Antibiyotik adaptif laboratuvar evrimi uygulanan Escherichia coli MG1655'de önemi artan genlerin CRISPRi ile belirlenmesi
Identification of genes of increasing importance in Escherichia coli MG1655 with antibiotic adaptive laboratory evolution by CRISPRi
Yazar: DİLAN CAN
Danışman: DOÇ. DR. TÜLİN ÖZBEK ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ENES SEYFULLAH KOTİL
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotik dirençliliği =   ; Bakteriler = Bacteria ; CRISPR = CRISPR ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Genom bilimi = Genomics

Özet:
Bakteriler antibiyotiklere adapte olurken çok sayıda değişikliğe uğrar. Dirençli ve yabanıl tip bakteriler arasındaki farklılıkların karakterizasyonu dirençle mücadele için kritik bir öneme sahiptir. Bu farklılıklardan gen ifadesi seviyesi ve nükleotit değişimlerini tanımlamak üzere Tüm Genom Dizilimi ve Transkriptom Dizileme yöntemleri kullanılmıştır. Adaptasyona aracılık eden bir diğer değişim ise, esansiyel olmayan genlerin hücresel faktörleri etkileyerek adaptasyondan sonra bakteri için daha önemli hale gelmesidir. Yapılan çalışmalarda dirençli mutantların hayatta kalmasında kritik roller üstlenen esansiyel olmayan genlerin varlığı Transpozon Mutajenez Dizileme ile gösterilmiştir. Fakat birçok antibiyotik direnci ve mutantı için ortaklık gösterebilecek, dirençli bakterilerin büyümesini azaltabilecek genler araştırılmamıştır. Bu tez çalışmasında, adaptasyondan sonra önemi artan genleri belirlemek için laboratuvarda evrimleştirilmiş Escherichia coli MG1655 (E. coli) de genom çapında CRISPRi tarama kullanılmıştır. Ampisilin, doksisiklin, kloramfenikol, oksasilin ve kloramfenikole dirençli 2 soy hattı elde edilmiştir. İnhibisyonu halinde yabanıl tipe kıyasla mutant tiplerde daha çok büyüme kusuruna sebep olan genler belirlenmiştir. 28 genin adaptasyondan sonra daha önemli hale geldiği belirlenmiştir. En düşük kat değişim değerini veren 4 gen; lapB, yrfF; mrdA ve rsfS öne çıkmıştır. Ampisiline adaptasyondan sonra önemi artan 19 genin diğer deney gruplarından ayrı bir küme oluşturduğu gözlemlenmiştir. Kloramfenikol, doksasiklin, oksasilin ve spiramisin gruplarında hücre membranı ve zar yapısını düzenleyen genlerin varlığı tespit edilmiştir. En çok zenginleşen hücresel yollar DNA replikasyonu, lizin biyosentezi, yanlış baz eşleşmesi tamiri, homolog rekombinasyon ve peptidoglikan biyosentezi olmuştur. Bu genlerin tanımlanması, özellikle dirençli suşları hedefleyen, uygun yeni tedaviler geliştirme potansiyeline sahiptir.

Abstract:
Bacteria undergo numerous changes as they adapt to antibiotics. Characterization of differences between resistant and wild-type bacteria is critical for combating resistance. Whole Genome Sequencing and Transcriptome Sequencing methods were used to identify gene expression level and nucleotide changes from these differences. Another change that mediates adaptation is that non-essential genes become more important for bacteria after adaptation by influencing cellular factors. The presence of non-essential genes that play critical roles in the survival of resistant mutants has been demonstrated by Transposon Mutagenesis Sequencing. However, genes that may be associated with many antibiotic resistances and mutants, and that may reduce the growth of resistant bacteria, have not been investigated. In this thesis, genome-wide CRISPRi screening was used in laboratory-evolved Escherichia coli MG1655 (E. coli) to identify genes of increased importance after adaptation. Two strains were obtained, each resistant to ampicillin, doxycycline, chloramphenicol, oxacillin and chloramphenicol. In case of inhibition, genes that cause more growth defects were determined in mutant types compared to wild type. 28 genes were determined to become more important after adaptation. 4 genes (lapB, yrfF; mrdA and rsfS) came to the forefront by giving the lowest fold change value. It was observed that 19 genes, whose importance increased after adaptation to ampicillin, formed a separate cluster from other experimental groups. The presence of genes regulating cell membrane and membrane structure was detected in chloramphenicol, doxacycline, oxacillin and spiramycin resistant groups. The most enriched cellular pathways were DNA replication, lysine biosynthesis, mismatch repair, homologous recombination, and peptidoglycan biosynthesis. Identification of these genes has the potential to develop appropriate and novel therapies that specifically target resistant strains.