NGF uyarımlı nöronal farklılaşma modelinde shootin1 proteininin tanımlanması ve ilişkili hücre-içi sinyal iletim yolağının ortaya çıkarılması
Identification of shootin1 protein and determination of related intracellular signaling pathway in an NGF-stimulated neuronal differentiation model
Yazar: VOLKAN ERGİN
Danışman: PROF. DR. EMİNE SEVDA MENEVŞE
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Aksonlar = Axons ; Fosfatidilinozitoller = Phosphatidylinositols ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücre iletişimi = Cell communication ; Hücreler = Cells ; Nöronlar = Neurons ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Merkezi ve periferal sinir sisteminin gelişimi, sinir hücrelerinin öncü hücrelerden farklılaşması ve nöronlara işlevselliklerini kazandıran akson ve dendrit yapılarının oluşmasıyla karakterizedir. Bu özelliği edinmelerini sağlayan temel biyolojik olgu, sinir hücresi farklılaşması denilen ve doğası henüz tam olarak anlaşılamamış bir süreçtir. Bu süreçleri yöneten ve yürüten moleküler mekanizmaların anlaşılması günümüz sinirbilim, hücre biyolojisi ve tıbbi bilimlerin temel araştırma alanlarından birisidir. 2006'da embriyonik sıçan hipokampal nöronlarında tanımlanan Shootin1, akson oluşumunda rol aldığı gösterilen bir proteindir. Literatürde beyine özgü olarak kabul edilen bu proteinin, yaptığımız çalışmalar neticesinde beyin kökenli olmayan PC12 hücre hattında varlığı ilk kez gösterilmiştir. PC12 hücrelerinin nöronal farklılaşma sürecini başlatan sinir büyüme faktörü (NGF); Ras/MAPK, PI3K/Akt ve PLCg olmak üzere üç farklı ana hücre-içi yolağı harekete geçirmektedir. Bu yolaklar; nörona özgü proteinlerin ifadelenmesi ve nöronal uzantıların oluşumu ile karakterize sinir hücresi farklılaşmasını yürüten hücre-içi aracı moleküllerin ve bu süreçte rol oynayan çeşitli transkripsiyon faktörlerinin etkinleşmesini sağlamaktadır. Bahsi geçen yolakların her biri farklı kimyasal inhibitörler kullanılarak seçici bir şekilde baskılanarak ve Shootin1 proteininin bu yolaklardan PI3K/Akt yolağı ile ifadelendiği ortaya konulmuştur. Bunun yanı sıra laboratuvarımızda GFP işaretli ve Shootin1 shRNA ifadeleyen plasmid kullanılarak PC12 hücrelerinde gen aktarımı sonrasında NGF ile uyarılan kontrol hücrelerine nazaran aksonogenezde anlamlı bir gecikme olduğu gözlenmiştir. Bu bulgular neticesinde Shootin1 proteinin, nöronal morfolojinin tesisi sırasında önemli bir aracı molekül olduğu, PI3K/Akt yolağı tarafından ifadelendiği ve beyine özgü olarak kabul edilen bu proteinin beyin kökenli olmayan bir hücrede yine aynı amaca hizmet edecek şekilde ifadelenmesi bu proteinin bir nöral belirteç olma olasılığını güçlendirmektedir.

Abstract:
Development of the central and peripheral nervous system is characterized both by differentiation of progenitor cells into adult neurons and by formation of axons and dendrites, cellular compartments that give neurons their functionalities.  The basic biological phenomenon that gives these cells their capability is neuronal differentiation, a complex process that is not completely understood, yet. Revealing the molecular mechanisms that regulate and mediate this process is one of the fundamental research fields of recent neuroscience, cell biology and medical studies. Shootin1, which is originally identified in rat hippocampal neurons in 2006, is a protein that has a role in axonogenesis. Our preliminary studies have demonstrated for the first time that Shootin1 protein, which is reported as brain-specific, is also expressed in PC12 cells, which is a cell line established from a non-brain tissue. In this project, by using various molecular biological techniques, we aim to identify the functionality of Shootin1 in PC12 cells during neuronal differentiation and to reveal its molecular localization within the network of intracellular signaling pathways. NGF, which initiates the neuronal differentiation of PC12 cells, triggers three main intracellular signaling pathways: Ras/MAPK, PI3K/Akt and PLCg. These pathways activate intracellular mediator molecules and transcription factors that operate neuronal differentiation process, which is characterized by the expression of neuronal marker proteins per se. In this project, by using specific chemical inhibitors, each of the pathways mentioned are selectively blocked; as a result, it is revealed that Shootin1 is mainly activated via PI3K/Akt pathway. In addition to this, using the GFP-tagged and Shootin1 shRNA plasmid, it is demonstrated that axonogenesis during NGF induced-differentiation is significantly delayed in Shootin1-silenced PC12 cells. Our results provide evidences for the role of Shootin1 protein as a mediator molecule in neuronal morphogenesis and that it is activated via PI3K/Akt pathway. Taken together with our data showing that this protein is also expressed and functioned similarly in a non-brain cell line, these results increase the probability of Shootin1 being a neuronal marker.