De novo antimikrobiyal peptidlerin tasarımı, Pichia pastoris (Komagetaella phafii) ekspresyon sisteminde rekombinant üretimi ve aktivitelerinin belirlenmesi
Design of de novo antimicrobial peptides, recombinant production in the expression system of Pichia pastoris (Komagetaella phafii) and determination of their activities
Yazar: ŞEYMA AYDIN
Danışman: PROF. DR. ZÜLAL KESMEN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Antimikrobiyal peptidler (AMP'ler), doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir parçası olup, tek hücreli mikroorganizmalardan böcekler, amfibiler ve memeliler gibi çok hücreli organizmalara kadar hemen hemen tüm canlılar tarafından sentezlenebilmektedir. AMP'lerin bakteriler, mantarlar, virüsler, parazitler ve kanserli hücrelere karşı inhibitör etki gösterdikleri tespit edilmiştir. Ancak, AMP'ler geniş spektrumlu yeni antimikrobiyal ajanların geliştirilmesinde umut verici moleküller olarak görülse de, terapötik veya diğer uygulamalarda kullanımlarını sınırlandıran toksisite, düşük stabilite ve yüksek üretim maliyeti gibi dezavantajları bulunmaktadır. AMP'lerin yapısal ve fizikokimyasal özellikleri ile biyolojik aktiviteleri arasında doğrudan bir ilişkinin olduğu tespit edilmiştir. Doğal AMP'lerin yapısal özelliklerinin değiştirilmesiyle antimikrobiyal aktivitelerinin de geliştirilebildiği özellikle de novo tasarlanmış peptidlerin bu zorlukların üstesinden gelmede başarılı olduğu bilinmektedir. Bu nedenle bu tez çalışmasında, öncelikli olarak de novo peptidlerin tasarımına yönelik motif tabanlı bir tasarım stratejisi geliştirilerek yüksek antimikrobiyal etki ve stabiliteye sahip peptid dizileri tasarlanmıştır. Daha sonra tasarlanan bu peptidleri kodlayan DNA fragmentleri, pPICZαA ekspresyon vektörüne bağlandıktan sonra E. coli DH5α hücrelerinde klonlanmış ve P. pastoris konak hücrelerinde ekspresyonu gerçekleştirilmiştir.
Tez çalışması kapsamında tasarlanan ve rekombinant yöntemle üretilen rL12-49-6His ve rL12-22-6His peptidlerinin antimikrobiyal aktiviteleri B. cereus (ATCC 33019), B. cereus (ATCC 11778), L. monocytogenes (ATCC 7644), Metisilin dirençli S. aureus (MRSA) (ATCC 43300), S.aureus (ATCC 25223), S.aureus (ATCC 29213), A.baumannii (klinik İzolat), E. coli O157:H7 (ATCC 43894), E. coli (ATCC 25922), E. cloacae (ATCC 13047), E. sakazakii (klinik İzolat), K. pneumoniae (klinik İzolat), P. aeruginosa (klinik İzolat), S. Typhimurium (ATCC 1428), Y.enterocolitica (ATCC 27729), Y. pseudotuberculosis (ATCC 911), C. albicans (ATCC 1223), C. albicans (ATCC 90029), C. glabrata (klinik izolat) olmak üzere 19 mikroorganizma üzerinde test edilmiştir. rL12-49-6His ve rL12-22-6His peptidlerinin her ikisinin de Gram-pozitif bakterilere karşı minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) değerleri 0.25->128 µg/ml iken; Gram-negatif bakterilere karşı sırasıyla 8-64 µg/ml ve 4-8 µg/ml aralığında bulunmuştur. rL12-49-6His ve rL12-22-6His peptidlerinin test edilen patojenik maya suşlarına karşı MİK değerlerinin ise sırasıyla 32-64 µg/ml ve 8-16 µg/ml aralığında değiştiği gösterilmiştir. MİK analiz sonuçlarına göre rL12-22-6His peptidinin rL12-49-6His peptidine kıyasla daha yüksek antimikrobiyal aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. Tez çalışması kapsamında üretilen rL12-49-6His ve rL12-22-6His peptidlerinin hemolitik aktiviteleri fare eritrositine karşı test edilmiştir. Her iki peptidin de ≥ 8 μg/ml konsantrasyonlarda % 98'e yakın hemolitik etki gösterdiği belirlenmiştir. rL12-49-6His ve rL12-22-6His peptidlerinin sıcaklık stabilite testi sonucunda 4°C ve 24°C'de 1 saatlik muameleden sonra E. coli ATCC suşuna karşı tespit edilen inhibisyon zon çaplarında  istatistiksel olarak önemli bir farklılık bulunmazken, 65°C ve 95°C'de 1 saat ısıl işleme maruz bırakılan peptidlerinin zon çapında  24°C'ye kıyasla sırasıyla %6'lık ve %16'lık bir küçülme olmuştur. rL12-49-6His ve rL12-22-6His peptidlerinin proteaz enzimi ile muamale edildikten sonra E. coli ATCC 25922 suşuna karşı belirlenen inhibisyon zon çaplarında kontrole kıyasla istatistiksel olarak önemli bir fark bulunmamıştır. Sonuç olarak, tez çalışmasında, yüksek antimikrobiyal aktivite ve stabiliteye sahip peptid dizileri tasarlanmış ve rekombinant yöntemle üretilmiştir. Üretilen peptidlerin gıda, tıp, hayvancılık ve veterinerlik gibi alanlarda kullanım potansiyelinin olduğu düşünülmekle birlikte hemolitik aktivitesinin düşürülmesi için daha ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Anahtar Kelimeler: AMP, de novo, rekombinant peptid, motif tabanlı yaklaşımlar, Pichia pastoris ekspresyonu

Abstract:
Antimicrobial peptides (AMPs) are an important part of the innate immune system and can be synthesized by almost all living organisms, from microorganisms to multicellular organisms such as insects, amphibians, and mammals. AMPs have been found to have an inhibitory effect against bacteria, fungi, viruses, parasites and cancer cells. Although AMPs are considered promising molecules for the development of new antimicrobial agents with broad spectrum activity, they have drawbacks such as toxicity, low stability, and high production costs that limit their use in therapeutic or other applications. It was found that there is a direct relationship between the structural and physicochemical properties of AMPs and their biological activities. It is well known that the antimicrobial activities of natural AMPs can be improved by altering their structural properties, and de novo designed peptides in particular have been successful in overcoming these difficulties. Therefore, in this thesis study, peptide sequences with high antimicrobial activity and stability were designed by developing a motif-based design strategy mainly for de novo peptide design.Subsequently, DNA fragments encoding these designed peptides were cloned into E. coli DH5α cells after ligation into the pPICZαA expression vector and expressed in P. pastoris host cells.
The antimicrobial activities of rL12-49-6His and rL12-22-6His peptides developed and recombinantly produced in this work were tested against 19 microorganisms including B. cereus (ATCC 33019), B. cereus (ATCC 11778), L. monocytogenes (ATCC 7644), Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) (ATCC 43300), S. aureus (ATCC 25223), S. aureus (ATCC 29213), A. baumannii (clinical Isolate), E. coli O157:H7 (ATCC 43894), E. coli (ATCC 25922), E. cloacae (ATCC 13047), E. sakazakii (clinical Isolate), K. pneumoniae (clinical Isolate), P. aeruginosa (clinical Isolate), S. Typhimurium (ATCC 1428), Y. enterocolitica (ATCC 27729), Y. pseudotuberculosis (ATCC 911), C. albicans (ATCC 1223), C. albicans (ATCC 90029), C. glabrata (clinical isolate). rL12-49-6His and rL12-22-6His peptides both exhibited minimum inhibitory concentrations (MIC) against Gram-positive bacteria of 0.25-128 µg/ml; against Gram-negative bacteria, values were found in the range of 8-64 µg/ml and 4-8 µg/ml, respectively. rL12-49-6His and rL12-22-6His peptides shown antimicrobial activity against pathogenic yeast strains tested in 32-64 µg/ml and 8-16 µg/ml, respectively. According to the results of MIC analysis, rL12-22-6His exhibited higher antimicrobial activity than rL12-49-6His. The hemolytic activities of rL12-49-6His and rL12-22-6His peptides were tested against mouse erythrocytes and both peptides were found to exhibit nearly 98% hemolytic activity at concentrations of ≥ 8 μg/ml. As a result of the temperature stability test of peptides rL12-49-6His and rL12-22-6His, no statistically significant difference in the diameters of the zones of inhibition against the E. coli ATCC strain was observed after one-hour treatment at 4°C and 24°C. The peptides subjected to one-hour heat treatment at 65°C and 95°C showed a 6% and 16% reduction in zone diameters, respectively, compared with 24°C. There was no statistically significant difference in the inhibition zone diameters of rL12-49-6His and rL12-22-6His peptides against E. coli ATCC 25922 strain after treatment with protease enzyme compared to the control.In conclusion, in this thesis, peptide sequences with high antimicrobial activity and stability were designed and produced by recombinant method. Although the peptides produced are considered to have potential for use in areas such as food, medicine, animal husbandry, and veterinary medicine, further studies are needed to reduce hemolytic activity.

Keywords: AMP, De novo, recombinant peptide, motif-based approaches, Pichia pastoris expression