Salmonella spp. ve Escherichia coli'ye etkili bakteriyofajların karakterizasyonu ve gıda uygulamaları
Characterization and food application of phages effective against Salmonella spp. and Escherichia coli
Yazar: ESRA EKİZ
Danışman: PROF. DR. İSMAİL HAKKI BOYACI
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bakteriyofajlar = Bacteriophages ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Patojenler = Pathogens ; Salmonella enteritidis = Salmonella enteritidis ; Salmonella typhimurium = Salmonella typhimurium ; Süt = Milk

Özet:
Gıda kaynaklı hastalıklar ile ilişkilendirilmekte olan patojenler ile mücadelede biyolojik ve kimyasal birçok yöntem bulunmaktadır. Antimikrobiyal kimyasalların yani antibiyotiklerin kullanımı antibiyotik dirençli bakterilerin ortaya çıkmasının ivmelenmesinden dolayı geliştirmelere veya alternatiflere gereksinim duymaktadır. Salmonella türleri, gıda kaynaklı enfeksiyonlara yol açan ve ciddi sağlık etkileri barındıran patojen bakteriler olmalarının yanı sıra gıda bozulmalarına da yol açmaktadırlar. Escherichia coli (E. coli) ise gıdalara kontaminasyonlar, yetersiz ısıl işlem gibi problemler ile bulaşmakta ve gıda bozulmalarına sebebiyet vermektedir. Bakteriyofaj uygulamaları ile bu bakterilerin eliminasyonu sağlanabilmektedir. Bu tez kapsamında E. coli K-12 bakterisine etkili bakteriyofajlar izole edilmiş, saflaştırılmış ve konsantre edilmiştir. Bakteriyofajlar için konakçı skalası belirlenmiş ve adsorpsiyon hız sabitleri hesaplanmıştır. Konsantre edilmiş bakteriyofajların DNA izolasyonu gerçekleştirilmiş ve bu DNA'lar restriksiyon enzimleri ile kesim yöntemiyle fragment şablonları elde etmek amacıyla kullanılmıştır. Bu yönteme göre farklı olduğu saptanan bakteriyofajların tek aşamalı gelişme eğrileri çıkarılmış, patlama büyüklüğü ve latent dönem süreleri hesaplanmıştır. Bakteriyofajların pH ve sıcaklık stabiliteleri belirlenmiştir. Konsantre fajlar, transmisyon elektron mikroskobu ile morfolojik olarak karakterize edilmiştir. Konak bakterilere etkili bakteriyofaj karışımları kullanılarak yağsız sütteki S. enteritidis, S. typhimurium ve E. coli K-12 bakterilerinin inhibisyonu test edilmiştir. Bu denemeler farklı ortam sıcaklıklarında (4 ve 25℃) ve farklı bakteri inokülasyon miktarlarında gerçekleştirilmiştir. 24 saatin sonunda 25℃'de en yüksek bakteri inaktivasyonu, Salmonella faj karışımı için 3,5 log10 KOB/ml ve E. coli K-12 faj karışımı için 4,8 log10 KOB/ml olarak düşük bakteri inokülasyon miktarlarında saptanmıştır. Soğuk zincirin kırılması durumunu simüle etmek amacıyla E. coli K-12 bakterisi içeren kontrol grubu ile farklı MOI değerinde bakteriyofaj karışımı eklenmiş deney grubu sütler 7 gün boyunca 4℃'de muhafaza edilmiştir. Süt örnekleri, 7 günün sonunda 25℃'de inkübe edilerek 24 saat boyunca bakteri/ bakteriyofaj sayılarındaki değişimler takip edilmiştir. E. coli K-12 inaktivasyonunda, bakteriyofaj uygulaması üzerinde stres varlığının etkisi ilk defa bu çalışma ile ortaya koyulmuştur. Tez kapsamında, yağsız süte bakteriyofaj karışımı uygulamasında ortam parametrelerinin etkisi araştırılmış olup Salmonella ve E. coli K-12 bakterilerinin biyokontrolünde bu karışımların kullanılabileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
There are many biological and chemical methods to combat with foodborne pathogens. Improvements or alternatives are required about the use of antimicrobial chemicals, namely antibiotics, due to the acceleration of the emergence of antibiotic-resistant bacteria. Salmonella species are pathogenic bacteria that cause foodborne infections and have serious health effects, as well as induce food spoilage. Escherichia coli(E. coli) which passed foods via problems such as contamination, insufficient heat treatment causes spoilages. Phage therapy is used as a biological control method for the elimination of these bacteria. In this thesis, bacteriophages effective against E. coli K-12 were isolated, purified and concentrated. Host ranges of bacteriophages were determined and their adsorption rate constants were calculated. DNA isolation of concentrated bacteriophages was performed and these DNAs were used to obtain fragment templates by digesting with restriction enzymes. One-step growth curves of bacteriophages, which were found to be different according to this method, were inferred, burst size and latent periods were determined. Moreover,  pH and temperature stability are determined. Concentrated phages were also morphologically characterized by transmission electron microscopy. Inhibition of S. enteritidis, S. typhimurium and E. coli K-12 bacteria in skimmed milk was tested using bacteriophage mixtures effective against host bacteria. These experiments were carried out at different ambient temperatures (4 and 25°C) and different bacterial inoculation amounts. At the end of 24 hours, the highest bacterial inactivation was detected at low bacterial inoculation amounts as 3.5 log10 CFU/ml for Salmonella phage mix and 4.8 log10 CFU/ml for E. coli K-12 phage mix at 25°C. In order to simulate the breaking of the cold chain, the milks of the control group containing E. coli K-12 and the experimental group milks to which a mixture of bacteriophages with different MOIs were stored at 4°C for 7 days. At the end of 7 days, the milk samples were incubated at 25°C and the changes in bacteria or bacteriophage numbers were followed for 24 hours. The effect of the presence of stress on bacteriophage therapy in E. coli K-12 inactivation in milk was demonstrated for the first time with this study. Within the scope of the thesis, the effect of environmental parameters in the application of bacteriophage mixture to skimmed milk was investigated and it was concluded that these mixtures could be used in the biocontrol of Salmonella  and  E. coli K-12 bacteria.