Toxoplasma gondii'ye özgü aşı adayı antijenlerin kullanıldığı adjuvante multivalan rekombinant protein aşısının oluşturduğu immun yanıt ve korunmanın belirlenmesi
Determination of immune response and protection elicited by adjuvanted multivalent recombinant protein vaccine using toxoplasma gondii specific vaccine candidate antigens
Yazar: ESRA ATALAY ŞAHAR
Danışman: DOÇ. DR. REMZİYE DEVECİ ; PROF. DR. ADNAN YÜKSEL GÜRÜZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Parazitoloji = Parasitology

Özet:
Toxoplasma gondii, hemen hemen her sıcakkanlı hayvanı, kuş türlerini ve insanları enfekte edebilen bir zorunlu hücre içi parazitidir. Toksoplazmozis, immun sistemi sağlam kişilerde asemptomatik ilerlerken, immun sistemi baskılanmış ya da immun yetmezliği olan kişilerde ölüme neden olabilmektedir. Bu sebeplerden dolayı T. gondii'ye karşı geliştirilecek aşı enfeksiyondan korunmak için büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında T. gondii'ye karşı multivalan rekombinant protein aşısı geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Bu amaçla protein mikroarray taramasıyla belirlenen T. gondii'ye ait 49 aşı adayı antijenik protein; biyoinformatik yöntemler, küçük çaplı ekspresyon ve saflaştırma özelliklerine göre analiz edilmiştir. Analiz sonucunda aralarından altı protein aşı adayı olarak seçilmiş ve ilk kez 6-Valantlı adjuvante rekombinant protein aşı formülasyonu geliştirilmiştir [6-Valant (+) Montanide]. Fareler üç hafta arayla iki kez aşılanmış ve daha sonra uyarılan humoral immun yanıt Western blot ve Rec-ELISA ile, hücresel immun yanıt ise flow sitometri ve sitokin ELISA ile belirlenmiştir. Aşılanan fareler T. gondii Ankara suşu takizoiti ile intraperitoneal yoldan letal dozda enfekte edilerek oluşturulan korunma belirlenmiştir.
Sonuçlara göre, aşılama sonrası 6-Valant (+) Montanide aşısı kontrollere göre kuvvetli total IgG yanıtı uyarmıştır (P<0,0001). IgG1 ve IgG2a yanıtı incelendiğinde polarizasyonun belirgin şekilde TH1 yönüne doğru olduğu belirlenmiştir (P<0,001). IFN-γ salgılayan CD4 T-Yardımcı lenfositleri ile IFN-γ salgılayan CD8 T-Sitotoksik lenfosit oranlarının kontrollere göre sırasıyla 1,45-2 ve 1,6-2 kat arasında arttığı saptanmıştır. Ayrıca lenfositlerin hücre dışına salgıladığı IFN-γ miktarları incelendiğinde 6-Valant (+) Montanide aşısının kontrollere göre belirgin şekilde daha fazla olduğu (P<0,001) saptanmıştır. Bu sonuçlar 6-Valant (+) Montanide aşısının güçlü koruyucu TH1 immun yanıt oluşturduğunu göstermektedir. Aşılanan farelerin yaşam süresininin 8,38±2,13 güne çıkartıldığı ve kontrollere göre belirgin şekilde yüksek olduğu saptanmıştır (P<0,01). 
Sonuçta bu çalışmada protein mikroarray taraması ile seçilen aşı adayı antijenlerin kuvvetli humoral ve hücresel immun yanıtı uyarılabildiği ve letal toksoplazmosize karşı kısmi korunma sağladığı gösterilmiştir. Ayrıca toksoplazmozise karşı altı ya da daha fazla antijenik protein içeren multivalan rekombinant protein aşısı geliştirilerek kullanılabilir. Böylece gelecek çalışmalarda daha fazla anjenik protein içeren multivalant rekombinant protein aşı formülasyonun geliştirilmesiyle toksoplazmozise karşı tam korunmanın sağlanabileceği öngörülmektedir.

Abstract:
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can infect almost all warm-blooded animals, avian species and humans. Toxoplasmosis is asymptomatic in healthy individuals, whereas may lead to death in immune suppressed or deficient patients. For these reasons, a vaccine against T. gondii is important to prevent consequences of the infection. The aim of this thesis is to generate a multivalent recombinant protein vaccine against T. gondii.  
	For this purpose, 49 antigenic proteins of T gondii which were determined by protein microarray screening are analyzed by the bioinformatics approaches as well as expressed and purified in small scale. Among them, six vaccine candidate proteins were selected to generate a six-valent adjuvanted recombinant protein vaccine formulation for the first time [6-Valant (+) Montanide]. Mice were vaccinated two times at three week intervals and then humoral immune response was analyzed by Western blot and Rec-ELISA, cellular immune response was detected by flow cytometry and cytokine ELISA. Mice were infected intra-peritoneally with a lethal dose of the T. gondii Ankara strain tachyzoites to determine protection conferred by vaccination.
Results show that 6-Valant (+) Montanide vaccine induced strong total IgG response compared to controls (P<0,0001). Analysis of IgG1 and IgG2a responses displayed that polarization was significantly towards TH1 direction (P<0,001). IFN-γ secreting CD4 T-Helper and CD8 T-Cytotoxic lymphocyte ratios increased 1,45 to 2 and  1,6 to 2 times compared to the controls. In addition, 6-Valant (+) Montanide induced significantly higher extracellular IFN-γ level secretion from lymphocytes compared to the controls (P<0,001). These results show that 6-Valant (+) Montanide vaccine induced strong protective TH1 immune response. The survival time of the vaccinated mice was increased to 8,38 ± 2,13 days which was significantly higher than controls (P<0,01).
	Overall, this study showed that vaccine candidate antigens selected from a protein microarray screening data induced strong humoral and cellular immune response as well as conferred some protection against lethal toxoplasmosis. In addition, multivalent recombinant protein vaccines containing six or more antigenic proteins can be generated and used against toxoplasmosis. Thus, future studies can develop multivalent recombinant protein vaccines and use more antigenic proteins in their formulations to confer full protection against toxoplasmosis.