Amycolatopsıs ve Nocardıa üyelerinin izolasyonu ve polifazik karakterizasyonu
Isolation and polyphasic characterization of Amycolatopsis and Nocardia members
Yazar: MUSTAFA ÇAMAŞ
Danışman: PROF. DR. NEVZAT ŞAHİN
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Moleküler sistematik = Molecular systematic

Özet:
Bu çalışmada, Amycolatopsis ve Nocardia cinsi üyelerinin izolasyonu ve polifazik karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.
Olası Amycolatopsis ve Nocardia suşları Türkiye?nin farklı bölgeleri ile, Kıbrıs, Nijerya, Mekke ve Medine?den temin edilen toprak örneklerinden dilüsyon plak yöntemi ile SM1, SM2 ve SM3 seçici besiyerlerinden izole edildi. İzolatlar ISP2 ve Bennett?s agarda kültüre alındı ve % 20?lik gliserol çözeltilerde -20 °C?de muhafaza edildi. 16S rRNA gen bölgesi PCR amplifikasyonu 27F ve 1525R primerleri ile gerçekleştirilen test organizmalarının tüm 16S rRNA gen dizisi 800R, MG3 ve MG5 primerleri ile belirlendi. Filogenetik ağaçlar, neighbour-joining, maximum likelihood ve maximum parsimony algoritmaları ile MEGA5 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Amycolatopsis ve Nocardia cinslerine ait olduğu belirlenen suşların DNA-DNA hibridizasyonları gerçekleştirildi. Yeni tür ve yeni tür olması kuvvetle muhtemel suşların NRPS-PKS antibiyotik gen bölgelerinin varlığı, ilgili primerler ile Thermal Cycler?da çoğaltılarak belirlendi.

Seçici besiyerlerinden toplam 238 organizma izole edildi ve bunların 138?inin 16S rRNA geni PCR amplifikasyonları gerçekleştirildi. Filogenetik verilere göre 19 tane Amycolatopsis ve 32 tane Nocardia suşu belirlendi. Yakın akraba tip türleri ile nükleotit farkı 9 nükleotitten fazla olan test izolatları, neighbour joining metoduna dayalı filogenetik dendogramlarda filetik bir hat oluşturmakta ve bu durum yüksek bootstrap değeri ile desteklenmektedir. Bu suşlar ayrıca en yakın akrabaları ile oldukça düşük DNA-DNA hibridizasyon değerlerine sahiptir. Ayrıca izolatların kemotaksonomik ve fenotipik karakteristikleri ait oldukları cinsler ile tutarlıdır.

Fenotipik ve genotipik verilere dayanarak, PKS ve NRPS pozitif Kıbrıs izolatı KT2025T suşu Amycolatopsis magusensis sp. nov. DSM 45510T, Edirne izolatı A2012T suşu Nocardia goodfellowii sp. nov. DSM 45516T,  A2019T suşu Nocardia thraciensis sp. nov. DSM 45516T ve Çorum izolatı CR3272T suşu Nocardia sungurluensis sp. nov. KCTC 29094T adları ile önerilmiş ve yayımlanmıştır.
Anahtar Kelimeler: Polifazik karakterizasyon, Amycolatopsis, Nocardia, Kemotaksonomi

Abstract:
In this study, isolation and polyphasic characterization of members of the genus Amycolatopsis and Nocardia were carried out.Putative Amycolatopsis and Nocardia strains were isolated from soil samples collected from different ecological region belonging to Turkey, Cyprus, Nigeria and Saudi Arabia, using a dilution plate procedure on SM1, SM2 and SM3 selective media.  Isolates were subcultured on ISP2 and Bennett?s agar medium, purified and maintained in 20 % glycerol stock solutions at ?20 °C. PCR-mediated amplification of the 16S rRNA gene region of test organisms were performed with primers of 27F /1525R. Almost complete 16S rRNA gene sequence of the isolates were determined using automatic sequencer with 800R, MG3 and MG5 primers. Phylogenetic trees based on 16S rRNA gene were constructed with the neighbour-joining, maximum likelihood and maximum parsmony algorithms by using MEGA5 software. DNA-DNA hybridizations of strains assigned to genus Amycolatopsis and Nocardia were carried out. Phenotypic and chemotaxonomic characters of either novel or most probably novel strains were determined. NRPS-PKS antibiotic gene regions were amplified through primers using Thermal Cycler.

Two hundred and thirty eight strains were isolated from selective media and carried out 16S rRNA gene PCR amplification of a hundred and thirty eight test strains. According to the phylogenetic data, nineteen Amycolatopsis isolates and thirty two Nocardia isolates were determined. Novel or most probably novel strains have showed phyletic line in phylogenetic dendograms based on the neighbour joining method supported high bootstrap values. Test strains which include greater nucleotide (more than 9 nt) difference from most related type species have lower DNA-DNA hibridization values. The chemotaxonomic and phenotypic characteristics of isolates were consistent with its assignment to the genus Amycolatopsis and Nocardia.  

On the basis of phenotypic and genotypic data, strain KT2025T from Cyprus for which the name Amycolatopsis magusensis sp. nov. DSM 45510T, strain A2012T from Edirne with the name Nocardia goodfellowii sp. nov. DSM 45516T, strain A2019T with the name Nocardia thraciensis sp. nov. DSM 45517T, from Edirne and strain CR3272T from Corum with the name Nocardia sungurluensis sp. nov., KCTC 29094T were proposed and published.
 
Key Words: Polyphasic taxonomy, Amycolatopsis, Nocardia, Chemotaxonomy