İn vitro diyabetik retinopati modelinde aldoz redüktaz enzimi ile protein kinaz C sinyal yolağının ilişkisi
Relation between aldose reductase enzyme and the signal pathway of protein kinase C in the in vitro diabetic retinopathy model
Yazar: MUTLU SARIKAYA
Danışman: DOÇ. DR. NET DAŞ EVCİMEN ; DOÇ. DR. NURAY YAZIHAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Eczacılık Bölümü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Aldose redüktaz = Aldose reductase ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Diabetik retinopati = Diabetic retinopathy ; Enzimler = Enzymes ; Hiperglisemi = Hyperglycemia ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Protein kinazlar = Protein kinases

Özet:
Diyabetik retinopati; retinanın prekapiller arteriollerini, kapillerini ve venüllerini etkileyen önemli bir mikroanjiyopatidir. Tüm diyabetik bireylerin yaklaşık olarak % 90'nından fazlasında zaman içerisinde gelişmekte ve bireylerde ciddi sağlık sorunlarına neden olmaktadır. Diyabetin retinal, nöral, renal ve vasküler düzensizliklerinin nedenlerini açıklayan birkaç moleküler mekanizma bulunmaktadır. Bunlar; ileri glikasyon son ürünlerinin oluşumu, oksidatif stres, heksozamin yolağı, PKC sinyal yolağı ve poliol yolağıdır. Bu mekanizmalar arasında yer alan PKC sinyal yolağı ve AR enzimi ile ilişkili olan poliol yolağının sürekli etkileşim halinde olduğu biliniyor ise de, insan retinal hücrelerinde AR inhibisyon ve aktivasyonunun hiperglisemi ve oksidatif koşullarda PKC düzey ve aktivasyonuna etkisi, bu etki sonucu hücresel çoğalma ve apoptozun nasıl etkilendiği net olarak bilinmemektedir. Bu çalışmada ARPE-19 hücrelerinde hiperglisemi ve oksidatif stres koşullarında AR ve PKC arasındaki etkileşim araştırılmıştır. Bu amaçla, AR ve PKC protein düzeyleri western blot yöntemi ile, oksidatif stres düzeyi MDA miktar ve GSH-Px enzim aktivite tayini ile, NF-kB, IkB-α, Total c-Jun, Fosfo c-Jun, SAPK/JNK ve sitokrom c protein düzeyleri ELISA yöntemi ile belirlenmiştir. ARPE-19 hücrelerinde hiperglisemi ve oksidatif stres koşullarında AR ve PKC protein düzeylerinin arttığı tespit edilmiştir. Hiperglisemi durumunda AR ve PKC'de meydana gelen bu artışın majör nedeninin oksidatif stres olduğunu düşünmekteyiz. Hiperglisemi durumunda PKC'nin etkilediği NF-kB ve AP-1'in AR protein düzeylerinde artışa neden olduğu düşünülmektedir. AR inhibitörü olan sorbinilin PKC aktivitesinde azalmaya neden olarak hücre içi NF-kB ve AP-1 protein düzeylerinde düşmeye neden olduğu ve apoptozu önlediği belirlenmiştir. PKC aktivatörü olan PMA'nın uzun süreli uygulamasının ise AR protein düzeylerinde ve apoptozda azalmaya neden olduğu saptanmıştır. Oksidatif stres, PKC ve AR enzimi arasındaki bu ilişki retinopati başta olmak üzere diğer diyabetik komplikasyonların da gelişiminde önemli bir yer tutmaktadır. Yaptığımız çalışmalar bu üç temel mekanizmanın birbiri ile sıkı bir ilişki içerisinde olduğunu göstermektedir. Bu bağlamda, farklı fonksiyonel özellikler gösteren AR enziminin doku bağımlı olarak düşünülmesi ve enzimin inhibisyonunun hücre için yarar/zarar ilişkisinin doğru bir şekilde değerlendirilmesi gerektiğini düşünmekteyiz. Sonuç olarak, in vitro diyabetik retinopati modelinde AR ve PKC sinyal yolağı birbiri ile yakından ilişkilidir. Hiperglisemi ve oksidatif stres durumlarında AR ve PKC sinyal yolağı arasındaki bu ilişki hücresel birçok yolağın kontrolünde önemli roller oynamaktadır.

Abstract:
Diabetic retinopathy is an important microangiopathy which effects the pre-capillary arterioles, capillaries and venules of retina. More than 90 % of all diabetic patients have retinopathy within which causes serious health problems. Several molecular mechanisms have been described to explain the retinal, neural and vascular disorders caused by diabetes. Formation of advanced glycation products, oxidative stress, hexosamine pathway, PKC pathway and polyol pathways are among of these mechanisms. Although it has been known that the PKC signaling pathway and the aldose reductase related polyol pathway are interacting with each other, it is not clearly known whether inhibition or activation of aldose reductase in human retinal cells effects the PKC level and activity, cell proliferation and apoptosis under hyperglycemia and oxidative conditions. In this study, the interaction between AR and PKC in ARPE-19 cells have been investigated. For this purpose, AR and PKC protein levels have been detected with western blot, oxidative stress level has been measured by MDA and GSH-Px enzyme activity assays, NF-kB, IkB-α, Total c-Jun, Fosfo c-Jun, SAPK/JNK and cytochrome c protein levels have been determined with ELISA. It has been shown that AR and PKC protein levels increased in ARPE-19 cells under hyperglycemia and oxidative stress conditions. We thought that the major reason of the increasing in AR and PKC protein levels is oxidative stress. In hyperglycemia condition, NF-kB and AP-1 protein levels which are effected by PKC are increased. Decrease in PKC activity in the presence of AR inhibitor sorbinil causes decrease in intracellular NF-kB and AP-1 protein levels and inhibits apoptosis. Long term incubation with PKC activator PMA leads decreased apoptosis and AR protein levels. The relationship between oxidative stress, PKC and AR is very important for the development of diabetic complications such as retinopathy. Our studies have shown that these three mechanisms are closely related to each other. In this context, the AR enzyme can be considered as tissue dependent and its inhibition for the benefit/harm of the cell must be evaluated carefully. In conclusion, AR and PKC pathways are closely related to each other in in-vitro diabetic retinopathy model. The relation between AR and PKC signaling pathways under hyperglycemia and oxidative stress conditions plays an important role in the control of various cellular pathways.