Primer idiopatik nefrotik sendromlu hastaların böbrek biyopsilerinde interlökin-13 varlığı ve steroid cevabı arasındaki ilişki
The relationship between interleukin-13 presence in kidney biopsies of patients with primary idiopathic nephrotic syndrome and steroid response
Yazar: HÜLYA TÜRKMEN
Danışman: PROF. DR. SELÇUK YÜKSEL
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Biyopsi = Biopsy ; Böbrek = Kidney ; Böbrek hastalıkları = Kidney diseases ; Nefrotik sendrom = Nephrotic syndrome ; Steroidler = Steroids ; İnterlökin 13 = Interleukin 13

Özet:
Amaç: Çocukluk çağında sık görülen idiopatik nefrotik sendromların (İNS) büyük bir çoğunluğunu minimal değişiklik hastalığı (MDH) ve fokal segmental glomeruloskleroz (FSGS) oluşturur. MDH büyük oranda (%95) steroide yanıt verirken, FSGS'de bu oran çok düşüktür (%20). Klinisyenler genellikle steroide verilen yanıta göre hastalığın MDH veya FSGS olabileceği konusunda ön değerlendirme yapmakta ve çoğunlukla da steroide yanıt vermeyen gruba FSGS olabileceği için biyopsi yapmaktadırlar. Bununla birlikte steroid dirençli hastaların bir kısmında biyopsi materyallerinde FSGS bulgusu lezyon fokal olduğu için tespit edilememektedir. Oysa ki, bu hastaların glomerüllerinde daha önceden başlayan moleküler ve protein düzeyinde değişikliklerin var olduğu zaten bilinmektedir. İnterlökin-13 (IL-13) helmint enfeksiyonlarında ve alerjik hastalıklarda anahtar role sahip olmakla birlikte son yıllarda İNS hastalarının serum örneklerinde yapılan çalışmalarda önem kazanmış bir sitokindir (1-7). IL-13 immün sistemdeki rolü gereği; makrofaj aktivasyonunda klasik yoldan inflamatuar etki gösterirken, alternatif yoldan ise inflamasyonu kontrol etme, doku onarımı ve fibrozis gelişimini tetiklemektedir (8). Yapılan birçok çalışmada podosit yapısında değişikliğe yol açarak gerek sirküle eden faktör olarak gerek immünolojik olarak özellikle steroide duyarlı nefrotik sendromda (SSNS) proteinürinin başlangıcı ve relaps patogenezi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir (9-11). Bununla birlikte bugüne kadar IL-13'ün steroide yanıt veren ve vermeyen İNS'da doku düzeyindeki farklılıkları bilinmemektedir. Bu çalışmada hastalığın başlangıcında steroide yanıt veren ve vermeyen İNS'lu hastalarda böbrek dokusu düzeyinde IL-13'ün varlığı ve anti IL-13 ile boyanma yoğunluğundaki değişiklikleri araştırmayı hedefledik.
Yöntem: Kliniğimizde İNS tanısı alıp böbrek biyopsisi yapılmış 42 hastanın biyopsi materyalleri yeniden hazırlandı ve anti IL-3 ile uygun tekniklerle boyandı (1:100) (AB106732-Rabbit polyclonal antibody IL-13-Abcam plc 330 Cambridge). İmmünhistokimyasal boyanma özellikleri görsel derecelendirme sistemi kullanılarak ışık mikroskobunda karşılaştırıldı (0=boyanma yok, 1=hafif hissedilebilir boyanma, 2=orta derecede boyanma, 3=güçlü boyanma). Hastaların demografik özellikleri (biyopsi endikasyonu, steroid yanıtı, ilave immünsupresif tedavileri, son durumu, laboratuvar değerleri, komplikasyonları) kayıt edildi ve hastalar steroid yanıtına göre iki gruba [yanıt verenler (steroid bağımlılar dahil) ve vermeyenler] ayrıldı (SSNS-SRNS). Hasta grupları için İNS olmayan ancak izole proteinürisi olan ve böbrek biyopsisi yapılmış hastalardan kontrol grubu oluşturuldu. Biyopsi materyallerinin (anti IL-13 boyanımı) negatif kontrolü için de başka nedenlerle nefrektomi yapılıp proteinürisi olmayan 21 hastanın sağlam böbrek dokuları kullanıldı. Verilerin istatistiksel analizinde SPSS 20.0 (SPSS Inc, USA) paket programı kullanıldı. 
Bulgular: Hastaların %52,4'ü (n=22) erkek, %47,6'sı (n=20) kızdı. Yaş ortalaması 9,5 ± 4,2 saptandı. Steroid cevabına göre 19 hasta (%45,2) steroid dirençli nefrotik sendrom (SRNS), 16 hasta (%38,1) steroid duyarlı nefrotik sendrom (SSNS) olarak gruplandırıldı. İzole proteinüri grubu olarak 7 (%16,7) hasta alındı. İncelenen glomerül sayısı her hasta için 19 ± 11 idi. Hastalardan 14'ünün (%33,3) patolojisi FSGS ile uyumlu iken geri kalan 28 (%66,7) hastanın böbrek biyopsisi normal bulgular ya da nonspesifik değişiklikler içermekteydi. Anti IL-13 ile immünhistokimyasal boyanma 19 (%45,2) hastada '0', 15 (%35,7) hastada '1+', 8 (%19) hastada '2+' olarak değerlendirildi. Hiçbir hastada '3+' boyanma olmadı. 
İki pozitif boyanma olan hastaların tamamı SRNS grubunda idi. Ayrıca '2+' yoğunlukta boyanan dokulara sahip hastaların hiçbiri, steroid dışındaki immunsupresif ajanlara da yanıt vermemişti. İki pozitif boyanma olan 8 hastanın 5'i (%63) hiç remisyona girmemiş diğer 3 hasta ise kısmi remisyonda idi.
Sonuç: Bu çalışmada SRNS olan, özellikle diğer immünsupresiflere de dirençli olan grupta doku düzeyinde anti IL-13 boyanımıının daha yoğun olduğunu saptadık. Önceki çalışmalarda; SSNS'li hastaların serumunda IL-13 mRNA ekspresyonunun, idrarda IL-13 atılımının, relaps sırasında remisyona kıyasla arttığı, IL-13 aşırı ekspresyonunun MDH oluşturulmuş sıçanlarda podosit hasarına yol açtığı, SSNS'de relaps sırasında serum IgE düzeylerinin yükseldiği ve bunun IL-13 upregülasyonu ile korele olduğu gösterilmiştir. Biz çalışmamızda SRNS grubunda daha yoğun boyanma olduğunu gözledik. Bunun nedeni önceki çalışmalardan farklı olarak bu çalışmada doku düzeyinde moleküler olarak çalışılması olabileceğini düşünmekteyiz. FSGS hastalarında yoğun boyanma olması fibrozis başlangıcı ile ilişkili olabilir. IL-13'ün immün sistemdeki iki yönlü görevi nedenli farklı sonuçlar elde edilmiş olabilir. Bu çalışmanın FSGS'de morfolojik bulgular başlamadan önce doku düzeyinde IL-13'teki değişiklikler ile immünsupresif tedavilere yanıtın belirlenmesinde ileride yapılacak çalışmalar ve tedavide kullanılabilecek alternatif biyolojik ajanlar için yol gösterici olacağı kanısındayız.

Anahtar Kelimeler; Nefrotik Sendrom, Steroid yanıtı ve Ġnterlökin-13

Abstract:
Objectives: The majority of idiopathic nephrotic syndromes (INS) that are common in childhood form minimal change disease (MDH) and focal segmental glomerulosclerosis (FSGS). MDH responds to steroids in a large proportion (95%) while this rate is very low in FSGS (20%). Clinicians often make a preliminary assessment that the disease may be MDH or FSGS according to the response to the steroid, and biopsy is often performed because the FSGS may be the group that does not respond to the steroid. However, in some of the steroid resistant patients, FSGS findings in biopsy materials cannot be detected because the lesion is focal. However, it is already known that there are changes in the molecular and protein level of the glomeruli of these patients. Interleukin-13 (IL-13) has a key role in helminth infections and allergic diseases (1-7). The role of IL-13 in the immune system; In the macrophage activation, it has a classical inflammatory effect, while the alternative way is to control inflammation, tissue repair and fibrosis. In many studies, it is thought to be related to the onset of proteinuria and the pathogenesis of relapse, especially in the steroid sensitive nephrotic syndrome (SSNS), as a circulating factor, leading to a change in podocyte structure (9-11). However, until now, the differences in the tissue level of IL-13 in steroid-responsive and non-stabile insulin are unknown. In this study, we aimed to investigate the presence of IL-13 in renal tissue levels and the changes in the intensity of anti-IL-13 staining in patients with non-steroid response and non-steroid response at the onset of the disease.
Methods: The biopsy specimens of 42 patients who underwent renal biopsy in our clinic were re-prepared and stained with anti-IL-3 techniques (1: 100) (AB106732-Rabbit polyclonal antibody IL-13-Abcam plc 330 Cambridge). Immunohistochemical staining properties were compared in light microscopy using a visual grading system (0=no staining, 1=mild, 2=moderate, 3=strong staining). Demographic characteristics (biopsy indication, steroid response, additional immunosuppressive therapies, final status, laboratory values, complications) of the patients were recorded and patients were divided into two groups (including those responding to steroid addicts and non-responders) according to steroid response (SSNS-SRNS). For the patient groups, control group was formed from patients who had non-NS but isolated proteinuria and underwent kidney biopsy. For the negative control of the biopsy materials (anti IL-13 staining), 21 patients with nephrectomy and proteinuria were used for intact renal tissues. SPSS 20.0 (SPSS Inc, USA) package program was used for statistical analysis of the data.
Results: Fifty-two-point four percent (n=22) of the patients were male and 47.6% (n=20) were female. The mean age was 9.5 ± 4.2. According to the steroid response, 19 patients (45.2%) were grouped as steroid resistant nephrotic syndrome (SRNS) and 16 patients (38.1%) as steroid-sensitive nephrotic syndrome (SSNS). Seven (16.7%) patients were isolated as isolated proteinuria group. The number of glomeruli was 19 ± 11 for each patient. The pathology of 14 (33.3%) patients was consistent with FSGS and the remaining 28 (66.7%) patients had normal findings or nonspecific changes. Immunohistochemical staining with anti-IL-13 was assessed as '0' in 19 (45.2%) patients, '1+' in 15 (35.7%), and '2+' in 8 (19%) patients. None of the patients had '3+' staining. All patients with two positive staining were in the SRNS group. In addition, none of the patients with tissues stained in two densities responded to immunosuppressive agents other than steroids. Of 8 patients with two positive staining, 5 (63%) were not in remission at all; the other 3 patients were in partial remission.
Conclusion: In this study, we found that anti-IL-13 staining was more intense in patients with SRNS, especially those resistant to other immunosuppressors. In previous studies; IL-13 mRNA expression in the serum of patients with SSNS, IL-13 excretion in urine increased compared to remission during relapse, IL-13 overexpression caused podocyte damage in MDH-induced rats, increased serum IgE levels during relapse in SSNS and IL-13 has been shown to be correlated with upregulation. In our study, we observed more intense staining in the SRNS group.
The reason for this is that, unlike previous studies, this study may be studied molecularly at the tissue level. Intense staining in FSGS patients may be associated with the onset of fibrosis. Different results may have been obtained due to the two-way task of IL-13 in the immune system. We believe that this study will guide the determination of changes in IL-13 at the tissue level before the initiation of morphological findings in FSGS and will be a guide for future studies and alternative biological agents in the treatment of the response to immunosuppressive therapies.

Keywords; Nephrotic Syndrome, Steroid Response and Interleukin-13