Termofilik geobacıllus Sp.  TF16'dan ksilanazın klonlanması, ekspresyonu, immobilizasyonu,  karakterizasyonu ve 
endüstriyel uygulamalarının incelenmesi
Cloning, expression, immobilisation, characterization of xylanase from Thermophilic geobacillus Sp. TF16 and investigation of industrial applications
Yazar: ÜMMÜHAN ÇAKMAK
Danışman: DOÇ. DR. NAGİHAN SAĞLAM ERTUNGA
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Enzim immobilizasyonu = Enzyme immobilization ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Gen klonlama = Gene cloning ; Gıda endüstrisi = Food industry

Özet:
Bu çalışmada, Geobacillus sp. TF16 suşundan 996 bç'lik ksilanazı kodlayan genin baz dizilimi belirlendi ve bu DNA parçası pET-28a(+) vektörüne klonlandıktan sonra, Escherichia coli BL21(DE3)pLysS hücresine aktarılarak rekombinant ksilanaz ekspres edilip nikel afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. SDS-PAGE ile 39,8 kDa'luk tek bir bandın varlığı tespit edildi. Ayrıca enzimin amino asit benzerliğine göre familya 10 glikozil hidrolaz sınıfı bir enzim olduğu belirlendi. Serbest enzim dowexe %58,8,  kitine %68,1 ve kitosana %85,6 verimle immobilize edildi. Serbest ve immobilize enzimin en yüksek aktiviteyi ksilan substratı varlığında gösterdi tespit edildi. Serbest enzimin optimum pH değeri 8,5 ve sıcaklığı 55°C, kitosana immobilize enzimin optimum pH değeri 6,0 ve sıcaklığı 65 °C olarak belirlendi. Saf enzimin ve immobilize enzimin Vmax değeri sırasıyla 30,86±0,96 µmol.dak-1.mg-1 ve 1,20±0,03 µmol.dak-1.mg-1 olarak bulunurken, K0,5 değerleri sırasıyla 1,75 mg/L ve 1,65 mg/mL olarak bulundu. Isıl ve pH kararlılığı incelendiğinde immobilize enzimin serbest enzime göre daha kararlı olduğu belirlendi. Serbest enzimin düşük konsantrasyonda bazı metal iyonları ve kimyasalların varlığında inhibisyona uğradığı, immobilize enzimin ise düşük konsantrasyonlardaki metal iyonları ve kimyasallardan etkilenmediği tespit edildi. Elma suyunda enzimin kullanılmasıyla indirgen şeker miktarı 1,03 kat, immobilize enzim kullanılmasıyla 1,05 kat artarken, portakal suyunda enzimin kullanılmasıyla indirgen şeker miktarı 2,84 kat, immobilize enzim kullanılmasıyla 3,23 kat arttığı belirlendi. Serbest enzimin kümes hayvanı yemiyle etkileşimi sonucunda indirgen şeker miktarındaki artış oranı %12,0 ve immobilize enzim varlığında indirgen şeker miktarındaki artış oranı %34,0 olarak bulundu. Ayrıca serbest enzimin hamur kabarmasını 2,7 kat artırırken, immobilize enzimin 5 kat artırdığı gözlemlendi.

Abstract:
In this study, three experimental steps were performed: (1) cloning, (2) expression of the 996 bp xylanase gene coding from a thermophilic bacterium, Geobacillus sp. TF16, and (3) characterization of its product, Xylanase enzyme, aiming to improve its use in industry. For cloning (1), TF16 strain was determined, cloned into pET-28a(+) vector and expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS. Enzyme was purified by nickel affinity chromatography. (2) Expression analyses showed that molecular weight of recombinant enzyme was 39.8 kDa by a single band on SDS-PAGE . It is a member of family 10 of glycosyl hydrolases in terms of amino acid similarity. (3) Characterisation includes immobilization and activity assays. Free enzyme was immobilized with a yield of 58.8% on dowex, 68.1% on chitin and 85.6% on chitosan. Free and immobilized enzyme on chitosan showed the highest activity in the presence of xylan substrate. The optimum pH and temperature of the free enzyme were measured 8.5 and 55°C, whereas these were 6.0 and 65°C, respectively, for the immobilized enzyme. Vmax values were 30.86±0.96 µmol.min-1.mg-1 and 1.20±0.03 µmol.min-1.mg-1 for free and immobilized enzymes, respectively. K0,5 values were  1.75 mg/mL and 1.65 mg/mL for free and immobilized enzyme, respectively. Thermostability and pH stability of the immobilized enzyme was determined more constant than the free enzyme. Free enzyme was inhibited in the presence of some metal ions and chemicals at low concentrations, but the immobilized enzyme was not. The enzymes characterized were then applied for practical use in food industry and animal breeding. These are as follows: the rate of reducing sugar increased 1.03 and 1.05-fold in apple juice, 2.84 and 3.23-fold in orange juice, 2.7 and 5-fold in oven spring, 12 % and 34% in poultry feeds by the use of free and immobilized enzymes, respectively.