İpek fibroin/polidimetilakrilamid esaslı yarı içiçe geçmiş (semi-IPN) hidrojellerin sentezi ve karakterizasyonu
Synthesis and characterization of semi-interpenetrating polymer network hydrogel based on silk fibroin/poly(dimethylacrylamide)
Yazar: TUĞBA ÇELİKER
Danışman: PROF. DR. OĞUZ OKAY
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Hidrojeller suda çözünmeden yüksek miktarda su veya biyolojik sıvı absorplayabilen hidrofilik malzemelerdir. Akıllılık, yumuşaklık ve su depolayabilme özellikleri hidrojelleri eşsiz birer malzeme haline getirmektedir. Sentetik hidrojeller biyolojik dokulara çok benzemesine rağmen, genellikle kırılgandırlar ve kuvvet dayanımı gerektiren uygulamalarda kullanımlarını sınırlandırmaktadır. Kimyasal çapraz bağlı hidrojellerin düşük mekanik özellik göstermelerinin nedeni parçalanma anında etkili bir enerji dağıtım mekanizmalarının bulunmamasıdır. Yüksek tokluğa sahip jeller elde edebilmek için hidrojel numunesi içerisinde moleküler düzeyde bir enerji dağıtım mekanizması oluşturmak gerekir. Son yıllarda tok jeller elde etmek için geliştirilen yöntemlerden bir tanesi de iç içe geçmiş ağ yapılı (IPN) jel tekniğidir. Bu teknik sayesinde etkin bir enerji dağıtım mekanizması oluşturularak yüksek tokluk, yüksek basma dayanımı ve parçalanma enerjisi gösteren jellerin üretimi gerçekleştirilmektedir. IPN ve yarı içi içe geçmiş (semi-IPN) polimerik ağ yapılar ilk kez 1900'lü yıllarda literatüre girmiş ve bu çalışmalar ile bu malzemelerin ilaç taşıyıcı ve hücre kültürlerinde yapı iskelesi olarak kullanılabilecekleri ortaya konmuştur. IPN, aralarında hiçbir kimyasal bağ olmayan en az iki farklı öncül malzeme içeren bunlardan en az birinin diğerinin varlığında sentezlendiği ve/veya çapraz bağlandığı üç boyutlu polimerik ağ yapılardır; elde edilen yeni jel, IPN; bileşenleri ile sentezlenen bireysel jellere kıyasla çok daha iyi mekanik dayanıklılık göstermektedir. 
İpek, ipek böceklerinden ve bazı örümcek türleri tarafından üretilen doğal bir polimerdir. İpek biyouyumluluğu, biyobozunurluğu ve üstün mekanik özelliklere sahip olması, biyomedikal uygulamalarda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bombyx mori ipek böceği kozalarından elde edilen ipek esas olarak iki protein bileşeninden oluşur, bunlar fibroin ve serisin proteinleridir. Fibroin ipek liflerinin yapısal proteinidir, serisin ise fibroin liflerini birbirine bağlayan suda çözünebilen yapışkan kısımdır. Fibroin ağırlıklı olarak glisin ve alanin amino asitlerinden oluşmaktadır. Bu aminoasitler fibroin zincirlerindeki büyük hidrofobik blokları oluştururken bu blokların arasında ve zincir uçlarındaki diğer aminoasitler de hidrofilik blokları oluşturarak fibroinin kopolimerik bir mimariye sahip olmasını sağlamaktadır. Fibroinin yapısındaki hidrofilik kısımlar suda çözünmeyi sağlarken; hidrofobik kısımlar arasında meydana gelen -tabakalar ise malzemeye mukavemet ve sertlik kazandırmaktadır.
Fibroinin jelleşmesinin temel nedeni hidrofobik kısımlar arasında meydana gelen etkileşimler sonucu rastgele yumak yapıdan tabaka yapısına geçişin gerçekleşmesidir. Diğer proteinlerin jelleşmesine oranla fibroinin jelleşmesi için uzun bir süre gerekmektedir. 2012 yılında araştırma grubumuz tarafından geliştirilen bir yöntemle fibroinin jelleşme süreci kısaltılmıştır. Bu yöntemde fibroin çözeltilerine diepoksitlerin ilavesi ile fibroin zincirleri üzerindeki hidrofilik gruplar birbirine bağlanarak molekülün hareketliliğini azaltmakta ve bu da hidrofobik blokların birbirine yaklaşmasına neden olarak -tabaka oluşumunu hızlandırmakta ve jelleşme süresini birkaç haftadan bir  günün altına düşürmektedir. Ancak elde edilen tek ağ yapılı fibroin hidrojelleri özellikle stres dayanımı gerektiren uygulamalar için yeterli mekanik dayanıma sahip değildir.
Bu tez çalışması kapsamında mekanik dayanımı düşük olan tek ağ yapılı fibroin hidrojellerinin mekanik dayanımını arttırmak için fibroin ve N,N-dimetilakrilamid (DMA) monomeri değişik oranlarda karıştırılarak ipek fibroin/polidimetilakrilamid (SF/PDMA) semi-IPN hidrojelleri elde edilmiştir. Bu amaçla farklı konsantrasyonlarda fibroin içeren sulu çözeltilere değişen miktarlarda DMA ilave edilmiş ve DMA'nın fibroin varlığında polimerizasyonu amonyum persülfat (APS)-N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin (TEMED) redoks başlatıcı sistemi ile 50°C'de gerçekleştirilmiştir. Üç seri deneme yapılmıştır. Birinci seri denemelerde fibroin/DMA ağırlıkça eşit (50/50) tutulmuş; toplam fibroin+DMA konsantrasyonu %25, %16 ve %8,33 (ağ/hac) olarak değiştirilerek 3 farklı konsantrasyonda jel sentezi gerçekleştirilmiş ve jellerin mekanik özelliklerine toplam fibroin+DMA konsantrasyonunun yani Co'ın etkisi incelenmiştir. İkinci seri denemelerde birinci denemede en iyi mekanik özelliğe sahip olan yani fibroin+DMA konsantrasyonu %25 (ağ/hac) olan jel üzerinden devam edilerek fibroin/DMA ağırlık oranı 100/0, 75/25, 50/50 ve 25/75 olarak değiştirilerek fibroin/DMA ağırlık oranlarının etkisi incelenmiştir. Üçüncü seri denemelerde ise fibroin/DMA ağırlık oranı 50/50 sabit tutulmuş toplam fibroin+DMA konsantrasyonu %8,33 olan çözelti ortamına DMA'yı çapraz bağlamak için DMA'nın molce %0,5-2'si arasında değişen mol oranlarında BAAm ilave edilerek kimyasal çapraz bağlayıcının etkisi incelenmiştir. Elde edilen bütün hidrojellerin şişme davranışları, mekanik test cihazı ile mekanik davranışları incelenmiş ve ATR-FTIR spektroskopisi ile fibroinin yapısı aydınlatılmıştır. 
Elde edilen bütün jel örneklerinin ATR-FTIR spektroskopisi ile aydınlatılan yapıları sonucunda jelleşme öncesi fibroin çözeltisinin 1640 cm⁻1'de görülen karakteristik pikinin jelleşme sonucu 1620 cm⁻1'e kaydığı gözlenmiştir. Bu karakteristik pikin yer değiştirmesi ise jelleşme ile oluşan β-tabakalardan kaynaklanmakta olup bu da semi-IPN jel eldesi yöntemi ile SF/PDMA jellerinin başarılı bir şekilde sentezlendiğini ortaya koymaktadır.
Hidrojellerin mekanik özelliklerine bakıldığında PDMA içermeyen %25(ağ/hac) konsantrasyonda tek ağ yapılı fibroin hidrojelin parçalanma anındaki deformasyonu %40, gerilim değeri 1,2 MPa ve tokluğu 236 kJ/m³ bulunarak mekanik olarak oldukça zayıf olduğu gözlenmiştir. Ağ yapı içerisine PDMA zincirlerinin girmesiyle elde edilen semi-IPN fibroin/PDMA hidrojellerin parçalanma anındaki deformasyonu 2 kattan fazla artarak %90'a, gerilimi ve tokluğu ise 5 kat artırılarak sırasıyla 6,3 MPa'a ve 1168 kJ/m³'e kadar yükseltilmiştir. Ayrıca hidrofilik yapıdaki DMA'nın ağ yapı içerisinde ki miktarı arttıkça jellerin ağırlıkça şişme miktarları artmıştır. 
Sonuç olarak bu çalışma ile PDMA polimer zincirlerinin fibroin ağ yapı içerisine sokulması ile mukavemeti yüksek, biyouyumlu ve doku mühendisliğinde kullanıma uygun ipek fibroin hidrojellerin elde edilebileceği ortaya konmuştur.

Abstract:
Hydrogels are hydrophilic materials which can absorb high quantities of water or biofluids without dissolving in them. Smartness, softness and capability of water uptake properties make hydogels unique materials. Although synthetic hydrogels are very similar to biologic tissues, they are generally brittle and thus limits the use of these hydrogels for load-beaing applications. Reason of weak mechanical properties exhibited by chemically crosslinked hydrogels is having no effective energy distribution mechanism inside these gel networks. In oder to achieve highly tough gels, it is a must to introduce a enegy distribition mechanism inside the gel netwok in molecular level. In recent years, one of these methods to obtain tough gels is interpenetrating network (IPN) technique. By means of this technique, an effective energy distribution mechanism is created in the gel network so, gels exhibiting high tougness, compressive strength and fracture energy can be produced. IPNs and semi-interpenetating networks (semi-IPN) were introduce into literature in 1900s for the first time and by the help of these studies it was released that these materials can be used as drug carrier and tissue scaffold for cell culturing aims. IPNs are polymeric networks comprised of at least two other polymer chains at which no chemical bonds between. Furthermore, at least one of these polymer chains were synthesized and /or crosslinked in the existance of other polymer chain which results in better properties than that of each individual materials' properties involving in IPN. 
Silk is a natural polymer produced by silk worms and some kids of spiders are used for biomedical applications in a wide range due to its extraordinary mechanical properties and biodegradability. Silk, acquired from silk worms named as Bombyx mori, is composed of two main proteins called fibroin and sericin. Fiboin is the structural protein of silk fibre and other protein, sericin which is water soluble gummy part, keep these fibre together. Fibroin mainly comprised of two amino acids as glycine and alanine. These amino acids form the large hydrophobic blocks inside the fibroin chains while other amino acids in between these blocks and at the chain ends create hydrophilic blocks; thus, fibroin have a copolymeric architecture. Mentioned hydrophic parts provides water solubility to fibre, while -sheets formed between hydrophobic parts bring to structure endurance and rigidity.
The main reason of fibroin gelation is transition of random coils into sheet structures by the help of interactions between hydrophobic parts. Gelation of fibroin takes relatively longer time than that of other proteins. In 2012, a method was described by our research group to shorten the time required for gelation of fibroin. With this method, gelation time of fibroin was shorten from a few weeks to less than a day by addition of diepoxides to fibroin solutions. Diepoxides was provided to bind hydrophilic groups to each other located on fibroin chains. Thus, immobility of molecules can be obtained which helps obtaining -sheets by getting hydophobic blocks together and accodingly shortening of gelation time can be achived. However, obtained single netwok fibroin hydogels are not sufficient in the meaning of mechanical enduance for load-bearing applications.
Within the scope of this thesis, semi-IPN hydrogels were obtained to enhance the single network fibroin hydrogels' mechanical endurance by mixing fibroin solution and N,N-dimethyl acrylamide (DMA) monomers in various ratios. For this purpose, various amounts of DMA was added to aqueous fibroin solutions and polymerization of fibroin in the existance of DMA was carried out by the redox initiator system, comprising of ammonium persulphate (APS) and N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED), at 50 °C. Three sets of experiments were performed. For the first set of experiments, fibroin/DMA ratio was set in equal weights (50/50); total fibroin+DMA concentration was varied as 25, 16 and 8.33 % (w/v) and synthesis of gels were performed for these three concentrations to investigate the effect of total concentration, fiboin+DMA, on mechanical popeties of gels. Second set of expeiments were focused on the sample, having fibroin+DMA total concentation as 25 % (w/v), which have exhibited best mechanical properties in the first set of experiments. For this total concentration, fiboin/DMA weight ratios were varied as 100/0, 75/25, 50/50 and 25/75 and effect of weight ratios at the same total concentation for change in mechanical properties were investigated. For the third set of experiments, effect of chemical crosslink to the system was examined. Fibroin/DMA weight ratio was set as 50/50 for the total concentation, fibroin+DMA, of 8.33 %; to crosslink the DMA, N,N'-methylenebisacrylamide (BAAm)  was added  as crosslinker at 0.5-2 % mol concentrations relative to mol ratios of DMA. Hdyrogels obtained by these three sets of experiments were subjected to swelling measurements, their mechanical prroperties were examined by using universal uniaxial testing machine and interstructures of fibroins were illuminated by using ATR-FTIR spectroscopy.
Results of ATR-FTIR spectroscopy, for all gel samples obtained, were exhibited that the characteristic peak of fibroin solution at 1640 cm-1 before the gelation shifts to 1620 cm-1 after gelation. Shifting of this peak was originated from the β-sheets formed during the gelation and this case reveals that semi-IPN gels, composed of fibroin/poly(N,N-dimethylacrylamide) (PDMA), were successfully obtained by this method. 
Increasing fibroin+DMA concentrations in the first set of experiments resulted in decrease in equilibrium weights (qw) and water contents (H2O %). This is because, as fibroin+DMA total concentration is increasing, fibroin amount in a unit gel volume is increased accordingly. A conformation change in fibroin is occurred during the gelation, thus provides formation of β-sheets which behave as crosslink in the structure. Therefore, increasing fibroin+DMA concentration, in the meaning of increasing fibroin and increasing β-sheets amount in a unit volume of gel, was resulted in an increase in crosslink points and a decrease in swelling ratios. Gels in swelling equilibrium was subjected to uniaxial compression tests to reveal mechanical properties. As a result of compression tests performed for semi-IPN gels with the fibroin+DMA concentration of 8.33, 16 and 25 %, young modulus values were acquired as 0.294±0.002, 0.57±0.3 MPa, fracture stresses were measured as 3.1±0.6, 5.5±0.3, 6.3±0.3 MPa and toughness values were recorded as 349±37, 683±40, 901±35 Jm-3, respectively. Gels with increasing fibroin+DMA concentration were displayed increasing young moduli, facture stresses and toughness values. In other words, increasing fibroin in the structure was resulted in gels with better toughness and mechanical endurance.
Experiments for the second set of single network gels with pure fibroin at the total concentration of 25 % (w/v) were exhibited weak mechanical properties and hardly no endurance under applied forces which was observed as it can not maintain its structural integrity. In order to enhance mechanical endurance of single network pure fibroin gels at the total concentration of 25 % (w/v), semi-IPN gels were synthesized by the addition of 75, 50 and 25% DMA relative to total weight in the same total concentation and so, an energy dissipation mechanism was introduced into system. By increasing DMA ratios in semi-IPN gel samples, Young moduli values were decreased. In contrast with young moduli, fracture stress values were increased from 1.25±0.1 MPa to 6.3±0.3 MPa, toughness values were increased from 236±32 kJm-3 to  1168±186 kJm-3. Pure fibroin hydrogels were fractured under aproximately 40 % strain ratio while after introducing PDMA polymer chains in the structure, ratio was increased to 90 %. Mechanical measurements show that, by addition of PDMA chains to the system brittle and relatively weak tough pure fibroin gels were turned into tougher and more durable semi-IPN gels.
Gel samples obtained from third set of experiment with no BAAm at fibroin+DMA concentration of 8.33 % (w/v) were exhibited the highest equilibrium swelling ratio. As the crosslink concentration increases in gel, decreases the equilibrium swelling ratio because of the limitation of water intake caused by crosslink points. Gels acquired at fibroin+DMA concentration of 8.33 % (w/v) with fibroin/DMA weight ratio of 50/50 were synthesized by using 2.1 and 0.5 % mol BAAm, relative to DMA mol concentration, and these gels subjected to unaxial compression tests to reveal the effect of chemical crosslink on mechanical properties of fibroin hydrogels. It was cleare up that, by increasing of BAAm from 0 to 2% mol in the structure, Young modolus E, fracture stress f , strain ratio %f and toughness values were decreased. Due to the lack of energy dissipation mechanism in chemically crosslinked gels, by increasing crosslink amount, mechanical properties of fibroin gels were gotten worse and obtained with weaker mechanical properties.
As a result of this study, by introducing PDMA chains to the networks including fibroin, it was provided to obtain gels with better endurance, biocompatibility and possibility for the tissue engineering benefits.