Scytalidium thermophilum'dan ksi̇lanaz üreti̇mi̇ni̇n opti̇mi̇zasyonu, endüstri̇yel uygulamalar i̇çi̇n saflaştirilmasi ve karakteri̇zasyonu
Optımızatıon of xylanase productıon from scytalıdıum thermophılum, purıfıcatıon and characterızatıon for ındustrıal applıcatıons
Yazar: NESLİHAN ÖZBEN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. DİDEM SUTAY KOCABAŞ
Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, termofilik bir küf olan Scytalidium thermophilum'dan ksilanaz üretim koşulları, Box-Behnken deney tasarım yöntemi kullanılarak Tepki Yüzey Metodolojisi ile istatistiksel olarak optimize edilmiştir. Beş bağımsız değişkenin; aşı oranı, sıcaklık, pH, karbon ve azot kaynağı konsantrasyonunun ksilanaz üretimine etkisi incelenmiş ve çalışılan aralıkta en uygun fermantasyon koşulu 1 mL aşı oranı, 50˚C sıcaklık, 7,0 pH, 20 g/L mısır koçanı ve 5 g/L maya özütü olarak belirlenmiştir. Optimum koşullarda gerçekleştirilen fermantasyon sonucunda 134,09 IU/mL ksilanaz aktivitesi tespit edilmiştir. Bu sonucun, geliştirilen model eşitliğinden hesaplanan 133,91 IU/mL değeriyle uyumlu olduğu belirlenmiştir. Optimizasyon çalışmaları sonucunda enzim üretimi, başlangıç seviyesinin yaklaşık 2 katına çıkarılmıştır.

Ksilanazın endüstriyel uygulamalar için kısmi olarak saflaştırılması amonyum sülfat ile çöktürme, sulu iki faz ayrıştırma ve ultrafiltrasyon yöntemleri ile gerçekleştirilmiştir. Amonyum sülfatla çöktürme sonucunda %52 verimle 2,5 kat saflaştırma elde edilirken, sulu iki faz ayrıştırma tekniğinde  %79 verim ve 2,7, ultrafiltrasyon tekniğinde  ise %25 verimle 4,3 kat saflaştırma elde edilmiştir.

Karakterizasyon çalışmaları kapsamında ham ksilanaz aktivitesi ve dayanımına pH etkisi incelendiğinde, en yüksek bağıl aktivite pH 7-7,5 aralığında elde edilmiş ve enzim pH 7'de 4 saat inkübe edildiğinde aktivitesinin %70'ini korumuştur. Ksilanaz aktivitesi ve dayanımına sıcaklığın etkisi incelenmiş ve en yüksek aktivite 70ºC sıcaklıkta tespit edilirken, enzim 50°C sıcaklıkta 1 saat inkübasyon sonucunda aktivitesinin %75'ini korumuştur. Ham enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 1,93 mg/mL ve 347,1 U/mL olarak tespit edilmiştir.  Substrat seçiciliği incelemesi sonucunda ksilanazın, denenen ticari ve lignoselülozik substratlar içinde en yüksek afiniteyi sırasıyla huş ağacı ksilanı ve buğday kepeğine karşı gösterdiği belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, xylanase production conditions from a thermophilic fungus, Scytalidium thermophilum, were statistically optimized with Response Surface Methodology by using Box-Behnken experimental design method. Effect of five independent variables; inoculum level, temperature, pH, carbon and nitrogen source concentration, on xylanase production was investigated and optimum fermentation conditions were determined as 1 mL inoculum level, 50˚C temperature, 7.0 pH, 20 g/L corn cob and 5 g/L yeast extract within the working range. As a result of the fermentation at optimum conditions, 134.09 IU/mL xylanase activity was observed. This result was in agreement with the calculated value of 133.91 IU/mL from the proposed model equation. As the result of the optimization studies, enzyme production was increased to 2 fold of the initial level.

Partial purification of xylanase for industrial applications was studied with ammonium sulphate precipitation, aqueous two phase separation, ultrafiltration, and after ammonium sulphate precipitation 2.5 fold purification with 52% yield, aqueous two phase separation 2.7 fold purification with 79% yield and ultrafiltration 4.3 fold purification with 25% yield was obtained.

In the scope of characterization studies, by investigating the effect of pH on xylanase activity and stability, maximum residual activity was observed in the range of pH 7-7.5 and enzyme retained 70% of its activity after 4 hours incubation at pH 7.0. Effect of temperature on xylanase activity and stability was studied and maximum activity was determined at 70°C, whereas enzyme retained 75% of its activity at 50ºC after 1 hour incubation. Km and Vmax values of crude enzyme was found as 1.93 mg/mL ve 347.1 U/mL, respectively. As the results of substrate specificity studies, it was determined that within the commercial substrates tested, xylanase showed highest affinity towards birchwood xylan and wheat bran, respectively.