HeLa hücre kültürlerinde apoptoz ve moleküler mekanizması
Apoptosis and its molecular mechanism in HeLa cell cultures
Yazar: UĞUR SERBES
Danışman: YRD. DOÇ. GÜL ÖZCAN ARICAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Apoproteinler = Apoproteins ; Apoptozis = Apoptosis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Bu çalışmada, kanser kemoterapisinde aktif olarak kullanılan bir kemoterapötik ajan olan Paklitaksel'in insan serviks karsinomu kökenli HeLa hücre soyu üzerine apoptotik etkisi ve bu etkinin moleküler mekanizması ele alındı. Öncelikle seçilen 6 doz (D1= 3 nM, D2= 7,5 nM, D3= 15 nM, D4= 30 nM, D5= 60 nM, D6= 120 nM) ile 48 saat boyunca hücre kültürleri inkübe edildi. Mitokondrial dehidrogenaz enzim aktivitesi analizi ile çoğalma hızları incelendi. 4'-6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) uygulaması ile floresan mikroskopta apoptotik indeks değerleri belirlendi ve sitotoksisite analizi ile karşılaştırılarak D3 dozu (D3= 15 nM) optimum doz olarak belirlendi.Belirlenen optimum doz (IC50) ile 48 saatlik süreçte hangi saatlerde en yüksek sitotoksisite ve apoptotik indeks değerlerine ulaşıldığının tespiti için 0- 48 saat (0s, 4s, 8s, 12s, 24s, 36s, 48s) zaman periyodunda D3 dozunun uygulandığı HeLa hücre kültürlerinde çoğalma hızı ve apoptotik indeks tespiti yapıldı. Sonuçlar 48 saatlik inkübasyon süresinde kontrole göre en yüksek sitotoksisite ve apoptotik indeks değerlerine ulaşıldığını gösterdi (p<0,05).D3 dozu (D3= 15 nM) ile 48 saat süre sonunda hücrelerde meydana gelen apoptozun moleküler seviyede tespiti için agaroz jel elektroforezi yöntemi ile DNA fragmentasyonu, Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) tekniği ile apoptozda fonksiyonel bcl-2 gen ailesinin (mcl-1, bfl-1, bax, bcl-2, bak, bik, bcl-x) anlatımları ve floresan spektroskopi ile kaspaz 3, 7 ve 10 enzimlerinin zamana bağlı olarak aktivasyonları gösterildi (p<0,05).Sonuç olarak D3 dozunun 48 saat uygulanmasına bağlı olarak bcl-2 gen ekspresyonunun olmadığı ve bcl-x geninin ekspresyon seviyesinde kontrole göre bir azalmanın olduğu tespit edildi. Ayrıca çalışmada kaspaz 3, 7 ve 10 enzimlerinde saptanan aktivasyon ile, HeLa hücrelerinde Paklitaksel'in teşvik ettiği apoptozun kaspaz bağımlı apoptotik yol ile gerçekleştiği sonucu ortaya kondu.

Abstract:
In this project, apoptotic effect of Paclitaxel, which is a chemotherapeutic agent and has an active role in cancer chemotherapy, and its molecular mechanisms in HeLa cell line originated from human servical carcinoma has been investigated. At first, cells incubated with 6 different doses (D1= 3 nM, D2= 7,5 nM, D3= 15 nM, D4= 30 nM, D5= 60 nM, D6= 120 nM) for 48 hours. Proliferation rates investigated by mitochondrial dehydrogenase enzyme activity analysis. Apoptotic index determined by 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining application under flouroscent microscope and D3 dose (D3= 15 nM) has been decided as optimum dose after comparing the results with cytotoxicity analysis.To determine the highest cytotoxicity and apoptotic index values caused by determined optimum dose (IC50) in 48 hours time period, proliferation rate and apoptotic index analysis have been conducted for D3 dose applied HeLa cell cultures between 0 to 48 hours (0h, 4h, 8h, 12h, 24h, 36h, 48h). According to the results cytotoxicity and apoptotic index values reached to the highest level in 48 hours incubation time, comparing to the control (p<0,05).To evaluate molecular level of apoptosis, which induced by D3 dose (D3= 15 nM) after 48 hours time period in cells, DNA fragmentation hes been shown by agarose gel electrophoresis method, bcl-2 gene family (mcl-1, bfl-1, bax, bcl-2, bak, bik, bcl-x) expression presented by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technique and time dependent activation of caspase 3, 7 and 10 has been shown by flouroscent spectroscopy (p<0,05).As a result, it has been observed that bcl-2 expression did not occur and bcl-x expression level showed a decrease depending on 48 hours D3 treatment, comparing to control. Also, it has presented by observed caspase 3, 7 and 10 enzyme activation that Paclitaxel induced apoptosis in HeLa cells is caspase dependent.