Batı Akdeniz bölgesi domates üretim alanlarında domates kloroz virüsü (Tomato Chlorosis Virus; ToCV)'nün biyolojik ve moleküler karakterizasyonu
Molecular chracterization and biological of tomato chlorosis virus (ToCV) in tomato production areas in Western Mediterranean region
Yazar: NEVİN AKDURA
Danışman: DOÇ. DR. BAYRAM ÇEVİK
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Domates kloroz virüsü (Tomato chlorosis virus, ToCV) Closteroviridae familyasının Crinivirus cinsine ait, floem sınırlıdır ve semi-persistent biçimde beyazsinek vektörleri ile bitkiden bitkiye taşınan bir virüstür. TocV tek iplikli pozitif duyarlı olup iki parçalı bir RNA genomuna sahiptir. Virüsün ülkemizde varlığı ilk olarak Muğla'nın Fethiye ilçesinde tespit edilmiştir. Bu çalışmada, ülkemizin önemli domates üretim alanlarından Batı Akdeniz Bölgesi'nde ToCV'nün varlığı araştırılarak bulunan virüs izolatlarının moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Bu amaçla; Antalya, Burdur, Isparta ve Muğla illerinde domates yetiştiriciliği yapılan örtüaltı ve açık alanlardan toplam 515 örnek toplanmıştır. Bu örneklerden 329 tanesinden CTAB yöntemi ile toplam nükleik asit izolasyonu yapılarak ToCV'nün varlığı, kılıf protein (CP) genine spesifik primerler kullanılarak iki aşamalı ters transkripsiyon?polimeraz zincir reaksiyon (RT-PCR) yöntemi ile belirlenmiştir. RT-PCR analizleri sonucunda test edilen 329 örneğin 113 tanesinde 780 bp büyüklüğünde ToCV CP genine denk gelen bant elde edilerek örneklerin ToCV'üyle enfekteli oldukları belirlenmiştir. RT-PCR yöntemiyle Antalya'dan alınan örneklerin %50'den fazlası enfekteli bulunurken Isparta ve Burdur'da ToCV tespit edilememiştir. Isparta ve Burdur örneklerinde ToCV'nün varlığı, Hsp70 genine spesifik primerler kullanılarak Nested PCR yöntemi ile belirlenmiştir. Nested PCR analizleri sonucunda test edilen 82 örneğin 6 tanesinde 463 bp büyüklüğünde ToCV Hsp70 genine denk gelen bant elde edilerek bu örneklerin ToCV'üyle enfekteli oldukları belirlenmiştir. Antalya ilinde farklı domates üretim alanlarını temsil eden 13 farklı ToCV izolatı seçilerek CP genleri T-A klonlama yöntemi ile pGEM Teasy plazmit vektörlerine klonlanmıştır. Daha sonra, seçilen ToCV izolatlarının kılıf protein genlerinin dizilimi yapılarak bunların nükleotid dizilimi ve kodladıkları amino asit dizilimleri belirlenmiştir. Ayrıca Burdur'da nested PCR yöntemiyle ToCV enfekteli bulunan örneklerden birinden çoğaltılan Hsp70 geninin dizilimi yapılarak içerdikleri nükleotid dizilimi ve kodladığı amino asit dizilimi belirlenmiştir. Elde edilen nükleotid ve amino asit dizilerinin analizi yapılarak ülkemiz ToCV izolatlarının birbirleriyle ve dünyadaki diğer izolatlarla benzerlik oranları ve filogenetik ilişkileri ortaya konmuştur. Yapılan analizler sonucunda ülkemiz ToCV izolatlarının yüksek oranda benzerlık gösterdiği ve fılogenetik olarak Doğu Akdeniz ülkerinden elde edilen ToCV izoltalarıyla daha yakından ilişkili olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Tomato chlorosis virus (ToCV) is a phloem-limited virus belonging to the Crinivirus genus within the Closteroviridae family and transmitted from plant to plant by the whitefly vectors in a semi-persistent manner. ToCV has a positive sense single-stranded bipartite RNA genome. The presence of ToCV in Turkey was first determined previously in Fethiye district of Muğla province. In this study, the presence of ToCV was investigated in the major tomato production areas of the western Mediterranean region of Turkey and molecular characterization of the isolates found in the region was reported. For this purpose, a total of 515 samples were collected from the fields or greenhouse tomato productions areas in the provinces of Antalya, Burdur, Isparta and Muğla. Total nucleic acids were isolated from 329 of these samples by CTAB method. Presence of ToCV in these samples was determined by the two-step reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using primers specific to the coat protein (CP) gene A DNA fragment of 780 bp corresponding to ToCV CP gene were amplified from 113 of 329 samples tested by RT-PCR analysis demonstrating that they are infected with ToCV. While more than 50% of the samples collected from Antalya were found to be infected, ToCV could not be detected in samples from Isparta and Burdur by RT-PCR method Presence of ToCV in some samples from Isparta and Burdur was determined by a nested PCR method using primers specific to the Hsp70 gene. A DNA fragment of 463 bp corresponding to a part of the Hsp70 gene was amplified in 6 of 82 samples tested by nested PCR showing that they are infected with ToCV. 13 different ToCV isolates representing different tomato production areas of Antalya province were selected and their CP genes were cloned into the pGEM-Teasy plasmid vector using a T-A cloning method. The cloned CP genes were sequenced and their nucleotide and deduced amino acid sequences were determined. In addition the Hsp70 gene of one of the ToCV isolates from Burdur was sequenced and their nucleotide and deduced amino acid sequences were determined. The nucleotide and deduced amino acid sequences of the CP and Hsp70 genes ToCV isolates from Turkey with each other and ToCV isolates from other tomato producing regions of the world were compared. The similarity and phylogenetic relationship of Turkish ToCV isolates with each other and ToCV isolates from other different regions of the world were determined and analyzed. The results indicated that the ToCV isolates from Turkey are genetically conserved and they were phylogenetically more related with ToCV isolates from eastern Mediterranean countries.