Yara örtücü ve benzeri uygulamalarda kullanılmak üzere biyopolimerik filmler geliştirilmesi
Biopolymers; as a wound dressing and similar applications, production and properties
Yazar: NİL ERGE AKKAYA YILDIRIMLI
Danışman: PROF. DR. HATİCE HÜCESTE GİZ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Agar = Agar ; Antimikrobiyal aktivite = Antimicrobial activity ; Biyopolimerler = Biopolymers ; Geçirgenlik = Permeability ; Uçucu yağlar = Essential oils

Özet:
Günümüzde denizlerde ve karalarda kirlilik tehlikeli boyutlara ulaşmıştır. Bu kirliliğin önemli bir kısmı hayatımıza girmiş olan sentetik polimerik malzemelerden kaynaklanmaktadır. Doğada bozunmaları yüzyıllar mertebesinde olan bu sentetik polimerler deniz ve kara hayvanlarının ve hatta insanların da besin zincirine girmiş durumdadır. Bu hal, sentetik polimerlerin kullanıldığı her alan için doğada çözünebilen, bozunabilen alternatiflerinin bulunmasını gerektirmektedir.
Çalışmamızda sağlık ve gıda alanındaki ihtiyaca bir ölçü de olsa katkı sağlayabilmek amacı ile biyobozunur olmanın ötesinde insan, hayvan, tüm canlıların rahatça tüketebileceği, doğrudan besin zincirinde yer alan polisakkarit yenilebilir filmlerin elde edilmesi ve özelliklerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Biyouyumlu filmlerin sağlık alanında çeşitli kullanım yerleri vardır. Bunlar arasında yara örtücüler ve ilaç salım sistemleri sayılabilir.  Pamuk ve selüloz bazlı sargıların yaraya yapışması, değiştirilmesindeki zorluk, yarayı dış etkilerden korumada yetersizlikleri yeni arayışlara yol açmıştır. Biyouyumlu polisakkarit bazlı filmler, yara iyileşmesi için gereken nem ve oksijen miktarını sağlamaları, yarayı mikroplardan korumaları ve yara iyileşmesini hızlandırmaları sebebiyle tercih edilmektedirler. Vücuda uzun süre yapıştırılması gereken ilaç salım sistemlerinde ve uzun iyileşme süresi gerektiren kronik yaralarda iyileşme süresini kısaltmaları ve hasta konforunu arttırmaları dolayısı ile biyopolimerik filmler tercih edilmektedir. Yara örtücülerin yüksek katma değerli malzemeler olması yeni yeni piyasaya girmekte olan polisakkarit filmlerin uygulanma şansını da arttırmaktadır.
Yenilebilir gıda ambalajı ise bu filmlerin diğer önemli bir kullanım yeri olacaktır. Günümüzde her dakika 15 ton plastik atık okyanuslara dökülmektedir ve bunun %40 kadarı tek kullanımlık ambalaj malzemeleridir. Bu malzemelerin bozulmaları da yüzyıllar aldığından denizler çöplük halini almaktadır. Avrupa Birliğinin aldığı bir karar gereğince 2030 itibarı ile tüm gıda ambalajlarının biyobozunur olması gerekmektedir. Gıda ambalajlarının biyobozunur ve yenilebilir olması elbette günümüzde alışılmış teknolojilerin terk edilerek yeni teknolojilerin geliştirilmesini gerektirdiğinden ek maliyet anlamına gelmektedir ve rekabetçi pazarın da buna tahammülü yoktur. Ancak tüketicilerin bilinçlenmesi ve doğru tercihler kullanması ile yakın zamanda hayatımıza gireceği kesindir. 
Çalışmamızda potansiyel yara örtücü ve yenilebilir gıda ambalajı olarak agar, keçiboynuzu zamkı ve salep temelli filmler üretildi. Agar kırmızı deniz yosunundan üretilen bir hidrokolloittir. Agaroz ve agaropektin adı verilen iki ayrı birimden oluşur. Agaroz jelleşebilen yapıdadır, agaropektin ise sülfat grubu taşıyan, yüklü, jel oluşturmayan birimdir. Agar oda ve vücut sıcaklığında suda çözünmez ancak 90oC sıcaklıkta suda çözünür, soğuduğu zaman tekrar heliks yapısını alarak suda çözünmez forma geri döner. Agarın jelleşebilen yapısı ve yüksek sıcaklık çözünürlüğü oda sıcaklığında veya en fazla vücut sıcaklığı olarak 36 - 40oC'lerde güvenle kullanılabilmesine olanak sağlar. Jelleşmesi için sentetik bir çapraz bağlayıcı gerektirmemesi de ayrı bir üstünlüğüdür. Agar filmlerinin mukavemetleri ve yüksek yüzde uzama değerleri bu amaçlar için uygundur fakat antimikrobiyal özellikleri yoktur. Bu sebeple antimikrobiyal özellik gösteren diğer polisakkaritlerle katkılanarak kullanılması yoluna gidilmiştir. Seçilen ikincil malzemelerden biri keçiboynuzu zamkıdır (locust bean gum; LBG). Keçiboynuzu zamkı, keçiboynuzu ağacının tohumlarından elde edilen bir polisakkarittir. Ana zinciri mannan, yan grupları ise galaktoz gruplarından oluşur. Bu yapı jelleşen bir yapı değildir fakat uzun agar zincirleri ile etkileşerek suda çözünmeyen filmler oluşturur. Mekanik özellikleri ve su buharı geçirgenliği de uygun değerdedir. Diğer polisakkarit olarak ülkemize özel bir ürün olan salep seçildi. Salep ülkemizde de yetişen orchid genus orchis adlı yabani bir orkide türünün kök yumrularından elde edilir. Çok bileşenli bir polisakkarittir. Yapısında nişasta, kalsiyum, potasyum, demir klorürleri ve zengin miktarda glukomannan bulunur. 
Çalışmamızın ilk bölümünde agar-LBG ve agar-Salep filmleri elde edilerek fiziksel, antimikrobiyal özellikleri ve hücre yaşamasına etkileri incelendi. LBG ilavesi filmlerin su buharı geçirgenliğini arttırdı, suda ve fosfat tamponunda çözünmeyen, antimikrobiyal özellikleri saf agar filmlerinden çok daha güçlü, hücre yaşam yüzdeleri saf filmlerden daha yüksek, UV geçirgenliği daha düşük filmler elde edildi. Salep katkısı ise (agar-salep) suda çözünür, su buharı geçirgenliği ve UV geçirgenliği daha düşük, antimikrobiyal özellikleri ve hücre yaşam yüzdeleri daha yüksek filmler elde edilmesini sağladı. 
Hem LBG hem de salebin antimikrobiyal özellikleri yüksek olduğundan ikili filmlerinin daha yüksek antimikrobiyal özellik taşıyabileceği, yumuşak yapılarının da gerek yara örtücü gerekse yenilebilir film olarak daha uygun olabileceği düşünülerek LBG-Salep filmleri yapıldı. Çalışmanın sonunda, LBG-Salep filmleri agar içeren filmlerden çok daha iyi antimikrobiyal özellik göstermiştir. Tek tek gıdaların ambalajlanmasında veya suda çözünebilen filmler gerektiği durumlarda LBG-Salep filmleri iyi bir alternatif olacaktır.
Suda çözünmeyen filmlerin uygulama alanı daha geniştir. Su içeren veya içermeyen gıdalar, hazır yemekler vb. ürünler bu tür filmlerden yapılan ambalajlarda saklanabilir. İlk bölümde üretilen agar-LBG filmleri suda çözünmez yapıdadır. Antimikrobiyal değerleri de saf agar filmlerinden oldukça iyi olmasına rağmen biraz daha arttırabilmek amacıyla agar-LBG filmlerine uçucu yağlar katıldı. Uçucu yağ olarak, antimikrobiyal özellikleri bilinen çörek otu, kantaron ve biberiye yağları seçildi.  Çalışma sonucunda transparan, kopma mukavemeti ve kopma uzaması daha düşük filmler elde edilmiş ise de antimikrobiyal sonuçlar beklenen aşırı artışı göstermemiştir.  Yağların antimikrobiyal özelliğinin çok artmaması, filmin besin değerini de arttırmış oldukları sebebine bağlanabilir.
Bu çalışma sonunda her biri farklı özelliklerde biyouyumlu, biyobozunur, yenilebilir agar, LBG, salep ikili kompozit filmleri ilk defa üretilmiş ve özellikleri incelenmiştir, böylelikle yara örtücü ve gıda ambalajı konusunda yeni ve faydalı alternatifler oluşturduğumuza inanıyoruz.

Abstract:
A significant fraction of the pollution on both land and seas is composed of discarded synthetic polymeric materials in our daily use. These synthetic polymers take centuries to decompose in nature and have already entered the food chain of sea and land animals and even humans. This requires the replacement of the synthetic polymers by biodegradable alternatives in every field of their use.
In this study our aim was to produce and investigate the properties of edible polysaccharide films which are not only biodegradable but can be safely consumed by humans, animals and all kinds of wildlife. 
Biocompatible films have several areas of application in the medical field including wound dressings and systems for slow release of drugs. Cotton and other cellulose based dressings tend to stick to the wound and are deficient in protecting it from harmful external effects. For this reason, a suitable replacement is needed. Biocompatible polysaccharide-based films protect the wound from microbial infection, supply the necessary oxygen and humidity for rapid recovery of the wounds and are among the materials preferred for this purpose.   
Biofilms are preferred for drug release patches for long term use and dressings for slow recovering wounds because they improve patient comfort and reduce the recovery time. Wound coverings are high value-added items. This increases the market chances of newly introduced polysaccharide wound dressing films.
Another field of application for these films will be edible food packaging. Nowadays 15 tons of plastic waste is discarded in the oceans every minute. 40 % of this waste is single use packaging. As these materials take centuries to decompose, the ocean is gradually turning into a garbage patch. According to a recent EU regulation, all food packaging must be biodegradable by 2030.
In order to contribute to the solution of these problems, in this work agar, locust bean gum and salep based films were produced for the first time. Agar is a hydrocolloid obtained from marine red algae. It is a carbohydrate composed of agarose and agaropectin units. Agarose is the gelling component in the agar structure and agaropectin is the charged, sulfated non-gelling part. Agar is not water soluble at room or body temperature, but when heated up to 90o C, it dissolves in water. When it is cooled down, the agarose part adopts a helix structure and forms an insoluble gel with an exothermic reversible process. Its ability to form a cross-linked structure without any toxic chemical is one of the reasons for which it is preferred for applications in food and medical fields. Agar produces transparent and clear films. Agar films have high tensile strengths and elongation at break values however they do not have any antimicrobial activity. To improve their properties for wound dressing and edible food packaging applications, agar films need to be compounded, preferably with natural materials. In literature, the physical and mechanical properties of glycerol added agar films were investigated by Arham et al. and they showed that increasing glycerol concentration decreased their tensile strength and elongation at break and increased their solubility. To obtain antibacterial agar films, savory essential oil incorporated cellulose-agar and carboxymethyl cellulose-agar films were prepared.  Nanoparticle addition was also used to improve physical properties of agar and agar containing films, such as, TiO2 nanoparticle added gelatin-agar films and ZnO incorporated bionanocomposite agar films. Effect of SiO2 addition on agar-sodium alginate nanocomposite film and agar-carrageenan-TiO2 nanocomposite films were also investigated.
Locust bean gum (LBG) is a non-starch polysaccharide extracted from the seeds of the carob tree. Its backbone structure is formed by linear chains of mannan with side units of galactose. Galactomannans are not intrinsically gelling products however, long galactose chains create synergic interactions with agar helices and LBG enhances gelation by binding double helices of agar into a continuous network. The most significant feature of this polysaccharide is that it creates high viscosity solutions in a wide pH and temperature range. LBG also has good film forming properties, and can also be used as a coating material with good mechanical and water vapor barrier properties. These viscous solutions can even be formed at relatively low concentrations. LBG also has good film forming properties, and can also be used as a coating material with good mechanical and water vapor barrier properties. Mechanical strength and water resistance of native and alkali modified agar-LBG gels and rheology of film forming solutions were investigated by Sousa et al. Extensive toxicological studies were conducted on LBG by Meunier et al. and no reproducible adverse effects were observed.
Salep is a multi-component polysaccharide, obtained from the rizoms of a wild orchid called orchid genus orchis. It contains starch, calcium, potassium, iron chlorides and is a rich source of glucomannan (16-55%). Glucomannans are soluble in water and are used as thickening agents and emulsifiers at low temperatures in food and pharmaceutical fields. Physical properties of salep films were investigated by Kurt et al. and Ekrami et al. Glucomannan content and acetylation degree are the main factors determining the solubility and gelation properties of salep, where glucomannan rich and deacetylated salep powders have low solubility and the ability to form gels.  
The aim of this work was to combine the ability of agar to form crosslinked films without any synthetic crosslinking agent, with other polysaccharides in order to form non-toxic films for wound dressing and edible food packaging applications. Gel-formed agar has applications in numerous fields such as biomedicine and biopharmaceuticals. However, the hard and tough structure and lack of antimicrobial properties prevent agar films from being used as a wound dressing.
In this study, agar-locust bean gum (LBG) and agar-salep films were prepared for the first time to improve their physical, antimicrobial and cell viability properties. Films containing LBG and salep showed high antimicrobial and cell viability properties. Agar-LBG films showed higher water vapor permeability and were insoluble in water and phosphate buffer solutions. With the addition of salep, a decrease in water vapor permeability was observed and the films were dissolved in both media. All films were transparent. With the addition of LBG and salep, films with lower tensile strength were obtained and the thicknesses of all films were suitable for wound dressing applications. Due to their solubility, agar-salep films can be preferred especially in cases where removal from the wound is a priority without damaging the tissue structure.
Salep and LBG had high antimicrobial properties, considering their biary mixtures will have very high antimicrobial properties LBG-Salep films were prepared. Both their high antimicrobial properties and soft structure make them a good candidate for wound dressing and edible food packaging. In line with these expectations LBG-Salep films had higher antimicrobial values than agar containing films. In case water solubility is desired, soft LBG-Salep films will be a good alterantive. 
On the other hand water insoluble packaging films may have higher market share. Foods, ready-to-eat meals and such products can be stored in packages with water insoluble films. Studies have been carried out by adding essential oils to agar-LBG films in order to increase antimicrobial properties. Black kumin oil, St. John's Wort oil and rosemary oil, which are known for their antimicrobial properties, were chosen as essential oils. As a result of this work, transparent films with low tensile stress and low tensile strain were obtained, however the antimicrobial results did not show the expected high increase. This result can be explained as increased microbial vulnerability of essential oil containing films. 
As a result of this study, Agar-LBG, Agar-Salep, LBG-Salep and essential oil containing Agar-LBG films were prepared for the first time. Each group have different transparency, mechanical property, water vapor permeability, antibacterial activity, cell viability values. We believe these are new and good alternatives for wound dressing and edible food packaging applications.