Alerjenik bitki lipit transfer proteininin biyoteknolojik üretimi
Biotechnological production of an allergenic lipid transfer protein
Yazar: NARMİN AGHALAROVA
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Alerji dünya çapında yaygın bir hastalıktır ve görülme sıklığı giderek artmaktadır. İmmün sistemi çeşitli şekillerde uyararak alerjik reaksiyonlara yol açan en önemli molekül grubu proteinlerdir. Alerjen proteinler çeşitli kaynaklardan gelmektedir. En iyi bilinen kaynaklardan biri aeroalerjen olan polenlerdir.
Polenlerdeki yaygın alerjenlerin tanımlanması ve biyoteknolojik yöntemlerle üretilmesi, alerjinin moleküler mekanizmasını aydınlatmaya yönelik temel bilim çalışmaları için önemli olduğu gibi, alerji tanı ve tedavisinde de gelişmelere yol açacağından güncel araştırma konuları içinde yer almaktadır.
Bitkilerdeki spesifik olmayan lipit transfer proteinlerinin (nsLTP'ler), özellikle Akdeniz ülkelerinde sıklıkla görülen polen ve gıda alerjilerine neden olduğu bilinmektedir. Polenlerde bulunan nsLTP'lerin alerjik özellikleri bitki türüne, coğrafi bölgeye ve çevresel koşullara göre değişir. Alerjenitesinin yüksek olduğu bilinen Morus alba (akdut) polenindeki nsLTP üzerine bir çalışma bugüne kadar yapılmamıştır.
Bu çalışmanın temel amacı, gelecek çalışmalarda kullanmak üzere, M. alba polenindeki nsLTP'yi biyoteknolojik olarak üretmektir.
Çalışmanın ilk aşamasında, M. alba polenlerinden total RNA izolasyonu yapıldı ve daha sonra RT-PZR ile cDNA kütüphanesi oluşturuldu. cDNA kütüphanesindeki nsLTP geni uygun primerler kullanılarak PZR ile çoğaltıldı ve Sanger DNA dizileme yöntemi ile gen dizisi doğrulandı. nsLTP geni, uygun restriksiyon enzim kesim noktalarının dizilerini içeren primerler kullanılarak PZR ile çoğaltıldı. PZR ürünü 6xHis etiketi taşıyan pQE-2 vektörüne klonlandı ve ardından Escherichia coli BL21 (DE3) hücreleri bu vektörle transforme edildi. Transformant E. coli hücreleri koloni PZR yöntemi ile seçildi.
Çalışmanın ikinci aşamasında, rekombinant nsLTP proteinini bol miktarda üretmek için çalışma hacmi artırıldı ve transformant hücrelerdeki protein sentezi izopropiltiyo-β-D-galaktopiranosid (IPTG) ile indüklendi. Hücre toplama ve parçalama işlemlerinin ardından izole edilen total proteinler, histidin etiketli nsLTP'nin saflaştırılması için immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) sistemine yüklendi. İmidazol ile elüe edilen rekombinant proteinin miktarı bişinkoninik asit (BCA) yöntemiyle belirlendi. nsLTP'yi izlemek ve IgE bağlama kapasitesini, alerjenitesini M. alba polen alerjisi olan hastaların serumlarıyla Western blotlama yaparak test etmek için elektroforetik ayrımlar ve analizler yürütüldü.
Sonuç olarak doğal protein gibi alerjenik özelliklere sahip, yüksek miktarda, saf rekombinant nsLTP başarıyla üretildi. 
Bu çalışmada elde edilmiş biyoteknolojik ürün, LTP'lerin alerji gelişimindeki rolünü daha iyi anlamak için yürütülecek ileri temel ve klinik çalışmalarda kullanılabilir. Ayrıca gelecekte, özgün alerji tanı ve tedavi stratejilerinin ve araçlarının bir parçası olabilir.

Abstract:
Allergy is a widespread disease worldwide, and its incidence gradually increases. The most important group of molecules leading allergic reactions by exciting the immune system diversely are proteins. Allergen proteins arise from various sources. One of the most well-known sources are aeroallergen pollens. 
Identification and biotechnological production of common allergens in pollens are not only important for basic science studies intending to enlighten molecular mechanism of allergy, but also take part in current research topics, since they lead to developments in allergy diagnosis and treatment.
Non-specific lipid transfer proteins (LTPs) in plants are known to cause pollen and food allergies, that are common in especially Mediterranean countries. Allergic properties of nsLTPs in pollen vary according to plant species, geographic region and environmental conditions. No study has been conducted up to date on the nsLTP in Morus alba (white mulberry) pollen known to have high allergenicity.
The main purpose of current study is the biotecnological production of nsLTP in M. alba pollen for further use. 
In the first step of the study, total RNA was isolated from M. alba pollens and a cDNA library was constructed using RT-PCR. The nsLTP gene in cDNA library was amplified with appropriate primers by PCR from this cDNA library and the accuracy of the gene sequence was confirmed by Sanger DNA sequencing method. The nsLTP gene was amplified by PCR with primers containing sequences of proper restriction enzyme breakpoints. PCR product was cloned into the pQE-2 vector carrying 6xHis tag, followed by E. coli BL21 (DE3) cells were transformed with this vector. Transformant E. coli cells were selected by the colony PCR method. 
In the second step of the study, working volume was increased and protein synthesis in transformant cells was induced with isopropylthio-β-D-galactopyranoside (IPTG) to produce high amount of recombinant nsLTP protein. Total proteins isolated after the cell collection and disruption were loaded onto the immobilized metal affinity chromatography (IMAC) system for the purification of his tagged nsLTP.  Amount of recombinant protein eluted with imidazol was detected with bicinchoninic acid (BCA) method. Electrophoretic separations and analyses were carried out in order to trail nsLTP, and to test its IgE binding capacity, allergenicity, by Western blotting with the sera of patients allergic to M. alba.
As a result, high amount of pure recombinant nsLTP having allergenic properties like natural protein was successfuly produced.  
Biotechnologial product obtained in this study can be used further basic and clinical studies for a better understanding the role of LTPs in allergy progression. Besides, it can be a part of specific diagnosis and treatment strategies and tools in the future.