Parkinson tedavisi için nöral farklılaşmış diş pulpası kök hücreleri-enjekte edilebilir polimer modeli: in-vitro çalışmalar
A model of neural differentiated dental pulp stem cells-injectable polymer gel for treatment of parkinson's disease: In-vitro studies
Yazar: MERVE ÇAPKIN YURTSEVER
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışma 113S285 numaralı "İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin Dopaminerjik Nöronlara Farklılaştırılmasında Fotobiyomodülasyon Yapan Işık Kaynaklarının Etkinliğinin İncelenmesi" adlı TÜBİTAK projesi ve Hacette Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi 10875 kodlu proje destekleri ile hazırlanmıştır. Sunulan tez çalışmasının amacı, Parkinson hastalığının tedavisi için kimyasal ajanlar ve fotobiyomodülasyonun etkisi ile dopaminerjik nöronlara indüklenmiş kök hücreler ve niş işlevi görecek enjekte edilebilir polimerlerin birlikte kullanımının yeni bir transplante edilebilir sistem oluşturulması için incelenmesidir. 
İnsan diş pulpası kök hücreleri (iDPKH), Hacettepe Üniversitesi, Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu'ndan alınan LUT 12/94 – 09 karar numaralı izin çerçevesinde izole edilmiştir. Akış sitometrisi yöntemi ile hücre yüzey antijenleri belirlenmiş, hücrelerin kemik, kıkırdak ve yağ hücrelerine farklılaşmaları incelenerek mezenkimal kök hücre karakteri taşıdıkları gösterilmiştir. Çalışmada, farklı kadın (K) hastalardan izole edilen iDPKH-K4, iDPKH-K8 ve 3 farklı kadın hastadan alınan hücrelerin karışımından oluşan iDPKH-1'ler kullanılmıştır. 
Fotobiyomodülasyon uygulamalarında, 590-1395 nm dalga boyu aralığında ışıma yapan plazma ark (PAC) ışık kaynağı ve düşük seviyeli 660 nm diyot lazer kullanılmıştır. PAC ışık kaynağının iDPKH'lerin canlılıkları üzerindeki etkisi, cihazın hücrelere 10 ve 15 cm uzaklıklardan 2.5 ve 5 dk uygulanması sonrası farklı günlerde MTT analizi ile incelenmiştir. Hücrelerin tüm koşullarda canlılıklarını korudukları, hücresel aktivitenin koşullar arasında belirgin bir fark göstermediği belirlenmiştir. Seçilen PAC uygulama koşullarında, Neurobasal A ortamında kültüre edilen hücrelerde, BDNF (beyin türevli nörotropik faktör), GDNF (glial hücre türevli nörotropik faktör) ve NGF (sinir büyüme faktörü) ekspresyonları incelendiğinde, özellikle BDNF ve GDNF'nin ekspresyonunun PAC uygulaması ile hiç bir kimyasal indükleyici ajan olmadan arttırılabileceği belirlenmiştir. NGF mRNA ekspresyonunun ise genel olarak fotobiyomodülasyon uygulamasından olumsuz yönde etkilendiği gösterilmiştir. Ayrıca, farklı hastalardan elde edilen hücrelerin fotobiyomodülasyon uygulamasına farklı cevaplar verdikleri görülmüştür. 
İnsan diş pulpası kök hücrelerinin dopaminerjik nöronlara indüksiyonu için SHH (sonic hedgehog), FGF8 (fibroblast büyüme faktörü 8), bFGF (bazik fibroblast büyüme faktörü), BDNF, GDNF ve TGF-β3 (transforme edici büyüme faktörü β3) gibi kimyasal ajanlar farklı konsantrasyonlarda ve sürelerde uygulanmıştır. Hücrelerde NURR1 (nükleer reseptör ilgili-1) ekspresyonunu arttıran en uygun koşulun, pre-indüksiyon faktörlerinin ilk 7 gün boyunca; SHH 200 ng/mL, FGF8 100 ng/mL ve bFGF 50 ng/mL konsantrasyonlarda, sonraki 7 gün boyunca her ortam değişiminde yarı yarıya azalan konsantrasyonlarda kullanıldığı, post-indüksiyon faktörlerinin ise; BDNF 10 ng/mL, GDNF 10 ng/mL ve TGFβ3'ün 20 ng/mL sabit konsantrasyonda uygulandığı koşul olduğu belirlenmiştir. 
Hücrelerde dopaminerjik nöronlara spesifik genlerin ekspresyonu gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile belirlenmiştir. Bu amaçla mRNA ekspresyonları; NURR1, BDNF, GDNF, NGF, MAP2 (matriks ilgili protein 2), DAT (dopamin taşıyıcı protein), TH (tirozin hidroksilaz) ve PTX3 (pituitary homeobox 3) genlerine spesifik primerler kullanılarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, NURR1 ekspresyonunun pre-indüksiyon faktörleriyle tetiklendiğini ancak, post-indüksiyon faktörleri ile baskılandığını göstermiştir. Pre-indüksiyon faktörlerinin 14 gün boyunca kültür ortamında bulunmasının hücrelerde dopaminerjik mRNA ekspresyonlarını tetiklediği, post-indüksiyon ortamına geçilmesiyle azalan NURR1, BDNF ve GDNF ekspresyonlarının 11. günden sonra tekrar artış gösterdiği belirlenmiştir. Farklılaşma öncesi ve sonrası hücrelerde TH ve PITX3 mRNA ekspresyonu görülmemiştir. Hücrelerde TH enzimi immün boyama ile de incelenmiş ve enzim varlığına rastlanmamıştır.
Fotobiyomodülasyon uygulamaları incelendiğinde, pre-indüksiyon ve post-indüksiyonun ilk günlerinde ve fazla sayıda uygulamanın hücrelerde dopaminerjik nöronlara spesifik genlerin ekspresyonunu inhibe ettiği, özellikle lazer gruplarında belirgin bir şekilde görülmüştür. Bu nedenle, optimize edilen dopaminerjik indüksiyon koşullarında hücrelere pre-indüksiyondan 4 gün sonra ve post-indüksiyondan 4 gün sonra olmak üzere iki kez fotobiyomodülasyon uygulanmasına karar verilmiştir. PAC uygulama mesafesi ve süresi sırasıyla kültür kabı yüzeyinden 10 cm  uzaklıkta ve 2.5 veya 5 dk olarak, laser uygulaması için ise 10 dk veya 4 dk olarak seçilmiştir. Uygulanan toplam enerji yoğunluğu, PAC için cihazdan 1 cm uzaklıkta 78.0 J/cm2,  31.2 J/cm2  ve 660 nm lazer için (doğrudan hücrelere etkiyen) 1.584 J/cm2 ve 0.634 J/cm2 olarak belirlenmiştir.  
Dördüncü pasajdaki iDPKH-1'lerin dopaminerjik nöronlara indüksiyonu optimize edilen kimyasal indüksiyon ve fotobiyomodülasyon koşullarında incelenmiştir. Hücrelerde, özellikle dopaminerjik indüksiyonun ilk yedi gününde 660 nm lazerin 1.58 J/cm2 enerji yoğunluğunda uygulandığı grupta BDNF, GNDF, MAP2, NURR1 ve DAT gibi büyüme ve transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonlarının anlamlı olarak arttığı RT-qPCR analizleri ile belirlenmiştir. PAC ışık kaynağının etkinliğinin de farklılaşma ortamına ve farklı protein yapısına bağlı olarak değiştiği gösterilmiştir. Hücrelerin dopaminerjik nöronlara spesifik mRNA ekspresyon düzeyleri hem kimyasal ajanlar hem de fotobiyomodülasyondan etkilense de farklılaşma süresi sonunda yüzeyden kaldırıldıklarında canlılıklarını koruyamadıkları belirlenmiştir. Dopamin alımının/salımının TH antikoru ile immün boyama, ELISA yöntemi ve Fluo-8® AM ajanı ile incelenmesi sonucunda olumlu sonuçlar elde edilememiştir. Hücrelerin uygulanan koşullarda fonksiyonel dopaminerjik nöronlara farklılaşamasalar da dopaminerjik nöronları koruyucu protein ekspresyonlarının 660 nm lazer ve PAC uygulamaları ile belli koşullarda arttırılabildiği tez çalışmasının önemli bir çıktısıdır.
Enjekte edilebilir jel hazırlanması için %92.7 deasetilasyon derecesine sahip, tıbbi kullanıma uygun %3'lük (w/v) kitosan çözeltisi kullanılmıştır. Farklı hacimlerde 1 g/mL gliserol fosfat ve 0.18 g/mL genipin, kitosan çözeltisine eklenerek 37oC'de genipin çapraz bağlı hidrojeller elde edilmiştir. Hidrojellerin biyouyumluluğunu ve enjekte edilebilirliğini arttırmak ve jelleşme süresini azaltmak için laminin çözeltisi (50 μL/100 μL, 1 mg/mL) eklenmiştir. 0.5 mM genipin ve 50 μL (1 mg/mL) laminin içeren enjekte edilebilir kitosan jel hücre kültürü çalışmaları için seçilmiştir. Seçilen jelin elastisite modülü ve viskozitesi 37oC'de 3 saat jelleşmeden sonra sırasıyla, 3.0 Pa ve 0.3 Pa.s'dir. Canlı dokudaki jel bütünlüğü sıçan deri altına yapılan enjeksiyon ile gösterilmiştir. Jelleşme başında yapılan enjeksiyonda jel yapısının oluşmadığı ve dağıldığı ancak, 37oC'de 2-3 saatlik jelleşmeden sonra jel ile hücreler karıştırıldığında deri altında jel bütünlüğünün korunduğu görülmüştür. Dopaminerjik yol izinde kimyasal ajanlar ve fotobiyomodülasyonun etkisiyle indüklenen hücrelerin enjekte edilebilir jeller içerisindeki canlılıkları canlı/ölü hücre analizi ile incelenmiştir. Jelleşme başladıktan belli bir süre sonra hücreler 1000-1500 hücre/µL jel oranında 37oC'de karıştırılmıştır. En yüksek hücre canlılığının laminin katkılı 0.5 mM genipin ile çapraz bağlı jellerde olduğu görülmüştür. Jel yapısına %5 FBS (fötal sığır serumu) ve %1 L-glutamin eklendiğinde hücre canlılığının arttırılabildiği belirlenmiştir. Genipin ile çapraz bağlı kitosan/laminin biyopolimerleri ile enjekte edilebilir bir jel oluşturulabildiği, jelin elastik modülünün beyin dokusu için uygun olduğu, hücrelerin jel ile homojen olarak karıştırılabildiği ve jel içerisinde askıda kaldıkları için transplantasyon sırasında kümelenme eğiliminin önlenebileceği ve modifikasyonlar ile jel içerisinde hücre canlılığının iyileştirilebildiği yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir.
Elde edilen bulgular, iDPKH'lerin kimyasal ajanlar varlığında ve fotobiyomodülasyon etkisi ile dopaminerjik nöronlara indüklenebildiğini ve genipin ile çapraz bağlı kitosan/laminin enjekte edilebilir jel desteği ile bu hücrelerin Parkinson hastalığında alternatif bir tedavi yaklaşımı olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
This thesis was prepared with the support of TÜBİTAK Project, entitled "İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin Dopaminerjik Nöronlara Farklılaştırılmasında Fotobiyomodülasyon Yapan Işık Kaynaklarının Etkinliğinin İncelenmesi" with the project number of 113S285 and Hacettepe University Scientific Research Coordination Unit with the project number of 10875.
The aim of the present study is to investigate the interaction between dopaminergically induced and photobiomodulated human dental pulp stem cells and injectable polymer gels as an alternative therapy for Parkinson's disease. 
Human dental pulp stem cells (hDPSCs) were isolated from third molars of patients under approval of the Non-invasive Clinical Research Ethic Committee of Hacettepe University (number: LUT 12/94-09) after informed consent. The cell surface antigens were determined by flow cytometry and the differentiation capacity of hDPSCs was investigated by staining the induced cells to bone, cartilage and adipose tissues with specific dyes. hDPSC-K4 and hDPSC-K8 were isolated from different female donors while hDPSC-1 is a mixture of hDPSCs from other three female donors. 
Photobiomodulation was applied using two different light sources. One of them was plasma arc (PAC) lamp including 590-1395 nm wavelengths and the other one was fiber optic diode laser with 660 nm wavelength. Preliminary experiments were carried out with hDPSC-K4 and hDPSC-K8 to analyse the effect of PAC light source on cell proliferation. The distance between the PAC light source and top of the 24 well plate was kept as 10 or 15 cm and exposure time was 2.5 or 5 min for each exposure distance. MTT results showed that cell viability was not affected by PAC light application and there were no differences among the groups and the cells maintained their viability. The same cells were cultured in Neurobasal A medium without any chemical inducing factors and then analysed for their BDNF (brain derived neurotropic factor), GDNF (glial cell line derived neurotropic factor) and NGF (nerve growth factor) mRNA expressions. Real time polymerase chain reaction (RT-qPCR) results indicated that BDNF and GDNF expressions were increased, however, NGF expression was decreased by PAC application. In addition, mRNA expressions under PAC application of selected proteins were found to be different for hDPSCs which were obtained from different donors. 

Dopaminergic induction of hDPSCs were investigated by using different culture periods and concentrations of the chemical agents; SHH (sonic hedgehog), FGF8 (fibroblast growth factor 8), bFGF (basic fibroblast growth factor), BDNF, GDNF and TGF-β3 (transforming growth factor β3). The best induction condition which triggers sustained NURR1 (nuclear receptor related 1) expression during dopaminergic induction in hDPSCs was selected as 200 ng/mL SHH, 100 ng/mL FGF8 and 50 ng/mL bFGF for pre-induction for 7 days and 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF and 20 ng/mL TGF-β3 for post-induction medium for another 7 days. Half of the cell culture medium was changed with fresh induction medium for every 3-4 days to ensure that pre-induction factors were present in culture medium for 14 days. 

Expressions of dopaminergic neuron specific mRNAs such as, NURR1, BDNF, GDNF, NGF, MAP2 (matrix associated protein 2), DAT (dopamine transporter), TH (tyrosine hydroxylase), PTX3 (pituitary homeobox 3) were analysed by RT-qPCR. The obtained results showed that NURR1 mRNA expression was increased in the presence of pre-induction factors whereas it was suppressed in the presence of post-induction factors. NURR1, BDNF, GDNF and NGF expressions were also increased after 11 days. Induced or non-induced hDPSCs did not express TH or PITX3 and they did not show any immunoreactivity for TH antibody after 7 or 14 days of induction culture. 
Photobiomodulation results showed that, mRNA expressions of dopaminergic neuron specific genes in the induced hDPSCs were inhibited when the light sources were applied to the cells on the days of pre-induction and post-induction and more than two times during culture period. This effect was more significant in 660 nm laser light exposed hDPSCs than PAC light exposed hDPSCs. For differentiation studies, in the light of these findings, photobiomodulation was applied to the cells for two different times, 4 days after pre-induction and 4 days after post-induction. Exposure distance was 10 cm and exposure time was 5 and 2 min for PAC light source, while it was 10 or 4 min for laser light source. At these two exposure times energy densities were calculated as 78.0 J/cm2 and 31.2 J/cm2 at 1 cm below of PAC light source and 1.584 J/cm2 and 0.634 J/cm2 for laser light source with 75mW output power (directly applied to the cell surface). RT-qPCR analyses indicated that expressions of growth and transcription factors such as BDNF, GNDF, MAP2, NURR1 and DAT increased significantly especially in the first 7 days of dopaminergic induction of hDPSCs exposed to 1.58 J/cm2 laser light energy density. It was also found that the effect of PAC light source on hDPSCs depends mostly on the differentiation medium and the protein type. Although, differentiation potential of hDPSCs was affected by chemical agents and photobiomodulation, the cells started to die at the end of the cell culture period. No positive immunoreactivity for TH activity and dopamine synthesis (ELISA) or uptake  (Fluo-8® AM) was observed. In conclusion, dopaminergic neuron protective protein expression of hDPSCs was increased by  photobiomodulation in defined conditions, however, the cells were not able to differentiate into functional dopaminergic neurons either in control or in photobiomodulated groups.
Injectable polymer gels were prepared using medical grade 3% (w/v) chitosan with 92.7% degree of deacetylation. Different volumes of 1 g/mL glycerol phosphate and 0.18 g/mL genipin solutions were added to chitosan solution to obtain genipin-crosslinked injectable hydrogels at 37oC. Laminin solution (50 μL/100 μL of              1 mg/mL) was added to increase injectability and biocompatibility and to decrease gelation time of hydrogels. Injectable chitosan gel containing 0.5 mM genipin and 50 μL (1 mg/mL) laminin was selected for cell culture experiments. Storage modulus and viscosity of selected gel were 3.0 Pa and 0.3 Pa.s, respectively, after gelation for 3 h at 37oC. The integrity of gels was tested by subcutaneous injection to the rats. Crosslinking and gel integrity were not observed when the gels were combined with the cells and injected just after the preparation. However, if the gels were combined with the cells following a 2-3 h gelation period at 37oC and injected, the integrity was preserved. 
The viability of dopaminergically induced hDPSCs combined with injectable gels was investigated with live/dead assay. The cells were combined with the gels as 1000-1500 cells/µL after the 2-3 h of gelation at 37oC. The viability was the highest in the 50 μL laminin containing and 0.5 mM genipin crosslinked chitosan gels. Cellular viability increased when 5% (v/v) FBS (Fetal bovine serum) and 1% (v/v) L-glutamine were added to the chitosan solution before gelation. It was concluded that, genipin crosslinked chitosan/laminin injectable gels could be obtained and they may be suitable vehicles for stem cell transplantation for the treatment of Parkinson's disease preventing the formation of cell clusters during transplantation and cell distribution after transplantation. 
The findings of this study has shown that adult hDPSCs could be induced to dopaminergic neuron like cells under defined chemical conditions and this induction could be increased by 660 nm laser and PAC light sources with different energy densities. The combination of the induced cells with genipin crosslinked chitosan/laminin hydrogels may be considered as an alternative treatment for the patients diagnosed with Parkinson's disease.