Doping kontrol analizlerinde eritropoetin tespitine yönelik spektroskopik metotların geliştirilmesi
The development of spectroscopic methods for the erythropoietin detection in  doping control analysis
Yazar: YEŞİM SOMAY SELBES
Danışman: PROF. DR. NECDET SAĞLAM ; PROF. DR. ARİF AHMET BAŞARAN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Sporda doping = Doping in sport

Özet:
Dopingle mücadele,  sporcuların haksız rekabetlerini engellemek amacıyla Dünya Anti Doping Ajansı ( World Anti-Doping Agency, WADA)'nın yasaklı maddeler ve yöntemler listesinde yer alan maddelerin detaylı analizleriyle mümkün olmaktadır. Eritropoetin (EPO), WADA tarafından yayınlanan listede 'peptit hormonlar ve büyüme faktörleri ve ilişkili maddeler' sınıfında yer alır ve özellikle dayanıklılık gerektiren spor dallarında ( yüzme, koşu, bisiklet gibi)  kanın oksijen taşıma kapasitesini arttırdığından dolayı doping maddesi olarak kullanılır. Günümüzde doping analizlerinde EPO tayini için WADA'nın belirlediği elektroforetik ve Western Blot teknikleri kullanılır. Ancak bu tekniklerin uygulanmasındaki zorluklar ve uzun süren deney aşamalarından dolayı daha hızlı ve kolay yeni analiz yöntemlerinin geliştirilmesi gerekmektedir. Bu çalışmada biorad orijinli kontrol idrar matriksinden oldukça düşük miktarlarda bulunan Eritropoetin (EPO)'i hızlı ve hassas bir şekilde tayin edebilmek için SERS ölçümüne dayanan iki farklı sandviç immunoanaliz yöntemi geliştirilmiştir. Her iki yöntemde de SERS probu (5-5'-Ditiobis (2-Nitrobenzoik asit), DTNB) olarak antikor ile modifiye edilmiş altın nanoçubuklar kullanılmıştır.  Homojen sandviç immunoanaliz yönteminde EPO, idrar matriksinden antikor ile modifiye edilmiş altın kaplı manyetik nanopartiküller kullanılarak ekstrakte edilmiştir. Manyetik nanopartiküller, altın nanoçubuklar ile etkinleştirilmiştir ve sandviç yöntemle EPO analizi gerçekleştirilmiştir. Heterojen sandviç immunoanaliz yönteminde ise EPO'nun katı faz ekstraksiyonu'ndan sonra altın nanoçubuklar ile etkinleştirilerek sandviç analizi gerçekleştirilmiştir. Aynı zamanda hedef protein EPO ile antikor bağlı manyetik nanopartiküller arasındaki seçici bağlanma SDS-PAGE ve Western Blot yöntemleri ile kontrol edilmiştir. EPO derişimlerine karşı DTNB'nin 1335 cm-1 deki nitro grubuna ait sinyal şiddetlerinin grafiğe geçirilmesiyle kalibrasyon grafiği elde edilmiştir. Biorad orijinli kontrol idrar örneklerinde EPO derişimi ve SERS sinyalleri arasındaki korelasyon 0 – 1000 pg/mL derişimleri arasında doğrusal olarak bulunmuştur (homojen sandviç sistemi, R2=0.9692; heterojen sandviç sistemi, R2=0.9320). Geliştirilen analiz sistemlerinin seçicilikleri ve hassasiyetleri incelenmiş; idrar örnekleri üzerinde uygulanabilir olduğu görülmüştür.

Abstract:
Fighting against doping is possible with detailed analysis of the prohibited substances and methods in the list of the World Anti -Doping Agency to prevent unfair competition of the athletes.  Erythropoietin (EPO) takes place in the class of the peptide hormones and growth factors and related substances in the list published by WADA and especially is used as a doping agent in the demanding sport endurance (   swimming, jogging, bicycle, etc. ) to increase the oxygen-carrying capacity of the blood. Today in doping analysis, electrophoretic and Western Blot techniques, which are determined by WADA, are used to detecting of EPO analysis. However,  the development of new analytical methods are required faster and easier due to difficulties in the implementation of these techniques and time consuming.
In this study, two different sandwich immunoassays based on surface enhanced Raman Spectroscopy (SERS)  were developed for fast and sensitive detection of ultra trace amounts of erythropoietin (EPO) in biorad lypocheck urine matrix. In both methods, antibody modified rod shaped gold nanoparticles were used as SERS probe (5-5'-Ditiobis (2-Nitrobenzoik asit), DTNB). In homogeneous assay, EPO were extracted from biorad lypocheck urine matrix by using antibody modified core shell-structured magnetic iron oxide gold nanoparticles.  Magnetic nanoparticles were activated with the gold nanorods and EPO analysis was performed with sandwich assay. In Heterogenous assay, after solid phase extraction of prohibited substances, sandwich assay with the rod shaped gold nanoparticles was performed. The selective binding between the target protein EPO and antibody bound magnetic nanoparticle was also monitored by SDS-PAGE and Western blotting. The correlation between the EPO concentration in urine and SERS signal was found to be linear within the range of 0–1000 pg /mL  (R2=0.96920 and 0.9320 for homogeneous assay and heterogenous assay, respectively). The selectivity and sensitivity of developed analysis methods; it is shown that the developed methods can be applied on biorad lypocheck urine samples.