İnsan sperm akrozomal enzimleri üzerinde sitokimyasal çalışmalar
Enzyme cytochemical studies on the human acrosomal enzymes
Yazar: RUKİYE ERDOĞAN
Danışman: PROF. DR. İLHAMİ ÇELİK ; DOÇ. DR. MEHMET KAYNAR
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Alkalen = Alkaline ; Alkalen fosfataz = Alkaline phosphatase ; Asit fosfataz = Acid phosphatase ; Enzimler = Enzymes ; Meni = Semen ; Sitokimya = Cytochemistry ; Sperm = Spermatozoa

Özet:
Sperm enzimleri, özellikle de akrozomal enzimler, fertilizasyonda oynadıkları roller nedeniyle erkek üreme fizyolojisinde çok büyük öneme sahiptir. Bununla birlikte, sperm enzimlerinin sitokimyası ve bu enzimlerin erkek üreme bozukluklarıyla ilişkisi hakkında yeterli bilgi bulunmamaktadır. 
Sunulan bu araştırma projesinde; sigara içmeyen-varikoselsiz, sigara içmeyen-varikoselli, sigara içmeyen-varikosel ameliyatlı, sigara içen-varikoselsiz ve sigara içen-varikosel ameliyatlı olan cinsel bakımdan olgun erkeklerden alınan semen örneklerinde, sperm enzimlerinden olan ANAE, ACP-az ve ALP-az enzimleri sitokimyasal yöntemlerle demonstre edilerek, gruplar arasındaki enzimatik pozitivite farkları belirlenmiştir.
Çalışmada materyal olarak, Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Tüp Bebek Ünitesi Androloji Laboratuvarı'na başvuran 21-45 yaş aralığındaki sigara içen veya içmeyen, diyabet, hipertansiyon ve romatizma gibi kronik rahatsızlığı olmayan, varikoselli ya da varikosel operasyonu geçirmiş, ciddi ürolojik enfeksiyon ve inmemiş testis tıbbi hikayesi olmayan toplam 42 erkekten alınan semen örneğinden hazırlanan frotiler kullanılmıştır. Semen örneklerinin yıkanmasında PBS solüsyonu kullanılmıştır. Santrifüj tüpüne taze semen örneğinden 1 ml alınıp üzerine 9 ml PBS eklenerek 800 G'de oda sıcaklığında (22℃) 8 dakika santrifüje edilmiştir. Üst kısım atılmış, dipteki sperm pelletinin üzerine 10 ml'ye tamamlayacak şekilde tekrar PBS eklenerek 800 G'de oda sıcaklığında 8 dakika santrifüje edilmiştir. Üst kısım atılmış ve alttaki sperm peletinden hazırlanan yayma preparatlar havada kurutularak enzim sitokimyasal işlemlerde kullanılmıştır. Oda sıcaklığında kurutulan frotiler enzimin demonstre edileceği tespit sıvısında -10°C'de uygun sürelerle tespit edilerek, bu frotilerde her enzim uygun sitokimyasal metotla demonstre edilmiştir. Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobuyla (Nikon Eclipse E100) incelenmiş ve gerekli görülen sahaların dijital görüntüleri kaydedilmiştir. Bir enzimin spesifik reaksiyon ürününe sahip olan bir sperm o enzim bakımından pozitif olarak kabul edilmiştir. Her enzim için pozitivite oranları belirlenmiş ve yüzde (%) olarak ifade edilmiştir. Değerlendirmede, reaksiyon ürününün dağılım şekli (iri lokalize granüler, ince granüler ya da diffüz), hücredeki yerleşimi ve sayısı dikkate alınmıştır.  
ANAE reaksiyonu, çoğunlukla spermlerin baş bölgesinde ve boyun-orta parçasında yerleşen kırmızımsı-kahverengi renkli ve lokalize granüler ya da ince granüler tarzda gözlenmiştir. Bazı hücrelerde bu reaksiyon akrozomun ön tarafında dar bir bant halinde gözlenmiştir. ACP-az enzimi reaksiyonu spermlerin baş bölgesinde ve boyun-orta parçasında yerleşen iri granüler, ince granüler ya da diffüz karakterde, kırmızımsı-kahverengi renkli reaksiyon ürünü halinde gözlenmiştir. ALP-az enzimi reaksiyonu ise spermlerin baş bölgesinde ve boyun-orta parçasında yerleşen iri granüler ya da ince granüler karakterde, pembemsi-kırmızı renkli reaksiyon ürünü halinde gözlenmiştir.
Bu çalışmanın enzim sitokimyasal inceleme sonuçları, sigara içmenin ve varikoselin sperm ANAE, ACP-az ve ALP-az pozitivitelerinde belirgin düşüşlere yol açtığını; varikosel ameliyatının, bu enzimlerin pozitivitelerinde belirgin bir iyileşme sağlamakla birlikte, sigara içmenin devam etmesinin ameliyatın olumlu etkisinde belirgin azalmayla sonuçlandığını ortaya koymuştur. Çalışmada az sayıda örnek üzerinde çalışılmış olmakla birlikte, spermin ANAE, ACP-az ve ALP-az pozitivitelerinin insanlarda semen kalitesinin değerlendirilmesinde yardımcı bir parametre olarak dikkate alınabileceği sonucuna varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: akrozomal enzimler; alfa-naftil asetat esteraz; alkalin fosfataz; asit fosfataz; semen.

Abstract:
Sperm enzymes, specifically acromal enzymes have enormous importance in the male reproductive physiology because that they play vital roles in fertilization. However, there is not sufficent information about the cytochemistry of sperm enzymes and their relationship with male reproductive disorders.
In the present study; ANAE, ACP-ase and ALP-ase were cytochemically demonstrated in the smears prepared from semen samples of sexually mature men, who were non-smoker-without varicocele (healthy), non-smoker-varicocele diseased, non-smoker-varicocele operated, smoker-without varicocele and smoker-varicocele operated, and the differences between enzymatic positivity values of the groups were determined. The semen smears were used as material which were prepared form the semen samples obtained from sexually mature men aged between 21-45, either smokers or non-smokers, varicocele diseased or varicocele operated, who applied to Andrology Laboratory of In Vitro Fertilization Unit in Selcuk University Medical Faculty Hospital. The semen samples were washed with a PBS solution. Onto 1 ml of semen sample, 9 ml of the PBS solution was added and centrifuged at 800 G'de for 8 minutes at room temperature (22℃). Supernatant was discarged, sperm pellet was diluted to 10 ml with the solution given above and centrifuged at 800 G'de for 8 minutes at room temperature (22°C). The supernatant was discarged again and smears were prepared from the sperm pellet.  The smears were air dried and used in enzyme cytochemistry. The dried smears were fixed in special fixatives for each enzyme for sufficent periods at -10°C. Enzymes were demonstrated by means of enzyme-specific cytochemical reactions for each enzyme. Preparations were investigated under light microscope (Nikon Eclipse E100) and digital images of selected areas were recorded. A sperm with specific enzymatic reaction product was evaluated as "positive" in terms of the enzyme regarded. Positivity rates of each enzyme were determined and and expressed as % of the counted sperms. In the evaluation of the enzyme positivity, location, distribution pattern (large-localised granular, fine-granular or diffuse) and number of the reaction product were taken into consideration.
ANAE positivity reaction products were observed as reddish-brown localised granular or fine granular pattern, mainly located in the head region of the sperm. In some of the cells, reaction product was seen as a narrow band located at front acrosomal membrane. ACP-ase reaction was observed in reddish-brown color as large granular, fine granular or diffuse pattern in the head region and head-midpiece of the sperm. ALP-ase reaction product displayed pale pinkish-red coloured large granular or fine granular pattern located in the head and head-midpeice connection of the sperm.
Results of the enzyme cytochemical investigations of the present study have revealed that smoking and varicocele cuased definite reductions in ANAE, ACP-ase and ALP-ase positivities. Varicocele operation significantly recovered the enzyme positivity values. Nevertheless, keeping the smoking decreased recovery effects on the enzymatic positivities of the varicocele operation. 
Although sample population of the present study has limited number, it was concluded that sperm ANAE, ACP-ase and ALP-ase positivity values could be used as an additional parameter in the evaluation of the male semen quality.
Key words: acid phosphatase; alkaline phosphatase; alpha-naphthyl acetate esterase; semen; sperm enzymes,