Hepatoselüler karsinomda mitofajik genlerin rolü ile genetik ve epigenetik profilinin araştırılması
Investigation of the role of mitophagic genes and their genetic and epigenetic profile in hepatocellular carcinoma
Yazar: METEHAN KARATAŞ
Danışman: PROF. DR. MATEM TUNÇDEMİR ; DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞBA SOYDAŞ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Epigenetik = Epigenetic ; Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Hepatoselüler karsinom = Hepatocellular carcinoma ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Promotor bölgeler-genetik = Promoter regions-genetic ; Protein ekspresyonu = Protein expression

Özet:
Hepatoselüler karsinom (HCC) en sık ve mortalite oranı en yüksek olan karaciğer kanseridir ve dünyada kansere bağlı ölümlerde 2. Sırada yer alır. Normal süreçte hücrenin genetik materyalinde bir hasar olduğunda ve bu hasar tamir edilemezse hücre ölüm mekanizmaları aktifleşir. Bu mekanizmalardan biri olan otofajinin alt tipi olan ve mitokondriyal kalite kontrolü sağlayan mitofaji ise hücrede kanser oluşumunu engelleyen bir olaydır. Karsinogenez süreci içerisinde genetik değişiklikler dışında DNA dizilerinde kalıcı değişikliklere yol açmayan Epigenetik mekanizmalarda oluşan anomaliteler de kansere neden olmaktadır. Epigenetik mekanizmalardan birisi olan DNA metilasyonu karsinogenez sırasında hipermetile olarak tümör baskılayıcı genleri susturarak kanserleşmeye sebep olabilir. Mitofajide rol alan AMBRA1, FUNDC1, PGAM5 ve LC3 genlerinin HCC karsinogenezindeki rollerini aydınlatmayı amaçladığımız çalışmada HepG2 ve HUVEC hücre hatlarına ait örneklerde AMBRA1, FUNDC1, PGAM5 ile LC3 genlerinin mRNA ekspresyonu, metilasyon ve protein seviyeleri qRT-PCR, QMSP ve ELISA yöntemleriyle incelenmiştir. AMBRA1 için tümör örnekleri ile normal örnekler kıyaslandığında protein seviyesinde azalma ile birlikte mRNA ekspresyonu açısından örneklerin %60 (3/5)'ında artış, %20'sinde (1/5) azalma gözlenirken %20 (1/5)'sinde ise değişiklik gözlemlenmedi. Tümör örneklerinin %40 (2/5)'ında ve normal örneklerin %80 (4/5)'inde AMBRA1 geninin promotör bölgesine ait hipermetilasyon tespit edilmiştir. FUNDC1 için protein seviyesi istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azalma gözlemlenirken (p=0.024), mRNA ekspresyonunda %80 (4/5) ekspresyon artışı, %20 (1/5) azalma gözlemlendi. Promotör hipermetilasyonuna bakıldığında yalnızca tümör örneklerinin %20 (1/5)'sinde promotör hipermetilasyonu gözlemlendi. Tümör örneklerinde PGAM5'in hem protein seviyesi de anlamlı şekilde azalırken (p=0.0005) hem de mRNA ekspresyonunda %80 (4/5) PGAM5 ekspresyonunda artış gözlemlendi. Promotör metilasyonu ise hem tümör hem normal örneklerin %40 (2/5) ve %40 (2/5)'ında tespit edildi. LC3 geninin tümör hücrelerinin %60(3/5)'ında mRNA ekspresyonunda azalma gözlemlenirken %20 (1/5)'sinde ekspresyon artışı gözlemlendi ve %20(1/5)'sinde ise ekspresyonda değişim gözlemlenmedi. Protein seviyelerine bakıldığında tümör grubundaki protein seviyesi normal gruba kıyasla artmıştır. Tümör örneklerinin %40 (2/5)'ında, normal örneklerin ise %80 (4/5)'inde LC3 geninin promotör bölgesine ait hipermetilasyon tespit edilmiştir. AMBRA1, FUNDC1, PGAM5 ve LC3'ün protein ve metilasyon seviyeleri arasında istatistiksel anlamlılık bulunmuştur (sırasıyla p<0.0001, p=0.001, p=0.002, p<0.0001). İn vitro olarak incelenen bu mitofajik genlerin diğer genlerle olan etkileşimlerinin daha geniş hasta kohortlarında çalışılması hem terapötik hem de biyobelirteç stratejilerin oluşturulmasında kullanılabilir

Abstract:
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common liver cancer with the highest mortality rate and ranks 2nd in cancer-related deaths in the world. Under physiological circumstances, the activation of cell death pathways becomes imperative when the genetic material of a cell sustains irreparable damage. Mitophagy, a specific subtype of autophagy entrusted with the maintenance of mitochondrial quality control, emerges as a pivotal cellular process impeding the genesis of cancer within the cell. During the carcinogenesis process, disruptions in epigenetic mechanisms, which don't involve permanent changes in DNA sequences, are implicated in causing cancer. DNA methylation, a specific epigenetic mechanism, can lead to the development of cancer by hypermethylating tumor suppressor genes, causing their suppression and promoting carcinogenesis. In our investigation we aim to unraveling the roles of AMBRA1, FUNDC1, PGAM5, and LC3 genes in hepatocellular carcinoma (HCC) carcinogenesis through mitophagy and we examined samples from HepG2 and HUVEC cell lines. We utilized qRT-PCR, QMSP, and ELISA methods to determine the mRNA expression level, promoter methylation, and protein levels.When comparing tumor samples to normal ones for AMBRA1, 60% (3/5) of the samples showed an increase in mRNA expression alongside a decrease in protein levels. In 20% (1/5) of the samples showed expression decrease while 20% (1/5) showed no change. Hypermethylation of the promoter region of the AMBRA1 gene was detected in 40% (2/5) of tumor samples and 80% (4/5) of normal samples. While a statistically significant decrease in protein level was observed for FUNDC1 (p=0.024), an 80% (4/5) increase in expression and a 20% (1/5) decrease in mRNA expression was observed. When promoter hypermethylation was examined, FUNDC1 promoter hypermethylation was observed only in 20% (1/5) of the tumor samples. In tumor samples, both the protein level of PGAM5 decreased significantly (p = 0.0005) and an 80% (4/5) increase in PGAM5 expression was observed in its mRNA expression. Promoter methylation was detected in 40% (2/5) and 40% (2/5) of both tumor and normal samples. In 60% (3/5) of the tumor cells, there was an observed decrease in mRNA expression of the LC3 gene, whereas 20% (1/5) of samples showed elevated expression level and  20% (1/5), no expression change is noticed. The protein level in the tumor group increased compared to the normal group. Hypermethylation of the promoter region of the LC3 gene was detected in 40% (2/5) of tumor samples and 80% (4/5) of normal samples. Statistical significance was found between the protein and methylation levels of AMBRA1, FUNDC1, PGAM5 and LC3 (p<0.0001, p=0.001, p=0.002, p<0.0001, respectively). Studying the interactions of these mitophagic genes examined in vitro with other genes in larger patient cohorts can be used to create both therapeutic and biomarker strategies.