Ras proteininin G12D izoformu oluşturularak terapötik moleküller ile hedeflenmesi ve ras aktivitesinin in vitro incelenmesi
Targeting ras protein with therapeutic molecules by engineering G12D isoform and in vitro examination of ras activity
Yazar: RAMAZAN KAŞMER
Danışman: DOÇ. DR. NİHAL KARAKAŞ
İstanbul Medipol Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Hücrede büyüme, çoğalma ve farklılaşma gibi biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde rol alan onkojenik RAS proteinleri ile yapılan araştırmalar, HRAS ve KRAS4B genlerinin 12. aminoasidinde meydana gelen nokta mutasyonunun (G12D) özellikle bazı kanser türlerinin oluşumunda ve ilerlemesinde etkili olduğunu ortaya koymuştur. Bu mutasyon, RAS'ın RAF ile etkileşimini arttırırken, GAP'a bağlanmasını önler. Sonuç olarak G12D mutasyonuna sahip RAS, hücre yüzeyindeki reseptör proteinlerinden sinyal almasa dahi taşıdığı mutasyon nedeniyle RAF/MEK/ERK yolu aracılığıyla hücre çekirdeğine sürekli olarak büyüme ve çoğalma sinyali iletir. Dolayısıyla, hücrenin uyarılmasına gerek duymadan sürekli olarak aktif olan bu sinyal yolağının baskılanması için RAS ile RAF arasındaki etkileşimi engelleyebilecek terapötik moleküller önem kazanmaktadır. Bu doğrultuda gerçekleştirilen in-silico analizler ile G12D onkojenik mutasyonuna sahip H-RAS veya KRAS4B izoformlarına bağlanabilen, RAS proteininin RAF ile etkileşimini engelleyen hedef moleküller, küçük molekül kütüphanesinden tespit edilmiştir. Bu çalışmada, daha önce belirlenmiş olan bu aday ligandlardan halihazırda klinikte kullanılanlarına öncelik verilerek in-vitro etkinliklerinin araştırılması hedeflenmiş ve öncelikle mutant proteinleri eksprese eden hücre hatları oluşturulmuştur. Optimum doz aralığı, 0-100µM molekül uygulamasını içeren hücre canlılığı analizleri neticesinde belirlenmiş ve aday moleküllerin hücrelere artan optimum dozlarda (0-10µM) uygulanmasının ardından aktif RAS çöktürme deneyleri ile RAS-RAF etkileşimi üzerindeki etkisi 0-24 saat aralığında incelenmiştir. Sonuç olarak, küçük molekül uygulamasının G12D mutant RAS proteinlerinin RAF'a bağlanma kapasitesinde anlamlı derecede azalmaya sebep olduğu gösterilmiştir. Böylece kanser hastalarına, özellikle RAS-G12D mutasyou taşıyalar için kişiselleştirilmiş tedavi seçeneklerini mümkün kılabilecek bir yaklaşım sağlayabilecek hedef moleküllerin in-vitro etkinliği belirlendi.

Abstract:
Studies with oncogenic RAS proteins, which play a role in the regulation of biological processes such as cell growth, proliferation and differentiation, revealed that the point mutation (G12D) in the 12th amino acid of the HRAS and KRAS4B genes is involved in the formation and progression of some cancer types. This mutation prevents RAS from binding to GAP while increasing its interaction with RAF. As a result, RAS with G12D mutation continuously transmits growth and proliferation signals to the cell nucleus via the RAF/MEK/ERK pathway due to the mutation it carries, even if it does not receive signals from receptor proteins on the cell surface. Therefore, therapeutic molecules that can inhibit the interaction between RAS and RAF gain importance in order to suppress this signaling pathway, which is constantly active without the need for stimulation of the cell. In this direction, target molecules that can bind to H-RAS or KRAS4B isoforms with G12D oncogenic mutation and prevent the interaction of RAS protein with RAF have been determined from the small molecule library via in silico studies. In this study, it was aimed to investigate the in-vitro activities of these previously determined candidate ligands, giving priority to the repurposed drugs. For this, firstly, cell lines expressing mutant proteins were created. Optimum dose range was determined according to cell viability analyzes upon 0-100µM molecule treatments. Then, cells were treated with an optimum dose (0-10µM) of candidate molecules, and the effect on RAS-RAF interaction by active RAS precipitation was investigated. In conclusion, small molecule administration has been shown to cause a significant decrease in the RAF binding capacity of G12D mutant RAS proteins. Thus, in-vitro efficacy of target molecules was determined , which may provide an approach that can enable personalized therapy options for cancer patients, especially RAS-G12D expressors.