Toplam monoamin oksidaz aktivite ölçümü için yeni bir florojenik prob geliştirilmesi
Development of a new fluorogenic probe for total monoamine oxidase activity measurement
Yazar: EMİN AHMET YEŞİL
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ÖZYÜREK
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Organik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Monoamin oksidaz (MAO), merkezi sinir sistemindeki nörotransmitterlerin (dopamin, serotonin vb.) oksidasyonunda rol oynayan ve X kromozomundaki genler tarafından kodlanan bir enzimdir; A ve B olmak üzere iki ayrı izoform şeklinde bulunmaktadır. Bu izoformlar canlı dokulardaki dağılımları ve fizyolojik etkileri gibi birçok yönden farklılık gösterirler. MAO-A çoğunlukla plasenta, adipoz doku, tiroid bezi ve akciğerlerde bulunurken; MAO-B ise genel olarak beyin ve karaciğer hücrelerinde, nöronlarda, rahimde ve kalpte daha fazla dağılım göstermektedir. Yaş, travma ve stres faktörleri sonucunda enzim aktivitesinin yükselmesi ile çeşitli psikiyatrik (panik atak, kişilik bozukluğu vb.) ve nörolojik (şizofreni, anoreksiya, depresyon, Parkinson ve Alzheimer vb.) bozukluklar ortaya çıkmaktadır. MAO enzim aktivitesinin yüksekliğine bağlı olarak gelişen hastalıkların tanılamasında ve tedavi sürecinin takibinde invaziv olmayan, yüksek çözünürlük ve hassasiyette gerçek zamanlı görüntülemeye olanak tanıyan floresans esaslı; özellikle de elektromanyetik spektrumun yakın kızılötesi (near infrared, NIR) bölgesinde emisyon dalgaboyuna sahip, hücre ve dokulara derinlemesine penetrasyon sağlayabilen; ancak foto hasar oluşturmayan NIR florojenik probların kullanıldığı floresans görüntüleme teknikleri daha çok tercih edilmektedir. Bu tez çalışmasında, Cy7-Cl boyası ve piperazin molekülü arasında gerçekleştirilen kondenzasyon reaksiyonuyla toplam MAO enzim aktivite tayininin yüksek seçicilik ve duyarlılıkta gerçekleştirilmesine olanak sağlayan; sitotoksik olmayan yeni bir NIR florojenik prob (NM-T, λem = 786 nm) sentezlendi.  Bileşiğin kimyasal karakterizasyonu FTIR, NMR ve MS teknikleriyle gerçekleştirildi. Sentezlenen prob (dedektör molekül) ile her bir eenzim izoformu arasındaki reaksiyona bağlı olarak enzim konsantrasyonu artışı ile probun başlangıç floresans intensitesinde azalma gerçekleşti. MAO-A ve MAO-B izoformlarının ilavesiyle floresans şiddetindeki azalma miktarı esas alınarak kalibrasyon grafiği üzerinden lineer denklem oluşturuldu ve geliştirilen yöntemin korelasyon katsayıları sırasıyla (r) 0.998 ve 0.9944 olarak hesaplandı. Geliştirilen yöntemde MAO-A ve MAO-B izoformları için en düşük dedeksiyon limitleri (LOD) sırasıyla 1.88 ng/mL ve 9.15 ng/mL olarak bulundu. Sentetik serum çözeltisine enzim stndart katkısı yapılarak yöntemin geri kazanımı doğrulandı. Sonuç olarak, NIR dalgaboyunda, siyanin boyası esaslı, düşük LOD değerlerine sahip ve toplam MAO aktivite tayininde kullanılabilen; bu özellikleriyle literatürdekilere üstünlük getiren yeni bir florojenik prob sentezlendi ve yeni bir spektroflorometrik yöntem geliştirilerek toplam aktivite tayini başarıyla gerçekleştirildi.

Abstract:
Monoamine oxidase (MAO) is an enzyme that plays a role in the oxidation of neurotransmitters (dopamine, serotonin, etc.) in the central nervous system and is encoded by the genes on the X chromosome; It exists in two different isoforms, A and B. These isoforms differ in many aspects, such as their distribution in living tissues and their physiological effects. While MAO-A is mostly found in the placenta, adipose tissue, thyroid gland and lungs; MAO-B is generally more distributed in brain and liver cells, neurons, uterus and heart. As a result of the increase in enzyme activity as a result of age, trauma and stress factors, various psychiatric (panic attacks, personality disorders, etc.) and neurological (schizophrenia, anorexia, depression, Parkinson and Alzheimer's etc.) disorders occur. Fluorescence-based, which allows non-invasive, high resolution and sensitive real-time imaging in the diagnosis of diseases that develop due to high MAO enzyme activity and in the follow-up of the treatment process; It has an emission wavelength, especially in the near infrared (NIR) region of the electromagnetic spectrum, that can provide deep penetration into cells and tissues; however, fluorescence imaging techniques using NIR fluorogenic probes that do not cause photodamage are more preferred. In this thesis, the condensation reaction between the Cy7-Cl dye and the piperazine molecule allows the determination of total MAO enzyme activity to be performed with high selectivity and sensitivity; A new non-cytotoxic NIR fluorogenic probe (NM-T, λem = 786 nm) was synthesized. Chemical characterization of the compound was carried out by FTIR, NMR and MS techniques. Depending on the reaction between the synthesized probe (detector molecule) and each enzyme isoform, the initial fluorescence intensity of the probe decreased with the increase in enzyme concentration. Based on the amount of decrease in fluorescence intensity with the addition of MAO-A and MAO-B isoforms, a linear equation was created on the calibration chart and the correlation coefficients of the developed method were calculated as (r) 0.998 and 0.9944, respectively. In the developed method, the lowest detection limits (LOD) for MAO-A and MAO-B isoforms were found to be 1.88 ng/mL and 9.15 ng/mL, respectively. Recovery of the method was confirmed by adding enzyme standard to the synthetic serum solution. As a result; a new fluorogenic probe, which is superior to those in the literature with these features, was synthesized and a new spectrofluorometric method was developed to determine the total activity successfully.