PCR tekniği kullanımı ile DNA dizilerinde mutasyon oluşturulması (İn vitro mutagenez)
Constittution of mutations in DNA segments (In vitro mutagenesis) with the usage of PCR technique
Yazar: YUSUF ÇETİN KOCAEFE
Danışman: PROF.DR. MERAL ÖZGÜÇ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 1999
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Fenilalanin hidroksilaz = Phenylalanine hydroxylases ; Fenilketonüri = Phenylketonuria ; Mutagenez = Mutagenesis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Transfeksiyon = Transfection

Özet:
Bir canlının genetik şifre dizisinde meydana gelen değişikliğe mutasyon adı verilir. Bir mutasyonun patolojik bir durum ortaya çıkarması, fenotipi etkilemesiyle mümkündür. Bunun gösterilmesinin en iyi yolu mutant proteinin fonksiyon analizi çalışmasının yapılmasıdır. Bu amaçla, mutant proteini kodlayacak olan gene ait olan cDNA, bir vektör yardımı ile model bir hücre sistemine verilerek mutant proteinin ekspresyonu sağlanır. Bu mutant proteinin fonksiyonu ölçülerek fenotipi etkileyici niteliği ortaya konur. Bir enzimin incelenmesi durumunda fonksiyon analizi, mutant proteinin biyolojik aktivitesinin doğal proteinle karşılaştırılması ile yapılır. Otozomal ressesif hastalıklar, iki allellerinden birinde mutasyon taşıyan anne ve babanın çocuğuna hasta alicileri aktarmaları sonucunda lA olasılıkla görülür. Bu hastalıklardan biri olan fenilketonüri hastalığı insan karaciğerinde sentezlenen Fenilalanin Hidroksilaz enzim geninde meydanan gelen mutasyon sonucu oluşan fonksiyon kaybı ile meydana gelir. Fonksiyon analizi çalışması için, mutasyon taşıyan hasta bireylerin karaciğerlerinden örnek alarak enzim çalışması yapmak etik değildir. Bu amaçla, bu mutasyonu Fenilalanin Hidroksilaz enzim geninde oluşturmak gerekmektedir. Bu çalışmanın amacı insan Fenilalanin Hidroksilaz cDNAsı üzerinde L48S mutasyonunu PCR ile mutagenez yöntemi kullanarak oluşturmaktır. PCR tekniği ile mutagenez, uygulaması kolay, düşük maliyetli bir yöntemdir. Oluşturulan mutant cDNAnın, COS-1 memeli hücrelerine transfekte edilerek bu mutant enzimin fonksiyon analizi çalışmasında kullanılması öngörülmektedir. Çalışmada, iki aşamada oluşturulan iki mutajenik fragman birleştirilerek mutant cDNA fragmanı elde edilmiştir. Fonksiyon analizi çalışmasında kullanılmak üzere COS-1 hücre hatlarında DEAE-Dextran transfeksiyon protokolü standardize edilmiştir. DEAE-Dextran transfeksiyonu uygulaması kolay, düşük maliyetli ve özel gereç istemeyen bir metoddur. COS-1 hücrelerine pEGFP plazmidi transfekte edilerek green fluorescent protein, bildirici gen olarak eksprese edilmiş ve transfeksiyon başarı oranı %10 olarak saptanmıştır.Anahtar Kelimeler: İn-vitro mutagenez, PCR, Fenilalanin Hidroksilaz, Fenilketonüri, Transfeksiyon

Abstract:
The best way to define a phenotypic change due to a mutation is the functional analysis of the protein. For this, the mutant cDNA must be cloned into a vector and must be expressed in a model system. If the protein studied is an enzyme, the function analysis is achieved by the comparison of the mutant enzyme's activity with the wild-type protein. As an autosomal recessive disease, phenylketonuria is due to the mutations in the Phenylalanine Hydroxylase enzyme gene. It is not ethical to obtain liver biopsy samples from the mutation bearing patients for enzyme activity study. The mutant Phenylalanine Hydroxylase enzyme cDNA with the mutation of interest should be produced under in-vitro conditions. In this study the L48S mutation on the human Phenylalanine Hydroxylase cDNA is produced with the use of the PCR technique. In-vitro mutagenesis using PCR is an easy to perform, low-cost technique. The mutant cDNA produced is transfected to COS-1 cell lines to perform function analysis. The two mutagenic fragments produced over the wild-type cDNA by the use of mutagenic primers are united by a second reaction for a full length mutated fragment. The DEAE-Dextran transfection protocol is standardized for transfection of COS-1 cells to be used in the enzyme activity study. This is an easy-to-use, low cost method for the transfection of eucaryotic cell lines. The pEGF plasmid is transfected into COS-1 cells by DEAE-Dextran method and the green fluorescent protein is expressed as a reporter gene. The transfection efficiency is calculated as 10%.Key Words: In-vitro mutagenesis, PCR, Phenylalanine Hydroxylase, Phenylketonuria, Transfection