Nilotinib ile indüklenmiş KML hücre modeli apoptozunda JAK-STAT yolağı elemanlarından STAT5A ve STAT5B'nin etkilerinin araştırılması
Investigating the role of JAK-STAT pathway's elements STAT5A and STAT5B upon nilotinib induced apoptosis for CML cell model
Yazar: TUNZALA YAVUZ
Danışman: PROF. DR. GÜRAY SAYDAM
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nilotinib = Nilotinib ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
AMAÇ:  Kronik Myeloid Lösemi  (KML) multipotent kök hücrelerinin neoplastik transformasyonu sonucunda ortaya çıkan klonal myeloproliferatif hastalıktır. t(9,22) translokasyonu sonucunda oluşan BCR-ABL füzyon geni KML'nin patogenezinde merkezi rol oynamaktadır. BCR-ABL füzyon geni kontrolsüz tirozin kinaz aktivitesi göstermekte ve bazı sinyal yolaklarını uyarmaktadır. JAK-STAT sinyal yolağı KML'nin patogenezinde rol oynayan yolaklardan en önemlisidir. JAK-STAT sinyal yolunda işlev gören STAT proteinleri fosforilasyon ile aktifleşirler. Bu sinyal yolağı, hücre büyümesi, proliferasyonu, farklılaşması, sağkalımı gibi birçok hücre süreçlerini etkiler.  JAK-STAT yolağı elemanları STAT5A ve STAT5B; sinyal iletiminde ve malignitede ekspresyonu artan genlerin aktivasyonunda görevli olup, lösemi gelişiminde rol alırlar.  STAT gen ekspresyonunun baskılanmasının tümör hücrelerinde apoptoz indüklenmesi ile sonuçlandığı gösterildikten sonra bu alanda çalışmalar hız kazanmıştır. Nilotinib, KML tedavisinde kullanılan tirozin kinaz inhibitörlerinden biridir.
Bu çalışmada; nilotinib ile induklenmiş KML hücre modeli apoptozunda JAK-STAT yolağı elemanlarından STAT5A, STAT5B-nin etkilerinin araştırılması ve apoptoz oranlarının belirlenmesi amaçlandı.
MATERYAL VE METOD: Nilotinibin sitotoksik efektif dozu IC50 değeri tripan mavisi ve WST-1 hücre proliferasyon analizi testi ile belirlendi. Nilotinib muamelesi sonrasında hücrelerin apoptotik durumu "Cell Death Detection kit" ve  "Caspase 3 Activity Assay kit" ile belirlendi.  STAT5A ve STAT5B mRNA ekspresyon düzeyleri, nilotinib ile muamele sonrasında eş zamanlı olarak qRT-PCR ile belirlendi. STAT5A ve STAT5B  protein  düzeylerinin WesternBreeze® Chromogenic Kit–Anti-Rabbit"  kit ile değerlendirilmesi yapıldı. İstatistik analizler Student T Test ile (Graph Pad Prism Programı) anlamlılık düzeyi p<0.05 kullanılarak değerlendirilmiştir.
BULGULAR:  Nilotinib' in IC50 dozu, 48. saat için 34.5 nM olarak belirlenmiştir. Nilotinib muamelesi sonrasında hücrelerin apoptotik durumu "Cell Death Detection kit" ve  "Caspase 3 Activity Assay kit" ile belirlendi. Buna göre, IC50 dozunda nilotinib uygulaması sonrasında, kontrol grubuna göre "Cell Death Detection kit" ile 1.89 katlık (52.8% oranında) apoptoz artışı (p=0.0012),  "Caspase 3 Activity Assay kit" ile  2.1 katlık apoptoz artışı saptandı (p=0.045). Hedef genlerin mRNAekspresyonlarını kıyasladığımızda, STAT5A ekspresyonu 72. saatte 2.87 kat (%65.12  oranında baskılanmıştır,  p= 0.0033 ), 96. saatte 11 kat azalırken (%90.9 oranında baskılanmıştır, p<0.0001), STAT5B ekspresyonu 72. saatte 5.2 kat (% 80.9 oranında baskılanmıştır,  p= 0.0032 ), 96.saatte 15 kat azalmıştır(%93.3 oranında baskılanmıştır, p<0.0001). STAT5A protein düzeyleri  özellikle 96.saatte, STAT5B protein düzeyleri  zamana bağlı olarak 24. saatten itibaren kontrol grubuna göre belirgin olarak baskılandı. Sonuçlar mRNA ekspresyon sonuçları ile uyumlu saptandı.
SONUÇ: Çalışmamızda K562 KML hücre dizisinde nilotinibin apoptozisi anlamlı düzeyde indüklediği ve JAK-STAT yolağı üzerinden, STAT5A ve STAT5B ekspresyonlarını baskılayarak bu etkiyi gösterdiği, apoptozda STAT5A, STAT5B'nin önemi gösterildi, bu da KML ve JAK-STAT mekanizması ile gerçekleşen  bir çok malignitelerin tedavisinin hedefi olarak, STAT5A ve STAT5B'ni hedef alan tedavi yöntemlerinin üzerinde çalışmalar yapılması gerektiğini düşündürmektedir.

Abstract:
AIM: Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal disorder which is based on neoplastic transformation of a multipotent stem cell. BCR-ABL fusion gen occurs as a result of translocation t(9,22). BCR-ABL fusion gene play a central role in the pathogenesis of CML. BCR-ABL fusion gene has a limitless tyrosine kinase property and induces several signal transduction pathways. JAK-STAT signaling pathway is one of the most important of pathways in the pathogenesis of CML. STAT proteins function in the JAK-STAT signaling pathway and are activated by phosphorylation. As a result of this signaling event, they affect many cellular processes including cell growth, proliferation, differentiation, and survival.  STAT5A and STAT5B ; members of JAK-STAT signaling pathway; are assigned in signal transduction and in the activation of the genes whose expressions increase in malignancy and also play an important role in the development of leukemia. After it has been found out that suppression of STAT gene expression results in induction of tumor cell apoptosis, investigations made in this area have been accelerated. For CML therapy, tyrosine kinase inhibitors are widely being used and one of them is nilotinib.
 In the current study, we aimed to determine transcriptional and translational differences of STAT5A and STAT5B and also apoptosis rates following nilotinib treatment in CML model K562 cells.
METHODS: By using trypan blue and Cell Proliferation Reagent WST-1, we calculated the cytotoxic effective dose IC50 concentration of nilotinib. The apoptotic case of the cells was assessed by 'Caspase 3 Activity Assay Kit' and 'Cell Death Detecton Kit' following the same treatments with same time intervals.  While mRNA expression levels of STAT5A and STAT5B were also determined by real time qRT-PCR following nilotinib treatment for the same time interval. Protein expression analyses were performed by Western Blot analysis according to 'WesternBreeze Chromogenic Kit-Anti-Rabbit' kit manuel instructions. Statistical analyses were done by GraphPad prism sofware with a significance of p<0.05
RESULTS: The IC50 dose of nilotinib was determined as 34.5 nM for 48th hour. While number of apoptotic cells were increased by 2.1 fold, (p=0.045) as a result of measurement of caspase 3 activity; a 1.89 fold, 52.8% increase was detected in apoptosis rate following Cell Death assay (p=0.0012) in nilotinib treated group. As for mRNA expression results, while STAT5A expression was significantly decreased by 65.12% [(2.87 fold; p= 0.0033)] and by 90.9% [(10.99 fold; p<0.0001)] at 72th – 96th hours respectively; STAT5B was downregulated by 80.95% [(5.25 fold; p= 0.0032), and 93.36% (15.08 fold; p<0.0001)] for 72th and 96th hours in nilotinib treated group compared to control group. As for protein results, both STAT5A and STAT5B protein expression levels were inhibited in a time dependent manner but dramatic suppressions were detected especially at 96th hour for each protein.
CONCLUSION: According to the results of this study, nilotinib induced apoptosis through STAT pathway via the supression of STAT5A and STAT5B expressions. Therefore, STAT5A and STAT5B are important moleculer targets in the research of CML pathogenesis.
Thus, targeting STAT5A and STAT5B may be an effective strategy for the treatment of CML and other myeloproliferative diseases.