Prostat kanseri hücrelerinde resveratrol analoğunun anti-kanser etkinliğinin in vitro değerlendirilmesi
Evaluation of anti-cancer efficiency of resveratrol analogue on prostate cancer cells in vitro
Yazar: BESRA ÖZMEN YELKEN
Danışman: PROF. DR. CUMHUR GÜNDÜZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Epitel hücreleri = Epithelial cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prostat hastalıkları = Prostatic diseases ; Prostat neoplazmları = Prostatic neoplasms ; Resveratrol = Resveratrol ; Stilben = Stilbene ; İn vitro = In vitro

Özet:
Prostat kanseri (PCa), gelişmiş ülkelerde erkeklerde en sık görülen ikinci kanser türüdür. PCa klinik olarak, yavaş başlayarak hızla ilerleyebilen ve ölümcül olabilen heterojen bir seyir izlemektedir. Karsinom ilerlemesi, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) olarak bilinen, mezenkimal fenotip kazanımı ve epitelyal özelliklerin kaybıyla ilişkilidir. Böylece, kanser hücrelerinin metastatik özellikleri, EMT ile hücre migrasyonu ve invazyonu için gelişmiş bir yetenek kazanarak artmaktadır. Resveratrol, kırmızı üzümde bulunan, potansiyel bir kemopreventif ve kemoterapötik ajandır. Resveratrol çeşitli kanserlerde anti-tümörijenik etkiye sahiptir ve EMT inhibisyonuna neden olabileceği öne sürülmektedir. Sentezlenen resveratrol analogları arasında yer alan DMU-212, çeşitli kanser türlerine karşı yüksek seçicilik ve aktivite göstermektedir ve resveratrole göre daha güçlü bir antitümör aktiviteye sahiptir.
Prostat kanserindeki ölüm oranlarının erken tanı ve tedavideki gelişmelere rağmen, hala yüksek olmasından dolayı, kansere karşı terapötik stratejiler geliştirilebilmek adına, bitkilerden elde edilen moleküler inhibitörler ile ilgili çalışmalara olan ilgi son yıllarda oldukça artmıştır. Bu tez çalışmasında, EMT terapötik bir hedef olarak alınarak, yeni bir stilben türevi olan DMU-212'nin PCa hücrelerinde daha önce çalışılmamış olan EMT üzerine olan etkileri araştırılmış, PCa hücrelerinde invazyon ve metastazı engelleyebilecek mekanizmaların belirlenebilmesi hedeflenmiştir.
LNCaP, PC-3 ve DU-145 hücrelerinde, DMU-212 etken maddesinin sitotoksik etkileri WST-8 testi ve koloni oluşumu deneyleriyle belirlendi. DMU-212'nin belirlenen IC50 değerlerinin apoptotik etkileri Anneksin V yöntemiyle, hücre döngüsüne etkileri propidyum iyodür (PI) analizi ile değerlendirildi. 
Etken maddenin belirlenen IC50 dozlarının hücre migrasyonu üzerine etkileri yara iyileşmesi deneyiyle, tümör invazyonu üzerine etkileri hücre invazyon analizleriyle, EMT-ilişkili genlerin ekspresyon seviyelerindeki değişimler ise qRT-PCR ile değerlendirildi. EMT belirteçlerinden E-kaderin ve vimentin değişimleri immunofloresan işaretleme yöntemiyle belirlendi. Siklin B1, siklin D1, E-kaderin ve β-katenin proteinlerinin ekspresyon değişimleri western blot ile değerlendirildi. NFkB transkripsiyon faktörünün aktivitesindeki değişimler, dual lusiferaz aktivitesi ile incelendi. 
DMU-212'nin LNCaP, PC-3 ve DU-145 hücre hatlarında düşük dozlarda yüksek sitotoksik etkiye sahip olduğu ve bu hücre hatlarında apoptozu indükleyerek, belirgin bir şekilde G2/M arrestine neden olduğu belirlendi. DMU-212'nin, prostat kanseri hücrelerinde, migrasyonu ve invazyonu inhibe ettiği, bu mekanizmanın TFPI-2 geninin artan ekspresyonu üzerinden olabileceği, PC-3 hücrelerinde ise aynı zamanda, β-kateninin transkripsiyonel aktivitesini azaltarak, Wnt-β katenin sinyal yolağının baskılanması ile gerçekleşebileceği saptandı. DU-145 hücrelerinde ise, EMT ile ilişkili olan TGF-β sinyalizasyonunun, DMU-212 tarafından baskılandığı gen ekspresyon sonuçlarıyla belirlendi. DMU-212'nin prostat kanseri hücrelerinde E-kaderin artışı ve vimentin azalışını sağladığı gösterildi. NFkB transkripsiyon faktörünün, LNCaP ve PC-3 hücrelerinde yüksek aktivite gösterdiği gözlendi.
DMU-212'nin güçlü antikanser aktivitesi ile metastatik prostat kanserini önlemeye yönelik yeni fırsatlar sağlayabilmek adına umut verici bir ajan olabileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Prostate cancer (PCa) is the second most common cancer type in men in developing countries. PCa has a clinically heterogeneous course, which initiates slowly and progresses rapidly, and may be fatal. Carcinoma progression is associated with mesenchymal fenotype achievement and epithelial feature loss, which has been known as epithelial-mesenchymal transition (EMT). Therefore, metastatic characteristics of cancer cells increase by cell migration and invasion ability achievement via EMT. Resveratrol is a potential chemo-preventive and chemotherapeutic agent that is found in red grape. Resveratrol has anti-tumorigenic effect in various cancer types, and it has been revealed that it may lead to EMT inhibition. DMU-212, one of the synthesized resveratrol analogue, has high selectivity and activity against various cancer types, and it has stronger anti-tumor activity than resveratrol. 
In recent years, the relevance on studies including inhibitors obtained from plants has been increasing on behalf of therapeutic strategy development against cancer, because of high death incidence in prostate cancer, despite of developments in early diagnosis and treatment. Thus, in this thesis, it was aimed to determine the mechanisms that may prevent invasion and metastasis in PCa cells by considering EMT as a therapeutic target and investigating the effects of DMU-212, a new stilbene derivative, on EMT, which has not been studied in PCa cells so far.  
Cytotoxic effects of DMU-212 active ingredient was determined by WST-8 test and colony formation experiments in LNCaP, PC-3 and DU-145 cells. Apoptotic effects of identified IC50 doses of DMU-212 were evaluated by Annexine V method, whereas its effect on cell cycle was assessed by propidium iodide (PI) analysis. 
The effects of IC50 doses on cell migration was studied by wound healing, on tumor invasion was analyzed by cell invasion analyses, and its effects on EMT was investigated by qRT-PCR in order to observe the changes in EMT-related gene expression levels. The alterations of E-cadherin and vimentin, which are EMT indicators, were determined by immunofluorescence labeling method. Expression profiles of cyclin B1, cyclin D1, E-cadherin, and β-catenin proteins were evaluated by western blot analysis. The changes in transcription factor NFkB activity was investigated by dual luciferase activity. 
It was determined that low level of DMU-212 has high cytotoxic effect on LNCaP, PC-3, and DU-145 cell lines, and it led to G2/M arrest by inducing apoptosis in those cell lines. It was also found that DMU-212 inhibited migration and invasion in prostate cancer cells. This mechanism may be the result of increased expression of TFP1-2 gene. We also found that this effect may occur by inhibition of transcriptional β-catenin activity via attenuation of Wnt-β catenin signal pathway in PC-3 cells. In DU-145 cells, gene expression results showed that DMU-212 inhibited EMT-related TGF-β signaling. It was found that DMU-212 increased E-cadherin and decreased vimentin in prostate cancer cells. Furthermore, it was determined that NFkB transcription factor had high activity on LNCaP and PC-3 cells.
In conclusion, DMU-212 may be a promising agent in order to provide new opportunities devoted for metastatic prostate cancer prevention with its strong anti-cancer activity.