Halofilik arke kaynaklı lipaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of extracellular lipase from halophilic archaea
Yazar: TANJU YILDIZ
Danışman: DOÇ. DR. GÜL ÖZYILMAZ
Mustafa Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Halofilik archaea = Halophilic archaea ; Hücre dışı enzimler = Extracellular ezymes

Özet:
Bu çalışmada halofilik arke kaynaklı ekstraselüler lipaz enziminin izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Halofilik arke suşlarının seçimi lipolitik aktivitelerine göre yapılmıştır. Seçilen suşlar, A-206 ve B-49 olarak sembolize edilmiştir. Suşlar %25 NaCl içeren SG broth besi ortamında üretilmiştir. En yüksek lipaz aktivitesi B-49 ve A-206 için sırasıyla 4 ve 5. üreme günlerinde elde edilmiştir. Ekstraselüler lipaz çözeltisi besi ortamının sırasıyla santrifüj, diyaliz ve deriştirilmesi ile elde edilmiştir. Lipaz enzimi saflaştırılmasında (NH4)2SO4 ile fraksiyonlu çöktürme, aseton ile fraksiyonlu çöktürme, Fenil-Sefaroz hidrofobik etkileşim kromatografisi ve DEAE-Sefadeks iyon değiştirici kromatografisi teknikleri kullanılarak saflaştırılmıştır. Enzimin saflığını kontrol etmek amacıyla saflaştırma aşamalarının herbirinin sonunda SDS-PAGE analizi yapılmıştır. Uygulanan teknikler kıyaslandığında, en yüksek oranda saflaştırmanın DEAE-Sefadex iyon değiştirici kromatografisi tekniği kullanıldığında B-49 suşuna ait lipaz enziminin 3,58 U/mg spesifik aktivite ile 62,81 kat; A-206 suşuna ait lipaz enziminin 4,49 U/mg spesifik aktivite ile 28,42 kat daha saf izole edildiği belirlenmiştir. Suşlara ait lipaz enziminin pNPB ve pNPA substratları için karakterizasyonu yapılmıştır. DEAE-Sefadeks iyon değiştirici ile elde edilen halofilik arke lipaz fraksiyonları pNPA ve pNPB substartları için karakterize edilmiştir. Optimal çalışma koşulları araştırılmış ve her  iki kaynak ve subsrat için pH (6,0-7,5), sıcaklık (40 º) ve NaCl derişimleri (3,0-3,5 M) belirlenmiştir. Ayrıca Ea (28,3-84,7 kJ/mol.K), enzimlerin denatürasyonunun başladığı sıcaklık (40-43 ?C), Km (3,81-7,16 mM) ve Vmax (7,93-65,47 U/mg) değerleri B-49 ve A-206 ve iki substrat için hesaplanmıştır

Abstract:
In this study, isolation and characterization of extracellular lipase of halophilic archaea was carried out.  Halophilic archaeal strains are selected according to their lipolytic activities. The selected strains are symbolized as A-206 and B-49. Strains were growth in SG broth medium containing 25 % NaCl. The highest lipase activities were get after 4 and 5 day culture period for B-49 and A-206, respectively. Extracellular lipase solution was obtained after centrifugation, dialysis and concentration of growth medium, respectively. Purification of lipase was carried out by using fractional precipitation with (NH4)2SO4,   fractional precipitation with acetone, DEAE-Sephadex   ion exchange chromatography and Phenyl Sepharose hydrophobic interaction chromatography techniques. In order to check purifying of the enzyme, SDS-PAGE analysis was carried out at end of the each purification step. When compared with crude lipase, B-49 strain lipase was 62.81 fold pure isolated with 3.58 U / mg specific activity and A-206 strain lipase was 28.42 fold pure isolated with 4.49 U/mg specific activity by DEAE-Sefadex ion exchange chromatography. Halophilic lipases get from DEAE-Sephadex ion exchange chromatography were characterized by pNPA and pNPB substrates. The optimal working conditions were investigated and pHs (6.0-7.5), temperatures (40 ºC) and NaCl concentrations (3.0-3.5 M) were determined for both lipases and substrates. Also, Ea values (28.3-84.7 kJ/mol.K), denaturation temperatures (40-43 ºC), Km (3.81-7.16 mM) and Vmax values (7.93-65.47 U/mg) were calculated for B-49 and A-206 for two substrates.