Manyetofeksiyon yöntemiyle transfer edilen azurinin MCF-10A hücrelerinde heterolog ekspresyonu
Heterologous expression of azurin transferred by magnetofection method in MCF-10A cells
Yazar: SAADET KALAKENGER
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ YAĞMUR ÜNVER
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Gen Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Amaç: Bu çalışmada, sağlıklı meme epitel hücrelerine (MCF-10A) Fe3O4 manyetik nanopartiküller aracılığıyla rekombinant pCMV-Azu-GFP'nin manyetofeksiyonu gerçekleştirilerek hücrelerde füzyon Azu-GFP proteininin ekspresyonu amaçlandı.
Yöntem: Kodon optimize azurin geni pCMV-GFP'ye yerleştirilerek rekombinant pCMV-Azu-GFP elde edildi. Daha sonra gen aktarım aracı olarak kullanılan MNP'ler sentezlendi ve biyouyumlu hale getirmek için silika kaplama yapıldı (MSNP). Sentezlenen MSNP'lerin yüzeyi, negatif yüklü DNA'yı bağlayabilmesi için pozitif yük sağlayan PEI (MSNP@PEI) veya APTES (MSNP-NH2) ile modifiye edildi. Sentezlenen MSNP'leri karakterize etmek için TEM, FTIR ve DLS analizi kullanıldı. pCMV-Azu-GFP ve sentezlenen pozitif yüklü MSNP'ler bir araya getirilerek (manyetofektin) optimizasyon çalışmaları yapıldı. Gen aktarım aracı olarak önerilen yapının ve ayrı ayrı her bir bileşeninin proliferatif, canlılık ve sitotoksik etkisini değerlendirmek için MCF-10A hücre hattı ile MTS testi uygulandı. Sentezlenen MSNP'lerin hücresel alımı, bir floresan işaret olan Oregon-green 488 ile etiketli MSNP'ler üretilerek belirlendi. Optimum şartlarda hazırlanan manyetofektinler, mıknatıs aracılığıyla hücrelere transfer edildi. Azu-GFP füzyon proteininin MCF-10A hücrelerinde ekspresyonunu belirlemek için hücreler konfokal mikroskopta görüntülendi. Diğer yandan, hazırlanan hücre lizatlarında protein tespiti için western blot analizi yapıldı.
Bulgular: pCMV-Azu-GFP, nükleotid blastlama sonucuna göre %100 doğrulukla elde edildi. Gen aktarım aracı olarak sentezlenen manyetitlerin ortalama 10 nm boyutunda olduğu, yüzey modifikasyonu yapılan MSNP'lerin ise ortalama 100 nm boyutunda olduğu, TEM ile belirlendi. DLS analiziyle yüzey modifikasyonu sonucu MSNP'lerin pozitif yüke sahip olduğu belirlendi. Manyetofektin optimizasyonu sonuçlarına göre 30 dakika inkübasyon süresinde en çok DNA bağlandığı, manyetofektin ortamı olarak PBS kullanılabileceği belirlendi. Aynı zamanda artan MSNP konsantrasyonuyla birlikte bağlanan DNA miktarının arttığı, ekstra kullanılan PEI miktarı da arttıkça bağlanan DNA miktarının arttığı belirlendi. MSNP'lerin MCF-10A hücreleri için sitotoksik olmadığı görülürken, yüzeyi modifiye edilen MSNP@PEI ve MSNP-NH2 uygulanan gruplarda doz bağımlı olarak hücre canlılığında istatistiki fark gözlendi. Hücresel alım sonuçları, 30 dakika mıknatıs tutulan gruplarda MSNP'lerin hücre çekirdeği etrafında daha iyi lokalize olduğunu ortaya koydu. Manyetofeksiyon sonucu hücrelerin konfokal mikroskop görüntülerine bakıldığında, hücrelerde füzyon proteinin ekspresyonu gözlendi. Western blot analizi sonucunda ise füzyon proteine ait azurin bandı görüldü.
Sonuç: Bu tez çalışmasında MCF-10A hücrelerine manyetofeksiyon yöntemiyle başarılı bir şekilde gen aktarımı yapılarak hücrelerde Azu-GFP füzyon proteininin ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Ayrıca tümör terapisinde kullanılabilen azurinin sağlıklı hücrelerde toksik etki göstermeden ifade edildiği gösterilmiştir.
Anahtar Kelimeler: Gen klonlama, azurin, manyetofeksiyon, MCF-10A, füzyon protein

Abstract:
Purpose: In this study, it was aimed to express the fusion Azu-GFP protein in healthy breast epithelial cells (MCF-10A) by performing magnetofection of recombinant pCMV-Azu-GFP via Fe3O4 magnetic nanoparticles.
Method: Recombinant pCMV-Azu-GFP was obtained by inserting the codon optimized azurin gene into the pCMV-GFP. Then, MNPs used as gene transfer vehicles were synthesized and silica coated (MSNP) to make them biocompatible. The surface of the synthesized MSNPs was modified with PEI (MSNP@PEI) or APTES (MSNP-NH2), which provides a positive charge to bind negatively charged DNA. TEM, FTIR and DLS analysis were used to characterize the synthesized MSNPs. Optimization studies were performed by combining pCMV-Azu-GFP and synthesized positively charged MSNPs (magnetofectin). In order to evaluate the proliferative, viability and cytotoxic effect of the proposed construct as a gene transfer vehicle and each component separately, MTS test was performed with the MCF-10A cell line. Cellular uptake of synthesized MSNPs was determined by producing MSNPs labeled with a fluorescent marker, Oregon-green 488. The magnetofectins prepared under optimum conditions were transferred to the cells by means of a magnet. To determine the expression of the Azu-GFP fusion protein in MCF-10A cells, the cells were imaged under a confocal microscope. On the other hand, western blot analysis was performed for protein detection in prepared cell lysates.
Findings: pCMV-Azu-GFP was obtained with 100% accuracy based on the nucleotide blasting result. It was determined by TEM that the magnetite synthesized as a gene transfer medium had an average size of 10 nm, and the surface modified MSNPs were an average of 100 nm in size. As a result of surface modification by DLS analysis, MSNPs were determined to have a positive charge. According to the optimization results of the magnetofect, it was determined that the most DNA binds during the incubation period of 30 minutes, and PBS can be used as the medium of the magnetofect. At the same time, it was determined that the amount of DNA bound increased with increasing MSNP concentration, and the amount of DNA bound increased as the amount of extra PEI used increased. While MSNPs were not found to be cytotoxic to MCF-10A cells, a dose-dependent statistical difference in cell viability was observed in the surface-modified MSNP@PEI and MSNP-NH2 applied groups. Cellular uptake results revealed that MSNPs were better localized around the cell nucleus in groups held magnets for 30 minutes. When the confocal microscope images of the cells as a result of magnetofection were examined, the expression of the fusion protein was observed in the cells. Western blot analysis revealed azurin band of the fusion protein.
Results: In this thesis study, the expression of Azu-GFP fusion protein was carried out in MCF-10A cells by successful gene transfer to MCF-10A cells by magnetofection method. In addition, it has been shown that azurin, which can be used in tumor therapy, is expressed in healthy cells without toxic effects.
Keywords:  Gene cloning, azurin, magnetofection, MCF-10A, fusion protein