Proteaz profillendirmesi için afinite materyallerinin hazırlanması
Preparation of affinity materials for protease profiling
Yazar: ESRA MENFAATLI
Danışman: PROF. DR. FİGEN ZİHNİOĞLU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Proteazlar, aktiviteleri ve ekspresyonları açısından, kardiyovasküler hastalıklar, enflamasyon, kanser, osteoporoz ve nörolojik bozukluklar gibi birçok patolojik durum ile ilişkilendirilmiş proteolitik enzimler olup, önemli ilaç hedefleri olarak görülmektedir. Bu nedenle proteazların değişen koşullarda belirlenmesi önemlidir ve sonrasında ise lokalizasyonlarının, biyolojik fonksiyonlarının, aktivite ve regülasyon mekanizmalarının, yapı fonksiyon ilişkilerinin iyi anlaşılması gerekmektedir. Bu ise dinamik koşullarda proteazların profillendirilmesi ile mümkündür. Bu çalışmada kompleks proteomda farklı proteaz sınıflarına yönelik serin, sistein ve metalloproteazların profillendirilmesinde kullanılabilecek afinite materyallerinin hazırlanması, karakterizasyonu ve uygulamaları hedeflendi.
Bu amaçla, yumurta akı protein yapısında proteaz inhibitörleri ve zengin protein içermesi sebebiyle afinite materyali hazırlanmasında kaynak olarak seçildi. Proteaz spesifik afinite materyalleri elde etmek için, taşıyıcıya bağlama, çöktürme ve glutaraldehit ile çapraz bağlama gibi çeşitli yöntemler denendi ve aseton çöktürmesi sonrası çapraz bağlama yöntemi afinite materyali hazırlanmasında kullanılmak için en uygun yöntem olarak belirlendi. Elde edilen materyal Yumurta Akı Proteini Tabanlı Polimer (YA-PTP) olarak isimlendirildi.
YA-PTP'in hazırlanmasında kullanılan glutaraldehit konsantrasyonu % 0,5 (v/v) olarak optimize edildi ve proteaz bağlama etkinliği farklı proteazlar kullanılarak çalışıldı. YA-PTP, karışık sindirim enzimleri içeren pankreatin proteazları, tripsin (serin proteaz) ve papaini (sistein proteaz) etkin olarak bağladığı görüldü. İleri aşamada optimizasyon çalışmaları tripsin, papain ve pankreatin üzerinden gerçekleştirildi. YA-PTP'in proteaz bağlama kapasitesi pankreatin, tripsin ve papain için sırasıyla 38, 60 ve 70 mg/g polimer olarak bulundu. YA-PTP'e proteaz bağlanması için optimum bağlanma ortamı 25 mM NaCl içeren 50 mM, pH 6,0 sodyum fosfat tamponu ve maksimum proteaz bağlanma süresi de 20 dakika olarak belirlendi. Serbest, enzim bağlı ve enzim uzaklaştırılmış polimerin yüzey morfolojisi Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) kullanılarak incelendi ve polimere proteaz bağlanmasının polimer yüzeyinde morfolojik değişikliklere sebep olduğu görüldü.
YA-PTP'in spesifik proteaz bağlama etkinliği SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi) ve aktiviteye dayalı difüzyon agar plate yöntemleri ile irdelendi. Polimere uygulanan ve polimerden elüe edilen enzimlerin SDS-PAGE analizleri ve farklı substratlar ve inhibitörler varlığında uygulanan difüzyon agar plate aktivite testleri ile YA-PTP'in proteaz spesifik bağlama etkinliği kanıtlandı.
Sonuç olarak elde edilen yumurta akı proteini tabanlı polimer (YA-PTP)'in proteaz bağlanmasına spesifik olduğu ve proteazlarının profillendirilmesi ve saflaştırılması için uygun ve düşük maliyetli bir materyal olabileceği düşünüldü. Bu tez çalışmasında, hazırlanan materyalin gerek proteomik gerek degradomik çalışmalarda ön fraksiyonlama/zenginleştirme materyali olarak kullanımlarının yanısıra farklı kaynaklardan proteaz saflaştırmada kullanılabilecek yüksek spesifiklikte ve yüksek kapasiteli bir materyal olması nedeniyle, varolan literatüre katkı sağlayarak ileri düzeydeki çalışmalara ışık tutacağı açıktır.

Abstract:
Proteases are proteolytic enzymes associated with some pathological conditions such as cardiovascular diseases, inflammation, cancer, osteoporosis and neurological disorders by means of their activity and expression. Therefore, proteases are potential drug targets and it is necessary to determine proteases within variable conditions to enlighten their localization, biological functions, activity and regulation mechanisms, structure-function relationship. This can be possible by profiling the proteases at dynamic conditions. For this aim, preparation of affinity materials for profiling various types of proteases under defined conditions was targeted.
For this purpose egg white was chosen for preparation of affinity material on account of egg white protein protease inhibitors and high protein content. Various methods such as binding to a carrier, precipitation of egg white proteins, cross-linking with glutaraldehyde were performed in order to obtain unsoluble affinity materials. Precipitation with acetone followed by glutaraldehyde cross linking approach was chosen as the most convenient method and the resultant material named as "Egg White Protein Based Polymer (EW-PBP)".
Glutaraldehyde concentration of EW-PBP was optimised as %0,5 (v/v) and protease binding efficiency was studied with different proteases. EW-PBP effectively bound trypsin (serine protease), papain (cysteine protease) and the different proteases from pancreatin which is a commercial mixture of amylase, lipase, and protease. Protease binding capacity of EW-PBP was found to be 60 mg, 70 mg and 38 mg per 1 g polymer for trypsin, papain and pancreatin respectively. 50 mM sodium phosphate buffer at pH 6,0 with 25 mM NaCl addition and 20 minutes of incubation were chosen as optimum conditions for protease binding to EW-PBP. Surface morphology of free, enyzme bound and enzyme removed polymer was investigated with Scanning Electron Microscopy (SEM) and showed protease binding changed the surface morphology of EW-PBP.
Protease binding efficiency of EW-PBP was also investigated via SDS- PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) and diffusion agar plate methods. SDS-PAGE results of enzymes before introducing to the polymer and after elution from the polymer supported the protease binding efficiency of EW-PBP. Also, diffusion agar plate tests with different substrates and protease inhibitors proved the protease specifity of EW-PBP.
As a conclusion, EW-PBP is able to specifically bind proteases and it is a convenient and cost-effective material for profiling and purifying of proteases. Clearly, EW-PBP will shed light on proteomic and degradomic studies as a highly specific and capacitively fractioning/enrichment material.