Titanyum esaslı medikal malzeme yüzeyinde bakteriyel tutunma ve biyofilm oluşumunun incelenmesi
Investigation of microbial adhesion and biofilm formation on the surface of titanium based medical material
Yazar: SEMİH BAYRAKTAR
Danışman: PROF. DR. ESRA SUNGUR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Medikal sektör = Medical sector ; Mikrobiyal = Mikrobial ; Nanotüp = Nanotube ; Titanyum = Titanium

Özet:
Biyomedikal malzemeler kalça, diz, omuz, diş vb. gibi insan vücudunun çeşitli bölgelerinde 
doku veya organın işlevini artırmak ve tedavi etmek amacıyla kullanılan, mekanik ve kimyasal 
dayanım gibi özelliklere sahip olan, zararlı veya toksik etki oluşturmayan biyouyumlu 
malzemelerdir. Biyomedikal uygulamalarda en sık kullanılan biyomalzeme, Ti-6Al-4V ELI 
(TAV) alaşımıdır. Cerrahi uygulama sonrası biyomedikal malzeme yüzeyinde bakterilerin 
kolonizasyonu sonucunda biyofilm tabakası oluşabilir ve böylece protez enfeksiyonları ortaya 
çıkabilir. Protez enfeksiyonları, yüksek maliyet ve morbidite nedeniyle en önemli 
komplikasyondur. Protez ilişkili enfeksiyonlardan sorumlu mikroorganizmalar arasında S. 
aureus en yaygın izole edilen bakteri türüdür. Bakteriyel tutunmayı önleyerek biyofilm 
oluşumuna dirençli biyomalzemeler elde etmek için yüzey modifikasyonu ve yüzey kaplama 
gibi çeşitli stratejiler geliştirilmektedir. Bu yüzey modifikasyon işlemleri arasında, titanyum 
bazlı malzemelerin yüzeyinde nano boyutta yapıların oluşturulması da yer almaktadır. 
Ortopedik/dental protezlerin başarısını arttırmaya yönelik olarak özellikle TiO2 nanotüpleri
üzerine odaklanılan çalışmaların sayısının zamanla arttığı görülmektedir. 
Bu tez çalışmasında esas olarak, TAV yüzeyinde oluşturulmuş TiO2 nanotüplerin, S. aureus
ATCC 6538 bakteri suşunun yüzeye tutunması ve biyofilm oluşturması üzerine bir etkisi olup 
olmadığının ortaya konulması hedeflenmiştir. Ayrıca biyofilm yoğunluğundaki ve yapısındaki
olası değişimlerin, nanotüplerin fiziksel olarak varlığından mı yoksa yapısında bulunan 
TiO2'nin toksik etkisinden mi kaynaklandığını tespit etmek de amaçlanmıştır.
Bu amaçlar doğrultusunda, biyofilm deneylerinde 3 farklı TAV kuponu kullanılmıştır: 1) 
Yüzeyinde nanotüp oluşturulmuş (TAV-1) deney kuponları, 2) yüzeyinde termal oksidasyon 
işlemi ile TiO2 tabakası oluşturulan (TAV-2) deney kuponları ve 3) parlak yüzeye sahip (TAV-3) kontrol kuponları. TAV-1 deney kuponları Yıldız Teknik Üniversitesi Metalurji ve Malzeme 
Mühendisliği'nden temin edilmiştir. Farklı yüzey özelliklerine sahip bu deney ve kontrol 
kuponları 168 sa süresince S. aureus ATCC 6538 bakteri suşuna maruz bırakılarak yüzeylerinde 
biyofilm oluşumu sağlanmıştır. Belirli örneklem saatlerinde (2, 4, 8, 10, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 
144 ve 168 sa) kuponlardan biyofilm örnekleri toplanmış ve biyofilmdeki bakteri sayısı ile 
birlikte hücre dışı polisakkarit madde elde edilerek içeriğindeki toplam karbonhidrat miktarı 
tespit edilmiştir. Ayrıca biyofilmin yapısı SEM analizi ile incelenmiştir.
TAV kuponlarının deneyin 2. sa'sındaki SEM görüntüleri, S. aureus'un 3 TAV kuponunun 
yüzeyine de tutunduğunu göstermektedir. Bakteriyolojik analiz sonucunda, deneyin 2. sa'sında
her 3 TAV kuponunda saptanan bakteri sayılarının da birbirine yakın değerlerde olduğu 
saptanmıştır. Bu bulgular, nanotüplerin ve TiO2 tabakasının bakteriyel tutunmayı
engellemediğini göstermektedir. Ancak en yüksek biyofilm yoğunluğu, TAV-1 kuponunda 8. 
sa'da gözlemlenirken, TAV-2 ve TAV-3 kuponlarında 10. sa'da tespit edilmiştir. Ayrıca, TAV-1 kuponunun yüzeyindeki biyofilmin büyüme sürecini takip eden durgun fazının, TAV-3 
kontrol kuponundakine göre daha uzun sürdüğü gözlemlenmiştir. Elde edilen bu veriler, TAV-1 kuponundaki biyofilmin diğer kuponlara göre 2 sa daha erken olgunlaştığını ve daha geç ölüm 
fazına girdiğini göstermektedir.
TAV-1, TAV-2 ve TAV-3 kuponlarından elde edilen bakteri sayıları arasında anlamlı bir farkın 
olmadığı tespit edilmiştir. Bununla birlikte, TAV-3 kontrol kuponunun 168. sa'daki SEM 
görüntüsü, kültür yöntemi ile saptanan bakteri sayısının aksine biyofilmin çok daha fazla sayıda 
bakteri içerdiğini ve ayrıca çok tabakalı ve katman halinde biyofilm oluşturarak tüm yüzeyi 
kapladığını göstermektedir. Bu durum, S. aureus bakterisinin oluşturduğu biyofilm tabakası 
çok yoğun olduğunda, 2 dk'lık sonikasyon işleminin yetersiz olduğunu göstermektedir. DAPI 
boyama işlemi sonucu elde edilen fotoğraflar da bu sonucu destekler niteliktedir. Bu nedenle, 
sonikasyon işlemi süresinin bakteri suşuna ve uygulanan deney koşullarına göre belirlenmesi 
gerektiği söylenebilir. Ayrıca, SEM görüntüsünün, bakteri sayısının tespitinde kullanılan 
yöntemin eksikliğini ortaya koymuş olması, biyofilm çalışmalarında SEM analizinin önemi 
vurgulamaktadır.
SEM görüntülerinde, TAV-3 kuponunun aksine, TAV-1 ve TAV-2 kuponunda bakteri 
hücrelerinin yüzeyde kümeler halinde bulundukları ve biyofilmin tüm yüzeyi örtmediği 
gözlemlenmiştir. Böylece kupon yüzeylerinde oluşturulan nanotüplerin ve TiO2 tabakasının, 
biyofilm yapısını değiştirdiği ve çok katmanlı biyofilm oluşumunu engellediği söylenebilir.
TAV-1 kuponundaki biyofilmden elde edilen EPS'deki toplam karbonhidrat miktarının, 
biyofilm oluşumunun ilk saatlerinde (2 ve 4. sa) TAV-2 ve TAV-3 kuponuna göre daha yüksek 
olduğu tespit edilmiştir. Bu durum, nanotüplerin fiziksel varlığının biyofilm oluşturulmasına 
karşı yarattığı olumsuz etkinin üstesinden gelebilmek için bakterilerin daha fazla EPS ürettiği 
şeklinde yorumlanabilir. Deney süresince, TAV-2 kuponunda saptanan toplam karbonhidrat 
miktarının, TAV-1 ve TAV-3 kuponlarına kıyasla anlamlı derecede daha fazla olduğu tespit 
edilmiştir. EPS sentezindeki bu artış, kupon yüzeyindeki TiO2 tabakasının toksik etkisinden 
kaynaklanabilir. 
Sonuç olarak, bu tez çalışmasında, kupon yüzeylerinde oluşturulan nanotüplerin ve TiO2
tabakasının, bakteriyel tutunmaya karşı azaltıcı/önleyici bir etkisinin bulunmadığı sonucuna
ulaşılmıştır. Ancak bu yapıların, hem olgunlaşma sürecindeki biyofilmin gelişim fazlarının 
sürelerini hem de yapısını değiştirdiği ve bunun yanı sıra çok katmanlı yoğun bir biyofilm 
oluşumunu engelledikleri görülmüştür. TAV-1 ve TAV-2 kuponlarından elde edilen bulgular 
doğrultusunda, nanotüplerin biyofilmin gelişimi üzerine tespit edilen bu olumsuz etkisinin, 
fiziksel yapılarından ziyade yapısında bulunan TiO2'den kaynaklandığı söylenebilir. Elde 
edilen tüm veriler değerlendirildiğinde, protez kaynaklı enfeksiyon riskinin azaltılmasında 
nanotüplerin biyomedikal malzeme olarak kullanımının fayda sağlayabileceği kanısına 
varılmıştır.

Abstract:
Biomedical materials are biocompatible materials that are used to increase and treat the function 
of tissues or organs in various parts of the human body such as hips, knees, shoulders, teeth, 
have mechanical and chemical resistance, and do not cause harmful or toxic effects. The most 
commonly used biomaterial in biomedical applications is Ti-6Al-4V ELI (TAV) alloy. As a 
result of the colonization of bacteria on the surface of the biomedical material after surgical 
application, a biofilm layer may form and thus prosthetic infections may occur. Prosthetic 
infections are the most important complication due to high cost and morbidity. Among the 
microorganisms responsible for prosthetic-associated infections, S. aureus is the most 
commonly isolated bacterial species. Various strategies such as surface modification and 
surface coating have been developed to obtain biomaterials that are resistant to biofilm 
formation by preventing bacterial attachment. These surface modification processes include the 
creation of nano-sized structures on the surface of titanium-based materials. It is seen that the 
number of studies focused on TiO2 nanotubes in order to increase the success of orthopedic / 
dental prostheses has increased over time.
In this thesis, it is mainly aimed to determine whether TiO2 nanotubes formed on the TAV 
surface have an effect on the adhesion and biofilm formation of S. aureus ATCC 6538 bacterial 
strain. It is also aimed to determine whether the possible changes in biofilm density and 
structure are due to the physical presence of nanotubes or the toxic effect of TiO2 in its structure.
For these purposes, 3 different TAV coupons were used in biofilm experiments: 1) Experiment 
coupons with nanotubes formed on the surface (TAV-1), 2) test coupons with a TiO2 layer 
formed on the surface by thermal oxidation process (TAV-2) and 3) control coupons with a 
shiny surface (TAV-3). TAV-1 test coupons were obtained from Yıldız Technical University 
Metallurgical and Materials Engineering. These test and control coupons with different surface 
properties were exposed to S. aureus ATCC 6538 bacterial strain for 168 h, resulting in biofilm 
formation on their surfaces. Biofilm samples were collected from coupons at certain sampling 
times (2, 4, 8, 10, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 h) and the total carbohydrate content 
was determined by obtaining the extracellular polysaccharide substance together with the 
number of bacteria in the biofilm. In addition, the structure of the biofilm was investigated by 
SEM analysis.
SEM images of the TAV coupons at the 2nd hour of the experiment show that S. aureus attaches 
to the surface of all 3 TAV coupons. As a result of the bacteriological analysis, it was 
determined that the bacterial counts detected in each of the 3 TAV coupons in the 2nd hour of 
the experiment were close to each other. These findings show that the nanotubes and TiO2 layer 
do not inhibit bacterial attachment. However, the highest biofilm density was observed at the 
8th hour in the TAV-1 coupon, while it was detected at the 10th hour in the TAV-2 and TAV-3 coupons. In addition, it was observed that the stagnant phase following the growth process of 
the biofilm on the surface of the TAV-1 coupon lasted longer than that of the TAV-3 control 
coupon. These data show that the biofilm in the TAV-1 coupon, matures 2 hours earlier and 
enters the death phase later than the other coupons.
It was determined that there was no significant difference between the bacterial counts obtained 
from the TAV-1, TAV-2 and TAV-3 coupons. However, the SEM image of the TAV-3 control 
coupon at 168 h shows that, in contrast to the number of bacteria determined by the culture 
method, the biofilm contains a much higher number of bacteria and also covers the entire 
surface by forming a multilayered and layered biofilm. This indicates that the 2-minute
sonication process is insufficient when the biofilm layer formed by S. aureus bacteria is very 
dense. The photographs obtained as a result of the DAPI staining process also support this 
result. Therefore, it can be said that the duration of the sonication process should be determined 
according to the bacterial strain and the experimental conditions applied. In addition, the fact 
that the SEM image reveals the inadequacy of the method used to determine the number of 
bacteria highlights the importance of SEM analysis in biofilm studies.
In SEM images, unlike the TAV-3 coupon, it was observed that bacterial cells in TAV-1 and 
TAV-2 coupon were in clusters on the surface and the biofilm did not cover the entire surface. 
Thus, it can be said that the nanotubes and TiO2 layer formed on the coupon surfaces change 
the biofilm structure and prevent the formation of multi-layered biofilm.
It was determined that the total amount of carbohydrates in EPS obtained from the biofilm in 
the TAV-1 coupon was higher in the first hours of biofilm formation (2 and 4 h) compared to 
the TAV-2 and TAV-3 coupons. This can be interpreted as bacteria producing more EPS in 
order to overcome the negative effect of the physical presence of nanotubes against biofilm 
formation. During the experiment, the total amount of carbohydrates detected in the TAV-2 
coupon was found to be significantly higher than in the TAV-1 and TAV-3 coupons. This 
increase in EPS synthesis may be due to the toxic effect of the TiO2 layer on the coupon surface.
As a result, in this thesis study, it was concluded that the nanotubes and TiO2 layer formed on 
the coupon surfaces did not have a reducing/preventing effect against bacterial adhesion.
However, it was observed that these structures changed both the duration and structure of the 
developmental phases of the biofilm in the maturation process, and also prevented the formation 
of a dense multilayered biofilm. In line with the findings obtained from TAV-1 and TAV-2 
coupons, it can be said that this negative effect of nanotubes on the development of biofilm is 
caused by TiO2 in its structure rather than its physical structure. When all the data obtained 
were evaluated, it was concluded that the use of nanotubes as a biomedical material could be 
beneficial in reducing the risk of infection originating from the prosthesis.