Tunceli yöresinde yetişen yenilebilir bazı makrofungus türlerinin sitotoksik etkileri ile antioksidan ve antimikrobiyal aktivitelerinin araştırılması
The investigation of cytotoxic effects, antioxidant and antimicrobial activities in some edible macrofungus strains growing in Tunceli region
Yazar: HEVİDAR ALP
Danışman: PROF. DR. ABDUNNASIR YILDIZ
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada; Tunceli yöresinden toplamış olduğumuz Agaricus campestris, Morchella esculenta, Morchella vulgaris, Amanita vaginata, Langermannia gigantea, Pleurotus eryngii var. ferulae ve Pleurotus eryngii var. eryngii'nin metanolik ekstraktlarının, sitotoksik etkileri ile antioksidan ve antimikrobiyal aktiviteleri incelenmiştir. 
Farklı 3 lokasyondan toplanan, 7 türe ait metanolik ekstraktların antioksidan aktivitesi; demir ve askorbik asit ile indüklenmiş fosfatidilkolin lipozomlarının peroksidasyonunu inhibe edici (LPO), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH•) serbest radikali giderici, ABTS•+ radikal katyonu kullanılarak, total radikal antioksidan potansiyeli (TRAP) ve ferri iyonu redükleme antioksidan potansiyeli (FRAP) testleri ile belirlenmiştir. Buna ilaveten, bu türlerin, toplam fenolik bileşik ve flavonoit miktarları da tespit edilmiştir. 
Çalışılan türlere ait metanolik ekstraktların, DPPH• radikali giderici aktivitesine sahip oldukları belirlenmiştir. Ayrıca, mantar ekstraktlarının antioksidan aktivitelerinin, konsantrasyon artışına paralel olarak değiştiği de tespit edilmiştir. Hesaplanan EC50 değerlerine göre; en yüksek aktiviteyi A. campestris, en düşüğünü ise L. gigantea göstermiştir. 
Test edilen türlerin, ABTS•+ radikal katyonu giderici aktivitesine de sahip oldukları saptanmıştır. Hesaplanan EC50 değerlerine göre; istatistiksel olarak (p>0.05) benzer aktivite gösteren A. campestris, M. vulgaris ve M. esculenta'nın en yüksek, P. eryngii var. ferulae'nin ise en düşük antioksidan aktiviteye sahip olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, 20 mg/ml'lik konsantrasyonda; en yüksek troloks ekivalan antioksidan kapasitesini (TEAC); M. esculenta, M. vulgaris ve A. campestris göstermiştir. Bu türlerin, 20 mg/ml'lik konsantrasyonunda, kullanılan standartlar kadar etkin ABTS•+ radikal katyonu giderici aktivitesine sahip oldukları gözlenmiştir. En düşük antioksidan aktiviteyi ise P. eryngii var. ferulae göstermiştir. 
A. campestris'e ait metanolik ekstraktın, 20 mg/ml'lik konsantrasyonda; kullanılan standartlardan daha fazla ferri iyonu redükleme antioksidan potansiyeline (FRAP) sahip olduğu belirlenmiştir. En düşük indirgeyici gücü ise P. eryngii var. ferulae ile L. gigantea göstermiştir.
Ayrıca, çalışılan bütün türler arasında, en etkili lipid peroksidasyon inhibitörünün A. campestris olduğu saptanmıştır. 
Çalışılan türlerin fenolik bileşik ve flavonoit miktarı ile antioksidan aktiviteleri arasında sıkı bir ilişki olduğu tespit edilmiştir. Yani, en yüksek fenolik bileşen miktarına sahip olan A. campestris'in; bütün antioksidan aktivite belirleme testleri sonucunda da en yüksek aktiviteyi gösterdiği saptanmıştır. Bu türden sonra en yüksek antioksidan aktivite gösteren M. vulgaris'in ise en yüksek miktarda flavonoit içeren tür olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca bu çalışmada; kullanılan mantarların yetişme yerlerindeki farklılığın, antioksidan aktiviteyi etkileyebildiği gözlenmiştir. Bu durum; türlerin yapısında bulunan antioksidan bileşenlerin miktarı ile yetiştikleri coğrafik ortam arasında bir ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.  
Bütün mantar türlerinden elde edilen metanolik ekstraktların, Mikrodilüsyon Yöntemi kullanılarak; Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 4352, Proteus mirabilis ATCC 14153, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228'e karşı antibakteriyal ve Candida albicans ATCC 10231'a karşı da antifungal aktiviteleri araştırılmıştır. Gözle görünür üremenin olmadığı en düşük madde konsantrasyonları (MİK) belirlenmiştir. Çalışmada kullanılan mantar ekstraktlarının, test edilen mikroorganizmaların gelişimleri üzerinde, değişik ya da benzer dozlarda etkiye sahip olduğu saptanmıştır. Bütün mantar ekstraktlarının, en iyi antibakteriyal etkiyi; Gram(+) olan S. aureus ve S. epidermidis'e karşı gösterdiği, Gram(-) mikroorganizmalara karşı ise zayıf etkinin görüldüğü tespit edilmiştir. En yüksek antibakteriyal aktiviteyi; S. aureus'a karşı, A. campestris'e ait metanolik ekstraktı göstermiştir. Çalışılan mantar ekstraktların hiçbirinde, C. albicans'a karşı antifungal aktiviteye rastlanmamıştır. Çalışmanın bu kısmında, kullanılan test mikroorganizmasının ve mantarın türüne bağlı olarak, antimikrobiyal aktivitenin değiştiği saptanmıştır. Ayrıca, aynı türe ait farklı bölgelerden toplanan mantar örneklerinin, aynı mikroorganizmaya karşı, farklı düzeyde antimikrobiyal aktivite gösterebildiği ve türün yetiştiği ekolojik çevrenin, antimikrobiyal aktivite düzeyine etki edebileceği sonucuna varılmıştır.
Son olarak, türlerden elde edilen değişik konsantrasyonlardaki metanolik ekstraktların, seçilen kanser hücre hattı (HeLa) üzerindeki sitotoksik etkilerinin belirlenebilmesi için Mitokondriyal Süksinat Dehidrojenaz (MTT testi) tayini yapılmıştır. P. eryngii var. eryngii ve A. vaginata'nın metanolik ekstraktında, HeLa hücre hattı üzerinde sitotoksik etki gözlenmiştir. A. campestris, M. vulgaris, L. gigantea, M. esculenta ve P. eryngii var. ferulae'nin metanolik ekstraktlarında ise, 5 farklı konsantrasyonda da, HeLa hücre hattı üzerinde sitotoksik etkiye rastlanmamıştır.

Abstract:
In this study, the cytotoxic effects and antioxidant and antimicrobial activities of methanolic extracts from Agaricus campestris, Morchella esculenta, Morchella vulgaris, Amanita vaginata, Langermannia gigantea, Pleurotus eryngii var. ferulae and Pleurotus eryngii var. eryngii collected from Tunceli region were examined.
Antioxidant activities of methanolic extracts from 7 species, collected from 3 locations were detected through total radical antioxidant potential (TRAP) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) tests by using the peroxidation of phosphatidylcholine liposomes induced by iron and ascorbic acid (LPO), 2,2-diphenyl-1-pikrilhidrazil (DPPH•) free radical scavenger and ABTS•+ radical cation. Besides, the total amount of phenolic compounds and flavonoids of these species was identified. 
It was detected that methanolic extracts of the studied species have DPPH• radical scavenging antioxidant activity. In addition, it was also found that the antioxidant activity of the fungi extracts change correspondingly with the increase of the concentration. According to the calculated EC50 values, the most active one is A. campestris, while L. gigantea is the least active one.
Tested species were found to have ABTS•+ radical cation suppressor activity too. According to the calculated EC50 values, among the fungi showing statistically (p>0.05) similar activity, A. campestris, M. vulgaris and M. esculenta were discovered to have the highest antioxidant activity, whereas P. eryngii var. ferulae has the lowest. Also, in 20 mg/ml concentration, M. esculenta, M. vulgaris and A. campestris showed the highest trolox equivalence antioxidant capacity (TEAC). These species were observed to have ABTS•+ radical cation suppressor activity as effective as applied standards in 20 mg/ml concentration. On the other hand, P. eryngii var. ferulae shows the lowest antioxidant activity. 
It was found out that the methanolic extract from A. campestris has more ferri ion reducing antioxidant potential (FRAP) in its 20 mg/ml concentration than used standards. P. eryngii var. ferulae and L. gigantea demonstrates the lowest reducing power.
Moreover, among all studied species, A. campestris was discovered to be the most effective inhibitors of lipid peroxidation. 
It was detected that there is a close relationship between the amount of antioxidant activity and flavonoids and phenolic compounds of the examined species. In this regard, A. campestris having the highest amount of phenolic compounds shows the highest activity in the results of all tests to determine the antioxidant activity. It was also found that M. vulgaris having the second highest antioxidant activity after A. campestris is the species which includes the highest amount of flavonoid. Besides, it was observed that the difference between the places where the fungi species grow may affect the antioxidant activity. This situation suggests that there can be a correlation between the amount of antioxidant components the species have in their structure and their geographic habitat. 
By using Microdilution Method on methanolic extracts from all the species studied, their antibacterial activity against Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 4352, Proteus mirabilis ATCC 14153, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 and their antifungal activity against Candida albicans ATCC 10231 were investigated. Besides, their minimum inhibitory concentration (MIC) where there is no visible reproduction was found out. It was also detected that the fungi extracts used in the study have different or similar effects on the development of tested microorganisms. All fungi extracts show the best antimicrobial effects against S. aureus and S. epidermidis, which are Gram(+), whereas their effect is weak against Gram(-) microorganisms. The methanolic extract from A. campestris show the highest antibacterial activity against S. aureus. Antifungal activity against C. albicans was not observed in any of the fungi extracts examined. In this part of the study, it was discovered that the antimicrobial activity varies according to the species of used testing microorganisms and fungi. Besides, it was detected that fungi samples collected from different areas may show antimicrobial activity against the same microorganisms at different levels and hence it was concluded that the habitat can affect the level of antimicrobial activity.
Lastly, determination of Mitochondrial Succinate Dehydrogenase (MTT assay) was applied to determine the cytotoxic effects of methanolic extracts at varying concentrations obtained from the fungi species on selected cancer cell line (HeLa). Cytotoxic effect was observed on the HeLa cell line in the methanolic extract from P. eryngii var. eryngii and A. vaginata. On the other hand, no cytotoxic effect on HeLa cell line was observed in any 5 different concentrations of methanolic extracts from A. campestris, M. vulgaris, L. gigantea, M. esculenta and P. eryngii var. ferulae.