LC-MS/MS metoduyla steroid ölçümü ve metot validasyonu
Measurement of steroids by LC-MS/MS and method validation
Yazar: FATİH YEŞİLDAL
Danışman: PROF. DR. TANER ÖZGÜRTAŞ
GATA / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Steroidler, kolesterolden türevlenen ve çoğunluğu adrenal korteks, plasenta ve gonadlardan sentezlenen, vücutta birçok metabolik aktivitenin düzenlenmesinde rol alan biyolojik moleküllerdir. Birçok endokrin hastalık steroid biyosentezindeki bozukluklar nedeniyle yetersiz veya aşırı üretim sonucu ortaya çıkar. Bu hastalıkların teşhis ve takibinde, klinik laboratuvarlardaki steroid hormon ölçümü belirleyici rol oynar.     
Klinik laboratuvarlarda steroid ölçümü için en yaygın kullanılan metot immunoassaydir. Geçmişte yaygın olarak radyo immunoassay (RIA) tekniği kullanılırken, günümüzde ise çoğunlukla kemilüminesans immunoassay (CLIA) tekniğiyle çalışan otomatize cihazlar kullanılmaktadır. Bu metodun en önemli sorunu spesifitesinin yetersiz olmasıdır. Metotta kullanılan antikorlar başka steroidlerle veya benzer yapıdaki başka moleküllerle çapraz reaksiyon verebilmekte ve sonuçta interferanslar ciddi bir sorun oluşturmaktadır. Bununla birlikte, birçok steroid için kullanılan ticari kitlerin ve metodun kesinlik ve gerçeklik açısından test performansı yetersizdir. Steroid ölçümünde kullanılan bir diğer metot ise altın standart olarak kabul edilen GC-MS metodudur. Ancak bu metot da zahmetli örnek hazırlığı aşamaları ve uzun analiz süreleri nedeniyle rutin laboratuvarlarda kullanılamamaktadır. 
Bu tezin amacı sensitivitesi ve spesifitesi iyi olan gerçeklik ve kesinlik açısından test performansı yeterli ve klinik laboratuvarlarda yaygın olarak analizi yapılan steroidler için bir çalışma paneli oluşturmaktı. Sonuçta aynı çalışmada 14 steroidin ölçümüne olanak sağlayan bir izotop dilüsyon (ID) LC-MS/MS metodu geliştirildi. Bu çalışmada, MS için valide edilmiş kalibratör ve IS karışımı (Chromsystems, Gräfelfing, Almanya) kullanıldı. Bu metotta; örnek ekstraksiyonu için protein çöktürme işlemi, kromatografik ayrım için UPLC sistemi (Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 Rapid Separation LC System UHPLC+ Focused, San Jose, California, ABD) ve C18 selektivitesine sahip bir analitik kolon (Thermo Scientific, Hypersil GOLD UHPLC Kolon, 50 × 2.1 mm, Partikül Büyüklüğü: 1.9 µm), iyonizasyon için APCI iyon kaynağı ve üçlü kuadrupol (QQQ) içeren ardışık MS sistemi (Thermo Scientific TSQ Quantum Access MAX, San Jose, California, ABD) kullanıldı. MS taraması SRM (seçilmiş reaksiyon izleme) modunda ve pozitif polaritede yapıldı. 
Metot validasyonu işlemi CLSI kılavuzlarında belirtilen esaslara göre planlandı ve kesinlik, gerçeklik, tespit ve tayin limitleri, geri kazanım ve doğrusallık açısından değerlendirme yapıldı. Ayrıca 40 hasta örneği için, GATA Tıbbi Biyokimya Laboratuvarlarında kullanılan mevcut immunoassay metotlarla karşılaştırma yapıldı. Elde edilen ID-LC-MS/MS sonuçları; aldosteron (Beckman Coulter Immunotech Prag, Çek Cumhuriyeti) ve 17α-hidroksi progesteron (DIAsource, Louvain-la-Neuve, Belçika) için RIA ile; kortizol, DHEAS, östradiol, progesteron, total testosteron için CLIA ile (Siemens Advia Centaur XP, Tarrytown, NY, ABD); androstenedion için ise CLEIA metotlarıyla (Siemens Immulite 2000 XPi, Llanberis, Gwynedd, UK) karşılaştırıldı. Laboratuvarımızdaki bu metotlar için de ayrıca test performansı değerlendirildi. Sonuçlar aldosteron ve östradiol için; ID-LC-MS/MS metodunda, sırasıyla RIA ve CLIA metotlarına göre suboptimal düzeyde saptandı. CLIA metodu için kortizol, DHEAS, total testosteron, progesteron; CLEIA metodu için androstenedion ve RIA metodu için 17α-hidroksi progesteron sonuçları ID-LC-MS/MS sonuçlarıyla karşılaştırıldığında; ID-LC-MS/MS metot performansının daha üstün olduğu tespit edildi. Metot validasyonu verilerine göre 11-deoksikortizol, kortizon, kortikosteron, DHEA ve dihidrotestosteron sonuçlarının da test performanslarının iyi olduğu görüldü. 
Sonuçta, bu çalışma ile iki tanesi suboptimal olmak üzere 13 tane steroid için 11 dakikada sonuç veren bir ID-LC-MS/MS metodu valide edilmiştir. Özellikle immunoassay performansı kötü olan testler için veya interferans şüphesi olan immunoassay analizlerin kontrolü açısından, bu metotların yaygınlaşması klinik laboratuvarlar için faydalı olacaktır.

Abstract:
Steroids; which are derived from cholesterol and mostly synthesized in adrenal cortex, placenta and gonads; are biological molecules functioning in regulation of many metabolic activities in organism. Many endocrinological pathologies emerge because of the defects in steroid biosynthesis resulting in excess or insufficient secretion of steroids. Measurement of steroid hormones in clinical laboratories plays a decisive role in diagnosis and monitoring of these diseases.     
Immunoassays are the most commonly used methods for steroid analysis in clinical laboratories. In the past, radio immunoassay (RIA) methods were commonly used, but today automated instruments employing chemiluminescece immunoassay (CLIA) are widely used. The major drawback of this method is the lack of specificity.  The antibodies used in this methods may cross-react with other steroids or other similar molecules, and these intereferences result in serious problems. Additionally, commercially available many kits and methods have insufficient test performance, considering the precision and trueness. Another method for steroid analysis is GC-MS which is considered as the gold standard. However, this method can not be used in routine clinical laboratories because of laborious sample pretreatment steps and long analysis times. 
The aim of this study was to create a steroid profiling panel which was composed of the most commonly analyzed steroid hormones in clinical laboratory, and had a good test performance considering the precision, trueness, sensitivity and specificity. As a result, an isotope dilution (ID) LC-MS/MS method was developed, in which 14 steroids can be analysed in the same run. Validated calibrators for MS and IS mix (Chromsystems, Gräfelfing, Germany) were used in this study. In this method; protein precipitation was performed for sample extraction, UPLC system (Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 Rapid Separation LC System UHPLC+ Focused, San Jose, California, USA) and an analytical column with C18 selectivity (Thermo Scientific, Hypersil GOLD UHPLC Column, 50 × 2.1 mm, Particle Size 1.9 µm) was chosen for chromatographic seperation, APCI ion source was preferred for ionization, and tandem MS with triple quadrupole (QQQ) (Thermo Scientific TSQ Quantum Access MAX, San Jose, California, USA) was used. MS scan was performed using the SRM (selected reaction monitoring) mode in positive polarity. 
Method validation procedures were planned according to CLSI guidelines; and precision, trueness, limits of detection and quantitation, recovery and linearity were assessed. Besides, 40 patient samples were analysed for steroid hormones, using the available immunoassay methods in GATA Medical Biochemistry Laboratories for method comparison study. The collected data from ID-LC-MS/MS method was compared with the data from RIA method for aldosterone (Beckman Coulter Immunotech Prague, Czech Republic) and 17α-Hydroxy progesterone (DIAsource, Louvain-la-Neuve, Belgium); CLIA method (Siemens Advia Centaur XP, Tarrytown, NY, USA) for cortisol, DHEAS, estradiol, progesterone, total testosterone; and CLEIA method (Siemens Immulite 2000 XPi, Llanberis, Gwynedd, UK) for androstenedione. Test performance for these immunoassay methods were also evaluated. The results for analysis of aldosterone and estradiol with ID-LC-MS/MS method were suboptimal, compared with RIA and CLIA methods, respectively. Performance of ID-LC-MS/MS method was found to be superior when compared with CLIA method for cortisol, DHEAS, total testosterone, progesterone; CLEIA method for androstenedione and RIA method for 17α-Hydroxy progesterone. Method validation data showed that the test performance of 11-deoxycortisol, cortisone, corticosterone, DHEA and dihydrotestosterone were good. 
In conclusion; an ID-LC-MS/MS method; having an 11 minutes of analysis time, with 13 steroids, two of suboptimal; was validated. This ID-LC-MS/MS method would be useful in clinical laboratories, especially for the immunoassays having insufficient test performance and when checking for possible interferences in immunoassays available.