Muğla bölgesinden elde edilen toprak-gübre karışımlarından izole edilen mikroorganizmalarda antibiyotik dirençlilik değişiminin tespiti
Detection of antibiotic resistance change in microorganisms isolated from soil-fertilizer mixtures obtained from Muğla region
Yazar: SAADAT SAMADOVA
Danışman: PROF. DR. ÖZGÜR CEYLAN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Çevre Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering

Özet:
Tarımsal üretimde yüksek verim elde etmek için gübre uygulamaları zorunluluk olarak görülmektedir. Ancak uygulanan gübrelerin miktarları, çeşitleri ve uygulama zamanlarının farklılık göstermesi ve bu alandakı bilgi yetersizliği nedeniyle çevreyi olumsuz olarak etkilenmektedir. Yapılan yalnış gübre uygulamalarıyla topraklarda besin maddesi dengesizliği, mikroorganizma etkinliğinin bozulması, ağır metal birikimi vb. sorunlar oluşturmaktadır. Bu tez çalışmasında, gübrelerin bilinçsiz ve fazla kullanımlarının oluşturacağı çevre ve sağlık sorunları, mikroorganizmlar üzerinde etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. 
Bu çalışmada Muğla ilinin 3 farklı bölgesinden elde edilen toprak örneklerinden Bacillus spp. ve Pseudomonas spp. bakterileri izole edilmiştir. Bakterilerin izolasyonu ilk önce toprak örneklerinden daha sonra toprak+gübre karışımlarından (1/6, 1/10 ve 1/12), 3 farklı bekleme süresi (1.,7. ve 30. gün) sonrasında yapılmıştır. Toprak+gübre  karışımı için amonyum sülfat (kimyasal gübre) ve leonardit (organik  gübre) kullanılmıştır. Bacillus suşlarının izolasyonunda sodyum asetatlı Nutrient Broth, Pseudomonas suşlarının izolasyonunda ise supplementli (SR103E) selektif Pseudomonas Agar kullanılmıştır. İzolatların morfolojik özellikleri (koloni rengi, koloni büyüklüğü, koloni tipi) ve Gram boyama test sonuçlarına göre gruplandırılma yapılmıştır. Ön identifikasyon testleri sonucunda 8 adet izolatın  Bacillus  ve 3 adet izolatın Pseudomonas cinsine ait  olduğu belirlenmiştir. Her bir toprak örneğinden ve toprak+gübre karışımlarından  birer Bacillus spp.  ve birer Pseudomonas spp. bakteri suşu seçilmiştir. Çalışmanın antimikrobiyal aktivite kısmına  fenotipik identifikasyonları API 20NE test kiti ile belirlenmiş olan 3 adet Pseudomonas spp. ve API 50CH ve API 20E test kitleri ile belirlenmiş 3 adet Bacillus spp. ile devam edilmiştir. İdentifikasyon testleri neticesinde çalışmaya alınan Pseudomonas türleri  P.fluorescens ve P.putida (2 adet), Bacillus türleri ise B.lentus, B.subtilis ve B. licheniformis'dir.  
Antibiyotik duyarlılık testlerinin belirlenmesinde  Bacillus spp'ler için  Penicillin (P), Oxacillin (OX), Streptomycin (S), Vancomycin (VA), Ampicillin (AM), Pseudomonas spp.'ler için Mezlocillin (MEZ), Trimethoprim sulfamethoxazole (SXT), Gentamicin (GN), Aztreonam (ATM), Ceftazidime (CAZ) antibiyotik diskleri kullanılmıştır.  Bakterilerin antibiyotik dirençlilik durumları CLSI M39-A4 standartlarına göre belirlenmiştir. 
Saf toprak, toprak+leonardit ve toprak+amonyum sülfat karışımlarından elde edilen B. lentus, B. subtilis ve B. licheniformis suşlarının Penicilin, Oxacillin, Ampicillin antibiyotiklerine karşı karışım oranı ve bekleme süresi sonrası direnç değişimi tespit edilememiştir. B.subtilis  suşunun Streptomycin antibiyotiğine karşı dirençlilik değişimi görülmezken, B.lentus suşunda 1/6 ve 1/10 karışımında 30. günde dirençlilikte artış tespit edilmiştir. B. licheniformis suşunda ise sadece 1/6  karışımında 30.günde Streptomycin antibiyotiğine karşı dirençlilik artmıştır. B. lentus ve B.licheniformis suşlarının  Vancomycin antibiyotiğine karşı 1/6 karışım oranında dirençlilik artışı görülmüştür.  
Toprak+amonyum sülfat karışımından elde edilen  B. subtilis ve B. lentus suşlarının Vancomycin antibiyotiğine karşı tüm oran ve bekleme süreleri sonunda dirençli oldukları, B. licheniformis suşunun ise tüm oranlarda 1. gün orta seviyede olan dirençlilik 7. ve 30. günde dirençli oldukları tespit edilmiştir.  B. lentus suşunun Streptomycin antibiyotiğine karşı amonyum sülfat karışımında tüm oran ve bekleme süresi sonrası değişiklik görülmezken, B. subtilis suşunun 1/12 karışımında 30. günde, B. licheniformis suşunun ise 1/10 ve 1/12 karışımında 30. günde   dirençlilikte artış görülmüştür.  
Toprak+leonardit karışımlarından elde edilen P. fluorescens, P. putida (1) ve  P. putida (2) suşlarının Mezlocillin, Aztreonam ve Ceftazidime antibiyotiklerine karşı dirençli, toprak+amonyum sülfat karışımlarından elde edilenlerde ise Ceftazidime ve Trimethoprim Sulfahoxazole antibiyotiklerine karşı dirençli oldukları, gübre oranı ve bekleme süresinin etkisi olmadığı tespit edilmiştir. 
Toprak+leonardit karışımından elde edilen P.fluorescens suşunda trimethoprim sulfamethoxazole antibiyotiğine karşı  tüm oran ve bekleme süreleri sonunda etki görülmezken, P. putida (1) suşu 1/6 oranında dirençlilik kazanmış, P.putida  (2) suşu ise  trimethoprim sulfamethoxazole antibiyotiğine karşı her 3 oranda  bekleme süresi sonunda dirençlilik azalmıştır. P. fluorescens suşlarının toprak+leonardit karışımlarında gentamycin antibiyotiğine karşı karışım oranı ve bekleme süresi sonunda dirençliliği artarken, P. putida (1)  ve (2) suşlarını  ise gentamycin antibiyotiğine karşı karışım oranı ve bekleme süresi sonunda  orta seviyede dirençli bulunmuştur.
Toprak+amonyum sülfat karışımından elde edilen P.flourescens  ve P.putida (2) suşlarında mezlocillin antibiyotiğine karşı her 3 oranda, P.putida (1) suşunda ise sadece 1/6 oranında  30. günde dirençlilik artışı tespit edilmiştir. P. flourescens suşu Aztreonam antibiyotiğine karşı her 3 oranda ve bekleme süreleri sonucunda dirençli iken, aynı suşun Gentamycin antibiyotiğine karşı karışım oranı ve bekleme süresi sonrası dirençliliğinin azaldığı tespit edilmiştir. Bu durum P.putida suşları içinde benzer olup, toprak+amonyum sülfat karışımında karışım oranı bekleme süresi sonrası Gentamycin antibiyotiğine karşı dirençlilikleri zayıflamıştır. P.putida (1) ve (2)  suşları Aztreonam antibiyotiğine karşı farklı duyarlılık göstermiş olup, P.putida (1) karışım oranı ve bekleme süresi sonrasında duyarlı bulunurken, P.putida (2) suşu dirençli bulunmuştur. 
  
Anahtar kelimeler: Pseudomonas, Bacillus, Leonardit, Amonyum sülfat, Antibiyotik dirençlilik

Abstract:
To reach a high level of agricultural production efficiency, fertilizer applications are deemed necessary. However, the ecosystem is negatively impacted by the varying amounts, types, and application timings of applied fertilizers and the paucity of information in this subject. With improper fertilizer applications, nutritional imbalance in the soil, decrease of microbial activity, buildup of heavy metals, etc. might cause issues. The purpose of this thesis is to explore the impact of unintentional and excessive fertilizer use on environmental and health issues and microorganisms.
Bacillus spp. and Pseudomonas spp. bacteria have been isolated for this study. Bacteria were first extracted from soil samples, followed by soil-fertilizer mixes (1/6, 1/10, and 1/12) after three different waiting periods (1st, 7th and 30th days). For the soil+fertilizer mixture, ammonium sulfate (a chemical fertilizer) and leonardite (an organic fertilizer) were utilized. Bacillus strains were isolated using Nutrient Broth supplemented with sodium acetate, whilst Pseudomonas bacteria were isolated using selected Pseudomonas Agar supplemented (SR103E). The isolates were categorized based on their morphological characteristics (colony color, colony size, and colony type) and Gram stain test outcomes. The early identification tests revealed that 8 of the isolates belonged to the species Bacillus and 3 to the genus Pseudomonas. From each soil sample and soil+fertilizer mixture, one Bacillus spp. and one Pseudomonas spp. bacterial strains were isolated. Using API 50CH and API 20E test kits, the antimicrobial activity of 3 Pseudomonas spp. and 3 Bacillus spp. was assessed in the antimicrobial activity portion of the study. P.fluorescens and P.putida (2 units) are the Pseudomonas species included in the study as a result of identification tests, while the Bacillus species are B.lentus, B.subtilis, and B. licheniformis.  
Utilized antibiotic discs included Penicillin (P), Oxacillin (OX), Streptomycin (S), Vancomycin (VA), Ampicillin (AM), Mezlocillin (MEZ), Trimethoprim sulfamethoxazole (SXT) for Pseudomonas spp., Gentamicin (GN), Aztreonam (ATM), and Ceftazidime (CAZ). According to CLSI M39-A4 specifications, the antibiotic resistance status of bacteria was determined.
Strains of B. lentus, B. subtilis, and B. licheniformis produced from pure soil, soil+leonardite, and soil+ammonium sulphate were unable to identify resistance changes to Penicillin, Oxacillin, and Ampicillin after a period of mixing ratio and waiting. On the 30th day, while no change in Streptomycin resistance was identified in the B.subtilis strain, an increase in resistance was detected in the 1/6 and 1/10 mixture of the B.lentus strain. On the other hand, resistance to the antibiotic Streptomycin increased on day 30 in just 1/6 of the B. licheniformis strain. At a combination ratio of 1/6, resistance of B. lentus and B.licheniformis strains to the Vancomycin antibiotic increased.
B. subtilis and B. lentus strains obtained from a soil + ammonium sulfate mixture were found to be resistant to the Vancomycin antibiotic at the conclusion of all ratios and waiting periods, while the B. licheniformis strain was found to be resistant on the first day, with moderate resistance on the seventh and thirty-first days in all ratios. While no change was observed in the ammonium sulfate mixture against the Streptomycin antibiotic of the B. lentus strain after the entire ratio and waiting time, an increase in resistance was observed at day 30 in the mixture of 1/12 of the B. subtilis strain and in the mixture of 1/10 and 1/12 of the B. licheniformis strain.
P. fluorescens, P. putida (1), and P. putida (2) strains obtained from soil + leonardite mixtures are resistant to Mezlocillin, Aztreonam, and Ceftazidime antibiotics, whereas strains obtained from soil + ammonium sulfate mixtures are resistant to Ceftazidime and Trimethoprim Sulfahydanol antibiotics. Fertilizer rate and
While no effect was observed against trimethoprim sulfamethoxazole antibiotic in the P.fluorescens strain obtained from the soil+leonardite mixture at the conclusion of all ratios and waiting times, P. putida (1) strain developed resistance at a rate of 1/6, and P. putida (2) strain was always resistant to trimethoprim sulfamethoxazole antibiotic. At the conclusion of the 3-percent cooling interval, resistance lessened. While P. fluorescens strains' resistance to gentamycin antibiotic increased in soil+leonardite mixes at the mixture ratio and at the conclusion of the waiting time, P. putida (1) and (2) strains were found to be moderately resistant at the mixture ratio and at the end of the waiting period.
On the 30th day, P.flourescens, P.putida (2), and P.putida (1) strains isolated from a soil+ammonium sulphate mixture exhibited a threefold rise in resistance to the antibiotic mezlocillin, but P.putida (1) strain exhibited just a one-sixth increase. While P. flourescens strain was resistant to the Aztreonam antibiotic at a 3:1 ratio and after a waiting period, the same strain's resistance to the Gentamycin antibiotic reduced after a mixing ratio of 3:1 and after a waiting period. The same was true for P.putida strains, whose resistance to the antibiotic Gentamycin diminished following the soil-ammonium sulfate mixing ratio waiting period. P.putida (1) and (2) strains exhibited differing susceptibilities to the Aztreonam antibiotic; P.putida (1) was found to be susceptible after adjusting the mixing ratio and incubation period, whereas P.putida (2) was found to be resistant. 
  
Keywords: Pseudomonas, Bacillus, Leonardite, Ammonium sulfate, Antibiotic resistance