Sıçan arka bacak damar yatağı perfüzyon basıncı üzerine RHO/RHO-kinaz yolağının katkısı
Effects of RHO/RHO-kinase signalling on the perfusion pressure in the rat hind limb vascular bed
Yazar: ESRA İLHAN
Danışman: PROF. DR. KANSU BÜYÜKAFŞAR
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Atorvastatin = Atorvastatin ; Fasudil = Fasudil ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hipertansiyon = Hypertension ; Kan damarları = Blood vessels ; Kas-iskelet sistemi = Musculoskelatal system ; Perfüzyon = Perfusion ; Rhokinaz = Rhokinase ; Sıçanlar = Rats

Özet:
İnsan iskelet kası vücudumuzun en büyük organıdır ve tüm vücut ağırlığının neredeyse yarısını oluşturur. Kas dokusu post mitotik çok çekirdekli miyofibrillerden oluşur ve vücut hareketlerinin başlatılması ve kontrolünde görev alır. Diğer taraftan kardiyovasküler sistemin homeostazına da katkıda bulunur. Özellikle egzersiz sırasında dolaşımdan çok miktarda kan çeker. Hipertansiyon, kan basıncının yükselmesi ile karakterize ve bir dizi kardiyovasküler hastalıklarla ilişkilidir. Hipertansiyon patofizyolojisinde yer alan çok sayıda sinyal yolu olmasına rağmen, hipertansiyonun gelişiminden sorumlu ortak bir sinyal yolu yoktur. 3-hidroksi-3-metilglutaril Co enzimi A (HMG-CoA) redüktaz, kolesterol biyosentezindeki hız sınırlayıcı adımı katalize eder ve bu enzimin statinler tarafından inhibisyonu, kolesterol seviyesini düşürebilir ve koroner kalp hastalığının ve aterosklerozun iyileşmesine yol açabilir. Rho/Rho-kinaz sinyal yolağının artmış seviyesi veya aktivitesi hipertansiyondan sorumlu tutulmaktadır ve artan arteriyel basıncın moleküler mekanizmalarından birini oluşturur. Bu nedenle, bu sinyal yolu hipertansiyon tedavisinde önemli bir terapötik hedeftir. Rho/ROCK sinyallerinin birçok arteriyel ağın vasküler reaktivitesinde yaygın olarak rol aldığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, RhoA ve Rho kinaz (ROCK) proteinlerinin ekspresyonu ve perfüzyon basıncının kontrolüne katkıları, iskelet kası vasküler ağı olarak sıçan arka bacak ekstremite vasküler yatağında henüz araştırılmamıştır. Bu nedenle, sıçan arka bacak vasküler yatağındaki fenilefrin yükseltilmiş perfüzyon basıncı üzerine iki RhoA inhibitörü (atorvastatin ve C3 ekzoenzimi) ve Rho kinaz inhibitörlerini (Y-27632 ve fasudil) test ettik. Ayrıca, femoral, popliteal ve safen arterlerin yanı sıra quadriceps ve gastrocnemius kasların da Rho (RhoA) ve Rho-kinaz proteinlerinin (ROCK-1, ROCK-2) ekspresyonunu Western blot yöntemi ile araştırdık. Rho inhibitörleri, atorvastatin (10-7-10-4 M) ve C3 ekzoenzimi (3x10-8 M) hafif ila orta dereceli vazodilatasyon sağlarken, ROCK inhibitörleri, Y-27632 (10-8-10-5 M) ve fasudil (10-8-10-5 M), esaslı bir vazodilatasyona neden olmuştur. Y-27632 ve fasudil (her ikisi de 10-5 M'de) ile indüklenen maksimum vazodilatasyonlar sırasıyla %84.02 ± 6.9 ve %76.91 ± 6.9 idi (P=0.091). Ancak, Y-27632, fasudilden daha etkili değildi, çünkü Y-27632 için EC50 değerleri ve fasudil değeri sırasıyla 0.7 ± 2.1 M ve 2.5 ± 2.4 M idi (P=0.177). Western blot analizi, femoral, safen ve popliteal arterlerin yanı sıra gastrocnemius ve quadriceps kaslarının RhoA, ROCK-1 ve ROCK-2 proteinlerini ifade edebildiğini gösterdi. Sonuç olarak, bu veriler Rho/ROCK yolağının sıçan arka bacak vasküler yatağındaki perfüzyon basıncının kontrolüne önemli ölçüde katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Diğer taraftan, hem kapasitans hem de rezistans arterlerin, üstelik masif bir kas dokusunun da bulunduğu izole-perfüze sıçan arka bacak damar yatağı preparatı, bir takım ajanların vasküler etkilerinin değerlendirilmesi için bir deneysel yöntem olarak kullanılabilir. 


Anahtar Kelimeler: İskelet kas, hipertansiyon, Rho/ROCK, Y-27632, fasudil, atorvastatin, C3 ekzoenzim

Abstract:
Human skeletal muscle is the largest organ in our body, constituting almost the half of the whole body weight. This organ is composed of post-mitotic multinuclear myofibrils, and takes a role in the initiation and control of the body movements with substantial impact on cardiovascular homeostasis. Especially during exercise it takes massive amount of blood from the circulation. Hypertension is characterized with the elevation of blood pressure, and associated with a number of cardiovascular complications. Although there are numerous signalling pathways, which are involved in the pathophysiology of hypertension, there is no common signalling pathway responsible for the development of hypertension. 3-hydroxy-3-methylglutaryl Co enzyme A (HMG Co A) reductase catalyses the rate limiting step in cholesterol biosynthesis, and inhibition of this enzyme by statins may decrease cholesterol level, leading the improvement of coronary heart disease and atherosclerosis. These drugs have also beneficial effects on vascular endothelial function. Elevated level or activity of Rho kinase have been hold responsible for hypertension and it has constituted one of the molecular mechanisms of increased arterial pressure. Therefore, this signalling cascade is an important therapeutic target in the treatment of hypertension. Rho/ROCK signalling has been demonstrated to be widely involved in vascular reactivity of many arterial networks. However, RhoA and Rho-kinase (ROCK) expression and their contribution to the control of perfusion pressure have yet to be investigated in the rat hind limb vascular bed as a skeletal muscle vascular network. Therefore, we tested two Rho inhibitors (atorvastatin and C3 exoenzyme) and Rho-kinase inhibitors (Y-27632 and fasudil) on the phenylephrine-elevated perfusion pressure in the rat hind limb vascular bed. Furthermore, we sought the expression of Rho (RhoA) and Rho-kinase proteins (ROCK-1, ROCK-2) in the femoral, popliteal and saphenous arteries as well as quadriceps and gastrocnemius muscles by Western blotting. While the Rho inhibitors, atorvastatin (10-7-10-4 M) and C3 exoenzyme (3x10-8 M) produced mild-to-moderate vasodilatation, the ROCK inhibitors, Y-27632 (10-8-10-5 M) and fasudil (10-8-10-5 M) induced substantial vasodilatation, The maximum vasodilatations induced by Y-27632 and fasudil (both at 10-5  M) were %84.02 ± 6.9 and %76.91 ± 6.9, respectively (P = 0.091). However, Y-27632 was not more potent than fasudil as EC50 values for Y-27632 and fasudil were 0.7 ± 2.1 M and 2.5 ± 2.4 M respectively (P=0.177). Western blot analysis showed that femoral, saphenous and popliteal arteries as well as gastrocnemius and quadriceps muscles can express RhoA, ROCK-1 and ROCK-2 proteins. In conclusion, these data demonstrate that Rho/ROCK pathway could substantially contribute to the control of perfusion pressure in the rat hind limb vascular bed. Moreover, the isolated-perfused rat hind limb preparation, which involves both capacitance and resistance arteries as well as a massive muscular tissue may be a pharmacological model for the evaluation of agents that have vasodilatory or antihypertensive action potential. 

Keywords: Skeletal muscle, hypertension, Rho/ROCK, Y-27632, fasudil, atorvastatin, C3 exoenzyme