Kronik hepatit b virüs (HBV) hastalarında hepatit d virüs (HDV) genotiplendirilmesi ve filogenetik analizi
Genotypes and phylogenetic characterization of hepatitis delta virus (HDV) in patients with chronic hepatitis B virus
Yazar: PINAR DEMİREL ÖNER
Danışman: DOÇ. DR. YASEMİN BULUT
Fırat Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Enzimler = Enzymes ; Genotip = Genotype ; Hepatit B virüsü = Hepatitis B virus ; Hepatit D virüsü = Hepatitis D virus ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Hepatit delta virüsü (HDV), hepatit B virüsü (HBV) ile enfekte hastalarda karaciğerle ilişkili mortalitelerin önemli bir sebebidir. HDV'nin genotiplerinin belirlenmesi HBV ile ilişkili karaciğer hastalıklarının patogenezinin daha iyi anlaşılmasında önemlidir. Bu tezin amacı HBV ile kronik olarak enfekte hastalarda HDV'un genotip veya genotiplerinin belirlenmesidir. Bu amaçla, bu çalışmaya HBV ile kronik olarak enfekte 113 hasta dahil edilmiştir. Hastalığın klinik gidişatının incelenmesi amacıyla, bu hastaların serumlarında HDV RNA, HBsAg, HBV DNA miktarları ve biyokimyasal parametreler belirlenmiştir. HDV'nin genotipilendirmesi için, öncelikle, hasta serumlarından elde edilen RNA'lar kullanılarak cDNA çoğaltılması ve semi-nested polymerase chain reaction (PCR) gerçekleştirilmiştir. Genotiplendirme için, restiriksiyon enzim analizine ek olarak, semi-nested PCR ürünlerinde 11'i jel purifikasyon kiti kullanılarak elde edilmiş, bu gen ürünleri öncü ve ters primerler ile çift yönlü olarak sekanslatılmıştır. Sekanslama işleminden sonra, elde edilen gen dizilimleri ClustalW programı kullanılarak sıralandırılmıştır ve gen bankasında elde edilen HDV'un dizilimleri ile kıyaslanmıştır. Daha sonra, bu dizilimlerin filogenetik ağacı PHYLIP bilgisayar programı ile komşu-birlikteliği metoduna göre tespit edilmiştir. Çalışma sonuçlarına göre, daha yüksek miktarlarda HDV RNA'ya sahip hastalarda HBV ve alanine aminotransferase (ALT)'ın önemli derecede daha düşük miktarda bulundukları tespit edilmiştir. Aynı hastalarda, aspartate transaminase (AST) ve gamma glutamyl transpeptidase (GGT)'ın ise önemli derecede daha yüksek miktarda bulundukları belirlenmiştir. HDV RNA miktarı ile yaş ve erkek cinsiyet arasında ters orantı tespit edilmiştir. Sekansların sıralama işleminde, 11 klinik örneğe ait genetik dizilimlerin birbirleri ile % 95-98 oranında benzer oldukları tespit edilmiştir. Bu dizilimlerin filogenetik analizi neticesinde tüm örneklerin HDV'nin genotip I grubunda olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, HBV ile enfekte kronik hastalarda HDV ile ilişkili karaciğer hastalıklarının patogenezinin ve klinik gidişatının daha iyi anlaşılması için serolojik ve moleküler metotların birlikte değerlendirilmesi gerekliliğini önermekteyiz.Anahtar kelimeler: Hepatit delta virüsü, hepatit B virüsü, genotiplendirme, restriksiyon enzim analizi, filogenik analiz.

Abstract:
Hepatitis delta virus (HDV) is a serious cause of liver-related mortality in patients who are infected with hepatitis B virus (HBV). Determination of genotypes of HDV is important for better understanding the pathogenesis of the liver diseases that are associated with HBV infection. The aim of this thesis was to determine the genotype or genotypes of HDV among patients chronically infected with HBV. A group of 113 chronic patients infected with HBV were were included in this study. For investigation of the clinical progress, the amounts of HDV RNA, HbsAg, HBV DNA and the biochemical parameters from serum samples of these patients were determined. For genotyping of HDV, first, cDNA amplification and semi-nested polymerase chain reaction (PCR) were performed using the RNA extracted from serum samples of the patients. Next, restriction enzyme analysis were carried out with the semi-nested PCR products. For genotyping, in addition to restriction enzyme analysis, eleven of the semi-nested PCR products were purified using gel purification kit and the gene products were sequenced in both directions with the forward and reverse primers. The gene sequences were aligned using ClustalW program and compared to the sequences of HDV present in GenBank database. The position of the sequences in the phylogenetic tree was analyzed by a neighbour-joining method using the PHYLIP computer software. According to the results of this study, while the patients with higher levels of HDV RNA had significantly lower HBV and alanine aminotransferase (ALT) amounts, same patients had significantly higher aspartate transaminase (AST) and gamma glutamyl transpeptidase (GGT) levels. Reverse correlation was found between HDV RNA levels and demographic factors including age, male gender. In the result of alignment analysis, the sequences of eleven clinical samples were shown to be 95-98% similar. Phylogenetic analysis of the sequences showed that the all samples were infected with genotype I of HDV. As a result, for better understanding of clinical course of the patients and pathogenesis related with HDV among patients chronically infected with HBV, we recommend using both of molecular techniques along with serological methods.Key words: Hepatitis delta virus, hepatitis B virus, genotyping, restriction enzyme analysis, philogenetic analysis.