Sığır serum paraoksonaz enziminin saflaştırılması ve immobilizasyonu
The purification and immobilization of bovine serum paraoxonase
Yazar: MURAT SAYIN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ÖZEN ÖZENSOY GÜLER
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışmada, Eupergit C 250 L taşıyıcısına kovalent bağlanma yöntemiyle, HDL'nin antioksidatif bileşeni olarak düşünülen, oksidasyona karşı hem LDL ve HDL'yi, lipoproteinleri koruyan HDL'ye bağlı enzim bir enzim olan sığır serum paraoksonaz enziminin immobilizasyonu incelendi. Bu taşıyıcı enzimlerin özellikle endüstriyel uygulamalarında kovalent immobilizasyon metodu için uygun taşıyıcı olarak tanımlanmıştır. Önemli özellikleri ve ticari olarak farklı formları olan bir taşıyıcıdır.Sığır serum paraoksonaz enziminin saflaştırılması için hidrofobik etkileşim kromatografisini jeli, saf enzimden immobilizasyon prosesi ile immobilize enzim elde edilmesi amacıyla sentezlendi. Hidrofobik etkileşim kromatografisi jeli, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B'ye uzantı kolu olarak L-tirozin bağlandıktan sonra ligand olarak hidrofobik bir molekül olan 1-naftilaminin L-tirozine kenetlenmesi sonucu sentezlenmiştir.Sentezlenen hidrofobik etkileşim jeli ile uygulanan hidrofobik etkileşim kromatografisi ve amonyum sülfat çöktürmesi yöntemleri kullanılarak sığır serum paraoksonaz enzimi saflaştırılmıştır. Saflaştırılan sığır serum paraoksonaz enzimi SDS poliakrilamid jel elektroforezine uygulanarak yaklaşık 45kDa molekül ağırlığına sahip tek bant elde edilmiştirEnzim bağlanma yüzdesi ortalama % 74.6 ve katalatik etkinliği ortalama % 56.1 dir.Sığır serum paraoksonaz saf ve immobilize formlarının paraokson substratına karşı KM ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk yöntemi ile sırasıyla saf enzim için, 6.261 mM ve 169.65 U/mldakika olarak immobilize enzim için, 2.479 mM and 149.44 U/mldakika olarak bulunmuştur.Sığır serum paraoksonaz enziminin immobilize durumunun enzimatik özellikleri incelendi ve saf enzim ile karşılaştırıldı. Saf ve immobilize sığır paraoksonaz benzer optimum sıcaklıklar (25-45 ºC) ve pH (7.0) değerleri gösterdi ancak immobilize sığır serum paraoksonaz formu geniş pH aralıklarında daha güçlüdür. Sığır serum paraoksonaz enzimin Eupergit C 250 L ile bağlanmasının termal inaktivasyonu daha doğal durumuna göre daha yavaş olduğu gözlemlendi.ANAHTAR SÖZCÜKLER: Paraoksonaz (PON1), Hidrofobik etkileşim kromatografisi, İmmobilizasyon metodları, Eupergit C

Abstract:
In this work, we have investigated the immobilization of bovine serum paraoxonase which is a HDL-associated enzyme that protects lipoproteins, both LDL and HDL, against oxidation and it is considered as an antioxidative component of HDL, by covalent attachment to unmodified Eupergit C 250L. This support has been described as a suitable carrier for covalent immobilization of enzymes for industrial applications. It possesses good properties and is commercially available in different forms.On account of getting purified enzyme for immobilization process, a gel of hydrophobic interaction chromatography for purification of bovine serum paraoxonase was synthesized. The gel was synthesized with Sepharose-4B-L-tyrosine and 1-napthylamine as a hydrophobic ligand. Sepharose-4B was activated with CNBr and than L-tyrosine was add as a extension arm.Bovine serum paraoxonase was purified with ammonium sulfate precipitation and synthesized hydrophobic interaction chromatography. On SDS-polyacyrilamide gel electrophoresis, purified bovine serum paraoxonase to give a single band on SDS-PAGE with about weight of 45 kDa.The yield of bound enzyme was around % 74.6 and the catalytic efficiency was approximately % 56.1.The KM and Vmax values were determined for soluble and immobilized enzyme by the method of Lineweaver-Burk plots, using paraoxon as a substrate. For soluble enzyme the Km and Vmax was 6.261 mM and 169.65 U/mlmin., immobilized enzyme?s Km and Vmax was 2.479 mM and 149.44 U/mlmin., respectively.The enzymatic properties of immobilized bovine serum paraoxonase were investigated and compared with those of the soluble enzyme. Soluble and immobilized bovine serum paraoxonase showed similar optimum temperature (25?45 ºC) and pH (7.0) values, but the pH profile of the immobilized bovine serum paraoxonase was stronger at broad pH ranges. The thermo inactivation of the bovine serum paraoxonase coupled to Eupergit C 250 L was slower than the observed with the native enzyme.KEY WORDS: Paraoxonase (PON1), Hydrophobic interection chromatography, Immobilization methods, Eupergit C