Mikrodalga-destekli kitosan/hidroksiapatit doku iskelesi üretimi ve İn-vitro kemik doku mühendisliği
Microwave-assisted chitosan/hydroxyapatite scaffold production and In-vitro bone tissue engineering
Yazar: MÜGE DAĞLI DURUKAN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Hidrojeller = Hydrogels ; Hidroksiapatitler = Hydroxyapatites ; Kemik rejenerasyonu = Bone regeneration ; Kitosan = Chitosan ; Mikrodalgalar = Microwaves

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, kemik doku rejenerasyonunu destekleyecek özelliklere sahip kitosan/hidroksiapatit süpergözenekli hidrojellerin üretimi için etkin bir yöntemin geliştirilmesi amaçlanmıştır.Tez kapsamında yapılan çalışmaların ilk aşamasında, doku iskelelerinin sentezi için mikrodalga ışıma ve gaz köpükleştirme tekniği bir araya getirilerek yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Kitosan süpergözenekli hidrojeller (SPH) ve kitosan-hidroksiapatit (HA) süpergözenekli hidrojel kompozitler (SPCH) çapraz bağlayıcı ajan, glioksal ve köpükleştirici ajan, NaHCO3 kullanılarak sentezlenmiştir. HA'nın kompozit yapıya ve hücresel davranış üzerine etkilerini araştırmak amacıyla 45-80 µm çapında boncuk formdaki ve toz yapıdaki, iki tip HA partikülü kullanılmıştır. Mikrodalga ışıma ile sağlanan ani ısınma ile gaz köpükleşme artmaktadır. Aynı zamanda, NaHCO3'ün bozunması ile hızlanan pH artışı da daha iyi çapraz bağlanma sağlamaktadır. Böylece, içsel bağlantılı gözeneklere sahip ve iyi yapılanmış makrogözenekli hidrojel ve hidrojel kompozitler kolaylıkla ve hızlı bir şekilde (? 1 dk.) sentezlenmiştir.Karakterizasyon çalışmaları sonucunda, kitosan SPH'lere HA katılması ile sentezlenen SPCH'lerin, gözeneklerinin korunduğu ve gözenek dayanımlarının arttığı belirlenmiştir. Kapiler etkinin artışı ile daha fazla su absorplama kapasitesine sahip olan boncuk formda HA içeren SPCH'lerin, en yüksek denge şişme oranına sahip oldukları görülmüştür. Ayrıca, sentezlenen SPCH'lerin mekanik dayanımı, kitosan SPH'lere göre önemli derecede artmıştır. Sentezlenen tüm hidrojeller arasında en yüksek mekanik dayanıma sahip olan yapı kitosan-HA (boncuk) SPCH'lerdir ve elastik modül değeri 1.40 ± 0.06 N/mm2 olarak belirlenmiştir.Çalışmanın bir sonraki aşamasında, kitosan-bazlı doku iskelelerinin osteojenik aktiviteleri preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri kullanılarak, durgun koşullarda yürütülen hücre kültür çalışmaları ile incelenmiştir. Hücre canlılığı ve üremesi MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analizi ile takip edilmiş, hücre morfolojileri SEM (taramalı elektron mikroskobu) ile görüntülenmiştir. Hücre farklılaşması, alkalen fosfataz (ALP) aktivitesinin ölçümü ile belirlenmiştir. Sonuçlar, kitosan-HA (boncuk) SPCH'lerin hücrelerin üremesini ve farklılaşmasını desteklediğini göstermiştir.Tez çalışmasının son aşamasında, kitosan-HA (boncuk) SPCH'lerinin MC3T3-E1 hücreleri üzerindeki etkisi karıştırmalı kap biyoreaktör kullanılarak incelenmiştir. Hücre üremesi yine MTT analizi ile belirlenmiş, hücrelerin doku iskelesi içerisindeki morfolojileri ise SEM ile incelenmiştir. Erken dönem farklılaşma, ALP aktivitesinin ölçümü ile ve doku iskeleleri üzerindeki hücre sayısı DNA analizi ile belirlenmiştir. RT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) ile MC3T3-E1 hücrelerinin kollajen I, osteokalsin, ß-aktin ve ALP ekspresyon seviyeleri tespit edilmiştir. Sonuç olarak, dinamik koşulların hücre farklılaşmasını, durgun koşullara göre daha fazla arttırdığı anlaşılmıştır.Sonuçlar, gaz köpükleştirme yöntemi ve mikrodalga ışıma ile çapraz bağlanmanın bir araya getirildiği yeni SPH sentez yöntemi ile köpükleşmenin ve jelleşmenin daha hızlı ve etkin bir şekilde gerçekleştiğini göstermektedir. Ayrıca sentezlenen kitosan-HA (boncuk) SPCH'lerin kemik doku mühendisliği uygulamaları için uygun malzemeler olabileceği ve karıştırmalı kap biyoreaktörün hücre farklılaşması üzerinde olumlu etkisi olduğu ortaya konmuştur.

Abstract:
The aim of the present study was to reproduce an effective method for fabrication of chitosan/hydroxyapatite superporous hydrogels for bone tissue regeneration.In the first part of the study, a novel scaffold fabrication method was developed by combining microwave irradiation and gas foaming. Chitosan superporous hydrogels (SPHs) and chitosan-hydroxyapatite (HA) superporous hydrogel composites (SPCHs) were prepared by using this method in the presence of crosslinking agent, glyoxal, and gas blowing agent, NaHCO3. In order to examine the effect of HA on composite structure and cellular behavior, two types of HA particles, i.e. spherical beads in 45-80 µm diameter and powder form, were used. While rapid heating with microwave irradiation enhances gas blowing, pH increment, which is accelerated by NaHCO3 decomposition, provides beter crosslinking. Thus, interconnected and well-established macroporous hydrogels/hydrogel composites were produced easily and rapidly (? 1 min.).As a result of characterization studies, it is found that the pores of SPCHs sythesized by adding HA, were preserved and pore strenght was increased. It was revealed that the SPCHs containing HA in spherical form having more water absorption capacity through increased capillary effect, had the highest equilibrium swelling ratio. Also, mechanical properties of SPCHs were significantly improved when compared with chitosan SPHs. Among all the synthesized hydrogels, chitosan-HA (bead) SPCHs showed great improvement in mechanical strength and its elastic modulus value was determined as 1.40 ± 0.06 N/mm2.In the next part of the study, osteogenic activities of chitosan-based scaffolds were examined with cell culture studies performed under static conditions by using preosteoblastic MC3T3-E1 cell line. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT (3-[4,5-dimethylthiazoyl-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide) assay and morphological examination was done with SEM (scanning electron microscope). Cell differentiation was quantified by determination of alkaline phosphatase (ALP) activities. Results showed that, chitosan-HA (bead) SPCHs improved cell proliferation and differentiation.In the last part of the study, the effect of chitosan-HA (bead) SPCHs on MC3T3-E1 cells were investigated using a spinner flask bioreactor. Cell proliferation was again analysed by MTT assay and the morphologies of cells in the scaffold were examined by SEM. Early cell differentiation was quantified by the determination of ALP activity and cell number on scaffolds is determined by DNA analysis. Collagen I, osteocalcin, ß-actin and ALP expression levels were determined using RT-PCR (real time polymerase chain reaction). As a result, it was understood that, dynamic conditions improved cell differentiation more than static conditions.The results indicate that a new SPH synthesis method combining gas foaming and crosslinking by microwave radiation, provides more effective and faster foaming and gelation. Also, chitosan-HA (bead) SPCHs could be considered as potential scaffolds for bone tissue engineering applications, and spinner flask bioreactor has a positive effect on cell differentiation.