İstanbul'daki ak dut (Morus alba l.) ve mavi atlas sediri [Cedrus atlantica (endl.) carr. cv. 'glauca'] polenlerinin alerjenik proteinleri
Allergenic proteins of white mulberry (Morus alba l.) and blue atlas cedar [Cedrus atlantica (endl.) carr. cv. 'glauca'] pollens in Istanbul
Yazar: DEMİRHAN ÇETEREİSİ
Danışman: PROF. DR. NAZLI ARDA ; DOÇ. DR. ASLI GELİNCİK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Solunumla alınan polen tanecikleri alerjik hastalıkların en sık rastlanan nedenlerinden biridir. Polenlerin yapıları, havadaki miktarları ve duyarlılaştırma kapasiteleri coğrafî bölgeye, iklime ve sıcaklığa bağlı olarak değişir. Bu nedenle hastanın yaşadığı bölgedeki polenlerin kimyasal bileşenlerinin ve alerjenik özelliklerinin bilinmesi, tanı ve tedavi bakımından  önem taşımaktadır. 
Bu tez projesinde İstanbul'da yaygın olarak bulunan  ak dut (Morus alba L.) ve mavi atlas sediri [Cedrus atlantica (Endl.) Carr. cv. 'Glauca'] polenlerinin alerjenik proteinleri araştırıldı.
Polen örnekleri disseminasyon dönemlerinde toplandı ve polen proteinleri ekstre edildi. Bu ekstreler daha önceden çeşitli ağaç polenlerine alerjik olduğu saptanmış hastalara (deney grubu) ve sağlıklı bireylere (kontrol grubu) deri prik ve nazal provokasyon testleri ile uygulandı. Hastalar semptom skorlarına ve anterior rinomanometri ile ölçülen hava akım oranlarına göre değerlendirildi.
Polen proteinleri bir boyutlu (1D-) sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrıştırıldı ve farklı boyama yöntemleri ile görünür hale getirildi. 1D-jellerde ayrıştırılan proteinler elektrotroblotlama tekniği ile poliviniliden diflorür (PVDF) membranlara aktarıldı. Her bir membran önce bir hasta serumu ile, ardından da yabanturpu peroksidazı (HRP)-bağlı fare anti-insan IgE antikoru ile muamele edildi. Western blotlama ile belirlenen IgE-bağlayan proteinler klinik bulgularla birlikte değerlendirildi. 
50-100 kDa arasındaki polipeptidlerin ak dut polen ekstresi uygulanmış tüm hastaların serumlarındaki spesifik IgE'ler ile, ≤30 kDa'luk polipeptidlerin ise bazı hastaların IgE'leri ile reaksiyon verdiği gözlendi. Ayrıntılı blot analizleri bazı hastalarda spesifik IgE'lerin 15 kDa'luk polen proteinlerine de bağlandığını gösterdi. Potansiyel alerjenik protein(ler)in 75-80 kDa ve/veya ~ 15 kDa olabileceği sonucuna varıldı.
Mavi atlas sediri polipeptidlerinin Western blotlama sonuçları; genel olarak 30-130 kDa arasındaki polen polipeptidlerinin mavi atlas sediri polen ekstresi uygulanmış tüm hastaların serumlarındaki spesifik IgE'leri bağladığı gözlendi. Ancak 40-130 kDa arasındaki protein bantlarının çoğu, kontrol bireylerinin IgE'leri ile de reaksiyon verdiğinden, potansiyel alerjenik protein(ler)in  ≤30 kDa molekül ağırlığında olabileceği öngörüldü.  
Son olarak ak dut polen ekstresi 2-boyutlu (2D-) elektroforez ile ayrıştırıldı, membrana aktarıldı ve IgE bağlayan proteinleri belirlemek için hasta serumlarıyla işleme sokuldu. Western blotlama sonuçları referans alınarak 1D-jelden 5 bant (82, 79, 68, 56 ve 15 kDa) ve 2D-jelden 7 spot (78 kDa civarında 3; 51 kDa civarında 3 ve 36 kDa civarında 1 spot) kesildi ve MALDI-TOF/TOF MS (Matriks destekli lazer dezorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi/uçuş süresi kütle spektrometrisi) yöntemiyle analiz edildi. Daha sonra veriler Mascot ve Swisprot veritabanında biyoinformatik olarak değerlendirildi. 
Ak dut'a ait protein veri bankası bulunmadığından, analiz edilen proteinler ile olası proteinler arasında düşük bir benzerlik gözlendi. Biyoinformatik analizler sonucunda sadece 82 kDa'luk bant 1 için teorik molekül ağırlığı 82054 Da olan 5-metiltetrahidropterioltriglutamat-homosistein metiltransferaz verisine ulaşıldı. Dolayısıyla bu proteinin ak dut polenindeki potansiyel alerjenlerden biri olabileceği öngörüldü.

Abstract:
Inhalant pollen grains are one of the most common causes of allergic diseases. Structures, quantity in the air and sensitization capacity of pollens vary depending on the geographical region, climate and temperature. Therefore, knowing chemical constituents and allergenic features of the pollens within the region where the patient lives is important in respect to diagnosis and treatment.
In this thesis project, allergenic proteins from white mulberry (Morus alba L.) and blue atlas cedar [Cedrus atlantica (Endl.) Carr. cv. 'Glauca'] pollens, which widely distributed in Istanbul were investigated.
Pollen samples were collected during their dissemination period and pollen proteins were extracted. These extracts were subjected to patients who are diagnosed as allergic to pollens of various trees (experimental group) and healty individuals (control group) by skin prick and nasal provocation tests. Patients were evaluated according to their symptom scores and nasal flow rates measured by anterior rhinomanometry.
Pollen proteins were separated by one dimensional (1D-) sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and visualized with different staining methods. Proteins resolved on 1D-gels were trasferred onto polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes by electroblotting technique. Each membrane was incubated first with a patient's serum then with horseradishperoxidase (HRP)-conjugated mouse anti-human IgE antibody. IgE-binding proteins detected by Western blotting were evaluated along with clinical symptoms.
Polypeptides between 50-100 kDa were observed to react with specific IgEs of all patients sera subjected with white mulberry pollen extract, whereas polypeptides of ≤ 30 kDa reacted with only IgEs of some patients. Detailed blot analyses revealed that specific IgEs of some patients also bound to pollen protein(s) with 15 kDa. It was concluded that potential allergenic proteins might be 75-80 kDa and/or 15 kDa. 
Western blotting results of blue atlas cedar polypeptides indicated that  generally polen polypeptides with 30-130 kDa bound to specific IgEs in sera of all patients subjected with blue atlas cedar pollen extract. However, as most of the protein bands between 40-130 kDa were reacted with IgEs of control individuals, it was predicted that potential alergenic protein(s) might be ≤30 kDa.
Finally, white mulberry pollen extract was separated by 2-dimensional (2D-) gel electrophoresis, transferred to the membrane and incubated with patient's sera for detection of IgE-binding proteins. Five bands (82, 79, 68, 56 and 15 kDa) from 1D-gel and 7 spots (3 spots as 78 kDa, 3 spots as 51 kDa and 1 spot as 36 kDa) were picked based on Western blotting results, and analysed by MALDI-TOF/TOF MS ("Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry") technique. Afterwards, data were evaluated with bioinformatic tools by using Mascot and Swisprot database.
As the lack of protein databank for white mulberry, a low similarity was observed between the analyzed proteins and probable proteins. As a result of bioinformatic analyses, only "5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase" with 82054 Da theoretical molecular weight data was detected for band 1 of 82 kDa. Thus this protein was predicted as one of the potential allergenic proteins in white mulberry pollen.