İnsersiyon/delesyon (InDel) lokuslarına ait kimliklendirme panelinin geliştirilmesi ve validasyonu
Development and validation of the identification panel for insertion/deletion (InDel) locus
Yazar: ARZU DÜVENCİ
Danışman: DOÇ. DR. GÖNÜL FİLOĞLU TÜFEK
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine

Özet:
Günümüzde adli kimliklendirmede genellikle STR (Kısa ardışık tekrarlar) ve SNP (Tek nükleotid polimorfizmi) lokusları kullanılmaktadır. STR'lerin büyük amplikonlara ve yüksek mutasyon oranına sahip olması, SNP'lerin zaman alıcı ek prosedürler içermesi adli genetikçileri STR ve SNP lokuslarının avantajlarını birleştiren insersiyon  (eklenme) / delesyon (çıkarılma) (InDeL) lokuslarına yöneltmiştir. InDel lokuslarının en büyük avantajı degrede ve az miktardaki DNA örneklerinde tiplendirme başarısının yüksek olmasından kaynaklanmaktadır.
Bu çalışmada, cinsiyet belirteci olan Amelogenin (AMG-XY)  ve otozomal kromozomlar üzerinde bulunan 34 InDel lokusu ve Y kromozomu üzerinde bulunan 1 InDel lokusundan oluşan 36-InDelplex paneli geliştirilmiştir. NCBI ve Ensemble veribankaları taranarak, her bir InDel lokusunun dünya popülasyonlarında çalışılmış olması,  minimum alel sıklıkları 0.4'ten büyük ve heterozigot oranları 0,5'ten büyük olan lokuslar dikkate alınarak dünya popülasyonlarında dengeli olan 36 InDel lokusu seçildi. Seçilen InDel lokuslarının primer tasarımı multipleks PCR çoğaltılmasındaki kriterlere uyularak bilgisayar yazılımları (Applied Biosystems'in Primer Express yazılımının 2.0) ve web uygulamaları (AutoDimer yazılımının v1)  kullanılarak yapıldı. 
Önce tüm lokuslar single (tekli) olarak çalışıldı daha sonra 36 InDel lokusu mutipleks (çoklu) olarak optimize edildi. Panelin optimizasyonundan sonra validasyonu (yöntemin geçerli kılınması) yapılarak; analiz eşiği, dinamik alan, duyarlılık, stokastik eşik, tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik parametreleri çalışıldı. 36-InDelplex panelinin analiz eşiği 112,39 RFU olarak hesaplandı. Dinamik alan ve duyarlılık hesaplamaları sonucunda analiz eşiğinin üstündeki tam ve güvenilir profilin elde edilebildiği en az DNA konsantrasyonun 0,25 ng/μl olarak belirlendi. Kardeş alel pik yüksekliklerinin birbirine oranı (stokastik eşik) 0,5 ng/μl'de 73,02 ve 1 ng/μl'de 86,29 olarak belirlendi. Daha sonra 36-InDelplex paneli farklı laboratuvar ve cihazlarda ve farklı kişilerce çalışılarak tekrarlanabilirliği ve tekrar üretilebilirliği ispatlanarak yöntemin geçerliliği (validasyonu) yapıldı.
Validasyonu yapılan 36-InDelplex paneli belirli oranlarda (1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 ve 50:1 20:1, 10:1, 5:1)  karışım DNA örnekleriyle çalışıldı. Minör ve majör katılımcı arasındaki konsantrasyon farkı arttıkça sadece majör katılımcının profili hakim olurken katılımcılar arasındaki konsantrasyon farkı 1:20/20:1 olana kadar her iki katılımcının da tüm lokuslarda ayırt edilebildiği saptandı. 
36-InDelplex paneli sıcaklık ve/veya nem ve UV ışığına maruz bırakılarak gönüllü bir bireyden alınan ve degrede edilen kan ve DNA örneklerinde çalışıldı. Sıcaklık etkeni için 95 0C'de 5, 15, 30, 60 ve 120 dakika bekletilen DNA örneklerinde 5. ve 15. dakikalarda tüm lokuslarda tam profil elde edilebilirken 30. dakikada ID7 lokusunda, 60. dakikada 10 lokusta, 120. dakikada ise tüm lokuslarda kayıp gözlenmiştir. Nem etkeni için 4 0C'de 1, 2, 4, 8 ve 16 hafta bekletilen kan örneklerinde 1, 2.  ve 4. haftalarda tüm lokuslarda tam profil elde edilebilirken 8. haftada ID7 ve ID13 lokusunda, 16. haftada ise tüm lokuslarda kayıp gözlenmiştir. Sıcaklık ve nem etkeni için 56 0C'de 1, 2, 4, 8 ve 16 hafta bekletilen kan örneklerinde 1. ve 2. haftalarda tüm lokuslarda tam profil elde edilebilirken 4. haftada ID7 lokusunda, 8. haftada ID8 ve ID13 lokusunda, 16. haftada ise tüm lokuslarda kayıp gözlenmiştir. UV ışığı etkeni için 254 nm'de 5, 15, 30, 60 ve 120 dakika bekletilen DNA örneklerinde 5, 15, 30. ve 60.  dakikalarda tam profil elde edilebilirken 120. Dakikada ise 12 lokusta kayıp gözlenmiştir. 
36-InDelplex paneli üzerinde bazı inhibitör ajanlarının (hematin, hümik asit ve indigo) etkileri de araştırıldı. 125, 250, 500 ve 1000 uM hematinin konsantrasyonlarına maruz bırakılan K562 kontrol DNA'sında 125 ve 250 uM konsantrasyonlarda tüm lokuslarda tam profil elde edilebilirken 500 uM konsantrasyonunda 6 lokusta, 1000 uM konsantrasyonunda ise profil gözlenememiştir. Hümik asitin 1 ul 6.25, 12.5, 25 ve 50 ng/ul konsantrasyonlarına maruz bırakılan K562 kontrol DNA'sında, 6.25 ve 12.5 ng/ul konsantrasyonlarında tam profil elde edilebilirken 25 ve 50 ng/ul konsantrasyonlarında ise 8 lokusta kayıp gözlenmiştir.  İndigonun 1, 2, 3 ve 4mM indigo konsantrasyonlarına maruz bırakılan K562 kontrol DNA'sında indigonun 1, 2 ve 3 mM konsantrasyonlarında tam profil elde edilebilirken, 4mM konsantrasyonunda ise ID7 lokusunda tipleme yapılamamıştır.
36-InDelplex paneli üzerinde yakın ve uzak aile çalışmaları yapılarak babalık indeksi hesaplandı. Son olarakta 36-InDelplex paneli için alelik leader oluşturuldu.
Geliştirilen bu 36-InDelplex panelinin popülasyon çalışmaları tamamlandığında Türkiye'deki adli laboratuvarlarda genetik kimliklendirmede ve nesep tayininde kullanılabilecektir.

Abstract:
STR (Short Tandem Repeat) and SNP (Single Nucleotide Polymorphism) loci are generally used in forensic identification. The fact that STRs have large amplicons and high mutation rates, and SNPs include additional time-consuming procedures, led the forensic geneticists to insertion / deletion (InDeL) loci combining the advantages of STR and SNP loci. The biggest advantage of InDel loci has a high typing success in the sample and in small amounts of DNA samples.
In this study, the 36-InDelplex panel was developed, consisting of the sex marker Amelogenin (AMG-XY) and 34 InDel locus on autosomal chromosomes and 1 InDel locus on the Y chromosome. By scanning NCBI and Ensemble databases, 36 InDel loci were selected which were balanced in the world populations, considering that each InDel locus was studied in the world populations, with a minimum allele frequency greater than 0.4 and heterozygous ratios greater than 0.5. The primary design of the selected InDel loci was performed using computer software (2.0 of Applied Biosystems' Primary Express software) and web applications (AutoDimer software v1), following the criteria in multiplex PCR replication.
First, all loci were studied as singles, then 36 InDel loci were optimized as multiplex (multiple). Subsequently the optimization of the panel, validation (validation of the method) was performed; analysis threshold, dynamic area, sensitivity, stochastic threshold, reproducibility and repeatability parameters were studied. The analysis threshold of the 36-InDelplex panel was calculated as 112.39 RFU. As a result of the dynamic area and sensitivity calculations, the minimum DNA concentration at which the full and reliable profile above the analysis threshold can be obtained was determined as 0.25 ng/μl. The ratio of sibling allele peak heights to each other (stochastic threshold) was 73.02 at 0.5 ng/μl and 86.29 at 1 ng/μl. Later, the 36-InDelplex panel was studied in different laboratories and devices and different people proving the repeatability and reproducibility and validated the method.
The validated 36-InDelplex panel was studied in specific proportions (1:1, 1:5,1:10, 1:20, 1:50 and 50:1, 20:1, 10:1, 5:1) with mixed DNA samples. As the concentration difference between the minor and major participants increased, only the profile of the major participant dominated, while it was determined that both participants could be distinguished at all loci until the concentration difference between the participants was 1:20/20:1.
The 36-InDelplex panel which includes, blood and DNA sample obtained from a volunteer was exposed to temperature and/or moisture and UV light, were studied. In DNA samples that are kept at 95 0C for 5, 15, 30, 60 and 120 minutes for the hot agent, the full profile can be obtained in all loci in the 5th and 15th minutes, while in the 30th minute at the ID7 locus, in the 60th minute at 10 loci and in the 120th minute at all loci lost was observed. For the moisture factor at keeping 4 0C for 1, 2, 4, 8 and 16 weeks of periods; full profiles can be obtained in all loci in the 1st, 2nd and 4th weeks, while the loss was observed in the ID7 and ID13 loci in the 8th week and in all loci in the 16th week. For the temperature and humidity factors keeping at 56 0C for 1, 2, 4, 8 and 16 weeks, full profiles can be obtained at all loci in the 1st and 2nd weeks, at the ID7 locus in the 4th week, at the ID8 and ID13 locus in the 8th week, at the all loci in the 16th-week losses were observed. For the UV light factor, the DNA samples are kept at 254 nm at 5, 15, 30, 60 and 120 minutes, while the full profile can be obtained at 5, 15, 30 and 60 minutes, but losses at 120 minutes, at the 12 loci were observed.
The effects of some inhibitor agents (hematin, humic acid, and indigo) on the 36-InDelplex panel were also investigated. In K562 control DNA exposed to the concentrations of 125, 250, 500 and 1000 µM hematin, a full profile can be obtained in all loci at 125 and 250 µM concentrations, whereas it was not observed in 6 loci at 500 µM concentration and at 1000 µM concentration. In K562 control DNA exposed to 1 µl of humic acid concentrations at 6.25, 12.5, 25 and 50 ng / µl, a full profile can be obtained at 6.25 and 12.5 ng/µl concentrations, while loss at 25 and 50 ng / µl concentrations was observed at 8 loci. In K562 control DNA exposed to indigo concentrations of 1, 2, 3, and 4mM indigo, the full profile can be obtained at 1, 2, and 3 mM concentrations of indigo, while typing at ID7 locus at 4mM concentration.
The paternity index was calculated by conducting close and distant family studies on the 36-InDelplex panel. Finally, the allelic leader was created for the 36-InDelplex panel.
This 36-InDelplex panel completed in population studies it could be used in forensic laboratories in Turkey on identification and genetic lineage determination.