Metavinkülin kardiyomiyopati mutantlarının rekombinant olarak üretilmesi, saflaştırılması ve biyofiziksel karakterizasyonu
Recombinant generation, purification and biophysical characterization of metavinculin cardiomyopathy mutants
Yazar: HANDE İPEK YETKE
Danışman: PROF. OYA ORUN ; DOÇ. DR. ZEYNEP ASLIHAN DURER
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Aktinler = Actins ; Kardiyomiyopatiler = Cardiomyopathies ; Metavinkülin = Metavinculin ; Proteinler = Proteins ; Rekombinasyon = Recombination ; Vinkülin = Vinculin

Özet:
Amaç: Metavinkülinin ek bölgesinde meydana gelen mutasyonlar kardiyomiyopatiye neden olur. Bu tez çalışmasının amacı metavinkülin kardiyomiyopati mutantlarını rekombinant olarak üretmek, kromatografik yöntemlerle saflaştırmak ve biyofiziksel karakterizasyonunu yapmaktır.
Gereç ve yöntem: Hedeflenen proteinler rekombinant DNA teknolojisi yöntemi ile ifade edildi. Saflaştırmak için iyon değişimli kolon kromatografisi kullanıldı. Proteinlerin termal kararlılıklarının belirlenmesi için diferansiyel tarama fluorometrisi yöntemi kullanıldı. Dinamik ışık saçılımı yöntemi ile hidrodinamik çapları ve agregasyon eğilimleri belirlendi.
Bulgular: Hedeflenen proteinler başarılı bir şekilde ifade edildi ve %95 saflık oranında, yeterli miktarda elde edildi. Yabanıl tip metavinkülin ile DelLeu metavinkülinin termal kararlılıklarının benzer, R975W metavinkülinin ise her iki proteinden daha düşük olduğu tespit edildi. Her üç proteinin monomerik hidrodinamik çaplarının benzer olduğu tespit edildi. Agregat oluşturma eğilimleri kıyaslandığında ise yabanıl tip ile mutantlar arasında farklılıklar olduğu gözlemlendi. Sonuç: Bu tez çalışmasıyla yabanıl tip metavinkülin ile mutantlar arasındaki yapısal farklılıklar ortaya konmuştur. Literatüre ek olarak DelLeu metavinkülinin termal kararlılığı belirlenmiştir. Ayrıca hedeflenen tüm proteinlerin monomer olarak hidrodinamik çapları ve agregat oluşturma eğilimleri kıyaslanmıştır. Tüm bu sonuçlar, yabanıl tip metavinkülin ve mutantlarının kardiyomiyopati ve diğer hastalık mekanizmalarındaki rollerinin anlaşılmasına katkı sağlayacaktır.Anahtar kelimeler: Metavinkülin, vinkülin, aktin, kardiyomiyopati, protein saflaştırma

Abstract:
Materials and methods: Targeted proteins were expressed by recombinant DNA technology method. Ion exchange column chromatography was used for purification. Differential scanning fluorimetry method was used to determine the thermal stability of the proteins. Hydrodynamic diameters and aggregation tendencies were determined by dynamic light scattering method.
Results: The targeted proteins were successfully expressed and obtained in sufficient quantity at 95% purity. It was determined that the thermal stability of wild-type metavinculin and DelLeu metavinculin were similar, while R975W metavinculin was lower than both proteins. It was determined that the monomeric hydrodynamic diameters of all three proteins were similar. When the aggregation tendencies were compared, it was observed that there were differences between wild type and mutants.
Conclusion: In this thesis, structural differences between wild-type metavinculin and mutants were revealed. In addition to the literature, the thermal stability of DelLeu has been determined. In addition, the hydrodynamic diameters of all targeted proteins as monomers and their tendency to form aggregates were compared. All these results will contribute to the understanding of the roles of wild-type metavinculin and its mutants in cardiomyopathy and other disease mechanisms.Keywords: Metavinculin, vinculin, actin, cardiomyopathy, protein purification