Limnodrilus profundicola (Verril 1871) kolinesteraz ve etoksirezorufin o-deetilaz aktivitelerinin biyomarkör olarak kullanılmasının araştırılması
Investigation of using Limnodrilus profundicola (Verril 1871) cholinesterase and ethoxyresorufin o-deetilase activities as a biomarker
Yazar: ADİLE ÖZDEMİR
Danışman: PROF.DR. ALAATTİN ŞEN ; Y.DOÇ.DR. MUSTAFA DURAN
Pamukkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, Büyük Menderes Nehri'nin bir kolu olan Çürüksu Çayı üzerinde farklıistasyonlardan toplanan oligoket Limnodrilus profundicola'ların homojenizasyonuylamikrozomal ve sitozolik fraksiyonlar elde edildi. L. profundicola'larda sitozolik kolinesteraz(ChE) karakterizasyonu, asetiltiyokolin (ATC), propiyoniltiyokolin (PTC) ve butiriltiyokolin(BTC) substratları kullanılarak gerçekleştirildi. ChE aktivitesi; asetilkolinesteraz (AChE),propiyonilkolinesteraz (PChE) ve butirilkolinesteraz (BChE) için sırasıyla 50 Âµg, 50 Âµg ve 100Âµg protein miktarına ve 150 saniye reaksiyon zamanına kadar lineerlik göstermiştir. Optimum pHve sıcaklık her üç substrat için pH 8,5 ve 35 ºC olarak bulunmuştur. AChE, PChE ve BChE içinenzim aktivitesinin sırasıyla 7,5 ÂµM ATC, 5 ÂµM PTC ve 2,5 ÂµM BTC konsantrasyonu üzerindesature olduğu gözlenmiştir. Lineweaver-Burk grafiği kullanılarak yapılan saptamalarda AChE,PChE ve BChE için Vmax ve Km değerleri sırasıyla 8636 U/dak/mg protein ve 1,202 mM; 6064U/dak/mg protein ve 0,537 mM; 3065 U/dak/mg protein ve 0,560 mM olarak hesaplanmıştır.Yapılan çalışmalarda L. profundicola sitozolik ChE aktivitesi üzerine organofosfat, karbamat vepiretroid insektisitlerin etkisi incelenmiş ve insektisitlerin enzim aktivitelerini inhibe ettiğibulunmuştur. Bununla birlikte Çürüksu Çayı üzerinde belirlenen farklı istasyonlardan toplanan L.profundicola bireylerinde AChE aktiviteleri ölçülmüş ve farklılıklar bulunmuştur. Ayrıca,Sitokrom P4501A1 (CYP1A1) indüksiyonunu anlamak için EROD aktivitesi, 7-Etoksirezorufinsubstratı kullanılarak ölçülmüştür. CYP1A1 ve CYP4A ekspresyon düzeylerinin saptanması içinWestern blot analizleri, anti-Rat CYP1A1 ve CYP4A antikorları kullanılarak yapılmıştır. Sonuçolarak, bu çalışmada kirliliğe duyarsız olmayan ama dirençlilik kazanabilen, kirli ve temizsularda yaşayabilen kozmopolit bir tür olan L. profundicola'nın geniş çeşitlilikteki çevreselkoşullara adaptasyonu ile kirlilik ve ekotoksikoloji çalışmalarında biyomarkör organizma olarakkullanılabilirliği gösterilmiştir.

Abstract:
In this study, oligochaete Limnodrilus profundicola collected from different sites alongCuruksu stream on Menderes River were homogenized and microsomal and cytosolic fractionswere prepared. Characterization of cytosolic cholinesterase (ChE) activities were carried out usingacetylthiocholine (ATC), propionylthiocholine (PTC) and butyrylthiocholine (BTC) substrates.AChE, PChE and BChE activities were found to be linear with respect to 50, 50 and 100 Âµgprotein concentrations, respectively for 150 seconds incubation time . Optimum pH andtemperature have found to be pH 8.5 and 35 ºC for all substrate. It has been observed that AChE,PChE and BChE enzyme activities have saturated at and above 7.5 mM ATC, 5 mM PTC and 2.5mM BTC concentrations, respectively. Apparent Vmax and Km values of AChE, PChE and BChEwere determined using Lineweaver-Burk graph and calculated as 8636 U/min/mg proteins and1,202 mM; 6064 U/min/mg proteins and 0,537 mM; 3065 U/min/mg proteins and 0,560 mM,respectively. In our studies, the effects of organophosphorous, carbamate and piretroid insecticideson L. profundicola cytosolic ChE activites were investigated and were found that these insecticideshave inhibitory effects. AChE activities of L. profundicola collected from different stations ofCuruksu Stream have measured and were observed to be different. In addition, for CytochromeP4501A1 induction, EROD activity has been measured using 7-ethoxyresorufin as substrate.CYP1A1 and CYP4A expression levels were also determined by Western blot analysis using anti-Rat CYP1A1 and CYP4A antibodies. Consequently, L. profundicola which is a cosmopolitanorganism with a reputation for being very resistant but not insensitive to pollution can adapt to awide range of environmental conditions and our results suggests that L. profundicola can be used asa biomarker organism for organic pollution and ecotoxicological studies.