Manyetik nanopartikül aracılığıyla Pichia pastoris'e yeni bir gen aktarım yönteminin geliştirilmesi
Improvement of a new gene transfer method to Pichia pastoris with magnetic nanoparticle
Yazar: ŞEYDA YILDIZ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ YAĞMUR ÜNVER
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Gen Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Bu tez çalışmasında Pichia pastoris mayasına şimdiye kadar gerçekleştirilen gen aktarım yöntemlerinden (LiCl-ısı şoku veya elektroporasyon vb.) farklı olarak yeni bir gen aktarım yöntemi geliştirilmiştir. Bu doğrultuda, maya hücrelerine gen aktarımında aracı olarak kullanılan manyetik nanopartiküller (Fe3O4@PEI) sentezlenmiş ve karakterize edilmiştir. Sentezlenen manyetik nanopartiküllerin maya hücreleri üzerinde toksik etkisinin olmadığı görülmüştür. Gen aktarımının doğrulanması için kullanılan yeşil floresan protein raportör geninin (Green Fluorescent Protein; GFP) kodon optimizasyonu yapılmış ve bu gen dizisi, ticari olarak temin edilen sentetik DNA'dan amplifiye edilerek pGKB ekspresyon plazmitine yerleştirilmiştir. E. coli hücrelerinde klonlanarak elde edilen rekombinant DNA (pGKB-GFP) manyetik nanopartiküller ile bir araya getirilmiş, optimum şartlarda elde edilen manyetofektin mıknatıs aracılığıyla maya hücrelerine transfer edilmiştir. Antibiyotik seçilimi ve PCR reaksiyonu ile genomlarında GFP genini taşıyan maya transformantları doğrulanmış, GFP üreten hücreler konfokal mikroskopta görüntülenmiştir. Böylece rekombinant protein üretiminde sıklıkla kullanılan P. pastoris mayasına ilk defa manyetik nanopartikül aracılığıyla gen aktarımı gerçekleştirilmiştir. Bu yöntemin, kolay bir şekilde uygulanabilir olması, ucuz olması, az miktarda DNA'ya gereksinim duyması, kompetent hücre hazırlanmasına gerek duymaması ve transformasyon işleminin kısa sürede gerçekleştirilmesi gibi birçok avantaja sahip olduğu söylenebilir.

Abstract:
In this thesis study, a new gene transfer method has been developed in contrast to the gene transfer methods (LiCl-heat shock or electroporation etc.) applied to Pichia pastoris yeast up to now. Accordingly, magnetic nanoparticles (Fe3O4@PEI), which are used as a mediator of gene transfer to yeast cells, have been synthesized and characterized. It was found that the synthesized magnetic nanoparticles had no toxic effect on yeast cells. The codons of the Green Fluorescent Protein reporter gene (GFP) used to confirm gene transfer was optimized and this gene sequence was amplified from commercially assured synthetic DNA and inserted into the expression plasmid pGKB. Recombinant DNA (pGKB-GFP) obtained by cloning in E. coli cells was combined with magnetic nanoparticles and the magnetofectin obtained under optimum conditions was transferred to yeast cells by means of magnet. Yeast transformants carrying GFP gene in their genomes were confirmed by antibiotic selection and PCR reaction, GFP producing cells were visualized on confocal microscope. Thus, gene transfer by means of magnetic nanoparticle, to P. pastoris yeast, which is frequently used in recombinant protein production was realized for the first time. It can be said that this method has many advantages such as being easy to apply, being inexpensive, requiring a small amount of DNA, not requiring a competent cell preparation and the transformation process being performed in a short time.