İzole edilen ALCAP moleküllerinin kronik myeloid lösemi hücre hattı-K562'de DNA hasarı ve onarımına olan etkilerinin incelenmesi
Effects of some novel ALCAP molecules on DNA damage and repair mechanisms in chronic myeloid leukemia cell line-K562
Yazar: NURAY BÖĞÜRCÜ
Danışman: DOÇ. DR. KEMAL SAMİ KORKMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Alkanna cinsi, Alkanna cappadocica'dan izole edilmiş olan ve ALCAP olarak isimlendirilen 4 yeni, 4 bilinen bileşiğin DNA hasarı, onarım mekanizması ve apoptoz üzerine olan etkileri K562, PC-3 ve HT-29 kanser hücre hatlarında araştırılmıştır. Bu bileşiklerden ALCAP2 (ß,ß-dimetilakrilalkanin), ALCAP7 (5-metoksiasetilalkanin) ve ALCAP8'in (5-metoksi ß,ß-dimetilakrilalkanin) K562 ve PC-3'de DNA hasarına sebep olduğu ?-H2AX ekspresyon seviyesine Western blot ile bakılarak belirlenmiştir. HT-29 hücrelerinde ise ALCAP7 ve 8'in ?-H2AX seviyesinde artışa sebep olurken diğer bileşiklerin herhangi bir artışa sebep olmadığı belirlenmiştir. K562 hücrelerinde ALCAP2, 7 ve 8'in DNA hasarı sinyalinin ATM üzerinden ilerlediği ayrıca apoptoz uyarısıyla aktive olan kaspaz 3 ve PARP-1 kesimin oluştuğu saptanmıştır. Bu sonuçlar ile ALCAP2, 7 ve 8'in K562 hücre hattında DNA hasarı aracılıklı apoptozu uyardığı belirlenmiştir.K562 hücre hattında ALCAP2 ve 7'nin DNA hasarı ve apoptoz uyarısı üzerine etkilerinin zamana bağlı değişimini belirlenmek amaçlı, ?-H2AX ve kesilmiş PARP-1 seviyesindeki değişimler Western blot ile araştırılmıştır. ALCAP2'nin 500nM konsantrasyonda 12 saatte DNA hasarı oluşturduğu ve PARP-1 kesiminin meydana geldiği belirlenmiştir. ALCAP7'nin ise 500nM konsantrasyonda 6 saatte hem DNA hasarı oluşturduğu hem de PARP-1 kesimine sebep olduğu görülmüştür.K562 hücre hattında ALCAP2 ve 7'nin DNA hasarını, ROS (Reaktif oksijen türleri) oluşumunu uyarmaları veya topoizomeraz inhibisyonuna bağlı olarak gerçekleştirdiğini belirlemek için hücre içi ROS miktarı DCFH-DA kullanılarak akışsitometrisinde analiz edilmiştir. ALCAP2 ve 7'nin doza bağımlı olarak ROS oluşumunu arttırdığı, ALCAP7'nin 2'ye oranla daha düşük dozlarda daha yüksek miktarda ROS oluşturduğu saptanmıştır. ROS oluşumunun yarattığı DNA hasarı ve apoptozun LNAC uygulamasıyla engellendiği, immünoflöresan ve Western blot teknikleri kullanılarak belirlenmiştir.Bu çalışma ile potansiyel antikanser ilaçları olan doğal yeni bileşiklerin etki mekanizmaları araştırılmıştır. Doğal ve yeni bu bileşiklerin etkilerinin hücre kültürlerinde çalışılması bu araştırma alanının ilk adımı olarak gerçekleştirilmiş, bu sonuçlar ile özellikle ALCAP2 ve 7'nin iyi birer DNA hasarı yaratıcısı dolayısı ile apoptoz indükleyici maddeler oldukları gösterilmiştir.Anahtar sözcükler: DNA hasarı, ?-H2AX, apoptoz, Alkanna cappadocica.

Abstract:
Four novel and four known compounds named ALCAP were isolated from Alkanna cappadocia a geinus of Alkanna. Effects of these molecules on DNA damage, repair pathways and apoptosis were investigated in K562, PC-3 and HT-29 cancer cell lines. Of these molecules, ALCAP2 (ß,ß-Dimethylakrilalkanin), ALCAP7 (5-Methoxyasetilalkanin) and ALCAP8 (5-Methoxyß,ß-dimethylakrilalkanin) were found to cause DNA damage that was measured by increased ?-H2AX in K562 and PC-3 cells using Western blotting. While in HT-29 cells, only ALCAP7 and 8 were able to induce an increase in ?-H2AX levels rather than other molecules. In K562 cells, since DNA damage signalling was known to be progressed through ATM, ALCAP2, 7 and 8 administrations resulted apoptosis induction by activation of caspase 3 and PARP-1 cleavage.In order to investigate time dependent alterations in DNA damage and apoptosis induction by our molecules, changes in the level of ?-H2AX and PARP-1 cleavage were investigated using Western blotting. As a result, we found that ALCAP2 induced the DNA damage and PARP-1 cleavage at a concentration of 500nM after 12 hours administration while ALCAP7 resulted at the same dose of DNA damage and PARP-1 cleavage at 6 hours suggest that ALCAP7 is more potent compound than ALCAP2.In order to determine if the DNA damage caused by ALCAP2 and 7 in K562 was mediated through ROS generation or if these molecules themselves behave like radicals, cellular amounts of ROS were measured using DCFH-DA assay using flowcytometry. We found that ALCAP2 and 7 increased the ROS production in a dose dependent manner and ALCAP7 was more effective in producing higher amounts of ROS at lower doses. Furthermore, by using Western blotting and immunoflorescence microscopy, it was also seen that DNA damage and apoptosis resulted by ROS production can be blocked by using an antioxidant LNAC, a ROS scavanger.In this research, we investigated the effects and mechanisms of some novel and natural anti-cancer molecules. Finding the mechanism of action of these novel molecules in cell culture is the first step in this research field. ALCAP2 and 7 have been shown as potent DNA damaging agents and potential candidates for further cancer research.Key Words: DNA Damage, ?-H2AX, Apoptosis, Alkanna cappadocica.