Havuç (Daucus carota L.) bitkisinde Rf lokusu ile bağlantılı SNP moleküler işaretleyicilerin GBS yöntemi kullanılarak belirlenmesi ve doğrulanması
Identification and validation of SNP markers linked to Rf locus in carrot (Daucus carota L.) using GBS
Yazar: SEVİN TEOMAN DURAN
Danışman: PROF. DR. AHMET İPEK
Bursa Uludağ Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Bu çalışmada, havuç bitkisinde erkek kısırlığı kontrol eden Rf (Restorers of fertility) lokusu ile bağlantılı SNP moleküler işaretleyicilerin GBS (Genotyping by sequencing) yöntemi kullanılarak tespit edilmesi ve eş zamanlı PZR simple probe yöntemi ile doğrulanması amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak erkek kısırlık karakterinin 3:1 oranında açılım gösterdiği 96 adet bitkiden oluşan F2 haritalama popülasyonu oluşturulmuştur. 96 adet bitkiden elde edilen DNA örnekleri ile GBS analizi yapılmış ve 10 425 adet SNP moleküler işaretleyicisi tespit edilmiştir. Bu SNP moleküler işaretleyicileri kullanılarak oluşturulan ilişkilendirme haritalaması ile Rf1 geninin havucun 9. kromozomu üzerinde bulunduğu tespit edilmiştir. Havucun 9. Kromozom üzerinde yer alan SNP moleküler işaretleyiciler kullanılarak oluşturulan genetik bağlantı haritası Rf1 geninin yerini doğrulamıştır. Buna göre; Rf1 genine yakın olduğu tespit edilen üç adet SNP moleküler işaretleyicisi (DcSNP_3342931, DcSNP_4822988 ve DcSNP_6233708) belirlenmiştir. 
Tespit edilen SNP moleküler işaretleyicilerinin (DcSNP_3342931, DcSNP_4822988 ve DcSNP_6233708) doğrulanmasında, eş zamanlı PZR simple probe yöntemi sonucunda oluşturulan erime eğrisi (melting curve) analizleri kullanılmıştır.  Erime eğrisi analizleri ile; popülasyondaki tüm bireylerin homozigot fertil (Rf1Rf1), heterozigot fertil (Rf1rf1) ve erkek kısır (rf1rf1) olma durumları ayrı ayrı tespit edilmiştir. Fenotipik gözlem verileri ve GBS analizi sonuçları, erime eğrisi analizi sonuçları ile karşılaştırılmış; simple probe yönteminin fenotipik gözlem verilerini %97,9 oranında doğruladığı tespit edilmiştir. 
Sonuç olarak; havuç bitkisinde erkek kısırlık karakterini kontrol eden Rf1 geninin havuç genomundaki yerinin tespit edilmesi ve Rf1 geni ile bağlantılı olduğu belirlenen DcSNP_3342931, DcSNP_4822988 ve DcSNP_6233708 SNP moleküler işaretleyicilerinin belirlenmesi hibrit havuç çeşitlerinin geliştirilmesini hızlandıracaktır. Ülkemizdeki yerel standart havuç çeşitlerinin hibrit çeşitlere dönüştürülmesine yardımcı olacaktır. Yerel hibrit havuç çeşitlerinin geliştirilmesi yurtdışına ödenen döviz kaybının önüne geçerek ülkemiz ekonomisine katkıda bulunacaktır.

Abstract:
In this PhD thesis, it was aimed to identify SNP (Single nucleotide polymorphism) markers linked to Rf locus using GBS (genotyping by sequencing) and validate SNPs using A SimpleProbe® real-time PCR assay. For this purpose, a F2 carrot population composed of 96 plants and segregating for male sterility (male fertile (3): male sterile (1)) was produced. 
In this population, 10 425 segregating SNP markers were discovered by GBS analysis. Association mapping analysis demonstrated that Rf1 is located on chromosome 9 of the carrot genome. A genetic linkage map of carrot chromosome 9 was developed using GBS generated SNP markers and confirmed the location of Rf1 on chromosome 9 of the carrot genome. Using the results from association mapping and genetic mapping analyses, three SNP markers (DcSNP_3342931, DcSNP_4822988 and DcSNP_6233708) were selected for SimpleProbe® real-time PCR assay.
Melting curve analysis of SimpleProbe® real-time PCR assay was performed for SNP markers (DcSNP_3342931, DcSNP_4822988 ve DcSNP_6233708) and genotypes of all plants in this F2 population were determine as homozygous male fertil (Rf1Rf1), heterozygous male fertile (Rf1rf1) and male sterile (rf1rf1). When the phenotypic observation data and GBS analysis results were compared with melt curve analysis results, simpleProbe® real-time PCR assay confirmed the phenotypic observation data by 97,9 %.
Consequently, determination of the Rf1 located on chromosome 9 of the carrot genome and identification of SNP molecular markers (DcSNP_3342931, DcSNP_4822988 ve DcSNP_6233708) linked to Rf1 gene would accelerate the development of new hybrid carrot varieties. Furthermore, the results of this research would help to convert open-pollinated carrot varieties to hybrid varieties in our country. Thus, development of local hybrid varieties will contribute to economy of our country by preventing foreign exchange losses.