Deneysel omurilik hasarı modelinde antioksidan ve lipit peroksidasyon inhibitörlerinin kullanımının iyileşme üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the healing effects of antioxidants and lipid peroxidation inhibitors in an experimental spinal cord injury model
Yazar: BÜNYAMİN KILIÇLI
Danışman: DOÇ. DR. ANIL MURAT ÖZTÜRK
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology

Özet:
Omurilik yaralanması (SCI), motor, duyu ve otonomik fonksiyonların dejeneratif
kaybından kaynaklanır. Uzun süreli engelliliğin önemli bir nedenidir. SCI iki fazda gerçekleşir.
İlk olarak, mekanik travmaya bağlı olarak gerçekleşen nöral parankim yıkımı olur ve bu
düzeltilemez. Sonrasında sekonder faz aktive olur. Sekonder fazın klinik belirtileri arasında
hücre geçirgenliğinde artış, apoptotik sinyalleme, iskemi, vasküler hasar, ödem, eksitotoksisite,
iyonik serbestleşme, inflamasyon, lipid peroksidasyonu, serbest radikal oluşumu,
demiyelinizasyon, Wallerian dejenerasyonu yer alır. Sekonder hasar mekanizmalarının neden
olduğu fonksiyonel hücre kaybının primer hasar sebebiyle meydana gelen kayıp miktarından
daha fazla olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle sekonder hasar yolaklarının baskılanması omurilik
yaralanması için tedavi arayışlarında bir umut ışığı olarak görülmektedir.
Ferroptoz, demire bağımlı, lipid peroksit birikimi ve reaktif oksijen türlerinin (ROS)
artışıyla tetiklenen, apoptotik olmayan bir hücre ölümüdür. Apoptoz ve nekrozdan farklı olarak,
hücre büzülmesi, kromatin yoğunlaşması veya organel şişmesi gibi özellikler göstermez.
Ferroptoz, mitokondri büzülmesi ve kristaların kaybıyla morfolojik olarak ayırt edilir.
Glutatyon (GSH) ve GPX4 aktivitesinin azalmasıyla lipid peroksitler temizlenemez ve ROS
birikimi ferroptozu tetikler. Kanser ve nörodejeneratif hastalıklar gibi birçok rahatsızlıkta
önemli bir rol oynar ve tedavi hedefi olarak değerlendirilir. Ayrıca omurilik yaralanmasında
etkili olduğu gösterilmiştir. Ferroptozun baskılanmasında temel hedefler; demir birikiminin
azaltılması, reaktif oksijen türlerinin kontrol altına alınması ve lipid peroksidasyonunun
durdurulmasıdır. Bu yaklaşımlar, terapötik müdahaleler için önemli fırsatlar sunar. Ferroptoz,
omurilik yaralanmasının sekonder faz aşamasında etkili olduğu net bir şekilde ortaya
konmuştur ancak terapötik bir ajan henüz bulunamamamıştır.
Ebselen olarak bilinen 2-Fenilbenzo[d][1,2]-selenazol-3(2H)-on, güçlü antioksidan
özelliklere sahip olan, lipidde çözünebilen bir seleno-organik bileşiktir. Glutatyon peroksidaz
benzeri etkiler göstererek lipid peroksidasyonunu engeller. Bu sayede, hücre zarındaki
lipidlerin oksidatif hasara uğramasını önleyerek, ferroptozu inhibe edebilir. Ebselen'in bazı
klinik çalışmalarda önemli hücresel toksisiteye sahip olduğu gösterilmiştir, bu da terapötik
pencereyi genişleterek daha az toksik olabilecek türevleri keşfetmeyi önemli kılmaktadır. Hücre
kültürü çalışmalarında Landgraf ve ark. ürettiği türevlerden Ebselen 9 ve Ebselen 27 yüksek
hücresel canlılık sağladıklarından nöroprotektif özellikleri bakımından hayvan çalışmasına
uygun bulunmuştur.
Çalışmamız deneysel hayvan modeli olarak tasarlanmıştır. Omurilik hasarı yöntemi
olarak klip-kompresyon modeli uygulanmıştır. Biyokimyasal analizler omurilik doku
numunelerinden 24.saat, 72. Saatte örnekler alınmıştır. Bu numunelerde Fe+2, GSH, GPX4,
TfR1, FPN, MDA, 4-HNE ve ACSL4 düzeyleri çalışılmıştır. 6 haftalık gruplar da fonksiyonel
değerlendirme skalası olarak BBB lokomotor skalası kullanılmıştır.
Çalışmada elde edilen veriler ışığında; Ebselen etkisini demir şelasyonu ve GPX4
benzeri aktivite ile göstermiştir. Ebselen demir şelasyonu etkisini 24 saate gösteremezken
Ebselen 9 ve Ebselen 27 24. ve 72. saatte demir şelasyonu etkisini göstermiştir. Ayrıca GPX4
düzeylerinde her üç molekülde 24. saatte etkin artırma sağlarken Ebselen 9 ve Ebselen 27 bu
etkisini 72. saatte kadar korumuştur. GSH düzeylerine bakıldığında her üç molekülünde 24. ve
72. Saatlerde etkili artırımı gösterdiği görülmektedir. Bu veriler Ebselen ve türevlerinin
antioksidan etkinliğini GSH aracılığı ile de yaptığını desteklemekte, hem de ferroptoz açısından
önemli bir enzim olan GPX4'ün aktivitesini artırma potansiyeli olduğu gösterilmiştir. Bu
potansiyel Ebselen 9 ve 27 özellikle 72. saatte daha anlamlıdır. MDA ve 4-HNE düzeylerine
bakıldığında Ebselen'in 24. ve 72. Saatlerde etkin olmadığı görülmektedir. Diğer taraftan
Ebselen 9 4-HNE düzeylerini 72.saatte düşürebilmiştir. Ebselen 27 ise MDA seviyelerini 24.
ve 72.saatte düşürmüştür. Ebselen 27 MDA seviyelerini Ebselen'e oranla daha etkin
düşürmüştür. Ebselen 9 ve 27 lipit peroksidasyonunu uygun şekilde azaltmasa da Ebselen'e
göre daha etkin olduğu süreçler mevcuttur. TfR1 seviyeleri açısından Ebselen ve Ebselen 9
etkilerini 24.saatte etkin baskılama sağlayamamıştır ancak Ebselen 27 24. ve 72. Saatte etkin
baskılanma oluşturmuştur. Ferroportin seviyelerine bakıldığında ise Ebselen ve Ebselen 9
etkilerini 72.saate taşıyamamış ancak Ebselen 27 24. ve 72.saatlerde anlamlı etki göstermiştir.
ACSL4 baskılanmasını her üç molekülde 24.saatte etkin şekilde yapmamış olup 72.saatte etkin
baskılanmayı sağlamışlardır.
Fonksiyonel kazanım olarak değerlendirildiğinde 6 haftalık takip sürecinin sonunda her
üç molekül ile kontrol grubu arasında anlamlı fark bulunamamıştır. Zaman içinde tüm gruplarda
anlamlı bir iyileşme görülmüştür. Gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark
bulunmamaktadır. Grupların zaman içindeki değişim paterni benzerdir.
Ebselen molekülünün omurilik hasarında antiferroptotik etkinliği bulunmaktadır. Bunu
demir metabolizması düzenlemeleri ve GPX4 benzeri aktiviteyi artırarak oluşturmaktadır.
Ebselen 9 ve Ebselen 27 etki başlangıçlarının hızlı olması ve daha uzun etki oluşturmaları
nedeniyle Ebselen'e üstünlükleri bulunmaktadır. Ayrıca kısmen lipit peroksidasyon ürünlerinin
azaltmaları Ebselen'e göre lipit peroksidasyonuna etkileri olduğunu düşündürebilir.
Ferroptoz yolağı, umut vaaden bir yolak olmasına rağmen omurilik
yaralanmasında hala çalışmalar devam etmektedir. Sekonder hücre ölümünün önemli bir
değişken olduğu omurilik yaralanmasında, sekonder hasar mekanizmalarını etkin ve
güvenli bir şekilde baskılamayı başaran terapötik ajanlar gelecekte kurgulanacak klinik
araştırmalara konu edilebilecektir.
Anahtar kelimeler: ferroptoz; Ebselen; Ebselen9; Ebselen 27; omurilik

Abstract:
Spinal cord injury (SCI) results from the degenerative loss of motor, sensory, and
autonomic functions and is a significant cause of long-term disability. SCI occurs in two phases.
First, neural parenchymal destruction occurs due to mechanical trauma, which is irreversible.
Then, the secondary phase is activated. The clinical manifestations of the secondary phase
include increased cell permeability, apoptotic signaling, ischemia, vascular damage, edema,
excitotoxicity, ionic release, inflammation, lipid peroxidation, free radical formation,
demyelination, and Wallerian degeneration. It has been reported that the functional cell loss
caused by secondary injury mechanisms exceeds the loss caused by primary injury. Therefore,
suppressing secondary injury pathways is considered a beacon of hope in the search for
treatments for spinal cord injury.
Ferroptosis is a form of non-apoptotic cell death triggered by iron dependency, lipid
peroxide accumulation, and an increase in reactive oxygen species (ROS). Unlike apoptosis and
necrosis, it does not exhibit characteristics such as cell shrinkage, chromatin condensation, or
organelle swelling. Ferroptosis is morphologically distinguished by mitochondrial shrinkage
and the loss of cristae. Lipid peroxides cannot be cleared due to decreased glutathione (GSH)
and GPX4 activity, and ROS accumulation triggers ferroptosis. It plays a critical role in various
conditions, including cancer and neurodegenerative diseases, and is considered a therapeutic
target. Moreover, it has been shown to be effective in spinal cord injury.The main targets in
suppressing ferroptosis are reducing iron accumulation, controlling reactive oxygen species,
and stopping lipid peroxidation. These approaches offer significant opportunities for
therapeutic interventions. Although it has been clearly demonstrated that ferroptosis is effective
in the secondary phase of spinal cord injury, no therapeutic agent has yet been discovered.

Ebselen, known as 2-Phenylbenzo[d][1,2]-selenazol-3(2H)-one, is a lipophilic seleno-
organic compound with potent antioxidant properties. By exhibiting glutathione peroxidase-
like effects, it prevents lipid peroxidation. Thus, it may inhibit ferroptosis by preventing
oxidative damage to lipids in the cell membrane. Ebselen has been shown in some clinical
studies to have significant cellular toxicity, highlighting the importance of discovering
derivatives that may widen the therapeutic window with lower toxicity. In cell culture studies,
derivatives produced by Landgraf et al., namely Ebselen 9 and Ebselen 27, were found to be
suitable for animal studies due to their high cellular viability and neuroprotective properties.
Our study was designed as an experimental animal model. The clip-compression model
was applied as a spinal cord injury method. Biochemical analyses were performed on spinal
cord tissue samples taken at the 24th and 72nd hours. The levels of Fe+2, GSH, GPX4, TfR1,
FPN, MDA, 4-HNE, and ACSL4 were measured in these samples. The BBB locomotor
scale was used for functional evaluation in the 6-week groups.
Based on the data obtained in the study, Ebselen demonstrated its effect through iron
chelation and GPX4-like activity. While Ebselen did not show an iron chelation effect at 24
hours, Ebselen 9 and Ebselen 27 exhibited this effect at both 24 and 72 hours. Furthermore, all
three molecules effectively increased GPX4 levels at 24 hours, with Ebselen 9 and Ebselen 27
maintaining this effect until 72 hours. GSH levels were significantly increased by all three
molecules at both 24 and 72 hours. These data support the notion that Ebselen and its derivatives
enhance antioxidant activity via GSH and increase the activity of GPX4, an enzyme critical to
ferroptosis. This potential was particularly significant for Ebselen 9 and 27 at 72 hours.
Regarding MDA and 4-HNE levels, Ebselen was ineffective at 24 and 72 hours. On the
other hand, Ebselen 9 was able to reduce 4-HNE levels at 72 hours, and Ebselen 27 reduced
MDA levels at both 24 and 72 hours, showing greater effectiveness in lowering MDA levels
compared to Ebselen. Ebselen 9 and 27 demonstrated more effective processes in reducing lipid
peroxidation compared to Ebselen.In terms of TfR1 levels, neither Ebselen nor Ebselen 9
showed effective suppression at 24 hours, while Ebselen 27 achieved significant suppression at
both 24 and 72 hours. Regarding ferroportin levels, Ebselen and Ebselen 9 did not maintain
their effects until 72 hours, but Ebselen 27 showed a significant effect at both 24 and 72 hours.
For ACSL4 suppression, all three molecules were ineffective at 24 hours but achieved
significant suppression at 72 hours.
From a functional recovery perspective, no significant differences were found between
the control group and any of the three molecules at the end of the 6-week follow-up period.
Over time, significant improvement was observed in all groups, but no statistically significant
difference was detected between the groups. The change patterns over time were similar across
the groups.
The anti-ferroptotic efficacy of the Ebselen molecule in spinal cord injury is evident. It
exerts this effect by regulating iron metabolism and increasing GPX4-like activity. Ebselen 9
and Ebselen 27 outperform Ebselen due to their faster onset and longer duration of effects.
Moreover, their partial reduction of lipid peroxidation products suggests that they might have a
more pronounced impact on lipid peroxidation compared to Ebselen.
Although the ferroptosis pathway shows promise, research on spinal cord injury is still
ongoing. In spinal cord injury, where secondary cell death is a critical factor, therapeutic agents
that can effectively and safely suppress secondary injury mechanisms may become the subject
of future clinical research.
Keywords: ferroptosis; Ebselen; Ebselen 9; Ebselen 27; spinal cord