Biyolojik örneklerde reaktif oksijen türleri süpürme etkinliği ölçümü için spektrofotometrik yöntemler geliştirilmesi
Development of spectrophotometric methods for measurement of reactive oxygen species scavenging activity in biological samples
Yazar: BURCU BEKDEŞER
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA ÖZYÜREK ; PROF. DR. REŞAT APAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Biyolojik dokular = Biological tissues ; Hidroksil radikali = Hydroxil radical ; Serbest radikaller = Free radicals

Özet:
Hidroksil radikali (?OH), süperoksit anyon radikali (O2.-), ve hipokloroz asit (HOCl) gibi reaktif oksijen türlerini süpürebilen antioksidanların araştırılmasına olan ilgi günümüzde giderek artmaktadır. Bu nedenle bu reaktif oksijen türlerinin (ROS) saptanması ve antioksidanların bu reaktif türleri süpürme aktivitesinin belirlenebilmesi için basit, duyarlı ve hızlı yöntemler gereklidir. Tez çalışmasında geliştirilen spektroskopik yöntemlerde amaç; bu reaktif türleri süpürme aktivite tayini için literatürdeki mevcut yöntemlerin eksikliklerini ve kısıtlamalarını ortadan kaldırabilmektir. Bunun için çalışma grubumuzca daha önce literatüre kazandırılan ve hem ülkemizde hem de dünyada yaygın kullanım alanına sahip CUPRAC `Bakır(II) iyonu indirgeyici antioksidan kapasite' yönteminin esasına bağlı kalınarak çeşitli modifikasyonlarla hidroksil radikali (?OH) ve süperoksit anyon radikali (O2.-) süpürülmesine dayalı antioksidan aktivite analiz yöntemleri geliştirilmiştir. Hipokloroz asit (HOCl) süpürülmesine dayalı antioksidan aktivite tayini için CUPRAC yönteminden bağımsız olarak florometrik bir yöntem geliştirilmiştir.İnsan vücudunda üretilen ve en reaktif oksijen türü olan hidroksil radikali, oksidatif stres kaynaklı hastalıklarla sonuçlanan doku hasarının oluşumunda önemli bir rol oynamaktadır. Hidroksil radikal süpürme aktivitesinin tayini için spesifik olmayan, düşük verimli TBARS yöntemi gibi mevcut tekniklere alternatif olarak geliştirilen Modifiye CUPRAC Yöntemi-I daha uygun, yüksek verimli bir yöntemdir. Bu çalışmada, Fe(II)-EDTA kompleksi ve H2O2 karışımından oluşan Fenton reaksiyonu ile üretilen hidroksil radikallerinin belirlenmesinde tereftalat probu kullanılmıştır. İnkübasyon periyodunun sonunda etil asetat ilavesiyle prob ve hidroksillenme ürünü ekstrakte edilerek CUPRAC yöntemiyle spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Tereftalat probu CUPRAC-reaktif olmadığı halde hidroksillenme ürünü 2-hidroksi tereftalat CUPRAC reaktifine yanıt vermektedir. İnkübasyon ortamına ilave edilen hidroksil radikal süpürücülerin tereftalat probu ile yarışması sonucunda daha az hidroksillenme ürünü oluşmakta ve CUPRAC reaktifinden Cu(I)-Nc kromofor oluşumu azalmaktadır. Bu çalışmada, bazı tiyol tipi antioksidanların, amino asitlerin ve plazma antioksidanlarının ikinci mertebeden hidroksil radikali süpürme hızları yarışmalı kinetik yöntemiyle belirlenerek sonuçlar referans yöntem olarak seçilen TBARS yöntemiyle karşılaştırılmıştır.Süperoksit anyon radikali çeşitli bileşikler için indirgen veya yükseltgen olarak hareket edebilir ve hidroksil radikali, singlet oksijen gibi daha aktif oksijen türleri oluşumu için anahtar rol oynar. Hücrede süperoksit anyon radikal üretimi enzimatik ve enzimatik olmayan reaksiyonlar sonucunda gerçekleşmektedir. Süperoksit anyon radikali süpürme aktivitesi tayini için geliştirilen yöntemde PMS-NADH (fenazin metasülfat-nikotinamid dinükleotid) sistemiyle üretilen süperoksit radikallerinin belirlenmesinde 2-tert-butil hidrokinon (TBHQ) probu kullanılmıştır. Bu tez çalışmasıyla birlikte literatürde ilk kez süperoksit süpürme aktivite tayini için prob olarak kullanılan TBHQ, sıklıkla kullanılan mevcut problara (NBT ve ferrisitokrom c) göre seçimlilik ve kapsayıcılık açısından daha üstün bir probdur. NBT ve ferrisitokrom c problarının süperoksit anyon radikali ile olduğu gibi doku homojenizatlarında bulunan düşük konsantrasyondaki askorbik asit tarafından da indirgenmesi söz konusudur. İnkübasyon ortamında süpürücü varlığında ve yokluğunda süperoksit anyon radikali tarafından yükseltgenmeden kalan TBHQ probu etil asetat ile reaksiyon ortamından ekstrakte edilerek organik çözücü fazında CUPRAC yöntemi ile spektrofotometrik olarak belirlenmektedir. Bu çalışmada tiyol tipi antioksidanlar, amino asitler ve plazma antioksidanları için süperoksit anyon süpürme aktiviteleri geliştirilen Modifiye CUPRAC Yöntemi-II ile belirlenerek sonuçlar referans yöntem olarak seçilen NBT yöntemiyle karşılaştırılmıştır.Hipokloroz asit, radikalik olmayan bir reaktif oksijen türü olmakla birlikte oksidatif süreç içerisinde dokularda bulunabilmektedir. Hipokloroz asit süpürme aktivite tayini için literatürde mevcut yöntemlerin çeşitli kısıtlamaları bulunmaktadır. Hipokloroz asit süpürme aktivitesinin ölçümü için literatürde sıklıkla kullanılan TNB oksidasyonu yöntemi tiyol tipi antioksidanlar için kullanılamamaktadır. Bu tez çalışmasıyla birlikte literatürde ilk kez HOCl süpürme aktivite tayini için prob olarak resorsinol bileşiği kullanılarak tiyol tipi antioksidanlar, amino asitler ve plazma antioksidanlarının aktiviteleri florometrik olarak ölçülmüştür. Resorsinol probunun hipokloroz asit ile inkübasyonu sonucunda klorinasyon ürünlerinin oluşumu nedeniyle proba ait floresans şiddeti azalmaktadır, çünkü resorsinol floresan olduğu halde klorinasyon ürünleri değildir. Süpürücü varlığında ve yokluğunda ölçülen floresans şiddetlerinin farkından yararlanarak hipokloroz asit süpürme aktivitesi tayin edilmiştir. Geliştirilen yeni florometrik yöntem ile bulunan sonuçlar referans yöntem olarak seçilen KI/taurin yöntemiyle karşılaştırılmıştır.Tez çalışmasında reaktif oksijen türleri süpürme etkinliği için geliştirilen tüm yöntemlerde kullanılan problar (tereftalat, 2-tert-butil hidrokinon, resorsinol) ve bu probların reaktif oksijen türü ile reaksiyonu sonucunda oluşan ürünler HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) yöntemiyle belirlenerek sonuçların istatistiksel karşılaştırması yoluyla geliştirilen yöntemler valide edilmiştir.Ayrıca reaktif oksijen türleri süpürme etkinliği tayini için geliştirilen tüm yöntemler, biyolojik bakımdan önemli antioksidanlara (tiyol-tipi antioksidanlar, amino asitler ve plazma antioksidanları) ek olarak karaciğer ve böbrek doku homojenizatlarına uygulanarak gerçek örnekler için % inhibisyon değerleri hesaplanmış ve bulguların gıda kimyası yanında klinik biyokimya araştırmalarına da yararlı olması sağlanmıştır.

Abstract:
Recently the growing interest in finding antioxidants that can scavenge superoxide anion (O2.-), hydroxyl radical (?OH) and hypochlorous acid (HOCl) is becoming increasingly recognized. So simple and sensitive methods for the determination of related reactive oxygen species (ROS) species and of the scavenging activity of antioxidants are necessary. The aim of the developed spectrophotometric procedures is to resolve shortcomings and limitations of the available methods in literature for the determination of reactive species scavenging activity. The widely used CUPRAC (CUPric ion Reducing Antioxidant Capacity) method was originally developed and introduced to world literature by our research group. Sticking to the essentials of the original CUPRAC method, modified CUPRAC assays were developed to establish novel antioxidant activity analysis methods based on scavenging hydroxyl and superoxide anion radicals. A fluorometric method has been developed for hypochlorous acid scavenging activity assay, independently of the CUPRAC method.Hydroxyl radicals (?OH) generated in the human body may play an important role in tissue injury at sites of inflammation in oxidative stress?originated diseases. We developed more convenient and highly efficient Modified CUPRAC Assay-I as an alternative to the nonspecific, low-yield TBARS (thiobarbituric acid?reactive substances) test. We used a terephthalate probe for detecting ?OH generated by the reaction of iron(II)-EDTA complex with H2O2 (Fenton reaction). At the end of the incubation period, the probe and its hydroxylation product were determined spectrophotometrically by extracting with ethyl acetate. Whilst the terephthalate probe is not CUPRAC?reactive, its hydroxylation product, 2-hydroxy terephthalate, responds to the CUPRAC reagent. Added radical scavengers to the incubation medium compete with terephthalate for the ?OH produced, and diminish chromophore formation from Cu(II)-neocuproine (Nc). With the aid of competitive kinetic reaction, the second-order rate constant of thiol-type antioxidants, amino acids and plasma antioxidants were evaluated for their ?OH scavenging activity using the developed method and compared with the reference TBARS test.The superoxide anion radical can act both as a reducing and oxidizing agent for a variety of compounds and is a key intermediate for more active oxygen species, such as hydroxyl radical and singlet oxygen. Superoxide anion radical formation occurs continuously in the cells as a consequence of both enzymatic and nonenzymatic reactions. We used a 2-tert-butyl hydroquinone (TBHQ) probe for detecting superoxide generated by the reaction of PMS-NADH (phenazine methosulfate-nicotinamide adenine dinucleotide). In this thesis, TBHQ, firstly used as a probe for the detection of superoxide scavenging activity, is a superior probe compared to existing probes (NBT and ferricytochrome c) in terms of selectivity and versatility. NBT and cytochrome c can be chemically reduced by low concentrations of ascorbic acid present in tissue homogenates as superoxide radicals. The remaining TBHQ probe in the reaction mixture (in the absence and presence of scavenger) was extracted with ethyl acetate and determined spectrophotometrically in the organic phase by the CUPRAC assay. Thiol-type antioxidants, amino acids and plasma antioxidants were evaluated for their superoxide radical scavenging activity using the developed Modified CUPRAC Assay-II, and the results compared with those of the reference NBT method.Hypochlorous acid is a biologically relevant, non-radical oxidizing species, and may be formed in tissues through oxidative processes. A variety of methods available in literature for the determination of hypochlorous acid scavenging activity have some limitations. TNB oxidation method which is commonly used in literature is not suitable for hypochlorous acid scavenging activity measurement of thiol type antioxidants. In this thesis, resorcinol has been firstly used as a probe for the fluorometric determination of HOCl scavenging activity of thiol-type antioxidants, amino acids and plasma antioxidants. Resorcinol probe can be chlorinated with HOCl, and the fluorescence intensity of resorcinol is attenuated as a result of its reaction with HOCl, because resorcinol is fluorescent while its chlorination products are not. The attenuated intensity of resorcinol fluorescence is dependent upon the HOCl scavenging activity of the tested compound. With the aid of resorcinol fluorescence values recorded in the presence and absence of scavengers, the HOCl scavenging activity of scavengers can be calculated. The HOCl scavenging activity measured by the fluorometric method was compared with that by the reference KI/taurine method.The developed methods for measurement of ROS scavenging activity were validated by quantifying the probes (terephthalate, 2-tert-butyl hydroquinone, resorcinol) and their oxidation products by HPLC (high performance liquid chromatography) method, and by statistically comparing the results.In addition to biologically important antioxidants (thiol type antioxidants, amino acids and plasma antioxidants), tissue (e.g., liver and kidney) homogenates were evaluated for their ROS activity to calculate percentage inhibition values using the developed methods, thereby contributing research related to clinical biochemistry as well as food chemistry.