Mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasına fungal beta-glukanın etkilerinin incelenmesi
The effects of fungal beta-glucan on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells
Yazar: LEYLA KAYİŞ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. GÖKHAN DURUKSU
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre ve Doku Yenilenmesi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Glukanlar = Glucans ; Kök hücreler = Stem cells ; Mantarlar = Fungi ; Osteogenez = Osteogenesis ; Pleurotus ostreatus = Pleurotus ostreatus ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Amaç: Mantarlar çok eski zamanlardan günümüze dek özellikle Orta Asya ülkelerinde çeşitli hastalıkların tedavisi için kullanılmaktadır. Günümüzde mantarlardaki bu tedaviyi sağlayan bileşenlerin birçoğu tespit edilmiş olup pek çok ilacın yapımında aktif olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bunlardan biri olan β-glukanlar, günümüzde immün sistemi güçlendirmekten, kolesterolün düşürülmesine veya çeşitli tümörlerin azaltılmasını hedefleyen tedavi yöntemlerinde kullanılmaktadır. Bu çalışmada P.ostreatus'dan izole edilen β(1,3)-(1,6)-glukanların iKİ-MKH'lerin osteojenik farklılaşma üzerindeki etkilerinin ve bu süreçte MAPK sinyal yolağının rolünün incelenmesi amaçlanmıştır.
Yöntem: Bu çalışmada, ülkemiz florasında doğal olarak yetişen P.ostreatus'un hücre duvarı elemanlarından olan β-(1,3)-(1,6) zincir yapısına sahip olan glukanlar sıcak sodyum hidroksit yöntemi ile izole edilmiştir. iKİ-MKH'ler ile etkileşim kurabilmelerini sağlamak için izole edilen glukanlarla kültür kaplarının yüzeyleri kaplanmıştır. iKİ-MKH'ler bu yüzeyler üzerine ekilerek kültürü yapılmıştır. β-glukanların MKH'lerin osteojenik farklılaşması üzerindeki etkisi 21 gün süren osteojenik farklılaştırma sonrasında gen ifadesi analizi, alkalen fosfataz aktivitesi ölçümü ve histolojik boyamalar ile ortaya konmuştur. β-glukanların iKİ-MKH'lerin osteojenik farklılaşmalarını MAPK sinyal yolağı üzerinden desteklediğini anlayabilmek için p38α ve MKK/MEK proteinleri inhibe edilmiştir. Yapılan inhibisyonların sonucunda hücrelerde meydana gelen değişimler gen ifadesi analizi ve immün floresan boyamalar ile ortaya koyulmuştur.
Bulgular: β-glukan kaplı yüzeylere ekilerek farklılaştırmaya yönlendirilen hücrelerde osteojenik farklılaşma belirteçlerinden olan OPN'in 252,5±7,6 kat, cFos, Runx2 ve BMP2 gibi genlerin ise yaklaşık 500 kat artış gösterdiği gözlemlenmiştir. Aynı hücrelerde MAPK sinyal yolağına ait proteinlerden olan MEK1'in 4255,2±170,2 kat, p38α'nın 528,2±19,5 kat, ERK1'in 63,6±2,7 kat ve Jnk'nın da 51,9±2,1 kat artmış olduğu gözlemlenmiştir. Bununla beraber β-glukan kaplı yüzeylere ekilen hücreler, p38α inhibisyonu yapılarak osteojenik farklılaşmaya alındığında hem osteojenik farklılaşma belirteçlerininin gen ifadesinde hem de MAPK sinyal yolağı elemanlarının gen ifadesinde anlamlı (p<0,05) bir düşüşün olduğu gözlemlenmiştir.
Sonuç: Gerçekleştirilen analizler doğrultusunda β-glukanın iKİ-MKH'lerin MAPK sinyal yolağını uyardığı ve osteojenik belirteçlerin ifadelerini kısıtlı da olsa artıdığı gösterilmiştir. Ancak farklılaşma sürecinin gerçekleşebilmesi için yeterli bir uyarı sağlamayan β-glukanın diğer kimyasal uyarıcılarla birlikte kullanılmasıyla daha iyi sonuçlar elde edilmiştir. Birlikte kullanım ile sinerjik bir etki yaratılarak osteojenik farklılaşma yüksek oranda desteklenmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda β-glukanın osteojenik farklılaştırmayı destekleyen bir biyomalzeme olarak kullanılması önerilebilir.

Abstract:
Objective: Fungi have been used from ancient times to recent time for the treatment of various diseases, especially in Central Asian countries. Nowadays many of these therapeutic ingredients in fungi have been identified and actively used in the production of many medicines. β-glucan, one of these ingredients, is currently used in supporting the immune system, in cholesterol level control, or in the treatment for various tumors. In this study, it was aimed to investigate the effects of β-(1,3)-(1,6)-glucans isolated from P.ostreatus on osteogenic differentiation of hBM-MSCs and the role of MAPK signaling pathway in this process.

Method: In this study, glucans with β-(1,3)-(1,6) chain structure were isolated by hot sodium hydroxide method from the cell wall of P.ostreatus, which grow naturally in Turkey. Surfaces of the culture vessels were coated with the isolated glucans, and cells were cultured on these surfaces to provide interaction with hBM-MSCs. The effect of β-glucans on the osteogenic differentiation of MSCs lasting 21 days was demonstrated by gene expression analyses, alkaline phosphatase activity and histological staining of samples. p38α and MKK / MEK proteins were inhibited to understand that β-glucans promote the osteogenic differentiation of hBM-MSCs via the MAPK signaling pathway. As a result of the inhibitions, the alterations in the cells were revealed by gene expression analysis and immunofluorescence staining.

Result: In the cells induced by differentiating on the β-glucan-coated surfaces, the expression of osteogenic differentiation marker OPN was induced by 252.5±7.6 fold, and the expression level of cFos, Runx2 and BMP2 increased about 500 fold. In the same cells, MAPK signal pathway proteins MEK1, p38α and ERK1 were induced by 4255,2±170.2 fold, 528.2±19.5 fold and 51,9±2,1 fold with respect to the control group, respectively. In addition, cells seeded on the β-glucan-coated surfaces showed significant decrease both in the expression of osteogenic differentiation markers and in the expression of MAPK signaling pathway proteins when p38α inhibition during the osteogenic differentiation (p <0.05).

Conclusion: It has been shown that β-glucan stimulates the MAPK signaling pathway and induces limitedly the expression of osteogenic markers. However, better results were obtained by using other chemical stimulants together with β-glucan, which did not provide sufficient stimulation for the differentiation. Simultaneous use of β-glucan and chemical inducers highly supported the osteogenic differentiation by creating a synergistic effect. As conclusion, it might be suggested that β-glucan can be used as a biomaterial to support the osteogenic differentiation.