TRPC iyon kanallarının işlevsel ekspresyon kalıplarının post-transkripsiyonel gen susturma ile araştırılması
Investigation of functional expression profile of TRPC ion channels via post-transcriptional gene silencing
Yazar: ÇİĞDEM SELLİ
Danışman: PROF. DR. METİNER TOSUN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Genetik = Genetics
Dizin: Genler = Genes ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kalsiyum = Calcium ; Karaciğer neoplazmları = Liver neoplasms ; Kas-düz-vasküler = Muscle-smooth-vascular ; RNA = RNA

Özet:
Bu çalışmada, yaşlanma sürecindeki sıçan aortunda belirlediğimiz TRPC1 iyon kanalı geninin ?down?-regülasyonunun işlevsel sonuçları, A7r5 sıçan embriyonik damar düz kas ve HuH-7 insan karaciğer kanseri hücre kültürleri olmak üzere iki farklı hücre hattında RNA'ya müdahale yöntemi ile araştırılmıştır. Bu amaçla, hücrelerde nicel gen ve protein ekspresyonunun yanı sıra işlevsel analizler de gerçekleştirilmiştir. mRNA ve protein düzeylerini belirlemek amacıyla sırasıyla nicel RT-PCR ve western blot çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, HuH-7 hücrelerinde tüm gen ekspresyonunu kapsayan transkriptom analizi gen çipi kullanılarak yapılmıştır. A7r5 hücrelerinde sadece TRPC1 ve TRPC6 mRNA'ları belirlenebilir düzeyde bulunmuştur. TRPC1 mRNA'sına özgü susturucu çift sarmal RNA dizisi (siTRPC1) uygulanan A7r5 hücrelerinde, TRPC1 mRNA ve protein düzeyleri azalmış (sırasıyla: P<0,05, n=8 ve P<0,05, n=3) TRPC6 düzeyleri ise artmıştır (sırasıyla: P<0,01, n=8 ve P<0,01, n=3). TRPC1 düzeyleri baskılanmış ve Ca+2 özgü boya fura-2 yüklenmiş A7r5 hücrelerinde, depo-kontrollü Ca+2 girişi artmıştır (P<0,01, n=5). A7r5 hücrelerindekine benzer şekilde, siTRPC1 uygulanan HuH-7 hücrelerinde, TRPC1 mRNA ve protein düzeyleri azalmış (sırasıyla: P<0,05, n=4 ve P<0,05, n=3) ve depo-kontrollü Ca+2 girişi artmıştır (P<0,01, n=3). TRPC1 düzeyleri baskılanan A7r5 ve HuH-7 hücrelerinin proliferasyonu anlamlı düzeyde azalmıştır (sırasıyla: P<0,01, n=8 ve P<0,01, n=10). Bu sonuçlar, TRPC1'in damar düz kas ve kanser hücrelerinde depo-kontrollü Ca+2 girişindeki olası düzenleyici işlevini ve hücre proliferasyonundaki işlevini önermektedir. Ayrıca, siTRPC1 uygulanan HuH-7 hücrelerinde gerçekleştirilen transkriptom analizinde en az 40 farklı genin transkripsiyon düzeylerinde değişim belirlenmesi, TRPC1 gen ekspresyonunun epigenetik olarak kontrol edildiğini düşündürmüştür.

Abstract:
This study investigates functional consequences of TRPC1 ion channel downregulation that we observed in aging rat aorta by employing RNA interference in two different cultured cells, A7r5 rat embryonic vascular smooth muscle cells and HuH-7 human hepatocellular carcinoma cell lines. For this purpose, cells were used in quantitative gene and protein expression as well as in functional analyses. To determine mRNA and protein levels, qRT-PCR and western blot analyses were performed, respectively. In addition, whole genome gene expression, transcriptome, analysis was carried out using gene chips in HuH-7 cells. In A7r5 cells, only TRPC1 and TRPC6 mRNA?s were detected. In double-stranded RNA targeting TRPC1 mRNA (siTRPC1)-transfected A7r5 cells, TRPC1 mRNA and protein levels were decreased (P<0.05, n=8 and P<0.05, n=3, respectively); while, those of TRPC6 were increased (P<0.01, n=8 and P<0.01, n=3, respectively). In Ca2+-specific dye, fura-2-loaded TRPC1-silenced A7r5 cells, store-operated Ca2+ entry was elevated (P<0.01, n=5). Similar to that of A7r5 cells, in siTRPC1-transfected HuH-7 cells, TRPC1 mRNA and protein levels were decreased (P<0.05, n=4 and P<0.05, n=3, respectively) and store-operated Ca2+ entry was elevated (P<0.01, n=3). Proliferation of TRPC1-silenced A7r5 and HuH-7 cells were decreased significantly (P<0.01, n=8 and P<0.01, n=10, respectively). These results suggest that TRPC1 may take part in store-operated Ca2+ entry and proliferation of both vascular smooth muscle cells and hepatocellular carcinoma cells. In addition, genome-wide expression analysis performed on total mRNA from TRPC1-silenced HuH-7 cells shows drastic changes covering 40 genes suggesting a possible epigenetic control over TRPC1 expression.