Termofilik bir aktinomiset olan Thermobifida fusca EFTS 7A suşundan selülaz geninin klonlanmasi ve rekombinant proteininin üretilmesi
Cloning of cellulase genes from Thermobifida fusca EFTS 7A which is a thermophylic actinomyces and production of its recombinant protein
Yazar: GİZEM VAR
Danışman: PROF. DR. İSMAİL KARABOZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu tezde, İzmir Eski Foça'da bulunan, bir mantar çiftliği kompostundan elde edilen bir izolat kullanılmıştır. Bu izolatın, ekstraselüler selülaz ve ksilanaz üretim kapasiteleri, Kongo Red ve Gram İyodür gibi tarama metodları ile modifiye Thermoactinomyces besiyerinde belirlenmiştir. İzolatın tanılanması, 16S rRNA gen bölgesine göre yapılmış ve Gen Bankası'ndaki baz dizisi çakışmasına göre Thermobifida fusca EFTS 7A olarak adlandırılmıştır. Ekstraselüler selülaz, β-glukosidaz ve ksilanaz aktiviteleri spektrofotometrik yöntemle ölçülmüştür. Enzimlerin optimum aktivite gösterdiği koşullar, çeşitli pH ortamları, farklı karbon, organik ve inorganik azot kaynakları denenerek tespit edilmiştir. Optimum şartlar altında en yüksek selülaz aktivitesi avicel subsuratı varlığında 7.günde 230,6 U/L ve en yüksek ksilanaz aktivitesi ise ksilan subsuratı varlığında 7.günde 1350,6 U/L olarak ölçülmüştür. En yüksek β-glukosidaz aktivitesi, gliserol ve sellobiyoz içeren ortamda 6.günde 203,3 U/L olarak belirlenmiştir. Klonlanması düşünülen selülolitik gen bölgesi, genomu oluşturulmuş Thermobifida fusca YX aktinomiseti baz alınarak belirlenmiştir. Seçilen bölge, Tfu_0901 (cel5A) olup bir endoglukanazdır. Klonlama çalışmalarında kullanılacak kit içeriğine uygun primer çifti tasarlanmıştır. Bu gen bölgesi PZR aracılığıyla izole edilmiş ve jelden ekstraksiyonu yapılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan bu PZR ürünü dizi analizine gönderilmiş ve diziler veritabanları ile karşılaştırılarak PZR ürününün ilgilenilen gen bölgesi olduğu belirlenmiştir. Klonlama için, gen bölgesi cel5A ve pKLAC2 vektörü restriksiyon enzimleri ile muamele edilmiş ve iki kesim ürünü tekrar saflaştırılıp ligasyon işlemi gerçekleştirilerek pKLAC2 vektörüne aktarımı tamamlanmıştır. Plazmit lineer ekspresyon kaseti oluşturmak için BstXI ile kesilmiş ve kompotent K.lactis GG79 hücrelerine lineer ekspresyon kaseti transforme edilmiştir. Petriler 5mM asetamid içeren YCB agar ortamında inkübe edilmiş ve zayıf koloni gelişimi gözlenmiştir. K.lactis GG799'a ait rekombinant selülaz aktivite ölçümleri DNS yöntemi ile 2.günde 50,4 U/L ve 3.günde 44,7 U/L olarak ölçülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Termofilik aktinomiset, selülaz, primer, PZR, restriksiyon enzimi, klonlama

Abstract:
In this thesis, an isolate obtained from a mushroom farm compost situated in Izmir Eski Foca was used. The extracellular cellulase and xylanase production capacities of these isolates, were determined with methods such as Congo Red and Gram's Iodine in modified Thermoactinomyces medium. Identification of the microorganism was done by its 16S rRNA gene sequencing and it was named Thermobifida fusca EFTS 7A according to the GeneBank sequence comparison studies. Activities of extracellular cellulase, beta glucocidase and xylanase were measured spectrophotometrically. The optimum activity conditions of enzymes were designated by experimenting different carbon, organic, inorganic nitrogen sources and various pH areas. Under optimum conditions, the highest cellulase
activity within the presence of avicel on 7th day measured as 230,6 U/L and the highest xylanase activity within the presence of xylan on the 7th day measured as 1350,6 U/L. The highest β-glucosidase activity has been determined as 203,3 U/L, in an environment that contains glycerol and cellobiose. The cellulolytic gene region to be cloned is designated based on the Thermobifida fusca YX actinomycete which its genome was sequenced. The depicted region tfu_0901(cel5A) is an endoglucanase. A primer couple is designed accordingly to be used in the kit which was used in cloning processes. This gene region was isolated via PCR and was purified by extracting from gel. This purified PCR product was sent to DNA sequence analysis and the sequences were compared to sequences in databases so that the region was proven the significant region of PCR. The gene region cel5A and pKLAC2 vector were cut off with restriction enzymes and both products were purified again. The PCR product was transferred
to pKLAC2 vector, by performing ligation process. In order to form linear expression cassette, the pKLAC2 vector was cut by BstXI enzyme. The linear expression cassette was transformed to the compotent Kluyveromyces lactis GG79
cells. The recombinant cellulase activity measurements performed via DNS methodology were calculated as 50,4 U/L on 2nd day and 44,7 U/L on 3rd day. 

Keywords: Thermophilic actinomyces, cellulase, primers, PCR, restriction enzymes and cloning