İnülinaz enziminin fermentasyonla üretiminde inhibitör bileşiklerin etkisi
The effect of inhibitor compounds in the production of inulinase enzyme by fermentation
Yazar: HİLAL NUR GÜRLER
Danışman: DOÇ. DR. İRFAN TURHAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Biyoteknolojik yöntemlerle inülinaz gibi katma değeri yüksek ürünlerin üretiminde son zamanlarda saf karbon kaynaklarının kullanımına alternatif olarak lignoselülozik kaynakların kullanımına ilgi artmıştır. Ancak söz konusu kaynakların karbon kaynağı olarak kullanılabilmesi için uygulanan çeşitli ön işlemler sonucunda fermentasyon ortamını etkileyecek inhibitörler oluşmaktadır. Bu aşamada son ürün üretiminde kullanılacak mikroorganizmanın inhibitör bileşiklere karşı hassasiyetinin bilinmesi oldukça önem taşımaktadır. Bu çalışmada inhibitör olarak farklı konsantrasyonlarda HMF (1.0-6.0 g/L), furfural (0.1-2.0 g/L), fenol (0.1-5.0 g/L), asetik asit (2.5-12.5 g/L) ve formik asit (1.5-7.0 g/L) kullanılarak Aspergillus niger A42 (ATCC® 204407) ile inülinaz fermentasyonları gerçekleştirilmiştir. Her bir inhibitör için en iyi Iase aktivitesinin elde edildiği fermentasyonlara 10 farklı matematiksel model (MGM, MLM, MRM, Stannard, Weibull, MMF, Asimetrik, Baranyi, Huang, Fitzhugh) uygulanmıştur. Ayrıca tüm denemelerin sonuçları incelendikten sonra lignoselülozik materyalden gelmesi muhtemel tüm inhibitörleri içeren karışım fermentasyonunun sinerjist etkisini incelemek için Placket-Burman Dizayn kullanılmıştır. Çalışmanın son aşamasında ise arpa kavuzu, yulaf kavuzu, buğday kepeği ve çavdar kepeği hidrolizatları sülfürik asit ile hidroliz edilmiş ve hidrolizatlarda inhibitör bileşen tayini yapılmıştır. Hidrolizatlar detoksifiye edilmeden fermentasyon sıvısı olarak kullanılmış olup inülinaz fermentasyonları gerçekleştirilmiştir.
 
Fermentasyon denemeleri sonucunda her inhibitör bileşik için en yüksek ve en düşük Iase aktivitesi HMF için 268.74 U/mL (1 g/L HMF), 62.76 U/mL (6 g/L HMF) furfural için 197.35 U/mL (0.1 g/L furfural), 5.14 U/mL (1.0 g/L furfural), fenol için 117.39 U/mL (0.1 g/L fenol), 12.57 U/mL (5 g/L fenol), asetik asit için  340.32 U/mL (2.5 g/L), 3.24 U/mL (12.5 g/L) ve formik asit için 136.83 U/ml (1.5 g/L formik asit), 312.69 U/mL (7 g/L formik asit) olarak bulunmuştur. Iase aktivitesinin en yüksek olduğu fermentasyonlara 10 farklı model uygulanmıştır. Modeller, model parametreleri (RMSE, MAE, AF, BF, R2) yardımıyla kıyaslanmış olup HMF ilavesiyle gerçekleştirilen fermentasyon için Stannard, furfural için Weibull, fenol için MGM, asetik asit için Huang ve formik asit için Weibull inülinaz üretimi açısından en uyumlu modeller olarak belirlenmiştir. İnhibitörlerin sinerjist etkisinin incelenmesi amacıyla Plackett-Burman Dizayn (PBD) ile inhibitörlerin karışım fermentasyonlarının optimizasyonunda tüm inhibitörlerin minimum (3.0 g/L HMF, 0.1 g/L furfural, 0.1 g/L fenol, 2.5 g/L asetik asit ve 3.0 g/L) konsantrasyonda olduğu fermentasyonda (3 numaralı deneme) 215.77 U/mL Iase aktivitesi tespit edilmiştir. Optimum karışım fermentasyonuna ait Iase aktivitesinin kontrol fermentasyonundan istatistiksel olarak da farklı olmadığı görülmüştür (P>0.05). Çalışmanın son aşamasında ise arpa kavuzu, yulaf kavuzu, buğday kepeği ve çavdar kepeğinin seyreltik asit ile hidrolizi ile inülinaz fermentasyonları gerçekleştirilmiş olup Iase aktivitesi sırasıyla 202.29, 42.03, 244.13 ve 254.60 U/mL olarak bulunmuştur. 

Bu çalışma sonucunda Aspergillus niger A42 (ATCC® 20447)'nin farklı inhibitör (HMF, furfural, fenol, asetik asit ve formik asit) konsantrasyonlarına karşı tolerans aralıkları belirlenmiştir. Böylece mikroorganizmanın, lignoselülozik materyallerin işlenmesiyle açığa çıkması muhtemel inhibitör konsantrasyonlarına karşı tepkisi ortaya konmuştur. Ayrıca PBD ile gerçekleştirilen karışım fermentasyonları ile mikroorganizmanın tolere edebileceği inhibitör karışımı optimize edilmiştir (3.0 g/L HMF, 0.1 g/L furfural, 0.1 g/L fenol, 2.5 g/L asetik asit ve 3.0 g/L). Arpa kavuzu, çavdar kepeği ve buğday kepeği hidrolizatlarındaki inhibitör bileşik konsantrasyonlarını mikroorganizmanın tolere edebildiği ve detoksifikasyon işleminin gerek olmadığı ortaya konmuştur. Bu tez çalışması kapsamındaki gerçekleştirilen tüm fermentasyonların lignoselülozik maddeler ile gerçekleştirilecek fermentasyonlarda detoksifikasyon gibi proseslerin gerekliliğine karar verme aşamasında önemli olacağı düşünülmektedir.

ANAHTAR KELİMELER: İnülinaz, inhibitör, Aspergillus niger, asetik asit, fenol, fermentasyon, formik asit, furfural, HMF.

Abstract:
The usage of lignocellulosic sources as an alternative to the pure carbon sources in the production of value-added products such as inulinase by the biotechnological process has been recently increased. However, some pretreatment methods for the use of these sources in the medium lead to the formation of inhibitors that will affect the fermentation medium. In this situation, it is very important to know the tolerance of the microorganism to inhibitory compounds to be used in the production of the value-added product. In this study, inulinase fermentations were performed by Aspergillus nigerA42 (ATCC® 204407) using different concentrations of HMF (1.0-6.0 g/L), furfural (0.1-2.0 g/L), phenol (0.1-5.0 g/L), acetic acid (2.5-12.5 g/L) and formic acid (1.5-7.0 g/L) as an inhibitor. The ten different mathematical models (MGM, MLM, MRM, Stannard, Weibull, MMF, Asymmetric, Baranyi, Huang, Fitzhugh) were applied to fermentations in which the best Iase activity was obtained for each inhibitor and control fermentation. In addition, the Placket-Burman design was used to investigate the synergistic effect of mix fermentation, which contains all possible inhibitors from lignocellulosic material after data analysis. Finally, the lignocellulosic compounds such as barley husk, oat husk, wheat bran, and rye bran were hydrolyzed with dilute acid and inulinase fermentations were performed.
 
The highest and lowest Iase activity was obtained for HMF 268.74 U/mL (1 g/L HMF), 62.76 U/mL (6 g/L HMF); for furfural 197.35 U/mL (0.1 g/L  furfural), 5.14 U/mL (1.0 g/L furfural), for phenol 117.39 U/mL (0.1 g/L phenol), 12.57 U/mL (5 g/L phenol),  for acetic acid  340.32 U/mL (2.5 g/L), 3.24 U/mL (12.5 g/L) and for formic acid 136.83 U/ml (1.5 g/L formic acid), 312.69 U/mL (7 g/L formic acid). 10 different models were applied to fermentations with highest Iase activity. The models were compared with some model parameters such as RMSE, MAE, AF, BF, R2. The most compatible models for the production of inulinase was determined to Stannard for HMF, Weibull for furfural, MGM for phenol, Huang for acetic acid, and Weibull for formic acid. Plackett-Burman Design results showed that, the Iase activity was determined as 215.77 U/mL in fermentations which all inhibitors were at minimum concentration (HMF=3.0 g/L, furfural= 0.1 g/L, phenol= 0.1 g/L, acetic acid= 2.5 g/L, formic acid= 3.,0 g/L). The enzyme activity was not statistically different from control fermentation (P>0.05). Finally, inulinase fermentations were carried out by hydrolysis of barley, oat, wheat bran and rye bran with dilute acid and Iase activity was found to be 202.29, 42.03, 244.13 and 254.60 U/mL, respectively.
 
In this study, the tolerance ranges of different inhibitor (HMF, furfural, phenol, acetic acid, and formic acid) concentrations of Aspergillus niger A42 (ATCC® 20447) were determined. Thus, it will be predetermined whether the microorganism will work at inhibitor concentrations likely to be released by lignocellulosic materials. This is considered to be important in deciding the necessity of processes such as detoxification. In addition, the mixture fermentations were optimized for the inhibitor mixture to be tolerated by the microorganism (HMF=3.0 g/L, furfural= 0.1 g/L, phenol= 0.1 g/L, acetic acid= 2.5 g/L, formic acid= 3.,0 g/L). It was demonstrated that the inhibitor compound concentrations in barley, rye bran and wheat bran hydrolysates are tolerated by the microorganism and no detoxification process is required. It was thought that all fermentations performed would be important in deciding the necessity of processes such as detoxification in fermentations with lignocellulosic materials.

KEYWORDS: Inulinase, inhibitor, Aspergillus niger, acetic acid, phenol, fermentation, formic acid, furfural, HMF.