Glioma hücrelerinde SIRT1 ve HSF1 etkileşiminin incelenmesi
Investigation of SIRT1 and HSF1 interactions in Glioma cells
Yazar: İREM ÖĞÜTCÜ
Danışman: PROF. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Glioblastoma yetişkinlerde merkezi sinir sisteminde (MSS) en sık görülen primer malign beyin
tümörlerinin en agresif tipi olup yüksek ölüm oranı ve kötü prognoz ile seyretmektedir.
Uygulanan mevcut tedavi, cerrahi, radyoterapi ve kemoterapiye dayalı kombine terapilerdir,
ancak henüz hastalığın kesin bir tedavisi yoktur. Bu nedenle, glioblastomayı hedeflenen
alternatif terapötiklerle ilgili araştırmalar oldukça önemlidir.
Kanserde ısı şoku proteinlerinin ("Heat Shock Protein", HSP) ekspresyon seviyelerinin anlamlı
bir şekilde artış gösterdiği bilinmektedir. Bu HSP'lerin ekspresyonlarını kontrol eden ana
transkripsiyon faktörü Isı şoku faktörü 1 ("Heat Shock Factor 1", HSF1)'dir. Yapılan
çalışmalar, gliomalarda HSF1'in aşırı eksprese edildiğini ve bu artışın kötü prognozla ilişkili
olduğunu göstermektedir. Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) bağımlı protein deasetilaz
sirtuin-1 ("NAD- dependent deacetylase sirtuin-1", SIRT-1), histon deasetilaz protein ailesinin
bir üyesi olarak yaşlanma, transkripsiyon, apoptoz, otofaji, inflamasyon, stres direnci, oksidatif
stres, ER stresi ve ilaç direnci gibi çok çeşitli hücresel süreçlerde rol oynayan ve proteinlerin
deasetilasyonundan sorumlu bir enzimdir. Bununla birlikte SIRT1'in, glioblastomanında dahil
olduğu birçok kanser tipinde aşırı eksprese edildiği ve hücre canlılığını destekleyerek apoptozu
inhibe ettiği bilinmektedir. Gliomada SIRT1/HSF1 etkileşimi ile ilgili yapılan çalışmalar
sınırlıdır. Bu yüksek lisans tezi kapsamında, SIRT1 ve HSF1 etkileşimi ile SIRT1'in bazı
antikanser moleküler mekanizmalar üzerine etkileri 2D-monolayer (MN) ve 3D-sferoid (SF)
U87-MG insan glioma hücrelerinde araştırılmıştır. Hücrelerde, SIRT1 ekspresyonunun baskılanması için siRNA transfeksiyonu yapılmıştır. 2D-monolayer ve 3D sferoid hücrelerinde
50 nM SIRT1uygulamasının, HSF1 ile bazı Hsp'lerle olan ilişkisi incelenmiş ve proliferasyon,
migrasyon, anjiyogenez, metastaz, EMT, apoptoz, otofaji, oksidatif stres, ER stresi, koloni
oluşturma yeteneği, DNA tamiri mekanizmaları üzerine olan etkileri de değerlendirilmiştir.
Yapılan uygulamanın GB agresifliğinde ve ilerleyişinde önemli etkisi olan anjiyogenez,
migrasyon, metastaz ve koloni oluşturma yeteneğini önemli ölçüde azalttığı görülmüştür. Hem
2D-monolayer hem de 3D-sferoid kültürde, SIRT1 susturumunun başta HSF1 ve p-HSF1
olmak üzere Hsp90, Hsp70, Hsp60 ve Hsp27 protein ekspresyonlarını önemli ölçüde azalttığı
belirlenmiştir. İmmünofloresan analizleri SIRT1 ve HSF1 transkripsiyon faktörlerinin nükleer
translokasyonunun azalttığını göstermiştir. Hücre içi ROS ve ER stresi analizleri hem 2Dmonolayer hem de 3D-sferoid hücrelerinde ROS seviyesinin, ER stresinin bir göstergesi olan
Grp78 ekspresyonunun arttığını ortaya koymuştur. SIRT1 ekspresyonunun azalmasının hem
FOXO1 ekspresyonunu hem de nükleer translokasyonunu arttırdığı görülmüştür. SIRT1
susturumu ile birlikte FOXO1 ekspresyonun artmasının NF-κB-p65 ekspresyonunu azalttığı
saptanmıştır. SIRT1'in GAPDH proteinini sitoplazmada tuttuğu bilinmektedir. SIRT1'in
baskılanmasının GAPDH protein ekspresyonunu azalttığı, nükleer translokasyonunu ise
arttırdığı anlaşılmıştır. Hem 2D-monolayer hem de 3D-sferoid kültürde yapılan apoptotik
analizler SIRT1 susturumu yapılan grupta kesilmiş kaspaz-3, Bax/Bcl-2 oranı, PARP1
fragmentlerinin arttığını göstermiştir. Ayrıca HO/PI boyaması ile SIRT1'in baskılandığı
durumda nükleer yoğunlaşma, parçalanma ve ölü hücre sayısında artış olduğu gözlenmiştir.
Hem 2D-monolayer hem de 3D-sferoid kültürde gerçekleştirilen otofaji analizleri SIRT1
susturumu yapılan grupta LC3-II ekspresyonunun arttığını göstermiştir. Benzer şekilde akridin
oranj boyama sonuçlarında SIRT1 baskılanmasının AVO oluşumunu arttırdığını ortaya
koymuştur. SIRT1 ekspresyonunun baskılanmasının hem 2D-monolayer hem de 3D-sferoid
kültürde E-kaderin gibi epitelyal belirteçlerin ekspresyonlarını arttırdığı, N-kaderin, β-katenin,
TGF-β gibi mezenkimal belirteçlerin ekspresyonlarını ise azalttığı saptanmıştır. Bu durum
kanser kök hücresi özelliği gösteren (CSC) sferoidlerde ve monolayer kanser hücrelerinde
SIRT1'in EMT'ye geçişin engellenmesi için önemli bir hedef olabileceğini göstermektedir.
Bu tez kapsamında elde edilen sonuçlar, SIRT1 baskılanmasının karsinogenezde önemli bir
hedef olabileceğini desteklemektedir. GB tedavisi için SIRT1'in HSF1, FOXO1, NF-κB, p53
gibi transkripsiyon faktörleri ile olan etkileşimlerinin değerlendirilmesinin ne kadar önemli
olduğu anlaşılmaktadır. GB tedavisinde kişiye özgü terapilerin geliştirilebilmesi adına bu
çalışmalar öncü olabilecektir.

Abstract:
Glioblastoma is the most aggressive type of primary malignant brain tumors that are most
common in the central nervous system (CNS) in adults and has a high mortality rate and poor
prognosis. The current treatment applied is combined therapies based on surgery, radiotherapy
and chemotherapy, but there is no definitive cure for the disease yet. Therefore, research on
alternative therapeutics targeting glioblastoma is extremely important.
It is known that the expression levels of heat shock proteins ("Heat Shock Protein", HSP)
increase significantly in cancer. The main transcription factor controlling the expression of
these HSPs is Heat Shock Factor 1 ("HSF1"). Studies show that HSF1 is overexpressed in
gliomas and this increase is associated with poor prognosis. Nicotinamide adenine dinucleotide
(NAD) dependent protein deacetylase sirtuin-1 ("NAD- dependent deacetylase sirtuin-1",
SIRT-1), as a member of the histone deacetylase protein family, is involved in aging,
transcription, apoptosis, autophagy, inflammation, stress resistance, oxidative stress. It is an
enzyme that plays a role in a wide variety of cellular processes such as ER stress and drug
resistance and is responsible for the deacetylation of proteins. However, SIRT1 is known to be
overexpressed in many types of cancer, including glioblastoma, and to inhibit apoptosis by
supporting cell viability. Studies on the SIRT1/HSF1 interaction in glioma are limited. Within
the scope of this master's thesis, the interaction of SIRT1 and HSF1 and the effects of SIRT1
on some anticancer molecular mechanisms were investigated in 2D-monolayer (MN) and 3D-spheroid (SF) U87-MG human glioma cells. In cells, siRNA transfection was performed to
suppress SIRT1 expression. The relationship of 50 nM SIRT1 application with HSF1 and some
Hsps in 2D-monolayer and 3D spheroid cells was examined and its effects on proliferation,
migration, angiogenesis, metastasis, EMT, apoptosis, autophagy, oxidative stress, ER stress,
colony-forming ability, and DNA repair mechanisms were examined. The effects were also
evaluated.
It has been observed that the application significantly reduces angiogenesis, migration,
metastasis and colony formation ability, which have a significant impact on GB aggressiveness
and progression. It was determined that in both 2D-monolayer and 3D-spheroid culture, SIRT1
silencing significantly reduced Hsp90, Hsp70, Hsp60 and Hsp27 protein expressions, especially
HSF1 and p-HSF1. Immunofluorescence analyzes showed reduced nuclear translocation of
SIRT1 and HSF1 transcription factors. Intracellular ROS and ER stress analyzes revealed that
the ROS level and Grp78 expression, an indicator of ER stress, increased in both 2D-monolayer
and 3D-spheroid cells. Decreasing SIRT1 expression has been shown to increase both FOXO1
expression and nuclear translocation. It was determined that increasing FOXO1 expression
along with SIRT1 silencing decreased NF-κB-p65 expression. It is known that SIRT1 keeps the
GAPDH protein in the cytoplasm. It has been understood that suppression of SIRT1 reduces
GAPDH protein expression and increases its nuclear translocation. Apoptotic analyzes
performed in both 2D-monolayer and 3D-spheroid culture showed that truncated caspase-3,
Bax/Bcl-2 ratio, and PARP1 fragments increased in the SIRT1 silencing group. Additionally,
HO/PI staining showed that when SIRT1 was suppressed, there was an increase in nuclear
condensation, fragmentation and the number of dead cells. Autophagy analyzes performed in
both 2D-monolayer and 3D-spheroid culture showed that LC3-II expression increased in the
SIRT1 silenced group. Similarly, acridine orange staining results revealed that SIRT1
suppression increased AVO formation. It was determined that suppression of SIRT1 expression
increased the expression of epithelial markers such as E-cadherin and decreased the expression
of mesenchymal markers such as N-cadherin, β-catenin, and TGF-β in both 2D-monolayer and
3D-spheroid culture. This shows that SIRT1 may be an important target for preventing the
transition to EMT in cancer stem cell (CSC) spheroids and monolayer cancer cells.
The results obtained in this thesis support that SIRT1 suppression may be an important target
in carcinogenesis. It is understood how important it is to evaluate the interactions of SIRT1 with
transcription factors such as HSF1, FOXO1, NF-κB, p53 for the treatment of GB. These studies
may be pioneers in developing personalized therapies in the treatment of GB.