Farelerde oluşturulan deneysel otoimmün ensefalomiyelit modelinde çözünebilir epoksit hidrolaz inhibisyonunun etkisinin NLRC4 inflamazomu ve antienflamatuvar NLRC3 ile ilişkilendirilerek araştırılması
Investigation of the effect of soluble epoxide hydrolase inhibition in relation to NLRC4 inflammasome and antiiiflammatory NLRC3 in experimental autoimmune encephalomyelitis model in mice
Yazar: MERVE BİLİKTÜ
Danışman: PROF. DR. BAHAR TUNÇTAN
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Eczacılık Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antiinflamatuar ajanlar = Anti inflammatory agents ; Ensefalomiyelit = Encephalomyelitis ; Epoksit hidrolaz = Epoxide hydrolase ; Fareler = Mice ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Otoimmün hastalıklar = Autoimmune diseases ; İnflamazom = Inflammasome

Özet:
Bu tezde, deneysel bir fare MS modeli olarak MOG35-55 peptit ile oluşturulan kronik DOE'de çEH inhibisyonunun hastalık bulguları üzerindeki etkisinin mekanizmasının EET'ler (14,15-DHET oluşumu üzerinden), antienflamatuvar NLR'ler (NLRC3 ekspresyonu üzerinden) ve NLRC3/ASC/prokaspaz-1 inflamazom oluşumu ve etkinliği (kaspaz-1 p20 ekspresyonu ve IL-1β oluşumu üzerinden) ile ilişkilendirilerek araştırılması amaçlanmıştır. Deneylerin 0. günü farelere MOG35-55 peptit (200 g/fare; 0.1 ml/fare; s.k.) ile birlikte PT (400 ng/fare; 0.1 ml/fare; i.p.) enjekte edilmiştir. PT ayrıca 2. gün de uygulanmıştır. Fareler DOE bulgularına göre her gün gözlemlenerek puanlanmıştır. DOE bulgularına göre puanların ≥ 2 veya ≤ 3 olduğu gün olan 17. günden itibaren her gün farelere SFT (0.1 ml/fare; i.p.), DMSO (0.1 ml/fare; i.p.) veya potent çEH inhibitörü TPPU (1, 3 veya 10 mg/kg; 0.1 ml/fare; i.p.) uygulanmıştır. SFT uygulanan farelerin puanının ard arda 7 gün  3 olduğu 25. günde ötanazi yapılmasının ardından farelerin beyinleri ve omurilikleri alınmıştır. Dokularda NLRC3, NLRC4, ASC, kaspaz-1 p20 ve β-tübülin protein ekspresyonları ile 14,15-DHET ile IL-1β düzeyleri ölçülmüştür. Farelere MOG35-55 peptit/PT uygulanmasından sonra DOE puanları 9. günden itibaren artmaya başlamış, ≥ 2 veya ≤ 3 olduğu 17. günde ise doruk değere ulaşmıştır. Bu güne dek %8 oranında mortalite gözlenmiştir. 17. günden itibaren her gün 3 mg/kg dozda TPPU uygulanması, 19., 20., 21., 22., 23. ve 25. günlerde SFT ve/veya DMSO gruplarına göre DOE puanlarında azalmaya neden olmuştur. TPPU 1 veya 10 mg/kg dozda uygulandığında ise DOE puanlarının sırasıyla yalnızca 25. ile 20., 22. ve 25. günlerde SFT grubuna göre az olduğu görülmüştür. Hastalık süresince elde edilen DOE puanlarından hesaplanan EAA değerlerinde TPPU yalnızca 3 mg/kg dozda SFT ve DMSO gruplarına göre azalmaya neden olmuştur. Ayrıca, TPPU uygulanan farelerden izole edilen beyin ve omuriliklerde, SFT ve DMSO gruplarına göre, NLRC3 protein ekspresyonunun daha yüksek, NLRC4, ASC ve kaspaz-1 p20 protein ekspresyonu ile 14,15-DHET ve IL-1β düzeylerinin daha düşük olduğu görülmüştür. Bulgularımız, TPPU ile çEH inhibe edildiğinde, olasılıkla, MOG35-55 peptit/PT uygulanan farelerin santral sinir sisteminde EET düzeyleri ile birlikte NLRC3 ekspresyonundaki artmanın yanı sıra, NLRC4/ASC/prokaspaz-1 inflamazomunun baskılanmasından dolayı DOE bulgularının azaltılabileceğini düşündürmüştür.

Abstract:
The aim of this thesis is to investigate mechanism of the effect of sEH inhibition on disease signs in relation to EETs (through 14,15-DHET formation), antiinflammatory NLRs (through NLRC3 expression), and NLRC3/ASC/procaspase-1 inflammasome formation and activity (through caspase-1 p20 expression and IL-1β formation) in MOG35-55 peptide-induced chronic EAE in a mouse model of MS. On day 0, mice were injected with MOG35-55 peptide (200 g/mouse; s.c.) and PT (400 ng/mouse; i.p.). On day 2, PT was also injected to mice. Mice were monitored daily and scored for EAE signs. Upon reaching a disease score of ≥ 2 or ≤ 3 on day 17, mice were administered with daily PBS (0.1 ml/mouse; i.p.), DMSO (0.1 ml/ mouse; i.p.), or a potent sEH inhibitor, TPPU, (1, 3, or 10 mg/kg; 0.1 ml/mouse; i.p.) until the end of the study. When PBS-treated mice were scored as a  3 on seven consecutive days, all animals were euthanized and brains and spinal cords were collected. Tissue homogenates were used for the measurement of NLRC3, NLRC4, ASC, caspase-1 p20, and β-tubulin protein expression in addition to 14,15-DHET and IL-1β levels. Following administration of MOG35-55 peptide/PT to mice, EAE scores were increased after 9 days and reached to peak value as determined by ≥ 2 or ≤ 3 with 8% mortality rate on day 17. Administration of 3 mg/kg dose of TPPU daily from day 17 onwards resulted in a reduction in EAE scores on days 19, 20, 21, 22, 23, and 25 compared to PBS and/or DMSO groups. When TPPU was administered at 1 or 10 mg/kg dose, EAE scores were found to be lower only on the 25. and 20., 22., and 25. days, respectively, compared to the PBS group. TPPU only at 3 mg/kg dose caused a decrease in the AUC values calculated from EAE scores obtained during the disease compared to PBS and DMSO groups. It was also found that, compared to the PBS and DMSO groups, NLRC3 protein expression was higher and NLRC4, ASC, and caspase-1 p20 protein expression in addition to 14,15-DHET and IL-1β levels were lower in the brains and spinal cords of mice-treated with TPPU. Our findings suggest that inhibition of sEH with TPPU might attenuate EAE signs, presumably, due to increased levels of EETs associated with NLRC3 expression in addition to suppressing NLRC4/ASC/pro-caspase-1 inflammasome in the central nervous system of MOG35-55 peptide/PT-administered mice.