ALDH pozitif CD44 pozitif CD24 negatif MCF-7 meme kanseri hücrelerinin proliferasyonunda rol oynayan genlerin siRNA ile susturulması
Sirna silencing of the genes playing role in the proliferation of ALDH positive CD44 positive CD24 negative MCF-7 breast cancer cells
Yazar: GAMZE ÖNECEK
Danışman: PROF. DR. HAMDİ ŞÜKÜR KILIÇ
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve İleri Malzemeler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Kanser tedavisinde başarıya ulaşmak için genellikle birden fazla antikanser ilacı uygulanmaktadır. Ancak, sonradan kazanılan ya da tedavi öncesi kişide var olan ilaç dirençliliği, kanser kemoterapisinde başarıya ulaşmayı büyük ölçüde engellemektedir. Bu duruma "çoklu ilaç dirençliliği" (ÇİD, multiple drug resistance; MDR) denilmektedir. Paklitaksel metastatik meme kanseri tedavisinde tek başına kullanılan aktif maddelerden biridir. Paklıtakselin başlıca atılımı karaciğer ve safra yoluyla olmaktadır. Paklıtaksel karaciğerde sitokrom P450 enzim sistemi ile metabolize olmaktadır. Meme kanserinin tedavisinde kullanılan antimikrotübül ajanlardan biri olan paklitaksel mikrotübüllerin ß-tübülin alt grubuna bağlanmaktadırlar. Bu ilaca karşı gelişen çoklu ilaç dirençliliği tedavinin başarısını kısıtlayan önemli bir problemdir. 
RNAse III ribonükleaz ailesine ait enzimler RNA interferansın ilk adımını başlatır. Bu nükleazlar sahip oldukları dsRNase aktivitesi ile dsRNA'ları siRNA (small interfering RNA) adı verilen 21- 23 nükleotid uzunluğunda küçük engelleyici RNA'lara parçalamaktadırlar. siRNA'lar uygun mRNA degradasyonu için rehber RNA olarak görev alırlar. Dicer enziminin nükleaz aktivitesi ile dsRNA'lar, 5´- fosfat ve 3´- hidroksil uçlara sahip ve 3´- hidroksil uçlarında 2- 3 nükleotidlik çıkıntı bulunan 21- 23 nükleotid uzunluğunda siRNA'lara parçalanırlar. siRNA ile gen susturma yöntemi aşırı ifade edilen genleri mRNA seviyesinde durdurmak ve mRNA'dan oluşan proteinlerin aktivitesini düşürmek amacıyla uygulanmaktadır.
Tez çalışmasında amacımız olan Paklitaksele dirençli meme kanseri kök hücrelerinde (ALDH pozitif CD44 pozitif CD24 negatif) dirençliliği ve hücre üremesini artıran MDR1, EGFR, ALDH ve BAG4 genlerinin ifadesinin siRNA ile susturulmasıdır. Bu çalışmanın ön hazırlık aşamaları için hücre kültürü çalışması yapılmıştır. Kök hücrelerin proliferasyonunu ve ilaçlara direncini artıran genler siRNA ile susturma çalışması yapılmıştır ve paklıtaksel tedavisi uygulanmıştır. siRNAlar ile hedeflenmiş genlerin ifade düzeyleri RT-PCR ve Western Blot yöntemleri ile analiz edilmiştir.
Çalışma sırasında kullanılan Paklıtaksele dirençli meme kanseri kök hücrelerinde (ALDH pozitif CD44 pozitif CD24 negatif) kök hücre belirteçleri olan  mamosfer üretilmesi hücre kültür ortamında, CD44 pozitifliği, konfokal mikroskop ile ve ALDH pozitifliği ise akış stometrisive RT-PCR yöntemiyle gösterilmiştir.
Çalışma sonucunda 24 saatlik siRNA uygulaması ile MDR1 geni susturulurken, diğer hedef gen ifadeleri de eş zamanlı olarak azalmıştır. Aynı zamanda da bu siRNA uygulamasından sonra paklıtaksel ilacı ile tedaviye duyarlılığın arttığı gözlenmiştir.

Abstract:
More than one drug are used to suceed in cancer therapy. But, acquired or intrinsic resistance to cancer chemotherapy limits the success of therapy. This phenotype is called  "multiple drug resistance". Paclitaxel is one of the active molecules used for the treatment of metastatic breast cancer.  Paclitaxel is metabolized in the liver by the cytochrome P450 enzyme system. Paclitaxel is an anti-microtubule agent  that binds to one of  the ß-tubulin sub-group. Developing multi-drug resistance against these drugs is a major problem that limits chemotherapy. 
RNase III ribonuclease enzymes initiate the first step of the RNA interference. These nucleases break dsRNAs to siRNAs (small interfering RNA) 21- 23 nucleotides in length, which are called small inhibitory RNA. siRNAs serves as guide to appropriate mRNA degradation of RNA. Nuclease activity of the enzyme Dicer breaks dsRNA to 21-23 nt siRNAs with 5'-phosphate and 3'-hydroxyl end and 3'-hydroxyl ends with 2- 3 overhang nucleotides. gene silencing with siRNA  is a method  used to silence over-expressed genes at mRNA level and is applied to reduce the activity of a protein expression.
The purpose of this project is to silence the proliferative and drug resistance causing genes ( MDR1, EGFR, ALDH and BAG4) in breast cancer stem cells (ALDH positive, CD44 positive, CD24 negative). Cell culture was applied siRNA to silence MDR1 gene in breast cancer stem cells. Paclitaxel therapy was applied to the cells that were silenced by siRNs. The mRNA expression levels of the silenced cells was analyzed. The mRNA expression levels of the silenced genes was analyzed by RT-PCR and Western Blot analysis.
Breast cancer stem cells which are ALDH positive were sorted by flow cytometry and the stemness of the cells was also confirmed by  mamosphere culture and stem cell marker CD44 was detected by confocal microscopy.
At the end of the study expression levels of MDR1, BAG4, EGFR, ALDH genes were the silenced in 24 hours incubation. Here it was demonstrated that the genes expression levels have decreased remarkably. At the same time, it was shown that the breast cancer stem cells treated significantly with paclitaxel drug.