Domates (Solanum lycopersicum L.) bakteriyel öz nekrozu hastalık etmenleri Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea ve Pseudomonas viridiflava'nın lna probe kullanılarak real-tıme pcr ile tanısı  ve hastalıklı bitki dokularından tespiti
Identification and detection by real-time pcr using lna probe of Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea and Pseudomonas viridiflava, casual agents of  tomato (Solanum lycopersicum L.)  pith necrosis disease
Yazar: DERYA BAKİ
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN BASIM
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Bu çalışmada domates yetiştiriciliğinde önemli kalite ve ekonomik ürün kayıplarına sebep olan domates öz nekrozu hastalık etmenleri Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea ve Pseudomonas viridiflava'nın LNA (Locked Nucleic Acid) probu kullanılarak Real-Time PCR yöntemi ile hassas ve seçici olarak tanıları ve tespitleri yapılmıştır.
Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea ve Pseudomonas viridiflava etmenlerin her birine özel  hassas primer ve prob setleri geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob setlerinin spesifikliğinin belirlenmesi amacıyla farklı Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea, Pseudomonas viridiflava strainleri ve farklı bitki patojeni bakteriyel izolatlar kullanılmıştır. Farklı bitki patojeni bakterilerin genomlarından hiçbir amplifikasyon tespit edilmemesine rağmen, test edilen tüm yerli ve yabancı Dickeya chrysanthemi strainlerinden 65 bp, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum strainlerinden 63 bp, Pseudomonas cichorii strainlerinden 73 bp, Pseudomonas corrugata strainlerinden 70 bp, Pseudomonas fluorescens strainlerinden 70 bp, Pseudomonas mediterranea strainlerinden 73 bp ve Pseudomonas viridiflava strainlerinden 77 bp'lik amplifikasyonlar elde edilmiştir.
Bu çalışmada geliştirilen yöntemin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı Dickeya chrysanthemi için 2 hücre, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum için 4 hücre, Pseudomonas cichorii için 4 hücre, Pseudomonas corrugata için 4 hücre, Pseudomonas fluorescens  için 5 hücre, Pseudomonas mediterranea için 5 hücre, Pseudomonas viridiflava için 2 hücre olarak tespit edilmiştir. Geliştirilen yöntemin DNA düzeyindeki hasasiyet sınırı ise Dickeya chrysanthemi için 12 pg, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum için 11 pg, Pseudomonas cichorii için 14 pg, Pseudomonas corrugata için 14 pg, Pseudomonas fluorescens için 14 pg, Pseudomonas mediterranea için 13 pg, Pseudomonas viridiflava için 12 pg olarak tespit edilmiştir.
Sonuç olarak, Real-Time PCR yöntemini kullanarak her birine özel primer ve  prob setleri geliştirilen domates bakteriyel öz nekrozu hastalığına sebep olan 7 farklı bakteriyel patojen; Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea ve Pseudomonas viridiflava'nın hem bakteriyel hücreden hem de hastalıklı bitki dokularından hızlı (17-27 dk) ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği ortaya çıkarılmıştır.

Abstract:
In this study, Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea and Pseudomonas viridiflava, causal agents of tomato pith necrosis disease causing serious economical yield losses on tomato, were sensitively and selectively identified and detected in short time by Real-Time PCR methods using LNA (Locked Nucleic Acid)probes.
The sensitivity of primer and probe sets developed for Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea and Pseudomonas viridiflava. Primer and probe sets developed in this study were tested against different Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea and Pseudomonas viridiflava strains, other plant pathogenic bacteria from different genus and species. Although no amplication product was detected from genome of different species of plant pathogenic bacteria, 65 bp-amplification product of Dickeya chrysanthemi, 63 bp-amplification product of the Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, 73 bp-amplification product of Pseudomonas cichorii,  70 bp-amplification product were detected from different strains of Pseudomonas corrugata, 70 bp-amplification product of Pseudomonas fluorescens, 73 bp-amplification product of Pseudomonas mediterranea and 77 bp-amplification product of Pseudomonas viridiflava.
In this study, the detection of bacterial pathogen causing pith necrosis by Real- Time PCR was carried out from bacterial cell suspension, genomic DNA and plant material. The detection from cell suspension was carried out with precision limits of 2 cell for Dickeya chrysanthemi, 4 cell for Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, 4 cell for Pseudomonas cichorii, 4 cell for Pseudomonas corrugata, 5 cell for Pseudomonas fluorescens, 5 cell for Pseudomonas mediterranea and 2 cell for Pseudomonas viridiflava. The detection of genomic DNA in pg (picogram) of the bacterial genome was also found to be 12 pg for Dickeya chrysanthemi, 11 pg for Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, 14 pg for Pseudomonas cichorii, 14 pg for Pseudomonas corrugata, 14 pg for Pseudomonas fluorescens and 13 pg for Pseudomonas mediterranea 12 pg for Pseudomonas viridiflava. 
In conclusion, Real-Time PCR method using primer and probe sets specific for each of 7 different tomato bacterial pith necrosis pathogens including Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea and Pseudomonas viridiflava were sensitive  and quick (17-27 min.) for identification of the bacteria from the cells and for detection of the pathogens from the tomato diseased plant tissue.