Pichia pastoris pıb4a sekresyon plazmid vektörünün moleküler olarak modifikasyonu
Molecular modification of pichia pastoris pib4a secretion plazmid vector
Yazar: AHMET BULDAĞ
Danışman: PROF. DR. İSA GÖKÇE
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Biyoteknoloji ürünlerinin geneli "rekombinant proteinlerdir". Proteinler yaşam için gerekli olan önemli yapısal ve düzenleyici moleküllerdir. Amaca uygun yani istediğimiz proteine uygun bir expresyon sistemi ve vektör temini ve konstrüksiyonu rekombinant protein üretiminin temelini teşkil etmektedir. İşte bu amaca yönelik olarak hem ticari hemde ticari olmayan bir takım vektör ve ekspresyon sistemleri kullanılmaktadır.  Genelde E. coli ve Saccharomyces cereviciae sistemleri bu amaca en çok hizmet veren vektörlerdir ancak bu sistemler bazen expresyon için gerekli olan mekanizmaları gerçekleştiremediklerinden farklı bir sistemin denenmesi gerekmektedir. 
Daha önceden üniversitemizde konstrükt etmiş olduğumuz Pichia pastoris sekresyon vektörü üretilmesi istenilen bir takım endüstriyel proteinleri üretebilecek kapasitede bir vektör sistemidir. Bu sistem istenilen proteinleri Pichia pastoris organizmasının dışarısına salgılayabilmekte ve bu sayede organizmaları toplayıp parçalama gereği duymadan bu organizmanın yetiştirildiği basit içerikli minimal medyumdan (besiyeri) toplanacak olan proteinler yine vektörün bize sağlamış olduğu afinite kromatografisinden (Ni-NTA agaroz veya aynı içerikli) saflaştırılabilme özelliği sayesinde (karboksil ucunda içerdiği 6 adet histidin amino asitinden dolayı) ortamdan kolaylıkla sadece tek bir basamakta saflaştırılabilmektedir. Yukardaki avantajların yanı sıra vektörümüzün özellikle kısıtlı çoklu klonlama bölgesine sahip olmasından dolayı klonlama işlemlerinde şu anda sadece bir iki restriksiyon enzimi kullanabilmektedir. Bu çalışma ile plazmid üzerinde birden fazla olan restriksiyon enzimlerinin kesim bölgelerini teke indirerek  çoklu klonlama bölgesinde kullanılabilecek olan enzim miktarı artırılmıştır. Bu sayede varolan vektör üzerinde birtakım genetik manipilasyon çalışmalarıyla daha kısa zamanda ve daha ucuz enzimlerle klonlama işlemleri gerçekleştirilebilecek sonrasında ise daha yüksek verimlerde proteinlerin üretilmesine imkan sağlayacak bir rekombinant vektör sistemini elde etmeyi planlamaktayız.

Abstract:
Biotechnology products in general are "recombinant protein". Proteins are important structural and regulatory molecules and they are essential for life. A suitable protein expression system and a desired plasmid vector is the fundamentals of production of recombinant proteins. There are several commercial and non-commercial vectors and expression systems for this purpose and they are used. E. coli and Saccharomyces cerevicia systems are that most serve this purpose, but different systems must be tested because sometimes previous used systems can not perform the necessary mechanisms for the protein expression.

We have already designed a Pichia pastoris secretion vector previously in our university that has a capacity to produce desired industrial proteins in Pichia pastoris organism. Pichia can secrete out these proteins and we do not need to break the yeast. Secreted proteins can be harvested from the simple-minimal medium where the organism is grown. Proteins can be easily purified using the affinity chromatography that is provided by vector (Ni-NTA agarose or similar contents) Vector includes 6 histidine amino acids at the carboxyl terminus therefore proteins can be purified easily from the growth medium at one step. Although our expression system has above advantages but it has a multiple cloning site with limited restriction enzymes for cloning the desired gene fragments. In this study, we would like to reduce the recognition sites of enzymes that is in the multiple cloning site (our vector has two or three sites for these enzymes) for increasing the single cut enzymes in the multiple cloning site.. In this way, we intend to obtain a recombinant vector system that allows us a shorter time and use of cheaper and suitable enzymes for cloning process for the production of high yield of recombinant.