Doğal suş Rhodococcus pyridinivorans'tan elde edilen EPS'nin karakterizasyonu ve bu EPS film ile kaplanmış doğal ve çiftlik levreklerinin (dicentrarchus labrax) raf ömrü ve kalite özelliklerinin belirlenmesi
Characterization of EPS obtained from natural strain rhodococcus pyridinivorans and determination of the shelf life and quality characteristics of natural and farmed seabass (dicentrarchus labrax) coated with this EPS film
Yazar: AYLİN TAŞKAYA
Danışman: PROF. DR. NUR CEYHAN GÜVENSEN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada atık su arıtım tesislerinden izole edilen Rhodococcus pyridinivorans AF173005 (ZZ 47) bakterisinden üretilen ekzopolisakkaritin (EPS) kısmi saflaştırması yapılarak in-vitro biyoaktiviteleri ve fizikokimyasal karakterizasyonları yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar yorumlanarak potansiyel biyoteknolojik kullanımları ve biyoürün kapasiteleri değerlendirilmiştir. Gıda endüstrisinde koyulaştırıcı ve stabilizatör olanarak kullanılan ticari suş Xanthomonas campestris 'den üretilen xanthan gam pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. R. pyridinivorans AF173005 (ZZ 47)'den üretilen EPS'nin eldesi ve saflaştırılması yapılarak, EPS'nin verim oranı hesaplanmıştır. Rhodococcus pyridinivorans ZZ47' den 100ml. Kültürden %1,71 oranında yaş EPS ve %1,01 oranında kuru EPS üretilmiştir. Ayrıca Rhodoccocus pyridinivorans ZZ47 büyüme eğrisi yapılmıştır. Elde edilen EPS'nin HT-29 ve MCF-7 hücreleri üzerindeki antiproliferatif aktivitesi HT-29 ve MCF-7 hücrelerinin hücre canlılıklarının, 24 ve 48 saat boyunca test edilen tüm EPS konsantrasyonlarında %85'in üzerinde olduğu bulunmuştur. EPS' nin biyolojik aktivite analizlerinin sonuçlarına göre, süramin uygulanan pozitif kontrol grubunda 24 saat sonrası yoğun bir hemoraj, vasküler liziz veya koagülasyon gözlemlenirken, %0,9'luk NaCl uygulanan negatif kontrol grubunda herhangi bir etkinlik gözlenmemiştir. EPS'nin uygulanan çeşitli konsantrasyonları sonucunda Leghron beyaz tavuk yumurtaları üzerinde 24 saat sonrasında herhangi bir hemoraj, vasküler liziz veya koagülasyon etkisi gözlenmemiştir. Bu sebeplerden ötürü EPS' nin 2 – 0,5 mg/ml konsantrasyonlarda herhangi bir antianjiyogenik etkinliği bulunmamaktadır. EPS' nin In vivo toksisite denemeleri süresince farelerde ölüm, genel görünüm, davranış veya kilo kaybı gibi bir olumsuz reaksiyon görülmemiştir. Bu sebeple EPS'nin LD50 değeri >2000 mg/kg'dir. Hazırlanan EPS materyali çözeltisinin kontrol (K) ve ksantan gum (KG) grupları ile levrek balıklarının raf ömrü ve et kalitesi üzerine etkisinin belirlenmesi amacıyla aerobik şartlarda soğuk havada (+4±2°C) depolanarak 0., 4., 7., 10. ve 13. günlerde besinsel kompozisyon (Nem, yağ, Kül, Protein tayini analizi), Fiziksel analizler (pH analizi), Kimyasal analizler (TVB-N analizi, TBA analizi, histamin analizi), Mikrobiyolojik analizler (Toplam aerobik mezofilik bakteri sayısı (ISO 4833-1), Toplam aerobik psikrofilik bakteri sayısı (Halkman., 2005), Enterobactericeae sayısı (TS EN ISO 21528-2), E. coli sayısı (Katı Besiyerinde) (ISO 16649-2), Küf ve maya (TS EN ISO 21527-1 ve 21527-2), Pseudomonas spp. Sayısı (Katı Besiyerinde) (Pereira vd., 2018)), duyusal analizler (Taze balıkta duyusal analiz, taze balıkta beğeni skalası, Taze balıkta sözel hedonik skala) yapılmıştır. Kimyasal analiz sonuçlarına göre depolama periyodu boyunca tüm gruplarda Tiyobarbütirik asit (TBA) değerinin kontrol grubunda hızlı bir artış gösterirken kaplama materyali kullandığımız gruplarda TBA değerindeki artışın daha az olduğu görülmektedir. Hatta EPS ile kaplanan deniz ve kültür levreklerinin, ksantan gum ile kaplanan deniz ve kültür levreklerine oranlara TBA değerlerinin daha az artış gösterdiği grafikte görülmektedir. Çalışma boyunca hiçbir grup tüketilebilir sınır değeri olan 8 mg malonaldehit/kg.'ı aşmamıştır. Analizlerini yaptığımız levrek balıklarının 10.gün TVB-N değerleri kültür ve deniz levreğinde 25.00 mg/100gr. ile 26.16 mg/100gr arasında değişim gösterdiği, fakat bu değerlerin tüketim sınırını geçmediği görülmektedir. Depolama periyodu boyunca kültür ve deniz levreğinde yapılan histamin analizinde kültür levreği örneklerinde histamin içeriğine rastlanmamışken deniz levreklerinde D7KG, D10EPS ve D13EPS gruplarında histamin değerleri mevcut bulunmuştur. Fakat bulunan histamin değerlerinin FDA tarafından belirlenen yasal limitlerin altında olduğu görülmüştür. Yapılan araştırmada depolama periyodu boyunca kimyasal kompozisyona baktığımızda % protein değerleri 0. günde kültür levreğinde %21.74, 13.günde %19.03 ve deniz levreğinde %22.83, 13. Günde %19.46 olarak tespit edilmiştir. Depolama periyodunun tüm grupları arasında protein oranı %19.88-%19.03 arasında değişim göstermektedir. Depolamanın 7. gününde kontrol grubundaki levreklerin ham yağ değeri %5.23 iken, diğer gruplardaki yağ oranı anlamlı değişkenlik göstermiştir. Depolamanın 10. gününde kültür levreklerinde yağ oranında artış gözlemlenirken, deniz levreklerinde yağ oranında düşüş gözlemlenmiştir. Depolama periyodu boyunca deniz levreğinin yağ oranının kültür levreğine göre daha az düşüş gösterdiği görülmektedir. Kültür levreğinde depolama periyodu boyunca kaplama materyali ile kaplanan balıkların yağ oranının daha az düştüğü, EPS ile kaplanan balıkların ksantan gum ile kaplanan balıklara oranla daha az yağ kaybının olduğu görülmektedir. Mikrobiyolojik açıdan taze örnekte toplam bakteri sayısı raf ömrünü kontrol grubuna göre depolamanın 13. gününe kadar limit değeri (7 log kob/g) aşmadığı belirlenmiştir. Depolama periyodunun tüm gruplardaki balıklarda toplam aerobik psikrofilik bakteri gelişimi sayılabilir limitlerin altındadır. Küf&maya sonuçları E.coli sonuçları gibi başlangıçta sayılabilir limit değerin altında kalmıştır. Pseudomonas spp. sayısı 0., 4., 7., 10., 13. günde balıklara uygulanan kaplama materyalleri ve kontrol grubu arasındaki MANOVA sonuçlarına bakıldığında kültür levreğinin kontrol grubunun 10.gününde diğer gruplarla arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuş (P<0.05). Ksantan gum ile kaplanmış kültür levreğinde 13.günde, deniz levreği ile arasındaki fark anlamlı bulunmuştur. Depolanan kültür levreği ve deniz levreği gruplarının duyusal analiz sonuçları deri, göz, solungaç, koku, et kıvamı, et dokusu ve genel beğeni skalası olmak üzere 7 farklı kriterde incelenmiştir. Depolama süresince deniz ve kültür levreklerinin analiz günlerinde yapılan duyusal analizlerden deri kriteri, göz kriteri, sonuçları 4 gün "en iyi kalite" ile "iyi kalite arası" puanlar almıştır. Duyusal analizlerden et dokusu görünümü kriteri kontrol, ksantan gum ve EPS grupları "en iyi kalite" ve "iyi kalite" arası puanlar almıştır. 7.günde EPS kaplı deniz levrekleri hariç diğer gruplar "orta kalite" puanlaması almıştır. Panelistler deniz levreği balıklarını mükemmel olarak değerlendirmişlerdir. Kültür levreği grubu balıklar hızlı bir düşüş göstererek 7. Günden itibaren aşırı kötünün altında bir puan almıştır. Depolama süresince deniz levreği 0. Günde panelistler tarafından 'fevkalade beğendim' şeklinde belirtilirken, kültür levreği 'Pek çok beğendim' şeklinde değerlendirilmiştir. EPS materyali depolama periyodu boyunca levrek balığının bozulma etmeni olan mikroorganizmalar üzerinde inhibe edici etkisi ortaya konulmuştur. Yapılan denemeler sonucunda EPS materyalinin levrek balığına spreyleme yöntemiyle uygulanarak balığın raf ömrünü uzatmak için etkili bir yöntem olabileceği belirlenmiştir. Ayrıca su ürünleri işleme tesislerinde biyoteknolojik uygulamalarla üretilmiş yerli EPS materyalinin kullanılma potansiyeli ve önemi tartışılmıştır. 

Anahtar Kelimeler: Mikrobiyal Ekzopolisakkarit (EPS), Kaplama filmi (bakteriyel ekzopolisakkarit), Raf Ömrü, Levrek, Biyoteknolojik Uygulamalar

Abstract:
In this study, partial purification of exopolysaccharide (EPS) produced from Rhodococcus pyridinivorans AF173005 (ZZ 47) isolated from wastewater treatment plants was carried out, and in-vitro bioactivities and physicochemical characterizations were performed. The obtained results were interpreted, and potential biotechnological uses and bioyield capacities were evaluated. A commercial strain, Xanthomonas campestris, which is used as a thickener and stabilizer in the food industry, was used as a positive control. The extraction and purification of EPS from R. pyridinivorans AF173005 (ZZ 47) were performed, and the yield ratio of EPS was calculated. From 100 ml culture of Rhodococcus pyridinivorans ZZ47, 1.71% fresh EPS and 1.01% dry EPS were produced. Additionally, the growth curve of R. pyridinivorans ZZ47 was constructed. The anti-proliferative activity of the obtained EPS on HT-29 and MCF-7 cells showed that the cell viabilities of HT-29 and MCF-7 cells were over 85% at all tested EPS concentrations for 24 and 48 hours. According to the results of the biological activity analyses of EPS, after 24 hours, a pronounced hemorrhage, vascular lysis, or coagulation was observed in the positive control group treated with suramin, while no activity was observed in the negative control group treated with 0.9% NaCl. No hemorrhage, vascular lysis, or coagulation effect was observed on Leghorn white chicken eggs after 24 hours of application of various concentrations of EPS. Therefore, EPS does not exhibit any anti-angiogenic activity at concentrations of 2 - 0.5 mg/ml. During the in vivo toxicity trials of EPS, no adverse reactions such as death, general appearance, behavior, or weight loss were observed in mice. Therefore, the LD50 value of EPS is >2000 mg/kg. The prepared EPS material solution was stored under aerobic conditions at cold air (+4±2°C) on days 0, 4, 7, 10, and 13 to determine its effect on the shelf life and meat quality of sea bass with control (K) and xanthan gum (KG) groups. Nutritional composition analysis (moisture, fat, ash, protein determination), physical analysis (pH analysis), chemical analysis (TVB-N analysis, TBA analysis, histamine analysis), microbiological analysis (Total aerobic mesophilic bacterial count (ISO 4833-1), total aerobic psychrophilic bacterial count (Halkman, 2005), Enterobacteriaceae count (TS EN ISO 21528-2), E. coli count (Solid Medium) (ISO 16649-2), Mold and yeast (TS EN ISO 21527-1 and 21527-2), Pseudomonas spp. Count (Solid Medium) (Pereira et al., 2018)), Sensory analysis (Sensory analysis of fresh fish, Sensory scale of fresh fish, Verbal hedonic scale of fresh fish) were performed. According to the results of chemical analysis, throughout the storage period, while there was a rapid increase in the Thiobarbituric Acid (TBA) value in the control group, it was observed that the increase in TBA value was less pronounced in the groups where coating material was used. In fact, it can be seen in the graph that the TBA values of sea bass and cultured sea bass coated with EPS showed less increase compared to those coated with xanthan gum. None of the groups exceeded the edible limit value of 8 mg malonaldehyde/kg throughout the study. The TVB-N values of the analyzed sea bass on the 10th day ranged between 25.00 mg/100g and 26.16 mg/100g for cultured and sea bass, respectively, which did not exceed the consumption limit. Histamine analysis performed on cultured and sea bass during the storage period revealed that while no histamine content was detected in the cultured sea bass samples, histamine values were present in the D7KG, D10EPS, and D13EPS groups of sea bass. However, the detected histamine values were found to be below the legal limits set by the FDA. In the conducted research, when looking at the chemical composition throughout the storage period, the protein percentages were determined as follows: on day 0, cultured sea bass had a protein percentage of 21.74%, which decreased to 19.03% on day 13, while for sea bass, it was 22.83% on day 0 and 19.46% on day 13. The protein content among all groups during the storage period ranged from 19.88% to 19.03%. On the 7th day of storage, the crude fat value in the control group sea bass was 5.23%, while the fat content in the other groups showed significant variability. On the 10th day of storage, an increase in fat content was observed in cultured sea bass, while a decrease in fat content was observed in sea bass. Throughout the storage period, it is observed that the decrease in fat content in sea bass is less than that in cultured sea bass. In terms of microbiology, the total bacterial count in the fresh sample did not exceed the limit value (7 log CFU/g) until the 13th day of storage compared to the shelf life control group. The development of total aerobic psychrophilic bacteria in fish in all groups during the storage period is below countable limits. Mold and yeast results remained below the countable limit value initially, similar to E. coli results. When looking at the MANOVA results between the coating materials applied to fish and the control group on days 0, 4, 7, 10, and 13 for Pseudomonas spp., a statistically significant difference was found between the control group and other groups on day 10 for cultured sea bass (P<0.05). On day 13, a significant difference was observed between sea bass coated with xanthan gum and cultured sea bass. The sensory analysis results of the stored cultured sea bass and sea bass groups were evaluated based on 7 different criteria, including skin, eyes, gills, odor, meat firmness, meat texture, and overall liking scale. During the storage period, sensory analysis of sea bass and cultured sea bass on the analysis days revealed the following results for the criteria of skin and eyes: Both sea bass and cultured sea bass received scores ranging from "best quality" to "good quality" for the skin and eyes criteria on day 4. Regarding the appearance of meat texture from sensory analysis, the control, xanthan gum, and EPS groups received scores ranging from "best quality" to "good quality". However, on day 7, except for EPS-coated sea bass, all other groups received a rating of "moderate quality". The panelists rated the sea bass as excellent, while the cultured sea bass group showed a rapid decline, receiving a score below extremely poor starting from day 7. Throughout the storage period, on day 0, the panelists described the sea bass as 'exceptionally pleasing,' whereas the cultured sea bass was evaluated as 'quite pleasing.' The EPS material demonstrated an inhibitory effect on the microorganisms responsible for the deterioration of sea bass during the storage period. Through the conducted trials, it was determined that the application of EPS material to sea bass via spraying could be an effective method to extend the fish's shelf life. Additionally, the potential and significance of indigenous EPS material produced through biotechnological applications in fish processing facilities have been discussed. 

Keywords: Microbial Exopolysaccharide (EPS), Coating film (bacterial exopolysaccharide), Shelf Life, Sea Bass, Biotechnological Applications