Bitki genlerinin Schizosaccharomyces pombe`de anlatımı
Expression of plant genes in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: BEDİA GEMİCİ PALABIYIK
Danışman: PROF. DR. GÜLER TEMİZKAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2004
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
xÖZETBİTKİ GENLERİNİN Schizosaccharomyces pombe'de ANLATIMIBu çalışmada, Schizosaccharomyces pombe'nin bitkisel genlerin özellikle işlevsel analizlerininyapılmasında, uygun bir model organizma olarak kullanılabilirliğini araştırmak amacıylaSorghum bicolor (akdarı)'un Î²-O-glukozidazını şifreleyen dhr1, Zea mays (mısır)'ınÎ²-O-glukozidazını şifreleyen glu1 ile Sinapis alba (beyaz hardal)'nın Î²-S-glukozidazınışifreleyen myr1 genlerinin bu mayadaki heterolog anlatımları araştırıldı.pBluescript II KS (+) klonlanmış olan dhr1, glu1 ve myr1 genlerinin cDNA'ları PCR ileçoğaltıldı. Her bir gene ait PCR ürünleri, S. pombe için geliştirilmiş pART1 ve pREP42ekspresyon vektörlerinde klonlandı. Bu vektörlerden pART1'de dhr1 ve glu1 genlerini içerenrekombinant plazmidler (pDA27 ve pGA2) elde edildi. Rekombinant plazmidler, S. pombeleu1-32 ırkına lityum asetat ve de elektroporasyon yöntemleri ile transfer edildi. S. pombetransformantlarında yabancı genlerin varlığı, hem koloni PCR hem de transformant kolonilerdenizole edilen genom ve plazmid DNA'larının PCR ile taranması ile DNA düzeyinde gösterildi.pREP42'de dhr1, glu1 ve myr1 genlerinin klonlanması ile elde edilen rekombinant plazmidler(pDR41, pGR8 ve pMR4) S. pombe ura4-D18 ırkına elektroporasyon yöntemi ile transferedildi. Transformantlar koloni PCR tekniği ile tarandı; pDR41'i içeren 2 (DR41-S22 veDR41-S25), pGR8'i içeren 3 (GR8-S2, GR8-S6 ve GR8-S9), pMR4'ü içeren 5 (MR4-S1,MR4-S2, MR4-S3, MR4-S4, MR4-S5) adet S. pombe klonu elde edildi.Bu genlerin S. pombe'deki heterolog anlatımlarını transkripsiyon düzeyinde analiz etmek için,klonlardan total RNA izolasyonu yapıldı. Northern melezleme tekniği ile genlerin mRNAürünlerinin varlığı saptanamadı. Aynı klonlar genlere özgü primerlerin kullanıldığı RT-PCRtekniği ile tarandığında ise DR41-S22 klonunda dhr1'in ve MR4-S1 klonunda myr1'inmRNA'ları belirlendi.Heterolog gen anlatımlarını translasyon düzeyinde analiz etmek için, rekombinant klonlardan(DR41-S22, MR4-S1 ve GR8-S2) ham protein özütleri elde edildi. dhr1, glu1 ve myr1 genlerineait heterolog proteinlerin varlığı denatüre-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) veWestern melezleme teknikleri ile saptandı. Ancak, yapılan enzim aktivitesi testleri ile buheterolog proteinlerin aktif olmadıkları anlaşıldı.Sonuç olarak, bu çalışmada kullanılan bitki Î²-glukozidazlarını şifreleyen genlerin S. pombe'detranskripsiyon ve translasyon düzeyinde anlatım yaptıkları halde aktif protein ürünoluşturamamalarının, translasyon sonrası bazı işlemlerde eksikliklerden veya S. pombeÎ²-glukozidazı ile heterolog Î²-glukozidazlar arasındaki olumsuz etkileşimlerdenkaynaklanabileceğini düşündürdü.

Abstract:
xiSUMMARYEXPRESSION OF PLANT GENES IN Schizosaccharomyces pombeIn order to investigate whether Schizosacchramyces pombe could be used as a model organismespecially for the functional analysis of plant genes, the heterologous expressions of dhr1 genesencoding Î²-O-glucosidase in Sorghum bicolor, glu1 gene encoding Î²-O-glucosidase inZea mays and myr1 gene encoding Î²-S-glucosidase in Sinapis alba have been studied in thisfission yeastcDNA?s of dhr1, glu1 and myr1 genes which had been cloned in pBluescript II KS (+) areamplified using PCR. PCR products of each gene are cloned in pART1 and pREP42 expressionvectors of S. pombe. The recombinant plasmids (pDA27 and pGA2) carrying the dhr1 and glu1genes in pART1 are constructed. These plasmids are then transferred to S. pombe leu1-32 strainby lithium acetate and electroporation methods. The presence of foreign genes in S. pombetransformants are shown either with colony PCR or with PCR amplifications of genomic andplasmid DNA?s isolated from the transformant colonies. By cloning of dhr1, glu1 and myr1genes in pREP42 we have obtained recombinant plasmids pDR41, pGR8, pMR4, respectively,by electroporation method in S. pombe ura4-D18 strain. The resulting transformants arescreened using colony PCR technique. Consequently, 2 clones of S pombe containing pDR41(DR41-S22 and DR41-S25), 3 clones carrying pGR8 (GR8-S2, GR8-S6 and GR8-S9) and5 clones carrying pMR4 (MR4-S1, MR4-S2, MR4-S3, MR4-S4, MR4-S5) have been obtained.In order to analyze the heterologous expression of these genes at the level of transcription inS. pombe total RNA is isolated. mRNA products of the genes could not be detected by Northernhybridization technique. However, when the same clones were screened with RT-PCRtechnique using gene specific primers, mRNA products of dhr1 genes in DR41-S22 clone andmyr1 gene in MR4-S1 clone could be detected.Crude protein extracts prepared from the recombinant clones (DR41-S22, MR4-S1 andGR8-S2) are analyzed for the heterologous gene expression at the level of translation. Thepresence of heterologous proteins encoded by dhr1, glu1 and myr1 genes are detected bydenaturating polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western hybridizationmethods. However when enzyme activities are tested these heterologous proteins are found tobe inactive.In this study, we have shown that although plant genes encoding Î²-glucosidase are expressedboth at the levels of transcription and translation, proteins products are inactive. These resultsmay point out for some deficiencies in the post translational modifications or negativeinteractions between the S. pombe and heterologous Î²-glucosidases.