Eser elementlerin yol açtığı dna hasarlarının seminal plazma ve sperm kromatin yapısı üzerine etkisinin tek hücre jel elektroforez (Comet assay) yöntemi ile analizi
The analysis of the effects of the dna damage caused (induced) by the trace elements on seminal plasma and sperm chromatine structure by single cell gel electrophoresis (Comet assay)
Yazar: PINAR ALTINER
Danışman: PROF. DR. IŞIL ALBENİZ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Comet tekniği = Comet assay ; DNA = DNA ; DNA hasarı = DNA damage ; Eser elementler = Trace elements ; Kısırlık = Infertility ; Sperm = Spermatozoa

Özet:
Spermatozoonların genetik yapısındaki bozulma ile infertilite arasında kuvvetli bir ilişki vardır. Bu ilişkinin infertilitedeki önemi farklı mekanizmalar ile açıklanmış in vivo ve in vitro çalışmalarla da gösterilmiştir. Son yıllarda kromatin hasarları, fertilizasyon ve embriyo gelişim bozukluğu sık durulan konular arasındadır. Çevresel etmenler spermatozoanın oosit ile etkileşimini olumsuz yönde etkileyebilmektedir. Anormal kromatin yapılanması infertil erkeklerde, fertil erkeklere göre daha sık görülmektedir. Spermatozoonların genetik yapısındaki bozulma oranı arttıkça doğal yolla gebe kalma şansı da azalmaktadır. IVF (İn Vitro Fertilizasyon) laboratuvarına başvuran hastalardan alınan semen örnekleri ile yapılan fiziksel ve mikroskobik analiz sonuçları hastanın sperm genetik yapısı ile ilgili analiz sonuçları ile fark gösterebilmektedir.
Bu bilgilerden yola çıkarak, sperm kaynaklı sorunların daha net anlaşılması ve üreme tekniklerinde uygulanan rutin analizlere ek olarak ultrayapısal çalışmaların infertiliteye olan katkısı çalışmamızda incelendi. Sigara içimine bağlı olarak IVF merkezine başvuran fertil ve infertil erkeklerden semen örnekleri alındı. Fertil sigara içmeyen (I), fertil sigara içen (II); infertil sigara içmeyen (III), infertil sigara içen (IV) erkekler olarak gruplandırıldı.Toplam 52 semen örneği ile çalışıldı (n=13). Toplanan semen örneklerinde sırasıyla makroskopik ve mikroskopik semen analizi, sperm kromatin yapısı, DNA hasarı,apoptoz ve eser element analizi değerlendirmeleri yapıldı. Sperm kromatin yapısı; sperm kromatin dekondansasyon testi ve anilin mavisi testi ile araştırıldı. DNA hasarı Comet analiz yöntemi ile değerlendirildi. DNA hasarına maruz kalmış hücrelerde Apoptoz Anneksin V-PI boyama yöntemi kullanılarak akım sitometri analizleriyle belirlendi. Seminal plazmada ICP-MS (İndüktüf olarak eşleştirilmiş plazma emisyon spektroskopisi) cihazı ile bakır, kurşun, nikel, alüminyum, vanadyum, krom ve mangan gibi eser elementlerin analizi yapıldı.
Dört grup aralarında karşılaştırıldığında sperm sayısı (p1=0,012), morfolojisi  (p2<0,001), sperm nuklear kromatin dekondansasyonu (p3<0,001), anilin mavisi ile kromatin kondansasyonu , (p4<0,001), comet analizi (p5<0,001) ve apoptoz (p6=0,001) kriterlerinde istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı fark bulundu. Sperm motilitesi, semen hacmi ve yaş kriterleri arasında fark olmakla birlikte istatistiksel açıdan ilişki bulunmadı. Sigara içimine bağlı olarak 2 grup karşılaştırıldığında (II ve IV) semende bazı eser element düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı fark bulundu. (Al p7=0,003, Pb p<0,001, Mn p9=0,005 , Ni p10=0,031 V p11=0,004). Sperm kaynaklı sorunların daha net anlaşılması için yardımla üreme tekniklerinde uygulanan rutin analizlere ek olarak yaptığımız ultrayapısal çalışma sonuçlarının infertilite merkezine başvuran çiftlerin klinik tedavi gelişimine kolaylık ve katkı sağlayacağı ve etkili olabileceği görülmüştür.

Abstract:
There is a strong relationship between genetic disruption of spermatozoon and infertility. The importance of this relationship was explained and shown with in vivo and in vitro studies. In recent years chromatin damages, fertilization and embriyonic developmental anomalies are the most investigated subjects. Environmental factors can affect the interaction between spermatozoa and ooctye negatively. Abnormal chromatin structuring are seeing more often in infertile men than fertil men. Becoming pregnant in normal way is getting hard when the damege rates in spermatozoon chromatin status increase. The microscopical and physiological analysis of semen samples collected frım patients who applied to the IVF laboratory, may differs from the analytical results of the semen?s genetic profile of the patient. 
Based on this informations, to understand  sperm welded problems and contribution of ultrastructural studies addivetely IVF rutine analyses to infertility was examined in our study. Semen samples was taken by the infertile men who applied IVF centre and fertile men depends on smoking status. Groups are fertile non-smoker men (I), fertile smoker men (II); infertile non-smoker men (III), infertile smoker men (IV). The study was executed 52 semen samples (n=13). Macroskopic and microskopic semen analysis, sperm chromatin status, DNA damage, apoptosis and trace element analysis was done with the semen samples. Sperm chromatin status was investigated with sperm chromatin decondansation assay and aniline blue assay. DNA damage was measured with Comet assay. Apoptosis was defined at the cells which exposed to DNA damage Annexin V-PI staining procedure and flow cytometry analysis. Trace elements analysis like copper, lead, nickel, chrome, vanadium, manganese, aluminium was done with ICP-MS (Inductively coupled plasma mass spectrometry). 
When four groups compared to each other sperm number (p1=0,012), sperm morphology (p2<0,001), nuclear chromatin dekondansation (p3<0,001), chromatin packaging (p4<0,001), DNA damage rate (p5<0,001) and apoptosis (p6=0,001) criterias was found statistically significant difference. When four groups compared to each other sperm motility, semen volume and age criterias was different. But the difference was not significant. When two groups compared to each others depending on smoking (II and IV) some trace elements rates was found statistically significant different (Al p7=0,003, Pb p<0,001, Mn p9=0,005 , Ni p10=0,031 V p11=0,004). To explain the issues caused by sperm clearly, in addition to the regular analysis that we have done on assisted reproductive technology, result of the ultrastructural study could be helpful, improver and effective for the clinical treatment of couples whom applied to the IVF center.