Antibiyotik üretici streptomisetlerin izolasyonu, identifikasyonu, aktif metabolitlerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu
The isolation and identification of antibiotic producing streptomycetes, purification and characterization of active metabolites
Yazar: ÖZGÜR CEYLAN
Danışman: DOÇ. DR. AYSEL UĞUR
Muğla Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalısmada, antibiyotiklere çoklu dirençli bakteriler basta olmak üzereklinik açıdan önemli bakterilere karsı antibakteriyal aktivite gösteren streptomisetlereait sekonder metabolitlerin kesfi hedeflenmistir. Bu amaçla, Mugla ve civarındakidegisik bitki örtülerinin bulundugu topraklardan izole edilmis Streptomyces cinsineait oldugu belirlenen 154 farklı izolat kullanılmıstır. Bütün izolatların 10 Grampozitif ve 9 Gram negatif bakteri üzerindeki antibakteriyal aktiviteleri spektrum-plakmetodu kullanılarak belirlenmistir. zolatların 112'sinde (% 72.7) Gram pozitif,40'ında (% 25.9) Gram negatif hedef bakterilere karsı antibakteriyal aktivite tespitedilmistir. Gram pozitif hedef bakterilere karsı antibakteriyal aktiviteye sahipizolatların % 66.9'unun ve Gram negatif hedef bakterilere karsı antibakteriyalaktiviteye sahip izolatların % 60'ının gri renkli havai misel tasıdıgı görülmüstür.Antibakteriyal aktivite ve etki spektrumları dikkate alınarak seçilen 3 izolatınnümerik taksonomisi ve moleküler karakterizasyonları yapılmıstır.Morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal kriterler kullanılarak yapılanidentifikasyonlara göre OC. 25-4 kodlu izolat S. bambergiensis, OC. 35-1 kodluizolat S. griseorubens ve OC. 124-2 kodlu izolat S.griseoflavus olarak identifiyeIIedilmistir. 16S rRNA gen nükleotid sekans analizleri Applied BiosystemsMicroseqTM mikrobiyal analiz yazılım ve veri tabanı kullanılarak karsılastırıldıgındaOC. 25-4 kodlu izolat % 99 oranında S. bambergiensis, OC. 35-1 kodlu izolat % 100oranında S. griseorubens ve OC. 124-2 kodlu izolat % 99.6 oranında S. griseoflavustürleri ile benzerlik gösterdigi belirlenmistir.dentifiye edilen bu susların, antibakteriyal aktivite açısından aktif sekondermetabolitlerinin miktarının artırılması amacıyla bazı kültivasyon parametrelerioptimize edilmistir. Her 3 sus için Tryptone - Yeast Ekstrakt - Glikoz Broth (TYGB)en uygun sporulasyon ortamı olarak tespit edilmistir. S. bambergiensis OC. 25-4 veS. griseorubens OC. 35-1 suslarının fermentasyonu için en uygun ortamınFermentasyon Ortamı 2 oldugu, optimum fermentasyon süresinin ise 120 saat oldugutespit edilmistir. S. griseoflavus OC. 124-2 susunun fermentasyonu için en uygunortamın Fermentasyon Ortamı 1 oldugu, optimum fermentasyon süresinin ise 144saat oldugu tespit edilmistir. Seçilen susların aktif bilesiklerinin elde edilmesiamacıyla solvent ekstraksiyonu yapılmıs ve en yüksek antibakteriyal etkiye sahipekstrakt S. griseoflavus OC. 124-2 susuna ait etil asetat ekstraktı olarakbelirlenmistir. Bu ekstrakt, S.aureus ATCC 25923 ve S.maltophilia MU 52 suslarınıngelisimini sırasıyla 23 mm ve 22 mm çapında inhibisyon zonları ile inhibe etmistir.Bu ekstraktta bulunan antibakteriyal aktiviteye sahip metabolitin saflastırılmasıkromatagrafik teknikler kullanılarak yapılmıs ve elde edilen saf aktif metabolitinpreperatif ince tabakada Rf degeri 44.5 olarak bulunmustur. Bu metabolitin yapısınınaydınlatılması elementel analiz, UV, 1H-NMR, 13C-NMR, APT-13C-NMR ve FT-IRspektrumları alınarak saglanmıstır. Bu spektroskopik çalısmalar sonucunda eldeedilen verilere göre kısmen karakterizasyonu yapılan aktif metabolitin aminoglikozityapısında bir antibiyotik olabilecegi, moleküler agırlıgının 563 g/mol ve kapalıformülünün C22H41N7O10 oldugu bulunmustur.Anahtar Kelimeler : Streptomyces, Antibiyotik, dentifikasyon, Aktif Metabolit,Kimyasal Karakterizasyon

Abstract:
In this study, it was aimed to find out the secondary metabolites belonging toStreptomycetes that have antibacterial activity against clinically important bacteria,mostly against bacteria with multi-resistant antibiotics. For this purpose, 154different isolates identified as belonging to Streptomyces isolated from the soil ofvaried vegetation in and around Mugla Province were used. The antibacterialactivities of all these isolates against 10 Gram positive and 9 Gram negative bacteriahave been identified by using spektra-plak method. In 112 (72.7 %) isolatesantibacterial activities against Gram positive, in 40 (25.9 %) isolates against Gramnegative bacteria have been determined. 66.9 % of the isolates showing antibacterialactivity against Gram positive bacteria and 60 % of those isolates with antibacterialactivity against Gram negative bacteria have been found to carry gray aerial mycelia.Numeric taxonomy and molecular characterization of the three isolates selected byconsidering their antibacterial activity and effect spectra have been obtained in thisresearch.According to the identifications by using morphological, physiological andbiochemical criteria OC. 25-4 coded isolate was identified as S. bambergiensis, OC.35-1 coded isolate as S.griseorubens, and OC. 124-2 coded isolate as S.griseoflavus.IIIt has been found that, in the analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNAgene of the OC. 25-4 coded isolate shows 99 percent similarity to S. bambergiensis,OC. 35-1 coded isolate 100 % similarity to S.griseorubens and OC. 124-2 codedisolate 99.6 percent similarity to S.griseoflavus when compared by using AppliedBiosystems MicroseqTM microbial analysis software and data-base.Some cultivation parameters of these identified strains have been optimizedin order to increase the number of secondary metabolites active in terms ofantibacterial activity. For each of these three strains Tryptone ? Yeast Extract ?Glucose Broth (TYGB) was determined as the most suitable sporulation medium.For the fermentation of S. bambergiensis OC. 25-4 and S.griseorubens OC. 35-1strains, Fermantation Medium 2 was found to be most suitable medium, and theiroptimum fermantation duration was 120 hours. On the other hand, for S.griseoflavusOC.124-2 strain Fermentation Medium 1 was found most suitable medium, andduration of their fermentation was 144 hours. Solvent extraction was made in orderto obtain the active compounds of selected strains. The extract with the highestantibacterial effect was seen in ethyl acetate extract belonging to S.griseoflavusOC.124-2 strain. This extract inhibited the growth of S. aureus ATCC 25923 and S.maltophilia MU 52 strains respectively with 23 mm and 22 mm diameter inhibitionzones. In this extract, the purification of metabolite with antibacterial activity wascarried out by using chromatographic techniques and Rf value of this pure activemetabolite in preparative-thin layer was found as 44.5. The identification of thestructure of this metabolite was obtained by making the elemental analysis and usingUV, 1H-NMR, 13C-NMR, APT- 13C-NMR anf FT-IR spectra. There might beantibiotics in the aminoglikozid nature of partially characterized metaboliteaccording to the findings obtained from these spectroscopic studies and its molecularweight was found 563 g/mol and the closed formulation as C22H41N7O10.Key words : Streptomyces, Antibiotic, Identification, Active Metabolite, Chemicalcharacterization