Guinea piglerde intratimpanik gentamisin ile oluşturulan vestibülotoksisite modeli üzerine intratimpanik N asetil sisteinin etkisi
Effect of intratympanic N acetyl cysteine onvestibulotoxicity model formed withintratympanic gentamicine in guinea pigs
Yazar: FATMA ZEHRA BABAYİĞİT
Danışman: PROF. DR. ÖZGÜR YİĞİT
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Kulak Burun Boğaz ve Baş-Boyun Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Kulak Burun ve Boğaz = Otorhinolaryngology (Ear-Nose-Throat)
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Gentamisinler = Gentamicins ; Kobaylar = Guinea pigs ; N-asetilsistein = N-acetylcysteine ; Timpanik membran = Tympanic membrane ; Toksisite = Toxicity ; Uyarılmış potansiyeller = Evoked potentials ; Vestibüler sistem = Vestibular system

Özet:
İç kulakta dengeyi sağlayan saçlı hücreler oldukça hassastır ve birçok dış etmenden
etkilenir. Bunlara örnek olarak yaşlanma, genetik hastalıklar,birçok kemoteröpatikler
verilebilir. Kemoteröpatikler içerinde yer alanlardan birtanesi de aminoglikozidlerdir.
Aminoglikozidler içerisinde ise en çok vestibülotoksik etkisi olan Gentamisindir. 1
Aminoglikozidlerin iç kulaktaki bu etkisi geçici veya kalıcı olabilir. Gentamisin
kalıcı etkisini hücre içerisinde reaktif oksijen molekülleri oluşturup hücre ölümüne
sebebiyet vererek gösterir. Gentemisin toksisitesini en çok Tip 1 hücrelerde gösterir. 2
Literatürde aminoglikozidler ile oluşturulan vestibülotoksisite tedavisinde A
vitamini, N Asetil Sistein, E vitamini üzerinde çalışılmaktadır. Ama hala etkin bir
ajan bulunamamıştır. 3
Gentamisin ile vestibülotoksisite oluşturulmuş guinea piglerde N Asetil Sisteinin
vestibüler sistem üzerine etkisini fonksiyonel, biyokimyasal ve histopatolojik olarak
araştırmayı amaçladık.
GEREÇ VE YÖNTEM
Bezmi Alem Vakıf Üniversitesi Deney Hayvanları Yerel Etik kurulundan onay alındı
ve Bezmi Alem Vakıf Üniversitesi hayvan laboratuvarında çalışma yürütüldü.
(Tarih-Sayı 2019/34) Çalışmaya 16 Guinea Pig dahil edildi.(6-8haftalık 900-1200 gr
ağırlığında). Vestibüler sistemin menstüral siklusun ve hormonların değişimlerinden
etkilenmemesi adına erkek guinea pigler çalışmaya alındı. Denekler 21-23 santigrat
derecede 12 saatlik gündüz ve gece siklusu olacak şekilde döngüde tutuldular.
Guinea pigler Randomize olarak üç gruba ayrıldı.Herhangi bir müdahalede
bulunulmayan grup 1.grup(kontrol grubu),İntratimpanik gentamisin(0.5 cc salin
içersinde 4mg/kg gentamisin) 2.grup ve intratimpanik gentamisin+NAC(0.5 cc salin
içersinde 4mg/kg gentamisin+150mg/kg NAC) 3.grup olarak ayrıldı.2.ve 3.gruba tek
doz olmak üzere 1.gün it gentamisin uygulandı.3. gruba 1. 3. Ve 5.günler olmak
üzere intratimpanik NAC uygulandı.Guine pig lerden 0.gün c-VEMP ölçmleri
alındı.Aynı zamanda plazmada total antioksidan kapasite bakılmak üzere 2 cc kan
alındı.Aynı işlem 10. Ve 30.gün tekrarlandı.30.günün sonunda hayvanlar sakrifiye
edilerek 3 grup arasındaki vestibüler hücrelerdeki silya kaybı,nekroz ve
vakualizasyon gibi patolojik değişiklikler hematoksin eozin ve p53 ve bcl-2 ile
boyanma immünhistokimyasal yöntemler kullanılarak ışık mikroskopu altında
değerlendirilerek karşılaştırıldı.Aynı zamanda vestibüler dokudaki antioksidan-
oksidan kapasite biyokimyasal analiz ile ölçülerek 3 grup arasında karşılaştırıldı.
BULGULAR
Kontrol grubunda c-VEMP ilk pozitif dalga 6-9.saniyeler arası ilk negatif dalga 9-
11.saniyeler arasında alındı. Gentamisin grubunda 10.günde c-VEMP latansında
uzama görüldü. Gentamisin grubunda ilk pozitif dalga oluşum süresi 10.günde
ortalama 13±1,87 sn ölçülmüşken,N-Asetil sistein+Gentamisin grubunda ise
9,40±0,55 sn olarak ölçülmüştür.bu fark anlamlı olarak bulunmuştur.(p:0,013)
30.gün bakıldığında Gentamisin grubunda c-VEMP cevapları hayvanların yüzde
%50sinde alınamadı. N-Asetil sistein+gentamisin grubunda c-Vemp değerlerinde
kısmi kayıp gözlendi.
Antioksidan ve oksidan kapasiteye serumda baktığımızda NAC-gentamisin
(17,40±3,78 10.gün;17,33±4,63 30.gün) ile gentamisin (12,77±2,34
7.gün;11,42±2,42 30.gün) grubunu karşılaştırdığımızda NAC-gentamisin grubunda
7. Ve 30.gün SOD değerleri anlamlı olarak daha yüksekti.(p:0,007 7.gün, p:0.014
30.gün)Oksidan stresde rol alan MDA 30.günde ve LOOH 7.günde genta grubunda
en yüksekti.(MDA p:0,005 LOOH p:0,025)
Doku da ise SOD ve GSH anlamlı olarak gentamisin grubunda düşük bulunurken
oksidan stresde rol alan MDA ve LOOH değerleri en yüksekti(Kontrol grubunda
ortalama SOD değeri 19,82±2,28 GSH ortalama 0,79±0,3 iken; Gentamisin grubunda
SOD ortalama 12,13±3,22 GSH ortalama 0,67±0,44 NAC+Gentamisin grubunda
SOD ortalama 17,91±3,16 GSH ortalama 0,78±0,34 olarak bulunmuştur. Gentamisin
ile genta+NAC grubundaki fark anlamlı bulunmuştur.(SOD p:0,010 GSH p:0,014)
Histopatolojik değerlendirmede Genta grubunda 4 hayvanda orta şiddette atrofi,
vakualizasyon silya kaybı görülürken 1 hayvanda çok şiddetli olmuştur.Genta+NAC
grubunda ise bu durum çok hafif olarak izlenmiştir.Ve aralarındaki fark anlamlı
bulunmuştur.(p<0.001)
İmmünhistokimyasal olarak p53 ve Bcl-2 boyanmasına bakıldığında p53 pozitifliği
NAC ve genta grubunda gözlendi. Bcl-2 pozitifliği ise her 2 grupta gözlenirken NAC
grubunda biraz daha fazla idi.2 grup arasındaki fark anlamlı bulunmadı.

SONUÇ
Gentamisin ile oluşturulan vestibülotoksisite modelinde c-VEMP cevaplarında
anlamlı kayıp yaşanırken, NAC bu kaybın azalmasında etkili rol oynadığı görüldü.
Aynı zamanda serumda ve doku örneklerinde bakılan oksidan belirteçlerin NAC
grubunda anlamlı olarak daha düşük yoğunlukta olduğu görüldü.Histopatolojik
incelemede NAC ve Gentamisin grubunda dejenerasyon izlenirken NACın az da olsa
protektif etkisi görüldü.
NAC ın vestibülotoksisite üzerine tedavi edici etkisinin aydınlatılması için daha
büyük sayıda deney gruplarına ve insan çalışmalarına ihtiyaç vardır.

ANAHTAR KELİMELER Vestibülotoksisite, c-VEMP,Antioksidan,N-Asetil
Sistein,Gentamisin

Abstract:
OBJECTİVE
Hair cells that provide balance in the inner ear are very sensitive and are affected by
many external factors. Examples of these include aging, genetic diseases, many
chemotheropatİc. Aminoglycosides are one of chemotheropatics. Among the
aminoglycosides, Gentamicin has the most vestibulotoxic effect. This effect of
aminoglycosides on the inner ear can be temporary or permanent. Gentamicin shows
its permanent effect by creating reactive oxygen molecules in the cell, causing cell
death. Gentamicin shows its toxic effect mostly in Type 1 cells.
In the literature, studies have been studied on vitamin A, N Acetyl Cysteine, and
vitamin E in the treatment of vestibulotoxicity induced by aminoglycosides.
However, an effective agent has not been found yet. We aimed to investigate the
effect of N Acetyl Cysteine on the vestibular system in guinea pigs with Gentamicin.

MATERİALS AND METHODS
Approval was obtained from Bezmi Alem Vakıf University Experimental Animals
Local Ethics Committee and the study was carried out in the animal laboratory of
Bezmi Alem Vakıf University. (Date-Number 2019/34) 16 Guinea Pigs were
included in the study (weighing 900-1200 g for 6-8 weeks). Male guine pigs were
included in the study in order to prevent the vestibular system from being affected by
changes in the menstrual cycle and hormones. The subjects were kept in a cycle at
21-23 degrees Celsius for a 12 hour day and night cycle. Guinea pigs were randomly
divided into three groups. 2nd group and intratympanic gentamicin + NAC (4mg / kg
gentamicin in 0.5 cc saline + 150mg / kg NAC) were divided into 3rd group. It was
administered to the 2nd and 3rd groups as a single dose on the 1st day. It NAC was
applied to the group on the 1st, 3rd and 5th days. C-VEMP measurements were taken
from the guinea pigs on the 0th day. At the same time, 2 cc of blood was taken to
check the total antioxidant capacity in the plasma. The same procedure was repeated
on the 10th and 30th days. At the end of the 30th day, animals were sacrificed and
pathological changes such as loss of cilia in vestibular cells, necrosis and
vacualization between the three groups were evaluated under a light microscope
using hematoxin eosin and staining with p53 and bcl-2, and compared under the light
microscope. At the same time, antioxidant-oxidant capacity biochemical analysis in
vestibular tissue and compared between 3 groups.

RESULTS
In the control group, the first positive wave of c-VEMP was taken between the 6th
and 9th seconds, the first negative wave was taken between the 9th and 11th seconds.
The c-VEMP latency was prolonged at the 10th day in the gentamycin group. While
the first positive wave formation time was measured as 13 ± 1.87 seconds on the
10th day in the gentamicin group, it was measured as 9.40 ± 0.55 seconds in the N-
Acetyl cysteine ​​+ Gentamicin group, this difference was found to be significant (p:
0.013). On the 30th day, c-VEMP responses were not obtained in 50% of the animals
in the Gentamicin group. A partial loss of c-Vemp values ​​was observed in the N-
Acetyl cysteine ​​+ gentamicin group.
Antioxidant and oxidant capacity in serum, NAC-gentamicin (17.40 ± 3.78 7th day;
17.33 ± 4.63 30th day) and gentamicin (12.77 ± 2.34 10th day; 11.42 ± 2.42 30th
day), the 7th and 30th day SOD values ​​were significantly higher in the NAC-
gentamicin group. (P: 0,007 7th day, p: 0.014 30th day) LOOH was the highest in the
genta group on day 7. (MDA p: 0.005 LOOH p: 0.025) In tissue, SOD and GSH
were significantly lower in the gentamicin group, while the MDA and LOOH values
​​involved in oxidant stress were the highest (mean SOD value was 19.82 ± 2.28, mean
GSH was 0.79 ± 0.3 in the control group; 12.13 ± 3.22 mean GSH 0.67 ± 0.44 NAC
+ mean SOD 17.91 ± 3.16 GSH mean 0.78 ± 0.34 in Gentamycin group The
difference between gentamycin and genta + NAC group was significant (SOD p:
0.010 GSH p: 0.014)
In histopathological evaluation, 4 animals in the Genta group had moderate atrophy
and loss of vacualization cilia, while it was very severe in 1 animal. In the Genta +
NAC group, this was very mild and the difference between them was significant (p
<0.001)
When p53 and Bcl-2 staining was examined by immunohistochemistry, p53
positivity was observed in NAC and genta groups. Bcl-2 positivity was observed in
both groups, while it was slightly higher in the NAC group. The difference between
the 2 groups was not significant.

CONCLUSION
While there was a significant loss in c-VEMP responses in the vestibulotoxicity
model created with gentamicin, it was observed that NAC played an effective role in
reducing this loss. At the same time, it was observed that oxidant markers measured
in serum and tissue samples were significantly lower in the NAC group. It had a little
protective effect.A larger number of groups and human studies are needed to
elucidate the therapeutic effect of NAC on vestibulotoxicity.
KEYWORDS Vestibulotoxicity, c-VEMP, Antioxidant, N-Acetyl Cysteine,
Gentamicin