TRPM-2 katyon kanalı antagonisti 2-Aminoetoksidifenil borat'ın sisplatin nörotoksisitesindeki rolü
The role of TRPM-2 cation channel antagonist 2-aminoethoxydiphenyl borate in cisplatin neurotoxicity
Yazar: EZGİ EROĞLU
Danışman: PROF. DR. KEVSER EROL
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: 2-aminoetoksifenil borat = 2-aminoethoxydiphenyl borate ; Antagonistler = Antagonists ; Katyonlar = Cations ; Nöropatiler = Neuropathies ; Nörotoksinler = Neurotoxins ; Sisplatin = Cisplatin ; Toksisite = Toxicity

Özet:
Amaç: Bu çalışmada primer sıçan dorsal kök gangliyon (DRG) hücre kültüründe sisplatinin (CIS) sebep olduğu nörotoksisitede ve sisplatinle oluşturulan periferik nöropatide (PN) transient reseptör potansiyel melastatin 2 (TRPM2) iyon kanalı antagonisti 2-aminoetoksidifenil borat'ın (2-APB) potansiyel nöroprotektif ve antihiperaljezik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
Kapsam: CIS çeşitli tümörlerin tedavisinde yaygın olarak kullanılan platin türevi kemoterapötik bir ajandır. CIS ototoksisite, nefrotoksisite ve PN gibi yan etkilere neden olabilmektedir. TRPM2 eksikliğinin kemoterapiyle indüklenen periferik nöropatide (KİPN) anti-allodinik etkilerinin olduğu gösterilmiştir. 2-APB'nin DRG nöronlarında TRPM2 kanal inhibitörü olarak davrandığı tespit edilmiştir.
Yöntem: İn vitro deneylerde toksisite değerlendirmesi MTT testiyle yapılmıştır. CIS'in submaksimal toksik etki oluşturan konsantrasyonu belirlenerek, CIS (200 µM) ile birlikte uygulanan 2-APB'nin (0.5, 1, 2 mM) sitoprotektif etkisi incelenmiştir. In vivo deneylerde ise 6-8 haftalık (200-250 g) Spraque Dawley türü sıçanlara 5 hafta süreyle haftada bir kez sisplatin (3 mg/kg) intraperitonal yolla uygulanarak periferik nöropati geliştirilmiştir. İlk aşamada 2-APB (2, 4, 8 mg/kg) CIS ile eş zamanlı uygulanmıştır. Nöropati mekanik allodini, termal hiperaljezi, kuyruk sıkıştırma testi ve soğuk plaka testleriyle değerlendirilmiştir. Motor koordinasyonu değerlendirmek için rotarod ve ayak izi analizi, lokomotor aktiviteyi değerlendirmek için ise aktivitemetre testi uygulanmıştır. İkinci aşamada CIS yine 5 hafta süreyle haftada bir kez 3 mg/kg dozda uygulanırken; 2-APB'nin etkili bulunan dozu (4mg/kg) ve TRPM2 kanalının farklı bir inhibitörü olan flufenamik asid (FFA)  haftada 3 kez uygulanmış, yine aynı davranış testleriyle değerlendirme yapılmıştır. DRG, siyatik sinir, karaciğer ve böbrekler izole edilip, histolojik değerlendirme yapılmıştır. NGF, BDNF, TNF-α, GSH, MDA ve LDH düzeyleri sıçanlardan alınan DRG doku homojenatlarında ELISA yöntemiyle çalışılmıştır. Verilerin değerlendirmesinde tek yönlü varyans analizi, çift yönlü varyans analizi ve Kruskal-Wallis testleri kullanılmıştır.
Bulgular: CIS mekanik allodini ve soğuk allodiniye, ayrıca akut spinal düzeyde ağrı duyarlığının artmasına neden olmuştur. Termal hiperaljezi testinde anlamlı bir değişim saptanmamıştır. CIS'in sıçanlarda motor koordinasyonu bozduğu ve lokomotor aktiviteyi azalttığı görülmüştür. 2-APB (4 mg/kg), CIS'in allodinik etkilerini anlamlı olarak düzeltmiştir. Ayrıca lokomotor aktiviteyi artırmış ve motor koordinasyonu iyileştirmiştir. CIS'in yol açtığı periferik dokulardaki yapısal toksisiteyi 2-APB anlamlı ölçüde azaltmıştır. CIS uygulaması sonucu azalan NGF ve BDNF düzeyleri 2-APB ile artmıştır. 2-APB, TNF-α, MDA ve LDH düzeylerini azaltırken; GSH seviyesini artırmıştır.
Sonuç: 2-APB, CIS'in neden olduğu PN ve nörotoksisitede sitoprotektif ve antiallodinik etkiler göstermiştir. Ayrıca periferik dokularda yapılan histolojik incelemelerde ve antioksidan parametreler üzerinde 2-APB'nin olumlu etkileri belirlenmiştir. 2-APB'nin CIS'e bağlı gelişen PN'nin tedavisinde tek başına ya da diğer tedavi seçenekleriyle birlikte kullanılabilecek potansiyel bir ajan olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Aim: It is aimed to investigate the potential neuroprotective and antihyperalgesic effects of transient receptor potential melastatin 2 (TRPM2) ion channel antagonist 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) in primary rat dorsal root ganglion (DRG) cell culture and peripheral neuropathy (PN) induced by cisplatin (CIS).
Content: CIS is a platinum-derived chemotherapeutic agent commonly used in the treatment of various tumors. CIS can cause side effects such as ototoxicity, nephrotoxicity, and PN. TRPM2 deficiency has been shown to have anti-allodynic effects in chemotherapy-induced peripheral neuropathy (CIPN). It has been found that 2-APB acts as a TRPM2 channel inhibitor in DRG neurons.
Method: Toxicity was evaluated by MTT test in in vitro experiments. By determining the submaximal toxic effect concentration of CIS, the cytoprotective effect of 2-APB (0.5, 1, 2 mM) applied together with CIS (200 µM) was examined. In in vivo experiments, peripheral neuropathy was developed by administering cisplatin (3 mg/kg) intraperitoneally to Spraque Dawley rats of 6-8 weeks (200-250 g) once a week for 5 weeks. In the first stage, 2-APB (2, 4, 8 mg/kg) was administered simultaneously with CIS. Neuropathy was evaluated by mechanical allodynia, thermal hyperalgesia, tail compression and cold plate tests. Rotarod and footprint analysis were used to evaluate motor coordination, and an activity meter test was used to evaluate locomotor activity. In the second stage, CIS is administered once a week at a dose of 3 mg / kg for 5 weeks; the effective dose of 2-APB (4 mg/kg) and flufenamic acid (FFA), which is a different inhibitor of TRPM2 channel, were applied 3 times a week and evaluated with the same behavior tests. DRG, sciatic nerve, liver and kidneys were isolated and histological evaluation was performed. NGF, BDNF, TNF-α, GSH, MDA and LDH levels were studied by ELISA method in DRG tissue homogenates taken from rats. One-way analysis of variance, two-way analysis of variance and Kruskal-Wallis tests were used to evaluate the data.
Results: CIS caused mechanical allodynia and cold allodynia, as well as increased pain sensitivity in the acute spinal level. There was no significant change in the thermal hyperalgesia test. CIS has been shown to impair motor coordination and decrease locomotor activity in rats. 2-APB (4 mg / kg) significantly altered the allodynic effects of CIS. It also increased locomotor activity and improved motor coordination. 2-APB significantly reduced structural toxicity in peripheral tissues caused by CIS. As a result of CIS administiration, reduced levels of NGF and BDNF increased following 2-APB administiration. While 2-APB decreased TNF-α, MDA and LDH levels and it increased GSH level. 
Conclusion: 2-APB showed cytoprotective and antiallodynic effects in PN and neurotoxicity caused by CIS. In addition, positive effects of 2-APB were determined on histological examinations and antioxidant parameters in peripheral tissues. 2-APB is thought to be a potential agent that may be used alone or in combination with other treatment options in the treatment of PN developed due to CIS administration.