Stevia (Stevia rebaudiana B.) bitkisi ekstraktında bulunan steviol glikozitlerin saflaştırılmasında bazı fiziksel ayırma tekniklerinin uygulanması
Application of some physical separation techniques on the purification of steviol glycosides in the stevia (Stevia rebaudiana B.) plant extract
Yazar: AHMET HACIOĞLU
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA KARHAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Günümüzde, tatlandırıcıların gıda formülasyonlarında kullanımının giderek arttığı görülmektedir. Bu tatlandırıcıların ilavesiyle gıdaların enerji içerikleri düşürülmektedir. Özellikle de obezite ve diyabet ile mücadeleye uygun enerjisi azaltılmış gıdalar elde edilebilmektedir. Fakat, yaygın olarak kullanılan bazı tatlandırıcıların sentetik olması tüketicide güvensizliğe neden olmaktadır. Bu durum tüketiciyi doğal kaynak arayışına sevk etmekte ve doğal kaynaklara olan yönelimi artırmaktadır. Şeker alkoller her ne kadar doğal kaynaklardan elde edilebiliyor olsa da laksatif etki göstermeleri nedeniyle çeşitli gıda formülasyonlarında kullanımı sınırlı seviyede kalmaktadır. Bu nedenlerle sentetik tatlandırıcılara ve şeker alkollere alternatif olarak stevia (şeker otu) bitkisinden elde edilen doğal tatlı bileşikler gelişmiş toplumların oldukça ilgisini çekmektedir. Steviol glikozitler olarak adlandırılan bu tatlı bileşiklerin yaklaşık sıfır (0) kalori enerjiye sahip olduğu belirtilmektedir. Ayrıca bağıl tatlılığının da sakkaroza göre 200-300 kat olduğu ifade edilmektedir. Stevia ekstraktları üzerine yapılan birçok toksikolojik çalışmada da bu bileşiklerin sağlık açısından olumsuz bir etkiye neden olmadığı ve bazı  hastalıkların gelişmesini de engellediği bildirilmektedir.  

Stevia ürünlerinin dünyada yaygın olarak üretiminde bazı ekstraksiyon ve saflaştırma metotlarından yararlanılmaktadır. Steviol glikozitler özellikle  kromatografik yöntemlerle yüksek oranda saflaştırılabilmektedir. Fakat kromatografik yöntemlerin zor ve maliyetli olması elde edilen son ürünün çok yüksek fiyatlara satılmasına yol açmaktadır. Ayrıca, steviol glikozitlerin saflaştırılmasında halihazırda uygulanan yöntemlerde etil alkol ve benzeri kimyasallar kullanılmaktadır. Bu nedenle steviol glikozitlerin zenginleştirilmesi ve saflaştırılmasına yönelik kullanılan diğer yöntemlerin etkinliğinin araştırılması önemlidir. Patent altına alınmış yaygın saflaştırma tekniklerine alternatif olabilecek uygun maliyetli fiziksel ayırma yöntemlerinin potansiyelini araştırmak ve ortaya koymak dikkate değer bulunmuştur. 

Bu tez çalışması kapsamında fiziksel ayırma metotları kullanılarak sulu stevia ekstraktlarından steviol glikozitlerin kabul edilebilir saflıkta (% 90) elde edilmesi amaçlanmıştır. Saflaştırmada elektrokoagülasyon (EK), adsorpsiyon ve membran filtrasyon tekniklerinden yararlanılmıştır. Elektrokoagülasyon sisteminde elektrot olarak alüminyum (Al) ve 304L paslanmaz çelik (Ç) levhalar anot (+) ve katot (-) olarak kullanılmış; böylece dört farklı elektrot kombinasyonu elde edilmiştir. Elektrik kaynağı olarak ise doğru akım (DC) uygulanmıştır. Ham stevia ekstraktı sırasıyla elektrokoagülasyon [Al(+)/Ç(-)], adsorpsiyon (polivinil polipirrolidon-PVPP), elektrokoagülasyon [Al(+)/Al(-)], ultrafiltrasyon (30 kDa Permeat-P), nanofiltrasyon (5 kDa Retentat-R) ve karışık yatak reçine sistemleri kullanılarak işlenmiştir. Uygulamada bir prosesten elde edilen ekstrakt sırasıyla diğer prosese beslenmiştir. Araştırma kapsamında öncelikle elektrot cinsi, elektrot aralığı, akım yoğunluğu, gerilim ve süre parametrelerine bağlı olarak elektrokoagülasyon sisteminin optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Ayrıca elde edilen veriler kullanılarak sistemin etkinliği matematiksel modelleme ile ifade edilmiştir. Ön denemeler sonunda en uygun elektrot kombinasyonunun Al(+)/Ç(-) elektrot kombinasyonu olduğu belirlenmiştir. Sonraki aşamada cevap yüzey metodu (CYM) kullanılarak toplam steviol glikozit (TSG) konsantrasyonunun maksimum olduğu noktadaki EK parametrelerine ait optimum değerler belirlenmiş; 1 cm elektrot aralığı, 100 mA/cm2 akım yoğunluğu, 30 V gerilim, 60 dakika uygulama süresi optimum koşullar olarak saaptanmıştır. En uygun PVPP konsantrasyonu ise % 0,02 olarak belirlenmiştir.

Sonuçlar değerlendirildiğinde saflaştırılmış son örnekte toplam kuru madde (TKM) 1,86 g/100 g (ham ekstraktta 2,10 g/100 g), toplam mineral madde 0,22 g/100 g TKM (ham ekstraktta 12,02 g/100 g TKM) ve toplam steviol glikozit konsantrasyonu da 81,21 g/100 g TKM (ham ekstraktta 42,70 g/100 g TKM) olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte renk ölçümü yapılmış olup L (açıklık-koyuluk) değeri 99,21 (ham ekstraktta 0,08), a (kırmızılık ve yeşillik) değeri -1,02 (ham ekstraktta -0,01) ve b (sarılık ve mavilik) değeri de 4,09 (ham ekstraktta 0,03)  olarak tespit edilmiştir. Ayrıca proses ara basamaklarından alınan stevia ekstraktı örneklerinde toplam fenolik madde ve toplam asitlik içerikleri ile bulanıklık değerinde önemli düzeyde azalma sağlandığı görülürken transmittans değerinde önemli seviyede artış olduğu belirlenmiştir. Bunlara ilave olarak her bir uygulamanın bir önceki prosese göre steviol glikozitleri saflaştırmadaki etkinliği belirlenmiştir. Bu kapsamda belirlenen saflaştırma etkinlikleri sırasıyla; EK [Al(+)/Ç(-)] % 34,52, adsorpsiyon (% 0,02 PVPP) % 4,83, ikinci EK [Al(+)/Al(-)] % 2,18, membran filtrasyon (5 kDa R) % 20,51 ve karışık yatak reçine % 21,05 olarak hesaplanmıştır. Ham stevia ekstraktının TSG konsantrasyonu 42,70 g/100 g TKM olarak bulunmuştur. Bu miktar üzerinden, kullanılan tekniklerin saflaştırma etkinliklerine göre TSG konsantrasyonlarına bakıldığında; EK [Al(+)/Ç(-)]  uygulaması sonunda 57,44 g TSG/100 g TKM, % 0,02 PVPP uygulaması sonunda 60,21 g TSG/100 g TKM, EK [Al (+)/Al(-)] uygulaması sonunda 61,52 g TSG/100 g TKM, membran filtrasyon (5 kDa R) uygulaması sonunda 74,14 g TSG/100 g TKM ve karışık yatak reçine uygulaması sonunda 89,75≈90,0 g TSG/100 g TKM değerine ulaşıldığı görülmüştür.

Abstract:
Nowadays it seems that the use of sweeteners in food formulations is increasing. With the addition of these sweeteners, the energy content of foods is reduced. In particular, energy-reduced foods suitable for combating obesity and diabetes can be obtained. However, some commonly used sweeteners are synthetic, causing distrust among consumers. This situation drives the consumer to search for natural resources and increases the tendency towards natural resources. Although sugar alcohols can be obtained from natural sources, their use in various food formulations remains limited due to their laxative effects. For these reasons, natural sweet compounds obtained from the stevia plant as an alternative to synthetic sweeteners and sugar alcohols attract the attention of developed societies. It is stated that these sweet compounds, called steviol glycosides, have approximately zero (0) calorie energy. It is also stated that its relative sweetness is 200-300 times that of sucrose. Many toxicological studies on stevia extracts report that these compounds do not cause any negative effects on health and prevent the development of some diseases.

Some extraction and purification methods are used in the widespread production of stevia products in the world. Steviol glycosides can be purified to a high extent, especially by chromatographic methods. However, chromatographic methods are difficult and costly, causing the final product to be sold at very high prices. In addition, ethyl alcohol and similar chemicals are used in the currently applied methods for purifying steviol glycosides. Therefore, it is important to investigate the effectiveness of other methods used to enrich and purify steviol glycosides. It has been deemed noteworthy to investigate and demonstrate the potential of cost-effective physical separation methods that can be an alternative to common patented purification techniques. 

Within the scope of this thesis study, it is aimed to obtain steviol glycosides with acceptable purity (90 %) from aqueous stevia extracts by using physical separation methods. Electrocoagulation (EC), adsorption, and membrane filtration techniques were used for purification. In the electrocoagulation system, aluminum (Al) and 304L stainless steel (S) plates were used as anode (+) and cathode (-) as electrodes; Thus, four different electrode combinations were obtained. Direct current (DC) was used as the electrical source. Crude stevia extract was processed using electrocoagulation [Al(+)/S (-)], adsorption (polyvinyl polypyrrolidone-PVPP), electrocoagulation [Al(+)/Al(-)], ultrafiltration (30 kDa Permeate-P), nanofiltration (5 kDa Retentate-R) and mixed bed 
resin systems, respectively. In practice, the extract obtained from one process was fed to the other process respectively. Within the scope of the research, firstly, the optimization of the electrocoagulation system was carried out depending on the electrode type, electrode spacing, current density, voltage and time parameters. In addition, the effectiveness of the system was expressed by mathematical modeling using the data obtained. As a result of preliminary trials, it was determined that the most suitable electrode combination was the Al(+)/S(-) electrode combination. In the next stage, optimum values of EC parameters were determined at the point where the total steviol glycoside (TSG) concentration was maximum, using the response surface method (RSM); 1 cm electrode gap, 100 mA/cm2 current density, 30 V voltage, 60 minutes application time were determined as optimum conditions. The most suitable PVPP concentration was determined as 0.02 %. 

When the results were evaluated in the final purified sample, the total dry matter (TDM) was determined as 1.86 g/100 g (2.10 g/100 g in crude extract), the total mineral matter was determined as 0.22 g/100 g TDM (12.02 g/100 g TDM in crude extract), and the total steviol glycoside concentration was determined as 81.21 g/100 g TDM (42.70 g/100 g TDM in crude extract). In addition, color measurement was made and the L (lightness-darkness) value was determined as 99.21 (0.08 in crude extract), a (redness and greenness) value was determined as -1.02 (-0.01 in crude extract), and b (yellowness and blueness) value was determined as 4.09 (0.03 in crude extract). In addition, it was determined that there was a significant decrease in the total phenolic substance, total acidity contents, and turbidity value in the stevia extract samples taken from the intermediate stages of the process. At the same time, there was a significant increase in the transmittance value. In addition, the effectiveness of each application in purifying steviol glycosides compared to the previous process was determined. Purification activities determined in this context are respectively; was calculated as EC [Al(+)/S(-)] 34.52 %, adsorption (0.02 % PVPP) 4.83 %, second EC [Al(+)/Al(-)] 2.18 %, membrane filtration (5 kDa R) 20.51 % and mixed bed resin 21.05 %. The TSG concentration of crude stevia extract was found to be 42.70 g/100 g TDM. Based on this amount, when TSG concentrations are considered according to the purification efficiencies of the techniques used was reached values 57.44 g TSG/100 g TDM at the end of EC [Al(+)/S(-)] application, 60.21 g TSG/100 g TDM at the end of 0.02 % PVPP application, 61.52 g TSG/100 g TDM at the end of EC [Al(+)/Al(-)] application, 74.14 g TSG/100 g TDM at the end of membrane filtration (5 kDa R) application and 89.75≈90.0 g TSG/100 g TDM at the end of mixed bed resin application.