Β-glukozidaz enziminin seçimli ayrımına yönelik hidrojellerin hazırlanması ve karakterizasyonu
Preparation and characterization of hydrogels for selective separation of β-glucosidase enzyme
Yazar: MERVECAN SEVİLDİK
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE DİNÇER
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Poliakrilamid jel elektroforezi = Polyarcrylamide gel electrophoresis ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
Tez çalışmasının ilk adımında moleküler damgalama tekniği ile akrilamid (AA), hidroksietilmetakrilat (HEMA), 1-vinilimidazol (1-VI), 4-vinil piridin (4-VP), metakrilik asit (MAA) gibi farklı fonksiyonlara sahip monomerler kullanılarak β-glukozidaz damgalı hidrojeller hazırlandı. Hidrojellerin damgalama etkinlikleri karşılaştırıldı ve en yüksek damgalama etkinliğine sahip hidrojelin akrilamid monomeri ile hazırlanan hidrojelin olduğu görüldü. β-Glukozidaz enziminin seçimli ayrımına yönelik hazırlanan hidrojelin yapısal karakterizasyonu Fourier Transform Infrared Spektroskopisi (FTIR) analizi ve yüzey morfolojilerinin analizi ise taramalı elektron mikroskopi (SEM) ile yapıldı. β-Glukozidaz enziminin MIP ve NIP hidrojeller üzerine geri bağlama koşullarının optimizasyonu amacıyla inkübasyon süresi, sıcaklık, enzim konsantrasyonu ve pH etkisi incelendi. Deneysel çalışmalar sonucunda MIP ve NIP hidrojeller üzerine enzimin optimum geri bağlama süresi 120 dakika, optimum geri bağlama sıcaklığı 25 °C ve optimum pH 7,0 olarak belirlendi. Başlangıç enzim konsantrasyonu 2,5 mg/mL'ye ulaştığında adsorpsiyonun doygunluğa ulaştığı görüldü. Bu verilerden yola çıkarak adsorpsiyon izotermleri olan Langmuir ve Freundlich izotermleri oluşturuldu. Freundlich izoterm modelinin MIP ve NIP hidrojeline enzim adsorpsiyonunu Langmuir izoterm modeline göre daha iyi tanımladığı görüldü. MIP ve NIP hidrojellerin β-glukozidaz adsorpsiyon kapasiteleri sırasıyla 7,2 mg/g ve 4,6 mg/g olarak hesaplandı.  Deneysel veriler doğrultusunda kinetik analiz sonucu adsorpsiyon kinetiğini en iyi yalancı ikinci derece modelinin temsil ettiği belirlendi. Adsorpsiyonunun sıcaklıkla azalması adsorpsiyonun ekzotermik olduğunu gösterdi.
Çapraz bağlı hidrojellerin şişme  özellikleri zamana bağlı olarak incelendi. Her iki hidrojelin şişme oranının yaklaşık 90 dakika sonunda dengeye geldiği ve belirlenen süre sonunda MIP ve NIP için maksimum şişmenin % 24,79 ve % 16,43 oranında olduğu görüldü. β-Glukozidaz damgalı hidrojelin seçiciliği farklı enzimler (α-Amilaz ve lipaz) ile çapraz tanıma testleri yapılarak ölçüldü. Tezin son kısmında hazırlanan β-glukozidaz damgalı hidrojelin afinite materyali olarak kullanılabilirliği test edildi.

Abstract:
In the first step of the thesis study, β-glucosidase imprinted hydrogels were prepared using monomers having different functions such as acrylamide (AA), hydroxyethylmethacrylate (HEMA), 1-vinylimidazole (1-VI), 4-vinylpyridine (4-VP), methacrylic acid. The imprinting efficiencies of the hydrogels were compared and it was seen that the hydrogel with the highest imprinted efficiency was prepared with the acrylamide monomer. Structural characterization of hydrogel prepared for the selective separation of β-glucosidase enzyme was performed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) analysis and surface morphology analysis by scanning electron microscopy (SEM). Effect of incubation time, pH temperature and enzyme concentration were examined in order to optimize the rebinding conditions of β-glucosidase enzyme on MIP and NIP hydrogels. As a result of experimental studies, optimum rebinding time of enzyme on MIP and NIP hydrogels was determined as 120 min, optimum rebinding temperature as 25 ° C and optimum pH 7.0. When the initial enzyme concentration reached 2.5 mg / mL, the adsorption reached saturation. From these data, adsorption isotherms  like Langmuir and Freundlich isotherms were formed. It is seen that the Freundlich isotherm model describes the MIP and NIP hydrogel adsorption better than the Langmuir isotherm model. β-Glucosidase adsorption capacities of MIP and NIP hydrogels were calculated as 7.2 mg / g and 4.6 mg / g, respectively. Kinetic analysis of the experimental data showed that the  pseudo second order model represented the best adsorption kinetics. The decrease in adsorption with temperature showed that the adsorption was exothermic.
The swelling properties of cross-linked hydrogels were studied related time. It was observed that the rate of swelling of both hydrogels reached equilibrium at the end of 90 minutes and the maximum swelling ratio was calculated as 24.79% and 16.43%. The selectivity of β-glucosidase imprinted hydrogel was measured by cross-recognition tests with different enzymes (α-Amylase and lipase). The availability of β-glucosidase imprinted hydrogel prepared as the affinity material was tested at the end of the thesis.