Kara hardal (Brassica nigra) bitkisinde bakır stresiyle ilişkili bazı genlerin anlatımsal profillemesi.
The expression profiling of some genes associated with copper stress from black mustard (Brassica nigra).
Yazar: YASEMİN YILDIZHAN
Danışman: PROF. DR. GÜL CEVAHİR ÖZ ; DR. BİRSEN CEVHER KESKİN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Botanik = Botany ; Genetik = Genetics

Özet:
Topraktaki ağır metal kirliliğini ortadan kaldırmak için çevreye zararlı ve oldukça pahalı olan fiziksel arıtım (remediyasyon) teknolojileri yerine bitkiler kullanılmakta ve bu teknolojiler "Fitoremediyasyon Teknolojisi" olarak adlandırılmaktadır. Bazı bitkiler ağır metal detoksifikasyonu ile ilişkili potansiyel mekanizmalara sahip olduğundan metal stresi altında canlılıklarını sürdürebilmektedir. Ağır metal toleransı ve birikimi ile ilgili mekanizmaların daha iyi anlaşılmasında bu bitkilerde yapılan moleküler çalışmalar büyük önem taşımaktadır.
Bu çalışmada fitoteknolojik yaklaşımların geliştirilmesi ve daha etkin hale getirilmesi için ağır metal metabolizmasındaki düzenleyici mekanizmaların belirlenmesi hedeflenmiştir. İlgili mekanizmalarda yer alan bazı genlerin bakır (Cu) stresi altında oluşan anlatım farklılıkları detaylı olarak incelenmiştir. Bu kapsamda kara hardal (Brassica nigra L.) bitkisinin, temel ağır metal kirleticilerden biri olan bakıra karşı gösterdiği tepkiler, farklı deneysel yaklaşımlarla analiz edilmiştir. Bitkiler için yaşamsal bir element olan, ancak fazla birikimi toksik etki oluşturan Cu, düşük konsantrasyonlarda (25 ve 50 µM CuSO4) 72 saat boyunca farklı ekotiplere uygulanmıştır. Yüksek bakır içeren topraklarda kolaylıkla yetişebilen, Diyarbakır ili civarından toplanan Brassica nigra bitkisinin bu metale karşı toleransı, aynı bitkinin farklı ekotipleriyle (CGN06625 ve CGN06626, Etiyopya kökenli) karşılaştırılmıştır. Ekotiplerin kök, gövde ve yapraklarında bulunan Cu miktarları ICP-OES (İndüktif Eşlenmiş Plazma-Optik Emisyon Spektrometre) tekniği kullanılarak belirlenmiş ve Diyarbakır ekotipinin diğer ekotiplere nazaran Cu stresine karşı toleransının daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, yapılan istatistiksel analizlerle sonuçların kendi içinde anlamlı olduğu doğrulanmıştır.
Brassica nigra' nın Cu stresi altında kök dokusunda farklı anlatım yapan genlere ait mikroarray verileri temel alınarak, ağır metal metabolizması ve metal homeostazisi ile ilişkili olan 23 adet gen tespit edilmiştir. Bu genlerden seçilen 8 tanesinin doğrulama çalışmaları, daha güvenilir bir metot olan kantitatif RT-PZR (Ters Yazılım Polimeraz Zincir Reaksiyonu) analizi ile yapılmıştır. Toleranslı olan ve olmayan ekotiplerin kök, gövde ve yaprak dokularında bu genlerin, farklı konsantrasyonlarda Cu stresi altındaki mRNA anlatım profilleri detaylı olarak incelenmiştir. Genlerin anlatımlarında tespit edilen bu farklılıklar, bitkilerde Cu metabolizmasıyla ilişkili yolakların aydınlatılmasına ve fitoremediyasyon amaçlı transgenik çalışmalara önemli katkılar sağlayacaktır.

Abstract:
The use of plants to bioremediate of heavy metals from contaminated soil is called "Phytoremediation Technology" which is considered less harmful and cheaper than physicochemical approaches. Some plants can survive under metal stress since they have the potential mechanisms to detoxify heavy metals. Molecular studies conducted with these plants are considerably important for better understanding of the mechanisms related with heavy metal tolerance and accumulation. 
In this study, we aimed to identify regulatory mechanisms of heavy metal metabolism in response to heavy metal copper (Cu) to develop and increase the efficiency of phytotechnological approaches. Detailed studies were completed to find out differentially expressed genes under Cu stress, one of the environmental important heavy metal contaminant. For this aim, the response of black mustard (Brassica nigra L.) to Cu, was thoroughly evaluated using different experimental approaches. Copper is an essential trace element for plants, but it can be toxic in case of high levels of accumulation. Low concentrations (25 and 50 µM CuSO4) of Cu were applied to different ecotypes for 72 hours. Brassica nigra plants collected from Diyarbakır, Turkey, which can survive at high level Cu concentrations, and two other ecotypes (CGN06625 and CGN06626, Ethiopian origin) were compared for Cu tolerance. Heavy metal accumulation in root, shoot and leaves of these ecotypes were detected using ICP-OES (Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy). It was shown that Diyarbakır ecotype had higher Cu tolerance than the other ecotypes. Also, statistical analyses were conducted to confirm the consistency of the results. 
Twenty-three genes related to heavy metal mechanism and metal homeostasis were defined from Brassica nigra microarray data which performed with root tissue under Cu stress. Among the these genes, 8 genes were selected for the validation with more robust technique quantitative RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Detailed mRNA expression profiles of these genes were evaluated in roots, shoots and leaves of three tolerant and non-tolerant Brassica nigra ecotypes exposed to different concentrations of Cu. Genes shown to be differentially expressed will provide important contributions to understand pathways related to Cu metabolism and transgenic studies for phytoremediation applications of plants.