DNA dizilerinin tayinine yönelik uygulama seti (kit) tipinde elektrokimyasal nanobiyosensörlerin tasarımı
Design of electrochemical nanobiosensors in the application kit type for the determination of DNA sequences
Yazar: HASRET SUBAK
Danışman: DOÇ. DR. DİLŞAT ARIKSOYSAL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyosensörler = Biosensors ; Dizi analizi-DNA = Sequence analysis-DNA ; Dönüşümlü voltametri = Cyclic voltammetry ; Elektrokimya = Electrochemistry ; Laboratuvarlar = Laboratories ; Mikroskopi-elektron taramalı = Microscopy-electron scanning ; Nanoteknoloji = Nanotechnology ; Nanotüp = Nanotube ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
DNA'nın keşfi, moleküler biyolojideki gelişmeler ve nanoteknolojide elde edilen yeni buluşlar ile günümüze kadar birçok farklı çalışma esasına sahip farklı biyosensörler geliştirilmiştir. Hızlı, hassas, uygun maliyetle DNA analizi yapabilen biyosensör sistemleri, halihazırda kullanımı mevcut tayin sistemlerine alternatif olarak gösterilmektedir. 
Dünya sağlık örgütü verilerine göre antibiyotik direnci; her yıl 700.000 kişinin ölümüne sebep olmaktadır. Bu sayının herhangi bir alınamaması durumunda 2050 yılına kadar antibiyotik direnci nedeniyle tedavi edilemeyerek ölen kişi sayısının 10 milyona kadar artacağı tahmin edilmektedir. Bu çalışmada, antibiyotik direnci kaynaklı ölümlerin %50'sinden fazlasından sorumlu olan karbapenemaz enzimine ait gen bölgesinin analizi, tasarımı yapılan kit tipindeki nanobiyosensörle gerçekleştirilmiştir. Karbapenemaz enzimine sahip bakterilerde, ilgili antibiyotiğe karşı direnç gelişimi görülmektedir. β-laktam grubundaki bu enzimin etki mekanizması, kullanılan antibiyotiğin hidrolize edilmesi yoluyladır. Direnç gelişiminde Karbapenemaz enziminin kodlanmasından sorumlu direnç genlerinin farklı tür patojen gruplarına aktarımı da söz konusudur.  Bu durum çoklu antibiyotik direncine yani antibiyotik direncinin katlanarak artmasına sebep olmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında direnç genlerinden OXA-48 ve VIM gen bölgelerinin tayini için elektrokimyasal biyosensör tasarımı yapılmıştır. 
Çalışmanın ilk aşamasında, geliştirilen biyosensörün iletkenliği ve yüzey alanının arttırılması için sensördeki algılama birimine karbon nanotüp (CNT) modifikasyonu dönüşümlü voltametri tekniği kullanılarak geçekleştirilmiştir. En uygun yüzey modifikasyon koşullarının bulunmasından sonra, tayini yapılacak direnç genlerine (OXA-48 ve VIM adlı spesifik gen bölgeleri) ait 23 nükleotit içeren sentetik DNA dizileri ile tek kullanımlık sensör yüzeyleri hazırlanmıştır. Nanomalzeme içeren sensör yüzeyine DNA tutturulması için sentetik prob dizileri NH2 işaretli olarak ve enzime dayalı hibridizasyon tayininin sağlanması için ise sentetik hedef dizileri biyotin işaretli olarak kullanılmıştır. Bu dizilere ilişkin hibritleşme özelliklerinin kontrolü, agaroz jel elektroforezi yöntemiyle gerçekleştirilmiştir.  
Çalışmada, CNT modifiye sensör yüzeyine prob dizilerinin kovalent yolla immobilizasyonundan sonra hibridizasyon gerçekleştirilmiş, avidin-biyotin afinitesi ve enzime dayalı tayin tekniği kullanılarak α-naftol sinyali ölçülmüştür. Elde edilen yüksek α-naftol sinyali, hibritleşmenin varlığını kanıtlamaktadır. Elde edilen bulgular doğrultusunda hibritten elde edilen sinyal, prob dizisine ait sinyale göre 7 kat farklanma sağlamıştır. Ayrıca yapılan modifikasyon sonucu; nanomalzeme modifye edilmeyen elektroda göre elde edilen hibrit sinyali, nanobiyosensörle 3 kat artış göstermiştir. Tasarımı yapılan biyosensörün daha sonra analize yönelik en uygun koşulları (hedef konsantrasyonu, hibridizasyon süresi, hibridizasyon sonrası sensör yüzeyinin yıkanma süresi, sensör seçimliliği, en düşük tayin sınırı ve tekrarlanabilirlik vb.) bulunmuştur. Ayrıca sensör yüzeyinin karakterizasyonu, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile değerlendirilmiştir.
Antibiyotik direnci analizine yönelik geliştirlen nanobiyosensörün kit sistemine dönüştürülmesi için, çalışmanın son aşamasında sentetik prob dizileri immobilize edilen nanomalzeme modifiye elektrotlar hazırlanarak, uygun saklama koşullarında bekletilmiştir. Günler arası yapılan ve sentetik DNA içeren çalışmalarda, hedef dizilerinin doğrudan tayini kit-tipindeki biyosensörle 30 dakikada gerçekleştirilmiştir. Çalışmada ayrıca kullanıma hazır kit tipi biyosensör ile OXA-48 ve VIM'e ait simetrik ve asimetrik polimeraz zincir tepkimesi (PZT) ürünlerinin tayini de yapılmıştır. Gerçek örnek analizinde PZT ürün tayini için en uygun şartların bulunmasından sonra, geliştirilen biyosensörün 150 gün sonrasında bile hassas gen analizi yapabildiği bulunmuştur. Çalışmanın tüm aşamalarında nanobiyosensörle aynı şartlarda hazırlanmış fakat nanomalzeme içermeyen biyosensörle de tayin sağlanarak karşılaştırmalar yapılmıştır. Nanomalzeme modifikasyonunun etkisi sayesinde geçen süreye rağmen hassas tayin sağlanabilmiş ve tayin sınırı 2,50 pikomol/50µL olarak hesaplanmıştır. Geliştirilen kit tipi nanobiyosensörle DNA temelli antibiyotik direnç geni analizi yapılarak klasik tayin yöntemlerine yeni bir alternatif getirilmiştir.

Anahtar Kelimeler; Antibiyotik direnci, kit, elektrokimyasal DNA nanobiyosensör,
karbon nanotüp, polimeraz zincir tepkimesi (PZT), taramalı elektron mikroskobu
(SEM)

Abstract:
The discovery of DNA, developments in molecular biology and new discoveries in nanotechnology have led to the development of different biosensors with many different working principles. Biosensor systems that can perform fast, sensitive, cost-effective DNA analysis are shown as an alternative to the present systems.
According to World Health Organization data, antibiotic resistance causes the death of 700.000 people every year. Unless a solution is provided; it is estimated that the number of people who died due to antibiotic resistance by 2050 will increase up to 10 million. In this study, gene regions that transmit the resistance mechanism of carbapenemase enzyme which responsible for more than 50% of antibiotic resistance deaths were investigated. The carbapenemase enzyme; are β-lactam enzymes that cause multiple drug resistance in bacteria by hydrolyzing antibiotics. The resistance genes which responsible for the coding of the carbapenemase enzyme  could be transferred to different species of pathogen families and this causes the antibiotic resistance to increase exponentially. In this study; for the determination of OXA-48 and VIM gene regions which are the carbapenemase resistance genes,  a ready-to-use kit type electrochemical biosensor design have been made with pencil graphite electrode. 
In the first phase of the study, sensor surface was modified with carbon nanotube (CNT) by using cyclic voltammetry technique to increase the conductivity and surface area of the developed biosensor. At first the optimal surface modification conditions were found, disposable sensor surfaces were prepared with synthetic DNA sequences containing 23 nucleotides which of the resistance genes to be identified (specific gene regions named OXA-48 and VIM). The synthetic probe sequences were labeled with NH2 for the binding to the nanomaterial-containing sensor surface, and the synthetic target sequences were biotinylated to provide the enzyme-based hybridization assay. The hybridization properties of the synthetic probe and target sequences were determined by agarose gel electrophoresis. After the covalent immobilization of the probe sequences to the CNT-modified sensor surface, hybridization was performed with the biotin-labeled target sequence. And then the genosensor has interacted S-ALP. The final step sensor surface was incubated with substrate α-naphtyl phosphate and the assay was completed by measuring the α-naftol signal which is α-naphtyl hydrolysis product and has electroactive property, by DPV method. Hybrid-induced high α-naphthol signaling according to the probe proves the presence of hybridization. According to the findings, the hybrid signal provided a 7-fold difference according to the signal of the probe sequence. On the other hand, the result of the nano material modification; the hybrid signal obtained from to the unmodified electrode showed about 3-fold increase. The most appropriate conditions for the analysis of the designed biosensor (target concentration, hybridization time, post-hybridization sensor surface washing time, sensor selectivity, minimum determination limit and repeatability etc.) were found. And, characterization of the sensor surface was evaluated by scanning electron microscopy (SEM). In order to convert the nanobiosensor to the kit system developed for the antibiotic resistance analysis, the synthetic probe sequences immobilize on to electrod surfaces which modified with CNT, and then this electrodes kept under appropriate storage conditions. In studies involving with synthetic DNA sequences, determination of target sequences was carried out for 30 minutes by enzyme mediated hybridization with a kit-type biosensor.  In addition, symmetric and asymmetric polymerase chain reaction (PCR) products of OXA-48 and VIM were determined by using ready-to-use kit type biosensor. It was found that the developed kit type biosensor can perform gene analysis even after 150 days after the optimum conditions for the determination of PCR product in real sample analysis. Additionally, the ability of CNT modified and non-CNT modified electrodes to determine antibiotic resistance genes was compared. Due to the effect of nanomaterial modification, sensitive determination was achieved despite the elapsed time by using CNT modified sensor and the limit of detection was calculated as 2.50 picomole/50µL. As a result, DNA-based antibiotic resistance gene analysis was performed with kit type nanobiosensor and a new alternative method was introduced to the classical methods.


Keywords: Antibiotic resistance, kit, electrochemical DNA nanobiosensor, carbon
nanotube, polymerase chain reaction (PCR), scanning electron microscopy (SEM).