Beta-arrestin-2 proteininin P2X7 reseptörü ile etkileşimi
Beta-arrestin-2 interactions with P2X7 receptors
Yazar: SEDA UYSAL
Danışman: PROF. DR. MEHMET UĞUR
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyoloji = Biology
Dizin: Beta arrestinler = Beta arrestins ; G proteinleri = G proteins ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
ß-arrestinlerin, G-proteini kenetli reseptörlerin (GPKR) sinyal iletiminin sonlandırılmasında görev aldığı bilinmektedir. Ayrıca ß-arrestinlerin GPKR?leri ile oluşan sinyal iletiminde G-proteinleri aracılığıyla olana paralel, yeni bir sinyal iletim yolağı oluşturdukları da düşünülmektedir. Pürinerjik P2X7 reseptörleri ise ligand bağımlı iyon kanalları olarak GPKRlerinden tamamen ayrı, başka bir reseptör ailesine mensupturlar. P2X7 reseptörü ile ß-arrestinler bir iletişim olduğuna dair literatürde bilgi yok denecek kadar azdır ve ikna edici, net bir çalışma bulunmamaktadır (Feng ve ark., 2005). Bu bilinenlerden farklı olarak, bu çalışmada HEK-P2X7-ßarr-2-GFP hücrelerinde, konfokal mikroskopi yöntemi kullanılarak, ßarr-2 proteininin ATP uyarısı ile (uyarıdan10-15 dk sonra) çekirdeğe toplandığı, bu toplaşmanın çekirdek içerisinde homojen olmayıp çekirdeğin bir alt bölgesinde (çekirdekçik olabileceği düşünülen) lokalize olduğu gösterilmiştir Yapılan kontrol deneyleri ile de desteklenen bu bulgular, HEK hücrelerinde gözlemlediğimiz ATP uygulaması ile oluşan ßarr-2-GFP yer değiştirmesinin P2X7 reseptörü aracılığı ile oluştuğunu düşündürmektedir. Konfokal mikroskopta, HEK-P2X7 hücrelerinde oluşan yanıtın, P2X7Rlerinde ATP ye göre daha etkin olduğu bilinen BzATP agonistine (örnek olarak; Suprenant ve ark.,1996; North, 2002) daha duyarlı olduğu gösterilmiştir. Aynı şekilde P2X7R için iyi agonist olmayan ancak P2YR?ler için agonist olduğu bilinen UTP ve ADP (Jacobson ve Boeynaems, 2010) ile yapılan deneylerde, ölçülebilir bir yanıt oluşmadığı, böylece oluşan yanıtın P2YR?lerine ait bir yanıt olmadığına dair bir bulgu elde edilmiştir. Ayrıca ATP uygulaması NaCl deney çözeltisinde yapıldığında oluşan ßarr-2-GFP proteininin çekirdeğe translokasyon yanıtı, KCl deney çözeltisinde oluşan yanıt ile karşılaştırıldığında yanıt oluşan hücre oranının daha az olduğu görülmüştür. Bu çalışmada yapılan tüm deneyler, ATP uygulaması ile gözlenen ßarr-2-GFP yer değiştirme yanıtını oluşturan reseptörün, P2X7R olduğuna işaret etmektedir. ßarr-2nin NES pompası tarafından sürekli aktif olarak hücre çekirdeği dışına taşındığı bilinmektedir, dolayısı ile çekirdek içindeki derişimi sitoplazmaya göre belirgin olarak daha azdır. Literatürde LMB kullanılan çalışmalarda, ßarr-2-GFP proteininin, NES inhibisyonu sonrasında çekirdek içinde homojen bir dağılım gösterdiği bildirilmektedir (Wang ve ark., 2003). Bu çalışmada literatürde bilinenlerden tamamen farklı olarak, NES inhibitörü LMB (20 ng/ml) ile hücrelerin 20 saat inkübe edilmesi sonrası HEK-293-ßarr-2-GFP ve HEK-P2X7-ßarr-2-GFP hücrelerinin önemli bir kısmında ßarr-2-GFP proteininin çekirdek içinde, çekirdekçik benzeri bir yapıda toplaştığı gözlendi. Bu bulgu ßarr-2 proteinin çekirdekçikte yüksek afiniteli bir bağlanma bölgesine sahip olduğunu ve bu bölgeye bağlanmasının NES ve bazı reseptörler tarafından regüle edilebildiğini düşündürmektedir.

Abstract:
In the cell ß-arrestins are known to play an important role in signal transduction of the G-protein dependent receptors (GPCRs). Even though this role was initially thought to be only inhibitory, it is now known that they have an important role in the G-protein independent cellular signal transduction via GPCRs. Purinergic P2X7 receptor, being a member of the ligand gated channel family, belongs to a class of receptors which are totally different from GPCRs. There is a single report in the literature indicating that P2X7 receptors can interact with ß-arrestins (Feng and et al., 2005). Our observations in HEK-P2X7-ßarr-2-GFP cells indicate that upon stimulation with 1 mM ATP (10-15 min after stimulation)), GFP tagged ßarr-2, translocates into nucleus of the cell, forming clusters within the nucleus. These clusters of ßarr-2-GFP, which are formed after ATP stimulation, appear to localize in a sub-compartment of nucleus. Combined DIC and fluorescent images suggest that this subcomparment may be the nucleolus. This ATP effect is not observed in HEK-293-ßarr-2-GFP cells, which do not express the P2X7R, indicating that the receptor responsible for this translocation response is P2X7 receptor. Further support for the idea that in HEK-P2X7-ßarr-2-GFP cells, the receptor mediating the ATP induced response of ßarr-2 translocation is indeed P2X7R, comes from the finding that BzATP, which is known to be a more effective agonist than ATP for P2X7R (e.g., Suprenant et al., 1996; North, 2002), can induce ßarr-2 translocation into the nucleus at a low concentration (5 µm), at which ATP is completely ineffective. Furthermore application of UTP or ADP (1 mM), which are effective agonist for purinergic P2YR but not P2X7R (Jacobson and Boeynaems, 2010), cause no measurable ßarr-2 translocation response in the same cells. When taken together all these experiments suggest that the ßarr-2 translocation response, observed with the application ATP is mediated by P2X7R. It has been proposed that ßarr-2 is constantly moved out of the cell nucleus by the NES pump. Therefore, the nuclear concentration of ßarr-2 is less than the cytoplasmic one. It has been reported in the literature that ßarr-2-GFP, after inhibition of NES pump with LMB, show a homogeneous distribution within the cytoplasm and the nucleus (Wang et al., 2003). Our results with LMB are entirely different from what is known in the literature, after incubating (20 hours) the HEK-P2X7-ßarr-2-GFP and HEK-293-ßarr-2-GFP cells with LMB (20 ng/ml), we observed that in majority of the cells GFP tagged ßarr-2 translocates into nucleus, forming clumps, probably in nucleolus. This finding may indicate that ßarr-2 has a high affinity binding site within the nucleus (nucleolus), and its binding to this site can be regulated by the functions of NES and some membrane receptors.