Koç spermatozoonlarının farklı gelişim aşamalarındaki yapısal farklılıklarının belirlenmesi
Determining structural differences in different developmental stages of ram spermatozoa
Yazar: GÜL İPEK GÜNDOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. ABİT AKTAŞ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Fertilizasyon = Fertilization ; Histoloji = Histology ; Koçlar = Rams ; Olgunlaşma = Maturation ; Sperm = Spermatozoa ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Mezbahadan alınan örneklerden testis ve epididimisin 3 farklı bölgesinden gelişim aşamasındaki spermatozoonlar elde edilmiştir. Koç spermatozoonlarının gelişim ve maturasyonunda geçirdiği morfolojik değişimler, kromatin kondensasyonu aşamalarının spermatozoon gelişim aşamaları ile olan ilişkisi ile birlikte ejakulat ve dondurulup çözdürülmüş koç spermatozoonlarında in vitro kapasitasyon/akrozom reaksiyonu geçirmeden ve geçirdikten sonraki yapısal özellikleri ışık mikroskopisi çalışmayla ortaya konması amaçlanmıştır. Testis ve epididimisten alınan spermatozoon örneklerinin morfolojik özellikleri elektron mikroskobik çalışma ile incelenmiştir.  Aynı gruplarda immunofloresan yöntem ile Fertilin-β,  Calmegin, İzumo-1, P34H, ACE ve Fibronektin'in varlıkları ve konumlarının tespit edilmesi aynı zamanda bu gruplarda western blot tekniği ile kantitatif olarak aynı proteinlerin ekspresyon analizleri yapılmıştır. Kromatin kondensasyonu çalışmasında numuneler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık tespit edilmemiştir (p>0,05). İndirekt immunofloresan yöntemi ile Fertilin-β, Calmegin, P34H proteinlerinde kaput, korpus, kauda ve matur spermatozoonlarda bölgeye göre farklı yoğunluk ve dağılımda işaretlenme görülmiştür. Dondurulup-çözdürülmüş örneklerde ise hem ejakulat örneklerine hem de kauda örneklerine göre çok daha az yoğun bir işaretlenme tespit edilmiştir. İn vitro kapasitasyon/akrozom reaksiyonu geçiren örneklerde ise İzumo-1 proteini dışında diğer incelenen proteinlerde bir işaretlenme görülmemiştir. İn vitro kapasitasyondan sonra İzumo-1'lerin akrozomun üzerinde ekvatoral bölgeye doğru artan bir bant şeklinde işaretlenmesi görülürken in vitro akrozom reaksiyonu sonrası sadece ekvatoral bölgede bant şeklinde işaretlenme görülmüştür. Fibronektin antikoru ile numunelerde beklenenin tersine spermatozoonun baş bölgesinde değil de bölgeye göre farklı konumlarda non spesifik olarak işaretlenmiştir. ACE antikoru ile numunelerin hiç birinde işaretlenme görülmemiştir. Western blot yöntemi ile incelenen proteinlerin kDa düzeylerinde numunelerin alındığı bölgelere özgü farklılıklar olduğu ve koç spermatozoonlarına özgü olası izoformlar ya da benzer epitoplara sahip proteinler işaretlenmiştir. Ultrastrüktür çalışmasında da, testis ve epididimisin kaput, korpus ve kauda bölgelerindeki spermatozoonların yapısal özelliklerinin birbirlerinden farklı olmadıkları gözlenmiştir.

Abstract:
Spermatozoas at developing stages obtained from testis and 3 different regions of epididymis. Determination of morphological changes of ram spermatozoa during development and maturation have been aimed and relation ship between chromatin condensation stages and spermatozoa developmental stages with ejaculate and structural features of freezed-thawed ram spermatozoas with and without in vitro capacitation/acrosome reaction also been evaluated by using light microscopy. Morphology of spermatozoas obtained from testis ande epididymis were evaluated by electron microscopy techniques. In the same groups, determination of existence and localisation of Fertilin-β, Calmegin, Izumo-1, P34H, ACE and Fibronectin were analyzed quantatively via their protein expression profiles by western blotting technique. In chromatin condensation experiments, statistically meaning full results could not be obtained between samples (p>0.05). Fertilin-β, Calmegin, P34H proteins in caput, corpus, cauda and mature spermatozoas showed marking in different density and distrubition with indirect immunofluorescence technique. Freezed-thawed samples had lower density and marking than both ejaculate and cauda samples. Marking was not obtained except Izumo-1 protein from the samples undergo in vitro capatitation/acrosome reaction. Marking of Izumo-1 protein was seen as increasing band formation through equatorial region on acrosome, after in vitro capacitation, however after acrosome reaction, the band formation was only equatorial region. In contrast to expected marking on spermatozoa head, non specific marking was obtained on different localization changing with the region in fibronectin antibody and samples. ACE antibody did not mark the samples. Region specific differences of proteins at kDa level were obtained with western blotting and possible isoforms specific to ram spermatozoa or proteins with similar epitops were marked. In ultrastructure study, spermatozoa structure did not show any differences in testis, caput, corpus and cauda region of epididyms.