Yüksek glikozlu besiyeri ile deneysel diyabetik modelde hasara uğramış spermlere kök hücre ve niş ile desteklenmiş trombosit zengin plazma (PRP) ve stromal vasküler fraksiyon (SVF) etkisi
Effect of platelet rich plasma (PRP) and stromal vascular fraction (SVF) supplemented with stem cells and niches on sperms damaged in experimental diabetic model with high glucose medium
Yazar: RABİA DURUŞMA
Danışman: DOÇ. DR. ERDOĞAN KOCAMAZ
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Glükoz = Glucose ; Kök hücreler = Stem cells ; Kısırlık-erkek = Infertility-male

Özet:
Amaç: Bu çalışmada sağlıklı hayvanlardan alınan spermlerde kültür ortamında yüksek glikozlu besiyeri kullanılarak diyabetik hasar [DH] oluşturuldu. Spermlere mezenkimal kök hücre [MKH], 48 saatlik salgıladıkları faktörler olan koşullu besiyeri [KB] yani Niş ve Trombosit Zengin Plazma [PRP] ile desteklenmiş Stromal Vasküler Fraksiyon (SVF) uygulamaları yapılarak deneysel diyabetik modelde sperm hasarının azaltılması amaçlandı.
Gereç ve Yöntem: 12 haftalık Wistar Albino cinsi 15 adet erkek sıçandan elde edilen spermler kültür ortamında 6 gözlü flasklara alınarak 15 farklı grup olacak şekilde belirlendi. Kontrol (KG), Sham (SG), DG, DG+ MKH, DG + KBY, DG+MKH+ KBY, DG+ PRP, DG+ SVF, DG+ MKH+PRP, DG+ MKH+ SVF, DG+ KBY+ PRP, DG+ KBY+ SVF, DG+MKH+ KBY+ PRP, DG+MKH + KBY+ SVF ve DG+ MKH+ KBY+ PRP+SVF olarak grupları ayrıldı. Üç saatlik uygulamada morfoloji, canlılık ve hareket değerlendirilmeleri yapılarak yaymaları hazırlanan örnekler oksidatif stres için e-NOS ve i-NOS ile apoptoz için TUNEL, CASPAZ 3, CASPAZ 8 ve CASPAZ 9 ile immünohistokimyasal olarak analiz edildi.
Bulgular: DH besiyeri ortamının sperme verdiği hasarda oluşan morfolojik, canlılık ve hareket bozukluklarının artan eNOS ve iNOS ile artan apoptotik belirteçler ile ilişkili olduğu belirlendi. Uygulamaların istatistiksel olarak anlamlı bir biçimde sperm morfoloji, canlılık ve hareketini koruyarak oksidatif stres ve apoptozu azalttığı görüldü. Bireysel uygulamalarda olumlu etki varken MKH+KB+PRP+SVF kombinasyonunun anlamlı bir şekilde daha etkin olduğu saptandı.
Sonuçlar: DH invitro modelin sperm hasarı yapması ve uygulamalar ile bu hasarın önlenebilmesi model olarak diğer tedavi olasılıkları için önemli olabileceğini gösterdi. MKH, PRP, KB ve SVF kombinasyonunun ilk defa kullanıldığı bu çalışma ile hücresel tedavi olarak hücre sayısının artırılması, büyüme faktörlerinin çoğaltılması ve sinyal mekanizmalarının güçlendirilmesi sonucunda oldukça yararlı olabileceği belirlendi. Toplumda yüksek prevalansta görülen ve giderek artan erkek infertilitesine yönelik hücresel tedavi gibi maliyetleri az ve etkinliği çok yeni rejeneratif yöntemin gelişmesine katkı sağlayacak sonuçlarımız çocuk sahibi olmak isteyen ailelere ümit olacaktır. Deney hayvanı ve insan çalışmaları ile bulguların doğrulanması ve mekanizmaların aydınlatılması klinikte kullanımlarını sağlayacaktır.

Abstract:
Aim: Diabetic damage (DD) was created in this work by utilizing a high glucose medium in the culture media of healthy animals sperm. We used mesenchymal stem cells (MSC), conditioned media (CM) Niche, which is the factors they secrete for 48 hours, and Stromal Vascular Fraction (SVF) mixed with Platelet Rich Plasma (PRP) to minimize sperm damage in experimental diabetes. Sperm samples from 15 Wistar Albino rats were collected and divided into 15 groups in 6-well flasks filled with culture medium.
Materials and Methods: The groups were divided into Control (CG), Sham (SG), DD, DD+ MSC, DD + CM, DD+MKH+ CM, DD+ PRP, DD+ SVF, DD+ MSC+PRP, DD+ MSC+ SVF, DD+ CM + PRP, DD+ CM + SVF, DD+MKH+ CM + PRP, DD+ MSC + CM + SVF, and
DD+ MSC+ CM + PRP+SVF. Smears of sperms were prepared after analyzing morphology, viability, and movement in three-hour application by phase-contrast microscopy. Smears were used for morphology and immunocytochemistry which e-NOS and i-NOS for oxidative stress, and TUNEL, Caspase 3, 8, and 9 for apoptosis were used. It was observed that morphological, viability, and movement abnormalities produced by diabetic medium damage to sperm were linked to higher levels of eNOS and iNOS, as well as higher levels of apoptotic markers. The applications reversed these markers to lower level while preserving sperm morphology, vitality, and motility. These results were statistically significant. While individual applications showed promise, the combination of MSC+CM+PRP SVF showed much more success.
Results: The high glucose medium as an in vitro model for DD has been proven to induce sperm damage similar to diabetic testis which could be good model for other treatment options. As a consequence of raising the number of MSC, boosting the growth factors, and enhancing the signaling mechanisms by combination of cell therapies used in this study, it was found that the combination of MSC, PRP, CM, and SVF might be highly effective as a cellular therapy.
Conclusions: Our results, which will aid in the creation of a novel low-cost, high-efficiency regenerative treatment, such as cellular therapy for male infertility which has a high prevalence in society and is gradually expanding, will provide hope to families who wish to have a baby. Experimental animal and human investigations will be used to confirm these findings and elucidate the mechanisms, allowing them to be used in the clinic.