İnfertil erkeklerin seminal plazma sıvısı ve spermatozoasında sisteinden zengin salgı proteini 2 (Crisp2) ve semenogelin 1 (Semg1) ile mir-582-5p, mir-27a, mir-21 ve mir-216b ekspresyonunun araştırılması
Investigation of cystein-rich secreting protein 2 (Crisp2),  semenogelin 1 (Semg1) and mir-582-5p, mir-27a, mir-21,  mir-216b expression  in seminal plasma  and  spermatozoa of  infertil men
Yazar: GİZEM AYDINAY
Danışman: PROF. DR. CELAL KALOĞLU
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Gen ifadesi profili = Gene expression profiling ; Kısırlık = Infertility ; Kısırlık-erkek = Infertility-male ; Meni = Semen ; Mikro RNA = Micro RNA ; Mikroskopi-ışık = Microscopy-polarization ; Sperm = Spermatozoa ; Sıvılaşma = Liquefaction ; Teratozoospermi = Teratozoospermia

Özet:
Total infertilite vakalarının yaklaşık %50'si erkek infertilitesi ile ilişkili olmasına rağmen erkek infertilitesinin değerlendirilmesi konvansiyonel parametreler ile sınırlı kalmış olup açıklanamayan infertilitenin de anlaşılmasını zorlaştırmıştır. 
Günümüzde konvansiyonel sperm parametrelerindeki hızlı düşüşler dikkate alındığında küresel bir sağlık sorun haline gelen, infertilite tedavilerinde başarı oranını artırmada erkek infertilitesinin açıklanamayan yönlerini tanımlamak kritik bir öneme sahiptir. Bu nedenle bu çalışmada insan CRISP2 ve SEMG1 proteinlerinin konvansiyonel sperm parametre gruplarında farklı bir dağılıma sahip olacağı varsayılarak, sperm fonksiyon değerlendirilmesinde yeni nesil parametre olarak kullanılıp kullanılamayacağının belirlenmesi hedeflenmiştir.
Diğer taraftan CRISP2 ve SEMG1 proteinlerinin farklı sperm parametre gruplarında miRNA-582-5p, miRNA-27a, miRNA-21 ve miRNA-216b'nin korelasyonlarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Çalışmamızda, Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi, Üremeye Yardımcı Tedavi Merkezi'ne infertilite problemi ile müracaat ederek spermiyogram tetkiki yaptırması için yönlendirilen infertil erkek hastalarından 3 günlük cinsel perhiz sonrasında mastürbasyon yolu ile semen numunesi alınırak başlandı ve sperm parametrelerine göre normozoospermi, oligozoospermi, teratozoospermi ve likefaksiyon (60+) olmak üzere 4 gruba ayrılmıştır. Toplam 30 infertil erkeğin semen numuneleri her bir işlem için farklı değerlerde santrifüj edilerek -80°C'de saklanmıştır. Sperm DNA bütünlüğünü göstermek üzere TUNEL analizi, CRISP2 ve SEMG1 proteinlerinin ifade düzeylerini kalitatif ve kantitatif olarak göstermek için İmmünfloresan ve Western Blot analizli ve miRNA'ların ekspresyon düzeylerini belirlemek için ise Kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu analizi uygulandı. Sonuçta histolojik ve moleküler veriler gruplar arasında karşılaştırılmıştır.
TUNEL analizlerimiz sonucunda %DFİ oaranlarının normozoospermi hastalarına göre (%30,85) oligozoospermi (%90,12), teratozoospermi (%75,27) hasta gruplarında belirgin bir şekilde arttğını göstermiştir. Özellikle daha önce hiç çalışılmamış grup olan likefaksiyon (%80,25) hasta grubunda %DFİ oranının normozoospermi hasta grubuna kıyasla neredeyse 3 kat artışı çalışmamızın önemli ve ayırt edici sonuçlarındandır. 
CRISP2 ve SEMG1 proteinlerinin immünofloresan analiz sonuçlarına göre, bu proteinlerin aralarında ters bir ilişki olduğu belirlendi. Normozoospermi'de CRISP2 en yüksek ekspresyon seviyesi gösterirken, SEMG1'in normozoospermi grubunda en düşük düzeyde olduğu tespit edildi. CRIPS2 özellikle postakrozomal ve boyun bölgelerinde dikkat çekici bir şekilde çok yüksek derecede ifade edilmiş olup SEMG1 ise en yüksek boyun bölgesinde ifade edildiği gözlendi. Çalışmada dikkat çeken bir nokta daha önce çalışılmamış grup olan likefaksiyon hasta grubunun SEMG1 protein ifadesinin normozoospermi grubuna kıyasla belirgin bir şekilde yüksek olmasıdır. Diğer taraftan Western blot ve immünofloresan sonuçları arasında pozitif anlamda bir uyum olduğu belirlendi ve çalışmamız bu şekilde desteklenmiştir. 
miRNA gruplarımızın RT-PCR analizlerine baktığımızda miR-582-5p için normozoospermi hasta grubunun bağıl ifadelenme düzeyi, diğer tüm gruplara göre en yüksek olup, oligozoospermi (0.3988035, sd: 1.4621217) ve teratozooospermi (0.3598373, sd:1.8387750) hasta gruplarının bağıl ifadelenme düzeyi birbirine çok yakın ve en düşük değere sahip olduğu gözlenmiştir.  miR-21 için oligozoospermi hasta grubunda en yüksek ifadelenme düzeyi (1.6847097, sd: 0.9087491)  gösterirken en düşük teratozoospermi (0.7232168, sd: 1.6006415) hasta grubunda gözlenmiştir. miR-27a için bağıl ifadelenme düzeyi oligozoospermi (1.0619138, sd: 0.8049431) ve normozoospermi (1.0000000, sd: 1.2474107) hasta gruplarında birbirine yakın ve en yüksek ifadelenme düzeyine sahip olduğu gözlenirken en düşük ifadelenme düzeyi teratozoospermi (0.2764327, sd: 1.2562338) hasta grubu için gözlenmiştir. Bu çalışma sonucunda ise miR-216b'nin ifadelenme düzeyi için hiçbir grupta anlamlı bir sonuç elde edilememiştir. miR-216b'nin infertilite ile ilişkisinin kesin olarak belirlenebilmesi için daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.
Aynı zamanda miR-582-5p, miR-21 ve miR-27a için Go encrichment ve biyolojik yol analizi yaparak bu üç miRNA'nın özellikle spermatogenez, hücre döngüsü, hücre bölünmesi, zona pellucida'ya spermin bağlanması, spermatit gelişimi ve DNA hasarı uyaranına karşı hücresel yanıt gibi yolları hedeflendiği gözlendi.
Sonuç olarak, çalışmamız erkek infertilitesinin tanı ve tedavisi için potansiyel bir teşhis belirteci ve erkek infertilitesine ilişkin terapötik hedef sağlamaya yardımcı olabilecek değerli bir fikir vermekte olup kritik öneme sahiptir.

Abstract:
Although approximately 50% of total infertility cases are associated with male infertility, the evaluation of male infertility has been limited to conventional parameters, making it difficult to understand unexplained infertility.
It is critical to define the unexplained aspects of male infertility to increasing the success rate of infertility treatments, which has become a global health problem considering the rapid declines in conventional sperm parameters today. Therefore, in this study, suggesting that human CRISP2 and SEMG1 proteins will have a different distribution in conventional sperm parameter groups, it is aimed to determine whether they can be used as a new generation parameter in the evaluation of sperm function. On the other hand, it was aimed to evaluate the correlations of miRNA-582-5p, miRNA-27a, miRNA-21 and miRNA-216b in different sperm parameter groups of CRISP2 and SEMG1 proteins.
In the present study, semen samples taken by masturbation after 3 days of sexual abstinence from infertile male patients who were referred to Cumhuriyet University Faculty of Medicine Research and Practice Hospital, Assisted Reproductive Treatment Center with infertility problem and were directed to have spermiogram examination, were determined according to sperm parameters for normozoospermia (6), oligozoospermia. (8), teratozoospermia (8) and (60+) liquefaction (8). Semen samples from a total of 30 infertile men were centrifuged at different values for each treatment and stored at -80°C. TUNEL analysis was used to show sperm DNA integrity, Immunofluorescence and Western Blot analysis were used to qualitatively and quantitatively show the expression levels of CRISP2 and SEMG1 proteins, and Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction analysis was used to determine the expression levels of miRNAs. Finally, histological and molecular data were compared between groups.
As a result of our TUNEL analyzes, it was shown that %DFI rates increased significantly in oligozoospermia (90.12%) and teratozoospermia (75.27%) patient groups compared to normozoospermia patients (30.85%). Especially in the liquefaction patient group, which has never been studied before, the rate of DFI (80.25%) increased almost 3 times compared to the normozoospermia patient group, which is one of the important and distinctive results of our study.
Immunofluorescence analyzes of CRISP2 and SEMG1 proteins showed that these proteins have an inverse level of distribution between normozoospermia and other groups. While CRISP2 showed the highest expression level in normozoospermia, SEMG1 was found to be the lowest in the normozoospermia group. CRIPS2 was particularly highly expressed in the postacrosomal and neck regions, while SEMG1 was most highly expressed in the neck region. A striking point in the study is that the SEMG1 protein expression of the liquefaction patient group, which has not been studied before, is significantly higher than the normozoospermia group. On the other hand, it was determined that there was a positive agreement between Western blot and immunofluorescence results.
In the RT-PCR analyzes of the studied miRNA groups, the relative expression level of the normozoospermia patient group for miR-582-5p was the highest compared to all other groups, and the relative expression level of the oligozoospermia (0.3988035, sd: 1.4621217) and teratozooospermia (0.3598373, sd:1.8387750) patient groups. It was observed that the expression level was very close to each other and had the lowest value. For miR-21, the highest expression level (1.6847097, sd: 0.9087491) was observed in the oligozoospermia patient group, while the lowest was observed in the teratozoospermia (0.7232168, sd: 1.6006415) patient group. Relative expression level for miR-27a was observed in oligozoospermia (1.0619138, sd: 0.8049431) and normozoospermia (1.0000000, sd: 1.2474107) patient groups and had the highest expression level, while the lowest expression level was in the teratozoospermia (0.2764327, sd: 1.2562338) patient group has been observed for As a result of this study, no significant results were obtained for the expression level of miR-216b in any group. More comprehensive studies are needed to definitively determine the relationship between miR-216b and infertility. At the same time, by performing Go encrichment and biological pathway analysis for miR-582-5p, miR-21 and miR-27a, these three miRNAs were particularly stimulus for spermatogenesis, cell cycle, cell division, sperm binding to the zona pellucida, spermatid development and DNA damage. It was observed that pathways such as the cellular response against
In conclusion, our study is critically important and provides valuable insight into the diagnosis and treatment of male infertility that can help provide a potential diagnostic marker and therapeutic target for male infertility.