Bazı tıbbi bitkisel ürünlerin In vıtro ve In vıvo antimikrobiyal etkileri üzerinde araştırmalar
A study on antimicrobial effects of some medicinal plants product at In vitro and In vivo
Yazar: ÖZNUR GÖRMEZ
Danışman: PROF. DR. ÖZNUR DİLER
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Bu tez çalışması ile tıbbi bitki türlerinin (Hypericum perforatum L., Urtica dioica L., Origanum vulgare L., Artemisia absinthium L., Origanum onites L., Lonicera periclymenum L., Origanum minutiflorum  O. Schwarz & PH Davis) uçucu yağları bakteri türlerine (Aeromonas hydrophila (9), Yersinia ruckeri (10), Flavobacterium psychrophilum (3), Lactococcus garvieae (10), Vagococcus salmoninarum (2), Vibrio anguillarum (11), Vibrio alginolyticus (1), Photobacterium damselae (1)) karşı in vitro antibakteriyel etkisi disk difüzyon testi ile ve Origanum onites ve Lonicera periclymenum bitki türlerinin etanol ekstraktları ise viral hemorajik septisemi (VHS) virüsüne karşı in vitro antiviral etkisi sitopatik etki inhibisyon testi kullanılarak incelenmiştir. Antibakteriyel aktivite denemesinde, U. dioica bitkisi hariç diğer uçucu yağların test edilen bakteri suşlarına karşı değişen antibakteriyel etkileri olduğu görülmüştür. U. dioica bitkisinin test edilen bakteri suşlarına karşı herhangi bir antibakteriyel etkiye sahip olmadığı belirlenmiştir. Balık patojenlerine karşı en iyi etki, en yüksek zon çapı (50.33±1.52 mm) ve en düşük MIC değeri (0.97 µl/ml) ile Oregano türlerinde olmuştur (p<0.05). Antiviral aktivite sonuçlarına göre, O. onites ve L. periclymenum etanol ekstraktlarının 1/16 ve 1/32 dilüsyonlarında VHS virüsünün hücresel sitopatik etkisini kısıtladığı görülmüştür.    

Aşılı (Yersiniosis) ve aşısız gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss) yem katkı maddesi olarak kullanılan O. onites bitkisinin büyüme performansı, bağışıklık sistemi ve hastalıklara karşı direnç üzerine in vivo etkisi bu tez çalışması ile incelenmiştir. Ortama ağırlığı 14.08±2.74 - 16.81±3.89 g olan toplamda 2100 adet sağlıklı gökkuşağı alabalığı ticari bir alabalık işletmesinden temin edilmiştir. Daha sonra balıklar rastgele 10 farklı gruba ayrılmış ve her grup 70 balık içeren 3 tekrardan oluşturulmuştur. Balıklar 8 hafta süresince O. onites bitkisi toz (1.0 ve 10.0 g/kg) ve uçucu yağı (0.5 ve 3.0 ml/kg) ilaveli yemlerle beslenmişlerdir. Denemenin başlangıcında 5 grup Y. ruckeri patojenine karşı aşılanmış (i.p. 0.1 ml/balık) ve aynı özellikteki yemlerle beslenmişlerdir. Kontrol grubundaki balıklar ticari alabalık yemi ile beslenen aşısız bitki olmayan / aşılı bitki olmayan şeklinde oluşturulmuştur.

56 günlük besleme periyodunun sonunda balıklarda final ağırlık, kondüsyon faktörü, canlı ağırlık artışı, oransal büyüme, spesifik büyüme oranı, yem dönüşüm oranı ve yem değerlendirme oranı değerleri hesaplanmıştır. O. onites bitkisi toz ve uçucu yağ ilaveli yemle beslenen aşısız balıklarda final ağırlık, kondüsyon faktörü, canlı ağırlık artışı, oransal büyüme ve spesifik büyüme oranı değerleri kontrol grubuna göre önemli oranda yüksek olmuştur (p<0.05). Aşısız balıklarda yem dönüşüm oranı değerleri O. onites bitkisi toz ve uçucu yağ ilaveli yemle beslenen gruplarla kontrol grubu arasında önemli bir farklılık oluşturmamıştır (p˃0.05). Balıklarda aşı ile birlikte O. onites bitkisi toz ve uçucu yağ kullanılan gruplarda ise final ağırlık, canlı ağırlık artışı, oransal büyüme ve spesifik büyüme oranı değerleri aşılı kontrol grubuna göre önemli oranda yüksek olmuştur (p<0.05). Büyüme performansı parametreleri 1.0 g/kg toz ve 0.5 ml/kg uçucu yağ içeren yemlerle beslenen aşılı balıklarda diğer gruplara (O. onites bitkisi 3.0 ml/kg uçucu yağ ve 10.0 g/kg toz) göre istatistiksel olarak daha yüksek olmuştur (p<0.05). Ayrıca yem dönüşüm oranı değerleri, O. onites bitkisi 1.0 g/kg toz, 0.5 ve 3.0 ml/kg uçucu yağ içeren yemle beslenen aşılı balıklarda istatistiksel olarak diğer gruplardan (10.0 g/kg toz ve aşılı kontrol grubu) daha iyi olmuştur (p<0.05).      

Besleme periyodunun 20 ve 56. günlerinde fenoksi etanol (0.1-0.5 ml/l) ile anestezi sonrasında balıkların (12 balık/grup) kaudal venalarından kan örnekleri toplanmış ve balıkların bağışıklık tepkileri incelenmiştir. Çalışmanın sonuçları, O. onites bitkisi ile beslenen aşısız ve aşılı gruplarda fagositik aktivite, nitroblue tetrazolium (+) hücre sayısı, lizozim ve immunoglobulin M düzeylerinin önemli oranda geliştiğini göstermiştir. Fagositik aktivite değerleri, aşılı ve aşısız balıklarda 56. günde O. onites bitkisi 3.0 ml/kg uçucu yağ ile beslenen gruplarda en yüksek olmuştur. Nitroblue tetrazolium (+) hücre sayısı değerleri O. onites bitkisi 10.0 g/kg toz ile beslenen aşısız balıklarda 20 gün sonra en yüksek seviyeye ulaşmışken aşılı balıklarda O. onites bitkisi 0.5 ml/kg uçucu yağ ile beslenen gruplarda 20. günde en yüksek seviyede ölçülmüştür. Lizozim aktivitesi değerleri 56. günde O. onites bitkisi 0.5 ml/kg uçucu yağ ile beslenen aşısız balıklarda en yüksek seviyeye ulaşmışken aşılı balıklarda O. onites bitkisi 1.0 g/kg toz ve 0.5 ml/kg uçucu yağ ile beslenen gruplarda 56. günde en yüksek seviyede ölçülmüştür. İmmunoglobulin M düzeyleri O. onites bitkisi 1.0 g/kg toz ve 0.5 ml/kg uçucu yağ ile beslenen aşısız balıklarda 20 gün sonra en yüksek seviyeye ulaşmışken aşılı balıklarda O. onites bitkisi 10.0 g/kg toz ile beslenen gruplarda 20. günde en yüksek seviyede ölçülmüştür. 

Besleme periyodunun sonunda Y. ruckeri ile deneysel enfeksiyon uygulaması yapılmış ve 15 gün süresince mortaliteler kaydedilmiştir. O. onites ile beslenen tüm aşılı ve aşısız gruplarda mortaliteler kontrol grubuna göre önemli ölçüde düşük olmuştur (p<0.05). O. onites bitkisi 0.5 ml/kg uçucu yağ içeren yemlerle beslenen aşılı balıklarda mortalitenin görülmemesi ile en etkili grup olmuştur. 0.5 ml/kg O. onites bitkisi uçucu yağ ilaveli yemlerle beslenen aşısız balıklarda ise mortalite %12.5 oranına düşmüştür.

Yem katkı maddesi olarak kullanılan O. onites bitkisinin deneysel olarak Yersiniosis ile enfekte edilmiş ve klinik hastalık belirtileri görülen balıkların karaciğer, dalak ve böbrek dokularının histopatolojisi üzerindeki etkileri bu tez çalışması ile incelenmiştir. Denemenin başlangıcında balıklar Y. ruckeri (i.p. 0.1 ml/balık) ile enfekte edilmiş ve sonrasında O. onites bitkisi toz (1.0 ve 10.0 g/kg) ve uçucu yağ (0.5 ve 3.0 ml/kg) içeren yemlerle 10 gün süresince beslenmişlerdir. Negatif kontrol grubundaki balıklar bitki ilavesiz ticari alabalık yemiyle beslenmişlerdir. Ortama ağırlığı 15-20 g olan toplamda 450 adet sağlıklı gökkuşağı alabalığı ticari bir alabalık işletmesinden temin edilmiştir. Balıklar rastgele 6 farklı gruba ayrılmış ve her grup 25 balık içeren 3 tekrardan oluşturulmuştur. İnfekte balıklardaki karaciğer, dalak ve böbrek dokularının histolojik analizlerinde nekrozis, ödem ve dejenerasyon gibi bazı patolojik değişimler görülmüştür. Karaciğer, dalak ve böbrek dokularındaki bu değişiklikler O. onites bitkisi ile 10 gün süren uygulama sonucunda kısmen azalmışken, Oksitetrasiklin (pozitif kontrol) ilavesi yapılan balıklarda ise dokuların daha hızlı düzelme gösterdiği görülmüştür. Bu çalışmanın sonuçları, Y. ruckeri enfeksiyonlarında O. onites bitkisi ile yapılan 10 günlük uygulamanın pozitif kontrole göre kısıtlı bir etkisi olduğunu göstermiştir.

In vitro deneme sonuçları, tıbbi bitkilerin su ürünleri endüstrisi için antibakteriyel ve antiviral özellikleri ile bakteriyel ve viral enfeksiyonlara karşı alternatif bir ürün olarak önerilebileceğini göstermiştir. In vivo sonuçlar ise kültürü yapılan gökkuşağı alabalıklarında yeme ilave edilen O. onites bitkisi toz ve uçucu yağının aşısız ve aşılı balık gruplarında immunostimulant olarak kullanılmasının etkili olabileceği ve büyümeyi artırdığı, ayrıca aşılı ve bitkili gruplarda yemden yararlanmanın arttığı, bağışıklık yanıtı geliştirdiği, Yersiniosis' e karşı direnci artırdığı belirlenmiştir.

Abstract:
In vitro antibacterial effects of medicinal plants' (Hypericum perforatum L., Urtica dioica L., Origanum vulgare L., Artemisia absinthium L., Origanum onites L., Lonicera periclymenum L., Origanum minutiflorum  O. Schwarz & PH Davis) essential oils against bacteria species (Aeromonas hydrophila (9), Yersinia ruckeri (10), Flavobacterium psychrophilum (3), Lactococcus garvieae (10), Vagococcus salmoninarum (2), Vibrio anguillarum (11), Vibrio alginolyticus (1), Photobacterium damselae (1)) by disc difusion test and in vitro antiviral effects of medicinal plants' (Origanum onites and Lonicera periclymenum) ethanol extracts against viral haemorrhagic septicemia virus (VHSV) by cytopathic effect inhibition  test were investigated in this thesis. In antibacterial screening, the essential oils except to U. dioica showed variable antibacterial activity against the tested bacterial strain. U. dioica had no antibacterial effect against tested to bacteria strains. The most antibacterial effective was Oregano essential oil with the highest zone diameter (50.33±1.52 mm) and the lowest MIC value (0.97 µl ml-1) of all the fish pathogens (p<0.05). Results for antiviral activity was shown which O. onites and L. periclymenum extracts were observed to inhibit the cellular cytopathology induced by VHS virus at the 1/16 and 1/32 plant ethanol extract dilutions used. 

In vivo effects of O. onites as feed additives on the growth performance, immune response and disease resistance of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) were investigated in this thesis. A total of 2100 apparently healthy rainbow trout, with average body weight of 14.08±2.74 - 16.81±3.89 g were obtained from commercial fish farm. Then fish were randomly allocated into ten different groups with three replicates each group consisting of 70 fish. Fish were fed diets containing O. onites powder (1.0 and 10.0 g kg-1) and essential oil (0.5 and 3.0 ml kg-1) for 8 weeks. At the beginning of experiment five groups of fish were vaccinated (i.p. 0.1 ml fish-1) against Y. ruckeri and fed the same diets as described above. Control groups were used basal diets without supplements of herb in non-vaccinated fish / vaccinated fish.

At the end of the experimental feeding period (56 days) final weight, condition factor, weight gain, growth rates, specific growth rate, feed conversion ratio and feed efficiency rate of the fish were calculated. Non-vaccinated fish fed diets containing powder and essential oil of O. onites had significantly higher final weight, condition factor, weight gain, growth rates and specific growth rate than the control group (p<0.05). Feed conversion ratio in non-vaccinated fish was no significant differences among control and groups fed with powder and essential oil of O. onites (p˃0.05). When using the combination powder and essential oil of O. onites and vaccine in fish had significantly higher final weight, weight gain, growth rates and specific growth rate than the vaccinated control group (p<0.05). These growth performance parameters in vaccinated fish fed diets containing 1.0 g kg-1 powder and 0.5 ml kg-1 essential oil of O. onites were statistically higher than other groups (3.0 ml kg-1 essential oil and 10.0 g kg-1 powder of O. onites) (p<0.05). In addition to feed conversion ratio in vaccinated fish fed diets containing 1.0 g kg-1 powder, 0.5 and 3.0 ml kg-1 essential oil of O. onites were statistically better than other groups (10.0 g kg-1 powder and vaccinated control groups) (p<0.05). 

At the 20 and 56 days of the experimental feeding period, fish blood samples (12 fish/group) were collected from the caudal vein after anesthetizing with phenoxyethanol (0.1-0.5 ml l-1) and the immune response of the fish was investigated. Results of this study showed that non-vaccinated and vaccinated rainbow trout feeding with O. onites significantly enhanced phagocytic activity, nitroblue tetrazolium, lysozyme and immunoglobulin M levels. Phagocytic activity had highest level in the non-vaccinated and vaccinated fish fed with 3.0 ml kg-1 essential oil of O. onites at 56 days. Nitroblue tetrazolium positive cell had highest level after 20 days in the non-vaccinated fish fed with 10.0 g kg-1 powder of O. onites whereas in the vaccinated fish had highest level were measured in group fed with 0.5 ml kg-1 essential oil of O. onites at 20 days. Lysozyme activity had highest level in the non-vaccinated fish fed with 0.5 ml kg-1 essential oil of O. onites at 56 days whereas in the vaccinated fish had highest level was measured in group fed with 1.0 g kg-1 powder and 0.5 ml kg-1 essential oil of O. onites at 56 days. Immunoglobulin M had highest level after 20 days in the non-vaccinated fish fed with 1.0 g kg-1 powder and 0.5 ml kg-1 essential oil of O. onites whereas in the vaccinated fish had highest level was measured in group fed with 10.0 g kg-1 powder of O. onites at 20 days. 

At the end of the experimental feeding period, a challenge test was performed on each experiemental group with Y. ruckeri and mortalities were recorded during 15 days. The mortality was significantly lower in all the non-vaccinated and the vaccinated fish fed with O. onites compared to control group (p<0.05). The combination 0.5 ml kg-1 essential oil of O. onites and vaccinated fish was the most effective with no mortality. Feeds supplemented with 0.5 ml kg-1 essential oil of O. onites reduced mortality by 12.5% at the the non-vaccinated fish. 

Effects of O. onites as feed additives on the histopathologic of liver, spleen and kidney of rainbow trout which experimentally infected with Yersiniosis and showed clinical disease symptom was investigated in this thesis. At the beginning of experiment, fish were infected with Y. ruckeri (i.p. 0.1 ml fish-1) and then fed diets containing O. onites powder (1.0 and 10.0 g kg-1), essential oil (0.5 and 3.0 ml kg-1) and Oxytetracycline (positive control) for 10 days. Negative control fish were fed basal diets without supplements of herb. A total of 450 apparently healthy rainbow trout, with average body weight of 15-20 g were obtained from commercial fish farm. Fish were randomly allocated into six different groups with three replicates each group consisting of 25 fish. Histological analysis of liver, kidney and spleen in infected fish was indicated some pathological changes such as necrosis, oedema and degeneration. These alterations were partially improved in the liver, spleen and kidney tissue of fish applied with O. onites for 10 days whereas fish following administration of Oxytetracyclin (positive control) was showed that rapidly recovery in the tissue. Results of this study showed that limited effectiveness of O. onites during 10 days against Y. ruckeri infection according to the positive control group.

Thus, in vitro assay results indicated that medicinal plants with antibacterial and antiviral properties may offer alternative product against bacterial and viral infections in aquaculture industry. In vivo results indicated that powder and essential oil of O. onites supplementation added to feed can act as immunostimulants and growth promoter, feed conversion ratio in vaccinated fish fed diets containing plant were improved, enhance the immune response and improve resistance against Yersiniosis in cultured rainbow trout fish.