Gingival fibroblastlarda bifosfonat uygulamasına bağlı oluşan yaranın iyileşmesinde ozonun etkilerinin in vitro olarak değerlendirilmesi
Effect of the ozone on healing of bisphosphonate related wounds using  gingival fibroblasts: an  in-vitro study
Yazar: ESRA ERSÖZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. UFUK ATEŞ
Başkent Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Ağız, Diş, Çene Hastalıkları ve Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Fibroblastlar = Fibroblasts ; Fosfonat = Phosphonate ; Gingiva = Gingiva ; Kollajen = Collagen ; Ozon = Ozone ; Yara iyileşmesi = Wound healing ; Çene = Jaw ; İn vitro = In vitro

Özet:
Bifosfanat kullanımına bağlı çene kemiği nekrozu (BRONJ) uzun dönem bifosfonat terapisi altındaki hastalarda görülen, iyileşmeyen oral mukoza ve ekspoze çene kemiği ile karakterize bir komplikasyondur. Etyopatogenizini açıklamak için önceleri kemik doku üzerinde durulurken günümüzde yumuşak doku çalışmaları önem kazanmıştır. 
Hastaların yaşam kalitesini önemli derecede etkileyen BRONJ `un tedavisi oldukça karmaşık ve güçtür. Hiperbarik oksijen terapisi, lazer gibi  birçok alternatif yöntem denenmiştir ancak kesin bir tedavi protokolü oluşturulamamıştır. Son dönemlerde BRONJ tedavisinde ozonun faydalı olduğunu bildiren vaka raporları literatürde yer almıştır.
 Bu çalışmada, gingival fibroblastlarda bifosfonat uygulamasına bağlı oluşan yaranın iyileşmesinde ozonun etkilerinin in vitro olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
18-30 yaş arası, sağlıklı 6 hastadan sürmemiş dişlerin ortodontik tedavi ile sürdürülmesi için üzerinin açılması sırasında elde edilen gingival doku örneklerinden fibroblast kültürü elde edilmiştir. İstenilen miktarda hücreye 6 - 9. pasajda ulaşılmıştır. 
Kültürlere yalnızca pamidronat, pamidronat + ozon veya yalnızca ozon uygulaması yapılarak 24, 48 ve 72 saat inkübe edilmiştir ve herhangi bir uygulama yapılmayan kontrol grubu ile karşılaştırılmıştır. Pamidronat + ozon uygulaması yapılan grupta, 24 saat inkübe edilen kültürlere pamidronat ve ozon eş zamanlı olarak uygulanırken,  48 ve 72 saat inkübe edilen kültürlere pamidronat uygulaması sonrası 24. saatte ozon uygulanmıştır. 3ml besiyeri içindeki kültürlere son konsantrasyon  10-4 M olacak şekilde pamidronat uygulanmıştır. Ozon uygulması Ozonytron X medikal ozon jeneratörü aracılığı ile uygulanmıştır.
 İnkübasyon süresi dolan kültürler 1 ml Tripure Isolation Reagent içine alınarak total RNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir ve -200C?de saklanmıştır . COL1A1 ve COL1A2 genlerinin ifadelenme düzeyleri, housekeeping gen olarak GAPDH kullanılarak incelenmiştir. RT-PCR yöntemi ile COL1A1 ve COL1A2 genlerinin ifadelenmeleri incelenmiştir.
Ozon uygulaması, yalnızca ozon uygulanan grupta ve ozon ve pamidronatın birlikte uygulandığı grupta COL1A1 ve COL1A2 gen ifadelenme düzeylerini arttırmıştır. Ozon grubunda en anlamlı artış 48 saatte görülürken, ozon + pamidronat grubunda 72 saatte, yani ozonun 24. saatte uygulanarak, 48 saat ozona maruz kalma süresi sonunda gözlenmiştir. Ozon uygulaması sonrası 72 saatte ozonun etkisinin ortadan kalktığı  belirlenmiştir ve COL1A1 ve COL1A2 ifadelenmelerinde artış görülmemiştir. 
Çalışmadan elde edilen bulgular ozon uygulamasının yara iyileşmesinin önemli bir basamağı olan kollajen sentezini arttırdığını ortaya koymaktadır.  Ozonun kollajen sentezine olan maksimum etkisi uygulamadan 48 saat sonra görülmüştür ve 72 saat sonunda 48 saate göre düşüş gözlenmiştir. Bu bulgu doğrultusunda, oral mukozal yaralarda ozon uygulaması 48 saat aralıklar ile yapılmalıdır.

Abstract:
Bisphosphonate related osteonecrosis of the jaws (BRONJ) is a complication seen in patients undergoing long-term bisphosphonate therapy and characterized by non-healing oral mucosa and exposed necrotic jaw bone. Previously, bone tissue studies was commonly performed to explain the pathogenesis of BRONJ, recently soft tissue researches became more important.   
Treatment of BRONJ is still complicated. Alternative modalities as hyperbaric oxygen and laser have been tired in BRONJ treatment, however; there has not been effective treatment protocol yet. Recently, some case reports have been published stating the effect of ozone therapy in BRONJ treatment have been published.
The purpose of this study was to evaluate the effect of the ozone on healing of   bisphosphonate related wounds using gingival fibroblasts in-vitro.
6 healthy patients, with age range 18-30 included in this study. Human gingival fibroblasts obtained from gingiva excised above unerupted teeth for orthodontic traction. Sufficient cell number was achieved at passage 6-9. 
Cultures were treated with only pamidronate, pamidronate + ozone or only ozone and incubated 24, 48 or 72 hours and compared with untreated group.  Pamidronate and ozone were applied simultaneously to  the cultures incubated 24 hours.  The cultures, incubated 48 and 72 hours, treated with ozone 24 hours after pamidronate application. Final concentration of applied pamidronate was regulated as 10-4 M and ozone application was made by OzonytronX medical ozone generator. 
Total RNA isolation was achieved by 1ml Tripure Isolation Reagent application to cultures at the end of the incubation period and freezed at -200C. COL1A1 and COL1A2 gene expressions were evaluated with RT-PCR. GAPDH was used as housekeeping gene. 
COL1A1 and COL1A2 expressions were higher in ozone group compared with control group at 48 hours. In pamidronat + ozone group, COL1A1and COL1A2 expressions was increased at 72 hours which means 48 hours after ozone application. After 72 hours of ozone application, there was no increase in COL1A1 and COL1A2 expressions.
The results of this study show that; ozone induced the collagen expression, an important phase of wound healing. Maximum effect of ozone on collagen expression was observed at 48 hours after application and collagen expression decreased at 72 hours. In oral mucosal wounds, ozone must be applied at 48 hours intervals to keep increased collagen expression.