Speed mam color ™ testi 'nin ineklerde önemli mastitis patojenlerinin teşhisinde spesifite ve sensitivitesinin araştırılması
Investigation of the specificity and sensitivity of the speed mam colour ™ test in the diagnosis of important mastitis pathogens in cows
Yazar: TUĞBA OĞUZ
Danışman: PROF. DR. AYHAN BAŞTAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Mastitis, meme bezinin yangısı olarak bilinen, süt inekçiliğinde yaygın olarak gözlenen ve en fazla ekonomik kayba neden olan bir hastalıktır. Hastalık etkenlerinin saha koşullarında hızlı teşhis edilmesi, hastalığa neden olan patojenlerin belirlenerek tedaviye erken başlanmasıyla birlikte tedavi başarı şansı artmakta ve antibiyotiklerin daha etkin kullanımı sağlanmaktadır. Sunulan bu tez çalışmasının amacı Speed Mam ColorTM testinin ineklerde önemli mastitis patojeni olarak bilinen Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Streptococcus uberis ve Escherichia coli'nin teşhisinde güvenilirliğinin araştırılmasıdır. Çalışma kapsamında testin tespit limitinin belirlenmesi, spesifite ve sensitivite çalışmalarında kullanılmak üzere anamnezi alınmış sağlıklı sürülerden; en az bir kez doğum yapmış, laktasyonun 5. ve 200. günleri arasında, sağlıklı ve klinik herhangi bir belirti göstermeyen meme loblarından, 15 gün öncesine kadar antibiyotik veya nonsteroidal bir ilaç tedavisi uygulanmamış ineklerden toplanan sütler kullanılmıştır. Referans suşlar kullanılarak kontamine edilen süt örnekleriyle hedef her bir bakteri için 7 farklı dilüsyon hazırlanarak dilüsyon oranlarının kontrolü için test kitine paralel olarak her bir bakteri dilüsyonu mikrobiyolojik kültüre ekilmiş ve inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda 10 katlı azalan bakteri üremelerinin gözlenmesi dilüsyonun doğru şekilde yapıldığını göstermiştir. Test kiti ile pozitif sonuç alınan en düşük konsantrasyon kitin deteksiyon limiti olarak belirlenmiştir. Buna göre yapılan testler sonucunda 48 saatin sonunda Speed Mam Color ™ kitine ait tespit limiti sonuçları Staphylococcus spp. için 101 CFU/ml; Streptococcus spp. için 103 CFU /ml; S. uberis için 103 CFU/ml; E. coli için 101 CFU/ml olarak bulundu. Duyarlılık ve özgüllüğün belirlenmesi amacıyla her bir hedef bakterinin referans suşu, kültür yöntemiyle nutrient broth sıvı besi yerinde üretilerek konsantrasyonları McFarland 0.5'e göre ayarlamış ve Speed Mam Color ™ prospektüsünde belirtilen tespit limitinin üzerinde olmak üzere farklı konsantrasyonları (>103) sağlıklı süt içeren 5 tüpte dilüe edilerek elde edilen faklı konsantrasyonlar bu tüplerden 1'er ml alınıp 4 ml sağlıklı süt içeren 25 adet tüpe rastgele dağıtıldı. Bu sayede her hedef için elde edilen 25 kontamine 25 sağlıklı süt numunesi mikrobiyolojik kültür yöntemi ve Speed Mam Color ™ ile test edilmiştir. Speed Mam Color ™ testinin spesifitesi Staphylococcus spp., Streptococcus spp., S.uberis ve E. coli için %100 iken, sensitivite ise Staphylococcus spp. %100, Streptococcus spp., için %92, S.uberis için %92 ve E. coli %96 olarak bulundu. Pozitif prediktif değeri (PPV) değeri Staphylococcus spp., Streptococcus spp., S.uberis ve E. coli için %100 iken, negatif prediktif değeri (NPV) değeri ilgili bakteriler için sırasıyla %100, %93, %93 ve %96; kesinlik (Ac) değeri ise sırasıyla %100, %96, %96 ve %98 olarak hesaplandı. Çalışmanın diğer aşaması olan testin doğrulanmasında, yukarı belirtilen kriterler göz önünde tutularak ineklere CMT uygulanmış ve CMT sonuçlarına göre pozitiflik gösteren 318 süt numunesi toplandı. Speed Mam Color ™ testinin doğrulaması amacıyla toplanan CMT pozitif olan 318 adet subklinik mastitisli süt numunesini karşılaştırmada altın standart yöntem olarak kabul edilen mikrobiyolojik kültür yöntemi kullanılmıştır. Kültür yöntemi ile test edilen sütler, Speed Mam Color ™ testinde analiz edilen bakteri sonuçları karşılaştırıldı. Süt örneğinde 3'ten fazla koloni tespit edilmesi kontaminasyon olarak kabul edilirken; 2-3 koloni tespit edildiğinde miks enfeksiyon olarak olarak tanımlandı. Subklinik mastitisli süt örnekleri yapılan araştırmada hedef bakterilerin 5 farklı farklı kombinasyonu elde edilirken, bazı hedef bakterilerin Speed Mam Color ™ ve mikrobiyolojik kültürde üreme durumları incelediğinde verifikasyon çalışmasının sonucunda Speed Mam Color ™ testinin spesifitesi Staphylococcus spp., S.uberis ve E. coli için %100 iken, Streptococcus spp., için %95, sensitivite ise Staphylococcus spp. %96, Streptococcus spp., için %83, S.uberis ve E. coli için %100 olarak bulundu. PPV değeri Staphylococcus spp., S.uberis ve E. coli için %100 iken, Streptococcus spp. için %94 olarak hesaplandı. NPV değeri ilgili bakteriler için sırasıyla %95, %87, %100 ve %100; Ac değeri ise sırasıyla %98, %90, %100 ve %100 olarak hesaplandı. Sonuç olarak Speed Mam Color ™ testinin saha koşullarında mastitise neden olan önemli mastitis patojenlerini teşhis etmede kullanılabilecek bir test olabileceği düşünüldü.

Abstract:
Mastitis, known as inflammation of the mammary gland, is a disease that is widely observed in dairy farming and causes the highest economic loss. Rapid diagnosis of the disease agents in field conditions, identification of the pathogens causing the disease and early initiation of treatment increases the chance of success and more effective use of antibiotics. The aim of this thesis is to investigate the reliability of Speed Mam ColourTM test in the diagnosis of Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Streptococcus uberis and Escherichia coli, which are known as important mastitis pathogens in cows. Within the scope of the study, milk collected from healthy herds, which had given birth at least once, between the 5th and 200th days of lactation, healthy, without any clinical symptoms, without udder abnormalities, without antibiotic or nonsteroidal drug treatment until 15 days ago were used for the determination of the detection limit of the test, specificity and sensitivity studies. With milk samples contaminated with reference strains, 7 different dilutions were prepared for each target bacteria and each bacterial dilution was added to the microbiological culture in parallel with the test kit to control the dilution rates and left for incubation. The observation of 10-fold decreasing bacterial growth at the end of incubation showed that the dilution was performed correctly. The lowest concentration at which positive results were obtained with the test kit was determined as the detection limit of the kit. As a result of the tests performed accordingly, the detection limit results of the Speed Mam Colour™ kit at the end of 48 hours were 101 CFU/ml for Staphylococcus spp.; 103 CFU/ml for Streptococcus spp.; 103 CFU/ml for S. uberis; 101 CFU/ml for E. coli. In order to determine the sensitivity and specificity, the reference strain of each target bacterium was grown in nutrient broth liquid medium by culture method, the concentrations were adjusted according to McFarland 0.5 and different concentrations (>103 CFU/ml) above the detection limit specified in the Speed Mam Colour ™ package insert were diluted in 5 tubes containing healthy milk and the different concentrations obtained were randomly distributed to 25 tubes containing 4 ml of healthy milk by taking 1 ml each from these tubes. In this way, 25 contaminated 25 healthy milk samples obtained for each target were tested by microbiological culture method and Speed Mam Colour ™. The specificity of the Speed Mam Colour™ test was 100% for Staphylococcus spp., Streptococcus spp., S.uberis and E. coli , while the sensitivity was 100% for Staphylococcus spp., 92% for Streptococcus spp., 92% for S.uberis and 96% for E. coli . The positive predictive value (PPV) value was 100% for Staphylococcus spp., Streptococcus spp., S. uberis and E. coli, while the negative predictive value (NPV) value was 100%, 93%, 93% and 96%, and the accuracy (Ac) value was 100%, 96%, 96% and 98%, respectively. In the other stage of the study, which was the verification of the test, CMT was applied to the cows considering the above mentioned criteria and 318 milk samples showing positivity according to CMT results were collected. Microbiological culture method, which is accepted as the gold standard method, was used to compare 318 CMT positive milk samples with subclinical mastitis collected for the verification of Speed Mam Colour™ test. Milk samples tested by culture method were compared with the bacterial results analysed in the Speed Mam Colour™ test. Detection of more than 3 colonies in the milk sample was considered as contamination; when 2-3 colonies were detected, it was defined as mixed infection. While 5 different combinations of target bacteria were obtained in the study of milk samples with subclinical mastitis, when the growth status of some target bacteria in Speed Mam Colour ™ and microbiological culture was examined, the specificity of the Speed Mam Colour ™ test was determined as Staphylococcus spp, S.uberis and E. coli was 100%, for Streptococcus spp. 95%, sensitivity was 96% for Staphylococcus spp. 96%, for Streptococcus spp. 83%, for S.uberis and E. coli 100%. PPV value was calculated as 100% for Staphylococcus spp., S.uberis and E. coli and 94% for Streptococcus spp. NPV values were 95%, 87%, 100% and 100% for the related bacteria, and Ac values were 98%, 90%, 100% and 100%, respectively. As a result, it was thought that the Speed Mam Colour™ test could be a test that can be used to diagnose important mastitis pathogens causing mastitis under field conditions.