Erciyes dağı akarsularında simulium türlerinin araştırılması ve moleküler klasifikasyonu
Investigation and molecular clasification of simulium species in the streams of Erciyes mountain
Yazar: AHMET DEMİRCİOĞLU
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH İNCİ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Akarsular = Streams ; Erciyes Dağı = Erciyes Mountain ; Larva = Larva ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Simuliidae = Simuliidae ; Simulium spp. = Simulium spp.

Özet:
bu çalışma, Erciyes dağı akarsularında simuliid türlerinin moleküler karakterizasyonunun yapılması amacıyla planlanmıştır. Bu amaçla Mayıs-Eylül 2012 tarihleri arasında Erciyes dağı akarsularında üç istasyondan toplam 100 adet simuliid larva örneklemesi yapılmıştır. Toplanan larvaların önce morfolojik ve kromozomal incelemeleri yapılmış daha sonra moleküler analize geçilmiştir. Morfolojik ve kromozomal analizler ile araştırma yöresinden toplanan 100 larvanın 20'sinin S. bezzi sitoform (Cyt) 2, 20'sinin S. bezzi Cyt 3, 50'sinin S. ornatum grup ve 10'unun ise S. velutinum olduğu tespit edilmiştir. Moleküler analizler için örnekleme istasyonlarından seçilmiş toplam 4 larvadan genomik DNA ekstraksiyonu yapılmış ve elde edilen DNA'lar parsiyel mitokondriyal cytochrome oxidase subunit 1 ve ribosomal parsiyel 5.8S, complete internal transcript spacer 2 ve parsiyel 28S gen bölgelerini amplifiye eden spesifik primerler ile PCR'a tabii tutulmuştur. İzolatlara ait amplikonların PCR primerleri ile klonlanlanıp plasmid pürifikasyonundan sonra sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen izolatların GenBank kayıtları yapılmış ve dünyadaki benzer izolatlar ile Multiple alignmentları yapılarak filogenetik analizleri gerçekleştirilmiştir. Mt-COI gen bölgesinin filogenetik analizi sonucu S. bezzii cytoform 2 ve cytoform 3 izolatları arasında  %0,8 farklılık saptanmıştır. S. bezzii  ve S. ornatum grup izolatları arasında %9,6±1,2, S. bezzii ve S. velutinum arasında 13,9±1,4 ve S. ornatum grup ve S. velutinum izolatları arasında ise %13,5±1,4 genetik farklılık tespit edilmiştir. Ribozomal 5.8S, ITS-2 ve 28S gen bölgelerinin nükleotid sekansları sonucunda S. bezzii (TrERUSimbe3) Dünyada ilk kez karakterize edilmiştir. TrERUSimbe3 izolatı GenBank'ta ilgili gen bölgesi yönünden kayıtlı Simulium izolatlarından en yüksek filogenetik yakınlığı %96,2 ile S. ornatum grubuna dâhil izolatlarla göstermiştir. Araştırma yöresinde karakterize edilen S. ornatum grup TrERUSimor izolatı ise en yüksek identikliği %99,7 ile aynı grupta yer alan S. trifasciatum ve S. ornatum  izolatları ile göstermiştir. S. bezzii TrERUSimbe3 ve S. ornatum grup TrERUSimor izolatları arasında ise %3,7±1,0 genetik farklılık belirlenmiştir. Sonuç olarak bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez Erciyes dağı akarsularında Simulium türlerinin morfolojik, kromozomal ve moleküler karakterizasyonları yapılmıştır.  Bu çalışmayla Türkiye'de ilk kez S. bezzi cyt2, S. bezzi cyt3, S. velutinum ve S. ornatum izolatlarının mitokondriyal gen bölgesine göre karakterizasyonları yapılarak filogenileri ortaya konmuş ve GenBank kayıtları gerçekleştirilmiştir. Aynı zamanda araştırma yöresinden izole edilen S. bezzii Cyt 2 (TrERUSimbe2) ve S. ornatum grup (TrERUSimor) izolatlarının ribozomal gen bölgesine göre moleküler analizleri sonucunda karakterizasyonları yapılarak GenBank kayıtları gerçekleştirilmiş ve S. bezzii Cyt 2 izolatının ribozomal ITS-2 gen bölgesi Dünya'da GenBank'a kayıdı gerçekleştirilen ilk izolat olmuştur. 

Anahtar kelimeler: Simulidae,  Erciyes dağı,  larva, Moleküler karakterizasyon

Abstract:
This study was carried out to determine the molecular characterization of simuliid species in Strems of Erciyes Mountain. For this aim between May-September 2012, totally 100 simuliid larvae collected from three collection sites. Morphological and chromosomal examination was performed before molecular analyzes in collected larvae. 20 Simulium bezzi cytoform (Cyt) 2, 20 S. bezzi Cyt 3, 50 S. ornatum group and 10 S. velutinum from totally 100 larvae were determined by morphological and chromosomal examination. For molecular analyses the genomic DNA extractions were utilized on 4 larvae selected from sampled area and PCR analyses were performed with the primer pairs that amplified mitochondrial partial cytochrome oxidase subunit 1 and ribosomal partial 5.8S, complete internal transcript spacer 2 and partial 28S gene regions. Sequence analyses of the isolates were done with PCR primers after cloning and plasmid purifications. GenBank records of isolates were done and performing multiple alignments between the obtained isolates and other similar isolates from the world completed phylogenetic analyses. The pairwise analyses between the S. bezzi Cyt2 and Cyt3 isolates characterized by Mt-COI sequences showed 5.3±0.6% genetic difference. The genetic difference between S. bezzii and S. ornatum group, S. bezzii and S. velutinum, S. ornatum group and S. velutinum isolates were determined as 9,6±1,2%, 13,9±1,4% and 13,5±1,4%, respectively. S. bezzii (TrERUSimbe3) isolate was firstly revealed in the world according to ribosomal 5.8S, ITS-2 and 25S gene region. The maximum identity rates between the TrERUSimbe3 isolate and S. ornatum group isolates within Simulium isolates from the world were determined as 96, 2% according to the phylogenetic analyses of ribosomal 5.8S, ITS-2 and 28S gene regions. S. ornatum group TrERUSimor isolate showed 99,7% identitity with S. trifasciatum and S. ornatum by phylogenetic analyses of ribosomal 5.8S, ITS-2 and 28S gene regions. Also genetic difference between the S. bezzii TrERUSimbe3 and S. ornatum group TrERUSimor isolates established as 3,7±1,0%.
In conclusion, morphological, chromosomal and molecular characterization of Simulium sp. in Erciyes Mountain Strems in Turkey was determined for the first time with this study. S. bezzi cyt2, S. bezzi cyt3, S. velutinum and S. ornatum isolates were done molecular characterization and exhibited phylogeny according to mt-COI gene region and were also deposited to the GenBank. While molecular characterization S. bezzii Cyt 2 (TrERUSimbe2) and S. ornatum group (TrERUSimor) isolates were detected according to ribosomal 5.8S, ITS-2 and 28S gene region and deposited to the GenBank. S. bezzii Cyt 2 isolate was initially recorded to the GenBank in the World.

Key words: Black fly, Erciyes Mountain, Molecular classification, Simuliidae