Mesane kanser hücrelerinde hsp90 inhibitörlerinin histon metilasyonu üzerine etkisi
The effect of hsp90 inhibitors on histone methylation in bladder cancer
Yazar: NURAN ÇOBAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. NURAY VAROL
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Histonlar = Histones ; Mesane hastalıkları = Urinary bladder diseases ; Mesane neoplazmları = Urinary bladder neoplasms ; Metilasyon = Methylation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sıcaklık şoku proteinleri = Heat shock proteins

Özet:
Isı şok protein 90 (HSP90), ATP-bağımlı moleküler bir şaperon olup kanserin temel özellikleri olarak tanımlanan çok sayıdaki onkogenik sinyal proteinlerinin stabilitesi ve fonksiyonu için gereklidir. Son yollarda, HSP90'ın epigenetik yolaklarda da önemli rol oynadığı gösterilmiştir. Mesane kanseri, en sık görülen ürogenital kanserler içerisinde ikinci sırada yer almaktadır. Mesane kanseri, geleneksel olarak genetik bir hastalık olarak kabul edilmekle birlikte epigenetik mekanizmaların da bu hastalığın etiyolojisinde önemli rol oynadığı bilinmektedir. Bu çalışmanın amacı HSP90 proteininin mesane kanserinde inaktive edici metilasyon düzeyine olan etkisinin belirlenmedir. HSP90 spesifik inhibitörü Geldanamisin (GA)'nin sitotoksitesi, insan mesane kanser hücre hattı T24 hücrelerinde zamana ve doza bağımlı olarak WST1 aracılığıyla, DNMT1, HDAC1 ve WIF-1 hedef genlerin ifadelenme değişimleri real-time PCR DNMT1, H3K27me3, Histone H4, H4K20me1, H4K20me3, Akt1, pAkt1(S473), SET8, KMT5C, Bax ve Bcl2 protein düzeyleri western blot kullanılarak belirlendi. Bulgularımıza göre geldanamisin yüksek dozda (10µM) hücre proliferasyonunu inhibisyonuna neden olmaktadır. Düşük ve yüksek dozlarda GA, Akt1 inhibisyonu aracılığıyla transkripsiyonel ve translasyonel düzeyde DNMT1'in ifadelenmesini ve aynı zamada HDAC1 ifadelenmesini azaltmaktadır. Bunula birlikte, GA muamelesi sonrasında DNMT ve HDAC1 gen düzeylerindeki azalmaya bağlı olarak WIF1 geninin yeniden ifadelendiği gözlemlendi. Buna ek olarak, histon post-transalsyonel modifikasyonlar (H3K27me3, H4K20me1 and H4K20me3) ve bu modifikasyonlardan sorumlu enzimlerin (SET8 ve KMT5C), GA uygulamasını takiben doz ve zaman bağlımlı olarak upregüle veya downregüle olduğu ve Histon H4 protein düzeyinde önemli bir değişimin olmadığı gözlemlendi. WIF1 yeniden ifadelenmesini takiben kanser hücrelerinde apoptotik indüksiyon belirlendi.  Bizim sonuçlarımız, HSP90 proteininin moleküler etkilerinin epigenetik düzenlenme üzerine etkilerinin tam olarak belirlenmesine ve invaziv mesane kanserlerinin tedavisi için yeni moleküler hedeflerin  (HSP 90 client proteinler) tanımlanmasına katkı sağlayabilecektir.

Abstract:
Heat shock protein 90 (HSP90) is an ATP-dependent molecular chaperone that required for the stability and function of numerous oncogenic signaling proteins that determine the hallmarks of cancer. HSP90 has been shown to play an privotal role in epigenetic pathways in recent years. Bladder cancer constitutes the second most common type of cancer among urogenital cancers. Bladder cancer has traditionally been accepted as a genetic disease, however it is known that the epigenetic mechanisms also play an important role in the etiology of this disease. The aim of this thesis project to explain how the HSP90 protein affects to inactivating histone methylation markers levels in bladder cancers. Cytotoxic effect of HSP90 spesific inhibitor Geldanamycin (GA) in human bladder cancer cell line T24 was detected time and dose dependent manner with WST1, expression aberration of target genes DNMT1, HDAC1 and WIF-1 using real-time PCR and  protein levels of DNMT1, H3K27me3, Histone H4, H4K20me1, H4K20me3, Akt1, pAkt1(S473), SET8, KMT5C, Bax and Bcl2 using western blot.  Our results demostrated that  GA caused an decreased cell proliferation at high dose (10 µM). In both low and high dose cases, GA was decreased DNMT1 at both transcriptional and translational levels via inhibition of Akt1 and therewithal HDAC1 expression. However, reexpression of WIF1 gene was observed after treatment GA based on decreased DNMT1 and HDAC1 gene levels. Furthermore we showed that histone post-translational modifications (H3K27me3, H4K20me1 and H4K20me3) and enzymes (SET8 and KMT5C) responsible for this modifications  was up regulated or downregulated depend on the dose and time following GA treatment and also not observe significantly any changes at Histone H4 protein level. We demonstrated to induce apoptosis following reexpression of WIF. Our findings may offer a new approach determination of molecular effect of HSP90 on epigenetic regulation would allow us to identify new molecular targets (HSP90 client proteins) for treatment of the invasive bladder cancer.