Klaritromisin timokinon içeren polimerik, cumin temelli metalik nanopartiküllerin sentezi, karakterizasyonu ve helicobacter pylori üzerinde antibakteriyel etkinliklerinin ın vıtro incelenmesi
Synthesis and characteri̇zation of clarithromycin and tymoquinone encapsulated polymeric, cumin based metallic nanoparticles and examination antibacterial effect on helicobacter pylori in vitro culture
Yazar: TURAL SAFAROV
Danışman: DOÇ. DR. MELAHAT BAĞIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Helicobacter pylori (H.pylori) dünya genelinde değişken bir prevalansa sahiptir. Gelişmiş ülkelerde %20-40 oranında görülen enfeksiyon oranı gelişmekte olan ülkelerde %46-54 civarında değişmektedir. Enfeksiyonun tanı ve tedavisindeki zorlukların temel nedenlerinden biri gelişen antibiyotik direncidir. Günümüzde H.pylori enfeksiyonuna karşı antibiyotik temelli ve alternatif tedaviye dayalı tedavi yaklaşımları geliştirilmiştir. Başarı oranının istenen oranda elde edilememesi nedeniyle son yıllarda H.pylori tedavisinde nanoteknolojiye dayalı yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine önem verilmektedir. Bu yaklaşımların temelini metalik ve polimerik nanopartiküller oluşturmaktadır. Metalik nanopartiküllerin toksik etki göstermeleri sebebiyle son yıllarda yeşil sentez yöntemi ile elde edilen nanopartiküllere daha çok önem verilmektedir. Cuminim Cyminum (cumin) bitkisinden elde edilen ekstraktın güçlü antibakteriyal, antiviral etkinliğe sahip olduğu biliniyor. Aynı zamanda cumin bitkisi kullanılarak yeşil sentez yöntemi ile metalik nanopartiküller sentezlenebilektedir. Ancak çalışmamıza kadar literatürde cumin temelli gümüş nanopartiküllerinin H.pylori üzerinde antibakteriyal etkisine yönelik herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. 
Bu nedenle mevcut tez çalışmasında cumin bitkisinden elde edilen ekstrakt kullanılarak gümüş nanopartikülleri sentezlenerek antibakteriyel etkileri in vitro H.pylori kültüründe incelenmiştir. Biyobozunur, biyouyumlu, FDA onaylı, non-toksik özellikleri nedeniyle polikaprolakton (PCL) ilaç taşıyıcı sistemlerde sıklıkla tercih edilmektedir. İlaçların nanopartiküllere kapsüllenerek biyolojik sisteme verilmesi ilacın toksik etkisinin azaltılmasına, stabilitelerinin ve biyolojik aktivitelerinin arttırılabilmesine olanak sağlamaktadır. Ayrıca ilaçlar doğal bileşikler ile birlikte kombinasyon halde nanopartiküllere kapsüle edilebilmektedir. Nigella Sativa bitkisinin esas bileşenlerinden olan timokinon'un (TQ) antibakteriyel etkiye sahip olduğu bilinmektedir. Fakat çalışmamıza kadar tedavide kullanılan antibiyotikler ile TQ bileşeninin birlikte kombinasyon halinde kullanımına yönelik çalışma bulunmamaktadır. Aynı zamanda bu ikili kombinasyonun PCL nanopartiküllerine kapsüllenerek elde edilen nanoformülasyonların H.pylori üzerindeki antibakteriyal etkisinin incelenmesine yönelik de her hangi bir çalışma mevcut değildir. Bu sebeplerden dolayı H.pylori tedavisinde kullanılan klaritromisin (CRL) ile TQ bileşeni tekli ve kombinasyon halde PCL nanopartiküllerine kapsüllenerek H.pylori üzerindeki antibakteriyel etkinlikleri incelenmiştir.
Sentezlenen metalik ve polimerik nanopartiküllerin karakterizasyonu SEM, FTIR, UV-VIS, DLS analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Nanopartiküllerin toksisite çalışmaları J774 makrofaj hücrelerinde MTT yöntemi kullanılarak test edilmiştir. Elde edilen nanopartiküllerin antibakteriyel etkinlikleri brot dilüsyn ve disk difüzyon yöntemleri ile tespit edilmiştir.
Cumin temelli Ag nanopartiküllerin karakterizasyon çalışmaları sonucuna göre partiküllerin ortalama boyutunun 45-50nm arasında olduğu tespit edilmiştir. FTIR analizleri zamanı cumin bitkisine ve Ag nanopartiküllerine özgü bantların görülmesi sentezin başarıyla gerçekleştiğini ortaya koymaktadır.  UV-VIS sonuçları da önceki sonuçları doğrular niteliktedir. Karakterize edilmiş kimyasal ve yeşil sentez yöntemi ile elde edilen Ag nanopartiküller ve cumin ekstraktının antibakteriyel etkisi incelenmiştir. Yeşil sentez yöntemi ile elde edilen nanopartiküllerin kimyasal Ag nanopartiküllerine ve cumin ekstraktına kıyasla güçlü etkisi olduğu gözlemlenmiştir. Bundan başka disk difüzyon testi sonrası görülen zon çaplarına bakıldığında cumin nanopartiküllerinin oluşturduğu zon çapının kimyasal yöntemle sentezlenen gümüş nanopartiküllerinin oluşturduğu zon çapına nazaran daha büyük olduğu görülmüştür.   
Tek başına CRL / TQ ve CRL-TQ kombinasyonları içeren PCL nanopartiküllerinin karakterizasyonuna yönelik çalışmalarda bu nanopartiküllerin ortalama boyutlarının 209-215 nm arasında değiştiği gözlemlenmiştir. Diğer yandan yapılan FTIR analizi sonuçlarına göre TQ ve CRL içeren PCL nanopartiküllerinde TQ ve CRL'e spesifik bantlar görülmemiştir. Bu durum bu bileşenlerin nanopartiküllere başarıyla enkapsüle edildiğini göstermektedir. UV-VIS spektroskopisinde gerçekleştirilen salım analizine göre ise TQ ve CRL içeren PCL nanopartiküllerinin %70 civarında salım yaptıkları belirlenmiştir. Sentezlenen ve karakterize edilen nanopartiküllerin H.pylori üzerindeki antibakteriyal etkinlikleri incelendiğinde ikili kombinasyon içeren PCL nanopartiküllerinin tekli ajan içeren PCL nanopartiküllerine göre bakterileri daha yüksek düzeyde inhibe ettikleri tespit edilmiştir. Aynı zamanda yapılan disk difüzyon testi sonucu ikili kombinasyon içeren PCL nanopartiküllerinin oluşturduğu zon çapının tekli PCL nanopartiküllerine kıyasla fazla olduğu ikili formülasyonun tekli formülasyonlara nazaran etkili olduğunu ortaya koymaktadır. 
Bu yapılan çalışmalar cuminden elde edilen gümüş nanopartiküllerinin ve TQ, CRL kombinasyonu içeren PCL nanopartiküllerinin H.pylori üzerinde yüksek düzeyde antibakteriyal etkinlik gösterdiklerini ortaya koymaktadır. Bu tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlar metalik ve polimerik nanopartiküllerin gelecekte geleneksel antibiyotik uygulamalarına güçlü bir alternatif oluşturabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Helicobacter pylori (H.pylori) has a variable prevalence worldwide. The rate of infection, which is 20-40% in developed countries, varies around 46-54% in developing countries. One of the main causes of difficulties in the diagnosis and treatment of infection is developing antibiotic resistance. Today, antibiotic-based and alternative treatment-based treatment approaches have been developed against H.pylori infection. In recent years, importance has been attached to the development of new treatment approaches based on nanotechnology in H.pylori treatment, since the success rate cannot be achieved at the desired rate. Metallic and polymeric nanoparticles form the basis of these approaches. Due to the toxic effect of metallic nanoparticles, more attention has been given to nanoparticles obtained by green synthesis method in recent years. The extract from the Cuminim Cyminum (cumin) plant is known to have strong antibacterial, antiviral activity. At the same time, metallic nanoparticles can be synthesized by green synthesis method using cumin plants. However, no study on the antibacterial effect of cumin-based silver nanoparticles on H.pylori has been found in the literature until our study. For this reason, in the current thesis, antibacterial effects were synthesized in H. pylori culture by synthesizing silver nanoparticles using the extract obtained from the cumin plant.
Due to its biodegradable, biocompatible, FDA approved, non-toxic properties, polycaprolactone (PCL) is frequently preferred in drug delivery systems. The encapsulation of drugs into nanoparticles and their introduction into the biological system enables the toxic effect of the drug to be reduced, and their stability and biological activities can be increased. In addition, drugs can be encapsulated into nanoparticles in combination with natural compounds. It is known that thymoquinone (TQ), which is one of the main components of the Nigella Sativa plant, has an antibacterial effect. However, there is no study on the combination of antibiotics used in the treatment and TQ component in our study. There is also no study to investigate the antibacterial effect of nanoformulations obtained by encapsulating this binary combination into PCL nanoparticles on H.pylori. For these reasons, the clarithromycin (CRL) and TQ used in the treatment of H.pylori was encapsulated in PCL nanoparticles in single and combination and the antibacterial activities on H.pylori were investigated. 
Characterization of synthesized metallic and polymeric nanoparticles was performed by SEM, FTIR, UV-VIS, DLS analysis. Toxicity studies of nanoparticles were tested in J774 macrophage cells using the MTT method. Antibacterial activities of the nanoparticles obtained were determined by broth dilution and disk diffusion methods.
According to the results of the characterization studies of Cumin-based Ag nanoparticles, it was determined that the average size of the particles was between 45-50nm. FTIR analysis shows that the bands specific to the cumin plant and Ag nanoparticles have been successful in synthesis. UV-VIS results also confirm previous results. The antibacterial effect of Ag nanoparticles and cumin extract obtained by the characterized chemical and green synthesis method were investigated. It has been observed that nanoparticles obtained by the green synthesis method have a strong effect compared to chemical Ag nanoparticles and cumin extract. Furthermore, when the zone diameters observed after the disc diffusion test were examined, it was observed that the zone diameter formed by the cumin nanoparticles was larger than the zone diameter formed by the silver nanoparticles synthesized by the chemical method.
In studies for characterization of PCL nanoparticles containing CRL / TQ and CRL-TQ combinations alone, it was observed that the average size of these nanoparticles ranged from 209 to 215 nm. On the other hand, according to the results of FTIR analysis, TQ and CRL-specific bands were not seen in PCL nanoparticles containing TQ and CRL. This indicates that these components have been successfully encapsulated into nanoparticles. According to the release analysis performed in UV-VIS spectroscopy, PCL nanoparticles containing TQ and CRL released around 70%. When the antibacterial activities of the synthesized and characterized nanoparticles on H.pylori were examined, it was found that PCL nanoparticles containing double combination inhibited bacteria at a higher level compared to PCL nanoparticles containing a single agent. At the same time, as a result of the disk diffusion test, it is revealed that the binary formulation, which consists of dual combination PCL nanoparticles, is more than the single PCL nanoparticles compared to single formulations.
These studies reveal that cumin-based silver nanoparticles and PCL nanoparticles containing TQ and CRL combination show high levels of antibacterial activity on H.pylori. The results obtained in this thesis study show that metallic and polymeric nanoparticles may be a powerful alternative to traditional antibiotic applications in the future.