HbF veya HbA2 anormalliği olan bireylerde Kruppel-like factor 1 ve Hemoglobin subunit delta genlerindeki mutasyonların genotip-fenotip ilişkisinin incelenmesi
Investigation of the genotype-fenotype relationship between the mutations of Kruppel-like factor 1 and Hemoglobin subunit delta genes in patients with HbF or HbA2 abnormalities
Yazar: TANER KARAKAYA
Danışman: PROF. DR. ÖZTÜRK ÖZDEMİR
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Genetik = Genetics ; Hematoloji = Hematology
Dizin: Elektroforez = Electrophoresis ; Fenotip = Phenotype ; Fetal hemoglobin = Fetal hemoglobin ; Genler = Genes ; Genotip = Genotype ; Hemoglobin A2 = Hemoglobin A2 ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Mutasyon = Mutation ; Talasemi = Thalassemia

Özet:
GİRİŞ ve AMAÇ: Hemoglobinopatiler; hemoglobin proteininin biyokimyasal yapısını oluşturan globin zincirlerinden herhangi birisinin yapısının ya da sentezinin bozulduğu, tek gen hastalıklarının en sık görülenidir. Hemoglobinopatilerden birisi olan β-talasemi; β-globin zincir sentezinin yetersiz ya da olmaması ile karakterize, Türkiye'nin de içerisinde bulunduğu Akdeniz ülkelerinde sık görülen önemli bir halk sağlığı sorunudur. Dolayısıyla talasemi prevalansının yüksek olduğu bölgelerde talasemi önleme programlarının yürütülmesi oldukça önemlidir. Talasemi taramasında günümüzde ilk basamak yaklaşım; olguların tam kan sayımı analizlerinin yapılması, hematolojik parametrelerinde anormallik saptananların (örneğin; hipokromi, mikrositik anemi, eritrositoz gibi) ise takiben otomatize HPLC ya da kapiller elektroforez cihazı ile hemoglobin fraksiyonlarının analiz edilmesinden oluşur. 
     Talasemi taşıyıcılığı tespitinde hemoglobin elektroforezinin yeri çok önemli olmakla birlikte pek çok klinik durumda ölçülen HbF ve HbA2 seviyelerinin değişiklik gösterdiği ve mevcut klinik durumla bu hemoglobin fraksiyon seviyelerinin uyumsuz olduğu rapor edilmiştir. HbA2 seviyesini düşüren bu klinik sebeplerden bir tanesi de δ-globin (HBD) gen değişiklikleridir. HBD genindeki mutasyonların herhangi bir klinik şikayet ya da hematolojik bulgu oluşturduğu bildirilmemiştir; ancak HbA2 seviyesini düşürerek β-talasemi taşıyıcılarında yanlış tanılara sebep olabilmektedir. Ayrıca demir eksikliği anemisi ya da α-talasemi taşıyıcılığı gibi düşük HbA2 seviyesine neden olan durumların yanında HBD genindeki mutasyonların da sorumlu olduğu bilinmektedir. 
     HbF ve HbA2 seviyeleri üzerine etkisi olan genlerden bir diğeri de Kruppel-like factor 1 (KLF1) genidir. KLF1 genindeki mutasyonların persiste HbF yüksekliği ya da β-talasemi minör fenotipinden sorumlu olduğunu bildiren çalışmalar mevcuttur. Özellikle borderline seviyede HbA2 yüksekliği olan bireylerde HBB geni intakt ise mutlaka KLF1 geninin analiz edilmesi önerilmektedir. 
     Mevcut araştırmada, HPLC sonrası HbF yüksekliği ya da HbA2 seviyesi anormalliği bulunan olgularda KLF1 ya da HBD genlerinin olası bir rolünün olup olmadığının ortaya konması amaçlanmıştır.
 
GEREÇ ve YÖNTEM: Araştırma Mart 2013-Ağustos 2018 yılları arası Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Genetik Tanı ve Tedavi Merkezine HBB geni analizi için başvurmuş toplam 100 kişi ile yürütülmüştür. Olgu grubu 20'şer kişiden oluşan dört alt gruba ayrılmıştır; HPLC ile yapılan hemoglobin elektroforezinde yalnızca HbF yüksekliği saptananlar Grup A, yalnızca borderline HbA2 yüksekliği saptananlar Grup B, yalnızca borderline seviyesi üzerinde HbA2 yüksekliği saptananlar Grup C ve yalnızca HbA2 düşüklüğü saptananlar Grup D olarak tanımlanmıştır Araştırmada kontol grubu olarak kendisinde ve/veya birinci derece akrabalarında talasemi öyküsü olmayan sağlıklı toplam 20 kişiye ait laboratuarımızda mevcut olan DNA örnekleri kullanılmıştır. Araştırmaya dahil edilen olgu ve kontrol bireylerine ait toplam 100 adet DNA örneği kullanılarak hedef KLF1 ve HBD genleri analiz edilmiş ve karşılaştırılmıştır. Bunun için, hedef her bir gen için spesifik primer çifti kullanılarak PCR ürünleri çağaltılmış ve bu ürünler sanger dizi analizi yöntemiyle dizilenerek mutasyon analizleri yapılmıştır. Genlere ait elde edilen baz profilleri yardımcı software programlar yardımıyla değerlendirilmiştir.

BULGULAR: Araştırma sonunda elde edilen veriler KLF1 geni açısından değerlendirildiğinde; çalışılan olgu grubu bireylerin 43'ünde (%53,75; n=80) KLF1 geninde mutasyon saptanırken (4 olguda KLF1 geninde iki mutasyon birlikte saptanmıştır), 37'sinin (%46,25) normal yapıda oldukları ortaya konmuştur. Olgu grubunda saptanan beş farklı nokta mutasyon sırasıyla 41 kişide S102P mutasyonu (36'sı heterozigot, 5'i homozigot), bir olguda M39L heterozigot mutasyonu, bir olguda P109S heterozigot mutasyonu, üç olguda F182L heterozigot mutasyonu ve bir olguda R268L heterozigot mutasyonudur. Kontrol grubunda altı kişide S102P heterozigot mutasyonu (%30; n=20) ve bir kişide P109S heterozigot mutasyonu (%5) saptanmıştır. Araştırma sonunda elde edilen veriler HBD geni açısından değerlendirildiğinde; Olgu grubunda 19 olguda (%23,75; n=80) dört farklı varyasyon tespit edilmiş; bunların üçü daha önce literatürde tanımlanmıştır [(12 olguda (%15; n=80) HbA2-Yialousa, beş olguda (%6,25) HbA2-Bornova ve bir olguda (%1,25) HbA2-Yokoshima)]. Araştırmamız kapsamında çalışılan olgulardan sadece birisinde saptanan "Delta 10(A7) Ala-->Val; HBD:c.32C>T" nokta mutasyonu ilk kez bu araştırmada tanımlanmıştır. HBD geninde mutasyon sadece Grup D olgu grubunda saptanmıştır.
 
TARTIŞMA ve SONUÇ: β-talasemi taşıyıcılığı nedeniyle tanısal yükselmesi beklenen HbA2 seviyesi; δ-talasemi nedeniyle normal sınırlara inebilmekte ve bu bireylerin β-talasemi taşıyıcısı olduğu bilenen başka bir bireyle evliliği sonrası β-talasemi majorlu çocukları doğabilmektedir. Normal HbA2 piki nedeniyle göz ardı edilen; ileri değerlendirmeye yönlendirilmeyen bireylerin δβ-talasemi olabileceği unutulmamalıdır. Hb elektroforez sonucu normal sınırlarda olsa bile β-talasemi taşıyıcılığı saptanmış bireylerin partnerleri mutlaka DNA analiz yöntemleri ile β-talasemi taşıyıcılığı açısından değerlendirilmelidir ve eşlik edebilecek δ-talasemi açısından mutlaka HBD geni genotiplendirmesi akılda tutulmalıdır. Nitekim sınırlı sayıda olgunun dahil edildiği mevcut araştırma sonucuna göre elektroforez profilleri anormal olan şüpheli olgularda çalışılan iki gen açısından kayda değer oranda nokta mutasyonların eşlik ettiği ortaya konmuştur. Mevcut araştırmada olguların %53,75'inde KLF1 geninde ve %23,75'inde HBD genininde mutasyon saptanmıştır. Bulgularımız literatürdeki diğer araştırma sonuçları ile benzerlik göstermektedir.
     Borderline seviyede HbA2 seviyesine sahip olan kişiler de mutlaka ayrıntılı olarak değerlendirilmelidir. Nütrisyonel eksikliklerin, sessiz β-talasemi mutasyonlarının, β-talasemi taşıyıcılığı ile δ-talasemi birlikteliğinin, α-gen triplikasyonu/kuadriplikasyonunun yanında KLF1 gen mutasyonlarının da borderline seviyede HbA2 seviyesine neden olabileceği unutulmamalıdır. MCV ve MCH değerleri normal ya da hafif düşük olgularda görülebilen HbF yüksekliği ya da borderline seviyede HbA2 yüksekliği KLF1 genindeki mutasyondan kaynaklanıyor olabilir; ya da fenotipik olarak tipik talasemi minör ile uyumlu bulguları olan ancak HBB geninin intakt olarak saptandığı olgularda mutlaka KLF1 genotiplendirmesi de akılda tutulmalıdır. 
     Mevcut araştırma sonucunda saptanan HBD:c.32C>T mutasyonu yeni bir hemoglobin HbA2 varyantı olarak değerlendirilmiş ve HbA2-Canakkale ismiyle literatüre kazandırılmıştır. Varyantın "HbVar" veritabanına eklenmesi ve ilgili mutasyonun görüldüğü tek nükleotid polimorfizminin (referans SNP) "rs" numarası alması hedeflenmiştir. Araştırmamız ayrıca, bilindiği kadarıyla, HbA2-Bornova varyantına sahip olgulardan oluşmuş bir serinin (n=5) sunulduğu ilk çalışmadır. Yine araştırmamız KLF1 geni mutasyonları ile HbA2 seviyesi arasındaki ilişkiyi değerlendiren Türkiye'deki ilk çalışma olması özelliğini de taşımaktadır. 
     Türkiye'de KLF1 ve HBD genleri ile ilgili çalışmalar, bilindiği kadarıyla, oldukça azdır. Genotipik çeşitlilik açısından eşsiz bir yelpazeye sahip olan ülkemizde bu genlerle ilgili bilgi ve tecrübelerimiz arttıkça literatüre daha önce girmemiş varyantların ve fenotipik etkilerinin ortaya konulmasının da önü bu şekilde açılmış olacaktır. Sonuç olarak, hemoglobin elektroforez anormalliklerinin moleküler etyolojik sebepleri araştırılırken KLF1 ve HBD gibi globin proteini üreten ya da üretimi üzerinde etkisi bulunan diğer alternatif genlerin olası varyasyonlar açısından genotiplendirilmesinin kesin tanı açısından önemli olduğu önerilmiştir.

Abstract:
INTRODUCTION and AIM: Hemoglobinopathies are the most common single-gene disorders, which the structure or synthesis of the any globin chains that design the biochemical structure of hemoglobin protein is impaired. β-thalassemia, one of the hemoglobinopathies, is characterized by inadequate or lack of globin chain synthesis and poses a significant public health burden in Turkey as being one of the Mediterranean countries. Thus, it is very substantial to conduct thalassemia prevention programs in regions where the prevalence of thalassemia is high. The first step approach in the screening of thalassemia comprimises complete blood count analysis of the cases and then followed by analysis of hemoglobin fractions with an automated HPLC or capillary electrophoresis device for those with abnormalities in hematologic parameters (e.g. hypochromia, microcytic anemia, erythrocytosis).
	The role of hemoglobin electrophoresis in the detection of thalassemia trait is very important but HbF and HbA2 levels measured in many clinical conditions have been reported to vary and these hemoglobin fraction levels are incompatible with the current clinical condition. One of the clinical manifestations that decrease HbA2 level is δ-globin gene (HBD) mutations. Mutations in the HBD gene have not been reported as having any clinical consequences or hematological findings; but, it may lead to misdiagnose the β-thalassemia carriers by decreasing HbA2 levels. It is also known that mutations in the HBD gene are also responsible for low levels of HbA2, such as also due to iron deficiency anemia or α-thalassemia trait.
        Another gene that affects HbF and HbA2 levels is the Kruppel-like factor 1 (KLF1) gene. There are studies implicating that mutations in the KLF1 gene are responsible for hereditary persistence HbF or β-thalassemia minor phenotype. Especially in individuals with borderline HbA2 levels, it is recommended to analyze the KLF1 gene if HBB gene is intact.
	In the present study, it was aimed to determine whether KLF1 or HBD genes have a possible role in patients with HbF elevation or HbA2 level abnormalities performed by HPLC.

MATERIALS and METHODS: The study was conducted between March 2013-August 2018 with 100 subjects who were referred for the HBB gene analysis in Canakkale Onsekiz Mart University Medical Faculty Hospital Genetic Diagnosis and Treatment Center. The case group was divided into four sub-groups of 20 individuals. In hemoglobin electrophoresis performed by HPLC, only those with high HbF levels were identified as Group A, only those with borderline HbA2 levels were defined as Group B, only those with HbA2 levels above the borderline level were identified as Group C and only those with low HbA2 levels were identified as Group D. DNA samples present in our laboratory belonging to 20 healthy individuals who have and/or first degree relatives have no history of thalassemia are used as control group for the study. A total of 100 DNA samples from patient and control subjects recruited in the study were analyzed for target KLF1 and HBD genes and compared. For this purpose, PCR products were used by using specific primer pair for each gene and these products were sequenced by sanger sequence analysis and mutation analyzes were performed. The base profiles obtained from genes were evaluated with the help of analysis softwares.

RESULTS: The data obtained at the end of the study were evaluated in terms of the KLF1 gene; mutations in the KLF1 gene were detected in 43 subjects (two mutations both were detected in four cases) (53,75%; n=80) and 37 subjects (46,25%) were found to be normal. As KLF1 gene mutations in the case groups, five different point mutations were detected; S102P mutation in 41 subjects (36 heterozygous, 5 homozygous), M39L heterozygous mutation in one case, P109S heterozygous mutation in one case, F182L heterozygous mutation in three cases, and R268L heterozygous mutation in one case were found respectively. In control group, S102P heterozygous mutation in six individuals (%30; n=20) and P109S heterozygous mutation in one individual (%5) were detected. As HBD gene mutations; four different variations were detected in 19 cases (%23,75; n=80). Three of these were previously described in the literature (HbA2-Yialousa in 12 cases (%15; n=80), HbA2-Bornova in five cases (%6,25), and HbA2-Yokoshima in one case (%1,25)). "Delta 10(A7) Ala-->Val; HBD:c.32C>T" mutation described in only one of the cases was determined in this study for the first time. Mutations in the HBD gene was found only in Group D.

DISCUSSION and CONCLUSION: The level of HbA2, which is expected to be elevated due to β-thalassemia trait, may fall into normal limits because of coexistence of δ-thalassemia, and children with β-thalassemia major may be born after a marriage with another person who is known to be a carrier of β-thalassemia. It should be kept in mind that individuals who are ignored and are not directed to the further evaluation due to normal HbA2 levels may have δβ-thalassemia. Even if the hemoglobin electrophoresis result is within normal limits, partners of individuals known to be β-thalassemia trait should be necessarily evaluated in terms of the carrier of β-thalassemia by DNA analysis methods and should be noted HBD gene genotyping in case of δ-thalassemia coexistence. As a matter of fact, according to the results of the current study, where a limited number of patients were included, it was revealed that significant numbers of point mutations observed in the two target genes with suspected cases of abnormal electrophoresis profiles. In the present study, 53,75% of the subjects had a mutation in the KLF1 gene and of 23.75% had in HBD gene. Our findings are similar to those of other studies in the literature.
        Individuals with borderline HbA2 levels should also be considered in detail. It should be kept in mind that nutritional deficiencies, silent β-thalassemia mutations, coexistence of β-thalassemia trait and δ-thalassemia, α-gene triplication/quadruplication as well as KLF1 gene mutations may cause borderline HbA2 levels. In cases having normal or slightly low MCV and MCH values with high HbF or borderline HbA2 level or in cases with phenotypic findings consistent with thalassemia minor but in which HBB gene is detected intact may be caused by mutations in the KLF1 gene.
	The "HBD:c.32C>T" mutation detected as a result of the present study is evaluated as a new hemoglobin HbA2 variant and is introduced to the literature under the name of HbA2-Canakkale. It is also aimed to be deposited to the "HbVar" database and to get a new "rs number" of that single nucleotide polymorphism (SNP). Our study is also, to the best of our knowledge, the first study in which a series of cases with HbA2-Bornova (n=5) is presented. Our study also bears the distinction of being the first study in Turkey by evaluating the relationship between KLF1 gene mutations and HbA2 levels.

	Studies with KLF1 and HBD genes in Turkey, as far as is known, is quite limited. As our knowledge and experience on these genes increase in our country, which has a unique spectrum in terms of genotypic diversity, it will be opened in such a way to reveal the new variants of these genes that have not entered the literature before and their phenotypic effects. In conclusion, the molecular etiology of hemoglobin electrophoresis abnormalities has been suggested to be important in terms of definitive diagnosis of genotyping of variants, such as in KLF1 and HBD genes which are essential in producing globin proteins or controlling the process of globin synthesis.