Gama radyasyonu ile çeltik (Oryza sativa L.) çeşitlerinde tuzluluk toleransının teşviki
Inducing salt tolerance in rice (Oryza sativa L.) varieties by gamma radiation
Yazar: ALP AYAN
Danışman: PROF. DR. SEYHAN ALTUN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Radyobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Elektroforez-jel-iki boyutlu = Electrophoresis-gel-two dimensional ; Mutasyon ıslahı = Mutation breeding ; Oryza sativa = Oryza sativa ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; Tuz toleransı = Salt tolerance

Özet:
Bu tez çalışması kapsamında  ülkemizde yaygın ekime sahip olan Osmancık-97 ve Karadeniz bölgesinde geliştirilmiş olan Mevlütbey çeltik çeşitlerinden, gama radyasyonu ile tuzluluğa toleranslı mutantların elde edilmesi amaçlanmıştır. Cs-137 gama radyasyonu kaynağı ile 0, 250, 300 ve 400 Gy dozlarında çeltik tohumları ışınlanmıştır. Işınlanan tohumlar Karadeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü deneme tarlalarına ekilerek M1 generasyonunda radyasyonun neden olduğu fizyolojik zararlanmalar gözlenmiş ve bitkilerden tohum alınmıştır.
Tuza toleranslı mutantların belirlenmesi için seleksiyonlar M2 generasyonunda T.C. İstanbul Kültür Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Bitki Biyoteknolojisi Laboratuvarı'nda yapılmıştır. In vivo ortamda yapılan seleksiyonlarda seçilen tuzluluğa toleranslı 86 mutantın 43 tanesi Osmancık-97 çeşidine aittir. Seçilen M2 generasyonundaki mutant bitkiler tohum elde etmek amacıyla Trakya Tarımsal Araştırma Müdürlüğü deneme tarlalarına dikilmiştir.
M3 generasyonunda tuz toleransının devamlılığının kontrol edilmesi için in vitro kallus kültürleri kurulmuştur. Kültürler için kullanılan eksplantlar tohumların embriyonik kısımlarından alınmıştır. Doku kültürlerinde kallus eldesi için en uygun besi yeri içeriği B3 besi yeri (MS tuzları, 3 mg/L 2,4-D ve 560 mg/L prolin) olarak tespit edilmiştir. In vitro kültürlerin sonuçları doğrultusunda tuz stresi altında, tuz stresi uygulanmamış Osmancık-97 kontrol kalluslarına göre daha iyi kallus gelişimi gösteren 250-2, 300-5, 400-2 ve 400-5 mutantları ile moleküler karakterizasyon çalışmalarının  yapılmasına karar verilmiştir.
Seçilen tuza toleranslı mutantların tuzlu ve tuzsuz ortamlarda biyokimyasal cevaplarını belirlemek amacı ile lipid peroksidasyon, prolin miktarı, fotosentetik pigment konsantrasyonu, total protein konsantrasyonu, peroksidaz, superoksit dismutaz, katalaz enzim aktivitesi saptanmıştır.
Seçilen tuza toleranslı mutantların kökenlendikleri Osmancık-97 çeşidi ile ve birbirleriyle olan genetik uzaklıklarını belirlemek için ISSR primerleri kullanılarak PZR yapılmıştır. Elde edilen bant profillerine göre Jaccard genetik benzerlik matrisi oluşturulmuş ve UPGMA dendogramı çizilmiştir. Elde edilen dendogramda Osmancık-97 çeşidi ve mutantların tuz uygulanmış ve uygulanmamış örnekleri iki kümeye ayrılmıştır. Dendogram sonuçları mutantların tamamının Osmancık-97 çeşidinden ayrı alt gruplarda yer aldıklarını göstermiştir.
Tuza toleranslı mutantların iki boyutlu proteomik analizleri yapılmıştır. Elde edilen protein spotu profilleri değerlendirilerek tuz stresi altında anlatım farklılığı gösteren 30 protein tespit edilmiştir. Kütle spektroskopisi yöntemi ile tanımlanan bu proteinlerden 9 tanesinin (ribüloz bisfosfat karboksilaz/oksigeneaz aktivaz, trioz fosfat izomeraz, 2-Cys peroksiredoksin, oksijen-evolving enhancer protein 1, ferritin-1, ferredoksin--NADP redüktaz, gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz, tubby-benzeri F-box protein 11, peptidil-prolil cis-trans izomeraz) tuz stresine tolerans ile bağlantılı olduğu tespit edilmiştir. Çalışmamızda, çeltik mutantlarının tuz stresi altında verdiği cevaplardaki farklılıklarda, özellikle ferredoksin-NADP redüktaz, oksijen-evolving enhancer protein 1, trioz fosfat izomeraz ve 2-Cys peroksiredoksin proteinleri rol oynamaktadır.
Sonuç olarak, ülkemizde bu tez kapsamında ilk defa radyasyon ile tuza toleranslı çeltik mutantların geliştirilebildiği gösterilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda tuza toleranslı dört farklı çeltik mutantı elde edilmiştir. Bu dört mutantın farklı çevre, iklim ve coğrafik koşullarda daha yüksek ürün potansiyeline sahip çeşitlerin geliştirilmesinde önemli rolü olacaktır. Ayrıca araştırmada kullanılan çeltik çeşitleri ülkemizde geliştirilen yerli çeşitler olması nedeni ile yapılan bu mutasyon çalışması ülkemiz ekonomisi açısından ayrı bir öneme sahiptir.

Abstract:
In context of this Ph. D. thesis study, it is aimed to obtain salinity tolerance on Osmancık-97, which is widely planted rice variety in our country, and Mevlütbey, which is a rice variety improved in Black Sea  region, by using gamma radiation. Rice seeds were irradiated by 0, 250, 300 ve 400 Gy dose of Cs-137 source. Irradiated seeds were planted in the experimental fields of Black Sea Agricultural Research Institute and physiological effects of radiation on M1 generation were observed, as well as seed were harvested.
Selections in  M2 generation for determination of salt tolerant mutants were conducted in Plant Biotechnology Laboratory of T.C. Istanbul Kultur University, Department of Molecular Biology and Genetics. Following in vivo selections, 43 of selected salt tolerant mutants were belonging to Osmancık-97 variety. Selected M2 generation mutant plants were planted to Trakya Agricultural Research Institute to obtain seeds.
In vitro callus cultures were established in order to determine persistence of salt tolerance in M3 generation. Embrios of the seeds were selected as explant source. B3 medium (MS salts, 3 mg/L 2,4-D, 560 mg/L proline) is determined to be the most suitable medium for callus induction. In respect to the data obtained from in vitro studies, 250-2, 300-5, 400-2 and 400-5 mutants which presented better callus growth comparing to the untreated Osmancık-97 control calluses were selected for further molecular characterization studies.
Biochemical responses of selected salt tolerant mutants under salt treated and untreated conditions were evaluated by lipid peroxidation, proline content, photosynthetic pigment content, total protein content, enzyme activities of peroxidase, superoxide dismutase and catalase results.
Genetic distance between mutants and Osmancık-97 as their origin were determined by PCR reactions conducted with ISSR primers. Jaccard genetic similarity matrix was generated according to the band profiles and UPGMA dendrogram was drawn. According to the dendrogram, Osmancık-97 variety and salt treated/untreated mutants divided into two distinct clusters. Moreover, all the mutants were seperated from Osmancık-97 variety in different sub-clusters.
Two dimensional proteomic analysis of salt tolerant mutants were conducted. Evaluation of protein spot profiles of samples presented that 30 proteins were differed in expression. 9 of these 30 proteins (ribulose biphosphate carboxylase/oxidase activase, triose phosphate isomerase, 2-Cys peroxiredoxin, oxygene-evolving enhancer protein 1, ferritine-1, ferredoxin-NADP reductase, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, tubby-like F-box protein 11, peptydil-prolyl cis-trans isomerase) were characterized by mass spectroscopy and they were found to be salt tolerans related. In this study, proteomic response differences between rice mutants under salt stress were found to be related to the roles of ferredoxin-NADP reductase, oxygene-evolving enhancer protein 1, triose phosphate isomerase and 2-Cys peroxiredoxin proteins.
As a result, it is the first time in Turkey that we presented salt tolerant rice mutants can be induced by gamma radiation. In this study, four different salt tolerant rice mutants were obtained. These four mutants will play important roles on improving novel rice varieties which have higher yield potential under different environmental, climate and geographical conditions. Also, this study is important for our country's economy due to the fact that our salt tolerant mutants were induced from our local rice varieties.