Clostridium difficile toksin A geninin klonlanması
The cloning of Clostridium difficile toxin A gene
Yazar: NİLGÜL UZUN
Danışman: PROF. DR. BÜLENT BOZDOĞAN
Adnan Menderes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Clostridium difficile = Clostridium difficile ; Gen klonlama = Gene cloning ; Genler = Genes ; Klonlama = Cloning ; Toksinler = Toxins

Özet:
Son 20 yılda gerek hastane, gerekse toplum kaynaklı Clostridium difficile enfeksiyon insidans ve mortalitesinde belirgin bir artış görülmektedir. Hastalığın patogenezinden toksin A (enterotoksin) ve toksin B (sitotoksin) sorumludur. Ayrıca son yıllarda hastane salgınlarına neden olan binary toksin tanımlanmıştır. Bu çalışmada C. difficile toksin A geninin klonlanması ile toksin A elde edilerek tanı testlerinde kullanılabilecek antijen elde edilmesi amaçlanmıştır.
Çalışmamızda,  Türkiye Halk Sağlığı Kurumu (Ankara)'ndan temin edilen tcdA pozitif C. difficile 06012 suşu kullanılmıştır. Gen bankasından NCBI Reference Sequence: NC-009089.1 nolu tcdA sekansı baz alınarak spesifik primerler dizayn edilmiş ve primerler sonlarına BamHI restriksiyon enzim yeri eklenerek modifiye edilmiştir. C. difficile suşundan DNA saflaştırılmış ve PCR yoluyla ExTaq polimeraz enzimi yardımıyla tcdA genini içeren DNA fragmanıçoğaltılmıştır. Amplikon ve pUC19 plazmidi Bam HI enzimi ile kesilmiş ve ligasyondan sonra E. coli DH10B suşuna elektroporasyon yoluylaaktarılmıştır. Rekombinant plazmidler incelenmiş ve tcdA geni içeren plazmid seçilerek ileri araştırmalar için stoklanmıştır.
Bu çalışmada C. difficile tcdA geni rekombinant toksin sentezi için klonlanmıştır. Toksin A'nın rekombinant teknoloji ile sentezlenmesi ve saflaştırılması daha ileri çalışmalar için kolaylık sağlayacaktır. Toksinin saflaştırılmasıyla poliklonal ve monoklonal antikorların eldesi,  serum antikor düzeylerinin saptanması, enzim aktivitesi üzerine in vitro ve in vivo çalışmalar yapılabilmesi mümkün olacaktır.

Abstract:
In the past twenty years,  there has been a significant increase in incidence and mortality of both hospital acquired and community acquired Clostridium difficile. Toxin A (enterotoxin) and toxin B (cytotoxin) are responsible for the pathogenesis of the disease. Moreover,  binary toxin,  the cause of hospital outbreaks,  has recently been identified. The current study aimed to produce the antigen that can be used in diagnostic tests by cloning C. difficile toxin A gene. 
In our study,  tcdA positive strain, C. difficile 06012 obtained from Turkey Public Health Association (Ankara) was used. Specific primers were designed according to the reference sequence in Genbank NC-009089.1 and modified by adding Bam HI restriction site to the end. DNA was isolated from C. difficile strain and by using Extaq polymerase enzyme, DNA fragment including tcdA gene was amplified. Amplicon and pUC19 plasmid were digested with BamHI and ligated,  than it was used to transform E. coli DH10B strain by electroporation. Recombinant plasmids were studied and the plasmid that contained tcdA gene was chosen and stored for further studies. 
In this study, C. difficile tcdA gene was cloned for the synthesis of recombinant toxin. The synthesis and purification of toxin A by recombinant technology will be helpful for further studies. Using purified toxin production of polyclonal and monoclonal antibodies and,  determining serum antibody levels,  conducting studies on in vitro and in vivo enzyme activity will be possible.