Amsacta moorei entomopoxvirus (AMEV) muhtemel kaspaz orf'si̇ni̇n (AMV063) fonksi̇yonel anali̇zi̇
Functional analysis of putative amsacta moorei entomopoxvirus (AMEV) caspase orf (AMV063)
Yazar: FUNDA BİLGİLİ
Danışman: DOÇ. DR. HACER MURATOĞLU
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Amsacta moorei entomopoxvirus (AMEV), tarımsal açıdan önemli zararlıları enfekte ettiği için, AMEV'nin genomunda yapılan genetik mühendisliği çalışmalarıyla hem bu virüslerin biyoteknolojik ajan olarak kullanımının artırılması amaçlanmakta hem de henüz keşfedilmeyen gen fonksiyonları aydınlatılmaktadır. AMEV'nin, LD652 ve CF-70-B2 gibi böcek hücre hatlarını enfekte edilebildiği ve viral yaşam döngüsünü devam ettirmek için apoptozise sebep olduğu gösterilmiştir. Kaspazlar, sistein proteaz ailesinin üyeleridir ve apoptozisin düzenlenmesinde önemli rollere sahiptir. AMEV'ye ait muhtemel kaspaz proteinini kodladığı belirlenen 63. ORF'nin, AMEV protein kinazlarıyla etkileşimi belirlenmiş olmasına rağmen, AMV063 proteininin apoptozis ve kaspaz aktivitesi daha önce araştırılmamıştır.
Bu tez kapsamında, AMEV063 ORF'sinin fonksiyonel analizi yapıldı. AMV063 proteini prokaryotik sistemde ifade edildi. Homolog rekombinasyonla AMV063 dizisi silinen nakavt Am∆063/gfp oluşturuldu. Apoptozise duyarlı CF-70-B2 hücreleri, AMV063 proteini ve Am∆063/gfp kombinasyonları ile muamele edilerek apoptozis ve kaspaz-2 aktiviteleri araştırıldı. AMV063 proteini ile muamele edilen CF-70-B2 hücrelerinde, kaspaz-2 ve TUNEL aktivitesi belirlenemedi. Am∆063/gfp virüsü ile muamele edilen CF-70-B2 hücrelerinin kaspaz-2 ve TUNEL aktivitesi, kontrol Am∆sph/gfp virüsü ile muamele edilenlere göre önemli derecede azaldı. Bu sonuçlar, AMV063 dizisinin kaspaz-2 proteinini kodladığını ve doğal sisteminde üretilen AMV063 proteininin, kaspaz-2 ve apoptozis aktivitesine sahip olduğunu açık bir şekilde gösterdi.

Anahtar Kelimeler: Böcek virüsleri, Amsacta moorei entomopoxvirus, AMV063, Am∆063/gfp, kaspaz-2, apoptozis

Abstract:
Amsacta moorei entomopoxvirus (AMEV) infects agriculturally important pests. Genetic engineering studies on the genome of AMEV helped to reveal undiscovered gene functions and also its potential to be used as biotechnological agent. It has been shown that AMEV infects and causes apoptosis of insect cells, such as Ld652 and CF-70-B2. Caspases are members of cysteine protease family and have important roles in apoptosis. Although the interaction of AMEV putative caspase ORF (AMV063) with protein kinase of AMEV has been determined, the apoptosis and caspase activity of these proteins has not been investigated.
In this thesis, functional analysis of AMEV063 ORF was performed. AMV063 protein was expressed in the prokaryotic system. Knock-out mutant, Am∆063/gfp was created by deleting its sequence with homologue recombination. Apoptosis and caspase-2 activities of apoptosis sensitive CF-70-B2 cells were investigated by treating AMV063 protein and Am∆063/gfp mutant with different combinations. Caspase-2 and TUNEL activity could not be determined in AMV063 protein the treated cells. Significant decrease in caspase-2 and TUNEL activity was observed in the cells treated with Am∆063/gfp compared to the same cell line treated with Am∆sph/gfp. These results clearly indicate that AMV063 sequence encodes the caspase-2 protein and only AMV063 protein produced in its natural system has caspase-2 and apoptosis activity.
Keywords: Insect viruses, Amsacta moorei entomopoxvirus, AMV063, Am∆063/gfp, caspase-2, apoptosis