Reseptörle etkileşen serin treonin kinaz 4 (RIPK4)'ü sürekli eksprese eden HaCaT hücre hattı oluşturulması
Generation of HaCaT cell line that continually express the receptor interacting serine-threonine kinase (RİPK4)
Yazar: EDA GÜNEŞ
Danışman: DOÇ. DR. TUBA DİNÇER
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Epidermis = Epidermis ; HaCaT = HaCaT ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; RIPK4 = RIPK4 ; Transfeksiyon = Transfection

Özet:
Deride koruyucu bariyer rolünü üstlenen epidermis çok katmanlı bir yapıdır. En alt
katmanda bulunan bazal tabakadaki kök hücreler dermisten gelen komutla asimetrik
bölünerek bazal tabakadan uzaklaşmaya başlar ve farklılaşarak subrabazal katmanları
oluşturur. Epidermal farklılaşma olarak adlandırılan bu süreç çok hassas bir şekilde
düzenlenirken süreç esnasında oluşabilecek bazı aksaklıklar konjenital anomalilere neden
olabilmektedir. Reseptörle Etkileşen Serin Treonin Kinaz 4 (RIPK4), epidermal
farklılaşmayı düzenleyen öncül proteinler arasındadır. Fonksiyonu ile ilişkili olarak
patolojik RIPK4 varyasyonları konjenital ektoderm gelişim bozuklukları olan BartsocasPapas, Popliteal Pytergium, AEC-Like ve CHAND sendromları ile ilişkilendirilmiştir.
Keratinosit hücre hatlarının kullanıldığı laboratuvar koşullarında epidermal
farklılaşma süreci iki ila üç hafta arasındadır. Laboratuvar analizleriyle epidermal
farklılaşmanın araştırıldığı çalışmalarda normal insan keratinositlerine (NHK) alternatif
olarak büyüme koşulları daha kolay olan ölümsüz HaCaT insan keratinosit hücre hattı
kullanılmaktadır. HaCaT hücrelerine çalışılmak istenen geni transfekte etmek oldukça
zordur. Ayrıca, transfekte edilen HaCaT hücrelerinde istenilen genin ekspresyonu ancak
birkaç gün sağlanabilir. Yaklaşık 14 gün süren epidermal farklılaşmanın araştırıldığı
çalışmalarda ise incelenecek genin hücrelerde sürekli ekspresyonunun sağlanması
gerekmektedir. Bu tez çalışması ile amaçlanan uzun süreli analizlerde kullanılmak üzere
araştırılacak genin sürekli ekspresyonuna olanak veren transgenik HaCaT hücrelerini
oluşturmak ve bu hücrelerde RIPK4'ün sürekli ekspresyonunu sağlamaktır.
Bu amaç doğrultusunda ilk olarak Flp-InTM Sistemi kullanılarak istenilen genin
HaCaT genomuna entegrasyonuna olanak veren FRT kaseti hücrelerin genomuna entegre
edildi. FRT kasetinin genomda transkripsiyonel olarak aktif bölgeye tek kopya olarak
yerleştiği ve hücrenin yaşamsal fonksiyonlarına etkilemediği doğrulandı. Sonrasında RIPK4
geni HaCaT genomuna yerleşmiş FRT kasetine entegre edilerek RIPK4'ü sürekli eksprese
eden HaCaT hücreleri oluşturuldu. Oluşturulan bu hücreler ile epidermal farklılaşma süreci
gibi uzun süreli hücresel süreçlerin çalışılacağı deneylerin tasarlanması mümkün olacaktır.

Anahtar Sözcükler: Epidermal farklılaşma, Flp-In sistemi, HaCaT, Kalıcı Transfeksiyon,
RIPK4.

Abstract:
The multilayered epidermis acts as a protective barrier of the skin. Upon dermis
originated differentiation signal, basal layer localized stem cells start to divide
asymmetrically and the daughter cells that move apart from stem cells enters differentiation
process to form epidermal suprabasal layers. This process, known as epidermal
differentiation, is regulated very precisely and failures can cause congenital anomalies.
Receptor Interacting Serine Threonine Kinase 4 (RIPK4) is one of the leading proteins that
regulate epidermal differentiation. Regarding its function, RIPK4 variations have been
associated with congenital ectodermal development defects such as Bartsocas-Papas,
Popliteal pytergium, AEC-Like and CHAND syndromes.
In laboratory conditions in which keratinocyte cell lines are used, the epidermal
differentiation process is between two and three weeks. In studies investigating epidermal
differentiation by laboratory analysis, HaCaT cells, which can grow in simple conditions
and easy to handle, are generally used instead of normal human keratinocytes (NHC).
However, the transfection efficiency of the gene of interest to HaCaT cells is very low. In
addition, in these transfected cells the expression of the gene of interest can last only couple
days. However, in epidermal differentiation-based studies the expression of the gene of
interest should last for at least 14 days. Therefore, the aim of this thesis is to establish
transgenic HaCaT cells that allow stable integration of gene of interest into their genome
and to over express RIPK4 continuously by using these established HaCaT cells.
Within this scope firstly FRT cassette, which allows the integration of gene of interest
into the HaCaT cells genome, was integrated to the genome of HaCaT cells genome by using
Flp-InTM system. The integration of single copy FRT cassette to the transcriptionally active
site of the genome without disturbing the vital cellular functions was confirmed. After that,
RIPK4 was integrated to the HaCaT cell genome through FRT cassette to provide continuous
expression of RIPK4. With these transgenic cells, it will be possible to design long-term
experiments such as epidermal differentiation.

Keyword: Epidermal differentiation, Flp-In system, HaCaT, Stable transfection, RIPK4