Bryum capillare hedw., Sphagnum palustre L. ve thamnobryum alopecurum (Hedw.) gangulee'nin doku kültürü yöntemleriyle çoğaltılması, biyolojik aktivite ve fenolik içeriklerinin tesbiti
Propagating of bryum capillare hedw., Sphagnum palustre L. ve thamnobryum alopecurum (Hedw.) gangulee with tissue culture methods, identifying biological activity and phenolic content
Yazar: YASİN HAZER
Danışman: DOÇ. DR. HATİCE ÇÖLGEÇEN
Bülent Ecevit Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Doku kültürü = Tissue culture ; Fenolik bileşikler = Phenolic compounds ; HPLC =   ; Yüksek basınç sıvı kromatografisi =

Özet:
Bu çalışmada Bryum capillare Hedw., Sphagnum palustre L. ve Thamnobryum alopecurum (Hedw.) Gangulee türlerinin in vitro doku kültürü, antioksidan aktivitesi, total fenol içeriği ve 12 fenolik bileşik standardı kullanılarak HPLC-UV analiziyle kantitatif miktar tayininin yapılması amaçlandı. B. capillare ve T. alopecurum türlerinin olgun kapsüllerinin sporları ve gametofitin uç sürgünleri kullanılarak, S. palustre'nin ise sporofit evresine rastlanmadığından yalnızca gametofitin kapitulum kısımları kullanılarak in vitro kültürleri yapıldı. 8 farklı modifiye MS (Murashige and Skoog, 1962) besin ortamına (farklı konsantrasyonlarda bitki büyüme düzenleyicileri ve/veya şeker eklenerek) ekimi yapılan bu üç türün in vitro doku kültürü ile rejenerasyonları başarıyla sağlandı. B. capillare spor kültürü ve gametofit kültüründe en iyi büyüme gösteren ortam MS3 (30 g/l sakkaroz, 0,5 mg/l kinetin, 0,5 mg/l 2,4 D)'tür. S. palustre gametofit kültüründe en iyi büyümenin görüldüğü ortam MS1 (şekersiz, bitki büyüme düzenleyicisiz)'dir.T. alopecurum spor kültüründe en iyi büyümenin gerçekleştiği ortam MS3(30 g/l sakkaroz, 0,5 mg/l kinetin, 0,5 mg/l 2,4 D) iken gametofit kültüründe bu MS1 (bitki büyüme düzenleyicisiz ve şekersiz)'dir.
Üç türün doğadan toplanan taze örneklerinin antioksidan aktivitesi, DPPH (2,2 difenil 1, pikril hidrazil) serbest radikali giderim aktivitesi metoduyla, total fenol miktarı ise Folin-Ciocaltaeu metoduyla yapılmıştır. BHT (Butil Hidroksi Toluen), BHA (Bütilhidroksianisol) ve askorbik asit ile bu üç türün antioksidan aktivitesi karşılaştırıldığında en yüksek DPPH serbest radikali giderme etkisi %85 civarında B. capillare'de görüldü. Total fenol içeriği bakımından gallik asit eşdeğerine göre en yüksek B. capillare ekstraktının ortalama 0,034±0,004 mg/g, S. palustre 0,032±0,004 mg/g ve T. alopecurum ise 0,0065±0,0015 mg/g içeriğe sahip olduğu saptanmıştır.
Üç türün doğadan Kasım ve Mayıs (2012) aylarında toplanmış taze örnekleri, farklı tarihlerde toplanmış B. capillare ve T. alopecurum herbaryum örnekleri ile in vitro doku kültürü ile üretilen örnekler arasında 12 farklı fenolik bileşiğin (gallik asit, kafeik asit, p-kumarik asit, taksifolin, rosmarinik asit, kaempferol, genistein, quercetin, biokanin A, daidzein, formononetin, şikimik asit) HPLC-UV ile kantitatif tayinleri yapıldı. Türler arasında 12 farklı bileşikte en yüksek miktarı veren tür B. capillare oldu. B. capillare spor kültüründe en yüksek miktarda MS4 ortamında şikimik asit 261,65±21,84 mg/g, gametofit kültüründe en yüksek miktarda MS6 ortamında şikimik asit 220,4±17,3 mg/g, herbaryum örneklerinde ise en yüksek miktarda 9. ayda toplanan ekstraklarında gallik asit 1,20±0,4 mg/g.S. palustre gametofit, T. alopecurum spor ve gametofit kültürlerinde en yüksek miktarda şikimik asit sırasıyla MS4 251,88±88,3 mg/g, MS8 120,92±41,4 mg/g, MS1 118,6±47,7 mg/g ortamlarında saptanmıştır. Ancak herbaryum örneklerinde ise en yüksek miktarda 4. ayda toplanan ekstraklarında şikimik asit 3,52±1,84 mg/g olarak belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre bu üç tür, etkin bir şekilde in vitro kültür ortamlarında üretildi veayrıca fenolik bileşikler yönünden zengin ve dikkate değer antioksidan aktiviteye de sahip oldukları saptandı.

Abstract:
In this study, it is aimed to find out the quantitative amount of Bryum capillare Hedw., Sphagnum palustre L. ve Thamnobryum alopecurum (Hedw.) Gangulee species, which have important roles in the ecosystem, via HPLC-UV analysis by using the in vitro tissue culture, antioxidant activity, total phenol content and 12 phenolic compound standart. For in vitro cultures, spores of the mature capsules and apical shoots of gametophyte of B. capillare and T. alopecurum species were used, whereas for S. palustre L. species only the capitulums parts of gametophyte were used due to the fact that its sporophytes stage of was not seen. Through in vitro tissue culture, the regeneration of these three species which were cultivated (by adding various concentrations of plant growth regulators and/or sugar) in 8 different modified MS (Murashige and Skoog, 1962) nutrient medium was successfully achieved. In B. capillare spores culture and gametophyte culture, the medium which showed the best growth was MS3 (30 g sucrose, 0.5 mg/l kinetin, 0.5 mg/l 2,4 D). In S. palustre gametophyte culture, the best growth was observed in MS1 (plant growth regulator and sugar free) medium. While the best growth in T. alopecurum spores culture was observed in MS3 (30 g sucrose, 0.5 mg/l kinetin, 0.5 mg/l 2,4 D) medium, in gametophyte culture it was MS1 (plant growth regulator and sugar free). 
The antioxidant activity of the fresh samples of these three species that have been collected from nature was done with the DPPH (2,2 diphenyl- 1, picryl hydrazyl) free radical scavenging activity method, while their total phenol amount was identified with the Folin-Ciocaltae method. When the antioxidant activity of these three species was compared withBHT (Butylated hydroxytoluene), BHA (Butylated hydroxyanisole) and ascorbic acid, the highest free radical scavenging effect, nearly about 85%, was seen in B. capillare. In terms of total phenol content, according to gallic acid equivalents, it was defined that the highest B. capillare extract had an approximate content of 0.034 ± 0.002 mg/g, S. palustre 0.031 ± 0.004 mg/g and T. alopecurum had the content of 0.0065 ± 0.0015 mg/g on the average.
On the fresh samples of three species collected from nature in November and May (2012), the B. capillare and T. alopecurum herbarium samples collected at different times and the other samples which were grown with in vitro tissue culture, 12 different phenolic compounds (gallic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, taxifolin, rosmarinic acid, kaempferol, genistein, quercetin, biochanin A, daidzein, formononetin, shikimic acid) were determined quantitatively by means of HPLC-UV. Among the species in 12 different compounds, B. capillare had the highest amount. In B. capillare spores culture, the highest amount of shikimic acid was in MS4 medium (261.65 ± 21.84 mg/g); in gametophyte culture, the highest amount of the same acid was in MS6 medium (220.4 ± 17.3 mg/g), while in herbarium samples the highest amount of gallic acid collected from the 9-month-old extracts was 1.20 ± 0.4 mg/g. The highest amounts of shikimic acid in S. palustregametophyte culture, T. alopecurum spores culture and in gametophyte culture were determined in MS4 medium (251.88 ± 88.3 mg/g), in MS8 medium (120.92 ± 41.4 mg/g) and in MS8 medium (120.92 ± 41.4 mg/g) respectively. However, in herbarium samples the highest amount of shikimic acid collected from the 4-month-old extracts was seen as 3.52 ± 1.84 mg/g. By means of the obtained results, these three species were found to be rich in phenolic compounds and also with antioxidant activity.