Hepatik stellat hücreler üzerine çörek otu bileşenlerinin anti-fibrotik etkileri
Anti-fibrotic effects of nigella components on hepatic stellate cells
Yazar: REHAM ALWARDA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSTAFA ÖRKMEZ
Gaziantep Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Fibroz = Fibrosis ; Hücre dizisi = Cell line ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer hastalıkları = Liver diseases ; Timokinon = Thymoquinone ; Transforme edici büyüme faktörü-beta = Transforming growth factor-beta ; Çörekotu = Nigella

Özet:
Karaciğer fibrozisi dünyadaki morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerden biridir. Karaciğer fibrozisi, viral enfeksiyonu, alkolik karaciğer hastalığı (ALD), nonalkolik karaciğer hastalığı (NASH) de içeren herhangi bir etyolojinin kronik karaciğer hasarından kaynaklanan ekstrasellüler matriksin birikimi ile karakterize edilen dinamik bir süreçtir. Karaciğer fibrozisi, tekrarlayan yaralanmalara karşı karaciğerin yara iyileşmesi tepkisinin bir sonucudur. Akut karaciğer hasarından sonra parankimal hücreler nekrotik veya apoptotik hücreleri yeniler. Hepatik fibroziste patojenik anahtar olay, karakteristik bir sitoskeletal belirteç olarak α-düz kas aktini ve bağ dokusunu oluşturan kollajenler ve glikozaminoglikanlar gibi çeşitli proteinlerin artmasıyla durgun HSC'ler fibrojenik miyofibroblastlara aktivasyonu ve transdiferansiyonu gerçekleşir. Bu süreç öncelikle stresli veya yaralanmış karaciğer hücrelerinden (hepatositler, Kupffer hücreleri ve sinüzoidal endotel hücreleri) ve infiltre eden immün hücrelerinden salınan çok sayıda profibrojenik ve promitojenik mediatör tarafından tetiklenir. Bu faktörler arasında, transforme edici büyüme faktörü-β (TGF-β) ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) protein ailesinin üyeleri en etkili profibrojenik medyatörlerdir. Önceki çalışmalar, timokinonun hayvan modellerinde çörek otunun karaciğer fibrozisine karşı koruyucu etkisi olabileceğini göstermiştir. Ayrıca in vitro HSC'ler üzerinden yapılan bir çalışmada timokinonun antifibrotik etkisi gösterilmiştir. Fakat çörek otu ve ürünlerini antifibrotik etkilerinin detaylı mekanizması henüz bilinmemektedir ve bu alanda çörek otu ekstraktları, timokinon ve çörek otu yağının etkilerini birlikte inceleyen hücre kültürü çalışmaları bulunmamaktadır. Biz bu çalışmada bir tür hepatik stellat hücre (HSC) tipi olan LX2 hücrelerinde çörek otu ekstraktı, timokinon ve çörek otu yağının antifibrotik etkilerini belirlemeyi amaçladık. Bu bağlamda hücre canlılık testi (MTT) ile çörek otu ve ürünlerinin HSC üzerine olan koruyucu ve toksik etkilerini belirlendi. Dört grubumuz, her grupta bir kontrol grubu (DMEM) ve beş farklı konsantrasyonda ( 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 62.5 µg/mL, 31.25 µg/mL ) çörek otu polar ve apolar ekstraktları, TQ ve çörek otu yağı ile 24 saat maruz bırakıldı sonra MTT testi yapıldı. Sonuçlarmızda çörek otu polar ekstraktı serum free (SF) ile karşılaştırildığında 31, 62, 125, 250 µg ekstrakt hücre canlığı anlamlı bir şekilde değiştirmemiştır. 500 µg'lık konsantrasyonda hücre canlılığı % 50'den fazla düşerek anlamlı olarak göstermiştir (p<0.001-SF). Çörek otu apolar ekstraktleri SF ile karşılaştırildığında 31, 62, 125, 250 µg ekstrakt hücre canlığı anlamlı bir şekilde değiştirmemiştır. 500 µg'lık konsantrasyonda hücre canlığı % 50'den fazla düşerek anlamlı olarak göstermiştir. (p<0.001-SF). Timokinon gurubunda 31 µg'lık dozu SF'e göre hücre canlılığı anlamlı bir şekilde azalmıştır (p<0.01-SF). Bunların beraber 62, 125, 250 ve 500 µg'lık dozların daha yüksek oranda hücre canlılığını düşmesi tespit edilmiştir (p<0.001-SF). Çörek otu yağı gurubunda ise 31, 62, 125 ve 250 µg'lık dozların SF'e kıyasla hücre canlılığı üzerine anlamlı bir değişime neden olmamıştır. 500 µg'lık dozda hücre canlılığı anlamlı bir şekilde azalmıştır (p<0.05-SF). Bu bağlamda bir ön çalışma niteliğinde olan projemizden elde ettiğimiz veriler gösterdi ki TQ ile birlikte çörek otunun polar, apolar ekstraktları ve çörek otu yağının karaciğer fibrozis tedavisinde, öncül hücreler olan HSC'lere karşı kullanılabileceğidir.

Abstract:
Liver fibrosis is one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide.  Hepatic fibrosis is a dynamic process characterized by the net accumulation of extracellular matrix (ECM), or scar, resulting from chronic liver injury of any aetiology, including chronic viral infection, alcoholic liver dis¬ease (ALD) and nonalcoholic steatohepatitis (NASH), a progressive form of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Hepatic fibrosis is the result of the wound-healing response of the liver to repeated injury. After an acute liver injury, parenchymal cells regenerate and replace the necrotic or apoptotic cells. The pathogenic key event in hepatic fibrosis is the activation and transdifferentiation of quiescent hepatic stellate cells (HSC) into fibrogenic myofibroblasts that increasingly express a-smooth muscle actin as a characteristic cytoskeletal marker and a large variety of proteins forming the connective tissue such as collagens and glycosaminoglycans. This process is primarily triggered by a multitude of profibrogenic and promitogenic mediators that are released from stressed or injured liver cells (hepatocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells) and from infiltrating immune cells. Among these factors, transforming
growth factor-b (TGF-b) and members of the platelet-derived growth factor (PDGF) protein family are the most effective profibrogenic mediators. Previous studies have shown that thymokinone may have a protective effect against liver fibrosis in animal models. In addition, an antifibrotic effect of thymokinone was demonstrated in a study conducted in vitro HSCs. However, the detailed mechanism of the antifibrotic effects of black seed and its products is not yet known and there are no cell culture studies examining the effects of black seed extracts, thymokinone and black seed oil together. In this study, we aimed to determine the antifibrotic effects of black seed extracts, thymokinone and black seed oil in LX2 cells, a type of hepatic stellate cell (HSC). In this context, the protective and toxic effects of black seed and its products on HSC were determined by cell viability test (MTT). Four of our groups, one control group (DMEM) and five different concentrations (500 µg / mL, 250 µg / mL, 125 µg / mL, 62.5 µg / mL, 31.25 /g / mL) of black seed polar and apolar extracts, TQ and black seed oil was exposed for 24 hours. After that MTT test was performed. In our results, 31, 62, 125, 250 µg doses of black seed polar and apolar extracts did not significantly change cell viability when compared with serum free (SF). Concentration of 500 µg, cell viability was significantly reduced by more than 50% (p <0.001-SF). In the thymokinone group, 31 µg dose significantly decreased cell viability compared to SF (p <0.01-SF). In addition, 62, 125, 250 and 500 µg doses were found to decrease the cell viability at a higher rate (p <0.001-SF). In the black seed oil group, the cell viability of 31, 62, 125 and 250 µg doses did not cause a significant change compared to SF. Cell viability was significantly reduced at a dose of 500 µg (p <0.05-SF).  In this context, the data obtained from our project, which is a preliminary study, showed that TQ together with polar, apolar extracts of black seed and black seed oil can be used against HSCs which are precursor cells in the treatment of liver fibrosis.