Rhizobium cinsi bakterilerin poli-beta-hidroksibütirat üretimlerinin belirlenmesi, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile elde edilen toplam protein profillerinin ve plazmid DNA'larının incelenmesi
Determination of production of poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) of some rhizobium bacteria, discrimination of strains by total cell protein profiles obtained by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and isolation of ...
Yazar: NAZİME MERCAN
Danışman: PROF.DR. YAVUZ BEYATLI
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2002
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Biyoplastik = Bioplastic ; Plazmit DNA = Plasmit DNA ; Protein profili = Protein profile ; Rhizobium = Rhizobium ; Şeker pancarı = Sugar beet

Özet:
Rhizobium CİNSİ BAKTERİLERİN POLİ-B-HİDROKSİBÜTİRAT ÜRETİMLERİNİN BELİRLENMESİ, SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ (SDS-PAGE) İLE ELDE EDİLEN TOPLAM PROTEİN PROFİLLERİNİN VE PLAZMİD DNA'LARININ İNCELENMESİ (Doktora Tezi) Nazime MERCAN GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Haziran 2002 ÖZET Araştırmada Rhizobium meliloti, Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium phaseoli, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium viciae ve Rhizobium sp. türlerine ait toplam 31 adet suş kullanılmıştır. Bakterilerin karbon kaynaklarını kullanma yetenekleri belirlenmiş ve suşlann monosakkarit olarak glukoz, dekstroz ve mannitolu kullandıkları gözlenirken, trehaloz, ksiloz, rafinoz, maltoz, galaktoz, sukroz, laktoz ve pirüvik asit-sodyum tuzunu kullanma yeteneklerinde farklılık gösterdikleri tespit edilmiştir. Genel olarak Rhizobium suşların asidik ortamda üremedikleri gözlenirken, suşlardan yalnız R viciae F69, Fiil, R phaseoli Fa28, Fa41, R cicer Nl, N2, N4, N6'nın pH 4,5'te üredikleri ve bu suşların asite tolerant olduktan tespit edilmiştir. Bakterilerin toplam hücre proteinlerinin SDS-PAGE analizi yapılmış, proteinlerin moleküler ağırlıktan 11-215 kD arasında olduğu bulunmuştur. SDS-PAGE analizi, aynı türe ait suşların protein profillerinin birbirine benzer olduğunu, diğer türlerden farklı olduğunu göstermiştir. Rhizobium bakterilerin PHB üretimleri spektrofotometrik olarak belirlenmiş, hücredeki polimer içeriğinin kalitatif tayininde ise Nile Blue A kullanılmıştır.Bakteri kolonilerin PHB miktarına bağlı olarak 254 nm UV ışığı altında rengin pembeden turuncuya doğru değişiklik gösterdiği gözlenmiştir. Bakterilerin PHB üretimleri hücre kuru ağırlığına göre %5,37-57,09 arasında değiştiği bulunmuştur. Maksimum PHB üretimi gösteren R viciae F111 (%57,09), R meliloti Y11 (%39,25) ve B. japonicum S irat Fab (%34,43) suşlarının farklı karbon ve azot kaynaklarında PHB üretimleri araştırılmıştır. R meliloti Y11 ve B. japonicum S irat Fab suşları karbon kaynağı olarak glukoz besi ortamında maksimum PHB verimi gösterirken (sırasıyla, %83,75 ve %34,31), R viciae Fiil suşu mannitol içeren besiyerinde yüksek oranda (%41,22) PHB üretmiştir. Suşların azot kaynaklarında (Fiil dışında) PHB verimlerinin yüksek olmadığı bulunmuştur. Azot kaynağı olarak proteaz pepton içeren besi ortamında R meliloti Y11 suşu maksimum %26,23 ve B. japonicum S irat Fab suşu %26,78 PHB üretirken, R viciae F111 suşu asparajin azot kaynağında maksimum %48,13 oranında PHB üretmiştir. Ayrıca kültür ortamının asitliği arttıkça PHB içeriğinde azalma olduğu bulunmuştur. Yüksek PHB üreten suşlar arasından R meliloti Y11 suşu seçilerek mutasyonun PHB üretimine etkisi incelenmiştir. Fiziksel mutajen olarak farklı sürelerde 254 nm dalga boyunda UY ışını, kimyasal mutajen olarak da farklı konsantrasyonlarda akriflavin, 5-bromourasil ve nitrosoguanidin uygulanmıştır. Muhtemel mutant suşlar ile atasal susun PHB üretimleri tespit edilmiş ve bir yıl arayla suşların PHB sentez yetenekleri incelenmiştir. Muhtemel mutant suşlar ilk ölçümlerde atasal susa kıyasla daha düşük oranlarda PHB üretirken, bazı suşların bir yıl sonraki ölçümlerde PHB üretimlerinde yükselme olduğu tespit edilmiştir. Araştırmada, farklı melas konsantrasyonlarında R meliloti Y11, B. japonicum S irat Fab ve R. viciae F 111 suşları üretilmiş ve bu besi ortamlarında suşların PHB üretimleri incelenmiştir. R meliloti Y11 suşu melasın %0,5 konsantrasyonunda maksimum %56,31 oranında PHB üretirken, R viciae Fiil ve B. japonicum S irat Fab suşlarında PHB üretimin düşük olduğubelirlenmiştir. R. viciae F111 suşunda kültür ortamındaki viskozitenin artışına bağlı olarak PHB veriminde bir azalma olduğu gözlenmiştir. Rhizobium bakterilerin bazı test bakterileri üzerinde genel inhibisyon etkileri agar difüzyon metodu ile incelenmiştir. Kullanılan test bakterileri üzerinde Rhizobium bakterilerin inhibisyon etkilerinin olmadığı bulunmuştur. Rhizobium suşlarının plazmid DNA profilleri çıkarılarak, bunların moleküler ağırlıkları tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre yalnız 13 adet susun plazmid içerdiği, diğer suşlarda plazmidin bulunmadığı gözlenmiştir. Bakterilerde plazmidlerin moleküler ağırlıkları 13,5-16,74 kb arasında bulunmuştur. Bilim Kodu Anahtar Kelimeler Sayfa adedi Tez Yöneticisi : 401.02.00 : Rhizobium, izolasyon, karbon kaynaklarını kullanım yeteneği, biyoplastik (PHB) üretimi, farklı karbon ve azot kaynakları, şeker pancarı melası, antimikrobiyal aktivite, protein profili, plazmid DNA :175 : Prof. Dr. Yavuz BEYATLI

Abstract:
IV DETERMINATION OF PRODUCTION OFPOLY-p- HYDROXYBUTYRATE (PHB) OF SOME Rhizobium BACTERIA, DISCRIMINATION OF STRAINS BY TOTAL CELL PROTEIN PROFILES OBTAINED BY SODIUM DODECYL SULPHATE POLYACRYLAMTOE GEL ELECTROPHORESIS (PAGE) AND ISOLATION OF PLASMH) DNA (Ph.D.Thesis) Nazime MERCAN GAZİ UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY June 2002 ABSTRACT In the research, a total of 31 of Rhizobium strains (R melihti, R japonicum, R phaseoli, R leguminosarum, R viciae, Rhizobium sp.) were used. Determination of carbon source utilization showed that these strains could use glucose, dextrose and mannitole as monosaccharides while they showed differences in the utilization of trehalose, xylose, raffinose, maltose, galactose, sucrose, lactose and pyruvic acid-sodyum salt. Generally, Rhizobium strains did not grow at low pH, but R. viciae F69, Fill, R phaseoli Fa28 and Fa41, R cicer Nl, N2, N4, N6 strains were able to grow at pH 4,5 and these strains were characterized to be acid tolerant. Total cell protein profiles of bacteria were analysed using SDS- PAGE and molecular weights of proteins were found between 11-215 kD. Based on the protein profiles, it was possible to distinguish all of the strains. According to the SDS-PAGE analysis, it has been found strains belonging to the same species showed similarities in their protein patterns and differences from other species. PHB production by Rhizobium bacteria was determined by a spectrophotometry method. A qualitative method using Nile Blue A reagent T, «EiMET-M VMM 'lrt!i^SY0Mwas used for the detection of PHB in the cells. The color of the colonies under 254 nm-ultraviolet ligth at 254 nm ranged from pink to orange depending on the amount of PHB in the cells. It was found that the PHB contents of the strains the cell dry weight were between 5,37-57,09%. The effects of different carbon and nitrogen sources on the production of PHB by some of the strains were examined. For this purpose the strains R viciae Fill (57,09%), R meliloti Yll (39,25%) and B. japonicum S irat Fab (34,43%) which had been shownto have the highest PHB production were used. The maximum yield of PHB îor R, meliloti Yll and R japonicum S irat Fab strains were 83,75% and 34,31% of the cell dry weight respectively when they were grown in glucose medium as the carbon source. R viciae Fill produced a high level of PHB (41,22%) in the mannitol medium. The percentage yield of PHB by the strains (except Fill) was not found high in the media containing nitrogen sources. While the highest PHB accumulation was obtained with the strain R meliloti Yll (26,23%) and B. japonicum S irat Fab (26,78%) grown in the medium containing protease peptone, R viciae Fill was produced 48,13% of PHB in medium containing asparagine. The PHB concentration of the cells decreased with decreasing pH of the cultures. Amoung the strains showing the highest production of PHB R meliloti Yll was selected for mutation studies. Acriflavine, 5-bromourasiI, nitrosoguanidine as chemical mutations and UV irridiation at 254 nm as physical mutation were applied on the selected strain. The PHB production by parent and mutant strains were determined periodically and continued one year interval. Compared with the parent strains the percentage were determined in the first period of measurement The amount of PHB in some mutant strains increased in the second period measurement. In addition, the effects of physical and chemical mutations on the production of PHB by the strains were different. Ability of strains in the production of PHB by R meliloti Yll, B. japonicum S irat Fab and R viciae Fill grown in different concentration of beet molasses were studied. While R meliloti Yll strain produced maximum of PHB asVI 56,31% in medium containing 0,5% beet molasses, R viciae Fill and R japonicum S irat Fab strains in beet molasses medium showed production of PHB at lower percentage. A lower yield of PHB for R viciae Fill was observed with increasing viscosity of the medium. The agar diffusion method was used to study the general inhibitory effect of Rhizobium strains on some test bacteria. None of the strains were shown to have any inhibitory affect on test bacteria. Plasmid DNA profiles of Rhizobium strains and their molecular weight were determined. According to the results, only 13 strains carried plasmid, while the did not carry. Molecular weights of plasmids ranged between 13,5-16,74 kb. Science Code Key Words Page number Advisor : 401.02.00 : Rhizobium, isolation, utizilation of carbon sources, bioplastic (PHB), different carbon and nitrogen sources, beet molasses, antimicrobial activity, protein profile, plasmid DNA :175 : Prof. Dr. Yavuz BEYATLI