Zorunlu akalifilik Bacillus marmariensis GMBE 72 soyundan izole edilen alkalen proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of alkaline protease from obligate alkaliphilic Bacillus marmariensis GMBE 72
Yazar: MİNE NAZAN KERİMAK ÖNER
Danışman: PROF. DR. A. ALTAN ERARSLAN
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Alkali proteaz = Alkaline protease ; Bacillus = Bacillus ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification

Özet:
Çalışmada TÜBİTAK-MAM-GMBE, Enzim ve Fermentasyon Teknolojisi Laboratuvarı tarafından izole edilen ve yeni bir tür olan Bacillus marmariensis GMBE 72 suşundan izole edilen alkalen proteaz (AP) enziminin saflaştırılarak karakterizasyonu yapılmıştır. 54 saatlik fermentasyon sonunda kültür ortamı santrifüjlenerek hücreler uzaklaştırılmış, kültür üst sıvısındaki protein % 55 (NH4)2SO4 çöktürmesi ve DEAE-selüloz iyon-değişim kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Tuz ilavesinden önce kültür üst sıvısının pH değeri 6.5'e ayarlanmıştır. Tuz çöktürmesinden elde edilen çökelek 50 mM pH 10.5 NaOH-glisin tampon çözeltisine karşı gece boyunca diyaliz edilmiş elde edilen diyalizat DEAE-selüloz anyon değişim kromatografi kolonuna yüklenmiştir. Enzim pH 10.5 NaOH-glisin tampon çözeltisindeki 0-0.25 mol l-1 NaCl lineer gradienti ile kolondan yıkanmıştır. Proteolitik aktivite piki 0.20 mol l-1 iyonik güçte gözlenmiştir. Saflaştırma verimi % 35 ürün ve saflaştırma katsayısı değeri 17'dir. Enzim SDS-PAGE'de tek bant protein olarak gözlenmiş ve molekül ağırlığı 24.26 kDa olarak tespit edilmiştir. Alkalen proteazın; Km ve Vm değerleri sırasıyla 3.12 mg ml-1 kazein, 1.60 µmol tirozin ml-1dak-1, optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 60ºC ve 11.0 olarak tespit edilmiştir. Enzim 2 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF) tarafından tamamen inhibe edildiği için enzimin serin alkalen proteaz olduğu tespit edilmiştir. Peptid nitroanilid ve protein substratlar arasında N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA ve süt tozunu en yüksek spesifite ile hidrolizlemiştir. Enzim % 2 Tween-20, 40, 60, 80 varlığında stabilitesini korurken % 0.2 sodyumdodesil sülfat (SDS) ve 5% H2O2 varlığında stabilitesini kaybetmiştir. Alkalen proteaz aktivitesi üzerine 4 mM Cu2+ iyonlarının etkisi incelenmiş 30 ve 60°C sıcaklıklarda Cu2+ iyonlarının enzimi aktive ettiği Fe2+ iyonunun ise her iki sıcaklık değerinde enzim üzerinde kuvvetli inhibisyon etkisi yarattığı gözlenmiştir.

Abstract:
In this study was carried out purification and characterization of a serine alkaline protease from newly isolated Bacillus marmariensis GMBE 72 by TÜBİTAK-MAM-GMBE, Enzyme and Fermentation Technologies Lab. After 54 h cultivation, the culture medium was centrifuged to remove cells. The dissolved proteins in the supernatant were precipitated by the addition of ammonium sulphate to 55% saturation and DEAE-cellulose ion-exchange chromatography. Culture filtrate pH was adjusted to 6.5 before salt addition. The precipitate was collected by centrifugation dialyzed against 50 mM NaOH-glisin buffer, pH 10.5 and then loaded to a DEAE-cellulose anion-exchange column. Alkaline protease (AP) was eluted with lineer gradient of 0-0.25 mol l-1 NaCl in the pH 10.5 NaOH-Gly buffer. The peak of proteolytic activity was observed at 0.2 mol l-1 ionic strength. The enzyme was purified 17-fold by DEAE-cellulose chromatography followed by (NH4)2SO4 precipitation with 35% yield. The enzyme was showed single band protein on SDS-PAGE and molecular mass was estimated to be 24.26 kDa. Km and Vm values of the alkaline protease of the strain GMBE 72 were found to be 3.12 mg ml-1 caseine, 1.60 µmol tyrosine ml-1 min-1 respectively. The optimal temperature and pH for the proteolytic activity were 60ºC and 11.0 respectively. Enzyme activity was completely inhibited by 2 mM phenylmethylsulphonylfloride (PMSF), suggesting that the enzyme is a serin protease. Among the peptide nitroanilides and protein substrates examined, AP efficiently hydrolysed N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA and skim milk respectively. Enzyme was stable in the presence of the 2 % concentration of Tween-20, 40, 60, 80 however it was not stable in the presence of 5% H2O2 and 0.2 % sodiumdodecyl sulphate (SDS). AP activity was increased and stabilized by Cu2+ divalent metal ions at 30-60°C. Enzyme was strongly inhibited by Fe2+ ions in the same conditions Cu2+ metal ions.