Elektrokimyasal immün yöntem ve radioaktif immün yöntemle yapılan 25-hidroksivitamin D3'ün ölçümlerinin karşılaştırılması
Comparison of 25-hydroxyvitamin D3 measurements made by elecrtochemical immune and radioactive immune methods
Yazar: SELMA YÖRDEM
Danışman: PROF. DR. AHMET ZEHİR
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kan dolaşımındaki 25-Hidroksivitamin vitamin D3'ün (25-OH D3 vitamin)konsantrasyonunun insan vücudundaki kullanılabilir D vitaminini en iyi yansıtanparametre olduğu bilinmektedir. Dolaşımdaki 25-OH D3'ün konsantrasyonununkemik hastalıklarının takibinde son derece önemlidir. İnsan kemik yapısınındüzenli gelişiminin sağlanması ve sürdürülmesi için gerekli olan D vitamini aynızamanda kalsiyum ve fosfat dengesinin sağlanmasında da önemlidir.Bu çalışmada 25-OH D3 vitamin tayininde kullanılan Radyoimmün ölçüm(RIA, Radıoımmun Assay) yöntemine alternatif olarak Elektrokemiluminesansimmün ölçüm (ECLIA, Electrochemiluminescence Immunoassay) yöntemi esasalınarak ölçüm sonuçları karşılaştırılmış ve ayrıca yöntemin etkinliğininaraştırılması amaçlanmıştır. Her yeni yöntemin performansının uygunluğunugösterebilmek için rutin hasta örneklerinin analiz sonuçlarının izlenmesi vebulunan sonuçların değerlendirmesi amacıyla bir seri metod çalışmasınınyapılması gerekmektedir. Yöntem değerlendirme çalışması sırasında gün-içi vegünler-arası kesinlik (presizyon), linearite (doğrusallık), interferans (etkenmadde), geri elde deneyi ve yöntem karşılaştırma çalışmaları yapıldı.Kesinlik deneyinde 25-OH D3 vitamin'in gün-içi tekrarlayıcılığını saptamakamacıyla yapılan çalışmada 2. seviye kontrol serumu için CV (Coefficient ofVariation) değeri % 3.32, 3. seviye kontrol serumu için CV değeri %3.42bulundu. Günler-arası kesinlik çalışmasında ise 1. seviye kontrol serumu içinCV değerleri %3.29, 2. seviye kontrol serumu için CV değeri % 4.78 bulundu.Linearitenin belirlenebilmesi için yapılan çalışmada 25-OH D3 vitamin'in11.18 - 50 ng/ml arasında linear olduğu bulundu. Hemolizin 25-OH D3 vitaminiüzerine olan etkisi araştırmak için EDTA'lı tüplere iki farklı kan örneği alındı vetüp içersinde eritrositler fiziksel olarak farklı düzeylerde parçalandı. Farklıhemoliz düzeylerindeki % azalmalar hesaplandı ve hemoliz miktarınınartmasıyla 25-OH D3 vitamin konsantrasyonların da azalma olduğu tespit edildi.Geri elde deneylerinde 10,94 ng/ml ve 55,65 ng/ml 25-OH D3 vitaminiçeren stok çözeltilerine 2 farklı konsantrasyonda miktarı bilinen 25-OH D3vitamin plazma havuzlarından belirli miktarlarda eklendi. Eklemeler sonrasıyapılan 25-OH D3 vitamin ölçümler ile başlangıçtaki 25-OH D3 vitamindeğerleri karşılaştırılarak her bir seviye için geri elde yüzdeleri hesaplandı.Ortalama geri elde yüzdesi % 106,5 bulundu. Bu değerden yola çıkarak oransalhata (OH) hesabı yapıldı. OH (% 106,5 ? % 100) % 6,5 bulundu. Bulunansonuç izin verilebilen hatadan düşük olduğu için yöntem performansının kabuledilebilir düzeyde olduğuna karar verildi.Yöntem karşılaştırma deneylerinde için 40 plazma örneği kullanıldı.Referans yöntem olarak laboratuarımızda rutin olarak kullandığımız RIAyöntemi seçildi. Her bir plazma örneği aynı zaman diliminde her iki yöntemleçalışıldı. Lineer regresyon analizi kullanılarak yapılan istatistik incelemedekorelasyon katsayısı (r) r= 0,94 olarak bulundu.Bu çalışmalar doğrultusunda 25-OH D3 vitamin ölçümünde yeni metodungeliştirilmesi, analitik performans, laboratuvarda kolayca uygulanabilirliği veklinik olarak alışılagelmiş RIA metoduna karşı pek çok üstünlük sağlamıştır.Bunun için 25-OH D3 vitamin `in in vivo değişkenlikleri ve her laboratuvardafarklı ortam şartlarının bulunması göz önüne alınarak bu çalışmaların düzenli vegüvenilir bir biçimde yapılması sağlanmıştır.

Abstract:
It is known that the measurement of 25-OH Vitamin D3 in blood circulation isthe best parameter for determination of usable Vitamin D in the human body. Themeasurement of 25?OH Vitamin D3 in circulation is extremely important formonitoring of bone diseases. Vitamin D, which is needed for obtaining andmaintaining the proper development of human bone structure, is also important forkeeping the calcium ? phosphate balance.In this research study, as an alternative for Radioimmun Measurement (RIA)method for determination of 25?OH Vitamin D3, ECLIA (ElectromilumlunesansImmune Measurement) is used and measurements have been mutually compared,and it is desired to examine the effectiveness of the study. To be able to demonstratethe proper performance of each new method, a series of methods studies should becarried out for routine patients? analysis results and evaluation of the obtainedoutcomes. During the method evaluation study phase, within-days and betweendaysprecision, linearity, interference, feedback experiments and method comparisonstudies have been undertaken.During the study for determination of the precision of 25?OH Vitamin D3,the within- days reoccurrence of 2nd level control serum, the CV (Coefficient ofVariation) value is found as 3.32 %; and for the 3rd level control serum the CV valueis found as 3.42 %. During the between-days precision study, the CV value for 1stlevel control serum is found as 3.29%, and the CV value for the 2nd level serum isfound as 4.78 %.During the study for determination of the linearity of 25?OH Vitamin D3,linearity is observed between 11,18-150 ng/ml levels. To search the effect ofhemolysis on 25-OH Vitamin D3, two different blood samples have been taken intubes with EDTA, and erythrocytes have been physically crashed at different levels.Percentage decreases at different hemolysis levels have been calculated and it isfound that the concentrations of 25 ? Vitamin D3 decrease as the hemolysis increase.Through feedback experiments, certain amounts from 25 ? OH Vitamin D3plasma pools at 2 different levels have been added into dissolved stocks containing10,94 ng/ml and 55,65 ng/ml of 25?OH Vitamin D3. The 25?OH Vitamin D3 valuespre ?addition and post- addition have been compared ad feedback percentage isfound to be as 106.5 %. Rational mistake calculation is made based on this value.OH (106.5 % - 100 % ) is found as 6.5%. As the obtained result is less than theallowable mistake, it is concluded that the method performance is acceptable.40 plasma samples have been used for method comparison studies. RIAmethod, which we routinely use at our laboratories has been chosen as the referencemethod. For each plasma sample, it is worked with each two methods within thesame time period. Linear regression analysis has been used for statistical evaluationand the coefficient of correlation is found to be as r = 0,94.Through these studies, the development of the new method for 25?OHVitamin D3 measurement has demonstrated many advantages over the clinicallyroutine RIA method, such as analytical performance, easy application at laboratories.For this reason, in vivo variability of 25?OH Vitamin D3, and different conditions inany given laboratory have been taken into consideration and it is established thatthese studies have been undertaken in a proper and reliable manner.