İnsan embriyonik böbrek hücrelerinden kodon optimize mini intronik plazmid aracılı uyarılmış pluripotent kök hücre oluşturulması ve karakterizasyonu
Generation and characterization of induced pluripotent stem cells from human embryonic kidney cells via codon-optimized mini-intronic plasmids
Yazar: GİZEM ŞEKER ERSAN
Danışman: PROF. DR. AHTER DİLŞAD ŞANLIOĞLU
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Böbrek = Kidney ; Derma elektroporasyon = Derma electroporation ; Embriyo = Embryo ; Kök hücreler = Stem cells ; Plazmitler = Plasmids ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells ; Sodyum bütirat = Sodium butyrate

Özet:
Amaç: Uyarılmış pluripotent kök hücreler (uPKHler), rejeneratif tıp ve in vitro hastalık modellemeleri gibi birçok alanda önemli potansiyele sahiptir. uPKH oluşturma metodojilerinin verimliliklerinin ve güvenliliklerinin geliştirilmesi amacıyla yeniden programlama faktörlerinin yüksek ekspresyonu, verim arttırıcı küçük moleküllerin kullanılması, farklı vektör sistemlerinin kullanımı gibi yaklaşımlardan yararlanılmaktadır. uPKH eldesinde kullanılan entegre olmayan vektörlerden kodon-optimize mini intronik (CoMiP) plazmidler, etkin, uygun maliyetli ve güvenli vektörler olarak kullanım alanı bulmaktadır. Çalışmamızda, CoMiP plazmidleri ve sodyum butirat molekülünü birarada kullanarak HEK293T insan embriyonik böbrek hücrelerinden uPKH eldesini ve karakterizasyonunu amaçladık. 
Yöntem: Çalışmamızda, HEK293T hücrelerinin yeniden programlanması amacıyla OSKM faktörlerini (Oct-4, Sox2, Klf4 ve c-Myc) ve p53'e karşı kısa hairpin RNA'yı birarada kodlayan "MIP 247 CoMiP 4in1 with shRNA p53" plazmidleri ile, Lin28 ve Nanog moleküllerini birarada kodlayan "MIP 339 CoMiP coLin28 2A Nanog IRES eGFP" plazmidleri kullanıldı. Elektroporasyon ve lipofektamin aracılı ko-transfeksiyonların etkinlikleri, vektörlerin taşıdığı floresan belirteçlerin ışımalarıyla takip edildi. uPKH kolonilerinin karakterizasyonları, morfolojik kriterler, pluripotensi belirteçlerine yönelik immunositokimyasal/immunofloresan analizler, ve embryoid cisimcik (EC) oluşturma etkinliğinin test edilmesiyle gerçekleştirildi. 
Bulgular: CoMiP mini intronik plazmid ve sodyum butiratın birarada kullanıldığı etkin bir yaklaşımla HEK293T hücrelerinden uPKH eldesi gerçekleştirildi. Elde edilen koloniler, pluripotensi belirteçleri olan alkalin fosfataz, Tra-1-81, Tra-1-60, Oct4, Klf4, c-Myc ve Nanog açısından pozitifti ve ECler oluşturabildi.
Sonuç: Çalışmamızda kullanılan geriye programlama yaklaşımı, etkin, uygun maliyetli ve güvenli bir strateji olarak farklı hücrelerin geriye programlamasında kullanılabilir. uPKHlerin, farklılaştırıldıktan sonra çeşitli hastalıklarda in vitro model oluşturma ve terapötik amaçlı olarak kullanılma potansiyelleri önemlidir. 
Anahtar Kelimeler: uyarılmış pluripotent kök hücreler, CoMiP plazmidler, elektroporasyon, lipofeksiyon, sodyum butirat

Abstract:
Objective: Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have a great potential to be used in many fields such as regenerative medicine and in vitro disease modeling. Strategies such as overexpression of the reprogramming factors, use of small molecules to increase efficiency, and use of various different vector systems are utilized for improvement of the efficiency and safety of iPSC generation methodologies. Codon-optimized mini intronic plasmids (CoMiPs) serve as effective, cost-efficient, and safe non-integrating vectors. We aimed to generate and characterize iPSCs from HEK293T human embryonic kidney cells via a combined strategy involving CoMiP plasmids and sodium butyrate.
Methods: "MIP 247 CoMiP 4in1 with shRNA p53" plasmids that code for the OSKM factors (Oct-4, Sox2, Klf4 and c-Myc) and short hairpin RNA against p53, and "MIP 339 CoMiP coLin28 2A Nanog IRES eGFP" plasmids that code for Lin28 and Nanog were used for reprogramming of HEK293T cells. Efficiencies of the electroporation- and lipofectamine-mediated co-transfections were evaluated via fluorescent markers encoded by the plasmid vectors. Morphological criteria, immunocytochemical/immunofluorescence analyses for pluripotency markers, and potential for formation of embryoid bodies were utilized for characterization of the iPSC colonies. 
Results: iPSCs were generated from HEK293T cells via an efficient approach comprising CoMiP mini intronic plasmids and sodium butyrate. The obtained colonies stained positive for the pluripotency markers alkaline phosphatase, Tra-1-81, Tra-1-60, Oct4, Klf4, c-Myc and Nanog, and successfully formed embryoid bodies (EBs); thus were characterized as iPSC clusters. 
Conclusion: The reprogramming approach used in our study may be utilized for reprogramming of various different cells as an efficient, cost-effective, and safe methodology. The iPSCs obtained has the potential to be used in disease modeling and for various therapeutic purposes, following differentiation. 
Keywords: induced pluripotent stem cells, CoMiP plasmids, electroporation, lipofection, sodium butyrate