Gliserinden lipaz katalizli gliserin karbonat üretimi
Lipase catalyzed glycerol carbonate production from glycerine
Yazar: SELDA AYDOĞDU
Danışman: DOÇ. DR. NURCAN KAPUCU
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Bu çalışmada gliserinin katma değerli bir ürünü olan gliserin karbonatın (GlyC) gliserin ve dimetilkarbonat (DMC) ile enzimatik üretimi amaçlanmıştır.  Bu amaç kapsamında çalışma üç aşamada gerçekleştirilmiştir. İlk aşamada kitosan ve çok duvarlı karbonnanotüp (ÇDKNT) ile hazırlanmış olan biyonanokompozit desteğe Candida antartica B (CalB) ve Novozyme 51032 enzimleri çapraz bağlayıcı ajanı gluteraldehit (Gla) yardımı ile tutuklanmıştır. Tutuklamaya etki eden parametreler ve tutuklanan enzimlerin çözücülü/çözücüsüz ortamdaki tekrar kullanımı araştırılmıştır. CalB için en uygun tutuklama koşullarında (%4 Gla, 3 saat Gla ile bekleme süresi, 35 ⁰C, 400 µL enzim, pH 7, %0,2 ÇDKNT (w/w), 0,5 g destek ve 22 saat) tutuklama verimi %82,47, hidrolitik enzim aktivitesi 3,38 U/mg destek ve adsorplanan protein miktarı (APM) 20,66 mg/g olarak belirlenmiştir. Novozyme 51032 enzimi için belirlenen en uygun tutuklama koşullarında (300 µL enzim, pH 8, 40 ⁰C ve 20 saat, diğer koşullar CalB ile aynı) ulaşılan tutuklama verimi %64,06, hidrolitik enzim aktivitesi 9,43 U/mg destek ve APM 10,63 mg/g olarak elde edilmiştir.
2. aşamada her iki enzimin adsorpsiyon prosesi incelenerek, adsorpsiyon sürecine ait izotermler, adsorpsiyon kinetiği ve termodinamik parametreler belirlenmiştir.
3. aşamada ise, tutuklanmış CalB ve Novozyme 51032 ile enzimatik GlyC üretimine sıcaklık, enzim miktarı, DMC/Gly mol oranı, süre, su miktarı, çözücü (tert-butanol) ve tekrar kullanım etkisi incelenmiştir. Çözücüsüz ortamda, CalB enzimi ile GlyC üretim ön denemelerinde belirlenen en uygun çalışma koşullarında (50 ⁰C sıcaklık, 3/1 DMC/Gly mol oranı, %10 enzim miktarı, 24 saat süre) Gly dönüşümü ile GlyC seçimliliği ve verimi sırasıyla, %60,9, %44,5 ve %27,1  olarak elde edilmiş, enzimin beş tekrarlı kullanımı sonunda GlyC verimindeki düşme %31 olmuştur. Ayrıca CalB enzimi ile GlyC üretimi Yanıt Yüzey Yöntemi (YYY) kullanılarak optimize edilmiş; ön denemelerle belirlenen üç bağımsız değişkenin (sıcaklık:40-60oC, DMC/Gly mol oranı:2/1-4/1 ve enzim miktarı:%5-15) 24 saat süre sonunda yanıt değişkenlerine (Gly dönüşümü ile GlyC seçimliliği ve verimi) etkisi araştırılmıştır. YYY tarafından önerilen optimum tepkime koşullarında (52,2 ⁰C sıcaklık, 2,79/1 DMC/Gly mol oranı ve %11,7 enzim miktarı) belirlenen Gly dönüşümü ile GlyC seçimliliği ve verimi sırasıyla,  %63,4, %45,3 ve %28,7 olmuş; bu koşullarda yapılan deney sonucunda elde edilen bu değerler ise sırasıyla, %64,7, %44,9 ve %29 olarak belirlenmiştir. 2. dereceden kuadratik modelin R2 değeri ise 0,99'dur. Novozyme 51032 enzimi ile GlyC üretimi için ise 50⁰C sıcaklık, 10/1 DMC/Gly mol oranı, %10 (w/w) enzim kullanılarak, ortama su ve çözücü eklemesi olmadığı durumda 24 h süre sonunda %80,3 Gly dönüşümü, % 99,8 GlyC seçimliliği ve %80 GlyC verimi elde edilmiş, enzimin beş tekrarlı kullanımı sonunda GlyC verimindeki düşme %28 olmuştur. Bu enzim ile yüksek değerlerde GlyC seçimliliği ve verimi elde edilmesi nedeniyle YYY kullanılmamıştır. Novozyme 51032, CalB enzimine kıyasla GlyC üretimi için daha yüksek seçimlilik ve verim değerlerine sahip olması nedeniyle ticari enzimlere alternatif ve umut verici olarak değerlendirilmiştir.

Abstract:
In this study, enzymatic production of glycerine carbonate (GlyC), one of the most value-added products, from glycerine and dimethylcarbonate (DMC) was aimed. For this purpose, the study was carried out in three stages. 
In first stage the CalB and Novozyme 51032 enzymes were immobilized on the bionanocomposite support by crosslinking agent gluteraldehyde (Gla), arisen from chitosan and carboxyl functionalized multi walled carbon nanotube (f-MWCNT). Parameters affecting the immobilization efficiency and the reusability of immobilized enzymes with/without solvent were also examined. The optimum immobilization parameters for CalB enzyme are; 4% Gla (gluteraldehyde), 3 hours, 35⁰ C, 400 µL CalB, pH 7, 0,2% f-ÇDKNT (w/w), 0,5 g support, and 22 hours. In this immobilisation conditions the arrived immobilisation yield was 82,47%, the hydrolytic activity 3,38 U/mg support, 20,66 mg/g (adsorbed protein ammount (APM). The optimum immobilisation parameters of Novozyme 51032 enzymes are; 300 µL enzym, ph 8, 40 ⁰, and 20 hours, the other conditions is same as CalB. In this immobilisation conditions of Novozyme 51032 enzymes the reached immobilisation performance are; 64,06% immobilisation yield, 9,43 U/ mg support hydrolytic activity, and 10,63 mg/g APM.
Second, the adsorption process of same enzymes during immobilisation were examined and the adsorption isotherm, kinetic and thermodynamics were determined. 
Last, the effect of parameters including temperature, enzym amount, DMC/Gly molar ratio, time, water, and solvent (tert-butanol) amount, and reusability on GlyC production using immobilized CalB, and Novozyme 51032 enzymes were analyzed. 
In a solvent-free environment, in preliminary optimum conditions (50⁰C temparature, 3/ DMC/Gly mole ratio, 10% enzyme ammount, 24 hours) for GlyC production by CalB enzym are performed. In this conditions the arrived Gly conversion, GlyC selectivity, and GlyC yields are respectively 60,9%, 44,5% and, 27,1%. After 5 reusability the decrease on GlyC yield was 31%. 
In addition, the GlyC Production by CalB was optimized using Response Surface Method (YYY), which is investigated the effect of independent variable (temperature: 40-60 ⁰C, DMC/Gly mole ratio: 2/1-4/1 and, enzyme ammount: 5-15%) on the response variable (Gly conversion, GlyC selectivity, and GlyC yield) after 24 hours.
In the recommended reaction conditions (52,2 ⁰C, 2,79/1 DMC/Gly mole ratio and, 11,7% enzyme ammount) from YYY the determined Gly conversion, GlyC selectivity and, GlyC yield are respectively 63,4%, 45,3% and, 28,7%. In the same reaction conditions the experimental results are respectively 64,7%, 44,9% and, 29%. 
The optimal condition for the GlyC production with Novozyme 51032 are 50 ⁰C, 10/ 1 molar ratio, 10% enzyme ammount (w/w), 24 hours, without water and without solvent. In this conditions the 80,3% Gly conversion, 99,8% GlyC selectivity, and 80% GlyC yield are arrived. Novozyme 51032 enzyme shows in comparison to CalB a high selectivity, and yield, so that the Novozyme 51032 are an promising, and alternative and to commercial enzyme.