Humik ve fulvik asitin Cryphonectria parasitica üzerinde hipovirülans oluşumuna etkisinin lakkaz enzimi kullanılarak araştırılması
Investigation of the effect of humic and fulvic acid on hypovirulence formation on Cryphonectria parasitica by using laccase enzyme
Yazar: İREM ARSLAN
Danışman: PROF. DR. SEMİHA ERİŞEN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Cryphonectria parasitica = Cryphonectria parasitica ; Fulvik asit = Fulvic acid ; Hümik asit = Humic acid ; Lakkaz = Laccase

Özet:
Cryphonectria parasitica, Latincesi Castanea olan kestane ağaçlarında kestane dal kanserine neden olan bir mantardır. Pozitif çift sarmallı RNA (dsRNA) virüsü ile enfekte olan hipovirülent C.parasitica suşu, hastalığın biyolojik kontrolü olarak Avrupa ülkelerinde sıklıkla kullanılmaktadır. dsRNA'nın varlığı mantar sporülasyonunu azaltmakta ve aseksüel üremeyi engellemekte; böylece hastalığın yayılmasını önlemektedir. Kestane dal kanseri etkeni olan virülent izolat, hipovirülent izolatla birlikte kültürlendiğinde hipovirülans geliştirdiği bilinmektedir. Lakkaz, mantarlarda lignin yıkımı, pigment sentezi ve morfogenez gibi birçok süreçte görev yapan bir enzimdir. C. parasitica'nın patojenitesi lakkaz ile bağlantılıdır. C. parasitica'da hipovirülans gelişmesi lakkaz aktivitesinde azalmaya neden olur.
Bu çalışmada, topraktaki fulvik ve humik asit konsantrasyonlarının C. parasitica'da hipovirülans gelişimine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla virülent ve hipovirülent C. parasitica suşları PDA ortamına inoküle edildi ve karanlıkta 7 gün 24 ± 2°C'de inkübe edildi. Suşlar Bavendamm testi yapılarak değerlendirildi. Suşlar, hipovirülent suşun virülent suşun transformasyonu üzerindeki etkisi ile fulvik ve humik asidin bu transformasyon üzerindeki etkisini incelemek için farklı konsantrasyonlarda fulvik asit ile  fulvik + humik içeren selofanlı PDA ortamında ekildi. 14 günlük inkübasyondan sonra toplanan örneklerden RNA ve protein izolasyonları yapılmıştır. İzole edilen total RNA, lakkaz spesifik oligonükleotidler kullanılarak kurulan real time PCR ile transkrpsiyon düzeyindeki farklılıkları nicel olarak analiz edildi. Enzim aktivitesi ise total ham özütteki lakkaz enzimin aktivitesi ölçülerek değerlendirildi.
Sonuçlar, fulvik ve humik asit içeren PDA besiyerlerinde hipovirülent izolat ile birlikte kültüre edilen virülent izolatların hipovirülans özellik kazandığı ve C. parasitica'nın virülent suşlarının her zaman hem hipovirülent izolattan hem de hipovirülente dönüşümü sağlanmış izolatlardan daha fazla lakkaz ürettiğini göstermektedir. Ayrıca 75 ppm'lik fulvik asit varlığında lac1 gen transkripsiyonunun düşmesi aynı zamanda lakkaz enzim aktivitesinindeki azalmanında gözlenmiş olması ve bunun  morfolojik bulgularla desteklemesi ile hipovirülans  özelliğin kazanılmasında 75 ppm'lik fulvik asit varlığının önemli olabileceğini  düşündürmüştür.  

Anahtar Kelimeler: Kestane dal kanseri, Cryphonectria parasitica, Hipovirülanslık, Humik asit, Fulvik asit, Lakkaz

Abstract:
Cryphonectria parasitica is a fungus that cause chestnut blight in chestnut trees (Castanea). The hypovirulent strain of C. parasitica, infected with positive double-stranded RNA (dsRNA) virus, is frequently used in European countries as a biological control of the disease. The presence of dsRNA reduces fungal sporulation, prevents asexual reproduction, thus prevents the spread of the disease. The virulent C. parasitica, the agent of chestnut blight, can develop hypovirulence when co-cultured with hypovirulent C. parasitica. Laccase is an enzyme involved in many processes such as lignin degradation, pigment synthesis, and morphogenesis in fungi. The pathogenicity of C. parasitica is linked to laccase. The development of hypovirulence in C. parasitica causes a decrease in laccase enzyme activity. 
In this study, aimed to investigate the effect of fulvic and humic acid concentrations in the soil on the development of hypovirulence in C. parasitica, For this purpose, virulent and hypovirulent C. parasitica strains were inoculated into PDA medium and incubated at 24 ± 2°C for 7 days in the dark. The strains were evaluated by the Bavendamm test. The strains were inoculated on cellophane PDA media containing different concentrations of fulvic acid and fulvic+humic acid to examine the effect of the hypovirulent strain on transformation the virulent strain and the effect of fulvic and humic acid on this transformation. After 14 days of incubation, RNA isolation and protein extraction were made from collected samples. The isolatedtotal RNA was quantitatively analyzed for differences in transcription level by real time PCR using laccase specific oligonucleotides. Enzyme activity was evaluated by measuring the laccase enzyme in the total crude extract. 
The results showed that virulent isolates co-cultured with hypovirulent isolate on PDA media containing fulvic and humic acid acquired hypovirulence and that virulent strains of C. parasitica always produced more laccase than both hypovirulent isolates and transformed isolates. In addition, the decrease in lac1 gene transcription in the presence of 75 ppm fulvic acid and the decrease in laccase enzyme activity in the presence of 75 ppm fulvic acid, supported by morphological findings. Those results sugges that the presence of 75 ppm fulvic acid may be important in the acquisition of hypovirulence. 

Keywords: Chestnut blight, Cryphonectria parasitica, Hypovirulence, Humic acid, Fulvic acid, Laccase