Zoledronik asidin D-17 köpek osteosarkoma hücre hattında sitotoksik ve apoptotik etkileri
Cytotoxic and apoptotic effects of zoledronic acid in D-17 canine osteosarcoma cell line
Yazar: GAMZE SEVRİ EKREN AŞICI
Danışman: PROF. DR. FUNDA KIRAL
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Hücre dizisi = Cell line ; Köpekler = Dogs ; Osteosarkom = Osteosarcoma ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Zoledronik asit = Zoledronic acid

Özet:
Çalışmamızda; in vitro olarak zoledronik asidin (ZA) D-17 (CCL-183) köpek osteosarkoma (OSA) hücre hattı üzerinde antiproliferatif etkisinin olup olmadığı ve olası hücre ölüm tipinin (apoptoz/nekroz) belirlenmesi amaçlandı. D-17 köpek osteosarkoma hücre hattına uygulanan zoledronik asidin (1 µM, 5 µM, 10 µM, 25 µM, 50 µM, 75 µM, 100 µM) hücre canlılığına etkisi ve IC50 değeri WST-1 canlılık testi ile 24, 48, 72 ve 96 saat inkübasyon sürelerince tespit edildi. WST-1 canlılık analizleri sonuçlarına göre 24 saatte anlamlı bir sitotoksik etki görülmezken (p≥0,05), ZA'nın IC50 değerleri 48. saat, 72. saat ve 96. saat için sırası ile 82,5 µM, 26,0 µM ve 17,6 µM olarak hesaplandı. ZA'nın hücrelerin koloni oluşturma yeteneklerine etkisi kristal violet, mineral içeriği üzerine etkisi alizarin kırmızısı boyaması ile gösterilirken, ZA'nın ekstraselüler ve intraselüler alkalen fosfataz aktivitesine olan etkisi ise spektrofotometrik yöntemle ölçüldü. ZA'nın hücrelerin koloni oluşturma, mineral içeriği ve alkalen fosfataz üzerine etkisi incelendiğinde hücrede doz ve zamana bağlı olarak azalmaya neden olduğu belirlendi (p<0,05). Hücrelerin göç etme potansiyellerine olan etkisi ucuz ve basit bir yöntem olan yara iyileştirme yöntemi ile belirlendi ve ZA'nın köpek OSA hücre hattı üzerine 5 µM, 7,5 µM, 10 µM, 15 µM konsantrasyonları uygulandığında hücrenin göç etme potansiyelini anlamlı ölçüde azalttığı görüldü. Zoledronik asidin hücredeki apoptotik etkileri ise elektroforetik ve ELİSA yöntemleri ile DNA kırıklarının analizi yapılarak gösterildi. Kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9 düzeyleri ELİSA yöntemi ile belirlenerek apoptotik yolaklardaki kaspaz-kaskat sistemi üzerine etkisi saptandı. Ayrıca apoptotik yolaklar üzerinde yer alan Bcl-2, Bax ve Bid genleri, hücrelerinin çoğaltılması ve sağkalımı ile ilişkili gen olarak kabul edilen survivin genlerinin ekspresyon düzeyleri RT-PCR yöntemleri kullanılarak belirlendi. Apoptotik etkilerinin saptanmasında WST-1 canlılık testi sonucu bulunan IC50 değerinin altındaki 5 µM, 7,5 µM, 10 µM, 15 µM konsantrasyonları kullanıldı. D-17 köpek OSA hücreleri üzerine seçilen dozlarda ZA uygulandığında doz ve zamana bağlı olarak apoptotik DNA kırıklarında, kaspaz 3 ve kaspaz 9 düzeyinde, Bax/Bcl-2 oranında anlamlı artış (p<0,05) gözlenirken, kaspaz 8 düzeyinde ve Bid ekspresyonunda anlamlı bir değişiklik bulunmadı (p≥0,05). Hücre sağkalımını belirleyen survivinin ekspresyon düzeylerinde ise doz ve zamana bağlı olarak anlamlı bir azalma (p<0,05) saptandı.
Çalışmanın sonuçları ZA'nın D-17 köpek osteosarkoma hücrelerinde tek başına uygulanmasının in vitro olarak antikanserojenik etki gösterdiğini ortaya çıkarmıştır. Bu konudaki araştırmaların kapsamı genişletilmeli ve daha ileri moleküler çalışmalar gerçekleştirilmelidir. Ayrıca in vivo hayvan modelleri üzerinde denenerek doğrulukları kanıtlanmalıdır.

Anahtar Kelimeler: Apoptoz, bisfosfonatlar, köpek osteosarkoma, zoledronik asit.

Abstract:
The aim of our study was to determine whether zoledronic acid (ZA) has antiproliferative effect on D-17 (CCL-183) canine osteosarcoma (OSA) cell line in vitro and to determine possible cell death type (apoptosis/necrosis). The effect of zoledronic acid (1 μM, 5μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) on cell viability of the D-17 canine osteosarcoma cell line and the IC50 value were determined during 24, 48, 72 and 96 hours incubation time with the WST-1 viability test. According to the results of WST-1 vitality analysis, no significant cytotoxic effect was observed in 24 hours (p≥0,05), the IC50 values of ZA were calculated as 82,5 µM, 26,0 µM and 17,6 µM respectively for 48 th hour, 72 th and 96 th hours. The effect of zoledronic acid on the colony forming ability of the cells was shown by crystal violet, on mineral content with alizarin red staining while the effect of ZA on extracellular and intracellular alkaline phosphatase activity was measured by spectrophotometric method. When the effect of ZA on colony formation, mineral content and alkaline phosphatase was investigated, ıt was determined decreased on cell dependent on dose and time (p<0,05). The effect of cells on migration potentials was determined by a cheap and simple method is wound healing and ZA significantly decreased cell migration potential when the concentrations of 5 μM, 7,5 μM, 10 μM, 15 μM were applied to on the canine OSA cell line. Apoptotic effects of zoledronic acid in the cell were showed analysis by electrophoretic and ELISA methods. The effect on caspase-cascade system in the apoptotic pathways was detected by determining the caspase 3, caspase 8 and caspase 9 activities with ELISA method. Moreover, expression levels of survivin, regarded as genes related to proliferation and survival of Bcl-2, Bax and Bid genes and cells in the apoptotic pathways, were determined using RT-PCR methods. Below the IC50 value that found by the WST-1 viability test 5 µM, 7,5 µM, 10 µM, 15 µM concentrations were used to determine the apoptotic effects. When the selected doses of ZA were applied on D-17 canine osteosarcoma cells was significantly increased apoptotic DNA fragments, level of caspase 3 and caspase 9, Bax/Bcl-2 ratio (p<0,05) while there was no significant change in caspase 8 level and Bid expression (p≥0,05) depending on dose and time. There was a significant decrease (p<0,05) in the expression levels of the survivin which determined cell survival.
The result of this study has been shown that the treatment of ZA alone in D-17 canine osteosarcoma cells shows an anticarcinogenic effect in vitro. The scope of research on this subject should be expanded and proven by testing on more advanced molecular studies and in vivo animal models.


Keywords: Apoptosis, bisphosphonates, canine osteosarcoma, zoledronic acid.