Gıda takviyesi tabletlerinde bulunan glukozamin etken maddesinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile tayini için metot optimizasyonu ve validasyonu
Method optimization and validation for the determination of glucosamine active ingredient in food supplement tablets by high performance liquid chromatography (HPLC) method
Yazar: AYŞEGÜL SEMİZ
Danışman: PROF. DR. SİBEL TUNÇ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışma, gıda takviyesi tabletlerinde bulunan glukozamin etken maddesinin yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) cihazı ile metot optimizasyonunu ve validasyonunu kapsamaktadır. Glukozaminin gıda takviyesi tabletlerinden tespiti, Agilent marka 1100 model HPLC cihazı ile diyot dizi (array) dedektörü (DAD) kullanılarak sağlanmıştır. Sabit faz olarak Prodigy™ C18 (5 μm partikül büyüklüğünde, 150 mm uzunluğunda ve 3,2 mm iç çapında) ters faz sıvı kromatografi kolonu seçilmiştir. Gıda takviyesi tabletlerindeki glukozamin tespitinde referans standart madde olarak glukozamin sülfat kullanılmış ve Fmoc-OSu ile türevlendirme işlemi yapılmıştır.

Glukozamin etken maddesinin metot optimizasyon çalışmalarında hareketli fazın belirlenmesi için farklı hareketli faz bileşimleri denenmiş ve asetonitril (ACN):H2O karışımı (50:50) (pH 4'e trifloroasetik asit (TFA) ile ayarlanmıştır) uygun hareketli faz olarak bulunmuştur. DAD dedektörü ile farklı dalga boylarında çalışmalar yapılmış ve glukozaminin maksimum absorplama yaptığı dalga boyu 206 nm olarak belirlenmiştir. Band genişliği (bw) için optimum değer 4 olarak seçilmiştir. Hareketli faz akış hızı belirlenirken Van Deemter eğrisinden yararlanılmış ve optimum akış hızı 0,6 mL/dk olarak tespit edilmiştir. Optimum kolon sıcaklık değeri 35 ºC olarak saptanmış ve optimum enjeksiyon hacmi 5 μL seçilmiştir. Tespit limiti (LOD) ve kantitatif tayin limiti (LOQ) değerleri sırasıyla 0,014 mg/L ve 0,046 mg/L olarak hesaplanmıştır. Kesinliği belirlemek için, gün içi ve günler arası çalışmalar yapılmış ve yüzde bağıl standart sapma (%RSD) değerleri hesaplanmıştır. Gerçeklik parametresi için gıda takviyesi tabletlerine belirli derişimlerde glukozamin maddesi ilave edilerek çalışmalar yapılmış ve %85,15-%116,88 aralığında %geri kazanım değerleri elde edilmiştir. Seçicilik parametresi için, deneylerde kullanılan gıda takviyesi tablet numunesinden farklı formülasyona sahip gıda takviyesi tableti kullanılmıştır. Kararlılık testleri için kontrol numuneleri hazırlanmış ve oda sıcaklığında 5 gün boyunca farklı günlerde kısa dönem kararlılıkları karşılaştırılmıştır. Glukozamin etken maddesi için yapılan optimizasyon ve validasyon çalışmaları sonuçları değerlendirildiğinde, sistemin sağlam ve uygulanabilir olduğu görülmüştür.

Abstract:
This study involves the method optimization and validation of the glucosamine agent contained in dietary supplement tablets with a high-performance liquid chromatography (HPLC) device. Detection of glucosamine from dietary supplement tablets was performed using an Agilent brand 1100 model HPLC device with diode array detector (DAD). Prodigy™ C18 (150 mm length, with a particle size of 5 μm and an inner diameter of 3.2 mm) the reversed phase liquid chromatography column was used as a stationary phase. Glucosamine sulphate was used as a reference standard substance for detecting glucosamine in the dietary supplement tablets and derivatization process was realized with Fmoc-OSu.
 
In order to determine the mobile phase in the method optimization studies of the glucosamine agent, different mobile phase compositions were tested and the acetonitrile (ACN):H2O mixture (50:50) (pH adjusted to 4 with trifluoroacetic acid (TFA)) was selected as the appropriate mobile phase. Studies were carried out with the DAD dedector at different wavelengths, and the wavelength at which glucosamine performed a maximum absorbance was obtained at 206 nm. The optimum value for band width (bw) was selected as 4. Van Deemter equation was used for determining the flow rate of the mobile phase and the optimum flow rate was found to be 0,6 mL/min. The optimum column temperature value was assigned as 35 ºC and the optimum injection volume was selected as 5 μL. The values of the limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) were calculated as 0,014 mg/L and 0,046 mg/L, respectively. For determination of precision, intra-day and inter-day studies were carried out and percent relative standard deviation (%RSD) values were calculated. Glucosamine agent was added to the dietary supplement tablets at certain concentrations for the trueness parameter and %recovery values were obtained between 85,15% and 116,88%. For selectivity parameter, studies were carried out with a dietary supplement tablets with a different formulations than the dietary supplement tablet samples used in the experiments. For stability tests, control samples were prepared and their short-term stability values were compared at room temperature on different days for 5 days. When the results of optimization and validation studies for the glucosamine agent were evaluated, it was seen that the system was steady and applicable.