Biyomoleküler tanı sistemleri için taşınabilir, gerçek zamanlı ve etiketsiz biyosensor geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterization of portable, real-time & label-free biosensors for biomolecular recognition
Yazar: MUSTAFA OĞUZHAN ÇAĞLAYAN
Danışman: PROF. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Elipsometri = Ellipsometry ; Sensörler = Sensors ; Tek tabaka analizi = Single layer analysis ; Yüzey plazmon rezonans teorisi = Surface plasmon resonance theory

Özet:
Sunulan çalışmanın amacı, optik transdüsere sahip, etiketsiz tanı yapabilen, taşınabilir ve gerçek zamanlı analiz imkanı sağlayan biyosensörlerin geliştirilmesi ve karakterizasyonudur. Bu kapsamda, tez çalışması 11 ayrı çalışma halinde gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmalarında optik esaslı biyosensör geliştirilmesi için, uygun yüzey seçimi, ligand ? analit çiftleri, bu ligandların yüzeye immobilizasyonu, tek yongada birden fazla analiz yapabilmek için gerekler ile farklı ?sensör duyarlığını artırma? yöntemleri denenmiştir. Birinci bölümde, SPR sensöründe kullanılabilecek alternatif substrat/metal film ve ışık kaynağı seçimi için, Fresnel yansıma eşitliklerinin MATLAB ® yardımı ile çözülmesi sonucu elde edilen sonuçlar karşılaştırılmıştır. Hazırlanan model, farklı substrat kombinasyonları ile fonksiyonel yüzeyin modellemesinde başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Tezin 2. bölümünde, sensör yüzeylerinin modifikasyonu (substrat yüzeylerinin temizlenmesi ve kaplanması) ile ilgili optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Farklı temzileme yöntemlerinin uygulandığı bu bölümde, temizlenen yüzeyler elipsometrik yöntemlerle karakterize edilmiştir.Tezin 3. Bölümünde, akışlı sistemlerde mikro-akışkan kanal yaklaşımı yerine, görüntülemeli SPR kullanılarak, bir yonga üzerinde birden fazla analizin aynı anda gerçekleştirilebilmesi için mikro-desenleme yöntemi olarak Ink-Jet litografi çalışmaları yapılmıştır. Alternatif mikro-desenleme yöntemi olarak fotolitografi çalışmaları yapılmış ve fotolitografik desenlemelerin optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu bölümde 50 µm büyüklüğünde desenler oluşturulmuştur. Ink-Jet litografi çok daha esnek çalışma imkanı sunmaktadır ancak, elde edilen desenlerin yüzeyde yayılması sonucu sınırlardaki belirsizlik, bu yöntemin tercih edilmemesine neden olmuştur. Çalışmanın bir sonraki bölümünde, fotolitografi ile elde edilen mikro-desenlenmiş SPR yongalarında alınan sinyal incelenerek, desenleme boyutunun etkisi incelenmiştir.Tezin bundan sonraki bölümünde, immobilizasyon tekniklerinin geliştirilmesi amacıyla, farklı çözücü ve etkileşim parametrelerinde kendiliğinden düzenlenmiş tek tabakaların(SAM) formasyonu ile ilgili bir çalışma yapılmıştır. Taban malzeme olarak, prüzlülüğü ve yüzey bozukluğu az olan Si yongalar seçilmiştir. Tek tabaka oluşumuna çözücü ve immobilizasyon parametrelerinin etkisi incelenmiştir. Çözücü tipinin tek tabaka oluşumunda en büyük parametre olduğu görülmüştür.Bir sonraki çalışmada, biyomolekül immobilizasyonu için, tabaka üstü tabaka (layer by layer) formasyonu ile kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar üzerine farklı fonksiyonellikte gruplar immobilize edilerek, bir IgG sensörün duyarlığının artırılması amaçlanmıştır. Tabaka üstü tabaka formasyonu ile IgG molekülleri Protein A üzerinde yönlenmiş olarak immobilize edilmiş ve sinyal farkı gözlenmiştir.Alternatif optik sensör yöntemi olan elipsometri kullanılarak, oligonükleotid proba sahip yüzeyin sensör performansı ise bir diğer çalışmada değerlendirilmiştir. İmmobilizasyon sırasında kademeli tabaka üstü tabaka immobilizasyon tekniği kullanılmıştır. Oligonükleotid problar ile 50 nM tayin sınırı elde edilmiş, nonspesifik bağlanma miktarının, en düşük derişimde alınan sinyale oranla 1/5 civarında olduğu bulunmuştur.Tezin bir sonraki bölümünde, farklı bir alternatif denenmiştir. Elipsometrik sensör uygulamasında Au-nanopartikül kullanılarak, yüzeye immobilize edilen Au-nanopartikülün TIRE sensöründen alınan cevapta yapacağı muhtemel iyileştirme incelenmiştir. İmmobilizasyon tekniği olarak çok kademeli immobilizasyon ile kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar kullanılmıştır. Au-nanopartiküle sahip yüzeyin lokalize plazmon rezonans etkisi ile daha yüksek bir hassasiyette sensör cevabı verdiği (yaklaşık % 450 daha yüksek) görülmüştür. Bu uygulama LPRe-TIRE (Localized Plasmon Resonance enhanced Total Internal reflection Ellipsometry) olarak adlandırılmıştır.Bir sonraki çalışmada, mikro-desenlenmiş yüzeyde oligonükleotid prob taşıyan SPR yongası hazırlanmış ve performansı değerlendirilmiştir. Mikro desenlenmiş yüzeylerde eşlenik hibridizasyonu ile nonspesifik etkileşimler incelenmiştir. Sensör cevabının 20 dakika içerisinde alındığı ve nonspesifik sinyalin çok düşük olduğu görülmüştür.Tezin son çalışmasında ise, iki optik sensör sisteminin (Yüzey plazmon rezonans, SPR ve içten tam yansımalı elipsometri TIRE) bir arada kullanıldığı ve böylece sensör hassasiyetinin artırıldığı bir çalışma yapılmıştır. SPR ile güçlendirilmiş TIRE uygulaması (SPRe-TIRE) ile Cu2+ tayini için kullanılan yüzeyde bu kez immobilizasyon kendiliğinden düzenlenme yerine elektrokimyasal indirgeme ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, kompleks oluşturma reaksiyonu eş zamanlı olarak incelenmiş ve 10 nM Cu2+ algılama sınırına ulaşılmıştır.

Abstract:
The aim of the presented study is; to develop and characterize biosensors that enabling real time analysis, and provide label-free diagnosis and having optical transducer. The thesis includes 11 different studies were held in this scope. In these studies, several processes were investigated to develop optical based biosensors; including selection of a appropriate surface for substrates and of analyte-ligand pairs, immobilization techniques of these pairs and requirements to be able to do more than one analysis on a single chip, as well as, increment of sensor sensitivity. In the first part, for selecting the light source and alternative substrate/metal film used in SPR sensor; results which were obtained from the solution of Fresnel equations by MATLAB ® modeling have been evaluated. The prepared model has been successfully utilized to model the functional surface containing different substrate combinations. Optimization works have been carried out to modify the sensor surfaces (cleaning and coating of substrate surface) in the second part of the thesis. The cleaned surfaces were characterized by ellipsometric methods in the part where different cleaning methods were applied.Third part of the thesis to perform multi analyze in one assay by using imaging SPR, Ink-Jet lithography techniques is one of the micropatterning techniques were utilized instead of microfluidic approach. For an alternative micro-patterning method, photolithography studies and optimization of photolithographic patterning were also done. In this part, patterns are formed 50 µm in size. Ink-Jet lithography provides way flexibility but, the uncertainty at the boundaries that come out with spreading of the patterns obtained on the surface, caused this method undesirable. In the following part of the study, the possible effects of patterning size to SPR signal was observed by examining the signals from the micro-patterned SPR chips obtained by photolithography.In the next part of the thesis, in order to develop immobilization techniques, formation of self assembled monolayers in different solvents and with various interaction conditions was investigated. Si chips were selected due to having less surface foulness and roughness as substrate material. The effect of immobilization parameters and solvents on the single layer formation is examined. It was observed that the type of the solvent is the most important parameter in single layer formation process.In the following study, for bimolecular immobilization, the goal is set to increase the IgG sensor sensitivity by immobilizing groups having different functionality on the self assembled monolayers by using layer by layer formation. With layer by layer formation, it is observed that IgG molecules are found to be directed on Protein A and this orientation was observed and proved with an increment in fluorescence signal.Using ellipsometry as an alternative optical sensor method, the sensor performance of a surface having an oligonucleotide probe is examined in another study. During immobilization, stepwise layer by layer immobilization technique was used. It is found that the signal observed from nonspecific interaction is 1/5 of specific signal observed at minimal target concentration of 50 nM.In the following part of the thesis, a different alternative method is studied. By using Au-nanoparticle in ellipsometric sensor application; the possible improvement brought by the response received from TIRE sensor having Au-nanoparticle immobilized on surface; is examined. As the immobilization technique, self assembled monolayer and layer by layer stepwise fictionalization techniques were used. It is observed that, with a localized surface resonance effect on Au-nanoparticle, gives a sensor response with a higher sensitivity (about 450% higher than without Au nanoparticles). This application was labeled as for the first time LPRe-TIRE (Localized Plasmon Resonance enhanced Total Internal reflection Ellipsometry) in the related literature.In the next study, SPR chip carrying oligonucleotide probe on a micro-patterned surface was prepared and its performance was evaluated. Nonspecific interactions and conjugate hybridization on micro-patterned surfaces were also examined. It was observed that the sensor response is received in 20 minutes to a plateau and the nonspecific signal obtained is very low (i.e in detection limit).In the last study of the thesis, two optical sensors are used together bringing by an increase in sensor sensitivity. In this case, instead of self assembly techniques, electrochemical reduction technique was used to form monolayers. SPR enhanced TIRE application (SPRe-TIRE) technique was also implemented in Cu2+ ion sensors. In this study, complex forming reaction was examined simultaneously and the 10nM Cu2+ detection limit was achieved.