Tıkanma ikteri yapılan ratlarda etanercept'in karaciğer hücrelerine ve apoptoza etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of etanercept on hepatic cells and apoptosis in rats with obstructive jaundice
Yazar: ERKAN KARACAN
Danışman: PROF. DR. PARS TUNÇYÜREK
Adnan Menderes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Genel Cerrahi = General Surgery
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Etanersept = Etanercept ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Karaciğer = Liver ; Safra kanalları = Bile ducts ; Sarılık-tıkayıcı = Jaundice-obstructive ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Safra yollarının herhangi bir seviyesinde, herhangi hastalığa bağlı olarak gelişen kısmi veya tam tıkanıklık sonucu safra akışının engellenmesi ile tıkanma sarılığı oluşur. Kolestazda gelişen hastalarda morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenleri arasında sepsis gibi infeksiyöz komplikasyonların gelişimidir (1).Barsağa safra akışının olmamasına bağlı olarak safra ile atılan maddelerin kanda birikimine neden olur. Kolestaz sonucu ile retiküloendotelyal sistem fonksiyon bozukluğu, intestinal mukozanın yapı ve fonksiyonlarında bozulma, immun sistem supresyonu, barsak duvarında oksidatif hasar, bakteriyemi ve endotoksemi gibi patolojik durumlar ortaya çıkar (2, 3). Kolestazda staza sekonder karaciğer hasarı ortaya çıkar.
Kolestatik sarılıkta, enfeksiyöz patojenlere ek olarak hücresel stres ve hasar, alarm moleküller olarak bilinen endojen moleküllerin salınımını tetikleyebilmektedir. Bunun sonucunda konakçıda immun sistem yanıtı başlamakta olup Tool like receptor molekülleri (TLR1,2,4,6,7,9) salınmaktadır. HMGB1 (High mobility group box-1) proteininin ise ilk defa 1999 yılında farelerde endotoksin ile ilgili ölümlerde önemli bir molekül olduğu rapor edilmiştir. Bu nedenle, HMGB 1 molekülünün kolestatik karaciğer hastalığının gelişmesinde önemli olabileceği öne sürülmüştür. Huang ve ark., çalışmalarında ratlarda tıkanma sarılığında glukokortikoidlerin HMGB 1 ekspresyonunu ve TLR aktivasyonları araştırmışlar. Plazmada HMGB 1 düzeylerini ölçmüşler ve yüksek saptamışlar. Ratlara glukokortikoid tedavisi uyguladıklarında ise karaciğerde HMGB 1 protein ekspresyonunun ve serum düzeylerinin azaldığını saptamışlar. Yine, TLR 2 ve TLR 4 ekspresyonlarının HMGB 1 sinyali ile ilişkili olduğünü rapor etmişler, bununla birlikte glukokortikoid tedavisinin TLR 4 düzeylerine TLR 2 düzeylerine kıyasla daha fazla etkili olduğunu bildirmişlerdir. Bu bulgulardan, tıkanma sarılıklarında karaciğer hasarında HMGB 1 –TLR4 ekseninin önemli bir rolü olduğunu belirtmişlerdir(9)
Karaciğerde hücre ile tedavide transplante edilen hücrelerin aşılanması çok kritiktir, nötrofillerin veya Kupffer hücrelerinin aktivasyonundan sonra, transplante edilen hücrelerin çoğu karaciğer sinüzoidleri tarafından proinflamatuar sitokinler/kemokinler/reseptörler tarafından hızlı bir şekilde karaciğerden temizlenmektedir. Wiswanathan ve ark., çalışmalarında hücre-transplantasyonu ile

indüklenen hepatik inflamasyonda, TNF α antagonisti olan etanerceptin ratlarda hepatosit transplantasyonunda etkisini araştırmışlar. Hücre transplantasyonundan sonra, bir çok sitokin/kemokin/reseptörlerin miktarlarında artış olduğunu, halbuki hücre transplantasyonundan önce etarnercept kullanımının bu yanıtı normalize ettiğini bildirmişlerdir. Bundan başka, etanerceptin hücre transplantasyonu ile indüklenen intrahepatik sekretuar sitokinlerin High Mobility Group Box Protein 1 (HMGB1) gibi salınımını önemli ölçüde azalttığını rapor etmişlerdir. Etanerceptin bu etkisinin hücre transplantasyonu ile ilgili nötrofillerin aktivasyonunu azalttığı, fakat Kupffer hücrelerine etkisi olmadığını bildirmişlerdir. Etanerceptinin yüksek dozları ile muamele edilen hayvanlarda transplante edilen hücrelerin reddedilmesinin azaldığı bildirilmiştir(7).
Her grupta 10 adet hayvan içeren deney, kontrol ve sham grubu olmak üzere toplam 3 grup oluşturuldu. Sham grubu anestezik maddelerin ve olası risklerin diğer gruplarla karşılaştırılması,çalışmanın standardize edilmesi amacıyla oluşturuldu.Grup I (n=10): Sham Grubu Laparatomi sonrası ana safra kanalı ortaya konup batın kapatıldı ve takiben hayvanlara 7 gün süre ile standart yem ve su verildi.Grup II (n=10): Kontrol Grubu Laparatomi sonrası ana safra kanalı ortaya konup 4/0 ipek ile bağlanan hayvanlara 7 gün süre ile standart yem ve su verildi.Grup III (n=10): Deney Grubu Laparatomi sonrasında ana safra kanalı ortayakonup 4/0 ipek ile bağlanan hayvanlara 7 gün süre ile standart yem ve su verildi. Bu gruptaki hayvanlara, safra kanalı bağlandıkları günden itibaren 7 gün oyunca 2 mg/kg dozunda intraperitoneal etanercept verildi. Sonrasında ratlardan karaciğer ve kan örnekleri alınarak ratlar sakrifiye edildi.
TS‟ nın tedavisinde antiinflamatuar ve antiapopitotik amaçla etanerceptin etkilerini araştırdık. Biyokimyasal, histopatolojik olarak çalışma verilerimizi incelediğimiz zaman; etanerceptin tıkanma sarılığı tedavisinde antiinflamatuar, antiapoptotoik etkinliğinin olmadığını ancak hücresel düzeyde DNA hasarı üzerine etkilerinin olabileceğini düşünmekteyiz. Histopatolojik düzeydede etkisinin kısa dönemde olmadığını gözlemledik.

Abstract:
At any level of the bile ducts, as a result of the partial or complete occlusion concluding of any disease, obstructive jaundice occurs by the inhibition of bile flow. One of the leading causes of morbidity and mortality in patients with cholestasis is the development of infectious complications such as sepsis(1). If there is no bile secretion to the intestine, substances that excreted from the bile may accumulate at blood. As a result of the cholestasis, pathologic conditions such as reticuloendothelial dysfunction, deterioration of structure and function of intestinal mucosa, immunosuppression, oxidative damage in the intestinal wall, bacteraemia and endotoxemia occur (2, 3). In cholestasis, stasis secondary liver damage occurs.
At cholestatic jaundice, in addition to infectious pathogens, cellular stress and damage can trigger release of endogenous molecules known as alarming molecules. As a result, in the host, the immune system response is initiatedand the Tool like receptor molecules (TLR1,2,4,6,7,9) are released. HMGB1 (High mobility group box-1) protein was reported to be an important molecule in endotoxin-related deaths in mice for the first time in 1999. For this reason, it has been suggested that HMGB1 molecule may be important in the development of cholestatic liver disease. In their study, Huang et al. investigated HMGB1 expression and TLR activation of glucocorticoids in obstructive jaundice rats.They measured HMGB1 levels in plazma and found them to be high.When they administered glucocorticoid therapy to rats, they found that HMGB1 protein expression and serum levels were decreased in the liver. Again, they reported that TLR2 and TLR4 expressions are associated with the HMGB1 signal, and that glucocorticoid therapy is more effective at TLR4 levels compared to TLR2 levels. From these findings, they found that HMGB1, TLR4 axis plays an important role in hepatic damage in obstructive jaundice (9).
In liver, inoculation of transplanted cells in cell therapy is very critical, after activation of neutrophils or Kupffer cells, most of the transplanted cells are rapidly cleared from the liver by the proinflammatory cytokines / chemokines / receptors by the liver sinusoids. In their study, Wiswanathan et al. investigated the etanerceptin, a TNF α antagonist effect on hepatocyte transplantation of rat, in cell-transplantation-induced
hepatic inflammation. There was an increase in the quantities of many cytokines/chemokines/receptors after cell transplantation, whereas prior to cell transplantation, they reported that the use of etarnercept normalized this response. Furthermore, they reported that etanerceptine significantly reduced the release of intrahepatic secretory cytokines [such as High Mobility Group Box Protein 1 (HMGB1)] induced by cell transplantation. Etanerceptin has reported that this effect reduces neutrophil activation associated with cell transplantation, but does not affect Kupffer cells. It has been reported that the rejection of cells transplanted in animals treated with high doses of etanerceptin (7).
In each group, which had 10 animals, 3 groups were formed for experiment, control and sham group. The Sham group was created to standardize the study of anaesthetics and the possible risks compared to other groups. Group I (n = 10): Sham Group, after the laparotomy, the main bile duct of animals was exposed and the bell was closed, followed by feeding the animal with standard feed and water for 7 days. Group II (n = 10): Control Group after laparotomy, the main bile ducts of animals were exposed and bonded with 4/0 silk, and the animals fed were given standard feed and water for 7 days. Group III (n = 10): Experimental Group after laparotomy, the main bile ducts of animals were exposed and bonded with 4/4 silk, and the animals fed were given standard feed and water for 7 days. The animals in this group were given intraperitoneal etanercept at a dose of 2 mg / kg for 7 days starting from the day when they were biliary duct. Afterwards, liver and blood samples were taken from the rats and the rats were sacrificed.
We investigated the effects of etanerceptin for anti-inflammatory and antiapoptotic purposes in the treatment of obstructive jaundice. Biochemically and histopathologically, when we examine our study data; we think that there is no anti-inflammatory, antiapoptotic effect of etanerceptin on obstructive jaundice therapy, but it may have effects on DNA damage at cellular level. At the histopathological level, we also observed that this effect was not in the short term.