Doğal Bacillus thuringiensis suşlarının Cyt gen profillerinin belirlenmesi ve kanser hücreleri üzerine etkilerinin araştırılması
Identification of Cyt gene profiles of native Bacillus thuringiensis strains and investigation of the effects on cancer cells
Yazar: MÜJGAN KESİK OKTAY
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bacillus thuringiensis gram pozitif ve spor oluşturan fakültatif anaerob bir bakteri olup farklı suşları yaşamlarının farklı evrelerinde değişik toksinler üretirler. Bunlardan en önemlisi insektisidal kristal proteinlerdir (ICP). Entomopatojenik özelliği olan ICP?ler belirli böcek türlerine karşı spesifik insektisidal aktivite gösterirler. Buna karşın, çoğu kristal (Cry) proteinlerin insektisidal aktivitesinin olmaması yeni araştırmalara yol açmıştır. Böylece literatürde insan kanser hücrelerini hedef alan ancak sağlıklı hücrelere etki etmeyen ve parasporin olarak adlandırılan yeni parasporal protein sınıfı tanımlanmıştır. Özellikle insektisit etkisi olmayan ve hemolitik etkiden sorumlu Cyt (sitolitik) proteini içermeyen Bt suşlarında parasporin varlığı tespit edilmiştir. İnsektisidal olmayan Bt suşlarının doğadaki geniş yayılımları nedeniyle yeni parasporinlerin bulunması olasılığı oldukça yüksektir. Dolayısıyla bu tez çalışmasının amacı, cry geni içeren ancak insektisidal etkisi olmayan ve cyt geni içermeyen bazı Bt izolatlarının beş farklı kanser hücre hattında (K-562, PC-3, DU-145, A-549, MCF-7) hücre çoğalması üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Bu amaçla, önceki çalışmalarımızdan elde ettiğimiz ve Aydın ili incirlik alanlarından toplanan 101 adedi toprak ve 19 adedi meyve-yapraktan izole edilen toplam 120 Bt izolatı kullanılmıştır. Öncelikle 120 Bt izolatının cyt1 ve cyt2 gen içeriği PCR analizi ile araştırılmıştır. Referans suşu hariç izolatların hiçbirinin cyt1 geni içermediği, toprak izolatlarının ise 19?unda cyt2 geninin varlığı tespit edilmiştir. Parasporal proteinler protoksin olarak salgılandıklarından, Bt izolatlarından elde edilen parasporal proteini tripsin (1, 5, 10 mg/ml) veya proteinaz K (10 ve 350 µg/ml) enzimleriyle aktive edilmiştir. Aktiflenen parasporal proteinlerin kanser hücre hatlarının çoğalması üzerine etkileri MTT yöntemi ile belirlenmiştir. İzolatın çeşidine bağlı olarak bazı parasporal proteinlerin proteinaz K ile aktivasyonu bazı proteinlerin ise tripsin ile aktivasyonu hücre çoğalmasını engellemede daha etkili olmuştur. Bazı izolatlardan elde edilen parasporal toksinlerin hücre çoğalmasını arttırıcı etkileri gözlenirken, bazılarının hücre çoğalmasını azaltıcı etki gösterdiği bulunmuştur. Özellikle 1mg/ml tripsin ile muamele edilmiş 2T, 11T ve 10 µg/ml proteinaz K ile muamele edilmiş 11T parasporalproteinlerinin A549 hücre çoğalmasını kontrole göre sırasıyla; 1.7, 2.19 ve 1.78 kat azalttığı kaydedilmiştir. Ayrıca10 µg/ml proteinaz K ile muamele edilmiş 3T parasporal proteininin CCC-221 hücre çoğalmasını kontrole göre 2.04 kat azalttığı tespit edilmiştir. DU-145 hücre hattına uygulanan en etkili protein kontrole vgöre hücre çoğalmasını 1.86 kat azaltan 1mg/ml tripsin ile muamele edilmiş olan 22T parasporal proteinidir.Sonuç olarak, kullanılan Bt izolatlarının hiçbirinin cyt1 geni içermediği, sadece 19 Bt izolatının cyt2 geni içerdiği; Bt izolatlarından 2T, 3T, 11T ve 22T?nin kristal proteinlerinin sırasıyla A-549, CCC-221 ve DU-145 hücre hatlarında hücre bölünmesini engelleyici etkileri olduğu bulunmuştur. İleride yapılacak olan çalışmalarda etkili bulunan izolatlara ait parasporal proteinlerin parasporin olup olmadığı belirlenip daha detaylı karakterizasyonları gerçekleştirilecektir.Anahtar kelimeler: Bacillus thuringiensis, Parasporin, Anti-kanser Aktivite, cyt Genler

Abstract:
Bacillus thuringiensis is a gram positive and spore-forming facultative anaerob bacterium that produces different toxins at different stages of its life cycle. The most important one of these proteins is insecticidal crystal protein (ICP). Because of the entemopathogenic property of ICPs, they show spesific insecticidal activity aganist different types of insects. However the lack of insecticidal actvity in all of crystal proteins has led to new researches. Thus a new class of crystal protein called parasporin was emerged that effective on target human cancer cells but not healthy cells. Parasporin was detected especially in Bt strains which are lack of insecticidal activity and Cyt proteins responsible for hemolytic activity. Due to widely distribution of non-insecticidal Bt strains in naturel environments, presence of new parasporins is highly probable.Therefore in this thesis, the effects of some Bt isolates that have crystal proteins but does not have insecticidal activity and Cyt protein on cell proliferation of five different cancer cell lines was investigated. For this purpose, a total of 120 isolates from 101 soil and 19 fruit-leaves isolated that we have obtained from previous studies and collected from the fig areas of province of Aydın were used. Firstly, cyt1and cyt2 gene content of 120 isolates were investigated by PCR analysis. As a result, none of the Bt strains except for the referance strain does not contain cyt genes and the presence of cyt2 gene have been identified in 19 isolates of soil. Protein extraction from Bt isolates including crystal proteins but not contain Cyt proteins were performed and then activated with proteinase K and trypsin enzymes. Effects on proliferation of cancer cells lines of activated crystal proteins were determined by MTT assay. Depending on the type of isolate, trypsin activation was more effective in preventing cell proliferation than proteinase K activation in some isolates. Unlike, in some isolates proteinase K was more effective than trypsin. It was observed that some crystal proteins were enhanced cell growth but on the contrary it was also found that some crystal proteins showed anti-proliferative effect on cell lines.Especially it was reported that trypsin (1mg/ml) treated crystal proteins 2T and 11T and proteinase K (10 µg/ml) treated 11T were decreased cell proliferation compared to the control respectively 1.7, 2.19 and 1.78 fold on A549 cell lines.viiAlso, ıt was obtained that 3T parasporal crystal protein treated with proteinase K (10 µg/ml) and 22T parasporal crystal protein treated with tripsin (1 mg/ml) had antiproliferative effect on cell proliferation compared to the control respectively on CCC-221 (2.04 fold) and DU-145 (1.86 fold) cell lines. As a result, it was found that none of the Bt isolates used in this thesis contained cyt1gene, only 19 isolates contained cyt2 gene. Among these Bt isolates, 2T , 3T, 11T and 22T crystal proteins were antiproliferative compared to the cancer cell lines. Works to be performed in the future the effective parasporal crystals are parasporins or not will be detected.Keywords: Bacillus thuringiensis, Parasporin, Anti-cancer Activity, cyt Genes