Bazı fitokimyasalların in vitro ve in vivo biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi
Investigation of in vitro and in vivo biological activities of some pytochemicals
Yazar: MELİSA MANAV
Danışman: PROF. DR. EBRU GÜREL GÜREVİN ; DR. ÖĞR. ÜYESİ HÜLYA TUBA KIYAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kanser; yılda yaklaşık 2,6 milyon vakayla, dünya çapında en önemli sağlık sorunlarının başında
gelmektedir. Kanserin metastaz yoluyla yayılmasında kilit rol oynayan faktör, anjiyogenez
sürecidir. Anjiyogenez, mevcut damar endotelinden tomurcuklanma yoluyla yeni kan damarları
oluşturmak için endotel hücrelerinin aktivasyonu, göçü ve proliferasyonunu içeren karmaşık
bir mekanizmadır. Kanser gibi patolojik koşullarda, anjiyogenez süreci kontrolden çıkmaktadır.
Kemoterapi ve radyoterapi, yan etki profili ve doza bağlı direnç göstermeleri nedeniyle kanser
tedavilerinde sınırlı etkinliğe sahiptir. Bu nedenler, kanser tedavisinde kullanılacak yeni
terapötik ilaçlara duyulan ihtiyacı arttırmaktadır. Anjiyogenezin kanser sürecindeki rolü göz
önüne alındığında, tümörlerde damarlanmayı bozarak kanserin gelişimini baskılayan antianjiyogenik tedaviler umut vadetmektedir. Kanser tedavisinde uygulanan anjiyogenez hedefli
ilaçların önemli bir bölümünün, bitkilerden izole edilen alkaloidler, polifenoller veya terpen
gruplarına ait anti-kanser etkinliği olan doğal biyoaktif bileşikler olduğu bilinmektedir. Doğal
biyoaktif bileşikler olan Combretastatin A-4 (CA-4), plumbagin, berbamin, silibinin ve
lentinanın anti-kanser, antioksidan, anti-inflamatuvar gibi birçok biyolojik aktiviteye sahip
olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle, farklı kanser türlerine karşı, etkili birer potansiyel terapötik
ajan olabilecekleri düşünülmektedir. Bu tez çalışmasında, CA-4, plumbagin, berbamin,
silibinin ve lentinanın, A549 küçük hücreli olmayan akciğer kanseri ve HUVEC insan umblikal
ven endotel hücrelerinde in vitro sitotoksik etkinlikleri belirlenerek, etkin biyoaktif bileşiklerin
in vitro anjiyogenez ve anjiyogenik faktörlerin ifadesi üzerindeki etkileri, ayrıca A549 akciğerkanseri hücreleriyle tümör oluşturulan kuluçkalık yumurtalarda in vivo tümör anjiyogenezi
üzerindeki etkileri araştırıldı.
CA-4 (1-10 µM), plumbagin (0,1-10 µM), berbamin (2,5-40 µM), silibinin (10-200 µM) ve
lentinan (20-320 µM) biyoaktif bileşiklerinin, A549 ve HUVEC hücre hatlarında hücre canlılığı
üzerindeki etkileri, 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil tetrazolyum bromid (MTT) canlılık
testiyle değerlendirildi. Etkin bulunan CA-4, plumbagin ve berbamin maddelerinin hücre
canlılığı üzerine etkileri, Sülforodamin B (SRB) canlılık testi ile doğrulandı. CA-4, plumbagin
ve berbaminin, HUVEC hücrelerinde tüp oluşumu yöntemiyle in vitro anjiyogenez üzerine
etkileri belirlendi. Ardından bu maddelerin, MTT testi ile belirlenen IC50 dozlarında, A549
hücrelerinde anjiyogenik faktörlerin ifadesi üzerine etkileri western blot yöntemi ile belirlendi.
CA-4, plumbagin ve berbaminin tümör anjiyogenezi üzerine etkileri, in vivo CAM yöntemiyle
araştırıldı. Kuluçkalık yumurtalar, embriyonik gelişimlerinin 9.gününe kadar inkübasyona
bırakıldı. 9.günde, A549 hücreleri (3x106 hücre/yumurta), IC50 dozlarındaki CA-4, plumbagin
ve berbamin ile süspanse edilerek matrigel ile silikon bir disk içerisinde CAM alanına
uygulandı. 72 saatlik tedavinin ardından, kuluçkalık yumurtalardaki vasküler yoğunluk
incelendi ve tümör dokularının histokimyasal analizi yapıldı.
MTT sonuçlarıyla, CA-4, plumbagin ve berbaminin, A549 hücrelerinde hücre canlılığını inhibe
ettiği belirlendi. Silibinin ve lentinanın, kanser hücrelerinde canlılığı azaltmadığı tespit edildi.
Doğal biyoaktif bileşiklerin HUVEC hücrelerinde, belirli bir sitotoksik aktivite gösterdiği
belirlendi. Plumbaginin, yüksek dozlarda HUVEC hücrelerinin canlılığını, A549 hücrelerine
kıyasla daha fazla etkilediği saptandı. CA-4, plumbagin ve berbaminin A549 ve HUVEC
hücrelerindeki üzerindeki etkilerinin, SRB sonuçlarıyla paralellik gösterdiği belirlendi. CA-4
(1 ve 5 µM), plumbagin (1 ve 3 µM) ve berbamin (5 ve 10 µM) biyoaktif bileşiklerinin,
belirlenen tüm dozlarda, HUVEC hücrelerinde tüp benzeri yapıların oluşumunu inhibe ettiğini
belirlendi. Western blot sonuçları, CA-4 (5 µM), plumbagin (10 µM) ve berbaminin (10 µM),
A549 hücrelerinde VEGF-A ve MMP-2 ifadesini kontrole kıyasla inhibe ettiğini gösterdi. İn
vivo CAM yöntemi sonuçlarıyla, CA-4 (5 µM), plumbagin (10 µM) ve berbamin (10 µM)
biyoaktif bileşikleriyle tedavi edilen tedavi edilen kuluçkalık yumurtalarda, vasküler
yoğunluğun kontrole kıyasla anlamlı olarak önemli ölçüde inhibe edildiği belirlendi. Tümör
dokularının histolojik analizleri, biyoaktif bileşiklerle tedavi edilen tümörlerde CAM alanına
invazyonun kontrole kıyasla azaldığı gösterdi. Bütün bu sonuçlar göz önüne alındığında,
Combretastatin A-4, plumbagin ve berbamin doğal biyoaktif bileşiklerinin, akciğer kanserinde
anjiyogenez inhibitörleri olarak terapötik ilaç potansiyeli gösterdikleri düşünülmektedir.

Abstract:
Cancer is one of the world's most serious health diseases, affecting around 2.6 million people
annually. Angiogenesis is a major factor in the spread of cancer via metastasis. Angiogenesis
is an intricate process in which endothelial cells are activated, migrated, and proliferated to
generate new blood vessels by budding from the existing vascular endothelium. In
pathological circumstances like cancer, the angiogenesis process becomes uncontrolled.
Chemotherapy and radiotherapy have limited efficacy in cancer therapies due to side effects
and dose dependence. These factors highlight the need for new therapeutic medications to be
employed in cancer treatment. Anti-angiogenic treatments, which prevent the growth of cancer
by altering the vascularization of tumors, show promise in light of the role that angiogenesis
plays in the development of cancer. It is well recognized that a significant portion of
angiogenesis-targeted cancer treatments are naturally occurring bioactive substances with antitumor properties that are derived from plant groups called terpenes, polyphenols, or alkaloids.
Natural bioactive substances Combretastatin A-4 (CA-4), plumbagin, berbamine, silibinin, and
lentinan have been demonstrated to have a variety of biological properties, including antiinflammatory, anti-cancer, and antioxidant properties. As a result, they are regarded as
promising therapeutic agents that could be useful against many cancer types. In this thesis, the
in vitro cytotoxic activities of CA-4, plumbagin, berbamine, silibinin, and lentinan were determined on A549 non-small cell lung cancer and HUVEC human umbilical vein endothelial
cells, and the effects of active bioactive compounds on in vitro angiogenesis and the expression
of angiogenic factors, as well as the effects on in vivo tumor angiogenesis in hatching eggs in
which tumors were created with A549 lung cancer cells, were investigated.
CA-4 (1-10 µM), plumbagin (0,1-10 µM), berbamine (2,5-40 µM), silibinin (10-200 µM), and
lentinan (20-320 µM) The effects of bioactive compounds on cell viability in A549 and
HUVEC cell lines were evaluated by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium
bromide (MTT) viability assay. The effects of the active substances CA-4, plumbagin, and
berbamine on cell viability were confirmed by the Sulfordamine B (SRB) viability test. The
effects of CA-4, plumbagin, and berbamine on in vitro angiogenesis in HUVEC cells were
determined by the tube formation method. Then, the effects of these substances on the
expression of angiogenic factors in A549 cells, at IC50 doses determined by the MTT test, were
determined by the western blot method. The effects of CA-4, plumbagin, and berbamine on
tumor angiogenesis were investigated by the in vivo CAM method. Hatching eggs were
incubated until the 9th day of their embryonic development. On day 9, A549 cells (3x106
cells/egg) were suspended with IC50 doses of CA-4, plumbagin, and berbamine and applied to
the CAM area in a silicone disk with matrigel. After 72 hours of treatment, vascular density in
hatching eggs was examined, and histochemical analysis of tumor tissues was performed.
The MTT results indicate that the viability of A549 cells was decreased by CA-4, plumbagin,
and berbamine. According to MTT data, silibinin and lentinan had no effect on the survival of
cancer cells. Additionally, MTT results proved that naturally occurring bioactive substances
showed a specific cytotoxic impact in HUVEC cells. Plumbagin was found to have a greater
effect at higher doses on HUVEC cell viability than A549 cells. The effects of berbamine,
plumbagin, and CA-4 on A549 and HUVEC cells were shown to be consistent with the SRB
findings. The production of tube-like structures in HUVEC cells was found to be suppressed
by the bioactive substances CA-4 (1 and 5 µM), plumbagin (1 and 3 µM), and berbamine (5
and 10 µM) at all indicated dosages. According to Western blot results, in A549 cells, the
expression of MMP-2 and VEGF-A was decreased by CA-4 (5 µM), plumbagin (10 µM), and
berbamine (10 µM) in contrast to the control. The findings of the in vivo CAM method showed
that vascular density was considerably reduced in hatching eggs treated with the bioactive
substances CA-4 (5 µM), plumbagin (10 µM), and berbamine (10 µM) in comparison to the
control. Histological examinations of the tumor tissues revealed that, tumors treated with
bioactive chemicals had less invasion into the CAM region, in comparison to the control. In
light of all these findings, it is believed that the naturally occurring bioactive substances
Combretastatin A-4, plumbagin and berbamine have therapeutic pharmaceutical potential as
lung cancer angiogenesis inhibitors.