Ana arı (Apis mellifera L.)'nın yumurta kanallarından sperm torbasına sperm göçü sürecinde sperm rekabetinin pirosekanslama tekniği ile analizi
The analysis of sperm competition during migration of sperm from oviducts into spermathecae of honey bee (Apis mellifera L.) queens by pyrosequencing technique
Yazar: YASİN KAHYA
Danışman: PROF. DR. HALİT VASFİ GENCER
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture
Dizin: DNA analizi = DNA analysis

Özet:
Bal arılarında sperm rekabetinin çiftleşmeden çok kısa bir süre sonra farklı erkek spermlerinin ana arının sperm torbasına göçü sırasında ve/veya ana arının yumurtaları döllemek için sperm kullanımı sırasında olması beklenir. Bununla birlikte, günümüz teknikleri bir kolonideki erkek ebeveyn dağılımının göç sürecindeki rekabetin mi yoksa fertilizasyon sürecindeki rekabetin mi bir sonucu olduğunu ayırt etmeyi sağlamamaktadır. Bu tez çalışmasının birinci amacı; yapay tohumlanmış ana arıların heterospermik sperm torbası içeriklerinin genotipik tanımlanmasını ve böylece sperm torbasına göç sürecinde sperm rekabetinin belirlenmesini sağlayacak pirosekanslama tekniğine dayalı bir yöntem geliştirmektir. Tez çalışmasının ikinci amacı yapay tohumlanmış ana arıların sperm torbası içeriklerinde 2 erkek ebeveyn genotipinin bulunma oranlarına semen enjeksiyon sırasının ve ana arı genotipinin (dişinin gizli seçimi) etkilerinin olup olmadığını ortaya koymaktır.
Kafkas (A. m. caucasica) ve İtalyan (A. m. ligustica) ırkı birer damızlık koloniden yetiştirilen ana arılar 2 tohumlama grubuna ayrılmıştır. Bir gruptaki Kafkas ve İtalyan ana arılar önce Kafkas (4 µl), sonra İtalyan (4 µl) erkeklerinden eşit hacimde (8 µl) toplanan semen ile, diğer gruptaki Kafkas ve İtalyan ana arılar ise önce İtalyan (4 µl), sonra Kafkas (4 µl) erkelerinden toplanmış semen ile yapay tohumlanmıştır. Sperm torbası içeriklerinde 2 genotip oranının belirlenebilmesi için yapay tohumlanmış ana arıların sperm torbası içeriklerinden ekstrakte edilen DNA, Kafkas ve İtalyan erkeklerini ayırmayı sağlayan tek SNP bakımından pirosekanslanmıştır. 
Pirosekanslama analizi verileri yapay tohumlanmış ana arıların sperm torbalarında Kafkas spermlerinin (%69) İtalyan spermlerine (%31) göre önemli düzeyde daha fazla bulunduğunu göstermiştir (P<0,05). Ne ana arı genotipine ne de semen enjeksiyon sırasına göre Kafkas ve İtalyan spermlerinin sperm torbası içindeki oranları değişmiştir (P>0,05). Sonuçlar, göç sürecinde bir erkek arı genotipi lehine sperm rekabetinin gerçekleştiğini açıkça ortaya koymuştur.

Abstract:
Sperm competition is expected to occur in honey bees during migration of sperm from several drones into the spermatheca of the queen shortly after mating and/or during sperm use by the queen for fertilizing the eggs. However, present techniques do not enable to recognise whether the patriline distribution within the colony is the result of competition during migration or during fertilization process. The first aim of the study was to develop a pyrosequencing based method enabling the genotypic identity of the heterospermic contents in the spermathecae of instrumentally inseminated queens (IIQs) to detect sperm competition during sperm migration process. The second aim was to disclose whether injection order of semen and queen genotype (cryptic female choice) affect the proportions of two drone genotypes in spermathecal contents of these IIQs or not.
The Caucasian (A. m. caucasica) and Italian (A. m. ligustica) queens that were reared from one breeder colony of each subspecies were allocated into 2 insemination batches. The first batch of the virgin Caucasian and Italian queens were instrumentally inseminated with equal volumes of semen (8 µl) collected first from Caucasian (4 µl) and then from Italian drones (4 µl), while the second batch of queens were inseminated with the same amount of semen collected first from Italian and then from Caucasian drones. The extracts of DNA isolated from spermathecal contents of IIQs were pyrosequenced in order to determine two genotypic proportions in each spermathecal content by using single SNP discriminating Caucasian drones from Italian drones.
Pyrosequencing analysis data demonstrated that the mean proportion of Caucasian sperm (69%) was significantly more than that of Italian sperm (31%) in spermathecae of IIQs at all events (P<0.05). Neither queen genotype nor injection order of semen affected the proportions of Caucasian and Italian sperm (P>0.05). The results clearly proved that sperm competition during migration process occurred in favour of one genotype.