Tabaklama öncesi işlem basamaklarından bazı alkalifilik mikroorganizmaların izolasyonu ve moleküler tekniklerle identifikasyonu
Isolation of some alkaliphilic microorganisms from pre-tanning processes and their identification via molecular techniques
Yazar: DERYA DOĞANAY
Danışman: DOÇ. DR. BİNNUR MERİÇLİ YAPICI
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Alkaliler = Alkalies ; Amilazlar = Amylases ; Bacillus = Bacillus ; Lipaz = Lipase ; Proteaz =   ; Proteolitik aktivite = Proteolytic activity

Özet:
Çalışmada tabaklama öncesi işlem basamaklarından ıslatma-yumuşatma, kireçlik, kireç giderme-samadan proteaz, α-amilaz ve lipaz enzim aktivitesi gösteren alkalifilik bakterilerin izolasyonu, elde edilen izolatların fenotipik özelliklerinin belirlenmesi, fenotipik özelliklerine göre seçilen birbirinden farklı izolatların nicel enzim aktivitelerinin belirlenmesi ve moleküler tanımlamalarının yapılması amaçlanmıştır.Araştırma bulgularına göre söz konusu işlem basamaklarından 50 adet proteaz, 52 adet α-amilaz ve 15 adet lipaz aktivitesine sahip toplam 117 adet bakteri izole edilmiştir. Ancak lipaz aktivitesine sahip izolatların lipaz aktivitesi yerine esteraz aktivitesi gösterdikleri belirlenmiştir.İzolatların fenotipik özelliklerinin belirlenmesi için Gram boyama, bazı biyokimyasal testler, pH, NaCl ve sıcaklık tolerans testleri uygulanmıştır. 
Çalışmada fenotipik özellikleri belirlenmiş 117 izolatdan moleküler tanılama için birbirinden farklı 29 izolat seçilmiştir. Ayrıca bu izolatlardan nitel enzim aktivitesine göre yüksek aktiviteye sahip 12 adet proteolitik, 10 adet amilolitik toplam 22 adet izolat seçilerek nicel enzim aktiviteleri belirlenmiştir.Nicel enzim aktivitesi belirlenen proteolitik özellikteki 12 izolattan PS6 izolatının 4,40 ± 0,10 U/mL ve amilolitik özellikteki 10 izolattan AS6 izolatının 0,76 ± 0,01 U/mL' lik enzim aktivitesi ile diğer izolatlardan daha yüksek enzim aktivitesine sahip olduğu belirlenmiştir.
Araştırmamızda 29 izolatın moleküler tanımlaması 16S rRNA dizi analizi ile yapılmıştır.

Bu sonuçlara göre filogenetik olarak izolatların Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus altitudinis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus majovensis, Bacillus sp. LCP66, Bacillus pseudofirmus, Bacillus polygoni,  Bacillus clarkii, Bacillus sp. 2b-2, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus tequilensis, Uncultured organism clone ELU 0110, Bacillus thuringiensis ve Bacillus sp. LCP65 türlerine ait strainlere benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Sonuç olarak araştırmamızda moleküler olarak tanımlanan 17 farklı Bacillus türünün 8'inin alkalifilik ve 9'unun ise alkalitolerant olduğu belirlenmiştir. Böylece deri proseslerinden daha önceden klasik ve moleküler yöntemlerle tanımlanan ve bilinen türler haricinde 11 yeni Bacillus türü bu çalışmada ilk kez tanımlanmıştır. Araştırma sonuçlarının bu konu kapsamında yürütülecek olan diğer araştırmalara ve hem ülkemiz hem de yurtdışındaki deri sektörüne oldukça önemli katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
The current study aims to isolate alkaliphilic bacteria with protease, α-amylase and lipase (enzyme) activities from such pre-tanning processes as first and main soaking, liming, deliming-bating steps, to phenotypically characterize the isolates, to determine the quantitative enzyme activities of various isolated selected by their phenotypic properties, and to carry out their molecular identification.According to the findings, total 117 bacteria with 50 protease, 52 α-amylase and 15 lipase activities were isolated from mentioned process step. However, isolates with lipase activity displayed esterase activity instead of lipase activity.
Gram's staining, some biochemical tests, pH, NaCl and temperature tolerance tests were carried out for the phenotypic characterization of the isolates.

117 isolates phenotypic properties of which were characterized, 29 different isolates were chosen for the molecular identification. Moreover, 22 isolates - 12 proteolitic and 10 amilolitic - with high qualitative enzyme activity were chosen to determine their quantitative enzyme activities. 
It was revealed that out of 12 proteolitic isolates, the isolate PS6 was determined to have an enzyme activity of 4,40 ± 0,10 U/mL, while the isolate AS6 of 10 amilolitic isolates had an enzyme activity of 0,76 ± 0,01 U/mL, which were higher than those of the other isolates. Molecular identifications of 29 isolates were performed via 16S rRNA sequence analysis. The analyses showed that the isolates phylogenetically shared similarities with strains Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus altitudinis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus majovensis, Bacillus sp. LCP66, Bacillus pseudofirmus, Bacillus polygoni, Bacillus clarkii, Bacillus sp. 2b-2, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus tequilensis, Uncultured organism clone ELU 0110, Bacillus thuringiensis and Bacillus sp. LCP65.

It was concluded from the results that 8 of 17 molecularly-identified Bacillus species were alkaliphilic and 9 were alkalitolerant. Thus, 11 new Bacillus species were identified for the first time apart from the ones which were already known or identified in tanning processes via regular or molecular methods. It is considered that the results obtained in the present study will greatly contribute to other relevant studies and to the national and international leather production industry.