İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden spermatogonyal kök hücre ve öncülü primordiyal germ hücrelerinin farklılaştırılması ve çoğaltılmasında endokannabinoidlerin etkisi
The effect of endocannabinoids on the differentiation and proliferation of spermatogonial stem cells and their precursor primordial germ cells from human induced pluripotent stem cells
Yazar: MERVE GİZER
Danışman: PROF. DR. PETEK KORKUSUZ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells

Özet:
İnfertilite vakalarının %50'si erkek faktörlü olup, %15'inde germ hücre aplazisi nedeniyle sperm bulunmamaktadır. Üremeye yardımcı tekniklerinin (ÜYTE) protokolleri, germ hücresi aplazili erkeklerin çocuk sahibi olmaları için yetersizdir. İnsan pluripotent kök hücre (iUPKH) kaynaklı primordiyal germ hücreler (iPGH) ve spermatogonyal kök hücreler (iSKH), erkek infertilitesi için otolog bir germ hücre kaynağı sunmakla birlikte in vitro koşulda elde edilme verimleri düşüktür. Endokannabinoid sisteminin (ECS) fare embriyonik kök hücreleri ve insan testiküler mikroçevresinde bulunduğu bilinmekte, ECS'nin iUPKH, iUPKH kaynaklı iPGH ve iSKH'lerdeki olası varlığı ve etkinliği ise bilinmemektedir. Bu tez çalışmasında, iUPKH, iUPKH kaynaklı iPGH ve iSKH'lerde ECS'nin olası varlığı ve uyarıcı etkisiyle germ hücre havuzunun genişletilerek devamlılığın sağlanabileceği varsayılmıştır. Bu varsayımı test etmek için insan dermal fibroblastları (iDF) pluripotentlik belirteçlerini taşıyan iUPKH'lere yeniden programlanmış; iUPKH'lerden Blimp1+, VASA+ iPGH ve ID4+, PLZF+ iSKH'ler farklılaştırılmış, polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), akım sitometrisi (FCM) ve immünofloresan (IF) işaretleme yöntemleri ile karakterize edilmiştir. iUPKH, iPGH, iSKH'ler picomolar- nanomolar seviyelerinde 2-AG ve AEA salgılandığı sıvı kromatografisi/kütle spektrometrisi ile; iDF, iUPKH, iPGH ve iSKH'lerde CB1R, CB2R, TRPV1 ve GPR55 reseptörlerini ifade ettiği qPCR, FCM ve IF yöntemleri ile ortaya konmuştur. iSKH'lerde CB2R ifadesi diğer tüm reseptörlere ve iDF, iUPKH ve iPGH'lerine göre daha fazladır. CB2R agonistleri diğer reseptör agonistlerine göre reseptör dağılımına uygun olarak iUPKH proliferasyonunu daha fazla arttırmış, CB65'in EC50 değeri gerçek zamanlı olarak 78. saatte 2.092x10-8 M olarak  belirlenmiştir. CB65, submaksimal dozda iUPKH'lerin pluripotentliğini sürdürmüş, ID4+ iSKH, PLZF+ SKPH ve SCP3+ spermatositlerin farklılaşmasını 10 ve 12. günlerde uyarmıştır. Bu tez çalışmasında, iUPKH ve iUPKH kaynaklı iSKH'lerin CB2R agonizması ile veriminin artışı ilk defa gösterilmiştir. Erkek germ/kök hücre havuzunun CB65 ile zenginleştirilmesi, klinikte tam germ hücre aplazisi olan infertil erkeklere yönelik ÜYTE ile ilişkili protokollerin bir parçası olabilir.

Abstract:
Male factor is responsible for 50% of infertility cases, while 15% are due to germ cell aplasia resulting in no sperm. Assisted reproductive techniques (ART) protocols are inadequate for men with germ cell aplasia to have children. Although human pluripotent stem cell (hiPSC)- derived primordial germ cells (hPGCs) and spermatogonial stem cells (hSSCs) provide an autologous germ cell source for infertile men, however, their yield in vitro is low. The endocannabinoid system (ECS) is present in mouse embryonic stem cells and human testicular microenvironment, but the potential distribution and involvement of ECS in hiPSC, hiPSC- derived hPGCs and hSSCs remain unknown. In this study, we hypothesized that ECS involvement could expand the germ cell pool and stimulate the proliferation and maintenance of the hiPSCs, hiPSC- derived hPGCs, and hSSCs. To test this hypothesis, the human dermal fibroblasts (hDFs) were reprogrammed into hiPSCs carrying markers of pluripotency and Blimp1+, VASA+ hPGCs, ID4+, PLZF+ hSSCs were differentiated from hiPSCs and characterized by qPCR, flow cytometry (FCM) and immunofluorescent (IF) labeling.  The hiPSCs, hPGCs, and hSSCs secrete 2-AG and AEA at picomolar to nanomolar levels by liquid chromatography/mass spectrometry. The qPCR, FCM, and IF revealed the expression of CB1R, CB2R, TRPV1, and GPR55 receptors of hDFs, hIPSCs, hPGCs, and hSSCs at various levels. CB2R expression is higher in hSSCs compared to all other receptors and  hDFs, hiPSCs, hPGCs. CB2R agonists increase hiPSCs proliferation in line with the receptor distribution pattern compared to other receptor agonists. The EC50 of CB65 was determined as 2.092x10-8 M on 78 hours by real-time analysis. CB65 maintains the pluripotency of hiPSCs and stimulates the differentiation of ID4+ hSSCs, PLZF+ SSPCs, and SCP3+ spermatocytes on days 10 and 12 when applied at submaximal dose. This study demonstrated for the first time that CB2R agonism increases the yield of hiPSCs and hiPSC- derived hSSCs. Enrichment of the male germ/stem cell pool with CB65 may be a part of ART protocols in clinic for infertile men having complete germ cell aplasia.