Amfizemde alfa-1-protez inhibitörü varyantlarının incelenmesi
Determination of alfa-1-protease inhibitor variants in patients with pulmonary emphysema
Yazar: ÖZDEN ÜNAL
Danışman: PROF.DR. NİLGÜN SÜMER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 1996
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Alfa 1-antitripsin = Alpha 1 antitrypsin ; Amfizem = Emphysema ; İzoelektrik odaklama = Isoelectric focusing

Özet:
ÖZET Yaşlan ve sigara içme öykülerine göre iki gruba ayrılan amfizemli hastalarda (Grup I (n=8); ort.yaş 31.13+7.40, ort. sigara öyküsü 13.40±9.21 paket-yıl, Grup II (n=12); ort yaş 60±9.31, ort sigara öyküsü 41.67±15.45 paket-yıl) ve hiç sigara içmemiş yaş ortalaması 31.92±15.17 olan sağlıklı bireylerin oluşturduğu Kontrol grubunda (n=25) serum alfa-1-proteaz inhibitörü (cc-1-PI) ve alfa-2-makroglobulin (a2M) düzeyleri belirlendi ve tripsinin bu iki inhibitor arasında paylaşımı incelendi. Serum a-1-PI ve a2M'in antiproteaz etkisini incelemek üzere, sığır pankreas tripsini, pH 7.4 ve 25 °C'de diyalizlenmiş serum örnekleri ile preinkübe edildi ve preinkübasyon sonrası kalan triptik aktivite şubstrat olarak N-benzoil-L-arjinin etil ester (BAEE) kullanılarak belirlendi. Ayrıca tüm bireylerde a-1-PI varyantlarının belirlenmesi için 20-30 mM ditiyoeritritol (DTE) ile indirgenmiş serum örnekleri pH 4.2-4.9 aralığında poliakrilamid jelde izoelektrik odaklamaya (PAG-İEO) tabi tutuldu. Amfizemli hasta ve kontrol gruplarında gözlenen ortalama serum a-1-PI düzeyleri Grup I için 22.14±4.49 jiM, Grup II için 24.43 ±9.36 nM ve Kontrol grubu için 21.35±4.33 jıM olup, gruplar arasındaki fark anlamsızdı (p>0.05). Serum a2M derişimleri her üç grupta yer alan bireylerde normal sınırlar (2.7-5.5 ^M) içinde olup hasta ve kontrol gruplarının ortalama serum a2M düzeyleri (Grup I için 4.15±1.24 ^M, Grup II için 3.51±1.32 ^M ve Kontrol grubu için 4.43±1.10 uM) arasında anlamlı bir fark yoktu (p>0.05). Tripsinin diyalizlenmiş serum örnekleri ile titrasyonunda her üç grupta gözlenen limit aktivite değerlerinin ortalamaları (kontrol aktivitenin yüzdesi olarak; Grup I için 73.38±13.00, Grup II için 62.08114.13 ve Kontrol grubu için 65.40±12.68)arasında da anlamlı bir fark bulunamadı (p>0.05).Gözlenen limit aktivite değerlerinden yararlanılarak hesaplanan tripsinin a2M ve a-1-PI ile assosiyasyon hız sabitleri oranlarının (Iwi/ka-i-pi ) ortalama değerleri (Grup I için 13.50±10.59, Grup II için 10.08±6.48 ve Kontrol grubu için 7.62±3.60) karşılaştırıldığında Grup I ile Kontrol grubu arasında anlamlı bir fark (p<0.05) olmasına karşın Grup II ile kontrol grubu ve iki hasta grubu arasında anlamlı bir fark yoktu (p>0.05). oc-1-PI varyantlarının hasta ve kontrol gruplarında dağılımı incelendiğinde Grup l'de yer alan tüm hastaların, Grup ll'de yer alan 10 hastanın ve kontrol grubunda yer alan tüm bireylerin homozigot/heterozigot Pl M aleli taşıdığı saptandı. Elde edilen veriler ışığında, incelenen hastalarda amfızem gelişiminin akciğerlerde elastaz yükündeki bir artış ve/veya cc-1-PPnün inhibitor kapasitesindeki bir düşüşten kaynaklandığı düşünüldü. Anahtar Kelimeler: amfizem, alfa-1-proteaz inhibitörü, alfa-2-makroglobulin, alfa-1-proteaz inhibitörü varyantları, izoelektrik odaklama.

Abstract:
ABSTRACT Serum alpha-1 -protease inhibitor (cc-1-PI) and alpha-2-macroglobulin (a2M) levels were determined and the participation of these two inhibitors in the inactivation of trypsin was investigated in sera of patients with emphysema and in sera of healthy subjects. Patients were classified into two groups based on age and smoking habit (Group I; mean age (m.a.) 31.13±7.40 (n=8), mean smoking habit (m.s.h.) 13.40±9.21 package-year, Group II ; m.a. 60±9.31 (n=12); m.s.h. 41.67±15.45 package-year ). Control group consisted of 25 nonsmoker healthy subjects with a mean age of 31.92±15.17 (n=25). Bovine pancreatic trypsin was titrated with serum samples dialysed against 20 mM phosphate buffer (pH 7.4). Residual tryptic activity was measured using N-benzoyl-L-arginine ethyl ester (BAEE) as a substrate. The determination of a-1-PI phenotypes was carried out by isoelectric focusing with carrier ampholytes (pH of 4.2-4.9) on polyacrylamide gels. Mean serum a-1-PI levels were 22.14+4.49 uM for Group I ; 24.43 ±9.36 pM for Group II; and 21.35±4.33 ^M for control group and the difference between these three groups was insignificant (p>0.05). Serum cc2M levels of patients and controls were within normal limits (2.7-5.5 \M). Mean serum a2M levels were 4.15±1.24 jaM for group I, 3.51±1.32 \xM for group II, 4.43+1.10 \iM for control group and there were no significant differences between them (p>0.05). There were also no significant differences (p>0.05) between mean values of observed limit activities of patients and controls ( as per cent of control activity; 73.38±13.00 for Group I, 62.08±14.13 for Group II, 65.40±12.68 for control group). When the mean ratio of the rate constants VI(calculated from observed limit activities) for the association of trypsin with a-1-PI and a2M (ka2M/ka-i-pi ) were compared there was a significant difference (p<0.05) between Group I (13.50±10.59) and control group (7.62±3.60) but there were no significant differences (p>0.05) between Group II (10.08±6.48) and control group and between two patient groups. When the distribution of PI phenotypes in patients and control groups was investigated our data showed that, all the patients in Group I, all the subjects in control group and ten of the patients in Group II had homozygote/heterozygote PI M alleles. These findings suggested that the development of emphysema in patients, investigated in this study, was due to increased elastase burden and/or decreased a-1-PI activity in their lungs. Key words: emphysema, alpha-1 -protease inhibitor, alpha-2-macroglobuIin, alpha-1 -protease inhibitor phenotypes, isoelectric focusing. Vll