Deneysel fare toksoplazmozunda kan ve çeşitli doku örneklerinde enfeksiyon tanısının polimeraz zincir reaksiyon yöntemi ile saptanması
Detection of toxoplasmosis in blood and tissue samples of experimentallay infected mice by polymerase chain
Yazar: MUHAMMAD NORAL
Danışman: PROF.DR. SEMRA KUŞTİMUR
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Parazitoloji = Parasitology

Özet:
- 98 -7. ÖZETApicomplex gurubundaki Toxoplasma cinsinin insan, diğermemeliler ve kanatlılarda yerleşip hastalık etkeni olabilen tek türüToxoplasma gondii ( T.gondii )'dir. Primer enfeksiyon başlangıçtagenellikle subkliniktir. Enfekte kişilerin çoğu asemptomatik kalırlar.Bazılarında ise hafif belirtiler ortaya çıkar. Bununla beraber morbidite vemortiliteye neden olabilir. Bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda ise,latent enfeksiyonun reaktive olması ensefalit, oküler toksoplazmoz gibihastalıklara neden olur. Primer maternal toksoplazmoz enfeksiyonu fetüsegeçme riski taşır. Bu da konjenital toksoplazmoza yol açar. Serolojik tanıyöntemleri ile doğum öncesi ve immün sistemi baskılanmış hastalardatoksoplazmoz tanısını koymak kolay olmamaktadır. Bu gibi durumlardamoleküler tanı yöntemleri önem kazanır ve bu tür hastalarda, hastanınimmünolojik durumundan bağımsız olarak tanı konulabilmektedir. Buyüzden T.gondii için Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) yöntemi değerlibir alternatif yöntem olarak kabul edilmektedir.Çalışmamızda 10'ar fareden 4 grup oluşturulmuş ve tüm bufareler intraperitonal yolla 50,000 T.gondii RH suşunun takizoiti ile enfekteedilmiştir, ayrıca çalışmaya 6 fareden oluşan bir kontrol grubu daalınmıştır. Daha sonra farelerin kan, karaciğer, beyin ve dalakdokularından enfeksiyonun 24'üncü, 48'inci, 72'inci ve 96'ıncı saatlerindeörnekler alınmıştır. Patolojik lezyonlar en iyi enfeksiyonun 96'ıncı saatinde- 99 -makroskobik olarak gözlenmiştir. Tüm grupların kan örnaklerinde Giemsaboyası ile hazırlanan preparatlarında takizoitler saptanmıştır. Doku ve kanörneklerinin DNA ekstraksiyonları B1 gen bölgesi için iki turlu PZR ile, 529bç ardışık tekrar bölgesi geni için konvansiyonel PZR ile çalışılmıştır. Eldeedilen sonuçlara göre hem B1 gen bölgesi genine, hemde 529 bç ardışıktekrar bölgesi genine ait bandlar enfeksiyonun 24'üncü saatinden itibarentüm örneklerde genel olarak elde edilmiştir. Ancak 529 bç ardışık tekrarbölgesi geninin daha duyarlı olduğu saptanmıştır. Çalışmamızda B1 geniile en az 1,4 X 104 takizoit/ml saptarken, 529 bç ardışık tekrar bölgesi geniile en az 1,4 X 102 takizoit/ml saptanabildiği ve bu gen bölgesinin 100 katdaha duyarlı olduğu belirlenmiştir.Sonuç olarak; deneysel fare toksoplazmozunda, PZRyönteminin kısa zamanda hızlı sonuç vermesi, duyarlılığının yüksekolması ve immün sisteminden bağımsız olarak değerlendirilebilmesinedeniyle toksoplazmoz tanısında kullanılan konvansiyonel yöntemlereyardımcı olabileceği kanısına varılmıştır. Çalışmamızda kullanılanprimerlerden 529bç ardışık tekrar bölgesi gen primeri B1 gen bölgesiprimerinden daha duyarlıdır.

Abstract:
- 100 -8. SUMMARYDETECTION OF TOXOPLASMOSIS IN BLOOD AND TISSUE SAMPLESOF EXPERIMENTALLAYINFECTED MICE, BY POLYMERASE CHAINREACTIONToxoplasma gondii is the only species of Toxoplasma genuswhich able to infects humen and wingeds and other memelian. Theprimary infection is generally subclinical. The majority of infectedpopulation remains asemptomatic, but some patients present mildsaymptoms. However, the infection can cause morbidity and mortality. Thereactivation of the latent infection cause ocular toxoplasmosis andencephalitis in immunocompromised patients. Primary maternaltoxoplasmosis exposes the risk of transmission of the fetus leading tocongenital toxoplasmosis. Serological diagnosis can be difficult in theimmundeficiency or in the pregnancy. The use of molecular teqniques inthese group of patient gain importance particularly. Because molecularteqniques are not affected form the immu status of the patients. Thus,polymerase chain reaction (PCR) consider a valuable alternative for thediagnosis of toxoplasmosis.In our study, four groups of mice including 10 mice in each ofthese groups, were infected with 50.000 tachyzoites of sin mice. Brain,liver, spleen and blood samples were obtained from infected mice at 24,48, 72 and 96 houres of infection. Pathologic lesions were best visualised- 101 -macroscopically and microscopically at 96 houres of infection. DNA wereisolated from blood and tissue samples. The extracted DNA wereamplified with B1 gene specific primers by using a nested PCR protocol.Comparatively, 529 bp repeatative element were also amplified by using asingal step PCR. PCR products of B1 gene and the repeatative element of529 bp were both detected in tissue samples of the mice after 24 houersof infection. Detection limit was 1,4 x 104 tachyzoites/ ml by using B1primers, which it was 1,4 x 102 takyzoit/ ml by using primers selected formrepeatative element. Thus, repeatative element detection by PCR wasfound to be more (100 folf) sensitive than B1 detection.As a result of our study, PCR was evaluated as a rapid,highly sensitive method which is not effected from the immun system ofthe patient. For these reason, this method can be use as a complimentarymethod with conventional methods in the diagnosis of toxoplasmosis.Thus, repeatative element primer detection by PCR wasfound to be more sensitive than B1 gene primer detection.