Glutatyon redüktaz enziminin koyun dalak dokusundan saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı antibiyotiklerin enzim aktivitesi üzerine etkilerinin araştırılması
Purification, characterization of glutathion reductase enzyme from sheep splen tissue and investigation of the effects of some chemical substances on enzyme activity
Yazar: ÇİĞDEM ÇOBAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET ÇİFTCİ
Bingöl Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Dalak = Spleen ; Glütatyon redüktaz = Glutathione reductase ; Karakterizasyon = Characterization ; Koyunlar = Sheep ; İlaçlar = Drugs ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Bu çalışmada antioksidan metabolizmasının kilit enzimi olan Glutatyon redüktaz (EC
1.8.1.7; GR, Glutatyon: NADP+
oksidoredüktaz) enzimi koyun dalak dokusundan
saflaştırıldı. Bu işlem %20-70 arası amonyum sülfat çöktürmesi ve 2', 5'-ADP Sepharose
4B afinite kormatografisi uygulanarak gerçekleştirildi. Neticede enzim %40,61 verimle ve
1564,8 kat saflaştırıldı. SDS-PAGE ile enzimin saflık derecesi kontrol edilip
karakterizasyonu yapıldı. Karekterizasyon çalışmalarında; optimum pH : 8,0 ( KH2PO4
tamponu ), optimum iyonik şiddet : 100 mM (KH2PO4 tamponu), stabil pH : 7,0 (KH2PO4
tamponu), optimum sıcaklık : 400C, alt birim molekül kütlesi : 91 kDa olarak tespit edildi.
Ayrıca enzimin GSSG ve NADPH substratlarına olan ilgisini belirlemek amacı ile
substratların KM sabiti ve Vmax değerleri tespit edildi. NADPH için ; KM sabiti : 0,0061 mM,
Vmax değeri 0,259 EÜ/mL, GSSG için ise, KM sabiti : 0,351 mM, Vmax değeri 0,604 EÜ/mL
olduğu belirlendi. Bu sonuçlara göre; GR enziminin substratları olan NADPH'a
afinitesinin GSSG'ye olandan daha fazla olduğu tespit edildi. Ayrıca koyun dalak GR
enzim aktivitesi üzerine bazı ilaçların etkileri araştırıldı. Ampisilin, streptomisin sülfat,
gentamisin, sefoperazone sodyum ve prekort-liyo'nun inhibisyon etkisi gösterdiği
belirlendi. Bu ilaçların IC50 (mM) değerleri; prekort-liyo :1,27 mM, ampisilin : 3,22 mM,
streptomisin sülfat : 7,95 mM, sefoperazon sodyum : 16,97 mM, gentamisin :17,20 Mm,
Ki sabitleri; ampisilin : 1,057 ± 0,110, gentamisin : 20,770 ± 8,169, streptomisin sülfat :
3,386 ± 1,305, sefoperazon sodyum : 4,910 ± 0,960 ve precort-liyo : 0,466 ± 0,387,
inhibisyon türleri ise; ampisilin ve gentamisin yarışmasız, streptomisin sülfat, sefoperazon
sodyum ve precort-liyo yarışmalı olarak tespit edilmiştir.

Abstract:
In this study, the enzyme Glutathione reductase (Glutathione: NADP+
oxidoreductase, EC
1.8.1.7; GR), which is the key enzyme of antioxidant metabolism, was purified from sheep
spleen tissue. Purification was carried out using 20-70% ammonium sulfate precipitation
and 2', 5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography. As a result, the enzyme was purified
in 40.61% yield and 1564.8 fold. The purity level of was checked by SDS-PAGE and
characterizated. In characterization studies; optimum pH: 8.0 (KH2PO4 buffer), optimum
ionic strength: 100 mM (KH2PO4 buffer), stable pH: 7.0 (KH2PO4 buffer), optimum
temperature: 400C, subunit molecular mass: 91 kDa. In addition, KM constant and Vmax
values of the substrates were determined in order to determine the affinity of the enzyme
to GSSG and NADPH substrates. For NADPH; KM constant: 0.0061 mM, Vmax value was
0.259 EU/mL, for GSSG, KM constant: 0.351 mM, Vmax value was 0.604 EU/mL.
According to these results; It was determined that the affinity of the GR enzyme to the
NADPH substrate was higher than its affinity to the GSSG substrate. In addition, the effects
of some drugs on sheep spleen GR enzyme activity were investigated. It was determined
that ampicillin, streptomycin sulfate, gentamicin, cefoperazone sodium and precort-lyo
showed inhibitory effects. IC50 values of these drugs; precort-lyo: 1.27 mM, ampicillin:
3.22 mM, streptomycin sulfate: 7.95 mM, cefoperazone sodium: 16.97 mM, gentamicin:
17.20 mM, Ki constants; ampicillin : 1.057 ± 0.110, gentamicin : 20.770 ± 8.169,
streptomycin sulfate : 3.386 ± 1.305, cefoperazone sodium : 4.910 ± 0.960 and precort-lio
: 0.466 ± 0.387, inhibition types; Ampicillin and gentamicin were determined as noncompetitive, streptomycin sulfate, cefoperazone sodium and precort-lyo were determined
competitively.