Laktoperoksidaz enziminin kefirden afinite kromatografisi tekniği ile saflaştırılması ve bazı kimyasallar üzerine etkilerinin araştırılması
Purification of lactoperoxidase enzyme from kefir by affinity chromatography technique and investigation of its effects on some chemicals
Yazar: ÖZLEM ALBAYRAK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ BAŞAK GÖKÇE
Süleyman Demirel Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İlaç Araştırma ve Geliştirme Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Laktoperoksidaz enzimi (LPO: E.C.1.11.1.7), memeli sütlerinde bulunan bir peroksidazdır. Sütten elde edilen peroksidaz enzimi ile tükürük ve gözyaşında bulunan peroksidazlar arasında benzerlik bulunmaktadır. Laktoperoksidaz yaklaşık 78 kDa molekül ağırlığında, %8-10 karbonhidratlık bir glikoproteine sahip, 612 aminoasit içeren tek bir polipeptitten oluşur. Yapısında prostetik grup olarak hem bulunur. LPO antibakteriyel özelliklere sahip bir oksidoredüktaz grubu enzimidir. 
Bu çalışmada Jersey cinsi sığır sütünden ve geleneksel yolla aynı sütten elde edilen kefirden laktoperoksidaz (LPO) enzimini, afinite kromotografisinin bir türü olan hidrofobik etkileşim kromotografisi yöntemi geliştirilerek saflaştırılması amaçlanmıştır.
Bu amaçla LPO enzimleri önce toluen ve ardından amonyum sülfat ile protein çöktürmesi uygulanarak kısmi saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. Süt laktoperoksidaz enziminin en iyi aktivite gösterdiği amonyum sülfat konsantrasyon aralığı %60 ve kefir laktoperoksidaz enziminin en iyi aktivite gösterdiği amonyum sülfat konsantrasyon aralığı %50 olarak tespit edilmiştir. Ardından Sepharose 4B-L-tirozin-1-naftilamin jeli kullanılarak, süt LPO enzimi %24.08 verimle 220.8 kat; kefir LPO enzimi %39.91 verimle 399.20 kat saflaştırılmıştır.
Enzimlerin saflığı SDS-PAGE elektroforez yöntemi kullanılarak kontrol edilmiştir. Kefir laktoperoksidaz ve süt laktoperoksidaz için 80 kDa civarında tek bant elde edilmiştir. Süt LPO ve kefir LPO enzimlerinin Km ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk yönteminden yararlanarak bulunmuştur. ABTS substratı için süt LPO için Km değeri 0.166±0.071 mM ve Vmax değeri 238.095±0.71 EU/mL; kefir LPO için Km değeri 0.088±0.016 mM ve Vmax değeri 294.117±0.89 EU/mL olarak belirlenmiştir.
Çalışmanın son aşamasında, bazı kimyasalların elde edilen saf süt ve kefir LPO enzimleri üzerine etkileri incelenmiştir. Enzimin spesifik inhibitörleri olan sülfanilamid ve sülfaguanidinin süt LPO ve kefir LPO enzimleri üzerine inhibisyon etkileri çalışılmıştır. Süt LPO enzimi üzerine sülfanilamid ve sülfaguanidinin IC50 ve Ki değerleri sırasıyla 3.41±0.54, 1.15±0.32 ve 0.019.10-4±0.009.10-4, 0.035.10-5±0.003.10-5 µM bulunmuştur. Kefir LPO enzimi üzerine sülfanilamid ve sülfaguanidinin IC50 ve Ki değerleri sırasıyla 4.24±0.67, 1.9±0.59 ve 0.044.10-4±0.002.10-4, 0.065.10-5 ± 0.004.10-5 µM bulunmuştur.

Abstract:
Lactoperoxidase enzyme (LPO: E.C.1.11.1.7) is a peroxidase found in mammalian milk. There is a similarity between the peroxidase enzyme obtained from milk and the peroxidases found in saliva and tears. Lactoperoxidase consists of a single polypeptide with a molecular weight of approximately 78 kDa, a glycoprotein of 8-10% carbohydrate, and 612 amino acids. Its structure contains heme as a prosthetic group. LPO is an oxidoreductase group enzyme with antibacterial properties. 
In this study, it was aimed to purify lactoperoxidase (LPO) enzyme from Jersey milk and kefir obtained from the same milk by developing hydrophobic interaction chromatography method, which is a type of affinity chromatography.
For this purpose, partial purification of LPO enzymes was carried out by protein precipitation with toluene and then ammonium sulphate. The ammonium sulphate concentration range in which milk lactoperoxidase enzyme showed the best activity was 60% and the ammonium sulphate concentration range in which kefir lactoperoxidase enzyme showed the best activity was 50%. Then, using Sepharose 4B-L-tyrosine-1-naphthylamine gel, milk LPO enzyme was purified 220.8-fold with 24.08 yield and kefir LPO enzyme 399.20-fold with 39.91 yield.
The purity of the enzymes was checked using SDS-PAGE electrophoresis method. A single band around 80 kDa was obtained for kefir lactoperoxidase and milk lactoperoxidase. Km and Vmax values of milk LPO and kefir LPO enzymes were determined using Lineweaver-Burk method. For ABTS substrate, Km value for milk LPO was 0.166±0.071 mM and Vmax value was 238.095±0.71 EU/mL; Km value for kefir LPO was 0.088±0.016 mM and Vmax value was 294.117±0.89 EU/mL.
In the last step of the study, the effects of some chemicals on pure milk and kefir LPO enzymes were investigated. The inhibition effects of sulfanilamide and sulfaguanidine, which are specific inhibitors of the enzyme, on milk LPO and kefir LPO enzymes were studied. The IC50 and Ki values of sulfanilamide and sulfaguanidine on milk LPO enzyme were 2.14±0.54, 1.5±0.32 and               0.019.10-4±0.009.10-4, 0.035.10-5±0.003.10-5 µM, respectively. IC50 and Ki values of sulfanilamide and sulfaguanidine on kefir LPO enzyme were 2.75±0.67, 2.5±0.59 and 0.044.10-4±0.002.10-4, 0.065.10-5 ± 0.004.10-5 µM, respectively.