Entomopatojen funguslara ait hidrofobin genlerinin araştırılması, hidrofobin-infektivite ilişkisinin belirlenmesi ve in vitro sistemde ifadesi
Investigation of hydrophobin genes of entomopathogenic fungi, determination of hydrophobin-infectivity relationship and expression in the in vitro system
Yazar: DİLEK CİVELEK
Danışman: PROF. DR. ZİHNİ DEMİRBAĞ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Hidrofobik özellik = Hydrophobic property ; Mantarlar = Fungi ; Pichia pastoris = Pichia pastoris

Özet:
Hidrofobinler, moleküler kütlesi yaklaşık 10 kDa olan filamentli funguslarda üretilen sistein açısından zengin, amfipatik proteinlerdir. Bu özelliklerinden dolayı yüzey kaplamaları, biyosensörler, rekombinant proteinlerin saflaştırılması ve kendi kendini temizleyen yüzeyler gibi birçok endüstriyel uygulamada önemli rol oynarlar. Bu tezde, entomopatojenik funguslarda (EPF) bulunan hidrofobin genlerinin belirlenmesi, hidrofobin özellikleri ile insektisidal özelliklerin karşılaştırılması ve seçilen hidrofobin geninin Pichia pastoris maya sisteminde ifade edilerek endüstriyel kullanıma hazırlanması amaçlanmıştır. Bu amaçla Karadeniz Teknik Üniversitesi fungus koleksiyonundan elde edilen 20 adet entomopatojenik fungus izolatında hidrofobin geninin varlığı araştırılmış ve bu izolatların 14'ünde hidrofobin geni (hyd)  tespit edilmiştir. hyd taşıyan tüm izolatların sınıf I hidrofobin grubuna ait oldukları belirlenmiştir.
Hidrofobin geni ihtiva eden entomopatojenik funguslar değerlendirildiğinde, insektisidal aktivite, morfolojik özellikler, hızlı büyüme, konak spektrumu, konak yüzeylerindeki adhezyon derecesi ve yüksek mortaliteye sahip olma özellikleri göz önünde bulundurulduğunda Beauveria bassiana KTU-57 izolatına ait hidrofobin geninin P. pastoris maya sisteminde ifade edilmesine karar verildi. Bu doğrultuda fungal genomdan ribozomal RNA elde edilerek revers transkriptaz enzimi ile cDNA'sı oluşturuldu. RT-PCR (Reverse Transcriptase-Ters Transkriptaz) ile elde edilen hidrofobin geni, pPICZC vektörüne klonlandı ve rekombinant maya vektörünün (pPICZC+hyd) P. pastoris X-33 gen ifade konağında ifadesi sağlandı. Önemli miktarda protein ifadesi gerçekleştirilmiş olmakla birlikte hidrofobin proteinin endüstriyel amaçlı kullanılması için üretim kapasitesinin arttırılmasına yönelik optimizasyon çalışmaları devam etmektedir.

Abstract:
Hydrophobins are cysteine-rich, amphipathic proteins produced in filamentous fungi with a molecular mass of about 10 kDa. Because of these properties, they play an important role in many industrial applications such as surface coatings, biosensors, purification of recombinant proteins and self-cleaning surfaces. In this thesis, it was aimed to determine the hydrophobin genes found in entomopathogenic fungi (EPF), to compare the hydrophobin properties and insecticidal properties, and to prepare the selected hydrophobin gene for industrial use by expressing it in Pichia pastoris yeast system. For this purpose, the presence of hydrophobin gene was investigated in 20 entomopathogenic fungus isolates obtained from the fungus collection of Karadeniz Technical University, and the hydrophobin gene (hyd) was detected in 14 of these isolates. It was determined that all isolates carrying the hydrophobin gene belong to the class I hydrophobin group.
When the entomopathogenic fungi containing the hydrophobin gene were evaluated, considering the insecticidal activity, morphological features, rapid growth, host spectrum, degree of adhesion on the host surfaces and high mortality, it was decided to express the hydrophobin gene of Beauveria bassiana KTU-57 in the P. pastoris yeast system. In this direction, ribosomal RNA was obtained from the fungal genome and its cDNA was created with the reverse transcriptase enzyme. The hydrobin gene obtained by RT-PCR (Reverse Transcriptase-Reverse Transcriptase) was cloned into the pPICZC vector and expression of the recombinant yeast vector (pPICZC+hyd) in the P. pastoris X-33 gene expression host was achieved. Although a significant amount of protein expression has been achieved, optimization studies are continuing to increase the production capacity for the industrial use of hydrophobin protein.