Epitel hücre kökenli SERPINB1'in nötrofil elastaz ilişkili anti apoptotik ve pro apoptotik yolaklar üzerine etkisi
The effect of epithelial cell-derived SERPINB1 on neutrophil elastase-associated anti-apoptotic and pro-apoptotic pathways
Yazar: BÜŞRA KILIÇ
Danışman: DOÇ. DR. İBRAHİM ÇAĞATAY KARAASLAN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Astım farklı yaş gruplarındaki insanların yaşam kalitesini etkileyen kronik inflamatuvar akciğer hastalıklarından biridir. Duyarlı kişilerin havayolunda sıklıkla nefes darlığı, öksürük, göğüste sıkışma hissi gibi belirtilerle kendini gösterebilmektedir. Astım hastalığında ortaya çıkan hava yolu obstrüksiyonunda genetik faktörlerle birlikte maruz kalınan spesifik alerjenler, sigara dumanı, hava kirliliği gibi çevresel uyaranlar da etkili olmaktadır. Nötrofil, eozinofil ve mast hücreleri gibi inflamatuvar hücrelerin hastalığın patolojisine katkı sağladığı da bilinmektedir.
Astım cevabı heterojenik bir yapıya sahip olduğu için eozinofilik ve nötrofilik (non-eozinofilik) fenotiplere ayırmak mümkündür. Nötrofilik astım patolojisinde nötrofillerin hastalığın seyrinde önemli bir yer kapladığı bilinmektedir. Nötrofiller, kandan inflamasyon olan dokulara göç ederek biyolojik ya da kimyasal madde kaynaklı inflamasyonu ortadan kaldırmaya çalışmaktadırlar. Nötrofiller bu fonksiyonu özelleşmiş granüllerinde depolanan proteazlar ve ürettikleri reaktif oksijen türleri aracılığıyla gerçekleştirirler. Hava yolu epitel hücreleri ile nötrofil hücrelerinin etkileşimi ve nötrofil sayısının progresif bir şekilde artmasını takiben proteaz-anti proteaz arasındaki dengenin bozulması sonucu epitelyal hasara neden olarak
ii
konakçıya zarar vermektedir. Nötrofil elastaz ve MMP-9 da dahil olmak üzere bir takım proteolitik enzim, hava yollarında doku yeniden yapılanmasında önemli rol oynar.
Nötrofillerin azurofilik granüllerinde depolanan nötrofil elastaz, katepsin G, proteinaz 3 gibi güçlü sitotoksik etkiye sahip olan antimikrobiyal proteinlerin kontrolsüz salımı hücresel harabiyete sebebiyet vermektedir. Yapılan çalışmalarda nötrofil elastazın hücre içi sinyal yolaklarını aktive ettiği ve doku harabiyetine sebebiyet verdiği görülmektedir. Nötrofillerin özelleşmiş kompartmanlarındaki proteazların kontrolsüz salımının etkilerine karşı sitoplazma içerisinde anti-proteolitik aktivitesi olan çeşitli proteinler bulunmaktadır. Bu proteaz inhibitörleri arasında serin proteaz inhibitörlerinden biri olan ve lökosit elastaz inhibitörü olarak da bilinen SERPINB1'in anti proteaz aktivitelerinin yanı sıra hücre içi sinyal yolaklarının aktivasyonu veya inhibisyonu yoluyla kaspazlar gibi çeşitli ölüm yolaklarında bulunan molekülleri regüle ederek pro apoptotik ve anti apoptotik etkiler sergileyebildiği bilinmektedir. SERPIN'lerin yarı kararlı moleküller olmaları ve konformasyonel değişime açık çok fazla bölge içermeleri, diğer moleküllerle etkileşerek farklı aktivitelerinin ortaya çıkmasına neden olmaktadır. Hücresel stres sırasında SERPINB1'in P1-P1 bölgesine yapılan proteaz ataklar sonucunda konformasyonel değişime uğrayarak anti-proteaz aktivitesini kaybettiği ve endonükleaz aktivitesi kazanarak nükleusa transloke olduğu gösterilmiştir. Aktivitesindeki değişimle birlikte bu yeni molekül L-DNase II (lökosit elastaz inhibitöründen türeyen DNase II) adını almaktadır. Nükleusa transloke olan L-DNase II DNA'yı oligonükleozomlarına parçalayarak hücreyi apoptoza (programlı hücre ölümü) götürmektedir. DNase'lar apoptoz çalışmalarında önemli bir yere sahiptir. Bu nedenle, L-DNase II molekülünün NE ilişkili apoptotik yolaklardaki fonksiyonunun aydınlatılması gerekmektedir. Buna karşın, proteazlarla başlayan bu yolağın nötrofil inflamasyonu ile epitel hücreler arasındaki ilişkisiyle ilgili bilgiler literatürde sınırlıdır.
Tez çalışması kapsamında SERPINB1'in nötrofil elastazla ilişkili olarak pro ve anti apoptotik etkileri ALI-kültür yöntemiyle bronş epitel hücrelerinin (BEAS-2B) farklılaştırılması aracılığıyla RNA ve protein düzeyinde araştırılmıştır. BEAS-2B hücrelerinin artan konsantrasyonlarda nötrofil elastaz ile uyarılmasının apoptoza sebebiyet verdiği bulunmuştur. LEI/L-DNase II yolağını spesifik olarak aktifleştirecek doza/dozlara karar verilmiştir. Protein ve gen düzeyinde Kaspaz-3, Kaspaz-8 ve Kaspaz-9 moleküllerinin seviyesinde anlamlı bir değişiklik olmadığı ortaya konmuştur. Protein seviyesindeki analizler sonucunda nötrofil elastazın SERPINB1'in farklı molekül ağırlıklarına sahip formlarını ortaya çıkardığı tespit
iii
edilmiştir. Epitel hücrelerde sitozolik ve nükleer olmak üzere SERPINB1 miktarının nötrofil elastaz ile birlikte değişkenlik gösterdiği bulunmuştur.

Abstract:
Asthma is a chronic inflammatory lung disease that significantly impacts the quality of life of people of all ages. Shortness of breath, coughing, and chest tightness in the airway are common symptoms in sensitive people. While hereditary factors may play a role in airway obstruction in asthma, other stimuli such as particular allergens, cigarette smoke, and air pollution may also be effective. Although airway obstruction occurs in different phases, inflammatory cells such as neutrophils, eosinophils, and mast cells contribute to the disease's pathophysiology.
As the asthma response has heterogenic nature, it is also possible to divide them into eosinophilic and neutrophilic (non-eosinophilic). It is known that neutrophils occupy an essential place in the course of the disease in the pathology of neutrophilic asthma. By transmigrating from the vascular area to the inflamed tissues, neutrophils attempt to eliminate the response caused by the effects of biological or chemical substances. Proteases and reactive oxygen species with cytotoxic effects that neutrophils store in their specialized granules are critical molecules for neutrophils to perform this function. Although the interaction of airway epithelial cells and neutrophils affects the existing pathogen or chemical, the progressive increase in neutrophil numbers harms the host by disrupting the balance of proteases and anti-proteases. Proteolytic enzymes, including NE and MMP-9, play essential roles in airway remodeling and repair.
The uncontrolled release of antimicrobial proteins with strong cytotoxic effects such as neutrophil elastase, cathepsin G, proteinase 3 stored in the azurophilic granules of neutrophils
v
causes cellular destruction. Studies have shown that neutrophil elastase activates intracellular signaling pathways and causes tissue damage. Against the effects of uncontrolled release of proteases in specialized compartments of neutrophils, there are various proteins with anti-proteolytic activity in the cytoplasm. The leukocyte elastase inhibitor SERPINB1, which has anti-protease properties in the cytoplasm and is responsible for the inhibition of these proteases, protects against the effects of uncontrolled protease release in specific parts of neutrophils. Furthermore, SERPINB1 has been shown to have pro-apoptotic and anti-apoptotic effects by regulating molecules involved in various death pathways, such as caspases, via the activation or inhibition of intracellular signaling pathways as well as anti-protease activities. It is also seen that SERPINB1 may have a direct or indirect decisive role in determining the fate of the cell. The fact that SERPINs are metastable molecules and contain many regions open to conformational change can encourage the emergence of different activities by interacting with other molecules. It has been shown that during cellular stress, SERPINB1 loses its anti-protease activity by undergoing conformational changes as a result of protease attacks on the P1-P1 region and translocates to the nucleus by gaining endonuclease activity. This new molecule is called L-DNase II (DNase II derived from leukocyte elastase inhibitor) with the change in its activity. L-DNase II, translocated to the nucleus, cleaves DNA into oligonucleosomes and leads the cell to apoptosis (programmed cell death). DNases have an essential place in apoptosis studies. Therefore, the function of L-Dnase II molecule in NE-related apoptotic pathways needs to be clarified. However, information on the relationship between neutrophil inflammation and epithelial cells of this pathway, which starts with proteases, is limited in the literature.
Within the scope of this thesis, the pro-and anti-apoptotic effects of SERPINB1 in relation to neutrophil elastase were investigated at the RNA and protein level by differentiation of bronchial epithelial cells (BEAS-2B) by the ALI-culture method. It was shown that the stimulation of BEAS-2B cells with increasing concentrations of neutrophil elastase-induced apoptosis. The dose(s) to specifically activate the LEI/L-DNase II pathway was decided. Consistent with the literature, it was revealed that there was no significant change in Caspase-3, Caspase-8, and Caspase-9 molecules at protein and gene levels. As a result of analyzes at the protein level, it was determined that neutrophil elastase revealed forms of SERPINB1 with different molecular weights. In addition, it was found that the amount of SERPINB1 in the cytosolic and nuclear sections of epithelial cells changes with neutrophil elastase stimulation.