Sığırlarda tüberkülozun farklı metotlar ile karşılaştırmalı teşhisi
Comparative diagnosis of cattles tuberculosis by different methods
Yazar: ZAFER SAYIN
Danışman: PROF. DR. OSMAN ERGANİŞ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Hayvan hastalıkları = Animal diseases ; Hayvancılık = Animal husbandry ; Mycobacterium bovis = Mycobacterium bovis ; Sığırlar = Cattles ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis-ayırıcı = Diagnosis-differential ; Tüberküloz = Tuberculosis ; İnterferonlar = Interferons

Özet:
Bu çalışmada mikobakterium kültür sonuçları altın standart kabul edilerek sığır tüberkülozunun antemortem ve postmortem teşhisinde ideal metot belirlenmeye çalışıldı. Konya (2), Çorum (2) ve Aksaray'da (1) bulunan 5 farklı çiftlikteki, 772 adet süt ineğine PPD B (Bovine) ve PPD A (Avian) deri testi uygulandı. PPD deri testi uygulanan sığırların 448'inden otuz gün sonra kan örnekleri alınarak BOVIGAM (IFN-?) ve PPD B ELISA, M. bovis sonikasyon ELISA testleri uygulandı. PPD ve IFN-? pozitif test sonuçlarına seçilen 135 sığırın kesimleri yaptırılarak, akciğer (ACLD), preskapular (PLD), mezenteriyel (MLD) lenf düğümleri ve tüberkül (TB) örnekleri alındı. Postmortem doku örneklerinin Ziehl Neelsen boyama metodu ile bakteriyoskopik muayeneleri, Lowenstein Jensen besiyerinde kültürleri ve M. tuberculosis kompleks PZR analizleri yapıldı. Lowenstein Jensen besiyerinde mikobakterium şüpheli üreme gösteren kolonilerin bakteriyoskopik incelemeleri ve M. tuberculosis kompleks PZR analizleri gerçekleştirildi. M. tuberculosis kompleks PZR pozitif sonuç elde edilen DNA ürünlerinin tür düzeyinde identifikasyonları için, SacII ve RsaI, enzimleri ile Restriksiyon Endonüklease Analizleri (REA) yapıldı.Postmortem klinik örneklerde bakteriyoskopinin sensitivitesi %82,5, spesifitesi %100 olarak belirlendi, 77 sığıra ait 99 lenf düğümü ve 18 tüberkülden etken izole edildi.PPD deri testi uygulanan 772 sığırın 169'unda (%21,8) PPD B pozitif olarak belirlendi, metodun sensitivitesi %69,8, spesifitesi %98 tespit edildi.Kan örnekleri alınan, 448 sığırın 92'sinde (%205) IFN-? testi, 160'ında (%35,7) PPD B ELISA testi, 158'inde (%35,2) M. bovis sonikasyon ELISA testi ile pozitif sonuç elde edildi. IFN-? testi, PPD B ELISA ve M. bovis sonikasyon ELISA testlerinin sensitiviteleri sırasıyla, %91,5, %48,2, %31,28 ve spesifiteleri %93,4, %55,2, %44,5 olarak hesaplandı.425 postmortem doku örneğinin ve Lowenstein Jensen besiyerinde üreyen mikobakterium şüpheli 117 izolatın M. tuberculosis kompleks PZR analizinde, 66 sığıra ait 88 lenf düğümü, 18 tüberkül örneği ve izolatların tamamına ait DNA örnekleri M. tuberculosis kompleks olarak belirlendi. PZR ürünlerinin REA sonucunda saha izolatlarından 93'ü (58 sığırdan izole edilen) M. bovis, 24'ü (19 sığırdan izole edildi) M. bovis subsp. caprae, doku örneklerine ait PZR ürünlerinin 88'i (47 sığıra ait) M. bovis, 18'i (19 hayvana ait) M. bovis subsp. caprae olarak identifiye edildi. Postmortem klinik örneklerde M. tuberculosis kompleks PZR metodunun sensitivitesi %90,5, spesifitesi %100 olarak tespit edildi.Sonuç olarak, 5 işletmede 3 farklı antemortem teşhis metodu ile sığır tüberkülozunun sürü prevalansının %100, sürü içi prevalansın PPD deri testi, IFN-? testi, PPD BELISA ve M .bovis sonikasyon ELISA testlerine göre sırası ile %21,8, %20,5, %35,7 ve %35,2 olduğu belirlendi. Sığır tüberkülozunun antemortem teşhisinde IFN-? testinin tek başına kullanılabileceği ancak saha taramalarında kullanımının sınırlı olduğu, PPD deri testinin düşük sensitivitesine rağmen alternatifsiz olduğu, PPD B ve M. bovis sonikasyon ELISA testlerinin uygun olmadığı sonucuna varıldı. Postmortem teşhiste, M. tuberculosis kompleks PZR metodunun kültüre alternatif olarak kullanılabileceği, mikobakteriumların tür düzeyinde identifikasyonda REA metodunun uygun olduğu, sığır tüberkülozunda M. bovis dışında, M. bovis subsp. caprae'ninde etken olduğu kanaatine varıldı.

Abstract:
The aim of this research was to determination of the best method in postmortem and antemortem diagnosis of bovine tuberculosis as bacteriological culture accepted to be the gold standard. PPD B (Bovine) and PPD A (Avian) tuberculin tests were performed in 772 dairy cattle of five different farms located in Konya (2), Aksaray, and Çorum (2). Blood samples were collected from PPD tuberculins administered 448 cattle after 30 days, and samples were analyzed by BOVIGAM (IFN-?), PPD B ELISA, M. bovis sonikasyon ELISA tests. 135 cattle were slaughtered according to positive observed results of PPD tuberculin and IFN-? test. Bronchial, mesenteric, prescapular lymph node and tubercules samples were taken from slaughtered cattle. Tissue samples were stained with Ziehl-Neelsen method and examined in direct microscopy. They were cultured in Lowenstein Jensen medium and PZR technique to detect the members of M. tuberculosis complex. Suspected mycobacteria colonies cultured in Lowenstein Jensen medium were examined with direct microscopy and M. tuberculosis complex PZR technique. Restriction Endonuclease Analysis (REA) of M. tuberculosis complex PZR positive amplified products were done with SacII and RsaII enzymes for identification of strains.The sensitivity and specificity of the direct microscopy with Ziehl Neelsen method in postmortem tissue samples were detected 82,5% and 100%, respectively. Mycobacterium ssp. were isolated from 99 lympathic nodule and 18 tubercule samples obtained from 77 cattle.PPD B tuberculin positive was found in 169 (21,8%) out of 772 tested cattle, and the sensitivity and specificity of this method were detected 69,8% and 98%, respectively.IFN-? test, PPD B ELISA test and M. bovis sonication ELISA test positive were determined in 92 (20,5%), 160 (35,7%) and 158 (35,2%) out of 448 cattle, respectively. The sensitivity and specificity of these methods were 91,5%, 48,2%, 31,2% and 93,4%, 55,2%, 44,5%, respectively.In M. tuberculosis complex PZR analysis of 425 postmortem tissue samples and 117 bacterial strains cultured in Lowenstein Jensen medium, DNA of the 88 lympathic nodules and 18 tubercules samples obtained from 66 cattle and all isolate was detected as M. tuberculosis complex. 93 bacterial strains obtained from 58 cattle and 88 tissue samples obtained from 47 cattle were identified as M. bovis with REA of these PZR products. 24 bacterial strains and 18 tissue samples obtained from 19 cattle were identified as M. bovis subsp. caprae. The sensitivity and specificity of the M. tuberculosis complex PZR method of tissue samples were detected 90,5% and 100%, respectively.Consequently, the herds prevalence of cattle tuberculosis was found %100 by using four different antemortem diagnosis methods in five farms, and the individual prevalence was found 21,8%, 20,5%, 35,7% and 35,2% according to PPD tuberculin, IFN-?, PPD B ELISA and M. bovis sonication ELISA tests, respectively. IFN-? test has sensitivity 91,5 and specificity 93,4%, and it can be used conveniently in the antemortem diagnosis of bovine tuberculosis. However, the application of this method is limited for herds screening. The PPD tuberculin test is unprecedented in spite of its low sensitivity. The PPD B and M bovis sonication ELISA tests did not useful for diagnosis of bovine tuberculosis. M. tuberculosis complex PZR method can be used alternatively to culture in postortem diagnosis, and REA method can be suitable for identification of mycobacterium strains. In addition to M. bovis, M. bovis subsp. caprae was determined as agent in bovine tuberculosis.