NicC enziminin nikotinat üzerindeki katalitik aktivitesinin kuantum mekanik yöntemlerle incelenmesi
The investigation of the catalytic activity of NicC enzyme on nicotinate with quantum mechanical methods
Yazar: NERİMAN ELA PEHLİVANOĞLU
Danışman: PROF. DR. NURCAN TÜZÜN
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu tezin amacı NicC enzimi tarafından gerçekleştirilen dekarboksilasyon ve hidroksilasyon tepkimelerinin mekanizmasını hesaplamalı kimya yöntemleri ile aydınlatmaktır. Bu enzimin mekanizmasını ortaya çıkarmak bir çok sistemde bulunan N-heterosiklik aromatik bileşik sınıfının biyo-bozunmalarını anlamak açısından oldukça önemlidir. Bu da, biyo-bozunma süreçlerinin kontrol altına alınabilmesi, dünya üzerinde çeşitli şekillerde kirlilik yaratan bileşiklerin elimine edilmesi amacıyla yapılan çalışmalara katkı sağlayabilecektir. Flavin içeren monoksijenaz enzim ailesine mensup NicC enziminin, toprağın ve yeraltı sularının en önemli kirleticilerinden olan N-heterosiklik aromatik bileşiklerin biyo-bozunmalarında katalizör görevi gördüğü bilinmektedir. Bu tez kapsamında, NicC enzimi varlığında N-heterosiklik bileşiklerin biyobozunma tepkimelerinde yer alan hidroksilasyon ve dekarboksilasyon tepkimelerinin modellenmesi ve bu enzim varlığında gerçekleşen biyobozunma süreçlerinin anlaşılması hedeflenmiştir. Proje kapsamında enzimin aktif bölgesi incelenmiş, aktif bölgedeki aminoasitlerin varlığında enzimin substrat ile tepkimesi kuantum mekanik olarak modellenmiştir.  Öncelikle tepkimeyi anlayabilmek için en küçük model üzerinde hesaplamalar yapılmıştır. Devamında ise enzimin aktif bölgesi ve önerilen tepkime mekanizmaları kuantum küme yaklaşımı ile ele alınmıştır. Bu yaklaşımda enzimin aktif bölgesinde var olan aminoasitler tepkimeye dahil edilmiş, devamındaki atomlar ise dondurularak ortam etkisi suni bir şekilde yaratılmaya çalışılmıştır. Bu yaklaşımla enzimin aktif bölgesinin gerçeğe en yakın şekilde modellenmesi hedeflenmiştir. Literatürde NicC enziminin tepkimesi 6-HNA'yı 2,5-DHP' ye dönüştürme reaksiyonu için deneysel yöntemlerle iki farklı mekanizma önerilmiştir. İlk mekanizma substratın 6-okso tautomerini kullanırken diğer mekanizmada substrat 6-enol tautomeri halinde bulunur. İlk mekanizmada substrat Michael katılması ile tiyolatı substrata bağlar ve böylelikle bir oksianyon elde edilmiş olur. Bahsi geçen tiyolat bu reaksiyon için enzimin aktif bölgesinde bulunan deprotone bir sistein rezidüsüdür. Tiyolatın substrata katılması sonrası oluşan oksianyon ara ürünü derhal hidroksilasyonu başlatır ve substrat tetrahedral yapıya dönüşür. Akabinde substratta dekarboksilasyon gerçekleşir ve CO2 molekülü ayrılır. Substratın 6-enol tautomeri ile gerçekleşen mekanizmada ilk basamakta substart hidroperoksiflavin tarafından hidroksillenir ve dekaboksilasyona uğrar. İstenilen 2,5-DHP ürünü ilk basamakta elde edilmiş olur. Literatürdeki son çalışmalar sistein rezidüsünün reaksiyon koordinatına olan uzaklığı sebebi ile bu mekanizmanın gerçekleşemeyeceği, reaksiyonun 6-enol mekanizması üzerinden yürüyeceğini ortaya çıkarmıştır. Bu tez kapsamında 6-enol üzerinden gerçekleşen mekanizma kullanılarak bu enzim tepkimesi için üç farklı model üzerinde hesaplamalar yapılmış, daha sonra kuantum kümeleme yöntemi ile modeller büyütülmüştür. Hesaplamalarımız sonucunda reaksiyonda aktif rol oynayan rezidüler ve bu rezidülerin protonasyon durumları aydınlatılmıştır. En küçük modeller olan A, B ve C modelleri göstermiştir ki reaksiyon ortamında asidik halde bulunan bir histidin hidroksilasyonun gerçekleşmesi için çok önemli bir rol oynamaktadır. A modelinde reaksiyon ortamına eklenen deprotone histidin hidroksilasyonun gerçekleşmesine müsaade etmemektedir. Bu rezidünün asidik halde bulunması reaksiyonun başlaması adına önemlidir. B ve C modellerinde bahsi geçen histidin rezidüsü asidik halde kullanılmıştır. Bu iki modeli (B ve C) birbirinden ayıran oluşturulan farklı H-bağı etkleşimleri olmuştur. Hesaplamalarımız reaksiyon ortamında bulunan rezidülerin ve bu rezidülerin protonasyon durumlarının reaksiyona olan katkısını anlamaya yardımcı olmuş ve bu tez kapsamında yapılan çalışmalar ile tepkimenin hangi dinamiklerle gerçekleşeceğini detaylı bir şekilde göstermiştir. Bu da NHACS tipi bileşiklerin biyo-bozunma süreçlerinin aydınlatılmasında önemli bir rol oynamaktadır.

Abstract:
The aim of the proposed project is to elucidate the mechanism of decarboxylation and hydroxylation reactions carried out by NicC enzyme with computational chemistry methods. Elucidating the mechanism of this enzyme is very important to understand the biodegradation of the class of N-heterocyclic compounds found in many systems. This can contribute to the studies carried out in order to control the biodegradation processes and to eliminate the compounds causing pollution in various ways in the world.It is known that the NicC enzyme of the monoxygenase enzyme family acts as a catalyst in the biodegradation of N-heterocyclic aromatic compounds, one of the most important pollutants of soil and groundwater. In this thesis we used computational chemistry methods to investigate the catalytic activity of NicC enzyme on 6-hydroxynicotinate (6-HNA). The modeling of enzymes using computational chemistry methods is a valuable complement to experimential studies. Quantum chemical studies can describe reaction paths and the roles of the residues in the active site.Different reaction paths can be analyzed and their feasibility can be determined according to the calculated energy barriers. The quantum chemical cluster approach has been used to design active site models based on the existing crystal structure of the enzyme. Nowadays, the quantum chemical clustering approach is seen as a powerful and effective tool in modeling the enzyme active site and reaction mechanisms. The basic idea of the cluster approach is that the effect of rest of the enzyme which are not explicitly included in the model are approximated by a coordinate-locking scheme. In a model size of 200-240 atoms, the solvation effects almost disappear and the choice of the dielectric constant becomes insignificant.
In this thesis, we aimed to model the hydroxylation and decarboxylation reactions involved in the biodegradation reactions of NicC enzyme and N-heterocyclic compounds and to understand the biodegradation processes in the presence of this enzyme. The active region of the enzyme was investigated and the reaction of the enzyme with the substrate in the presence of amino acids in the active region was modelled with quantum mechanically. First, calculations were made on the smallest model to understand the reaction mechanism in detail. Then, the active region of the enzyme and the proposed reaction mechanisms are examined by quantum cluster approach. In the literature, two different mechanisms have been proposed by experimental methods for the reaction of NicC enzyme reaction to convert 6-HNA to 2.5 DHP. 
In the first proposal a general acid catalyst was proposed to initiate the reaction. In this model, a cysteine was suggested to act as catalyst In the other suggested mechanism, a proton from a base within the active site is suggested to promote the reaction. This proposal was in line with an earlier study where C-C bond cleavage was suggested to take place after hydroxylation. Quantum mechanical calculations at the 6-31G(d,p) level with B3LYP functionalwere performed to elucidate the reaction of 6-HNA to 2,5-DHP. Both proposals, acid and base catalyzed were modelled and it is seen that the base catalyzed path is a more facile process. Then, the base catalyzed path was further testedwith quantum cluster approach. The calculations were performed with a quantum cluster approach in which the active region of the enzyme was aimed to be modelled in the closest to the real life. The geometry of the active site of the enzyme is taken from the X-ray structure. The residues which are not contributing to the reaction are cut out from the system. The atoms from which the cutting procedure is followed kept frozen during the optimization calculations. 
Our studies have shown that mechanism B is more likely than mechanism A. We have proposed three different models for B mechanism. Decarboxylation performed by NicC enzyme and the mechanism of hydroxylation reactions are tried to investigate by computational chemistry methods. First, small models for the reaction mechanism have been created. Only amino acids involved in the reaction were included in the models. These models are designed to fit the reaction mechanism. In these models only Histidine 302 and Tyrosine 215 residues were added to the reaction between FAD and substrate. 
Our studies showed that due to the protonation status of this model Histidin 302 this reaction can not occur in reality. During hydroxylation, hydroperoxiflavin could not be protonated. Hydroxylation followed by decarboxylation failed. Besides the energy barrier of the reaction is also quite high. In models B and C, in addition to Histidine 302 and tyrosine 215 residues, Histidine 47 was also included in the calculations. In these models (B and C) the protonation status of Histidin 302 residue was used as acidic. When B and C models are examined it is seen that the energy barrier of B model is smaller than C. The H-bond interactions in model B gave the system greater stability than the H-bond interactions in model C. Therefore, the energy barrier of model B was found to be less compared to C model. Then, cluster structures were modeled and the system was enlarged to contain 222 atoms. K1 and K_TS1, optimized in the gas phase using B3LYP / 6-31G (d, p) functional and basis set combination. Then 
three different dielectric constant, (ε = 1, ε = 4, ε = 80), using 6-311 + G (2d, 2p) at the theoretical level single point energy calculations were made and these to data were compared whether the cluster is saturated enough or not. Although the cluster model that we have formed contains a large number of atoms (222), it has been found that more residues must be included in the reaction in order to successfully model the reaction. Therefore, in this study, the cluster model can be further expanded and the system examined. In addition, molecular dynamics simulation studies, which can be performed in the continuation of the study, will reveal the reaction dynamics in more detail. Examination of the mechanism of this enzyme is very important to understand the biodegradation of the class of N-heterocyclic compounds found in many systems. It will create further insights to understand the biodegradation in general.