Siyanobakterilerde koku üretimi ile ilişkili çevresel etmenlerin moleküler yöntemlerle belirlenmesi
Determination of environmental factors associated with odour production in cyanobacteria by molecular methods
Yazar: ZUHAL ZENGİN
Danışman: PROF. DR. REYHAN AKÇAALAN ALBAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Deniz ve İçsu Kaynakları Yönetimi Ana Bilim Dalı / İçsu Kaynakları ve Yönetimi Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: DNA dizileme = DNA sequencing ; PCR =   ; Siyanobakteriler = Cyanobacteria ; Sıcaklık = Temperature

Özet:
Bu çalışmada, moleküler yöntemlerin hem ülkemizde hem de dünyada tat ve koku sorunu problemlerinde rutin olarak kullanılabilmesine yönelik olarak öncelikle siyanobakterilerde geosmin sentaz geni için evrensel bir primer tasarlanması ve bu metabolitlerin üretiminde rol oynayan çevresel faktörlerin ortaya konması hedeflendi. Bu doğrultuda, veri bankalarında mevcut tüm siyanobakteri genomları geosmin sentaz geni hedeflenerek tarandı, veri madenciliği çalışması yapıldı ve evrensel primerler hem PCR hem kantitatif PCR (qPCR)  için tasarlandı. Tasarlanan primerlerin optimizasyonu ve validasyonu geosmin ürettiği bilinen farklı siyanobakteri kültürleri kullanılarak yapıldı. Bu primerlerin ülkemizdeki su kaynaklarındaki üreticilerin tespitine yönelik validasyonu, Türkiye'de geosmin ve mib üreticisi olarak ilk kez kültüre alınan bir siyanobakteri olan Microcoleus sp. MCAS-MC01 suşu ve farklı siyanobakteri suşları kullanılarak yapıldı. Ayrıca sularda tat ve koku probleminin ortaya çıkış süreçlerinin anlaşılması amacıyla yürütülen deneysel çalışmalarıın ilkinde, Microcoleus sp. MCAS-01, Oscillatoria sp. UHCC 0332 ve Phormidium sp. NIVA-CYA 7 suşlarının iki farklı sıcaklıkta gelişim dinamikleri izlendi. Artan sıcaklık suşa bağlı farklı etkiler gösterdiği; Microcoleus sp.  suşunda MİB (2-metilizoborneol) üretimini ve Phormidium sp.'de geosmin üretimini arttırırken Oscillatoria sp. suşunda önemli bir etki göstermediği tespit edildi. Ardından, siyanobakteri artışlarında önemli rolü olan fosfor konsantrasyonunun ve tam tersi etkisi olduğu bilinen mevsimsel sıcaklık düşüşlerinin koku üreticisi siyanobakterilerin koku üretimlerine, geosmin sentaz ve mib sentaz gen kopyası seviyelerine etkisi incelendi. Soğuk stresinin koku üreticisi türlerde gelişimi engellediği ve ortak olarak koku seviyesini arttırdığı görülürken türe özgü yanıt olarak Oscillatoria sp.'de yalnızca geosmin seviyesini arttırdığı görüldü. Bu bakımdan mevsimsel sıcaklıklık düşüşlerinin yaşandığı ve siyanobakteri gelişiminin olumsuz etkilendiği dönemlerde de hücrelerin parçalanması yoluyla suda koku sorunu olabileceği görüldü. Fosfor azlığı stresinin koku üretici türlerde koku seviyesini arttırdığı görülürken gelişime suşa özgü etkisi görüldü; Microcoleus sp. gelişimi engellenirken Oscillatoria sp.'de önemli bir etki görülmedi. Deneylerde gen kopya sayılarında tespit limitinin üzerinde geosmin ve MİB sentaz tespit edilmiş olsa da strese yanıt bakımından genel olarak belirgin bir değişim gözlenmemesi ortamdaki koku artışının ölen hücreler nedeniyle olduğuna işaret etti. Yanı sıra, fosfor ve azot artışının uzun süreli etkilerinin ve koku üreten organizma gruplarının belirlenmesine yönelik olarak, İngiltere'de kurulan mezokozm deneyinde metabolitlerin tespiti ve izlenmesine yönelik çalışmalar yürütüldü. Bu çalışma hem fosfor hem de azotun mezokozmda koku seviyesini arttırıcı etkileri görüldü. Geosmin üretiminden sorumlu bakterilerin aktinobakteriler olabileceği tespit edilirken MİB üretiminden sorumlu bakterilerin tespiti için ileri çalışmalara ihtiyaç olduğu görüldü.  Deneysel çalışmaların yanısıra, önemli bir içme suyu kaynağı olan Sapanca Gölü'nde MİB ve geosmin konsantrasyonlarının izlenmesi ve bakteriyel komünitenin koku sorunundaki rolünün tespiti amacı ile izleme çalışması yapıldı. Bu çalışmayla,  ilk kez yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak gölde geosmin ve MİB üreticisi bakterilerinin yanısıra bu bileşikleri degrede edebilme potansiyeline sahip bakterilerin varlığı tespit edildi.

Abstract:
The aim of this study was to design a universal primer for the geosmin synthase gene in cyanobacteria and to elucidate the environmental factors that are involved in the production of these metabolites, so that molecular methods can be routinely used in taste and odor problems in our country and around the world. In this direction, all cyanobacterial genomes available in databases were scanned for the geosmin synthase gene, data mining was performed and universal primers were designed for both PCR and quantitative PCR (qPCR). Optimization and validation of the designed primers were performed using different cyanobacterial cultures known to produce geosmin. The validation of these primers for the detection of producers in water resources in Türkiye was performed using Microcoleus sp. strain MCAS-MC01, a cyanobacterium cultured for the first time in Türkiye as a producer of geosmin and MIB, and different cyanobacterial strains. In addition, the growth dynamics of Microcoleus sp. MCAS-01, Oscillatoria sp. UHCC 0332 and Phormidium sp. NIVA-CYA 7 strains were monitored at two different temperatures in the first of the experimental studies conducted to understand the processes involved in causing taste and odor problems in water. Increased temperature showed different effects among strains, Microcoleus sp. increased MIB production and Phormidium sp. increased geosmin production, whereas Oscillatoria sp. showed no significant effect. Subsequently, the effects of phosphorus concentration, which plays an important role in cyanobacterial growth, and seasonal temperature decrease, which is known to have the opposite effect, on odor production, geosmin synthase and MIB synthase gene copy levels of odor producing cyanobacteria were studied.  It was observed that cold stress inhibited the development of odor-producing species and increased odor levels in general, while only geosmin levels increased in Oscillatoria sp.  as a species-specific response. In this regard, it was observed that there may be odor problems in the water during periods of seasonal temperature decrease and negative effects on cyanobacterial growth through cell lysis. Phosphorus deficiency stress increased odor levels in odor-producing species, while strain-specific effects on growth were observed; growth of Microcoleus sp. was inhibited, while Oscillatoria sp. showed no significant effect. Although geosmin and MIB synthase were detected above the detection limit in gene copy numbers in the experiments, in general no significant change in stress response was observed, indicating that the increase in odor in the environment was due to cell death. In addition, to determine the long-term effects of phosphorus and nitrogen increases and odor-producing organism groups, studies were conducted to detect and monitor metabolites in the mesocosm experiment in the United Kingdom. This study showed that both phosphorus and nitrogen increased odor levels in the mesocosms. While it was determined that the bacteria responsible for the production of geosmin may be actinobacteria, further studies are needed to identify the bacteria responsible for the production of MIB.  In addition to the experimental studies, a monitoring study was conducted to monitor MIB and geosmin concentrations in Sapanca Lake, an important drinking water source, and to determine the role of the bacterial community in the odor problem. This study was the first to use next-generation sequencing technology to detect the presence of geosmin- and MIB-producing bacteria in the lake, as well as bacteria with the potential to degrade these compounds.