Akut myeloid lösemide epigenetik ajanlarin "Epitelyal Mezenkimal Geçiş - EMT" transkripsyon faktörleri üzerindeki etkisinin araştırılması
Investigating the effect of epigenetic agents on Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) transcription factors in acute myeloid leukemia
Yazar: BOUBACAR BALDE
Danışman: DOÇ. DR. BURÇİN KAYMAZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) hem myeloid hem de lenfoid kökenli kanser gelişiminde kritik öneme sahiptir. Epitelyal kökenli kanserin ilerlemesi esnasında, epitelyal mezenkimal geçişin aktivasyonu, metastaz ve ilaç direnci ile ilişkilidir. EMT süreci, EMT ile ilişkilendirilmiş transkripsiyon faktörlerinin (TF) ekspresyonel değişimlerinin belirlenmesi ile tanımlanabilmektedir. 
Epitelyal-mezenkimal geçişin epitelyal olmayan kanserdeki rolü net olarak bilinmemektedir. Bu bağlamda, epigenetik regülasyonun EMT geçişi açısından araştırılması önemli bir konu haline gelmiştir. Literatürdeki çalışmalar, bromodomain ve ekstraterminal (BET) proteinlerinin EMT transkripsiyon faktörlerini kontrol ettiği ve EMT süreciyle bağlantılı olduğu, bu durumun da epitelyal/mezenkimal markerları olan TF' nin ekspresyonunda değişikliklere yol açtığını göstermiştir. Son birkaç yılda, BET proteinleri kritik transkripsiyon aracıları olarak tanımlanmış ve özellikle akut lösemi ve diğer hematolojik kanserler bağlamında çeşitli anormal transkripsiyonel ekspresyon paterni sergileyerek, önemli rol oynadıklarını gösterilmiştir. Sağlıklı hematopoetik hücrelerin düşük ve değişken üretimi ile karakterize olan Akut myeloid lösemi, myeloid progenitör hücrelerin klonal genişlemesi ve farklılaşmasının durması ile karakterize kemik iliğinin malin bir hastalığı olarak tanımlanmaktadır. 
Bu tez çalışmasında, bromodomain inhibitörü olan PLX51107 ve HDAC inhibitörü SAHA' nın (vorinostat), lösemi hücrelerinde epitelyal mezenkimal geçiş biyomarkerları olarak kabul edilen EMT transkripsiyon faktörünün(Vimentin;Snail1;N-kadherin;Claudin1;Zeb1;Zo1; E-kadherin;Snail2;Zeb2;Twist1) ekspresyonel değişimlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu hedefe ulaşmak için uygun koşullar altında HL-60 akut myeloid lösemi hücre hattını ve kontrol grubu olarak NCI-BL2171 hücrelerini kültüre ettik. TGA-2019-20763 kodlu projemiz verilerinden belirlenen hücre spesifik mono ve sinerjistik kombinasyon IC50 dozlarını uyguladıktan sonra, EMT ile ilişkili TF'lerin mRNA ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler Cfx Biorad yazılımı kullanılarak belirlenmiştir. 
Elde edilen veriler doğrultusunda, VIM geninde Plx51107 ve Vorinostat mono ve kombine dozlarında ekspresyonel olarak artış görülmüştür. SNAI1 geninde 6.68 µm Plx51107 dozunda 10 katlık; 10 µm Plx51107 dozunda yaklaşık 12 katlık; Vorinosat IC50 dozunda 14,74 katlık ve son olarak kombinasyon dozunda 17,37 katlık ekspresyonel down regülasyon görülmüştür. N-kadherin, klaudin, Zeb1, E-kadherin, SNAI2 ve TWIST1 genlerinin tüm doz gruplarında da ekspresyonel azalış söz konusu olmuştur. ZO-1 geninde Plx51105 ve Vorinostat'ın mono ve kombine dozlarında  max. 4 katlık ekspresyonel artış görülmüştür. ZEB-2 geninin tüm doz gruplarında, sırasıyla 6.68 µm Plx51107 için 2,42; 10 µm Plx51107 için 2,06; 4,3 µm Vorinostat için 1,89; kombinasyon dozu için 1,8 katlık, ekspresyonel artış görülmüştür.
Sonuç olarak, EMT ilişkili TF' lerinin ekspresyonel değişimlerinin belirlenmesiyle,  EMT geçiş sürecini durduracak olası terapötik etkisinin olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
The importance of Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) cannot be understated in the pathogenesis of myeloid and lymphoid neoplasms. In the progression of epithelial originated cancers, the induction of EMT is commonly linked with metastasis and chemoresistance. Thus, the identification of differentially expressed EMT-associated transcription factors (TF) can provide a means of characterizing the EMT process.  
The implication of the EMT in non-epithelial cancer is not clearly known. In this context, investigating epigenetic regulation in terms of EMT transition has become an important issue. Studies in the literature have shown that bromodomain and extraterminal (BET) proteins control EMT transcription factors and are associated with the EMT process, resulting in some modifications in the expression of epithelial/mesenchymal markers, TF. In the last few years, BET proteins have been identified as critical transcription mediators and key role players, especially in the case of acute leukemia and other hematological cancers, displaying a variety of aberrant transcriptional expression patterns. Acute myeloid leukemia, which is identified by a low and unstable production of healthy hematopoietic cells, is generally defined as a malignant disease of the bone marrow characterized by a clonal expansion and differentiation of myeloid progenitor cells. The aim of this thesis is to determine the expression changes of epithelial-mesenchymal transition (EMT) transcription factors, which are considered as EMT biomarkers (Vimentin, Snail1, N-cadherin, Claudin1, Zeb1, Zo1, E-cadherin, Snail2, Zeb2, Twist1), in leukemia cells treated with the bromodomain inhibitor PLX51107 and the HDAC inhibitor SAHA (vorinostat).  In order to achieve this goal, we cultured the HL-60 acute myeloid leukemia cell line and the NCI-BL2171 cells as a control group under appropriate conditions. After applying the cell-specific mono and synergistic combination IC50 doses determined from our project with the code TGA-2019-20763, changes in mRNA expression levels of EMT-related transcription factors were determined using Cfx Biorad software.


 

 In line with the data obtained, the observation showed an expression increase in the VIM gene in mono and combined doses of Plx51107 and Vorinostat. 10-fold at a dose of 6.68 µm Plx51107 in the SNAI1 gene; Approximately 12 layers at a dose of 10 µm Plx51107; Expressive down-regulation was observed 14.74-fold in the vorinosat IC50 dose and finally 17.37-fold in the combination dose. There was also a decrease in the expression of claudin, N-cadherin, Zeb1, TWIST1, E-cadherin, and SNAI2 genes in all dose groups. In the mono and combined doses of Plx51105 and Vorinostat in the ZO-1 gene, a maximum of 4-fold increase in expression was observed. In the case of the ZEB-2 gene, an expression increase of 2.42-fold for 6.68 µm Plx51107, 2.06-fold for 10 µm Plx51107, 1.89-fold for 4.3 µm Vorinostat, and 1.8-fold for the combination dose was observed in all dose groups. 

As a result, it is believed that determining the expression changes of EMT-associated TFs may have a potential therapeutic effect to halt the EMT transition process.