Halofilik Halomonas smyrnensis AAD6'da quorum sensing mekanizmasının araştırılması
IInvestigating quorum sensing mechanism in Halomonas smyrnensis AAD6
Yazar: SALİM SÜNER
Danışman: PROF. DR. EBRU TOKSOY ÖNER ; PROF. DR. AHMET ZEHİR
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Halomonas smyrnensis AAD6 suşu, oldukça değerli bir biyopolimer olan levan'ı
yüksek miktarda ürettiği çalışma grubumuzca saptanan ılımlı halofilik karakterde
Gram negatif bir bakteri suşudur. Quorum sensing ise pek çok farklı çalışma
grubu tarafından polimer üretimi, antibiyotik sentezi, virülens faktörlerin
salınması, biyofilm oluşumu, kompetans gibi çok önemli süreçleri regüle ettiği
bildirilen bir sinyal mekanizmasıdır ve 100 den fazla bakteride varlığı
gösterilmiştir. Bu veriler ışığında Quorum sensing mekanizmasının elemanlarının
araştırılması ve bu elemanlar ile levan üretiminden sorumlu olan levan sükraz
geni (sacB)'nin farklı koşullardaki ifadelenme profillerinin olası bir parelelliğin
varlığı açısından araştırılması bir gereklilik haline gelmiştir. Gerçekleştirilen
çalışmalarda, AAD6 suşundan elde edilen ve hücre içermeyen süpernatantların
diklorometan özütleri, A.tumefaciens NTL4 raportör suşu varlığında; ince tabaka
kromatografisini takip eden soft agar overlay tekniği ve nihayetinde LC-MS-MS
kullanılarak, bilinen Gram negatif quorum sensing sinyal molekülleri varlığı
yönünden taranmıştır. Bu çalışmalar sonucunda AAD6'nın sinyal molekülü
olarak diğer Gram negatif bakterilerin kullandığı sinyal molekülleriyle aynı sinyal
ailesine dahil bir sinyal kullandığı ve yapısının 16 karbonlu bir açil homoserin
lakton olduğu saptanmıştır. Anotasyon çalışmaları ise, quorum sensing
genlerinden luxS, luxP ve luxR genlerinin varlığına delil olabilecek bulgular elde
edilmiştir. Gerçekleştirilen ekspresyon çalışmalarında ise, türler arası haberleşme
sinyalinin sentezinden sorumlu luxS geninin, levan üretiminden sorumlu
levansükraz geni ile oldukça benzer bir ifadelenme profiline sahip olduğu
anlaşılmıştır. Benzerliğin, iki genin birlikte regüle olduğunu düşündürecek
düzeyde olduğu ortaya çıkmıştır. Buna göre her iki gen de maksimum olarak,
inokülasyonu takiben ilk 24 saat içinde eksprese olmaktadır. Quorum sensing
mekanizması ile levan üretimi arasındaki ilişkinin eksiksiz olarak ortaya
çıkarılması için ise ek deneylere ihtiyaç duyulduğu ortaya çıkmıştır.

Abstract:
Halomonas smyrnensis AAD6, is a moderate halophilic Gram negative bacterium
that proved to be producing high levels of levan, a precious polymer, by our
research group. Polymer and antibiotic synthesis, secretion of virulence factors,
biofilm formation, competence are some of crucial phenotypes reported to be
regulated via specific and common, , signaling pathway called Quorum sensing
for more than 100 bacteria species. For these reasons, it becomes a necessity to
explore AAD6's quorum sensing mechanism's metabolic and genetic elements
and their relations with levan synthesis. Cell free supernatants from strain AAD6
extracted with dichloromethane, analyzed via thin layer chromatography followed by LC/MS-MS and
tested for known signals of acyl homoserine lactones by using soft agar
overlay which contains Agrobacterium tumefaciens NTL4 reporter strain. These
studies showed that AAD6 employs the typical signal family, acyl homoserine
lactones family, same as other Gram negative bacteria and besides its chemical
structure is proved to be a C16 acyl homoserine lactone. Genome annotation
studies via RAST annotation server, showed the existence of luxS, luxP, and
some possible luxR genes in AAD6 genome. Gene expression studies indicated
such highly similar expression pattern for luxS and sacB genes that it lead us to
hypothesize that these genes are being regulated together. Both of the genes are
expressed at their maximum level, during the first 24 hour following inoculation.
It is well understood that additional experiments needs to be conducted to clarify
the quorum sensing mechanism and its relation with levan biosynthesis in detail.