İdrarda amfetamin ve türevlerinin C vitamini varlığında değişimlerinin Immunoassay ve GC/MS ile değerlendirilmesi
Evaluation of changes of amphetamine and its derivatives in urine in the presence of vitamin C by immunoassay and GC/MS
Yazar: EZGİ KAYTAR
Danışman: DOÇ. DR. YUSUF KURTULMUŞ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Bağımlılık Toksikolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Biyokimya = Biochemistry ; Uyuşturucu Alışkanlığı ve Alkolizm = Drug Addiction and Alcoholism
Dizin: Adli toksikoloji = Forensic toxicology ; Antioksidan vitaminler = Antioxidant vitamins ; Gaz kromatografisi = Gas chromatography ; Gıda takviyesi = Food supplement ; Kütle spektroskopisi = Mass spectroscopy ; N-methyl-3,4-metilendioksiamfetamin = N-methyl-3,4-methylenedioxyamphetamine ; İmmünoenzim teknikleri = Immunoenzyme technics

Özet:
Vitaminler ve diğer gıda takviyelerinin kullanımı toplumda hızla büyüyen bir trend haline gelmiştir. Genel olarak, vitaminler reçeteye gerek olmadan kolaylıkla her yerden satın alınabilen reçetesiz preparatlardan oluşur ve pazarlama tekniğinin gelişmesinden kaynaklı, insanlar genellikle bağışıklık sistemlerini güçlendirmek için sıklıkla tercih etmekte ve ayrıca vitaminler birçok hastalıklarda bağışıklığı destekleyici olarak da kullanılmaktadır. Bu vitaminler aynı zamanda adli analizlerde kullanılan idrar örneğinde hilesel girişim içinde kullanılabilmektedir. Bu vitaminleri dışarıdan katı formda eklemek ya da bol miktarda tüketerek idrar pH'sında oluşacak değişiklikler nedeniyle yasadışı maddelerin sonuçları yanlış negatif sonuçlar elde edilebilmektedir. Amfetamin tipi stimülanlar (ATS), sentetik kökenli olup ana üyeleri amfetamin (AMP), metamfetamin (MET) ve ekstazi (MDMA) olan uyarıcı madde grubudur. Dünyada ve ülkemizde ATS kullanımının oldukça yaygındır.  2023 yılında yayınlanan "World Drug Report"ta 2021 yılında 36 milyon kişinin amfetamin ve 20 milyon kişinin ise "ekstazi" türü sentetik maddenin kullandığını bildirmiştir. Bu tez çalışmasında, katı ve sıvı formda C vitamininin ülkemizde de oldukça yaygın olarak suiistimal edilen ATS grubu maddelerden amfetamin, metamfetamin ve ekstazinin idrar analizler üzerindeki etkilerinin araştırılması olup, tarama ve doğrulama analizlerinde yanlış negatiflik oranlarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Katı ve sıvı formda C vitamini (askorbik asit) için maksimum biyoyararlanımının 200 mg olduğunu ve fazlası alındığı taktirde büyük bir oranda değişmeden idrara atılım söz konusu olduğundan 400 mg ve 800 mg olacak şekilde, bir kişinin günde ortalama 2500 mL idrar atılımı gerçekleştirdiği varsayılarak hesaplamalar yapılmıştır. İki farklı derişimde vitamin çalışılmasındaki amaç, idrar ortamının pH'ı düştüğünde bazik forma sahip olan ATS'lerin asidik ortamda etkileşimi araştırmaktır. İlk aşamada; saf su ve kör idrar havuzu örneklerinde sıvı formda askorbik asit katımı ile ATS ve pH değişimleri izlenmiştir. İkinci aşamada, tarama ve doğrulama analizleri ile ATS pozitif olarak raporlanan 64 idrar numunesi seçilmiştir. Bu idrarlara sıvı ve katı formlarda askorbik asit 400 mg ve 800 mg olacak şekilde standart katımı yapılmıştır. Tüm örneklerin pH ölçümleri yapılmıştır. Üçüncü aşamada ise, 8 ATS pozitif idrar numunesi için katı askorbik asidin belirlenen derişimlerde eklenmesi sonrasında Gaz Kromatografisi-Kütle Spektroskopisi (GC-MS) ile doğrulama analizleri yapılmış, alan değerlerinde değişimler izlenmiştir. Tarama ve doğrulama test sonuçları istatistiksel olarak değerlendirilmiştir.
Saf ve idrar havuzunda yapılan çalışmalarda ATS standart katımı yapıldıktan sonra 400 ve 800 mg askorbik asit eklenmesiyle saf su pH'sında hızlı bir düşüş, idrar havuzunda nispeten daha az bir düşüş olduğu belirlenmiştir. Hem katı hem de sıvı formda kullanılan askorbik asit immunoassay çalışmalarındaki bütün örnekler değerlendirildiğinde, toplam 64 örnekten 58'i AMP pozitif için 400 mg C-vit eklendiğinde 13 örnek negatif (%22,4) 800 mg C-vit için 26 örnek negatif (%44,8) bulunur. 59 MET pozitif örnekten 400 mg C-vit eklendiği zaman 9 örnek negatif (%15,3) olurken, 800 mg C-vit için 18 örnek negatif (%30,5) olur. 16 pozitif MDMA örneklerinden 400 mg C-vit eklendiğinde 5 örnek negatif (%31,2) iken, 800 mg C-vit için de 6 örnek negatif (%37,5) olmaktadır.
AMP, MET ve MDMA için katı ve sıvı formda yapılan katımlar sonucunda elde edilen değerler istatistiksel olarak değerlendiğinde yüksek derişimde C vitaminin katı ya da sıvı formda idrarda bulunması büyük oranda yanlış negatifliğe sebep olduğu belirlenmiştir. GC-MS ile yapılan analizlerde ise alan değerlerinde düzenli bir artış ya da azalış olmadığı, ATS grubu maddelerin vitamin C'ye rağmen tespit edilebildiği ancak pH farkları nedeniyle çalışma sırasında bazı zorluklar yaşanmıştır.
Amfetamin Tipi Stimülanların (ATS) kimyasal özellikleri ile vitamin C molekülünün vücutta kullanılacak olandan fazlasının birlikte alınmasının bu maddelerin analiz sonuçları üzerine nasıl etki ettiğine cevap aramak amacıyla yapılan bu çalışmada elde edilen bulgular, daha geniş bir olgu grubunda yapılacak analizlerin faydalı bilgiler sunacağını göstermektedir. Bu testlerin yapıldığı laboratuvarlarda beklenmedik sonuçlarla karşılaşıldığında, numune verilmeden önce yüksek dozlarda vitamin C alımını akılda tutmanın yararlı olacağı söylenebilir.

Abstract:
The use of vitamins and other food supplements has become a rapidly growing trend in society. In general, vitamins consist of over-the-counter preparations that can be easily purchased anywhere without the need for a prescription, and due to the development of marketing techniques, people often prefer them to strengthen their immune systems, and vitamins are also used as immune support in many diseases. These vitamins can also be used to manipulate urine samples used in forensic analyses. Adding these vitamins externally in solid form or consuming large amounts of them may cause false negative results due to changes in urine pH due to illegal substances. Amphetamine-type stimulants (ATS) are a group of stimulants of synthetic origin, the main members of which are amphetamine (AMP), methamphetamine (MET) and ecstasy (MDMA). The use of ATS is quite common in the world and in our country. The "World Drug Report" published in 2023 reported that 36 million people used amphetamine and 20 million people used the synthetic substance "ecstasy" in 2021. This thesis study aims to investigate the effects of vitamin C in solid and liquid form on urine analysis of amphetamine, methamphetamine and ecstasy, which are among the ATS group substances that are widely abused in our country, and to evaluate the false negative rates in screening and confirmation analyses.
Calculations were made assuming that the maximum bioavailability of vitamin C (ascorbic acid) in solid and liquid form is 200 mg, and that a person excretes an average of 2500 mL of urine per day, as 400 mg and 800 mg, since if more is taken, it is excreted into the urine largely unchanged. The purpose of studying vitamins at two different concentrations is to investigate the interaction of ATSs, which have a basic form, in an acidic environment when the pH of the urine environment decreases. First stage; ATS and pH changes were monitored with the addition of ascorbic acid in liquid form in pure water and blind urine pool samples. In the second stage, 64 urine samples reported as ATS positive were selected through screening and confirmation analyses. Standard amounts of 400 mg and 800 mg of ascorbic acid in liquid and solid forms were added to these urines. pH measurements of all samples were made. In the third stage, after adding solid ascorbic acid at the determined concentrations to 8 ATS positive urine samples, confirmation analyzes were performed with Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) and changes in the field values were monitored. Screening and confirmation test results were evaluated statistically.
In studies conducted in pure and urine pools, it was determined that there was a rapid decrease in pure water pH with the addition of 400 and 800 mg ascorbic acid after the ATS standard addition, and a relatively smaller decrease in the urine pool. When all samples in ascorbic acid immunoassay studies used in both solid and liquid forms were evaluated, 58 out of a total of 64 samples were AMP positive, 13 samples were negative (22.4%) when 400 mg C-vit was added, and 26 samples were negative (26 samples were negative) for 800 mg C-vit. 44.8) is found. Of 59 MET positive samples, when 400 mg C-vit is added, 9 samples become negative (15.3%), while for 800 mg C-vit, 18 samples become negative (30.5%). Among 16 positive MDMA samples, when 400 mg C-vit is added, 5 samples become negative (31.2%), while 6 samples become negative (37.5%) for 800 mg C-vit.
When the values obtained as a result of solid and liquid additions for AMP, MET and MDMA were evaluated statistically, it was determined that the presence of high concentrations of vitamin C in solid or liquid form in the urine caused a large number of false negatives. In the analyzes performed by GC-MS, it was determined that there was no regular increase or decrease in the field values, ATS group substances could be detected despite vitamin C, but some difficulties were experienced during the study due to pH differences. 
The findings obtained in this study, which was conducted to seek answers to the chemical properties of Amphetamine Type Stimulants (ATS) and how taking more vitamin C molecules than will be used in the body, affect the analysis results of these substances, show that analyzes to be performed on a larger group of cases will provide useful information. When unexpected results are encountered in laboratories where these tests are performed, it can be said that it would be useful to keep in mind the intake of high doses of vitamin C before the sample is given.