Küçük organik moleküllerin biyotransformasyonununu katalizleyen enzimlerin mühendisliği için yeni bir strateji: rıboswıtch-eşlenmiş tarama platformu
A novel strategy for engineering of enzymes for the catalysis of small organic molecule biotransformation: riboswitch-coupled screening platform
Yazar: BURHAN BORA
Danışman: PROF. DR. SERAP EVRAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Yeni antibiyotiklerin geliştirilmesi, toksik moleküllerin uzaklaştırılması, ilaç moleküllerinin sentezlenmesi, terapötik araştırmalarda yeni fonksiyonelliklerin keşfi gibi biyoteknolojinin çeşitli alanlarında yeni enzim katalizlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Yönlendirilmiş evrim uygulamalarının günümüze değin katetmiş oldukları mesafe hiç şüphesiz çok değerlidir. Ancak, yeni enzim katalizlerinin geliştirilebilmesi için yenilikçi bir yaklaşıma ihtiyaç duymaktayız. Özellikle küçük moleküllerin biyotransformasyonunu katalizleyen enzim mühendisliği bu alanlardan biridir. Genotip-fenotip bağlantısının kurulmasına dayalı güncel protein mühendisliği teknikleri protein-protein, protein-DNA, protein-ligand etkileşimleri gibi uygulama alanlarında oldukça hızlı bir gelişim kaydetmektedir. Ancak, söz konusu küçük moleküllerin biyotransformasyonunu katalizleyen enzimlerin evrimi olduğunda bilimsel gelişmeler ya pahalı ve yüksek verimli robotik sistemlere gereksinim duymakta, ya da DNA polimeraz, aminoaçil tRNA sentetaz, beta-laktamaz vb gibi genotip-fenotip bağlantısının kurulmasına olanak tanıyan pozitif geri beslemeli reaksiyonlar ile sınırlı kalmaktadır. Bu durumda yeni enzimlerin evrimi için farklı bir yaklaşım sergilenmesi gerekliliği ortaya çıkmaktadır. 
Riboswitchler genetik ekspresyonu hedef analit derişimine yanıt olarak kontrol edebilen nükleik asit yapısında elementlerdir. Dahası, riboswitchlerin yapısında bulunan aptamer alt birimleri sayesinde yeni riboswitchlerin geliştirilebilmesi süreci zorlayıcı olmaktan çıkmaktadır.  Bu nedenle bu tez çalışmasının araştırma konusu protein mühendisliğinde riboswitchlerin, dolayısıyla aptamerlerin kullanım potansiyelinin ortaya konmasıdır. Çalışma kapsamında emülsifiye edilmiş in vitro protein ekspresyon reaksiyonlarında riboswitch mühendisliği ve enzim mühendisliği protokolleri optimize edildi. Elde edilen bulgular, riboswitch eşlenmiş tarama platformunun önümüzdeki yıllarda yeni enzim katalizlerinin keşfini hızlandıracağı düşüncesini destekler niteliktedir. 
Anahtar sözcükler: protein mühendisliği, aptamer, riboswitch, riboswitch mühendisliği, in vitro seleksiyon

Abstract:
There is an urgent need for novel enzymatic biocatalysis in order to meet demand for the development of novel antibiotics, bioremediation of toxic molecules and enzyme catalysis in therapeutic research area. Undoubtedly, directed evolution approaches had resulted in inestimable goals untill today. However, in order to develop novel enzyme catalysis, we need an innovative approach in this prospect. Compared to the other areas in protein engineering, development of novel enzymes that capable of catalyzing biotransformation of small organic molecules, it is an urgent demand to accelerate the research for novel enzyme discovery. Already available protein engineering approaches that are based on genotype-phenotype linkage, have their own success when it comes to protein-protein, protein-DNA and protein-ligand interaction. However, it is stil an expensive endevaour to develop novel enzymes that are able to act on small organic molecules. Unfortunately, we are restricted to highly expensive high-throughput robotic systems, or to study self-reporting DNA polymerase, amino-acyl tRNA synthetase or beta-lactamase like enzymes. Consequently, a novel method is inevitable when it comes to the evolution of small organic molecule acting enzymes.
Riboswitches are genetic control elements that can respond to the target molecule concentration. Furthermore, aptamer domain that exists in riboswitch structure makes it easier to develop a new riboswitch sequence against almost any available target. For this reason, the main objective of this work is to evaluate the potential of riboswitches, relatedly aptamers, to be used in the area of protein engineering. Wihtin the study, we aimed to optimize riboswitch engineering and enzyme engineering protocols within the emulsified in vitro protein expression reactions. Findings of our study supports the idea that riboswitch-coupled protein engineering platforms will result in novel enzyme catalysis in the close future. 
Keywords: protein engineering, aptamers, riboswitches, riboswitch engineering, in vitro selection