Hematopoetik kök hücre nakli yapılan hastalarda gelişen intestinal komplikasyonlar ile bağırsakta blastocystis spp. varlığı ilişkisinin araştırılması
Investigation of the relationship between intestinal complications developing in patients who underwent hematopoietic stem cell transplantation and the presence of blastocystis spp. in the intestine
Yazar: BÜŞRA DEDECAN
Danışman: PROF. DR. GÜLAY AKARSU
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Hematoloji = Hematology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Parazitoloji = Parasitology

Özet:
Amaç: Hematopoetik kök hücre nakli (HKHN), çocuklarda ve yetişkinlerde çeşitli malign ve malign olmayan hastalıkların tedavisinde kullanılan ve yıllık uygulanma sayısı giderek artan bir yöntemdir. Bu hasta grubunda gelişmesi olası intestinal komplikasyonlar bulunmaktadır. Bağırsak mukoziti, HKHN'nin erken döneminde miyeloablatif hazırlayıcı rejimlerin ve metotreksatın en sık görülen komplikasyonudur. HKHN sonrası intestinal komplikasyonların gelişiminden %10-15 oranında enfeksiyöz etkenler sorumlu tutulmuştur. Genellikle ishale yol açan bağırsak enfeksiyonları, bu popülasyonda morbidite ve mortalite oranlarını yükseltmektedir. Bu duruma bağlı olarak, bağışıklığı baskılanmış popülasyonda intestinal enfeksiyöz etkenlerden olan parazitlerin klinik önemi de artmaktadır.
Blastocystis spp.'nin, en sık görülen bağırsak protozoonu olarak, sağlıklı ve bağışıklığı baskılanmış kişilerde gastrointestinal hastalıktaki rolü henüz belirsizliğini korumaktadır. Şimdiye kadar HKHN yapılan iki hastada, Blastocystis spp.'nin özgül tedavisi sonucu dışkıdan eradikasyonu ile klinik iyileşmenin eşzamanlı görülmesi Blastocystis spp.'nin etken olabileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmanın amacı bağırsakta en sık görülen protozoon olan Blastocystis spp.'nin HKHN hastalarındaki varlığını ve HKHN sonrası intestinal komplikasyonların gelişimi ile olan birlikteliğini araştırmaktır.
Gereç ve Yöntem: Çalışmaya Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı Kök Hücre Nakil Merkezi'nde HKHN yapılıp çalışmaya dahil olmayı kabul eden hastalar (n=51) ve sağlıklı bireyler (n=50) dahil edilmiştir. HKHN yapılmış hastalardan, hazırlık rejimi öncesi, nakil sonrası ishal geliştiğinde ve engraftman gelişimi sonrası olmak üzere üçer defa dışkı örneği alınmıştır. İshal gelişmeyen hastalardan ise hazırlık rejimi öncesi, engraftman gelişimi sonrası ve otolog hematopoetik kök hücre nakli ise nakil sonrası birinci ayda, allojenik hematopoetik kök hücre nakli ise nakil sonrası 100. günde olmak üzere yine üçer dışkı örneği alınmıştır. Alınan dışkı örnekleri direkt, yoğunlaştırma ve boyama sonrası mikroskobik inceleme ile Blastocystis spp. ve diğer bağırsak parazitlerinin varlığı açısından araştırılmıştır. Bunun yanı sıra, Blastocystis spp.'ye özgül olarak kültür ve moleküler yöntemler kullanılarak dışkı örnekleri Blastocystis spp. açısından kapsamlı olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca hastaların hastane bilgi yönetim sistemi üzerinden dışkı kültürü ve moleküler gastroenterit panel (GEP) sonuçları diğer etkenler açısından retrospektif olarak incelenmiştir.
Bulgular: Hastaların tedavi öncesi alınan örneklerinin %15,68'inde (8/51), ishal geliştiğinde alınan örneklerin %8,10'unda (3/37), engraftman gelişimi sonrası alınan örneklerin %2,27'sinde (1/44); sağlıklı kontrol grubunun ise %34'ünde (17/50) Blastocystis spp. saptanmıştır. Bir hastada Iodomoeba buetschlii, iki sağlıklı gönüllüde Entamoeba coli, bir sağlıklı gönüllüde Endolimax nana tespit edilmiştir. Dışkı incelemeleri ile tüm örneklerin direkt bakı ile %9,47'si (18/190) Trichrome boyama ile %4,73'ü (9/190), kültür ile %12,63'ü (24/190), PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile %14,73'ü (28/190) Blastocystis spp. açısından pozitif bulunmuştur. Ayrıca dokuz hastanın konvansiyonel ve/veya moleküler yöntemler ile Blastocystis spp. pozitif bulunan 12 örneği ve 17 sağlıklı gönüllünün örrneklerine STS-PZR ve dizileme ile alt tip tayini yapılmıştır. STS-PZR ile hasta örneklerinin dördü (%33,33) alt tiplendirilebilmiştir; üç örnekte (%75) ST3, bir örnekte ST1 (%25) tespit edilmiştir. Dizileme ile hasta örneklerinin 11'i (%91,66) alt tiplendirilebilmiş; yedi örnekte ST3 (%63,63), iki örnekte ST1 (%18,18), iki örnekte ise ST2 (%18,18) saptanmıştır. Bir örnekte ise kültürü pozitif saptanmış olmasına rağmen, PZR'de negatif sonuç alınmış olması nedeniyle alt tip tayini yapılamamıştır. STS-PZR ile sağlıklı gönüllü örneklerinin sekizi (%47,05) alt tiplendirilebilmiştir; beş örnekte ST3 (%62,50), bir örnekte ST1 (%12,50) ve iki örnekte ST1+ST3'ü (%25) içeren mikst tip görülmüştür. Dizileme ile sağlıklı gönüllü örneklerinin tamamı alt tiplendirilmiş; 11 sağlıklı gönüllüde ST3 (%64,70), üç sağlıklı gönüllüde ST2 (%17,64), iki sağlıklı gönüllüde ST1 (%11,76) ve bir sağlıklı gönüllüde mikst tip (%5,88) tespit edilmiştir. İshal gelişen hastaların retrospektif sonuçları incelendiğinde hastaların tümünden dışkı kültürü istenmiş, ayrıca uzamış ishali olan 26 hastadan GEP istemi yapılmıştır. Hastaların hiçbirinin dışkı kültüründe Salmonella-Shigella tespit edilmediği, GEP istemi yapılan hastaların ikisinde Clostridium difficile ve birinde Enteropatojenik Escherichia coli saptandığı görülmüştür.
Sonuç: Hastaların ishal döneminde incelenen örneklerindeki Blastocystis spp. sıklığının (%8,10) hem sağlıklı kontrol grubu örneklerinden hem de aynı hastaların hazırlık rejimi öncesi alınan örneklerinden daha az saptanmış olması nedeni ile bu protozoonun HKHN sonrası ishal gelişimi ile negatif bir birlikteliği olabileceği düşünülmüştür. HKHN sonrası ishalin nedenleri arasında enfeksiyöz etkenlerinin rolünün az olduğu gözlenmiştir.  Çalışmamızda Blastocystis spp.'nin sağlıklı kontrol grubunda daha sık görülmesi, literatürde son yıllarda Blastocystis spp.'nin kommensal bir protozoon olduğu ve sağlıklı mikrobiyota göstergesi olabileceği hipotezini desteklemektedir. Ancak bu durumun HKHN yapılan hastalarda, sık antibiyotik kullanımından kaynaklanabileceği de düşünülmüştür. HKHN yapılan hastalarda Blastocystis spp.'nin bağırsak sağlığı ve hastalığı üzerindeki rolünün anlaşılması için daha fazla çalışma yapılmasına ihtiyaç vardır. Anahtar Kelimeler: Blastocystis spp., hematopoetik kök hücre nakli, intestinal komplikasyon, mikroskopi, kültür, moleküler yöntemler

Abstract:
Aim: Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a confirmed treatment method for various malignant and non-malignant diseases in children and adults and is increasing at a rapid pace every year worldwide. There are possible intestinal complications that may develop in this patient group. Intestinal mucositis is the most common complication of myeloablative conditioning regimens and methotrexate in the early stages of HSCT. Infectious factors have been held responsible for 10-15% of the development of intestinal complications after HSCT. Intestinal infections causing diarrhea lead, increasing morbidity and mortality rates in this population. Therefore, the clinical importance of intestinal parasites in the immunosuppressed population is increasing.
The role of Blastocystis spp. in gastrointestinal disease in both immunocompetent and immunocompromised individuals is unclear. Up to now, in only one report of a case who underwent HSCT, the eradication of Blastocystis spp. from feces as a result of specific treatment and simultaneous clinical improvement suggested that Blastocystis spp. might be the causative agent. The aim of this study is to identify Blastocystis spp., the most common intestinal protozoan, in various phases of HSCT and define the association of its presence with the development of intestinal complications after HSCT.
Materials and methods: The study included patients (n=51) who underwent HSCT at  the Stem Cell Transplantation Center, Department of Hematology, Ankara University Faculty of Medicine, and healthy individuals (n=50). All accepted to participate in the study. Three stool samples were obtained from patients who underwent HSCT: before the preparation regimen, during diarrhea which developed after transplantation, and after engraftment. Three stool samples were taken from patients who did not develop diarrhea: before the preparation regimen, after engraftment, at the end of the first month after transplantation for autologous haematopoietic stem cell transplantation, and on the 100th day after transplantation for allogeneic stem cell transplantation. The stool samples were investigated for the presence of Blastocystis spp. and other intestinal parasites by direct, concentrated, and stained microscopic examination. In addition, Blastocystis spp. specific culture and molecular methods were used to deepen the Blastocystis spp. research. In addition, stool culture and molecular gastroenteritis panel results of the patients were retrospectively examined for other factors through the hospital information management system.
Results: Blastocystis spp. was detected in 15.7% (8/51) of the samples taken before treatment from the patients, in 8.1% (3/37) of the samples obtained when diarrhea developed, in 2.2% (1/44) of the samples taken after engraftment development, and in 34% (17/50) of the healthy control group. Iodomoeba buetschlii was detected in one patient, Entamoeba coli in two healthy volunteers, and Endolimax nana in one healthy volunteer. No coccidian parasites were found in the patient and healthy control groups. Of all stool samples, 9.47% (18/190) were found to be positive for Blastocystis spp. by direct examination, 4.73% (9/190) by Trichrome staining, 12.63% (24/190) by culture and 14.73% (28/190) by PCR (Polymerase Chain Reaction). Samples from 12 patients and 17 healthy volunteers who were found to be positive for Blastocystis spp. by conventional and/or molecular methods were subtyped by STS-PCR and sequencing. With STS-PCR, four (33.33%) of the patient samples could be subtyped; ST3 was detected in three samples (75%) and ST1 (25%) in one sample. With sequencing, 11 (91.66%) of the patient samples could be subtyped; ST3 (63.63%) was detected in seven samples, ST1 (18.18%) in two samples, and ST2 (18.18%) in two samples. Eight (47.05%) of the healthy volunteer samples could be subtyped with STS-PCR; ST3 (62.50%) was seen in five samples, ST1 (12.50%) in one sample, and a mixed type containing ST1+ST3 (25%) was seen in two samples. All of the healthy volunteer samples were subtyped by sequencing; ST3 was detected in 11 healthy volunteers (64.70%), ST2 in three healthy volunteers (17.64%), ST1 in two healthy volunteers (11.76%) and mixed type in one healthy volunteer (5.88%). When the retrospective results of the patients who developed diarrhea were examined, stool cultures were requested from all patients, and GEP was requested from 26 patients with prolonged diarrhea. It was observed that Salmonella-Shigella was not detected in the stool culture of any of the patients, C. difficile was detected in two of the patients who had a GEP request, and Enteropathogenic E. coli was detected in one.
Conclusions: It has been observed that infectious agents are more in the background among the causes of diarrhea after HSCT. Since the frequency of Blastocystis spp. in the samples examined during the diarrhea period of the patients (8.10%) was detected less than both the healthy control group samples and the samples taken from the same patients before the preparation regimen, it was not thought that this protozoa had a positive association with the development of diarrhea after HSCT. The fact that Blastocystis spp. was seen more frequently in the healthy control group in our study supports the hypothesis that Blastocystis spp. is a commensal protozoan and may be an indicator of healthy microbiota in the literature in recent years. However, it has also been thought that this situation may be due to the frequent use of antibiotics in patients undergoing HSCT. More studies are needed to understand the role of Blastocystis spp. in health and disease.
Key Words: Blastocystis spp., hematopoietic stem cell transplantation, intestinal compliation, microscopy, culture, molecular methods