Kanser tedavisinde gen susturulması için hyalüronik asit-polietilenimin taşıyıcı sisteminin geliştirilmesi
Development of hyaluronic acid-polyethyleneimine delivery system for gene silencing in cancer treatment
Yazar: BESTE ÇAĞDAŞ TUNALI
Danışman: DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR ; PROF. DR. MUSTAFA TÜRK
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kanser tedavisinde kısa engelleyici siRNA'ların hedefe spesifik taşınımı günümüzün önde gelen araştırma konularından birisidir. Sunulan tez çalışması kapsamında siRNA'ların hyalüronik asit (HA) reseptörü aracılığı ile etkili bir şekilde taşınımı, biyobozunur HA ve düşük molekül ağırlıklı polietilenimin (PEI) temelli taşıma sistemleri ile gerçekleştirilmiştir. Yine bu tez çalışması kapsamında literatürde ilk defa, fototermal yanıt verebilme yeteneğindeki, inorganik temelli nanotaşıyıcılardan olan altın nanoparçacıkların ve bunların PEI ve HA ile yapmış olduğu konjugatların, bunlara ilaveten yapıya kemoterapötik ajan olarak kullanılan Doksorubisinin de ilave edilmesi ile oluşturulan nihai parçacıkların (AuPEI-HA-DOX) birçok kanser türünde aşırı eksprese olduğu kanıtlanmış CXCR4 reseptörlerine özgü siRNA'lar ile kompleks oluşturması ile, sonuçta bu tezin en önemli özelliklerinden biri olan gen susturma, fototermal terapi ve kemoterapinin kombinasyonu sağlanmıştır. Kanserin etkin bir şekilde hedeflenmesi ve kombine terapisi amacıyla tez çalışmasında ilk olarak PEI ve HA temelli siRNA taşıyıcı sistemleri sentezlenmiş ve karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Sentezlenen parçacıkların boyutları, PEI-HA, PEI-SS-HA, AuNP, AuPEI NP, AuPEI-HA ve AuPEI-HA-DOX için sırasıyla, 330 nm, 203 nm, 91 nm, 25 nm, 366 nm ve 692 nm olarak tespit edilmiştir. Konjugatların oluşumu ise 1H-NMR, FT-IR ve elementel analiz yöntemleri ile doğrulanmıştır. Sentezlenen konjugatların siRNA ile elektrostatik etkileşimi ise konjugat yüzey yükü değişimi ve jelde gecikme analizi ile belirlenmiştir. Daha sonra, konjugatların hedef hücrelerin (L929 fare fibroblast hücre hattı, MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattı ve CAPAN-1 pankreas kanseri hücre hattı) canlılığına etkileri WST-1 hücre canlılık testi ile belirlenmiş; tüm parçalar için (AuPEI NP hariç), 100 µg/mL konsantrasyonunda, hücre canlılığı %50'nin üzerinde bulunmuştur. Bu konjugatların (özellikle Au içeren) siRNA ile oluşturdukları komplekslerin ardından uygulanan radyasyonun, özellikle MDA-MB-231 hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkiyi arttırdığı sonucuna ulaşılmıştır. Konjugatların apoptotik-nekrotik etkilerine ise ikili boyama yöntemi ile bakılmış, her üç hücre hattında genel olarak apoptotik etki düşük bulunmuştur. Nekrotik etki ise, AuPEI-HA-DOX konjugatı uygulaması sonrasında (sırasıyla, %50 ve %25), hem MDA-MB-231 hem de CAPAN-1 hücre hattında en yüksek seviyede görülmüştür. Konjugat/siRNA komplekslerinin hücre proliferasyonu üzerindeki etkileri RTCA hücre proliferasyon analizi ile araştırılmış, L929 hücre hattında antiproliferatif etki görülmezken, MDA-MB-231 ve CAPAN-1 hücre hatlarında en yüksek antiproliferatif etki PEI-HA/siRNA, PEI-SS-HA/siRNA, AuPEI NP/siRNA ve AuPEI-HA-DOX/siRNA komplekslerinin uygulaması sonrasında görülmüştür. Hazırlanan komplekslerin kanser hücre hatlarında hedef gen ifadelenmesini baskılama etkileri Real Time- PCR yöntemi ile araştırılmış, MDA-MB-231 hücre hattında tüm konjugat veya komplekslerin, CAPAN-1 hücre hattında ise, AuPEI NP/siRNA kompleksinin hedef CXCR4 geni ifadelenmesini baskılayabildiği saptanmıştır. Elde edilen tüm bu veriler, sentezlenen PEI-HA ve AuPEI-HA-DOX konjugatlarının özellikle meme kanseri tedavisinde etkili siRNA taşıyıcıları olarak kullanılabileceklerini göstermektedir.

Abstract:
Target-specific delivery of small interfering siRNAs in cancer treatment is one of today's leading research topics. Within the scope of the thesis, effective transport of siRNAs via hyaluronic acid (HA) receptor was carried out with biodegradable HA and low molecular weight polyethyleneimine (PEI) based transport systems. Within the thesis study, gold nanoparticles which are inorganic based nanoparticles capable of giving photothermal response and their conjugates with PEI and HA are added to the structure, which is first in the literature. As a consequence, a combination of gene silencing, photothermal therapy and chemotherapy, which is one of the most important features of this thesis, has been provided. In the first part of the thesis study, PEI and HA-based siRNA delivery systems were synthesized and characterized. The dimensions of the PEI-HA, PEI-SS-HA, AuNP, AuPEI NP, AuPEI-HA and AuPEI-HA-DOX particles were measured as, 330 nm, 203 nm, 91 nm, 25 nm, 366 nm and 692 nm, respectively. The formation of conjugates was confirmed by 1H-NMR, FT-IR and elemental analysis methods. The electrostatic interaction of the synthesized conjugates with siRNA was determined by the gel retardation analysis and the change in zeta potentials. In the second part of the study, effects of the conjugates on the viability of target cells (L929 mouse fibroblast cell line, MDA-MB-231 breast cancer cell line and CAPAN-1 pancreatic cancer cell line) were determined by the WST-1 cell viability test; in general (except AuPEI NP) the cell viability was above 50% when the synthesized particles (100 µg/mL) were applied. In the application of radiation following the conjugate/siRNA complex (especially those containing Au), application increased the cytotoxic effect on the MDA-MB-231 cell line. Apoptotic-necrotic effects of conjugates were investigated by double staining method, and overall apoptotic effect was low in all three cell lines. However, the necrotic effect was highest in both MDA-MB-231 and CAPAN-1 cell lines, after administration of the AuPEI-HA-DOX conjugates (50% and 25%, respectively). The effects of the complexes of the synthesized conjugates and siRNA on the cell proliferation were also investigated by RTCA real-time cell proliferation analysis. Antiproliferative effect was not observed in L929 cell line in accordance with cytotoxicity results, whereas the highest antiproliferative effects in MDA-MB-231 and CAPAN-1 cell lines were observed after administration of PEI-HA/siRNA, PEI-SS-HA/siRNA, AuPEI NP/siRNA and AuPEI-HA-DOX/siRNA complexes. The effects of suppression of target gene expression in cancer cell lines were investigated by Real Time-PCR method. All conjugates or complexes in MDA-MB-231 cell line were able to suppress target gene expression of AuPEI NP/siRNA complex in CAPAN-1 cell line. It was found that all conjugates or complexes in the MDA-MB-231 cell line, AuPEI NP/siRNA complex in the CAPAN-1 cell line could suppress the target CXCR4 gene expression. All these data show that the synthesized PEI-HA and AuPEI-HA-DOX conjugates can be used as siRNA carriers that are particularly effective, especially in the treatment of breast cancer.