Trofoblastların oksidatif strese yanıtında rol oynayan mekanizmalar
The mechanisms involved in the response of trophoblasts against oxidative stress
Yazar: ERENGLÜL TOKAY
Danışman: PROF. DR. MERAL KOYUTÜRK
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Oksidatif stres = Oxidative stress ; Plasenta = Placenta ; Preeklampsi = Pre-eclampsia ; Trofoblastlar = Trophoblasts ; Tümör nekroz faktörleri = Tumor necrosis factors

Özet:
İnsan plasentasının gelişiminin temeli, trofoblast hücrelerinin çoğalmasına ve farklılaşmasına bağlıdır. Trofoblastların fonksiyon yetersizliğinin preeklampsi benzeri patolojilerin gelişiminde kritik bir rol oynadığı bilinmektedir. Ancak ilişkili mekanizmalar henüz tam olarak açıklanamamıştır. Çalışmamızda, JAR hücre soyu kullanarak oluşturulan in vitro modelde trofoblast hücrelerinin TNF-alfa aracılı oksidatif strese yanıtı incelenerek preeklampsi benzeri plasental patolojilere yeni yaklaşımlar kazandırılması amaçlanmıştır. Oksidatif stres modeli TNF-alfa sitokininin farklı zaman ve dozlarda JAR hücrelerine uygulanması ile oluşturuldu. TNF-alfa?nın sinsisyotrofoblast hücrelerinde NF-KB sinyal yolağı, hücre proliferasyonu ve apopitotik hücre ölümü üzerine etkileri ve pentoksifilinin (PTX) TNF-alfa aracılı NF-KB sinyal yolağı üzerine etkisi incelendi. NF-KB immünreaktivitesi, ön çalışmalar sonucunda belirlenen 100 ng TNF-alfa?nın, 1, 6, 12 ve 24 saatlik sürelerde uygulanmasıyla oluşturulan deney gruplarında immünositokimyasal ve western blot işaretleme yöntemleri ile incelendi. PCNA immünreaktivitesi ile hücre proliferasyonu oranı 6, 12 ve 24 saat?lik deney gruplarında değerlendirildi. Anti kaspaz-8 ve DAPI nükleer işaretlemeleri ile apopitotik hücrelerin belirlenmesi 24 saatlik deney grubunda gerçekleştirildi. İmmünreaktivite sonuçları H skorlama yapılarak değerlendirildi. Hücre proliferasyonu ve apopitoz oranları işaretli hücre yüzdelerinin belirlenmesi ile saptandı. TNF-alfa uygulanarak oluşturulan in vitro stres koşullarında immünositokimyasal işaretleme ile NF-KB immünreaktivitesinin hem nükleer hem de sitoplazmik olarak anlamlı artış gösterdiğini ancak bu reaktivitenin TNF-alfa uygulama saatlerine göre değişiklik gösterdiğini tespit ettik. JAR hücrelerinde PTX?in (1,10,20mM) NF-?B immünreaktivitesi üzerine etkisini, immünositokimyasal olarak inceledik. 10 mM PTX+TNF-alfa grubunda nükleer NF-KB düzeylerinin yalnız TNF-? uygulanan grupla karşılaştırıldığında azaldığını gördük. Yalnızca PTX uygulanan gruplarda ise JAR hücrelerinde mevcut nükleer NF-KB immünreaktivitesinin izlenmediğini gördük. TNF-alfa?nın zamana bağlı olarak proliferasyonu baskılayıcı etki gösterdiğini tespit ettik. Kaspaz-8 pozitif JAR hücrelerinde TNF-alfa?nın immünreaktivite artışına neden olduğu izlendi. DAPI işaretli apopitotik hücrelerin de 24 saatte anlamlı artış gösterdiği tespit edildi. Elde ettiğimiz bulgular, oksidatif stres kaynağı TNF-alfa?nın JAR hücrelerinde bir stres kaynağı olarak önemli rol oynadığını, PTX?in bu stres modelinde NF-KB immünreaktivitesini etkilediğini ve bir terapötik olarak rolünün ileri çalışmalarla desteklenmesi gerektiğini ortaya koymuştur.

Abstract:
The development of human placenta depends on the proliferation and differentiation of trophoblastic cells. Deficiencies in trophoblastic functions are known to have a critical role in progression preeclampsia like pathogenes. However, the mechanisms have not been explained yet. In this study, establishing in vitro model of JAR cell line, the response of trophoblast cells against TNF-alpha mediated oxidative stress was searched and it is aimed to represent new approaches in preeclamptic like placental pathologies. An oxidative stress model of TNF-alpha cytokine was established by application on JAR cells in different periods and dosages. The effects of TNF-alpha on NF-KB pathway, cell proliferation and apoptotic cell death of syncytiotrophoblasts and the effect of pentoxifylline on TNF-alpha mediated NF-KB pathway were investigated. NF-KB immunoreactivity was examined by immunocytochemical and western blot techniques on experimental groups generated by applying 100 ng TNF-alpha dose, determine by preliminary studies, for 1, 6, 12 and 24 hour periods. PCNA immunoreactivity of cell proliferation rate was evaluated in experimental groups of 6, 12 and 24 hours. Determination of apoptotic cells by anti-caspase-8 and DAPI nuclear staining was performed in 24 hour-experimental group. Results of immunoreactivities were evaluated bu H-score. The ratio of cell proliferation and apoptosis was calculated by cell percentages. As a result of immunocytochemical staining, we determined that NF-KB immunoreactivity was significantly increased in both nuclear and cytoplasmic levels in vitro stress conditions constituted by TNF-alpha application; however, this reactivity was changed according to application time of TNF-alpha. The effect of PTX (1, 10, 20 mM) on NF-KB immunoreactivity of JAR cells was also investigated immunocytochemically. Nuclear NF-KB levels in the group of 10 mM PTX+ TNF-alpha was decreased more than sole TNF-alpha applied group. In sole PTX applied groups, there was no nuclear NF-KB immunoreactivity in JAR cells. We concluded that TNF-alpha has an inhibitory effect on time dependent cell proliferation. TNF-alpha was shown to cause an increased in immunoreactivity in caspase-8 positive JAR cells. Moreover, apoptotic cells stained with DAPI was determined to increased significantly in 24 hours.Our findings presented that TNF-alpha which leads oxidative stress has a significant role as a stress source in JAR cells; PTX affects NF-KB immunoreactivity in this stress model and its therapeutic role needs to be explained by advanced researches.