Smac mimetiklerinin nöroblastom hücreleri üzerinde apoptotik ve nekropitotik ölüm mekanizmalarına etkisi
The effect of smac mimetics on apoptotic and necroptotic cell death mechanisms on neuroblastoma cells
Yazar: BURÇİN BARAN
Danışman: PROF. DR. HATİCE NUR OLGUN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Onkoloji Ana Bilim Dalı / Temel Onkoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Onkoloji = Oncology

Özet:
SMAC proteinleri, hücre içerisindeki inhibitör apoptoz proteinlerine bağlanır ve onları ubikutinleyerek parçalanmasını sağlar veya direkt onları bloklarlar. Bu sayede hücre ölüm yanıtının başlatılmasına katkıda bulunurlar. SMAC mimetikleri, SMAC proteinlerinin 3 boyutlu yapısını taklit ederek geliştirilen kimyasal ajanlardır. Birçok farklı hematolojik veya solid kanser hücre hatlarında SMAC mimetiklerinin hücre ölümünü ve kemoterapi etkinliğini arttırdığı gösterilmiştir. Nöroblastom çocukluk çağının en sık görülen solid tümörüdür. Hastaların sağ kalım oranları farklılık göstermekle birlikte özellikle yüksek risk grubu hastaların sağ kalımları halen yüzde ellinin altındadır. Yüksek riskli hastalar için daha iyi tedavilerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. 
Yapılan çalışmada SMAC mimetik çeşitlerinden biri olan LCL-161'in nöroblastom tedavisinde aday ajan olup olamayacağının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada farklı prognostik fenotipleri yansıtan iki insan nöroblastom hücre hattı kullanılmıştır: MYCN- pozitif KELLY ve MYCN-negatif SH-SY5Y. LCL-161'in mono veya kombine ajan olarak Etoposid ve Cisplatin ilaçları ile hücre canlılığı ve apoptotik hücre ölümü üzerindeki etkisi incelenmiştir. KELLY hücrelerinin LCL-161'e ve uygulanan kemoterapi ajanlarına SH-SY5Y hücrelerine göre daha duyarlı olduğu saptanmıştır. Kombine kullanımda LCL-161, bu hücre hatlarında Cisplatin etkinliğini arttırırken Etoposid etkinliğini arttıramamıştır.
Çalışmanın devamında, mono olarak LCL-161 uygulamasının total gen ekspresyonu değişimleri üzerindeki etkisi RNA sekanslama yöntemiyle, apoptotik, anti-apoptotik ve nekroptotik gen ekspresyonları üzerindeki etkisi eş-zamanlı kantitatif PCR yöntemleriyle incelenmiştir. RNA sekanslama sonuçlarında, LCL-161 uygulamasının hücrelerde endoplazmik retikulum stresi (ER) ile ilişkili genlerin ekspresyonunda önemli bir artışa yol açtığı gösterilmiştir. ER-stres ilişkili genlerin ekspresyonundaki artış PCR çalışmaları ile de doğrulanmıştır. Bunun haricinde LCL-161 uygulamasına bağlı olarak bazı apoptotik genlerde artış, bazı anti-apoptotik genler de azalış saptanırken, nekroptotik genler de ise herhangi bir değişim izlenmemiştir. Sonuç olarak, yapılan tez çalışmamızda ilk defa hücrelerde LCL-161 yanıtında ER-stres aracılıklı yolakların da yer aldığını ve bunun LCL-161 tarafından indüklenen apoptotik yanıtın regülasyonunda önemli bir rol üstlenebileceğini ortaya koyduk.

Abstract:
SMAC proteins bind to inhibitory apoptosis proteins within the cell and ubiquitinate them, causing their degradation or directly blocking them. In this way, they contribute to initiating the cell death response. SMAC mimetics are chemical agents developed by mimicking the 3D structure of SMAC proteins. SMAC mimetics have increased cell death and chemotherapy efficacy in many hematological or solid cancer cell lines. Neuroblastoma is the most common solid tumor of childhood. Although the survival rates of patients vary, the survival of especially high-risk group patients is still below fifty percent. There is a need to develop better treatments for high-risk patients.
The study aimed to investigate whether LCL-161, one of the SMAC mimetic varieties, could be a candidate agent in the treatment of neuroblastoma. The study used two human neuroblastoma cell lines reflecting different prognostic phenotypes: MYCN-positive KELLY and MYCN-negative SH-SY5Y. The effect of LCL-161 as a mono agent or as a combined agent with the drugs Etoposide and Cisplatin on cell viability and apoptotic cell death was examined. It was determined that KELLY cells were more sensitive to LCL-161 and applied chemotherapy agents than SH-SY5Y cells. In combined use, LCL-161 increased the effectiveness of Cisplatin in these cell lines but failed to increase the effectiveness of Etoposide.In the continuation of the study, the effect of mono LCL-161 application on total gene expression changes was examined by RNA sequencing method, and its effect on apoptotic, anti-apoptotic, and necroptotic gene expressions was examined by real-time quantitative PCR method. RNA sequencing results showed that LCL-161 treatment led to a significant increase in the expression of endoplasmic reticulum stress (ER)-related genes in cells. PCR studies also confirmed the increase in the expression of ER-stress-related genes. Furthermore, an increase in some apoptotic genes and a decrease in some anti-apoptotic genes were detected due to LCL-161 treatment, while no change was observed in necroptotic genes. In conclusion, in our thesis study, we revealed for the first time that ER-stress-mediated pathways are involved in the LCL-161 response in cells and that this may play an essential role in the regulation of the apoptotic response induced by LCL-161.