Glukoz 6 fosfat dehidrojenaz tanı kiti kontrol materyalinin geliştirilmesi ve stabilizasyonu
Development and stabilization of glucose 6 phosphate dehydrogenase diagnostic kit control material
Yazar: TUĞÇE YILDIZ
Danışman: DOÇ. DR. ÖMER FARUK ÖZER
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
ÖZET
Glukoz 6 fosfat dehidrojenaz (G6PD), eritrositlerin bütünlüğünü korumak ve oksidatif stresi önlemek için nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) üreten pentoz fosfat yolundaki hız kısıtlayıcı enzimdir. G6PD eksikliği, dünyanın birçok bölgesinde olmak üzere 400 milyondan fazla kişiyi etkilemektedir. Ülkemiz genelinde %0,5, Çukurova bölgesinde %8.2 oranında görülmektedir. Hastalara sadece eksikliğin olduğunu söylemek yeterli değildir, çünkü semptomların şiddeti enzim aktivitesinin miktarına bağlıdır. Bu sebeple kantitatif metotlar klinik takip, tedavi ve alınacak önlemler açısından önem taşımaktadır. 

Üniversitemiz bünyesinde ürettiğimiz G6PD aktivite ölçüm kitinin validasyon aşamalarını tamamladıktan sonra rutin laboratuvarımızda kullanılmaya başlanıldı. Yaptığımız ön çalışmalarda kullanmış olduğumuz likit enzim kontrol materyallerinin merkezler arası transfer sırasında sıcaklık değişiminden etkilenerek aktivite kaybına uğradığı tespit edildi. Rutin laboratuvarlarda gün içinde doğru sonuç verilip verilmediğini kontrol etmek ve analitik hataları belirleyebilmek için kullanılan kontrol materyalleri önemli olduğundan bu soruna odaklanıldı. Çalışmamızda farklı yöntem ve kimyasallar kullanılarak stabilitesi uzun G6PD kontrol materyali geliştirmek hedeflendi. Likit tam kan, likit enzim ve liyofilize kontrol materyalleri üzerine çalışıldı.

Likit tam kan kontrol materyali için planladığımız 45°C ve +4°C  koşullarında yaptığımız deneyler sonucunda kontrol materyali olarak likit tam kanın kullanılmasının uzun süre depolama ve uzak merkezler arası transport koşullarında bir avantaj sağlamayacağı sonucuna varıldı. Stabilite takiplerinde ACD ve CPDA tüplerinin +4°C saklama koşullarında 6-8 hafta arasında stabil kaldığı görüldü. G6PD enzim aktivitesi çalışmak isteyip hemen çalışamayan ve numunelerin dış merkeze transportunu gerektiren durumlarda ACD ve CPDA içeren tüpler kullanılabilir.

Likit enzim kontrol materyali için yaptığımız deneyler ve laboratuvarlar arası çalışmada Glisin ve GlisinTris tamponunda çözülen enzim kontrol materyalleri hedeflenen sürelerde stabil kaldı. 

Liyofilize kontrol materyalleri, rutin kullanımda uzun süreli depolama ve uzak merkezlere transfer gibi uzun süreli stabilite gerektiren durumlarda avantajlıdır. Çalışmamızda hemolizat örneklerinin liyofilizasyonu üzerine çalışıldı. CPDA solüsyonu ile farklı dilüsyon oranları oluşturularak liyofilize edilen ve CPDA ile oda sıcaklığında çözülen kontrol materyallerinde 1 haftalık stabilite elde edildi. G6PD enzim aktivitesi eksik ve normal olan bireylerden alınacak kan örnekleriyle ayrı ayrı stok hazırlamadan farklı dilüsyonlarla farklı seviyelerde kontrol materyali hazırlanabilir. Çalışmamızda hazırlanan liyofilize kontrol materyalleri deney setlerinden bazıları -20°C ve 4°C'de muhafaza edildi. 2 ay muhafaza edildikten sonra çözülen materyallerin stabilite çalışma verilerinde -20°C koşullarında saklama koşullarının faydalı olacağı görüldü. Aynı zamanda her iki sıcaklık koşullarında da albumin ve gliserol gibi liyoprotektanlar eklenerek stabilitenin arttığı gözlemlendi.

Çalışmamızda, G6PD enzimi aktivitesi ölçüm kiti için stabil bir kontrol materyali geliştirilmiştir. Ayrıca tezimiz eritrositlerde çalışılan ve benzeri enzim parametrelerinin kontrol materyallerinin geliştirilmesi konusunda literatüre katkı sağlamıştır. Üniversitemizde üretilen G6PD kiti ve kontrol materyali üretimi konusunda yaptığımız tez çalışmamız yerli ve milli üretimde, laboratuvarlarda dışa bağımlılığı azaltmada önemli bir adım olacak ve ülkemize büyük katkı sağlayacaktır.
Anahtar Kelimeler: G6PD, tanı kiti, kontrol materyali, otoanalizör

Abstract:
SUMMARY
Glucose 6 phosphate dehydrogenase (G6PD) is the rate-limiting enzyme in the pentose phosphate pathway, which produces nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) to maintain the integrity of erythrocytes and prevent oxidative stress. G6PD deficiency affects more than 400 million people in many regions of the world. It is seen at a rate of 0.5% throughout our country and 8.2% in the Çukurova region. It is not enough to just tell patients that there is a deficiency, because the severity of the symptoms depends on the amount of enzyme activity. For this reason, quantitative methods are important for clinical follow-up, treatment and precautions to be taken.
After completing the validation stages of the G6PD activity measurement kit we produced within our university, it started to be used routinely in our laboratory. In our preliminary studies, it was determined that the liquid enzyme control materials we used suffered loss of activity as a result of temperature changes during transfer between centers. This problem was focused on because the control materials used in routine laboratories to check whether correct results are given during the day and to detect analytical errors are important. In our study, we aimed to develop G6PD control material with long stability by using different methods and chemicals. Liquid whole blood, liquid enzyme and lyophilized control materials were studied.
As a result of the experiments we conducted at 45°C and +4°C conditions that we planned for liquid whole blood control material, it was concluded that using liquid whole blood as control material would not provide an advantage in long-term storage and transportation conditions between remote centers. Stability follow-ups showed that ACD and CPDA tubes remained stable for 6-8 weeks under +4°C storage conditions. Tubes containing ACD and CPDA can be used in cases where G6PD enzyme activity cannot be studied immediately and samples need to be transported to an external center.
In our experiments and interlaboratory studies for liquid enzyme control material, enzyme control materials dissolved in Glycine and GlycineTris buffer remained stable for the targeted periods.
Lyophilized control materials are advantageous in routine use in situations requiring long-term stability, such as long-term storage and transfer to remote centers. In our study, lyophilization of hemolysate samples was studied. Stability for 1 week was achieved in control materials that were lyophilized by creating different dilution rates with CPDA solution and dissolved with CPDA at room temperature. With blood samples taken from individuals with deficient and normal G6PD enzyme activity, different levels of control material can be prepared with different dilutions without preparing separate stocks. Some of the experimental sets of lyophilized control materials prepared in our study were stored at -20°C and 4°C. In the stability study data of the thawed materials after being stored for 2 months, it was seen that storage conditions at -20°C would be beneficial. At the same time, it was observed that stability increased by adding lyoprotectants such as albumin and glycerol in both temperature conditions.
In our study, a stable control material was developed for the G6PD enzyme activity measurement kit. In addition, our thesis contributed to the literature on the development of control materials for similar enzyme parameters studied in erythrocytes. Our thesis work on the production of G6PD kit and control material produced at our university will be an important step in reducing foreign dependency in domestic and national production and laboratories and will make a great contribution to our country.
Keywords: G6PD, diagnostic kit, control material, autoanalyzer