İnsan A549 hücre hattında sigara dumanı özütünün olumsuz etkileri
Adverse effects of cigarette smoke extract on the human A549 cell line
Yazar: EZGİ SARI
Danışman: PROF. DR. FÜSÜN ÖZTAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Göğüs Hastalıkları = Chest Diseases ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Sigara kullanımı kronik akciğer hastalıklarının patogenezi ile doğrudan ilişkilidir. Sigara içeriğindeki 7000'den fazla zararlı madde, epiteliyal-mezenkimal geçiş (EMT)'i uyarabilir. EMT, idiopatik pulmoner fibrozis (IPF), kronik obstruktif akciğer hastalığı ve akciğer kanserinin patogenezinde etkilidir. Yapılan çalışmalar, D vitamininin fibrotik dokularda anti-fibrotik ve kanserde ise EMT'yi geriletici etkileri olduğunu göstermektedir. Ayrıca IPF hastalarında D vitamini eksikliği olduğu bilinmektedir. Çalışmamızda (The present study),  sigara ekstraktı özütü (CSE) ve TGF-β  ile uyarılan A549 hücrelerinde EMT aracılı miyofibroblast farklılaşmasının, eksojen D vitamini (kolekalsiferol) ile önlenip önlenemeyeceği test edildi ve D vitamininin EMT ile ilişkili  transforme edici büyüme faltörü-beta (TGF-β) ve Wnt/β-katenin sinyal yolları  ve çeşitli proteinlerle olan muhtemel etkileşimi araştırıldı.

	
İnsan A549 hücrelerinin bir kısmı, %5 CSE ve %5CSE+ 5ng/ml TGF-β ile uyarıldılar. Diğer bir grup hücre ise 50 nM D vitamini ile muamele edildikten yarım saat sonra %5 CSE ve %5CSE+TGF-β uyarıldı. Tüm hücreler, %5 CSE ve TGF-β uygulamalarını takip eden 24., 48. ve 72. saatlerde toplandılar. D vitaminin toksik olmayan dozu, MTT analizleri ile belirlendi. Hücre lizatlarında Western emdirimi yöntemi ile E-kaderin, α-SMA, p-VDR, p-SMAD2/3, SMAD4, SMAD7, aktif β-katenin, DKK1, p120ctn, Kaiso ve NEDD9 proteinlerinin seviyelerindeki değişiklikler belirlendi. İmmünfloresan yöntemi ile p-VDR/Kaiso ve p-VDR/p-SMAD2/3 proteinlerinin hücre içerisindeki konumları belirlendi. Fibrotik (IPF'li, n=3) ve fibrotik olmayan (n=4) insan akciğer örneklerinde, ko-immünpresipitasyon ile p-VDR ve aktif β-katenin, Kaiso ve p120ctn proteinleri ilişkilerine bakılarak, aralarındaki fiziksel etkileşim incelendi.


%5 CSE ve %5 CSE+TGF-β ile uyarılan A549 hücrelerinde zamana bağlı olarak, p-VDR ve E-kaderin protein seviyelerinin azalıp, α-SMA seviyelerinin arttığı; TGF-β sinyal yolu elemanlarından p-SMAD2/3 ve SMAD4 seviyelerinin artarken, SMAD7 seviyelerinin azaldığı; Wnt sinyal yolu elemanlarından aktif β-katenin seviyelerinin artıp, DKK1 seviyelerinin azaldığı tespit edildi. Ayrıca bu hücrelerde, E-kaderin stabilizasyonunda görevli olan Kaiso ve p120ctn seviyelerinin ve E-kaderinin yıkımından sorumlu olan NEDD9 seviyelerinin de zamana bağlı olarak  arttığı saptandı. CSE ve TGF-β uygulamalarından yarım saat önce A549 hücreleri 50 nM D vitamini ile muamele edildiklerinde, uyarılan p-VDR sinyalleme, E-kaderin seviyelerini arttırıp, α-SMA seviyelerini azaltarak EMT'nin gerilemesine sebep oldu. Ayrıca,  p-SMAD2/3 ve SMAD4 protein seviyelerinin azalması, SMAD7 seviyelerinin artması nedeniyle TGF-β sinyal yolu aktivasyonunun; aktif β-katenin protein seviyelerinin azaltılması ve DKK1 seviyelerini arttırılması yolları ile  de Wnt sinyal yolu  aktivasyonunun azaldığı belirlendi. Ayrıca, D vitamini uygulamaları, %5 CSE ve %5 CSE+TGF-β ile uyarılan A549 hücrelerinde p120ctn, Kaiso  ve NEDD9 protein seviyelerini azaltarak E-kaderin yıkımını önlediği saptandı. İmmünfloresan analizler,  CSE ve TGF-β uygulanan gruplarda hücrelerin sitoplazma ve nukleusunda görülen p-VDR immunoreaktivitesinin (IR) azaldığını göstermektedir. Bu gruplarda ayrıca nuklear p-SMAD2/3-IR'nin arttığı, Kaiso-IR'nin ise sitoplazmada artarak nukleus periferinde yoğunlaştığı belirlendi.  D vitamini uygulanan gruplarda ise sitoplazmik ve nuklear p-VDR-IR artarken; p-SMAD2/3-IR'nin çoğunlukla sitoplazmada, Kaiso-IR'nin ise nukleus ve nukleus periferinde yoğunlaştığı tespit edildi. Yapılan ko-immünopresipitasyon analizler, IPF'li insan akciğerlerinde p-VDR proteinin Kaiso ve aktif β-katenin ile fiziksel olarak etkileşebileceğini, p-VDR'nin p120ctn ile bağlantı kurmadığını ortaya koydu.


%5 CSE ve %5 CSE+TGF-β uygulamaları, A549 hücrelerinde p-VDR sinyallemenin azalmasına bağlı olarak TGF-β ve Wnt/β-katenin sinyal yollarının aktivasyonunu, E-kaderin stabilizasyonunu ve yıkımını düzenleyen p120ctn ve NEDD9 proteinlerin ekspresyonunun uyarır. Bu durum, A549 hücrelerinin E-kaderin protein miktarını azaltıp, α-SMA proteinini üretmeye başlamalarına neden olarak hücreleri  EMT aracılı miyofibroblast farklılaşmasına yönlendirmektedir.  Bu sonuçlar, sigara içiciliği, sigara içiciliğine eşlik eden TGF-β sinyal yolunun aşırı aktivasyonu ve azalan VDR sinyallemenin, IPF gelişiminde önemli risk faktörleri olabileceğini açıkça göstermektedir. Ayrıca, çalışmamızın verileri, CSE ve TGF-β uygulamalarından yarım saat önce A549 hücrelerinin 50 nM D vitamini ile muamele edildiklerinde, bu hücrelerde VDR sinyallemenin artmasının DKK1, aktif β-katenin ve Kaiso proteinleri aracılığı ile TGF-β ve Wnt/β-katenin sinyal yollarının aktivasyonunun azalmasını sağlayarak A549 hücrelerini EMT'ye karşı koruduğunu ortaya koymaktadır. İlaveten, VDR sinyalleme β-katenin ve Kaisonun  transkripsyonel aktivitesini kontrol ederek hücrelerde Wnt/β-katenin sinyal yolunun aktivasyonunu düzenler. Sigara içiciliği, sigara içiciliğine eşlik eden TGF-β sinyal yolunun aşırı aktivasyonu ve azalan VDR sinyalleme, EMT'ye neden olduğu için IPF gelişimine sebep olabilirler. D vitamini eksikliği olan IPF hastalarında tedavisinde kullanılan terapötiklerin yanında ek destek olarak D vitamini kullanımı önerilebilir.

Abstract:
Smoking is directly related to the pathogenesis of chronic lung diseases. Cigarette with more than 7000 harmful substances in its content can stimulate epithelial-mesenchymal transition (EMT). EMT has a role in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer. Studies have shown that vitamin D has anti-fibrotic effects in fibrotic tissues and EMT regressive effects in cancer. It is also known that IPF patients have vitamin D deficiency. In the present study, we tested EMT-mediated myofibroblast differentiation whether or not could be prevented by exogenous vitamin D (cholecalciferol) in cigarette extract (CSE) and TGF-β-stimulated A549 cells. Additionally, interactions of EMT-associated transforming growth factor beta (TGF-β), Wnt / β-catenin signaling pathways and various proteins with vitamin D were investigated.

One group of human A549 cells was stimulated with 5% CSE and 5% CSE + 5ng / ml TGF-β. Second group was treated with 50 nM vitamin D half an hour before stimulating with 5% CSE and 5% CSE + TGF-β. All cells were collected at 24, 48 and 72 hours following 5% CSE and TGF-β stimulation. The nontoxic dose of vitamin D was determined by MTT analysis. Changes in levels of E-cadherin, α-SMA, p-VDR, p-SMAD2/3, SMAD4, SMAD7, active β-catenin, DKK1, p120ctn, Kaiso, and NEDD9 proteins were determined by Western impregnation method from cell lysates. Cellular localizations of P-VDR/Kaiso and p-VDR/p-SMAD2/3 proteins were determined by immunofluorescence method. The physical interactions between p-VDR and active β-catenin, Kaiso and p120ctn proteins were examined by co-immunoprecipitation in fibrotic (IPF, n = 3) and non-fibrotic (n = 4) human lung samples.

In the A549 cells that were stimulated with 5% CSE and 5% CSE + TGF-β, p-VDR and E-cadherin protein levels decreased and α-SMA levels increased; TGF-β signaling pathway elements that p-SMAD2/3 and SMAD4 levels increased while SMAD7 levels decreased when time progresses. It was found that active β-catenin levels increased and DKK1 levels decreased from Wnt signaling pathway elements. In addition, the levels of Kaiso and p120ctn, which are involved in the stabilization of E-cadherin and NEDD9 levels which is responsible for the destruction of E-cadherin were also increased in these cells when time progresses. When the A549 cells were treated with 50 nM vitamin D half an hour before CSE and TGF-β stimulation, induced p-VDR signaling increased the levels of E-cadherin and reduced α-SMA levels, causing EMT regression. In addition, TGF-β signaling pathway activation decreased due to reducedlevels of p-SMAD2/3 and SMAD4 protein with elevatedlevels of SMAD7 protein; Wnt signaling pathway activation was also decreased by reducedlevels of active β-catenin protein and elevated DKK1 levels. In addition, vitamin D applications prevented the destruction of E-cadherin by reduced p120ctn, Kaiso and NEDD9 protein levels in A549 cells that were stimulated with 5% CSE and 5% CSE+TGF-β. Immunofluorescence analysis showed that in CSE and TGF-β treated groups, the p-VDR immunoreactivity (IR) in the cytoplasm and nucleus of the cell is decreased; furthermore, it was seen that p-SMAD2/3-IR was increased in nucleus but Kaiso-IR was increased in cytoplasm, mostly around nucleus periphery. In vitamin D treated groups, while cytoplasmic and nuclear p-VDR-IR was increased, p-SMAD2/3-IR was increased in cytoplasm but Kaiso-IR concentrated in the nucleus and nucleus periphery. Co-immunoprecipitation analysis revealed that in human lungs with IPF, the p-VDR protein could physically interact with Kaiso and active β-catenin and also that p-VDR did not interact with p120ctn. 

Due to decreased p-VDR signaling in A549 cells, applications of 5% CSE and 5% CSE+TGF-β stimulated the activation of TGF-β and Wnt/β-catenin signaling pathways along with expression of p120ctn and NEDD9 proteins which regulate the E-cadherin stabilization and degradation. This lead the A549 cells to decrease the amount of E-cadherin protein and start to produce α-SMA protein, which then caused EMT-mediated myofibroblast differentiation. These results clearly show that smoking and excessive activation of TGF-β signaling pathway associated with smoking, together withdecreased VDR signaling might be important risk factors for IPF development. In addition, the results of the current study showed that, when treated with 50 nM vitamin D of A549 cells half an hour before CSE and TGF-β administration, the increase in VDR signaling in these cells was mediated by DKK1, active β-catenin and Kaiso proteins, and the increase of vitamin D signalling reduced the activation of TGF-β and Wnt/β-catenin pathways thus protecting the A549 cells against EMT. In addition, VDR signaling regulated the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in cells by controlling the transcriptional activity of β-catenin and Kaiso. Smoking, overactivation of the TGF-β signaling pathway associated with smoking, and decreased VDR signaling may lead to IPF development, leading to EMT. In addition to the therapeutics used in the treatment of IPF patients with vitamin D deficiency, the use of vitamin D as additional support may be recommended.