Türkiye kaynaklı peynir örneklerinden izole edilen Enterococcus cinsi üyelerinin biyofilm oluşturma özelliklerinin araştırılması
Determination biofilm producing characteristics of Enterococcus strains isolated from turkey originated cheese samples
Yazar: MARYAM DIANI
Danışman: YRD. DOÇ. DR. NEFİSE AKÇELİK
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Çalışmamızda ilk olarak peynir izolatı olan 15 adet Enterococcus faecalis ve 33 adet
Enterococcus faecium izolatları ile, Enterococcus faecalis ATCC29212 ve Enterococcus
faecalis OG1RF kontrol suşularının biyofilm oluşum özellikleri incelenmiştir. E.
faecalis izolatların %26.6' si biyofilm üreticisi iken geri kalan izolatların biyofilm
üretim özelliğine sahip olmadığı belirlenmiştir. Bunun yanında, E. faecium izolatlarının
%33'sının biyofilm üreticisi olduğu belirlenmiştir. 48 Enterokok izolatının MIC
değerleri incelendiğinde kanamisin antibiyotiğine karşı 48 izolatın tamamı dirençli
bulunurken, izolatların %83.3' ü vankomisin antibiyotiğine karşı direnç profili
sergilemiştir. Ayrıca biyofilm üreticisi olan izolatların tamamı planktonik formdayken
gentamisine karşı duyarlı olmalarına karşın biyofilm ürettikleri durumlarda gentamisine
yüksek düzeyde (32000 mg/L) dirençli hale geçmişlerdir. Benzer şekilde, izolatlar
biyofilm oluşturduklarında vankomisin antibiyotiğine dirençlerinin 16000 mg/L'ye
kadar yükselmiştir. Hidrofobisite sonuçlarına göre izolatların biyofilm oluşturma
düzeyleri ve hidrofobisite yeteneği arasında anlamlı bir ilişkiye rastlanmamıştır.
İzolatların jelatinaz üretim denemesi sonucuna göre E. faecalis izolatları içerisinde dört
(64, 72, 78, 140 kodlu izolatlar) güçlü proteaz (+++), ve üç (ATCC 29212, 79, 81 kodlu
suşlar) negatif proteaz (-) ve kalan dokuz suş zayıf proteaz (+) özelliğinde suş
saptanmıştır. E. faecium izolatlarında ise bir suş (14 kodlu izolat) proteaz negatif
bulunurken, diğer 32 izolatın tamamının zayıf proteaz (+) olduğu belirlenmiştir.
İzolatların değişik glukoz konsantasyonda biyofilm üretimleri incelendiğinde; %0.1 ve
%1.5'lik glukoz içeren TSB besi ortamında %0.5'lik glukoz içeren TSB besi ortamına 
göre daha yüksek miktar biyofilm ürettikleri görülmüştür. Morfotiplendirme
denemesinde Enterokok izolatları tarafından üretilen biyofilmlerin tamamının aynı
morfotipte olduğu bulunmuştur. esp geni araştırılması sonucunda 48 suş arasında toplam
4 suş esp genini sahip olduğu belirlenmiştir. esp geni bakımından pozitif bulunan iki E.
faecalis izolatı (81 ve 119 kodlu izolatlar) ve iki E. faecium (60 ve 134 kodlu izolatlar)
izolatları arasında biyofilm üreticisi olmadığı ve biyofilm üreticisi E. faecalis ve E.
faecium izolatları arasında hiçbirinin esp genini içermediği tespit edilmiştir.
Enterokokların yüzey proteini kodlayan esp geninin biyofilm üreticisi olmayan S.
Typhimurium LT2'suşuna aktarımı sonucunda, bu genin S. Typhimurium LT2 suşunda
ifade edildiği qRT-PCR denemesi ile gösterilmiştir. Ayrıca bu bulgu, esp geninin Gram
pozitif bakteri proteini olmasına rağmen Gram negatif bir bakteride ifade olması ve daha
önce biyofilm üreticisi değilken, orta düzeyde biyofilm üreticisine dönüşmesi bakından
da önem taşımaktadır.

Abstract:
In this project, firstly, biofilm producing abilities of cheese originated 15 Enterococcus
faecalis and 33 Enterococcus faecium strains, and also Enterococcus faecalis
ATCC29212 and Enterococcus faecalis OG1RF control strains was investigated. 26.6%
of E. faecalis isolates was biofilm producer while, the rest of were not able to produce
biofilm. Besides these findings, 33% of E. faecium isolates was determined as biofilm
producers. Considering the MIC value of 48 enterococci isolate, all of tested 48 strains
were resistant against Kanamycin antibiotic and 83.3% of them were also exhibited
resistance profile against Vancomycin. In addition, despite of the entire biofilm
producer strains were resistant against Gentamicin antibiotic, they improved higher
levels of Gentamicin resistance (32,000 mg / L) after they form biofilm structure.
Similarly, when isolates form biofilm, their resistance level to Vancomycin antibiotic
had risen up to 16000 mg/L. According to results of hydrophobicity assay, there was no
any significant relation was found between hydrophobicity and biofilm production of
the strains. While considering results of gelatinase production experiments, we found
four of E. faecalis isolates (64, 72, 78, 140 coded isolates) were strong protease (+++)
and three of E. faecalis isolates (ATCC 29212, 79, 81 coded strains) were negative
protease (-) and the remaining nine strains were detected as weak protease (+) property.
Among E. faecium isolates, only one strain (14 coded isolates) was found as negative
proteases while the other 32 isolates was determined as weak protease (+). While we
examined the biofilm producing abilities of strains at different glucose concentrations,
we found that while strains grown in TSB medium supplemented with 0.1% and 1.5% 
glucose they produced higher levels of biofilm compared to 0.5% glucose. All strains
were found to be in the same morphotype. As a result of the investigation for the
presence of esp gene among strains, this gene was determined in four of the isolates. We
found that, none of the two E. faecalis isolates (81 and 119 coded isolates) and two E.
faecium (60 and 134 coded isolates) isolates who contains esp gene were biofilm
producer, while none of the biofilm producer strains were contains esp gene. Following
the clonning esp gene, encoding Enterococci surface protein, to non-biofilm producer S.
Typhimurium LT2 strains, we shown by qRT-PCR that this gene is expressed in S.
Typhimurium LT2. Also, these findings are important because esp gene is belong to a
Gram positive organism and can expressed in a Gram negative organism and this
organism become intermediate level biofilm producer following the transforming this
gene