Kars yöresinde yetiştirilen sığır ırklarındaki dna polimorfizminin Rapd-Pcr yöntemiyle belirlenmesi
An investigation on dna polymorphism of the cattle breeds in the province of Kars by Rapd-Pcr technique
Yazar: ALPARSLAN KADİR DEVRİM
Danışman: PROF. DR. NECATİ KAYA
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics

Özet:
Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RAPD-PCR) tekniği; rastgele dizilimdeki kısa oligonükleotid primerleri kullanarak ve genomdaki farklı bölgeleri çoğaltarak, genetik polimorfizmi belirleyen bir PCR tekniğidir. Bu çalışmanın amacı; Türkiye hayvancılığında önemli bir yeri olan Kars yöresinde yetiştirilen sığır ırklarındaki RAPD bant profillerinin belirlenmesi, ırk içi ve ırklar arasındaki genetik farklılıkların değerlendirilmesi ve araştırmada kullanılan primerler arasında eğer varsa bir ırka ya da ırklara özgü RAPD bantları veren primerlerin belirlenmesi olmuştur.

Örneklemeler her bir ırkın bulunduğu köy ve çiftliklerden hayvanların fenotiplerine göre yapıldı. DNA izolasyonu periferal kan lökositlerinden konsantre tuz solüsyonu yöntemine dayalı olarak ticari kitle gerçekleştirildi. Kars yöresinde yetiştirilmekte olan Doğu Anadolu Kırmızısı (DAK), Zavot (ZAV), Esmer (ESM) ve Simental (SIM) ırklarına mensup 91 sığırdan izole edilen DNA örnekleri bu projenin materyelini teşkil etti. İzole edilen DNA'lar RAPD-PCR uygulamasına başlanmadan önce 100 ng/µl yoğunluğuna ayarlandı. Irk başına 10'ar hayvan üzerinde, toplam 18 adet primerle RAPD-PCR tekniği gerçekleştirildi. Reaksiyonlar bantların yeniden elde edilme özelliği denenerek ve 94 °C'de 1 dakika (ayrılma), 35 °C'de 1 dakika (yapışma) ve 72°C'de 1 dakika (sentez) olacak şekilde toplam 40 döngü halinde gerçekleştirildi. Çalışma kapsamında; 12 adet 10 bazlık, 4 adet 9 bazlık, 1 adet 19 bazlık primer ve 1 adet de 21 bazlık primer kullanıldı. PCR işlemi ile elde edilen RAPD bantları elektroforez yöntemi ile belirlendi. Bu amaçla %1.5'lik agaroz ile hazırlanan jele boya maddesi olarak 0.5 µg/ml etidyum bromid katıldı. İncelenen 18 adet primerden yeterli sayıda ve belirgin RAPD bandı veren 10 tanesi değerlendirmeye alındı.

Irklar arasındaki genetik ilişkiler, toplam 89 lokustan elde edilen RAPD polimorfizmleriyle tayin edildi. Veri setinin istatistik analizi, ırklar arası genetik uzaklıkların belirlenmesi ve UPGMA yöntemi ile dendogramların çizilmesi işlemleri bilgisayar ile paket programdan yararlanılarak yapıldı.

Irklar arasında bu çalışma ile ortaya konan genetik ilişkiler incelendiğinde araştırılan dört sığır ırkının iki farklı kümede toplandıkları görüldü. Bunlardan ilkinden DAK ve SIM ırkları toplandı. İkinci kümede ise ESM ve ZAV ırkları yer aldı. Araştırma kapsamında ırka ve cinsiyete özgü RAPD bandına rastlanmadı.

Bu çalışma ile elde edilen veriler RAPD-PCR yönteminin Kars yöresinde yetiştirilen sığır ırklarının genetik yapılarının ve bu ırklar arasındaki genetik ilişkilerin belirlenmesinde etkili bir yöntem olduğunu göstermiştir.

Abstract:
Randomly Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction (RAPD- PCR) is a technique that determines genetic polymorphism by using randomly sequenced short oligonucleotide primers and amplifying different regions in the genome. The aim of this study was to determine the breed-specific primers and designate the RAPD fingerprints and genetic diversities of cattle breeds in Kars an important province where cattle reanring is common.
Animals were sampled from their native breeding ranches and villages regrding to the phenotypic appearances. The DNA samples were isolated from the leukocytes of peripheral blood by commercial kit using the salting out DNA extraction method. The DNA samples were isolated from a total of 91 animals from four breeds; East Anatholian Red (DAK), Zavot (ZAV), Turkish Brown Swiss (ESM) and simmental (SIM) which are the cattle breeds in the province of Kars. Isolated DNA samples were concentrated at 100ng/µl prior to RAPD-PCR process. A total of 18 primers were performed on 10 animals per breed. Duplicate PCR reactions of each animal were carried out for 40 cycles; 1 min. at 94 ̊C (denaturation), 1 min. at  35 °C (annealing) and 1 min. at 72 ̊ C (extension). Amplification products were seperated by agarose gel (%1.5) electrophoresis  and detected by ethidium bromide (0.5 µg/ml) staining. Eighteen primers were screened and 10 of them were selected for furter use as their clear and capable number of amplified bands. 
 
Genetic relations between breeds were determined by RAPD polymorphisms obtained from a total of 89 loci. Statistical analysis of the data, estimating the genetic distances between breeds  and sketching the cluster trees by UPGMA method were performed by a computer program.

Estimation of genetic relationships between the breeds revealed two clearly distinct groups of breeds: one was consisted of DAK and SIM, and the other was ESM and ZAV. No breed-specific or  sex-specific RAPD bands were detected in this study.

The study showed that the polymorphisms generated by RAPD-PCR in the cattle Breeds of the Province of Kars enables this method for the determination of genetic relationships and fingerprints.