İnsan immunoglobulin G1 bağlayan mikroorganizmaların saptanması için yöntem geliştirilmesi
Establishment of A method to detect human immunoglobulin G1 binding microorganisms
Yazar: OLKAR HIGRAN ABDULMAJED ABDULMAJED
Danışman: PROF. DR. KAYHAN ÇAĞLAR
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antikor bağlayan proteinler = Antibody-binding protein ; Antikorlar = Antibodies ; ELISA =   ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Monoklonal antikorlar =   ; Protein bağlama = Protein binding ; Terapötik yöntemler = Therapeutics ; İmmünoglobülin G = Immunoglobulin G ; İmmünoglobülinler = Immunoglobulins

Özet:
Bazı bakterilerin yüzeyinde insan ve diğer memeli organizmalardaki antikorlara ve bazı proteinlere bağlanma özelliğine sahip olan protein yapısında moleküller bulunmaktadır. Şu ana kadar bu moleküller az sayıdaki bakteri türünde saptanmıştır. Stafilokoklardaki protein A molekülü, streptokoklardaki protein G molekülü ve peptostreptokoklardaki L proteini bu moleküllere örnektir. Bu proteinlerin farklı organizmalardaki ve insanlardaki antikor sınıf ve alt sınıflarını bağlama özellikleri, eğilimleri, güçleri ve antikorları bağladıkları bölgeler farklılık göstermektedir. Antikor bağlayan proteinlerin bu özelliklerinden faydalanılarak bu moleküller biyoteknoloji alanında monoklonal antikorların elde edilmesinde ve özelliklerinin incelenmesinde kullanılmaktadır. Bu çalışmada, mikroorganizmaların yüzeyinde bulunan immunoglobulin bağlayan proteinlerin saptanmasına yönelik orijinal ve pratik bir tarama testinin geliştirilmesi amaçlandı. Son yıllarda insanlarda monoklonal antikorların ilaç olarak sık bir şekilde kullanılmasına bağlı olarak, bu ilaçların vücuttaki metabolizmasını belirlemek için ilaç-anti ilaç ELISA sistemleri (idiyotipik-anti idiyotipik antikor ELISA sistemleri) tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır. Bizde çalışmamızda yöntem olarak, immunoglobulin bağlayan protein taşıyan mikroorganizmaları saptamak için, bu amaca yönelik şimdiye kadar literatürde tanımlananlardan farklı "anti-idiopatik antikor (AİA) tabanlı" bir ELISA ölçüm sistemi geliştirdik. Çalışmamızdaki test antikoru, anti-idiotipik antikor tabanlı ölçüm sistemindeki idiotipik antikordur. Test antikoru olarak kullanılan bu idiotipik antikor, rekombinant insan immunoglobulin G1 kappa (IgG1) yapısında ve Tocilizumab (Actemra®) isimli tedavi amaçlı kullanılmakta olan bir ilaçtır. Bu amaçla ELISA plakları anti-idiotipik antikor (anti-Tocilizumab) ile kaplandı. Çalışmamızda mikrobiyoloji laboratuvarına gönderilen çeşitli klinik örneklerden izole edilmiş ve tiplendirilmiş olan çeşitli bakteri ve mantar izolatları kullanıldı. Mikroorganizmalar çalışma gününe kadar -30oC'de saklandı. Çalışma günü mikroorganizmaların canlandırılmasını takiben, besiyerinden alınan mikroorganizma, içinde sabit miktarda test antikoru bulunan solüsyona aktarıldı ve kısa bir inkübasyon sonrası santrifüj edilerek üst sıvıda kalan test antikorunun miktarı "anti-idiopatik antikor tabanlı ELISA" ile ölçüldü. ELISA kuyucuklarına eklenen örnek içerisinde eğer özgül olduğu idiotipik antikor (test antikoru) var ise, zemindeki anti-idiotipik antikor bunu spesifik olarak bağlayacaktır. Bu bağlama ortamdaki test antikor miktarı ile doğru orantılı olacak ve bağlanmış olanlar yıkama işlemi ile ortamdan uzaklaşmayacaktır. Zemindeki anti-idiopatik antikor aracılığı ile bağlanmış olan test antikoru, ortama eklenen enzim ile işaretli anti-idiopatik antikor'a da bağlanacaktır; çünkü test antikorumuz insan IgG1 olup, spesifik bağlanmadan sorumlu özdeş iki adet Fab ucu bulunmaktadır. Dolayısıyla, ortamda test antikoru var ise miktarıyla orantılı olarak köprü bağlanması yapacak, o ölçüde renklenmeye neden olacak ve nicel (kantitatif) bir ölçüm sistemi oluşturacaktır. Bu çalışma sonunda, mikroorganizmalarda antikor bağlayan proteinlerin varlığını göstermek için orijinal, hızlı ve pratik bir yöntem geliştirildi.

Anahtar Kelimeler : Antikor bağlayan proteinler, ELISA, terapötik antikor

Abstract:
Immunoglobulin binding proteins are the molecules that may be found on the surface of some bacteria that have ability to bind antibodies and some proteins in human and other mammalian organisms. These kind of proteins have been identified in a small number of bacteria up to the present. Protein A molecule in staphylococci, protein G molecule in streptococci and protein L in peptostreptococci are examples of these molecules. Binding specifities of these proteins to antibody classes and subclasses in human and different organisms, their afinity, strenght, and parts in the antibody molecule that they bind may show differences. Immunoglobulin binding molecules have been extensively used to obtain and purify monoclonal antibodies in the area of biotechnology. In this study, it is aimed to develop an original and practical screening method for the detection of immunoglobulin binding proteins on the surface of bacteria. Due to common usage of therapeutic antibodies in humans in recent years, drug-anti drug ELISA methods (idiotypic-anti idiotypic antibody ELISA) have also been widely used worldwide to determine the metabolism of these drugs. In this study, we developed an original and rapid idiotypic-anti idiotypic ELISA method, different from the techniques defined in the literature for this purpose so far, to detect immunoglobulin binding proteins on the surface of bacteria. The test antibody used in our study to detect immunoglobulin binding proteins was the idiotypic antibody in our idiotypic-anti idiotypic ELISA measurement system. This idiopathic antibody is a recombinant human immunoglobulin G1 Kappa (IgG1) molecule, and has been used as a drug, Tocilizumab (Actemra®), in humans for theurapotic purposes. ELISA microplates were covered with anti-idiotypic antibodies (anti-Tocilizumab). Bacterial and fungal isolates which were isolated and identified from different clinical specimens submitted to our clinical microbiology laboratory were used in the experiments. Microorganisms were maintained at -30oC until the study day. Frozen isolates were transferred to the appropriate growth media on the study day. After an overnight incubation they were subcultered again and used in the screeening experiments. Isolates were transferred to the tubes containing a fixed concentration of the test antibody. After a short incubation period (30 min), tubes were centrifuged and supernatants were measured for the presence of test antibody with our idiotypic-anti idiotypic ELISA system. If the samples added to the ELISA wells contain the test antibody, this idiotypic antibody will then bind specifically to the anti-idiotypic antibody in the solid phase. This binding will directly be proportional to the amount of the test antibody in the supernatant and bound antibodies will not be washed away from the wells during the washing of the ELISA plates. The bound test antibody will also bind to the anti-idiotypic antibody conjugate labelled with an enzyme since our test antibody has two identical Fabs responsible for specific antigen binding. Therefore, if the test antibody is present in the supernatant, it will cause a bridging directly proportional to its quantity and a color development will be seen forming a quantitative measurement system. At the end of this study, a fast, original and practical method was developed in the detection of the immunoglobulin binding proteins on the surface of bacteria

Key Words : Antibody-binding protein, ELISA, therapeutic antibody