Lökosit miyeloperoksidaz enziminin saflaştırılması, kinetik özellikleri ile reaktif türlerin oluşumundaki etkilerinin araştırılması
Purification of human loukocyte myeloperoxdase, kinetic properties and its role on reactive species generation
Yazar: BAHRAM SARKARATİ
Danışman: PROF. DR. NACİYE LEYLA AÇAN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzimler = Enzymes ; Kinematik = Kinematic ; Miyeloperoksidaz = Myeloperoxidase ; Nitritler = Nitrites ; Oksitlenme = Oxidation ; Tirozin = Tyrosine

Özet:
Miyeloperoksidaz (MPO) enzimi, lökoferez ile elde edilen insan lökositlerinden saflaştırıldıktan sonra kinetik özellikleri belirlendi; MPO tarafından katalizlenen nitrit oksidasyonu ve tirozin nitrasyonu araştırıldı. Serum fizyolojik ile yıkanan lökositlerden MPO enzimi %1 (w/v) HETAB içeren fosfat tamponu içinde çözünürleştirildi. Çözünürleştirilmiş enzim fraksiyonu, Concanavalin A-Sepharose kromatografisi ve pH:8?de yapılan CM-Sephadex iyon-değiştirici kromatografisi ile % 70.3 verimle saflaştırıldı. Saflaştırılan enzim indirgen koşullardaki SDS-PAGE?de 57000 ve 13100 Dalton molekül ağırlığında iki protein bandı verdi. Enzimin spektral analizinde, saflaştırılan MPO?nun Reinheit Zahl (RZ) değeri 0.86 olarak bulundu. Bu veri enzimin en az % 99 oranında saf olduğunu gösterdi. Substrat olarak H2O2 ve tetrametilbenzidin kullanılarak saflaştırılan enzimin bu iki substratı için kinetik özellikleri belirlendi. MPO?nun H2O2 için Km ve Vmax değerleri 0.727mM ile 273±8 IU/mg protein; tetrametilbenzidin için ise sırası ile 0.111 mM ve 283.04±39 IU/mg protein olarak bulundu. MPO, fagozom-içi pH değerleri civarında (pH 4.5-6) ve H2O2 varlığında, nitriti substrat olarak kullanarak oksidasyonunu katalizlemektedir. Daha düşük pH?da nitritin oksidasyonu MPO?dan bağımsızdır. pH:7 civarında ise MPO nitrit oksidasyonuna (aktivasyonuna) etkisizdir. Nitritin oksidasyonu zamana bağlı olup, MPO tarafından kullanılan nitritin yaklaşık % 50?si nitrata çevrilmektedir. MPO, nitrit ve H2O2 varlığında, serbest tirozinlerin veya proteine bağlı tirozinlerin nitrasyonunu katalizleyebilir. Saflaştırılan MPO?nun fagozom içi pH aralıklarında (pH:5-6), etkili olarak tirozin nitrasyonunu katalizlediği; nitrasyon hızının sübstratları olan nitrit, H2O2 ve tirozin derişimlerine ayrı ayrı bağlı olduğu görüldü. MPO tarafından katalizlenen tirozin nitrasyonunun, iki önemli fizyolojik elektron verici antioksidan bileşik olan askorbik asit ile indirgenmiş glutatyon tarafından karışık-tip inhibisyon mekanizması ile inhibe edildiği bulundu. 

Anahtar kelimeler: Miyeloperoksidaz, kinetik özellikleri, nitrit oksidasyonu, tirozin nitrasyonu.

Abstract:
Myeloperoxidase (MPO) has been purified from human leucocytes obtained by leukapheresis, and kinetic properties were determined, nitrite oxidation and tyrosine nitration catalyzed by the purified enzyme have been studied. MPO was solubilized and extracted from saline-washed leucocytes using phosphate buffer containing 1 % (w/v) HETAB. MPO from the extract was purified by chromatography on Concanavalin A-Sepharose, and CM-Sephadex ion-exchange chromatography at pH 8 with a yield of 70.3. Under reducing and denaturing conditions on polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE), purified enzyme gave rise to protein bands of M, 57000 and 15500 Dalton. Spectral analysis of the enzyme gave a Reinheit Zahl (RZ) values (A430/A280) of 86, indicating that the enzyme was pure at least 99 % pure. Kinetic properties of MPO were determined using hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine as co-substrates. Km and Vmax values for H2O2 were 0.727mM and 273±8 IU/mg protein; for tetramethylbenzidine were 0.111 mM and 283.04±39 IU/mg protein, respectively. Myeloperoxidase was found to catalyze the oxidation of nitrite in the presence of  H2O2. The oxidation of nitrate was pH and time-dependent, and half of nitrite disappeared in the reaction medium was recovered as nitrate. MPO-catalyzed nitrite oxidation was observed between pH 4.5-6, and no spontaneous oxidation could be detected within this pH range. Above pH 6.5.  Myeloperoxidase can utilize nitrite and hydrogen peroxide as substrates to catalyze tyrosine nitration. Both free tyrosine and tyrosine residues on proteins are subject to nitration. MPO was found to catalyze free tyrosine nitration around intra-phagosom pH (between pH 5-6). The extent of nitration was dependent on concentration of substrates (nitrite, hydrogen peroxide and tyrosine). Two physiological antioxidant compounds, reduced glutathione and ascorbic acid were found to inhibit MPO-catalyzed tyrosine nitration by a mixed-type inhibition mechanism.

Key words: Myeloperoxidase, kinetic properties, nitrite oxidation, tyrosine nitration.