"Subtractive" hibridizasyon tekniği ile kalbe özgü bilinmeyen genlerin izolasyonu ve analizi
Isolation and analysis of heart specific unknown genes using subtractive hybridization technique
Yazar: AYŞE EVRİM KÖMÜRCÜ
Danışman: DOÇ.DR. NİHAN ÜNALTUNA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2001
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Dokulardaki gelişimsel ve patolojik değişikliklerin çoğunlukla genlerin ekspresyonunda, kalitatif ve kantitatif değişimlere yol açtığı bilinmektedir. Bu olayın regülasyonu ile ilgili genlerin tanımlanması, meydana gelen değişikliği anlamak için önemlidir. Çıkartılmış ("subtractive") cDNA kütüphaneleri, doku veya hücre dizilerinde farklı olarak eksprese edilen genlerin izolasyonu ve tanımlanmasında, güçlü bir yaklaşım sağlar. Örnek olarak bu metod, kanserli dokulardaki farklı ekspresyonlara sahip olan genlerin ayırd edilmesi için kullanılmıştır. Ayrıca, insan blastositlerine ait transkriptlerin çıkartılmış cDNA kütüphaneleri ile incelenmesi sonucunda, insan preimplantasyon gelişimi hakkında da bilgiler edinilmiştir. Deney hayvanlarında yapılan çıkartılmış hibridizasyon çalışmaları ile izole edilen ve tanımlanan yeni genlerin, insandaki homolojisini saptamak mümkün olmaktadır. Bu çalışmada, fare (BALB/c) kalp kası ve iskelet kası arasında çıkartılmış ı hibridizasyon tekniğini uygulayarak kalp kasına özgü genlerin cDNA'larını içeren bir ı kütüphane oluşturuldu. Uyguladığımız Çıkartılmış Hibridizasyon Tekniğinde, oligo(dT)3o- latex partikülleri kullanarak cDNA sentezi yapılmıştır. Kalp dokusuna ait cDNA'nm 3' ucuna terminal transferaz ile dC-kuyruğu eklenerek ve PCR ile "sense strand" DNA sentezi yapılmıştır. Tekrarlayan hibridizasyonlar sonucu elde edilen çıkartılmış "sense strand" DNA' lan PCR ile çoğaltılmıştır. Daha sonra çıkartılmış cDNA'ların TA klonlaması yapılmıştır. Oluşturulan kütüphaneden rastgele seçilen 107 adet klonun plazmidleri izole edilmiş ve klonlanmış DNA parçacıklarının uzunluklarına bakılmıştır. Klonlanmış DNA parçacıklarının yaklaşık ortalama uzunlukları 500 baz olarak belirlenmiştir. Dizileme analizi yapılan 40 adet DNA parçacığı, GenBankasında araştırılmıştır. Bunların 12 tanesi GenBankasında analizi sonucu henüz tanımlanmadığı, diğerlerinin tanımlanmış genlere homoloji gösterdikleri saptanmıştır. Kalbe özgü genlerin bilinmesinin önemi büyüktür. Konjenital kalp malformasyonlarının prenatal tanısının mo leküler genetik teknikleri ile incelenebilmesi için, ilgili genlerinin bulunması gerekmektedir. Kalp hastalıkları ile bağlantılı gen lokuslarında bulunan polimorfizmleri inceleyerek ailelerde hastalık hakkında bilgi sahibi olunabilir. Günümüzde kardiyovasküler hastalıklarda gen tedavisi çalışmaları da bulunmaktadır. Daha sonraki çalışmalarda bu yeni bilinmeyen genlerin, ayrıntılı bilgilerinin edinilmesi hedeflenmektedir.

Abstract:
It is well known that developmental and pathological changes in several tissues cause qualitative and quantitative differences in gene expression. The isolation of the genes related with these regulations is important to understand such changes. Subtractive cDNA libraries provide a powerfull approach for identifying and isolating genes that are differentially expressed in defined tissues or cell lines. This method has been used previously to distungish among genes that are differentially expressed in cancerous tissues. As transcripts specific to human blastosysts are examined with subtractive cDNA libraries, lots of information is gained about human preimplantation. It be comes possible to identify human homologs of the new genes identified and isolated as described on other studies using subtractive hybridization on rodent models. By using subtractive hybridization technique between heart muscle and skeletal muscle of mice (BALB/c), we aimed to create a cDNA-library that was specific to heart muscle. Thus new and rare genes that are expressed in the heart could be isolated and their relations with some heart. diseases could be examined. Using this subtractive cDNA hybridization cDNA was synthesized on oligo dT-linked latex particules. The sense strand DNA was made by asymmetric PCR using only one primer. Hybridization is performed between heart sense strand DNA and skeletal muscle cDNA linked to oligotex particules. The heart specific is then isolated and cloned. 107 recombinant plasmids were randomly selected out of this subtractive hybridization library and analyzed for their insert sizes. The average insert size was estimated to be 500 bp. DNA sequences of 40 insert were determined, and a homology search was performed with the data available through the GenBank data banks. Sixteen of the insert DNAs showed homology to other known genes whereas twelve of those had unique sequences. It is very important to identify and analyze heart specific genes for clinical approaches. To be able to perform prenatal diagnosis on congenital heart diseases, it is necessary to find out, the genes responsible for such diseases. Analysing polymorphisms that are localized on genes which are correlated with heart diseases, one can have information on familial transmission of hereditary diseases. In the future, our purpose is to continue the studies on these unknown genes and get detailed information about their function.