İnsan endometriozis dokusunda nükleer faktör kappa B yolağı ve bcl-2 etkileşiminin olası rolü: Morfometrik ve histolojik bir çalışma
Possible role of nuclear factor kappa b pathway and bcl-2 interaction in human endometriosis tissue: a morphometric and histological study
Yazar: TUĞBA DAĞDEVİREN
Danışman: PROF. DR. CELAL KALOĞLU
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Endometriyoz = Endometriosis ; Morfometri = Morphometry

Özet:
İNSAN ENDOMETRİOZİS DOKUSUNDA NÜKLEER FAKTÖR KAPPA B YOLAĞI VE BCL-2 ETKİLEŞİMİNİN OLASI ROLÜ: MORFOMETRİK VE HİSTOLOJİK BİR ÇALIŞMA
Tuğba Dağdeviren
Tıbbi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Celal KALOĞLU
2024, xx+187 Sayfa
     Endometriozis, endometriyal dokunun uterus dışı yerleşimi sonucunda gelişen ve kronik inflamasyonla seyreden patolojik bir hastalık olup, etiyolojisi halen belirsizliğini korumaktadır. Endometriozisli ektopik implantlarda, inflamatuar yanıtların düzenleyicisi olan NF-κB sinyal yolunun aşırı aktif olduğu ve hücresel transkripsiyonu düzenleyen genler olduğu bilinmektedir. Apoptoz, endometriumda kanıtlanmış ve anti-apoptotik gen olan Bcl-2 proteini, apoptotik sürecin kontrolünde endometrial stromal hücrelerin (ESH) hayatta kalmasına katkıda bulunarak endometriozisin patofizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır.
ESH'lerin farklı davranışının endometriozisin patogenezi üzerinde kilit bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bu öngörü doğrultusunda gerçekleştirilen çalışmada, proliferatif dönem endometriozisli hastaların ESH'lerin invazivlik, hücresel transkripsiyonla ilişkili proliferatif kapasite ve artmış apoptozun sağlıklı endometriumdan farklı olduğunu göstermek amaçlanmıştır. 
Bugüne kadar yapılan çalışmalarda, NF-κB p65'in ve apoptozun endometriozis sürecini nasıl etkilediği tam anlamıyla açıklanamamıştır. Bu çalışmada, proliferatif dönem endometriozisli endometrium dokusunda NF-κB p65'in, ESH'lerin hücresel transkripsiyon yoluyla endometrial dokunun ektopik implantasyonunu kolaylaştırabileceği ve angionegezi tetikleyebileceği hipotezi sorgulanmıştır. NF-κB p65 ve Bcl-2 aktivasyon derecesinin, ESH'ler açısından ektopik implantların oluşumundaki rolünü belirleyebilmek için, ötopik endometrial stromal hücrelerin (öESH) ve ektopik endometrial stromal hücrelerin (eESH) aktivitesi ile kontrol endometrial stromal hücrelerin (kESH) aktivitesi karşılaştırılmış ve hücresel transkripsiyon potansiyeli ile apoptoz arasındaki ilişkiler analiz edilmiştir. Ektopik implantların oluşum sürecinde gerçekleşen anjiyogenezin ekspresyon düzeyi ile NF-κB p65 ve Bcl-2 molekülleri arasındaki ilişkileri de gösterilmiştir.
      Endometriozisin tanımlanmasında, histopatolojik kriterlerin dışında endometriozisli ektopik ve ötopik dokunun morfometrik özellikleri de kullanılmaktadır. Bu kapsamda, proliferatif dönemdeki endometriozisli dokuya ait ektopik lezyonların stromal vaskülarizasyon yoğunluğu, matriks, ESH'ler ile normal endometrium dokusu arasındaki morfometrik hacim fraksiyonu, hastalığın morfolojik özellikleri ile ilgili detaylı kantitaf bilgiler edinmeyi sağlayarak, endometriozisli dokunun anjiyogenez ve ESH farklılığı açısından ayırıcı tanıda menstrual safhanın belirleyici bir faktör olup olmadığı değerlendirilmiştir. Proliferatif dönem endometriozisi üzerine yapılan sınırlı sayıdaki morfometrik araştırmalar arasında yer alan bu çalışmanın sonuçlarının, endometriozisi karakterize eden morfolojik ve histolojik anormalliklerin elde edilmesi ve sürecin kontrol edilmesine yardımcı olabileceği düşünülmektedir.
Çalışma, Sivas Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı ve Tıbbi Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı'nda gerçekleştirilmiştir. 18-45 yaşları arasında, düzenli adet döngüleri bulunan, kist çapı 30 mm'den büyük 25 hasta çalışmaya dahil edilmiştir. Çalışmanın ilk grubu endometriozis mevcut ektopik ve ötopik (n= 9) hasta kadınlardan, ikinci grubu oluşturan kontrol bireyleri ise (n=16) sağlıklı kadınlardan seçilmiştir. Proliferatif dönemde biyopsi sonrasında alınan endometrial doku örnekleri, rutin histolojik preparasyon sürecinin ardından parafine gömülmüştür. Parafin bloklardan alınan kesitlere Bcl-2 ve NF-κB p65 antikorları uygulanarak, immunfloresan işaretleme yapılmıştır. Aynı doku grupları JB-4 için plastik gömme materyaline gömülmüş ve bloklardan alınan kesitlere Toluidin Blue- Asit Fuksin boyaması yapılmıştır. Elde edilen görüntüler üzerinden, kontrol ve endometriozis grupları arasındaki morfolojik farklılıklar, hacim fraksiyon analizi ile tespit edilmiştir. Gruplar arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak değerlendirilmiştir.
Mevcut çalışmadan alınan örneklerin immünflorasan analizlerinde, öESH gruplarında tüm antikorlar, ektopik grupta ise kan damarları en güçlü limmunokalizasyona sahiptir. Endometriozisli hastaların öESH'leri invazivlik, artmış apoptoz ve proliferatif kapasite açısından, ektopik gruptan farklılık göstermiştir. Bcl-2 ve NF-κB p65 moleküllerinin her ikisi de öESH'lerde güçlü immunlokalizasyon göstermiştir. Bcl-2'nin kontrol ve ötopik grubu glandüler epitel hücrelerinde çok güçlü, öESH'lerde ise güçlü lokalizasyonu ektopik endometriumun eESH'lerine kıyasla çok yüksek immunlokalize olduğu belirlenmiştir. NF-κB p65' de öESH'lerde çok güçlü glandüler epitel hücrelerinde güçlü lokalize iken, eESH'lerde ise ekspresyonun yüksek olduğu gösterilmiştir. Her iki antikor için dikkat çekici olan, ektopik dokuda kan damarlarının boyanma derecesinin tüm gruplara oranla, en güçlü immunlokalizasyona sahip olmasıdır. Bu durum ektopik lezyonların geniş ve güçlü bir anjiyogenez potansiyeline sahip olduğunu kanıtlamaktadır. 
Morfometrik analizlerde, ektopik dokunun anjiyogenez ve ötopik dokunun bez mimarisi, menstrual siklusun proliferatif fazı ile ilişkili endometriozisi, morfolojik olarak gösterilmiştir. Kan damarları ve stromanın ektopik, ötopik ve kontrol grupları arasında farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptanmıştır. Endometrial stromal hücreler ve matriks bakımından tüm gruplar karşılaştırıldığında, farklılığın önemli olduğu belirlenmiştir. 
Sonuç olarak, Bcl-2 endometriozis patogenezinde, anjiyogenezin etkin bir rolü olduğunu ve öESH'lerin proliferatif davranışlar sergileyerek, ektopik lokasyonlarda anormal hayatta kalmalarına katkıda bulunduğunu eESH'lerin ise hücre ölümüne karşı durduğunu, NF-κB p65'in artan aktivasyon paterninin, ektopik implantların meydana gelmesi için hücresel transaktivasyonu başlattığı ve anjiyogenezde etkin bir rol aldığı belirlenmiştir. Bcl-2 ve NF-кB p65 hücre çoğalmasının, göçünün ve yapışmasının desteklenmesi için endometriozis patogenezinin çeşitli yönlerinde rol oynadığı bir gerçektir. NF-κB ve Bcl-2'nin inhibe edilmesi hücresel transkripsiyon, invazyon, anjiyogenez ve proliferasyon gibi endometriozis gelişiminde yer alan farklı hücre fonksiyonlarını etkileyerek, endometriozis için tanısal belirteçler veya terapötik hedefler için potansiyel adaylar olabileceği düşünülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Endometriozis, Apoptoz, Morfometri, NF-κB Sinyal Yolağı, Bcl-2, NF-κB / p65, Hücre Transkripsiyonu, Proliferatif Faz

Abstract:
POSSIBLE ROLE of NUCLEAR FACTOR KAPPA B PATHWAY and BCL-2INTERACTION in HUMAN ENDOMETRİOZİS TISSUE: A MORPHOMETRIC and HISTOLOGICAL STUDY
Tuğba DAĞDEVİREN
Histology and Embryology Department
Advisor: Prof. Dr. Celal KALOĞLU
2024, xx+187 Pages
     Endometriozis is a pathological disease that develops as a result of the extrauterine location of the endometrial tissue and progresses with chronic inflammation, and its etiology remains unclear. In ectopic implants with endometriozis, it is known that the NF-κB signaling pathway, which is the regulator of inflammatory responses, is overactive and there are genes that regulate cellular transcription. Apoptosis plays an important role in the pathophysiology of endometriozis by contributing to the survival of endometrial stromal cells (ESC) in the control of the apoptotic process.
The different behavior of ESCs is thought to play a key role in the pathogenesis of endometriozis. In the study conducted in line with this prediction, it was aimed to show that the ESCs of patients with proliferative period endometriozis differed from the healthy endometrium in invasiveness, proliferative capacity associated with cellular transcription, and increased apoptosis. 
Studies have not fully explained how NF-κB p65 and apoptosis affect the endometriozis process. In this study, the hypothesis that NF-κB p65 can facilitate ectopic implantation of endometrial tissue through cellular transcription of ESCs and trigger angionegesis in proliferative period endometriozis was questioned. In order to determine the role of NF-κB p65 and Bcl-2 activation degree in the formation of ectopic implants in terms of ESCs, eutopic endometrial stromal cells (EuESC) and ectopic endometrial cells (EESC) activity and control endometrial stromal cells (CESC) activity were compared and the relationships between cellular transcription potential and apoptosis were analyzed. The relationship between the expression level of angiogenesis in the formation process of ectopic implants and NF-κB p65 and Bcl-2 molecules has also been demonstrated.
In the definition of endometriozis, morphometric properties of ectopic and eutopic tissue with endometriozis are also used in addition to histopathological characters. In this context, it was evaluated whether the menstrual phase was a determining factor in the diagnosis of endometriozis in terms of angiogenesis and ESC difference of the endometriotic tissue by enabling us to obtain detailed quantitative information about the density of stromal vascularization of ectopic lesions of endometriotic tissue in the proliferative period, the morphometric volume fraction between matrix, ESCs and normal endometrial tissue, and the morphological characteristics of the disease. The results of this study, which is among the limited number of morphometric studies on proliferative period endometriozis, are thought to help control the processes of obtaining and maintaining morphological and histological abnormalities that characterize endometriozis.
The study was carried out in Sivas Cumhuriyet University, Faculty of Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology and Department of Medical Histology-Embryology. 25 patients aged 18-45 years with regular menstrual cycles and a cyst diameter greater than 30 mm were included in the study. The first group of the study was selected from ectopic and eutopic (n= 9) patients with endometriozis, and the control individuals (n=16) constituting the second group were selected from healthy women. Endometrial tissue samples taken after biopsy in the proliferative period were embedded in paraffin after the routine histological preparation process. Immunofluorescence marking was performed by applying Bcl-2 and NF-κB p65 antibodies to the sections taken from paraffin blocks. The same tissue groups were embedded in plastic embedding material for JB-4 and Toluidine Blue-Acid Fucsin staining was applied to the sections taken from the blocks. Through the images obtained, the morphological differences between the control and endometriozis groups were determined by volume fraction analysis. The differences between the groups were evaluated statistically.
In the immunofluorescence analyses of the samples taken in the results of the current study, EuESCs for all antibodies and blood vessels for ectopic implants have the strongest localization. Eutopic endometrial stromal cells of patients with endometriozis differed in terms of invasiveness, increased apoptosis and proliferative capacity. Both Bcl-2 and NF-κB p65 molecules showed strong expression in EuESC. Very strong expression of Bcl-2'in glandular epithelial cells and strong expression in EuESCs were found to be very high compared to EESCs of the ectopic endometrium, and control endometrial tissue had similar expression to EuESCs in CESCs and glandular epithelial cells. In NF-κB p65, strong localization was determined in very strong glandular epithelial cells in EuESCs, while expression was shown to be high in EESCs. What is noteworthy for both antibodies is that the degree of expression of ectopic tissue blood vessels has the strongest immunolocalization compared to all groups. This proves that ectopic lesions have a wide and strong angiogenesis potential. 
In morphometric analyses, angiogenesis of ectopic tissue and gland architecture of eutopic tissue, endometriozis associated with the proliferative phase of the menstrual cycle, have been morphologically demonstrated. The difference between the ectopic, eutopic and control groups in terms of blood vessels and stroma was found to be statistically significant. When all groups were compared in terms of endometrial stromal cells and matrix, the difference was found to be significant. 
As a result, it was determined that angiogenesis has an active role in the pathogenesis of Bcl-2 endometriozis and that EuESCs exhibit invasive and proliferative behaviors, contributing to their abnormal survival in ectopic locations, and that the increased cyclic activation pattern of NF-κB p65, cellular transactivation of angionegesis as a mediator for the occurrence of ectopic implants, is performed by NF-кB. It is also a fact that Bcl-2 and NF-κB p65 play a role in various aspects of endometriozis pathogenesis to support cell proliferation, migration and adhesion. Inhibition of NF-κB and Bcl-2 is thought to be potential candidates for diagnostic markers or therapeutic targets for endometriozis by affecting different cell functions involved in the development of endometriozis, such as cellular transcription, invasion, angiogenesis, and proliferation.
Keywords: Endometriozis, Apoptosis, Morphometry, NF-κB Signaling Pathway, Bcl-2, NF-κB/ p65, Cell Transcription, Proliferative Phase.