Nörometabolik hastalık nedeni olan mutasyonların drosophila melanogasterda modellenmesi ve sinaps fonksiyonu üzerine etkilerinin araştırılması
Investigating the effects of neurometabolic disease-causing genes on synapse function in drosophila melanogaster
Yazar: RUKİYE KARATEPE
Danışman: PROF. DR. RIZA KÖKSAL ÖZGÜL
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Pediatrik Temel Bilimler Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Drosophila melanogaster = Drosophila melanogaster ; Genler = Genes ; Glutamat = Glutamates ; Metabolik hastalıklar = Metabolic diseases ; Mutasyon = Mutation ; Nörolojik hastalıklar = Neurological diseases ; RNA = RNA ; Reseptörler = Receptors ; Sinapslar = Synapses

Özet:
Sinaptopatiler nadir metabolik hastalıklar içerisinde önemli bir yer tutmasına rağmen, sinaptik disfonksiyona sebep olan mekanizmaların bilinmemesi teşhis ve tedaviyi zorlaştırmaktadır. Grubumuz tarafından son yıllarda sinaptopati ile ilişkilendirilebilecek UNC79 ve MBOAT7 gibi patojenik olduğu değerlendirilen yeni varyantlar saptanmıştır. 
UNC79 geni, NALCN ve UNC80 proteinleri ile birleşerek NALCN sızıntı kanalı olarak isimlendirilen bir kanalı oluşturmaktadır. Ekzom dizi analizi yaptığımız bir ailede UNC79 geninde patojenik olduğu değerlendirilen bir varyant saptanmıştır. UNC79 geninde varyasyon saptanan hastada gözlenen sinaptopatinin NALCN kanalının disfonksiyonuna bağlı olarak sinaptik iletimde meydana gelen disfonksiyon ile alakalı olabileceği düşünülmektedir. Fakat literatürde UNC79 geninin sinaps fonksiyonu üzerine etkilerini inceleyen veya UNC79 genini sinaptopati ile ilişkilendiren bir çalışma mevcut değildir. Yine aynı şekilde, NALCN kanalının diğer bileşenleri olan NALCN ve UNC80 genlerinde patojenik varyant saptanan hastalar literatürde mevcut olmasına ve benzer patofizyoloji göstermelerine rağmen bahsi geçen proteinlerin susturulması sonucu sinaptik proteinlerin miktarının değişip değişmediği ve sinaptik iletimin gerçekleştiği yerler olan aktif zonların sayısının nasıl değiştiği bilinmemektedir.
MBOAT7 geni ise Lands lipid modelleme yolağında yer alan önemli enzimlerden biridir. Memelilerde fosfoinositidlerin sn-2 konumuna arakidonik asid takılmasından sorumlu  oldugu bilinmektedir. Memeli beynindeki fosfolipidlerin sn-2 pozisyonunda çogunlukla arakidonik asit bulunduğu için, enzim beyinde daha önemli hale gelmektedir. 
Yukarıda verilen bilgiler ışığında UNC79 geni ve etkileşim içerisinde olduğu NALCN kanal bileşenlerinin (UNC80 ve NALCN) ve MBOAT7 geninin sinaps fonksiyonu ve sinaptik iletimde önemli rolleri olabileceği fikri güçlenmektedir. Fakat, proteinlerin yokluğunda sinaptik iletim, sinaps büyüklüğü ve şeklinin nasıl etkilendiği bilinmemektedir. Bu soruların cevaplanabilmesi için ilgili genler Drosophila melanogaster'de motor nöronlarında ve tüm beyinde doku bazlı susturulmuştur. Bahsi geçen genlerin moto-nöronal ve pan-nöronal olarak susturulması sonucunda Drosophila 3. instar larva nöromüsküler kavşağında bulunan brp ve glutamat reseptör miktarlarının kontrol grubuna göre arttığı/azaldığı yani sabit olmadığı  gözlenmiştir. 
Sonucun sirkadiyen ritim ile ilişkili olup olmadığının anlaşılması için yabanıl tip sinek larvasının zamana baglı olarak disekte edilmesi sonucunda brp ve glutamat reseptörünün zamana baglı olarak osile ettiği ve bu osilasyon paterninin literatürde bahsi geçen sinek lokomotor aktivitesine benzediği gözlenmiştir. Son olarak NALCN Drosophila ortoloğu na motonöronal olarak susturulup zamana bağlı brp ve glutamat reseptör miktarı incelendiğinde proteinlerin zamana bağlı olarak osile ettiği, fakat osilasyonun kontrol grubuna göre kaydığı gözlenmiştir

Abstract:
One subgroup of rare metabolic diseases, synaptopathies, add up to considerable amounts of rare metabolic diseases, yet the lack in the knowledge in underpinnings leading to synaptic dysfunction results in lack of appropriate diagnostics and interventions in this subgroup. Our group has identified several patients that harbor mutations in genes that hold the potential for being important players of synapse  function, UNC79 and MBOAT7 being two of them. 
UNC79 is one of the accessory subunits of a sodium leak channel, NALCN, which is composed of NALCN, UNC80 and UNC79 subunits. It is widely expressed in  the brain and known to inhabit neuropils in Drosophila. Its expression pattern is in parallel to brp, a conserved active zone component renown to give the shape to the active zones. MBOAT7, on the other hand, is an enzyme that attaches preferentially arachidonic acid to sn-2 positions of phosphoinositide (PI) in specifically brain tissues of mammals. PIs, are renown players of synapse function. 
In the light of information given above, we aimed to reveal the effects of UNC79 and MBOAT7 knockdowns on synapse size, number and morphology via combination of molecular biology and imaging techniques by using fruit fly as a model organism.
Pan-neuronal and motoneuronal silencing of NALCN channel components -NALCN- UNC79, and UNC80- and motoneuronal silencing MBOAT7 ortholog in Drosophila 3rd instar larvae resulted in discrepancies in both brp and glutamate receptor levels and morphologies compared to control groups. Besides, pan-neuronal silencing MBOAT7 ortholog has no effect on brp and glutamate receptor intensities.
Dissecting wild-type larvae in a time-dependent fashion showed that brp and glutamate receptor levels oscillate in 1b NMJs that protrude 4th muscle of 3rd instar larvae. Diet had a drastic effect on not only brp and glutamate receptor levels but also on brp and glutamate receptor spot shapes proving that environmental and intrinsic factors are important in oscillatory pattern.
Dissecting motoneuronally silenced na  in a time dependent fashion showed a shift in brp and glutamate receptor intensities compared to control groups.