Bitkisel kökenli antibakteriyel ajanların E. faecalis biyofilmi oluşumu ve eliminasyonuna etkileri: in vitro çalışma
The effect of antibacterial herbal agents on the formation and elimination of E. faecalis biofilm: An in vitro study
Yazar: JÜLİDE OCAK
Danışman: PROF. DR. AYŞE DİLJİN KEÇECİ
Süleyman Demirel Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Endodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2021
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Alfa pinen = Alpha pinene ; Antibakteriyel ajanlar = Anti-bacterial agents ; Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Berberin = Berberine ; Biyofilmler = Biofilms ; Enterococcus faecalis = Enterococcus faecalis ; Tıbbi bitkiler = Plants-medicinal

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı; farklı etken maddelerin diş örneklerinde oluşturulan Enterococcus faecalis (E. faecalis) biyofilm yapısı üzerindeki eliminasyon veya biyofilm oluşumu üzerindeki inhibisyon etkinliğinin kültür yöntemi, spektrofotometrik yöntem ve konfokal lazer taramalı mikroskop (KLTM) analizi kullanılarak incelenmesidir.

Yöntem: Bitkisel kökenli etken madde çözeltilerinin antibakteriyel ve antibiyofilm etkinliklerinin belirlenmesi amacıyla bir ön çalışma yapıldı ve çeşitli testler uygulandıktan sonra en etkili bulunan 2 etken maddenin NaOCl ile karşılaştırılması hedeflendi. Çekilmiş insan premolar dişlerinin kemomekanik preparasyon ve dekoranizasyon işlemlerinden sonra dikey kesitleri alındı (n=98) ve E. faecalis'e maruz bırakılmak üzere hücre kültür plağına yerleştirildi. Etken maddelerin biyofilm eliminasyonuna etkisinin değerlendirildiği ilk deneyde (deney 1; n=50), dişler gruplara ayrıldı (n=12) ve test solüsyonu varlığında 1 hafta süreyle inkübe edildi [Grup 1: alfa-pinen (AP) (2mM); Grup 2: berberin (BE) (2mM); Grup 3: NaOCl (%2,5); Grup 4: kontrol]. Etken maddelerin biyofilm oluşumuna etkilerinin (deney 2; n=48) değerlendirilmesi amacıyla dişler gruplara ayrıldı (n=12) ve E. faecalis ile 1 haftalık inkübasyonun ardından çeşitli test solüsyonlarına tabi tutuldu [Grup 1: AP (24 saat); Grup 2: BE (24 saat); Grup 3: NaOCl (5 dakika); Grup 4: kontrol (24 saat)]. Kök kanalları kültür yöntemi ile ve konfokal lazer taramalı mikroskop (KLTM) altında incelendi. Toplanan veriler sonucunda istatistiksel analiz yapıldı.	

Bulgular: Farklı bitkisel kökenli etken madde çözeltilerinin E. faecalis biyofilm oluşumu ve eliminasyonuna potansiyel etkileri kuyucuk difüzyon ve spektrofotometrik kristal viyole metodu ile incelendi. E. faecalis için biyofilm oluşumunu en yüksek oranda AP (%25,1) ve BE (%17,7)'nin inhibe ettiği belirlendi. E. faecalis ile 1 haftalık inkübasyon süresi biyofilm oluşumu TEM görüntüleri ile doğrulandı. Diş örneklerinde 1 haftalık E. faecalis biyofilmi oluşumu sonrasında kontrol grubu olan Grup 4'de ise 8,08 log10 KOB/mL E. faecalis hücresi mevcut iken, Grup 1, 2 ve 3 için hiç canlı hücre bulunmadı (p<0,001). Diş örnekleri test solüsyonu varlığında E. faecalis hücreleri ile 1 hafta inkübe edilmesi sonucunda kontrol grubu olan Grup 4'de 8,08 log10 E. faecalis hücresi mevcut iken, BE ve NaOCl ile inkübe edilen diş örneklerinde hiç canlı hücre bulunmadığı, AP ile inkübe edilen diş örneklerinde ise 7,47 log10 canlı hücre olduğu bulundu (p<0,001).

Sonuç: Bitkisel kökenli etken madde çözeltilerinin gerek E. faecalis biyofilmi üzerindeki antibakteriyel gerekse biyofilm oluşumu üzerindeki inhibitör etkinliğinin incelendiği bu çalışmada, her bir deneyin kendi içerisinde AP, BE ve NaOCl uygulama sonrası kontrol grubuna kıyasla canlı E. faecalis hücre sayısında istatistiksel olarak anlamlı azalma bulunmuştur (p<0,001).

Anahtar Kelimeler: Bitkisel kökenli etken madde, berberin, alfa-pinen, E. faecalis, biyofilm eliminasyonu, biyofilm inhibisyonu.

Abstract:
Aim: The aim of this study was to evaluate the biofilm elimination capacity as well as the inhibitory effect of some herbal components on the formation of Enterococcus faecalis (E. faecalis) biofilm, which was analyzed by spectrophotometric method and confocal scanning laser microscopy (CSLM).

Method: A preliminary study was carried out to determine the antibacterial and antibiofilm activities of plant derived active components, after which the 2 most effective ones were compared with NaOCl. Extracted human premolars were vertically sectioned after chemomechanical preparation and decoranization (n=98) and placed in cell culture plates for exposure to E. faecalis. In the first experiment (n=50) in which the effect of active substances on biofilm elimination was evaluated, the teeth (n=12) were incubated for 1 week in the presence of a test solution [Group 1: alpha-pinene (AP) (2mM); Group 2: berberine (BE) (2mM); Group 3: NaOCl (2.5%); Group 4: control]. To evaluate the effects of active substances on biofilm formation (experiment 2; n=48), the teeth were divided into groups (n=12) and subjected to various test solutions after a 1-week incubation with E. faecalis. [Group 1: AP (24); Group 2: BE (24 hours); Group 3: NaOCl (5 min); Group 4: control (24 hours)]. Root canals were examined by microbiological culturing and confocal scanning laser microscopy (CSLM). Statistical analysis was performed.


Results: The potential effects of different plant-derived bioactive components on the formation and elimination of E. faecalis biofilm were investigated by well diffusion and spectrophotometric crystal violet analysis. It was determined that AP (25.1%) and BE (17.7%) inhibited E. faecalis biofilm formation at the highest rate. After 1 week of E. faecalis biofilm formation in tooth samples, 8.08 log10 CFU/mL E. faecalis cells were present in Group 4 (control), while no viable cells were found for Groups 1, 2 and 3 (p<0.001). Samples that were cultured with E. faecalis cells in the presence of test solution for 1 week, 8.08 log10 E. faecalis cells were present in Group 4 (control) whereas no viable cells were found in the samples incubated with BE and NaOCl (p<0.001).

Conclusion: In this study, in which the antibacterial and inhibitory effects of herbal bioactive components on both E. faecalis biofilm formation and elimination were investigated, a statistically significant decrease in the number of viable E. faecalis cells was found in each experiment compared to the control group after the application of AP, BE and NaOCl (p<0.001).

Keywords: Herbal antibacterial components, berberine, alpha-pinene, E. faecalis, biofilm elimination, biofilm inhibition.