Encephalitozoon intestinalis enfeksiyonlarında toll-like reseptörlerin araştırılması
Investigation of toll-like receptors in encephalitozoon intestinalis infections
Yazar: ERDİ UZUN
Danışman: DOÇ. DR. ÜLFET ÇETİNKAYA
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veteriner Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu çalışmada, Encephalitozoon intestinalis (E. intestinalis) sporları ile stimüle edilen Madin Darby Canine Kidney (MDCK) hücrelerinde TLR gen ekspresyonlarındaki değişimin hücre kültürü ortamında araştırılması amaçlandı. 
Çalışmada üç grup oluşturuldu. Birinci gruba E.intestinalis için hazırlanan besiyeri eklendi ve kontrol grubu olarak kaydedildi. İkinci gruba +4 °C'de bekleyen 108 canlı spor eklendi. Üçüncü gruba ısı ile inaktive edilmiş 108 spor eklendi. Her üç grupta 37ºC'de % 5 CO2'li ortamda inkübe edildi. Bu gruplardan 1., 3., 6., 12. ve 24. saatlerde alınan örneklerden RNA izolasyonu  ve cDNA sentezi gerçekleştirildi. Elde edilen cDNA'lardan TLR1-10 genlerinin ekspresyonları real time PCR ile değerlendirildi. Çalışmada housekeeping gen olarak GAPDH ve ACTB genleri kullanıldı. Bu iki genin ortalaması alınarak hedef genler normalize edildi ve 2-ΔΔCt formülü uygulanarak istatistiksel analiz yapıldı. Eşik değerinin (threshold 1) üzerinde tespit edilen genlerin ekspresyonun arttığı, eşik değerinin altında tespit edilen genlerin ekspresyonun azaldığı kabul edildi. 
İnaktive sporlar ile stimüle edilen hücrelerin gen ekspresyonlarında istatistiksel olarak anlamlı bir değişim görülmezken, canlı sporlar ile stimüle edilen hücrelerde TLR3 ve TLR4 gen ekspresyonlarında anlamlı bir artış görülmüştür. TLR3 gen ekspresyonunda birinci saatte anlamlı bir artış (kontrolün 1.6 katı) olduğu fakat üçüncü saatte ekspresyon düzeyinin azalmaya başladığı (kontrolün 1.4 katı), altıncı saatte ise kontrol seviyesine döndüğü gözlendi. TLR4 gen ekspresyonunun ise 24. saate kadar kontrole paralel gittiği 24. saatte ise anlamlı şekilde arttığı (kontrolün 2.1 katı) gözlendi.  
Sonuç olarak, bu çalışma E.intestinalis ile stimule edilen MDCK hücrelerinde on farklı toll like reseptörün ekspresyon değişimleri farklı saatlerde değerlendirildiği ve TLT3 gen ekspresyonunda değişimin bildirildiği ilk çalışmadır. 
Anahtar kelimeler: Encephalitozoon intestinalis, TLR, MDCK, Hücre kültürü, Gen ekspresyonu

Abstract:
This study aimed to investigate the changes in TLR gene expression in Madin Darby Canine Kidney (MDCK) cells stimulated with Encephalitozoon intestinalis (E. intestinalis) spores in a cell culture medium. Three groups were formed in the study. Medium prepared for E.intestinalis was added to the first group and recorded as the control group. In the second group, 108 live spores waiting at +4 °C were added. Heat-inactivated 108 spores were added to the third group. All three groups were incubated at 37ºC with 5% CO2. RNA isolation and cDNA synthesis were performed from samples taken from these groups at the 1st, 3rd, 6th, 12th and 24th hours. Expression of TLR1-10 genes from the obtained cDNAs was evaluated by real-time PCR. GAPDH and ACTB genes were used as housekeeping genes in the study. Target genes were normalised by taking the average of these two genes and statistical analysis was performed by applying the 2-ΔΔCt formula. It was accepted that the expression of genes detected above the threshold value (threshold 1) increased and the expression of genes detected below the threshold value decreased. While there was no statistically significant change in gene expression in cells stimulated with inactivated spores, a significant increase was observed in TLR3 and TLR4 gene expression in cells stimulated with live spores. It was observed that there was a significant increase in TLR3 gene expression in the first hour (1.6 times the control), but the expression level started to decrease in the third hour (1.4 times the control) and returned to the control level in the sixth hour. TLR4 gene expression was parallel to the control until the 24th hour and increased significantly at the 24th hour (2.1 times the control).  
In conclusion, this study is the first study in which the expression changes of ten different toll-like receptors were evaluated at different hours in MDCK cells stimulated with E. intestinalis and changes in TLT3 gene expression were reported.
Keyword: Encephalitozoon intestinalis, TLR, MDCK, Cell culture, Gene expression