AMHR2 reseptörünü hedef alan monoklonal antikorların üretilmesi
Production of monoclonal antibodies specific for AMHR2 receptor
Yazar: HURİYE AKSU
Danışman: YRD. DOÇ. DR. AHMET EKEN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antikorlar = Antibodies ; Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Antimüllerian hormon = Antimullerian hormone ; Hibridomalar = Hybridomas ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Over neoplazmları = Ovarian neoplasms ; Reseptörler = Receptors ; İmmünoterapi = Immunotherapy

Özet:
Over kanseri kadınlarda kanser nedenli ölümlerde beşinci sıradadır. Genel olarak over kanserli hastaların 5 yıllık hayatta kalma oranları %44'tür. Anti Mullerian Hormon Reseptör 2 (AMHR2), anti mullerian hormonun (AMH) bağlandığı hücre zarında bulunan transmembran bir reseptördür. AMHR2 insanlarda over kanserlerinin çoğunluğunda üretilen over spesifik bir antijendir. Monoklonal antikorlar (MAbs) antikor üreten B lenfositlerle myeloma hücrelerinin füzyonu sonucu elde edilmiş stabil hibridoma klonları tarafından üretilir. Monoklonal antikorların klinik ve tanı laboratuarlarında kullanımı yaygındır. Kanser hücrelerinde yüksek miktarda ve doku spesifik olarak üretilen reseptörler ile büyüme faktörlerini hedef alan monoklonal antikorlar klinik uygulamalara en fazla aktarılan ve onaylanan kanser immünoterapi uygulamasıdır. Over kanseri için klinik olarak onaylanmış VEGF'i hedef alan sadece bir monoklonal antikor bulunmaktadır.
Bu çalışmada hibridoma teknolojisi kullanılarak over kanserinde üretilen AMHR2'nin ekstrasellüler kısmına spesifik CNANYSHLPPPGSPGTPGSQ ve MQGCRDSDEPGCESLHCDPS peptitleri hedef alan monoklonal antikorların üretimi amaçlanmıştır. Sonrasında elde edilen monoklonal antikorların SKOV-3 insan over kanser hücreleri tarafından üretilen AMHR2'ye bağlanabilirliklerinin test edilmesi amaçlanmıştır.
Çalışmanın ilk aşamasında, iki farklı hedef antijene karşı stabil şekilde monoklonal antikor üreten beş klon (P2C9 ve P3B1, P2A6, P10B6, P10A10) elde edildi. Elde edilen klonların rekombinant AMHR2'nin doğal katlanmış formuna bağlanabilirliği ELISA ile test edildi. ELISA deneyinde, P2C9 ve P3B1, P10B6, P10A10 klonları güçlü bağlanma gösterirken, P2A6 daha zayıf bağlanma gösterdi. Ayrıca, transfekte edilmiş SKOV-3 insan over kanser hücreleri tarafından üretilen AMHR2'nin denatüre formuna antikorların bağlanması western blot ile test edildi. P3B1 ve P2C9 klonu güçlü, P10B6 ve P10A10 klonları zayıf şekilde, P2A6'nın ise bağlanmadığı görüldü.
Sonuç olarak, Peptit 1'e (CNANYSHLPPPGSPGTPGSQ) spesifik antikor üreten P3B1, P2A6, P10B6, P10A10 klonları ve Peptit 2'ye (MQGCRDSDEPGCESLHCDPS) spesifik antikor üreten P2C9 klonu elde edildi.  İnsan over kanser hücreleri tarafından üretilen AMHR2'nin denatüre formuna bağlanan antikorların over kanseri tanısında ve immunoterapisinde kullanım potansiyeli olduğunu düşünmekteyiz.

Abstract:
Ovarian cancer is the fifth most lethal cancer in women. Five-year-survival rate of ovarian cancer patients is 44%. Anti Mullerian Hormone Receptor Type 2 (AMHR2) is a transmembrane receptor that islocated on the cell membrane and Anti Mullerian Hormone (AMH) binds to AMHR2. AMHR2 is an ovary specific antigen that is expressed in the most of the ovarian cancers. Monoclonal antibodies (MAbs) are produced by stable hybridoma clones which are obtained by the fusion of antibody producing B lymphocytes and myeloma cells. The use of MAbs in the clinic and diagnostic laboratories are common. MAbs targeting tissue specific overexpressed antigens or receptors or growth factors in cancer cells are the most common and clinically approved application of cancer immunotherapy. There is only one clinically approved monoclonal antibody for ovarian cancer which targets VEGF.
In this study, we aimed to produce monoclonal antibodies targeting CNANYSHLPPPGSPGTPGSQ and MQGCRDSDEPGCESLHCDPS peptides which are specific to the extracellular domain of AMHR2 by using hybridoma technology Then we aimed to test the binding abilities of these MAbs to AMHR2 expressed by SKOV-3 ovarian cancer cells.
In the first part of the study, 5 stable hybridoma clones (P2C9, P3B1, P2A6, P10B6, P10A10), which produce MAbs specific for two peptides, were produced. MAbs were tested for their affinity to native recombinant AMHR2 by using ELISA. P2C9, P3B1, P10B6 and P10A10 showed strong affinity in the ELISA experiment, however, P2A6 showed weak affinity. Next, MAbs were tested for their affinity to bind AMHR2 expressed by transfected SKOV-3 ovarian cancer cells by western blot. In the western blot experiment, P3B1 and P2C9 clones showed strong affinity, P10B6 and P10A10 clones showed weak affinity and P2A6 did not show affinity.
In conclusion, 4 MAbs for peptide 1 (CNANYSHLPPPGSPGTPGSQ) and one MAb for peptide 2 (MQGCRDSDEPGCESLHCDPS) were produced. These Mabs with their affinity for native and denatured forms of AMHR2 have the potential use for diagnostics and immunotherapy of ovarian cancer.