Biyobozunur plastik polihidroksialkanoatların bacillus megaterium'da genetik mühendisliği yoluyla üretiminin artırılması
Overproduction of biodegradable plastic polyhydroxyalkanoates by bacillus megaterium via genetic engineering
Yazar: BATUHAN DOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Günümüzde yaygın bir şekilde kullanılmakta olan fosil yakıt türevli plastik malzemeler, hafiflik, kolay şekillendirilebilme, hammadde ve imalat açısından ekonomik olmaları gibi avantajlarıyla hemen her alanda artan bir üretim ve tüketim değerine sahiptir. Ancak bu plastikler doğada uzun zamanda parçalanmaları ve içerdiği kanserojen bileşenler nedeniyle insan ve çevre sağlığına ciddi tehdit oluşturmaktadır. Sınırlı fosil yakıt kaynaklarının hızla tükenmesiyle birlikte petrol bazlı plastiklerin yerini alabilecek alternatif malzemelerden birisi de biyoparçalanabilirlik ve biyouyumluluk özellikleri bulunan polihidroksialkanoatlardır (PHA). PHA, oksijen, azot ve fosfor gibi bileşenler yönünden zayıf, karbonca zengin bir besi yerinde, hücresel stres anında kullanılmak üzere sentezlenen poliesterlerdir. Ancak, bu biyopolimerlerin ticari olarak tercih edilebilmesi için bakterilerde üretim verimlerinin arttırılması gerekmektedir.
Bu tez çalışmasında, PHA'yı rekombinant (r)-Bacillus megaterium bakterisinden çeşitli genetik modifikasyonlarla yüksek verimlilikte üretmek için genetik mühendisliği yöntemleri uygulanmıştır. B. megaterium genomunda bulunan PHA sentez genleri phaC ve phaR ekspresyon vektörüne klonlanarak (r)-B. megaterium suşu ilk kez geliştirilmiştir. Doğal fenotip B. megaterium NRRL B-14308 suşu ile phaC-phaR genleri overekspres edilmiş (r)-B. megaterium suşu ve daha önce araştırma grubumuzda geliştirilmiş olan ve phaC geni overekspres edilmiş (r)-B. megaterium suşunda üretilen PHA'nın üretim verimleri ve üretilen PHA'ların yapıları karşılaştırılmıştır. Orbital çalkalamalı biyoreaktörde 72 saat inkübasyon sonucunda pC-HIS1623hp-phaC-phaR, pC-HIS1623hp-phaC ve kontrol grubu olan pC-HIS1623hp plazmidlerini içeren (r)-B. megaterium suşlarından sırasıyla 2,3 g L-1, 2,2 g L-1 ve 2,1 g L-1 verimlerinde PHA elde edilmiştir. PHA sentezi için gerekli olan PhaC ve PhaR proteinleri SDS-PAGE yöntemli ile teyit edildikten sonra, çözücü ekstraksiyonu yöntemiyle saflaştırılan biyopolimerlerin yapısal ve termal özellikleri Gaz Kromatografisi (GC-FID), Fourier Transform Infrared Spektroskopisi (FT-IR), Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (1H-NMR), Termogravimetrik Analiz (TGA) ve Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) analizleri ile karakterize edilmiştir. Rekombinant suşlardan elde edilen PHA'ların karakterizasyonları sonucunda polimerlerin kopolimer (PHB-ko-PHV) yapısında olduğu ve 3-hidroksibütirat (3HB) ile 3-hidroksivalerat (3HV) monomer birimlerinden oluştuğu belirlenmiştir.

Abstract:
Fossil fuel-derived plastic materials, have currently production and consumption values at increasing quantities, due to their lightness, easy malleability and economical reasons. Owing to their poor degradation rates and their carcinogenic components, fossil-resource based plastics pose serious health problems on humans and the environment. With the rapid depletion of limited fossil fuel resources, one of the alternative materials that can replace petroleum based plastics is polyhydroxyalkanoates (PHA) with their biodegradability and biocompatibility properties. PHAs are polyesters synthesized to be used during cellular stress, in a carbon-rich nutrient medium that is poor in terms of components such as oxygen, nitrogen and phosphorus. However, in order for these biopolymers to be preferred commercially, the production efficiency in bacteria should be increased.
In this thesis study, genetic engineering methods have been applied to produce PHA at high efficiency, from recombinant (r)-Bacillus megaterium bacterium with various genetic modifications. PHA synthesis genes phaC and phaR found in the B. megaterium genome were cloned into an expression vector and a new (r)-B. megaterium strain was developed. The production efficiency and structure of PHA produced by the wild type Bacillus megaterium NRRL B-14308 strain, the (r)-Bacillus megaterium strain overexpressing phaC and phaR, and our previously developed (r)- Bacillus megaterium strain overexpressing phaC, were compared. After 72 hours of incubation in an orbitally shaken bioreactor, PHA was obtained from (r)-B. megaterium NRRL B-14308 strains containing pC-HIS1623hp-phaC-phaR, pC-HIS1623hp-phaC and as a control group pC-HIS1623hp plasmids with yields of 2.3 g L-1, 2.2 g L-1 and 2.1 g L-1, respectively. Following the confirmation of PhaC and PhaR proteins required for PHA synthesis via SDS-PAGE method, the structural and thermal properties of biopolymers obtained by chloroform purification method were characterized by Gas Chromatography (GC-FID), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR), Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR), Thermogravimetric Analysis (TGA) and Differential Scanning Calorimetry (DSC) analyses. As a result of the characterization of PHAs obtained from the recombinant strains, it has been determined that the polymers are in copolymer (PHB-co-PHV) structure, and consist of 3-hydroxybutyrate (3HB) and 3-hydroxyvalerate (3HV) monomer units.