Kordon kanı kök hücrelerinin diyabetik ayak yaralarında iyileşmeyi sağlayan faktörler üzerine etkisinin immünohistokimyasal yöntemle gösterilmesi
The indication of the influence of cordon blood stem cells on the factors that provide healing on diabetic foot scars using immunohistochemical method
Yazar: NAZLI ÇİL
Danışman: DOÇ. DR. EMİN OĞUZHAN OĞUZ
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Ayak = Foot ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Fetal kan = Fetal blood ; Kök hücreler = Stem cells ; Yara iyileşmesi = Wound healing ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries ; Ülser = Ulcer ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Diyabetik ayak tedavisinde kemik iliğinden, periferik kandan ve kordon kanından elde edilen  kök/progenitör hücrelerin kullanılması gün geçtikçe daha yaygın hale gelmektedir. Kök/Progenitör hücreler anjiogenik faktörleri salgılatarak neovaskülarizasyona yardım ederler. Aynı zamanda bu hücreler iskemik durumlarda, diabetik ayak ülserasyonunu da içeren bazı patolojik durumlarda hücre çoğalması ve hücre göçünü uyararak  epitelizasyonu sağlarlar. Biz çalışmamızda kordon kanından elde ettiğimiz CD 34(+) kök hücrelerini  diyabetik yara  oluşturduğumuz sıçanlara vererek yara iyileşmesindeki rollerini incelemeyi amaçladık.
Çalışmamızda Wistar-Albino cinsi, sağlıklı, 18 adet erkek sıçan kullanıldı. Ortalama ağırlıkları 230 gr (200–250 gr), rasgele seçilerek üç gruba ayrıldı. 1.grup kontrol (K grubu; n: 6), 2. grup diyabet oluşturulan grup (D grubu; n: 6), 3. grup ise diyabet oluşturulduktan sonra kordan kanı kök/progenitör hücre verilen grup (KH grubu; n:6 ) olarak 3 eşit gruba ayrıldı. Tüm sıçanların başlangıç ağırlıkları ve kan glikoz düzeyleri ölçüldü. D grubu ve KH grubundaki her bir sıçan deneysel diyabet oluşturmak için streptozosin 50-60 mg/kg tek doz intraperitoneal olarak uygulandı. Streptozosin uygulamasından sonraki 3. gün sıçanlarda kan glikoz düzeyleri'i 250 mg/dl nin üzerinde olan sıçanlar diyabet olarak kabul edildi. Tüm sıçanların sağ ön ayaklarına steril punch biyopsi kullanılarak 5 mm çapında yara yeri oluşturuldu. KH grubuna 0,5x106 kordon kanı kökenli CD 34 (+) hematopoetik kök hücre lokal olarak yara yerine uygulandı. Yara oluşumundan sonra sıçanların 10. günde ağırlıkları ve kan glikoz düzeyleri tekrar ölçüldü. Sıçanlar genel anestezi altında dekapitasyon ile sakrifiye edildiler. Yara bölgesinden deri dokuları alınıp formaldehitte tespit edildi. Işık mikroskop takip yöntemi uygulanarak  parafine gömülen bloklardan 5 µm kalınlığında kesitler alındı.  Kesitlere daha sonra Terminal deoksinükleotidil-transferaz aracılı dUTP nick-and labelling (TUNEL) yöntemi, TGF-β ,PDGF, VEGF , FGF, IL-1 ,TNF-α ve kaspaz 3 aktivasyonlarını belirlemek için  immunohistokimyasal yöntem uygulandı.
Diyabetik sıçan modelinde ayak ülseri tedavisinde kullandığımız  kordon kanı CD34(+) kök hücreleri yaralarda belirgin iyileşme sağlamıştır. Işık mikroskobik bulgularımız KH uygulanan deneklerde ayak yaralarında yeni oluşan derinin diyabet grubuyla karşılaştırıldığında çok daha normal yapıda olduğu saptanmıştır. 
Çalışmamızda VEGF, PDGF, IL-1, FGF, TGFβ TUNEL, kaspaz 3 ve TNF- ekspresyonları açısından diyabet ve  kök hücre uygulanan gruplar arasında   farklılık vardı. VEGF, PDGF ve TGFβ'nin kök hücre uygulanma gruplarda fazla olması   yara iyileşmesinde bu  faktörlerin etkili olduğunu göstermektedir. 
TNF- sonuçlarımız bizim için oldukça anlamlıydı. Apoptozisin önlenmesinde FGF uyarımının  etkin olduğu düşünülmektedir. FGF'nin TNF- yı inhibe ederek apoptozisi engellemesi yara iyileşmesinde önemli bir süreçtir. Kök hücre uygulamalarının FGF ekspresyonun artırmasının  diyabetik yara iyileşmesinde yeni tedavi yaklaşımlarında anahtar molekül olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
It gets commoner each day to use stem/progenitor cells procured from bone marrow, peripheral blood and cordon blood in diabetic foot treatment. The stem/progenitor cells help neovascularization by having angiogenic factors excreted. At the same time, these cells provide epithelisation by stimulating cell multiplication and cell migration in certain pathological situations that also includes diabetic foot ulceration in ischemic conditions. Stem/progenitor cells help the restoration of the scarred area. In this study, we aimed to examine the role of the CD 34(+) stem cells acquired from cordon blood in healing the scars by applying it on rats.
In our study, 18 healthy male rats of Wistar-Albino kind were used. Their average weight was 230 gr (200-250 gr) and they were randomly divided into three groups. The first group was the control group (Group K; n: 6), the second group was a group consisting of diabetics (Group D; n: 6) and the third group was the group which was given cordon blood stem/progenitor after the creation of diabetic (Group KH; n: 6 ). The weights and glucose levels of all the rats were measured at the beginning. Each rat in group D and group KH was given a single dose of 50-60 mg/kg streptozosin intraperitoneally. On the third day after the streptozosin application, the rats with over 250 mg/dl glucose level were regarded as diabetics. Scarred areas of 5 mm in diameter were generated on the feet of all the rats by the application of sterile punch biopsy. CD 34(+) rooted in 0,5x106 cordon blood was applied locally on the scarred area in group KH. On the tenth day after the generation of the scar, the weights and blood glucose levels of the rats were measured. The rats were sacrificed by decapitation under general anaesthesia. By the use of light microscopy monitoring method, tissues in 5 µm thickness were taken from the paraffin-embedded blocks. The tissues were later applied with terminal deoxynucleotydal-transferase mediated  dUTP nick-and labelling (TUNEL) and TGF-β ,PDGF, VEGF , FGF, IL-1 ,TNF-α methods; and were also applied immunohistochemical method in order to determine their caspase 3 activations.
In the treatment of foot ulcer in diabetic rat model, the use of cordon blood CD 34(+) stem cells provided a significant healing. Our light microscopic findings showed that the newly formed skin in the foot scars in KH applied subjects were found to be a lot more normal compared to diabetic group. 
In our study, there were differences between diabetic and stem cell applied groups in terms of their VEGF, PDGF, IL-1, FGF, TGFβ, TUNEL, caspase3 and TNF- expressions. The higher amount of VEGF, PDGF and TGFβ in stem cell applied groups indicates that these factors are influential in scar healing. 
The TNF- results were rather significant for us. It is thought that the FGF stimulation has an active role in apoptosis prevention. FGF's prevention of apoptosis by inhibiting TNF- is an important process in the healing process of the scars. We assume that the increase of FGF expressions by the application of stem cells will be a key molecule in new treatment approaches to diabetic scar healings.