Probiyotikler ile ilişkili bazı kısa zincirli yağ asitlerinin solunum yolu epiteli bariyer işlevi üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of some probiotic related short-chain fatty acids on respiratory epithelial barrier function
Yazar: YAĞIZ PAT
Danışman: PROF. DR. NERİMAN AYDIN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Akkermansia muciniphila = Akkermansia muciniphila ; Bifidobacterium longum = Bifidobacterium longum ; Epitel = Epithelium ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Mukozalar = Mucous membrane ; Probiyotikler = Probiotics ; Solunum sistemi = Respiratory system ; Yağ asitleri = Fatty acids

Özet:
Mukoza ve deri epiteli bariyer işlev bozukluğu birçok hastalığın patogenezinde rol almaktadır. Sıkı bağlantı yapısı epitel bariyer işlevinin oluşturulmasında ana unsurdur. Probiyotik bakteriler suşa ve doza bağımlı olarak, farklı doku epitellerinin bariyer işlevini güçlendirici etki göstermektedir ve ürettikleri kısa zincirli yağ asitlerinin (KZYA) bağırsak epitel bariyer işlevini güçlendirdiği bilinmektedir. Buna karşın KZYA'ların solunum yolu epiteli bariyer işlevi üzerine etkisi üzerinde kısıtlı çalışmalar bulunmaktadır. Bu çalışmanın amacı bazı KZYA'ların solunum yolu epiteli bariyer işlevi üzerine etkisinin araştırılmasıdır. 
Bu çalışmada ilk olarak Bifidobacterium longum subsp. longum 35624 ve Akkermancia muciniphila kültürü yapılmış ve ürettikleri KZYA'lar yüksek basınçlı sıvı kromotografi (YBSK) ile belirlenmiştir. Ticari olarak temin edilen kizinostatın (quisinostat, JNJ-26481585) ve birer KZYA olan bütirat ve valeratın, bağırsak epiteli bariyer işlevi üzerine etkisi farklılaşmış ve farklılaşmamış Caco-2 hücreleri kullanılarak sıvı-sıvı arayüzlü kültür yöntemi ile araştırılmıştır. Kizinostatın 5, 10, 50 ve 100nM, bütiratın 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4 ve 8 mM ve valeratın 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2 ve 4 mM'lik konsantrasyonları farklılaşmış ve farklılaşmamış Caco-2 hücre kültürlerine eklenmiştir. Caco-2 epitel bariyer işlevi transepitelyal rezistans (TER) ölçümü ile değerlendirilmiştir. Hücre kültürü kontrolü için sadece hücre kültürü sıvısı eklenmiştir. Sitotoksisite kontrolü için 1/105 oranında dimetilsülfoksit kullanılmıştır
Valeratın solunum yolu epitel bariyer işlevine etkisi farklılaşmış ve farklılaşmamış sağlıklı insan primer bronşiyal epitel hücresi (SİBEH) ve farklılaşmamış astımlı insan primer bronşiyal epitel hücre (AİBEH) kültürlerinde araştırılmıştır. Farklılaşmış SİBEH epitel bariyer işlevine valeratın etkisi apikal bölmeden, 0.03, 0.125, 0.5 ve 2 mM konsantrasyonlarda tek başına veya 50ng/ml IL-13 ile birlikte eklenerek araştırıldı. Bu hücrelerde pozitif kontrol olarak epitel bariyer işlevi güçlendirici olan kizinostat (100nM, apikal), negatif kontrol olarak epitel bariyer işlev bozucu olan IL-13 (50ng/ml, bazal) kullanıldı. Ayrıca bu iki kontrol hücre kültürüne birlikte eklenerek etkileri araştırıldı. 
Farklılaşmamış SİBEH epitel bariyer işlevine valeratın etkisi, bazal bölmeden 1nM, 10nM, 100nM, 1uM, 10uM ve 100uM'lık konsantrasyonlarda tek başına veya 10ng/ml IL-13 ile birlikte eklenerek araştırıldı. Bu hücrelerle yapılan deneylerde pozitif kontrol olarak bazal bölmeden 10nM kizinostat, negatif kontrol olarak bazal bölmeden 10ng/ml IL-13 kullanıldı. Farklılaşmamış AİBEH epitel bariyer işlevine valeratın etkisi, bazal bölmeden 10nM, 100nM ve 1uM'lik konsantrasyonlarının tek başına uygulanması ile araştırıldı. Farklılaşmamış AİBEH kültürüyle yapılan deneylerde pozitif kontrol olarak bazal bölmeden 10nM kizinostat kullanıldı. Primer insan solunum yolu hücre kültürü ile yapılan deneylerde herhangi bir etken maddenin kullanılmadığı hücre kültürü kontrolü için sadece hücre kültürü sıvısı eklenmiştir. 
Yapılan deneylerde hücrelerin epitel bariyer işlevi TER ölçümü ve parasellüler geçiş analizi ile değerlendirilmiştir. 
Çalışmamızda B. longum subsp. longum 35624'un laktat, formiat ve asetat ürettiği  buna karşın propionat, bütirat veya valerat üretmediği gösterilmiştir. Valeratın farklılaşmış SİBEH hücreleri tarafından metabolizasyonu YBSK yöntemi ile belirlenmiştir. Farklılaşmış Caco-2 epitel hücrelerinde; valeratın tüm konsantrasyonlarının TER değerine etkisi olmamıştır, buna karşın kizinostatın 100nM ve bütiratın 4 ve 8 mM'lık konsantrasyonları TER değerlerinde düşmeye neden olmuştur. Farklılaşmamış Caco-2 epitel hücrelerinde ise; valeratın 0.1, 0.5, 1 ve 4mM'lık ve kizinostatın 50 ve 100nM'lık konsantrasyonları TER değerlerini arttırmıştır, bütiratın ise 4mM'lık konsantrasyonu TER değerinde düşmeye yol açmıştır. Farklılaşmış SİBEH kültüründe, valerat TER değerlerinde ve paraselüler geçiş miktarında değişikliğe neden olmamıştır ve bu hücrelerde IL-13'ün bariyer bozucu etkisini geri döndüremediği belirlenmiştir. Farklılaşmamış SİBEH kültüründe; valeratın bazal bölgeden uyarımı ile donör örneğine bağlı olarak TER değerlerini kontrole göre arttırdığı belirlenmiştir, ancak IL-13'ün epitel bariyer bozucu etkisini geri döndüremediği ve AİBEH bariyer işlevini güçlendiremediği gösterilmiştir.  
Çalışmamızda kizinostatın ve valeratın Caco-2 epitel bariyer işlevini güçlendirdiği bulunmuştur. Valeratın solunum yolu epiteli bariyerine etkisinin donöre, hücrelerin farklılaşma durumuna, uyarımın süresine ve kültüre ekleniş yoluna (bazal veya apikal) bağlı olarak değiştiği saptanmıştır. Bunun yanında valeratın farklılaşmış SİBEH'ler tarafından metabolize edildiği belirlenmiştir. Kısa zincirli yağ asitlerinin solunum sistemi epitel bariyer işlevini güçlendirici etkisinin araştırıldığı daha geniş çalışmalara ihtiyaç olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
Barrier dysfunction of the mucosa and skin epithelium is involved in the pathogenesis of many diseases. The tight junction structure is the main element in establishing the epithelial barrier function. Probiotic bacteria strain and dose-dependently strengthen the barrier function of different tissue epithelium, and it is known that their products such as short-chain fatty acids (SCFA) strengthen the intestinal epithelial barrier function. However, there are limited studies on the effect of SCFAs on the barrier function of the airway epithelium. The aim of this study is to investigate the effects of some SCFAs on the respiratory epithelial barrier function.
In this study, Bifidobacterium longum subsp. longum 35624 and Akkermancia muciniphila were cultured and the SCFAs they produced were determined by high pressure liquid chromatography (HPLC). The effects of commercially available quisinostat, (JNJ-26481585) and each of the SCFAs, butyrate and valerate, on intestinal epithelial barrier function were investigated by liquid-liquid interface culture method using differentiated and undifferentiated Caco-2 cells. Concentrations of 5, 10, 50, and 100 nM of quisinostat, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, and 8 mM of butyrate, and 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, and 4 mM of valerate were added to differentiated and undifferentiated Caco-2 cell cultures. Caco-2 epithelial barrier function was evaluated by transepithelial resistance (TER) measurement. Only cell culture broth was added for cell culture control. 1/105 dimethylsulfoxide was used for cytotoxicity control.
The effect of valerate on airway epithelial barrier function was investigated in cultures of differentiated and undifferentiated normal human primary bronchial epithelial cell (NHBEC) and undifferentiated human asthmatic human primary bronchial epithelial cell (AIBEH). The effect of valerate on differentiated NHBEC epithelial barrier function was investigated by adding it alone or in combination with 50ng/ml IL-13 at concentrations of 0.03, 0.125, 0.5 and 2 mM from the apical compartment. In these cells, quisinostat (100nM, apical) was used as epithelial barrier function enhancer control (positive control), and epithelial barrier function disruptor IL-13 (50ng/ml, basal) was used as negative control. In addition, these two controls were added to the cell culture together and their effects were investigated. 
The effect of valerate on the undifferentiated NHBEC epithelial barrier function was investigated by adding it alone or together with 10ng/ml IL-13 at concentrations of 1nM, 10nM, 100nM, 1uM, 10uM and 100uM from the basal compartment. In experiments with these cells, 10nM quisinostat from the basal chamber was used as the positive control, and 10ng/ml IL-13 from the basal chamber was used as the negative control. The effect of valerate on the epithelial barrier function of undifferentiated AHBEC was investigated by administration of 10nM, 100nM, and 1uM concentrations alone from the basal compartment. In experiments with undifferentiated AHBEC culture, 10nM quisinostat from the basal chamber was used as a positive control. In experiments with primary human respiratory tract cell culture, only cell culture liquid was added for cell culture control, in which no active substance was used.
In the experiments, the epithelial barrier function of the cells was evaluated by TER measurement and paracellular transition analysis.
In our study, B. longum subsp. longum 35624 has been shown to produce lactate, formiate and acetate, but not propionate, butyrate or valerate. Metabolism of valerate by differentiated NHBEC cells was determined by HPLC method. In differentiated Caco-2 epithelial cells; All concentrations of valerate had no effect on TER, whereas 100nM of quinostat and 4 and 8 mM of butyrate caused a decrease in TER values. In undifferentiated Caco-2 epithelial cells; The 0.1, 0.5, 1 and 4mM concentrations of valerate and the 50 and 100nM concentrations of quinostat increased the TER values, while the 4mM concentration of butyrate caused a decrease in the TER value. In differentiated NHBEC culture, valerate did not cause any change in TER values and the amount of paracellular permeability, and it could not reverse the barrier disrupting effect of IL-13 in these cells. In the undifferentiated NHBEC culture; It was determined that valerate increased TER values compared to control, depending on the donor sample, with stimulation from the basal region, but it was shown that it could not reverse the epithelial barrier disrupting effect of IL-13 and could not strengthen the AHBEC barrier function.
In our study, it was found that quisinostat and valerate strengthen the Caco-2 epithelial barrier function. It has been determined that the effect of valerate on the respiratory epithelial barrier varies depending on the donor, the differentiation status of the cells, the duration of stimulation and the way it was added to the culture (basal or apical). In addition, it has been determined that valerate is metabolized by differentiated NHBECs. It is thought that there is a need for larger studies investigating the strengthening effect of SCFAs on the respiratory system epithelial barrier function.