Kullanılmayan hücre kültürlerinden saflaştırılan histonlardan katyonik peptitlerin eldesi ve potansiyel biyolojik aktivitelerinin araştırılması
Production and potential biological activities of cationic peptides derived from unused cell culture purified histones
Yazar: SUDE YILMAZ
Danışman: PROF. DR. FİGEN ZİHNİOĞLU ; DR. ÖĞR. ÜYESİ HICHEM MOULAHOUM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Günümüzde biyoteknolojik çalışmalara olan ihtiyacın ve ilginin giderek artmasıyla  çeşitli amaçlara yönelik olarak hücre kültürü çalışmaları oldukça önem kazanmıştır. Rekombinant protein üretiminde, çeşitli preparatların potansiyel biyoaktivitesinin değerlendirmesi için in vitro çalışmalarda, ilaç taşıyıcı sistemlerde, gıda endüstrisinde ve diğer birçok alanda hücre kültürü çalışmaları önemli rol almaktadır. Bu uygulamalarda  ana kaynağın hücre olması maliyeti ve hassasiyeti önemli ölçüde arttırır. Çalışma sonrası atılan hücre kültürleri, çeşitli amaçlar için kullanım potansiyeli olan önemli biyolojik kaynaklardır. Bu tez kapsamında  atık hürelerin biyolojik bir kaynak olarak yeniden kullanılabileceğini gösteren bir bakış açısı sunuldu. Bu yaklaşım ile atık hücrelerden pozitif yük ile karakterize histon proteinlerinin izolasyonu ve histonlardan katyonik peptidlerin üretilmesi hedeflendi. Katyonik peptidler bakterilerden hayvanlara, bitkilerden memelilere kadar çeşitli organizmalarda bulunan ve tipik olarak 12 ila 50 amino asit uzunluğunda fizyolojik pH'da +2 ile +9 arasında net pozitif yüklere sahip peptidlerdir.  Primer yapılarına bağlı olarak antimikrobiyal, antidiyabetik, antihipertansif, antioksidatif ya da immunomodülatör gibi birçok biyolojik aktivite sergilerler.  Histonlar Arg ve Lys bakımından zengin pozitif yüklü proteinler oldukları için katyonik peptid üretiminde kaynak olarak kullanıldı. Katyonik peptidlerin özellikle membranlarla olan etkileşimlerine bağlı olarak çeşiti antimikrobiyal etkiler sergiledikleri bilinmektedir. 
  İlgili tez çalışmasında biyoteknolojik bir atık ürünün yeniden değerlendirilmesini kapsayan bir yaklaşım sunuldu. Bunun için ilk olarak atık hücrelerden histon proteinleri saflaştırıldı. Ardından Tripsin ve Nötraz ile hidrolizlendi. Yüksek hidroliz etkinliği için Enzim/Substrat oranı ve zaman parametreleri optimize edildi. Hidrolizatlar ultrafiltrasyon yoluyla moleküler ağırlıklarına göre (<3 kDa ve 3-10 kDa) fraksiyonlara ayrıldı. Yapılan ön çalışmalar doğrultusunda DPP-IV inhibisyonu, Lipid Peroksidasyonunun inhibsiyonu ve Antioksidan etki için  biyolojik aktiviteler analizlendi. Aktivitelere ilişkin IC50 ve EC50 değerleri belirlendi. Hücresel toksisitenin belirlenmesinde uygulanan ilk testlerden birisi olan Hemolitik Aktivite için analizler yapıldı.  Bu çalışmaların paralelinde, in silico araçlarıyla birleştirilen LC-Q-TOF-MS analizi ile biyolojik aktivite sergileme potansiyeli gösteren fragmentler karakterize edildi. Aynı zamanda in silico araçlarıyla histonların tripsin ve nötraz ile hidrolizi sonucu açığa çıkabilecek potansiyel tüm peptid fragmentleri ve bu fragmentlerin potansiyel biyolojik aktiviteleri analizlendi. Tez kapsamında atık hücreler katyonik peptid elde etmek üzere kullanıldı ancak bunun yanında, farklı proteinlerin, lipidlerin veya birçok biyomolekülün eldesi için de uygulanma potansiyeline sahiptir.

Abstract:
Today, with the increasing need and interest in biotechnological studies, cell culture studies have gained importance for various purposes. Cell culture studies play an important role in recombinant protein production, in vitro studies for the evaluation of the potential bioactivity of various preparations, drug carrier systems, food industry and many other fields. In these applications, the fact that the main source is cells significantly increases the cost and sensitivity. Cell cultures discarded after the study are important biological resources with the potential to be used for various purposes. Within the scope of this thesis, a perspective that shows that waste cells can be reused as a biological resource is presented. The aim of this approach was to isolate histone proteins characterised by positive charge from waste cells and to produce cationic peptides from histones. Cationic peptides are found in organisms ranging from bacteria to animals, plants to mammals and are typically 12 to 50 amino acids in length with net positive charges between +2 and +9 at physiological pH.  Depending on their primary structure, they exhibit many biological activities such as antimicrobial, antidiabetic, antihypertensive, antioxidative or immunomodulatory.  Since histones are positively charged proteins rich in Arg and Lys, they were used as a source for the production of cationic peptides. Cationic peptides are known to exhibit various antimicrobial effects, especially depending on their interaction with membranes.
In this thesis, an approach involving the reuse of a biotechnological waste product was presented. For this, histone proteins were first purified from waste cells. Then they were hydrolysed with Trypsin and Neutrase. Enzyme/Substrate ratio and time parameters were optimised for high hydrolysis efficiency. Hydrolysates were fractionated according to their molecular weights (<3 kDa and 3-10 kDa) by ultrafiltration. Biological activities were analysed for DPP-IV inhibition, inhibition of lipid peroxidation and antioxidant effect. IC50 and EC50 values related to the activities were determined. Haemolytic activity, one of the first tests applied to determine cellular toxicity, was analysed.  In parallel with these studies, fragments showing potential for biological activity were characterised by LC-Q-TOF-MS analysis combined with in silico tools. At the same time, all potential peptide fragments that could be released as a result of hydrolysis of histones with trypsin and neutralase and the potential biological activities of these fragments were analysed with in silico tools. Within the scope of the thesis, the waste cells were used to obtain cationic peptides, but they also have the potential to be applied for the production of different proteins, lipids or many other biomolecules.