Diaçilgliserol kinaz enzim aktivitesi ölçümünde yüksek performans ince tabaka kromatografisinin kullanılabilirliğinin araştırılması
Investigation of the usability of high performance thin layer chromatography for measurement of diacylglycerol kinase enzyme activity
Yazar: ENDER ERDOĞAN
Danışman: PROF. DR. ÖZGÜR KAYNAR
Atatürk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kinaz enzimleri = Kinase enzymes ; İnce tabaka kromatografisi = Thin layer chromatography

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı; Diaçilgliserol kinaz enzim aktivitesinin ilk defa Yüksek Performans İnce Tabaka Kromatografisi ile ölçümünün yapılabilirliğini araştırmaktır. 
Materyal ve Metod: Öncelikle farklı konsantrasyonlarda (0-1000 μmol) floresan  işaretli diaçil gliserol kullanarak YPİTK metodunun tespit limitleri ve geçerliliği ortaya kondu. Sonrasında  1 U standart DGK enzimleri ile 0-400 nmol NBD-DAG, 37ºC' de ayrı ayrı inkübe edilerek substrattan dakikada açığa çıkan nmol ürün miktarları tespit edildi (Aktivite, nmol/dakika). Daha sonra hem standart DGK solüsyonları hem florometrik YPİTK hem de diaçilgliserol kinaz ölçümünde en yaygın metod olan florometrik mikroplaka yöntemi ile DGK enzim aktiviteleri belirlendi.
Bulgular: İlk önce 1.0 U DGK tarafından NBD-DAG' den açığa çıkan NBD-ürün konsantrasyon grafikleri çizildiğinde DAG-K, yüksek oranda tekrarlanabilir ve doğrusal seyreden "substrat-enzim aktivite" grafiği vermişlerdir. Daha sonra "reaksiyon karışımı içindeki substrat miktarına karşılık DGK tarafından NBD-DAG' dan açığa çıkarılan NBD-fosfatidik asit konsantrasyon grafiği çizildiğinde, yüksek oranda tekrarlanabilir ve doğrusal seyreden "artan enzim/ürün" grafiği alındı.
Sonuç: Diaçilgliserol kinaz standartlarında ve standart substrat konsantrasyonlarında florometrik mikroplaka yöntemi ve florometrik YPİTK ile DGK enzim aktivitesi ölçülerek, elde edilen veriler istatistiksel olarak karşılaştırılmış, iki metodun DGK enzim aktivite ölçüm sonuçlarının çoklu karşılaştırılmaları sonucu ise aralarında fark olmadığı ve böylece florometrik İTK yönteminin florometrik mikroplaka yöntemi yerine kullanılabileceği görülmüştür.

Abstract:
Aim: The aim of this study; to investigate the feasibility of measuring diacylglycerol kinase enzyme activity for the first time with High Performance Thin Layer Chromatography.
Material and method: First, the detection limits and validity of the YPITK method were demonstrated by using fluorescently labeled diacyl glycerol at different concentrations (0-1000 μmol). Afterwards, 1 mUnit of standard DGK enzymes and 0-400 nmol NBD-DAG were incubated separately at 37ºC and the amount of nmol product released from the substrate per minute was determined (Activity, nmol/min). Then, DGK enzyme activities were determined by fluorometric microplate method, which is the most common method for both standard DGK solutions, fluorometric HPTLC and diacylglycerol kinase measurement.
Results:  When the NBD-product concentration graphs released from NBD-DAG by 1.0 mUnit DGK were drawn first, DAG-K gave a highly reproducible and linear "substrate-enzyme activity" graph. Then, when the concentration graph of NBD-phosphatidic acid released from NBD-DAG by DGK versus the amount of substrate in the reaction mixture was plotted, a highly reproducible and linear "increasing enzyme/product" graph was obtained.
Conclusion: By measuring DGK enzyme activity with the fluorometric microplate method and fluorometric HPTLC in diacylglycerol kinase standards and standard substrate concentrations, the obtained data were statistically compared and the results of multiple comparisons of the DGK enzyme activity measurement results of the two methods did not differ, and it was seen that the fluorometric TLC method could be used instead of the fluorometric microplate method.