İmmunostimulan polimerler ile attenüe edilmiş Leismania parazitlerinin aşı olarak etkinliğinin in vitro ve in vivo incelenmesi
In vitro and in vivo investigation of effectiveness of attenuated Leishmania parasites by immunostimulant polymers as a vaccine
Yazar: SERHAT ELÇİÇEK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MELAHAT BAĞIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Adjuvanlar-immünolojik = Adjuvants-immunologic ; Leishmania = Leishmania ; Leishmaniasis-visceral = Leishmaniasis-visceral ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Poliakrilik asit = Polyacrilic acid ; Toksisite testleri = Toxicity tests ; İmmunostimulanlar = Immunostimulants

Özet:
Türkiye?nin ve dünyanın önemli halk sağlığı problemlerinden birisi olan leishmaniasis, dünya genelinde 98 ülkede yaygın olarak görülmekte olup, 350 milyon insan bu hastalığın tehdidi altında bulunmaktadır. Dünyada 12 milyon kişinin leishmaniasis ile enfekte olduğu ve her yıl bunlara 2 milyon yeni olgunun (1.5 milyon KL, 500.000 VL) eklendiği tahmin edilmektedir. Türkiye?de ise yaklaşık 20 milyon kişi bu enfeksiyona yakalanma riski altındadır. Hastalığın tedavisinde kullanılan ilaçlar oldukça toksik olup, son yıllarda hastalık etkenlerinde kullanılan ilaçlara, vektörlerinde ise insektisitlere karşı direnç geliştiği, ayrıca küresel iklim değişikliği ile hastalığın giderek yaygınlaştığı bilinmektedir. Bununla birlikte çeşitli çalışmalar yapılmasına rağmen, şimdiye kadar Leishmania?ya karşı etkin bir aşı geliştirilmesi mümkün olmamıştır. Günümüze kadar Leishmaniasis?e karşı aşı geliştirilmesinde farklı yaklaşımlar denenmiştir. Bu yaklaşımlardan biri de zayıflatılmış canlı aşılardır. Ancak şimdiye kadar elde edilen zayıflatılmış aşılar da diğer aşı yaklaşımları gibi yeterli etkinlik gösterememiştir. Bunun esas nedenlerinden birisi, parazitlerin uzun süreli kültür ortamında avirulent hale getirilmesi sırasında parazitlerin önemli immunojen moleküllerinin (LPG ve gp63 gibi) giderek azalması veya bu moleküllere ait genlerden sorumlu bölgelerin susturulmasıdır. Buna göre de, etkinliği yüksek olan zayıflatılmış canlı aşıların elde edilebilmesi için bu dezavantajları barındırmayan yeni yaklaşımların geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Aynı zamanda polielektrolitlerin in vivo koşullarda immun cevabı artırdığı, özellikle xixPoliakrilik asit (PAA) ve Polioksidonyum (POX)?un yüksek adjuvant etkisi olduğu bilinmektedir. Ancak, adjuvant özelliği olan polielektrolitlerin canlı Leishmania parazit molekülleri ile etkileşimi sonucunda in vitro (makrofaj hücre kültüründe) ve in vivokoşularda oluşacak immun yanıt ve enfektiflik konusunda hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Buna göre de, bu tez çalışmasının amacı ilk kez olarak immünostümülan özelliği olan pozitif ve negatif yüklü polielektrolitlere (PAA ve POX) maruz kalan VL etkeni L.infantum promastigotlarının in vitro makrofaj kültürlerindeki enfektifliklerinin ve oluşturdukları hücre yanıtlarının, in vivo olarak ise parazite karşı oluşan hümoral ve hücresel immün yanıtın incelenmesi sonucunda leishmaniasise karşı attenüe aşı modelinin oluşturulmasında yeni bir yaklaşımın geliştirilmesi olmuştur. Kullanılan Yöntemler: Hedefe ulaşmak için çalışmalarda Giemsa boyama ile enfektiflik tayini, Griess Reaktifi ile Nitrik Oksit Tayini, MTT ile hücre canlılık belirleme yöntemi ve morfolojik incelemeler için taramalı elektron mikroskobu kullanılmıştır. İn vivoçalışmalarda ise, fare serumundaki total IgG miktarı ve sitokin (IL-2, IL-4, IL-10 ve IFN-?) miktarları ELISA yöntemi kullanılarak, karaciğer ve dalaktaki parazit yükü LDU birimi olarak, periton makrofajlardaki % enfektiflik düşüşü ise giemsa boyama ile hesaplanmıştır. Ayrıca fare periferik kanındaki parazit varlığı giemsa boyama ve mikro kültür yöntemi (MKY) ile, gecikmiş tip aşırı duyarlılık ise DTH testi ile belirlenmiştir. Veriler, SPSS version 19.0 for Windows programı ile belirlenmiş ve p < 0,05 değeri istatistiki olarak anlamlı kabul edilmiştir.Sonuçlar: In vitro makrofaj kültürü incelendiğinde, polimere maruz kalmış parazitlerin enfektifliğini kaybetmiş olmasına rağmen, makrofajların NO üretimini indüklediği gösterilmiştir. İn vivo fare modellerinde ise PAA?ya maruz kalmış parazitlerle enfekte olmuş fare gruplarında IgG antikor seviyesinin kontrole göre anlamlı olarak arttığı belirlenmiştir. Kontrole göre parazit yükündeki azalma yüzdeleri ise PAA?ya maruz kalan parazitler ile enfekte olmuş farelerin dalakları için 84,27±2,98, karaciğerleri için 89,75±2,12 olduğu belirlenmiştir. POX?a maruz kalan parazitlerle enfekte olmuş farelerin dalakları için 76,92±1,88 ve karaciğerleri için ise 80,02±3,11 oranında parazit yükünde düşüş olduğu tespit edilmiştir (p < 0,05). Özellikle PAA?ya maruz kalan promastigotların immün sistemi Th1 tip hücre proliferasyonu yönünde uyararak, L.infantum enfeksiyonlarında koruyucu rolü olan IFN?? sitokinlerinin üretimini indüklediği ve kontrole göre 7 kat artış olduğu saptanmıştır (p<0,05). Ayrıca POX ile yapılan deney sonuçları ise POX?un 6000 ?g/ml ve üzerindeki dozlarının hücre içi parazitlerin proliferasyonunu inhibe ettiği de gösterilmiştir. Böylece bu çalışmada ilk kez olarak PAA ve POX kullanılarak leishmaniasise karşı attenüe olmuş aşı modelinin geliştirilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Elde edilen bu sonuçların ileride leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde önemli bir rol oynayabileceği ve aynı zamanda immünoterapi açısından yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinin temelini oluşturabileceği düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler: POX, PAA, J774, L.infantum, toksisite, MTT, hücre kültürü, amastigot,Nitrik Oksit, Aşı

Abstract:
Leishmaniasis, which is one of the important public health problems for both Turkey and the world, commonly occurs in 98 countries around the world and 350 million people are under the threat of this disease. Furthermore, 12 million people arecurrently infected with Leishmaniasis at worldwide and it is estimated that 2 million new cases are being added each year (1.5 million CL, 500,000 VL). Also in Turkey, approximately 20 million people are at the risk of the infection. At the same time,drugs that are used for the treatmenti, are highly toxic, besides the disease pathogens and vectors have developed resistance to the antileishmanial drugs and insecticides. Furthermore, it is known that the disease is spreading all around the world by the effect of global warming. However, although there are several studies to develop aneffective vaccine against Leishmania, these endeavors have not reached to a success. Up to the present, different approaches have been tried to develop a vaccine against Leishmaniasis. One of these approaches is live attenuated vaccines approach. However, obtained attenuated vaccines could not demonstrate sufficienteffectiveness, just like other vaccine approaches so far. One of the main reasons for this failure is gradually decrease of important immunogenic molecules of the parasites(such as LPG and gp63) during the avirulation process in long term culture or silencing of genes of these molecules. In order to obtain highly effective attenuated live xxivaccines which alter these disadvantages, there is a great need to develop new approaches. Accordingly, it is known that polyelectrolytes increase the immune response, especially polyacrylic acid (PAA) and polyoxidonium (POX) shows high adjuvant effect in vivo. On the other hand, there is no study about the effects of the polyelectrolytes those have adjuvant properties and interacted with live Leishmaniaparasites related to immune response and infectivity in vivo and in vitro (macrophage cell cultures). According to this, the aim of this thesis study, as a first time, is to determineinfluence of immunostimulant negative and positive charged polyelectrolytes (PAA and POX) exposed VL agent L. infantum parasites to infectivity rates, resultant cell response effects in vitro and humoral and cellular immune responses in vivo and according to this todevelop an approach in generating attenue vaccine models against Leishmania. Methods: To reach this target, Infectivity determination with Giemsa staining studies, determination of Nitric Oxide with Griess reagent, MTT method to determine cell viability and scanning electron microscopy for morphological studies were used in this thesis. On the other hand, in the in vivo studies total IgG and cytokine (IL-2, IL-4, IL-10 and IFN-?) amounts in the mouse serum was determined by ELISA method while liver and spleen parasite amount in LDU units, % infectivity decrease in peritoneal macrophages was calculated by Giemsa staining method. In addition, presence of parasites in the mouse peripheral blood was determined with Giemsa staining and micro culture method (MCM) while delayed-type hypersensitivity was determined by the DTH test. The data was performed with SPSS version 19.0 for Windows program and p <0.05 was considered as statistically significant.Results: In the in vitro macrophage cells, it has been shown that parasites exposed to the polymer both lost infectivity and induced the production of NO. In in vivo mouse models PAA subjected mouse groups IgG antibody levels significantly increased compared to the control group, while the percentage of reduction in parasite burden compared to the control for PAA spleen 84.27 ± 2.98, for PAA liver 89.75 ± 2.12, for POX spleen 76.92 ± 1.88 and finally for POX liver 80.02 ± 3.11 has been found (p <0.05). In particular PAA exposed promastigotes induces the immune system to Th1 type of cell proliferation, induce the production of IFN-? cytokines that have protective role in L.infantum infections and 7-fold increase compared to control (p <0.05). In addition, results of tests carried out with POX has shown for the first time that Pox doses that are above 6000 ?g / ml, inhibits the proliferation of intracellular parasites.Thus, for the first time in this study it was shown that by using POX and PAA it is possible to develop a attenuated vaccine against leishmaniasis. The obtained results may constitute a basis for the development of a vaccine against leishmaniasis in the future or immunotherapy methods to be developed.Keywords: POX, PAA, J774, L.infantum , toxcicity, MTT, cell culture, amastigot,Nitric Oxide, vacci