Ratlarda deneysel subaraknoid kanama ile oluşturulan serebral vazospazm etyopatogenezinde rol oynayan apopitozis ve lipid peroksidasyonunun önlenmesinde sildenafil'in rolü
The effect of the sildenafil citrate on cerebral vasospasm and apoptosis following experimental subarachnoid hemorrhage in rats
Yazar: EMRE CEMAL GÖKCE
Danışman: PROF. DR. HAKAN HULUSİ CANER
Başkent Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroşirürji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2007
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery

Özet:
Subaraknoid kanama sonrası gelişen vazospazmın meydana gelişi ve oluşum
mekanizmaları ile ilgili yapılan klinik ve labaratuar çalışmalar neticesinde, bu patolojik
durumun multifaktöriyel ve içiçe girmiş bir çok biyokimyasal reaksiyonlar sonucunda
oluştuğu düşünülmektedir.
Ancak anevrizma rüptürü neticesinde subaraknoid alana olan kanamada
eritrositlerin hemolizi sonucunda ortaya çıkan oksihemoglobinin, vasküler ve nöronal
yapılarda patolojik süreci başlatan bir çok reaksiyonda rol alması nedeniyle vazospazmın
oluşumuna neden olan en önemli faktörlerden biri olduğu kabul edilmektedir. Bununla
beraber hemoglobine olan affinitesi oksijenden 1000 kat daha fazla olduğu tespit edilen
Nitrik oksid adlı moleküler yapının keşfiyle beraber, SAK sonrası miktarının azalmasının,
vazospazm gelişiminde çok önemli bir faktör olduğu ileri sürülmektedir(1).
Oksihemoglobinin ve diğer kan hücrelerinin kanama sahasında başlattığı inflamasyon,
serbest radikal üretimi, lipid peroksidasyonu ve apopitoz, vasküler yapılarda vazospazma
neden olarak damarsal yapıların konstrikte olmasına ve nöronal ve vasküler yapıların
iskemiye girmesine neden olmaktadır. Vasküler endotelyal hücrelerde olan bu hasar ve
serbest radikal üretimi nedeniyle NO'in hem yapımı azalmakta hemde varolan NO
tüketilerek damarlar konstrikte olmaktadır. Bu amaçla vazodilatatör, antienflamatuar,
antioksidan ve serebral kan akımı regülasyon özellikleri olan NO'in miktarının
arttırılmasının vazospazmda iyi bir tedavi seçeneği olacağını düşündük. Bu amaçla
fosfodiesteraz V inhibitör etkisi ile NO-cGMP yolağının artımına neden olan, klinikte
erektil disfonksiyon ve pulmoner hipertansiyon tedavisinde kullanılan sildenafil sitratın
vazospazm tedavisindeki etkilerini araştırmak amacıyla deneysel çalışmamızı
gerçekleştirdik.
Bu çalışmada 7 adet Sprague-Dawley cinsi ağırlıkları 245-550 gr arası olan erkek
ratlardan oluşan 4 grup oluşturuldu. Grup 1'de yer alan ratlara hiç bir işlem uygulanmadan
sakrifikasyon uygulandı. Grup 2'de yer alan ratların sisterna magnalarına 0.4 cc/kg'a
otolog arteryal kan verilerek deneysel subaraknoid kanama oluşturuldu. Grup 3'te yer alan
ratlara aynı şekilde subaraknoid kanama oluşturularak kanamadan hemen sonra 5
mg/kg/gün sildenafil oral olarak verildi. Grup 4'te yer alan ratlarada aynı usulde deneysel
v
subaraknoid kanama oluşturularak kanamadan hemen sonra 15 mg/kg/gün sildenafil oral
verildi. Deneyde, östrojenin iskemide eksitoksisiteyi, glutamat reseptör etkinliğini ve
immun enflamasyonu azaltarak akson myelinizasyonunu sinaptogenezisi ve dendritik
dallanmayı arttırarak nöroprotektif etki göstermesi nedeniyle erkek rat kullanıldı(2).
Subaraknoid kanama yapılan tüm ratlar 48.saatte sakrifiye edildi. Tüm ratların
baziller arterlerinden 3'er kesit alınarak baziller arterin çapı freeware imaj analiz sistemleri
(ImageJ, version 1.341; National Institutes of Health, Bethesda, MD) bilgisayar programı
ile ölçüldü. Lipid peroksidasyon değerleri için baziller arterin beslediği serebellumdan
örnekler alındı ve tiyo barbitürik asit yöntemi ile nmolTBA/g yaş doku olarak hesaplandı.
Gruplardaki baziller arter kesitlerindeki apopitozu göstermek amacıyla In Situ Cell
Detection Kit, POD (Roche, Germany) kullanıldı. Apopitotik indeks immünreaktif
nukleusların total endotel hücre sayısına oranı ile hesaplandı. Sonuçlar yüzde olarak ifade
edildi. Buna göre boyanma saptanmayan kesitler Grade 0, %0-24 oranında apopitoz Grade
1, %25-49 arasındakiler Grade 2, %50-74 arasındakiler Grade 3 ve %75-100 oranında
arteriyal apopitotik hücre boyanması gösterenler Grade 4 olarak ifade edildi. In Situ Cell
Detection Kit ile yapılan çalışmalarda apopitotik hücrelerle beraber nekrotik hücrelerde de
TUNEL reaksiyonunun yanlış pozitif reaksiyona neden olmasından dolayı kaspaz 3,
kaspaz 8, p53 ve sitokrom c adlı apopitotik markerlarda çalışılmıştır(3). Çalışmamızda
sitokrom c'yi apopitotik mitokondriyal yolağı, kaspaz 8'i kaspaz bağımlı yolağı, kaspaz
3'ü kaspaz bağımlı ve bağımsız yolun ortak ürünü, p53'ü ise tüm apopitotik sürecin en
önemli markerı olduğu için kullandık(100,101).
Buna göre SAK grubundaki ratların baziller arterler kesit alanlarının kontrol
grubuna göre %57 oranında daraldığı, sildenafil 5mg/kg/gün verilen grupta ise daralmanın
kontrol grubu olan grup 1'e göre %16.8 olduğu tespit edildi. Sildenafil 15 mg/kg/gün
verilen grupta ise bu daralmanın %7.1 olduğu görüldü. Elde edilen kesit alanları istatiksel
açıdan Post Hoc Tukey testi ile karşılaştırıldığında sildenafilin vazospazma karşı koruyucu
etkisinin olduğu saptandı (p<0.0001). Lipid peroksid değerlerine bakıldığında SAK
oluşturulan Grup 2'deki lipid peroksid değerinin kontrol grubu olan grup 1'e göre belirgin
olarak arttığı görüldü. Tedavi gruplarındaki lipid peroksid miktarlarının grup 2'deki
değerlere göre anlamlı derecede azaldığı tespit edildi (p<0.0001). Gruplardaki In Situ Cell
Detection Kit (POD (Roche, Germany) ile yapılan immunohistokimyasal boyama yöntemi
ile apopitotik hücre oranlarına baktığımızda grup 2, 3 ve 4'teki apopitotik hücre
yüzdelerinin sırasıyla %88, %83 ve %81 olduğu, kontrol grubundaki apopitotik hücre
vi
yüzdesinin %0 olduğu saptandı. Kaspaz 3, kaspaz 8, sitokrom c ve p53 ile yapılan
incelemede herhangi bir işlem yapılmayan kontrol grubu grup 1de endotelyal hücrelerde
apopitotik bir boyanma saptanmazken, tedavi grupları ile SAK grubu arasında apopitotik
endotelyal hücreler incelendiğinde herhangi bir fark saptanmadı. Tedavi gruplarının
apopitoz üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığı görüldü.
Sonuçlar dahilinde sildenafilin vazospastik damarlar üzerindeki iyileştirici etkisi ve
lipid peroksidasyonunu önlemedeki anlamlı sonuçları nedeniyle yakın gelecekte
vazospazm tedavisinde yer alabilecek bir ilaç olduğuna inanıyoruz. Apopitozu
engellemenin vazospazm oluşumunu engellemeyeceğini, vasküler ve nöronal hücreleri
canlı tutmada yeterli olmadığını, tedavinin amacının ve asıl önem verilmesi gereken
konunun kan pıhtısının kimyasal reaksiyonlarını engellemek, lipid peroksidasyon
oluşumunu önlemek ve NO miktarını arttırmak olduğunu düşünüyoruz.
Anahtar kelimeler: Subaraknoid kanama, Vazospazm, apopitoz, lipid
peroksidasyonu, sildenafil.

Abstract:
After fulfilling many clinical and experimental studies about the mechanism of
cerebral vasospasm following subarachnoidal hemorrhage, it is thought that this
pathologic disease to become after many connecting reactions and it is multifactorial.
It is widely accepted that oxyhemoglobine, appearing following hemolysis of
erythrocytes in the subarachnoidal space as a result of bleeding after rupture of an
aneurysm, is the most important factor in the pathogenesis of vasospasm because of acting
in many reactions causing the pathological process against the vascular and neuronal
tissues. However since the discovery that nitric oxide, an endothelial derived relaxing
factor has 1000 times higher affinity for hemoglobin than oxygen, it is put forward that
decreased NO availibility following SAH is one of the most important factor in
vasospasm(1). Vasoconstriction, vasospasm of the vessels and ischemia in the neurons and
vascular tissue cells is the cause of inflammation, free radical production, lipid
peroxidation and apoptosis developing after oxyhemoglobin and other blood products.
Because of the damage in the vascular endothelial cells and production of free radicals,
either decreasing NO availibility or running out of the present NO, cause of conctriction of
the vessels. As we take into consideration of decreased levels of NO and antiinflamatuar,
vasodilatation, antioxidan and cerebral blood flow regulation effect of NO; we thought that
increasing the amount of NO availibility would be a good option in the treatment of
vasospasm. We carried out our experimental study aiming at searching out the effect of
sildenafil citrate PDE V inhibitor on cerebral vasospasm, which are currently approved for
the treatment of erectil dysfunction and pulmonary hypertension by increasing NO-cGMP
pathway.
In this study 7 male Sprague-Dawley rats weighting between 245-550 grams were
grouped into 4 groups. In group 2 ,3 and 4 the cisterna magna was aseptically punctured
with a needle and 0.5 ml/kg of autologous arterial blood obtained by directly puncturing
the femoral artery was slowly injected intracisternally. Group 1 (Control) rats were
sacrificed and submitted to biochemical study without surgical manipulation. Group 3 and
group 4 after administering the blood intracisternally, received 5 mg/kg and 15 mg/kg
sildenafil respectively for 2 days, respectively. Estrogen has a neuroprotective effect by
decreasing excitotoxicity, glutamate receptor activity and immun inflamation and by
viii
increasing axonal myelinization, synaptogenesis and dendtritic branch so that we used
male rats in the experiment.
All rats were decapitated following sacrification using high dose anesthetic agent
on the second day. The rats basillary artery were sectioned from three seperate zones and
three sections were obtained from each rat. Basillary artery luminal sectional areas were
measured using freeware computerized image-analyse systems (ImageJ, version 1.341;
National Institutes of Health, Bethesda, MD). For lipid peroxidation study cerebellum
section samples from the rats fed by basillary artery were taken. The concentration of lipid
preoxides was measured by thiobarbituric acid test. Immunohistology using the ApopTag
Peroxidase In Situ Apoptosis Cell Detection Kit, POD (Roche, Germany) was used to
demonstrate apoptosis in a cross section of basillary artery. Apoptotic index was calculated
as the number of the immunoreactive nuclei per total number of endothelial cells,
expressed as a percentage. No positive staining of endothelial cells with the ApopTag have
been expressed as Grade 0, 0-24% immunostaining of endothelial cells as Grade 1, 25-49%
as Grade 2, 50-74% as Grade 3, 75-100% immunostaining of endothelial cells have been
expressed by Grade 4. Considering possible false positive results in TUNEL reaction in
necrotic cells, each section was immunostained using for p53 (Clone Pab 240, mouse
monoclonal antibody, NeoMarkers), caspase 3 (CPP32, NeoMarkers), caspase 8 (FLICE,
NeoMarkers) and cytochrome c (Clone 7H8.2C12, mouse monoclonal antibody,
NeoMarkers). Under light microscope examination, the positivity for all of these
antibodies was calculated as positive and negative in the endothelial cells of basillary
artery. In our atudy we used cytochrome c, representing the apoptotic mithocondrial
pathway; caspase 8 respresenting the caspase dependent pathway, caspase 3 representing
the both caspase dependent and independent pathway and p53 playing the essential role in
the whole apoptotic cascade.
In the SAH group(Group 2) the basillary artery circumferences constriction rate
was 61.7% compared with the control group (Group 1). In the SC (5mg/kg)-treated SAH
group, the basillary artery circumference contriction rate was 16.8% and in the SC-treated
15mg/kg SAH group this rate was 7.1% compared with the control group (Group 1). For
the comparison of the effect of SC treatment after SAH, a Post Hoc Tukey test was
performed between the groups. P value was less than 0.05 was considered significant. The
results of group 1 between group 2, group 1 between group 3 and group 1 between group 4
ix
was regarded as statistically significant (p<0.0001). As we take a look at the lipid peroxide
results , lipid peroxide values in SAH group (group 2) was significantly higher compared
with gruop 1(p<0.0001). the lipid peroxide values in the treatment groups (group 3 and
group 4) was significantly decreased compared with group 2 (p<0.0001). We observed that
sildenafil has prevented lipid peroxidation. The apoptotic cells rate, the immunostaining
with In Situ Cell Detection Kit (POD (Roche, Germany)in the groups were 0%, 88%, 83%
and 81%, respectively. With the immunostaining using for p53, caspase 3, caspase 8 and
cytochrome c, there was no actual apoptotic nuclei in group 1. In group 2, 3 and 4 there
was no significant difference in the number of apoptotic nuclei among these groups. In
conclusion no preventing effect of sildenafil has been detected against apoptosis.
In conclusion, we believe sildenafil will take a part in the treatment of vasospasm
in the future because of improving effect on the vessels and preventing effect of lipid
peroxidation. We think that impeding apoptosis is not enough to cure vasospasm and not
enough to keep the cells alive; the main aim of the treatment and the most important issue
is to hinder the chemical reactions of the blood cells in the subarachnoid region and lipid
peroxidation and to increase NO availibility.
Key Words: Subarachnoidal hemorrhage, Vasospasm, apoptosis, lipid
peroxidation, sildenafil.