Oryctolagus cuniculus kimozin geninin Pichia pastoris'te ekspresyonunun optimizasyonu
Optimization of Oryctolagus cuniculus chymosin gene expression in Pichia pastoris
Yazar: SELİN ALİHANOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET KARAASLAN
Harran Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Rekombinant kimozin üretiminde inek, kuzu, bufalo, keçi, domuz, deve gibi birçok hayvandan klonlanan kimozin genleri kullanılsa da tavşan kimozin geninin rekombinant olarak üretilmesini konu alan bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada öncelikle tavşan kimozininin peynir yapımına uygunluğunun belirlenmesi amacı ile tavşan renneti, ticari buzağı ve deve kimozinleri kullanılarak beyaz peynir üretimi yapılmış ve 60 gün depolanmıştır. Yapılan çalışmalarda tavşan renneti ile üretilen peynirlerin buzağı kimozini ile üretilen peynirlerden duyusal ve proteolitik açıdan üstünlük, deve kimozini ile üretilen peynirler ile de benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Bu ön çalışmalar doğrultusunda rekombinant tavşan kimozini üretimi için tavşanda bulunan kimozin gen diziliminin pre, pro ve aktif bölgeleri biyoinformatik analizler ile belirlenmiş, belirlenen pro-kimozin enzimi kodon optimizasyonu yapıldıktan sonra pPIC9K vektörüne klonlanmıştır. Tavşan kimozin genini içeren pPIC9K vektörü, Pichia pastoris GS115 suşuna elektroporasyon yöntemi ile aktarılmıştır. Antibiyotik (0.25, 0.50, 1.0, 2.0, 4.0 mg/mL genetisin)  içeren YPD agarda kademeli olarak geliştirilmiş tek kolonilerden antibiyotiğe en dirençli olan (4.0 mg/mL genetisin içeren besi ortamında gelişebilen) koloniler seçilerek farklı sıcaklıklar (20, 25, 30 ºC) altında AOX1 promotörü kontrolünde 96 saat boyunca ekstraselülar protein üretimi yapılmıştır. Belirlenen optimum fermentasyon sıcaklığında farklı pH (3.0, 4.0, 5.0, 6.0) değerlerine sahip BMM besiyerlerinde ekspresyon tekrarlanarak optimum besiyeri pH'ı belirlenmiştir. Maksimum protein verimi 30ºC'de ve pH'ı 6.0 olan besiyeri kullanılarak yapılan ekspresyon sonucu elde edilmiştir. SDS-PAGE analizi sonucunda kimozin (40 kDa) ve glikolize kimozine (45 kDa) ait bantlar elde edilmiştir. Aktif kimozinin 40 ºC ve 75 mM CaCl2 konsantrasyonunda %100 aktivite gösterdiği ve pH 3.0- 6.0 arasındaki değerlerde stabilitesini koruduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca rekombinant tavşan kimozininin eşek, inek, keçi, koyun, deve sütleri üzerlerindeki aktiviteleri sırası ile 40, 10, 5.7, 3.07, 2.66 IMCU/mL olarak belirlenmiştir. Rekombinant tavşan kimozininin kazein üzerindeki proteolitik özellikleri incelendiğinde ise α-kazeini parçalamadığı, β-kazeini az miktarda κ-kazeini ise tamamen parçaladığı gözlemlenmiştir. Sonuç olarak rekombinant kimozinin diğer hayvansal kimozinlere iyi bir alternatif pıhtılaştırıcı ajan olabileceği ve peynir endüstrisinde kullanılabileceği ortaya konmuştur.

Abstract:
There is no study about production of recombinant rabbit chymosin, although chymosin genes of many animals as cow, lamb, buffalo, goat, pig and camel are cloned in recombinant enzyme production. In this study firstly the suitability of rabbit chymosin for white cheese production was determined. For this purpose commercial calf and bovine chymosin was used as coagulant besides rabbit rennet in cheese production. During 60 days storage cheeses produced with rabbit rennet displayed superior sensorial and proteolytical properties than cheeses produced with bovine chymosin and similar properties with cheeses produced with camel chymosin. Secondly pre, pro and active regions of rabbit chymosin were determined with bioinformatics studies and rabbit pro- chymosin was cloned in to pPIC9K after codon optimization. Cloned vector was transformed in to P. pastoris GS115 strain with electroporation. Single colonies grow on antibiotic (4.0 mg/mL genetisin) containing YPD agars were selected and expressed extracellular at different temperatures under AOX1 promoter during 96 hour fermentation. Fermentation was repeated under optimum temperature at different pHs (3.0, 4.0, 5.0, 6.0) of BMM medium. Maximum protein yield was determined at 30 ºC and pH 6.0.  SDS-PAGE bands were indicated that chymosin (40 kDa) and the glycolised chymosin (45 kDa). Active chymosin was shown %100 activity at 40 ºC and 75 mM CaCl2 concentration and stable between pH 3.0- 6.0. Furthermore, activity of rabbit chymosin on donkey, calf, goat, sheep, camel milks were determined as 40, 10, 5.7, 3.07, 2.66 IMCU/mL respectively. While α-casein was not digested by recombinant rabbit chymosin β- and κ-caseins were digested partially and completely respectively. Consequently rabbit chymosin was determined as an alternative milk couagulant and can be used in cheese industry.