olarak kullanılarak elde edilen homoloji modelleme sonuçlarına göre Cys51 ve Cys267 bakiyelerinin sırasıyla serin ve lösine ikamesi için bölgeye özel mutagenez yöntemi uygulanmıştır. Dizi analizi ile hedeflenen mutasyonlara sahip oldukları doğrulanan enzimlerin aktivitesini ve stabilitesini netleştirmek için yapılan karakterizasyon çalışmalarına göre her iki mutant da oksidatif strese karşı rekombinant yabanıl tip GhFDH'ye göre daha toleranslıdır.

Abstract:
The most important feature demanded in industrial enzymes is that it can
remain stable under the harsh conditions of industrial synthesis. Therefore,
comprehensive elucidation of protein stability is critical to design new enzymes
that have improved activity or stability. NAD+-dependent formate
dehydrogenases (EC 1.2.1.2, FDH) are industrially important enzymes in the
regeneration of NAD(P)H which is an expensive coenzyme used in the synthesis
of chiral molecules requested to be optically pure, and the reduction of CO2
to product formate which is a stabilized form of hydrogen fuel, because they
catalyze the oxidation of formate into CO2 concomitant with the reduction of
NAD+ to NADH, while it catalyzes reduction of the CO2 into formate under appropriate conditions. Plant FDHs also play a crucial role in the maintenance of a reducing environment to combat oxidative stress in plants. Recombinant FDH from Gossypium hirsutum contains 5 cysteine amino acids in the C22, C51, C185, C218, C267 residues. It has been shown that the oxidation of Cys residues
to the sulfoxide forms reduces stability and activity depending on their position
in the protein structure. In this study, it is aimed to investigate the effect of free
cysteine residues of the GhFDH enzyme on the stability of enzyme. According to
the homology modeling results obtained by using the crystal structure of
Arabidopsis thalinana FDH as a template, site-specific mutagenesis method was
applied for the substitution of Cys51 and Cys267 residues to serine and leucine,
respectively. Both mutants were more tolerant to oxidative stress than
recombinant wild-type GhFDH, according to characterization studies performed
to clarify the activity and stability of enzymes that were confirmed to have
targeted mutations by sequence analysis.