Haşhaşta alkaloit biyosentezinin metabolik mühendislik, yeni nesil dizileme ve işlevsel genomik yaklaşımları uygulanarak incelenmesi
Evaluation of alkaloid biosynthesis in opium poppy by applying metabolic engineering, next-generation sequencing and functional genomics approaches
Yazar: ESMA ÖZHÜNER
Danışman: DOÇ. DR. İSKENDER PARMAKSIZ ; DOÇ. DR. TURGAY ÜNVER
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Haşhaş (Papaver somniferum L.), morfin gibi benzilizokuinolin tipi alkaloitleri (BIA) üreten önemli bir tıbbî bitkidir. Bu çalışmada BIA biyosentezinde rol oynayan 3-hidroksi-N-metilkoklaurin4´-O-metiltransferaz (4´OMT) ve retikulin 7-O- metiltransferaz (7OMT) genleri; yaprak, gövde ve kapsül dokularında aşırı ifade ettirilmiş ve ayrıca virüs indükleyici gen susturma (VIGS) metodu ile baskılanmıştır. Bu genlerde gerçekleşen baskılanma ve aşırı ifadelenme,  transkript ve protein düzeyinde doğrulanmıştır. Ek olarak, doğrulamaları yapılan manipülâsyonların alkaloit seviyelerine olan etkileri de araştırılmıştır. Sonuçlar; aynı genin baskılanması ve aşırı ifade ettirilmesi, farklı dokularda çeşitli metabolitlerin seviyelerini değiştirdiğini ve bununla birlikte morfin sentezinde rol alan genlerin (COR, SAT, TYDC, CNMT ve 6-OMT) transkripsiyonunu da değişik seviyelerde etkilediğini göstermiştir. Örneğin, 4´OMT geninin baskılanmasının, toplam alkaloit içeriğini gövdede azaltırken, kapsülde artırdığı belirlenmiştir. 7OMT gen baskılanması ise gövde dokusunda toplam alkaloit miktarının artmasına neden olmuştur. Diğer taraftan, 4´OMT ve 7OMT genlerinin aşırı ifade edilmesi, gövde dokusunda daha yüksek morfin birikimiyle sonuçlanırken, kapsül dokusunda ise morfin miktarı azalmıştır. Ayrıca, kapsül dokusunda Roche 454-GS FLX+ teknolojisi ile gerçekleştirilen transkriptom dizilemesi sonucuna göre, 4´OMT ve 7OMT genlerinin manipülasyonunun pek çok transkriptin ifadesinide değiştirdiği görülmüştür. Bu transkriptlerden özellikle sekonder metabolit birikimi ile ilişkili olan adenozilhomosisteinaz 1 transkriptinin ve toplam alkaloit miktarının, 4´OMT geni aşırı ifade edilince kapsül dokusunda ifade düzeylerinde azalma tespit edilmiştir. 7OMT geni baskılandığında ise, ifadesi değişen transkriptlerin enerji ve metabolit üretimini arttırırken morfin birikimini de indüklediği bulunmuştur.

Abstract:
Opium poppy (Papaver somniferum L.) is a valuable plant producing BIA, such as morphine. In this study, 3-hydroxy-N-coclaurine 4'-O-methyltransferase (4'OMT) and reticulin 7-O- methyltransferase (7OMT) genes, which play an important role in the BIA biosynthesis, were over-expressed in leaf, stem and capsule tissues. The genes were also suppressed by virus inducer gene silencing (VIGS) method. The over-expression and suppression that occured in the genes were confirmed at transcript and protein levels. In addition, the effects of verified manipulations on alkaloid levels were also investigated. The results showed that the suppression and over-expression of the same gene changed the levels of various metabolites in different tissues, while variously effecting the levels of the transcription of some genes that play a role in morphine synthesis. Suppression of the expression of 4'OMT gene caused reduction in total alkaloid content in stem tissue, whereas it was found to increase in the capsule. The 7OMT gene suppression led to an increase in total alkaloid content in stem tissues. On the other hand, over-expressions of 4'OMT and 7OMT genes resulted in higher morphine accumulation in stem tissues, whereas the amount of morphine decreased in capsule tissue. In addition, according to transcriptome studies carried out by Roche 454 GS-FLX sequencing technology, the manipulation of 4'OMT and 7OMT genes led to changes in expression of many transcripts in capsule tissue. When 4'OMT gene was over-expressed in capsule, there was a decrease in the levels of total alkaloid amount and transcription of adenosylhomocysteinase 1 gene, which is associated with the accumulation of secondary metabolites. As a result of suppression of 7OMT gene, transcripts whose expression changed were found to increase energy and metabolite production while inducing morphine accumulation.