Ciddi hiperbilirübinemili yenidoğanlarda mikroRNA ekspresyon profilleri
MicroRNA expression profiles in newborns with severe hyperbilirubinaemia
Yazar: AYKUT DEMİR
Danışman: PROF. DR. HACER ERGİN
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Bebek-yenidoğmuş = Infant-newborn ; Bebek-yenidoğmuş hastalıkları = Infant-newborn diseases ; Bilirubin = Bilirubin ; Hiperbilirubinemi = Hyperbilirubinemia ; Mikro RNA = Micro RNA ; RNA = RNA ; Toksisite = Toxicity

Özet:
Ciddi hiperbilirübinemi, bebeklerin %2'sinden azında görülmesine rağmen; bilirübinin indüklediği nörolojik disfonksiyon (BİND) ve kernikterus tüm dünyada önlenebilir halk sağlığı sorunu olmayı sürdürmektedir. MikroRNA'lar (miRNA), tek iplikçikli, 18-24 nükleotid uzunluğunda kodlanmayan RNA molekülleridir. Hücre büyümesi, proliferasyonu, farklılaşması, apoptoz, metabolizma ve immün yanıt gibi biyolojik süreçlerde rol alan miRNA'lar, hedef genlerin 3′translate edilmemiş bölgesine (3′-UTR) bağlanıp; hedef mRNA'nın bozunmasını sağlayarak veya protein translasyonunu inhibe ederek gen ekspresyonunu baskılarlar. Bu çalışmada ciddi hiperbilirübinemi ile UGT1A1 enzim ekspresyonu ve nöroinflamasyon ile ilişkili miRNA'lar arasındaki ilişki prospektif olarak araştırıldı. 
Gebelik yaşı≥35 hafta, sTB<13 mg/dl olan sağlıklı bebekler kontrol (n:30), sTB≥20 mg/dl olan bebekler sarılık grubunu (n:115) oluşturdu. Sarılık grubu, demografik, klinik, laboratuvar, tedavi verileri kaydedilerek, sTB düzeyine göre Grup1 (sTB≥20-≤25 mg/dl), Grup2 (sTB>25-≤30mg/dl), Grup3 (sTB>30mg/dl), BİND skoruna göre normal (0 puan), hafif (1-3 puan), orta (4-6 puan), ağır (7-9 puan) akut bilirübin ensefalopatisi (ABE) olarak gruplandırıldı. Ticari kit kullanılarak, periferik kan örneklerinden miRNA izolasyonu yapıldı ve real-time PCR analiziyle, UGT1A1 enzim ekspresyonu (miR-21-3p, miR-491-3p, miR-141-3p) ve nöroinflamasyonla ilişkilendirilen (miR-Let7a, miR-124, miR-155, miR-146a, miR-210, miR-384, miR-376c-3p, miR-374a-5p, miR-93, miR-181c) miRNA'ların ekspresyon değişimleri ve relatif kantitatif değerleri incelendi. 
Kontrol ve sarılık gruplarında gebelik yaşı (38,1±1,1/37,9±1,5 hf), doğum ağırlığı (3139±338/3126±493 gr), prematürelik (%10/25,2), cinsiyet (erkek %63,3/44,3), kardeşte fototerapi öyküsü farksız (p>0.05); sezaryen doğum kontrol grubunda (%76,6/44,3) (p=0,002),  akraba evliliği sarılık grubunda (%29,9/3.3) (p1=0.01) ve Grup3'te (Grup1/2/3: %22,3/21,9/56,2) yüksekti (p=0.017). Ciddi hiperbilirübinemi etyolojisinde prematürite %25,2, ABO/Rh/subgrup uyuşmazlığı %37,4/7,8/14,7, immün hemolitik hastalık %20,9, ≥%10 kilo kaybı %17,3, G6PD/pirüvat kinaz eksikliği %14,7, klinik/kesin sepsis %10,4, kültür (+) üriner infeksiyon %9,5, MCHC≥36 %8,7, hipotiroidi %6,1, polisitemi %3,4, sefal hematom %1,7, Crigler Najar tip2 %0,9, heterozigot/homozigot promoter polimorfizmi %23,4/%7,4 sıklıkta saptandı; %0,9'unda neden bulunamadı. 
Sarılık grubundaki bebeklerin %21,7'si işitme testinden kaldı; %23,4'üne kan değişimi yapıldı. Grup1/2/3'te sTB arttıkça (21,6±1,3/26,7±1,3/33,9±4,8) (p<0,001), sTB/Alb oranı (6,08±0,69/7,5±0,94/9,31±1,59) (p<0,001), retikülosit (2,1±2,6/ 3,3±2,4 3,3±3,8) (p<0,001), işitme testinden kalanlar (%14,9/28,1/37,5) (p=0,092) arttı. BİND skorlamasına göre normal/hafif/orta/ağır ABE sıklığı %34,8/40,9/14,8 /9,5 olup; BİND skoru ile sTB düzeyi (r:0,712) (p<0,001) ve sTB/Alb oranı (r:0,564) (p<0,001) pozitif korelasyon gösterdi. Sarılık şiddeti arttıkça ağır ABE sıklığı (Grup 1/2/3'te % 0/6,3/56,2) (p<0,001); ABE şiddeti arttıkça işitme testiden kalanların oranı arttı (p<0,001). Lojistik regresyon analizine göre ciddi hiperbilirübinemi riskini akraba evliliği 10,7 kat, ABO uyuşmazlığı 5,4 kat, normal doğum 4,1 kat, ABE riskini sTB/Alb≥6,8 olması 6,3 kat (p<0,001), D.Coombs pozitifliği 3 kat (p=0.049), ABO uyuşmazlığı 2,8 kat (p=0.018) arttırdı 
Kontrol grubuna göre sarılık grubunda miR-491-3p (p=0.025), miR-210 (p=0,047), miR-21-3p (p<0,001) ve miR-93'ün (P<0,001) upregüle, miR-124'ün (p=0,019) downregüle olduğu, miR-491-3p (p=0.03), miR-21-3p (p<0,001), miR-93'ün (p<0,001) relatif kantitatif değerleri yüksek iken; miR-Let7a (p=0,020) ve miR-124'ün (p=0,038) relatif kantitatif değerleri düşük saptandı. ABE gelişenlerde miR-124 ekspresyonunun relatif kantitatif değerleri azalırken (p=0,007), miR-146a (p=0,002), miR-21-3p (p=0,001), mir-93'ün (p=0,001) relatif kantitatif değerleri artış gösterdi. ABE şiddetine göre miRNA ekspresyonları değerlendirildiğinde; miR-491-3p, (p=0,03), miR-21-3p (p<0,001) ve miR-93'ün (p<0,001) upregülasyonunun ağır ABE'lerde en çok arttığı; miR-146a (p=0,007) ve miR-181c (p=0,026) down-regülasyonunun en fazla azaldığı,  miR-374a-5p (p=0,015) down-regülasyonunun en fazla olduğu görüldü. MiR-21-3p, miR-491-3p, miR-124, miR-210 ve miR-93 dahil diğer aday miRNA'ların, mimik ve antimimiklerinin farklı etnisiteden, çok sayıda olguda çalışılması, BİND ve kernikterusun önlenmesinde yeni ufuklar açacaktır. 

Anahtar Kelimeler: Yenidoğan, ciddi hiperbilirübinemi, bilirübin nörotoksisitesi, miRNA

Abstract:
Although severe hyperbilirubinaemia is seen in less than 2% of infants; bilirubin-induced neurological dysfunction (BIND) and kernicterus continue to be preventable public health problems around the world. MicroRNAs (miRNA) are single-stranded, 18-24 nucleotide long non-coding RNA molecules. MiRNAs, which play a role in biological processes such as cell growth, proliferation, differentiation, apoptosis, metabolism and immune response, bind to the 3′-untranslated region (3′-UTR) of target genes, and they suppress gene expression by causing degradation of target mRNA or inhibiting protein translation. In this study, the relationship between severe hyperbilirubinaemia and of miRNA's expression associated with UGT1A1 enzyme and neuroinflammation were investigated prospectively.
The infants with gestational age ≥35 weeks constituted Control Group (sTB <13 mg/dl, n:30), and Jaundice Group (sTB≥20 mg/dl, n:115). Jaundice group were clasified as Group1 (sTB≥20-25 mg/dl), Group2 (sTB>25-≤30 mg/dl), Group3 (sTB>30 mg/dl) according to severity of jaundice, and mild (1-3 points), moderate (4-6 points), and severe (7-9 points) acute bilirubin encephalopathy (ABE) according to the BIND score. Using a commercial kit, miRNA isolation was performed from peripheral blood samples and the expression changes and relative quantitative values of miRNAs associated with UGT1A1 enzyme expression (miR-21-3p, miR-491-3p, miR-141-3p) and neuroinflammation (miR-Let7a, miR-124, miR-155, miR-146a, miR-210, miR-384, miR-376c-3p, miR-374a-5p, miR-93, miR-181c) were investigated by real-time PCR analysis.
While gestational age (38.1±1.1/37.9±1.5 w), birth weight (3139±338/ 3126±493 gr), prematurity (10/25.2%), male gender  (63.3/44.3%), sibling phototherapy history was not different (p>0.05) between control and jaundice groups, cesarean birth in control group (76/44.3%) (p=0.002), consanguineous in jaundice group (29.9/3.3%) (p=0.01) and Group3 (Group1/2/3:22.3/21.9/56.2%) were higher (p=0.017). The etiology of severe hyperbilirubinemia were determined as prematurity (25.2%), ABO/Rh/subgroup incompatibility (37.4/%7.8/%14.7%), immune hemolytic disease (20.9%), ≥%10 weight loss (17.3%), G6PD/pyruvate kinase deficiency (14.7%), clinical/proven sepsis (10.4%), urinary infection (9.5%), MCHC≥36 (8.7%), hypothyroidism (6.1%), polycythemia (3.4%), cephalic hematoma (1.7%), Crigler Najar type 2 (0.9%), hetero-/homo-zygous promoter polymorphism (23.4/ %7.4%), and idiopathic (0.9%).
In the jaundice group, 21,7% infants failed the hearing test, and 23.4% of them were exposed to exchange transfusion. As sTB increases in Group 1/2/3 (21.6±1.3/ 26.7±1.3/ 33.9±4.8) (p<0.001), sTB/Alb ratio (6.08±0,69/7.5±0.94 /9.31±1.59) (p<0.001), reticulocyte counts (2.1±2.6/3.3±2.4/3.3±3.8)(p<0.001) and those who failed the hearing test (%14.9/28.1/37.5)(p=0.092) increased. According to the BIND scoring, the frequency of normal/mild/moderate/severe ABE were 34.8/40.9/14.8/9.5%. BIND score were positively correlated with sTB levels (r:0.712)(p<0.001) and sTB/Alb ratio (r:0.564) (p<0.001). As the severity of jaundice increases, the frequency of severe ABE (Group 1/2/3 %0/6.3/56.2) increased (p<0.001). Similarly, as the severity of ABE increased, the percentage of those who failed the hearing test increased (p<0.001). According to logistic regression analysis, while consanguineous marriage (10.7 times), ABO incompatibility (5.4 times), and vaginal birth (4.1 times) increased the risk of severe hyperbilirubinemia, sepsis+urinary infection (6.4 times),  sTB/Alb≥6,8  (6,3 times, p<0,001), D. Coombs positivity (3 times, p=0.049) and ABO incompatibility (2.8 times, p= 0.018) increased the risk of ABE.
In the Jaundice group, miR-21-3p (p<0.001), miR-93 (p<0.001),  miR-491-3p (p=0.025), and miR-210 (p=0.047) expression were upregulated, miR-124 (p=0.019) was downregulated; while relative quantitative values of miR-21-3p (p<0.001), miR-93 (p<0.001), miR-491-3p (p=0.03) were higher; relative quantitative values of miR-Let7a (p=0.020) and miR-124 (p=0.038) were lower than Control group. Relative quantitative values of miR-124 expression decreased (p=0.007) while the relative quantitative values of miR-21-3p (p=0.001), miR-93 (p=0.001), miR-146a (p=0.002) increased in those who developed ABE. When miRNA expressions are evaluated according to ABE severity, upregulation of miR-491-3p (p=0.03), miR-21-3p (p<0.001) and miR-93 expression (p<0.001) increased the most those severe ABE develop. It was observed that miR-146a (p=0.007) and miR-181c (p=0.026) down-regulation decreased the most, miR-374a-5p (p=0.015) down-regulation was greatest. İnvestigating candidate miRNAs including miR-21-3p, miR491-3p, miR-124, miR-210 and miR-93, and their mimics and antimimics in a large number of cases of different ethnicity, will open new horizons for prevention of BIND and kernicterus.

Keywords: Newborn, severe hyperbilirubinaemia, bilirubin neurotoxicity, miRNA