Sıçanlarda adipoz kaynaklı kök hücre, stromal vasküler fraksiyon, yağ grefti ve doku kokteylinin dondurma işlemi sonrasında sağkalımlarının ve yağ dokusuna katkılarının karşılaştırılması
Comparison of survival and effectivity of cryopreserved adiposed derived stem cell, stromal vascular fraction, fat graft and tissue cocktail in rats
Yazar: SİNEM ÇİLİNGİR
Danışman: PROF. DR. ÖZLENEN ÖZKAN
Akdeniz Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Gref yaşaması = Graft survival ; Kök hücreler = Stem cells ; Stromal vasküler fraksiyon = Stromal vascular fraction ; Sıçanlar = Rats ; Transplantlar = Transplants

Özet:
Yağ greftleri, kişinin kendisinden elde edilip, oluşturduğu kontur ile güvenli, doğal bir dolgu maddesidir. Fakat yağ hücrelerinin (adiposit) hipoksiye hassasiyeti nedeniyle nakledilen yağın kısmi nekrozu kaçınılmaz olmaktadır. Manyetik rezonans ile yapılan incelemelerde nakledilen hacmin ancak %55-70'i korunarak greftin devamlılığını sürdürdüğü gösterilmiştir.
Dolayısıyla, tedavi hedeflerine ulaşmak için sıklıkla birden fazla işlem gerekir ve bu da hem ekstra maliyete hem de hasta için artan morbiditeye neden olmaktadır. Yağ grefti uygulamasının, bu istenmeyen etkilerinin azaltılabilmesi için, ilk seansta alınacak yağ dokusunun bir bölümünün, hastanın ek tedavi ihtiyacı olduğunda tekrar kullanılabilmesi için düşük derece sıcaklıklarda saklanması yani kryoprezervasyonu deneysel ve klinik olarak denenmiştir. Fakat kryoprezervasyon protokolünün basamakları, saklanan dokunun çözünme sonrası nakledildiği dokudaki sağ kalımı hakkında net bir görüş yoktur. 
Çalışmamızda, 48 adet Wistar sıçan (erkek, 200-500 gram) her grupta 8 denek olacak şekilde 6 gruba ayrılmıştır. Her bir sıçanın önce bir taraftaki inguinal yağ dokusu çıkarılarak, bu yağ dokusundan yağ grefti, adipoz doku kaynaklı kök hücre (AKKH), stromal vasküler fraksiyon (SVF) ve doku kokteyli elde edilmiştir. Elde edilen bu materyaller, dondurma protokolü için, öncelikle 43°C'de %5 CO2 ile 1 saat ısı şoku uygulanması sonrasında, 37°C'lik hücre kültürü inkübatörlerinde 3 saat dinlendirilmiş sonrasında %10 DMSO+FBS solüsyonu içerisinde 4°C'de 10 dakika bekletilerek, her dakika 1°C soğutulacak şekilde depolama ısısı olan -80°C'de 3 ay depolanmıştır. Sürecin sonunda her bir materyal 37°C sıcak su banyosunda hızlıca çözündürülmüş ve otolog olarak sıçanların kontralateral inguinal yağ dokusuna nakledilmiştir. H&E ile yapılan morfolojik incelemede ve VEGF, Ki67 ile yapılan immünohistokimyasal değerlendirmede kontrol grubu ile diğer gruplar arasında anlamlı farklılık görülmüştür (p>0.0001). AKKH, SVF, AKKH ve SVF gruplarında yağ grefti ve doku kokteyli gruplarıyla olan karşılaştırmada, yağ grefti ve doku kokteylinin VEGF ve Ki67 boyanması anlamlı derecede yüksek izlenmiştir (p>0.0001). Ayrıca yağ grefti ve doku kokteyli gruplarında diğer gruplardan farklı olarak nekroz ve dev hücreler görülmüştür. AKKH, SVF, AKKH ve SVF gruplarında hücrelerin sağ kalımı ve anjiogenez ile adipogenez için yağ grefti, doku kokteyli gruplarına göre ideal morfolojiye ve VEGF, Ki67 boyanmasına sahip olduğu düşünülmüştür. 
Sonuç olarak, yağ grefti ve doku kokteyli gibi görece daha büyük dokuların dondurulması sonrasında hücrelerin sağ kalımı ve işlevleri azalmaktadır. Yağ dokusunda bulunan ve anjiogenezi, adipogenezi düzenleyen; oluşturan ve destekleyen hücrelerin dondurulmasının dokunun bütününün dondurulmasına göre daha iyi sonuçlar verdiği düşünülmektedir. Hücrelerin kryoprezervasyona karşı dayanıklılığı sayesinde daha fazla hücrenin canlılığını koruması; dokuda nakledilen hacmin korunmasıyla beraber yeni damar ve adiposit oluşumunu da sağlayacaktır. Klinik uygulamada, bu avantajların kullanılması hem tedavinin etkinliğini arttırırken hem de hastanın tedavi süresince konforunda da etkili olacaktır.

Abstract:
Fat grafts are a safe, natural filler material, which can be taken from the person himself. However, partial necrosis of the transplanted fat is inevitable due to the sensitivity of fat cells to hypoxia. With magnetic resonance, it has been shown that the graft maintains, preserving only 55-70% of the transplanted volume. Thus, multiple procedures are often required to achieve treatment goals, resulting in both extra cost and increased morbidity for the patient. In order to reduce these undesirable effects of fat grafting, at the first session of liposuction, a portion of lipoaspirate can be taken and stored at low temperatures so that it can be reused when the patient needs additional treatment, that is, so called cryopreservation. However, in the literature there is no single opinion about the cryopreservation protocol, survival of the preserved tissue and the effect of thawed tissue in the transplanted area.
In our study, 48 Wistar rats (male, 200-500 grams) were divided into 6 groups with 8 subjects in each group. Inguinal adipose tissue on one side of each rat was excised first, and after, from that tissue we got fat graft, adipose tissue derived stem cell (ADSC), stromal vascular fraction (SVF) and tissue cocktail. As a cryopreservation protocol, materials were first applied to 43°C with 5% CO2 for 1 hour as a heat shock, then stayed in 37°C cell culture incubators for 3 hours. After 3 hours, materials stayed at 4°C for a 10 minutes with 10% DMSO+FBS solution, then cooled and stored -80°C (-1°C/min) as the final temperature for 3 months. At the end, each material was rapidly thawed in a 37°C hot water bath and transferred autologously to the contralateral inguinal adipose tissue of the rats. Morphological examination with H&E and immunohistochemical evaluation with VEGF and Ki67 showed significant differences between the control group and the other groups (p>0.0001). VEGF and Ki67 staining of the fat graft and tissue cocktail was observed to be significantly higher than in the ADSC, SVF, ADSC and SVF groups (p>0.0001). In addition, necrosis and giant cells were observed in the fat graft and tissue cocktail groups. Fat graft and tissue cocktail groups may have shown higher results as a staining, but we found the ideal morphology for cell survival, angiogenesis and adipogenesis in the ADSC, SVF, ADSC and SVF groups.
As a result, the survival of cells decrease after cryopreservation in relatively larger tissues such as fat graft and tissue cocktail. It is thought that freezing the cells in the adipose tissue that regulate, form and support angiogenesis and adipogenesis gives better results than freezing the whole tissue. Resistance of the stem cells to cryodamage ensure that more cells maintain their viability, so that the graft volume will be preserved, as well as with the formation of new vessels and adipocytes. In clinical practice, the use of these advantages will both increase the effectiveness of the treatment and be effective in the comfort of the patient during the treatment.