Hastanemizdeki steril vücut bölgeleri enfeksiyonlarında 16S RRNA dizi analizi yönteminin tanıdaki yeri
The role of 16S RRNA sequence analysis in sterile body sites infections in our hospital
Yazar: ŞERİFE SATILMIŞ
Danışman: PROF. DR. GÜNER SÖYLEDİR
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: DNA = DNA ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Dizi analizi-RNA = Sequence analysis-RNA ; Enfeksiyon = Infection ; Hastaneler = Hospitals ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA ; Sterilizasyon = Sterilization

Özet:
Steril vücut bölgesi enfeksiyonlarında mikrobiyolojik tanı için altın standart kültürdür. Ancak antibiyotik tedavisi, yavaş üreyen veya kültürde üreyemeyen bakteriler yanlış negatif sonuçlara neden olmaktadır. Bu sorunun üstesinden gelmek üzere geliştirilmiş ticari moleküler kitler sınırlı sayıda mikroorganizmayı saptayabildiğinden 16S ribozomal RNA (16S rRNA) gen dizi analizi alternatif bir tanı yöntemi olarak umut vaat etmektedir.   Çalışmamızda steril vücut bölgeleri enfeksiyonlarında 16S rRNA gen dizi analizi yöntemi ile kültürün kıyaslanması amaçlanmıştır. 
Temmuz 2017- Eylül 2018 tarihleri arasında laboratuvarımıza gönderilen steril vücut bölgelerine ait örnekler (beyin omurilik, plevra, periton, perikart, eklem, vitreus sıvıları ile biyopsi ve apse aspiratları) rutin kültür işlemlerinin  ardından 16S rRNA PZR yöntemiyle çalışılmıştır. Klinik, radyolojik, laboratuvar bulguları doğrultusunda klinisyenin kesin enfeksiyon düşündüğü örnekler  birinci grupta, enfeksiyon olabileceği şüphesiyle gönderilen ancak klinik, radyolojik ve laboratuvar bulgularıyla bakteriyel enfeksiyon tanısından uzaklaşılan örnekler ikinci grupta değerlendirilmiştir. 16S rRNA PZR için DNA izolasyon kiti olarak DNeasy Blood&Tissue Kit (Qiagen) kulanılmış, saptama limiti 1000 kob/ml bulunmuştur. 16S rRNA primeri kullanılarak pozitif saptanan PZR ürünlerine  dizi analizi gerçekleştirilmiştir (GATC Biotech/Almanya). Karışık kromatogramların analizi RipSeq Mixed (iSentio, Norveç) programıyla yapılmıştır. Verilerin istatistiksel analizleri için Stata 15.1 programı kullanılmıştır. 
Çalışmamızda 116 hastaya ait 139 örneğin  87 si birinci grupta, 52 si ikinci grupta değerlendirilmiştir. Klinik ve laboratuvar bulguları referans alındığında, kültürün duyarlılığı, özgüllüğü, pozitif prediktif değeri ve negatif prediktif değeri sırasıyla %52, %92,%92 ve %53 iken; 16S rRNA PZR nin duyarlılığı, özgüllüğü, pozitif prediktif değeri ve negatif prediktif değeri sırasıyla %63,%96,%96 ve %61 bulunmuştur. Kesin enfeksiyon düşünülen örneklerin 13 ünde  kültür negatif iken 16S rRNA PZR pozitif saptanmış olup bu örneklerin üçünde ticari olarak sunulan hiçbir multipleks PZR kiti ile saptanamayacak Bartonella quintana, Mycoplasma salivarium ve Mycobacterium avium complex varlığı gösterilmiştir. 
Çalışmamız 16S rRNA PZR nin özellikle rutin kültür yöntemi ile bakteri saptanamayan menenjit ve enfektif endokardit vakalarında tanıya katkı sağladığını açıkça ortaya koymaktadır.

Anahtar kelimeler: Steril, kültür, 16S rRNA PZR, DNA izolasyonu, klinik örnek

Abstract:
Culture is the gold standard for microbiological diagnosis of sterile body sites infections. However antibiotic treatment, slow-growing or non-cultivable bacteria leads to false negative results. 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene sequence analysis is promising as an alternative diagnostic method, as commercial molecular kits developed to overcome this problem can detect a limited number of microorganisms. In our study, it was aimed to compare the culture with 16S rRNA gene sequence analysis method in sterile body sites  infections.
Following routine culture procedures were performed for all samples from sterile body sites (cerebrospinal, pleural, peritoneal, pericardial, synovial, vitreous fluids, biopsy and abscess material) 16S rRNA PCR method between July 2017 and September 2018. Factors such as clinical, radiological, laboratory findings and clinician opinion were evaluated and samples which were considered for definite infection were evaluated in the first group. Samples from patients which were suspected to have infection but diagnosis of bacterial infection were excluded according to clinical, radiological and laboratory findings were evaluated in the second group. DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) was used as DNA isolation kit for 16S rRNA PCR. The detection limit was found to be 1000 cfu/ml.  Sequence analysis was performed for positive PCR products using the 16S rRNA primer (GATC Biotech/Germany). Analysis of mixed chromatograms was performed with RipSeq Mixed program (iSentio, Norway). Stata 15.1 program was used for statistical analysis of the data.
Out of 139 samples from 116 patients, 87 were included ın group 1 and remaining 52 in group 2. When the clinical and laboratory findings were taken as reference;  the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of the culture were 52%, 92%, 92% and 53% respectively; the sensitivity, specificity, PPV and NPV of 16S rRNA PCR were 63%, 96%, 96% and 61%, respectively. Thirteen culture-negative samples were found to be positive by 16S rRNA PCR, of which, three were identifed as Bartonella quintana, Mycoplasma salivarium and Mycobacterium avium complex which would not be detected by commercial multiplex PCR kits.
Our study demonstrates that 16S rRNA PCR contributes to the diagnosis of sterile body sites infections, especially in meningitis and infective endocarditis where routine culture method fails.

Keywords: Sterile, culture, 16S rRNA PCR, DNA isolation, clinical specimen