DOCK8 eksikliği olan hastalarda T hücre reseptör repertuvarının yeni nesil dizileme ile belirlenmesi
Characterization of T cell receptor repertoire in patients with DOCK8 deficiency BY next-generation sequencing
Yazar: CEREN BOZKURT
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ BARAN ERMAN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Pediatrik Temel Bilimler Ana Bilim Dalı / İmmünoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology
Dizin: Dizi analizi = Sequence analysis ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic ; Reseptörler = Receptors ; T lenfositleri = T lymphocytes ; İmmün sistem = Immune system ; İmmün yetmezlik = Immun deficiency

Özet:
Primer immün yetmezliklerde immün repertuvarın tanımlanması ve adaptif immün yanıtların karakterizasyonu hastalıklara yaklaşım ve hastalıkların değerlendirilmesi açısından önemlidir. İmmün repertuvarın oluşumda en önemli faktörlerden biri V(D)J rekombinasyonudur. T hücre reseptörünü oluşturan V (variable), D (diversity) ve J (joining) genlerinin rekombinasyonu sonucu oluşan çeşitlilik, farklı antijenlere bağlanmadaki en önemli bölge olan CDR3 (complementarity determining region 3) bölgesi, yeni nesil dizileme teknolojileri ve biyoinformatik programları kullanılarak araştırılabilmektedir. Bu çalışmada, DOCK8 eksikliği tanısı almış hastalarda T hücre reseptör repertuvarı araştırılmıştır. Öncelikle hastalardan lenfosit izolasyonu gerçekleştirildi. Lenfositlerden, manyetik negatif seperasyon yöntemi ile, CD4+ ve CD8+ T hücreler izole edildi. Elde edilen CD4+ ve CD8+ T hücrelerden total RNA izolasyonu yapıldı, konsantrasyon ölçümü ile total RNA miktarları kaydedildi. SMARTer teknolojisi ile TRB zincir amplifikasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen diziler Illumina Miseq kullanılarak dizilendi. Çıkan sonuçların biyoinformatik ve istatistik analizleri Cogent, Immunarch ve IMGT programları aracılığı ile yapıldı. Hastaların ve kontrollerin CD4+ T hücre repertuvar çeşitliliği ve eşsiz klonotip sayıları arasında anlamlı farklılık elde edilmedi. Hastaların CD4+ T hücre V-J gen kullanımlarının kontrollerden farklı profilde olduğu görüldü. Hastaların CD8+ T hücre repertuvar çeşitliliği ve eşsiz klonotip sayılarında kontrole oranla belirgin düşüklük saptandı. Hastaların CD8+ T hücrelerinde farklı V-J genlerinin kullanım frekanslarının kontrole oranla belirgin olarak düşük olduğu gözlemlendi. CD8+ T hücrelerin CDR3 uzunluklarının dağılımının CD4+ T hücrelere oranla düşük olduğu sonucu elde edildi. Elde edilen sonuçlarda DOCK8 eksikliği olan hastaların CD8+ T hücre repertuvarlarının belirgin şekilde etkilenmesi, DOCK8 mutasyonlarının CD4+ ve CD8+ hücre repertuvarının oluşumunda etkisi olabileceğine ve DOCK8 proteininin hücre farklılaşmasında rolü olabileceğine dair ipuçları vermektedir. Bu çalışma, DOCK8 eksikliğinde görülen hücre içi patojenlere ve kutanöz enfeksiyonlara yatkınlığın, CD8+ T hücre repertuvarının etkilenmesi sebebiyle oluşabileceğine dair fikir vermektedir.

Abstract:
Identification of immüne repertoire is crucial to characterize adaptive immüne responses in terms of disease approach. V(D)J recombination is one of the most crucial factors in the development of the immune repertoire. The repertoire diversity that results from V (variable), D (diversity), and J (joining) genes and the structure of CDR3 (complementarity determining region 3) can be investigated by using next-generation sequencing (NGS) technologies and bioinformatics softwares. In this study, the T cell receptor (TCR) repertoire was evaluated in patients with DOCK8 deficiency. First, lymphocyte isolation was performed from the patients. By using magnetic negative separation technique, CD4+ and CD8+ T cells were separated from lymphocytes. Total RNA was extracted from the collected CD4+ and CD8+ T cells, and total RNA concentration were determined. TCR β chain amplification was performed with SMARTer technology. The TCR region was sequenced by Illumina Miseq. Bioinformatics and statistical analyzes of the results were carried out by using Cogent, Immunarch and IMGT softwares. The results showed that there was no significant difference between the CD4+ T cell repertoire diversity and unique clonotype numbers of patients and controls. It was observed that CD4+ T cell V-J gene usage of the patients was different than the controls. The patients' CD8+ T cell repertoire richness and number of distinct clonotypes were considerably lower than those of the control group. It was observed that the frequency of the usage of diverse V-J genes in CD8+ T cells of the patients was significantly lower than in the control. It was revealed that the distribution of CDR3 lengths of CD8+ T cells was lower than those of CD4+ T cells. The results showed that patients with DOCK8 deficiency have drastically altered CD8+ T cell repertoires, which suggests that DOCK8 mutations may affect how CD4+ and CD8+ cell repertoires are generated. DOCK8 protein may be thought to play a key role in the differentiation. This study indicates that the skewed CD8+ T cell repertoire may influence the susceptibility to infections by intracellular pathogens and cutaneous infections observed in DOCK8 deficiency.