Serumda hepatit B virus DNA kantitasyonu için ?real-time? PCR testi geliştirilmesi
Developing a Real-Time PCR assay to determine the Hepatitis B virus DNA in serum
Yazar: GÜNEŞ ÖZÇOLPAN
Danışman: PROF. DR. AYÇA ARZU SAYINER
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2009
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Hepatit B virusu, dünyada iki milyar kişinin karşılaştığı, bunların 400 milyonunda kronik enfeksiyona yol açmış önemli bir enfeksiyon etkenidir. Ülkemiz, ortalama %5'lik (bölgelere göre %1 - 14,3 arasında değişmektedir) HBsAg pozitifliği ile orta endemisite ülkeleri arasında yer almaktadır.HBV infeksiyonunun virolojik tanısı ve izlenmesi, özgül antikorların, antijenlerin ve nükleik asidin saptanması ve nükleik asitin kantitasyonu ile yapılmaktadır. HBV DNA'nın kanda gösterilmesi aktif HBV infeksiyonunun güvenilir bir göstergesidir ve infeksiyon tanısında, evrelendirilmesinde, tedaviye karar vermede ve tedavi başarısının izlenmesinde önemli rol oynamaktadır. HBV DNA, HBsAg'den 3-5 hafta önce kanda saptanabildiği için erken tanıda önemli bir parametredir ve kan bankacılığında, donor taramasında kullanımı gündeme gelmiştir.Günümüzde HBV DNA saptamada, sıklıkla, nükleik asit amplifikasyon testlerinden olan PZT esaslı testler kullanılmaktadır. Kalitatif konvansiyonel PZT testlerine bakıldığında, duyarlılıklarının yüksek olması, tekrarlanabilirliklerinin düşük olması, ?carryover? kontaminasyon oranlarının yüksek olması gibi nedenlerle kullanımları sınırlıdır. Gerçek zamanlı PZT yönteminde amplifikasyon sırasında saptama yapıldığından kontaminasyon riski, klasik PZT yöntemine göre daha azdır. Ayrıca amplifikasyon sırasında her döngüde prob sinyali ölçülerek, eşik değeri aşan döngüye (ct) göre kantitatif değer belirlendiğinden, gerçek zamanlı PZT yöntemiyle, klasik PZT yöntemine göre daha doğru kantitatif sonuçlar elde edilebilmektedir. Dinamik aralığının geniş olması da gerçek zamanlı PZT yönteminin avantajlı yönlerindendir. Böylece kanda geniş bir aralıkta saptanabilen HBV DNA'nın (> 9 logaritma) takibi yapılabilmektedir.Bu çalışmada, rutin hasta hizmetinde kullanılabilecek, maliyeti ticari testlerden daha düşük, gerçek zamanlı PZT yöntemiyle HBV DNA kantitasyonu yapabilen, internal kontrol içeren, tüm HBV genotiplerini saptayabilen ve ticari kitlerin performansına sahip bir test geliştirilmesi hedeflenmiştir.Çalışmamızda internal kontrol olarak, insanlarda enfeksiyon yapmayan, zarflı bir DNA virusu olan, hücre kültüründe üretilmiş bovin herpes virus tip 1 (BHV-1) kullanılmış ve örneğe ekstraksiyondan önce eklenmiştir. Böylece yalancı negatifliğe yol açabilecek ekstraksiyon ve amplifikasyon basamaklarındaki sorunlar izlenebilmiştir.Standart olarak kullanılmak üzere, tez primerleriyle elde edilen ürünü taşıyan plazmid oluşturulmuş ve Escherichiae coli' de çoğaltılmıştır. Absolü kantitasyon yöntemi kullanılan testte, her çalışmaya alınan beş adet plazmid dilüsyonu ile elde edilen standart eğri kullanılmıştır.Yeni testin dinamik aralığı 5x101 - 5x1010 IU/ml ve en düşük saptama sınırı 48 IU/ml (32 ? 129) olarak saptanmıştır. Bu parametreler, HBV infeksiyonu tanısı ve izlemi için uygun bulunmuştur.Testin tekrarlanabilirliği sonuçların güvenilirliği ve hasta izleminde anlam ifade edecek değişiklik miktarının belirlenmesinde önemlidir. Ct değerleri üzerinden yapılan değerlendirmede, yeni testte % CV değerleri, test içi değerlendirmede % 0,7 - % 4,1; testler arası değerlendirmede % 0,3 - % 1,9 olarak saptanmıştır. Bu değerler ticari testlerle karşılaştırıldığında kabul edilebilir sınırlar içindedir.A, B, C, D, E, G genotiplerini içeren genotip panelindeki tüm örnekler yeni testle saptanmıştır. Ancak genotip B ve C içeren panel üyelerinde beklenen değerin yaklaşık iki logaritma altında kantitatif sonuçlar elde edilmiştir. Bu sorunun nedeni tez süresi sonlandığından aydınlatılamamıştır. Ülkemizdeki çalışmalarda sadece genotip D saptanmaktadır. Bu nedenle yeni testin genotip B ve C'deki kısmi kantitasyon sorununun rutin hizmette soruna yol açmayacağı varsayılabilir.Doğruluk çalışmasında 2007 HBV DNA dış kalite kontrol panelinin (QCMD, İngiltere) yeni testle çalışılması ile elde edilen sonuçlar, beklenen değerlerle uyumlu olarak saptanmıştır (R2 = 0.92).Ticari testle HBV DNA pozitif saptanan 180 adet, HBV DNA negatif saptanan 80 adet plazma örneği yeni testle de çalışılmıştır ve her iki test arasındaki uyum değerlendirilmiştir. Kalitatif değerlendirmede, ticari test altın standart olarak alındığında yeni testin duyarlılığı % 99, özğüllüğü % 94 olarak saptanmıştır. Her iki testle de HBV DNA pozitif saptanan örneklerde iki testin uyumu lineer regresyon analizi ile değerlendirilmiş, aralarında güçlü ve anlamlı bir korelasyon olduğu saptanmıştır (r= 0.86, p=0.000, R2= 0.74).Yalancı pozitiflik olasılığını değerlendirmek için HCV RNA pozitif, HBsAg negatif 26 örnek yeni test ile çalışılmıştır. Tümü HBV DNA negatif saptanmıştır.Maliyet analizine göre yeni test, ticari teste göre, test başına 45 TL daha ucuzdur. Laboratuvarımızda yılda yaklaşık 1500 HBV DNA testi yapıldığı göz önüne alındığında, yeni testin rutinde kullanılması durumunda elde edilecek yararın yaklaşık 67500 TL/yıl olacağı hesaplanmıştır.Sonuç olarak, gerçek zamanlı PZT yöntemini kullanan, internal kontrol içeren kantitatif bir HBV DNA testi geliştirilmiştir. Testin duyarlılık, özgüllük, tekrarlanabilirilik ve doğruluk çalışmalarında elde edilen başarılı sonuçlar ve taşıdığı maliyet avantajı, rutinde kullanıma uygun olduğunu göstermiştir.

Abstract:
Hepatitis B virus is an important infectious agent, infected two billion people worldwide and caused chronic infection in 400 millions. Turkey is one of the modereately endemic countries with an average HBsAg positivity rate of 5% (differs between 1 and 14,3 % according to the region).Virologic diagnosis and follow-up of HBV infection is made by the detection of specific antigens, antibodies and HBV DNA. Presence of HBV DNA in blood is a reliable indicator for active HBV infection and is an important marker for staging and managing the infection and following the sucess of the treatment. HBV DNA can be determined 3-5 weeks earlier than HBsAg in blood, therefore is useful for the early diagnosis and currently in use for screening of the donors in blood banksNucleic acid amplification assays using PCR method are frequently used for HBV DNA determination. There are some limitations of conventional qualitative PCR assays, such as high sensitivity, low reproducibility and high carryover contamination rates. Real-time PCR method has a lower contamination risk compared to classical PCR since the detection is performed during amplification. In addition, quantitative results of real time PCR is more accurate, because the quantification is made according to the number of the cycle in which the signal crosses the threshold (cycle threshold, ct) by measuring the probe signal in every cyclus during amplification. Therefore, real-time PCR has a wider dynamic range of quantification. These advantages make the real-time PCR method ideal tool for HBV DNA monitoring which fluctates over a wide dynamic range (> 9 logarithma).The aim of this study was to develop a quantitative real-time PCR assay for HBV DNA that can be used for routine patient management, with a performance similar to commercial assay but with a lower cost. The new assay is expected to have an internal control and to detect all six genotypes of HBV.An enveloped, cell cultured DNA virus, bovine herpes virus type 1 (BHV-1), which does not infect human, used as an internal control. Internal control added to the patient sample before the extraction in order to monitor the problems of both extraction and amplification steps.Plasmid standart carrying the amplicon was generated and transfected into Escherichiae coli. Absolute quantitation method was used by drawing a standart curve with five plasmid diluents in each run.Dynamic range of the developed HBV DNA assay was between 5x101 and 5x1010 IU/ml and the limit of detection was 48 IU/ml (between 32 and 129 IU/ml). These parameters were suitable for diagnosis and monitoring of the HBV infection.Reproducibility of the assay is important in order to determine the reliable differences in HBV DNA levels during the follow-up of the patients. Intra- and interassay CV% values of the developed assay were 0.7- 4.1% and 0.3 - 1.9%, respectively. These values were comparable to commercial assays.The developed assay was able to detect all the samples of a HBV genotyping panel, containing genotype A, B, C, D and G. However, quantitative results of the samples containing genotype B and C were approximately 2 log10 below the expected value. The cause of this variation could not be determined since primers and probes were designed to detect all the genotypes. It is unlikely that this quantitation problem of the developed assay will cause a major problem in the routine patient service, since D is the only genotype detected in Turkey to date.The accuracy of the new assay was tested with the QCMD - 2007 HBV DNA proficiency panel. Results were correlated with expected results (r2=0.92).The correlation of the developed assay and the commercial test used in the routine laboratory was evaluated by 180 HBV DNA positive and 80 HBV DNA negative plasma samples. The sensitivity and specificity were 99% and 94%, respectively, when the commercial assay was accepted as the gold standart. Quantitative results of the samples detected by two assays (178 samples) showed a strong and significant correlation (r=0.86, p=0.000, R2=0.74).No false positivity was detected by the new assay, when 26 HCV-RNA positive, HBsAg-negative samples were tested.Cost analysis showed that the new assay was 45 TL/test cheaper than the commercial assay. If the annual HBV DNA test number (approximately 1500) taken into account, the benefit would be 67500 TL/year, if the developed assay is used for the routine diagnostics.As a result, we developed a quantitative real-time PCR assay for HBV DNA. Sensitivity, specificity, reproducibility and accuracy of test results and cost benefit showed that it is convenient for routine use.