Horseradish peroksidaz (HRP) enzimi üzerine bazı benzohidrazidtürevlerinin etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of some benzohidrazidederivatives on horseradish peroxidase (HRP) enzyme
Yazar: DENİZ EREL
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada, Horseradish peroksidaz enziminin inhibitörleri olan 3-Amino benzohidrazid ve 4-Amino benzohidrazid türevi moleküller kullanılarak tek basamakta saflaştırılması için etkili ve yeni afinite ligantlarının belirlenmesi hedeflendi. Bu amaçla, literatürde bulunan bitki peroksidaz POD saflaştırma çalışmalarına katkı sağlamak için 3-amino benzohidrazid ve türevleri olan 3-amino 5-metil benzohidrazid, 3-amino 5-metoksi benzohidrazid ve 4-amino benzohidrazid ve türevleri olan 4-amino 2-nitro benzohidrazid, 4 amino 3-nitro benzohidrazid molekülleri sentezlendi ve POD enziminin saflaştırılmasında kullanıldı. 3-Amino benzohidrazid türevi ve 4-amino benzohidrazid türevi moleküllerin metilbenzoat formlarından hidrazin sentezleri yapılarak Horseradish Peroksidaz (HRP) enzimi üzerine inhibisyon etkileri incelendi ve dönüşümlü inhibisyon gösteren moleküller Sepharose-4B-L-Tirozin jel materyaline bağlanarak elde edilen afinite jelleri tek kademede Horseradish peroksidaz (HRP) enziminin saflaştırılması gerçekleştirildi. 3-Amino 5-metil benzohidrazid molekülü kullanılarak HRP enzimi ile %2,21 verimle 70,3 kat;3-amino 5-metoksi benzohidrazid ile %2,39 verimle 135,43 kat; 4-amino 2-nitro benzohidrazid ile %6,5 verimle 151,7 kat, 4-amino 3-nitro benzohidrazid kullanılarak %1,2 verimle 60,3 kat saflaştırıldı. HRP enziminin molekül ağırlığı ve saflığı sodyum dodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile kontrol edildi ve 43-47 kDa'da aralıklarında tek bant gözlendi. Tüm kolonların saflaştırma sonuçları karşılaştırıldı ve en iyi kolon materyali olan Sepharose-4B-L-Tirozin-4-amino-2-nitro benzohidrazid kolonu ile Sepharose-4B-L-Tirozin-3-amino-5-metoksi benzohidrazid için kolon tutma kapasitesi,HRP enzimi için değişik pH, sıcaklık, iyonik şiddetlerde çalışıldı. Horseradish POD enzimi 4-amino-2-nitro benzohidrazid kolonu için optimum şartlar: pH 7,5 sıcaklık 20°C ve iyonik şiddet 0,3 M konsantrasyonunda optimum bağlanma 2060 µg/g jel ve 3-amino-5-metoksi benzohidrazid kolonu için optimum şartlar: pH 7 sıcaklık 20°C ve iyonik şiddet 0,2 M aynı şartlar altında 2363,3 µg/g jel olarak tespit edildi.

Abstract:
In the current study, it was aimed to determine the effective and novel affinity ligands using 3-amino benzohydrazide and 4-amino benzohydrazide derivative molecules, which are inhibitors of the enzyme, for purification of the enzyme in one step. For this aim, 3-amino benzohydrazide and its derivatives which are 3-amino 5-methyl benzohydrazide, 3-amino 5-methoxy benzohydrazide and 4-amino benzohydrazide and its derivatives which are 4-amino 2-nitro benzohydrazide and and 4-amino 3-nitro benzohydrazide molecules were synthesized in order to contribute to the purification studies on plant peroxidase enzymes (POD) in the literature and used purification of POD enzyme. Hydrazine synthesis were done from the methyl benzoate forms of the 3-amino benzohydrazide and 4-amino benzohydrazide derivatives and investigated the inhibition effects on HRP enzyme. Molecules with reversible inhibition were bound to Sepharose-4B-L-Tyrosine gel material and HRP enzyme was purified in single step. Using 3-amino 5-methyl benzohydrazide molecule, HRP enzyme was purified with a yield of 2,21%, 70,3 fold, using 3-amino 5-methoxy benzohydrazide with a yield of 2.39%, 135.43 fold, using 4-amino 2-nitro benzohydrazide with a yield 6.5 fold 151,7 fold, using 4-amino 3-nitro benzohydrazide with a yield of 1.2%, 60.3 fold. HRP enzyme purity and molecular weight were controlled by sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and single band were observed at 43-47 kDa. The purification results of all the column material were compared and the column holding capacity was studied in different pH, temperature and ionic strengths for HRP enzyme using Sepharose-4B-L-Tyrosine-4-amino-2-nitro benzohydrazide and Sepharose-4B-L-Tyrosine-3-amino-5-methoxy benzohydrazide column, which are the best column materials. Optimum parameters for Horseradish POD enzyme were determined as 7.5 for pH, 20°C for temperature, 0.3 M for ionic intensity and 2060 µg/g gel for optimum binding for 4-amino 2-nitro benzohydrazide coloumn and optimum parameter for Horseradish POD enzyme were determined as 7 for pH, 20°C for temperature, 0.2 M for ionic intensity and 2363.3 µg/g gel for optimum binding for 3-amino 5-metoxy benzohydrazide coloumn.