Fibrinolitik lumbrokinaz enziminin filamentli mantar Aspergillus oryzae'de üretimi ve saflaştırılması
Production and purification if fibrinolitic lumbokinase enzyme in filamentous fungus Aspergillus oryzae
Yazar: GAMZE BEK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SERDAR UYSAL
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada lumbrokinaz enziminin Aspergillus oryzae'de yüksek verimde üretilmesi ve saflaştırılması hedeflenmektedir. Bu enzim fibrinolitik etkiye sahip olduğundan dolayı birçok hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Homolog üretim kaynağı lumbrokinaz için Lumbricus bimastus (283 aa)'dır. Homolog olarak üretimlerinin kısıtlı, zaman alıcı ve pahalı olması sebebiyle araştırmacılar bu enzimin heterolog çalışmalarına yönelmiştir. Fakat farklı ekspresyon sistemlerinde üretilme çalışmalarına rağmen yeterli ve istenilen verimde üretimi sağlanamamıştır. A. oryzae, amilolitik ve proteolitik enzimler gibi büyük miktarlarda hidrolitik enzim üretme yeteneğine sahiptir.  Bu özellik sayesinde A. oryzae homolog ve heterolog enzim üretimi için önemli bir kaynak oluşturmaktadır. A. oryzae'nin güçlü protein salgılama, hızlı büyüme, kolay kültüre ve optimize edilebilme özelliklerinden dolayı bu çalışmada ekspresyon sistemi olarak seçilmiştir. 
C-terminaline 6X His-tag etiketlenmiş ve Aspergillus oryzae'ye kodon optimize şekilde tasarlanmış lumbrokinaz enzimi, pUC19 plazmid vektörüne ligasyon yapılarak sentezlettirilecektir. Gelen vektörün önce Escherichia coli TOP10 hücrelerine transformasyonu, daha sonra protoplast yöntemi ile A. oryzae'ye transformasyonu yapılacaktır. Daha sonra, CD Agar plaklarına ekimi yapılarak koloni seçilecek ve seçilen koloniler daha spesifik koloniler ve protein salınımları için DPY besiyerine ekilecektir. SDS PAGE ile kontroller sağlanacak ve bir koloni seçilerek ekspresyon başlatılacaktır. Proteinlerin saflaştırılması için IMAC (İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi) metodu kullanılacaktır.

Abstract:
In this study, it is aimed to produce and purify the lumbrokinase enzyme in high yield in Aspergillus oryzae. Since this enzyme has a fibrinolytic effect, it is used in the treatment of many diseases. The homologous production source for lumbrokinase is Lumbricus bimastus (283 aa). Since homologous production is limited, time-consuming and expensive, researchers have turned to heterologous studies of this enzyme. However, despite the efforts to be produced in different expression systems, sufficient and desired yield could not be produced. A. oryzae is capable of producing large amounts of hydrolytic enzymes such as amylolytic and proteolytic enzymes. Thanks to this feature, A. oryzae constitutes an important source for homologous and heterologous enzyme production. A. oryzae was chosen as the expression system in this study due to its strong protein secretion, rapid growth, easy culture and optimizability.
The lumbrokinase enzyme tagged 6X His-tag to the C-terminus and codon-optimized designed to Aspergillus oryzae will be synthesized by ligation into the pUC19 plasmid vector. The incoming vector will be transformed into Escherichia coli TOP10 cells first and then into A. oryzae by protoplast method. Next, the colony will be selected by seeding on CD Agar plates and the selected colonies will be seeded on DPY medium for more specific colonies and protein releases. Controls will be provided by SDS PAGE and expression will be initiated by selecting a colony. IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) method will be used for purification of proteins.