MikroRNA ve doğal öldürücü hücre (natural killer cell) temelli kombine immünoterapi yaklaşımının üçlü negatif meme kanseri üzerindeki etkisinin araştırılması
Studying of the effect of microRNA and natural killer cell based combined immunotherapy approach on triple negative breast cancer
Yazar: SELDA KARAMİL
Danışman: DOÇ. DR. NURAY ALTINTAŞ ; DOÇ. DR. BÜLENT ÖZPOLAT
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Katil hücreler-doğal = Killer cells-natural ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Mikro RNA = Micro RNA ; Mikro RNA = Micro RNA ; İmmünoterapi = Immunotherapy ; İmmünoterapi = Immunotherapy

Özet:
Amaç: Çalışmamızda üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hücrelerinde miR-3977 ile eEF2K, PD-L1 ve FOXM1 üçlü baskılanmasının tümörigenez üzerindeki etkisinin yanısıra, bu hücrelerdeki doğal öldürücü hücre (NK) aracılıklı immün yanıt etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 
Gereç ve Yöntem: Üçlü negatif meme kanseri hücreleri olarak MDA-MB-436, MDA-MB-231, BT-20 hücre hatları ve doğal öldürücü hücreler olarak kordon kanı doğal öldürücü hücreleri ve NK-92 hücre hattı grubu olarak kullanılacaktır. Tümörogenez çalışmaları için koloni oluşum analizleri, miRNA ve siRNA mimik transfeksiyonu, RNA ekstraksiyonu, miRNA ve mRNA ters transkripsiyonu, RT-qPCR analizi, protein ekstraksiyonu ve immünoblotlama analizi, hücre hareketliliği, migrasyon ve invazyon testleri, akım sitometri testi, miRNA nanoparçacıklarının hazırlanması, ortotopik ksenogreft tümör modeli ve istatistiksel analiz metotları kullanılacaktır. NK ayrıcalıklı immünoyanıtın belirlenmesi çalışmaları için ise Ko-kültür yöntemi uygulanarak Kromiyum (Cr51) analiz metotları kullanılacaktır.
Bulgular: Çalışmamızda miR-3977'nin rolü araştırılmış ve miR-3977'nin TNBC'de anlamlı derecede daha uzun hasta sağkalımı ile ilişkili olduğu ve anlamlı derecede daha kısa genel hasta sağkalımı ile ilişkili olan proto-onkojenik eEF2K seviyeleri ile ters korelasyonlu olduğu bulunmuştur. Sonuçlarımız miR-3977'nin eEF2K, PD-L1 ve FOXM1 mRNA'ların 3'-tercüme edilmemiş bölgesine (3'-UTR) doğrudan bağlandığını ve bu genlerin ekspresyonlarını baskılayarak TNBC'de hücre proliferasyonunu, motilitesini ve invazyonunu inhibe ettiğini göstermiştir. Ayrıca, miR-3977 nanopartiküllerinin sistemik intraperitoneal uygulama ile in vivo terapötik olarak verilmesi, eEF2K, PD-L1 and FOXM1 sinyal yolaklarını, intratümöral proliferasyonu ve anjiyogenezi inhibe ederek ve apoptozu indükleyerek ortotopik TNBC tümör ksenograft modelinde tümör büyümesini geciktirmiştir. Önemli bir şekilde, çalışmamızda ilk kez, eEF2K, PD-L1 veya FOXM1 inhibisyonunun NK-92 ve CBNK hücrelerinin sitotoksisitesini indüklediği, miR-3977 veya siRNA tedavilerinin NK aracılıklı immün sistem yanını arttırmada etkili olabileceği gösterilmiştir.
Sonuçlar: Çalışmamız, üçlü negatif meme kanseri hücrelerinde miR-3977 gen terapisi ile hem EF2K hem FOXM1 hem de programlanmış hücre ölüm (PD-L1) mekanizmalarının yeniden aktivasyonunu hem de bu hücrelere karşı aktive olmuş NK aracılıklı immün yanıt ile karsinogenez sürecinin durdurulmasını ve tümör hücrelerinin yıkımını birlikte yürüten ilk çalışma olması nedeniyle yüksek bir özgün değere sahiptir. Dahası, miR-3977'nin eEF2K ve FOXM1 sinyal yolaklarının çift hedeflenmesiyle TNBC'de tümör baskılayıcı rolü olduğu ve miR-3977 tabanlı gen terapisinin TNBC'de potansiyel bir terapötik strateji olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Aim: In our study, we aimed to determine the effect of triple suppression on eEF2K, PD-L1 and FOXM1 with miR-3977 in triple negative breast cancer (TNBC) cells, as well as identified the natural killer cell (NK) mediated immune response effect in these cells.
Materials and Method: As triple negative breast cancer cells MDA-MB-436, MDA-MB-231, BT-20 cell lines; as natural killer cells cord blood natural killer cells and NK-92 cell line will be used. To identified tumorigenesis studies colony formation assay, miRNA and siRNA mimic transfection, RNA extraction, miRNA and mRNA reverse transcription, RT-qPCR assay, protein extraction and immunoblotting assay, cell mobility, migration and invasion assays, flow cytometry, preparation of miRNA nanoparticles, orthotopic xenograft tumor model and statistical analysis methods will be used. To determination of NK mediated immunoassay studies Chromium (Cr51) analysis methods will be used.
Results: In our study, we investigated the role of miR-3977 and found that miR-3977 is associated with significantly longer patient survival in TNBC and inversely correlated with levels of proto-oncogenic eEF2K, which was associated with significantly shorter overall patient survival. We showed that miR-3977 directly binds to the 3′-untranslated region (3'-UTR) of eEF2K, PD-L1 and FOXM1 mRNAs and suppresses their expression, leading to inhibition of TNBC cell proliferation, motility, and invasion. Moreover, in vivo therapeutic delivery of miR-3977 nanoparticles by systemic intraperitoneal administration delayed tumor growth of orthotopic TNBC tumor xenograft models by inhibiting eEF2K, PD-L1 and FOXM1, intratumoral proliferation and angiogenesis, and inducing apoptosis. Importantly in our study it has been shown at the first time, with either miR-3977 or siRNA treatments of each eEF2K, CD274 or FOXM1 inhibition NK-92 and CBNK cells cytotoxicity were induced.
Conclusion: Our study has a high specific value due to miR-3977 gene therapy in triple negative breast cancer cells as it is the first study to both re-activate the programmed cell death (PD-L1) mechanisms and to stop the carcinogenesis process and the destruction of tumor cells with the activation of NK-mediated immune response against these cells. Furthermore, our findings provide new insights into the tumor suppressor role of miR-3977 by dual-targeting of eEF2K and FOXM1 signaling axis and suggest that miR-3977-based gene therapy may be a potential therapeutic strategy in TNBC.