Yabani buğdayda (Triticum boeticum L.) farklı bor uygulamaları ile meydana gelen tepkilerin fizyolojik ve moleküler yöntemlerle araştırılması
Determination of the reactions of wild wheat (Triticum boeticum L.)  against different boron applications via physiological and molecular methods
Yazar: SONGÜL UYĞAN
Danışman: DOÇ. DR. ERDOĞAN EŞREF HAKKI
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Fizyoloji = Physiology

Özet:
Bu çalışmada, bor (B) stresine karşı tolerans düzeyi kültür buğdaylarından farklılık gösteren, yabani bir buğday türü olan Triticum boeticum L. kullanılmıştır. Çalışmada kontrollü şartlarda perlit ortamında farklı B dozları (toksik ve ileri derecede toksit düzeyler dahil), borik asit formunda, uygulanmıştır. Kontrol grubuna sadece Half Hoagland besin çözeltisi, diğer serilere ise 25, 250 ve 500 mg kg-1 bor içeren Half Hoagland çözeltisi uygulanmış ve bitkiler bu uygulama dozlarında 2-3 yapraklı döneme kadar yetiştirilmiştir. Bor uygulamasındaki bitkilerden alınan örneklerde, büyüme parametreleri (kök ve gövde), bağıl su içeriği, bor konsantrasyonları, prolin (PRO) ve lipid peroksidasyon (MDA) antioksidant enzim aktiviteleri karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Çalışmada ayrıca, kullanılan T. boeticum L. genotipine ait farklı B dozlarındaki örneklerde, kültür buğdayında B dışlama mekanizmasında rol aldığı varsayılan TaBOR2 genine ait ekspresyon düzeyleri de gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yöntemi ile araştırılmıştır.
Yabani buğday genotiplerinde bor toksisitesi sonucu kök ve gövde gelişiminin etkilendiği ve gerilediği görülmüştür. Araştırmada kullanılan bitkilerin bor konsantrasyonları bor uygulamasına bağlı olarak artış göstermiştir. Prolin ve lipid peroksidasyon miktarları da benzer bir şekilde yabani buğday genotipinde artmıştır. 
Farklı B uygulama gruplarından uygulamadan 1 gün sonra (1. zaman),  1 hafta sonra (2. zaman) ve 2 hafta sonra (3. zaman) örnek alımı gerçekleştirilmiştir. Her bir ortama ait ayrı ayrı alınan kök ve gövde örneklerinden total RNA'lar izole edilerek bu RNA örnekler önce ilk zincir komplementer DNA'ya (cDNA) dönüştürülmüştür. Daha sonra farklı dozlara ait örnekler kullanılarak B uygulamasından en az etkilenen bir referans gen (Puroindolin b geni) tespit edilmiştir. TaBOR2 geninin aktivitesi bu referans gen ile normalizasyonu neticesinde zamana bağlı olarak qRT-PCR ile tespit edilmiştir. TaBOR2/Puroindolin b kök ve gövde ekspresyonlarına bakıldığında 1. zaman diliminde kökteki ekpresyonlar tüm dozlarda artış gösterirken diğer zamanlarda (2. ve 3. zaman) azalmış, gövde örneklerinde ise 1. ve 2. zaman diliminde ekpresyon düşük seviyede iken 3. zaman diliminde tüm dozlarda artış olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuçlar B'un ortamda yüksek dozlarda bulunması durumunda bitki bünyesinde de artış gösteren bor içeriğinin etkilerinden korunmak isteyen dokularda boru dışlama mekanizmasının dokuya bağlı olarak bor içeriği ile orantılı bir şekilde dışlamada görev alan TaBOR2 proteininin devreye girdiğini göstermektedir. 

Anahtar Kelimeler: Bor toksitesi, Bitki fizyolojik analizleri, Real-Time kantitatif PCR, qRTPCR, Triticum boeticum L., Yabani buğday.

Abstract:
In this study, a wild wheat species, Triticum boeticum L., which differs from cultivars in terms of its tolerance level against boron (B) stress was utilized. Different leves of B (including toxic and highly toxic levels) was applied, in the form of boric acid, in controlled growth environment to the plants grown in perlite. Half Hoagland solution was used in control group, while the remaining series contained 25, 250 and 500 mg kg-1 of boron and the plants were grown until 2-3 leaf stage. Comparisons have been performed for the B treatment groups measuring plant growth parameters (root and stem), relative water content, boron concentrations, proline (PRO) contents and MDA activities of antioxidant enzymes. TaBOR2 is known to be involved in the B extrusion mechanism of wheat cultivars. In our study, TaBOR2 gene expression levels of the samples of T. boeticum L. genotype were analysed using Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). 
It was determined that the root and stem development of wild wheat genotype used was decreased as a result of B toxicity. An increment in the B concentrations of the plants were observed with an increase in the B concentration of the medium. Similarly, proline contents and lipid peroxidation levels were also increased.
For different B treatment groups samples were collected after 1 day (time zone 1), 7 days (time zone 2) and 14 days (time zone 3) of treatment. Total RNA extraction of each sample were conducted and the samples were used to obtain the first strand complementary DNAs (cDNAs) for further analyses. Firstly, different target cDNAs obtained from differing B treatment groups were tested for the determination of best performing house keeping genes. Puroindolin b was found to be the best suited reference gene which was further used for the normalization and time dependent TaBOR2 gene expression. Considering TaBOR2/Puroindolin b levels of root and shoot samples, it can be concluded that at time zone 1, expressions of the root samples were increased in all the samples while in remaining time zones (2nd and 3th) expressions were decreased. That was in contrary with the samples collected from stem tissues. These results indicated that TaBOR2 protein is involved in protecting the plants and the transport organs (root and shoot) from the negative effects of high B levels in the growth environment.

Keywords: Boron toxicity, Plant physiological analyses, Real-Time quantitative PCR, qRTPCR, Triticum boeticum L., Wild Wheat.