Dispeptik hastalarda ELISA ve Western blot yöntemleri ile Helicobacter pylori'nin antijenik varyasyonlarının araştırılması
Investigation of Helicobacter pylori antigenic variations by ELISA and Western blot methods in patients with dyspepsia
Yazar: NESLİHAN BEKMEN
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM YILMAZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Helicobacter pylori (H. pylori) gastrik mukozada kolonize olan spiral, mikroaerofilik, Gram-negatif bir bakteridir. H. pylori enfeksiyonu gelişmiş ülkelerde nüfusun % 20-50'inde, gelişmekte olan ülkelerde nüfusun % 80-90'nında ortaya çıkan en yaygın kronik bakteriyel enfeksiyondur. H. pylori kronik gastrit, duodenal ve gastrik ülser, gastrik adenokarsinoma mukoza ilişkili lenfoid doku (MALT) lenfoma gibi birçok üst gastrointestinal sistem hastalıklarıyla ilişkilidir ve sınıf 1 karsinojeni olarak sınıflandırılmıştır. Dispeptik hasta serum ve idrar örneklerinde anti-H. pylori antikor (IgG, IgA/IgG, CagA IgG) varlığı Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blot, URINELISA ve RAPIRUN yöntemleri ile araştırıldı. Ayrıca anti-H. pylori pozitif hasta serumlarında Western blot yöntemi ile saptanan virülans faktörlerinden sitotoksin ile ilişkili gen A (CagA), vakuol oluşturucu sitotoksin A (VacA) ve diğer H. pylori antijenlerine karşı oluşan antikorların görülme sıklığı ve bu antijenlere karşı oluşan antikorların histopatoloji bulguları ile ilişkisi karşılaştırıldı. Bu hasta grubunda antijenik varyasyonun moleküler düzeyde belirlenmesinde ileri araştırmalar yapılabilmesi amacıyla da altın standart yöntem olan H. pylori kültür optimizasyonu yapıldı.Nisan 2006 ve Temmuz 2008 tarihleri arasında dispeptik yakınmaları nedeniyle Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Polikliniği'ne başvuran ve endoskopi endikasyonu konulan 136 olgu (102 kadın, 34 erkek yaş ortalaması 46.57 ± 12.63 standart deviasyonu (SD); yaş aralığı 21-78) çalışmaya alındı. Hastalardan alınan dört biyopsi örneğine (iki antrum, iki korpus) hızlı üreaz testi (HUT) ve histopatolojik inceleme uygulandı.H. pylori enfeksiyonu histopatoloji ve/veya hızlı üreaz testi olumluluğu, H. pylori enfeksiyonu negatifliği ise her iki testin olumsuzluğu ile belirlendi. Morfolojik olarak ?Helicobacter-like organisms (HLO)?, gastrik aktivite ve H. pylori bakteriyal dansitesi yönünden Güncelleştirilmiş Sydney Sistemine göre değerlendirildi.Serum ve idrar örneklerinde H. pylori antikorları; anti-H. pylori IgG ELISA, anti-H. pylori CagA IgG ELISA (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika, Lübeck), H. pylori IgA/IgG ELISA (BIOHIT, Finland), anti-H. pylori IgG Western blot (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika, Lübeck), anti-H. pylori IgG URINELISA ve RAPIRUN (Otsuka Pharmacautical, Tokyo, Japan) testleri kullanılarak araştırıldı.Toplam 136 hastanın; 103'ü (% 75.7) altın standart yöntemlere göre H. pylori enfeksiyonu olumlu, 33'ü (%24.3) olumsuz bulundu. 115'i (% 84.5) anti-H. pylori IgG ELISA testi ile olumlu, 21'i (% 15.5) olumsuz saptandı. Duyarlılık % 91.1; seçicilik % 34.3, olabilirlik oranı (LR) 0.77, olumlu öngörü değeri (PPV) % 80, olumsuz öngörü değeri (NPV) ise % 57.2 olup, altın standart yöntemler ile istatistiksel anlamlı fark gözlendi (p=0.02). 47'si (% 34.6) anti-H. pylori CagA IgG ELISA testi ile olumlu, 89'u (% 65.4) olumsuz saptandı. Duyarlılık % 35.6; seçicilik % 65.7, LR 0.44, PPV % 76.6, NPV ise % 25.9 olup, altın standart yöntemler ile istatistiksel anlamlı fark gözlendi (p=0.00). 100' ü (% 73.5) H. pylori IgA/IgG ELISA testi ile olumlu, 36' sı (% 26.5) olumsuz saptandı. Duyarlılık % 85.2; seçicilik % 60, LR 0.89, PPV % 86, NPV ise % 58.3 olup, altın standart yöntemler ile istatistiksel anlamlı fark gözlenmedi (p=1). 72' si (% 52.9) anti-H. pylori IgG URINELISA testi ile olumlu, 64' ü (% 47.1) olumsuz saptandı. Duyarlılık % 66.3; seçicilik % 85.7, LR 0.71, PPV % 93.1, NPV ise % 46.9 olup, altın standart yöntemler ile istatistiksel anlamlı fark gözlendi (p=0.00). 70' i (% 51.4) RAPIRUN testi ile olumlu, 66' sı (% 48.6) olumsuz saptandı. Duyarlılık % 65.4; seçicilik % 82.9, LR 0.69, PPV % 91.6, NPV ise % 45.3 olup, altın standart yöntemler ile istatistiksel anlamlı fark gözlendi (p=0.00).Anti-H. pylori IgG Western blot testi ile 95'i (% 69.8) olumlu, 25'i (% 18.4) olumsuz, 16' sı (% 11.8) belirsiz olarak saptandı. Belirsiz sonuçlar dahil edilmediğinde; duyarlılık % 85.7; seçicilik % 44.8, LR 0.76, PPV % 82.9, NPV ise % 50 bulundu.H. pylori enfeksiyonu tanısında altın standart yöntem kültürün, H. pylori standart suş NCTC 11637 kullanılarak %10 insan serumlu Columbia agar, %7 at kanlı Columbia agar, %7 koyun kanlı Columbia agar besiyerlerinde optimizasyonu gerçekleştirilmiş ve ileri araştırmalar için deoksiribonükleik asit (DNA) ekstraksiyonu da yapılmıştır.Çalışmamızda anti-H. pylori IgG ELISA testlerinin karşılaştırılmasında duyarlılığın literatür ile uyumlu, seçiciliğin düşük bulunması ve dünyanın farklı bölgelerindeki H. pylori izolatlarının antijenik yapıları bölgesel farklılık gösterdiği için serolojik testlerin populasyonların antijenik özelliklerine göre uyarlanmasının önerilmesi gerektiği sonucuna varıldı.Anahtar kelimeler: Helicobacter pylori, ELISA, Western blot, kültür

Abstract:
Helicobacter pylori (H. pylori) is a spiral-shaped, microaerophilic, Gram-negative bacteria which colonize gastric mucosal. H. pylori infection is one of the most common chronic bacterial infections occurring 20-50 % in developed countries and 80-90 % in developing countries. H. pylori is related to a number of upper gastrointestinal diseases, such as chronic gastritis, duodenal and gastric ulcer, gastric adenocarcinoma and mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma and has been classified as a class 1 carcinogen. Anti-H. pylori antibodies (IgG, IgA/IgG, CagA IgG) were determined in the sera and urine specimens of patients with dyspepsia by ELISA, Western blot, URINELISA and RAPIRUN methods. Also, the frequency of the antibodies againts virulence factors CagA, VacA and other H. pylori antigens were detected by Western blot method and their relationship were assessed with histopathology results in anti-H. pylori positive patient sera. Moreover, with the aim of making further researches to determine H. pylori antigenic variations in molecular level, as gold standard method H. pylori culture optimizations were performed.The study population consisted of 136 adult patients with dyspepsia (102 females, 34 males; mean age, 46.57±12.63 SD years; age range 21 to 78 years) from Outpatient Gastroenterology Service at Dokuz Eylül University Hospital between April 2006 and July 2008. All patients had dyspeptic symptoms and were referred to a diagnostic upper endoscopy. Four biopsy specimens (two antrum, two corpus) were taken from each patient; rapid urease test (RUT) and histopathological examination were applied.Infection by H. pylori was defined as positivity and negativity of histopathology and/or RUT. Morphologic examination of Helicobacter-like organisms (HLO), gastritis activity and to grade bacterial density of H. pylori were evaluated according to Updated Sydney System.Sera and urine specimens of these patients were examined by anti-H. pylori IgG ELISA, anti-H. pylori CagA IgG ELISA (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika, Lübeck), H. pylori IgA/IgG ELISA (BIOHIT, Finland), anti-H. pylori IgG Western blot (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika, Lübeck), anti-H. pylori IgG URINELISA and RAPIRUN (Otsuka Pharmacautical, Tokyo, Japan) methods.A hundred three of 136 patients (75.7 %) were diagnosed as positive and 33 (24.3 %) were negative for H. pylori infection by the gold standard methods.115 (84.5 %) were diagnosed positive and 21 (15.5 %) were diagnosed negative by anti- H. pylori IgG ELISA method. The sensitivity, specificity, positive and negative predictive values (PPV, NPV) and likelihood ratio (LR) were 91.1 %, 34.3 %, 80%, 57.2 % and 0.77, respectively. Statistical difference was found between the results of gold standard methods and anti- H. pylori IgG ELISA (p=0.02). 47 (34.6 %) were diagnosed positive and 89 (65.4 %) were diagnosed negative by anti- H. pylori CagA IgG ELISA method. The sensitivity, specificity, PPV, NPV and LR were 35.6 %, 65.7 % , 76.6 %, 25.9 % and 0.44, respectively. Statistical difference was found between the results of gold standard methods and anti- H. pylori CagA IgG ELISA (p=0.00). 100 (73.5 %) were diagnosed positive and 36 (26.5 %) were diagnosed negative by H. pylori IgA/IgG ELISA method. The sensitivity, specificity, PPV, NPV and LR were 85.2 %, 60 % , 86 %, 58.3 % and 0.89, respectively. No statistical difference was found between the results of gold standard methods and H. pylori IgA/IgG ELISA (p=1). 72 (52.9 %) were diagnosed positive and 64 (47.1 %) were diagnosed negative by anti-H. pylori IgG URINELISA method. The sensitivity, specificity, PPV, NPV and LR were 66.3 %, 85.7 % , 93.1 %, 46.9 % and 0.71, respectively. Statistical difference was found between the results of gold standard methods and anti-H. pylori IgG URINELISA (p=0.00). 70 (51.4 %) were diagnosed positive and 66 (48.6 %) were diagnosed negative by RAPIRUN method. The sensitivity, specificity, PPV, NPV and LR were 65.4 %, 82.9 % , 91.6 %, 45.3 % and 0.69, respectively. Statistical difference was found between the results of gold standard methods and RAPIRUN (p=0.00).Ninety-five (69.8 %) patients were positive, 25 (%18.4) were negative, and 16 were borderline (11.8 %) by anti- H. pylori IgG Western blot test. When the borderline results were not included, the sensitivity, specificity, PPV, NPV and LR were 85.7 %, 44.8 %, 82.9 %, 50 % and 0.76, respectively.The culture is the gold standard method in the diagnosis of H. pylori infection. H. pylori NCTC 11637 standard strain was used in the optimization of H. pylori culture using different culture media (10% human sera Columbia agar, 7% horse blood Columbia agar and 7% sheep blood Columbia agar with different supplements) and the optimization of bacterial DNA extraction was also performed for further molecular analysis of isolated H. pylori strains.In this study, the sensitivity of the anti- H. pylori IgG ELISA was in accordance but the the specificity was lower with the other studies on H. pylori. We suggest that H. pylori strains have a diverse genetic heterogeneity in the world, the serological test kits should be adapted to the most common H. pylori strain in that region.Key words: Helicobacter pylori, ELISA, Western blot, culture