NAD+ bağımlı Candida methylica format dehidrogenaz enziminin R258 ve H311 pozisyonlarının reaksiyon mekanizmasındaki rollerinin incelenmesi
Investigation of the role of R258 ve H311 positions of NAD+ dependent Candida methylica formate dehydrogenase on the reaction mechanism
Yazar: MELTEM ÇORBACIOĞLU
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BARIŞ BİNAY
Gebze Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
ÖZET
Endüstride gerçekleştirilen enzimatik reaksiyonlarda ihtiyaç duyulan
kofaktörlerin pahalı olmasından dolayı, reaksiyon ortamındaki kofaktörlerin
yenilenmesinin önemi büyüktür. NAD + -bağımlı format dehidrogenazlar (EC 1.2.1.2)
karbonil grubunun oksidasyonunu katalizleyerek ürün olarak CO 2 oluştururken,
NAD + ' i, NADH' e indirgerler. Endüstride kullanımı yaygın olan NADH' in format
dehidrogenaz enzimi kullanılarak yenilenmesi, kolay ve ucuz bir yöntemdir. Fakat bu
enzimlerin aktivitesi endüstride kullanım için yeterli değildir. Bu çalışmada, Candida
methylica format dehidrogenaz (CmFDH) enziminin R258 ve H311 pozisyonlarının
reaksiyon mekanizmasındaki rollerinin incelenmesi hedeflenmektedir.
CmFDH enziminin aktif bölgesinde bulunduğu düşünülen H311 ve R258
amino asit pozisyonlarına Tekrarlayan doyurulmuş mutasyon (ISM) - Kombine aktif
bölge doyurulmuş test (CAST) yöntemi ile protein mühendisliği uygulanmıştır.
CmFDH H311 ve R258 pozisyonları için dejeneratif kodon içeren primerler
tasarlanarak, mutasyonlar gerçekleştirilmiştir. Otoindüksiyon-Studier besiyerinde
E.Coli BL21 (DE3) hücrelerinde ifade edilmesi sağlanan, yabanıl tip ve mutant
enzimler, Ni-NTA HisTrap kolonu kullanılarak saflaştırılmıştır. Mutantların aktivite
ve kinetik ölçümleri yapılarak yabanıl tip ile karşılaştırılmıştır. Format ve NAD +
substrat olarak kullanılıp kararlı hal kinetik çalışmaları gerçekleştirilerek, Michaelis-
Menten kinetik değerler hesaplanmıştır. Yaklaşık olarak R258 kütüphanesi için 200
koloni, H311 kütüphanesi için 70 koloni taranmıştır. R258S, H311S, H311C, H311Y
mutant CmFDH' lar elde edilmiş ama bu mutasyonlarda formata karşı ölçülebilir bir
aktivite görülmemiştir. Yabanıl tip CmFDH ile kıyaslandığında H311D mutant
CmFDH' ın katalitik verimliliğinde artış görülmüştür.
Elde edilen bu sonuçlar, seçilen pozisyonların enzim aktivitesi için fonksiyonel
amino asitler olduğunu göstermiştir. Seçilen pozisyonlarda yeni amino asitlerin,
substrat ile olan etkileşiminin görülmesi ve enzimin aktivitesindeki rolünün daha
detaylı anlaşılması için modelleme çalışmaları halen devam etmektedir.

Abstract:
SUMMARY
The regeneration of NADH in the reaction has great importance because the
cofactor required by the enzymatic reactions carried out in the industry is very
expensive. NAD + -dependent formate dehydrogenases (EC 1.2.1.2) catalyse the
oxidation of formate anion into carbon dioxide, coupled with the reduction of NAD +
to NADH. Regeneration of NADH using formate dehydrogenase is easy and
inexpensive. However, the activity of these enzymes is not sufficient for industrial
use. In this study, it is aimed to investigate of the role of R258 and H311 positions of
Candida methylica formate dehydrogenase on the reaction mechanism by protein
engineering.
Mutagenesis for H311 and R258 aminoacid positions of CmFDH, which are
thought to present in the active-site of the enzyme, was performed by the ISM-CAST
method. Primers containing NRT degenerative codon was used for mutagenesis.
Wild-type and mutant CmFDHs were expressed in E.Coli BL21 (DE3) cells in auto-
induction Studier medium. Then the proteins were purified by using Ni-NTA
HisTrap column. Activity and kinetic measurements of mutant CmFDHs were
carried out and kinetic parameters were compared to the wild type CmFDH. Steady-
state kinetic studies were performed against both formate and NAD + and Michaelis-
Menten kinetic parameters were calculated. Approximately 200 colonies for the
R258 library and 70 colonies for the H311 library were scanned. R258S, H311S,
H311C, H311Y mutant CmFDHs were obtained, however these mutations did not
show any measurable activity. When compared to wild-type CmFDH, the H311D
mutant of CmFDH showed an increase in catalatic efficiency.
These results show that selected positions are functional amino acids for
enzyme activity. Modeling studies are still in progress to better understand the
interaction of new amino acids with the substrate in selected positions and the role of
these positions in enzyme activity.