Topraktan izole edilen Bacillus subtilis A8'den proteaz üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of protease from Bacillus subtilis A8 isolated from soil
Yazar: DUYGU ÇELİK ALGÜL
Danışman: DOÇ. DR. SEMA FİNCAN
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Alkali proteaz = Alkaline protease ; Bacillus subtilis = Bacillus subtilis ; Hücre dışı enzimler = Extracellular ezymes

Özet:
Bu çalışmada, Ergani Makam Dağı'ndan alınan toprak örneğinden bakteri izole edildi. İzole edilen bakteri biyokimyasal ve 16S rRNA analizleri yardımıyla Bacillus subtilis A8 olarak tanımlandı. Bakteri üremesinin optimum koşulları 24. saat, 37°C ve pH 9.0 olarak belirlendi. Proteaz aktivitesine bakıldığında optimum üretim zamanı 24 saat, optimum sıcaklık 37°C, optimum pH ise 9.0 olarak tespit edildi.
Bakterinin üretim ortamına karbon ve azot kaynakları ilave edilerek proteaz üretimi üzerine etkisi araştırıldı. Karbon kaynaklarında; nişasta, glukoz, maltoz, laktozun proteaz üretiminde kontrole göre yaklaşık üç kat artış, galaktoz ilavesiyle de enzim üretiminde azalış gözlendi. Azot kaynakları içinde en yüksek değere üre ile ulaşılırken amonyum sülfat etkisi ile de enzim üretiminde önemli ölçüde inhibisyon tespit edildi.
Enzimin optimum koşulları belirlendikten sonra kısmi saflaştırma gerçekleştirildi. Kısmi olarak saflaştırılan enzim üzerine %0.5'lik SDS, BRIJ, Tween- 40, Tween-80 ve TritonX-100 kullanılarak deterjan etkisi araştırıldı. SDS'nin proteaz aktivitesini %80 oranında inhibe ettiği görülürken diğer deterjanların enzim aktivitesi üzerine önemli bir etki yapmadığı tespit edildi. Kısmi saflaştırılması yapılan proteaz üzerine inhibitör etkisi incelendiğinde; EDTA (Etilendiamin tetraasetik asit), PMSF (Fenilmetilsulfonil florid), DTT (Ditiyothreitol ve β-merkaptoetanol gibi inhibitörler arasında en yüksek inhibisyon etkisi 10 mM PMSF (%92) ile elde edildi.

Abstract:
In this study, bacteria were isolated from soil sample taken from Mount Ergani Authority. Bacteria which isolated with the help of biochemical tests and 16S rRNA analysis defined as Bacillus subtilis A8. Optimal conditions of bacterial growth were determined at 24th hour, 37°C and pH 7.0, respectively. Optimum production time was 24 hours, optimum temperature was 37°C and optimum pH was 9.0.
Carbon and nitrogen sources were added to the production medium of the bacteria to investigate their effect on the production of protease. In carbon resources; starch, glucose, maltose, lactose protease production of approximately three-fold increase, galactose addition of enzyme production was observed to decrease. Among the nitrogen sources, the highest protease activity was reached with urea, while the addition of ammonium sulfate decreased the enzyme production significantly.
After optimum conditions was determined, the enzyme partial was purified. To determine the effect of some detergents on the partially purified enzyme 0.5% SDS, Tween-40, Tween-80 and TritonX-100, BRIJ was used. While it was seen that SDS inhibited protease activity by 80%, it was found that other detergents had no significant effect on enzyme activity. When the effect of inhibitors such as EDTA (Ethylenediamintetra acetic acide), PMSF (Phenylmethylsulfonyl flüoride), DTT (Dithiothreitol) and β-mercaptoethanol on the partially purified protease was examined, the highest inhibition effect was obtained with 10 mM PMSF (92%).