Burkholderia multivorans SB6 kökenli lipaz enziminin deterjanlarda kullanım potansiyeli ve bor ile stabilizasyonu
The potential use of lipase enzyme from burkholderia multivorans SB6 in detergents and stabilization with boron
Yazar: RUKİYE BORAN
Danışman: PROF. DR. AYSEL UĞUR
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Son yıllarda, yıkama performansını artırmak için deterjanlara çeşitli enzimler ilave edilmektedir. Bu enzimlerden biri olan lipazlar deterjan endüstrisinde evsel ya da endüstriyel ölçekli çamaşır ve bulaşıklarda yağlı lekelerin uzaklaştrılması ve tıkanmış kanalların temizlenmesinde kullanılmaktadırlar. Lipazların yıkama ajanı olarak kullanımı oldukça önemlidir, çünkü bunlar sadece deterjanın etkinliğini artırmakla kalmayıp aynı zamanda enerjinin korunmasına da yardım etmekte ve kumaşların renklerini de koruma gibi avantajlar da sağlamaktadırlar. Fakat mevcut enzimlerin bazıları deterjan formülasyonlarındaki yaygın içeriklere karşı düşük aktivite ve stabilite sergilemektedirler. Bu problemlerin üstesinden gelebilmek için pek çok girişimde bulunulmakta ve çeşitli stabilizasyon teknikleri kullanılmaktadır. Ayrıca böyle uygulamalar için uygun özelliklere sahip yeni enzim arayışları da devam etmektedir. Dolayısıyla, bu çalışmada deterjan içeriği olarak kullanılabilecek alkalin stabil, düşük sıcaklıklarda aktif, sürfaktan, ağartıcı ve ticari deterjan stabilitesi olan bir lipazın üretimi, saflaştırılması, karakterizasyonu ve bor bileşikleri kullanılarak stabilize edilmesini amaçlanmıştır.
Bu çalışmada mutfak atık su örneklerinden Rhodamine B Agar besiyeri kullanılarak 265 bakteri izole edilmiştir ve bu besiyerine ticari deterjan eklendiği zaman 115 izolat pozitif sinyal vermiştir. Bu izolatların lipaz aktiviteleri ve deterjan stabiliteleri substrat olarak p-nitrophenyl palmitat?ın kullanılmasıyla spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Ticari deterjanların varlığında yüksek stabilite gösteren SB6 izolatı, 16S rDNA dizi analiziyle %99 homoloji ile Burkholderia multivorans olarak tanımlanmıştır. B. multivorans SB6 lipazı sırasıyla amonyum sülfat çöktürmesi, anyon değişim kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi kullanılarak 23 kat saflaştırılmıştır. Saf proteinin moleküler ağırlığı SDS-PAGE ile yaklaşık 70 kDa olarak belirlenmiştir. SB6 lipazının optimum aktivitesi pH 9.0 ve 40 ºC olarak tespit edilmiştir. Bu enzim bazı metal iyonları, sürfaktanlar ve ağartıcı ajanların varlığında, ayrıca pH 9.0-12.0 aralığında stabilitesini korumuştur. Bor bileşiklerinin eklenmesi enzimin pH stabilitesi ve termostabilitesini de artırmıştır. Bu enzim pH 9.0 ve pH 10.0?da 1 h inkübasyondan sonra kullanılan tüm bor bileşenlerinin konsantrasyonlarında % 100 aktif kalmıştır.Tüm sıcaklık değerlerinde incelenen bor bileşikleri arasından en iyi sonuçlar potasyum metaboratta elde edilmiştir. Diğer taraftan, SB6 lipazı, ticari deterjanların varlığında aktivitesini %40?dan daha fazla korumayı başarmıştır. Enzim bazı ticari deterjanlara karşı ise ticari lipaz enzimi kadar iyi bir stabilite göstermiştir. Inkübasyon ortamına stabilizatör olarak bor bileşikleri eklendiği zaman enzimin ticari deterjanlara karşı olan stabilitesi artmıştır. Bu özellikler bu enzimin deterjan formülasyonlarında kullanılabilecek özellikler taşıdığını göstermektedir. Ayrıca, bor bileşenlerinin enzim stabilizasyonuna ek olarak, çeşitli mikroorganizmalara karşı olan antimikrobiyal aktiviteleri de ölçülmüştür. 
B. multivorans SB6 tarafından üretilen lipaz deterjan içeriği olarak kullanılırsa, deterjanın etkinliğini iyileştirebilecek, kimyasal kullanımını azaltacak, atık sulardaki kirlenmeyi azaltacak ve enerji tasarrufu sağlayabilecektir. Ayrıca bor bileşenlerinin deterjan içeriği olarak kullanımı temizleme işlemlerinde gerekli olan hijyenik koşulların da sağlanmasına yardım edecektir.

Anahtar kelimeler:Burkholderia multivorans, lipaz, bor, stabilizasyon, deterjan

Abstract:
In recent years, various enzymes are added to detergents in order to increase their washing performances. One of these enzymes are lipases using in the detergent industry for household or industrial-scale operations such as washing machines and dishwashers for removal of fatty residues and for clearing the clogged drains. The use of lipases in washing agents is important because they not only improve the efficacy of the detergent but also help save energy and provides protect the color of fabrics. However many of the available enzymes exhibit low activity and stability towards common ingredients in detergent formulations. To overcome these problems, several attempts have been made and various stabilization techniques are used. Otherwise new enzyme search continues for these applications.The aims of this study production, purification, characterization and using boron compounds stabilization of alkaline stable, low temperature active, surfactant, oxidizing agents and commercial detergents stable a lipase for using detergent component. 
In the present study; 265 bacterial isolates were collected from oily kitchen waste water samples by using Rhodamine B Agar mediumand 115 isolates give a positive signal when commercial detergent was added to this medium. Lipase activities and detergent stabilities were measured through a spectrophotometer with using p-nitrophenyl palmitate as a substrate.The isolate showing the highest stability towards commercial detergents was identified as B. multivorans with 99% homology according to the 16S rDNA sequence analysis. The SB6 lipase was purified from B. multivorans SB623 fold through ammonium sulphate precipitation, anion exchange and gel filtration chromatography. Thereby, the molecular weight of SB6 lipase was determined as 70 kDa by SDS-PAGE.The optimum activity of SB6 lipase was at pH 9.0and 40 ºC. This enzyme maintained its stability in the presence of metal ions, surfactants and oxidizing agents and in the conditions of between pH 9.0?12.0. The addition of boron compounds improved the pH stability and thermo stability of relevant enzyme. SB6 lipase retained its activity 100% in the presence of all of the boron compounds used after 1 h incubation at pH 9.0 and pH 10.0.Among the boron compounds examined, the best results were obtained with potassium metaborate at all temperature values.In addition, SB6 lipase retained its activity more than 40% in the presence of commercial detergents. This enzyme displayed stability against commercial detergents as well as well-known commercial lipase. The stability of SB6 lipase against commercial detergents increased when boron compounds were used as stabilizers in the incubation media. Furthermore, in addition to enzyme stabilization of the boron compounds, the antimicrobial effects were assayed to against various microorganisms.
As conclusion, lipase produced by B. multivorans SB6is possible detergent enzyme additive which may improve the detergent effectiveness, eliminate chemical usage, reduce pollution level of wastewater and consequently save energy. Also, the use of boron compounds in detergent content may contribute in obtaining the required hygienic conditions.


Keywords:Burkholderia multivorans, lipase, boron, stabilization, detergent