Deneysel periodontitis oluşturulan sıçanlarda n-asetilsistein ve karvakrol kombinasyonunun alveolar kemik kaybına etkilerinin değerlendirilmesi
Evaluation of the effects of n-acetylcysteine and carvacrol combination on alveolar bone loss in rats with experimental periodontitis
Yazar: MUHAMMET GÜLSOY
Danışman: DOÇ. DR. EMİNE PİRİM GÖRGÜN
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Periodontoloji Ana Bilim Dalı / Periodontoloji Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2024
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Karvakrol = Carvacrol

Özet:
Periodontal hastalık oral biyofilm ile konağın tepkisi arasındaki dengesizliğin neden olduğu kronik enflamatuvar bir tablodur. Oksidatif stres veya antioksidan eksikliğinin neden olduğu serbest radikallerin aşırı varlığı periodontal hastalıkla ilişkilendirilmiştir. Antioksidan bileşenlerle takviyenin, dirence veya ikincil enfeksiyonların başlamasına neden olabilecek antibiyotik tedavileriyle karşılaştırıldığında periodontal hasarı ve bunun sistemik etkilerini azaltmaya yardımcı olabileceğini öne sürülmektedir. Karvakrol (KAR), kekik, biber ve yabani bergamot gibi aromatik bitkilerin uçucu yağlarında bulunan çeşitli hastalıklarda tedavi edici etkiye sahip antioksidan bir fenolik monoterpen bileşiğidir. N-Asetilsistein (NAC), amino asit sisteinin asetillenmiş formu olan doğal bir antioksidandır. Son çalışmalar deneysel periodontitiste reaktif oksijen türlerinin seviyelerinin azaltılmasında ve alveolar kemik kaybının engellenmesinde benzer terapötik etkilere sahip N-asetilsistein ve karvakrolün önemli rol oynadığını göstermiştir. Biz de çalışmamızda deneysel periodontitis modelinde sistemik olarak uygulanan N- asetilsistein ve karvakrol uygulamasının alveolar kemik kaybı üzerine etkisini ve immünohistokimyasal olarak nükleer faktör kappa B'nin reseptör aktivatör bağlayıcısı (RANKL), osteoprotogerin (OPG), interlökin (IL)-6, Matriks metalloproteinaz (MMP)-9, Myeloperoksidaz (MPO) seviyelerini değerlendirmeyi amaçladık. Ayrıca, cevap yüzey yöntemi kullanarak alveolar yıkımı azaltan optimum N-asetilsistein ve karvakrol kombinasyonunu bulmayı amaçladık.
Çalışma, yaşları ortalama 4 aylık, ağırlıkları ortalama 230-250 gr olan 53 adet erkek Wistar albino rat üzerinde gerçekleştirilmiştir. Deney hayvanları kontrol grubu (K), deneysel periodontitis oluşturulan grup (P), deneysel periodontitis oluşturulup sistemik 35 mg/kg NAC uygulanan grup (P+N), deneysel periodontitis oluşturulup sistemik 25 mg/kg KAR uygulanan grup (P+C), deneysel periodontitis oluşturulup sistemik 35 mg/kg NAC ve sistemik 25 mg/kg KAR uygulanan grup (P+N+C) ve cevap yüzey yöntemi (RSM:Responce surface methodology) analiziyle belirlenen farklı dozlarda sistemik NAC ve KAR kombinasyonları uygulanan grup (RSM) olmak üzere 6 gruba ayrılmıştır. Ajanlar günlük tek doz olacak şekilde uygulanmıştır. 5 grup 8 hayvan, RSM grubu ise 13 deney hayvanından oluşmuştur. Deney gruplarına, oral bakterilere retansiyon sağlaması ve deneysel periodontitis oluşturmak için, anestezi sağlanarak alt 1. molar dişlerinin etrafına 4.0 ipek süturlar subgingival konumda yerleştirilmiştir. Ratlar,  operasyondan sonra 10. günde sakrifiye edilmiştir. Sakrifiye edildikten sonra alveolar kemikte immünohistokimyasal analizler yapılmıştır.
Çalışmamızda RANKL için K grubunda önemli düzeyde immunpozitiflik görülmezken, P+N grubunda hafif, P+C ve P+N+C gruplarında orta, P grubunda şiddetli düzeyde RANKL immunpozitifliği görülmüştür. OPG açısından değerlendirildiğinde sonuçlar RANKL seviyeleriyle negatif korelasyon göstermiştir.
IL-6 açısından K grubunda önemli düzeyde immunpozitiflik görülmezken; P+N, P+C ve P+N+C gruplarında orta düzeyde, P grubunda ise şiddetli IL-6 immunpozitifliği görülmüştür.
MPO açısından K grubunda önemli düzeyde immunpozitiflik görülmezken; P+N ve P+N+C grubunda hafif düzeyde, P+C grubunda orta düzeyde, P grubunda ise şiddetli MPO immunpozitifliği görülmüştür.
MMP-9 açısından sonuçlar iNOS seviyeleriyle pozitif korelasyon göstermiştir. 
K grubunda önemli düzeyde immunpozitiflik görülmezken; P+N+C grubunda hafif düzeyde, P+N ve P+C gruplarında orta düzeyde, P grubunda ise şiddetli MMP-9 ve iNOS immunpozitifliği görülmüştür. 
Çalışmamızda antioksidan NAC ve KAR uygulamasının ayrı ve kombine uygulamasının, periodontitisin alveolar kemik üzerindeki yıkıcı etkisini proenflamatuvar sitokin düzeylerini düşürerek periodontal inflamasyonu ve alveolar kemik kaybını azaltabileceği ve osteoblastik aktiviteyi artırabileceği sonucuna vardık. Bununla birlikte kombine uygulama grubunda (P+N+C) kemik yapım ve yıkımı P+C grubuna benzerlik gösterirken yangısal parametrelerin çoğunda antienflamatuvar etkinin diğer gruplara göre artış gösterdiği görülmüştür.
RSM analizi değerlendirildiğinde optimum alveolar kemik kaybı cevabının RSM 3 (35mg/kg NAC + 5 mg/kg KAR) deneyinde görüldüğü ve immunohistokimyasal karşılaştırmalarda da bu sonucun desteklendiği, matematiksel modellemenin güvenilirliğinin yüksek bulunması sonucu bu kombinasyonun çalışmalarda uygulanabilir olduğu sonucuna varılmıştır.
RSM analizinde çeşitli faktörler arasındaki etkileşimin anlaşılması temel alındığında, optimum doz kombinasyonlarının modellenmesi daha az sayıda hayvan kullanılarak daha az deney ile çalışmalar gerçekleştirilebilecektir.

Abstract:
Periodontal disease is a chronic inflammatory condition caused by an imbalance between the oral biofilm and the host response. Excessive free radicals caused by oxidative stress or antioxidant deficiency have been associated with periodontal disease. It has been suggested that supplementation with antioxidant compounds may help reduce periodontal damage and its systemic effects when compared to antibiotic treatments that may cause resistance or the onset of secondary infections. Carvacrol (CAR) is an antioxidant phenolic monoterpene compound found in the essential oils of aromatic plants such as thyme, pepper and wild bergamot, which has therapeutic effects on various diseases. N-Acetylcysteine (NAC) is a natural antioxidant that is the acetylated form of the amino acid cysteine. Recent studies have shown that N-acetylcysteine and carvacrol play an important role in reducing reactive oxygen species levels and preventing alveolar bone loss in experimental periodontitis, with similar therapeutic effects. In our study, we aimed to evaluate the effects of systemic N-acetylcysteine and carvacrol application on alveolar bone loss in an experimental periodontitis model and immunohistochemically the levels of receptor activator binding factor kappa B (RANKL), osteoprotogerin (OPG), interleukin (IL)-6, Matrix metalloproteinase (MMP)-9, and Myeloperoxidase (MPO). We also aimed to find the optimum combination of N-acetylcysteine and carvacrol that reduces alveolar destruction using response surface methodology. 
The study was conducted on 53 male Wistar albino rats with an average age of 4 months and an average weight of 230-250 g. The experimental animals were divided into 6 groups as control group (C), experimental periodontitis induced group (P), experimental periodontitis induced group and systemic 35 mg/kg NAC administered group (P+N), experimental periodontitis induced group and systemic 25 mg/kg KAR administered group (P+C), experimental periodontitis induced group and systemic 35 mg/kg NAC and systemic 25 mg/kg CAR administered group (P+N+C) and the group administered systemic NAC and CAR combinations at different doses determined by response surface methodology (RSM) analysis. Agents were applied as a single daily dose. 5 groups consisted of 8 animals, and the RSM group consisted of 13 experimental animals. In order to provide retention of oral bacteria and to create experimental periodontitis, 4.0 silk sutures were placed subgingivally around the lower 1st molar teeth under anesthesia. The rats were sacrificed on the 10th day after the operation. Immunohistochemical analyses were performed on the alveolar bone after sacrifice.
In our study, no significant immunopositivity was observed for RANKL in the K group, while mild RANKL immunopositivity was observed in the P+N group, moderate in the P+C and P+N+C groups, and severe RANKL immunopositivity was observed in the P group. When evaluated in terms of OPG, the results showed a negative correlation with RANKL levels.
When examined in terms of IL-6, no significant immunopositivity was observed in the K group, moderate IL-6 immunopositivity was observed in the P+N, P+C and P+N+C groups, and severe IL-6 immunopositivity was observed in the P group.
When OPG immunopositivity was examined, no significant immunopositivity was observed in the K group in terms of MPO, mild MPO immunopositivity was observed in the P+N and P+N+C groups, moderate MPO immunopositivity was observed in the P+C group, and severe MPO immunopositivity was observed in the P group.
The results for MMP-9 showed a positive correlation with iNOS levels. While no significant immunopositivity was observed in the K group, mild MMP-9 and iNOS immunopositivity was observed in the P+N+C group, moderate in the P+N and P+C groups, and severe in the P group.
In our study, we concluded that the separate and combined application of antioxidant NAC and CAR can reduce the destructive effect of periodontitis on alveolar bone by decreasing proinflammatory cytokine levels, reducing periodontal inflammation and alveolar bone loss and increasing osteoblastic activity. However, in the combined application group (P+N+C), bone formation and resorption were similar to the P+C group, while it was observed that the anti-inflammatory effect increased in most of the inflammatory parameters compared to the other groups.
When the RSM analysis was evaluated, it was concluded that the optimum alveolar bone loss response was seen in the RSM 3 (35mg/kg NAC + 5mg/kg CAR) experiment and this result was also supported in immunohistochemical comparisons, and that this combination was applicable in studies as a result of the high reliability of the mathematical modeling.
When the interaction between various factors is understood in the RSM analysis, modeling of optimum dose combinations can be carried out with fewer experiments using fewer animals.