Quikchange nokta mutasyonu tekniği ile elde edilentolaııı-eunag geninin escherıchıa colı'de ekspresyonuve enerji uygulamaları
Generation and expression of tola iii-eunag gene byquikchange site directed mutation technique in escherichiacoli and energy applications
Yazar: KADER TÜMER
Danışman: DOÇ. DR. YAKUP ULUSU ; PROF. DR. SAVAŞ SÖNMEZOĞLU
Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Floresans proteinler ilk 1960'lı yıllarda keşfedilirken üzerinde yapılan mutasyon
çalışmaları ile birçok varyantları elde edilmiştir. UnaG floresans proteini ligand
(Un-konjuge Bilirubin) ile aktive olabilen, bilirubine yüksek afinite ve özgünlükle
bağlanarak UV ışık altında ışıma yapan bir floresans proteindir. Üzerinde yapılan
mutasyon çalışmaları sonucunda geliştirilmiş (eUnaG) UnaG floresanss proteini,
yabani tip (Wild type) UnaG floresans proteine göre % 230 floresans ışıma yaptığı,
kuantum veriminin arttığı görülmüştür. Bu tez çalışmasında yabani tip UnaG geni
üzerinde QuikChange Site Directed Mutagenesis (Nokta mutasyonu) tekniği ile V2L
mutasyonu gerçekleştirilerek Escherichia coli pTolT heterolog protein ekspresyon
sisteminde üretilmiş, afinite kromatografisiyle saflaştırılmış ve karakterizasyon
çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Protein üretim verimini artırmak ve inklüzyon
cisimciği oluşumlarını engellemek amacıyla eUnaG, E.coli'nin intermembran proteini
olan TolAIII ile birlikte kimerik olarak ifade edilmiştir. Yabani tip ve mutant UnaG
proteinleri SDS-PAGE jel sonuçlarına göre yüksek çözünürlük ve konsantre halde saf
olarak elde edilmiştir. Yapılan mutasyon sonucu, füzyon olarak üretilen ve saflaştırılan
V2L UnaG floresans proteini yabani tiple karşılaştırmalı olarak incelendiğinde
sırasıyla eksitasyon 495 nm, 498,6 nm; emisyon 532,8 nm, 531,8 nm olarak
belirlenmiştir. Her iki proteine ait BR afinitelerinin belirlenmesi amacıyla titrasyon
çalışmaları gerçekleştirilerek, Lineer doyğunluk eğrileri çizilmiştir. Sonuç olarak
TolAIII-eUnaG, yabani tip UnaG'a göre % 200'ün üzerinde bir emisyon göstermiştir.
Yabani tip UnaG ve V2L UnaG floresans biyomalzemelerinin tek başına boya
molekülü olarak kullanıldığı fotovoltaik hücreler dikkate alındığında
V2L UnaG + BR temelli fotovoltaik hücreler % 0.26 verimlilik ile en yüksek verimi
göstermiştir.

Abstract:
Fluorescent proteins were first discovered in the 1960s and many variants have been
obtained by mutation studies on them. UnaG is a fluorescent protein that can be
activated by ligand (Unconjugated Bilirubin), binds to bilirubin with high affinity and
specificity and radiates under UV light. eUnaG developed as a result of mutation
studies on it was observed to emit 230 % fluorescence compared to wild type UnaG
fluorescence protein and increase the quantum efficiency. In this thesis study, V2L
mutation was performed on the wild type UnaG gene by Quikchange site directed
mutagenesis technique, produced in Escherichia coli pTolT heterologous protein
expression system, purified by affinity chromatography and characterization studies
were carried out. In order to increase protein production efficiency and prevent
inclusion body formation, eUnaG was expressed chimerically with TolAIII, the
intermembrane protein of E. coli. Wild type and mutant UnaG proteins were obtained
pure in high resolution and concentrated form according to SDS-PAGE gel results. As
a result of the mutation, when the V2L UnaG fluorescence protein produced and
purified as fusion was compared with wild type, excitation was 495 nm, 498.6 nm,
emission was determined to be 532.8 nm, 531.8 nm respectively. Titration studies were
carried out in order to determine the BR affinity of both proteins and linear saturation
curves were drawn. As a result, TolAIII-eUnaG showed an emission of over 200 %
compared to wild type UnaG. Considering the photovoltaic cells where wild type
UnaG and V2L UnaG fluorescence biomaterials were used as dye molecules alone,
V2L UnaG + BR based photovoltaic cells showed the highest efficiency with 0.26 %
efficiency.