Fare embriyonik kök hücre koloni parçalarının açık çekilmiş payet yöntemi ile dondurulması
Freezing of mouse embryonic stem cell colony fragments by open pulled straw method
Yazar: KAMBER DEMİR
Danışman: PROF. DR. SEMA BİRLER
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2009
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Fare embriyonik kök hücre hatları; terapötik amaçlı, insan hastalık modeli fare oluşturulması, kimyasal maddelerin toksik etkilerinin ve hücre içi sinyal mekanizmalarının araştırılması çalışmalarında kullanılmaktadır. Fare embriyonik kök hücreleri yavaş dondurma veya vitrifikasyon yöntemleri ile dondurulduğunda sırasıyla kristal oluşumu veya yüksek kriyoprotektan maddelerin toksik etkileri nedeniyle hasara uğramaktadır. Bu nedenle hücrelerin pluripotent yapısını ve canlılık oranını koruyan dondurma yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Çalışmamızda, fare embriyonik kök hücre hatlarının saklanabilmesi için güvenilir ve kolay uygulanabilir bir dondurma yönteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır. ?Açık Çekilmiş Payet? tekniği kullanılarak; 50 mM Taurin içeren veya Taurin içermeyen vitrifikasyon medyumu (%20 DMSO, %20 EG ve 0,5 M Trehaloz) ile embriyonik kök hücreler dondurulmuş, eritme sonrası sırasıyla %53,9 ve %55,6 canlılık oranı elde edilmiştir. Eritilen koloniler toplam altı pasaj ilerletildikten sonra embriyonik kök hücre belirteci olan Oct-4 ve Nanog transkripisyon faktörlerini eksprese ettiği ve 40-XY kromozomal yapıya sahip olduğu gösterilmiştir. Antioksidan etkili Taurin maddesinin hücrelerin eritme sonrası canlılık oranları ve transkripsiyon faktörlerinin salgısı üzerine etkili olmadığı bulunmuştur. Sadece DMSO ve EG oranları yarıya düşürülerek (%10 DMSO, %10 EG ve 0,5 M Trehaloz) vitrifikasyon yapılan gruplarda ise, eritme sonrası sırasıyla %28,45 ve %34,55 canlılık oranına ulaşılmasına karşın hücreler ilk pasaj sonrası canlılığını kaybetmiştir.Sunulan çalışmada fare embriyonik kök hücreleri yüksek oranda kriyoprotektan (%20 DMSO, %20 EG) içeren medyum içerisinde, açık çekilmiş payet yöntemiyle dondurularak başarıyla saklanabilmiştir.

Abstract:
Mouse embryonic stem cell lines; can be used in studies for therapeutic purposes, to form human disease model mice, to investigate the toxic effects of chemicals and intra cellular signal mechanisms. Mouse embryonic stem cells can be deteriorated during freezing or vitrification as a result of crystal formation and high toxicity of cryoprotectans. It is necessary to develop new freezing methods keeping the pluripotent structure and survival rate of cells. In our study it was aimed to develop a reliable and appliable freezing method to store mouse embryonic stem cell lines.Embryonic stem cells were frozen by using ?Open Pulled Straw? method in vitrification medium (20% DMSO, 20% EG and 0,5 M trehalose) with or without 50 mM taurin. Post-thaw vitality rate was 53,9% and 55,6%, respectively. Thawed colonies were passaged 6 times and Oct-4 and Nanog transcription factors were shown to express and have 40-XY chromosomal structure. Taurin had no effect on post-thaw survival rate and secretion of transcription factors of cells. Only by halving DMSO and EG amounts (10% DMSO, 10% EG and 0,5 M trehalose), 28,45% and 34,55% post-thaw survival rates were reached in vitrification groups respectively. However, cells lost their vitality after the first passage.In conclusion, mouse stem cells could be frozen and stored successfully in high cryoprotectant (20% DMSO, 20% EG) bearing medium by open pulled straw method.