THP-1 kökenli M1 makrofaj hücreleri ile indüklenen nöroinflamatuar yanıtın düzenlenmesinde protokateşuik asit'in etkilerinin hücre kültüründe araştırılması
Investigation of the effects of protocatechuecuic acid in cellculture on regulating the neuroinflammatory response induced by M1 macrophage cells of THP-1 origin
Yazar: FIDAN BAYRAMOVA
Danışman: DOÇ. DR. GÖZDE AYDOĞAN KILIÇ ; PROF. DR. MİRİŞ DİKMEN
Eskişehir Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Beyin hücreleri = Brain cells ; Hücre boyama = Cell staining ; Hücre canlılığı = Cell survival ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücre kültürü = Cell culture ; Hücre çoğalması = Cell proliferation ; Hücre ölümü = Cell death ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells

Özet:
Beyin tümörleri, beyindeki hücrelerin kontrolsüz bir şekilde çoğalarak kitle oluşturması sonucu oluşur ve en yaygın beyin tümörü gliomlardır. Gliomlar çok az proliferasyona sahip olmakla birlikte sağlıklı dokulara metastaz yaparak, radioterapi ve cerrahi yolla tedavi edilemez duruma gelir.                                                                        
Protokateşuik asit (3,4-dihidrobenzoik asit, PCA) bitkilerde yaygın olarak bulunan, suda ve alkolde çözünebilen bir kristalik fenolik bileşiktir. Polifenollerin başlıca biyoaktif metaboliti olmasının yanısıra, antioksidan, antimikrobiyal, antienflamatuvar, antiapoptotik ve antiproliferatif etkiler göstermektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda PCA' nın bu biyolojik aktivitelerinin ön plana çıkması nedeniyle bu tez çalışmasında PCA' nın C6 sıçan glioma hücreleri üzerindeki etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. PCA' nın etkileri hem tek başına C6 sıçan glioma hücreleri üzerinde, hemde THP-1 insan monosit hücrelerinden farklılaştırılan M1 makrofaj sitokin ortamında araştırılmıştır. PCA' nın C6 sıçan glioma hücrelerinde ilk olarak WST-1 yöntemi ile toksik olan ve olmayan konsantrasyonları belirlenmiştir. Daha sonra THP-1 monosit hücreleri, sırasıyla M0 ve M1 makrofajlara farklılaştırılarak, M1 makrofajlarda IL-1β ve TNF- α mRNA ekspresyon seviyeleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile çalışmalarının doğruluğu belirlenmiştir. Daha sonra PCA konsantrasyonlarının; C6 sıçan glioma hücreleri üzerinde akridin oranj/propidyüm iyodür boyama ile anti-apoptotik etkileri, çizik testi ve RTCA-DP analiz sistemi ile hücre migrasyonuna etkileri, koloni formasyonu üzerine etkileri, PCNA immünfloresan yöntemi ile antiproliferatif etkileri ve tek hücre jel elektroforezi (SCGE) yöntemiyle de DNA hasarına olan etkileri araştırılmıştır.                                                 
C6 hücreleri için WST-1 yöntemi sonucu PCA' nın 24, 48 ve 72 saatlik IC50 değerleri sırasıyla 1.7, 2.8 ve 3.8 mM olarak belirlenmiştir. RTCA-DP kullanılarak yapılan proliferasyon değerlendirmesinde de 72 saatlik IC50 değeri 3.8 mM olarak belirlenmiştir. PCA, C6 hücrelerinde ve M1 makrofaj sitokin ortamında (inflamasyon ortamı) anlamlı düzeyde anti-proliferatif ve anti-apoptotik etkiler göstermiştir. Bununla birlikte inflamasyon ortamında, PCA' nın anti-proliferatif ve anti-apoptotik etkilerini arttırdığı belirlenmiştir. PCA konsantrasyon artışına bağlı olarak, C6 hücrelerinin koloni oluşturma yetenekleri ve migrasyonu etkileri azalırken, inflamasyon ortamında C6 hücre migrasyon yetenekleri artış göstermiştir. Ancak inflamasyon ortamında artan hücre migrasyonu ise PCA konsantrasyon artışına paralel olarak azalmıştır. PCNA yöntemi ile PCA konsantrasyonlarının C6 hücrelerinde hem tek başına, hem de M1-1 sitokin ortamı uygulanan grupların artan konsantrasyonlarında hücre proliferasyonunun anlamlı düzeyde azaldığı görülmektedir. PCA' nın 3.8 ve 5 mM konsantrasyonları DNA hasarını önemli ölçüde arttırmış, M1-1 kontrol grubu ise PCA gruplarına oranla DNA hasarına daha az neden olmuş ve aynı zamanda M1-1'in PCA ile beraber uygulandığı gruplarda C6 hücrelerine tek başına PCA uygulanan gruplara oranla DNA hasarını daha fazla arttırdığı gözlemlenmiştir.

Abstract:
Brain tumors occur when cells in the brain multiply uncontrollably and form a mass, and the most common brain tumor is gliomas. Although gliomas have very little proliferation, they metastasize to healthy tissues and become untreatable by radiotherapy and surgery.
Protocatechuic acid (3,4-dihydrobenzoic acid, PCA) is a water- and alcohol-soluble crystalline phenolic compound commonly found in plants. In addition to being the main bioactive metabolite of polyphenols, it has antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory, antiapoptotic and antiproliferative effects. Since these biological activities of PCA have come to the fore in recent studies, it was aimed to determine the effects of PCA on C6 rat glioma cells in this thesis study. The effects of PCA were investigated both on C6 rat glioma cells alone and in M1 macrophage cytokine medium differentiated from THP-1 human monocyte cells. Firstly, non-toxic and non-toxic doses of PCA were determined in C6 rat glioma cells by WST-1 method. Then, THP-1 monocyte cells were differentiated into M0 and M1 macrophages, respectively, and IL-1β and TNF-α mRNA expression levels in M1 macrophages were determined by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Then PCA concentrations; Anti-apoptotic effects with acridine orange/propidium iodide staining on C6 rat glioma cells, effects on cell migration with scratch test and RTCA-DP analysis system, effects on colony formation, antiproliferative effects with PCNA immunofluorescence method and single cell gel electrophoresis (SCGE) method. The effects on DNA damage were also investigated.
As a result of WST-1 method for C6 cells, IC50 values of PCA at 24, 48 and 72 hours were determined as 1.7, 2.8 and 3.8 mM, respectively. In the proliferation evaluation using RTCA-DP, the 72 hour IC50 value was determined as 3.8 mM. PCA showed significant anti-proliferative and anti-apoptotic effects in C6 cells and M1 macrophage cytokine medium (inflammation medium). However, in the environment of inflammation, it was determined that PCA increased its anti-proliferative and anti-apoptotic effects. Depending on the increase in PCA concentration, the colony forming abilities and migration effects of C6 cells decreased, while the migration abilities of C6 cells increased in the inflammatory environment. However, increased cell migration in the inflammatory environment decreased in parallel with the increase in PCA concentration. With PCNA method, it was observed that cell proliferation decreased significantly in C6 cells, both alone and in increasing concentrations of the groups treated with M1-1 cytokine medium. 3.8 and 5 mM concentrations of PCA significantly increased DNA damage. It has been observed to increase DNA damage more.