H2o2 ile oksidatif hasar oluşturulan ARPE-19 hücrelerinde resveratrol, lutein ve krosetin'in etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of resveratrol, lutein and crosetin on H2o2-induced oxidative stress model of ARPE-19 cells
Yazar: AYŞEGÜL YABAŞ
Danışman: PROF. DR. VEYSEL LEVENT KARABAŞ
Kocaeli Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases

Özet:
Amaç: H2O2 ile oksidatif hasar modeli oluşturulan ARPE-19 hücrelerinde, Resveratrol, Lutein ve Krosetin'in antioksidan etkilerini, hücre canlılığını, otofaji ve mitofajiye olan etkilerini araştırmak ve bu etkilerini karşılaştırmak. 
Gereç ve Yöntem: ARPE hücrelerinde oksidatif hasar, hücrelere 1 saat süre boyunca 800 μM H2O2 maruziyeti sonucu oluşturuldu. Oksidatif hasar sonrası hücreler resveratrolün değişen dozları (0 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM dozlarında) ile inkübe edildikten sonra hücrelerdeki canlılığa olan etkileri %10 WST-1 ile karşılaştırmalı olarak değerlendirildi. WST-1 analizi sonucunda resveratrolün etkili dozu seçildi (100 μM). Lutein ve krosetinin etkin dozu, Kocaeli Üniversitesi Kök Hücre Laboratuvarı'nda daha önce yürütülmüş olan deney düzeneği sonuçları kullanılarak seçildi. Oksidatif hasara uğratılmış ARPE-19 hücreleri ve bu hücrelere tedavi amacıyla farklı dozlarda uygulanan lutein (5 ve 10 μM), krosetin (10 ve 20 μM) ve resveratrolün (100 μM) malondialdehit (MDA), glutatyon (GSH) ve nitrik oksit (NO) oksidatif biyobelirteç seviyeleri üzerine etkileri spektrofotometrik yöntemle tespit edildi. Etkin dozlarla oluşturulan ilaç gruplarının hücrelerle 48 saat inkübasyonu sonrası WST-1 ile hücre canlılık yüzdeleri tespit edildi ve bu yüzdeler kıyaslandı. Otofaji belirteci olan LC3B, mitofaji belirteci olan PINK-1 ve PARKIN otoantikorlarıyla immunfloresan boyama yapılan hücre gruplarının konfokal mikroskopta görüntülemeleri alındı ve bu görüntüler kıyaslandı. Son olarak kontrol, hasar ve ilaç gruplarının her birinde Western Blot yöntemi kullanılarak, LC3B ve PARKIN otoantikorlarının protein ekspresyon seviyelerine bakıldı, bu ölçümler karşılaştırıldı.
Bulgular: Kontrol ve hasar grubundaki hücre canlılığı değerlendirildiğinde, hücre canlılığının kontrol grubunun yaklaşık %50'sine düştüğü konsantrasyon 800 μM olarak belirlendi. Resveratrolün hücre canlılığı üzerine en etkili olan dozu 100 μM olarak tespit edildi. Lutein ve krosetinin hücre canlılığı üzerine en etkili dozları, Kocaeli Üniversitesi Kök Hücre Laboratuvarı'nda daha önce yürütülmüş olan deney düzeneği sonuçları baz alınarak kullanıldı. (lutein için 5 ve 10 μM, krosetin için 10 ve 20 μM). Hücre canlılığı yüzdeleri WST-1 ile tespit edildi; büyükten küçüğe olarak kontrol (%100), krosetin 10 (%73,5), krosetin 20 μM (%69,1), lutein 5 (%62,7), lutein 10 μM (%59,3) resveratrol 100 μM (%52,7) ve H2O2 grubu (%0,04) sıralamasını oluşturmuştur. Biyokimyasal analizlerde MDA, GSH ve NO düzeyleri incelendi. H2O2 GSH'ı anlamlı oranda yükseltmiş, MDA ve NO'yu anlamlı oranda azaltmıştır (p<0.05, p<0.05, p<0.05). Kontrol grubuna göre MDA sonuçlarında, lutein 10 μM grubunda anlamlı yükseklik bulundu (p=0,038). Yine kontrol grubuna göre NO sonuçlarında, lutein 10 μM grubunda anlamlı yükseklik bulunmuştur (p=0,009). MDA ve NO aktivitesi krosetin 10 μM grubunda anlamlı olarak düşük tespit edilmiştir (p=0,019 ve p=0,005). Lutein 5 μM grubunda anlamlı NO aktivite düşüşü görülmüştür (p=0,043). GSH düzeyleri lutein 10 μM grubunda hasar grubuna göre anlamlı artmıştır (p=0,009). Kontrol grubuna göre, krosetin 20 μM grubunda anlamlı düşüş görülmüştür (p=0,011). Tüm hücre grupları LC3B, PINK-1 ve PARKIN antikorlarıyla immun boyama yapılması sonucu, hücre içerisinde bu proteinlerin ekspresyonu olduğunu gösterecek şekilde boyanmış ve görüntüleme yapılmıştır. Devamında LC3B antikorunun tüm gruplarda protein ekspresyonu Western Blot ile ölçülmüş; en yüksek LC3B ölçümü lutein 5 μM grubunda bulunmuştur. Kontrol grubuna göre lutein 5 μM, lutein 10 μM ve resveratrol 100 μM grupları anlamlı yüksek bulunmuştur (p<0,001, p=0,02 ve p=0,047). Hasar grubuna göre lutein 5 μM ve lutein 10 μM grupları anlamlı yüksek bulunmuştur (p<0,001 ve p=0,04). Lutein 5 μM grubu, krosetin 20 μM grubuna göre anlamlı yüksek tespit edilmiştir (p=0,015). PARKIN antikorunun Western Blot ile ölçümü sonucu, kontrol grubuna göre lutein 10 μM, krosetin 20 μM ve resveratrol 100 μM grubu anlamlı yüksek bulunmuştur (p=0,015, p<0,001 ve p<0,001). Krosetin 20 μM ve resveratrol 100 μM grupları, lutein 5 μM grubuna göre anlamlı yüksek tespit edilmiştir (p<0,001 ve p=0,015). Krosetin 20 μM grubu, krosetin 10 μM grubuna göre anlamlı yüksek bulunmuştur (p=0,015). 


Sonuç: Gruplar arasında krosetin 10 μM grubunun direkt antioksidan etkisi en yüksek olan grup olabileceğini ve lutein 5 μM dozunun daha çok otofaji yolağını uyararak hücre sağ kalımını artırabileceğini düşünüyoruz. Ağırlıklı olarak iki farklı mekanizmayla hücre sağ kalımı etkinliğini gösteren lutein ve krosetinin, böylelikle sinerjistik etkinliğinden yararlanılarak çalışmalar yapılabileceğine inanıyoruz. Ayrıca resveratrol 100 μm dozunun, literatürle uyumlu olarak otofajiyi ve mitofajiyi yüksek oranda uyardığını görüyoruz. Resveratrolün krosetine göre direkt antioksidan etkisinin daha düşük olabileceğini, otofaji ve mitofaji yolağını beraber uyararak etki gösterebileceğini düşünüyoruz.

Abstract:
Purpose: To investigate and compare the antioxidant effects, cell viability, autophagy and mitophagy effects of resveratrol, lutein and crocetin in ARPE-19 cells in which an oxidative damage model was created with H2O2.
Materials and Methods: ARPE cells were exposed to 800 μM H2O2 for one hour to observe oxidative damage. After observing oxidative damage, cells were incubated with varying doses of resveratrol (0 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 300 μM), and then the effects on cell viability were compared with 10% WST-1. As a result of WST-1 analysis, the effective dose of resveratrol was selected (100 μM). The effective dose of lutein and crocetin were selected using the results of the experimental setup previously conducted at Kocaeli University Stem Cell Laboratory. Oxidatively damaged ARPE-19 cells and lutein (5 and 10 μM), crocetin (10 and 20 μM) and resveratrol (100 μM) doses which are applied to these cells at different doses for treatment purposes were tested for malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) and NO levels called as oxidative biomarkers, These effects on oxidative biomarkers were determined by spectrophotometric method. After 48 hours of incubation with the drug groups based on effective doses of these cells, cell viability percentages were determined with WST-1 and these percentages were compared. Confocal images of each of the control, injury and drug groups immunofluorescently stained with LC3B, PINK-1 (marker of mitophagy) and PARKIN antibodies were taken and these images were compared. Finally, in these cells the protein expression levels of the autophagy marker LC3B and the mitophagy marker PARKIN antibodies were compared using Western blot method. 
Results: Cell viability in the control and damage groups was evaluated, and the concentration at which cell viability decreased to approximately 50% of the control group was determined as 800 μM. The most effective dose of resveratrol on cell viability was determined to be 100 μM. The most effective doses of lutein and crocetin on cell viability were used based on the results of the experimental setup previously conducted at Kocaeli University Stem Cell Laboratory (5 and 10 µM for lutein, 10 and 20 µM for crocetin). Cell viability percentages were determined by WST-1 and the ranking from biggest to smallest is such as; control (100%), crocetin 10 (73.5%), crocetin 20 μM (69.1%), lutein 5 (62.7%), lutein 10 μM (59.3%) resveratrol 100 μM (52.7%) and H2O2 group (0.04%). MDA, GSH and NO levels were determined in biochemical analyses. H2O2 significantly increased GSH and significantly decreased MDA and NO (p<0.05, p<0.05, p<0.05). A significant increase in MDA results was found in the lutein 10 μM group compared to the control group (p = 0.038). Again, a significant increase was found in the NO results in the lutein 10 μM group compared to the control group (p=0.009). MDA and NO activities were found to be significantly lower in the crocetin 10 μM group (p=0.019 and p=0.005). A significant decrease in NO activity was observed in the lutein 5 μM group (p = 0.043). GSH levels increased significantly in the lutein 10 μM group compared to the damage group (p = 0.009). There was a significant decrease in GSH values in the crocetin 20 μM group compared to the control group (p=0.011). After immunostaining of all cell groups with LC3B, PINK-1 and PARKIN antibodies, imaging was performed so as to show and prove the expression of these proteins in the cells. Subsequently, protein expression of LC3B antibody in all groups was measured by Western Blot technique and the highest amount of LC3B was observed in the lutein 5 μM group. Lutein 5 μM, lutein 10 μM and resveratrol 100 μM groups were found to be significantly higher than the control group in the LC3B section (p<0.001, p=0.02 and p=0.047). Compared to the damage group, lutein 5 μM and lutein 10 μM groups were found to be significantly higher (p<0.001 and p=0.04). Lutein 5 μM group was found to be significantly higher than crocetin 20 μM group (p = 0.015). As a result of detection of PARKIN antibody by Western Blot technique, lutein 10 μM, crocetin 20 μM and resveratrol 100 μM group were found to be significantly higher than the control group (p=0.015, p<0.001 and p<0.001). Crocetin 20 μM and resveratrol 100 μM groups were found to be significantly higher than the lutein 5 μM group in the PARKIN section (p<0.001 and p=0.015). The crocetin 20 μM group was found to be significantly higher than the crocetin 10 μM group (p=0.015).

Conclusion: We think that among the groups, the crocetin 10 μM group may be the group with the highest direct antioxidant effect and the lutein 5 μM dose may increase cell survival by stimulating the autophagy pathway. We believe that studies can be conducted by utilizing the synergistic activity of lutein and crocetin, which show cell survival efficiency mainly through two different mechanisms. Besides, we see that resveratrol 100 μM dose stimulates autophagy and mitophagy at a high rate, consistent with the literature. We think that the direct antioxidant effect of resveratrol may be lower than crocetin, and that it may act by stimulating the autophagy and mitophagy pathways together.