Glaucium grandiflorum Boiss. & A. Huet subsp. refractum (Nábělek) Mory alkaloit ekstraktlarının kalsiyum homeostazı, mitojenle aktifleştirilen protein kinaz ve nöral ölüm yolakları üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of Glaucium grandiflorum Boiss. & A. Huet subsp. refractum (Nábělek) Mory alkaloid extracts on calcium homeostasis, mitogen activated protein kinase and neural death pathways
Yazar: SERAP NİĞDELİOĞLU DOLANBAY
Danışman: PROF. DR. BELMA ASLIM
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Nörodejeneratif hastalıklar (NH'ler), mitojenle aktifleştirilen protein kinaz (MAPK) sinyal yolaklarının aktivasyonu, hücre içi kalsiyum (Ca+2) homeostazının ve nöral ölüm sinyal yolaklarının disregülasyonu gibi nöral ölümü indükleyen ortak mekanizmalara sahiptir. NH'lerin tedavisinde kullanılan mevcut ilaçların, yalnızca bir biyobelirteci hedef alması ve istenilen başarının elde edilememesi nedeniyle, günümüzde birden fazla mekanizmayı hedef alan alternatif tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine odaklanılmıştır. Bu tez çalışmasında, izokinolin alkaloitlerini içeren Glaucium grandiflorum alkaloit ekstraktlarının NH'lerin ortak mekanizmaları üzerindeki etkisi araştırılarak, NH'ler için etkin bir ilacın geliştirilmesinde kullanılabilecek çoklu etki mekanizmasına sahip yeni bir ajanın bulunması amaçlanmıştır. G. grandiflorum'un kloroform, metanol ve su çözücüleriyle hazırlanan alkaloit ekstraktlarının kalitatif/kantitatif içerik analizi GC-MS ile belirlenmiştir. Alkaloit ekstraktlarının H2O2 ile oksidatif strese indüklenen farklılaştırılmış PC12 hücrelerinde, anti-oksidatif ve hücre döngüsü regüle edici etkileri flow sitometri, anti-apoptotik etkileri ise flow sitometri ve qRT-PCR ile belirlenmiştir. Kloroform alkaloit ekstraktı (KAE)'nin hücre içi Ca+2 homeostazını regüle edici etkisi flow sitometri, qRT-PCR ve Western blot, MAPK sinyal yolaklarının aktivasyonunu inhibe edici ve nöral ölüm sinyal yolaklarını regüle edici etkileri ise Western blot ile belirlenmiştir. Alkaloit ekstraktlarında majör alkaloit %46,4-91,5 allokriptopin olup, en yüksek allokriptopin kloroform çözücüsünün kullanıldığı alkaloit ekstraktında tespit edilmiştir. Çalışmalarda en iyi sonuçların elde edildiği KAE, hücre içi ROS seviyesini (5,7 kat), apoptotik hücreleri (3,0 kat) ve Sub G1 fazındaki hücreleri baskılarken (6,8 kat); G1 fazındaki hücreleri arttırmıştır (1,5 kat). KAE, Bcl-2 mRNA ekspresyon seviyesini arttırırken (3,0 kat), Bax ve Kaspaz-9/-3 mRNA ekspresyon seviyelerini azaltmıştır (2,4-3,5 kat). KAE hücre içi Ca+2 seviyesini (3,4 kat), Cav1.2 ve Cav1.3'ü hem gen (2,5 ve 2,4 kat) hem de protein düzeyinde (2,4 ve 1,9 kat) baskılamıştır. KAE, MAPK sinyal yolaklarının aktivasyonunu inhibe ederken (ERK1/2: 2,4; JNK: 2,7 ve p38: 2,2 kat), nöral ölüm sinyal yolaklarını (Akt: 4,5 kat artış/GSK-3β: 3,2 kat artış/Tau: Ser 396; 3,7 ve Thr 212; 2,0 kat baskılama) regüle etmiştir. Bu sonuçlar, allokriptopinin nöral ölümün farklı sinyal yolaklarında çoklu etki mekanizmalarına sahip olduğunu göstermiştir. Buna göre, allokriptopince zengin KAE ve allokriptopin NH'lerin tedavisinde kullanılan ilaçlara alternatif yeni bir nöroprotektif ve/veya terapötik farmakolojik ajan olma potansiyelini taşıyabilir.

Abstract:
Neurodegenerative diseases (NDs) have common mechanisms that induce neural death, such as activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways, dysregulation of intracellular calcium (Ca+2) homeostasis and neural death signaling pathways. Since, the current drugs used in the treatment of NDs target only one biomarker and the desired success cannot be achieved, the development of alternative treatment methods targeting more than one mechanism has been focused on. In this thesis, it was aimed to find a new agent with multiple action mechanisms that can be used in the development of an effective drug for NDs by investigating the effect of Glaucium grandiflorum alkaloid extracts containing isoquinoline alkaloids on the common mechanisms of NDs. Qualitative/quantitative content analysis of alkaloid extracts of G. grandiflorum prepared with chloroform, methanol and water solvents were determined by GC-MS. Anti-oxidative and cell cycle-regulating effects of alkaloid extracts in differentiated PC12 cells induced by oxidative stress with H2O2 were determined by flow cytometry, and anti-apoptotic effects were determined by flow cytometry and qRT-PCR. The regulating effect of chloroform alkaloid extract (CAE) on intracellular Ca+2 homeostasis was determined by flow cytometry, qRT-PCR and Western blot, and its inhibitory effects on MAPK signaling pathway activation and regulating neural death signaling pathways were determined by Western blot. The major alkaloid was 46.4-91.5% allocryptopine, and the highest allocryptopine was detected in the alkaloid extract using chloroform solvent. CAE, in which the best results were obtained in the studies, suppressed intracellular ROS level (5.7-fold), apoptotic cells (3.0-fold) and cells in Sub G1 phase (6.8-fold); it increased the cells in the G1 phase (1.5-fold). CAE increased the expression level of Bcl-2 mRNA (3.0-fold), while it decreased the expression levels of Bax and Caspase-9/-3 mRNA (2.4-3.5-fold). In addition, CAE suppressed intracellular Ca+2 level (3.4-fold), Cav1.2 and Cav1.3 at both gene (2.5 and 2.4-fold) and protein level (2.4 and 1.9-fold). CAE inhibited the activation of MAPK signaling pathways (ERK1/2: 2.4; JNK: 2.7, and p38: 2.2-fold) and regulated neural death signaling pathways (Akt: 4.5-fold increase/GSK-3β: 3.2-fold increase/Tau: Ser 396; 3.7 and Thr 212; 2.0-fold supression). These results demonstrated that allocryptopine has multiple mechanisms of action in different signaling pathways of neural death. Accordingly, allocryptopine-rich CAE and allocryptopine may have the potential to be a new neuroprotective and/or therapeutic pharmacological agent as an alternative to drugs used in the treatment of NDs.