Hipoksik ortamın mikroveziküllere etkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of the effect of hypoxia condition on microvesicles
Yazar: NUR SEDA ŞAHİN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ZEYNEP BURÇİN GÖNEN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Eksozomlar = Exosomes ; Hipoksi = Hypoxia ; Hücreler = Cells ; Kök hücreler = Stem cells ; Tedavi = Treatment ; Vezikül = Blister

Özet:
Günümüzde birçok hastalığın tedavisinde kök hücreler denenmeye ve/veya kullanılmaya başlanmıştır. Literatürde hastaya hücre uygulamadan hücrelerin etkinliğinden faydalanılan yeni konseptin adı: Hücresiz hücresel tedavilerdir. Bu şekilde hücreler hastaya verilmez ancak hücrenin ürettiği içerik hastaya taşınır. Bu taşınan içerik eksozomları da içeren mikroveziküllerdir. Hipoksi oksijen konsantrasyonunun azalarak kritik eşik değerin altına düştüğü koşulu ifade etmektedir.  Çalışmanın amacı, oksijen konsantrasyonunun daha düşük olduğu hipoksik ortamın; elde edilen eksozomlar üzerine etkisini değerlendirmektir.
Bu amaçla, farklı oksijen konsantrasyonlarında (%21, %5, %3) h-UK mezenkimal kök hücreleri ve tam kandan izole edilen nötrofil hücrelerinin kültürü yapıldı ve eksozomları izole edildi. Eksozomlar SEM, partikül boyut analizi ve western blot yöntemi ile tanımlandı. Umblikal kord kaynaklı eksozomların lenfosit proliferasyonuna olan etkisi Kİ67 ve XTT proliferasyon testleri ile belirlenerek etkinlilik analizi yapıldı. 
Çalışmanın sonucunda farklı oksijen koşulları ve farklı kaynaklardan başarılı bir şekilde eksozom izolasyonu yapıldı. İzole edilen eksozomların miktarı, miktar tayin kiti ile belirlendi. Çalışılan grupların miktarları hesaplandı ve ortalama miktar 88-93x107 olarak ölçüldü. Sonuç olarak %5 hipoksi grubunda daha fazla miktarda eksozom izole edildi ancak gruplar arası yapılan karşılaştırmada miktar olarak bir fark gözlenmedi (p nötrofil= 0,22, p h-UK=0.43). SEM analizinde eksozomların çapları h-UK-MKH örneklerinde ortalama 66.07±15.33 nm olarak ölçülürken, nötrofil hücrelerinde ortalama 63.66±5.38 nm olarak ölçüldü. Gruplar arasındaki %3 hipoksi nötrofil kaynaklı eksozom grubunda daha büyük boyutta eksozom izole edildi (p˂0.001). Partikül boyut analizinde yapılan ölçüm ile elde edilen sonuçlarda h-UK kaynaklı eksozomların boyutu 68.98 nm olarak hesaplanırken, nötrofil eksozomları 53.35 nm olarak hesaplandı. Western blot analizinde eksozomlar tarafından CD63 ve CD9 yüzey belirteçlerini eksprese eden protein bantları gösterildi. %3 hipoksi ile elde edilmiş h-UK kaynaklı eksozom grubunun normoksi ve %5 hipoksiye göre, lenfosit proliferasyon testi sonucunda daha etkin olduğu belirlendi (p˂0.001). 
%3 hipoksik koşul varlığı; nötrofil eksozomlarının daha büyük boyutta olmasına ve umbilikal kord eksozomlarının daha etkin olmasına yol açmaktadır.

Anahtar Kelimeler: Kök hücre, Hipoksi, Ekstraselüler Vezikül, Eksozom, Hücresiz Hücresel Tedavi

Abstract:
At the present time, stem cells are being tested and / or used in the treatment of many diseases. The name of the new concept in the literature, which benefits from the effectiveness of cells without administering cells to the patient, is called Cell-free cellular treatments. In this way, the cells are not delivered to the patient, but the content produced by the cell is transported to the patient. These transported contents are microvesicles, including exosomes. Hypoxia refers to the condition where the oxygen concentration decreases and falls below the critical threshold. The aim of this study was to investigate the hypoxic environment where oxygen concentration was lower; to evaluate the effect on the resulting exosomes.
For this purpose, h-UK mesenchymal stem cells and neutrophil cells isolated from whole blood were cultured at different oxygen concentrations (21%, 5%, 3%) and exosomes were isolated. Exosomes were identified by SEM, particle size analysis and western blot method. The effect of umbilical cord-derived exosomes on lymphocyte proliferation was determined by Ki67 and XTT proliferation tests and efficiency analysis was performed.
As a result of the study, exosome isolation was performed successfully from different oxygen conditions and different sources. The amount of isolated exosomes was determined by the quantification kit, and the amounts of the studied groups were calculated and the average amount was measured as 88-93x107. As a result, more exosomes were isolated in the 5% hypoxia group but no difference was observed in the comparison between the groups (p neutrophil = 0.22, p h-UK = 0.43). Diameters of exosomes were measured as 66.07 ± 15.33 in h-UK-MSC samples and 63.66 ± 5.38 in neutrophil cells. Exosomes of larger size were isolated in the 3% hypoxia neutrophil-derived exosome group between the groups (p˂0.001). In the results obtained by the particle size analysis, h-UK-derived exosomes were calculated as 68.98 nm, while neutrophil exosomes were calculated as 53.35 nm. Western blot analysis showed protein bands expressing CD63 and CD9 surface markers by exosomes. H-UK-derived exosome group obtained by 3% hypoxia was found to be more effective than lymphocyte proliferation test compared to normoxia and 5% hypoxia (p˂0.001).
3% presence of hypoxic condition; the neutrophil exosomes are larger in size and the umbilical cord exosomes are more effective.

Keywords: Stem cell, Hypoxia, Extracellular Vesicle, Exosome, Cell-free Cellular Therapy