Anetol'ün deneysel travmatik beyin hasarında doz bağımlı koruyucu etkisinin apopitotik ve inflamatuar protein ekspresyonları ile oksidatif stres yönünden incelenmesi
Dose-dependent protective effect of anetol in experimental traumatic brain injury is mediated by apopytotic and inflammatory proteins examination of their expression in terms of oxidative stress
Yazar: AZİZ ÇEVİK
Danışman: PROF. DR. TEVFİK YILMAZ
Dicle Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery

Özet:
AMAÇ: Travmatik beyin hasarı (TBH), her yaşta görülebilen morbidite ve mortalitenin önemli sebeplerinden biri olarak gösterilmektedir. Tüm dünyada her yıl 50 milyonu aşkın insan travmatik beyin hasarıyla karşılaşmaktadır. TBH'nın klinik özellikleri ve altında yatan kompleks patofizyoloji, özellikle klinik öncesi çalışmalarda, ayrıca faz I/II çalışmaların değerini daha da arttırmaktadır. Ancak halen travmatik beyin yaralanmalarının tedavisine yönelik cerrahi müdahale dışında terapötik bir yöntem halen geliştirilememiştir. Yapılmış olan araştırmalarda Anetol'ün antioksidan, antikanserojenik , anti-inflamatuar ve antihipernosiseptif etkisinin olması bu bitkisel yağın son dönemlerde araştırmalarda önemli bir yer edinmesini sağlamıştır. Güçlü antioksidan potansiyeline yönelik bulgular Anetol'ün kalp iskemi reperfüzyon hasarında koruyucu olabileceğine yönelik veriler sunmuştur. Ucuz bir bitkisel bileşen olması ve kolay elde edilebilirliği sayesinde mevcut çalışmamızda Anetol'ün TBH modelinde koruyucu etkisini doz bağımlı şekilde araştırmayı planlamaktayız. Yaptığımız literatür taramasında antioksidan bir bileşen olduğuna yönelik veriler bulunan Anetol'ün TBH modeli oluşturulan hayvanlarda doz bağımlı koruyucu gücünün araştırılmasına yönelik bir çalışma bulunmamaktadır. Bu sebeple söz konusu araştırma TBH araştırma başlığına yeni bir bakış açısı kazandıracak potansiyel taşımaktadır.

GEREÇ VE YÖNTEM: Bu çalışma için DÜSAM(Dicle Üniversitesi Sağlık Bilimleri Uygulama Araştırma Merkezi) biriminden 28-30gr ağırlığındaki yetişkin erkek farelerden 35 adet temin edildi. Bu 35 hayvan 5 gruba eşit sayıda olacak şekilde ayrıldı. Bu gruplar oluşturulduktan sonra kontrol grubundaki hayvanlara 72 saat boyunca herhangi bir uygulamada bulunulmadı. Travma grubundaki hayvanlara ağırlık düşürme yöntemi ile travma uygulandı ve daha sonra herhangi bir uygulamaya tabi tutulmadan sadece analjezi uygulanarak optimal koşullarda takibi yapılarak deney sonunda sakrifikasyon sonrası dekapitasyon yapıldı. Travma sonrası doz bağımlı gruplarda ise öncelikle hayvanlara ksilazin ve ketamin yardımı ile genel anestezi uygulandı daha sonra serbest ağırlık düşürme yöntemi ile orta düzey travmatik beyin hasarı oluşturuldu ve travma uygulandıktan 3 saat sonra ve takip eden 72 saat boyunda aynı gün ve saatte bir grup için 40mg/kğ anetol diğer grup için 80mg/kğ anetol ve son grup için ise 160mg/kğ anetol oral gavaj olarak uygulandı. Tüm deney hayvanlarına son tedavi dozları uygulandıktan 1 saat sonra kalpten kan alınarak sakrifiye edildi. Toplanan beyin örnekleri %10'luk tamponlanmış formalin solüsyonu içerisinde fikse edildi ve rutin histolojik takibe tabi tutuldu. Parafine gömülen dokulardan alınan 5 µm kalınlığındaki kesitler Hematoksilen & Eozin (H&E) ile rutin histopatolojik değerlendirme amacıyla boyandı. Ayrıca beyin dokularından alınan seri kesit örneklerine TNF-alfa, Bax, Kaspaz-3 immunohistokimya uygulanarak apapitotik proteinlerin ekspresyon düzeyleri incelendi. Son olarak MDA düzeleri bakılması için deneysel çalışmada biyopsi örneği alındı.

BULGULAR: Kontrol grubunda beyin dokusunun normal morfolojide olduğu menings ile örtülü olduğu ve bol miktarda nöron ve glial hücre barındırdığını fakat travma grubunda yoğun hemoraji, vasküler konjesyon görüldü. Nöron hücre gövdelerinde piknotik çekirdek görüntüsü, karyolizis ve yer yer perinöral kavitede artış ve ödem alanları izlendi. Travma sonrası 80mg/kğ ve üzeri anetol uygulanımı sonrası piknozisin olduğunu fakat piramidal nöronların piramit üçgen görüntüsünün güçlü şekilde korunduğunu göstermiştir. Bununla birlikte oksidatif stres, inflamasyon, apopitotik indüksiyon gibi etmenlerden düşük düzeyde etkilendiği ve sağlıklı nöron görüntüsü oluştuğu görüldü. Travma sonrası artan TNF-alfa, Bax ve Caspase-3 düzeyleri için yapılan çalışmalardan elde edilen immunhistokimyasal sonuçlarda bu moleküllerin düzeylerinde yüksek dozlarda ciddi miktarlarda azalma saptanmıştır. MDA analizi sonuçlarına bakıldığında ise travma sonrası artan MDA düzeylerinde anetol uygulanan gruplarda ciddi azalma tespit edilmiştir.

SONUÇ: Yaptığımız bu çalışmada anetol travma sonrası uygulanmasında glial hücre miktarını arttırdığını bununla birlikte beyin dokusunun piramidal nöronlarında piramit üçgen görüntüsünün oldukça güçlü şekilde korunduğunu ve travmaya eşlik eden oksidatif stres, inflamasyon, ve apopitotik indüksiyon gibi etmenlerden düşük düzeyde etkilendiğini ortaya koymuştur. Bunlara ek olarak Bax immunopozitivitesinde anlamlı bir azalma, Caspase-3 immunointensitesinde anlamlı bir azalma ve TNF-alfa düzeylerinde ciddi düzeylerde azalmalar olduğunu tespit edilmiştir. MDA analizi sonuçlarına bakıldığında ise travma sonrası artan MDA düzeylerinde anetol uygulanan gruplarda ciddi azalma tespit edilmiştir.

Anahtar kelimeler; Travmatik beyin hasarı, anetol, apopitozis

Abstract:
OBJECTIVES: Traumatic brain injury (TBI) is one of the leading causes of morbidity and mortality in all ages. More than 50 million people worldwide suffer from traumatic brain injury each year. The clinical features of TBI and the underlying complex pathophysiology increase the value of preclinical studies and phase I/II studies. However, a therapeutic method other than surgical intervention for the treatment of traumatic brain injuries has not yet been developed. The fact that Anetol has antioxidant, anticarcinogenic, anti-inflammatory and antihypernociceptive effects has made this vegetable oil gain an important place in recent studies. Findings on its strong antioxidant potential have provided data suggesting that Anetol may be protective in cardiac ischemia reperfusion injury. In our current study, we plan to investigate the protective effect of Anetol in the TBI model in a dose-dependent manner, thanks to its cheap herbal component and easy availability. In our literature review, there is no study to investigate the dose-dependent protective power of Anetol, which is an antioxidant component, in animals with TBI model. For this reason, this research has the potential to bring a new perspective to the TBI research topic.

MATERIALS AND METHODS: For this study, 35 adult male mice weighing 28-30 g were obtained from DÜSAM (Dicle University Health Sciences Application Research Center). These 35 animals were divided into 5 groups in equal numbers. After these groups were formed, the animals in the control group were not given any treatment for 72 hours. The animals in the trauma group were traumatized by weight reduction method and then only analgesia was applied without any application and followed up under optimal conditions and decapitation was performed after sacrification at the end of the experiment.In the post-traumatic dose-dependent groups, the animals were firstly anesthetized with the help of xylazine and ketamine, then moderate traumatic brain injury was induced by free weight reduction method and 3 hours after the trauma was applied and for the following 72 hours on the same day and hour, 40mg/kg anethole for one group, 80mg/kg anethole for the other group and 160mg/kg anethole for the last group were administered by oral gavage.All experimental animals were sacrificed 1 hour after the last treatment doses. The collected brain samples were fixed in 10% buffered formalin solution and subjected to routine histologic follow-up. Paraffin embedded 5 µm thick sections were stained with Hematoxylin & Eosin (H&E) for routine histopathologic evaluation. In addition, the expression levels of apapitotic proteins were examined by immunohistochemistry of TNF-alfa, Bax, Caspase-3 in serial sections taken from brain tissues. Finally, biopsy samples were taken for MDA levels in the experimental study.

FINDINGS: In the control group, the brain tissue had normal morphology, was covered with meninges and contained abundant neurons and glial cells, but in the trauma group, intense hemorrhage and vascular congestion were observed. Pyknotic nuclei, karyolysis, increased perineural cavity and edema areas were observed in neuron cell bodies. Post-traumatic administration of 80mg/kg or more of anethole after trauma showed that pyknosis occurred but the pyramidal triangle image of pyramidal neurons was strongly preserved. However, oxidative stress, inflammation, apopitotic induction were affected at a low level and a healthy neuron image was observed. Immunohistochemical results obtained from studies on TNF-alpha, Bax and Caspase-3 levels after trauma showed a significant decrease in the levels of these molecules at high doses. When the results of MDA analysis were analyzed, a significant decrease was found in the anetol-treated groups in the MDA levels that increased after trauma.

CONCLUSIONS: In this study, we found that anethole increased the amount of glial cells in the post-traumatic administration of anethole, however, the pyramidal triangle image was strongly preserved in the pyramidal neurons of the brain tissue, and it was affected at a low level by factors such as oxidative stress, inflammation, and apopitotic induction accompanying trauma. In addition, there was a significant decrease in Bax immunopositivity, a significant decrease in Caspase-3 immunointensity and significant decreases in TNF-alpha levels. When the results of MDA analysis were analyzed, a significant decrease was found in the anetol-treated groups in the MDA levels that increased after trauma.

Keywords; Traumatic brain injury, anetol, apoptosis