Özgür yaşayan amiplerin hücresiz sıvılarının pseudomonas üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effects of free-living amoeba cell-free supernatants on pseudomonas
Yazar: ÇİSE KEBABCI
Danışman: DOÇ. DR. ZUHAL ZEYBEK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Özgür yaşayan amipler (ÖYA) doğada ve insan yapımı su sistemlerinde sıklıkla rastlanan ve konağın bağışıklık sistemine bağlı olarak ölümcül de olabilen hastalıklara sebep olan mikroorganizmalardır. Ayrıca aynı ortamda yaşadıkları çeşitli bakteriler için konak olma özelliği de gösterirler. Bunun sonucu olarak bakterilerin çoğalmasına katkı sağlayabilir yada kendileri lizise uğrayabilir. Ancak ÖYA'nın bu ortamlarda hayatta kalmasını sağlayabilecek olan antimikrobiyal maddeler üretmesi konusundaki bilgiler oldukça kısıtlıdır. Bu bağlamda, bu çalışmada ÖYA suşlarına ait hücresiz sıvıların (ACM), Pseudomonas aeruginosa karşısında antibakteriyel etkisinin olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır.
Bu çalışmada,  Acanthamoeba castellanii ATCC 50373 suşuna ek olarak, ülkemize ait üç yüzme havuzundan ve bir göl suyundan izole edilmiş olan toplam dört çevresel ÖYA suşu (A10, A13, A14, U.GÖL) kullanılmıştır. P. aeruginosa suşları, ülkemizdeki hastalara ait klinik suşlardan (PA2, PA3, PA4, PA5) seçilmiş, standart suş olarak P. aeruginosa ATCC 27853 kullanılmıştır. Tüm ÖYA suşları, ısı ile inaktive edilmiş Escherichia coli ATCC 25922 süspansiyonu yayılmış olan non-nutrient agar (NNA) içeren Petri kutularında üretilmiştir. Aksenik kültürlerinin eldesi için pepton yeast ekstrakt glukoz (PYG) besiyeri kullanılmıştır. Kültürlerdeki canlı ÖYA trofozoitlerinin sayısı (hücre/mL) Thoma lamı ve tripan mavisi kullanılarak tespit edilmiştir. Her bir ÖYA suşuna ait hücresiz sıvıların (ACM) elde edilmesi, aksenik kültür sıvısının 3000 rpm'de 5 dakika santrifüj edilmesinden sonra 0.22 µm por çaplı steril filtreden geçirilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Her bir P. aeruginosa suşunun süspansiyonları (108 kob/mL) spektrofotometre (OD=595) kullanılarak ölçülmüştür. ÖYA suşlarına ait ACM'lerin, P. aeruginosa suşları karsısındaki antibakteriyel aktivite deneyleri nutrient agarda, koloni sayım yöntemi kullanılarak yapılmıştır.
Denenen ÖYA suşlarına ait ACM'lerin, denenen P. aeruginosa suşları karşısında değişen oranlarda (%3.9 - 91.5) antibakteriyel etki gösterdiği saptanmıştır. En yüksek ortalama inhibe edici etkiyi A13 suşunun (%64.6), en düşük ortalama inhibe edici etkiyi A14 suşunun (%34.4) gösterdiği bulunmuştur. Ülkemize ait dört çevresel ÖYA izolatından üçünün (A13, U.GÖL, A10) ortalama olarak Acanthamoeba castellanii ATCC 50373'e göre daha yüksek inhibe edici etki gösterdiği tespit edilmiştir. ACM'lere en duyarlı P. aeruginosa suşunun PA5 suşu olduğu (ort: %82.64), bunu sırasıyla PA4, PA2, PA ATCC 27853 ve PA3 suşlarının izlediği saptanmıştır. 
Bu çalışma, ülkemize ait ÖYA suşlarına ait ACM'lerin, Pseudomonas aeruginosa'ya etkili antimikrobiyal maddelere sahip olduğunu gösteren ilk çalışmadır. Bununla beraber örnek sayısının arttırılmasıyla yapılacak yeni çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca, bu suşlara ait ACM'lerin, P. aeruginosa dışındaki mikroorganizmalar (diğer patojen bakteriler, virüsler vb.) karşısındaki antimikrobiyal aktivitelerini keşfetmek, ilerideki çalışmalarla mümkün olabilecektir.

Abstract:
Free-living amoebas (FLA) are microorganisms that are common in nature and man-made water systems, causing diseases that can also be fatal depending on the host's immune system. They also act as hosts for the various bacteria living in the same environment. As a result, they can contribute to the growth of bacteria or they may be lysed. However, the knowledge about the production of antimicrobial agents that can ensure survival of  FLA in these environments is quite limited. In this context,  it was aimed to investigate whether cell-free supernatants (ACM) belonging to FLA strains have an antibacterial effect against Pseudomonas aeruginosa in this study. 
Totallly four environmental FLA strains (A10, A13, A14, U.GÖL) isolated from our country's swimming pools and a lake water, in addition to the Acanthamoeba castellanii ATCC 50373 strain were used In this study. Pseudomonas aeruginosa strains were selected from the clinical strains (PA2, PA3, PA4, PA5) belonging to patients in our country, and P. aeruginosa ATCC 27853 was used as the standard strain. All FLA strains were grown in non-nutrient agar (NNA) seeded with heat-inactivated Escherichia coli ATCC 25922 suspension. Peptone yeast extract glucose (PYG) medium was used to obtain axenic cultures The number of viable FLA trophozoites (cell /mL) in cultures was determined using Thoma slide and trypan blue. Obtaining the cell-free supernatants (ACM) of each FLA strain was accomplished by centrifuging of the axenic culture liquid at 3000 rpm for 5 minutes, then passing through a 0.22 µm pore diameter sterile filter. Suspensions (108 cfu/mL) of each P. aeruginosa strain were measured using a spectrophotometer (OD = 595). Antibacterial activity experiments of ACMs belonging to FLA strains against P. aeruginosa strains were performed on nutrient agar using colony count method.
It has been determined that ACMs of FLA strains tested showed antibacterial effect at varying rates (3.9 - 91.5 %) against P. aeruginosa strains tested. It was found that strain A13 (64.6 %) has the highest mean inhibitory effect and strain A14 (34.4 %) had the lowest mean inhibitory effect. It has been determined that three of the four environmental FLA isolates (A13, U.GÖL, A10) belonging to our country have higher inhibitory effect than Acanthamoeba castellanii ATCC 50373 on average. It was determined that the most sensitive P. aeruginosa strain to ACMs was PA5 strain (mean: 82.64 %), followed by PA4, PA2, PA ATCC 27853 and PA3 strains, respectively.
This is the first study to show that ACMs of FLA strains belonging to our country have antimicrobial agents against P. aeruginosa. However, new studies are needed to increase the number of samples. In addition, it will be possible with future studies to discover the antimicrobial activities of ACMs of these strains against microorganisms (other pathogenic bacteria, viruses, etc.) other than P. aeruginosa.