siRNA için uygun taşıyıcı sistem geliştirilmesi; in vitro ve in vivo çalışmalar
The development of aapropriate carrier system for siRNA; in vitro and in vivo studies
Yazar: EMİNE ŞALVA
Danışman: PROF. DR. JÜLİDE AKBUĞA
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Kitosan = Chitosan ; Kompleksler = Complexes ; Nanopartiküller = Nanoparticles

Özet:
RNAi (RNA interferans), son zamanlarda başta kanser olmak üzere diğer önemli hastalıkların tedavisinde diğer geleneksel tedavilere alternatif olarak araştırılmaktadır. Ancak siRNA ile tedavide, uygun taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi önemli bir sorundur. Çalışmamızda biyogeçimli, toksik ve immunojenik olmayan bir polimer olan kitozan ile VEGF siRNA ve shRNA ile oluşturulan kompleksleri kullanarak deneysel meme tümör modelinde VEGF genini baskılamayı ve tümörde anjiogenezi durdurmayı amaçladık. Bu çalışmada katyonik bir polimer olan kitozan ile sentetik siRNA ve plazmid siRNA'ların kompleks ve nanopartikül formları hazırlanarak karakterizasyonu ve transfeksiyon etkinliği araştırılmıştır. Uygun formülasyonların in vitro HEK293, HeLa, MCF-7 ve MDA-MB-435 hücre hatlarında antisens etkinlikleri ve ELISA yöntemi ile de VEGF protein ekspressiyonu incelenmiştir. In vivo deneysel tümör modelinde de (Sprague-Dawley sıçanlarda) siVEGF ve shVEGF içeren kitozan komplekslerin VEGF mRNA'sı ve proteinini inhibe etme özellikleri, tümör hacminin ölçülmesi, immunohistokimya, kantitatif Real-Time PCR ve Western blot gibi değişik yöntemlerle araştırılmıştır. Sonuç olarak, 280 nm boyutundaki kompleks ve 246 nm boyutundaki nanopartikül formlarında kitozanın, VEGF siRNA'ları ekstrasellüler enzim ve serum parçalanmasına karşı koruduğu saptanmıştır. Farklı kompleks ve nanopartikül formlarının, in vitro transfeksiyon etkisini arttırarak gen susturma etkinliğini arttırdığı saptanmıştır. In vivo çalışmada ise, her iki tip siRNA'yı içeren kompleks formlarının meme tümöründe VEGF ekspressiyonunu hem mRNA, hem de protein seviyesinde azalttığı saptanmıştır. Özellikle tümör hacmi ve damar yoğunluğunda en fazla azalma, kitozan/siVEGF kompleksinin i.t uygulandığı grupta gözlenmiştir. shVEGF ile elde edilen sonuçlar daha düşük olmakla beraber i.t uygulanan grupta susturma i.p uygulanan gruplara göre daha yüksek bulunmuştur. Kitozanın VEGF siRNA için etkin ve güvenilir bir taşıyıcı sistem olarak kullanılabileceği görülmüştür. Bu çalışma gelecekte kitozan polimeri ile yapılacak siRNA taşıyıcı sistem araştırmaları için temel oluşturmaktadır.

Abstract:
Recently, RNA interference (RNAi) is frequently used in treatmet of the primarily to cancer, infectious, inflammation, apoptosis, oculer and respiratory tract diseases. However, treatment with siRNA, the development of appropriate systems are important problem. The aim of this study, is to VEGF gene silencing and angiogenesis inhibition in the experimental mammary tumor model using plasmid siRNA and synthetic siRNA to specific VEGF gene with chitosan as non viral vector for transfection because of several advantages such as biocompatibility, biodegredability, low immune response and non toxic. In this thesis, the complex and nanoparticle forms of siRNAs were prepared by using a cationic polymer called chitosan. Afterwards, the physicochemical properties such as zeta-potential, particle size, serum and enzyme stability and morphologic features of these formulations were measured and ELISA method with VEGF protein expression and the antisense activity in the different cell lines of the appropriate formulations were investigated in vitro. Measuring of the tumor volume, immunohistochemistry, Real-Time PCR and Western Blot methods inhibition to VEGF mRNA and protein of the complexes were investigated in vivo experimental mammary tumor model. Eventually, both forms protected siRNAs from potential enzymatic degredations. We were established to increased gene silencing efficiency to increase in vitro transfection efficiency of the different complex and nanoparticle forms. In vivo study was to performed determine decreased in the VEGF mRNA and protein expression in the mammary tumor of the complex forms containing siVEGF and psiVEGF. As a result, chitosan can be considered as a suitable carrier for siRNAs. This study can form the basis for the forthcoming studies related with carrier systems of siRNAs that will be done with chitosan polymer.