Alerjen spesifik immunoglobulin e tayini için yüzey plazmon biyosensörlerin geliştirilmesi
Development of surface plasmon biosensors for detection of allergen specific immunoglobulin E
Yazar: MUHAMMED ERKEK
Danışman: DOÇ. DR. NİLAY BERELİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Antikorlar = Antibodies ; Biyosensörler = Biosensors ; Hipersensitivite = Hypersensitivity ; Yüzey plazmon rezonans teorisi = Surface plasmon resonance theory

Özet:
Alerji dünya nüfusunun %10-20'sini etkileyen oldukça yaygın kronik bir hastalıktır. Alerji, yetişkin nüfusun %2'sini ve çocukların %8'ini etkilemektedir. Alerjik hastalıklar, solunum sisteminin toz ve polenlere, sindirim sisteminin belirli bir gıdaya, cildin bir kimyasal maddeye maruz kalması ile ortaya çıkabilir. Serumda, antijen-spesifik immunoglobulin E'nin (IgE) tayini antijene karşı aşırı duyarlılığı belirtir. IgE düzeyi alerjik durumlarda yükselir. Başlıca alerjenik kaynaklar polenler, besinler, akarlar, küfler ve zehirlerdir. Bu nedenle astım, egzama ve saman nezlesi gibi alerjik hastalıkların teşhisi için IgE düzeyindeki artış önemlidir. Alerjen tespiti için geleneksel yöntemler genellikle enzimatik etiketleme gerektiren Enzim-bağlı immunosorbent analizi (ELISA) tekniğidir. Bu etiketleme süreci zaman alıcıdır ve hedef biyomoleküllerin immunokimyasal aktivitesini değiştirebilir. Yüzey plazmon rezonans (SPR), biyomoleküller arasındaki etkileşim ölçümü için iyi bilinen bir teknolojidir. Bu tez kapsamında alerjen-spesifik serum IgE tayini için optik temelli yüzey plazmon rezonans biyosensörler hazırlanmıştır. SPR biyosensor çip yüzeyi öncelikle 3-merkaptopropionik asit ile işsevleştirilmiştir. N-etil-N′-(3-dietilaminopropil)karbodiimid (EDC)/sülfo-N-hidroksisülfosüksinimit (NHS) ile aktive edilmiş karboksilik asit fonksiyonlarına kovalent bağlanması gerçekleştirilmiştir. Antikor üzerindeki terminal amin grupları ile Anti-immünoglobulin E daha sonra tanıma bölgeleri olarak yüzeye immobilize edilmiştir. Hazırlanan SPR biyosensor çip yüzeyi temas açısı ve atomik kuvvet mikroskop (AFM) ile karakterize edilmiştir. Yüzey pürüzlülük değerleri boş çip yüzeyi ve modifiye edilmiş çip yüzeyi için sırasıyla 2.0 nm ve 8.36 nm olarak bulunmuştur. IgE tayini 1.0 ng/mL-1000 ng/mL derişim aralığında yürütülmüştür. SPR biyosensörde plazma ve sulu çözeltilerde IgE'nin tayini yaklaşık 10 dakika analiz süresiyle çok seçici bir şekilde gerçekleştirilmiştir. IgE tayin sınırı (LOD) 0.22 ng/mL olarak bulunmuştur. Albumin, immunoglobulin G, miyoglobin proteinleri ile seçicilik çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Tekrarlanbilirlik çalışmaları SPR biyosensor sistemine ard ard 5 defa IgE örnkeleri verilerek sinyal yanıt kararlılığı incelenmiştir. Tasarlanan SPR biyosensor çiplerin yüzey homojenliğini incelemek için Scatchard, Langmuir, Freundlich ve Langmuir-Freundlich adsorpsiyon izoterm modelleri hesaplanmıştır. Hem çiplerde adsorpsiyon davranışı, Langmuir izoterm modeline uygun olarak bulunmuştur.

Abstract:
Allergy is a mysterious chronic disease that causes the digestive system to be exposed to certain foods, the respiratory system to dust or pollen, or the skin to chemicals. Allergy is a very common disease affecting 10-20% of the world's population. Allergy affects 2% of the adult population and 8% of children. Immunoglobulin E (IgE) level rises in allergic conditions. The main allergenic sources are pollen, foods, mites, molds and poisons. Therefore, the increase in IgE level is important for the diagnosis of allergic diseases such as asthma, eczema and hay fever. Food allergy is defined by the adverse reactions of the immune system when triggered by the consumption of certain foods. Food allergy reactions occur as a result of recognition of allergenic proteins by allergen-specific IgE antibodies. For some allergic individuals, selective food contact can develop into life-threatening reactions (such as anaphylactic shock). Traditional methods for allergen detection are Enzyme-linked immunosorbent analysis (ELISA), which usually requires enzymatic labeling. This labeling process is time consuming and can alter the immunochemical activity of target biomolecules. Surface plasmon resonance (SPR) is a well-known technology for the measurement of interactions between biomolecules. In this thesis, optical-based surface plasmon resonance biosensors were prepared for allergen-specific serum IgE determination. 
The surface of the SPR biosensor gold chip is primarily functionalized with 3-mercaptopropionic acid. The covalent coupling of N-ethyl-N'-(3-diethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)/sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) to activated carboxylic acid functions was performed. Anti-immunoglobulin E with terminal amine groups on the antibody were then immobilized to the surface as recognition sites. The prepared SPR biosensor chip surface was characterized by contact angle and atomic force microscope (AFM). Surface roughness values were found as 2.00 nm and 8.36 nm for the blank chip surface and the modified chip surface, respectively. IgE determination was carried out in the range of 1.0 ng/mL-1000 ng/mL. The determination of IgE in plasma and aqueous solutions in the SPR biosensor was performed very selectively with an analysis time of approximately 10 minutes. The limit of detection (LOD) value for IgE was found to be 0.22 ng/mL. Selectivity studies were performed with albumin, immunoglobulin G, and myoglobin proteins. Reproducibility studies IgE samples were given to the SPR biosensor system five times in a row and the stability of the signal response was examined. Scatchard, Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich adsorption isotherm models were calculated to examine the surface homogeneity of the designed SPR biosensor gold chips. The adsorption behavior of both chips was found following the Langmuir isotherm model.