Laktoperoksidaz enziminin sığır sütünden afinite kromatografisi tekniği ile saflaştırılması
Purification of lactoperoxidase enzyme from bovine milk by affinity chromatography technique
Yazar: ALİ ATASEVER
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Laktoperoksidaz (LPO) (E.C.1.11.1.7) memelilerin sütünde, gözyaşında ve tükürüğünde bulunan prostetik grup olarak hem grubu içeren bir glikoproteindir. Bu çalışmada sığır laktoperoksidaz (LPO) enzimi literatürde bilinen mevcut yöntemler haricinde, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B matriksi üzerine uzantı kolu olarak tirozin takılarak ve ligand olarak enzimin inhibitörleri sülfanilamid ve sülfapiridin kullanılarak sentezlenen kolon materyallerinde enzimin afinite kromatografisi tekniği ile saflaştırılması yapıldı. 200 ml yağı alınmış sığır sütü amberlite CG 50 H+ reçinesine tatbik edildi ve elde edilen homojenatın 50 ml'si hazırlanan afinite kolonuna verildi. Saflaştırma basamakları sonucunda sülfanilamid bağlı kolonla 200 ml sütten 0,77 mg LPO, %62,3 verimle 409 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve tek bant bulundu (80 kDa). Enzim aktivite ölçümünde pH:6'da 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonik asit) (ABTS) kromojenik substratı kullanıldı. Saflaştırılan LPO'nun 20oC'de pH:6'da KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,14 mM ve 0,55 ?mol/min. ml olarak belirlendi. Hazırlanan afinite kolonunda bağlanma kapasitesi 4oC'de pH:8,6 ve 0,25 M iyonik şiddet konsantrasyonunda 395 mg/g jel olarak belirlendi. Ligand olarak kullanılan sülfanilamid ve sülfapiridin inhibitörleri yarışmalı inhibisyon göstermekte olup, I50 değeri sırasıyla 8,48.10-4 ve 2,27.10-4 M olarak, Ki değerleri ise sırasıyla 3,57.10-5 M ve 6,50.10-5 olarak tespit edildi.

Abstract:
Lactoperoxidase (LPO; E.C.1.11.1.7) is a glicoprotein, present in mammalian milk, tear and saliva, which contains prostetic heme group. In this study, bovine milk lactoperoxidase (LPO) enzyme was achieved to be purified by a novel affinity chromatography, prepared by using CNBr-activated Sepharose-4B as a matrix, L-tyrosine as a spacer-arm and inhibitors, sulfanilamide and sulphapyridine as the ligands. 200 ml bovine milk was applied to amberlite CG 50 H+ resign after the oil was removed, and 50 ml of the obtained homogenate was applied to the prepared affinity column. After the purification steps, 0.77 mg LPO was purified 409-fold in a yield of 62.3% by means of sulfanilamide column. The purity of the enzyme, purified by means of the synthesized affinity gel, was checked by SDS-PAGE, and a single band was detected corresponding to 80 kDa. 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin?6-sulfonic acid) (ABTS) chromogenic substrate was used to in measurement of the activity. KM and Vmax values of the purified enzyme were determined to be 0.14 mM and 0.55 ?mol/min. ml, respectively, for pH:6 at 20oC. The binding capacity of the affinity gel was determined to be 395 mg/g gel at 4oC, pH:8.6 and 0.25 M ionic strenght conditions. The inhibitors, sulfanilamide and sulphapyridine, used as ligands, exhibited competitive inhibition with the I50 values of 8.48x10-4 and 2.27x10-4 M, and Ki constants of 3.57x10-5 M and 6.50x10-5 respectively.