İnvazif enfeksiyonlara neden olan genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) oluşturan Enterobacteriaceae izolatlarının hızlı teşhisi için DNA aptamerlerinin geliştirilmesi
Development of DNA aptamers for rapid diagnosis of extensive spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Enterobacteriaceae isolates which causes invasive infections
Yazar: HATİCE NUR HALİPÇİ TOPSAKAL
Danışman: DOÇ. DR. ASHABİL AYGAN ; PROF. DR. FATMA KÖKSAL ÇAKIRLAR
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Enterobacteriaceae ailesinin bir üyesi olan Escherichia coli, insanların bağırsak sistemlerinin normal florasında bulunan bir bakteridir. Ancak bu bakteri bakteriyemi, menenjit, gıda ve su ile bulaşan salgınlara neden olmaktadır. Hastane ve toplum kökenli enfeksiyonlar oluşturan E.coli, çeşitli antibiyotiklerin etkisinden kaçabilen patojen bir bakteridir. Antibiyotiklere kolay direnç geliştirmesi nedeniyle bugün bu bakteriyle gelişen enfeksiyonlar tedaviyi giderek güçleştiren global bir sorun haline gelmiştir. Teşhis ve tedavi gecikirse, hastaların hastanede yatış sürelerinin uzamasına, morbidite ve mortaliteye neden olabilmektedir. Aynı zamanda, ilaç kullanımının artmasına, ek laboratuvar, diğer tanı testleri ve izolasyon gereksinimine yol açmaktadır. Dolayısıyla ekonomik maliyetleri de oldukça yükseltmektedir. Bu nedenle enfeksiyon etkenlerinin hızlı tanısı ve bu etkenlerin yol açtığı enfeksiyonların tedavisinde sık kullanılan antibiyotiklere direnç durumlarının belirlenmesinin hayati önemi vardır. Klinik örneklerde bakterilerin türe özgü tanısının hızlı bir şekilde yapılması gerekmektedir. 
Bu çalışmada, hedef mikroorganizma E.coli' nin identifikasyonu için hızlı sonuç veren bir sistemde kullanılacak ssDNA aptamerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır.
E. coli izolasyonu BACTEC 9120 kan kültür sistemi ile, tanımlanması ve antimikrobiyal direnci, PHOENIX Otomatik Bakteri Identifikasyon ve Antibiyotik Duyarlılık Test Sistem ile belirlendi, şüpheli dirençler E-Test ile onaylandı. Slime oluşumu Congo red agar yöntemi ile tespit edildi. E. coli'ye afinite gösteren aptamerin seçiminde cell-SELEX (Eksponansiyel Zenginleştirme ile Sistematik Ligand Geliştirme) kullanıldı. Aptamerin özgüllüğü ve duyarlılığı floresan mikroskopi tekniğiyle belirlendi. Yüksek afinite gösteren aptamerimiz Gözenekli Silisyum (GS) ve Interdijital Transduser (IdT) olmak üzere iki ayrı platform üzerine immobilize edildi. E.coli'ye bağlanma, empedans spektrometre ve frekans analizörü kullanılarak biyosensör ölçümleri ile gösterildi.
Çalışmada, kan kültüründen izole edilmiş olan altmış iki E. coli izolatında genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz  (GSBL) üretimi %61.2 (38/62) ve karbapenemaz üretiminin % 19.3 (12/62) olarak tespit edildi. SELEX sonucunda E.coli'ye en yüksek afinite gösteren bir  
ssDNA dizisi belirlendi. Aptamerin duyarlılığı ise altmış iki farklı E. coli izolatında floresan mikroskopi tekniğiyle incelendi ve duyarlılığı %94-100 olarak bulundu. Spesifite çalışmaları sonucunda, E.coli için spesifik olarak belirlenen aptamerin K. pneumoniae, P. aeuroginosa, S. aureus ve E. faecium bakterileri türlerine bağlanmadığı ve floresan mikroskobuyla belirlendi. Biyosensör ölçümlerinde gözenekli silisyum ve interdijital transduser kullanılan platformlarda, empedans spektrometre ile,  5 Hz-100 kHz aralığında değiştirilebilen genliği sabit (250 mV)  olan alternatif akım sinyali altında sensörün ortalama 300 saniyede cevap verdiği belirlendi ve anlamlı datalar bu kısa süre sonucunda elde edildi. 
Bu çalışmada, seçilen aptamer ile biyosensör bazlı tıbbi tanı sistemi optimize edildiğinde örnek alımı ve sonuç alma süresinin 30 dakika gibi az bir süreye düşürülebileceği anlaşılmıştır. Böylece mikrobiyal tanılamanın, enfeksiyon kontrolünün ve tedavisinin daha hızlı ve kolay bir şekilde yapılmasına olanak sağlanacağı tespit edilmiştir. Sağlanan erken teşhis sayesinde sağlık kuruluşlarında mortalite, morbidite ve yüksek maliyet oranlarının düşürülebilecektir. Surveyans çalışmaları kolaylaşacaktır. Ayrıca yapılan temel çalışmanın geliştirilecek olan ileri çalışmalara başlangıç noktası olacağı ve ışık tutacağı sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Escherichia coli, a member of the Enterobacteriaceae family, is a bacterium found in the normal flora of human intestinal systems. However, this bacterium causes bacteremia, meningitis, food and waterborne outbreaks. Hospital and community-acquired infections causing E. coli that can escape from the effects of several antibiotics. Because of the arising easy resistance against antibiotics, infections caused by this bacterium today have become a global problem that has become increasingly difficult to treat. If the diagnosis and treatment are delayed, patients may cause prolonged hospitalization, morbidity and mortality. At the same time, increased use of medicine leads to additional laboratories, other diagnostic tests and isolation requirements. Therefore, economic costs are also increasing considerably. For this reason, rapid diagnosis of infectious agents and the determination of antibiotic resistance conditions frequently used in the treatment of infections caused by these agents are vital.
In this study, it is aimed to develop an ssDNA aptamer to be used in a system for the rapid identification of the target microorganism E. coli. 
E. coli isolation was determined by BACTEC 9120 blood culture system, identification and antimicrobial resistance were conducted by PHOENIX Automated Bacteria Identification and Antibiotic Susceptibility Test System, uncertain resistance confirmed with E-Test. Slime production was determined by Congo red agar method. Cell-SELEX (Systematic Ligand Enhancement with Exponential Enrichment) was used in the selection of aptamer which shows high affinity to E. coli. Specificity and sensitivity were determined by fluorescence microscopy technique. This aptamer was immobilized on two different platforms, Porous Silicon (GS) and Interdigital Transduser (IdT). Binding trials to E. coli was demonstrated by biosensor measurements using an impedance spectrometer and frequency analyzer. 
In this study, expanded spectrum beta-lactamase (ESBL) production was found as 61.2% (38/62) and carbapenemase production was 19.3% (12/62) in sixty-two E. coli isolates which were isolated from blood culture. As a result of SELEX, an ssDNA sequence with the highest affinity to E. coli was identified. Sensitivity was examined by fluorescence microscopy in sixty two different E. coli isolates and the sensitivity was found to be 94-100%. According to flourescence microscopy specificity tests, it is shown that E. coli specific aptamer did not bind to species of K. pneumoniae, P. aeuroginosa, S. aureus and E. faecium bacterias. As a result of biosensor trials, on the porous silicon and interdigital transducer platforms, the impedance constant was measured with an impedance spectrometer under a.c. (alternating current 250 mV), which can be varied between 5 Hz and 100 kHz signals and meaningful data was obtained in this short time.
In this study, it was realized that time between sample and result acquisition could be reduced to as little as 30 minutes when the biosensor based medical diagnostic system was optimized with the selected aptamer. Thus, it has been determined that microbial diagnosis will enable infection control and treatment to be performed more quickly and easily. By means of early diognosis, mortality, morbidity and high cost rates can be reduced in health institutions. Surveillance studies will be easier. In addition it was also understood that the basic work to be done will be the starting point for the further work and it will enlight advancing researches.