Yenidoğan tarama programı kapsamında taranan biyotinidaz eksikliğinin genetik etiyolojisinde yer alan mutasyonların dağılımı ve genotip-fenotip korelasyonu
Distribution and genotype-phenotype correlation of mutations involved in the genetic etiology of biotinidase deficiency screened within the scope of the newborn screening program
Yazar: NIGAR SHIRINOVA
Danışman: PROF. DR. MUNİS DÜNDAR
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
ÖZET
Biyotinidaz eksikliği, otozomal resesif kalıtım paterni gösteren dünya çapında görülme sıklığı 1:40.000 ile 1:60.000 arasında değişen, belirti ve semptomları tipik olarak yaşamın ilk birkaç ayında veya yılında ortaya çıkan, hafiften şiddetliye kadar değişen geniş bir klinik belirti yelpazesine sahip nörokütanöz metabolik hastalıktır. Erken tanı ve tedaviye başlama zamanı semptomların önlenebilirliği ve geridönüştürülebilirliği ile doğru orantılı olduğundan bu hastalık dünyada ve Türkiyede Ulusal Yenidoğan Tarama Programına (UYTP) dahil edilen hastalıklardan biri olmuştur. 
Bu çalışmada Biyotinidaz Eksikliğine yönelik genetik tetkikleri çalışılması amacıyla yönlendirilmiş hastaların genetik sonuçları incelenerek saptanan varyantların retrospektif olarak değerlendirilmesi, biyokimyasal bulguları ile karşılaştırılarak genotip-fenotip ilişkisinin incelenmesi amaçlanmıştır.
Çalışmamızda 2013-2023 yılları arasında Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim dalına ve Çukurova Üniversitesi Adana Genetik Hastalıklar Tanı ve Tedavi Merkezi'ne (AGENTEM) yönlendirilen hastaların serum biyotinidaz enzim değerleri ve BTD geni dizi analizi sonuçları retrospektif olarak değerlendirilmiş, tespit edilen mutasyonlar genin NM_001370658.1 (MANE Select) olarak tanımlanan en son transkripti referans alınarak güncellenmiş, kalıtım paternine ve American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) kriterlerine göre patojenite sınıflaması ile sınıflandırılmaları yapılmışdır. Ayrıca bu çalışmada, varyant saptanmış bireylerin aile üyelerinden çalışılmış (aile taraması kapsamında) BTD geni dizi analiz sonuçları da retrospektif olarak değerlendirilmiştir. 
Çalışmaya 2013-2023 yılları arasında merkezimize yönlendirilmiş 2672 hasta dahil edilmiştir. Hastaların çoğu pediatrik ve Yenidoğan Tarama Programı ile yönlendirilmiş hastalar olup, 1245 (%47) hasta 30 günden küçük, 672 (%25) hasta 30-365 gün arasında, 125 (%5) hasta 1-18 yaş arasında ve 630 (%23) hasta 18 yaşından büyüktü.
Hastalardan 2105'nin enzim aktivitesi fluorometrik yöntemle ölçülmüştür. Bu hastaların 100'ünde (%5) enzim aktivitesi %10'un altında (Belirgin Biyotinidaz Eksikliği), 1039 (%49) hastada enzim aktivitesi %10-%30 arasında (Kısmi Biyotinidaz Eksikliği), 966 (%46) hastada ise enzim aktivitesi %30'un üzerinde görüldü. Tüm hastaların BTD genine yönelik genetik tetkikleri çalışılmış olup, bu hastaların 2307'sinde mutasyon tespit edildi, 365 hastada ise herhangi bir varyant görülmedi. Mutasyon tespit edilmiş hastalarda toplam 83 farklı varyant görüldü. Varyantlar özellikle genin 4.ekzonunda kümelenmişti. Saptanan 83 varyantın 68'i (%82) missense, 8 (%10) varyant frameshift (çerçeve kayması), 5 (%6) varyant sinonim (sessiz), 1 (%1) varyant nonsense (anlamsız), 1 (%1) varyant intronik olarak sınıflandırıldı. Tespit edilmiş varyantlar ACMG kriterlerine göre 5'i Benign, 3'ü Olası Benign, 29'u Klinik Önemi Belirsiz, 21'i Olası Patojenik ve 25'i Patojenik olmak üzere sınıflandırıldı. 68 missense varyantı REVEL skoruna göre değerlendirildiğinde REVEL skoru 0,75'in üzerinde olan 32, 0,94'ün üzerinde olan 4 varyant görüldü. 
Bu çalışmada hastalarda en sık tespit edilmiş genotipler 709 hastada heterozigot c.1270G>C (p.D424H) mutasyonu, 479 hastada homozigot c.1270G>C (p.D424H) mutasyonu, 163 hastada heterozigot c.410G>A (p.R137H) mutasyonu, 143 hastada heterozigot c.1535C>T (p.T512M) mutasyonu, 101 hastada c.40_44delGGCTGinsC (p.G14Lfs*35)/c.38G>T (p.C13F) birleşik heterozigot mutasyonları oldu. Daha önce veri tabanlarında tanımlanmamış on dört yeni varyant bildirildi. 
Ulusal Yenidoğan Tarama Programı, etkilenen binlerce çocuğun ve hatta her yıl bir milyondan fazla yenidoğanın yaşamını büyük ölçüde iyileştiren, hastalıkların nüfus çapında tespit edilmesini sağlayan dikkate değer bir başarı elde etmiştir. BTD hastalığının tanısı serumda biyotinidaz aktivitesinin ölçümü ve moleküler analiz yöntemlerine dayanmaktadır. Çalışmamızda literatürle uyumlu olarak ciddi patojenik varyantlara sahip birçok asemptomatik vakalar mevcuttu. Enzim aktivitesi %30'un üzerinde tespit edilmiş 157 hastada homozigot, 107 hastada birleşik heterozigot mutasyon görüldü. Ayrıca mutasyon tespit edilmemiş 365 hastanın 30'unda Kısmi Biyotinidaz Eksikliği görüldü. Biyotinidaz enzim aktivite seviyelerinin yaşamın ilk günlerinde en düşük olup, sonraki günlerde arttığı bildirilmektedir. Aynı zamanda biyotinidaz aktivitesindeki değişkenlikler, çeşitli klinik durumlardan (erken doğum, çevre sıcaklığı, örneklerin transfer koşulları, hiperbilirubinemi ve perinatal asfiksi) etkilenebilmektedir. Bu bulgular, neonatal dönemdeki ölçümlerin mevcut enzim aktivite düzeyini belirlemek için yeterli olmadığını ve ardışık testlerle takip edilmesi gerektiğini göstermektedir. Bu çalışmanın sonuçları, bu bölgedeki BTD'li yenidoğanlarda genotip ile biyokimyasal fenotip arasında düşük bir uyum olduğunu ve varyant patojenitesi ile biyokimyasal fenotip arasında öngörülebilir bir korelasyon kurmanın yeterli olmadığını doğrulamaktadır. Ek olarak, bu çalışma, genotip ve biyokimyasal fenotip arasındaki uyumsuzluğu açıklamak için enzim aktivitesi ölçümlerinde ve moleküler analizlerde analitik zorlukların ele alınmasının önemini vurgulamaktadır.
Anahtar Kelimeler: Biyotinidaz eksikliği, yenidoğan tarama programı, BTD geni, yeni nesil dizileme yöntemleri.

Abstract:
ABSTRACT
Biotinidase deficiency is a neurocutaneous metabolic disease with an autosomal recessive inheritance pattern, a worldwide prevalence of 1:40,000 to 1:60,000, and signs and symptoms typically appear in the first few months or years of life, with a wide range of clinical symptoms ranging from mild to severe. Since early diagnosis and the time to start treatment are directly proportional to the preventability and reversibility of symptoms, this disease has become one of the diseases included in the National Newborn Screening Program (NBS) worldwide and in Turkey.
This study aimed to retrospectively evaluate the detected variants by examining the genetic results of patients referred for genetic tests for Biotinidase Deficiency, compare them with biochemical findings, and examine the genotype-phenotype relationship.
In our study, serum biotinidase enzyme values and BTD gene sequence analysis results of patients referred to Çukurova University Faculty of Medicine, Department of Medical Genetics and Çukurova University Adana Genetic Diseases Diagnosis and Treatment Center (AGENTEM) between 2013-2023 were evaluated retrospectively, the detected mutations were updated by taking the latest transcript of the gene defined as NM_001370658.1 (MANE Select) as reference, and they were classified with pathogenicity classification according to the inheritance pattern and American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) criteria. In addition, in this study, BTD gene sequence analysis results studied from family members of individuals with variants detected (within the scope of family screening) were also evaluated retrospectively.
In our study, serum biotinidase enzyme values and BTD gene sequence analysis results of patients referred to Çukurova University Faculty of Medicine, Department of Medical Genetics and Çukurova University Adana Genetic Diseases Diagnosis and Treatment Center (AGENTEM) between 2013-2023 were evaluated retrospectively, the detected mutations were updated by taking the latest transcript of the gene defined as NM_001370658.1 (MANE Select) as reference, and they were classified with pathogenicity classification according to the inheritance pattern and American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) criteria. In addition, in this study, BTD gene sequence analysis results studied from family members of individuals with variants detected (within the scope of family screening) were also evaluated retrospectively.
The study included 2672 patients referred to our center between 2013-2023. Most of the patients were pediatric and referred through the Newborn Screening Program, 1245 (47%) patients were younger than 30 days, 672 (25%) patients were between 30-365 days, 125 (5%) patients were between 1-18 years of age, and 630 (23%) patients were older than 18 years. Enzyme activity was measured in 2105 patients using the fluorometric method. In 100 (5%) of these patients, enzyme activity was below 10% (Significant Biotinidase Deficiency); in 1039 (49%) patients, enzyme activity was between 10%-30% (Partial Biotinidase Deficiency), and in 966 (46%) patients, enzyme activity was above 30%. Genetic tests for the BTD gene were performed on all patients, and mutations were detected in 2307 of these patients, while no variants were seen in 365 patients. A total of 83 different variants were seen in patients with mutations. The variants were clustered, particularly in the 4th exon of the gene. Of the 83 variants detected, 68 (82%) were classified as missense, 8 (10%) as frameshift, 5 (6%) as synonymous, 1 (1%) as nonsense, and 1 (1%) as intronic. The detected variants were classified according to ACMG criteria as 5 as Benign, 3 as Possible Benign, 29 as Clinically Uncertain, 21 as Possibly Pathogenic, and 25 as Pathogenic. When 68 missense variants were evaluated according to the REVEL score, 32 variants with a REVEL score above 0.75 and 4 variants with a REVEL score above 0.94 were observed. The most frequently detected genotypes in this study were heterozygous c.1270G>C (p.D424H) mutation in 709 patients, homozygous c.1270G>C (p.D424H) mutation in 479 patients, heterozygous c.410G>A (p.R137H) mutation in 163 patients, heterozygous c.1535C>T (p.T512M) mutation in 143 patients, and combined heterozygous c.40_44delGGCTGinsC (p.G14Lfs*35)/c.38G>T (p.C13F) mutations in 101 patients. Fourteen new variants not previously identified in databases were reported. The National Newborn Screening Program has achieved remarkable success in detecting the disease population-wide, significantly improving the lives of thousands of affected children and more than a million newborns annually. The diagnosis of BTD disease is based on the measurement of biotinidase activity in serum and molecular analysis methods. In our study, there were many asymptomatic cases with severe pathogenic variants, consistent with the literature. Homozygous mutations were seen in 157 patients, and compound heterozygous mutations in 107 patients with enzyme activity above 30%. In addition, partial biotinidase deficiency was seen in 30 of 365 patients without mutation. Biotinidase enzyme activity levels are reported to be lowest in the first days of life and increase in the following days. At the same time, variations in biotinidase activity can be affected by various clinical conditions (premature birth, environmental temperature, transfer conditions of samples, hyperbilirubinemia and perinatal asphyxia). These findings indicate that neonatal period measurements are insufficient to determine the current enzyme activity level and should be followed up with sequential tests. The results of this study confirm that there is a low concordance between genotype and biochemical phenotype in newborns with BTD in this region and that it is not sufficient to establish a predictable correlation between variant pathogenicity and biochemical phenotype. In addition, this study highlights the importance of addressing analytical difficulties in enzyme activity measurements and molecular analyses to explain the discordance between genotype and biochemical phenotype. 
KEYWORDS: Biotinidase deficiency, newborn screening program, BTD gene, following generation sequencing methods.