Akut myeloid lösemide spınk2'nin hücre ölümü ve proliferasyonu üzerindeki rolünün araştırılması
Investigation of the role of spink2 in acute myeloid leukemia on cell death and proliferation
Yazar: BERK İLERİ
Danışman: PROF. DR. SEMA SIRMA EKMEKCİ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Genetik = Genetics ; Hematoloji = Hematology

Özet:
Akut miyeloid lösemi (AML) hematopoez sırasında olgunlaşamayan öncül hematopeotik kök hücrelerinin kontrolsüz bir şekilde çoğalıp kemik iliği ve periferik kanda birikmesi ile oluşan bir hastalıktır. Gen mutasyonları ve sitogenetik değişimler AML gelişiminde önemli rol oynayan faktörlerdir. Tripsin inhibitörü olan SPINK2 serin proteaz ailesinin önemli üyelerinden biridir. SPINK2 geninin AML hastalarında ve AML hücre hatlarında normalden yüksek eksprese olduğu bulunmuştur. SPINK2 ekspresyon seviyesinin artması kötü prognozla  ilişkilendirilmiştir. Artmış SPINK2 ekspresyonunun AML'deki fonksiyonu tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu tez çalışmasında, AML hücre hattı olan THP-1 hücrelerinde SPINK2 ekspresyonunun etkisinin araştırılması amaçlandı. Bu kapsamda SPINK2 gen ekspresyonu kalıcı bir şekilde 3. Nesil lentivirüs aracılığı ile baskılandı. Gen ifadesinin baskılanmasının hücre proliferasyonu üzerindeki etkisi MTT testi ile belirlendi. Hücre ölümü analizleri akan hücre ölçer cihazı, apoptoz ile ilişkisi western blot ve ferroptoz ile ilişkisi ise qRT-PZR yöntemi ile incelendi. SPINK2'nin baskılanmasından 24 saat sonra hücre canlılığında %27,8, 48 ve 72. saat dilimlerinde ise  %39 ve %40 oranında azalma belirlendi. Akan hücre ölçer cihazı ile yapılan analizlerde hücre canlılığı %15 oranında azalırken, apoptoz dışı hücre ölüm oranının %10 arttığı tespit edildi. Kaspaz3 antikoru ile yapılan western blot analizleri sonucunda aktif kaspaz3 ekspresyonu görülmedi. Bu sonuçlar SPINK2'nin apoptoz dışı hücre ölümü ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir. SPINK2'nin baskılanmasının ferroptozda görev alan STEAP3 geninin ifadesinde %90 oranında azalmaya neden olduğu tespit edildi. Yapmış olduğumuz bu çalışmada, THP-1 hücreleri TP53 mutant olduğu için SPINK2'nin baskılanmasında görülen hücre ölümünün ferroptoz ile ilişki olmadığını düşündürmektedir

Abstract:
Acute miyeloid leukemia is a disease caused by the accumulation of undifferentiated progenitor hematopoietic stem cells in bone marrow and peripheral blood. The gene mutations and sitogenetic anomalies are curial factors playing role in developing of AML. 
SPINK2 known as trypsin inhibitors is one of the members of the protease family. SPINK2 gene was found overexpressed in AML patients and cell lines. The overexpression is associated with a poor prognosis. In this study, we aimed to investigate the function of SPINK2 expression in THP-1 cells, which is AML cell line. In this context, SPINK2 gene expression was downregulated by 3rd generation lentivirus system. The effects of downregulation in cell proliferation were detected by MTT assay. Cell death analysis was detected by flow cytometry, as the association with apoptosis was detected using western blot, and ferroptosis was evaluated using qRT-PZR. It's been shown that downregulation of SPINK2 cause decreasing in cell proliferation by 27.8% at 24 hours, as 39% and 40% at 48 and 72 hours, respectively. It was detected that the non-apoptotic cell death was increased %10 percent, while viability was decreased by 15% as the result of analysis of flow cytometry. As a result of western blot analysis, it's has been found that the downregulation of SPINK2 is not associated with apoptosis. On the contrary, the down regulation of SPINK2 cause the 90% decrease in expression level of STEAP3 gene playing a role in ferroptosis has been found. As a result of this study, As a result of this study after downregulating the SPINK2,   the observed cell doesn't appear to be associated with ferroptosis, because  THP-1 cells that we used for this study is TP53 mutant