Pleurotus eryngii var. ferulae mantarından lektin saflaştırılması ve bazı biyolojik aktivitelerinin incelenmesi
Purification of lectin from pleurotus eryngii var ferulae mushroom and investigation some of its biological properties
Yazar: THOIBA MOGAHID HUSSEIN SELIMAN
Danışman: PROF. DR. NURTEN ÖZSOY
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Lektinler = Lectins ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Makrofajlar = Macrophages ; Mantarlar = Fungi ; Pleurotus eryngii = Pleurotus eryngii ; Sitokinler = Cytokines

Özet:
Bu çalışmada toz haline getirilmiş Pleurotus eryngii var. ferulae mantarından hazırlanan ham ekstresinden % 80 amonyum sülfat ile çöktürme, DEAE-Sefaroz anyon değiştirici ve Sefadeks G-100 jel filtrasyonu kromatografi yöntemleri kullanılarak lektin 18,3 kez saflaştırıldı. Saflaştırılan lektinin spesifik aktivitesi 5 120 HB/mg protein olarak hesaplandı, molekül ağırlığı ise denatürasyon ve indirgeme koşullarında yapılan SDS-PAGE'de 43 kDa olarak belirlendi. 
Pleurotus eryngii var. ferulae lektinin (PEFL), lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılmış RAW 264.7 makrofajlarda, siklooksijenaz-2 (COX-2) ve indüklenen nitrik oksit sentaz (iNOS) gibi enzimlerin, tümör nekroz faktör-α (TNF-α), interlökin-1β (IL-1β), interlökin-6 (IL-6) ve interferon- (INF-) gibi pro-inflamatuar ile interlökin-10 gibi anti-inflamatuar sitokinlerin ve prostaglandin E2 (PGE2) üretimi üzerine olan inhibitör etkisi araştırıldı. PEFL'in, LPS ile uyarılmış PGE2, TNF-α, IL-1β, IL-6 ve INF- üretimi üzerine güçlü bir inhibitor etki gösterdiği sonucuna varıldı. LPS uygulanan hücre grubunda, PGE2, TNF-α, IL-1β, IL-6 ve INF- düzeylerinde kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış saptanırken (p<0,05), LPS+PEFL uygulanan hücre grubunda yalnız LPS uygulanan hücre grubuna göre PGE2 ve sitokin düzeylerinde de anlamlı bir azalma olduğu tespit edildi (p<0,05). Western Blot analiz sonuçlarına göre, kontrol grubunda, iNOS ve COX-2 proteinleri oldukça az düzeyde ifade edildi. iNOS ve COX-2 düzeyleri LPS uygulanan gruplarda anlamlı bir şekilde artmışken (p<0,05), LPS+PEFL uygulanan gruplarda doza bağlı olarak anlamlı bir şekilde azaldığı görüldü (p<0,05). Ayrıca, PEFL uygulaması yapılan LPS grubuna ait hücre süpernatantların IL-10 düzeyinde ise, LPS grubuna oranla, anlamlı bir artış olduğu tespit edildi (p<0,05).
Bu çalışmada, PEFL'in anti-inflamatuar etkisinin, iNOS ve COX-2 enzimleri ve sitokin üretimi üzerine olan inhibe edici etkisinden ileri geldiği sonucuna varıldı.

Anahtar Kelimeler: Pleurotus eryngii var. ferulae, Mantar, Lektin, Lipopolisakkarit, RAW 264.7 makrofajlar, Sitokinler

Abstract:
In this study the lectin from the crude extract of mushroom Pleurotus eryngyii var. ferulae (PEFL) was purified to homogeneity by 80 % ammonium sulfate fractional precipitation, DEAE Sepharose-4B anion exchange and Sephadex G-100 gel filtration chromatographies. The enzyme was obtained in 18.3 % yield. The specific activity of the purified enzyme was calculated as 5120 HB/mg protein, the molecule weight was found to be 43 kDa determined by SDS-PAGE under denaturing and reducing conditions. 
In this study we also evaluated the effect of PEFL on lypopolysaccaride (LPS)-induced levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxigenase-2 (COX-2) enzymes in RAW 264.7 macrophages and assessed the inhibitory effect of PEFL on the production of pro-inflammatory cytokines such as tumor necrose factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) and interferon- (INF-) and anti-inflammatory cytokine IL-10 as well as prostaglandin E2 (PGE2) . We found that PEFL is a potent inhibitor of LPS-induced PGE2, TNF-α, IL-1β, IL-6 and INF-. In the LPS treated group PGE2, TNF-α, IL-1β and IL-6 levels were significantly (p < 0,05) higher than those of the control group. A significant (p < 0,05) reduction was observed in the LPS+PEFL treated groups (p < 0,05), compared with the only LPS treated group. In addition, a significant increase in the IL-10 levels was observed in the LPS+PEFL treated groups (p < 0,05), compared with the only LPS treated group. As determined by Western Blotting analysis, in the control groups, iNOS, and COX-2 protein levels were slightly detectable. However, in the LPS treated groups, iNOS and COX-2 were markedly expressed by LPS, whereas in the LPS+PEFL treated groups, PEFL significantly inhibit the expressions of these proteins in a concentration-dependent manner. 
These results suggest that the inhibitions of the iNOS and COX-2 expressions and PGE2 and cytokines production are responsible for the anti-inflammatory effects of PEFL.

Keywords: Pleurotus eryngii var ferulae, Mushroom, Lectin, Lipopolysaccharide, RAW 264.7 Macrophage, Cytokines.