Antikanserojenik l-asparaginazın farklı gram-negatif bakterilerde üretimi, kimyasal karakterizasyonu ve in vitro uygulaması
Production, chemical characterization and in vitro application of anti-cancerogenic l-asparaginase from different gram-negative bacteria
Yazar: BURHAN ATEŞ
Danışman: DOÇ. HİKMET GEÇKİL ; DOÇ. İSMET YILMAZ
İnönü Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Asparajinaz = Asparaginase ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim üretimi = Enzyme production

Özet:
Bakteriyel L-asparaginaz akut lenfoblastik lösemi(ALL) başta olmak üzere belli kansertürlerinde yüksek terapötik değeri ile bilinen bir enzimdir. Bu çalışmada, karbon katabolitbaskılanma gösteren ve oksijenle regüle olduğu bilinen bu enzimin değişik gram-negatifbakterilerde farklı ortam koşulları altındaki sentezi çalışılmıştır. Bu amaçla; Enterobacteraerogenes, Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia coli ve bu bakterilerin rekombinant etkinbir oksijen alım sistemi, Vitreoscilla hemoglobini (VHb), içeren suşları kullanılmıştır. Buçalışmada bakterilerin doğal konakçıları ve onların VHb içeren rekombinantlarında enziminkarbon katabolit baskılanmaya verdiği cevap değişik karbon kaynakları (glukoz, fruktoz,sukroz, laktoz ve gliserol) kullanılarak belirlenmiştir. Ayrıca, farklı azot kaynaklarının (Lasparagin,L-glutamin, üre ve sodyum nitrit) enzimin sentezi üzerine etkisi araştırılmıştır. Enyüksek enzim sentezinin görüldüğü suş kullanılarak enzimin kısmi saflaştırılması (amonyumsülfat çöktürmesi ve iyon-değişim kromatografisi) yapılmış ve çeşitli kimyasalkarakteristikleri (optimum ve maksimum aktivite sıcaklık aralıkları, optimum pH, kinetikparametreler ve depo kararlılığı) belirlenmiştir. Ayrıca, in vivo bir sistemi simüle eden in vitrobir düzenek ile enzimin muhtemel terapötik bir uygulama için kararlılığı saptanmıştır.L-asparaginaz üretiminin değişik gram-negatif bakterilerde kompleks regülatörmekanizmalarla olduğu ve bir bakteri için geçerli optimal sentez koşullarının benzer bir diğerbakteriye uygulanamayabileceği saptanmıştır (örneğin, azot kaynaklarında glutamini hariçbırakırsak, VHb varlığında, E. coli'de bir indüklenme görülürken, buna benzer bir bakteriolan E. aerogenes'de baskılama görülmüştür). Özellikle terapötik değeri kanıtlanmış ve ticariolarak üretilen E. coli L-asparajinazlarının üretiminde, VHb'nin böyle pozitif bir regülasyongöstermesi önemli bir bulgudur. Saflaştırılmış olan enzimin kimyasal karakterizasyonuyapılmış, termostabil bir enzim olarak bilinen bu enzimin optimum aktivitesi 40 oC'de ve pH9.0'da, maksimum aktivitesi ise 60 oC'de belirlenmiştir. Bu bağlamda, enzimin yüksek depokararlılığına ve diğer L-asparaginazlara benzer kinetik parametrelere sahip olduğusaptanmıştır.Anahtar Kelimeler: L-asparaginaz, Vitreoscilla hemoglobin, katabolik represyon, terapötikenzimler, enzim saflaştırma.

Abstract:
Bacterial L-asparaginase is an enzyme of high therapeutic value, due to its use in certain kindsof cancer therapies, mainly in acute lymphoblastic leukemia (ALL). This study was carriedout to further clarify how the synthesis of this enzyme is affected from various cultureconditions, given the fact that L-asparaginase is an enzyme regulated by oxygen and carboncatabolite repression. For this objective, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosave Escherichia coli and their recombinant strains carrying a recombinant oxygen uptakesystem, the Viteroscilla hemoglobin (VHb), were used. In this study, these host bacteria andtheir recombinants carrying the VHb were studied with respect to carbon catabolite repressioninflicted by various carbon sources (glucose, fructose, sucrose, lactose and glycerol).Furthermore, the effect of different nitrogen sources (L-asparagine, L-glutamine, urea andsodium nitrite) on the enzyme synthesis was investigated. The strain with the highest enzymeactivity was used for L-asparaginase isolation and purification (ammonium sulfateprecipitation and ion-exchange chromatography). The purified enzyme was analyzed forvarious chemical characteristics (the temperature range for optimum and maximum activities,optimal pH, kinetic parameters and stability). Moreover, an in vitro setting simulating that ofin vivo system was utilized to determine the stability of the enzyme, an important parameterfor possible therapeutic application of the enzyme.It has been determined that the production of L-asparaginase in different bacteria isgoverned by complex regulatory mechanisms and conditions required for the optimalsynthesis of the enzyme in one bacterium may not be applicable to other (e.g., exceptglutamine in nitrogen source, the presence of VHb in E. coli has a stimulatory effect on theenzyme synthesis, while in E. aerogenes its presence is inhibitory). This positive effect ofVHb on L-asparaginase synthesis is an important finding since the enzyme with cancertherapeutic activity has mainly been produced and commercialized using E. coli. Thechemical characterization of purified enzyme revealed an optimal activity at 40 oC and pH 9.0while the maximum activity was recorded at 60 oC a finding in accordance with its knownthermostabile nature. In this context, enzyme was determined to have a high stability duringits storage at different temperatures and similar kinetic parameters to that of other Lasparaginases.Key words: L-asparaginase, Vitreoscilla hemoglobin, catabolic repression, therapeuticenzymes, enzyme purification.