Vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF)'nün rekombinant olarak üretilmesi, saflaştırılması ve biyolojik özelliklerinin araştırılması
Production of recombinant VEGF (vascular endothelial growth factor), purification and investigation of biological proporties
Yazar: HÜLYA KUDUĞ
Danışman: PROF. DR. İSA GÖKÇE
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Kluyveromyces lactis = Kluyveromyces lactis ; Protein ekspresyonu = Protein expression ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors

Özet:
Vasküler endotelyal büyüme faktörleri (VEGF) genel olarak endotel hücre büyümesi, anjiyojenez ve vaskülojenez gibi fonksiyonlar göstermektedir. VEGF165 proteini VEGF ailesi içerisinde en yüksek anjiyojenik etkiye sahip türü olup birçok hücre ve doku türünde bulunmaktadır. VEGF165,  özellikle VEGF reseptörlerine bağlanarak ve bu reseptörleri aktive ederek endotel hücreleri için mitojenik faktör olarak rol almaktadır. Bu tez çalışmasında, insan VEGF165 proteinin (rhVEGF165) rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak maya ekspresyon sisteminde üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın üç amacı, VEGF165 geninin klonlanması; Kluyveromyces lactis sisteminde rekombinant olarak ekspresyonu ve saflaştırılması; endotel hücreleri için biyolojik karakterizasyonunun belirlenmesidir. VEGF165 geni K. lactis pKLAC2 vektörüne K. lactis'e ait α-MF dizisinin alt bölgesine klonlanmıştır. VEGF165-pKLAC2 kontsrüktü lineer hale getirilip K. lactis kompetent hücrelerine tranforme edilmiş ve K. lactis genomuna entegrasyonu sağlanmıştır. Transforme hücrelerin seçilimi azot bulunmayan ve asetamid içeren besiyerinde gerçekleştirilmiştir. VEGF165 His-etiketi ile eksprese edilmiş ve K. lactis kültür ortamına sekresyonu sağlanmıştır. Amonyum sülfat ile çöktürme ve nikel temelli afinite kromotografisi teknikleri saflaştırma amacı ile kullanılmıştır. Saflaştırılmış rhVEGF165 SDS-PAGE yöntemi ile kalitatif olarak analiz edilmiştir. Bu çalışmada üretilen rekombinant VEGF165'nin biyolojik olarak aktifliği insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) kullanılarak yapılan proliferasyon analizi ile belirlenmiş ve EC50 değeri 3.06 ng/mL olarak tespit edilmiştir. Ayrıca in vitro yara modeli oluşturularak yara iyileşmesi üzerine olan etkisi araştırılmıştır.

Abstract:
Vascular endothelial growth factors (VEGFs) generally have functions such as endothelial cell growth, angiogenesis and vasculogenesis. Human VEGF165 is the most efficient angiogenic factor variant in the VEGF family and mainly found in many different cells and tissues. Especially, VEGF165 plays a role as an endothelial cell mitogenic factor via binding and activating of VEGF receptors. In this study, the expression of human protein VEGF165 (rhVEGF165) has been achieved using recombinant DNA tecnology in yeast expression system. The following three aims of this project are focusing on cloning of VEGF165 gene, expression and purification of the protein from the yeast Kluyveromyces lactis recombinantly and its biological characterization for endothelial cells. The gene VEGF165 was cloned into expression vector, pKLAC2 downstream of K. lactis α-MF. The VEGF165-pKLAC2 construct was linearized and transformed into K. lactis competent cells and integrated in its genome by electroporation. The selection of transformed strains was carried out using nitrogen-free medium containinig acetamide. VEGF165 was expressed with His-tag and secreted in K. lactis culture medium. Ammonium sulfate precipitation and the nickel based affinity chromotography were used for purification. Purified VEGF165 was qualitatively analyzed by SDS-PAGE. The recombinant VEGF165 was functionally active as assessed by human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) proliferation assay with EC50 of 3.06 ng/mL. In addition, in vitro wound model was created and its effect on wound healing was investigated.