Farelerde kronik kistogenik ve reaktive toksoplazmoz modelinde toltrazuril tedavisinin toksoplazmik ensefalit oluşumunda koruyucu etkinliğinin araştırılması
Investigation of protective effect of toltrazuril treatment on relapsing encephalitic toxoplasmosis in chronic cystogenic and reactivated toxoplasmosis model in mice
Yazar: TUBA BAYRAM
Danışman: PROF. DR. OĞUZ KUL
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Parazitoloji = Parasitology ; Patoloji = Pathology
Dizin: Ensefalitler = Encephalitis ; Fareler = Mice ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kistler = Cysts ; Reaktivasyon = Reactivation ; Toksoplazmoz = Toxoplasmosis ; Toltrazuril = Toltrazuril ; Toxoplasma gondii = Toxoplasma gondii ; İmmünperoksidaz boyama tekniği = Immunoperoxidase staining procedure

Özet:
Toksoplazmoz, insan ve hayvanlarda şekillenen, bir protozoon olan Toxoplasma gondii'nin oluşturduğu, ölümcül enfeksiyonlara neden olan yaygın bir paraziter infeksiyondur. Yapılan çalışmalar sonucunda oldukça yaygın olduğu bilinen bu paraziter enfeksiyon, konağın dokularına yerleştikten sonra kendini korumaya alarak doku kisti formunu oluşturur. Herhangi bir nedenden immun sistemin baskılanması sonucunda (AIDS, kortizon tedavisi alan veya organ transplantasyonu yapılan hastalarda) zayıflayan hücresel bağışıklıkla birlikte, beyindeki bu kistlerin rupturu sonucu toksoplazmozis reaktive olabilmekte, oldukça şiddetli nörolojik bulguların eşlik ettiği toksoplazmik ensefalit gelişebilmektedir. Immunyetmezlikli bu bireylerde, toksoplazmoz tedavisi için klinikte en yaygın kullanım alanı bulan Sulfonamid + trimetoprim tedavisi ya da Primetamin + Sulfadiazin karışımı da akut dönem tedavisinin ardından daha düşük dozda uzun süreli (belki de hayat boyu) uygulamalarda gözlenen alerjik reaksiyonlar ve hematoksisite gibi yan etkileri nedeniyle kesilmek zorunda kalmaktadır. Yan etkisi en az düzeyde ve reaktive toksoplazmozun önlenmesinde etkili bir ilacın bulunmasına yönelik yoğun çabalar hala devam etmektedir. 
       Bu çalışmada kullanılan 67 adet swis albino farede 3 grup oluşturuldu. T. gondii doku kisti içeren inokülum farelere (n=67) oral gavaj yoluyla uygulandı. Doku kistinin varlığından emin olmak için 15. ve 30. günlerde n=2 fareye ötenazi uygulandı. Doku kistinin şekillendiği görüldükten sonra n=21 immunsupresyon ve n=21 immunsupresyon+tedavi grubu oluşturuldu.  Buna göre Grup 1. Doku kisti kontrol grup, Grup 2.İmmunsupresyon grup, Grup 3.İmmunsupresyon+tedavi grubu oluşturulduktan sonra 45, 47 ve 52. günlerde ötenazi uygulandı. Ölen farelerin vücut ve dalak ağırlıklarına, alınan beyin örneklerinde kist durumuna ve yangısal reaksiyonlara hematoksilen-eozin ve immunperoksidaz boyamalar ışığında bakıldı. Oluşan doku kisti sayısı, çapı, yangısal reaksiyonlar skorlanarak değerlendirildi. Buna göre uygulanan tedavinin etkinliği çalışmanın sonucunda tespit edilmiş oldu. 
       Çalışmada klinik belirti olarak, oral yolla verilen parazitin verilmesini izleyen 24 saat farelerde fiziksel aktivilerinde azalma, tüylerde karışıklık gibi belirtiler gözlendi.     Histopatolojik incelemede, parazitin verilmesini takiben 15'inci günde parazitin beyne ulaştığını tespit amacıyla ötenazi yapılan farelerde (n=2) histopatolojik ve immunperoksidaz testlerde parazitin oluşturduğu herhangi bir hasara rastlanmazken 30'uncu günde hafif şiddette perivasküler mononüklear hücre infiltrasyonları, kapillar endotel hipertrofisi, nöronlarda büzüşme, gliozis ve genç doku kistine rastlandı. Ayrıca, dejenere nöron sitoplazmaları, damar duvarı ve çevresi astrosit, glia hücreleri ile doku kistlerinde T.gondii immunpozitifliklerine rastlandı. 
       Deney sonunda incelenen tüm beyin dokuları çalışma gruplarına göre değerlendirildiğinde, doku kistlerine tüm gruplarda rastlanırken sayı ve büyüklüklerinin farklı olduğu tespit edildi. İnokülasyon sonrası 45, 47, 52'nci günlerde ötanezi yapılan farelerden Grup 1 (n=21)'de etrafında yangısal reaksiyon bulunmayan doku kistlerine rastlanmazken, nekroz ve doku kisti reaktivasyonu da gözlenmedi. Grup 2 (n=21) fare beyinlerinde, kapillar hiperemi, nöronlarda dejenerasyon ve nekroz, hafif astroglial reaksiyonlar ve merkezde rupture doku kisti yer aldığı değerlendirilen yaygın gliozis gözlendi. Grup 3 (n=21) fare beyinlerinde ise başlıca hiperemi, vasküler endotel hipertrofisi, değişen derecelerde gliozis, nöron dejenerasyonu gözlendi. Ayrıca belirgin şekilde dejenere doku kisti gözlendi.
       İmmunperoksidaz test sonuçlarına göre, Grup 1'de doku kistlerinin belirgin bir şekilde boyandığı görüldü. Damar duvarı, bazı nöron sitoplazmalarında hafif immunpozitifliklere rastlandı. Grup 2 ve Grup 3'de fare beyinlerinde, gliozis doku kisti reaktivasyon alanları ve çevresinde yer alan mikroglia, astrosit ve nöron sitoplazmaları ile damar duvarları şiddetli derecede immunopozitiflik gösterdi. 
       Sonuç olarak; T.gondii ME49 suşu ile beyinde doku kisti oluşturulmuş, immunyeterli farelere uygulanan dekzametazon ile immunsupresyon ve doku kisti rupturu gerçekleştirilmiş ve doku kisti rupturunun uyarıldığı anda uygulanan toltrazuril tedavisinin beyinde parazit yükünü ve lezyonları azalttığı görülmüştür.

Abstract:
Toxoplasmosis is a common parasitic infection that occurs in humans and animals, caused by Toxoplasma gondii, a protozoon, that causes fatal infections. This parasitic infection, which is known to be quite common as a result of the studies performed, forms a tissue cyst form by protecting itself after settling in the tissues of the host. As a result of the suppression of the immune system for any reason (in patients receiving AIDS, cortisone therapy or organ transplantation), toxoplasmosis may be reactive due to the rupture of these cysts in the brain, and toxoplasmic encephalitis accompanied by severe neurological findings may develope.  In these immunocompromised individuals, Sulfonamide + trimethoprim treatment or Primetamin + Sulfadiazin mixture, which are found to be the most common use in the clinic for the treatment of toxoplasmosis, are also discontinued due to side effects such as allergic reactions and hematoxicity observed in lower doses after acute treatment.    Extensive efforts to find a drug with minimal side effects and effective in the prevention of reactive toxoplasmosis are still ongoing. Three groups were formed in 67 swis albino mice used in this study.  Inoculum containing T. gondii tissue cyst was administered to the mice (n = 67) by oral gavage. To ensure the presence of tissue cyst, n = 2 mice were euthanized on the 15th and 30th days. After seeing that the tissue cyst was shaped, n = 21 immunosuppression and n = 21 immunosuppression + treatment groups were created. Accordingly, Group 1 Tissue cyst control group, Group 2 Immunosuppression group, Group 3 Immunosuppression + treatment group were formed, and euthanasia was performed on 45, 47 and 52 days.  Body and spleen weights of dead mice, cyst status in the brain samples and inflammatory reactions were examined in the light of hematoxylin-eosin and immunperoxidase staining. The number of tissue cysts formed, their diameter, and inflammatory reactions were evaluated by scoring. Accordingly, the effectiveness of the treatment was determined as a result of the study.
       As a clinical symptom in the study, symptoms such as decreased physical activity and tangling in the mice were observed within 24 hours following the administration of the orally induced parasite. In histopathological examination, no damage caused by the parasite was found in histopathological and immunperoxidase tests in euthanized mice (n = 2) in order to determine that the parasite reached the brain on the 15th day after the parasite was administered. On the 30th day, mild perivascular mononuclear cell infiltrations, capillary endothelial hypertrophy, shrinkage of neurons, gliosis and young tissue cyst were encountered. In addition, T.gondii immunopositivities were detected in degenerated neuron cytoplasms, vascular wall and surrounding astrocyte, glia cells and tissue cysts.
       When all brain tissues examined at the end of the experiment were evaluated according to the study groups, it was found that the number and size of the cysts were different in all groups. Tissue cysts without an inflammatory reaction were not observed in Group 1 (n = 21) of mice that were euthanized on the 45th, 47th, 52nd days after inoculation, and necrosis and tissue cyst reactivation were not observed. In group 2 (n = 21) mouse brains, capillary hyperemia, degeneration and necrosis in neurons, mild astroglial reactions, and widespread gliosis, which were evaluated in the center, were observed. In group 3 (n = 21) mouse brains, mainly hyperemia, vascular endothelial hypertrophy, varying degrees of gliosis, neuron degeneration were observed. In addition, significantly degenerate tissue cyst was observed.
       According to the immunoperoxidase test results, it was observed that tissue cysts were stained significantly in Group 1. Mild immunopositivities were found in the vascular wall and some neuron cytoplasms. In Group 2 and 3, mouse brains showed strong immunopositivity with gliosis tissue cyst reactivation areas and microglia, astrocyte and neuron cytoplasms located around it and vascular walls.
       As a result; Tissue cyst was created in the brain with T.gondii ME49 strain, immunosuppression and tissue cyst rupture were performed with dexamethasone applied to immunocompetent mice, and toltrazuril treatment applied at the time of stimulation of tissue cyst rupture reduced the parasite load and lesions in the brain.