Bazı antimikrobiyal peptidlerin meme kanser hücre soyları üzerine etkileri
The effects of some antimicrobial peptides on breast cancer cell lines
Yazar: SERAP SANCAR BAŞ
Danışman: PROF. DR. ŞEHNAZ BOLKENT
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents

Özet:
Antimikrobiyal peptidler böceklerden memelilere kadar pek çok organizmada bulunur ve aminoasit dizisi ile sekonder yapıları bakımından birbirinden farklılık gösterir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, bu peptidlerin mikroorganizmaların yanı sıra tümör hücreleri üzerinde de etkili olduğunu göstermektedir. Bakteri membranı gibi anyonik özelliğe sahip olan tümör hücre membranlarına, katyonik antimikrobiyal peptidlerin elektrostatik olarak bağlanması ve bu membranlarla etkileşiminin ardından, bu peptidlerin membrana yerleşerek membran bütünlüğünü bozduğu ileri sürülmektedir. Katyonik antimikrobiyal peptidlerin bu direkt etkisinin yanı sıra, bazı peptidlerin hücre içine girerek mitokondri membran bütünlüğünü bozduğu ve kanser hücrelerinde apoptozu indüklediği de bilinmektedir.Bu çalışmada, daha önce antikanser aktivitesi araştırılmamış dört farklı antimikrobiyal peptidin meme kanseri hücre soyları olan MCF-7 ve MDA-MB 231 hücrelerine olan etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Antikanser aktivitesini araştırdığımız peptidler sığır (Bos taurus) nötrofillerinde bulunan siklik dodekapeptid, kurbağa (Rana palustris) deri salgısında saptanan Eskulentin-2PLa, ağustos böceği (Cryptotympana dubia) hemolenfinde tanımlanan kriptonin ve yaban arısının (Bombus pascuorum) hemolenfinde bulunan apiadesindir. Farklı organizmalarda bulunan bu peptidlerin seçiminde, tümör hücre membranları ile etkileşebilmeleri için katyonik karakterde ve amfipatik bir yapıda olmalarına dikkat edildi. Ayrıca normal hücrelere olan etkilerin incelenebilmesi için fare 3T3 fibroblast hücre soyu da kullanılmıştır.Antikanser aktivitesini araştırdığımız bu peptidlerin kanser hücre canlılığı üzerine etkileri tiazolil mavi tetrazolyum bromid (MTT) testi ile; hücreler üzerine olası litik etkileri laktat dehidrogenaz (LDH) salınımının ölçülmesi ile; apoptuzu indükleyici etkileri kaspaz-3 aktivitesinin spektrofotometik ölçülmesi ile ve DNA fragmentasyonunun agaroz jel elektroforezinde analizi ile; hücre ölümünün morfolojik olarak belirlenmesi akridin oranj/etidyum bromür ikili floresan boyama tekniği kullanılarak floresan mikroskopta incelenmesi ile araştırılmıştır. Katyonik antimikrobiyal peptidlerin hücre membranlarına verdikleri olası hasarların incelenmesi amacı ile taramalı elektron mikroskobu kullanılmıştır. Kanser hücre membranlarının negatif özellikte olmasına katkı sağladığı öne sürülen anyonik karakterdeki heparan sülfat ve kondroitin sülfata karşı peptidlerin olası afiniteleri, solid faz heparan sülfat ve kondroitin sülfat bağlama ölçümü ile araştırılmıştır. Negatif yüklü tümör hücre membranları ile antikanser aktivitesini araştırdığımız antimikrobiyal peptidlerin elektrostatik etkileşimlerini incelemek için, peptidlerin normal ve tümör hücrelerine olan afinitesi peptid bağlama ölçümü yöntemi ile araştırılmıştır.Elde ettiğimiz sonuçlara göre, siklik dodekapeptid, eskulentin-2PLa ve kriptoninin meme kanser hücrelerinde hücre canlılığını azalttığı, ancak apidaesinin böyle bir etkisinin olmadığı saptanmıştır. Siklik dodekapeptidin bu etkisi, MCF-7 ve MDA-MB 231 hücrelerine karşı gözlenirken, fibroblast hücre canlılığında gözlenmemiştir. Eskulentin-2PLa ve kriptonin ise tümör hücreleri yanı sıra fibroblast hücre canlılığını da azaltmıştır. Antikanser aktivitesini ilk kez ortaya koyduğumuz bu üç katyonik antimikrobiyal peptidin meme kanseri hücrelerini, membran bütünlüğünü bozarak ve membranlarda por oluşturarak nekrotik hücre ölümü ile öldürdüğü gözlenmiştir. Üç farklı katyonik antimikrobiyal peptidin negatif yüklü glikozaminoglikanlara bağlandığı ve fibroblast hücrelerine oranla meme kanseri hücrelerine daha fazla bir afinite gösterdiği de saptanmıştır.Tüm bu sonuçlar değerlendirildiğinde, meme kanseri hücrelerine gösterdiği toksisiteden dolayı, siklik dodekapeptid, eskulentin-2PLa ve kriptoninin terapötik öneminin olduğu, ancak bu peptidlerin arasında siklik dodekapeptidin seçici toksisitesinden dolayı diğer iki peptide göre terapötik değerinin daha fazla olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte, henüz in vivo kanser modellerinde etkinliği bilinmeyen bu peptidlerin, seçici olarak kemoterapiye dirençli tümör hücrelerine ulaştırılması sonucunda, tümör hücre ölümünü nekroz yolu ile indükleyebileceği ve kemoterapide karşılaşılan güçlüklerin üstesinden gelinebileceği ileri sürülebilir.

Abstract:
Antimicrobial peptides are present in many organisms ranging from insects to mammals and they are different in amino acid sequences and secondary structures. Recent studies have shown that these peptides are effective on both microorganisms and tumor cells. Tumor cell membranes, which have anionic character like bacterial membranes, are attacked by cationic antimicrobial peptides bind by an electrostatic manner and after they interact with membranes, they locate at the membrane and impair its integrity. In addition to this direct effect of cationic antimicrobial peptides, some peptides are known to penetrate into the cells and impair the integrity of mitochondrial membrane and to induce apoptosis in the cancer cells.In this study, it was aimed to investigate the effects of four different antimicrobial peptides, whose anticancer activities were not studied before, on MCF-7 and MDA-MB 231 cells, which are breast cancer cell lines. The possible anticancer peptides of our interest were cyclic dodecapeptide, present in bovine (Bos taurus) neutrophiles, esculentin-2PLa, which was detected in the skin secretion of frogs (Rana palustris), cryptonin, which was detected in the hemolymph of cicada (Cryptotympana dubia), and last but not least, apiadecin, which is present in the hemolymph of bumblebee (Bombus pascuorum). It was considered that these peptides, present in different organisms, were selected because they are cationic and amphipathic in character and they might interact with tumor cell membranes. For the investigation of effects to normal cells, mouse 3T3 fibroblast cell line was used.The peptides, which were investigated in terms of anticancer activity, were studied for cancer cell viability with thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) test, possible lytic effects on the cells were studied by measuring the lactate dehydrogenase (LDH) release, apoptose-inducing effects were detected by spectrophotometric measurement of caspase-3 activity and also by agarose gel electrophoresis of DNA fragmentation, morphologic means of determination of cell death was performed with acridine orange/ethidium bromide dual fluorescence dying technique on fluorescent microscope. Scanning electron microscope was used to investigate the possible damages of cationic antimicrobial peptides to cell membranes. The possible affinities of these peptides against anionic heparin sulphate and chondroitine sulphate, which were suggested to support the negativity of cancer cell membranes, were investigated with solid phase heparin sulphate and chondroitine sulphate binding measurements. In order to investigate the electrostatic interactions between antimicrobial peptides which were studied in terms of anticancer activity and negatively charged tumor cell membranes, the affinity of antimicrobial peptides against normal cells and tumor cells was investigated with peptide binding measurements.