Bufo viridis metamorfozu sırasında kuyruktaki apoptoziste hücre-ekstrasellüler matriks etkileşimlerinin rolünün belirlenmesi
Determination of the role of cell to extracellular matrix interactions on apoptosis in Bufo viridis tail during metamorphosis
Yazar: MESUT ŞAHİN
Danışman: DOÇ. DR. ERDAL BALCAN
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Bufo viridis = Bufo viridis ; Kollajen = Collagen ; Matriks metalloproteinazlar = Matrix metalloproteinases

Özet:
Anur metamorfozu en ilgi çekici biyolojik olaylardan biridir. Tek hormon etkisiyle başlatılan ve sürdürülen metamorfoz oldukça kısa zamanda gerçekleşir. Metamorfoz sürecinde larvalar sucul ve herbivor bir yaşamdan karasal ve karnivor bir yaşama uyum için gerekli dramatik değişimler geçirirler. Ergin yaşam için gerekli yeni organların oluşması başlıca hücre çoğalması ve farklılaşmasını içerir. Larval hayata ait, ergin yaşamda ihtiyaç duyulmayan organların ortadan kaldırılması ise apoptozis aracılığıyla gerçekleşir. Kısalan kuyruktaki hücre ölümünün mekanizması için iki model önesürülmüştür. Bunlardan ilki olan intihar modeli hücrelerin hormona yanıt olarak dahili yolaktan ölüme yönlendiklerini öne sürer, diğeri, katil modeli ise hücrelerin diğer hücrelertarafından veya ekstrasellüler matriksle olan bağlantılarını kaybetmeleri sonucunda öldürüldüklerini öne sürer. Bu çalışmada Bufo viridis larvalarında kendiliğinden ve tiroidhormonu ile indüklenen metamorfoz sırasında kuyruktaki hücre ? ekstrasellüler matriks etkileşimlerinin apoptozisle ilişkisi TUNEL, immunohistokimya ve immunoblotting yöntemleriyle belirlenmeye çalışılmıştır. Bu amaçla hücre ? ekstrasellüler matriks etkileşimlerinde önemli rolü olan integrin beta 1 alt ünitesi; integrin beta 1'in ekstrasellüler ligandlarından biri olan tip IV kollajen ve her ikisinin de yıkımında rol alanmatriks metalloproteinaz 1 moleküllerine spesifik antikorlar seçilmiştir. Ayrıca apoptozisi belirleme yöntemlerinden TUNEL ve aktif kaspaz 3 immunohistokimyası karşılaştırılmıştır. Özellikle kas dokusundaki matriks metalloproteinaz 1 miktarınınmetamorfoz klimaksının erken evrelerinde büyük oranda arttığı ve kollajen yıkımının bu evrede gerçekleştiği gözlenmiştir. Apoptotik hücrelerde integrin beta 1 işaretlenmesininarttığı belirlenmiştir. Apoptozisin erken evrelerindeki hücreleri belirlemede kaspaz 3 immunohistokimyasının, ilerleyen evrelerindeki hücreleri belirlemede ise TUNELyönteminin daha uygun olduğu gözlenmiştir. Kas hücrelerinin ölümünün metamorfoz klimaksının erken evrelerinde başladığı ve kuyruk gerilemesi süresince devam ettiği gözlenmiştir. Bulgularımız kas dokusundaki hücre ölümünün hücre ekstrasellüler matriks bağlanmalarının kopması sonucunda gerçekleştiğini düşündürmüştür. Epitel dokusunda hücrelerin tek tek ölüme yönlendikleri görülmüştür. Sürecin tam olarak aydınlatılması için integrin/fokal adezyon kinaz sinyal yolağında yer alan moleküllerin immunohistokimya ve immunoblotting yöntemleriyle incelenmesi veya floresan boyalarla işaretenerek in vivo incelenmesi yararlı olabilir.

Abstract:
Anuran metamorphosis is one of the most interesting biological phenomenons. Metamorphosis, which is started and continued with single hormone action, takes place quite short time. Larvae undergo dramatic changes needed to adopt terrestrial andcarnivore life from aquatic and herbivore life during metamorphosis. Forming of new organs include mainly cell proliferation and differentiation necessary for adult life.Elimination of larval organs, which is not necessary for adult life, occurs via apoptosis. There are two models were argued for explaining cell death in regressing tail. The first oneis suicide model which suggests that cells commit to death by intrinsic pathway to respond of hormone; the latter one is murder model which suggests that cells killed by other cells orby losing their connections between extracellular matrix. In this study, relationship between cell to extracellular matrix interactions to apoptosis were tried to determine in tailduring spontaneously occurring and thyroid hormone induced metamorphosis of Bufo viridis larvae using TUNEL, immunohistochemistry and immunoblotting techniques. Forthis purpose, antibodies specific for integrin beta 1 which has important role in cell to extracellular matrix connection; type IV collagen which is one of the extracellular ligandsof integrin beta 1 and matrix metalloproteinase 1 which has role of degradation of both of these molecules selected. Additionally, apoptosis determination methods TUNEL andactive caspase 3 immunohistochemistry were compared. It was seen that especially matrix metalloproteinase 1 amount in the muscle tissue was increased onset of metamorphic climax and coincides with collagen IV degradation. Integrin beta 1 labeling was increased in apoptotic cells, was determined. Also, while determining the cells in early stages ofapoptosis, caspase 3 immunohistochemistry was more appropriate, determining the cells in late stages of apoptosis, TUNEL was more appropriate, was seen. It was seen that death of muscle cells begin in early stages of metamorphic climax and continue for regressionperiod of the tail. Our results suggest that cell death in muscle tissue derived from disruption of cell to extracellular matrix adhesion. Cells commit to die individually in epithelium was seen. Detecting molecules of Integrin/focal adhesion kinase pathway by immunohistochemical and immunoblotting methods or in vivo by marking withfluorescence dyes might be useful to clarify the process.