Array-CGH ile tespit edilen kopya sayısı değişikliklerinin doğrulanmasında kantitatif PCR yönteminin kullanılması /
Yazar: AYSEL ÜNAL
Danışman: PROF. DR. FERDA EMRİYE PERÇİN
Gazi Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Genetik = Genetics ; Genetik varyasyon = Genetic variation ; Genler = Genes ; Genom = Genome ; Kromozom delesyonu = Chromosome deletion ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic

Özet:
İnsan genomunda yaklaşık 3,2 milyar nükleotid bulunmaktadır. Bireylerin genomları arasında, farklı büyüklüklerde değişiklikler olabilmektedir. Bu değişiklikler, insanların birbirinden farklı özelliklere sahip olmasını sağladığı gibi, hastalıklara da neden olduğu bilinmektedir. Tek nükleotid değişikliklerine tek nükleotid polimorfizmi (Single nucleotide polymorfism-SNP), kısa (2-50 baz) delesyon ve insersiyonlara indel, kromozom bölümlerinin 50 bazdan büyük değişikliklerine ise kopya sayısı değişimi (Copy Number Variation, CNV) adı verilmektedir. CNV'lerin hastalıklardaki önemi anlaşıldıkça bunları saptamaya yönelik yöntemler de gelişmeye başlamıştır. CNV araştırmalarında, genom boyu veya hedefe yönelik yöntemler kullanılmaktadır. 
Array tabanlı komperatif genomik hibridizasyon (Array CGH) ve tek nükleotid polimorfizm (Single Nucleotide Polymorphisim, SNP) array, genel isimlendirme olarak kromozomal mikroarray, entelektüel yetersizlik, gelişme geriliği ve çoklu konjenital anomalisi olan hastalarda ilk seçenek tanı testi olarak önerilmektedir. Günümüzde CNV saptamada kullanılan standart metod, array-CGH'dir ancak teknik nedenlerden kaynaklanan yanlış pozitif sonuçlar nedeniyle, yanlış tanıya yönlendirebilmektedir. Bu nedenle, fenotipik etkisi olduğu düşünülen değişikliklerin güvenilir bir yöntem ile doğrulanması gerekmektedir. 
Bu tez çalışmasında hedefe yönelik bir CNV saptama yöntemi olan kantitatif real-time PCR (qPCR)'ın doğrulama çalışmalarında güvenilirliğinin gösterilmesi; ayrıca, doğrulanan spesifik mikrodelesyon/mikroduplikasyon sendromlarının genotip/fenotip korelasyonu yapılarak literatüre katkı sağlanması amaçlanmıştır. 
Bu araştırma retrospektif bir çalışma olup, Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı'na entelektüel yetersizlik ve/veya çoklu konjenital anomali nedeniyle başvuran, klinik değerlendirme sonucunda Array-CGH uygulanan ve sonuçların doğrulanması için qPCR yöntemi uygulanmış olan 10 hastanın 10 CNV bölgesi değerlendirilmiştir. qPCR çalışmasında 10 CNV'den 2'sinin yanlış pozitif olduğu saptanmış, 8'i başarı ile doğrulanmıştır. Doğrulanan 8 CNV'den 4'ünün ailesel (3'ü anneden 1'i babadan), 4'ünün de novo olduğu görülmüştür. Bu sonuçlar; array CGH'te saptanan ve hastanın kliniği ile ilişkili olabilecek değişikliklerin mutlaka ikinci bir yöntemle doğrulanması gerektiğini ve literatürdeki güvenilirlik çalışmalarıyla birlikte, qPCR'ın bu amaçla güvenle kullanılabilecek bir yöntem olduğunu göstermiştir. Doğrulama çalışmalarının ebeveynlerle birllikte yapılması, CNV'lerin patojenite değerlendirmesine katkıda bulunmuş ve doğru genetik danışma verilmesini sağlamıştır. Bu tez çalışmasında ayrıca doğrulanan mikrodelesyon/ mikroduplikasyonlarda bulunan HTR7, CDC16, OPHN1, GLRA1, ATP6AP2 genleri ile hastaların kliniği arasında genotip/fenotip korelasyonu yapılmış ve literatüre katkı sağlanacağı düşünülmüştür.

Abstract:
The human genome contains approximately 3,2 billion nucleotides. There are different size of variations between individuals which are the basis for phenotypic variations or may be the cause for diseases. Single nucleotide changes from the reference genome  are called single nucleotide polymorphism (SNP), short (2-50 bases) deletions and insertions are named indels and chromosome changes greater than 50 bases are called copy number variation (CNV). As the importance of CNVs are recognized in diseases, methods for detecting them have increased to develop. Genome-wide or targeted methods are used in CNV studies.
Array-based Comperative Genomic Hybridization (Array-CGH) and Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP Array), chromosomal microarray as  the general name, is suggested as the first choice diagnostic test in patients with intellectual disability, developmental delay and multiple congenital abnormalities. The standard method used in CNV detection today is array-CGH but it may lead to false positive results due to technical reasons. Therefore copy number changes that are thought to heve phenotypic effects need to be confirmed by a reliable method.
In this study, it is aimed to demonstrate the reliability of a targeted CNV detection method, quantitative real-time PCR (qPCR) in validation studies and also to contribute to the literature by correlating the genotype / phenotype of specific microdeletion / microduplication syndromes confirmed.
This study was a retrospective study evaluating 10 CNV regions of 10 patients who applied to Gazi University Medical Genetics Department due to intellectual disability and / or multiple congenital anomalies. After clinical evaluation, Array-CGH and then qPCR methods  were applied to confirm the results. In the qPCR trial, 2 out of 10 CNVs were found to be false positive and 8 were successfully verified. Of the 8 confirmed CNVs, 4 were familial (3 maternal and 1 paternal) and 4 were novo.
These results have shown that phenotypically important copy number changes detected in the array CGH should be confirmed with a second method and together with reliability studies in the literature, qPCR is a safe method for this purpose. Verification studies in conjunction with parents has contributed to the pathogenicity assessment of CNVs and provided a more accurate genetic counseling. It is also thought that this study will contribute to the literature with genotype/ phenotype correlation of  HTR7, CDC16, OPHN1, GLRA1, ATP6AP2 genes the confirmed microdeletions / microduplications.