Hyphantria cunea nükleopolihedrovirüs`ünün Spodoptera frugiperda ve Lymantria dispar hücre kültürlerinde replikasyonunun karşılaştırılması
Comparative replication of Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus in Spodoptera frugiperda and Lymantria dispar insect cell lines
Yazar: İSMAİL DEMİR
Danışman: PROF. DR. ZİHNİ DEMİRBAĞ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2004
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, Hyphantria cunea nükleopolihedrovirüs (HcNPV)'ün Spodoptera frugiperda (IPLB-Sf21) ve Lymantria dispar (IPLB-LdElta) hücre kültürlerinde replikasyon özellikleri araştırıldı. Enfeksiyon, oluşan sitopatik etkiler (CPE), ektrasellüler virüs üretimi ve virüs çoğalma eğrisi, polihedral inklüzyon yapı (PIB) oluşumu, viral DNA replikasyonu, viral yapısal proteinlerin sentezi vepolh gen transkripsiyonuyla belirlendi. Işık mikroskobuyla tespit edilen CPE'lerin Sf21 hücrelerinde LdElta hücrelerine göre yaklaşık 12 saat önce meydana geldiği görüldü. Polihedral inklüzyon yapılar Sf21 hücrelerinde enfeksiyondan 36 saat sonra meydana gelirken, LdElta hücrelerinde ilk olarak enfeksiyondan 48 saat sonra tespit edildi. Doku kültürü enfektif doz %50 (TCID5o)'ye göre belirlenen ektrasellüler virüs üretiminin Sf21 hücrelerine göre LdElta hücrelerinde yaklaşık 12 saat geç meydana geldiği belirlendi. Enfeksiyondan 72 saat sonra Sf21 ve LdElta hücrelerinde üretilen ekstrasellüler virüs miktarı sırasıyla 5,6 x 10 pfu/ml ve 1,77 x 10 pfu/ml olarak hesaplandı. Viral DNA replikasyonunun her iki hücrede de enfeksiyondan 12 saat sonra başladığı Slot Blot hibridizasyonuyla tespit edildi. Viral proteinlerin sentezi poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile belirlendi ve polihedrin proteininin her iki hücrede de enfeksiyondan 24 saat sonra ortaya çıktığı gösterildi. HcNPV -polh geninin hem Sf21 hem de LdElta hücrelerinde enfeksiyondan 10 saat sonra transkrip olduğu revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile gösterildi. Hücrelerde üretilen PIB'lerin H. cunea ve L. dispar larvaları üzerinde sırasıyla %51,9 ve %65,38 insektisidal etkiye sahip olduğu biyoassay testleriyle hesaplandı. HcNPV'nin makromoleküllerinin sentezinin Sf21 hücrelerindekine göre LdElta hücrelerinde yaklaşık 12 saat daha geç ve toplam virüs partikülleri üretiminin ise yaklaşık 3 kat az olduğu belirlendi. Anahtar Kelimeler: Baculovirus, HcNPV, Sf21, LdElta, Virüs Replikasyonu VI

Abstract:
Comparative Replication of Hyphantria cunea Nucleopolyhedrovirus in Spodoptera frugiperda and Lymantria dispar Insect Cell Lines In this study, replicational properties of Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus (HcNPV) were investigated in Spodoptera frugiperda (IPLB-Sf21) and Lymantria dispar (IPLB-Elta) cell lines. Infection was determined by formation of cytopathic effects (CPE), replication of viral DNA, transcription ofpolh gene, synthesis of viral structural proteins, production of extracellular virus, and formation of polyhedral inclusion body (PIB). It was observed that the CPEs determined by light microscopy in Sf21 cells appeared about 12 hours earlier as compared to those of LdElta cells. While polyhedral inclusion bodies formed at 36 h postinfection (p.i) in Sf21 cells, it was at 48 h p.i. in LdElta cells. Extracellular virus production determined according to cell culture infective dose 50% methods (TCID50) in LdElta cells formed about 12 h later when compared with Sf21 cells. Extracellular virus amounts produced in Sf21 and LdElta cells were calculated as 5.6 x 10 pfu/ml and 1.77 x 109 pfu/ml respectively, at 72 h p.i. It was determined that viral DNA replication defined by slot blot hibridization began at 12 h p.i. in both cells. Viral protein synthesis was determined by SDS-polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) and polyhedrine synthesis was observed at 12 h p.i. in both cells. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) results indicate that HcNPV-polh gene was transcribed at 10 h p.i. in both Sf2 1 and LdElta cells. Insecticidal effects of PIBs produced in cells were calculated as 51.9% and 65.38% on H. cunea and L. dispar larvae, respectively, by bioassay. Results indicate that the synthesis of macromolecules is 12 h late and production of extracellular virus is almost 3-fold low in LdElta cells compare to Sf21 cells. Key Words: Baculovirus, HcNPV, Sf21, LdElta, Virus Replication VII