Akuatik bitki Lemna minörde ağır metal stresine karşı miRNA cevaplarının araştırılması
Investigation of miRNA responses against heavy metal stress in aquatic plant Lemna minör
Yazar: MERVE SAĞLAM
Danışman: PROF. DR. EMEL SÖZEN
Eskişehir Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Ağır metaller günümüzde en yaygın rastladığımız çevre kirleticilerindendir. Özellikle su ekosistemleri başta olmak üzere yeryüzündeki tüm ekosistemler ağır metallerin yapmış olduğu toksik etkilerden olumsuz olarak etkilenmektedirler. Lemna minör, Lemnaceae familyasına ait olan monokotil sucul bir bitkidir ve genelde mineral ve organik kontaminasyonu gidermek için atık su arıtımında kullanılır. MikroRNA'ların (miRNA), metalin detoksifikasyonu için ağır metal stresine karşı verilen tepkilerin önemli modülatörleri olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada kadmiyum stresine maruz bırakılan L. minor'de ağır metal stresinde görevli olduğu bilinen 5 farklı miRNA (miR156, miR159, miR171, miR395 ve miR396) ve bunların hedef genlerinin (SPL, MYB, GRAS, SULTR ve GRF) ekspresyon seviyelerindeki değişikliğin belirlenmesi amaçlanmıştır. Hoagland solusyonu içinde kültüre alınan L. minor 0, 6, 12, 24saat süreyle 100 µM CdCl2 içeren Hoagland solusyonu içinde inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası sıvı azotta öğütülen bitki örneklerinden miRNA ve mRNA izolasyonu yapılmış ardından RT-PCR ile cDNA elde edilerek qRT-PCR ile de ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir. Aynı L. minor örneklerindeki kadmiyum miktarını belirlemek için yaş yakma yöntemi kullanılmış ve numuneler ICP-OES cihazında ölçülmüştür. Sonuç olarak kadmiyuma maruz bırakılan L. minor örneklerinde ağır metal miktarının saate bağlı olarak arttığı tespit edilmiştir. Çalışılan miRNA ekspresyon seviyeleri kontrolle kıyaslandığında her bir miRNA için 6. ve 12. saatlerde ekspresyon artarken 24. saatte ekspresyonun azaldığı görülmüştür. SPL geninin ekspresyon seviyesi değişmezken, MYB ve SULTR2 genlerinin ekspresyon seviyesinin azaldığı, GRAS geninin ekspresyon seviyesinin arttığı ve GRF geninde ise ekspresyonun 6. ve 12. saatlerde arttığı fakat 24. saatte azaldığı gözlemlenmiştir. Bu çalışma kadmiyum stresine maruz bırakılan örneklerde çalışılan miRNA'lar ve onların hedef genlerinin ekspresyon profillerinin, literatürde çalışması yapılan diğer bitkilerdeki miRNA ekspresyon profillerine göre farklı düzenlendiğini göstermiştir. Bunun da Lemna minor bitkisinin hiperakümülatör bir bitki olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. L. minör bugüne kadar ağır metal stresinde oldukça fazla tercih edilmiş bir bitki olmasına rağmen gen ekspresyon profilleri ile ilgili yapılan herhangi bir çalışma örneğine literatürde rastlanılmamıştır. Çalışmadan elde edilen bilgiler bu bitki ile ilgili yapılacak sonraki çalışmalara rehberlik etmesi yönünden önemlidir.

Abstract:
Heavy metals are among the most common environmental pollutants we encounter today. All ecosystems on earth, especially water ecosystems, are negatively affected by the toxic effects of heavy metals. Lemna minor is a monocotyl aquatic plant that belongs to the Lemnaceae family and is generally used in wastewater treatment to remove mineral and organic contamination. MicroRNAs (miRNAs) are known to be important modulators of responses to heavy metal stress for detoxification of metal. In this study, we aimed to determine expression levels of 5 different miRNA (miR156, miR159, miR171, miR395 and miR396) and their target genes (SPL, MYB, GRAS, SULTR and GRF) in L. minor exposed to cadmium stress. L. minor cultured in Hoagland solution was incubated in Hoagland solution containing 100 µM CdCl2 for 0, 6, 12, 24hours. After incubation, miRNA and mRNA isolation were performed from plant samples powdered in liquid nitrogen. After that cDNAs were obtained by RT-PCR and expression levels were determined by qRT-PCR. The wet burning method was used to determine the amount of cadmium in the same L. minor samples. Measurements were accomplished by using the ICP-OES instrument. As a result, it was determined that the amount of heavy metal increased depending on time in L. minor samples exposed to cadmium. Compared to control, the miRNA expression levels showed that expression increased at 6th and 12th hours for each studied miRNA, whereas expression decreased at 24th hour. While the expression level of the SPL gene did not change, the expression levels of the MYB and SULTR2 genes decreased, the expression level of the GRAS gene increased. On the other hand, the expression in the GRF gene increased at the 6th and 12th hours, but decreased at the 24th hour. This study showed that the expression profiles of miRNAs studied in L. minör samples exposed to cadmium stress and that of their target genes were arranged differently from the expression profiles compared to the plants studied in the literature. This is thought to be due to the hyperacumulator characteristic of Lemna minor. Although L. minor is a highly preferred organism to study heavy metal stress, to date, no study examples related to gene expression profiles have been found in the literature. The information obtained from the study is important in terms of guiding further studies on this plant.