Saccharomyces cerevisiae DNA barkodunun belirlenmesi ve veri tabanının oluşturulması
Determination of the Saccharomyces cerevisiae DNA barcode and creating a data base
Yazar: MİTHAT KURBAN
Danışman: DOÇ. DR. REMZİYE YILMAZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışması kapsamında canlıların tanımlanmasında kullanılan DNA barkodlama teknolojisinden faydalanılarak birçok geleneksel ürün üretiminde, biyoteknolojik proseslerde ve birçok araştırmada kullanılan model bir mikroorganizma olan S. cerevisiae türünün izolasyonu, tanımlanması ve DNA barkodlarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında; İç Anadolu Bölgesi'nin farklı şehirlerindeki üzüm bağlarından toprak ve üzüm örnekleri toplanarak maya izolasyonları yapılmıştır. Ayrıca ulusal ve uluslararası kültür koleksiyonu kuruluşlarından referans olarak kullanılacak S. cerevisiae  suşları ((S. cerevisiae ATCC® 9763™, S. cerevisiae ATCC® 6328™, S. cerevisiae 08022 RSK (Refik Saydam Külür Kolleksiyonu)), ulusal ve uluslararası maya üreticisi firmalardan ve ulusal üniversitelerin araştırma laboratuvarlarından çalışmada kullanılan S. cerevisiae suşları temin edilmiştir. Sağlanan tüm bu suşların morfolojik (makroskobik, mikroskobik), biyokimyasal testlerle tanımlanmaları yapılmış ve karşılaştırmalı olarak evrensel DNA barkod dizileri araştırılıp ortaya konmuştur. Bu amaçla toplam 287 izolasyon elde edilmiş bunların 229 tanesi makroskobik ve mikroskobik tanımlamalara göre S. cerevisiae türünün karekteristiklerine uygun bulunmuştur.
Elde edilen bu suşlar üzerinde ileri tanımlama olarak Matriks Destekli Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon-Uçuş Zamanlı Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF MS, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization–Time-Of-Flight Mass Spectrometry) ile cins düzeyinde klasik doğrulama çalışmalarına ek olarak, tür düzeyinde ileri tanımlamalar gerçekleştirilmiştir. MALDI TOF MS ve moleküler tanımlamalar dikkate alındığında 229 izolasyondan 152 adet izolasyon S. cerevisae türü olarak tespit edilmiştir. Elde edilen izolatların tanımlama aşaması sonrasında literatür taramaları doğrultusunda DNA barkodlamada kullanılacak olan gen bölgelerinin tespiti için  ITS "Internal Transcription Spacer",  LSU "Long Sub Unit", SSU "Short Sub Unit" ve/veya RPB1 "RNA polymerase subunit1", RPB2 "RNA polymerase subunit2", TOP1 "DNA Topoisomerase" gen bölgeleri ile ön PCR "polimerase chain reaction" denemeleri yapılmıştır. Yapılan ön denemelerde uygun bulunan gen bölgelerinin (ITS, LSU, RPB2) DNA barkod yapılarının ortaya konulmasında kullanılmasına karar verilmiştir.  Ön tanımlamaları yapılmış olan 2016-2017 izolasyonlarından 120 izolatın DNA ekstraksiyonları yapılmış PCR amplifikasyonları gerçekleştirilmiş ve DNA barkodlarının ortaya konulması araştırmasına bu 120 izolat üzerinden devam edilmiştir. 
İzolatların PCR amplifikasyonlarının jel elektroforez ayrımlarında ITS gen bölgesinde taksonomik gruplara bağlı ayrımlar görüntülenebilirken, LSU gen bölgesinde  bütün izolasyonlar için tek büyüklükte bant ayrımı gözlemlenmiş takson ayrımları jel görüntüleri üzerinden yapılamamıştır.  RPB2 gen bölgesi amplifikasyonları jel ayrımında ise her bir izolatta çoklu bant oluşumu gözlemlendiğinden takson ayrımları jel görüntüleri üzerinden yapılamamıştır. RPB2 gen bölgesinde gözlemlenen bu çoklu bant oluşumu sorununun jelden ekstraksiyon yapılarak sekans analizi yapılması sonucu ile aşılabileceği  belirlenmiştir. 
DNA ekstraksiyonu ve ilgili gen bölgeleri için PCR amplifikasyonları yapılan suşların Sanger Sekanslama yöntemi ile dizi analizleri yapılmıştır. ITS gen bölgesi için ortalama 820 baz çifti, LSU gen bölgesi için ortalama 1100 baz çifti, RPB2 gen bölgesi için ortalama 1200 baz çifti içeren sekans verileri DNA barkod tabanlı tanımlamada kullanılmıştır. Suşlardan elde edilen dizi ham verilerinin temizlenmesi FinchTv (https://digitalworldbiology.com/FinchTV) ile yapılmış ve ham veriler ileri veri analizine hazırlanması amacıyla BioEdit programı  ile gerekli ön işlemlere tabi tutulmuştur (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Ardından elde edilen veriler üzerinden NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ile karşılaştırmaya dayalı moleküler düzeyde tanımlamalar yapılmıştır. Yapılan tüm tanımlamalar göz önünde bulundurularak, ClustalW programı (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ile izole edilen ve tanımlanan türler arası ve tür içi ilişkiyi ortaya çıkaran filogenetik ağaçlar oluşturulmuştur. Oluşturulan bu filogenetik ağaçlar yardımıyla S. cerevisiae türlerini en iyi tanımlayan barkod bölgeleri belirlenmeye çalışılmıştır. Barkod yapısı olarak kullanılacak motif bölgelerinin belirleme amacıyla MEME-suit programı (http://meme-suite.org/) kullanılmıştır.  Elde edilen sekans verileri gen bölgeleri izolasyon sekansları ve barkod sekansları olarak ayrı ayrı değerlendirmeye alınmıştır. 
Değerlendirmeler sonucunda S.cerevisiae türleri için  RPB2 gen bölgesinin izolasyon sekanslarının ayrım başarısı % 98.24,  ITS gen bölgesi izolasyon sekanslarının ayrım başarısı % 95.83,  LSU gen bölgesi izolasyon sekanslarının ayrım başarısı % 92.3 ve birleştirilmiş (ITS_LSU_RPB) gen bölgesi izolasyon sekanslarının ayrım başarısı ise % 95.16 olarak belirlenmiştir. Barkod sekans yapıları kullanılarak ortaya konan filogenetik ayrımda S.cerevisiae türleri için RPB2 gen bölgesi barkod yapılarının ayrım başarısının % 100, LSU gen bölgesi barkod yapılarının ayrım başarısı % 96.153,  ITS gen bölgesi barkod yapılarının ayrım başarısı % 95.83 ve birleştirilmiş gen bölgeleri (ITS_LSU_RPB2) barkod yapılarının ayrım başarısı ise % 95.45  olarak belirlenmiştir.
Gen bölgelerinin ayrışma katsayıları,  izolasyon sekansları ve barkod yapıları için sırasıyla (ITS, LSU, RPB2, ITS_LSU_RPB2)  0.848±0.01, 0.157±0.002, 0.427±0.011, 0.412±0.008 ve 0.873±0,01, 0.725±0.017, 0.7636±0.0136, 0.412±0.008 olarak belirlenmiştir. Barkod sekansı kullanımı ITS bölgesi için büyük bir ayrım gücü farklılığı yaratmazken, LSU ve RPB2 gen bölgeleri için etkili ayrım gücü farklılığı oluşturduğu gözlemlenmiştir. Sonuç olarak S. cerevisiae maya türünün tanımlamasında ITS, LSU ve RPB2 gen bölgelerinin başarılı bir şekilde kullanılabileceği ve MEME-suit programı ile elde edilen barkod yapılarının bu ayrımı daha başarılı sağlayabildiği gözlemlenmiştir. Fakat elde edilen barkod yapılarının S. cerevisiae türü için izolasyon kaynağı ve yılı yönünden ayrım yapma konusunda anlamlı homojen bir ayrım gerçekleştiremediği belirlenmiştir.
İzolasyonlarla ilgi elde edilen tüm araştırma bilgileri bir veritabanında ("www.dnabarcodefoodomics.com") kayıt altına alınmıştır. Sonuç olarak DNA barkod bilgilerinin oluşturulması, kayıt altına alınması ve böylece bu konudaki bilgiye hızlı erişim sağlanması, önemli bir uluslararası maya üreticisi olan ülkemizde bu alanda rekabet edebilme gücüne katkı sağlaması yönünde bir katkı sağladığı düşünülmektedir.

Abstract:
The aim of this project was to isolate and identify DNA barcodes of S. cerevisiae  , which a model microorganism used in many traditional products, biotechnological processes and many researches, by using DNA barcoding technology used in the identification of living things. In this study; soil and grape samples were collected from the vineyards in different cities of Central Anatolia and the isolations were made. Also strains of S. cerevisiae   which were used for barcoding research obtained from national and international yeast producers and from research laboratories of national universities, the strains which decided to be used as a control obtained from national and international culture collection organizations, ((S. cerevisiae   ATCC® 9763 ™, S. cerevisiae   ATCC®). 6328 ™, S. cerevisiae   RSK08022 (Refik Saydam Culture Colllection)), and comparatively analysis of universal DNA barcodes was performed. All these strains were identified by morphological (macroscopic, microscopic) and biochemical tests, the universal DNA barcode sequences for these strains comparatively analyzed and revealed. For this purpose, 287 isolates were obtained and 229 of them were found to be suitable for the characteristics of S. cerevisiae   according to macroscopic and microscopic definitions.
To increase the identification level of species to the strain level in addition to classical validation studies on these strains the MALDI-TOF MS  (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization, Time-Of-Flight Mass Spectrometry) method has also used. When MALDI TOF MS and molecular definitions were taken into consideration, 152 isolation were determined as S. cerevisae species. 
Following the identification of the isolations obtained, for choosing gene regions to be used in DNA barcoding research, according to the  literature ITS "Internal Transcription Spacer" , LSU "Long Sub Unit", SSU "Short Sub Unit" RPB1 "RNA polymerase subunit1", RPB2 "RNA polymerase subunit2", TOP1 "DNA Topoisomerase gene regions" pre-PCR "polymerase chain reaction" experiments were performed. According to the preliminary experiments, it was decided to use the appropriate gene regions (ITS, LSU, RPB2) to identify effective DNA barcode structures. PCR amplifications were performed on these 120 isolates of 2016-2017 years, whose DNA isolation and pre-definition have already done and DNA barcodes were investigated on these 120 isolates.
Gel electrophoresis differentiations for PCR amplifications of isolates in the ITS gene region can be seen by due to taxonomic groups, while for the LSU gene region, single size band separation was observed for all isolations so separations could not be seen by due to taxonomic groups. Since for the amplification of RPB2 gene region gel separation that taxon distinctions could not be made on the gel images, because multiple band formation was observed for each isolate. This multi-band formation problem observed in the RPB2 gene region was determined that could be effectively overcome by extraction from the gel and doing sequence analysis.
Sequence analysis was performed by Sanger Sequencing method on isolations whose DNA extraction and related gene regions PCR amplification has been done already. An average of 820 base pairs for the ITS gene region, 1100 base pairs for the LSU gene region, and 1200 base pairs for the RPB2 gene region were used for DNA barcode-based identification. The raw data obtained from the strains were cleaned with FinchTv (https://digitalworldbiology.com/FinchTV) and the raw data were subjected to necessary pre-treatment with BioEdit program for the preparation of advanced data analysis (http://www.mbio.ncsu.edu/ BioEdit / bioedit.html). Then, molecular level based comparison were made with NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) on data. Considering all the definitions made, phylogenetic trees have been formed which reveal the inter-species and intra-species relationship by ClustalW program (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
With the help of these created phylogenetic trees, it was tried to determine the barcode regions that best describe S. cerevisiae   species. The MEME-suit program (http://meme-suite.org/) was used to determine the motif regions to be used as barcode structure. The resulting sequence data were evaluated separately as isolation gene regions sequences and barcode sequences.
As a result of the evaluations, according the phylogenetic distinction the success of the isolation sequences of the RPB2 gene region for S.cerevisiae species has been determined as % 98.24, success of the the ITS gene region determined as % 95.83, success of the the LSU gene region determined as % 92.3, and success of the unified region (ITS_LSU_RPB2) determined as % 95.16.
In the phylogenetic distinction using barcode sequence structures, the succession of RPB2 gene region barcode structures for S. cerevisiae species is % 100, the separation success of the barcode structures of the ITS gene region is % 95.83, the separation success of the barcode structures of the LSU gene region is % 96.153, and the separation success of the barcode structures of the unified region (ITS_LSU_RPB2) determined as % 95.45.
The dissociation coefficients of gene regions for isolation sequences and barcode sequence are respectively (ITS, LSU, RPB, ITS_LSU_RPB2) 0.848 ± 0.01, 0.157 ± 0.002, 0.427 ± 0.011, 0.412 ± 0.008 and 0.873 ± 0.01, 0.725 ± 0.017, 0.7636 ± 0.0136,  0.412 ± 0.008. While the use of the barcode sequence did not create a large difference in discrimination power for the ITS region, it was observed that the difference between the LSU and RPB2 gene regions was effective. As a result, it was observed that the ITS, LSU and RPB2 gene regions could be used successfully in the identification of S. cerevisiae  yeast species and the barcode structures obtained by the MEME-suite program could provide this distinction more successfully. However, it was determined that the obtained barcode structures did not make a meaningful homogenous distinction in terms of isolation source and year for S. cerevisiae species.
All research information obtained from the isolations is recorded in a database ("www.dnabarcodefoodomics.com"). As a result, it is thought that the creation and recording of DNA barcode information and thus providing quick access to the information in this field has contributed to the competitiveness for our country which is an important international yeast producer.