Biyomedikal uygulamalar için çok-işlevli demir oksit-gadolinyum borat kompozit nanoplatformların geliştirilmesi
Development of multifunctional iron oxidegadolinium borate composite nanoplatforms for biomedical applications
Yazar: OKAN İÇTEN
Danışman: PROF. DR. BİRGÜL KARAN ; DOÇ. DR. DURSUN ALİ KÖSE
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Kimya = Chemistry ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
Bu doktora çalışmasının ilk bölümünde, basit ve biyouyumlu inorganik kimyasallar kullanılarak ve bir hidrotermal yolla Fe3O4-GdBO3 nanokompozitleri hazırlandı. Bor kaynağı olarak boraks (BX) ve borik asit (BA), demir oksit olarak kaplanmamış ve PEG-lenmiş (polietilen glikol) magnetit (Fe3O4) ve Gd(III) kaynağı olarak Gd(NO3)3.6H2O kullanıldı. Elde edilen kompozitlerin özelliklerini metodoloji ile ilişkilendirmek amacıyla deneysel koşullar sistematik olarak değiştirildi. Fe3O4 üzerine GdBO3 kaplanmasıyla elde edilen ürünler X-Işını Kırınımı (XRD), Fourier Dönüşümlü İnfrared Spektroskopisi (FT-IR),Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), Enerji Dispersif X- Işını Spektroskopisi (EDS), Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM), Termogravimetrik Analiz (TGA) ve manyetizasyon ölçümleri ile karakterize edildi. Toz XRD desenleri, Fe3O4 ve GdBO3 yansımaları ile örtüşen iki-fazlı kompozitlerin oluştuğunu gösterdi. BX veya BA kullanımı, kaplanmamış veya PEG
kaplanmış Fe3O4 kullanımı, reaktantların mol oranının değiştirilmesi ve pH gibi deneysel
parametrelerin kaplanan borat yapısını, boyutunu, nanokompozit morfolojisini ve doyum
manyetizasyon değerini etkilediği görüldü. Bor kaynağı olarak BA kullanıldığında vaterit
tipi [Gd3(B3O9)], BX kullanıldığında ise triklinik GdBO3 içeren ve Gd/B mol oranı 1:1 olan borat fazları oluştu. Daha küçük ve düzgün kompozit yapılar elde etmek için PEG kaplı
Fe3O4 nanoparçacıklarının daha elverişli bir destek malzemesi olduğu anlaşıldı. BX ile
hazırlanan nanokompozitlerin TEM görüntülerinde; 20-40 nm büyüklüğünde magnetit
nanoparçacıklarının gadolinyum borat bulutu ile çevrelendiği, BA ile hazırlanan
nanokompozitlerin ise 100-150 nm boyutunda kübik şekilde parçacıklardan oluştuğu
anlaşıldı. Hazırlanan Fe3O4-GdBO3 nanokompozitlerin hepsi, biyoteknoloji ve tıp
uygulamaları için uygun olabilecek yumuşak ferromanyetik özellikler sergiledi. Uygulanan
hidrotermal sentez tekniği; basitlik, verimlilik ve deney koşullarının ayarlanmasıyla
kontrollü nanokompozit yapılarının hazırlanmasına izin veren avantajlı bir yöntem olarak
değerlendirildi.
İkinci bölüm, Fe3O4-GdBO3 nanokompozitlerinin biyo-işlevlendirilmesini içermektedir.
Biyo-konjugasyon işlemi (i) sitrik asit (CA) ve (ii) Floresein izotiyosiyanat katkılanmış
silika (FITC-SiO2) ve ardından folik asit (FA) ile gerçekleştirildi. Çeşitli nitel ve nicel analiz
teknikleriyle (X-Işını Fotoelektron Spektroskopisi / XPS, SEM, TEM, İndüktif Eşleşmiş
Plazma-Optik Emisyon Spektroskopisi / ICP-OES) nanokompozitlerin başarılı bir şekilde
işlevlendirildiği gösterildi. Hepsinin biyolojik uygulamalar için uygun yumuşak
ferrromanyetik özelliğe ve zeta potansiyeline sahip olduğu bulundu. Biyokonjuge
nanokompozitlerdeki ortalama 10B ve 157Gd içerikleri 1014 atom/μg olarak hesaplandı ve
Gd/Fe mol oranlarının da 0.27-0.63 arasında değiştiği bulundu. Bu değerler; Fe3O4-GdBO3
nanokompozitlerinin BNCT, GdNCT ve kombine GdBNCT uygulamalarında
kullanılabileceğini ve Gd/Fe oranının ayarlanabilir olması ile aynı zamanda multi-modal
MRI (T1, T+T2) ajanı olarak da kullanılabileceklerini gösterdi.
Son olarak; bu parçacıkların biyouyumluluğu ve NCT/MRI uygulamalarındaki olası
kullanılabilirliğini incelemek için, in vitro hücre çalışmaları yapıldı. MIA-Pa-CA-2
hücreleriyle yapılan akış sitometre çalışmaları, nanokompozit parçacıklarının doza bağlı
olarak kanserli hücreler tarafından alımının arttığını gösterdi. Nokta-alan analizleri, 10
μg/mL konsantrasyondaki nanokompozit örnekleri ile inkübasyon sonucunda tüm
parçacıkların hücre içine girdiğini; 1 μg/mL konsantrasyon ile floresans gözlenmeye
başladığını ve 10 μg/mL ile inkübasyon sonucunda oldukça net floresans görüntüleme
yapıldığını gösterdi. 1015 tane 10B ve 157Gd atomu içeren 10 g FA-konjuge nanokompozit
örneğinin 0.125x106 tane kanser hücresiyle etkileştiği, bu değerin BNCT ve GdNCT için istenen değerin on kat fazlası olduğu ve aynı zamanda GdBNCT için de uygun bir Gd/10B
oranının sağlandığı anlaşıldı.
Bu çalışmada hazırlanan yeni nesil biyo-işlevlendirilmiş Fe3O4–GdBO3 kompozit
nanoplatformlarının, "manyetik hedefli tedavi, floresan görüntüleme, manyetik rezonans
görüntüleme, nötron yakalama tedavisi" gibi potansiyel teranostik uygulamalar için uygun
kapasitede oldukları gösterilmiştir.

Abstract:
In the first part of this PhD study, Fe3O4-GdBO3 nanocomposites were prepared via a
hydrothermal route using simple and biocompatible inorganic chemicals. Borax (BX) and
boric acid (BA) were used as the boron precursors; plain and PEGylated magnetite were
used as the source precursors for Fe3O4 and Gd(NO3)3.6H2O as the source of Gd(III). The
experimental conditions were systematically varied to link the properties of the final
composites with the methodology. The products obtained by depositing gadolinium borate
over magnetite were analyzed by powder X-Ray Diffraction (XRD), Fourier Transform
Infrared Spectroscopy (FT-IR), Scanning Electron Microscopy (SEM), Energy Dispersive
X-Ray Spectroscopy (EDS), Transmission Electron Microscopy (TEM), Thermogravimetric
Analysis (TGA) and magnetization measurements. The XRD patterns of the nanocomposites
showed a bi-phase pattern with reflections matching with those of Fe3O4 and GdBO3. The
results showed that the experimental parameters e.g. using either BX or BA, uncoated- or
polyethylene glycol (PEG) coated-Fe3O4 as the precursors, changing reactant concentrations
and the pH, all influence the structure of the borate coating, coverage type, size and
morphology of the nanocomposites and saturation magnetization values to some extent. The
coating was yielded in the form of vaterite-type orthoborate [Gd3(B3O9)] with BA and triclinic-GdBO3 with BX, both having the Gd/B ratio of 1/1. PEGylated Fe3O4 appeared to
be a preferable support for coating with the borate layer to obtain smaller size and uniform
composite structures. The composites prepared with BX displayed typical TEM images
where a bunch of spherical 20-40 nm size magnetite nanoparticles were surrounded with a
gadolinium borate cloud while nearly cubic, pseudo core-shell nanocomposite particles of
100-150 nm size were obtained with BA at pH 9. The prepared Fe3O4-GdBO3
nanocomposites all displayed soft ferromagnetic properties that might be relevant for
applications in biotechnology and medicine. Hydrothermal synthesis offered the advantages
of simplicity, efficiency and allowed for the preparation of controlled nanocomposite
structures by carefully tuning the experimental conditions.
The second part of this study involves the bioconjugation of GdBO3-Fe3O4 nanocomposites.
The bioconjugation processes were performed with citric acid (CA) and
floresceinisothiocyanate-doped silica (FITC-SiO2), followed by the treatment with folic acid
(FA). The successful functionalization of the nanocomposite particles was demonstrated by
qualitative and quantitative (X-Ray Photoelectron Spectroscopy/XPS, SEM, TEM,
Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectroscopy/ICP-OES) analytical data. All
bioconjugates displayed soft ferromagnetic properties and zeta potential values that are
appropriate for biological applications. The 10B and 157Gd contents were ca. 1014 atom/g
making them promising agents for Boron Neutron Capture Therapy (BNCT), Gadolinium
Neutron Capture Therapy (GdNCT) and the combined GdBNCT. The Gd/Fe molar ratios
(0.27-0.63) provided capability for T1- or dual (T1+T2) magnetic resonance imaging (MRI).
Finally, to examine the biocompatibility and possible applicability of these particles for NCT
and MRI imaging, in vitro tests were performed. Flow cytometry results with MIA-Pa-CA-
2 cells demonstrated that there is a dose-dependent increase in cellular uptake of all
nanocomposites. The dot-plot analysis of MIA-PaCA-2 cells showed that all nanocomposite
particles penetrated into MIA-Pa-CA-2 cells after incubation at 10 μg/mL. The cells began
to show fluorescence intensity after incubated with 1 μg/mL concentration and the green
dots due to FITC were clearly observed at the 10 μg/mL incubation. Overall, a 10g of FAconjugated
nanocomposite containing 1015 atoms of 10B and 157Gd was found effective for
0.125x106 cancer cells making 1010 atoms per cell. The boron and gadolinium contents
exceed the required concentrations to sustain a neutron capture reaction for BNCT and
GdNCT by tenfold also providing an appropriate Gd/10B ratio for GdBNCT. The bioconjugated nanoplatforms of GdBO3-Fe3O4 composites, introduced herein, proved
to have potential features of next generation agents for theranostic applications like
"magnetically targeted therapy, fluorescence imaging, magnetic resonance
imaging/diagnosis and neutron capture therapy".