Fruktoz 1,6 bis fosfat aldolaz enziminin normal ve diyabetli plasentalardan saflaştırılarak enzim aktivitesi ve kinetiklerinin karşılaştırılması
Purification and comparision of kinetic properties of fructose 1,6 bisphosphate aldolase from healty and gestational diabetic human placenta
Yazar: NEŞE HAYAT AKSOY
Danışman: PROF. DR. PAKİZE DOĞAN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
ÖZETAksoy N. H., Fruktoz 1,6 bis fosfat aldolaz enziminin normal ve diyabetliplasentalardan saflaştırılarak enzim aktivitesi ve kinetiklerininkarşılaştırılması. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü BiyokimyaProgramı, Doktora Tezi, Ankara, 2005. Fruktoz 1,6-bisfosfat Aldolaz, (E.C.4.1.2.13), (FBPA), fosfoselüloz kolondan sağlıklı insan plasentasından 40.5 kez,diyabetik insan dokusundan 63 kez saflaştırıldı. Poliakrilamid jel elektroforezi(PAGE) ile saflık kontrolü yapıldı. Saflaştırılan enzimlerin optimum pH'ları 7,4 ve0optimum sıcaklık değerleri 37 C olarak saptandı. Enzimin Lineweaver-Burkgrafiklemesinde doğrunun belli bir substrat derişiminden sonra aşağıya doğrukıvrıldığı gözlendi. Bu kıvrılmanın olduğu noktadan ayrılan fazlar için iki ayrıgrafikleme daha yapıldı. Sağlıklı plasentadan saflaştırılan enzimin; Düşük substratderişiminde Km değeri 3,048Â±1,39 mM ve Vm ise 636,103Â±196,165 olarak bulundu.Yüksek derişimlerde ise Vm değeri 1885,457Â±292,48 ve Km değeri 23,063 Â± 6,845mM olarak hesaplandı. GDM'li plasentadan saflaştırılan enzimin Vm'i939,548Â±60,869 ve Km'i 24,304Â±2,948 olarak hesaplandı. Gestasyonel diyabetikplasental aldolazın yüksek derişimlerinde Vm değeri 981,093 Â± 38,483, Km değeri26,686Â±1,913 mM olarak; düşük derişimde ise Km 1,385Â±0,403 mM ve Vm ise159,422Â±26,180 mM olarak bulundu. Enzimatik çalışmanın ikinci aşamasında,DHAP, ATP ve Mg+2'un inhibisyon etkileri araştırıldı. Buna göre; Sağlıklı plasentalaldolaz için; DHAP'ın (Ki=1,039Â±0,107) non-kompetitif inhibitör, ATP'nin ?partialkompetitif? inhibitör (Ki= 0,074 Â± 0,026 ve alfa katsayısı 3,287Â±0,434), Mg+2'un?pure-kompetitif? inhibitör (Ki=14,678Â±2,702) olduğu bulundu. Gestasyoneldiyabetik plasental aldolaz için; DHAP kompetitif inhibitör (Ki= 0,766 Â± 0,035),ATP'nin ?partial kompetitif? inhibitör (Ki= 0,136 Â± 0,049, alfa katsayısı4,089Â±0,539), Mg+2'un ?partial kompetitif? inhibitör (Ki=0,218Â±0,113 ve alfakatsayısı 1,676Â±0,118) olduğu saptandı.Anahtar sözcükler: Aldolaz, GDM, plasenta, saflaştırma, substrat ve inhibitörkinetiği.H.Ü.B.A.B. Tez destekleme (05.T06.101.001).

Abstract:
ABSTRACTAksoy N. H., Purification and Comparision of Kinetic Properties of Fructose 1,6bisphosphate aldolase from Healty and Gestational Diabetic Human Placenta.Hacettepe University Institute of Health Sciences Ph.D. Thesis in Biochemistry,Ankara, 2005. Fructose 1,6 bisphosphate aldolase (E.C. 4.1.2.13, FBPA), waspurified 40,5 fold from healty human placenta and 63 fold from gestational diabeticplacenta, by phosphocelluse chromatography. Purity was controlled bypolyacrilamide gel electrophoresis (PAGE). Optimum pH value was determined as7,4 and optimum temperature was determined as 37 0C for both of purified enzymes.It was observed that, Lineweaver-Burk diagram line was appeared to be down. Anew diagram was performed for the phases that separate this point. At lowconcentrations of subtrate, value of Km of healty placental aldolase was determinedas 3,048Â±1,39 mM and value of Vm was determined as 636,103 Â± 196,165. At highconcentrations of subtrate, Vm 1885,457 Â± 292,48 and Km 23,063 Â± 6,845 mM. Vmvalue of enzyme that purified from diabetic placenta was estimated as939,548Â±60,869 mM and Km value was determined as 24,304Â±2,948. At lowconcentrations, Km value of diabetic placental aldolase was determined as26,686Â±1,913 mM and value of Vm was determined as 981,093 Â± 38,483. At highconcentrations of substrate, Vm was 159,422Â±26, and Km was 1,385Â±0,403. DHAP,ATP and Mg+2 were used as inhibitors of the enzyme at the second part of this study.As for this; for healty placental aldolase, DHAP was found (Ki=1,039Â±0,107) as anon-competitive inhibitor, ATP was found as a partial-competitive inhibitor (Ki=0,074Â±0,026 and alpha coefficient 3,287Â±0,434), Mg+2 was a pure-competitiveinhibitor (Ki=14,678Â±2,702). For diabetic placental aldolase, DHAP was found to bea competitive inhibitor, (Ki= 0,766Â±0,035), ATP was a partial-competitive inhibitor(Ki= 0,136Â±0,049, alpha coefficient 4,089Â±0,539), Mg+2 was a partial-competitiveinhibitor (Ki=0,218Â±0,113 and alpha coefficient 1,676Â±0,118).Key words: Aldolase, GDM, placenta, purification, substrate and inhibitor kinetics.H.U.B.A.B. PhD Thesis Grant (05.T06.101.001).