Yüksek katyonik özellikli nanoteknolojik adjuvan sistemlerinin geliştirilmesi ve etkinliğinin Her2 meme kanseri DNA aşısı modelinde gösterilmesi
Development of high cationic nanotechnological adjuvant systems and demonstration of their efficiency in Her2 breast cancer DNA vaccine model
Yazar: PELİN SAĞLAM METİNER
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SULTAN GÜLÇE İZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
DNA aşıları son yıllarda farklı uygulama alanları bulmakta ve hem farklı türdeki enfeksiyöz ajanlara karşı hem de çeşitli kanser türlerine karşı aşı olarak kullanılmaktadır. DNA aşıları, tüm enfeksiyöz ajanın kullanıldığı sistemlere göre daha güvenilir ve tanımlanabilir immun yanıtı uyarmaları ve ayrıca daha etkili sitotoksik T hücre yanıtı vermeleri sebebiyle geleneksel aşılara göre avantaj sağlamaktadır. Fakat, DNA aşılarının tek başına kullanıldığında serum nükleazlar tarafından hızlı degredasyona uğraması ve buna bağlı olarak da yarı ömürlerinin kısa olması istenilen seviyede yüksek immun yanıtı uyaramamalarına neden olmaktadır. Bu nedenle çeşitli stratejilerle bu immun yanıtın arttırılması gerekmektedir. Özellikle, yeni nanoteknolojik yaklaşımlar ile oluşturulan adjuvan sistemleri bu açıdan umut vaad etmektedir. 
Kompozisyonu, boyutu, şekli ve yüzey özellikleri değişen çok sayıda farklı nanopartiküler adjuvan formülasyonları, aşı ve transfeksiyon etkinliğinin arttırılmasında,  hücresel ve antikor yanıtlarının ikisinin de uyarılmasında, hem de aşının hedeflenmesinde kullanılabilmektedir. Genel olarak katyonik özellik gösteren katyonik lipit ve katyonik polimer bazlı adjuvanlar, plazmit DNAsı'nın negatif yüklü fosfat grubu ile lipopleksler ve polipleksler oluşturmakta ve bu şekilde DNA'nın hücre içine taşınımını kolaylaştırmaktadırlar. 
Bu tez çalışmasının amacı; piyasa değeri yüksek olan adjuvan sistemlerine alternatif, laboratuar ve büyük ölçekli üretim sistemleri ile in vivo çalşmalarda daha ucuza mal edilebilecek pHEMA temelli yeni adjuvan sistemlerinin geliştirilmesi, gelişmekte olan DNA aşısı sektöründe kullanılma potansiyelinin araştırılmasıdır. Bu tez kapsamında; katyonik özellikli pHEMA-His/PEG, pHEMA-Kitosan/PEG, pHEMA-PEI/PEG ve pHEMA-DOTAP/PEG partikülleri oluşturuldu. Şekilsel ve boyutsal analizi, zeta potansiyeli ve partikül boyutu ölçümü, DNA yükleme kapsiteleri de belirlenerek karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirildi. Ardından, CHO-K1, MCF-7 ve TUBO hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerine bakılıp in vitro transfeksiyon çalışmalarında kullanılacak konsantrasyon değerleri belirlendi. Son aşamada ise, çıplak DNA ve ticari satın alınan transfeksiyon ajanı kontrolünde, öncelikle pIRES2EGFP empty vektörü kullanılarak, daha sonra da Her2 pozitif meme kanserine karşı geliştirilen pIRES2-EGFP/DEC205ScFvMEHer2 DNA aşısı vektörü kullanılarak, pDNA/adjuvan formülasyonlarının in vitro transfeksiyon etkinlikleri floresan mikroskobi ve akış sitometrisi analizleri ile ölçüldü. 
Sonuç olarak, nano boyutlarda ve istenilen özelliklerde üretilebilen pHEMA temelli adjuvan sistemlerinin, farklı pDNA/adjuvan formülasyonları oranlarında kullanılması ile çıplak DNA'ya oranla in vitro transfeksiyon etkinliğini arttırdığı görüldü. Ticari satın alınan Lipofektamin 2000 ajanı ile kıyaslandığında ise; CHO-K1 ve MCF-7 hücreleri için pDNA/pHEMA-PEI polipleksinin 2:4 oranının, TUBO hücreleri için ise pDNA/pHEMA-DOTAP kompleksinin 2:6 oranının daha etkili transfeksiyon sağladığı saptandı. Bu nedenle, tez kapsamında geliştirilen bu adjuvan formülasyonlarının büyük ölçekte gerçekleştirilen transfeksiyon çalışmalarında ve in vivo çalışmalarda gen taşınımı ajanı olarak kullanılabilecekleri düşünülmektedir.

Abstract:
DNA vaccines have found different application areas in recent years, they are used both against infectious agents and different types of cancer. DNA vaccines elicit defined immune responses and they are safer compared to traditional vaccines, moreover they induce effective cytotoxic T cell responses. However, DNA vaccines can not stimulate desired immune responses when they are used alone because they are rapidly degraded by serum nucleases and consequently they have short half-lives. Therefore, immune stimulator substances or micro/nano delivery systems are used as adjuvants to increase the immune response elicited by DNA vaccines. In particular, the adjuvant systems created by new nanotechnological approaches are promising in this respect.
A wide variety of different nanoparticulate adjuvant formulations varying in composition, size, shape and surface properties can be used to increase vaccine and transfection efficiency to stimulate both cellular and antibody responses. In general, cationic lipids and cationic polymer-based adjuvants with cationic functionality constitute lipoplex and polyplex with the negatively charged phosphate groups of plasmid DNA and thus facilitate the transport of DNA into cells.
The purpose of this study is to develop new pHEMA-based adjuvant system to increase the immune effectiveness and protectivity of the DNA vaccine. In addition, to investigate the potential use in the developing DNA vaccination industry as a cheaper alternative in the large-scale vaccine production systems. Within this scope; cationic pHEMA-His/PEG, pHEMA-Kitosan/PEG, pHEMA-PEI/PEG and pHEMA-DOTAP/PEG particles were developed. Characterization studies were carried out by shape and dimensional analysis, zeta potential and particle size measurement, and determination of DNA loading capacities. Then, the cytotoxic effects on CHO-K1, MCF-7 and TUBO cells were defined and the concentration values to be used in in vitro transfection studies were determined. Finally, in vitro transfection efficiencies of the pDNA/adjuvant formulations under the control of naked DNA and commercially purchased transfection agent were measured using pIRES2EGFP empty vector and then pIRES2-EGFP/DEC205ScFvMEHer2 DNA vaccine vector, which was developed against Her2 positive breast cancer by fluorescent microscopy and flow cytometry analyzes.
As a result, all pHEMA-based adjuvant systems, which can be produced in nano-sizes and in the desired properties, have been shown to increase in vitro transfection efficiency compared to naked DNA by using them in different pDNA/ adjuvant formulation ratios. When compared to the commercially purchased Lipofectamine 2000 agent; it was found that a 2:4 ratio of pDNA/pHEMA-PEI polyplex for CHO-K1 and MCF-7 cells and a 2:6 ratio of pDNA/pHEMA-DOTAP complex for TUBO cells provided more effective transfection. For this reason, it is concluded that these adjuvant formulations are promising candidates as gene delivery agents in large scale transfection studies and in vivo studies.