Yeni geliştirilen terapötik monoklonal antikorların fizikokimyasal özelliklerinin ve stres koşullarındaki değişikliklerinin değerlendirilmesi ve validasyonu
Investigation of physicochemical behavior of newly developed therapeutic monoclonal antibodies under stress conditions and validation of results
Yazar: YİĞİT ERDEMGİL
Danışman: PROF. DR. MUHİTTİN ABDULKADİR SERDAR
Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Biyobenzer ilaçlar = Biosimilar drugs ; Fizikokimyasal özellikler = Physicochemical properties ; Kapiler elektroforez = Capillary electrophoresis ; Stres = Stress ; Yüksek basınç sıvı kromatografisi =   ; İlaç formülleri = Formularies ; İlaç üretimi = Drug production

Özet:
Biyobenzerler ve orijinatörlere stres uygulanarak, klinik çalışmalardan önce önemli bilgiler elde edilebilmektedir. Bu çalışmada, dondurma/çözme döngüsü, termal, oksidasyon, ve asidik/bazik pH stresi uygulanan biyobenzer ve orijinatör tümor nekroz faktörü (TNF-α) örneklerinde degradasyon ürünlerinin değişimi, CE-SDS, SE-UPLC, icIEF ve UPLC-ESI-QToF-MS yöntemleri ile araştırılmıştır. Stres uygulanan örnekler, ANOVA ve Dunnett'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak, stres uygulanmamış kontrol örnekleriyle karşılaştırılmıştır. Ayrıca, degradasyon oranını karşılaştırmak için, stres boyunca değişen mAb miktarı kullanılarak oluşturulan lineer eğrilerin eğimleri istatistiki olarak karşılaştırılmıştır. Termal stres 50°C'de uygulandığında %monomer değişimleri, biyobenzer ve orijinatör arasında anlamlı farklılık (P=0,32) göstermemiştir. Termal stres ile asidik varyantlar, biyobenzer (%23,1) ve orijinator (%23,0) ürünlerinde anlamlı artış göstermişlerdir. Asidik varyant değişimlerinin Asn deamidasyonu ve N-terminal pE oluşumu ile ilişkili olduğu belirlenmiştir. Kimyasal oksidasyon stresi uygulaması sonrasında ürünlerin parçalanma eğiliminde olduğu gözlenmiştir. Stres sonunda bütün IgG, biyobenzer ve orijinatör için, sırasıyla, %34 ve %41 oranında azalmıştır. IgG'lerin Fc bölgesindeki Met256 ve Met432 yüksek oranda (<%98) okside olurken, CDR bölgesinde bulunan Met34'te, iki üründe de, <%83 oranında oksidasyon görülmüştür. Asidik pH 3,0 koşulunda iki ürün de degrade olurken, Bazik pH 9,0 koşulunda iki üründe de yüksek oranda anlamlı asidik yük artışı (<%31) görülmüştür (P=0,27). Asidik yük artışının Asn deamidasyonuna bağlı olduğu ve çok etkilenen bölgenin HC:T35 olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma sonucunda, biyobenzer ürünün geliştirilmesinde kullanılabilecek, orijinatör ve biyobenzer ürünlerin degradasyon mekanizmaları hakkında değerli bilgiler elde edilmiştir.

Abstract:
Prior to clinical trials, stress treatment to biosimilars and originators might yield valuable information. In this study, the degradation product changes in freeze/thaw cycle, thermal, oxidation, and acidic/basic pH stress applied to biosimilar and originator tumor necrosis factor (TNF-α) samples were investigated by CE-SDS, SE-UPLC, icIEF, and UPLC-ESI-QToF-MS. Stressed treated samples were compared with unstressed control samples using ANOVA and Dunnett's Multiple Comparison test. Also, to compare the degradation rate, the slopes of the linear curves generated using the changing amount of mAb during the stress were compared statistically. The percent monomer changes between the biosimilar and the original were similar at 50°C (P=0.32). Thermal stress raised acidic variant levels in biosimilar (23.1%) and originator (23.1%) products. Acidic variant alterations were associated to Asn deamidation and N-terminal pE. After oxidation stress, intact IgG levels decreased by 34% and 41% for the biosimilar and the original, respectively. While Met256 and Met432 in the Fc region of IgGs were extensively oxidized (<98 %), Met34 in the CDR region of both products was oxidized at an <83 %. Both products were degraded excessively at acidic pH 3.0 conditions. Both products significantly increased the acidic content (<31%) in the basic pH 9.0 condition (P=0.27). The elevated acidic variants was determined to be caused by Asn deamidation, with HC:T35 being the most affected location. As a result of this study, valuable information has been obtained about the originator and degradation mechanisms of biosimilar products, which can be used in the development of biosimilar products.