Gastroenterit semptomu olan hastaların dışkılarında koronavirüslerin belirlenmesi ve moleküler karakterizasyonu
Detection and molecular characterization of coronaviruses in the stools of patients with gastroenteritis symptom
Yazar: ŞEYMA AKBULUT
Danışman: PROF. DR. SEDA TEZCAN ÜLGER
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: DNA dizileme = DNA sequencing ; Dışkı = Feces ; Filogenetik = Phylogenetic ; Korona virüs enfeksiyonları = Coronavirus enfections ; Korona virüsler = Coronaviridae ; PCR =

Özet:
Koronavirüsler (CoV'ler), enfekte ettikleri canlılarda; solunum, gastrointestinal, nörolojik ve sistemik hastalıklar gibi çeşitli enfeksiyonlara neden olabilen önemli patojenlerdir. Başlıca solunum kanalı etkeni olan HCoV'lerinden olan OC43, HKU1, 229E ve NL63'ün gastrointestinal kanal örneklerinde saptandığı yapılan çalışmalarla ortaya çıkarılmıştır. SARS-CoV ve MERS-CoV'a benzer şekilde, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun da gastrointestinal kanalı etkilediğine dair artan kanıtlar bulunmaktadır. Bununla birlikte, CoV'ler çeşitli hayvan türlerinde ishal hastalığı ile ilişkilidir. CoV'lerin son derece bulaşıcı doğası göz önünde bulundurulduğunda, mevcut ve olası salgınların önlenmesi ve kontrolü için özellikle yeni vakaların sürveyansına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tez çalışmasında; gastrointestinal sistem semptomu olan hastalardan toplanan dışkı örneklerinde, tüm CoV'leri hedefleyen pan-CoVprimerlerinin kullanıldığı RT-PCR temelli bir yaklaşım ile CoV'lerinsaçılımı ve sirkülasyonunun değerlendirilmesi amaçlandı. 
Çalışmaya Kasım 2021-Ekim 2022 tarih aralığında Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı'na gelen ishalli hastalara ait 152 sulu dışkı örneği dahil edildi. Dışkı örneklerinden nükleik asit saflaştırılması; innuPREPVirus DNA/RNA Kit (IST InnuscreenGmbH, Almanya) kullanılarak üretici firma önerileri doğrultusunda gerçekleştirildi. SARS-CoV-2 dahil olmak üzere Orthocoronavirinae ailesinin tüm üyeleri için ortak olan korunmuş RNA'ya bağımlı RNA polimeraz (RdRp) genom bölgesini hedefleyen semi-nested RT-PCR tekniği uygulandı. Elde edilen PCR ürünleri, işaretli dideoksinükleotidleri içeren "BigdyeTerminator v3.1 CycleSequencing kit" (AppliedBiosystems, ABD) kullanarak, sense ve antisense zinciri "CycleSequence" PCR'ı yapıldı. Reaksiyon ürünlerinin elektroforez işlemi "ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer" (AppliedBiosystems, ABD) otomatize DNA dizi analizi cihazında gerçekleştirildi. Dizisi çıkarılan örnekler, NCBI (National Center forBiotechnology Information)-BLAST (the Basic LocalAlignmentSearchTool) programına yüklendi ve Gen-Bankası veri tabanında yayınlanmış referans dizi verileri ile karşılaştırılarak olası CoVtiplendirilmesi yapıldı.
RT-PCR sonucunda toplam 152 örneğin 18'inde (%11,8) pozitif kontrol hizasında bant elde edildi. Düzenlemesi yapılan dizi analizi verilerinin BLAST, NCBI veritabanında karşılaştırılması ile 4 örneğin (%2,6, 4/152) SARS-CoV-2 olduğu belirlendi. Çalışmada, gaitada lökosit varlığı, gastrointestinal semptomlar (bulantı, karın ağrısı, ishal, kusma), diğer semptomlar (halsizlik, ateş, dispne, öksürük, üst solunum yolu enfeksiyonu) ve altta yatan hastalıklar (ülseratif kolit, Crohn hastalığı, kronik ishal, kanser, hematolojik malignite, akut veya kronik böbrek yetmezliği) ile kemoterapi ve immünsüpresif tedavi alma durumu ile CoV RT-PCR pozitifliği arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamıştır (p>0,05).
Elde edilen veriler ile gastrointestinal semptomu olan hastaların dışkı örneğinde SARS-CoV-2 sirkülasyonu gösterildi. Enterik kanalda da hastalık yapma özelliği olan CoV'lerin araştırılması, rutin laboratuvar tanılarını iyileştirmek, toplumda ve hastane ortamlarında bu virüslerin dolaşımı hakkında epidemiyolojik veriler sağlamak için büyük önem arz etmektedir.

Abstract:
Coronaviruses (CoVs) are significant pathogens that can cause a variety of infections in
infected organisms, including respiratory, gastrointestinal, neurological, and systemic diseases.
Studies have revealed that HCoVs, primarily respiratory pathogens such as OC43, HKU1, 229E,
and NL63, have also been detected in gastrointestinal tract samples. Similar to SARS-CoV and
MERS-CoV, there is increasing evidence that SARS-CoV-2 infection also affects the
gastrointestinal tract. Additionally, CoVs are associated with diarrheal disease in various animal
species. Given the highly contagious nature of CoVs, surveillance of new cases is essential for the
prevention and control of current and potential outbreaks. This thesis aims to evaluate the
shedding and circulation of endemic HCoVs and potential SARS-CoV-2 in stool samples collected
from patients with gastrointestinal symptoms, using an RT-PCR-based approach with pan-CoV
primers targeting all CoVs.
The study included 152 watery stool samples from patients with diarrhea who visited
the Laboratory of the Department of Medical Microbiology at Mersin University Faculty of
Medicine Hospital between November 2021 and October 2022. Nucleic acid purification from
stool samples was performed using the innuPREP Virus DNA/RNA Kit (IST Innuscreen GmbH,
Germany) according to the manufacturer's recommendations. A semi-nested RT-PCR technique
targeting the conserved RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) genomic region common to all
members of the Orthocoronavirinae family, including SARS-CoV-2, was applied. The obtained
PCR products underwent "Cycle Sequence" PCR for both sense and antisense strands using the
"Bigdye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit" (Applied Biosystems, USA), which contains
labeled dideoxynucleotides. The electrophoresis of reaction products was performed using an
automated DNA sequencing device, the "ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer" (Applied
Biosystems, USA). The sequenced samples were uploaded to the NCBI (National Center for
Biotechnology Information)-BLAST (the Basic Local Alignment Search Tool) program and
compared with published reference sequence data in the GenBank database for potential CoV
typing.
RT-PCR results showed that 18 out of 152 samples (11.8%) exhibited bands at the
positive control position. Comparison of the processed sequencing data with the BLAST and
NCBI databases revealed that 4 samples (2.6%, 4/152) were identified as SARS-CoV-2. The
study found no statistically significant association between RT-PCR positivity for CoV and the
presence of leukocytes in feces, gastrointestinal symptoms (nausea, abdominal pain, diarrhea,
vomiting), other symptoms (weakness, fever, dyspnea, cough, upper respiratory tract infection),
underlying conditions (ulcerative colitis, Crohn's disease, chronic diarrhea, cancer, hematologic
malignancy, acute or chronic kidney failure), or the receipt of chemotherapy and
immunosuppressive therapy (p>0.05).With the obtained data, the circulation of SARS-CoV-2 in
the stool samples of patients with gastrointestinal symptoms was demonstrated. Investigating
CoVs capable of causing disease in the enteric canal is of great importance for improving routine
laboratory diagnoses and providing epidemiological data on the circulation of these viruses in
community and hospital environments.