Ülkemizden izole edilen bacillus licheniformis BA17'den elde edilen alkalen proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of alkaline protease produced by bacillus licheniformis BA17 isolated from Turkey
Yazar: SELÇUK ÖZTÜRK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MÜŞERREF ÖZEREN MORGAN
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çahsmada Van Gölü'nden izole edilen B. licheniformis BA17 alkalenproteaz enziminin saflaştinlması ve karakterizasyonu araştinlmıştır.B. licheniformis BA17'den proteaz iiretimi için (w/v) %1 maltoz, %0.8 yeast,%0.02 MgS04.7H20, %0.1 K2HP04, %l NaN03 içeren besi yeri kullamlmıştır.Alkalen proteaz iiretimi BA17'nin 37°C'de ve 180rpm çalkalama hızında 24 saatbüyütülmesi ile gerçekleştirilmiştir. Ultrafiltrasyon ve iyon değiştirme (DEAEselüloz) kromatografisi adımları ile enzim %58 verimde ve 5.4 kat saflaştinlmıştır.Enzimin molekiiler agirhgi 19.7 kDa, Ca+2 iyonu varhginda ve yokluğunda optimumsıcakhgi 60°C olarak bulunmuştur. Saf enzimin 40°C, 50°C, 60°C ve 70°Csıcakhklarda yarılanma ömrii sırası ile 38 saat, 93 dakika, 14 dakika ve 6 dakikaolarak bulunmuştur. Enzimin optimum pH'sı 10 olarak belirlenmiş ve pH 8.0-10araliginda 30°C sabit sıcakhkta 2.5 saat inkiibe edildiğinde aktivitesini kaybetmediği,pH 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5 ve 13 değerlerinde, aym koşullarda inkiibe edildiğinde isesırasıyla %15, %15, %36.6, %50.7, %54.3 ve %90 oramnda aktivite kaybimn olduğugözlenmiştir. 30°C sıcakhkta 5mM konsantrasyonunda Cu+2, Mg+2, Mn+2 ve K+1iyonu varhginda enzim aktivitesinin sırasıyla %23, %4, %6 ve %12 oramnda arttigi,5mM Ca+2 ve NH4+1 iyonu varhginda enzim aktivitesinin etkilenmediği, 5mM Co+2,Fe+2 ve Na+1 iyonu varhginda ise enzim aktivitesinin sırasıyla %6, %27 ve %5oramnda azaldigi belirlenmiştir. 5mM (NH4)2S04'in enzim aktivitesinde %17oramnda kayba neden olduğu gözlenmiştir. %5 SDS(w/v) ve %1 Triton X-100(v/v)varhginda enzimin aktivitesini kaybettiği, %1 Tween 20(v/v) varhginda iseaktivitesinin %23.5 oramnda arttigi gözlenmiştir. 5mM PMSF varhgindaiaktivitesinin tamamen kaybolması sebebi ile enzimin serin proteaz olduğu, 5mMEDTA varhginda aktivitede göriilen %81 oranındaki kayıp sebebi ile enzimin Ca+2bağlama bölgesine sahip olduğu belirlenmiştir. lOmM NBS, lOmM TLCK ve TPCK,lOmM etilasetimidat ve iodoasetik asit varhginda aktivitede göriilen kayıp sebebi iletriptofan, histidin ve lizin rezidiilerinin aktif bölgede bulunduğu belirlenmiştir.Enzimin sentetik substratlardan kemotripsin substratı olan 7V-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA'yı hidrolizlediği belirlenmiştir. Enzimin kazein hidrolizi için, Km ve Vmdeğerleri sırasıyla 0.209mg/ml ve 5.5(imol tirosin/ml/dak olarak hesaplanmıştır.Anahtar Kelimeler: Alkaline proteaz, Bacillus licheniformis, safla§tırma,karakterizasyon

Abstract:
Purification and Characterization of Alkaline ProteaseProduced By Bacillus licheniformis BA17 Isolated from TurkeyIn this work, purification and characterization of alkaline protease produced byB. licheniformis BA17 isolated from Van Lake in Turkey was investigated.Medium containing (w/v) 1% maltose, 0.8% yeast extract, 0.02%MgSO4.7H2O, 0.1% K2HPO4, and 1% NaNO3 was used for alkaline proteaseproduction. B. licheniformis BA17 was grown overnight at 37°C and 180rpm.Purification fold and yield obtained by using the ultrafiltration and ion exchangechromatography in series were 5.4 and 58 %, respectively. The molecular weight ofenzyme was found to be 19.7 kDa by using SDS-PAGE electrophoresis, and theoptimum temperature was 60°C in the presence and absence of Ca+2 ion. The halflifeof the pure enzyme was 38 hours, 93 minutes, 14 minutes and 6 minutes at 40°C,50°C, 60°C and 70°C, respectively. The optimum pH of enzyme was determined as10, and activity was not affected when the enzyme was incubated for 2.5 hours at30°C and at pH between 8.0 and 10. Under the same incubation conditions, 15%,15%, 36.6%, 50.7,% 54.3% and 90% of the activity was lost at pH 10.5, 11, 11.5,12, 12.5 and 13, respectively. The catalytic activity of enzyme increased 23%, 4%,6% and 12% in the presence of 5mM Cu+2, Mg+2, Mn+2 and K+1 ions at 30°C,respectively but activity did not change in the presence of 5mM Ca+2 and NH41+ ions.However activity decreased 6%, 27% and 5% in the presence of 5mM Co+2, Fe+2 andNa+1 ions, respectively. 17% of the enzyme activity was lost in the presence of 5mM(NH4)2SO4. In the presence of 5% SDS (w/v) and 1% Triton X-100(v/v), the enzymeretained its original activity, but in the presence of 1% Tween 20 (v/v) enzymeactivity increased by 23.5 %. Enzyme activity was inhibited by PMSF, suggestingthat the enzyme is a serine protease. The enzyme has a Ca+2 binding site since 81%of the activity was retained in the presence of 5 mM EDTA. The inhibition ofenzyme activity in the presence of 10mM NBS, 10mM TLCK and TPCK, 10mMethylacetimidate and iodoacetic acid, suggested the presence of tryptophan, histidineand lysine residues at the active site It was also found that enzyme hydrolyzedsynthetic kemotrypsin substrate "N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA?. Km and Vm valuesof the enzyme for casein hydrolysis were found approximately 0.209 mg/ml and 5.5umol tyrosine/ml/min respectively.Key words: Alkaline protease, Bacillus licheniformis, purification,characterization