Veteriner hekimlikte yaygın olarak kullanılan enrofloksasin ve ketokonazolün yeni nesil immobilizasyon tekniği kullanılarak farklı metallerle kombinasyonu sağlanarak antimikrobiyal etkinliklerinin geliştirilmesi
Enhancing antimicrobial activity of enrofloxacin and ketoconazole, commonly utilized in veterinary medicine, through combination with various metals using new generation immobilization technique
Yazar: MUHAMMET HAYDAR UYSAL
Danışman: PROF. DR. ALİ BİLGİLİ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Farmakoloji ve Toksikoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antibakteriyel aktivite = Antibacterial activity ; Antibiyotik dirençliliği =   ; Nanoçiçek = Nanoflower

Özet:
Veteriner Hekimlikte Yaygın Olarak Kullanılan Enrofloksasin ve Ketokonazolün Yeni Nesil İmmobilizasyon Tekniği Kullanılarak Farklı Metallerle Kombinasyonu Sağlanarak Antimikrobiyal Etkinliklerinin Geliştirilmesi

Doktora tez kapsamında, Antibiyotik ve antifungal maddelerden sentezlenen çiçek görünümlü nanoyapıların antifungal ve antibakteriyel etkinliklerinin artırılması, kısa sürede düşük dozda yapılan sağaltımda daha fazla etkin olmalarını sağlama, yan etkilerinin azaltılması, direnç gelişimi gözlenen olgularda etkili olması hedeflenlendi. Çalışmada 2 etken madde (enrofloksasin, ketokonazol) ile 5 farklı metal (Zn+2, Fe+2, Ca+2, Cu+2 ve Mg+2) 3 farklı pH (pH 5, pH 7,4 ve pH 9) aralığında çalışıldı. Antifungal özelliği olduğu bilinen azol grubunda yer alan ketakonazol ve antibakteriyel özelliği olduğu bilinen enrofloksasin antibiyotiklerin fosfat tampon çözeltisinde CuSO4.5H2O ile muamele edilerek çiçek görünümlü nano hibrit yapıların elde edilmesi hedeflendi. Sentez durumu Cu+2 dışında farklı metal iyonlarıyla (Ca+2, Fe+2, Zn+2 ve Mg+2) da denendi.  Üç farklı pH'da (pH 5, pH 7,4 ve pH 9) 0,02 mg/ml ile 0,1 mg/ml olmak üzere iki farklı yoğunlukta çiçek görünümlü nano hibrit yapıların sentezi denendi. Sentez denemesi sonucu 0,02 mg/ml yoğunlukta uygun (düzenli, tek dağılımlı ve sıkı) morfolojiye sahip çiçek görünümlü nanoyapılar elde edilirken 0,1 mg/ml yoğunlukta uygun morfolojiye sahip nanoyapılar elde edilemedi. Çalışma 0,02 mg/ml yoğunlukta elde edilen çiçek görünümlü nanoyapılar ile gerçekleştirildi. Çalışmada 2 etken madde ile 4 farklı metal (Zn+2, Fe+2, Ca+2 ve Cu+2) yapının sentezi sonucunda çiçek görünümlü nano hibrit yapı oluşumu meydana gelirken Mg+2 metali ile etken maddelerin sentezi sonucu nanoyapı oluşumu gözlenmedi. Ayrıca sentezlenen nanoyapıların enkapsülasyon oranının hesaplanması için süpernatantlar (pelet üstünde kalan sıvı) alındı. Numunelerden alınan süpernatantların enkapsülasyon oranları ultraviyole görünür spektroskopi (UV–Vis) yardımıyla değerlendirildi. Nano çiçek yapıların oluşumunun karakterizasyonu için Kayseri Erciyes Üniversitesi Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezinden Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) görüntülemeleri ile eşzamanlı X Işını Kristalografisi (XRD), Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FT-IR) ve Nanoteknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezi'nden (ERNAM) Zeta Potansiyeli ile Dinamik Işık Saçılımı (DLS) analizleri yapıldı. Alınan görüntülemelerin sonucuna göre nano çiçek yapıların 0,02 mg/ml yoğunlukta oluştuğu tespit edildi ve antimikrobiyal etkinlik çalışmalarına karar verildi. Antimikrobiyal etkinliğin belirlenmesi için sıvı mikrodilüsyon ve disk difüzyon (DF) yöntemleri kullanıldı. Sentezlenen çiçek görünümlü nanoyapılar kullanılarak gram pozitif özellik taşıyan Staphylococcus aureus, metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis ve gram negatif özellik taşıyan Escherichia coli, Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Helicobacter pylori, Vibrio parahaemolyticus ile mantar etkenlerinden Candida albicans standart ATCC suşlarına yönelik antimikrobiyal etkinlikleri değerlendirildi. Aynı zamanda standart maddelerin (ketokonazol, enrofloksasin) gram pozitif özellik taşıyan Staphylococcus aureus, metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis ve gram negatif özellik taşıyan Escherichia coli, Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Helicobacter pylori, Vibrio parahaemolyticus ile mantar etkenlerinden Candida albicans standart ATCC suşlarına yönelik antimikrobiyal etkinlikleri de değerlendirildi. Son olarak standart maddeler ile çiçek görünümlü nanoyapıların antimikrobiyal etkinlikleri GraphPad Prism 8.0.1 programı ile istatistiksel olarak karşılaştırıldı. SEM bulgularına göre nanoyapıların ideal morfolojilerinin pH 7,4 ortamda meydana geldiği tespit edildi. XRD bulgularına göre pH 7.4 ortamda Cu+2 çiçek görünümlü hibrit nanoyapılarda Cu3(PO4)2•3H2O (JPSCD 00-022-0548) kristal yapı ile uyumlu spektrum gösterdiği belirlendi. FT-IR bulgularına göre pH 7,4 aralığında Cu+2 sentezinin FT-IR spektrumu incelendiğinde birincil fosfat kristallerinin titreşim bantlarındaki bükülme 1036 cm-1 bükülme 557 cm-1 olarak gözlendi. Zeta potansiyeli sonuçlarına göre enrofloksasin + Cu+2 çiçek görünümlü nanoyapının pH 7,4 ortamda yüzey yükleri -50 mV civarı olduğu belirlenirken ketokonazol + Cu+2 sentezlenen çiçek görünümlü nanoyapının ise pH 7,4 ortamda, yüzey yükünün -49 mV olduğu tespit edildi. Enkapsülasyon oranlarının %80 üzerinde ve birbirine yakın değerlerde olduğu tespit edildi. Elde edilen veriler sonucu ideal morfolojiye sahip nanoyapıların pH ortamının 7,4, sentez yoğunluğunun 0,02 mg/ml olduğu belirlendi. Standart etken maddeler ile nanoyapıların GraphPad Prism 8.0.1 programı ile istatistiksel karşılaştırılması sonucu p<0,001 %95 anlamlı bulundu. Elde edilen nanoyapıların etken maddelere göre genel olarak etkili olduğu tespit edildi.

Anahtar Sözcükler: Antibiyotik Direnci, Antimikrobiyal Etkinlik, Hibrit Nanoyapı, Nanoçiçek

Abstract:
Enhancing Antimicrobial Activity of Enrofloxacin and Ketoconazole, Commonly Utilized in Veterinary Medicine, through Combination with Various Metals Using New Generation Immobilization Technique

Within the scope of the doctoral thesis, the aim was to enhance the antifungal and antibacterial activ-ities of flower-like nanostructures synthesized from antibiotic and antifungal substances, to enabling them to be more effective in low-dose treatment over a short period, to minimize side effects, and to be effective in cases of resistance development. In the study, 2 active substances (enrofloxacin, keto-conazole) and 5 different metals (Zn2+, Fe2+, Ca2+, Cu2+ and Mg2+) were investigated at 3 different pH levels (pH 5, pH 7.4 and pH 9). It was aimed to obtain flower-like nano hybrid structures by treating ketoconazole, which belongs to the azole group known for its antifungal properties, and enrofloxacin antibiotics known for their antibacterial properties, with CuSO4.5H2O in a phosphate buffer solution. The synthesis was also tested with different metal ions (Ca+2, Fe+2, Zn+2 and Mg+2) other than Cu+2. The synthesis of flower-like nano-hybrid structures was attempted using two different concentrations: 0.02 mg/mL and 0.1 mg/mL, at three different pH levels (pH 5, pH 7.4 and pH 9). As a result of the synthesis experiment, flower-like nanostructures with appropriate morphology (regular, monodisperse, and compact) were obtained at a density of 0.02 mg/mL, but nanostructures with the desired mor-phology could not be obtained at a density of 0.1 mg/mL. The study was conducted using flower-like nanostructures obtained at a density of 0.02 mg/mL. In the study, as a result of the synthesis of 2 active substances with 4 different metals (Zn+2, Fe+2, Ca+2 and Cu+2), the formation of flower-like nano hybrid structures developed, but no nanostructure formation was observed when the active substances were synthesized with Mg+2 metal. In addition, supernatants (the liquid remaining on the pellet) were collected to calculate the encapsulation rate of the synthesized nanostructures. The en-capsulation rates of the supernatants obtained from the samples were evaluated using ultraviolet-visible spectroscopy (UV-Vis). For the characterization of the formation of nanoflower structures, using scanning electron microscopy (SEM) imaging, simultaneous X-ray crystallography (XRD), Fou-rier transform infrared spectroscopy (FT-IR), and zeta potential and dynamic light scattering (DLS), analyses were conducted at the Technology Research and Application Centre of Kayseri Erciyes University and the Nanotechnology Application and Research Centre (ERNAM). According to the imaging results, nano flower structures were found to have formed at a density of 0.02 mg/mL, and studies on antimicrobial activity were initiated. Liquid microdilution and disc diffusion (DF) methods were used to determine antimicrobial activity. The antimicrobial activities were evaluated using syn-thesized flower-like nanostructures against Staphylococcus aureus, methicillin-resistant Staphylococ-cus aureus (MRSA), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis, and gram-positive Staphylococcus aureus, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis, and gram-negative Escherichia coli, Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Helicobacter pylori, Vibrio parahaemolyticus, and Candida albicans standard ATCC strains of fungal agensts. At the same time, the antimicrobial activities of standard substances (ketoconazole, enrofloxacin) were also evaluated against gram-positive Staphy-lococcus aureus, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Enterococcus faecalis, Enter-ococcus faecium, Bacillus subtilis, and gram-negative Escherichia coli, Bacteroides fragilis, Bac-teroides thetaiotaomicron, Helicobacter pylori, Vibrio parahaemolyticus, and Candida albicans standard ATCC strains of fungal agents. Finally, the antimicrobial activities of standard substances and floral nanostructures were statistically compared using GraphPad Prism 8.0.1 software. Accord-ing to SEM findings, it was determined that the ideal morphologies of the nanostructures occurred in a pH 7.4 environment. According to XRD findings, it was determined that Cu+2 flower-like hybrid nanostructures in pH 7.4 environment showed a spectrum compatible with the Cu3(PO4)2•3H2O (JPSCD 00-022-0548) crystal structure. According to FT-IR findings, when the FT-IR spectrum of Cu+2 synthesis was examined in the pH range of 7.4, the bending in the vibration bands of the prima-ry phosphate crystals was observed as 1036 cm-1 and the bending was observed as 557 cm-1. Accord-ing to the zeta potential results, the surface charge of the enrofloxacin + Cu+2 flower-like nanostruc-ture was determined to be around -50 mV in pH 7.4 environment, while the surface charge of the ketoconazole + Cu+2 synthesized flower-like nanostructure was determined to be -49 mV in pH 7.4 environment. It was determined that the encapsulation rates were above 80% and at values close to each other. As a result of the data obtained, it was determined that the pH environment of the nanostructures with ideal morphology was 7.4 and the synthesis density was 0.02 mg/ml. As a result of statistical comparison of standard active ingredients and nanostructures with GraphPad Prism 8.0.1 program, p<0.001 was found to be 95% significant. It was determined that the obtained nanostructures were generally effective compared to the active ingredients.

Keywords: Antibiotic Resistance, Antimicrobial Activity, Hybrid Nanostructure, Nano Flower