Pankreatik B hücrelerinin endoplasmik retikulum stres cevabında ATF6'nın rolü
The role of ATF6'in endoplasmic reticulum stress respone in pancreatic B cell
Yazar: HASİBE VERDİ
Danışman: PROF. DR. ASUMAN SUNGUROĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Otofaji = Autophagy ; Pankreas = Pancreas ; Stres = Stress

Özet:
ER stresi çeşitli tetikleyicilere karşı cevap olarak oluşur. Çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar ER' da katlanmamış ya da yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine sebep olur. Bunun sonucunda Katlanmamış Protein Cevabı (KPC) tetiklenir ve hücre içi sinyal iletim yolakları kullanılarak stres aşılmaya çalışılır.  ER stresi aşılamaz ya da stres uzun süre devam ederse, ER stresi apoptozu aktive eder. Yapılan çalışmalar ER stresinin indüklediği otofajinin yoğun ve devam eden ER stresine karşı koruyucu bir rol oynadığı göstermektedir. Pankreatik beta hücrelerinde insülin üretimi fazla olduğundan ER'lerinde oldukça fazla yük vardır. Bu neden ile pankreatik beta hücreleri ER stresine karşı oldukça hassastır. ER stresi koşullarında aktif hale gelen ATF6'nın aktivasyon mekanizması konusunda az sayıda çalışma bulunsa da insülin salgılayan pankreatik β hücrelerindeki ATF6 yolağını açıklayan bir mekanizma tam olarak rapor edilmemiştir. Pankreatik β Hücrelerinin endoplasmik retikulum stres cevabında ATF6 yolağının aktivasyonunun, otofaji üzerinden gösterebileceği hipotezinden yola çıkarak, hücrenin hayatta kalımı/ölümünü seçim sürecinde hangi genlerin işlevsel olduğunu ve otofaji-KPY arasındaki ilişkiyi ATF6 üzerinden tanımlaması amaçlanmıştır.  
Bu kapsamda rat pankreatik beta hücreleri INS-1E hücrelerine palmitik asit, palmitik asit + rapamisin ve tek başına rapamisin uygulveı. MTT testi ile hücrelerin canlılık oranları, Annexin V testi ile apoptoz oranları belirlendi. Her üç koşulda 3., 6., 9., 12., ve 24. saatlerde ER stres genleri ATF6, PERK, GRP78, XBP1, CHOP otofaji genleri Beklin-1, Atg5,Atg7, LC3-1 ve apoptoz genleri Bcl-2, Bcl-XL, Bax genlerinin ifadelenme oranlarına bakıldı. Otofajik vakuollerin oluşumu MDC boyama ve LC3-II immunohistokimyasal analiz ile gösterildi. Palmitik asit ile yaratılan strese karşı en etkili cevap 6. saatte oluşmuştur. Palmitik asit ve palmitik asit ile birlikte rapamisin uygulanan ortamlarda 6. saatten itibaren otofaji başlamış 12. saatte ise apoptotik yolağın aktif hale geldiği belirlenmiştir. ER stresinde otofaji tetiklendiğinde ATF6 ifadelenmesindeki artış hücrenin hayatta kalmasına katkı sağlamıştır. Bazal ATF6 düzeyinin, GRP78 ifadelenmesi için yeterli olabileceği söylenebilir. ER stres koşullarında PERK ile ATF6'nın CHOP'un ifadelenmesine katkıda bulunduğu gözlenmiştir.

Anahtar Sözcükler: ATF6, ER stres, pankreatik β hücresi, otofaji

Abstract:
ER stress is a response to several triggering factors. Several  physiological ve pathological conditions may lead to the  accumulation of unfolded or misfolded proteins in ER. Finally Unfolded Protein Response (KPC ,Unfolded Protein Response) is triggered ve by using the intracellular signal pathways the effcet of the stress is reduced.  In case of prolonged ER stress apoptosis is induced ER stress-induced autophagy has been reported as a protective player against  intense ve prolonged ER stress. Due to the high insulin production there is a heavy load in the ER of the pancreatic cells. Therefore these cells are so sensitive to the ER stress. Although there are few studies about activation mechanisms of ATF6 in insulin-secreting pancreatic β cells,  there is no clear information explanation of  Atf6 pathway in ER stress conditions is stil remained to be elucidative. 
We hypothesized that ATF 6 pathway may induce autopahgy as a response to Endoplasmic Reticulum Stress in pancreatic β cells. So in order to explain the autophagy –KPC relationship the expression of the genes in the cell survival/death  has been investigated in this study. 
In this context Palmitic acid, palmitic acid+rapamycine ve rapamycin were applied to INS-1E cells of rat pancreatic beta-cells.  MTT assay was used for cell viability analysis ve apoptosis rates were measured with a Annexin V test.  At 3th, 6th, 9th, 12th, 24th hours  ER stress genes ATF6, PERK, GRP78, XBP1, CHOP , autophagy genes  Beclin-1, Atg5,Atg7, LC3-1 ve apoptosis genes  Bcl-2, Bcl-XL, Bax  exppression rates  were analaysis in all three  experimental conditions.  MDC staining ve immunohistochemical staining of LC3-II were used for the detection of the autophagic vacuole formation. The most effective response to palmitic acid induced stress was in the 6th hour. Palmitic acid, palmitic acid+rapamycine conditions autophagy starts at 6th hour and apoptosis starts at 12th hour. An increase ATF 6 expression has been observed  as a result of the autophagy induced by ER stress ve thus  may contribute to the cell survival. Basal ATF6 level, can be sufficient for the GRP78 expression. Under ER stress condition PERK and ATF6 contribute to CHOP expression.

Key Words: ATF6, ER stress, pancreatic β cells, autophagy