Hipokampal mikroglia aktivasyonu ile serum S100B düzeyi arasındaki olası korelasyonun sıçanlarda lityum-pilokarpin ile oluşturulan deneysel bir status epileptikus modelinde incelenmesi ve minosiklinin etkilerinin araştırılması
Investigation of the putative correlation between hippocampal microglia activation and serum S100B level lithium – pilocarpine induced status epilepticus model in rats and evaluation of the effects of minocycline
Yazar: ERKUT BAHA BULDUK
Danışman: PROF. DR. GÖKHAN KURT
Gazi Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroşirürji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Epilepsi = Epilepsy ; Hipokampus = Hippocampus ; Lityum = Lithium ; Makrofajlar = Macrophages ; Pilokarpin = Pilocarpine ; Protein S = Protein S ; Sıçanlar = Rats ; Tedavi = Treatment

Özet:
Bu çalışmanın amacı hipokampal mikroglia aktivasyonu ile serum S100B düzeyi arasındaki olası korelasyonun lityum-pilokarpin ile oluşturulan deneysel bir status epileptikus modelinde incelenmesi ve minosiklin'in etkilerinin araştırılmasıdır. Deneylerde 12 haftalık 200-250 g arası ağırlığa sahip erkek Sprague-Dawley sıçanlar kullanıldı (n=24). Sıçanlar, 4 gruba ayrıldı. Deney grubunda lityum-pilokarpin ile SE indüklenmiş hayvanlar yer aldı. Deney hayvanlarına pilokarpin enjeksiyonundan 24 saat önce lityum klorid uygulandı (127 mg/kg. i.p.). Pilokarpin tek doz olarak uygulandı (30 mg/kg, i.p.). Ayrıca pilokarpin'den 30 dakika önce kolinerjik yan etkileri ortadan kaldırmak maksadı ile sıçanlara metilskopolamin-bromid (1mg/kg) verildi. Nöbetler Racine skalasına göre derecelendirildi.  SE'nin başlangıcı süregelen nöbet aktivitesinin başlangıcı olarak tanımlandı (nöbetler arasında normalleşme olmaksızın) . SE oluşan sıçanlarda, SE süresi i.p. diazepam (10 mg/kg) ile kontrol altına alındı. 
Deney grupları aşağıdaki şekilde planlanmıştır:
Grup 1(Kontrol, n=6): Bu gruptaki hayvanlara herhangi bir işlem uygulanmadı.
Grup 2 (Sham,n=6): Sıçanlara lityum, metilskopolamin ve pilokarpin yerine salin verildi. Salin enjeksiyonundan 2 saat sonra tek doz diazepam enjekte edildi.
Grup 3 (Status Epileptikus): Sıçanlara pilokarpin enjeksiyonundan 24 saat önce lityum klorid uygulandı (127 mg/kg. i.p.). Pilokarpin tek doz olarak uygulandı (30 mg/kg, i.p.). Ayrıca hayvanlara metilskopolamin de verildi. Nöbetleri sonlandırmak  için ilk pilokarpin dozundan 60 dakika sonra diazepam ( 10 mg/kg i.p. ) uygulandı. 3, 4, 5, 6 ve 7. günlerde bütün sıçanlara ölüm oranını azaltmak için 09:30-10:30 ve 16:30- 17:30 zaman dilimlerinde günde 2 defa 5 ml subkutan enjeksiyon ile salin ve gavaj ile yaklaşık 1 ml TPN solüsyonu verildi
Grup 4 (Status Epileptikus + Minosiklin): Grup 3'deki aynı deney protokolü minosiklin varlığında tekrarlandı. Minosiklin 0.1 M fosfat tamponu içerisinde çözülerek (pH:7.4),  i.p olarak 3, 4, 5, 6 ve 7. günlerde 50 mg/kg dozunda uygulandı.
 Lityum uygulamasını takiben 8. günde sıçanların tamamının hipokampusları çıkarıldı ve dorsal hipokampusta OX-42 ve GFAP ekspresyonu immünhistokimyasal yöntemlerle değerlendirildi. Ayrıca, hipokampuslar çıkarılmadan önce hayvanların periferik venlerinden kan alınarak S100B tayini yapıldı. 
Bu çalışmanın sonucunda, Kontrol grubuna göre SE ve SE + Minosiklin gruplarındaki kan S100B düzeylerindeki yüksekliğin, literatüre bakıldığında eksitotoksik hasar sonucu glialar tarafından salınan S100B' nin , sürmekte olan hasarı ve buna karşı gelişen glial reaktiviteyi yansıtmasından kaynaklandığını düşündürdü. Ayrıca Kontrol grubundaki CA1'de OX42 (+) mikroglia sayısı ve DG'de GFAP (+) astrosit sayısının SE grubundan anlamlı olarak daha düşük bulunması ise epilepsi gibi nörodejeneratif hastalıklarda  nöroinflamatuar süreçlerin tetiklendiği mikroglial aktivasyonun varlığını düşündürdü.

Abstract:
The purpose of this study is the investigation of the effect of Minocycline and the possible correlation between hippocampal microglial activation and S100B serum in an experimental status epilepticus model. In the experiments, 12 week old male Sprague-Dawley rats weighting 200 to 250 grams were used (n=24). Rats were separated in to four groups. Animals induced with lithium and pilocarpin was used in the experiment group. Lithium chloride was given to the experimental animals 24 hours before the injection of pilocarpin (127 mg/kg. i.p.). One dose of Pilocarpin was applied (30 mg/kg, i.p.). Besides that methilschoplamine-bromide (1mg/kg) was given to the animals 30 minutes before pilocarpin injection to remove the cholinergic side effects.  Seizures were degreed due to Racine scale. The beginning of SE was defined as the start of lasting seizure activity (without normalizing between seizures). SE time was taken under control using diazepam (30 mg/kg, i.p.) in the rats having SE.
Experiment groups are planned as follows:
Group 1 (Control,n=6): There was no proceeding on the animals in this group.
Group 2 (Sham,n=6): Saline was given to the animals instead of Lithium, methilescopolamine. One dose of diazepam was injected after 2 hours of Saline injection.
Group 3 (SE):  Lithium Chloride (127 mg/kg. i.p.). was applied to the animals 24 hours before one dose of  pilocarpin injection(30 mg/kg, i.p.). Methilescopolamine was also given. Diazepam (10 mg/kg i.p. ) was applied after 60 minutes of pilocarpin injection to end the seizures. At the days of 3, 4, 5, 6 and 7, subcutaneous injection with 5 ml saline and gavage and 1 ml TPN solution is given to the rats two times a day between 09:30-10:30 and 16:30- 17:30 to reduce the death rate.
Group 4 (SE + minocycline): the experiment protocol in the group 3 was repeated with the existence of minocycline.  Minocycline dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH:7.4,  i.p ) was applied with a 50 mg/kg dose at the days 3, 4, 5, 6 ve 7.
After Lithium application at eight day all the hippocampuses of the rats was removed and OX-42 and  GFAP  expression  in the dorsal hippocampus  was evaluated with immunohistochemical methods. Besides, determination of S100B was performed by taking blood from peripheral veins before the removel of hippocampuses.
As a result of this, the high levels of S100B at SE and SE+ minocycline groups with respect to the control group suggest that    S100B released from glias as a result of excitotoxic injury is the projection of the ongoing injury and glial reactivity developing against it referring to the literature. Also  the significant low level of OX42 (+) microglia number and GFAP (+) astrocyte number  in the control group at CA1 with respect to SE group suggests the presence of microglial  activation triggered by  neuroinflammatory processes in neurodegenerative diseases like epilepsy.