Sıçan insülinoma beta-hücrelerinde (INS-1) 4-metilkatekol'ün etkileri
The effects of 4-methylcatechol in rat insulinoma beta-cells (INS-1)
Yazar: AYŞE KARATUĞ
Danışman: PROF. DR. ŞEHNAZ BOLKENT
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
İnsülinoma, pankreasın endokrin kısmını oluşturan Langerhans adacıklarının beta hücrelerinden kaynaklanan ve insülin salgılayan bir tümördür. Sağlıklı bireylerde artan kan glukozunu düşürmek için beta hücrelerinden insülin salgılanır. Kan glukozu homeostaza ulaşınca inhibe edici bir mekanizma insülinin fazla salınımını durdurur. Oysa, bu mekanizma insülinoma da insülin salınımını düzenlemez ve insülinomalar insülin salınımına devam eder. 3, 4-dihidroksitoluen olarak da bilinen 4-metilkatekol bir katekolamin türevidir ve reaktif oksijen türlerini üreterek sitotoksik etkisini gösterdiği bilinmektedir. Çalışmanın amacı sıçan insülinoma β-hücrelerine (INS-1) uygulanan 4-metilkatekol'ün hücre ölümüne neden olan dozlarının belirlenerek, bu dozlarda hücrelerin hangi ölüm tipi ile öldüğünü ve meydana gelen hücre ölümünün moleküler mekanizmasını araştırmaktır. 
Çalışmada insülinoma INS-1 hücre soyu kullanılmıştır. Hücre ölümünün olduğu dozlarda hücrenin erken apoptoz, geç apoptoz ve nekroz ölüm tiplerinden hangisi ile hangi oranda öldüğünü belirlemek için hücreler akridin oranj/etidyum bromür ile işaretlenerek floresan mikroskobunda görüntülenmiştir. Apoptoz kiti kullanılarak bu dozlardaki apoptoz oranı ve sitotoksisite kiti kullanılarak da nekroz oranı spektrofotometrik olarak hesaplanmıştır. Reaktif oksijen türlerini diklorofloressin diasetat ile, mitokondri membran potansiyel kaybı ise 3,3′-diheksiloksakarbosiyanin iyodit ile hücrelerin inkübasyonu sonucu spektrofotometrik olarak gösterilmiştir. Hücre içi ATP ve GTP azalması yüksek performanslı likit kromotografisi ile belirlenmiştir. Hücre içi ve sekresyonundaki insülin miktarı insülin ELISA kiti kullanılarak hesaplanmıştır. Ekzojen verilen 4-metilkatekol sonucu hücreleri ölüme götüren dozlarda JNK/ERK hücre sinyal yolağı incelenmiştir. Hem aktif hem de total JNK ve ERK miktarları ELISA yöntemi ile gösterilmiştir. Hücre içinde MAPK yolağında fonksiyonel olan p-RAF1, hem aktif hem total Elk1, c-Jun ve ATF2 transkripsiyon faktörleri, ısı şok proteinlerinden Hsp 70, Hsp 90, hem hücre içi hem de hücre sekresyonunda Betasellülin ve inhibin beta-A miktarları western blot yöntemi ile gösterilmiştir. Protein seviyeleri belirlenen moleküllerin ekpresyon dereceleri q-RT-PCR ile elde edilen Ct değerlerinden hesaplanmıştır. 
INS-1 hücrelerinde 4-metilkatekol'ün 250-450 µM arasındaki dozlarında hücre ölümünün olduğu gözlenmiştir. Belirlenen dozlarda apoptoz ile meydana gelen hücre ölümünün kontrol grubuna göre anlamlı bir artış gösterdiği hesaplanmıştır. 350, 400 ve 450 µM 4-metilkatekol verilmesi ile apoptoza kıyasla daha yüksek oranda nekrotik hücre ölümü gözlenmiştir. Bu dozlarda laktat dehidrogenaz değerlerinde, reaktif oksijen türlerinde ve mitokondri membran potansiyel kaybında artış gözlenmiştir. ATP ve GTP azalması da bulgularımızı desteklemektedir. 
JNK ve ERK hücre sinyal yolağına bakıldığı zaman ise, 4-metilkatekol verilmesi ile belirlenen dozlarda kontrol grubuna göre p-RAF1 aktivitesinde artma, ekspresyonunda azalma, total JNK miktarında azalma, aktif JNK miktarınında artma, ekpresyonunda azalma, total c-Jun miktarında artma bulunurken, aktif c-Jun miktarında ve ekspresyonunda değişiklik bulunmamıştır. Total ATF2 ve aktif ATF2 miktarlarında herhangi bir değişiklik gözlenmezken, ekpresyonunda azalma gözlenmiştir. Total ERK miktarı değişmezken, aktif ERK'da ve ekpresyonunda azalma görülmüştür. Total Elk1 ve aktif Elk1 miktarlarında değişiklik olmamıştır, ancak Elk1 ekspresyonunda azalma bulunmuştur. Isı şok proteinlerinden Hsp 70 ve Hsp 90 miktarlarında ve ekpresyonlarında gruplar arasında değişiklik bulunmamıştır. Betasellülin hem hücre içinde ve sekresyonda hem de ekpresyonda azalma göstermiştir. İnhibin beta A'nın ise hücre içi ve sekresyonda değişiklik görülmezken, ekspresyonda azalma dikkati çekmiştir. 
Hücre içi insülin miktarında gruplar arasında fark gözlenmezken, Ins1 ekspresyonunda azalma görülmüştür. 4-metilkatekol'ün artan dozlarında düşük doz glukoz verilmesi ile insülin sekresyonu artarken, yüksek doz glukoz verilmesi sonucu gruplar arasında herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. Ayrıca GLUT2 ekspresyonunda azalma bulunmuştur.
Sonuç olarak, 250-450 µM dozlarda 4-metilkatekol'ün insülinoma INS-1 hücrelerine uygulanması ile hücre ölümü gerçekleşmektedir. 350, 400 ve 450 µM 4-metilkatekol verilmesi ile hücreler apoptoza oranla daha fazla olarak nekrotik ölüme gitmektedir. Hücrelerin bu nekrotik hücre ölümünü, i) fosforile olan RAF1 ve transkripsiyon faktörü c-Jun ile JNK yolağının aktif hale gelmesi, ii) Hsp 70 ve Hsp 90'nın hücre içerisinde herhangi bir değişiklik göstermeyerek, JNK yolağınının aktif halde kalması sonucunda gerçekleştirdiğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Insülinoma is a tumor originating from the beta cells of the Langerhans islets, which form the endocrine part of the pancreas and secretes insulin. In healthy individuals, insulin is secreted from the beta cells in order to decrease the increased blood glucose. When the blood glucose reaches homeostasis, an inhibitory mechanism stops the excessive secretion of insulin. However, insulin secretion could not be regulated by this mechanism in insülinoma and insülinomas continue insulin secrection. 4-methylcatechol, which is also known as 3,4-dihydroxytoluene, is a catecholamine derivative and it is known that it show a cytotoxic effect by generating reactive oxygen species. The aim of this study was to determine the doses of 4-methylcatechol that caused cell death in rat insülinoma  β-cells (INS-1), to find out the type of cellular death at these doses, and to investigate the molecular mechanism of cellular death occurred. 
In this study, we have used INS-1 cell line. In order to determine the death rate of the cell along with what type of death (early apoptosis, later apoptosis, and necrosis) occurred at the doses causing cellular death, the cells were marked with acridine orange/ethidium bromide and visualized under fluorescent microscope. Under these doses, the apoptosis rate with apoptose kit and necrosis rate with cytotoxicity kit were measured as spectrophotometric method. Reactive oxygen species were shown by using dichlorofluorescein diacetate and mitochondrial membrane potential loss was indicated with 3,3'-dihexyloxycarbocyanine iodide, both spectrophotometric method, as a result of incubation of the cells. High-performance liquid chromatography was used to determine the intracellular ATP and GTP decrease. The amount of insulin in the cell and the secretion were calculated by using insulin ELISA kit. The JNK/ERK cellular pathway was investigated at the cell death-causing doses after exogeneously administered 4-methylcatechol. Both active and total JNK and ERK amounts were shown with the ELISA method. In the MAPK pathway, functional p-RAF1, both active and total Elk1, c-Jun and ATF2 transcription factors, heat shock proteins (Hsp 70 and Hsp 90) were shown in the cell. Betacellulin and inhibin beta-A amounts were shown in both the cell and the secretion with western blot method. Expression levels of the molecules that determined the protein levels were calculated from the Ct values obtained with q-RT-PCR method. 
It was shown that cellular death was observed in between 250-450 µM doses of 4-methycatechol in INS-1 cells. We calculated that there was a significant increase of apoptotic cell death at determined doses compared to control group. It was observated more necrotic cells than apoptosis with administration of 350, 400, and 450 µM 4-methylcatechol. Lactate dehydrogenase levels, reactive oxygen species, and mitochondrial potential loss were increased at these doses. Our findings were supported by ATP and GTP losses.
When JNK and ERK cellular pathway were screened, an increase in p-RAF1 activity, a decrease in its expression, a decrease in the total JNK amount, an increase in active JNK amount, a decrease in its expression, an increase in total c-Jun amount were found, but no change in active c-Jun amount and its expression were observed by 4-methylcatechol administration when compared to control group at determinated doses. Total ATF2 and active ATF2 amounts did not lead to any change, but there was a decrease in its expression. Total ERK amount did not change, but active ERK and its expression did decrease. There was no change in total Elk1 and active Elk1 amounts, but it was found a decrease in Elk1 expression. The amounts of Hsp 70 and Hsp 90 from heat shock proteins their expressions were not found a change in between the groups. Betacellulin was decreased in the cell, the secretion and its expression. Inhibin beta A did not lead to a change in the cell and the secretion, while a decrease in its expression was noticed. 
Intracellular insulin amount did not change significantly in between the groups, but Ins1 expression showed a decrease. Insulin secrection increased with giving a low dose of glucose in increasing doses of 4-methylcatechol, whereas there was no difference in between the groups with giving a high dose of glucose. In addition, a decrease was observed in GLUT2 expression.
As a result, cellular death occurred when 4-methylcatechol was applied to insülinoma INS-1 cells at 250-450 µM doses. Giving 350, 400, and 450 µM 4-methylcatechol led to more necrotic death of the cells. We concluded that cells perform necrotic death by the following options: i) phosphorylated RAF1 activates the JNK pathway with the activity of transcription factor c-Jun, ii) Hsp 70 and Hsp 90 did not show a change inside the cell, rendering the JNK pathway active.