Sığır ve insan respiratör sinsityal virusların filogenetik analizi ve sığırlardan respiratör sinsityal virusun izolasyonu
Phylogenetic analysis of bovine and human respiratory syncytial viruses and isolation of bovine respiratory syncytial virus
Yazar: ÖZGE AYDIN
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN YILMAZ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı / Viroloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Filogenetik = Phylogenetic ; Hayvan hastalıkları = Animal diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Respiratuvar sinsityal virüsleri = Respiratory syncytial viruses ; Sığırlar = Cattles ; Virüsler = Viruses

Özet:
Sığır Respiratörik Sinsityal Virus (Bovine respiratory syncytial virus=BRSV) tüm yaş grubu sığırlarda solunum sistemi infeksiyonlarına ve özellikle buzağı ve genç sığırlarda ölüm ve tedavi masrafları sonucu ekonomik kayıplara neden olmaktadır.
Bu tez çalışmasında; BRSV'nin real time RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction=RT-PCR) ile hızlı tanısı, BRSV-G geninin RT-PCR ile kısmi çoğaltılması, sekans ve filogenetik analizleri yapılarak ülkemiz ve diğer ülkelerdeki sığır ve insan respiratörik sinsityal virusları (BRSV ve HRSV) ile karşılaştırılması ve soy ağacı oluşturulması amaçlandı. RT-PCR sonucu BRSV pozitif olduğu tespit edilen örneklerden aşı ve diğer çalışmalarda kullanılmak üzere virus izolasyonu çalışmaları da planlandı. Ayrıca BRSV'ye karşı oluşan spesifik antikorlar saptanarak hayvanların bağışıklık durumunun araştırılması amaçlandı. Bu amaçlara yönelik olarak Trakya bölgesi ve Uşak ilinde lokalize olmuş çiftlikler ziyaret edilerek, solunum sistemi bozukluğu görülen buzağı ve genç sığırlardan örnekler alındı. BRSV-N genini hedefleyen real time RT-PCR ile pozitiflik saptanan örneklerde sekans amacıyla BRSV-G geni hedeflenerek RT-PCR yapıldı. Sekans ve filogenetik analizler sonucunda elde edilen dizilimler ülkemiz ve diğer ülkelerde tespit edilen BRSV ve HRSV genotipleri ile karşılaştırıldı ve soy ağacı oluşturuldu. RT-PCR sonucu BRSV yönünden pozitif olduğu tespit edilen örneklerden BRSV izolasyonu amacıyla MDBK hücre kültürü kullanıldı. BRSV'ye karşı oluşan antikorlar ELISA ile tespit edildi.
Çalışmada real time RT-PCR ile incelenen toplam 314 örnekten 14 örnekte (%4.4) BRSV-RNA saptandı. BRSV-N geni hedeflenerek yapılan real time RT-PCR ile pozitif bulunan örneklerden BRSV-G geni hedeflenerek yapılan RT-PCR çalışmaları sonucunda 4 nazal/orofarengeal svab ve 1 akciğer örneğinin sekans analizi yapıldı. Sekans ve filogenetik analizler sonucu oluşturulan soyağacı verilerine göre bu çalışmada saptanan genotiplerin daha önce ülkemizde tespit edilen ve Gen Bankası'na bildirilen BRSV-G geni dizilimleri ile %89-%98 oranında benzer olduğu ve BRSV Subgrup III'e ait olduğu bulundu. Diğer ülkelerde saptanan BRSV genotipleri ile karşılaştırıldığında Amerika'da ve Çekya'da bildirilen genotipler ile arasında %90-%93 oranında en yüksek benzerlik saptandı. Bu çalışmada saptanan BRSV genotipleri, ülkemizde tespit edilen ve Gen Bankası'na bildirilen HRSV-G geni ile karşılaştırıldığında %43-%48 benzerlik bulundu. MDBK hücre kültüründe yapılan virus izolasyon çalışmalarında RT-PCR ile BRSV pozitif olarak tespit edilen örneklerden virus izole edilemedi. Aşısız ve aşılı buzağı ve genç sığırlardan alınan toplam 162 kan serumu örneğinden 76 örnekte (%46,9) BRSV seropozitifliği saptandı.
Sonuç olarak, BRSV'nin hızlı tanısı amacıyla prob temelli real time RT-PCR,  BRSV'de olabilecek değişiklik ve mutasyonların takibi için ise BRSV-G geni hedeflenerek sekans analizleri ve filogenetik analizler kullanılabilir. Aşılamalara rağmen ülkemizde virus sirküle olmaktadır bu nedenle BRSV infeksiyonlarına yönelik araştırmalar, aşılamalar ve eradikasyon çalışmalarının devam etmesinde yarar vardır.

Abstract:
Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV) causes respiratory system infections in cattle of all age groups and economic losses as a result of death and treatment costs, especially in calves and young cattle. 
The aim of this PhD thesis was rapid diagnosis of BRSV by real time RT-PCR, partial amplification of the BRSV- G gene by RT-PCR, sequence and phylogenetic analyses and comparison with other BRSV and HRSV (Human Respiratory Syncytial Virus) genotypes in the GenBank from our country and other countries by generating phylogenetic trees. Virus isolation from BRSV positive samples was also planned to be used in vaccine research and other studies. It was also aimed to investigate the immune status of animals by detecting specific antibodies against BRSV. For this aims, farms localized in Trakya regions and Usak province were visited, samples were taken from calves and young cattle which shows respiratory system disorders. These samples were analyzed by real time RT-PCR using BRSV-N gene specific primers and probe. Samples found positive by real time RT-PCR were further analyzed for sequencing by RT-PCR using BRSV-G gene specific primers. The results of the sequence and phylogenetic analyzes were compared with the genotypes BRSV and HRSV reported from our country and other countries, and phylogenetic trees were generated. Virus isolation studies were performed by inoculating RT-PCR positive samples in MDBK cell cultures. Antibody response to BRSV was measured in sera by ELISA. 
In this study, BRSV-RNA was detected in 14 (4,4%) of the 314 samples by real time RT-PCR. RT-PCR was performed by targeting BRSV-G gene specific primers on 4 nasal/oropharyngeal swab and 1 lung sample for sequencing. Phylogenetic analysis of these sequences indicated that the BRSVs were clustered in Subgroup III and were closely related (89%-98%) to previously identified Turkish genotypes. Sequences of 4 nasal/oropharyngeal swab and 1 lung sample compared with the BRSV genotypes reported from other countries, 90%-93% the highest similarity was found with the genotypes reported in the USA and Czechia. When sequences of 4 nasal/oropharyngeal swab and 1 lung sample compared with the HRSV genotypes reported from our country, 43%-%48 similarity was found. No virus could be isolated from the samples tested. Antibodies to BRSV were detected in 76 of a total of 162 vaccinated and unvaccinated calves sera (46,9%).
In conclusion, probe based real time RT-PCR can be applied for rapid diagnosis. BRSV-G gene sequence analyzes and phylogenetic analyzes can be used to detect mutations in BRSV G gene. It is important that BRSV infections are detected in spite of vaccination. For this reason, further studies are necessary on surveyans, vaccination and eradication of BRSV infections.