Kapsaisinin insan kıkırdak dokusunun normal ve kanserli hücrelerine etkisinin in vitro koşullarda incelenmesi
Investigation of the effect of capsaicin on normal and cancerous cells of human cartilage tissue in vitro
Yazar: NAGİHAN HELVACI DURMAZOĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SABAHATTİN CÖMERTPAY
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Kondrosarkom, kemik kanserleri türleri içinde en yaygın görülen ikinci türdür. Bu kanser türünde fibröz bağ doku etki görür ve kıkırdak ve kemik anormal düzeylerde büyüme gösterir. Kapsaisin, kırmızı acı biberde bulunan aktif bir ikincil metabolittir.  Kapsaisinin glioma, meme kanseri, idrar kesesi kanseri ve kan kanseri gibi birçok farklı türden kanser hücreleri üzerinde öldürücü etkisi olduğu gösterilmiştir. Etki mekanizmasını açıklamaya yönelik yapılan çalışmalar, kapsaisinin kanser hücrelerinde hücre döngüsü ve apoptoz süreçlerini etkilediğini ortaya koymuştur. Ancak kapsaisinin kıkırdak hücreleri üzerine etkisi için yapılan çalışmalar bu etkinin benzer bir şekilde gerçekleşip gerçekleşmediğini ortaya koyamayacak denli kısıtlıdır. Bu tezin amacı; in vitro koşullar altında kapsaisin muamelesinin, sağlıklı ve kanserli kıkırdak hücrelerinin hayatta kalabilirliklerini nasıl etkilediğini saptamak ve hücrelerin apoptoz, migrasyon ve invazyon yeteneklerindeki değişikliklere ışık tutmaktır. Çalışmamızda, kondrosarkom ve kondrosit hücrelerinde kapsaisinin IC50 değerleri, hem fetal sığır serumu (FBS) içeren hem de içermeyen ortamda MTS aracılığıyla belirlenmiştir.  Buna göre FBS'li ortamda IC50 değeri OUMS (kondrosarkoma) hücreleri için 254 μM CHO (sağlıklı kondrosit) hücreleri için ise 284 μM olarak hesaplanmış ve iki yönlü ANOVA testi bu değerlerin istatiksel olarak bir fark taşımadığını ortaya koymuştur (p>0.05). Western blot aracılığıyla FBS'siz ortamda Siklin E seviyesinde anlamlı bir düşüş olduğu gözlenmiştir (p<0.05).  Sonrasında, FBS'siz ortamda OUMS hücreleri için IC50 değeri 106 μM olarak CHO hücreleri için ise 60 μM olarak belirlenmiş ve aralarında anlamlı bir fark olmadığı ortaya konulmuştur (p>0.05). Ancak, FBS'li ve FBS'siz ortamda yetiştirilen aynı hücreler karşılaştırıldığında, azalan Siklin E miktarının hücrelerin IC50 değerlerini belirgin bir şekilde düşürdüğü tespit edilmiştir (p<0.05). Ayrıca, FBS'li ortamda IC50 derişiminde kapsaisine 24 saat boyunca maruz kalan hücrelerle gerçekleştirilen kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve Western blotlama tekniği sonuçlarına göre; OUMS ve CHO hücrelerinin Kaspaz-3, -8 ve -9 mRNA ve protein seviyeleri kapsaisin maruziyetinden etkilenmemektedir. Bunun yanında, DNA fragmentasyon deneyleri de kapsaisin muamelesinin apoptoza yönelttiğine ilişkin bir veri sunmamıştır.   Öte yandan, yara iyileştirme ve invazyon deneyleri sonunda, kapsaisin ile muamele edilmiş hücrelerin hareket hızının kontrol grubuna göre çarpıcı bir biçimde azaldığı tespit edilmiştir (p <0.05).  Sonuç olarak; kapsaisin hem sağlıklı hem de kanserli kondrosit hücrelerinde benzer sitotoksiste gösterdiği sonucuna varılmıştır. Siklin E seviyesinin düşüşü hücrelerin G1 basamağında tutulması olarak değerlendirildiğinde, hücrelerin bu fazda kapsaisin hassasiyetlerinin arttığı ancak kapsaisin özgüllüğünün değişmediği söylenebilir. Gözlenen hücre ölümleri kaspazlardan bağımsız ve yüksek ihtimalle apoptotik olmayan bir mekanizma üzerinden gerçekleşmektedir ve kapsaisin, kondrosarkoma hücrelerinin göç ve istila yeteneklerini zayıflatmaktadır. Kapsaisinin kanser hücrelerinin invazyon ve migrasyon yeteneklerini önemli ölçüde azaltmasından dolayı diğer ilaçlarla birlikte terapiyi destekleyici bir rolü olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Chondrosarcoma is the second most common type of bone cancer. In this type of cancer, fibrous connective tissue becomes affected and cartilage and bone grow at abnormal levels. Capsaicin is an active secondary metabolite found in red hot pepper. It has been shown that capsaicin may have lethal effects on different types of cancer cells such as glioma, breast, urinary bladder, and blood cancers. Attempts to elucidate the mechanism of its action have revealed that capsaicin interferes with the cell cycle and apoptotic pathways of cancer cells. However, studies on the effect of capsaicin on cartilage cells have remained so limited that it is virtually unknown whether a similar action also applies to chondrosarcoma or not. The aim of this thesis is to determine how capsaicin treatment under in vitro conditions may affect the survival of healthy and cancerous cartilage cells, and to shed light on changes in apoptotic pathways as well as migration and invasion abilities of the cancer cells. In our study, we determined the IC50 values of capsaicin on cancerous and healthy cells of cartilage grown in both fetal bovine serum (FBS)-containing and not-containing (non-FBS) media by MTS. Accordingly, the IC50 value in FBS-containing medium was calculated as 284 μM for CHO (chondrocyte) and as 254 μM for OUMS (chondrosarcoma) and two-way ANOVA analysis revealed that these values did not differ statistically (p> 0.05). In the cells grown in non-FBS medium, a significant reduction in the level of cyclin E protein (p<0.05) was observed via Western Blotting (WB). Subsequently, IC50 values of OUMS and CHO cells in FBS-free media were determined as 106 μM and 60 μM, respectively, with no significant difference (p>0.05). However, when the same cells in non-FBS and FBS media were compared, lowered cyclin E levels were found to cause a significant decrease in IC50 values of capsaicin on both cells (p <0.05). Moreover, quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and WB were performed for the cells exposed to capsaicin at IC50 concentration in FBS medium, and mRNA and protein levels of Caspase-3, -8 and -9 of OUMS and CHO cells were detected to be unaffected. In addition, DNA fragmentation assays did not provide any evidence that capsaicin treatment may lead the cells to apoptosis. On the other hand, at the end of wound healing and invasion assay experiments, it was determined that the speed of movement of capsaicin treated cells decreased significantly compared to the control group (P <0.05). As a result, we concluded that capsaicin appears to have similar cytotoxicity against both healthy and cancerous chondrocyte cells. When the decrease in cyclin E level is considered as keeping G1 in the cells, it can be said that the capsaicin sensitivities of the cells increased by G1-arrest, however capsaicin specificity did not change. We also believe that the cell death observed upon capsaicin exposure is most likely to occur via a non-apoptotic mechanism that is independent of caspases, and capsaicin attenuates the migration and invasion capabilities of chondrosarcoma cells. Since it significantly reduces invasion and migration capabilities of cancer cells, it is thought that capsaicin may support the therapy when used in conjuction with other drugs.