Spinal müsküler atrofide RNA işlenme hatasının ve tedavinin araştırılması
The investigation of RNA splicing defects and treatment of spinal muscular atrophy
Yazar: DİDEM DAYANGAÇ
Danışman: PROF.DR. HAYAT ERDEM YURTER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
ÖZETSPİNAL MÜSKÜLER ATROFİ'DE RNA İŞLENME HATASININ VE TEDAVİNİNARAŞTIRILMASIDidem DayangaçSpinal müsküler atrofi alfa motor nöronların dejenerasyonuna, simetrik kas zayıflığına nedenolan ve otozomal resesif olarak aktarılan bir çocukluk çağı hastalığıdır. Hastaların %95-98'inde SMN1 geninde homozigot delesyonlar görülmektedir. Delesyon olmayan SMN2geninden ise işlevsel olmayan bir protein sentezlenmekte ve hastalık oluşumunuengelleyememektedir. Ancak SMN2 gen kopya sayısı çok olan bireylerde hastalığın dahahafif seyirli olduğu bulunmuştur. Çalışmamızda farklı sayıda SMN2 gen kopyası içerenhastalardan oluşturulan lenfoblastoid hücre hatları üzerinde HDAC inhibitörlerinin etkisiniaraştırmak amaçlanmıştır. Bir tipI, iki tipII ve iki tipIII SMA hastasından izole edilenlenfositler, EBV ile transforme edilerek lenfoblastoid hücre hatları oluşturulmuştur. Bir adettipI ve bir adet tipIII hücre hattı 0.05-50mM sodyum bütirat ile 4,8,24,32s inkübe edildiktensonra, doğru uzunlukta bulunan SMN2 mRNA'sı RT-PCR yöntemi ile incelenmiştir. İki tipIIIhücre hattı ise 0.05-5mM fenil bütirat ile 8,16,24,48s inkübe edilerek, doğru uzunluktakiSMN2 mRNA'sının incelenmesi için kantitatif realtime RT-PCR yöntemi kullanılmıştır. İkiHDAC inhibitörünün de doğru uzunlukta bulunan SMN2 transkript miktarını arttırmadığısaptanmıştır. Bunun üzerine SMN2 gen kopya sayısı ile tedavi arasındaki ilişkiyiaraştırılamamıştır. Fenil bütiratın SMN protein miktarına etkisini araştırmak için ise iki tipIIIhücre hattı 2mM fenil bütirat ile 24,48,72s inkübe edilmiş ve fenil bütiratın SMN proteinmiktarını arttırmadığı gözlenmiştir. SMA'da HDAC inhibitörlerinin tedavi edici etkisiniaraştırmak için EBV ile immortalize edilen lenfoblastoid hücre hatlarının uygun olmadığısonucuna varılmıştır. Aynı hastaların fibroblast veya kas hücrelerinde HDAC inhibitöretkisinin araştırılmasıyla bu düşüncemiz kanıtlanabilecektir. HDAC inhibitörleri ile SMAtedavisine yönelik kazandığımız tecrübeler sayesinde, ekzon atlama hatalarının neden olduğudiğer hastalıkların farmakolojik tedavi stratejilerinin geliştirilmesi mümkün olabilecektir.

Abstract:
ABSTRACTTHE INVESTIGATION OF RNA SPLICING DEFECTS AND TREATMENT OFSPINAL MUSCULAR ATROPHYDidem DayangaçSpinal muscular atrophy is an autosomal recessive disorder characterized by degeneration ofalpha motor neurons and symmetric weakness of muscles. SMN1 gene is deleted in 95-98%of patients. SMN2 produces non-functional protein that is insufficient to protect againstdisease. Increased SMN2 gene copy number is associated with a milder phenotype. In thisstudy, our aim was to analyze the effect of HDAC inhibitors on lymphoblastoid cell linesestablished from patients with different SMN2 copy numbers. We established EBV-transformed lymphoblastoid cell lines from one typeI, two typeII, two typeIII patients. OnetypeI and one typeIII cell lines were treated with 0.05-50mM sodium butyrate for 4,8,24,32h.The amount of SMN2 mRNA was analyzed by RT-PCR. We also treated 2 typeIII cell linewith 0.05-5mM phenylbutyrate for 8,16,24,48h and measured SMN2 mRNA by quantitativereal-time RT-PCR. We found that both HDAC inhibitors didn?t increase the level of SMN2mRNA. Therefore investigation of the correlation between SMN2 gene copy number andtreatment were excluded from our study. To determine whether phenylbutyrate has an effecton SMN protein level, we analyzed two typeIII cell lines with 2mM phenylbutyrate for24,48,72h and no increase in SMN protein was observed. In conclusion, our data suggest thatEBV-transformed lymphoblastoid cell lines are not suitable for studying the effect of HDACinhibitors in SMA. Therefore it may be possible to prove this idea by analyzing the effect ofHDAC inhibitors on fibroblast, muscle cells from same patients. Our findings may represent apharmacological therapeutic strategy for exon skipping defects.