Anti-HBc pozitif hastalarda immuno-real time PCR ile HBsAg saptanması ve ?a? determinantı mutasyonlarının incelenmesi
Detection of HBsAg in isolated anti-HBC positive patients with immuno-real time PCR and investigation of ?a? determinant mutations.
Yazar: MERT AHMET KUŞKUCU
Danışman: PROF. DR. KEMAL ALTAŞ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Hepatit B Virüsü (HBV), Hepadnaviridae ailesi üyesi zarflı bir DNA virüsüdür. Dünyada 2 milyar kişinin HBV ile infekte olduğu tahmin edilmektedir. Taşıyıcıların %20-25'inde siroz ve hepatosellüler karsinom dahil olmak üzere kronik karaciğer hastalıkları gelişebilmektedir. HBV'de de diğer virüsler gibi mutasyonlar oluşabilmektedir. Bu mutasyonlar immuno dominant ?a? antijenik determinantını da içine alan bölgelerde oluşabilmektedir. Bu mutantlar, aşılanmış kişilerde, HBIG tedavisi almış kişilerde ve kronik hepatit B hastalarında gösterilmiştir. Bazı hastalarda bu mutasyonlar, anti-HBs antikorlarıyla bir arada bulunabilirler.Bu çalışmada izole anti-HBc pozitif hastalarda HBsAg'yi ?Immuno-Real Time PCR? yöntemi ile saptamayı ve ?a? antijenik determinantının mutasyonlarını belirlemeyi amaçladık. Bu amaçla, HBsAg'yi daha duyarlı saptayabilecek yeni bir ?Immuno-Real Time PCR? protokolünü optimize ettik. Üç ana örnek grubu incelendi; serolojik olarak hepatit B pozitif grup (30 örnek), hepatit B negatif grup (30 örnek) ve izole anti-HBc pozitif grup (24 örnek). Optimize ettiğimiz, ?Immuno-Real Time PCR? protokolünün analitik duyarlılığını klasik ELISA (200-400 pg/ml) yönteminden 20-40 kat daha (10 pg/ml) yüksek bulduk. Testin yapılan optimizasyon ve kontrol çalışmalarından sonra, tanısal kullanım açısından testin pozitif prediktif değerini %100, negatif prediktif değerini %100, duyarlılığını %100 ve özgüllüğünü %100 olarak bulduk. ?Immuno-Real Time PCR? yöntemi için anti-HBs kaplı manyetik boncuklar kullandık. HBV DNA değerlerini Real Time PCR yöntemi ile belirledik. ?a? antijenik determinantı mutasyonları için izole anti-HBc pozitif örneklerden HBV DNA pozitif olanların, DNA dizi analizi ile incelendi. İzole anti-HBc pozitif örneklerde HBV DNA pozitif olanların (%33) biri dışında (bu örnekte prematür S proteinine neden olan stop kodon oluşum mutasyonu vardı) tümü ?Immuno-Real Time PCR? yöntemi ile HBsAg pozitif bulundu. Erken ?stop? kodonu mutasyonu saptanan örnek dışındaki örneklerde . ?a? antijenik determinantında antijenik değişikliklerle ilişkili olabilecek mutasyon saptanmadı. Sonuç olarak optimize ettiğimiz ?Immuno-Real Time PCR? yöntemini ELISA testlerinden daha duyarlı bir yöntem olarak bulunurken ?a? antijenik determinantında dünyada ilk olarak C137 erken ?stop? kodon mutasyonu saptadık.

Abstract:
HBV is a double-stranded, enveloped DNA virus of the Hepadnaviridae family. It is estimated that around 2 billion people are infected with the hepatitis B virus (HBV). Approximately 20% to 25% of carriers develop chronic liver disease, including cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Due to the low fidelity of the polymerase, the high replication rate, and overlapping reading frames, mutations occur throughout the HBV genome, including the immunodominant ?a? determinant of the viral envelope gene, which result with HBsAg mutants. These mutants have been described in HBV vaccine and/or hepatitis B immune globulin recipients, and in patients with underlying chronic conditions. In some patients HBsAg and anti-HBs may be found simultaneously.In this study we aimed to detect HBsAg in isolated anti-HBc positive patients with ?Immuno-Real Time PCR? and investigate ?a? determinant mutations. For this purpose we optimized a new ?Immuno-Real Time PCR? for sensitive detection of HBsAg. Three groups were included to the study: Serologically hepatitis B positive group (30 samples), Serologically hepatitis B negative group (30 samples) and isolated anti-HBc Positive Group (24 patients). The analytic sensitivity of ?Immuno-Real Time PCR? had been estimated as 10 pg/ml. This was 20-40 fold higher than those of the available commercial ELISA kits. PPV, NPV, sensitivity and specificity were all 100 %. Anti-HBs coated magnetic beads were used in ?Immuno-Real Time PCR? method. HBV DNA levels were determined with quantitative Real Time PCR. ?a? determinant mutations in isolated anti-HBc and HBV DNA positive samples were investigated using DNA sequencing. All but one patient with isolated anti-HBc were positive for HBsAg and one of them harbored a premature stop codon leading truncation in S protein. As a conclusion we found ?Immuno-Real Time PCR? is more sensitive than commercially available ELISA assays. C137 premature stop codon mutation in ?a? determinant is first time defined in this study.