Metilasyon-hidroksi metilasyon tayini için LC-MS/MS ile yöntem geliştirilmesi /
Yazar: ALEYNA İLHAN
Danışman: DOÇ. DR. SELDA MERCAN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Genetik = Genetics ; Kimya = Chemistry
Dizin: Adli toksikoloji = Forensic toxicology ; DNA metilasyon = DNA methylation ; Epigenetik = Epigenetic

Özet:
20.yüzyılın ortalarında hayatımıza girmiş olan ''epigenetik'' terimi, günümüzde giderek önemini artırmaya devam etmektedir. Başlarda yalnızca genler ile fenotipi ortaya çıkaran gen ürünleri arasındaki nedensel etkileşimleri inceleyen bir bilim dalı olarak tanımlanan epigenetik, bilimin ve teknolojinin gelişimiyle birlikte birçok alanda canlı mekanizmasının bir parçası olarak ortaya konmuştur. Epigenetik mekanizmalar arasında en çok çalışılan mekanizma metilasyondur.
İncelenen deoksiribonükleik asit (DNA) metilasyon düzeyleri, insan genomundaki farklı dokular veya farklı bireyler arasındaki ayrımın yapılmasına olanak sağlamaktadır. Ayrıca şimdiye kadar birçok hastalıkla ilişkisi ortaya konulmuş olan metilasyon, hastalıkların temel mekanizmalarının çözümlenmesinde ve kişiye özgü tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Birçok bilim dalında önemli bir yeri olan DNA metilasyonu, adli bilimler için de oldukça değerlidir. Yapılan DNA metilasyon analizleri sayesinde adli bilimler için, yaş tayini, olay yerinde vücut sıvısı teşhisi ve monozigotik i̇kizleri birbirinden ayırma gibi uygulamalar yapılabilmektedir. 
Günümüze kadar global DNA metilasyon düzeylerini saptamaya yönelik birçok yöntem geliştirilmiştir. Geliştirilmiş olan yöntemlerin arasında sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometresi (LC-MS/MS) duyarlılık, tekrarlanabilirlik ve maliyet açısından diğer yöntemlere göre üstünlüğünü ortaya koymaktadır. Bu projenin amacı LC-MS/MS'in avantajlarından faydalanarak, DNA metilasyon düzeylerinin ölçülmesi için her açıdan kazanım sağlanan bir yöntem geliştirmektir. Bu amaç doğrultusunda, 45 yaş altı ve 45 yaş üstü olmak üzere iki ayrı yaş grubuna ait toplamda 14 gönüllü bireyden kan ve tükürük örnekleri alınarak, DNA izolasyonu E.Z.N.A. ® Tissue DNA Kit protokolüne göre gerçekleştirildi. Bu örnekler geliştirilmiş olan LC-MS/MS yöntemi ile birlikte analiz edildi. 
Yapılan çalışmanın bulgularına göre %mdC=(mdC/dC+mdC+hmdC)*100 ve %hmdC=(hmdC/dC+mdC+hmdC)*100  formülleri kullanılarak yapılan hesaplamalar sonucu kan örneklerindeki (n=11) ortalama metilasyon düzeyi  % 3.132 (±0.619) ve hidroksimetilasyon düzeyi %0.080 (±0.089) olarak bulunurken; tükürük örneklerinde (n=14) ortalama metilasyon düzeyi  %4.186(±0.729) ve hidroksimetilasyon düzeyi % 0.038 (±0.024) olarak bulundu. Kan örnekleri ile karşılaştırıldığında, global DNA metilasyon düzeylerinin tükürük örneklerinde daha yüksek oranlarda olduğu görüldü (ρ=0.0066). Buna karşılık hidroksimetilasyon düzeyleri iki materyal arasında anlamlı bir fark olmamakla birlikte, kan örneklerinde daha yüksek değerlerde çıktı (ρ=0.207). İki biyolojik materyal arasındaki %mdC-hmdC düzeylerinde çıkan farklılıklar, bu iki materyalin analizlerde birbirinin yerine kullanılamayacağını göstermektedir. Çalışmanın kalibrasyonunu oluşturmak amacıyla seçilen MeOH ve DNA olmak üzere iki matriks arasındaki ilişki Student's t-test ile araştırıldı. Yapılan test sonucunda anlamlı bir farklılık çıkmadığı görüldü (%5mdC kan için ρ=0.887; tükürük için ρ=0.875) (%5hmdC kan için ρ=0.488; tükürük için ρ=0.424). Bu durum her iki matriksin de DNA metilasyon/hidroksimetilasyon analizi için uygun olduğunu göstermektedir. Tükürük ve kan örneklerinin kendi içerisinde mdC ve hmdC değerleri arasındaki ilişki Student's t-test ile incelendi. Test sonucunda hem kan hem tükürük örnekleri kendi içerisinde mdC ve hmdC için anlamlı bir farklılık gösterdi (kanda ρ=0.0005; tükürükte ρ=0.00004). Bu sonuçlar değerlendirildiğinde, hem kan hem tükürük örnekleri için, mdC ve hmdC düzeylerinin karşılaştırılabilir olmadığı söylenebilir. 
Bu çalışmada LC-MS/MS kullanılarak, insan vücudunun farklı dokularındaki DNA metilasyon ve hidroksimetilasyon düzeylerinin eş zamanlı olarak ve 5 dk gibi kısa bir süre içerisinde analiz edilmesine olanak sağlayan bir yöntem geliştirildi. Biyolojik materyal olarak tercih edilen kan ve tükürük örnekleri hem kendi içlerinde hem de birbirleri arasında incelenerek ileriki çalışmalar için önemli olabilecek bulgular ortaya kondu. Böylelikle gelecekteki epigenetik araştırmalar için yol gösterici olan ve bu çalışmaların analitik sistemler yardımıyla gerçekleştirilmesine olanak sağlayan kromatografik bir yöntem geliştirildi.

Abstract:
The term "epigenetics", which entered our lives in the middle of the 20th century, continues to increase its importance today. Epigenetics, which was initially defined as a branch of science that only studies the causal interactions between genes and gene products that reveal the phenotype, has been revealed as a part of the living mechanism in many areas with the development of science and technology. Among all of the epigenetic mechanisms, DNA methylation is the most studied mechanism until now.
Analysis of DNA methylation levels allow differentiation between different tissues or different individuals in the human genome. In addition, methylation, which has been associated with many diseases so far, plays an important role in the analysis of the basic mechanisms of diseases and in the development of personalized treatment methods. DNA methylation, which has an important place in many sciences, is also very valuable for forensic sciences. With DNA methylation analysis studies, applications such as age determination, body fluid identification in crime scenes and separating monozygotic twins are able to be done for forensic sciences.
Up to this date, many methods have been developed to determine global DNA methylation levels. Among the developed methods, LC-MS/MS demonstrates its superiority over other methods in terms of sensitivity, reproducibility and cost. The aim of this project is to develop an all-round method for measuring DNA methylation levels by taking advantage of LC-MS/MS. For this purpose, blood and saliva samples were taken from 14 volunteers in two different age groups (under 45 years old and over 45 years old) and DNA isolation was performed by E.Z.N.A. ® Tissue DNA Kit protocol. These samples were analyzed together with the developed LC-MS/MS method.
According to the findings of this study, as a result of the calculations which was done using the formulas %mdC=(mdC/dC+mdC+hmdC)*100 and %hmdC=(hmdC/dC+mdC+hmdC)*100, the mean methylation and hydroxymethylation levels in blood samples (n=11) was found to be 3.132% (±0.619) and 0.080% (±0.089) respectively; the mean methylation and hydroxymethylation levels in saliva samples (n=14) was 4.186% (±0.729) and 0.038% (±0.024) respectively. Compared to blood samples, global DNA methylation levels were found to be higher in saliva samples (ρ=0.0066). On the other hand, although there was no significant difference between the two materials, hydroxymethylation levels were higher in blood samples (ρ=0.207). The differences in %mdC-hmdC levels between the two biological materials show that these two materials can't be used as a surrogate for each other in analysis. The relationship between two matrices, MeOH and DNA, which was used for calibration, was studied by Student's t-test. As a result of the test, there was no significant difference [(%mdC ρ=0.887 (blood); ρ=0.875 (saliva)] [%hmdC ρ=0.488 (blood); ρ=0.424 (saliva)]. This indicates that both matrices are suitable for DNA methylation/hydroxymethylation analysis. The relationship between mdC and hmdC values in saliva and blood samples was examined by Student's t-test. As a result of the test, both blood and saliva samples showed a significant difference for mdC and hmdC (ρ=0.0005 in blood; ρ=0.00004 in saliva). When these results are evaluated, it can be said that mdC and hmdC levels are not comparable for both blood and saliva samples. 
In this study, a method was developed which allows simultaneous analysis of DNA methylation and hydroxymethylation levels in different tissues of the human body, in such a short amount of time like 5 minutes using LC-MS/MS. Blood and saliva samples were examined both among themselves and among each other and findings that may be important for future studies were revealed. Thus, a chromatographic method has been developed that guides future epigenetic studies and allows these studies to be carried out with the help of analytical systems.