Schizosaccharomyces pombe'de homolog olmayan kromozomlar arasında yönlendirilmiş translokasyon çalışmaları
Studies on directed translocation between non-homolog chromosomes in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: BURÇİN ALTUN
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL TOPAL SARIKAYA ; PROF. DR. CARLO V. BRUSCHİ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Delesyon = Deletion ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic ; Schizosaccharomyces pombe = Schizosaccharomyces pombe ; Transformant = Transformant ; Transformasyon-genetik = Transformation-genetic ; Translokasyon-genetik = Translocation-genetics

Özet:
Ökaryotik organizmalar, pek çok hastalığın (kanser, down sendromu, kısırlık vb.) temelinde yatan ve kromozom yeniden düzenlenmesinde rol oynayan translokasyon olayında çok fazla ve karmaşık moleküler mekanizmalara sahiptir. Translokasyonun moleküler mekanizması ile ilgili çeşitli çalışmalar yapılmaktadır fakat yönlendirilmiş translokasyon ilk kez İtalya'da bulunan?International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology? (ICGEB) Enstitüsü Maya Moleküler Biyoloji Laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. ICGEB Maya Moleküler Biyoloji Laboratuarında, Saccharomyces cerevisiae'de önceden belirlenen DNA noktalarında homolog olmayan kromozomlar arasında yönlendirilmiş kromozom translokasyonu gerçekleştirilmiş ve yöntem ?Bridge Induced Translocation? (BIT) olarak isimlendirilmiştir.Bu proje, translokasyon sonrasında oluşan moleküler olayların aydınlatılmasına yönelik olarak moleküler düzeyde memeli hücrelerine olan benzerliğinden dolayı model organizma olarak yaygın bir şekilde kullanılan Schizosaccharomyces pombe organizmasında yönlendirilmiş translokasyon gerçekleştirmeyi amaçlamaktadır. Böylece insan hastalıklarıyla ilgili çok sayıda genin homologlarını taşıyan S. pombe organizması ile elde edilecek translokantın analizi sonucunda hastalıkların moleküler mekanizmasının aydınlatılmasına olanak sağlanmış olacaktır.Çalışmada S. pombe'nin yabani ırkı model organizma olarak kullanıldı. Translokasyonu gerçekleştirmek için kullanılan DNA kasetleri farklı iki kromozoma (kromozom 1 ile kromozom 3) homolog iki farklı dizi (yaklaşık 90bç-800bç arasında değişen boyutlarda) ve kanamisin işaret geni içerecek şekilde hazırlandı. Bu homolog diziler translokasyonu gerçekleştirmede görevli olacak dizilerdir ve translokasyonun kırılma noktasını oluşturmaktadırlar. Tez kapsamında doğrusal DNA kaseti PCR ile üretilip, S. pombe hücrelerine aktarıldı ve ardından kanamisin dirençlilik özelliği kontrol edildi. Daha sonra koloni PCR tekniği ile transformant koloniler kontrol edildi.Bu çalışma ile hedeflenen model translokant S. pombe elde edilememiştir. Translokasyon kasetinin sadece 3. kromozoma homoloji gösteren bölgesinin giriş yaptığı koloni PCR tekniği ile saptanmıştır fakat 1. kromozoma homoloji gösteren bölgesi istenilen yerde bulunamamıştır. Ayrıca seçici işaret genine özgü tasarlanan kanamisin probu ile gerçekleştirilen hibridizasyon sonrasında transformantların yaklaşık %50'sinde kasetlerin hem hedef bölgeye hem de 2. kromozoma giriş yapması bu çalışmanın diğer bir önemli bulgusudur. Kasetlerin hedefi olmadığı halde 2. kromozomu tercih etmelerinin nedenlerinin araştırılması bu çalışmanın ortaya çıkardığı bir sonuçtur. Literatürde 2. kromozomun bu özelliği ile ilgili herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. S. pombe hücrelerinde yönlendirilmiş translokasyon çalışmaları bu konuyla ilgili başlangıç çalışması olup ilerde farklı kromozom ile farklı bölgeler arasında farklı uzunlukta homoloji kullanılarak translokant model S. pombe hücreleri elde etme çalışmalarına devam edilecektir.

Abstract:
Eukaryotic organisms have so many and complex molecular mechanisms that underlie many diseases and take role in chromosomal rearrangement in translocation occasion. There are so many studies on molecular mechanism of translocation. However first directed translocation was achieved by Yeast Molecular Laboratory in ?International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology? (ICGEB) in Italy. In ICGEB Yeast Molecular Laboratory, non-homolog directed translocation was performed with DNA locus was chosen randomly before in Saccharomyces cerevisiae and the method was called ?Bridge Induced Translocation? (BIT).The main goal of this project is to generate directed translocation for elucidating molecular events after translocation by using Schizosaccharomyces pombe as a model organism which is used frequently in molecular studies because of its similarities to mammalian cells. Obtaining a model translocant S. pombe will be an important work for medical science because S. pombe has a lot of homolog genes that are responsible for human diseases. So cellular and molecular differences, which are appeared after chromosomal rearrangement, can be contrasted between transformant and parental strains by directed translocation. And also the effects mechanisms of translocations can be clarified.In this study, wild type of S. pombe was used. A special cassette was prepared with kanamycin and the cassette contained homology to two different chromosomes (chromosome 1 and chromosome 3) with two different sequences (approximately 90bp-800bp) for generating translocation. These homolog sequences are responsible to generate translocation and they are breakpoints of translocation. In content of this thesis, linear DNA cassette was produced by PCR and transported to S .pombe. Then kanamycin resistance features were controlled. Subsequently, colony PCR was performed to control for correct integration.Model translocant S. pombe, what the aim of the project is, could not be obtained. One side of translocation cassette integrated to just one chromosome (Chromosome 3) and another side of translocation cassette which aims to integrate to chromosome 1, could not be found where it is. Also after hybridization of transformant cells? chromosomes with the prob that designed specific to marker gene, in some transformant colonies (50% of colonies), translocation and knock-out cassettes were detected on two chromosomes, one of chromosomes is targeted chromosome but another one, chromosome 2, isn?t targeted. This result is a new research subject to understand chromosome 2?s structure and chemicals features that allow the unspecific cassette integration. In the literature no studies were found about this interesting result. Directed translocation studies with S. pombe is just beginning studies of this subject and in the future, creating model translocant S. pombe experiments will be continued by using different chromosomes, different locations and different homology lengths.