Miyeloproliferatif neoplazilerde eksozom kompleksinin rolünün incelenmesi
The investigation of the role of exosome complex in myeloproliferative neoplasms
Yazar: ESRA NUR DEMİRTAŞ
Danışman: DOÇ. DR. SELÇUK SÖZER TOKDEMİR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Philadelphia kromozom-negatif miyeloproliferatif neoplaziler (Ph-MPN), kemik iliğinde hematopoietik kök hücrelerde oluşan mutasyonlar sonucu ortaya çıkan ve eritrositlerin, lökositlerin ve trombositlerin aşırı üretimiyle sonuçlanan bir kanserdir. JAK'de oluşan aktivasyon mutasyonu JAK2V617F, çoğunlukla tespit edilir. Bu mutasyon, JAK2'nin sürekli aktive olmasına ve ilişkili yolakları uyarmak suretiyle birçok ilgili genin artan anlatımına neden olur. Artan mekanizma, sitozolde çeşitli mRNA'ların üretilmesine yol açar. Eksozom kompleksi, bir ribonükleaz kompleksi olup, kararsız RNA'ları parçalayarak stabil RNA'ların işlenmesini ve transkripsiyon stabilizasyonunu, genomun stabilitesini ve hücresel homeostazın korunmasını sağlar. Bu çalışmada, hücre içi genomik homeostazı dengelemek üzere işlev yapan eksozom kompleksini oluşturan birimlerden olan EXOSC1, EXOSC10 ve Dis3'in MPN'deki rolü incelendi. Özellikle, eksozom kompleksine RNA'ların bağlanmasını sağlayan, mutagenezde ve tek zincirli DNA (tzDNA) kesiminde rolü olan EXOSC1 anlatım değişimleri değerlendirildi. Hipotezimiz "Ph-MPN hücrelerden salınan tek zincirli DNA (tzDNA)'nın mikro çevrede oluşturduğu etkiyle, hücre içi eksozom kompleks genlerinden biri olan EXOSC1 indüklenir ve artan EXOSC1 anlatımı inflamasyonu tetikler" dir. Bu amaçla oluşturulan in vitro modelde, JAK2V617F mutasyonu taşıyan hücre hatları olan HEL, SET2 ve bu hücrelerin kültür besiyerlerinden elde edilen hücre dışı tzDNA'lar kullanıldı. Sağlıklı kontrol olarak kordon kanı mononükleer hücreler (KK-MNH) ve KK serumundan elde edilen tz-DNA (KK-tzDNA) kullanıldı. Yapılan değerlendirmede, HEL ve SET2 hücre hatlarından salınan tzDNA'ların JAK2V617F taşıdığı iki aşamalı alel spesifik PZR ile gösterildi. Bu tzDNA'ların eksozom kompleksinin aktivitesini azaltarak RNA birikimine neden olabileceğini ve böylece hücrelerin fonksiyonunu bozabileceği öngörüldü. Akabinde yapılan ko-kültür çalışmasında, KK-MNH ile JAK2V617F pozitif (JAK2V617F+) tzDNA'ların birlikte kültürü yapıldı. Kültür sonunda, KK-MNH'lerde EXOSC1 ifadesinin arttığı görüldü (p<0.05). JAK2V617F ise alel spesifik PZR ile tespit edilmedi. Buna ek olarak, bu hücrelerde JAK2V617F mRNA yükünün değişmiş olma durumu, JAK2V617F ve yabanıl tip JAK2'ye özel problar kullanılarak gerçek zamanlı kantitatif RT-PZR ile değerlendirildi. JAK2V617F+tzDNA'ların KK-MNH'lerde, sitozolik DNA'yı tanıyan cGAS ve TLR9 ve IRF3'ün artan anlatımına neden oldu(p<0.001). Metile olmayan tzDNA'yı tanıyan TLR9'un aktivasyonunda bu durumun etkisini incelemek üzere JAK2V617F+ ve KK-tzDNA global metilasyon paternleri değerlendirildiğinde, TLR9'un aşırı aktivasyonuna neden olan JAK2V617F+tzDNA'ların global metilasyonunun, kontrol olarak kullanılan KK-tzDNA'larından farklı olmadığı bulundu. Ayrıca, tzDNA'ların sitokin salınımında anlamlı bir değişime neden olmadığı ve KK-MNH'lerde apoptozu tetiklemediği gösterildi. JAK2 tirozin kinaz inhibitörü olan Ruksolitinib uygulandığında, HEL hücrelerinde EXOSC1 (p<0.01) ve EXOSC10 (p<0.5) ifadesi arttı. Kronik miyeloid lösemi (KML) hücre hattı olan K562'de tirozin kinaz inhibitörü olan Imatinib tedavisi uygulandığında ise EXOSC1 protein seviyesi azaldı. KML'de EXOSC1 ifadesi tirozin kinaz aktivitesiyle ilişkili olabilir. Sonuç olarak, tzDNA ile uyarıldığında EXOSC1 ifadesi artan KK-MNH'lerde sitokin salınımının olmaması neticesinde EXOSC1'in enflamasyonda rolü olmayabilir. tzDNA'ların ve EXOSC1'in hücredeki rollerinin anlaşılabilmesi için ilave çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Myeloproliferative neoplasms (MPN), blood cancer, is characterized by mutations in hematopoietic stem cells in the bone marrow and leads to the overproduction of erythrocytes, leukocytes, and thrombocytes. An activation mutation in the JAK2 gene, JAK2V617F, was detected in Ph-MPN. This mutation leads to constant activation of JAK2 and increased expression of several genes by stimulating related pathways. This accumulation mechanism induces the production of various mRNA in the cytosol. The exosome complex is a ribonuclease complex that enables RNA processing by degrading unstable RNAs, stabilizing transcription, and maintaining cellular homeostasis. In this study, the role of the exosome complex in MPN, which functions to balance intracellular genomic homeostasis, was examined. In particular, EXOSC1 enables the binding of RNA to the exosome complex, mutagenesis, and cutting of single-stranded DNA (ssDNA). Our hypothesis is "EXOSC1 which is one of the exosome complex genes is induced by the effect of single-stranded DNA released by Ph-MPN cells in the micro-environment and EXOSC1 expression triggers the inflammation."   HEL and SET2 cell lines carrying the JAK2V617F mutation and ssDNA isolated from their culture media were used. As healthy controls, cord blood mononuclear cells (CB-MNC) and cord blood ssDNA (CB-ssDNA) were used. It was shown that ssDNA released from HEL and SET2 cell lines carries the JAK2V617F mutation, according to Nested PCR results. It is predicted that JAK2V617F positive ssDNA (JAK2V617F+ssDNA) may lead to RNA accumulation by reducing exosome complex activity and deteriorating cell function. In co-culture studies, JAK2V617F+ssDNA was cultured with CB-MNC. After culture, EXOSC1 expression increased in CB-MNC (p<0.05). JAK2V617F mutation was not detected by Nested PCR. In addition, the JAK2V617F mRNA burden was evaluated by real-time quantitative RT-PCR using mutant and wild-type JAK2-specific probes in these cells. In CB-MNC, JAK2V617F+ssDNA caused an increase in cGAS, TLR9, and IRF3, which recognize cytosolic DNA(p<0.001). To investigate TLR9 activation that senses unmethylated ssDNA, the global methylation patterns of JAK2V617F+ and CB-ssDNA were evaluated. There was no difference between the global methylation of JAK2V617F+ ssDNA and CB-ssDNA used as controls. In addition, ssDNA did not lead to a significant alteration in cytokine release or induce apoptosis in CB-MNC. Since HEL and SET2 cells were treated with the JAK2 tyrosine kinase inhibitor Ruxolitinib, EXOSC1 (p<0.01) and EXOSC10 (p<0.5) expression increased in HEL cells. In the chronic myeloid leukemia (CML) cell line K562, EXOSC1 protein levels decreased after imatinib treatment. EXOSC1 expression may be associated with tyrosine kinase activity in CML. As a result of no cytokine release in CB-MNC that EXOSC1 induced by ssDNA, EXOSC1 might not have a role in inflammation. Further studies are needed to understand the roles of EXOSC1 and ssDNA in cells.