Glutatyona bağlı antioksidatif kapasite inhibisyonunun kolorektal kanser metabolizması üzerine etkileri
Effects of glutathione-induced antioxidative capacity inhibition on colorectal cancer metabolism
Yazar: SENANUR MALCANLI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖYKÜ GÖNÜL GEYİK ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ALİ BURAK ÖZKAYA
İstinye Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kanser Biyolojisi ve Farmakolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kolorektal kanser, dünya çapında insidans açısından üçüncü, mortalite açısından ise ikinci sırada yer alan önemli bir malignitedir. Potansiyel yan etkiler ve ilaç direnci nedeniyle geleneksel kemoterapi yaklaşımlarının etkisizliği, konvansiyonel kemoterapötik ilaçların antioksidan mekanizma inhibitörleri ile kombine uygulanması gibi yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açmaktadır. Çalışmamızda, antioksidatif mekanizmada önemli rol oynayan glutatyonun inhibisyonuna, glutaminaz ve glukoz-6-fosfat dehidrogenaz aktivitesinin inhibe edilmesiyle NADPH seviyesinin düşürülmesi olarak iki temel mekanizmayla odaklandık. Glutatyon inhibisyonunun, kanser hücrelerinde geleneksel kemoterapötik ilaç olan 5-fluorourasil'in etkilerini artırıp artırmadığını araştırdık. HCT-116 ve HT-29 kolorektal kanser hücrelerinde glutaminaz ve glukoz-6-fosfat dehidrogenaz inhibisyonuyla, glutatyon aktivitesini azaltmak için sırasıyla küçük molekül inhibitörler CB-839 ve Polidatin kullanıldı. HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde 5-fluorourasil'in hücre canlılığı üzerindeki etkisi Sülforodamin-B testi ile araştırılmış ve kombinasyon için IC50 dozu belirlenmiştir. CB-839 inhibitörünün hücre canlılığındaki etkisi araştırılmış ve HT-29 hücrelerinde 100 nM, 10 nM, 1 nM; HCT-116 hücrelerinde 10 nM, 1 nM, 0,1 nM dozları sırasıyla canlılığı düşüren ilk doz, canlılığı düşürmeyen en yüksek doz ve canlılığı düşürmeyen en yüksek dozdan bir önceki doz olarak seçilmiştir. HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Polidatin inhibitörünün hücre canlılığındaki etkisi araştırılmış, hücre canlılığını etkilemediği belirlenmiş ve kombinasyon için denenen en yüksek doz olan 100 μM dozu seçilmiştir. GSH ve GSSG miktarı tespit edilerek CB-839'un glutaminaz inhibisyonunu; NADP+/NADPH oranı tespit edilerek de, Polidatin'in glukoz-6-fosfat dehidrogenaz inhibisyonunu gerçekleştirdiği gösterilmiştir. İnhibitörlerin ve inhibitör-5-FU kombinasyonunun ROS seviyesindeki etkileri akış sitometrisi; hücre ölümü üzerindeki etkileri Hoechst-33342&PI boyamasıyla belirlenmiş ve kolorektal kanser hücrelerinde ROS seviyesini artırmadığı ve hücre ölümünü tetiklemediği görülmüştür. Sonuç olarak, antioksidan sistem inhibisyonu, 5-fluorourasil'in etkinliğine katkıda bulunmamıştır.

Abstract:
Colorectal cancer is concerning malignancy death ranking third in incidence and second in mortality worldwide. Ineffectiveness of classical chemotherapeutical approaches due to potential side effects and drug resistance leads to development of novel treatment strategies such as combining oxidant chemotherapy with inhibitors of antioxidant mechanism. In our study, we focused on the inhibition of glutathione, which plays an important role in the antioxidant mechanism, by two main mechanisms as inhibition of glutaminase activity and inhibition of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity and reduction of NADPH level. We investigated whether glutathione inhibition enhances effects of 5-fluorouracil, conventional chemotherapeutic, on cancer cells. Small molecule inhibitors CB-839 and polydatin were used to reduce glutathione activity respectively via glutaminase and glucose-6-phosphate dehydrogenase inhibition in HCT-116 and HT-29 colorectal cancer cell lines. The effect of 5-fluorouracil on cell viability in HT-29 and HCT-116 cells was investigated by Sulforodamine-B test and IC50 dose was determined for the combination. The effect of CB-839 inhibitor on cell viability was investigated and doses of 100 nM, 10 nM, 1 nM in HT-29 cells; 10 nM, 1 nM, 0.1 nM in HCT-116 cells were selected as the first dose that reduced viability, the highest dose that did not reduce viability, and the previous dose from the highest dose that did not reduce viability, respectively. The effect of polydatin inhibitor on cell viability was investigated in HT-29 and HCT-116 cells, it was determined that it did not affect cell viability, and the highest dose of 100 μM was selected for the combination. By determining the amount of GSH and GSSG, it was shown that CB-839 inhibits glutaminase; and by determining the NADP+/NADPH ratio, it was shown that Polydatin inhibits glucose-6-phosphate dehydrogenase. The effects of inhibitors and inhibitor-5-FU combination on ROS level were determined by flow cytometry; the effects on cell death were determined by Hoechst-33342&PI staining and it was found that it did not increase ROS level in colorectal cancer cells and did not trigger cell death. As a result, inhibition of the antioxidant system did not contribute to the effectiveness of 5-fluorouracil.