Acinetobacter baumannii izolatlarında antibiyotik direnç genlerinin taranması, Blages-22 ve Blaoxa-66 varyantlarının moleküler karakterizasyonu
Screening of antibiotic resistance genes isolates of acinetobacter baumannii,  molecular characterization of variants of Blages-22 and Blaoxa-66
Yazar: AYŞEGÜL SARAL
Danışman: DOÇ. DR. CEMAL SANDALLI
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
Bu doktora tezinde, 101 Acinetobacter baumannii klinik suşunda direncin genetik mekanizmaları çalışıldı. blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-40 ve blaOXA-58 benzeri genlerin tespiti için multipleks PZR kullanıldı. ISAba1, blaIMP, blaVIM, blaGES, blaVEB, blaPER-2, aac-3-Ia, aac-6′-Ib ve blaNDM-1 genleri PZR ve baz dizin analizi ile tespit edildi. Multipleks PZR'da, tüm suşların blaOXA-51, 79 suşun blaOXA-23 ve bir suşun blaOXA-40 taşıdığı tespit edildi. blaOXA-51 ve blaOXA-23 79 suşta birlikte bulundu. ISAba1 elementi 81 suşta tespit edildi ve tüm durumlarda blaOXA-51'in yukarı bölgesinde bulundu. GES tipi beta laktamazlar 24 suşta bulundu (16 suşta GES-11 ve 8 suşta GES-22). blaOXA-58, blaIMP, blaVIM, blaVEB, blaPER-2, ve blaNDM-1 genlerinin hiçbiri tespit edilmedi. aac-3-Ia ve aac-6′Ib genleri sırasıyla 13 ve 15 suşta tespit edildi. REP-PZR ile tüm suşlar 12 farklı grup altında toplandı. Türkiye'de A. baumannii'de GES-11 ve OXA-40 bulunması ilk kez rapor edildi. GES-22, GES-11'den bir amino asit substitüsyonu (M169L) ile farklılaşır. M169, sınıf A beta laktamazlarda substrat seçiciliğinde büyük etkileri olduğu bilinen omega halkasının bir parçası olduğundan GES-22 ifade edildi, saflaştırıldı ve kinetik olarak karakterize edildi. Bu çalışma, GES-11 ile karşılaştırıldığında GES-22'nin penisilinleri, sefotaksimi ve aztreonamı daha etkili hidroliz ettiğini seftazidime karşı etkinliğinin azaldığını gösterdi. Bunun yanı sıra, M169L substitüsyonu GES-22'nin klavulanik asit hidrolizinde daha etkili olmasına neden oldu. Bu sonuçların diğer sınıf A beta laktamazların homolog pozisyonlarında görülen diğer mutasyonlarınkine benzer olması metiyoninin sınıf A beta laktamazlarda substrat seçiciliğinde ve aktif bölge residülerinin sıralanmasında yapısal bir rol oynadığını düşündürdü. OXA-66 mutantları ifade edildi, saflaştırıldı ve kinetik olarak karakterize edildi. W222L, I129V, P130Q klinik mutasyonlarının OXA-66'da karbapenemlere karşı hidrolitik aktiviteyi arttırdığı gözlendi.

Abstract:
Genetic mechanisms of resistance were determined in clinical strains of 101 Acinetobacter baumannii in this PhD thesis. Multiplex PCR was used for detecting blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, blaOXA-40-like  and blaOXA-58-like genes. ISAba1, blaIMP, blaVIM, blaGES, blaVEB, blaPER-2, aac-3-Ia, aac-6′-Ib and blaNDM-1 genes were detected by PCR and sequencing. By multiplex PCR, all strains carried blaOXA-51, 79 strains carried blaOXA-23 and one strain carried blaOXA-40. blaOXA-51 and blaOXA-23 were found together in 79 strains. ISAba1 element was detected in 81 strains, and in all cases it was found upstream of blaOXA-51. GES-type beta lactamases were found in 24 strains (GES-11 in 16 strains and GES-22 in 8 strains). blaOXA-58, blaIMP, blaVIM, blaVEB, blaPER-2, and blaNDM-1 genes were not observed. aac-3-Ia and aac-6′Ib genes were detected in 13 and 15 strains, respectively. All strains were collected into 12 different groups with REP-PCR. It was first reported that GES-11 and OXA-40 in A. baumannii from Turkey. GES-22 differs from GES-11 by a single amino acid substitution (M169L).  Because M169 is part of the omega loop, a structure that is known to have major effects on substrate selectivity in class A β-lactamases, GES-22 was expressed, purified and kinetically characterized.  This study shows that compared to GES-11, GES-22 displays more efficient hydrolysis of penicillins, cefotaxime and aztreonam, but a loss of efficiency against ceftazidime. Additionally, the M169L substitution confers on GES-22 more efficient hydrolysis of the clavulanic acid. These effects are highly similar to other mutations at the homologous position in other class A β-lactamases, suggesting that this methionine plays a key structural role in aligning active site residues and in substrate selectivity across the class. OXA-66 mutants were expressed, purified and kinetically characterized. It was observed that clinical mutations W222L, I129V, P130Q can increase the hydrolytic activity against carbapenems in OXA-66.