Domates üretim alanlarından bakteriyel kanser ve solgunluk (Clavibacter michiganensis subsp. michiganenis) hastalığına spesifik bakteriyofajların izolasyonu, biyoformülasyonu ve biyokontrol ajanı olarak kullanılabilme potansiyelinin araştırılması
Isolation, bioformulation of bacteriophages specific to bacterial cancer and wilth (Clavibacter michiganensis subsp. michiganenis) disease from tomato production areas and investigation of their potential to use as biocontrol agent
Yazar: DUYGU BEKİRCAN ESKİ
Danışman: PROF. DR. CİHAN DARCAN
Bilecik Şeyh Edebali Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) domates yetiştiriciliğinde verim kayıplarına neden olan bakteriyel solgunluk ve kanser hastalığı etmenidir. Patojen ile mücadelede mevcut mücadele yöntemlerin yetersizliği fajlar ile mücadeleye olan ilgiyi artırmıştır. Bu amaçla Çanakkale, İzmir ve Bilecik illerinde hastalık belirtisi görülen domates ekim alanlarından toprak ve bitki örnekleri toplandı. Toplanan örneklerden biyokimyasal ve moleküler yöntemler ile Cmm izolasyonu ve faj izolasyonu gerçekleştirildi. Abiyotik faktörlere toleransı yüksek olan fajlar belirlenerek sinerjistik-antagonistik özellikleri belirlendi. Etkinliği belirlenen fajın moleküler ve morfolojik karakterizasyonu yapılarak biyokontrol ajanı olarak kullanılabilme potansiyeli araştırıldı. Fajın su içinde yağ formülasyonu Taguchi metodu ile optimize edildi. Belirlenen optimum şartlar ile su içinde yağ formülasyonu hazırlandı ve Cmm-DB3 üzerindeki inhibe etme oranı in-vitro'da belirlendi. Formülasyonun etkinliği saksı denemeleri ile gösterildi. Gerçekleştirilen çalışma ile, 8 Cmm izolatı ve Cmm-DB3 üzerinde etkinliği belirlenen 22 adet litik faj elde edildi. Abiyotik faktörlere toleransı yüksek Phage33'ün komple genom analizi yapılarak NCBI veri tabanındaki fajlarla karşılaştırıldı ve tür bazında eşleşme olmadığı belirlenerek faj literatürüne yeni bir faj kazandırıldı. Phage33'ün optimum koşullar ile emülsiyon formülasyon hazırlandı ve emülsiyonun Cmm-DB3 üzerindeki inhibe etme oranı in-vitro'da %80,7 olarak belirlendi. Emülsiyonun 6. ay sonunda oda ısında Cmm-DB3'i inhibe etme oranı %78,12 iken 4 °C'de ise %79,23 olduğu belirlendi. Ayrıca damlacık boyut analizi sonucu emülsiyonun polidispers yapıda olduğu belirlendi. Hazırlanan emülsiyonun saksı denemeleri sonucu Cmm uygulanan saksılarda hastalık belirtileri %78 iken emülsiyon uygulanan saksılarda ise %17 olduğu belirlendi. Phage33'ün abiyotik faktörlere olan toleransını artırmak amacıyla emülsiyon formülasyonu ilk kez Taguchi metodu ile optimize edilmiş ve patojenin mücadelesinde kullanılabilecek yerli bir prototip ürün ortaya konmuştur.

Abstract:
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) is a bacterial wilt and canker pathogen that causes yield losses in tomato cultivation. The inadequacy of existing methods to control the pathogen has increased interest in phage control. For this purpose, soil and plant samples were collected from tomato growing areas with symptoms of the disease in the provinces of Canakkale, Izmir and Bilecik. Cmm isolations and phage isolations were performed from the collected samples using biochemical and molecular methods. Phages with high tolerance to abiotic factors were identified and their synergistic-antagonistic properties were determined. Molecular and morphological characterisation of the phages whose activity was determined was performed and their potential for use as biocontrol agents was investigated. The oil-in-water formulation of the phage was optimised using the Taguchi method. An oil-in-water formulation was prepared with the optimal conditions determined and the inhibition rate on Cmm-DB3 was determined in vitro. The efficacy of the formulation was verified by pot experiments. With the study performed, 22 lytic phages were obtained and their activity on 8 Cmm isolates and Cmm-DB3 was determined. The complete genome analysis of phage33, which has a high tolerance to abiotic factors, was compared with the phages in the NCBI database and it was found that there was no match on a species basis. An emulsion formulation of Phage33 was prepared under optimal conditions, and the inhibition rate of the emulsion on Cmm-DB3 was determined to be 80.7% in vitro. At the end of the 6th month, the Cmm-DB3 inhibition rate of the emulsion was determined to be 78.12% at room temperature and 79.23% at 4 °C. Furthermore, when analysing the droplet size, it was found that the emulsion had a polydisperse structure. As a result of the pot trials with the prepared emulsion, it was found that the disease symptoms were 78% in the pots where Cmm was applied and 17% in the pots where the emulsion was applied. In order to increase the tolerance of Phage33 to abiotic factors, the emulsion formulation was optimised for the first time using the Taguchi method and a local prototype was introduced that can be used in against the pathogen.