İnfeksiyöz bursal hastalık virusunun revers transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile teşhisi ve moleküler tiplendirilmesi
Diagnosis of infectious bursal disease virus by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and its molecular characterization
Yazar: GAZEL AYÇA KURTBEYOĞLU
Danışman: PROF. DR. MEHMET AKAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) = Reverse transcription polimerase chain reaction ; Tavuklar = Chickens ; Virüsler = Viruses

Özet:
İnfeksiyöz Bursal Hastalık (IBD), tavuklarda klinik olarak ölüm ve verim kayıplarına, subklinik seyrinde ise kalıcı immunsupresyona neden olan viral bir hastalıktır. Hastalığın etkeni olan infeksiyöz bursal hastalık virüsü, Birnaviridae familyasına ait Avibirnavirus cinsi içinde yer alan çift segmentli bir RNA virüsüdür. Yapısında beş farklı viral protein barındırmakta olup bunlar arasında VP1 ve VP2 proteinleri moleküler teşhis ve karakterizasyonda kullanılmaktadır. Bu tezde, Türkiye'deki broiler, yumurtacı ve damızlık tavuk işletmelerinden alınan bursa Fabricius ve dalak numunelerinde infeksiyöz Bursal Hastalık virusunun revers ranskriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile tespit edilmesi, bu suşların hedef gen bölgelerinin dizileme çalışması sonrasında moleküler tiplendirilmesi ve filogenetik analizlerinin yapılması amaçlanmıştır. 

Tez çalışması kapsamında, 2022-2023 yılları arasında Türkiye'nin çeşitli coğrafik bölgelerinde bulunan farklı yetiştirme tiplerindeki (broiler, yumurtacı ve damızlık) işletmelere ait 50 kümesten İnfeksiyöz Bursal Hastalık şüpheli tavuklardan alınan bursa Fabricius ve dalak numuneleri incelendi. Her kümesten 5 adet bursa Fabricius ve dalak numuneleri havuz numunesi haline getirilip nükleik asit ekstraksiyonu yapıldı. Elde edilen nükleik asitler, ilk aşamada VP2 gen spesifik primerlerle RT-PCR ile incelendi. VP2 pozitif bulunan bursa Fabricius numunelerinin arasından klinik bulgular ve aşılama bilgileri göz önünde bulundurularak seçilen numuneler, RT-PCR ile VP1 geni yönünden analiz edildi. Pozitif numunelerde saptanan suşların VP2 ve VP1 gen bölgeleri Sanger dizileme tekniği ile dizilendi. Elde edilen diziler, belirlenen referans suşlar ile BLAST yazılımında karşılaştırıldı ve filogenetik analiz ile karşılaştırmalı olarak değerlendirildi. 

Analiz edilen toplamda 50 adet bursa Fabricius numunesinin 30 (%60) adedi, RT-PCR işlemi ile VP2 geni yönünden pozitif olarak saptandı. VP2 geni yönünden pozitif olarak saptanan 30 adet numuneden 25 adeti broiler, 3 adeti yumurtacı ve 2 adeti damızlık sürülere ait numunelere aitti. Bunlar arasından seçilen 8 adet numune (7 adet broiler bir adet yumurtacı) RT-PCR ile VP1 geni spesifik primerler ile analiz edildi. RT-PCR neticesinde saptanan IBDV suşlarının VP2 gen bölgeleri Sanger dizileme yöntemiyle dizilenip belirlenen referans suşlarla karşılaştırıldığında, broiler sürülerde saptanan iki suşun yüksek virulanslı IBDV (vvIBDV) olduğu, diğerlerinin ise klasik suşlar olduğu belirlendi. Yumurtacı ve damızlık numunelerinden saptanan suşların ise klasik suşlar olduğu ve bu bulgunun yapılan aşılamalar ile uyumlu olduğu bulundu. Suşların VP1 gen bölgeleri dizilenip referans suşlarla karşılaştırıldığında ise broiler numunelerinde VP2 geni yönünden vvIBDV olarak saptanan iki virüsün VP1 geninin klasik bir suşla benzerlik gösterdiği, VP2 geni yönünden klasik bir suş olarak saptanan iki virüsün VP1 gen bölgelerinin ise vvIBDV suşlarıyla yüksek benzerlik oranına sahip olduğu tespit edildi. Diğer broiler numunelerinde hem VP2 hem de VP1 geni bakımından klasik suşlar saptanmış olsa da bu numunelerin iki gen bölgelerinin de farklı suşlarla yüksek benzerlik oranlarına sahip olduğu gözlendi. Yumurtacı sürüden seçilen numunede saptanan suşun VP1 geni ise VP2 geninde saptanan suş ile benzerlik gösterdiği belirlendi.

Elde edilen sonuçlar, klinik ya da subklinik enfeksiyona neden olan saha suşlarında reassortment bulunduğunu ortaya koydu. Diğer yandan vektör aşıyla aşılanmış hayvanlarda farklı klasik aşı suşlarının saptanması ise saha suşlarının kümeslerde kaldığını ve sürülere bulaştığını gösterdi. Yapılan bu tez çalışması, Türkiye'de IBDV'nin hem VP2 hem de VP1 genlerinin incelendiği ve saptanan suşların moleküler olarak tiplendirilip filogenetik analizinin yapıldığı ilk çalışma olma özelliği taşımaktadır. Bu çalışmada elde edilen bulgular, Türkiye'de hem klinik hem de subklinik enfeksiyon görülen broiler kümeslerinde IBDV'ye ait reassortant suşların varlığını kanıtlar niteliktedir.

Abstract:
Infectious bursal disease (IBD) is a viral disease that clinically causes death and productivity losses, and subclinically permanent immunosuppression in chickens. Infectious bursal disease virus, which is the causative agent of the disease, is a bi-segmented RNA virus belonging to the genus Avibirnavirus in the family Birnaviridae. It contains five viral proteins in its structure, among which VP1 and VP2 proteins are analyzed for molecular diagnosis and characterization. In this thesis, it was aimed to detect infectious bursal disease virus in bursa of Fabricius and spleen samples taken from broiler, layer and breeder chicken farms in Turkey by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), molecular characterization of these strains after sequencing of the target gene regions, and phylogenetic analysis of the strains.

Within the scope of the thesis study, bursa of Fabricius and spleen samples taken from chickens suspected of infectious bursal disease from 50 chicken flocks of different poultry types (broiler, layer, and breeder) in various geographical regions of Turkey between 2022 and 2023 were examined. Five bursa of Fabricius and spleen samples from each flock were pooled and nucleic acid extraction was performed. First, the obtained nucleic acids were examined by RT-PCR with VP2 gene-specific primers. Samples selected among the bursa of Fabricius samples found to be VP2 positive, considering clinical findings and vaccination information, were analyzed for the VP1 gene by RT-PCR. VP2 and VP1 gene regions of the strains detected in positive samples were sequenced by Sanger sequencing. The obtained sequences were compared with the sequences of reference strains in BLAST software and all of them were evaluated comparatively by phylogenetic analysis.

Of the total 50 bursa of Fabricius samples analyzed, thirty samples (60%) were detected positive for the VP2 gene by RT-PCR. Of the 30 samples found to be positive for the VP2 gene, twenty-five sample were taken from broiler flocks, three from layer flocks and two from breeder flocks. 8 samples selected among these (Seven from broilers and one from layer) were analyzed by RT-PCR with VP1 gene specific primers. When the VP2 gene regions of the IBDV strains detected as a result of RT-PCR were sequenced by the Sanger sequencing method and compared with the sequences of reference strains, it was determined that the two strains detected in broiler flocks were very virulent IBDV (vvIBDV) and the others were classical strains. It was found that the strains detected in the layer and breeder samples were classical strains, and this finding was compatible with the vaccinations. When the VP1 gene regions of the strains were sequenced and compared with the reference strains, it was determined that the VP1 gene of the two viruses found in broiler samples whose VP2 genes were identified as vvIBDV was similar to a classical strain, and the VP1 gene regions of the two viruses whose VP2 genes were detected as a classical strain were found to have a high similarity with vvIBDV strains. Although classical strains were detected in other broiler samples when both VP2 and VP1 genes were analyzed, it was observed that both gene regions of these samples had high similarity rates with different strains. It was determined that the VP1 gene of the strain detected in the sample selected from the layer flock was similar to the same strain detected in its VP2 gene.

The obtained results revealed that there was reassortment in field strains causing clinical or subclinical infection. On the other hand, the detection of different classical vaccine strains in animals vaccinated with the vector vaccine showed that the field strains remained in the poultry houses and infected the flocks. This thesis is the first study in Turkey in which both the VP2 and VP1 genes of IBDV were examined and the detected strains were molecularly characterized and phylogenetically analyzed. The findings obtained in this study prove the presence of reassortant strains of IBDV in broiler houses with both clinical and subclinical infections in Turkey.