Domuz yetiştirme çiftliğinin çevresinde bulunan toprak örneklerinden izole edilen antibiyotik dirençli bakterilerin fenotipik ve genotipik özellikleri
Phenotypic and genotypic characterization of antibiotic resistant soil bacteria adjacent to swine production facilities
Yazar: MELİKE EKİZOĞLU
Danışman: PROF. NEDİM SULTAN
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Antibiyotiklerin tarımda kullanımı ile insanlarda antibiyotiğe dirençli infeksiyonların artışı arasında bir bağ olup olmadığı son zamanlarda antibiyotik direnci ile ilgili olarak en çok tartışılan konulardan biridir. Bu çalışmada antibiyotik direncinin artışında çevresel faktörlerin rolü değerlendirilmiştir. Bu amaçla bir domuz yetiştirme çiftliği çevresinde bulunan tarlaya hayvan dışkısının uygulanmasının toprakta bulunan bakterilerin fenotipik ve genotipik dirençlerine olan etkisi araştırılmıştır.Gübreden, gübre uygulanmamış topraktan ve uygulama sonrası (bir gün, üç hafta ve üç ay) topraktan izole edilen bakterilerin tetrasiklin ve eritromisine karşı minimum inhibisyon konsantrasyonları agar dilüsyon ve E test yöntemleriyle belirlenmiştir. Toprak örneklerinin %68'i tetrasikline ve %94'ü eritromisine dirençli bulunmuştur. Gübre örneklerinde ise bu oran sırasıyla %64 ve %61'dir. Topraktan ve gübreden izole edilen suşların sırasıyla %69'u ve %43'ü iki antibiyotiğe de dirençlidirBakteriler 16S rRNA geninin V3 bölgesine ait nükleotid dizilerinin belirlenmesi yoluyla tanımlanmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonuyla amplifiye edilen bu bölgenin dizi analizleri Sanger'in dideoksi yöntemi kullanılarak Illinois Üniversitesi'nde gerçekleştirilmiştir. Diziler bilinen en yakın dizilerle nükleotid blast programı kullanılarak karşılaştırılmıştır. Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes olmak üzere 4 farklı şubeden 213 bakteri izole edilmiştir. Kırkaltı izolatta efluks direnç genlerinden olan tet(C), tet(H), tet(Z) ve ribozomal korunma mekanizmasından sorumlu tet(M), tet(O), tet(Q) ile 32 izolatta erm(A,B,C,F,G,Q) genlerinin varlığı araştırılmıştır. Tet(Q) sadece toprak izolatlarında ve tet(W) ve tet(M) ise sadece gübre izolatlarında bulunmakta iken diğer tüm tetrasiklin direnç genleri hem toprak hem gübre izolatlarındasaptanmıştır. Ayrıca 2 gübre izolatında erm(Q) genine rastlanmıştır. Sonuç olarak eritromisin ve tetrasiklin direnç genlerinin, gübreden ve topraktan alınan örneklerde gösterilmesi, bu antibiyotiklerin kullanımı ile direncin çevreye yayılımı arasındaki ilişkinin gösterilmesinde ilk önemli basamaktır.Araştırmacılar yine domuz dışkısı uygulanmış bir toprakta antibiyotik dirençli Pseudomonas türleri ve Bacillus cereus izolatlarının arttığını ortaya koymuşlardır. Onan ve LaPara ise gübre uygulamış toprakta uygulanmayana göre yüksek oranda taylosin dirençli bakteri olduğunu göstermiştir.

Abstract:
Whether there was a correlation between the antibiotic use in agriculture and the recent increase in the rate of antiotic resistant infections in humans has been highly debated. In this study, the environmental factors in the increase of antibiotic resistance were investigated. In this regard, the effect of manure application from swine confinement facility to the fields has been evaluated.Sampling was performed four times in a year: one day before manure application, one day after manure application, three weeks after manure application, and three months after manure application. Eritromycin and tetracycline susceptibility of isolates was determined by agar dilution and E-test methods. 68 per cent of the soil samples was detected as resistant to tetracycline and 94 per cent of the soil samples was found to be resistant to erithromycin. Samples were double resistant to both antibiotics.Bacteria were identified by determining the nucleotide sequence of 16S rRNA gene fragments from each organism. Polymerase chain reaction (PCR) used to amplify the V3 region of the rRNA gene. The phylogenic positions of the isolates were determined by searching the GeneBank database. 213 bacteria from 4 different phylum were isolated namely Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes.Class-specific primers were used to amplify each of the six erythromycin resistance genes erm(A,B,C,F,G,Q) in 32 samples. In 46 samples were investigated the distribution of tet genes (4 genes encoding efflux pumps tet(C), tet(H), tet(Z), tet(W) and 3 genes encoding ribosomal protection proteins tet(M), tet(O), tet(Q). While Tet(Q) gene was detected in only soil isolates, tet(W) andtet(M) were detected in only manure isolates. Other tet genes were identified both in soil and manure samples. Furthermore, erm(Q) gene was found in only two manure samples. In conclusion, the demonstration of the resistance genes of erithromycin and tetracycline in samples grabbed from soil and manure, constitutes the first phase of linking the antibiotic use with the spread of resistance to the environment.