Laktik asit bakterilerinin bazı suşlarında L-laktat dehidrogenaz geni ile ilgili nakavt çalışmaları
Knock-out studies on L-lactate dehydrogenase gene in some lactic acid bacteria
Yazar: HARUN ÖNLÜ
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM OSMANAĞAOĞLU
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Gıda kaynaklı izolatlar olan Lactobacillus plantarum OZH8 ve Lactobacillus helveticus OZH12 suşlarında L-laktat dehidrogenaz enzim üretiminden sorumlu olan ldhL geni "plazmid tabanlı çift çaprazlama homolog entegrasyon" yöntemi ile nakavtlanmış ve genin nakavt edilmesi PZR, gen sekansı ve qRT-PZR tekniklerinin kullanımı ile kontrol edilmiştir. qRT-PZR de en iyi ekspresyon gösteren ve MLP ile MLH olarak isimlendirilen suşlar yabanil tip suşlar ile kıyaslandığında D-ldh gen ekspresyonun ldhL MLP'de 21 kat, ldhL MLH'de ise ~ 18 kat arttığının tespit edilmesi laktik asit yolağının DL-LA üretiminden D-LA üretimine doğru yön değiştirdiğini göstermektedir. Portakal kabuğu ve mısır koçanı fermentasyonu sonucunda adı geçen sıra dahilinde 17.6 mg/ml ve 15.1 mg/ml D-LA üreten yabanil tip Lb. plantarum OZH8 suşunun MLP mutantı ise yine adı geçen sıra dahilinde 29.1 mg/ml ve 22.2 mg/ml D-LA üretmiştir (p <0.05). Lb. helveticus OZH12 suşu ile portakal kabuğunda gerçekleştirilen fermentasyon çalışmalarında 23.5 mg/ml D-LA üreten yabanil suşun MLH mutantı 34.2 mg/ml D-LA üretirken mısır koçanı fermentasyonunda bu değer 14.7 mg/ml'den 19.9 mg/ml D-LA değerine yükselmiştir (p <0.05). Bu sonuçlar yabanil suşlar tarafından üretilen D-LA miktarının mutant suşların kullanımı ile arttığını ortaya koymaktadır. En büyük artış % 71 oranı ile MLH mutantı ile gerçekleştirilen mısır koçanı fermentasyonunda gözlenmiştir.

Abstract:
The ldhL gene responsible for the production of L-lactate dehydrogenase enzyme in Lactobacillus plantarum OZH8 and Lactobacillus helveticus OZH12 strains, which are food-borne isolates, was knocked out using the "plasmid-based double-crossover homologous integration" and was controlled by use of PCR, gene sequencing and qRT-PCR techniques. When the strains designated MLP and MLH, showing best expression in qRT-PCR were compared with wild-type strains, it was found that ldhD gene expression has increased 21-fold in ldhL MLP and ~ 18-fold in ldhL MLH which showed possible shifts in lactic acid pathway from DL-LA production to D-LA production. As far as fermentation in orange peel and corn cob is compared, MLP of wild-type Lb. plantarum OZH8 was found to produce 29.1 mg/ml ve 22.2 mg/ml D-LA, as compared to wild type Lb. plantarum producing 17.6 mg/ml and 15.1 mg ml D-LA respectively.  Fermentation studies carried out by the use of Lb.helveticus OZH12 in orange peel showed that MLH mutant of 23.5 mg/ml D-LA producing wild-type strain was shown to produce 34.2 mg/ml D-LA. In corn-cob fermentation, this value increased from 14.7 mg/ml to 19.9 mg/ml D-LA by use of the mutant strain. These results suggested that the amount of D-LA produced by the wild strains could be increased by the use of the mutant strains. The greatest increase was observed in the corn-cob fermentation with MLH at a rate of 71%.