Oksidatif stres altında mezenkimal kök hücrelerde Src-YAP aktivitesi ve apoptoz ile ilişkisi
Src-YAP activity in mesenchymal stem cells under oxidative stress and its relation with apoptosis
Yazar: ÖZLEM BOZDEMİR
Danışman: PROF. DR. NACİYE DİLARA ZEYBEK
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı / Kök Hücre Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
İmmunomodulatör ve rejeneratif özellikleri ile birçok hastalığın tedavisinde kullanılan mezenkimal kök hücrelerin (MKH) transplantasyon sonrası kaybının nedenlerinden biri de oksidatif stres ile indüklenmiş hücre ölümüdür. Bu nedenle oksidatif stres altında MKH'lerde oluşan hücresel sinyal yanıtlarının araştırılarak aydınlatılması gelecekte yapılacak tedavilerin geliştirilmesine katkı sağlayacaktır. Tez çalışmasında, H2O2 ile oluşturulmuş oksidatif stres altında MKH'lerde Src-YAP aktivitesindeki değişimlere bakılması ve bunun apoptoz ile Bax eksresyonu ve pYAPY357-p73 etkileşimi üzerinden ilişkilendirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, lipo-aspirattan izole edilerek karakterizasyonları yapılmış MKH'lerde oksidatif stres indüklenmesi için H2O2 konsantrasyonu WST-1 analizi ile 300 μM olarak belirlenmiştir. H2O2'in 15,30, 60, ve 120 dakika uygulamaları sonrası hücre içi ROS düzeylerinin arttığı akım sitometri yöntemiyle tespit edilmiştir. Western blot analizlerinde, Src fosforilasyonun arttığı, bunu YAP'ın ve fosforilasyonlardaki artışın izlediği tespit edilmiştir. Western blot ve immunofloresan analizlerinde, YAP ve fosforilasyonlarının çekirdek-sitoplazma dağılımlarının H2O2 uygulaması sonrası değiştiği saptanmıştır. Bax/Bcl-2 oranı H2O2 uygulaması sonrası arttığı tespit edilmiştir. İmmünpresipitasyon analizinde, nükleer ekstraktta p73 ile çöktürülen örneklerde pYAPY357 protein bandı tespit edilmiştir. Bu tez çalışması, belirlenen amaç doğrultusunda, oksidatif stres altındaki MKH'lerde Src-YAP ilişkisini tespit eden ilk çalışma olmakla birlikte pYAPY357'nin arttığını ve çekirdekte lokalize olduğunu göstermesiyle özgündür. MKH'lerde pYAPY357 ve p73 etkileşimi de ilk kez bu çalışmada gösterilmiştir.

Abstract:
One of the reasons for the post-transplantation loss of mesenchymal stem cells (MSCs), which are used in the treatment of many diseases with their immunomodulatory and regenerative properties, is oxidative stress-induced cell death. Therefore, investigating and elucidating the cellular signaling responses occurring in MSCs under oxidative stress will contribute to the development of future treatments. In the thesis study, it was aimed to examine the changes in Src-YAP activity in MSCs under oxidative stress caused by H2O2 and to correlate this with apoptosis through Bax excretion and pYAPY357-p73 interaction. For this purpose, the H2O2 concentration was determined as 300 μM by WST-1 analysis to induce oxidative stress in MSCs isolated from lipo-aspirate and characterized. It was determined by flow cytometry that intracellular ROS levels increased after H2O2 applications for 15, 30, 60, and 120 minutes. In Western blot analyses, it was determined that Src phosphorylation increased, followed by an increase in YAP and phosphorylations. In Western blot and immunofluorescence analyses, it was determined that the nucleus-cytoplasm distribution of YAP and its phosphorylations changed after H2O2 application. It was determined that the Bax/Bcl-2 ratio increased after H2O2 application. In the immunoprecipitation analysis, the pYAPY357 protein band was detected in the samples precipitated with p73 in the nuclear extract. In line with the stated purpose, this thesis is the first study to detect the Src-YAP relationship in MSCs under oxidative stress, and it is unique in that it shows that pYAPY357 increases and is localized in the nucleus. The interaction of pYAPY357 and p73 in MSCs was also shown for the first time in this study.