Isırgan otu (Urtica dioica L.), papatya (Matricaria chamomilla L.) ve hayıt meyvesi (Vitex agnus-castus L.) ekstraktlarının normal koşullarda ve asidoz koşullarında rumen mikrobiyal fermentasyonuna in vitro etkileri
Effects of stinging nettle (Urtica dioica L.), chamomile (Matricaria chamomilla L.) and chasteberry (Vitex agnus-castus L.) extracts on in vitro rumen microbial fermentation in normal conditions and acidosis
Yazar: AHU DEMİRTAŞ
Danışman: PROF. DR. İLKSİN PİŞKİN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Asidoz = Acidosis ; Bitki özütü = Plant extract ; Isırgan otu = Stinging nettles ; Matricaria chamomilla L. = Matricaria chamomilla L. ; Rumen = Rumen ; Urtica dioica L. = Urtica dioica L. ; Vitex agnus-castus = Vitex agnus-castus

Özet:
Bu çalışmada ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraktlarının normal koşullarda ve asidoz koşullarında rumen mikrobiyal fermentasyonuna in vitro etkilerinin monensin ile karşılaştırmalı olarak incelenmesi amaçlanmıştır. 
Araştırma yarı-sürekli kapalı bir inkübasyon metodu olan Rumen Simülasyon Tekniği (Rumen Simulation Technique-Rusitec) ile yapılmıştır. Çalışmada, gerçek hacimleri 0,75 l olan on adet fermenter eş zamanlı olarak kullanılmıştır. Fermenterlerde inokulum olarak kullanılacak rumen içeriği, mezbahaneye sevk edilmiş yaklaşık 500 kg canlı ağırlığındaki 2 yaşında Holstein ırkı sağlıklı bir besi boğadan elde edilmiştir. Toplamda 21 gün süren araştırmanın ilk 7 günü (1.-7. günler) adaptasyon fazı olup bu fazda rumen mikroorganizmalarının in vitro şartlara alışması sağlanmıştır. İkinci 7 günlük aşamada (8-14. günler) ise bitki ekstraktlarının normal koşullardaki etkilerini araştırmak amacıyla Rusitec sistemin 10 fermenteri 5 gruba ayrılmıştır. İlk grubu oluşturan iki fermenter negatif kontrol grubu olup herhangi bir madde ilavesi yapılmamış, ikinci grup fermenterlere 500 mg/gün ısırgan otu ekstraktı, üçüncü grup fermenterlere 500 mg/gün papatya ekstraktı ve dördüncü gruptaki fermenterlere 500 mg/gün hayıt meyvesi ekstraktı eklenmiştir. Beşinci grup ise pozitif kontrol olarak kabul edilip fermenterlerine günde 5 mg monensin ilavesi yapılmıştır. Katkı maddelerinin normal koşullardaki etkilerinin incelendiği süre boyunca her bir fermenterde günlük olarak, kaba yemin konsantre yeme oranı 80:20 olacak şekilde 12,8 gram arpa samanı ve 3,2 gram konsantre yemden oluşan bir deneme yemi karışımı inkübe edilmiş ve peristaltik pompalar ile fermenterlere günlük yaklaşık 0,75 l suni tükürük solüsyonu iletilmiştir. Araştırmanın üçüncü 7 günlük aşamasında (15.-21. günler) ise yem keselerindeki kaba yemin konsantre yeme oranı 20:80 olarak değiştirilerek ve suni tükürük solüsyonu içerisindeki tamponlayıcı bileşiklerin miktarı azaltılarak Rusitec fermenterlerinde asidoz koşulları oluşturulmuştur. Etkileri incelenecek maddeler fermenterlere aynı miktarlarda ilave edilerek asidoz koşullarındaki etkinlikleri araştırılmıştır. Araştırmanın deneme fazları boyunca her gün ruminal pH, protozoon ve toplam bakteri sayıları belirlenmiş, uçucu yağ asitleri (UYA), laktik asit, amonyak azotu (NH3-N) ve yem kuru maddesi sindirilebilirliği (KMS) analizleri için numuneler toplanıp saklanmıştır.
Asidoz koşullarında normal koşullara kıyasla genel olarak tüm gruplarda subakut rumen asidozunun (SARA) tanımına uygun olacak şekilde ruminal pH'nın yanı sıra asetik asit üretimi, asetatın propiyonata oranı (A:P) ve protozoon sayısı azalırken (P<0,001), propiyonik asit, bütirik asit ve toplam UYA üretimi ile KMS, bakteri sayısı, amonyak ve laktik asit konsantrasyonları artmıştır (P<0,001). Ruminal pH'da her iki koşulda da hem monensin hem de bitki ekstraktı gruplarında istatistiksel olarak önemli bir değişiklik gözlenmemiştir. Her üç ekstrakt da normal koşullarda, asetik asit ve toplam UYA üretimini arttırırken (P<0,05), papatya ve hayıt meyvesi ekstraktları ayrıca propiyonik asit üretimini de arttırmışlardır (P<0,05). Bütirik asit üretimi ise sadece hayıt meyvesi ekstraktı grubunda artmıştır (P<0,05). Monensin asetik ve bütirik asit üretiminde önemli bir değişiklik oluşturmazken, propiyonik asit ve toplam UYA üretimini arttırmıştır (P<0,05). Asidoz koşullarında ise her üç ekstrakt da toplam UYA ve bütirik asit üretimini arttırmıştır (P<0,05). Propiyonik asit üretimi ise ısırgan otu grubunda değişmezken, papatya ve hayıt meyvesi gruplarında artış (P<0,05) göstermiştir. Bununla birlikte asetik asit üretimi papatya grubunda artarken (P<0,05), ısırgan otu ve hayıt meyvesi gruplarında normal koşullardakinden farklı olarak değişmemiştir. Monensin ise normal koşullardan farklı olarak bütirik asit üretimini azaltırken (P<0,05), UYA profiliyle ilgili diğer parametreler üzerine etkisi normal koşullardaki ile aynı yönde olmuştur (P<0,05). A:P'yi, her iki koşulda da sadece monensin düşürürken (P<0,05), bitki ekstraktı gruplarında değişiklik gözlenmemiş, KMS'yi ise her iki koşulda da ısırgan otu ekstraktı hariç diğer tüm gruplar arttırmışlardır (P<0,05). Protozoon sayısı her iki koşulda da hayıt meyvesi ekstraktı grubunda değişmezken, diğer tüm gruplarda azalmıştır (P<0,05). Bakteri sayısı ise normal koşullarda ısırgan otu, papatya ve monensin gruplarında artarken (P<0,05), hayıt grubunda değişmemiş, asidoz koşullarında ise sadece monensin grubunda artmış (P<0,05), bitki ekstraktı gruplarında ise anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir. NH3-N konsantrasyonunu normal koşullarda hiçbir katkı maddesi etkilemezken, asidoz koşullarında sadece hayıt meyvesi düşürmüştür (P<0,05). Laktik asit konsantrasyonunu hayıt ve monensin her iki koşulda da değiştirmezken, papatya arttırmıştır (P<0,05). Isırgan otu ise laktik asit konsantrasyonunu normal koşullarda değiştirmezken asidoz koşullarında arttırmıştır (P<0,05).
Sonuç olarak, ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraktları her iki koşulda da rumen mikroorganizmalarının fermentatif faaliyetlerini uyararak ruminal fermentasyon verimliliğini olumlu yönde etkilemişlerdir. Bitki ekstraktlarının asidozu önleme/düzeltme potansiyelleri bulunmamakla birlikte asidoz koşullarında mevcut olumlu etkilerini korumuş ve hatta bazı parametreler açısından daha iyiye götürmüşlerdir. Ruminal fermentasyon parametreleri üzerine her iki koşulda da monensinden farklı bir mekanizmayla olsa da in vitro olumlu etkiler oluşturan ve farklı açılardan antibiyotiklerin alternatifi olma potansiyelleri bulunan bu üç bitki ekstraktının in vivo kullanımları benzer etkiler meydana getirdiği taktirde ruminant verimliliğini geliştirebilecekleri kanısına varılmıştır.

Abstract:
The aim of this study was to investigate the effects of stinging nettle, chamomile and chasteberry extracts compared with monensin on in vitro rumen microbial fermentation in normal conditions and acidosis.
The study was carried out with Rumen Simulation Technique (Rusitec), a semicontinuous closed incubation method. Ten incubation vessels with a nominal volume of 0,75 l were simultaneously used in the experiment. The inoculum was obtained from a freshly slaughtered two years old healthy Holstein bull with 500 kg mean body weight at a commercial slaughter facility. The experiment lasted 21 days and the first 7 days (from 1 to 7 days) of the study was considered as the adaptation phase for microorganisms to get used to in vitro conditions. In the second 7-days (from 8 to 14 days), 10 fermentation vessels of Rusitec system were divided into 5 groups in order to investigate the effects of plant extracts in normal conditions. First two vessels received no additives (negative control), second group of vessels received 500 mg/day stinging nettle extract, third group of vessels received 500 mg/day chamomile extract and forth group of vessels received 500 mg/day chasteberry extract. Fifth group which was considered as positive control received 5 mg monensin daily. Each fermentation vessel was incubated daily with experimental diet consisting of a mixture of 12.8 g of barley straw and 3.2 g of commercial concentrate to reach the 80:20 forage to concentrate ratio and fermentation vessels received a continuous infusion of an artificial saliva solution at a rate of approximately 0,75 l/day with peristaltic pumps during normal conditions of study. In the third phase of a 7-days period (from 15 to 21 days), acidosis was established in Rusitec fermenters by changing the forage to concentrate ratio to 20:80 and reducing the amount of buffering compounds in artificial saliva solution. The same amount of substances added to the vessels to investigate their effects in acidosis. Ruminal pH, protozoa and total bacteria numbers were determined and samples were collected and kept for the analysis of volatile fatty acids (VFA), lactic acid, ammonia nitrogen (NH3-N) and dry matter digestibility (DMD) daily during the experimental periods.
In acidosis, compared to normal conditions while acetic acid, acetate to propionate ratio (A:P) and the number of protozoa decreased (P<0,001) in all groups as well as the ruminal pH; propionic acid, butyric acid and total VFA production, DMD, total bacteria number and concentrations of NH3-N and lactic acid increased (P<0,001) in accordance with the definition of subacute rumen acidosis (SARA). No significant changes were observed in ruminal pH neither in monensin nor in plant extract groups. In normal conditions, while all three extracts increased (P<0,05) acetic acid and total VFA production, chamomile and chasteberry extracts also increased (P<0,05) propionic acid production. However, the production of butyric acid was increased (P<0,05) only in chasteberry extract group. Monensin had no significant effect on acetic and butyric acid production, but increased (P<0,05) the production of propionic acid and total VFA. In acidosis, all three extracts increased total VFA and butyric acid production. Propionic acid production remained unchanged in stinging nettle, while it was increased (P<0,05) in chamomile and chasteberry groups. However, acetic acid production did not change in stinging nettle and chasteberry groups unlike normal conditions while it was increased (P<0,05) in the chamomile group. Effect of monensin on other parameters related to the VFA profile in acidosis had the same direction as the normal conditions (P<0,05) while butyric acid production was reduced (P<0,05) by monensin unlike normal conditions. In both conditions, only monensin reduced A:P so that, no significant change was observed in groups of plant extracts and all groups except stinging nettle increased DMD. Protozoan number was remained unchanged in chasteberry group while decreased (P<0,05) in all other groups in both conditions. Total bacteria number was increased (P<0,05) in stinging nettle, chamomile and monensin groups, while remained unchanged in chasteberry group in normal conditions and it was increased (P<0,05) only by monensin while no significant change was observed in groups of plant extracts in acidosis. NH3-N concentration was not affected by any additive in normal conditions, only the chasteberry reduced (P<0,05) its levels in acidosis. Chasteberry and monensin had no significant effect on lactic acid concentration while it was increased (P<0,05) in the presence of chamomile in both conditions. Stinging nettle did not change lactic acid concentration in normal conditions but increased (P<0,05) it in acidosis.
As a result, stinging nettle, chamomile and chasteberry extracts influenced the efficiency of ruminal fermentation positively by stimulating fermentative activity of rumen microorganisms in both conditions. Plant extracts did not have the potential to prevent acidosis however, they preserved their positive effects in acidosis, and even improved these in some parameters. All three extracts had positive impact on in vitro ruminal fermentation parameters in both conditions though by a mechanism different from monensin, and had the potential to be an alternative to antibiotics in different angles. So, it is concluded that if in vivo use of extracts causes similar effects, these three extracts may improve the efficiency of ruminants.