Non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı modelinde oksisiterollerin lipid metabolizması ve endoplazmik retikulum stres yolağına etkisi
Role of oxysterols, on lipid metabolism and endoplasmic reticulum stress pathway in non-alcoholic fatty liver disease
Yazar: ALİ ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. NESRİN KARTAL ÖZER
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer hastalıkları = Liver diseases ; Karaciğer yağlanması = Fatty liver ; Lipid metabolizması = Lipid metabolism ; Oksisteroller = Oxysterols ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Stres = Stress

Özet:
Amaç: Yüksek kolesterol diyetiyle oluşturulan NAYKH modelinde değişen oksisterol düzeylerinin karaciğer dokusunda lipit metabolizması ve ER stres üzerindeki etkisini ve vitamin E'nin bu süreçteki rolünü araştırmaktır. Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda, 2-4 aylık 24 adet erkek albino tavşan 4 gruba ayrıldı: 1) Kontrol; normal yem 2) Kolesterol; %2 kolesterol içeren yem. 3) Kolesterol + vitamin E; %2 kolesterol içeren yem ve vitamin E i.m. uygulandı. 4) Vitamin E; normal yem + vitamin E i.m. uygulandı. 8 hafta sonunda, tavşanlardan kan örnekleri ve karaciğer dokuları alındı. Karaciğer dokuları makroskobik olarak incelendi. Karaciğer dokularından alınan kesitlerde kolesterol ile beslenen tavşanlarda NAYK oluşumu Oil red boyamasıyla ve enflamasyon ve steatosizin geliştiği, α-SMA, RAM11, col1A1 ve 4HNE belirteçleriyle ışık mikroskobunda gösterildi. ER stres (pIRE1, pPERK, Grp78 ve Grp94), lipit metabolizması değişikliği (PPARα, PPARγ, SREBP1 ve SREBP2 transkripsiyon faktörü) ve oksisterol ilişkili proteinler (LXRα and ABCA1)  immunblotlama tekniği ile belirlendi. Oksisterol düzeyleri LC-MS/MS tekniği ile MRM metodu kullanılarak ölçüldü. Bulgular: pIRE1 ve Grp94 protein ekspresyonları kolesterol grubunda anlamlı bir şekilde artarken kolesterol+vitamin E verilen grupta anlamlı bir şekilde azaldığı gözlendi. SREBP1,  SREBP2 ve PPARγ ekspresyonları hiperkolesterolemi ile artarken, kolesterol+vitamin E verilen grupta anlamlı olarak azaldı. LXRα hiperkolesterolemi ile azalırken ABCA1'de değişiklik gözlenmedi. Vitamin E verilmesi LXRα'yı daha da azaltırken ABCA1 ekspresyonunu anlamlı bir şekilde artırdı. Oksisterol düzeyleri ise; 24(S)-OHC, 25-OHC ve 7-KC hiperkolesterolemi ile artarken, 27-OHC ve 7α-OHC'de değişiklik gözlenmedi. Kolesterol+vitamin E verilen gruplarda 24(S)-OHC, 25-OHC ve 7-KC anlamlı olarak azalırken, 27-OHC ve 7α-OHC anlamlı olarak arttı. Sonuçlar: Tavşanlarda yüksek kolesterollü yem ile değişen oksisterol düzeylerinin ER stresin tetiklenmesinde rolü olduğu, artan lipit birikiminin oksisterol düzeyini de etkilediğini ve NAYKH oluşumuna yol açtığını ve Vitamin E verilmesinin NAYKH gelişimini azaltıcı yönde etkilediğini göstermektedir.
Anahtar kelimeler: Non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı, oksisterol, ER stres

Abstract:
Aim: The aim of this study is to investigate the effect of varying oxysterol levels on liver lipid metabolism and ER stress in NAFLD model of high cholesterol diet, and the role of vitamin E in this process. Material and Methods: 24 male albino rabbits were assigned randomly to 4 groups: 1) Control; normal rabbit chow 2) Cholesterol; 2% cholesterol containing chow 3) Cholesterol+Vitamin E; 2% cholesterol food with daily i.m. injections of vitamin E and 4) Vitamin E; normal food + daily i.m. injections of vitamin E. After 8 weeks, blood samples and liver tissues were collected. Liver tissues were examined macroscopically. In sections obtained from high cholesterol fed rabbits liver tissues were photographed NAFL formation with oil red staining and immunohistochemically development of inflammation and steatosis with α-SMA, RAM11, col1A1 and 4HNE markers on a light microscope. Endoplasmic reticulum stress (pIRE1, pPERK, Grp78 and Grp94), lipid metabolism alteration (transcription factor of PPARα, PPARγ, SREBP1 and SREBP2) and oxysterol-related (LXRα and ABCA1) proteins were determined by immunoblotting technique.  Oxysterol levels were measured by LC-MS/MS using the MRM method. Results: Expression of pIRE1 and Grp94 protein significantly increased in the hypercholesterolemic group, but significantly decreased in the cholesterol + vitamin E group. While SREBP1, SREBP2 and PPARγ expressions were increased in cholesterol group, these proteins were significantly decreased in cholesterol + vitamin E group. LXRα decreased in cholesterol group but ABCA1 was not change. While vitamin E administration was further decreasing LXRα, ABCA1 expression significantly increased. Oxysterols; 24(S)-OHC, 25-OHC and 7-KC increased in cholesterol group, but no change were found for 27-OHC and 7α-OHC. While 24(S)-OHC, 25-OHC and 7-KC were significantly decreased with vitamin E supplementation, 27-OHC and 7α-OHC were significantly increased. Conclusion: Our results suggest that NAFLD develped in high cholesterol fed rabbits by increased accumulation of lipids in the liver, thus affects oxysterol levels, and that varying levels of oxysterols play a role in triggering ER stress, and vitamin E administration is thought to play a role in reducing NAFLD development in this process.
Key Words: Non-alcoholic fatty liver disease, oxysterol, ER stress