Ganoderma türlerinde biyoaktif bileşiklerin HPLC-DAD ile belirlenmesi ve kemometrik analizleri
Determination of bioactive compounds in ganoderma species by HPLC-DAD and chemometric analysis
Yazar: ÖZGE TOKUL ÖLMEZ
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Günümüzde, dünyada ekonomik değeri yüksek olan Ganoderma türleri yıllardır başta kanser olmak üzere çeşitli hastalıklarda kullanılagelmektedir. Ülkemizde de Ganoderma türleri doğal olarak yetişmektedir. Bu türler arasında Ganoderma lucidum yüksek ekonomik değeri olan bir ağaç mantarıdır. Ayrıca, Ganoderma lucidum'un ülkemizde kültürü de yapılmaktadır.  Bu çalışmada, Ganoderma lucidum mantarına benzer yapı özellikleri gösteren Ganoderma adspersum, Ganoderma applanatum ve Ganoderma resinaceum türlerinin biyoaktif bileşiklerinin parmak izlerinin belirlenmesi amaçlandı. Buna ilaveten, üzerinde daha önceden çalışma yapılmamış Ganoderma recinaceum'dan biyoaktif bileşiklerin izolasyonlarının yapılması ve yapılarının spektroskopik yöntemlerle aydınlatılması hedeflendi. 
Farklı bölgelerden ve farklı ağaç türlerinden toplanan 4 farklı türe ait 14 adet Ganoderma örnekleri üçe ayrılarak, maserasyon, soxhlet ve utrasonik teknikleri kullanılarak sırasıyla petrol eteri, aseton ve metanol ile ekstraksiyonları yapıldı. Toplamda 126 farklı ekstre elde edildi. Elde edilen ekstrelerin antioksidan aktivitesi -karoten-linoleik asit, DPPH serbest radikal giderimi, ABTS katyon radikali giderimi ve CUPRAC yöntemleriyle kullanılarak test edildi. Tüm aseton ve metanol ekstrelerinin HPLC-DAD cihazıyla en iyi rezolusyonda parmak izi kromatogramları alındı. Tüm petrol eteri ekstreleri ise metillenerek GC-MS cihazında analiz edildi.
Ganoderma resinaceum mantarının antioksidan aktivite gösteren aseton ekstresi, silika jel adsorban üzerinden kolon kromatografisiyle fraksiyonlandırıldı. İnce tabaka kromatografisi kullanılarak benzer fraksiyonlar birleştirildi ve bu fraksiyonlardan, Sephadex LH-20, silika jel ve C18 ters faz kolon takılı preparatif HPLC ile 8 bileşik saflaştırıldı. Saflaştırılan saf maddelerin yapıları, 1D- ve 2D-NMR ve diğer spektroskopik metotlar kullanılarak aydınlatıldı. Ganoderma resinaceum'dan saflaştırılan bileşiklerin yapıları ergosterol peroksit (1), ganoderik asit C2 (2), ganoderik asit G (3), ganoderik asit B (4), ganoderik asit A (5), ganoderenik asit D (6), ganoderenik asit C (7) ve ganoderik asit D (8) olarak aydınlatıldı.
Ganoderma resinaceum'dan elde edilen bileşikler (1-8) ile grubumuzda Tricholoma anatolicum, Bjerkandera adusta, Inonutus dryadeus ve Sarcosphaera crassa mantarlarından izole edilen ergosterol (TA1), 5α,6α-epoksi ergosta-7,22-dien-3β-ol (TA2), ergosta-7,9,22 trien-3-O--D-glukozit (BA1), ergosta-22-en 3-ol (BA2), betulinan A (BA3), betulinan B (BA4), ergosta-5,22-dien 3-ol (ID1) ve ergosta-5,22-dien-3-on (ID2), ergosta-5,22-dien 3-O--D-glukopiranosit (SC1), ergosta-5,22-dien 3-O--D-ksilofuranosil (SC2), ergosta-5,22-dienil 3-O--heptanoat (SC3), ergosta-5,22-dienil 3-O--12-cis-hegzadekenoat (SC4), ergosta-5,22-dienil 3-O--dekanoat (SC5) bileşikleri ve 27 adet standart bileşiğin (St1-St27) HPLC cihazında ekstrelerin kromatogramlarının alındığı şartlarda kromatogramda yerleri belirlendi. Bu Ganoderma türlerinde tespit edilen yukarıdaki standart bileşiklerin (St1-St27) ve Ganoderma resinaceum'dan elde edilen bileşiklerin (1-8) validasyonları yapılarak çalışılan mantarlardaki miktarları belirlendi. Böylece 42 aseton ve 42 metanol ekstrelerinde çok sayıda fenolik bileşen, steroit ve triterpen Ganoderma türü mantarlarda taranmış oldu.
Bunun yanı sıra HPLC-DAD kromatogramlarında antioksidan aktivite gösteren bileşiklere ait pikler DPPH radikali kullanılarak belirlendi. Çalışmamızda farklı ekstraksiyon tekniklerinin, bölgesel farklılıkların, mantarın yetiştiği ağaç türlerinin etkisinin değerlendirilmesi için kemometrik yaklaşımdan yararlanıldı.
Bu tez çalışması ile günümüzde Reishi mantarı olarak bilinen ve tıpta yaygın olarak kullanılan Ganoderma lucidum mantarının kimyasal içerikleri bakımından diğer Ganoderma türü mantarlarla benzerliği tespit edildi. Ege bölgesi civarından toplanan mantarların kimyasal içeriklerinde mantarın yerleştiği ağaç türünün etkisi ilk kez bu tez çalışması ile araştırıldı ve mantarın yetiştiği ağacın ve ekstraksiyon yönteminin özellikle triterpenlerin türü ve miktarlarında değişikliğe yol açtığı belirlendi.

Abstract:
Ganoderma species, having high economic valued tree mushroom in the world, have been used for various diseases, especially against cancer for years. Ganoderma species are also naturally grown in our country. Among these species, Ganoderma lucidum has the highest economic value. In addition, Ganoderma lucidum is cultured in our country. In this study, it was aimed to determine the fingerprints of bioactive compounds of Ganoderma adspersum, Ganoderma applanatum and Ganoderma resinaceum species and to compare them with that of Ganoderma lucidum. In addition, the isolation and structure elucidation of bioactive compounds of Ganoderma resinaceum, previously unstudied, using spectroscopic methods were aimed.
Fourteen Ganoderma samples belonging to 4 different species collected from different regions and different host trees were separated into three parts and each part was extracted with petroleum ether, acetone and methanol, successively, using maceration, soxhlet and ultrasonic techniques. A total of 126 different extracts were obtained. Antioxidant activity of the extracts was tested by three complimentary assays; namely, β-carotene-linoleic acid, DPPH free radical scavenging, ABTS cation radical scavenging and CUPRAC. Fingerprint chromatograms of all acetone and methanol extracts were obtained with the best resolution using HPLC-DAD instrument. All petroleum ether extracts, however, were methylated and analyzed on a GC-MS instrument.
The acetone extract of Ganoderma resinaceum exhibiting antioxidant activity was fractionated by column chromatography over silica gel adsorbent. Similar fractions were combined using thin layer chromatography and 8 compounds were purified from these fractions by column chromatography over sephadex LH-20 and silica gel adsorbents, and by preparative recycling HPLC equipped with C18 reverse phase column. The structures of the purified compounds were elucidated using 1D-, and 2D-NMR and mass spectroscopic techniques. The structures of the compounds purified from Ganoderma resinaceum were ergosterol peroxide (1), ganoderic acid C 2 (2), ganoderic acid G (3), ganoderic acid B (4), ganoderic acid (5) acid C (7) and ganoderic acid D (8).
The compounds (1-8) isolated from Ganoderma resinaceum, and ergosterol (TA1), 5α,6α-epoxy ergosta-7,22-dien 3β-ol (TA2), ergosta-7,9,22 triene 3-O-β-D-glucose (BA1), ergosta-22-en 3-ol (BA2), betulinan A (BA3), betulinan B (BA4), ergosta-5,22-diene 3β-ol (ID1), ergosta-5,22-dien-3-one (ID2), ergosta-5,22-diene 3-O-β-D-glucopyranoside (SC1), ergosta-5,22-diene 3-O-β-D-xylofuranosyl (SC2), ergosta-5,22-dienyl 3-O--heptanoate (SC3), ergosta-5,22-dienyl 3-O-α-12-cis-hexadecenoate (SC4), ergosta-5,22-dienyl 3-O--decanoate (SC5) isolated from Tricholoma anatolicum, Bjerkandera adusta, Inonutus dryadeus and Sarcosphaera crassa mushrooms by our other group members, and 27 purchased standards (St1-St27) were studied using developed two HPLC methods in HPLC-DAD to chromatographically located the compounds. Two validated HPLC methods were established for the standard compounds (St1-St27) and the compounds obtained from Ganoderma resinaceum (1-8) to search the amounts of these compounds in 84 Ganoderma extracts. Thus, a large number of phenolic compounds, steroids and triterpenes in acetone and methanol extracts of Ganoderma species were screened.
Besides, the peaks of the compounds having antioxidant activity were determined by HPLC-DAD chromatograms using the DPPH free radical. We used a chemometric approach to assess the effects of different extraction techniques, regional differences, and mushroom species to the compounds amounts.
In this thesis, a similarity was found between in terms of the chemical content of Ganoderma lucidum, which is commonly known as Reishi and used as for medicinal purposes, and other Ganoderma species studied herein. The effect of the host tree on the chemical content of the mushrooms collected from the Aegean region were investigated for the first time in this thesis. It has been determined that the host tree and the extraction method are leaded to differences of the amounts of triterpenes, especially.