Botulinum toksin ile ön koşullandırmanın yağ grefti sağ kalımı üzerine etkisi
The effects of botulinum toxin pre-conditioning on fat graft survival
Yazar: SAMET ŞENDUR
Danışman: PROF. DR. MEHMET NURİ ÜMİT BAYRAMİÇLİ
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Botulinum toksinleri = Botulinum toxins ; Cerrahi-plastik = Surgery-plastic ; Gref yaşaması = Graft survival ; Transplantlar = Transplants ; Ön koşullama = Pre-conditioning

Özet:
Giriş ve Amaç:   
Son yıllarda otolog yağ grefti uygulamaları, rekonstrüktif ve estetik cerrahide sıkça kullanılmaktadır. Yağ grefti uygulamasının ana avantajları; kolay uygulanabilir olması, tekrarlanabilir olması, hastanın mevcut dokularının kullanılması ve uygulanan hastaya göre istenilen miktarda elde edilebilir olmasıdır. Yağ grefti sağ kalım oranlarının yüzde 20 ile 90 arasında değişim göstermesi ve bu sağ kalımın ön görülemez olması ise en önemli dezavantajıdır (Ersek, 1991) (Goldwyn, 1988).
Botulinium toksin enjeksiyonları, yüz germe efekti (Kashkouli, Amani, Jamshidian-Tehrani, Yousefi, & Jazayeri, 2014), skar dokusunu azaltma (Xiao, Zhang, Liu, & Ren, 2011) ve flep sağkalımını artırma (Chenwang et al., 2009) gibi geniş yelpazede klinik uygulamalarda kullanılmaktadır. Deri fleplerinde botulinium toksin-A'nın sempatik nöronları baskılaması sonucunda vazodilatasyon yapması ile flebin kan akımını ve yaşayabilirliğini arttırabileceğini, bunu da VEGF ve CD31 gibi mediyatörlerin salınımını artırması ile gerçekleştirdiğini belirten çalışmalar literatürde mevcuttur (Kim et al., 2009).
Bu çalışmanın amacı; sıçanlarda botulinium toksin-A ile denerve edilmiş ve damarlanması artmış alanlardan 'alınan' veya böyle alanlara 'verilen' yağ greftinin sağ kalımına etkisinin hem alıcı hem de verici alan üzerinden değerlendirmektir.  
Gereç ve Yöntem:	
Bu çalışma çift kör randomize bir çalışma olarak tasarlanmıştır. Araştırmamızda 40 adet Wistar cinsi sıçanlar randomize olarak 5 gruba ayrılmıştır. Tüm gruplarda yağ grefti verici alan olarak sağ inguinal yağ yastıkçığı ve alıcı alan olarak interskapular bölgedeki dorsal subkutan saha kullanılmıştır. Kontrol grubu dışındaki enjeksiyonlar, gruplara uygun olarak belirtilen bölgelere uygulanmıştır.
Kontrol grubunda (grup 1); yağ grefti, sağ inguinal bölgeye insizyon ile girilip yağ yastıkçığı şeklinde alınmıştır. Verici alanın primer sütüre edilmesinin ardından, alınan yağ grefti serum fizyolojik ile yıkanıp, dorsal subkutan bölgeye kesi ile girilmiş ve burada standart olarak açılan alana yerleştirilmiştir. 
İkinci grupta; sağ inguinal bölgeye 1.5 Ü (0,75 cc serum fizyolojik içerisinde) botulinium toksin A (BTx- A) enjeksiyonu uygulanıp, 7 gün sonra aynı işlem ile alınan yağ grefti dorsal subkutan bölgeye aynı işlem ile yerleştirilmiştir. Üçüncü grupta; sağ inguinal bölgeye 0,75 cc serum fizyolojik enjeksiyonu uygulanıp, 7 gün sonra aynı işlem ile alınan yağ grefti dorsal subkutan bölgeye aynı işlem ile yerleştirilmiştir.
Dördüncü grupta; dorsal subkutan bölgeye 1.5 Ü BTx- A (0,75 cc serum fizyolojik içerisinde) uygulanıp; yedi gün sonra, sağ inguinal bölgeden alınan yağ grefti ön koşullandırılan dorsal subkutan bölgeye aynı işlem ile yerleştirilmiştir. Beşinci grupta ise; dorsal subkutan bölgeye 0.75 cc serum fizyolojik uygulanıp; 7 gün sonra, sağ inguinal bölgeden alınan yağ greftinin, daha önce enjeksiyon yapılan dorsal subkutan bölgeye aynı işlem ile yerleştirilmiştir.
Beş gruptaki dorsal bölgeye yerleştirilmiş olan yağ greftleri sekiz haftanın sonunda ağırlık ve hacim kaybı açısından, apoptotik hücre varlığı açısından ve histopatolojik olarak da beş kriter altında (kist oluşumu, inflamasyon, anjiyogenez, hasarlı uniloküler yağ doku varlığı ve multiloküler yağ doku oluşumu) incelenmiştir.
Her bir grubun kendi içerisindeki ağırlık ve hacim değişim verileri 'Wilcoxon matched pairs signed rank test' ile değerlendirilmiştir. Beş grubun biribiri ile histolojik parametrelerin değerlendirilmesinde 'Kruskal-Wallis (non-parametrik ANOVA) testi' kullanılmıştır. Bu testte değerlerin anlamlı bulunması durumunda ise 'Dunn çoklu karşılaştırma testi' ile gruplar ikili olarak karşılaştırılmıştır.




Bulgular: 
Yağ greftlerindeki ağırlık ve hacim kaybı açısından gruplar arasında anlamlı bir farkın olmadığı tespit edildi (p >0,05). Ancak dorsal alıcı alana botulinum toksin-A (BTx- A) enjeksiyonu uygulanan dördüncü gruptaki yağ grefti ağırlık kaybının en az olduğu, kontrol grubu olan birinci gruptaki yağ grefti ağırlık kaybının ise en fazla olduğu tespit edildi. 

Beş grup arasında; kist oluşumu, inflamasyon derecesi, apoptotik hücre varlığı ve anjiyogenez açısından anlamlı bir farkın olmadığı tespit edildi (p > 0,05). İnguinal ve dorsal bölgenin BTx-A ile ön koşullandırıldığı iki gruptaki anjiogenez skorlamasının diğer gruplara göre göreceli olarak artmış olduğu saptandı. 

Hasarlı uniloküler yağ doku varlığı açısından gruplar değerlendirildiğinde; verici alana (inguinal bölgeye) BTx-A enjeksiyonu yapılan grupta (grup 2), hasarlı doku oranının istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmış olduğu tespit edildi             (p: 0.0023). Multiloküler yağ doku oluşumu açısından gruplar değerlendirildiğinde ise; alıcı alana BTx-A enjeksiyonu yapılan grupta (grup 4), yeni yağ doku oluşumunun istatistiksel olarak anlamlı derecede artmış olduğu tespit edildi (p: 0.0016).  

Tartışma ve Sonuç: 
Botulinum toksin-A ile birlikte yağ grefti işlemi plastik ve rekonstrüktif cerrahide yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu kombine kullanım halen tartışmalıdır. Baek ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada, BTx-A ile karıştırılarak verilen yağ greftlerindeki hücresel bütünlüğün, yağ grefti ağırlığının ve hacminin istatistiksel olarak anlamlı derecede artmış olduğu, bununda alıcı alandaki kas kasılmasının BTx-A ile azalmasına bağlı olabileceği savunulmuştur (Baek et al., 2012). Bizim çalışmamızda, alıcı alandaki kas kasılmasına BTx-A ile müdahale edilmeksizin verici alana uygulanan BTx-A grubunda hasarlı yağ dokularının anlamlı derecede daha az olduğu ortaya konulmuştur. Elde edilen bu sonuç ise, BTx-A'nın yağ grefti üzerine etkisinin sadece kas kasılmasını engelleyerek etki etmediği şeklinde yorumlanabilir.

Tang ve arkadaşlarının yaptıkları deneysel bir çalışmada ise botulinum toksin-A ile karıştırılarak verilen yağ greftlerinde CD31 ve VEGF ekspresyon düzeyinin istatistiksel olarak arttığı saptanmıştır (Tang et al., 2017). Bizim çalışmamızda ise BTx-A'nın etkinliği dokular üzerine ön koşullandırma yapılarak ve verici alan üzerindeki etkisi de araştırmaya alınarak yağ grefti sağ kalıma etkisi incelenmiştir.

Sonuç olarak bizim çalışmamızda alıcı ve verici saha BTx-A ile ön koşullandırılmasının ardından yağ grefti sağ kalımı araştırılmıştır. Verici alanın BTx-A ile ön koşullandırıldığı yağ greftlerinde hasarlı yağ doku oranın istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmış olduğu, alıcı alanın BTx-A ile ön koşullandırıldığı yağ greftlerinde ise yağ greftindeki yeni multiloküler yağ oranın istatistiksel olarak anlamlı derecede artmış olduğu tespit edilmiştir. Alıcı alanda BTx-A ile kas kasılması engellenmeksizin sadece verici alana BTx-A uygulanan grupta hasarlı yağ dokuların daha az olması, BTx-A'nın yağ grefti üzerinde sağ kalım artırıcı etkisinin sadece kas kasılmasını engelleyerek yapmadığını göstermektedir. Alıcı veya verici sahanın botulinum toksin-A ile ön koşullandırılan dokulardaki yağ grefti sağ kalım artışının net mekanizması ve bunun adipoz kökenli kök hücre ile ilişkisi ilerleyen çalışmaların konusu olabilir.

Abstract:
Introduction and Purpose:  
In recent years, autologous fat graft applications have been frequently used in reconstructive and aesthetic surgery. The main advantages of fat graft procedures are; ease of application, harvesting from patients' tissues and the availability of desired amount. The most important disadvantage is the survival rate of fat grafts varies between 20 and 90 percent and this survival rate is unpredictable (Ersek, 1991; Goldwyn, 1988).
The botulinium toxin injection is used for wide range of clinical applications such as face lift effect (Kashkouli et al., 2014), scar tissue reduction (Xiao et al., 2011), and increasing the flap survival rate (Chenwang et al., 2009). Studies have shown that, the usage of botulinium toxin A for skin flaps could cause vasodilatation as a result of suppression of sympathetic neurons, thereby increasing the flaps' blood flow and viability. In the literature; this have been related to increased amount of the released mediators, such as VEGF, CD31 (Kim et al., 2009).
The purpose of this study is to assess the survival rate of the fat graft after preconditioning the recipient and the donor site which is vascularised and denervated by botulinum toxin-A.
Material and Methods:  
This research was designed as a double blind randomized study. In this study, 40 Wistar rats were randomly divided into 5 groups. In all groups, right inguinal fat pad was used for the fat graft donor area and the interscapular subcutaneous region of the rat was used for the recipient area.
In the control group (Group 1); the fat graft was harvested from the right inguinal area as an inguinal fat pad. After suturing the donor site primarily, the fat graft irrigated with saline and adapted into the dorsal subcutaneous region of the rat and the recipient incision was sutured primarily.
In the second group; 1.5 U (in 0.75 cc saline) botulinum toxin (BTx-A) was injected on the right inguinal region. Seven days later, the fat graft was harvested from right inguinal area and adapted into the dorsal subcutaneous region with the same procedure. In the third group; 0.75 cc saline was injected on the right inguinal region. Seven days later, the fat graft was harvested from right inguinal area and adapted into the dorsal subcutaneous region with the same procedure.
In the fourth group; 1.5 U (in 0.75 cc saline) botulinum toxin (BTx-A) was injected on the dorsal subcutaneous region. Seven days later the fat graft was harvested from right inguinal area and adapted into the dorsal subcutaneous region with the same procedure. In the fifth group; 0.75 cc saline was injected on the dorsal subcutaneous region. Seven days later, the fat graft was harvested from right inguinal area and adapted into the dorsal subcutaneous region with the same procedure.
After eight weeks of follow up, fat grafts that were placed in the dorsal region of all rats were examined in terms of weight and volume loss, apoptotic cell entity and then they were evaluated by five histopathological criteria (cyst formation, inflammation, angiogenesis, damaged unilocular fat tissue and new multilocular fat tissue formation).
The data of weight and volume differentiation for each group were evaluated by 'Wilcoxon matched pairs signed rank test'. The 'Kruskal-Wallis (non-parametric ANOVA) test' was used to assess histologic parameters to compare the values for five groups. If the values found to be significant in this test, the groups were compared by two groups with 'Dunn multiple comparison test'.
Results:    
In terms of weight and volume reduction in fat grafts, there was no statistically significant difference between the groups (p > 0,05). However, it was observed that the weight loss in the fourth group which BTx- A injection was applied to the dorsal recipient area had the lowest figure whereas the fat graft weight loss in the the control group had the highest figure.
There was no significant difference between the groups in terms of apoptotic cell entity, cyst formation, degree of inflammation and angiogenesis (p > 0.05). Although, the angiogenesis was relatively increased in both pre-conditioned donor and recepient areas with BTx-A groups (group 2 and 4).
When groups were evaluated in terms of damaged unilocular fat tissue, the ratio of damaged fat tissue was significantly lower (p: 0.0023) in the donor area BTx-A injected group (group 2). In addition to that, the groups were evaluated in terms of new formed multilocular fat tissue and this category was significantly higher (p: 0.0016) in pre-conditioned recipient area with BTx-A group (group 4).

Discussion and Conclusion:  
Fat grafting with botulinum toxin-A is widely used in plastic and reconstructive surgery. However, this combined use is still controversial. In a study conducted by Baek et al., it was demonstrated that cell integrity, fat graft weight and volume increased significantly with the mixture of fat graft and BTx-A. It was concluded that the reason for this significant increase could be related to the inhibition of muscle contractions in the recipient area (Baek et al., 2012). In our study, it was found that the score of damaged fat tissue was significantly lower in pre-conditioned donor area with BTx-A group (without interfering with BTx-A for muscle contraction on the recipient area). This result suggests that the positive effect of the botulinum toxin on fat graft survival is not only caused by inhibition of muscle contraction at recipient area.
In an experimental study conducted by Tang et al., it was reported that CD31 and VEGF expression levels increased significantly in the mixture of fat graft and BTx-A group (Tang et al., 2017). However, in our study the survival of the fat graft was examined by preconditioning with BTx-A both on donor and recipient area rather than mixing the fat graft with BTx-A.
In conclusion, the fat graft survival rate was investigated after preconditioning the recipient and donor site with BTx-A in our research. We found that the proportion of damaged fat tissue in the fat grafts pre-conditioned with BTx-A at the donor area decreased significantly while the ratio of new fat cells increased significantly in the fat grafts preconditioned with BTx-A at the recipient area. Nevertheless, the net mechanism of fat graft survival in pre-conditioned recipient and donor tissues with botulinum toxin-A and its relation to the adipose-derived stem cells, is still not clear and it could be the subject for further studies.