Glutensiz gıda üretimi amaçlı, prolil endopeptidaz (PEP) enziminin üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Production, purification and characterization of prolyl endopeptidase (PEP) enzyme, for gluten free food production
Yazar: BELMA ŞENOL
Danışman: PROF. DR. İSA GÖKÇE
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Gluten, tahıllar olarak bilinen buğday, arpa, çavdar ve yulafta bulunan bir protein grubudur. Bu bitkisel proteinin vücuda alınması ile ince bağırsakta emilim bozukluğunun ön planda olduğu, sistemik bir hastalık olan çölyak hastalığı meydana gelmektedir. Gluten içeren yiyeceklerin diyete eklenmesi ile birlikte; kusma, yağlı ishal, kilo alamama ve karın şişliği gibi bulgular gözlenmektedir. Glutensiz diyet, çölyak hastalığının tek tedavisidir. Günümüzde, glutenin toksik olmayan fragmanlara parçalanmasını sağlamak amacıyla bakteriyel ve fungal oligopeptidazların kullanılması da umut vadeden alternatif bir tedavi olarak değerlendirilmektedir. Aspergillus niger'den elde edilen Prolil Endopeptidaz (PEP) enzimi gluteni tümüyle sindiren bir enzimdir.
Bu çalışmada Prolil Endopeptidaz (PEP) enziminin pET22b vektörü kullanılarak E.coli ekspresyon sisteminde rekombinant olarak üretilmesi hedeflenmiştir. Ekspresyon suşu olarak E. coli BL21 (DE3) pLysE hücreleri kullanılmıştır. İnklüzyon cisimciği oluşumu gözlenen PEP enziminin yeniden katlanması sağlanmış ve PEP proteini afinite kolon kromotoğrafisi yöntemiyle saflaştırılmıştır. Saflaştırılan PEP enzimi gluten ve sentetik substrat (benziloksikarbonil-glisin-prolin-p-nitroanilid) kullanılarak aktivite testi yapılmıştır. Sonuçta, rekombinant olarak üretilen PEP enzimi 280 mg/L verim ile elde edilmiş ve gluteni parçaladığı tespit edilmiştir. Üretilen PEP enzim pH 6 da optimum aktivite göstermiş olup, optimum sıcaklığı da 30oC olarak bulunmuştur.

Abstract:
Gluten is a group of protein found in wheat, barley, rye and oats known as grains. Celiac is a systemic disease in which malabsorption in the small intestine is at the forefront and occurs with the intake of these vegetable proteins into the body. With the addition of gluten-containing foods to the diet, symptoms such as vomiting, fatty diarrhea, inability to gain weight and abdominal distension are observed. Gluten-free diet is the only treatment for celiac disease. Today, the use of bacterial and fungal oligopeptidases that break down gluten into non-toxic fragments is considered as a promising alternative therapy. Prolyl Endopeptidase (PEP) enzyme obtained from Aspergillus niger is an enzyme that completely digests gluten.
In this study, it was aimed to produce recombinant A. niger Prolyl Endopeptidase (PEP) enzyme in E. coli expression system using the pET22b vector. E. coli BL21 (DE3) pLysE cells were used as the expression strain. The PEP enzyme, which was observed in a form of inclusion bodies, then it was refolded and the PEP protein was purified by affinity column chromatography. The activity test of the purified PEP enzyme was performed using gluten and benzyloxycarbonyl-glycine-proline-p-nitroanilide that is a synthetic substrate. As a result, produced PEP enzyme was obtained at a yield of 280 mg / L and it was capable to digest gluten. The PEP enzyme demonstrated its optimum activity at pH 6 and its optimum temperature was 30oC.