Biyoproseslerde kullanılmak üzere mdck hücrelerinin karıştırmalı tank biyoreaktör ve döner hücre kültürü biyoreaktöründe üretim verimliliğin karşılaştırılması
Comparison of the production efficiency of mdck cells for use in bioprocesses in a stirred tank bioreactor and a rotating cell culture bioreactor
Yazar: KADİR ALPTEKİN
Danışman: DOÇ. DR. SUPHİ ŞURİŞVAN ÖNCEL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Yumurta temelli influenza aşılarının karmaşık proses yapısı ve yumurta alerjenlerinin etkisinden dolayı son yıllarda hücre kültürü temelli influenza aşılarına olan ilgi arttırmıştır. MDCK hücreleri son yıllarda biyoproseslerde ve influenza aşısı üretiminde kullanılmaktadır. Bu hücrelerin biyoreaktörlerde üretiminin proses kontrolü, proses tasarımı çok daha güvenilir ve iyi üretim uygulamalarına (GMP) uygunluğuyla yumurta temelli sistemlerden çok daha avantajlıdır. Aynı zamanda aşılarda kullanılan serum içeriği de birtakım kontaminasyonlara ve fazladan proses adımına sebep olduğundan gerek maddi açıdan gerekse sağlık açısından serum ve hayvansal protein içermeyen besin ortamlarına ilgi artmış ve yeni nesil aşılar bu tür besin ortamlarında hücrelerin kültürlenmesiyle geliştirilmektedir. Bu düşünce ile yapılan tez kapsamında yüzey bağımlı MDCK hücreleri öncelikle DMEM-HG besin ortamında (% 10 (v/v) FBS içerikli) kültürlendi. MTT ile üreme kinetiği çıkarılan yüzey bağımlı MDCK hücrelerinin 7.günde Cmax=4,8441x106 hücre/mL ulaştığı ve ikilenme süresinin (td)=29,13 saat olduğu bulundu. Yapılan metabolit analizleri sonucunda, 0,282 g/L L-glutamin ve 4,04 g/L glikoz kullanımı ile 5,14 g/L ve 0,119 g/L amonyak miktarı belirlendi. Hücreler ticari olarak geliştirilen serum ve hayvansal protein içermeyen CAMELLIA besin ortamında doğrudan serumsuz ortama 10 pasaj sonrasında adapte edildi. Adaptasyon sonrası dinamik sistemlere geçilerek ölçek büyütüldü ve her bir adımda üreme kinetikleri belirlendi. Erlenlerde yapılan üretimde, en iyi karıştırma hızı 170 rpm olarak bulunurken, en iyi üretim metodunun % 0,15 (v/v) rekombinant tripsin-EDTA içerikli besin ortamının olduğu ve hücrelerin 6.günde Cmax=1,82x106 hücre/mL ulaştığı, td=49,8 saat olduğu, 3,03 g/L glikoz ve 0,637 g/L L-glutamin kullanıldığı, 2,38 g/L laktat ve 0,145 g/L amonyak salındığı sonucuna ulaşıldı. Spinner flasktaki en iyi karıştırma hızı 100 rpm olarak belirlenirken, üreme kinetiği sonucu 6.günde     Cmax = 1,93x106 hücre/mL ve td=49,5 saat bulundu. Metabolit analizi sonucunda 2,87 g/L glikoz ve 0,609 g/L L-glutamin kullanımı, 1,71 g/L laktat ve 0,094 g/L amonyak salınımı tespit edildi. Karıştırmalı tank biyoreaktörde (STR) 95 rpm hızında yapılan üreme kinetiği sonucu 5.günde Cmax=1,45x106 hücre/mL ve td=50,18 saat olarak bulundu. Yapılan metabolit analizinde 3,06 g/L glikoz ve 0,582 g/L L-glutamin kullanım, 3,44 g/L laktat ve 0,121 g/L amonyak salınım tespit edildi. RCCS üretimi için 35 rpm karıştırma hızı en optimum hız olarak bulundu ve hava boşluğu bırakılan (450 mL çalışma hacmi) üretimde 5.günde Cmax = 1,42x106 hücre/mL, td=46,55 saat bulunurken, üretimde 3,01 g/L glikoz kullanımı, 3,46 g/L laktat salınımı, 0,629 g/L L-glutamin kullanımı ve 0,111 g/L amonyak salınımı tespit edildi. Hava boşluğu bırakılmadan yapılan üretimde 5.günde Cmax = 1,5x106 hücre/mL ve td=53 saat olarak bulundu. Böylece havalandırmanın hücreler üzerinde çok büyük etkisi olduğu sonucuna ulaşıldı. Süspanseye adapte edilen hücrelerin (MDCK-SUS) ikilenme sürelerinin arttığı sonucuna ulaşıldı ve en iyi ikilenme süresinin hava boşluğu bırakılan RCCS üretiminde olduğu belirlendi. Virüs enfektivitesini belirlemek amacıyla, 0,001 MOI değeri kullanılarak belirlenen virüs inokülasyon miktarı ile yüzey bağımlı MDCK hücrelerinde influenza virüsünün TCID50 denemesi sonucunda 4,6 x 103 TCID50 /mL hesaplandı ve analizin doğruluğunu kanıtlamak amacıyla immunofloresan boyama ve RT-qPCR yapıldı. Boyama sonrası 3 üretimde de (yüzey bağımlı MDCK, STR üretimindeki MDCK-SUS, RCCS üretimindeki MDCK-SUS) CPE gözlendi. RT-qPCR sonucunda virüsün influenza A H1N1 olduğu ve yüzey bağımlı MDCK hücrelerinde Ct=12,66 bulunurken, STR üretiminde Ct=13,83 ve RCCS üretiminde Ct=13,81 olarak bulundu. Bu sonuçlar RCCS sisteminin de influenza aşı üretimi için ideal bir sistem olduğu ve STR ile karşılaştırıldığında gerekli modifikasyonlarla aynı verimlilikte çalıştığı sonucuna ulaştırmıştır.

Abstract:
Due to the complex process structure of egg-based influenza vaccines and the effect of egg allergens, interest in cell culture-based influenza vaccines has increased in recent years. MDCK cells have been used in bioprocesses and influenza vaccine production in recent years. Process control of the production of these cells in bioreactors is much more advantageous than egg-based systems as the process design is much more reliable and conforms to good manufacturing practices (GMP). At the same time, since the content of serum used in vaccines causes some contaminations and extra process steps, interest in nutritional media that does not contain serum and animal protein has increased in terms of both material and health, and new generation vaccines are developed by culturing cells in such nutrient media. Within the scope of this thesis, monolayer MDCK cells were first cultured in DMEM-HG nutrient medium (10% (v/v) FBS content). It was found that the surface-dependent MDCK cells, whose growth kinetics were extracted with MTT, reached Cmax=4.8441x106 cells/mL on the 7th day and the doubling time (td)=29.13 hours. As a result of the metabolite analyzes, 0.282 g/L L-glutamine and 4.04 g/L glucose usage and 5.14 g/L and 0.119 g/L ammonia amounts were determined. Cells were adapted after 10 passages directly into serum-free medium in commercially developed CAMELLIA nutrient medium without serum and animal protein. After adaptation, the scale was scaled up by switching to dynamic systems and reproductive kinetics were determined at each step. In the production made in erlenmeyer flasks, the best mixing speed was found as 170 rpm, the best production method was 0.15% (v/v) recombinant trypsin-EDTA-containing nutrient medium and the cells reached Cmax=1.82x106 cells/mL on the 6th day. It was concluded that td=49.8 hours, 3.03 g/L glucose and 0.637 g/L L-glutamine were used, 2.38 g/L lactate and 0.145 g/L ammonia were released. While the best mixing speed in the spinner flask was determined as 100 rpm, the growth kinetic result was                   Cmax = 1.93x106 cells/mL and td=49.5 hours on the 6th day. As a result of metabolite analysis, 2.87 g/L glucose and 0.609 g/L L-glutamine use, 1.71 g/L lactate and 0.094 g/L ammonia release were detected. Growth kinetic results in a stirred tank bioreactor (STR) at 95 rpm were found to be Cmax=1.45x106 cells/mL and td=50.18 hours on the 5th day. In the metabolite analysis, 3.06 g/L glucose and 0.582 g/L L-glutamine usage, 3.44 g/L lactate and 0.121 g/L ammonia release were detected. 35 rpm stirring speed was found to be the optimum speed for RCCS production, and Cmax = 1.42x106 cells/mL, td=46.55 hours on the 5th day in the production with a head-space (450 mL working volume), while it was 3.01 g/L in production. glucose use, 3.46 g/L lactate release, 0.629 g/L L-glutamine use and 0.111 g/L ammonia release were detected. Cmax = 1.5x106 cells/mL and td=53 hours were found on the 5th day in the production without head-space. Thus, it was concluded that aeration had a great effect on the cells. It was concluded that the doubling times of the cells adapted to the suspended culture (MDCK-SUS) increased, and it was determined that the best doubling time was in the production of RCCS with a head-space. In order to determine the virus infectivity, the amount of virus inoculation determined using the MOI value of 0.001 and the TCID50 test of the influenza virus in monolayer MDCK cells were calculated as 4.6 x 103 TCID50 /mL, and immunofluorescence staining and RT-qPCR were performed to prove the accuracy of the analysis. CPE was observed in all 3 productions (monolayer MDCK, MDCK-SUS in STR production, MDCK-SUS in RCCS production) after dyeing. As a result of RT-qPCR, it was found that the virus was influenza A H1N1 and Ct=12.66 in monolayer MDCK cells, Ct=13.83 in STR production and Ct=13.81 in RCCS production. These results led to the conclusion that the RCCS system is also an ideal system for influenza vaccine production and works with the same efficiency with the necessary modifications compared to STR.