Nergis (Narcissus tazetta subsp. tazetta) bitkisinde RITA biyoreaktörleri kullanılarak in vitro soğan üretimi
In vitro bulb production using RITA bioreactors in daffodil (Narcissus tazetta subsp. tazetta) plants
Yazar: CANAN YILAN
Danışman: PROF. DR. AYNUR GÜREL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu tez çalışmasının amacı, Narcissus tazetta subsp. tazetta bitkisinde, in vitro sürgün ve in vitro soğancık çoğaltımı için etkili bir protokol oluşturulmuştur ve RITA® biyoreaktörlerinde büyük ölçekli in vitro soğancık üretimini gerçekleştirmektir.
Sterilizasyon protokolünün belirlenmesi amacıyla, doğadan toplanan soğanlar farklı sterilizasyon yöntemlerine maruz bırakılmışlardır. Otuzbeş dk süreyle %20 NaOCl'de bırakıldıktan sonra 5 dk süreyle %0.1'lik HgCl2 uygulanan soğanlardan en iyi sterilizasyon yüzdesi (%43.33) elde edilmiştir. Başlangıç olarak, aseptik soğanlardan izole edilen ikili-pullar 2 mg/l 6-benzilaminopürin (BAP) ve 1 mg/l indol-3-bütirik asit (IBA) ile desteklenen Murashige&Skoog (MS) besin ortamında kültüre alınmış ve bunlardan elde edilen rejenere sürgünlerin ise 6 hafta aralıklarla iki defa aynı besin ortamında altkültürleri gerçekleştirilmiştir. Eksplant başına sürgün sayısını arttırmak için, in vitro sürgünlerden elde edilen ikiz-pul eksplantları, BAP, IBA ya da BAP+IBA kombinasyonlarını içeren MS besin ortamına transfer edilmişlerdir. Eksplant başına en yüksek sürgün sayısı (6.10 adet sürgün) 1.0 mg/l BAP + 1.0 mg/l IBA içeren MS besin ortamında elde edilmiştir. In vitro sürgünler en iyi 1 mg/l indolasetik asit (IAA) ve 15 g/l sükroz ihtiva eden ½ MS besin ortamında köklendirilmişlerdir. In vitro bitkicikler, %90 yaşama oranı ile başarıyla aklimatize olmuşlardır.  On üç ay sonunda soğanların hepsi tekrar sürgün vermişlerdir
İkiz-pul eksplantları, in vitro soğancık üretimi için, 30-120 g/l konsantrasyonlarında sükroz ya da 0.5- 2.0 mg/l konsantrasyonlarında klorokolin klorit (CCC), paklobütrazol (PBZ) ya da daminozide (DMZ) ile desteklenen MS ortamında kültüre alınmışlardır. Bu eksplantlar, 1 mg/l BAP + 1.0 mg/l IBA + 60 g/l sükroz içeren MS ortamında, in vitro soğancık üretimi için, en iyi sonucu (4.27 adet soğancık) vermişlerdir. Geçici daldırma sistemi olan, RITA® biyoreaktörleri N. tazetta bitkisinde in vitro soğancık üretiminde ilk kez kullanılmıştır. İçeriğinde 1 mg/l BAP + 1.0 mg/l IBA + 60 g/l sükroz bulunan sıvı MS besin ortamı içeren RITA® biyoreaktörlerinde, kültüre alınan ikiz-pul eksplantları kararmışlardır.

Abstract:
The aims of this thesis were to establish an efficient protocol for propagation of the in vitro shoots and in vitro bulblets in Narcissus tazetta subsp. tazetta and realise large scale propagation of in vitro bulblets in RITA® bioreactors.  
To develop a sterilization protocol, bulbs collected from nature were exposed to different sterilization procedures. Bulbs treated with 20% NaOCl for 35 min and 0.1% HgCl2 for 5 min showed best sterilization rate (43.33%). Initially, triplet-scales isolated from aseptic bulbs were cultured on Murashige and Skoog Medium (MS) supplemented with 2 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP) and 1 mg/l indole-3-butyric acid (IBA) and regenerated shoots were then subcultured twice on these medium every 6 weeks. To improve the number of shoots per explant, twin-scale explants obtained from in vitro shoots were transferred on MS medium supplemented with BAP, IBA or BAP+IBA combinations. The highest number of shoots per explant (6.10 shoots) was obtained on MS containing 1.0 mg/l BAP + 1.0 mg/l IBA. In vitro shoots rooted best on ½ MS containing 1 mg/l indoleacetic acid (IAA) and 15 g/l sucrose. In vitro plantlets were successfully acclimatized with 90% survival rate. All acclimatized bulbs had shown shoot rejeneration after 13 months.
Twin-scale explants were cultured on MS medium supplemented with sucrose at the concentrations of 30-120 g/l or chlorocholine chloride (CCC), paclobutrazol (PBZ) or daminozide (DMZ) at the concentration of 0.5-2.0 mg/l for in vitro bulblet production. Twin-scale explants cultured on MS medium containing 1 mg/l BAP + 1.0 mg/l IBA + 60 g/l sucrose gave best results (4.27 bulblets) for in vitro bulblets propagation. RITA® bioreactor based on temporary immersion system was used for the first time in vitro bulblet propagation of N. tazetta. All of twin-scale explants cultured in RITA® bioreactors containing liquid MS medium supplemented with 1 mg/l BAP + 1.0 mg/l IBA + 60 g/l sucrose browned and gave no response.