Behçet hastalığı'nda otoreaktivite gösteren antijenlerin serum seviyelerinin hasta gruplarında araştırılması, il-10 geni ekspresyonu ve rs 1554286 SNP'si  incelenmesi
Autoantigens of immune response in beçet's disease and il-10 gene expression levem and rs 1554286 SNP
Yazar: ELÇİN ŞEHİTOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. BURÇAK VURAL
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Antijenler = Antigens ; Behçet sendromu = Behcet syndrome ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Gen ifadesi = Gene expression ; Mikrodizilim analizi = Microarray analysis ; Proteinler = Proteins ; İnterlökin 10 = Interleukin 10

Özet:
Behçet hastalığı (BH) genel olarak  tekrarlayan oral aftlar, genital ülserasyonlar, deri  lezyonları ve üveit  ile  karakterize  olan  kronik  inflamatuar  bir  hastalıktır.  BH'nın etiyopatogenezi  bilinmemektedir.  
Bu çalışmada, daha önce BH'nın patogenezinde otoreaktivite geliştiren antijenlerin belirlenmesi için yaptığımız Protein MakroArray çalışması sonucunda bulunan 12 antijenin; Behçet hastaların (n=100) ve sağlıklı kontrollerin (n=100), serum örneklerinde antikor yanıt seviyeleri ELISA yöntemi ile araştırıldı. Western Blot yöntemi ile ELISA sonuçları doğrulandı. İlk ELISA sonuçları ile yapılan istatistiksel analizlere göre antijenlerin hassasiyet-özgüllük değerleri hesaplandı. En yüksek değerlere sahip 5 antijen seçildi ve çalışma gruplarında incelendi. Elde edilen ELİSA sonuçları BH'nin alt gruplarında karşılaştırıldı.
Ayrıca çalışmamızda IL-10 genindeki bir SNP (rs1554286) ve IL-10 ekspresyonu çalışıldı.  Behçet hastalarının (n=48) ve sağlıklı kontrollerin (n=24) kan örneklerinden RNA ve DNA izolasyonu yapıldı. RNA örneklerinden cDNA elde edilerek IL-10 gen ekspresyonu gerçek zamanlı kantitatif PZR ile çalışıldı. DNA örneklerinden ise rs1554286'nin genotiplemesi yapıldı. 
ELISA sonuçlarının BH alt gruplarında yapılan istatistiksel hesaplamalara göre, seçilen 5 antijen için hassasiyet ve özgüllük değerleri: artrit tutulumu için %35.7 ve %82.1, deri tutulumu için %29.6 ve %96.4, vasküler tutulumu için %12 ve %96, göz tutulumu için %23,8 ve %81 bulundu. Antijenleri teker teker incelediğimizde B-cell lymphoma/ leukemia 11A'nın BH için diğer antijenlere göre hassasiyeti (%10,9) daha yüksek bulundu.
IL-10 geni ekspresyon ve SNP genotiplemesi sonucunda Behçet hastaları ve sağlıklı kontroller arasında istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç bulunmadı (P=0,31 ve P=0,39).                   Ayrıca IL-10 ekspresyon düzeyi ile rs1554286 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir değer bulunmadı.
Örnek sayısının az olması nedeniyle, ekspresyon ve SNP sonuçları ile antikor pozitif ve negatif olgu sonuçları karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç bulunmadı.
Bu çalışma sonucunda, BH için geniş bir antijen taranması sonucu prognostik biyobelirteç olabilecek aday antijenler belirlendi.

Anahtar Kelimeler : Behçet Hastalığı, Protein Makroarray, ELISA, IL-10, Otoantijen

Abstract:
Behçet's disease (BD) is a chronic, recurrent and inflammatory disorder characterized with oral and genital aphthous ulcerations, uveitis, skin lesions and skin pathergy reaction. Although the etiology of BD remains unknown.
In our previous study, we indentified 12 autoreactive antigens in BD patients' sera (n=100) versus HC (n=100) by protein macroarray method. In this study, we determined autoantigen response level of these 12 antigens in BD patients and HC with ELISA and confirm the response level with Western Blot method and determined a  SNP (rs1554286) in IL-10 gene and expression levels of IL-10 in seropositive-seronegative cases. We compared ELISA results in subtypes with different involvements of BH.
Also we studied expression level of IL-10 and rs1554286 SNP on IL-10 region. For the expression analysis, blood specimens of BD patients (n=48) and HC (n=28) were collected and RNA and DNA was extracted from blood. We performed qRT-PCR from cDNA samples to identified expression level of IL-10 gene and genotyped re1554286 from DNA samples.
The panel of antigens evaluated for BD subtypes were identified as 12% sensitivity, %96 spesificity in vascular, 23.80% sensitivity and 81% spesificity in uveitis, 35.7% sensitivity and 82.1% spesificity in arthritis, 29.6%sensitivity and 96.4% spesificity in involvement. We also analyzed candidate antigens one by one and B-cell lymphoma/ leukemia 11A was found  more sensitive (10,9%) than other antigens.
We compared expression levels of IL10(P=0.463)and also genotyping analysis(X²=1.85,P=0.396)  no significant difference was observed between BD patients and HC. Additionally no significant difference was observed between expression level of IL-10 and rs1554286.
As a result of this study, we may identified prognostic biomarkers for BH.

Key Words: Behçet's Disease Protein Macroarray, ELISA, IL-10 Autoantigen