İzole sıçan kalbinde iskemi/reperfüzyon hasarında TRPC kanallarının rolü
Role of TRPC channels in ischemia/reperfusion injury in isolated rat heart
Yazar: CANSU USTA
Danışman: DOÇ. DR. EBRU GÜREL GÜREVİN ; PROF. DR. İSMAİL MERAL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Fizyoloji = Physiology

Özet:
Kalp fonksiyonlarının yerine getirilmesinde hücre içi ve dışı iyonlar oldukça büyük bir öneme sahiptirler. Bunlardan, özellikle kalsiyum (Ca+2) kardiyovasküler elektrofizyolojinin düzenlenmesinde etkili bir rol oynar. TRPC kanal ailesi üyeleri, pek çok dokuda anlatımı yapılan ve Ca+2 iyonlarına geçirgen olan membran proteinleridir. İskemi/reperfüzyon (IR) hasarında kalp kası hücrelerindeki TRPC kanallarının aşırı anlatımı çeşitli kalp hastalıklarıyla ilişkilidir. TRPC kanallarının inhibisyonuyla ilgili çalışmalar, bu kalp hastalıklarının tedavisinde oldukça önem taşımaktadır. Ancak, TRPC kanal blokerlerinin iskemik kalp rahatsızlıkları üzerindeki etkilerini kapsayan çalışmalar oldukça sınırlıdır.
İzole perfüze sıçan kalbi (Langendorff) modelini kullandığımız bu çalışmamızda, bir TRPC kanal blokeri olan SKF-96365'in normal ve iskemik kalplere uygulanması ile IR hasarındaki etkilerinin belirlenmesi amaçlanmış ve TRPC kanallarının kalp hastalıklarındaki rolleri tespit edilmeye çalışılmıştır.
Çalışmada 32 adet 3 aylık, ağırlıkları 250-300 g arasında değişen erkek Wistar albino sıçanlar kullanılmıştır. Hayvanlar kontrol, IR, SKF-96365 (5 µM) ve IR+SKF-96365 olarak dört gruba ayrılmıştır. Kalpler, Langendorff izole kalp sistemine in situ kanülasyon yöntemi ile asılmış ve kardiyodinamik parametreler (sol ventrikül içi basıncı, perfüzyon basıncı, sistolik basınç, diyastolik basınç ve kalp vurumu) deney boyunca kaydedilmiştir. Ayrıca, deney sonunda kalpler biyokimyasal analizler için alınmış ve elde edilen veriler istatistiksel olarak değerlendirilmiştir.
İzole edilen sıçan kalplerinde, IR'den kaynaklanan hasarlar deney boyunca düzelmezken, SKF-96365 uygulanması ile kardiyodinamik parametrelerde kısmi bir geri dönüş gözlenmiştir. Hücresel hasarı göstermek için kullanılan kreatin kinaz-MB ve kardiyak troponin T, inflamasyon belirteci olarak miyeloperoksidaz, lipit peroksidasyonunun göstergesi olarak malondialdehit, nekrozun belirteci olarak laktat dehidrogenaz düzeylerinde, IR grubunda anlamlı bir artış belirlenirken, bloker uygulanan tüm gruplarda bu artışın azaldığı gösterilmiştir. Hücresel endojen antioksidan düzeylerinin tespit edilmesi için ölçülen glutatyon peroksidaz ve süperoksit dismutaz düzeylerinin IR grubunda anlamlı derecede düşük, bloker uygulanan tüm gruplarda ise yüksek olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, IR grubunda total oksidan kapasite ve oksidatif stres indeksinin yükseldiği; SKF-96365 uygulamasının bu düzeylerde belirgin bir azalmaya neden olduğu görülmüştür. IR grubunda düşük olan total antioksidan kapasitenin ise SKF-96365 uygulanan gruplarda arttığı belirlenmiştir. Kontrol ve SKF-96365 uygulanan gruplarda TRPC1, TRPC3, TRPC6, Angiotensin II ve TRPC kanalları ile etkileşime giren ve bir adaptör protein olarak işlev gösteren ENKUR düzeylerinde önemli bir fark gözlenmezken, bu parametrelerin IR uygulaması ile arttığı, IR+SKF-96365 uygulanan grupta ise azaldığı belirlenmiştir. TRPC kanal ailesinden kalpte en fazla anlatımı yapılan TRPC3'ün IR hasarındaki anlatımının TRPC1 ve TRPC6'ya göre daha fazla olduğu tespit edilmiştir.
Sonuç olarak, kardiyodinamik veriler değerlendirildiğinde, IR hasarının miyokardiyal fonksiyon bozukluğuna neden olduğu, SKF-96365 uygulamasının bu hasara karşı kısmen kalbi koruyucu rolünün olduğu ve bu etkisinin kalpte özellikle TRPC3 kanallarının inhibisyonuna dayandığı belirlenmiştir. Biyokimyasal olarak hasar belirteçleri analiz edildiğinde, IR'nin kalp dokusunda hücresel hasara yol açtığı, bloker uygulaması yapılan gruplarda bu hasarın azaldığı, antioksidan enzimlerin ise arttığı ve TRPC kanallarının kardiyak fonksiyonların düzenlenmesinde önemli rolleri olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
The intra and extracellular ions have a great impact in performing cardiac functions. Of these, particularly calcium (Ca2+) plays an effective role in the regulation of cardiovascular electrophysiology. Members of the TRPC channel family are membrane proteins, which are expressed in most tissues and especially permeable to Ca2+ ions. The over-expression of TRPC channels in cardiomyocytes during ischemia/reperfusion (IR) injury are related to several heart diseases. Studies concerning the inhibition of TRPC channels are of great importance in the treatment of these heart diseases. However, studies on the effects of TRPC channel blockers on ischemic heart diseases are limited.
In our study employing the isolated perfused rat heart (Langendorff) model, we aimed to determine the effects of SKF-96365, a TRPC channel blocker, in IR injury, and to reveal the roles of TRPC channels in heart diseases, by applying it to healthy and ischemic hearts.
In the study, 32 male Wistar albino rats, 3 months old and weighing between 250-300 g, were used. They were separated into four groups as control, IR, SKF-96365 (5 µM) and IR+SKF-96365. The hearts were attached to Langendorff isolated heart system by employing in situ cannulation method, and cardiodynamic parameters (left ventricular pressure, perfusion pressure, systolic pressure, diastolic pressure and heart rate) were recorded during the experiment. Besides, at the end of experiment, hearts were retained for biochemical analysis, and all data were statistically evaluated.
While IR injury was not recovered during the experiment in isolated rat hearts, a partial recovery of cardiodynamic parameters was observed with the administration of SKF-96365. A significant increase in creatine kinase-MB and cardiac troponin T indicating cellular injury, inflammatory enzyme myeloperoxidase, malondialdehyde as a lipid peroxidation marker and lactate dehydrogenase for detection of necrosis was detected in IR group, whereas all groups treated with the blocker exhibited lower increase. Levels of glutathione peroxidase and superoxide dismutase to detect cellular endogenous antioxidant level were significantly lower in IR group, but higher in the groups treated with the blocker. Furthermore, total oxidant capacity and oxidative stress index which were elevated in IR group were lowered with the administration of SKF-96365. However, total antioxidant capacity increased in the groups received SKF-96365, while it declined in IR group. Concerning the levels of TRPC1, TRPC3, TRPC6, Angiotensin II, and ENKUR, which interacts with TRPC channels and functions as an adaptor protein, there was no significant difference between the control and SKF-96365-treated groups, while these parameters increased with IR application, and decreased in IR+SKF-96365 group. Of the TRPC family, the expression of TRPC3, the most expressed in the heart, was determined to be higher than TRPC1 and TRPC6 in IR injury.
As a result, considering cardiodynamic parameters, it was determined that IR injury caused myocardial dysfunction, and treatment of SKF-96365 partly played a cardioprotective role against that injury, and its effect was based on especially inhibition of TRPC3 channels in the heart. When biochemical injury markers were evaluated, it was concluded that IR caused cellular injury in the heart tissue, and this injury was decreased in the groups treated with the blocker, whereas antioxidant enzymes were increased, and TRPC channels had important roles in the regulation of cardiac functions.