Akış enjeksiyon?kromatografik yöntemlerle immobilize hümik asidin sabit faz özelliklerinin incelenmesi
Investigating the stationary phase characteristics of immobilized humic acid by using flow injection-chromatographic methods
Yazar: ORHAN GEZİCİ
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN KARA
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Hümik asit = Humic acid ; Hümik maddeler = Humic substances ; Kromatografi = Chromatography ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Ligand değiştirme = Ligand exchange ; Nükleosid = Nucleoside ; Nükleotid = Nucleotide ; İmmobilizasyon = Immobilization

Özet:
Bu çalışmada; saflaştırılmış hümik asit (HA), 15-35 µm parçacık ebadına sahip aminopropil silika (APS) destek katısına kimyasal bağ oluşumu temelinde immobilize edilmiş ve bazı nükleosit (Uridin, Timidin, Sitidin, Adenosin ve Guanosin) ve nükleobazlara (Urasil, Timin, Sitosin, Adenin, Guanin) karşı sergilediği sabit faz özellikleri kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.Çeşitli yöntemler ve tekniklerle (elemental analiz, FTIR, termogravimetrik analizler, potansiyometrik titrasyonlar, yüzey yük özellikleri, katı-sıvı temas açısı ölçümleri, SEM analizleri ve çözünürlük testleri) karakterize edilen immobilize hümik asit esaslı materyalin (EC-HA-APS) çalışılan şartlarda yüksek fiziksel ve kimyasal dayanım sergilediği görülmüştür. FTIR analizlerinden, HA'nın APS'ye amid bağı yoluyla bağlandığı tespit edilmiş ve 170 mgHA/gAPS'lik immobilizasyon verimi elde edilmiştir. Çözünürlük testlerinden, EC-HA-APS'nin, çalışılan şartlara bağlı olarak, pH=8'e kadar kararlı olduğu görülmüş ve EC-HA-APS ile yürütülen HPLC denemeleri pH?7,5'te gerçekleştirilmiştir.EC-HA-APS'nin çalışılan türlere karşı sergilediği sabit faz özellikleri önce; ters-faz sıvı kromatografisi (RPLC) ve hidrofilik etkileşme kromatografisi (HILIC) şartlarında incelenmiş ve kromatografik davranışların şekillenmesinde rol alan mekanizmalar tartışılmıştır. RPLC ve HILIC modları için 4,6x100 mm ölçülerinde EC-HA-APS ile doldurulmuş bir kromatografik kolon kullanılmıştır. Kolon şartlandırma işlemi, hareketli faz bileşimi, sıcaklık ve akış hızı gibi deneysel parametrelerin kapasite faktörü (k'), seçicilik faktörü (?) ve ayırma gücü (RS) üzerine etkisi detaylı bir şekilde incelenmiştir.RPLC ve HILIC şartlarında yürütülen analizlerden sonra, çalışılan türlerin özellikleri de dikkate alınarak, EC-HA-APS'ye ligand-değiştirme özelliği kazandırılıp ligand-değiştirme kromatografisi (LEC) şartlarında da bazı çalışmalar yapılmıştır. Çalışmalarda; 4,6x150 mm ölçülerinde, EC-HA-APS ile doldurulmuş bir kromatografik kolon kullanılmış ve EC-HA-APS'ye ligand-değiştirici özellik kazandırmak için metal iyonu (Mn+) çözeltilerinin kolona basamaklı bir şekilde yüklendiği bir yöntem izlenmiştir. Böylece; sabit faz, kolon şartlarında, ligand değiştirici bir şekle kolayca dönüştürülebilmiştir. Sabit fazın çalışılan şartlardaki maksimum gözlenen kapasitesinin Cu(II) ve Co(II) için sırasıyla 0,278 ve 0,297 mmolMn+/gEC-HA-APS olduğu tespit edilmiştir.LEC şartlarında; hareketli fazdaki organik çözücü oranı (%0-50), sıcaklık (25-45 oC) ve yüklenen metal iyonu türü (Cu2+ ve Co2+) gibi deneysel parametrelerin k', ? ve RS değerleri üzerindeki etkisi incelenmiştir. Yapısında ?NH2 grubu bulunduran nükleosit ve nükleobazların Cu(II) yüklenmiş sabit fazla daha yüksek düzeyde etkileşmeye girdiği görülmüştür.Organik çözücü oranı, RPLC ve LEC şartlarında (%0-50 aralığında) arttıkça; HILIC şartlarında ise (%70-90 aralığında) azaldıkça, türlerin kolondan daha hızlı bir şekilde elue edildikleri tespit edilmiştir.RPLC, HILIC ve LEC modları için türetilen van't Hoff eğrilerinden alıkonma entalpisinin ekzotermik olduğu ve çalışılan sıcaklık aralığında (25-45 oC) sıcaklığa bağlı olarak mekanizmada bir değişikliğin meydana gelmediği anlaşılmıştır. Kromatografik ayırmaların iyileştirilmesinde, sıcaklığın etkisi kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve sıcaklık arttırıldıkça türlerin kolondan daha kolay bir şekilde elue edilebildiği, sıcaklıkta yapılacak uygun ayarlamalar ile istenilen ayırma gücüne erişilebildiği görülmüştür. Ayırmaları optimize edebilmek için; HPLC uygulamalarında sıkça rastlanmayan bir deneysel parametre olan sıcaklık gradyenti bu çalışmada (LEC şartlarında) uygulanmış ve bu şekilde kromatografik ayırmaların önemli oranda iyileştirilebildiği görülmüştür.RPLC-HILIC ve RPLC-LEC modları arasındaki ortogonallik geometrik yaklaşım temelinde değerlendirilmiş olup; RPLC ve HILIC modları arasında %48,5; RPLC ve LEC modları arasında da %17,6'lık bir ortogonalliğin olduğu bulunmuştur. Elde edilen sonuçlar; immobilize hümik asidin farklı HPLC modlarında kullanılabilirliği ile ilişkilendirilmiştir.Çalışılan üç HPLC modunda, türleri hem izokratik hem de gradyent şartlarda yüksek tekrarlanabilirlikle ayırmanın mümkün olduğu görülmüştür. Hareketli fazdaki organik çözücü yüzdesi, akış hızı ve sıcaklıkta uygulanan gradyent programları ile ayırmalar önemli oranda iyileştirilebilmiştir. Türlerin k' değerlerindeki standart sapma düzeyinin ?0,03 olduğu tespit edilmiştir. EC-HA-APS ve APS ile doldurulmuş kolonlar üzerinde çeşitli şartlarda kaydedilen kromatogramlar birbiriyle karşılaştırılmış ve böylece immobilizasyon işleminin önemi vurgulanmıştır.Çalışılan HPLC modlarında, türlerin EC-HA-APS sabit fazı üzerindeki elüsyon verimliliklerini değerlendirmek amacıyla, akış enjeksiyon tekniğiyle kaydedilen pik alanları ile HPLC analizlerinden kaydedilen pik alanları karşılaştırılmıştır. Sonuçlar; her iki teknikle elde edilen pik alanlarının %95 ve üzerinde birbiriyle örtüştüğünü göstermiştir. Böylece; türlerin sabit faza tersinmez bir şekilde tutunduğu ile ilgili herhangi bir bulguya rastlanmamıştır.Çeşitli yöntemler ve tekniklerle karakterize edilen EC-HA-APS'nin;?Çalışılan şartlarda yüksek fiziksel ve kimyasal kararlılığa sahip olması,?RPLC, HILIC ve LEC gibi farklı kromatografik modlarda çalışabilme esnekliğini göstermesi,?RPLC, HILIC ve LEC modları arasında kolayca geçiş imkanı vermesi?Farklı metal iyonları yüklenmek sûretiyle farklı türlere karşı sergilediği kapasite ve seçiciliğin kolayca değiştirilebilmesi,gibi özellikleri göz önünde bulundurulduğunda, sabit faz olarak üstün özellikler sergilediği görülmüştür.İmmobilize hümik asit esaslı materyalin ?multifonksiyonel sabit faz? karakterinin ilk defa bu kadar kapsamlı bir incelemeye/değerlendirmeye tabi tutulduğu bu çalışmayla, farklı HPLC modlarında (ör. RPLC, HILIC ve LEC) kullanılmaya elverişli, ucuz, verimli ve çevreyle dost bir sabit fazı bilim dünyasına sunabilme fırsatı doğmuştur.

Abstract:
In the present study, purified humic acid (HA) was immobilized to aminopropyl silica solid support (15-35 µm in particle size) through chemical bond formation, and the stationary phase characteristics of the obtained material towards some nucleosides (i.e. Uridine, Thymidine, Cytidine, Adenosine, and Guanosine) and nucleobases (i.e. Uracil, Thymine, Cytosine, Adenine, and Guanine) were investigated, in detail.Humic acid-immobilized material (EC-HA-APS), which was characterized through various methods and techniques (such as elemental analysis, FTIR, thermogravimetric analyses, potentiometric titrations, surface charge characteristics, contact angel measurements, SEM analyses, and stability tests), was found to exhibit high physical and chemical stability under studied conditions. It was concluded from the FTIR analyses that HA was immobilized to APS via amid-bond formation, and amount of HA bonded to APS was found to be 170 mgHA/gAPS. Stability tests revealed high stability of EC-HA-APS until pH=8, depending on the studied conditions, and so in HPLC studies performed on EC-HA-APS medium pH was ?7.5.The stationary phase characteristics of EC-HA-APS were, at first, investigated under reversed phase liquid chromatography (RPLC) and hydrophilic interaction chromatography (HILIC) conditions, and the mechanisms taking role in chromatographic behaviors were discussed. An HPLC column (4.6x100, i.d. x length; as mm) packed with EC-HA-APS was used in HPLC analyses performed under RPLC and HILIC conditions. Effect of some experimental variables, such as column conditioning process, mobile phase composition, temperature, and flow rate, on retention factor (k'), selectivity factor (?), and resolution (RS) was investigated, in detail.After having been performed the analyses under RPLC and HILIC conditions, EC-HA-APS has been turned into a ligand exchanger form, and thus some experiments have been performed under ligand-exchange chromatography (LEC) conditions, too, by taking the physicochemical properties of the studied species into account. In the studies, a column (4.6x150, i.d. x length; as mm) packed with EC-HA-APS was used, and the stationary phase was turned into a ligand exchanger form by loading a metal ion (Mn+) solution to the column in a stepwise manner where the concentration of metal ion solution was gradually increased. Thus, the stationary phase was, easily, turned into a ligand exchanger form under column conditions. Maximum observable capacities of the column towards Cu(II) and Co(II) were determined as 0,278 and 0,297 mmolMn+/gEC-HA-APS, respectively.Under LEC conditions, the effect of percentage of organic modifier in mobile phase (within the range 0-50%; v/v), temperature (25-45 oC), type of the metal ion loaded (Cu2+ and Co2+) on k', ?, and RS was studied. The species, which bear ?NH2 group in their structure, showed higher degree of interaction with Cu-EC-HA-APS.The studied species eluted more easily with (i) increasing the percentage of organic modifier in the range 0-50% under RPLC and LEC conditions, and (ii) decreasing the percentage of organic modifier in the range 70-90% under HILIC conditions.It was concluded from the van?t Hoff plots derived for RPLC, HILIC and LEC modes that retention enthalpy had an exothermic character, and there was no change in the mechanism responsible for retention depending on temperature. Special care was given to the effect of temperature on chromatographic separations, and the studied species were found to elute faster with increasing temperature. Also, chromatographic separations were found to be improved by careful adjustment of temperature. The temperature gradient, which is not a common experimental parameter being used in HPLC studies, has been also used in the present (under LEC conditions), and chromatographic separations have been significantly improved in this way.Orthogonality between RPLC-HILIC, and RPLC-LEC modes was evaluated through geometric approach, and % orthogonalities between the applied modes were found as 48.5% and 17.6%, respectively. Obtained results were related with the usability of EC-HA-APS in different modes of HPLC.The studied species were found to be separated through isocratic and gradient elution under each studied HPLC mode with high reproducibility. Through the gradient programs applied in percentage of organic modifier, flow rate and temperature, chromatographic separations were improved, significantly. Standard deviation in k' values of the species were found as ?0.03. Under different experimental conditions, the chromatograms recorded on the columns packed with EC-HA-APS and APS were compared with each other, and thus the importance of HA immobilization to APS was emphasized.In order to evaluate the elution efficiency of the studied species for each applied HPLC mode, area of the peaks recorded via flow injection technique and those recorded from HPLC analyses were compared. The results showed that peak areas fitted over 95%. So, no evidence, which could be related with irreversible binding of the species to the stationary phase, was observed.EC-HA-APS exhibited superior properties due to the following reasons:?High physical and chemical stability under the studied conditions,?Flexibility to use it in different HPLC modes, such as RPLC, HILIC and LEC,?Easy adaptation to different HPLC modes?Easy variations in its capacity and selectivity by loading different metal ions?Multifunctional stationary phase? behavior of a humic-based material has been studied/evaluated for the first time through this study, and thus an inexpensive, efficient and environmentally-friendly stationary phase, which is useful in different HPLC modes (i.e. RPLC, HILIC, and LEC) as well, has been presented to the scientific committee.