HepG2 ve MCF-7 hücre modellerinde desferoksamin ve fenantrolin'in antikanser etkilerinin moleküler düzeyde araştırılması
Molecular investigation of anticancer effects of desferrioxamine and phenanthroline on HepG2 and MCF-7 cell models
Yazar: VELİ KILINÇ
Danışman: PROF. DR. ABDULKERİM BEDİR
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Temel Tıp Bilimleri Bölümü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Deferoksamin = Deferoxamine ; Fenantrolin = Phenanthroline ; Hem = Heme ; Hem oksijenaz = Hem oxygenase ; Hücre dizisi = Cell line ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular

Özet:
HepG2 VE MCF-7 HÜCRE MODELLERİNDE DESFEROKSİAMİN VE FENANTROLİN?İN ANTİKANSER ETKİLERİNİN MOLEKÜLER DÜZEYDE ARAŞTIRILMASI
Endoplazmik retikulum (ER)?de protein katlanmasının çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar altında bozulması topluca 'ER stres' olarak adlandırılır. Protein katlanmasına yardımcı olan moleküler şaperonlardan Grp78, ER stres sensörü, UPR (Unfolded Protein Response) sinyal regülasyonu, protein katlanması, kalsiyum bağlanması, apopitozisin düzenlenmesi,  protein degradasyonunda rol almaktadır. ER homeostazisini sürdürme fonksiyonunun yanında Grp78 anti-apopitotik özellik göstererek tümör proliferasyonu, sağkalım, anjiyogenez ve ilaç direncinde kritik rol oynar. HDAC1 (Histon Deasetilaz 1) enzimi Grp78 ekspresyonunu negatif düzenleyicisidir. HDAC inhibitörleri kanser hücrelerinde differansiasyon artışına, büyümenin durmasına ve apopitozise yol açar. Bununla beraber, sağkalım proteini olan Grp78?i uyararak hücreleri tedaviye dirençli hale getirmektedir. Kanser tedavisinde önemli bir sorun olmaya devam eden rezidü tümörlerin eradikasyonunda konvansiyonel tedaviye ek olarak Grp78?i baskılayan ilaçların kullanılması yeni bir tedavi yaklaşımı olarak düşünülmektedir. Çalışmamızda, HDAC inhibitörü olan TSA ile birlikte Grp78 ekspresyonunu azaltan ajan olarak Desferoksamin ve Fenantrolin kullanarak TSA?nın etkinliğindeki artış göstermek için hücre canlılık deneyleri, UPR cevabı üzerine olan etkilerini incelemek için gen ekspresyon analizi ve desferoksamin (DFO) ve fenantrolinin (PHEN) Grp78 ekspresyonunu azaltma mekanizmasını açıklamak için ChIP deneyi yapıldı.
MCF-7 (16000/kuyucuk) ve HepG2 (9000/kuyucuk) hücreleri 96-kuyucuklu pleytte bir gece kültüre edildi. 500 nM TSA, 150 µM DFO, 25 µM PHEN ve TSA ile birlikte bu iki demir şelatörü ajan 24 saat boyunca muamele edilidi. Daha sonra kantitatif olarak RT-PCR ile Grp78, Grp94, CHOP, HKII, HO-1 MDR-1, MRP-1 ve p53 ekspresyon düzeyleri ölçüldü. TSA?nın çeşitli dozları ile DFO ve PHEN?i birlikte kullanarak hücrelerin sayısı, canlılığı ve çoğalmasını gerçek zamanlı hücre analiz sistemi ile değerlendirildi. HDAC-1 antikor ve Grp78 prometer spesifik primerler kullanarak ChIP deneyi yapıldı.
Glikolizi inhibe eden ve hücre büyümesini bloklayan sentetik bir glukoz analoğu olan 2-deoksiglukoz (2-DG) protein glikozilasyon inhibisyonu yolu ile ER stresini uyarmakta ve Grp78 ekspresyonunu artırmaktadır. 10 mM 2-DG varlığında her iki hücrede yukarıda geçen genlerin ekspresyon düzeylerini çalışıldı ve DFO ve PHEN ile birlikte hücre canlılığı analizi yapıldı.
 DFO ve PHEN?in Grp78, Grp94 ve p53 ekspresyonunu her iki hücredede azalttığını ve HK-2 ekspresyonunu artırdığını bulduk. MCF-7 hücrelerinde TSA?nın artırdığı Grp78, Grp94, HO-1 ve MRP1 ekspresyonunu, HepG2 hücrelerinde ise HO-1, MDR1 ve MRP1 ekspresyonunu DFO ve PHEN?in azalttığını bulduk. Her iki hücrede de CHOP artışı mevcuttu. DFO ve PHEN?in Grp78 ekspresyon azalmasını; HDAC1?leri Grp78 prometer bölgesinde artırarak yaptığı ChIP deneyi ile gösterildi. RTCA (Real Time Cell Analyser) çalışmasında düşük doz TSA? nın DFO ve PHEN ile kombine edildiği gruplarda MCF-7 hücrelerini ilk 24 saatte öldürürken HepG2 hücrelerinde bu etki görülmedi. Benzer bulguları 2-DG? u DFO ve PHEN ile kombine edildiğinde de görüldü.
TSA gibi HDAC inhibitörleri ile adjuvan ajan olarak DFO ve PHEN kullanımı bu ilaçların etkinliğinin artırılmasında ve bu ilaçlara karşı gelişen direncin azaltılmasında yeni bir yaklaşım olabilir. Seçilmiş kanserlerde ve rezidü tümörlerin eradikasyonunda konvansiyonel tedaviye ek olarak Grp78 ve Grp94 ekspresyonunu azaltan DFO ve PHEN? nin kullanılması yeni bir tedavi yöntemi olabileceği gibi bu tür ilaçların geliştirilmesine ön ayak olabilir.  
Anahtar kelimeler: DFO, PHEN, TSA, Grp78, HO-1.

Abstract:
MOLECULAR INVESTIGATION OF ANTICANCER EFFECTS OF DESFERRIOXAMINE AND PHENANTHROLINE ON HepG2 AND MCF-7 CELL MODELS
Disruption of protein folding in endoplasmic reticulum (ER) under various physiological and pathological conditions is collectively called `ER stress?. Grp78, the molecular chaperon serving a function in protein folding, ER stress sensor, UPR (Unfolded Protein Response) signal regulation, protein folding, calcium binding, and regulation of apoptosis play a role in protein degradation. In addition to its function to continue ER homeostasis, Grp78 plays a critical role in tumor proliferation, survival, angiogenesis and drug resistance with anti-apoptotic characteristic. HDAC1 (Histone Deacetylase 1) enzyme is the negative regulator of Grp78 expression. HDAC inhibitors result in increased differentiation in cancer cells, cessation of growth and apoptosis. However, it makes the cells resistant to treatment by inducing Grp78, a protein of survival. In addition to conventional therapy in eradication of residue tumors which is still a significant problem in cancer treatment, use of drugs suppressing Grp78 is considered to be a new treatment approach. In our study, we performed cell viability assays to demonstrate the increase in efficiency of TSA by using desferrioxamine and phenanthroline as an agent reducing Grp78 expression with TSA, an HDAC inhibitor; gene expression analysis to investigate its effects on UPR response; and ChIP assay to define the mechanism of desferrioxamine (DFO) and phenanthroline (PHEN) reducing Grp78 expression.
MCF-7 (16000/well) and HepG2 (9000/well) cells were cultivated in 96-well plate for over a night. These two iron chelatagents were processed with 500 nM TSA, 150 µM DFO, 25 µM PHEN and TSA for 24 hours. Then the expression levels of Grp78, Grp94, CHOP, HKII, HO-1 MDR-1, MRP-1 and p53 were quantitively measured with RT-PCR. The number, viability and reproduction of cells were evaluated with a real-time cell analysis system by using various doses of TSA and combination of DFO and PHEN. ChIP assay was performed with HDAC-1 antibody and Grp78 prometer-specific primaries.
2-deoksiglukoz (2-DG), which is a synthetic glucose inhibiting glycolysis and blocking cell growth, induces ER stress and increases Grp78 expression through protein glicosylation inhibition. In the presence of 10 mM 2-DG, the expression levels of above mentioned genes were studied for both of the cells and cell viability was analyzed with DFO and PHEN together.
 We found that DFO and PHEN reduced the expression of Grp78, Grp94 and p53 in both of the cells while increasing the expression of HK-2. We also found that TSA increased the expression of Grp78, Grp94, HO-1 and MRP1 in MCF-7 cells, and DFO and PHEN reduced the expression of HO-1, MDR1 and MRP1 in HepG2 cells. CHOP was increased in both of the cells. Reduction of Grp78 expression due to DFO and PHEN was demonstrated with ChIP assay, increasing HDAC1s in Grp78 prometer region. In RTCA (Real Time Cell Analyzer), low-dose TSA destroyed the MCF-7 cells within the first 24 hours in the groups where it was combined with DFO and PHEN whereas HepG2 cells were not affected. Similar findings were observed when 2-DG was combined with DFO and PHEN.
Like TSA, the use of HDAC inhibitors and DFO and PHEN, as adjuvant agents, could be a new approach to enhancing efficiency of these drugs and reducing resistance to these drugs. In addition to conventional therapy of eradication of residue tumors and selected cancers, the use of DFO and PHEN reducing Grp78 and Grp94 expression can be a new treatment method and initiate development of such drugs.   
Keywords: DFO, PHEN, TSA, Grp78, HO-1.