E. coli hücrelerinden polimerik mikrokriyojeller ile RNA saflaştırılması
RNA purification by polimeric microcryogels from E.coli cells
Yazar: MELEK ÖZSEVGİÇ
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; Mikrokriyojeller = Microcryogel ; RNA = RNA ; Saflaştırma = Purification

Özet:
RNA saflaştırma, yaşam bilimlerini konu alan birçok çalışmada, özellikle viral, bakteriyel ve parazitik hastalıkların teşhisinde, kalıtsal bozuklukların diagnozunda, bir dizi hazırlayıcı ve analitik yöntemin kritik bir ilk aşamasını oluşturmaktadır. Bu bağlamda moleküler biyoloji teknikleri uygulamalarıyla hassas ve güvenilir sonuçlar elde etmek için saf ve bozulmamış halde saflaştırılmış RNA molekülleri gerekmektedir. Afinite kromatografisi, iyonik/hidrofobik etkileşimler, hidrojen bağı, disülfür köprüsü gibi moleküler etkileşimler kullanılarak bir karışımdaki belirli bir molekülün veya bir grup molekülün ayrılması, uzaklaştırılması ve saflaştırılması için kullanılan bir yöntemdir. Afinite kromatografisi; antikorlar, enzimler, hormonlar, DNA, reseptörler ve vitaminler dahil olmak üzere birçok biyomolekülün ayrılması ve saflaştırılması gibi biyokimyasal ve biyoteknolojik süreçlerde sıklıkla kullanılmaktadır. Boronat afinite kromatografisi, cis-diol içeren biyomoleküllerin izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılan yaygın bir saflaştırma yöntemidir. Son dönemlerde spesifik afinite etkileşimlerinden yararlanan kromatografik stratejileri giderek geliştirilmektedir. RNA'nın ayrılması için geliştirilen
ii
etkili tekniklerden yararlanarak boronat afinite kromatografisi, cis-diol grupları içeren çok çeşitli biyomoleküllerin biyoseçici ayrımı ve zenginleştirilmesi için umut verici bir yaklaşımdır. Geleneksel partikül bazlı adsorbanlar farklı ölçeklerde kolonlara eklenebilmeleri sebebiyle kromatografide sıklıkla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, genellikle nispeten küçük gözenek boyutlarına sahiptirler ve yavaş difüzyonlu kütle transferi, düşük akış hızları ve yüksek basınç düşüşü gibi bazı dezavantajlara neden olurlar. Bu nedenle, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı adsorbanlar geliştirilmiştir. En iyi bilinen alternatiflerden biri kriyojel bazlı adsorbanlardır. Kriyojeller, sıfır altı sıcaklıklarda jelleşme yoluyla üretilen makro gözenekli polimerik malzemelerdir. Ek olarak, kriyojeller, orijinal kalıbı ölçülerinde monolitik formda hazırlanır ve genellikle sadece kendi şekline uygun olan belirli bir kolonda kullanılır. Sunulan tez kapsamında, istenen ölçek ve şekilde sentezlenebilen mikron boyutlu kriyojeller, mikrokriyojeller olarak adlandırılmıştır, boronat afinite adsorbanı olarak imal edilmiştir. İki farklı türde sentezlenen PHEMA ve poli(HEMA-VPBA) mikrokriyojeller, SEM, FT-IR, μCT gibi çeşitli yöntemlerle karakterize edildikten sonra kesikli sistemde optimum adsorpsiyon koşullar belirlenmiştir. Yapılan tez çalışmasında, uygun karakterizasyona sahip olması nedeniyle Poli(HEMA-VPBA) mikrokriyojeller kullanılarak optimum koşullar pH 8.5 etilenamin tamponu 0.1 M CaCl2 tuz varlığı 37 oC olarak elde edilmiştir. Sulu çözeltiden RNA adsorpsiyonu deneyleri sonucunda 50. dakikadan sonra adsorpsiyon doygunluğuna ulaşıldığı, 0.5 mg/ml RNA derişiminde maksimum adsorpsiyon kapasitesinin 303 mg/g polimer olduğu bulgusuna erişilmiştir. Adsorpsiyon izotermi inceleme çalışmalarında Langmuir izotermine uygunluk gösterdiği ve ikinci dereceden izoterm kinetiği ile örtüştüğü belirlenmiştir. Mikrokriyojellerin tekrar kullanılabilirlik incelemeleri 8 kez yapılarak sonucunda 223.4 mg/g adsorpsiyon kapasitesi değerine ulaşılmıştır. Tezde, deney ve kontrol kolaylığı sağladığından dolayı biyokimyasal süreçlerde sıklıkla tercih edilen E. coli hücreleri kullanılmış ve E. coli hücrelerinden inkübasyon ve santrifüj işlemleri sonucunda RNA özütü elde edilmiştir. RNA özüt, desorpsiyon ajanı olarak 0.1 M borat tamponu 0.5 M CaCl2 vasıtasıyla yıkanmıştır. Yıkama sonucu agaroz jel elektoforez analizi sonucunda RNA'nın yüksek oranda başarılı şekilde saflaştırıldığı kanıtlanmıştır.

Abstract:
RNA purification is a critical first step in many life science studies, particularly in the diagnosis of viral, bacterial and parasitic diseases, in the diagnosis of hereditary disorders, tumors and in a number of preparatory and analytical methods. In this context, pure and pristine RNA molecules are required in order to obtain sensitive and reliable results with the applications of molecular biology techniques. Affinity chromatography is a method for separation, removal and purification of a particular molecule or group of molecules in a mixture using molecular interactions such as ionic/hydrophobic interactions, hydrogen bonding, disulfide bridge. Affinity chromatography; It is frequently used in biochemical and biotechnological processes such as the separation and purification of many biomolecules, including antibodies, enzymes, hormones, DNA, receptors and vitamins. Boronate affinity chromatography is a common purification method used for the isolation and purification of cis-diol containing biomolecules. Recently, chromatographic
iv
strategies utilizing specific affinity interactions have been increasingly developed. Leveraging effective techniques developed for RNA separation, boronate affinity chromatography is a promising approach for bioselective separation and enrichment of a wide variety of biomolecules containing cis-diol groups. Conventional particle-based adsorbents are frequently used in chromatography because they can be added to columns at different scales. However, they usually have relatively small pore sizes and cause some disadvantages such as slow diffusion mass transfer, low flow rates and high pressure drop. Therefore, different adsorbents have been developed to overcome these limitations. One of the best-known alternatives is cryogel-based adsorbents. Cryogels are macroporous polymeric materials produced by gelation at subzero temperatures. In addition, cryogels are prepared in monolithic form in the original mold dimensions and are usually only used in a particular column that conforms to its shape. Within the scope of the presented thesis, micron-sized cryogels that can be synthesized in the desired scale and shape were named as microcryogels, and were manufactured as boronate affinity adsorbent. PHEMA and poly(HEMA-VPBA) microcryogels synthesized in two different types were characterized by various methods such as SEM, FT-IR, μCT, and optimum adsorption conditions were determined in the batch system. In the thesis study, optimum conditions were obtained by using poly(HEMA-VPBA) microcryogels due to its suitable characterization, pH 8.5 ethyleneamine buffer 0.1 M CaCl2 salt presence at 37oC. As a result of RNA adsorption experiments from aqueous solution, it was found that adsorption saturation was reached after 50 minutes, and the maximum adsorption capacity was 303 mg/g polymer at 0.5 mg/ml RNA concentration. In the adsorption isotherm studies, it was determined that it conforms to the Langmuir isotherm and overlaps with the second-order isotherm kinetics. The reusability examinations of the microcryogels were performed 8 times and the adsorption capacity value of 223.4 mg/g was reached. In the thesis, Escherichia coli cells (E. coli), which are frequently preferred in biochemical processes due to their ease of experimentation and control, were used and RNA extract was obtained from E. coli cells as a result of incubation and centrifugation. The RNA extract was washed with 0.1 M borate buffer 0.5 M CaCl2 as desorption agent. As a result of washing and agarose gel electrophoresis analysis, it was proved that RNA was purified with a high degree of success.