DNAJC9 geninin meme kanserindeki ifadesi, genetik/ epigenetik alterasyonları ve prognostik değeri
Expression, genetic/epigenetic alterations and prognostic value of DNAJC9 gene in breast cancer
Yazar: OYA İNCEKARA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ TOLGA ACUN
Zonguldak Bülent Ecevit Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Metilasyon = Methylation ; Sağkalım = Survival ; İfade = Statement

Özet:
Meme kanseri, dünyada kadınlar arasında görülme sıklığı en yüksek kanser türüdür. Heterojen yapıda ve kemoterapiye direnç mekanizmaları geliştirebilen bir kanser türü olması sebebiyle, meme kanserinin tedavisine, tanısına ve prognozuna yönelik hedef genlerin belirlenmesi önemlidir. Isı şoku proteinleri (HSP) son yıllarda sıklıkla kanserlerle ilişkili gösterilmektedir ve birçoğu biyobelirteç ve anti-kanser ilaç hedefi olarak önerilmiştir. DNAJC9, HSP ailesi üyesidir ve önceki çalışmalarda DNAJC9 ifadesi karsinogenez ve radyoterapi direnci ile ilişkili bulunmuştur. Bu çalışmada, DNAJC9 geninin ifadesi, genetik alterasyonları, promotor metilasyon düzeyi ve meme kanserinde sağ-kalıma etkisi meme hücre hatlarında ve meme kanseri klinik örneklerinde analiz edilmiştir.
DNAJC9 geninin mRNA ifadesi, meme hücre hatlarında (BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231, ZR-75-1, MCF 10A) multipleks semi kantitatif-RT-PCR ve kantitatif-RT-PCR (Q-RT-PCR) yöntemleri ile incelenmiştir. MDA-MB-231 hücre hattındaki DNAJC9 mRNA seviyesi, tümörijenik olmayan meme epitel hücre hattına (MCF 10A) göre yüksek (>2kat) bulunmuştur. BT-20, ZR-75-1, SK-BR-3 hücre hatlarında, MCF 10A 'ya kıyasla anlamlı bir ifade farklılığı gözlenmemiştir. 
Meme kanseri klinik örneklerindeki DNAJC9 ifadesi, meme kanseri alt tiplerini de kapsayacak şekilde Breast Cancer Gene-ExpressionMiner (bc-GenExMiner v4.8) in siliko aracını kullanarak incelenmiştir. DNA mikroarray ve RNA-seq verisetlerine göre; DNAJC9 mRNA ifadesi, basal-benzeri, HER2-E, luminalB alt tiplerinde, normal meme-benzeri örneklere kıyasla anlamlı olarak daha yüksek bulunmuştur (P < 0.0001). DNAJC9 geninin genetik alterasyonları meme hücre hatlarında ve meme kanseri klinik örneklerinde, sırasıyla, dizileme yoluyla ve Sanger-COSMIC veri tabanında araştırılmıştır. Meme hücre hatlarında, DNAJC9 geninin kor promotor bölgesinde mutasyon tespit edilmemiştir. Sanger COSMIC (v95) veri tabanındaki bilgilere göre meme kanseri klinik örneklerinde de mutasyon oranı oldukça düşüktür (<%1). DNAJC9 geninin promotor bölgesi metilasyon durumu, birleşik bisülfitrestriksiyon analizi (COBRA) yöntemi ile meme hücre hatlarında analiz edilmiş ve metilasyon tespit edilmemiştir. Promotor metilasyon düzeyi, UALCAN in siliko aracı ile klinik örneklerde de incelenmiştir. Meme kanseri klinik örneklerinde, alt tiplere ait örneklerde ve normal örneklerde promotor bölgesi hipometile bulunmuştur (beta değeri<0.25). Çalışmanın son kısmında, DNAJC9 geninin mRNA ifadesinin hasta sağkalımına etkisi, DNA mikroarray ve RNA-seq veri setlerinde, Breast Cancer Gene-ExpressionMiner (bc-GenExMiner; v4.8) in siliko aracını kullanarak incelenmiştir. DNAJC9 mRNA ifadesi, meme kanseri hastalarında, tam sağ kalım (OS), hastalıksız sağ kalım (DFS) ve uzak metaztazsız sağ kalım (DMFS) değerlerini olumsuz etkilemektedir.
Sonuç olarak, yüksek DNAJC9 ifadesi meme kanserinde olumsuz sağ kalım değerleri ile ilişkilidir ve bir biyobelirteç adayı olarak önerilebilir. Promotor metilasyonunun DNAJC9 gen ifadesine etkisinin olmadığını düşünmekle birlikte, histon modifikasyonları, miRNA'lar, antisens-RNA'lar gibi diğer epigenetik etmenlerin DNAJC9 ifadesine olan etkileri araştırılmalıdır. DNAJC9 geninin meme karsinogenezindeki öneminin daha iyi anlaşılması için fonksiyonel araştırmalara da ihtiyaç vardır.

Abstract:
Breast cancer is the most common type of cancer among women in the world. It is important to identify target genes for the treatment, diagnosis, and prognosis of breast cancer, since it is a heterogeneous type of cancer that can develop mechanisms of resistance to chemotherapy. Heat shock proteins (HSP) have been shown to be frequently associated with cancers in recent years, and many of them have been proposed as biomarkers and anti-cancer drug targets. DNAJC9 is a member of the HSP family, and DNAJC9 expression has been associated with carcinogenesis and radiotherapy resistance in previous studies. In this study, the expression of DNAJC9 gene, its genetic alterations, the level of promoter methylation and its effect on breast cancer survival were analyzed in breast cell lines and breast cancer clinical samples.
DNAJC9 mRNA expression was examined in breast cell lines (BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231, ZR-75-1, MCF 10A) by multiplex semi-quantitative-RT-PCR and quantitative-RT-PCR (Q-RT-PCR) methods. DNAJC9 mRNA level in the MDA-MB-231 cell line was found to be higher (>2 fold) compared to the non-tumorigenic breast epithelial cell line (MCF 10A). No significant expression difference was observed in BT-20, ZR-75-1, SK-BR-3 cell lines compared to MCF 10A.
DNAJC9 expression in breast cancer clinical samples, including breast cancer subtypes, was examined by using Breast Cancer Gene-Expression Miner (bc-GenExMiner v4.8) in silico tool. According to DNA microarray and RNA-seq datasets; DNAJC9 mRNA expression was significantly higher in basal-like, HER2-E, luminalB subtypes compared to normal breast-like samples (P < 0.0001). Genetic alterations of the DNAJC9 gene were investigated in breast cell lines and breast cancer clinical specimens, by sequencing and in the Sanger-COSMIC database, respectively. No mutations were detected in the core promoter region of the DNAJC9 gene in breast cell lines. According to the information in the Sanger COSMIC (v95) database, the mutation rate in breast cancer clinical samples is low (<%1). The methylation status of the promoter region of the DNAJC9 gene was analyzed by the combined bisulfite restriction analysis (COBRA) method in breast cell lines and no methylation was detected. The level of promoter methylation was also investigated in clinical samples with the in silico vehicle of UALCAN. The promoter region was found to be hypo methylated in clinical breast cancer samples, samples of subtypes, and normal samples (beta value<0.25). In the final part of thestudy, the effect of DNAJC9 mRNA expression on patient survival was examined in DNA microarray and RNA-seq data set susing the Breast Cancer Gene-ExpressionMiner (bc-GenExMiner; v4.8) in silicotool. DNAJC9 mRNA expression negatively affects overall survival (OS), disease-freesurvival (DFS), and distant metastasis-free survival (DMFS) values in breast cancer patients.
In conclusion, high DNAJC9 expression is associated with unfavorable survival values in breast cancer and could be suggested as a biomarker candidate. Although, we think that promoter methylation has no effect on DNAJC9 gene expression, the effects of other epigenetic factors such as histone modifications, miRNAs, antisense-RNAs on DNAJC9 expression should be investigated. Functional studies are also needed to better understand the importance of the DNAJC9 gene in breast carcinogenesis.