Retina pigment epitel hücrelerinde (ARPE-19) hidrojen peroksit ile oluşturulan oksidatif streste pinosembrin ve pinostrobinin hücre canlılığı üzerindeki etkinliğinin araştırılması
Investigation of the effectiveness of oxidative stress pinocembrin and pinostrobin on cell viability of hydrogen peroxide in retinal pigment epithelial cells (ARPE-19)
Yazar: DERYA KILIÇASLAN
Danışman: DOÇ. DR. AKİF HAKAN KURT
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya = Chemistry

Özet:
Yaşa bağlı makula dejenerasyonu, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen görme kaybının önde gelen sebeblerinden biridir. Temel ve klinik çalışmalardan elde edilen verilerin artması, oksidatif hasarın yaşa bağlı makula dejenerasyonunun patogenezinde önemli rol oynadığını ve dolayısıyla, antioksidatif özelliklere sahip maddelerin yaşa bağlı makula dejenerasyonu için umut verici terapötik seçenekler olabileceğini göstermektedir. Son yıllarda önemi giderek artan ve doğal bir ürün olan propolis; bitki ve ağaçların yaprak ve sürgünlerinden bal arıları tarafından toplanan, reçine içeren karışık bir maddedir. Propolisin yapısında bulunan pinosembrin ve pinostrobin propoliste yüksek konsantrasyonda bulunan flavonoidlerdir. Biz bu çalışmamızda hidrojen peroksit (H2O2) ile oksidatif strese maruz kalan retina pigment epitel hücrelerinde (ARPE-19) pinosembrin ve pinostrobinin koruyucu etkisini araştırmayı amaçladık.
Çalışmamızda hücre kültürü olarak, retina pigment epitel hücre serilerinden biri olan ARPE-19 hücre serisi seçildi. ARPE-19 hücre serisinde oksidatif stres hasarını oluşturmak için, 500 µM H2O2'nin 20 saat uygulama süresi esas alınarak inkübasyon uygulandı. Çalışmada H2O2 ile oluşturulan oksidatif streste pinosembrin ve pinostrobinin koruyucu etkisini araştırmak için 4 farklı çalışma grubu oluşturuldu. Öncelikle ARPE-19 hücre serisinde pinosembrin ve pinostrobinin hücre canlılığına etkisine bakıldı. Sonrasında ise ARPE-19 hücre serisinde H2O2 ile oluşturulan oksidatif hasar oluşumunda, pinosembrin ve pinostrobinin öncesi, sonrası ve birlikte uygulamalarıyla etkin dozu belirlendi. Bu uygulamanın ardından hücre canlılık testi için hücre serilerine Metiltiazol difenil tetrazolyum (MTT) analizi yapıldı. Pinosembrin ve pinostrobinin, süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesini belirlemek için 2-(4-iyodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolyum (WST1) analizi kullanıldı. Verilerin değerlendirilmesinde değişkenlerin normal dağılıma uygunluğu Shapiro-Wilk testi ile incelendi. Hücre canlılığının gruplar arasındaki farklılığının incelenmesinde One-Way Anova (tek yönlü varyans analizi) yöntemi uygulandı.
Pinosembrin tek başına ARPE-19 hücre serisine uygulandığında hücre canlılığı üzerine anlamlı bir etki oluşturmadı. Pinosembrinin ARPE 19 hücre serisine, H2O2 ile oksidatif hasar oluşturulmadan 4 saat önce uygulandı ve hücre canlılığını düşük konsantrasyonlarda anlamlı bir şekilde arttırdı. Pinosembrin uygulamasının H2O2 ile oksidatif hasar oluşumuyla birlikte yapıldığında ise hücrede aynı etki görülmedi. Diğer bir uygulama olan pinosembrinin H2O2 ile oksidatif hasar oluşumu sonrasında hücreye uygulanmasının ise hücre canlılığına anlamlı etkisinin olmadığı ve H2O2 ile benzer etki gösterdiği görüldü. Çalışma sonuçlarına göre, pinostrobin üç farklı uygulama olan tek başına, H2O2 ile oksidatif hasar oluşumu öncesi ve sonrası uygulamalarında hücre canlılığını artırarak hücrede oksidatif hasara karşı koruyucu etki gösterdi. Pinostrobinin oksidatif hasar oluşumu öncesi ve sonrası yüksek konsantrasyonda uygulanması antiproliferatif etki gösterdi.
 Bulgularımız sonucunda pinosembrin ve pinostrobinin oksidatif stres kaynaklı hücre hasarında koruyucu veya tedavi edici etkileri görülmektedir. Hücre hasarındaki koruyucu ve tedavi edici etkileri SOD aracılı olabilir. Ayrıca pinosembrin ve pinostrobinin yüksek konsantrasyonda uygulanması antiproliferatif etki gösterdiğinden dolayı, gelecekte kanser çalışmalarında terapötik ajan olarak değerlendirilebilir

Abstract:
Age-related macular degeneration is one of the leading causes of vision loss affecting millions of people worldwide. Increased data from baseline and clinical trials indicate that oxidative damage plays an important role in the pathogenesis of age-related macular degeneration and therefore substances with antioxidative properties may be promising therapeutic options for age-related macular degeneration. In recent years, propolis, a natural and growing product, is a mixed material containing resin, collected by the honey bees from the leaves and shoots of plants and trees. Pinocembrin and pinostrobin, which are found in the structure of propolisine, are flavonoids found in high constructions. Pinocembrin and pinostrobin, which are found in propolisine structure, are flavonoids found in high concentration in propolis. In this study, we aimed to investigate the protective effect of Pinocembrin and pinostrobin in retinal pigment epithelial cells (ARPE-19) exposed to oxidative stress by hydrogen peroxide (H2O2).
In our study, ARPE-19 cell line, one of the retinal pigment epithelial cell lines, was selected as cell culture. In order to generate oxidative stress damage in the ARPE-19 cell line, incubation was carried out based on a 20-hour application period of 500 μM H2O2. The study was carried out with 4 different study groups to investigate the protective effect of Pinocembrin and pinostrobin on the oxidative oxidative damage formed with H2O2. First, the effects of Pinocembrin and pinostrobin on cell viability were examined in ARPE-19 cell series. Subsequently, in the formation of oxidative damage caused by H2O2 in the ARPE-19 cell line, the effective dose was determined by pre-, post- and co-administration of pinocembrin and pinostrobin. Following this procedure, Methyl Thiazol Tetrazolium (MTT) analysis was performed on the cell lines for cell viability test. Pinocembrin and pinostrobin were used for 2-(4-Iodophenyl)- 3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)- 2H-tetrazolium, monosodium salt (WST1) analysis to determine superoxide dismutase (SOD) activity. The normal distribution of the variables was evaluated by the Shapiro-Wilk test in the evaluation of the data. One-way ANOVA (one-way ANOVA) was used to examine the differences in cell viability between groups.
Pinocembrin alone did not have a significant effect on cell viability when applied to the ARPE-19 cell line. Pinocembrin was administered to the ARPE-19 cell line four hours prior to the formation of oxidative damage with H2O2 and significantly increased cell viability at low concentrations. When the application of pinocembrin was performed together with the formation of oxidative damage with H2O2, the same effect was not observed in the cell. According to the results of the study, pinostrobin showed protective effect against oxidative damage in the cell by increasing cell viability before and after the formation of oxidative damage with H2O2 alone in three different applications. The application of pinostrobin at high concentration before and after the formation of oxidative damage showed an antiproliferative effect.