Biyolojik atıklarda üretilen küf misellerinden ekstrakte edilen kitin nanofiber kullanılarak antifungal yenilebilir kaplama üretimi
Production of antifungal renewable coatings by using fungal chitin nanofibre extracted from mould mycelia produced in biological wastes
Yazar: ÖZGE ASLAN
Danışman: PROF. DR. ARZU ÇAĞRI MEHMETOĞLU
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında, Aspergillus niger tarafından kitin nanofiber üretimi için gıda atıklarının bir büyüme ortamı olarak kullanılma potansiyeli ve küf kitin-glukan nanofiberinden elde edilen hidrojel kaplama malzemesinin Kaşar peynirinin raf ömrünü artırmadaki etkisi araştırılmıştır. 
Çalışma kapsamında, ilk aşamada A. niger 'den kitin-glukan nanofiber üretmek için bir otelden elde edilen gıda atıklarının steril olmayan koşullarda matematiksel modelleme tekniği ile optimize edilerek besiyeri olarak kullanılma olasılığı belirlenmiştir. Yerel bir otelin gıda atığı, atığın protein ve polisakkarit içeriğine bağlı olarak dört farklı besiyeri hazırlamak için kullanılmıştır. Referans çalışmalardan farklı olarak protein ve polisakkarit ağırlıklı grubun   A. niger gelişimi üzerindeki etkisi incelenmek istendiğinden sebze meyve ağırlıklı bileşenler tüm gruplara sabit oranda katılmıştır. Ön denemeler gerçekleştirilirken kullanılan kontrol besiyerinde test mikroorganizmanın ticari besiyerlerindeki gelişimine benzer oranda biyokütle oluşturduğu belirlenmiştir. Bu durum kullanılan besiyerinin dışarıdan herhangi bir madde ilave edilmeksizin mikroorganizma gelişimi için uygun ortam olduğunu göstermektedir. İçerik olarak bileşimi belirlenen besiyerinde protein ve polisakkarit miktarının oransal farklılıklarının A. niger üzerindeki etkisi incelenmek istendiğinden bileşimde farklı yüzdeler kullanılmıştır.
Bu çalışma otellerden toplanan gıda atıklarının besiyeri olarak geri dönüştürülerek çevre kirliliğinin önüne geçilmesi ve ekonomik kayıpların önlenmesini sağlayacak ve kitin-glukan nanofiber üretiminde fungusların steril olmayan koşullarda kullanımına farklı bir bakış açısı sağlayacaktır. Biyokütle üretiminde besiyeri ortamının bileşimi, A. niger inokulum çapı, inkübasyon süresi ve çalkalama hızı dahil olmak üzere optimum fermantasyon koşulları 4x4 Taguchi deney tasarımı kullanılarak analiz edilmiştir. Üretilen kitin-glukan nanofiberin karakterizasyonu FESEM, FT-IR ve NMR kullanılarak belirlenmiştir. 
 Deneysel tasarım sonuçları, en yüksek kitin-glukan nanofiber miktarının pH 5 ve 30 °C'de %58.82 verimle 1.9 g/l olarak bulunduğunu göstermiştir. En yüksek verim için optimum koşullar, %20 meyve-sebze, %30 protein ve %50 polisakkarit açısından zengin atık içeren ortam kullanıldığında, 8 mm A. niger aşılama boyutu ile 6 gün inkübasyon süresinde 100 RPM çalkalama hızında gözlenmiştir. 
Çalışmanın ikinci aşamasında biyolojik atıklarda üretilen küf misellerinden ekstrakte edilen kitin nanofiber kullanılarak antifungal özellikli yenilebilir kaplama üretimi hedeflenmiştir. Kitin-glukanın sahip olduğu önemli özelliklerden biri de kararlı kristal yapıda olması ve çözünürlüğünün bu sebeple yalnızca dimetilasetamid, lityum klorür, tetrabutilamonyum klorid, dimetil sülfoksit gibi özel çözücülerle gerçekleşmesidir. Bu özelliğinden yararlanılarak kitin-glukandan hidrojel oluşturulmaktadır. Kitin-glukan nano-fibriller suda çözünmez ve sulu alkalin sistemlerde hidrofilik kısımlar geniş bir yüzey alanı ile bir ağ yapısı meydana getirir. Bu ağ yapısı donma noktasının altında, polimer zincir matrisindeki hidrojen bağlarının parçalanmasını teşvik etmekte ve alkalide çözünmüş kitin-glukanın diyaliz edilmesiyle fiziksel hidrojeller meydana gelmektedir. Bu durum toksik bileşenler içeren kimyasal ajanlar kullanılarak oluşturulan hidrojellerin aksine hem insan sağlığı açısından yenilebilir ambakaj üretiminde kullanımını hem de daha az kimyasal kullanımı ile çevre kirliliğinin  önlenmesini mümkün kılmaktadır.Bu nednele çalışma da kaplama materyali olarak NaOH ve KOH kullanılarak dondurma- çözme prosedürü ile kitin nanofiberden hidrojel elde edilmiş ve daha sonraki aşamada hidrojelin karakterizasyonuna yönelik analizler yapılmıştır. Kitin-glukan bazlı hidrojellerle (KGH) kaplanmış örnekler 28 gün boyunca 4 °C'de saklanmıştır. Hidrojeller Fourier-transform infrared spektroskopisi (FI-TIR) ile gözlemlenmiştir. Kaplanan peynir örnekleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiş, ayrıca Kaşar peynirinde depolama süresince pH, ağırlık kaybı, nem miktarı ve peroksit sayısı gözlenmiştir, toplam aerobik mezofilik bakteri (TAMB) sayısı, laktik asit bakteri (LAB) sayısı ve maya-küf sayısı hesaplanmıştır. Depolamanın son günü peynir örneklerine tekstür analizi ve renk tayini yapılmıştır. 
FI-TIR analizinde meydana gelen bantlar kaplamanın kitin-glukandan oluştuğunu göstermiştir. SEM analizinden elde edilen yüzey morfolojisine göre Kaşar peyniri yüzeyi kaplama uygulamaları ile başarılı bir şekilde kaplanmıştır. Kaşar peynirinin hidrojelle kaplanması örneklerin pH' değerinde kontrole göre istatistiksel olarak önemli bir artışa neden olmuştur (p≤ 0.05). Depolama süresince, kaplama uygulaması örneklerin ağırlık kaybını önemli ölçüde artırmıştır (p≤0.05). Kontrol, KOH-CGH ve NaOH-CGH ile kaplı örneklerde nem kaybı sırasıyla %8, %18 ve %14 olarak hesaplanmıştır. Hidrojel kaplama, 28 günlük depolama süresince peynir örneklerinde KOH-CGH örneklerde LAB üremesini engellemiştir (p≤0.05) fakat küf/maya ve mezofilik bakteri gelişimini engelleyememiştir (p≥0.05), bunun yanı sıra hidrojel kaplama uygulaması Kaşar peynirindeki peroksit sayısını önemli ölçüde azaltmıştır (p≤0.05). Hidrojel kaplama Kaşar peyniri örneklerin de oksijen geçişini yavaşlatmış ve depolama süresince hidrolizi geciktirmiştir. Kitin-glukan hidrojel ile kaplama uygulanan peynir örneklerinde hidrojelin kuruması sonucu  nem kaybı kontrol grubunda ki peynir örneğine göre daha fazla gerçekleşmiş ve kaplanan peynir örneklerinde sertlik artmıştır. Hidrojel ile kaplanmış peynir örneklerinin sertlik, sakızımsılık, dış yapışkanlık ve iç yapışkanlık değerleri kontrolden önemli ölçüde yüksek bulunmuş, ancak kaplama uygulamaları peynirin esnekliğini azaltmıştır (p≤ 0.05). Sonuç genel anlamda sertlik ve elastikiyet arasında negatif bir korelasyon olduğunun götergesidir. Kaşar peynirin parlaklığı hidrojel kaplama uygulamaları ile önemli ölçüde azalmıştır (p≤0.05). Karakterizasyon çalışmaları, atıklardan elde edilen kitin-glukan nanoliflerin ticari muadillerine eşdeğer olduğunu göstermiştir. 
A. niger 'den kitin-glukan nanolif üretmek için gıda atıklarının kullanılması maliyet tasarrufu sağlayabilir ve çevre kirliliğini önemli ölçüde azaltabilir. Kitin-glukan bazlı hidrojellerin antioksidan etkisi, Kaşar peynirinin kalitesini korumak ve depolama sürecindeki kayıpları önlemek için yenilikçi ve sürdürülebilir bir teknik olarak kullanımlarının umut verici olduğunu göstermektedir.

Abstract:
In this thesis, the potential of using food waste as a growth medium for the production of chitin nanofibres by Aspergillus niger and the effect of hydrogel coating material obtained from fungus chitin-glucan nanofibres on increasing the shelf life of Kashar cheese were investigated.
Within the scope of the study, in the first stage, the possibility of using food waste from a hotel as a medium to produce chitin-glucan nanofibres from A. niger was determined by optimising it with mathematical modelling technique under non-sterile conditions. Food waste from a local hotel was used to prepare four different media depending on the protein and polysaccharide content of the waste. Unlike the reference studies, since the effect of the protein and polysaccharide-dominated group on A. niger growth was wanted to be examined, vegetable and fruit-dominated components were added to all groups at a constant rate. In the control medium used during the preliminary experiments, it was determined that the test microorganism formed biomass at a rate similar to the growth of the test microorganism in commercial media. This indicates that the medium used is suitable for the growth of microorganisms without the addition of any external substances. Since the effect of proportional differences in the amount of protein and polysaccharide on A. niger in the medium, different percentages were used in the composition. 
This study will prevent environmental pollution and economic losses by recycling food waste collected from hotels medium and will provide a different perspective on the use of fungi in non-sterile conditions in the production of chitin-glucan nanofibres. The optimum fermentation conditions for biomass production, including the composition of the medium, A. niger inoculum diameter, incubation time and agitation rate, were analysed using a 4x4 Taguchi experimental design. The characterisation of the produced chitin-glucan nanofibre was determined using FESEM, FT-IR and NMR.
 The results of the experimental design showed that the highest amount of chitin-glucan nanofibre was found to be 1.9 g/l with 58.82% yield at pH 5 and 30 °C. The optimum conditions for the highest yield were observed at an incubation time of 6 days with an inoculum size of 8 mm A. niger and an incubation time of 6 days at a shaking speed of 100 RPM when using media containing 20% fruit-vegetable, 30% protein and 50% polysaccharide-rich waste.
In the second stage of the study, it was aimed to produce edible coatings with antifungal properties using chitin nanofibres extracted from fungus mycelia produced in biological wastes. One of the important properties of chitin-glucan is that it has a stable crystal structure and its solubility is realised only with special solvents such as dimethylacetamide, lithium chloride, tetrabutylammonium chloride, dimethyl sulfoxide. By utilising this feature, hydrogel is formed from chitin-glucan. Chitin-glucan nano-fibrils are insoluble in water and in aqueous alkaline systems the hydrophilic parts form a network structure with a large surface area. This network structure promotes the breakdown of hydrogen bonds in the polymer chain matrix below the freezing point and physical hydrogels are formed by dialysing alkaline dissolved chitin-glucan. Unlike hydrogels formed by using chemical agents containing toxic components, this situation makes it possible to use both in the production of edible packaging in terms of human health and to prevent environmental pollution with less chemical use.
For this reason, in this study, hydrogel was obtained from chitin nanofibre by freeze-thawing procedure using NaOH and KOH as coating material and then analyses for the characterisation of the hydrogel were carried out. Kashar cheese obtained from the local market was sliced into 10±2 g pieces of 2x2x0.5 cm thickness under aseptic conditions. They were immersed in 50 mL of chitin-glucan-based hydrogels prepared with KOH, NaOH for 10 seconds and dried on a wire grid in a sterile cabinet for 1 hour. The cheese samples coated with chitin-glucan-based hydrogels (KGH) were stored at 4 °C for 28 days. The hydrogels were observed by Fourier-transform infrared spectroscopy (FI-TIR). The coated cheese samples were analysed by scanning electron microscopy (SEM) and pH, weight loss, moisture content and peroxide number were observed, total aerobic mesophilic bacteria (TAMB) count, lactic acid bacteria (LAB) count and yeast-mould count were calculated. On the last day of storage, cheese samples were subjected to texture analysis and colour determination. 
The bands formed in FI-TIR analysis showed that the hydrogel consisted of chitin-glucan. SEM analysis showed that the surface of Kashar cheese was successfully coated with coating applications. The microstructure of hydrogels prepared with KOH was tighter than those prepared with NaOH and a dense three-dimensional network microstructure formation was observed. While a heterogeneous microstructure with larger pores was obtained with NaOH-KGH, a smaller pore size and a more homogeneous network structure was observed in cheese samples coated with KOH-KGH. Coating Kashar cheese with either hydrogel caused a statistically significant increase in the pH of the samples compared to the control (distilled water) (p≤ 0.05). LAB growth was inhibited in the Kashar cheese samples coated with KOH-KGH during storage, which is thought to have prevented the decrease in pH. The coating process significantly increased the weight loss of the samples during storage (p≤0.05). It is thought that the water in the hydrogel causes more water loss from the cheese during storage and the weight loss is higher in the hydrogel coated samples due to drying.  Moisture loss in samples coated with water, KOH-CGH and NaOH-CGH was calculated as 8%, 18% and 14%, respectively. The water loss in the control cheese samples coated with pure water was due to the drying of the cheese. The water loss in Kashar cheese samples coated with chitin-glucan hydrogels is thought to occur due to the drying of the hydrogels. Although not as fast as in the control samples, the higher moisture loss in the cheese samples coated with hydrogel is associated with this situation. Either of the hydrogel could not inhibit the growth of mold/yeast and mesophilic bacteria (p≥0.05) in the cheese samples during 28 days of storage period; whereas, only coating with KOH-CGH inhibited the growth of LAB (p≤0.05). Moreover, coating with the hydrogels significantly reduced the peroxide number in Kashar cheese (p≤0.05). Hydrogel coating slowed down the oxygen transfer in Kashar cheese samples and delayed hydrolysis during storage. This is the result that the hydrogel coating prevents oxidative degeneration of lipids and has antioxidant properties. Chitin-glucan based hydrogel coating showed antioxidant properties and fulfilled the function of slowing down lipid peroxidation.
In the cheese samples coated with chitin-glucan hydrogel, moisture loss occurred more than the cheese samples in the control group as a result of the drying of the hydrogel and hardness increased in the coated cheese samples. The hardness, chewiness, adhesiveness, and cohesiveness values of the hydrogel-coated cheese samples were significantly higher than the control, but the coating treatments decreased the resilience and the gumminess of the cheese (p≤ 0.05). The result generally indicates a negative correlation between stiffness and elasticity. The brightness of Kashar cheese significantly decreased with hydrogel coating treatments (p≤0.05). The results of the analyses to determine the characterisation applied to chitin-glucan nanofibres showed that the chitin-glucan nanofibres produced using food waste had the same properties as commercial chitin-glucan nanofibres. 
At the stage where the application of the obtained chitin-glucan nanofibre as a coating material on the cheese surface by dissolving it in a suitable solvent system was investigated, the use of chitin-glucan extracted from biological wastes for the first time as a coating material in cheddar cheese by converting it into hydrogel and the effect of KOH-KGH and NaOH-KGH coatings on the shelf life of cheese during storage was investigated. Under the conditions tested, oxygen permeation was slowed down in cheese samples treated with chitin-glucan hydrogel coating and hydrolysis of fats was delayed in both coating applications. The utilisation of food waste in the production of chitin-glucan nanofibres with A. niger has been effective in both cost reduction and significant reduction of environmental pollution. With the antioxidant effect of chitin-glucan-based hydrogels, it was found promising as an innovative and sustainable technique for the preservation of quality in Kashar cheese and prevention of losses that may occur during the storage process of cheese.