Zeytin sineği (Bactrocera oleae) popülasyonlarının genetik karakterizasyonu ve bu popülasyonlarda organofosfat insektisit direnç mutasyon frekanslarının belirlenmesi
Genetic characterization of olive fly (Bactrocera oleae) populations and the determination of organophosphate resistance-associated mutation frequencies of these populations
Yazar: ERSİN DOĞAÇ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. VATAN TAŞKIN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Asetilkolinesteraz = Acetylcholinesterase ; Bactrocera oleae = Bactrocera oleae ; Genetik-popülasyon = Genetics-population ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Zeytin sineği = Olive fly ; İnsektisit direnci = Insecticide resistance

Özet:
Zeytin sineği (Bactrocera oleae) dünya?da zeytin bitkisinin yetiştirildiği bütün alanlarda, özellikle de Akdeniz havzasında ve Kuzey Amerika?da en önemli zeytin zararlısıdır. Zeytin sineğinin ekonomik açıdan önemli olmasına rağmen, bu türün yayılım yolları net değildir. Bu tez çalışmasında Doğu Akdeniz havzasının önemli bir kısmını temsil eden Türkiye'deki zeytin sineği popülasyonlarının yayılım yolları ve bu popülasyonların genetik yapısı hakkında bilgi sağlamak için mikrosatellit ve mitokondriyal DNA belirteçleri kullanılmıştır. Bu amaçla ülkemizde zeytin yetiştiriciliğinin yapıldığı bütün alanları kapsayacak şekilde 12 ile ait 38 alt lokasyondan vuruklu meyveler toplanarak ergin bireyler elde edilmiştir. Sonuçlar, zeytin sineği popülasyonları arasında önemli bir genetik çeşitlilik olduğu ve Ege ve Akdeniz popülasyonları arasında önemli derecede genetik farklılık olduğunu ortaya koymuştur. Akdeniz popülasyonları, Ege popülasyonlarına oranla daha yüksek seviyede mikrosatellit çeşitliliğine sahiptir ve bu durum Akdeniz'in Doğu kısmının bu organizmanın Orta Doğu?dan Avrupa?ya yayılımında önemli bir yere sahip olduğuna işaret etmektedir. Çalışma sonucu populasyonlardaki ortalama gözlenen heterozigotluk değeri 0.78, ortalama beklenen heterozigotluk değeri 0.76 olarak bulunmuştur. Popülasyonlar arasında gen akış düzeyi Nem= 8.36 olarak bulunmuştur. MtDNA sonuçları Türkiye?nin Batı'sından toplanan zeytin sineği örneklerinin Akdeniz havzasının İtalya-Ege grubu ile oldukça yakından ilişkili olduğunu ve bu organizmanın Avrupa?ya ülkemiz üzerinden yayıldığı ihtimalini göstermektedir. Buna ek olarak Amerika kıtasına ait daha önceki çalışmalardan elde edilen mtDNA haplotiplerinin çalışmamızda yüksek frekansta bulunması bu kıtada bulunan zeytin sineği popülasyonlarının muhtemel kaynağının ülkemiz olabileceğini göstermektedir. Bu organizmanın popülasyon yapısını ve yayılım yollarını daha kesin bir şekilde belirlemek için daha fazla DNAya dayalı baz dizi analizi çalışmalarının yapılması gerekmektedir.
Ace geni tarafından kodlanan asetilkolinesteraz enzimi organofosfat grubu insektisitlerin temel hedefidir. Zeytin sineğinde daha önceden tanımlanmış üç mutasyon, farklı seviyelerde organofosfat duyarsızlaşmasını sağlamaktadır. Çalışmamızda organofosfat insektisit direncinde önemli bir rol oynayan asetilkolinesteraz enziminin 214 ve 488 numaralı bölgelerini kodlayan Ace geninin kısmi baz dizi analizi yapılmak suretiyle ve ekzon10 içerisinde bulunan 9 bç?lik delesyon bölgesinin ise poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) yöntemi kullanılarak çalışılan bireylerdeki organofosfat direnç mutasyonlarının sıklığı belirlenmiştir. Çalışmamızda kullandığımız zeytin sineği popülasyonlarında Ace geni ekzon 3 ve 6 bölgelerinin kısmi baz dizi analizlerinin yapılması sonucu elde edilen gen içi çeşitlilik değerleri karşılaştırıldığında Akdeniz popülasyonları Ege popülasyonlarına oranla daha yüksek gen içi çeşitliliği değerlerine sahiptir. Bunun yanı sıra Ace geninde direnç mutasyon sıklık farklılıklarına bakıldığında ülkemizde direnç mutasyon oranları yüksek bulunmuştur. Bu direnç mutasyonlarını bölgeler bazında kıyasladığımızda Ege popülasyonlarında Akdeniz?e oranla çok daha yüksek direnç mutasyon frekansları gözlenmiştir. Ekzon 10 bölgesinde bulunan ?3Q mutasyon frekansı ise 0.064 olarak bulunmuştur. Ekzon 3-6 ve 10 da gözlenen allel kombinasyonlarına bakıldığında çalışmamızdaki popülasyonlarda en fazla gözlenen allel kombinasyonu 214Val/Val-488Ser/Ser-SS kombinasyonudur (% 41). İkinci en fazla görülen kombinasyon ise %28 ile 214Ile/Val-488Gly/Ser-SS kombinasyonudur.
 
Anahtar Kelimeler: Zeytin sineği, Popülasyon genetiği, Mikrosatellit, mtDNA, Ace geni, Asetilkolinesteraz, Organofosfat direnci.

Abstract:
The olive fruit fly, Bactrocera oleae, is the most important pest in olive growing regions worldwide, especially in the Mediterranean basin and North America. Despite the economic importance of the olive fly, the spreading route of this species is unclear. In this thesis microsatellite and mitochondrial DNA markers were used for providing information about the population structure and invasion route of olive fly populations in Turkey, as representative of the Eastern Mediterranean region. In this purpose, hatched fruit samples were collected from 38 sublocations belonging 12 cities including all olive growing regions in Turkey. The results were presented significant genetic diversity between olive fly populations and a certain degree of differentiation between Mediterranean and Aegean populations. Mediterranean populations present higher levels of microsatellite variation than Aegean populations and this situation indicates that the eastern part of the Mediterranean has an important role on the invasion of this organism from Middle East to Europe. At the end of the study average observed heterozygosity value in populations was found as 0.78 and the average expected heterozygosity value was found as 0.76. High gene flow among populations, Nem=8.36, were determined. MtDNA results suggest olive flies from the western part of Turkey are closely related to Italo-Aegean flies of the Mediterranean basin and the olive fly populations have invaded the northern part of the Mediterranean basin through western Turkey. In addition, finding specific American haplotypes in high frequencies might indicate that Turkey is the possible source of American olive fly populations. In order to more precisely characterize the population structure and invasion routes of this organism, more DNA-based sequence analysis should be carried out worldwide.
Acetylcholinesterase, encoded by the Ace gene, is the molecular target of organophosphate insecticides. Three mutations have previously been identified in the olive fly confer different levels of organophosphate resistance. In this study 214 and 488 numbered regions, which play a significant role in organophosphate insecticide resistance of the olive fruit fly, is detected through base sequence analysis and 9 base pairs deletion region inside exon10 is analyzed through polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) for the frequency of organophosphate resistance mutation in the members being studied. When gene diversity acquired by the partial base sequence analysis of the regions 3 and 6 of Ace gene belonging to the olive fly populations used in our study, Meditterranean populations have higher gene diversity compared to the Aegean populations. In addition, with regards to resistance mutation frequency differences in Ace gene Resistance mutation ratio in our country is found to be high. When we compared this resistance mutations on the basis of regions, Aegean populations has higher resistance mutation frequency than Mediterranean populations. ?3Q mutation frequency in Exon 10 region is found to be 0.064. In our study highest allele combination observed in the populations, when allele combinations in Exon 3-6 and 10 is monitored, is 214Val/Val-488Ser/Ser-SS combination (% 41). Second most frequently observed combinations is 214Ile/Val-488Gly/Ser-SS with a ratio of % 28.

Keywords: Olive fly, Microsatellite, Population genetics, mtDNA, Ace gene, Acetylcholinesterase, Organophosphate resistance.