Mikroakışkan kanalda hidrojel içinde tutuklanmış enzim ile model bir saponinin aglikonuna dönüşümü
Conversion of a model saponine to its aglycone in a microfluidic channel by an enzyme entrapped in hydrogel
Yazar: CAHİT MÜDERRİSOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. SAYIT SARGIN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu tez kapsamında terapötik öneme sahip baicalein molekülünün, baicalin molekülü hidrolizi yoluyla üretimi için rutin olarak uygulanan kimyasal ve serbest enzim hidroliz işlemleri gerçekleştirilmiş ve elde edilen verim değerleri ilk kez, bu çalışma kapsamında tasarlanan mikroakışkan sistemlerden elde edilen reaksiyon verimleriyle kıyaslanmıştır. Mikroakışkan ortamda gerçekleştirilen enzimatik hidroliz çalışmaları için farklı kanal uzunluğu, geometrisi ve mikro ölçekli-hacme sahip biri PDMS (Polidimetoksisilan)-cam (tek kanallı, 100 µL)  ve diğer ikisi cam-silikon-cam (Tip-I ve Tip-II, 37 µL) olmak üzere, üç farklı mikroreaktör sistemi kullanılmıştır.   
Helix pomatia kaynaklı beta-glukuronidaz (GUS) enzimi, sürekli akış prensibiyle çalışan farklı mikroakışkan sistemlerde, TEOS-PEO (tetraetoksi silan-polietilen oksit) türevli sol-gel materyali aracılığıyla immobilize edilmiştir. Silika jeller içerisinde immobilize edilen GUS enziminin hem serbest hem de immobilize formu için Km ve Vmax gibi kinetik sabitleri, bu enzimin sentetik substratı olan pNPG (para-nitrofenol- β-D- glukuronik asit) kullanılarak sırasıyla 1,57 mM, 56,82 µmol ml-1 dk-1 ve 0,40 mM, 11,88 µmol ml-1 dk-1 olarak belirlenmiştir.  
Baicalin subsratının 4 saatlik asidik ve bazik hidrolizlerinde yüksek yan ürün oluşumlarıyla elde edilen baicalein üretim verimleri sırasıyla % 10±3 ve % 0,10±0,02 olarak belirlenmiştir. Baicalin molekülü serbest GUS enzimi ile 4 saat kesikli inkübasyon işlemi sonunda baicaleine, yan ürün oluşumu görülmeden % 99±1 oranında dönüştürülmüştür. Üç farklı mikroreaktör sisteminin mikrokanalları içerisinde, 4 saatlik çalışma süresi sonunda, PDMS-cam, cam-silikon-cam Tip-I ve Tip-II mikroçiplerde elde edilen baicalein üretim verimleri sırasıyla % 62±2, % 50±1 ve % 10±2 olarak belirlenmiştir. Tasarlanan mikroakışkan sistemlerinin, kimyasal hidroliz yöntemlerine göre daha yüksek, serbest enzim hidroliz işlerine göre ise daha düşük baicalein dönüşümü sağladığı belirlenmiştir. Mikroreaktörlerden elde edilen baicalein dönüşüm verimlerinin, serbest enzim ile elde edilen verimin altında olduğu tespit edilse de, geliştirilen mikroreaktör sistemlerinin baicalein üretiminde, enzimin geri kazanımı ve sürekli işletim imkanı sunması yönüyle etkin işlem alternatifleri oluşturabileceği ortaya konmuştur.

Abstract:
In this thesis, an effective and novel method for the production of baicalein was developed by hydrolysis of baicalin. Routine chemical and free enzyme hydrolysis procedures were performed for the production of baicalein and the yields obtained, were compared for the first time with the reaction efficiencies obtained from the microfluidic systems designed in this study. For enzymatic hydrolysis studies carried out in a microfluidic platform, a total of three different microreactor systems with the different channel length, geometry and volume - one with PDMS-glass (single channel, 100 μL) and the other two with glass-silicon-glass (Type-I and Type-II, 37 μL) - were used. 
Helix pomatia derived beta-glucuronidase (GUS) enzyme was immobilized in different microfluidic systems operating on the principle of continuous flow by silica-based sol-gel materials. Kinetic constants such as KM and VMAX for both free and encapsulated GUS enzyme in sol-gel materials were measured using pNPG (para-nitrophenol-β-D-glucuronic acid) and determined as 1,57 mM, 56,82 µmol ml-1 min-1 and 0,40 mM, 11,88 μmol ml-1 min-1, respectively.  
Yields of baicalein production with 4h acidic and basic hydrolysis of baicalin resulted in 10±3% and 0,10±0,02%, respectively, together with high by-product formation. 99±1% of baicalin molecule was converted to baicalein at the end of the 4 hours of incubation with free GUS enzyme without any by-product formation. After 4 hours of process period, the production yields of baicalein in PDMS-glass, glass-silicon-glass Type-I and Type-II microchips were determined as  62±2%,  50±1% and  10±2%, respectively.     
Although it has been found that the conversion efficiency of baicalein obtained from microreactors is lower than the yield obtained with free enzyme, it has been revealed that the developed microreactor systems can produce effective processing alternatives in the production of baicalein by providing the possibility of recovery and continuous operation of the enzyme.