Vasküler düz kas hücrelerinde ras transfeksiyonu sonrasında anjiyotensin II uyarımında interferon-gama ile oluşturulan apoptoziste akt'nin rolü
The role of akt in induced apoptosis via interferon-gamma and angiotensin II stimulation after ras transfection in vascular smooth muscle cells
Yazar: ALPER TOKAY
Danışman: PROF. DR. AKIN YEŞİLKAYA
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Anjiyotensin II = Angiotensin II ; Apoptozis = Apoptosis ; Ras = Ras

Özet:
Angiotensin II'nin (Ang II) hem apoptotik hem de anti-apoptotik sinyal mekanizmaları üzerinde etkili olduğu yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir. Vasküler düz kas hücrelerinde (VDKH) anti-apoptotik etkilerini Akt/protein kinaz B (PKB) üzerinden gösterdiği de bilinmektedir. Bununla birlikte, aktive olmuş fosforile Akt'nin hücre içinde aktivasyonunu sağladığı birçok alt sinyalizasyon yolları arasında IKK (NF-KapaB ? hücre yaşamsallığı), p70S6K (protein sentezi) gibi yolların yanı sıra, mitokondriyal proteinlerden Bad, Bcl?2 gibi aktivatörler üzerinden apoptozisi tetiklediği de gösterilmiştir.Literatürdeki çalışmalarda gözlemlediğimiz bu ikilem ve çelişki; Akt'nin hem hücre yaşamsallığında hem de apoptoziste rolünün olması, bu molekülün onkojenik şartlarda da hücreyi apoptozise götüren bir hedef molekül olabileceğini göstermektedir. Çalışmamızda, VDKH'lerinde, Ang II uyarımına bağlı olarak Akt fosforilasyonuna hangi ulaklar üzerinden erişildiği ve özellikle apoptozis için bir kavşak proteini olduğunu gösterebilmek amacıyla, primer VDKH kültüründe Akt fosforilasyon düzeylerini, aynı hücre kültüründe interferon-gama uyarımlı apoptotik şartlarda da gözlenmiştir. Bununla birlikte, Ras miktarının fazla olduğu VDKH'lerinde interferon-gama ile apoptotik sinyalizasyon yollarının aktive olduğu durumlarda Akt fosforilasyon düzeyleri kıyaslanmıştır. Ras'ın fazlasıyla yoğun olduğu ve normal hücrelerde olası Akt fosforilasyonunun etkilediği aşağı efektör molekülleri ile etkileşimini gözlemleyebilmek amacıyla Bad ve Bcl?XL immünpresipitasyonları ve kaspas III ölçümleri ile apoptotik sinyallerin ne derecede etkilendiği gösterilmiştir.Sonuç olarak özellikle apoptozis sinyal yolağı üzerinde Akt/PKB önemli bir kavşak molekül olarak gözlemlenmiştir. Bununla birlikte Ras miktarının arttığı VDKH'lerinde azalmış Akt/PKB fosforilasyonu ve Bad/Bcl-XL kompleks oluşum düzeyleri, bize Ras miktarının arttığı şartlarda Akt/PKB anti-apoptotik sinyal yolu üzerinde, özellikle Bad/Bcl-XL kompleks oluşumunun miktarının azalması, indüklediğimiz apoptotik ortama katkı yapması beklenirken, apoptotik sinyallerin artışı gözlenmemiştir.

Abstract:
Angiotensin II (Ang II) is related with both signalization mechanisms concerning apoptosis and anti-apoptosis. It is also known that Ang II triggers its anti-apoptotic effects via Akt/protein kinase B (PKB) in vascular smooth muscle cells (VSMCs). In addition, there are many sub signalization pathways, such as IKK (NF-KappaB ? cell survival) and p70S6K (protein synthesis) which are being triggered over Akt and also it was shown that apoptosis is being induced via such mitochondrial proteins Bad, Bcl?2 by active phosphorylated Akt.This contradiction, which Akt is having a part in both apoptosis and cell survival, overviewed in the studies, makes us to predict a hypothesis that Akt can be a target molecule, which can take the cell to apoptosis even in Ras over-expressed media.In our study, as to emphasize that Akt is a junction molecule especially for apoptosis in VSMCs, we have tried to establish a model, after which the cell culture media induced by Ang II, Akt phosphorylation was measured as well as we did the same assays with the same parameters in VSMC culture after being induced by interferon-gamma that takes the cells to apoptosis. Besides, phosphorylated Akt levels were observed in such a media, which activated apoptotic signalization pathways via interferon-gamma in VSMC culture formed by the transfection of Ras plasmids. Both in Ras over-expressed and normal cells, as to observe interactions between phosphorylated Akt and the sub-effector molecules such as Bad and Bcl-XL, the immunprecipitation assays were carried out and by doing caspas-3 assays the level of apoptotic signals have been demonstrated in Ras over-expressed VSMC culture.Briefly, what we have showed is that the Akt/PKB is a junction molecule and especially plays an individual role on going apoptosis in VSMCs. On the other hand, decreased levels of Akt/PKB phosphorylation and Bad/Bcl-XL complex formation, emphasized the possible apoptotic mechanisms in Ras over-expressed media can easily be manipulated, but the resident fact is just the direct contrary.