Köpeklerde gastroenteritise neden olan bazı enfeksiyöz ve non-enfeksiyöz hastalıklarda serum ve fekal zonulin seviyelerinin tespiti
Determination of serum and fecal zonulin levels in gastroenteritis of dogs caused by some infectious and NON-infectious diseases
Yazar: DENİZ ŞARDAĞ
Danışman: PROF. DR. KEREM URAL
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İç Hastalıkları (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Gastroenteroloji = Gastroenterology

Özet:
Amaç: Günümüzde güncel olarak önemi anlaşılan ve muhtemel bu proje ile kısmen ispatlanır nitelikte çok fazla hastalığın etiyopatogenezisinde rol oynayan sızıntılı bağırsak durumunun güvenilir ve ispatlanabilir sınırlı sayıda biyobelirteci bulunmakta, bu biyobelirteçler kanda ya da dışkıda tespit edilmediği sürece sızıntılı bağırsağın ve ilişkili hastalığın ilerlemesinin engellenmesi mümkün olmamaktadır. Zonulin, sızıntılı bağırsak tanısında güçlü bir belirteçtir. Bağırsak mikrobiyatasında gerçekleşen değişiklikler ya da epitel hücre hasarının varlığında salınımı önemli ölçüde artmaktadır. Sızıntılı bağırsağın erken tanısı için zonulin en sık üstünde çalışılan ve en çok umut vadeden biyobelirteçtir. Bu bağlamda bu çalışmada köpeklerde farklı etiyolojik nedenlerle oluşan infeksiyöz veya noninfeksiyöz ishallere bağlı gelişebilen sızıntılı bağırsağın saptanmasında ve şiddetinin derecelendirilmesinde eş zamanlı gerçek biyobelirteç olarak, gerek dışkı gerekse kanda zonulin düzeylerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışma kapsamında hemorajik ya da non-hemorajik gastorenteritis saptanan köpekler değerlendirilmiştir. En az 1 gündür süregelen ishal anamnezi ile kliniğe getirilen farklı yaş, ırk ve her iki cinsiyetten en az 50 olgu, klinik laboratuvar analizleri doğrultusunda etiyolojik sınıflandırmaya tabi tutulacak (tablo 1) gruplandırma ile beraber her olgudan vena cephalica antebrachii' den anikoagülantsız tüplere 2' şer ml kan alınmış, ardından santrifüje edilerek ELISA ile serum zonulin testi uygulanmıştır. Test için örnekler    -80 derecede saklanmış, sonuçlara yönelik olarak tüm analizler akredite laboratuvarlardan birinde yapılmıştır. Aynı şekilde olgulardan steril svaplar aracılığıyla fekal örnekler alınmış ve örnekler %70 'lik etanol içerisine konularak ELISA yöntemiyle fekal zonulin testi uygulanasaya kadar +4 derece sabit sıcaklıkta saklanmıştır. Zonulin bozulmuş bağırsak geçirgenliğinin gösterilmesinde önemli bir biyobelirteç olduğundan, olgular üzerinde en az bir ay öncesine kadar antibiyotik kullanılmamış olmasına dikkat edilmiştir.
Bulgular: Çalışma kapsamına 1-5 yaşlı her iki cinsiyetten (25 adet erkek-22 adet dişi) ve farklı ırklardan (1 adet alman kurdu, 1 adet cane corso, 2 adet doberman, 3 adet french bulldog, 1 adet golden retriever, 5 adet kangal, 2 adet labrador retriever, 2 adet maltipoo, 19 adet melez, 3 adet pitbull, 2 adet pug, 4 adet rottweiler, 2 adet terrier) 47 adet köpek dahil edildi. Fekal analizleri yapılan hastalarda, sağlıklı grup ile tüm gruplar arasında anlamlı farklar bulunmuştur. Ayrıca Corona virüs grubu ile Giardia ve Coronavirus ile Parvovirus grupları arasında anlamlı farklar gözlenmiştir. Serum analizleri yapılan hastalarda, sağlıklı grup ile tüm gruplar arasında anlamlı farklar bulunmuştur. Ayrıca Corona grubu ile Giardia, Distemper ve Parvovirus grupları arasında anlamlı farklar gözlenmiştir. Fekal ve serum karşılaştırmalarında ise aynı grup içinde giardia hariç tüm gruplar birbirinden farklıdır. İshalli köpeklere ait fekal ve serum örneklerinden elde edilen zonulin verilerinin ortalama ve standart hata değerleri tablolaştırıldı. Verilerin homojenite testleri Shapiro-Wilk analizine göre gerçekleştirildiğinde normal dağılım göstermediği ve logaritmik transformasyon işlemlerine rağmen normal dağılım göstermeyen verilerin bulunduğu tespit edildi. Bu bağlamda non-parametrik test tekniklerinden yararlanılarak gruplar arasındaki karşılaştırmalar gerçekleştirildi. Fekal ve serum örneklerinin arasındaki farkların gruplar arası değerlendirmelerinde Kruskall-Wallis ANOVA, aynı grubun fekal ve serum zonulin seviyelerinin karşılaştırılmasında ise Wilcoxon testinden yararlanıldı. Fekal ve serum örneklerinin her bir grup içerisinde ayrı ayrı korelasyon analizlerinde de Spearman korelasyon yönteminden yararlanıldı.  Tüm analizler SPSS 26.0 (IBM, Amerika) programında gerçekleştirilmiş olup analizlerde p değerinin 0,05' in altında olduğu durumlar istatistiksel anlamlı kabul edildi.   
Sonuç:  Serum  analizleri yapılan hastalarda, sağlıklı grup ile tüm gruplar fekal ve serum zonulin seviyeleri arasında anlamlı farklar bulunmuştur. 

Anahtar kelimeler: zonulin, fekal zonulin, serum zonulin, giardia, parvovirus, coronavirus, non-enfeksiyöz ishal,

Abstract:
Objective: Today, there are a limited number of reliable and demonstrable biomarkers of leaky gut, which plays a role in the etiopathogenesis of many diseases, the importance of which is currently understood and partially proven with this project. Unless these biomarkers are detected in the blood or stool, it is not possible to prevent the progression of leaky gut and the associated disease. Zonulin is a strong marker in the diagnosis of leaky gut. Its secretion increases significantly in the presence of changes in the intestinal microbiota or epithelial cell damage. Zonulin is the most studied and most promising biomarker for the early diagnosis of leaky gut. In this context, in this study, it was aimed to determine zonulin levels in both stool and blood as a real biomarker simultaneously in the detection and grading of the severity of leaky gut that may develop due to infectious or noninfectious diarrhea caused by different etiological reasons in dogs.
Material and Methods: In this study, dogs with hemorrhagic or non-hemorrhagic gastroenteritis were evaluated. At least 50 cases of different ages, races and both genders brought to the clinic with a history of diarrhea lasting for at least 1 day, 2 ml of blood were collected from vena cephalica antebrachii in tubes without ancoagulant from each case, together with the grouping to be subjected to etiological classification (table 1) in accordance with clinical laboratory analysis, then it was centrifuged and serum zonulin test was applied by ELISA. Samples for testing were stored at -80 degrees, and all analyzes for the results were performed in one of the accredited laboratories. In the same way, fecal samples were taken from the subjects by means of sterile swabs, and the samples were placed in 70% ethanol and stored at a constant temperature of +4 degrees until the fecal zonulin test by ELISA method was applied. Since zonulin is an important biomarker in demonstrating impaired intestinal permeability, it was noted that antibiotics were not used on the cases until at least one month ago.
Results: The scope of the study included both genders aged 1-5 years (25 males-22 females) and different breeds (1 German Shepherd, 1 Cane Corso, 2 Dobermans, 3 French Bulldogs, 1 Golden Retriever, 5 Kangal, 2 labrador retrievers, 2 maltipoos, 19 crossbreeds, 3 pitbulls, 2 pugs, 4 rottweilers, 2 terriers) 47 dogs were included. Significant differences were found between the healthy group and all groups in patients who underwent fecal analysis. In addition, significant differences were observed between the Coronavirus group and Giardia, and between the Coronavirus and Parvovirus groups. Significant differences were found between the healthy group and all groups in patients who underwent serum analysis. In addition, significant differences were observed between the Corona group and the Giardia, Distemper and Parvovirus groups. In fecal and serum comparisons, all groups are different from each other except giardia within the same group. Mean and standard error values of zonulin data obtained from fecal and serum samples of dogs with diarrhea were tabulated. When the homogeneity tests of the data were performed according to the Shapiro-Wilk analysis, it was found that they did not show normal distribution and there were data that did not show normal distribution despite the logarithmic transformation processes. In this context, comparisons between groups were made using non-parametric test techniques. Kruskall-Wallis ANOVA was used to evaluate the differences between fecal and serum samples between groups, and Wilcoxon test was used to compare fecal and serum zonulin levels of the same group. Spearman correlation method was also used in the correlation analyzes of fecal and serum samples separately within each group. All analyzes were performed in the SPSS 26.0 (IBM, USA) program, and cases where the p value was below 0.05 were considered statistically significant.
Conclusion: Significant differences were found between the fecal and serum zonulin levels of the healthy group and all groups in patients who underwent serum and fecal analysis.

Keywords: zonulin, fecal zonulin, serum zonulin, giardia, parvovirus, coronavirus, non-enfeksiyöz ishal