Deneysel migren modeli oluşturulan sıçanlarda timokinon'un analjezik etkisi ve nöroglial aktivite ve öğrenme-bellek ile ilişkisinin değerlendirilmesi
Analgesic effect of thymoquinone in rats with experimental migraine model and its relationship with neuroglial activity and learning-memory
Yazar: TUĞBA BÜYÜKDEMİRTAŞ
Danışman: PROF. DR. İSMAİL MERAL ; DR. SAVAŞ ÜSTÜNOVA
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı / Sinirbilim Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Ağrı = Pain ; Baş ağrısı = Headache ; Bellek = Memory ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hipokampus = Hippocampus ; Migren hastalıkları = Migraine disorders ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Sıçanlar = Rats ; Timokinon = Thymoquinone ; Öğrenme = Learning

Özet:
Migren, tekrarlayıcı ataklarla seyreden, tek taraflı ve zonklayıcı özellikteki baş ağrısı ile karakterize nörovasküler bir bozukluktur. Baş ağrısına, birçok semptomla birlikte dikkat eksikliği gibi kognitif bozukluklar da eşlik edebilmektedir. Timokinon, çörek otunun ana biyoaktif maddesidir ve yüzyıllardır bitkisel bir ilaç olarak kullanılmaktadır. Günümüzde yapılan çalışmalar ise timokinonun, antikanser, antimikrobiyal, antiiflamatuvar, antihistaminik, antidiyabetik, gastroprotektif, hepatoprotektif, kardiyoprotektif ve nefroprotektif etkileri olan bir bileşik olduğunu ortaya koymuştur. Tüm bu etkileri yanında antinosiseptif, nöroprotektif ve antioksidan aktiviteleri olduğu da bildirilmektedir. Çalışmamızda, migren modeli oluşturulan sıçanlarda timokinonun ağrı, öğrenme-bellek ve nöroglial aktivasyon üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlandı.
Çalışmada, 3 aylık, ağırlıkları 250-350 gram arasında değişen 27 adet yetişkin erkek Wistar albino türü sıçan kullanıldı. Migren modeli nitrogliserin (NTG) kullanılarak oluşturuldu. NTG, %0.9 izotonik serum fizyolojik (SF) ile dilüe edilerek her bir hayvan için 10 mg/kg/1 ml olacak şekilde hazırlandı. Kontrol (K) grubu (n=6), nitrogliserin (NTG) grubu (n=7), timokinon (TQ) grubu (n=7) ve nitrogliserin ile timokinon (NTG+TQ) uygulanan grup (n=7) olmak üzere 4 grup oluşturuldu. K grubu ve NTG grubuna 15 gün boyunca1 ml mısır yağı gastrik gavaj ile uygulandı. TQ ve NTG+TQ gruplarına ise 15 gün boyunca, mısır yağında çözdürülen TQ 10 mg/kg/1 ml olacak şekilde gastrik gavaj ile uygulandı. NTG ve NTG+TQ gruplarına 1, 5, 10 ve 15. günlerde 10 mg/kg NTG intraperitoneal (i.p.) olarak uygulandı. K ve TQ gruplarına ise aynı günlerde 0.3 ml SF i.p. olarak uygulandı. Hayvanların ağrı eşiğini belirlemek için, gastrik gavajdan hemen önce ve i.p. enjeksiyon uygulamasından 2 saat sonra tail flick test gerçekleştirildi. Deneyin 16. gününde, öğrenme-bellek fonksiyonlarını değerlendirmek için Morris su labirenti testi uygulandı. Deneyin 22. gününde hayvanlar 10 mg/kg ksilazin i.p. ve 100 mg/kg ketamin i.p. ile oluşturulan genel anestezi altında dekapite edildi ve beyinleri çıkarıldı. Beyinlerin bir yarıküresinin hipokampal bölgesi öğrenme-bellek ve oksidatif stres belirteçlerinin değerlendirilmesi amacıyla biyokimyasal analizlerde kullanıldı. Beyinlerin diğer yarıküresinin hipokampal bölgesi ise nöroglial aktivasyonun değerlendirilmesi amacıyla immunohistokimyasal çalışmalarda kullanıldı. Veriler tek yönlü varyans analizi uygulanarak Benforroni'nin çoklu karşılaştırma testi ile değerlendirildi ve değerler ± standart sapma olarak verildi. P<0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Timokinon, Morris su labirenti testinde hayvanların platformu bulma sürelerini, TQ (***p<0.001) ve NTG+TQ (*p<0.05) gruplarında anlamlı olarak azalttı. NTG grubunun platformu bulma süresinde ise anlamlı bir artış (**p<0.01) olduğu
xvi
belirlendi. Hipokampus dokusunda BDNF düzeyleri K grubu ile kıyaslandığında, NTG grubunda azaldığı belirlendi. BDNF seviyeleri NTG grubuna göre kıyaslandığında ise TQ ve NTG+TQ gruplarının ikisinde de arttığı, ancak bu artışın sadece TQ grubunda anlamlı (**p<0.01) olduğu belirlendi. CREB1 seviyelerinin K grubuna göre NTG ve NTG+TQ gruplarında azaldığı, ancak bu azalmanın sadece NTG grubunda istatistiksel olarak anlamlı (*p<0.05) olduğu tespit edildi. Gruplar NTG grubuna göre kıyaslandığında ise, hem TQ (***p<0.001) hem de NTG+TQ (**p<0.01) gruplarında anlamlı bir artış olduğu görüldü. Hipokampus dokusunda SOD düzeyleri değerlendirildiğinde, TQ grubunda diğer tüm gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış (***p<0.001) olduğu belirlendi. CAT düzeylerinin de benzer şekilde, TQ grubunda diğer tüm gruplara göre anlamlı olarak arttığı (*p<0.05, ***p<0.001) görüldü. İmmunohistokimyasal boyamalar değerlendirildiğinde ise, GFAP pozitif hücre sayısının K grubuna kıyasla NTG, TQ ve NTG+TQ gruplarının üçünde de istatistiksel olarak anlamlı biçimde arttığı görüldü (sırayla ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05). Tail flick testinde ise grup içinde ve gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı tespit edildi.
Çalışmamızın sonuçları değerlendirildiğinde, deneysel migren modelinde timokinon uygulamasının; migren ağrısı üzerinde analjezik etkisinin olmadığı, mekânsal öğrenme ve bellek mekanizmasına BDNF ve CREB1 seviyelerini artırarak katkı sağladığı, migrenle ilişkili oksidatif stres üzerine SOD ve CAT seviyelerini artırarak olumlu etki gösterdiği, migren ve oksidatif stres ile ilişkili öğrenme--bellek defisitine astrosit aktivasyonu ile olumlu etki edebileceği, migrenle ilişkili astroglial aktivasyon üzerinde protektif etki gösterebileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Migraine is a neurovascular disorder characterized by unilateral and throbbing headache with recurrent attacks. Headache can be accompanied by cognitive impairments such as attention deficit along with many symptoms. Thymoquinone is the main bioactive ingredient of black cumin and has been used as an herbal remedy for centuries. Recent studies have shown that thymoquinone is a compound with anticancer, antimicrobial, anti-inflammatory, antihistamine, antidiabetic, gastroprotective, hepatoprotective, cardioprotective, and nephroprotective effects. In addition to all these effects, it is also reported to have antinociceptive, neuroprotective and antioxidant activities. In our study, we aimed to investigate the effects of thymoquinone on pain, learning-memory and neuroglial activation in rat model of migraine.
In the study, 27 adults male Wistar albino type rats aged 3 months, weighing between 250-350 gram, were used. The migraine model was induced using nitroglycerin (NTG). NTG was prepared by diluting with isotonic saline to be 10 mg/kg/1 ml for each animal. There were 4 groups as; control (K) group (n=6), nitroglycerin (NTG) group (n=7), thymoquinone (TQ) group (n=7) and nitroglycerin and thymoquinone (NTG+TQ) applied group (n=7). The K group and the NTG group were administered 1 ml of corn oil with gastric gavage for 15 days. TQ and NTG+TQ groups were treated with gastric gavage of 10 mg/kg/1 ml of TQ dissolved in corn oil for 15 days. NTG and NTG+TQ groups were administered 10 mg/kg NTG intraperitoneal (i.p.) on days 1, 5, 10 and 15th. K and TQ groups were administered with 0.3 ml saline i.p. on the same days. To determine the pain threshold of the animals, tail flick test was performed just before gastric gavage and 2 hours after i.p. injection administration. On the 16th day of the experiment, the Morris water maze test was administered to assess learning-memory functions. On the 22nd day of the experiment, the animals were decapitated under general anesthesia with 10 mg/kg xylazine i.p. and 100 mg/kg ketamine i.p. and their brains were removed. The hippocampal region of a hemisphere of the brain was used in biochemical analyses to evaluate markers of learning-memory and oxidative stress. The hippocampal region of the other hemisphere of the brain was used in immunohistochemical studies to evaluate neuroglial activation. The data were evaluated by Benforroni's multiple comparison test by applying one-way analysis of variance and the values were given as standard deviation ±. P<0.05 value was considered statistically significant.
In the Morris water maze test, thymoquinone significantly reduced the animals' latency to find the hidden platform in the TQ (***p<0.001) and NTG+TQ (*p<0.05) groups. There was a significant increase (**p<0.01) in the latency of the NTG group to find the platform. When BDNF levels in hippocampus tissue were compared to the
xviii
K group, it was determined that it was lower in the NTG group. When BDNF levels were compared according to the NTG group, it was found that both TQ and NTG+TQ groups increased, but this increment was only significant in the TQ group (**p<0.01). CREB1 levels were found decreased in the NTG and NTG+TQ groups compared to the K group. But it was statistically significant (*p<0.05) only in the NTG group. When the groups were compared to the NTG group, there was a significant increase in both the TQ (***p<0.001) and NTG+TQ (**p<0.01) groups. SOD levels were evaluated in hippocampus tissue, and it was determined that there was a statistically significant increase (***p<0.001) in the TQ group compared to all other groups. CAT levels similarly increased significantly in the TQ group compared to all other groups (*p<0.05, ***p<0.001). When immunohistochemical staining was evaluated, it was seen that the number of GFAP positive cells increased statistically significantly in all three of the NTG, TQ and NTG+TQ groups compared to the K group (***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, respectively). In the tail flick test, it was found that there was no statistically significant difference within the group and between the groups.
When the results of our study were evaluated, it was seen that the application of thymoquinone in the experimental migraine model; It has been concluded that it does not have an analgesic effect on migraine pain, contributes to the spatial learning and memory mechanism by increasing BDNF and CREB1 levels, has a positive effect on migraine-related oxidative stress by increasing SOD and CAT levels, may have a positive effect on migraine and oxidative stress associated with learning-memory deficit with astrocyte activation, and may have a protective effect on migraine-related astroglial activation.