Anaerobik ruminal fungus Orpinomyces sp. ve Neocallimastix sp.nin amilolitik özelliklerinin araştırılması
Amylolytic activities of anaerobic ruminal fungi Orpinomyces sp. and Neocallimastix sp.
Yazar: BEKİR MEHMET KELLECİ
Danışman: DOÇ. DR. UĞUR ÇÖMLEKCİOĞLU
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada polisentrik Orpinomyces sp. GMLF5 ve monosentrik  Neocallimastix sp. GMLF7 suşlarının amilolitik özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.  
Karbon kaynağı olarak avisel, nişasta, glikoz, maltoz içeren besi ortamlarında amilolitik enzim aktivitesi 24 saatlik periyotlar ile değerlendirilmiş, en yüksek aktivite nişasta içeren besi ortamında Orpinomyces sp. için 3. günde belirlenirken, Neocallimastix sp. için 4. gün olarak belirlenmiştir. Nişastalı besi ortamında 3, 5 ve 7 günlük periyotlar ile hücresel ve hücre dışı enzim aktivitesi karşılaştırıldığında, her iki suş için hücresel enzim aktivitesinin daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen hücre dışı enzim ekstraktlarının fibrolitik etkisini incelendiğinde % 1 ksilan içeren substratta en yüksek enzim aktivitesi belirlenirken, % 1 avisel içeren substratta da en düşük enzim aktivitesi belirlenmiştir. Besi ortamına eklenen nişasta konsantrasyonunun enzim aktivitesi üzerine etkisi incelendiğinde, Orpinomyces sp. için 4 mg/ml; Neocallimastix sp. için 5 mg/ml olarak belirlenen nişasta konsantrasyonunun en yüksek enzim aktivitesini sağladığı bulunmuştur. Her iki fungus içinde amilaz aktivitesi için optimum sıcaklık 45 oC, optimum pH 5.5 olarak belirlenmiştir. Orpinomyces sp. deki amilaz aktivitesinin termal stabilitesi 35 oC?deki tüm sürelerde (15., 30., 45. ve 60. dk) artış gösterirken 35 °C?de 15. dakikasında en yüksek aktiviteyi göstermiş ve test edilen sürelerde sırası ile % 49, % 39, % 22 ve % 35 oranında aktivitesinin artırdığı belirlenmiştir. 45 oC?de ilk 15 dakikada aktivitesini kaybetmiştir. Bunun yanında Neocallimastix sp. deki termal stabilite için ise 35 °C?de tüm sürelerde aktivite kaybı gözlenmiş, 15. dk?da % 11 olarak tespit edilen aktivite kaybı diğer sürelerde değişmeyip % 27 olarak belirlenmiştir. pH stabilitesi yönünden Orpinomyces sp. için pH 3.5-8.0 arasında 15 dk % 64 oranında enzim aktivitesi stabil kalırken, Neocallimastix sp. için pH 3.5-8.0 arasında aynı sürede ortalama % 77 oranında enzim aktivitesi ile stabilitesini korumuştur. Farklı pH?larda hazırlanan substratlara bağlanan rölatif enzim miktarı Orpinomyces sp. için pH 6.5?de en az % 51, Neocallimastix sp. için pH 5.5?de en az % 68 olarak değerlendirilmiştir. Substrat konsantrasyonu üzerinde yapılan incelemede fungusların ürettiği amilaz enzimlerinin doyum kinetiği Orpinomyces sp. için 80mg/ml, Neocallimastix sp. için 70 mg/ml olarak tespit edilmiştir. İnhibitör (1,10 Phenanthroline monohidrat, sodyum sülfit (Na2(SO)3), sodyum azid (NaN3), EDTA, PMSF, üre, ß-merkaptoetanol, triton X-114 ve SDS) ve metal iyonlarının (BaCl2, CoCl2, MnCl2, NiCl2, FeCl3, ZnCl2, MgCl2, CaCl2, CuCl2, KCl, HgCl2) enzim aktivitesi üzerine etkisi incelenmiştir. Genel olarak metal iyonlarının Orpinomyces sp.?nin enzim aktivitesini arttırdığını, Neocallimastix sp.?nin enzim aktivitesini değiştirmediği tespit edilmiştir. Her iki fungus için de EDTA, 1,10-Phenanthrolin Monohidrat, Fe3+, Mn2+ ve ß-Merkaptoetanol?un enzim aktivitesini arttırdığı;  Hg2+, Cu2+, Zn2+, üre ve SDS?nin ise azalttığı tespit edilmiştir. Ayrıca  Orpinomyces sp. ve Neocallimastix sp. suşlarından elde edilen amilolitik enzimlerin yüksek tuz konsantrasyonunda kademeli olarak aktivite kaybettiği gözlenmiştir. İnce tabaka kromatografi sonuçlarına göre elde edilen karbon kaynağına ve zamana bağlı olmaksızın funguslardan elde edilen amilaz enzimlerinin nişasta substratını parçalamasıyla büyük miktarda glikoz eser miktarda ise maltoz açığa çıkmıştır. Elde edilen amilazların zimogram analizleri sonuca göre Orpinomyces sp. ve Neocallimastix sp.?nin ürettiği amilolitik enzimlerin formasyonu besi ortamında kullanılan karbon kaynağına göre değişmemekle beraber iki suş arasında üretilen amilazlar arasında moleküler büyüklük bakımından fark olduğu gözlenmiştir.

Abstract:
The study has analyzed polycentric Orpinomyces sp. GMLF5 and monocentric Neocallimastix sp. GMLF7 to determine the amylolytic properties.
For amylolytic enzyme activity determination, 24-hour durations were used with carbon sources as avicel, starch, glucose, and maltose in mediums. The highest activity in starch was determined to be Orpinomyces sp. for the third day and fourth day for Neocallimastix sp. In a starch medium comparison of cellular and extracellular enzyme activity between 3, 5, and 7 day periods, it was observed that both of the strain had higher cellular enzyme activity. The extracts from the extracellular enzyme were analyzed for fibrolytic features on different substrates and the highest enzyme activity was found to be on substrate with 1 % xylan while the lowest was 1 % avicel. The enzyme activity of the added starch concentration into the medium was evaluated to be the highest for Orpinomyces sp. at 4 mg/ml and 5 mg/ml for Neocallimastix sp. Both of the fungi had amylase activity optimum temperature at 45 oC and optimum pH at 5.5. The amylase activity for Orpinomyces sp. was thermally stable in all of the times including 15, 30, 45, and 60 minutes for 35 oC while there was a higher increase of activity after first 15 minute in 35 oC. In the order of the tested times, the amylase activity increase was determined to be 49 %, 39 %, 22 % and 35 %. The first 15 minutes after 45 oC, Orpinomyces sp. lost its amylase activity. The thermal stability of Neocallimastix sp. was observed to decrease in amylase activity in all times of 35 °C temperature by 27 % except the15 minute duration which was at a decrease level of 11 %. Orpinomyces sp. has a pH stability of 3.5 to 8.0 for 15 minutes of 64% enzyme activity and Neocallimastix sp. has the same pH stability in the same time interval but with a higher enzyme activity of 77 %. The relative enzyme amount binding to substrates at pH 6.5 for Orpinomyces sp. is at least 51 % while the amount is at least 68 % for Neocallimastix sp. at pH 5.5. The substate concentration for Orpinomyces sp. is optimal at producing amylase enzyme at 80 mg/ml while the optima is 70 mg/ml for Neocallimastix sp. The effects of detergents, inhibitors (1,10 phenanthroline monohydrate, sodium sulfite (Na2(SO)3), sodium azide (NaN3), EDTA, PMSF, urea, ß-mercaptoethanol, triton X-114 and SDS) and metal ions (BaCl2, CoCl2, MnCl2, NiCl2, FeCl3, ZnCl2, MgCl2, CaCl2, CuCl2, KCl, HgCl2) on enzyme activity were analyzed. In general, the effects of metal ions on Orpinomyces sp. increased enzyme activity but had no effect on  Neocallimastix sp. EDTA, 1,10 phenanthroline monohydrate, Fe3+, Mn2+ and ß-mercaptoethanol increased enzyme activity for both fungi but Hg2+, Cu2+, Zn2+, urea and SDS decreased it. In addition, Orpinomyces sp. and Neocallimastix sp. was observed to gradually decrease amylolitic activity in high salt concentrations. The results of thin layer chromatography from carbon source and amylase enzyme without a time restriction showed high levels of glucose and little amounts of maltose produced from starch. The analyzed amylase results from the zymogram showed the amylolytic enzyme products of Orpinomyces sp. and Neocallimastix sp. do not change formations through carbon sources and the products formed in between the two strain have different molecular size.