Sert doku onarımına yönelik makrogözenekli kollajen-hidroksiapatit matriks yapıların geliştirilmesi ve hücre kültüründe kullanımı
Development of macroporous collagen-hydroxyapatite matrix structures for hard tissue repair and use in cell cultures
Yazar: ZEYNEP AKTAŞ
Danışman: PROF. DR. Y. MURAT ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Hidroksiapatitler = Hydroxyapatites ; Kollajen = Collagen

Özet:
Bu çalışmada, sert doku onarımına yönelik makrogözenekli kollajen/hidroksiapatit (Kol/HA) iskeleler üretilmesi amaçlandı. Gözenek oluşturucu olarak sodyumbikarbonat (NaHCO3) ve çapraz bağlayıcı olarak 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC)-N-hidroksisüksinimid (NHS) kullanılarak makrogözenekli matriks yapılar elde edildi. Bu amaçla polimer bileşimi, çapraz bağlayıcı konsantrasyonu, dondurma sıcaklığı, vb. şartlar optimize edildi. ATR-FTIR (Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi) ve SEM (Taramalı elektron mikroskopisi) analizleri ile iskelelerin kimyası hakkında bilgi elde edildi. İskele üretim şartları optimize edildikten sonra, iskeleler insan adipoz mezenkimal kök hücreleri ile etkileştirildi. Kültür 10 gün boyunca kök hücre vasatı ile sürdürüldükten sonra besi yeri ortamı osteojenik vasat ile değiştirilerek osteojenik indüksiyona geçildi. Hücre canlılığı ve çoğalması MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür] testi ile takip edildi. Kol/HA iskeleler üzerinde hücrelerin osteojenik farklılaşma seviyesi immünohistokimya çalışmaları ile incelendi. Kollajenin ve hidroksiapatitin kimyasal yapılarını koruduğu FTIR sonuçları ile belirlendi. SEM mikrograftları, HA'in yapıya dahil edilmesi ile oluşan kompozit yapının saf kollajene göre daha düzgün bir morfolojiye sahip olduğunu gösterdi. MTT sonuçlarına göre %2,5'lik kollajen ile hazırlanan kompozit iskele içerisindeki hücre canlılık oranının %1,0'lık kollajen ile hazırlanana göre daha yüksek olduğu gözlendi. İnsan adipoz mezenkimal kök hücrelerinin kemik benzeri hücrelerine farklılaştığı Alizarin Kırmızısı ve von Kossa gibi histokimya boyaları ile yapılan analizlerle belirlendi.

Abstract:
The aim of this study was to fabricate macroporous collagen/hydroxyapatite (col/HA) composite scaffolds for hard tissue repair. Macroporous matrix structure was obtained by using sodiumbicarbonate as the pore-forming agent and 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)-N-hydroxysuccinimide (NHS) as the crosslinker. Experimental parameters such as, polymer composition, concentration of crosslinkers and freezing temperature were optimized. The fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and scanning electron microscopy (SEM) analyses were performed to provide chemical information regarding the composite scaffolds. After optimising the fabrication procedure, human adipose-derived mesenchymal stem cells (hAMSCs) were seeded on these scaffolds. hAMSCs were expanded for 10 days on the scaffolds, and then culture medium was exchanged with the osteogenic differentiation induction medium. Cell viability and proliferation were evaluated using the MTT [3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] test. The osteogenic differentiation level of the cells on the col/HA scaffolds were investigated by immunohistochemistry. FTIR results indicated that chemical compositions of collagen and HA were maintained within the composites. SEM images showed that the composite structure with HA was more uniform than pure collagen. According to the MTT results, the cell viability ratio in composite scaffolds prepared with 2,5% collagen was significantly higher than that of the composite scaffolds prepared with 1,0% collagen. The differentation of hAMSCs into osteogenic cells was confirmed particularly by the histochemical analysis using Alizarin red and von Kossa stainings.