Venöz tromboli hastalarında faktör VIII gen bölgesinin moleküler tanısı
Molecular identification of factor VIII gene region in venous thromboli patients
Yazar: MUSTAFA AY
Danışman: PROF. DR. NERMİN GÖZÜKIRMIZI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Koagülasyon = Coagulation ; Trombofili = Thrombophilia

Özet:
Tromboz kanın damarlar içerisinde patolojik bir şekilde pıhtılaşması durumudur. Dünyada ve Türk toplumunda hastalık ve ölümlere neden olduğu bilinmektedir. Tromboz, kan akımındaki değişiklikler, damar duvar değişiklikleri, pıhtılaşma faktörleri ve bunların inhibitörlerinin kan düzeylerindeki değişiklikleri sonucu ortaya çıkmaktadır. Son yıllarda yapılan araştırmalar tedavi stratejilerinin geliştirilmesi, tromboz patogenezinin önlenmesi ve tanımlanması üzerinde yoğunlaştığından, bu çalışmalarda genellikle moleküler biyoloji ve genetik temeline dayanan teknikler kullanılmaktadır.Tromboz patogenezi, multifaktöriyel olup çok sayıda kalıtsal ve edinsel faktörün değişik mekanizmalarla rol oynadığı karmaşık bir süreç ile meydana gelmektedir. Tromboz ile ilgili çalışmalar bugüne kadar antitrombin III, protein C ve S, faktör V, protrombin, metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) gen bölgeleri ve bu gen bölgelerindeki spesifik mutasyonlara odaklanmıştır. Bununla birlikte faktör yükseklikleri ile ilgili olarak yapılan araştırmaların birçoğu fizyolojik çalışmalardan oluşmaktadır. Bu çalışmalar, faktör VIII düzeyi yüksekliğinin tromboz ile ilişkili olduğunu ortaya çıkarmıştır. Ayrıca yüksek faktör VIII düzeylerinin kalıtılsal olduğuda birçok olguda belirtilmektedir.Bu tez çalışmasında, çalışma grubu venöz tromboz teşhisi konulmuş 20 birey ile 20 sağlıklı kontrol bireyden oluşturuldu. Tüm bireylerin faktör VIII geni promotor bölgesi ve 26 ekson bölgesi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılıp, SSCA yöntemi ile bilinmeyen bir mutasyon ya da polimofizim taraması yapıldı.Yaptığımız analizler sonucunda faktör VIII geni promotor bölgesinde venöz tromboz hastaları ve sağlıklı kontrol grubu bireyleri açısından, PCR sonrası yapılan SSCA poliakrilamit jel görüntülerinde herhangi bir patern farklılığına rastlamadık. Faktör VIII geninde, APC kesim yerlerinin bulunduğu ekson 8/9 ve ekson 11 bölgelerinin venöz tromboz hastaları ve sağlıklı kontrol grubu bireyleri için, herhangi bir patern farklılığına rastlamadık. APC bağlanma bölgesi olan ekson 19'da bir venöz tromboz hastasında farklı patern belirlendi. Dizileme analiz sonucunda bunun bir mutasyon ya da polimorfizm olmadığı saptandı.Faktör VIII geninin ekson 6, ekson 13, ekson 14F ve ekson 25 bölgelerinde ise farklı paternler belirlendi. Farklı patern veren bireylerin dizileme analizi sonuçlarına göre ekson 6 ve ekson 13'te herhangi bir mutasyon ya da polimorfizm olmadığı saptandı. Ekson 14F ve ekson 25 bölgelerine ait dizileme sonuçlarında 3 bireye ait belirli bölgelerde baz değişimleri olduğu tespit edildi. 14F bölgesinde saptanan baz değişimlerinden birinin gen ürününün amino asit dizisini değiştirdiği belirlenirken, diğer 2 baz değişikliğinin amino asit dizisine etki etmediği saptandı.Sonuç olarak, faktör VIII geni promotor bölgesi ve 26 ekson bölgesinde yapılan moleküler analizler sonucunda, faktör VIII seviyesi yüksekliği ile ilişkilendirilebilecek herhangi bir mutasyon ya da polimorfizm olmadığı tespit edildi.

Abstract:
Thrombosis is pathologic coagulation of blood in vessels. It is known that it leads to disease and death in the world and in Turkish population. Thrombosis results from variations in blood flow, structural changes in vessel walls, alterations in the level of coagulation factors and their inhibitors. Since the recent researches are focused on improvement of therapy strategies, prevention and identification of thrombosis pathogenesis, generally the techniques employed in these studies are based on molecular biology and genetics.Pathogenesis of thrombosis is a complex multifactorial condition in which various hereditary and environmental factors play role. The studies focused on thrombosis until today involves antithrombin III, protein C and S, factor V, prothrombin, methylentetrahidrofolat reductase (MTHFR) gene regions and the mutations found within these gene regions. Besides, most of the researches performed about factor levels consist of physiologic studies. These studies revealed that high FVIII level is associated with thrombosis. Also, in many cases it was mentioned that high FVIII levels are inherited.In this study, experiment groups are selected from 20 individuals with venouse thrombosis diagnosis and control groups are selected from 20 healthty individuals. FVIII gene promotor regions and 26 exon regions of all individuals were amplified by polymerase chain reaction and unknown mutation detection or polymorphism screening were made by SSCA method.As a result of our analysis, we have not detected any different patterns in the FVIII gene promoter region of healthy individuals and venous thrombosis patients in the SSCA polyacrylamide gels which were performed after PCR. In FVIII gene, there was no pattern difference between exon 8/9 and exon 11 regions which have an APC cleavage site when venous thrombosis patients and healthy individuals were compared. A different pattern was detected from a venous thrombosis patient in exon 19 which has an APC binding region. After sequence analysis, it was found that there is not any mutation or a polymorphism.Different patterns were detected in the exon 6, exon 13, exon 14F and exon 25 regions of FVIII gene. It was also found that there were no mutations or polymorphism in exon 6 and exon 13 according to sequence analysis of the individuals who have different patterns. Base changes were detected in specific regions of 3 individuals after the sequence analysis of exon 14F and exon 25. While one of the base changes detected in the 14F region, was found to change the amino acid sequence of the gene product, other 2 base changes were found not to affect the amino acid sequence.As a result of molecular analysis performed on factor VIII promoter and 26 exon regions, neither any mutations nor polymorphisms related with high levels of factor VIII were detected.