Testis biyopsisinde matürasyon arresti saptanan olgularda MLH1 varyantlarının araştırılması
The investigation of MLH1 variants in cases with maturation arrest in their testicular biopsy
Yazar: YASEMİN ÜLGER
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ TİMUR TUNCALI
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Genetik = Genetics ; Üroloji = Urology
Dizin: Azospermi = Azoospermia ; Biyopsi = Biopsy ; Biyopsi-iğne = Biopsy-needle ; DNA onarım testi = DNA repair test ; DNA onarımı = DNA repair ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Genetik varyasyon = Genetic variation ; Testis = Testis

Özet:
Amaç: 
İnfertilite tüm dünyada çiftlerin %13-15'ini etkileyen önemli bir sağlık sorunudur ve olguların yaklaşık yarısı erkek infertilitesinden kaynaklanmaktadır. Nonobstruktif azoospermi (NOA) erkek infertilitesinin önde gelen nedenlerinden biri olmakla birlikte olguların %85'inde genetik ve moleküler nedenler henüz aydınlatılamamıştır. Testis biyopsisi sonuçları kullanılarak yapılan endofenotipleme ile NOA'da tek gen varyantlarının araştırılması güncel bir yaklaşımdır ve bugüne kadar bu yaklaşımla NOA olgularının bir kısmından TEX11, MEIOB gibi birkaç genin sorumlu olduğu gösterilmiştir. 
Öncellikle kanserdeki rolüyle bilinen ve bir yanlış eşleşme onarımı (MMR) proteini olan MLH1'in mayozda rekombinasyon odaklarında yerleşim gösterdiği ve MSH4, MSH5, MLH3 ile birlikte rekombinasyonda görev aldığı hem hayvan hem de insan çalışmalarında gösterilmiştir. NOA'lı olguların testis dokularında anti-MLH1 antikorlarıyla yapılan immünositokimyasal incelemelerde MLH1 odaklarının sayısında azalma ile MLH1 fonksiyon bozukluğunun diğer bir göstergesi olan mikrosatellit instabilitesinde ise artış olduğu saptanmıştır. Öte yandan MLH1 geni varyantlarının insanlarda erkek infertilitesi, NOA ve testis biyopsisi sonuçları ile ilişkisini olumlayan veya olumsuzlayan bir çalışmaya henüz rastlanmamıştır. Bu projede literatürdeki bu eksikliği gidermek amacıyla testis biyopsisi sonucunda öncelikle matürasyon arresti olan veya hipospermatogenez saptanan NOA'lı olgularda yeni nesil dizileme ile MLH1 varyantlarının araştırılması hedeflenmiştir. 
Gereç ve yöntem: 
Toplamda 42 hastanın onamları alındıktan sonra periferik kan örnekleri EDTA'lı tüplerde -20°C'de çalışma başlayana kadar saklanmıştır. Primerlerin oluşturulmasında MLH1 geninin biyolojik olarak en yaygın ifadesi olan ve en uzun transkriptine göre (NM_000249.4), promoter bölgesini de içerecek şekilde literatür bilgisi kullanılmış ve Primer3, in-silico PCR ve BLAT ile özgünlükleri teyit edilmiştir. Dreamtaq master miks kullanılarak amplikonlar elde edilmiş ve %2'lik agaroz jelde PCR doğruluğu tespit edildikten sonra yeni nesil dizileme ile dizilenmiştir. Yeni nesil dizileme tamamlandıktan sonra ".BAM" uzantılı dosyalarda 42 hastanın MLH1 genindeki varyantlar IGV programında incelenmiştir. Varyantlar VarSome kullanılarak ACMG kriterlerine göre sınıflandırılmıştır. Sapyanan varyantlar Sanger dizileme ile de doğrulanmıştır. 
Bulgular: 
13 benign, 5 olası benign, 6 önemi bilinmeyen, 1 olası patojenik ve 1 patojenik varyant tespit edilmiştir. Lys618Ala olası patojenik, Val326Ala ise patojenik varyant olarak sınıflandırılmıştır.

Sonuç: 

Araştırmamızda matürasyon arrestine bağlı NOA fenotipi için risk oluşturabilecek ya da yatkınlık yaratacak iki kodlayıcı varyant bulunmuştur. V326A ve K618A olan bu varyantlar dışında önemi bilinmeyen bazı varyantlar literatürde ilk kez ortaya konmuştur. Ek olarak, benign veya olası benign olarak sınıflandırılmakla birlikte, bir promoter varyantı rs1800734 ve iki 3'UTR varyantı kompleks hastalık patofizyolojisi ile uyumlu olarak NOA'da yatkınlık oluşturabileceği şeklinde değerlendirilmiştir. Bu varyantlar NOA'da monogenik etkiden çok kişiselleştirilmiş tıp kapsamında yatkınlık faktörleri olarak önerilebilir. Bu yatkınlık faktörlerinin MLH1 varyantları olmasının önemi, erkek genel sağlık durumunun göstergesi olarak kabul edilen erkek infertilitesiyle kanser arasında bağlantı kurmasında yatmaktadır.

Abstract:
Aim:

 Infertility is an important health issue that affects 13-15% of couples worldwide and male factor is a cause or a contributer to the half of the cases. Although nonobstructive azoospermia (NOA) is one of the leading causes of male infertility, genetic and molecular aetiology of NOA remains unexplained in 85% of the cases. Investigation of monogenic causes of NOA by endophenotyping using testicular biopsy results is an up-to-date approach by which it has been shown that several genes such as TEX11, MEIOB are responsible in some cases with NOA.

Being a mismatch repair (MMR) protein and primarily known for its role in cancer, MLH1 has been shown to be a constituent in recombination foci and a participant in recombination together with MSH4, MSH5 and MLH3 both in animal and human studies. Reduced number of the MLH1 foci detected by immunocytochemistry analyses using anti-MLH1 antibodies and an increase in the microsatellite instability which is indicative of MLH1 dysfunction have been evidenced in testicular tissues of cases with NOA. On the other hand, no study in humans has been found to affirm nor negate an association between variants of MLH1 gene with male infertility, NOA and testicular biopsy results. To fill this gap in the literature, it is aimed in this project to investigate the MLH1 variants by next-generation sequencing in NOA cases with testicular biopsy results of maturation arrest or hypospermatogenesis. 

Materials and methods: 

After obtaining the consents of 42 patients in total, the blood samples were stored at -20°C until the study began. The primers for the gene MLH1 were adapted from the literature based on the most biologically relevant and longest transcript (NM_00249.4)of the gene including the promoter region. The specifity of the primers were confirmed by using Primer3, in-silico PCR and BLAT tools. Amplicons obtained using Dreamtaq master mix and confirmed on a 2% agarose gel; afterwards they were sequenced by next generation seqeuncing technology. ".BAM" files were obtained for each patient and investigated for variants using IGV. Detected variants were confirmed by Sanger sequencing.

Results: 

13 benign, 5 likely benign, 6 uncertain significance, 1 likely pathogenic and 1 pathogenic variants were detected. Lys618Ala and Val326Ala were classified as likely pathogenic and pathogenic, respectively.

Conclusions: 

In this study, two coding variants have been detected which may be risk factors for the NOA phenotype related to maturation arrest. For the first time in the literature some variants of uncertain significance have been reported other than the V326A and K618A variants. Additionally, although classified as benign or likely benign, one promoter variant and two 3'UTR variants may cause susceptibility to NOA in accordance with the pathophysiology of complex disease. It is not realistic to assume these variants are monogenic causes of NOA; however, they can be considered as susceptibility factors within the context of precision medicine. The value of these factors as MLH1 variants is that they make the connection of cancer with male infertility which is regarded as an indicator of general male health status.