Akciğer kanseri deney hayvan modelinde farklı fraksiyonasyon şemaları ile uygulanan hipofraksiyone yüksek doz radyoterapi'nin olası apiskobal etkisi ve mekanizmalarının araştırılması
Investigation of abscopal effect and mechanisms of high-dose hypofractionated radiotherapy applied with different fractionation schemes in the lung cancer experimental animal model
Yazar: AHMET KURU
Danışman: PROF. DR. EMRULLAH RIZA ÇETİNGÖZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Radyasyon Onkolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Fraksinasyon = Fractionation ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Radyasyon dozajı = Radiation dosage ; Radyoterapi = Radiotherapy ; Sitokinler = Cytokines

Özet:
Amaç: Metastatik akciğer kanseri deney hayvan modelinde, farklı fraksiyon şemaları ile uygulanan hipofraksiyone yüksek doz radyoterapi (RT)'nin olası apiskobal etkisi (AE) ve mekanizmalarının araştırılması amaçlanmıştır.
Gereç – Yöntem: Çalışmamızda 39 adet 6-8 haftalık C57BL/6 türü erkek siyah farelerin sağ ve sol flank bölgelerine "Lewis lung carcinoma (LLC)" hücre hattı inoküle edilerek primer (prm) ve metastaz (met) olarak modellenen iki tümöral lezyon oluşturulmuştur. Tümör (tm) volümleri en az 108 mm3 (6x6 mm)'e ulaşınca gruplara randomize edilmiştir. Birinci grup, tedavi uygulanmayan kontrol grubu; ikinci grup, tek fraksiyonda 16 Gy; üçüncü grup üç fraksiyonda 24 Gy RT uygulanan tedavi grupları ve dördüncü grup ise LLC inoküle edilmesine karşın tm gelişmeyen "tümörsüz" gruptan oluşmaktadır. Tedavi gruplarında RT, sol flank bölgedeki ya da volümü daha büyük olan prm tm'e uygulanmıştır.  Fareler, tedavi sonrası erken ve geç dönem AE mekanizmalarını araştırmak için, 24. sa ve izlem süresi sonunda sakrifiye edilmişlerdir. İzlem süresince tm volüm takibi yapılarak büyüme hızları hesaplanmıştır. Sakrifikasyon ile elde edilen dokular histopatolojik olarak incelenmişlerdir. Ayrıca olası AE mekanizmasında rol oynayabileceği düşünülen 12 adet sitokinin (IL12a, IL12b, IFN-γ, Fas-ligand, GM-CSF, CD40-ligand, CD70, VEGFa, IL-2, IL-15, TGF-β2, IFN-α) hem kanda hem de tm dokularındaki düzeyleri Real Time PCR yöntemi ile belirlenmiştir. Saptanan veriler SPSS v.24'e kaydedilerek istatistiksel analiz yapılmıştır.
Bulgular: Çalışmamızda grupların izlem kollarındaki fareler, LLC inokülasyonu sonrası kontrol grubunda ortalama 62 gün ve tedavi gruplarında 41 gün izlenmişlerdir. Kontrol grubunda küçük olan tm volümü 108 mm3'e ulaşmasının ardından ortalama 43 gün, tedavi gruplarında ise RT sonrası 17 gün izlenmişlerdir. İzlem süreleri tamamlandıktan sonra histopatolojik değerlendirmelerde tedavi gruplarında daha fazla olmak üzere tüm gruplarda nekroz ve apoptoz yüzdelerinin geç dönemde arttığı, tm'de canlılık yüzdesinin de azaldığı saptanmıştır. RT uygulamanın her iki şemada da prm tm büyümesini yavaşlattığı gözlenmiştir. Met tm büyüme hızının ise, monofraksiyone şemada, fraksiyone şemaya kıyasla daha yavaş olduğu saptanmıştır. Monofraksiyone RT grubunda, yalnızca bir örnekte kısa bir süre için met tm volümünde küçülme gözlenmiş olup olası AE olarak yorumlanmıştır. Nonparametrik analizlerde, monofraksiyone 16 Gy RT sonrası 24. saatte prm tm'de IL-15'in (p:0.032), geç dönemde IL-2'nin arttığı (p:0.017); fraksiyone RT sonrası met tm'de 24.saatte VEGF'ün (p:0.008), geç dönemde ise IFN-α'nın arttığı (p:0.017) saptanmıştır. Çok değişkenli analizlerde, monofraksiyone 16 Gy RT sonrası 24. saatte IL-12a düzeyinin prm tm'de arttığı (p:0.027), IFN-α'nın geç dönemde met tm'de azaldığı, prm'de arttığı saptanmıştır (p:0.025). Fraksiyone RT sonrası ise IFN-α'nın geç dönemde met tm'de arttığı, prm'de azaldığı (p:0.025); ayrıca kanda da IFN-γ'nın azaldığı saptanmıştır (p:0.014). Farklı fraksiyonlarda uygulanan RT sonrası AE gözlenen tek örnekte ve diğer bazı deneklerde de gerek prm gerekse met'lerde istatistiksel anlamlı IFN-α yüksekliğine eşlik eden tm büyümesinde yavaşlama gözlenmiştir.
Sonuç: Çalışmamızda sınırlı sayıda fare üzerinde uygulanılan yöntemlerle metastatik akciğer kanseri modelinde bir örnek dışında apiskobal etki gözlenememiştir. Ancak fraksiyone RT sonrası met tm'de erken dönemde arttığını gözlediğimiz VEGF'ü bloke eden bir ajanın ya da tm gelişimini engelleyici rolü olduğunu düşündürten, aynı zamanda iki RT şemasında da geç dönemde prm ve met tm'de miktarı artan IFN-α türevi ajanların RT ile kombine kullanımı sonrasında AE elde edilip edilemeyeceğini araştıracak hem klinik hem de preklinik daha ileri çalışmalar düzenlenerek AE sıklığının saptanmasına ve gerçek mekanizmalarının ortaya konulmasına gereksinim vardır.

Abstract:
Purpose: To investigate the possible mechanisms of abscopal effect (AE) in hypofractionated high-dose radiotherapy (RT) applied with different fractionation schemes in the lung cancer experimental animal model.
Materials and Methods: In our study, Lewis lung carcinoma (LLC) cell lines were used for modelling the metastatic lung cancer by inoculation subcutaneously into the right and left flank regions of mice. 39 C57BL / 6 male black mice aged 6-8 weeks were used in the model and tumoral lesions were accepted as primary (prm) and metastatic (met). All mice were randomized to the groups when the tumor (tm) volumes reached a minimum of 108 mm3 (6 x 6 mm). Control is the first group with no treatment whatsoever.  Treatment groups are comprised of 16 Gy in single fraction in second group and 24 Gy in three fractions in the third group. The last group is consisted of the "tumor free" group which did not develop tumors despite four LLC inoculations. In the treatment groups, RT was applied to the tm in the left flank or the larger one which was accepted as prm. Half of mice were sacrificed at 24th hours and the other half at the end of the follow-up period in order to evaluate the early and late mechanisms of AE. During follow-up, tm volume was monitored regularly to calculate the ratio and rapidity of tm growth. Tissues were obtained after sacrification to examine histopathologically. To quantify the levels in both blood and tumoral tissue samples by Real Time PCR, 12 cytokines (IL12a, IL12b, IFN-γ, Fas-ligand, GM-CSF, CD40-ligand, CD70, VEGFa, IL-2, IL-15, TGF-β2, IFN- α) were chosen. The data collected were recorded in SPSS database to perform statistical analyzes.
Results: The mice in the follow-up arms of the groups were followed up on average 62 days in the control group and 41 days in the treatment groups after LLC inoculation. Once smaller tm volume in the control group reached a minimum of 108 mm3, mice were followed up on average of 43 days. In the treatment groups, mice were followed up on average of 17 days after RT. Histopathological examinations that were made after the completion of early and late follow-up periods revealed that necrosis and apoptosis percentages increased and tm viability increased in all groups. It was observed that RT administration slowed the prm tm growth during the follow-up period in both treatment groups. The rapidity of tm growth in met tm's were found to be lower in the monofractionated scheme than in the fractionated scheme. Volume shrinkage was seen in only one single mice's metastatic tumor for a very short time in the monofractionated scheme and that was interpreted as possible AE. IL-15 was found higher in the prm tm at the 24th hour following 16 Gy RT in single fraction (p:0.032) and increased IL-2 in the follow-up arm of this group (p:0.017). VEGF at 24th hours (p:0.008) and IFN-α by the end of follow-up period (p:0.017) were found increased in the met tm after fractionated RT in nonparametric analyzes. In multivariate analyzes, IL-12a levels were found higher in prm tm at 24th hours (p:0.027) and IFN-α were found lower in met tm by the end of follow-up period after 16 Gy RT in single fraction (p:0.025). IFN-α was increased in met tm and decreased in prm by the end of follow-up after fractionated RT (p:0.025). It was also shown that IFN-γ levels decreased in blood samples in this group (p:0.014). In some other subjects, including the single sample with AE for a very short time after RT applied in different fractions, slowing in tm growth associated with statistically significant elevation of IFN-α was observed in both prm and mets.
Conclusions: We have not been able to observe abscopal effect in our metastatic lung cancer model that contains limited number of animals, except for one single mice. However, we believe an agent blocking VEGF that was found increased in early period after fractionated RT or IFN-α derived agents which was also found increased in both tumoral lesions in both RT schemes can be used to investigate AE in metastatic lung cancer model. Therefore, more further clinical and preclinical studies are needed to determine the frequency of AE and its actual mechanisms.