Hiperglisemik nöropati ve mitokondriyal fonksiyonun ilintisi: Mitokondri (dis)fonksiyonu ve mitofaji/otofaji modülasyonunun potansiyel nöroprotektif etkisi üzerine in vitro araştırmalar
Hyperglycemic neuropathy and its relevance to mitochondrial function: In vitro investigations on the potential neuroprotective effect of mitochondrial (dys)function and mitophagy/autophagy modulation
Yazar: ARİF KAMİL SALİHOĞLU
Danışman: PROF. DR. AHMET AYAR
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Diabetik nöropatiler = Diabetic neuropathies ; Hiperglisemi = Hyperglycemia ; Hücre ölümü = Cell death ; Mitofaji = Mitophagy ; Mitokondriler = Mitochondria ; Nöropatiler = Neuropathies ; Nöroproteksiyon = Neuroprotection ; Otofaji = Autophagy ; Toksisite testleri = Toxicity tests

Özet:
Nöropati, kronik hiperglisemili hastaların yaklaşık yarısında gelişen en yaygın komplikasyondur. Mitokondri disfonksiyonunun ve mitofaji/otofaji modülasyonundaki bozuklukların, hiperglisemik nöropatinin patogenezinde kritik rolleri olduğu gösterilmiştir; ancak bu modülasyonları düzenleyen ajanların nöroprotektif etkisi araştırılmamıştır. Bu bağlamda tez çalışmasının amacı, bu modülasyonları düzenlediği bilinen seçilmiş ajanların (anetol trition, ürolitin A, rapamisin ve metformin ile kombinasyonlarının), dorsal kök gangliyon (DKG) nöron hücre kültüründe hiperglisemi ile tetiklenen in vitro strese karşı nöroprotektif etkilerini test ederek, tedavi edici potansiyelleri için kanıt sunmaktır.

Hiperglisemik nöropatinin hücresel modeli olarak (12 haftalık) C57BL/6J farelerden elde edilen DKG nöronları kültüre edildi. Test ajanlarının yüksek glukoz konsantrasyonunda (YG, 50 mM) inkübe edilen nöronlar üzerindeki nöroprotektif etkileri, 70 saat boyunca gerçek zamanlı hücre analizi yöntemi (xCELLigence) ile "hücre indeksi" ana ölçüm parametresi kullanılarak incelendi. İstatistik analizler, tek yönlü ANOVA ve Fisher'in LSD post-hoc testi ile gerçekleştirildi ve 0.05'ten küçük p değerleri anlamlı kabul edildi.

YG maruziyeti, DKG nöronlarının hücre indeksinde anlamlı düzeyde düşüşe yol açtı (p=0.006). YG ile eşzamanlı anetol trition uygulamasının herhangi bir dozunda YG nörotoksisitesini anlamlı olarak önleyemedi (p>0.05). YG ile eşzamanlı ürolitin A (10 μM veya 30 μM) veya rapamisin (0.1 μM veya 0.3 μM) uygulamasının YG nörotoksisitesini önlediği saptandı (sırasıyla p=0.01, p=0.04, p=0.036 ve p=0.008). YG ile eş zamanlı metformin veya test ajanlarıyla kombinasyonlarının YG nörotoksisitesini anlamlı düzeyde önleyemediği tespit edildi (p>0.05).

Bu tez çalışması ile, mitofaji/otofaji modülatörü ajanlar olan ürolitin A ve rapamisin'in fare DKG nöronlarında doz bağımlı olarak YG nörotoksisitesine karşı nöroprotektif kapasiteye sahip olduğuna dair özgün kanıtlar elde edildi. Bu çalışmanın sonuçlarına ve aracılık eden moleküler mekanizmalar hakkında kanıta yönelik daha ileri in vivo preklinik ve klinik çalışmalara ihtiyaç vardır.

Anahtar Sözcükler: Diyabetik Nöropati, Hiperglisemi, Mitofaji, Mitokondri, Otofaji

Abstract:
Neuropathy is the most prominent complication (approximately in half of patients) of chronic hyperglycemia. Mitochondrial dysfunction and mitophagy/autophagy demodulation have been indicated to play crucial roles in pathogenesis of hyperglycemic neuropathy; however, whether agents that provide these modulatory effects have neuroprotective effects has not investigated. In this context, the aim of this thesis study is to evaluate the neuroprotective effects of selected agents known to provide aforementioned modulations (anethole trithione, urolithin A, rapamycin and their combinations with metformin) against in vitro stress induced by high glucose (HG) in dorsal root ganglion (DRG) neuron cell culture and to provide evidence for their therapeutic potential.

DRG neurons from (12 weeks old) C57BL/6J mice were cultured as a cellular model of hyperglycemic neuropathy. The neuroprotective effects of test agents on HG-induced neurons were examined using "cell index" as main parameter with xCELLigence real-time cell analyzer for 70 hours. Statistical analyses were performed by one-way ANOVA and Fisher's LSD post-hoc test, with significance set at p<0.05.

HG (50 mM) exposure caused a significant decline in cell indices in DRG neurons with physiological glucose levels. Co-treatment of anethole trithione with HG-induction failed to significantly attenuate HG-induced neurotoxicity at any dose (p>0.05). Co-treatment of urolithin A (10 μM or 30 μM) or rapamycin (0.1 μM or 0.3 μM) with HG-induction significantly prevented HG-induced decrease in cell index (p=0.01, p=0.04, p=0.036 and p=0.008 respectively). Co-treatment of metformin or its combinations with other test agents failed to significantly attenuate HG-induced neurotoxicity (p>0.05).

This thesis study indicates unique evidence that urolithin A and rapamycin, which modulate mitophagy/autophagy, have dose-dependent neuroprotective capacity against HG-induced neurotoxicity in murine DRG neurons. Further in vivo preclinical and clinical studies are warranted to address the results of this study and providing evidence on the mediating molecular mechanisms.

Keywords: Diabetic Neuropathy, Hyperglycemia, Mitophagy, Mitochondria, Autophagy