Kandesartan sileksetilin ilaç etkileşimlerinin in vitro olarak incelenmesi ve çeşitli analitik yöntemlerle analizi
Investigation of in vitro drug-drug interactions and analysis of candesartan cilexetil by various analytical techniques
Yazar: ARIN GÜL DAL
Danışman: PROF. DR. MUZAFFER TUNÇEL
Anadolu Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Cilexetil = Cilexetil ; Diklofenak sodyum = Diclofenac sodium ; Kandesartan = Candesartan ; Kapiler elektroforez = Capillary electrophoresis ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Sitokrom P 450 = Cytochrome P 450

Özet:
Kandesartan sileksetil (KSSL) hipertansiyon tedavisinde kullanılan kandesartan (KS)'ın ön ilacıdır. Bu çalışmada, KS'nin, bir sitokrom P450 2C9 (CYP 2C9) standart substratı olan diklofenak sodyum (DIC) ile farmakokinetik etkileşiminin in vitro koşullarda, sıçan karaciğer mikrozom enzimleri kullanılarak incelenmesi amacıyla kapiler elektroforez (KE) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (YPSK) yöntemleri tanıtılmaktadır.Çalışmanın ilk aşamasında metoprolol süksinat (MTP) ve lansoprazol (LNS)'ün iç standart (IS) olarak kullanıldığı KS, KSSL ve DIC'in aynı anda tayinine olanak sağlayan KE yöntemi geliştirilmiştir. KE yönteminde sinyaller 214 nm'de UV detektörle kaydedilmiştir. Yöntemin optimizasyonu sonucunda, 15 mM borat, % 10 (h/h) metanol içeren, pH 8.50 çalışma tamponu, 25 kV potansiyel ve 1 sn enjeksiyon süresinin en uygun ayırımı sağladığı belirlenmiştir. Belirtilen koşullarda MTP 3.3 dk, LNS 4.7 dk, KSSL 5.1 dk ve KS'nin 7.5 dk göç zamanına sahip olduğu gözlenmiştir. KSSL için 1.88 x 10-6 ? 9.41 x 10-5 M ve KS için 1.91 x 10-6 ? 9.58 x 10-5 M derişim aralıklarında KE yönteminin doğrusallığı, kesinliği, doğruluğu, tutarlılığı, sağlamlığı ve seçiciliği gösterilmiştir. Yöntemin KS ve KSSL için gözlenebilme sınırı (LOD) sırasıyla 3.07 x 10-7 M ve 4.79 x 10-7 M ve alt tayin sınırı (LOQ) sırasıyla 9.15 x 10-7 M ve 1.45 x 10-6 M olarak bulunmuştur. Geliştirilen yöntemin bir uygulaması ticari tabletlerde KSSL analizi ile gösterilmiş ve analiz sonuçları USP XXIV kriterlerine uygun bulunmuştur.KE yöntemini karşılaştırmak amacıyla, MTP'nin IS olarak kullanıldığı DIC ve KS'nin aynı anda analizine olanak sağlayan YPSK yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemde, 290 nm uyarma ve 360 nm yayma dalga boylarında floresans detektör kullanılmıştır. % 0.01 (a/h) 1-heptan sülfonik asit içeren, pH 3.5, % 57 (h/h) metanol çözeltisinden oluşan hareketli faz sisteminde, C18 kolonda, (3.0 x 150 mm, 5 µm) 1 mL/dk akış hızında ve izokratik sistemle ayırım gerçekleştirilmiştir. Belirtilen koşullarda MTP 2.5 dk, KS 4.6 dk ve DIC 16.4 dk alıkonma zamanına sahiptir. KS için 1.14 x 10-8 ? 1.46 x 10 -6 M, DIC için de 3.67 x 10-7 ? 3.91 x 10-5 M derişim aralığında yöntemin doğrusallığı, doğruluğu, kesinliği, tutarlılığı, sağlamlığı ve seçiciliği gösterilmiştir. DIC için LOD 2.46 x 10-7 M, LOQ 7.47 x 10-7 M ve KS için LOD 1.72 x 10-8 M, LOQ 5.22 x 10-8 M olarak bulunmuştur.Çalışmanın son aşamasında, KS'nin, DIC ile farmakokinetik etkileşimi in vitro koşullarda, sıçan karaciğer mikrozomal enzimleri kullanılarak incelenmiştir. İn vitro ilaç metabolizması incelemelerinin optimizasyonu için mikrozomal protein derişimi ve substrat (DIC ve KS) derişimleri parametreleri incelenmiş ve örneklerin analizi için önerilen KE ve YPSK yöntemleri kullanılmış ve elde edilen sonuçlar karşılaştırılmıştır.Anahtar Kelimeler: kandesartan sileksetil, kapiler elektroforez, sitokrom P450 2C9, diklofenak sodyum, yüksek performanslı sıvı kromatografisi

Abstract:
Candesartan cilexetil (KSSL) is a prodrug of candesartan (KS) which is used for hypertension therapy. Capillary electrophoretic (CE) and high performance liquid chromatographic (HPLC) methods are described for the investigation of the in vitro pharmacokinetic interaction between KS and diclofenac sodium (DIC) which is a standard CYP 2C9 substrate using rat liver microsomal enzymes, in this study.In the first step, a CE method was developed for the simultaneous determination of KS, KSSL and DIC by using metoprolol succinate (MTP) and lansoprazole (LNS) as internal standards (IS). The signals were recorded at 214 nm by UV detector. The optimum conditions for the best separation were 15 mM borate buffer (pH 8.5) containing 10 % (v/v) methanol as run buffer, 25 kV for separation potential and 1 s for injection time. The migration times were 3.3 min for MTP, 4.7 min for LNS, 5.1 min KSSL and 7.5 min for KS. The method was validated in the concentration range of 1.88 x 10-6 ? 9.41 x 10-5 M for KSSL and 1.91 x 10-6 ? 9.58 x 10-5 M for KS for linearity, precision, accuracy, ruggedness, robustness and selectivity. The limit of detection (LOD) of the method for KSSL and KS were 3.07 x 10-7 M and 4.79 x 10-7 M respectively and limit of quantitation (LOQ) for KSSL and KS were 9.15 x 10-7 M and 1.45 x 10-6 M respectively. The method was also applied to the commercial tablet for the determination of KSSL and the results obtained were in the limits of USP XXIV.In the second step the analysis of DIC, MTP and KS by HPLC was performed with fluorescence detector at 290 nm as excitation and 360 nm as emission wavelengths, and a pH 3.5, 57 % methanol (v/v) solution containing 0.01 % (w/v) 1-heptane sulphonic acid was used as mobile phase. Separation was achieved using C18 column (3.0 x 150 mm, 5 µm) at 1 mL/min flow rate with isocratic system. Retention times were 2.5 min for MTP, 4.6 min for KS and 16.4 min for DIC. The method validation was also investigated in the concentration range 1.14 x 10-8 ? 1.46 x 10 -6 M for KS and 3.67 x 10-7 ? 3.91 x 10-5 M for DIC to show the linearity, accuracy, precision, ruggedness, robustness and selectivity. LOD was 2.46 x 10-7 M and LOQ was 7.47 x 10-7 M for DIC, and LOD was 1.72 x 10-8 M and LOQ was 5.22 x 10-8 M for KS.The in vitro pharmacokinetic interaction between KS and DIC has been investigated using rat liver microsomal enzymes in the last part of the study. The effects of the microsomal protein and substrate (DIC and KS) concentration on the drug metabolization were investigated to find out optimum parameters. The samples obtained from in vitro KS and DIC interaction studies were analyzed by using the developed methods and the results were compared.Key Words: candesartan cilexetil, capillary electrophoresis, cytochrome P450 2C9, diclofenac sodium, high performance liquid chromatography