Mikro ve nano boyutlu polimer esaslı floresans kemosensörlerin dizaynı
Designing of micro and nano sized polymer based fluorescence chemosensors
Yazar: ECE AKKOÇ
Danışman: PROF. DR. BÜNYAMİN KARAGÖZ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Kimya = Chemistry ; Polimer sentezi = Polymer synthesis

Özet:
Nitroaromatik bileşikler günümüzde tüm dünyada tehdit oluşturan kimyasalların başında gelmektedir. Bunların en yaygın olarak bilinenleri ise 2,4,6-trinitrotoluen (TNT), 2,4,6-trinitrofenol (TNP veya PA, pikrik asit), 2,4-dinitrotoluen (DNT)'dir. Bu bileşikler tüm kullanım alanlarının yanısıra özellikle patlayıcı yapıda olmalarıyla terörist tehditlerin temelini oluşturmaktadırlar. Aynı zamanda kimyasal yapıları ile de ekosisteme, karıştıkları sular aracılığıyla da insan sağlığına doğrudan olumsuz etkiler yaratmaktadırlar. Bu sebeple nitroaromatik bileşiklerin hassas ve güvenilir bir şekilde tespiti büyük önem taşımaktadır. Bu anlamda literatüre kazandırılmış makro molekül veya polimer yapılarında pek çok kemosensör bulunmaktadır. Bunlardan florofor grubu piren olan floresans kemosensörler yüksek kuantum verimine ve kimyasal stabiliteye sahip olmaları nedeniyle en çok tercih edilenlerdir. Ancak piren gruplarının hidrofobik doğası sebebiyle sudaki deteksiyon etkinlikleri organik çözücü koşullarına kıyasla oldukça düşük çıkmaktadır. Bu anlamda piren ünitelerinin sulu koşullarda etkin şekilde kullanılabilirliğinin sağlanması ve içme sularındaki nitroaromatik bileşiklerin (NAB) tayininin en verimli şekilde yürütülebilmesi için sayılı araştırma literatüre kazandırılmıştır. 
Bu tezde de mikro ve nano boyutlu polimer esaslı çeşitli floresans kemosensörlerin tasarımlarının, sentezlerinin ve özellikle sulu ortamda nitroaromatik bileşiklere karşı deteksiyon etkinliklerinin incelemelerinin yapılması hedeflenmiştir. Bu bağlamda her bir kemosensör için ortak floresans etkinliğini sağlayacak bir birimin yapıda olması uygun görülmüştür. Bunun için güçlü elektron delokalizasyonuna sahip, yapısında metilen köprü bağları bulundurmayan stiren esaslı 4-(1-pirenil)-stiren (PySt) monomeri, tasarlanan her bir kemosensörün fonksiyonel monomeri olarak tercih edilmiştir. PySt monomeri Suzuki kenetlenme reaksiyonu üzerinden sentezlenmiş ve karakterizasyonu proton nükleer manyetik rezonans (1H-NMR) ve Fourier transform infrared (FT-IR) spektrumları üzerinden sağlanmıştır. Ardından tezin ilk bölümüne geçiş yapılmıştır. Mikro boyutlu çapraz bağlı küre eldesi için distilasyon çökelme polimerleşmesine başvurulmuştur. Tez çalışmasının fonksiyonel monomeri PySt'nin ve çapraz bağlayıcı olarak seçilen etilen glikol dimetakrilat (EGDMA)'ın bir saatlik polimerizasyonu neticesinde, 850-1000 nm partikül boyut aralığına sahip homojen dağılım gösteren poli(4-(1-pirenil)-stiren-ko-etilenglikoldimetakrilat) mikroküreleri elde edilmiştir. Sentezlenen mikrokürelerin karakterizasyonu için FT-IR, taramalı elektron mikroskopu (SEM) ve dinamik ışık saçılımı (DLS) ile zeta potansiyel ölçümlerine başvurulmuştur. SEM ve DLS analizleri ile yaklaşık bir mikronluk partikül boyutuna sahip olduğu saptanan çapraz bağlı bu kemosensörün yapısal olarak sağladığı önemli avantajlarından bir tanesi hem suda hem de organik çözücü içerisinde homojen dispersiyon göstermesi olmuştur. Bu sayede deteksiyon etkinliklerinin kararlı ve eş koşullarda tespiti mümkün hale gelmiştir. Nitroaromatik bileşiklere karşı deteksiyon tespitinde çözücü ortamı olarak su, asetonitril, metanol ve tetrahidrofuran seçilmiştir. Tüm süspansiyon sistemler içerisinde mikrokürelerin sudaki dispersiyonun en iyi floresans söndürme aktivitesi gösterdiği Stern Volmer hesaplamaları ile ortaya konmuştur. Ayrıca en hassas ölçüm değerleri için de deteksiyon limit (LOD) hesaplamaları yapılmış ve en düşük nitroaromatik bileşik konsantrasyonunun detekte edilebilirliğinin yine sulu ortamda olduğu kanıtlanmıştır. Bunun yanısıra mikrokürelerin nitrobenzen (NB), nitroetan (NE) ve 4-nitrofenol (NP) gibi diğer nitro bileşiklere karşı verdiği yanıtlar da incelenip hesaplanmıştır. Takiben tüm nitro bileşiklere karşı verilen yanıtlar birbiri ile kıyaslanmıştır. Son adım olarak sentezlenen kemosensörün, P(PySt-EGDMA) mikrokürelerinin, hangi patlayıcıya karşı seçimlilik ve duyarlılık gösterdiği yapılan floresans titrasyon çalışmaları ile ortaya konmuştur. 
Tezin ikinci bölümünde polimerleşmenin tetiklediği kendi kendine düzenlenme (Polymerization Induced Self Assembly) yaklaşımı üzerinden nano boyutlu farklı morfolojilerde amfifilik diblok kopolimerlerinin sentezine gidilmiştir. Bunun için ilk olarak fonksiyonel monomerin hidrofobikliğini taşıyacak olan hidrofilik segmentin sentezi ile deneylere başlanılmıştır. RAFT polimerleşmesi üzerinden oligo (etilen glikol) metil eter metakrilat monomeri (Mw= 300 g.mol-1) zincir transfer ajanı kullanılarak polimerleştirilmiştir. Elde edilen POEGMA makro-CTA'sının karakterizasyonu için FT-IR, 1H-NMR ve jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) analizlerine başvurulmuştur. Sonrasında POEGMA ve farklı mol oranlarında 4-(1-pirenil)-stiren monomerinin uygun sıcaklıkta 24 saatlik PISA yaklaşımının uygulandığı RAFT polimerleşmesi neticesinde reaksiyon ortamında dispers nanoaggregatlar elde edilmiştir. Membran kullanımı ile sulu ortama geçirilen amfifilik diblok kopolimerlerinin karakterizasyonları için FT-IR, 1H-NMR, GPC, DLS, geçirimli elektron mikroskopu (TEM) analizleri yapılmıştır. TEM analizleri neticesinde elde edilen poli (oligo (etilen glikol) metil eter metakrilat)-blok-poli (4-(1-pirenil)-stiren) (POEGMA-b-PPySt) amfifilik diblok kopolimerlerinin misel, misel-solucan tipi ve çubuk tiplerinde olduğu ortaya konmuştur. Bu noktada her bir nanoaggregatın floresans spektrofotometre kullanımı ile nitroaromatik bileşiklerle titrasyon çalışmaları yürütülmüştür. Saptanan veriler üzerinden Stern Volmer grafikleri çizilmiştir ve bu grafiklerin eğiminden Stern Volmer katsayıları bulunmuştur. Ayrıca LOD değerleri hesaplanmıştır. Asimetrik diblok kopolimerlerinin organik çözücü ortamlarındaki ve farklı nitro bileşiklere karşı deteksiyon etkinlikleri yine titrasyon çalışmaları ile ortaya konmuştur. Organik çözücü ve nitroaromatik bileşiklerdeki çeşitlilik birinci bölümde uygulananlarla eş tutulmuştur. Sonuç olarak farklı morfolojilere sahip POEGMA-b-PPySt amfifilik diblok kopolimerleri arasından en yüksek deteksiyon kabiliyetine sahip, ideal morfoloji saptaması yapılmıştır. Mikrokürede olduğu gibi, saf suda hazırlanan dispersiyonlara ait analiz sonuçlarının daha hassas gerçekleştiği titrasyon çalışmaları neticesinde belirlenmiştir. Son olarak tüm nitro bileşiklere karşı kemosensörün sönümleme etkinliği sıralanarak seçiciliğin ve duyarlılığın en yüksek olduğu nitro bileşik saptanmıştır. 
Tez çalışmasının son bölümünde ise ikinci bölümün çizgisinden ilerlenmiştir ancak farklı olarak hidrofobik segmentin seyreltilmesi amaçlanmıştır. Bu sayede piren ünitelerine kazandırılacak olan esneklik ile deteksiyon kabiliyetinin daha iyi hale getirilmesi hedeflenmiştir. Bunun için, POEGMA ve farklı mol oranlarında 4-(1-pirenil)-stiren monomerinin uygun koşullarda PISA RAFT polimerleşme basamağına seyreltici olarak 2- etil hekzil metakrilat komonomeri eklenmiştir. Elde edilen poli (oligo (etilen glikol) metil eter metakrilat)-blok-(poli (4-(1-pirenil)-stiren)-ko-poli (2-etil hekzil metakrilat)) (POEGMA-b-(PPySt-ko-PEHA)) amfifilik diblok kopolimerleri membran üzerinden saflaştırılıp, saf su ortamına alınmıştır. Ürün karakterizasyonları için yine FT-IR, 1H-NMR, GPC, DLS ve TEM analizlerine başvurulmuştur. Ürünlerin TEM görüntülerinin değerlendirilmesi neticesinde tamamı misel morfolojisinde elde edilmiş EHA içerikli amfifilik diblok kopolimerler serisinin (E serisi) nitroaromatik bileşiklere karşı deteksiyon etkinlikleri floresans spektrofotometresi üzerinden detaylı olarak incelenmiştir. Öncelikli olarak optimizasyon çalışmaları ile ideal floresans ölçüm koşulları yakalanmış, ardından her bir patlayıcı bileşen ile suda dispers kemosensörlerin titrasyonları yapılmıştır. E serisi içerisinden seçilen en küçük boyutlu ve ideal misel formuna sahip kemosensör ile tezin diğer iki bölümünde olduğu gibi nitrobenzen, 4-nitrofenol ve nitroetan bileşiklerine karşı yanıtları titrasyon çalışması üzerinden irdelenmiştir. Devamında farklı solvent (ACN, MeOH ve THF) koşullarının deteksiyon sönümlemesine etkileri de yine aynı kemosensör üzerinden sağlanmıştır. Her bir titrasyon verileri üzerinden Stern Volmer grafikleri çizilmiştir ve Stern Volmer katsayıları ile deteksiyon limit (LOD) değerleri hesaplanıp karşılaştırılmıştır. Böylelikle en iyi deteksiyon kabiliyeti ve en yüksek deteksiyon hassasiyetinin hangi nitro bileşiğe karşı, hangi kemosensör tarafından sağlandığı adım adım ortaya konmuştur. 
Ayrıca, tezin her bölümünün üç ana kemosensörü için florometrik çalışma yapılarak deteksiyon mekanizmasının ilerleyişi aydınlatılmıştır. Bunun için ilgili dalgaboylarında her bir kemosensörün zamana bağlı floresans ölçümleri üzerinden yarılanma ömür değerlerine ulaşılmıştır. Saptanan verilerden ortalama yarılanma ömür değerleri, üstel bozunma sayıları, sönümleme hız sabitleri ve sönümlemenin statik veya dinamik olarak ilerleme gösterdiği ortaya konmuştur. 
Son olarak, tez çalışmasının üç bölümünde de elde edilen kemosensörlerin UV ışık ve gün ışığı altında yalın ve patlayıcı etkileşimli halleri, sonuçların kalitatif anlamda desteklenmesi amacıyla fotoğraflanmıştır. 
Bu şekilde tezi oluşturan üç ana bölüme ait her bir polimerik kemosensör ayrı ayrı sentezlenmiş ve karakterize edilmiştir. Ek olarak, her biri, nitro bileşiklere karşı floresans aktiviteleri açısından ayrıntılı olarak incelenmiştir. Yapılan bu kalitatif ve kantitatif çalışmalar sonucunda tez çalışmasına ait ürünlerin, mikro ve nano boyutlu polimer esaslı floresans kemosensörlerin, kullanım kolaylıkları ve algılama aralıkları kıyaslanarak ifade edilmiştir. Bu tez çalışmasının üç ana polimerik malzemesi de özellikle DNT ve TNT bileşiklerine karşı sulu ortamda hedeflendiği gibi, 7 ile 88 nM'lık minimum detekte edilebilir konsantrasyon (LOD, deteksiyon limiti) aralığı ile çok yüksek hassasiyette tespit kabiliyeti ortaya koymuştur.

Abstract:
Nitroaromatic compounds (NACs) are the leading chemicals that pose a threat all over the world today. The most widely known of these are 2,4,6-trinitrotoluene (TNT), 2,4,6-trinitrophenol (TNP or PA, picric acid), 2,4-dinitrotoluene (DNT). These compounds form the basis of terrorist threats, especially with their explosive nature, in addition to all areas of use. At the same time, they have direct negative effects on the ecosystem and on human health by being exposed the spring waters with their chemical structures before and after the explosion. For this reason, sensitive and reliable detection of nitroaromatic compounds (NACs) is of great importance. In this sense, there are many sensors in small molecule, macromolecular or polymeric structures that have been introduced to the literature. Among electrochemical sensors, biosensors and optical sensors (including chemosensors; colorimetric and fluorescent), the chemosensors are most applicable, easy and cost-effective systems. Especially the fluorescent chemosensors containing pyrene as the fluorophore group in their structure are the most preferred because of their high quantum efficiency and chemical stability compared to both colorimetric chemosensors and fluorescent chemosensors containing the other fluorophore groups suh as pyrimidine, porphirine and carbazole. However, due to the hydrophobic nature of pyrene group, their detection efficiency in aqueous media is rather low compared to organic solvent conditions. In this regard, few studies have been brought to the literature in order to ensure the effective use of pyrene units in aqueous conditions and to determine nitroaromatic compounds in drinking water in the most efficient way.
In this thesis, it is aimed to investigate the designs and syntheses of various pyrene containing micro and nano-sized polymer-based fluorescent chemosensors. It is not only structurally planned and synthesized, but also their detection capabilities are designed against nitroaromatic compounds especially in aqueous medium in order to provide solutions for the protection of environment and human health. In this context, it has been deemed appropriate to have a common functional monomer, containing pyrene fluorophore group, that will provide fluorescence efficiency for each chemosensor. For this reason, styrene-based pyrene containing monomer (4-(1-pyrenyl)-styrene (PySt)), which has strong electron delocalization and lack of methylene bridge bonds in its structure, was preferred as the functional monomer of each designed chemosensor. PySt monomer was synthesized with using bromo styrene and pyrene boronic acid via Suzuki coupling reaction and its characterization was provided by proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) and Fourier transform infrared (FT-IR) spectra. Afterwards, each part of the thesis has been progressed. 
In the first chapter of this thesis, distillation precipitation polymerization was preferred and applied to obtain micron-sized, crosslinked spheres. Microspheres were obtained as a result of one (1) hour polymerization of the functional monomer of the thesis, PySt, and selected crosslinker, ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA). For the characterization of the product, FT-IR, scanning electron microscope (SEM) and dynamic light scattering (DLS) and zeta potential measurements were applied. According to SEM images and DLS measurements, poly(4-(1-pyrenyl)-styrene-co-etyleneglycoledimethacrylate) microbeads demonstrated disperse homogeneous distribution and its particle size is found in the range of 850-1000 nm (approximately 1 µm). One of the important structural advantages of this crosslinked chemosensor was that it showed homogeneous dispersion in both aqueous and organic solvent mediums. In this way, it has become possible to analyze detection activities in stable and suitable conditions. In the detection of nitroaromatic compounds, water, acetonitrile, methanol and tetrahydrofuran were chosen as solvent media. Stern Volmer calculations revealed that the dispersion of microspheres in aqueous medium showed the best fluorescence quenching activity among all suspension systems. In addition, the limit of detection (LOD) calculations was made for finding out the lowest detectability and it was proved that the the lowest detectable nitroaromatic compound concentration was again in the aqueous medium. The detection responses of P(PySt-EGDMA) microbeads for all nitroaromatic compounds (TNT, DNT, PA) are compared among themselves. Additionally, the responses of the P(PySt-EGDMA) to nitrobenzene (NB), nitro ethane (NE) and 4-nitrophenol (NP) compounds, which are preferred as other nitro compounds, were also examined and evaluated via Stern Volmer equation. Finally, the selectivity and sensitivity of P(PySt-EGDMA) microspheres, which is the output of the first chapter of the thesis, was demonstrated by fluorescence titration studies.
In the second chapter of the thesis, the synthesis of amphiphilic diblock copolymers with nano-sized different morphologies have been synthesized through RAFT mediated the Polymerization-Induced Self-Assembly (PISA) approach. For this purpose, experiments were started with the synthesis of the hydrophilic segment, POEGMA, which will carry the hydrophobicity of the functional polymer block, PPySt. Therefore, oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate monomer (OEGMA, Mw= 300 g.mol-1) was polymerized using chain transfer agent via RAFT polymerization. FT-IR, 1H-NMR and gel permeation chromatography (GPC) analyses were used for the characterization of the obtained POEGMA macro-CTA. Afterwards, disperse nanoaggregates were obtained in the reaction medium as a result of RAFT polymerization mediated PISA approach of POEGMA and 4-(1-pyrenyl)-styrene monomer in different molar ratios at the appropriate temperature and 24-hours conditions. FT-IR, 1H-NMR, GPC, dynamic light scattering (DLS), and transmission electron microscopy (TEM) analyses were performed for the characterization of amphiphilic diblock copolymers transferred to aqueous media using membranes with MWCO 3500. It was revealed that the amphiphilic diblock copolymers of poly (oligo (ethylene glycole) methyl ether methacrylate)-block-poly (4-(1-pyrenyl)-styrene (POEGMA-b-PPySt) obtained as a result of TEM analyzes were in micelle, micelle-worm like and rod-like morphologies. At this point, fluorescence titration studies of each nanoparticles with related nitroaromatic compounds were carried out using fluorescence spectrophotometer. Stern Volmer graphs were drawn over the determined data, thereafter Stern Volmer coefficients and LOD values were calculated. Detection efficiencies of asymmetric diblock copolymers in organic solvent environments and against different nitro compounds were also demonstrated by titration studies. To investigate the advanced detection abilities of POEGMA-b-PPySt amphiphilic diblock copolymers, the responses at different solvent mediums and the responses against different nitrocompounds were examined in detail. As a different solvent media, again acetonitrile, methanol and tetrahydrofuran and as another nitroaromatic compounds nitrobenzene, 4-nitrophenol and nitroethane were preferred. Consequently, the ideal morphology with the highest detection ability was determined from POEGMA-b-PPySt amphiphilic diblock copolymers with different morphologies. Among the morphologies obtained with stable growth, LOD calculations indicate that the rod-like structured POEGMA-b-PPySt amphiphilic diblock copolymer had the ability to detect nitroaromatic compounds with the highest susceptibility. As a result of the titration studies, it was also determined that the analyses performed in the aqueous medium as in the microsphere were more sensitive. Finally, the quenching efficiency of the chemosensor against all nitro compounds was ranked and the nitro compound with the highest selectivity and sensitivity was determined.
In the last chapter of the thesis, the line of the second part was chased, but differently, it was aimed to dilute the hydrophobic segment. In this way, it is aimed to improve the flexibility and detection capability that will be brought to the pyrene units. Hence, the diluenting co-monomer 2-ethyl hexyl methacrylate was integrated to the PISA RAFT polymerization step, which was provided under suitable conditions by introducing POEGMA and 4-(1-pyrenyl)-styrene monomer in different molar ratios. The obtained poly (oligo (ethylene glycole) methyl ether methacrylate)-block-(poly (4-(1-pyrenyl)-styrene)-co-poly (2-ethyl hexyl methacrylate)) (POEGMA-b-(PPySt-co-PEHA)) amphiphilic diblock copolymers were purified over the membrane with MWCO 3500 and migrated to the aqueous medium. For the asymmetrical diblock copolymers characterizations, FT-IR, 1H-NMR, GPC, DLS and TEM analyses were applied. As a result of the evaluation of the TEM images, it was determined that all POEGMA-b-(PPySt-co-PEHA) diblock copolymers have micelle morphology. After the structural characterization, the detection efficiency of the EHA-containing amphiphilic diblock copolymer series (E series) against nitroaromatic compounds were examined in detail by fluorescence spectrophotometer. First of all, ideal fluorescence measurement conditions were achieved with optimization studies, then titration studies of chemosensors dispersed in aqueous medium were made with each explosive solution; DNT, TNT and PA, respectively. POEGMA-b-(PPySt-co-PEHA) amphiphilic diblock copolymer with the smallest size and ideal micelle form was selected from the E series as model chemosensor and this was examined towards nitrobenzene (NB), 4-nitrophenol (NP) and nitroethane (NE) compounds through fluorescence titration study as in the other two parts of the thesis. Afterwards, the effects of different solvent (ACN, MeOH and THF) conditions on the detection, quenching efficiencies, were also studied by the selected chemosensor. By the application of each collected data from titration studies, Stern Volmer plots were drawn. Following that, Stern Volmer coefficients and limit of detection (LOD) values were calculated and compared. Thus, it has been demonstrated step by step the best detection capable amphiphilic diblock copolymer with the highest sensitivity to related nitro compound.
Besides, the progress of the detection mechanism was clarified by performing fluorometric studies for the three main chemosensors of each part of the thesis. For this purpose, the life-time values of each chemosensors at the relevant wavelengths were obtained through time-dependent fluorescence measurements. From the determined data, it has been revealed that the average life-time values, exponential decay numbers, quenching rate constants and quenching progress statically or dynamically.
Finally, in all chapters of the thesis, the bare and explosive interacted states of the chemosensors were photographed under UV light and daylight in order to support the results qualitatively.
In this manner, the each product belonging to the three major parts of the thesis was synthesized and characterized separately. Additionally, each has been studied in detail regarding their fluorescence activities against explosive nitro compounds. Finally, as a result of these qualitative and quantitative studies, the products of the thesis, micro and nano-sized polymer-based fluorescence chemosensors, are expressed by comparing their ease of use and sensing ranges. These three main polymeric materials of the thesis showed very high sensitivity detection ability, especially against DNT and TNT compounds in aqueous media, with a minimum detectable concetration (LOD, detection limit) range of 7 to 88 nM, as targeted.