Deneysel spinal kord hasarında AC-SDKP uygulamasının NLRP3 inflamazom kompleksi ve kan-spinal kord bariyeri üzerine etkileri
Effects of ac-sdkp (n-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline) administration on the NLRP3 inflammasome complex and blood-spinal cord barrier in experimental spinal cord injury
Yazar: ALİ UFUK KEÇEBAŞ
Danışman: DOÇ. DR. KADİR OKTAY
Çukurova Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı / Tıp Eğitimi Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı, Ac-SDKP (N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline) tedavisinin deneysel spinal kord hasarında NLRP3 inflamatuar kompleksi ve kan-spinal kord bariyeri (KSKB) geçirgenliği üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Çalışma, AC-SDKP'nin inflamasyon yanıtı ve KSKB bütünlüğü üzerindeki düzenleyici potansiyelini değerlendirmeyi hedeflemiştir.
Giriş: Omurilik yaralanmaları, merkezi sinir sisteminde koruyucu bariyerlerin zayıflamasına yol açarak inflamatuar süreçleri tetikler ve kan-omurilik bariyerinde (KSKB) geçirgenliği artırır. Bu geçirgenlik artışı, hasarlı dokuya inflamatuar hücrelerin geçişini kolaylaştırmakla birlikte, bariyerin bozulmasına ve nöroprotektif etkinin azalmasına neden olabilir. NLRP3 inflammasomu, omurilik yaralanması sırasında aktive olan inflamatuar bir kompleks olarak dikkat çeker. NLRP3 inflammasomunun aktivasyonu, inflamasyon sürecinin artmasına yol açarak hasarın şiddetlenmesine katkıda bulunur.AC-SDKP (N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline) adlı immünomodülatör bir peptidin, inflamasyonu düzenleyici etkileri ile KSKB'nin bütünlüğünü koruma potansiyeline sahip olduğu düşünülmektedir. AC-SDKP'nin NLRP3 inflammasomunun aktivitesini baskılayarak, inflamatuar yanıtı kontrol altına alabileceği ve böylece omurilik yaralanmalarında KSKB'nin korunmasına katkıda bulunabileceği hipotezi bu çalışmanın temelini oluşturmaktadır. Bu araştırma, AC-SDKP'nin omurilik yaralanma modelinde NLRP3 inflammasomu ve KSKB üzerindeki etkilerini detaylı olarak incelemeyi amaçlamaktadır.

Gereç ve Yöntem: Bu çalışma, Çukurova Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu'nun onayı ile gerçekleştirilmiştir. Deneylerde 300-350 gram ağırlığında, 3-6 aylık 78 erkek Wistar sıçan kullanılmıştır. Sıçanlar üç ana gruba ayrılmıştır: herhangi bir işlem yapılmayan ve yalnızca örnek alınan kontrol grubu (n=10), yalnızca laminektomi işlemi uygulanan sham grubu (n=20) ve spinal kord hasarı (SKH) oluşturulan deney grubu (n=48). Deney grubu, SKH sonrasında kendi içinde iki alt gruba ayrılmıştır: yalnızca serum fizyolojik verilen deney kontrol grubu (n=24) ve AC-SDKP tedavisi uygulanan tedavi grubu (n=24) Elde edilen doku örnekleri ışık ve elektron mikroskobik yöntemler ile biyokimyasal ve moleküler biyolojik metotlar kullanılarak analizler yapıldı. Tüm gruplarda IL-1β, IL-18, NLRP3, kaspaz-1, NeuN, MMP-9, NF-κB, Okludin, klaudin-5 ve VE-cadherin düzeyleri araştırıldı. IL-1β ve IL-18 seviyeleri biyokimyasal analizlerle (Elisa) tespit edildi. NeuN, MMP-9, Okludin, klaudin-5 ve VE-cadherin seviyeleri immünohistokimyasal yöntemlerle belirlendi. NF-κB, NLRP3, kaspaz-1, IL-1β, IL-18 ekspresyon seviyeleri ise qRT-PCR yöntemi ile gösterildi.
Bulgular: Tedavi grubunda, NF-ΚB ve NLRP3 inflammasom aktivitesi baskılanmıştır. İnflamatuar sitokinlerden IL-1β ve IL-18'in düzeylerinde azalma gözlenmiş, Bu bulgular, AC-SDKP'nin inflamasyonu kontrol altına alma etkisini göstermektedir. Ayrıca, tedavi sonrası okludin, klaudin ve VE-kaderin gibi bariyer bütünlüğünü sağlayan proteinlerin ekspresyon seviyelerinin arttığı kaydedilmiştir. Bununla birlikte, KSKB geçirgenliğinde beklenenin aksine bir artış gözlenmiş ve bu durum, tedavi süresince mikroglia ve makrofaj gibi inflamatuar hücrelerin aktivasyonuna bağlı olarak gelişmiş olabileceği şeklinde yorumlanmıştır. Mikroskopik incelemelerde, AC-SDKP'nin inflamatuar hücre sayısını azaltıcı ve ödemi hafifletici etkileri gözlemlenmiştir.
Sonuç: Bu çalışmanın bulguları, AC-SDKP'nin omurilik yaralanması durumunda inflamasyonu düzenleyici ve doku iyileşmesini destekleyici özellikler sergilediğini göstermektedir. AC-SDKP tedavisi, NF-Κb ve NLRP3 inflammasom aktivitesini baskılamıştır. İnflamatuar yanıtı azaltarak IL-1β ve IL-18 gibi sitokin seviyelerini düşürmüştür. NLRP3 inflammasomunun aktivitesindeki bu baskılama, inflamasyon sürecinin kontrol altına alınmasına ve hasarlı dokuda daha az inflamatuar hücre birikimine katkı sağlamıştır. Aynı zamanda, AC-SDKP tedavisinin KSKB bütünlüğünü destekleyen okludin, klaudin ve VE-kaderin gibi proteinlerin ekspresyonunu artırdığı gözlenmiştir. Ancak, KSKB geçirgenliğinde gözlenen artış, AC-SDKP'nin nöroprotektif etkinliğini sınırlandırabilecek bir faktör olarak değerlendirilmektedir ve bu artışın inflamatuar hücrelerin aktivasyonuna bağlı olabileceği düşünülmektedir.AC-SDKP'nin omurilik yaralanmasında inflamasyon kontrolünde ve iyileşme sürecinde umut vadeden bir ajan olabileceği anlaşılmaktadır. Ancak, NLRP3 inflammasomu ve KSKB geçirgenliği üzerindeki etkilerinin daha iyi anlaşılması için uygun doz, tedavi süresi ve inflamatuar yanıt üzerindeki uzun vadeli etkilerinin ileri çalışmalarda detaylandırılması gerekmektedir. AC-SDKP, inflamasyon kontrolü ve doku iyileşmesi açısından potansiyel sunmakla birlikte, KSKB geçirgenliği ve güvenlik profili açısından daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır.

Abstract:
Objective: This study aims to investigate the effects of Ac-SDKP (N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline) treatment on the NLRP3 inflammasome complex and blood-spinal cord barrier (BSCB) permeability in an experimental spinal cord injury model. The study specifically targets the potential regulatory effects of Ac-SDKP on the inflammatory response and BSCB integrity.
Introduction: Spinal cord injuries weaken the protective barriers in the central nervous system, triggering inflammatory processes and increasing the permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB). This increase in permeability facilitates the migration of inflammatory cells into the damaged tissue but also leads to barrier disruption and a reduction in neuroprotective efficacy. The NLRP3 inflammasome stands out as an inflammatory complex activated during spinal cord injury. Activation of the NLRP3 inflammasome contributes to the severity of the injury by intensifying the inflammatory process. The immunomodulatory peptide AC-SDKP (N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline) is thought to have the potential to regulate inflammation and preserve BSCB integrity. The hypothesis underpinning this study is that AC-SDKP may suppress NLRP3 inflammasome activity, thereby controlling the inflammatory response and aiding in the preservation of BSCB in spinal cord injuries. This research aims to examine in detail the effects of AC-SDKP on the NLRP3 inflammasome and BSCB in a spinal cord injury model.
Materials and Methods: This study was conducted with the approval of the Çukurova University Local Ethics Committee for Animal Experiments. A total of 78 male Wistar rats, aged 3–6 months and weighing 300–350 grams, were used in the experiments. The rats were divided into three main groups: a control group with no intervention and only sampling (n=10), a sham group that underwent only laminectomy (n=20), and an experimental group with induced spinal cord injury (SCI) (n=48). The experimental group was further divided into two subgroups following SCI: an experimental control group that received only saline (n=24) and a treatment group that received AC-SDKP (n=24). Tissue samples were analyzed using light and electron microscopic methods along with biochemical and molecular biological techniques. Levels of IL-1β, IL-18, NLRP3, caspase-1, NeuN, MMP-9, NF-κB, occludin, claudin-5, and VE-cadherin were investigated in all groups. IL-1β and IL-18 levels were determined by biochemical analysis (ELISA). NeuN, MMP-9, occludin, claudin-5, and VE-cadherin levels were identified by immunohistochemical methods. NF-κB, NLRP3, caspase-1, IL-1β, and IL-18 expression levels were determined by qRT-PCR.
Findings: In the treatment group, NF-ΚB and NLRP3 inflammasome activity were suppressed. Levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-18 were observed to decrease, indicating AC-SDKP's effect in controlling inflammation. Additionally, post-treatment expression levels of proteins that maintain barrier integrity, such as occludin, claudin, and VE-cadherin, were found to increase. However, contrary to expectations, an increase in BSCB permeability was noted, which is interpreted as possibly due to the activation of inflammatory cells like microglia and macrophages during the treatment. Microscopic examination also revealed that AC-SDKP reduced the number of inflammatory cells and alleviated edema.
Conclusion: The findings of this study indicate that AC-SDKP exhibits inflammation-regulating and tissue-healing properties in the context of spinal cord injury. AC-SDKP treatment suppressed NF-κB and NLRP3 inflammasome activity, reducing cytokine levels such as IL-1β and IL-18 by mitigating the inflammatory response. This suppression of NLRP3 inflammasome activity contributed to controlling the inflammatory process and reduced the accumulation of inflammatory cells in damaged tissue. Additionally, AC-SDKP treatment was observed to increase the expression of proteins such as occludin, claudin, and VE-cadherin, which support BSCB integrity. However, the observed increase in BSCB permeability is considered a factor that may limit AC-SDKP's neuroprotective efficacy, potentially due to the activation of inflammatory cells.While AC-SDKP shows promise as an agent for inflammation control and recovery in spinal cord injuries, further research is required to better understand its effects on NLRP3 inflammasome activity and BSCB permeability. This includes studies that detail the appropriate dosage, treatment duration, and long-term impacts on the inflammatory response. AC-SDKP offers potential in terms of inflammation control and tissue healing, but additional research is necessary to evaluate its effects on BSCB permeability and its safety profile.