Elektrospin tekniği ile nHAp/jelatin/antikanserojen içeren nanofibril üretimi, karakterizasyonu ve hücre uyumunun araştırılması
Production and characterization of anticarcinogen containing nHAp/gelatin nanofibers by using electrospin technique and investigation of cell biocompatibility
Yazar: EZGİ EMÜL
Danışman: PROF. DR. NECDET SAĞLAM ; PROF. DR. FEZA KORKUSUZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Günümüzde kanser, oldukça yaygın olup, teşhis ve tedavisinde büyük sorunlar barındıran, uzun ve sancılı süreç gerektiren bir hastalıktır. Özellikle çeşitli kanser tipleri ameliyat, radyasyon, kemoterapi ve hedefli ilaç salım ile tedavi edilmektedir. Fakat bu tedaviler; hastanın yaşam kalitesini düşüren etkilere yol açan ve pahalı uygulamalardır. Tümörlerin metastaz etme olasılığı nedeniyle de kanserin tekrarlaması, vücut uzuvlarının kaybedilmesi ve bazı sert doku kanser türlerinde kullanılan implantların vücutta enfeksiyona neden olması, kırılması veya yerinden çıkması durumları görülebilmektedir. Bunun yanında, kanser tedavisinde uygulanan radyasyon ve kemoterapi, sinir sisteminde ve perifer dokularda hasara neden olmaktadır. Sözü edilen dokuların rejenerasyon sürecinin çok yavaş olması, ayrıca bulantı, kilo ve saç kaybı, ağız içi yaralanma, düşük kan hücresi sayımı gibi sağlığı ciddi şekilde etkileyen yan etkileri de kanserin teşhis ve tedavisinin yoğun olarak araştırılmasının nedenlerindendir. 
Yapılan tez çalışmasında başta kanser olmak üzere diğer ciddi hastalıklarla ilgili teşhis ve tedavide nanoteknolojik bir yaklaşımla çözüm getirmek amaçlanmıştır. Bu çalışmada kemik kanserlerinde, kanserin genel tedavi yöntemlerinin yanında doğal bir alternatif geliştirmek amacıyla, elektrospin yöntemiyle oluşturulan jelatin, poli-L-laktik asit (PLLA) ve nanohidroksiapatit (nHAp) içeren nanofiber yapısı üretilmiştir. Üretilen nano malzemenin kemik defektlerinin onarımında alternatif bir implant olarak kullanılması planlanmış ve yapıya eklenen antikanserojenler; sisplatin ve metotraksat ile de kanserin sözü edilen tekrarlama olasılığının erken teşhis ve tedavi uygulanarak önlenmesi ileriki çalışmalar için hedeflenmiştir. 
Tez kapsamında ilaç içermeyen Jelatin/nHAp, Jelatin/PLLA/nHAp nanofiberleri yanında, Jelatin/PLLA/nHAp/Sisplatin ve Jelatin/PLLA/nHAp/Metotraksat nanofiberleri elektrospin yöntemiyle üretilmiştir. Elde edilen nanofiber örnekleri ve bileşenlerine karakterizasyon amacıyla FTIR analizleri uygulanmıştır. SEM analizleriyle de fiber morfolojileri incelenmiş ve ortalama fiber çapları sırasıyla; 157.750 nm, 215.908 nm, 536.959 nm ve 471.026 nm olarak hesaplanmıştır. Nanofiber örnekleri içerisinde bulunan nanohidroksiapatitin (nHAp) fiberlere başarılı bir şekilde entegre olduğu gösterilmiştir.
Karakterizasyon çalışmalarından sonra, üretilen ilaçsız nanofiberlerin mezenkimal kök hücrelerle in vitro hücre uyum testleri gerçekleştirilmiştir. Üretilen Jelatin/nHAp ve Jelatin/PLLA/nHAp nanofiberlerine hücre adhezyonu ve üremesini gösteren WST-1 testleri uygulanmış ve belirli zamanlarda optik dansite (OD450nm) olarak değerlendirmesi sonucu, her iki nanofiberin birinci günde sırasıyla 0.977 ve 0.786, üçüncü günde 1.303 ve 0.999, yedinci günde ise 1.977 ve 1.689 değerleri saptanmıştır. Bu sonuçlar, hücrelerin üretilen nanofiberler üzerine başarılı bir şekilde tutunduğunu göstermektedir. Ayrıca hücrelerin farklılaşma özelliğini araştırmak amacıyla yapılan alkalin fosfataz (ALP) testinde, Jelatin/nHAp ve Jelatin/PLLA/nHAp nanofiberlerinden alınan sonuçlar sırasıyla 0.058 ve 0.073 olarak bulunmuştur. Bu sonuçlar, üretilen iki nanofiber üzerindeki hücre farklılaşmasını açıkça ifade etmektedir. WST-1 testinde Jelatin/nHAp nanofiberlerinin Jelatin/PLLA/nHAp'ye kıyasla %15-30 daha çok hücre üremesine uygun olduğu görülmüştür. ALP testlerinde de hücre farklılaşmasının Jelatin/PLLA/nHAp nanofiberleri için %26 daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak tarafımızdan elektrospin yöntemiyle üretilen her iki nanofiberin kanser çalışması başta olmak üzere kullanımının uygun olduğu görülmüştür.
Bu çalışma TÜBİTAK 2210-C Öncelikli Alanlara Yönelik Yurtiçi Yüksek Lisans Burs Programı tarafından desteklenmiştir.

Abstract:
Cancer is a very common disease characterized by its tough diagnosis process and rigorous therapy period that is generally long lasting and painful. Especially, many cancer types are treated mainly by surgery, radiation, chemotherapy and targeted drug release systems. But all these treatments reduce the quality of life and all of them are expensive methods. Cancer recurrence caused by the possible metastatic activity of cancer cells, removal of part or all of a limb and infected, loose or broken bone grafts or endoprosthesis issues that used for treatment of some hard tissues might occur. Furthermore, radiotherapy and chemotherapy can damage nervous system and the peripheral tissues. Slow regeneration of these tissues and some serious side effects such as nausea, loss of appetite, hair loss, mouth sores and low blood cell counts are the main reasons of performing many intense researches on diagnosis and therapy of cancer.
This thesis study offers a nanotechnological approach for diagnosis and therapy of serious diseases in particular to cancer. Gelatin, poly-L-lactic acid (PLLA) and nanohydroxyapatite (nHAp) included nanofibers have been produced by electrospinning method for improving a natural option in addition to all conventional methods. This material was intended to be used for further studies as an alternative implant to repair bone defects and because of the anticarcinogens; cisplatin and methotrexate addition, the possibility of cancer recurrence will be eliminated with early diagnosis and treatment. 
Gelatin/nHAp, Gelatin/PLLA/nHAp drug-free nanofibers and drug included Gelatin/PLLA/nHAp/Sisplatin and Gelatin/PLLA/nHAp/Methotrexate nanofibers were produced within the scope of the thesis. FTIR analyses were applied to the obtained nanofibers and components with the purpose of characterization. The morphology of fibers was examined with SEM analysis and the average fiber diameters were found as 157.750 nm, 215.908 nm, 536.959 nm and 471.026 nm, respectively. It was shown in the study that the nanohydroxyapatite (nHAp) in the nanofiber samples has successfully integrated to fibers.
After the characterization studies, in vitro cell biocompatibility tests for the obtained drug-free nanofibers were carried out with mesenchymal stem cells. WST-1 tests were applied to Gelatin/nHAp and Gelatin/PLLA/nHAp nanofibers in order to detect cell adhesion and proliferation on fiber mats and the first day results of optic density (OD450nm) were observed as 0.977 and 0.786, the third day results were observed as 1.303 and 0.999, finally the seventh day results were observed as 1.977 and 1.689, respectively. These obtained values showed that the successful cell adhesion on the nanofibers. Besides, alkaline phosphatase (ALP) tests were applied to same nanofibers in order to assess cell differentiation, and ALP results were found as 0.058 and 0.073 for Gelatin/nHAp and Gelatin/PLLA/nHAp nanofibers, respectively. These results clearly expressed that the enhanced cell differentiation on two produced nanofibers. When Gelatin/nHAp nanofibers are compared to Gelatin/PLLA/nHAp nanofibers within WST-1 tests, Gelatin/nHAp nanofibers were found as 15-30% more suitable for cell proliferation. However, Gelatin/PLLA/nHAp nanofibers were found as 26% more successful for cell differentiation in ALP tests. As a result of our study, the utilization of both two electrospun nanofibers in cancer studies is found favorable. 
This study was funded by TÜBİTAK 2210-C National Scholarship Programme for MSc Students.