Dihidroartemisinin'in insan kronik lenfositik lösemi hücre serilerinde apoptoza etkilerinin immünomoleküler değerlendirilmesi
Immunomolecular evaluation of dihydroartemisinin effects on apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cell lines
Yazar: SANEM GÖKÇEN
Danışman: PROF. DR. EMİN ÜMİT BAĞRIAÇIK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İmmünoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Hematoloji = Hematology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Dihidroartemisinin = Dihydroartemisinin ; Hücre dizisi = Cell line ; Lösemi = Leukemia

Özet:
Bu çalışmada, Dihidroartemisin'in (DHA) insan kronik lenfositik lösemi (KLL) hücre serileri üzerindeki apoptoza etkilerini hücre canlılığı, apoptoz, mRNA ve protein ifadelenme düzeyleri araştırılarak belirlemeyi amaçladık. Bu amaçla PGA-1, CII, MEC-1 insan KLL hücre serileri kullanıldı. Bu hücrelere öncelikle DHA ve KLL tedavisinde etkili bir pürin analoğu olan Fludurabin (FLU) ayrı ayrı ve birlikte olarak 24, 48 ve 72 saat boyunca uygulandı. Bu süreler sonunda, XTT yöntemiyle belirlenen hücrelerin canlılık oranlarının doza ve zamana bağlı olarak azaldığı görüldü. Buradan elde edilen canlılık oranlarından, ilaçların KLL hücrelerinin çoğalmasında %50 azalmaya neden olan  inhibitör konsantrasyonları yani IC50 değerleri belirlendi. Hücrelere DHA ve FLU ayrı ayrı ve birlikte IC50 konsantrasyonlarının 24 saat boyunca uygulanmasından sonra apoptoza etkilerini belirlemek için hücreler, Annexin V-FITC ve PI ile boyanarak Akım Sitometri ile analizleri yapıldı. Sonuçlarımız DHA'nın tek başına ve FLU ile birlikte kullanılmasının doza bağlı olarak PGA-1, CII ve MEC-1 hücrelerinde apoptotik cevaba neden olduğunu gösterdi. DHA'nın tek başına uygulanmasının, FLU'nun tek başına veya DHA ve FLU'nun birlikte uygulanmasına göre daha etkili olduğu görüldü. Apoptozun moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak için kantitatif Real Time PCR ve Akım Sitometrik yöntemler kullanılarak TCTP, Mcl-1, Bcl-2, Bax ve Kaspaz-3 mRNA ve protein ifade düzeyleri analiz edildi. Tüm hücre serilerinde DHA'nın tek başına ve FLU ile birlikte uygulanmasından sonra Kaspaz-3'ün ifadelenmesinde artış oldu. DHA'nın tek başına ve FLU ile birlikte uygulanmasından sonra görülen apoptotik etkide Bcl-2 protein ailesi üyelerinin rol oynadığı ve genel olarak Bax'ın ifadelenmesinde artış olduğu bulundu. Buradan yola çıkarak PGA-1, CII ve MEC-1 hücrelerinde görülen apoptotik cevapta intrinsik apoptotik yolağın aktif olduğu belirlendi. Elde edilen bu bulgulara göre DHA, kronik lenfositik lösemi için potansiyel kansere karşı bir ilaç olabilir ve bu yüzden, gelecekte yapılacak in vivo ve in vitro çalışmalarla DHA'nın moleküler etkilerinin tam olarak belirlenmesi KLL'nin tedavisi için yeni moleküler hedeflerin tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.

Abstract:
In this study, we aimed to determine the effects of dihydroartemisinin (DHA) on human chronic lymphocytic leukemia (CLL) cell lines by investigating the cell viability, apoptosis, mRNA and protein expression levels. PGA-1, CII and MEC-1 human CLL cell lines were used for this purpose. At first, the cells were treated separately and combined by DHA and Fludurabine (FLU), a purine analogue used in the treatment of CLL, during 24, 48 and 72 hours. At the end of these durations, it was seen that the cell viabilities determined by XTT method were decreased in a time and dose dependent manner. IC50 values, the concentrations of drugs to cause 50% reduction in proliferation of CLL cells, were determined from these cell viabilites. Following separate and combined treatment of IC50 concentrations of DHA and FLU to the cells during 24 hours, the cells were analyzed by flow cytometry to determine the effects on apopotis staining with AnnexinV-FITC and PI. Our results showed that treatment with DHA alone and in combination with FLU resulted in an apoptotic response in a dose dependent manner in PGA-1, CII ve MEC-1 cells. It was seen that DHA treatment alone was more effective than FLU treatment alone or combined treatment with DHA and FLU. mRNA and protein expression levels of TCTP, Mcl-1, Bcl-2, Bax and Caspase-3 were analyzed to find out the molecular mechanisms of apoptosis by using quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometric methods. Caspase-3 expression was increased in all cell lines after DHA treatment alone and  in combination with FLU. It was found that members of Bcl-2 protein family were act on the apoptotic activity after DHA treatment alone and in combination with FLU, and Bax expression was generally increased. Starting from this point of view, it was determined that intrinsic pathway of apoptosis was  active in the apoptotic response of PGA-1, CII ve MEC-1 cells. According to the obtained these findings, DHA might be a potential anti-cancer therapeutic for chronic chronic lymphocytic leukemia and therefore, determination of the exact molecular effects of DHA with future in vivo and in vitro studies would allow us to identify new molecular targets for the treatment of the CLL.