Hepatit B virus DNA polimeraz geni mutasyonlarının saptanması
Detection of Hepatitis B virus DNA polymerase gene mutations
Yazar: AYLİN ŞENGÖNÜL
Danışman: DOÇ. DR. ARZU SAYINER
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Genetik = Genetics ; Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Hepatit-viral-insan = Hepatitis-viral-human ; Lamivudine = Lamivudine

Özet:
HBV, dünya nüfusunun üçte birinin karşılaştığı ve 350 milyondan fazla taşıyıcısı olan önemli bir sağlık sorunu etkenidir. Kronik B hepatiti, siroz ve hepatosellüler karsinomaya ilerleme potansiyeli nedeniyle tedavi edilmesi gereken ciddi bir hastalıktır. Tedavide interferon ve nükleozit analogları kullanılmaktadır. Nükleozit analogları arasında, etkinliği yüksek, iyi tolere edilen, ciddi yan etkisi olmayan ve diğer ilaçlara göre daha ucuz olan lamivudin (LAM), sık tercih edilen bir ilaçtır. LAM tedavisi sırasında ortaya çıkan ve dirence yol açan mutasyonlar, genellikle tedavinin 6-8. ayından sonra görülmeye başlanmakta ve ilacın kullanıldığı süreyle orantılı olarak yıllar içerisinde artış göstermektedir. Tedavi başarısını izlemek ve başarısızlık halinde alternatif ilaçlarla tedaviye devam edebilmek için lamivudine karşı direnç gelişiminin saptanması önemlidir.Tedavi sırasında HBV pol geninde saptanan değişikliklerin izlenmesi ve bildirilmesi, yeni ilaç direnç paternlerinin ve klinik sonuçlarının tanımlanmasını sağlayacaktır. Bu bilgilerden yola çıkarak planladığımız çalışmamızda,1) LAM direnç mutasyonlarının gelişme sıklığının ve zamanının belirlenmesi,2) HBV polimeraz geninde oluşan YMDD motif mutasyonlarının saptanması için dizi analizi (DA), restriksiyon enzim analizi (REA) ve strip hibridizasyon (LiPA) yöntemlerinin karşılaştırılması,3) LAM direnç mutasyonu saptanan olgularda, mutasyonun saptanma zamanı ile viral yük / ALT değerlerindeki artış arasındaki ilişkinin belirlenmesi,4) LAM direnç mutasyonları ile çakışan bölgedeki S mutasyonlarının incelenmesi,5) HBV-DNA polimeraz geninde oluşan diğer sekans değişikliklerinin belirlenmesi6) Olguların viral genotip ve subtiplerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.Çalışma grubumuz, Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Bilim Dalı'nın izlediği kronik B hepatiti nedeniyle lamivudin tedavisi başlanan olgulardan oluşturulmuş ve iki alt grupta değerlendirilmiştir.·Grup A: En az bir yıl izlenen, tedavi öncesi ve tedavinin 3, 6, 9, 12. ayına ait seri serum örneği bulunan 30 olgu ve·Grup B: Seri örnekleri olmayan ancak tedavinin farklı zamanlarına ait serumları bulunan 16 olgu. Bu gruptaki 11 olgunun 12. ay, 14 olgunun 24. ay ve 9 olgunun 36. ay serum örneği vardı.Grup A'da yıllar içinde dizi analizi yöntemi ile YMDD mutantı gelişme oranları değerlendirildi. YMDD mutantı saptanan olgu sayısı, tedavinin birinci yılında 6/30 (%20), ikinci yılında 8/20 (%40), üçüncü yılında 4/10 (%40) idi. Grup A ve Grup B olgularının tümü için dizi analizi ve LiPA yöntemleri ile saptanmış olan YMDD mutantlı olguların oranı lamivudin tedavisinin birinci yılı sonunda %23.1 (9/39 olgu), 2. yılı sonunda %36.4 (12/33 olgu), 3. yılı sonunda %35.0 (7/20 olgu) idi.Lamivudin tedavisi alan olguların izlemi ile elde edilen ve tedavinin farklı basamaklarına ait (tedavi öncesinde, sırasında ve sonrasında) toplam 123 serum örneğinin dizi analizi sonuçları, LiPA ve REA yöntemlerinin sonuçları ile karşılaştırıldı. Varyantları saptamada LiPA testinin, DA ve REA'dan daha başarılı olduğu gözlendi. LiPA testi kodon 204 için minör viral populasyonları saptamada, DA'ne göre 4/123 örnekte (%3,25) daha duyarlıydı. LiPA testi, REA'ya göre, kodon 180 için 64/123 örnekte (%52), kodon 204 için 63/123 örnekte (%51,2) daha duyarlı bulundu. DA ve LiPA sonuçları, kodon 180 için %99,9 (122/123 örnek), kodon 204 için %94,3 (116/123 örnek) oranında birbiriyle uyumlu saptandı. LiPA testi, genellikle minor popülasyonları yakalamada daha başarılı olmakla birlikte, kodon 180 için bir, kodon 204 için bir olmak üzere toplam iki örnekte, karışık viral populasyonlardan birini saptayamadı. Bir hastanın iki örneğinde ise DA ile rtM204I mutasyonu belirlenirken, LiPA ile 204. kodona ait yabanıl ve mutant diziye özgü problardan hiçbirinde hibridizasyon bandı oluşmamıştı.REA yönteminin 103 kopya/ml'nin altındaki HBV DNA düzeylerinde sonuç veremediği saptandı ve 62 örneğin (%50.4) sonucu elde edilemedi. DA yönteminin karışık viral populasyona sahip örnekleri saptamada, REA ile karşılaştırıldığında, kodon 180 için %52.0 (64/123 örnek), kodon 204 için %52.8 (65/123 örnek) oranında daha duyarlı olduğu saptandı. Bu örneklerde REA yöntemi ile ya viral yüke bağlı olarak hiç sonuç alınamamış veya karışık viral populasyonlu örneklerdeki minör tipler saptanamamıştı. Çalışmamızda REA yönteminin, DA'ne göre kodon 204 için sadece bir örnekte, LiPA'ya göre kodon 180 için 1, kodon 204 için 1 örnekte karışık viral populasyonları tanımlamada daha başarılı olduğu saptandı.Çalışmamızda, hasta grubunun %50'sinde YMDD mutantı saptanırken, YMDD mutantına sahip olguların %80'inde (12/15 olgu) viral direnç geliştiği gözlendi. YMDD mutantı gelişen olgularda, mutasyonlar ortalama 18,8. ayda belirlendi. Mutasyonlar en erken (bir olguda) tedavinin 3. ayında saptandı. YMDD mutantlarının saptanmasından ortalama 5 ay sonra viral yükte anlamlı artış olduğu görüldü. ALT yükselmesi, genellikle (11 olgu) viral yük artışından sonra gelişti ve tedavinin ortalama 26. ayından sonra saptandı.Lamivudin tedavisinden önce Grup A' ya ait 30 olgudan sadece 1'inde (%3.3) dizi analizi (DA) ve LiPA yöntemleri ile YMDD mutantı saptandı. Örnekte, rtM204I mutasyonu, minör populasyonu oluşturmaktaydı ve baskın yabanıl tip ile birlikteydi. Tedaviden önce saptanan YIDD mutantının, tedavinin başlamasıyla kaybolduğu, tedavinin 30. ayında DA ve LiPA yöntemleri ile tekrar saptandığı görüldü. Tedavi öncesi örnekte, DA ve LiPA yöntemleri ile saptanmış olan YMDD ve YIDD dizili viral populasyonların varlığı, klonal analiz ile doğrulandı. Tedavinin 9. ayındaki serum örneğinden yapılan klonal analizde ise elde edilen yedi klonun tümünün YMDD dizisi taşıdığı saptandı.Çalışmamızda, A grubu olgularda lamivudin tedavisi sırasında ilk gözlenen YMDD mutasyonları sıklık sırasıyla, YIDD (6 olgu), YMDD+YIDD (4 olgu), YMDD+YIDD+YVDD (3 olgu), YIDD+YVDD (1 olgu), YVDD (1 olgu) olarak belirlendi. Mutasyon saptanan beş olgunun izleminde, mutasyonlardaki ardışık değişiklikler benzer bir patern gösteriyordu. Bu olgularda yabanıl tip viruslar yerini öncelikle YIDD mutantlarına bırakıyor, bir süre sonra YIDD mutantlarından YVDD mutantlarına geçiş gözleniyordu. Olgularımızda, kompansatuar rt L180M mutasyonu, YVDD/YIDD mutasyonu ile aynı zamanda veya daha sonra saptandı. On iki olguya ait 16 örnekte saptanan rtL80I/V mutasyonlarının 13'ünde YIDD, üçünde YIDD + YVDD bulunuyordu.Lamivudin tedavisine direnç geliştiren olgularımızda rtM204I, rtM204V, rtV173L polimeraz mutasyonlarının, S bölgesinde sırasıyla W196L/S, I195M, E164D mutasyonlarına yol açtığı saptandı.Lamivudin direnç mutasyonu saptanan olgularda; HBV DNA pol/rt geninde dizi analizi yöntemi ile N76D (3 olgu), R110G (2 olgu), L115Y, S117Y, N123D, G127R, T128N (2 olgu), T128I, N139K, L144C, L145M, T184I, V214E, S219A, F221Y, T225N L229W, L231V, P237H, N238H, Y245H, K270R değişiklikleri gözlendi.30 olgunun serum örneğinde, dizi analizi yöntemi kullanılarak HBV genotipleri değerlendirildi. Filogenetik analiz sonucu; tüm olgulara ait dizilerin, Genotip D dizileriyle birlikte kümelendiği görüldü. Olgulardan 7'sinin (%23,3) ayw3, 23'ünün (%76,7) ayw2 subtipi ile infekte olduğu belirlendi.

Abstract:
HBV is an important health problem affecting one third of the world population and more than 350 million people being carriers. Chronic B hepatitis is a serious disease which must be treated because of its potential to progress to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Interferon and nucleoside analogs are used for treatment. Among the nucleoside analogs, lamivudine (LAM) is frequently the drug of choice because of its high efficacy, good tolerability, low rate of adverse effects and low cost compared with other drugs. Mutations that arise during LAM treatment and cause resistance are usually seen at the 6th-8th months of treatment and the frequency increases with the duration of treatment. LAM resistance should be determined in order to monitor treatment success and to continue treatment with alternative drugs.Monitoring and reporting of changes in HBV pol gene during treatment will help to define the new drug resistance patterns and clinical consequences. Based on these data, this study aimed to1.Determine the incidence and timing of development of LAM resistance mutations,2.Compare sequence analysis, restriction enzyme analysis (REA) and strip hybridization (LiPA) in determining YMDD motif mutations in HBV pol gene,3.Determine the relationship between the timing of mutation appearance and rise in viral load / ALT level in cases with LAM resistance mutation,4.Examine S mutations in regions that overlap with LAM resistance mutations,5.Determine other sequence changes that develop in HBV DNA pol gene,6.Determine the viral genotype/subtypes of the cases.The study group has been composed of chronic B hepatitis cases who were followed by the Dokuz Eylül University Medical Faculty, Division of Gastroenterology and in whom lamivudine treatment was started. The study population was divided into two subgroups:·Group A (n=30): Cases who were followed-up for at least one year and of whom serial serum samples from the pretreatment period and of 3rd, 6th, 9th and 12th months of treatment were available.·Group B (n=16): Cases who did not have serial serum samples but who could provide samples from time periods of the treatment. In this group, eleven of the cases had a sample from the 12th month, 14 cases had a sample from the 24th month and 9 cases had a sample from the 36th month of treatment.Emergence ratio of YMDD mutants in Group A was evaluated according to the years by sequencing. Number of cases who have YMDD mutants was 6/30 (20%) in first year, was 8/20 (40%) in second year and was 4/10 (40%) in third year. For all cases of Group A and Group B, ratio of cases with YMDD mutant determined by sequencing and LiPA method was 23.1% (9/39 cases) end of the 1st year of lamivudine therapy, was 36.4% (12/33 cases) at the end of the 2nd year and was 35.0% (7/20 cases) at the end of the 3rd year.The results of sequencing analysis of 123 serum samples obtained from followed-up cases who treated with lamivudine at different stage of therapy (before, during and after therapy) were compared with the results of LiPA and REA methods. LiPA test was more successful than sequencing and REA for the determination of variants. LiPA test was more sensitive to determine of minor viral populations for codon 204 than sequencing analysis by 3.25% for 4/123 samples. It was observed the LiPA test was more sensitive than REA for 64/123 samples at codon 180 by 52% and for 63/123 samples at codon 204 by 51.2%. Results of sequencing and LiPA were in consistence by 99.9% for codon 180 (122/123 samples) and by 94.3% for codon 204 (116/123 samples). Although LiPA test is usually more successful to detect the minor populations , it could not detect one of the mixed viral populations in two samples (one for codon 180, one for codon 204). While for two samples of a patient, rt M204I mutation was detected by sequencing, hybridization bands for YMDD and mutant sequence specific probes were not observed by LiPA.REA method could not give any results below 103 copy/mL HBV-DNA level and any results were obtained for 62 samples (50.4%). Sequencing method was more sensitive to detect samples containing mixed viral populations than REA for codon 180 by 52.0% (64/123 samples), for codon 204 by 52.8 (65/123 örnek). In these samples either any results were obtained with REA method because of viral load or could not be detected minor types in mixed viral populations. REA method was more successful than sequencing to identify mixed viral populations for only one sample at codon 204 and than LiPA for one sample at codon 180 and one sample at codon 204.In this study while YMDD mutant was detected in 50% of the patient group, the viral resistance was observed for 80% of cases (12/15 cases) have YMDD mutant. In cases with YMDD mutants, mutations were detected at the 18.8th month. Mutations were detected at least 3rd month of therapy (one case). Significant increase was observed for viral load at average 5 months later than detected YMDD mutations. Generally ALT elevations were occurred after an increase of viral load and were detected after at average 26th months of therapy.YMDD mutant was detected for only one case in Group A (n=30) with sequencing and LiPA methods before LAM treatment. rtM204I mutation was constituted the minor population and together with dominant YMDD type. YIDD mutant observed before therapy disappeared with starting therapy and again was detected with sequencing and LiPA methods at the 30th months of therapy. Existence of viral populations with YMDD and YIDD sequences detected by sequencing and LiPA was confirmed by clonal analysis for pretreatment sample. It was observed that all seven clones obtained from clonal analysis of the serum sample at 9 th months of therapy had YMDD sequences.The first observation YMDD mutations were YIDD (6 cases), YMDD+YIDD (4 cases), YMDD+YIDD+YVDD (3 cases), YIDD+YVDD (1 case) in study group A cases during LAM therapy. In 5 cases who developed a mutation, we were capable of determining a pattern of consecutive mutations. In these cases first exchange YMDD viruses with YIDD mutants and after a while a shift from YIDD mutants to YVDD mutants are observed. In cases compensatory rtL180M mutation was observed at the same time with YVDD/YIDD mutation or later. 13 of rtL80I/V mutations detected at 16 samples in 12 cases has YIDD mutation and 3 of mentioned samples has YIDD+YVDD mutation.In cases who developed LAM resistance, W196S/L, I195M, E164D mutations in the S gene produced as a consequence of the rt M204I, rtM204V, rtV173L mutations in the polymerase gene.N76D (3 cases), R110G (2 olgu), L115Y, S117Y, N123D, G127R, T128N (2 cases), T128I, N139K, L144C, L145M, T184I, V214E, S219A, F221Y, T225N L229W, L231V, P237H, N238H, Y245H, K270R sequence changes detected by sequencing were observed in the pol gene of cases with LAM resistance mutations.In serum samples of 30 cases, HBV genotypes were evaluated using by sequencing. As a result of phylogenetic analysis, sequences of all cases was observed that clustered with genotype D sequences. It was determined, 7 of cases infected with ayw3 subtype (23.3%) and 23 of cases infected with ayw2 subtype (76.7%).