İnfluenza virüsü yüzey antijen proteinlerinin mikroorganizmalarda rekombinant olarak üretilmesi ve analizi
Production and analysis of influenza virus surface antigen proteins in microorganisms
Yazar: ŞEYMA ÖZAYDIN
Danışman: PROF. DR. KADİR TURAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antijenler-yüzey = Antigens-surface ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Hemaglütininler = Hemagglutinins ; Mikroorganizmalar = Microorganisms ; Nöraminidaz = Neuraminidases ; Ortomiksovirüsler = Orthomyxoviridae ; Pichia pastoris = Pichia pastoris ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic ; İnfluenza = Influenza ; İnfluenza virüs = Influenza virus

Özet:
Amaç:İnfluenza A virüsleri insanlarda sık sık tekrarlayan grip salgınlarına sebep olan zarflı virüslerdir. Virüs membranında yer alan HA ve NA proteinleri enfeksiyonların seyrini belirler. Bu proteinler, influenza virüsüne karşı kullanılan rekombinant aşıların da temel bileşenidir. Bu tez çalışmasında, aşı olarak kullanım potansiyeline sahip influenza virüsü HA ve NA proteinlerinin rekombinant DNA teknolojileri ile bakteri ve maya hücrelerinde üretilmesi, bakteri ve maya hücrelerinin bu proteinleri üretebilme kapasitelerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem:Çalışmada viral genlerin elde edilmesinde İnfluenza A/WSN/33 (H1N1) virüsleri kullanıldı. Konak olarak Escherichia coli ve Pichia pastoris hücrelerinden yararlanıldı.  HA ve NA proteinlerini kodlayan genler İnfluenza A virüsleri ile enfekte HEK293 hücrelerden ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu ile elde edildi. cDNA'lar, standart DNA klonlama teknikleri ile ekspresyon vektörlerine klonlandı. Elde edilen plazmit vektörler E. coli veya P. pastoris hücrelerine transforme edildi. Hücreler liziz tamponunda ya da sonikasyon ile parçalandı ve hücre lizatları SDS-PAGE / Western melezleme teknikleri ile viral proteinler için analiz edildi. Bulgular ve Sonuç: Çalışmada İnfluenza A virüsü HA ve NA proteinlerini kodlayan altı adet bakteri ekpresyon vektörü; dört adet maya ekpresyon vektörleri elde edildi. Vektörlerde taşınan genlerin doğruluğu DNA dizi analizleri ile ortaya kondu. E. coli hücrelerinde sentez edilen HA ve NA proteinlerinin hücreler için toksik olduğu ve bakteri üremesini ileri düzeyde yavaşlattığı saptandı. E. coli hücrelerinin NA proteinin HA proteinine göre daha yüksek düzeylerde sentez edebildiği görüldü. P. pastoris maya hücrelerinin ise, çalışmada denenen koşullarda, viral genleri genomlarında taşımalarına karşın SDS-PAGE/Western melezleme teknikleri ile belirlenebilecek düzeyde viral protein sentez etmediği saptandı.

Abstract:
Aim:Influenza A viruses are enveloped viruses that cause recurrent flu epidemics in humans. Viral membrane proteins, HA and NA determine the course of infections. These proteins are also a key component of recombinant vaccines used against influenza virus. In this study, it was aimed to product the Influenza virus HA and NA proteins by using DNA technology in bacterial and yeast cells and, to compare the viral protein production capacity of these cells.Material and Methods:Influenza A/WSN/33 (H1N1) viruses were used for isolation of viral genes. Escherichia coli and Pichia pastoris cells were used as hosts. The HA and NA genes were isolated by reverse transcription-polymerase chain reaction from influenza A virus-infected HEK293 cells. The cDNAs were cloned into the expression vectors by standard DNA cloning techniques. The resulting plasmids were transformed into E. coli and P. pastoris cells. The cells were lysed in lysis buffer or sonication, and the lysates were analyzed with SDS-PAGE / Western blotting techniques for viral proteins.Results and Discussion:In this study, six expression plasmids for bacteria and, four expression plasmids for yeast cells, encoding Influenza A virus HA and NA proteins, were constructed. The accuracy of the plasmids for viral genes were revealed with DNA sequencing. It was shown that the HA and NA proteins are very toxic for E. coli cells and, these proteins significantly reduce bacterial growth in culture. It was also found that E. coli cells produce NA protein at higher levels compering to HA protein. In Pichia pastoris, it was shown that the viral HA and NA genes were integrated in the yeast genome by using PCR. However, viral proteins could not be detected by SDS-PAGE / Western blotting techniques under the experimental conditions applied in the study.