TAF7-CIITA etkileşiminin programlanmış hücre ölümü üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigating the effects of CIITA,-TAF7 interaction on programmed cell death
Yazar: DİLEK GÖKTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. ZEYNEP SERCAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Genler = Genes ; Genler-MHC-klas 1 = Genes-MHC-class 1 ; HIV = HIV ; HIV enfeksiyonları = HIV infections ; Hücre ölümü = Cell death ; TAFİ = TAFI

Özet:
Genel transkripsiyon faktörü TFIID'nin yapısında yer alan TAF7'nin, HIV genomundaki 9 genden biri olan Tat'ın ökaryotik işlevsel homoloğu olduğu ileri sürülmüştür. TAF7, HIV-Tat'a benzer şekilde transkripsiyonel elongasyonu destekleme veya transkripsiyonu baskılayabilme özelliklerini barındırmaktadır. Daha önceki çalışmalarımızda TAF7'nin HIV-Tat'a benzer şekilde hücre ölümünü tetiklediğini destekleyen bulgular elde ettik. Tat proteininin önemli bir özelliği CIITA ile olan etkileşimidir. CIITA MHC sınıf II genleri için transkripsiyonel bir aktivatör işlevi görür ve yokluğunda MHC sınıf II proteinleri ifade edilmez. Tat, CIITA ve MHC sınıf II ekspresyonunu baskılayabilirken; CIITA over-ekspresyonu da Tat'ı ve bu yolla da HIV transkripsiyonunu baskılayabilmektedir. Buradan yola çıkarak TAF7 ile CIITA arasında da benzer bir etkileşim olup omadığını araştırmak hedeflenmiştir. HeLa ve Kelly hücrelerine tek tek ve ko-transfeksiyonla TAF7 ve CIITA genlerinin yüksek düzeyde ekspresyonu sağlanarak hücre ölümü kaspaz aktivasyonları, hücre döngüsü davranışları ölçülerek değerlendirildi. Geçici transfeksiyon deneylerinin yanı sıra TAF7 over-ekspresyonu için tetrasiklin ile regüle edilen ekspresyon sistemi kullanıldı. Ayrıca TAF7'nin tubulin polimerizasyonu üzerindeki etkisi invitro tubulin polimerizasyon deneyi ile araştırıldı. TAF7'nin Beta Tubulin proteini ile ilişkisi in vitro immün presipitasyon ve floresan mikroskobi deneyleri ile gösterildi. Bu proje kapsamında yapmış olduğumuz deneyler CIITA'in TAF7'nin apoptotik etkisini baskılayabildiğini (önceki çalışmalarımız ve bu proje ile elde edilmiş veriler) ve buna ek olarak TAF7'nın BCL-2, kaspaz2 gibi apoptotik proteinlerle doğrudan etkileştiğini gösterdik. Proje kapsamında site-directed mutagenez ile TAF7'nin fosforilasyon mutantını oluşturduk ve mutant formun hücre ölümünü indüklemede yabanıl TAF7 kadar etkili olmadığını gösterdik. Bu bulgular son 1-2 yıla kadar bir genel transkripsiyon faktörü olan TFIID'ın yapısal bir komponenti olarak kabul edilen TAF7'nin hücre döngüsüne bağlı olarak bir regülasyona tabi olduğunu; modifiye olup olmamasına bağlı olarak farklı etkinliğe sahip olduğunu düşündürmektedir.Bunlara ek olarak TAF7 ekspresyonunun indüklediği apoptozun CIITA varlığında baskılanabileceğini ve CIITA mutantları kullanarak bu etkinin oldukça spesifik olduğunu gösterdik. Bu gözlem bağışıklık sistemi için önemlidir. Bağışıklık sisteminin bu önemli molekülünün, TAF7 ile olan etkileşiminin niteliği ve bu etkileşiminin hücre ölümüne olan etkisinin açığa kavuşturulması, immun sistem biyolojisi açısından önem kazanmaktadır. Bu yönde elde edilecek tüm verilerin bağışık yanıtın oluşması, immun hücrelerin gelişimi (pozitif ve negatif seleksiyon), HIV biyolojisi gibi çok geniş alanlarda etkisi olabilir.

Abstract:
It has been proposed that TAF7 could be a eukaryotic analogue of HIV Tat. HIV-Tat functions can be summarized as: 1) transcriptional transactivation of the provirus 2) transcriptional inhibition of host genes and 3) induction of apoptosis in host cells. TAF7 has been shown to both support transcriptional elongation and to inhibit transcription by mechanisms very similar to HIV Tat; and we have also previously reported that TAF7 over-expression induces cell death. An important feature of the Tat protein is its interaction with CIITA, the transcriptional activator for MHC class II genes. While Tat can suppress MHC class II expression through its interaction with CIITA; CIITA over-expression can suppress Tat and thereby inhibit HIV transcription and host cell death. Given the functional similarities between HIV-Tat and TAF7 we aimed to investigate the effects of CIITA-TAF7 interactions on programmed cell death. Another important feature of the Tat protein is its ability to bind tubulin proteins during apoptosis. We also aimed to investigate whether TAF7 also binds to tubulin proteins.TAF7 gene was cloned in to expression vectors which were transfected in to HeLa and Kelly cells. In addition to transient transfection, a tetracycline regulated expression system (TREX) was used for TAF7 over-expression. TAF7 was cloned to TREX system?s plasmid and was stable transfected into a Tet-repressor expressing Hela cell line.TAF7 ? Beta Tubulin interaction was shown by immune precipitation experiments performed using both pure isolated proteins and cell lysates. Functional outcome of the interaction was analyzed by invitro tubulin polymerization assays. We?ve shown that TAF7 over-expression induced cell death and CIITA expression suppressed TAF7's apoptotic effect . Our data supports a model in which TAF7 causes stabilization of tubulin polymerization. I the presence of an apoptotic signal, TAF7 remains bound to tubulin proteins and the cell cycle halts. In the absence of an apoptotic signal, the chromosomes attach to the mitotic spindle properly and cell cycle continues with the termination of mitosis. We also showed that the phosphorylation mutant of TAF7 did not induce apoprosis as its wild type form. In addition by using CIITA mutants we were able to show that the inhibition of apoptosis is specific to the presence of a functional CIITA molecule When taking the role TAF7 plays in apoptosis under consideration, its interactions with CIITA during this process has very important implication fort he field of immunology. Futhermore when one considers CIITA and Tat interactions during HIV infection; the importance to elucidating molecular interactions between CIITA and TAF7 is evident.