Anoxybacillus ayderensis Ay9 ısıl kararlı β-Glukozidazının çift mutasyonu (G226Q/Y227F), karakterizasyonu ve bazı polifenolik substratların antioksidan kapasiteleri üzerine etkilerinin araştırılması
Double mutation (G226Q/Y227F) of Anoxybacillus ayderensis Ay9 thermal  stable  β-Glucosidase, characterization and investigation of the effects of some polyphenolic substrates on antioxidant capacities
Yazar: MİNE KARAOĞLAN
Danışman: PROF. DR. AHMET ADIGÜZEL
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Glükozidaz = Glucosidase ; Mutasyon = Mutation ; Organik bileşikler = Organic compounds ; Polifenol = Polyphenol

Özet:
Amaç: β-Glukosidazlar, birçok polifenolik bileşiği de-glikosile edebilen glikozit hidrolazlar ailesinin önemli üyeleridir. Yapılan bu tez bu çalışmasının amacı, aktif yapısındaki amino asitlerin mutasyonları ile enzimin termostabilitesini ve doğal olarak oluşan ve ticari olarak satın alınan sentetik substratlara bağlı glukoz rezidülerinin seçici olarak uzaklaştırılmasını artırmak ve sonrasında polifenolik glikozitlerin antioksidan etkilerini artırıp enzimin endüstriyel alanlarda kullanımını kolaylaştırmaktır.  
Yöntem: Bgl Ay9 G226Q/Y227F mutant geni PCR temelli mutagenez yöntemi ile spesifik primerler kullanılarak oluşturuldu. PCR ürünü pGEMT klonlama vektörüne aktarıldı. .DNA dizisi Anoxybacillus ayderensis Ay9'un β-glukosidaz gen dizisi ile hizalandı ve pET28(+) ekpresiyon vektörüne aktarıldı. Protein ekspresyonu için rekombinant pET28(+) vektörü taşıyan E. coli BL21 hücreleri LB içerisinde büyütüldü. Enzim ekspresyonunu indüklemek amacıyla IPTG. Rekombinant protein, Ni2+ NTA afinite kromatografisiyle saflaştırıldı ve SDS PAGE'de görüntülendi. Enzimin biyokimyasal karakterizasyon işlemleri ve doğal substratların kinetik parametleri farklı yöntemler kullanılarak oluşturuldu. Enzimin polifenolik bileşikler üzerindeki antioksidan etkisi DPPH yöntemi kullanılarak test edildi.
Bulgular: PCR temelli mutagenez yöntemi ile Bgl Ay9 G226Q/Y227F geni elde edildi. Enzimin ağırlığı SDS PAGE' de yaklaşık 54 KDa olarak tespit edildi. Enzimin optimum sıcaklığı 50°C ve optimum pH 'sı 6,0 olarak belirlendi.. Enzimin pNPG substratı ile oluşturulan Km, Vmax, değerleri sırasıyla 0,246 mM, 0,057 umol/dk, olarak belirlendi. Enzimin Polidatin, Mirisetin 3-O glikozit ve Kukurbitasin 2-E-O glikozit substratları üzerinde ki antioksidan etkisi sırasıyla %54,5 , %32,95 ve %41,2 olarak saptandı.
Sonuç: Yabani tip(BglA9 WT) ve mutant Bgl Ay9 G226Q/Y227F enzimin karakterizasyon sonuçları karşılaştırıldı, mutantın optimum pH seviyesinin düştüğü (pH 8'den pH 6'ya) ve çözücüler, metallerle, deterjanlar ve glukoz etkileşimlerinde değişiklikler olduğu ve Optimum sıcaklığının, yabani tip ile uyumlu olduğu tespit edildi. Bunun yanında kinetik parametreler kıyaslandığında mutant enzimin bazı substratlara karşı ilgisinin azaldığı ve çalışma kapsamında belirlenen substratlar üzerindeki antioksidan etkisi arttığı tespit edildi. 
Anahtar Kelimeler: β-Glukosidazlar, polifenolik bileşikler, mutasyon, DPPH

Abstract:
Purpose: β-Glucosidases are important members of the family of glycoside hydrolases capable of de-glycosylating many polyphenolic compounds. The aim of this thesis study is to increase the thermostability of the enzyme with the mutations of amino acids in its active structure and the selective removal of glucose residues due to naturally occurring and commercially purchased synthetic substrates, and then to increase the antioxidant effects of polyphenolic glycosides and facilitate the use of the enzyme in industrial areas.
Method: Bgl Ay9 G226Q/Y227F mutant gene was generated by PCR-based mutagenesis method using specific primers. The PCR product was transferred into the pGEMT cloning vector. The DNA sequence was aligned with the β-glucosidase gene sequence of Anoxybacillus ayderensis Ay9 and transferred into the expression vector pET28(+). E. coli BL21 cells carrying the recombinant pET28(+) vector for protein expression were grown in LB. IPTG to induce enzyme expression. The recombinant protein was purified by Ni2+ NTA affinity chromatography and visualized on SDS PAGE. The biochemical characterization processes of the enzyme and the kinetic parameters of the natural substrates were created using different methods. The antioxidant effect of the enzyme on polyphenolic compounds was tested using the DPPH method. 
Findings: Bgl Ay9 G226Q/Y227F gene was obtained by PCR-based mutagenesis method. The weight of the enzyme was determined as approximately 54 KDa in SDS PAGE. The optimum temperature of the enzyme was determined as 50°C and the optimum pH was determined as 6.0. The Km, Vmax, values of the enzyme formed with the pNPG substrate were determined as 0.246 mM and 0.057 umol/min, respectively. The antioxidant effect of the enzyme on the substrates of Polydatin, Myricetin 3-O glycoside and Cucurbitacin 2-E-O glycoside was determined as 54.5%, 32.95% and 41.2%, respectively.
Results: Characterization results of wild-type (BglA9 WT) and mutant Bgl Ay9 G226Q/Y227F enzyme were compared, showing that the mutant's optimum pH level decreased (from pH 8 to pH 6) and there were changes in interactions with solvents, metals, detergents and glucose. found to be compatible with In addition, when the kinetic parameters were compared, it was determined that the affinity of the mutant enzyme towards some substrates decreased and the antioxidant effect on the substrates determined within the scope of the study increased.
Keywords: β-Glucosidases, polyphenolic compounds, mutation, DPPH