DNA hasar yanıtında XRCC1-PARP1 etkileşimine XRCCC1 polimorfizm etkisinin co-ıp yöntemi ile incelenmesi
Investigation of the effect of XRCC1 polymorphism on XRCC1-PARP1 interaction by co-ip method in response to dna damage
Yazar: MERVE BOSTANCI
Danışman: PROF. DR. MEHMET GÜVEN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: DNA = DNA ; DNA hasarı = DNA damage ; DNA onarımı = DNA repair ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Genotip = Genotype ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic

Özet:
İyonize radyasyonun neden olduğu DNA hasarları, baz kesip çıkarma tamir (BER) yolağı tarafından tamir edilir. X-ray repair cross complementing group 1 (XRCC1) ve Poly (AP-ribose) polymerase 1 (PARP1), BER yolağının önemli proteinleridir. XRCC1 ve PARP1 genlerindeki tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) ile iyonize radyasyona bağlı DNA hasar düzeyleri arasında ilişki olduğunu bildiren çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. SNP'ler protein-protein etkileşimlerini ve dolayısıyla BER etkinliğini değiştirebilir. XRCC1 Arg399Gln polimorfizmi, XRCC1'in PARP1 proteini ile etkileşen bölgesine denk gelmektedir. Çalışmamızın amacı, BER tamir mekanizmasında görevli XRCC1'in PARP1 ile etkileştiği bölgedeki polimorfizmin, bu etkileşime etkisini tespit etmektir.
Bu amaçla, toplanan 53 örnekten XRCC1 Arg399Gln polimorfizminine genotiplemesi, PZR-RFLP yöntemleri ilegerçekleştirildi. Total kandan izole edilen lenfosit örneklerine 72 saatlik kültür sonrasında uygulanan 2 Gy iyonize radyasyon ile oluşturulan DNA hasar sonrası, XRCC1-PARP1 etkileşimleri Co-IP metodu ile incelendi ve genotip dağılımları ile bu protein-protein etkileşimleri arasındaki ilişki Western Blot ve ELİZA testleri ile analiz edildi. DNA hasar düzeyleri ise in vitro 2 Gy radyasyon uygulanan lenfositlerde mikronükleus testi ile tespit edildi.
Çalışmamızda XRCC1 Arg399Gln genotiplerine göre Gln/Gln genotipine ait MN düzeyleri diger genotiplere göre daha yüksek olmasına rağmen bu fark istatistiksel olarak anlamlı degildi (P>0,05).Gln/Gln genotipindeki PARP1 düzeyinin istatistiksel olarak  anlamlı olmamasına (P=0,14) rağmen diğer genotiplere göre daha yüksek düzeyde olması,  Gln/Gln genotipindeki XRCC1-PARP1 etkileşiminin diğer genotiplere göre daha yüksek olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, Western Blot  çalışmasının sonuçları ile paralellik göstermektedir. Çalışmamızın sonuçları, XRCC1 Arg399Gln polimorfizmi için Gln alleline sahip olmanın daha güclü bir XRCC1-PARP1 etkileşimine ve dolayısıyla da  daha güçlü DNA tamir yanıtına yol açabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
DNA damage caused by ionizing radiation is repaired by base excision repair (BER) pathway. X-ray repair cross complementing group 1 (XRCC1) and Poly (AP-ribose) polymerase 1 (PARP1) are important proteins of the BER pathway. There are several studies reporting a relationship between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the XRCC1 and PARP1 genes and DNA damage levels due to ionizing radiation. SNPs can alter protein-protein interactions and BER activity. The XRCC1 Arg399Gln polymorphism corresponds to the region of  XRCC1 that interacts with the PARP1 protein. The aim of our study is to determine the effect of this polymorphism on XRCC1-PARP1 protein-protein interaction.
For this purpose, genotyping of XRCC1-399 polymorphism from 53 collected samples was performed by PCR-RFLP methods. The XRCC1-PARP1 interactions were analyzed by Co-IP method in lymphocytes treated with 2 Gy ionizing radiation and the relationship between genotype distributions and protein-protein interactions was analyzed by Western Blotting and ELISA tests. DNA damage levels were determined by micronucleus assay in lymphocytes treated with 2 Gy radiation in vitro.
In our study, although the MN levels of the Gln/Gln genotypes were higher than the other genotypes according to the XRCC1 Arg399Gln polymorphism, this difference was not statistically significant (P>0.05). The fact that PARP1 levels in the Gln/Gln genotype were not statistically significant (P = 0.14) compared to other genotypes. These results suggest that the XRCC1-PARP1 interaction in the Gln/Gln genotype is higher than the other genotypes. These results are in consistent with Western Blotting. Our results show that having Gln alleles for the XRCC1 Arg399Gln polymorphism may lead to stronger XRCC1-PARP1 interaction and increased DNA repair response.