Meme kanserinin immünoterapisinde rekombinant protein içeren yeni nanoformülasyonların geliştirilmesi karakterizasyonu ve etkinliğinin ın vıtro incelenmesi
Development, characterization and investigation of efficacy of new nanoformulations containing recombinant protein in immunotherapy of breast cancer in vitro
Yazar: SAHAR DINPARVAR
Danışman: PROF. DR. DİLEK BALIK ; PROF. DR. ADİL M. ALLAHVERDİYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyoloji = Biology

Özet:
Meme kanseri, kadınlarda en sık görülen kanser türlerinden biridir. Bir kadının genel olarak yaşam boyunca bu hastalığa yakalanma riski %12 ile %13 oranındadır. Meme kanserinin tedavisinde, yaygın olarak cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi kullanılmaktadır. Cerrahi müdahale, kanserin erken evrelerinde olumlu sonuçlar sağlayabilir ancak ileri evrelerde her zaman etkili sonuçlar vermemektedir. Radyoterapi, kanser hücrelerinin X ışınlarına direnç göstermesi nedeniyle metastazlara yol açabilir. Kemoterapide ise kanser ilaçlarının hem kanser hücrelerine hem de normal hücrelere etki göstermesi, toksik yan etkilere ve ilacın hızla vücuttan atılması gibi önemli sorunlara yol açabilir. Son yıllarda, nanoteknolojinin ilerlemesiyle birlikte meme kanserinin tedavisinde nanotaşıyıcı sistemlere dayalı yeni yaklaşımlar geliştirilmektedir. Nanotaşıyıcı sistemler, mevcut toksik kanser ilaçlarının toksisitesini en aza indirmenin yanı sıra ilaç salım süresini uzatma ve terapotik indeksi artırma gibi bir çok avantajlar sağlamaktadırlar. Nano taşıyıcı sistemlerin tüm avantajlarını göz önünde bulundurarak bu çalışmada, doksorubisin (DOX), MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri antijenleri yüklü PCL nanopartiküllerinin (NP'ler), rekombinant survivin proteini (RP) ve alum adjuvanı ile kombinasyon halinde immün sistemi uyarıcı ve antikanser etkileri in vitro olarak J774 makrofaj, MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatları üzerinde değerlendirildi. DOX ve antijenlerin PCL NP'lere kapsüllenmesi çift emülsiyon çözücü buharlaştırma yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. NP'lerin fizikokimyasal özelliklerini değerlendirmek amacıyla taramalı elektron mikroskobu (SEM), zeta sizer ve UV-Vis spektrometresi kullanılarak boyut, morfoloji, zeta potansiyeli, salım profilleri ve enkapsülasyon etkinlikleri belirlendi. NP'lerin sitotoksik ve inhibe edici etkileri MTT yöntemiyle değerlendirildi, immünostimülatör etkileri ise nitrik oksit ve sitokin düzeylerini belirleyerek Griess reaksiyonu ve ELISA testleriyle analiz edildi. Elde edilen sonuçlara göre, DOX ve antijen yüklü PCL NP'lerinin boyutu 240 nm ile 290 nm arasında değiştiği gözlendi. Ayrıca, antijen ve ilaç yüklü NP'lerin, kapsüllenmemiş serbest ajanlara kıyasla makrofaj hücreleri üzerinde daha az toksik etkiye sahip olduğu ortaya çıktı. Ayrıca, insan meme kanseri hücre hatları üzerinde toksik olmayan konsantrasyonlarda (25 ve 50 μg/ml gibi) antijen ve ilaç yüklü NP'lerin önemli ölçüde inhibe edici etkisinin olduğu ortaya çıktı (p≤0.0001). Makrofaj hücreleri üzerinde test edilmiş olan alum ve survivin RP ile birlikte antijen ve DOX yüklü PCL NP'ler, 96 saatlik inkübasyon süresinin ardından özellikle 50 ve 100 µg/ml konsantrasyonlarında önemli ölçüde nitrik oksit üretimine yol açtığı saptandı. Ayrıca, IL-4 ve IL-12 sitokin düzeylerinde kontrole kıyasla belirgin bir artış gözlendi. Sonuç olarak, DOX ve antijen yüklü PCL NP'lerin survivin ve alum adjuvanı ile birlikte kullanımı, sırasıyla makrofaj ve meme kanseri hücreleri üzerinde önemli immün sistemi uyarıcı ve inhibe edici etkiler sergiledi. Sonuçlar, rekombinant survivin proteini ve alum adjuvanı ile kombinasyon halinde kullanılan antijen+ilaç yüklü PCL NP'lerin, meme kanseri hücrelerini inhibe etmek için etkili bir platform oluşturduğunu göstermektedir. Elde edilen sonuçlar, nanoteknoloji tabanlı immünoterapötik araçların geliştirilmesinde önemli bir adım olarak değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu sonuçların geçerliliğini sağlamak için daha ileri in vivo çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
Breast cancer is one of the most common types of cancer in women. The overall risk for a woman to develop this disease throughout her lifetime is between 12% and 13%. Commonly used treatments for breast cancer include surgery, chemotherapy, and radiation therapy. Surgical intervention can provide positive outcomes in early stages of cancer, but it may not always be effective in advanced stages. Radiation therapy can lead to metastasis as cancer cells may develop resistance to X-rays. In chemotherapy, the drugs used can affect both cancer cells and normal cells, causing significant toxic side effects and rapid elimination from the body. In recent years, new approaches based on nanocarrier systems have been developed for the treatment of breast cancer, thanks to advancements in nanotechnology. Nanocarrier systems offer several advantages, such as minimizing the toxicity of current cancer drugs, prolonging drug release, and increasing the therapeutic index. This study aims to assess the immunostimulatory and anticancer effects of PCL nanoparticles (NPs) loaded with doxorubicin (DOX) and breast cancer antigens (MCF-7 and MDA-MB-231), in combination with survivin recombinant protein (RP) and alum adjuvant. The evaluation was conducted in vitro using J774 macrophages, MCF-7, and MDA-MB-231 breast cancinoma cell lines. DOX and antigens were successfully encapsulated into PCL NPs using the double emulsion solvent evaporation method. SEM, DLS, and UV-Vis spectrometry techniques were employed to comprehensively examine the physicochemical characteristics of the nanoparticles. The properties of the NPs were evaluated by analyzing parameters such as morphology, diameter, zeta potential, release profiles, and encapsulation efficiencies. The cytotoxicity and inhibitory effects of the NPs were evaluated using the MTT assay, while the immunostimulatory effects were assessed through the nitric oxide and ELISA tests, measuring nitric oxide and cytokine levels, respectively. The results revealed that the size of the DOX and antigen-loaded PCL NPs ranged from 240nm to 290nm. The encapsulation of antigens and drugs within NPs resulted in reduced toxicity towards macrophage cells when compared to non-capsulated free agents. Furthermore, significant inhibitory effects were observed at non-toxic concentrations (25 and 50 μg/ml) on human cancinoma cell lines (p≤0.0001) when using antigen and DOX-loaded NPs. In the 96-hour incubation period, macrophages treated with antigen and DOX-encapsulated PCL NPs, in combination with alum and survivin RP, exhibited a notably higher release of nitrite compared to the control group, particularly at 50 and 100 µg/ml. Additionally, these treated macrophages stimulated the production of IL-4 and IL-12 cytokines in a significantly greater quantity than the control group. As a result, the combination of drug and antigen-loaded PCL NPs ın combination of survivin and alum adjuvant demonstrated a substantial immunostimulatory effect on macrophages and an inhibitory influence on breast cancer cells. The results underscore the potential of utilizing antigen+drug loaded PCL NPs in combination with RP and alum adjuvant as a promising platform for the development of nanotechnology-based immunotherapeutic tools, offering effective inhibition of breast cancer cells. However, further in vivo studies are needed to validate these findings.