HK-2 hücre hattında anti-HLA antikorlarının mirna ekspresyonu üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of anti-HLA antibodies on mirna expression in HK-2 cell line
Yazar: ASLI ELDEM
Danışman: PROF. DR. TÜLAY KILIÇASLAN AYNA
İzmir Katip Çelebi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Amaç: 
Son dönem böbrek hastalarının en kesin tedavi yöntemi böbrek nakli olarak bilinmektedir. Bu hastalarda kan transfüzyonu, nakil geçmişi ve gebelik öyküsüyle meydana gelen anti-insan lökosit antijeni (HLA) antikorları oluşabilmektedir. Anti-HLA antikorları vericiye özgü (DSA) ise antikor aracılı rejeksiyona (AAR) sebep olmaktadır. Kompleman proteinleri AAR gelişiminde ve organ kaybının ortaya çıkmasında önemlidir. Son yıllarda, miRNA olarak adlandırılan kısa RNA dizilerinin hücrelerde gen ifadesinin (ekspresyonunun) düzenlenmesine katkı sağladığı saptanmıştır. Böbrek naklinde bazı miRNA'ların rejeksiyon veya naklinden sonra hastalık nüksü gibi patolojik süreçlerde yer aldığı bulunmuştur. Önerdiğimiz tez projesinde çaprazlama (cross match-XM) testi yaparak bu süreçte bazı miRNA'ların let-7c-5p, miR-21, miR-28-3p, miR-29b-3p, miR-125a-5p, miR-142-5p, miR-145, miR-155, miR-217, miR-520e, miR-885 ve bu miRNA'ların ilişkili olduğu genlerin (C1q ve TGF-β, TNF-α, Kaspaz 3) mRNA ifade düzeyleri belirlenerek in vitro AAR'deki rolü araştırıldı.
Yöntem: 
Bu çalışma kapsamında insan proksimal tübüler epitel hücreleri (HK-2) ile bu hücrelere özgü DSA(+) ve kontrol olarak antikor  içermeyen DSA(-) serum örnekleri kullanıldı. Komplemana Bağlı Sitotoksik XM (CDC-XM) koşulları sağlanarak, HK-2 hücreleri ve serum örnekleri ile in vitro AAR modeli oluşturuldu. Belirlenen süre sonunda örneklerden RNA ve miRNA izolasyonu gerçekleştirildi. cDNA (komplementer DNA) sentezi gerçekleştirildikten sonra gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) yöntemi ile belirlenen genlerin ekspresyon düzeyleri araştırıldı.


Bulgular:
Tez çalışması sonucunda in vitro AAR modelinde DSA(-)'e göre DSA(+) 'de TGF-β, TNF-α, C1qA, C1qC, Kaspaz 3 genlerinin ve let-7c-5p, miR-28-3p, miR-125a-5p, miR-142-5p, miR-155, miR-520e miRNA'ların ekspresyon düzeylerinde anlamlı derecede artış görüldü. C1qB, miR-21, miR-29b-3p, miR-145, miR-217, miR-885 anlamlı azalış görüldü. Ayrıca DSA(+) CDC C(-) örneklerinin DSA (-) CDC C(-)'e göre  kat değişimleri incelendiğinde miR-21, miR-28-3p , miR-29b-3p, miR-145, miR-217, miR-520e ve TGF-β, C1qA, C1qB, C1qC ve Kaspaz 3 genlerinde istatistiksel olarak anlamlı kat artışı görülmüştür.

Sonuçlar: 
Tez çalışmasından elde ettiğimiz sonuçlar bazı miRNA'ların (let-7c-5p, miR-28-3p, miR-125a-5p, miR-142-5p, miR-155, miR-520e) ekspresyonlarındaki artışın TGF-β, TNF-α, C1qA, C1qC, Kaspaz 3 genlerinin ekspresyonlarının artışı ile parelellik gösterirken, C1qB gen ekspresyonu ile zıt etki gösterdiği yönündedir. miR-21, miR-29b-3p, miR-145, miR-217, miR-885 ekspresyonları ise in vitro AAR'de  literatürle uyumlu olarak  anlamlı azalma göstermektedir. 
AAR da moleküler mekanizmanın daha iyi anlaşılması için miRNA'lar ve ilişkili olabilecekleri mRNA paneli genişletilerek in vivo AAR için bir biyobelirteç oluşturabilir. Bu sayede nakil sonrasında rejeksiyon riskli olan hastalarda bu miRNA'ların ve hedef genlerinin ekspresyon düzeylerinin takibi yeni tedavilere de katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Aim:
The most definitive treatment method for end-stage renal disease is known as kidney transplantation. Anti-human leukocyte antigen (HLA) antibodies may occur in these patients due to blood transfusion, transplant history and pregnancy history. If anti-HLA antibodies are donor-specific (DSA), they cause antibody-mediated rejection (AAR). Complement proteins are important in the development of AAR and the occurrence of organ loss. In recent years, it has been determined that short RNA sequences called miRNA contribute to the regulation of gene expression in cells. Some miRNAs in kidney transplantation have been found to be involved in pathological processes such as rejection or disease recurrence after transplantation. In the proposed thesis project, by performing a cross match-XM test, some miRNAs in this process let-7c-5p, miR-21, miR-28-3p, miR-29b-3p, miR-125a-5p, miR-142- 5p, miR-145, miR-155, miR-217, miR-520e, miR-885, and the mRNA expression levels of genes associated with these miRNAs (C1q and TGF-β, TNF-α, Caspase 3) were determined and their role in in vitro AAR was investigated
Methods:
In this study, serum samples containing human renal tubule epithelial cells (HK-2) and specific for these cells (DSA) and (DSA (+)) and without antibodies (DSA (-)) as controls were used. An in vitro AAR model was established with HK-2 cells and serum samples by providing Complement-Dependent Cytotoxic XM (CDC-XM) conditions. At the end of the specified time, RNA and miRNA isolation were performed from the samples. After performing cDNA (complementary DNA) synthesis, the expression levels of genes determined by real-time PCR (qRT-PCR) method were investigated..
Results:
As a result of the thesis study, TGF-β, TNF-α, C1qA, C1qC, Caspase 3 genes and let-7c-5p, miR-28-3p, miR- expression levels of 125a-5p, miR-142-5p, miR-155, miR-520e miRNAs were significantly increased. C1qB, miR-21, miR-145, miR-217, miR-885 were significantly decreased. In addition, when the fold changes of DSA(+) CDC C(-) samples were examined according to DSA (-) CDC C(-), miR-21, miR-28-3p , miR-29b-3p, miR-145, miR-217 a fold increase was observed in miR-520e and TGF-β, C1qA, C1qB, C1qC and Caspase3 genes.
Conclusion:
Our results from the thesis study showed that the expression of some miRNAs (let-7c-5p, miR-28-3p, miR-125a-5p, miR-142-5p, miR-155, miR-520e) increased TGF-β, TNF- α, C1qA, C1qC, Caspase 3 genes show parallelism with the increase in their expression, while it has the opposite effect with C1qB gene expression. The expressions of miR-21, miR-145, miR-217, and miR-885 show a significant decrease in AAR in vitro, which is in line with the literature, and inversely correlate with the expressions of TGF-β, TNF-α, C1qA, C1qC, Caspase 3 genes. In order to better understand the molecular mechanism of AAR, miRNAs and the mRNA panel they may be related to can be expanded to form a biomarker for AAR in vivo. In this way, monitoring the expression levels of these miRNAs and their target genes in patients at risk of rejection after transplantation will also contribute to new treatments.