B16F10 malign melanoma hücrelerinde flavopiridol ve oksaliplatin'in ve bu hücrelerin aktarıldığı C57Bl6 farelerinde flavopiridol'ün apoptoz sinyal yolağına etkileri
The apoptotic effects of flavopiridol combined with oxaliplatin on B16F10 malignant melanoma cells and in vivo effects of alone on B16F10 inoculated C57Bl6 mice
Yazar: ÖZLEM GÖKÇE
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH EKMEKÇİ
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Melanom = Melanoma

Özet:
Malignant melanoma (MM) bir deri tümörüdür ve hem görülme sıklığı hem de ölüm oranı açısından büyük bir sağlık problemi olarak değerlendirilmektedir. Siklin bağımlı kinazlar (CDK) hücre döngüsünün düzenlenmesinde çok etkili olduklarından kanser tedavisinde hedeftirler. P16INK4A hücre döngüsünün giriş çıkışında ve kontrol noktasının bütünlüğünde görevlidir. Bir CDK inhibitörü olan flavopiridol, hücre döngüsünün durmasını uyaran P16INK4A'yı taklit eden bir ajandır. Flavopiridol en güçlü etkisini oksaliplatin gibi DNA hasarı uyarıcılarıyla birlikte uygulandığında gösterir. Çalışmamızda P16INK4A olmayan hücre hattı B16F10'da flavopiridol ve oksaliplatin kombinasyonunun antiproliferatif etkilerini ve ayrıca B16F10 enjeksiyonuyla oluşturulmuş melanoma tümör modelinde tek ajan olarak flavopiridolün apoptotik etkilerini araştırdık.Oksaliplatin (40 ?M and 80 ?M), flavopiridol (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM) ve bunların kombinasyonlarının B16F10 hücrelerindeki antiproliferatif etkileri 24 ve 48 saatte MTT testiyle ölçüldü. Flavopiridol hücre canlılığını 24 saatte 100 nM'da bile azaltmıştır. Diğer yandan flavopiridol ve oksaliplatin antagonistik etkiye sahiptir ve birlikte kullanıldıklarında hücre ölümünü azaltırlar. B16F10 hücreleri subkutanöz olarak C57BL6 farelere enjekte edilip, tümör oluşumu gözlendikten sonra bu fareler flavopiridol (2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg) ve DMSO (kontrol grubu) ile tedavi edildi. Kaspaz 3/7 ve kaspaz 9 aktiviteleri kolorimetrik yöntemle analiz edildi. Flavopiridol in vitro ve in vivo kaspaz 3/7 ve kaspaz 9 aktivitelerini doza bağımlı olarak artırdı. Bcl-2 ve PCNA ifadeleri immünohistokimyasal olarak analiz edildi. Her ne kadar Bcl-2 boyaması flavopiridol ile tedavi edilen gruplarda artsa da, PCNA boyaması flavopiridol uygulanan farelerde azalmıştır. BRAF, kaspaz 3 ve Bcl2l1 mRNA ifade düzeyleri qPCR ile değerlendirildi.Sonuç olarak, flavopiridol tedavisi tek ajan olarak B16F10 hücrelerinin hücre canlılığında daha iyi bir etkiye sahiptir. Ayrıca mitokondriyal apoptotik yolak aracılığıyla doza bağımlı olarak kaspaz aktivitesini artırır. PCNA ifadesindeki azalış flavopridolün hücre döngüsünün durması ile sonuçlanabilen antiproliferatif etkisini gösterdi.

Abstract:
Malign melanoma is the neoplasm of the skin and is considered a major health problem as both incidence and mortality rates. The cyclin dependent kinases (CDKs) are major players in cell cycle regulation and rational targets for cancer. P16INK4A has functions on cell cycle entry/exit and checkpoint integrity. Flavopiridol is a CDK inhibitor and a potent P16INK4A simulator that promotes cell cycle arrest. Flavopiridol exhibits its most potent effects when administered together with a DNA damage inducer, such as oxaliplatin. In this study, we aimed to examine the anti-proliferative effects of flavopiridol and oxaliplatin combination on p16INK4A deficient melanoma cell line B16F10 and also its apoptotic effects on B16F10 injected melanoma tumor model as a single agent.Anti-proliferative effects of oxaliplatin (40 ?M and 80 ?M) and flavopiridol (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM) and combination of flavopiridol and oxaliplatin on B16F10 cells were measured by MTT assay at 24h and 48h. Flavopiridol decreased cell viability even at 100 nM at 24 hour. On the other hand, flavopiridol and oxaliplatin have antagonistic effects and decreased cell death when used in combination. B16F10 cells were injected subcutaneously into C57BL6 mice and after tumor formation these mice were treated with flavopiridol (2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg) and the control group was treated with DMSO. Caspase 3/7 and caspase 9 activities were analyzed by colorimetric assays. Flavopiridol enhanced caspase 3/7 and caspase 9 activities in vitro and in vivo in a dose dependent manner. Bcl-2 and PCNA expression were analyzed by immunohistochemistry. Even though there was a significant increase in Bcl-2 staining, PCNA staining was decreased in flavopiridol administered mice. BRAF, caspase 3 and Bcl2l1 mRNA expression levels were quantified with q-PCR.As a conclusion, flavopiridol treatment had better effects on cell viability of B16F10 cells as a single agent. It also increased caspase activity in a dose dependent manner in vitro and in vivo via mitochondrial apoptotic pathway. Decreased PCNA expression showed antiproliferative effects of flavopiridol which might be result of cell cycle arrest.