Klotho geni transfekte edilmiş kolon kanser hücrelerinde canlılık ve proliferasyonun belirlenmesi
Determination of viability and proliferation in klotho gene transfected colon cancer cells
Yazar: MERVE NUR SOYKAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SİBEL GÜNEŞ
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Genler = Genes ; Genler-tümör baskılayıcı = Genes-suppressor-tumor ; Klotho = Klotho ; Kolon hastalıkları = Colonic diseases ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Kök hücreler = Stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Klotho geni birçok biyolojik süreçte yer alan anti-aging, anti-inflamatuvar ve anti-tümör özellikleri olan humoral bir faktördür. Klotho geninin ifadesindeki azalma, kolon kanseri de dahil olmak üzere çoğu kanser tipinde malign oluşumlara neden olur. İnsan tümörlerinin %60 gibi önemli bir oranı tümör nekroz faktörüne bağlı apoptozu indükleyen liganda (TRAIL) karşı direnç gösterir. TRAIL, ölüm reseptörleri olan DR4 ve DR5 ile etkileşime girerek apoptotik etki gösterir.
Bu çalışmadaki amaç, TRAIL dirençli insan adenokarsinom kolon kanser hücrelerinde (Caco-2), klotho geninin ekspresyonunu değiştirerek (gen aktivasyonu ve knock-out yaparak), bu ekspresyon değişimlerinin kanser hücrelerindeki TRAIL aracılı apoptotik duyarlılığa etkisinin olup olmadığını araştırmaktı. Böylece klotho geninin önemli fonksiyonlarından biri olan apoptotik sürecin, ilk kez TRAIL ölüm reseptörleri (DR4, DR5, DcR1veDcR2) üzerinden analiz edilmesi sağlandı. Bu amaçla öncelikle klotho geni CRISPR/Cas9 tekniği ile Caco-2 hücrelerinde aktifleştirildi ve knock-out edildi. Klotho geninde yapılan bu ekspresyon değişikliklerinin kanser hücrelerindeki etkisi; annexinV/PI flow sitometri, WST-8, qRT-PCR, invazyon, koloni oluşturma potansiyeli ve immunohistokimyasal analizler ile de değerlendirildi.
Sonuçlarımızda Caco-2 hücrelerinde klotho gen ekspresyon artışının hücrelerin proliferasyon, invazyon ve koloni oluşturma potansiyelini baskıladığı ve kaspaz aktivitesini artırdığı görüldü. Bu etkinin gen aktivasyonuna bağlı olup olmadığı ise genin knock-out edilmesiyle test edildi. Bulgularımız klotho gen aktivasyonunun apoptoza dirençli kanser hücresinde antitümör etkiye sahip olduğunu gösterdi.

Abstract:
The klotho gene is a humoral factor with anti-aging, anti-inflammatory and antitumor properties, which is involved in many biological processes. Decreased expression of the klotho gene causes malignant formations in most types of cancer, including colon cancer. A significant 60% of human tumors show resistance to tumor necrosis factor-induced apoptosis inducing ligand (TRAIL). TRAIL interacts with the death receptors DR4andDR5 and demonstrate an apoptotic effect.
The aim of this study was to investigate whether these expression changes have an effect on TRAIL-mediated apoptotic sensitivity in cancer cells by altering the expression of the klotho gene,in TRAIL-resistant human adenocarcinoma colon cancer cells (Caco-2). Thus, the apoptotic process, one of the important functions of the klotho gene, was analysed for the first time on TRAIL-death receptors (DR4,DR5,DcR1andDcR2). For that purpose, the klotho gene was firstly activation and knock-out on Caco-2cells using the CRISPR/Cas9 technique. The effect of these expression changes in the klotho gene on cancer cells; annexinV/PIflow cytometry, WST-8, qRT-PCR, invasion, colony-forming potential and immunohistochemical analysis. 
In our results, it was seen that the increase in klotho gene expression in Caco-2 cells inhibited the proliferation, invasion and colony forming potential of the cells and increased the caspase activity. Whether this effect is due to gene activation was tested by knock-out the gene. It was determined that the decrease in klotho gene expression had no effect on the viability of Caco-2cells. These results show that klotho gene activation has an antitumor effect in resistant cancer cells to apoptosis.