Bacillus licheniformis OSBS6'dan amilaz ve proteaz enzimlerinin üçlü faz ayırma sistemi (TPP) ile saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of amylase and protease enzymes from Bbacillus licheniformis OSBS6 by three-phase partitioning system
Yazar: DAMLA RÜZGAR
Danışman: DOÇ. DR. MELDA ŞİŞECİOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu tez çalışması kapsamında; Türkiye'nin farklı jeotermal alanlarından sıcak su alınarak izole edilen 26 izolatın amilaz ve proteaz üretme potansiyelleri petri denemeleri ile araştırıldı. Sonuçta en geniş zon çapı veren OSBS6 izolatı seçilerek 16S rRNA sekans analizi sonucu %99 Bacillus licheniformis'e benzerlik gösterdiği tespit edildi. B. licheniformis OSBS6'dan amilaz ve proteaz enzimleri üçlü faz ayırma (TPP) sistemi ile kısmi olarak saflaştırıldıktan sonra biyokimyasal karakterizasyonları yapıldı. TPP sistemi ile amilaz enzimi pH 7,0, 1,0:1,5 (Ham enzim çözeltisi: t-bütanol oranı) ve %30 doygun amonyum sülfat kullanılarak %32,84 verimle 7,23 kat; proteaz enzimi ise pH 6,0, 1,0:1,5 (Ham enzim çözeltisi: t-bütanol oranı) ve %70 doygun amonyum sülfat kullanılarak %87,65 verimle 13,33 kat saflaştırıldı. SDS-PAGE jel elektroforez yöntemiyle amilaz ve proteaz enzimlerinin molekül ağırlıkları sırasıyla ~56,65 ve ~35,87 kDa olarak hesaplandı. B. licheniformis OSBS6'dan saflaştırılan amilaz ve proteaz enzimlerinin optimum pH'ları ise sırasıyla 9,0 ve 10,0; optimum sıcaklıkları ise sırasıyla 70°C ve 60°C olarak belirlendi. 10 mM'lık K+1 metal iyonu %8 oranında amilaz enzimini artırırken 10 mM'lık Mn+2 metal iyonu ise %92 oranında proteaz enzim aktivitesini arttırdığı tespit edildi.10 mM'lık Co+2 metal iyonu amilaz enzimini tamamen inhibe ederken proteaz enziminin ise aktivitesini düşürdüğü belirlendi. Amilaz ve proteaz enzimlerinin metaloenzim inhibitörü olan EDTA ile tamamen inhibe olduğu tespit edildi. Amilaz enzim aktivitesinin %20'lik gliserol varlığında %5 oranında artırdığı, proteaz enzim aktivitesinin %15'lik etanol varlığında %94 oranında korunduğu gözlemlendi. Amilaz ve proteaz enzimlerinin aktivitelerini %1'lik H2O2 varlığında sırasıyla %94 ve %97 oranında koruduğu belirlendi. Amilaz ve proteaz enzimlerinin sırasıyla patates nişastası ve kazeine substratlarına karşı yüksek spesifiklik gösterdiği belirlendi. B. licheniformis OSBS6'dan saflaştırılan amilaz ve proteaz enzimlerinin sırasıyla patates nişastası ve kazein subtsratları için Km ve Vmax değerleri sırasıyla 5,18 mg/mL; 5,76 mg/mL ve 0,0604 µmol.ml-1.dk-1; 27,10 µmol. ml-1.dk-1 olarak hesaplandı.

Abstract:
In this thesis; The amylase and protease producing potentials of 26 isolates isolated from different geothermal fields of Turkey were investigated by petri dishes. As a result, 16S rRNA sequence analysis was found to be similar to 99% Bacillus licheniformis by selecting OSBS6 isolate which gives the widest zone diameter. Biochemical characterization of amylase and protease enzymes from B. licheniformis OSBS6 was performed after partial purification by three phase partitioning (TPP) method. With the TPP system, the amylase enzyme was purified by 7.23 fold with 32.84% yield using pH 7.0, 1.0: 1.5 (Crude enzyme solution: t-butanol ratio) and 30% saturated ammonium sulfate, while the protease enzyme was purified by 13,33 fold with %87,65 yield using pH 6,0, 1,0:1,5 (Crude enzyme solution: t-butanol ratio) and 70% saturated ammonium sulfate. The molecular weights of amylase and protease enzymes were calculated as ~ 56,65 and ~ 35,87 kDa by SDS-PAGE gel electrophoresis, respectively. The optimum pH of amylase and protease enzymes purified from B. licheniformis OSBS6 were found to be 9.0 and 10.0, respectively; optimum temperatures were determined as 70 ° C and 60 ° C, respectively. 10 mM K + 1 metal ions increased the activity of amylase enzyme by 8% and 10 mM Mn + 2 metal ion was found to increase the protease enzyme activity by 92%. The 10 mM Co+ 2 metal ion completely inhibited the amylase enzyme, while it decreased protease enzyme activity. Amylase and protease enzymes were found to be completely inhibited by EDTA, a metalloenzyme inhibitor. It was observed that amylase enzyme activity increased by 5% in the presence of 20% glycerol and the protease enzyme activity was protected by 94% in the presence of 15% ethanol. It was determined that amylase and protease enzymes maintained their activity in 94% and 97% respectively in the presence of 1% H2O2. Amylase and protease enzymes were found to show high specificity against potato starch and casein substrates, respectively. The Km and Vmax values for the potato starch and casein substrates of amylase and protease enzymes, purified from B. licheniformis OSBS6, were calculated as 5,18 mg/mL; 5,76 mg/mL and 0,0604 µmol ml-1.min-1; 27,10 µmol.ml-1.min-1, respectively.