Yaşlanma sürecinde overlerde Klotho genininifade düzeyinin incelenmesi
Investigation of expression level of Klotho gene in the aging process
Yazar: AYLA KURT
Danışman: PROF. DR. ASUMAN SUNGUROĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Yaşlanma zamana bağlı olarak canlı organizmada görülen anatomik ve fizyolojik değişikliklerdir. Moleküler düzeyde yaşlanmada genomik kararsızlık (özellikle DNA hasarının olması), telomer kısalması ve epigenetik değişiklikler görülürken hücresel yaşlanmada kök hücrelerin tükenmesi mitokondrilerin fonksiyonunun bozulması ile oluşan oksidatif stresin artması, hücreler arası iletişimin bozulması, hücrelerde lizozomal enzim aktivitesinin artması ve hücre çoğalmasının durması görülmektedir.  Ovaryum, kadınlarda üreme ve hormonal işlevlerini yerine getiren üreme endokrin organıdır. Yaşlanma ile birlikte kadın doğurganlığında doğal bir düşüş görülmektedir. ROS, ovaryumda oosit olgunlaşmasından döllenmeye kadar birçok fizyolojik ve patolojik aktivitede rol oynamaktadır. ROS'un aşırı miktarda artması OS'ye yol açarak ovaryum yaşlanmasına neden olmaktadır. 

NRF2, antioksidan ve sitoprotektif genleri düzenleyerek hücreleri oksidatif stresten koruyan bir transkripsiyon faktörüdür. Ovaryum hücrelerinde NRF2 gen ifadesinin artmasının antioksidan genleri tetiklediği ve ovaryum fonksiyonunu koruduğu gösterilmiştir.

Klotho yaşlanma baskılayıcı bir gendir. Yapılan çalışmalarda Klotho gen ifadesinin artmasının yaşam süresini uzattığı, Klotho gen ifadesinin azalmasının ise yaşlanma sürecini hızlandırdığı gösterilmiştir. 

IL-1β güçlü proinflamatuar sitokindir ve yaşlanma ile gen ekspresyonu artmaktadır. IL-6, hücre çoğalmasını, hayatta kalmasını ve farklılaşmasını düzenleyen çok işlevli bir sitokindir. IL-6, genellikle inflamasyon, kronik bağışıklık hastalıkları, nörolojik hastalıklar ve doku yaşlanması ile ilişkili çeşitli hastalıkların oluşmasında yer almakta ve yaşlanma ile gen ekspresyonu artmaktadır. p53 proteini, bir tümör baskılayıcı gen olan TP53 geni tarafından kodlanan bir transkripsiyon faktörüdür. 
Hücre döngüsü sürecini ve programlanmış hücre ölümünü (apoptoz) kontrol eden p53 geni DNA hasarı, besin eksikliği ve hipoksi gibi çeşitli hücresel stres durumunda hücrenin tepkisini belirlemede çok önemli bir rol oynamaktadır ve yaşlanma ile p53 gen ekspresyonu artmaktadır. 

AKT, hücresel sinyal yolaklarında yer alan bir serin-treonin kinazdır. PI3K / AKT sinyal yolağı hücrelerde yaygın olarak  etkindir ve hücre büyümesi, çoğalması, farklılaşması ve apoptozda işlev göstermektedir. mTOR bir serin-treonin kinazdır ve hücre büyümesi, hücresel yaşlanma ve yaşam süresi dahil birçok biyolojik süreçte yer almaktadır. Epitelyal ovaryan kök hücreleri, yetişkinlerde oosit hücre üretiminin ana kaynağını oluşturmaktadır. 

OSE hücreleri kök hücre özelliklerine sahiptir. OSE hücreleri epitel hücrelerin çoğalmasında, folikül, granüloza ve teka hücrelerinin üretiminde ve yenilenmesinde rol oynamaktadır.

 SOX2, OCT4 ve NANOG farklılaşmamış embriyonik kök hücrelerin kendini yenilemesi veya pluripotensi için gerekli olan transkripsiyon faktörleridir. 

H2O2 yüksek seviyelerde hücrelerde oksidatif stres oluşturarak erken yaşlanmaya yol açmaktadır. 
Bu projede insan ovaryum epitel hücre serisinde (IHOEC) H2O2 uygulanarak hücreler kültür ortamında yaşlandırılmıştır. H2O2 uygulanmış hücrelere real-time PCR ile Klotho, NRF2, mTOR, p53, IL-6, IL-1β, OCT4, NANOG, SOX2 ve AKT genlerinin ifadelerine bakılmıştır. Bu çalışmada doğal yaşlanma sürecinde hem Klotho hem de NRF2 gen ifadesi azalmıştır. IHOEC hücrelerinde H2O2 ile oluşturulan yaşlanmada mTOR, p53, IL-6, IL-1β, OCT4, NANOG, SOX2, AKT gen ifadeleri artmıştır. Bu  çalışmada IHOEC hücre hattında Klotho ve NRF2 gen ifadesinin incelenmiş olması bu hücre hattı için ilk çalışmadır.

Bu tez kapsamında sağlıklı over yüzey epitel hücrelerinde:

1- İki senesens türü (a-stres kaynaklı senesens, b-ileri pasaj ile oluşan senesens) için iki ayrı senesens hücre modelinin oluşturulması ve bu iki senesens modelinin SABG ve SAHF denemeleri ile doğrulanması, 
2- Oluşturulan iki farklı senesens modelinde; Antioksidan yolak (alfa-Klotho, NRF2), SASP belirteçleri (p53, IL6, IL1-beta), kök hücre (Oct4, Nanog, Sox2) ve sağkalım (mTOR, AKT)-ilişkili genlerin ifadelerinin RT-qPCR yöntemi ile araştırılması amaçlanmıştır.

Anahtar Kelimeler: Yaşlanma, Klotho gen ekspresyonu, Ovaryum yaşlanması, NRF2, ROS

Abstract:
Investigation of Expression Level of Klotho Gene in the Aging Process

Aging is the anatomical and physiological changes seen in living organisms over time. At the molecular level, genomic instability (especially DNA damage), telomere shortening and epigenetic changes are seen in aging, while stem cells depletion, increase in oxidative stress caused by deterioration of the function of mitochondria, deterioration of intercellular communication, increase in lysosomal enzyme activity in cells and cessation of cell proliferation are observed. The ovary is the reproductive endocrine organ that performs reproductive and hormonal functions in women. There is a natural decline in female fertility with aging. ROS play a role in many physiological and pathological activities in the ovary, from oocyte maturation to fertilization. Excessive increase in ROS leads to OS and causes ovarian aging.

NRF2 is a transcription factor that protects cells from oxidative stress by regulating antioxidant and cytoprotective genes. It has been shown that increased NRF2 gene expression in ovarian cells triggers antioxidant genes and protects ovarian function.

Klotho is an aging suppressor gene. Studies have shown that an increase in Klotho gene expression prolongs lifespan, and a decrease in Klotho gene expression accelerates the aging process.

IL-1β is a potent proinflammatory cytokine and gene expression increases with aging. IL-6 is a multifunctional cytokine that regulates cell proliferation, survival and differentiation. IL-6 is involved in the formation of various diseases generally associated with inflammation, chronic immune diseases, neurological diseases and tissue aging, and gene expression increases with aging.

The p53 protein is a transcription factor encoded by the TP53 gene, a tumor suppressor gene.

The p53 gene, which controls the cell cycle process and programmed cell death (apoptosis), plays a very important role in determining the cell's response in various states of cellular stress, such as DNA damage, nutrient deficiency, and hypoxia, and p53 gene expression increases with aging.

AKT is a serine-threonine kinase involved in cellular signaling pathways. The PI3K/AKT signaling pathway is extensively active in cells and functions in cell growth, proliferation, differentiation and apoptosis. mTOR is a serine-threonine kinase and is involved in many biological processes, including cell growth, cellular senescence, and lifespan.

Epithelial ovarian stem cells are the main source of oocyte cell production in adults.

OSE cells have stem cell properties. OSE cells play a role in the proliferation of epithelial cells, the production and regeneration of follicle, granulosa and theca cells.
 SOX2, OCT4 and NANOG are transcription factors required for self-renewal or pluripotency of undifferentiated embryonic stem cells.

High levels of H2O2 cause oxidative stress in cells, leading to premature aging.

In this project, the cells were aged in culture medium by applying H2O2 in the human ovarian epithelial cell line (IHOEC). The expressions of Klotho, NRF2, mTOR, p53, IL-6, IL-1β, OCT4, NANOG, SOX2 and AKT genes were examined by real-time PCR in HO treated cells. 

In this study, both Klotho and NRF2 gene expression were decreased during the natural aging process. In IHOEC cells, mTOR, p53, IL-6, IL-1β, OCT4, NANOG, SOX2, AKT gene expressions increased in aging induced by H2O2. The investigation of Klotho and NRF2 gene expression in the IHOEC cell line in this study is the first study for this cell line.

In the context of this thesis, healthy ovarian surface epithelial cells:

1- Creation of two separate senescence cell models for two senescence types (a-senescence caused by stress, b-senescence formed by advanced passage) and verification of these two senescence models by SABG and SAHF trials,

2- It was aimed to investigate the expressions of antioxidant pathway (alpha-Klotho, NRF2), SASP markers (p53, IL6, IL1-beta), stem cell (Oct4, Nanog, Sox2) and survival (mTOR, AKT)-related genes in two different senescence models created by RT-qPCR method.

Keywords: Age, Klotho gene expression, Ovum aging, NRF2, ROS