Ratlarda demir yüklemesinin hematopoietik sistem, kemik iliği ve ilişkili genler üzerindeki etkisi
The effect of iron overload on hematopoietic system, bone marow and related genes in rats
Yazar: ESİN GÜLEN
Danışman: PROF. DR. AYŞEN TİMURAĞAOĞLU
Akdeniz Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Demir = Iron ; Genler = Genes ; Hematopoietik sistem = Hematopoietic system ; Hepsidin = Hepcidin ; Kemik iliği = Bone marrow ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Eritrositlerin kemik iliğinde farklılaşması sürecinde, demirin bağırsaklardan emiliminde, hücrelere transportunda, kullanılmasında ve depolanmasında görevli olan proteinlerin ve ilişkili genlerin nasıl düzenlendiklerinin belirlenmesi konusunda yoğun araştırmalar yapılmaktadır. Yapılan çalışmalar çoğunlukla inefektif eritropoez ortamında araştırılmıştır. Eritropoezin normal olarak devam ettiği koşullarda, dışarıdan demir verilmesinin hematopoetik organlardaki etkileri sistematik olarak tümüyle açıklığa kavuşmamıştır. Demir uygulaması yapılmış ratlarda yürüteceğimiz çalışmamızda literatürdeki bu boşluğu doldurmak amaçlanmaktadır. Çalışmamızda kemik iliği, periferik dolaşım ve karaciğer dokularında, vücuttaki demir fazlalığını algılayan ve demir fazlalığından etkilenen sözkonusu hedef genlerde demir verilmesiyle gerçekleşecek ekspresyonel değişimlerin tanımlanması planlanlanmıştır. Elde edilecek verilerin demir birikimi ile seyreden hastalıklarda prognoz ve tedavi yanıtlarını takip etmede kullanılabileceği düşünülmektedir.Çalışmada Wistar-Albino cinsi 3 aylık 20 erkek rat kullanıldı. Ratlar kontrol (n=10) ve demir verilen grup (n=10) olarak ikiye ayrıldı. Deney grubundaki ratlara 100 mg / kg haftada 3 gün 2 hafta intraperitoneal olarak demir dekstran, kontrol grubuna ise aynı şekilde 5 ml SF verildikten sonraki 15 gün bekleme süresinden sonra ratlar aynı günde sakrifiye edilerek periferik kandan alınan örneklerden hemogram ve biyokimyasal paremetreler incelendi. Kemik iliği örneklerinden ise; flow sitometri yöntemi ile eritroid öncüllerde oluşan değişimler ve PCR yöntemi ile gen ekpresyon analizleri gerçekleştirildi. KC dokusundan ise PCR yöntemi ile gen ekspresyon ölçümleri yapılarak demir ilişkili genlerdeki ekpresyon değişimleri saptandı.Serumda yapılan ölçümlerde demir ve ferritin değerlerinde belirgin artış olduğu (p= 0.0001) saptanmış olmasına rağmen hemoglobin ve hematokrit gibi eritroid parametrelerde farklılık olmadığı saptanmıştır (p>0.05). RDW değerinde ise; anlamlı artış saptanmıştır (p= 0.001). Kemik iliğinde flow sitometri ile yapılan analizlerde tüm hematopoietik hücreler içinde CD71(+) olan hücre yüzdesinin demir uygulanan ratlarda değişmediği gözlenmiştir (p>0.05). Ancak CD71 ekspresyonu düşük (+) hücre yüzdesinin ve hücre büyüklüklerinin demir yüklenen grupta arttığı saptanmıştır (p<0.05). Kİ'de TfR1 gen ekspresyonunda azalma (p<0.05) ,EpoR ve TfR2 gen ekspresyonunda ise anlamlı artış (p<0.05) saptanmıştır. KC'deki gen ekspresyonlarına baktığımızda ise TfR1 ve TfR2 gen ekpresyonunda ayrıca HFE gen ekspresyonunda anlamlı azalma olduğu görülmüştür (p<0.05). Ayrıca KC'de Hepsidin gen ekspresyonunda anlamlı değişiklik saptanmamıştır (p>0.05) Çalışmamızda; periferik dolaşımdaki demir yüklenmesine karşılık hemoglobin ve hematokrit gibi eritroid parametrelerin korunduğu görülmektedir. Kemik iliğindeki eritropoetik hücrelerde demir girişini azaltmaya yönelik ekspresyon değişimleri gerçekleşmektedir. Kİ'de geç dönem eritroid hücre yüzdesi azalmış, buna karşılık erken dönem eritroid hücre yüzdesi artmıştır, bu durum artmış apopotozisin arttığını düşündürebilir. Demir verilmesi sonrasındaki subakut dönemde incelenmiş olan ratlarda sistemik demir yüküne yanıt olarak, hepatositlerde hepsidin sentezini azaltacak mekanizmalar uyarılmaya başlamıştır.Sonuç olarak demir yüklenmesi yapılmış ratlarda periferde ve kemik iliğinde eritroid parametreler değişmemiş ve organizmadaki demir yükünü azaltacak hepatik yanıt oluşturulmuştur. Gelecekte, demir yüklenmesi sonrasında eritropoezde ve karaciğerde gerçekleşen bu değişimlerin zamana bağlı olarak nasıl düzenlendiklerinin belirlenebilmesi, klinikte demir fazlalığı ile karakterize hastalıkların tanı ve tedavisi açısından yol gösterici olacaktır.

Abstract:
Most of research has been done about structure of the proteins and genes responsible for metamorphosis process of erythrocytes in the bone marrow, absorption of iron in the intestines, transportation to the cells, its usage and storage. Most of this research was done in ineffective eritropoezis. In the conditions which eritropoezis continue normally, it wasn?t entirely discovered what the systematic effects of external iron supplement on hematopoietic organs are. The aim of this research is to find out the information about iron overload on normal eritropoiesis. The target genes are in the bone marrow, peripheral circulation, liver tissue and they get effected by iron in the body. In our research, the goal is defining the expressional changes in these target genes caused by iron supplementation. The results of research is considered to be usable for prognosis and treatment in iron overload disease.In our research, Wistar-Albino type, 12-16 weeks-old, 20 male rats were used. They were separated into two groups: The group that is supplemented with iron (n=10) and the control group (n=10). The rats in the test group has been given 100 mg/ kg by intraperitoneally iron dekstran 3 days a week for 2 weeks. Control group is given 5 ml SF. After 1 mounth, rats were sacrificed and peripheral blood samples were collected. The samples were examined for hemogram and biochemical parameters. On the other hand, the samples of the bone marrow were examined for changes in eritropoietic precursors using flow cytometri, and for gene expression analysis using PCR technique. Gene expression analysises were done through PCR technique in the liver tissue to determine the changes iron related gene expression.Although results of iron and ferritin rates in serum were found to increase explicitly (p= 0.0001), there wasn?t any difference in the eritroid paremetres like hemoglobin and hematocrit (p>0.05). But RDW rates were determined to raise significantly (p= 0.001). Analysis of the bone marrow using the flow cytometri showed that the percentage of CD71 (+) cells in the total eritroid cells didn?t change for the iron overload rats (p>0.05). However, CD71 expression and cell sizes were observed to increase in the CD71 low (+) cells (p<0.05). In bone marrow, increase in EpoR gene expression (p=0.007) ,decrease in TfR1 gene expression (p=0.003) and increase in TfR2 gene expression (p=0.001) were observed. In liver tissue gene expressions, in addition to TfR1, TfR2 and HFE gene expressions were also seen to decrease significantly (p<0.05). Hepsidin gene expressions weren?t observed to change significantly in the other analysises of liver tissue (p>0.05)In our research, eritroid paremetres were not seen to be changed despite the iron overload. Expression changes were observed in erytropoietic cells in bone marrow for decreasing the entry of iron. Late period of cell percentage of bone marrow decreased due to compensate the iron increase in the peripheral eritroid indexes. On the contrary, the early period eritroid cell percentage increased. Mechnanisms that will decrease hepsidin synthesis in hepatocites started to be stimulated as a response to systematic iron accumulation in the rats that are examined in the subacute period after the iron accumulation.In conclusion, erytroid paremetres in peripheral and bone marrow of the iron overload rats were not changed and hepatic response to decrease iron load in organism is created. In the future, designating these changes after iron overload in the eritropoezis and liver with time- course study, will be important for diagnosis and treatment of the diseases characterized by iron accumulation.