siRNA yüklü kitosan nanopartikülleri ile helahücrelerinde e6 geninin susturulması
Silencing of the e6 gene in hela cells with siRNA-loaded chitosan nanoparticles
Yazar: ŞEYMA ERDAL
Danışman: PROF. DR. AYTEN ÇELEBİ KESKİN
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Genetik = Genetics

Özet:
Günümüzde kanser hastalığı ciddi sağlık sorunlarından ve en ölümcül hastalıklardan biridir. Rahim ağzı kanseri dünyada kadınlar arasında en sık görülen kanser türlerinde üçüncü sıradadır. Geleneksel kanser tedavilerinde hastalar, tümörü yok etmek için kemoterapi gibi yüksek doz sitotoksik ajanlara maruz kaldıklarından dolayı istenmeyen sistemik toksisiteye maruz kalmaktadır. Gen terapi yöntemi olarak kullanılan siRNA mekanizması, hedeflenen genin transkripsiyon sonrası diziye özgü bir şekilde inhibe edilmesini sağlayarak kanser gibi hastalıkların hedeflenmesi için gen tedavisinde önemli bir araç haline gelmiştir. siRNA'nın verimli bir şekilde hücrelere taşınması için nanoteknolojinin en önemli ürünlerinden olan nanopartiküler kullanılmaktadır. Kanser tedavisinde son yıllarda yapılan çalışmalar göstermiştir ki kitosan biyobozunurluluk, yüksek biyouyumluluk, pozitif yük ve düşük toksisite gibi özelliklere sahip olması nedeniyle siRNA'yı hücrelere verimli şekilde taşıyarak kanser tedavisi için umut vadeden gelişmelere katkı sağlamaktadır.
Sunulan tez kapsamında rahim ağzı kanseri tedavisi için katyonik potansiyele sahip kitosan nanopartiküllerine yüklenmiş siRNA'nın HeLa hücre hattına aktarılarak E6 gen ifadesinin baskılanması amaçlanmıştır. Bu çalışmanın ilk bölümünde kitosan nanopartikülleri iyonik jelasyon yöntemi ile sentezlenmiş ve nanopartiküllerin karakterizasyonu yapılmıştır. Daha sonra siRNA ile muamele edilmiş kitosan nanopartiküllerin agaroz jel elektroforez işlemi yapılarak, nanopartikül ile siRNA'ların birbirine tutunup tutunmadığı kontrol edilmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde ise; siRNA yüklü kitosan nanopartiküllerin HeLa kanser hücreleri üzerindeki etkilerine bakılmıştır. MTT testi yapılarak hücre ölüm oranları değerlendirilmiştir. Daha sonra ikili boyama yöntemi kullanılarak hücreler üzerinde ki apoptotik ve nekrotik etkileri incelenmiştir. Çalışmanın son aşamasında ise Real Time-PCR yöntemi kullanılarak siRNA yüklü kitosan nanopartiküllerin HeLa hücre hattında ki hedef genin ifade seviyelerine ve inhibasyon etkisine bakılmıştır. Elde edilen sonuçlar, kitosan nanopartiküllerin verimli siRNA taşıyıcıları olarak kullanılabileceğini ve uygun dozlarda kullanılan siRNA yüklü kitosan nanopartiküllerin E6 geninin ifade seviyesini etkili bir şekilde baskılayabileceğini göstermiştir.

Abstract:
Today, cancer is one of the most serious health problems and one of the deadliest diseases. Cervical cancer is the third most common cancer among women worldwide. In conventional cancer treatments, patients are exposed to unwanted systemic toxicity due to exposure to high doses of cytotoxic agents such as chemotherapy to destroy the tumour. The siRNA mechanism, which is used as a gene therapy method, has become an important tool in gene therapy for targeting diseases such as cancer by inhibiting the targeted gene in a sequence-specific manner after transcription. Nanoparticles, one of the most important products of nanotechnology, are used to efficiently transport siRNA into cells. Recent studies in cancer treatment have shown that chitosan contributes to promising developments for cancer treatment by efficiently transporting siRNA to cells due to its properties such as biodegradability, high biocompatibility, positive charge and low toxicity.
In this thesis, it was aimed to suppress E6 gene expression by transferring siRNA loaded in chitosan nanoparticles with cationic potential for cervical cancer treatment to HeLa cell line. In the first part of this study, chitosan nanoparticles were synthesised by ionic gelation method and nanoparticles were characterised. Then, agarose gel electrophoresis of siRNA-treated chitosan nanoparticles was performed and it was checked whether the nanoparticles and siRNAs adhered to each other. In the second part of the study, the effects of siRNA loaded chitosan nanoparticles on HeLa cancer cells were investigated. Cell death rates were evaluated using MTT test. Then, apoptotic and necrotic effects on cells were examined using the double staining method. In the last stage of the study, the expression levels and inhibition effect of siRNA-loaded chitosan nanoparticles on the target gene in HeLa cell line were examined using Real Time-PCR method. The results obtained showed that chitosan nanoparticles can be used as efficient siRNA carriers and siRNA-loaded chitosan nanoparticles used at appropriate doses can effectively suppress the expression level of the E6 gene.