Kolon kanser hücre hattında kuersetin ve kafeik asit fenetil ester yüklü nanopartiküllerin proliferasyon ve apoptoz üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of quercetin and caffeic acid phenethyl ester loaded nanoparticles on proliferation and apoptosis in colon cancer cell line
Yazar: REYHAN DİLSU ÇOLPAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AYŞEGÜL ERDEMİR
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Kolon kanseri, ülkemizde görülen kanser türleri arasında üçüncü sırada yer almakta ve görülme sıklığı giderek artmaktadır.  Günümüzde kemoterapi ve radyoterapi gibi kanser tedavisinde kullanılan yöntemler kısıtlı etkinliğe sahip olup birçok yan etkiyi barındırmaktadır. Bu nedenle, kanser tedavilerini desteklemek için yeni yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. Son yıllarda, bitkisel kökenli bileşikler birçok anti-kanser özellik sergilediklerinden dolayı anti-kanser ajan olarak kullanımları önem kazanmıştır. 
İki doğal kaynaklı bileşik, kuersetin ve kafeik asit fenetil ester (CAPE) molekülleri, immün yanıtın baskılanması, antioksidan, anti-inflamatuvar ve anti-karsinojenik özellikler başta olmak üzere geniş spektrumlu biyolojik aktiviteye sahiptirler.  Sahip oldukları bu avantajlı özelliklerinin yanı sıra suda düşük çözünürlük, düşük stabilite ve düşük biyoyararlanım gibi dezavantajlı özelliklerinden dolayı biyolojik sistemlerde kullanımları kısıtlanmaktadır. Günümüzde nanopartiküler sistemler, kuersetin ve CAPE gibi moleküllerin de sahip olduğu birçok dezavantajlı özelliğin bertaraf edilmesi amacıyla ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanılmaktadır. 
Bu tez çalışmasının amacı; kuersetin-CAPE içeren PLGA nanopartiküler sistemlerin sentezlenmesi ve HT-29 insan kolon kanser hücre hattı üzerinde anti-kanser aktivitesinin hücresel ve moleküler düzeyde belirlenmesidir. Kuersetin-CAPE yüklü nanopartiküller (QC-NP) tekli emülsiyon (w/o) çözücü uçurma yöntemi kullanılarak sentezlenmiştir. Nanopartiküllerin partikül boyutu, zeta potansiyeli, çoklu dağılım indeksi, ilaç yükleme kapasitesi ve enkapsülasyon verimi belirlenmiştir. QC-NP'nin enkapsülasyon verimi kuersetin için %74.28, CAPE için %65.24 olarak hesaplanmıştır.
Optimizasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilen QC-NP'nin serbest kuersetin-CAPE (Q-C) ile karşılaştırmalı olarak insan kolon kanser hücre hattı HT-29 üzerindeki sitotoksik aktivitesi MTT yöntemiyle belirlenmiştir. HT-29 hücrelerinin Q-C ve QC-NP ile inkübasyonu sonucunda IC50 değerleri sırasıyla 53.42 µg/ml ve 11.28 µg/ml (24 saat), 15.54 µg/ml ve 8.29 µg/ml (48 saat), 47.57 µg/ml ve 22.96 µg/ml (72 saat) olarak tespit edilmiştir. Bunlara ek olarak, Q-C ve QC-NP'nin HT-29 insan kolon kanser hücre hattı üzerindeki hücre göçü ve proliferasyonu üzerindeki etkisi incelenmiş; kanser hücrelerinin göç ve proliferasyonunu önemli ölçüde azalttığı gözlemlenmiştir. Aynı zamanda, hücreler üzerine Q-C ve QC-NP uygulanması ile apoptotik yolakta yer alan genlerin ekspresyon değişiklikleri mRNA ve protein düzeyinde gösterilmiştir. QC-NP'ler serbest moleküllere kıyasla HT-29 hücrelerinin kaspaz-3 ve cleaved kaspaz-9 ekspresyonunu arttırmıştır. Sonuç olarak, kuersetin-CAPE yüklü nanopartiküllerin HT-29 insan kolon karsinoma hücre hattında serbest moleküllere kıyasla sitotoksik aktiviteyi arttırdığı, proliferasyonu azalttığı ve apoptozu indüklediği tespit edilmiştir.

Abstract:
Colon cancer is in third place among the types of cancer seen in our country and its incidence is gradually increasing. Nowadays, methods used in cancer treatment such as chemotherapy and radiotherapy have limited efficacy and have many side effects. Therefore, new approaches are needed to support cancer therapies. Recently, plant derived compounds have gained an attraction as anti-cancer agents since they exhibit many anti-cancer properties. 
Two natural derived compounds, quercetin and caffeic acid phenethyl ester (CAPE) molecules, have broad spectrum of biological activity, especially in the suppression of immune response, antioxidant, anti-inflammatory and anti-carcinogenic properties. Besides their advantageous properties, their use in biological systems is limited due to their disadvantageous properties such as low solubility in water, low stability and low bioavailability. Nowadays, nanoparticle systems are being used as drug delivery systems to eliminate many disadvantageous properties which molecules such as quercetin and CAPE also have. 
The aim of this study is synthesis of quercetin-CAPE loaded nanoparticles and determination of their anti-cancer activity at cellular and molecular level on HT-29 human colon cancer cell line. Quercetin-CAPE loaded nanoparticles (QC-NPs) were synthesized by single emulsion (w/o) solvent evaporation method. Particle size, zeta potential, polydispersity index, drug loading capacity and encapsulation efficiency of nanoparticles were determined.  Particle size of QC-NP was determined as 348.6 nm. The encapsulation efficiency of the QC-NP was calculated 74.28% for quercetin and 65.24% for CAPE.  
Cytotoxic activity of optimized and characterized QC-NPs on HT-29 cell line was determined by MTT method in comparison with the free quercetin-CAPE (Q-C). Incubation of HT-29 cells with Q-C and QC-NPs resulted in IC50 values 53.42 µg/mL and 11.28 µg/mL (24 h), 15.54 µg/mL and 8.295 µg/mL (48 h), and 47.57 µg/mL and 22.96 µg/mL (72 h), respectively. Additionally, effect of Q-C and QC-NP on cell migration and proliferation of HT-29 human colon cancer cell line was examined and it was observed that migration and proliferation of cancer cells was significantly reduced.  Also, expression changes of genes in the apoptotic pathway were demonstrated at mRNA and protein level after treatment of cells with Q-C and QC-NP. QC-NPs increased the expression of caspase-3 and cleaved caspase-9 of HT-29 cells compared to free molecules. As a result, it was determined that quercetin-CAPE loaded nanoparticles increased cytotoxic activity, reduced proliferation and induced apoptosis in the HT-29 human colon carcinoma cell line in comparison with free molecules.