Spermatogenezde rol oynayan hücresel moleküler mekanizmaların araştırılması
Investigation of the cellular molecular mechanisms playing roles in spermatogenesis
Yazar: YUNUS YÜKSELTEN
Danışman: DOÇ. DR. OYA SENA AYDOS
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology ; Üroloji = Urology
Dizin: Androloji = Andrology ; Azospermi = Azoospermia ; Genetik belirteçler = Genetic markers ; Genler = Genes ; Kök hücreler = Stem cells ; Kısırlık = Infertility ; Kısırlık-erkek = Infertility-male ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Spermatogenez = Spermatogenesis

Özet:
Spermatogenez, olgun testiste spermatogonyal kök hücrelerinin mitoza girip farklılaşmış bir spermatogonya türünü tetiklemesiyle başlatılır. Böylece, spermatogenez spermatogonyal kök hücreler (SKH)'in farklılaşması ve spermatogonyaların kesintisiz bir kaynağı olarak devamlılığı sağlama yeteneği ile devam ettirilir. Erkek infertilitesinin etyolojisinin aydınlatılmasında SKH'lerin tanımlanması ve bu belirteçlerin spermatogenez defektlerindeki etkilerinin belirlenmesi çok önemlidir. Bu çalışmada spermatogenez sürecinde germ hücre proliferasyonu, diferensiyasyonu ve hücre canlılığında rol oynayan spermatogonyal kök hücreleri tanımlayacak yeni biyobelirteçler ve bu belirteçlerin spermatogenez defektleri ile olan ilişkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.  
Spermatogenez sürecinde etkin olan ve hücresel mekanizmalarda önemli rolleri olan biyobelirteçler ve bu biyobelirteçlerin spermatogenez defektleri ile olan ilişkileri RT-PCR array analizleri ile gerçekleştirildi. Anlamlı gen ifadeleri western blot, immunohistokimya ve immunositokimyasal analizlerle doğrulandı. HP grubunda CD117 ve ID1 genleri sırasıyla 2,42, 2,26 kat artış gösterdiği (p<0,05), CD29 genininde 0,08 kat (p<0,05) azalış gösterdiği tespit edildi. MA grubunda spermatogonyal kök hücre belirteçlerinde CD90, CD133, CD24, ITGA6, DNM2, LİN28A ve POU5F1 gen ifadelerinde sırasıyla 0,40, 0,04, 0,54, 0,22, 0,28, 0,22 ve 0,16 kat azalış gösterdiği tespit edildi (p<0,05). SCO grubunda CD90, CD117, CD29, ID1, LİN28A ve POU5F1 gen ifadelerinde sırasıyla 4,73, 6,23, 2,10, 2,86, 8,71 ve 3,56 kat artış gösterdiği tespit edildi (p<0,05). SCO grubunda CD133 gen ifadelerinin tespit edilmediği gösterildi.

Yapılan analizler sonucunda CD133'ün western blot analizinde HP, MA ve SCO gruplarında sırasıyla 1,83, 4,11 ve 11,4 kat azalan protein ifadeleri tespit edildi (p<0,05). CD133'ün immunohistokimyasal analizinde OA grubunda geniş yayılımlı bir pozitif boyanma gözlemlenirken, HP grubunda kısmen bir pozitif boyanma gözlemlendi. MA grubunda çok az ve SCO grubunda negatif boyanma tespit edildi. CD133'ün sağlıklı spermdeki lokalizasyonu lazer taramalı konfokal görüntü analizinde yoğun olarak kuyruk ve kısmen baş kısmında ifade edildiği gösterildi. Sağlıklı ticari Sertoli hücreleri ve OA'lı bireylerin Sertoli hücre kültürlerinde CD133 protein ifadesinin yoğun bir şekilde ifade edildiği tespit edildi.
SKH belirteçlerinin infertil hasta gruplarında farklı profil sergilediği tespit edildi. Bu belirteçlerin spermatogenez defektlerine olan etkilerine karşılık geliştirilecek küratif protokollerin insan üreme sağlığı açısından çok değerli olacağını düşünmekteyiz.

Abstract:
Spermatogenesis is initiated when spermatogonial stem cells in adult testis enter the mitosis and induce differentiated spermatogonia. Thus, spermatogenesis is continued with the differentiation of the ability of spermatogonial stem cells (SKH) and with the ability to maintain continuity as an uninterrupted source of spermatogonia.  Identification of SKHs and determination of their effects on defects of spermatogenesis are very important for elucidation of the etiology of male infertility. In this study, our aim is to investigate the new biomarkers that define spermatogonial stem cells which play a role in germ cell proliferation, differentiation, cell viability and to research the relationship between these biomarkers with spermatogenesis defects.  

The biomarkers, effective in the spermatogenesis process and have important roles in cellular mechanisms, and its relationshipn with spermatogenesis defects were analyzed by RT-PCR array analysis. Statistically significant gene expression was confirmed by western blot, immunohistochemistry and immunocytochemical assays. In the HP group, CD117 and ID1 genes showed a 2.42-fold, 2.26-fold increase (p <0.05)  respectively and 0.08-fold decrease (p <0.05) in the CD29 gene. In the MA group, CD90, CD133, CD24, ITGA6, DNM2, LIN28A and POU5F1 genes showed 0.40, 0.04, 0.54, 0.22, 0.28, 0.22 and 0.16- fold decrease (p <0.05) respectively. SCO group CD90, CD117, CD29, ID1, LIN28A and POU5F1 gene expressions showed 4.73, 6.23, 2.10, 2.86, 8.71 and 3.56 fold increase respectively (p <0.05). CD133 gene expression was not detected in the SCO group.

As a result of the western blot analysis of CD133 protein expression HP, MA and SCO groups showed 1.83, 4.11 and 11.4 fold decrease respectively (p <0.05). Immunohistochemical analysis of CD133 showed a partial positive staining in the HP group, while an excess positive staining was observed in the OA group. The negative staining was detected in the MA and SCO groups. The localization of the CD133 protein in the healthy sperm was shown to be mostly in the tail and partially in the head by laser scanning confocal image analysis. It has been found that healthy commercial Sertoli cells and OA groups express CD133 protein intensively confirmed by immunocytochemical analysis of CD133 protein expression in Sertoli cell cultures.

It was found that SKH biomarkers exhibit different profiles in infertile patient groups. We think that the curative protocols which will be developed against the effects of these markers in spermatogenesis defects will be very valuable in terms of human reproductive health.