Pichia pastoris mayalarından rekombinant ekspanzin üretiminin optimizasyonu
Optimization of recombinant expansin production from Pichia pastoris yeast
Yazar: ASLİYE KARAASLAN
Danışman: DOÇ. DR. HASAN VARDİN
Harran Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada Solanum lycopersicum (domates) bitkisinden ekspanzin üretiminden sorumlu gen
bölgesi (LeExp1) izole edilerek metilotropik bir maya olan Pichia pastoris mayalarında rekombinant olarak ekspanzin proteinlerinin üretilmesi sağlanmıştır. LeExp1 gen dizilimi sırasıyla alfa mating faktör (AMF) ve Pichia pastoris asit fosfataz (PHO1) sekresyon sinyal sekanslarına sahip pPIC9K ve pHIL-S1 vektörlerine uygun enzimler vasıtasıyla aktarılmıştır. Hedef gen ile klonlanmış vektörler ısı şoku yolu ile E. coli JM109 hücelerine transforme edilmiş ve burada çoğaltılmıştır. Klonlanan vektörler elektroporasyon vasıtasıyla Pichia pastoris GS115 ve SMD1168 suşlarına transfer edilmiştir. PZR yöntemiyle transfer işlemi doğrulanmıştır ve elde edilen dört adet transgenik suştan ekstraselülar rekombinant protein üretimi AOX1 promotörü kontrolünde, pH 6.0'da, 200 rpm'de, 30°C'de 96 saat boyunca gerçekleştirilmiştir. Eksprese edilen toplam protein miktarı Bradford assay analizleri ile hesaplanmış ve elde edilen proteinler SDS-PAGE yöntemi ile poliakrilamid jel üzerinde görüntülenmiştir. Western-Blot yöntemi ile poliklonal ekspanzin antibadileri kullanılarak ekspanzin proteinleri tanımlanmıştır. Elde edilen ekspanzin proteinlerinin meyve suyu endüstrisinde kullanılan selülozik enzimlere olan sinerjistik etkileri araştırılmıştır. Çalışma sonunda pPIC9K vektörünü taşıyan, proteaz enzimleri inhibe edilmiş SMD1168 transgenik suşundan 283 mg/L düzeyinde, GS115 suşuna göre yaklaşık olarak 1.4 kat daha fazla rekombinant ekspanzin proteini elde edilmiştir.

Abstract:
In this study LeExp1 gene from Solanum lycopersicum (tomato) genome was isolated and recombinantly expressed in methylotropic Pichia pastoris in order to produce expansin proteins. Open reading frame of LeExp1 gene transferred to pPIC9K and pHIL-S1 vectors containing alpha mating factor and acid phosphatase secretion signals, respectively. The vectors harboring target gene subcloned to E. coli JM109 competent cells via heat-shock method. The cloned vectors were transformed to Pichia pastoris GS115 and Pichia pastoris SMD1168 strains by electroporation. The presence of the transgene in Pichia pastoris genome was verified by Polymerase Chain Reaction (PCR) and recombinant expansin protein expression was carried under the control of AOX1 promoter, at pH 6.0, 30oC, 200 rpm for 96 hours from four different transgenic strains (GS115-pPIC9K-Exp1, GS115-pHIL-S1-Exp1, SMD1168-pPIC9K-Exp1, SMD1168-pHIL-S1-Exp1). The amount of expressed of total proteins were determined by using Bradford Assay and recombinant proteins separated and visualized on polyacrylamide gels (SDS-PAGE). Immunodetection of recombinant expansin proteins were conducted by using polyclonal tomato expansin antibodies. The synergistic activity of recombinant expansin proteins on cellulolytic enzymes were investigated. The higher amount of proteins were obtained from SMD1168-pPIC9K-Exp1 and SMD1168-pHIL-S1-Exp1 cell lines compared to those of GS115 lines. The proteins obtained from SMD1168 cells displayed higher synergistic activity with celluloytic enzymes compared to recombinant proteins obtained from GS115 cells.