Visseral leishmaniasis etkeni Leishmania infantum parazitlerinin büyük ölçekli üretimi ve immunojen özellikli GP63 molekülünün izolasyonu ve karakterizasyonu
Large scale production of Leishmania infantum which cause Visseral leishmaniasis and isolation and characterization of immunogen GP63 molecule
Yazar: MEHMET AYDOĞDU
Danışman: YRD. DOÇ. MELAHAT BAĞIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Leishmaniasis, Leishmania parazitleri ile enfekte olmuş Phlebotomus'ların kan emme esnasında parazitlerin memeli konaklara bulaşmasıyla gelişen bir hastalıktır. Hastalığın visseral, kütanöz ve mükokütanöz olmak üzere 3 klinik formu vardır. L. infantum'un neden olduğu visseral leishmaniasis (VL) iç organların tahribatına yol açar ve tedavi edilmediğinde ise ölümle sonuçlanır. Leishmaniasis dünyanın yaklaşık 98 ülkesinde özellikle tropikal ve subtropikal bölgelerinde endemik olarak görülmektedir. Her yıl 3 milyon insan kütanoz, 500 bin insan ise visseral leishmaniasise yakalanır. Ülkemizde ise leishmaniasisin kutanoz ve visseral formları olup daha çok Ege, Akdeniz, İç ve Güneydoğu anadolu bölgelerinde tespit edilmektedir.
Leishmania parazitlerinin çoğaltılması in vitro ve in vivo modellerde gerçekleştirilir. Her iki model de Leishmania parazitlerinin izolasyonuna ve biomas elde edilmesine imkan sağlamaktadır. Günümüzde Leishmania parazitlerinin in vitro kültürünün yapılması ve çoğaltılması için RPMI 1640 , Brain heart, yeast extract gibi besiyerleri kullanılarak klasik yöntem tüplerde, flasklarda, erlenmeyerlerde çoğaltılmaktadır. Leishmania parazitlerinin çoğaltılmasıyla elde edilen biomas moleküler, genomik, immünolojik, biyokimyasal çalışmalarda ve doğal antijen temelli aşılların geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, klasik büyük ölçek yöntemlerinin; parazitlerin üremesine etki eden fiziksel ve kimyasal faktörler (pH, sıcaklı, CO2, O2, besiyeri), ekonomik açıdan pahalılık ve işgücü fazlalığı gibi dezavantajları vardır. Son yıllarda bu dezavantajları barındırmayan büyük ölçekli biyoreaktör sistemleri geliştirilmektedir. Bu sistemlerde protozoanlardan maleria, trypanasoma, hayvanlarda hastalık oluşturan L .tarantolae parazitlerinin kültürünün yapılmasına yönelik çalışmalar olsada, visseral leishmaniasis etkeni L. infantum kültürüne ait çalışma bulunmamaktadır.
Diğer Leishmania türlerinde olduğu gibi visseral leishmaniasise karşı şimdiye kadar aşının bulunmaması, hastalığın etkenlerinde kullanılan ilaçlara karşı dirençliğin gelişmesi ve var olan ilaçların çok toksik olması bu hastalığa karşı aşı geliştirilmesinin son derece önemli olduğunu göstermektedir. Son yıllarda leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde doğal immünojen moleküllere daha çok önem verilmektedir. Ancak Leishmania parazitleri prokaryotlardan farklı olarak kültür ortamında daha yavaş çoğaldığından ve büyük ölçekte elde edilmesi zor olduğundan yeteri kadar doğal immünojen moleküllerin izolasyonu mümkün olmamaktadır. Leishmania parazitinin yüzeyinde bulunan immünojen ve aşı geliştirilmesinde önerilen moleküllerden biri olan proteinaz glikoprotein 63 (gp63) molekülüdür. Ancak şimdiye kadar yapılan çalışmalarda büyük ölçekte L. infantum'un biomasının elde edilmesinin zorluklarından dolayı gp63 molekülüyle ilgili çalışmalar dünyanın az sayılı laboratuvarında yapılmaktadır. Leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde önemli olan bu molekülün eldesi ancak biyoreaktörde büyük ölçekte L. infantum parazitlerinin çoğaltılmasıyla mümkün olabilir.
Bu bilgiler ışığında tezin amacı, visseral leishmaniasis etkeni L. infantum promastigot kültürünün ilk kez olarak pH ve sıcaklık değerleri kontrol edilebilir karıştırmalı biyoreaktör ortamında büyük ölçekte üretiminin incelenmesi, klasik büyük ölçek yöntemlerine göre daha fazla biomass elde edilmesi için optimize edilmesi ve elde edilen biomasın Leishmania parazitlerinin immünojen moleküllerinden gp63'ün izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılmasıdır. Tezin amaç ve hedefine ulaşmak için çalışmalarda aşağıdaki yöntemler kullanıldı. Bunlar; devamlı olarak flask ve laboratuvarımızda geliştirilmiş olan kademeli büyük ölçek kültürünün yapılması, karıştırmalı biyoreaktörde büyük ölçek kültürünün yapılması, yeteri miktarda toplanan parazit biyomasının gp63 izolasyonu için vorteks ve sonikasyon ile parçalanması, elde edilen tüm parazit antijenlerinin ConA ve DEAE kolonlarında kromatografileri yapılarak gp63'ün saflaştırılması, SDS-PAGE ve ELISA analizleri yapılarak karakterizasyonun gerçekleştirilmesidir.
Elde edilen sonuçlar göre sıcaklık, pH, besiyeri optimizasyonları yapılan biyorektörde klasik yönteme göre 1.5 kat daha fazla üremenin olduğu görüldü. Erlenmeyerde 0.73 litre kültür hacminde 10 milyon/ml parazit sayısıyla 7.3 milyar parazit sayısında biyomas elde edilirken, optimize edilmiş biyorektörde 3.5 litre kültür hacminde 15 milyon/ml parazit sayısına ulaşarak 51 milyar parazit sayısında biomas elde edildi. Biyoreaktör sistemiyle biyomas eldesinde 7 kat artış sağlandı.
Böylece bu tez kapsamında ilk kez olarak L.infantum'un pH ve sıcaklık değerleri kontrol edilebilir karıştırmalı biyoreaktörde üretilmesi gerçekleştirilmiş ve büyük ölçekte biyoması elde edilmiştir. Elde edilen biyomasın parazitin immünojen moleküllerinden olan gp63'ün izolasyonu ve karakterizasyonu için yeterli olduğu ortaya çıkmıştır. Geliştirilen bu sistemin diğer Leishmania parazitlerinin biyomasının elde edilmesi için de önerilebilir. Bu çalışma TÜBİTAK tarafından desteklenen SBAG 213S148 numaralı proje kapsamında gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
Leishmaniasis is a disease caused by infection of mammalian hosts with intracellular Leishmania protozoans during the blood-sucking of Phlebotomus (infected sand flies). The Leishmaniasis have three forms; Visceral, cutaneous, and mucocutaneous. Visceral leishmaniasis (VL), caused by L. infantum, is a chronic disease that can cause internal organ damage and death. Leishmaniasis is currently endemic in nearly 98 countries especially tropical and subtropical regions around the world. Every year, 3 million people are caught to cutaneous and 500 thousand people are caught visceral leishmaniasis. In Turkey, it is reported mostly in Aegean, Mediterranean, Central and Southeast Anatolia region.
Reproduction of Leishmania parasites occurs in in vitro and in vivo models. Both models allow isolation of Leishmania parasites and biomass retrieval. Today, in vitro culture of Leishmania parasites is carried out using conventional techniques with media such as RPMI 1640, Brain heart, yeast extract, in tubes, in flasks, in erlenmeyers. The biomas obtained by the amplification of Leishmania parasites are widely used in molecular, genomic, immunological, biochemical studies and in the development of natural antigen-based grafts. Bioreactors are used to eliminate the disadvantages of conventional large-scale microorganism production methods such as physical and chemical factors (pH, temperature, O2, CO2) , economic reasons, and surplus labor. In these systems, there are no culture studies with L. infantum which causes visceral leishmaniasis, although studies have been done on protozoans such malaria, trypanosoma, and L. tarantolae which animal parasites.
The lack of vaccines against visceral leishmaniasis as in other Leishmania species, the development of resistance to the drugs used in the disease, and the high toxicity of existing drugs suggest that vaccine development is extremely important for this disease. In recent years, more emphasis has been given to natural immunogenic molecules in the development of vaccines against leishmaniasis. However, as Leishmania parasites differs from prokaryotes, it is difficult to isolate natural immunogen molecules as much as because it grows more slowly in the culture and is difficult to obtain on a large scale, one of the recommended molecules in the vaccine development is immunogen proteinase glycoprotein 63 (GP63) molecule which is on the surface of Leishmania parasite. However, because of the difficulties of obtaining the biomass of L. infantum on a large scale in studies carried up to now, studies on the gp63 molecule are being carried out in the world's few laboratories. This molecule, which is important in the development of vaccine against Leishmaniasis, can only be achieved by the multiplication of L. infantum parasites on a large scale in the bioreactor.
The aim of the thesis, examination of large scale production of L. infantum which causes visseral leishmaniasis promastigot culture in a stirred bioreactor which pH and temperature values can be controlled for the first time, optimization for more biomass than conventional large scale methods and the using biomass for isolation and characterization of gp63 which is immunogenic molecule of Leishmania parasites. The following methods were used when trying to reach the aim and objectives of the thesis. These are; Continuous flask and graduated large-scale culturing developed in our laboratory, large scale culturing in a stirred bioreactor, disruption of the collected parasite biomass by vortex and sonication for gp63 isolation, purification of gp63 from all obtained parasite antigens by performing chromatography on ConA and DEAE columns, SDS-PAGE and ELISA analyzes.
According to the results obtained, the number of parasites in classical large scale culture increased 10 times compared to the number of beginnings; 15 times higher in the bioreactor which temperature, pH, and nutrient optimizations were done. When equal volumes of cultures were compared, 1.5 times more parasites were detected in the bioreactor than in the conventional method. In Erlenmeyer, a biomass of 7.3 billion parasites was obtained at a culture volume of 0.73 liters of culture volume of 10 million / ml, reaching a total of 15 million / ml of parasites at a volume of 3.5 liters in the optimized bioreactor, resulted in a biomass of 51 billion parasites. The bioreactor system provided a 7 fold increase in biomass at one time compared to the conventional method.
Thus, for the first time in this thesis, culture of L. infantum were performed in a stirred bioreactor which pH and temperature values controllable and large scale biomass was obtained. It has been found that the obtained biomass is sufficient for the isolation and characterization of gp63, the immunogen molecule of parasite. This developed system can also be proposed for the biomass of other Leishmania parasites. This study was carried out within the scope of SBAG 213S148 project supported by TÜBİTAK.