Antraks sporlarının hızlı deteksiyonuna yönelik kuartz kristal mikrobalans (QCM)yöntemine dayalı biyosensör geliştirilmesi
Development of quartz crystal microbalance (QCM) based biosensor for rapid detection of anthrax spores
Yazar: ALİ ÖZTUNA
Danışman: PROF. DR. MEHMET BAYSALLAR
GATA / Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Derece: Doktora, 2009
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: İmmünosensör = Immunosensor

Özet:
Bu tez çalışması kapsamında Biyolojik Savaş Ajanları içerisinde kullanılma potansiyeli en fazla olan Bacillus anthracis sporlarının deteksiyonuna yönelik QCM-immünosensörü geliştirilmesi amaçlanmıştır. Hazırlanan sensörün değerlendirilmesinde patojen saha suşuyla çalışılmıştır. Kullanılan suşun patojenitesi, pXO1 ve pXO2 plazmidlerinin varlığı, in-house PCR ile gösterilmiştir. Ayrıca identifikasyon için 16S rRNA gen sekans analizi yapılmıştır. Analiz sonucunda kullanılan suşun NCBI GenBank'ta kayıtlı B. anthracis CEB95-0033 alt türü (GenBank no: AM747220) ile uyumlu olduğu gösterilmiş ve filogenetik ağacı da çizilmiştir. Sensör yüzeyinde monoklonal B. anthracis spor antikorlarının immobilizasyonunu sağlamak için adhezif tabaka olarak aminlenmiş-PVC (PVC-NH2) ve 4-aminotiyofenol (4-AT) kullanılmıştır. PVC-NH2 laboratuvarda sentezlenerek hazırlanmıştır. Kuartz kristali yüzeyinin PVC-NH2 ve 4-AT ile amaca uygun olarak modifiye edildiği Fourier transform infrared (FTIR) spektroskopisi ile ispatlanmış ve kristal yüzeyleri tarayıcı elektron mikroskopisi (SEM) ile de görüntülenmiştir. Hazırlanan QCM-immünosensörlerinin B. anthracis sporlarının deteksiyonunda kullanılabilirliği akışkan ortamda incelenmiş ve PVC-NH2 ile modifiye edilerek hazırlanmış sensör için 20 bin spor, 4-AT ile modifiye edilerek hazırlanmış QCM sensörü için ise 30 bin spor alt deteksiyon limitlerine ulaşılmıştır. B. anthracis sporlarının sensör yüzeyinde immobilize olduğu SEM görüntüleriyle de kanıtlanmıştır. B. anthracis için tahmini enfektif dozun 8000-50000 spor olduğu bilgisi göz önüne alındığında bu tez çalışması kapsamında ulaşılan alt deteksiyon limitleri de belirtilen enfektif doz aralığında yer almaktadır. Geobacillus stearothermophilus sporlarıyla yapılan deney ile, monoklonal B. anthracis spor antikorlarıyla hazırlanmış olan QCM-immünosensörlerinin yanlış pozitif sonuç vermediği, dolayısıyla hazırlanan sensörlerin B. anthracis sporlarına karşı spesifik olduğu da gösterilmiştir. Bu çalışma kapsamında hazırlanan QCM-immünosensörleri, B. anthracis sporlarının deteksiyonu amacıyla kullanılabilecek gerçek zamanlı, işaretsiz ve direkt sistemler olma yönünde ümit vaat etmektedir.

Abstract:
In this thesis study, it was aimed to develop a QCM-immunosensor for the detection of Bacillus anthracis spores which have the highest use of potential among the biological warfare agents. In order to evaluate prepared sensors a pathogen field strain was used. The pathogenity of the employed strain; that is, the presence of the pXO1 and PXO2 plasmids, was shown by in-house PCR. Furthermore, 16S rRNA gene sequence analysis was performed for identification. As a result of this analysis, it was shown that employed strain was well matched with subtype of B. anthracis CEB95-0033 which is registered on NCBI GenBank (GenBank no: AM747220) and the phylogenetic tree was also drawn. Aminated-PVC (PVC-NH2) and 4-aminothiophenol (4-AT) were used as an adhesive layer in order to immobilize monoclonal B. anthracis spore antibodies on sensor surface. PVC-NH2 was prepared by synthesizing in the laboratory. By using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, it was proved that the quartz crystal surface was modificated by PVC-NH2 and 4-AT according to the predetermined aim and crystal surfaces were also observed with scanning electron microscope (SEM). Availability of the prepared QCM-immunusensors for the detection of B. anthracis spores was investigated in flow system and 20000 and 30000 spore lowest detection limits were reached with PVC-NH2 and 4-AT modified sensors, respectively. Also, immobilization of the B. anthracis spores on the surface was proved by SEM images. When the knowledge that estimated infective dose for the B. anthracis is 8000-50000 spores is taken into consideration, lowest detection limits reached in this study also take place in the stated infective dose range. By the experiment with Geobacillus stearothermophilus spores, it was found that, QCM-immunosensors prepared with monoclonal B. anthracis spore antibodies didn?t give false positive result and thereby they were specific to B. anthracis spores. QCM-immunosensors prepared within this study are promising as real-time, label-free and direct systems which might be used for detection of B. anthracis spores.