Mesane kanserinde immunoterapiye yanıtta kanser kök hücrelerinin rolü
Role of cancer stem cells in response to immunotherapy in bladder cancer
Yazar: YEGANE KOULİEVA ÖZCAN
Danışman: PROF. DR. SAFİYE AKTAŞ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Onkoloji Ana Bilim Dalı / Temel Onkoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Hücre dizisi = Cell line ; Kök hücreler = Stem cells ; Mesane neoplazmları = Urinary bladder neoplasms ; Mycobacterium bovis = Mycobacterium bovis ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nüks = Recurrence ; İmmünoterapi = Immunotherapy

Özet:
Mesane kanseri mesanenin en içte bulunan tabakasından köken alır.  Sık rekürrenslerle karakterizedir. Rekürrenslerin ana  kaynaklarından biri olarak CD44+ kanser kök hücreleri (KKH) düşünülebilir.  Bacillus calmette guerin (BCG) mesane kanserlerinin tedavisinde altın standart haline gelmiş bir immunoterapi çeşidi olmasına karşın rekürrensler ile oldukça sık karşılaşılmaktadır. Bu bilgilerden yola çıkarak bu çalışmanın amacı mesane kanseri hücre kültürlerinde BCG tedavisi ile mesane kanseri kök hücreleri arasındaki ilişkiyi araştırmaktır. 
Bu çalışmada, farklı karakteristiklerdeki (T24, 5637 ve CLS439) insan mesane kanseri hücre hatları ve manyetik boncuk izolasyon yöntemi ile (Miltenyl Magtech) izole edilmiş, CD44+ fenotipindeki KKH 'leri kullanılmıştır.  Mesane kanseri hücre hatları ve bunlardan izole edilmiş KKH'leri, 37 °C sıcaklıkta %5 CO2 içeren nemli ortamda komplet DMEM ve  RPMI 1640 ortamlarında üretildikten sonra BCG, interferon alfa, interlökin 2 , mononükleer hücre ve kombinasyonları  24, 48 ve 72 saat süre ile uygulanmıştır.  İlaç ve kontrol gruplarındaki apoptotik ve nekrotik hücre oranları tayin etmek için Anneksin V-PI testi uygulanmıştır. Uygulamalardan sonra RNA izolasyonu yapılarak, cDNA ya çevrim yapılıp Real Time PCR ile immün yanıtta görevli olan inflamatuar sitokinler ve reseptörleri PCR array yöntemi ile değerlendirilmiştir. Kantitatif olarak kat değişimleri değerlendirilmiştir. Genlerin ekspresyonlarının kat değişimleri gruplar arasında karşılaştırılmıştır. Sitokin ve kemokin standart array (Biorad) de  84 gen RT-PCR ile kantitatif olarak analiz edildi.
7,32 mikrogram/ml dozda BCG ile IL-2 (1000IU/ml) ve mononükleer hücre (1000 hücre/ml) mesane kanseri hücrelerine en etkili olarak saptandı. Her üç hücre hattına ait KKH'lerine BCG ve kombinasyonlar uygulandığında, BCG tedavisi kanser hücreleri yanında KKH'lerine de sitotoksik etkili bulundu.  Kanser hücreleri ile karşılaştırıldığında üç hücre hattına ait KKHlerinde CXCL5, CCL8 CNTF, CSF yüksek bulunmuştur. KKH ile karşılaştırıldığında kanser hücrelerinde, IL6, TNSFF11, FASLG, CXCL9 yüksek bulunmuştur. Tüm hücre hatlarında, BCG uygulaması CXCL5 ve LTB  ifadeleri arttarken; CCL20 ve IL6 azalmıştır. BCG; IL2 ve MNH ile birlikte uygulandığında, CXCL10, CXCL5, IFNG artmış; ve CXCL12, IL6, TNSF11 azalmıştır. KKH üzerine BCG uygulaması ADIPOQ, CXCL10, XCL1 de artışa ve CCL8 de azalışa sebep olmuştur. BCG ile IL2 ve MNH kombinasyonu, bir çok kemokin ve sitokinin ifadesini azaltmıştır. 
BCG uygulaması mesane kanserinde bir çok sitokin ve kemokin ifadesini değiştirmektedir. Üç hücre hattında ve onların KKH' ları arasında ekspresyonlar farklıdır. Her olgunun immune modülasyonu kendi aralarında farklılıklar göstermektedir.   Mesane KKH üzerine BCG temelli immünoterapinin etkinliğini MNH ve IL2 kombinasyonları azaltabilecektir. Bulgularımız, mesane kanserinde BCG tedavisi sonrasında rekürrenslerin nedeninin temel olarak KKH hipotezi ile açıklanamayacağını göstermektedir. Mesane kanseri yüzey epitelinin farklı loküslerinden gelişen sistemik bir hastalık olarak düşünülebilir.  Bundan sonraki hedefimiz hastalardan elde edilen kanser hücreleri üzerinde BCG etkisini ex vivo değerlendirmektir.

Anahtar Kelimeler: Mesane Kanseri, Basil Kalmet Guerin, Kanser Kök Hücreleri

Abstract:
Bladder cancer originates from innermost layer of the bladder. It is characterized with frequent recurrences.  CD44+ cancer stem cells (CSCs) might be one of the main reasons of recurrence. Although Bacillus Calmette Guerin (BCG) has become a gold standard immunotherapy, after treatment the recurrences are frequently occurring. Upon this knowledge, the aim of this study was to evaluate the changes of cytokine and chemokine expressions in bladder cancer and cancer stem cell cultures in vitro on which BCG treatment in combination with other immunotherapeutic agents applied. 
In this study, three cell lines with different characteristics (T24, 5637 and JMSU-1) of human bladder cancer cells and CD44+ bladder CSCs isolated by magnetic bead isolation (Miltenyl Magtech) were used. Bladder cancer cell lines and bladder CSCs in complete medium were cultured under humidified conditions of 37 °C temperature in 5% CO2. BCG, interferon alpha, interleukin 2, mononuclear cells and their combination were applied on bladder cancer cell lines and bladder CSCs for 24, 48 and 72 hours. Annexin V- PI was used to detect the percentages of apoptotic and necrotic cells in treatment groups and control groups. After treatments, total RNAs were isolated and converted to cDNA for each group and controls. Quantitative fold changes in terms of gene expression were measured by RT –PCR array and fold changes for expression levels of genes were compared among groups. 84 genes in standard array of chemokines and cytokines (Biorad) were analyzed. 
BCG treatment at 7.32 microgram/ml dose in combination with IL-2 (1000IU/ml) and mononuclear cells (MNC) (1000 cells/ml) was found to be most effective in bladder cancer cells. When BCG and its combinations were applied to CSCs of each three cell line, BCG treatment showed cytotoxic effect on CSCs as well as cancer cells. CSCs of three cell lines over expressed CXCL5, CCL8, CNTF, CSF2 compared with cancer cells. Cancer cells over expressed IL6, TNSFF11, FASLG, CXCL9 compared with CSCs. In all three cell lines; BCG application increased expression of CXCL5 and LTB; besides decreased CCL20 and IL6. When BCG was combined with IL-2 and MNCs CXCL10, CXCL5, IFNG were increased and CXCL12, IL-6,  TNSF11 were decreased. BCG treatment on CSCs caused increase in ADIPOQ, CXCL10, XCL1 and decrease in CCL8. When IL-2 and MNCs were combined with BCG; expression of many of the cytokines and chemokines were decreased. 
BCG treatment differs many of the cytokines and chemokines expression in bladder cancer. The expression differs on three different cell lines and their CSCs. Immun modulation of each case differs among each other. The affectivity of BCG based immunotherapy in bladder cancer on CSCs might decrease with combination of MNCs and IL-2.  Our results indicate that recurrences after BCG treatment in bladder cancer may not be mainly based on CSC hypothesis considering bladder cancer as a systemic disease occurring at different loci of surface epitheliumOur next step will be evaluating BCG effect ex vivo on cancer cells obtained from patients with bladder cancer..

Key Words: Bladder cancer, Bacillus Calmette Guerin, Cancer Stem Cells