DUSP1 proteininin meme kanseri üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of DUSP1 protein on breast cancer
Yazar: SEFA METİN
Danışman: PROF. DR. HAKAN GÜRDAL
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme kanseri =   ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Mitojenler = Mitogens ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Protein kinazlar = Protein kinases ; Sisplatin = Cisplatin

Özet:
Mitogen-activated protein kinase (MAPK) ailesi hedef proteinlerinin serin ve treonin aminoasitlerini fosforile eden bir protein kinaz ailesidir. Bu protein kinazlar ERK, JNK, p38 olmak üzere üç temel alt aile şeklinde sınıflandırılabilir. MAPK ailesi hücre büyümesi, hücre proliferasyonu, mitoz, apoptozis gibi birçok hayati hücresel fonksiyonun düzenlenmesinde görev alır. Dual-specificity phosphatase (DUSP) ailesi MAPK'leri defosforile eden protein fosfataz ailesidir. Hedef proteinlerinin hem tirozin hem de serin/treonin rezidülerini defosforile edebilme yeteneklerinden dolayı bu proteinlere Çift Spesifik fosfataz ismi verilmiştir. Dual-specificity phosphatase 1 (DUSP1) MAPK aktivasyonunu düzenleyerek inflamasyon, apoptozis, hücre büyümesi, hücre proliferasyonu gibi birçok hücresel fonksiyonda rol alır. 
Çalışmamızda üçlü negatif meme kanseri olan MDA-MB-231 hücreleri kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 yöntemi ile bu hücrelerde DUSP1 proteini ifadesi azaltılmıştır. Bu hücrelerde proliferasyon ve motilite deneyleri yapılmış, Western Blot yöntemi ile MAPK proteinlerinin ifadelerinde değişmeler değerlendirilmiştir. Proliferasyon deneyleri Incucyte live-cell analysis' sistemi ile yapılmıştır. Elde edilen proliferasyon eğrileri üzerinden hücrelerin ikiye katlanma zamanları ve maksimum hücre sayıları hesaplanmıştır. Hücre motilitesi 'Transwell migration assay' ve yara iyileşmesi deneyleri ile ölçülmüştür. 
Proliferasyon deneylerinde DUSP1 ifadesinin azalmasının hücrelerin proliferasyonunu azalttığı görülmüştür. Ek olarak DUSP1 inhibitörü olan BCI, MDA-MB231 hücrelerinde antiproliferatif etki göstermiştir. Bu antiproliferatif etki kontrol hücrelerinde daha fazladır. Bu durumun nedeninin, DUSP1-CRISPR hücrelerinde DUSP1 proteininin azalmasından kaynaklandığı ve azalmış DUSP1 ifadesi nedeniyle BCI'nın bu grupta daha az etkin olduğu düşünülmüştür. Ayrıca DUSP1 ifadesinin azalması bu hücrelerde sisplatinin antiproliferatif etkisinin artmasına neden olmuştur. Aynı sisplatin konsantrasyonunda DUSP1-CRISPR hücrelerinin ikiye katlanma zamanları kontrol hücrelerine göre daha fazla artmıştır. Yukarıdaki sonuçlara benzer şekilde DUSP1 inhibitörü olan BCI'nın kontrol hücrelerinde sisplatinin antiproliferatif etkisini DUSP1- CRİSPR grubuna göre daha fazla artırdığı görülmüştür. Bu sonuç da benzer şekilde bize, DUSP1-CRISPR hücrelerinde BCI'nın daha az etkili olmasının DUSP1 proteininin azalmasından kaynaklandığını düşündürmüştür.
 DUSP1-CRISPR uygulaması sonrasında hücrelerin migrasyon kapasiteleri yara iyileşme deneyi ve Transwell migrasyon deneyi ile değerlendirilmiştir. Bu deneyler sonucunda DUSP1-CRISPR uygulamasının hücrelerin migrasyon kapasitesini azalttığı görülmüştür. Bu sonuç DUSP1 düzeyinin azalmasının MDA-MB231 hücrelerinin hareketliliği ve metastaz yeteneğini azalttığını göstermektedir.
 p38 ve JNK inhibitörleri ile yapılan deneylerde,  p38 inhibitörü SB202190'ın her iki hücre grubunda benzer düzeylerde proliferasyonu artırdığı görülmüştür. Sisplatin etkinliğinde, tedavisinde ve gelişen dirençte, p38 ve JNK'nın aktivitesinin rol aldığı düşünülmektedir. Sisplatin ve p38 inhibitörünün beraber verilmesi DUSP1-CRISPR hücrelerinde kontrol hücrelerine göre daha büyük bir proliferasyon artışına yol açmıştır. Bu durum DUSP1-CRISPR hücrelerinde görülen sisplatinin antiproliferatif etkisindeki artışın nedeninin, artmış p38 proteini aktivasyonundan kaynaklanabileceğini düşündürmüştür. Bu sonuçlar DUSP1 aktivitesindeki azalmanın dolaylı olarak p38 proteini aktivitesini değiştirerek sisplatine olan duyarlılığı ve tedaviye direnci etkileyebileceğini göstermektedir.
Western blot sonuçlarına göre DUSP1-CRISPR hücrelerinde p38 ve JNK proteinlerinin fosforile/total protein oranlarında artış saptanmış bu artış ERK proteininde görülmemiştir. DUSP1 proteininin hedef seçiciliği düşünüldüğünde DUSP1 aktivitesindeki değişikliğin p38 ve JNK proteini üzerinden olabileceğini göstermektedir ve bu sonuç literatür ile uyumludur.
Sonuç olarak DUSP1 proteini ifadesinin azalması MDA-MB231 kanser hücrelerinde, hücre hareketliliğini, migrasyonu ve proliferasyonunu azaltarak antikanser etkinlik göstermektedir. Ayrıca sonuçlarımız, sisplatine olan duyarlılıkta ve gelişen dirençte p38 aktivitesinin önemli olduğunu düşündürmüş ve DUSP1 inhibisyonu ile p38 aktivitesinin dolaylı olarak artırılmasıyla, sisplatin duyarlılığının ve antikanser etkinliğin arttırılabileceğini düşündürmüştür.

Abstract:
The Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) family is a protein kinase family that phosphorylate the serine and threonine amino acids of target proteins. These protein kinases can be classified as three basics subfamilies: ERK, JNK, p38. The MAPK family is involved in the regulation of many vital cellular functions such as cell growth, cell proliferation and apoptosis. Dual-Specificity Phosphase (DUSP) family is the protein phosphatase family that dephosphorylate MAPKs. These proteins are called double specificity phosphatases because of their ability of dephosphorylating both tyrosine and serine/Treonin residues of target proteins. Dual-Specificity Phosphase 1 (DUSP1) protein regulates MAPK activation. In this way, it is involved in many cellular functions such as inflammation, apoptosis, cell growth, cell proliferation.
In our study, triple negative breast cancer cell line, MDA-MB-231 were used. With the CRISPR/CAS9 method, the expression of DUSP1 protein in these cells is reduced. We performed proliferation and motility assays in these cells and evaluated the changes in the expressions of MAPK proteins. Proliferation assays were performed with Incucyte Live-Cell Analysis system. The doubling time of the cells and the maximum number of cells were calculated over the obtained proliferation curves. Protein expression analysis were evaluated by Western Blot method. The cell motility was measured by 'Transwell Migration Assay' and wound healing assay.
In proliferation assays, the reducing the expersion level of DUSP1 by using CRISPR/Cas9 methodology inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells. In addition, BCI, which is an inhibitor of DUSP1, has an antiproliferative effect on MDA-MB-231 cells. The antiproliferative effect of BCI is lower in the DUSP1-CRISPR group than Control CRISPR group. This is most probably related to decreased DUSP1 expression in DUSP1 CRISPR group. The decrease in DUSP1 expression caused an increased antiproliferative effect of sisplatin in MDA-MB-231cells. In the same concentration of cisplatin, doubling times of DUSP1-CRISPR group were more than the control group's. Similar to the above results, it has been seen that BCI increased the antiproliferative effect of cisplatin in DUSP1-CRISPR group more than the control group. Similarly, this result supported the explanation that the less effectiveness of BCI in DUSP1-CRISPR group was due to the reduction of the DUSP1protein.
Migration capacities of the cells in DUSP1-CRISPR group were evaluated by wound healing assay and transwell migration assay. As the result of these experiments, the migration capacity of MDA-MB-231 cells in DUSP1-CRISPR group significantly declined compared to Control CRISPR group. This result shows that the decrease in DUSP1 protein level reduces the mobility and metastasis ability of MDA-MB-231 cells.
In experiments with p38 and JNK inhibitors, the p38 inhibitor SB202190, increased proliferation in both groups at similar levels. When cells treated together with p38 inhibitor and cisplatin, DUSP1-CRISPR group has led to a greater increase in proliferation than control group. This situation was thought to be caused by increased p38 protein activation in DUSP1-CRISPR group. Additionally, it is thought that p38 and JNK proteins can take a part in developing cisplatin resistance.
According to Western Blot results, ratio of phosphorylated/total proteins of p38 and JNK were increased in DUSP1-CRISPR group. This increase has not been seen in ERK protein. Considering the target selectivity of DUSP1 protein, this result is compatible with the literature.
As a result, the decrease in DUSP1 protein expression mediates anticancer activity in MDA-MB231 cancer cells by reducing cell mobility, migration and proliferation. In addition, our results suggest that p38 activity takes important role in DUSP1-inhibition mediated anticancer effect and also in susceptibility to cisplatin treatment in MDA-MB-231 cells.