Anoxybacillus gonensis G2 bakterisinin alüminyuma dirençlilik geninin belirlenmesi, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of the aluminium resistance gene of Anoxybacillus gonensis G2
Yazar: FATİH ŞABAN BERİŞ
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada, 100 mM'a kadar Al+3'e dirençli olduğunu belirlediğimiz,Anoxybacillus gonensis G2 termofilik bakterisinin alüminyum dirençlilik genine aitözellikler araştırılmıştır. lgili gen klonlandıktan sonra DNA dizin analizi yapıldı ve aminoasit sırası tespit edildi. Gen dizisi, Genbank ile karşılaştırılarak, gen hakkında detaylıbilgilere ulaşıldı. Karşılaştırmalar sonucunca ATPaz'lara olan benzerliği nedeniyle, ilgiligen önce bir ekspresyon vektörüne klonlandı ve bu sayede bol miktarda üretilereksaflaştırıldı. Saf enzimin ATPaz aktivitesi belirlendikten sonra, bu aktiviteye aitbiyokimyasal karakterizasyon çalışmaları yapıldı.A. gonensis G2 bakterisinin sahip olduğu alüminyum dirençlilik geni, 666 baz çiftibüyüklüğünde ve 222 amino asit içerdiği bulundu. AlR geninin Genbank karşılaştırmalarıda hem alüminyum dirençliliği genlerine yüksek oranda benzediğini hem de ATPazbenzerliğini ortaya koydu. Enzimin çalıştığı optimum pH 6,0 ve sıcaklık değeri ise 73ºColarak belirlendi. Enzimin Km değeri 10 ÂµM, Vmax değeri ise 7,2 ünite olarak tespit edildi.Zn+2 ve Al+3 iyonlarının enzimin aktivitesini arttırdığı, Ag+, Li+, Mn+2, Co+2, Cu+2 ve Cd+2iyonlarının ise aktiviteyi azalttığı bulundu. 100 mM Li+, 100 mM Co+2 ve 200 mM Cu+2iyon konsantrasyonlarının aktiviteyi tamamen inhibe ettiği belirlendi. EDTA'nın aktiviyi80 mM konsantrasyonda % 62 ve sodyum azidürün 50 mM konsantrasyonda % 86azalttığı, 200 mM Î²-merkaptoetanolün ve 7 mM Ouabainin konsantrasyonlarının iseenzimi tamamen inhibe ettiği tespit edildi. Enzimin kristallendirilebilmesi için en uygunşartların, % 10 izopropanol ve % 22 PEG-4000 içeren 1 M HEPES (pH 7,5) tamponunolduğu tespit edildi. Enzimin, bu şartlar altında iğne şeklinde kristal yapılar oluşturduğugözlendi.

Abstract:
In this study, we studied the properties of aluminum resistance gene from athermophilic bacteria, A. gonensis G2 that is resistant up to 100 mM Al+3. First of all, thegene was cloned and then, the nucleotide and amino acid sequences oh this gene weredetermined. We obtained more information about the gene after Genbank similarities ofthe gene were done. According to these data, we found that the gene is similar to someATPases. This gene also was cloned into the expression vector in order to obtain more andpure gene product. This gene product was used to determine the ATPase activity and thebiochemical features of the activity.We found that the aluminum resistance gene from A. gonensis G2 has 666 basepairs and 222 amino acids. It was confirmed that this gene is responsible for aluminumresistancy and is similar to some ATPases by Genbank comparisons. We determined theoptimum pH value for the activity is 6,0 and the temperature is 73ºC. We calculated thatKm is 10 ÂµM and Vmax is 7,2 units for the activity. The activity was increased by Zn+2 andAl+3 ions and decreased by Ag+, Li+, Mn+2, Co+2, Cu+2, and Cd+2 ions. Especially, Li+,Co+2, and Cu+2 ions completely inhibited the activity at high concentration, 100, 100, and200 mM, respectively. We determined the activity was reduced to 62% with 80 mM ofEDTA and 86% with 50 mM sodium azide. 200 mM of Î²-mercaptoethanol and 7 mM ofouabain completely inhibited the activity.The optimum crystallization conditions were determined as 1 M HEPES (pH 7,5)including 10% isopropanol, 22% PEG-4000. We obtained the crystal structure of theenzyme likes needle.