Vibrio parahaemolyticus'un deniz levreklerinde (dicentrarchus labrax) farklı muhafaza sıcaklıklarında yaşamının klasik kültürel, qpcr ve REAL-TIME LAMP metotları ile incelenmesi
Investigation the living of vibrio parahaemolyticus in sea bass (dicentrarchus labrax) at different storage temperatures by classical cultural, QPCR and REAL-TIME LAMP METHOD
Yazar: ARİFE EZGİ TELLİ
Danışman: PROF. DR. YUSUF DOĞRUER
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Besin Hijyeni ve Teknolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Besin Hijyeni ve Teknolojisi = Food Hygiene and Technology
Dizin: Balıklar = Fishes ; Besin işleme endüstrisi = Food processing industry ; Besin koruyucu maddeler = Food preservatives ; Besin saklanması = Food preservation ; Deniz levreği = Sea bass ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Propidyum = Propidium ; Vibrio parahaemolyticus = Vibrio parahaemolyticus

Özet:
Araştırmada Vibrio parahaemolyticus hücrelerine soğuk ve donmuş muhafaza koşullarının
etkisinin ortaya konması, etkenlerin saptanabilme seviyeleri bakımından yöntem duyarlılıklarının
karşılaştırılması amaçlandı. Proje kapsamında uygulanacak olan Real-Time LAMP ve qPCR
yöntemlerinin yanısıra, canlı ve ölü hücrelerin ayrımı amacıyla kullanılacak olan PMA dozu optimize
edildi. Daha sonra V. parahaemolyticus inokule edilen deniz levrekleri soğuk (4°C) ve dondurulmuş (-
18 °C, -45 °C) sıcaklık derecelerine maruz bırakıldı. Belirlenen depolama günlerinde (1, 3, 7 ve 14)
yapılan örneklemelerde klasik kültürel, Real-Time LAMP, PMA-Real-Time LAMP, qPCR ve PMAqPCR
metotlarıyla etken varlığı araştırıldı.
Real-Time LAMP ve qPCR optimizasyonunda tespit edilebilen en düşük bakteri sayıları
sırasıyla 2,5x104 ve 2,5x103 KOB/g olarak belirlendi. PMA' nın optimum dozu ise 50 μM olarak
saptandı. Deneysel numunelerden elde edilen bulgulara göre bakteri sayıları karşılaştırıldığında tüm
günlerde ve depolama sıcaklıklarında en yüksek sayı PMA uygulanmayan moleküler yöntemlerle, en
düşük sayı ise klasik kültürel yöntemle tespit edildi. PMA uygulanan ve uygulanmayan örneklerden
elde edilen bulgular kendi aralarında istatistiksel açıdan benzer sonuçlar gösterdi. Klasik kültürel
yöntemle gerçekleştirilen örneklemelerde 7. ve 14. günde yapılan ekimlerde uygulanan depolama
sıcaklıklarının hiçbirinde üreme gözlenmemesine karşın diğer yöntemlerle bakteri varlığı tespit edildi.
Uygulanan tüm depolama sıcaklıklarında 1. günden 14. güne kadar gerçekleşen bakteri sayılarındaki
azalma, yöntemlerin hepsinde gözlemlendi.
Araştırmada kullanılan mikroorganizma tespit yöntemlerinden klasik kültürel yöntemin,
moleküler metotlara kıyasla süre ve işgücü gereksiniminin fazlalığı, VBNC formun tespit
edilememesi gibi dezavantajları bulunmaktadır. Bu nedenle özellikle VBNC forma geçebilen
mikroorganizmaların izolasyon ve identifikasyonunda DNA tespitine olanak sağlayan moleküler
yöntemlerin klasik kültürel yöntemlerle kombine olarak uygulanması gerektiği düşünülmektedir.
PMA gibi bazı azide grubu kimyasallar ile ölü ve canlı hücrelerin birlikte bulunduğu bir popülasyonda
yüksek seçicilikte bir ayrım yapılabilmektedir. PMA'nın moleküler yöntemlerle kombine olarak
kullanılmasıyla yüksek seçicilik ve özgünlükte sonuçlar elde edilmesi ve mikroorganizmaların VBNC
formunun da tespitinin sağlanması nedeniyle gıda mikrobiyolojisinde daha geniş kullanım alanı
bulması önem arz etmektedir. Real-Time LAMP ve qPCR yöntemlerinin PMA uygulanan ve
uygulanmayan örneklerde benzer sonuçlar göstermesi nedeniyle daha düşük maliyetli ve daha kısa
sürede sonuç veren Real-Time LAMP yönteminin qPCR'a alternatif olarak uygulanabileceği
düşünülmektedir.

Abstract:
In the study it was aimed to demonstrate the effect of cold and frozen storage conditions on
Vibrio parahaemolyticus and to compare the sensitivities of the methods in terms of ability to
determine the level of bacterial cells. In addition to the optimization of LAMP and Real-Time PCR
methods to be implemented under the project, PMA dose has also been optimized which will be used
to distinguish live and dead cells. Sea basses inoculated with V. parahaemolyticus were subsequently
exposed to cold (4 °C) and frozen (-18 °C, -45 °C) temperatures. Levels of the bacteria were
investigated at the designated storage days (1, 3, 7 and 14) with sampling by classic cultural, Real-
Time LAMP, PMA-Real-Time LAMP, qPCR, PMA-qPCR methods.
By optimizing the Real-Time LAMP and qPCR, the lowest bacteria counts were detected as
2,5x104 and 2,5x103 CFU/g, respectively. The optimum dose of PMA was detected as 50 μM.
According to the findings compared with the number of bacteria from the experimental samples, the
highest number was determined by molecular methods which PMA was not applied and the lowest
number was determined by the conventional cultural methods at all storage temperature and on all
sampling days. The results obtained from PMA treated and untreated samples showed statistically
similar results with each other. Although bacterial growth was not observed by classical cultural
methods at any of the storage temperatures, presence of bacteria was determined by other methods
performed in the sampling days of 7. and 14. The reduction occur in the number of bacteria was
observed by all of methods applied at all the storage temperatures from the 1. day to the 14. day.
Classical cultural method used in the study has some drawbacks compared to molecular
methods for detection of microorganisms such as time consuming labor requirements and inability to
detect VBNC form. Therefore it is thought that conventional cultural methods should be implemented
in combination with molecular methods allowing detection of DNA for isolation and identification of
microorganisms which can pass to VBNC form. In a population of dead and live cells are co-located,
discrimination can be done with some azide group chemicals such as PMA with a high selectivity. It
is crucial in food microbiology to obtain results in high selectivity and specificity with wider use of
molecular methods in combination with PMA and also for the detection of microorganisms in VBNC
state. Owing to the similar results of Real-Time LAMP and qPCR methods in PMA treated and
untreated samples, Real-Time LAMP can be applied as an alternative to qPCR because of lower cost
and less time required for getting results.