Brassıca juncea (L.)'da kroma (Cr) duyarlı genlerin ve mikroRNA'ların analizi
Analysis of chromium (Cr)-responses genes and miRNAs in brassica juncea (L.)
Yazar: NURİYE MERAKLI
Danışman: PROF. DR. ABDÜLREZZAK MEMON ; PROF. DR. HÜSEYİN ALTUNDAĞ
Uşak Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Ağır metal giderimi = Heavy metal removal ; Ağır metal kirliliği = Heavy metal pollution ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Yağlı tohumlu bitkiler = Oilseed plants

Özet:
Brassica juncea, yaygın olarak Hint veya kahverengi hardal olarak bilinir ve dünya çapında önemli bir endüstriyel yağ bitkisidir. Hayvan yemi, biyodizel, yemeklik yağ ve ilaç gibi birçok endüstri için hammadde sağlaması nedeniyle ekonomik değeri yüksektir. B. juncea, yüksek biyokütlesi, hızlı büyümesi, orta düzeyde metal birikimi, hasat kolaylığı ve metal toleransı sayesinde krom (Cr) ile kirlenmiş toprakların fitoremediasyonunda önemli bir potansiyel göstermektedir. Son zamanlarda, mikroRNA'lar bitkilerin farklı metal streslerine karşı yanıtların düzenlenmesinde önemli roller üstlenmeleri nedeniyle daha fazla araştırılmaktadır. Ancak, B. juncea'nın krom (Cr) stresine karşı yanıtta mikroRNA'ların rolü hakkında sınırlı bilgi bulunmaktadır. 
Bu çalışmada, krom toleranslı B. juncea var. Early raya ve krom duyarlı B. juncea var. Sindh raya bitkilerinin transkriptomik yanıtı, RNA dizileme yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Cr toksisitesi toleransında rol oynayan spesifik genlerin ekspresyonu, RT-qPCR ile daha detaylı bir şekilde incelenmiştir. Fizyolojik büyüme analizinde, yüksek krom (1000 µM) uygulamasına karşı, Early raya'nın kök-gövde uzunluğu, gövde yaş ağırlığı, kök yaş ağırlığı ve kök-gövde kuru ağırlığı gibi büyüme parametreleri, diğer B. juncea varyetelerine kıyasla daha az etkilenmiştir. Buna karşın, Sindh raya, yüksek krom (1000 µM) etkisine karşı aynı büyüme parametrelerinde daha belirgin olumsuz etkiler göstermiştir. Ayrıca, Cr uygulamasından sonra yüksek Cr alımının köklerde gerçekleştiği ve kök Cr içeriğinin toprak üstü kısımlara göre önemli ölçüde yüksek olduğu tespit edilmiştir. Early raya, iki hafta (15 gün) boyunca Cr³⁺ (1000 µM) uygulandığında köklerde yüksek krom biriktirmiş ve diğer Brassica juncea varyetelerine kıyasla yüksek krom toleransı göstermiştir. 1000 µM Cr uygulanan Early raya bitkilerinin köklerinde, kontrol bitkilerine (Cr- uygulanmayan) kıyasla toplam 70 genin farklı şekilde ifade edildiği tespit edilmiştir. Bu genlerden 27'sinin ifadesi istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Anlamlı fark gösteren genlerin 19'u yukarı düzenlenen, 8'i ise aşağı düzenlenen genler olarak tespit edilmiştir. Diğer taraftan, iki hafta (15 gün) boyunca Cr³⁺ uygulanan Sindh raya bitkisi düşük krom toleransı göstermiştir; bu bitkide kontrol grubuna kıyasla toplam 80 genin farklı şekilde ifade edildiği ve bu genlerden sadece 50'sinin istatistiksel olarak anlamlı olduğu tespit edilmiştir (p<0.05). Bu genler arasında, 28'i yukarı düzenlenen, 22'si ise aşağı düzenlenen genler olarak tespit edilmiştir. RT-qPCR analizi için transkriptom dizileme sonuçlarına göre ROS ile ilişkili mekanizmalarda yer alan ve önemli ölçüde diferansiyel ekspresyon gösteren üç gen seçilmiştir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, Cr uygulanan deney gruplarında incelenen APX, Fe-SOD ve RBOH genleri yukarı düzenlendiği bulunmuştur.
Bu tez çalışması, B. juncea'da miRNA ve mRNA profillemesi aracılığıyla Cr³⁺ stresine yanıtta ilişkili potansiyel olarak önemli miRNA'ları, hedef genleri ve yolakları tanımlamaktadır. Tanımlanan yolaklar, hedef genler ve miRNA'lar, B. juncea'da krom toleransını arttırmada gelecekteki omik araştırmalar için önemli hedefler olacaktır. Ayrıca, B. juncea'da krom stresine tolerans ve transkriptom düzeyindeki değişiklikler üzerine yapılan kapsamlı ve öncü bir araştırma olarak değerlendirilmektedir.
Bu çalışma, Yükseköğretim Kurulu'nun (YÖK) 100/2000 (Bitki Genetiği ve Tarımsal Biyoteknoloji Programı) Doktora Burs Programı ve Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu'nun (TÜBİTAK) 2211-A Yurt içi Doktora Programı tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, Uşak Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından (BAP) Prof. Dr. Abdülrezzak Memon'a verilen (proje no: 2024/MF002) proje ile desteklenmiştir.

Abstract:
Brassica juncea, commonly known as Indian or brown mustard, is a significant industrial oil crop worldwide. It is commercially valuable because it provides raw materials for various industries, including animal feed, biodiesel, cooking oil, and medicine. B. juncea demonstrates substantial potential for the phytoremediation of chromium (Cr)-contaminated soils owing to its high biomass, rapid growth, moderate metal accumulation, ease of harvesting, and metal tolerance. Recently, microRNAs are recognized for their crucial regulatory roles in plant responses to different metal stresses. Nevertheless, there is limited information on microRNAs in B. juncea, particularly those involved to chromium (Cr) stress response.
         In this study, the transcriptomic response of B. juncea Early raya, which is tolerant to chromium toxicity, and B. juncea Sindh raya, which is sensitive to chromium toxicity, was investigated using RNA sequencing. The expression of specific genes be regulated by chromium toxicity tolerance was further examined through RT-qPCR. In the physiological growth analysis, Early raya showed less impact from high chromium (1000 µM) on all growth parameters, including root-shoot length, shoot fresh weight, root fresh weight, and root-shoot dry weight, compared to other B. juncea varieties. Conversely, Sindh raya exhibited more significant effects from high chromium (1000 µM) on the same growth parameters. Additionally, after chromium application, the highest chromium uptake was observed in the roots, with the root chromium content being significantly higher than in plant's above-ground parts. Early raya accumulated high chromium in the roots when treated with Cr³⁺ (1000 µM) for two weeks (15 days) and showed high chromium tolerance compared to the other Brassica juncea varieties.  A total of 70 genes were differentially expressed in the roots of Early raya when treated with 1000 µM Cr, compared to the control plants (without Cr). Of these genes, the expression of 27 were statistically significant (p<0.05). Among the significantly different genes, 19 were upregulated and 8 were downregulated. On the other hand, the roots of Sindh raya when treated with 1000 µM Cr for two weeks showed low chromium tolerance; 80 genes in variety were differentially expressed compared to the control. Of these genes, the expression of 50 were statistically significant (p<0.05). Among them, 28 were upregulated, and 22 were downregulated. For RT-qPCR analysis, three genes involved in different mechanisms and showing significant differential expression were selected according to transcriptome sequencing results. Among the genes studied in the Cr-treated experimental groups compared to the control, the APX, Fe-SOD, and RBOH genes were upregulated. 
       This thesis identifies potentially significant miRNAs, genes, and pathways related to Cr³⁺ stress response through miRNA and mRNA profiling in B. juncea. The identified pathways, genes, and miRNAs are significant targets for future omics studies to enhance chromium tolerance in B. juncea. This represents the first comprehensive study on chromium stress tolerance and transcriptomic changes in B. juncea.
This study supported by the Council of Higher Education's (YOK) 100/2000 (Plant Genetics and Agricultural Biotechnology Program) Doctoral Scholarship Program and the Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) (2211-A Ph.D. Program). Additionally, the support from BAP Project given to Prof. Dr. Abdülrezzak Memon (project no: 2024/MF002) is appreciated.