Aspir bitkisinde Puccinia carthami'nin teşhisi için moleküler yöntem geliştirilmesi
Development of molecular method for diognosis of Puccinia carthami in safflower plant
Yazar: MUTLU ŞEN
Danışman: PROF. DR. SEMRA HASANÇEBİ
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Aspir = Safflower ; Bitkisel yağlar = Plant oils ; DNA = DNA ; Mantarlar = Fungi ; Moleküler tanı = Molecular identification ; Pas hastalığı = Rust disease

Özet:
Bu araştırma, ülkemizde üretilen önemli yağ bitkilerinden biri olan aspirde (Carthamus tinctorius L.) pas hastalığına neden olan Puccinia carthami fungusunun teşhisi için PCR'a dayalı moleküler yöntemlerin geliştirilmesi amacıyla gerçekleştirilmiştir. Tez kapsamında fungusların moleküler tanısında yaygın olarak kullanılan ITS bölgesi ve β-tubulin geni hedef alınmıştır. Bunun için NCBI da bulunan Puccinia türlerinin ITS bölgesi ve β-tubulin gen dizileri kullanılmış, diziler bioedit programı aracılığı ile hizalanarak türe spesifik varyasyonun en fazla olduğu bölgeler tespit edilmiştir. Ardından varyasyon bölgesini çoğaltacak biçimde ortak dizilere özgü primerler tasarlanmıştır. Tez kapsamında 2 ITS (Pc.ITS-1 ve Pc.ITS-2) ve 1 β-tubulin (Pc.β-tub) primer çifti tasarlanıp kullanılmıştır. Bunlara ek olarak daha önce bölümümüzde yürütülen TÜBİTAK 2209A-Lisans projesi kapsamında P.tiriticina için tasarlanan ITS (Pt.ITS) ve β-tubulin (Pt.β-tub) primer çifti ile literatürde ayırıcı olduğu rapor edilen RA68 primeri de çalışmaya dahil edilmiştir. İncelenen primer çiftlerinin P.carthami'nin teşhisi için kullanılabilir olup olmadıkları bölgemizde gözlenen farklı fungal bitki patojenlerinde tarama yapılarak tespit edilmiştir. Tarama için Puccinia triticina, Ustilago, Phoma spp., Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Plasmaphora halstedi, Pyrenophora f. teres, Cochliobolus sativus, Macrophomina phaseolina fungusları kullanılmıştır.
Sunulan tez çalışması kapsamında P.carthami'ye özgü tasarlanan primerlerden Pc.β-tub primeri P.carthami ve P.triticina'da aynı büyüklükte bantlar verirken çalışılan diğer patojenlerden ayrımı sağlanmıştır. Pt.β-tub primeri ise P.carthami'de herhangi bir DNA fragmenti çoğaltmamıştır. ITS bölgesine özgü tasarlanan primerlerden Pc.ITS-1 primer çiftinin birden fazla DNA fragmenti çoğaltımı ile hedef dışı genom bölgelerine de bağlanabildiği ancak P.carthami'ye özgü çoğalttığı 302 bç'lik DNA fragmenti ile de moleküler teşhis için kullanılabileceği görüşüne varılmıştır. Pc.ITS-2 primer çiftinde ise P.carthami'de çoğaltılan 364 bç ve 445 bç uzunluklarında 2 DNA fragmentinin teşhis için kullanılabileceği tespit edilmiştir. Bir diğer ITS bölgesi primeri olan Pt.ITS ise belirgin bir şekilde P.carthami ve P.triticina'yı kendi aralarında ve diğer patojenlerden ayırmıştır. Kullanılan tüm primerler arasında moleküler teşhis için en umut verici olan Pt.ITS primer çifti olmuştur. Ön bulgular bu primer çiftinin Puccina türlerine özgü ve türleri birbirinden ayırıcı nitelikte olabileceğini göstermektedir. Bunu doğrulamak için daha fazla Puccinia türü ile çalışmanın genişletilmesi gerekmektedir. Liretaürde P.triticina için rapor edilmiş RA68 primer çifti ile elde edilen sonuçlar ise RA68'in P.triticina için moleküler teşhiste kullanılabilirliği doğrulanmıştır. Bunun yanında P.carthami'de elde edilen 388 ve 452 bç uzunluğunda 2 DNA fragmentinin, P.carthami'de moleküler teşhis için alternatif olabileceği görüşüne varılmıştır.
Sonuç olarak tez çalışmasında test edilen 6 primerden Pc.ITS-1 ve Pc.ITS-2, sadece P.carthami için ayırıcı iken Pt.ITS ve RA68 her iki Puccinia türü için de spesifik DNA fragmentleri üretmiştir. Böylece P.carthami'nin klasik yöntemlere göre hızlı ve tam teşhisini mümkün kılacak moleküler yöntem geliştirilmiştir.

Abstract:
This research was carried out in order to develop PCR-based molecular methods for the diagnosis of Puccinia carthami fungus, which causes rust disease in safflower (Carthamus tinctorius L.), one of the important oil plants grown in our country. Within the scope of the thesis, the ITS region and β-tubulin gene, which are widely used in the molecular diagnosis of fungi, were targeted. For this, the ITS region and β-tubulin gene sequences of Puccinia species found in NCBI were used, and the regions with the highest species-specific variation were determined by aligning the sequences via the bioedit program. Then, primers specific to common sequences were designed to amplify the region of variation. Within the scope of the thesis, 2 ITS (Pc.ITS-1 and Pc.ITS-2) and 1 β-tubulin (Pc.β-tub) primer pairs were designed and used. In addition to these, ITS (Pt.ITS) and β-tubulin (Pt.β-tub) primer pair designed for P.tiriticina within the scope of the TÜBİTAK 2209A-License project previously carried out in our department, and the RA68 primer, which was reported to be distinctive in the literature, were also included in the study. Whether the examined primer pairs can be used for the diagnosis of P.carthami was determined by screening different fungal plant pathogens observed in our region. For screening, Puccinia triticina, Ustilago, Phoma spp., Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Plasmaphora halstedi, Pyrenophora f. teres, Cochliobolus sativus, Macrophomina phaseolina fungi were used.
Within the scope of the presented thesis, Pc.β-tub primer, one of the primers designed specifically for P.carthami, gave bands of the same size in P.carthami and P.triticina, while distinguishing them from other pathogens studied. Pt.β-tub primer did not amplify any DNA fragments in P.carthami. It was concluded that Pc.ITS-1 primer pair, one of the primers designed specifically for ITS region, can bind to non-target genome regions by amplifying more than one DNA fragment, but it can also be used for molecular diagnosis with a 302 bp DNA fragment amplified specifically for P.carthami. In the Pc.ITS-2 primer pair, it was determined that 2 DNA fragments of 364 bp and 445 bp lengths amplified in P.carthami could be used for diagnosis. Another ITS region primer, Pt.ITS, distinctly separated P.carthami and P.triticina among themselves and from other pathogens. Of all the primers used, the Pt.ITS primer pair was the most promising for molecular diagnostics. Preliminary findings suggest that this primer pair may be specific to Puccina species and may be species discriminating. To confirm this, the study needs to be expanded with more Puccinia species. The results obtained with the RA68 primer pair reported for P. triticina in the literature confirmed the usability of RA68 in molecular diagnosis for P. triticina. In addition, it was concluded that 2 DNA fragments with a length of 388 and 452 bp obtained in P.carthami could be an alternative for molecular diagnosis in P.carthami.
As a result, Pc.ITS-1 and Pc.ITS-2 of the 6 primers tested in the thesis study were distinctive only for P.carthami, while Pt.ITS and RA68 produced specific DNA fragments for both Puccinia species. Thus, a molecular method has been developed that will enable rapid and complete diagnosis of P.carthami according to classical methods.