Gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss,W.) deneysel olarak oluşturulan lactococcosis' in bakteriyolojik ve serolojik metotlarla teşhisi
A diagnostic study of experimentaly induced lactococcosis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, W.) by bacteriological and serological techniques
Yazar: ÇİĞDEM ÜRKÜ
Danışman: PROF. DR. GÜLŞEN TİMUR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: Aglütinasyon testleri = Agglutination tests ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Floresan antikor tekniği = Fluorescent antibody technic ; Lactococcus = Lactococcus ; Serolojik testler = Serological tests

Özet:
Bu çalışma, yerli ve referans Lactococcus garvieae suşları ile deneysel olarak enfekte edilen genç gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss, W.) oluşturulan lactococcosis' in bakteriyolojik ve serolojik tekniklerle teşhisini ve histopatolojik konfirmasyonunu yapmak için yürütülmüştür. Bu amaçla konvensiyonel bakteriyolojik teşhis metodları ile hızlı tanı kitleri; lam aglütinasyon, İndirekt Floresan Antikor Tekniği (IFAT) ve Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) gibi serolojik testler ve histopatolojik yöntemler kullanılmıştır.Bu çalışmada İstanbul Üniversitesi, Sapanca İçsu Ürünleri Üretimi Araştırma ve Uygulama Biriminden temin edilen 65 ±5 gr ağırlığındaki 100 adet gökkuşağı alabalığı Fakültemizin Yetiştiricilik Anabilim Dalı Hastalıklar Programına ait adaptasyon tanklarına yerleştirilmiş ve 7 gün boyunca adaptasyona tabi tutulmuştur. Adaptasyon tankından rastgele seçilen 6 adet balığın otopsileri yapıldıktan sonra bakteriyolojik kontrol amacıyla böbrek, dalak ve karaciğer gibi bakteriyolojik inokülasyonlardan TSA besiyerine ekim yapılmıştır. Sağlıklı 75 adet balık 3 gruba ayrılmış, 25' şer adet alabalık denemede kullanılan 1 m çapında 70 cm derinliğindeki üç adet sirküler fiberglas tanka yerleştirilmiştir. Birinci deneme grubundaki balıklara 107 hücre/ml yerli L. garvieae suşu, ikinci deneme grubundaki balıklara 107 hücre/mll referans L. garvieae suşu üçüncü kontrol grubundaki 20 adet balığa 0. 1 ml steril PBS intraperitonal olarak enjekte edilmiştir. Deneme boyunca tanklardaki suyun sıcaklığı 17 ± 1 ºC olarak ayarlanmıştır.Enjeksiyonun 5. gününde deneysel olarak enfekte edilen her iki gruptaki balıklarda letarji ve iştahta azalma gözlenmiştir. 5. günden sonra eksternal olarak gözlerde bilateral ekzoftalmus, hemoraji ve korneal opaklaşma, derinin renginde koyulaşma, yüzgeç diplerinde hemorajiler, internal olarak hava kesesi, sindirim kanalı ve viseral yağ dokuda yaygın hemoraji, karaciğerde renkte solgunluk ve hemoraji, dalakta büyüme gözlenmiştir.Histopatolojik olarak, her iki deneme grubunda karaciğer, böbrek ve dalakta multifokal liquefactive nekroz odakları ve haemopoietik dokuda boşalma; solungaç filamentlerinde hemoraji, talengectiaisis, solungaç filament epitel hücrelerinde hiperplazi ve gözlerde retina altında hemorajik odaklar görülmüştür. Doku Gramı ile boyanan bağırsak preparatlarında lamina propria da Gram pozitif bakteriler tespit edilmiştir.Enfekte kan serumunda L. garvieae' nin her iki suşuna karşı antikor oluşumu lam aglütinasyon, IFAT ve ELISA testleri ile tespit edilmiştir. Kuvvetli aglütinasyon lam aglütinasyon testiyle enjeksiyonun 4. haftasında elde edilen kan serumunda tespit edilirken patojen bakteri enjeksiyonun 5. gününde enfekte balıkların karaciğer, böbrek, göz ve dalaklarında tespit edilmiştir. Kan serumundaki spesifik antikorların varlığı enfeksiyonun 4. haftasında lam aglütinasyon, IFAT ve ELISA testleri ile kanıtlanmıştır.Sonuç olarak, lactococosis lam aglütinasyon, IFAT, ELISA tesleri kullanılarak teşhis edilmiştir. Bu serolojik teknikler konvensiyonel bakteriyolojik metotlarla karşılaştırıldığında daha kısa sürdüğü tespit edilmiştir.

Abstract:
This study was carried out in young rainbow trouts (Oncorhynchus mykiss, W.) experimentally infected with local and reference Lactococcus garvieae strains to diagnose lactococcosis by bacteriological and serological tecniques and to confirm by histopathology. For this purpose, conventional bacteriological diagnostic methods and rapid diagnostic kits, slide agglutination, Indirect Fluorescent Antibody Technique (IFAT) and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) tests and histological methods were used.In this study, young 100 rainbow trouts weighing 65 ± 5 gr obtained from Istanbul University Sapanca Freshwater Fish Production Research and Applied Unit were replaced into adaptation tanks belonging Diseases Section of Aquaculture Department and were adapted for a period of 7 days. Six randomly selected fish from adaption tanks was autopsied then bacteriological inoculation from liver, kidney and spleen were streaked onto TSA medium for bacteriological control. 75 healty fish were divided into 3 group and each 25 rainbow trouts were placed into 3 circular fiberglass tanks, 1 m in diameter and 70 cm depth. The first experimental group fish were injected with 107 cells/ml of local L. garvieae strain, second experimental group fish were injected with 107 cells/ml of reference L. garvieae strain also third control group including 20 fish were injected with 0.1 ml sterile PBS. The temperature of water in the tanks was adjusted at 17 ± 1 Cº during the experiment period.On the fifth day of injection, both group of experimentally infected rainbow trout were showed lethargy and loss of appetite. After the fifth day, externally bilateral exophthalmia with haemorrhagie and corneal opacification, darkening of the skin and haemorrhages at the base of fins and internally extensive haemorrhages in the gut wall, swim bladder and visceral adipose tissue, pale liver with petechial haemorrhagie and enlarged spleen were observed.Histopathologically, in the expermental groups liquefactive necrosis and reduced of interrenal haemopoietic tissue in the spleen and kidney; liquefactive necrosis in the liver; in the gill filaments hemorrhagie, telangiectasis and hyperplasia of the gill filament; sub-retinal haemorrhagie in the eyes were observed. Gram positive bacteria were present in the lamina propria of intestine stained with Tissue Gram.The antibody formation against two strains of L. garvieae has been demonstrated in the infected blood serum by the slide agglutination, IFAT and ELISA tests. While strong agglutination were observed in the blodd serum obtained on the fourth week of injection by slide agglutination test, the pathogen bacteria were demonstrated in the eye, spleen, kidney and liver of the moribund fish by IFAT from after fifth day of injection. The presence of spesific antibody in the blood serum were demonstrated by slide agglutination, IFAT and ELISA test from moribund fish four week after injection.As a result, lactococcosis was diagnosed using by namely as slide agglutination, IFAT and ELISA. This serological tecniques have been performed in a short time when compared with conventional bacteriologic metods.