Farklı yöntemlerle kitosan eldesi ve karakterizasyonu
Synthesis and characterization of chitosan by different methods
Yazar: İLKAY KOÇER
Danışman: PROF. DR. HÜLYA YAVUZ ERSAN ; YRD. DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Aspergillus niger = Aspergillus niger ; DNA-rekombinant = DNA-recombinant

Özet:
Kitosanın endüstride geniş kullanım alanlarına sahip olmasından dolayı daha verimli ve daha iyi fizikokimyasal özellikteki kitosan üretimi için alternatif yollar bulmaya yönelik çalışmalar gün geçtikçe artmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında, farklı kaynaklardan ekstrakte edilen kitinden kitosan elde edilmiş ve ayrıca kitinin deasetilasyonunu katalizleyen kitin deasetilaz enziminin, rekombinant üretimi gerçekleştirilmiştir.
Çalışmanın ilk aşamasında, kitin kaynağı olarak kerevit ve karides kabukları kullanılmıştır. Kitin ekstraksiyonunda farklı işlem sırasıyla ve farklı deasetilasyon koşullarıyla kitin ve kitosan üretim verimleri karşılaştırılmıştır. İşlem sırasının üretim verimini etkilemediği ancak otoklav kullanımının deasetilasyon verimini (%18) arttırdığı gözlemlenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında, Aspergillus niger fungusundan kitin ve kitosan ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir. A. niger'den elde edilen kitin ve kitosan verimlerine göre, bu fungusun kitin için daha uygun bir kaynak olduğu tespit edilmiştir.
Kabuklardan ve A. niger'den elde edilen kitinler ve bu kitinlerin kimyasal deasetilasyonu ile üretilen kitosanların FT-IR ve TGA ile karakterizasyonu yapılmıştır. FT-IR spektrumları, birbirleri ve literatür ile karşılaştırılarak absorpsiyon bantlarının örtüştüğü gözlenmiştir. A. niger küf mantarının hücre duvarından elde edilen kitosanın deasetilasyon derecesi en yüksek %74 olarak bulunmuştur. Elde edilen kitinden yola çıkılarak kimyasal yolla üretilen kitosanın deasetilasyon derecesi ise %86 olarak bulunmuştur. Kitin ve kitosanların TGA grafikleri karşılaştırıldığında, kitosanın termal stabilitesinin (250-270˚C) kitine (350-400˚C) göre düşük olduğu görülmüştür.
Çalışmanın son aşamasında, Saccharomyces cerevisiae'dan elde edilen kitin deasetilaz (cda2) geni ekspresyon vektörlerine klonlanıp, glikozilasyon genlerine sahip rekombinant Escherichia coli suşlarına aktarılmıştır. Sentezlenen plazmidler saflaştırılarak, restriksiyon analizi ve DNA dizilemesi ile doğrulanmıştır. Üretilen rekombinant enzimlerin aktiviteleri spektrofotometrik yöntem ile belirlenmiş ve farklı ekspresyon sistemlerinden üretilen enzimler birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Aktivitede en iyi sonuç veren enzim (0.56 U/mL),  ticari kitin ile inkübe edilmiş ve literatüre göre daha yüksek deasetilasyon oranı (%4.1) elde edilmiştir. Kitin deasetilaz geninin E. coli'ye klonlanmasıyla elde edilen rekombinant enzimin, doğal yapısına benzer bir yapıda üretimi ilk kez bu çalışma ile gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
Studies have been increasing rapidly to find alternative ways for efficient production of chitosan with better physicochemical properties due to it's broad range of applications in industry. In this study, chitosan was obtained from chitin which was extracted from different sources and also recombinant production of chitin deacetylase enzyme catalyzing the deacetylation of chitin was achieved. 
In the first part of the study, crawfish and shrimp shells were used as chitin sources. Production yields of chitin and chitosan were compared for different procedures in chitin extraction process and different deacetylation conditions. It was observed that the order of steps did not affect the production yield whereas deacetylation under autoclaving conditions increased the efficiency (18%). In the second part of the work, chitin and chitosan extraction from Aspergillus niger fungus was performed. According to yields of chitin and chitosan, it was confirmed that this fungus is more favorable source for chitin rather than chitosan. 
Chitins which were obtained from crustaceans and A. niger, and chitosans which were produced with chemical deacetylation of these chitins were characterized by FT-IR and TGA. When the FT-IR spectra were compared, absorption bands of products matched up with each other and literature. The highest degree of deacetylation of chitosan which was extracted from cell wall of A. niger mold was obtained as 74%. At the same time, the highest degree of deacetylation of chitosan which was produced by chemical deacetylation of A. niger chitin was obtained as 86%. When TGA diagrams were compared, it was observed that the thermal stability of chitosan (250-270˚C) was lower than that of chitin (350-400˚C).   
In the last part of the study, chitin deacetylase (cda2) gene derived from Saccharomyces cerevisiae was cloned into expression vectors and transferred into recombinant Escherichia coli strains which have glycosylation genes. The plasmids were verified by restriction analysis and DNA sequencing. Enzyme activities of recombinant enzymes were tested by a spectrophotometric assay and activities of enzymes which are produced from different expression systems were compared with each other. Enzyme which has the best activity (0.56 U/mL), was incubated with commercial chitin and a higher deacetylation rate (4.1%) than the literature value was obtained. The production of enzyme, which has a similar structure to the wild type, was achieved for the first time with this study, by cloning of chitin deacetylase (cda2) gene to E. coli.