Fusarium'da fludioksonil'in mikotoksin sentezinden sorumlu özgün genlerin anlatımı üzerindeki etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of fludioxonil on expressions of specific genes responsible for mycotoxin synthesis in Fusarium
Yazar: ESMA ÖZSOY
Danışman: PROF. DR. GÜLRUH ALBAYRAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Yüksek lisans tezinde fungisit aktif bileşenlerinden fludioksonilin deoksinivelanol (DON) biyosentezinden sorumlu tri4, tri5 ve tri11 genlerinin anlatım seviyelerine etkisi F. culmorum UK99 (FcUK99) referans suşunda transkriptomik düzeyde araştırıldı. Bu kapsamda aktif bileşiğin 0.11 µg/mL (MİK25) ve 0.22 µg/mL (MİK50) dozları PDA besi ortamına eklenerek FcUK99 kültürleri kuruldu. Fludioksonil içermeyen PDA ortamında üretilen FcUK99 kültürleri kontrol grubunu oluşturdu. Kültürlerin 7. gününde doğrusal büyüme oranları (ing., linear growth rate; LGR) kontrol grubunda 22.5±0.00 mm/gün, MİK25 uygulanmış kültürler için 5.78±0.03 mm/gün ve MİK50 için 3.68±0.04 mm/gün olarak hesaplandı. MİK25 uygulaması kültürlerde fungal büyümeyi %25 oranında, MİK50 uygulaması ise %83.6 oranında azalttı. Doz artışına bağlı olarak hücre canlılığında meydana gelen azalma istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.0001). Bileşiğin hücre canlılığına etkisi akridin turuncusu/etidyum bromür ikili boyaması ile gösterildi. Floresan mikroskobunda kontrol grubuna ait örneklerin yeşil ışıma yaymaları kültürün metabolik olarak aktif hücrelerden oluştuğunu gösterdi. Fludioksonilin MİK25 dozuna maruz bırakılan kültürlerde yeşilden sarıya lüminesans veren hücre sayısının çokluğu ve MİK50'nin eklendiği kültürlerde sarıdan turuncuya lüminesans veren hücrelerin varlığı fludioksonilin apoptoz benzeri hücre ölümünü tetiklediğini gösterdi. 
Kontrol ve deney gruplarının 7 günlük kültürlerinden izole edilen uygun saflıktaki (1.8-2.0) total RNA'lardan çevrilen cDNA'lar tri4, tri5 ve tri11 genlerinin anlatım seviyelerinin belirlenmesi için gerçekleştirilen damlacıklı dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPZR) ve gerçek zamanlı PZR (qPZR)'de kalıp olarak kullanıldı. ddPZR analizi fludioksonilin MİK25 dozunun tri4 gen anlatım düzeyini kontrol grubuna göre 12.7 kat, MİK50 dozunun ise 78.5 kat arttırdığını ortaya koydu. Fludioksonilin MİK25 uygulaması tri5 gen anlatımını 17.5 kat arttırırken, MİK50 dozu 241.7 kat arttırdı. tri11 gen anlatımı ise MİK25 uygulamasında 4.7 kat, MİK50 uygulamasında 23.1 kat arttı. Fludioksonilin artan dozlarının her üç genin anlatım düzeyinde neden olduğu up-regülasyon kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı (tri4 kontrol-MİK50 grubu için p<0.0001 düzeyinde, diğer genler için ise p<0.001) bulundu. qPZR analizi tri4 gen anlatımının MİK25 uygulamasında 9.1 kat, MİK50 uygulamasında ise 17.07 kat arttığını gösterdi. tri5 geninde kat artışı MİK25 uygulamasında 12.95 kat, MİK50 uygulamasında 41.12 kat olarak belirlendi. tri11 geninde kat artışı MİK25 uygulamasında 4.7 kat, MİK50 uygulamasında 5.2 kat olarak tespit edildi. MİK25 ve MİK50 uygulamalarının tri4 ve tri5 genlerinin anlatım seviyelerinde neden olduğu up-regülasyon istatistiksel olarak anlamlı (tri4 için p<0.05, tri5 için p<0.001) iken, tri11 genininki anlamlı bulunmadı (p>0.05). Her iki transkriptomik verisi fludioksonilin üç genin anlatım düzeylerini arttırdığını, tri11 genindeki kat artışının tri4'e göre oldukça az olduğunu belirlemeyi sağladı.
FcUK99 suşunun kontrol ve deney gruplarından izole edilen mikotoksinlerin ince tabaka kromatografisi (İTK), kontrol grubunda DON üretildiğini (Rf: 0.29) ve fludioksonil uygulanmasının üretimi baskıladığını gösterdi. Ek olarak aktif maddeye maruz kalan örneklerde 3-ADON'un Rf değerine (0.27) ait spota yakın spotların ortaya çıktığı, doz artışı ile birlikte spotların sinyallerinin azaldığı gözlendi.
Transkriptomik ve kromatografik veriler birlikte değerlendirildiğinde; tri11 genindeki kat değişiminin tri4'tekinden az olması TRI11'in hidroksilasyon işlevinde yetersiz kaldığını, dolayısıyla ara metabolitin hücrede birikimi yoluyla DON üretiminin baskılanmasına yol açabileceğini belirlemeyi sağladı. Bu yüksek lisans tez çalışması, olası DON biyosentez yolağının F. culmorum'da da işlevsel olduğunu ve fludioksonilin sadece F. culmorum'un üremesini engellemekle kalmayıp aynı zamanda patojenitede virulansdan sorumlu DON mikotoksin üretimini de baskıladığını ortaya koyması bakımından büyük önem taşımaktadır.

Abstract:
In the master's thesis, the effect of fludioxonil, which is one of the fungicide active compounds, on the expression levels of tri4, tri5 and tri11 genes responsible for the biosynthesis of deoxynivalenol (DON) was investigated in the reference strain of Fusarium culmorum (FcUK99) at the transcriptomic level. In this context, FcUK99 cultures were established by adding doses of 0.11 µg/mL (MIC25) and 0.22 µg/mL (MIC50) of the active compound to the PDA medium. FcUK99 cultures grown in PDA medium without fludioxonil consisted the control group. Linear growth rates (LGR) were calculated as 22.5±0.00 mm/day in the control group, 5.78±0.03 mm/day for cultures treated with MIC25, and 3.68±0.04 mm/day for MIC50 on the 7th day of the cultures.MIC25 application reduced the fungal growth in cultures by 25%, and MIC50 by 83.6%. The decrease in cell viability due to the increase in dose was found to be statistically significant (p<0.0001). The effect of the compound on cell viability was demonstrated by acridine orange/ethidium bromide double staining. The green light emission of the control group samples under the fluorescence microscope displayed that the culture consisted of metabolically active cells. The redundancy of the number of cells emitting green-to-yellow luminescence in cultures of application of the MIC25 fludioxonil dose and the presence of cells emitting yellow-to-orange luminescence in cultures added of the MIC50 also displayed that fludioxonil triggered apoptosis-like cell death.
cDNAs, translated from total RNAs of appropriate purity (1.8-2.0) isolated from 7-day cultures of control and experimental groups, were used as templates in digital polymerase chain reaction (ddPCR) and real-time PCR (qPCR) to determine the expression levels of tri4, tri5 and, tri11 genes. ddPCR analysis revealed that the MIC25 dose of fludioxonil increased the tri4 gene expression level by 12.7 times compared to the control group, and the MIC50 dose increased by 78.5 times. MIC25 application of fludioxonil increased tri5 gene expression by 17.5 times, while the MIC50 dose increased it by 241.7 times. tri11 gene expression increased 4.7-fold in the MIC25 application and 23.1-fold in the MIC50. The up-regulation caused by increasing doses of fludioxonil at the expression level of all three genes was found statistically significant (p<0.0001 for the tri4 control-MIC50 group, p<0.001 for the other genes) compared to the control group. qPCR analysis indicated that the tri4 gene expression was increased 9.1 times in the MIC25 application and 17.07 times in the MIC50 application. The fold change in the tri5 gene was determined as 12.95-fold in the MIC25 application and 41.12-fold in the MIC50 application. The fold change in the tri11 gene was detected as 4.7-fold in the MIC25 application and 5.2-fold in the MIC50 application. The up-regulation caused by MIC25 and MIC50 applications in the expression levels of tri4 and tri5 genes was statistically significant (p<0.05 for tri4, p<0.001 for tri5) while that of tri11 gene was not (p>0.05). Both transcriptomic data enabled us to determine that fludioxonil increased the expression levels of three genes, and the fold increase in the tri11 gene was significantly less than that in tri4.
Thin layer chromatography (TLC) of mycotoxins isolated from control and experimental sets of FcUK99 strain demonstrated that DON was produced in the control group (Rf: 0.29), and fludioxonil application suppressed the production. In addition, it was observed that the spots close to the the spot belonging to Rf value of 3-ADON (0.27) appeared in the samples exposed to the active substance, and the spot' signals decreased with the increase in dose.
When transcriptomic and chromatographic data are evaluated together; the fact that the fold change in the tri11 gene was less than that of tri4 provided to determine that TRI11 remained insufficient in its hydroxylation function, hence that it could lead to the inhibition of DON production through the accumulation of the intermediate metabolite in the cell. This master's thesis study is of great importance as it reveals that the possible DON biosynthesis pathway is also functional in F. culmorum and that fludioxonil not only prevents the reproduction of F. culmorum but also suppresses the DON mycotoxin production responsible to virulence in pathogenicity.