O-asetilpeptidoglukan esteraz (APE1) enziminin tepkime mekanizmasının ın silico yöntemlerle aydınlatılması
Elucidation  of reaction mechanism of APE1 enzyme with in silico methods
Yazar: ZEYNEP AKSAKAL
Danışman: PROF. DR. NURCAN TÜZÜN ; PROF. DR. FETHİYE AYLİN SUNGUR
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Enzimlerin katalitik mekanizmalarını anlamak daha etkili ve daha az yan etkiye sahip ilaçların geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Enzimlerin hesapsal kimya yöntemleri kullanılarak modellenmesi, deneyler için değerli bir tamamlayıcıdır ve bu çalışmalar sayesinde reaksiyon mekanizmaları ve rezidülerin rolleri ayrıntılı bir şekilde tanımlanabilir. 
O-asetilpeptidoglukan esteraz enzimi, SGNH hidrolaz süper ailesinin bir alt sınıfı olan karbonhidrat esteraz ailesinin üyesidir. Gonore, Neisseria gonorrheae'nin neden olduğu, cinsel yolla bulaşan bakteriyel bir enfeksiyondur. Antimikrobiyal direncin devam etmesi nedeniyle gonore, tedavi edilemeyen bir hastalık olma riski altındadır. Günümüzde β-laktam ve glikopeptitler gibi peptidoglikan sentezini hedefleyen antimikrobiyel maddelere karşı antibiyotik direnci ortaya çıkmıştır. Bu nedenle yeni antibakteriyel hedeflerin tanımlanması ve geliştirilmesine acil bir ihtiyaç vardır. Antibiyotiklerin çalışma prensiplerinden biri de bakteri hücre duvarının geri dönüşümsüz yıkımı veya modifikasyonu sonucu patojen bakteriyi etkisiz hale getirmektir. Neisseria gonore'da bulunan Ape1 enziminin üç boyutlu yapısı 2014 yılında belirlenmiş ve literatürde potansiyel antibakteriyel hedef olarak raporlanmıştır. Ape1'in temel fizyolojik fonksiyonu, peptidoglukanların de-O-asetilasyonunu katalize etmektir.
Literatürde Ape1'in hidroliz tepkimesi için iki farklı mekanizma önerilmiştir. Bunlardan ilki Pfeffer ve grubunun enzimin üç boyutlu yapısı tayin edilmeden önceki deneysel çalışmalarına dayanarak tek adımda gerçekleştiğini önerdikleri mekanizmadır. Bu mekanizmada tepkime basit olarak Ser80 nükleofilinin substratın (O-asetillenmiş MurNac) asetat grubundaki karbonil karbonuna saldırarak tetrahedral ara ürünü oluşturması ve oluşan yapının tekrar düzenlenerek ürün ve asil enzim ara ürünü meydana getirmesiyle gerçekleşir. Son adımda ise aktif  bölgede yer alan sulardan birinin tepkimeye katılması ile  asil enzim kompleksi suyla reaksiyona girerek, asetat ve protonlanmış halde Ser80 oluşur. Böylelikle enzim yeni bir katalitik döngü için hazır hale gelir. Williams vd. tarafından raporlanan enzimin üç boyutlu yapısının da belirlendiği çalışmada ise hidroliz tepkimesinin adım adım gerçekleştiği öne sürülmüştür. Tepkimedeki proton transferinin katalitik bir su molekülü yardımıyla gerçekleşebileceği diğer bir alternatif de bu tezde önerilmiştir. Bu tez kapsamındaki kuantum mekanik hesaplamalarda O-asetillenmiş MurNAC'ın hidroliz mekanizmasının bu üç olasılığı ayrıntılı olarak analiz edilmiştir.
Bu tez kapsamında enzimin O-asetilasyon ve rejenerasyon(de-O-asetilasyon) tepkime mekanizmaları farklı boyutlardaki model yapılar ile kuantum mekanik yöntemlerle aydınlatılmaya çalışılmıştır.
Tepkime mekanizmasının tam olarak anlaşılabilmesi, geçiş konumu ve ara yapıların belirlenebilmesi ve genel anlamda olası yollar hakkında detaylı bilgi edinmek amacıyla model yapılar tanımlanmıştır. Bu modellerde en küçük temsili yapıdan başlayarak aşama aşama çalışılan sistemler büyütüldü ve beş model tasarlanarak aktif bölgede tepkimeye giren rezidü ve substratların geometrik parametrelerinin anlaşılması hedeflendi. Reaksiyon mekanizmasını anlamak için oluşturulan en küçük model sistemde serin rezidüsü etanol (CH3CH2OH) molekülü ile temsil edilmiş, O-asetillenmiş MurNac rezidüsü ise metil propanoat (CH3CH2COOCH3) molekülü ile gösterilmiştir. Model II'de Model I'den farklı olarak peptidoglikanda yer alan MurNAc rezidüsü altılı şeker halkasının 2.pozisyonundaki asetamit (NHCOCH3) sübstitüyesi hesaplamalara tamemen dahil edilirken 3. pozisyonunda yer alan peptit zinciri metoksi (–OCH3 ) ile modellenmiştir. Ayrıca 1-4 bağlantı noktaları da kesilerek metoksi (–OCH3) ile tanımlanmıştır. Aktif bölgedeki His369 ve Asp366 rezidülerinin tepkime mekanizmasına etkisinin anlaşılması için model III'te Asp366 ve His369 rezidüleri C'dan kesilmiş ve metillenmiştir. Öte yandan O-asetillenmiş Murnac yapısı ise metil propanoat (CH3CH2COOCH3) molekülü ile temsil edilmeye devam edilmiştir. Model IV, Model III'ün genişletilmiş hali olup peptidoglikanda yer alan MurNAc rezidüsünün altılı şeker halkasının 2. pozisyonunda asetamit (NHCOCH3) sübstitüyesi hesaplamalara tamamen dahil edilirken 3. pozisyonunda yer alan peptit zinciri metoksi (–OCH3) ile modellenmiştir.  Model IV'e ise aktif bölgede bulunan ve oksianyon boşluğunu Ser80 ile birlikte oluşturan iki önemli rezidü, Gly236 ve Asn268 eklenerek Model V oluşturulmuştur. Aktif bölgede bulunan su moleküllerinin proton transferi aşamasında etkili olabileceği düşünülerek su molekülleri Model III ve Model IV ve Model V'te mekanizmaya açık şekilde (explicit) dahil edilmiştir. Model yapıların hesaplamaları, YFT hibrit fonksiyonellerinden M06-2X kullanılarak 6-31+G(d,p) seviyesinde gerçekleştirilmiştir. Çözücü ortamında gerçekleşen modellemeler için suyun dielektrik sabiti tanımlanarak G09 programında yer alan PCM yöntemi kullanılmıştır. 
Çalışılan tüm model sistemler (beş model) değerlendirildiğinde O-asetilasyon tepkimesinin yüksek enerji bariyerleri nedeniyle tek adımda gerçekleşme olasılığının bulunmadığı görülmüştür. Suyun yardımı tek adım mekanizma bariyerlerini düşürmesine rağmen elde edilen yüksek enerji bariyeri tek adım mekanizmasını olanaksız kılmıştır. Model III'e geçildiğinde, O-asetilasyon tepkimesinin ilk aşamasının His369 rezidüsünün yardımı ile gerçekleşmesi olasılığı değerlendirilmiş ve His369'un yer aldığı Model III - Model V sistemleri için uygulanmıştır. Ancak elde edilen enerji profillerinde ara ürünlerin enerjileri geçiş konumu yapılarının enerjileri ile uyumsuzluk göstermiştir. Bu nedenle, His369 desteğine ek olarak bir su molekülünün de proton transferinde yer aldığı alternatif mekanizma Model III - Model V için çalışılmıştır. Elde edilen bariyerler, incelenen diğer olası mekanizmalara oranla belirgin bir şekilde aşılabilir değerlere düşmüştür. 
Ape1'in O-asetilasyon reaksiyonunun susuz ve sulu  adım adım gerçekleşmesi durumunda diğer denenen bütün alternatiflerden (tek adım, su yardımlı tek adım) daha düşük tepkime bariyerlerine sahip olduğu görülmüştür ve enerji değerleri bakımdan da daha olası bir tepkime olarak ortaya çıkmıştır. Tepkimenin son aşaması olan enzim rejenerasyonunda ise, tek su yardımlı adım adım gerçekleşmesinin en olası mekanizma olduğu tespit edilmiştir. Bu bulgular kuantum küme hesap yöntemi çalışmalarına temel teşkil etmiş ve enzimin aktif bölgesi etrafındaki amino asitlerin mekanizmaya etkisi incelenmiştir.
Aktif bölge rezidülerinin hidroliz reaksiyon mekanizması üzerindeki etkileri, önemli rezidüleri içeren kümelerin kuantum mekanik hesaplamalarla modellenmesi ile araştırılmıştır. Ape1'in hidroliz reaksiyonunu ayrıntılı inceleyebilmek için farklı boyutlarda iki farklı aktif bölge modeli kullanılmıştır. 
Küme yapı hesap yaklaşımının temel fikri, enzim tepkimesinin gerçekleştiği aktif bölgedeki amino asitleri hesaplamalara dahil ederek tepkime mekanizmasını incelemektir. Modelin sistematik olarak büyütülmesiyle tepkimeye etki eden rezidülerin ve çözücünün etkisinin enerji değerlerinde görülmediği nokta modelin doğru boyuta ulaştığına işaret eder. Bu noktada, çözücünün etkileri neredeyse yok olur ve dielektrik sabitinin seçimi oldukça önemsiz hale gelir.
Küme yapı hesaplamaları çerçevesinde öncelikle en az sayıda rezidüye sahip olan  ve 146 atom içeren CI modeli oluşturulmuş ancak tepkimeyi modellemede yetersiz kalmıştır. En büyük küme, CII, 236 atom ile modellenmiştir ve çözücünün etkisi implicit çözücü kullanılarak dikkate alınmıştır. Özellikle, hesaplanan enerjilerin modelin boyutuna, dielektrik ortamın etkisine ve dielektrik sabitinin özel seçimine olan bağımlılığı tartışılmıştır. CII küme büyüklüğünde farklı dilektrik sabitleriyle hesaplanan bağıl enerji değerlerinin aynı bulunması optimal küme büyüklüğüne ulaşılabildiğini göstermiştir. Küme modellerinin geometri optimizasyonları ve frekans hesaplamalarında, literatürdeki nükleofilik katılma reaksiyonlarının DFT çalışmaları referans alınarak, gaz fazında 6-31G (d, p) temel baz seti ile B3LYP hibrid yoğunluk fonksiyonel yöntemi kullanılmıştır. Bu geometri optimizasyonlarına dayanarak daha büyük baz seti ile, 6-311+G(2d,2p) kullanılarak tek nokta enerji hesaplamaları gerçekleştirilmiştir.  Enzim ortamının polarizasyon etkisi, çözücü, iletken benzeri kutuplanabilir süreklilik modeli (PCM, Polarizable Continuum Model) kullanılarak 6-31G(d,p) teori seviyesinde gaz fazında optimize edilmiş yapılar üzerinde tek nokta enerji hesaplamaları yapılarak değerlendirilmiştir. Ayrıca rezidülerin sahip olduğu olası farklı protonasyon durumlarının Ape1 O-asetilasyon reaksiyonunun enerji profilini nasıl etkilediğini anlayabilmek için O-asetilasyon reaksiyonunun ilk iki adımının bariyerleri CII modelinde incelenmiştir (CII* küme modeli).  CII*'de Asp79 ve His81'in protonasyon durumlarının Ape1 ve MurNAC arasındaki etkileşimlerin stabilitesi üzerindeki etkisini analiz etmek için, Ape1'in O-asetilasyon reaksiyonu, Asp79 ve His81'in farklı protonasyon durumları göz önüne alınmıştır. Hesaplamalar Asp79 yan zincirinin iyonize olması ile oluşan ortamdaki eksi yükün O-asetilasyon kısmına ait geçiş konumunu ve ara ürünleri elektrostatik etkileşimler  yoluyla destabilize ettiğini göstermiştir.  CII küme modeline ait susuz ve sulu adım adım de-O-asetilasyon ve enzim rejenerasyon aşamalarını içeren tüm olası enerji profilleri incelendiğinde, O-asetilasyon reaksiyonunun ilk proton transferinin su yardımıyla gerçekleştiği mekanizmanın mekanistik açıdan olasılığının daha yüksek olduğu görülmüştür
Model yapı (Model V) ve küme model yapı (CII)  tepkime enerji profilleri karşılaştırıldığında aktif bölge çevre rezidülerinin varlığının O-asetilasyon mekanizmasının ilk adımında ve de-O-asetilasyon mekanizmasının  son adımında etkili olarak ilk adımda bariyeri 5,7 kkal/mol düşürürken, son adımda 4,6 kkal/mol arttırdığı görülmüştür.  Değişkenlik gösteren değerlerin tüm mekanizmanın hız belirleyici adımını değiştirmediği görülmektedir. Her iki modelde de elde edilen bariyer değerleri oda sıcaklığında aşılabilecek değerlerdir. 
Yapılan çalışmalar enzimin tepkime mekanizmasının kuantum mekanik seviyede incelenmesini ve aydınlatılmasını sağlamıştır.  Bu çalışmaların devamında enzimin dinamiğinin ve aktif bölgede yer alan rezidülerin farklı protonasyon durumları ile tasarlanmış sistemlerle çalışılacak moleküler dinamik simülasyon gerçekleştirilebilir.

Abstract:
Understanding the catalytic mechanisms of enzymes is crucial in terms of developing more effective drugs with less side effects. The active site residues of an enzyme may either be responsible for facilitating only the enzymatic reaction, or for maintaining the orientation of the substrates well, or both. The modeling of enzymes using computational chemistry methods is a valuable complement to experimential studies. Quantum chemical studies of enzymatic reactions can describe reaction mechanisms and the roles of the various residues in the active site. Different reaction paths can be analyzed and their feasibility can be determined according to the calculated energy barriers.
In this master's thesis, the active site of the Ape1 enzyme and the reaction mechanism were investigated using density functional theory. The quantum chemical cluster approach has been used to design active site models based on the existing crystal structure of the enzyme. Nowadays, the quantum chemical clustering approach is seen as a powerful and effective tool in modeling the enzyme active site and reaction mechanisms. The basic idea of the cluster approach is that the effect of  rest of the enzyme which are not explicitly included in the model are approximated by a coordinate-locking scheme and an implicit solvent model. As an example, evaluation of the solvation effects with the acetylpeptidoglycan esterase was carried out by a systematic increase of the model size. In a model size of 200-240 atoms, the solvation effects almost disappear and the choice of the dielectric constant becomes rather insignificant.
The O-acetylpeptidoglycan esterase (Ape1) from N-Gonorrhoeae has an important role in the bacterial O-acetylation/deacetylation pathway. The main physiological function of Ape1 is to catalyze the de-O-acetylation of PGN. This enzyme is also present in all bacteria which produce O-acetylated peptidoglycan. The Ape1 enzyme is a member of the carbohydrate esterase family, a subclass of the SGNH hydrolase superfamily. The esterases (EC 3.1.1.1) which belong to this family of enzymes are known in biochemistry due to their ability to catalyze the hydrolysis of amide and ester substrates. Gonorrhea is a bacterial infection caused by the Gram negative bacterium Neisseria gonorrheae that is transmitted sexually. The antibiotic classes which are penicillin, tetracycline and fluoroquinolones have been used for treatment for the past 80 years; however, N. Gonorrhoeae has gradually developed resistance mechanisms against these antibiotics after their widespread use. Due to the continuing emergence of antimicrobial resistance, gonorrhea may be at risk of becoming an untreatable disease. More detailed knowledge of the pathogen-host interaction is needed to explore new therapeutic alternatives to this disease. Therefore, in light of the continued rise of antibiotic resistance, O-acetylpeptidoglycan esterase found in N. Gonorrhoeae, has suggested that this enzyme and its de-O-acetylation present themselves as novel antibacterial target.

Hydrolysis of O-acetylated MurNAC by the O-acetylpeptidoglycan esterase, Ape1, is a two-step process involving de-O-acetylation and enzyme regeneration. It is well estabilished that the mechanism of action centers on serine residue which is activated by the salt bridge between Asp366 and His369 in the presence of the substrate and oxygen of catalytic serine corresponds to nucleophilic attack of the substrate carbonyl carbon to form a tetrahedral oxyanion intermediate while the proton is transfering from Ser80 to imidazole of His369. At the end of de-O-acetylation, while the substrate leaves the enzyme environment with a hydroxylated state to form the acyl enzyme intermediate. Enzyme regeneration of the enzyme begins with the nucleophilic addition of the active site water molecule to the substrate carbonyl center to form the tetrahedral intermediate and is facilitated by His369 which accepts one proton from the water. At the final step, His369 serves as a general acid to transfer one proton to the oxygen of serine, which assists the rupture of the ester bond and leads to the acetic acid product. Possible reaction pathways can be considered in the design of future Ape1 inhibitors. In the literature two different mechanisms for the hydrolysis reaction of Ape1 have been proposed. In addition to the concerted reaction mechanism, the reaction was also evaluated for the possibility of stepwise. There are two alternatives in the de-O-acetylation process, which takes place with the aid of water. In this computational study, we analyzed in detail the reaction pathways for the hydrolysis of O-acetylated MurNAC via histidine assisted and water assisted.
Before moving on to the quantum cluster models, to understand the reaction mechanism well, five models were designed. With the five designed models, it was aimed to understand the geometric parameters of the residues and substrates in the active site. The model structures were gradually enlarged starting from the smallest model. In the smallest model, the serine residue is represented by the ethanol (CH3CH2OH) molecule and the O-acetylated MurNac residue is represented by the CH3CH2COOCH3 molecule. In Model II, while the NHCOCH3 substituent in position 2 of the hexagonal sugar ring is completely included into the calculations, the peptide chain in position 3 was modeled with the -OCH3. Also the β-1,4-glycosidic bond between N-acetylmuramic acid (MurNAc) and GlcNAc in the PG glycan strand is cut off and saturated with methyl group. To understand the effect of His369 and Asp366 residues in the active site on the reaction mechanism, Asp366 and His369 residues were cut from Cβ and methylated in Model III. On the other hand, the O-acetylated MurNac structure continued to be represented by the CH3CH2COOCH3 molecule. Model IV is an extended version of Model III with the substrate in Model II. Model V was designed by adding two important residues, Gly236 and Asn268, which are located in the active site and form the oxyanion hole together with Ser80. Water molecules in the active site that may be effective in the proton transfer are explicitly included in the Model III and Model IV and Model V mechanism. The calculations of the model structures were performed with M06-2X method and the 6-31+G (d, p) basis set. The solvation effect of water is considered by using the polarizable continuum model.
When all the model systems studied (five models) were evaluated, it was seen that the de-O-acetylation reaction through concerted mechanism is unlikely to occur due to the high energy barriers. However, although assistance of water reduced the concerted mechanism barriers, enzyme regeneration reaction is still not feasible to occur via concerted path because of the high barrier. The possibility of the first step of the de-O-acetylation reaction taking place stepwise and applied for Model III - Model V systems where His369 is located. However, in the obtained energy profiles, the energy of the intermediates was incompatible with the energies of the transition states. Thus, in addition to His369 support, an alternative mechanism in which a water molecule participates in proton transfer has been studied for Model III - Model V. Obtained barriers were considerably reduced, according to other investigated possible mechanisms.
The enzyme regeneration step of Ape1,via one water assisted stepwise reaction, has lower reaction barriers than all other alternatives ( concerted, concerted with water, two water assisted stepwise) energy values are  more likely to occur. It is determined that the most likely mechanism for the first step of regeneration is stepwise without water, and the last step is water assisted. Energy profiles of possible mechanisms have been investigated and it has been determined that the de-O-acetylation reaction will not take place concerted and that the stepwise mechanism requires the histidine residue (His369) and / or water in the active area. These findings were the basis for the quantum cluster approach and the effect of the residues around the active site on the reaciton mechanism was investigated.
The effects of active site residues on the hydrolysis reaction mechanism were investigated by modeling clusters at QM level containing important residues. In order to elucidate the hydrolysis reaction of Ape1 in detail, two different active site models were used in different sizes. In the context of cluster calculations, the de-O-acetylation reaction mechanism was first modeled using CI model with the least number of residues and o-acetylated MurNac as a substrate. In the model CII (146 atoms), all of the Gly236, Asn268 residues forming the oxyanion hole and two important residues in the active region, Gly367 and Val368, are also included in the system. The largest cluster, CII, was designed with 236 atoms and the effect of the solvent was taken into account using an implicit solvent. In particular, the dependence of the calculated energies on the size of the model, on the influence of the dielectric medium and on the specific choice of the dielectric constant has been discussed. Converging of the barriers calculated using different dielectric constants for the CII cluster model shows that the optimal cluster size can be achieved. The geometry optimizations and frequency calculations of cluster models were performed with the B3LYP method and the 6-31G(d,p) basis set. Based on the geometries optimized in a vacuum, all single point calculations were calculated using the larger basis set 6–311+G(2d,2p) to obtain more accurate energies. To model the polarization effect of enzyme environment single point calculations were evaluated by using four different dielectric constants, ε=1,4,16,80.
It is predicted that aspartate and histidine residues may be effective in the barrier and on the  reaction energies calculated for the hydrolysis reaction of Model CII. Considering two different protonation states for aspartate in calculations with the CII cluster model was investigated. The residues have been  proven to have a critical role in the reaction. Mechanistic calculations at the DFT level, within a carefully selected cluster model (CII) of the Ape1 enzyme, demonstrated that the overall hydrolysis is occur via water assisted stepwise path.
By elucidating the details of the mechanism of the enzyme, illuminating the active site will guide the synthesis of new antibacterial drugs. In this study, density functional theory is applied to investigate the reaction mechanisms and to examine the energetic feasibility of this suggested mechanism of the Ape1 enzyme from N. Gonorrhoeae belonging to the SGNH-superfamily. From  the studies of Ape1, it is obtained that the density functional calculations are able to solve mechanistic problems related to enzymatic reactions.