Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin ilaç ve aşı tasarım çalışmalarında kullanılmak üzere izolasyonu, klonlanması ve analiz edilmesi
Isolation, cloning and analysis of the gene encoding enolase from Theileria annulata for drug and vaccine designing studies
Yazar: AYBERK AKAT
Danışman: DOÇ. DR. DİLEK TURGUT-BALIK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics
Dizin: Enolaz = Enolase ; Theileria annulata = Theileria annulata

Özet:
Theileria annulata'nın sebep olduğu tropikal theileriosis, yabanıl ve evcil sığırları enfekte eden ve Hyalomma cinsi keneler tarafından taşınan ciddi bir hastalıktır. Hastalığın tedavisi için günümüzde kullanılan antiparazitik ilaçlar mevcuttur, ancak bu yıl ilk kez önemli bir antitheilerial ilaca karşı oluşmuş bir direnç rapor edilmiştir. Yeni antitheilerial ilaç ya da aşıların geliştirilmesi amacıyla, enolaz geni Theileria annulata Elazığ soyu genomik DNA'sından polimeraz zincir reaksiyonu ile izole edilmiş, pGEM-T easy vector sistemi kullanılarak, bilgimize göre literatürde ilk kez klonlanmış ve çeşitli web tabanlı programlar kullanılarak nükleotid ve amino asit düzeyinde analiz edilmiştir.Yapılan analizler genin, 40-41 rezidüleri arasında yer alan, 36 baz çifti uzunluğunda bir intron dizisi de dahil olmak üzere toplam 1365 nükleotidden oluştuğunu göstermiştir. İntron hariç genin %GC oranı 44.3 olarak hesaplanmıştır. Theileria annulata'nın Elazığ ve Ankara soylarının enolaz nükleotid dizisi karşılaştırıldığı zaman, aralarındaki 37 bazlık farklılığın 3 amino asit değişikliğine neden olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca Theileria annulata enolazı ile konak Bos taurus'taki eşdeğeri olan kas enolazı amino asit düzeyinde karşılaştırıldığı zaman, Theileria annulata enolazındaki, konak Bos taurus'ta bulunmayan, biri pentapeptid diğeri dipeptid olmak üzere iki insersiyon bölgesinin tespit edilmesi bu tez çalışmasının önemli bir bulgusu olarak kaydedilmiştir.Theileria annulata enolazında bulunan beş ve iki amino asitlik iki insersiyonun, yapılan modelleme çalışması sonucunda konak Bos taurus enolazında bulunmayan birer halka oluşturduğu, oluşan bu halkaların da Plasmodium LDH'ında ve enolazında olduğu gibi spesifik enzim inhibitörleri için birer bağlanma bölgesi olabileceği önerilmiştir. Tespit edilen insersiyon bölgelerinin, enolazın tam aktivitesi için gerekli olduğu göz önüne alındığı zaman bölgelerin aynı zamanda Theileria annulata enolazı için de bir antijenik epitop olabileceği bu çalışma ile önerilmektedir.Restriksiyon harita analizi, iki soy arasındaki nükleotid düzeyindeki farklılıkların, enolaz genini kesen restriksiyon endonükleazlarında da farklılıklar yarattığı ve bazılarının Ankara yada Elazığ soyuna spesifik yeni kesim bölgeleri oluşturduğunu veya bazı enzim kesim bölgelerinin yok olmasına neden olduğunu göstermiştir. Elde edilen bu sonuçların Theileria annulata soylarının soy tanısının yapılması ve coğrafik dağılım haritalarının çıkarılması için kullanılabileceği önerilmektedir.Sonuç olarak bu tez çalışmasında Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin yeni bir ilaç ve aşı tasarımında kullanım potansiyelinin açıklanması, türün soy tanısının yapılması ve coğrafik dağılımının belirlenmesi yönünde önemli bulgular sunulmuştur.

Abstract:
Tropical theileriosis is a serious disease, caused by Theileria annulata, which infects wild and domestic ruminants and is transmitted by ticks from Hyalomma genus. Currently available antiparasitic drugs are still in use to treat this disease but a resistance against one of the important antitheilerial drugs has been reported for the first time this year. For the aim of developing new antitheilerial drugs or vaccines, enolase gene was isolated from the genomic DNA of Theileria annulata, Elazig strain, by polymerase chain reaction, cloned for the first time in the literature via pGEM-T easy vector system and analyzed at both nucleotide and amino acid levels by using different web based tools.These analyses showed that the gene was consisted of 1365 nucleotides including an intron sequence placed between residues 40-41. GC% content of the gene was calculated as 44.3, excluding the intron sequence. As the comparison of enolase gene sequences from Elazig and Ankara strains of Theileria annulata was made, 37 nucleotide differences causing 3 amino acid changes were determined. Also when the same comparison was made between, Theileria annulata enolase and the muscle enolase isoform of the host Bos taurus, detection of one pentapeptide and one dipeptide insertions in Theileria annulata enolase that do not exist in Bos taurus enolase was reported as an important discovery of this study.The modelling studies on Theileria annulata enolase gene showed that the pentapeptide and dipeptide insertions constituted loops that do not exist in Bos taurus enolase, suggesting that these loops could be specific binding sites for enzyme inhibitors as the lactate dehydrogenase and enolase of Plasmodium. Considering that these detected insertion sites are essential for the activity of enolase, it is also suggested that these sites could also be antigenic epitopes for Theileria annulata enolase.Restriction mapping analysis showed that the differences at nucleotide level between the two strains caused differences on recognition sequences of restriction endonucleases that cut the enolase gene, creating some new strain specific cutting sites or removing some enzyme cutting sites. It is suggested that these results could be used for identifying Theileria annulata strains and mapping geographical distribution of the parasite.In conclusion, important informations were presented in this study about the potential use of the gene, encoding enolase of Theileria annulata for design of new drugs or vaccines and, determination of strains identification and geographical distribution of Theileria annulata strains.