Pro-apoptotik ve anti-apoptotik proteinlerin EGCG ile tetiklenen apoptoz mekanizmasındaki rollerinin HCT-116 kolon kanser hücrelerinde incelenmesi
Investigation of pro-apoptoti?c and anti-apoptotic proteins in the apoptotic mechanism triggered by egcg in HCT-116 colon cancer cells
Yazar: AYŞENUR ÇATALER KARAKUŞ
Danışman: PROF. DR. A.SEMRA KOÇTÜRK
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Epigallokateşin = Epigallokatechin ; Epigallokateşin gallat = Epigallokatechin gallate ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Yeşil çay ekstraktı olan EGCG kolay elde edilebilen, ucuz ve toksik olmayan katekin türevi bir polifenol bileşiğidir. Çeşitli kanser hücrelerinde programlı hücre ölümünü tetikleyebildiğinden kemoterapötik ajan olarak kullanımı yoğun olarak araştırılmaktadır. Buna rağmen EGCG'nin etkisi hücre tipine göre değişkenlik göstermektedir ve apoptoz mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır. Özellikle kolon karsinoma üzerinde gerçekleştirilen çalışmalar oldukça kısıtlıdır ve henüz EGCG'nin kolon kanserinde pro- ve anti-apoptotik genlerin ekspresyon profiline etkisini gösteren bir çalışma mevcut değildir. Bu bilgiler ışığında bu çalışmada, kolon karsinoma hücrelerinde apoptozu tetikleyen dozda EGCG'nin pro- ve anti-apoptotik genlerin ekspresyonlarına etkisi, artış gösteren ve apoptotik süreçte önemli rol oynayan proteinlerin mRNA düzeyinde susturulması ile bu proteinlerin apoptotik süreç açısından öneminin incelenmesi amaçlanmıştır. Bunun yanısıra EGCG'nin prooksidan özelliği ile hücrede oluşturduğu oksidatif etkinin hücre içi reaktif oksijen düzeyinin ölçülmesi ile incelenmesi amaçlanmıştır.Bu amaç doğrultusunda çalışmada HCT-116Bax+/+ ve HCT116Bax-/- insan kolorektal tümör hücre hatları kullanıldı. EGCG'nin hücre canlılığı üzerine etkisi MTT yöntemi ile, hücre ölüm tipi ve yüzdesi akış sitometrik analiz ile belirlendi. İntrensek ve ekstrinsik apoptotik yolakta görevli kazpazların protein ekspresyon değişimleri western-blot analizi ile incelendi. EGCG'nin pro- ve anti-apoptotik gen ekspresyon düzeylerine etkisi Real-Time PZR yöntemi ile belirlendi. İntrensek ve ekstrinsik apoptoz yolaklarının başlatıcı kaspazları olan kaspaz-8 ve kaspaz-9 genleri susturulmak üzere seçildi ve EGCG'nin etkinliğinde kaspaz-8 ve -9'un önemi incelendi. EGCG'nin hücrede oluşturduğu oksidatif etki oluşan reaktif oksijen türevlerinin akış sitometrik analizi ile saptandı.Elde edilen gen ve protein ekspresyon analiz verileri değerlendirildiğinde EGCG'nin apoptotik etkisini ağırlıklı olarak kaspaz 8 enzim aracılı ekstrinsik yolak ile gösterdiği ancak kaspaz 9 enzim aracılı intrinsik yolağın dolaylı olarak apoptotik etkiyi güçlendirdiği ve etkide EGCG'nin oluşturduğu hücre içi ROT'ların da etkin olduğu öngörülmektedir.Anahtar Sözcükler: EGCG, Kolon kanseri, İntrinsik apoptoz, Ekstrinsik apoptoz

Abstract:
EGCG, a catechin derivative polyphenol, exist in green tea, is easy-to-handle and non-toxic. Its potential chemoteraputic usage is studied recently because it is ability to trigger programmed-cell death. However, its effect may change according to cell type and apoptotic mechanism has not been explained yet. Especially, the sudies on colon carcinoma are limited and any study about the effect of EGCG on pro-and apoptotic gene expression profile does not exist yet. According to this information, in this study, it is aimed to reveal the effects of apoptosis-triggering dose of EGCG on pro-and apoptotic gene expression and to investigate the importance of overexpressed apoptotic proteins by gene-silencing. Beside of this, oxidative influence of EGCG, produced in a cell by its prooxidant property, was intended for measurement with rective oxygen species.On this aim, HCT- 116Bax+/+ ve HCT116Bax-/- human colorectal tumor cell lines were used in the study. The effect of EGCG on cell viability is determined with MTT method, cell death type is examined by flow cytometric analyses. The changes in protein expression levels of caspases is determined by western-blotting method. The effect on pro-and apoptotic gene expression is analysed by Real-Time PCR method. The initiator caspases of intrinsic and extrinsic apoptosis pathways, caspase-8 and caspase-9 is selected for gene-silencing by siRNA. Reactive oxygen species produced by oxidative effects of EGCG was determined by flow cytometry.According to obtained gene and protein expression data, it is claimed that the apoptotic effect of EGCG occurs via caspase 8 enzyme-mediated extrinsic pathway, but caspase 9 enzyme-mediated intrinsic pathway enhances this effect indirectly and intracellular ROS production by EGCG has also roles in the mechanism.Key Words: EGCG, Colon cancer, Intrinsic apoptosis, Extrinsic apoptosis