Bacillus mojavensis TH309 tipII I-asparajinaz geninin klonlaması ve heterolog ifadesi
Cloning and heterolog expression of the bacillus mojavensis TH309 type II I-asparaginase gene
Yazar: RAGHD BAHAR
Danışman: DOÇ. DR. ALİ OSMAN ADIGÜZEL
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Asparajinin amonyak ve aspartata parçalanmasını katalize eden Tip II Lasparaginaz enzimleri, tıpta lenfoblastik lösemi (ALL) ve diğer bazı hematolojik 
malignitelerin tedavisinin yanı sıra gıda endüstrisinde akrilamid oluşum riskinin 
azaltılması amacıyla kullanılabilmektedir. Sunulan bu tez çalışmasında; Bacillus 
mojavensis TH309 genomundaki tip II L-asparaginaz enzimini kodlayan genin 
Escherichia coli BL21(DE3)'de ifadesi gerçekleştirilmiştir. İlk olarak; yaklaşık 1083 
bç büyüklüğündeki B. mojavensis TH309 tip II L-asparaginaz geni (aspII) polimeraz 
zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmış ve pET20b(+) vektörüne klonlanmıştır. 
Rekombinant molekül ısı şoku uygulanarak E. coli BL21(DE3)'ye transforme 
edilmiştir. Rekombinant molekülü içeren klonun (E. coli BL21(DE3)-pET20b(+)-
aspII) 100 mM IPTG varlığında kültüvasyonu ile aspII'nin ifadesi (BmAspII) 
gerçekleştirilmiştir. Üretilen enzim miktarı ve spesifik aktivitesi sırasıyla 7.65 U/mg 
protein ve 253.4 U/mL olarak tespit edilmiştir. SDS-PAGE analizi sonucunda 
heterolog olarak ifade edilen BmAspII enziminin moleküler ağırlığının yaklaşık 35 
kDa olduğu tespit edilmiştir. Enzim; nikel-afinite kromotografisi yöntemi ile %76.5 
verimle 5.3 kat saflaştırılmıştır. Enzimin en iyi aktivite sergilediği sıcaklık ve pH 
sırasıyla 37 °C ve 8.0 olarak tespit edilmiştir. Mg²⁺ ve Ca²⁺ enzim aktivitesini sırasıyla 
%46.2 ve %38.4 arttırdığı, Zn²⁺ ve Cu²⁺ ise sırasıyla %29.7 ve %22.3 azalttığı tespit 
edilmiştir. Test edilen kimyasallardan PMSF ve EDTA'nın enzim aktivitesi üzerinde 
aktive edici, SDS ve β-mercaptoethanol'un ise inhibe edici etkisi olduğu belirlenmiştir. 
Ayrıca, enzimin amino asitlerinin %23'ü alfa helks, %23'ünün de beta-tabakada 
konumlandığı tespit edilmiştir. Ayrıca; enzimin pKI, aliphatic indeksi ve GRAVY 
değerleri sırasıyla 8.79, 89.79 ve -0.228 olarak hesaplanmıştır

Abstract:
Type II L-asparaginase enzymes, which catalyze the breakdown of asparagine 
into ammonia and aspartate, are used in medicine for the treatment of lymphoblastic 
leukemia (ALL) and other hematological malignancies, as well as in the food industry 
to reduce the risk of acrylamide formation. In this thesis study, the gene encoding the 
type II L-asparaginase enzyme from the genome of Bacillus mojavensis TH309 was 
expressed in Escherichia coli BL21(DE3). First, the approximately 1083 bp B. 
mojavensis TH309 type II L-asparaginase gene (aspII) was amplified by polymerase 
chain reaction (PCR) and cloned into the pET20b(+) vector. The recombinant 
molecule was transformed into E. coli BL21(DE3) by heat shock. The expression of 
aspII (BmAspII) was induced in the clone containing the recombinant molecule (E. 
coli BL21(DE3)-pET20b(+)-aspII) in the presence of 0.5 mM IPTG. The amount of 
enzyme produced and its specific activity were determined to be 7.65 U/mg protein 
and 253.4 U/mL, respectively. SDS-PAGE analysis revealed that the molecular weight 
of the heterologously expressed BmAspII enzyme was approximately 35 kDa. The 
enzyme was purified using nickel-affinity chromatography with a yield of 76.5% and 
a purification fold of 5.3. The optimal temperature and pH for the enzyme's activity 
were found to be 37°C and 8.0, respectively. Mg²⁺ and Ca²⁺ increased enzyme activity 
by 46.2% and 38.4%, respectively, while Zn²⁺ and Cu²⁺ decreased it by 29.7% and 
22.3%, respectively. Of the chemicals tested, PMSF and EDTA were found to enhance 
enzyme activity, while SDS and β-mercaptoethanol had inhibitory effects. In addition, 
it was found that 23% of the enzyme's amino acids were located in alpha helices and 
another 23% in beta sheets. Furthermore, the enzyme's isoelectric point, aliphatic 
index, and GRAVY values were calculated to be 8.79, 89.79, and -0.228, respectively.