Investigation of the ın vitro and ex vivo efficacy of the CRISPR-PE system according to the types of Spinal Muscular Atrophy disease
CRISPR-PE sisteminin Spinal Musküler Atrofi hastaliğinin tiplerine göre in vitro ve ex vivo etkinliğinin araştirilmasi
Yazar: GAMZE YELGEN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHAN TAŞTAN
Üsküdar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
SMA hastalığı nöron kaybı ve kas atrofisi ile seyreden nöromüsküler bir hastalıktır. SMA hastalığında sorumlu iki gen bölgesi mevcuttur; SMN1 ve SMN2. SMA hastalığının klinik alt tipleri hastalığın başlangıç yaşına ve SMN2 kopya sayısına dayanmaktadır. SMN1 geninde gerçekleşen nokta mutasyonları ve heterozigot delesyonlar sonucu ekzon 7 katılımı engellenerek fonksiyonel olmayan SMN protein üretilmektedir. SMN2 geni üzerinden eksprese edilen kesikli yapıdaki SMN proteini SMNΔ7 (delta SMN) olarak adlandırılmaktadır. Düşük miktarda SMN protein ekspresyonu SMN2 geni üzerinden gerçekleştirilmektedir. Her bireyde farklı kopya sayısı bulunan SMN2 geninin hastalık seyri ve fenotipik şiddet ile ilişkisine yönelik sonuçlar mevcuttur. Bugüne kadar SMA hastalığı için FDA onaylı; Nusinersen, Zolgensma ve Risdiplam olmak üzere üç ilaç bulunmaktadır. Bu ilaçların tedaviye yönelik ciddi olumlu sonuçları olsa da tedavilerin maaliyetleri oldukça yüksektir. CRISPR/Cas9 sistemi genomda meydana gelen gelen değişikliklerin düzeltilmesini mümkün kılmaktadır. Kesilen DNA'nın onarımı için meydana gelebilecek iki farklı onarım mekanizması bulunmaktadır; NHEJ ve HDR. CRISPR-PE sisteminin Cas9 aracılı HDR yöntemine kıyasla yüksek verimlilik, daha az indel oluşum riski ve DSB oluşturmama gibi avantajları bulunmaktadır. Tez hipotezi; CRISPR Prime Editing yönteminin SMA hastalığı tedavisi için farklı SMN2 kopya sayılarına sahip alt tiplerde çalışarak SMN ekspresyon profilinin artırılabileceğidir. Tez kapsamında HDR tabanlı yaklaşımlara oranla pek çok avantaja sahip olan CRISPR-PE sistemi tercih edilerek bir terapötik bir tedavi geliştirilmiştir. SMN2 geni üzerinde c.859 G>C ve c.840 C-T tek nokta mutasyonunun modifiye edilerek stabil SMN protein ekspresyonunun sağlanması için pegRNA'lar tasarlanmıştır. Primer SMA Tip 1, Tip 2 fibroblast, Jurkat, HEK293T, HeLa, U87, gibi çeşitli hücre hatlarında CRISPR-PE sisteminin etkinliği yaklaşık 3 ay süre ile test edilmiştir. SMN-düşük Jurkat hücre hattında 3 aya kadar SMN ekspresyonunun stabil şekilde yüksek kaldığı tespit edilmiştir. SMA Tip 2 fibroblast hücrelerinde SMA Tip 1 fibroblast hücrelerine oranla SMN ve GFP ifadesinin uzun dönemde daha yüksek ve stabil bir şekilde sağlandığı tespit edilmiştir. Yapılan deneyler ile CRISPR-PE sisteminin SMN ekspresyonunu farklı SMN2 kopya sayısına sahip hücre hatları üzerinde artırma kapasitesi test edilmiştir. DNA üzerinde çift zincir kırılımına sebep olmadan ve hücre canlılığı üzerinde düşük toksisite gösterdiği tespit edilmiştir. SMA hastalığında  farklı alt tiplere yönelik çalışılacak CRISPR-PE sistemi için altyapı oluşturulmuştur.

Abstract:
SMA disease is a neuromuscular disease that progresses with neuron loss and muscle atrophy. There are two gene regions responsible for SMA disease; SMN1 and SMN2. Clinical subtypes of SMA disease are based on age of disease onset and SMN2 copy number. As a result of point mutations and heterozygous deletions in the SMN1 gene, exon 7 participation is prevented and non-functional SMN protein is produced. The truncated SMN protein expressed through the SMN2 gene is called SMNΔ7 (delta SMN). Low amounts of SMN protein expression is achieved through the SMN2 gene. There are results regarding the relationship of the SMN2 gene, which has a different copy number in each individual, with the disease course and phenotypic severity. To date, FDA approved for SMA disease; There are three drugs: Nusinersen, Zolgensma and Risdiplam. Although these drugs have serious positive results for treatment, the costs of the treatments are quite high. The CRISPR/Cas9 system makes it possible to correct changes in the genome. There are two different repair mechanisms that can occur for the repair of cut DNA; NHEJ and HDR. The CRISPR-PE system has advantages such as high efficiency, less risk of indel formation and no DSB formation compared to the Cas9-mediated HDR method. Thesis hypothesis; The CRISPR Prime Editing method can increase the SMN expression profile by working on subtypes with different SMN2 copy numbers for the treatment of SMA disease. Within the scope of the thesis, a therapeutic treatment was developed by choosing the CRISPR-PE system, which has many advantages compared to HDR-based approaches. PegRNAs were designed to ensure stable SMN protein expression by modifying the c.859 G>C and c.840 C-T single point mutations on the SMN2 gene. The effectiveness of the CRISPR-PE system was tested for approximately 3 months on various cell lines such as Primary SMA Type 1, Type 2 fibroblast, Jurkat, HEK293T, HeLa, U87. It was found that SMN expression remained stably high for up to 3 months in the SMN-low Jurkat cell line. It has been determined that SMN and GFP expression is higher and more stable in the long term in SMA Type 2 fibroblast cells than in SMA Type 1 fibroblast cells. With the experiments, the capacity of the CRISPR-PE system to increase SMN expression on cell lines with different SMN2 copy numbers was tested. It has been determined that it does not cause double strand breaks on DNA and has low toxicity on cell viability. An infrastructure has been created for the CRISPR-PE system to be used to study different subtypes of SMA disease.