Epidermal growth faktör (EGF) ve EGF yüklenmiş polikaprolakton skafoldun tendon defekt iyileşmesine etkileri
Effects of epidermal growth factor (EGF) and EGF-loaded 
polycaprolactone scaffolds on tendon defect healing
Yazar: İSMAİL AYKUT KOÇYİĞİT
Danışman: DOÇ. DR. GAZİ HURİ
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology
Dizin: Aşil tendonu = Achilles tendon ; Büyüme maddeleri = Growth substances ; Epidermal büyüme faktörü = Epidermal growth factor ; Polikaprolakton = Polycaprolactone ; Tavşanlar = Rabbits ; Tendon yaralanmaları = Tendon injuries ; Tendonlar = Tendons

Özet:
Genel Bilgi: En uygun histolojik ve anatomik tendon iyileşmesini sağlamak için,
Platelet'ten zengin plazma (PRP), mezenkimal kök hücre uygulamaları, kemik morfojenik
protein, kemik iliği aspiratı, büyüme faktörleri (bFGF, HGF, rhPDGF-BB, TGF-b, VEGF)
geleneksel tedavi protokolüne eklenmektedir. Epidermal Growth Faktör (EGF), hücre
gelişmesini, farklılaşmasını EGFR reseptörüne bağlanarak sağlayan bir büyüme faktörüdür.
Günümüzde EGF' in cilt rejenerasyonunda epidermisler arasında köprüleşmeyi içeren,
özellikle diyabetik ayak gibi kronik yara problemleri olan hastalarda klinik uygulanmaları
vardır. Bu çalışmada, daha önce araştırılmamış olan defektif tendon tamiri ve iyileşmesinde
EGF'in potansiyel rolünün araştırılması hedeflenmiştir.
Gereç ve Yöntemler: Hayvan deneyi çalışmasında 30 tane Yeni Zellanda beyaz tavşanının
aşil tendonunda 1 cm büyüklüğünde defekt oluşturuldu. Herbirinde 10 tendon bulunan 3
denek grubu oluşturuldu; (1)"Sham grubu: 1 cm lik tendon defekti gap bırakılarak
emilmeyen dikiş ile "splint"leme uygulandı. (2) EGF(+) grup: 1 cm lik tendon defektine
"gap" bırakılarak emilmeyen dikiş ile "splint"leme uygulandı ve defekt oluşturulan
bölgeye 25 μg/kg EGF enjekte edildi. (3) Skafold+EGF(+) grup: 1 cm lik tendon
defektine 25 μg/kg EGF yüklenmiş dönüşebilen, poroz polikaprolakton (PCL) "skafold"
yerleştirilerek emilmeyen dikiş ile tespit edildi. 2. ve 3. Gruplara aynı dozlarda EGF
enjeksiyonuna postoperatif gün aşırı 10 gün devam edildi. 8. haftada hayvanlar sakrifiye
edildikten sonra sonra aşil tendon tamiri ve rejenerasyonu histolojik ve biyomekanik olarak
incelendi. Histolojik incelemede ışık mikroskopi yöntemi kullanıldı. Işık mikroskopi
yöntemi için dokular %10 formalinde fikse edildi. Bütün parçalar parafine gömüldü, 10
mm kesitlere ayrıldı, Hematoksilen - Eosin (H&E) ve Masson's trichrome ile boyandı.
Biyomekanik çalışma, hayvanlar sakrifiye edildikten hemen sonra tendonlar tazeliğini
korurken uygulandı. Çekme testi uygulanan aşil tendonlarında kopma kuvveti, kopma
anındaki uzama miktarı ve young modulus değerleri ölçüldü. Tüm prosedürler Hayvan
Araştırma Etik Kurulundan onay alınarak yapılmıştır.
Bulgular: Bütün denek gruplarında, defektin iyileştiği ve köprüleşmenin olduğu
makroskopik olarak gözlemlendi. Histolojik olarak "Sham" grup: Damar formasyonu ve
Tip 3 kollojenin yeni yapılmaya başlanmış olduğu gözlemlendi. Nadir adipozit izlendi.
EGF (+) grup: Tendon içinde damar formasyonu, periferal sinir tomurcuklanması, daha
fazla adipoz dokular gözlemlendi. Tamamen tendon rejenerasyonu için sonuçta Tip 1
kollajene dönüşen ve fibroblastlar tarafından üretilen yüksek düzeyde Tip 3 kollajen
görüldü. Skafold + EGF(+) grup: damar formasyonu, periferal sinir tomurcaklanması yine
gözlemlendi fakat adipoz doku miktarı, ve üretilen Tip 3 kollajen mıktarı EGF(+) grup ile
karşılaştırıldığında daha az olduğu gözlemlendi. Tip Ⅰ/Tip Ⅲ kollajen oranının en fazla
Skafold + EGF grubunda olduğu, en az ise Sham grubunda olduğu saptandı. Biyomekanik
olarak, kopma kuvvetleri açısından 3 deney grubu ve kontrol grupları arasında istatiksel
olarak anlamlı fark saptanmadı(p>0,05). Kopma anındaki uzama miktarı açısından da
gruplar arasında anlamlı fark saptanmadı(p>0,05). Young modulus açısından 3 deney grubu
arasında anlamlı fark saptanmadı(p>0,05) ama kontrol grubuyla EGF ve Skafold + EGF
gruplarının ikili karşılaştırılması sonucunda anlamlı fark olduğu saptanmıştır(P<0,05).
Sonuçlar: Geleneksel tedavi ile beraber EGF uygulanması daha uygun ve histolojik olarak
ileri düzeyde tendon iyileşmesi ile sonuçlandı. Bizim hipotezimiz; EGF uygulanması,
damarlanmanın artması, damarda endotel hücreye komşu " perisit" hücrelerin (kök
hücrelerin) defekt boyunca toplanması, iyileşmede gerekli enerjinin sağlanabilmesi için
tendon defekt bölgesinde yağ hücrelerinin gelişiminin görülmesi yüksek doku onarımının
olabileceği histolojik olarak göstermiştir. Kopma kuvvetleri açısından gruplar arasında
anlamlı bir fark saptanmamıştır. EGF eklenmesi tendon iyileşmesini biyomekanik açıdan
negatif etkilememiştir. Biyomekanik açıdan olumsuz etkileri bulunmayan EGF'in, Tip Ⅰ/Tip Ⅲ kollajen oranını artırarak histolojik olarak daha uygun ve daha ileri seviyede tendon
iyileşmesinini sağladığı gözlemlendi. Tedaviye EGF eklenmesiyle histolojik olarak etkin
tendon iyileşmesi elde edildi. Tedaviye EGF + skafold birlikte eklenmesiyle en etkin
tendon iyileşmesi elde edildi. Skafoldun boşluk doldurarak ve büyüme faktörünün
etkinliğini artırarak daha az Tip 3 kollajen formasyonu ve böylece daha hızlı tendon tamiri
olabileceği savı da ortaya çıkmıştır.

Abstract:
Introduction: In order to obtain the most accurate anatomical and histological tendon
regeneration, therapies including the administration of platelet rich plasma (PRP), bone
marrow aspiration, bone morphogenic protein, mesenchymal stem cells and growth factors
(bFGF, HGF, rhPDGF-BB, TGF-b, VEGF) are being applied along with the conventional
treatment. Epidermal growth factor (EGF) is a growth factor that stimulates cell growth,
proliferation and differentiation through binding EGFR cell surface receptor. Its current
clinical application includes the bridging in between epidermis fragments in skin
regeneration. In this study, the aim was to investigate the potential role of EGF in tendon
repair and regenaration which has not been investigated previously.
Material and Methods: In this preclinical study, 1 cm size defects were created on one of
the Achilles tendon of 30 New Zealand white rabbits. 3 experimental groups of 10 tendons
were made including:(1) "Sham" group: 1 cm tendon defect was splinted leaving the gap
with non absorbable suture; (2) EGF(+) group: 1 cm tendon defect was splinted leaving the
gap with non absorbable suture and 25 μg/kg EGF injection was made in the defect; (3)
Scaffold+ EGF(+) group: 1 cm tendon defect was grafted with biodegradable, porous
polycaprolactone (PCL) scaffolds loaded with 25 μg/kg EGF and stabilized using non
absorbable suture. In groups 2 and 3, same dose EGF injections were made every other day
for 10 days. Animals were sacrificed at 8 weeks postop, and Achilles tendon repair and
regeneration was investigated by histopathological and biomechanics analysis. The tissues
were rapidly fixed in 10% formalin and processed for routine light microscopy. All
specimens were embedded in paraffin, 10 mm sections were cut and stained by
hematoxylin and eosin (H&E) and Masson's trichrome. The biomechanical study was
performed immediately after the animal was sacrificed and the tendons were maintained
fresh. Pullout force test was performed for Achilles tendons and then was measured
breaking force, amount of elongation at break and young modulus. All procedures were
approved by Animal Research Ethical Committee.
Results: It was observed macroscopically that defects healed and bridged in all of the
experimental groups. Histologically, "Sham" group: Damar formation and Type 3 collagen
have been observed to be newly constructed. Rare adiposity was observed EGF(+) group:
vessel formation, peripheral nerve buds and more adipocytes were observed inside the
tendon. A high level of type III collagen was detected which was laid by fibroblasts to be
replaced by type I collagen eventually for complete tendon regeneration.
Scaffold +EGF(+)group: vessel formation and peripheral nerve buds were again observed,
but the amount of adipocytes and laid type III collagen were less compared to EGF(+)
group. Type Ⅰ/Type Ⅲ collagen ratio was highest in Skafold + EGF group and at least in
sham group. Biomechanically, there was no statistically significant difference between the
3 experimental groups and the control groups in terms of the breaking forces (p> 0,05).
There was no significant difference between the groups in terms of the amount of
elongation at break (p> 0,05). Young modulus was not significantly different between the
three experimental groups (p> 0,05) but it was found that there was a significant difference
between control group , EGF and Skafold + EGF groups (P <0,05).
Conclusion: EGF application together with the conventional therapy led to more
appropriate, advanced tendon regeneration histologically. Our hypothesis is; The
histological demonstration that EGF application, increased vascularity, accumulation of
"pericyte" cells (stem cells) adjacent to the endothelial cell in the vasculature, and
appearance of the development of fat cells in the tendon defect region in order to provide
the necessary energy for healing can provide high tissue repair. There was no significant
difference between the groups in terms of breaking forces. EGF application did not
negatively affect tendon healing in biomechanical aspects. It was observed that EGF
without biomechanical adverse effects improves histologically more appropriate and
advanced tendon healing by increasing the proportion of Type I/Type Ⅲ collagen.
Histologically effective tendon healing was achieved by the addition of EGF. Treatment
with EGF + scaffold was obtained the most effective tendon healing. Scaffold implantation
into the defect as the void filler and by increasing the effectiveness of the growth factor,
resulted in less type III collagen formation and thus faster tendon repair response.