Sistemik klinik örneklerden üretilen aspergillus türlerinin antifungal duyarlılıklarının farklı yöntemlerle araştırılması
Investigation of antifungal susceptibility of aspergillus species isolated from systemic clinical specimens with different methods
Yazar: EMİNE KORKMAZ
Danışman: DOÇ. DR. MAHMUT CEM ERGON
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Amfoterisin B = Amphotericin B ; Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Antifungal duyarlılık testleri = Antifungal sensitivity tests ; Aspergillus = Aspergillus ; Difüzyon = Diffusion ; Kaspofungin = Caspofungin ; Mikrodelesyon = Microdeletion ; Vorikonazol = Voriconazole

Özet:
Aspergillus türlerinin, bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde ölümcül enfeksiyonlara yol açması ve son yıllarda antifungallere direnç oranının artması nedeniyle antifungal duyarlılık testlerinin önemi artmıştır. Çalışmamızda Aspergillus türleri için disk difüzyon (DD) ve gradient difüzyon (GD) yöntemlerini, referans duyarlılık yöntemi olan sıvı mikrodilüsyon (SMD) yöntemi ile karşılaştırmayı amaçladık. Ayrıca amfoterisin B (AMB), itrakonazol (İTZ), vorikonazol (VOR) ve kaspofungine (KAS) karşı duyarlılık durumunu ve MİK değerlerini belirleyerek ülkemiz epidemiyolojik verilerine katkıda bulunmayı ve hastanemizde üreyen Aspergillus türlerinde direnç oranlarını belirleyerek ampirik tedaviye yön vermeyi hedefledik.
Yöntem: Çalışmada 62 A. fumigatus, 28 A. flavus ve 16 A. terreus izolatı (toplam 106 Aspergillus izolatı) yer aldı. Çalışmaya dahil edilen Aspergillus izolatları, geleneksel yöntemler ve Matriks İlişkili Lazer Dezorpsiyon İyonizasyon Uçuş Zamanı Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF MS) ile tanımlandı. Tüm izolatların DD, GD ve SMD yöntemi ile AMB, VOR, İTZ ve KAS'a karşı duyarlılıkları belirlendi. SMD yönteminde RPMI 1640 sıvı besiyeri, DD ve GD yönteminde saf Mueller Hinton agar (MHA) kullanıldı.
Bulgular: Çalışmamızda SMD yöntemi ile en düşük MİK/MEK90 değerleri VOR ve KAS (sırasıyla 0.5 µg/ml ve 0.06 µg/ml) ile saptandı. AMB ve İTZ MİK90 değerleri ise 2 µg/ml olarak bulundu. Tür düzeyinde incelediğimizde, A. flavus ve A. terreus izolatlarının AMB MİK90 değerleri (sırasıyla 2 µg/ml ve 4 µg/ml), A. fumigatus izolatlarından (1 µg/ml) yüksek saptandı. A. flavus ve A. terreus izolatlarının İTZ MİK90 değerleri 1 µg/ml olup, A. fumigatus izolatlarından (2 µg/ml) daha düşük bulundu. Tüm türlerin İTZ MİK değerlerinin literatürle karşılaştırdırıldığında yıllar içinde artış gösterdiği saptandı.
GD yöntemini SMD yöntemi ile karşılaştırdığımızda ±2 dilüsyonda temel uyum oranları, AMB, VOR, İTZ ve KAS için sırası ile %91.6, %99.1, %100 ve %38.6 olarak saptandı. KAS ile temel uyum oranları düşük bulunmasına rağmen kategorik uyum oranları yüksek bulundu.
DD yöntemi SMD yöntem ile karşılaştırıldığında kategorik uyum oranları AMB, VOR, İTZ ve KAS için sırası ile %65.1, %99.1, %77.3 ve %100 olarak saptandı. 
GD yöntemini SMD yöntemi ile karşılaştırdığımızda, tüm türler bir arada değerlendirildiğinde kategorik uyum oranları AMB, VOR, İTZ ve KAS için sırası ile %79.2, %99.1, %87.8 ve %100 olarak saptandı. GD yöntemi kategorik uyum oranları, DD yönteminin AMB ve İTZ uyum oranlarından yüksek olup VOR ve KAS için her iki yöntemde aynı bulunmuştur. 
Sonuç: Saptanan yüksek temel ve kategorik uyum oranlarına göre GD yönteminin, SMD yöntemine iyi bir alternatif olabileceğini düşünmekteyiz. Ayrıca GD yöntemi için kullandığımız saf MHA, diğer besiyerlerine göre daha ucuz ve kolay ulaşılabilir olmasıyla avantaj sağlamaktadır. 
CLSI M51-A DD yöntemini SMD yöntemiyle karşılaştırdığımızda tüm ilaçlar için yüksek uyum oranları saptandı. Fakat AMB ve İTZ uyum sonuçları diğer ilaçlara göre daha düşük saptanmıştır. Bu sonuçlara göre DD yöntemi de SMD yöntemine bir alternatif olarak düşünülebilir fakat AMB ve İTZ sonuçları daha dikkatli yorumlanmalıdır.

Abstract:
The importance of antifungal susceptibility tests has increased due to the fact that Aspergillus species cause fatal infections in immunocompromised individuals and the resistance rate to antifungals has increased in recent years.In our study, we aimed to compare the disc diffusion (DD) and gradient diffusion (GD) methods for Aspergillus species with the broth microdilution (SMD) method, which is the reference susceptibility method.In addition, we aimed to contribute to the epidemiological data of our country by determining the susceptibility status and MIC values for amphotericin B (AMB), itraconazole (ITZ), voriconazole (VOR) and caspofungin (CAS) and to guide empirical treatment by determining the resistance rates in Aspergillus species isolated in our hospital.
Method: Sixty-two A. fumigatus, 28 A. flavus and 16 A. terreus isolates (a total of 106 Aspergillus isolates) were included in the study. Aspergillus isolates included in the study were identified by conventional methods and Matrix Associated Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometer (MALDI-TOF MS). The susceptibilities of all isolates to AMB, VOR, ITZ and CAS were determined by performing DD, GD and SMD methods. RPMI 1640 broth was used in the SMD method, and nonsupplemented Mueller Hinton agar (MHA) was used in the DD and GD methods.
Results: In our study, the lowest MIC/MEC90 values were determined for VOR and CAS (0.5 µg/ml and 0.06 µg/ml, respectively) with SMD method. AMB and ITZ MIC90 values were found to be 2 µg/ml. When we analyzed at the species level, A. flavus and A. terreus isolates had higher AMB MIC90 values (2 µg/ml and 4 µg/ml, respectively) than A. fumigatus isolates (1 µg/ml). ITZ MIC90 values of A. flavus and A. terreus isolates were 1 µg/ml and were found lower than A. fumigatus isolates (2 µg/ml). It was determined that ITZ MIC values of all species have increased over the years when compared with the literature. 
When we compared the GD method with the SMD method, the essential agreement rates at ±2 dilution were found to be 91.6%, 99.1%, 100% and 38.6% for AMB, VOR, ITZ, and CAS, respectively. Although essential agreement rates with CAS were low, categorical agreement rates were high.
When the DD method was compared with the SMD method, categorical agreement rates were found to be 65.1%, 99.1%, 77.3% and 100% for AMB, VOR, ITZ, and CAS, respectively.
When the GD method was compared with the SMD method, the categorical agreement rates were found to be 79.2%, 99.1%, 87.8% and 100% for AMB, VOR, ITZ and CAS, respectively if all species were evaluated together. The categorical agreement rates of the GD method were higher than the AMB and ITZ agreement rates of the DD method while they were found to be the same in both methods for VOR and CAS.
Conclusion: According to the high essential and categorical agreement rates, we think that GD method may be a good alternative for SMD method. Furthermore, nonsupplemented MHA which we used for GD method provides an advantage as it is cheaper and easily accessible than other media.
When we compared CLSI M51-A DD method with SMD method, high agreement rates were found for all drugs. However, AMB and ITZ agreement results were found to be lower than other drugs. According to these results, DD method can also be considered as an alternative to SMD method, but AMB and ITZ results should be interpreted more carefully.