Hücre dışı genom materyallerinin hematopoetik kök hücreler üzerindeki etkisi
The effect of extracellular genome materials on hematopoietic stem cells
Yazar: SELİN FULYA TOPRAK
Danışman: DOÇ. DR. SELÇUK SÖZER TOKDEMİR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Genom = Genome ; Hematopoetik kök hücreler = Hematopoietic stem cells ; JAK 2 = JAK 2 ; Kök hücreler = Stem cells ; Miyeloproliferatif hastalıklar = Myeloproliferative disorders ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Amaç: Bu tezin ana amacı HKH'leri(Hematopoetik kök hücreler) başarıyla transfekte etmek ve bunlarda oluşan hücresel fonksiyon değişimlerini saptamaktır. Tüm biyolojik sıvılarda buluna hücre dışı genom materyallerinin(hdGM), hücrelerden salınarak komşu ve distal hücrelere entegre olabildiği bilinmektedir. Onkogen taşımaları halinde, hdGMler normal hücreleri onkojenik olarak transformasyona uğratabilir ve sonuçta genometastaz gelişebilir. Hücreler arasındaki etkileşimindeki bu rolleri nedeniyle, bu çalışmada hdGMler transfeksiyon için kullanılmış ve HKH'lerin kanser kök hücrelerine farklılaşabildikleri  gösterilmeye çalışılmıştır. 
Yöntem: Sağlıklı bireylerden kordon kanları toplanarak mononükleer hücre izolasyonu yapıldı. Ardından CD34+/- hücreler seçildi. HEL hücre hattı JAK2V617F nokta mutasyonunu biallelik taşıması nedeniyle,  K562 hücre hattı ise BCR/ABL pozitif olması nedeniyle kullanıldı. CD34+/- hücreleri ise, bu kültürden elde edilen serumlar ile transfekte edildi. Bu transfekte hücrelerde gerçekleşen değişimleri saptamak amacıyla, progenitör hücre koloni deneyleri, apoptoz ve hücre proliferasyon deneyleri ve immünfenotipleme yapıldı.
Bulgular: CD34+/-  hücreleri HEL serumuyla 24 saat boyunca muamele edildiğinde JAK2V617F mutasyonunu monoallelik geliştiği, süre 48 saat olduğunda mutasyonun biallelik geliştiği saptandı. BCR/ABL1 taşıyan K562 hücrelerinden elde edilmiş serumla transfeksiyon sonrasında HKH'lerin BCR/ABL1 pozitifliğinin tüm örneklerde geliştiği (%100) belirlendi. Hematopoietik progenitor kolonilerinde transfekte HKH kolonilerinde, JAK2V617F mutasyonu %XX oranında gösterildi. Kolonilerde, BCR/ABL1 füzyon geni ise %XX oranında gösterildi. Transfeksiyon sonrasında yapılan hücre fonksiyon analizleriyle, apoptozda tutarlı değişiklik olmadığı, ancak HEL serumu uygulandığında STAT5 ekspresyonun arttığı, K562 serumu eklendiğinde ise CD45, CD16+56, CD14'de artış görüldü. 
Sonuç: Bulgularımız, hdGM'lerin taşıdıkları onkogenleri, salındıkları hücrelerden farklı hücrelere lateral olarak transfer edebildiği ve bu hücrelere onkojenik özellik kazandırarak hücrenin biyolojik özelliklerini değiştirebildiğine dair literatür bilgisini desteklemektedir. Bu çalışma ile ilk defa olarak, JAK2V617F mutasyonu ve BCR/ABL1 füzyon genlerinin HKH'lere hdGM aracılığıyla entegrasyonunun mümkün olduğunu gösterdik. Bu veriler, hdGM'lerin hücreler arası iletişimde rolü olduğunu ve genometastaza katkıda bulunduğunu göstermektedir.

Abstract:
Aim:Main aim of thesis is successfully transfected HSC(Hematopoietic stem cells) and determine cellular function changes. Extracellular genome materials(EGM) found in all biological fluids which can released from cells and integrated into neighboring and distal cells.EGMs may carry oncogenes, they can oncogenically transform normal cells.Because of roles in the interaction between cells, EGMs were used for transfection in this study and it was show that HSCs can differentiate into cancer stem cells.
Methods:Cord blood was collected from donors and mononuclear cells were isolated. Then, CD34+/- cells were sorted. HEL cell was used because it carries the JAK2-V617F biallelic and the K562 cell was BCR/ABL1 positive. CD34+/- cells were transfected with serum collected from these cultures. In order to detect changes in transfected cells, ımmunophenotyping was performed with progenitor cell colony(PCC), apoptosis and proliferation assays.
Results: HEL serum transfected CD34+/- cells were detected the JAK2-V617F mutation monoallelic in 24h.When the incubate period was 48 hours, HSCs were JAK2-V617 mutation biallelic. After transfection, all samples(100%) of K562 serum transfected HSCs were detected BCR/ABL1 positive. While JAK2-V617F mutation was shown at a rate of 50% in transfected PCC; BCR/ABL1 was shown at a rate of 6%. after transfection, the cell function analysis was performed. After transfection, the cell function analysis was increased as apoptosis of CD34- cell, pSTAT5 in  HEL/CD34+/- , lympocyte count  in K562 serum/CD34+/-.  
Conclusion:Our findings support literature  that EGMs can transfer the oncogenes, carry from the cells they are released to different cells laterally and change  biological properties of cell by giving these cells oncogenic properties.  In this study, we have shown for the first time that it is possible to integrate the JAK2-V617F mutation and BCR/ABL1 fusion genes into HSCs via EGMs. These data show that hdGMs play a role in intercellular communication and contribute to genometastasis.