D398S, I323V, I372Q/V VE V380F mutasyonlarının Anoxybacillus gonensis glukoz izomerazının kinetik parametreleri ve ısıl kararlılığı üzerine olan etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of D398S, I323V, I372Q/V and V380F mutations on the kinetic parameters and thermal stability of glucose isomerase from Anoxybacillus gonensis G2T
Yazar: MERVE KIZAKLI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ HAKAN KARAOĞLU
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Glukozun fruktoza isomerizasyonunu katalizleyen glukoz izomeraz (D- xylose ketol - isomerase E.C 5.3.1.5) birçok mikroorganizmada bulunmaktadır. Günümüze kadar birçok termofilik bakteriden GI' lar karakterize edilerek birçoğu endüstriyel alanlarda kullanılır hale getirilmiştir. Ayrıca endüstriyel alanlarda kullanılmak üzere birçok GI geni biyomühendislik uygulamaları ile mutant hale getirilerek GI' ın hem kinetik hem de biyokimyasal parametrelerinin geliştirilmesi üzerine birçok çalışma yapılmıştır. Anoxybacillus gonensis G2T glukoz izomerazı rekombinant olarak izole edilmiştir. Elde edilen veriler sonucunda; Anoxybacillus gonensis G2T glukoz izomerazının kinetik parametreler açısından ticari olarak kullanılan birçok GI' dan üstün nitelikler taşıdığı belirlenmiştir.
Bu çalışmada, genetik manipülasyonlarla kinetik özellikleri geliştirilmiş olan AgoGI' sının yine aynı yöntemler ile biyokimyasal ve kinetik parametrelerinin geliştirilmesi amaçlanmaktadır. Bu amaçla AgoGI' sı üzerinde I323V, I372V, I372Q, V380F, D398S, bölge spesifik mutasyonları uygulanmıştır. Ayrıca, başarılı sonuç alınan I373V ve V380F mutasyonları kinetik parametreler açısından geliştirilmiş olan enzimin W137F/ V184S mutantı üzerinde de uygulanmıştır.  W137F/ V184S/I372V' ye ait kinetik veriler; Km değeri 64,37 ± 1,3 mM, Vmax değeri 99,05 ± 0,44, kcat değeri 82,62 1/sn ve kcat/ Km değeri 1,283 olarak hesaplanmıştır.  W137F/ V184S/W380F' ye ait kinetik veriler ise Km değeri 116,57 ± 4,37 mM, Vmax değeri 37,22 ± 0,39 µmol/dk/mg protein, kcat değeri 31,05 1/sn ve kcat/ Km değeri 0,266 olarak hesaplandı.

Abstract:
Glucose isomerase, known as xylose isomerase (E.C 5.3.1.5), catalyzes isomerization of glucose to fructose and found in many microorganisms. Until today, many GI' s from different thermophilic bacteria have been characterized and most of them have been used in industrial applications. In addition, a great deal of studies has been performed to improve kinetic and biochemical parameters of GI by bioengineering applications such as mutagenesis for using in industrial areas. GI of Anoxybacillus gonensis G2T was isolated as recombinant. According to the results, the G2T GI of Anoxybacillus gonensis was found to possess superior properties than the other GI' s being used today in terms of kinetic parameters.
In this study, we aimed to improve biochemical and kinetic parameters of AgoGI with improved kinetic properties by genetic manipulations. To this end, I323V, I372V, I372Q, V380F, D398S site-specific mutations were created on AgoGI. In addition, successful I373V and V380F mutations were applied on GI with W137F/ V184S mutation with improved kinetic parameters. Kinetic parameters for W137F/ V184S/I372V were calculated as 64,37 ± 1,3 mM for Km, 99,05 ± 0,44 for Vmax, 82,62 1/sn for kcat and 1,283 for kcat/ Km. Kinetic parameters for W137F/ V184S/V380F were calculated as 116,57 ± 4,37 mM for Km, 37,22 ± 0,39 µmol/dk/mg protein for Vmax, 31,05 1/sn for kcat ve 0,266 for kcat/ Km.