Hücresel tedavilere yönelik hızlı kök hücre karakterizasyon kitlerinin geliştirilmesi
Development of rapid stem cell characterization kits for cellular therapies
Yazar: HATİCE YAZICI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖZGÜR TATAROĞLU
İstinye Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kök Hücre ve Doku Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre terapisi = Cell therapy ; Karakterizasyon = Characterization ; Kök hücreler = Stem cells ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Mezenkimal kök hücreler (MKH) yüksek oranda kendini yenileme kapasitesi ve immunomodulasyon gibi yetenekleri sayesinde hücresel tedavi için büyük avantaj sağlamaktadır. Fetal ve erişkin birçok kaynaktan izole edilebilen MKH'lerin tanımlanması için 3 önemli belirteç vardır; Plastik yüzeye yapışma özelliği göstermesi, CD90, CD105, CD73 genlerinin pozitif ve CD34, HLA-DR, CD14, CD11 b, CD34, CD79a veya CD19 genlerinin negatif olması ve son olarak da kondrosit, osteoblast ve adiposite farklılaşabilme yeteneği gösterebilmesidir. MKH'lerin karakterizasyonunu için birçok yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemlerden en yaygın olanı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPZR) ile gen ifade düzeyleri belirlenerek karakterizasyon işleminin gerçekleştirilmesidir. Ancak ticari olarak satılan kök hücre karakterizasyon kitlerinin kullanılabilmesi için genomik DNA (gDNA)'dan komplementer DNA (cDNA) elde edilmesi gerekmektedir. Ancak bu metodun çok adımlı işlem basamağı içermesi, harcanan zaman ve emek açısından yüksek olması qPZR'ın dezavantajlı yanını oluşturmaktadır. Bu tez kapsamında yapılan çalışmada MKH'lerin gen ifade düzeylerinin qPZR ile belirlenerek karakterize edilebilmesi için daha hızlı ve kolay bir yöntem ve kit geliştirmesi sağlanmıştır. Belirlenen genlerin protein izoformları ve bu izoformların hepsinde ortak olan protein sekansı belirlenmiştir. G-C oranları ve TM derecesi gözetilerek ekson-ekson birleşimi sağlanacak şekilde primerler dizayn edilmiştir. Son olarak dizayn edilen primerin belirlenen gen bölgesine spesifik olduğunun ölçülmesi için jel elektroforezi ve polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) teknikleri kullanılmıştır. Tez kapsamında bu mesajcı RNA (mRNA)'ya spesifik olarak tasarlanan primerler, ticari primerler ile farklı koşullarda karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak bu tezde geliştirilen kit ile MKH'lerin uygun maliyetli ve daha hızlı bir şekilde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPZR) ile tek adımda gen ifade düzeyinin analiz edilmesi sağlanmıştır.

Abstract:
Mesenchymal stem cells (MSC) provide a great advantage for cellular therapy with their high self-renewal capacity and abilities such as immunomodulation. MSC's that can be isolated from many fetal and adult sources have three important features for identification; Adhesion to plastic surfaces, CD90, CD105, CD73 genes are positive, CD34, HLA-DR, CD14, CD11 b, CD34, CD79a, CD19 genes are negative, and finally, it can show the ability to differentiate into chondrocyte, osteoblast and adipocyte. Many methods have been developed to characterize MSCs, mostly using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) where gene expression levels are determined and characterization is performed. However, these methods are expensive and time consuming. In the current commercial stem cell characterization kits, cDNA must be obtained from gDNA, followed by multi-step qPCR processes which requires a lot of time and effort. With the study carried out within the scope of this thesis, a single-step kit has been developed to characterize the gene expression levels of MSCs. Isoforms of the target genes were analysed and the protein sequences common to all of these isoforms were determined. Primers were designed to ensure exon-skipping, as well as proper G-C ratios and TM values. Finally, gel electrophoresis and PCR techniques were used to validate that the designed primers were specific to the target gene regions. Within the scope of the thesis, primers designed specifically for target mRNAs were also compared to commercial primers under various conditions. As a result, with the kit developed in this thesis, it is possible to analyze the gene expression level of MSCs with RT-qPCR in a cost-effective, rapid, specific and one-step kit.