Helicoverpa armıgera'dan izole edilen serratıa marcescens bakterisine ait kitinaz A, B ve C genlerinin klonlanması, karakterizasyonu, ekspresyonu ve enzim aktivitelerinin belirlenmesi
Characterisation, expression, and purification, of chitinase A, B and C genes isolated from serratia marcescens originating from Helicoverpa armigera and determining their enzyme activity
Yazar: MEHTAP YAKUPOĞLU
Danışman: YRD. DOÇ. DR. REMZİYE NALÇACIOĞLU
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Fungal hücre duvarı ve böcek dış iskeleti temel yapı bileşeni olarak kitin içerdiğinden kitinaz enzimleri hem çeşitli bitki hastalıklarına neden olan fitopatojen funguslara hem de zararlı böceklere karşı biyolojik kontrol ajanı olarak kullanılma potansiyeline sahiptirler.Bu çalışmada, doğal olarak ölmüş Helicoverpa armigera larvasından Serratia marcescens bakterisi izole edildi. Bu bakteriden kitinaz A, B ve C enzimlerini kodlayan genler ( chiA, chiB ve chiC) dejenerat primerler kullanılarak PCR ile çoğaltıldı. Çoğaltılan genlerin nükleotid dizilimini belirlemek için PCR ürünleri pGEM-T Easy klonlama vektörüne klonlandı ve dizin analizine gönderildi. Dizin analizi yapılan kitinaz A, B ve C genlerinin DNA ve aminoasit sıraları literatürdeki mevcut kitinaz genlerinin DNA ve aminoasit sıraları ile karşılaştırıldı.Analiz sonuçları bu çalışmada izole edilmiş S. marcescens bakterisine ait kitinaz A geninin literatürde ki S.marcescens (BJL200) chiA genine %99, kitinaz B'nin literatürde ki S.marcescens (BJL200) chiB genine %97 ve kitinaz C'nin ise literatürde ki S. marcescens chiC1 genine %96 oranında benzer olduğunu gösterdi. Dizin analizi yapılan bu kitinaz genleri pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanarak Escherichia coli'de proteinleri ekspres edildi. Ekspres edilen proteinler saflaştırılarak, SDS-PAGE analizine tabi tutuldular. Bu analiz sonucunda kitinaz A genine ait 57kDa'luk, kitinaz B genine ait 53kDa'luk ve kitinaz C genine ait 50kDa'luk protein bantları jel üzerinde belirlendi.Elde edilen enzimlerin en iyi çalıştığı pH ve sıcaklık aralıklarına bakıldı. Buna göre; kitinaz B'nin en iyi pH 9 ve 35oC sıcaklıkta, kitinaz C'nin ise pH 8,5 ve 33 oC sıcaklıkta aktivite gösterdiği belirlendi.

Abstract:
Chitinases have been shown to be potential agents for biological control of the plant diseases caused by various phytopathogenic fungi and insect pests, because fungal cell walls and insect exoskeletons contain chitin as a major structural component.In this study, the gene encoding chitinase A (chiA), chitinase B (chiB) and chitinase C (chiC) from Serratia marcescens that isolated from naturally died Helicoverpa armigera larvae, amplified with dejenerate primers by PCR. For identifying the nucleotide sequence of the amplified genes, PCR products were cloned into the pGEM-T Easy cloning vector. Nucleotide sequences of chitinase A (chiA), chitinase B (chiB) and chitinase C genes and their deduced amino acid sequences were determined and compared with other chitinase A (chiA), chitinase B (chiB) and chitinase C (chiC) genes.For the analysis results, chitinase A, chitinase B and chitinase C proteins belong to Serratia marcescens have %99 homology with (BJL200) chiA for chitinase A, 97% homology with S.marcescens (BJL200) chiB gene for chitinase B and 96% homology with S.marcescens chiC1 for chitinase C1. To express the protein produced by chitinase A chitinase B and chitinase C genes in a different host and detect their activity the genes were cloned into pET-28a(+) expression vector. The proteins expressed in expression vector were isolated, purified and SDS-PAGE analysis of the proteins were performed. 57 kDa protein band belonged to chitinase A gene, 53 kDa protein band belonged to chitinase B gene and 50 kDa protein band belonged to chitinase C gene were observed on polyacrylamide gel.The enzymes were obtained and their optimum pH and temperature were determined. For this chitinase B has activity at pH 9 and 35oC and chitinase C has activity pH 8,5 ve 33 oC.