Gebelik boyunca kısrak maternal plazmasında sex-determining region y (SRY) ve amelogenin y (AMELY) genlerinin belirlenmesi ve bu genlerin fetal cinsiyetle ilişkisi
Sex-determining region y(SRY) and amelogenin y (AMELY) genes amplification in pregnant mare maternal plasma and relation between these genes and sex
Yazar: ÖMER MEHMET ERZENGİN
Danışman: PROF. DR. MEHMET CAN GÜNDÜZ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Veteriner Doğum ve Jinekoloji Ana Bilim Dalı / Veterinerlik Doğum ve Jinekolojisi Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu çalışmada 24  adet kısraktan (13 dişi fetüs, 11 erkek fetüs gebeliği) gebeliğin her ayında (1-11. aylar) periferal kan örnekleri alınarak SRY ve AMELY genlerinin amplifikasyon etkinlikleri karşılaştırıldı. Çalışmaya dahil edilen kısraklar Arap ırkından olup, yaşları 5-15 yıl arasında değişmekteydi. Vücut kondüsyon skorları (BCS) 5-7 arasındaydı. Çalışma grupları, doğum sonrasında doğrulanan yenidoğan cinsiyetlerine göre sınıflandırıldı. cfDNA izolasyonu sonrasında yoğunluklarının 5,9-64 ng/µl arasında değişim gösterdiği tespit edildi. İstatistiksel analizler sonucunda erkek ve dişi fetüs taşıyan gebeliklerde cinsiyete bağlı olarak AMELY geninin Ct değerleri (amplifikasyon miktarı) arasında anlamlı bir farklılık olmadığı görüldü (p>0.05). qRT-PCR yönteminden sonra uygulanan çözülme eğrisi analizlerinde her örnek için amplikasyon özgüllüğü kontrol edildi. Bu analizde çalışılan maternal cfDNA örnekleri içerisinde fetal cinsiyet ile ilgili olarak araştırılan genlerin tespit edilebilme gücü belirlendi. Y kromozomu üzerindeki AMELY geni ve X kromozomu üzerindeki AMELX geni arasında yüksek dizi benzerliği vardır. Ancak,  AMELY gen dizisinde AMELX'den farklı olarak 24 bazlık bir delesyon olması PCR sonrasında iki gen ürünün birbirinden ayrılabilmesini sağlandı. Benzer şekilde SRY genine özgü primer tasarımı yapıldığında farklı algoritmalar kullanılarak yapılan in-silico analizlerde sadece SRY dizisinin amplikasyonun olduğu doğrulanırken, qRT-PCR sonrasında dişilerde de amplifikasyon olduğu gözlendi. Ancak yaptığımız çözülme eğrisi analizlerinde dişilere ait homolog bölge amplifikasyonu ile gerçekte hedeflenen SRY geninin amplifikasyonu net olarak belirlenerek doğrulandı. Erkek ve dişi fetüsların AMELY ve SRY genlerinin tüm gebelik aylarındaki çözülme eğrisi analizi ele alındığında her iki gen için de 5. gebelik ayından itibaren tespit gücünün yükseldiğini ve en yüksek tespit oranının 9-10. aylar arasında olduğu gözlendi. Bu projede, kısraklarda tüm gebelik aylarındaki (1-11 ay) maternal dolaşımdaki fetal cfDNA'lardan kullanılarak cinsiyet tayininde AMELY ve SRY genlerinin etkinlikleri karşılaştırıldı. Gebe kısraklarda maternal serumdan fetüs cinsiyetinin tayininde birden fazla sayıda cinsiyet spesifik markerların kullanılması yapılan testin doğruluğunu arttıracağı kanısındayız.

Abstract:
In this study, peripheral blood samples were taken from 24 mares (13 female fetuses, 11 male fetus pregnancies) at each month of pregnancy (1-11 months), and the amplification efficiencies of SRY and AMELY genes were compared. The mares included in the study were of Arabian racehorses and their ages ranged from 5-15 years. Body condition scores (BCS) ranged from 5-7. Study groups were classified according to newborn sex, which was confirmed postnatally. After cfDNA isolation, their densities were found to vary between 5.9-64 ng/µl. As a result of statistical analysis, it was observed that there was no significant difference between Ct values (amplification amount) of AMELY gene depending on gender in pregnancies carrying male and female fetuses (p>0.05). Amplification specificity was checked for each sample in the dissolution curve analyzes performed after the qRT-PCR method. In this analysis, the detectability of the investigated genes related to fetal sex was determined in the maternal cfDNA samples studied. There is high sequence similarity between the AMELY gene on the Y chromosome and the AMELX gene on the X chromosome. However, unlike AMELX, a 24-base deletion in the AMELY gene sequence enabled the two gene products to be separated from each other after PCR. Similarly, when the primer design specific to the SRY gene was designed, in-silico analyzes using different algorithms confirmed that only the SRY sequence was amplified, while amplification was observed in females after qRT-PCR. However, in the dissolution curve analyzes we performed, the amplification of the female homologous region and the amplification of the actually targeted SRY gene were clearly identified and confirmed. When the resolution curve analysis of the AMELY and SRY genes of male and female fetuses is considered at all gestational months, the detection power for both genes increases from the 5th gestational month and the highest detection rate is between 9-10. observed between months. In this project, the efficacy of AMELY and SRY genes in sex determination was compared using fetal cfDNAs from maternal circulation at all gestational months (1-11 months) in mares. We believe that the use of multiple sex-specific markers in the determination of fetal sex from maternal serum in pregnant mares will increase the accuracy of the test.