Kistik ekinokokkoz tanısında doğal ve rekombinant antijenlerin karşılaştırılması
Comparison of native and recombinant antigens for serological diagnosis of cystic echinococcosis
Yazar: FATMA İRVASA BİLGİÇ
Danışman: DOÇ. DR. DERYA DİRİM ERDOĞAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Antijenler = Antigens ; Echinococcosis = Echinococcosis ; Echinococcus granulosus = Echinococcus granulosus ; Kistler = Cysts ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic ; Seroloji = Serology ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Kistik ekinokokkoz (KE) Echinococcus granulosus larvalarının neden olduğu en yaygın helmint enfeksiyonlarından biridir. KE tanısı ve takibi serolojik testlerle tamamlanan görüntüleme yöntemlerine dayanır. Başta Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), İndirekt Hemaglutinasyon Testi) IHA ve Western Blotlama (WB) olmak üzere spesifik antikorların arandığı serolojik testlerde kist sıvısı (KS) en yaygın kullanılan antijen kaynağıdır. Fakat kist sıvısının heterojen yapısı, testlere göre değişen oranlarda yalancı pozitif veya yalancı negatif reaksiyonlara neden olmaktadır. Ayrıca iyileşen hastalarda KS'ye karşı oluşan antikorların uzun süre varlığını koruması nedeniyle tedavi sonrası takipte yetersiz kalabilmektedir. Standardizasyonun sağlanması ve test performansının artırılması amacıyla özellikle kist sıvısının bileşenlerinden Antijen B (AgB) ve Antijen 5 (Ag5)'in alt üniteleri olmak üzere çok sayıda rekombinant antijen tanımlanmıştır. Çalışmamızda, her biri yüksek duyarlılık ve özgüllük değerlerine sahip yeni AgB8/1, AgB8/2 ve Ag5'den oluşan rekombinant füzyon protein (Ag5+AgB8/1+AgB8/2) in total Immunoglobulin G (IgG) ELISA performansları KS ile karşılaştırılmış, KE hastalarının tanı ve takibinde yararlılığı araştırılmıştır. Radyolojik, serolojik ve/veya cerrahi olarak doğrulanmış 182 KE hastasına ait toplam 252 KE hasta serumu, diğer paraziter enfeksiyonlar açısından klinik, serolojik veya parazitolojik olarak pozitif tanı alan (alveoler ekinokokkoz (AE), fasiyolaz, toksokariyaz, toksoplazmoz, visseral leyişmanyaz, trişinelloz) 160 hasta serumu ve sağlıklı bireylere ait 30 serum örneği olmak üzere toplam 442 serum test edilmiştir. Kist sıvısı ve rekombinant antijen ELISA'da duyarlılık sırasıyla %86.5 ve %29.3, özgüllük sırasıyla % 82.6 ve % 94.2 olarak saptanmıştır. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ)'nün bildirdiği şekilde yapılan sonografik sınıflandırmaya göre kist evrelerine göre KS ELISA'nın pozitiflik oranı değiştirmiştir. Buna göre KS ELISA inaktif kist evresine (CE4-CE5) sahip hasta serum örneklerinde düşük oranlarda pozitiflik gösterirken, tedavi öncesi veya postoperatif nüks olduğu bilinen hastalarda, tedavi sonrası iyileşenlere göre daha yüksek seropozitiflik göstermiştir. Rekombinant antijen ELISA'da ise kist evrelerine göre anlamlı bir fark saptanmamış (P=0,085) iken, kistin karaciğer ve diğer organlarda yerleşimi arasında anlamlı fark bulunmuştur (P=0,030). Sonuç olarak çalışmamızda ilk kez tanımlanan (Ag5+AgB8/1+Ag8/2) füzyon rekombinant proteini, KE hastalarının tanı ve tedavi sonrası takibinde kullanılabilecek aday antijen olarak değerlendirilmiş, ancak antijenlerin tek tek olan hallerinden daha düşük duyarlılıkta bulunmuştur. Buna, rekombinant antijenlerin birbirine bağlanmasıyla oluşan füzyon proteinin üç boyutlu konfigürasyonu etki etmiş olabilir. Bu nedenle füzyon protein ve bileşenlerinin (Ag5, AgB8/1, Ag8/2) aynı şartlar altında karşılaştırılmalı olarak test edilmesi gerektiği kanısına ulaşılmıştır.

Abstract:
Cystic echinococcosis (CE) is one of the most common helminthic infections and is caused by larvae of the tapeworm Echinococcus granulosus. Diagnosis and monitoring CE is mainly based on imaging methods. Serologic tests complement the imaging methods. Cystic fluid (CF) is the most commonly utilized antigen source when performing serologic tests. Specific antibodies are sought in serologic tests such as ELISA, IHA and WB. However, heterogeneous antigenic nature of cyst fluid results in varying percentages of false positive and false negative reactions with respect to the type of serologic test. Additionally, serology may be inadequate in post-treatment follow-up due to long term presence of antibodies against CF in cured patients. In order to ensure standardization and increase test performance many recombinant antigens were described. Two of these antigens are the subunits of the cyst fluid components Antigen B (AgB) and Antigen 5 (Ag5). In our study, recombinant fusion protein (Ag5+AgB8/1+AgB8/2) consisting of AgB8/1, AgB8/2 and Ag5, all of which having a high sensitivity and specificity, was compared to cyst fluid using total Immunoglobulin G (IgG) ELISA test. Also, the usefulness of the recombinant fusion protein (Ag5+AgB8/1+AgB8/2) in the diagnosis and follow-up of CE patients was investigated. Two hundred fifty two patient sera belonging to 182 CE patients whose diagnoses were confirmed radiologically, serologically and/or surgically were tested. Together with 252 CE sera, 160 patient sera from individuals who received a positive clinical, serologic or parasitological diagnosis with regards to other parasitic infections such as alveolar echinococcosis (AE), fascioliasis, toxocariasis, toxoplasmosis, visceral leishmaniasis, and trichinellosis were also tested. Finally, 30 serum samples from healthy individuals were tested bringing the total number of tested serum samples to 442. The sensitivity of cyst fluid and recombinant antigen tested by ELISA were 86.5% and 29.3%, respectively, whereas, the specificity of cyst fluid and recombinant antigen were 82.6% and 94.2%, respectively. Cyst stage as classified by ultrasound according to the World Health Organization (WHO) influenced the positivity rate of cyst fluid ELISA. Cyst fluid ELISA showed low percentage of positivity in patients with inactive cyst stage (CE4-CE5). However, before treatment or in patients with post-operative relapse seropositivity was higher compared to those who were cured after treatment. In recombinant antigen ELISA no significant difference was found between cyst stages (P=0,085), however, significant difference was found between the presence of cyst in the liver and in other organs (P=0,030). As a result, fusion recombinant protein (Ag5+AgB8/1+Ag8/2) which first described in our study was determined as a candidate antigen to be used in the diagnosis and post-treatment follow-up of CE patients. However, this recombinant antigen's sensitivity was found to be lower than the sensitivity of the individual antigens. This may be due the three dimensional configuration of the fusion protein resulting from connection of recombinant antigens to each other. For this reason, we conclude that the fusion protein and its constituents (Ag5, AgB8/1, Ag8/2) should be tested comparatively under the same conditions.