Ht-22 fare hipokampal nöronal hücre hattında NOX-2 inhibisyonunun pentilentetrazol (PTZ) ile oluşturulan nöronal hasar üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of NOX-2 inhibition on pentylenetetrazole (PTZ)-induced neuronal damage in HT-22 mouse hippocampal neuronal cell line
Yazar: MERYEM YAPRAK
Danışman: DOÇ. DR. AHMET ŞEVKİ TAŞKIRAN
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Oksidatif stres = Oxidative stress

Özet:
Amaç: Bu çalışmada amaç; NADPH oksidaz-2 (NOX-2) enzim inhibisyonunun pentilentetrazol (PTZ) ile oluşturulan nöronal hasar üzerine etkisini ortaya koymak ve NOX-2 inhibitörü GSK2795039'un (GSK) PTZ ile oluşturulan nöronal hasar üzerine etkisini oksidan-antioksidan sistem üzerine etkilerini gösterip aralarındaki ilişkiyi aydınlatmaktır.
Materyal ve Metot: Çalışmada HT-22 fare hipokampal nöronal hücre hattı kullanıldı. PTZ ile oluşturulan nöronal hasar sonrası NOX-2 inhibitörü GSK'nın hücre ölümü üzerindeki etkisini değerlendirmek için hücreler dört gruba ayrıldı. Kontrol grubuna tedavi uygulanmadı, PTZ grubuna PTZ 60 mM, GSK grubuna farklı konsantrasyonlarda (40, 20, 10, 5 ve 2,5 μM) GSK2795039 ve GSK + PTZ grubuna hücrelere farklı konsantrasyonlarda (40, 20, 10, 5 ve 2,5 μM) GSK uygulandı 2 saat sonra 60 mM PTZ eklendi. Tüm gruplar toplamda 3 saat inkübe edildi. Sonrasında hücre canlılığı için XTT testi kullanıldı, total oksidan seviyeleri (TOS), total antioksidan seviyeleri (TAS), nitrik oksit sentaz (nNOS) ve nitrik oksit (NO) seviyeleri ticari kitler ile ölçüldü. Apoptotik süreç için flow sitometri testi uygulandı. B-kaspaz-3 ve NOX-2 seviyeleri floresan boyama yöntemi ile değerlendirildi. Verilerin istatistiksel analizinde tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı. İstatistiksel anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edildi.
Bulgular: HT-22 hücrelerine 60 mM PTZ uygulanması kontrolle kıyaslandığında canlı hücre sayısını azaltmış; TOS, NO, nNOS seviyelerini, erken ve geç apoptotik hücre sayısını anlamlı ölçüde artırmıştır (p<0,05). 40 μM GSK ile NOX-2 inhibisyonu sonrası PTZ uygulanması tek başına PTZ'ye maruz kalan hücrelerle kıyaslandığında canlı hücre sayısını artırmış; TOS, NO, nNOS seviyelerini, erken ve geç apoptotik hücre sayısını anlamlı ölçüde azaltmıştır (p<0,05). İmmun floresan boyama sonuçlarına göre HT-22 hücrelerine 60 mM PTZ uygulanması kontrolle kıyaslandığında NOX-2 ve B-kaspaz-3 protein seviyelerini anlamlı olarak artırmıştır (p<0,05). Fakat GSK ile NOX-2 inhibisyonu sonrası PTZ uygulanması tek başına PTZ'e maruz kalan hücrelerle kıyaslandığında NOX-2 protein seviyesini anlamlı olarak azaltmıştır (p<0,05).
Sonuç: Araştırma sonuçları, NOX-2 inhibisyonunun PTZ'ye bağlı nöronal hasarı ve oksidatif stresi azaltabileceğini göstermiştir. Deneysel ölçümler GSK'nın antioksidatif ve protektif etkisini NO seviyeleri üzerinden gerçekleştirdiğini ortaya çıkarmıştır. Ancak bu konuyla ilgili in vitro ve in vivo daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Anahtar Kelimeler: Nöronal Hasar; Oksidatif Stres; Pentilentetrazol (PTZ); NOX-2 inhibisyonu; HT-22 Hücre Hattı.

Abstract:
Aim: The aim of this study is; To reveal the effect of NADPH oxidase-2 (NOX-2) enzyme inhibition on neuronal damage caused by pentylenetetrazol (PTZ) and to reveal the effect of GSK2795039 (GSK), which is a NOX-2 inhibitor, on neuronal damage caused by PTZ, on the activation of the oxidant-antioxidant system show their effects and to illuminate the relationship between them.
Materials and Methods: HT-22 mouse hippocampal neuronal cell line was used in the study. To evaluate the effect of the NOX-2 inhibitor GSK on cell death after neuronal damage caused by PTZ, the cells were divided into four groups. No treatment was applied to the control group, PTZ 60 mM was applied to the PTZ group, GSK2795039 was applied to the cells at different concentrations (40, 20, 10, 5 and 2.5 μM) to the GSK group, GSK2795039 was applied to the cells at different concentrations (40, 20, 10, 5 and 2 μM) to the GSK + PTZ group. .5 μM) GSK was applied, 2 hours later, 60 mM PTZ was added. All groups were incubated for 3 hours in total. Afterwards, XTT test was used for cell viability, total oxidant levels (TOS), total antioxidant levels (TAS), nitric oxide synthase (nNOS) and nitric oxide (NO) levels were measured with commercial kits. Flow cytometry test was performed for the apoptotic process. B-caspase-3 and NOX-2 levels were evaluated by fluorescent staining method. One-way analysis of variance (ANOVA) was used in statistical analysis of the data. Statistical significance level was accepted as p<0,05.
Results: Application of 60 mM PTZ to HT-22 cells reduced the number of viable cells compared to the control; It significantly increased TOS, NO, nNOS levels and the number of early and late apoptotic cells (p<0,05). Application of PTZ after NOX-2 inhibition with 40 μM GSK increased the number of viable cells compared to cells exposed to PTZ alone; It significantly reduced TOS, NO, nNOS levels and the number of early and late apoptotic cells (p<0,05). According to the immunofluorescent staining results, application of 60 mM PTZ to HT-22 cells significantly increased NOX-2 and B-caspase-3 protein levels compared to the control (p<0,05). However, application of PTZ after NOX-2 inhibition with GSK significantly reduced the NOX-2 protein level compared to cells exposed to PTZ alone (p<0,05).
Conclusion: Research results showed that NOX-2 inhibition can reduce neuronal damage and oxidative stress. Experimental measurements have revealed that GSK exerts its antioxidative and protective effects through the NO levels. However, more in vitro and in vivo studies are needed on this subject.
Keywords: Neuronal Damage; Oxidative Stress; Pentylenetetrazol (PTZ); NOX-2 inhibition; HT-22 Cell Line.