Küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücrelerinde ezrin ve EGFR ilişkisinin incelenmesi
Evaluation of ezrin and EGFR interaction in non small cell lung cancer cells
Yazar: YASEMİN SAYGIDEĞER KONT
Danışman: PROF. DR. SAFİYE NEŞE ATABEY ; PROF. DR. AYKUT ÜREN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Epidermal büyüme faktörü = Epidermal growth factor ; Ezrin = Ezrin ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Giriş ve Amaç: Ezrin, hücre iskeleti ile hücre yüzeyi proteinlerini bağlayarak onkogenezde rol alan bir proteindir. Hücre membranında Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü (EGFR) ile etkileştiği gösterilmekle birlikte, bu etkileşimin EGFR sinyal yolağına etkisi bilinmemektedir. Bu araştırmada bu iki proteinin etkileşiminin sinyal yolağına biyolojik ve fonksiyonel etkisini incelemek amaçlı küçük hücreli akciğer kanseri hücreleri kullanılmıştır.
Yöntemler: İmmünopresipitasyon ve immünofloresan yöntemlerle Ezrin ve EGFR ilişkisi gösterildi. EGFR sinyal yolağına ve nükleusa göçüne etkisini incelemek amacıyla Ezrin geni siRNA ile susuturuldu. Western-blot yöntemi ile protein düzeyleri incelendi ve qPCR yöntemiyle nükleer EGFR hedef genlerin mRNA seviyeleri belirlendi. Hücre canlılığı, proliferasyon ve ilaç toksisite ve sinerji deneyleri için MTT testi uygulandı. Mutant Ezrin taşıyan plazmidler oluşturulararak ve hücrelere klonlanarak Ezrin fosforilasyonunun etkisi incelendi.
Sonuçlar: Ezrin sessizleştirildiğinde EGFR ve sinyal yolağı proteinleri ERK ve STAT3 fosforilasyonları azaldı. Nükleer EGFR düzeyleri belirgin olarak düştü ve buna bağlı olarak nükleer EGFR hedef genleri AURKA, COX2, iNOS ve Cyclin D1 mRNA seviyelerinde de benzer düşüş izlendi. Ezrin inhibitörü NSC305787, EGF ile uyarılan EGFR ve sinyal yolağı proteinlerinin fosforilasyonunu ve de EGFR'ın nükleusa göçünü Ezrin baskılanmasına benzer şekilde azalttı. NSC305787 aynı zamanda EGFR eksprese eden hücrelerde Erlotinib ile sinerji gösterirken EGFR ekspresyonu olmayan hücrelerde sinerji olmadığı saptandı. Ezrin'in Y146 fosforilasyonunun EGFR ile etkileşimi arttırdığı, bu fosforilasyonun proliferasyon, koloni formasyonunda EGFR eksprese eden hücrelerde artış yönünde etkili olduğu, Erlotinib duyarlılığını ise azalttığı belirlendi. Bu bulgular, Ezrin – EGFR etkileşiminin, EGFR'ın onkojenik potansiyelini arttırdığını ve Ezrin'in hedeflenmesinin Küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücrelerinde Erlotinib direncini aşmada yeni bir yaklaşım olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Introduction: Ezrin is a scaffolding protein that is involved in oncogenesis by linking cytoskeletal and membrane proteins. Ezrin interacts with epidermal growth factor receptor (EGFR) in the cell membrane, but little is known about the effects of this interaction on EGFR signaling pathway. In this study, we established the biological and functional significance of ezrin-EGFR interaction in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells.
Methods: Co-immunoprecipitation and immunofluorescent staining were used to evaluate ezrin – EGFR interaction. Ezrin levels were reduced using siRNA oligos and downstream signaling protein phosphorylation and nuclear localization of EGFR were detected after EGF treatment via immune blot. Expressions of nuclear EGFR target genes were evaluated with qPCR. MTT test was carried out to analyze cell viability, proliferation, and synergy between Erlotinib and small molecule inhibitor of ezrin. Overexpression of mutant phosphorylated forms of ezrin was performed to assess the role of ezrin phosphorylation to this interaction.
Results: When expression of ezrin was inhibited, EGFR activity and phosphorylation levels of downstream signaling pathway proteins ERK and STAT3 were decreased. Nuclear EGFR was significantly diminished in ezrin-knockdown cells. Consequently, mRNA levels of EGFR target genes AURKA, COX-2, cyclin D1 and iNOS were decreased in ezrin-depleted cells. A small molecule inhibitor of ezrin, NSC305787, reduced EGF-induced phosphorylation of EGFR and downstream target proteins, EGFR nuclear translocation and mRNA levels of nuclear EGFR target genes similar to ezrin suppression. NSC305787 showed synergism with erlotinib in wild type EGFR-expressing NSCLC cells, whereas no synergy was observed in EGFR-null cells. Phosphorylation of ezrin on Y146 was found as an enhancer of ezrin-EGFR interaction and required for increased proliferation, colony formation and drug resistance to erlotinib. These findings suggest that ezrin-EGFR interaction augments oncogenic functions of EGFR and targeting ezrin may provide a potential novel approach to overcome erlotinib resistance in NSCLC cells.