HIV pozitif hastalarda genotip tayini ve filogenetik analiz
Genotyping and phylogenetic analysis in HIV positive patients
Yazar: ERDEM ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. GÜLENDAM BOZDAYI
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: AIDS = AIDS ; AIDS = AIDS ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Filogenetik = Phylogenetic ; Genotip = Genotype ; HIV = HIV ; HIV = HIV ; HIV enfeksiyonları = HIV infections ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
HIV enfeksiyonunun klinik yönetiminde ilaç direncinin değerlendirilmesi önemlidir. HIV genotiplendirmesinde Sanger dizileme altın standart kabul edilsede, yeni nesil dizileme yöntemleri, düşük frekanslı direnç mutasyonlarını saptamasıyla ön plana çıkmaktadır. Bu çalışmada HIV/AIDS hastalarından izole edilen HIV-1 suşlarının genotiplendirmesi Sanger ve yeni nesil dizileme yöntemleriyle yapılmıştır. Yöntemlerin direnç mutasyonlarını saptamadaki etkinlikleri karşılaştırılmıştır. Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Viroloji Laboratuvarı'nda rutin çalışılan 47 HIV pozitif hasta örneği çalışmaya dahil edilmiştir. Viral nükleik asit ekstraksiyonunu takiben, HIV pol gen bölgesinin proteaz ve reverse transkriptaz proteinlerini kodlayan kısımları çoğaltılmıştır. Nükleotid dizileri Sanger ve yeni nesil dizileme yöntemleriyle belirlenmiştir. Sanger dizilemeyle en az bir ilaca %10,6, nükleozid ters transkriptaz inhibitörlerine %4,3, nükleozid olmayan ters transkriptaz inhibitörlerine %6,4 direnç bulunmuştur. Proteaz inhibitörlerine direnç mutasyonu görülmemiştir. Yeni nesil dizilemeyle %1 eşik değer ve üzerinde en az bir ilaca %46,8, proteaz inhibitörlerine %19,1, nükleozid ters transkriptaz inhibitörlerine %27,7 ve nükleozid olmayan ters transkriptaz inhibitörlerine %19,2 direnç bulunmuştur. %5 ve üzerindeki eşik değerlerde %14,9 en az bir ilaca direnç bulunmuştur. %1 eşik değer üzerinde proteaz inhibitörleri için direnci mutasyonu görülmemiştir. Sanger dizilemeyle saptanan mutasyonların tamamı yeni nesil dizilemeyle tespit edilmiştir. Hastaların %66'sının alt tip B ile enfekte olduğu gözlenmiştir. Bunu %13 ile A, %9 ile G, %4 ile C, CRF_02AG, %2 ile B/CRF02_AG, %2 ile CRF63_02A1 tipleri takip etmektedir. Direnç mutasyonlarının yüksek prevalansı, HIV-1 genotiplendirmesinin önemini vurgulamaktadır. Yeni nesil dizileme, %5 eşik değerin altındaki düşük frekanslı direnç mutasyonlarının tespitinde artan duyarlılığa sahiptir. %5 eşik değerin altında düşük frekanslı direnç mutasyonlarının sayısında anlamlı artış görülmüştür. Türkiye'de HIV-1 genotiplerinin dağılımı çeşitlilik göstermektedir.

Abstract:
Assessment of drug resistance is critical in clinical management of HIV infection. Although Sanger sequencing is considered gold standard in HIV genotyping, next-generation sequencing methods have emerged as a viable option for detecting low-frequency resistance mutations. Sanger and next generation sequencing methods were used in this study to genotype HIV-1 strains isolated from HIV/AIDS patients. Efficacy of methods in detecting resistance mutations was compared. Study included 47 samples routinely studied in Medical Virology Laboratory at Gazi University Medical Faculty. Following extraction, pol gene region encoding protease and reverse transcriptase were amplified. Sanger and next-generation sequencing were used to determine sequences. Sanger revealed 10.6%, 4.3% and 6.4% resistance to at least one drug, nucleoside reverse transcriptase inhibitors and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, respectively. At 1% threshold and above, next generation sequencing revealed 46.8%, 19.1%, 27.7% and 19.2% resistance to at least one drug, protease inhibitors, nucleoside reverse transcriptase inhibitors and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, respectively. At 5% and higher thresholds, 14.9% were found to be resistant to at least one drug. No resistance mutations observed for protease inhibitors above 1% threshold or with Sanger. All mutations detected by Sanger were also detected by next-generation sequencing. 66% of sequences were found to be subtype B followed by A (13%), G (9%), C (4%), CRF_02AG (4%), B/CRF02_AG (2%), CRF63_02A1 (2%). Prevalence of resistance mutations emphasizes significance of HIV-1 genotyping. Next-generation sequencing has improved sensitivity in detecting low-frequency resistance mutations below 5% threshold. Number of low-frequency resistance mutations below 5% threshold increased significantly. In Turkey, distribution of HIV-1 genotypes varies.