Çipura (Sparus aurata) balığının karaciğer, solungaç ve böbrek dokularından karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması, karakterizsayonu ve bazı metal iyonarının enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification and characterization of carbonic anhydrase from gilthead bream (Sparus aurata) tissues and inhibition effects of some metal ionson the enzyme activity
Yazar: ELİF DUYGU KAYA
Danışman: DOÇ. DR. ŞÜKRÜ BEYDEMİR ; YRD. DOÇ. DR. HAKAN SÖYÜT
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada çipura balığının karaciğer, solungaç ve böbrek dokuları karbonik anhidraz (CA) enzimleri Sepharose-4B-L-tirozin-sülfanilamid afinite kromatografisi kullanılarak sırasıyla %9,1, %32,84 ve %83,6 verimlerle saflaştırıldı. Çipura balığının karaciğer, solungaç ve böbrek dokuları için tüm saflaştırma işlemleri boyunca saflaştırma kat sayıları sırasıyla yaklaşık 354, 841 ve 455 olarak bulundu.Enzimlerin saflığını kontrol etmek ve alt birim molekül kütlelerini tespit etmek amacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve tek bant gözlendi. Alt birim molekül kütleleri karaciğer için yaklaşık 25,3 kDa, solungaç için yaklaşık 30,5 ve böbrek için yaklaşık 30,13 kDa olarak belirlendi.Tüm dokulardan saflaştırılan CA'lar için optimum iyonik şiddetler 1M Tris-SO4 tamponu olarak belirlendi. Optimum ve stabil pH değerleri 4oC'de 1M Tris-SO4 ve fosfat tamponlarında tespit edildi. Çipura balığı karaciğer, solungaç ve böbrek dokuları CA enzimi için optimum sıcaklık, aktivasyon enerjisi (Ea), aktivasyon entalpisi ( ?H ) ve Q10 değerleri Arrhenius grafiğinden elde edildi. P-nitrofenilasetat (P-NPA) substratı için saf enzimlerin KM ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk grafiklerinden hesaplandı. Ayrıca çipura balığı dokuları CA aktiviteleri üzerine bazı metallerin (bakır, gümüş, kurşun, nikel ve kadmiyum) inhibitör etkileri hidrataz ve esteraz metodu kullanılarak in vitro şartlarda ayrı ayrı incelendi. CA enzim aktivitelerinin %50'sinin inhibe edildiği metal konsantrasyonları tüm dokulardan saflaştırılan CA enzimleri için elde edildi. Daha sonra, esteraz metodu kullanılarak bu maddeler için Ki değerleri ve inhibisyon tipleri Lineweaver-Burk grafiklerinden hesaplandı.

Abstract:
In this study, carbonic anhydrase enzymes were purified from gilthead bream (Sparus aurata) liver, gills and kidney tissues a yield of 9,1%, 32,84% and 83,6% using Sepharose-4B-L tyrosine-sulfanilamide affinity gel chromatography, respectively. The overall purifications from gilthead bream liver, gill and kidney tissues CA enzymes, were approximately 354, 841 and 455 fold respectively.SDS-gel electrophoresis was applied to determine the purification of the enzyme and subunit molecular weights and observed as a single band. The subunit molecular weight of the enzymes were evaluated as25.3 kDa for liver, 30.5 kDa for gill and 30.13 kDa for kidney.Optimum ionic strengths for the CAs from all tissues were obtained as 1M Tris-SO4 buffer. Optimum and stable pHs were determined in 1M Tris-SO4 and phosphate buffers at 4oC. The optimum temperature, activation energy (Ea), activation enthalpy (?H) and Q10 values were obtained from Arrhenius plot for the gilthead bream liver, gill and kidney tissues CA enzymes. KM and Vmax values for p-nitrophenilacetate (P-NPA) of the purified enzymes were calculated from Lineweaver-Burk graphs. Furtermore, the inhibitory effects of different metals (copper, silver, lead, nickel and cadmium) on gilthead bream CA activities were investigated by using the hydratese and esterase method under in vitro conditions. The heavy metal concentrations, inhibiting 50% of tissue CA enzymes activity, were obtained for CA enzymes from all tissues. Finally, Ki values and inhibition types for these inhibitors were also calculated by using esterase method, from Linewaewer-Burk graphs.