Dasatinib ile indüklenmiş KML hücre dizisi(K562) apoptozunun JAK-STAT yolağı üzerine etkisinin araştırılması
Investigating the role of JAK/STAT pathway upon dasatinib induced apoptosis for CML cell model K562
Yazar: CEYDA TUNAKAN DALGIÇ
Danışman: PROF. DR. GÜRAY SAYDAM
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Dahili Tıp Bilimleri Bölümü / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı / İç Hastalıkları Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Dasatinib = Dasatinib ; Genler = Genes ; JAK 2 = JAK 2 ; Lösemi = Leukemia ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive

Özet:
ANAHTAR KELİMELER: STAT, Dasatinib, KML, Apoptoz

AMAÇ : JAK/STAT sinyal yolağında görevli STAT5A ve S5B genleri sinyal iletiminde ve malinitede ekspresyonu artan genlerin aktivasyonunda görevli nükleer transkripsiyon faktörleridir ve hematolojik hastalıklarda aktifleşerek lösemi gelişiminde rol alırlar. Dasatinib, BCR-ABL, SRC ailesi (SRC, LCK, YES, FYN),c-KIT,EPHA2 ve PDGFR kinazları inhibe ederek ve SRC kinaz ailesini (LYN, HCK) kapsayan iletim yolaklarını aktive ederek, BCR-ABL kinaz bölgesi mutasyonlarının ve MDR geninin fazla eksprese olmasından kaynaklanan imatinib direncini kırar. Bu çalışmanın amacı, potansiyel hedef olan JAK/STAT yolağı elemanlarından STAT5A ve STAT5B'nin dasatinib uygulaması sonrasında mRNA düzeyindeki transkripsiyon değişimini ve lösemi hücrelerinin apoptotik durumunu KML hücre modeli K-562 hücreleri üzerinden incelemektir.

YÖNTEM-GEREÇ: Dasatinib' in K-562 hücreleri üzerinde sitotoksik etki oluşturduğu IC50 dozu XTT yöntemiyle belirlenmiş, belirlenen doz uygulandıktan 24-96. saatler için hücrelerin apoptotik durumu "Cell Death Detection kit"  ile spektrofotometrik olarak değerlendirilmiştir. Hedef genlerin ekspresyon seviyeleri dasatinib uygulamasını takiben eş zamanlı olarak qRT-PCR ile saptanmıştır. Protein ekspresyon analizleri 'WesternBreeze Chromogenic Kit-Anti-Rabbit' kitin uygulama esaslarına dayanarak western blot analizi ile belirlenmiştir.İstatistik analizler GraphPad prism metodu ile anlamlılık düzeyi p<0.05 kullanılarak değerlendirilmiştir. 
BULGULAR:  Dasatinib' in IC50 dozu, 48. saat için 3.3 nM olarak belirlenmiştir. Dasatinib uygulanmış ve uygulanmamış hücrelerin apoptotik durumu kıyaslandığında; muamele grubu hücrelerde 96. saatte 4.5 katlık anlamlı bir apoptoz indüksiyonu saptanmıştır (p<0.0001). Hedef genlere ait mRNA ekspresyon seviyeleri kıyaslandığında, STAT5A ekspresyonu 96. saatte 1.5 katlık (%33.2 oranında) anlamlı bir azalma sergilemişken (p=0.02); aynı saatte STAT5B ekspresyonunda, 4.47 katlık (%77.6 oranında) azalma belirlenmiştir (p<0.001). STAT5A ve STAT5B protein ekspresyon seviyeleri 96.saatte anlamlı olarak baskılanmıştır ve bu sonuçlar mRNA ekspresyon sonuçları ile korele saptanmıştır.

SONUÇ: Dasatinib ile indüklenmiş lösemi hücre apoptozunun olası nedenlerinden biri de, JAK/STAT sinyal yolağı elemanlarından; transkripsiyon faktörü olan ve lösemide artmış ekspresyon sergileyen STAT5A ve -5B ekspresyon seviyelerinin anlamlı derecede azalmış olması olabilir. Bu nedenle STAT5A ve S5B, KML patogenezinin aydınlatılmasında önemli birer terapotik moleküler hedef durumundadır.

Abstract:
KEY WORDS: STAT, Dasatinib, CML, Apoptosis
AIM: :STAT5A and STAT5B genes; members of JAK-STAT signaling pathway; are nuclear transcription factors that are responsible for activating the genes that exhibit increased expression in hematological malignancies and signal transduction. Dasatinib prevents the gained imatinib resistance, responsible for MDR genes' overexpression and BCR-ABL kinase region mutations by activating signalling ways of SRC kinase family (LYN, HCK) and by inhibiting BCR-ABL, SRC kinase family (SRC, LCK, YES, FYN),c-KIT,EPHA2,PDGFR kinases. 
   The aim of this study is to investigate the apoptotic case of leukemic cells and to evaluate the transcriptional changes of STAT5A and STAT5B that are the members of JAK-STAT pathway following dasatinib treatment on CML model cell line K562.
METHODS: The cytotoxic effective dose IC50 of dasatinib upon K562 cells was determined via XTT method. The apoptotic case of the cells was assessed spectrophotometrically by 'Cell Death Detecton Kit' after applying of IC50 dose between 24–96 hours. Target genes' expression levels were also determined by real time qRT-PCR following dasatinib treatment for the same time interval. Protein expression analyses were performed by Western Blot analysis according to 'WesternBreeze Chromogenic Kit-Anti-Rabbit' kit manuel instructions. Statistical analyses were done by GraphPad prism sofware with a significance of p<0.05 
RESULTS: The IC50 dose of dasatinib was determined as 3.3 nM for 48th hour. When we compared the apoptosis rate of dasatinib treated/untreated cells'; a 4.5 fold apoptosis induction was assessed at 96th hour in dasatinib applied group (p<0.0001). When we compared target genes' mRNA expression levels, while STAT5A expression was decreased 1.5 fold (by %33.2 inhibition) at 96th hour (p=0.02), STAT5B exhibited a 4.47 fold downregulation (by %77.6 inhibition) for the same hour (p<0.001). STAT5A and STAT5B protein expression levels were significantly supressed at 96th hour and these protein expression results were in the same line with mRNA expression results.
CONCLUSION: One possible reason of dasatinib induced leukemic cell apoptosis might be due to significant decrease in STAT5A and STAT5B expression levels that are transcription factors and exhibit upregulated expression in leukemia. Therefore, STAT5A and STAT5B are important moleculer targets in the research of CML pathogenesis.