Erişkin erkek sıçanlarda kisspeptinin spermatogenezis ve apoptozise etkisinin immünohistokimyasal, ışık ve elektron mikroskopik olarak incelenmesi
The ımmunohistochemistry, light and electron microscopic study of the effects of kisspeptin on spermatogenesis and apoptosis in the adult male rats
Yazar: NİLÜFER ULAŞ
Danışman: PROF. DR. AYSEL KÜKNER
Abant İzzet Baysal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Kisspeptin = Kisspeptin ; Mikroskopi-elektron taramalı = Microscopy-electron scanning ; Mikroskopi-ışık = Microscopy-polarization ; Sperm = Spermatozoa ; Sperm oluşumu = Spermatogenesis ; Spermatogenez = Spermatogenesis ; Sıçanlar = Rats ; Testis = Testis ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Bu çalışmada, erişkin sıçanlara akut ve kronik uygulanan kisspeptinin testis dokusundaki etkilerinin ışık ve elektron mikroskopik ve biyokimyasal olarak incelenmesi amaçlanmıştır.Hipofizden LH ve FSH salgılanmasını uyaran çok güçlü bir nöropeptit olan kisspeptin, bu etkisini GnRH düzeylerini artırarak yapmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda ergenliğe geçişte kimyasal öpücük olarak tanımlanan kisspeptinin üreme işlevlerine etkili olduğu bildirilmektedir.Çalışmada, 1 gün serum fizyolojik (SF), 5 gün SF, 13 gün SF, 1 gün Kisspeptin-10, 5 gün Kisspeptin-10, 13 gün Kisspeptin-10, 13 gün Kisspeptin-10 uygulamasının ardından 7 gün uygulama yapılmadan bekletilen olmak üzere toplam 7 grup oluşturuldu. Ayrı olan SF grupları tek bir kontrol grubu olarak değerlendirildi. 1 ve 5 günlük uygulamalar akut, 13 günlük uygulama kronik olarak kabul edildi. Kisspeptin-10, 50nmol dozunda intraperitoneal (i.p.) olarak günde 1 defa uygulandı. Kisspeptin ve GPR54'ün testis dokusundaki ekspresyonu immünfluerosan mikroskobunda incelendi. Işık mikroskopik incelemeler için Hematoksilen-Eozin, PAS (+), Masson Trikrom boyaması, proliferasyonu tanımlamak için Ki 67, apoptotik hücreleri tanımlamak için TUNEL immün boyamaları yapıldı, serumda testosteron düzeyleri ELISA ile ölçüldü. Testis dokusunun ince yapısı değerlendirildi. Kontrol grubuna göre akut dönemde testosteron seviyesi artarken, kronik uygulamada bu seviye azaldı. Spermatogenetik hürelerde Ki-67 (+) hücre sayısı kontrol grubuna göre tüm gruplarda artış göstermesine rağmen, bekletilen grupta azaldı. TUNEL yöntemi ile belirlenen apoptotik hücre sayısı, kontrol grubuna göre akut dönemde azalma gösterirken, kronik dönem uygulamalarında anlamlı olarak artmıştı. Testis ağırlığı ve tübül çaplarında anlamlı farklılık gözlenmedi. Elektron mikroskopik incelemelerde, kontrol grubunda seminifer tübül epiteli normal görünümde saptandı. Akut uygulama gruplarında (1-5) seminifer tübül epitelinde, bazal membran üzerinde apoptotik hücreler, Sertoli hücre ve spermatogonium sitoplazmasında krista yapılarında erime olan mitokondriyonlar tespit edildi. Kiss (5) grubunda, spermatik kord hücre serileri arasındaki bağlantı birimlerinde oluşan dejenerasyon sonucu spermatogenetik hücreler arasında açıklıklar görüldü. Kiss (13) grubunda ise seminifer tübül epitelinin bazal bölgesinde apoptotik hücreler gözlendi. Kiss (13+7) grubunda tübül hücreleri genellikle normal yapıda gözlenirken, bazalde yer alan bazı koyu spermatogonyumların sitoplazmasında vakuolizasyon görüldü. Tüm deney gruplarında intertisyal dokuda aktif Leydig hücreleri saptandı.Sonuç olarak, yapılan bu deneysel çalışmada kisspeptin-10'un seminifer tübüllerde akut ve kronik uygulama dönemlerinde hücre proliferasyonunu artırdığı, kisspeptinin kesilmesiyle birlikte proliferasyonun ve testosteron seviyesinin azaldığı, apoptozisin arttığı tespit edilmiştir.

Abstract:
In this study, it is intended to investigate the effects of acute and chronic administration of Kisspeptin on testis tissue by biochemical methods, light and electron microscopy.Kisspeptin is a very strong neuropeptide inducing the LH and FSH secretion from the hypophysis and shows this effect by increasing the level of GnRH. In the recent studies, Kisspeptin known as a ?chemical kiss? has been reported to be effective about the reaching puberty.In this research, seven groups were formed as 1 day saline (SF), 5 days SF, 13 days SF, 1 day Kisspeptin-10(Kiss-10), 5 days Kiss-10, 13 days Kiss-10, 7 days waiting period after 13 days. The different SF groups were assessed as a control group, both 1 and 5 days adminstration as acute group, 13 days as chronic group. 50 nmol Kiss-10 was treated intraperitoneal (i.p.) one time in a day. Expression of Kisspeptin and GPR54 in the testis tissue was examined with immunfluerosans microscope. Hematoxylene- Eosine, PAS (+), Masson Trichrome staining, Ki-67 immunohistochemistry staining for defining proliferation, TUNEL immunreaction for apoptosis staining were performed for light microscopical evaluations. The level of testosterone was measured in serum by ELISA. The ultrastructure of testis tissues were evaluated.In the Kisspeptin group, the level of testosterone increased in acute period, decreased in chronic period compared to controls. Although the spermatogenetic cells stained with Ki-67 increased according to control group, these decreased in (13+7) group. The number of apoptotic cells defined with TUNEL decreased in acute group according to control, increased in chronic period. There was no differences about testis weight and diameter of tubules. In electron microscopic observation, seminifer tubule epithelium was normal appearance in control groups. In acute groups (1-5 days), apoptotic cells on the basement membran and epithelium of the seminifer tubule and also mitochondrial crystalisis in Sertoli cells and spermatogonium cytoplasm were determined. In 5 days Kiss group, the spaces among the spermatogenetic cells caused by degeneration of the connection units of spermatogenetic cord cell line were observed. In 13 days Kiss group, apoptotic cells were determined at the basal region of the seminifer tubule epithelium. In (13+7) group, as the tubule cells were observed in normal structure, vacuolization was determined in the cytoplasm of the dark spermatogonium placed in basal. In all experiment groups, active Leydig cells were situated in interstitial tissue.As a result, Kisspeptin-10 used in this study increased proliferation in seminifer tubule in acute and chronic adminstration groups. When it gave up, testosteron level and proliferation decreased, apoptosis increased.