Crohn hastalığında kalprotektin tayini için aptamer temelli biyosensör geliştirilmesi
Development of aptamer-based biosensor for the determination of calprotectin in crohn's disease
Yazar: ÇİĞDEM GÖZDE ASLAN
Danışman: PROF. DR. YASEMİN AKÇAY
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Gastroenteroloji = Gastroenterology
Dizin: Aptamerler = Aptamers ; Biyosensörler = Biosensors ; Crohn hastalığı = Crohn disease ; Empedans = Impedance ; Kalprotektin = Calprotectin ; Sensörler = Sensors ; Spektroskopi = Spectroscopy ; İnflamatuar bağırsak hastalıkları = Inflammatory bowel diseases

Özet:
İnflamatuvar bağırsak hastalıkları (İBH), bilinen bir tedavisi olmayan gastrointestinal sistemin (GİS) kronik seyirli, remisyon ve alevlenme dönemleriyle karakterize inflamatuvar bir hastalık grubudur. İBH kişilerde genetik yatkınlığa bağlı olarak farklı seyredebilir ve hayati tehlike oluşturacak şekilde ileri boyutlarda da görülebilir. İBH, Ülseratif kolit (UK) ve Crohn Hastalığı (CH) olarak iki gruba ayrılır. İBH'nin tanısında kolonoskopi altın standarttır ancak girişimsel olması, maliyetinin yüksek olması, uzun zaman gerektirmesi gibi dezavantajları vardır. Günümüzde hastalıkların tanı, tedavi ve tedavi sonrası izleme süreçlerinde büyük gelişmeler kaydedilmiştir. Bu gelişmelerin ışığında tanı, tedavi ve tedavi sonrası izleme süreçlerinin birbiri ile bağlantılı olduğu bilinmektedir. Bu tez projesinin başvurusunda ise Crohn hastalığının tüm bu süreçlerini ele alan, özellikle de tanı kısmı yani başlangıç kısmını hedef alacak şekilde bu projeyi geliştirmek amaçlanmıştır. Buna göre, Crohn hastalığında ölçülen parametrelerden olan fekal kalprotektin ölçümü için düşük maliyetli, hızlı, doğru ve etkili bir tanı sistemi olan biyosensör ve sensör sistemleri geliştirilmesi sayesinde hastaya konfor sağlanması, sağlık harcamalarının düşürülmesi ve dışa bağımlılığın azaltılması ile ileride oluşacak hastalıklar için de önlemlerin alınmasını sağlayacak işlemlerin gerçekleştirilmesi bu projenin temel hedefidir.
Elde edilen bulgulara bakıldığında, biyosensör sistemi hedef immobilizasyon metodu ile modifiye edildikten sonra kalprotektin biyobelirtecinin belirlenmesi için uygun hale getirilmiştir. Altın nanopartikül üzerine, sisteamin ve avidin-biyotin etkileşmesi ile immobilize edilen aptamer ile biyosensör geliştirilmiştir. Aptamer üzerindeki işaretçi molekül her ne kadar yüksek potansiyelde dönüşüme uğrasa da, konformasyonel değişimler sonucunda kalprotektin bağlanması ile elektrokimyasal potansiyeli azalmıştır. Bu Tek Taramalı Voltametri (Linear Sweep Voltammetry-LSV) sonuçlarından görülmektedir. Biyosensör 20-800 g/g aralığında ölçüm olanağı sağlamaktadır. Bu değer, piyasada kullanılan bir metot olan Lateral Akış Analizi (Lateral Flow Assay-LFA)'den daha duyarlı olduğunu göstermektedir. Metot karşılaştırması bakımından yorumlandığında ise biyosensör LFA kadar doğru sonuç verebilmektedir. En düşük saptama sınırı (Limit Of Detection-LOD) ve en düşük ölçüm sınırı (Limit Of  Quantification-LOQ) değerleri ise standart grafikle korele olduğundan oldukça uygun bir biyosensör olarak karşımıza çıkmaktadır. Kronoimpedimetrik ölçüm ile ölçüm süresi, 900 saniye olarak belirlenmiştir. Daha düşük zamanlarda ölçüm yapılması da optimizasyon çalışmaları ile mümkün olmakla birlikte deneysel deneysel olarak geliştirmede anlamlı sinyal bakımından bu süre yeterlidir. Afinite temelli bağlanma ve aptamerin afinitesi bu süreyi belirlemektedir. Seçicilik olarak bakıldığında ise dimerleşmeden önceki halleri olan S100A8 ve 9'a karşı çok düşük oranlarda sinyal vermesi çalışmanın geleceği açısından umut vadetmektedir. Sonuç olarak aptamer temelli olarak tasarlanan kalprotektin biyosensörü Crohn hastalığında kullanılan bu biyobelirtecin ölçülmesi için oldukça uygundur.

Abstract:
Inflammatory bowel diseases (İBD) are a group of inflammatory diseases of the gastrointestinal system (GIS) for which there is no known cure, with a chronic course, characterized by periods of remission and exacerbation. IBD can have a different course in people depending on genetic predisposition and can be seen in life-threatening advanced dimensions. İBD is divided into two groups as Ulcerative Colitis (UC) and Crohn's Disease (CH). Colonoscopy is the gold standard in the diagnosis of IBD, but it has disadvantages such as being invasive, high cost, and requiring a long time. Today, great progress has been made in the diagnosis, treatment and post-treatment monitoring of diseases. In the light of these developments, it is obvious that diagnosis, treatment and post-treatment monitoring processes are interrelated. In this project application, we aim to develop this project, which deals with all these processes of diseases, especially the diagnosis part, namely the beginning part. Accordingly, our main goal is to develop a low-cost, fast, accurate and effective diagnosis system, to reduce health expenditures, to reduce foreign dependency, and to take measures to prevent future diseases. Considering the findings, the biosensor system was modified with the target immobilization metot and made suitable for the determination of the calprotectin biomarker. A biosensor was developed with the aptamer immobilized on the gold nanoparticle by the interaction of cystamine and avidin biotin. Although the marker molecule on the aptamer undergoes transformation at high potential, its electrochemical potential decreased with calprotectin binding as a result of conformational changes. This is evident from the Linear Sweep Voltammetry (LSV) results. The biosensor provides measurement in the range of 20-800 g/g. This shows that it is more sensitive than the commercially used Lateral Flow Assay (LFA). When the methods are compared, the biosensor can give as accurate results as LFA. Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantification (LOQ) values are correlated with the standard graph, making it a very suitable biosensor. The measurement time was determined as 900 seconds with chronoimpedimetric measurement. It is also possible to measure at lower times with optimization studies in this way, but this time is sufficient for a meaningful signal in experimental development. Affinity-based binding and the affinity of the aptamer determine this time. From the point of view of selectivity, it is promising for the future of the study that it gives very low signals against S100A8 and 9, which are the states of dimerization. In conclusion, the aptamer-based calprotectin biosensor is very suitable for measuring this biomarker used in Crohn's disease.