Protein izolasyonu için immobilize metal afinite kromatografisi bazlı kesikli sistemlerin geliştirilmesi
Development of immobilized metal affinity chromatography based batch systems for protein isolation
Yazar: BUKET ÇELİKKAYA
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN ALİ TUNCEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
Proteinler vücutta enzimsel, hormonal, yapısal ve savunma fonksiyonlarında yer alan makromoleküllerdir. Proteinlerin bulundukları ortamdan izolasyonu ve saflaştırılması, işlevlerinin belirlenmesi ve biyokimyasal reaksiyonlarının açıklanabilmesi günümüzde önem kazanan konular arasındadır. İmmobilize metal afinite kromatografisi (İMAK); rekombinant proteinlerin saflaştırılması, serum proteinlerinin izolasyonu, protein ve peptidlerin karakterizasyonu, fosfopeptidlerin izolasyonu, oligonükleotid, RNA, DNA gibi makromoleküllerin izolasyonunu sağlayarak vücutta gerçekleşen biyolojik tepkimeleri açıklamak için kullanılmaktadır.  
Çalışma kapsamında, elde edilen manyetik silika mikrokürelerin yüzeyi polidopamin (PDA) ile kaplanmış ve bu moleküllere Ni2+ iyonu immobilize edilmiştir. Bunun için öncelikle dispersiyon polimerizasyonu ile elde edilen poli(glisidil metakrilat) çok basamaklı mikrosüspansiyon polimerizasyonu için çıkış lateksi olarak kullanılmış ve monodispers-gözenekli yapıdaki poli(metakrilik asit-co-etilendimetakrilat) mikroküreler elde edilmiştir. Sentezlenen mikroküreler, Fe2+ ve Fe3+ iyonları kullanılarak ikili çöktürme ile manyetik forma dönüştürülmüştür. Bu mikroküreler üzerine hidroliz-kondenzasyon reaksiyonu yöntemiyle TEOS yüklemesi gerçekleştirilmiştir. Böylece 6 µm ortalama boy dağılımına ve 8.6 nm ortalama gözenek boyutuna sahip monodispers-gözenekli manyetik silika mikroküreler sentezlenmiştir. PDA, silika mikroküreler üzerine ince bir tabaka halinde kaplanmıştır. Manyetik silika mikroküreler ve PDA kaplanmış mikrokürelere ait doygunluk manyetizasyon değerleri ise sırasıyla 25 ve 21 emu/g olarak bulunmuş ve bu değerin manyetik alan ile ayırma için gerekli değerin (16.3 emu/g) üzerinde olduğu görüşmüştür. İMAK uygulamalarında kromatografik sorbent olarak kullanılabilmeleri için partiküllerin PDA katmanında yer alan hidroksil grupları üzerinden Ni2+ iyonlarının immobilizasyonu sağlanmıştır. 
Elde edilen kromatografik sorbent ile kesikli sistemde protein adsorpsiyon-desorpsiyon prosesleri gerçekleştirilmiştir. Sorbentlerin, serum albumin (BSA), hemoglobin (HB) ve lizozim proteinlerine karşı afinitenin belirlenmesi için, adsorpsiyon kapasiteleri, desorpsiyon ve izolasyon verimleri ölçülmüştür. Artan sorbent derişimi ile adsorpsiyon kapasitesi ve desorpsiyon veriminde azalma gözlenmiştir. Bütün proteinler için 2 mg/mL başlangıç derişimi ile maksimum adsorpsiyon kapasitesine ulaşılmıştır. Bu değerler HB, Lizozim, BSA için sırası ile 80, 70 ve 54 mg/g olarak belirlenmiştir. Desorpsiyon verimleri artan protein konsantrasyonu ile artarken, izolasyon verimlerinde maksimum değer 0.5 ve 1.0 mg/mL protein konsantrasyonlarında elde edilmiştir. Aynı çalışmalar Ni2+ iyonunun protein izolasyonundaki fonksiyonunu belirlemek amacıyla Ni2+ iyonu immobilize edilmemiş PDA kaplı mikroküreler ile tekrarlanmıştır. Bu çalışmalarda Ni2+ içeren sorbente kıyasla daha düşük adsorpsiyon kapasitesi değerleri elde edilmiştir. Desorpsiyon ile izolasyon verimleri ise Ni2+ iyonu içeren mikrokürelere göre daha düşük düzeyde kalmıştır. Kullanılan iki tür mikropartikül türü için farklı proteinler ile adsorpsiyon izotermleri oluşturulmuştur. Sonuçta her iki partikül türü için proteinlerin mikroküreler üzerine adsorpsiyonunun Langmuir izotermi ile uyumlu olduğu ve homojen yapıda, tek tabaka şeklinde gerçekleştiği görülmüştür.


Anahtar Kelimeler: İMAK, Protein İzolasyonu, Serum Albumin, Lizozim, Hemoglobin

Abstract:
Proteins are macromolecules that have functions as hormon, enzyme, structure and defense. Today, the isolation and purification of proteins, determination of their functions and explanation of their biochemical reactions are developing issues. For the identification  of biological processes in organisms, a new approach is getting important called 'immobilized metal affinity chromatography (IMAC)'. Purification of recombinant proteins, isolation of serum proteins and phosphopeptides,  characterization of proteins and peptides, isolations of macromolecules like RNA, DNA, oligonucleotide are major applications of IMAC. 
In the scope of this study, the magnetic silica microspheres were coated with a polydopamine (PDA) layer and Ni2+ ions were immobilized on the PDA coating. In the first step of the synthesis, the product of the dispersion polymerization process, poly(glycidyl methacrylate), was used as seed latex in the multistage microsuspension polymerization. Then, the monodisperse-porous poly(methacrylic acid-co-ethylene dimethacrylate) microspheres were obtained. The magnetization of microspheres was performed by the impregnation of Fe2+ ve Fe3+ ions into the particles. Next, monodisperse-porous magnetic silica microspheres were synthesized using the sol-gel templating protocol, with 6 µm in size and the average pore size of 8.6 nm. The magnetic SiO2 microspheres were coated with a thin layer of PDA for functionalization. The magnetic SiO2 microshperes and PDA coated microspheres had the saturation magnetization values of 25 and 21 emu/g, respectively, those were higher than the sufficient value for magnetic seperation (16.3 emu/g). Finally, Ni2+ ions were immobilized via the functional hydroxyl groups of PDA layer on the magnetic microspheres and the final product was used as the chromatographic sorbent in IMAC process. 
The chromatographic sorbent was used in the successive adsorption-desorption in batch fashion. The adsorption capacity, and the desorption and isolation efficiencies were determined to demonstrate the affinity of sorbent against to bovine serum albumin (BSA), hemoglobin (HB) and lysozyme. The results indicated that the adsorption capacity and the desorpsiton efficiency decreased with the increasing sorbent concentration. The adsorption capacity took its maximum value for all proteins at a protein concentration of 2.0 mg/mL. The corresponding values were 80, 70 and 54 mg/g for HB, lysozyme and BSA, respectively. The maximum isolation efficiencies were obtained at 0.5 and 1.0 mg/mL protein concentrations. All analyses were repeated with PDA coated microspheres not containing  Ni2+ ions to figure out the function of Ni2+ ions during the protein isolation. The results showed that the sorbent not containing Ni2+ ions had lower adsorption capacity when compared to Ni2+ immobilized one. The desorption and isolation efficiencies were also lower with the sorbent not containing Ni2+ ions. The adsorption isotherms were plotted for all proteins. As a result, the adsorption of proteins onto the synthesized sorbent was adequately described by Langmuir isotherm. This model demonstrated that the adsorption was homogeneous and occurred in the form of a monolayer on the sorbent surface. 


Keywords: IMAC, Protein Isolation, Serum Albumin, Lysozyme, Hemoglobin