Plasmodium falciparum'un laktat dehidrogenaz enziminin saflaştırılması ve analizi
Purification and analysis of Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase enzyme
Yazar: ASLIHAN HURİ BALCIOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. DİLEK TURGUT BALIK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Laktat dehidrogenaz = Lactate dehydrogenase ; Protein saflaştırma = Protein purification ; Sıtma = Malaria

Özet:
Sıtma, dişi anofel cinsi sivrisineklerinin kan emerken konak canlıya bulaştırdıkları, Plasmodium parazitlerinin sebep olduğu ateşli bir parazit hastalığıdır. Günümüzde kullanılmakta olan antimalaryal ilaçlara karşı parazit direnç kazanmış ve sıtmanın kontrol altına alınmasını zorlaştırmıştır. Bu nedenle alternatif ilaçların geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Genetik mühendisliğindeki hızlı gelişmeler, Plasmodium falciparum'un glikolitik yolunda görevli olan laktat dehidrogenaz enziminin yeni antimalaryalların tasarımında hedef olarak belirlenmesine yön vermiştir. Ancak bu alandaki çalışmalar .hücrelerde gerçekleşen moleküler olayları keşfetmemizi ve anlamamızı sağlamakla birlikte, protein aktivitesi ve fonksiyonu hakkında bilgi vermemektedir. Bu nedenden dolayı tanı ve tedavi amaçlı kullanılacak olan bir proteinin fonksiyonunun ve yapısının anlaşılması için izole edilmesi ve saflaştırılmasını gerekmektedir.Bu tez çalışmasında Plasmodium falciparum'un laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan gen, 3'ucuna 6 histidin amino asidi ilave edilerek polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmış ve standart metodlar kullanılarak pKK223-3 vektörüne aktarılarak genin E. coli'de ifadesi gerçekleştirilmiştir. Enzimatik aktivitesi onaylanan protein Ni-NTA agaroz içeren kolonlar hazırlanarak saflaştırılmış ve analiz edilmiştir.Klonlama sonrasında elde edilen ve His-tag içeren PfLDH total proteinin SDS-PAGE ile analizi His-tag içermeyen kontrol proteini ile karşılaştırmalı olarak yapılmış ve bantlaşma profillerinin aynı olduğu dolayısıyla His-tag ilavesinin proteinin ifadesine bir etkisinin olmadığını gösterilmiştir. Protein indüklenmesi ise protein üretimini dört kat artırmıştır. SDS-PAGE ve Western blot analizleri uygulanan saflaştırma protokolü sonucunda PfLDH proteininin yaklaşık % 95 saflıkta elde edilmiş olduğunu göstermiştir. Bu tez çalışması sonucunda PfLDH proteininin; yüksek saflıkta, ihtiyaç duyulan miktarda ve kolay uygulanabilir bir protokol ile elde edilmiş olmasıyla; protein, inhibitör tespiti çalışmalarında kullanıma hazır hale getirilmiştir.

Abstract:
Malaria is a fevered disease caused by Plasmodium parasites which infect the host organism through female anopheles while sucking blood. The parasites have developed resistance against antimalarial drugs used nowadays and complicated the control of malaria. For this reason, developing alternative drugs is necessary. Rapid improvements in genetic engineering have pointed lactate dehydrogenase enzyme of Plasmodium falciparum, which has a role in glycolytic pathway, as a target for developing new antimalarial drugs. Although, studies on this field provided us to discover and understand the molecular mechanisms happening in the cell, they do not inform about the protein activity and functions. Because of this reason, isolation and purification of this protein, which will be used for diagnosis and treatment, is required to understand it's function and structure.In this study, the gene encoding lactate dehydrogenase enzyme of Plasmodium falciparum was amplified by polymerase chain reaction with 6 histidine amino acids added to 3' end of the gene, transfered to pKK223-3 vector by using standart methods and expressed in E. coli. The protein with a confirmed enzymatic activity was then purified in Ni-NTA agarose containing columns and analyzed.The SDS-PAGE analysis of the total His-tag containing PfLDH protein obtained from cloning was made comparatively to the His-tag free control protein and the banding profiles were determined as the same, so it was shown that the His-tag addition does not have any effect on protein expression. But the protein induction has increased the protein production for four times. The SDS-PAGE and Western blot analyses showed that the PfLDH protein was obtained approximately at 95% purity through the purification method performed. As a result of this study, the needed amount of PfLDH protein was acquired in high purity by an easy applicable protocol for inhibitor determining studies.