MCF-7 hücrelerinde hücre ölümü ve rho kinaz arasındaki olası ilişkinin değerlendirilmesi
Evaluation of the possible relationship between cell death and RHO kinase in MCF-7 cells
Yazar: BURÇİN İBİŞOĞLU
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ARK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: GTP fosfohidrolazlar = GTP phosphohydrolases ; Hücre ölümü = Cell death ; Hücreler = Cells ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Rhokinaz = Rhokinase

Özet:
Kaspazlar, apoptoz sırasında proteaz kaskadının aktive edilmesinde rol almakta, anahtar yapısal proteinlerin ve önemli hücresel sinyallerin aktivasyonuna/ inaktivasyonuna yol açmaktadır. Diğer taraftan küçük G proteini Rho ve onun downstream efektörü Rho kinazın (ROCK 1 ve ROCK 2) hücre kontraksiyonu, proliferasyonu, apoptozu ve migrasyonu gibi çok çeşitli fizyopatolojik mekanizmada yer aldığı gösterilmiştir. Rho kinazlar yapısal olarak otoinhibitör aktiviteye sahiptir. ROCK 1'in, efektör kaspazlardan kaspaz-3 ile, ROCK 2'nin granzim B veya kaspaz-2 ile kesilerek aktive olduğu bilinmektedir. MCF-7 hücrelerinde kaspaz-3 geninin ekson 3 bölgesinden 47 baz çifti genomik bir mutasyonla fonksiyonel olarak silinmiştir. Bu nedenle birçok çalışma MCF-7 hücrelerinde apoptozun kaspaz-3 ile ilişkilendirilen birçok karakteristik özelliğinin (DNA fragmentasyonu, membran bleblenmesi gibi) gözlemlenmediğini söylemektedir. Bu tez kapsamında yapılan çalışmalar sırasında, kaspaz-3 bulunmayan MCF-7 hücrelerinde çeşitli ajanlar ile indüklenen hücre ölümünde, ROCK 1'in kesildiği ve bu kesilmenin kaspaz inhibitörlerine duyarlı olduğu tespit edilmiştir. ROCK 1'in gerçekten kaspaz-2 aracılığı ile kesilip kesilmeyeceğini belirlemek için, öncelikle bu proteinin aminoasit sekansı incelenmiştir. Yapılan biyoinformatik incelemelerde kaspaz-2 için birkaç olası ROCK 1 tanıma bölgesi olduğu saptanmıştır. Kaspaz-2'nin ROCK 1'i kesip kesmediğini doğrulamak için 3 farklı hücre lizatı (HeLA, MCF-7, MDA-MB-231) rekombinant aktif kaspaz-2 ile inkübe edilmiştir. Her üç hücre lizatında da eksojen aktif kaspaz-2 inkübasyonu ile ROCK 1 kesilmesi gözlenmiştir. Bu bulgular, hem ilaçla indüklenen hücre ölümü ile endojen olarak hem de eksojen aktif kaspaz-2 uygulaması sonucu meydana gelen ROCK 1 kesilmesinden, kaspaz-2'nin de sorumlu olabileceğine işaret etmektedir. Sonuç olarak, apoptotik süreçte kaspaz-2 aracılı yeni bir ROCK 1 kesilme bölgesinin belirlenmesi kanser tedavisinde yeni tedavi yaklaşımlarına katkı sağlayabilecektir.

Abstract:
Caspases play role in activating the protease cascade during apoptosis and  lead to activation/inactivation of the key structural proteins and cellular signalings. On the other hand, it is shown that small G protein Rho and its downstream effector Rho kinase (ROCK 1 and ROCK 2) are involved in several pathophysiologic mechanisms such as cell contraction, proliferation, apoptosis and cell migration. ROCK has constituve autoinhibitory activity. It is known that ROCKs are activated after ROCK 1 is cleaved by caspase 3, which is one of the effector caspases, and ROCK 2 is cleaved by caspase 2 and granzyme B. 47 base pairs located in exon 3 of caspase-3 gene is functionally removed with a genomic mutation in MCF-7 cells. Therefore, many studies state that many caspase 3-related apoptotic characteristics features (such as DNA fragmentation, membrane blebbing etc.) are not observable in MCF-7 cells. During the studies within the context of this thesis, it is observed that ROCK 1 is cleaved in various agents induced cell death in caspase-3-deficient MCF-7 cells, and that cleavage is sensitive to caspase inhibitors. Therefore, first the amino acid sequence of that protein has been analyzed for whether ROCK 1 might be literally cleaved by caspase 2. In bioinformatics analysis, it is found that there exist several possible recognition sequences of ROCK 1 for caspase-2. To confirm whether caspase-2 cleaves ROCK 1, three different cell lysates (HeLa, MCF-7 and MDA-MB-231) were incubated with recombinant active caspase-2. Cleavage of ROCK 1 with active caspase-2 incubation was observed for all three cell lysates. These findings suggest that caspase-2 might also be responsible for ROCK 1 cleavage endogenously in various agents-induced cell death and exogenously with recombinant active caspase-2 incubation as well. As a result, determination of a new possible caspase-2 mediated ROCK 1 cleavage site in the apoptotic process will contribute to new therapeutic approaches in cancer treatment.