Trichomonas vaginalis ve cryptosporidium parvum parazitlerinde bulunan sistein proteaz genlerinin klonlanması ve rekombinant olarak üretilmesi
Cloning and recombinant   production of cysteine protease genes in the parasites of trichomonas vaginalis and cryptosporidium parvum
Yazar: ZEYNEP ERDEM AYNUR
Danışman: PROF. DR. BÜLENT BOZDOĞAN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Cryptosporidium parvum = Cryptosporidium parvum ; Gen klonlama = Gene cloning ; Genler = Genes ; Klonlama = Cloning ; Paraziter hastalıklar = Parasitic diseases ; Parazitler = Parasites ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic ; Sistein = Cysteine ; Trichomonas vaginalis = Trichomonas vaginalis ; Vajinal hastalıklar = Vaginal disease

Özet:
Protozoa âleminin Apicomplexa filumunda yer alan Cryptosporidium türleri ökaryotik protozoonlardır ve tüm türleri hücre içi parazitlerdir. Cryptosporidiosis, Cryptosporidium cinsine bağlı, protozoonların neden olduğu, tüm dünyada oldukça yaygın olarak bulunan ve 100'den fazla canlı türünde görülen zoonoz bir hastalıktır. Flagellalı bir protozoon olan Trichomonas vaginalis, insanlarda üreme yolu enfeksiyonu olan trikomoniyaza neden olur. Trikomoniyaz dünyada viral olmayan cinsel yolla bulaşan en yaygın hastalıktır. T. vaginalis, idrar yolu, vajina ve prostata bulaşan, flagellalı, tek hücreli, anaerobik bir protozoondur.
Sistein proteazlar hem Cryptosporidium hem de Trichomonas suşlarında önemli virulans faktörleri arasındadır. Birçok parazitte bulunan ve invazyonda önemli olan bu enzimler ilaç tasarımları için hedef olarak kabul edilirler.     
Bu çalışmada patojen olan Cryptosporidium parvum ve Trichomonas vaginalis türlerinin sistein proteaz genlerinin klonlanması amaçlanmıştır. Klonlamada kullanılmak  amacıyla gen pozitif örnek bulmak için 63 Cryptosporidium spp ve 28 T. vaginalis örneği çalışılmış ve cryptopain için, 22(%35) ve CP39 içinse 19(%68) pozitiflik bulunmuştur. Tüm cryptopain pozitif suşların aynı zamanda cryptostatin için de pozitif olduğu saptanmıştır. Cryptopain, cryptostatin ve CP39 için pozitif saptanan örneklerden, restriksiyon enzim tanıma bölgeleri eklenerek oluşturulan primerler yardımıyla PCR yöntemiyle çoğaltılmıştır. Amplikonlar pET-28a ekspresyon plazmidine yerleştirilmiş ve E.coli BL21 suşuna transformasyon yoluyla aktarılmıştır. Klonlanan cryptostatin, cryptopain ve cp39 genlerinden protein sentezlenip sentezlenmediği SDSPage yöntemiyle test edilmiştir. Transformantların sistein proteaz aktivitesinin belirlenmesi için jelatini parçalama özelliği test edilmiş sonuçta hem cryptopain hem de CP39 genleri aktarılmış E.coli BL21 suşlarının jelatinaz aktivitesi gösterdiği saptanmıştır. Cryptostatinin bu aktiviteyi önleme etkisi test edilmiş ve jelatinaz aktivitesinin önlendiği belirlenmiştir.  
Rekombinant olarak üretilen sistein proteazların tanıda ve tedavide kullanım potansiyeli vardır. Bu proteinlerin antijen olarak kullanılmasıyla elde edilecek antikorların tanı kitlerinde kullanım olasılığı mevcuttur. Bu proteazların hasarlı dokuda debridman olarak kullanılabileceği öngörülmektedir. Ayrıca sistein proteazların başka parazitlerde aşı antijeni olarak kullanımı üzerine çalışmalar mevcuttur. Proteaz inhibitörlerinin ise parazit enfeksiyonlarının tedavisinde ilaç olarak kullanılma olasılığı vardır.

Abstract:
The Cryptosporidium species in the Apicomplexa phylum of the Protozoa realm are eukaryotic protozoons and all species are intracellular parasites. Cryptosporodiosis is a zoonotic disease that is caused by protozoal species in the  genus Cryptosporidium and has been reported in more than 100 species. Trichomonas vaginalis is  a flagellated, single-celled and anaerobic protozoon that causes trichomoniasis in humans. This protozoal infection affects the reproductive tract, urinary tract, vagina and prostate. Trichomoniasis is the most common non-viral sexually transmitted disease in the world. 
 Cysteine proteases are among the major virulence factors in both Cryptosporidium and Trichomonas strains. These enzymes, which are found in many parasites and are important in invasion, are considered as targets for drug designs. 
In this study, it was aimed to clone the cysteine protease genes of the pathogen C. parvum and T. vaginalis species. In order to find gene positive samples for cloning, 63 Cryptosporidium spp and 28 T. vaginalis samples were studied and 22 (35%) and 19 (68%) positivity were found for cryptopain and CP39, respectively. All cryptopain positive strains were also found to be positive for cryptostatin. Cryptopain was amplified using PCR method with the help of primers created by adding restriction enzyme recognition regions from the samples found positive for cryptostatin and CP39. Amplicons were placed in the expression plasmid pET-28a and transferred to E. coli BL21 strain by transformation. Protein synthesis of the cloned cryptostatin, cryptopain and cp39 genes was tested by SDS Page method. The cysteine protease activity of transformants was tested against  gelatin. It has been determined that E. coli BL21 strains showing both gelatinase activity have been transferred to both cryptopain and CP39 genes. Prevention of gelatinase activity of cryptostatin was tested and it was found that gelatinase activity was inhibited.
Recombinantly produced cysteine proteases have the potential to be used in diagnosis and treatment of protozoal infections. It is possible to use the antibodies produced against these proteins as antigens in diagnostic kits. It is envisaged that these proteases can be used as debridement in damaged tissue. Also, there are studies on the use of cysteine proteases as vaccine antigens in other parasites. In conclusion, protease inhibitors can be used as drugs in the treatment of parasitic infections.