Thermus oshimai DSMZ 12092'ye ait ß-galaktosidazın kısmi karakterizasyonu ile transferaz aktivitesinin belirlenmesi ve ß-galaktosidaz geninin E. coli'de klonlanması
Partial characterization and determination of the transferase activity of ß-galactosidase and cloning in E. coli of ß-galactosidase gene from Thermus oshimai DSMZ 12092
Yazar: YÜKSEL GEZGİN
Danışman: PROF. DR. RENGİN ELTEM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
ß-Galaktosidazlar hidrolitik enzim sınıfına ait olup laktoz hidrolizi amacıyla süt endüstrisinde uzun bir süredir kullanılmaktadır. Laktoz intoleransı, sütün baskın şekeri laktozun yeterli sindirilememesinden kaynaklanmaktadır ve bu sebeple ß-galaktosidazlar laktozsuz süt ürünlerinin üretimi amacıyla son derece önemlidir. Termofiliklerden elde edilen termostabil ß-galaktosidazlar mezofilik enzimlerle karşılaştırıldığında düşük-laktozlu süt ürünlerinin üretiminde çok önemli avantajlara sahiptir. Enzimin laktoz hidrolizinde kullanılmalarının yanı sıra son zamanlarda transferaz aktivitesi sonucu laktozdan galakto-oligasakkaritlerin üretimi açısından oldukça ilgi çekici olmaya başlamıştır.Çalışmamızda Thermus oshimai DSMZ 12092'ye ait ß-galaktosidaz enziminin kısmi karakterizasyonuyla beraber transferaz aktivitesi olup olmadığı incelenmiş ve ß-galaktosidaz geninin E. coli'de klonlanması gerçekleştirilmiştir. Thermus oshimai DSMZ 12092'nin ß-galaktosidaz enziminin hücre içi bir enzim olması sebebiyle öncelikle çalkalamalı erlenlerde ve biyoreaktörlerde pellet üretimi gerçekleştirilmiştir. Çalkalamalı erlenlerde ve biyoreaktörler bakteriye ait büyüme hızı ve ikilenme süresi belirlenmiş olup sırasıyla 0,29 h-1, 2,41 h ve 0,42 h-1, 1,65 h olarak saptanmıştır. Enzimin kısmi karakterizasyonu amacıyla yapılan çalışmada enzimin çalıştığı optimal sıcaklık ve pH sırasıyla 75 °C ve nötral olarak belirlenmiştir. Enzim aktivitesi üzerine en etkili iki değerlikli katyonun 1,0 mM konsantrasyon kullanıldığında Zn2+ olduğu saptanmış (Zn2+> Fe+2> Ca+2>Cu+2> Mg+2> Mn+2) ve konsantrasyonun artmasına bağlı olarak bu etkinin azaldığı görülmüştür. Ayrıca enzimin bazik pH'lara ve yüksek sıcaklıklara karşı stabilitesinin yüksek olması sebebiyle Thermus oshimai DSMZ 12092'ye ait ß-galaktosidaz gen bölgesinin dizisi belirlenmiş olup GenBanka'sına kayıtlanmıştır. Ayrıca ß-galaktosidaz geni pBR322 plazmidine klonlanmıştır.ß-Galaktosidaz enziminin transferaz aktivitesi ile galaktooligosakkarit (GOS) sentezi HPLC ile kromatografik olarak belirlenmiş ve maksimum GOS üretiminin sağlanması amacıyla farklı reaksiyon (pH, sıcaklık, başlangıç laktoz konsantrasyonu, reaksiyon süresi, enzim konsantrasyonu ve enzim saflığı) koşulları incelenmiştir. En yüksek GOS üretimi 85 oC'de pH 6,0'da, 0,1 U/ml saf enzim ile başlangıç laktoz konsantrasyonu %50 kullanıldığında gerçekleşmiştir.

Abstract:
ß- Galactosidases belongs to the class of hydrolytic enzymes and they have been used as lactose hyrolysis in milk industry. Lactose intolerance occure in human because lactose, is a main sugar in milk, is not to be able to be digested and therefore ß-galactosidases are crucially important to produce lactose-free milk. When thermostable ß-galactosidase isolated from thermophylic organisms compared to ß-galactosidase isolated from mesophylic organisms, they have advantage to produce milk with low level of lactose. Beside the enzyme is used in lactose hydrolysis, recently they started to be interesting in production of galacto-oligosaccarides from lactose as a result of transferase activity.In the study, partial characterization of ß-galactosidase from Thermus oshimai DSMZ 12092 was performed and the transferase activity of the enzyme was investigated. And finally the ß-galactosidase gene was cloned into E. coli. Pellet production was performed in both shaking flasks and bioreactor because the enzyme locates within a cell. Spesific growth rate (µ, h-1) and the doubling time (tD, h) were detected in shaking flasks and bioreactors and the values were idendified as 0,29 h-1, 2,41 h ve 0,42 h-1, 1,65 h respectively. In the study of partial characterization of the enzyme, optimum pH temperature and pH were measured as 75 °C and neutral respectively. The most effective cation on enzyme activity was Zn2+ in 1 mM concentration (Zn2+> Fe+2> Ca+2>Cu+2> Mg+2> Mn+2) and it was detected that when the concentration was increased, the enzyme activity was decreased. In addition to this properties of enzyme, the enzyme was stable in high pH and high temperature. After that, the gene region of the enzyme from Thermus oshimai DSMZ 12092 was sequenced and the sequence information was registered to the GenBank. ß-Galactosidase gene was cloned into pBR322 plasmid.Transferase activity of enzyme and synthesis of galactooligosaccharide (GOS) were detected in HPLC. In order to produce maximum GOS, different reaction conditions (pH, temperature, initial lactose concentration, time of reaction, concentration of enzyme, and purify of enzyme) were investigated. The maximum GOS production were obtained at 85 C, at pH 6.5 in 0.1U/ml pure enzyme conditions and at 50% of initial concenration of lactose.