Akciğer kanserinde kannabinoidlerin CB reseptörleri aracılı antiproliferatif ve  proapoptotik etkisinin araştırılması
Investigation of CB receptor-mediated antiproliferative and proapoptotic effect of cannabinoids in lung cancer
Yazar: ÖZGE BOYACIOĞLU
Danışman: PROF. DR. PETEK KORKUSUZ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ELİF BİLGİÇ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Akciğer kanseri, hızlı metastaz özelliği ve geç tanı alması nedeniyle dünyada en sık ölüme yol açan kanser olarak bilinmektedir. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), tüm akciğer kanseri vakalarının %80'ini oluşturmaktadır. Endokannabinoidler, vücutta sentezlenen ve genellikle klasik kannabinoid reseptörleri üzerinden etki gösteren lipid yapılı endojen esrar ligandlarıdır. Endokannabinoid sisteminin fizyolojik koşullarda akciğerde bulunduğu ve kanser patogenezinde bileşenlerinin artış göstererek CB1 reseptörleri aracılı rol oynayabileceği bildirilmiştir. Pankreas ve endometriyum kanserlerinde antiproliferatif etkisi bildirilen Araşidonilsiklopropilamid (ACPA), psikoaktif etki göstermeyen, kan-beyin bariyerini geçmeyen, lipid yapılı sentetik spesifik CB1 agonistidir. ACPA, CB1 reseptör agonizması aracılı olarak KHDAK'nde çoğalmayı azaltıcı ve apoptozu uyarıcı etki gösterebilir. ACPA'nın akciğer tümörüne hedefli ilaç adayı olarak kontrollü salımını sağlayabilecek biyouyumlu ve biyodegradasyon hızı düşük polikaprolakton yapılı nanopartiküler sistem kullanılabilir. Kurgulanan varsayımı test etmek üzere in vitro koşullarda, deney ve kontrol grubu içeren gözlemsel bir deney tasarlanmıştır. Tez çalışmasında ilk olarak in vitro koşullarda insan kökenli ticari, altı KHDAK hattında (A549, H1299, H358, H838, H1975 ve SW-1573) qRT-PCR, akım sitometrisi ve immünositokimya yöntemleriyle kannabinoid reseptörlerinin varlığı ve düzeyleri gösterilmiştir. Buna göre A549, H1299, H358 ve H838 hatlarında yüksek CB1 reseptör ekspresyonu saptanmıştır. İkinci aşamada kannabinoid 1 reseptörünü yüksek düzeyde eksprese eden A549, H1299, H358 ve H838 hücre hatlarında WST-1 ve gerçek zamanlı impedans temelli proliferasyon analizi yöntemleriyle ACPA'nın doz ve zaman bağımlı antiproliferatif etkisi ve akım sitometrisi tekniğiyle kantitatif olarak apoptozu arttırıcı etkisi ortaya konmuştur. ACPA'nın, WST-1 tekniğiyle incelenen hücre hatlarındaki antiproliferatif etkili doz aralığı 10-12 – 10-9 M olarak belirlenmiştir. Bu doz aralığına göre çalışılan gerçek zamanlı proliferasyon analizinde hücreler için etkili doz (IC50) 1.39x10-12 M olarak hesaplanmıştır. Üçüncü aşamada ACPA'nın stabilite çalışmalarında molekülün tek başına hücre kültür süpernatanlarında 1-3. günlerde stabil olmadığından hareketle ACPA yüklü polikaprolakton yapılı nanopartiküler sistem çöktürme yöntemiyle geliştirilmiş ve optimizasyonu sağlanmıştır. Ardından ACPA'nın nanopartiküller ile kontrollü ve uzun süreli salımı sağlanmıştır. Son aşamada ACPA yüklü polikaprolakton yapılı nanopartikül sistemi gerçek zamanlı impedans temelli proliferasyon analizinde KHDAK hatlarına uygulanmıştır. Sonuç olarak 1.39x10-12 M ACPA dozu salan polikaprolakton nanopartiküllerin genellikle antiproliferatif etkiyi sürdürdüğü sonucuna varılmıştır. Polikaprolakton nanopartiküler salım sistemiyle uzun süre etkili ve hedefli formülasyonu geliştirilen ACPA, CB1 agonizması aracılı olarak klinikte küratif tedavisi olmayan KHDAK için yeni bir ilaç adayı olabilir. Bu doğrultuda, tez çalışması kapsamında elde edilen çıktılar ile Hacettepe Teknokent Teknoloji Transfer Merkezi Patent Ofisi'ne buluş başvurusunda bulunulmuştur.

Abstract:
Lung cancer is the most common cause of death among all cancers in the world due to its rapid metastasis and late diagnosis. Non-small cell lung cancer (NSCLC) constitutes 80% of lung cancer cases. Endocannabinoids are endogenous cannabis ligands with lipid structure, which are synthesized in the body and generally act on classical cannabinoid receptors. It has been revealed that the endocannabinoid system is present in lung under physiological conditions and its components can play a mediating role in the pathogenesis of cancer via CB1 receptors. Arachidonoylcyclopropylamide (ACPA) is a lipid structured, synthetic-specific CB1 agonist that does not have a psychoactive effect and does not pass through the blood-brain barrier. ACPA can decrease proliferation and increase apoptosis via CB1 receptor agonism in NSCLC. A biocompatible polycaprolactone-based nanoparticular system with low biodegradation rate for controlled release of ACPA to the targeted lung tumor as a drug candidate can be used. An in vitro observative set up with experimental and control groups was designed in order to test the presumed hypothesis. In the thesis, firstly, the presence and levels of cannabinoid receptors were determined by in vitro qRT-PCR, flow cytometry and immunocytochemistry methods in human commercial, six non-small cell lung adenocarcinoma cell lines (A549, H1299, H358, H838, H1975 and SW-1573). Accordingly, high CB1 receptor expression was found in the A549, H1299, H358 and H838 lines. In the second step, the dose and time-dependent antiproliferative effect of ACPA has been tested by WST-1 and real-time impedance-based proliferation analysis in the A549, H1299, H358 and H838 cell lines that highly express the cannabinoid 1 receptor. The effect of ACPA on apoptosis has been quantified by flow cytometry technique. The antiproliferative dose range of ACPA in the cell lines was determined as 10-12 – 10-9 M by WST-1 technique. The effective dose (IC50) for the cells in the real-time proliferation assay was calculated as 1.39x10-12 M. In the third step, the stability studies of ACPA have been performed. The molecule alone in cell culture supernatants were not stable on days 1-3. Since ACPA is not stable, a new ACPA loaded polycaprolactone-based nanoparticular system was developed and optimized by nanoprecipitation method. Subsequently, controlled and prolonged release of ACPA with nanoparticles was achieved. In the final stage, the polycaprolactone-based nanoparticle system with ACPA was applied to NSCLC lines in impedance-based real-time proliferation analysis. As a result, polycaprolactone nanoparticles that release a dose of 1.39x10-12 M ACPA generally have antiproliferative effect. The long-acting and targeted formulation of the ACPA loaded polycaprolactone nanoparticular system may be a new drug candidate for NSCLC. In this context, an application was made to the Patent Office of Hacettepe Technopolis Technology Transfer Center with the outputs obtained within the scope of the thesis study.