Biyoteknolojik uygulamalar için Rhodobacter sphaeroides'e özgü ve oto-indüksiyon özelliğe sahip bir ekspresyon vektörünün geliştirilmesi
Construction of an auto-inducible expression vector for Rhodobacter sphaeroides for biotechnological applications
Yazar: MÜNEVVER GÜLSÜM ORUÇ
Danışman: PROF. DR. HASAN HÜSEYİN DOĞAN
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
PNS grubu Rhodobacter sphaeroides, birçok biyolojik olayın aydınlatılmasında model bakteri olarak kullanılması ve çok önemli birçok katma değerli ürünleri üretebilmesi bu bakterileri son derece önemli kılmaktadır. Rhodobacter sphaeroides'e özgü  özenle seçilmiş ekspresyon vektörü parçalarının plazmit iskeletiyle birleştirilmesiyle çeşitli moleküler araçların geliştirilmesi amaçlanmaktadır. Sentezlettirdiğimiz PTZGKF plazmiti XbaI ve BamHI enzimleri ile kesilerek istediğimiz gen bölgesi elde edilmiştir. Elde ettiğimiz bu gen bölgesini SspI enzimi ile kestiğimiz PBBR1MCS2 plazmitine klonlanmıştır.  Hazırlık kapsamda "Clone Manager 6" adlı yazılım kullanılarak vektör parçaları hassas çalışmalar neticesinde belirlenmiştir. Vektör tasarımında kullanılacak promotor, 6-Histidine etiketi, stop kodonları ve transkripsiyon terminatör dizileri ayrı ayrı tespit edilip "Clone Manager 6" yazılımı ile birleştirilerek bir sentetik gen kaseti oluşturulmuştur. Birleştirilen bu DNA parçaları tek bir parça olarak sentezlettirilip vektör ana iskeletiyle birleştirilerek ana ekspresyon plazmiti oluşturulmuştur. Ekspresyon vektörü ana iskeleti olarak pBBR1MCS2(5144bp) seçilmiştir. Bu vektör çeşitli konak hücrelerde tutunabilen ve ekspresyon çalışmalarında kullanılan bir vektördür. Bu vektör üzerinde Kanamisin'e dirençlilik geni taşımaktadır. In silico tasarlanan ve bir araya getirilen vektör parçaları (UAS, promotor, RBS, 6-His, terminator) GeneArt® veya Genscript gibi firmalara sentezlettirilmiştir. Bu gen bölgesi plazmitten SspI ile kesilen pBBR1MCS2'ye klonlanmıştır. Böylece pTR1 (4836bp) ekspresyon plazmiti elde edilmiştir. pTR1 vektör tasarımı, iki ayrı yapısal genin klonlanabilmesine olanak verecek şekilde yapılmıştır. PZR'de kullanılacak primerler, primer tasarım programları kullanarak oluşturulmuştur.  Rhodobacter sphaeroides türünün katma değeri yüksek olan 5-aminolevulinik asit (5-ALA) üretiminin arttırılması için gerekli olan ekspresyon vektörlerinin tasarlanması için ptr1 ekspresyon plazmiti oluşturulmuştur. 
Bu çalışmada gen mühendisliği yöntemleri kullanılarak Rhodobacter sphaeroides'e özgü ancak E.coli ve diğer yakın PNS bakterilerde de çoğalabilen ekspresyon plazmidi olan PTR1(4836bp) oluştulmuştur.

Abstract:
The usage of Rhodobacter sphaeroides belonging PNS bacteria group in elucidation of many biological processes as model bacteria and their capability to produce many important high value-added products make PNS bacteria extremely important. The aim is to develop a variety of molecular tools by linking carefully selected expression vector fragments specific to Rhodobacter sphaeroides with the plasmid skeleton. The synthesized PTZGKF plasmid was cut with XbaI and BamHI enzymes to obtain the desired gene region. This gene region that we have obtained has been cloned into the PBBR1MCS2 plasmid which cut with SspI enzyme. In preparation, the vector fragments are determined on the basis of precise work using the software called "Clone Manager 6". The promoter to be used in vector design, 6-His tag, stop codons in three reading frame, transcription terminator and unique restriction endonuclease recognition sites were assembled using "Clone Manager 6" software. These joined DNA fragments were synthesized as a single fragment and combined with the vector parent framework to form the parent expression plasmid. The expression vector pBBR1MCS2 (5144 bp) was selected as the main framework.
This vector is a vector that can be grafted onto various host cells and used in expression studies. This vector has Kanamycin resistance gene. In silico designed and assembled vector fragments (UAS, promotor, RBS, 6-His, terminator) have been synthesized by companies such as GeneArt® or Genscript. This gene region was cloned into pBBR1MCS2 which cut with the plasmid SspI. Thus, the pTR1 (4836bp) expression plasmid was obtained. The pTR1 vector design was made to allow two distinct structural genes to be cloned. The primers to be used in the PZR were created using primer design programs. The ptr1 expression plasmid was constructed to design expression vectors required for the enhancement of 5-aminolevulinic acid (5-ALA) production, which is high in Rhodobacter sphaeroides.
       In this study, PTR1 (4836 bp), an expression plasmid specific for Rhodobacter sphaeroides but able to replicate in E. coli and other nearby PNS bacteria, was generated using genetic engineering methods.