Kolistin dirençli klebsiella pneumoniae sepsisinde mezenkimal kök hücre ve resveratrol+piperin kombine tedavisi etkinliğinin araştırılması
Mesenchymal stem cell in colistin-resistant klebsiella pneumoniae sepsis and investigation of the efficacy of resveratrol+piperine combined treatment
Yazar: YUSUF AYKEMAT
Danışman: PROF. DR. GÖKÇEN DİNÇ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Beslenme ve Diyetetik = Nutrition and Dietetics ; Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji = Infectious Diseases and Clinical Microbiology

Özet:
Klebsiella pneumoniae, Enterobacteriaceae familyasına ait, Gram negatif ve çomak şeklinde bir bakteridir Etken uzun yıllardır, dünya genelinde nozokomiyal enfeksiyonların önde gelen nedenlerinden biridir ve geliştirdiği kolistin direnci ile de günümüzde hala önemli bir halk sağlığı sorunu olarak varlığını sürdürmektedir. Bu araştırma kolistin dirençli K. pneumoniae ile oluşturulmuş deneysel sepsis modelinde mezenkimal kök hücre (MKH) ile resveratrol (RSV)-piperin kombinasyonunun etkinliğinin araştırılması amacı ile planlanıp yürütülmüştür. Bu amaçla 610 haftalık dişi BALB-c fareler pozitif kontrol, negatif kontrol ve tedavi gruplarına ayrılmışlardır. Tedavi grupları kolistin-fosfomisin kombinasyonu (ANT) ve resveratrol gavajı alan ANT+RSV grubu, MKH tedavisi alan MKH grubu, MKH tedavisinin yanısıra RSV gavajı da alan MKH+RSV grubu ve tüm tedavileri alan kombine grup (MKH+ANT+RSV) şeklinde oluşturulmuştur. Deneysel sepsis dozu ön çalışma ile belirlendikten sonra K. pneumoniae bakteri süspansiyonunun intraperitonal (ip) enjeksiyonu ile sepsis oluşturulmuş, inokulumdan 2,5 saat sonra 200 mcg/kg RSV içeren RSV, piperin ve balık yağından oluşturulan RSV gavajı sakrifikasyona kadar her 24 saatte bir uygulanmıştır. Antibiyotik uygulamaları ise inokulumdan 3 saat sonra başlatılarak kolistin, 12 saatte bir 5 mg/kg, fosfomisin ise 4 saatte 100 mg/kg, ip olarak uygulanmıştır. MKH ise 2x 106 hücre/kg  dozda 0,1 mlde ip olarak 24 saatte bir verilmiştir. Fareler 24. ve 48.saatlerde sakrifiye edildikten sonra akciğer ve karaciğerden ekim yapılarak bakteri yükleri (cfu/g) hesaplanmış, serum IL-6, IL-10, IF-ɣ düzeyleri ELISA yöntemi ile belirlenmiştir. Ayrıca akciğer, karaciğer ve böbrek dokuları Hematoksilen-Eozin (H&E) boyama ile histopatolojik olarak değerlendirilerek skorlandırılmıştır. Hayvanların akciğer kantitatif üreme sonuçları incelendiğinde 24. saatte MKH+RSV ve MKH+ ANT+ RSV gruplarının, 48. saatte ise ANT+RSV ve MKH+ANT+RSV gruplarındaki akciğer bakteri yüklerinin diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı derece düşük olduğu görülmüştür (p<0,05). Karaciğer bakteri yükleri değerlendirildiğinde ise yalnızca 48. saatte ANT+RSV, MKH+RSV ve MKH+ANT+RSV alt gruplarının    üremelerinin pozitif kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derece düşük olduğu belirlenmiştir(p<0,05). Farelerin serum IL-10 sonuçları incelendiğinde hem 24, hem de 48. saatlerde tüm tedavi grupları ve negatif kontrol grubunun serum IL-10 düzeylerinin ilgili saatlerin pozitif kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak daha düşük olduğu (p<0,001), serum IF-γ düzeyleri karşılaştırıldığında 24. saatte ANT+RSV alt grubunun serum IF-γ düzeylerinin aynı saatteki diğer alt gruplardan istatistiksel anlamlı olarak daha düşük olduğu (p<0,05), serum CRP düzeyleri incelendiğinde ise 48. saat alt grupları incelendiğinde MKH tedavisi alan alt grubun serum CRP düzeylerinin diğer tüm tedavi grupları ve negatif kontrollerden yüksek olduğu saptanmıştır (p<0,05). Ayrıca histopatolojik incelemelerde kombine tedavi alan MKH+ANT+RSV grubununun en az patolojik değişikliğe sahip olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak kolistin dirençli K. pneumoniae ile oluşturulan deneysel sepsis modelinde MKH, antibiyotik, resveratrol ve piperin kombinasyonu tedavisinin diğer mono ve kombine tedavilere kıyasla üstünlük sağladığı belirlenmiştir. 
Anahtar Kelimeler: Deneysel Sepsis; Fosfomisin; Kolistin; Kolistin Dirençli Klebsiella pneumoniae; Mezenkimal Kök Hücre, Resveratrol, Piperin

Abstract:
Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative, rod-shaped bacterium belonging to the Enterobacteriaceae family. The patogen has been one of the leading causes of nosocomial infections worldwide for many years, as it is an important source of various antimicrobial resistance genes, and is still an important public health problem today with the colistin resistance it has developed continues to exist. This research was planned and carried out with the aim of investigating the effectiveness of mesenchymal stem cells (MSC) and resveratrol (RSV)-piperine combination in an experimental sepsis model created with colistin-resistant K. Pneumoniae. For this purpose, 6-10 week old female BALB-c mice were divided into positive control, negative control and treatment groups. Treatment groups were formed as ANT+RSV group receiving colistin-fosfomycin combination (ANT) and resveratrol gavage, MSC group receiving MSC treatment, MSC+RSV group receiving RSV gavage in addition to MSC treatment, and combined group (MSC+ANT+RSV) receiving all treatments. After the experimental sepsis dose was determined by the preliminary study, sepsis was induced by intraperitoneal injection (ip), and 2.5 hours after the inoculum, RSV gavage containing 200 mcg/kg RSV and composed of RSV, piperine and fish oil was applied once every 24 hours until sacrifices. Antibiotic applications started 3 hours after the inoculum and colistin given as 5 mg/kg per kg every 12 hours -with the first dose being twice the loading dose as this dose - and fosfomycin divided into 6 doses and given as 100 mg per kg every 4 hours until sacrifices. MSCs were given as 2x106 cell/kg as 1 injection per animals every 24 hours. After the mice were sacrificed at 24 and 48 hours, bacterial cultures and lung and liver bacterial loads (cfu/g) were calculated, and serum IL-6, IL10, IF-ɣ levels were determined by ELISA method. In addition, histopathological examinations were performed using Hematoxylin-Eosin (H&E) staining in lung, liver and kidney tissues and organ status was scored. When the lung bacterial load results of the animals were examined, it was seen that bacterial counts of the 24th hour subgroups of the MKH+RSV and MKH+ ANT+ RSV groups at the 24th hour and the ANT+RSV and MKH+ANT+RSV groups at the 48th hour were statistically significantly lower than the other groups (p<0.05) while in liver loads, it was noted that only at the 48th hour there was a significant difference. The liver bacterial loads of ANT+RSV, MKH+RSV and MKH+ANT+RSV subgroups were statistically significantly lower than the positive controls (p<0.05). When examining the serum IL-10 results of mice, it was observed that at both 24 and 48 hours, the serum IL-10 levels of all treatment groups and the negative control group were statistically lower compared to the positive control groups at the respective hours (p < 0.001). When comparing serum IF-γ levels, it was found that at 24 hours, the serum IF-γ levels of the ANT+RSV subgroup were statistically significantly lower than those of the other subgroups at the same hour (p < 0.05). Upon examination of serum CRP levels at 48 hours, it was determined that the subgroup receiving MKH treatment had higher serum CRP levels compared to all other treatment groups and negative controls (p < 0.05). Furthermore, histopathological examinations revealed that the MKH+ANT+RSV group receiving combined treatment exhibited the least pathological alterations and demonstrated the best tissue architecture. As a result, it has been determined that the combination treatment of MKH, antibiotic, resveratrol, and piperine provides superiority compared to other mono and combined treatments in the experimental sepsis model created with colistin-resistant K. pneumoniae. 
Keywords: , Colistin-Resistant Klebsiella pneumoniae; Colistin Experimental Sepsis; Fosfomycin; Mesenchymal Stem Cell Resveratrol, Piperine