Uyarılmış sitotoksik (CD8+)T hücre eksozomlarının akciğer kanseri üzerine etkisinin incelenmesi.
Examining the effect of activated cytotoxic (CD8+)T cell exosomes to the lung cancer.
Yazar: ELDAR SOVUNJOV
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ZEHRA SEDA HALBUTOĞULLARI
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Eksozomlar = Exosomes ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; T lenfositleri = T lymphocytes

Özet:
Amaç: Akciğer kanseri (AK) görülme sıklığı ve yol açtığı fiziksel, ruhsal, sosyal ve ekonomik sorunlar nedeniyle tüm dünyada ve ülkemizde önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Yapılan çalışmalar uyarılmış sitotoksik T hücreleri (USTH) ile tümör mikroçevresi (TMÇ) ve kanserin iyi seyri arasında pozitif bağlantı olduğunu göstermiştir. Son zamanlarda USTH'lerin bu etkisinde eksozomların da TMÇ'de metastazı destekleyebilecek mezenkimal kök hücrelerini engelleyerek rol aldığı gösterilmiştir. Eksozomlar çapı genellikle 40-150 nm olan; nükleik asit ve çeşitli proteinleri içeren mikroveziküllerdir. Eksozomlar doğal lipozom özelliği taşıdıkları, nanoboyutta oldukları ve membranlarında taşıdıkları protein ve lipid içeriklerinden dolayı kanda büyük ölçüde stabil kaldıkları için ilaçların kanser hücrelerine spesifik olarak iletilmesinde avantajlı olabilecekleri düşünülmektedir. Çalışmamızda USTH eksozomlarının A549 AK hücre hattı üzerindeki sitotoksik ve metastatik önleyici etkilerini in vitro olarak tespit etmeyi amaçladık.
Yöntem: Sitotoksik T hücreleri, sağlıklı bireylerden elde edilen tam kandan izole edildi ve uyarıldıktan sonra 5 ila 7 gün kültüre edildi. USTH serumsuz besiyerinden diferansiye ultrasantrifüj yöntemiyle eksozom izolasyonu yapıldı. İzole edilen eksozomların karakterizasyonu ve protein miktar tayini, akım sitometrisi ve BCA testi ile analiz edildi. Daha sonra USTH eksozomları ve USTH'ler 48 saat boyunca A549 hücreleri ile ortak kültüre alındı. Ortak kültür sonrası A549 hücrelerinin hücre canlılık analizi WST-1 deneyi ile gerçekleştirildi. Metastazla ilgili genlerin- MMP2, MMP9, TWİST, SNAIL, CDH1 - ifade düzeyleri qRT-PCR'da incelendi ve MMP2 ve MMP9 proteinleri konfokal mikroskopisinde değerlendirildi.
Bulgular: USTH ve eksozom izolasyon ve karakterizasyonları başarıyla gerçekleştirildi.
Yapılan analizlerde, USTH eksozomlarının kanser hücrelerinin çoğalmasını ve metastatik
özelliklerini azalttığı bulunmuştur.
Sonuçlar: AK hücre hattı üzerinde USTH eksozomlarının anti-metastatik ve anti-proliferatif
etkilerinin olduğu saptanmıştır.
Anahtar sözcükler: Akciğer kanseri, immunoterapi, eksozomlar, sitotoksik T
hücreler.

Abstract:
Objective: Lung cancer (LC) continues to be a major health problem worldwide due to its incidence and causing physical, psychological, social, and economic problems. Several studies have indicated a positive correlation between activated cytotoxic T cells (ACTC) in the tumor microenvironment (TME) and a good prognosis in cancer. Recently, ACTCderived exosomes (ACTC-dEX) have been implicated in this effect through inhibiting mesenchymal stem cells that may promote metastasis in the TME. Exosomes are microvesicles that are usually 40-150 nm in diameter and containing many biomolecules such as proteins, lipids, a wide variety of RNA molecules and DNA fragments. Exosomes are thought to be advantageous in the specific delivery of drugs to cancer cells, as they have the characteristics of natural liposomes, are nano-sized and remain largely stable in the blood due to the protein and lipid content they carry on their membranes. In this study, we aimed to detect the cytotoxic and metastatic inhibitory effects of ACTC-dEX on the A549 LC cell line in-vitro.
Method: Cytotoxic T cells were isolated from whole blood obtained from healthy individuals and cultured 5 to 7 days after stimulation. Exosomes from ACTC serum-free culture medium were collected by ultracentrifugation. The characterization and quantification of the isolated exosomes were analyzed by flow cytometry and BCA assay. We then co-cultured ACTC and ACTC-dEX with A549 cells for 48 hours. Afterward, the cell viability of A549 cells performed by WST-1 assay. MMP2 and MMP9 proteins evaluated by confocal microscopy and metastasis-related genes MMP2, MMP9, TWİST, SNAIL, CDH1 were detected by qRTPCR.
Results: ACTC and exosome isolation and characterization were performed successfully. In the analysis, it was found that ACTC-dEX reduced the proliferation and metastatic properties
of cancer cells.
Conclusions: As a result of the experiments, it was determined that ACTC-dEX have antimetastatic and anti-proliferative effects on LC cell line.
Keywords: Lung cancer, immunotherapy, exosomes, cytotoxic T cells.