Halofilik mikroorganizmalara ait lipaz enzimlerinin Escherichia coli'de üretilmesi ve analizi
Production and analysis of lipase enzymes of halophilic microorganisms in Escherichia coli
Yazar: ABDOULIE O. TOURAY
Danışman: PROF. DR. AYŞE OGAN ; PROF. DR. KADİR TURAN
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Lipazlar (triaçilgliserol hidrolazlar E.C. 3.1.1.3), hidrolazlar enzim ailesi içerisinde yer alan, gliserol ve yağ asiti zincirlerinin oluşturduğu esterlerin hidrolizini katalizleyen enzimlerdir. Lipazlar ökaryotik ve prokaryotik yapıda tüm canlılarda yaygın olarak bulunurlar. Özellikle mirobiyal organizmalarda sentezlenen lipazlar, pH, sıcaklık, tuz konsantrasyon gibi ortam koşullarındaki değişmelere karşı daha toleranslı olmaları ve substrat spsesifikliklerinin yüksek olması nedeniyle, endüstriyel açıdan büyük önem taşımaktadır. Bu enzimlerin bir kısmı, gıda, deterjan, ilaç ve çeşitli kimyasal maddelerin üretilmesinde endüstride yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bakımdan var olan lipaz enzimlerini daha etkin hale getirmek, daha düşük maliyetlerle üretmek, endüstriyel kullanım kapasitesi yüksek yeni lipaz enzimleri keşfetmek amacıyla, rekombinant DNA teknolojilerini de kullanarak yoğun bilimsel çalışmalar yapılmaktadır. Bu tez çalışmasında da ılımlı halofilik bakteriler olan Bacillus safensis ve Bacillus licheniformis ile aşırı halofilik arkebakter olan Haloarcula hispanica'ya ait hipotetik olarak tanımlanmış lipaz genleri, daha düşük maliyette enzim üretmek amacıyla Escherichia coli hücrelerine aktarıldı. Escherichia coli hücrelerinde sentez edilen halofilik bakteri lipaz enzimleri kalitatif ve kantitatif olarak analiz edildi.
Çalışmada mikroorganizma olarak B. safensis, B. licheniformis, H. hispanica ve E. coli'nin farklı suşları kullanıldı. Halofilik bakteri genleri, bu bakterilerden izole edilen genom DNA'sı üzerinden, spesifik oligonukleotid primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyon (PZR) ile çoğaltıldı. Çoğaltılan lipaz genleri, standart DNA teknikleri ile E. coli hücrelerinde ekspresyon yapan plazmit vektörler klonlandı. Vektörlere klonlanan lipaz genleri DNA dizi analizleri ile kontrol edildi. Lipaz ekspresyon vektörleri E. coli hücrelerine transforme edildi ve bu hücrelerde lipaz enzimi sentezi SDS-PAGE teknikleri ile analiz edildi. Lipaz geni aktarılan E. coli hücrelerinde, lipaz enzim aktiviteleri pNFL, pNFP ve pNFA sentetik substratlar kullanılarak spektrofotometrik yöntemle belirlendi. 
DNA dizi analizleri sonuçları oluşturulan pazmit vektörlerinin tasarlanan yapılar ile birbiri uyumlu olduğunu gösterdi. Transformant E. coli lizatlarının SDS-PAGE analizleri halofilik organizma lipaz enzimlerinin farklı miktarlarda da olsa sentezlendiğini ortaya koydu. Sentetik p-nitrofenil laurat ve p-nitrofenil palmıitat substratları kullanılarak yapılan aktivite testlerinde, B. licheniformis'e ait hipotetik lipaz geni üzerinde sentez edilen enzimin en yüksek aktiviteye sahip olduğu görüldü. 
Aşırı halofilik H. hispanica lipaz enziminin E. coli hücrelerinde yeteri kadar sentez edilmediği ve istenilen düzeyde aktif olmadığı saptandı. P-nitrofenil asetat ile yapılan aktivite testlerinde ise, büyük olasılıkla endojen esteraz enzimlerinin reaksiyonu etkilemeleri nedeniyle ayırt edici sonuç alınamadı. Ilımlı halofilik özellik taşıyan B. licheniformis'e ait lipaz enziminin NaCl ve Triton X-100 konsantrasyonlarındaki artışa daha yüksek tolerans gösterdiği ortaya konuldu. Bu özellikler, B. licheniformis lipaz enziminin, endüstriyel kullanım potansiyeline sahip oluğunu göstermektedir. Dolayısıyla B. lichenifomis hipotetik lipaz geni tarafından kodlanan bu enzimin saflaştırılması ve daha ileri düzeylerde işlevsel analizlerin gerçekleştirilmesi ileriye yönelik önemli bir hedef olarak görünmektedir.

Abstract:
Lipases (EC.3.1.1.3, triacylglycerol acyl hydrolases) are members of hydrolases that catalyze the hydrolysis of ester bonds between glycerol and fatty acids. Lipases are abundant in all eukaryotic and prokaryotic organisms. Microbial lipases are relatively tolerant to changes in pH, temperature and salt concentration and are capable of catalyzing reactions with high substrate specificity, therefore, are potentially important for industrial applications. Microbial lipases are mostly used in food, detergent, pharmaceutical industries and production of fine chemicals. Using recombinant DNA technologies, intensive studies are being performed to improve the existing lipases, reduce the production cost, and discover new lipases with high industrial performance. In this thesis, to produce a low-cost lipase, hypothetically defined lipase genes belonging to Bacillus safensis, Bacillus licheniformis and extremely halophilic archaea Haloarcula hispanica were transformed into Escherichia coli cells. Halophilic bacterial lipase enzymes synthesized in Escherichia coli cells were then quantitatively and qualitatively analyzed. 
The test microorganisms used were B. safensis, B. licheniformis, H. hispanica and different strains of E. coli. Genomic DNA isolated from these bacteria comprising the halophilic bacteria genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers. Using standard recombinant DNA technologies, amplified lipase genes were cloned into the plasmid vectors expressing in E. coli cells. Lipase genes cloned into the vectors were checked by DNA sequence analysis. The expression vectors carrying lipase genes were transformed into the E. coli cells. Synthesized lipases were characterized by SDS-PAGE and the lipase activities were assayed spectrophotometrically using p-nitrophenyl laurate (p-NPL) and p-nitro-phenyl palmitate (p-NPP) as synthetic substrates.
DNA sequence analysis and the designed vectors were compatible. SDS-PAGE analysis of the transformed E. coli lysates confirmed the production of lipases by the halophilic organisms at various yields. High lipase activity was observed for hypothetically defined lipase belonging to B. licheniformis with p-NPLand p-NPP substrates. Lipase of extremely halophilic Haloarcula hispanica could not be synthesized in good yield and was not active at the desired level. Due to the presence of endogenous esterase enzymes, no distinctive activity was obtained with p-nitrophenyl acetate (p-NPA). Lipase of moderately halophile, B. licheniformis was shown to be tolerant to high NaCl and Triton X-100  concentration. These features reveal that B. licheniformis may have potential in industrial uses. Therefore, further purification and characterization tests seem to be important goals for future research.