Çeşitli klinik izolatlara karşı tedavide kullanılan antimikrobiyaller ile uçucu yağ bileşenlerinin ın vitro sinerji ve antibiyofilm etkinliklerinin belirlenmesi
Determination of in vitro synergy and antibiofilm activities of antimicrobials and essential oil components used in the treatment against various clinical isolates
Yazar: ABDULHAMİT ÇALI
Danışman: PROF. DR. CEM ÇELİK
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Candida albicans = Candida albicans ; Sinerji = Synergy ; Stenotrophomonas maltophilia = Stenotrophomonas maltophilia

Özet:
Mikroorganizmaların antimikrobiyallere direnç kazanması enfeksiyonların tedavilerinde başarısızlık riskini artırmaktadır. Bu durum, yeni ve daha etkili tedavi seçeneklerinin araştırılmasını zorunlu hale getirmektedir. Ancak, yeni tedavi seçeneklerinin oluşturulması için yeni antimikrobiyallerin geliştirilmesi günümüzde oldukça zorlaşmıştır. Bu nedenle, mevcut antimikrobiyallerin yeni stratejiler ile kullanılması oldukça popüler bir konudur. Uçucu yağlar ve etken maddeleri, potansiyel olarak güçlü antimikrobiyal özelliklerinden dolayı bu yeni stratejiler için ilgi kaynağı olmuştur. Bu kapsamda, çalışmamızda hastane kaynaklı metisilin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), Stenotrophomonas maltophilia ve Candida albicans izolatlarının, antimikrobiyal ajanlar ile uçucu yağ bileşenlerine karşı direnç durumlarının, sinerji kombinasyonlarının ve in vitro biyofilm formasyon aktivitelerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, ilgili mikroorganizmaların trimetoprim-sülfametoksazol, oksasilin ve flukonazol antimikrobiyalleri ile sinnamaldehit, karvakrol, öjenol, limonen ve ökaliptol etken maddelerine karşı antimikrobiyal etkinlikleri mikrodilüsyon yöntemi ile çalışılmıştır. Antimikrobiyallerle etken maddelerin kombinasyon çalışmaları dama tahtası yöntemiyle değerlendirilmiş ve sinerjik etki gösteren izolatların mikrobisidal aktivitesi ise time-kill yöntemiyle belirlenmiştir. Mikroorganizmaların biyofilm formasyonları ve antimikrobiyaller ile etken maddelerin antibiyofilm etkinlikleri mikrotitrasyon plak yöntemiyle çalışılmıştır. Sinnamaldehit, karvakrol, öjenol, limonen ve ökaliptolün L929 hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkileri XTT yöntemiyle belirlenmiştir. 
S. maltophilia izolatlarına karşı sinnamaldehit, karvakrol ve öjenol güçlü antimikrobiyal etkinlik göstermiştir. MRSA ve C. albicans izolatlarına karşı sinnamaldehit ve karvakrol daha düşük MİK değerlerinde güçlü antimikrobiyal etkinlik göstermiştir. Çalışmamızda, bütün izolatlar biyofilm oluşturmuştur. S. maltophilia izolatlarının %70'i, MRSA izolatlarının %90'ı güçlü ya da orta düzeyde biyofilm oluştururken C. albicans izolatlarının ise %20'si orta düzeyde biyofilm oluşturmuştur. Tüm izolatlara karşı sinnamaldehit, karvakrol, öjenol, limonen ve ökaliptol uçucu yağ etken maddelerinin trimetoprim-sülfametoksazol, oksasilin ve flukonazol ile birlikte kullanılmasıyla sinerjik etkiler görülmüştür. Oluşan bu sinerji antimikrobiyallerin MİK değerlerinin 2-10 kat azalmasına neden olmuştur. Ancak C. albicans izolatları için sinnamaldehitin flukonazol ile kombinasyonları iki izolatta antagonistik etki oluşturduğu için bu etkinin diğer etken maddelere göre daha az sinerjik etki gösterdiği bulunmuştur. Etken maddelerin L929 hücre hattında sitotoksik etki gösterdikleri konsantrasyonlar belirlenmiştir. Buna göre, sinnamaldehitin 8 µg/mL'den, karvakrolün 128 µg/mL'den, öjenolün 2048 µg/mL'den ve ökaliptolün ise 256 mg/mL'den yüksek konsantrasyonlarda hücre canlılığını anlamlı derecede azalttığı tespit edilmiştir. Limonen için çalışılan tüm konsantrasyonlarda hücre canlılığında herhangi bir azalma gözlenmemiştir. Çalışma sonuçlarımıza göre, etken maddelerin antimikrobiyal özelliklerinin yanı sıra biyofilm oluşumunu engelleme konusunda da hem tek başlarına hem de kombinasyon halinde kullanıldığı zaman iyi bir potansiyele sahip olduğu belirlenmiştir. Dama tahtası yöntemiyle sinerji tespit edilen bazı izolatlardan time-kill analizi yapılmıştır. Buna göre, S. maltophilia izolatlarında etken maddeler arasında sinerji gözlenmezken, bakteriyostatik etki tespit edilmiştir. MRSA izolatlarında sadece sinnamaldehit ve karvakrolde sinerjik etki gözlenirken tüm etken maddeler bakteriyostatik etki göstermiştir. C. albicans izolatlarında ise tüm etken maddeler sinerjik etki göstermiş, karvakrol dışında kalan diğer etken maddelerin bakterisidal etkiye sahip olduğu görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlara göre, in vitro koşullarda; S. maltophilia, MRSA ve C. albicans mikroorganizmalarına karşı, uçucu yağ etken maddelerinin antimikrobiyallerle kombinasyon halinde kullanılması güçlü bir antimikrobiyal ve antibiyofilm etkinlik göstermiştir. Bu sonuçların, tedavide kullanılan antimikrobiyallerin etkinliklerinin artırılması ya da yeni antimikrobiyal maddelerin geliştirilmesi konularında yapılacak daha ileri çalışmalar için literatüre veri sunacağını düşünmekteyiz.

Abstract:
Acquiring resistance of microorganisms to antimicrobials increases the risk of failure in the treatment of infections. This situation necessitates the search for new and more effective treatment options. However, the development of new antimicrobials to create new treatment options is very difficult today. Therefore, the use of existing antimicrobials with new strategies is a very popular topic. Essential oils and their components are a source of interest for these new strategies due to their potentially potent antimicrobial properties. In this context, our study aimed to investigate the resistance status, synergy combinations and in vitro biofilm formation activities of hospital-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Stenotrophomonas maltophilia and Candida albicans isolates against antimicrobial agents and essential oil components. For this purpose, the antimicrobial activities of the microorganisms against trimethoprim-sulfamethoxazole, oxacillin, and fluconazole antimicrobials and the cinnamaldehyde, carvacrol, eugenol, limonene and eucalyptol were studied by microdilution method. Combination studies of antimicrobials and essential oil components were evaluated by checkerboard method and microbicidal activity of the isolates showing synergistic effect was determined by time-kill method. Biofilm formation of microorganisms and antibiofilm activity of antimicrobials and essential oil components were studied by microtiter plate method. The cytotoxic effects of cinnamaldehyde, carvacrol, eugenol, limonene, and eucalyptol on L929 cell line were determined by XTT method. 
Cinnamaldehyde, carvacrol and eugenol showed strong antimicrobial activity against S. maltophilia isolates. Against MRSA and C. albicans isolates, cinnamaldehyde and carvacrol showed strong antimicrobial activity at lower minimum inhibitory concentration (MIC) values. All isolates formed biofilm in our study. While 70% of S. maltophilia and 90% of MRSA isolates formed strong or moderate biofilms, 20% of C. albicans isolates formed moderate biofilms. Synergistic effects were observed against all isolates when cinnamaldehyde, carvacrol, eugenol, limonene and eucalyptol essential oil components were used together with trimethoprim-sulfamethoxazole, oxacillin, and fluconazole. This synergy caused a 2-10-fold decrease in the MIC values of antimicrobials. However, for C. albicans isolates, combinations of cinnamaldehyde with fluconazole were found to have less synergistic effect than other active substances since they showed antagonistic effect in two isolates. The concentrations at which the essential oil components showed cytotoxic effects in the L929 cell line were determined. Accordingly, it was found that cinnamaldehyde significantly decreased cell viability at concentrations higher than 8 µg/mL, carvacrol at 128 µg/mL, eugenol at 2048 µg/mL and eucalyptol at 256 mg/mL. For limonene, no decrease in cell viability was observed at all concentrations studied. According to our study results, it was determined that the essential oil components have a good potential in preventing biofilm formation as well as their antimicrobial properties, both alone and in combination. Time-kill analysis was performed on some isolates for which synergy was detected by checkerboard method. Accordingly, no synergy was observed between the essential oil components in S. maltophilia isolates, while bacteriostatic effect was detected. In MRSA isolates, only cinnamaldehyde and carvacrol showed synergistic effect, while all active ingredients showed bacteriostatic effect. In C. albicans isolates, all active ingredients showed synergistic effect and all essential oil components except carvacrol showed bactericidal effect. According to these results, the use of essential oil components in combination with antimicrobials showed a strong antimicrobial and antibiofilm activity against S. maltophilia, MRSA and C. albicans microorganisms. We think that these results will provide data to the literature for further studies to increase the efficacy of antimicrobials used in treatment or to develop new antimicrobial agents.