Caretta caretta kaynaklı defensin benzeri TEWP peptidi ve analoglarının Pichia pastoris ekspresyon sisteminde rekombinant üretimi
Recombinant production of TEWP defensin-like peptide from Caretta caretta and its analogues in Pichia pastoris expression system
Yazar: SAİME GÜLSÜM BATMAN
Danışman: PROF. DR. ZÜLAL KESMEN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Antimikrobiyal peptidler (AMP'ler), mikroorganizmalardan insanlara kadar çok çeşitli yaşam formları tarafından doğal olarak üretilen ve patojenlere karşı ilk savunma hattını oluşturan peptidlerdir. Son yıllarda AMP'ler antimikrobiyal gıda ajanlarına ve antibiyotiklere alternatif bileşikler olarak öne çıkmaktadır. Bugüne kadar çeşitli organizmalardan izole edilmiş binlerce AMP tanımlanmıştır. Ancak doğal kaynaklardan izole edilen AMP'ler, zayıf proteaz direnci, yüksek hemolitik aktivite, düşük çözünürlük ve tuza duyarlılık gibi bazı istenmeyen özellikler sergileyebilmektedirler. Bu dezavantajların üstesinden gelmek için peptid dizilerinin modifikasyonlarına dayalı sentetik AMP tasarımları giderek daha çok önem kazanmaktadır.
Bu amaçla tez çalışmasında, doğal bir peptid ile bu peptidin modifikasyonu ile tasarlanan 3 farklı analoğunun rekombinant ekspresyon yöntemi ile üretimi gerçekleştirilmiştir. Doğal antimikrobiyal peptid olarak omurgalı deniz kaplumbağasına (Caretta caretta) ait defensin familyasından "Defensin-like turtle egg white protein (TEWP)" seçilmiştir. Doğal TEWP peptidinin aminoasit dizisi modifiye edilerek "modifiye analog, MTEWP peptidi", MTEWP peptidinin dizisi ters çevrilerek "retro analog, RMTEWP peptidi", son olarak RMTEWP peptidine hücreye nüfuz eden bir motif (RWRWRWRW) eklenerek (RW)4-RMTEWP peptidi" elde edilmiştir. Herbir peptidi kodlayan DNA dizileri, rekürsif PCR ile elde edildikten sonra E. coli DH5α hücrelerinde klonlanmış ve ardından P. pastoris GS115 hücrelerine transforme edilmiştir. P. pastoris transformantları çalkalamalı kültür ortamında metanol ile indüklenerek herbir rekombinant peptidin ekspresyonu gerçekleştirilmiştir.
Tez kapsamında üretilen rTEWP, rMTEWP, rRMTEWP ve r(RW)4-RMTEWP peptidlerinin antimikrobiyal aktiviteleri 6 Gram-pozitif bakteri suşu, 10 Gram-negatif bakteri suşu ve 3 maya suşu olmak üzere toplam 19 mikroorganizma suşu üzerinde test edilmiştir. Rekombinant peptitlerin minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) testi sonucuna göre; rTEWP ve rMTEWP'nin Gram-pozitif bakteri suşlarına karşı MİK değerleri 4 - >256 µg/ml, rRMTEWP ve r(RW)4-RMTEWP peptidlerinin MİK değerleri ise 2 - >256 µg/ml arasında bulunmuştur. Gram-negatif bakterilerde ise MİK değerlerinin, rTEWP ve rMTEWP peptidleri için sırasıyla 8 - 32 µg/ml ve 8 - 64 µg/ml, rRMTEWP ve r(RW)4-RMTEWP peptidleri için ise 4 - 32 µg/ml arasında değiştiği belirlenmiştir. Ayrıca rTEWP ve rMTEWP peptidlerinin test edilen maya suşlarına karşı MİK değerleri16-64 µg/ml aralığında, rRMTEWP ve r(RW)4-RMTEWP peptidleri için ise sırasıyla 16-32 µg/ml ve 32 - 64 µg/ml aralığında değiştiği belirlenmiştir. Üretilen tüm peptidler en yüksek inhibisyon etkisini L. monocytogenes ATTC 7644 suşuna karşı gösterirmişlerdir. En düşük inhibisyon etkisi ise S. aureus ATCC 25923 ve MRSA ATTC 43300 suşlarına karşı gözlenmiştir. MİK analizi sonuçlarına göre rRMTEWP ve r(RW)4-RMTEWP analog peptidlerinin rTEWP ve rMTEWP peptidlerine kıyasla daha yüksek bir antimikrobiyal aktivite sergilediği gözlenmiştir.
Tez çalışması kapsamında üretilen peptidlerin hemolitik aktiviteleri fare eritrositine karşı test edilmiştir. rTEWP ve rMTEWP peptidlerinin 8 µg/ml konsantrasyondaki % hemoliz değerleri > % 95 iken, rRMTEWP peptidinin % 23, r(RW)4-RMTEWP peptidinin ise % 4 olarak bulunmuştur. Tüm peptidlerin < 4 µg/ml konsantrasyonlardaki % hemoliz değerlerinin ise < % 0,4 olduğu tespit edilmiştir.
Tez çalışması kapsamında üretilen peptidlerin farklı sıcaklık, yüksek NaCl konsantrasyonları ve farklı enzimlerle muamlelelerinden sonra stabiliteleri, E. coli ATCC 25922 suşuna karşı MİK değerlerindeki değişime göre değerlendirilmiş ve sonuçta peptidlerin antimikrobiyal aktivitelerini dolaysıyla da stabilitelerini genel olarak koruduğu tespit edilmiştir.
Sonuç olarak bu tez çalışmasında aminoasit dizisi doğal bir kaynaktan elde edilen TEWP peptidi ile bu peptidin modifikasyonu ile tasarlanan analoglarının P. pastoris ekspresyon sisteminde üretimi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Üretilen tüm rekombinant peptidler, test edilen patojen mikroorganizmalara karşı belirli düzeyde antimikrobiyal aktivite göstermişlerdir. Ancak gerek antimikrobiyal aktivite ve gerekse hemolitik aktivite bakımından r(RW)4-RMTEWP peptidinin diğer peptidlere kıyasla sonuçları daha başarılı bulunmuştur. Bu tez çalışmasında üretilen peptidlerin gıda, ilaç, tarım ve hayvancılık alanlarında kullanılma potansiyelinin olduğu ancak ticari ürüne dönüştürülmesi için daha ileri çalışmaların yapılması gerektiği sonucuna varılmıştır.

Anahtar Kelimeler: Antimikrobiyal peptid, AMP, Defensin, Defensin benzeri peptid, Hücreye nüfus eden peptid, CPP, Peptid modifikasyonu, Retro analog, Rekombinant AMP, Pichia pastoris, pPICZαA, TEWP

Abstract:
Antimicrobial peptides (AMPs) are peptides naturally produced by a wide variety of life forms, from microorganisms to humans, and they are first line of defense against pathogens. In recent years, AMPs have become popular as alternative compounds to antimicrobial food agents and antibiotics. To date, thousands of AMPs isolated from various organisms have been identified. However, AMPs isolated from natural sources may exhibit some undesirable properties such as poor protease resistance, high hemolytic, low solubility and salt sensitivity. To overcome these disadvantages, synthetic AMP design approaches based on peptide modifications are gaining more and more importance.
For this purpose, in the thesis study, the production of a natural peptide and 3 different analogues designed by modification of this peptide was carried out by recombinant expression method. "Defensin-like turtle egg white protein (TEWP)" from the defensin family which was identified from the vertebrate sea turtle (Caretta caretta) was chosen as a natural antimicrobial peptide. The modified analogue, "MTEWP peptide", was obtained by modifying the amino acid sequence of the natural TEWP peptide; "retro analogue, RMTEWP peptide" was obtained by reversing the sequence of the MTEWP peptide; finally "(RW)4-RMTEWP analog" was obtained by adding a cell-penetrating motif (RWRWRWRW) to the RMTEWP peptide. DNA sequences encoding each peptide were obtained by recursive PCR, then cloned into E. coli DH5α cells and subsequently transformed into P. pastoris GS115 cells. Expression of each recombinant peptide was performed by methanol-induced P. pastoris transformants in a shake culture medium.
Antimicrobial activities of rTEWP, rMTEWP, rRMTEWP and r(RW)4-RMTEWP peptides produced within the scope of the thesis were tested against a total of 19 strains of microorganisms, including 6 Gram-positive bacterial strains, 10 Gram-negative bacterial strains, and 3 yeast strains. According to the results of the minimum inhibition concentration (MIC) test of recombinant peptides; the MIC values of rTEWP and rMTEWP against Gram-positive bacterial strains were found between 4 - >256 µg/ml, while the MIC values of rRMTEWP and r(RW)4-RMTEWP peptides were between 2 - >256 µg/ml. For Gram-positive bacteria, MIC values of rTEWP and rMTEWP peptides were found 8 - 32 µg/ml and 8 - 64 µg/ml respectively, while MIC values of rRMTEWP and r(RW)4-RMTEWP peptides ranged between 4 and 32 µg/ml. It was also determined that the MIC values of rTEWP and rMTEWP peptides against the tested yeast strains were in the range of 16 - 64 µg/ml, while MIC values of rRMTEWP and r(RW)4-RMTEWP peptides, were 16 - 32 µg/ml and 32 - 64 µg/ml, respectively. All produced peptides showed the highest inhibitory effect against L. monocytogenes ATTC 7644 strain. The lowest inhibitory effect was observed against S. aureus ATCC 25923 and MRSA ATTC 43300 strains. According to the results of MIC analysis, it was observed that rRMTEWP and r(RW)4-RMTEWP analog peptides exhibited a higher antimicrobial activity compared to rTEWP and rMTEWP peptides.
The hemolytic activities of the peptides produced within the thesis study were tested against mouse erythrocytes. The % hemolysis values of rTEWP and rMTEWP peptides at 8 µg/ml concentration were found > 95 %  while the % hemolysis value was determined as 23 % for rRMTEWP and 4 % for r(RW)4-RMTEWP at the same peptide concentration. It was determined that the % hemolysis values of all peptides at concentrations <  4 µg/ml were <  0,4 %.
The stabilities of the peptides in the thesis study after treatment with different temperatures, high NaCl concentrations, and different enzymes were evaluated according to the change in MIC values against E. coli ATCC 25922 and it was determined that the peptides generally preserved their antimicrobial activities, and so stabilities.
As a result, in this thesis study, the production of the TEWP peptide, of which amino acid sequence was obtained from a natural source and its analogues designed by modification of this peptide were successfully carried out in the P. pastoris expression system. All recombinant peptides showed a certain level of antimicrobial activity against the pathogenic microorganisms tested. However, r(RW)4-RMTEWP peptide was found to be more successful than other peptides in terms of both antimicrobial activity and hemolytic activity. It has been concluded that the peptides produced in this thesis have the potential to be used in the fields of food, medicine, agriculture, and livestock, but further studies are needed to turn them into commercial products.

Keywords: Antimicrobial peptide, AMP, Defensin, Defensin-like peptide, Cell penetrating peptide, CPP, Peptide modification, Retro analog, Recombinant AMP, Pichia pastoris, pPICZαA, TEWP