Lactococcus lactis'ten rekombinant hyaluronik asit üretimi
Recombinant hyaluronic acid production from Lactococcus lactis
Yazar: RAMAZAN DEMİRHAN
Danışman: PROF. DR. CEM BÜLENT ÜSTÜNDAĞ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Hyaluronik asit (HA), viskoelastisite, nem tutma kapasitesi ve biyokompatibilite özellikleri ile bilinen tekrarlayan disakkarit birimlerden oluşan doğal bir biyopolimerdir. Tıp, kozmetik ve nutrasötikler gibi çeşitli endüstrilerde kullanım alanı bulunmaktadır. Geleneksel olarak horoz ibiklerinden elde edilen HA, şu anda çoğunlukla streptokok fermantasyonu yoluyla üretilmektedir. Bununla birlikte, rekombinant sistemlerin potansiyel toksin içermeyen üretim için artan ilgi görmesiyle birlikte bu tez, Lactococcus lactis'in üç modifiye edilmiş suşunun mühendislik çalışmasını içermiştir. S. zooepidemicus'tan hyaluronan sentaz geni (has A), glikoz dehidrojenaz geni (has B), fosfoglukoizomeraz geni (has E) ve L. lactis'ten α-fosfoglukomutaz geni (pgm A) karışımı içeren genlerin bu suşlara eklenmesiyle gerçekleştirilmiştir. Bu modifiye bakteri suşları, 10 μg/ml kloramfenikol ile desteklenen M17 ortamında, 30°C sıcaklık ve 150 rpm karıştırma hızı koşullarında inkübe edildikten sonra en yüksek HA üretimini gösteren suş belirlenmiştir. Daha sonra bu seçilen organizma kullanılarak sonraki deneyler gerçekleştirilmiştir. Optimal HA üretimi için başlangıçta nisin konsantrasyonunun ve OD600 ölçümlerine dayalı indüksiyon noktasının belirlenmesi amacıyla ilk optimizasyonlar erlen seviyesinde yapılmıştır. Biyoreaktör sistemi, karıştırma hızları, başlangıç glukoz konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri gibi çeşitli parametrelerin optimizasyonuna tabi tutulmuştur. Bu çalışmaların bir sonucu olarak, 1 litrelik bir fermentörde 3.80 gram saf HA üretilmiştir. Bu çalışma, nisin promotorü altında L. lactis konakçısında HA genlerinin ifadesinin endüstriyel ölçekte HA üretimi için temel oluşturabileceğini göstermiştir.

Abstract:
Hyaluronic acid (HA) is a natural biopolymer composed of repeating disaccharide units, known for its viscoelasticity, moisture retention capacity, and biocompatibility. Its applications span various industries such as medicine, cosmetics, and nutraceuticals. Traditionally extracted from rooster combs, HA is now predominantly produced through streptococcal fermentation. However, the emergence of recombinant systems has garnered interest due to their potential for toxin-free production. This thesis involved the engineering of three modified strains of Lactococcus lactis by incorporating a mixture of genes from S. zooepidemicus, specifically the hyaluronan synthase gene (has A), glucose dehydrogenase gene (has B), phosphoglucoisomerase gene (has E), along with the α-phosphoglucomutase gene (pgm A) from L. lactis. Following the incubation of these modified bacterial strains in M17 medium supplemented with 10 μg/ml chloramphenicol (cam), under conditions of 30°C temperature and a stirring speed of 150 rpm, the strain exhibiting the highest production of HA was identified. Subsequent experiments were then conducted using this chosen organism. To achieve optimal HA production, initial optimizations were conducted at the flask level to determine the appropriate concentration of nisin and the induction point based on OD600 measurements. The bioreactor system underwent optimization of various parameters including mixing rates, initial glucose concentrations, and incubation periods. As a result of these studies, a 1-liter fermenter produced 3.80 grams of pure hyaluronic acid. This study demonstrated that the expression of HA genes in the L. lactis host under the nisin promoter can lay the groundwork for industrial-scale HA production.