Türkiye'den izole edilen alkalifilik Bacillus cinsi izolatların taksonomik sınıflandırması ve alkalen proteaz üretim kapasiteleri
Taxonomic classification and alkaline protease production capacities of the alkaliphilic isolates belonging to genus Bacillus isolated from Turkey
Yazar: NİLGÜN TEKİN
Danışman: PROF. DR. CUMHUR ÇÖKMÜŞ
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Bacillus = Bacillus

Özet:
Yüksek pH koşullarında gelişim gösteren, ekstremofil olarak tanımlanan alkalifilik bakterilere ait enzimler, yüksek pH değerlerinde stabil olmaları nedeniyle bir çok endüstri dalı tarafından talep görmektedir. Bu enzimlerin başında alkalen proteazlar gelmekte olup, deterjan, medikal, gıda, deri, farmasötik, biyolojik atık giderimi ve tekstil endüstrisi gibi pek çok alanda kullanılmaktadır. Pek çok ülkede endüstriyel enzim üretimi amacıyla yasal iznin alınması ve enzimlerin ticari olarak kullanılabilmesi için, endüstriyel öneme sahip enzim üretimi yapan mikroorganizma türlerinin tam olarak teşhis edilmesi gerekmektedir. Bu çalışmada biyoteknolojik öneme sahip alkalen proteaz üreticisi basillerin belirlenmesi için Türkiye'nin farklı bölgelerinden yüksek alkali koşullarda gelişebilen 56 adet Gram pozitif, endospor oluşturan çubuk şeklinde bakteriler izole edilmiştir. Herbir izolatın alkalen proteaz ürettiği uygun koşulun belirlenmesi için bir çok farklı parametrede enzim aktivitesi deneyleri gerçekleştirilmiştir. İncelenen parametrelerin her birinde 7 izolatın standart suşlardan daha yüksek enzim aktivitesi gösterdiği belirlenmiştir. Bu izolatlardan E114 ve C265 kodlu izolatların en yüksek alkalen proteaz üreten (103125 U/ml/g) izolatlar olduğu belirlenmiştir. Ayrıca bütün izolatların fenotipik karakterleri belirlenmiş ve 16S rRNA geni dizi analizleri gerçekleştirilmiştir. Yüksek alkalen proteaz üreticisi izolatlar olan E114 ve C265, sırasıyla %99.4 dizi benzerliği ile B. licheniformis ve %99.8 dizi benzerliği ile B. mojavensis olarak tanımlanmıştır. B. safensis olarak gruplandırılan izolatların yüksek kapasitede alkalen proteaz üreten izolatlar olduğu belirlenmiştir. İzolatların genotipik karakterizasyonları birden fazla moleküler teknikle (ITS-PCR, (GTG)5-PCR, BOX-PCR, ARDRA ve toplam hücre proteinlerinin SDS-PGE analizi) yapılmıştır. Bu farklı tekniklerle alkalifilik izolatlar arasındaki farklılıklar ortaya koyulurken elde edilen sonuçların 16S rRNA geninin filogenetik analizi ile uyumluluğu da gösterilmiştir. Sonuç olarak biyoteknolojik öneme sahip alkalen proteaz üreticisi izolatlar daha sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere belirlenirken, her bir izolat polifazik bir yaklaşımla çoklu-genotipik analizler ile taksonomik pozisyonlarına göre gruplandırılmıştır.

Abstract:
Alkaliphilic bacteria, which are also called as extremophile, can grow at high pH conditions. The enzymes of these alkaliphilic bacteria have a high demand for (hayatım bu daha dogru gibi geldi ama emin olamadım) many industrial branches due to their stability at high pH values. Of these enzymes, alkaline proteases take the lead and have been used in many areas such as detergent, medicine, food, leather, pharmaceuticals, biological waste elimination and textile industry. In many countries, obtaining legal permission is necessary in order to produce industrial enzymes and the types of microorganisms that produce enzymes with industrial importance should be fully identified to use enzymes commercially. In this study, 56 gram positive, endospore forming, rod shaped bacteria, capable of growing under highly alkaline conditions were isolated from different regions of Turkey in order to isolate biotechnologically important alkaline protease producing bacilli. Alkaline protease activity experiments were carried out at different parameters to determine the suitable alkaline protease production condition of the each isolates. Seven of the isolates showed higher enzyme activity than the standard strains at each parameter of which E114 and C265 isolates were found to be the highest alkaline protease producers (103125 U/ml/g). All these isolates were examined by means of their phenotypic characters and 16S rRNA sequences. The highest alkaline protease producing isolates, E114 and C265, were identified as B. licheniformis with 99.4% and B. mojavensis with 99.8% sequence similarities, respectively. The isolates identified as B.safensis determined as high capacity alkaline protease producer. Genotypic characterizations of the isolates were also determined by using a wide range of molecular techniques (ARDRA, ITS-PCR, (GTG)5-PCR, BOX-PCR and SDS-PAGE of whole cell proteins). These different techniques allowed us to differentiate the alkaliphilic isolates and the results were in concurrence with phylogenetic analyses of the 16S rRNA gene. In conclusion, biotechnologically valuable alkaline protease producing isolates were introduced in order to use in further studies and each of the isolated strains grouped into their taxonomic position by using polyphasic approach with multi-genotypic analyses.