Ratlarda oluşturulan deneysel peritonit modelinde intraperitoneal LR-PRP'nin bakteriyel translokasyona etkisi
The effect of intraperitoneal LR-PRP on bacterial translocation in an experimental model of peritonitis in rats
Yazar: MUSTAFA HİLKAT BİLALOĞLU
Danışman: PROF. DR. ÖMER RIDVAN TARHAN
Süleyman Demirel Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Genel Cerrahi = General Surgery
Dizin: Bakteriyel translokasyon = Bacterial translocation ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Lökositler = Leukocytes ; Peritonit = Peritonitis ; Sıçanlar = Rats ; Trombositten zengin plazma = Platelet rich plasma

Özet:
Amaç: Sekonder peritonit, gastrointestinal veya genitoüriner sistemin mukozal bariyerinin bütünlüğünün kaybı ile mikroorganizmaların peritoneal boşluğa direk kontaminasyonu sonucu ortaya çıkan peritonit tablosudur. Sekonder peritonit tablosu hemen daima polimikrobiyaldir ve gram negatif mikroorganizmaların baskın olduğu aerobik ve anaerobik bakteri türlerini birlikte ihtiva eder. Sekonder peritonitin en önemli sonuçlarından birisi intraabdominal abseler ve bunun sonucunda gelişen hayatı tehdit eden çok sayıda organ disfonksiyonuna neden olan, etken mikroorganizmaların ve tüm vücudun inflamatuar yanıtı ile karakterize bir sistemik enflamatuvar yanıt sendromu olan fekal peritoneal sepsistir. LR-PRP'nin pozitif anti-enfeksiyöz, immün modülatör ve anjiyogenetik etkileri olduğu gösterilmiştir. Dokuların hücre proliferasyonunu, kollajen sentezini ve vaskularizasyonu arttırarak iyileşmeyi hızlandırdığına dair literatürde pek çok çalışma mevcuttur. Bu çalışmadaki amacımız; ratlarda oluşturulan deneysel peritonit modelinde intraperitoneal LR-PRP'nin bakteriyel translokasyona etkisini incelemektir.
Gereç ve Yöntem: Çalışmada en düşüğü 380 gram en yükseği 625 gram ağırlık aralığında, 12 aylık Wistar-Albino ırkı toplam 27 adet rat, Sham (n:9), Kontrol (n:9) ve Deney (n:9) olmak üzere 3 gruba ayrıldı. Her üç gruptaki ratlara anestezi altında abdominal insizyon uygulanarak laparotomi yapıldı ve çekum izole edildikten sonra ileoçekal valv ortaya konuldu. Sham grubundaki ratlara herhangi bir işlem yapılmadan batınları açıldıktan 8 dakika sonra kapatıldı. Kontrol ve Deney gruplarındaki ratların çekumları ileçekal valv distalinden sütur ile bağlanıp antimezenterik yüzden 18 Gauge iğne ile 5 dakika içerisinde 2 kez delinerek çekal ligasyon ve ponksiyon işlemi uygulandı. Ardından kontrol grubundaki ratların batınları açıldıktan 8 dakika sonra kapatıldı. Deney grubundaki ratlarda ise her bir ratın kan ürünü kendi üzerinde kullanılmak üzere İnferior Vena Cava'dan 1.5-2 ml kan alınarak santrifüj cihazında 830 Gravite (G) 8 dakika boyunca santrifüj edilerek LR-PRP hazırlandı ve intraperitoneal olarak uygulandı. Daha sonra deney grubundaki ratların da batınları kapatıldı. 8 saat sonra tüm hayvanlara anestezi altında relaparotomi yapılarak İnferior Vena Cava'dan kan alınarak cerrahi egzanguinasyon uygulandı ve doku ve kan örnekleri alınıp hayvanlar sakrifiye edildi. Alınan kanlardan inflamatuvar parametreler (TNF-α,IL-1 ve IL-6) ve kan kültürü, alınan karaciğer, dalak ve mezenterik lenf nodu doku örneklerinden ise kültür (gram başına düşen mikroorganizma sayısı) çalışıldı.
Bulgular: Sham grubunda karaciğer doku kültürü üremesi saptanmamışken; kontrol grubunda ratların 6'sında, deney grubunda ise 1'inde üreme saptandı. Kontrol grubundaki ratların 3'ünde (%11,1) E.Coli, 1'inde (%3,7) Streptococcus Gallolyticus, 1'inde (%3,7) Staphylococcus Aureus, 1'inde (%3,7) Streptococcus Viridans baskın tür üremesi görüldü. Karaciğer doku kültürü bakımından, Sham grubu ve kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu elde edildi (p=0,009). Deney grubundaki ratların 1'inde (%11,1) Streptococcus Viridans baskın tür üremesi görüldü. Karaciğer doku kültürü bakımından, Sham grubu ve deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olmadığı saptandı (p=0,229). Karaciğer doku kültüründe, kontrol grubu ve deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu gözlendi (p=0,049).
Sham grubundaki ratların 2'sinde, kontrol grubundakilerin 7'sinde, deney grubundakilerin ise 1'inde mezenter lenf nodu doku kültür üremesi saptandı. Sham grubundaki ratların 2'sinde E.Coli; kontrol grubundakilerin 4'ünde (%44,4) E.Coli, 2'sinde (%22,2) Streptococcus Gallolyticus, 1'inde (%11,1) Staphylococcus Aureus; deney grubundakilerin ise 1'inde Streptococcus Gallolyticus üremesi görüldü. Mezenter lenf nodu doku kültürü bakımından, Sham grubu ve kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olmadığı elde edildi (p=0,081). Mezenter lenf nodu doku kültürü bakımından, Sham grubu ve deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olmadığı saptandı (p=0,471). Mezenter lenf nodu doku kültürü bakımından, kontrol grubu ve deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu gözlendi (p=0,008).
Sham grubundaki ratlarda kan kültür üremesi saptanmadı. Kontrol grubundakilerin 8'inde, deney grubundakilerin ise 3'ünde kan kültür üremesi saptandı. Kontrol grubundakilerin 5'inde (%55,6) E.Coli, 2'sinde (%22,2) Streptococcus Gallolyticus, 1'inde (%11,1) Staphylococcus Aureus üremesi görüldü. Deney grubundaki ratların ise 1'inde Staphylococcus Aureus, 1'inde Streptococcus Gallolyticus, 1'inde Klebsiella pneumoniae tespit edildi. Kan kültürü bakımından, Sham grubu ve kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu elde edildi (p<0,001). Kan kültürü bakımından, Sham grubu ve deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olmadığı saptandı (p=0,206). Kan kültürü bakımından, kontrol grubu ve deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu gözlendi (p=0,015).
Sham grubu ve deney grubundaki ratların dalak doku kültüründe üreme saptanmamışken; kontrol grubundakilerde 2'şer ratta üreme saptandı. Kontrol grubundaki ratların 2'sinde de (%22,2) E.Coli görüldü. Dalak doku kültürü bakımından, Sham grubu ve kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olmadığı elde edildi (p=0,471). Dalak doku kültürü bakımından, kontrol grubu ve deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olmadığı gözlendi (p=0,471).
Sham grubundaki ratların ortalama TNF-α değeri 148,42±40,19 ng/L, kontrol grubundakilerin 174,16±34,74 ng/L, deney grubundakilerin ise 165,46±42,15 ng/L'ydi. Ortalama TNF-alfa değerlerinin sham ve kontrol, sham ve deney, kontrol ve deney grupları arasında da istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermediği elde edildi (sırasıyla, p=0,528, p=0,999, p=0,999).
Sham grubundaki ratların ortalama IL-1 değeri 8,84±1,31 pg/mL, kontrol grubundakilerin 9,41±1,20 pg/mL, deney grubundakilerin ise 9,40±0,68 pg/mL'di. Ortalama IL-1 değerlerinin sham ve kontrol, sham ve deney, kontrol ve deney grupları arasında da istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermediği saptandı (sırasıyla, p=0,842, p=0,873, p=0,999).
Sham grubundaki ratların ortalama IL-6 değeri 2,56±0,52 ng/L, kontrol grubundakilerin 3,56±0,99 ng/L, deney grubundakilerin ise 2,93±1,31 ng/L'di. Ortalama IL-6 değerinin sham ve kontrol, sham ve deney, kontrol ve deney grupları arasında da istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermediği saptandı (sırasıyla, p=0,133, p=0,999, p=0,590).
Sonuç: Ratlarda çekal ligasyon ve ponksiyon yöntemiyle oluşturulan deneysel peritonit modeli bakteriyel translokasyona yol açmış olup, intraperitoneal olarak uygulanan LR-PRP'nin, kontrol grupları ve deney grupları karşılaştırıldığında bakteriyel translokasyonu karaciğer doku kültürü, mezenterik lenf nodu doku kültürü ve kan kültüründe istatistiksel olarak anlamlı ölçüde baskıladığı tespit edildi.
LR-PRP uygulamasının dalak doku kültüründe bakteri üremesini azaltmasına rağmen kontrol grubu ve deney grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olmadığının saptanması örneklem büyüklüğünün kısıtlılığına ve deneyin peritonit-sepsis modeli olması nedeniyle deney süresinin kısalığına bağlandı.
Alınan kan örneklerinden çalışılan ELISA sonuçlarında inflamasyon belirteçleri olan TNF-alfa, IL-1 ve IL-6 ortalama değerlerinin deneydeki rat gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı ölçüde farklılık göstermediğini ve böylece LR-PRP'nin literatüre uygun şekilde inflamasyonu baskılamadığını tespit ettik.
Tüm bu sonuçlar göz önüne alındığında LR-PRP; literatürde belirtildiği gibi antimikrobiyal özellikler gösterip pozitif anti-enfeksiyöz olarak inflamasyonu baskılamadan bakteriyel translokasyonu engelleme ve azaltmada etkili bulunmuştur. 


Anahtar Kelimeler: LR-PRP, Bakteriyel Translokasyon, Peritonit, İntraabdominal Sepsis

Abstract:
Aim: Secondary peritonitis is a picture of peritonitis that occurs as a result of loss of the integrity of the mucosal barrier of the gastrointestinal or genitourinary system and direct contamination of microorganisms into the peritoneal space. Secondary peritonitis is almost always polymicrobial and includes both aerobic and anaerobic bacterial species dominated by gram-negative microorganisms. One of the most important consequences of secondary peritonitis is fecal peritoneal sepsis, a systemic inflammatory response syndrome characterized by the inflammatory response of the causative microorganisms and the whole body, causing intra-abdominal abscesses and the resulting life-threatening multiple organ dysfunction. LR-PRP has been shown to have positive anti-infectious, immune modulatory and angiogenic effects. There are many studies in the literature showing that tissues accelerate healing by increasing cell proliferation, collagen synthesis and vascularization. Our aim in this study; To examine the effect of intraperitoneal LR-PRP on bacterial translocation in the experimental peritonitis model created in rats.
Materials and Methods: In the study, a total of 27 Wistar-Albino rats aged 12 months, with a minimum weight of 380 grams and a maximum weight of 625 grams, were divided into 3 groups as Sham (n:9), Control (n:9) and Experiment (n:9). Laparotomy was performed by applying an abdominal incision under anesthesia to the rats in all three groups, and the ileocecal valve was revealed after the cecum was isolated. The rats in the Sham group were closed 8 minutes after the abdomen was opened without any procedure. Cecal ligation and puncture were performed by connecting the cecum of the rats in the control and experimental groups with a suture from the distal of the cecal valve, and puncturing the antimesenteric face with an 18-gauge needle 2 times within 5 minutes. Then, the abdomen of the rats in the control group was closed 8 minutes after opening. In the rats in the experimental group, 1.5-2 ml of blood was taken from the Inferior Vena Cava for use on each rat's blood product, and LR-PRP was prepared by centrifuging in a centrifuge device at 830 Gravity (G) for 8 minutes and administered intraperitoneally. Then, the abdomens of the rats in the experimental group were closed. After 8 hours, all animals underwent relaparotomy under anesthesia and surgical exsanguination was performed by taking blood from the Inferior Vena Cava. Tissue and blood samples were taken and the animals were sacrificed. Inflammatory parameters (TNF-α, IL-1 and IL-6) and blood culture were studied from the blood taken, and culture (number of microorganisms per gram) was studied from liver, spleen and mesenteric lymph node tissue samples taken.
Results: While liver tissue culture growth was not detected in the sham group; Reproduction was detected in 6 of the rats in the control group and in 1 of the experimental group. E.Coli in 3 (11.1%) of the rats in the control group, Streptococcus Gallolyticus in 1 (3.7%), Staphylococcus Aureus in 1 (3.7%), Streptococcus in 1 (3.7%) Viridans dominant species reproduction was seen. In terms of liver tissue culture, a statistically significant relationship was found between the Sham group and the control group (p=0.009). Streptococcus viridans dominant species growth was observed in 1 (11.1%) of the rats in the experimental group. In terms of liver tissue culture, there was no statistically significant relationship between the Sham group and the experimental group (p=0.229). In liver tissue culture, a statistically significant relationship was observed between the control group and the experimental group (p=0.049).
Mesenteric lymph node tissue culture growth was detected in 2 of the rats in the sham group, 7 of the rats in the control group, and 1 of the experimental group. E.Coli in 2 of the rats in the Sham group; E.Coli in 4 (44.4%), Streptococcus Gallolyticus in 2 (22.2%), Staphylococcus Aureus in 1 (11.1%) of the control group; Streptococcus Gallolyticus growth was observed in 1 of those in the experimental group. In terms of mesenteric lymph node tissue culture, there was no statistically significant relationship between the Sham group and the control group (p=0.081). In terms of mesenteric lymph node tissue culture, there was no statistically significant relationship between the Sham group and the experimental group (p=0.471). In terms of mesenteric lymph node tissue culture, a statistically significant relationship was observed between the control group and the experimental group (p=0.008).
No blood culture growth was detected in rats in the sham group. Blood culture growth was detected in 8 of the control group and 3 of the experimental group. E.Coli growth was observed in 5 (55.6%) of the control group, Streptococcus Gallolyticus in 2 (22.2%) and Staphylococcus Aureus in 1 (11.1%). Staphylococcus Aureus was detected in 1, Streptococcus Gallolyticus in 1, and Klebsiella pneumoniae in 1 of the rats in the experimental group. In terms of blood culture, a statistically significant relationship was found between the Sham group and the control group (p<0.001). In terms of blood culture, there was no statistically significant relationship between the Sham group and the experimental group (p=0.206). In terms of blood culture, it was observed that there was a statistically significant relationship between the control group and the experimental group (p=0.015).
While no growth was detected in the spleen tissue culture of the rats in the Sham group and the experimental group; Reproduction was detected in 2 rats each in the control group. E. Coli was detected in 2 (22.2%) of the rats in the control group. In terms of spleen tissue culture, it was found that there was no statistically significant relationship between the Sham group and the control group (p=0.471). In terms of spleen tissue culture, it was observed that there was no statistically significant relationship between the control group and the experimental group (p=0.471).
The mean TNF-α value in the sham group was 148.42±40.19 ng/L, 174.16±34.74 ng/L in the control group, and 165.46±42.15 ng/L in the experimental group. It was also found that the mean TNF-alpha values did not show a statistically significant difference between sham and control, sham and experimental, control and experimental groups (respectively, p=0.528, p=0.999, p=0.999).
The mean IL-1 value of the rats in the sham group was 8.84±1.31 pg/mL, 9.41±1.20 pg/mL in the control group, and 9.40±0.68 pg/mL in the experimental group. It was determined that the mean IL-1 values did not show a statistically significant difference between sham and control, sham and experimental, control and experimental groups (respectively, p=0.842, p=0.873, p=0.999).
The mean IL-6 value of the rats in the sham group was 2.56±0.52 ng/L, 3.56±0.99 ng/L in the control group, and 2.93±1.31 ng/L in the experimental group. It was also determined that the mean IL-6 value did not show a statistically significant difference between sham and control, sham and experimental, control and experimental groups (respectively, p=0.133, p=0.999, p=0.590).
Conclusion: Experimental peritonitis model created by cecal ligation and puncture method in rats caused bacterial translocation and intraperitoneally administered LR-PRP suppressed bacterial translocation statistically in liver tissue culture, mesenteric lymph node tissue culture and blood culture when the control and experimental groups were compared.
Although LR-PRP application reduced bacterial growth in spleen tissue culture, the determination that there was no statistically significant relationship between the control and experimental groups was attributed to the limited sample size and the short duration of the experiment since the experiment was a peritonitis-sepsis model.
We found that the mean values of TNF-alpha, IL-1 and IL-6, which are inflammation markers, in the ELISA results studied from the blood samples taken from the blood samples did not differ statistically significantly compared to the rat groups in the experiment, and thus LR-PRP did not suppress inflammation in accordance with the literature.
Considering all these results, LR-PRP; As stated in the literature, it was found to be effective in preventing and reducing bacterial translocation without suppressing inflammation by showing antimicrobial properties and being positive anti-infectious.

Keywords: LR-PRP, Bacterial Translocation, Peritonitis, Intraabdominal Sepsis