Cloning and expression of gerE and glmS genes in Escherichia coli and Bacillus subtilis, and investigation of their possible interrelation with bacilysin biosynthesis
gerE ve glmS genlerinin Escherichia coli ve Bacillus subtilise klonlanlamasi, ekspresyonu ve basilisin biyosentezi ile olası karşılıklı ilişkilerinin araştırılması
Yazar: SERGEN AKAYSOY
Danışman: PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ
Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bacillus subtilis = Bacillus subtilis ; Basilisin = Bacilysin ; Elektroforetik analiz = Electrophoretic analysis ; Gen klonlama = Gene cloning ; Kayma analizi = Sliding analysis

Özet:
Bacillus subtilis, basilisin isimli dipeptit antibiyotiği enzimatik olarak üreten Gram pozitif model bakteridir. Basilisin, N-terminalinde L-alanin ve C-terminalinde L-antikapsinden oluşan en basit biyoaktif peptitdir. Standard suş B. subtilis PY79un basilisin üretemeyen OGU1 isimli mutant türevi bacA-hedefli pMutinT3 insersiyonu yoluyla laboratuvarımızda daha önce oluşturulmuş, bacA::lacZ::erm::bacABCDEF genomic organizasyonuna sahip olduğu gösterilmişti. Yine laboratuvarımızda yürütülmüş olan RT-qPCR, transkriptom, sekretom, and proteom çalışmaları OGU1 ve PY79 arasında gen ekspresyonu bakımından çok sayıda gen için çok önemli farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur. Şimdiki çalışmanın konusunu oluşturan gerE and glmS transkriptlerinin ve kodladıkları proteinlerin, PY79 suşuna göre OGU1da oldukça düşük seviyelerde ifade edildikleri gösterilmiştir. Bacillus subtilis'in, gerE ve glmS genleri OGU1de negatif regüle edilen genlere örnektir. Kendi regülonunun master proteini olan gerE, transkripsiyon regülatörlerinin LuxR-FixJ ailesine mensuptur ve sporulasyonun geç aşamalarında ana hücre kompartmanında ifade edilir. Glutamin-fruktoz-6-phosphate transaminaz enzimini kodlayan glmS ise hücre duvarı sentezinden sorumludur. Bu iki gen, ayrı ayrı E. coli DH5α, E. coli BL21 ve B. subtilis OGU1e klonlanmıştır. Sporların farklı kimyasallara karşı direnci, bu sporların jerminasyon profili, koloni morfolojisi ve pigmentasyonu dahil olmak üzere çeşitli fenotipik analizler ana suş PY79, mutant suş OGU1 ve gerE ve glmS genlerini yüksek seviyede ifade eden rekombinant OGU1 suşlarında yapılarak sonuçlar karşılaştırılmıştır. gerE ve glmS genlerinin saflaştırılmış proteinleri ile basilisin operonunun promotör bölgesi ve ayrıca saflaştırılmış basilisin molekülü ile gerE ve glmS genlerinin promotor bölgeleri arasındaki olası DNA-protein etkileşimlerini aydınlatmak için elektroforetik mobilite kayma analizleri (EMSA) yapılmıştır.

Abstract:
Bacillus subtilis is the Gram-positive model bacterium that enzymatically produces the dipeptide antibiotic bacilysin. Bacilysin is the simplest bioactive peptide known composed of L-alanine at its N-terminal and L-anticapsin at its C-terminal. In a former work in our laboratory, a mutant strain of B. subtilis, namely OGU1 was constructed by bacA-targeted pMutin T3 insertion into the parental strain PY79 genome resulting in a genomic organization bacA::lacZ::erm::bacABCDEF and unable to synthesize bacilysin. RT-qPCR, transcriptome, secretome, and proteome studies conducted so far revealed that there are significant differences in the expression of a vast number of genes between OGU1 and PY79, including gerE and glmS which are significantly downregulated in OGU1. In B. subtilis, GerE, a member of LuxR-FixJ family of transcription regulators, is expressed late during sporulation in the mother cell compartment and acts as the master protein of its own regulon. It is involved in spore germination and spore coat assembly. glmS, on the other hand, encodes glutamine-fructose-6-phosphate transaminase for cell wall synthesis. These two genes were cloned in E. coli DH5α, next subcloned and expressed in E. coli BL21 and B. subtilis OGU1. The effects of these genes were determined by comparing the parental strain PY79, the mutant strain OGU1, and the OGU1 complemented with cloned and expressed gerE and glmS with each other, respectively. Phenotypic analyses were performed, including the resistance of endospores against different chemicals, the germination profile of endospores as well as colony morphology and pigmentation of each strain. Moreover, the possible interrelations between bac operon and gerE and glmS functions were investigated by performing electrophoretic mobility shift assays (EMSA). These assays were conducted to elucidate the possible DNA-protein interactions between the bac promoter and the purified GerE and GlmS proteins.