HT-29 insan kolon kanseri hücre hattında Eriodictyol ve Brusatol'un 5-Florourasil ile kullanımının hücre canlılığı ve apoptoz üzerindeki potansiyel etkilerinin araştırılması
Investıgatıon of the potentıal effects of Erıodıctyol and Brusatol wıth 5-Florouracıl on cell vıtalıty and apoptosis ın HT-29 human colon cancer cell
Yazar: BUSE ARDIL
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MEHLİKA ALPER
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Hücre canlılığı = Cell survival ; Hücre dizisi = Cell line ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms

Özet:
Kanser önemli ölüm nedenlerinden biridir. Kanserin tedavisi için kullanılan geleneksel yöntemlerin yan etkileri nedeniyle, kanseri önlemek veya tedavi etmek için yeni stratejiler geliştirilmesine yönelik çalışmalar hız kazanmıştır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda kanser tedavisinde kombine yaklaşımın önemi vurgulanmıştır. Çok eski çağlardan beri insanoğlunun başvurduğu doğa aktif ve güvenli anti-kanser ajanları için büyük bir zenginliğe sahiptir. 
Kolorektal kanser en sık teşhis edilen kanserler arasındadır. Bu hastalığın tedavisinde geleneksel olarak cerrahi yöntem ve kemoterapinin yanı sıra tedaviyi geliştirmenin ve yan etkileri ertelemenin potansiyel bir yolu olarak kombinasyon veya çok bileşenli tedavi gösterilmektedir. Bu çalışmada bildiğimiz kadarıyla ilk defa ticari Eriodictyol ve Brusatol'ün insan kolon kanseri/kolorektal kanser hücre hattında (HT-29 hücre hattı) 5-FU antikanser ilacı ile birlikte kullanımlarının hücre canlılığı üzerindeki etkilerinin belirlenmesinin yanı sıra apoptoz üzerindeki potansiyel etkilerinin de değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla öncelikle etken maddelerin ayrı ayrı ve kombine uygulamalarının HT-29 hücre hattında hücre canlılığı üzerindeki etkileri doz ve zamana bağlı olarak MTT deneyi ile araştırılmıştır ve her bir etken maddenin IC50 değeri belirlenmiştir. IC50 değerleri dikkate alınarak etken maddelerin ayrı ayrı ve kombine uygulamalarının HT-29 hücre hattında hücre canlılığı üzerindeki etkileri 24, 48 ve 72 saat için değerlendirilmiştir ve kombinasyon indeksi değerleri hesaplanmıştır. Brusatol veya Eriodictyol'ün IC50 ve IC50/2 konsantrasyonları ile 5-FU'nun IC50 konsantrasyonları ile yapılan kombinasyon uygulamalarının apoptoz üzerindeki etkisi ise Annexin V/PI boyama ve apoptotik genlerin Real-Time PCR analizi ile 48 saat için araştırılmıştır. Ayrıca etken maddelerin tek başına ve kombin uygulamalarının hücre döngü profili üzerindeki etkisi de 48 saat için incelenmiştir. En düşük IC50 değerleri Brusatol için hesaplanmıştır. Brusatol'ün 24, 48 ve 72. saatler için hesaplanan IC50 değerleri sırasıyla 109.5, 1.15 ve 0.96 µM'dır. Kombinasyon uygulamalarında hesaplanan Kİ değerleri farklılık göstermektedir. Brusatol ve 5-Florourasil'in yapılan kombin uygulamaları arasında Brusatol'ün IC50 ve IC50/2 değerindeki konsantrasyonları ile 5-FU'nun IC50 ve IC50/2 değerindeki konsantrasyonları ile yapılan kombin uygulamaların ortak olarak 24 ve 48 saatte sinerjik etki gösterdiği belirlenmiştir. 48 saatte Eriodictyol'ün IC50/2 değerindeki konsantrasyonu ile 5-FU'nun IC50 ve IC50/2 değerindeki konsantrasyonlarının yanı sıra Eriodictyol'ün IC50 ve 5-FU'nun IC50/2 değerindeki konsantrasyonları ile yapılan kombin uygulamaların etkisinin sinerjik olduğu görülmüştür. Brusatol'dan farklı olarak Eriodictyol'ün 5-FU ile 72 saat kombin uygulamalarında sinerjik etki belirlenmiştir. Brusatol, Eriodictyol ve 5-FU'nun test edilen üçlü kombinasyonlarının ise her inkübasyon zamanı için antagonist olduğu tespit edilmiştir. Brusatol'ün 5-FU ile denenen kombin uygulamalarında toplam apoptotik hücre yüzdesinin etken maddelerin tek başlarına neden olduğu toplam apoptotik hücre yüzdesine kıyasla daha fazla olduğu belirlenmiştir. Real time PCR analizi sonuçlarına göre test edilen genler içerisinde bax ve kaspaz-3 apoptotik gen seviyesindeki anlamlı artış Brusatol ve 5-FU'nun IC50 değerindeki konsantrasyonları ile yapılan kombinasyonda tespit edilmiştir. Bununla birlikte Brusatol ve Eriodictyol'ün tek başlarına HT-29 hücrelerinde kontrole kıyasla özellikle S evresindeki hücre yüzdesinde artışa neden olduğu belirlenmiştir. Brusatol'ün 5-FU ile kombinasyon uygulamalarında yine özellikle S evresindeki hücre yüzdesinin kontrole kıyasla daha fazla olduğu görülmüştür. 48 saat için yapılan deneylerden elde edilen veriler Eriodictyol'e göre Brusatol'ün tek başına veya 5-FU ile kombinasyon halinde HT-29 hücrelerinde apoptotik hücre yüzdesinde artışa neden olabileceğini göstermiştir. Bu çalışmadan elde edilen veriler özellikle kolon kanserine karşı kombin veya diğer alternatif yaklaşımlarına temel veri sağlayabilir. Yapılacak in vivo çalışmalar bu etken maddelerin kullanımına yönelik çalışmalara katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Cancer is one of the major causes of death. Due to the side effects of traditional methods used for the treatment of cancer, studies on developing new strategies to prevent or treat cancer have gained momentum. In recent studies, the importance of a combined approach in cancer treatment has been emphasized. Nature has a great wealth of active and safe anti-cancer agents, which mankind has applied to since ancient times.
Colorectal cancer is among the most frequently diagnosed cancers. Combination or multicomponent therapy is traditionally indicated for the treatment of this disease alongside surgery and chemotherapy as a potential way to improve treatment and delay side effects. In this study, it was aimed to determine the effects of commercial Eriodictyol and Brusatol together with 5-FU anticancer drug in human colon cancer/colorectal cancer cell line (HT-29 cell line) on cell viability for the first time as far as we know, as well as to evaluate the potential effects on apoptosis. For this purpose, first of all, the effects of separate and combined applications of active substances on cell viability in the HT-29 cell line were investigated depending on dose and time with the MTT experiment, and the IC50 value of each active substance was determined. Considering the IC50 values, the effects of the individual and combined applications of the active substances on cell viability in the HT-29 cell line were evaluated for 24, 48 and 72 hours, and the combination index values were calculated. The effects of combination treatments with IC50 and IC50/2 concentrations of Brusatol or Eriodictyol and IC50 concentrations of 5-FU on apoptosis were investigated for 48 hours by Annexin V/PI staining and Real-Time PCR analysis of apoptotic genes. In addition, the effect of the combined applications of the active substances on the cell cycle profile was also investigated for 48 hours. The lowest IC50 values were calculated for Brusatol. The IC50 values of Brusatol calculated for 24, 48 and 72 hours are 109.5, 1.15 and 0.96 µM, respectively. CI values calculated in combination applications differ. Among the combined applications of Brusatol and 5-Fluorouracil, it was determined that the IC50 and IC50/2 value of Brusatol and the combined applications of 5-FU with the IC50 and IC50/2 value of the combined applications showed a synergistic effect in 24 and 48 hours. It has been observed that the effect of combined applications with the IC50/2 concentration of Eriodictyol and the IC50 and IC50/2 concentrations of 5-FU in 48 hours, as well as the IC50 and IC50/2 value of Eriodictyol concentrations, is synergistic. Unlike Brusatol, a synergistic effect was determined in the combination of 5-FU with Eriodictyol for 72 hours. The triple combinations of Brusatol, Eriodictyol and 5-FU tested were found to be antagonists for each incubation time. It was determined that the percentage of total apoptotic cells in combined applications of Brusatol with 5-FU was higher than the percentage of total apoptotic cells caused by the active substances alone. According to the results of real time PCR analysis, a significant increase in the level of bax and caspase-3 apoptotic genes among the tested genes was detected in combination with the IC50 concentrations of Brusatol and 5-FU. However, it was determined that Brusatol and Eriodictyol alone caused an increase in the percentage of cells in HT-29 cells compared to the control, especially in the S phase. In the combination applications of Brusatol with 5-FU, it was observed that the percentage of cells, especially in the S phase, was higher than the control. Data from experiments for 48 hours showed that Brusatol, alone or in combination with 5-FU, can cause an increase in the percentage of apoptotic cells in HT-29 cells compared to Eriodictyol. The data obtained from this study can provide basic data for combination or other alternative approaches, especially against colon cancer. In vivo studies will contribute to studies on the use of these active substances.