Aeribacillus pallidus AC6'da yüksek seviyede ekspres edilen flagellin geninin (hag) klonlanması, promotor yapısı, flagellar spesifik transkripsiyon faktörünün (sigma-d) izolasyonu ve saflaştırılması
Cloning and promoter architecture of flagellin gene (hag) expressed at high-level and isolation and purification flagellar-specific transcription factor (?d) in Aeribacillus pallidus AC6
Yazar: ELİF SEVİM
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada Aydın ili Çamköy köyü Çamur kaplıca suyundan izole edilen termofilik bir bakteri olan Aeribacillus pallidus AC6 bakterisi kullanıldı. AC6 hücresinde yüksek seviyede ekspres edilen bir protein belirlendi ve MALTI-TOF analizleri sonucunda bu proteinin flagellin protein olduğu belirlendi. Bu protein sekanslarından yola çıkılarak AC6 flagellin (hag) genin birkısmı çoğaltıldı. Genin geri kalan kısmı invers-PCR yöntemi ile tamamlandı.5'-RACE tekniği ile flagellin geninin transkripsiyon başlama bölgesinin translasyon başlama kodonundan 79 ve 80 bp upstream bölgede yer alan G ve T bazları olduğunu gösterildi. Transkripsiyon başlama kodunu belirlendikten sonra incelenen upstream bölgede ?D faktör tarafından tanınan promotor bölge sekanslarının varlığı gözlemlendi. Yapılan ß-galaktosidaz deneyi sonucunda, AC6 hag geninin -35 bölgede TAAA sekanslarına, -10 bölgede CCGATAT sekanslarına sahip olduğu ve bu sekansların bakteriyel RNAP enziminin ?D faktörü tarafından tanındığı tespit edildi.AC6 hag promotor ve ?D faktör etkileşimlerinin in-vitro olarak açıklanabilmesi için, AC6 ve B. subtilis ?D proteinleri ve B. subtilis kor RNAP enzimi saflaştırıldı. Yapılan in vitro transkripsiyon deneyleri sonucunda, AC6 ve B. subtilis ?D proteinlerinin kor RNAP enzimi ile yeniden yapılandığını ve ?D proteinlerinin AC6 hag promotor bölgesinde transkripsiyonu aktive ettiği gösterildi. AC6 hag promotorunun uzun -10 promotor elementi içindeki CGG motifinin ?D proteinin promotor bölgesinin tanınma ve bağlanmasında önemli olduğu tespit edildi.AC6 hag geni mRNA'sının sekonder yapısı incelendiğinde, hag transkriplerinin 5' ve 3' uçlarında stem-loop yapılarının varlığı tespit edildi. AC6 hag geni için tercih edilen kodonların B. subtilis bakterisi için yüksek sıklıkta kullanılan, G. kaustophilus ve G. stearothermophilus bakterileri için düşük sıklıkta kullanılan a.a. kodonları olduğu tespit edildi.

Abstract:
Aeribacillus pallidus AC6 , a thermophilic bacteria, isolated from hot spring water was used in this study. An over-expressed protein was determined and results of MALTI-TOF analyses showed that the over-expressed protein is similar flagellin protein. The AC6 flagellin gene was amplifioed based on this protein sequences. Rest of the flagellin gene was amplified by inverse PCR.5?-RACE expreriment showed that transcriptional start bases of hag gene are G and T residue located 79 and 80 bp upstream from translational start codon. When Upstream sequences were examined, we have seen that upstream sequence revealed potential sequence recognized ?D-dependent RNA polymerase. After ß-galactosidase experiment, We determined that AC6 hag gene has TAAA sequences at -35 region and CCGATAT sequences at -10 region and these region recognized by ?D of bacterial RNA polymerase.For describing interactions between AC6 hag promoter and ?D factor as in-vitro, ?D protein of AC6 and B. subtilis and kor RNAP of B. subtilis were purified. In vitro transcription assay showed that ?D proteins and kor RNAP enzyme reconstructed as holoenzyme form and this holoenzyme was activated transcription at AC6 hag promoter region. We determined that CCG motif of a long -10 region (CCGATAT) of promoter is important for the recognition and binding by ?D.When secondary structure of mRNA of AC6 hag gene was examined, we noted the prensence of a potetial steem-loop structure at 5? and 3? ends of hag gene transcripts. As a result of investigation, while AC6 hag gene includes same high frequencies codons of B. subtilis, it does not include same high frequencies codons of G. kaustophilus and G. stearothermophilus.