Amyotrofik lateral skleroz (ALS) hastalarında mitokondriyal fonksiyon bozukluğu ile ilgili genleri hedef alan mirna'ların in siliko ve in vitro yöntemlerle araştırılması
In silico and in vitro analysis of mirnas that target genes associated with mitochondrial dysfunction in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
Yazar: GÜLÇİN BAYKAL
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞENAY VURAL KORKUT
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Nöroloji = Neurology

Özet:
Amyotrofik Lateral Skleroz, motor nöronların dejenerasyonu ve iskelet kaslarının atrofisi ile karakterize ilerleyici, ölümcül bir hastalıktır. İnsidansı yılda 2,1/100.000 ve prevalansı yılda 5,4/100.000'dir. Genellikle fokal olarak başlar ve solunum sistemi felci nedeniyle ölümcüldür. Güncel olarak 100'den fazla gende ALS'ye neden olan mutasyonlar tanımlanmıştır. Bunlar, hastalık patofizyolojisinin farklı mekanizmalarına etki eder. MikroRNA'lar olarak bilinen kodlama yapmayan, tek sarmallı RNA molekülleri, transkripsiyondan sonra mRNA bozulması yoluyla gen ekspresyonunu düzenlerler. miRNA'lar, Amyotrofik Lateral Skleroz gibi nörodejeneratif hastalıklar için biyobelirteç olarak kullanılabilir. Nöronal hücreler mitokondriye oldukça bağımlıdır ve mitokondriyal disfonksiyon nörodejeneratif hastalıklarla bağlantılıdır. Literatür taramasıyla, mitokondriyal disfonksiyona neden olan ve ALS patogenezinde rol oynayan SOD1, FUS, TARDBP, C9orf72, CHCHD10, OPTN, VCP, TBK1 ve BCL2 genleri belirlendi. Enrichr, g: Profiler ve CROssBAR araçlarını kullanılarak yapılan yolak zenginleştirme analizlerinde, tanımlanan genlerin ALS, mitokondriyal işlev bozukluğu ve nöron farklılaşması ile önemli bağlantılara sahip olduğu doğrulandı. In siliko miRNA tahminleri miRWalk, miRTargetLink, TargetScan ve miRNet veri tabanları kullanılarak yapıldı. Ortak miRNA'ları seçmek için bir Venn diyagramı aracı kullanıldı ve 28 miRNA keşfedildi. Belirlenen 28 miRNA miRNet ve TAM araçları kullanılarak fonksiyonel ve zenginleştirme analizleri için set analizine tabi tutuldu. Her iki veri tabanında, iki ortak miRNA'nın, hsa-miR-9-5p ve hsa-miR-141-3p'nin ALS ile bağlantılı olduğu bulundu. İn vitro kısmın da ise, ALS hastalığının teşhis, izlem ve tedavisinde biyobelirteç olarak kullanılma potansiyeline sahip miRNA'ları belirlemek için in siliko analizinden elde edilen verilerimizin biyolojik örnekler üzerinde doğrulanmasıdır. Bu çalışmada yeni tanı almış, herhangi bir ilaç kullanmaya başlamamış ve ilaç tedavisi gören ALS hastalarından kan örnekleri alınmıştır. Herhangi bir nörolojik hastalığı olmayan sağlıklı bireylerden ve ALS dışında nörolojik hastalığa sahip nörolojik kontrollerden kan örnekleri elde edilmiştir. Tüm örneklerden periferik kan mononükleer hücreleri ve bunlardan miRNA izolasyonu yapılmıştır. hsa-miR-9-5p ve hsa-miR-141-3p'nin ekspresyon seviyeleri, gerçek zamanlı qPZR kullanılarak incelenmiştir.

Abstract:
Amyotrophic Lateral Sclerosis is a progressive, fatal disease characterized by degeneration of motor neurons and atrophy of skeletal muscles. Its incidence is 2.1/100,000 per year and its prevalence is 5.4/100,000 per year. Non-coding, single-stranded RNA molecules known as microRNAs regulate gene expression via mRNA degradation after transcription. miRNAs can be utilized as biomarkers for neurodegenerative diseases such as Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neuronal cells are highly dependent on mitochondria, and mitochondrial dysfunction has been linked to neurodegenerative diseases. A literature search revealed the genes SOD1, FUS, TARDBP, C9orf72, CHCHD10, OPTN, VCP, TBK1, and BCL2 that cause mitochondrial dysfunction and are involved in the pathogenesis of ALS. Pathway enrichment analyses using Enrichr, g: Profiler, and CROssBAR tools confirmed that the identified genes have significant associations with ALS, mitochondrial dysfunction, and neuron differentiation. In silico miRNA predictions have been made using miRWalk, miRTargetLink, TargetScan, and miRNet tools. A Venn diagram tool was used to select common miRNAs, and finally, 28 miRNAs were discovered. A set of 28 miRNAs were subjected to set analysis using the miRNet and TAM tools for functional and enrichment analyses, respectively. In both databases, two common miRNAs, hsa-miR-9-5p and hsa-miR-141-3p, were found to be linked to ALS. The principal aim of the study is further analysis of our data obtained from in silico analysis to identify miRNAs that have the potential to be used as biomarkers for the diagnosis, prognosis, and treatment of ALS disease. In this study, blood samples taken from newly diagnosed ALS patients who have not started to use any medication, and from ALS patients on medication. Blood samples also obtained from healthy individuals without any neurological disease and from neurological controls. Peripheral blood mononuclear cell and miRNA isolation made from all samples. Expression levels of hsa-miR-9-5p and hsa-miR-141-3p examine using real-time qPCR.