Uzun kodlamayan rna anrıl tek nükelotid değişimlerinin fonksiyonel etkilerinin primer makrofaj hücre kültüründe incelenmesi
Investigation of functional effects of long non-coding rna anril single nucelotide changes in primary macrophage cell culture
Yazar: CEMRE BUSE KESİCİ
Danışman: DOÇ. DR. NESLİHAN ÇOBAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Ateroskleroz oluşumu ve gelişiminde çevresel etmenlerin yanı sıra genetik arka plan büyük önem arz etmektedir. Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA) aterosklerotik süreçte hücre büyümesi ve gelişmesi, anjiyogenez ve inflamasyon gibi birçok farklı olayda düzenleyici görev almaktadır. INK4 lokusunda yer alan bir lncRNA olan ANRIL, gen ekspresyonunun düzenlenmesi başta olmak üzere pek çok süreçte rol almaktadır. Yakın tarihli genom boyu ilişkilendirme çalışmaları (GWAS), ANRIL'deki tek nükleotid değişimlerinin (SNP) koroner arter hastalığı (KAH) ile ilişkili olduğunu göstermiştir, ancak bu hastalığın patolojisindeki moleküler rolü tam olarak aydınlatılamamıştır. Yapılan birçok çalışmada, ANRIL'in ekspresyon seviyelerinin kardiyovasküler hastalık riski ile ilişkili olduğunu gösterilmiş ve ANRIL'in sirküler izoformları ateroprotektif etki gösterirken lineer izoformlarının aterojenik etki gösterdiği belirlenmiştir.
Bu çalışmada, ANRIL'in linear ve sirküler izoformlarının aterogenezdeki bu ikili rolünün araştırılması için; rs1333049, rs564398 ve rs10757274 polimorfizmlerine ait belirli genotipleri birlikte bulundurma durumlarına göre seçilen kişilerin periferik kanlarından izole edilen monositler ile primer M2 benzeri fenotipte makrofaj hücre kültürü oluşturulmuştur. İzole edilen monositler akış sitometrisi ile kontrol edilirken M2 benzeri fenotipteki makrofajlar ise May Grunwald boyama, immünohistokimyasal boyama ve makrofaj alt tip belirteçlerinin gen anlatım düzeyleri ile kontrol edilmiştir.  Bu hücrelerde, belirli genotip kombinasyonlarının ANRIL izoformlarının ve aterosklerozda ilişkili olduğu bilinen genlerin anlatımları ile ilişkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, seçilen SNP'lere ait farklı genotipleri taşıyan sağlıklı erkek bireyler genotiplere göre gruplara ayrılmış ve makrofaja farklılaştırılan primer hücrelerde, SNP'lerin tek tek ve belirli genotipleri birlikte bulundurma durumunda lineer ANRIL, sirküler ANRIL, ABCA1, PPARGC1A, PRKAA1, CDKN2A ve CDKN2B gen anlatım düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile karşılaştırılmıştır. 
Bu tez çalışması sonucunda, lineer ANRIL, CDKN2A, PRKAA1 ve PPARGC1A anlatım düzeylerinin sırasıyla rs1333049 ve rs10757274 polimorfizmlerinin CC ve AA genotipini taşıyan bireylerde homozigot genotip taşıyan bireylere kıyasla daha düşük olduğu gözlenirken rs564398 polimorfizminde CC genotipli bireylerde lineer ANRIL ve CDNKN2A anlatım düzeylerinin TC genotipine göre artmış olduğu saptanmıştır. Ek olarak, rs564398 polimorfizmi için PRKAA1 ve PPARGC1A anlatım düzeylerinin TT genotipli bireylerde TC genotipli bireylere kıyasla daha yüksek olduğu bulunmuştur. Genotipleri birlikte bulundurma durumuna göre oluşturan gruplarda ise 1. grupraki (rs1333049 CC, rs10757274 AA, rs564398 CC) bireylerin lineer ANRIL, CDKN2A, PRKAA1 ve PPARGC1A anlatım düzeylerinin 2. Gruptaki gruptaki (rs1333049 CG, rs10757274 AG, rs564398 TC) bireylere kıyasla daha düşük olduğu saptanmıştır.
 Sonuç olarak, çalışma kapsamında ANRIL SNP'lerinin sirküler ANRIL, lineer ANRIL, ABCA1, PPARGC1A, PRKAA1, CDKN2A ve CDKN2B gen anlatım düzeyleri üzerinde etkileri olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
The formation and progression of atherosclerosis are significantly influenced by genetic background in addition to environmental factors. Long noncoding RNAs (lncRNAs) play regulatory roles in various processes involved in the atherosclerotic process, such as cell growth and development, angiogenesis, and inflammation. ANRIL, an lncRNA located at the INK4 locus, is involved in several processes, primarily the regulation of gene expression. Recent genome-wide association studies (GWAS) have shown that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in ANRIL are associated with coronary artery disease (CAD), although the molecular role of ANRIL in the pathology of this disease has not been fully elucidated. Numerous studies have demonstrated that ANRIL expression levels are associated with the risk of cardiovascular disease, and it has been determined that circular isoforms of ANRIL exhibit atheroprotective effects, whereas linear isoforms have atherogenic effects.
In this study, in order to investigate the dual role of linear and circular isoforms of ANRIL in atherogenesis; primary M2-like phenotype macrophage cell culture was established with monocytes isolated from peripheral blood of individuals selected according to their presence of certain genotypes of rs1333049, rs564398 and rs10757274 polymorphisms. Isolated monocytes were checked by flow cytometry, while M2-like phenotype macrophages were checked by May Grunwald staining, immunohistochemical staining and gene expression levels of macrophage subtype markers. The study aimed to examine the relationship between ANRIL isoform expression and the expression of genes known to be associated with atherosclerosis in primary cells differentiated into macrophages, based on individual and combined genotype combinations. For this purpose, healthy male individuals carrying different genotypes for the selected SNPs were grouped according to genotypes, and the expression levels of linear ANRIL, circular ANRIL, ABCA1, PPARGC1A, PRKAA1, CDKN2A, and CDKN2B were compared using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in primary cells differentiated into macrophages.
The results of this thesis study showed that the expression levels of linear ANRIL, CDKN2A, PRKAA1, and PPARGC1A were lower in individuals carrying the CC and AA genotypes of rs1333049 and rs10757274 polymorphisms, respectively, compared to homozygous individuals. For the rs564398 polymorphism, linear ANRIL and CDKN2A expression levels were found to be higher in individuals with the CC genotype compared to the TC genotype. Additionally, for the rs564398 polymorphism, PRKAA1 and PPARGC1A expression levels were higher in individuals with the TT genotype compared to those with the TC genotype. In groups formed based on the combination of genotypes, the expression levels of linear ANRIL, CDKN2A, PRKAA1, and PPARGC1A were lower in individuals in the first group grupraki (rs1333049 CC, rs10757274 AA, rs564398 CC) compared to those in the second group grupraki (rs1333049 CG, rs10757274 AG, rs564398 TC).
In conclusion, the study determined that ANRIL SNPs affect the expression levels of circular ANRIL, linear ANRIL, ABCA1, PPARGC1A, PRKAA1, CDKN2A, and CDKN2B genes.