Farklı boyutlardaki Fe2O3 nanopartiküllerinin genotoksik potansiyellerinin drosophila melanogaster somatik hücreleri ve allium test yöntemleri ile araştırılması
İnvestigation of genotoxic potential  of various sizes  Fe2O3 nanoparticles with drosophila melanogaster somatic cells and allium test methods
Yazar: ŞÖHRET YÜKSEK KAYGISIZ
Danışman: DOÇ. DR. İBRAHİM HAKKI CİĞERCİ
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Nanopartiküller (NP) doğada yaygın olarak bulunmaktadır. Örneğin tüm biyolojik sistemlerde var olan proteinler gibi metal oksit nanopartikülleri de kolaylıkla üretilebilmektedir. Benzersiz manyetik özelliklere sahip olan demir oksit nanopartikülleri (Fe2O3 NP) birçok biyomedikal, biyomühendislik ve in vivo uygulamalarda, doku onarımı da dahil manyetik rezonans görüntüleme, immunoassay, ilaç dağıtımı, hipertermi ve biyolojik sıvıların detoksifikasyonu için yüksek bir potansiyele sahiptir. Nanopartiküller; çeşitli yüzey modifikasyonuna sahip olmasına rağmen biyolojik olarak parçalanamayan biyouyumlu maddelerdir. Ancak nanopartiküllerin toksik potansiyeli hala önemli bir husustur. Bu nedenle nanopartiküllerin etkilerini öğrenmek için daha fazla çalışma yapılması gereklidir.

Bu çalışmada Fe2O3'in farklı formlarının (<50 nm, <100 nm ve iyonik) muhtemel genotoksik etkisi Drosophila melanogaster'de (D. melanogaster) kanat somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) ve Allium test yöntemi kullanarak belirlenmesi amaçlandı. SMART yöntemi için, genomlarında çekinik flare (flr3) ve çoklu kanat kılı (mwh) genlerini taşıyan üçüncü evre transheterozigot larvalar söz konusu Fe2O3'ün NP ve iyonik formunun dört farklı konsantrasyonu (1mM, 2 mM, 5 mM ve 10 mM ) ile kronik olarak beslenmiştir. Söz konusu Fe2O3'ün genotoksik etkileri, larvaların kanat imajinal disk hücrelerinde meydana gelen genetik değişimlerin sonucunda oluşan mutant trikomlara göre değerlendirildi. <100 nm NP ve iyonik form uygulamasında toplam klonlarda genotoksik etki gözlenmezken; <50 nm Fe2O3 NP'ünün 1 ve 10 mM'lık konsantrasyon uygulanması ile elde edilen sonuçlarda toplam klonlarda genotoksik etki gözlenmiştir.  

Allium test hızlı, güvenilir, uygulanması kolay ve ekonomik bir test sistemidir. Ayrıca prokaryotik veya ökaryotik canlılarla yapılan diğer, alternatif kısa dönem toksisite test sistemleriyle iyi bir korelasyon göstermektedir. Fe2O3'in farklı formlarının (<50 nm, <100 nm ve iyonik) Allium cepa (A. cepa) kök ucu hücrelerindeki mitoz bölünme ve kromozomlar üzerine olan etkileri incelendi. <100 nm Fe2O3 NP'ü için Allium kök büyüme inhibisyon testinde EC50 değeri 5 mM olarak belirlendi ve Fe2O3 NP'ünün 0,5xEC50, EC50 and 2xEC50 konsantrasyonları soğan kök hücrelerine uygulandı. Distile su ve metil metan sülfanat (MMS, 10 ppm) sırasıyla negatif ve pozitif kontrol grubu olarak kullanıldı. A. cepa'nın hücre döngüsü 24 saat olduğu için uygulama süresi 24 ve 96 saat olarak belirlendi. <50 nm Fe2O3 NP ve iyonik formunun uygulama süresi 4 saat olarak belirlendi. Mitotik indeks ve mitotik faz frekansları her bir konsantrasyon ve süre için ayrı ayrı hesaplandı. <100 nm boyutundaki Fe2O3 NP'ünün mitotik faz frekanslarına etkisi incelendiğinde kontrol grubuna göre 24 saatlik uygulamanın 5 mM'lık konsantrasyonu, 96 saatlik uygulamanın ise tüm konsantrasyonlarının faz frekansları istatiksel açıdan anlamlı bulundu. Ayrıca <50 nm Fe2O3 NP'ünün ve iyonik formunun 4 er saatlik uygulamalarının ise tüm konsantrasyonlarının faz frekansları istatiksel açıdan anlamlı bulundu. Anafaz telofaz hücrelerinde kalgın kromozom, bozulmuş anafaz telofaz, yapışıklık ve anafaz köprüsü gözlemlendi. 

Komet testinde; Fe2O3 NP'ünün  <100 nm boyutunun 24 ve 96 saat'lik uygulama süresine ve konsantrasyon artışına; <50 nm boyutunun ve iyonik formunun 4'er saatlik uygulamanın konsantrasyon artışına bağlı olarak DNA hasarındaki artış istatistiksel açıdan önemli olduğu bulundu (p<0,05).

Sonuç olarak çalışmamızda kullanılan test sistemlerinde, Fe2O3'ün <50 nm boyutunun <100 nm boyutu ve iyonik formuna göre genotoksisiteyi indüklediği gözlendi. NP ve iyonik formu kıyaslandığında küçük boyutlu ve geniş yüzeye sahip olan maddelerin daha toksik olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Nanoparticles are found very common in nature. For instance, proteins exist in almost all biological systems and metal-oxide nanoparticles are easily produced etc. Iron oxide nanoparticles with unique magnetic properties have a high potential to use in several biomedical, bioengineering and in vivo applications, including tissue repair, magnetic resonance imaging, immunoassay, drug delivery, detoxification of biologic fluids, cell sorting, and hyperthermia. Although various surface modifications are being done for making these nonbiodegradable nanoparticles more biocompatible. But their toxic potential is still a major concern.  Therefore, it is necessary to use further examination assay systems in order to check nanoparticle's effects.

In this study, genotoxic potential of <50 nm,  <100 nm Fe2O3 nanoparticles and ionic form were investigated by using Allium test, Comet Assay and wing somatic mutation and recombination test (SMART). In SMART assay, Flare-3 virgin females and mwh males were crossed to get transheterozygous larvae. Different concentrations (1mM, 2 mM, 5 mM and 10 mM) of nanoparticles and ionic form were fed to transheterozygous larvae. No significant genotoxic effect was observd in <100 nm nanoparticles and ionic form while <50 nm Fe2O3 nanoparticles showed genotoxicity at 1 mM and 10 mM concentrations.

A. cepa root meristems were exposed with five doses (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 mM)  of < 50 nm and ionic form for 4 hour and three doses  (2,5, 5, 10 mM) for <100 nm of Fe2O3 nanoparticles for 24 and 96 h. MMS and distilled water were used as a positive and negative control respectively. Mitotic index and mitotic phase frequencies were calculated separately for each concentration and duration. Effect on mitotic phase of <100 nm of Fe2O3 nanoparticles for 24 at 5 mM concentration was observed while there was the statistically significant effect for 96 h at all concentrations of <100 nm of Fe2O3 nanoparticles. Similarly, <50 nm of Fe2O3 nanoparticles and ionic form also showed statistically significant effect on mitotic phase frequencies for all concentrations at 4 h.

Comet assay results showed time and concentration dependent increase in <100 nm nanoparticles at 24 and 96 h. Similarly, application of <50 nm nanoparticles and ionic form for 4 h also showed DNA damage as the concentration increased and it was found statistically significant (p <0.05).

Consequently, the <50 nm of Fe2O3 was found toxic compared to 100 nm Fe2O3 and ionic form. It could be deduced that nanoparticles especially <50 nm,  were more genotoxic because of its smaller size and large surface area.