C6 Glioma hücre hattında tosilizumab'in glutamat eksitotoksisitesi üzerine etkisi
The effect of tocilizumab against glutamate-induced excitotoxicity in C6 Glioma cell line
Yazar: RÜMEYSA KILIÇER
Danışman: DOÇ. DR. AHMET ŞEVKİ TAŞKIRAN
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı / Fizyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Glutamat = Glutamates ; İnterlökin 6 = Interleukin 6

Özet:
Amaç: Bu çalışmada amaç; İnterlökin-6 (IL-6) reseptör inhibisyonunun glutamat ile oluşturulan eksitotoksisitite sonucu oluşturulan hasarın etkisini göstermek ve IL-6 reseptör antagonisti Tosilimuzab'ın glutamat ile eksitotoksisite ile oluşturulan üzerine etkisini nöroinflamasyon sistem üzerine etkilerini gösterip aralarındaki ilişkiyi aydınlatmaktır.
Materyal ve Metot: Çalışmada C6 sıçan glioma hücre hattı kullanıldı. Glutamat ile oluşturulan eksitotoksisite üzerine IL-6 reseptör antagonisti tosilizumab'ın etkisini değerlendirmek için hücreler dört gruba ayrıldı. Kontrol grubuna tedavi uygulanmadı, glutamat grubuna glutamat 10 mM, tosilizumab grubuna farklı konsantrasyonlar da (3, 6, 12, 25 ve 50 μM) tosilizumab ve tosilizumab+glutamat grubuna hücrelere farklı konsantrasyonlarda (3, 6, 12, 25 ve 50 μM) tosilizumab uygulandı 1 saat sonra 10 mM glutamat eklendi. Tüm gruplar toplamda 24 saat inkübe edildi. Sonrasında hücre canlılığı için XTT testi kullanıldı, total oksidan seviyeleri (TOS), total antioksidan seviyeleri (TAS), indiklenmiş oksit sentaz (iNOS) ve nitrik oksit (NO) seviyeleri ticari kitler ile ölçüldü. Apoptotik süreç için TUNEL florasan boyama yapıldı. Hücrelerde tosilizumab'ın glutamat toksisitesi sonrası ROS üretimi üzerine etkilerini değerlendirmek için immünfloresan ve IL-6 reseptör seviyeleri floresan boyama yöntemi ile değerlendirildi. Verilerin istatistiksel analizinde tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı. İstatistiksel anlamlılık düzeyi p˂0,05 olarak kabul edildi.
Bulgular:C6 hücrelerine 10 mM glutamat uygulanması kontrolle kıyaslandığında canlı hücre sayısını azaltmış; TOS, NO, iNOS seviyelerini, apoptotik hücre sayısını anlamlı ölçüde artırmıştır (p<0,05). 25 μM Tosilizumab ile IL-6 reseptörü antagonize edilmesi sonrası glutamat uygulanması tek başına glutamat'a maruz kalan hücrelerle kıyaslandığında canlı hücre sayısını artırmış; TOS, NO, iNOS seviyelerini, apoptotik hücre sayısını anlamlı ölçüde azaltmıştır (p˂0,05). C6 hücrelerine 10 mM glutamat uygulanması kontrolle kıyaslandığında IL-6 reseptör ve ROS seviyelerini anlamlı olarak artırmıştır (p<0,05).  Fakat tosilizumab ile IL-6 reseptörün sonrası glutamat uygulanması tek başına glutamat'a maruz kalan hücrelerle kıyaslandığında IL-6 protein seviyesini anlamlı olarak azaltmıştır (p˂0,05)
Sonuç: Araştırma sonuçları, IL-6 reseptörü tosilizumab ile inhibisyonunun glutamat'a bağlı eksitotoksisite ve nöroinflamasyonu azaltabileceğini göstermiştir. Deneysel ölçümler tosilizumab'ın etkisini oksitadif stres seviyeleri üzerinden gerçekleştirdiğini ortaya çıkarmıştır. Ancak bu konuyla ilgili in vitro ve in vivo daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Abstract:
Aim: In this study, we aim to show the effect of Interleukin-6 (IL-6) enzyme inhibition on the damage caused by Glutamate-induced excitotoxicity, and to show the effect of the IL-6 inhibitor Tosilimuzab on the damage caused by Glutamate-induced excitotoxicity, on the neuroinflammation system and to elucidate the relationship between them.
Materials and Methods: C6 rat glioma cell line was used in the study. To evaluate the effect of the IL-6 inhibitor Tosilizumab on cell death after glutamate-induced excitotoxicity, the cells were divided into four groups. Treatment wasn't applied to the control group,  Glutamate 10 mM was administered to the Glutamate group, Tocilizumab was administered to the cells at different concentrations ( 3, 6, 12, 25 and 50 μM) to the Tocilizumab group, and Tocilizumab was administered to the cells at different concentrations, ( 3, 6, 12, 25 and 50 μM) to the Tocilizumab+Glutamate group. After 1 hour, 10 mM Glutamate was added. All groups were incubated for 24 hours in total. Afterwards, XTT test was used for cell viability, total oxidant levels (TOS), total antioxidant levels (TAS), induced oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) levels were measured with commercial kits. TUNEL test was applied for the apoptotic process. Effects of Tocilizumab on ROS production after glutamate toxicity in cellsTo evaluate the results, immunofluorescence and IL-6 levels were evaluated by fluorescent staining method. One-way analysis of variance (ANOVA) was used in statistical analysis of the data. Statistical significance level was accepted as (p˂0,05)
Results: Application of 10 mM Glutamate to C6 cells reduced the number of viable cells compared to the control; It significantly increased TOS, NO, iNOS levels and the number of early and late apoptotic cells (p<0.05). Application of Glutamate after IL-6 inhibition with 25mm Tocilizumab increased the number of viable cells compared to cells exposed to Glutamate alone; It significantly reduced TOS, NO, iNOS levels, and the number of early and early apoptotic cells (p˂0.05). According to TUNEL staining results, application of 10 mM Glutamate to C6 cells significantly increased IL-6 and ROS protein levels compared to the control (p<0.05). However, Glutamate application after IL-6 inhibition with Tocilizumab significantly reduced the IL-6 protein level compared to cells exposed to Glutamate alone (p˂0.05).
Conclusion: Research results showed that IL-6 inhibition could reduce Glutama-induced excitotoxicity and neuroinflammation. Experimental measurements revealed that Tocilizumab exerts its antioxidative and protective effect through NO levels. However, more studies on this subject are needed in vitro and in vivo.