1,5-pentanditiyol/altın nanopartikül/sisteamin/glutaraldehit modifiye tirozinaz biyosensörü ile bisfenol A tayin olanaklarının araştırılması
Investigation of bisphenol A determination capabilities with 1,5-pentanedithiol/gold nanoparticle/cysteamine/glutaraldehyde modified tyrosinase biosensor
Yazar: EFE DENİZ ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. EROL AKYILMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Tez kapsamında biyosensör teknolojisine yeni ve orijinal bir bakış açısı getirecek olan 1,5-pentanditiyol/Altın Nanopartikül/Sisteamin/Glutaraldehit modifiye tirozinaz biyosensör sistemi ile gerek endüstriyel ve gerekse klinik anlamda tayini önem arz eden Bisfenol A maddesinin duyarlı bir şekilde tespitinin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Biyosensör tasarımında altın elektrot yüzeyinde; 1,5-pentanditiyol kullanılarak kendiliğinden oluşan tek tabaka oluşumu gerçekleştirilmiştir. 1,5-pentanditiyol modifiye edilmiş altın elektrot üzerine altın nanopartikül damlatılmış, elde edilen bu yüzey üzerine ise sisteamin kaplanmıştır. Sisteaminden kaynaklanan –NH grupları üzerine tirozinaz enzimi immobilize edilip, glutaraldehit ile çapraz bağlama yapılmıştır.
Tasarlanan enzim biyosensör sistemi ile bisfenol A ölçümleri, 0,0 & +0,4 V arasında diferansiyel puls voltametrisi yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Ölçüm ortamında bulunan K3[Fe(CN)6]'ün belirlenen potansiyel aralığındaki yükseltgenme piklerinde meydana gelene değişimler ile bisfenol A konsantrasyonu arasındaki doğrusal ilişkiden yararlanılarak ölçümler gerçekleştirilmiştir.
Tasarlanan biyosensörün optimizasyon çalışmalarında, elektrot yüzeyinde oluşturulan biyoaktif tabaka bileşenlerine yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda optimum enzim miktarı, SAM oluşum süresi, sisteamin bekleme süresi ve glutaraldehit miktarı belirlenmiştir. Çalışma koşullarının optimizasyonu sırasında ise sıcaklık, pH ve iyon şiddeti gibi parametreler incelenmiştir. Enzim biyosensörünün karakterizasyonuna yönelik yapılan çalışmalarda da bisfenol A'nın doğrusal tayin aralığının belirlenmesi, substrat spesifikliği, girişimci etkisi, tekrarlanabilirlik, tekrar üretilebilirlik, depo kararlılığı ve içme suyunda bisfenol A tayini gerçekleştirilmiştir.
Elde edilen sonuçlara göre en uygun enzim miktarı, SAM oluşum süresi, sisteamin bekletme süresi ve glutaraldehit miktarı sırası ile; 117 U/ml, 16 saat, 8 saat ve % 2,5 olarak bulunmuştur. Enzim biyosensörü için çalışma tamponu olarak 100 mM , pH: 7,0 fosfat tamponu kullanılmış, çalışma sıcaklığı ise 30ºC olarak belirlenmiştir. Karakterizasyon çalışmalarından elde edilen sonuçlara göre de enzim biyosensörünün doğrusal tayin aralığı 25-500 µM, cevap süresi 19 saniye olarak bulunmuştur. Geliştirilen enzim biyosensörü ile içme suyunda bisfenol A analizi yapılmış, elde edilen sonuçlar referans bir metot ile karşılaştırılmıştır.

Abstract:
In this thesis; 1,5-pentanedithiol/gold nanoparticle/cysteamine/glutaraldehyde modified tyrosinase biosensor system which brings a new and original biosensor design intented for bisphenol A determination was developed. Self-assembled monolayer was formed in the presence of 1,5-pentanedithiol onto gold electrode. Gold nanoparticle was dropped onto 1,5-pentanedithiol modified gold electrode; then modified electrode was immersed into cysteamine solution. Tyrosinase was immobilized to –NH groups of cysteamine. Finally, cross-linking agent glutaraldehyde was used.
Bisphenol A measurements with enzyme biosensor was operated between 0.0 & +0.4 V potantial with differantial pulse voltammetry. Measurements were implemented with the relation of the differantion of reduction peaks which belongs to K3[Fe(CN)6] and bisphenol A concentration.
In the optimization studies, bioactive layer of the enzyme biosensor was studied and optimized. Optimum enzyme amount, self-assembled monolayer formation time, cysteamine incubation time and glutaraldehyde amount was determined. Working conditions were also determined such as temparature, pH and ionic strength.
In the characterization studies; linear range of the biosensor, substrate specificity, interference effect, repeatability, reproducibility, stability and real sample analysis were determined.
Optimum enzyme amount, self-assembled monolayer formation time, cysteamine incubation time and glutaraldehyde amount was found to be 117 U/ml, 16 hours, 8 hours and % 2.5, 100 mM, pH: 7.0 phosphate buffer was used and working temperature was determined 30 ºC. Linear range of the biosensor was found to be 25-500 µM and response time was calculated to be 19 seconds. Real sample analysis were carried out with drink water samples with the enzyme biosensor.