Preeklampsinin erken tanısı için mezenkimal kök hücrelerden elde edilen mirnalar'dan biyobelirteç seçimi
Biomarker selection from mirnas obtained from mesenchymal stem cells for the early diagnosis of the preeclampsia
Yazar: NİLÜFER KAMALI
Danışman: DOÇ. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology

Özet:
Preeklampsi (PE), gebeliğe özgü hipertansif bir hastalıktır. Anormal plasentasyon preeklampsinin ayırt edici bir özelliğidir ve plasental oksidatif stresin artmasına neden olur. Oksidatif stres, desidual vasküler yapıda lokal hasara neden olan anti-anjiyogenik faktörlerin salınımını tetikler. Hasar daha sonra sistematik olarak yayılır ve maternal klinik semptomlarla sonuçlanır.
Maternal-fetal arayüzdeki mezenkimal kök hücrelerin (MKH) preeklampsi patogenezinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Desidua bazalis mezenkimal kök hücreleri (dMKH) vasküler bir mikroçevrede bulunur. Preeklampside, dMKH'ler anormal derecede yüksek seviyelerde oksidatif strese ve maternal kanda dolaşan inflamatuar faktörlere maruz kalırlar. Oksidatif strese maruz kalan dMKH'lerin preeklampsi gelişiminde rol aldığı düşünülmektedir.
MikroRNA'lar (miRNA) kısa (19-25 nükleotit), tek zincirli ve kodlama yapmayan RNA'lardır. Gen ekspresyonunu, hedef mRNA'ların 3' kodlama yapmayan bölgelerine bağlanarak düzenlerler. Gelişim, farklılaşma, apoptoz ve onkogenez gibi birçok biyolojik olayda önemli rol oynadıkları bilinmektedir. Küçük kodlama yapmayan RNA'lar sınıfından olan miRNA'ların MKH'lerin farklılaşması, olgunlaşması ve işlevleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu araştırmalarla gösterilmiştir. MiRNA'lar üzerinde yapılan son araştırmalar, bu RNA'ların PE'de yeni moleküler belirteçler olarak kullanılabileceği fikrini beraberinde getirmiştir.
Mezenkimal kök hücler (MKH) birçok hücre tipine farklılaşabilen multipotent öncü hücrelerdir ve maternal fetal arayüzde bol miktarda bulunurlar. Salgıladıkları maddeler yoluyla anjiyogenez ve nörogenezi teşvik etme yetenekleri vardır. Yapılan çalışmalarda, miRNA'ların PE hastası gebelerin plasentasından elde edilen MKH'lerde normal gebelere göre anlatımlarının farklılaştığı görülmüştür.
Bu tez, PE hastası ve sağlıklı gebelere ait desidua ve periferal kan kökenli MKH'lerin miRNA anlatım analizini kapsamakta ve olası biyobelirteçlerin araştırılması için bir ön çalışma niteliği taşımaktadır. Tez kapsamında, 7 PE hastası ve 7 sağlıklı olamak üzere toplam 14 gebenin hem desidua ve hem de periferal kan örnekleri ile çalışıldı. Toplam 28 örnek ile yapılan araştırmamızda MKH kültürü ile hücre sayısı arttırıldı ve ardından saf MKH eldesi için spesifik hücre yüzey belirteçleri kullanılarak MKH ayrımı ("sorting") gerçekleştirildi. MKH'lerden total RNA izolasyonu sonrasında miRNA analizi için let-7b-3p, let-7f-1-3p, miR-191-3p, miR-550a-5p, miR-33b-3p ve miR-425-3p ve normalizasyon için U6 snRNA kullanıldı. MiRNA analizi damlacıklı dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPZR) yöntemi ile gerçekleştirildi ve elde edilen sonuçlar "GraphPad Prism 8.1.2" programı kullanılarak değerlendirildi. Anlamlılık testleri parametrik olmayan "Mann Whitney Test", duyarlılık ve spesifiklik testleri ise "Receiver operating characteristic" (ROC) analizi ile yapıldı.
Yapılan analiz sonucunda, PE hastalarının dMKH'lerinde hsa-miR-33b-3p seviyesinde sağlıklı kontrollere göre anlamlı bir artış olduğu gözlendi (AUC: 0,93, p= 0,04, kat değişimi: 4,5). let-7b-3p, let-7f-1-3p, miR-191-3p, miR-550a-5p ve miR-425-3p p<0,05 şartını sağlamadıklarından anlamlı olarak değerlendirilmedi.

Abstract:
Preeclampsia (PE) is a pregnancy-specific hypertensive disease. Abnormal placentation is a distinctive feature of preeclampsia and causes increased placental oxidative stress. Oxidative stress triggers the release of anti-angiogenic factors that cause local damage to the decidual vascular structure. Afterwards, the damage spreads systematically and results in maternal clinical symptoms.
Mesenchymal stem cells (MSC) at the maternal-fetal interface are thought to play an important role in the pathogenesis of preeclampsia. Decidua basalis mesenchymal stem cells (dMSC) are found in a vascular microenvironment. In preeclampsia, dMSCs are exposed to abnormally high levels of oxidative stress and inflammatory factors circulating in the maternal blood. dMSC exposed to oxidative stress is thought to play a role in the development of preeclampsia.
Micro RNAs (miRNAs) are short (19-25 nucleotides), single-stranded, non-coding RNAs. They regulate gene expression by binding to 3'non-coding regions of target mRNAs. They are known to play an important role in many biological processes such as development, differentiation, apoptosis and oncogenesis. MiRNAs from the class of small non-coding RNAs have been shown to have a significant impact on the differentiation, maturation and function of MSCs. Recent researches on miRNAs have assert to the idea that these RNAs can be used as new molecular markers in PE.
MSCs are multipotent precursor cells that can differentiate into many cell types and are abundant at the maternal fetal interface. They have the ability to promote angiogenesis and neurogenesis through the substances they secrete. Studies have shown that the expression of miRNAs in MSCs obtained from placenta of pregnant women with PE differs from that of normal pregnant women.
This thesis covers miRNA expression analysis of MSCs originated decidua and peripheral blood obtained from PE patient and healthy pregnant women and is a preliminary study to investigate putative biomarkers. In this thesis, both decidua and peripheral blood samples were studied from total 14 pregnant women, 7 PE patients and 7 healthy subjects. In our research with a total of 28 samples, the number of cells was increased by MSC culture and then MSCs were sorted using by specific cell surface markers to obtain pure MSCs. After isolation of total RNA from MSCs, let-7b-3p, let-7f-1-3p, miR-191-3p, miR-550a-5p, miR-33b-3p and miR-425-3p were used for miRNA analysis and U6 snRNA was used for normalization of the samples. MiRNA analysis was performed by droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) method and the obtained results were evaluated using "GraphPad Prism 8.1.2" program. Significance tests were performed using non-parametric "Mann Whitney Test". Sensitivity and specificity tests were performed using "Receiver Operating Characteristic" (ROC) analysis.
As a result of the analysis, it was observed that the levels of hsa-miR-33b-3p significantly (AUC: 0.93, p = 0.04, fold change: 4.5) increased in dMSC of PE patients compared to healthy controls. However, let-7b-3p, let-7f-1-3p, miR-191-3p, miR-550a-5p, and miR-425-3p were not considered as significant because they did not meet the p<0,05 requirement.