Kültüre edilmiş amniotik hücrelerde mezankimal kök hücre özelliklerinin tayini:morfolojik tiplendirme, yüzey antijen ekspresyonu (İmmünfenotipleme) ve osteojenik, adipojenik, kondrojenik farklılaşma
The assesment of mesenchymal stem cells characteristics in cultured amniotic fluid cells: The morphological characteristics, the expression of surface antigens (immunophenotyping) and osteogenic, adipogenic, chondrogenic differentiation capacity.
Yazar: ÖZLEM SEZER
Danışman: PROF. DR. GÖNÜL OĞUR
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2009
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Amniosentez = Amniocentesis ; Antijenler-yüzey = Antigens-surface ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücreler = Cells ; Kök hücreler = Stem cells ; Morfoloji = Morphology ; İmmünofenotip tayini = Immunophenotyping

Özet:
Kök hücreler, kendilerini sürekli yenileyebilen ve çeşitli dokulara farklılaşabilen hücrelerdir ve özgün koşullar altında mesodermal, ektodermal ve endodermal kaynaklı hücre tiplerine dönüşebilmektedirler. Köken aldıkları doku ile ilişkili olarak, embriyonik ve erişkin kök hücreler olmak üzere iki sınıfta incelenebilirler.En güçlü kök hücre kaynağı olan embriyonik kök hücreler, embriyonun iç hücre kütlesinden alınması nedeni ile etik sorun yaratmakta ve vericiye nakledildiklerinde tümör (teratom) oluşturma potansiyelleri, allojenik kullanımlarında immün ?red? oluşturmaları ve elde edilmelerindeki teknik problemler bu hücrelerin klinik kullanım olanaklarını kısıtlamaktadır.Kemik iliği mezankimal kök hücreleri (MKH), halen klinikte en yaygın kullanılan erişkin kök hücre kaynağıdır; ancak kemik iliği kaynaklı MKH sıklığının göreceli düşük olması, hücrelerin invazif bir işlemle elde edilmesi, kültür sürecinde hücre oranı ve farklılaşma kapasitesinin azalması nedeni ile halen klinik kullanım olanakları sınırlıdır.Kök hücrelerle ilgili araştırmaların tıpta uygulama alanlarının giderek artması nedeniyle, insan uygulamalarında kullanılabilir başka kök hücre kaynakları aranması gereksinimi doğmuştur. Fetal mezankimal kök hücreler, bu araştırmalar sonucunda belirlenen kaynaklardandır. Amniotik hücreler, genetik hastalıkların tanısı için uzun yıllardır rutin olarak kullanılan fetal hücrelerdir; son yayınlar, biyolojik ve genetik özellikleri nedeni ile amniotik sıvı kökenli MKH lerini, hücre tedavi yaklaşımlarında belirli avantajlara sahip güçlü aday hücreler olarak tanımlamaktadır.Çalışmamızda, amniotik sıvı hücrelerinin mezankimal kök hücre potansiyelinin araştırılması hedeflenmiş, bu temelde hücrelerin kültür sürecindeki morfolojik özellikleri, immünfenotipik özellikleri, ve osteojenik, adipojenik ve kondrojenik farklılaşma kapasiteleri değerlendirilmiştir. Bu amaçla genetik analizi tamamlanmış, ?atık? konumdaki amniosentez materyalleri kullanılmıştır.Primer kültür ve sub-kültür (P02-P13a) hücreleri rutin prenatal tanı protokolleri ile gerçekleştirilmiş ve hücrelerin MKH temelinde immünfenotipik değerlendirilmesi, akım sitometri cihazında gerçekleştirilmiştir. İmmunfenotiplemede, CD90, CD73, CD166, CD49e, CD44, CD29, HLA-ABC yüzey antijenleri pozitif, CD34, CD45, HLA-DR ise negatif saptanmıştır. MKH immünfenotipik belirteçleri gösterilen hücrelerde histokimyasal boyamalar temelinde osteojenik ve kondrojenik farklılaşma da gösterilmiş, adipojenik farklılaşma ise gerçekleştirilememiştir.Morfolojik değerlendirmeler sonucunda amniotik sıvı hücreleri, (1) Amniotik sıvı spesifik hücre tipi (AF), (2) Fibroblastoid hücre tipi (FB1, FB2) ve (3) Epiteloid hücre tipi (E) olarak üç sınıfta değerlendirilmiştir. Fibroblastoid-tip (FB1 ve FB2), birbirine paralel iğ şeklindeki hücreler olarak belirlenmiştir; FB1 hücrelerinin uzun ve ince bir yapılarının olduğu ve FB2 hücrelerine göre çok daha homojen olduğu gözlemlenmiştir. AF-tip hücreler, sıkı bağlantısı olmayan, yuvarlak şekilli ve poligonal hücreler olarak, epiteloid-tip hücreler ise oldukça sıkı bağlantılı, küçük koloniler oluşturan, yuvarlak ve keskin kenarlı, adacıklar oluşturan hücreler olduğu saptanmıştır. Morfolojik değerlendirme verileri MKH immünfenotipi ile ilişkilendirildiğinde, amniotik sıvı mezankimal kök hücrelerinin, amniotik sıvının heterojen hücre popülasyonu içinde özgün bir hücre grubundan (FB2 tip hücreler) kaynaklandığını düşündürmektedir.Çalışmamızın sonucunda, laboratuarımız koşullarında temel çalışmaları tamamlanmış olan amniotik sıvı kökenli MKH lerin kullanılabileceği hücre tedavisi temelli (cell therapy), gelecek vaadeden pre-klinik/klinik araştırmalara da olanak sağlayabileceği inancındayız.ANAHTAR SÖZCÜKLER: Amniosentez, Mezankimal kök hücre, Hücre morfolojisi, Akım sitometri, Farklılaşma.

Abstract:
Stem cells are the cells that are thought to be able to proliferate indefinitely and differentiate into many different tissues. Under the right conditions, they have remarkable potential to develop intomany different cells types derived from mesoderm, ectoderm and endoderm. They can be analysed in two groups in relation with the tissue they derived from; embryonic stem cells and adult stem cells.The clinical use of embryonic stem cells is limited by its tumour and immune rejection development potential and difficulties in obtaining and ethical considerations.Clinical use of MSC is relatively limited by some reasons such as low frequency of MSC s derived from bone marrow or decrease in ratio of cells and capacity of differentiation in culture. The need for finding new stem cell sources result from researches on implementation of stem cells in medicine. Fetal mesenchymal stem cells are the new sources. Amniotic cells which been used for the diagnosis of genetic disorders for many years, have lately been identified as having MSC derived from amniotic cell population. They have significant advantages by their biological and genetic characteristics in cell therapy approaches.In our study, we aimed to examine heterogeneous amniotic fluid cells for their MSC potentcy. On this basis, the morphological and the immunphenotypic characteristics and osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation capacity of the cells were analysed. By this purpose, genetically analysed amniocentesis materials were used.Primary culture and sub-cultures were examined by routine prenatal diagnosis protocols. On the basis of MSC, cells were analysed by flow cytometry for immunophenotyping; CD90, CD73, CD166, CD49e, CD44, CD29, HLA-ABC? s surface antigens yielded positive result whereas CD34, CD45, HLA-DR? s surface antigens were observed to be negative. Histochemical staining, for osteogenic and chondrogenic differentiation achieved tissue differentiation specific for osteocytes and chondrocytes but adipogenic differentiation was not materialized.In the light of morphologic evaluations, amniotic fluid cells were analysed in three groups; (1) amniotic fluid specific cell type (AF), (2) fibroblastoid cell type (FB1, FB2) and (3) epitheloid ? type (E). Fibroblastoid cell type (FB1, FB2) was identified as spindle shaped cells parallel to each other. FB1 cells were observed to have long and thin and homogenous structures when compared with FB2 cells. AF cells had loose network and they were observed round and polygonal shaped cells; epitheloid-type cells had tight network and they were observed colonized, round sharp edged and clustered. When morphological assessment data were associated with MSC immunophenotype, amniotic fluid mesenchymal stem cells were suggested to be derived from a specific cell group (FB2) in a heterogeneous cell population.Our study provided contributions to promising cell therapy-based pre-clinic/clinic studies in which amniotic fluid derived MSC s can be used.KEY WORDS: Amniocentesis, Mesenchymal stem cell, Cell Morphology, Flow cytometry, Differentiation.