Yeni nesil dizileme teknolojisi ile Türkiye'den izole edilen toxoplasma gondii Ankara suşunun genom dizisinin çıkarılması
The genome sequencing with next generation sequencing technology of toxoplasma gondii Ankara strain from turkish isolate
Yazar: BANUÇİÇEK YÜCESAN
Danışman: PROF. DR. AYŞE ÇAKMAK
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Dizi analizi = Sequence analysis ; Genom = Genome ; Toxoplasma gondii = Toxoplasma gondii ; Türkiye = Türkiye

Özet:
Yeni Nesil Dizileme Teknolojisi ile Türkiye'den İzole Edilen Toxoplasma gondii Ankara Suşunun Genom Dizisinin Çıkarılması
Toxoplasma gondii tüm vertebralıları tutabilen ve ''toxoplasmosis'' hastalığının etkeni olan hücre içi bir parazittir. Dünya nüfusunda T. gondii enfeksiyonunun ortalama %25-%30 civarında olduğu bildirilmektedir. CDC bugün bu enfeksiyonu ihmal edilmiş hastalıklar arasında saymaktadır. Türkiye'de farklı bölgesel ve iklimsel yapılar nedeniyle farklı enfeksiyon profilleri görülmesine karşılık, oldukça yaygın bir protozoon enfeksiyonu olduğu bilinmektedir. Toxoplasma gondii 1908 yılından bu yana bilinen ve araştırmalara konu olan bir protozoon olmasına rağmen, halen tanımlanamayan birçok yapısı olduğu görülmektedir.
Bu çalışmada "Yeni Nesil Dizileme Teknolojisi" ile Türkiye'de Ankara'da Ekmen ve ark. (1974) tarafından konjenital toxoplasmosis bir bebekten izole edilmiş olan T. gondii'nin tüm genom dizisinin çıkarılması amaçlanmıştır. Başlangıç aşamasında cihazda T. gondii kütüphanesi oluşturulması gerekmektedir. Bu amaçla tüm genom çalışması yapılacak olan cihaz ile uyumlu kütüphane kiti kullanılmıştır. Kütüphane aşamasının tamamlanmasından sonra yeni nesil dizileme cihazı ile sekans analizlerine geçilmiştir. Genom analizi "Illumina HiSeq 2500" dizileme cihazı ve "HiSeq SBS Kit v2" kullanılarak yapılmıştır. Sonuçta elde edilen fragmanlar PE (Paired-ends) okuma kullanılarak birleştirilmiş ve tek fragmana dönüştürülmüştür. Biyoinformatik analizler Geneious 2.1. (www.genius.com) programı ile gerçekleştirilmiştir.
Bu çalışmada T.gondii'ye ait 61,5763 Mb uzunluğundaki tüm genom dizisi (WGS) elde edilmiştir. Toxoplasma gondii WGS'sinin coverage değeri 50x olup, büyüklüğü 61,5763 Mb ve GC oranı %52,4 olarak tespit edilmiştir. Elde edilen tüm genom dizisine ait veriler National Center for Biotechnology Information, USA, (NCBI) GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) veritabanına eklenmiştir. Yüklenen veriler Toxoplasma gondii TR01 (TGTR01) adı ile veri tabanı tarafından kabul görmüştür. Bu çalışma ile elde edilen genomun erişim numarası WOEV00000000.1'dir. Biyolojik numune erişim numarası SAMN13338796'dır. NCBI verileri incelendiğinde veri tabanında tek bir referans genom olduğu görülmüştür. Referans genom Toxoplasma gondii ME49 (Erişim numarası: ABPA00000000.2) dur. Yapılan çalışma sonucunda elde edilen genomun Toxoplasma gondii ME49 ile %99 benzerlik gösterdiği anlaşılmıştır. Çalışmamızda tüm genom analizi gerçekleştirilmiş olan Toxoplasma gondii suşu, Türkiye'de tüm genom analizi gerçekleştirilmiş olan ilk Toxoplasma gondii suşudur.
Toxoplasma gondii TR01 (TGTR01) suşu tüm Dünya'da Toxoplasma gondii ME49 suşu haricinde %75 oranında assemblysi tamamlanmış olan ve kromozomal verileri girilmiş olan ikinci suşdur.
Toxoplasma gondii TR01 (TGTR01)'in genom dizilerine ait olan 14 kromozomun erişim numaraları sırasıyla CM019722.1, CM019723.1, CM019724.1, CM019725.1, CM019726.1, CM019727.1, CM019728.1, CM019729.1, CM019730.1, CM019731.1, CM019732.1, CM019733.1, CM019734.1, CM019735.1' dir.
Bu çalışmada WGS'si elde edilen Toxoplasma gondii suşu referans genom ME49 ile karşılaştırıldığında 8312 CDS (protein kodlayan dizi), 183 tRNA, 294 rRNA ve 8789 gen bulunmuştur. 8312 CDS içinde 4284 tanesinin hipotetik protein (hypothetical protein CDS/ Fonksiyonu bilinmeyen proteinler) olduğu tespit edilmiştir. Toxoplasma gondii ME49 genomuyla yapılan karşılaştırmalar sonucunda 8836 adet polimorfik bölge bulunmuştur. Polimorfizmlerin 360 tanesi insertion, 473 tanesi deletion, 625 tanesi substitution, 7378 tanesi ise SNP (tek nükleotit polimorfizmi)'dir. Polimorfizmlerin 472 adeti bilinen proteinleri kodlamaktadır. Bu polimorfizmlerin 249 tanesi hipotetik proteinleri ve 223 tanesi ise fonksiyonu bilinen proteinleri kodlamaktadır. Tüm polimorfik değişimlerin incelendiğinde; 8 proteinde delesyon ile kısalma, 3 proteinde insersiyon ile eklenme, 1 tanesinde ekstansiyon ile uzama, 26 tanesinde çerçeve kayması (frame shift) ile proteinin tamamen değişmesi, 1 proteinde başlangıç kodonunun kaybedilmesiyle transkripsiyon mekanizmasının bozulması, 25 tanesinde transkripsiyon sonlandırma sekansının protein sekansı bitmeden ortaya çıkması ile proteinin eksik aminoasit dizisiyle üretilmesi (truncation) saptanmıştır. Protein farklılaşması göz önüne alındığında, Toxoplasma gondii suşunun Toxoplasma gondii ME49 suşundan %1 düzeyinde genotipik farklılığı olduğu belirlenmiştir. Bu değişimin fenotipe yansıyabileceği düşünülmektedir. 

Sonuçta Türkiye'de ilk defa T. gondii tüm genom çalışması yapıldı ve bu suşa T. gondii TR01 adı verildi. Bu çalışmalarla elde edilen veriler, T. gondii'nin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacak ve bu parazit üzerinde yapılacak çalışmalar için bir referans görevi görecektir. Toxoplasma gondii, sıra dışı popülasyon yapısı ile önemli bir patojendir. Oldukça zoonotik olması ve komplike bir yaşam döngüsüne sahip olmasına rağmen, genetik olarak halen korunabilmektedir. Bu çalışmadan sonra parazitoloji alanında başka parazitlerin de tüm genomu dizilerinin çalışılarak, tüm dünyaya veri olarak bildirilmesi Türkiye adına son derece olumlu olacaktır.

Abstract:
The Genome Sequencing with Next Generation Sequencing Technology of Toxoplasma gondii Ankara strain from Turkish isolate
Toxoplasma gondii is an intracellular parasite that can involve all vertebral bodies and is the causative agent of 'toxoplasmosis'. It is reported that T. gondii infection is 25% -30% in the world population. Nowadays CDC recognizes this infection as a neglected disease. T. gondii infection profiles for different because of the different regional and climatic response to the observed structures in Turkey, is known to be quite a common protozoan infection. Although it is a protozoon known since 1908 and subject to research, it still seems to have many unidentified structures.
In this study, it is aimed to obtain the whole genome sequence of T. gondii with "Next Generation Sequencing Technology. This strain was isolated from an infant with congenital toxoplasmosis by Ekmen et all.(1974) in Ankara in Turkey. T. gondii library must be created on the device in the initial stage. For this purpose, a library kit compatible with the whole genome study device was used. After the completion of the library phase, sequence analysis was started with a new generation sequencing device. Whole genome analysis was performed using "Illumina HiSeq 2500" sequencing device and "HiSeq SBS Kit v2. The resulting fragments were combined using PE (Paired-ends) reading and converted into a single fragment. Bioinformatics analysis were performed Geneious 2.1. program. 
In our study, the whole genome sequence (WGS) of T. gondii was obtained. T. gondii was found to be 61,5763 Mb long. Toxoplasma gondii WGS's has a coverage value of 50x, a size of 61,5763 Mb and a GC ratio of 52.4%. Data from the entire genome sequence obtained were uploaded to the National Center for Biotechnology Information, USA, (NCBI) GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) database. Uploaded data has been accepted by the database as Toxoplasma gondii TR01 (TGTR01). The access number of the genome obtained by this study is WOEV00000000.1. The biological sample access number is SAMN13338796. When NCBI data were analyzed, it was found that there was only one reference genome in the database. The reference genome is Toxoplasma gondii ME49 (Accession number: ABPA00000000.2). As a result of the study, the genome was found to be 99% similar to Toxoplasma gondii ME49. In our study, the analysis made Toxoplasma gondii strain, which was first performed whole genome analysis of T. gondii in Turkey. 
The Toxoplasma gondii strain obtained in this study was compared with the reference genome and found 8312 CDS (protein coding sequence), 183 tRNA, 294 rRNA and 8789 genes. In 8312 CDS, 4284 were found to be hypothetical proteins (hypothetical protein CDS / proteins of unknown function). As a result of comparisons with Toxoplasma gondii ME49 genome, 8836 polymorphic regions were found. Polymorphisms has 360 insertion, 473 deletion, 625 substitution and 7378 SNP (single nucleotide polymorphism). Of these polymorphisms, 249 were encoded hypothetical proteins and 223 were encoded proteins which was known function. When all polymorphic changes were examined; shortening by deletion in 8 proteins, insertion in 3 proteins, extension in 1 protein, complete alteration of protein by frame shift in 26 proteins, disruption of the transcription mechanism in 1 protein, truncation in 25 proteins. When protein differentiation was taken into consideration, it was determined that Toxoplasma gondii strain had 1% genotypic difference from Toxoplasma gondii ME49 strain. This change is thought to be reflected in the phenotype.
Assembly of Toxoplasma gondii TR01 (TGTR01) strain was 75% complete. This is the second strain after Toxoplasma gondii ME49 with the same characteristics all over the world. Chromosomal data were also completed in second all ove the World.
The access numbers of 14 chromosomes belonging to the genome sequences of Toxoplasma gondii TR01 (TGTR01) are CM019722.1, CM019723.1, CM019724.1, CM019725.1, CM019726.1, CM019727.1, CM019728.1, CM019729.1, CM019728.1, CM019729.1, CM019730.1, CM019731.1, CM019732.1, CM019733.1, CM019734.1, CM019735.1.
As a result, it was made T. gondii whole genome study for the first time in Turkey. This strain name was T. gondii TR01. The data obtained from these studies will contribute to a better understanding of T. gondii. So, it will serve as a reference for work on the interference. T. gondii is an important pathogen with its extraordinary population structure. Although it is highly zoonotic and has a complicated life cycle, it is still genetically preserved. After this study, whole genome sequences of other parasites should be studied in the field of parasitology. The identification of this strain in the genome bank will be very productive for the scientific community of our country.