Türkiye'ye endemik olan salsola grandis türünün antioksidan ve insan kolon adenokarsinom hücre hattı (HT-29) üzerine antikanserojenik etkisinin araştırılması
Investigation of anticancerogenic effect on human colon adenocarsinoma cell line (HT-29) and antioxidant effect of salsola grandis species which is endemic in Turkey
Yazar: SEDA ŞİRİN
Danışman: YRD. DOÇ. HATİCE GÜL DURSUN
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Hücre dizisi = Cell line ; Kolon = Colon ; Metanol = Methanol ; Salsola = Salsola ; Salsola grandis = Salsola grandis

Özet:
Kanser günümüzün en sık karşılaşılan hastalıklarından birisi haline gelmiştir. Kanser tedavisinde kullanılan kemoterapik ilaçlar tedaviye bağlı olarak ağır yan etkiler göstermektedir. Yapılan klinik, epidemiyolojik ve deneysel çalışmalarda kanser tedavisine yönelik alternatif ve tamamlayıcı ilaçların ve tedavi yöntemlerinin ortaya konulmasının önemi vurgulanmaktadır. Bitkiler kanserin birçok formunun tedavisi için yüksek derecede etkili geleneksel ilaçların birincil kaynağını oluşturmaktadır. 
S. grandis metanol ekstraktı (SGME)'nın antioksidan ve insan kolon adenokarsinom hücre hattı (HT-29) üzerine antikanserojenik etkisinin araştırılması ilk kez bu çalışma ile belirlenmiştir. SGME'nın askorbik asit, β-karoten, likopen, total alkaloid, total flavonoid ve total fenolik içeriği spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. SGME'nın en fazla total fenolik içeriğine, en az ise likopen içeriğine sahip olduğu gösterilmiştir. SGME'nın demir (II) iyonlarını şelatlama aktivitesi (5.36±0.00 mg/mL), plazma lipit peroksidasyon inhibisyonu (%21.45±0.04) ve 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikali giderme aktivitesi (0.08±0.00 mg/mL) tespit edilmiştir. SGME'nın fenolik asit kompozisyonu sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizi ile belirlenmiştir. Bitki ekstraktının fenolik asit kompozisyonunda en yüksek miktarda vanilik asit, en az miktarda gallik asit bulunmuştur. SGME'nın HT-29 hücre hattı üzerinde antiproliferatif etkisi 3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difenil tetrazolium bromid; tiazolil mavi (MTT) yöntemi ile belirlenmiştir. Bitki ekstraktının IC50 dozu 250 µg/mL 48 saat olarak hesaplanmıştır.  SGME'nın HT-29 hücre hattında apoptozda rol oynayan genler BCL2 associated X (BAX), BCL2,  kaspaz-3 (CASP3), kaspaz-7 (CASP7), kaspaz-8 (CASP8), kaspaz-9 (CASP9), sitokrom C (CYCS), Fas hücre yüzeyi ölüm reseptörü (FAS) ve tümör protein p53 (TP53) ekspresyon düzeylerindeki değişikliğin belirlenmesi gerçek zamanlı PZR ile gerçekleştirilmiştir. BCL2 geninin ekspresyonunda konrole göre dozda 1.63±0.40 kat azalma, BAX, CASP3, CASP7, CASP8, CASP9, CYCS, FAS ve TP53 genlerinin ekpresyonunda kontrole göre dozda sırasıyla 1.52±0.13, 1.52±0.30, 1.76±0.02, 1.81±0.06, 1.46±0.06, 1.91±0.03, 1.18±0.10 ve 1.79±0.07 kat artma belirlenmiştir. SGME'nın HT-29 hücre hattında apoptozda rol oynayan proteinlerin (Bcl-2, Bax, kaspaz-3 ve kaspaz-9) ekspresyon düzeylerindeki değişikliğin belirlenmesi Western blot yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Elde edilen proteinlerin ekspresyon düzeyleri, genlerin ekspresyon düzeyleri ile uyumlu bulunmuştur. 
Sonuç olarak, SGME antioksidan ve HT-29 hücre hattı üzerine antikanserojenik etkisinin yüksek olması bakımından öne çıkmıştır. Bu durum, S. grandis'in ekonomik değerinin artmasına ve Türkiye florasındaki yerinin güçlenmesine yol açacaktır. SGME'nın kanser tedavisinde yeni bir terapötik ajan haline geleceği ve özellikle ilaç endüstrisinde ürüne yönelik kullanımlarda öne çıkmasının mümkün olacağı düşünülmektedir. Ayrıca SGME'nın antikanser etkisi ile birlikte antikanser mekanizmasının da ortaya konulması daha etkin, hedefe yönelik koruyucu ve tedavi edici ilaç formülasyonlarının geliştirilmesini sağlayacaktır.

Abstract:
Today, cancer became one of the most common diseases. Chemotherapeutics for the treatment of cancer cause severe treatment-related side effects. Existing clinical, epidemiological and experimental studies emphasize the importance of introducing alternative and complementary medicinal products and methods for cancer treatment. Plants constitute a primary source of traditional drugs which are highly effective in the treatment of many forms of cancer.
This is the first study identifying the antioxidant characteristics of the S. grandis methanol extract (SGME) and its anticarcinogenic effects on the human colon adenocarcinoma cell line (HT-29). The ascorbic acid, β-carotene, lycopene, total alkaloids, total flavonoids and total phenolics content of SGME were determined spectrophotometrically. It was shown that while its total phenolics content is the highest, SGME's licopene content was the lowest. SGME's iron(II) ion chelating activity (5.36±0.00 mg/mL), plasma lipid peroxidation inhibition (21.45±0.04%) and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity (0.08±0.00 mg/mL) were determined. The phenolic acid composition of SGME was determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis. In the phenolic acid composition of the plant extract, vanillic acid was the component with the highest amount, while the component with the lowest amount was gallic acid. The antiproliferative action of SGME on the HT-29 cell line was determined by 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; thiazolyl blue (MTT) method. The IC50 dose of the plant extract was calculated as 250 µg/mL 48 hours. Following the treatment with SGME, the change in the expression levels of the genes involved in the apoptosis in HT-29 cell line (BCL2-associated X (BAX), BCL2, caspase-3 (CASP3), caspase-7 (CASP7), caspase-8 (CASP8), caspase-9 (CASP9), cytochrome C (CYCS), Fas cell surface death receptor (FAS) and tumor protein p53 (TP53)) were determined by real-time PCR. In the expression of the BCL2 gene, compared to the control, a decrease of 1.63±0.40 fold per dose was identified. In the expression of BAX, CASP3, CASP7, CASP8, CASP9, CYCS, FAS and TP53 genes, there were an increase as 1.52±0.13, 1.52±0.30, 1.76±0.02, 1.81±0.06, 1.46±0.06, 1.91±0.03, 1.18±0.10 and 1.79±0.07 fold per dose, respectively, compared to the control. Following the treatment with SGME, the change in the expression levels of the proteins involved in the apoptosis in HT-29 cell line (Bcl-2, Bax, caspase-3 and caspase-9) were determined by Western blot method. The expression levels of obtained proteins were considered as consistent with the expression levels of the genes.
In conclusion, SGME becomes significant due to its antioxidant characteristics and higher anticarcinogenic effect on HT-29 cell line. This would lead to an increase in the economic value of S. grandis and strengthen its position in the flora of Turkey. It is believed that SGME would become a new therapeutic agent for cancer treatment and that it may stand out in the product-oriented potantial applications in the pharmaceutical industry. Moreover, revealing the anticarcinogenic mechanism of SGME along with its anticarcinogenic effect would lead to the development of more efficient and targeted propyhlactic and therapeutic drug formulations.