Erzurum yöresinde sığır ve koyun pneumonili akciğerlerinden Pasteurella multocida ve Manheimia haemolytica etkenlerinin izolasyonu, identifikasyonu, antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesi ve olası direnç genlerinin analizi
Isolation, identification, determination of antibiotic susceptibility, analysis of possible resistance genes  of Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica from pneumonia lungs of cattle and sheep in the Erzurum region
Yazar: ELİF KARADENİZ PÜTÜR
Danışman: DOÇ. DR. FATİH BÜYÜK
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Erzurum = Erzurum ; Manheimia haemolytica = Manheimia haemolytica ; Mikrobiyal duyarlılık testleri = Microbial sensitivity tests ; Pasteurella multocida = Pasteurella multocida ; Pnömoni = Pneumonia ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sığırlar = Cattles ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Heterojen bir yapı sergileyen Pasteurellaceae familyasının patojen üyeleri genellikle
Pasteurella ve Mannheimia cinsi içerisinde yer almaktadır. Bunlar arasında
Pasteurella multocida ve Mannheimia haemolytica, sığır ve koyunlarda hemorajik
septisemi, enzootik pnömoni ve mastitis gibi enfeksiyonlara yol açarak hayvan
ölümleri, verim kayıpları ve tedavi-koruma-kontrol giderleri gibi önemli ekonomik
kayıplar oluşturmaktadır. Bu çalışmada, Erzurum yöresi mezbahanelerinden alınan
100 sığır ve 100 koyun pnömonili akciğer örnekleri Pasteurella ve Mannheimia
etkenlerinin varlığı yönünden araştırıldı. İzolatların identifikasyonu konvansiyonel
yöntemler, VITEK 2 Compact identifikasyon sistemi, tür spesifik PZR ile
gerçekleştirildi. Ayrıca, izolatların antibiyotik duyarlılıkları fenotipik olarak (VITEK
2 Compact sistemi) belirlendi ve direnç genleri araştırılması moleküler yöntemle
(PZR) belirlendi. İzolatların 16S rRNA sekans analizi ile identifikasyonları teyit edildi
ve filogenetik analizleri gerçekleştirildi. Pasteurella spp. kültür pozitifliği %8
saptandı. Tür dağılımı 7 adet Pasteurella multocida ve 9 adet Mannheimia haemolytica
olarak belirlendi. Sığırlarda P. multocida pozitifliği %4 ve M. haemolytica pozitifliği
%5 iken, koyunlarda P. multocida pozitifliği %3 ve M. haemolytica pozitifliği %4
olarak tespit edildi. Pasteurella türlerinin identifikasyonunda VITEK 2 Compact
identifikasyon sistemi ile PZR'nin tanısal uyumu %100 olarak saptandı. P. multocida
izolatlarının tamamı ampisilin, amoksisilin-klavulonik asit ve trimetoprimsulfametaksazole dirençli iken, seftiofur (%100) ve doksisiklin (%85,71) duyarlılıkları
yüksek bulundu. P. multocida izolatlarının en az %71,43'ünde çoklu antibiyotik
direncine rastlanıldı. M. haemolytica izolatlarının tamamı ampisilin ve trimetoprimsulfametaksazole dirençli iken, izolatların amoksisilin-klavulonik asit (%100),
doksisiklin (%100) ve seftiofur (%88,89) duyarlılığı yüksek bulundu. M. haemolytica
izolatlarının en az %44,44'ünde çoklu antibiyotik direncine rastlanıldı. Fenotipik
olarak saptanan yaygın antibiyotik direncine paralel olarak ilgili antibiyotiklere
dirençten sorumlu olan gen pozitiflikleri de yüksek belirlendi. P. multocida izolatları
arasında %71,43 AaDA25, %42 AaDB, %42,86 Tet H, %85,71 Sul 2, %100 blaOXA58
ve %100 blaTEM pozitifliği; M. haemolytica izolatları arasında %66,67 AaDA25,
%77,78 AaDB, %77,78 Sul 2, %22,22, blaOXA58 ve %100 blaTEM pozitifliği
belirlendi. Ayrıca, her iki tür bakteri izolatları için çoklu antibiyotik direnç gen varlığı
ve farklı direnç gen kombinasyonları belirlendi. 16S rRNA sekans analizi sonucu
oluşturulan dendrogramda, P. multocida izolatları 2 ana küme içerisinde yer aldı.
Monofiletik bir dağılım gösteren 4 sığır izolatı ile 1 koyun izolatından oluşan küme
yüksek (%97) homolojiye sahipti. Dendrogramın diğer kümesini ise parafiletik
görünümlü 2 koyun izolatı oluşturdu. İki ana küme içerisinde yer alan M. haemolytica
izolatları ise oldukça heterojen bir dağılım sergiledi. Dendrogramın birinci kümesinde
yer alan 3 sığır ve 1 koyun izolatları ile ikinci kümesinde yer alan 2 sığır ve 3 koyun
izolatının tümü parafletik bir görünümdeydi. Büyükbaş hayvan yetiştiriciliğinin yoğun
bir şekilde yapıldığı Erzurum yöresinde, sığır ve koyun pnömonilerinde etiyolojik
etken olarak P. multocida ve M. haemolytica'nın yaygınlığının saptanması, elde edilen
izolatların antibiyotik duyarlılıklarının ve mevcut antibiyotik direnç genlerinin
belirlenmesi gibi lokal bakteri davranışlarının yanı sıra ve evrensel bakıda filogenetik
pozisyonlarının belirlendiği bu çalışmaya ait verilerin pastörelloz hastalığının
eradikasyonunda fayda sağlayacağı umulmaktadır.
Anahtar Kelimeler: Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, PZR, 16S
rRNA sekanslama

Abstract:
The pathogenic members of the heterogeneous Pasteurellaceae family are generally
included in the genera Pasteurella and Mannheimia. Among these, Pasteurella
multocida and Mannheimia haemolytica cause serious infections such as hemorrhagic
septicemia, enzootic pneumonia and mastitis in cattle and sheep and cause significant
economic losses such as animal mortality, yield losses and treatment-protectioncontrol expenses. In this study, 100 cattle and 100 sheep pneumonic lung samples
collected from slaughterhouses in Erzurum region (Türkiye) were analyzed for the
presence of Pasteurella spp. by culture method. Identification of the isolates was
performed by conventional methods, VITEK 2 Compact identification system and
species-specific PZR. In addition, antibiotic susceptibilities of the isolates were
determined phenotypically (VITEK 2 Compact system) and molecular bases (PZR).
Identification and phylogenetic analysis of the isolates were confirmed by 16S rRNA
sequencing. Pasteurella spp. culture positivity was obtained 8%. The species
distribution was 7 for P. multocida and 9 for M. haemolytica. P. multocida positivity
was 4% and M. haemolytica positivity was 5% in cattle, whereas, P. multocida
positivity was 3% and M. haemolytica positivity was 4% in sheep. The diagnostic
concordance of PCR with VITEK 2 Compact identification system was 100%. All P.
multocida isolates were resistant to ampicillin, amoxicillin-clavulonic acid and
trimethoprim-sulfamethoxazole, while ceftiofur (100%) and doxycycline (85.71%)
susceptibilities were high. Multiple antibiotic resistance was found in at least 71.43%
of P. multocida isolates. While all M. haemolytica isolates were resistant to ampicillin
and trimethoprim-sulfamethoxazole, all isolates had high susceptibility to amoxicillinclavulonic acid (100%), doxycycline (100%) and ceftiofur (88.89%). Multiple
antibiotic resistance was found in at least 44.44% of M. haemolytica isolates. In
parallel with the phenotypically widespread antibiotic resistance, gene positivity
responsible for resistance to related antibiotics was also high. Among the P. multocida
isolates, 71.43% AaDA25, 42% AaDB, 42.86% Tet H, 85.71% Sul 2, 100% blaOXA58
and 100% blaTEM positivity was detected. Among the M. haemolytica isolates,
66.67% AaDA25, 77.78% AaDB, 77.78% Sul 2, 22.22% blaOXA58 and 100% blaTEM
positivity was detected. In addition, the presence of multiple antibiotic resistance genes
and different resistance gene combinations were determined for both bacterial isolates.
In the dendrogram generated by 16S rRNA gene sequencing, P. multocida isolates
were included in 2 main clusters. The cluster consisting of 4 bovine isolates and 1
sheep isolate with a monophyletic distribution had a high homology (97%). The other
cluster of the dendrogram consisted of 2 sheep isolates with paraphyletic appearance.
M. haemolytica isolates in the two main clusters showed a very heterogeneous
distribution. All 3 cattle and 1 sheep isolates in the first cluster of the dendrogram and
2 cattle and 3 sheep isolates in the second cluster had a paraphyletic appearance. It is
hoped that the data of this study, which determined the local bacterial behaviors such
as prevalence, antibiotic susceptibility and antibiotic resistance genes as well as the
phylogenetic positions in the universal perspective of the P. multocida and M.
haemolytica as the etiological agents of cattle and sheep pneumonia in Erzurum region,
where cattle and sheep pneumonia are intensively farmed, will be useful in the
eradication of the disease.
Keywords: Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, PCR, 16S rRNA
sequencing