İzmir ilinde toplanan çevresel örneklerde acanthamoeba spp., naegleria fowleri ve balamuthia mandrillaris araştırılması
The investigation of acanthamoeba spp., naegleria fowleri and balamuthia mandrillaris in environmental samples collected from İzmir province
Yazar: MEHMET AYKUR
Danışman: PROF. DR. HANDE DAĞCI
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Acanthamoeba = Acanthamoeba ; Acanthamoeba = Acanthamoeba ; Amipler = Amoeba ; Balamuthia mandrillaris = Balamuthia mandrillaris ; Naegleria = Naegleria ; Naegleria = Naegleria ; İzmir = Izmir

Özet:
Çalışmamızda, İzmir ilinin farklı bölgelerinden toplanan su, toprak ve sürüntü örneklerinde insanlar ve hayvanlar için patoejen olan serbest yaşayan amipler (SYA) Acanthamoeba spp., N. fowleri ve. B. mandrillaris'in varlığının non-nutrient agarda (NNA) kültür ve kantitatif real time PCR (qPCR) yöntemi ile araştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca, Acanthamoeba pozitif örneklerde sekans analizi yapılarak patojen genotiplerin belirlenmesi hedeflenmiştir.
İzmir ilinin 23 farklı ilçesinden su (n=148), toprak (n=35) ve sürüntü (n=20) (klima, göz yıkama ünitesi, lavoba, pencere) örnekleri toplanmıştır. Toplanan su örneklerine membran filtrasyon işlemi uygulanmış ve filtrenin yarısı, toprak ve sürüntü örnekleri NNA plağında kültüre edilmiştir. Ayrıca, filtrenin diğer yarısı ve toprak örneklerinden direkt DNA izolasyonu gerçekleştirilmiş ve qPCR yöntemi plazmid kontrolleri ile standart eğriler oluşturulduktan sonra konsantrasyonları belirlenmiştir. Acanthamoeba spp. pozitif örnekler için patojen genotipleri belirlemede sekans yöntemi kullanılarak filogenetik ağaç oluşturulmuştur.
İncelenen örneklerden, su 71/148'i (%47,97), toprak 24/35'ü (%68,57) ve sürüntü 4/20'ü (%20) örneklerinin SYA için NNA kültür yöntemiyle pozitif olarak tespit edilmiştir. Acanthamoeba spp. su %12,16 (18/148), toprak %25,71 (9/35) ve sürüntü %5 (1/20) örnekleri NNA kültür yöntemiyle pozitif bulunmuştur. Su örneklerin %55,5'i (n=10) ve toprak örneklerinin %77,7'si (n=7) 1 M mannitol osmolaritede ve 42°C'de çoğalma gözlenmiştir. Ayrıca, bir sürüntü örneğinde 0,5-1 M mannitol osmolaritede, 37 ve 42°C'de çoğalma gerçekleşmiştir.
qPCR yöntemi ile; su örneklerinde Acanthamoeba spp. ve N. fowleri sırasıyla %18,24 (n=27), %2,7 (n=4) oranında pozitif bulunurken ve B. mandrillaris hiçbir örnekte tespit edilememiştir. Toprak örneklerinde ise Acanthamoeba spp., N. fowleri ve B. mandrillaris sırasıyla %45,71 (n=16), %17,4 (n=6) ve %20 (n=7) oranlarında pozitif olarak tespit edilmiştir. Acanthamoeba spp., N. fowleri ve B. mandrillaris'in kantitatif miktarı, su kaynaklarında sırasıyla 1,4x102 - 3,2x105, 11x102 - 8x103 plasmid kopya/litre ve toprak örneklerinde 6x102 - 18x105, 9x103 - 8x102 ve 39x103 - 47x104 plazmid kopya/gr arasında tespit edilmiştir. Ancak, su örneklerinde qPCR yöntemi ile B. mandrillaris saptanamamıştır.
Su, toprak ve sürüntü örneklerinde sırasıyla %51,85 (n=14), %56,25 (n=9) ve %100 (n=1) oranlarında Acanthamoeba spp.'in T4 genotipi saptanmıştır. Su örneklerinin %22,22'si (n=6) genotip T5, %14,81'si (n=4) genotip T2, %11,11'i (n=3) genotip T15 olarak, toprak örneklerinin ise %25'i (n=4) genotip T5, %18,75'i (n=3) genotip T2 olarak belirlenmiştir. 
Sonuç olarak, gerçekleştirilen tez çalışması, İzmir ilinde insan temasının en fazla olduğu yerlerden toplanan çevresel örneklerde qPCR yöntemi ile Acanthamoeba spp., N. fowleri ve B. mandrillaris'in saptanması ve kapsamlı ilk çalışma olması açısından önemlidir. Türkiye'de ilk kez toprak örneklerinde qPCR yöntemi ile N. fowleri ve. B. mandrillaris'in varlığı ortaya konulmuştur. İnsanlarda ve hayvanlarda en yaygın patojen olan Acanthamoeba T4 genotipinin riskleri göz önünde bulundurulmalıdır. Su örneklerinde ikinci kez T5 genotipi belirlenmesine rağmen, Türkiye'de ilk kez toprak örneklerinde tespit edilmiştir. Bu nedenle insanların su ve toprak ile temaslarındaki gizli tehlikenin varlığı hakkında bilgilendirilmelidir. Ayrıca bu bölgedeki klinisyenler ve halk sağlığı çalışanları arasında bu konu hakkında farkındalık arttırılmalıdır.

Abstract:
In this study, it was aimed to investigate the presence of Acanthamoeba spp., N. fowleri and B. mandrillaris, which are pathogenic for humans and animals, using non-nutrient agar (NNA) culture and quantitative real-time PCR (qPCR) assay in water, soil and swab samples collected from different regions of Izmir province. In addition, it was aimed to determine the pathogen genotypes by performing sequence analysis in Acanthamoeba positive samples.
In İzmir province, water (n=148), soil (n=35), and swab samples (n=20) (air-conditioner, eyewash unit, sink, window) were collected from 23 various districts. Membrane filtration was applied to all collected water, and also soil samples, swab samples and half of the filter were cultured in the NNA plate. Also, direct DNA isolation from the other half of the filter water and soil samples was performed. Standard curves were established by plasmid controls with the qPCR method and their concentrations were determined. A phylogenetic tree was created using the obtained sequences to determine the pathogen genotypes of positive Acanthamoeba spp.. 
Of the examined samples, water 71/148 (47.97%), soil 24/35 (68.57%), and swap 4/20 (20%) samples were detected positive by NNA culture method for free-living amoebae (FLA). Acanthamoeba spp. were found positive in water 12.16% (n=18), soil 25.71% (n=9), and swab 5% (n=1) samples by NNA culture. Osmotolerance and thermotolerance tests in water of 55.5% (n=10) and soil samples 77.7% (n=7), a growth of 1 M mannitol osmolarity and at 42°C were observed, respectively. Besides, one swab sample was showed growth at 0.5-1 M mannitol osmolarity and 37-42 °C.
With the qPCR assay; Acanthamoeba spp. and N. fowleri were found to be 18.24% (n=27), 2.7% (n=4), respectively, and B. mandrillaris could not be detected in any sample. Acanthamoeba spp., N. fowleri, and B. mandrillaris were found positive in soil samples of 45.71% (n=16), 17.4% (n=6) and 20% (n=7), respectively. The quantitative amount of Acanthamoeba spp. and N. fowleri was calculated and in water sources were determined 1.4x102-3.2x105 and 11x102-8x103 plasmid copies/liter and Acanthamoeba spp., N. fowleri and B. mandrillaris in soil samples were determined 6x102-18x105, 9x103-8x102, and 39x103-47x104 plasmid copies/gr, respectively. However, B. mandrillaris could not be detected in water samples by qPCR method. 
Genotypes T4 of Acanthamoeba spp. were found to be 51.85% (n=14), 56.25% (n=9), and 100% (n=1) in water, soil and swab samples, respectively. Genotype T5 22.22% (n=6), genotype T2 14.81% (n=4), and genotype T15 11.11% (n=3) in water samples and genotype T5 25% (n=4), genotype T2 18.75% (n=3) in soil samples were identified. 
In conclusion, the thesis study carried out is important in terms of being the first comprehensive study and detecting Acanthamoeba spp., N. fowleri and B. mandrillaris by qPCR assay in environmental samples collected from the places where the most human contact in İzmir province. Present study is the first report of both N. fowleri and B. mandrillaris in Turkey by qPCR method in soil samples. The risks of possible health the Acanthamoeba T4 genotype, which is the most common pathogen in humans and animals, has to be taken into consideration. Although the presence of the genotype T5 was reported for the second time in water samples, the first time in soil samples were reported ın Turkey. Therefore, people should be informed about the existence of hidden danger in their contact with water and soil. In addition, awareness should be increased about this risk among clinicians and public health professionals in this region.