Triple negatif meme kanserinde fotodinamik tedavi ve kemoterapinin kombin etkisinin belirlenmesi
Determination the effect of the combination treatment of photodynamic therapy and chemotherapy on triple negative breast cancer
Yazar: BEYZANUR ERK
Danışman: DOÇ. DR. GAMZE GÜNEY ESKİLER ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ALİ FURKAN KAMANLI
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
Dünyada en sık görülen kanser türlerinden biri olan meme kanserinin alt tipi olarak triple negatif meme kanseri (TNMK) östrojen ve progesteron reseptörlerinden ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2'den yoksun ve tüm meme kanseri vakalarının yaklaşık % 10-20'sini oluşturmaktadır.  TNMK'nın tedavisinde cerrahi, radyoterapi ve immünoterapi gibi yöntemler kullanılmakla birlikte birincil tedavi basamağı kemoterapidir. Ancak,  TNMK'nın heterojen ve agresif yapısı, yüksek rekürrens ve metastatik potansiyeli ve mevcut kanser tedavilerine dirençli olması yeni tedavi stratejilerine yönelik çalışmaların dikkat çekmesine neden olmaktadır. 
Kanser tedavisinde güncel yaklaşımlardan biri fotodinamik tedavidir. Fotodinamik tedavinin (FDT) temelinde ışığa duyarlı maddenin spesifik dalga boyundaki ışık ile uyarıldıktan sonra oksijen ile etkileşime girmesi sonucunda reaktif oksijen türlerini üretmesi ve fotokimyasal olayların indüklenmesi sonucunda oluşan reaktif oksijen türlerinin (ROS) kanser hücrelerinde apoptotik, nekrotik veya otofajik ölüme neden olması yer almaktadır. FDT'nin temelinde fotosensitizer (FS), ışık ve oksijen olmak üzere üç bileşen bulunmaktadır. Bu bileşenler tek başına etkin olmamasına rağmen, bir araya geldiklerinde kanser hücrelerinde sitotoksik etki göstermekte ve bu sayede hedef dokuya özgü daha yüksek seçicilik sağlamaktadır. Bu üç önemli unsurdan ilki olan FS, etkili FDT için ışık enerjisini soğuran ROS oluşumunu katalize eden bir fotoaktif moleküldür. FDT'de ışık kaynağı etkinliğinde ise hedef dokuda istenen etkinin sağlanabilmesi için doğru ışık dozu, yeterli FS konsantrasyonu ve oksijene ihtiyaç bulunmaktadır. Bu kapsamda, FDT uygulamalarında farklı lazer veya lazer olmayan ışık kaynağı kullanılmaktadır. FDT'de en önemli son parametre ise oksijendir. FDT'de ROS üretiminde oksijenin dokulardaki konsantrasyonu önemli rol aldığı için FDT'nin terapötik etkinliği hedef dokularda bulunan moleküler oksijen konsantrasyonuna bağlıdır. 
5-aminolevülinik asit (5-ALA) protoporfirin IX (PpIX)'un öncüsü olarak FDT uygulamalarında kullanılan bir FS'dir. 5-ALA PpIX'e dönüştüğünde aktif bir FS haline gelmektedir. Tek başına FS olmayan 5-ALA Hem biyosentetik yolağıyla hızla Hem'in başka bir öncüsü olan PpIX'e metabolize olarak aktif bir FS haline gelmekte ve 635 nm dalga boylarındaki ışık ile uyarıldığı zaman ROS miktarındaki artışa bağlı olarak hücrelerin mitokondrilerine hasar vermektedir. Daha önce yapılmış olan çalışmalarda 5-ALA temelli FDT'nin hücrelerde intraselüler PpIX birikimine neden olduğu, buna bağlı olarak artan ROS üretimi ile farklı kanser hücrelerinde sitotoksik etkisi belirlenmiştir.  Ancak, 5-ALA başta olmak üzere FS'lerin tek başına yeterli düzeyde etkin olmaması, ışığın hedef dokuya penetrasyonu, FS seçiciliğinden kaynaklı sorunlar ve oksijen hipoksisi gibi kısıtlamalar FDT'nin etkinliğini sınırlamaktadır. Bu çerçevede FDT ile diğer tedavi yöntemlerinin kombin uygulanmasına yönelik çalışmalar dikkat çekmektedir. Bu kapsamda,  literatürde oral hücreli skuamöz karsinom, meme kanseri, melanom ve akciğer kanseri hücrelerinde 5-ALA temelli FDT ile dosetaksel, sisplatin, fluorourasil ve gefitinib kemoterapi ajanlarının kombin uygulamasının tek başına uygulamalara göre daha etkin olduğu belirlenmiştir. Ancak, TNMK hücrelerinde 5-ALA/FDT ile kemoterapi ajanlarının kombin etkisine dair bir çalışmaya rastlanılmamıştır. 
Çeşitli kanser türlerinin tedavisinde kullanılan güçlü bir kemoterapötik ajan olarak sisplatin hücrenin DNA'sında eklentiler oluşturmakta ve böylece DNA replikasyonunu ve zincir uzamasını engelleyerek antineoplastik aktivite göstermektedir Buna rağmen, sisplatinin neden olduğu yan etkiler ve zamanla sisplatine karşı gelişen direnç sisplatinin tedavide etkin kullanımını kısıtlamaktadır. 
Bu çerçevede tez çalışmasında sisplatinin neden olduğu yan etkilerini azaltmak ve 5-ALA temelli FDT uygulamalarında sınırlamaların üstesinden gelmek için ilk kez TNMK ve sağlıklı meme hücrelerinde sisplatin temelli kemoterapi ile 5-ALA/FDT'nin kombin tedavisinin in vitro etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 
Sisplatin ile 5-ALA/FDT kombin tedavisinin MDA-MB-231 TNMK hücreleri ve MCF-10A sağlıklı meme epitel hücrelerinde etkisini incelemek için tek başına sisplatin ve 5-ALA/FDT ile karşılaştırmalı olarak eş zamanlı ve sıralı olmak üzere iki farklı sisplatin ve 5-ALA/FDT kombin tedavi seçeneklerinin anti-kanser etkisi belirlenmiştir. Bu kapsamda tek başına 1, 2.5 ve 5 µM sisplatin, tek başına 1 mM 5- ALA ile inkübe edilen hücrelere 1.5, 3, 6, 9 ve 12 J/cm2 enerji yoğunluklarındaki 635 nm diyot lazer uygulaması yapıldı ve 24 saat inkübasyon sonunda hücre canlılığı WST-1 analizi ile belirlendi. Eş zamanlı kombin tedavi uygulamasında hücrelere 1 mM 5-ALA ile birlikte 2.5 ve 5 µM sisplatin uygulanarak 4 saat inkübe edildikten sonra 1.5, 3, 6, 9 ve 12 J/cm2 enerji yoğunluklarında lazer ışıtması yapılmıştır. Sıralı kombin tedavide ise 1 mM 5-ALA ile 4 saat inkübe edilen hücreler belirtilen enerji yoğunluklarında lazer ışıması yapıldıktan sonra 2.5 ve 5 µM sisplatin eklendi ve  24 saat sonra sitotoksik etkisi WST-1 analizi ile belirlendi. Hücrelerde meydana gelen apoptotik ölüm miktarının tayini için Anneksin V analizi gerçekleştirildi. Ayrıca, tek başına sisplatin, 5-ALA/FDT uygulaması ile karşılaştırmalı olarak eş zamanlı 5-ALA/FDT ve sisplatin  kombin uygulamasının hücre morfolojisinin yanı sıra mitokondri ve nükleusta neden olduğu hasarın görüntülenmesi için akridin oranj, Mitotracker ve DAPI boyaması yapıldı.
Elde edilen WST-1 bulgularına göre, MDA-MB-231 hücrelerinde tek başına 2.5 µM sisplatin (% 73.96) ve 5-ALA/FDT'ye kıyasla (6 J/cm2: % 75.97 ve 9 J/cm2: % 59.55) 5-ALA/FDT ve sisplatin eş zamanlı kombin uygulamasının (1.5 J/cm2: % 121.89, 3 J/cm2: % 113.34, 6 J/cm2: % 55.77, 9 J/cm2: % 43.83, 12 J/cm2: % 58.02) daha etkin olduğu belirlendi. Ayrıca sıralı kombin tedavi uygulaması ile karşılaştırıldığında (1.5 J/cm2: % 128.05, 3 J/cm2: % 128.12, 6 J/cm2: % 90.99, 9 J/cm2: % 77.80, 12 J/cm2: % 76.51)  eş zamanlı kombin tedavinin hücrelerde daha fazla anti-proliferatif etkiye sahip olduğu analiz edildi (p<0.05*).  Diğer yandan,  eş zamanlı 5 µM sisplatin ve 5-ALA/FDT uygulanan MDA-MB-231 hücrelerinde 2.5 µM sisplatin ve 5-ALA/FDT'ye göre antagonistik etki göstererek hücre canlılığında özelikle 6  ve 9 J/cm2 enerji yoğunluklarında daha az etkin olduğu tespit edildi (6 J/cm2: % 72.9 ve 9 J/cm2: % 65.50). Diğer yandan, MCF-10A hücrelerinde sisplatin ve 5-ALA/FDT kombin uygulamasının (6 J/cm2: % 48.10 ve 9 J/cm2: % 47.25) tek başına 5-ALA/FDT'ye (6 J/cm2: % 40.54 ve 9 J/cm2: % 42.22) göre daha az toksik etkisi olduğu analiz edildi.  Anneksin V analizi sonuçlarına göre, MDA-MB-231 hücrelerindeki toplam apoptotik ölüm yüzdesi tek başına 2.5 µM sisplatin (% 37.88) ve 5-ALA/FDT'ye (6 J/cm2: % 31.48 ve 9 J/cm2: % 37.78) kıyasla eş zamanlı kombin tedavide (6 J/cm2: % 46.78 ve 9 J/cm2: % 53.6) anlamlı olarak arttığı analiz edildi (p<0.01**).  Ayrıca, sisplatin ve 5-ALA/FDT eş zamanlı kombin uygulamasının MDA-MB-231 hücrelerinde daha fazla apoptotik ölüme, nükleer ve mitokondriyal hasara neden olduğu tespit edildi.
Bu çalışma ile sisplatin ile 5-ALA/FDT kombin tedavisinin TNMK hücrelerinde anti-kanser etkisi ilk defa araştırılmıştır.  Elde edilen bulgular, eş zamanlı 2.5 µM sisplatin ile 1 mM 5-ALA uygulaması sonrasında 6 J/cm2 ve 9 J/cm2 enerji yoğunluklarındaki lazer ışıması yapılan TNMK hücrelerinde tek başına 5-ALA/FDT ve sisplatin uygulamasına göre daha etkin olduğu ve sinerjistik etki gösterdiği (kombinasyon indeksi<1) belirlenmiştir.  Ancak, sisplatin ile 5-ALA/FDT'nin kombin etkisinin TNMK hücrelerinde etkisinin moleküler düzeyde aydınlatılmasına yönelik ileri çalışmaların gerçekleştirilmesi gerekmektedir.

Abstract:
Triple-negative breast cancer (TNBC) which is one of the subtypes of breast cancer that is one of the most common cancer types in the world, is lack of estrogen and progesterone receptors and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) and constitutes approximately 10-20 % of all breast cancer cases. Although different methods such as surgery, radiotherapy, and immunotherapy can be used, the primary treatment option is chemotherapy for the treatment of TNBC. However, the heterogeneous and aggressive nature of TNBC, its high recurrence and metastatic potential, and its resistance to existing cancer treatments should be paid attention to studies on new treatment strategies.
One of the current approaches in cancer treatment is photodynamic therapy. Photodynamic therapy (PDT) is based on the production of reactive oxygen species (ROS) as a result of the interaction between molecular oxygen in cells and a photosensitizer (PS) substance that is stimulated by light in a specific wavelength. ROS are formed as a result of the induction of photochemical events also cause apoptotic, necrotic, or autophagic death in cancer cells. There are three components of PDT: photosensitizer (PS), light and oxygen. These components are harmless on their own, but when they are combined, they exhibit cytotoxic effects on cancer cells and thus, providing higher selectivity in the target tissue.  The first of these three important elements, PS, is a photoactive molecule that catalyzes the formation of ROS, which absorbs light energy for effective PDT. In the light source activity in PDT, the right light dose, sufficient PS concentration and oxygen are needed to achieve the desired effect in the target tissue. Within this framework, different laser or non-laser light sources are used in PDT applications. The most important last parameter in PDT is oxygen. Since the concentration of oxygen in the tissues plays an important role in the production of ROS in PDT, the therapeutic effectiveness of PDT depends on the molecular oxygen concentration in the target tissues.
5-aminolevulinic acid (5-ALA) is a PS used in PDT applications as a precursor to protoporphyrin IX (PpIX). When 5-ALA is converted to protoporphyrin, it becomes an active PS. 5-ALA is not PS alone, but it becomes an active PS by rapidly metabolizing another Hem precursor, PpIX, with the Hem biosynthetic pathway. Then, 5-ALA is excited by light at 635 nm wavelengths, and damages the mitochondria of the cells due to the increase in the amount of ROS. In previous studies, it has been determined that 5-ALA-based PDT causes intracellular PpIX accumulation in cells, and increased ROS production leads to its cytotoxicity in different cancer cells. However, limitations such as the ineffectiveness of PS, especially 5-ALA alone, the penetration of light into the target tissue, problems of PS selectivity, and oxygen hypoxia restrict the effectiveness of PDT. In this context, studies on the combination of PDT and other treatment methods has drawn attention. In this context, it has been determined in the literature that the combined applications of 5-ALA-based PDT and docetaxel, cisplatin, fluorouracil, and gefitinib chemotherapy agents are more effective than the monotherapies in oral cell squamous carcinoma, breast cancer, melanoma, and lung cancer cells. However, there is no study evaluating the combined effect of 5-ALA/PDT and chemotherapy agents in TNBC cells.
Cisplatin as a potent chemotherapeutic agent used in the treatment of various types of cancer forms inserts in the DNA of the cell. Thus, it shows antineoplastic activity by inhibiting DNA replication and chain elongation. However, the side effects caused by cisplatin and acquired resistance limit the effective use of cisplatin in treatment.
From this viewpoint, it was aimed to determine the effect of cisplatin-based chemotherapy and 5-ALA/PDT combination treatment in vitro in TNBC and healthy breast cells for the first time to reduce the side effects caused by cisplatin and overcome the limitations in 5-ALA-based PDT applications.
To determine the effect of the combined treatment of cisplatin and 5-ALA/PDT in MDA-MB-231 TNBC cells and MCF-10A healthy breast epithelial cells, the anti-cancer effects of two different cisplatin and 5-ALA/PDT combined treatment options, simultaneously and sequentially, were compared with cisplatin alone and 5-ALA/PDT were determined. In this context, the cells treated with 1, 2.5 and 5 µM cisplatin alone or 1 mM 5-ALA and irradiated with 635 nm diode laser at energy densities of 1.5, 3, 6, 9 and 12 J/cm2 and the cell viability was determined by WST-1 analysis after 24 h incubation. In the simultaneous combined treatment application, 2.5 and 5 µM cisplatin was applied to the cells with 1 mM 5-ALA and after incubation for 4 hours, laser irradiation was performed at energy densities of 1.5, 3, 6, 9 and 12 J/cm2. In the sequential combination treatment, the cytotoxic effect of cells incubated with 1 mM 5-ALA for 4 hours and after laser irradiation at the indicated energy intensities, the cells were incubated with 2.5 and 5 µM cisplatin and the cell viability was determined for 24 hours. In this study, the cytotoxicity was determined by WST-1 analysis, and the total amount of apoptotic cell death was determined by Annexin V analysis. Additionally, acridine orange, MitoTracker, and DAPI staining were performed to observe the damage in the cell morphology, mitochondria and nucleus caused by cisplatin and 5-ALA/PDT alone and their combination treatment.
After the application of 2.5 µM cisplatin and 1 mM 5-ALA to MDA-MB-231 and MCF-10A cells, they were visualized with a red filter, and it was observed that the amount of intracellular PpIX associated with ROS production increased. 
According to the WST-1 results, it was determined that the simultaneous application of 5-ALA/PDT and cisplatin (1.5 J/cm2: 121.89 %, 3 J/cm2: 113.34 %, 6 J/cm2: 55.77 %, 9 J/cm2: 43.83 %, 12 J/cm2: 58.02 %) was more effective in MDA-MB-231 cells compared to 2.5 µM cisplatin (73.96 %) and 5-ALA/PDT (6 J/cm2: 75.97 % and 9 J/cm2: 59.55 %) monotherapies. Besides, it was analyzed that the simultaneous combination therapy had more anti-proliferative effect on cells compared to the sequential combination therapy (1.5 J/cm2: 128.05 %, 3 J/cm2: 128.12 %, 6 J/cm2: 90.99 %, 9 J/cm2: 77.80 %, 12 J/cm2: 76.51 %) (p<0.05*). On the other hand, when MDA-MB-231 cells treated with 5 µM cisplatin and 5-ALA/PDT simultaneously, it showed an antagonistic effect compared to 2.5 µM cisplatin and 5-ALA/PDT combination, and was less effective on cell viability, especially at energy densities of 6 and 9 J/cm2 (6 J/cm2: 72.9 % and 9 J/cm2: 65.50 %). On the other hand, combined administration of cisplatin and 5-ALA/PDT (6 J/cm2: 48.10 % and 9 J/cm2: 47.25 %) compared to 5-ALA/PDT alone (6 J/cm2: 40.54 % and 9 J/cm2: 42.22 %) induced less toxic effects in MCF-10A cells.
According to the results of the annexin V analysis, the percentage of total apoptotic death significantly increased in the simultaneous combined treatment (6 J/cm2 :46.78 % and 9 J/cm2: 53.6 %) compared with 2.5 µM cisplatin (37.88 %) and 5- ALA/PDT alone (6 J/cm2: 31.48 % and, 9 J/cm2: 37.78 %) in MDA-MB-231 cells (p<0.01**). In addition, it was determined that the simultaneous combination treatment of cisplatin and 5-ALA/PDT caused more apoptotic death and nuclear and mitochondrial damage in MDA-MB-231 cells. Differently from this, less apoptotic death and nuclear and mitochondrial damage were observed in MCF-10A cells treated with combination therapy compared to MCF-10A cells treated with cisplatin or 5-ALA/PDT monotherapies.
In this study, the anti-cancer effects of cisplatin and 5-ALA/PDT combination treatment on TNBC cells were investigated for the first time. The findings showed that the simultaneous application of 2.5 µM cisplatin and 1 mM 5-ALA irradiated by 6 J/cm2 and 9 J/cm2 energy densities is more effective than 5-ALA/FDT and cisplatin alone and the simultaneous combination therapy exerts a synergistic effects (Combination index<1).  However, further studies are needed to elucidate the combined effect of cisplatin and 5-ALA/PDT on TNBC cells at the molecular level. On the other hand, 5-ALA/PDT combination treatment with cisplatin exerts toxicity in MCF-10A normal cell line. Therefore,  nanoparticulate drug delivery systems  could be used for reducing the toxic effect of 5-ALA with cisplatin combination on MCF-10A cells and  increasing the selectivity in the target tissue. Additionally, further studies can be carried out with advanced molecular analysis to optimize  the PDT application protocol and to detect each FS in cancer cells after irradiation. Finally, the combined effects of different types of PS and cisplatin in different cancer types will be further analyzed.