İskemi ve reperfüzyonun adipöz fleplerde iyonize radyasyon uygulaması sonrası kök hücre kompozisyonu ve doku canlılığına etkisi: Deneysel çalışma
Evaluating the effect of ischemia-reperfusion on stem cell composition in irradiated fat flaps: An experimental study
Yazar: MEHMET CÖMERT
Danışman: DOÇ. DR. BÜLENT SAÇAK
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Cerrahi flepler = Surgical flaps ; Kök hücreler = Stem cells ; Radyasyon = Radiation ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; İskemi = Ischemia

Özet:
Amaç: Öz doku ile onarımların önemli bir yer tuttuğu meme kanseri onarımlarında  operasyon sonrası dönemde sıklıkla iyonize radyasyon tedavisi kullanılmakta ve bu durum, yağ doku içeriğinden zengin pediküllü veya serbest fleplerle rekonstrükte edilmiş yeni memede, yağ nekrozu, atrofi, şekil bozukluğu, fibrozis ve sertleşme gibi sorunlara yol açabilmektedir.  Karın bazlı pediküllü ve serbest adipöz fleplerin iyonize radyasyon sonrası yağ nekrozu miktarı ve hacim açısından kıyaslandığı bazı klinik çalışmalarda ise radyasyonun nakledilen dokunun hacmine yönelik anlamlı bir etkisi olmadığı, öz doku ile onarım cerrahisinden sonra güvenli bir şekilde radyasyon ile tedavinin devam edilebileceğini açıklanmaktadır. Adipöz dokunun iyonize radyasyon sonrası davranışları in-vivo ve in-vitro koşullarda çeşitli deneylerde araştırılmış olup preadipositler ve adiposit kökenli kök hücreler gibi bazı hücre popülasyonlarının bu hasara karşı koruyucu etkisinin olabileceği öne sürülmüştür. Hipoksik kültür koşullarında kök hücre proliferasyonunun arttığı literatürde tanımlanmıştır. İskemi ve reperfüzyon maruziyeti sonrasında kök hücre proliferasyonunun ve etkinliğinin arttığı deneysel çalışmalar ile gösterilmiştir. Serbest flepler  bir iskemi reperfüzyon modeli oluşturmakta ve klinik koşullarda sıklıkla transfer sonrasında iyonize radyasyona maruz kalabilmektedir. Pediküllü flepler de tamamen olmasa da kısmi bir iskemi maruziyeti yaşamaktadırlar. Bu iskemik durumun  yarattığı hücresel değişikliklerin, dokunun daha sonrasında maruz kalacağı iyonize radyasyonun etkilerine karşı koruyucu olabileceğini düşünmekteyiz. Bu amaçla çalışmamızda, adipöz flepler ile gerçekleştirilen onarımlarda, pediküllü flep ile serbest flep seçiminin cerrahi teknik farklılığı dışında, radyoterapi hasarı karşısında koruyuculuğunun olup olmadığı planladığımız hayvan deneyi modeli ile araştırıldı.  Sıçanların inguinal bölgesindeki yağ yastıkçığı epigastrik damarlar üzerinden beslenecek şekilde kaldırılarak, radyoterapi ve iskemi-reperfüzyona tabi tutuldu. Yağ  fleplerinde histolojik değişiklikler,  fibrozis ve inflamasyon parametreleri tespit edildi ve flow sitometri yoluyla kök hücre yoğunluğu belirlendi.

Gereç ve yöntem: Bu çalışma randomize bir çalışma olarak tasarlandı. 32 adet Sprague Dowley cinsi sıçan randomize 4 gruba ayrıldı. Tüm gruplarda sağ kasık yağ yastıkçığı incelenmek üzere seçildi ve bu bölgeye insizyon uygulanarak kasık yağ yastıkçıkları ortaya kondu. Birinci grup (Grup A) sham grubu olarak belirlenerek sadece insizyon uygulandı ve primer sütüre edildi. Ardından 24 gün sonra yağ yastıkçığı değerlendirme amaçlı alındı. İkinci grup (Grup B) kontrol grubu olarak belirlenerek birinci gruba benzer şekilde insizyon ve primer sütürasyon uygulandı. 14 gün sonra bu bölgeye iyonize radyasyon (20 Gray) (Gy)  uygulandı. 24 gün sonra ise inguinal yağ yastıkçığı değerlendirme amaçlı alındı. Üçüncü grup (Grup C) kısmi iskemi ve iyonize radyasyon uygulanan grup olarak belirlendi. Bu grupta yağ yastıkçığı flep elevasyonu tarzında çevre dokulardan serbestlenerek sadece yüzeyel epigastrik damarlar üzerinden dolaşımı sağlandı. Ardından yerine tekrar iade edilerek 14 gün sonra iyonize radyasyon uygulandı ve 24 gün sonra inguinal yağ yastıkçığı değerlendirme amaçlı alındı. Dördüncü grup (Grup D) iskemi-reperfüzyon ve iyonize radyasyon  uygulanan grup olarak belirlendi. Üçüncü gruba yapılan işlemler yapıldıktan sonra mikroklemp ile inguinal yağ yastıkçığının dolaşımını sağlayan yüzeyel epigastrik arter ve ven akımı 1 saat boyunca durduruldu ve klemp açılarak yağ yastıkçığı reperfüze edildi. Flep yerine tekrar adapte edilerek insizyon kapatıldı. İkinci ve üçüncü gruba benzer şekilde iyonize radyasyon uygulandı ve yağ yastıkçığı değerlendirme amaçlı alındı. 

Bulgular: Histolojik değerlendirmede, insizyon ve iyonize radyasyon uygulanan grupta (Grup B) diğer gruplara göre anlamlı derecede yoğun lökosit infiltrasyonu görülmüştür (p<0.05). İskemi-reperfüzyon ve iyonize radyasyon uygulanan grupta (Grup D) diğer gruplara göre anlamlı derecede fazla vaskülarizasyon artışı görülmekle birlikte (p<0.05), uniloküler hücre hasarı, interstisyel ödem, fibrozis gibi diğer inflamatuar parametrelerin de yine bu grupta anlamlı derecede yüksek olduğu tespit edilmiştir (p<0.05). Adipöz dokulardaki CD29+/CD34-, CD90+/CD14-, CD90+/45- hücre popülasyonlarına bakıldığında (dokudaki AKKH hücre yoğunlukları) ise, iskemi-reperfüzyon ve iyonize radyasyon uygulanan grupta (Grup D), AKKH yoğunluğunun diğer gruplara göre anlamlı derecede yüksek olduğu görülmüştür (p<0.05). Grup D'deki AKKH yoğunluğunun, kısmi iskemi ve iyonize radyasyon grubuna göre (Grup C) de göreceli olarak yüksek olduğu fakat bu yüksekliğin istatistiksel olarak anlamlı olmadığı görülmüştür. 
Sonuç: İskemik koşullar adipöz dokuda AKKH yoğunluğuna arttırıcı yönde etki etmektedir. AKKH yoğunluğunun artışı, vaskülarizasyonu arttırıcı ve lökosit infiltrasyonunu azaltıcı yönde etki etmekte iken, reperfüzyon ile birlikte iyonize radyasyonun oluşturduğu unilokuler hücre hasarı, interstisyel ödem ve fibrozis gibi inflamatuar parametrelere etki edemediği görülmektedir. Bu durumun radyasyon hasarı oluşturulduktan sonraki zaman dilimi ile ilişkili olabilir. Çalışmamızın adipöz fleplerdeki iskemik durumların, iyonize radyasyon hasarı üzerine etkisinin anlaşılması için uygun bir deney modeli olarak kullanılabileceği kanaatindeyiz.

Abstract:
Objective: Ionizing radiation therapy is frequently used in the postoperative period  as an adjuvant therapy in breast cancer patients, which leads to problems such as fat necrosis, fibrosis, flap atrophy and flap deformity, in the new breast reconstructed with pedicled or free adipose flaps. In some clinical studies comparing abdominal-based, free and pedicled adipose flaps in terms of the amount of fat necrosis after ionizing radiation, it is  explained that, radiation does not have a significant effect on the volume of the transplanted tissue, and that radiation therapy can be safely continued after reconstruction. The behavior of adipose tissue after ionizing radiation has been investigated in various experiments in-vivo and in-vitro, and it has been suggested that some cell populations such as preadipocytes and adipocyte stem cells may have a protective effect against radiation injury. Increased stem cell proliferation in hypoxic culture conditions has been described in the literature. Experimental studies have shown that stem cell proliferation and efficiency increase after exposure to ischemia and reperfusion. Free flaps constitute an ischemia reperfusion model, and can often be exposed to ionizing radiation. Pedicled flaps also experience partial, if not complete, ischemia exposure. We hypothesize that, the cellular changes caused by different levels of ischemic insult may be protective against the effects of ionizing radiation to which the tissue will be exposed later. For this purpose, apart from the technical difference of pedicled and free flap selection, it was investigated whether there is any protection against radiation injury. For this purpose, the inguinal fat pads of the rats were raised based on the epigastric vessels and subjected to ischemia-reperfusion and ionized radiation. Histological changes, fibrosis and inflammation parameters were determined in adipose flaps, and stem cell density was determined by flow cytometry.

Material and methods: This study was designed as a randomized study. 32 Sprague Dowley rats were randomly divided into 4 groups. In all groups, the right inguinal fat pad was selected to be examined and exposed by incision in this area. The first group (Group A) was determined to be the sham group, and incision was made and sutured primarily. After 24 days, the fat pad was taken for evaluation. The second group (Group B) was determined to be the control group, and incision and primary suturing were applied similar to the first group. Ionizing radiation (20 Gray) (Gy) was applied to this area after 14 days. After 24 days, the inguinal fat pad was removed for evaluation. Third group (Group C) was determined as the group that received partial ischemia and ionizing radiation. In this group, the fat pad was dissected from the surrounding tissues in the manner of pedicled flap elevation, and  was resutured back to its place to be irradiated 14 days later. The inguinal fat pad was taken for evaluation after 24 days. The fourth group (Group D) was determined to be the group that received ischemia-reperfusion and ionizing radiation. The blood flow to the inguinal fat pad was stopped with microclamping for 1 hour, later to be reperfused. The incision was closed by re-adapting the flap to its place. Similar to the second and third groups, ionizing radiation was applied and the fat pad was taken for evaluation.

Results: In histological evaluation, a significantly more intense leukocyte infiltration was observed in the incision and ionizing radiation group (Group B) compared to the other groups (p <0.05). Although there was a significantly higher increase in vascularization in the ischemia-reperfusion and ionizing radiation group (Group D) compared to the other groups (p <0.05), other inflammatory parameters such as unilocular cell damage, interstitial edema, and fibrosis were also scored significantly higher in this group. (p <0.05). When looking at CD29 + / CD34-, CD90 + / CD14-, CD90 + / 45- cell populations in adipose tissues (ADSC, adipose derived stem cell density), it was seen that the ADSC density was significantly higher in the ischemia-reperfusion and ionizing radiation group (Group D) compared to the other groups (p <0.05). It was observed that the ADSC density in Group D was relatively higher than the partial ischemia and ionizing radiation group (Group C), but this difference was statistically insignificant.