Schizosaccharomyces pombe'de septin 1 geninin susturulması ve hücre bölünmesine etkisi
The silencing of septin 1 gene in Schizosaccharomyces pombe and effects on cell division
Yazar: SÜLEYMAN SEMİH EKİMLER
Danışman: DOÇ. DR. ERCAN ARICAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Kodlama yapmayan küçük RNA'lar ökaryotlarda gen anlatımının düzenlenmesinde en önemli işlevsel moleküllerdir. Bu RNA'lar arasında çift zincirli öncül moleküllerden oluşan 21 ila 25 nükleotit büyüklüğündeki küçük interferans RNA'lar (siRNA) dizi benzerliği ile belirlenen hedef genlerinin anlatımını mRNA yıkımı, translasyonel baskılama ve kromatin modifikasyonu gibi çeşitli yöntemlerle sessizleştirirler. siRNA'ların bu sessizleştirici özelliği birçok genin in vitro olarak sessizleştirilmesinde kullanılmaktadır. Septinler ilk olarak S. cerevisiae'de hücre bölünmesi mutantlarında tanımlanmış, hücre bölünmesi sırasında tomurcuk yapısı oluşurken medyal halkanın oluşmasında görevli proteinlerdir. S. pombe'de ve insanda homologları bulunan bu proteinler hücre bölünmesinin kontrolü, hücre polarizasyonu, hücre hareketliliği ve hücre içi bölümlerin belirlenmesi gibi görevlerinden dolayı nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve infeksiyon ile ilişkilendirilmiştir. Özellikle Alzheimer Hastalığı'nda farklı septin türlerinin anlatım seviyelerinin ve fonksiyonlarının değiştiği gözlemlenmiştir. Ayrıca değişen bu septin fonksiyonlarının nöronlar içinde nörofilament düğümlerin oluşumuna, nörotransmitter madde salınımında ve sinaptik işlevlerde değişimlere yol açtığı belirtilmiştir. Bu tez çalışmasının amacı sentetik siRNA'lar ile gerçekleştirilen gen sessizleştirmesidir. Bu tez çalışması kapsamında S. pombe'de tanımlanmış yedi septin geni içerisinden septin 1 geninin anlatımının sessizleştirilmesi amacıyla bu gene özgü siRNA'lar tasarlanmış ve sentetik siRNA'ların hücre içine katyonik lipozomlar aracılığı ile integrasyonu gerçekleştirilmiştir. Sessizleştirme işleminin gen düzeyindeki etkisi qPCR ile analiz edilmiştir. Septin 1 genine ait farklı bölgelerden sentezlenen siRNA'lar arasında genin anlatımını en fazla miktarda azaltan siRNA genin 3'-UTR bölgesinden seçilen siRNA olmuştur. Sessizleştirmenin hücre bölünmesine etkisini belirlemek için farklı siRNA'larla gerçekleştirilen sessizleştirmeler ile hücre büyüme grafikleri oluşturulmuş ve yine 3'-UTR bölgesinden seçilen siRNA'nın hücrelerin bölünmelerini en çok yavaşlatan siRNA olduğu gözlemlenmiştir. Daha sonra GFP bağlı α2-tübülin içeren pDQ105 plazmidi ile transforme edilen S. pombe hücrelerinde 3'-UTR bölgesinden seçilen siRNA ile septin 1 geni sessizleştirilmiş ve sessizleştirmenin etkisi floresan mikroskopu ile incelenmiştir. Sessizleştirme sonucunda hücrelerin bölünme sırasında sitoplazma ayrımı tamamen gerçekleşmeden uzun zincir yapıları halinde bulunduğu gözlemlenmiştir. Septin 1 geninin sentetik siRNA'lar ile sessizleştirilmesinin hücre bölünmesini yavaşlatıcı yönde etkilediğinin gösterilmesi septinlerin doğrudan ilişkili olduğu nörodejeneratif hastalıkların moleküler temelinin açıklanması açısından önem teşkil etmektedir.

Abstract:
Non-coding small RNAs are the most important functional molecules in regulation of gene expressions for eukaryotes. Among these RNAs, 21-25 nucleotide long small interference RNAs (siRNA) that are derived from double-stranded precursor mulecules silence the expression of target genes based on sequence complementarity via mRNA degredation, translational inhibition and chromatin modification. The silencing effect of siRNAs has been used for silencing many genes in vitro. Septins were first discovered in S. cerevisiae in cell division mutants and they play a role in the formation of medial ring at bud-neck separation. The homologues of septins have been identified in S. pombe and in human and they have been associated with neurodegenerative diseases, cancer, and infections based on their roles in control of cell division, cell polarization, cell mobility, and cell compartmentalization. Especially in Alzheimer's Disease altered expression levels of different septins have been observed. Additionally, these altered expression levels lead to changes in function of septins and are associated with formation of neurofilamentous tangles, secretion of neurotransmitters, and changes in synaptic functions. The aim of this study is to silence genes in vitro via synthetic siRNAs. In this thesis project, among the seven identified septin genes of S. pombe septin 1 gene was aimed to be silenced via siRNAs. Specific siRNAs were designed for septin 1 gene and these synthetic siRNAs were introduced to cells via cationic liposomes. The effect of silencing was analysed via qPCR and the synthetic siRNA that had designed to be complementary to the 3'-UTR of septin 1 gene was found to have the most reducing effect in silencing. In order to define the effect of silencing on cell division, cell growth plots were constructed with the cells had been introduced by different siRNAs and again the same siRNA that has complementarity to the 3'-UTR was observed to slow the cell division the most. Subsequently GFP-combined α2-tubulin containing pDQ105 plazmids were transfered to S. pombe cells and these cells were subjected to siRNA silencing with the siRNA that had complementarity sequence to 3'-UTR of septin 1 gene. The effect of silencing were observed by flourescence microscope. Following the silencing cells were found as long chains of cells based on arresting of cytokinesis after cell division via siRNAs. The findings that have been presented here showed that the silencing of septin 1 gene via synthetic siRNAs have an obstructive effect on cell division and are valuable for understanding the molecular mechanisms of Alzheimer's Disease due to direct link of septins with the disease formation.