ISG15 aktive edici e1 enzimi Ube1L-uf domaıninin NMR solüsyon yapısının belirlenmesi ve bazı insan ubiquitilasyon E3 enzimleri ve RIG-1-CARDs'ın klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması
NMR solution structure of ISG15 activating enzyme Ube1L uf-domain and cloning, expression, purification of some ubiquitin E3 enzymes and RIG-I CARDs
Yazar: ÇAĞDAŞ DAĞ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. EMİNE SONAY ELGİN
Muğla Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Manyetik rezonans spektroskopi = Magnetic resonance spectroscopy ; Protein mühendisliği = Protein engineering ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
Ubiquitin (Ub) ve Ub benzeri (Ubl) proteinler bir dizi enzimatik reaksiyonlar ile ökaryotik proteinleri post translasyonel modifikasyonlara uğratan proteinlerdir. Hedef proteine Ub/Ubl konjugasyonu E1 aktive edici, E2 konjuge edici ve E3 ligazlar olarak adlandırılan üç enzim sınıfının aktivitesini gerektirir ve her bir Ub/Ubl protein için spesifik E1, E2 ve E3 enzimleri mevcuttur. Ub ve Ubl proteinler bağlandığı hedef proteinleri farklı yol ve işlevlere yönlendirirler. Hedef proteinin hangi yol ve işleve yönlendirileceği ise hedef proteine Ub/Ubl proteinin hangi aminoasitten bağlandığına ve bağlanan Ub/Ubl moleküllerinin sayısına göre çeşitlilik göstermektedir.İnterferonca uyarılan gen 15 (ISG15) bağışıklık sisteminde rol oynayan ubiquitin benzeri bir proteindir. ISG15'in ökaryotik proteinlere kovalent olarak bağlanması ile gerçekleşen post translasyonel modifikasyon ISGlasyon olarak adlandırılır. İnsan ISG15'i için spesifik E1 enzimi Ube1L'dir. Ub/Ubl konjugasyon sistemlerinde E1 enzimleri yapısal ve işlevsel bakımdan benzerlik göstermektedir. E1 aktive edici enzimler genellikle üç domainden oluşurlar; adenilasyon domaini, katalitik sistein domaini ve karboksil terminal ubiquitin benzeri beta grasp/ubiquitin fold (UF) domaini. Literatürde insan Ube1L enzimi ile ilgili yapısal bir çalışma mevcut değildir. Ancak diğer Ub/Ubl protinler için spesifik E1 enzimleri ile yapılan çalışmalarda, UF domaininin E2 ile etkileşimde ve doğru E2 enziminin seçilmesinde gerekli olduğu gösterilmiştir. Sistemler arasında seçiciliğin nasıl sağlandığının anlaşılmasında yapısal çalışmaların rolü büyüktür ve Ube1L enzimi ile ilgili yapısal çalışmalar bu seçiciliğin anlaşılmasına yardımcı olacaktır.Bu tezin ilk bölümünde, ISGylasyonda aktive edici E1 enzimi olarak işlev yapan Ube1L'nin ubiquitin benzeri domaininin (UFD) 3 boyutlu NMR solüsyon yapısının belirlenmesine yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Ube1L-UFD için gerekli NMR verileri kaydedilmiş, rezonans atamaları, verilerin analizi ve yapı hesaplamaları kısmi olarak tamamlanmıştır. Bu çalışmalar sonucunda, Ube1L-UFD'nin, diğer ubiquitin benzeri proteinlerde olduğu gibi beta-grasp fold olarak adlandırılan yapıya katlandığı ortaya koyulmuştur.Tezin ikinci bölümünde Ub/Ubl sisteminin hedeflerinden birisi olan insan RIG-I (retinoic acid inducible gene-1) proteininin modifikasyona uğrayan CAR (caspase activation and recruitment) domainleri ve bu modifikasyonda işlev yapan E3 enzimlerinin (Trim25 ve RNF125) yapısal çalışmalarda kullanılmak amacıyla üretilmesine yönelikçalışmalar gerçekleştirilmiştir. RIG-1, RNA virüsleri tarafından enfekte olmuş hücrelerde, viral RNA moleküllerinin tanınmasında ve savunma mekanizmasının harekete geçirilmesinde birinci basamakta yer alır. RIG-I'in regülasyonunda ubiquitilasyon önemli bir rol oynar. RIG-1'in ubiquitilasyonunda görev aldığı bilinen iki farklı E3 enzimi mevcuttur; Trim25 ve RNF125. Trim25 ve RNF125 aracılıklı ubiqutilasyonun RIG-I'i farklı sinyal yollarına yönlendirdiği bilinmektedir. RNF125 aracılıklı ubiquitilasyon RIG-I'i degredasyon için proteozoma yönlendirirken, Trim25 aracılıklı ubiquitilasyon RIG-1 bağımlı viral bağışıklığın harekete geçirilmesinde gereklidir.Bu bölümünde, RIG-1 CAR domainlerini ve Trim25-SPRY domainini ve RNF125'i kodlayan genler E. Coli ekspresyon vektörleri içerisine klonlanmış, bakteriyel sistemde ekspresyonları ve kromatografik yöntemlerle saflaştırılmaları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca RIG-I CARDs 15N-işaretli olarak üretilmiş ve NMR yapısal çalışmalar için uygun olup olmadığı test edilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda, Trim25-SPRY ve RNF125 proteinlerinin çözünürlüklerinin düşük olduğu, denenen solüsyon koşullarında kararsız oldukları ve hızla çöktükleri gözlenmiştir. RIG-I CARDs'ın ise kaydedilen 15N-1H HSQC spektrumundan, test edilen NMR koşullarında kararlı bir üç boyutlu yapıya sahip olmadığı belirlenmiştir.

Abstract:
Ubiquitin (Ub) and ubiquitin-like (Ubl) proteins are common post-translational modifiers of eukaryotic proteins. Ub/Ubl conjugation to target proteins occurs via similar enzymatic cascades and requires the activity of three enzyme classes, namely E1 activating enzymes, E2 conjugating enzymes and E3 ligases. Each Ub/Ubl protein has its own specific set of E1, E2 and E3 enzymes and each Ub/Ubl protein directs its target to different pathways and functions. Which pathway or function target is directed to depends both on the attachment position of Ub/Ubl on the target and the number of attached Ub/Ubl molecules.Interferon stimulated gene 15 is a ubiquitin-like protein involved in immune defense. Post-translational modification of eukaryotic proteins by covalent attachment of ISG15 is called ISGlation. Specific E1 enzyme for human ISG15 is Ube1L. E1 enzymes in Ub/Ubl conjugation systems display similar structural and functional aspects. They generallyconsist of three different domains: adenilation domain, the catalytic cysteine domain and the carboxyl terminal ubiquitin-like beta-grasp (ßG) / ubiquitin fold (UF). There is no structural work in the literature for human Ube1L enzyme yet. However, structural studies on other Ub/Ubl specific E1s show that UF domain is important for interacting E2s and necessary in selecting the correct E2 for the pathway. Structural studies play important roles in understanding how specificity is achieved in various conjugation systems. Structural studies on human Ube1L will help to understand this specificity.In the second part of this thesis, production of human RIG-1 CAR (caspase activation and recruitiment) domains, which are the targets of various Ub/Ubl modification systems, and two E3 ligases (Trim25 and RNF125), which are involded in ubiquitylation of RIG-1 CARDs (CAR domains), were carried out to use in structural studies. In cells infected with RNA viruses, RIG-1 is involved in the first step in recognition of viral RNA molecules and activation of host defense. Ubiquitylation plays an important role in RIG-1 regulation. There are two different E3 enzymes that are known to function in RIG-1 ubiquitylation; Trim25 and RNF125. Ubiquitylation of RIG-1 CAR domains by different E3s, targets RIG-1 to different signal pathways. While ubiquitylation by RNF125 targets RIG-1 to proteosome for degredation, ubiquitylation by Trim25 is necessary for activation of RIG-1 dependent viral defense system.In this part, genes coding for RIG-1 CARDs, Trim25-SPRY domain and RNF15 were cloned into E. Coli expression vectors, bacterial protein expressions and purification of target proteins by chromatographic methods were carried out. In addition, 15N-labeled RIG-I CARDs was produced to test whether free domains were suitable for structural studies. Result of these studies showed that both Trim25-SPRY and RNF125 had a low solubility and stability and precipitated immediately under the solution conditions tested. 15N-1H HSQC spectrum of RIG-I CARDs indicated that under the NMR condition used, free domains did not fold into a stable conformation.