Mikro ve nano desenlenmiş doku iskelelerinde nöral hücre davranışlarının incelenmesi
Investigation of neural cell behaviour on micro and nano-patterned scaffolds
Yazar: İLYAS ÖZÇİÇEK
Danışman: PROF. DR. KEZBAN ULUBAYRAM ; PROF. DR. GÜRKAN ÖZTÜRK
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Mekanik yollarla veya genetik mutasyonlarla oluşan nöral hasarlar nedeniyle her yıl 6.8 milyon kişi yaşamını yitirmektedir. Nöral hasarlar kişilerin yaşam kalitelerini yüksek oranda etkilerken, oldukça yüksek tedavi maliyetleri ortaya çıkmaktadır. Bu durum araştırmacıları daha yenilikçi ve etkili tedavi yaklaşımları üzerine yöneltmiştir. Sinir doku mühendisliği nöral hasarların tamiri için alternatif bir tedavi yaklaşımı sunmaktadır. Bu yaklaşım, sinir dokusunun rejenerasyonunu ve gelişimini sağlayacak uygun topografyada, üç boyutlu doku iskelelerinin (sinir kanallarının) geliştirilmesini hedeflemektedir. 
Sinir rejenerasyonu oldukça yavaş ilerleyen bir süreçtir. Nörit uzaması ve hücre göçü, sinir tamiri için zaruri süreçler olup; arzu edilen hedeflere yönlendirme ve sinaptik bağlantıların yeniden oluşturulması gerekmektedir. Bu nedenle ideal bir doku iskelesinin intralüminal kanallı ve nöral hücre gelişimini destekleyecek ve kılavuzluk edecek bir yapıda olması gerekmektedir.
Bu tez çalışmasının amacı; mikro kanallara sahip, altın nanomateryalerle nanodesenlenmiş, iletken ve biyo-uyumlu doku iskelelerinin geliştirilmesi ve bu iskelelerin üzerinde DRG (arka kök gangliyonu) primer duyu nöronu davranışlarının incelenmesidir. Bu amaca yönelik olarak; elektron demeti litografisi tekniğiyle 1, 5 ve 10 µm oluk genişliklerine sahip mikro-oluklu ipek fibroin/polietilen oksit (SF/PEO) ve poliüretan (PU, Velox-carbothaneTM) doku iskeleleri üretilmiştir. Mikrodesenlenmiş doku iskelelerinde iletken yüzeyler ve/veya diziler oluşturmak amacıyla; yüzeyler altın nanopartiküller (AuNPs) ve altın nanoçubuklarla (AuNRs) nanodesenlenmiş, nanoçubukları non-toksik hale getirmek için yüzeyleri polietilenimin (PEI) ile kaplanmıştır. Geliştirilen mikro/nanodesenlenmiş iskeleler üzerinde DRG nöronlar kullanılarak aksonal sıralanma düzeyleri araştırılmıştır. Bu amaçla immün boyamalar, LSCM (lazer taramalı konfokal mikroskobu) ve SEM (taramalı elektron mikroskobu) karakterizasyonları yapılmıştır. Altın nanomateryallerin pozitif katkısını incelemek ve in vivo şartları taklit etmek amacıyla mikro/nanodesenlenmiş yüzeylerdeki nöron kültürüne, biyoreaktör sistemde 100 mV düzeyinde voltaj uygulanmıştır. Gerekli immün boyamalar, ölçümler ve karakterizasyonlar ile mikro ve nanodesenlenmiş yüzeylerde farklı oluk genişliklerinin ve iletken altın nanopartiküllerin aksonal kılavuzluk ve sıralanma düzeyine olan etkisi incelenmiştir. 
Bu kapsamda litografi tekniği ile 3 farklı oluk genişliğine (1µm, 5 µm ve 10 µm) sahip oldukça düzgün mikro-oluklu iskeleler başarıyla üretilmiştir. Çekirdek-büyütme yöntemiyle yüksek monodispersiteye sahip (PDI:0.08) 48.59 nm boyutunda altın nanopartiküler ve 91 nm x 15 nm boyutunda altın nanoçubuklar sentezlenmiştir. Sentezlenen nanoçubukların yüzeyleri PEI ile nano düzeyde (5 nm) kaplanarak non-toksik hale getirilmiştir. 1 µm oluk genişliğine sahip PU yüzeylere elektriksel potansiyel (1V) uygulanarak, nanoçubukların oluklar boyunca kesintisiz olarak dizildikleri gözlenmiştir. 
Mikro-oluklu yüzeylerde nöral hücrelerin iyi tutundukları ve morfolojilerinin sağlıklı olduğu gözlenmiştir. Farklı oluk genişliklerine sahip yüzeylerde beta-III-tubulin ve NF-200 ifadesinin benzer olduğu izlenmiştir. İstatiksel olarak 1 µm oluk genişliğine sahip yüzeylerde aksonal sapma açısı 11.8 olup, 5 ve 10 µm oluk genişliğine sahip PU yüzeylerde sapma açılarının sırasıyla 23.6 ve 31.9 olduğu ve oluk genişliği arttıkça aksonal sapmaların önemli düzeyde arttığı görülmüştür. Buna ilaveten nanoçubuklarla iletken dizilere sahip PU yüzeylerde (1µm oluklu),  elektriksel uyarımın (100 mV) etkisiyle aksonal sapma açısının sıfıra yaklaştığı (0.6) izlenmiştir. Mikrotopografyanın aksonal kılavuzlukta etkili olduğu, ancak iletken nanodizilerin elektriksel uyarımı ile aksonal sıralanmanın çarpıcı düzeyde arttığı sonucuna varılmıştır.
Sonuç olarak, bu tez kapsamında geliştirilen mikro/nanodesenlenmiş PU yüzeyler, mikro oluklu yapısı ve iletken nanodizili özellikte olması nedeniyle nöral hücrelerin rejenerasyonu ve gelişimi için yenilikçi bir yaklaşım olup, sinir kanallarının geliştirilmesinde yol göstericidir.

Abstract:
Every year 6.8 million people are losing their lives due to neural diseases caused by either mechanical ways or genetic mutations. High treatment costs are forced by neural diseases which also affect the quality of life enormously. This situation has led scientists to a novel and effective approaches. Neural tissue engineering is proposing an alternative approach for the treatment of neuronal damages. This approach is aimed to develop three dimensional tissue scaffolds with desired topography capable of providing the regeneration and growth of neural tissue.
Neural regeneration is a process which progresses quite slowly. Neurite elongation and cell migration are of paramount importance for nerve repair and guidance to the desired targets and reconstitution of synaptic connections are necessary. Therefore, an ideal tissue scaffold should have intraluminal channels and should be in a structure that supports and provides guidance. 
The aim of this study; is to develop tissue scaffolds nanodecorated with gold nanomaterials which are conductive and biocompatible and evaluate the neuronal behavior of primary DRG (dorsal root ganglion) sensory neurons on these scaffolds. With this purpose, using electron beam lithography technique, micro channeled silk fibroin/polyethylene oxide (SF/PEO) and polyurethane (PU, Velox-carbothaneTM) scaffolds with 1, 5 and 10 micrometer grooves were developed. In order to create conductive series on micro-patterned scaffolds; scaffolds were nanodecorated with gold nanoparticles (AuNPs) and gold nanorods (AuNRs) and in order to get non-toxic gold nanorods, their surfaces were coated with polyethylenimine (PEI). The level of axonal guidance for DRG neurons was investigated on developed micro/nano-decorated scaffolds. In this regard, immunocytochemical staining, LSCM (laser scanning confocal microscope) and SEM (scanning electron microscope) characterizations were carried out. For the purpose of evaluating the positive contribution of gold nanomaterials and simulate the in vivo conditions, neuronal culture on micro/nano-patterned scaffolds was performed in a bioreactor system and 100 mV of electrical stimulation was applied. By doing immune staining, analysis and characterizations the effect of different groove widths and different surface coatings of micro and nano-patterned tissue scaffolds on the level of axonal guidance were evaluated.
In this respect, by lithography technique, fairly uniform micro-channeled scaffolds with 3 different groove widths (1µm, 5 µm and 10 µm) were successfully manufactured. By using seeding-growth method highly monodisperse gold nanoparticles (PDI: 0.08) with the size of 48.59 nm and gold nanorods in 91 nm x 15 nm dimensions were synthesized. Surface of synthesized nanorods was coated in nano level with PEI to make them nontoxic. It has been noticed that, in the studies performed by PU scaffolds nano-patterned with gold nanomaterials, by applying 1 V electrical field nanorods were aligned continuously inside the 1 µm width groove.
It was shown that neural cells were well attached and their morphologies were healthy on micro-channeled surfaces. Beta-III-tubulin and NF-200 expressions were the same on the surfaces with different groove widths. Statistically axonal deviation angle on surfaces with 1 µm Groove width was 11.8 and for the surfaces with 5 and 10 µm groove width it was 23.6 and 31.9 respectively. İt was found that İncrease in Groove width causes a significant increase in axonal deviation. Additionally, it was found that on PU surfaces made conductive with aligned gold nanorods, with electrical stimulation (100 mV) axonal deviation angle was close to zero (0.6). As a result, micro-topography was effective on axonal guidance, however, this guidance was increased by aligned nano structures.
In conclusion, developed neural tissue scaffold, due to its easily prepared, elastic, and microchanneled structure and having conductive channels is a novel approach for regeneration and growth of neural cells and paves the way for the development of nerve channels.