Akut myeloid lösemi tanılı olgularda yeni nesil dizileme'de myeloid panel analizi ile saptanan mutasyon profili, immunhistokimyasal belirteçler ve klinikopatolojik korelasyon değerlendirmeleri
Comparison of molecular analysis findings determined by new generation sequencing with immunhistochemical markers and clinicopathological parameters in acute myeloid leukemia
Yazar: GÖKÇE SU CEYLAN
Danışman: PROF. DR. FÜRUZAN DÖGER
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Lösemi = Leukemia ; Lösemi-miyeloid-akut = Leukemia-myeloid-acute ; Mutasyon = Mutation ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Akut Myeloid Lösemi (AML) hematopoietik progenitör hücrelerden köken alan kemik iliğinde anormal blastların birikimi ile karakterize hematolojik bir malignitedir. Hematopoietik kök hücrelerin diferansiasyonunun bloke olması immatür myeloid prekürsörlerin birikimine neden olur. AML, hastalık fenotipini, tedaviye yanıtı ve nüks riskini yönlendiren bir dizi tekrarlayan mutasyonla karakterize, genomik olarak heterojen bir hastalıktır. AML, yetişkinlerde en sık görülen akut lösemidir. İnsidansı cinsiyet ve ırkla birlikte farklılıklar gösterebilir.
Lökomogenez mekanizmalarının anlaşılmasındaki ilerlemeye ve tedavideki iyileşmeye rağmen, AML'li yetişkinlerin yalnızca yaklaşık %40'ı uzun vadeli sağkalıma ulaşır. 
Moleküler olarak hedeflenen tedavilere uygun farklı klinik ve biyolojik özelliklere sahip hasta alt kümelerinin belirlenmesi zorunlu olup moleküler yöntemler son dönemde hızla gelişmiştir. Çoğunlukla sınırlı doku örneklerinin hem tanı hem de tedavi testleri için kullanılması zorunluluğu çoklu gen panellerinin çalışılabildiği Yeni Nesil Dizileme (YND) sistemine geçişi gerektirmiştir.
Çalışmaya 2018-2020 yılları arasında Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı'nda incelenen kemik iliği biyopsi materyallerinde AML tanısı konmuş ve moleküler patoloji biriminde YND ile myeloid kanser paneli çalışılmış olan 99 adet hasta dahil edilmiştir. Kapsamlı panelde AML hastalarında görülen patojenik ve olası patojenik mutasyonlar incelenmiştir. Çalışmamız dahilinindeki 99 vakanın 47'sine immunhistokimyasal (İHK'sal) olarak CD34, FLT3, CD123 ve p53 boyaları uygulanmıştır. Hastalara ait klinik (yaş, cinsiyet, yaşam durumu, yaşam süresi, hemoglobin, lökosit, trombosit değerleri) veriler ile YND ile tespit edilen genlerin ve İHK'sal parametrelerin ilişkisi değerlendirilmiştir.

İstatistiksel analizler sonucu 60 yaş üzerinde istatistiksel anlamlı olarak hem kadınlarda hem erkeklerde ölüm oranı daha yüksek bulundu. ANKRD26, KMT2A, MSH6, KCNA4, NOTCH1 gen mutasyonları saptanan hastalarda istatistiksel anlamlı olarak yaş ortalaması daha gençti. RUNX1 gen mutasyonu saptanan hastaların yaş ortalaması mutasyon bulunmayanlara göre önemli ölçüde daha yüksekti.
ANKRD26, BRCA2, CEBPA gen mutasyonları saptanan hastalarda istatistiksel anlamlı olarak lökosit değerleri tanı anında 100 000'in üzerindeydi. MYC, KMT2A, KCNA4, NOTCH1 gen mutasyonları istatistiksel anlamlı olarak daha yüksek lökosit sayıları ile ilişkili bulundu. KMT2A gen mutasyonu istatistiksel anlamlı olarak daha düşük hemoglobin ve trombosit sayıları ile ilişkili bulundu. MYC gen mutasyonu bulunan hastalarda istatistiksel anlamlı olarak trombosit değeri 100 000'in altındaydı. NRAS mutasyonu daha düşük hemoglobin değeriyle istatistiksel anlamlı olarak ilişkili bulundu.
KMT2A, MYC gen mutasyonları mevcut olup ölen hastalarda; gen mutasyonları bulunmayıp ölen hastalara göre istatistiksel anlamlı olarak ortalama yaşam süresi daha uzun bulundu. MSH6 gen mutasyonuna sahip olan hastalar daha kısa ortalama yaşam süresine sahipti.
İHK'sal olarak FLT3 boyası uygulanmış ve ölmüş hastalar incelendiğinde FLT3 ile boyanması olmayan olguların ortalama yaşam süresi 11 ay olurken; boyanma saptanan hastalarda ortalama yaşam süresi beş aya düştü. Bu durum FLT3 pozitifliğinin ortalama yaşam süresini yarı yarıya düşürdüğünü gösterdi.
Diğer tüm genler ile immunhistokimyasal bulgular, klinikopatolojik parametreler arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmadı.
Türk hastalarda literatüre göre daha düşük oranlarda NPM1, FLT3 ve TP53 mutasyonları tespit edilirken; ASXL1, MSH6, BRCA2, MYC ve PTEN mutasyonları literatürden daha yüksek oranda saptandı. Dünya verilerinden farklı oranda saptanan mutasyonların tanı ve tedavide daha fazla dikkate alınmasının ülkemiz AML hastalarında tedavi başarısına katkıda bulunacağı düşünüldü. FLT3 mutasyonun daha kötü prognozla seyreden ITD tipi dünya verilerinde en sık görülen tip iken; bizim çalışmamızda TKD tipi daha yaygın izlendi. 

İyi prognoza sahip hastaların gereksiz yoğun terapiden korunması ve hedefe yönelik spesifik tedavi alabilmesi açısından mutasyon durumunun tanı anında saptanmasının önemli olduğunu düşünmekteyiz.
Çalışmamız solid tümörler ile hematolojik malignitelerin belirli gen mutasyonlarının (BRCA1, BRCA2, KMT2A) varlığında aynı hastada ortaya çıkabileceğini gösterdi. Ayrıca herhangi bir tümör nedeniyle Kemoterapi almış hastalarda AML gelişebileceği izlendi. Bu sebeple bu yüksek riskli hasta popülasyonunun ortaya konmasının önemini bir kez daha vurgulamaktayız.
Yapılacak daha çok çalışma ile toplumumuza özgü genetik değişikliklerin ortaya konması, AML'nin ülkemizdeki profilinin tespiti, en verimli standart panelin oluşturulmasını sağlayacak; hem klinisyene tedavide yol gösterici olacak, hem de tanıda öncelikleri belirlemede önemli katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Acute Myeloid Leukemia (AML) is a hematological malignancy characterized by the accumulation of abnormal blasts in the bone marrow originating from hematopoietic progenitor cells. Blocking the differentiation of hematopoietic stem cells results in the accumulation of immature myeloid precursors. AML is a genomically heterogeneous disease characterized by a series of recurrent mutations that drive the disease phenotype, response to therapy, and the risk of relapse. AML is the most common acute leukemia in adults. Its incidence may differ with gender and race.
Despite the progress in understanding the mechanisms of leukemogenesis and the improvement in treatment; only about 40% of adults with AML achieve long-term survival.
Molecular methods have developed rapidly recently. It is mandatory to identify subsets of patients with different clinical and biological characteristics suitable for molecularly targeted therapies. The necessity of using limited tissue samples for both diagnostic and therapeutic tests has necessitated the transition to a New Generation Sequencing (NGS) system in which multiple gene panels can be studied.
The study included 99 patients who were diagnosed with AML in bone marrow biopsy materials examined at the Department of Medical Pathology of Aydın Adnan Menderes University Faculty of Medicine between 2018 - 2020 and whose studied comprehensive myeloid cancer panel with NGS in the molecular pathology unit. 
Pathogenic and likely pathogenic mutations seen in AML patients were examined in the comprehensive panel. CD34, FLT3, CD123 and p53 immunohistochemical stains were applied to 47 of 99 patients in our study. The relationship between the clinical (age, sex, vitality, life expectancy, hemoglobin, leukocyte, and platelet counts data of the patients and the genes detected by NGS and immunohistochemical parameters were evaluated.
As a result of statistical analyzes, it was found that the mortality rate was significantly higher in both women and men over the age of 60. The mean age was statistically significantly younger in patients with ANKRD26, KMT2A, MSH6, KCNA4, NOTCH1 gene mutations. The average age of patients with RUNX1 gene mutation was significantly higher than those without mutations.
In patients with ANKRD26, BRCA2, CEBPA gene mutations, statistically significant leukocyte values were above 100 000 at the time of diagnosis. MYC, KMT2A, KCNA4, NOTCH1 gene mutations were found to be associated with statistically significantly higher leukocyte counts. KMT2A gene mutation was found to be statistically significantly associated with lower hemoglobin and platelet counts. The platelet value was statistically significantly lower than 100 000 in patients with a MYC gene mutation. NRAS mutation was found to be statistically significantly associated with lower hemoglobin value.
In patients who have KMT2A, MYC gene mutations and die; the average life expectancy was found to be statistically significantly longer than the patients who did not have gene mutations and died. Patients with the MSH6 gene mutation had a shorter average life expectancy than the patients who did not have gene mutation.
When immunohistochemically applied FLT3 dye and dead patients were examined, the average life expectancy of patients without FLT3 staining was 11 months; with FLT3 staining was decreased to five months. This showed that FLT3 positivity reduced the average life expectancy by half. No statistically significant correlation was found between all other genes, immunohistochemical findings and clinicopathological parameters.
NPM1, FLT3 and TP53 mutations were detected at lower rates in Turkish patients compared to the literature; ASXL1, MSH6, BRCA2, MYC and PTEN mutations were detected at a higher rate than the literature. It was thought that more consideration of mutations detected at different rates from world data in diagnosis and treatment would contribute to the success of treatment in AML patients in our country. FLT3-ITD type mutation which has worse prognosis is the most common type in the world data; TKD type was more common in our study.
We believe that it is important to detect the mutation status at the time of diagnosis in order to protect patients with a favorable prognosis from unnecessary intensive therapy and to receive targeted specific treatment.
Our study showed that solid tumors and hematological malignancies can occur in the same patient in the presence of certain gene mutations (BRCA1, BRCA2, KMT2A). It was also observed that AML could develop in patients who received chemotherapy due to any tumor. For this reason, we emphasize once again the importance of revealing this high-risk patient population.
With more studies to be done, revealing the genetic changes specific to our society, determining the profile of AML in our country, will enable the creation of the most effective standard panel; it will both guide the clinician in treatment and make an important contribution to determining priorities in diagnosis.