Anoxybacillus kestanbolensis AC26sarı suşundan arabinofuranosidaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve enzimin karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of thermophilic ?-L arabinofuranosidase from anoxybacillus kestanbolensis AC26sari
Yazar: MURAT KAÇAĞAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SABRİYE ÇANAKÇI
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, Anoxybacillus kestanbolensis AC26Sarı suşundan ? -L-Arabinofuranosidaz geninin elde edilmesi, klonlanması, ekspresyonu ve enziminin karakterizasyonu yapılmıştır.Klonlanıp ekspres edilen bu enzimin molekül ağırlığı 57 kDa olup amino asit benzerliğine göre glikosil hidrolaz familya 51 sınıfı bir enzim olduğu belirlendi. Ekpresyon vektörüne (pET28a+) his taq kuyruk içerecek şekilde klonlanan arabinofuranosidaz (Abf) geni Escherichia coli BL21 hücresine aktarılarak enziminin ekspresyonu gerçekleştirildi. MagneHisTM Protein Purification System (Promega) kiti kullanılarak enzim saflaştırıldı ve karakterizasyonu yapıldı. Enzimin çeşitli pH aralıklarında (pH 4.0 - 10.0) ve sıcaklıklarda (40-90?C) gerçekleştirilen çalışmalar sonucu optimum aktivite gösterdiği pH'ın 6.5 ve optimum aktivite gösterdiği sıcaklığın 65?C olduğunu belirlendi. Substrat olarak p-nitrophenyl ? -L-arabinofuranozid ve sugar beet arabinan kullanılarak yapılan kinetik çalışmalar sonucunda Km değerleri sırasıyla 0.139 mM ve 5.21 mg/ml, Vmax değerleri ise sırasıyla 1019 U/mg protein ve 156.25 ? mol olarak belirlendi. Metal iyonlarının ve çeşitli kimyasalların enzime olan etkileri değişik konsantrasyonlarda gerçekleştirilen çalışmalar sonucunda belirlendi ve 1 mM konsantrasyonda Cu2+ ve Hg2+ bivalent metal iyonlarının enzim aktivitesini neredeyse tamamen inhibe ettiği görüldü. Saflaştırılan enzim sugar beet arabinan, rye arabinoxylan, oat spelt xylan ve arabinooligosakkaritleri (arabinobiose, arabinotriose, arabinotetraose ve arabinopentaose) hidroliz ederek arabiboz şekeri açığa çıkardığı gözlendi ve bu açığa çıkan arabinoz şekeri ince tabaka kromotografisi (TLC) ile tespit edildi. A. kestanbolensis AC26Sarı suşuna ait arabinofuranosidaz enziminin endo arabinanaz aktivitesi substrat olarak Red Debranched Arabinan ( RDA) kullanılarak araştırıldı ve yapılan deneyler sonucunda enzimin endoarabinanaz aktivitesine sahip olmadığı görüldü. Yapılan çalışmalar sonucunda enzimin bir ekzo-arabinofuranosidaz olduğuna karar verildi.

Abstract:
The gene, AbfAC26Sari, encoding an ? -L-arabinofuranosidase from Anoxybacillus kestanbolensis AC26Sari, was isolated, cloned, expressed, and characterizated.On the basis of amino acid sequence similarities, this 57 kDa enzyme could be assigned to family 51 of the glycosyl hydrolase classification system. Characterization of the purified recombinant ? -L-arabinofuranosidase produced in Escherichia coli BL21 revealed that it is active at a broad pH range (pH 4.0 to 10.0) and at a broad temperature range (40-90?C), and it has an optimum pH of 5.5 and an optimum temperature of 65?C. Abf gen, includes his taq tail, cloned in expression vector (Pet28 a +) was transformed into E. coli cell BL21 and enzyme expression was done. The enzyme was purufied by MagneHisTM Protein Purification System (Promega) and characterized. Kinetic experiment at 65?C with p-nitrophenyl ? -L-arabinofuranoside and arabinan as substrate gave a Vmax of values 1019 U/mg and 156.25 ? mol , and Km values of 0.139 mM ve 5,21 mg/ml, respectively. Effects of metal ions and chemicals on the enzyme was determined by the studies that were conducted with different concnetrations. Cu+2 and Hg+2 (1Mm) almost compeletely inhibited the enzyme activity. The recombinant arabinofuranosidase released L-arabinose from arabinan, arabinoxylan, oat spelt xylan, arabinobiose, arabinotriose, arabinotetraose, and arabinopentaose and the sugars were seperated by thin layer chromatographi. Endoarabinase activity of ABf from Anoxybacillus kestanbolensis AC26Sarı was studied by using RDA as susbtrate. Endoarabinanase activity was not detected. These findings suggest that ABfAC26Sari is an exo-acting enzyme.