Dişi buttum (Pistacia khinjuk Stocks) ağaçlarının in vitro mikroçoğaltımı
In vitro micropropagation of female khinjuk pistachio (Pistacia khinjuk Stocks) trees
Yazar: YUSUF ERSALI
Danışman: PROF. DR. HASAN ÇETİN ÖZEN ; DOÇ. DR. ENGİN TİLKAT
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada, dişi buttum (Pistacia khinjuk Stocks) ağaçlarından alınan apikal ve lateral sürgün uçları kullanılarak in vitro mikroçoğaltım protokolü tanımlanmıştır. Kültür başlatmasında aksenik eksplantların eldesi için, ticari sodyum hipoklorit [NaOCl (ACE)] kullanılarak etkili bir yüzey sterilizasyonu protokolü tanımlanmıştır. Yüzey sterilizasyonu için apikal sürgün uçlarını %10'luk NaOCl'de 10 dakika çalkalamanın yeterli olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada kültür başlatılmasında eksplantların kültüre alınma tarihleri arasında, Temmuz- Ağustos aylarında kültüre alınan eksplantların diğer aylardan daha yüksek oranda yaşayan (%32.5) kültüre sahip olduğu ortaya konmuştur. Besi ortamı (MS, SH, WPM) tipi ve bitki büyüme düzenleyici (Kinetin, 2iP, BA, TDZ ) çeşitlerinin kültür başlatmaya ve sürgünlerin proliferasyonuna etkileri araştırılmıştır. Sürgün proliferasyonu için, çalışılan sitokinin çeşitlerinden 2 mgl-1 BA'nın eksplant başına ortalama 2.15 adet yeni sürgün en iyi besi ortamını oluşturduğu tespit edilmiştir. Proliferasyon oranını artırmak için, en iyi sitokinin ve stokininle beraber oksin (IAA, NAA, IBA) kombinasyonları ve konsantrasyonları (0.1 ve 0.3 mgl-1) denenmiştir. 2 mgl-1 BA+0.1 mgl-1 IBA destekli MS besi ortamının sürgün çoğaltımına en iyi cevap verme kapasitesine (eksplant başına düşen ortalama sürgün sayısı 2.55) sahip olduğu ortaya konmuştur. İn vitro çoğaltımı yapılan sürgünlerin köklendirilmesine IBA, NAA, 2,4-D ve IAA gibi oksin çeşitlerinin etkileri 1mg1-1 konsantrasyonları ile araştırılmıştır. Sürgünlerin in vitro köklendirilmesi araştırmalarında 2,4-D'nin köklendirme için uygun olmadığı, NAA'nın diğer oksinlerden daha üstün bir köklendirme oranına (%70) sahip olduğu açık bir şekilde ortaya konmuştur. İn vitro köklendirilen bitkilerin dış ortama alıştırılması çalışmalarında steril torfun ve nemin etkili olduğu ortaya konmuştur. Steril torfta kademeli olarak nem oranı azaltılan bitkiciklerin %60 oranında yaşamaya devam ettiği ve dış koşullara adaptasyonda başarılı olduğu tespit edilmiştir.
İn vitro çoğaltılan klonlarda meydana gelebilecek varyasyonu belirlemek için, kültürün 5., 10., 15., 20., 24. alt kültürü sonrası yaprak örneklerinden DNA'lar izole edildi ve ISSR analizi yapıldı. Ana materyal ile klonlar arasında en yakın benzerlik oranının 0.838, en uzak benzerliğin 0.748 olduğunu ve 0.792 ortalama benzerlik oranı çalışılan klonlarda genetik çeşitliliğin oluştuğunu göstermektedir.

Abstract:
In this study, a protocol was described for the micropropagation of khinjuk pistachio (Pistacia khinjuk Stocks) apical and lateral shoot tips explanted from mature trees. Effective surface sterilization method was described for the production of axenic explants from P. khinjuk shoots using commercial (ACE) sodium hypochlorite (NaOCl). Decontamination was best achieved when the apical buds were surface sterilized by immersion in an aqueous solution of 10% sodium hypochlorite for 10 minutes. Significant differences in explanting dates for the culture initiation were observed with the explants taken in the July-August time period showing higher living explants (32.5%) than the other periods tested. The effect of different plant growth regulators (Kinetin,  2iP,  BA, TDZ) and growth medium (MS, SH, WPM) for in vitro culture initiation and shoot proliferation were investigated. For in vitro shoot proliferation, the best response was obtained in MS medium supplemented with a 2 mg1-1 BA treatment, with a shoot number of 2.15 per explants. To optimize further the proliferation stage, one concentration of BA (2 mgl-1) was used in combination with three auxin types (IAA, NAA, IBA) at different concentrations (0.1, 0.3 and mgl-1). The best response for shoot proliferation was obtained from the explants cultured in the MS medium supplemented with 2 mgl-1 BA + 0.1 mgl-1 IBA with a shoot number of 2.55 per explants. For the rooting of in vitro regenerated shoots, different auxins (IBA, NAA, 2,4-D and IAA, each at 1 mgl-1) were investigated. In vitro proliferated shoots were utilized for the rooting. The rooting experiments have revealed that the cytokinin 2,4-D is not a suitable plant growth regulator (PGR) for the in vitro rooting of khinjuk pistachio shoots. The auxin NAA has superior rate (%70) of the rooting of shoots than the other PGRs tested. Humidity and sterile peat have been effective role for the acclimatization of in vitro regenerated plantlets. The in vitro regenerated plantlets of mature khinjuk pistachio were successfully acclimatized under in vitro conditions, with 60% survived rate when they were treated with a gradually decreasing humidity. DNAs from mother trees and micropropagated plantlets belonging to 5, 10, 15, 20 and 24 times subculture were isolated and subjected to ISSR analysis in order to evaluate their genetic stability and detect possibly existing variation among in vitro plantlets. Among mother plantlets and their regenerants for two of the clones tested, similarity ratio in the range of 0.838-0.749 indicated the presence of polymorphism within the clones studied.