Hipoksi ortamının hiyalüronan ekspresyonuna etkisinin  
in vitro koşullarda araştırılması
The investigation of the effects of hypoxia on hyaluronan expression in vitro conditions
Yazar: MUAZZEZ DERYA ANDEDEN
Danışman: DOÇ. DR. METİN AYTEKİN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: HIF = HIF ; HIF-1a = HIF-1a ; Hipoksi = Hypoxia ; Hyalüronik asit = Hyaluronic acid ; Rapamisin = Rapamycine

Özet:
HİPOKSİ ORTAMININ 
HİYALÜRONAN EKSPRESYONUNA ETKİSİNİN 
İN VİTRO KOŞULLARDA ARAŞTIRILMASI 



Muazzez DERYA ANDEDEN
Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı
Yüksek Lisans Tezi, Ocak 2016
Danışman: Doç. Dr. Metin AYTEKİN

ÖZET
Hiyalüronan, bağ dokuyu bir arada tutma,  hücre davranışını düzenleme, yara iyileşme süreci ve inflamasyon gibi bir çok hücresel olayda yer alan bir ekstraselüler matriks bileşenidir. Spesifik hücre yüzey reseptörlerine bağlanarak pek çok sinyal yolağının transdüksiyonunu indükler. Hiyalüronan üretimi farklı büyüme faktörlerinden doza bağlı bir şekilde etkilenir ancak hipoksi gibi stres faktörlerinin bu üretim üzerindeki etkisi hakkında literatürde yeterli bilgiye rastlanmamıştır. Bu tez çalışmasında, ilk olarak elimizde var olan hücre hatlarından hiyalüronan üretimi yapan hücre hattı seçildi. Bu hücre hattı için hipoksi ortamı oluşturuldu. Hipoksi koşulunun ve bir transkripsiyon faktörü olan ve hipokside aktif hale geçen hipoksi ile indüklenen faktör 1-alfa (HIF-1α)'nın hiyalüronan üretimi üzerindeki etkisini araştırmak için ELİSA yöntemi ile hücrelerden salgılanan hiyalüronan  miktarı belirlendi. MDA-MB-231 hücre hatları tezimiz için seçildi (24 saat inkübasyon için süpernatanttaki hiyalüronan miktarı (ng/ml, ortalama±SS): MDA-MB-231 25.17±2.06, kontrol 8.42±0.54; p<0.00001). Normoksi ve hipoksi ortamlarında HIF-1α'nın hiyalüronan sentezine MDA-MB-231 hücre hatları üzerine etkisi araştırıldı. Hipoksi ortamda HIF-1α'nın arttığı ve orantılı olarak hiyalüronan sentezinin de arttığı ve HIF-1α'yı Px478 inhibitörü ile baskılandığımızda hiyalüronan sentezinin de baskılandığı belirlendi (süpernatanttaki hiyalüronan miktarı (ng/ml, ortalama±SS): MDA-MB-231 (Hipoksi) 60.00±0.7, MDA-MB-231 (Hipoksi+Px478)  45.00±0.5; p<0.05). Hipoksi koşulunda hücrelerde hiyalüronan seviyesindeki değişikliğin mTOR ile ilişkili olduğu belirlendi (süpernatanttaki hiyalüronan miktarı (ng/ml, ortalama±SS): Rapamisin (-) 25.2±0.54, Rapamisin (+) 10.02±0.87; p<0.05] ve hipoksi koşullarda [süpernatanttaki hiyalüronan miktarı (ng/ml, ortalama±SS): Rapamisin (-) 58.0±2.2, Rapamisin (+) 40.02±2.0; p<0.05).
Tüm sonuçlar değerlendirildiğinde, hipoksi koşulunda normoksi koşuluna göre hiyalüronan üretiminin anlamlı derecede arttığı ve HIF-1α'nın bu artışı inhibe ettiği tespit edildi. Bununla birlikte mTOR baskılanmasının da hiyalüronan sentezini negatif yönde etkilediği belirlendi. mTOR, HIF-1α ve hiyalüronan molekülleri arasında muhtemel mekanistik bir ilişkinin olduğu sonucuna varıldı.

Anahtar Kelimeler: Hiyalüronan, Hipoksi, Hipoksi İle İndüklenen Faktör 1-Alfa (HIF-1α), Memeli Rapamisin Hedefi (mTOR)

Abstract:
THE INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF HYPOXIA ON HYALURONAN EXPRESSION IN VITRO CONDITIONS

Muazzez DERYA ANDEDEN
Erciyes University, Graduate School of Health Sciences
Department of Medical Biology
M.Sc. Thesis, January 2016
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Metin AYTEKİN

ABSTRACT


Hyaluronan is one of the most important components of the extracellular matrix and has been reported to be involved in regulation of cell behavior, wound healing process and inflammation. It induces a variety of cellular signal transduction binding to specific cell surface receptors. Hyaluronan production is affected from different growth factors in dose-dependent manner. However, little is known about the effect of cellular stress conditions such as hypoxia on hyaluronan production. In this study, hyaluronan-expressing cell lines were selected first and then cell culture studies were started ensuring suitable growth conditions for this cell line. MDA-MB-231 cell line was selected for further studies (hyaluronan in supernatant at 24 hour: (ng/ml, mean±SD): MDA-MB-231 25.17±2.06, control 8.42±0.54; p<0.00001). The hypoxia condition was provided using cobalt chloride and hyaluronan secreted from cells was measured by ELISA analysis to determine the effect of hypoxia and hypoxia inducible factor-1 alpha on hyaluronan production. HIF-1α and hyaluronan increased in hypoxia conditions, while hyaluronan synthesis was supressed when we inhibit HIF-1α with PX-478 (hyaluronan in supernatant (ng/ml, mean±SD): MDA-MB-231 (Hypoxia) 60.00±0.7, MDA-MB-231 (Hypoxia+Px478)  45.00±0.5; p<0.05). A relation was determined between mTOR and changes in hyaluronan levels in hypoxia (hyaluronan in supernatant (ng/ml, mean±SD): Rapamycin (-) 25.2±0.54, Rapamycin (+) 10.02±0.87; p<0.05] and in hypoxia [supernatant hyaluronan (ng/ml, mean±SD): Rapamycin (-) 58.0±2.2, Rapamycin (+) 40.02±2.0; p<0.05).
In summary, it is reported that hyaluronan production is significantly increased in hypoxia compared to normoxia and HIF-1α inhibits this production. On the other hand, inhibition of mTOR negatively affects hyaluronan synthesis.This relationship between these three molecules provides an understanding of the molecular mechanism of hyaluronan and will contribute to the literature.

Keywords: Hyaluronan, Hypoxia, Hypoxia Inducible Factor 1-Alpha (HIF-1α), Mammalian Target of Rapamycin (mTOR)