Farede sirkadyen ritim bozulmasının ovaryumda foliküler gelişim üzerindeki etkisinin hippo sinyal yolağı üzerinden belirlenmesi
Determination of the effect of circadian rhythm disruption on follicular development in the ovary in mice via the hippo signaling pathway
Yazar: NARMIN ASADOVA
Danışman: PROF. DR. AYLİN YABA UÇAR
Yeditepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Sirkadiyen ritim insanlarda ve memeli hayvanlarda birçok fiziyolojik, biyolojik döngüleri kontrol etmeye yarar. Sirkadiyen ritim sistemi, merkezi saat (SCN) ve periferik saat şeklinde iki kısımdan oluşmaktadır. Dişi üreme sisteminin gelişimi ve burada olan olayların düzenlenmesi için merkezi sirkadiyen saatin ritmik olarak işleyişi önemlidir. Dişi üreme sisteminde bu ritmiklik ışık-karanlık döngüsüne çok sıkı bir şekilde bağlıdır. Ovaryumda sirkadiyen ritim fonksiyonu genellikle steroidogenez, folikülogenez, hücresel farklılaşma, gonadotropinlere yanıt ve ovulasyon ile ilişkilidir. Yaptığımız çalışmada sirkadiyen ritim bozulmasının ovaryum ve folikül gelişimi üzerinde etkisini, hippo sinyal yolağı ve mTERT etkisinin olabileceğini hipotez ettik. Farede sirkadiyen ritim bozulmasının ovaryumda foliküler gelişim üzerindeki etisinin hippo sinyal yolağı üzerinden göstermeyi ve mTERT ekspresyonunu göstermeyi amaçladık. Tez çalışmamızda östrus siklusuna giren 6-8 haftalık 20 adet dişi  Balb/c fareler kullanılmıştır. Kontrol grubu (n=10) adet olmakla12:12 saat aydınlık/karanlık döngüsü olmakla ve 12:12 saat aydınlık/aydınlık döngüsü olan, deney grubu (n=10) olmakla sirkadiyen ritim bozulması sağlanmıştır. Deney süresinin sonunda fareler diseke edilerek ovaryum dokuları izole edildi. Deneklerin sol ovaryumları morfolojik analiz ve immünofloresan boyama yapmak üzere doku takibi için fiksatif içerisine alınırken, sol ovaryum dokusu kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PZR) yönteminde kullanılmak üzere izole edildi. PER2, YAP1, TEAD4 ve mTERT lokalizasyonu immünofloresan yöntem kullanılarak belirlenirken, qRT-PCR yöntemi ile YAP1, TEAD4 ve mTERT ekspresyonları ile sirkadiyen ritim genleri BMAL1, CLOCK, PER2 ve CRY'in ekspresyonları mRNA düzeyinde gösterildi. 12:12 saat aydınlık/karanlık döngüsü olan kontrol ve 12:12 saat aydınlık/aydınlık döngüsü olan deney grupları arasındaki tüm değerlendirmeler, ImageJ ve GraphPad programları kullanılarak yapıldı. Elde edilen veriler, student's t testi ile istatistiksel olarak değerlendirildi (p<0.05). İmmünofloresan sonuçlarımıza göre; PER2 ekspresyonunun azaldığı ve bununla da sirkadiyen ritmin bozulmuş olduğu gösterildi. Hippo sinyal yolağı proteinleri YAP1 ekspresyonun azaldığını ve TEAD4 ekspresyonnun deney grubunda kontrole kıyasla arttığını değerlendirdik.  Aynı şekilde mTERT ekspresyonunun da arttığını gösterdik. YAP1, TEAD4, mTERT, BMAL1, CLOCK, PER2 ve CRY1'in ekspresyonları mRNA düzeyinde değerlendirildiğinde anlamlı bir değişime rastlanmadı. Sonuç olarak, sirkadiyen ritim bozulmasının farede ovaryum ve folikül gelişimi üzerindeki etkisinin, translasyonel seviyede Hippo sinyal yolağı üzerinden gerçekleşebileceğini gösterdik. Bununla birlikte sirkadiyen ritim bozulması ile mTERT arasında ters orantılı bir ilişkinin olabileceğini düşündürmektedir. Sonuç olarak, Hippo sinyal yolağının ve mTERT ile ilişkisinin, sirkadiyen saat değişikliklerine bağlı ovaryum patolojilerini belirlemek için önemli bir role sahip olabileceğini öne sürdük.

Anahtar kelimeler: Sirkadiyen Ritim, Ovaryum, Hippo Sinyal Yolağı, mTERT

Abstract:
The circadian rhythm serves to control many physiological and biological cycles in humans and mammals. The circadian rhythm system consists of two parts: the central clock (SCN) and the peripheral clock. The rhythmic functioning of the central circadian clock is important for the development of the female reproductive system and the regulation of events that occur there. In the female reproductive system this rhythmicity is very tightly linked to the light-dark cycle. In the ovary, circadian clock function is often associated with steroidogenesis, folliculogenesis, cellular differentiation, response to gonadotropins and ovulation. In our study, we hypothesized that the effect of circadian rhythm disruption on ovarian and follicle development may be related to the hippo signaling pathway and mTERT. We aimed to show the effect of circadian rhythm disruption on follicular development in the ovary through the hippo signaling pathway and to show mTERT expression in mice. In our thesis study, 20 female Balb/c mice of 6-8 weeks of age entering the estrous cycle were used. We designed two expremental groups: The control group (n=10) with 12:12 h light/dark cycle and in the experimental group (n=10) with 12:12 h light/dark cycle. At the end of the experimental period, the mice were dissected and ovarian tissues were isolated. The left ovaries of the subjects were placed in fixative for morphological analysis and immunofluorescence staining, while the left ovarian tissue was isolated for quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The localization of PER2, YAP1, TEAD4 and mTERT was determined by immunofluorescence staining, while the expression of YAP1, TEAD4 and mTERT and the expression of circadian rhythm genes BMAL1, CLOCK, PER2 and CRY were determined at mRNA level by qRT-PCR. All evaluations between 12:12 h light/dark cycle control and 12:12 h light/dark cycle experimental groups were performed using ImageJ and GraphPad programs. The data obtained were statistically evaluated by Student's t test (p<0.05). Immunofluorescence results showed that PER2 expression was decreased, indicating that the circadian rhythm was disrupted. Hippo signaling pathway proteins YAP1 expression was decreased and TEAD4 expression was increased in the experimental group compared to the control group. We also showed that mTERT expression was increased. When the expressions of YAP1, TEAD4, mTERT, BMAL1, CLOCK, PER2 and CRY1 were evaluated at the mRNA level, no significant change was found. In conclusion, we demonstrated that the effect of circadian rhythm disruption on ovarian and follicle development in mice may be mediated through the Hippo signaling pathway at the translational level, suggesting that there may be an inverse relationship between circadian rhythm disruption and mTERT. In conclusion, we suggested that the Hippo signaling pathway and its relationship with mTERT may have important role to understanding ovarian patologies depend on the circadien clock changes.

Key words: Circadian Rhythm, Ovary, Hippo Signaling Pathway, mTERT,