Türkiye'de bulunan arı ırklarından elde edilecek arı zehiri bileşiminin analizi ve antikanserojen etkilerinin invitro olarak araştırılması
Analysis of BEE venom active compounds from bee species of Turkey and investigation of its potential invitro anticarcinogenic effects
Yazar: SİNEM PEHLİVAN
Danışman: PROF. DR. ENDER YARSAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Apis mellifera = Apis mellifera ; Arı zehirleri = Bee venoms ; Arı ürünleri = Bee products ; Arılar = Bees ; Beyin neoplazmları = Brain neoplasms ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Apiterapi, arı ürünlerinin, tamamlayıcı olarak çeşitli hastalıkların tedavisinde ve/veya hastalıklardan korunmak amacıyla kullanılmasıdır. Bu doktora tez çalışmasında, ülkemizde Afyon, Ankara, Balıkesir, Denizli, Muğla illerinde ki Apis meliffera L. arılarından zehirlerin elektroşok yöntemi kullanılarak elde edilmesi, bu zehirlerin apamin, fosfolipaz A2 ve melittin bakımından içerik analizlerinin yapılması, zehirlerin kolorektal adenokarsinoma ve glioblastoma multiforme kanser hücreleri üzerinde sitotoksik etkinliklerinin ortaya konulması hedeflenmektedir. Çalışmada, işlem yapılmayan negatif kontrol grubu, çözücü kullanılan çözücü kontrol grubu, Afyon-Ankara-Balıkesir-Denizli-Muğla illlerinden elde edilen bal arısı zehirlerinin uygulandığı gruplar ve triton-x uygulanan pozitif kontrol grubu olmak üzere in vitro deney grupları oluşturulmuştur. İlk olarak, kovanlara yerleştirilen arı zehiri toplama aleti yardımıyla ve elektroşok yöntemiyle, arılara zarar vermeden, zehir örnekleri toplanmıştır. DMSO içerisinde arı zehirlerinin farklı konsatrasyonları oluşturulmuştur. Arı zehirleri Caco-2 ve T98G hücrelerine uygulanarak 24 saat inkübe edilmiş ve süre bitiminde yüzde hücre canlılıkları MTT, Nötral Kırmızı ve LDH analiz yöntemleri kullanılarak belirlenmiştir. Her iki hücre hattında da tüm arı zehirlerine ait IC50 değerleri hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlar karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiş, her iki hücre hattında da yüzde sitotoksisite cevaplarında konsantrasyona bağlı artış görülmüştür. Sonuçlar istatistiki bakımdan değerlendirilmiştir. MTT ve LDH analizlerine göre her iki hücre hattında da, Nötral Kırmızı analizinde ise sadece T98G hücrelerinde sitotoksik etkinliği en fazla olan arı zehirinin Denizli olduğu belirlenmiştir. Nötral Kırmızı analizine göre Caco-2 hücreleri için sitotoksik etkinliği en fazla olan il Balıkesir olarak belirlenmiştir. Caco-2 hücrelerinde Denizli ilinden elde edilen zehirin IC50 değeri MTT analiziyle 12,42 ∓ 0,19 µg/mL, LDH analiziyle 8,19 ∓ 0,61 µg/mL, T98G hücre hattında MTT analiziyle 5,98 ∓ 0,40 µg/mL, LDH analiziyle 5,04 ∓ 0,17 µg/mL bulunmuştur. Caco-2 hücrelerinde MTT, Nötral Kırmızı ve LDH analizlerinde, sitotoksik etkinlik en düşük Afyon ilinde bulunmuş ve IC50 değerleri sırasıyla; 18,08 ∓ 1,31 µg/mL, 14,72 ∓ 0,35 µg/mL, 19,52 ∓ 0,58 µg/mL bulunmuştur. T98G hücrelerinde ise en düşük sitotoksik etki MTT ve Nötral Kırmızı analizlerinde Afyon ilinde, LDH analizinde Ankara ilinde belirlenmiştir. Arı zehirlerinin değişen apamin, melittin ve fosfolipaz A2 miktarları ve hücreler üzerinde ki sitotoksik etkinlikleri değerlendirilmiş ve genel anlamda zehirlerin melittin, fosfolipaz A2 miktarları ve IC50 değerleri arasında negatif korelasyon bulunmuştur. Belirtilen değerlendirmeler doğrultusunda, çalışmamızdaki arı zehirlerinin etkinliği ve etki mekanizmalarının daha kapsamlı değerlendirilmesi için, farklı inkübasyon süreleri ve konsantrasyonlarda da değerlendirilmeleri, hücre içi etki mekanizmalarının araştırılması ve araştırmaların in vivo deneylerle desteklenmesi yararlı olacaktır.

Abstract:
Apitherapy is the use of bee products as complementary, for the treatment and/or prevention of various diseases. In this PhD thesis we aimed to collect bee venom via electroschock method from Apis mellifera L.in Afyon, Ankara, Balıkesir, Denizli, Muğla provience in Turkey, analysis of their contents in terms of apamine, phospholipase A2 and melittine and determination of their cytotoxic effects on both colorectal adenocarcinoma and glioblastoma multiforme. In vitro experimental groups were designed as negative control group without any treatment, solvent control group with only applied solvent, bee venom groups of Afyon-Ankara-Balıkesir-Denizli-Muğla and positive control group applied triton-x. Initially samples were collected with bee venom collection device placed on the hives and by the electroshock method without harming the bees. Bee venom solutions were prepared using DMSO and diluated different concentrations. This dilutions were applied to Caco-2 and T98G cell lines and cells were incubated 24 hours. At the end of the period, cells viability were determined using MTT, Neutral Red and LDH analysis methods. IC50 values of all bee venoms were calculated for both cell lines. A dose dependent increase observed in cytotoxicity responses in both cell lines. Cytotoxic activity in both cell lines in MTT and LDH analysis and only in T98G cell line in Neutral Red analysis belongs to the poison that belongs to Denizli province. According to Neutral Red analysis in Caco-2 cell lines, the highest cytotoxic activity belongs to Balıkesir province. In Caco-2 cell lines, IC50 values of bee venom that belongs to Denizli was founded in MTT and LDH analysis; 12,42 ∓ 0,19 µg/mL and 8,19 ∓ 0,61 µg/mL whereas in T98G cell lines, 5,98 ∓ 0,40 and 5,04 ∓ 0,17 µg/mL respectively. According to MTT, Neutral Red and LDH analysis, in Caco-2 cell lines, the lowest cytotoxic activity was found in bee venom that belongs to Afyon and IC50 values were found 18,08 ∓ 1,31 µg/mL, 14,72 ∓ 0,35 µg/mL, 19,52 ∓ 0,58 µg/mL. In MTT and Neutral Red analysis, in T98G, the lowest cytotoxic activity belongs to Afyon province whereas Ankara in LDH analysis. Variable values of apamin, melittin and phospholipase A2 of bee venoms and the cytotoxic effects on the cells were determined and it was found that there is a negative correlation between the venoms and IC50. In order to more comprehensive evaluations of the efficacy and mechanism of action of bee venoms, it would be benefical to support this in vitro experimental datas with in vivo studies, investigating the intracellular mechanism of action and evaluating the different incubation times and concentrations