Bazı antimikrobiyal peptitlerin çeşitli antibiyotikler ile birlikte karbapenem dirençli acinetobacter baumannii klinik izolatlarına karşı in vitro ve in vivo galleria mellonella larva modeli üzerine etkinliğinin belirlenmesi
Determination of the effectiveness of some antimicrobial peptides along with various antibiotics against carbapenem-resistant acinetobacter baumannii clinical isolates on in vitro and in vivo galleria mellonella larva model
Yazar: DEMET GENÇ
Danışman: DOÇ. DR. BANU KAŞKATEPE
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Antimikrobiyal direnç, küresel sağlığa ciddi bir tehlike oluşturan çok yönlü bir krizdir. Antibiyotiklerin zaman içerisinde etkisiz hale gelmesi ile dirençli mikroorganizmaların sebep olduğu enfeksiyonları tedavi etmek giderek daha zor olmaktadır. Gelişen antimikrobiyal direnç nedeniyle geleneksel antibiyotiklerin tedavide kullanımı hızla sınırlanmakta ve alternatif antimikrobiyal stratejilere yönelik araştırmaların gelişmesine sebep olmaktadır. Antimikrobiyal peptitler (AMP), geleneksel antibiyotiklere göre belirgin avantajlar sundukları ve klinik potansiyelleri nedeniyle dikkat çeken, geniş spektrumlu antibakteriyel aktiviteye ve immünomodülatör fonksiyona sahip küçük moleküler peptitlerdir. Bu çalışma dahilinde LL-37 ve Melittin AMP' leri ile çalışılmıştır. 
Geçtiğimiz birkaç on yılda A. baumannii, enfeksiyon salgınlarına neden olma ve karbapenemler de dahil olmak üzere kullanılan hemen hemen tüm antibiyotiklere direnç kazanma konusundaki olağanüstü yeteneği nedeniyle özellikle hastane enfeksiyonu etkeni olarak artan klinik öneme sahip bir patojen haline gelmiştir. Bu bakterilerin neden olduğu enfeksiyon tedavileri için çok fazla seçeneğin kalmaması nedeni ile alışılmışın dışında kombinasyon tedavileri giderek daha fazla dikkate alınmaktadır. Bu çalışma kapsamında, hastane enfeksiyonu etkeni karbapenem dirençli 10 adet A. baumannii izolatı kullanılmıştır ve deney şartlarının standardizasyonunu sağlamak için A. baumanii ATCC 19606 izolatı kontrol olarak kullanılmıştır. Meropenem, imipenem, melittin ve LL-37 MİK değerleri EUCAST önerileri doğrultusunda sıvı mikro dilüsyon yöntemi ile belirlenmiştir. A. baumannii kökenleri üzerinde checkerboard ve time kill yöntemleriyle sinerji araştırılmıştır. Ayrıca MEL, IMP ve MER'in tek başlarına ve kombinasyonlar halinde in vivo G. mellonella larva modeli üzerinde etkinlikleri araştırılmıştır. MEL MİK değerleri 31,25-62,5 µg/ mL arasında değişmiştir. LL-37 MİK değerleri ise iki izolat hariç 500 µg/ mL'den büyük bulunmuştur.  Bu izolatlar ATCC 19606 ve M5'tir. MİK değerleri ise 250 µg/ mL bulunmuştur.M5 izolatı dama tahtası yöntemi kullanılarak araştırılan dört kombinasyonda da sinerji gösteren tek izolat olmuştur. Bu izolatın MER-MEL, MER-LL 37, IMP-MEL, IMP-LL 37 kombinasyonlarında elde edilen FİK indeksi değeri sırası ile 0,375, 0,375, 0,5 ve 0,5 'tir.  Time kill yöntemi ile sinerji araştırılmasında 1x MİK ve ½ x MİK konsantrasyonları çalışılmıştır. Çeşitli zaman aralıklarında hem bakterisidal aktivite hem de sinerjik etki belirlenmiştir. Ayrıca hem 1x MİK konsantrasyonunda hem de ½ x MİK konsantrasyonda en etkin madde MEL olarak belirlenmiştir.
G. mellonella larva modeli üzerinde gerçekleştiren in vivo çalışmada hem sağ kalım oranları hesaplanmış hem de cfu tayini gerçekleştirilmiştir.  
Anahtar Sözcükler: Acinetobacter baumannii, antimikrobiyal direnç, Galleria mellonella, LL-37, Melittin,

Abstract:
Determination of the Effectiveness of Some Antimicrobial Peptides along with Various Antibiotics Against Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Clinical Isolates on In Vitro and In Vivo Galleria mellonella Larva Model
Antimicrobial resistance is a multifaceted crisis that poses a serious threat to global health. As antibiotics become ineffective over time, it becomes increasingly difficult to treat infections caused by resistant microorganisms. Due to the development of antimicrobial resistance, the use of traditional antibiotics in treatment is rapidly limited, leading to the development of research on alternative antimicrobial strategies. Antimicrobial peptides (AMP) are small molecular peptides with broad-spectrum antibacterial activity and immunomodulatory function that have attracted attention because they offer distinct advantages over traditional antibiotics and their clinical potential. In this study, LL-37 and Melittin AMPs were used.
Over the past few decades, A. baumannii has significantly gained clinical importance, particularly as a causative agent of nosocomial infections. This is attributed to its exceptional capacity to trigger of infection and to develop resistance to nearly all commonly used antibiotics, including carbapenems. Since there are not many options left for treating infections caused by these bacteria, unconventional combination treatments are increasingly being taken into consideration. 
Within the scope of this study, we used 10 carbapenem-resistant A. baumannii isolates, causative agent of nosocomial infection. A. baumanii ATCC 19606 strain was used as a control to ensure standardization of experimental conditions. Meropenem, imipenem, melittin, LL-37 MIC values were determined by the liquid microdilution method in accordance with EUCAST recommendations. Synergy was investigated using checkerboard and time kill methods on A. baumannii isolates. Additionally, the effectiveness of MEL, IMP and MER, alone and in combination, were investigated on the in vivo G. mellonella larvae model. MEL MIC values ranged between 31,25-62,5 µg/mL. LL-37 MICvalues were found to be greater than 500 µg/mL except for two isolates. These isolates are ATCC 19606 and M5. MIC values were found to be 250 µg/mL. M5 isolate was the only isolate that showed synergy in all four combinations investigated using the checkerboard method. The fic index values for this isolate in the combinations of MER-MEL, MER-LL 37, IMP-MEL, IMP-LL 37 is 0,375, 0,375, 0,5 and 0,5, respectively. We studied 1x MIC and ½x MIC concentrations to investigate synergy using the time kill method. Both bactericidal activity and synergistic effect were determined at various time intervals.  In addition, the most active substance was determined to be MEL, both at 1x MIC concentration and ½x MIC concentration.
In the in vivo study performed on the G. mellonella larva model, survival rates were calculated and cfu determination was performed.
Key Words: Acinetobacter baumannii, antimicrobial resistance, Galleria mellonella, LL-37, Melittin,