Yeni nesil platin komplekslerinin kütle spektrometrik yöntemlerle incelenmesi ve antikanser aktivitelerinin in vitro olarak araştırılması
Investigation of new generation platinum complexes by mass spectrometric methods and their anti-cancer activities in vitro studies
Yazar: ASLI ÇAL
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Kütle spektroskopisi = Mass spectroscopy

Özet:
Kanserin ilaç ile tedavisinde metal içerikli cisplatin (CDDP) türevi ilaçların kullanılmasına yönelik çalışmalar, 1960'larda CDDP'nin antikanser aktivitesinin keşfi ile başlamıştır. CDDP ile tedavide karşılaşılan yan etkilerin şiddetli olması ve bazı hücre tiplerinin CDDP'ye direnç göstermesi, ilacın etki mekanizmasının araştırılmasını gerekli kılmıştır. Günümüzde yalnızca birkaç adet Pt bileşiğinin antikanser ilaç olarak klinik uygulamalarda kullanılıyor olması, yeni nesil platin ve diğer geçiş metal (Pd, Ru, Au) komplekslerinin sentezlenmesine ve in vitro ortamda antikanser aktivitelerinin araştırılmasına sebep olmuştur. Yapılan çalışmalar, aday antikanser molekül için hedef molekülün DNA olduğunu ve uygulanan ilacın yalnızca %1 oranında hedefe ulaştığını göstermiştir. Hedef moleküle ulaşan ilaç oranının yetersiz olması, ilacın DNA'ya ulaşana dek, hücre içinde veya dışında etkileşime girdiği diğer biyomoleküllerin tespit edilmesini ve etkileşim oranının belirlenmesini gerekli kılmıştır. Ayrıca ilacın hücre içine alınma mekanizmasının ve DNA'ya bağlanma sonrası gerçekleşen reaksiyonların aydınlatılması gerektirmektedir. 
Elektro Sprey İyonlaşma (ESI) ve Matriks Destekli Lazer Desorpsiyon İyonlaşmalı (MALDI) yumuşak iyonlaşma tekniklerinin keşfedilmesi ile biyomoleküllerin ve daha da önemlisi onların zayıf kovalent olmayan komplekslerinin kütle spektrometresi (MS) ile bozunmaya uğramadan analizleri mümkün hale gelmiştir. İnorganik yapının organik yapıya bağlanması öncesi ve sonrasında elde edilen kütle spektrumlarının farklılığı ilaç-biyomolekül etkileşimlerinin kütle spektrometresi ile incelenmesine olanak sağlamıştır. Organik ve inorganik yapıların aynı anda analiz edilebiliyor olması, Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) gibi klasik tekniklerle elde edilemeyen düşük tayin limitlerine inilebilmesine olanak sağlaması, kristolografik tekniklerde aranan mükemmel kristal oluşumuna gereksinim göstermemesi, ön ayırma gerektirmeksizin analize imkan sağlaması nedeniyle ESI-QTOF(Dört kutuplu-uçuş zamanlı)-MS ve MALDI-TOF(uçuş zamanlı)-MS tekniklerinin ilaç-biyomolekül etkileşimlerinin izlenmesinde kullanımı yaygınlaşmıştır.
Bu tez kapsamında; yeni nesil Pt komplekslerinden biri olan "Kloro-2,6-bis (N-metil-benzimidazol-2-il)piridinplatin(II)klorür" molekülünün (B19), IR, 1H NMR, ESI-QTOF MS ve MALDI-TOF MS teknikleri ile karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Antikanser ilaçlar için hedef molekül olan DNA ile etkileşimi temsil etmesi açısından in vivo ortamı taklit eden in vitro ortamda ilk kez nükleotid/oligonükleotid (dekamer) ile inkübasyonu sonucu oluşan kompleksler incelenmiş, etkileşim bölgeleri tespit edilmiştir. Oluşan kovalent olmayan komplekslerin MALDI ve ESI iyonlaşma mekanizmaları aydınlatılmıştır. İnkübasyon mol oranı, inkübasyon süresi ve tampon çözeltinin sırasıyla kompleks oluşumuna ve kütle spektrumuna etkisi incelenmiştir. 
Farklı derişimlerde hazırlanan B19 molekülüne ait ESI-QTOF MS verileri kullanılarak kalibrasyon eğrisi oluşturulmuş ve inkübasyon çözeltilerindeki azalan B19 derişimi hesaplanarak, biyomolekül-ilaç etkileşimleri hem inkübasyon mol oranı hem de inkübasyon süresi yönünden karşılaştırılmıştır.
Hedef molekül olan DNA'ya ilacın ulaşmasında engel teşkil eden sitokrom C, lizozim ve ubiqutin gibi proteinler ile B19 molekülünün yapmış olduğu kompleksler MALDI-TOF MS ve ESI-QTOF MS ile tayin edilmiştir. Bu tür kanser ilaçlarına yüksek oranda girişim gösteren ve ilaçların aktivitesinin azalmasında önemli rol oynayan glutatiyon peptidi (GSH)  ve oligomerin bir arada bulunduğu yarışmalı inkübasyon ortamında B19'un davranışı detaylı olarak incelenmiştir.B19 molekülü ile elde edilen olumlu sonuçlar nedeniyle, B19 molekülünün 3 farklı türevi ön denemelere tabi tutulmuştur. B19 molekülündeki Pt yerine Pd yerleştirilerek elde edilen ve B19 ile aynı ligandlara sahip olan B20 molekülü (kloro-2,6-bis(N-metil-benzimidazol-2-il)piridinpaladyum(II)klorür), sudaki düşük çözünürlüğü nedeniyle ileri analizlere alınmamıştır. B19 molekülündeki benzimidazol halkasına bağlı olan N-metil grubunun 1,3-propilsülfonat ile değiştirilmesi ile elde edilen Pt temelli B33 bileşiği (kloro-2,6-bis(1,3-propilsülfonat-benzimidazol-2-il)piridin platin(II) klorür) ve B33 ile aynı liganda sahip Pd temelli B35 bileşiğinin (kloro-2,6-bis(1,3-propilsülfonat-benzimidazol-2-il) piridinpaladyum(II)klorür) yapısı MALDI-TOF MS ile tayin edilmiş ve söz konusu bu moleküllerin nükleotidler ile inkübasyonuna ait çözeltiler MALDI-TOF MS sisteminde analiz edilmiştir. B19, B33 ve B35 moleküllerinin sitotoksik etkileri prostat kanseri hücre hattı PC-3 ve akciğer kanseri hücre hattı A-549 kullanılarak test edilmiş, IC50 değerleri belirlenmiştir.

Abstract:
Studies on the use of metal based drugs, derivatives of cisplatin (CDDP), in the treatment of cancer by medicine began in the 1960s with the discovery of CDDP. Investigation of the drug's effect mechanism became necessary due to the displayed CDDP resistance of many cell types and serious side effects of CDDP in treatment. Nowadays, only a few amount of Pt compounds have being used as anticancer drug in clinical applications, caused the synthesis of new genaration platinium and other transition metal complexes (Pd, Ru, Au)  and researching the anticancer activity of them in vitro. The studies showed that DNA is the target molecule of anticancer drug and only 1% of the used drug can reach the target. Since the rate of the drug reaches the target molecule is inadequate, it's necessary to detect the other biomolcules which can interact with drug until it reaches to the DNA in the cell or outside the cell and to determine the rate of interaction. Also the mechanism of drug uptake into cells and reactions that occur after binding to the DNA were should be determined.
By the discovery of soft ionization techniques, electrosprey ionization (ESI) and matrix assisted laser desorption ionization (MALDI), analysis of biomolecules and most importantly their weak noncovalent complexes by mass spectrometry (MS) are made possible without degradation. The differences between mass spectra of free organic structure and its complex compound allow to analyze the interactions of drug-biomolecule. Electrosprey ionization-Quadrapol-time-of-flight (ESI-QTOF MS) and MALDI-TOFMS techniques usage became widespread for monitoring the drug-biomolecule interactions due to organic and inorganic structures can be anlayzed simultaneously, low detection limit can be reached that can not be possible by classical techniques, such as Nuclear Magnetic Resonance (NMR), there is no necessarity to the perfect crystalline formation that is requirement for crystallographic techniques and enable to analyze the samples without any pre-separation step.
In this thesis, a new generation platinum compound, chloro-2,6-bis (N-methyl-benzimidazole-2-yl)pyridineplatinum(II) chloride (B19), was characterized by ESI-QTOF-MS, MALDI-TOF MS, Infrared (IR) and proton (1H)  NMR techniques. This is the first time, the complexes were analyzed that formed at the end of nucleotide / oligonucleotide (decamer) – B19 incubation in vitro that mimics in vivo to represent the interactions of target DNA and anticancer drug, and interaction sites were identified. Ionization mechanisms of noncovalent complexes in MALDI and ESI techniques were clarified. The effects of buffer type, incubation time and mol range on complex formation and mass spectra were investigated. Biomolecule-drug interactions were compared by using either incubation mol range or incubation time according to the concentration decreasing of B19 molecule that calculated via calibration curve obtained from ESI-QTOF-MS data of B19 molecule at different concentrations.
Complexes of B19 molecule with proteins, such as cytochrome C, lyzozime, ubiqutin, obstacle to the achieving of drug to the target molecule, DNA; were identified by MALDI-TOF MS and ESI-QTOF-MS. Behavior of B19 in competitive incubation medium that contains combination of oligonucleotide and the Gluthatione (GSH) peptide, shows interferance at high rates to the cancer drug and plays an important role in the reduction of activity of drugs, was examined in detail. 
Due to the significant results obtained with the B19 molecule, three different variants of B19 have undergone preliminary testing. B20 in which Pt was replaced with Pd, has not been studied further analysis due to its lower water solubility. The structure of Pt-based compound B33, obtained by replacing N-methyl group with  ionic 1,3-propyl sulfonate group  and the corresponding Pd complex compound B35, were identified by MALDI-TOF MS. The incubation of the solution of these compounds with nucleotides were analyzed by MALDI-TOF MS. Cytotoxic effects of B19, B33 and B35 molecules were tested by using PC-3 prostate cancer cell line and lung cancer cell line A-549. The IC50 values of each drug were determined.