CD44-spesifik nanopartikül temelli flavonoid taşıyıcı moleküllerin anti-kanser özelliklerinin prostat kanseri kök hücrelerinde araştırılması
Investigation of anti-cancer properties of CD44-specific nanoparticle based flavonoid carrier molecules in prostate cancer stem cells
Yazar: KADER GÖNÜL
Danışman: PROF. DR. SUAT ERDOGAN
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Prostat kanseri, erkeklerde en sık görülen ikinci kanser türüdür. Kanser kök hücreleri (KKH) terapiye karşı direnç oluşturarak metastaz ve hastalığın nüksüne yol açar. Bu sebeple tedavide KKH'lerin hedeflenmesi terapi etkinliğini artırabilir. Kuersetin, anti-tümör özellikleri bilinen ve flavonoid sınıfına giren doğal bir bileşiktir. Kuersetinin suda sınırlı çözünürlük ve düşük biyouyumluluk gibi dezavantajları, uygun taşıyıcı sistemler kullanılarak giderilebilir. Bu tez çalışmasının amacı, tek basamaklı yeşil etanol injeksiyon yöntemi ile hazırlanan ve hyaluronik asit (HA) ile modifiye edilerek CD44+ KKH'lere hedefli hale getirilen kuersetin yüklü nanolipozomal taşıtların prostat kanseri tedavisinde kullanılabilirliğini test etmektir.
Hazırlanan nanolipozomal formülasyonların boyut ve zetapotansiyel ölçümleri DLS yöntemi ile yapıldı, küresel formasyon görüntülenmesi SEM ile sağlandı ve yükleme verimliği sıvı kromotografi ile belirlendi. Çalışmada tedavisiz kontrol, serbest kuersetin, HA ile modifiye nanolipozom (NLP-HA), kuersetin taşıyan lipozomal nanoyapı (NLP-Kuer) ve kuersetin taşıyan HA ile modifiye nanolipozomal yapı (NLP-Kuer-HA) grupları oluşturuldu. NLP-Kuer insan prostat kanseri kastrasyona dirençli PC3 hücrelerinin sağkalımını konsantrasyona bağlı olarak inhibe etti. PC3 ve kastrasyona duyarlı LNCaP prostat kanser hücreleri ile kontrol amaçlı normal retina pigment epitel ARPE-19 hücreleri serbest kuersetin, NLP-Kuer-HA ve NLP-Kuer formülasyonlarına 72 saat süresince maruz bırakıldı. Uygulamaların hücrelerde yaptığı sitotoksik etki MTT testi ile belirlendi. NLP-Kuer-HA tedavisi serbest kuersetine göre PC3, LNCaP ve ARPE-19 hücrelerini sırasıyla % 60, % 52 ve % 20 oranında öldürdü. PC3 hücrelerinde yapılan tedavinin oluşturduğu hücresel ölüm çeşidi görüntü temelli sitometri, hücre içi sinyal yolakları üzerine etkileri RT-qPCR ve Western blot teknikleri ile belirlendi. NLP-Kuer-HA kontrol ve serbest kuersetin gruplarına göre Bcl-2 protein ifadesini inhibe ederken, sitokrom c ekspresyonunu artırdı. Tedavi ile birlikte, pro-apoptotik Bax, APAF, kaspaz 3 ve kaspaz 8 mRNA ifadeleri belirgin düzeyde arttı. Nanolipozomal tedavi hücre döngüsünü düzenleyen p21 ve p53 mRNA ifadelerini artırdı, siklin B ekspresyonunu ise baskılayarak hücre bölünmesini G2/M evresinde tuttu. Hücre proliferasyonu ile ilişkili sinyal moleküllerinden ERK1/2 protein ifadesinde inhibisyon gerçekleşirken p38/MAPK ve NF-κB protein ifadelerinde artış saptandı. Ayrıca, NLP-Kuer-HA tedavisi nekroz ve otofaji ile ilişkili TNFR1, TLR4, TNF-α, Myd88, Beklin ve ATG7 mRNA ifadelerini anlamlı düzeyde artırdı. HA taşıyan CD44+ KKH hedefli nanoyapı serbest kuersetine göre hücre göçünü büyük ölçüde engelledi. Göçün inhibisyonunda fibronektin, N-kaderin ve MMP9 protein ifadelerinde azalma ile E-kaderin ifadesinde artışın rol alabileceği belirlendi. Üç boyutlu hücre kültürü ortamında yapılan NLP-Kuer-HA tedavisi kanser hücreleri popülasyonunda bulunan CD44+ KKH sayısını anlamlı düzeyde azalttı. Bu tedavinin kök hücre markırlarından CD44, OCT3/4 mRNA ve Wnt protein ifadelerini inhibe edildiği saptandı.
CD44+ KKH hedefli kuersetin taşıyan nanoyapı, serbest kuersetin tedavisine göre kanser hücre proliferasyonunu baskılarken, KKH'lerin de eliminasyonuna neden oldu. Ayrıca, formülasyonun kanser hücre göçünü inhibe ederek invazyon ve metastazın önlenmesinde etkin olabileceği gösterildi. Hazırlanan CD44+ KKH hedefli nanolipozomal yapı, kuersetinin biyoyaralanımını artırarak daha düşük konsantrasyonlarında daha yüksek etkinlik oluşturmasını sağladı. Hedefli tedavinin sağlıklı hücrelerde oluşturduğu düşük sitotoksite ile yan etki oluşturma riskinin minimum düzeyde kalabileceğini gösterdi. Sonuç olarak, yapılan tedavi kanser ve KKH proliferasyonunu inhibe ederek güçlü bir tedavi alternatifi olabileceğini gösterdi. Bununla birlikte, elde edilen verilerin in vivo ortamda test edilerek klinikte kullanılabilirliğinin desteklenmesi önerildi.

Abstract:
Prostate cancer is the second most common type of cancer in men. Cancer stem cells (CSCs) resists to therapy, leading to metastasis and relapse of the disease. Therefore, targeting CSCs in treatment may increase therapy effectiveness. Quercetin is a natural flavonoid compound known for its anti-tumor properties. The disadvantages of quercetin such as limited water solubility and low biocompatibility can be overcome by using suitable carrier systems. The aim of this thesis is to test the usability of quercetin loaded nanoliposomal vehicles prepared by single-step green ethanol injection method and modified with hyaluronic acid (HA) to target CD44+ CSCs in prostate cancer treatment.
Size and zetapotential measurements of the prepared nanoliposomal formulations were made by DLS method, spherical formation visualization was provided by SEM, and loading efficiency was determined by liquid chromatography. In the study, untreated control, free quercetin, HA-modified nanoliposome (NLP-HA), quercetin-bearing liposomal nanostructure (NLP-Kuer) and quercetin-bearing HA-modified nanoliposomal structure (NLP-Kuer-HA) groups were formed. NLP-Kuer inhibited the survival of human prostate cancer castration-resistant PC3 cells in a concentration-dependent manner. PC3 and castration-sensitive LNCaP prostate cancer cells and control normal retinal pigment epithelial ARPE-19 cells were exposed to free quercetin, NLP-Kuer-HA and NLP-Kuer formulations for 72 hours. The cytotoxic effect of the treatments on cells was determined by the MTT test. NLP-Kuer-HA treatment killed PC3, LNCaP and ARPE-19 cells by 60%, 52% and 20%, respectively, relative to free quercetin. The type of cellular death caused by the treatment in PC3 cells was determined by image-based cytometry, its effects on intracellular signaling pathways were evaluated by RT-qPCR and Western blots. NLP-Kuer-HA inhibited Bcl-2 protein expression and increased cytochrome c expression compared to control and free quercetin groups. With treatment, pro-apoptotic Bax, APAF, caspase 3 and caspase 8 mRNA expression were upregulated significantly. Nanoliposomal treatment upregulated the expression of p21 and p53 mRNA, which regulates the cell cycle, and downregulated the expression of cyclin B, arresting the cell division in the G2/M phase. ERK1/2 protein expression, which is one of the signal molecules associated with cell proliferation, was inhibited, while p38/MAPK and NF-κB protein expressions were increased. In addition, NLP-Kuer-HA treatment significantly upregulated TNFR1, TLR4, TNF-α, Myd88, Beclin and ATG7 mRNA expressions associated with necrosis and autophagy. The CD44+ CSC-targeted nanostructure carrying HA greatly inhibited cell migration relative to free quercetin. It was determined that a decrease in fibronectin, N-cadherin and MMP9 protein expression and an increase in E-cadherin expression may play a role in the inhibition of migration. NLP-Kuer-HA treatment in a three-dimensional cell culture medium significantly reduced the number of CD44+ CSCs in the cancer cell population. It was determined that this treatment inhibited the stem cell markers CD44, OCT 3/4 mRNA and Wnt protein expression. 
The CD44+ CSC-targeted quercetin-carrying nanostructure suppressed cancer cell proliferation compared to free quercetin treatment, while also causing the elimination of CSCs. In addition, it was shown that the formulation could be effective in preventing invasion and metastasis by inhibiting cancer cell migration. The prepared CD44+ CSC-targeted nanoliposomal structure increased the bioavailability of quercetin, resulting in higher activity at lower concentrations. The results showed that the risk of side effects could be minimal with the low cytotoxicity of targeted therapy in healthy cells. In conclusion, the treatment demonstrated that it can be a powerful therapy alternative by inhibiting cancer and CSC proliferation. However, it was suggested to support the clinical usability by testing the obtained data in vivo.