Sağlıklı ve kanserli meme hücre hatlarında biyotinilasyon yardımıyla karşılaştırmalı sekretom analizi
Comparative secretome analysis with the aid of biotinylation in healthy and cancerous breast cell lines
Yazar: ELİF AKINCI
Danışman: DOÇ. DR. GÜRLER AKPINAR
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Meme kanseri insidansı ve mortalitesi yüksek olan genellikle kadınlarda görülen ve
GLOBOCAN 2020 veri analizlerine göre akciğer kanserinden sonra en çok görülen kanser
türüdür. Kanser hücrelerinin normal hücrelere kıyasla bulundukları nişi değiştirdikleri ve
enzimler, büyüme faktörleri ve hücreler arası matriks proteinleri gibi farklı molekülleri
hücre dışına salgıladıkları bilinmektedir. Bu moleküler immün sistemden kaçış, hipoksik
çevrenin oluşturulması, matestaz ve invazyon gibi pek çok farklı süreçte kritik roller
üstlenmektedir. Bu nedenle normal hücrelere kıyasla kanser hücrelerinde değişiklik
gösteren salgı moleküllerinin belirlenmesi hem süreç içerisindeki mekanizmaların
anlaşılması hem de bu mekanizmaların hedeflenmesi ile tanı ve tedavi alanlarında yeni
hedeflerin ortaya çıkartılması için oldukça önemlidir. Kanser hücre biyolojisinin
anlaşılmasında ve tanıya yönelik biyobelirteçlerinin keşfinde sekretom proteinleri değer
taşımaktadır. Ancak hücre kültüründe yapılan sekretom analizinde karşılaşılan bazı
zorluklar mevcuttur. Kısaca özetlemek gerekirse; hücre kültürü medyasındaki sekretom
proteinlerinin yüksek dilüsyonu, hücre lizizi ve hücre ölümü kaynaklı proteinlerin
sekretom proteinleri ile karışması sonucu salgı proteinlerinin maskelenmesi, kültür
medyasında bulunan serum proteinlerinin salgı proteinlerini baskılaması dolayısı ile
yaşanan güçlükler literatürdeki çalışmalarda yer almaktadır.
Bu tez çalışmasında, salgı proteinlerininin endoplazmik redikulumda (ER) biyotinilasyon
aracılığla işaretlenmesi ve daha sonrasında kültür medyasından biyotinile haldeki salgı
proteinlerinin streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanarak zenginleştirilmesi
amaçlanmıştır. Böylece ölü hücrelerden salınan proteinlerin ve sitozolik proteinlerin, salgı
proteinlerini maskelemesinin önüne geçilmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda biyotinilasyon
gerçekleştiren TurboID biotin ligaz enzimi kullanılmıştır. Sağlıklı meme epital hücresi
MCF-10A, non-invaziv özellikteki MCF-7 ve invaziv özellikteki MDA MB 231
hücrelerine pDisplay_KDEL_ER_TurboID plazmiti transfekte edilmiş ve Geneticin
antibiyotiği ile seçilim yapılmıştır. Hücreler uygun yoğunluğa geldiğinde 300mM ATP,
500mM MgCl2, 50mM biotin, %2 FBS içeren medyada 16 saatlik biyotinilasyon
reaksiyonu gerçekleştirilmiştir.
Immünfloresan boyamalarla TurboID ifadesi ve ER proteinlerinin biyotinilasyonu
gösterilmiştir. Sekretom ortamından biyotinile haldeki proteinler streptavidin kaplı
manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirilmiştir. Biyotinilasyonun etkinliği, sekretom
örneklerinde Western Blot (WB) analizleri yapılarak doğrulanmıştır. nLC-MS/MS
analizleri sonucunda invaziv özellikteki MDA MB 231 hücrelerinde non-invaziv
özellikteki MCF-7 hücrelerine kıyasla yukarı regüle olan 5 adet protein tanımlanmıştır. Bu
proteinler arasından Kardiyak Troponin I protein ekspresyonu hücre özütleri, sekretom
örnekleri ve doku örneklerinde WB analizleri yapılarak incelenmiştir. nLC-MS/MS ve WB
analizleri sonucunda, troponin sekrasyonunun invaziv özellikteki MDA MB 231
hücrelerinde daha fazla olduğu saptanmıştır. Elde ettiğimiz bu sonuç literatürde yer alan
troponin ve kanser ilişkisini destekler ve tamamlayıcı nitelikte bilgiler edinilmiştir. Bu tez
çalışmasında tanımlanmış olan metaztaz ile ilişkilendirilebilecek proteinler sayesinde
literatüre güncel bilgiler kazandırılmış ve meme kanseri tanı ve tedavisine yönelik
çalışmalara öncülük edebilecek veriler elde edilmiştir.

Anahtar kelimerler: Endoplazmikretikulum, Meme kanseri, Sekretom, TurboID

Abstract:
According to GLOBOCAN 2020 data analysis, it is the most common type of cancer after
cancer with a high incidence and death of breast cancer. They are known to change the
niche in which they compare usual constraints of cancer growth and to produce different
types of cells such as enzymes, growth replications and interstructural matrix proteins.
These departments play critical roles in many different processes such as escape from the
immune system, regulation of the hypoxic environment, metastasis and invasion.
Therefore, comparing normal structures and identifying the secretory regions that show
changes in cancer cells is very important both throughout the processes and targeting these
results for the diagnosis and revealing extremely new goals. Secretome proteins hold value
in the maintenance of cancer cell biology and in the control of recognition biomarkers.
However, there are some difficulties in secretome analysis in cell cells. To summarize;
High dilution of the secretome proteins in the cell culture media, masking the secretome
proteins released as a result of the effects of the proteins originating from cell lysis and cell
death, and suppressing the proteins released by the serum proteins in the culture media are
among their duties in the literature.
This thesis is designed for the purpose of labeling secretory proteins in the endoplasmic
reticulum (ER) via biotinylation and then enriching the biotinylated secretion proteins from
culture media using streptavidin-coated magnetics. Thus, it is aimed to prevent the
masking of secretory proteins and cytosolic proteins released from dead organisms.
TurboID biotin ligase enzyme was used, which performs biotinylation in these cells.
Healthy breast epithelial groups MCF-10A, non-invasive MCF-7 and invasive MDA MB
231 cells were transfected with pDisplay_KDEL_ER_TurboID plasmid and formed with
Geneticin antibiotic. When it became dense enough for cells, it did not perform 16
biotinylations in media containing 300mM ATP, 500mM MgCl2, 50mM biotin and 2%
FBS.
Based on TurboID expression and biotinylation of ER proteins by immunofluorescent
staining. Biotinylated proteins from the secretome medium were enriched using
streptavidin-coated magnetic beads. The success of biotinylation was verified by
structuring Western Blot (WB) analyses on secretome samples.
As a result of nLC-MS/MS analysis, invasive MDA MB 231 cells have 5 proteins that are
regulated above according to the non-invasive MCF-7 chart. Among these proteins,
Cardiac Troponin I protein expression was investigated by performing WB analyses in cell
extracts, secretome samples and tissue samples. As a result of nLC-MS/MS and WB
analysis, the invasive feature of troponin secretion is more in MDA MB 231 cells. This
result we obtained has realized the relationship between troponin and cancer in the
literature and got permanent information. Thanks to the proteins that can produce proteins
with metastasis, which defines the individuals of this thesis, up-to-date information has
been brought to the literature and the main points of the sections for the diagnosis and
treatment of the breast part have been obtained.

Keywords: Breastcancer, Endoplasmicreticulum, Secretome, TurboID