Kan kültürlerinden izole edilmiş meyerozyma guilliermondii suşlarının genotipik ve virülans özelliklerinin araştırılması
Investigation of the genotypic and virulence factors in blood culture i̇solates of meyerozyma guilliermondii
Yazar: NEJLA CEBECİ GÜLER
Danışman: PROF. DR. İLKNUR TOSUN
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Aspartik proteaz = Aspartic proteinase ; Elektroforez-agar jel = Electrophoresis-agar gel ; Kan kimyasal analizi = Blood chemical analysis ; Karyotip = Karyotype ; Meyerozyma guilliermondii = Meyerozyma guilliermondii ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Ribozomlar = Ribosomes

Özet:
Meyerozyma guilliermondii, insan deri ve mukozal yüzey mikroflorasının bir üyesidir. Bununla birlikte, fırsatçı patojen olarak ciddi enfeksiyonlara neden olmaktadır. Bu çalışmaya, 2006-2012 yılları arasında KTÜ Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarına gönderilen 119 hastanın örneklerinden izole edilmiş 136 izolat dahil edildi. Biyokimyasal yöntemlerle M. guilliermondii olarak tanımlanmış izolatlar genotipik yöntemlerle identifiye edilerek, antifungal duyarlılıkları ve salgı aspartik proteaz (Sap) aktiviteleri yönünden araştırıldı. Ayrıca, M. guillermondii suşlarının moleküler epidemiyolojik analizlerinde pulse field jel elektroforezi karyotipleme (PFGE-EK) ve PFGE genomik DNA restriksiyon enzim analizi (REAG) yöntemlerinin uygun birer yöntem olarak kullanılabilirliği araştırıldı. M. guillermondii izolatlarının moleküler identifikasyonları ribozomal ITS gen bölgelerinin DNA sekans analizleri ile ve ribozomal IGS gen bölgesinin PCR-RFLP bant paternleri karşılaştırılarak gerçekleştirildi. Antifulgal duyarlılık testleri Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems, ABD) mikrodilüsyon kiti ile 46 suşta saptandı. İzolatların Sap aktivitesi albümin agar besiyerlerinde gösterildi. M. guilliermondii suşlarının karyotipleri total genomik DNA'nın ve 12 değişik restriksiyon enzimi ile kesilen genomik DNA'nın PFGE'nde yürütülmesi ile gerçekleştirildi. İzolatlardan 135'i ITS DNA sekans analizlerine göre M. guilliermondii ve bir izolat Candida membranifaciens olarak tanımlandı. M. guilliermondii izolatlarının tümünün identifikasyonları PCR-RFLP analizi ile doğrulandı. Pan-azol (flukonazol, vorikonazol, itrakonazol) dirençli bir izolat belirlendi. İzolatlarda Sap aktivitesi zayıf veya hiç saptanmadı. M. guilliermondii'nin identifikasyonunda biyokimyasal ve moleküler yöntemlerin uyumlu olduğu gösterildi. ITS1 bölgesinin bu türlerin tanımlanmasında daha spesifik olduğu saptandı. M. guilliermondii suşlarının PFGE-REAG analizinde NotI, PacI ve SfiI enzimlerinin uygun olduğu belirlendi. M. guilliermondii suşlarının epidemiyolojik analizlerinde PFGE-EK ve PFGE-REAG yöntemlerinin kullanılabilirliği gösterildi.

Anahtar Sözcükler: Meyerozyma guilliermondii, ribozomal ITS gen sekansı, PCRRFLP, PFGE, antifungal duyarlılık, salgı aspartik proteaz2

Abstract:
Meyerozyma guilliermondii is a member of human normal skin and mucosal surface microflora. However, it causes serious infections as an opportunistic pathogen. This study included 136 M. guillermondii strains isolated from 119 patient samples sent to KTU, Faculty of Medicine, Medical Microbiology Laboratory between 2006-2012. The strains identified by using biochemical methods were identified by genetic methods, tested for their antifungal susceptibilities and secretory aspartic protease (Sap) activities. In addition, suitability of pulse field gel electrophoresis karyotyping (PFGE-EK) and PFGE genomic DNA restriction enzyme analysis (REAG) method use in the molecular epidemiological analysis of M. guillermondii was investigated. The molecular identification of M. guillermondii strains were carried out by DNA sequencing of the ITS gene regions and comparison of the PCR-RFLP band patterns of the ribosomal IGS regions. Antifungal susceptibility tests were performed for 46 strains using Sensititre YeastOne microdilution test kit (TREK Diagnostic Systems, USA). The Sap activities of isolates were tested on albumin agar medium. The karyotypes of M. guillermondii strains were determined by PFGE using total genomic DNA and genomic DNA digested with 12 different restriction endonuclease enzymes. Based on ITS DNA sequence analysis, 135 strains were identified as M. guilliermondii, and one strain as Candida membranifaciens. Identification of all M. guilliermondii strains was confirmed by PCR-RFLP analysis. One strain was pan-azol (fluconazole, voriconazole, itraconazole) resistant. Sap activity was found to be absent or weak for all strains. It has been demonstrated that biochemical and molecular methods were in agreement for the identification of M. guilliermondii. ITS1 region was shown to be more specific in the identification of these yeast species. The restriction endonuclease enzymes NotI, PacI and SfiI were determined to be suitable in PFGE-REAG analysis of M. guilliermondii strains. It was demonstrated that PFGE-EK and PFGE-REAG methods could be used in epidemiological typing of M. guilliermondii strains.

Key Words: Meyerozyma guilliermondii, ribosomal ITS gene sequence, PCR-RFLP,PFGE, antifungal susceptibility, secretory aspartic protease