IRE1-JNK yolağı protein-protein ve protein-ligand etkileşimlerinin moleküler dinamik simülasyon yöntemiyle araştırılması
Investigation of protein-protein and protein-ligand interactions in IRE1-JNK pathway by molecular dynamic simulation method
Yazar: ZEKERİYA DÜZGÜN
Danışman: DOÇ. DR. FATMA ZUHAL EROĞLU
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antikolesteremik ajanlar = Anticholesteremic agents ; Benzetim = Simulation ; Benzetim tekniği = Simulation technique ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Flavonoidler = Flavonoids ; Kardiyovasküler hastalıklar = Cardiovascular diseases ; Moleküler dinamik = Molecular dynamic ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
IRE1-JNK yolağı Endoplazmik Retikulum (ER) stresine karşı hücrenin yanıt verdiği en güçlü sinyal yolağıdır. Hipoksi gibi koşullarda aşırı ER stresine bağlı olarak bu yolak üzerinden apoptotik mekanizma tetiklenerek hücre ölümü meydana gelmektedir. Kardiyovasküler hastalıklarda hücreler aşırı ER stresine maruz kalabilmekte ve apoptoza bağlı hücre ve doku kaybı meydana gelebilmektedir. Kardiyovasküler hastalıklarda etkili Statin, ACE İnhibitörleri, Anti-Aritmik İlaçlar ve Flavonoid'lerin IRE1-JNK yolağı üzerindeki IRE1, ASK1 ve JNK1 ile etkileşimi tam olarak bilinmemektedir. Ayrıca IRE1-JNK yolağının en önemli başlatıcı ya da durdurucu faktörü olan BİP-IRE1LD bağlanması bilinmesine karşın bağlanmanın moleküler mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır. Çalışmamızda kardiyovasküler hastalıklarda etkili etken maddeler ve Flavonoid'lerin kendi etkileri dışında IRE1-JNK yolağının inhibisyonunda rol oynayıp oynamadıklarını belirlemek amacıyla IRE1, ASK1 ve JNK1 ile etkileşimleri moleküler kenetleme, moleküler dinamik simülasyon ve serbest enerji hesaplamalarıyla araştırıldı. Ayrıca BİP'in konformasyonel dinamiği ve BİP-IRE1LD etkileşiminin moleküler mekanizmasını aydınlatmak hedefiyle moleküler dinamik simülasyon ve serbest enerji hesaplamaları yapıldı. Olası BİP-IRE1LD bağlanma paternlerini belirlemek amacıyla iri taneli model ve kübik oryantasyonda moleküler dinamik simülasyonlar gerçekleştirildi. Yaptığımız çalışmada BİP'in yüksek esneklikteki SBDα alt domaininin kısa süreli burkulması ve tekrar eski durumuna dönmesi sonucu serbest enerji yüzeyinde minima meydana geldiği gözlendi. Bağlanma konformasyonu bilinen farklı büyüklük ve esneklikte olan Ddi1 ubikuitin benzeri (UBL) domaini-ubikuitin kompleksi (2MWS), ubikuitin-USP2 kompleksi (2HD5), kimerik SDZ CHI621'in fab fragmenti (1MIM) ve Sil1-BİP komplekslerinin (3QML) bağlanma paternini iri taneli kübik oryantasyon yaklaşımı ile doğru tahmin etmek için istatistiksel olarak ROC eğrisi ile hesaplandığında  F-değeri ve doğruluğu (ACC) 0,88 olarak ölçüldü. AUROC değeri ise 0,94 olarak belirlendi. BİP-IRELD etkileşiminin olası bağlanma paternleri taneli kübik oryantasyon yaklaşımı ile araştırıldığında, IRE1LD'in 4. bölgesi içinde yer alan düzensiz domainin BİP-NBDIIβ açık formunun kapalı forma göre daha yüksek afinite ile bağlandığı ayrıca BİP-SBDα alt domainin bağlanmada direkt rol oynadığı gözlendi. IRE1, ASK1 ve JNK1 ile kardiyovasküler hastalıklarda kullanılan etken maddeler ile Flavonoid'lerin etkileşimlerinin araştırıldığı bu çalışamada proteinlerin fosforilasyonunun inhibisyonunda Statinler'in en etkili moleküller olabileceği gözlendi. Ayrıca yaptığımız Umbrella Örnekleme Serbest Enerji Hesaplamlarında Statin'lerden Atorvastatin ve Pitavastatin ile Flavonoid'lerden Norizalpin, Chrysin ve Luteolin'in yüksek ortalama kuvvet potansiyelleri ile IRE1-JNK yolağının inhibisyonunda güçlü aday moleküller olabileceği gösterildi. Yaptığımız bu çalışmalar ile belirlenen BİP-IRE1LD bağlanma paterninin BİP ve IRE1LD hedefli  ileri teröpatik çalışmalara ışık tutacağı, İri taneli kübik oryantasyon yaklaşımının hızlı ve kolay kullanımı için algoritmalar yazılarak yüksek esneklikteki protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesinde kullanımının faydalı olabileceği ve IRE1-JNK yolağı etken madde etkileşimleri sonucu elde edilen veriler ışığında Statinler üzerinden geliştirilerek etken türev maddelerin ER stresi kaynaklı apoptozun önlenmesinde etkili olabileceğine  inanmaktayız.
Bu araştırmada yer alan kısmi nümerik hesaplamalar TÜBİTAK ULAKBİM, Yüksek Başarım ve Grid Hesaplama Merkezi'nde (TRUBA kaynaklarında) gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
The IRE1-JNK pathway is the strongest signaling pathway to respond to ER stress in the cell. Due to excessive ER stress in some conditions such as hypoxia, cell death occurs by initiating the apoptotic mechanism via this pathway. In cardiovascular diseases, cells may be exposed to excessive ER stress. Therefore, cells and tissue loss may occur due to apoptosis. The interaction of statins, ACE inhibitors, anti-arrhythmic drugs and flavonoids that effective in cardiovascular diseases with IRE1, ASK1 and JNK1 on the IRE1-JNK pathway is not fully known. In addition, binding of BİP-IRE1LD complex that is most important initiating or stopping factor of the IRE1-JNK pathway is known, but the molecular mechanism of the binding is not fully elucidated. In our study, the interactions of IRE1, ASK1 and JNK1 with the small molecule drugs and flavonoids were investigated by "molecular docking", "molecular dynamics simulation" and "free energy calculations" to determine whether these drugs and flavonoids could play a role or not in the inhibition of the IRE1-JNK pathway in cardiovascular diseases. In addition, molecular dynamic simulation and free energy calculations were performed to elucidate the conformational dynamics of BİP and molecular mechanism of BİP-IRE1LD binding interaction. In the coarse-grained model and cubic orientations, Molecular dynamic simulations were carried out to determine possible BİP-IRE1LD binding patterns. In our study, short term bending of highly flexible SBDα subdomain and returning to the old state was observed that there was a minima on the free energy surface of BİP. Whether correctly predicted the binding pattern of the four different protein complexes that are Ddi1 ubiquitin-like (UBL) domain-ubiquitin complex (2MWS), ubiquitin-USP2 complex (2HD5), fab fragment (1MIM) of chimeric SDZ CHI621 and Sil1-BIP complexes (3QML) known with their binding conformation by coarse-grained cubic orientation approach were statistically measured with F-value and accuracy (ACC) and calculated as 0,88. AUROC value was determined as 0.94. When the possible binding patterns of the BİP-IRELD interaction were investigated by the coarse-grained cubic orientation approach, the disordered domain of the IRE1LD IV. region was bound to the BİP-NBDIIβ open form with a higher free energy difference in comparison with closed form, in addition BİP-SBDα sub-domain played a direct role to the binding of IRE1LD. In the study of the interaction of small molecule drugs and Flavonoids that are effective in cardiovascular diseases with IRE1, ASK1 and JNK1, it was obsorved that Statins could be the most effective molecules in the inhibition of phosphorylation of these proteins. Furthermore, free energy calculations by umbrella sampling were shown that Norizalpine, Chrysin, Luteolin from flavonoids and Atorvastatin, Pitavastatin from Statins could be strong candidate molecules in the inhibition of IRE1-JNK pathway with high potential of mean force. The BİP-IRE1LD binding pattern determined by these studies will shed light on BİP and IRE1LD-targeted therapeutic studies. It may be useful to write algorithms for rapid and easy use of coarse-grained cubic orientation approach to determination of high flexible protein-protein interactions. In the light of the data that we have obtained from result of small molecule interactions with the IRE1-JNK pathway, the molecules to be derived from Statins could be thought effective in preventing severe ER stress induced apoptosis.
The numerical calculations reported in this paper were partially performed at TUBITAK ULAKBIM, High Performance and Grid Computing Center (TRUBA resources).