Leiurus abdullahbayrami türü akrep venomu bileşenlerinin fosfolipaz A2 aktivitesinin araştırılması
Investigation of phospholipase A2 activity in the venom components of the scorpion species Leiurus abdullahbayrami
Yazar: İREM ATAL
Danışman: DOÇ. DR. FİGEN ÇALIŞKAN
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Genel Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Akrep zehirleri = Scorpion venoms ; HPLC =   ; Lipaz = Lipase ; Poliakrilamid jel elektroforezi = Polyarcrylamide gel electrophoresis ; Ters faz kromatografisi = Reverse phase chromatography

Özet:
Leiurus abdullahbayrami türü akrepler halk sağlığı açısından önemli olan ve ülkemizde özellikle Güneydoğu Anadolu bölgesinde geniş bir dağılım gösteren ölümcül hayvanlardır. Akrep venomları enzim ve nörotoksik peptidler içeren biyoaktif moleküllerin kompleks karışımlarıdır. Bu çalışmada Leiurus abdullahbayrami ham venomunun ve bileşenlerinin lipaz ve fosfolipaz (PLA2) aktiviteleri araştırılmıştır.  Bu kapsamda, elektrostimülasyon yöntemi kullanılarak akreplerden ham venom eldesi gerçekleştirilmiş ve ardından saflaştırılma çalışmalarında Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC) kullanılmıştır. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi ile saflık kontrol edilmiş ve molekül ağırlığı belirlenmiştir. 
Ham venomun yumurta agaroz jeli ile inkübasyon sonucundaki PLA2 aktivitesi şeffaf zonlar olarak belirlenmiştir. Sıvı kromatografisinde toplam 41 major fraksiyon elde edilmiştir. Ardından en fazla aktivitenin gözlendiği 30-39. dakikalar ileri saflaştırılmaya alınarak 17 farklı alıkonma sürelerinde fraksiyonlanmıştır. Her fraksiyon yeniden PLA2 aktivitesi için araştırılmış ve en büyük zon 35,9 dakikalı alıkonma süresinde 1,8 cm olarak ölçülmüştür. Yüksek PLA2 aktivitesine sahip fraksiyonların C-18 Mikrobor ters-faz kolonunda ayrımı gerçekleştirilmiştir. Diğer yandan iyon değişim kromatografisi ile 36,2 dakika alıkonma süreli fraksiyondan 4 majör fraksiyon elde edilmiştir. SDS-PAGE jelinde ham venoma ait 8 belirgin band ve 6,5 kDa altında kalın bir band oluşumu gözlemlenmiştir. Ters-faz HPLC ayrımından 33 ve 36 dakika aralığında ve C-18 Mikrobor ters-faz kolonu ile saflaştırılan peptid için 6,5 kDa altında kalın bir band oluşumu gözlenmiştir. 
Bu çalışma ile sıvı kromatografisi fraksiyonlama tekniklerinin kullanımıyla Leiurus abdullahbayrami türü akrep venomunda bulunan peptidlerin kromatografik profili belirlenmiş, ileri saflaştırma aşamaları ile PLA2 aktiviteli fraksiyonların eldesi ve aktivitesi gösterilmiştir. Elde edilen bulgular, venom peptidlerinin biyokimyasal mekanizmalarının araştırılmasına katkı sağlamakta, aynı zamanda bu bileşenlerin tıbbi, biyoteknolojik ve çevresel uygulamalardaki potansiyel kullanım alanlarının belirlenmesine önemli bir temel oluşturmayı hedeflemektedir.

Abstract:
Leiurus abdullahbayrami is a scorpion species found in the Southeastern Anatolia region, and it is of significant importance in public health. Scorpion venoms are complex mixtures of bioactive molecules, including enzymes and neurotoxic peptides. This study investigated the crude venom's lipase and phospholipase A2 (PLA2) activities and its Leiurus abdullahbayrami components. For this purpose, crude venom was obtained from scorpions using electrostimulation. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) was used to purify the crude venom. The molecular weight determination and purity control of peptides were performed using the Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) technique.
PLA2 activity after incubation with egg yolk agarose was determined by forming clear zones. A total of 41 major fractions were obtained through liquid chromatography. The fractions with the highest activity, observed between the 30th and 39th minute, were further purified and fractionated at 17 different retention times. Each fraction was re-examined for PLA2 activity, with the largest zone measuring 1.8 cm at the 35.9-minute retention time. The fractions with high PLA2 activity were separated using a C-18 Microbore reversed-phase column. Also, ion-exchange chromatography obtained four major fractions from the 36.2-minute retention time fraction. SDS-PAGE gel analysis revealed 8 distinct bands in the crude venom, with a prominent band below 6.5 kDa. In the reversed-phase HPLC separation, a thick band below 6.5 kDa was also observed for peptides separated at 33 and 36 minutes.
This study characterized the chromatographic profile of peptides found in the venom of Leiurus abdullahbayrami using liquid chromatography fractionation techniques, demonstrating the purification of PLA2 active fractions and their associated activities. The findings of this study are expected to provide insights into the biochemical mechanisms of the fractions and facilitate the exploration of potential applications of these peptides in medical, biotechnological, and environmental fields.