Exiguobacterium alkaliphilum VLP1 tarafından üretilen alkali proteaz enziminin, saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulamaları
Purification, characterization and biotechnological applications of alkali protease enzyme produced by Exiguobacterium alkaliphilum VLP1
Yazar: ASİYE HEMŞİNLİ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SÜMEYRA GÜRKÖK
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Alkali proteaz = Alkaline protease ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Deterjanlar = Detergents ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim üretimi = Enzyme production ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında, Van Gölü'nden alkali proteaz üretme potansiyeli yüksek olan bir bakterinin izolasyonu ve tanılanması, bu izolattan alkali proteaz enziminin saflaştırılarak karakterize edilmesi, deterjan endüstrisinde ve tavuk tüylerinin parçalanmasında kullanım potansiyelinin araştırılması amaçlanmıştır.
Yöntem: Van Gölü alkalifilik izolatları arasından en yüksek proteolitik aktiviteye sahip bakteri seçilmiş, klasik ve moleküler yöntemlerle tanılanmıştır. Proteaz üretimi için optimum koşullar belirlenmiştir. Proteaz enzimi amonyum sülfatla çöktürme, ultrafiltrasyon ve iyon değişim kromatografisi ile saflaştırıldıktan sonra karakterize edilmiştir. Enzimin kumaşlardan kan lekelerini çıkarma ve proteolitik izolatın tavuk tüylerini parçalama potansiyeli araştırılmıştır.
Bulgular: Van Gölü izolatları arasından en yüksek proteolitik aktivite Exiguobacterium alkaliphilum VLP1 (GenBank Acc No: ON853834.1) ile elde edilmiştir. En yüksek proteaz üretimi 30 °C, pH 9,0, laktoz ve maya özütü varlığında, 2 günlük inkübasyon süresinde elde edilmiştir. Proteaz 45 kat, %6,4 verimle ve 1169 U/mg protein spesifik aktivite ile saflaştırılmış, moleküler ağırlığı 69 kDa, Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,4 mM ve 2000 U/mg protein olarak bulunmuştur. Aktivite için optimum sıcaklık 40 °C ve pH 9 olarak belirlenmiş ve bu koşullarda enzimin kararlılığını uzun süre koruduğu gözlemlenmiştir. Enzimin çeşitli metal iyonları, reaktifler, çözücüler ve deterjanlar varlığında kararlılığı belirlenmiştir. Alkali proteazın kumaş parçalarından kan lekelerini çıkarmada ve E. alkaliphilum VLP1'in tavuk tüylerini parçalamada etkin olduğu tespit edilmiştir.
Sonuç: Bu tez kapsamında, ilk kez E. alkaliphilum bakterisinden proteaz enzimi saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Alkali proteazın deterjan endüstrisinde ve tavuk tüyü parçalamada kullanılma potansiyeline sahip olduğu kanısına varılmıştır.

Abstract:
Purpose: In this thesis, isolation and identification of a bacterium with a high potential to produce alkaline protease from Lake Van, purification and characterization of the alkaline protease enzyme from this isolate, and investigation of its potential for use in the detergent industry and in the decomposition of chicken feathers were aimed.
Method: Among the alkaliphilic isolates of Lake Van, bacterium with the highest proteolytic activity was selected and identified by classical and molecular methods. Optimum conditions for protease production were determined. The protease enzyme was characterized after purification by precipitation with ammonium sulfate, ultrafiltration, and ion exchange chromatography. The potentials of the enzyme to remove bloodstains from fabrics and the proteolytic isolate to break down chicken feathers were investigated.
Results: Among the Van Lake isolates, the highest proteolytic activity was obtained with Exiguobacterium alkaliphilum VLP1 (GenBank Acc No: ON853834.1). The highest protease production was obtained at 30 °C, pH 9.0, 2 days incubation period in the presence of lactose and yeast extract. The protease was purified 45 fold, with 6.4% yield and 1169 U/mg protein specific activity, with a molecular weight of 69 kDa, Km and Vmax values of 0.4 mM and 2000 U/mg protein, respectively. The optimum temperature for the activity was determined as 40 °C and pH as 9, and it was observed that the enzyme remained stable under these conditions for a long time. The enzyme stability in the presence of various metal ions, reagents, solvents and detergents was determined. It has been found that alkaline protease is effective in removing blood stains from fabric pieces and E. alkaliphilum VLP1 in breaking down chicken feathers.
Conclusion: In this thesis, protease enzyme was purified and characterized for the first time from E. alkaliphilum bacteria. It has been concluded that alkaline protease has the potential to be used in the detergent industry and for decomposition of chicken feathers.