Bağımlılıkta gelişen glutamat eksitotoksisitesine bağlı nörodejenerasyonun engellenmesi
Prevention of glutamate induced neurodegeneration in the course of addiction
Yazar: CANER GEYİK
Danışman: PROF. DR. DİLEK ODACI DEMİRKOL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Madde Bağımlılığı Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Bağımlılık = Dependency ; Beyin biyokimyası = Brain biochemistry ; Eksitotoksisite = Excitotoxicity ; Emülsiyonlar = Emulsions ; Glutamat = Glutamates ; Metamfetamin = Methamphetamine ; Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Taşıyıcı proteinler = Carrier proteins

Özet:
Madde kullanımının bir sonucu olarak gelişen glutamat uyarımının artması, nörodejenerasyona yol açmakta ve sonuç olarak sinir hücrelerinde yapı-fonksiyon bozuklukları ve hücre ölümü görülmektedir. Glutamat eksitotoksisitesinden temel olarak iyonotropik glutamat reseptörlerinin aktivasyonu, hücre içi oksidatif stresin artması ve mitokondri fonksiyon bozuklukları sorumludur. Sinaptik glutamatın azaltılması, NMDA reseptör antagonistlerinin kullanılması, antioksidan bileşiklerin verilmesi ya da hücre içi antioksidan savunma mekanizmalarının güçlendirilmesi ile eksitotoksisite kaynaklı nörodejenerasyon ortadan kaldırılabilir.
Tez çalışması kapsamında, eksitotoksisitenin in vitro koşullarda modellenmesi için nöroblastoma hücre hatları ve primer serebral korteks hücreleri kullanılarak hücre canlılığı ve sitotoksisite testleri yapıldı. Glutamat ile tetiklenen eksitotoksik etkinin giderilmesi için doğal antioksidan bileşikler ve bunları içeren emülsiyonlar kullanılmıştır. Ayrıca, metamfetaminin yol açtığı eksitotoksisite mekanizmalarının aydınlatılması için eksitatör amino asit taşıyıcı protein 3 (EAAT3) mercek altına alınmıştır. EAAT3 proteinin hücre membran lokalizasyonu ile metamfetamin arasındaki ilişki mikroskobik olarak incelenmiş ve mutant EAAT3 kullanılarak protein yapısında sorumlu bölge çalışılmıştır. Ayrıca, bu proteinin glutamat ve sistein taşınımı üzerinden, hücre içi antioksidan savunmalara etkisi incelenmiştir.
Elde edilen bulgular ve literatür karşılaştırıldığında, hücre hatları ve glutamat kullanılarak oluşturulan in vitro eksitotoksisite modellerinde, kullanılan çözgen girişiminin ihmal edildiği ve hatalı olarak düşük konstantrasyonların etkin doz olarak verildiği görülmüştür. Yüksek doz glutamat ile devam ettiğimiz modelde, kurkumin ve kurkumin içeren nanoemülsiyonlar, glutamat eksitotoksisitesinin giderilmesinde etkili olmuştur. Bununla beraber, kurkumin içeren nanoemülsiyon, kontrol nanoemülsiyonlar ile karşılaştırıldığında daha etkin olmadığı görülmüştür. Metamfetaminin, sitotoksisiteden ziyade hücre proliferasyonu üzerinde inhibe edici bir etkisi olduğu görülmüştür. EAAT3 proteini incelendiğinde, bu proteinin metamfetamin etkisiyle hücre membranından ayrılarak hücre içine göç ettiği gösterilmiştir. Bunun sonucu olarak da hücre içi sistein alımı mekanizmaları etkilenerek, glutatyon sentezi ve indirgenmiş glutatyon miktarı azalmıştır.
Çalışmalar, eksitotoksisitede oksidatif stres gideriminin hedeflenebileceğini göstermiştir. Ayrıca, EAAT3 proteininin hücre içine alımında sorumlu motifinin belirlenmesi daha sonraki çalışmalarda protein-protein etkileşimlerinin aydınlatılmasına ve ilaç etki hedeflerinin belirlenmesini sağlayabilecektir.

Abstract:
Increased glutamate stimulation which may be result of drug abuse leads to increased neurodegeneration and as a result structural and functional disorders as well as cell death occurs in neural cells. Activation of ionotropic glutamate receptors, increased intracellular oxidative stress and mitochondrial dysfunction are mainly responsible for glutamate excitotoxicity. Excitotoxicity-induced neurodegeneration can be eliminated by reducing synaptic glutamate, using NMDA receptor antagonists, introducing antioxidant compounds or strengthening intracellular antioxidant defence mechanisms.
Within the scope of the thesis, in order to model excitotoxicity in vitro, cell viability and cytotoxicity assays were performed on neuroblastoma cell lines and primary cerebral cortex cells. Natural antioxidant compounds and emulsion containing these compounds ere used to eliminate the excitotoxic effect induced by glutamate. In addition, the excitatory amino acid transporter protein 3 (EAAT3) was examined to elucidate the mechanisms of excitotoxicity caused by methamphetamine. The relationship between the cell membrane localization of EAAT3 protein and methamphetamine was examined by microscopy and the responsible region in the protein structure was studied using mutant EAAT3. Moreover, effect of this protein on intracellular antioxidant defence systems via glutamat and cysteine transport.
Comparison of our findings and literature indicates that, in vitro excitotoxicity models using cell lines and glutamate neglect the intervention caused by solvent and thus, result of reporting low concentrations of glutamate as effective dose. Curcumin and curcumin-containing nanoemulsions were effective in removing glutamate excitotoxicity in the preferred model of high-dose glutamate applied in this study. However, curcumin-containing nanoemulsion was not more effective than control nanoemulsions. It was observed that, methamphetamine has an inhibitory effect on cell proliferation instead of direct cytotoxicity. When the EAAT3 protein was examined, it was shown that this protein was translocated from the cell membrane and migrated into the cell by methamphetamine. As a result, cellular uptake mechanisms of cysteine were affected and glutathione synthesis and reduced glutathione levels were decreased.
Studies show that, oxidative stress can be a viable target to reduce excitotoxicity. Additionally, identification of the motif responsible for EAAT3 internalization may elucidate future protein-protein interactions and identify drug action targets.