Karadeniz alabalığı (Salmo trutta labrax) germ hücrelerinin kriyoprezervasyonu üzerine bir çalışma
A study on cryopreservation of germ cells in Black Sea salmon (Salmo trutta labrax)
Yazar: EGE GÜNGÖR
Danışman: DOÇ. DR. AYGÜL EKİCİ ; DOÇ. DR. TAİJU SAİTO
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Günümüzde birçok Salmonid türü iklim değişikliği ve androprojenik etkiler nedeniyle yok olma tehlikesiyle karşı karşıyadır. Bu nedenle etkili bir koruma stratejisine ihtiyaç duyulmaktadır. Türlerin neslinin devamlılığının sağlanmasında gamet muhafazası birinci derecede önem arz etmektedir. Son 20 yıllık süreçte ise erken evre germ hücrelerinin (eGH) muhafazası yumurta ve sperm hücresine farklılaşabilmesi nedeni ile ön plana çıkmaktadır. 
Bu çalışmada, Karadeniz alabalığı (Salmo trutta labrax) eGH'lerinin izolasyonu ve uzun süreli muhafazası için türe özgü protokoller (izolasyon süresi, enzimatik ayırma solüsyonu, inkübasyon süresi, uygun kriyoprotektan ve kriyoprezervasyon yöntemi seçimi) oluşturulmuştur. Ayrıca, enzimatik olarak ayrılmış hücre ve tüm gonad dokusunun kriyoprezervasyonu sonrasında canlı hücre sayısı tespit edilmiştir. Yıl boyunca testis dokusunun histolojik kesitlerinden yapılan hücre sayımlarına göre, dokudaki spermatogonia konsantrasyonunun en yüksek olduğu dönemin Mayıs ve Haziran (%98.67 - %99.56) ayları arasında olduğu gösterilmiştir.
Optimum enzimatik ayrıştırma solüsyonunu belirlemek için, testis dokuları  (PBS veya L-15 ortamında %0,3-0,5 tripsin ve %0,1-0,3 kolajenaz) çeşitli tripsin ve kolajenaz kombinasyonları kullanılarak sindirime tabi tutulmuştur. Bulgularımız, %0,3 kolajenaz içeren L-15 ortamının en yüksek canlı hücre verimini (%90,9) sağladığını ortaya koymuştur.
Çalışmada; enzimatik ayrışma için inkübasyon süresi değerlendirildiğinde, 120 dk'lık inkübasyon süresinin en yüksek canlı hücre yüzdesini (%91,65) verdiği görülmüştür. Daha sonra; DMSO, gliserol ve ticari kriyoprotektan CryoSOfree™ dahil olmak üzere altı farklı kriyoprotektan kullanarak enzimatik olarak ayrışmış hücreler; hem L-15 hem de PBS ortamlarında ve ayrıca tüm doku sadece CryoSOfree™ ortamında olmak üzere kriyoprezerve edilmiştir. Örneklerin -152°C'de iki yıl boyunca prezervasyonundan sonra, L-15 + Gliserol içinde kriyoprezerve edilen enzimatik olarak ayrıştırılmış hücreler grubunun %93,3 ile en yüksek canlılığı verdiği gösterilmiştir. Bu arada çözüldükten sonra, tüm doku grubunun 33.210.000 adet hücre / mL en fazla hücre sayısı ihtiva ettiği görülmüştür. Tüm doku kriyoprezervasyon grubunun; hem canlılık (%91,11) hem de elde edilen hücre sayısı (33.210.000 adet hücre / mL) dikkate alındığında, toplam 30.257.631 adet /mL canlı hücre sağlayarak diğerlerinden daha iyi bir performans gösterdiği belirlenmiştir.
Sonuç olarak; bu çalışma, Karadeniz alabalığı (Salmo trutta labrax) eGH'lerinin kriyoprezervasyonu için etkin protokoller geliştirilmiş ve bu protokollerin uygulanabilirliği gösterilmiştir. Türün üreme biyolojisi ve genetik çeşitliliğinin korunmasına yönelik olarak erken evre germ hücrelerinin (eGH) izolasyonu, enzimatik ayrıştırma ve kriyoprezervasyonu için en uygun koşullar belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar, türlerin devamlılığını sağlamak ve nesli tükenmekte olan türlerin korunmasına katkı sağlamak için gamet muhafazasının kritik önemini vurgulamaktadır. Bu bağlamda, geliştirilen protokoller, hem biyoteknolojik uygulamalar için bir temel oluşturmakta hem de balık yetiştiriciliği ve doğal stok yönetimi için önemli bir kaynak sunmaktadır. Bu çalışmanın bulguları, gelecekteki araştırmalara yol gösterici olmanın yanı sıra, benzer yaklaşımların diğer balık türlerine uygulanabilirliğini de ortaya koymaktadır.

Abstract:
Many Salmonid species are currently facing the threat of extinction due to climate change and anthropogenic effects. Therefore, there is a need for effective conservation strategies. The preservation of gametes is of paramount importance in ensuring the continuity of these species. Over the past 20 years, the preservation of early-stage germ cells (eGH) has gained prominence due to their ability to differentiate into both egg and sperm cells.
In this study, species-specific protocols for the isolation and long-term preservation of eGHs in the Black Sea trout (Salmo trutta labrax) have been developed, including isolation duration, enzymatic dissociation solution, incubation time, appropriate cryoprotectants, and cryopreservation protocols. Additionally, the number of viable cells was determined following the cryopreservation of enzymatically dissociated cells and whole gonad tissue. Histological analysis of testis sections throughout the year indicated that the period with the highest spermatogonia concentration in the tissue was between May and June (98.67% - 99.56%).
To determine the optimal enzymatic dissociation solution, testicular tissues were subjected to digestion using various combinations of trypsin and collagenase (ranging from 0.3-0.5% trypsin and 0.1-0.3% collagenase in PBS or L-15 medium). Our findings revealed that L-15 medium containing 0.3% collagenase provided the highest yield of viable cells (90.9%).
When evaluating the incubation period for enzymatic dissociation, a 120-minute incubation provided the highest percentage of viable cells (91.65%). Subsequently, six different cryoprotectants, including DMSO, glycerol, and the commercial cryoprotectant CryoSOfree™, were used to cryopreserve enzymatically dissociated cells in both L-15 and PBS mediums, and whole tissue exclusively in CryoSOfree™. After two years of preservation at -152°C, the group of enzymatically dissociated cells cryopreserved in L-15 + glycerol exhibited the highest viability at 93.3%. Meanwhile, the whole tissue group yielded the highest cell count per milliliter post-thawing, with 33.210.000 cells. Considering both viability (91.11%) and the number of cells obtained (33.210.000 cells per milliliter), the whole tissue cryopreservation group outperformed the others, providing a total of 30.257.631 viable cells per milliliter.
In conclusion, this study has developed and demonstrated effective protocols for the cryopreservation of eGHs in Black Sea trout (Salmo trutta labrax). The optimal conditions for the isolation, enzymatic dissociation, and cryopreservation of early-stage germ cells (eGH) have been identified, contributing to the preservation of the reproductive biology and genetic diversity of the species. These results underscore the critical importance of gamete preservation for ensuring species continuity and protecting endangered species. The protocols developed herein provide a foundation for biotechnological applications and serve as a valuable resource for fish farming and natural stock management. The findings of this study not only guide future research but also demonstrate the applicability of similar approaches to other fish species.