Açıklanamayan infertilite olgularında kontrollü ovaryal stimulasyon protokollerinin endometriyal mikrobiyota üzerine etkisi ve prognoz ile ilişkisi
The effect of controlled ovarian stimulation protocols on endometrial microbiota and its relationship with prognosis in unexplained infertility cases
Yazar: GÜLŞAH ALKAN DEMİR
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE GÜL KEBAPCILAR
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology
Dizin: Endometriyum = Endometrium ; Kısırlık = Infertility ; Kısırlık-kadın = Infertility-female ; Mikrobiyota = Microbiota ; Over = Ovary ; Over hastalıkları = Ovarian diseases ; Uyarım = Stimulation

Özet:
AMAÇ: Bu çalışmamızdaki amacımız, endometrial mikrobiyomun ve bileşiklerinin implantasyon ve dolayısıyla doğurganlık için etkileri araştırarak uterus kolonizasyonunun İVF tedavilerinde uygulanan gonadotropin tedavisiyle farklılaşmaya uğrayarak gebelik sonuçları üzerine olan etkilerini göstermektir.
MATERYAL METOT:  Açıklanamayan infertilite tanısı konulan 24-44 yaş arası  10 olgu üzerinden yapıldı. bu kataterlerin uterin kaviteye temas eden 5mm'lik uçları steril olarak kesilerek DNA içermeyen PCR tüplerinde muhafaza edilmiştir. Çalışma sonunda her olgunun 2 adet numunesi olmuş olup bu örneklerden bakteriyal V4-16S ribosomal RNA hipervariable subunit genleri bölge analizleri The NEXTflex™ 16S V4 Amplicon-Seq Library Prep Kit 2.0 New Generation Sequence (NGS-Yeni nesil dizileme) ile çalışılarak mikrobiyotalar belirlenmiştir. Biyoinformatik analizle örneklerin taksonomik olarak sınıflandırılması, referans dizilere göre hizalanması, operasyonel taksonomik birim tespiti ve türlerin benzerliklerine göre gruplandırılması gerçekleştirilir. 
BULGULAR: Tüm hastalara tek veya iki blastosist transferi yapıldı. Hastaların yaş ortalaması 35.9 (dağılım 22.5-43.0) idi. Hastaların tümüne ultrasonografi ile endometriyal kalınlık ölçülerek progesteron başlatıldı. Endometrial trilaminar kalınlık ortalama 9,4 mm ( aralık 7,3-13 mm) olarak ölçüldü. Hastanın transfer döngüsü sırasındaki en yüksek östradiol değerleri rutin olarak alınan kontrol kanlarından bakıldı. Ortalama pik östradiol 907.5 pg / dL (aralık 136 - 2733 pg / dL) idi. Olgulara uygulanan ortalama gonadotropin dozu 1756,25 IU ( aralık 850-3500 IU) idi. 10 hastanın tümüne  embriyo transferleri transferi yapılmış olup, 6'sı devam etmemiş, 3 olgu term gebelik ile canlı doğum yapmış, 1 olgu ise 7. haftada missed abort ile sonuçlanmıştır..Filogenetikte açıklanabilecek toplam 102 bakteriyel filotip ile sonuçlandı (Şekil 4.1.). Filogenetik sıra düzeyleri (filotiplerin % 75,30'ü), Aile (filotiplerin % 73,51'ü), Cins (filotiplerin % 68,12'si) ve Türler (filotiplerin % 46.3'ü) olarak bulundu.
Örneklerin çeşitliliğini karakterize etmek için Alfa (birim içi) ve Beta (birimler arası) çeşitlilik analizi kullanılmıştır (Şekil 4.3, Şekil 4.4). Alfa ve Beta çeşitliliği yeterli olarak saptandı. Olguların küme analizilerinin gösterildiği dendogramlar pearson korelasyonuna göre yapıldı.
En çok tespit edilen cins Lactobacillus'tur (tanımlanmış bakterilerin% 52,43'ü); Gardnerella (% 12.6), Provotella (% 2,84), Streptococcus (% 2.2) ve Enterococcus (% 0.44) diğer en yaygın cinslerdir. İlk örnek grubunda bol miktarda Lactobacillus (>% 90) bulunan ve daha az oranda ise diğer OTU'lar 6 olgumuzda bulunmakta idi. Lactobasil türlerinin çoğunluğunu L. iners ve L. gallinarum oluşturmakta idi. İkinci numune grubunda ise , diğer OTU'lar tarafından temsil edilen bakterilerle bir arada bulunan daha düşük oranda Lactobacillus topluluğu içeren örnekler izlendi. Term doğum yapan 3 olgumuzda 1. örneklerde 3 olguda da non –laktobasil dominant (NLD) endometriyal ortam olmasına rağmen, 2. Örneklerin 1 tanesinde LD, 2 örnekte ise NLD izlenmiştir. (Şekil 4.12, Şekil 4.13, Şekil 4.14, Şekil 4.15, Şekil 4.22, Şekil 4.23). Dikkate değer bir bulgumuz ise term gebelik olarak sonuçlanan olgularımızın hepsinde ilk örneklerinde izlenmeyen Lactobacillus kefiri cinsinin bulunuyor olmasıydı

TARTIŞMA: Ürogenital sistemde bulunan bakteriler insanda bulunan total bakteri sayısının %9'unu içerir ve bunların çoğu kültüre edilebilir tarzda değildir. Her ne kadar üst genital sistem steril olarak kabul edilse de, in vitro fertilizasyon uygulanan olgularda transfer kataterlerinin ucu kültüre edildiğinde bakteriyal kolonizasyon gösterilmiş ve Enterobacteriaceae spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Escherichia coli, ve Gram-negatif bakterilerin üremesinin gebe kalmayı olumsuz etkilediği izlenmiştir. 16S ribozomal RNA yüksek düzeyde değişkenlik gösteren bölgenin araştırılması bu DNA dizesideki değişikenliklerin cins ve türler seviyesinde adeta bir parmak izi olduğunu göstermiştir. Moreno ve ark 2016 yılında yaptıkları çalışmada; endometriyal mikrobiyota varlığı, fertilite üzerine etkisi, hormonal değişimle mikrobiyota arasındaki ilişki konuları incelenmek üzere denek grupları oluşturulmuştur. Bizim çalışmamızda ise tüm olgularda endometrial mikrobiyota tamamen değişmiş olup, tüm gebe kalan olgularımız LD ya da NLD olsa da 2. örneklerimizde  L. kefiri tipini içerdiği izlendi. L. kefiri suşları, IL-1, IFN-𝛾, IL-6, IL-12p70 ve THF-PBin PBMC gibi proinflamatuar Th1 mediatörlerinin salgılanmasını ve ayrıca Th2 lerden sitokin IL-10'un üretilmesini sağladı. IL-10 bilindiği üzere anti-inflamatuar bir sitokindir. L. kefiri, mukozal Treg hücrelerinin aktivasyonunu teşvik eder.

SONUÇ: Literatürün gösterdiği üzere çalışmamızdaki gibi endometriyel mikrobiyotanın değişime uğrayarak gebelik için gerekli olan immün supresyon ile gebelik materyelinin kabulüne katkıda bulunma ihtimali gündeme gelmektedir. Bizim çalışmamızın her ne kadar vaka sayısı kısıtlıda olsa 16s rRNA çalışılmış olması nedeniyle bir ön veri olarak değerlendirilebilir. Kişi sayısı arttırıldığında gebelik ve mikrobiyota arasındaki ilişki daha net ortaya konabilecektir. Bizim verilerimize göre endometriyum  çeşitli hormonal ya da çevresel maruziyetlerle değişim gösterebilen bir mikrobiyotaya sahiptir. Bu çalışma mikrobiyotadaki yeni ortaya çıkan bakterilerin gebelik sonuçlarını olumlu ya da olumsuz etkileyebileceğini göstermiş olup, belki de bu mikro çevre artifisyel olarak oluşturularak İVF sonuçları değiştirilebilir. Uterin mikrobiyotanın önemini gösteren kişi sayısı artırılmış ek çalışmalarla bu değişimin desteklenmesi sonrasında çeşitli probiyotik ya da prebiyotik uygulamalarla da bu mikro çevre düzenlemelere açık hale gelebilir. Ek olarak açıklanamayan infertilite olgularında rutinde uygulanan testlerle gösteremediğimiz bu mikro çevre gizli kalmış bir infertilite sebebi olabilir. Bu mikro çevre eğer ki düzenlenebilirse belki de gebelik sonuçları iyileştirilebilir.

Abstract:
PURPOSE: The aim of this study was to investigate the effects of endometrial microbiome and its compounds on implantation and thus fertility, and the effects of uterine colonization on pregnancy outcomes by differentiating gonadotropin therapy for IVF treatment.
MATERIALS METHODS: Ten patients with unexplained infertility were included in the study. 5 mm of these catheters that contact the uterine cavity were cut in sterile form and stored in DNA-free PCR tubes. At the end of the study, 2 samples of each patient were examined and microbioli were determined by studying the bacterial V4-16S ribosomal RNA hypervariable subunit genes. The taxonomic classification of samples with bioinformatics analysis, alignment with reference sequences, operational taxonomic unit detection and grouping by species similarity
FINDINGS: Single or two blastocysts were transferred to all patients. The mean age of the patients was 35.9 (range 22.5-43.0). Progesterone was initiated by measuring the endometrial thickness by ultrasonography. The endometrial trilaminar thickness was measured as 9.4 mm (range 7.3-13 mm). The highest estradiol levels during the transfer cycle of the patient were evaluated from the control blood taken routinely. The mean peak estradiol was 907.5 pg / dL (range 136 - 2733 pg / dL). The mean gonadotropin dose was 1756.25 IU (range 850-3500 IU). Embryo transfers were transferred to all 10 patients, 6 did not continue, 3 cases had live birth with term pregnancy, 1 case resulted with missed abort on 7th week. It resulted in 102 bacterial filotypes which could be explained in phylogenetics (Figure 4.1.). Phylogenetic sequence levels (75.30% of filotypes), Family (73.51% of filotypes), Genus (68.12% of filotypes) and Species (46.3% of filotypes) were found.
Alpha (in-unit) and Beta (inter-unit) diversity analysis was used to characterize the diversity of samples (Figure 4.3, Figure 4.4). Alpha and Beta diversity were found to be sufficient. The dendograms showing the cluster analysis of the cases were made according to the pearson correlation.

Lactobacillus (52,43% of identified bacteria) is the most frequently detected genus; Gardnerella (12.6%), Provotella (2.84%), Streptococcus (2.2%) and Enterococcus (0.44%) were the most common genera. In the first sample group, there were abundant Lactobacillus (> 90%) and the other OTUs were found in 6 cases. The majority of Lactobacill species were L. iners and L. gallinarum. In the second group of samples, samples with a lower proportion of the Lactobacillus community combined with the bacteria represented by other OTUs were observed. In 3 cases who had term delivery, in 3 cases, non lerlaktobasil dominant (NLD) endometrial medium was observed in 1 case, whereas in 2 samples, LDD was observed in 1 sample and NLD in 2 samples. (Figure 4.12, Figure 4.13, Figure 4.14, Figure 4.15, Figure 4.22, Figure 4.23). A noteworthy finding was that in all of our cases, which resulted in term pregnancy, Lactobacillus kefiri was not observed in the first samples.

DISCUSSION: Bacteria in the urogenital system contain 9% of the total number of bacteria in humans and most of them are not cultured. Although the upper genital system was considered sterile, bacterial colonization was shown when the tip of the transfer catheters were cultured in in vitro fertilization and negative growth of Enterobacteriaceae spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Escherichia coli, and Gram-negative bacteria effected. The investigation of the highly variable region of 16S ribosomal RNA showed that the changes in this DNA strand had a fingerprint at the genus and species level. Moreno et al in their study in 2016; The presence of endometrial microbiota, the effect on fertility, the relationship between hormonal change and microbiota were studied. In our study, endometrial microbiota was completely altered in all cases and all of the cases in our study included LD or NLD. L. kefiri strains provided the secretion of proinflammatory Th1 mediators such as IL-1, IFN-ler, IL-6, IL-12p70 and THF-PBin PBMC as well as the production of cytokine IL-10 from Th2s. IL-10 is an anti-inflammatory cytokine. L. kefiri promotes the activation of mucosal Treg cells.
RESULT: As the literature shows, the possibility of endometrial microbiota, which is in our study, to be changed and to contribute to the acceptance of pregnancy material with the immune suppression necessary for pregnancy comes into question. Although our study is limited in number of cases, 16s rRNA has been studied as a preliminary data. When the number of people is increased, the relationship between pregnancy and microbiota can be revealed more clearly. According to our data, the endometrium has a microbiota that can vary with various hormonal or environmental exposures. This study has shown that the emerging bacteria in microbiota can affect the pregnancy results positively or negatively, and perhaps this microcirculation can be created artifically and the IVF results can be changed. Uterine microbiota can be exposed to micro-environmental regulations with various probiotic or prebiotic applications after supporting this change with increased number of people showing the importance of microbiota. In addition, this microenvironment, which cannot be demonstrated by routine tests in cases of unexplained infertility, may be a reason for hidden infertility. If this micro environment can be arranged, perhaps pregnancy outcomes can be improved.