Gluten degrede eden laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve karakterizasyonu
Isolation and characterization of gluten-degrading lactic acit bacteria
Yazar: SEDA HACIOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. BUKET KUNDUHOĞLU
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bakteri izolasyonu = Bacterial isolation ; Buğday gluteni = Wheat gluten ; Enzimatik hidroliz = Enzymatic hydrolysis ; Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria ; Çölyak hastalığı = Celiac disease

Özet:
Çölyak hastalığı (ÇH), genetik olarak yatkın kişilerde ortaya çıkan kronik bir otoimmün hastalıktır. Gluteni antijenik olmayan peptidlere parçalayan probiyotikler, ÇH'li bireylerde semptomları hafifletmek ve bağırsaklarındaki yararlı mikrobiyotayı geliştirme konusunda umut vericidir.  Bu nedenle bu çalışmada farklı un, ekşi maya, hamur ve peynir örneklerinden izole edilmiş laktik asit bakterisi (LAB) suşlarının gluten hidroliz yetenekleri ve probiyotik özellikleri belirlenmiştir.  Bu suşlar içinde buğday gluteni bulunan iki farklı Gluten Agara (GA-1 ve GA-2) ekilmiş ve inkübasyonun ardından plaklar Coomassie Blue Brillant R-250 protein boyası ile boyanmıştır.  GA-1 ve GA-2 plaklarında gelişen kolonilerin çevrelerindeki renksiz zonlar gluten hidrolizini işaret etmiştir.  İzolatlardan (119 adet) 43'ünün, hem aerobik hem de anaerobik koşullarda gluteni hidrolize edebilen LAB suşları olduğu belirlenmiştir.  Daha sonra bu suşların bazı temel probiyotik özellikleri araştırılmıştır. Düşük pH'da (pH 1-4), safra tuzlarında (%0,3-0,6) ve yapay mide sıvısında (pH 2 ve 3) canlı kalan suşlar arasından en iyi olanları seçilmiş (11P, 16P, 38P, 104P, 16, 23, 24, 28, 65, 68, 107 ve 108 ) ve bunlar sonraki çalışmalarda kullanılmıştır.  Bu suşlardan otoagregasyon kapasitesi ve hidrofobisitesi en yüksek olanlar, sırasıyla, 108 (%23,9) ve 24 nolu (%99,2) suşlardır.  Suşların çoğunluğu aerobik koşulda, anaerobik koşuldakine göre, daha geniş hidroliz zon çapları oluşturmuştur. 23, 24, 68 ve 107 no.lu suşlar pH'ı 3-8 arasında değişen GB-2 besiyerlerine ekilmiş ve tüm pH seviyelerinde gluten hidrolizi meydana geldiği belirlenmiştir.  38P nolu suşun 33-mer peptidlerin miktarını 495,2 mg/dl'den  431,6 mg/dl'ye düşürdüğü görülürken, 107 nolu suş 369,9 mg/dl'ye düşürmüştür.  107 no.lu suşun, konağı enfeksiyondan koruyucu/tedavi edici etkisi (Escherichia coli O157:H7'ye karşı) ve enfektif dozunu belirlemek için Galleria mellonella larvaları kullanılmıştır.  Sonuç olarak 107 no.lu suşun koruyucu etkisi %91 iken, tedavi edici etki %84 olmuştur.
Çalışmadan elde edilen bulgular, gluteni hidrolize edebilen ve birçok temel probiyotik özelliğe sahip olan suşların, ÇH'li bireyler için probiyotik takviye olarak kullanım potansiyeli olduğunu göstermiştir.

Anahtar kelimeler: Laktik asit bakterisi, Probiyotikler, Çölyak, Gluten hidrolizi, Gliadin hidrolizi, Galleria mellonella

Abstract:
Celiac disease (CD) is a chronic autoimmune disease that occurs in genetically susceptible individuals. Probiotics that break down gluten into non-antigenic peptides for susceptible individuals are promising for relieving symptoms in individuals with CD and improving the beneficial microbiota in the host gut.  Therefore, gluten hydrolysis capabilities and probiotic properties of LAB strains isolated from different flour, sourdough, dough and cheese samples were determined in this study. These isolates were inoculated into two different Gluten Agar plates (GA-1 and GA-2) containing wheat gluten, after incubation the plates were stained with Coomassie Blue Brilliant R-250 protein dye.  Colorless zones around the colonies that developed in GA-1 and GA-2 plates indicated gluten hydrolysis. It was determined that 43 of the 119 isolates were LAB strains that can hydrolyze gluten under both aerobic and anaerobic conditions. Then, some basic probiotic properties of these strains were investigated.  Among the strains that survive at low pH (pH1-4), bile salts (0.3-0.6%) and artificial gastric fluid (pH2 and 3), the best ones were selected (11P, 16P, 38P, 104P, 16, 23, 24, 28, 65, 68, 107, and 108), and these were used in subsequent studies.  Among these strains, the ones with the highest auto-aggregation capacity and hydrophobicity are 108 (23.9%) and 24 (99.2%) strains, respectively.  Compared to anaerobic condition, most of the strains produced larger hydrolysis zone diameters in aerobic condition.  Strains 23, 24, 68 and 107 were inoculated into GB-2 broth with pH varying ranged 3-8 and it was determined that gluten hydrolysis occurred at all pH levels.  While strain 38P decreased the amount of 33-mer peptides from 495.2 mg/dl to 431.6 mg/dl, strain 107 decreased to 369.9 mg/dl.  Galleria mellonella larvae were used to determine the preventive / therapeutic effect (against Escherichia coli O157: H7) and the infective dose of strain 107.  As a result, while the preventive effect of strain 107 was 91%, the therapeutic effect was 84%.
Findings obtained from the study showed that strains that can hydrolyze gluten and have many basic probiotic properties have the potential to be used as probiotic supplements for individuals with CD.

Keywords: Lactic acid bacteria, Probiotics, Celiac, Gluten hydrolysis, Gliadin hydrolysis, Galleria mellonella