Periodontitise yatkınlıkta rol oynadığı düşünülen RSPO4 genine ait putatif bir düzenleyici bölgenin gen ifadesini hızlandırıcı etkisinin gösterilmesi
Demonstration of the enhancing effect of a putative regulatory region of the RSPO4 gene predicted to play role in susceptibility to periodontitis
Yazar: HÜSEYİN GENCAY KEÇELİ
Danışman: PROF. DR. PERVİN RUKİYE DİNÇER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Periodontitis genetik, çevresel ve hayat tarzı faktörlerinin bir arada rol oynadığı, dişe özgü destek yapıların yıkımıyla karakterize kompleks hastalıklardan birisidir. Patogenezi ve yatkınlığı ile ilişkili genetik mekanizmalar henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. RSPO4 özellikle tırnak ve ekstremite gelişimi ile ilişkili mekanizmalarda rolünün yanı sıra kemik oluşumu ve olgun iskelette görev alan bir gendir. Porphyromonas gingivalis (majör periodontopatojen) kaynaklı oral enfeksiyona direnç gösteren spesifik fare hatlarında RNA dizi analizi sonucu RSPO4 ifadesinin arttığını gösteren bulgular RSPO4 gen regülasyonunun periodontal yıkıma dirençte rol oynadığını düşündürmüştür. Genom boyu ilişkilendirme çalışmaları, ENCODE verileri ve çeşitli hücre tiplerinde ChIP-dizileme analizleri; RSPO4'ün 3'UTR bölgesinde yer alan, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri olan, H3K4Me1 ve H3K27Ac histon modifikasyonlarına ve DNAz I aşırı duyarlılığına sahip, güçlü linkage disequilibrium değeri gösteren tek nükleotit polimorfizmleri görülen bir haplotip bloğun aşağı yönünde gen ifadesini hızlandırıcı etkisi olduğunu düşündürmüştür. Bu bilgiler ışığında ilgili kromozom bölgesinin periodontitis etiyolojisinde işlevi olan düzenleyici elemanlar içerdiği düşünülmüştür. Araştırmanın amacı bu putatif düzenleyici elemanların gen ifadesini hızlandırdığını doğrulamaktır. Bu amaçla putatif gen ifadesini düzenleyen bölge amplifiye edilip DNA dizi analizi ile doğrulanmış, firefly luciferase reporter vektörü (pgl4.24) içerisine klonlanıp ardından kompetan bakteriler içerisinde yüksek düzeyde ifadesi sağlandıktan sonra RSPO4'ün güçlü bir şekilde ifade edildiği SaOs-2 hücrelerine transfeksiyonu gerçekleştirilmiş ve putatif dizinin promotör aktivitesine olan etkisi lusiferaz assay ile incelenmiştir. İnceleme sonucunda dizinin promotör aktivitesini azalttığı belirlenmiştir. Mevcut sonuçlar incelenen bölgenin gen ifadesini azaltıcı (repressör) bir bölge olduğunu ortaya koymuştur.

Abstract:
Periodontitis is one of the complex diseases characterized by the destruction of tooth-specific supporting structures in which genetic, environmental and lifestyle factors play a role, and the genetic mechanisms associated with its pathogenesis and susceptibility have not yet been fully elucidated. RSPO4 is a gene that is involved in bone formation and mature skeleton, as well as has role in mechanisms related to nail and extremity development. Findings showing increased RSPO4 expression as a result of RNA-seq in specific mouse lines resistant to Porphyromonas gingivalis (major periodontopathogen) infection suggested that RSPO4 gene regulation plays a role in resistance to periodontal destruction. According to the genome-wide association studies, ENCODE data and ChIP-seq analyses in various cell types; a haplotype block located in the 3'UTR region of RSPO4, which has transcription factor binding sites, H3K4Me1 and H3K27Ac histone modifications, DNAse I hypersensitivity, and single nucleotide polymorphisms showing strong linkage disequilibrium suggested that the downstream gene expression of a haplotype block is a putative enhancer region. Accordingly, it was thought that the relevant chromosome region containing regulatory elements that have a function in the etiology of periodontitis. The aim of the study is to confirm that these putative regulatory elements enhance gene expression. For this purpose, the region was amplified and confirmed by DNA sequencing, cloned into the firefly luciferase reporter vector pgl4.24, and then transfected into cells where RSPO4 was strongly expressed after it was expressed at a high level in competent bacteria, and the effect of the putative sequence on the promoter activity was carried out. The effect was examined with the luciferase assay. As a result, it was determined that the sequence decreased the promoter activity revealing that the region is a repressor region.