Sülforafan'ın mikroglial hücrelerde aktivasyonla indüklenen hücre ölümüne etkisi
The effect of sulphoraphane on activation induced cell death of microglial cells
Yazar: ERDEN EREN
Danışman: PROF. DR. KEMAL KÜRŞAD GENÇ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Hücre ölümü = Cell death ; Nöroglia = Neuroglia ; Sulforafan = Sulphoraphane

Özet:
Aktivasyonla indüklenen hücre ölümü, mikroglial hücre gibi immün hücrelerin patojenle uyarımı ile ortaya çıkan proliferasyonlarını kontrol altına alan bir mekanizmadır. Sülforafan ise antioksidan ve anti-inflamatuar etkileri bilinen bir izotiyosiyanattır. Bu çalışmadaki amaç, Sülforafanın mikroglial hücrelerde aktivasyonla indüklenen hücre ölümüne (AİHÖ) etkisi ve bu etkinin mekanizmasının incelenmesidir.
Bu çalışmada N9 fare mikroglia hücre hattı kullanılmıştır. Hücre ölümü Laktat Dehidrojenaz (LDH) ve [2-(4-iyodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disülfofenil)-2H-tetrazolyum tuzu redüksiyonu (WST) testleri ile, apoptoz ise Cell Death ELISA kiti ve Akım sitometresi ile değerlendirilmiştir. Kaspaz aktiviteleri, kaspaz-3 için Ac-DEVD-pNA ve kaspaz-11 için Ac-LEDH-pNA substratları ile, Nitrit ölçümü ise Griess reaktifi kullanılarak analiz edilmiştir. İnflamatuar sitokinlerin (TNF-α, IL-1β ve IL-6) protein seviyeleri ve transkripsiyon faktörlerinin aktivasyon (NFκB, AP-1 ve Nrf2) analizi ELISA yöntemi ile, sitokinlerin ve Nrf2 hedef genlerinin mRNA seviyeleri ise qPCR yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir.
Çalışmamızda Lipopolisakkarid ile oluşturulan AİHÖ'ünde SFN'ın doza bağlı olarak koruyuculuk etkisini saptandı. İlaveten SFN'nin mikroglial hücrelerde apoptozu, kaspaz-3 ve kaspaz-11 aktivitesini azalttığı saptandı. SFN'nin TNF-α'nın salınımını doza bağlı olarak azalttığı belirlendi. SFN IL-1β'nın protein düzeyini hiçbir dozda etkilemezken, IL-6'nın protein düzeyini 10 μM dozda azalttığı belirlendi. Ayrıca SFN'nin TNF-α, IL-1β ve IL-6'nın mRNA düzeylerini azalttığı bulundu. SFN'nin nitrit ve reaktif oksijen türlerini doza bağlı olarak azaltıldığı saptandı. LPS ile artan NFκB ve AP-1, c-Fos alt birimi aktivasyonlarının SFN ile azaldığı bulundu. Ayrıca SFN'nin Nrf2 aktivasyonunu arttığı ve Nrf2 hedef genlerinin ekspresyonunu farklı zaman noktalarında düzenlendiği saptandı.
Bu çalışma SFN'nin mikroglial hücrelerde AİHÖ üzerine etkili olduğu gösteren ve bu etkinin hücre içi mekanizmasının aydınlatılmasını sağlayan ilk çalışmadır.

Abstract:
Activation Induced Cell Death (AICD) is a mechanism that controls proliferation of immune cells like microglia which are stimulated with pathogens. Sulforaphane is an isothiocyanate that has anti-inflammatory and antioxidant effects. The aim of this study is to investigate the effect of sulforaphane on Activation Induced Cell Death of microglial cells.
In this study, N9 murine microglial cell line was used. Cell death was assessed by LDH and WST-8 tests. Apoptosis evaluated by Cell death ELISA and using Flow Cytometry. Caspase activities were determined by using Ac-DEVD-pNA for caspase 3 and Ac-LEDH- pNA for caspase 11-like activity. Moreover, Nitrite assessment was done by using Griess Reagent. Levels of Inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6), transcription factors (NFκB, AP-1 ve Nrf2) were determined bu using ELISA method. Finally, mRNA levels of inflammatory cytokines and Nrf2 target genes were assessed by qPCR.
In our study, the protective effect of SFN was determined in a 3üpe dependent manner on LPS-induced AICD. Furthermore, SFN attenuated apoptosis of microglial cells and caspase 3 and 11-like activities. SFN reduced TNF-α secretion in a 3üpe dependent manner. While it did not effect IL-1β levels, IL-6 levels were decreased in at 3üpe of 10 μM of SFN. Moreover, SFN attenuated mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6. What is more, it was found that SFN decreased NO and ROS levels in a 3üpe dependent manner. In addition, Increased activation levels of NFκB and AP-1( c-Fos subunit) via LPS stimulation wad attenuated with SFN pretreatment. Besides, SFN increased Nrf2 activation and regulated Nrf2 target genes at different time points.
This study was the first study that SFN is effective on AICD of microglial cells and elucidated the mechanism of action.