Çay (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze) bitkisinde geçici daldırma sistemine dayalı biyoreaktörler aracılığıyla sentetik tohumların üretilmesi
Production of synthetic seeds in tea (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze) via bioreactors based on a temporary immersion system
Yazar: BEGÜM GÜLER
Danışman: PROF. DR. AYNUR GÜREL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Biyoreaktörler = Bioreactors ; Camellia sinensis =   ; Sentetik tohum = Synthetic seed ; Somatik embriyogenez = Somatic embryogenesis

Özet:
Çay (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze) bitkisinde in vitro teknikler, kitlesel klonal çoğaltım için en etkili teknikler olarak belirlenmiştir, bu sebeple kitlesel üretime olanak veren biyoreaktör üretimleri iyi birer alternatif haline gelmişlerdir. Gerçekleştirilen bu tez çalışması kapsamında, öncelikle in vitro çay bitkiciklerine ait yaprak eksplantlarının kültüre alınmasıyla elde edilen embriyogenik kalluslardan
somatik embriyoların RITA® ve SETISTM biyoreaktörlerde kitlesel üretimlerinin sağlanması amaçlanmıştır. Ayrıca çalışmada, kitlesel üretilen embriyogenik kalluslar, farklı dozlarda sodyum aljinat (Na-Alg) ve CaCl2 ile enkapsüle edilmelerinden sonra farklı sıcaklıklarda ve farklı sürelerde depolanmışlardır ve depolama süresinin bitmesinin ardından farklı besin ortamlarına aktarılarak
çimlenme için en uygun besin ortamı kompozisyonunun belirlenmesine çalışılmıştır. Embriyogenik kallusların rejenerasyonunun sağlanması amacıyla gerçekleştirilen denemelerde en yüksek rejenerasyon yüzdesi, 4 mg/L BAP ve 1,5 mg/L IBA içeren MS besin ortamında (Z38) %80 olarak elde edilmiştir. Bu besin ortamında elde edilen embriyogenik kalluslar olgunlaştırma ortamlarına aktarılmış ve 4 mg/L BAP, 1,5 mg/L IBA ve 50 g/L sükroz içeren MS besin ortamında (XS5) %100 oranında sekonder embriyogenez gözlenmiştir. Bu bulgudan yola çıkılarak biyoreaktör denemelerinde besin ortamı olarak XS5 besin ortamı kullanımına karar verilmiştir. Özellikle SETISTM biyoreaktörlerinde görülen kontaminasyon sorunu nedeniyle, antimikrobiyal bir ajan olan PPMTM besin ortamlarına 1 mL/L olarak ilave edilmiştir. PPMTM içeren ve içermeyen RITA® ve SETISTM biyoreaktörleri ile gerçekleştirilen çalışmalarda, en yüksek büyüme indeksi değeri (8,28), PPMTM içermeyen RITA® biyoreaktörlerde 1 g/L inokulum miktarında 3 dk/6 sa daldırma frekansında (B4R) bulunmuştur. En yüksek mL başına elde edilen embriyo adedi ise 7,57 embriyo/mL olarak yine RITA® biyoreaktörlerinde 5 g/L inokulum miktarında, 3 dk/3 sa'lik daldırma frekansında (B7R) tespit edilmiştir. Çalışmada elde edilen toplam embriyoların %54,49'unda kararma gözlenirken; %37,56'sı yeşil renkli, %7,95'u ise kırmızı renkli olmuştur. Kararmanın oluşmadığı B4R denemeleri, en yüksek yeşil embriyo rejenerasyonunun gözlendiği denemeler olarak belirlenmiştir. Elde edilen embriyoların genellikle globuler aşamada olmalarının yanı sıra, kalp şekilli ve kotiledon dönemindeki embriyolara da rastlanmıştır. Ayrıca 3 farklı denemede SETISTM biyoreaktörlerinde toplam 22, PPMTM içeren RITA® biyoreaktörlerinde ise toplam 6 adet sürgün rejenerasyonu da elde edilmiştir. Elde edilen embriyogenik kalluslar enkapsüle edildikten sonra depolanmışlar ve ardından çimlenme ortamlarına aktarılmışlardır. Ancak uzun depolamalar sonucunda sadece birkaç denemede başarılı sonuç elde edilmiş, elde edilen bu veriler istatistiki olarak anlamlı bulunmamıştır. Depolanmadan doğrudan çimlenme ortamına aktarılan ve %3 Na-Alg ve 50 mM CaCl2 kullanılarak enkapsüle edilen boncukların, ÇG5 (3 mg/L BAP ve 1 mg/L IBA içeren MS) ortamında çimlenme oranı %44,44 olarak belirlenmiştir. Ayrıca çalışmada artan depolama süresinin boncuklarda kararmayı arttırdığı, artan Na-Alg ve CaCl2 dozlarının ise daha sert ve daha mat renkli
boncuklar elde edilmesine neden olduğu gözlemlenmiştir. Çalışmada hiçbir denemede hiperhidrisite sorunu ile karşılaşılmamıştır.
Araştırma sonucunda çay bitkisine ait yaprak eksplantlarından embriyogenik kallusların üretimi için 4 mg/L BAP ve 1,5 mg/L IBA içeren MS besin ortamının kullanılması ve sekonder embriyogenez için ise aynı besin ortamı kompozisyonunda sükroz dozunun 50 g/L'ye çıkarılması gerektiği tespit edilmiştir. Geçici daldırma sistemine dayalı biyoreaktörlerde çay somatik embriyolarının kitlesel üretimi için en
etkili yöntem, RITA® biyoreaktörlerde 1 g/L inokulum miktarı ve 3 da/6 sa daldırma frekansı olarak belirlenmiştir. Sentetik tohumların üretimi için ise %3 Na-Alg ve 50 mM CaCl2 kullanılmasına, çimlenmenin sağlanması için ise 3 mg/L BAP ve 1 mg/L IBA içeren MS besin ortamının gerekli olduğuna karar verilmiştir. Elde edilen bu bilgiler pek çok çalışmaya yol gösterici niteliktedir.

Abstract:
In vitro techniques in the tea (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze) plant have been determined as the most effective techniques for clonal mass propagation, therefore, bioreactor productions that allow mass production have become a good alternative. Within the scope of this thesis, it was aimed to mass production of somatic embryos from embryogenic calli obtained by culturing leaf explants of in vitro tea plantlets in RITA® and SETISTM bioreactors. Morever in the study, after the encapsulation of the mass-produced embryogenic calli with different doses of sodium alginate (Na-Alg) and CaCl2, they were stored at different temperatures and at different times, and then transferred to different nutrient media after the expiry of the different storage period to determine the most suitable nutrient composition for germination.
In the trials carried out to ensure the regeneration of embryogenic calli, the highest regeneration percentage was obtained as 80% in MS medium (Z38) containing 4 mg/L BAP and 1.5 mg/L IBA. Embryogenic calli obtained in this nutrient medium were transferred to maturation media and 100% secondary embryogenesis was observed in MS medium (XS5) containing 4 mg/L BAP, 1.5 mg/L IBA and 50 g/L sucrose. Based on this finding, it was decided to use XS5 medium as the nutrient medium in the bioreactor trials. Due to the contamination problem especially in SETISTM bioreactors, PPMTM, an antimicrobial agent, was added to the nutrient media as 1 mL/L. In studies performed with RITA® and SETISTM bioreactors with and without PPMTM, the highest growth index value (8.28) was found in RITA® bioreactors without PPMTM in the amount of 1 g/L inoculum at 3 min/6 h immersion frequency (B4R). The highest number of embryos obtained per mL was determined as 7.57 embryos/mL, again in RITA® bioreactors in the amount of 5 g/L inoculum, at a immersion frequency of 3 min/3 h (B7R). While 54.49% of the total embryos obtained in the study were darkened, 37.56% of them were green and 7.95% were red. B4R trials in which darkening did not occur were determined as trials in which the highest green embryo regeneration was observed. Although the embryos obtained are generally in the globular stage, heart-shaped and cotyledonous embryos were also encountered. In addition, in 3 different trials, a total of 22 shoot regeneration were obtained in SETISTM bioreactors, and total of 6 shoot regeneration in RITA® bioreactors including PPMTM. The resulting embryogenic calli were stored after encapsulation and then transferred to germination media. However, as a result of long storage, successful results were obtained in only a few trials, and these data were not statistically significant. The germination rate of the beads, which were transferred directly to the germination medium without storage and encapsulated using 3% Na-Alg and 50 mM CaCl2, was determined as 44.44% in the MS medium containing 3 mg/L BAP and 1 mg/L IBA. In addition, it was observed in the study that increasing storage time increased the darkening of the beads, while increasing Na-Alg and CaCl2 doses caused obtaining harder and more nontransparent beads. Hyperhydricity problem was not encountered in any trial in the study.
As a result of the research, it was determined that MS medium containing 4 mg/L BAP and 1.5 mg/L IBA should be used for the production of embryogenic calli from leaf explants of the tea plant, and also the sucrose concentration should be increased to 50 g/L in the same medium composition for secondary embryogenesis. The most effective method for mass production of tea somatic embryos in bioreactors based on a temporary immersion system was determined as the immersion frequency for 3 da/6 h and the amount of 1 g/L inoculum in RITA® bioreactors. It was decided that 3% Na-Alg and 50 mM CaCl2 should be used for the production of synthetic seeds, and a MS medium containing 3 mg/L BAP and 1 mg/L IBA is required for germination. This information obtained is a guide for many studies.