Negatif sinyal ve yalancı pozitif üreme sinyali veren otomatize kan kültür şişelerinde moleküler yöntemler ile bakteriyemi ve fungemi etkeni mikroorganizma varlığının araştırılması
Investigation of the presence of bacteremia and fungemia- related microorganisms with molecular methods in automated blood cultures with false positive and negative growth signals
Yazar: MERVE ERTÜRK MELEZ
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ALTAY ATALAY
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: Dolaşım sistemi enfeksiyonlarında uygun antimikrobiyal tedaviye mümkün olan en kısa sürede başlanması morbidite ve mortaliteyi azaltmak için çok önemlidir. Ancak kan kültürlerinin geç sonuçlanması geniş spektrumlu ampirik tedavi başlanmasına ve dolayısıyla toksisiteye ve yan etkilerde artışa sebebiyet verir. Klinik çalışmalar; moleküler yöntemlerin patojen tanımlaması için daha hızlı ve daha duyarlı olduğunu ortaya koymaktadır. Bu çalışmada, BD BACTEC™ FX (BD Diagnostic Systems,  ABD) otomatize kan kültür cihazında pozitif üreme sinyali veren ancak rutin mikrobiyolojik inceleme sonucunda üreme görülmeyen (yalancı pozitif) kan kültür şişelerinde ve negatif üreme sinyali veren kan kültür şişelerinde, MALDI-TOF MS, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ve yeni nesil dizileme (YND) yöntemleri ile bakteri ve mantar varlığının araştırılması hedeflenmiştir.
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda BD BACTEC™ FX Otomatize Kan Kültürü (OKK) cihazında pozitif üreme sinyali veren, ancak rutin mikrobiyolojik ekimler sonrasında üreme saptanmayan 80 yalancı pozitif OKK şişesi ve 30 negatif sinyal veren OKK şişesi kullanılmıştır. OKK şişelerinden direkt olarak alınan örnekler, %10'luk Tween® 80 eklenip çeşitli işlemlerden geçirildikten sonra MALDI-TOF MS (BD MALDI Biotyper® sirius, Bruker Daltonics, Almanya) ile çalışılmıştır. Şişelerde bakteri ve mantar DNA'sının varlığı bakteriyel 16S rRNA, fungal 28s rRNA, ITS gen bölgelerinin nükleik asit amplifikasyonu ve YND ile araştırılmıştır.
Bulgular: Seksen örneğin dokuzunda mantar DNA'sı tespit edilmiş, hiçbir şişede bakteri DNA'sı saptanmamıştır. Yalancı pozitiflik oranı tüm şişeler içinde %0,2 olarak bulunmuştur. Fungal PZR sonucu pozitif numunelerin hasta bilgileri, en yüksek bağıl bollukla saptanan cins/tür, tanıları ve enfeksiyon parametrelerine ilişkin veriler Tablo 1'de verilmiştir. OKK şişelerinden direkt olarak çalışılan MALDI-TOF MS yöntemi ile hiçbir mikroorganizma saptanmamıştır.
Tablo 1. Fungal PZR sonucu pozitif numunelerin hasta bilgileri, en yüksek bağıl bollukla saptanan cins/tür, tanıları ve enfeksiyon parametrelerine ilişkin veriler
Hasta
No	Yaş	Cinsiyet	Servis	Mikroorganizma	Tanı	WBC (4,8-10,7 x 10.000 /µl)	CRP (0-5 mg/L)
14	13	E	PNS	Aspergillus melleus	Epilepsi	10,77	30,37
16	1	K	PHOS	Amorphotheca resinae	Adrenal bez malign neoplazmı	6,66	2,21
17	7	E	PHOS	Alternaria conjuncta	Beyin malign neoplazmı	14,43	61,5
20	7	K	PHOS	Eremomyces bilateralis	Ewing sarkomu	0,5	104,74
23	40	K	EHS	Pseudomicrostroma glucosiphilum	Diabetes Mellitus	11,75	26,41
33	1	K	YDYBU	Aspergillus melleus	Akut üst solunum yolu enfeksiyonu	11,92	43,9
34	73	E	GCYBU	Alternaria infectoria	Pankreas Ca	6,67	26,48
53	3	E	PHOS	Aspergillus steynii	Nöroblastom	3,41	58,11
80	74	E	BSCYBU	Alternaria infectoria	İntrakraniyal hemoraji	26,2	197
E: Erkek; K: Kadın; PNS: Pediatri Nöroloji Servisi; PHOS: Pediatri Hematoloji Onkolojisi Servisi; YDYBU: Yenidoğan Yoğum Bakım Ünitesi; GCYBU: Genel Cerrahi Yoğun Bakım Ünitesi; BSCYBU: Beyin Sinir Cerrahi Yoğun Bakım Ünitesi; EHS: Enfeksiyon Hastalıkları Servisi

Sonuç: Kandaki lökosit miktarının yüksek olması, asidoz, hiperkapni, kültür şişesinin kanla aşırı doldurulması, antibiyotik kullanımı nedeniyle L-forma dönüşen bakteriler, yavaş ve zor üreyen ya da kültürü yapılamayan mikroorganizmalar, anaerop mikroorganizmalar ve mikroorganizma DNA'ları ile kontamine olmuş kültür şişelerinin yalancı pozitif sinyal nedenleri arasında olabileceği bildirilmiştir.
Çalışmamızda, kan kültür şişelerinin üretimi aşamasında doğada bulunabilen ve patojen olmayan küf DNA'ları ile kontaminasyonu sonucu DNA parçalarının şişelerde bulunmasının pozitif sinyal sebebi olabileceği düşünülmüş olmakla birlikte doğada bulunan hemen her mantar türünün duyarlı konakta invazif mantar enfeksiyonuna neden olabilme potansiyeline sahip olabileceği de unutulmamalıdır. Bu nedenle, yalancı pozitif sinyal veren kan kültürü şişelerinden yapılan kültür ekimlerinin inkübasyon süresinin uzatılmasının küf mantarlarını saptamada faydalı olacağı, ancak antifungal tedaviye başlamadan önce de dikkatli bir klinik değerlendirme yapılması gerektiği sonucuna varılmıştır.
Anahtar Sözcükler: Kan Kültürü, Yalancı pozitif sinyal, MALDI-TOF MS, PZR, Yeni Nesil Dizileme

Abstract:
Aim: Initiating appropriate antimicrobial treatment as soon as possible in circulatory system infections is very important to reduce morbidity and mortality. However, delayed results of blood cultures lead to the initiation of broad-spectrum empiric treatment and, therefore, to an increase in toxicity and side effects. Clinical studies; suggest that molecular methods are faster and more sensitive for pathogen identification. In this study, blood culture bottles that gave a positive growth signal in the BD BACTEC™ FX (BD Diagnostic Systems, ABD) automated blood culture device, but no growth was observed as a result of routine microbiological examination (false positive) and blood culture bottles that gave a negative growth signal were used. The aim was to investigate the presence of bacteria and fungi in these bottles using MALDI-TOF MS, polymerase chain reaction (PCR) and next generation sequencing (NGS) methods.
Materials and Methods: In our study, 80 false-positive automated blood culture bottles that gave a positive growth signal in the BD BACTEC™ FX automated blood culture device, but no growth was detected after routine microbiological cultivation, and 30 automated blood culture bottles that gave a negative signal were used. Samples taken directly from automated blood culture bottles were studied with MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Germany) after adding 10% Tween® 80 and undergoing various processes. Bacterial and fungal DNA in the bottles was investigated by nucleic acid amplification and NGS analysis of bacterial 16S rRNA, fungal 28s rRNA and ITS gene regions.
Results: Our study revealed a low positive rate of %0,2 in all bottles, providing reassurance about the reliability of our findings. Fungal DNA was detected in nine of the eighty samples, while no bacterial DNA was found in any of the bottles. Data regarding patient information, genus/species detected with the highest relative abundance, diagnoses and infection parameters of samples with positive fungal PCR results are given in Table 1. Notably, no microorganisms were detected by the MALDI-TOF MS method, which was studied directly from automated blood culture bottles.
Table 1. Data regarding patient information, genus/species detected with the highest relative abundance, diagnoses and infection parameters of fungal PCR-positive samples
Patient Number	Age	Gender	Service	Microorganism	Diagnosis	WBC (4,8-10,7 x 10.000 /µl)	CRP (0-5 mg/L)
14	13	M	PNS	Aspergillus melleus	Epilepsy	10,77	30,37
16	1	F	PHOS	Amorphotheca resinae	Adrenal gland malignant neoplasm	6,66	2,21
17	7	M	PHOS	Alternaria conjuncta	Brain malignant neoplasm	14,43	61,5
20	7	F	PHOS	Eremomyces bilateralis	Ewing sarcoma	0,5	104,74
23	40	F	IDS	Pseudomicrostroma glucosiphilum	Diabetes Mellitus	11,75	26,41
33	1	F	NICU	Aspergillus melleus	Acute upper respiratory tract infection	11,92	43,9
34	73	M	GSICU	Alternaria infectoria	Pancreatic Ca	6,67	26,48
53	3	M	PHOS	Aspergillus steynii	Neuroblastoma	3,41	58,11
80	74	M	BNSICU	Alternaria infectoria	Intracranial hemorrhage	26,2	197
M: Male; F: Female; PNS: Pediatric Neurology Service; PHOS: Pediatric Hematology Oncology Service; NICU: Neonatal Intensive Care Unit; GSICU: General Surgery Intensive Care Unit; BNSICU: Brain Nerve Surgery Intensive Care Unit; IDS: Infectious Diseases Service
Conclusion: It has been reported that high amounts of leukocytes in the blood, acidosis, hypercapnia, overfilling of the culture bottle with blood, bacteria turning into L- form due to antibiotic use, microorganisms that grow slowly and difficulty or cannot be cultured, anaerobic microorganisms and culture bottles contaminated with microorganism DNAs may be among the causes of false positive signals.
In our study, it was thought that the presence of DNA fragments in the bottles as a result of contamination with non-pathogenic mold DNAs that can be found in nature during the production of blood culture bottles may be a reason for a positive signal. However, it should not be forgotten that almost every fungal species found in nature may have the potential to cause invasive fungal infection in a susceptible patients. Therefore, it was concluded that prolonging the incubation period of cultures from blood culture bottles with false positive signals would be useful in detecting mold fungi, but a careful clinical evaluation should be performed before starting antifungal treatment.

Key Words: Blood Culture, False positive signal, MALDI-TOF MS, PCR, Next Generation Sequencing