Resveratrol ile muamele edilmiş yağ dokusu kaynaklı mezenşimal kök hücre sitokinlerinin A549 kanser hücresine etkilerinin araştırılması
Effects of resveratrol treated adipose derived mesenchymal stem cell cytokines on A549 cancer cells
Yazar: ERHAN ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. CENGİZ BAYÇU ; PROF. DR. AYŞE TANSU KOPARAL
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Kemokinler = Chemokines ; Kök hücreler = Stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Resveratrol = Resveratrol ; Sitokinler = Cytokines ; Stroma = Stroma ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors ; İnterlökin 6 = Interleukin 6

Özet:
Günümüzde kök hücre tedavileri, tıbbın birçok alanında deneysel veya bazı alanlarında da klinik olarak kullanılan önemli tedavi yöntemlerindendir. Farklı tedavi yöntemleri kullanılmasına rağmen henüz kanseri eradike edebilecek bir tedavi mevcut değildir. Akciğer kanseri en sık görülen kanser türleri arasındadır. Birçok deneysel çalışmada tedavi edici ve koruyucu özelliği gösterilen MKH'nin kanser modellerinde kanserli hücreleri baskıladığı ve çoğalmalarını durdurduğu bildirilmiştir. Ancak son yıllarda kanser tedavisi için kök hücrelerin kullanıldığı çalışmalarda; kök hücrelerin kanser oluşumunu tetiklediği, kitleyi büyüttüğü, yeni damarların oluşumuna ve kanserin invazyonuna yardımcı olduğu gösterilmiştir. MKH'ler ile kanser hücreleri arasındaki iletişimin MKH'lerden salınan sitokinler yardımıyla sağlandığı bilinmektedir. MKH'nin salgıladığı bu sitokinlerin varlığı ve kanserli hücreler üzerindeki etkisi MKH'lerin tedavi güvenilirliğini azaltmaktadır. Resveratrolün inflamasyon, oksidatif stres, kanser oluşması ve ilerlemesi, platelet agregasyonu, aterosklerozis ve yaşlanma gibi birçok biyolojik aktivitede olumlu görev aldığı gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı, MKH'ler ile A549 akciğer kanser hücrelerini in-vitro olarak aynı ortamda tutarak, MKH'lerin kanserli hücreleri desteklerken kullandığı sitokinleri, faydalı ve anti kanserojenik özelliğiyle bilinen resveratrol ile baskılayarak, kanserin tedavisinde çok önemli yeri olan MKH'lerin kullanımını ve tedavinin güvenilirliğini araştırmaktır.
Bu çalışmada hücre kültürü seviyesinde 6 ayrı grup oluşturularak çalışılmıştır. MKH'lerden salınan sitokinler (IL 6, CCL5, VEGF, SDF-1) ve resveratrolün bu sitokinler üzerindeki etkileri toplanan medyumlarda ELISA, western blot ve gerçek zamanlı PCR (rt-PCR) yöntemleriyle araştırılmıştır. Deneyimizde in-vitro sitotoksisite testleri yapılmıştır. Fluoresan boyama ile morfolojik inceleme (DAPI boyama) yapılmıştır.
Yaptığımız sitotoksisite deneyleri sonucunda A549 kanser hücrelerinde ve MKH'de güvenli doz 1µM olarak bulunmuştur. DAPI floresan boyaması sonucunda resveratrolün ve MKH'nin A549 kanser hücresi üzerinde apoptotik etkisi görülmemiştir. ELISA ve western blot deneyi ile gruplar arası sitokin miktar değişimine baktığımızda IL-6 ve VEGF sitokinlerinin ifade olduğu, SDF-1 ve CCl-5 salınımının olmadığı tespit edilmiştir. Rt-PCR deneyleri ile VEGF mRNA ekspresyonuna bakılmış, ELISA ve western blot deneyleri ile paralellik gösterdiği bulunmuştur. Gruplar arası sitokin salınımına baktığımızda en yüksek IL-6 ve VEGF salınımının A549+MKH grubunda olduğu resveratrolün anlamlı bir şekilde bu salınımı azalttığı bulundu.
Sonuç olarak IL-6 ve VEGF salınımı A549 kanser hücreleri ve MKH'leri bir arada bulunduğunda artmaktadır. Resveratrol bu artışı anlamlı bir şekilde düşürmektedir. Tüm gruplarda SDF-1 ve CCL-5 salınımı gözlenmedi.

Abstract:
Stem cell therapies are very important treatment methods that are used in many areas of experimental medicine or clinical part. Despite the use of different treatment methods, there has been no definitive treatment for cancer treatment yet. Of all cancer types, lung cancer is the most common one. MSCs therapeutic and protective features have been demonstrated in various experimental studies. In cancer models, MSCs suppressed and stopped the growth of cancer cells in recent studies. However, recently the stem cells used in cancer treatment studies trigger the formation of cancer, make larger its mass, help the formation of new vessels and lead to cancer invasion. The communication between cancer cells and MSCs are known to be done with MSC's released cytokines. The presence of these cytokines that secreted by MSC's and effects on cancer cells reduces the reliability of MSC treatment. Resveratrol has been shown to have positive role in many biological activities such as atherosclerosis, aging, inflammation, oxidative stress, cancer development and progression, platelet aggregation. Within this scope the aim of this study is to co-cultured the MSCs with the A549 cancer cells, to suppress the releasing of cytokines that released from MSCs for supporting the cancer cells and increased the usage of stem cell therapies and therapy reliability with resveratrol known for its beneficial and anti-carcinogenic properties. Experimental studies in the thesis investigated at the cell culture level. Six separate groups were formed. MSCs secreted cytokines (IL-6, CCL5, VEGF, SDF-1) and effect of resveratrol on these cytokines analyzed by ELISA, western blot and rt-PCR at conditioned medium. The in-vitro cytotoxicity assays were performed. Morphological investigation was performed with DAPI staining. 1 μM resveratrol was found safety dose for A549 cancer cells and MSCs with in-vitro cytotoxicity assays. As a result of DAPI fluorescence staining apoptotic effects of resveratrol and MSCs not observed on A549 cancer cells. If we look cytokine levels among groups with ELISA and western blot methods; IL-6 and VEGF cytokines has been detected but SDF-1 and CCL-5 releasing has not been detected. VEGF mRNA levels were analyzed by rt-PCR and found paralleled results with ELISA and western blot assays. We observed the highest release of IL-6 and VEGF from the co-cultured A549 cells and MSCs, and resveratrol was found to significantly decrease the release of these cytokines.
Consequently, IL-6 and VEGF secretion was increased in co-culture of A549 cancer cells and MSCs. Resveratrol reduces this increase significantly. SDF-1 and CCL-5 secretion was not observed among groups.