Köpeklerde distemper hastalığında TLR1-9 genleri ve miR-155 ekspresyonunun araştırılması
Investigation of the expression levels of TLR1-9 genes and miR-155 on distemper disease in dogs
Yazar: FADİME DALDABAN
Danışman: DOÇ. DR. KORHAN ARSLAN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Zootekni (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Distemper virüsü-köpek = Distemper virus-canine ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Köpekler = Dogs ; Mikro RNA = Micro RNA ; RNA = RNA ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu çalışmada, köpek distemper hastalığında, immun yanıt oluşmasında görevli Toll-Benzeri Reseptörleri 1-9 (TLR1-9) kodlayan genler ve microRNA-155 (miR-155)'in, hasta köpeklerde tedavi önce ve sonrasında ekpresyon düzeylerinin ve TLR 1-9, miR-155 ve hematolojik parametreler arasındaki ilişkinin belirlenmesi amaçlandı. Çalışmada incelenen hayvanlar Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Eğitim Araştırma ve Uygulama Hastanesi klinikleri ve Kayseri'de bulunan özel kliniklerden temin edildi. Çalışma materyali 2-6 aylık yaşta, farklı ırk ve cinsiyette, distempere karşı aşılanmamış, Hızlı test kiti ve Revers Transkriptaz-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) ile distemper pozitif olduğu belirlenmiş 20 köpek oluşturmuşdu. Göz ve burunda mukoprulent akıntı, öksürük ve ishal gibi belirtiler gösteren köpeklerden alınan nazal-okuler svap örnekleri kullanılarak yapılan hızlı kit uygulaması ile rutin tanı ve tedavi takibi amacıyla tedavi öncesi ve sonrası alınan kan örnekleri ile genetik ve hematolojik analizler gerçekleştirildi. Hasta köpeklere destek tedavi prosedürü uygulandı. Genetik analizler için plazma örneklerinden miRNA, tam kan örneklerinden mRNA izolasyonları yapıldı. Elde edilen mRNA ve miRNA'ların ekspresyon analizleri SYBR Green yöntemi ile yapıldı. Yapılan istatistiki analizler sonucunda, tedavi öncesine göre tedavi sonrasında TLR2, TLR4 ile miR-155 genlerinin istatistiksel olarak önemli düzeyde up regüle ve TLR5'in ise down regüle olduğu belirlendi (p<0.05). Hasta hayvanlardan alınan kan numulerindeki tedavi öncesi ve tedavi sonrası ortalama eritrosit hacmi (MCH), ortalama eritrosit hemoglobin konsantrasyonu (MCHC) ve platelet (PLT) değerlerinde istatistiksel olarak önemli fark olduğu gözlendi (p<0.05).Çalışma kapsamında incelenen genlerin ekspresyon düzeyleri ile hematolojik değerler arasında korelasyon katsayılarına göre tedavi öncesi grupta TLR2 geni ile monosit (MON) değeri, TLR4 geni ile PLT değeri arasında pozitif yönlü ilişki tespit edildi.Tedavi sonrası grup da ise TLR3 geni ile eritrosit (RBC) ve hemoglobin (HGB) değerleri arasında; TLR5 geni ile RBC, HGB ve hematokrit (HCT) değerleri arasında; TLR9 geni ile RBC ve HGB değerleri arasında pozitif yönlü güçlü ilişki; Buna karşı TLR1 geni ile MON ve nötrofil (GRAN) değerleri arasında; TLR3 geni ile HCT değeri arasında; TLR9 geni ile MON ve HCT değerleri arasında pozitif yönlü ilişki tespit edildi. Çalışmada miR-155'in tedavi sonrasında TLR8 gen ekspresyonu ile pozitif ilişkili olduğu görüldü. Elde edilen sonuçlar Canine distemper virus ile enfekte köpeklerde TLR8 ve miR-155 ile ilgili farklı çalışmaların yapılmasının bağışıklık mekanizmasının aydınlatılması ve tedavi protokolü oluşturulması açısından önemli olabileceği önerilebilir Sonuç olarak sunulan çalışmada, köpek distemper hastalığının biyolojik mekanizmasının aydınlatılması ile ilgili önemli sonuçlar ortaya konduğu ve elde edilen sonuçların konu ile ilgili yapılacak sonraki çalışmalara katkı sağlayacak nitelikte olduğu düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: miR-155, Köpek Distemper Virus, TLR, Gen Ekspresyonu.

Abstract:
This study aims to determine the expression levels of Toll-Like Receptor (TLR)1-9 genes and microRNA-155 (miR-155) before and after distemper disease treatment. miR-155 and TLR1-9 are responsible for the immune response in canine distemper disease. The study group consists of dogs brought to Erciyes University, Veterinary Faculty, Training, Research and Practice Hospital clinics and private clinics in Kayseri. The study material consisted of 2-6 months age, of different breeds and gender, 20 unvaccinated dogs, determined to be distemper positive by a rapid test kit and Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). The rapid kit application was applied to nasal-ocular swab samples taken from dogs with distemper-related symptoms such as mucopurulent discharge in the eyes and nose, cough, and diarrhea. Genetic and hematological analyses were performed on blood samples taken before and after the treatment for routine diagnosis and treatment follow-up. A supportive treatment procedure was applied to sick dogs. For genetic analysis, miRNA from plasma samples and mRNA from whole blood samples were isolated. The expression of mRNA and miRNA were investigated by SYBR Green method. The result showed that the expression of TLR2, TLR4, and miR-155 genes was significantly (p <0.05) up-regulated while the expression of TLR5 was down-regulated after treatment compared to those of before treatment. In addition, a significant (p <0.05) difference in mean erythrocyte volume (MCH), mean erythrocyte hemoglobin concentration (MCHC), and platelet (PLT) values in blood samples taken from sick animals before ve after treatment was observed. According to the correlation coefficients between the expression levels of genes included in the study and hematological values, a positive correlation was found between the TLR2 gene and monocyte (MON) value, the TLR4 gene and PLT value in the before treatment group. A strong positive correlation between TLR3 gene and erythrocyte (RBC) and hemoglobin (HGB) values, between TLR5 gene and RBC, HGB and hematocrit (HCT) values, and between TLR9 gene and RBC ve HGB values were found in the after-treatment group. A positive correlation was also found between the TLR1 gene and MON and neutrophil (GRAN) values, between the TLR3 gene and HCT value, and between TLR-9 gene and MON and HCT values. This study revealed that miR-155 was positively associated with TLR8 gene expression in the after-treatment group. In conclusion, miR-155 and TLR8 genes may play a central role in the immune response and it is extremely important to conduct further studies on these genes in dogs infected with CDV to establishing an effective treatment protocol. In conclusion, the presented study thought that important results regarding the biological mechanism of canine distemper disease have been revealed and the results obtained will contribute to future studies on the subject.
Keywords: miR-155, Canine Distemper Virus, TLR, Gene Expression.