Floresan ve elektron mikroskop görüntüleme teknikleri ile Narcissus tazetta bitkisinde fitoplazma enfeksiyon mekanizmasının belirlenmesi
Determination of phytoplasma infection mechanism in Narcissus tazetta using fluorescence and electron microscope imaging techniques
Yazar: KADİR BOZTAŞ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ IŞIL TULUM
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Botanik = Botany

Özet:
Bitki patojeni olan fitoplazmalar, Mollicutes sınıfına ait hücre duvarsız, Gram-pozitif bakterilerce temsil edilir ve dünya genelinde 600 den fazla bitki türünde hastalık yaparak ciddi ekonomik kayıplara sebep olmaktadır. Öte yandan, nergis (Narcissus tazetta L.) bitkisinde fitoplazma varlığına ait literatür oldukça sınırlıdır. Bu nedenle, 2019 kışı Mersin ilinde gerçekleştirilen arazi çalışması sonucu tipik fillodi, steril çiçek ve bodurluk belirtileri gösteren nergis bitkileri toplanarak, bu semptomların nedenini belirlemek ve fitoplazma varlığını tespit etmek amacıyla 16S rRNA genleri üzerinden moleküler analizler yapılmıştır. Kısaca; semptomatik bitki örnekleri toplanmış, DNA ekstraksiyonu yapılmış ve ekstrakte edilen DNA, evrensel primerler P1/P7 ve akabinde R16F2n/R16R2 kullanılarak yuvalanmış polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak amplifiye edilmiştir. Asemptomatik numunelerde herhangi bir amplifikasyon gözlenmezken, semptomatik numunelerde 1,2 kb'lik amplikonlar (16S rRNA geni) elde edilmiştir. Yoğun bir şekilde fillodi semptomları görülen dokuz örnekten alınan 16S rRNA gen amplikonları dizilenmiştir.
Nergis fillodi izolat dizilerinin 16S rRNA'larının nükleotid BLAST analizleri, kendi aralarında %99,9 ve 'Candidatus Phytoplasma mali' ile %99,91 özdeşlik ortaya çıkarmıştır. 16S rRNA gen temelli filogenetik ağacın daha ileri analizleri, bilgisayarla simüle edilmiş kısıtlama fragmanı uzunluk polimorfizmi (sanal RFLP) ve RsaI ve SspI enzimleri kullanılarak 16S rRNA geninin geleneksel RFLP analizleri sonucu, fitoplazmanın 16Sr grup X ve alt grup A'ya atanması yapılmıştır. Enfekte nergis bitkilerinin elektron mikroskobu ile incelemesi sonucu, floem dokularının kalburlu borularında pleomorfik fitoplazma birimlerinin varlığı tespit edilmiş ve enfeksiyona bağlı floem dokusundaki değişimler incelenmiştir. Sonuç olarak, 16SrX-A alt grup fitoplazmalar odunsu bitkilerde sıklıkla rapor edilmesine rağmen, bilindiği kadarıyla bu çalışma, nergis bitkisinin 'Candidatus Pyhtolasma mali' (16SrX-A) tarafından enfekte edildiğini gösteren dünya çapındaki ilk rapordur.

Abstract:
Phytoplasmas, which are plant pathogens, are represented by cell wall-free, Gram-positive bacteria belonging to the Mollicutes class and cause serious economic losses by causing diseases in more than 600 plant species worldwide. On the other hand, the literature on the presence of phytoplasma in daffodil (Narcissus tazetta L.) is quite limited. For this reason, as a result of the field work carried out in Mersin province in winter 2019, daffodil plants showing typical phyllodes, sterile flowers and stunting symptoms were collected and molecular analyzes were performed on 16S rRNA genes in order to determine the cause of these symptoms and detect the presence of phytoplasma. Briefly, symptomatic plant samples were collected and DNA extraction was performed. The extracted DNA was amplified using nested polymerase chain reaction using the universal primers P1/P7 followed by R16F2n/R16R2. Amplicons of 1.2 kb (16S rRNA gene) were obtained in all symptomatic samples where no amplification was observed in asymptomatic samples. The 16S rRNA gene amplicons from nine samples having severe incidence of phyllody symptoms were sequenced.
Nucleotide BLAST analysis of 16S rRNA of the daffodil phyllody isolate sequences revealed 99.9% identity among themselves and 99.91% with 'Candidatus Phytoplasma mali'. Further analyses of the 16S rRNA gene-based phylogenetic tree, computer-simulated restriction fragment length polymorphism (virtual RFLP) and conventional RFLP analyses of 16S rRNA gene using RsaI and SspI enzymes led to assign the phytoplasma to 16Sr group X and subgroup A. Electron microscopic examination of the infected daffodil plants revealed the presence of pleomorphic phytoplasma units and changes due to infection were examined in the sieve elements of the phloem tissues. In conclusion, although 16SrX-A subgroup phytoplasmas are frequently reported in woody plants, to the best of our knowledge, this study is the first worldwide report showing that narcissus plant is infected by 'Candidatus Pyhtolasma mali' (16SrX-A).