Cakut hastalarının demografik özellikleri ve organogenezdeki faktörlerin değerlendirilmesi
Demographic characteristics of Cakut patients and evaluation of factors related with organogenesis
Yazar: AYŞENUR ÜRER
Danışman: PROF. DR. HARİKA ALPAY
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Böbrek hastalıkları = Kidney diseases ; Demografi = Demography ; Genler = Genes ; Konjenital anomaliler = Congenital abnormalities ; Metilasyon = Methylation ; Organogenez = Organogenesis ; Ürogenital malformasyonlar = Urogenital abnormalities ; Ürogenital sistem = Urogenital system

Özet:
Giriş ve Amaç: Üriner sistemin konjenital anomalileri (CAKUT) böbrek, üreter, mesane ve üretrayla ilgili; renal agenezi, renal hipodisplazi, antenatal hidronefroz (AH), multikistik displastik böbrek (MKDB), posterior üretral valv (PUV), vezikoüreteral reflü (VUR), üreteropelvik bileşke darlığı, ektopik böbrek ve at nalı böbrek gibi anomalileri kapsayan geniş bir hastalık grubunu içerir ve çocukluk çağında en sık görülen kronik böbrek yetmezliği nedenlerinden birisidir. Çalışmamızda CAKUT'un en büyük gruplarından biri olan multikistik displastik böbrek patogenezinde rol oynayan HNF1β geni fonksiyonu azalmasını epigenetik olarak analiz etmek ve kliniğe olan etkilerinin değerlendirilmesi amaçlandı.
Yöntem: Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Nefroloji Bilim Dalı'nda multikistik displastik böbrek tanısıyla izlenen 39 hasta çalışmaya alındı. Hastaların demografik bilgileri, 24 saatlik idrarda protein değerleri ve postnatal ilk 30 günde yapılan üriner ultrasonografi verilerine hasta takip dosyalarından ulaşıldı. Hastalardan 5 ml periferik kan örneği alındı. Periferik kan örneklerinden DNA izolasyonu yapıldıktan sonra DNA örnekleri metilasyona duyarlı ve dirençli enzimler ile kesilerek HNF1B promotor bölgesinde metile ve metile olmayan örnekler real-time PZR ile amplifikasyon sonucunda belirlendi. HNF1β metilasyonu saptanan dört hastanın sabah ilk idrarlarından taze olarak izole edilen RNAlardan komplementer DNA (cDNA) elde edildi. cDNA ile HNF1β ekpresyon primeri kullanılarak renal kaynaklı hücrelerden HNF1β ekspresyon analizi gerçekleştirildi. Elde edilen Ct değerleri Qiagen Data Analysis Center'da real-time PZR ekspresyon analizi sisteminde hesaplanarak analiz edildi. On yedi hastaya YİKB ölçümü yapıldı ve standart deviasyon skorları (SDS) hesaplandı. İstatistiksel analizler SPSS versiyon 17.0 programı yardımıyla gerçekleştirildi.
Bulgular: Çalışmaya 13 kız (%33,3), 26 erkek (%66,67) olmak üzere toplam 39 hasta alındı. Hastaların yaşları 2-21 yıl arasında olup, yaş ortalaması 8,74±4,65 yıl idi.
Dört hastada (%10,26) HNF1β metilasyonu bulundu. Metile ve unmetile allel sayısı ortanca değerleri sırasıyla sıfır ve iki, SDS ortalamaları 0,21±0,61 ve 1,90±0,45 olarak bulundu. HNF1β metilasyonu ile cinsiyet arasında anlamlı fark bulunmadı (p=0,455). Bir hastada akraba evliliği vardı (p=0,574). Dört hastanın tamamı prenatal tanı almıştı (p=0,275). Dört hastanın hiçbirinde oligohidramniyoz öyküsü yoktu (p=0,732). HNF1β metilasyonu ile doğum haftası arasında anlamlı ilişki saptanmadı (p=0,461).
HNF1β metilasyon varlığına göre hipertansiyon (p=0,542) ve proteinüri (p=0,078) oranları ile karşılaştırıldığında anlamlı ilişki olmadığı gözlendi.
Kist büyüklüğü (p=0,268) ve kist lokalizasyonu (p=0,649) ile HNF1β metilasyon varlığı ile anlamlı ilişki saptanmadı. Bir hastada (%50) kistlerin boyutunda küçülme/kaybolma vardı. Bir hastada (%50) kistlerin boyutu aynı kaldı. Kistlerin boyutunda büyüme hiçbir hastada yoktu. HNF1β metilasyon varlığı ile kistlerin boyutunda küçülme/kaybolma, aynı kalma ve büyüme arasında anlamlı ilişki olmadığı gözlendi (p=0,606, p=0,457, p=0,796).
HNF1β metliasyonu saptanan dört hastanın idrar örneklerinde yapılan HNF1β geni ekspresyon analizi sonucunda; hastaların idrar HNF1β ekspresyon düzeyinin sağlıklı kontrol ile daha düşük düzeyde HNF1β gen ekspresyonu gösterdiği saptandı.
Çalışmamızda HNF1β geni düşük ekspresyon düzeyinin kliniğe olan etkilerinin gösterilmesi hedeflenmiştir. İnvaziv olmayan bu metodun doku analizlerine göre daha kolay uygulanabilir bir metod olduğu ilk kez gösterildi. Sonuçlarımız HNF1β metilasyonunun downstream etkilerinin kontrol edilebilmesi yönünden preliminer bulgulardır. Ayrıca gelecekte bu grup hastalarda patogenezde rol oynayan mekanizmaların düzeltilebilmesi açısından umut vaat etmektedir.
Anahtar kelimeler: Ürogenital sistemin konjenital anomalileri (CAKUT), genetik, multikistik displastik böbrek, HNF-1β, metilasyon.

Abstract:
Introduction and Purpose: The congenital anomalies of the urinary system (CAKUT) are related to the kidney, bladder and ureter that includes a large group of anomalies such as renal agenesis, renal hypodysplasia, antenatal hydronephrosis (AH), multicystic dysplastic kidney (MCDK), posterior ureteral valve (PUV), vesicoureteral reflux (VUR), ureteropelvic junction obstruction, ectopic kidney etc. CAKUT is the most common cause of chronic renal failure in childhood. The aim of this study is to evaluate the impact of decreased HNBF1b gene funciton in the pathogenesis of multicystic dysplastic kidney, which is one of the largest groups of CAKUT and to evaluate its effect on clinical outcome.
Method: Thirty nine patients with multicystic dysplastic kidney who are followed up in Marmara University School of Medicine, Pediatric Nephrology Department were included in the study. Demographic data, 24-hour urine protein values and renal ultrasonographic data which made in the first 30 days of life were obtained from patient registery. Five mililiters of peripheral blood samples driven from patients were analyzed. After isolation of DNAs from blood, DNA molecules were subjected to methylation-sensitive and methylation-dependent endonuclease digestion. After digestion, methylated and unmethylated DNA fractions in the promoter region of the HNF1β gene were detected by real-time PCR. In four patients with HNF1β methylation, the complementary DNA (cDNA) was obtained from RNAs that were isolated from the first urine in the morning. Expression analysis of HNF1β was performed in renal cells using the HNF1β expression primer and cDNA. Ct values obtained were analyzed by real-time PCR expression analysis system in Qiagen Data Analysis Center. ABPM was made in seventeen patients.2 Statistical analysis was performed using of SPSS version 17.0.
Results: A total of 39 patients, 13 girls (33.3%) and 26 boys (66.67%), were included in the study. The mean age was 8.74 ± 4.65 years (minimum 2- maximum 21). HNF1β methylation was found in four of the patients (10.26%). The mean standart deviation score (SDS) of the number of methylated and unmethylated alleles was 0.21 ± 0.61 and 1.90 ± 0.45, respectively.
There was no significant difference between HNF1β methylation and gender (p = 0.455). One patient had consanguineous marriage (p = 0.574). All four patients were prenatally diagnosed (p = 0.275). None of the four patients had a history of oligohydramniosis (p = 0.732). There was no significant correlation between HNF1β methylation and gestational age (p = 0.461).
There was no significant relationship between HNF1β methylation and hypertension (p = 0.542), and no significant relationship between HNF1β methylation and proteinuria (p = 0.078). There was no significant relationship between cyst size (p = 0.268) and localization (p = 0.649) and presence of HNF1β methylation. One patient (50%) had a disappereance-decrease of the cysts. In one patient, cysts didn't show any change in size (50%). Growth in the size of the cysts wasn't seen in any of the patients. There was no significant relationship between the presence of HNF1β methylation and increase, no change or disappereance-deacrease in size of the cysts (p = 0.457, p = 0.796 p = 0.606).
HNF1β gene expression analysis performed in urine samples of four patients with HNF1β methylation, the methylated HNF1β gene had lower expression rate than the control group.
In our study, we aimed to evaluate the clinical effects of lower expression levels of HNF1β gene and showed for the first time that this non-invasive method was much more easy than invasive tissue analysis. These results are preliminary findings to evluate the downstream effects of HNF1β methylation and in addition these results provide hope about repairing the meachanisms involved in the pathogenesis.
Keywords: Congenital abnormalities of the kidney and urinary tract (CAKUT); genetics; multicystic dysplastic kidney, HNF-1β, methylation