Stevia rebaudiana yapraklarından steviol glikozitlerin farklı yöntemler ile ekstraksiyon sürecinin optimizasyonu ve rafinat fazın karakterizasyonu
Optimization of extraction of steviol glycosides from Stevia rebaudiana by using different extraction methods and characterization of rafinate phase
Yazar: ECE YILDIZ
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM YEŞİL ÇELİKTAŞ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu yüksek lisans tez çalışması kapsamında doğal ve kalorisiz tatlandırıcı özelliği olan Stevia rebaudiana bitkisinin yapraklarından farklı yöntemler ile (subkritik su ekstraksiyonu (SSE), mikrodalga ekstraksiyon (MDE), ultrasonik ekstraksiyon (USE) ve Soxhlet ekstraksiyonu) içeriğindeki steviol glikozitlerin ekstraksiyonu, optimum ekstraksiyon koşullarının belirlenmesi, elde edilen ekstrelerin biyolojik - sitotoksik aktivitelerinin belirlenmesi ve ekstraksiyon sonrası elde edilen rafinat fazın karakterizasyonu ile farklı sektörlerde kullanılabilirliğinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Stevia rebaudiana'nın farklı ekstraksiyon yöntemleri ile elde edilen ekstrelerinin HPLC analizi ile miktar tayinleri yapılmıştır. Box-Bhenken deneysel tasarım programı kullanılarak optimizasyon yapılmıştır. Subkritik su ekstraksiyonu için optimum çalışma koşulları 125 oC, 45 dk, 4 ml/dk olarak belirlenmiştir. Mikrodalga ve ultrasonik ekstraksiyonları için optimum çalışma koşulları sırasıyla 90 oC, 45 dk, 1:10 (g/ml), 400 W ve 90 oC, 45 dk, 1:15 (g/ml), 75 W olarak belirlenmiştir. Gram kuru yaprak başına elde edilen en yüksek glikozit miktarı subkritik su ekstraksiyonunda 74.35 mg/g, mikrodalga etanol ekstraksiyonunda 21.21 mg/g, mikrodalga su ekstraksiyonunda 23.63 mg/g, ultrasonik etanol ekstraksiyonunda 14.09 mg/g, ultrasonik su ekstraksiyonunda 30.72 mg/g, Soxhlet ekstraksiyonunda 26.33 mg/g olarak bulunmuştur. En yüksek ekstraksiyon verimi (0.489 g/g) ve verimliliği (0.011 g/g/dk) subkritik su ekstraksiyonunda elde edilmiştir. En yüksek fenol içeriği (86.47 mg gallik asit/g) ve flavonoit içeriği (126.7 mg kersetin/g) ultrasonik etanol ekstresinde elde edilmiştir. DPPH serbest süpürme aktiviteleri ise elde edilen tüm su ve etanol ekstrelerinde %91-93 olarak bulunmuştur. Ayrıca farklı dozlardaki Stevia ekstrelerinin (50 g/ml,  5 g/ml ve 0.5 g/ml) farklı kanser hücre hatları (HeLa, A-549, MCF-7, CaCo-2, mPANC96, PC-3, U87MG), sağlıklı hücre hattı (HEK) ve makrofaj hücre hattı (RAW264.7) üzerinde sitotoksik etkisinin olmadığı anlaşılmıştır. iNOS aktivite inhisiyon testi için farklı dozlardaki Stevia ekstrelerinin (100 g/ml, 10 g/ml ve 1 g/ml) RAW264.7 makrofaj hücre hattı üzerindeki etkisi taranmıştır. En etkili IC50 değeri (68 g/ml), mikrodalga etanol ekstresinin uygulandığı makrofaj hücre hattında bulunmuştur. Ekstraksiyon sonrası elde edilen rafinat fazlardaki toplam klorofil, karotenoit içerikleri ve toplam diyet lif oranları sırasıyla etanol fazında 15.15 mg/100 g, 2.93 mg/100 g ve %6.53 iken; sulu fazda 31.91 mg/100 g, 5.71 mg/100 g ve %4.98 olarak belirlenmiştir. Bu tez çalışması steviol glikozitlerin endüstriyel ölçek üretimi için subkritik su ekstraksiyon koşullarının optimizasyonunun yapıldığı ilk detaylı çalışmadır.

Abstract:
Aims of this thesis were to obtain steviol glycosides of S. rebaudiana leaves, possesing natural and noncaloric sweetener properties, using different extraction methods (subcritical water extraction, microwave assisted extraction, ultrasound assisted extraction and Soxhlet extraction); to determine optimum extraction conditions; to determine biological and cytotoxic activities of Stevia extracts; to characterize the rafinate phase after extractions and to determine utility of the rafinate phase in different sectors. Quantification of Stevia extracts obtaining from different extraction methods were carried out in HPLC analysis.  Box-Bhenken design method was used for optimization of the process. Optimum conditions were elicited as 125 oC, 45 min, 4 ml/min flow rate for subcritical water extraction. Optimum conditions were elicited as 90 oC, 45 min, 1:10 (g/ml), 400 W for microwave assisted extraction and 90 oC, 45 min, 1:15 (g/ml), 75 W for ultrasound assisted extraction. Total yields of glycosides were 74.35 mg/g in subcritical water extraction, 21.21 mg/g in microwave assisted ethanol extraction, 23.63 mg/g in microwave assisted water extraction, 14.09 mg/g in ultrasound assisted ethanol extraction, 30.72 mg/g in ultrasound assisted water extraction and 26.33 mg/g in Soxhlet extraction per gram dried leaves. The highest extraction yield (0.489 g/g) and productivity (0.011 g/g/min) were obtained in subcritical water extraction. The highest total phenolic content (86.47 mg gallic acid/g) and flavonoid content (126.7 mg quercetin/g) were obtained in ultrasound assisted ethanol extract. DPPH free radical scavenging activity were found as 91–93% in all of water and ethanolic extracts. Moreover no cytotoxicity was found in different cancer cell lines (HeLa, A-549, MCF-7, CaCo-2, mPANC96, PC-3, U87MG), healthy cell line (HEK) and macrophage cell line (RAW264.7) that were treated with Stevia extracts in different doses (50 g/ml,  5 g/ml ve 0.5 g/ml). The effect of Stevia extracts in different doses (100 g/ml, 10g/ml and 1 g/ml) on RAW264.7 macrophage cell line was investigated for iNOS activity inhibition test. The most efficient IC50 value (68 g/ml) were found in macrophage cell line that was treated with microwave ethanolic exctracts. After extraction, total chlorofil content, total carotenoid content and total dietary fiber rate were elicited as 15.15 mg/100 g, 2.93 mg/100 g and %6.53 in ethanol rafinate phase and 31.91 mg/100 g, 5.71 mg/100 g and %4.98 in water rafinate phase respectively. This study is the first detailed work about the optimization of subcritical water extraction conditions in steviol glycosides production for industrial scale up.