Metforminin invitro retina pigment epiteli hücrelerinde fibrogenezise olan etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of metformin on fibrogenesis in invitro retina pi̇gment epi̇theli̇al cells
Yazar: RUKİYE ÇETİNKAYA
Danışman: DOÇ. DR. JÜLİDE CANAN UMURHAN AKKAN
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Epitel hücreleri = Epithelial cells ; Göz hastalıkları = Eye diseases ; Metformin = Metformin ; Retina = Retina ; Retina hastalıkları = Retinal diseases ; Transforme edici büyüme faktörü-beta = Transforming growth factor-beta ; Vitreus = Vitreous

Özet:
GİRİŞ:Proliferatif vitreoretinopati, retina dekolmanı cerrahisi sonrası nükslerin en önemli sebeplerinden biridir. Proliferatif vitreoretinopatinin patogenezi ile ilgili çalışmalarda, epitelyal mezenkimal dönüşüm sürecinin önemli bir rol oynadığı görülmüştür. Epitelyal mezenkimal dönüşüm; epitel hücrelerinin farklı fenotiplerini kaybettiği ve mezenkimal benzeri hücrelere dönüştüğü biyolojik bir süreçtir. Epitelyal-mezenkimal dönüşüm geçiren retina pigment epiteli hücrelerinin proliferasyon, göç etme, migrasyon ve kontraksiyon yeteneklerinde artış görülür. Bu sürecin sonunda proliferatif vitreoretinopatinin önemli bir parçası olan fibrozis gelişir. Epitelyal mezenkimal dönüşümün ana tetikleyicisi TGF-β dır.
      AMAÇ: Çalışmamızda daha önce farklı dokularda epitelyal-mezenkimal dönüşümü ve fibrogenezisi inhibe ettiği gösterilmiş olan metforminin, invitro retina pigment epiteli hücrelerinde TGF-β2 ile indüklenen epitelyal mezenkimal dönüşüm sürecine olan etkisi incelenmiştir. 
      GEREÇ VE YÖNTEM: İnvitro ortamda inkübe edilmiş insan retina pigment epiteli hücre grupları üzerine  TGF-β2, metformin ve TGF-β2+metformin uygulandı. Uygulama sonrası, ATP testi ile hücre canlılığı, Western Blot  protein elektroforezi ile ZO-1, α-SMA, vimentin, SMAD2 SMAD3, pSMAD2, pSMAD3 protein ekspresyonu, yara iyileşmesi testi ile hücre migrasyon düzeyi, kollajen jel kontraksiyon testi ile kontraksiyon düzeyi değerlendirildi; veriler kontrol grubu ile karşılaştırıldı.   
      BULGULAR:   Western Blot protein elektroforezinde epitelyal belirteç olan ZO-1 ekspresyonunun,  TGF-β2 grubunda  kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azaldığı (p<0.05), TGF-β2+metformin grubunda ise kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı saptandı. Mezenkimal belirteç olan α-SMA  ekspresyonunun, TGF-β2 grubunda kontrol grubuna göre  çok yüksek düzeyde anlamlı  olarak arttığı (p<0.001), TGF-β2+metformin grubunda bu artışın daha az olduğu (p<0.01) izlendi. Mezenkimal belirteç olan vimentin ekspresyonunda, TGF-β2 grubunda kontrol grubuna göre  çok yüksek düzeyde anlamlı  arttığı (p<0.001), TGF-β2+metformin grubunda bu artışın daha az olduğu tespit edildi (p<0.05).  TGF-β/SMAD sinyal yolunun aktif proteinleri olan pSMAD2 ve pSMAD3 ekspresyonu değerlendirildiğinde, pSMAD2' nin TGF-β2 grubunda kontrol grubuna göre  çok yüksek düzeyde anlamlı  arttığı (p<0.001), TGF-β2+metformin grubunda  ise kontrol grubuna göre anlamlı düzeyde azaldığı tespit edildi (p<0.05). pSMAD3'ün TGF-β2 grubunda kontrol grubuna göre  çok yüksek düzeyde anlamlı olarak arttığı (p<0.001), TGF-β2+metformin grubunda  kontrol grubuna göre anlamlı fark olmadığı saptandı. Yara iyileşmesi testi sonuçlarında; hücre migrasyon düzeyinde, TGF-β2 grubunda kontrol grubuna göre  çok yüksek düzeyde anlamlı  artış izlendi  (p<0.001), TGF-β2+metformin grubunda kontrol grubuna göre fark izlenmedi. Kollajen jel kontraksiyon testi sonuçlarında; kontraksiyon düzeyinde TGF-β2 grubunda kontrol grubuna göre  çok yüksek düzeyde anlamlı  olarak artış  olduğu (p<0.001), TGF-β2+metformin grubunda  bu artışın daha az olduğu saptandı (p<0.05).
      SONUÇ: Metformin, epitelyal-mezenkimal dönüşüm geçiren retina pigment epiteli hücrelerinde epitelyal belirteçlerin sentezini arttırmış , mezenkimal belirteçlerin sentezini ise azaltmıştır. TGF-β/SMAD sinyal yolundaki SMAD2 ve SMAD3 proteinlerinin fosforilasyonunu azaltarak bu sinyal yolunu baskılamıştır.  Ayrıca metforminin,  epitelyal-mezenkimal dönüşüm geçiren retina pigment epiteli hücrelerinin hücresel migrasyon düzeyini ve kontraksiyon düzeyini de azalttığı gözlenmiştir. 
      Bu sonuçlar, metforminin invitro retina pigment epiteli hücrelerinde epitelyal-mezenkimal dönüşümü ve fibrogenezis gelişimini baskıladığını göstermektedir. 

ANAHTAR KELİMELER:  Metformin,  Proliferatif Vitreoretinopati, Epitelyal-Mezenkimal Dönüşüm, Retina Pigment Epiteli Hücreleri, TGF-β2

Abstract:
Proliferative vitreoretinopathy is one of the most important causes of recurrence after retinal detachment surgery. In studies on the pathogenesis of proliferative vitreoretinopathy, ''Epithelial-to-Mesenchymal Transition'' has been shown to play an important role. Epithelial-to-mesenchymal transition; it is a biological process in which epithelial cells lose their differentiated phenotypes and become mesenchymal-like cells. Retinal pigment epithelial cells undergoing epithelial-to-mesenchymal transition; proliferation, migration and contraction ability increases. Fibrosis, an important part of proliferative vitreoretinopathy, develops at the end of this process. The main trigger of epithelial-to-mesenchymal transition is TGF-β.
PURPOSE: In our study, the effect of metformin which has been shown to inhibit epithelial-to-mesenchymal transition and fibrogenesis in different tissues previously, on TGF-β2-induced epithelial-to-mesenchymal transition process in invitro retinal pigment epithelial cells was investigated.
MATERİALS abd METHODS: TGF-β2, metformin and TGF-β2 + metformin were applied to human retinal pigment epithelial cell groups incubated in vitro. After the application; cell viability by ATP test, ZO-1, α-SMA, vimentin, SMAD2, SMAD3, pSMAD2 and pSMAD3 protein expression by Western Blot Protein Electrophoresis, cell migration level by wound healing test and contraction level by collagen gel contraction test were evaluated, the data were compared with the control group.
RESULTS: In Western Blot protein electrophoresis, the expression of ZO-1, which is an epithelial marker, decreased significantly in the TGF-β2 group compared to the control group (p <0.05), but there was no statistically significant difference in the TGF-β2 + metformin group compared to the control group. It was observed that α-SMA expression, which is a mesenchymal marker, was significantly increased in the TGF-β2 group compared to the control group (p <0.001), whereas this increase was lower in the TGF-β2 + metformin group (p <0.01). The expression of vimentin, which is a mesenchymal marker, was significantly higher in the TGF-β2 group than in the control group (p <0.001), but this increase was less in the TGF-β2 + metformin group (p <0.05). When the expression of pSMAD2 and pSMAD3, the active proteins of the TGF-β / SMAD signaling pathway were evaluated, it was found that pSMAD2 increased significantly in the TGF-β2 group compared to the control group (p <0.001) and decreased significantly in the TGF-β2 + metformin group compared to the control group. (p <0.05). It was found that pSMAD3 increased significantly in TGF-β2 group compared to the control group (p <0.001), and there was no significant difference in TGF-β2 + metformin group compared to control group. In wound healing test results; There was a significant increase in cell migration level in TGF-β2 group compared to the control group (p <0.001). There was no difference in TGF-β2 + metformin group compared to the control group. Collagen gel contraction test results; The level of contraction was significantly higher in the TGF-β2 group than in the control group (p <0.001), whereas this increase was less in the TGF-β2 + metformin group (p <0.05).
CONCLUSION: Metformin increased the synthesis of epithelial markers and decreased the synthesis of mesenchymal markers in retinal pigment epithelial cells undergoing epithelial-to-mesenchymal transition. Metformin suppressed the TGF-β / SMAD signaling pathway by reducing phosphorylation of SMAD2 and SMAD3 proteins. In addition, it has been observed that metformin reduces cellular migration and contraction levels of retinal pigment epithelial cells undergoing epithelial-to-mesenchymal transition.
       These results show that metformin suppresses epithelial-to-mesenchymal transition and development of fibrogenesis in invitro retinal pigment epithelial cells.
KEYWORDS: Metformin, Proliferative Vitreoretinopathy, Epithelial-to-Mesenchymal Transition, Retinal Pigment Epithelial cells, TGF-β2