Gümüş ve glisirizik asit yüklenmiş poli (vinil alkol) kriyojellerinin yara örtü malzemesi olarak kullanımının incelenmesi
Investigation of the use of silver and glycyrrhizic acid loaded poly (vinyl alcohol) cryogels as wound dressing material
Yazar: SELMA USLU
Danışman: DOÇ. DR. MURAT İNAL
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Deri Mühendisliği = Leather Engineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Ditiyokarbamat = Dithiocarbamate ; Glisirizik asit = Glycyrrhizic acid ; Gümüş = Silver ; Kriyojeller = Cryogels

Özet:
Meyan kökü tıbbi araştırmalar için geçmişten günümüze kadar ilgi odağı olmuştur ve meyan kökünden elde edilen çeşitli ekstraktlar üzerindeki araştırmalar halen devam etmektedir. Meyan kökünün önemli bileşenlerinden biri olan glisirizik asit özellikle antimikrobiyal, antioksidan, antienflamatuvar özellikleri nedeniyle biyomedikal alanda ve farmakolojik çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır. Glisirizik asit yüklenmiş hidrojeller yara yanık tedavisi ve cilt kanseri üzerinde yapılan çeşitli çalışmalarda kullanılmaktadır. Bu alanda yapılan uygulamalar temel olarak, glisirizik asitin etkinliğinin ve işlevselliğinin incelenmesi üzerine yoğunlaşmıştır.
Bu çalışmada biyolojik olarak parçalanabilir olması ve biyouyumluluğu gibi özelliklerinden dolayı sentetik bir polimer poli (vinil alkol) ana bileşen olarak kriyojellerin sentezi amacıyla kullanılmıştır. Gümüş iyonlarının hızlı bir şekilde salınması sonucu sitotoksik etki göstermemesi için ditiyokarbamat kitosan ile kaplanmış formda gümüş nanopartikülleri kriyojellerin içine eklenmiştir. Glisirizik asit ise doğrudan kriyojel yara örtü malzemelerine ilave edilmiştir.
Bu çalışmanın ilk aşamasında meyan kökünden glisirizik asit elde edilmiştir. Elde edilen glisirizik asit fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR) ile karakterize edilmiştir. İkinci aşamasında ise kitosanın ditiyokarbamat türevi sentezlenmiştir. Daha sonra, karşılaştırma için hem sentezlenmiş ditiyokarbamat kitosan hem de kitosan ile kaplanmış gümüş nanopartiküller elde edilmiştir.
Elde edilen nanopartiküller ultraviyole-görünür bölge (UV-VİS) spektrofotometresi, zeta-sizer analizleri ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) çalışmaları ile karakterize edilmiştir. Daha sonra glisirizik asit ve gümüş nanopartikül yüklü poli (vinil alkol) kriyojelleri hazırlanmıştır. Sentezlenen kriyojeller taramalı elektron mikroskobu çalışmaları ve su tutma kapasiteleri ile karakterize edilmiştir.
Elde edilen kriyojellerin antioksidan aktivitesi 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal giderme testi, antibakteriyel etkisi ise modifiye sıvı besiyeri seyreltme metodu ve sitotoksitesi B16-F10 fare melanom hücre hattında 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyumbromür (MTT) testi ile belirlenmiştir.
Meyan kökünün aseton ekstraktından pH 1,2 ve pH 8,3'te meydana gelen çökeltilerin FTIR analizlerine bakıldığında glisirizik asit molekülü ile benzer yerlerde pikler verdiği belirlenmiştir. Sentezlenen kitosan ve ditiyokarbamat kitosan kaplanmış gümüş nanopartiküllerin (AgNP) UV-VİS spektrofotometre sonuçlarında yaklaşık 410 nm'de AgNP'lerin karakteristik piklerini sergilediği görülmüştür. Ayrıca AgNP'lerin hidrodinamik çap ve çoklu dağılım indeksi sonuçlarının birbirine oldukça yakın çıktığı ve zeta potansiyelleri sonuçlarının da nanopartiküllerin kararlı olduğunu doğruladığı belirlenmiştir. Kitosan kaplanmış AgNP'lerin SEM görüntüleri incelendiği zaman görülebilecek düzeyde kümelenme olmadığı fakat ditiyokarbamat kaplanmış AgNP' lerin çubuk benzeri yapılar şeklinde kümelenmeler olduğu açıkça görülmektedir.
Sentezlenen boş PVA ile glisirizik asit ve ditiyokarbamat kaplanmış AgNP yüklü PVA kriyojellerin SEM görüntüleri karşılaştırıldığı zaman eklenen maddelerin kiroyojellerin daha yoğun ve daha düzenli bir yapı oluşturmasını sağladığı görülmektedir. PVA kriyojellerin su tutma kapasitesi zamana bağlı olarak incelenmiştir. Kriyojellerin zaman içerisinde su tutma kapasitesinin, glisirizik asit miktarlarının artması ile artış gösterdiği belirlenmiştir. Glisirizik asit içeren kriyojellerin serbest glisirizik asit ile hemen hemen aynı antioksidan aktivite gösterdiği bulunmuştur. Kriyojellerin antibakteriyel aktiviteleri Staphylococcus aureus ve Esherichia coli bakteri türlerine karşı değerlendirilmiştir. Her iki bakteri türü için MIC değerleri sırasıyla 3,84 ve 4,86 μg Ag/mL besiyeri olarak belirlenmiştir. Kriyojellerin S. aureus için antibakteriyel etkinliğinin E. coli' ye göre daha fazla olduğu görülmüştür.
Kriyojelerin MTT sonuçları incelendiğinde, boş kriyojellerle muamele edilen hücrelerin canlılığını yüksek oranda koruduğu buna karşılık glisirizik asitin ve gümüş nanopartiküllerin kriyojellere ilave edilmesi ile hücre canlılığının azaldığı belirlenmiştir. Özellikle glisirizik asit miktarının artışının sitotoksisiteyi belirgin bir şekilde arttırdığı bulunmuştur.
Bu sonuçlar, ditiyokarbamat kitosan kaplanmış gümüş nanopartiküller ve glisirizik asit yüklenmiş kriyojeller formülasyonlarının yaraların enfeksiyona maruz kalmadan iyileşmesini sağlayacak antioksidan ve antibakteriyel aktivitelere sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca, geliştirilen kriyojel formülasyonları içinde bulunan yüksek miktarda glisirizik asitin B16-F10 fare melanom hücreleri üzerine yüksek oranda sitotoksik etki göstermesi, bu sistemin cilt kanserinin tedavisine yönelik yeni bir yaklaşım tarzı olabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Liquorice root has been the focus of interest for medical research from past to present and research on various extracts obtained from liquorice root is still ongoing. Glycyrrhizic acid, one of the important components of liquorice, is frequently used in biomedical and pharmacological studies, especially due to its antimicrobial, antioxidant and anti-inflammatory properties. Glycyrrhizic acid loaded hydrogels are used in various studies on wound burns treatment and skin cancer. Applications in this field are mainly focused on the investigation of the activity and functionality of glycyrrhizic acid.
In this study, a synthetic polymer poly (vinyl alcohol) was used as the main component for the synthesis of cryogels due to its biodegradability and biocompatibility. Silver nanoparticles in the form coated with dithiocarbamate chitosan were added into the cryogels to prevent cytotoxic effect as a result of rapid release of silver ions. Glycyrrhizic acid was added directly to the cryogel wound dressing materials.
In the first stage of this study, glycyrrhizic acid was obtained from liquorice root. The obtained glycyrrhizic acid was characterised by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). In the second step, dithiocarbamate derivative of chitosan was synthesised. Then, silver nanoparticles coated both with synthesised dithiocarbamate chitosan and chitosan for comparison were obtained.
The obtained nanoparticles were characterised by ultraviolet-visible region (UV-VIS) spectrophotometry, zeta-sizer analysis and scanning electron microscopy (SEM) studies. Then, glycyrrhizic acid and silver nanoparticle loaded poly (vinyl alcohol) cryogels were prepared. The synthesised cryogels were characterised by scanning electron microscopy studies and water retention capacity.
The antioxidant activity of the obtained cryogels was determined by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging test, antibacterial effect by modified liquid medium dilution method and cytotoxicity by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolyumbromide (MTT) test in B16-F10 mouse melanoma cell line.
The FTIR analyses of the precipitates formed from the acetone extract of liquorice root at pH 1.2 and pH 8.3 showed similar peaks with the glycyrrhizic acid molecule. The UV-VIS spectrophotometer results of the synthesised chitosan and dithiocarbamate chitosan coated silver nanoparticles (AgNPs) showed the characteristic peaks of AgNPs at approximately 410 nm. In addition, it was determined that the hydrodynamic diameter and multiple dispersion index results of AgNPs were very close to each other and the zeta potential results confirmed that the nanoparticles were stable. When the SEM images of chitosan coated AgNPs are examined, it is clearly seen that there is no visible clustering, but dithiocarbamate coated AgNPs have clusters in the form of rod-like structures.
When the SEM images of the synthesised empty PVA and glycyrrhizic acid and dithiocarbamate coated AgNP loaded PVA cryogels are compared, it is seen that the added substances provide a denser and more regular structure of the cryogels. The water retention capacity of PVA cryogels was analysed as a function of time. It was determined that the water retention capacity of the cryogels increased with the increase in the amount of glycyrrhizic acid. It was found that glycyrrhizic acid containing cryogels showed almost the same antioxidant activity as free glycyrrhizic acid. The antibacterial activities of cryogels were evaluated against Staphylococcus aureus and Esherichia coli bacterial species. MIC values for both bacterial species were determined as 3.84 and 4.86 μg Ag/mL culture medium, respectively. It was observed that the antibacterial activity of cryogels was higher for S. aureus than for E. coli.
When the MTT results of the cryogels were analysed, it was determined that the cells treated with empty cryogels maintained their viability at a high rate, whereas the cell viability decreased with the addition of glycyrrhizic acid and silver nanoparticles to the cryogels. In particular, it was found that the increase in the amount of glycyrrhizic acid significantly increased the cytotoxicity.
These results show that dithiocarbamate chitosan coated silver nanoparticles and glycyrrhizic acid loaded cryogel formulations have antioxidant and antibacterial activities that will enable wounds to heal without infection. In addition, the high amount of glycyrrhizic acid in the developed cryogel formulations showed a high cytotoxic effect on B16-F10 mouse melanoma cells, suggesting that this system may be a new approach to the treatment of skin cancer.