Plasenta sferoid (mikro doku) modelinde vortioksetin etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of vortioxetine on placental spheroid (micro tissue) model
Yazar: SELEN SANİN
Danışman: DOÇ. DR. AYSUN KILIÇ SÜLOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Gebelikte besinlerin maternal-plasental geçişini; annenin beslenmesi ve metabolizması, plasentadan geçiş gradiyenti, utero-plasental ve feto-plasental kan akışı, plasenta bariyerinin yapısı, büyüklüğü ve transfer kapasitesi belirlemektedir. Son yıllarda gebelik süresince maruz kalınan kimyasal madde ve ilaç kullanımında büyük bir artış olmuştur. Ancak, etik kısıtlamalar nedeniyle insanlar üzerinde testler yapılamadığından güncel plasenta bariyer modeli çalışmalarına olan ihtiyaç artmıştır. 
Bu tez çalışması kapsamında, insan plasenta koryokarsinom hücreleriyle (BeWo) birlikte insan göbek kordonu ven hücrelerinin (HUVEC) mono ve ortak kültürleri yapılarak plasenta dokusu iki boyutlu (2B) ve üç boyutlu (3B) sistemlerde modellenmiştir. 3B modelinde iskelesiz bir ortamda Petri Dish® kalıplarıyla sferoidler oluşturulmuş ve hücre lokalizasyonları floresan boyamalar ve çap ölçümleri ile karakterize edilmiştir. Oluşturulan kültürlerde gebelikte kullanımı konusunda literatür bilgilerinde eksiklikler bulunan bir antidepresan etken maddesi olan Vortioksetin 7,5,  15 ve 30 µM'lık konsantrasyonlarda 24, 48 ve 72 saat boyunca hücrelerle inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda hücre canlılık analizleri (MTS, Kalsein-PI-DAPI) yapılmıştır. Transepiteliyel elektriksel direnç ölçümü (TEER) ve sodyum floresan (Na-F) geçiş analiziyle bariyer bütünlüğü ölçülmüştür. Plasenta bariyerinin yapısına katılan bağlantı proteinlerinden epitelial (E)-kaderin, hücre iskeleti elemanlarından filamentöz (F)-aktin ve serotonin taşıyıcısı (SERT) protein lokalizasyonları immunfloresan boyama ile gösterilmiştir. İnsan koryonik gonadotropin (β-hCG) hormon üretim miktarındaki değişiklikler ölçülerek belirlenmiştir. 
Vortioksetinin artan dozlarına bağlı olarak 2B gruplarda hücre canlılığı azalmıştır. 3B mikro dokularda ise doz gruplarında Vortioksetinin toksik etkisine karşı direnç gösterilmiş ve canlılık kontrol gruplarından yüksek bulunmuştur. Sferoidler oluşturulurken BeWo, HUVEC ve ortak kültür grupları için çap uzunluğu ve alan ölçümleri inkübasyon süresiyle orantılı şekilde artmıştır. Ayrıca, sferoidlerin CellTracker boyaması ile hücre lokalizasyonları belirlenmiştir. Kalsein-PI floresan görüntüleme ile Vortioksetin uygulamalarının MTS canlılık analizi ile karşılaştırılması yapılarak nitel ve nicel ölçümler elde edilmiştir. BeWo hücrelerinde E-Kaderin, F-aktin ve SERT immünfloresan boyalar yapılarak artan doz miktarlarında inkübasyon süresine bağlı olarak hücrelerarası bütünlüğün bozulduğu, hücreiçi iskelet elemanlarının yapısının değiştiği ve SERT reseptör miktarında azalma olduğu görülmüştür. Aynı zamanda BeWo ve ortak kültür grubunda 2B ve 3B β-hCG hormon miktarı ölçülerek 3B kültür gruplarında daha yüksek miktarda hormon üretimi görülmüştür. 
Bu tez çalışması, antidepresan ilacı Brintelliks'in etken maddesi olan Vortioksetinin plasental toksisitesini, bariyer yapısının verdiği yanıtı, hormon üretimini 2B ve 3B sistemlerde kıyaslayarak mono ve ortak kültürleri açısından bir değerlendirme sunmaktadır.

Abstract:
Maternal-placental transmission of nutrients during pregnancy, maternal nutrition and metabolism, placental transition gradient, utero-placental and feto-placental blood flow, structure, size and transfer capacity of the placental barrier are determined. In recent years, there has been a great increase in the use of chemicals and drugs during pregnancy, but due to ethical restrictions, the need for current placental barrier model studies has increased as tests cannot be performed on humans.
Within the scope of this thesis, mono and co-cultures of human umbilical cord vein cells (HUVEC) together with human placental choriocarcinoma cells (BeWo) were made and placental tissue was modeled in two and three dimensional systems.
Spheroids were created with three dimensional (3D) Petri Dish® molds in a scaffold-free environment and cell localizations were characterized by fluorescent dyes and diameter measurements. Vortioxetine, the active ingredient of the SSRI type multimodal drug, was exposed to the cultures formed at 7.5, 15 and 30 µM concentrations for 24, 48 and 72 hours. At the end of the incubation, cell viability analyzes (MTS, Calcein-PI-DAPI) were performed. Barrier integrity was measured by transepithelial electrical resistance measurement (TEER) and sodium fluorescence (Na-F) transition analysis. The localizations of epithelial (E)-cadherin, filamentous (F)-actin and serotonin transporter (SERT) protein from cytoskeletal elements, which are the connecting proteins involved in the structure of the placental barrier, were demonstrated by immunofluorescence staining. It was determined by measuring changes in the amount of human chorionic gonadotropin (β-hCG) hormone production.
Cell viability decreased in 2D groups due to increasing doses of vortioxetine. In the 3D micro-tissues, on the other hand, the dose groups showed resistance to the toxic effect of Vortioxetine and the viability was higher than the control groups. While forming spheroids, diameter length and area increased proportionally with incubation time for BeWo, HUVEC and co-culture groups. Also, cell localization of spheroids was determined by CellTracker staining. Qualitative and quantitative measurements were obtained by comparing calcein-PI fluorescent imaging and Vortioxetine applications with MTS viability analysis. E-cadherin, F-actin and SERT immunofluorescent dyes were applied in BeWo cells, and it was observed that intercellular integrity was impaired, the structure of intracellular skeletal elements was changed, and SERT receptor expression decreased depending on the incubation period at increasing doses. At the same time, the amount of 2D and 3D β-hCG hormones was measured in the BeWo and co-culture groups, and a higher amount of hormone production was observed in the 3D culture groups. 
This thesis study presents an evaluation in terms of mono and co-cultures by comparing the placental toxicity of vortioxetine, the active ingredient of the antidepressant drug Brintellix, the response of the barrier structure, hormone production in 2D and 3D systems.