Karadutun meyve suyu ve reçele işlenmesi sırasında antioksidanlarında ve in-vitro biyoerişebilirliğinde meydana gelen değişimler
Changes in antioxidants and in-vitro bioaccesibility during black mulberry juice and jam processing
Yazar: MERVE TOMAŞ
Danışman: YRD. DOÇ. ESRA ÇAPANOĞLU GÜVEN
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Karadut içerdiği fitokimyasalların sağlık üzerindeki olumlu etkileri ve antosiyaninlerce zengin olması nedeniyle potansiyel bir gıda boyası kaynağı olması sebebiyle önemli bir gıda maddesidir. Karadutun içerdiği fenolik bileşiklerin endüstriyel işlemler sırasındaki değişimi ile ilgili yapılan çalışmalar oldukça sınırlı ve yetersizdir. Ayrıca, karadut ve ürünlerinin in vitro absorbsiyonu ve erişebilirliği konusunda herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışma ile karadutun meyve suyuna ve reçele işlenmesi sırasında meydana gelen değişimler ve biyoyararlılıkları konusunda bilgi sağlanması planlanmaktadır.
Genel olarak meyve suyu üretimi; hammadde, ezme, mayşeleme, presleme, posa, pastörizasyon (aseptik dolum) aşamalarından, reçel üretimi ise; hammadde, şurup ilavesi, pişirme, katkı maddelerinin ilavesi, çekirdeklerinin ayrılması ve pastörizasyon aşamalarından oluşmaktadır. Bu çalışmada üretim sürecinin her bir aşaması, gravimetrik yöntemle nem içeriği, spektrofotometrik yöntemler ile toplam fenolik, toplam flavonoid, toplam antioksidan kapasitesi, toplam monomerik antosiyanin, polimerik renk, HPLC ile fenolik asit, flavonoid ve antosiyanin profilleri incelenmiştir. Fenolik bileşiklerin biyoerişilebilirliği ise in vitro olarak mide-bağırsak simülasyon yöntemi ile incelenmiştir.
Bu çalışmada, karadutun reçel ve meyve suyuna işlenmesi sırasında fenoliklerin, flavonoidlerin ve antosiyaninlerin değişiminin incelenmesi amaçlanmıştır. Proses etkisinin araştırılması için endüstriyel örneklerle çalışılmıştır. Ayrıca yine endüstriyel prosesten alınan taze karadut ve meyve suyu ile donmuş karadut ve reçelinde bulunan fenolik maddelerin biyoerişilebilirliği incelenerek, prosesin biyoerişilebilirlik üzerindeki etkisi incelenmiştir.
Çalışmada elde edilen sonuçlar, karadutun meyve suyu olarak işlenmesi esnasında %31?lik bir nem artışına, reçele işlenmesi esnasındada %73?lük bir nem kaybına sebep olduğunu göstermiştir. Daha sonra yapılan tüm analizler kuru madde üzerinden hesaplanmış ve rapor edilmiştir.
Karadut ve meyve suyunun toplam fenolik madde miktarları sırasıyla 1375.1 ± 30.5 mg GAE/100 g kuru madde ve 1919.0 ± 15.4 mg GAE/100 g kuru madde olarak bulunmuştur. Karadutun meyve suyu olarak işlenmesi esnasında toplam fenolik madde miktarında toplamda %40?lık bir artış gözlenmiştir. Karadut ve reçelinin toplam fenolik madde miktarları sırasıyla 1575.2 ± 9.0 mg GAE/100 g kuru madde ve 192.8 ± 3.6 mg GAE/100 g kuru madde olarak bulunmuştur. Karadutun meyve suyuna işlenmesi esnasında toplam fenolik madde miktarında %88?lik bir azalma tespit edilmiştir. Meyve suyu prosesinde kullanılan karadutun toplam flavonoid miktarının 1472.7 ± 38.3 mg rutin/100 g kuru madde olduğu bulunmuştur. Karadutun meyve suyuna işlenmesi ile toplam flavonoid miktarında %16?lık bir artış tespit edilmiştir (p<0.05). Reçel prosesinde kullanılan karadutun ise toplam flavonoid miktarının 1384.6 ± 190.1 mg rutin/100 g kuru madde olduğu bulunmuştur. Karadutun reçele işlenmesi ile toplam flavonoid miktarında %89?luk bir azalış gözlemlenmiştir (p<0.05). 
CUPRAC, DPPH, ABTS ve FRAP yöntemleri ile analiz edilen meyve suyu prosesindeki karadut örneklerinin toplam antioksidan kapasitelerinin ortalama değerleri sırasıyla 4046.1 ± 25.0, 945.6 ± 60.5, 2788.1 ± 33.4 ve 1835.6 ± 247.2  mg TE/100 g kuru maddedir. Meyve suyuna işlenmesi sonucunda sırasıyla %29, %32, %81 ve %48?lik bir artış meydana gelmiştir (p<0.05). CUPRAC, DPPH, ABTS ve FRAP yöntemleri ile analiz edilen reçel prosesindeki karadut örneklerinin toplam antioksidan kapasitelerinin ortalama değerleri sırasıyla 4085.8 ± 181.4, 3657.0 ± 350.7, 4259.1 ± 112.4 ve 5247.2 ± 11.3 mg TE/100 g kuru maddedir. Reçele işlenmesi ile sırasıyla %90, %93, %88 ve %92?lik bir azalma meydana gelmiştir (p<0.05). 
Meyve suyu  ve reçel prosesinde, karadutun toplam monomerik antosiyanin içerikleri sırasıyla 216.9 ± 23.3 ve 996.5 ± 85.0 mg siyanidin-3-glukozit/ 100 g kuru madde olarak belirlenmiştir. Proses sonunda toplam monomerik antosiyanin miktarı kuru bazda meyve suyunda  iki katlık bir artışa neden olurken, reçelde %97?lik bir kayba neden olmuştur. Karadutun reçele ve meyve suyuna işlenmesi sırasında toplam monomerik antosiyanin miktarı prosesin her basamağında istatiksel olarak önemli farklılıklar göstermiştir (p<0.05).
Meyve suyu prosesinde polimerik renk miktarı %26.0 ± 1.9 - %58.5 ± 3.0 aralığında reçel prosesinde ise %22.4 ± 4.7 - %100.8 ± 26.2 aralığında değişmiştir. Meyve suyu prosesinde, ezme basamağında hammadeye göre polimerik renk 1.6 kat artmıştır. Diğer yandan, meyve suyunda 1.3 katlık bir düşüş görülürken presleme basamağı sonrası çıkan posada 1.7 kat artış tespit edilmiştir. Reçel prosesinde, reçelde 1.3 katlık, çekirdeklerinde ise 3.5 katlık artışlar görülmüştür (p<0.05). Toplam monomerik antosiyanin miktarıdaki düşüşler polimerik renk miktarının artışıyla ilişkilendirilmiştir. Bu artışların antosiyaninlerin polimerleşme reaksiyonlarından kaynaklandığı düşünülmüştür.
HPLC analizleri ile elde edilen sonuçlar, her basamakta fenolik, flavonoid ve antosiyanin profilleri açısından önemli farklılıklar göstermiştir (p<0.05). Fenolik asit olarak, gentisik, klorojenik, neoklorojenik ve siyrinjik asit bileşikleri karadut örneklerinde tespit edilmiştir. Gentisik asit karadut numunelerinde en fazla bulunan fenolik asit bileşeni olarak belirlenmiş ve meyve suyunda kullanılan hammaddede 355.4 ± 57.8 mg/100 g kuru madde, reçelde kullanılan hammaddede ise 1002.4 ± 113.8 mg/100 g kuru madde bulunmuştur. Meyve suyuna işleme sırasında gentisik, klorojenik, siyrinjik asit, neoklorojenik asit bileşiklerinde hammaddeye kıyasla sırasıyla 4.5, 4.1, 1.6 ve 5.9 kat artış, reçele işlemede ise gentisik, klorojenik ve neoklorojenik asit bileşiklerinde hammaddeye kıyasla sırasıyla %92, %83 ve %83 oranında bir azalma bulunmuştur. Karadutun hem meyve suyu hem de reçel prosesinde rutin, kuersetin-3-O-glukozit ve kaempferol 3-O-rutinozit olmak üzere 3 farklı flavonoid bileşiği HPLC ile tespit edilmiştir. Karadutun meyve suyuna işlenmesi ile rutin, kuersetin-3-O-glukozit ve kaempferol 3-O-rutinozit bileşiklerinde sırasıyla %42, %8 ve %36?lık artış bulunurken, reçele işlenmesi ile %92, %89 ve %94 oranlarında azalış tespit edilmiştir. Karadutun meyve suyu prosesinde siyanidin-3-glukozit, siyanidin-3-rutinozit ve pelorgonidin-3-O-glukozit tespit edilirken, reçel prosesinde bu 3 bileşğin dışında pelargonidin-3-rutinozit ve siyanidin türevi bileşikleri tespit edilmiştir. Meyve suyuna işleme ile siyanidin-3-glukozit, siyanidin-3-rutinozit ve pelorgonidin-3-O-glukozit bileşiklerinde sırasıyla %7, %70 artış ve %16 azalma tespit edilmiştir. Reçele işlenmesi ile siyanidin-3-glukozit, siyanidin-3-rutinozit, pelorgonidin-3-O-glukozit, pelorgonidin-3-O-rutinozit ve siyanidin türevi bileşiklerinde ise sırasıyla  meyvesine  göre %98, %87, %98, %96 ve %97 oranlarında azalış tespit edilmiştir.
In vitro mide-bağırsak sistemi simülasyonunun ardından, meyve suyu ve reçel olmak üzere 2 farklı prosesin her biri için hammadde ve ürünlerinin (meyve suyu, reçel)  toplam fenolik madde, toplam flavonoid madde ve toplam antosiyanin madde içerikleri ve 4 farklı toplam antioksidan kapasitesi değerlendirilmiştir.
In vitro mide-bağırsak sistemi simülasyonu sonucunda meyve suyu prosesinde emilen fenolik madde miktarı karadut meyvesinde %18, meyve suyuna işlenmesi ile de %6 oranında bir artış meydana gelerek %23?e yükselmiştir. Benzer şekilde, toplam flavonoid madde analizinden elde edilen sonuçlara göre de emilen flavonoid miktarında, karadut meyvesinde %33, meyve suyuna işlenmesi ile de %10 oranında bir artış meydana gelerek %43?e yükselmiştir. Bu sonuca göre karadut meyvesinin meye suyuna işlenmesiyle birlikte fenolik ve flavonoidler bakımından biyoerişebilirliğinin artmış olduğu tespit edilmiştir. Karadutun meyve suyuna işlenmesi ile meyvesi ve suyu için, diyalize edilmiş toplam fenolik madde ve flavonoid miktarları, meyvede başlangıçta bulunan miktarlardan önemli oranda farklılıklar göstermiştir (p<0.05). Karadutun diyalize edilmiş toplam monomerik antosiyanin miktarları sırası ile hammaddede %8, meyve suyunda %6 olarak bulunmuştur. Karadutun toplam antioksidan kapasitesi geri kazanım (%) oranları, CUPRAC yöntemi ile  karadut meyvesinde %24, meyve suyunda da %39, DPPH yöntemi karadut meyvesinde %50, meyve suyunda da %87, ABTS yöntemi ile karadut meyvesinde %14, meyve suyunda da %12, FRAP yöntemi ile karadut meyvesinde %6, meyve suyunda da %5 bulunmuştur. Toplam monomerik antosiyanin ve antioksidan kapasitelerinde başlangıçta bulunan miktarlardan önemli oranda farklılıklar tespit edilmiştir (p<0.05).
In vitro mide-bağırsak sistemi simülasyonu sonucunda reçel prosesinde IN fraksiyonunun başlangıç miktarına oranlanması ile elde edilen toplam fenolik madde miktarı karadut meyvesinde %13, reçelinde ise %15 bulunmuştur. Toplam flavonoid analizinden elde edilen sonuçlara göre serumda kalan flavonoid miktarı, karadut meyvesinde %33 iken reçele işlenmesi sonucu %24 oranında azalarak %9?a düşmüştür. Bu sonuca göre karadut meyvesinin reçele işlenmesiyle birlikte fenolik ve flavonoidler bakımından biyoerişebilirliğinin azalmış olduğu tespit edilmiştir. Karadutun reçele işlenmesi ile meyvesi ve reçeli için, diyalize edilmiş toplam fenolik madde ve flavonoid miktarları, meyvede başlangıçta bulunan miktarlardan önemli oranda farklılıklar göstermiştir (p<0.05). Karadutun diyalize edilmiş toplam monomerik antosiyanin analizinin madde miktarları sırası ile hammaddede %1 reçelinde %9 olarak bulunmuştur. Karadutun toplam antioksidan kapasitesi geri kazanım (%) oranları, CUPRAC yöntemi ile  karadut meyvesinde %7, reçelde de %10, DPPH yöntemi karadut meyvesinde %26, reçelde de %93, ABTS yöntemi ile karadut meyvesinde %14, reçelde de %38, FRAP yöntemi ile karadut meyvesinde %1, reçelde de %2 bulunmuştur. Toplam monomerik antosiyanin ve antioksidan kapasitelerinde başlangıçta bulunan miktarlardan önemli oranda farklılıklar tespit edilmiştir (p<0.05).

Abstract:
Black mulberry is an important foodstuff thanks to positive effects of phytochemicals being wealthy of anthocyanin and being a resource of potential natural colorant. Studies pursued about the change of phenolic compunds that black mulberry contains during the industrial processes are quite limited and insufficient. Besides, there are no studies about the in vitro absorption and accessibility of black mulberry and its products. It is planned that this study contributes valuable data to the changes that appear during black mulberry?s being processed into fruit juice and jam, and besides the subject of bioaccessibility.
In general, the production of fruit juice consists of stages of raw material, milling, mashing, pressing, press cake, pasteurization; on the other hand the production of jam consists of stages of raw material, syrup addition, cooking treatment, addition of additives, separation of seeds and pasteurization. In this study, every step of processing was investigated in detail to elucidate the changes in antioxidative compounds by analyzing the moisture content by gravimetric method, total phenolic and total flavonoid contents, total antioxidant capacity and polymeric color  by spectrophotometric methods and phenolic , flavanoid and anthocyanin contents by HPLC.
In this study is to investigate the effects of processing of black mulberry to juice and jam such on phenolics, flavonoids and anthocyanins by focusing on molecular level. This study performed at industrial-scale processing that will provide information about the effect of processing Moreover, black mulberry and black mulberry juice and jam samples collected from industrial scale processing are being evaluated on the basis of bioaccesibility of their bioactive compounds which will provide additional information on the effect of processing on bioaccesibility. 
The results showed that in black mulberry, the total moisture increase was found to be about 31% by processing raw material into the juice.  On the other hand, the total moisture loss was found to be about 73% by processing raw material into the jam.
Total phenolic content of black mulberry and fruit juice are respectively found as 1375.1 ± 30.5 and 1919.0 ± 15.4 mg GAE/100 g dried weight. During black mulberry?s being processed into fruit juice; totally, 40% of increase in total phenolic content is observed. Total phenolic content of black mulberry and jam are respectively found as 1575.2 ± 9.0 and 192.8 ± 3.6 mg GAE/100 g dried weight. During black mulberry?s being processed into fruit juice, 88% of decrease in total phenolic content amount is discovered. Significant (p?0.05) changes in the total phenolic content occurred in all processing samples.

It is found that the total flavanoid content of black mulberry used in fruit juice proses is 1472.7 ± 38.3 mg rutin/100 g dried weight. With black mulberry?s being processed into fruit juice, 16% of increase in total flavonoid content is observed (p<0.05). It is found that the total flavanoid content of black mulberry used in jam proses is 1384.6 ± 190.1 mg rutin/100 g dried weight. With black mulberry?s being processed into jam, 89% of decrease in total flavonoid amount is observed (p<0.05).
The mean values of total antioxidant capacity of black mulberry samples in fruit juice prosess analyzed with CUPRAC, DPPH, ABTS and FRAP methods are respectively 4046.1 ± 25.0, 945.6 ± 60.5, 2788.1 ± 33.4 and 1835.6 ± 247.2  mg TE/100 g dried weight. As a result of being processed into fruit juice, respectively 29, 32, 81 and 48% of increase have occurred (p<0.05). The mean values of total antioxidant capacity of black mulberry samples in jam proses analyzed with CUPRAC, DPPH, ABTS and FRAP methods are respectively 4085.8 ± 181.4, 3657.0 ± 350.7, 4259.1 ± 112.4 and 5247.2 ± 11.3 mg TE/100 g dried weight. With its being processed into jam, respectively 90, 93, 88 and 92% of decrease have occurred (p<0.05).
In fruit juice and jam process, total monomeric anthocyanin contents of black mulberry are respectively determined as 216.9 ± 23.3 and 996.5 ± 85.0 mg cyanidin-3-O-glukozit/ 100 g dried weight. At the end of process, while total monomeric anthocyanin content in fruit juice  has caused two times increase, it has caused 97% of loss in jam.
The percent polymeric color values in fruit juice process has changed in %26.0 ± 1.9 - %58.5 ± 3.0 while in jam proses it has changed in %22.4 ± 4.7 - %100.8 ± 26.2. In fruit juice proses; in the step of milling, polymeric color has increased 1.6 times according to raw material. On the other hand; while it is seen 1.3 times of decrease in fruit juice, it is found out 1.7 times of increase in press cake extracted after pressing step. In jam proses, 1.3 times of increase in jam and 3.5 times of increase in its seeds are seen (p<0.05). Decreases in total monomeric anthocyanin content are associated with increase of polymeric color value. It is considered that these increases result from polymerization reactions of anthocyanins.
The results clearly indicate that phenolic, flavanoid and anthocyanin contents of samples collected from each step were found to be statistically different (p?0.05). As phenolic acid, gentisic, chlorogenic acid, neochlorogenic acid and syringic acid were detected in black mulberry samples. Gentisic acid was most abundant phenolic acid; and it is found out that raw material used in fruit juice is 355.4 ± 57.8 mg/100 g dried weight while raw material used in jam is 1002.4 ± 113.8 mg/100 g dried weight. During being processed into fruit juice; in gentisic, chlorogenic, syringic acid, neochlorogenic acid compounds, in comparison with raw material, respectively 4.5, 4.1, 1.6 and 5.9 times of increase are found out. On the other hand; during being processed into jam, in gentisic, chlorogenic and neochlorogenic acid, in comparison with raw material, respectively 92, 83 and 83 per cent of decrease are found out. In both fruit juice and also jam proses of black mulberry, 3 different flavonoid compunds as rutin, quersetin-3-O-glucoside and kaempferol-3-O-rutinoside are determined with HPLC. With black mulberry?s being processed into fruit juice, respectively 42, 8 and 36% of increase are noted in rutin, quercetin-3-O-glucoside and kaempferol-3-O-rutinoside; with its being processed into jam, 92, 89 and 84% of decrease are noted. While cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-rutinoside and pelorgonidin-3-O-glukozit are determined in fruit juice proses of black mulberry; in the proses of jam, except these three compunds, pelargonidin-3-rutinoside and cyanidin derivatives are determined. With being processed into fruit juice; in cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-rutinoside and pelorgonidin-3-O-glukozit, respectively 7, 70% of increase and 16% of decrease are determined. With its being processed into jam; in cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-rutinoside, pelorgonidin-3-O-glukozit, pelorgonidin-3-O-rutinoside and cyanidin derivatives, in comparisition with its fruit, respectively 98, 87, 98, 96 and 97% of increase are determined.
After the simulation of in vitro gastrointestinal digestion system, total phenolic content, total flavonoid content and total anthocyanin content as well as the total antioxidant capacity of black mulberry, its jam and juice were evaluated. In order to determine the effect of in vitro gastrointestinal digestion on the total antioxidant capacity was performed four antioxidant capacity assays .
Results of in vitro gastrointestinal digestion showed that 23% by showing 18% of increase in the fruit of black mulberry and 6% of increase with being processed into fruit juice. Likewise; according to the results gained with total flavanoid  analysis, in dialyzed flavonoid supply, it has increased to 43% of increase by showing 33% of increase in the fruit of black mulberry and 10% of increase with being processed into fruit juice. According to this result, with the fruit of black mulberry?s being processed into fruit juice, it has been stated that its bioaccessibility has increased with regard to phenolic and flavanoid compunds. With black mulberry?s being processed into fruit juice, total phenoli and flavanoid contents dialyzed for its fruit and juice have shown differences to a significant extend in comparison with the amount found in the fruit at the beginning (p<0.05). Total anthocyanin amounts of black mulberry dialyzed are respectively found as 8% in the raw material and 6% in fruit juice. Total antioxidant capacity retrieval proportions of black mulberry are found out as 24% in black mulberry and 39% in fruit juice with CUPRAC method, 50% in black mulberry and 87% in fruit juice with DPPH method, 14% in black mulberry and 12% in fruit juice with ABTS method, 6% in black mulberry and 5%  in fruit juice with FRAP method.
As a result of the simulation of in vitro gastrointestinal system, total phenolic substance amount gained with proportion of IN fraction in jam proses to the amount at the beginning is found OUT as 13% in the fruit of black mulberry and 15% in its jam. According to the results taken from total flavanoid analysis, when flavanoid amount remaining in the serum is 33% in the fruit of black mulberry, it has contented to 9% by decreasing in the rate of 24%. According to this result, it is noted that its bioaccessibility has decreased with regard to phenolics and flavanoids with black mulberry?s being processed into jam. With black mulberry?s being processed into jam, total phenolic substance and flavanoid contents dialyzed for its fruit and jam have shown significant differences in comparison with the amounts found in the fruit at the beginning (p<0.05). Dialyzed total monomeric anthocyanin analysis? substance amounts of black mulberry are respectively found as 1% in the raw material and 9% in its jam. Total antioxidant capacity retrieval proportions (%) of black mulberry are found out as 7% in the fruit of black mulberry and 10% in the jam with CUPRAC method, 26% in the fruit of black mulberry and 93% in the jam with DPPH method, 14% in the fruit of black mulberry and 38% in the jam with ABTS method, and 1%  in the fruit of black mulberry and 2% in the jam with FRAP method. It is noted significant differences in total monomeric anthocyanin and antioxidant capacities in comparison with the amounts found at the beginning (p<0.05).