Denizel sediment örneklerinden biyoaktif metabolit üretici aktinomisetlerin kültürel ve moleküler yöntemlerle karakterizasyonu ve biyoaktif metabolitlerin saflaştırılması
Cultural and molecular characterization of bioactive metabolite producing actinomycetes from marine sediment samples and purification of bioactive metabolites
Yazar: SEMİHA ÇETİNEL AKSOY
Danışman: PROF. DR. ATAÇ UZEL ; PROF. DR. ERDAL BEDİR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Kimya = Chemistry ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu tez çalışmasında, Ege ve Akdeniz'in Türkiye kıyılarındaki farklı bölgelerinden elde edilen sediment örneklerinden denizel kökenli biyoaktif metabolit üretici aktinomisetlerin izolasyonu, kültürel ve moleküler yöntemlerle karakterizasyonu ve biyoaktif moleküllerin saflaştırılması amaçlanmıştır.
Bu çalışmada, TÜBİTAK projesi (SBAG 109S361) kapsamında 3 farklı bölgedeki 46 ayrı lokasyondan alınan sediment örneklerinden 104 adet aktinomiset izole edilmiştir. Disk difüzyon yöntemi kullanılarak, 104 izolattan 61'inin en az bir test organizmasına karşı antimikrobiyal aktivite gösterdiği saptanmıştır. Antimikrobiyal aktivite gösteren izolatlar, kültürel karakteristikler ve 16S rDNA bölgesi dizileri kullanılarak tanılanmıştır. Fenotipik ve moleküler karakterizasyon sonuçlarına göre biyoaktif izolatların, Streptomyces, Nocardia ve Nocardipsis genuslarına dahil olduğu görülmüştür.
3 farklı bölgeden alınan sediment örneklerindeki çevresel DNA'larda (eDNA) antibiyotik biyosentez genlerinin saptanması için eDNA'lar, antibiyotik üretimiyle ilişkili Poliketid sentaz 1, Poliketid sentaz 2 ve Ribozom dışı peptit sentetaz genlerinin mevcudiyeti açısından taranmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu amplifikasyonları sonrasında, ikişer örnekte Poliketid sentaz 2 ve Ribozom dışı peptit sentetaz genlerine rastlanırken, 3 örneğin hiçbirinde Poliketid sentaz 1 geninin varlığı gözlenmemiştir.
Çalışmamızda, kültüre edilebilir aktinomiset suşları da Poliketid sentaz 1, Poliketid sentaz 2 ve Ribozom dışı peptit sentetaz genlerinin varlığı açısından taranmıştır. Tarama sonrasında 104 aktinomiset suşundan 81 tanesinin, antibiyotik üretimi ile ilişkili genlerden en az birine sahip olduğu belirlenmiştir. Bunlardan 56 tanesinin antimikrobiyal aktivitesi saptanmış, geri kalanların aktivitesi ise kullanılan yöntemlerle test organizmalarına karşı saptanamamıştır. Diğer taraftan, antimikrobiyal aktivite gösteren 5 aktinomiset suşunda herhangi bir biyosentetik gen saptanamamıştır.
Ön fermentasyon denemeleri sonuçlarına göre, yüksek aktivite ve farklı İnce tabaka kromotografi profilleri gösteren 06ÇM016 ve 14ÇM034 no'lu aktinomiset suşları büyük-ölçekli fermentasyon çalışmalarına dahil edilmiştir. Kromatografik teknikler kullanılarak gerçekleştirilen biyoaktivite-rehberli izolasyon, 25 adet molekülün saflaştırılmasını sağlamış ve bunlardan 10 tanesinin yapı tayinleri gerçekleştirilmiştir. 06ÇM016 no'lu aktinomiset suşundan saflaştırılan 5 adet molekülün (06ÇM016-01, 06ÇM016-02, 06ÇM016-03, 06ÇM016-04 ve 06ÇM016-05), nükleozit analoğu olduğu anlaşılmıştır. Bu bileşiklerin tamamı, Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus ve Candida albicans'a karşı antimikrobiyal aktivite göstermiştir. Diğer taraftan, NMR ve MS verilerine göre 14ÇM034 no'lu aktinomiset suşundan elde edilen 5 adet molekülün polieter (14ÇM034-01, 14ÇM034-02 ve 14ÇM034-03) ve pirolobenzodiazepin (14ÇM034-04 ve 14ÇM034-05) olduğu anlaşılmıştır. Bu moleküllerin tamamı, test organizmalarının hepsine karşı antimikrobiyal aktivite göstermiştir.
Literatür taramaları, elde edilen bileşiklerden 5'inin (06ÇM016-02, 06ÇM016-05, 06ÇM016-08, 14ÇM034-02 ve 14ÇM034-04), doğa için yeni sekonder metabolitler olduğunu ortaya koymuştur. Özellikle 06ÇM016-05'deki 4-Metil-okzazolidin halkasına, doğal bir üründe ilk kez karşılaşılmıştır. Ayrıca Streptomyces cacaoi'de pirolobenzodiazepin türevlerinin varlığı ilk kez bu çalışma ile ortaya konmuştur.
İzole edilen moleküllerin Gram (+) ve Gram (-) dirençli patojenler ve ökaryotik organizmalar üzerine aktivitesinin olması geniş spektrumlu antibiyotik olarak kullanılabileceklerini göstermektedir ki bu özellikle nükleozit analogları için beklenen bir durumdur.

Abstract:
Aims of this thesis were isolate marine derived bioactive metabolite producing actinomycetes from marine sediments, which were obtained from different regions of Aegean and Mediterranean coasts of Turkey, to characterize the isolates by cultural and molecular methods and to purify their bioactive molecules.
In this study, 104 actinomycetes were isolated from sediment samples obtained from 46 different locations in 3 different regions within the scope of TUBİTAK project SBAG 109S361. Sixty-one out of 104 isolates were determined to have antimicrobial activity against at least one test organisms in the disc diffusion assay. The isolates showing antimicrobial activity were identified by using cultural characteristics and sequence of 16S rDNA region. According to the results of phenotypical and molecular characterisation, the bioactive isolates were found to be members of Streptomyces, Nocardia and Nocardiopsis genus.
To determine biosynthetic genes responsible for antibiotic production, the environmental DNAs (eDNA) were screened for the presence of PKS1, PKS2 and NRPS genes. Following the PCR amplifications, the PKS2 and NRPS genes were found in two samples, whereas the presence of PKS1 gene was not encountered in any samples.
Moreover, the cultivable actinomycete strains were also screened for the same genes, which revealed that 81 out of 104 actinomycete strains had at least one gene related to the antibiotic production. The antimicrobial activity results showed that 56 out of 104 isolates were active against the test strains. On the other hand, 5 of the bioactive isolates were negative for analyzed biosynthetic genes.
Based on the preliminary experiments, the actinomycete strains 06ÇM016 and 14ÇM034, displaying high activity with interesting thin layer chromatography profiles, were selected for further studies including large-scale fermentation, extraction and purification. Bioactivity-guided isolation by chromatographical techniques led to the isolation of 25 molecules and structural characterization of 10 compounds were accomplished. Five molecules (06ÇM016-01, 06ÇM016-02, 06ÇM016-03, 06ÇM016-04 and 06ÇM016-05) purified from the actinomycete strain 06ÇM016 were found to be nucleoside analogues. All of the compounds showed antimicrobial activity against Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus and Candida albicans. On the other hand, 5 molecules obtained from the actinomycete strain 14ÇM034 were deduced to be polyether (14ÇM034-01, 14ÇM034-02 and 14ÇM034-03) and pyrrolobenzodiazepine derivatives (14ÇM034-04 and 14ÇM034-05) by NMR and MS data. All the compounds showed antimicrobial activity against the whole test organisms.
A literature search revealed that 5 compounds (06ÇM016-02, 06ÇM016-05, 06ÇM016-08, 14ÇM034-02 and 14ÇM034-04) were new metabolites for nature. Especially, 4-Methyl-oxazolidine ring in 06ÇM016-05 was encountered for the first time in a natural product. Additionally, the presence of pyrrolobenzodiazepine derivatives in S. cacaoi was reported for the first time.
The potent antimicrobial activity against Gr (+) and (-) resistant pathogens and eukaryotic organisms implies that the compounds isolated, especially nucleoside analogues, will be of use as broad spectrum antibiotics.