Sülfidril grubu içeren bileşiklerin tat-proteini (Transkripsiyon transaktivatörü) üzerine etkileri
Effects of compounds containing sulphydrile group on tat protein (Transcription transactivator)
Yazar: BUKET KARAMANOĞLU
Danışman: PROF. DR. İLHAN DEMİRHAN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Eczacılık Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
İnsan immün yetmezliği virüsü (HIV), kazanılmış bağışıklık yetmezliği sendromu (AIDS)'nun temel etkenidir. HIV bir Retrovirüs olup, hayvan retrovirüslerinden farklı olarak yapısal (gag, pol, env) genleri yanında HIV replikasyonunu kontrol eden düzenleyici (tat, rev) genlere sahiptir. Düzenleyici genlerinden tat (transkripsiyon transaktivatörü) geni ve gen ürünü Tat-proteini gerek virüsün replikasyonunda, gerekse ekstrasellüler toksin olarak HIV-1 patogenezinde önemli rollere sahiptir. Bu nedenle anti-HIV ajan ve aşı çalışmaları için yoğunlaşılan bir hedeftir. Tat protein aktivitesinin inhibisyonu, HIV replikasyonunun inhibisyonunu ve virüsün pek çok patolojik etkilerinin ortadan kalkmasını sağlayacaktır.Bu çalışmada, Tat proteininin metal iyonları ile bağ kurarak aktive olmasını sağlayan, 22 ve 37 inci aminoasitleri arasındaki sisteince zengin bölgesinin, sistein amino asitleriyle disülfit bağı kurabilecek bileşikler kullanılarak inhibisyonu amaçlanmıştır. Bu amaçla sülfidril grubu içeren L-Sistein etil ester, L-Sistein metil ester ve 2-Merkaptoimidazol bileşikleri kullanılmış, bu bileşiklerin etkileri, HIV genom bölgelerini taşıyan pCV1 ve pC15CAT plazmitleri ile transfekte edilen jurkat hücre kültüründe araştırılmıştır. Hücreler üzerine bileşiklerin 50µg/ml ve 100µg/ml olmak üzere iki dozu denenmiş, her bir bileşik için her iki dozda da en az üç deneme yapılmıştır. Sonrasında hücrelerde CAT ELISA kiti ile CAT (Kloramfenikol Asetil Transferaz) enzim aktivasyonu tespit edilmiştir. Tat-proteinin aktivitesinin CAT ekspresyonu ile doğru orantılı olduğu esasına dayanarak, Tat protein aktivitesinin inhibe olması durumu CAT enzim aktivasyonunun 100' den az olması ile açıklanmıştır.50µg/ml dozda yapılan denemeler sonucunda L-Cystein ethyl ester için; %71,79, L-Cystein methyl ester için; %139,85, 2-Mercaptoimidazole için; %393,37 ortalama değerleri elde edilmiştir. 50µg/ml dozda, CAT enzim aktivasyonunun arttığı dolayısıyla bu dozda Tat protein inhibisyonunun gerçekleşmediği görülmüştür. Bunun üzerine bileşiklerin konsantrasyonlarının artırılmasına karar verilmiş ve 100µg/ml konsantrasyonda denenmiştir. 100µg/ml'de L-Cystein ethyl ester için; %20,88, L-Cystein methyl ester için; %76,95, 2-Mercaptoimidazole için; %372,06 ortalama değerleri elde edilmiş ve dolayısıyla bu dozda da inhibisyon gözlenmemiştir. CAT aktivasyonundaki yüksek değerlere bakılarak bileşiklerin hücrelerin mitotik aktivitesini artırdığı fikrinden ise sitotoksisite testleri sonuçlarına bakılarak vazgeçilmiştir. Elde edilen bulgular ışığında bu çalışmanın anti-HIV ajan çalışmalarında yararlanmak üzere literatüre katkı sağlayacağına inanılmaktadır.Anahtar kelimeler: HIV, Tat-protein, CAT, AIDS, Sülfidril

Abstract:
Human immune deficiency virus (HIV) is principal agent of acquired immune deficiency syndrome (AIDS). HIV is a member of retroviridae and it differs from animal retroviridae in that it has regulator genes (tat, rev) controlling replication of HIV besides structural genes (gag, pol, env). Tat gene (transcription transactivator), among regulator genes, and the gene product, TAT-protein, have significant roles both in viral replication and in HIV pathogenesis due to acting as extra-cellular toxin. Therefore, it is a targeted focused due to anti-HIV agent and vaccinization studies. Inhibition of Tat-protein will ensure inhibition of HIV replication and removal of many pathologic viral effects.In this study, it was aimed to inhibit cysteine-rich rich region between 22nd and 37th amino acids, which activates Tat protein by binding metal ions, using compounds that may form disulphide bond with cysteine amino acids. For this purpose, L-Cystein ethyl ester, L-Cystein methyl ester and 2-Mercaptoimidazole compounds containing sulphydril group were used and effects of those compounds were examined in jurkat cell culture transfected with pCV1 and pC15CAT plasmids carrying genomic regions of HIV. Compounds at two different doses including 50µg/ml and 100µg/ml were added to compounds and at least three assays were performed at both doses for each compound. Later, enzyme CAT (Chloramphenicol Acetyl Transferase) activation was determined in those cells using CAT ELISA kit. Bsed on the principle that activity of Tat-protein is directly proportional to CAT expression, inhibition status of Tat protein?s activity was defined as CAT enzyme activation lower than 100.In consequence of assays performed at dose of 50µg/ml, means values of 71,79% for L-Cystein ethyl ester, 139,85 % for L-Cystein methyl ester and 393,37 % for 2-Mercaptoimidazole were obtained. I t was observed that at dose of 50µg/ml, activation of enzyme CAT increased and thus, inhibition of Tat protein could not be provided at this dose. Upon this finding, it was decided to increase concentrations of compounds and concentration of 100µg/ml was tested. At dose of 100µg/ml, mean values of 20,88 % for L-Cystein ethyl ester, 76,95 % for L-Cystein methyl ester and 372,06 % for 2-Mercaptoimidazole were obtained and consequently, inhibition could not be also observed at this dose. The idea that compounds increase mitotic activity of cell with regards the high values in CAT activation was abandoned depending on results of cytotoxicity tests. In the end of those results, it is believed that this study will make contribution to the literature such that it may provide a basis for future anti-HIV studies.Key words: HIV, Tat-protein, CAT, AIDS, Sulphydril