Gıda patojenleri için dijital PCR ile hızlı tespit yöntemlerinin geliştirilmesi
Development of rapid detection methods for food pathogens using digital PCR
Yazar: YELİZ YÜCEL ÖZ
Danışman: PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Gıdalar besleyici ve metabolize edilebilen substratlar olarak değerlendirildiğinde bu özellikleri nedeniyle birçok mikroorganizmanın büyümesi için uygun ortam sağlamaları kaçınılmazdır. Kontamine yiyecek veya içeceklerin tüketilmesi ile gıda kaynaklı patojenlerin meydana getirebileceği birçok hastalık mevcuttur ve dünya üzerinde hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde halk sağlığı için yaygın ve ciddi bir tehdit olmaya devam etmektedir. Bu hastalıkların şiddeti basit akut semptomlarla ilgili olabileceği gibi ciddi ve yaşamı tehdit edici seviyelere erişebilir. Patojen mikroorganizma bulaşlarını önlemek ve dolayısıyla insan sağlığı açısından oluşabilecek ciddi durum ve ölümleri engellemek amacıyla gıdalar için üretim aşamasından tüketim aşamasına kadar gerekli kalite kontrol programlarının uygulanması son derece önemli bir süreçtir.
Kalite kontrolde kullanılabilecek geleneksel yöntemler kültüre dayalıdır. Bu yöntemler basit, kolaylıkla adapte edilebilir ve genel olarak ucuzdur. Kültüre dayalı yöntemlerde sırasıyla bakterinin kültür ortamında büyütülmesi, bu ortamdan izole edilmesi, izolasyon sonrası biyokimyasal ve/veya serolojik tanımlama yapılması ve bazı durumlarda subspesifik tanımlama yapılma aşamaları gerçekleşmektedir. Bu nedenle kültüre dayalı tanımlama uzun zaman almaktadır. Bu yöntemlerin, fenotipik özelliklerin ortaya konmasındaki yetersizlikleri, kültüre alınmamış mikroorganizmaların belirlenememesi ve sonuca birkaç günde ulaşılabiliyor olması gibi dezavantajları insanları hızlı, daha güvenilir, hassas metotların geliştirilmesine yöneltmiştir. Bu yöntemlerin büyük çoğunluğu antikor ve nükleik asit tabanlı teknikleri kapsamakla birlikte geleneksel yöntemlerin modifikasyonu ile oluşan teknikleri de içermektedir.
Patojen mikroorganizmaların tespitinde son yıllarda nükleik asit tabanlı teknikler oldukça önem kazanmıştır. Bunlardan en öne çıkanları Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) tekniklerine dayanmaktadır. Gıda patojenlerinin tespitinde gıda mikrobiyoloji laboratuvarları tarafından kullanılan PCR testleri mevcuttur. Geleneksel PCR yöntemi elektroforez gibi görüntüleme sistemlerine ihtiyaç duyar. İkinci nesil PCR olarak tabir edilebilecek Real Time-PCR tekniğinde, elektroforez gibi işlemlere gerek kalmadan çoğalan ürün aynı anda floresan sinyali ile görüntülenebilmesi yanında kantitasyona da olanak sağlayabilmektedir. Birçok doğrulanmış ve ticarileşmiş farklı özgüllüğe, doğruluğa ve hassasiyet limitine sahip ticari Real Time-PCR testi mevcuttur.
Teorik olarak PCR, bir kopya nükleik asitten iki saatten az bir zamanda milyonlarca kopya üretebilmektedir. Fakat gıdalardaki inhibitörlerin varlığı hassasiyeti düşürmektedir. Sonuca ulaşmak 30-90 dakika gibi bir zaman almakla birlikte hassasiyet limitleri 103-104 kob/g civarındadır. Bu nedenle mikrobiyal zenginleştirme yöntemleri ile sistemi kombine etmek düşük patojen sayısı nedeniyle negatif sonuç alınması, fizyolojik olarak strese girmiş veya yaralı patojen hücrelerin tespit zorluğu ve ölü hücrelerden gelebilecek deoksiribonükleik asitin (DNA) elimine edilememesi gibi birçok limitasyonla baş edilebilmek mümkün olacaktır. Kısmen yapılacak bir ön zenginleştirme işlemi ile hassasiyet limitleri bu yöntemde düşürülebilmektedir. Fakat bu işlem sonuç alma süresini uzatmaktadır. Ön zenginleştirme işlemi mikroorganizmanın çeşidine göre 6-8 saatten 48 saate kadar uzayabilmektedir. Uluslararası Standardizasyon Örgütü'ne göre Salmonella için bu süre 18-20 saat, Listeria monocytogenes için ise 25-26 saat olarak belirtilmiştir.
Teknolojinin gelişmesiyle bir öncekine göre daha avantajlı sistemler geliştirilmekte ve birçok farklı sistem kullanıcıların onayına sunulmaktadır. Nükleik asitlerin biyolojik ve moleküler biyolojik çalışmalarda doğru ve kesin bir şekilde kantite edilmesi, üzerinde çalışılan ve birçok alanda uygulaması olan önemli bir konudur. Dijital PCR bu iş için oldukça geniş kullanım yelpazesine ulaşmış yeni bir platform olarak görülmektedir. Bu yöntemle herhangi bir referans standarda veya dışsal kontrole ihtiyaç duyulmadan doğrudan nükleik asit kantitasyonu yapılabilmektedir ve yöntem Real Time-PCR sistemi ile aynı primer prob yapısını kullanmaktadır. Real Time-PCR yönteminden farklı olarak inhibitörlere daha dayanıklı olması ve yöntem gereği reaksiyon içerisindeki 1 kopyayı tespit edebilecek hassasiyete sahip olabilmesi dijital PCR yöntemini daha avantajlı duruma getirmiştir.
Bu çalışmada yaygın kullanılan Real Time-PCR sistemi yerine sonuç alma süresini azaltacak bir yöntem araştırması yapılmıştır. 3. nesil PCR olarak da adlandırılan ve bir kopyaya kadar hassas sonuç verebilme yeteneğine sahip Droplet Dijital PCR (ddPCR) sistemi ile Salmonella spp. türlerini ve Listeria monocytogenes'i yüksek hassasiyette tespit edebilecek minimum zenginleştirme aşamasına sahip bir yöntem geliştirmek üzerine çalışılmıştır. Salmonella spp. için gıda matrisi olarak çiğ kıyma örnekleri, Listeria monocytogenes için süt örnekleri seçilmiştir. Çalışma sonucunda Salmonella spp. için 25 g örnekte 1.39 kob hassasiyette sonuç alınırken Listeria monocytogenes için 1.35 kob hassasiyette sonuçlar alınmıştır.

Abstract:
Since foods can be utilized as nutrient and metabolized substrates, they inevitably provide a suitable environment for the growth of many microorganisms. Many diseases can be caused by foodborne pathogens through the consumption of contaminated food or beverages and continue to be a widespread and serious threat to public health around the world. The severity of these diseases may remain in simple acute symptoms or it can reach serious and life-threatening levels. Foodborne pathogens are defined as biological agents capable of causing a foodborne illness and they can be included in bacteria, virus or parasite groups. Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazakii, Esherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococccus aureus, Vibrio spp. and Yersinia enterocolitica are considered as the most common foodborne pathogenic bacteria. 
Salmonella which is found widely in nature is an important zoonotic pathogen having economic and political importance. Warm and cold-blooded animals' intestinal tract is the main reservoir of the Salmonella spp. Due to the contamination, this pathogen has been isolated from a large variety of foods both processed and unprocessed products such as meat, fruit, and vegetables. Salmonellosis caused by Salmonella spp., is an important public health problem. Every year, millions of cases are recorded around the world and resulting in thousands of deaths. The dose of bacteria taken through food is related to the severity of the infection and requires zero tolerance in the process of food control.
Another the most common foodborne pathogen Listeria can cause serious infections, especially in immunocompromised individuals, newborns, pregnant women, and elderly people. These infections can cause fetal loss, stillbirth, meningitis, meningoencephalitis, septicemia, and death. The mortality rate of Listeria monocytogenes infection is higher than the other food pathogens. Listeria species can be found in various environments such as soil, water, wastewater, and foods. This group of bacteria can also survive in refrigerator conditions and it has tolerance to high osmatic pressure, high salt concentration, and low pH. Listeriosis is a severe infectious disease caused by the consumption of food contaminated with Listeria monocytogenes. Due to the severity of this disease, zero tolerance is required in most food quality control processes.
It is extremely important to implement the necessary quality control programs for foods from production to the consumption stage to prevent the transmission of pathogenic microorganisms, and thus to prevent both the serious situations concerning human health, and deaths that may occur. Traditional methods used in quality control are based on cultivation. These methods are simple, easily adaptable, and generally inexpensive. However, these methods are time-consuming as they require the growing of bacteria in a culture media, performing biochemical and/or serological identification after bacterial isolation, and, in some cases, subspecific identification. The disadvantages of these methods, such as their inability to reveal phenotypic characteristics and to identify uncultured microorganisms, as well as the fact that it takes several days to obtain results, have prompted researchers to develop faster, more reliable, and more sensitive methods. The vast majority of these developed methods include not only antibody and DNA-based techniques, but also techniques formed by the modification of traditional methods as well. In recent years, DNA-based techniques have gained importance in the detection of pathogenic microorganisms. The most prominent of these techniques is based on Polymerase Chain Reaction (PCR). There are many PCR methods used in food microbiology laboratories to detect food pathogens. The traditional PCR method requires imaging systems such as electrophoresis. In the Real Time-PCR technique, which can be called the second-generation PCR, the proliferating DNA can be displayed simultaneously with the fluorescent signal without the need for processes such as electrophoresis, and this technique also enables quantitation. 
Many validated and commercialized Real Time-PCR methods are available with varying limits of specificity, accuracy, and sensitivity. Theoretically, PCR can produce millions of copies of one copy of DNA in less than two hours.  However, the presence of inhibitors in foods reduces sensitivity. Although producing result in PCR takes 30-90 minutes, its sensitivity limits are only around 103-104 cfu/g. Therefore, combining the PCR approach with the microbial enrichment methods can overcome many limitations such as false negative results due to low pathogen count, difficulty in detecting physiologically stressed or injured pathogen cells, and inability to eliminate DNA from dead cells. Combining PCR with a partial pre-enrichment process may reduce the sensitivity limits. However, the pre-enrichment process continues from 6-8 hours to 48 hours depending on the type of microorganism. The time of this process in the ISO standard is specified as 18-20 hours for Salmonella and 25-26 hours for Listeria. Advantageous systems are being launched out with the development of technology compared to the previous ones, and many different systems are offered to users for approval. The accurate and precise quantitation of nucleic acids by these systems is an important issue and continues to be studied in many fields.
Digital PCR is accepted as a new platform that has reached a wide range of uses. It enables direct nucleic acid quantification without the need for any reference standard or external control. Compared to Real Time-PCR, digital PCR is more resistant to inhibitors and has the sensitivity to detect even one copy in the reaction, making it more advantageous. This system combines PCR and digital imaging technology. The working principle of digital PCR can be summarized as, dividing the reaction into compartments and counting each compartment by checking of the selected fluorescent. One of the commercially available digital PCR technologies is based on microdroplet production, while the other is based on microfluidic chips. In droplet digital PCR (ddPCR) thousands of droplets are generated by the titration of water, oil, and stabilizing chemicals within a tube. In the first step, the sample is put into a machine called a droplet generator with all the required chemicals. After, the 20 µL mixture is divided into approximately 20000 droplets through titration. In this step, DNA is distributed randomly into the droplets with the chemicals required for PCR. Following this, the tube is put into a thermal cycler for the PCR process. Hereby, a separate PCR process occurs in every droplet. After the PCR step, the droplet reader counts droplets by determining the fluorescent as positive or negative. Using Poisson statistics, average target DNA copy number is calculated per reaction due to the estimation of concentration.
In this study, via using ddPCR, a highly sensitive, precise, and rapid method is developed for detecting the most common two food pathogens: Salmonella spp. and Listeria monocytogenes instead of widely used Real Time-PCR based methods. ddPCR technology is combined with the minimum enrichment time that would generate same-day reports. While raw minced meat samples are selected as a food matrix for Salmonella spp., milk samples are selected for Listeria monocytogenes. As a result, by means of this new method, a sensitivity of 1.39 CFU is obtained in a 25 g sample for Salmonella spp., while that of 1.35 CFU is obtained for Listeria monocytogenes.
The effectiveness of primer probes used in this study is investigated with various performance experiments. Taqman hydrolysis probe technology used in Real Time-PCR could also be used in ddPCR. Using the same primers and probes in the digital PCR stage makes it possible that Real Time-PCR can be used for the control of ddPCR. In this way, PCR can be screened simultaneously and the optimization of the PCR stage for the digital PCR will be completed to a large extent. In order to test the performance of the method, Real-Time PCR experiments are also conducted in this study. The addition of internal control to the experimental setup from the DNA isolation stage will provide information on both the success of DNA extraction and the existence of any PCR inhibitors. For this purpose, a sequence of 5' untranslated region (UTR) of the Hepatitis C Virus is selected and the probe binding region replaced a sequence belonging to the human Factor 5 gene by in vitro mutagenesis method. After that, it is cloned into a vector.
The specificity of the primers and probes used in this study is tested experimentally by exclusion and inclusion studies and is found as 100%. Specificity studies were also checked by in silico homology search. Since the primers and probes used in both Real Time-PCR and ddPCR studies share the same chemistry, specificity studies are limited by Real Time-PCR. Salmonella specificity test is performed with 86 different isolates belonging to Salmonella spp. species and with 74 non-Salmonella spp. The Listeria specificity test is performed with 10 different Listeria monocytogenes isolates, 4 different Listeria spp. isolates and 132 different non-Listeria isolates. Real Time-PCR linearity experiments are performed for both DNA isolated from serially diluted bacterial cultures from stock and dilutions of isolated DNA. The dynamic range is found at an acceptable range for both Salmonella spp. and Listeria monocytogenes. Linearity experiments are also performed for ddPCR. The dilution series obtained from 10-fold differences of the cultured bacteria are used to calculate the dynamic range. The range is found acceptable in both Salmonella and Listeria monocytogenes. The performance of the system is also tested in terms of its sensitivity, reproducibility, and repeatability. The results obtained from the experiments show that model performance meets the desirable criteria.
In this study, the recognition ability of ddPCR with maximum sensitivity is tried to be measured by adding the shortest possible pre-enrichment step. While this period is determined as 3 hours for Salmonella, it is determined as 4 hours for Listeria monocytogenes. This step also eliminates the problem of living-dead bacteria separation. The addition of this step makes the proposed method more sensitive and has higher performance when compared to the Real Time-PCR.