Kronik lenfositik lösemili hastaların kemik iliği biyopsi örneklerinde IGVH mutasyon durumu ile ZAP70 ve CD38'in immünhistokimyasal olarak analizinin prognostik önemi
Prognostic significance of the IGVH mutation status and immunohistochemical analysis of ZAP70 and CD38 in bone marrow biopsies in chronic lymphocytic leukemia
Yazar: NESİBE KAHRAMAN ÇETİN
Danışman: DOÇ. DR. FURÜZAN KACAR DÖGER
Adnan Menderes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Biyopsi = Biopsy ; Biyopsi-iğne = Biopsy-needle ; Kemik iliği = Bone marrow ; Kemik iliği incelenmesi = Bone marrow examination ; Lösemi-lenfositik-kronik-B hücreli = Leukemia-lymphocytic-chronic-B-Cell ; Mutasyon = Mutation ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis-ayırıcı = Diagnosis-differential ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Kronik lenfositik lösemi (KLL) batı toplumunda, erişkinlerde en sık görülen lösemi türüdür. KLL'nin kinik seyri oldukça değişkendir. Hastaların bir kısmı sessiz klinik gidişe sahipken, bir kısmı hızlı ilerleyen agresif bir davranış gösterir. KLL'nin klinik seyrinden dolayı hızlı seyredecek hastaları önceden belirlemek önemlidir. Rai ve Binet klinik evreleme sistemleri erken evrede tanı konmuş hastalardan hangilerinin hızlı seyredeceğini saptamada yetersizdir. Bu nedenle KLL'de prognozu belirlemeye yardımcı çeşitli faktörler tanımlanmıştır. Son zamanlarda immunglobulin ağır zincir değişken bölge (IgVH) mutasyonunun önemi üzerinde durulmakta olup, mutasyon yokluğunun hızlı ilerleyen hastalık ve kısa süreli sağkalım ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. IgVH mutasyonu pahalı, tesbiti zor bir inceleme olup, nasıl yapılacağı ve değerlendirileceği konusunda kabul edilmiş standart bir protokol yoktur. Bu nedenle mutasyon durumunu indirekt olarak gösterecek markerların kullanımı gündeme gelmiştir. KLL'li olguların IgVH mutasyonsuz formlarında zeta zincir iliskili protein70 (ZAP70) yanı sıra CD38 ekspresyonun saptandığı bildirilmektedir. Bu belirleyicilerin IgVH mutasyonunun yerine kullanılabileceği ileri sürülmektedir.Bu çalışma, KLL'de hızlı progresyon ve agresif gidişle ilişkileri çeşitli çalışmalarla belirlenen ZAP70 ve CD38 proteinleri ile IgVH mutasyon durumu arasındaki ilişkileri değerlendirmek ve bunların ekspresyonunun kemik iliği infiltrasyon paternleri ile bağlantısı olup olmadığını ortaya koymak amacıyla planlanmıştır.Gereç ve yöntem: Beş yıllık süre içinde KLL tanısı konan 84 olgunun kemik iliği biopsi örneklerinin parafin bloklarından elde edilen kesitlere avidin-biotin peroksidaz yöntemiyle ZAP70 ve CD38 antikorları uygulanmıştır. Tümör hücrelerinin her iki antikorla boyanma oranları saptanarak birbirleriyle karşılaştırılmış; her bir antikor ise kendi içinde kemik iliği infiltrasyon paternleri açısından değerlendirilmiştir. Ayrıca 20 hastaya ait parafine gömülü kemik iliği biyopsilerinden izole edilen DNA örneklerinden Biomed-2 primerler kullanılarak PCR ve sekans analizi ile IgVH mutasyon durumu değerlendirilmiş, immünhistokimya ile ilişkisi araştırılmıştır.Bulgular: Kötü prognostik faktör oldukları yaygın olarak kabul edilen ZAP70 ve CD38'in boyanma oranları arasında istatistiksel olarak pozitif korelasyon (P=0.000) bulunmuş, bu korelasyon bu iki belirleyici ile IgVH mutasyon durumu arasında saptanmamıştır. (sırasıyla p=1.000 ve p=0.931). Ayrıca ZAP70 boyanması gösteren olguların istatistiksel olrak anlamlı bir şekilde tanı sonrasında daha erken tedavi gereksinimi olduğu gözlenmiştir (p=0.046).Kemik iliği infiltrasyon paterni ile ZAP70 ve CD38 ekspresyonun diffüz tutulumda anlamlı biçimde fazla olduğu saptanmıştır (sırasıyla p=0,000, p=0,001). Ayrıca diffüz infiltrasyon gösteren olguların tanı sonrası erken tedavi gereksinimi olduğu (p=0,019) ve Binet klinik evre açısından ileri evrede (Evre B, C) bulunduğu (p=0,000) gözlenmiştir.Sonuç: KLL'de ZAP70 ve CD38 ekpresyonlarının kötü prognostik belirleyici olarak rutinde kullanılabileceği, IgVH mutasyon durumunun hastalığın seyri ve progresyon açısından riskini belirlemede yararlı olduğunu göstermek için daha geniş vaka gruplarına ihtiyaç olduğu ve kemik iliği biyopsi örneklerinde diffüz infiltrasyonunun kötü prognostik faktör olarak dikkate alınmaya devam edilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. Özellikle ZAP70 pozitif olan hastaların daha hızlı seyredebileceği ve erken tedavi gereksinimleri olabileceği düşünülerek bu hastalar yakın klinik takip altında tutulmalıdır.Anahtar kelimeler: KLL, kemik iliği biyopsisi, IgVH mutasyonu, ZAP70, CD38, immünohistokimya, PCR

Abstract:
Chronic lymhocytic leukemia (CLL) is a common malignancy among adults in Western countries. It may have a various processes in a range of between subtle and aggressive nature. It is important to predict whether the patients would have the agressive disease. Rai and Binnet Classification systems are not enough to make this prediction. Thus, a number of complementary factors have been introduced to predict the prognosis of CLL. Recently, efforts focus on the immunoglobulin heavy chain variable domain (IgVH); it is thought that the abcence of mutation is associated with aggressive disease and poor survival outcomes. Identification of IgVH mutations are expensive and difficult; moreover, there is no consensus on any standarts about how to perform or evaluate, so indirect methods indicating the mutation status become more important. It is reported that Zeta chain-associated protein 70 and CD38 are expressed in the absence of IgVH mutations in CLL. It is said these indicators may be used instead of IgVH mutation identification.This study aims to evaluate the relationships between IgVH, ZAP70 and CD38 proteins, which has been shown to be associated with poor prognosis, and to investigate whether their expression is related with the bone marrow infiltration patterns.MATERİAL&METHOD: Paraffin blocks of bone marrow biopsy specimen of 84 patients with CLL was collected within 5 years, then ZAP70 and CD38 antibodies were performed to the slices from the parafin blocks via avidin-biotin method. Staining of tumor cells with these two antibodies were compared, each antibody was assessed with respect to marrow infiltration patterns. On the other hand, DNA samples of 20 patients were isolated from the paraffin blocks and PCR was performed using Biomed-2 primers and IgVH mutation status with sequence analysis was evaluated; then results were compared to immunohistochemistry.RESULTS: Well known poor prognostic factors, ZAP70 and CD38 had positive correlation between their staining (p=0,000); but that correlation was not found between this two indicators and IgVH (p=1.000 and p=0.931, respectively). It is also observed that ZAP70 staining cases required earlier treatment following diagnosis (p=0,046).Bone marrow infiltration pattern and ZAP70 and CD38 expression were analyzed and with immunohistochemistry, both markers were found to have increased expression in diffuse infiltration (for ZAP70; p=0,000, for CD38; p=0,001). The patients with diffuse infiltration needed earlier treatment (p=0,019) and they had advanced disease according to Binnet classification (Stage B,C) (p=0,000).CONCLUSION: we conclude that ZAP70 and CD38 expressions may be used in routine practice as a negatif prognostic factor in CLL. Larger study groups are required to demonstrate the risk of IgVH mutation status on the nature and the progression of the disease. It is also revealed that we should propose the diffuse infiltration as a poor prognostic factor. Of note, patients with positive ZAP70 staining may have more agressive disease and earlier treatment should be considered and so they should have closer follow up.Keywords: CLL, bone marrow biopsy, IgVH mutation, ZAP70, CD38, immunohistochemistry, PCR