Gıdalardan izole edilen enterobacteriaceae suşlarında genişlemiş spektrumlu beta-laktamazların moleküler yöntemle araştırılması
Characterization of extended spectrum beta-lactamases in enterobacteriaceae from foods using molecular method
Yazar: İSMAİL HAKKI TEKİNER
Danışman: PROF. DR. HAYDAR ÖZPINAR
İstanbul Aydın Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Beta laktamazlar = Beta lactamases ; Enterobacteriaceae = Enterobacteriaceae ; Gıdalar = Foods ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Günümüzde hastane ve toplumsal kaynaklı olarak dirençli bakterilere artan şekilde rastlanmaktadır. Bu yeni tür biyolojik tehlike tüm Dünya'da insan sağlığını ciddi şekilde tehdit eder seviyelere gelmiştir. Bu nedenle WHO, FAO ve EFSA gibi otoriteler araştırmacıları bu konu üzerinde araştırma yapmaları için teşvik etmektedirler. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar (GSBL) plazmid-aracılı bla-genleri tarafından kodlanan, beta-laktam antibiyotikleri enzimatik inaktivasyon direnç mekanizması yoluyla etkisizleştiren ve infeksiyon tedavilerini başarısız kılan enzimlerdir. GSBL-kodlayan bla-genlerin farklı ve/veya türdeş bakteriler arasında aktarılabilir olmaları risk doğurmaktadır. Bakterilerde direnç gelişimi ve yayılmasında hastane ve toplumsal kaynaklı etmenler dışında gıdaların da potansiyel rolleri oldukları düşünülmektedir. Türkiye'de GSBL-kodlayan bla-genlerin varlıklarını tespite dönük hastane ve toplumsal kaynaklı araştırmalar yapılmış olmakla birlikte, gıda kaynaklı bulgular üzerinde ciddi şekilde durulmamıştır. Bu çalışmada hayvansal kaynaklı gıda maddelerinden izole edilen ve kütle spektrometresi ile tiplendirilen toplam 55 adet GSBL-üreten Enterobacteriaceae suşlarında blaTEM, blaSHV ve blaCTX-M genleri ile blaCTX-M altgruplarının karakterizasyonu amaçlanmıştır. GSBL-pozitif izolatlardan elde edilen DNA materyaller Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile amplifiye edilmiş ve amplikonları jel elektroforez tekniği ile görüntülenmiştir. Görüntülenen 1 adet blaTEM pozitif, 1 adet blaSHV pozitif ve 1 adet blaCTX-M pozitif amplikonlar saflaştırılmış, sekanslanmış ve BLAST Programı kullanılarak benzeşme doğrulamaları yapılmıştır. İstatistik analiz için SPSS 19 programı kullanılmıştır. GSBL-kodlayan bla genlerin gıda grupları bazında bulunma sıklıklarının niteliksel kıyaslaması Kruskal-Wallis H-testi ile yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar P<0,05 seviyesinde anlamlı kabul edilmiştir. Moleküler incelemeler bla-genlerin dağılımını %96,4 blaTEM, %65,5 blaCTX-M  ve %34,5 blaSHV olarak vermiştir. İzolatların %81,8'inin birden fazla bla-geni taşıdıkları tespit edilmiştir. bla-genlerin kombinasyonları %57,8 blaTEM+blaCTX-M, %22,2 blaTEM+blaSHV, %17,8 blaTEM+blaSHV+blaCTX-M ve %2,2 blaTEM+blaCTX-M olarak tayin edilmiştir. CTX-M-pozitif amplikonlar ileri analize alınmış ve alt grupları %97,2 blaCTX-M-1 ve %2,8 blaCTX-M-8 olarak karakterize edilmiştir. Sekanslama ve BLAST analizi sonuçları üç adet GSBL-pozitif amplikonların taşıdıkları blaTEM, blaSHV ve blaCTX-M genleri doğrulamıştır. İstatistik değerlendirme GSBL-kodlayan bla-genler için hayvansal kaynaklı gıdaların türüne bakılmaksızın potansiyel kaynak olduklarını göstermiştir. Sonuç olarak, hayvansal kaynaklı gıdalardan izole edilen Enterobacteriaceae suşlarının GSBL-kodlayan bla-genleri taşıdıkları, çoklu direnç özellikleri gösterdikleri ve tüketicilerin bu genetik materyaller ile kolonize olma riski taşıdıkları tespit edilmiştir.

Abstract:
Clinical and community-related resistant bacteria are widely found in the present time. This new type of biohazard is a growing health concern of Global significance for human health. That's why, international authorities, including WHO, FAO and EFSA, are enhancing the researchers to focus on this issue. Extended spectrum beta-lactamases (ESBL) are the enzymes that are encoded by plasmid-mediated bla-genes. inactivate beta-lactam antibiotics through a mechanism of resistance, so-called enzymatic inactivation, and lead to failure of treatment of bacterial infections. The bla-genes are easily transferable among the same and/or different bacterial species. Not only clinical and community settings, foods are also under suspicion for development and transmission of antibiotic resistance in bacteria. In Turkey, clinical and community-related ESBL-producers were examined well, whereas foodborne dissemination was not questioned seriously. The objective of this study was to characterize blaTEM, blaSHV and blaCTX-M genes and blaCTX-M subtypes in 55 ESBL-producing Enterobacteriaceae isolated from foods of animal origin after identification by mass spectrometer. DNA materials from each ESBL-positive isolate were initially amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR), and subsequently visualised by gel-electrophoresis. Within them, 1 blaTEM positive amplicon, 1 blaSHV positive amplicon and 1 blaCTX-M positive amplicon were purified, sequenced, and confirmed using BLAST Program. SPSS 19 was used for statistical analysis. Kruskal-Wallis H-test was performed for qualitative-comparison of frequency rate of each bla-genes with respect to their sampling groups. P<0.05 was considered to be significant. Genotypic results showed that frequency rates of blaTEM, blaCTX-M and blaSHV were determined to be 96.4%, 65.5%, and 34.5%, respectively. The co-existence of bla-genes were found as 57.8% blaTEM+blaCTX-M, 22.2% blaTEM+blaSHV, 17.8% blaTEM+blaCTX-M+blaSHV, and 2.2% blaTEM+blaCTX-M. Subtyping CTX-M-positive amplicons revealed that the most common subtype of blaCTX-M was 97.2% blaCTX-M-1, followed by 2.8% blaCTX-M-8. Sequencing and BLAST analysis also confirmed blaTEM, blaSHV and blaCTX-M genes. The statistical evaluation provided that foods of animal-origin were potential sources for ESBL-encoding bla-genes regardless type of food. To conclude, we found that Enterobacteriaceae from foods of animal orgin harboured ESBL-encoding bla-genes in some foods of animal origin, indicated a multiresistance pattern, and leaded to the colonization of the consumers with these spreadable genetic materials.