Fasciola hepatica enolaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve rekombinant proteinin koyun fasciolosisinin tanısındaki etkinliğinin belirlenmesi
Cloning and expression of the fasciola hepatica enolase gene and determination of the efficacy of recombinant protein in the diagnosis of sheep fasciolosis
Yazar: FİGEN ÇELİK
Danışman: PROF. DR. SAMİ ŞİMŞEK
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Blotting-western = Blotting-western ; ELISA =

Özet:
İhmal edilen bir hastalık olan fasciolosis, karaciğerde iki ana patojen tür olan Fasciola hepatica ve Fasciola gigantica başta olmak üzere Fasciolidae ailesindeki diğer digenetik trematodların neden olduğu bir enfeksiyondur. Fasciola hepatica'nın neden olduğu fasciolosis, dünya çapında yaygın olarak bulunan hem insanlarda hem de çiftlik hayvanlarında ciddi problemler oluşturabilen zoonotik öneme sahip bir hastalıktır. Koyunlarda fasciolosisin doğru tanısına yönelik tanı kitlerinin geliştirilmesi verim kayıplarının önlenmesi açısından oldukça önemlidir. Fasciola hepatica'nın Ekskret/Sekret (E/S) ürünlerinden olan enolaz enzimi ile yapılan çalışmalar ile bu enzimin koyun fasciolosisine karşı parazitin tegümentinde bulunan önemli bir koruyucu bileşen olabileceği gösterilmiştir. Bu tez çalışması ile koyunlardan elde edilen erişkin F. hepatica parazitinden izole edilen enolaz geninin klonlanarak ekspresyonunun yapılması ve elde edilen rekombinant antijenin koyun fasciolosisinin tanısındaki etkinliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, F. hepatica enolaz gen sekansından enolaz gen bölgesini çoğaltan primerler dizayn edildi. Takiben erişkin F. hepatica'dan mRNA izolasyonu yapılıp cDNA elde edildi. Dizayn edilen primerlerle ilgili gen bölgesi PCR ile çoğaltılıp, elde edilen ürün klonlanıp eksprese edildi. Daha sonra pürifiye edilen rekombinant proteinin etkinliği, pozitif ve negatif koyun serumları kullanılarak Western blot (WB) ve ELISA ile belirlendi. Bu işlemler neticesinde rekombinant FhENO'nun sensitivitesi WB ile %85, ELISA ile %90 olurken; spesifitesi WB ile %82,8 ve ELISA ile %97,14 olarak belirlenmiştir. Aynı zamanda Elazığ ve Siirt şehirlerinden toplanan koyun kan serum örneklerinde ise 200 serumun 100'ü (%50) WB ile 46'sı (%23) ELISA ile pozitif olarak bulunmuştur.
Rekombinant FhENO antijeninin koyunlarda fasciolosisin tanısında WB ve ELISA temelli bir testte kullanılabileceği gösterilmiştir. Ancak ELISA'daki en önemli sorun, WB'de olduğu gibi kullanılan rekombinant antijenin çapraz reaksiyon oranının yüksek olmasıydı. Çapraz reaksiyonları önlemek için yakın ailedeki parazitlerin enolaz proteinini kodlayan genlerin karşılaştırılması ve ortak epitop olmayan bölgelerin seçilmesi ve klonlanarak saflaştırılmış proteinin test edilmesi faydalı olacaktır.

Abstract:
Fasciolosis, a neglected disease, is an infection of the liver caused by two main pathogenic species, Fasciola hepatica and Fasciola gigantica, and other digenetic trematodes in the Fasciolidae family. Fasciolosis caused by F. hepatica is a disease of zoonotic importance that is common worldwide and can cause serious problems in both humans and livestocks. The development of diagnostic kits for the proper diagnosis of fasciolosis in sheep is highly important in terms of preventing yield losses. Studies with the enzyme enolase, one of the Excrete/Secrete (E/S) products of F. hepatica, have shown that this enzyme may be an important protective component in the tegument of the fluke against sheep fasciolosis. In this thesis, it was aimed to clone and express the enolase gene isolated from the adult F. hepatica fluke obtained from sheep and to determine the effectiveness of the recombinant antigen in the diagnosis of sheep fasciolosis. For this aim, primers were designed from the enolase gene fragment sequences of F. hepatica. Subsequently, mRNA was isolated from adult F. hepatica and cDNA was obtained. The gene region related to the designed primers was amplified by PCR and the product obtained was cloned and the protein was expressed. The activity of the purified recombinant protein was then determined by Western blot (WB) and ELISA using positive and negative sheep sera. As a result, the sensitivity of recombinant FhENO was 85% with WB and 90% with ELISA while the specificity was determined as 82.8% by WB and 97.14% by ELISA. At the same time, in sheep sera samples collected from Elazig and Siirt provinces of Turkey, 100 out of 200 (50%) sera were found to be positive by WB and 46 (23%) were found to be positive by ELISA. 
It has been shown that recombinant FhENO antigen can be used in a WB and ELISA-based test in the diagnosis of fasciolosis in sheep. However, the most important problem in ELISA was the high cross-reaction rate of the recombinant antigen used, as in WB. In order to prevent the cross-reactions, it will be useful to compare the genes encoding the enolase protein of parasites from the closely related parasite family, and select the regions where there are no common epitopes, and clone them and test the purified protein.