Resveratrol ve Sirtuin1'in p53(+/+) ve p53(-/-) kolon kanser hücreleri üzerindeki etkilerinin incelenmesi
The investigation of the effects of resveratrol and Sirtuin1 on p53(+/+) and p53(-/-) colon carcinoma cells
Yazar: GÜNEŞ ÖZEN
Danışman: PROF. DR. AYŞE SEMRA KOÇTÜRK
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Genler-P53 = Genes-P53 ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Protein-P53 = Protein-P53 ; Resveratrol = Resveratrol ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Sirtuin = Sirtuin ; Sirtuin-1 = Sirtuin-1

Özet:
Giriş: Kanser birden fazla kompleks moleküler değişikliklerden oluşan heterojen bir hastalıktır. Resveratrol, 70'ten fazla bitki türü tarafından sentezlenen doğal bir polifenoldür. Günümüzde resveratrolün anti-kanserojen etki gösterdiği ve çeşitli kanser hücreleri üzerinde anti-proliferatif ve apoptozu indükleyici etkilerinin olduğu bilinmektedir. Resveratrol ile ilgili yapılan son araştırmalar incelendiğinde; resveratrolün bir histon deasetilaz enzimi olan sirtuin1(SIRT1) aktivitesini arttırdığı belirlenmiştir. SIRT1'in tümör baskılayıcı molekül olan p53'ü deasetile ettiği de bilinmektedir. p53 mutasyonu kanser olgularının %50'sinden fazlasında görülmektedir; ancak teröpatik ajanların veya polifenollerin kanser hücrelerindeki etkileri çok farklı olabilmektedir. Bunun yanı sıra, kolon kanser hücrelerinde artmış SIRT1 ekspresyonu olduğu da bildirilmektedir. Resveratrolün SIRT1 ekspresyonu ve sinyal ileti yolakları üzerindeki etkileri düşünüldüğünde, kolon kanser hücrelerinin p53 mutasyonu taşıyıp taşımadığı önem kazanmaktadır. Yapılan literatür çalışmasında resveratrolün p53 varlığı ve yokluğunda kolon kanser hücrelerindeki sinyal ileti yolaklarına etkileri ve SIRT1 ilişkisine yönelik yeterli bilgi bulunamamıştır.
Amaç: Bu çalışmada amacımız, p53(+/+) ve p53(-/-) kolon kanser hücrelerinde resveratrolün SIRT1 aktivasyonu ve inhibisyonu şartlarında hücre canlılığı, apoptotik hücre ölümü ve çeşitli sinyal ileti yolakları üzerindeki etkilerinin incelenmesidir.
Materyal ve Yöntem:  HCT116p53(+/+) ve HCT116p53(-/-) kolon kanser hücrelerinde resveratrolün ve SIRT1 inhibitörü olan sirtinolün hücre canlılığına etkisi ve IC50 dozları WST-1 analizi ile değerlendirildi. IC50 dozlarında resveratrol ve sirtinol ile 24 ve 48 saat inkübasyon süresinde gerçekleşen hücre ölüm tipi (apoptotik/nekrotik) akış sitometrik Annexin-V/PI yöntemi ile incelendi. SIRT1 enzim aktivitesi fluorometrik aktivite kiti kullanılarak değerlendirildi. Hücre hatlarında SIRT1 ve p53 protein ekspresyon düzeyleri Western Blot yöntemi ile belirlendi. TGFβ, WNT, p53, NFκB ve JAK/STAT yolaklarında bulunan 29 adet gen ekspresyon değişimi Gerçek Zamanlı PZR Yöntemi ile tüm deney gruplarında incelendi. Elde edilen veriler Student's t testi ile istatistiksel analizi yapılarak p<0.05 anlamlılık düzeyinde resveratrolün sinyal ileti yolaklarındaki gen ekspresyonları üzerindeki etkileri, SIRT1 aktivitesi ve p53 bağımlılığı değerlendirildi.
Bulgular: HCT116p53(+/+) ve HCT116p53(-/-)  kolon kanser hücrelerinde resveratrolün IC50  değeri 48 saat için 60 µM olarak belirlendi. HCT116p53(+/+) hücrelerinde belirlenen, IC50 dozundaki resveratrolün apoptotik hücre ölüm yüzdesi akış sitometrik analizde 24 saatte %34.9; 48 saatte %45.7 ve HCT116p53(-/-) hücrelerinde apoptotik hücre yüzdesi 24 saatte %27.4 oranında, 48 saatte %40 oranında saptandı. SIRT1 aktivite analizine göre, HCT116p53(+/+) hücrelerinde sirtinol uygulaması ile SIRT1 inhibisyon dozu ve süresi sırasıyla 80 µM ve 24 saat olarak belirlendi. HCT116p53(+/+) hücrelerinde yapılan hücre canlılık analizinde, 24 saat 60 µM resveratrol uygulaması ile %40.4 oranında, sirtinol ve resveratrolün ardışık 24'er saat uygulanması ile hücre canlılığında %57.3 oranında azalma belirlendi. Aynı şekilde, HCT116p53(-/-) hücrelerinde 24 saat resveratrol uygulaması ile %43.6 oranında, ardışık uygulama ile canlılıkta %59.6 oranında azalma belirlendi. HCT116p53(+/+) hücrelerinde resveratrol uygulaması ile %27.6, 24'er saat sirtinol ve resveratrolün ardışık uygulanması ile %33.4 oranında apoptotik hücre yüzdesi belirlendi. Aynı şekilde HCT116p53(-/-) hücrelerinde, resveratrol uygulaması ile %17.9, ardışık uygulama ile %18.2 oranında apoptotik hücre yüzdesi saptandı. 
Sirtinol ve resveratrolün ardışık olarak uygulandığı HCT116p53(+/+) hücrelerinde SIRT1 protein ekspresyon düzeyinin kontrole göre p<0.05 düzeyinde anlamlı olarak azaldığı belirlendi. HCT116p53(-/-) hücrelerinde ise anlamlı bir fark saptanmadı. Deney gruplarında yapılan gen ekspresyon analizleri sonucunda resveratrolün, kolon kanser hücrelerinin p53 mutasyonu ve SIRT1 aktivite düzeyine bağlı olarak proliferatif ve apoptotik etki gösterebilen birçok gen üzerinde istatistiksel olarak anlamlı değişim oluşturduğu saptandı.
Sonuç: Yapılan bu araştırma ile resveratrolün (60 µM) HCT116p53(+/+) ve HCT116p53(-/-)  kolon kanser hücrelerinde hücre canlılığını etkilediği ve apoptotik hücre ölümüne yol açtığı saptanmıştır. Bununla birlikte araştırmamızın verileri hücrelerin p53 mutasyonu ve SIRT1 aktivite düzeylerine göre değerlendirildiğinde; resveratrol (60 µM) uygulamasının hem apoptotik etki hem de gen ekspresyonu düzeyinde farklı değişimlere neden olduğu ilk kez belirlenmiş oldu. Kolon kanser hücrelerinde resveratrolün p53 ve SIRT1 aktivitesine göre proliferatif ve/veya apoptotik etki gösterebileceğini öngörmekteyiz. Sonuç olarak kolon kanser hastalarında bilinçsiz resveratrol kullanımının farklı etkiler yaratabileceğini öngörmekteyiz.

Anahtar Sözcükler: Kolon kanseri, Resveratrol, SIRT1, p53, Apoptoz, Sinyal ileti yolakları

Abstract:
Introduction: Cancer is a disease that includes heterogenic and complex molecular changes. Resveratrol is a natural polyphenol synthesized by more than 70 plant species. Nowadays, anti-carcinogenic effects of resveratrol, as well as anti-proliferative and apoptosis inducing effects have been proved in a variety of cancer cells. When recent studies on resveratrol are reviewed, activation of SIRT1, a histone deacetylase enzyme called as sirtuins has been shown. It has been known that SIRT1 has a role on deacetylation of p53.  In order to in more than 50% of cancer cases have p53 mutation responses of a cancer cell to therapeutic agents or polyphenols could be very different. On the other hand, increased expression of cytosolic SIRT1 has been reported in colon cancer cells. Considering the effects of resveratrol on SIRT1 expression, the influence of the signal transduction pathways in the presence or absence of p53 of colon cancer cells is gaining importance. However we couldn't find illustrative knowledge in the literature about the effects of resveratrol on signal transduction in the presence or absence of p53 and also interaction with SIRT1. 
Aim: In the present study, we aim to investigate the effects of resveratrol on cell viability, apoptotic cell death levels and changes on gene expression of various signal transduction pathways under activated and inhibited SIRT1 conditions in p53(+/+) and p53(-/-) colon carcinoma cells. 
Material and Method: IC50 doses of resveratrol and sirtinol, which is a SIRT1 inhibitor, were determined by analysis of WST-1 in HCT116p53(+/+) and HCT116p53(-/-)  colon carcinoma cells. The cell death type (apoptotic/necrotic) of resveratrol and sirtinol applications in IC50 dosages was determined by flow cytometric Annexin/PI method for 24 and 48 hours. The activity of SIRT1 enzyme was evaluated by fluorometric activity assay kit. SIRT1 and p53 protein expressions were examined by western blot analyses. Real time PCR analyses were used to evaluate the changes of 29 gene expressions of TGF-β, WNT, p53, NF-κB and  JAK/STAT signal transduction pathways in all experimental groups. The effects of resveratrol on signal transduction pathways; SIRT1 activation and p53 dependency were evaluated by statistical analyses of obtained data. 
Results: IC50 level of resveratrol was found as 60 µM for 48 hour in HCT116p53(+/+) and HCT116p53(-/-) cell lines. Apoptotic cell death ratio was found as 34.9% for 24 hour and 45.7% for 48h and 27.4% for 24h and 40% for 48h in HCT116 p53(+/+)  and  HCT116p53(-/-) cell lines respectively. The inhibition dosage and timing of sirtinol application were determined by SIRT1 enzyme activity assay and found as 80 µM and 24 hour respectively. Decreases of cell viability for HCT116p53(+/+)  cell line was found as  40.4% for 24h after resveratrol treatment, and % 57.3 for 24h resveratrol treatment after pre-treatment with sirtinol for 24h. Decreases of cell viability for HCT116p53(-/-)  cell line was found as % 43.6 for 24h after resveratrol treatment, and  59.6% for 24h resveratrol treatment after pre-treatment with sirtinol for 24h. Apoptotic cell death ratios were determined as 17.9% for resveratrol treatment and 18.2% for consecutive treatments of sirtinol and resveratrol for 24h. Although in HCT116p53(+/+)  cell line SIRT1 protein expression levels were found statistically lower (p<0.05) than the control group in sirtinol pretreated group, statistically significant results have not been found for HCT116p53(-/-) cell line (p>0.05). The results of the gene expression analysis in all experimental groups showed that resveratrol has statistically significant capacity to change on multiple gene expressions which have proliferative or apoptotic capacity, depend on the p53 and SIRT1 activity of the cell lines.
Conclusion: This research has revealed that resveratrol (60µM) causes decrease in cell viability and increase in apoptotic cell death in HCT116p53(+/+) and HCT116p53(-/-) cell lines. However our research for the first time proved that the effects of resveratrol on some of gene expressions and apoptosis ratios could change by the p53 mutation and SIRT1 activity level of HCT116 colon carcinoma cells. We proposed that resveratrol might show proliferative and/or apoptotic effects according to p53 and SIRT1 activity in colon cancer cells. Consequently, we predicted that unconscious usage of resveratrol in colon cancer patient might cause adverse effects.

Key Words: Colon Cancer, Resveratrol, SIRT1, p53,  Apoptosis, Signal Transduction Pathways