Laktik asit bakterilerinde tür içi ve türler arası ayrımda 16S-23s rDNA ISR-RFLP tekniğinin değerlendirilmesi
Evaluation of 16S-23s rDNA intergenic spacer region ISR-RFLP for inter and intraspecific differentiation of lactic acid bacteria
Yazar: BİLGE ÇETİN
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM OSMANAĞAOĞLU
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Laktik asit bakterilerinin (LAB) endüstriyel uygulamaları düşünüldüğünde, araştırmaların en temel amacı kullanılabilecek olan LAB suşlarının seçimidir. Suş bazında güvenilir tiplendirme yöntemleri hem LAB starter kültürlerin performanslarının incelenmesinde hem de fonksiyonel gıda ürünlerinde katkı maddesi olarak kullanılacak olan kültürlerin incelenmesinde önem kazanmaktadır. Bu nedenle, herhangi bir suşun spesifik ve belirgin olarak ayrımını sağlayan güvenilir yöntemlerin uygulanması oldukça önemlidir. Günümüzde, LAB tanımlama/tiplendirme çalışmaları ilgi odağı olan fenotipik yöntemlerden daha kesin ve hassas sonuçlar veren moleküler yöntemlere (genotipik) doğru kaymıştır.Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Mikrobiyal Genetik laboratuarımızdaki kültür koleksiyonunda mevcut bulunan Laktik Asit Bakterilerine ait 144 adet suşun tanımlanması daha önceki çalışmalarda fenotipik testlerin kullanımı ile yapılmıştır. Çalışmamızda, bu 144 adet suşun tür/tür içi ayrımında 16S-23S ISR (intergenic spacer region) RFLP tekniğinin taksonomik potansiyelinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Çalışmamızda; 16S-23S ISR (intergenic spacer region) gen bölgesi evrensel primerlerin kullanımı ile amplifiye edilerek değişik restriksiyon endonükleazların kullanımı ile RFLP analizine tabi tutulmuştur. Bant paternlerine ait görüntüler daha ileriki analizlerde kullanılmak üzere GelCompar II, Version 4,1 (AppliedMath) bilgisayar yazılım programına aktarılmıştır. Bantların arasındaki benzerlik ise ?Dice product moment correlation coefficient? ile ifade edilip % değerine dönüştürüldükten sonra UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) analizi ile gruplandırma işlemi yapılmış ve neticede türler/suşlar arasındaki genetik benzerlik dendogram olarak gösterilmiştir. Grupları birbirinden ayırt etmek için korelasyon katsayısı %90 olarak belirlenmiştir. Kullanmış olduğumuz restriksiyon enzimlerine bağlı olarak tür/suş seviyesinde birbirleri ile oldukça yakın ilişkide bulunan LAB suşlarının ayrımında bu tekniğin ayrım gücü kısmen başarılı bulunmuştur.

Abstract:
As far as industrial applications of Lactic acid bacteria (LAB) are concerned, the aim of the researches is choosing the LAB strain which can be used. Reliable methods for identification and characterization of bacterial strains belonging to LAB are great interest in food industry in the study of the performance of LAB starter cultures and cultures used as additives in functional food type products as well as in fields of applied microbiology. Therefore, application of reliable methods on spesific and distinct discrimination of any strain is rather important. Nowadays, the main focus for the identification/tying of LAB has moved from phenotypic to genotypic methods as they yield more sensitive and accurate results.In our lab culture collection(Ankara University, Faculty of Science, Microbial Genetic Laboratory), we have 144 strains of LAB, the identification of which were previously carried out by phenotypic classification. It is the aim of this study to determine the taxonomic potential of 16S-23S ISR (intergenic spacer region) RFLP techniques in discrimination of 144 strains belonging to LAB at the species and the intra-species level. In our study; by use of universal primer sets, 16S-23S rDNA spacer regions (ISR) were amplified and the resultant amplicons were used in ISR RFLP analysis by use of several restriction endonucleases. These band patterns were exported into the AppliedMath GelCompare II, Version 4.1 software for further analysis. Calculation of similarities in the profiles of bands was based on Dice product-moment correlation coefficient (r) for 16S ARDRA. The UPGMA clustering algorithm was used to generate a dendogram. A coefficient of correlation of 90 % was selected to distinguish the clusters for 16S-23S rDNA ISR and RFLP. Depending on the restriction enzymes used throughout the studies, the result of the study demonstrated the slightly discrimination of these techniques towards the differentiation of related LAB strains on species and strains levels.