Klinik örneklerde Anaerob enfeksiyon etkenlerinin tanımlanması için multiplex PCR paneli geliştirilmesi
Development of multiplex pcr panel for identification of Anaerobic infectious agents in clinical samples
Yazar: MEHMET ÖLÇÜ
Danışman: PROF. DR. DUYGU PERÇİN RENDERS ; DOÇ. DR. MUSTAFA ALTAY ATALAY
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Anaerobik bakteriler = Anaerobic bacteria ; Enfeksiyon = Infection ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Anaerob bakteriler çok çeşitli ciddi enfeksiyonların önemli etkenlerinden olmakla birlikte izolasyon ve tanımlamadaki güçlükler nedeniyle enfeksiyon etiyolojisinde sıklıkla göz ardı edilmektedirler. Bu çalışma anaerob enfeksiyonlardan en sık izole edilen Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Veillonella, Clostridium, Peptostreptococcus ve Actinomyces bakterilerini aynı anda çeşitli klinik örneklerden cins düzeyinde tanımlayabilecek yeni bir multiplex PCR panelinin geliştirilmesi amacıyla yapılmıştır.
Çalışmaya dahil edilen anaerob bakterileri tanımlamak için her bir cinse özgü 16S rRNA genini hedef alan yeni bir multiplex PCR anaerob tanımlama testi geliştirildi ve optimize edildi. Çalışmada tasarlanan multiplex PCR testinin özgüllüğü ve analitik duyarlılığı çalışmaya dahil edilen pozitif ve negatif standart bakteri suşları üzerinde çalışılarak belirlendi.
Çalışmada anaerob enfeksiyon şüphesiyle laboratuvara gönderilen 46 klinik örneğin aerob ve anaerob kültürü yapıldı. Anaerob kültürden izole edilen anaerob bakteriler, konvansiyonel yöntemler ve VITEK 2 otomatize tanımlama sistemi kullanılarak tanımlandı. Aynı örneklerden DNA izolasyonu yapılarak çalışmada geliştirilen multiplex PCR testi ile anaerob bakteri tanımlaması yapıldı. Daha sonra multiplex PCR sonuçları ile rutin laboratuvar sonuçları karşılaştırıldı.
Geliştirilen panel ile tüm pozitif kontrol suşları hem tek tek hem de toplu olarak test edilmiş ve tanımlayıcı bantların oluştuğu gözlenmiştir. Multiplex PCR testinin analitik duyarlılığı bakteri cinsine göre değişmekle birlikte 1-103 CFU/ml aralığında bulunmuştur. 
Çalışmamızda 46 klinik örneğin 8'inde (%17,4) anaerob üreme olmuş ve bunlardan konvansiyonel yöntemler ve VITEK 2 otomatize tanımlama sistemi kullanılarak 9 anaerob bakteri tanımlanmıştır. Geliştirilen multiplex PCR testi ile ise 46 klinik örneğin 20'sinden (%43,5) 35 anaerob bakteri cins düzeyinde tanımlanmıştır. Anaerob kültüründe üreme olan 8 örneğin 5'i (%62,5) multiplex PCR test sonucu ile uyumlu çıkarken 3'ü (%37,5) uyumsuz çıkmıştır. Multiplex PCR testi ile klinik örneklerden en sık izole edilen anaeroblar Prevotella spp. (%37,1) ve Fusobacterium spp. (%22,9) cinsleri olurken bunları sırasıyla Clostridium spp. (%14,3), Peptostreptococcus spp. (%11,4), Bacteroides spp. (%8,6) ve Veillonella spp. (%5,7) cinsleri izlemiştir. Anaerob kültür sonucu referans yöntem olarak alındığında multiplex PCR testinin duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif prediktif değerleri sırasıyla %75, %63,2, %30 ve %92,3 bulunmuştur. 
Sonuç olarak, Çalışmamızda geliştirilen multiplex PCR paneli ile anaerobların kültüre dayalı tanımlanmalarındaki olumsuzluklar giderilerek, klinik örneklerden kısa sürede daha doğru anaerob bakteri tanımlaması yapılabileceği ve enfeksiyonların daha doğru bir şekilde tedavi edilebilmesine olanak sağlayacağı kanaatindeyiz.

Anahtar Kelimeler:	Anaerob bakteri tanımlama, Anaerob enfeksiyon tanısı, Multiplex 			PCR

Abstract:
Although anaerobic bacteria are important agents of a wide variety of serious infections, they are often overlooked in the etiology of infection due to difficulties in isolation and identification. The aim of this study was to develop a new multiplex PCR panel that can identify Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Veillonella, Clostridium, Peptostreptococcus and Actinomyces bacteria at the genus level which are most frequently isolated from anaerobic infections.
A new multiplex PCR panel for identification of anaerobic bacteria was developed by using genus specific 16S rRNA gene of each bacteria included in the study and the test was optimized. The specificity and analytical sensitivity of the multiplex PCR assay designed in the study were determined by using the positive and negative standard strains.
Aerobic and anaerobic cultures of 46 clinical specimens which were sent to the laboratory with suspicion of anaerobic infection were performed. Anaerobic bacteria were identified using conventional methods and VITEK 2 automated identification system. DNA isolation was performed from the same samples and anaerobic bacteria were identified by multiplex PCR test developed in the study. Multiplex PCR results and routine laboratory results were compared.
All positive control strains were tested individually and collectively by using the developed panel and it was observed that descriptive bands were formed in all tests. The analytical sensitivity of the Multiplex PCR assay was found to be 1-103 CFU / ml, depending on the bacterial species.
In our study, eight (17.4%) of 46 clinical specimens had anaerobic growth and nine anaerobic bacteria were identified using conventional methods and VITEK 2 automated identification system. Multiplex PCR test identified 35 anaerobic bacteria from 20 (43.5%) of 46 clinical samples. Five (62.5%) of the eight samples which had anaerobic growth in anaerobe culture were compatible with the multiplex PCR test and three (37.5%) were incompatible. The most common anaerobes isolated from clinical specimens by Multiplex PCR assay were Prevotella spp. (37.1%) and Fusobacterium spp. (22.9%) while Clostridium spp. (14.3%), Peptostreptococcus spp. (11.4%), Bacteroides spp. (8.6%) and Veillonella spp. (5.7%) followed these genera. When anaerobic culture was accepted as the reference method, the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the multiplex PCR test were 75%, 63.2%, 30% and 92.3%, respectively.
As a result, we concluded that the multiplex PCR panel developed in our study eliminates the problems in the identification of anaerobes based on culture and provides more accurate anaerobic bacteria identification from clinical specimens in a short period of time and allows more accurate infection treatment.
Keywords: Anaerobic bacteria identification, Anaerobic infection diagnosis, Multiplex
	     PCR