Klinik örneklerden izole edilen tüberküloz dışı mikobakterilerin dizi analizi  ile tanımlanması
Identification of non-tuberculous mycobacteria isolated from clinical specimens by sequence analysis
Yazar: SELÇUK TÜRKEL
Danışman: PROF. DR. AYŞE AYDAN ÖZKÜTÜK
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: DNA = DNA ; DNA analizi = DNA analysis ; Genler = Genes ; Mycobacterium = Mycobacterium

Özet:
Geçmişte hastalık etkeni olarak değerlendirilmeyen Tüberküloz dışı mikobakterilerin (TDM), günümüzde bağışıklık sistemini baskılayan hastalık ve tedavilerin artmasına bağlı olarak giderek artan sıklıkta enfeksiyon etkeni olarak izole edildiği görülmektedir. TDM?lerin oluşturdukları klinik tablolar ve tedavi protokolleri çok çeşitlilik gösterdiğinden tür düzeyinde tanımlanmaları gerekmektedir. Çalışmamızda, TDM?lerin tanımlanmasında altın standart olarak kabul edilen DNA dizi analizi ile izolatların tür düzeyinde identifiye edilmesi amaçlanmıştır.
     2004-2010 yılları arasında Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Merkez Laboratuvarında solunum yolu örneklerinden izole edilmiş olan 156 adet TDM izolatı LJ besiyerine pasajlanarak üretildi. DNA ekstraksiyonlarının ardından 65-kDa luk ısı şok proteinini kodlayan hsp65 gen bölgesinin 441 bp uzunluğundaki parsiyel bölgesi polimeraz zincir tepkimesi ile çoğaltıldı. hsp65 gen sekanslaması hizmet alımı ile gerçekleştirildi. Elde edilen DNA dizileri Genbank?tan indirilen referans mikobakteri hsp65 gen bölgesi dizileri ile karşılaştırılarak hizalandı. Hizalanmış DNA dizileri, BLAST programı ile analiz edilerek 156 adet izolat tür düzeyinde tanımlandı.
     Referans diziler ile karşılaştırılan izolatlardan 37?si %100, 111?i %99, dördü %98 ve birer tanesi ise %97, %95, %93 %90 uyumluluk ile tanımlandı. Çalışmaya alınan 156 izolatın tamamı hsp65 gen bölgesi sekans analizi ile belirlendi. Çalışmada 13 farklı TDM türü ve 2 farklı Nocardia türü olmak üzere, toplam 15 farklı tür saptandı. 
     En fazla izole edilen TDM türü 69 (%44,2) adet ile M.abscessus oldu. Bunu sırasıyla 26 (%16,7) izolat ile M. xenopi, 17 (%10,9) izolat ile M.peregrinum, 13 (%8,3) izolat ile M. fortuitum, 6 (%3,8) izolat ile M. intracellulare, 5 (%3,2) izolat ile M.simiae, 5 (%3,2) izolat ile M. lentiflavum, 3 (%1,9) izolat ile N.cyriacigeorgica, 3 (%1,9) izolat ile M.avium, 2 (%1,3) izolat ile N. abscessus, 2 (%1,3) izolat ile M. chelonae, 2 (%1,3) izolat ile M. bolletii ve birer (%0,6) adet olmak üzere M. senegalense, M. porcinum ve M. kansasii?nin takip ettiği belirlendi. 
     Sonuç olarak TDM türlerinin tanımlanmasında hsp65 gen bölgesinin parsiyel DNA dizi analizinin yeterli ve başarılı olduğu kanaatine varıldı.

Abstract:
Non-tuberculous mycobacteria (NTM), which was not accepted to cause disease in the past, has been observed to be isolated as an infection agent in increasing frequency in accordance with the rise in diseases and treatments that suppress immune system. Clinical syndromes that caused by NTM and their treatment protocols varies widely, therefore it is essential to be identified of NTM in species level. In our study, it is aimed to identify isolates in species level by DNA sequence analysis which is accepted as a gold standard in identification of NTM?s.
     156 NTM isolates have been grown on LJ medium, which were isolated from the respiratory tract specimens in Central Laboratories of Dokuz Eylul University Hospital, between 2004 and 2010. Four hundred and forty-one -bp fragment of the hsp65 gene encoding the 65-kDa heat shock protein was amplified by polymerase chain reaction after DNA extraction. Hsp65 gene sequencing has been accomplished by service procurement. DNA sequences have been aligned in accordance with the hsp65 gene sequences of reference mycobacteria at Genbank. Aligned DNA sequences have been analyzed by BLAST software and 156 isolates have been identified in species level. 
     Within isolates which were compared with reference sequences, 37 of them have been identified with 100% compatibility, whereas 111 of them have been identified with 99% compatibility, four of them with 98%, and remaining four isolates have been identified with 97%, 95%, 93% and 90% compatibilities. A total of the 156 isolates in the study have been identified by hsp65 sequence analysis. In the study, 15 different species have been detected 13 of which belong to NTM and 2 to Nocardia.   
     The most frequently isolated NTM species was detected as M. abscessus; 69 of which were isolated (44,2%). The rest of the results were obtained as follows; 26 isolates for M. xenopi (16,7%), 17 isolates for M. peregrinum (10,9%), 13 isolates for M. fortuitum (8,3%), 6 isolates for M. intracellulare (3,8%), 5 isolates for M. simiae (3,2%), 5 isolates for M. lentiflavum (3,2%), 3 isolates for N. cyriacigeorgica (1,9%), 3 isolates for M. avium (1,9%), 2 isolates for N. abscessus (1,3%), 2 isolates for M. chelonae  (1,3%), 2 isolates for M. bolletii (1,3%) and one isolate for M. senegalense, M. porcinum ve M. kansasii (0,6%) in order.
     As a result, hsp65 gene region?s partial DNA sequence analysis have been determined to be sufficient and succeeding at identification of NTM species.