Doksorubisin kaynaklı ovaryum hasarında adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin PTEN/AKT/FOXO3a yolağı ve follikülogenez üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of adipose derived mesenchymal stem cells on PTEN/AKT/FOXO3a pathway and folliculogenesis in doxorubicin-induced ovariandamage
Yazar: HATİCE ORUÇ DEMİRBAĞ
Danışman: PROF. DR. EBRU BALLI
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Doksorubisin = Doxorubicin ; Kök hücreler = Stem cells ; Over = Ovary ; Over hastalıkları = Ovarian diseases ; Over yetmezliği-prematür = Ovarian failure-premature

Özet:
Kemoterapik ajan olan doksorubisin (DOX) primordiyal folikül havuzuna hasar vererek over rezervinin azalmasına ve infertiliteye neden olmaktadır. Kanser tedavisi gören hastalarda fertilitenin korunması için kök hücre uygulamalarıyla ilgili birçok çalışma yapılmaktadır. Over rezervinin korunmasını sağlayan PTEN/AKT/FOXO3a yolağının aşırı aktivasyonu over rezervinin tükenmesine ve buna bağlı olarak infertiliteye neden olmaktadır. Bu çalışmada sıçan over dokusunda doksorubisinin PTEN/AKT/FOXO3a sinyal yolağı üzerine etkilerinin incelenmesi ve tedavi amaçlı verilen adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin (AKMKH) aynı yolak üzerinde etkili olup olmadığının araştırılması amaçlandı. Çalışma kapsamında 23 adet dişi sıçan 3 gruba ayrıldı; kontrol grubuna hiçbir işlem yapılmadı, DOX grubundaki deneklere 10 mg/kg DOX uygulandı, DOX+AKMKH grubundaki deneklere 10 mg/kg DOX verildikten bir gün sonra 2x106 AKMKH uygulandı. Denekler 21 gün sonra sakrifiye edildi ve ovaryum dokuları alındı. Ovaryum dokularından seri kesitler alındı ve her beşinci kesitteki foliküller sayıldı. Ayrıca AKT ve FOXO3a primer antikorlarıyla immün işaretleme ve RT-PCR yapıldı. Elde edilen veriler istatistiksel olarak değerlendirildi. Vücut ağırlığında üç grup arasında da istatistiksel olarak fark gözlendi. Deney boyunca kontrol grubunda düzenli östrus siklusu, DOX grubunda ise düzensiz sikluslar görüldü. Kontrol grubu normal over histomorfolojisine sahipti. DOX grubunda DOX+AKMKH grubundan daha az olmakla birlikte dejenere oosit ile granüloza hücrelerinde apoptoz gözlendi. DOX grubunda primordiyal, primer, sekonder foliküllerin kontrole göre azaldığı atretik foliküllerin ise arttığı bulundu. DOX+AKMKH grubunda ise sadece primordial ve primer foliküllerde azalma gözlendi. Primordiyal foliküllerde FOXO3a boyanması kontrol ve kök hücre grubunda nükleer, DOX grubunda ise sitoplazmikti. AKT boyanması ise kontrol ve DOX+AKMKH grubunda sitoplazmik, DOX grubunda hem nükleer hem de sitoplazmikti. Hem AKT hemde FOXO3a mRNA ekspresyon seviyeleri kontrol ve DOX+AKMKH grubunda benzer iken DOX grubunda azaldı. Sonuçlardan yola çıkarak DOX'un PTEN/AKT/FOXO3a yolağını aktive ettiği AKMKH'lerin ise bu aktivasyonu bloke ettiği düşünüldü.

Abstract:
Doxorubicin (DOX), a chemotherapeutic agent, is known to induce dormant primordial follicle pool depletion leading to a decrease in ovarian reserve and increase in infertility when used. There are numerous studies on stem cell applications to preserve fertility in patients undergoing cancer treatment. PTEN/AKT/FOXO3a pathway is one of the main regulatory pathway that ensures the protection of the ovarian reserve. Excessive activation of this pathway leads to ovarian reserve depletion and, eventually, infertility. The aim of the present study was to investigate the effects of doxorubicin on the PTEN/AKT/FOXO3a signal pathway in rat ovaries and also to determine whether adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) are effective on the same pathway. Within the scope of the study, 23 female rats were divided into 3 groups; Control rats were injected IP with saline, 10 mg/kg DOX was administered to the subjects in the DOX group, and 2x106 ADSC was administered one day after 10 mg/kg DOX was given to the subjects in the DOX+ADSC) group. Animals were sacrificed after 21 days and ovarian tissues removed. Serial sections were taken from the ovarian tissues and the follicles in each fifth section were counted. In addition, immunstaining and RT-PCR were performed with AKT and FOXO3a primary antibodies. The data obtained were evaluated statistically. A statistically significant difference was observed between the three groups in body weight. Throughout the experiment, regular oestrus cycles were observed in the control group and irregular cycles in the DOX group. The control group had normal ovarian histomorphology. Although the DOX group is less than the DOX+ADSC group, degenerated oocytes and apoptosis were observed in the granulosa cells. In the DOX group, it was found that the number of primordial, primary and secondary follicles decreased compared to control, while atretic follicles increased. In the DOX+ADSC group, there was a decrase in the number of primordial and primary follicles, only. FOXO3a staining of oocytes in primordial follicles was found to be nuclear in both control and stem cell treated groups, but cytoplasmic in DOX group. AKT staining was cytoplasmic in the control and stem cell treated groups whereas it was found to be nuclear and cytoplasmic in DOX group. While mRNA expression levels of AKT and FOXO3a were similar in the control and DOX + AKMKH groups, there was seen a significant decrease in the DOX group. Based on our results, it was thought that DOX activated the PTEN/AKT/FOXO3a pathway and ADSCs blocked this activation.