Ekstrakorporeal fotoferez ilişkili DNA hasarlarının araştırılması
Investigation of extracorporeal photopheresis-related DNA damages
Yazar: MUHAMMED BAHADIR SAMUR
Danışman: PROF. DR. MUSA KARAKÜKCÜ
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: DNA = DNA ; DNA hasarı = DNA damage ; Ekstrakorporeal dolaşım = Extracorporeal circulation ; Genotoksisite = Genotoxicity ; Greft versus host hastalığı = Graft versus host disease

Özet:
Giriş: Ekstrakorporeal Fotoferez (EKF), hastadan aferez ile elde edilen periferik kan mononükleer hücrelerinin in vitro psoralen ile etkileşime girip, ultaviyole-A ile ışınlandıktan sonra yeniden hastaya infüzyonunu içeren hücre bazlı bir immünoterapidir.  Mevcut literatürde yüksek güvenlik profili olduğu vurgulansa da bakteri ve memeli hücrelerinde yapılan çalışmalarda fotofereze bağlı gelişen fotokimyasal reaksiyonların, psoralenli DNA'lara hasar verdiğini gösteren çalışmalar vardır. İnsanlarda ise yeterli bilgi yoktur. Bu çalışma ile Graft versus host hastalığı (GvHD) tedavisinde kullanımı hızla yaygınlaşan Ekstrakorporeal fotoferezin potansiyel bir genotoksik etkisinin olup olmadığının, standardize ve otomatize bir değerlendirme metodu olan AKLIDES sistemi ile araştırılması amaçlamıştır.
Gereç ve Yöntemler: Bu çalışma 2020 yılında Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Kan Bankası'na kan bağışında bulunan 26 sağlıklı gönüllünün kanlarından elde edilen buffy coatlar kullanılarak yapıldı.  Her üründe 50 ml buffy coat için 0.5 ml 8-MOP infüze edildikten sonra 2 joule/cm2 ultraviyole-A uygulandı. EKF öncesi ve sonrasında kan örneklerinin tam kan sayımları ve immünofloresan boyamaları yapıldı. Bu boyamalardan 6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) ile boyanmış slaytlar lenfositlerin görselleştirilmelerini sağlarken, Fluorescein-isothiocyanate (FITC) boyaması hasarlanma odaklarını (γH2AX foci), Allophycocyanin (APC) boyaması ise tamir odaklarını (53BP1 foci) göstermek için kullanıldı. DNA hasarını belirlemede kullanılan parametrelerin hesaplamasında AKLIDES görüntüleme sistemiyle, (I) analiz edilen hücre sayısı; (II) foci sayısı; (III) foci floresan yoğunluğu/çapı (IV) foci eksprese eden hücre sayısı; (V) etkilenen hücre yüzdesi ve (VI) apoptotik hücre sayısı değerlendirildi.  
Bulgular: İşlem öncesi ve sonrası buffy coatlardan alınan örneklerin beyaz küreleri ve beyaz küre alt grupları arasında anlamlı farklılık saptanmadı. Bu hücrelerdeki ortalama DNA kırık sayısı göstergesi olan, foci γ-H2AX miktarı, fotoferez öncesinde median 11.42, sonrasında 18,65 olarak ölçülmüştür. Ancak aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0.153). Tamir mekanizmalarını gösteren foci 53BP1 miktarı, fotoferez öncesinde median 4.17, sonrasında 6.7 olarak ölçülmüştür. Aradaki fark yine istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0.088). EKF sonrasında FITC floresan boyama ile %58 hücrede etkilenme olmasına rağmen genotoksisite parametreleri karşılaştırıldığında hiçbir parametrede istatistiksel fark bulunmadı (Toplam apoptotik hücre sayısı p=0.210, Foci γ-H2AX Floresan Yoğunluğu p=0.446, Ortalama foci γ-H2AX çapı p=0.913 ve Etkilenmiş Hücre Oranı p=0.661). 
Sonuç: Genotoksisite uzun dönem sonuçları olan önemli bir komplikasyondur. EKF'nin genotoksik etkileri bilinmemekle beraber, bu çalışmada DNA kırıklarının objektif göstergelerinden birisi olan foci γ-H2AX parametresinde EKF öncesine göre sonrasında artış mevcuttu. Benzer şekilde hasar sonrası tamir mekanizmalarının devreye girdiğini gösteren foci 53BP1 parametresinde EKF öncesine göre sonrasında artış mevcuttu. EKF öncesi ve sonrası arasındaki bu farklar istatistiksel olarak anlamlı olmamasına rağmen vaka sayısının çok daha fazla olduğu çalışmalarda fark anlamlı olabilir. Ek olarak, bu in vitro çalışmada sadece bir seans fototerapi kullanıldı. Tekrarlayan seanslarda DNA hasarı artabilir. Bu çalışma, GvHD ve çeşitli kutanöz malign hastalıklar için kullanılan ve hızla kullanım alanı genişleyen EKF tedavisinin DNA kırıklarına sebep olabileceğini düşündürmektedir.
Anahtar Kelimeler: 	Ekstrakorporeal fotoferez, DNA hasarı, Genotoksisite, GvHD

Abstract:
INVESTIGATION OF EXTRACORPOREAL PHOTOPHERESIS-RELATED DNA DAMAGES
ABSTRACT
Aim: Extracorporeal Photopheresis (ECF) is the irradiation of peripheral blood mononuclear cells that interact with psoralen with ultraviolet-A. ECF is emphasized that it has a high safety profile in the current literature, however, animal studies showing that photochemical reactions due to photopheresis-related DNA damage. There is no admissible studies based on human research. This study was aimed to investigate whether Extracorporeal photopheresis treatment has a potential genotoxic effect or not with a standardized and automated evaluation method, the AKLIDES system.
Materials and Methods: Buffy coats were obtained from the blood of 26 healthy volunteers who donated blood to the Erciyes University Faculty of Medicine Blood Bank in 2020. (For each: 0.5 ml 8-MOP for 50 ml and 2 joules / cm2 ultraviolet-A). Blood counts and immunofluorescence samples before and after ECF were performed. All slides stained with DAPI for visualization of lymphocytes, FITC for visualization of damage foci marker (γH2AX), and APC for visualization of repair foci marker (53BP1). With the AKLIDES imaging system, (I) the number of cells analyzed; (II) number of foci; (III) foci fluorescence intensity (IV) cells expressing the foci; (V) Percentage of affected cells (VI) apoptotic cells were evaluated.
Results: There was no significant difference between white blood cells and  any other subgroups of samples. Foci γ-H2AX (damage biomarker) was measured as median 11.42 before and 18.65 after photopheresis. However, the difference was not statistically significant (p = 0.153). Foci 53BP1 (repair biomarker) was measured as median 4.17 before and 6.7 after photopheresis. The difference was also not statistically significant (p = 0.088). Despite the fact that 58% cells were affected by FITC fluorescent staining after ECF, no statistical difference was found in any genotoxicity parameter were compared (Apoptotic cell number p = 0.210, Foci γ-H2AX Fluorescence Intensity p = 0.446, Mean foci γ-H2AX diameter p = 0.913 and, Affected Cell Ratio p = 0.661).
Conclusion: Genotoxicity is a crucial complication with long-term consequences. The genotoxic effects of ECF are not known, in this study, there was an increase in the foci γ-H2AX parameter, which is one of the objective indicators of DNA breaks, compared to before and after ECF. Similarly, there was an increase in the foci 53BP1 parameter, which indicates that the post-damage repair mechanisms were activated, compared to before ECF. These differences between before and after ECF are not statistically significant, however, the difference may be significant in studies with large samples. Additionally, only one session of phototherapy was used in this in vitro study. DNA damage may increase in repetitive sessions. This study suggests that ECF treatment used for GvHD and various cutaneous malign diseases may cause DNA breaks.
Key Words:	Extracorporeal photopheresis, DNA damage, Genotoxicity, GvHD