Kitosan türevlerinde immobilize edilen lakkazın aktiviteleri, stabiliteleri ve reaksiyon kinetiklerinin incelenmesi
Researching for activities stability and reaction kinetic of laccase enzymes immobilized by chitosan derivatives
Yazar: SEMRA GÜLER
Danışman: PROF. DR. TÜLİN AYDEMİR
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Bölümü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kitosan = Chitosan ; Lakkaz = Laccase

Özet:
Spektroskopik olarak farklı olan 3 tip bakır iyonuna sahip olmaları nedeniyle lakkaz enzimleri (EC 1.10.3.2; p-difenol:dioksijen oksidoredüktazlar), çoklu-bakır içeren mavi proteinler sınıfına dâhil edilmektedirler. Lakkaz enzimleri, çeşitli substitiye fenolik bileşikleri, aromatik aminleri ve hatta bazı inorganik bileşikleri dahi elektron akseptörü olarak moleküler oksijeni kullanarak oksitleyebilmektedirler. Lakkaz enzimlerinin oldukça geniş bir çeşitlilikteki substratlar üzerinde aktivite gösterebilme yeteneği, son zamanlarda bu enzimlerin tekstil boyalarının renk giderimleri, kâğıt hamurunun biyolojik olarak ağartılması ve biyoremidasyon gibi farklı biyoteknolojik uygulamalarda biyokatalizör olarak kullanılmalarına yol açmıştır.Bu çalışmada kitosan glutaraldehit (GA), dopamin (DA), kil, Fe3O4, Epikolorohidrin (ECH) ve histidin ile modifiye edilerek kitosan-GA-DA, kitosan-kil-GA-DA, kitosan-Fe3O4-GA-DA, kitosan-Fe3O4-kil-GA-DA ve kitosan-ECH-histidin kitosan boncukları elde edildi. Daha sonra modifiye kitosan boncuklar taşıyıcı olarak lakkaz (benezenediol:oxygen oxidoreductase EC 1.10.3.2) immobilizasyonunda kullanıldı. % immobilizasyon verimleri ve gram taşıyıcı başına elde edilen enzim aktiviteleri, taşıyıcı olarak kitosan-GA-DA kullanıldığında sırasıyla % 82 ve 2,63 U/g, kitosan-kil-GA-DA kullanıldığında sırasıyla % 72 ve 2.89 U/g, kitosan-Fe3O4-GA-DA kullanıldığında sırasıyla % 86 ve 2.73 U/g, kitosan-Fe3O4-kil-GA-DA kullanıldığında sırasıyla % 75 ve 3.01 U/g, kitosan-ECH-histidin kullanıldığında ise %59 ve 2.84 U/g olarak hesaplandı.Serbest enzim ve modifiye kitosan boncuklar üzerine immobilize edilen lakkazın karakterizasyon ve optimizasyon çalışmaları sonucunda, serbest lakkaz için optimum pH 4.0, tüm taşıyıcılarda immobilize edilen lakkaz için optimum pH 5.0 ve optimum sıcaklık ise 40 oC olarak saptandı. Sıcaklık stabilitesi çalışmalarında ise immobilize enzimin serbest enzime oranla sıcaklık değişimlerine karşı dayanıklılığının daha iyi olduğu gözlemlendi.ABTS substrat olarak kullanıldığında serbest lakkazın KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,297mM ve 26,96 U/mg olarak bulundu. Aynı substrat ile İmmobilize enzimin KM ve Vmax değerleri taşıyıcı olarak Kitosan-GA-DA kullanıldığında 0,397 mM ve 11,24 U/mg, kitosan-kil-GA-DA kullanıldığında 0,410 mM ve 12,03 U/mg protein, kitosan-Fe3O4-GA-DA kullanıldığında 0,365 mM ve 11,76 U/mg, kitosan-kil-Fe3O4-GA-DA kullanıldığında 0,426 mM ve 12,26 U/mg, kitosan-ECH-histidin kullanıldığında 0,382 mM ve 10,89 U/mg olarak hesaplandı.Depolama çalışmalarında ise serbest lakkaz ve immobilize edilen lakkaz enzimleri 16 hafta boyunca 4 ve 25 oC'de depolanarak belirli aralıklarla aktiviteleri ölçüldü. Depolama çalışmaları sonucunda immobilize lakkazın serbest lakkaza göre 4 ve 25 oC'de daha kararlı olduğu saptandı. Farklı taşıyıcılar üzerine immobilize edilen lakkazın tekrar kullanılabilirliğini belirlemek için aynı boncuklarda 100 defa tekrarlanan aktivite ölçümleri sonucunda başlangıç aktivitelerinin % korunduğu görülmüştür.

Abstract:
Laccase enzymes (EC 1.10.3.2; p-diphenol:dioxygen oxidoreductases) are involved in multi-copper blue protein class due to their inclusion of 3 type cupper ions which are spectrpscopically different. Laccase enzymes catalyze the oxidation of various substituted phenolic compounds, aromatic amines and even some inorganic compounds by using molecular oxygen as the electron acceptor. The ability of laccase enzymes to act on a wide range of substrates makes them highly useful biocatalysts for various biotechnological applications such as textile dye decolorisation, paper pulp biobleaching and bioremediation.In this study, chitosan was modified by glutaraldehyde (GA), dopamine (DA), clay, Fe3O4, ECH and histidine. Therefore chitosan-GA-DA, chitosan-clay-GA-DA, chitosan-Fe3O4-GA-DA-, Fe3O4-clay-GA-DA-chitosan and chitosan-ECH-histidine was obtained. Modified chitosan beads was used as a carrier for the immobilization of laccase (benezenediol:oxygen oxidoreductase EC 1.10.3.2). % immobilization yields and enzyme activities per gram carrier was recorded % 82 and 2,63 U/g for chitosan-GA-DA, % 86 and 2.73 U/g for chitosan-clay-GA-DA, % 75 and 3.01 U/g for chitosan-Fe3O4-GA-DA, %59 and 2.84 U/g for chitosan-ECH-histidine.Optimum pH was found pH 4.0 for free laccase and found pH 5.0 for immobilized laccase. Also optimum temperature was found as 40 oC for free and immobilized laccase. It was observed that resistance of immobilized laccase to changes in temperature is more than free laccase. It was observed that immobilized laccase was more resistant than free laccase to temperature changes.When ABTS was used as a substrat, KM and Vmax values of free laccase was found as 0,297mM and 26,96 U/mg, respectively. , KM and Vmax values of immobilized laccase was recorded 0,397 mM and 11,24 U/mg for chitosan-GA-DA, 0,410 mM and 12,03 U/mg for chitosan-clay-GA-DA, 0,365 mM and 11,76 U/mg for chitosan-Fe3O4-GA-DA, 0,426 mM and 12,26 U/mg for chitosan-clay-Fe3O4-GA-DA and 0,385 mM and 10,89 U/mg for chitosan-ECH-histidine, respectively.In the storage studies, free and immobilized laccase enzyme was stared during 16 weeks at the 4 and 25 oC. Enzyme activities were measured at regular times. As a result of storage studies, immobilized laccase was found to be more stabile than free laccase. Reusability of laccase immobilized on the different carries was also studied. As a result of repeated 100 times activity, the enzyme activity was still observed.