Etiketsiz aptamer immobilizasyonu için yeni bir yöntemin araştırılması
Investigation of a novel technique for ?tag-free? aptamer immobilization
Yazar: OZAN SELVİ
Danışman: PROF. DR. MEHMET MUTLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Sunulan çalışmanın amacı, aptamer moleküllerinin yapılarında herhangi bir kimyasal modifikasyon gerçekleştirilmeden tutuklanmasını sağlamak için ?etiketsiz? bir aptamer immobilizasyon yönteminin araştırılmasıdır. Araştırma sürecinde model aptamer sistemi olarak 29 bazlık HD-22 trombin aptameri kullanılmıştır.Çalışmanın ilk basamağında, HD-22 aptamerinin trombin enzimi ile gerçekleştirdiği etkileşimler ve reaksiyonlar, İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) cihazı kullanılarak incelenmiştir. HD-22 aptamer-trombin enzim kompleksinin termodinamik karakterizasyonu yine ITC cihazı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.?Etiketsiz? aptamer immobilizasyon prosesi için immobilizasyon parametrelerin belirlenmesi sürecinde Kuartz Kristal Mikrobalans (QCM) sistemi kullanılmıştır. QCM kristallerinin yüzeyi plazma polimerizasyonu yöntemiyle yüzeyde (-PO3) grupları oluşturulacak şekilde modifiye edilmiştir. Plazma polimerizasyon parametreleri, yüzeye bağlanan oligonükleotid miktarı ve kaplamaların sulu ortamdaki stabiliteleri cinsinden optimize edilmiştir. ?Etiketsiz? aptamer immobilizasyon yöntemi ile ?etiketli? aptamer immobilizasyonu, yüzeye bağlanan oligonükleotid moleküllerinin sayısı cinsinden, aldehit grubu ile işaretlenmiş oligonükleotid immobilizasyonu gerçekleştirilerek kıyaslanmıştır.Çalışmanın son basamağında HD-22 trombin aptamerinin, ?etiketsiz? aptamer immobilizasyon prosesinin sonucunda trombin enzimine karşı gösterdiği etkileşim, öncelikle serbest HD-22 aptameri ile trombin enzimin ITC cihazı ile elde edilen deneysel karakteristik özellikleri ile karşılaştırılmıştır. Yine bu süreç içerisinde ?etiketsiz? aptamer immobilizasyon prosesinin ile geleneksel aptamer immobilizasyon yöntemlerinin verimlilikleri kıyaslanmıştır.Bu çalışma sonucunda, ?etiketsiz? immobilizasyon yöntemiyle kristal yüzeyine tutuklanan HD-22 DNA aptamerinin, ayrılma sabiti kd=0.05 nM olarak hesaplanmıştır. Bu değer ?etiketsiz? immobilizasyon yönteminin alternatiflerine kıyasla çok daha başarılı bir immobilizasyon yöntemi olduğunu ortaya koymaktadır.

Abstract:
The purpose of this research is to investigate a ?tag-free? aptamer immobilization technique for developing a novel methodology for aptamer immobilization that can stabilize the conformation of aptamers via plasma polymerization technique. The model aptamer system that has been chosen for this study is, a 29-oligonucleotide sequence, referred to as HD-22 thrombin binding aptamer.Characterization of the interactions between HD-22 and thrombin enzyme have been performed by using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) device. Furthermore, ITC device has been used to study the thermodynamic properties of HD-22 aptamer-thrombin complex.Parameters of ?tag-free? aptamer immobilization process have been investigated by using Quart Crystal Microbalance (QCM) measurement system. QCM crystals have been modified via plasma polymerization to form (-PO3) groups at the surface. Plasma polymerization parameters have been optimized with respect to the amount of the immobilized oligonucleotides and aquatic stability of the coating. Futhermore amounts of immobilized oligonucleotides via ?tag-free? aptamer immobilization process have been compared with the classical aptamer immobilization techniques.Interaction of free HD-22 aptamer and thrombin enzyme after ?tag-free? aptamer immobilization process, have been compared with the thermodynamic characteristics of free HD-22 trombin aptamer-thrombin complex. Thermodynamic interactions had been determined by performing ITC analysis of free HD-22 trombin aptamer-thrombin complex in the Phosphate Buffered Saline (PBS) solution. Moreover within this research, productivity of both ?tag-free? aptamer immobilization process and classical aptamer immobilization techniques has been compared.Binding affinity of HD-22 DNA aptamer that have been immobilized at the surface of the QCM crystal, have been determined as kd=0.05 nM. Hence, the success of the ?tag-free? aptamer immobilization process has been demonstrated by the comparisons of this binding affinity value with the possible alternative methods.