Kendiliğinden tek tabaka oluşumuna dayalı enzim temelli biyosensör sistemleri geliştirilmesi
Development of enzyme biosensor systems based on self-assembled monolayer
Yazar: EMİNE YORGANCI
Danışman: DOÇ. DR. EROL AKYILMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Alkalen fosfataz = Alkaline phosphatase ; Amperometri = Amperometry ; Dönüşümlü voltametri = Cyclic voltammetry

Özet:
Bu tezde, kendiliğinden tek tabaka oluşumu yöntemine dayalı olarak sarkozin oksidaz ve alkalen fosfataz içeren enzim biyosensörleri geliştirilmesi amaçlanmıştır. Sarkozin oksidaz temelli biosensör sisteminde altın elektrot yüzeyinde tiyoüre kullanılarak kendiliğinden tek tabaka oluşturulmuş ve glutaraldehid ile çapraz bağlandıktan sonra enzim immobilize edilmiştir. Geliştirilen biyosensör sistemi ile döngüsel voltammetri yöntemi kullanılarak sarkozin tayinine yönelik ölçümler yapılmıştır. Alkalen fosfataz içeren sensör sistemi, screen-printed altın elektrot üzerinde sisteamin kullanılarak kendiliğinden tek tabaka oluşturulması ve glutaraldehid ile çapraz bağlandıktan sonra enzim immobilizasyonu temeline dayanır. Biyosensör sistemi ile kronoamperometrik yöntem kullanılarak p-nitrofenil fosfat tayini yapılmıştır.Sarkozin oksidaz biyosensöründe ölçümler, sarkozin derişimi ile doğru orantılı olarak artan akım değerlerinin döngüsel voltametrik yöntem ile belirlenmesi ile gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan biyosensörler için öncelikle SAM tabaka bileşenlerinin optimizasyonları gerçekleştirilmiştir. Optimizasyon çalışmaları sonucunda sarkozin oksidaz biyosensörü için en uygun enzim miktarı, tiyoüre ile SAM oluşturma zamanı, glutaraldehid yüzdesi, tarama hızı sırasıyla 3.9 U/ml sarkozin oksidaz, 24 saat tiyoürede bekletme, %10'luk glutaraldehid, 0.025 V/s tarama hızı olarak bulunmuştur. Çalışma koşullarının optimizasyonu amacıyla yapılan denemelerde sarkozin oksidaz biyosensörü için çalışma tamponu olarak 50 mM pH: 8.3 fosfat tamponu ve çalışma sıcaklığı olarak 25 °C bulunmuştur. Sarkozin oksidaz biyosensörü için yapılan karakterizasyon çalışmalarında ise 50 nM ? 208 nM aralığında sarkozin için doğrusal sonuçların alındığı belirlenmiştir. Tekrarlanabilirlik denemelerinde (n= 6) 136 nM sarkozin konsantrasyonunda ortalama değer X= 138.67 nM, standart sapma (S.S)= ±5.44 ve % varyasyon katsayısı VK= %3.92 olarak bulunmuştur.Hazırlanan alkalen fosfataz enzim sensöründe p-nitrofenil fosfat (pNFF) ölçümü kronoamperometrik yöntem kullanılarak screen printed altın elektrot sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Biyosensör sistemi üzerinde yapılan deneyler ile optimum koşullar saptanmıştır. Bu sensör sistemi için alkalen fosfataz miktarı, sisteamin ile SAM oluşturma süresi, glutaraldehid yüzdesi sırayla 32.5 U/ml alkalen fosfataz, screen printed altın elektrotun 12 saat sisteamin ile muamelesi, %5 glutaraldehid oranı uygun bulunmuştur. Çalışma koşullarının optimizasyonunda pH:10.5; 0.1 M glisin tamponu ( 0,1 M KCl ve 1 mM MgCl2 içerir) kullanılmasına ve ölçümlerin 30°C da gerçekleştirilmesine karar verilmiştir. Geliştirilen biyosensör sisteminin karakterizasyon çalışmalarından 0.05 mM?0.6 mM arasında p-nitrofenil fosfat için doğrusal bir grafik elde edilmiştir. Ayrıca tekrarlanabilirlik çalışmalarının sonucunda (n= 8) 0.2mM p-nitrofenil fosfat derişimin de ortalama değer X= 0.199 mM standart sapma (S.S)= ±0.01 ve % varyasyon katsayısı VK= %5.02 olarak bulunmuştur.

Abstract:
Depending on self-assembled monolayer method, development of enzyme biosensors that contain sarcosine oxidase and alkaline phosphatase was the ultimate aim of this thesis. In the sarcosine oxidase based biosensor system, self-assembled monolayer was formed on the gold electrode with thiourea and enzyme was immobilized after cross linking with glutaraldehyde. Measurements of the sarcosine concentration were carried out using the formed biosensor and with the help of cyclic voltammetric method. Alkaline phosphatase containing biosensor system is based on formation of self-assembled monolayer on the screen printed gold electrode using cysteamine and enzyme immobilization after cross linking with glutaraldehyde. Using this biosensor system and the chronoamperometry method, p-nitrophenyl phosphate concentration was measured.The measurements on the sarcosine oxidase biosensor were carried out with the determination of increasing current values directly proportional with the sarcosine concentration using the cyclic voltammetric method. Primarily, SAM layer components optimization was carried out for the prepared biosensors. As a result of the optimization study, the optimum enzyme amount, SAM formation time with thiourea, glutaraldehyde percentage, scan rate for the sarcosine oxidase biosensor were discovered respectively; 3.9 U/ml sarcosine oxidase, 24 hours holding in thiourea, 10% glutaraldehyde, 0.025 V/s scan rate. It was discovered at the experiments for the optimization of the working conditions that the buffer at this study as 50 mM, pH 8.3 phosphate buffer and working temperature as 25 0C for the sarcosine oxidase biosensor. It was determined at the characterization studies on the sarcosine oxidase biosensor that linear results are obtained between the ranges of 50 nM to 208 nM sarcosine concentration. At the repeatability experiment, average value X=138.67 nM, standard deviation (SD)= ±5.44 and coefficient of variation CV=%3.92 was discovered for the (n=6) 136 nM sarcosine concentration.The measurement of p-nitrophenyl phosphate (pNPP) at the prepared alkaline phosphatase enzyme biosensor was carried out using chronoamperometry method on the screen printed gold electrode system. Optimum conditions were determined with the experiments that were carried on the biosensor system. For this biosensor system, the amount of alkaline phosphatase, SAM formation time with cysteamine and glutaraldehyde percentage were discovered respectively; 32.5 U/ml alkaline phosphatase, treatment of the screen printed gold electrode with cysteamine for 12 hours and 5% glutaraldehyde. The use of pH: 10.5; 0.1 M glycine buffer (contains 0.1 M KCl and 1 mM MgCl2) and carrying out the measurements at 30 0C was decided at the optimization of the study conditions. It was determined at the characterization studies of the developed biosensor system that linear results are obtained between the ranges of 0.05 mM- 0.6 mM p-nitrophenyl phosphate concentration. Moreover, as a result of the repeatability studies, average value X=0.199 mM, standard deviation (SD)= ±0.01 and coefficient of variation CV=%5.02 was discovered for the (n=8) 0.2 mM p-nitrophenyl phosphate concentration.