Kronik Lenfositik Lösemide MDM2/MDMX ifadesinin RO-5963 hedef molekülüyle engellenmesinin etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of inhibiting of MDM2/MDMX expression with RO-5963 target molecule in Chronic Lymphocytic Leukemia
Yazar: BERRAK KURT
Danışman: PROF. DR. GÖRKEM KISMALI
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veteriner Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Olgun B-lenfositlerin kanda ve lenfoid dokularda birikmesiyle karakterize bir kan kanseri olan Kronik lenfositik lösemi (KLL), son yirmi yılın en dinamik klinik araştırma alanlarından biri olmuştur. Bu hastalığın moleküler mekanizmasının anlaşılmasındaki önemli ilerlemeler, yeni teşhis ve tedavi araçlarının geliştirilmesine yol açmıştır. Ortanca yaşam süresinin 1-10 yıl arasında değişkenlik gösterdiği KLL hastalığında, tanı anında bireylerin sahip olduğu bazı genetik özellikler hastalığın prognozunu önemli ölçüde etkilemektedir. Genomun koruyucusu olarak bilinen tümör baskılayıcı protein p53'ü kodlayan gen olan TP53'ün mutasyonu, KLL'de yeni teşhis edilen vakaların %5-15'inde, nüks olguların ise yaklaşık %50'sinde görülmektedir. MDM2 ve MDM4 (MDMX), p53 proteininin ana negatif düzenleyicileridir. MDM2, p53'ün stabilitesini, MDM4 ise aktivitesini düzenlemektedir. TP53 mutasyonunun görülmediği KLL hastalarının %50-70'inde MDM2 ifadesinin arttığı tespit edilmiştir. MDM2 ve MDM4'ün oluşturduğu heterodimer, ubikitin ligaz enzimini (E3) aktifleştirerek p53 proteininin ubikitin molekülüyle bağlanmasını sağlamaktadır. Ubikitinle bağlanan p53 proteini, ubikitin protozeom sistemi aracılığıyla yıkımlanmaktadır. RO-5963, MDM2 ve MDMX'i eşzamanlı olarak hedefleyerek, p53'e bağlanmasını engellemek amacıyla geliştirilmiş bir hedef moleküldür. Pek çok kanser hücre hattında çalışılsa da kronik lenfositik lösemide ve hematolojik kanserlerde daha önce çalışılmamıştır.  Bu çalışmada kronik lenfositik lösemi hücre hatlarında RO-5963 dual inhibitörünün hücre canlılığına, apoptozis davranışlarına ve ilişkili proteinlerin aktivitelerine etkileri değerlendirilmiştir. Bu amaçla MEC-1 ve HG-3 insan kronik lenfositik lösemi hücre hatlarına MDM2/MDMX dual inhibitörü RO-5963 24, 48 ve 72 saat boyunca uygulanarak IC50 değerleri hesaplanmıştır. RO-5963'ün hücre canlılığını doza ve süreye bağımlı olarak azalttığı tespit edilmiştir. RO-5963'ün apoptotik etkilerinin değerlendirilmesi amacıyla akım sitometrik analizler gerçekleştirilmiştir. RO-5963'ün MEC-1 ve HG-3 hücrelerinde  geç apoptozis ve nekrozisi arttırdığı, sadece HG-3 hücrelerinde ise erken apoptozisin anlamlı bir şekilde artmasına neden olduğu tespit edilmiştir (p<0,01). Programlı hücre ölümünün moleküler mekanizmasını ortaya çıkarmak amacıyla MDM2, MDMX, p53, kaspaz 3, Bcl-2 ifade düzeyleri analiz edilmiştir. RO-5963 dual inhibitörü hem MEC-1 hem de HG-3 hücrelerinde MDM2 ve MDMX ifadesinin anlamlı bir şekilde azalmasına neden olmuştur (p<0,01). Kaspaz 3 ifadesi sadece HG-3 hücrelerinde artmış, Bcl-2 ifadesi ise sadece HG-3 hücrelerinde azalmıştır. Bu durum HG-3 hücrelerinde intrinsik apoptozisin etkili olduğunu, MEC-1 hücrelerinde ise diğer programlı hücre ölüm tiplerinin etkili olduğunu düşündürmüştür. Elde ettiğimiz veriler ışığında RO-5963'ün kronik lenfositik lösemide yeni bir moleküler ajan olabileceği değerlendirilmiştir.

Abstract:
Chronic lymphocytic leukemia (CLL), a blood cancer characterized by the accumulation of mature B-lymphocytes in the blood and lymphoid tissues, has been one of the most dynamic areas of clinical research over the past two decades. Significant advances in understanding the molecular mechanisms of this disease have led to the development of new diagnostic and therapeutic tools. In CLL, where the median life expectancy varies between 1-10 years, some genetic characteristics of individuals at the time of diagnosis significantly affect the prognosis of the disease.Mutation of TP53, the gene encoding the tumor suppressor protein p53, known as the protector of the genome, is seen in 5-15% of newly diagnosed cases of CLL and in approximately 50% of relapsed cases. MDM2 and MDM4 (MDMX) are major negative regulators of p53 protein. MDM2 regulates the stability of p53, and MDM4 regulates its activity. It has been determined that MDM2 expression is increased in 85% of CLL patients in whom TP53 mutation is not observed. The heterodimer formed by MDM2 and MDM4 activates the ubiquitin ligase enzyme (E3), allowing the p53 protein to bind with the ubiquitin molecule. The p53 protein bound with ubiquitin is degraded through the ubiquitin protozeome system. RO-5963 is a target molecule developed to simultaneously target MDM2 and MDMX, preventing them from binding to p53. Although it has been studied in many cancer cell lines, it has not been studied in chronic lymphocytic leukemia and hematological cancers before. In this study, the effects of RO-5963 exposure on cell viability, apoptosis behavior and activities of related proteins in chronic lymphocytic leukemia cell lines were evaluated. For this purpose, MDM2/MDMX dual inhibitor RO-5963 was applied to MEC-1 and HG-3 human chronic lymphocytic leukemia cell lines for 24, 48 and 72 hours and IC50 values were calculated. It has been determined that RO-5963 reduces cell viability in a dose- and time-dependent manner. Flow cytometric analyzes were performed to evaluate the apoptotic effects of RO-5963. It was determined that RO-5963 increased late apoptosis and necrosis in MEC-1 and HG-3 cells, and caused a significant increase in early apoptosis only in HG-3 cells (p<0.01). In order to reveal the molecular mechanism of programmed cell death, MDM2, MDMX, p53, caspase 3, Bcl-2 expression levels were analyzed. RO-5963 dual inhibitor caused a significant decrease in MDM2 and MDMX expression in both MEC-1 and HG-3 cells (p<0.01). Caspase 3 expression increased only in HG-3 cells, while Bcl-2 expression decreased only in HG-3 cells. This suggested that intrinsic apoptosis was effective in HG-3 cells, while other types of programmed cell death were effective in MEC-1 cells. In the light of the data we obtained, it was evaluated that RO-5963 may be a new molecular agent in chronic lymphocytic leukemia.