Glioma hücrelerinde rosmarinik asitin antikanser moleküler mekanizmalarının araştırılması
Investigation of anticancer molecular mechanisms of rosmarinic acid in glioma cells
Yazar: ASLIHAN ŞENGELEN
Danışman: PROF. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Antikanser = Anticancer ; Moleküler biyoloji = Molecular biology

Özet:
Gliomaların terapötik direnci hala çok önemli bir konudur ve indüklenmiş ısı şoku yanıtı (HSR) ile yakından ilişkilidir. Rosmarinik asit (RA), glioblastoma (GB) tedavisi için ümit verici bir antioksidan ajandır. Bununla birlikte, GB tedavi direncinde etkili olan ısı şoku faktörü HSF1'in RA'nın terapötik etkinliği üzerindeki rolü belirsizliğini korumaya devam etmektedir. Bu doktora tezi kapsamında RA uygulamasının glioma hücrelerinde antikanser moleküler mekanizmaları, tümör baskılayıcı genlerde farklı mutasyonlara sahip iki hücre hattında incelenmiştir. U-87MG (PTEN mutant, p53 wild) ve LN229 (PTEN wild, p53 mutant) insan glioblastoma hücrelerinde RA uygulamalarının etkileri 2D ve 3D-sferoid kültürlerinde araştırılmıştır. 2D kültürde farklı konsantrasyonlardaki RA'nın etkileri proliferasyon, migrasyon, invazyon, anjiyogenez, koloni oluşturma yeteneği, apoptoz, otofaji ve stres yanıtı üzerinde değerlendirilmiştir. Sonucunda monolayer kültürde iki hücre hattı için doz 200 µM olarak seçilmiştir.
Bu tez çalışmasında, HSF1 ifadesini bloke etmek için küçük interferans (si)RNA transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. GB ilerleyişinde önemli rolleri olan migrasyon (in vitro çizik ve transwell testleri), invazyon (transwell testi), koloni oluşturma özelliği (CFA ve SA-CFA testi) ve anjiyogenez (HUVEC tüp oluşum testi) uygulamalar sonucunda önemli ölçüde zayıflamıştır. Apoptoz üzerindeki etkiler western blot yöntemi ile Bax/Bcl2 oranı, kaspaz-8, kaspaz-3 ve PARP1 kesilmiş fragment analizi, sitokrom-c salınımı, HO/PI ikili boyaması (apoptotik ve ölü hücre değerlendirmesi) ve JC-1 boyaması (mitokondriyal membran potansiyelinin değerlendirmesi) ile incelenmiştir. Otofaji için ise akridin oranj boyaması ve LC3AI-II seviyelerinin analizi ile ortaya konmuştur. siRNA-aracılı HSF1 sessizleşmesi sonrası, rosmarinik asit hücre ölümünü tek uygulamalara göre daha fazla indüklemiştir. HSF1 ekspresyonu olmayan glioma hücrelerinde ER stresi (Grp78, PERK, ATF6, IRE1α) ve hücre içi ROS seviyeleri (DCF-pozitif hücre) yükselmiştir. siRNA transfeksiyonu sonrası RA uygulaması sonucunda ROS seviyeleri azalmıştır, ancak ER stres aracılı apoptoz belirteçleri PERK ve IRE1α'da daha fazla artış olmuştur. Dahası HSF1 yokluğuna bağlı Hsp70 ve Hsp90 seviyelerinde önemli düzeyde azalma görülmüştür. Ayrıca, HSF1 yokluğunda glioma hücrelerinin rosmarinik asit tedavisine duyarlılığının arttığı belirlenmiştir. İmmünofloresan işaretleme ile, SIRT1 ve NF-κB p65'in nükleer translokasyonunda azalış, FOXO1 ve GAPDH'de ise artış görülmüştür. PI3K-AKT anlatım seviyeleri azalmıştır (U-87MG hücreleri için). RA uygulaması p-ERK seviyelerinde artışa yol açarken, ERK inhibitörü U0126'nın RA-indüklü apoptoz ve otofajiyi engellediği görülmüştür. Bu durum rosmarinik asitin ERK-aracılı apoptoz ve otofaji mekanizmasını çalıştırdığını göstermiştir. 
RA uygulamaları, sağlıklı hücre hattı olan HEK-293 hücrelerini canlı tutarken, glioma hücrelerinin canlılığını doza ve zamana bağlı olarak azaltmıştır. Rosmarinik asit bu hücrelerde HSF1 tükenmesi sonrası oluşan oksidatif strese ve apoptoza karşı koruma sağlamıştır. 
Dahası, 3D-sferoid GB kültüründe HSF1 susturumu ve RA uygulaması sferoid büyümesini, migrasyon ve invazyonu yavaşlatmıştır/engellemiştir. Epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve kanser kök hücresi (CSC) benzeri özellik gösteren sferoidlerde, HSF1 yokluğu terapi direncini zayıflatmıştır.
Yapılan tüm analizler sonucunda, rosmarinik asitin iki GB hücre hattında ortak olarak HSF1-SIRT1-FOXO-NF-κB yolu ve ERK-aracılı hücre ölümü üzerinden antikanser etkilerini ortaya koyduğu bulunmuştur. Dahası rosmarinik asitin PI3K-AKT proliferasyon yolunu etkili bir şekilde kapattığı ve GAPDH'in nükleer lokalizasyonunu sağlayarak da hücre ölümü sürecine katkı sağladığı belirlenmiştir.
Sonuç olarak, genetik mutasyonları bakımında farklılık gösteren U-87MG ve LN229 hücre hatlarında elde edilen sonuçlar karşılaştırıldığında U-87MG hücrelerinde daha güçlü yanıtların oluştuğu görülmüştür. Bu bulgu kişiye özgü kanser terapisinde mutasyon taramasının önemini göstermektedir. Dahası, bu tez GB tedavisinde bir pivot molekül olarak HSF1'i hedeflemenin önemini göstermiştir. siRNA-aracılı HSF1 susturumu ve rosmarinik asit kombine terapi uygulaması alternatif bir terapi yaklaşımı olarak düşünülebilir. Elde edilen bulgular, HSF1-SIRT1-FOXO-NF-κB yolu ve ERK-aracılı hücre ölümünü hedefleyen tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesi için yeni bir bakış açısı kazandırabilir.

Abstract:
Therapeutic resistance of gliomas is still a crucial issue and closely related to induced heat shock response (HSR). Rosmarinic acid (RA) is a promising antioxidant agent for glioblastoma (GB) therapy. However, the role of the heat shock factor HSF1, which is effective in treatment resistance in gliomas, on the therapeutic efficacy of RA remains unclear. Within the scope of this doctoral thesis, the anticancer molecular mechanisms of RA treatment in glioma cells were examined in two cell lines, which have different mutations in tumor suppressor genes. The effects of RA treatments on U-87MG (PTEN mutant, p53 wild) and LN229 (PTEN wild, p53 mutant) human glioblastoma cells were investigated in 2D and 3D-spheroid cultures. The effects of different concentrations of RA in 2D culture were evaluated on proliferation, migration, invasion, angiogenesis, colony formation ability, apoptosis, autophagy, and stress response. As a result, the dose was chosen as 200 µM for two cell lines in monolayer culture.
In this thesis, small interference (si)RNA transfection was performed to block HSF1 expression. Migration (in vitro scratch and transwell tests), invasion (transwell test), colony formation (CFA and SA-CFA test), and angiogenesis (HUVEC tube formation test), which have important roles in the progression of GB, have been significantly weakened due to therapies. Effects on apoptosis were analyzed by western blot, Bax/Bcl2 ratio, caspase-8, caspase-3, and PARP1 cleaved fragment analysis, Cyt-c release, HO/PI double staining (apoptotic and dead cell assessment), and JC-1 staining (mitochondrial membrane potential assessment). Autophagy was demonstrated by acridine orange staining and analysis of LC3AI-II levels. After siRNA-mediated HSF1 silencing, rosmarinic acid induced cell death more than single applications. ER stress (Grp78, PERK, ATF6, IRE1α) and intracellular ROS levels (DCF-positive cell) were increased in glioma cells lacking HSF1 expression. As a result of RA treatment after siRNA transfection, ROS levels decreased, but there was more increase in ER stress-mediated apoptosis markers, PERK and IRE1α. Moreover, there was a significant decrease in Hsp70 and Hsp90 levels due to the absence of HSF1. It was also determined that the sensitivity of glioma cells to rosmarinic acid treatment increased in the absence of HSF1. A reduction of nuclear translocation of SIRT1 and NF-κB and an increase in FOXO1 and GAPDH was observed with immunofluorescence labeling. The PI3K-AKT expression levels decreased (for U-87MG cells). While RA treatment led to a rise in p-ERK levels, the ERK inhibitor U0126 was found to inhibit RA-induced apoptosis and autophagy. This showed that rosmarinic acid activates the mechanism of ERK-mediated apoptosis and autophagy.
RA treatments decreased the viability of glioma cells in a dose- and time-dependent manner while keeping healthy cell line HEK-293 cells alive. Rosmarinic acid provided protection against oxidative stress and apoptosis after HSF1 depletion in these cells.
Moreover, HSF1 silencing and RA therapy in 3D- spheroid cultures slowed/inhibited spheroid growth, migration, and invasion. The absence of HSF1 in spheroids with epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cancer stem cell (CSC)-like properties weakened therapy resistance.
As a result of all analyses, it was found that rosmarinic acid exhibited its anticancer effects through the HSF1-SIRT1-FOXO-NF-κB pathway and ERK-mediated cell death in both cell lines. Moreover, it was determined that rosmarinic acid effectively closed the PI3K-AKT proliferation pathway and contributed to cell death by providing the nuclear localization of GAPDH.
Consequently, more robust responses were observed in U-87MG cells when the therapy efficiency obtained in U-87MG and LN229 cell lines differed in their genetic mutations. This demonstrates the importance of mutation screening in personalized cancer therapy. Moreover, this thesis showed the importance of targeting HSF1 as a pivot molecule in treating GB. Combination therapy of siRNA-mediated HSF1 silencing and rosmarinic acid can be considered an alternative therapy approach. The findings may provide a new perspective for developing therapeutic strategies targeting the HSF1-SIRT1-FOXO-NF-κB pathway and ERK-mediated cell death.