İntrauterin gebelik kayıpları olan çiftlerde fetal materyallerinin moleküler etiyolojik sebepler açısından karşılaştırmalı genomik mikrodizin (mikroarray-cgh) yöntemi ile analizleri
The analysis of fetal materials for molecular ethiological parameters in couples with intrauterine pregnancy loss by comperative genomic hybridisation (microarray-cgh) technique
Yazar: BARIŞ PAKSOY
Danışman: PROF. DR. ÖZTÜRK ÖZDEMİR
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Genetik = Genetics ; Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Abortus = Abortion ; Etyoloji = Etiology ; Fetal ölüm = Fetal death ; Gebelik = Pregnancy ; Genetik varyasyon = Genetic variation ; Hibridizasyon-genetik = Hybridization-genetic

Özet:
Giriş ve Amaç: İntrauterin fetal kayıplarda başta genetik olmak üzere birden fazla etiyolojik sebep bildirilmekle birlikte olguların çok büyük bir oranında (%60) kesin etiyolojik neden tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu çalışmada; fetal dönem gebelik kayıpları olan çiftlerde fetüs materyallerinin array komperatif genomik hibridizasyon (aCGH) yöntemi ile analiz edilerek, moleküler genetik etiyolojik sebeplerin ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu temel amaç doğrultusunda, özellikle embriyonal dönem hücre bölünmesi, doku farklılaşmasında görev alan gen/genler ve gen ailelerinde olası kopya sayısı varyasyonları (CNV), yapısal değişimlerin (delesyon ve/veya duplikasyonlar) ileri düzeyde tespit edilerek konu ile ilgili güncel literatür verileri ile tartışılması amaçlanmıştır.

Yöntem: Mevcut retrospektif araştırma projesinde, 2016-2018 yılları arasında Tıbbi Genetik laboratuvarına gebelik kaybı sebebiyle başvuran çiftlere ait  toplam 39 adet fetal tahliye materyali analiz edilmiştir. Araştırmaya dahil edilen her bir materyale ait solid dokudan Qiagen kiti kullanılarak hedef genler açısından genotiplendirmede kullanılmak üzere total genomik Deoksiribo Nükleik Asit (DNA) izole edilmiş ve olgulara ait DNA bankası oluşturulmuştur. Fetal kayıplara ait genomik DNA'lar daha sonra kromozomal mikroarray-CGH yöntemi ile (aCGH, 60 K ISCA dizayn, Agilent, Germany) moleküler etiyolojik sebepler açısından genotiplendirilmiştir. Elde edilen sonuçlar, yine kit ile birlikte sağlanan referans DNA sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Olgu ve referans DNA lara ait hibridize prob korelasyonları intrauterin kayıplarla ilişkili toplam 54 fonksiyonel gen CNV'ler açısından genomik varyasyon analizinde kullanılan veri tabanları (Database of Genomic Variants Analysis) ile değerlendirilmiştir.

Bulgular: Araştırma kapsamında analiz edilen toplam 39 fetal materyalin 32 tanesinde (%82.05) CNV tespit edilmiştir. Saptanan CNV'lerin bazı olgularda duplikasyon şekline (%55), bazılarında delesyon (% 45) şeklinde oldukları saptanmıştır. Değerlendirilen toplam 54 genin 19'unda (%35) delesyon, 26 tanesinde (%48) duplikasyon saptanırken toplam 3 tanesinde ise (%6) hem
 
delesyon ve hemde duplikasyon saptanmıştır. Araştırma sonuçlarımız, diğer otozom kromozomlar yanısıra (1,2,3,4,5,7,8,10,12,13,14,15,20) intrauterin kayıplarda en fazla tutulumun X kromozomunda olduğunu ortaya koymuştur. Saptanan CNV'lerin yaygın olarak heterozigot allel tipinde ve duplikasyonlar şeklinde olduğu saptandı. Çalışmamızda, fetal kayıp etiyolojisi açısından sırasıyla COX7B, ZIC1, MECP2, FMR1, HOXD13, JAG1, MSX2, NEXN ve SIX3
gen CNV'lerinin daha sık olduğu saptanmıştır.


Tartışma ve Sonuç: Sınırlı sayıda fetal materyalin analiz edildiği araştırma sonuçları, başta X kromozomu olmak üzere farklı otozom kromozomlar üzerine lokalize fonksiyon genlerde meydana gelen delesyon, duplikasyon gibi yapısal kopya sayısı varyasyonlarının intrauterin kayıplarda önemli moleküler etiyolojik sebepler olduğunu ortaya koymuştur. Toplam 54 farklı gene ait analizlerinin yapıldığı mevcut sonuçlarda özellikle embriyonal dönem hücre bölünmesi, doku farklılaşmasında görev alan gen ve/veya genlerde tutulumlarının daha yaygın olduğu saptanmıştır. Bu fonksiyonel genlerden özellikle COX7B, ZIC1, MECP2, FMR1, HOXD13, JAG1, MSX2, NEXN ve SIX3 genlerde yapısal mutasyonların daha sık olduğu ortaya konmuştur. Araştırma sonuçlarının çok sayıda olgunun dahil edildiği ve daha kapsamlı gen profillemesinin yapıldığı ileri araştırmalar tarafından desteklenmesi ve bu doğrultuda özellikle tekrarlı intrauterin kaybı olan çiftlerin sağlıklı çocuk sahibi olmaları için yönlendirildikleri in vitro fertilizasyon vb gibi ihtiyaç duyulan yardımcı üreme tekniklerinden daha etkin yararlanmalarına akademik ve profesyonel katkı sağlanabileceği düşünülmüştür.

Anahtar kelimeler: İntrauterin fetal kayıplar; moleküler etiyolojik sebepler; aCGH; CNV

Abstract:
Objective and aim:
Although intrauterine fetal losses have been reported with more than one etiological cause, mainly genetic, a definite etiologic cause has not been elucidated at a great rate (60%) of the cases. In this study; it is aimed to  analyze fetal materials with array comperative genomic hybridization (aCGH) method in couples with fetal death and to reveal molecular genetic etiological causes. In accordance with this purpose, it is aimed to determine the possible copy number variation (CNV), structural changes (deletions and / or duplications) in the genes / genes and gene families involved in embryonic cell division, tissue differentiation, intended.

Method:
In the current retrospective study, a total of 39 fetal materials from couples who applied due to pregnancy loss to the Medical Genetics Laboratory between 2016 and 2018 were analyzed. Total genomic deoxyribonucleic acid (DNA) was isolated from the solid tissue of each material included in the study to be used for genotyping in terms of target genes using Qiagen kit and a DNA bank of cases was formed. The genomic DNA of the fetal loss was then genotyped for chromosomal microarray-CGH (aCGH, 60 K ISCA design, Agilent, Germany) in terms of molecular etiology. The results were compared with the reference DNA results provided with the kit. The correlations of the hybridization probes of the case and reference DNAs were evaluated by using the database of genomic variation analysis for the total 54 functional gene CNVs associated with fetal death.

Results:
Copy number variation was detected in 32 (82.05%) of 39 fetal material analyzed in the study. The detected CNVs were duplication (55%) and deletion (45%) in some cases. Deletions in 19 (35%) and Duplications in 26 (48%) of the
 
total 54 genes evaluated were detected, while deletion and duplication were detected in 3 (6%). Our results showed that, besides other autosomal chromosomes (1,2,3,4,5,7,8,10,12,13,14,15,20), the most involvement in fetal death is in the X chromosome. The CNVs detected are commonly heterozygous allele types and duplications. In this study, COX7B, ZIC1, MECP2, FMR1, HOXD13, JAG1, MSX2, NEXN and SIX3 gene CNV were found to be more frequent in terms of fetal loss etiology.

Conclusion:
The results of analysis of a limited number of fetal material have revealed that structural copy number variations such as deletion and duplication occurring in localized function genes on different chromosomes, mainly X chromosomes,  are important molecular etiologic factors in intrauterine losses. In the results of analysis of a total of 54 different genes, it has been determined that especially the embryonic phase cell division, involvement in genes and / or genes involved in tissue differentiation is prevalent. Structural mutations are more frequent in these functional genes, especially in COX7B, ZIC1, MECP2, FMR1, HOXD13, JAG1, MSX2, NEXN and SIX3 genes. It is thought that the results of the research are supported by the advanced researches in which a large number of cases are included and more extensive gene profiling has been done and in this direction it is thought that couples with a recurrent pregnancy loss can provide academic and professional contribution to make more effective use of assisted reproductive technologies such as In vitro fertilization (IVF) etc. which are directed to have healthy children.

Key words: Intrauterine fetal death; molecular etiological reasons; aCGH; CNV