Desfluranın genotoksik etkisinin alkali comet yöntemiyle insan lenfositlerinde incelenmesi ve tavşan lenfositlerinde sevofluran ile karşılaştırılması
Assessment of the genotoxic effect of desflurane in human lymphocytes and comparison with sevoflurane in rabbit lymphocytes using alkali comet assay
Yazar: LALE KARABIYIK
Danışman: PROF.DR. SEMRA ŞARDAŞ
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Anestezi ve Reanimasyon = Anesthesiology and Reanimation ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
İnhalasyon anesteziklerinin, fiziksel özelliklerine ve uygulandıkları doza bağlı olarak sistemve organlar üzerinde toksik etkiler meydana getirebildikleri bilinmektedir. Günümüze dek pek çokçalışmada, inhalasyon anesteziklerinin insan genetik materyalini etkileyerek in vivo ve in vitrokoşullarda mutajenik ve karsinojenik etkiler yapabildiği gösterilmiştir. Desfluran ve sevofluran,anestezide son yıllarda kullanımı yaygınlaşan, florlu yeni inhalasyon anestezikleridir. Bu çalışmadaalkali comet yöntemi kullanılarakÍ¾ cerrahi işlem uygulanan hastaların lenfositlerinde desfluranınpotansiyel genotoksik etkisini araştırmak, tek anestezik ajan olarak uzun süre uygulandıkları cerrahiişlem geçirmeyen tavşanların lenfositlerinde ise desfluran ve sevofluranın potansiyel genotoksiketkilerini karşılaştırmak amaçlandı.Çalışmanın 1. bölümünde: ASA IÂ­II risk grubunda yaşları 16 ile 66 arasında değişen yaklaşıkiki saat sürmesi beklenen elektif cerrahi operasyonu planlanan 25 erişkin hasta çalışma kapsamınaalındı. Sigara içme alışkanlığı, malignitesi, diyabet ve başka bir sistemik ya da genetik hastalığı olanbireyler ise, oksidatif DNA hasarına önceden sahip olabileceği düşünülerek çalışma kapsamı dışındabırakıldı. Tüm hastalar ameliyat öncesi sekiz saat süre ile aç bırakıldı ve premedikasyon uygulanmadı.Â­15Â­7 mg kg tiyopental sodyum ve 0.1 mg fentanil sitrat iv verilerek anestezi indüksiyonu sağlandıktanÂ­1 Â­1sonra 0.1 mg kg veküronyum iv verilerek endotrakeal entübasyon uygulandı. Hastalara, 4 l dkÂ­1 Â­1%50/50 oranında O2/hava karışımı, tidal volüm 6Â­8 ml kg , solunum sayısı 10Â­12 soluk dk olacakşekilde kontrollü solunum uygulandı. Anestezinin devamı BİS %50Â±5 olacak şekilde, %4Â­7 desfluranve aralıklı bolus fentanil verilmesi ile sağlandı. Hastalardan periferik venöz kan örnekleriÍ¾ anesteziuygulamadan önce, anestezi sırasında 2. saatte, anesteziden sonraki 1. gün ve anesteziden sonraki 3.günde alındı.Çalışmanın 2. bölümünde: Ağırlıkları 2250Â­3500 gr arasında değişen, 14 adet erkek YeniZelanda tavşanı rastgele iki eşit gruba ayrıldı. Premedikasyon uygulanmayan tavşanlara 20 GÂ­1intravenöz kanül ile kulak venlerinden damar yolu açıldı. Saatte 8 ml kg %0.9 NaCl infüzyonuyapıldı. Tavşanların kan basıncı, kalp hızı kaydedilip elektrokardiyografileri monitörize edildi.Herhangi bir cerrahi işlem uygulanmaksızın dört saat süre ile BİS monitörizasyonu altında indeks%50Â±5 olacak şekilde inhalasyon yolu ile genel anestezi uygulandı. Desfluran grubuna (n=7) %4Â­7desfluran sevofluran grubuna (n=7) ise %3Â­5 sevofluran, dakikada 2 l verilen oksijen içinde yüzmaskesi yoluyla uygulandı. Kulak veninden kan örnekleriÍ¾ anesteziden önce, anestezi başladıktan 4saat sonra, anestezi sonrası 1. gün ve anestezi sonrası 4. gün alındı.Anestezi uygulanmadan önce alınan örnekler kontrol olarak değerlendirildi. Elde edilen kanörneklerinden izole edilen lenfositlere alkali comet yöntemi uygulanarak oksidatif DNA hasarıaraştırıldı. Her bir kan örneğinde sayılan 100 hücre: N (normal), AH (az hasarlı) ve H (hasarlı) olmaküzere üç ayrı kategoride incelendi. Sonuçların değerlendirilmesi için comet yanıtı skorlandı (THÂ­TotalHasar). İstatistiksel analizlerde, Student's t test, Paired t test, Tekrarlı Ölçümler İki Yönlü VaryansAnalizi kullanıldı. Veriler ortalamaÂ±SD olarak verildi ve p<0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlıkabul edildi.Çalışmanın birinci bölümünde bulgular: Hastalarda 2. saatte alınan örneklerde AH, H ve THortalamaları artarken, N ortalamalarında azalma bulundu (p<0.05). Bu farklılıklar anestezi sonrası 1.günde ve 3. günde azalarak devam etti (p<0.05). Anestezi sonrası 1. gün ile 3. gün arasında yapılanistatistiksel değerlendirme sonucunda iseÍ¾ AH, H hücre sayısında ve TH'de azalma saptanırken (sırasıile p=0.0001, 0.002, 0.0001) N'nin arttığı belirlendi (p=0.0001). Total hasar bakımından genel birdeğerlendirme yapıldığındaÍ¾ anestezi öncesi (14.6Â±5.2) değere göre anestezinin 2. saatinde belirlenenhasar (26.4Â±10.0) anestezi sonrası 1. günde devam etti (24.6Â±8.9). Anestezinin 3. gününde DNAhasarı anlamlı olarak azalmakla birlikte (18.1Â±6.9) anestezi öncesi değere göre (14.6Â±5.2) yüksekkaldı.Çalışmanın ikinci bölümünde bulgular: Desfluran grubunun anestezi öncesi değerleri,sevofluran grubunun anestezi öncesi değerleri ile benzerdi (p>0.05). Desfluran grubunda anesteziöncesi değere göreÍ¾ anestezinin 4. saatinde H ve TH sayısı ortalamaları anlamlı bir şekilde artarken(p<0.05), bu farklılık anesteziden sonraki 1. günde başlangıç değerlere döndü. Sevofluran grubundaise H ve TH ortalamalarında yine başlangıca göre anestezinin 4. saatinde meydana gelen artış,anesteziden sonraki 1. günde devam ederken (p=0.05) anestezi sonrası 4. günde anestezi öncesideğerlere dönebildi. Her örnek alma zamanı için iki grup arasında yapılan karşılaştırmalarda isegruplar arasında anlamlı bir farklılık bulunmadı (p>0.05). Hem grup hem zaman etkisi birliktedeğerlendirildiğindeÍ¾ N, H, AH ve TH için zamana bağlı değişimlerde grup etkisi bulunamadı (sırasıile p=0.166, 0.127, 0.869 ve 0.811).TH bakımından genel bir değerlendirme yapıldığındaÍ¾ desfluran (21.5Â±4.5) ve sevofluran(17.4Â±3.6) anestezi öncesi değerlerinde farklılık olmadığı, desfluran grubunda anestezinin 4. saatindeDNA hasarı belirlendiği (30.7Â±6.5), anestezi sonrası 1. günde (25.5Â±6.9) ve anestezinin 4. gününde(23.7Â±6.8) ise bu hasarın ortadan kalktığı, sevofluran grubunda anestezinin 4. saatinde (28.7Â±5.7)belirlenen hasarın, anestezi sonrası 1. günde (24.2Â±5.9) devam ettiği ve ancak anestezi sonrası 4.günde (22.5Â±6.2) bu hasarın ortadan kalktığı görüldü. Desfluran ve sevofluran grupları arasındayapılan karşılaştırmada herhangi bir farklılık saptanmadı.Sonuç olarak bu çalışmada, desfluranın hastalarda, desfluran ve sevofluranın tavşanlardapotansiyel genotoksik etki meydana getirdikleri gözlendi. Desfluran uygulanan hastalarda anestezisonrası 2. saatte en yüksek düzeyde DNA hasarının olduğu ve bu hasarın 3. günde tamamen anesteziöncesi değerlere dönemese de azaldığı görüldü. Desfluran ve sevofluranın tek ajan olarak dört saatsüre ile cerrahi herhangi bir girişim yapılmaksızın uygulandıkları tavşanlarda DNA hasarı 4. saattebaşladı. Bu DNA hasarının desfluranda 1. günde onarılmasına rağmen, sevofluranda 4. gündeonarıldığı belirlendi. Desfluranın genotoksik etkisi hastalarda daha uzun sürerken tavşanlarda dahakısa süre devam etti. Hem hastalara uygulanan desfluranın hem tavşanlara uygulanan desfluran vesevofluranın meydana getirdikleri genotoksik etki, anestezi sonrasında geri dönebilir nitelikte bulundu.DNA hasarıÍ¾ diyabetli, maligniteli, yaşlı, genetik bozuklukları olan, sigara içenhastalarda tam olarak onarılamayabilir. Özellikle tekrarlayan ve çok uzun süren anesteziuygulamalarında DNA hasarı daha da belirgin olabilir. Bu gibi durumlarda desfluran vesevofluran dozlarını azaltabilmek için desfluran ve sevofluran ile ya intravenöz anesteziklerya da rejyonal anestezi yöntemleri kombine edilmelidir.

Abstract:
Inhalation anesthetics are known to cause toxic effects on systems and organs, depending onphysical properties and dose. In many studies to date, it is shown that inhalation anesthetics may causemutagenic and carcinogenic effects in vivo and in vitro conditions by affecting the human geneticstructure. Desflurane and sevoflurane are recently synthesized fluorinated anesthetics that have beenin common use in recent years. The aim of this study was to research the potential genotoxic effect ofdesflurane on lymphocytes of humans who underwent surgery and also to compare the potentialgenotoxic effect between prolonged exposures of desflurane and sevoflurane applied alone andseparately in lymphocytes of rabbits that did not undergo surgeryÍ¾ through single cell gelelectrophoresisÂ­alkali comet assay.In the first part of the study: 25 adult patients from ASA IÂ­II risk group were studied. Patientswhose ages varied from 16 to 66 years and who were scheduled for elective surgery with an estimatedduration of two hours were included. Patients with smoking habits, malignancy, diabetes, systemic orgenetic diseases were excluded from the studyÍ¾ on the basis that these conditions may have causedoxidative DNA damage prior to the study. All patients were starved for eight hours prior to operationÂ­1and they did not receive premedication. After anesthesia induction was provided with 5Â­7 mg kgÂ­1thiopental sodium and 0.1 mg fentanil citrat, endotracheal intubation was achieved with 0.1 mg kgÂ­1vecuronium, intravenously. Patients were applied 4 l min 50/50% O2/air mixture with a breathingÂ­1 Â­1rate of 10Â­12 breathes min and tidal volume of 6Â­8 ml kg through mechanical ventilation.Anesthesia was maintained with 4Â­7% desflurane and intermittant bolus fentanil, so that BIS was50Â±5%. Peripheric venous blood samples were taken from patients before anesthesia, in the secondhour of anesthesia and on the first and third days after anesthesia.In the second part of the study: 14 male New Zealand rabbits with weights varying from 2250to 3500 g were randomly divided into two groups. Vascular access was obtained with 20 GÂ­1intravenous cannula in the ear veins of unpremedicated rabbits. They were applied 8 ml kg 0.9%NaCl infusion. Blood pressure and heart rate of the rabbits were recorded and theirelectrocardiography was monitorized. General anesthesia was applied via inhalation for four hoursunder BIS monitorization and the index was kept at 50Â±5%. 4Â­7% desflurane was applied indesflurane group (n=7) and 3Â­5% sevoflurane was applied in sevoflurane groupÍ¾ in 2 l oxygen perminute, by face mask. Venous blood samples were taken from the ear before anesthesia, in the fourthhour during anesthesia, and on the first and fourth days after anesthesia.Samples taken before anesthesia were assessed as control. Comet assay was appliedon the lymphocytes that were isolated from blood samples and oxidative DNA damage wasinvestigated. 100 cells counted in each blood sample were examined in three categories: N (normal),AH (low damage), H (damaged) and TH (total damage). Comet response was scored to assess theresults as total damage (TH). Student?s t test, Paired t test, Repeated Measurements TwoÂ­WayVariance Analysis were used in statistical analysis. Data were given meanÂ±SD and p<0.05 value wasconsidered statistically significant.Findings in the first part of the study: While there was an increase in mean AH, H and THvalues in the samples taken on the second hour of desflurane group, mean N value decreased (p<0.05).These differences continued in the first and third days after anesthesia (p<0.05). In the statisticalassessment between the first and third days after anesthesiaÍ¾ there was a decrease in AH and H cellcounts and in TH (p=0.0001, 0.002, 0.0001 respectively), and an increase in N (p=0.0001). In terms oftotal damage, damage was detected on the second hour during anesthesia (26.4Â±10.0). This damagemaintained on the first day after anesthesia (24.6Â±8.9). Although this damage decreased significantlyon the third day after anesthesia (18.1Â±6.9), it remained high compared to the initial value (14.6Â±5.2).Findings in the second part of the study: Preanesthesia values of the desflurane group weresimilar to those of the sevoflurane group (p>0.05). According to the preanesthesia value of thedesflurane groupÍ¾ although mean H and TH cell count increased significantly in the fourth hour duringanesthesia (p<0.05), but this difference returned to initial values on the first day after anesthesia. In themean H and TH cell counts of sevoflurane group, the increase in the fourth hour during anesthesiacontinued in the first day after anesthesia (p=0.05), and finally returned to the preanesthesia value onthe fourth day after anesthesia. No significant difference was found between each group for eachsample taking time (p>0.05). When both group and time effects were assessedÍ¾ no group effect wasfound in timeÂ­related changes for N, H, AH and TH (p=0.166, 0.127, 0.869 and 0.811 respectively).As a general evaluation for THÍ¾ it was seen that there was no difference between preanesthesiavalues of desflurane (21.5Â±4.5) and sevoflurane (17.4Â±3.6), DNA damage was detected on the fourthhour during anesthesia in the desflurane group (30.7Â±6.5) and this damage disappeared in the firstday (25.5Â±6.9) and fourth day (23.7Â±6.8) after anesthesiaÍ¾ in the sevoflurane group the damagedetected on the fourth hour during anesthesia (28.7Â±5.7) continued in the first day after anesthesia(24.2Â±5.9) and repaired only on the fourth day after anesthesia (22.5Â±6.2). No difference was detectedbetween desflurane and sevoflurane groups.As a conclusion, in this study, it was observed that desflurane has genotoxic potential inpatients, while both desflurane and sevoflurane have genotoxic potential on rabbits. It was seen thatthe patients who were applied desflurane had the highest DNA damage on the second hour and thatthis damage decreased on the first day and the third day, even though it did not completely return topreanesthesia values. In the rabbits that were applied desflurane and sevoflurane as single agents forfour hours without surgical operation, the DNA damage occurred on the fourth hour. Although thisDNA damage repaired on the first day with desflurane, the damage caused by sevoflurane repaired onthe fourth day. The genotoxic effect of desflurane lasted longer on the patients, whereas on rabbits itwas shorter. The genotoxic effects of both desflurane applied on patients, and desflurane andsevoflurane on rabbits were found to be reversible after anesthesia.DNA damage may not be fully repaired in patients with diabetes mellitus, malignancy,genetical disordersÍ¾ elderly and smoking patients. DNA damage might be more obvious especially inrepeated and very long term anesthesia practices. In such cases desflurane and sevoflurane should becombined with either intravenous anesthetics or regional anesthesia methods in order to decrease thedoses of desflurane and sevoflurane.