Hepatit C'nin belirlenmesine yönelik yeni bir dna biyosensörünün hazırlanması
Preparation of a novel dna biosensor for detection of hepatitis C virus
Yazar: SONER DÖNMEZ
Danışman: DOÇ. DR. FATMA ARSLAN
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada, hepatit C virüsü genotip 1a (HCV1a) tespiti için indikatörsüz DNA dizi algılama yöntemine dayalı yeni bir elektrokimyasal DNA biyosensörü geliştirildi. HCV1a biyosensörü kalem grafit elektrot (KGE) ve poliglutamik asit (PGA) kaplı kalem grafit elektrot olmak üzere farklı iki tip çalışma elektrodu kullanılarak hazırlandı.

KGE ile yapılan çalışmalarda, elektrotlar öncelikle +1,4 V potansiyelde 30 saniye süreyle asetat tamponunda aktive edildi. İnozin bazı içeren amino grubu takılı prob DNA'lar aktive edilmiş elektrotlara kimyasal bağlanma yöntemi ile immobilize edildi. İmmobilizasyon için en uygun koşullar belirlendi. Daha sonra bu probların hedef ve rastgele diziler ile hibridizasyonu gerçekleştirildi ve hibridizasyon için en uygun koşullar belirlendi.

KGE ile hazırlanan DNA biyosensörü için yapılan optimizasyon çalışmalarında, HCV1a'ya ait probların immobilizasyonu için prob derişimi 2,5 µM, hibridizasyonda kullanılan hedef derişimi 2,5 µM, immobilizasyon süresi 60 dk, hibridizasyon süresi 60 dk, immobilizasyon tamponu olarak asetat tamponu (pH: 4,8), hibridizasyon tamponu olarak 5xSSC ve hibridizasyon sıcaklığı olarak 60 ºC bulundu. DNA biyosensörünün doğrusal çalışma aralığı 0,05-0,75 µM olarak bulundu. Tespit limiti ise 54,9 nM olarak hesaplandı.
PGA kaplı KGE'ler ile yapılan çalışmalarda, öncelikle KGE yüzeyleri L-glutamik asidin fosfat tamponu (pH: 7) ortamında elektropolimerizasyonu ile PGA kaplandı. Elde edilen PGA filmin yüzeyde oluşumu taramalı elektron mikroskobu (SEM), Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) ve termogravimetrik analiz (TGA) ile ispatlandı. İnozin içeren amino grubu takılı prob DNA'lar kimyasal bağlanma yöntemi ile PGA yüzeyine immobilize edildi. İmmobilizasyon için en uygun koşullar belirlendi. Daha sonra bu probların hedef ve rastgele dizilerle hibridizasyonu gerçekleştirildi ve hibridizasyon için en uygun koşullar belirlendi.

PGA ile hazırlanan DNA biyosensörü için yapılan optimizasyon çalışmalarında, HCV1a'ya ait probların immobilizasyonu için prob derişimi 1,0 µM, hibridizasyonda kullanılan hedef derişimi 1,0 µM, immobilizasyon süresi 30 dk, hibridizasyon süresi 30 dk, immobilizasyon tamponu olarak asetat tamponu (pH: 4,8), hibridizasyon tamponu olarak 2xSSC ve hibridizasyon sıcaklığı olarak 60 ºC bulundu. DNA biyosensörünün doğrusal çalışma aralığı 0,05-1,0 µM olarak bulundu. Tespit limiti ise 40,7 nM olarak hesaplandı.

Hazırlanan her iki biyosensörün sinyallerinin ölçümünde kare dalga voltametrisi kullanıldı. Ayrıca bu biyosensörlerin, en uygun koşullarda, sentetik HCV1a polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürününe uygulaması yapıldı.

Abstract:
In this study, an electrochemical DNA biosensor based on indicator-free DNA detection method was prepared for hepatitis C genotype 1 virus (HCV1a). In our experiment pencil graphite electrode (PGE) and polyglutamic acid (PGA) coated pencil graphite electrodes were used as two different types of working electrodes.

In PGE-used studies, firstly, electrodes were activated by applying +1.4 V for 30 seconds in acetate buffer. Inosine-substituted DNA probes with modified amino groups were immobilized onto activated electrode by covalent attachment. Optimal conditions were determined for immobilization. After probe immobilization, the hybridization with complementary and noncomplementary sequences was performed,  and optimal conditions were determined for hybridization.

In the optimization studies of DNA biosensors prepared by PGE, 2.5 µM was suitable concentration for both probe immobilization and and hybridization. Immobilization and hybridization time was found 60 minutes. Acetate buffer (pH: 4.8) was used as immobilization buffer and 5xSSC was used as hybridization buffer. Hybridization temperature was 60 ºC. The linear calibration graph of DNA biosensors was linear between 0,05-0,75 µM. And detection limit was obtained 54.9 nM.
 
In PGE coated with PGA-used studies, firstly, surfaces of PGE modified with PGA were coated by means of  electropolymerization of L-glutamic acid in pH 7.0 phosphate buffer solution. The formation of PGE coated with PGA was investigated by using scanning electron microscope (SEM), Fourier-transformed infrared spectroscopy (FT-IR) and thermogravimetric analysis (TGA).

Inosine-substituted DNA probes with modified amino groups were immobilized onto PGA surface by covalent attachment from amino link. Optimal conditions were determined for immobilization. After probe immobilization, the hybridization with complementary and noncomplementary sequences was performed,  and optimal conditions were determined for hybridization.

In the optimization studies of DNA biosensors prepared by PGA coated PGE, 1 µM was suitable concentration for both probe immobilization and and hybridization. Immobilization and hybridization time was found 30 minutes. Acetate buffer (pH: 4.8) was used as immobilization buffer and 2xSSC was used as hybridization buffer. Hybridization temperature was 60 ºC. The linear calibration graph of DNA biosensors was linear between 0,05-1,0 µM. And detection limit was obtained 40.7 nM.

The hybridization event was monitored by square wave voltammetry using the guanine signal. In addition, the applications of these biosensors for synthetic PCR analogue of HCV1a were performed  in optimal conditions.