Valproik asit ile indüklenen PANC-1 hücrelerinde WNT sinyal yolağının incelenmesi
Investigation of WNT signaling pathway in Valproic acid-induced PANC-1 cells
Yazar: FATMA YELİZ EKİCİ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ FEYZA NUR TUNCER KILINÇ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Hücre dizisi = Cell line ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Süksinatlar = Succinates ; Valproik asit = Valproic acid

Özet:
Pankreas duktal adenokarsinoma (PDAK), tüm dünyada 5 yıllık sağ kalım oranı %8'in altında gözlemlenen en agresif kanser türlerinden biri olarak tanımlanmaktadır. Hastalığın çoğu bireyde sergilediği agresif tümör davranışı ile konvansiyonel tedaviye direnç göstermesi ve erken tanıya uyumlu belirteçlerden yoksun olması, güncel etkin tedavi yaklaşımlarını uygun hastalarda cerrahi müdahale ile kısıtlamaktadır. Bu nedenle, hastalığın tedavisinde yeni stratejilerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar, tüm dünyada önem kazanmıştır. Bu doğrultuda yapılan çalışmalar, duktal pankreas kanser modellemeleri aşamasında PANC-1 hücrelerini kullanmıştır ve bu hücrelerde VPA'nın apoptozu indüklediğini göstermiştir.
Çalışmamızda, PANC-1 hücrelerine uygulanan VPA'nın, hücre proliferasyonunu %50 baskıladığı konsantrasyonu gösteren IC50 değerinin CFSE boyama yöntemi ile hesaplanmıştır. Bunu takiben Annexin V/PI boyası ile yapılan apoptoz ölçümü ile bulunan IC50 değeri desteklenmiştir. Daha sonra, IC50 değeri olarak tespit edilen VPA dozuna maruz kalmış PANC-1 hücrelerindeki Wnt/Beta katenin sinyal yolağı ana komponentlerinden olan LEF1, AXIN1, CCND1 ve CTNNB1 genlerinin anlatım düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (kRT-PZR) metodu kullanılarak ve 2-ΔΔCT analiz yöntemi incelenmiştir.
48. saatte elde edilen proliferasyon analizleri sonucunda IC50 değeri, 2,5 mM olarak hesaplanmıştır. Apoptoz ölçümleri sonucunda, 2,5 mM'lık VPA dozuna maruz kalan hücrelerde erken apoptozun belirginleştiği tespit edilerek, bulunan IC50 değerinin etkinliği onaylanmıştır. VPA uygulanması sonucu AXIN1 ve CTNNB1 genlerinin anlatım düzeylerinde anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir. CCND1 ve LEF1 genlerinde ise anlatım düzeylerinin anlamlı bir şekilde arttığı gözlemlenmiştir.
Bu bulgular ile ilk kez IC50 değerinin, CFSE ve annexin V/PI metotlarının birleştirilmesiyle hesaplanabileceği gösterilmiştir. Ayrıca VPA'nın kanser hücrelerindeki bölünmeyi durdurarak apoptozu indüklediği teyit edilmiştir.

Abstract:
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is defined as one of the most aggressive cancers worldwide with a 5-year survival rate of less than 8%. The facts that the disease is resistant to conventional treatment with aggressive tumor behavior in most individuals and the lack of markers compatible with early diagnosis, limit current effective treatment approaches to surgical intervention in suitable patients. Therefore, development of new strategies for the treatment of the disease has gained importance all over the world. Accordingly, studies have used PANC-1 cells in the ductal pancreatic cancer modeling stage and have shown that VPA induces apoptosis in these cells. 
In our study, IC50 value that shows the concentration of VPA that inhibits cell proliferation by 50%, is calculated using CFSE staining method. This IC50 value is supported by the apoptosis measurement made by Annexin V/PI staining. Afterwards, PANC-1 cells were exposed to the determined IC50 dose of VPA, and the expression levels of LEF1, AXIN1, CCND1 and CTNNB1 genes, as the main components of Wnt/Beta-catenin signal pathway, were determined by qRT-PCR method, utilizing 2-ΔΔCT analysis.
IC50 value is calculated as 2,5 mM after proliferation analyses made in 48th hour. Determination of early apoptosis in cells exposed to 2,5 mM VPA in the apoptosis analyses confirmed the calculated IC50 value. No significant difference has been observed in the expression levels of AXIN1 and CTNNB1 genes after the application of VPA. A significant increase was observed in the expression levels of CCND1 ve LEF1 genes.
These findings have shown for the first time that  IC50 value can be calculated by combining the CFSE and annexin V/PI methods. In addition, VPA has been confirmed to inhibit division of cancer cells and induce apoptosis.