L-asparaginaz içeren biyobozunur şekil hafızalı stent-enzim ilaç formülasyonlarının hazırlanması ve karakterizasyonu
The preparation and characterization of biodegradable shape-memory stent-enzyme drug formulation including L-asparaginase
Yazar: AHMET ULU
Danışman: PROF. DR. BURHAN ATEŞ
İnönü Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Biyopolimerler = Biopolymers ; Kopolimerler = Copolymers ; İmmobilize enzimler = Immobilized enzyme

Özet:
L-asparaginaz (L-ASNaz), Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) hastalığının tedavisinde kullanılan birincil kemoterapötik ilaçtır. Hastalara immün yanıtın azaltılması için, L-ASNaz'ın polietilen glikol (PEG) ile modifiye edilmiş formu uygulanmaktadır. Ancak, bu enzim ilacın plazma yarı ömrünün kısa ve pahalı olması yüzünden kullanımı ve erişilebilirliği kısıtlıdır. Bu noktada ALL tedavisinde karşılaşılan sorunları çözmek için yeni yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. Biyobozunur stentler son zamanlarda biyouyumlulukları ve zamanla bozunarak yok olmaları bakımından gelecek vaat eden uygulamalardır. 
Tez kapsamında öncelikle kitosan (CHI), gliserol (GLY), polietilen glikol (PEG), polipropilen glikol (PPG) ve polivinil alkol (PVA) monomerlerinden yola çıkarak CHI/GLY/PEG, CHI/GLY/PPG ve CHI/GLY/PVA temelli hidrojeller hazırlanmış ve çapraz bağlayıcı ajan (sodyum tripolifosfat) ile biyobozunur stent formuna dönüştürülmüştür. Stentlerin yapısal ve termal karakterizasyonları FTIR, DTA, TGA ve DSC ile belirlenmiştir. Bunun yanı sıra hazırlanan stentlerin şişme derecesi, su tutma kapasitesi, gaz geçirgenliği, in vitro biyobozunurluğu ve sıvı temas açıları belirlenmiştir. Daha sonra hazırlanan hidrojellere L-ASNaz enzimi in situ olarak immobilize edilmiş ve enzim konsantrasyonu, immobilizasyon süresi, çapraz bağlayıcı oranı ve çapraz bağlama süreleri incelenerek en uygun stent formülasyonu belirlenmiştir. Seçilen en uygun biyobozunur stentlerin in vitro biyouyumlulukları ASTM standartlarına göre L929 hücreleri üzerinde araştırılmıştır. Ayrıca, protein adsorpsiyonu, porozitesi ve mekanik özellikleri incelenmiştir. Hazırlanan bu stentlerdeki enzimin varlığı (FTIR, EDX, XRD) etkinliği ve optimum parametreleri (pH, sıcaklık, termal kararlılık, depo kararlılığı, yeniden kullanılabilirlik vb.) ayrıntılı olarak çalışılmıştır. Son olarak, stent-enzim ilaç formülasyonun in vitro damar akış koşullarında uygulanabilirliği mimetik olarak dizayn edilen biyoreaktör sisteminde test edilmiştir.
Sonuçlarımıza göre, CHI/GLY/PEG-3@L-ASNaz, CHI/GLY/PPG-4@L-ASNaz ve CHI/GLY/PVA-4@L-ASNaz stent formülasyonlarının damar akış koşullarında başlangıç aktivitelerinin yarısından fazlasını koruduğu görülmüştür. Ayrıca enzim içeren şekil hafızalı polimerik stent formülasyonlarının biyouyumluluk, biyobozunurluk ve yeterli mekanik karaktere sahip oldukları tespit edilmiştir. Buna ilaveten formülasyonların pH ve termal kararlılığı, yeniden kullanılabilirliği ve uzun süreli depolama kararlılığının umut verici düzeyde olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
L-asparaginase (L-ASNase) is the primary chemotherapeutic drug used in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL). To reduce the immune response in patients, the modified form of L-ASNase with polyethylene glycol (PEG) is applied. However, usage and accessibility of this enzyme has limited due to its short plasma half-life and expensive. At this point, it is needed novel approaches to solve the problems encountered in the treatment of ALL. Biodegradable stents are promising applications for their biocompatibility and degradation over time.
Within the scope of the thesis, firstly, hydrogels with CHI/GLY/PEG, CHI /GLY/PPG and CHI/GLY/PVA based on chitosan (CHI), glycerol (GLY), polyethylen glychol (PEG), polypropylene glychol (PPG) and polyvinyl alchol (PVA) were prepared and biodegradable stents with cross-linking agent (sodium tripolyphosphate) were obtained. Structural and thermal characterizations of the stents were determined by FTIR, DTA, TGA and DSC. In addition, the degree of swelling, water uptake capacity, gas permeability, in vitro biodegradability and water contact angles of the prepared stents were determined. Then, L-ASNase enzyme was immobilized on the stents as in situ and the optimal stent formulations were determined by examining enzyme concentration, immobilization time, crosslinker ratio and crosslinking times. In vitro biocompatibility of the optimal biodegradable stents was investigated on L929 cells according to ASTM standards. In addition, protein adsorption, porosity and mechanical properties were investigated in these stents. Presence of enzyme in these prepared stents (FTIR, EDX, XRD) and optimum parameters (pH, temperature, thermostability, storage stability, re-usability etc.) were studied in detail. Finally, the applicability of the stent-enzyme drug formulation in in vitro vessel flow conditions was tested in a mimetic designed bioreactor system.
According to our results, CHI/GLY/PEG-3@L-ASNase, CHI/GLY/PPG-4@L-ASNase and CHI/GLY/PVA-4@L-ASNase stent formulations maintained more than half of their initial activity under vascular flow conditions. In addition, it has been found that the shape memory polymeric stent formulations containing enzyme have biocompatibility, biodegradability and sufficient mechanical character. Additonally, the pH and thermostability, reusability and long-term storage stability of the formulations were determined to be promising.