Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin intronsuz olarak klonlanması, enzimin ifade edilmesi, saflaştırılması ve kinetik karakterizasyonu
Cloning of enolase gene without intron, expression, purification and kinetic characterization of the enzyme from Theileria annulata
Yazar: EBRU ÇAYIR
Danışman: PROF. DR. DİLEK BALIK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics

Özet:
Tropikal theilorisis, Hyalomma cinsi kenelerce taşınan apikompleksan paraziti Theileria annulata aracılığıyla yüksek verimli sığırlarda enfeksiyona ve yüksek oranda morbidite ve mortaliteye neden olmaktadır. Bu nedenle tropikal theilorisis büyük ekonomik kayıplara neden olan yaygın ve önemli bir hastalıktır. Son yıllarda parazitin hastalığın tedavisinde kullanılan en etkin ilaca karşı direnç geliştirdiği bildirilmiştir. Bu durum, alternatif tedavi yöntemlerine ihtiyaç doğurmuştur. 
Glikolizis, Theileria annulata'nın ATP eldesinde, canlılığı ve virülansında çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu  nedenle bu yolak, antitheilerial ilaçlar için aday olan hedeflerdendir. Enolaz 2-fosfogliserikasidin (2-PGA) ve fosfoenolpirüvatın (PEP) tersinir dönüşümünü katalizleyen kilit bir glikolitik enzimdir. Ayrıca, son yayınlar ile enolazın, bazı patojenik organizmaların hücre yüzeyinde ifade edildiği belirtilmiştir. Hücre yüzeyindeki enolaz, plazminojen bağlanma reseptörü olarak görev almakta ve dokuya invazyonda önemli bir rol oynamaktadır. Enolaz, Theileria annulata için kilit bir glikolitik enzim ve plazminojen bağlanma reseptörü olması olmasından dolayı, tropikal theilorisis tedavisinde makromoleküler bir hedef olarak seçilebilir.
Bu çalışmada Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan gendeki intron dizisi PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez ile uzakkalştırılmış ve bu gen pGEM-T Easy vektörüne klonlanmıştır. İntronun uzaklaştırılması DNA dizi analizi ile onaylanmıştır. Bu gen daha sonra C-terminalinde 6 Histag kuyruğu içeren pLATE31 vektörüne altklonlamış ve Escherichia coli BL21(DE3) hücrelerinde ifade edilmiştir. İfade edilen enzim Ni-NTA agaroz kolon kullanılarak afinite kromatografisi aracılığıyla saflaştırılmıştır. Enzime ait kararlı hal kinetik verileri GraFit 3.0 ile tanımlanmıştır.
Theileria annulata'ya ait RNA örneğinin yokluğundan dolayı, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı çalışmalarına uygun olacak aktif enzimin üretilmesi için, gendeki intron dizisinin uzaklaştırılmasında PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez kullanılarak bir strateji geliştirilmiştir. Bilgimiz dahilinde, bu çalışma orjinal intron dizisini içeren genden aktif enzimin üretilmesi amacıyla ilk kez uygulanmıştır. Aktif enzimin ifadesi ve saflaştırılması yeni ilaç tasarım çalışmaları ve hastalığın yok edilme stratejileri için önemlidir.
İntron uzaklaştırılmasını takiben saf rekombinant Theileria annulata enolazının yüksek miktarda eldesi (30 mg/litre kültür) yüksek saflık derecesinde (>% 95) sağlanmıştır. Saflaştırılan proteinin molekül ağırlığı SDS-PAGE'te amino asit sekansından hesaplanan kütle doğrulaması ile yaklaşık olarak 48 kDa büyüklüğünde tek bant vermiştir. 2-PGA'nın substrat olarak kullanıldığı enzim aktivite ölçümleri, spesifik aktivite değerini 43 U/mg, Km=106 µM, Vmax=0,132, kcat=37 s-1 ve kcat/Km=3,5x105 M-1.s-1 olarak vermiştir. Bu değerler bu parazit için ilk defa tanımlanmıştır ve enolaz enziminin büyük miktarlarda eldesi yeni antitheilerial ilaçların tasarımına yönelik daha ileri kinetik ve yapısal karakterizasyon çalışmalarına olanak sağlayacaktır.

Abstract:
Tropical theileriosis is caused by infection with the apicomplexan parasite Theileria annulata that is spread by ticks of the genus Hyalomma and high rate morbidity and mortality in high efficiency cattle. Thus, tropical theileriosis is a common and important disease causing huge economic losses. In recent years, parasite resistance has been reported to most effective antitheilerial drug used for the treatment of this disease. This situation has given rise to the need for alternative methods of treatment.
Glycolysis play crucial roles in the ATP supply, important for the viability and virulence of Theileria annulata. This pathway is, therefore, candidate targets for antitheilerial drugs. Enolase is a key glycolytic enzyme that catalyzes the inter conversion of 2-phosphoglycericacid (2-PGA) and phosphoenolpyruvate (PEP). Also, recent reports described that enolase expressed at the cell surface of several pathogenic organisms. The surface enolase acts as a plasminogen-binding receptor and plays an important role in tissue invasion. Since enolase is a key glycolytic enzyme and plasminogen-binding receptor for Theileria annulata, enolase can be selected as a macromolecular target of therapy of tropical theileriosis. 
In this study, an intron sequence present in Theileria annulata enolase enzyme gene was removed by PCR site directed mutagenesis and the gene was cloned into pGEM-T Easy vector.  Removal of intron sequence was confirmed by DNA sequencing. The gene was than subcloned into pLATE31 vector, having an C-terminal 6xHistaged sequence, and exspressed in Escherichia coli BL21(DE3) cells. The enzyme was purified by affinity choromatography using Ni-NTA agarose coloumn. Staedy state kinetic parameters of the enzyme was determined using GraFit 3.0.
Because of lack of RNA sample from Theileria annulata, a strategy has been design by using PCR site directed mutagenesis for removal of an intron sequence from a gene with the ultimate aim of producing active enzyme that will be available for structure based drug design studies. To our knowledge, present study is first to be applied with the aim of production of active protein from a gene that originally had an intron sequence. Expression and purification of active enzyme is of importance for novel drug design research and strategies to overcome the diseases. 
High quantities (30 mg per liter culture) of pure recombinant Theileria annulata enolase has been obtained in a higly purified form (> 95 %) following intron removal. Molecular weight of purified protein gave a single band on SDS-PAGE at about 48 kDa that is in aggrement with the mass calculated from the amino acid sequence. Enzyme kinetic measurements using 2-PGA as substrate gave a specific activity of 43 U/mg, Km=106 µM, Vmax=0,132, kcat=37 s-1 and kcat/Km=3,5x105 M-1.s-1. These values have been determined for the first time from this parasite and availability of large quantities of enolase enzyme will facilitate further kinetic and structural characterization towards design of new antitheilerial drugs.