CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak solanum lycopersıcum'da yağ asidi sentez yolağında yer alan genlerin susturulması
Silencing of genes involved in fatty acid synthesis pathway in solanum lycopersicum using CRISPR/Cas9 system
Yazar: SİBEL BAHADIR
Danışman: DOÇ. DR. MUSA KAVAS
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Domates (Solanum lycopersicum) dünya çapında en çok üretilen ve tüketilen gıda maddeleri arasında yer almaktadır. Domatesin sağlık yönünden zengin besin içeriğine sahip olması tüketicilerin ilgisini çeken bir gıda maddesi olmasını sağlamaktadır. Çeşitli genom düzenleme sistemleri kullanılarak gıda maddelerinin besin içeriğinin arttırılması, raf ömrünün uzatılması, biyotik/abiyotik stres faktörlerine dayanıklılığın arttırılması gibi pek çok çalışma yapılmaktadır. Hem sağlık hem de ekonomik yönden önemli bir gıda maddesi olan domates dikotil bitkiler arasında genom düzenleme çalışmalarının model organizması olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada domates bitkisinde yağ asidi sentez yolağında yer alan genlerin CRISPR/Cas9 sistemi ile susturulması ve bu sayede de bu genlerin domates bitkisindeki önemini belirlemek hedeflenmiştir. Fatty acyl-ACP thioesterase B (FATB) ve Palmitoyl-Acyl Carrier Protein Thioesterase (Solyc12g006930 ve Solyc03g097390) genleri yağ asidi sentezi sırasında zincir uzunluğunun belirlenmesinde ve bitkilerde iki lipid biyosentez yolu arasındaki karbon akışında önemli rol oynamaktadırlar. Hedef genlerdeki mutasyon için Cas9 ve gRNA'ları taşıyan vektör (pHSE401) Agrobacterium tumefacience bakterisi aracılığı ile domates bitkisine atılmıştır. Elde edilen mutant domates bitkilerinin yaprakları elektron mikroskobu ile incelendiğinde geliştirilen transgenik domatesin trikom sayısı yabani tipe göre azalmış olduğu görülmüştür. Elektron mikroskobunda incelenen kesitlerde yabani tipe oranla mutant hatlarda 9.7 mm'lik bir yaprak kesitinde 300 kat büyütmede hat 6 da %62.5, hat 8 de %66.7, hat 11 de %70.8'lik bir oranında azalma kaydedilmiştir, ayrıca kütikula yapısı da incelendiğinde yabani tipe göre kütin matrisinin üst yüzeyinde yapısal bozukluk şeklinde farklılaşma meydana geldiği gözlenmiştir. Mutant bitkiler bir domates zararlısı olan Tuta absoluta tarafından enfekte olmuşlar ve yabani tip bitkilere kıyasla daha fazla hassasiyet göstermişlerdir. Tüm bu sonuçlar göz önünde bulundurulduğunda, domates bitkisinde Fatty acyl-ACP thioesterase B (FATB) ve Palmitoyl-Acyl Carrier Protein Thioesterase  genlerinde meydana getirilen mutasyonların verdiği çıktılara bakarak biyotik stres koşullarında bitkinin daha hassas olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Bu farklılıklar sayesinde söz konusu domatesin, biyotik faktörlere daha hassas hale gelmesi ve dolayısıyla biyotik strese toleranslı bitkilerin geliştirilmesinde model olarak kullanılabileceği öngörülmektedir.

Abstract:
Tomatoes (Solanum lycopersicum) are among the most consumed foodstuffs worldwide. Tomatoes, which have a rich content in terms of health, attract the attention of consumers. Many studies such as increasing the nutritional content of foodstuffs, extending the shelf life, increasing the resistance to biotic/abiotic stress factors are carried out by using various genome editing systems. Tomato, which is an important foodstuff both in health and economic terms, is used as a model organism for genome editing studies among dicot  plants. In this study, it was aimed to silence the genes involved in the fatty acid synthesis pathway in the tomato plant with the CRISPR/Cas9 system and thus to determine the characterization of these genes in the tomato plant. Fatty acyl-ACP thioesterase B (FATB) and Palmitoyl-Acyl Carrier Protein Thioesterase genes play an important role in determining the chain length during fatty acid synthesis and in carbon flow between two lipid biosynthesis pathways in plants. The vector (pHSE401) carrying Cas9 and gRNAs for the mutation in the target genes was introduced into the plant by Agrobacterium tumefacience. When the leaves of the obtained mutant tomato plants were examined with electron microscopy, it was observed that the number of trichomes of the transgenic tomato developed decreased compared to the wild species. In the sections examined under the electron microscope, a decrease of 62.5% in plant 6, 66.7% in plant 8 and 70.8% in plant 11 were observed at 300 times magnification compared to wild type in the 9.7 mm leaf section of mutant plants. in addition, when the cuticle structure was also examined, it was observed that differentiation occurred on the upper surface of the cutin matrix in the form of structural disorders according to the wild type. Mutant plants were infected by Tuta absoluta, a tomato pest, and showed greater sensitivity compared to wild-type plants. Considering all these results, by looking at the results of mutations in the Fatty acyl-ACP thioesterase B (FATB) and Palmitoyl-Acyl Carrier Protein Thioesterase genes in the domatas plant, it was concluded that the plant is more sensitive under biotic stress conditions. Thanks to these differences, the tomato in question becomes more sensitive to biotic factors and therefore it is expected that it can be used as a model for the development of biotic stress-tolerant plants.