D-laktat dehidrogenazın kovalent immobilizasyonu ve karakterizasyonu
Covalent immobilization and characterization ofd-lactate dehydrogenase
Yazar: NAZLI ECE VARAN
Danışman: PROF. DR. SEYDE SEYHAN TÜKEL
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu tez çalışmasında, glutaraldehit ara kolu üzerinden 3–aminopropil silika jele kovalent immobilize edilen Leuconostoc mesenteroides D-laktat dehidrogenaz'ın (D-LDH), D-Laktik asit üretebilen aktif ve kararlı preparatları optimize edilmiştir. 0,250 g destek üzerine eklenen 1 mg/mL protein derişimindeki enzim çözeltisi ile % 86 immobilizasyon verimi elde edilmiştir.  Serbest ve immobilize D-LDH karakterize edilerek optimum pH ve sıcaklık değerleri ve kinetik parametreleri belirlenmiştir. Ayrıca, serbest ve immobilize D-LDH'ların depolanma ve termal kararlılıkları araştırılmış ve immobilize D-LDH'ın tekrar kullanım kararlılığı kesikli reaktörde incelenmiştir. Serbest D-LDH için optimum pH 7,0, immobilize D-LDH için ise pH 6,0 olarak belirlemiştir. Serbest ve immobilize D-LDH'lar için optimum sıcaklık sırasıyla 37 C ve 45 C olarak bulunmuştur. Serbest D-LDH için Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,365 mM ve 86,95 U/mg protein, immobilize D-LDH için bu değerler sırasıyla 0,077 mM ve 19,16 U/mg protein olarak belirlenmiştir. Serbest D-LDH, 4 C'de 30 gün depolama sonunda başlangıç aktivitesinin % 85'ini korumakta, 25 C'de ise 10 gün depolama sonunda başlangıç aktivitesinin % 97'sini kaybetmektedir. İmmobilize D-LDH ise 4 C ve 25 C'de 30 gün depolama sonunda sırasıyla başlangıç aktivitesinin % 82 ve % 37 'sini koruduğu belirlenmiştir. Serbest D-LDH, 45 C'de 4 saat inkübasyon sonunda aktivitesinin % 86'sını korurken, immobilize D-LDH aynı koşullarda % 82'sini korumuştur. İmmobilize D-LDH'ın kesikli reaktörde 10 kullanım sonunda başlangıç aktivitesinin % 38'ini koruduğu belirlenmiştir.

Anahtar Kelimeler: D-laktat dehidrogenaz, immobilizasyon, 3-aminopropil silika jel

Abstract:
In this thesis, the covalent immobilization of D-Lactate dehydrogenase (D-LDH) from Leuconostoc mesenteroides onto 3-aminopropyl silica gel via the glutaraldehyde spacer arm was optimized to have an active and stable preparation which is able to produce D-Lactic acid. The immobilization yield of 86 % was achieved using 1 mg/mL protein for 0.250 g support. The free and immobilized D-LDHs were characterized and their optimum pH and temperature values and kinetic parameters were determined. In addition, the storage and thermal stability of free and immobilized D-LDHs were investigated. The reuse stability of immobilized D-LDH was also determined in a batch reactor. The optimum pH for free D-LDH was determined as 7.0, however, it was 6.0 for immobilized D-LDH.The optimum temperatures for free and immobilized D-LDHs were found to be 37 C and 45 C, respectively. The Km and Vmax values for free D-LDH were determined as 0.365 mM, 86.95 U/mg protein, and the corresponding values were determined as 0.077 mM and 19.16 U/mg protein, respectively for immobilized D-LDH. The free D-LDH retained 85 % of its initial activity after 30 days of storage at 4 C, however it lost 97 % of its initial activity after 10 days of storage at 25 C. The immobilized D-LDH retained 82 % and 3 % of its initial activity after 30 days of storage at 4 C and 25 C, respectively. The free D-LDH preserved 86 % of its initial activity after 4 hours of incubation at 45 C, while immobilized D-LDH preserved 82 % under the same conditions. The immobilized D-LDH retained 38 % of its initial activity after 10 uses in a batch reactor.

Keywords:  D-lactate dehydrogenase, immobilization, 3-aminopropyl silica gel