Heksozaminidaz enzimi alfa-altbirim genindeki 12 bazçiftlik delesyon mutasyonunun heksozaminidaz enzimi beta-altbirim geninde in vitro mutagenez ile oluşturulması ve proteine etkilerinin araştırılması
Reproducing the 12 bp deletion mutation of alpha-subunit gene of hexosaminidase into the beta-subunit gene of hexosaminidase by in vitro mutagenesis and analysing its effects on protein
Yazar: İNCİLAY SİNİCİ
Danışman: PROF.DR. ASUMAN ÖZKARA
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2004
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
GM2 gangliozidoz, N-asetil~P~heksozaminidaz (EC 3,2,1,52) A (Hex A)'nın a veya P-altbirimlerini kodlayan genler veya GM2 aktivatör protein genindeki bozukluk nedeni ile oluşan bir grup lizozomal depo hastalığıdır. Eksikliğinde GM2 ganglioidozun ortaya çıktığı Hex enziminin, a ve P-altbirimleri %60 dizi benzerliği gösterdiği için, Hex A ve Hex B genlerinin ortak bir ata genden evrimleştiklerine inanılmaktadır. Bu nedenle a ve |3-atbirimlerinin korunmuş fonksiyonel domainler ile çok benzer üç boyutlu yapıyı paylaştıkları düşünülmektedir. Bu çalışmada, Hex'de yapı-fonksiyon ilişkilerini ve mutasyonun yeni tedavi yöntemlerine uygunluğunu belirlemek üzere, Türk toplumunda tanımlanmış Tay-Sachs hastalarında en sık görülen ve oc-altbirimin pro- şekilde kalmasına neden olan 12 bazçiftlik (bç) delesyon mutasyonu (1267-1279) in vitro mutagenez ile P-altbirim cDNA'smda oluşturuldu. Aynı zamanda Hex ekspresyonu için promotor etkinliği araştırıldı. îki tanesi HCMV IE promotoru taşıyan, diğeri EF-loc promotoru taşıyan 3 farklı set ekspresyon vektörü kullanıldı. EF-la promotoru taşıyan plazmid ile transfeksiyonu takiben CHO hücreleri normalin iki katı miktarda mutant protein ekspresyonu gösterdi. |3-altbirimin pro- şekilde kaldığı olgun hale çevrilemediği saptandı. Tespit edilebilir Hex B aktivitesi ve P-altbirimin olgun şeklinin olamayışı mutant proteinin bozuk katlandığım ve Endoplazmik Retikulum'da (ER) kaldığım gösterdi. Sonuç olarak, 1) Hex B eksprese eden hücre dizileri oluştururken, HCMV IE pomotoru yerine EF-la promotoru taşıyan vektörlerin kullanımı yüksek |3 protein ekspresyonu elde etmek için daha uygundur. 2) P-altbirimindeki dört aminoasidin (He398-Asn-Lys-Gly401) proteinin katlanmasında önemli rolü vardır. 3) Mutasyon, proteinde kimyasal şaperon ve/veya substrat azaltma tedavilerinin uygulanamayacağı kadar önemli etki yaratmaktadır. Heterodimer yapıdaki proteinlerde mutasyonun her bir altbirimde oluşturduğu etkinin derecesinin bilinmesi yeni tedavi yöntemlerine uygunluğu belirlemede önemlidir.Anahtar Kelimeler: Tay-Sachs, heksozaminidaz, 12 bazçiftlik delesyon mutasyonu, protein katlanması, in vitro mutagenez. uygunluğu belirlemede önemlidir

Abstract:
GM2 gangliosidoses are a group of lysosomal storage diseases that result from defects in one of three genes which encode the a, J3-subunits of N-acetyl- P-hexosaminidase (EC 3,2,1,52) A (Hex A) or GM2 activator protein. Because the a and fj-subunits of Hex which is lack in GM2 gangliosidoses, share 60% sequence identities, the Hex A and Hex B genes are believed to have arisen from a common ancestral gene. Thus, a and P-subunits share very similar three dimensional structures with conserved functional domains. In this study, in order to determine the structure-function relationships in Hex and the severity of the mutation for future therapies, we reproduced the 12 bp deletion mutation (1267-1279) in the P-subunit cDNA by in vitro mutagenesis, which is found to be the most frequent mutation in Turkish Tay-Sachs patients and leads to detectable levels of inactive a protein in its pro-form. Promoter evaluation for Hex expression was analyzed at the same time. Three different sets of expression vectors were used, two of which are carrying HCMV IE promoter and one having EF-loc promoter. Following transfection with the plasmid carrying EF-la promoter, CHO cells clearly demonstrated two times higher expression of the mutated protein from the normal, p-subunit was observed in its pro-P form showing that it could not undergo further proccesing to be a mature enzyme. The lack of the detectable Hex B activity and the absence of the mature form of the P-subunit show the mutant protein is misfolded and retained in the ER. As a conclusion, 1) for establishing Hex B cell lines, vectors having EF-la promoter rather than HCMV IE promoter are useful to obtain high expression of P proteins 2) the effect of four aminoacide residues (He398-Asn-Lys-Gly401) in P- subunit is on protein's overall folding 3) this is a severe mutation that is not likely to be treated by the emerging chemical chaperone and/or substrate depletion therapies. Because of the feasibility of new therapeutic approaches, it is important to determine the degree of mutation effects on each subunits of heterodimer proteins.Key Words: Tay-Sachs, hexosaminidase, 12 bp deletion mutation, protein folding, in vitro mutagenesis.