Rosiglatazonun minimal rezidüel hastalık modelinde nöronal kök hücre diferansiasyonu üzerine etkisi
The effect of rosi̇glatazone on di̇fferanti̇aton of neural stem cells in minimal residual disease model of neuroblastoma
Yazar: MERAL AYLA KOYUN
Danışman: PROF. DR. ZEKİYE SULTAN ALTUN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Onkoloji Ana Bilim Dalı / Temel Onkoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücre çoğalması = Cell proliferation ; Kök hücreler = Stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nöral kök hücreleri = Neural stem cells ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; PPAR = PPAR ; Rosiglitazone = Rosiglitazone ; Rosiglitazone = Rosiglitazone

Özet:
Nöroblastom (NB) nöral krestten köken alan embriyonik bir tümördür.Klinik remisyon elde edilen ileri evre hastalıkta en büyük sorun minimal rezidüel hastalığın (MRH) varlığıdır. Peroksizom proliferatör-aktive edici reseptör nükleer transkripsiyon faktörü olup hücre çoğalması ve diferansiasyonu regüle etmektedir.Rosiglatazon (RZG) peroksizom proliferatör- aktive edici reseptör agonisti antidiyabetik bir ajandır.
Bu çalışmada amacımız; Nöroblastom Minimal rezidüel hastalık hücre modeli oluşturmak ve rosiglatozonun (RZG) minimal rezidüel hastalık modelinde (MRH) nöronal kök hücre diferansiasyonu üzerinde etkili olup olmadığının belirlenmesiydi. 
Çalışmada N-Myc pozitif KELLY ve N-Myc negatif hücre hattı SH-SY5Y kullanılmıştır.Hücrelerin canlılıkları WST-1 ile analiz edilerek IC50 dozları belirlendi.NB hücrelerine tekrarlı sisplatin (CDDP) uygulamaları ile arta kalan hücrelere dayalı MRH modeli oluşturuldu.PHOX2B gen ekspresyonunun 2 kat ve daha fazla artış/azalışı hücrelerin MRH modelinin oluşmasının bir göstergesi olarak kullanıldı.PHOX2B gen ekspresyonu RT-PCR yöntemi ile belirlendi.MRH modeli oluşturulan NB hücrelerinde CDDP ve RZG  hücre canlılığı,apoptoz,nöronal kök hücre farklılaşması ile ilişkili S-100,Oct-3,Nestin,Sox2  ve CD133 protein ekspresyonları aracılığı ile farklılaşma üzerine etkisi değerlendirildi. Bulguların,SPSS22 programında non-parametrik Mann-Whitney-U testi ile istatistik analizi yapılmıştır.p<0,05 değeri istatistiksel anlamlı kabul edilmiştir. 
SH-SY5Y ve KELLY hücrelerinde RZG IC50 dozları;50,100µM, CDDP IC90 dozları KELLY'de 80µM,SH-SY5Y'de 50µM olarak belirlenmiştir.400µM CDDP ve CDDP+RGZ kombinasyonları NB  hücre hatlarında  hücre canlılıklarını azaltmış ve hücreleri apoptoza sürüklemiştir.Hücre siklusunda hücrelerin büyük kısmı SubG1'de tutuklanmıştır.
Dirençli-MRH gelişmiş hücrelerde CD133+ gözlenmemiştir.Dirençli-MRH gelişmiş KELLY ve SH-SY5Y hücresinin kontrole göre;CDDP+RGZ kombinasyonlarında PHOX2B gen ve OCT3-4 ekspresyonu artmış,Sox2  ekspresyonu azalmıştır. 
MRH modeli oluşturulan SH-SY5Y hücrelerinde CDDP+RZG kombinasyonu CDDP'e göre daha fazla apoptotik etki oluştururken farklılaşma belirteçlerinin azalması, KELLY hücrelerinde tersi durum gözlenmesi ve RZG etkisinin nöronal farklılaşma ile ilişkili olarak da gerçekleştiğini göstermiştir.
Dirençli-MRH gelişmiş SH-SY5Y hücrelerinde CD133+ hücre sayılarının dirençsizlere göre artması CDDP direnci ve MRH modelinde CD133+ kanser kök hücrelerinin de rolü olduğunu göstermiştir.N-MYC(-) ve (+) NB hücrelerinde farklı CD133 hücre oranlarının ortaya çıkması nöroblastomun  heterojen tümör olduğunu ve bu heterojenitenin  kök hücre profiliyle de karşımıza çıktığını desteklemiştir.
RZG, nöroblastom ana tedavi ajanı CDDP ile birlikte nöroblastomun  MRH modelinde PPRgama reseptörü olan tümörlerde tedaviyi destekleyecek bir ajan olarak in-vivo NB modellerinde değerlendirilmesi gerekmektedir.

Abstract:
Neuroblastoma (NB) is an embryonic tumor originating from the neural crest. The most important problem in advanced stage disease with clinical remission is the presence of minimal residual disease (MRD).Peroxisome proliferator-activating receptor is a nuclear transcription factor that regulates cell proliferation and differentiation.Rosiglatazone (RZG)  peroxisome proliferator-activating receptor agonist is an antidiabetic agent.
The aim of this study was to establish the MRD model and the determine whether  rosiglatazone has any effect on the differantiation of neuronal stem cell in minimal residual disease model. 
In this study N-Myc positive KELLY and N-Myc negative SH-SY5Y cell lines were used. By analysing the viability of the cells WST-1 and IC50 doses were determined.NB cells were generated by MRH model based on residual cells with repeated cisplatin (CDDP) tretmeants.A 2-fold or greater increase/decrease in PHOX2B gene expression was used as an indicator that the cells reached the minimal residual disease model.PHOX2B gene expression was determined by RT-PCR method.The effects of cisplatin (CDDP) and RZG cell viability, apoptosis and neuronal stem cell differentiation of neuroblastoma cells in the MRD model were investigated by using S-100, Oct-3, Nestin, Sox2 and CD133 protein expression.The statistical analysis was performed using the non-parametric Mann-Whitney-U test in the SPSS22 program. p <0.05 was considered statistically significant. 
In SH-SY5Y and KELLY cells RZG IC50 doses were determined as 50,100µM; CDDP IC90 doses were determined as 80µM in KELLY and 50µM in SH-SY5Y. 400µM CDDP and  CDDP+RGZ combinations reduced cell viability in NB cell lines and induced cells to apoptosis.In the cell cycle, most of the cells were imprisoned during the SubG1 phase. CD133+ in resistant cells.not observed.Resistive MRD KELLY and SH-SY5Y cell according to the control; in CDDP + RGZ combinations, expression of PHOX2B gene and OCT3-4 increased and Sox2 expression decreased.
The combination of CDDP+RZG in SH-SY5Y cells with MRD model showed more apoptotic effect when compared with CDDP, decrease in differentiation markers, observed opposite situation in KELLY cells, and effect of RZG in relation to neuronal differentiation.
Increased CD133+ cell counts in resistant MRH SH-SY5Y cells compared to non-resistant Showed resistance to CDDP and CD133+ cancer stem cells in MRD model.The emergence of different CD133 cell ratios in N-MYC (-) and (+) NB cells supported the fact that neuroblastoma was a heterogeneous tumor and this heterogeneity was encountered with stem cell profile. 
Rosiglatazone should be evaluate as an agent with CDDP main therapautic of neuroblastoma and as an supportive agent at PPRgama expresing tumors in MRD in-vivo NB model.