PANC-1 ve BxPC-3 pankreas kanseri hücre hatlarına juglon uygulamasının mitokondrial biyogenez ve aktivasyonla ilgili genlerin ifade düzeyleri üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of juglone application on the expression levels of the genes related to mitochondrial biogenesis and activation in PANC-1 and BxPC-3 pancreatic cancer cell lines
Yazar: EMİNE MERVE DEMİRBAŞ BÜYÜKTÜT
Danışman: PROF. DR. HİLAL ARIKOĞLU
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre dizisi = Cell line ; Juglon = Juglone ; Mammalian target of rapamycin = Mammalian target of rapamycin ; Mitokondriler = Mitochondria ; Neoplazmlar = Neoplasms ; PANC-1 = PANC-1 ; Pankreas hastalıkları = Pancreatic diseases ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms ; Transkripsiyon faktörleri = Transcription factors

Özet:
Pankreas kanseri genellikle hastalığın son evrelerinde belirti veren, klinikte kullanılan kemoterapötik ajanlara direncin gözlendiği, uygulanan tedavi yöntemlerinin yetersiz kaldığı, tanısındaki güçlükler ve yüksek ölüm oranlarıyla birlikte oldukça agresif bir kanser türüdür. GRP75 (HSPA9/Mortalin), mitokondride lokalize olan ve tümör hücrelerinde sıklıkla yukarı regüle edilen, tümör hücresi proliferasyonunu/hayatta kalmasını, metastazı ve anjiyogenezi teşvik ettiği ve apoptotik sinyali azalttığı gösterilen, ER-mitokondri arasındaki fiziksel ve kimyasal bağlantıyı sağlayan proteindir. TFAM, mtDNA'nın nükleoidlere yoğunlaşması için gerekli bağlayıcı şaperon olarak kabul edilir ve mtDNA replikasyonu ve transkripsiyonu için gereklidir. mTOR, katabolik ve anabolik metabolizmalar arasında anahtar işlevi olan bir kinaz olup, özellikle kanserde yukarı akış sinyallerine yanıt olarak hücrenin hayatta kalması, metabolizması, büyümesi, protein sentezinin düzenlenmesi ve mitokondrial biyogenezi ve işlevinde önemli rol oynar. Juglon, (5-hdroxy-1, 4-napthoquinone), ceviz ağaçlarının taze olgun meyve kabuğunda, köklerinde ve yapraklarında bulunan bir tür naftokinondur. Juglonun çeşitli kanser hücre hatlarında sitotoksik ve apoptotik etkisi gösterilmiş, daha önceki araştırmalarımızda PANC-1 ve BxPC-3 insan pankreas kanseri hücre hatlarında bu etkilerinin yanı sıra anti-invaziv ve anti-metastatik etki gösterdiği rapor edilmiştir. Bu çalışmada kanser hücrelerinin sağkalımı ve metastaz sürecinde mitokondri biyogenezi ve fonksiyonunda merkezi rol oynaması nedeniyle, juglonun, PANC-1 ve BxPC-3 pankreas kanseri hücre hatlarında, mitokondri biyogenezi ve aktivasyonu ile ilişkili anahtar proteinleri kodlayan GRP75, TFAM ve mTOR genleri üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Çalışmamızda MTT testi sonuçlarından elde edilen IC50 değeri dikkate alınarak 5, 10, 15 ve 20 μM juglon konsantrasyonları uygulama dozu olarak seçilmiş ve juglonun belirlenen dozlardaki 24 saatlik uygulamasından sonra hedef genlerin ifadeleri qPCR yöntemiyle incelenmiştir. Çalışma sonuçlarımız genel olarak değerlendirildiğinde juglonun her iki hücre hattında da GRP75 gen ifadesi üzerinde önemli bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir. TFAM ve mTOR gen ifadeleri üzerine, özellikle PANC-1 hücrelerinde 10, 15 ve 20 μM konsantrasyonlarda juglon uygulamasının ise önemli düzeyde etkilerinin olduğu ve bu etkilerini gen ifadelerini yukarı yönde regüle ederek gösterdikleri ortaya konulmuştur. Ancak ilginç olarak PANC-1 hücrelerinde mTOR geni ifadelerindeki güçlü artışın aksine BxPC-3 hücrelerinde juglonun sadece 20 μM konsantrasyonda mTOR gen ifadesini etkilediği ve dramatik bir şekilde azalmaya yol açtığı tespit edilmiştir. Çalışma bulgularımız, hücresel homeostazda, hücre büyümesi, hayatta kalması ve metabolizması dahil olmak üzere bir dizi hücresel olayda merkezi rol oynayan mTOR ifadesi üzerindeki bu etkileri ile juglonun geliştirilebilir bir potansiyele sahip olduğu ve pankreas kanseri ile savaşta yeni stratejiler için umut vaadeden bir teröpotik ajan olduğu düşüncemizi desteklemektedir.

Abstract:
Pancreatic cancer is a highly aggressive type of cancer that is usually symptomatic at the last stages of the disease, with resistance to chemotherapeutic agents used in the clinic, inadequate treatment methods, diagnostic difficulties and high mortality rates. GRP75 (HSPA9/Mortalin) is a protein localized in mitochondria and frequently upregulated in tumor cells which has been shown to promote tumor cell proliferation/survival, metastasis and angiogenesis and reduce apoptotic signaling by providing the physical and chemical link between ER and mitochondria. TFAM is considered as the essential binding chaperone for the condensation of mtDNA into nucleoids and is required for mtDNA replication and transcription. mTOR is a kinase with a key function between catabolic and anabolic metabolisms and plays important roles in cell survival, metabolism, growth, regulation of protein synthesis and mitochondrial biogenesis and function especially in response to upstream signals in cancer. Juglone, (5-hydroxy-1, 4-napthoquinone) is a type of naphthoquinone found in the fresh ripe fruit peel, roots and leaves of walnut trees. Juglone has been shown to have cytotoxic and apoptotic effects in various cancer cell lines and besides this effects it was reported to have anti-invasive and anti-metastatic effects in PANC-1 and BxPC-3 human pancreatic cancer cell lines in our previous studies. In this study, we investigated the effects of juglone on GRP75, TFAM and mTOR genes encoding key proteins associated with mitochondria biogenesis and activation in PANC-1 and BxPC-3 pancreatic cancer cell lines due to their central roles in mitochondria biogenesis and function in cancer cell survival and metastasis. In our study; 5, 10, 15 and 20 μM juglone concentrations were selected as the application doses considering the IC50 value determined after MTT test results and the expressions of the target genes were analyzed by qPCR method after application of juglone at determined doses for 24 hours. When our study results were evaluated totally, it was showed that juglone had no significant effect on GRP75 gene expression in both cell lines. It was revealed that juglone application at 10, 15 and 20 μM doses had significant effects on TFAM and mTOR gene expressions, especially in PANC-1 cells, by up-regulating gene expressions. Interestingly, in contrast to the strong increase in mTOR gene expression in PANC-1 cells, it was determined that juglone was effective only at 20 μM concentration on mTOR gene expression in BxPC-3 cells and caused a dramatic decrease. Our findings suggest  that juglone has a developable potential and is a promising theurapeutic agent to develop new strategies for the battle with cancer with those effects on mTOR gene which plays a central role in cellular homeostasis and several cellular events including cell growth, survival and metabolism.