Mezenşimal kök hücrelerin immün modülatör etkisinin hemofagositik sendrom klinik uygulamalarına temel oluşturmak üzere in vitro modelde incelenmesi
Investigation of the immune modulator effect of mesenchymal stem cells in in vitro model as the basis for hemophagocytic syndrome clinical applications
Yazar: HANDAN SEVİM
Danışman: DOÇ. DR. ÖZER AYLİN GÜRPINAR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Hematoloji = Hematology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Hematopoetik kök hücreler = Hematopoietic stem cells ; İmmün kompleks hastalıkları = Immune complex diseases

Özet:
Hemofagositik sendrom (hemofagositik lenfohistiyositoz, HLH), sitotoksik T lenfositlerin ve makrofajların aşırı aktivasyonu sonucu gelişen ve aşırı uyarılmış bir immün sistemin oluştuğu, tedavi edilmezse ölümcül olan bir immün yetmezlik hastalığıdır. Primer (ailevi) HLH (FHL)'nin bir tipi olan FHL2, perforin gen hasarlı tiptir. Perforin, sitotoksik T lenfositler ve doğal öldürücü (NK) hücrelerinin immün cevabı sırasında, hedef hücre zarında porlar oluşturarak granzimin bu porlardan geçişine ve böylece enfekte hücrenin apoptozla ölümüne aracılık eder. FHL2 hastalarında perforin genindeki mutasyon nedeniyle bu hastaların immün cevabı oluşmamakta ve sürekli uyarılan immün sistem nedeniyle yüksek oranda sitokin salgılanmaktadır. Hastalarda oluşan bu kontrol edilemeyen immün sistem uyarımı nedeniyle, aşırı aktivite gösteren NK hücreleri ve sitotoksik T hücreleri çoklu organ hasarlarına yol açmakta ve sistemik inflamasyona sebep olmaktadır.
HLH tedavisinde öncelikli amaç; dekzametazon, siklosprosin A ve etoposidden oluşan uluslararası HLH-2004 protokolü uygulanarak immun sistemin baskılanmasıdır. Ancak FHL'de kesin tedavi hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) ile mümkün olmaktadır. HKHT yapılmayan hastalar için bu hastalık öldürücüdür. Klasik tedavilerde 8. haftanın sonunda tam veya çok iyi yanıt alınamayan hastalarda HKHT kadar geçen sürede çaresiz kalınmaktadır.
Mezenşimal kök hücreler, düşük MHC-II ekspresyonları ve sentezledikleri sitokinler ile immün modülatör etkiye sahiptir. GvHD gibi çeşitli otoimmün hastalıklarda MKH'ler immün modülatör etkileri nedeniyle klinikte uygulanmaktadır. FHL2'de MKH'lerin immün modulatör olarak kullanılması ile ilgili literatürde yalnızca 23 yaşındaki bir hastaya yapılan uygulama ile ilgili bilgiler bulunmaktadır. Ancak bu gibi çalışmaların devamı için gerekli temel bilgiyi sağlayacak sistemler bulunmamaktadır. Bu nedenle, tez çalışmamızda perforin gen ifadesi baskılanmış bir insan NK hücre hattı oluşturarak FHL2 için in vitro model geliştirilmesi ve MKH'lerin bu model hücreler üzerindeki immünmodülatör etkisini incelenmesi hedeflenmiştir.
Bu amaçla ticari olarak satılan NK hücre hattı olan NK92 hücre hattı seçilmiştir. Bu hücrelerde PRF1 gen ifadesinin baskılanması amacıyla DNA'daki PRF1 gen bölgesini hedefleyen CRISPR/Cas sistemi kullanılmıştır. Hazırlanan sistemle NK92 hücrelerinde perforin gen bölgesine puromisin direnç geni eklenmiştir.  Transfeksiyon sonrası hücreler puromisin antibiyotiği ile seçilmiştir. Elde edilen klonlarda perforin geninin hedeflendiği qPCR, PCR ve ELISA yöntemleri ile analiz edilmiştir. Perforin geninin hedeflendiği PMA/İyonomisin ile uyarılmış klonlarda perforin ifadesinin baskılandığı qPCR analizi ile perforin salgılamadığı ELISA yöntemi ile gösterilmiştir. Elde edilen klonlar MKH'lerle ko-kültür edilmiş ve ko-kültür sisteminden elde edilen süpernatanlara çoklu sitokin analizi yapılmıştır. Sitokin analizinde ortamdaki immünmodülatör sitokinlerin (IL-4 ve IL-10) miktarının arttığı, ancak sistemi uyarıcı sitokinlerin ise (IL-6, IL-8, GM-CSF, G-CSF, IFNγ, TNFα) miktarının azaldığı görülmüştür. Bu sonuçlar MKH'lerin immün modülatör etkisini in vitro FHL2 modelli hücre hattında gösterdiğini desteklemektedir. 
Bu tez kapsamında, MKH'lerin immunmodülatör etkisi, insan kökenli MKH ve NK hücre hattı kullanılarak in vitro sistemde gösterilmiştir. Bu in vitro sistemden elde edilen sonuçların,  in vivo ve klinik uygulamalar için çok önemli bir basamak olduğu düşünülmektedir. Aynı zamanda günümüzde devam eden klinik çalışmalarda GvHD gibi immun sistem hastalıklarının tedavisinde MKH'lerin kullanıldığı görülmektedir. Bu nedenle MKH'lerin klinikte klasik tedavilerde çaresiz kalınan FHL2 hastalarında kemik iliği transplantasyonuna kadar geçen sürede destekleyici ve yan etkisi çok düşük bir tedavi olarak kullanılması önerilmektedir.

Abstract:
If untreated, Hemophagocytic syndrome (Hemophagocytic  Lymphohistiocytosis, HLH), is a fatal immunodeficiency disease, which results from the over activation of cytotoxic T lymphocytes and macrophages caused over activated immune system. A type of primary hemophagocytic syndrome FHL2 is a perforin gene is mutated. Perforin is the key protein for immune response of cytotoxic T cells and natural killer (NK) cells. Cytotoxic T lymphocytes and NK cells secrete their perforin and granzyme containing granules when they contact virus-infected cells or tumor cells. Perforin creates pores at the target cell membrane, and mediates passing granzyme through these pores and inducing apoptotic death of the target cell. Because of the perforin gene mutation in FHL2, these patients do not regulate their immune systems and continually stimulated immune response in these patients causes high levels of cytokine secretion. Uncontrolled stimulation of the immune system of these patients leads to excessive activity of cytotoxic T cells and NK cells causing multi-organ failure and systemic inflammation.
Primary focus on HLH therapy is to suppress immune system following the international HLH2004 protocol by using Dexamethasone, Cyclosporin and Etoposide. Furthermore hematopoietic stem cell transplantation is need for full recovery. The disease is fatal if there will there is no stem cell donor. End of 8 week classical therapy, there is a need for alternative therapy to maintain patients when steroids do not work properly. So a therapy is need which has low side effects.
Mesenchymal stem cells (MSCs) have immune modulatory properties that are attributable to low expression of MHC class II antigens as well as cytokine secretory properties. In vivo studies have shown immune modulatory effects of MSCs on autoimmune diseases. However, there is only one sole publication where MSCs are utilized as immune modulatory therapy for an FHL patient who is 23 years old. However, it's clear that a cell based in vitro model is needed to further assess the beneficial effects of such an approach. Therefore the ultimate aim of this thesis is to generate a perforin gene knock out human NK cell line as an in vitro model for FHL2 and show the immune modulatory effect of MSCs on FHL2  to claim a novel therapeutic approach. 
NK92 cell line is a commercial NK cell line that was chosen for experiments. CRISPR/Cas is a novel gene silencing tool that targets specific PRF1 sequences at DNA that will be used for silencing the PRF1 gene. Also this system has a puromycin resistance gene which will be added to NK92 cells after transfection. Transfected cells were selected with antibiotic resistance after transfection. After selection of the silenced cell clones, an initial mutation analysis will be done by qPCR, PCR screening. Also, perforin protein secretion levels will be further evaluated by ELISA. Selected clones were cocultured with MSCs and the supernatant were analyzed with multiplex cytokine assay.The results from qPCR showed that selected clones  has suppressed expression of perforin. Following stimulation via a PMA/ionomycin selected clones were showed no perforin secretion analyzed with ELISA. Co-culture system were performed with selected clones and MSCs. Multiplex cytokine array analysis showed that levels of immune modulator cytokines (IL-4 and IL-10) were altered while the pro inflamator cytokine (IL-6, IL-8, GM-CSF, G-CSF, IFNγ, TNFα) levels were decreased. These data showed that MSCs have immune modulatory effect on in vitro FHL2 model cell line. 
This thesis provided an important knowledge about using MSC as an immune modulator for the therapy of FHL2 patients. Meanwhile this in vitro system is a suitable and important human cell model for future in vivo investigations.  Meanwhile there are clinical trials using MSCs's immune modulatory effects for therapy to GvHD. In conclusion this work achieved a remarkable contribution to the current literature and knowledge base on the use of MSCs as a supportive therapy for FHL2 patients who have no response to conventional therapy which has low side effects.