Melanositik lezyonlarda prame'in diğer immünhistokimyasal belirteçler ile birlikte tanısal önemi
The diagnostic utility of prame in differential diagnosis of melanocytic lesions and comparative analysis with other immunohistochemical markers
Yazar: ZARIFAKHANIM GAHRAMANLI
Danışman: DOÇ. DR. BİLGE AYÇA KIRMIZI
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Patoloji = Pathology

Özet:
Amaç: Melanositik lezyonlar geniş bir yelpazeye sahip farklı morfolojik özellikleri nedeniyle rutin pratikte tanısal zorluklara neden olabilmektedir. Bu nedenle benign ve malign lezyonların ayrımında yardımcı olabilecek yeni immünhistokimyasal belirteçlerin tanımlanması önemli rol oynamaktadır. Çalışmamızda son dönemlerde melanomu benign lezyonlardan ayırmada önem kazanan, PRAME antikorunun ifadesi ve rutin pratikte kullanılan BRAF(VE1), p16, MelanA ve Ki67 ikili boyaması ve BAP1 antikorları ile birlikte tanısal yaklaşımda öneminin araştırılması amaçlanmıştır. 
Gereç ve Yöntem: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı'nda 2005-2022 yılları arasında tanı almış 27 atipik Spitz tümör 12 spitzoid melanom, 20 konvansiyonel melanom, 10 yüksek dereceli displazi içeren displastik nevüs çalışma grubunu oluşturmuştur. 20 melanositik dermal nevüs, 20 spitz nevüs ve 10 düşük dereceli displazi içeren displastik nevüs tanısı alan hastalar ise kontrol grubunu oluşturmuştur. 
Seçilen parafin bloklardan 4 µm kalınlığında kesitler pozitif yüklü lama alınmış, otomatik immünhistokimya boyama cihazlarında (Roche-Ventana), Streptavidin-Biotin Peroksidaz yöntemi kullanılarak, PRAME, BRAF, BAP1, p16, MelanA, Ki67 antikorları uygulanmıştır. 
Değerlendirmeler ışık mikroskobunda yapılmış ve anti-PRAME antikoru için %75`in üzerinde boyanma eşik değer olarak kabul edilmiştir. BRAF VE1 antikoru için değerlendirme membranöz-sitoplazmik boyanmanın şiddetine göre yapılmıştır; orta şiddette boyanma (+2) ve şiddetli boyanma gösteren olgular  (+3) olarak skorlanmış ve +2 ve +3 boyanma gösteren olgular BRAFV600E  pozitif olarak kabul edilmiştir. P16 ile diffüz nükleer ve sitoplazmik boyanma varlığı (+3), yamasal boyanma varlığı (+2) p16 ifadesi açısından pozitif kabul edilirken, fokal boyanma (skor: +1) veya boyanmanın izlenmemesi (skor: 0) ise p16 negatif (ifade kaybı) olarak değerlendirilmiştir. BAP1 nükleer boyanmanın varlığına göre pozitif veya negatif olarak değerlendirilmiştir. Lezyonel hücrelerin proliferasyonunu göstermek için MelanA ve Ki67 ikili boyaması tercih edilmiş ve Ki67 ifadesi yüzde olarak kaydedilmiştir. Verilerin analizi "SPSS for Windows 11,5" paket programında yapılmış, p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Bulgular: Tüm olguların cinsiyet dağılımına bakıldığında %55.5`inin kadın (n=66), %44.5`inin erkek (n=53) cinsiyetinde olduğu görülmektedir. Yaş dağılımına bakıldığında, yaş aralığı 1 ile 94 arasında değişmekte olup, yaş ortalaması 36.84 ± 20.16 bulunmuştur. 
PRAME`in boyanma yüzdesine bakıldığında; konvansiyonel melanomlarda nükleer boyanmanın %0-%95 arasında, ortalama %58.05 ±38.76 olduğu;  spitzoid melanomlarda %0-%85 arasında ortalama %28 ±37.72 olduğu; AST`lerde %0-%50 arasında ortalama %2 ±9.60; Spitz nevüslerde %0-%30 arasında ortalama %3.25 ±8.31; displastik nevüslerde %0-%10 arasında ortalama %0.75 ±2.44 oranında olduğu saptanmıştır. Melanositik nevüslerde (bileşik, bileşke, konjenital, dermal nevüs)  ise nükleer boyanma dikkati çekmemiştir.
%75`in üzerinde boyanma PRAME açısından pozitif kabul edildiğinde; konvansiyonel melanom olgularında 20 vakanın 12`sinde (%60), spitzoid melanomlarda 12 vakanın 3'ünde  (%25) bu eşik değerin üstünde boyanma görülmüştür. AST`lerde 27 vakanın 1'inde (%3.7), spitz nevüslerde 20 vakanın 3'ünde (%15), displastik nevüslerde ise 20 vakanın 2'sinde (%10) PRAME ile heterojen özellik gösteren, eşik değerin altında nükleer boyanma dikkati çekmiştir. 
İstatistiksel olarak konvansiyonel melanomlar ile melanositik nevüsler, displastik nevüsler, AST`ler ve Spitz nevüsler arasında PRAME pozitifliği açısından anlamlı fark olduğu saptanmıştır (p<0.05). 
%75`in üzerinde boyanma PRAME açısından pozitif kabul edildiğinde, konvansiyonel melanomlarda PRAME boyanmasının sensitivitesinin %60, spesifisitenin %100 olduğu görülmüştür. Spitzoid melanomlarda ise sensitivite %25, spesifisite %100 olarak saptanmıştır.
 ROC analizi sonucunda en yüksek Youden indeksi %55`te saptanmıştır. %55 oranında boyanma PRAME açısından pozitif kabul edildiğinde konvansiyonel melanomlarda sensitivitenin %70, spitzoid melanomlarda sensitivitenin %33.3`e yükseldiği görülmüş, spesifisite oranlarında fark saptanmamıştır.
Displastik nevüslerde displazi şiddeti ile PRAME ekspresyonu yüzdesi ve nükleer boyanmanın şiddeti karşılaştırıldığında, istatistiksel olarak anlamlı ilişki (p<0.05) saptanmamakla birlikte, displazi şiddeti arttıkça PRAME ekspresyon yüzdesi ve şiddetinin de arttığı saptanmıştır.
AST`lerde Clark seviyesi arttıkça PRAME ekspresyon derecesinin ve yüzdesinin arttığı saptanmıştır (p<0.05). Ancak spitzoid melanom ve konvansiyonel melanom olgularında Clark seviyesi veya Breslow kalınlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki izlenmemiştir (p>0.05). Ayrıca spitzoid melanom olgularında TİL derecesi ile PRAME ekspresyon düzeyi arasında anlamlı (p<0.05) ilişki saptanmış, konvansiyonel melanom olgularında ise bu iki parametre arasında fark saptanmamıştır (p=0.5). 
Sonuç: Çalışmamızda  PRAME ile melanositik nevüslerde boyanmanın izlenmemesi ve malign olgularda yüksek oranda boyanmanın olması, benign ve malign ayrımında PRAME antikorunun kullanımının faydalı olduğunu göstermiştir. PRAME pozitifliği için eşik değerin %55`e düşürülmesinin spesifisitede azalma olmadan sensitivitenin artması nedeniyle PRAME'in tanısal yaklaşımdaki değerini artıracağını düşündürmüştür. 

Anahtar Kelimeler: PRAME, melanom, spitz tümör, atipik spitz tümör, spitzoid melanom, histopatoloji

Abstract:
Aim: Melanocytic lesions can present with a wide range of morphological characteristics, making diagnosis difficult. Therefore, identifying new immunohistochemical markers for differentiating benign and malignant lesions plays an important role. Our study aimed to investigate the expression of PRAME antibody, which has gained importance in distinguishing melanoma from benign lesions in recent years, and it's importance in the diagnostic approach with BRAF(VE1), p16, MelanA+Ki67 dual staining, and BAP1 antibodies used in routine practice.
Materials and Methods: 27 atypical spitzoid lesions, 12 spitzoid melanoma, 20 conventional melanoma, and 10 dysplastic nevi with high grade dysplasia diagnosed in Ankara University Medical Faculty Pathology Department between 2005-2022 formed the study group. Patients diagnosed with 20 melanocytic nevi, 20 Spitz nevi and 10 dysplastic nevi with low grade dysplasia formed the control group. PRAME, BRAF, BAP1, p16, MelanA, and Ki67 antibodies were applied using the Streptavidin-Biotin Peroxidase method in automatic immunohistochemistry staining devices (Roche-Ventana). 
Evaluations were made under a light microscope and staining above 75% was accepted as the threshold value for anti-PRAME. Evaluation for the BRAF VE1 antibody was based on the severity of membranous-cytoplasmic staining; Cases with moderate membranous staining (2+) and cases with severe staining were scored as (3+), and cases with 2+ and 3+ staining patterns were considered positive for BRAF V600E . Presence of diffuse nuclear and cytoplasmic staining with p16 (3+), the presence of patchy staining (2+) were accepted as positive for p16 expression. Focal staining (score 1+) or complete absence of nuclear expression (score 0) were evaluated as loss of p16 expression. BAP1 evaluation was evaluated as positive or negative according to nuclear staining. MelanA and Ki67 dual staining was preferred to show the proliferation of melanocytic cells, and Ki67 expression was noted as percentage. The data was analyzed in the "SPSS for Windows 11.5" package program, and p<0.05 was considered statistically significant.
Results: When all of the groups were taken, 55.5% of them were female (n=66), and 44.5% were male (n=53). According to the age distribution, which ranged from 1 to 94, the mean age was determined to be 36.84 ±20.16. Considering the PRAME staining percentage, nuclear staining ranged from 0% to 95% in conventional melanomas, with a mean of 58.05% ±38.76; between 0% and 85% in spitzoid melanomas, with a mean 28% ±37.72; between 0% and 50% in ASTs with a mean 2% ±9.60; and between 0% and 30% in Spitz nevi with a mean 3.25% ±8.31; It was discovered to range from 0% to 10% in dysplastic nevi, with an average of 0.75% ±2.44. Melanocytic nevi did not show any nuclear staining.
When staining over 75% was considered as positive for PRAME, 12 (60%) of 20 cases in conventional melanoma group and 3 (25%) of 12 cases in spitzoid melanoma group were positive. Nuclear staining with PRAME below the threshold value was seen in 1 of 27 cases (3.7%) in AST, in 3 (15%) of 20 cases in Spitz nevi, and 2 (10%) of 20 cases in dysplastic nevi. 
 A statistically significant difference was found for PRAME staining between conventional melanoma and melanocytic nevi, dysplastic nevi, AST, and Spitz nevi (p<0.05). When staining over 75% was considered as threshold for PRAME, the sensitivity was 60%, and the specificity was 100% in conventional melanomas. For spitzoid melanomas, the sensitivity was 25%, and the specificity was 100%. 
As a result of ROC analysis, the highest Youden index was found at 55%. When 55% was considered positive for PRAME, sensitivity increased to 70% in conventional melanomas and 33.3% in spitzoid melanomas without change in specificity.
There was no statistically significant relationship between PRAME expression and the degree of dysplasia. However, the percentage and the severity of PRAME expression increased with the increasing severity of dysplasia.
In AST cases, there was a statistically significant relationship between PRAME expression and Clark level (p<0.05). However, there was no significant correlation between Clark level or Breslow thickness in spitzoid or conventional melanoma cases (p>0.05). 
We found a statistically significant relationship between TILs and PRAME expression in spitzoid melanoma cases (p<0.05). However, in conventional melanoma cases, no statistically significant association was found  (p=0.5).
Conclusion: In our study, the absence of staining in melanocytic nevi with PRAME and it's high and diffuse staining in malignant cases suggested that PRAME could be a helpful tool in the differentiation of benign and malignant lesions. Our results also suggested that reducing the used threshold value for PRAME to 55% would increase the value of PRAME in melanoma diagnosis due to the increased sensitivity without a decrease in specificity.

Key Words: PRAME, melanoma, Spitz tumor, atypical Spitz tumor, Spitzoid melanoma nevi, histopathology