Nokta mutasyonu yöntemi ile unag proteini varyantının (R112m/R132m) üretilmesi saflaştırılması ve karakterizasyonu
Expression, purification and characterization of unag protein variant (R112m / R132m) by site directed mutagenesis
Yazar: RAMAZAN BAYAT
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ YAKUP ULUSU
Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Biyoteknoloji canlı veya ürünlerinin, insanlığa yararlı ürünler üretmek veya bir problemi çözmede kullanılmasıdır. Biyoteknoloji ile doğayı anlamaya yönelik çalışmaların bazıları canlıların vücutlarında meydana gelen floresan ışıma yöneliktir. Floresan ışıma canlılarında floresan proteinler aracılığı ile olmaktadır. Yapılan bir çalışma sonucunda Japon yılan balığı Anguilla japonica'dan UnaG adı verilen bir floresan proteini bulunmuştur. UnaG omurgalı canlılarda ilk keşfedilen floresan proteini olması ve sadece unkonjuge bilirubin ile etkileşince ışıma vermesi yönünden önemlidir. Hem metabolizmasının yıkımı ürünü olan bilirubin, kanda konjuge ve unkonjuge olarak bulunur. Bilirubin seviyesinin kanda artması toksik etki yaparak çeşitli hastalıklara yol açmaktadır. Günümüzde bilirubin seviyesinin ölçülmesi için çeşitli yöntemler bulunmaktadır. Bu tez çalışmasında UnaG üzerinde nokta mutasyonu ile R112M ve R132M varyantları oluşturulmuştur. Bilirubinin UnaG ile bağlanma noktalarında yapılan bu mutasyonlar ile bağlanma noktalarındaki yük kaldırılarak proteinin floresan özelliklerindeki değişimler incelenmiştir. Mutant proteinlerin üretimi pTolT ekspresyon sistemi kullanılarak E.coli hücrelerinde IPTG ile indüklenerek protein üretimi yapılmıştır. Hücreler yüksek hızlarda santrifüj işlemi ile toplanarak, sonikatör ile parçalanmıştır. Süpernatant kısım Ni-NTA kolonundan geçirilerek protein saflaştırılmıştır. Saf proteinler SDS PAGE elektroforezinde yürütülerek kalitatif analizi yapılmıştır. Proteine bilirubin eklenerek, floresan özellikleri üzerindeki değişikler ölçülmüştür. R112M mutasyonu için Ex 519 nm ve EM 555 nm değerleri elde edilirken R132M mutasyonu için Ex 517 nm, Em ise 556 nm olarak ölçülmüştür. Bu çalışma ile mutant proteinlerin gelecekte bilirubin seviyesinin ölçülmesinde kullanılmasına olanak sağlayacaktır.

Abstract:
Biotechnology is to produce products that are beneficial to humanity, living or end product, or solving a problem. Some of the studies aimed at understanding nature with biotechnology are directed to the fluorescent emission that occurs in the bodies of living creatures. Fluorescence is caused by fluorescent proteins in living organisms. As a result of a study carried out in 2013, a fluorescent protein called UnaG was isolated from the Japanese eel Anguilla japonica. UnaG is the first discovered fluorescent protein in vertebrate organisms and is important in that it only emits when interacting with unconjugated bilirubin. Bilirubin, the product of the degradation of Hem metabolism, is present in the blood as conjugated and unconjugated. Increased bilirubin levels in the blood cause toxic effects and cause various diseases. In this thesis, R112M and R132M variants were created by point mutation on UnaG. These mutations at the binding sites of bilirubin with UnaG will remove the charge at the binding sites and examine the changes in the fluorescence properties of the protein. The production of mutant proteins was induced by IPTG in E.coli cells using the pTolT expression system. Cells were collected by centrifugation at high speeds, were lysed with sonication. Cell residues were then precipitated by ultracentrifugation. The protein was purified by passing the supernatant through the Ni-NTA column. Qualitative analysis of pure proteins was carried out by SDS PAGE electrophoresis. Changes in the fluorescence properties were determined by adding unconjugated bilirubin to the protein. The excitation wavelengths for R112M and R132 mutation is 519 nm, 517 nm and the emission wavelength was 555 nm, 556 nm respectively. This study will allow the use of mutant proteins to measure bilirubin levels in the future.