Kan dışı örneklerde hepatit C virus RNA'sının araştırılması
Investigation of hepatitis C virus RNA in samples other than blood
Yazar: TUĞÇE İŞADAM
Danışman: PROF. DR. A. ARZU SAYINER
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Genotip = Genotype ; Hepatit C = Hepatitis C ; Hepatit C virüsü = Hepatitis C virus ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA

Özet:
Hepatit C virus (HCV) enfeksiyonu kronik hepatit, karaciğer sirozu ve hepatoselüler karsinomun en önemli nedenlerinden biridir. Hepatit C, yüksek oranda (%70-80) kronikleşen ve yıllarca asemptomatik seyreden bir enfeksiyondur.Kronik hepatit C enfeksiyonunda patogenez ve interferon+ribavirin tedavisinde yanıtsızlığa yol açan etkenler net olarak ortaya konamamıştır. Ekstrahepatik hepatit C virusu (HCV) replikasyonun bulaşmada, bağışık yanıttan kaçışta ve tedavi başarısızlğında yol oynayabileceğine ilişkin çelişkili veriler bulunmaktadır. Bu alandaki verilere katkı yapmak amacı ile planlanan çalışmada, kronik HCV hastalarından alınan farklı örneklerde (idrar, tükürük, dışkı), HCV RNA varlığı araştırıldı, pozitif bulunması durumunda kantitasyon ve HCV genotipi açısından aynı hastaya ait plazma örneğinden elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldı. Araştırmanın hipotezi; Hepatit C ile enfekte hastalarda vücudun farklı kompartmanlarında Hepatit C virusunun bulunduğu ve bu kompartmanlardaki viral yükler arasında bir fark olmadığıdır.On beş adet kronik hepatit C enfeksiyonu olan kişiden alınan plazma, tükürük, idrar ve dışkı örnekleri kantitatif izlenebilir (?real-time?) ters transkriptaz polimeraz zincir tepkimesi (RT-PZT) yöntemi kullanılarak HCV RNA açısından incelendi. Nükleik asit ekstraksiyonu QIAamp® Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Almanya) ile yapıldı. Plazma dışı örneklerde farklı modifikasyonlar ile duyarlılığı en iyi yöntem araştırıldı. RT-PZT işlemi artus HCV RG RT-PCR Kit (Qiagen, Almanya) kullanılarak, Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Avusturalya) cihazında gerçekleştirildi. Aynı hastaya ait olan plazma ve plazma dışı örneklerde pozitiflik saptanması durumunda, restriksiyon enzim analizi yöntemi kullanılarak viral genotip belirlendi.İncelenen on beş hasta plazmasından on tanesinde HCV RNA pozitif olarak saptandı. Plazmasında viral RNA saptanan hastalardan birinde tükürük, birinde idrar ve bir diğerinde dışkı örneğinde plazma viral yüküne eşdeğer veya daha düşük miktarda HCV RNA saptandı. Plazma örneklerindeki virus, genotip 1 olarak belirlendi. Tükürük, idrar ve dışkı örneklerinin genotiplendirmesi düşük virus miktarı nedeniyle gerçekleştirilemedi. Sonuç olarak, HCV RNA serum dışındaki örneklerde de bulunmakta ve saptanabilmektedir.Anahtar Kelimeler: Hepatit C Virusu, Polimeraz Zincir Tepkimesi, Genotipleme

Abstract:
Hepatitis C virus (HCV) is the one of major causes of chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis C infection becomes chronic in about 70-80% of cases and mostly do not exhibit any symptoms for years.It is not clear how hepatitis C cause chronic infection or resists to interferon+ribavirin treatment. There are conflicting data related to role of extrahepatic HCV replication on transmission, escape from the immune response and failure of therapy. This study aimed to make a contribution on this field by investigation of presence of HCV RNA in saliva, urine and stool from patients with chronic Hepatitis C. Any positive result at saliva, urine and stool samples compared with the result of same patients? plasma for viral load and HCV genotype. Hypothesis of this study was that HCV is present on different compartments of the body of patients with chronic hepatitis C infection and there is no difference among compartments regarding the viral loads.Plasma, saliva, urine and stool samples of 15 chronic hepatitis C patients were analyzed for the presence of HCV RNA by a quantitative real time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Nucleic acid isolation was done by QIAamp® Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Germany) with some modifications for non-plasma samples in order to have the best sensitivity in the assay. The commercial RT-PCR (Artus HCV RG RT-PCR Kit, Qiagen, Germany) assay was performed with a Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Australi). When plasma and any of the non-plasma samples of the same patient were positive, HCV genotype was determined by restriction fragment length polymorphism analysis.Ten of 15 patients? plasma samples were HCV RNA positive. Among these patients? samples, one of saliva, urine and stool samples, each belonging to a different patient were also HCV RNA positive. Viral loads of the non-plasma samples were either equal or lower than the same patients? plasma viral load. HCV genotype of plasma samples was determined as genotype 1. Genotyping of non-plasma samples could not be completed due to the low viral load of the samples. In conclusion, it was shown that HCV RNA is present and detectable in non-plasma samples.Key words: Hepatitis C Virus, Polimerase Chain Reaction, Genotyping