Diabetes insipidus tanılı hastaların AVP-NPII geninde tanımlanan mutasyonların fonksiyonel analizleri
Functional analyses of mutations found in AVP-NPII gene of patients diagnosed with diabetes insipidus
Yazar: MERVE ÖZCAN TÜRKMEN
Danışman: PROF. DR. HATİCE MERGEN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Diabetes insipidus = Diabetes insipidus ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay

Özet:
Sağlıklı bireylerde kan ozmolalitesi, vücut su dengesini ayarlayan mekanizmalar aracılığıyla belirli sınırlar içerisinde tutulmaktadır. Plazma ozmolalitesindeki artış veya kan hacmindeki azalma ile böbreklere suyu koruması için sinyal gönderilerek susuzluk uyarılmaktadır. Bu uyarılma sonucu, arka hipofizde depolanmakta olan arjinin vazopressin hormonu (AVP, ADH, antidiüretik hormon) kana salınmaktadır. AVP hormonu, kan dolaşımı yoluyla böbreklere gelerek toplama kanalı hücrelerindeki arjinin vazopressin reseptör 2 (AVPR2)'ye bağlanmaktadır. AVP'nin AVPR2'ye bağlanması, hücre içerisinde bulunan akuaporin 2 su kanal proteinlerinin (AQP2) fosforillenerek apikal membrana yerleşmelerini sağlamaktadır. AQP2 su kanalı aracılığıyla ihtiyaç duyulan suyun geri emilimi gerçekleşmekte ve böylece vücuttaki su dengesi tekrar kurulmaktadır. Bu mekanizma içerisinde oluşabilecek herhangi bir aksaklık vücudun su dengesinin bozulmasına ve poliüri, polidipsi ile karakterize olan Diabetes insipidus (DI) hastalığının gelişimine neden olmaktadır.
DI, AVP hormonun yetersiz sentezi ve/veya salınımına bağlı olarak santral tip (CDI) veya böbreklerde AVP'ye karşı yetersiz cevap oluşmasına bağlı olarak nefrojenik tipte (NDI) olabilmektedir. CDI, kafa travmaları, beyin tümörleri, cerrahi operasyonlar veya çeşitli hastalıklar sonucu nörohipofiz bölgesinin hasarı nedeniyle sonradan meydana gelebileceği gibi, arjinin vazopressin-nörofizin II (AVP-NPII) geninde bulunan mutasyonlar nedeniyle kalıtsal olarak da oluşabilmektedir. AVP-NPII geni ile ilgili yapılan çalışmalarda, gendeki mutasyonlar nedeniyle öncül hormonun düzgün bir şekilde katlanması ve işlenmesinde başarısızlık olduğu bulunmuştur. Bunun sonucunda mutant proteinin endoplazmik retikulum (ER) içerisinde birikerek protein agregasyonları oluşturduğu ve diğer esansiyel proteinlerin düzenli işlenmesini engelleyerek magnoselüler sinir hücrelerinin ölümüne yol açtığı tespit edilmiştir.
Bu tez çalışmasının amacı, DI tanısı konmuş hastaların AVP-NPII geninde tanımlanmış G45C, 207_209delGGC ve G88V mutasyonlarına ilişkin literatürde yer almayan fonksiyonel analizlerinin gerçekleştirilmesidir. Bu amaçla yapılan deneysel çalışmalarda, yabanıl tip AVP-NPII geni içeren ifade vektörü üzerinde ilgili mutasyonlar bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak oluşturulmuş ve vektörlerin Neuro2A hücrelerine geçici transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. Neuro2A hücreleri tarafından besiyerine salınan yabanıl tip ve mutant AVP miktarları radyoimmün analiz (RIA) ve enzim-bağlı immünosorbent analiz (ELISA) yöntemleri olmak üzere iki ayrı yöntem ile belirlenmiştir. Yabanıl tip ve mutant öncül hormonların hücre içi trafiklerindeki farklılıkları belirleyebilmek için floresan görüntüleme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, AVP miktarının belirlenmesinde kullanılan RIA yönteminin gerçekleştirilmesi zor ve uzun süren bir yöntem olmasından dolayı, yerine alternatif bir yöntem olarak daha hızlı sonuç veren ve gerçekleştirilmesi kolay olan ELISA yönteminin kullanılabilirliği istatiksel bir analiz olan Bland-Altman yöntemi ile değerlendirilmiştir.
Çalışmanın sonucunda G45C ve G88V mutant proteinlerin yabanıl tip AVP-NPII proteinine göre hücre kültürü ortamında önemli ölçüde azalmış miktarda bulunduğu ve hücrede ER içerisinde takılı kaldığı belirlenmiştir. Bununla birlikte, 207_209delGGC mutant proteinin ise, hücre kültürü ortamında yabanıl tip proteine yakın miktarda bulunduğu ve yabanıl tip ile benzer şekilde ER'de takılı kalmayarak hücre içi kompartmanlara dağıldığı gözlenmiştir. G45C ve G88V mutasyonlarının öncül hormonun düzgün katlanması, üç boyutlu yapısını kazanması, işlenmesi veya hücre içi trafiği gibi süreçlerde önemli etkilere sahip olduğu, 207_209delGGC mutasyonunun ise bu süreçlerde herhangi bir önemli etkiye sahip olmadığı sonucuna varılmıştır. Ayrıca AVP miktarının belirlenmesinde, ELISA yönteminin RIA yöntemi yerine alternatif bir yöntem olarak kullanılabilceği belirlenmiştir.

Abstract:
In healthy individuals, blood osmolality is kept within certain limits through mechanisms that regulate body water balance. Thirst is stimulated by sending signals to the kidneys for water protection with an increase in plasma osmolality or a decrease in blood volume. As a result of this stimulation, the arginine vasopressin hormone (AVP, ADH, antidiuretic hormone) which is stored in the posterior pituitary, is released into the blood. The AVP hormone reaches to the kidneys through the bloodstream and binds to arginine vasopressin receptor 2 (AVPR2) in the collection duct cells. The binding of AVP to the AVPR2 leads to the aquaporin 2 water channel proteins (AQP2) to be phosphorylated and settle in the apical membrane. The reabsorption of the required water takes place through the AQP2 water channel, thus the water balance in the body is reestablished. Any malfunction that may occur within this mechanism causes disruption of the body's water balance and the development of Diabetes insipidus (DI) disease, which is characterized by polyuria and polydipsia.
DI can be either central type (CDI) due to inadequate synthesis and/or release of AVP hormone or nephrogenic type (NDI) due to inadequate response of the kidney to AVP. CDI can be either acquired by damage to the neurohypophysis region as a result of head injuries, brain tumors, surgical operations or various diseases or can be congenital due to mutations in the vasopressin-neurophysin II (AVP-NPII) gene. In many studies concerning AVP-NPII, it has been found that the precursor hormone fails during proper folding and processing due to mutations in the AVP-NPII gene. As a consequence, the mutant protein accumulates in the endoplasmic reticulum (ER), generates protein aggregations and leads to the death of magnocellular nerve cells by preventing the regular processing of other essential proteins.
The aim of this thesis is to perform functional analyzes of G45C, 207_209delGGC and G88V mutations defined in the AVP-NPII gene of patients diagnosed with DI, which are not included in the literature. In the experimental studies, the relevant mutations on the expression vector containing the wild-type AVP-NPII gene were created using the site-directed mutagenesis method and transient transfection of these vectors to Neuro2A cells was performed. The amount of wild type and mutant AVP that were released into the medium by Neuro2A cells were determined by two separate methods, namely radioimmunoassay (RIA) and Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Fluorescence imaging studies were performed to determine the differences in the intracellular traffic of wild-type and mutant precursor hormones. In addition, since the RIA method used in determining the amount of AVP is a difficult and long-lasting method, the usability of the ELISA method, which provides faster results and is easy to perform as an alternative method for RIA, was evaluated by the Bland-Altman method, which is a statistical analysis. 
As a result of the study, it was determined that G45C and G88V mutant proteins were significantly reduced in the cell culture medium compared to wild type AVP-NPII protein and were trapped in the ER in the cell. However, it was observed that the amount of 207_209delGGC mutant protein is similar to the wild type protein in the cell culture medium and was distributed in intracellular compartments by not being trapped in ER, likewise the wild type. It has been concluded that G45C and G88V mutations have significant effects in processes such as the proper folding, gain of three-dimensional structure, processing, or intracellular traffic of the precursor hormone, and the 207_209delGGC mutation does not have any significant effect in these processes. In addition, it was determined that ELISA method can be used as an alternative method instead of RIA method in determining the amount of AVP.