Aspergilloz etkenlerinde azol direncinin gradient test ve agar plak yöntemleriyle araştırılması
Investigation of azol resistance in Aspergillosis caused by gradient test and agar plaque methods
Yazar: ZEYNEP YAZGAN
Danışman: PROF. DR. REYHAN ÇALIŞKAN ; PROF. DR. GÖKHAN AYGÜN
İstanbul Aydın Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: İnvaziv fungal enfeksiyonlar özellikle immün sistemi baskılanmış hastalarda morbidite ve mortalite açısından ciddi bir tehdittir. En sık izole edilen etkenler Aspergillus cinsi mantarlar olup, tedavide ilk tercih azollere duyarlılık azalmaktadır. Çalışmamızda, Aspergillus spp. türlerinde azol direncinin belirlenmesinde agar plak tarama yönteminin hızlı, kolay ve pratik bir yöntem olarak kullanımının araştırılması amaçlanmıştır.
Yöntemler: Çalışmamız; çeşitli klinik örneklerden üretilen 125 Aspergillus spp. izolatıyla yürütülmüştür. Aspergillus spp. izolatları konvansiyonel yöntemlerle tür tanımı yapılarak, gradient test ve agar plak tarama yöntemiyle azol direnci belirlenmiştir. Dirençli izolatlarda broth mikrodilüsyon yöntemi uygulanmış, cyp51A geninde CypA-L98H ve CypA-M220 mutasyonları araştırılmıştır. 
Bulgular: Çalışmamızda 55 A.fumigatus(%44), 42 A.flavus(%33,6), 6 A.terreus(%5), 4 A.niger(%3), 18 Aspergillus spp.(%14) tanımlanmıştır. Gradient test yöntemiyle; A.fumigatus izolatlarından 1'inde(%1,8) VOR, POS'e, 3'ünde(%5,45) ITR'e direnç saptanmıştır. A.terreus izolatlarından 1'inde(%16,7) VOR-MİK 1µg/ml, A.niger izolatlarından 1'inde(%25) ITR-MİK 2µg/ml, Aspergillus spp. izolatlarından 1'inde(%5,6) ITR-MİK 4µg/ml, 2'sinde(%11) VOR-MİK ve POS-MİK sırasıyla 1,5µg/ml, >32µg/ml ve 0,5µg/ml, 8µg/ml saptanmıştır. 
Agar plak yöntemiyle; A.fumigatus izolatlarından 1'inde(%1,8) VOR, ITR, POS'e, A.terreus izolatlarından 1'inde(%16,7) VOR'e, A.niger izolatlarından 1'inde(%25) ITR'e, Aspergillus spp. izolatlarından 2'sinde(%11) VOR, POS'e, 1'inde(%5,6) ITR'e direnç saptanmıştır. Duyarlılık ve özgüllük A. fumigatus türlerinde VOR ve POS için %100, ITR için sırasıyla %33,3 ve %100, A. flavus türlerinde ITR için %100, A. terreus türlerinde ITR ve POS için %100 saptanmıştır. 
Gradient test ve/veya agar plak tarama yöntemiyle direnç saptanan 7 izolatta broth mikrodilüsyon yöntemiyle; 1 A.fumigatus ITR, VOR, POS'e dirençli, 2 A.fumigatus ITR'e dirençli, 1 A.terreus izolatında ITR ve VOR MİK 1µg/ml ve 0,5µg/ml, 1 A.niger ITR MİK 4µg/ml, 2 Aspergillus spp. ITR, VOR, POS MİK sırasıyla 2µg/ml ve 8µg/ml, 8µg/ml ve >32µg/ml, 0,5µg/ml ve 4µg/ml saptanmıştır. Bu izolatlardan 5'inde CypA-L98H, 6'sında CypA-M220 mutasyonları belirlenmiş, 1'inde mutasyon saptanmamıştır. Direnç saptanmayan 1 izolatta CypA-L98H ve CypA-M220 mutasyonları belirlenmiştir.
Sonuçlar: Aspergilloz tedavisinde hızlı antifungal duyarlılık tarama testlerine ihtiyaç artmaktadır. Çalışmamızda agar plak yönteminin duyarlılığı A.fumigatus ITR için %33,3 saptanmış olsa da, diğer türlerde ITR, VOR, POS için duyarlılığı ve özgüllüğü %100 belirlenmiştir. A.fumigatus için saptanan düşük duyarlılık değeri, agar plak ilaç konsantrasyonlarının EUCAST rehberlerinin son düzenlemeleriyle uyumlu olarak güncellenmesi gerektiğini göstermiştir. Çalışmamızda saptanan CypA-L98H ve CypA-M220 mutasyonları, ülkemizde azol direnciyle ilişkili mutasyonların farklı bölgelerdeki dağılımlarının araştırılması gerektiğini düşündürmüştür. Sonuç olarak; azol direncinin saptanması için kolayca uygulanabilen agar plak yönteminin rutin kullanımda hızlı ve pratik bir yöntem olması ile hem etkili tedavi stratejilerinin belirlenmesine, hem de epidemiyolojik verilerin oluşmasına katkı sağlayabileceği düşünülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Aspergillus, agar plak, azol direnci, cyp51A, cypA-L98H, cypA-M220.

Abstract:
Objective: Invasive fungal infections are a serious threat in terms of morbidity and mortality, especially in immunocompromised patients. The most frequently isolated agents are Aspergillus genus fungi, and sensitivity to azoles, which are the first choice in treatment, decreases. In our study, we aimed to investigate the use of the agar plate screening method as a fast, easy and practical method in determining azole resistance in Aspergillus spp. species.
Methods: Our study; was conducted with 125 Aspergillus spp. isolates produced from various clinical samples. Aspergillus spp. isolates were identified by conventional methods and azole resistance was determined by gradient test and agar plate screening method. Broth microdilution method was applied to resistant isolates, and CypA-L98H and CypA-M220 mutations in the cyp51A gene were investigated.
Results: In our study, 55 A. fumigatus complex (44%), 42 A. flavus (33.6%), 6 A. terreus (5%), 4 A. niger (3%) and 18 Aspergillus spp. (14%) were identified. With the gradient test method; resistance to VOR and POS was detected in 1 (1.8%) of A.fumigatus isolates, and resistance to ITR was detected in 3 (5.45%). In 1 of the A.terreus isolates (16.7%), the VOR-MIC was 1µg/ml, in 1 of the A.niger isolates (25%), the ITR-MIC was 2µg/ml, in 1 of the Aspergillus spp. isolates (5.6%). ITR-MIC was 4µg/ml, in 2 cases (11%) VOR-MIC and POS-MIC were found to be 1.5µg/ml, >32µg/ml and 0.5µg/ml, 8µg/ml respectively.
With the agar plate method; 1 of the A.fumigatus isolates (1.8%) had VOR, ITR, POS, 1 of the A.terreus isolates (16.7%) had VOR, 1 of the A.niger isolates (25%) had ITR. Resistance to VOR and POS was detected in 2 Aspergillus spp. isolates (11%), and resistance to ITR was detected in 1 (5.6%). Sensitivity and specificity were determined as 100% for VOR and POS in A. fumigatus species, 33.3% and 100% for ITR, respectively, 100% for ITR in A. flavus species, and 100% for ITR and POS in A. terreus species.
By broth microdilution method in 7 isolates in which resistance was detected by gradient test and/or agar plate screening method; 1 A.fumigatus resistant to ITR, VOR, POS, 2 A.fumigatus resistant to ITR, 1 A.terreus isolate with ITR and VOR MICs of 1µg/ml and 0.5µg/ml, 1 A.niger ITR MIC of 4µg/ml, 2 Aspergillus spp. ITR, VOR, POS MICs were determined as 2µg/ml and 8µg/ml, 8µg/ml and >32µg/ml, 0.5µg/ml and 4µg/ml, respectively. CypA-L98H mutations were detected in 5 of these isolates, CypA-M220 mutations were detected in 6, and no mutation was detected in 1. CypA-L98H and CypA-M220 mutations were detected in 1 isolate for which resistance was not detected.
Conclusion: The need for rapid antifungal susceptibility screening tests is increasing in the treatment of aspergillosis. Although the sensitivity of the agar plate method was determined to be 33.3% for A.fumigatus ITR in our study, its sensitivity and specificity were determined to be 100% for ITR, VOR, and POS in other species. The low sensitivity value detected for A.fumigatus showed that agar plate drug concentrations should be updated in accordance with the latest regulations of EUCAST guidelines. The CypA-L98H and CypA-M220 mutations detected in our study suggested that the distribution of azole resistance-related mutations in different regions in our country should be investigated. In conclusion; It is thought that the agar plate method, which can be easily applied to detect azole resistance, is a fast and practical method in routine use and can contribute to both the determination of effective treatment strategies and the generation of epidemiological data.

Keywords: Aspergillus, agar plate, azole resistance, cyp51A, cypA-L98H, cypA-M220.