Madde bağımlılığında rol oynayan fos ailesi transkripsiyon faktörlerinin dna aptamerleri ile hedeflenmesi
Targeting of fos family transcription factors playing role in drug addiction with dna aptamers
Yazar: ÖZGE UĞURLU
Danışman: PROF. DR. SERAP EVRAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Aptamerler = Aptamers ; Madde bağımlılığı = Drug addiction

Özet:
Bağımlılık, beyindeki gen ekspresyon düzeyinin değişmesiyle ilişkilendirilmektedir.  Spesifik genlerin düzenleyici bölgelerine bağlanarak gen ekspresyon seviyelerini kontrol eden transkripsiyon faktörleri,  bu sayede bağımlılık sürecinde transkripsiyonel yollar aracılığıyla aktif rol alırlar. Fos ailesi proteinleri madde bağımlılığı ile ilişkilendirilmiş ve en kapsamlı şekilde araştırılmış transkripsiyon faktörlerindendir. Bu nedenle, Fos proteini içeren AP-1 kompleksi, özellikle beyindeki ödül mekanizmasının düzenlenmesindeki işlevi nedeniyle önemli bir hedeftir.
Bu doktora tezi kapsamında, c-Fos ve FosB proteinlerine spesifik olarak ve yüksek afinite ile bağlanan, protein-protein etkileşim bölgesini bloke eden ve AP-1 kompleksi oluşumunu inhibe eden DNA aptamerlerinin SELEX yöntemi ile geliştirilmesi hedeflendi. İlk olarak, FosB ve c-Fos transkripsiyon faktörlerinin Jun proteini ile heterodimer oluşturmasında rol oynayan bZIP domainleri, Escherichia coli hücrelerinde rekombinant olarak üretildi ve saflaştırıldı. Daha sonra, manyetik boncuk tabanlı SELEX teknolojisi kullanılarak FosB ve c-Fos'un bZIP domainleri için DNA aptamerlerini geliştirildi. SELEX turlarının ardından, zenginleştirilmiş DNA aptamerleri, NGS ile tanımlandı. Aday aptamerlerin bağlanma afinitesini (Kd) karakterize etmek için de ITC yöntemi kullanıldı. Buna göre, FosB'ye en iyi afinite gösteren iki aday aptamerin FosBApt_1 ve FosBApt_13 aptamerlerin Kd değeri sırasıyla 727 nM ve 634 nM olarak belirlendi. Ayrıca, c-Fos'a en iyi afinite gösteren cfosApt_1 ve cfosApt_2 aptamerlerin Kd değeri sırasıyla 302 nM ve 390 nM olarak belirlendi.
Hedeflerine en iyi afinite ile bağlanan DNA aptamerlerinin AP-1 kompleks üzerindeki inhibisyon etkisinin deneysel olarak doğrulanması için iki yöntem kullanıldı. FosBApt_1'in FosB:JunD protein kompleks oluşumu üzerindeki inhibisyon etkisinin incelenmesi amacı ile His-tag pull-down assay yöntemi kullanılırken, cfosApt_2'nin c-Fos:MafB/c-Jun etkileşimleri üzerindeki inhibisyon etkisi içinse kolorimetrik analiz gerçekleştirildi. Her iki yöntem ile belirlenen inhibisyon yüzdesi, aptamer konsantrasyonuna karşı grafiğe geçirildi. Son olarak, FosBApt_1 ve cfosApt_2 aptamerleri ayrı ayrı U-87 MG insan glioblastoma hücre hattına transfeksiyon ajanı yardımı ile uygulandı ve hücre morfolojisi ile hücre miktarındaki değişimler belirlendi. Kontrol aptamer ile karşılaştırıldığında, FosBApt_1 aptamerinin hem hücre canlılığında azalmaya hem de hücresel morfolojide farklanmaya yol açtığı gösterildi. Bu farklanmalar, FosBApt_1 aptamerinin hedefine bağlanarak hücresel yanıta yol açtığını göstermektedir. cfosApt_2 için kontrol aptamer ile karşılaştırıldığında, canlılık sonuçlarında anlamlı bir farklanma görünmemesine rağmen morfolojik değişimler gözlendi.

Abstract:
Addiction is associated with changes in the level of gene expression in the brain. Transcription factors, which control gene expression levels by binding to the regulatory regions of specific genes, take an active role in the addiction process through transcriptional pathways. Fos family proteins have been associated with substance abuse and are among the most extensively studied transcription factors. Therefore, the AP-1 complex containing the Fos protein is an important target, particularly because it regulates the brain's reward mechanism.
In this doctoral thesis, it was aimed to develop DNA aptamers that bind to c-Fos and FosB proteins specifically and with high affinity, block the protein-protein interaction region and inhibit the formation of AP-1 complex by SELEX method. First, bZIP domains of FosB and c-Fos transcription factors, predominantly involved in heterodimer formation with Jun protein were produced recombinantly in Escherichia coli and purified. Subsequently, DNA aptamers were developed for the bZIP domains of FosB and c-Fos using magnetic bead-based SELEX technology. Following SELEX rounds, enriched DNA aptamers were identified by NGS. The ITC method was also used to characterize the binding affinity (Kd) of candidate aptamers. The Kd values of the two candidate aptamers FosBApt_1 and FosBApt_13 aptamers with the best affinity for FosB were determined as 727 nM and 634 nM, respectively. The Kd values of cfosApt_1 and cfosApt_2 aptamers with the best affinity for c-Fos were determined as 302 nM and 390 nM, respectively.
Two methods were used to experimentally confirm the inhibition effect of DNA aptamers that bind to their targets with the best affinity on the AP-1 complex. While the His-tag pull-down assay method was used on the inhibition effect of FosBApt_1 on FosB:JunD protein complex formation, colorimetric analysis was performed for the inhibition effect of cfosApt_2 on c-Fos:MafB/c-Jun interactions. Percent inhibition determined by both methods was plotted against aptamer concentration. Finally, FosBApt_1 and cfosApt_2 aptamers were applied separately to the U-87 MG human glioblastoma cell line with the help of a transfection agent, and changes in cell morphology and cell count were observed. Compared to the control aptamer, FosBApt_1 aptamer was shown to cause both a decrease in cell viability and differentiation in cellular morphology. This differentiation indicates that the FosBApt_1 aptamer binds to its target, leading to a cellular response. For cfosApt_2, morphological changes were observed when compared to the control aptamer, although no significant difference was observed in the viability results.