Radyasyona maruz bırakılan insan glioblastoma multiforme hücre kültürlerinde (U-87 MG VE T98G) trabectedin aracılı zenginleştirilmiş sitotoksik etkide dna tamir mekanizmalarının rolü
The role of dna repair mechanisms in trabectedin mediated enhanced cytotoxic effect in radiation treated human glioblastoma multiforme cell cultures (U-87 MG AND T98G)
Yazar: EMİR BOZKURT
Danışman: DOÇ. DR. SELİM UZUNOĞLU
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Radyasyon-iyonizan = Radiation-ionizing

Özet:
Glioblastoma Multiforme (GBM),  primer beyin tümörleri içerisinde en sık karşılaşılanı ve en ölümcül olanıdır. Tedavideki en önemli sorunlardan biri, tümör hücrelerinin radyasyona ve kemotörapötiklere karşı direnç geliştirmesidir. Bu yüzden güncel araştırma stratejileri, molekül bazlı hedeflerin belirlenmesini, yeni kematörapotikler geliştirilmesini, tümör hücrelerinin radyasyona karşı duyarlı hale getirilmesini içerir. Trabectedin (ET-743), Karayip Denizi?nde yaşayan omurgasız bir canlı olan Ecteinascidia turbinata (deniz fıskiyesi) organizmasından izole edilmiş, günümüzde yarı sentetik olarak üretilen bir moleküldür. DNA?nın küçük oluğuna bağlanıp konformasyonunda bozulmalara yol açarak, hücreyi ölüme götürdüğü bilinmektedir.
Bu çalışmanın öncelikli amacı, glioblastoma multiforme hücre (U-87 MG ve T98G) kültürlerine düşük dozlardaki radyasyon ve trabectedin molekülünün ardışık uygulanmasıyla sitotoksik ve apoptotik etkinliğin zenginleştirilip zenginleştirilemeyeceğini test etmektir. İkincil amaç ise, radyasyon ve trabectedin uygulanan GBM hücrelerinde gözlenen zenginleştirilmiş sitotoksik/apoptotik etkide, DNA tamir sistemlerinin rol alıp almadığını araştırmaktır. 
Trabectedin?in hücre canlılığı üzerindeki etkilerinin araştırılmasında xCELLigence sistemi kullanıldı. İyonize radyasyon ve ardışık uygulamaların hücre canlılığı üzerindeki etkileri Tripan mavisi yöntemi kullanılarak araştırıldı. Apotozisin gösterilmesinde, DNA fragmentasyon miktarı ve kaspaz 3/7 aktivasyon düzeyleri ölçüldü. Ardışık uygulanan etkin Trabectedin ve iyonize radyasyonun etkilediği DNA tamiri ile ilişkili genlerin mRNA düzeyindeki değişiklikler Human DNA Repair Array PCR Array kullanılarak araştırıldı. 
Trabectedin?in U-87 MG ve T98G hücre kültürlerinde 24. saatteki IC50 değerleri sırasıyla 8.4 nM ve 17 nM; 48. saatteki IC50 değerleri ise sırasıyla 5 ve 13 nM hesaplandı. İyonize radyasyon?un U-87 MG ve T98G hücre kültürlerinde 24. saatteki IC50 değerleri, sırasıyla 22Gy ve 25 Gy; 48. saatteki IC50 değerleri, sırasıyla 8 Gy ve 9.8 Gy bulundu. Her iki hücre kültüründe de, 24 saat Trabectedin ve 24 saat iyonize radyasyon ardışık uygulamasının sitotoksik etkiyi zenginleştirdiği saptandı. Trabectedin?in artan konsantrasyonları (0.01-100 nM) ile muamele edilen T98G hücre kültürlerinin DNA fragmentasyonu ve kaspaz 3/7 aktivite düzeylerinde doza ve zamana bağlı artış gözlendi. Her ikisinin ardışık uygulandığı T98G hücre kültürlerinde DNA fragmentasyonu ve kaspaz 3/7 aktivasyonu düzeylerinde artış gözlendi. Ardışık uygulamanın T98G hücre kültürlerinde Rad51B, XRCC4, ATM, ATR, MGMT; U-87 MG hücre kültürlerinde ise OGG1, Rad51B, XRCC4 gibi DNA tamir mekanizmaları ile ilişkili genlerin mRNA düzeyinde değişikliklere yol açtığı belirlendi. 
GBM hücre kültürlerinde (U-87 MG ve T98G) Trabectedin ve iyonize radyasyonun ardışık uygulamasının sitotoksik ve apoptotik etkileri, DNA tamir mekanizmalarını nasıl etkilediği ilk defa bu çalışma ile ortaya konuldu. Bu çalışmanın verileri, GBM kanserinin tedavisinde radyoterapinin etkinliğini artırmada, Trabectedin?in hücreleri hassaslaştırmada kullanılabilecek etkin bir kemoterapötik olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most common and lethal brain tumors. One of the most important problems in the treatment is drug and radiation resistance observed in glioblastoma cells. Thus, current research strategies include determining molecular targets, developing new chemotherapeutics and sensitization of tumor cells to radiation.
Trabectedin (ET-743) is a molecule that was originally isolated from the Caribbean sea squirt, Ecteinascidia turbinata and is currently prepared semi-synthetically. It is known that it binds to minor groove of the DNA and leads to cell death.
The main objective of the study is to investigate whether the cytotoxic and apoptotic effect of sequential treatment of the low doses of radiation and Trabectedin on human glioblastoma multiforme (U-87 MG ve T98G) cells would enhance. Moreover it is to investigate the role of DNA repair mechanisms on the enhanced cytotoxic/apoptotic effect of sequential treatment of the low doses of radiation and Trabectedin.
xCELLigence system was used for investigating the effects of Trabectedin on the cell viability. The effects of ionizing radiation and sequential treatments on the cell viability were determined by using Trypan blue dye exclusion assay. Apoptosis was shown by measuring the level of DNA fragmentation and caspase 3/7 activation. Changes in mRNA levels of DNA repair related genes which are affected by sequential treatment of efficient Trabectedin and radiation doses were determined by Human DNA Repair Array PCR Array. 
The IC50 values of Trabectedin in U-87 MG and T98G cell lines were 8.4 nM and 17 nM, respectively, at 24h; 5 and 13 nM, respectively, at 48h. The IC50 values of ionizing radiation in U-87 MG and T98G cell lines were 22 Gy and 25 Gy, respectively, at 24h; 8 Gy and 9.8 Gy, respectively, at 48h. Enhanced cytotoxicity was observed in both tested cell lines by sequential treatment of Trabectedin and ionizing radiation. Increased DNA fragmentation and caspase 3/7 activation was observed in T98G cell lines treated with increasing concentrations (0.01-100 nM) of Trabectedin in a time and dose dependent manner. Increased levels of DNA fragmentation and caspase 3/7 activation were observed in sequentially treated T98G cell lines. Sequential treatment was also caused significant changes in mRNA levels of DNA repair mechanisms related genes such as Rad51B, XRCC4, ATM, ATR, MGMT in T98G cell lines; OGG1, Rad51B, XRCC4 in U-87 MG cell lines. 
This is the first study in the GBM cell cultures that both cytotoxic/ apoptotic effects of the sequential treatment of Trabectedin and ionizing radiation and the role of DNA repair mechanisms in these effects were investigated. The preliminary data indicates that Trabectedin may be a promising chemotherapeutic for sensitizing cells to ionizing radiation in the treatment of GBM.