Embriyonik kök hücre ve insülin taşıyan lipozom, nanopartikül ve kohleat formülasyonlarının geliştirilerek etkinliğinin incelenmesi
Development and investigation of efficiency of embryonic stem cell and insulin-loaded liposome, nanoparticle and cochleate formulations
Yazar: ÇİĞDEM YÜCEL
Danışman: PROF. DR. ZELİHAGÜL DEĞİM
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Embriyo = Embryo ; Kök hücreler = Stem cells ; Lipozomlar = Liposomes ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; İnsülin = Insulin

Özet:
Diyabet, pankreastaki beta hücrelerinden insülin yapımının yetersiz oluşu ya da üretilen insülinin yeterince etki göstermemesi nedeni ile karbonhidrat, yağ, protein metabolizmasındaki bozuklukla karakterize kronik bir hastalıktır. Diyabet tedavisindeki en önemli araçlardan biri olan insülin Langerhans adasının beta hücreleri tarafından salınır. Diyabette bu hücreler hasar gördüğü için farklı kaynaklardan yeniden eldesi ile yeni hücrelerin oluşturulması düşüncesi kök hücre çalışmalarına hız kazandırmıştır. Embriyonik kök hücreler sınırsız olarak çoğalabilme yeteneğinden dolayı diyabet, miyokart enfarktüsü ve parkinson gibi hemen hemen bütün dejeneratif ve hasar görmüş dokuların yenilenmesinde kullanılabilmektedir. Çalışmamızda, beş farklı formülasyon (lipozom, pegile lipozom, nanokohleat, pegile nanokohleat ve nanopartikül) hazırlandı. İnsülin ve fare embriyonik kök hücre ile hazırlanan lipozomal ve nanopartiküler formülasyonların glukoz ve streptozosin çözeltisi ile diyabetik hale getirilmiş pankreatik beta TC hücreleri ve farelere uygulanmasının ardından hem in vitro hem de in vivo etkinliği incelendi. Formülasyonlarda kullanılacak maddelerin farklı derişimleri için MTT testleri yapıldı. Hazırlanan lipozom, nanokohleat ve nanopartikül formülasyonlarının karakterizasyonu (morfoloji, partikül büyüklüğü, zeta potansiyel ve yükleme etkinliği)  ve üç farklı sıcaklıkta (4⁰C ve 25⁰C) stabilite çalışmaları yapıldı. EKH ile hazırlanan formülasyonlarda yükleme etkinliği insülin ile hazırlanan formülasyonlardan farklı olarak hücre sayımı ve western blot yöntemi ile de analiz edilmiştir. İnsülinin pankreatik beta TC hücre kültürlerinden geçiş özellikleri, formülasyonlardan salım kinetikleri kıyaslanarak incelendi. Hücre kültürü geçiş çalışmaları sonucunda geçirgenlik katsayıları ve elektriksel dirençleri hesaplandı. İnsülin yüklü lipozomlarda en yüksek geçirgenlik katsayısı ve en düşük direnç elde edildi. Diyabetik hale getirilmiş hücrelere formülasyonların uygulanmasının ardından glukoz ve insülin miktarlarındaki değişimler kit ile ölçüldü. İn vivo çalışmalarda insülin yüklü formülasyonların i.p. uygulanmasının ardından 24 saat boyunca belirli zaman aralıklarında alınan örneklerden glukoz ve insülin miktar tayini yapıldı. İnsülin yüklü formülasyonların aynı örnek alma zamanlarında hücre geçiş çalışmaları ile kan örnekleri arasındaki in vivo-in vitro korelasyon incelendi. İnsülin yüklü lipozomlarda en yüksek korelasyon katsayısı bulundu (r2=0,967). Diyabet tedavisindeki yeni yaklaşımlardan olan kök hücre ile hazırlanan formülasyonlar hem i.p. hem de pankreas içi uygulandı ve farelerin pankreasları histopatolojik olarak incelendi. Özellikle lipozomlar ile Langerhans adacık sayısı ve kapladığı alan bakımından en yüksek sonuçlar elde edilmiş (p<0,01) ve bu formülasyonların diyabet tedavisinde umut vaad ettiği, tedaviye katkıda bulunacağı düşünülmüştür.

Abstract:
Diabetes is a chronic disease that takes place because of insufficient insulin build in the beta cells located in pancreas or inability of the insulin to act resulted in an imbalance in the carbohydrate, lipid and protein metabolism. Insulin is released by the beta cells of the islands of Langerhans that is one of the most important tools in the treatment of diabetes. Because of these cells are damaged in diabetes, the stem cell studies are increasing rapidly due to regain of beta cells from different sources. Embryonic stem cells (ESCs) because their ability to proliferate without limitation, may be used in the regeneration of damaged tissue. such as diabetes, myocardial infarction and Parkinson. In our study, we used five (liposome, Peg-liposome, nanocochleate, Peg-nanocochleate and nanoparticle) different formulations. After administration of liposomal and nanoparticulate formulations prepared with insulin and mouse embryonic stem cells to diabetic pancreatic beta TC cells and mice by glucose and streptozocin solution, activity was investigated both in vitro and in vivo. For different concentrations of the substance to be used in the formulations, MTT assays were performed. Characterisation (morphology, particle size, zeta potential and encapsulation efficieny)  of liposomes, nanocochleates and nanoparticulate formulations were performed and stability was investigated under three different conditions (4⁰C and 25⁰C). Encapsulation efficiency of ECHs formulations were calculated by cell counting and were also analyzed by western blotting unlike insulin formulations. Permeation properties of insulin through pancreatic beta TC cell line, release kinetics of formulations were investigated and compared. The permeability coefficient and electrical resistance of formulations were calculated after cell culture permeation studies. The highest permeability coefficient and lowest resistance is obtained from insulin-loaded liposomes. After applying formulations to diabetic pancreatic beta TC cell, changes in glucose and insulin concentrations were measured with the kit. In in vivo studies, after the  intraperitonal administration of insulin-loaded liposome formulation, samples were assayed for glucose and insulin amounts at determined time periods during 24 hours. At the same sampling time, calculated insulin amount from cell transport studies and blood samples were examined for the in vivo-in vitro correlation. Insulin-loaded liposomes were found in the highest correlation coefficient (r2=0,967). Formulations that were prepared with new approaches in the treatment of diabetes stem cells administered both intraperitonally and intrapancreas and pancreases of mice were examined histopathologically. The highest results (p<0,01) were obtained with liposomes in terms of the number of islets of Langerhans and the covered area and these formulations shown promise in the treatment of diabetes, which is thought to contribute to therapy.