Çok kopyalı polifosfat kinaz ve ekzopolifosfataz genlerinin potansiyel ekspresyonunun Streptomyces coelicolor'ın ağır metal toleransına ve fosfat depolamasına etkisi
The effect of potential expression of multiple copies of polyphosphate kinase and exopolyphosphatase genes on Streptomyces coelicolor?s heavy metal resistance and phosphate storage
Yazar: ÜMMEHAN SAVAŞ
Danışman: DOÇ. DR. SEDEF TUNCA GEDİK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyoremediasyon = Bioremediation ; Polifosfatlar = Polyphosphates ; Streptomyces = Streptomyces

Özet:
Son yıllarda, sanayi ve evsel atıklar nedeniyle ortaya çıkan fosfat ve ağır metal kirliliğinin, biyoteknolojik yöntemlerle biyoremediasyonu önem kazanmıştır. Bütün canlılarda bulunan önemli bir polimer olan polifosfatın ve polifosfat metabolizmasında görevli enzimlerin, atık sulardaki fosfat ve ağır metal kirliliğinin biyoremediasyonla giderilmesinde görev alabileceği düşünülmektedir.Bu çalışmada, S. coelicolor polifosfat metabolizmasında görev alan ppk (polifosfat kinaz) ve ppx (ekzopolifosfataz) genlerinin biyoinformatik analizi sonucu, ppk geni promotor bileşenleri için belirlenen konsensus dizilerinin, S. lividans konsensus dizileriyle örtüştüğü (Chouayekh ve Virolle, 2006) ve ppx genine ait herhangi bir promotor bölgesi bulunmadığı gözlenmiştir. Bunun ardından, S. coelicolor suşuna ait ppk genini taşıyan pHZ1351-ppk ve hem ppk hem de ppx genlerini taşıyan pHZ1351-ppk-ppxp plazmitleri elde edilmiş ve S. coelicolor'a aktarılmıştır. Bu genlerin yüksek seviyede ifadesinin, hücrelerin farklı stres faktörlerine karşı direnci üzerine ve hücrelerin ortamdan Pi'ı ve ağır metalleri (Cd ve Pb) uzaklaştırabilme kapasitelerine etkisi incelenmiştir. Yaban suş ile karşılaştırıldığında, rekombinant suşların optimum değerlerden farklı olan pH ve sıcaklık değerlerine daha dayanıklı oldukları görülmüştür. Ayrıca, pHZ1351-ppk plazmidini taşıyan rekombinant suşun, farklı KH2PO4 konsantrasyonlarında, yaban ve pHZ1351-ppk-ppxp plazmidini taşıyan suşlara göre H2O2'e daha hassas olduğu ortaya çıkarılmıştır. Daha sonra yaban suş ve rekombinant suşların, ortamdan fosfat uzaklaştırma kapasiteleri ölçülmüş ve yaban suşun fosfat alımı oranının rekombinant suşlardan daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, yaban suş ile karşılaştırıldığında, rekombinant suşların, farklı KH2PO4 konsantrasyonlarında kadmiyum ve kurşun ağır metallerine dirençliliklerinin daha az olduğu bulunmuştur.

Abstract:
In recent years, bioremediation of phosphate and heavy metal pollution by biotechnological procedures has become an important issue because of sewage and industrial wastes. Polyphosphate is a significant polymer found in all living species. It is suggested that, polyphosphate and the enzymes of polyphosphate metabolism, may be used in bioremediation of heavy metals and phosphorus in wastewaters.In this study, bioinformatic analysis of S. coelicolor ppk (polyphosphate kinase) and ppx (exopolyphosphatase) genes of polyphosphate metabolism showed that the consensus sequences exist in the promoter region of ppk gene is similar to that of S. lividans (Chouayekh and Virolle, 2002) and ppx gene has no promoter region in its upstream. Then, pHZ1351-ppk plasmid carrying S. coelicolor ppk gene and pHZ1351-ppkppxp plasmid carrying both ppk and ppx genes were constructed and they were used to transform S. coelicolor. The effect of overexpression of these genes on resistance of cells to different stress factors and on capacity of the cells to remove Pi and heavy metals (Cd and Pb) from the environment, were tested. When compared with the wild type, recombinant strains are more resistant to extreme pH and temperature. It has shown that recombinant strain carrying pHZ1351-ppk plasmid is more sensitive to H2O2 than the wild type and the strain carrying pHZ1351-ppk-ppxp plasmid. Phosphate uptake of wild type and recombinant strains is tested and it is found that wild type strain has higher phosphate uptake capacity than recombinant strains. In addition, when compared with wild type strain, in different KH2PO4 concentrations, recombinant strains were less resistant to lead and cadmium heavy metals.