Kardiyomiyosit ve mezenkimal kök hücre ko-kültürü aracılı hücre füzyonu ve hücresel değişimin fonksiyonel değerlendirilmesi
Cell fusion following cardiomyocyte and mesenchymal stem cell co-culture and functional evaluation of cellular changes
Yazar: AYNUR KARADAĞ
Danışman: PROF. DR. AHMET RÜÇHAN AKAR
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Anjiyogenez = Angiogenesis ; Hücre füzyonu = Cell fusion ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kardiyovasküler hastalıklar = Cardiovascular diseases ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Kardiyovasküler rejenerasyon odaklı hücresel tedavi araştırmaları, kök hücre aracılı anjiogenezis veya kardiyomiyogenezis, sistolik ve diastolik kardiyak fonksiyonların iyileştirilmesi ve/veya yeni, fonksiyonel miyokard dokusunun oluşturulmasını hedeflemektedir. Mezenkimal kök hücrelerle kardiyomiyosit füzyonu, kardiyak rejenerasyon mekanizmalarından biri olarak öngörülmektedir. Ancak füzyon ile onarım mekanizmaları ve fonksiyonel sonuçları tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu tezde, kök hücrelerin onarım mekanizmalarından biri olan füzyonun insan kardiyak onarımındaki rolünün açıklanması ve mezenkimal kök hücrelerin yeniden programlama özellikleri mikrodizin yöntemiyle araştırılmıştır.
İlk aşamada insan MKH/KM füzyonu PEG (polietilenglikol) kullanılarak indüklendi. iMKH ile iKM arasındaki maksimal füzyon, ko-kültür sonrası 15. günde elde edildi. Hibrid hücrelerin immünohistokimyasal, elektrofizyolojik özellikleri araştırıldı. Daha sonra iMKH, iKM ve hibrit hücrelerdeki gen ifade düzeyindeki değişikler mikrodizin yöntemi kullanılarak analiz edildi. Füzyondan sonra elde edilen hibrit hücrelerde kardiyak belirteçler (alfa sarkomerik aktin, kardiyak troponin, laminin) ve MKH pozitif yüzey belirteçleri (CD90, CD73, CD29) araştırıldı. Hibrit hücrelerde MKH ve KM belirteçlerinin pozitiflik gösterdiği saptandı. Böylelikle hibrit hücrelerde ko-kültüre giren her iki hücre kaynağının da özelliğini koruduğu gösterildi. Elektrofizyolojik çalışmalarda patch-klamp tekniği ile kalsiyum kanalları araştırıldı ve hibrit hücreler ile insan AC16 kardiyomiyositleri arasında ATP ve kafeine yanıt açısından bir fark bulunamadı. Mikrodizin sonuçlarına göre, hibrit hücreler MKH ve AC16 ile karşılaştırıldığında, MKH-Hibrit karşılaştırılmasında en az 4 kat farklı genlere bakıldığı zaman 1494 gen farklı ifadelenmiştir. AC16-Hibrit karşılaştrılmasında ise en az 4 kat farklı genlere bakıldığı zaman 139 gen farklı gen ifadelenmiştir. Kemokin sinyal yolağı, sitokin-sitokin reseptör etkileşim yolağı, ekstra selüler matriks-reseptör etkileşim yolağı,
fokal adezyon, TGF-beta sinyal yolağı, nod-like reseptör sinyal yolağı gibi KM farklılaşmasında öne çıkan yolaklar tesbit edildi. Hibrit hücrelerin kardiyomiyosit özelliğini koruduğunu yani MKH'lerin, kardiyomiyositleri destekleyerek kardiyomiyosit yönünde farklılaşmayı sağladığını söyleyebiliriz.
Kardiyovasküler hastalıklarda hücresel tedavi yolunda ilerleme, doğru kardiyak transdiferansiyasyon ve füzyon kapasitesine sahip hücreler üzerinde ileri araştırmalar yapılabilmesiyle mümkün olacaktır. Bu çalışmada iMKH/iKM kokültür sonrası elde edilen hibrid hücrelerin her iki hücre kaynağına da immünohistokimyasal ve elektrofizyolojik olarak benzerlikler gösterdiği ortaya konmuştur. Füzyon, kardiyovasküler rejenerasyonda önemli bir terapötik mekanizma olarak çevirimsel tıpta kullanılabilir.

Anahtar Sözcükler: Hücre füzyonu, Kardiyomiyosit, Mezenkimal kök hücre, Mikrodizin

Abstract:
Cell Fusion Following Cardiomyocyte and Mesenchymal Stem Cell Co-Culture and Functional Evaluation of Cellular Changes
Cellular thearpy research focusing on cardiovascular regeneration aims to achieve stem cell mediated angiogenesis/cardiomyogenesis leading to sistolic and diastolic cardiac functional improvement and/or development of new, functional cardiac tissue. Fusion of mesenchymal stem cells (MSCs) and host cardiomyocytes has been proposed as one of the mechanisms for cardiac regeneration. However, the mechanisms and the functional consequences of cell fusion remain undefined. The aim of this thesis study is to elucidate the role of fusion in cardiac repair and explore reprogramming characteristics of mesenchymal stem cells with microarray methodology..
We established an in vitro model that stimulates the fusion of human mesenchymal stem cells (h-MSCs) and human cardiomyocytes (hCM), which allowed functional evaluation of hybrid cells. Firstly, fusion between hMSCs/hCMs was induced with PEG (polyetilenglicol). Maximal fusion between hMSCs/hCMs was achieved on 15th day of culture. Hybrid cells were selected and re-cultured for another 15 days. After this period, hybrid cells were examined for their immunohistochemical and electrophysiological characteristics. Gene expression changes between hMSC, hCM and hybride cells were analysed with microarray methodology. Cardiac markers 8alpha-sarcomeric actin, cardiac troponin, laminin) and MSC positive surface markers (CD90, CD73, CD29) were examined. It was shown that hybrid cells were positive for both MKH and KM markers. Thus, hybride cells maintained the characteristics of both cell types. As a part of electrophysiological studies, calcium channels were also examined by patch-clamp. No significant difference was found between hybrides and human cardiomyocytes regarding response to ATP and caffeine. According to microarray results, 1494 and 139 genes were found to be expressed differently (4 fold or more) between MKH/hybride cells and AC16/hybride cells respectively. Chemokine signal pathway,
cytokine-cytokine interaction pathway, focal adhesion pathway, TGF-beta signal pathway, NOD-like receptor signal pathway were determined in hybride cells.
It can be concluded that hybride cells maintain the cardiomyocyte characteristics and MSCs support cardiomyocytes in a way to promote their differentiation to cardiomyocytes .
Progress in cellular therapy for cardiovascular diseases can be achieved by further analysis of cells with cardiac differentiation and fusion capacity. This study shows immunohistochemical and electrophysiologic similarities between hybrid cells following co-culture of hMSC/hCM and original hCMs. Fusion can be an important therapeutic mechanism in cardiovascular regeneration and also can be applied to translational science.

Key Words: Cardiomyocyte, Cell fusion, Mesenchymal Stem Cells, Microarray