Kornea örneklerinde etken mantarların klasik ve moleküler yöntemlerle araştırılması
Investıgatıon of fungal agents on corneal samples 
by classıcal and molecular methods
Yazar: MUHAMMED SOYLAR
Danışman: PROF. DR. SÜLEYHA HİLMİOĞLU POLAT
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Göz hastalıkları = Eye diseases ; Keratit = Keratitis ; Kornea = Cornea ; Korneal hastalıklar = Corneal diseases ; Mantarlar = Fungi ; Mikroskopi = Microscopy ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis testleri = Diagnostic tests

Özet:
Giriş ve Amaç: Kornea hastalıkları, katarakttan sonraki en önemli körlük nedenidir. Bunlar içinde fungal keratitler son 20-30 yıldır daha sık görülmeye başlanmıştır. Hem tanı yöntemlerinin gelişmesi, hem de kortikosteroit ve bağışıklığı baskılayıcı ilaçların kullanımının artması bundan sorumlu etkenler arasındadır. Tanının erken dönemde konması ve uygun antifungal tedaviye gecikilmeden başlanması iyileşmenin gerçekleşmesinde çok önemlidir. Bu çalışmada bir yıl boyunca Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı'nda fungal keratit kuşkusu ile izlenen hastaların, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Mikoloji Laboratuvarı'na gönderilen kornea kazıntı örneklerinde; mikroskobik inceleme ile mantar ve mantarlara ait yapıları görmek, örneklerden klasik konvansiyonel yöntemler ile etken mantarları üretmek ve direkt örnekten konvansiyonel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile mantarları saptamak amaçlanmıştır. İkincil olarak kornea kazıntı örneklerinde, klasik konvansiyonel yöntemlere ek olarak konvansiyonel PCR yöntemi ile mantar aranmasının mikoloji rutininde uygulanması hedeflenmiştir. 
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada fungal keratit kuşkulu hastalardan, göz hastalıkları hekimleri tarafından kornea kazıntı örnekleri alınmıştır. Örneğin bir bölümünden kültür için ekimler yapılmış, bir bölümü direkt ve boyalı mikroskobik incelemeler için, bir bölümü de moleküler incelemeler için kullanılmıştır. Örneklerin koyun kanlı agar (KKA) (bioMérieux, Fransa), Eosin-methylene-blue (EMB) agar (bioMérieux, Fransa), çukulata agar (bioMérieux, Fransa) ve antibiyotikli Saboraud dekstroz agar (SDA) (bioMérieux, Fransa) ile Staib agar (laboratuvarımızda hazırlanmıştır) besiyerlerine yarım ay şeklinde çizilerek ekimleri yapılmış ve 10 gün inkübe edilmiştir. Mikroskobik inceleme, %10'luk potasyum hidroksit (KOH) ve Gram boyama yöntemleri ile yapılmış, direkt mikroskobik incelemede mantara ait yapıların görülmesi durumunda kliniğe acilen bilgi verilmiştir. Kültürde üreyen mantarlar klasik konvansiyonel yöntemler ve Vitek-MS (bioMérieux, Fransa) otomatize sistemi ile tanımlanmıştır. Son olarak örneklere konvansiyonel PCR yöntemi uygulanmıştır.
Bulgular: Bir yıllık sürede kornea kazıntı örneği alınan 60 hastanın 23 (%38,4)'ü kadın, 37 (%61,6)'si erkekti. Hastaların yaş ortancası 49 (3-85) olarak bulundu. Altmış örneğin beş (%8,3) tanesinin direkt mikroskobik incelemesinde mantar hifleri görüldü. Örneklerin 12 (%20)'sinde kültürde üreme saptandı. Bunların yedi (%11,6) tanesinde KKA (35°C) besiyerlerinde olan üremeler bakteri üremesi olarak değerlendirildi. Beş (%8,3) örnekte antibiyotikli SDA (26°C) besiyerlerinde olan üremeler mantar (maya mantarı ve küf mantarı) üremesi olarak değerlendirildi. Çalışmaya alınan 60 örneğin panfungal primerler ile yapılan konvansiyonel PCR sonucunda yedisinde (%11,6) mantara ait deoksiribonükleik asit (DNA) saptandı. Direkt mikroskobik inceleme ile mantar hifleri görülen beş örneğin, üçünde hem kültür hem de konvansiyonel PCR yöntemi ile pozitiflik saptandı; iki örneğin kültüründe üreme olmadı ancak konvansiyonel PCR yöntemi ile mantar DNA'sı saptandı. Kültüründe üreme olan ve konvansiyonel PCR yöntemi ile mantar DNA'sı saptanan iki örneğin de direkt mikroskobisinde mantar hifleri görülmedi. 
Sonuç: Bu çalışmada hastaların yaklaşık %12'sinde fungal keratit saptanmıştır. Direkt mikroskobik inceleme, kültür ve konvansiyonel PCR yöntemleri ile bulunan sonuçlar birbirleriyle uyumlu bulunmuştur. Kornea kazıntı örneğinde mantar varlığının konvansiyonel PCR yöntemi ile gösterilmesi, hem kültürde üretilemeyen etkenlerin saptanmasını sağlamış hem de tanı süresini klasik konvansiyonel yöntemlere göre kısaltmıştır. Bu yöntemin klinik mikrobiyoloji pratiğinde kullanılması, hastaya mikolojik tedavinin erken başlanmasını sağlayarak göz kaybını önleyecektir.

Abstract:
Introduction and Aim: Corneal diseases are the second major cause of blindness other than cataracts. Among corneal diseases, fungal cataracts have been more frequently encountered for the last 20-30 years. Advances in diagnostic procedures and increased usage of corticosteroids or immun suppressive agents are thought to be responsible for this condition. Early diagnosis and early initiation of proper antifungal treatment are very important for the recovery of the disease. The aim of this study was to detect fungal agents and fungal particules by microscopic evaluation, to grow fungal agents by classical conventional methods and to identify fungal agents directly by polimerase chain reaction (PCR), from the samples obtained with the suspicion of fungal keratitis and evaluated in Micology Laboratory of Ege University School of Medicine Department of Medical Microbiology in one year period. In addition to conventional methods, routine application of the PCR method for searching fungus in micology labarotory practice was the secondary aim of the study.
Methods: In this study, corneal samples were obtained by ophtalmologists, from the patients with the suspicion of fungal keratitis. The samples were used in three ways; for culture inoculation, for direct or stained microscopic evaluations and for molecular methods. Conjunctival swabs collected from eyes were inoculated in the shape of halfmoon onto sheep blood agar (bioMérieux, France), chocolate agar (bioMérieux, France), Eosin methylene blue agar (bioMérieux, France), Sabouraud dextrose agar (SDA) with antibiotic (bioMérieux, France) and Staib agar (in house) and all were incubated for 10 days. Microscopic evaluation was made by potassium hydroxide (KOH) 10% and Gram staining, in the Micology Laboratory of Ege University School of Medicine Department of Medical Microbiology. In case of detecting fungal agents on direct microscopic evaluations, clinicians were informed emergantly. Fungal agents growing in the culture were described by conventional methods and Vitek-MS (bioMérieux, France) automized system. Lastly, conventional PCR method was applied to the samples.
Results: In a one year period, corneal scraping specimens were obtained from 60 patients, 37 (61,6%) of them were male and 23 (38,4%) were female. The median age of the patients was 49 (3-85). In direct microscopic evaluation of 5 (8,3%) of the 60 patients fungal hyphae were found. Growing in the culture was detected on 12 (20%) of the 60 samples. Seven (11,6%) of these growings on sheep blood agar (35°C) were considered as bacteria. On the five (8,3%) samples, growings in the SDA (26°C) with antibiotics were considered as fungal agents (yeasts and molds). By the PCR with parafungal primers of 60 samples, fungal deoxyribonucleic acid (DNA) were detected in the seven (11,6%) of them. In three of the five samples with fungal hyphae detected by direct evaluation, fungal agents were detected both by culture and conventional PCR method; in the rest of two samples fungal agents did not grow in culture but fungal DNA of them were detected by conventional PCR method. In two of the samples, in which fungal agents grew in the culture and fungal DNA's were be detected by conventional PCR, fungal hyphae could not be demonstrated by direct microscopic evaluation. 
Conclusion: In this study, fungal keratitis were demonstrated in nearly 12% of the patients. The results of direct microscopic evaluation, culture and conventional PCR were found compatible. Demonstration of fungal existance by conventional PCR method in corneal samples, caused determination of fungal agents which did not grow in the culture and moreover shortened the time passed for diagnosis in comparison with the classical conventional methods. The usage of this method in clinical microbiology practice will protect from eye loss by early initiaion of antimicotic treatment. 
Key words: Keratitis; Fungal keratitis; Direct microscopic evaluation; KOH; Culture; Conventional PCR.