Ege bölgesinde kültürü yapılan deniz balıklarından izole edilen lıstonella anguıllarum (Vıbrıo anguıllarum)izolatlarının patojenite durumunun multiplex pcr yöntemiyle araştırılması
Investigation of the pathogenicity status of the listonella anguillarum (Vibrio anguillarum) isolates from marine fish cultured in the aegean region with multiplex pcr
Yazar: MERİÇ LÜTFİ AVSEVER
Danışman: DOÇ. DR. CEMAL ÜN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Hemolizin proteinleri = Hemolysin proteins

Özet:
Ülkemizde akuakültür sektörü son yıllarda büyük bir gelişme kat etmiş, Avrupa'da ve dünyada önemli bir konuma gelmiştir. Bu sektör içerisinde en önemli yeri başta çipura ve levrek olmak üzere deniz balığı işletmeleri oluşturmaktadır. Ancak denizlerdeki ağ kafeslerde artan stok yoğunluğu ve yavru transportu enfeksiyon hastalıkların görülme sıklığını ve yaygınlığını arttırmıştır. Bu enfeksiyon etkenleri içerisinde bakteriyel etkenler  büyük bir yer tutmakta olup, Listonella anguillarum (eski adı Vibrio anguillarum)  en önemli bakteriyel balık patojenidir. L. anguillarum, her yaştan deniz ve tatlı su balığında hemorajik septisemi hastalığını oluşturur ve bu hastalığa bağlı kayıplar akuakültür sektörünün en önemli sorunlarındandır. Bu önemli sorun ile mücadele edebilmek için, hastalık mihraklarındaki L. anguillarum izolatlarının  kültürel ve moleküler yapısı, antibiyotik profilleri ve patojenitesi aydınlatılmadır. Ülkemizde L. anguillarum'un kültürel özellikleri ve antibiyotik profilleri üzerine çalışmalar yer almakta olup, moleküler özellikleri ve patojenitesi ile ilgili az sayıda çalışma bulunmaktadır. Diğer taraftan, Türkiye'de L. anguillarum'un virulans hemolizin genlerinin araştırıldığı bir literatür bilgisine rastlanmamıştır.  Hemolizin genleri L. anguillarum'un patojenitesine önemli bir katkı sağlar ve hastalığa hemorajik septisemi denmesinin en önemli sebebidir. 
Bu projede 2006-2013 yılları arasında, İzmir Bornova Veteriner Kontrol Enstitüsü, Balık Hastalıkları Ulusal Referans Laboratuvarı'na, hastalık teşhisi amacıyla gönderilen levrek, çipura ve alternatif deniz balığı türlerinden izole edilen 51 adet L. anguillarum izolatı üzerinde çalışılmıştır. Proje ile izolatların fenotipik özellikleri ve antibiyogram duyarlılıkları tespit edilmiş, amiB genlerindeki tür spesifik bölge çoğaltılarak PZR ile doğrulanmıştır. Kültürel ve moleküler yöntemlerle L. anguillarum olduğu tespit edilen izolatlar virulasn hemolizin genleri (vah 1,  vah 2, vah 3, vah 4, vah 5) yönünden multiplex PZR yöntemi ile araştırılarak patojeniteleri hakkında bilgi edinilmeye çalışılmıştır. Bunun yanında özgün olarak sentezlenen primerler kullanılarak temsili izolatlar üzerinde farklı bir PZR çalışması yapılmış, PZR ürünleri sekans analizine yollanarak izolatlar arasındaki flogenetik ilişki araştırılmıştır. 
Sonuç olarak, Ege Bölgesinin farklı koylarındaki balık çiftliklerinde yetiştirilen deniz balıklarından izole edilen 51 adet Listonella anguillarum izolatının üç çeşit fenotipik karakterizasyon gösterdiği, en duyarlı oldukları antibiyotiğin florfenicol, en dirençli oldukları antibiyotiğin ise Amoxycline olduğu; etkeninin identifiye edilmesinde konvansiyonel kültür yöntemi ile amiB gen bölgesindeki spesifik bölgenin çoğaltıldığı PZR yönteminin % 100 uyumlu olduğu, özgün olarak dizayn edilen primerlerin kullanıldığı PZR yönteminin L. anguillarum'u identifiye etmekte kullanılabilir olduğu fakat V. ordalii ile kros reaksiyon verebileceği;  kullanılan izolatların hemolizin genleri yönünden zengin olduğu, özellikle vah 1 ve 4' sahip olan izolatların yüksek mortaliteli enfeksiyonlara sebep olabildiği, vah 2, 3 ve 5 e sahip izolatların nispeten daha  az mortaliteye sebep olabilecekleri bilgilerine ulaşılmıştır. Flogenetik araştırma kapsamında izolatların çoğaltılan gen bölgelerinde polimorfizme ratslanmamıştır.

Abstract:
Aquaculture sector in Turkey has grown greatly in the past few years and gained important status in Europe and around the world. Mariculture, especially sea bass and sea bream culture, has the most significant place within this sector. Despite this, increasing stock density in the net cages and transportation of the young have caused the prevalence and incidence of infectious diseases. Bacteria have an important role within these infectious agents; Listonella anguillarum (Vibrio anguillarum) being the most important bacterial fish pathogen.
L. anguillarum, is the cause of the haemorrhagic septicemia disease in marine and fresh water fish. Losses due to this disease are among the most important problems of the aquaculture sector. To combat this important problem, cultural and molecular structure, antibiotic susceptibility profiles and pathogenicity of L. anguillarum should be discussed. Although research on culture properties and antibiotic susceptibility patterns of L. anguillarum is available in Turkey, publications on the molecular characteristics and pathogenicity are few. On the other hand, research information on virulence haemolysin genes were not found in Turkey. Haemolysin genes contribute greatly to the pathogenicity of  L. anguillarum and are the main reason behind the disease name being haemorrhagic septicemia.
In this project, 51 L. anguillarum isolates from sea bass, sea bream and other alternatice fish presented to the National Referance Laboratory for Fish Diseases in Izmir Bornova Veterinary Control Institute between 2006-2013 were researched. With this project phenotypic characteristics and antibiotic susceptibility patternsof the isolates were determined, species specific PCR amplification of amiB genes were carried out for confirmation. Isolates determined to be L. anguillarum with culture and molecular methods were investigated for virulence haemolysin genes (vah 1, vah 2, vah 3, vah 4, vah 5) with multiplex PCR. Also, originally designed primers were used to carry out a different PCR research, amplification products were then  sent to sequencing and phylogenetic relationship between isolates were researched.
As a result, 51 Listonella anguillarum isolates from fish in farms in different bays in the Aegean sea were found to have 3 types of phenotypic characterization, the antibiotic they were most susceptible to was found to be florfenicol and the least was Amoxycillin. PCR method with the amplification of amiB gene region was found to be 100% compliant. Originally designed PCR primers were found to be useful in identifiying Listonella anguillarum but could create cross-reactions with V. ordalii. Isolates were rich in haemolysin genes, especially vah 1 and 4 positive isolates were reported to be the cause of infections with high mortality levels and vah 2,3 and 5 positive isolates were reported to be the cause of less severe infections. As a result of the phylogenetic investigation, polymorphism was not found in amplified gene regions of the isolates.