İnsan GCSF proteininin koekspresyon ile çözünür formda üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Production, purification and characterization of human GCSF protein in soluble form with co-expression
Yazar: MUSTAFA SONGUR
Danışman: PROF. DR. İSA GÖKÇE
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
İnsan granülosit koloni uyarıcı faktör (GCSF) hematopoetik bir büyüme faktörü olup nötrofil yapımında ve farklılaşmasında önemli rol oynamaktadır. Klinikte oldukça önemli bir yere sahip olan GCSF, kemoterapiye bağlı nötropeni ve AIDS tedavisi gibi immün sistemin ihtiyaç duyduğu nötrofil seviyesine ulaşmasına yardımcı olması
amacıyla kullanılmaktadır. GCSF gibi özellikle insan kökenli olan bazı yabancı biyomoleküller Escherichia coli (E. coli) ekspresyon sistemi ile ekspresyonu sırasında farklı etmenlerden dolayı bazen agregasyona uğrar ve inklüzyon cisimciği oluştururlar. Bu çok değerli moleküllerin geri kazanımı için çoğu zaman yeniden katlama (refolding)
işlemleri uygulanır, fakat yine de kayda değer miktarda protein kullanılamaz halde kalır. Refolding işlemleri hem masraflı hem zaman alıcı hem de tam verimli etkiye sahip olmamaktadır. Bu nedenlerden dolayı, bu tez çalışmasında koekspresyon yöntemi ile şaperon proteinlerin kullanılması düşünülmüştür. Bu kapsamda beş şaperon plazmit
sistemi kullanılarak (pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16) GCSF'nin çözünür formda üretimi sağlanmaya çalışılmıştır. Yapılan deneyler sonucunda pKJE7 plazmidinin GCSF'yi çözünür formda elde etmede daha etkili olduğu bulunmuştur. Bu sistem ile koeksprese edilen GCSF proteini afinite kromotografisiyle yüksek saflıkta elde edilmiş ve insan göbek bağı endotel hücreleri (HUVEC) üzerindeki proliferatif aktivitesi ortaya koyulmuştur. Sonuç olarak, daha önce E. coli ekspresyon sisteminde inklüzyon cisimciği olarak çöken GCSF, şaperon proteinler ile koekspresyon
neticesinde doğru şekilde katlanarak, işlevsel ve saf olarak elde edilmiştir.

Abstract:
Human granulocyte colony stimulating factor (GCSF) is a hematopoietic growth factor and plays a crucial role in neutrophil production and differentiation. GCSF, which has a very important place in the clinic, is used to help the immune system up to the level of neutrophils required by the immune system, such as chemotherapy-induced neutropenia
and AIDS treatment. Some foreign biomolecules, especially of human origin, such as GCSF, sometimes aggregate because of different factors during expression and creates inclusion bodies in E.coli expression system. Refolding process is often used to recover these very valuable molecules, but still significant amounts of protein remain unusable.
Refolding processes are both costly, time consuming and not fully efficient. For these reasons, the use of chaperone proteins by co-expression method has been considered in this thesis study. In this context, using five chaperone plasmid systems (pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16) it has been tried to produce GCSF in soluble form. As a
result of the experiments, it was found that pKJE7 plasmid is more effective in obtaining GCSF in soluble form. GCSF protein co-expressed with this system was obtained in high purity by affinity chromatography and its proliferative activity on human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) was demonstrated. As a result, GCSF, which previously aggregated as an inclusion body in the E. coli expression system, was correctly folded by co-expression with chaperone proteins and was obtained as functional and pure.