Modifiye edilmiş kitosan boncuklar üzerine katalaz enziminin immobilizasyonu
Immobilization of catalase on modify chitosan beads
Yazar: ESRA BAŞAK
Danışman: PROF. DR. TÜLİN AYDEMİR
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry

Özet:
Enzime immobilizasyon teknikleri enzimin tekrar kullanımına ek olarak, üretim ortamından ayrılması ve sürekli üretime olanak vermesi gibi avantajlar sağlar. İmmobilize biyokatalizörün başarılı bir şekilde uygulanması ve geliştirilmesi için, enzim taşıyıcısı genellikle en önemli bileşen olarak göz önünde bulundurulur. İmmobilize enzim reaktörlerinin kolaylık sağlamasına rağmen taşıyıcı materyallerin pahalılığı yüzünden hala immobilize enzimlerin geniş uygulama alanları az bulunmaktadır. Bundan dolayı, enzim immobilizasyonu için ideal bir taşıyıcı olarak bilinen kitosan gibi ucuz taşıyıcılar üzerine enzim immobilizasyon teknikleri geliştirilmesi gerekir. Kimyasal olarak kitinin deasetilasyonuyla türeyen kitosan metal iyonları ve organik maddelerin uzaklaştırılması için ucuz ve çok yönlü bir polimerdir.Bu çalışmada kitosan ve modifiye kitosan boncuklar üzerine kovalent bağlama yöntemiyle katalaz enziminin immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Kitosanın, kil ve Fe3O4 ile fiziksel modifikasyonu, L-lizin ile kimyasal modifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Kitosan, kitosan-kil(1:1) ve kitosan-Fe3O4(1:0,2) asetik asit çözeltisi içinde çözüldü ve enjektör yardımıyla TPP çözeltisi içine damlatıldı. Belli bir süre olgunlaşması için bekletildi. Lizin modifiye kitosan boncukların hazırlanması için öncelikle kitosan boncuklar hazırlandı ve daha sonra bu boncuklar L-lizin ile kimyasal olarak modifiye edildi. Kitosan ve modifiye kitosan boncuklar üzerine immobilize edilen katalazın karakterizasyon ve optimizasyon çalışmaları (optimum glutaraldehit konsantrasyonu, optimum çapraz bağlama süresi, optimum immobilizasyon süresi) gerçekleştirildi. Çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehit kullanıldı ve uygun glutaraldehit konsantrasyonu kitosan, kitosan-kil ve magnetik Fe3O4 modifiye kitosan boncuklar için % 3 bulunurken lizin modifiye kitosan boncuklar için % 2 olarak belirlendi. Taşıyıcı üzerine bağlanan protein miktarını belirlemek için Bradford yöntemine göre serbest enzim, filtrat ve yıkama sularında protein tayini yapıldı. Kitosan, kitosan-kil, kitosan-Fe3O4 ve kitosan-lizin boncuklar üzerine bağlanan protein miktarı sırasıyla % 57.14, % 60.71, % 78.57 ve % 73.21 olarak hesaplandı. İmmobilize katalazın aktivitesi gram taşıyıcı başına düşen aktivite olarak hesaplandı. Kitosan, kitosan-kil,Fe3O4 modifiye kitosan ve lizin modifiye kitosan boncukların aktiviteleri sırasıyla 60.83 U/g, 79.07 U/g, 88.50 U/g ve 121.19 U/g olarak ölçüldü. Serbest ve immobilize katalazın optimum pH çalışmalarında pH 4.0-9.0 arasında değişen pH'larda aktivite ölçümleri yapıldı. Farklı taşıyıcılar üzerine immobilize edilen katalazın optimum pH'ı serbest katalaza göre değişmediği ve pH 7.0 olarak kaldığı belirlendi. Optimum sıcaklık çalışmalarında 5 0C-60 oC arasında değişen sıcaklıklarda serbest ve immobilize katalazın aktiviteleri ölçüldü. Optimum sıcaklık, serbest ve immobilize katalaz için 35 oC olarak saptandı. Sıcaklık ve pH stabilite çalışmalarında immobilize ve serbest katalaz farklı pH ve sıcaklıklarda 1 saat bekletilerek 1 saat sonrasında geri kalan aktiviteleri ölçüldü. İmmobilize enzimin serbest enzime oranla pH ve sıcaklık değişimlerine dayanıklılığının daha iyi olduğu gözlemlendi. Kitosan, kitosan-kil, Fe3O4 modifiye kitosan, lizin modifiye kitosan boncuklar ve serbest enzimin KM değerleri sırasıyla 33,76 mM, 30,33 mM, 26,66 mM, 27,0 mM ve 14,28 mM olarak hesaplanmıştır. Kitosan, kitosan-kil, Fe3O4 modifiye kitosan, lizin modifiye kitosan boncukların ve serbest enzimin Vmax değerleri 141,92 U/mg protein dk, 176,6 U/mg protein dk, 195,04 U/mg protein dk, 197,5 U/mg protein dk ve 3076,92 U/mg protein dk olarak hesaplandı. Elde edilen sonuçlardan immobilize katalazın KM değerinin serbest enzime göre arttığı Vmax değerinin ise azaldığı belirlenmiştir. Depolama çalışmalarında ise serbest katalaz ve immobilize katalaz 70 gün boyunca 4 oC ve 25 oC'de depolanarak belirli aralıklarla aktiviteleri ölçüldü. Depolama çalışmaları sonucunda immobilize katalazın serbest katalaza göre 4 oC ve 25 oC'de daha karalı olduğu saptandı. Farklı taşıyıcılar üzerine immobilize edilen katalazın tekrar kullanılabilirliğini belirlemek için aynı boncuklarda 100 defa tekrarlanan aktivite ölçümleri sonucunda hala aktivite gösterebildikleri tespit edildi.

Abstract:
Enzyme immobilization techniques usually provide, in addition to the desired reuse of the enzyme, unexcelled advantages such as product separation and continuous operation. For successful development and application of an immobilized biocatalyst, the enzyme support is generally considered as the most important component. Despite the great ease allowed by continuous immobilized enzymes reactors, the large-scale applications of immobilized enzymes are stil rare primarily owing to the unacceptable expense of the support materials in most cases. Accordingly, it is imperative to develop new techniques for enzyme immobilization on industrially available and cheaper carriers like chitosan that has been known as an ideal support material for enzyme immobilization because of its hyrophilicity, biocompatibility, biodegradability, and anti-bacterial property. This macromolecule, derived chemically by deacetylation of chitin the second most abundant biopolymer in nature next to cellulose, has widely been assumed to be a cheaper and versatile sorbent for transition metal ions and organic substances through the coordination and/or reaction sites composed of the amino (/NH2) and hydroxy (-OH) groups anchoring on chitosan chains.In this study, catalase immobilization was carried out covalently onto chitosan and modified chitosan beads. The physical modification of chitosan was fulfilled with clay and Fe3O4, the chemical modification was fulfilled with L-lysine. Chitosan, chitosan-clay (1:1), chitosan-Fe3O4 (1:0,2) were dissolved in asetic asid solution and these solutions were dropped through a syringe into cold TPP solution. The beads were stirred a certain time to become ripe. For preparing lysine modified chitosan beads, at first chitosan beads were prepared and than these beads were modifed with L-lysine. Optimization and characterization studies (optimum glutaraldehyde concentration, optimum Cross-linking time, optimum immobilization time) of catalase immobilized onto chitosan and modified chitosan beads were realized. Glutaraldehyde was used as a cross-linker and optimum glutaraldehyde concentration was determined %2 for lysine modified chitosan beads whereas it was determined % 3 for chitosan, chitosan-clay and Fe3O4 modified chitosan beads. The protein content of catalase solution was determined by the method of Bradford. the amount of protein bounded on chitosan, chitosan-clay, chitosan-Fe3O4 and chitosan-lysine beads were calculated % 57.14, % 60.71, % 78.57 and % 73.21.The activity of immobilized catalase was calculated as unite of 1 g carrier (U/g). The activity of chitosan, chitosan-clay, chitosan-Fe3O4 and chitosan-lysine were measured 60.83 U/g, 79.07 U/g, 88.50 U/g and 121.19 U/g, respectively. The measurement of activity of free and immobilized was carried out pH 4.0-9.0 at various pH, at optimum pH studies. Optimum pH of catalase immobilized on different carriers was determined pH 7.0. At optimum temperature studies, free and immobilized catalase activity were measured at various temperatures between 5 oC and 60 oC. Optimum temperature for free and immobilized catalase was determined 35 oC. At temperature and pH stability studies, free and immobilized catalase were incubated at various pH and temperatures. After 1 hour, the remaining activities of free and immobilized catalase were measured. We observed that immobilized catalase was more resistance than free catalase. The KM values of chitosan, chitosan-clay, chitosan-Fe3O4, chitosan-lysine and free catalase were found as 33,76 mM, 30,33 mM, 26,66 mM, 27,0 mM and 14,28 mM. The Vmax values of chitosan, chitosan-clay, chitosan-Fe3O4, chitosan-lysine and free catalase were found as 141,92 U/mg protein, 176,6 U/mg protein, 195,04 U/mg protein, 197,5 U/mg protein ve 3076,92 U/mg protein. These results were showed that the KM value of immobilized catalase was higher than free catalase and the Vmax value of immobilized catalase was lower than free catalase. At the end of the storage stability studies, it was determined that immobilized catalase was more stable than free catalase at 4 oC and 25 oC. For determining reusability of immobilized catalase, the activity of the same beads were measured 100 times and it was determined that the beads were stil active.