Fare Mx2 proteinlerinin influenza virüsü RNA polimeraz enzimine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of mouse Mx2 protein on influenza virus RNA polymerase enzyme
Yazar: İLKYAZ ERKAN
Danışman: DOÇ. DR. KADİR TURAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics
Dizin: Fareler = Mice ; Ortomiksovirüsler = Orthomyxoviridae ; Proteinler = Proteins ; RNA = RNA ; İnfluenza = Influenza ; İnterferonlar = Interferons

Özet:
İnfluenza virüsleri, Orthomyxoviridae ailesi içerisinde sınıflandırılan, negatif iplikli genoma sahip zarflı virüsleridir.  Bu virüs ailesi içerisinde yer alan influenza A virüsleri insan sağlığı açısından önemli ve yaygın infeksiyonlara yol açan virüs tipidir. İnfluenza virüs infeksiyonlarına karşı en etkili savunma sistemi, doğal ya da edinsel bağışıklık sistemidir. Doğal savunma sistemi içerisinde değerlendirilebilecek hücre içi savunma sistemi virüslerin replikasyonunu zorlaştıran önemli bir bariyerdir. Bu mekanizmanın aktörlerinden biri, interferonların uyarısı sonucu sentez edilen Mx proteinleridir. Mx proteinleri Orthomyxovirus, Rhabdovirus, Paramyxovirus, Bunyavirus ve Alfavirus familyalarında yer alan birçok RNA virüsün replikasyonunu inhibe etmektedir. Bununla birlikte Mx proteinlerin moleküler düzeyde etki mekanizmaları hakkında bilgiler yetersizdir. Bu konuda elde edilen bulgular, influenza virüs infeksiyonları ile mücadelede büyük önem taşımaktadır. 
Bu tez çalışması kapsamında, farelere ait Mx2 proteininin influenza virüsü RNA polimeraz enzimine etkileri araştırıldı. Bu amaçla, standart DNA klonlama teknikleri ile fare Mx2 geni pCHA memeli ekspresyon vektörüne klonlandı ve pCHA-Mx2 vektörü oluşturuldu. Sitoplazmik lokalizasyon gösteren Mx2 proteinin lokalizasyon profilini değiştirmek amacıyla, SV40-T antijeni NLS dizisi taşıyan nMx2 proteini kodlayan bir diğer vektör, pCHA-nMx2 oluşturuldu. Bu vektörlerin Mx2 proteini kodladıkları hem Western melezleme hem de immünfloresans tekniklerle saptandı. NLS dizisi taşıyan nMx2 proteinin beklenenin aksine baskın olarak hücre sitoplazmasında lokalize olduğu gözlendi. Bu proteinlerin influenza virüsü RNA polimeraz enzimine etkilerini saptamak amacıyla, yapay influenza virüsü minireplikon modelinden yararlanıldı. Artan miktarlarda pCHA-Mx2 ve pCHA-nMx2 vektörleri minireplikon komponentleri ile birlikte fare orijinli Swiss3T3 ve insan orijinli HEK293 hücrelerine transfekte edildi. Transfeksiyondan 48 saat sonra, hücrelerde influenza virüsü RNA polimeraz enzimi aktivitesine bağlı olarak sentez edilen belirteç lüsiferaz aktivitesi ölçüldü. Elde edilen sonuçlar, Swiss 3T3 ve HEK293 hücrelerinde Mx2 proteininin influenza RNA polimeraz enzimi üzerine etkisinin sınırlı olduğunu gösterdi. Bu sonucun elde edilmesinde Mx2 proteininin hücre sitoplazmasında lokalize olmasının etkili olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
Influenza viruses are enveloped viruses with a negative-stranded genome and classified in Orthomyxoviridae family. Influenza A virus type belong to this family are important in terms of human health and causes worldwide pandemics. The most effective defense system against influenza virus infections is natural or adaptive immunity. The intracellular defense system considered in the natural immunity is an important barrier blocking the replication of viruses into the cells. One of the important actors of this mechanism is the interferon-induced Mx proteins. Mx proteins inhibit several RNA viruses classified in Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses, Paramyxoviruses, Bunyaviruses and Alphaviruses families. However, information on the mechanisms of action of Mx proteins at the molecular level is inefficient. The findings on this issue, is of great importance in the fight against influenza virus infections.
In this Master Thesis study, the effects of the mice Mx2 protein on influenza virus RNA polymerase enzyme was investigated. For this aim, mouse Mx2 gene was cloned in pCHA mammalian expression vector by using the standard DNA cloning techniques and formed pCHA-Mx2 vector. In order to change the localization profile of cytoplasmic Mx2 protein, another plasmid vector named as pCHA-nMx2 encoding nMx2 protein carrying the SV40-T antigen NLS, was constructed. It is confirmed that these plasmids encode Mx2 protein with immunofluorescence and Western hybridization techniques. Contrary to expectations, nMx2 protein having NLS was found to be localized predominantly in the cytoplasm of the cells.  To determine effects of these proteins on influenza virus RNA polymerase enzyme, an artificial influenza virus minireplikon model was used. Increasing amounts of pCHA-Mx2 or pCHA-nMx2 vectors were co-transfected with minireplicon components into mouse Swiss3T3 and human HEK293 cells. Forty-eight hours after transfection, luciferase activity synthesized depend on influenza virus RNA polymerase into the cells was measured. The results showed that mouse Mx2 protein have a very limited effect on influenza RNA polymerase in Swiss 3T3 and HEK293 cells. It is considered that one of the reasons of this negative result is the cytoplasmic localization of Mx2 protein.