Doğal tetraploid Trifolium pratense L.'de gümüş (Ag) nanopartikülünün in vitro biyosentezi ve fonksiyonel fide üretimi
The silver (Ag) nanoparticles in vitro biosynthesis mediated by natural tetraploid Trifolium pratense l. and functional seedling production
Yazar: HAVVA KARAHAN
Danışman: PROF. DR. HATİCE ÇÖLGEÇEN ; PROF. DR. FİLİZ VARDAR
Zonguldak Bülent Ecevit Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Botanik = Botany
Dizin: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Botanik = Botany

Özet:
Bu çalışma ile yüksek miktarda fenolik bileşik ve glikosidik biyoaktif makromoleküller içeren doğal tetraploid Trifolium pratense L. aracılığıyla gümüş nanopartiküllerin (AgNP) biyosentezi ve fonksiyonel fide üretimi amaçlanmıştır. Doğal tetraploid T. pratense L.'nin herba, 15 günlük aseptik fide, kallus ve hücre süspansiyon kültürleri ekstraktları ile farklı konsantrasyonlarda AgNO3 (0.16, 0.5, 0.84, 1.18, 1.52 ve 1.96 mg/ml), farklı sıcaklık (40,50,60,70,80,90,100°C) ve farklı pH (5,7,10) denemeleri oluşturularak AgNP'lerin biyosentezi gerçekleştirilmiştir. Biyolojik olarak sentezlenen AgNP'ler renk değişimi ile karakterize edilmiş, bütün örneklerde ve farklı denemelerde ekstraktın renginde şeffaftan koyu kırmızıya değişiklik gözlenmiştir. AgNP'leri karakterize etmek için UV-VIS spektroskopisi, TEM, FTIR ve XRD analizleri yapılmıştır. Biyosentezlenmiş AgNP'ler UV-VIS spektrumunda 400-500 nm dalga boyu aralığında gözlenmiştir. Çalışmamızda konsantrasyon denemelerinde herba, 15 günlük aseptik fide, kallus ve hücre süspansiyon kültürlerinde en yüksek absorbans veren 1.96 AgNO3 + 1 g/10 ml ekstraktlarıdır. 24°C'de konsantrasyon denemelerinde ortalama 55 nm boyutta, üçgen, elips ve sferik şekillerde AgNP'ler görülmüştür. Sıcaklık denemelerinde herba ve kallus kültürlerinde en yüksek absorbans veren 90°C koşuludur ve ortalama 10 nm boyutlarında sferik AgNP'ler belirlenmiştir. 15 günlük aseptik fide ve hücre süspansiyon kültürlerinde ise 100°C koşuludur ve ortalama 40 nm boyutlarında tamamen sferik AgNP'ler oluşmuştur. pH 5 ve 10 denemelerinde herba, 15 günlük aseptik fide, kallus ve hücre süspansiyon kültürlerinde ortalama 20 nm aralığında ve tamamen sferik AgNP'ler görülmüştür. Genel olarak tüm denemeler sonunda iki farklı boyut ve şekil skalasında AgNP üretimi başarılmıştır. FTIR analizi ile AgNP yüzeyindeki fonksiyonel grupların O-H hidroksil grupları, H-bağlı OH esnemesi, C-H esnemesi, -CH2 ve -CH3 fonksiyonel gruplarının -CH esnemesi, C-N ve karboksilat, alifatik fosfat ve birincil amin esnemesi ifade edilmiştir. XRD analizi ile biyosentez ürünü AgNP'lerin kristal yapıları belirlenmiştir.
Biyosentezlenen AgNP'lerin DPPH ve ABTS'ye karşı antioksidan aktivitesi incelenmiştir. Herbada DPPH radikali aktivitesi en yüksek pH denemesinde %45 iken; ABTS radikali aktivitesi %78'dir.  15 günlük aseptik fidede DPPH radikali aktivitesi sıcaklık denemesinde en yüksek %49 iken; ABTS radikali aktivitesi %47'dir.  Hipokotil, apikal meristem ve epikotil kallusları arasında en yüksek antioksidan aktivite hipokotil-konsantrasyon denemelerinden elde edilen AgNP'lerde görülmüş ve DPPH radikali aktivitesi %52 iken; ABTS radikali aktivitesi %68'dir. Hücre süspansiyon kültürleri arasında en yüksek antioksidan aktivite hipokotil-sıcaklık denemelerinden elde edilen AgNP'lerde görülmüş ve DPPH radikali aktivitesi %58 iken; ABTS radikali aktivitesi %66'dır.
Doğal tetraploid T. pratense L.'nin aseptik fide, kallus ve hücre süspansiyon kültürleri ortamlarına eklenen iki farklı boyutta ve sferik biyosentez ürünü olan AgNP'lerin aseptik fidelerde kökten diğer dokulara translokasyonu, kallus ve hücre süspansiyon kültürlerinde ise hücre içine alınımını belirlemek amaçlanmıştır. Doğal tetraploid T. pratense L.'nin aseptik fideleri 5-13 nm AgNP içeren MS ortamında 35 gün boyunca büyütülmüştür. Yapılan TEM incelemelerinde 35 günlük AgNP'lere maruz kalan doğal tetraploid T. pratense L.'nin aseptik fidelerinde AgNP'lerin kökten yaprağa kadar taşındığı ve kök ucu, kök, hipokotil ve yapraklarda biriktiği gösterilmiş, bununla birlikte taşınım sırasında apoplastik yol izlediği belirlenmiştir. TEM mikrograflarına göre bitki organlardaki AgNP'ler 10-15 nm ve sferiktir. Aynı zamanda, ICP-MS ile kantitatif miktar analizi yapılarak kök, hipokotil ve yaprakta sırasıyla 1.263 µg/kg, 10.986 µg/kg ve 2.365 µg/kg AgNP olduğu tespit edilmiştir. TEM mikrograflarına göre AgNP'ler kallus ve hücre süspansiyon kültür hücreleri içerisine girdiğinde boyutlarının 12-24 nm'ye küçüldüğü ve sferik şekillerini koruduğu görülmüştür.

Abstract:
The aim of this study was to biosynthesize silver nanoparticles (AgNPs) and produce functional seedlings through natural tetraploid Trifolium pratense L., which contains high amounts of phenolic compounds and glycosidic bioactive macromolecules. The herb, 15-day-old aseptic seedlings, callus, and cell suspension cultures of natural tetraploid T. pratense L. were used to create different experiments with AgNO3 at various concentrations (0.16, 0.5, 0.84, 1.18, 1.52, and 1.96 mg/ml), different temperatures (40, 50, 60, 70, 80, 90, 100°C), and different pH levels (5, 7, 10) to carry out the biosynthesis of AgNPs. Biologically synthesized AgNPs were characterized by color change, and a change in the color of the extract from transparent to dark red was observed in all samples and in different experiments. UV-VIS spectroscopy, TEM, FTIR and XRD analysis were performed to characterize AgNPs. Biosynthesized AgNPs were observed in the wavelength range of 400-500 nm in the UV-VIS spectrum. In our study, the highest absorbance was obtained in the herb, 15-day-old aseptic seedlings, callus, and cell suspension cultures with 1.96 AgNO3 + 1 g/10 ml extracts. In the concentration experiments at 24°C, AgNPs with an average size of 55 nm were observed in triangular, elliptic, and spherical shapes. In the temperature experiments, the condition that yielded the highest absorbance in the herb and callus cultures was 90°C, and spherical AgNPs with an average size of 10 nm were identified. In the case of 15-day-old aseptic seedlings and cell suspension cultures, the condition of 100°C resulted in fully spherical AgNPs with an average size of 40 nm. In the pH 5 and 10 experiments, herb, 15-day-old aseptic seedlings, callus, and cell suspension cultures exhibited completely spherical AgNPs with an average size in the range of 20 nm. Overall, successful production of AgNPs was achieved in two different size and shape scales in all experiments. By FTIR analysis, O-H hydroxyl groups of functional groups on AgNP surface, H-linked OH stretching, C-H stretching, -CH stretching of -CH2 and -CH3 functional groups, C-N and carboxylate, aliphatic phosphate and primary amine stretching were expressed. The crystal structures of biosynthesized AgNPs were determined by XRD analysis.
Antioxidant activity of biosynthesized AgNPs against DPPH and ABTS was determined. While the DPPH radical activity in herb was 45% in the highest pH experiment; ABTS radical activity is 78%. While DPPH radical activity in the 15-day-old aseptic seedling was 49% in the highest temperature test; ABTS radical activity was 47%. Among the hypocotyl, apical meristem, and epicotyl callus cultures, the highest antioxidant activity was observed in the AgNPs obtained from hypocotyl-concentration experiments, with a DPPH radical activity of 52% and an ABTS radical activity of 68%. Among the cell suspension cultures, the highest antioxidant activity was seen in AgNPs obtained from hypocotyl-temperature experiments and DPPH radical activity was 58%; ABTS radical activity was 66%.
It was aimed to determine the translocation of natural tetraploid T. pratense L. AgNPs, which are two different sizes and spherical biosynthesis products added to aseptic seedling, callus and cell suspension culture media, from root to other tissues in aseptic seedlings, and their uptake into cells in callus and cell suspension cultures.  Aseptic seedlings of natural tetraploid T. pratense L. were grown in MS medium containing 5-13 nm AgNP for 35 days. TEM experiments revealed that AgNPs were transported from the roots to the leaves in aseptic seedlings of natural tetraploid T. pratense L. exposed to AgNPs for 35 days. It was shown that AgNPs accumulated in the root tip, root, hypocotyl, and leaves. Furthermore, it was determined that the translocation followed the apoplastic pathway.  According to TEM micrographs, AgNPs in plant organs are 10-15 nm and spherical. Additionally, quantitative analysis using ICP-MS determined the presence of 1.263 µg/kg AgNPs in the roots, 10.986 µg/kg AgNPs in the hypocotyl, and 2.365 µg/kg AgNPs in the leaves. According to TEM micrographs, it was observed that when AgNPs entered the callus and cell suspension culture cells, their sizes reduced to 12-24 nm and preserved their spherical shape.