Reşadiye kaplıcasının genomik ve metaproteomik açıdan incelenmesi
A genome and metaproteomic investigation of Resadiye spring
Yazar: MELİS ÇAKDİNLEYEN
Danışman: PROF. DR. BİLGE HİLAL ÇADIRCI
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Metaproteomiks, herhangi bir organizma kültürü yapmadan, doğrudan çevresel
örneklerin toplam proteinlerinin analizidir. Son yıllarda hastalıklar ile mücadelede
antibiyotiklere ilave olarak, peptitler kullanılmaya başlanmıştır. Bunun için
biyoinformatik veriler yardımı ile sentetik peptitlerin üretiminin yanı sıra, doğal
ürünlere yönelimin fazla olması nedeniyle yeni kaynak arayışları artmıştır. Bu tez
çalışmasında, yüzyıllardır içeriğindeki mineraller nedeni ile balneoterapi için kullanılan
kaplıcalar, biyoaktif polipeptit kaynağı olarak düşünülmüştür. Bu bağlamda, bölgemizde
bulunan, romatizmal, ortopedik ve dermatolojik hastalıkları tedavi edici özelliğe sahip
olduğu ifade edilen Reşadiye ve Sulusaray kaplıcalarının polipeptit yapıdaki aktif
maddelerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
Vakum filtrasyon ve evaporatör kullanılarak ekstrakte edilen proteinler, ekstraksiyon
yöntemine göre Reşadiye Evaporator (RE) ve Reşadiye Filtre (RF) olarak ikiye ayrılmış
ve Reşadiye Evaporatör yönteminin daha verimli olduğu tespit edilmiştir. Ekstrakte
edilen ham peptid/protein örneklerinin antimikrobiyal ve enzimatik (amilaz, lipaz,
proteaz, katalaz ve oksidaz) aktiviteleri belirlendikten sonra Reşadiye ve Sulusaray
kaplıcalarına ait ham protein ekstraktları, ters fazlı, yüksek performanslı sıvı
kromatografisi (Reversed-phase high-performance liquid chromatography; RP-HPLC)
ile C8 kolon kullanılarak fraksiyonlarına ayrılmıştır. İnsan Derisi Malign melanoma
hücre hatlarından SK-MEL 30/An1 (SKin MELanoma)'e karşı sitotoksik özellik
gösteren fraksiyonların kütleleri, MALDI-TOF/TOF ile tayin edilmiştir. Kaplıcada
yaşayan organizmalara ait izole edilen toplam DNA, yeni nesil dizi analizi yöntemleri
ile analiz edilmiş ve örneklerin alındığı ortamda bulunan prokaryotik ve ökaryotik
çeşitlilik belirlenmiştir. Elde edilen veriler, peptit dizisi veri bankalarından proteinleri
analiz etmek için kütle spektroskopisi verilerini kullanan MASCOT programı ile
değerlendirilmiştir. Böylece biyoaktif olduğu tespit edilen polipeptitlerin proteinin dizisi
ve kaynağı belirlenmiştir.
Reşadiye kaplıcasından ekstrakte edilen RE ham peptid/protein örneklerinin
konsantrasyonu Bradford yöntemi ile 32 μg/mL, RF ham peptid/protein örneklerinin
konsantrasyonu 10 μg/mL olarak bulunmuştur. Her iki ekstraktın enzimatik aktiviteleri
karşılaştırıldığında da RE örneklerinin daha yüksek aktiviteye sahip olduğu
gözlenmiştir. Bu bağlamda RE ve RF örneklerinin sırasıyla 79,756 ±0,0593 U/mL ve
60,731 ±0,0318 U/mL proteaz; 0,567 ±0,0305 U/mL ve0,0333 ±0,019 U/mL lipaz;
1,543 ±0,016 U/mL ve0,448 ±0,006 U/mL amilaz aktivitelerine sahip oldukları
belirlenmiştir. Katalaz ve oksidaz aktivitelerinin RE ham peptid/protein örnekleri için
pozitif olduğu gözlemlenmiştir. Çeşitli gram (+) ve gram (-) bakterilere karşı yapılan
antimikrobiyal aktivite denemeleri sonucunda RE ham peptid/protein örneklerinin
E.coli'ye karşı etkili oldukları gözlenmiştir.
Polipeptid karışımlarındaki protein/polipeptitler RP-HPLC ile saflaştırılmış, tek tek
fraksiyonların SK-MEL30-An1 hücrelerine karşı aktivitesi araştırılmıştır. RE ve RF
peptid/protein örneklerinden üçer ana fraksiyon, Sulusaray (SP) protein/peptid
örneklerinden ise onüç ana fraksiyon elde edilmiştir. SK-MEL 30/An1 hücreleri tüm
Sulusaray ve Reşadiye peptid/protein fraksiyonları ile muamele edilmiş, sadece SP9
fraksiyonun SK-MEL 30/An1 hücrelerinin membran bütünlüğünü bozduğu ve toksik
etki gösterdiği gözlemlenmiş (Şekil 4.11.e), IC50 değerinin ise 0,0061 ± 0,0003 μg/mL
olduğu bulunmuştur. SP9 fraksiyonundaki muhtemel polipeptit kompozisyonu,
MALDI-TOF analizi ile belirlenmiş, MASCOT programı ile veri tabanı eşleştirilmiştir.
MASCOT programında eşleşen diziler ile, yeni nesil dizileme sonucu elde edilen
organizmalar çakıştırılmış ve ekosistemde mevcut olan organizmalara ait proteinler
dikkate alınmıştır. Dizi analizine göre Reşadiye kaplıcasının sırasıyla Proteobacteria ve
Firmicutes sınıflarındaki bakterileri ve Ascomycota ve Artropoda familyasındaki
ökaryotları içerdiği belirlenmiştir. Sonuç olarak melanom SK-MEL hücrelerine karşı
sitotoksik olduğu gözlemlenen SP9 fraksiyonunun MALDI-TOF/MS analizinde
aminoasitlere ait immonium iyon kütlelerinin bilinen bir profili gözlenmemiştir. Bu
nedenle, sitotoksik SP9 fraksiyonunun MS/MS kütle parmak izine göre herhangi bir
peptid dizilimi tespit edilememiştir.

Abstract:
Metaproteomics is the analysis of total proteins from direct environmental samples,
without preparing organism culture. In recent years, peptides have begun to be used in
addition to antibiotics in combating diseases. The search for new sources has increased
due to the fact that the production of synthetic peptides with the help of bioinformatics
data, as well as the tendency towards natural products, is too much. In this thesis, spas
used for balneotherapy due to mineral its content for centuries are considered as
bioactive polypeptide source. In this context, it is aimed to determine the active
substances in the polypeptide structure of Resadiye and Sulusaray spas which are
known as therapeutic properties for rheumatismal, orthopedic and dermatological
diseases in our region.
Proteins extracted using vacuum filtration and evaporator were separated into two part
as Resadiye Evaporator (RE) and Resadiye Filter (RF) according to extraction method
and Resadiye Evaporator method has been found to be more efficient. After the activities
of the antimicrobial and enzymatic (amylase, lipase, protease, catalase, and oxidase)
activities of the extracted crude peptide/protein samples were determined, crude protein
extracts from Reşadiye and Sulusaray coaters were fractionated using a C8 column with
reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). The masses of
fractions that cytotoxic against human melanoma cell lines SK-MEL30/An1
(Skin Melanoma) were determined by MALDI-TOF/TOF. The isolated total DNA of
organisms living in the spa was analyzed by next-generation sequence analysis methods
and prokaryotic and eukaryotic types were determined in the environment where the
samples are taken. The obtained data were evaluated by MASCOT program using mass
spectroscopy data to analyze proteins from the peptide sequence databases. Thus, the
sequence of the protein and the source of the detected polypeptides were determined to
be bioactive.
The concentration of RE crude peptide/protein extracted from the reconstituted flask
was found to be 32 μg/mL by Bradford method and 10 μg/mL of RF crude
peptide/protein samples. When the enzymatic activities of both extracts were compared, it was observed that RE samples had higher activity. In this context, 79,756 ± 0.053
U/mL and 60,731 ± 0.0318 U/mL protease of RE and RF samples, respectively; 0.567 ±
0.0305 U/mL and 0.0333 ± 0.019 U/mL lipase; 1,543 ± 0.016 U/mL and 0,448 ± 0,006
U/mL amylase activity. Catalase and oxidase activities were observed to be positive for
the peptides/proteins obtained by both extraction methods. As a result of the
antimicrobial activity experiments against various grams (+) and grams (-) bacteria, RE
crude peptide/protein samples were observed to be effective against E. coli.
The protein/polypeptides in the polypeptide mixtures were purified by RP-HPLC, and
the activity of individual fractions against SK-MEL 30/An1 cells was investigated.
Three major fractions of RE and RF peptide/protein samples and thirteen major
fractions from Sulusaray (SP) protein/peptide samples were obtained. The SK Mel 30
An1 cells were treated with all Sulusaray and Reşadiye peptide/protein fractions, only
the SK-Mel 30/An1 cells of the SP9 fraction were found to disrupt membrane integrity
and exhibit toxic effects (Figure 4.11.e) and IC50 values of 0.0061 ± 0.0003 μg/mL. The
possible polypeptide composition in the SP9 fraction was determined by MALDI-TOF
analysis and the database was matched with the MASCOT program. The matching
sequences in the MASCOT program, the new generation sequencing organisms and the
organism-derived proteins in the ecosystem have been taken into account. According to
the sequence analysis, it was determined that the Reşadiye sp. Contains bacteria of
Proteobacteria and Firmicutes and eukaryotes of Ascomycota and Artropoda family
respectively. As a result, in MALDI-TOF/MS analysis of the SP9 fraction observed to
be cytotoxic to melanoma SK-MEL cells, no known profile of the immonium ion
masses of the amino acids was observed. Therefore, no peptide sequence could be
detected with the MS/MS mass fingerprint of the cytotoxic SP9 fraction.