Kara dut antosiyaninlerinin iyonik jelasyon yöntemi ile enkapsülasyonu ve enkapsülasyon parametrelerinin tepki yüzeyi metodu ile optimize edilmesi
Encapsulation of black mulberry anthocyanins by ionic gellation method and optimization of encapsulation paramaters by response surface methodology
Yazar: TUĞÇE ÇORUHLİ
Danışman: PROF. DR. BERAAT ÖZÇELİK
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Antosiyaninler = Anthocyanins ; Cevap yüzey yöntemi = Response surface methodology ; Enkapsülasyon = Encapsulation ; Karadut = Black mullberry ; Optimizasyon = Optimization

Özet:
Dut meyvesi Asya ve Avrupa'ya kadar pek çok bölgede yetiştirilebilen C vitamini, mineraller, fenolik maddeler, antosiyaninler ve antioksidanlarca zengin faydalı bir besin kaynağıdır. Karadut (Morus nigra) taze olarak veya pekmez, şurup, reçel ve pestil gibi işlenerek de tüketilebilen bir dut çeşididir. Karadut içeriğinde bulunan zengin antosiyaninler renk pigmentleri olup, bu antosiyaninler gıda sanayinde renklendirici olarak veya ürünlerin zenginleştirilmesinde kullanılabilmektedir. Doğada en çok bulunan antosiyanidinler pelargonidin (Pg), siyanidin (Cy), peonidin (Pn), delfinidin (Dp), petunidin (Pt) ve malvinidin (Mv) olup bunların farklı şekerlerle glikozit oluşturması ile antosiyaninler oluşmaktadır. Kara dutta en fazla bulunan aglikon siyanidin olup siyanidin-3-glikozit ve siyanidin-3-rutinosit açısından zengindir.Günümüzde sağlıklı beslenmeye verilen önemin artmasıyla tüketiciler antioksidanlarca zengin fonksiyonel ve doğal gıdalara yönelmeye başlamışlardır. Karadut sağlık açısından olumlu etkileri bulunan ve doğal renklendirici olarak kullanılan antosiyaninleri içermesi nedeniyle yiyecek ve içecek endüstrisinde kullanım potansiyeli bulunan önemli bir meyvedir. Ancak antosiyaninlerin ısı, ışık, metal iyonları, pH, ortamda şeker ve askorbik asit bulunması gibi çeşitli faktörlere duyarlı olmaları sebebiyle antosiyaninlerin özellikle işlenmiş gıda ürünlerinde kullanımı çok kısıtlıdır. Ayrıca fenolik bileşenlerin biyoyararlılıkları ve biyoulaşılabilirlikleri vücuttaki düşük absorbsiyonları ve hızlı metabolizasyonu sebebiyle oldukça düşüktür. Antosiyaninlerin büyük kısmı vucüda alındıktan kısa bir süre sonra midede metabolize edilirken, ince bağırsağa ulaşan kısmı yüksek pH koşullarında degrade olmaktadır. Antosiyaninler gibi çeşitli fenolik maddelerin stabiltesinin ve biyoulaşılabilirliğinin arttırılmasında enkapsülasyon teknolojisinin literatürde başarılı sonuçlar verdiği görülmüştür.Enkapsülasyon çeşitli biyoaktif maddelerin kapsüller içine hapsedilerek çevresel etkenlerden korunmasını sağlarken, belirli koşullar altında içeriğindeki maddelerin ortama salınmasını sağlayan teknolojidir. Çapraz bağlanma, iyonik jelasyon gibi isimlerle de anılan damlatma metodu ekonomik ve kolay uygulanabilir bir yöntem olması sebebiyle enkapsülasyon teknolojisinde sıklıkla tercih edilmektedir. Aljinat bazik çözeltilerde çözünebilen bir polisakkarit olduğundan damlatma yöntemiyle elde edilen kalsiyum-aljinat tanecikleri asidik mide koşullarında bütünlüğünü korumakta ancak ince bağırsak koşullarında tamamen çözünmektedir. Buna karşılık kitosan katyonik bir polimer olup gözenekli yapıdaki kalsiyum-aljinat taneciklerinin dayanıklılığının arttırılmasında kullanılabilmektedir. Enkapsülasyonda kullanılan metotlar, kaplamada kullanılan malzemeler ve prosesteki parametreler çok çeşitli olup başarılı bir enkapsülasyon için gerekli koşullar optimize edilmelidir. Tepki yüzey metodu (RSM) proses değişkenlerinin optimize edilmesinde kullanılan istatiksel bir metottur. Tepki yüzey metodunda amaç; bir çok değişken tarafından etkilenen tepkinin optimum yapılması ve tepkiyi optimum yapan karar değişkenlerinin değerlerinin belirlenmesidir. RSM kolay ve ekonomik bir yöntem olması sebebiyle optimizasyon çalışmalarında tercih edilmektedir.Bu çalışmanın amacı dut antosiyaninlerinin kitosan kaplı kalsiyum-aljinat tanecikler içine hapsedilerek enkapsüle edilmesi ve tepki yüzey metodu kullanılarak enkapsülasyonda kullanılan bazı faktörlerin optimize edilmesidir. Çalışmada kullanılan karadut öğütülerek -80°C'de depolanmıştır. Karadut antosiyaninlerinin ekstraksiyonu iki sıvı fazlı ekstraksiyon yöntemine göre etanol ve amonyum sülfat kullanılarak pH 4.5'te gerçekleştirilmiştir. Belirtilen hedefler doğrultusunda öncelikle fenolik bileşenlerce zengin karadut numunesinin renk, pH ve nem miktarları belirlenmiş ardından dut antosiyaninleri ekstrakte edilmiştir. Karadutun pH değeri 4,5, nem miktarı %80,83 ve renk değerleri L*=14,56±0,15, a*=7,87±0,29, b*=-11,75±0,22 , C*=14,24±0,25 olarak bulunmuştur. Hem dut meyvesinin, hem de antosiyanin ekstraktının toplam fenolik madde, toplam flavonoid, toplam antosiyanin miktarları ve antioksidan kapasitesi gibi özellikleri incelenmiştir. Buna göre toplam fenolik madde miktarı dut için 462,85±35,35 mg GAE/100g taze numune ve antosiyanin ekstraktı için 3224,30±745,67 mg GAE/100g ekstrakt; toplam flavonoid miktarı dut için 1349,26±34,3 mg kuersetin/100g numune ve antosiyanin ekstraktı için 10421,30±396,8 mg kuersetin/100g numune; antioksidan kapasitesi dut için 1393,14±40,6 mg trolox/100 g numune ve ekstrakt için 15165,23±117,99 trolox/mg numune ve toplam antosiyanin miktarı ise karadut numunesi için 462,85±35,35 mg Cy-3-gly/100 g numune ve antosiyanin ekstraktı için 3224,30±745,67 mg Cy-3-gly/100 g numune olarak ölçülmüştür. Elde edilen antosiyanin ekstraktları iyonik jelasyon (damlatma) yöntemi ile enkapsüle edilmiştir.İyonik jelasyon yönteminde duttan elde edilen antosiyanin ekstraktı aljinat çözeltisi ile karıştırılarak homojen hale getirilmiştir. Daha sonra bir şırınga yardımıyla bu karışım kitosanlı kalsiyum klorür çözeltisine damlatılarak kapsüller elde edilmiştir. Buna göre kalsiyum klorürdeki kalsiyum ve sodyum aljinattaki sodyum molekülleri çapraz bağ oluştururken, zıt yüklü kitosan ve aljinat arasında da iyonik bir bağlanma söz konusudur. RSM için Minitab 13.20 paket programı kullanılmış ve deneme deseni merkezi kompozit tasarımı ile 3 faktör ve 3 seviyeli olarak hazırlanmıştır. Deneysel tasarım için ekstrakt miktarı (%1, %3 ve %5), karıştırma süresi (15, 30 ve 45 dk) ve kitosan miktarı (%0.1, %0.3 ve %0.5) bağımsız değişkenler olarak belirlenirken, kapsüllerin uzunluk oranı, küresellik faktörü, enkapsülasyon etkinlikleri ve mide sıvısındaki salım miktarları bağımlı değişkenler olarak seçilmiştir. Kapsüllerin boyu ve şeklinin belirlenmesinde kapsüllerin optik mikroskop ile ölçülen minimum ve maksimum çapları kullanılmıştır. Enkapsülasyon etkinliği, kapsüle yüklenmek istenen toplam antosiyanin ekstraktı miktarından jelleşme ortamına salınan miktar çıkarılarak hesaplanmıştır. Salım çalışmaları sadece mide ortamında gerçekleştirilmiş olup çalkalamalı su banyosunda 37°C'de pH 1.2'de 2 saat bekletilen kapsül içeriğinin mide ortamını taklit eden sıvıya (SGF) salımı UV spektrofotometre ile absorbansı ölçülerek belirlenmiştir. Bu deney tasarımının hedefi enkapsülasyon etkinliği yüksek, düzgün şekilli (küresellik faktörü < 0,05 ve uzunluk oranı ~1 olan) ve asidik mide koşullarına dayanıklı kapsüller elde etmektir. Kapsüllerin boyutları kameralı optik mikroskop ile, enkapsülasyon etkinlikleri ve mide sıvısındaki salım miktarları ise UV-spektrofotometrede absorbansları ölçülerek belirlenmiştir. RSM sonuçlarına göre kapsüllerin uzunluk oranı 1,043 ? 1,118, küresellik faktörü 0,021 ? 0,070, enkapsülasyon etkinlikleri ~%54 ? 70 ve mide ortamında salım %10 ? 27 aralığında bulunmuştur.Yapılan istatistiksel analizler ve veri analizleri ile elde edilen veriler ANOVA sonuçları ve regresyon katsayıları incelenerek ikinci derece polinomial modeline uygun bulunmuştur. ANOVA tabloları, kontür grafikleri ve ikinci dereceden polinomial denklemler oluşturulmuştur. Buna göre kapsüllerin uzunluk oranı üzerinde ekstrakt miktarı ve kitosan-süre interaksiyonunun, küresellik faktörü üzerinde ise süre, ekstrakt-süre ve kitosan-süre interaksiyonlarının önemli olduğu (p<0.05) sonucuna varılmıştır. Enkapsülasyon etkinliği ise ekstrakt-kitosan miktarları, ekstrakt-süre ve kitosan miktarı-süre interaksiyonu dışındaki tüm faktörlere bağlı bulunmuştur. Antosiyanin ekstraktının mide sıvısındaki salım oranı süreye, ekstrakt-kitosan miktarlarına, ekstrakt miktarına ve süre interaksiyonlarına önemli derecede bağlı (p<0.05) olduğu belirlenmiştir. Genel olarak karıştırma süresi uzadıkça enkapsülasyon etkinlikleri (%EE) azalırken, aktif maddenin mide ortamına salım miktarı (%SGF) artmaktadır. Sürenin uzaması ile % SGF'nin artması iyonlar arasındaki bağlanmanın daha güçlü olması ve kapsülün daha sert bir yapıda olması ile % EE'nin azalması ise kapsüllerin yoğun jel yapısındaki kalsiyum iyonlarına daha uzun süre maruz kalmasıyla açıklanabilir. Ayrıca jelleşme ortamına eklenen kitosan belirli bir seviyeye kadar kapsülü koruyarak % EE'ni biraz arttırırken, fazla miktarda kullanımı negatif bir etki göstermiştir. Deney parametreleri maksimum enkapsülasyon etkinliği ve minimum mide sıvısına salım olarak optimize edildiğinde koşullar ekstrakt miktarı % 1.96, kitosan miktarı % 0.10 ve süre ~23 dk olarak bulunmuştur. Metot validasyonu yapılarak teorik ve deneysel veriler kıyaslanmıştır.

Abstract:
Mulberry fruit which can be grown in wide areas from Asia to Europe and also tropic regions is a healthy nutrient due to its anthocyanins, antioxidants and phenolic compound content. Black mulberry (Morus nigra) is a type of mulberry which is consumed freshly or mostly processed like jam, syrup, pekmez in Turkey. Pekmez is the most popular mulberry product with 70% of mulberry produced in Turkey consumed as pekmez. Black mulberry is a rich source of anthocyanins which are color pigments and those pigments are used as natural colorants in food and beverage industry and to produce functional or enhanced food products as well. Pelargonidine (Pg), cyanidine (Cy), peonidine (Pn), delphinidine (Dp), petunidine (Pt) and malvinidine (Mv) are the anthocyanidines that are found in nature commonly, can form glycosides with different sugars to form anthocyanins. Cyanidin is the predominant aglycone in black mulberry which has high cyanidine-3-glycosides and cyanidine-3-rutinosite.Since, awareness about consuming healthy and nutrious foods has been increased recently, people tend to consume functional and natural foods like products rich in antioxidants, omega 3 oils, vitamins and minerals. Black mulberry has a positive effect on health owing to its high anthocyanin content and it is a fruit that can be used as natural colorant in foods as well. However, anthocyanins are senstive to temperature, light, metal ions, pH, sugar and ascorbic acid content of the environment and easily degraded when the conditions are not suitable so their usage in processed food products are really limited. Also, bioavailability and bioaccessibility of phenolic compounds are limited because their absorption is low and they are metabolized quickly. While a significant amount of anthocyanins are metabolized in a short span of time in stomach, the part reached to intestine is degraded because of high pH conditions.Recent studies show that some novel technologies such as encapsulation can be useful to increase stability of phenolic compouns like anthocyanins and bioavailability/bioaccessibility also. Encapsulation is a technology that protect bioactive compounds against environmental damage/effect by entrapting them into capsules and release encapsulated compound to the surrounding environment under specific conditions (pH, temperature etc.). There are many different encapsulation methods such as spray drying, emulsification, coacervation and freeze drying while wall materials like alginte, chitosan, maltodextrin, starch, gums and process parameters like temperature, pH, pressure etc. can be adjusted according to used method and the aim of the study.Ionic gelation that is also called as cross linking and dripping method is a cheap and easy to use method which make this method is preferred in encapsulation technology. Since alginate is a polysaccharide that is soluble in basic solutions, obtained calcium-alginate beads from ionic gelation method stay uniform and resistant during asidic gastric conditions but can be easily dissolved when faced with basic intestine medium. In contrast, chitosan is a cationic polymer and can be used to increase stability of porous structured calcium-alginate beads. It is important to select optimum parameters and conditions to encapsulate active ingredent successfully. Response surface methodology (RSM) is a useful statistical method to optimize prosess variables. The aim of the RSM, is to optimize the response that is effected by various variables and decide to optimum independent variables.The aim of this study is to encapsulate black mulberry anthocyanins by entrapping of the bioactive component into chitosan coated calcium-alginate beads and to optimize some factors used in encapsulation by response surface methodology. First of all, phenolic-rich black mulberry sample evaluated according to its color, pH, and moisture and after that mulberry anthocyanins were extracted by two aqueous phase extraction method. pH and moisture content of the black mulberry sample was found 4.5 and 80,83% respectively and color values were measured as L*=14.56±0.15, a*=7.87±0.29, b*=-11.75±0.22, C*=14.24±0.25. Some properties like total phenolic content, total flavonoid content, total anthocyanin content and antioxidant capacity were evaluted both for black mulberry fruit and for anthocyanin extract. Total phenolic content was measured 462.85±35.35 GAE/100g fresh sample for black mulberry and 3224.30±745.67 mg GAE/100g extract for anthocyanin extract, total flavonoid content was found 1349.26±34.3 mg quercetin/100g fresh mulberry sample and 10421.30±396.8 mg quercetin/100g anthocyanin extract, antioxidant capacity was measured as 1393.14±40.6 mg trolox/100g fresh sample for mulberry and 15165.23±117.99 mg trolox/100g sample for anthocyanin extract and finally total anthocyanin content was measured as 462.85±35.35 mg Cy-3-gly/100 g mulberry sample and 3224.30±745.67 mg Cy-3-gly/100 g extract. Obtained anthocyanin extracts were encapsulated by using ionic gellation method. In ionic gellation method, active component (anthocyanin extract obtained from black mulberry) was mixed with alginate solution till the solution homogenized. Then, beads (capsules) were formed by dripping alginate-athocyanin mixture into chitosan-calcium chloride solution by the help of a needle. Calcium ions from calcium chloride molecule were cross-linked with sodium ions from sodium alginate and also, opposite charged cationic chitosan and anionic alginate molecules were attached each other. Minitab 13.20 programme was used for response surface methodology and experimental design was created for 3 factors and 3 level by cental composite design for 3 replicates in central points (3% extract, 0.3% chitosan and 30 minutes).Extract content (1%, 3% and 5%), mixing time (15, 30 and 45 min.) and chitosan content (0.1%, 0.3% and 0.5%) were selected as dependent variables and aspect ratio, sphericity factor, encapsulation efficiency and release of active ingredient into gastric medium were determined as independent variables for experminetal design conditions. To determine size and shape of beads, optic microscope was used to measure maximum and minimum diameters. Encapsulation efficiency was calculated by using total anthocyanin extract intended to loaded into capsules and released extract amount in the gelling medium. Release studies carried out only for gastric medium. Samples put into gastric medium (pH 1.2) in a shaking bath at 37°C for 2 hours and released anthocyanin content into simulated gastric medium (SGF) was determined by measuring absorbance with UV spectrophotometer.The target of this experimental design is to obtain uniform beads (sphericity factor < 0.05 ve aspect ratio ~1) that are and resistant to acidic gastric medium with high encapsulation efficiency. The size of the beads were measured by optic microscope, encapsulation efficiency and release in gastric medium were analyzed with UV-spectrophotometer by measuring their absorbances. RSM results show that aspect ratio is between 1.043 ? 1.118, sphericity factor is between 0.021 ? 0.070, encapsulation efficiency is between ~54 ? 70% and release in gastric medium is between 10 ? 27%.Regression coefficients and ANOVA results that were determined by statistical and data analysis proved that second order polynomial model was fit to the experimental design. ANOVA tables, contour plots and second order polynomial equations were formed. According to obtained data, extract content and chitosan content-mixing time interaction affect aspect ratio while time, extract content-mixing time, chitosan content-mixing time interactions have an important impact on sphericity factor (p<0.05). While encapsulation efficiency was found dependent to all variables except extract-chitosan contents, extract content-mixing time and chitosan content-mixing time interactions, release in gastric medium was affected by time, extract-chitosan contents, extract content and time interactions significantly (p<0.05). In general, when mixing time is increased release in gastric medium (SGF%) is also increased but encapsulation efficiency (EE%) is decreased in contrast. When mixing time is increased cross linking is more strong and bead structure is more rigid so SGF% is high but beads are exposed to calcium ions in dense gel structure for a longer time which result in the decreased EE%. Moreover, chitosan added into gelling medium can protect beads and rise EE% up to a specific level. However if chitosan content in gelling medium is too much has a negative impact on EE%. Experimental parameters were optimized as maximum encapsulation efficiency and minimum release in gastric medium and found like 1.96% extract content, 0.10% chitosan content and ~23 minutes. Method validation was done by comparing experimental and predicted results.