Selülotik atıklardan izole edilen Bacillus cereus bakterisi tarafından üretilen selülaz enziminin biyokimyasal karakterizasyonu
Biochemical characterization of cellulase enzyme by Bacillus cereus isolated from cellulotic waste
Yazar: HATİCE ELİF IŞIK BİÇEN
Danışman: DOÇ. DR. SERPİL UĞRAŞ
Düzce Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Bacillus cereus = Bacillus cereus ; Elektroforez-poliakrilamid jel = Electrophoresis-polyacrylamide gel ; Enzim aktivasyonu = Enzyme activation ; Selülaz = Cellulase

Özet:
Selülaz enzimi, bazı bakteri ve mantar türleri tarafından sentezlenen ve selülozun ß-l,4 glikozit bağlarını parçalayan enzimdir. Selülaz enzimi gıda, kâğıt, tekstil endüstrisi, hayvan yemleri ve deterjan üretimi gibi geniş bir kullanım alanına sahiptir. Böylesi geniş bir endüstriyel kullanıma sahip mevcut selülaz enzimlerine bir yenisini ekleyebilmek amacıyla tasarlanmış bu çalışmada, selülotik bakteri izolasyonu, tanımlanması, tanımlanan bakteri tarafından sentezlenen selülaz enziminin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Öncelikle, fındık atıklarının olduğu toprak numunelerinden izole edilen otuz adet bakteri suşunun selülaz enzimi üretme kapasitesi yapılan kalitatif tayin ile araştırılmış ve bu bakteriler arasında en iyi selülaz üreticisinin izolat DU-1 olduğu belirlenmiştir. Enzim üretici izolat morfolojik, biyokimyasal ve moleküler teknikler ile tanımlanmış ve bakteri Bacillus cereus DU-1 olarak tür boyunda tanımlanmıştır. Yapılan enzim karakterizasyonu çalışmaları neticesinde B. cereus DU-1 bakterisinin enzim üretmesi için gerekli optimum şartlar; tripton (azot kaynağı), pH 7.0, sıcaklık 37oC ve süre 24 saat olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, 50oC'de ve pH 6.0' da enzimin aktivitesinin (4,73 U/mL) optimum olduğu tespit edilmiştir. Enzim kinetiği analizi sonucunda enzimin Vmax değeri 3,18 U/mL ve Km değeri 0,0019 mM olarak bulunmuştur. Son olarak enzim amonyum sülfat çöktürmesi ile kısmi olarak saflaştırılmıştır. Kısmi saflaştırılan enzimin moleküler büyüklüğü SDS-PAGE ve Zimogram analizi ile yaklaşık 40 kDa olarak belirlenmiştir.

Abstract:
Cellulase enzyme is the enzyme synthesized by some bacterial and fungal species and breaks down the ß-1,4 glycoside bonds of cellulose. Cellulase enzyme has a wide range of uses such as food, paper, textile industry, animal feed and detergent production. In this study, which was designed to add a new cellulase enzyme to the existing cellulase enzymes with such a wide industrial use, cellulotic bacteria isolation, identification, partial purification and characterization of the cellulase enzyme synthesized by the identified bacteria were performed. First of all, cellulase enzyme production capacity of thirty bacterial strains isolated from soil samples containing hazelnut wastes was investigated by qualitative assay and it was determined that the best cellulase producer among these bacteria was isolate DU-1. The enzyme producing isolate was identified by morphological, biochemical and molecular techniques and the bacterium was identified  as Bacillus cereus DU-1. As a result of enzyme characterization studies, optimum conditions for enzyme production by B. cereus DU-1 bacteria was determined as tryptone (nitrogen source), pH 7.0, 37oC and 24 hours. However, it was determined that the activity of the enzyme (4.73 U/mL) was optimum at 50oC and pH 6.0. As a result of the enzyme kinetic analysis, the Vmax value of the enzyme was found as 3.18 U/mL and the Km value was found as 0.0019 mM. Finally, the enzyme was partially purified by ammonium sulfate precipitation.The molecular size of the partially purified enzyme was determined as approximately 40 kDa by SDS-PAGE and Zymogram analysis.