Bombyx mori posterior ipek bezinde, otofaji mekanizmasında rol alan otofaji bağlantılı gen ATG6'nın susturulmasının apoptotik sürece etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of silencing the autophagy-related gene ATG6 on the apoptotic process in the Bombyx mori posterior silk gland
Yazar: BÜŞRA GÜNAY
Danışman: PROF. DR. NESRİN EBRU GÖNCÜ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Hücre ölümü = Cell death ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; İpek böcekçiliği = Sericulture

Özet:
Otofaji, hücre sağ kalımı ve hücre ölümünde önemli bir mekanizmadır. Ancak, bu mekanizmanın hücre ölümündeki rolü hakkındaki bilgiler sınırlı ve çelişkilidir. Bombyx mori'nin ipek bezi, larva-pupa metamorfozu sırasında apoptoz ve otofaji aracılı hücre ölümü ile dejenerasyona uğrar. Bu çalışmada, otofajide önemli bir rol oynayan ve hücrede otofagozom zarının nükleasyonundan sorumlu olan ATG6 geninin programlanmış dejenerasyondaki rolünü araştırmayı amaçladık. Atg6 geni, koza örmenin üçüncü gününde RNA interferans tekniği ile susturuldu. İşlem sonrasında, yöntemin etkinliği, Atg6 mRNA seviyelerinin ölçülmesiyle belirlendi. Ardından otofaji süreci, otofaji ile ilgili bazı genlerin ifade seviyelerinin belirlenmesi, ATG8 proteinindeki değişikliklerin tespiti ve lizozomal aktivitenin değerlendirilmesi ile analiz edildi. Dokunun ince yapısı, transmisyon elektron mikroskobu ile belirlendi. Apoptotik süreç, TUNEL boyama, p53, Bcl-2, sitokrom-c, kaspaz-3 proteinlerinin ifade seviyelerinin belirlenmesi ve morfolojik gözlemlerle analiz edildi. Sonuçlar kontrol gruplarından elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı. dsATG6 uygulamasından sonra bu genin mRNA seviyelerindeki azalma qRT-PCR ile belirlendi. ATG6'nın susturulması, otofajiyi düzenleyen bazı genlerin ifade seviyelerinde dramatik bir düşüşe neden oldu. Atg8 protein seviyeleri kontrol grubundan önemli ölçüde daha yüksek seviyede belirlendi. Elektron mikroskobu, özellikle pupa evresinde uygulama grubunun hücrelerinde, çok sayıda dejenere mitokondri ve veziküler endoplazmik retikulum yapılarının varlığını gösterdi. Ayrıca, asit fosfataz ve lysotracker boyama ile lizozomal aktivitenin deney grubunda önemli ölçüde azaldığı belirlendi. ATG6 geninin susturulması, posterior ipek bezi programlanmış dejenerasyonunu önledi. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, apoptotik belirteçlerde, önemli artışlar belirlendi. Bu çalışmada, ATG6 geninin susturulmasının otofaji mekanizmasını bozduğu ve apoptotik mekanizma üzerinde etkili olduğu tespit edildi. Sonuç olarak, otofajideki önemli rolünün yanı sıra, ATG6'nın anti-apoptotik fonksiyonu ve otofaji ve apoptoz arasındaki moleküler bağlantıda da yer alabileceğine ilişkin önemli kanıtlar ortaya kondu.

Abstract:
Autophagy is an important mechanism in cellular homeostasis, cell survival under stress and cell death. However, knowledge about the role of this mechanism in cell death is limited and contradictory. The silk gland of Bombyx mori undergoes degeneration during larval-pupal metamorphosis through apoptosis and autophagy-mediated cell death. In this study, we aimed to investigate the role of the ATG6 gene, which plays an important role in autophagy and is responsible for the nucleation of the autophagosome membrane in the cell, in the programmed degeneration. The Atg6 gene was silenced by RNA interference on the third day of prepupal development. After the procedure, the efficiency of the method was determined by measuring Atg6 mRNA levels. The autophagy process was then analysed by determining the expression levels of some autophagy-related genes, detecting changes in ATG8 protein and assessing lysosomal activity. The fine structure of the tissue was determined by transmission electron microscopy. The apoptotic process was analysed by TUNEL staining, determination of the expression levels of p53, Bcl-2, cytochrome c, caspase-3 proteins and morphological observations. The results were compared with those of the control groups. The decrease in mRNA levels of this gene after dsATG6 treatment was determined by qRT-PCR. Silencing of ATG6 caused a dramatic decrease in the expression levels of some genes that regulate autophagy. Atg8 protein levels were significantly higher than in the control group. Electron microscopy showed an accumulation of degenerated mitochondria and an increase in vesicular endoplasmic reticulum structures in cells from the treatment group, especially at the pupal stage. In addition, acid phosphatase and lysotracker staining showed that lysosomal activity was significantly reduced in the experimental group. Silencing of the ATG6 gene prevented the programmed degeneration of the posterior silk gland. There was a significant increase in apoptotic markers compared to the control group. In this study, we found that silencing the ATG6 gene disrupts the autophagy mechanism and has an effect on the apoptotic mechanism. In conclusion, in addition to its important role in autophagy, there is strong evidence that ATG6 may be involved in anti-apoptotic function and the molecular link between autophagy and apoptosis.