Nepeta aristata Boiss et. Kotschy ex Boiss. bitkisinin fitokimyasal analizleri ve biyoaktivite yönlendirmeli izolasyon çalışmaları
Photochemical analyses and bioactivity-guided isolationstudies of Nepeta aristata Boiss. et Kotschy ex Boiss. plant
Yazar: YUNUS BAŞAR
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM DEMİRTAŞ
Iğdır Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
N. aristata Doğu Anadolu bölgesinde yayılış gösteren 1900-2100 rakımda, kayalık yamaçlarda, kaya çatlaklarında yetişen ve temmuz-eylül aylarında çiçeklenen Türkiye'ye endemik olan bir Nepeta türüdür. Endemik N. aristata Boiss. Et Kotschy Ex Boiss. bitkisinin toprak üstü kısmı metanol-kloroform (1:1) çözücü sisteminde ekstrakte edildi. Elde edilen ekstrakt, silika jel kolonda artan çözücü polaritesine (n-hekzan, kloroform, etil asetat, metanol) göre fraksiyonlandırılarak, fitokimyasal analizler (toplam fenol ve flavonoid içerikleri, LC-MS/MS, GC-MS, GC-MS/MS ve GC-FID) ve biyolojik aktivite testlerine (antioksidan, antibakteriyel, enzim inhibisyon ve DNA koruma aktiviteleri) tabi tutuldu. Biyolojik aktivite gösteren fraksiyonlardan, saf biyoaktif bileşikler tanımlanıncaya kadar biyoaktivite yönlendirmeli fraksiyonlandırma çalışmaları uygulandı ve kromatografik yöntemler yardımıyla kloroform fraksiyonundan β-sitosterol, ursolik asit, etil asetat fraksiyonundan, daukosterol, metanol fraksiyonundan iksorozit, nepetanudosit B, 1,5,9-epideoksiloganik asit ve rosmarinik asit molekülleri izole edildi. İzole edilen moleküllerin yapıları spektroskopik yöntemlerle (NMR, LC-MS/MS) aydınlatıldı. Moleküllerin antioksidan (fosfomolibden indirgeme, indirgeme gücü, H2O2 giderme, DPPH• giderme, ABTS•⁺ giderme, süperoksit anyon giderme, metal şelat testleri), enzim inhibisyon (üreaz, asetilkolinesteraz, bütirilkolinesteraz, karbonik anhidraz, α-amilaz, α-glikozidaz, lipaz ve tirozinaz), antibakteriyel (disk difüzyon ve mikrodilüsyon), DNA koruma (agaroz jel elektroforez ve deoksiriboz koruma) aktiviteleri belirlendi. Yapılan izolasyon ve aktivite çalışmalarına ilave olarak, temel bileşen analizi, enzim kinetiği ve moleküler doking çalışmaları yapılarak aktif özellikleri incelendi. Metanol-kloroform ham ekstraktının toplam fenol miktarı 33.905±0.076 mg (GAE/g kuru bitki) ve flavonoid miktarı 19.55±0.134 mg (KE/g kuru bitki) olarak belirlendi. Ayrıca LC-MS/MS sonuçlarına göre en fazla rosmarinik asit, GC-MS sonucuna göre 9,12,15-oktadekatrienoik asit metil esteri, GC-FID sonucuna göre en fazla cis-11-eikosanoat tespit edildi. Genel olarak izole edilen moleküller izole edildiği ham ekstrakt, fraksiyon ve standartlardan daha yüksek aktivite gösterdi. 
Sonuç olarak, "N. aristata bitkisinden ilaç öncülü olabilecek antioksidan, antibakteriyel, antidiabetik, antialzaymır, antilipaz, antitirozinaz ve DNA koruma biyolojik aktivite testleriyle metabolitlerin araştırılması" kapsamında yapılan bu tez çalışmaları sonucunda aktif fitokimyasal bileşikler belirlendi. İzole edilen moleküllerin enzim inhibisyon aktiviteleri, özellikle üreaz, AChE, BChE ve tirozinaz üzerinde daha yüksek etki göstermiştir. Bu sonuçlar kinetik ve moleküler doking değerleriyle desteklendi. Biyoaktivite yönlendirmeli izolasyon ile elde edilen sekonder metabolitlerin, oksidatif hasarların giderilmesinde antioksidan, enzim aktivitelerini düzenleyen, patojenik etkilere antibakteriyel ve genetik hasara karşı DNA koruyucu moleküller oldukları belirlendi.

Abstract:
N. aristata is a species endemic to Turkey that grows in the eastern Anatolia region at an altitude of 1900-2100, on rocky slopes, in rock cracks and blooms in July-September. The aerial part of endemic N. aristata Boiss. Et Kotschy Ex Boiss. plant was extracted in methanol-chloroform (1:1) solvent system. The obtained extract is fractionated according to increasing solvent polarity (n-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol) on a silica gel column. Phytochemical analyzes (total phenol and flavonoid contents, LC-MS/MS, GC-MS, GC-MS/MS and GC-FID) and biological activity tests (antioxidant, antibacterial, enzyme inhibition and DNA protection activities) were performed. Bioactivity-guided fractionation studies were applied from the biologically active fractions until the pure bioactive compounds were completed. and with the help of chromatographic methods (sephadex column, silica gel column and preparative LC), in chloroform fraction; β-sitosterol, ursolic acid, in ethyl acetate fraction; daucosterol, in methanol fraction; ixoroside, nepetanudoside B, 1,5,9-epideoxyloganic acid and rosmarinic acid have been isolated. The structures of the isolated molecules were elucidated by spectroscopic methods (NMR, MS). Antioxidant (phosphomolybdenum reduction, reducing power, H2O2 removal, DPPH• removal, ABTS•⁺ removal, superoxide anion removal, metal chelate tests), enzyme inhibition (urease, acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, carbonic anhydrase, α-amylase, α-glucosidase, lipase and tyrosinase tests), antibacterial (disc diffusion and microdilution) and DNA protection (agarose gel electrophoresis, deoxyribose protection) activities of the molecules were determined. In addition to the isolation and activity studies, basic component analysis, enzyme kinetics and molecular docking studies were performed and their active properties were examined. The total phenol 33.905±0.076 mg (GAE/g dry herb) and flavonoid 19.55±0.134 mg (KE/g dry plant) was determined in the crude extract. In addition, according to the LC-MS/MS result; rosmarinic acid, according to GC-MS results; 9,12,15-octadecatrienoic acid methyl ester, according to the GC-FID result; cis-11-eicosanoate was detected in the highest amount. In general, the isolated molecules showed higher activity than the crude extract, fraction and standards from which it was isolated. 
As a result, active phytochemical compounds were determined as a result of this thesis studies carried out within the scope of "Investigation of metabolites with antioxidant, antibacterial, antidiabetic, antialzheimeralantilipase, antityrosinase and DNA protection biological activity tests that can be drug precursors from N aristata plant". The enzyme inhibition activities of the isolated molecules showed higher effects, especially on urease, AChE, BChE and tyrosinase. These results were supported by kinetic and molecular docking values. Secondary metabolites obtained by bioactivity-guided isolation; They were determined to be antioxidants in eliminating oxidative damage, regulating enzyme activities, antibacterial against pathogenic effects and DNA protective against genetic damage.