Kanserli hücre hattında crıspr/cas9 yöntemi ile gen susturma
Gene silencing with crispr/cas9 method in cancer cell line
Yazar: SELDA KONDAKÇI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ FATMA AZİZE BUDAK YILDIRAN
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Günümüzde kanser, kardiyovasküler hastalıklardan sonra, ölüm nedenleri arasında ikinci sırada yer almaktadır. Özellikle bazı kanser türlerinde geleneksel tedavilere yanıt verme oranları düşüktür. Olumsuz etkilerin azaltılması için hedef odaklı alternatif tanı ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Gen terapisi, hedefe yönelik çalışmalarda ilk sıralarda yer almaktadır. Son yıllarda RNA interferans (RNAi) moleküllerinden hedef geni baskılayan küçük kodlamayan RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA), meganükleaz, ZFN, TALEN, CRISPR gibi farklı genom düzenleme araçları tasarlanmıştır. Özellikle CRISPR-Cas9 sistemi Charpentier, Doudna ve ekibinin 2020 yılında Nobel Kimya Ödülü'nü alması ile çalışmalar yeni bir boyuta taşındı. Bu sistem; DNA üzerinde ekleme, çıkarma yapma ya da DNA dizilimini değiştirmeye olanak tanıyan özgün bir teknoloji olarak değerlendirilmektedir.  
Çalışmada H1299 hücre hattındaki c-Myc geninin susturulması amaçlandı. Transfeksiyon için lipofektamin kullanılan çalışmada MTT analizi ve Real-Time PCR analizi gerçekleştirildi ve PCR sonuçları Agaroz Jel Elektroforezi ile kontrol edildi. MTT analizinde (% 99,54- 124,2) uygulamada kullanılan ajanların sitotoksik olmadığı belirlendi. Real-Time PCR analizi 2-ΔΔCT ile değerlendirildi. Elde edilen verilere göre Cas9/ gRNA/Kuersetin (10 ppm) grubunda gen ifadesinin azaldığı belirlendi. Agaroz jelde elde edilen bant profilinde benzer sonuçlar gözlendi. Transfeksiyonun viral ajanlar kullanılması ile daha etkili sonuçların elde edilebileceği düşünülmektedir. Bu tür çalışmaların artırılması hedef odaklı terapötik çalışmalar açısından büyük önem taşımaktadır.

Abstract:
Cancer ranks as the second leading cause of death after cardiovascular diseases in today's world. Particularly, response rates to conventional treatments are low in certain cancer types. Developing target-focused alternative diagnosis and treatment methods holds significant importance to mitigate adverse effects. Gene therapy stands out as a prominent approach in targeted studies. In recent years, various genome editing tools have been designed, such as RNA interference (RNAi) molecules like small non-coding RNAs (siRNAs), microRNAs (miRNAs), meganucleases, ZFN, TALEN, CRISPR, among others. Notably, the CRISPR-Cas9 system gained a new dimension following the awarding of the Nobel Chemistry Prize in 2020 to Charpentier, Doudna, and their team. This system is evaluated as a unique technology enabling modifications like insertions, deletions, or alterations in DNA sequences.
The objective of this study was to silence the c-Myc gene in the H1299 cell line. Using lipofectamine for transfection, the study involved MTT analysis and Real-Time PCR analysis, with PCR results verified using Agarose Gel Electrophoresis. MTT analysis revealed that the agents used in the application (99.54% - 124.2%) were non-cytotoxic. Real-Time PCR analysis was evaluated using the 2-ΔΔCT method. According to the obtained data, gene expression decreased in the Cas9/gRNA/Quercetin (10 ppm) group. Similar results were observed in the band profile obtained in the Agarose gel. Transfection with viral agents is believed to yield more effective results. Increasing such studies holds great importance for target-focused therapeutic investigations.