Gıda katkı maddelerinin HPLC ile analizi ve validasyonu
Analysis and validation of food additives with HPLC
Yazar: DİLEK KÜÇÜKKARACA
Danışman: DOÇ. DR. BÜRGE AŞÇI
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Potasyum sorbat = Potassium sorbate ; Sodyum benzoat = Sodium benzoate ; İzokinolin = Isoquinoline

Özet:
Bu tezde çeşitli gıdalara koruyucu olarak katılan potasyum sorbat ve sodyum benzoat ile renklendirici olarak katılan kinolin sarısı ve sunset sarısının bir arada analizi için HPLC yöntemi geliştirilmiştir. 
Öncelikle bu maddelerin kromatografik olarak ayrılması için çeşitli çözücü sistemleri denendi. Daha sonra deneysel tasarım kullanılarak analiz şartları optimize edildi. Deneysel Tasarım ile optimizasyonda faktör olarak; pH, akış hızı ve hareketli faz oranı kullanıldı.Bu faktörlerin ve aralarındaki etkileşimlerin, HPLC kromatogramındaki piklerin ayırma gücü üzerine etkileri incelendi. İncelemede 3 faktör için Box-Behnken Tasarımı kullanıldı. Her faktör için 3 seviye seçildi. Bu seviyeler pH için 6-6,5-7, akış hızı için 0,8-1-1,2 hareketli faz oranı için 80-85-90 olarak belirlendi. Faktörlerin düşük seviyeleri için –1 orta seviyeleri için 0 ve yüksek seviyeleri için +1 işareti kullanıldı. Toplam 15 deney yapıldı. Sonuçlarının değerlendirilmesi için regresyon analizi yapıldı. Ayırma gücüne en etkili faktörün hareketli fazın ikinci dereceden etkisine ait olduğu, akış hızının, pH'ın ve pH-akış hızı etkileşiminin de etkili olduğu saptandı. Sonuçların güvenilirliğini test etmek için ANOVA yapıldı. Elde edilen verilere göre ayırma gücüne ilişkin bir model oluşturuldu. Oluşturulan model kullanılarak ayırma gücü değerleri elde edildi. Bu değerlerle deneysel olarak bulunan değerler arasındaki ilişki incelendi. İncelemede regresyon katsayısı 0,9066 olarak bulundu.Ve modelin uygun olduğuna karar verildi. Geliştirilen model kullanıldığında, potasyum sorbat, sodyum benzoat, kinolin sarısı ve sunset sarısının HPLC ile bir arada analizi için optimum koşullar; pH 6, akış hızı 0,8 mL/dak ve hareketli faz bileşimi asetonitril-asetat tampon çözeltisi (15/85) olarak bulundu.
 Maddelerin kromatogramları, deneysel tasarım ile bulanan optimum koşullarda, potasyum sorbat ve sodyum benzoat için 230 nm, kinolin sarısı ve sunset sarısı için   460 nm'de spektrofotometrik dedektör kullanılarak kaydedildi.
Geliştirilen yöntemin, doğrusallık, tekrarlanabilirlik, doğruluk, tanınma ve tayin sınırı ve dayanıklılık parametreleri incelenerek analitik yöntem validasyonu yapıldı. Doğrusallık parametresi için, potasyum sorbat, sodyum benzoat, kinolin sarısı ve sunset sarısının konsantrasyonları ile pik alanları arasındaki ilişki incelendi. Elde edilen sonuçların regresyon analizi yapıldığında regresyon katsayısı (R2) sırası ile 0,9979; 0,9980; 0,9979; 0,9993 olarak bulundu. Tekrarlanabilirlik parametresi için, her maddenin 3 farklı konsantrasyonda hazırlanan çözeltilerinin aynı gün içinde 3 kez ve 4 farklı günde analizi yapıldı. Potasyum sorbat, sodyum benzoat, kinolin sarısı ve sunset sarısı için sırasıyla aynı gün içinde yapılan analizlerde 0,862-1,236; 0,200-1,447; 1,379-1,576; 0,287-1,275 farklı günlerde yapılan analizlerde 1,026-1,244; 0,228-0,638; 1,158-4,446; 0,854-1,933 % RSD değerleri elde edildi. Doğruluk için, incelenen maddeleri içeren örnek çözeltisi içine potasyum sorbat, sodyum benzoat,  kinolin sarısı ve sunset sarısından 3 farklı konsantrasyonda ilave edilerek analizi yapıldı. Sırası ile %97,600-103,350; 104,280-104,730; 95,600-104,600; 98,600-100,260 % geri kazanım değerleri elde edildi. Potasyum sorbat, sodyum benzoat,  kinolin sarısı ve sunset sarısı için sırası ile tanıma sınırı 0,082; 0,154; 0,044; 0,069 μg mL-1, tayin sınırı 0,273; 0,513; 0,146; 0,230μg mL-1 olarak hesaplandı. Çözeltilerin stabilitelerini incelemek için su ve hareketli faz içerisinde, oda sıcaklığında ve 4Co'de belli sürelerde bekletilerek analiz edildi. Potasyum sorbat, kinolin sarısı ve sunset sarısının tüm şartlarda, sodyum benzoatın 4Co de en az 1 ay boyunca bozulmadığı görüldü.
Geliştirilen yöntem kullanılarak limon sosu ve içecekleri analiz edildi. Bu ürünlerin 55,69-267,79 mg mL-1 potasyum sorbat, 105,47-159,34 mg mL-1 sodyum benzoat,    2,39-15,02 mg mL-1 kinolin sarısı, 0,86-0,92 mg mL-1 sunset sarısı içerdiği saptandı. Örnek analizlerinde 0,746-2,629 aralığında % RSD değerleri elde edildi.

Abstract:
In this thesis, an HPLC method is developed for analysis of sodium benzoate, potassium sorbate, which are added to preprocessed foods as preservatives, sunset yellow and quinoline, which are added as dyestuffs.
First of all, several solvent systems were carried out to separate these substances chromatographically. Then analytical conditions were optimized by using experimental design. pH, flow rate and mobile phase ratio were selected as optimization factors in the experimental design. Effects of these factors and the interactions between them on resolution between peaks in HPLC chromatogram were analyzed. Box-Behnken design was used for analysis of the 3 factors. 3 levels were selected for each factor. These levels were determined as pH 6-6.5-7, flow rate 0.8-1-1.2 mobile phase ratio 80-85-90. The values; -1, for low, 0, for middle, and +1, for high levels of the factors were used. 15 experiments were done in total. Regression analysis was used for evaluation of the results. It was determined that the second effect of mobile phase ratio is the most efficient factor; flow rate, pH and pH-flow rate interaction are also effective. ANOVA was performed to test reliability of the results. According to the data obtained a model was created with respect to the resolution. Resolution values were obtained by using the model. The relationship between these values and the empirical values has been examined. Regression coefficient was found 0.9066 at the end of the examination. And it was decided that the model is appropriate. When the model was used, the optimum conditions for the simultaneous analysis of sodium benzoate, potassium sorbate, sunset yellow and quinoline were found as pH 6, flow rate 0.8 mL min-1 and mobile phase combination 15/85 asetonitrile-acetate buffer. 
Chromatograms of the substances were recorded by using spectrophotometric detector, at the optimum conditions found in the experimental design, as potassium sorbate and sodium benzoate 230 nm, quinoline and sunset yellow at 460 nm.
Analytical method validation was made by the examination of the stability parameters as linearity, repeatability, accuracy, limit of quantification and detection. The correlation between the peak areas and the concentrations of potassium sorbate, sodium benzoate, quinoline and sunset yellow was examined for linearity parameter. The correlation coefficients (R2) were found 0.9979; 0.9980; 0.9979; 0.9993 respectively by regression analysis of the results. The solutions which were prepared at 3 different concentrations of each substance were analyzed 3 times within the same day and 4 times on different days for the repeatability parameter. In the analysis, RSD% values were obtained in the analysis performed for potassium sorbate, sodium benzoate, quinoline and sunset yellow, respectively, on the same day 0.862-1.236; 0.200-1.447; 1.379-1.576; 0.287-1.275, on different days 1.026-1.244; 0.228-0.638; 1.158-1.446; 0.854-1.933. In order to calculate accuracy, analyses were performed by the addition of 3 different concentrations of potassium sorbate, sodium benzoate, sunset yellow and quinoline into the examined samples which contain the substances. The recovery percentage values were obtained respectively, 97.600-103.350; 104.280-104.730; 95.600-104.600; 98.600-100.260. The limit of detection values were calculated as 0.082; 0.154; 0.044; 0.069 μg mL-1 and the limit of quantification values were calculated as 0.273; 0.513; 0.146; 0.230 μg mL-1 for sodium benzoate, quinoline and sunset yellow respectively. In order to determine stabilities of the substances, they were analyzed both in water and the mobile phase and both at 40C and room temperature. It was determined that potassium sorbate, quinoline and sunset yellow are stable at any condition and sodium benzoate is stable at 40C at least one month.
Some lemon juice and drink samples were analyzed by using the developed method. It was determined that these samples contain 55.69-267.79 mg mL-1 potassium sorbate, 105.47-159.34 mg mL-1 sodium benzoate, 2.39-15.02 mg mL-1 quinoline, 0.86-0.92 mg mL-1 sunset yellow. The RSD% values were obtained between 0.746-2.629 from the sample analysis.