Ege denizi doğal ve kültür (levrek ve çipura) balıklarından izole edilen vibrio listonella) anguillarum,v. alginolyticus türlerinde kinolon ile tetrasiklin grubu ilaç direncinin pcr yöntemiyle araştırılması
Detection of quinolone and tetracyline resistance in vibrio (listonella)anguillarum, vibrio alginolyticus strains isolated from cultured (seabream and sea bass) and wild fish in aegean sea by PCR
Yazar: FARAH GÖNÜL AYDIN
Danışman: PROF. DR. EMİNE BAYDAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Balıklar = Fishes ; Balıkçılık = Fisheries ; Ege Denizi = Aegean Sea ; Levrek balığı = Sea bass ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Vibrio = Vibrio ; Vibrio anguillarum = Vibrio anguillarum ; Çipura balığı = Seabream ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Çoklu doymamış yağ asitleri yönünden zengin olan balık, insanlar için önemli bir besin kaynağıdır. Türkiye İstatistik Kurumu 2015 yılı verilerine göre Türkiye'de su ürünleri üretimi 607,515 tondur. Ülkemiz levrek (Dicentrarchus labrax) ve çipura (Sparus aurata) üretiminde Akdeniz ülkeleri arasında üçüncü, alabalık (Oncorhynchus mykiss) üretiminde ise birinci sırada yer almaktadır. Su ürünleri yetiştiriciliğinde karşılaşılan en önemli sorunlardan biri hastalıkların neden olduğu ekonomik kayıplardır. Ülkemizde ve Avrupa Birliği Ülkelerinde balık hastalıklarını tedavi etmek için kullanılan ruhsatlandırılmış 7 adet etken maddeyi içeren çok sayıda antibakteriyel preparat bulunur; bunların arasında kinolon ve tetrasiklin grubu preparatlar önemli bir yer tutmaktadır. Ancak, özellikle su ürünleri yetiştiriciliğinde bilinçsiz ve yaygın antibiyotik kullanımı, su ortamı ve sedimentte antibiyotiklerin uzun süre etkin şekilde kalmasına ve mikroorganizmalarda direnç gelişmesine neden olur. Dirençli mikroorganizmalar su ortamındaki farklı tür balıklara ve diğer su canlılarına geçerek ekolojik dengenin bozulmasına ve bunları tüketenlerde çeşitli sağlık sorunlarının ortaya çıkmasına yol açar. Sağlığın, doğal ortamın ve tür çeşitliliğinin korunması tüm Dünya'nın önemsediği ve üzerinde durduğu konulardır. Bu nedenle bakterilerdeki antibiyotik direncini belirlemeye yönelik Türkiye'de ve Dünya'da kontrollü yetiştiricilik ortamında yapılmış pek çok araştırma bulunmaktadır. Buna karşılık, doğal ortam balıklarındaki antibiyotik direncine yönelik hemen hemen hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Türkiye'deki araştırmaların çoğu kültür balıklarında konvansiyonel (disk difizyon, brot dilusyon) yöntemle yapılan çalışmalardır. Ancak, son yıllarda bu bağlamda özellikle antibakteriyel direncin belirlenmesinde daha hassas ve etkin olan PCR yöntemi üzerinde durulmaktadır. 
Bu araştırmada, Ege denizinde yetiştiriciliği en çok yapılan kültür balığı (Levrek ve Çipura) ile doğal avlanan balıklardan Vibrio (Listonella) anguillarum ve Vibrio alginoliticus etkenlerinin izolasyonu ve identifikasyonu (konvansiyonel- biyokimyasal ve genotipik) yapılarak belirlenen izolatların tetrasiklin ve kinolon grubu ilaçlara karşı oluşan direncin klasik PCR yöntemle tespit edilmesi ve izole edilen bu etkenlere karşı gelişen direnç haritasının örnekleme alanı ve belirlenen balık türleri üzerinden çıkarılması amaçlanmıştır. Bu şekilde hızlı ve güvenilir alternatif antibakteriyel ilaç seçeneklerinin uygulamaya konularak antibakteriyel ilaçlardan kaynaklanan direncin sağlık ve çevreye yönelik etkilerinin en aza indirilmesi hedeflenmiştir. 
Örnekler su sıcaklığının değiştiği Mart-Ağustos tarihleri arasında kafes balığı yetiştiriciliği yapılan işletmelerden (120 levrek, 120 Çipura) ve serbest avlanan balık numuneleri 82 (40 levrek, 42 Çipura) adet olacak şekilde alınmıştır.
Etkenlerin idendifikasyonu klasik biyokimyasal yöntemlerle tespit edilmiş olup 14 adet kafes, 12 adet avlanan balık örneklerinden V. anguillarum; 49 adet kafes, 26 adet avlanan balık örneklerinden V. alginolyticus izole edilmiştir. Yapılan türe spesifik moleküler etken identifikasyonunda 12 adet kafes, 5 adet avlanan balık örneklerinden V. anguillarum; 42 adet kafes, 19 adet avlanan balık örneklerinden V. alginolyticus olarak identifiye edilmiştir.
Araştırmada seçilen antibiyotiklere karşı gelişen direnci ve etkili antibiyotiğin belirlenmesi için klasik metot olan disk diffüzyon yöntemi yapılmış olup, avlanan çipura balıklarında tetrasiklin direnç tespit edilirken kafesten alınan örneklerde enrofloksasine duyarlılık oksolinik asite olan duyarlılıktan daha fazla olduğu bulunmuştur. Etkili dozun belirlenmesinde mikroplaka dilüsyon yönteminden yararlanılmıştır. Üremenin gözlenmediği plak işaretlenerek o ilacın MİK değeri belirlenmiştir. Yapılan analiz sonucunda V. alginolyticus MİK değerleri ortalaması OTC, OXO ve ENR için sırasıyla 4,1, 0,3 μg/mL ve V. anguillarum için 4,2,0,5 μg/mL'tir.
Direncin çevredeki boyutu ve dağılımının tespiti için yapılan moleküler testlerde özellikle Vibrio spp. 'lerde kinolon grubu ilaç direncine neden olan kromozomal mutasyon tespit edilmiştir. Alınan örneklerin 6 tanesinde gyrA 83. kodonda meydana gelen mutasyona ve 1 örnekte parC 85. kodonda meydana değişim nedeniyle direnç geliştiği tespit edilmiştir. Sağaltımda yoğun olarak kullanılan ve etkinliğini uzun süre devam ettiren tetrasiklin grubu ilaçlarda direncin tespiti için Vibrio spp. 'lerde effluks pompasında mutasyona neden olan tetA, tetB ve tetD; ribozomal korunmada mutasyona yol açan tetM genleri araştırlmış olup, yapılan diğer çalışmalara paralel tetA en fazla olmakla birlikte bunu tetB ve tetM takip etmektedir. Çoğu örnekte gen çiftleri halinde direnç tespit edilmiştir. 
Diğer örneklerde de özellikle kinolon grubu ilaçlarda (OXO ve ENR) tespit edilen MİK ve disk difüzyon sonuçlarının moleküler yöntemle tespit edilen sonuçla örtüşmemesi direnç aktarımının kromozomal direncin yanı sıra plazmid aktarımlı (qnr) ya da çoklu ilaç (mar) direncinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Yapılacak diğer çalışmalarda bu sorunun yanıtı alınmaya çalışılacaktır.
Sağaltımda kullanılan antibiyotik ilaca paralel olarak direncin arttığı özellikle avlanan balıklarda da direnç genlerinin tespit edilmesi ve çoklu olarak bulunması gelişen direnç için gerekli önlemlerin alınmasını zorunlu hale getirmiştir.

Abstract:
Fish is an important source of food in human health, due to its rich content in polyunsaturated fatty acids. According to data from Turkish Statistics Institute in 2013, the production rate of aquaculture products is 607.515 tonnes. Turkey stands as the third country among Mediterranean region in the production of seabass (Dicentrarchus labrax) and gilt-head seabream (Sparus aurata); while first in the production of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). The most important loss in aquacultural production is related to the economical loss due to diseases. For the treatment of fish diseases, 7 active compounds and several antibacterial preparations are licensed in our country and European Union. Among these compounds, quinolone and tetracyclines are the most well known and important ones. Meanwhile, due to the unprudent and widespread use of antibiotics, lead accummulation of antibiotics in water environment and sediment for a long period of time leading resistance in the target and nontarget microorganisms. Resistant microorganisms are transferred to other fish species and aquatic organisms leading alteration of the ecological balance and cause health problems among the consumers. Conservation of health and species diversity is paid attention with an intente importance all around the world. Therefore, various studies are available for the detection of antibiotic resistance in bacteria in Turkey and globally; meanwhile there are few studies regarding the wild fishes. Studies available in Turkey were mostly conducted in cultured wish with conventional methods such as disk diffusion and broth dilution; while much susceptible and reliable molecular methods such as PCR are applied globally.
Samples of sea bass and gilt-head seabream as the most common cultured fishes in Aegean region and wild fishes are collected for the isolation of Vibrio (Listonella) anguillarum, and Vibrio alginoliticus isolation and identification (conventional-biochemical and genotypical) to test the tetracyclin and quinolon resistance using PCR and develop a resitance map for the tested fish species in the region. With this research, screening of the resistance with fast and reliable methods for selecting the most reliable antibacterial drug options would be evaluated; where the undesirable effects of these resistance on health and environment would be minimised.
82 samples (40 seabass and 42 gilt-head seabream) were collected from cage breeders and wild cought fishes at 30.10-03.11.2015; 07-17.04.2015; 15-27.06.2015 and 24.08-07.09.2015 dates where different temperatures are recorded. 
Identification of the bacteria were conducted using classical biochemical methods; where V. anguillarum was isolated from 14 cage, 12 wild caught fishes; V. alginolyticus was isolated from 35 cage and, 23 wild caught fishes. According to species specific identification V. anguillarum was identified from 12 cage, 5 wild caught fishes; where V. alginolyticus  was identified from 29 cage and 19 wildcaught fishes. The common method for the selection of drugs in the field, disk diffusion used in the study revealed that wild caught gilthead seabream have tetracyclin resistance; whereas cage bred ones were more susceptible to oxolinic acid than to enrofloxacin. In order to identify the effective concentration microplate dilution was used; where MIC values were found for OTC, OXO and ENR as 4, 1 and 0.5, μg/mLrespectively for Vibrio alginolyticus ve 4,2,0,5 μg mL− Vibrio (Listonella) anguillarum.
Molecular tests revealed the chromosal mutation leading qunolone resistance isolated from Vibrio spp. Mutations in the 83th codon of gyrA was present in 6 samples where a mutation in the 85th codon in parC was present in 1 sample. Efflux resistance genes of tetA, tetB and tetD, along with tetM for ribosomal mutation were tested for tetracycline resistance, the most common used antibiotic in aquaculture production having long lasting effects; where tetA was found the most similar to other studies followed by tetB and tetM. Most samples were positive for these tet genes as couples.
Along with its widespread antibiotic use, resistance were found to have increased; where detection of resistance genes in wild caught animals as multiple resistance genes lead to intensive precautionary measures to be taken seriously compulsory.