İnsülin direnci gelişmiş sıçan kardiyomiyositlerinde sarkolemmal iyon kanallarının fonksiyon ve yapısının elektrofizyolojik ve moleküler biyolojik tekniklerle incelenmesi
Investigation on function and structure of ion channels in cardiomyocytes from insluin-resistant rat heart by using electrophysiological and molecular biology techniques
Yazar: AYŞEGÜL DURAK
Danışman: PROF. DR. BELMA TURAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyofizik = Biophysics

Özet:
Genel olarak bireylerde alınan enerjinin harcanana oranının artması ile gelişen metabolik sendrom (MetS), hiperinsülinemi ve insülin direnci, hiperlipidemi ve hipertansiyon ile karakterize olup, kardiyovasküler hastalıklar için önemli bir risk faktörüdür. Önceki çalışmalarımızda, yüksek sükroz ile beslenen sıçanlarda deneysel olarak MetS oluşturularak kalp fonksiyonları incelenmişti. Bu deney hayvanlarında hipertansiyon ve kalp fonksiyon bozukluğu (sol ventrikül kasılma gücünde belirgin azalma gibi) geliştiği de gözlenmişti. Buna karşın bu model hayvanlarda, kalbin global elektriksel aktivitesini oluşturan tek hücre düzeyindeki elektriksel aktivitenin (kardiyomiyosit aksiyon potansiyeli gibi) ve bu aktivitede görev alan iyonik mekanizmaların (voltaj-kapılı iyon kanalları gibi) henüz detaylı olarak bilinmediği gözlemlenmiştir. Çalışmamızda öncelikle, MetS oluşturulmuş sıçanlarda, sistemik oksidatif stres durumunun arttığı ve antioksidan savunmanın azaldığı, paraoksonaz ve asetiltrensferaz enzimlerin aktivitelerinin azaldığı ve okside protein tiyol seviyesinin arttığı, serum örneklerinde ölçülerek gösterilmiştir. MetS grubu sıçanların sol ventrikül basınç değerlerinin insülin uygulaması ile düzelebildiği ve bu düzelmeye hücre düzeyinde yapılan Ca2+ homeostazı ile ilgili parametrelerdeki düzelmelerin de eşlik ettiği gözlenmiştir. Taze olarak izole edilen ventrikül kardiyomiyositlerinde hipertrofi geliştiği gözlenmiştir. Ayrıca, bu hücrelerde aksiyon potansiyeli parametrelerinin (genlik, depolarizasyon ve repolarizasyon süreleri, dinlenim membran potansiyeli gibi) ölçülmüş ve MetS grubunda aksiyon potansiyellerinin tepe değerinin yükseldiği ve repolarizasyon süresinin uzadığı gözlenmiştir. Repolarizasyondaki uzamaların insülin tedavisi ile normal değerlere dönüş yaptığı gözlenmiştir.
MetS grubunda gözlenen aksiyon potensiyeli tepe değerindeki artıştan voltaj-kapılı Na+-kanal akımlarındaki (INa) artışın sorumlu olduğu, repolarizasyon süresindeki uzamadan ise voltaj-kapılı K+-kanal akımlarının (IK) sorumlu olduğu gözlenmiştir. İyon-kanalların protein ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler ile akım şiddetlerindeki değişiklikler biri birine paraleldir. Ayrıca aksiyon potansiyelinde gözlenen bu değişikliklere Na+/K+-pompa akımındaki (INa/K) artışında katkıda bulunduğu, INa ve INa/K insulin uygulamasına yanıt vermezken, IK'nın pozitif yanıtlar vermesi, MetS grubu kardiyomiyositlerde hücre içi K+–homeostazı ile insulin arasında bir ilşki olabileceğini işaret etmiştir. Bu hipotez doğrultusunda kalpte bol miktarda bulunduğu ve insülin duyarlılığı olduğu ileri sürülen voltaj-kapılı KCNQ1 (Kv 7.1) K+–kanal akımları (IKs) incelendiğinde, bu kanalların MetS de gözlenene AP' deki uzamalara önemli derecede katkılarda bulunduğu ve insülin uygulaması ile hem akım seviyesinin hem de protein seviyesinin arttığı gösterilmiştir. 
MetS grubunda insülin uygulamasının GLUT-4 ve insülin reseptörünün mRNA seviyesindeki azalmayı düzeltemeden kalbin elektriksel ve mekanik aktivitesinde önemli pozitif etkiler göstermesinde, literatürde ilk kez olmak üzere, insülin uygulamasının bu yolak üzerinden değil, voltaj-kapılı K+-kanal akımları üzerindeki pozitif etkisinden olduğunu göstermiştir.

Abstract:
In general, metabolic syndrome (MetS) is a metabolic disease which results with obesity and progresses with the increasing ratio of energy uptake over consumption. MetS is an important risk factor for cardiovascular diseases and that is  characterized with hyperinsulinemia (with the advancement results in insulin resistance), hyperlipidemia and hypertension. In our previous studies, heart function was investigated by experimentally forming MetS in rats with fed high sucrose. However, in this model animal, it has been observed that the single cell level electrical activity (such as the cardiomyocyte action potential) and the ionic mechanisms responsible for this activity (such as voltage-gate ion channels), which constitute the global electrical activity of the heart, are not yet known in detail. In our study, it was first demonstrated in serum samples of MetS-induced rats, the systemic oxidative stress state increased and antioxidant defense decreased, the activities of paraoxonase and acetyltransferase enzymes decreased, and the level of oxidized protein thiol increased. It has been observed that the left ventricular pressure values of the MetS group rats can be corrected by insulin administration and this improvement is accompanied by improvements in Ca2+ homeostasis parameters at the cell level. Hypertrophy has been observed in freshly isolated ventricular cardiomyocytes. In addition, the action potential parameters (amplitude, depolarization and repolarization times, resting membrane potential, etc.) were measured in these cells and the peak of the action potentials in the MetS group was increased and the repolarization time was observed to be prolonged. Repolarizations were observed to return to normal values with insulin administration.
 The increase in the peak of action potential observed in the MetS group is responsible for the increase in voltage-gated Na+ -channel currents (INa+) and voltage-gated K+ -channel currents (IK+) were responsible for the extension of the repolarization period. The changes in protein levels of these channels were found to be parallel to changes in currents. It was also observed that these changes observed in the potential of action contributed to the increase in Na+/K+ pump current (INa+/K+). While INa and INa+/K+ did not respond to insulin administration, IK showed positive responses indicating that there might be a relationship between intracellular K+ -homeostasis and insulin in the MetS group cardiomyocytes. In the direction of this hypothesis, when the voltage-gated KCNQ1 (Kv 7.1) K+ -channel currents (IKs), which are abundant in the heart and claimed to be insulin sensitive, were investigated, KCNQ1 channel currents responsible significantly to the prolongation of the AP and insulin application increased both current level and protein level. 
Insulin administration in the MetS group had a significant positive effect on the electrical and mechanical activity of the heart without correcting the decrease in the mRNA level of GLUT-4 and the insulin receptor. This was the first time in the literature that insulin application was a positive effect on voltage-gated K+ channel currents rather than on this pathway.