CCP antikorlarının tayini için yüzey plazmon rezonans temelli biyosensörlerin hazırlanması
Preparation of surface plasmon resonance based biosensor for determination of anti-CCP antibodies
Yazar: HÜSEYİN DİBEKKAYA
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Romatoid artrit (RA) sık rastlanan kronik eklem iltihabı ile tanımlanan bir otoimmün hastalığıdır. Dünya nüfusunun yaklaşık %1'i RA hastalığından muzdariptir. Kadınları erkeklerden daha fazla (3-5 kat) etkilemektedir. RA'nın hem eklemsel hem de sistemik etkileri vardır. Şimdiye kadar RA teşhisinde en yaygın olarak romatoid faktör (RF) tayini kullanılmaktadır. Romatoid faktörler gamma globulinler ile reaksiyona giren ve genellikle IgM sınıfı antikorlardır. RA hastalarının %60 ile %80'inde bulunurlar. RF, RA için hassas ama spesifik olmayan bir işaretleyicidir. Çünkü sağlıklı bireylerde veya diğer otoimmün hastalığı olan bireylerde de bulunur.
RA hastalarının %40-60'ında epidermal flagrine karşı antikorlar gözlenir. Sitrülin, filagrin molekülünde bulunan nadir bir aminoasittir. Son araştırmalarda sitrülinin, filagrindeki antijenik epitopun yapısal bir parçası olduğu gösterilmiştir. Siklik peptid içeren sitrulin antikorları (anti-cyclic citrullinated peptide, anti-CCP) RA için yeni ve RF'den çok daha spesifik (anti-CCP: %96-%100, RF: %63) bir parametre olarak bildirilmektedir. Ayrıca CCP ile RF'in duyarlılıkları arasında belirgin bir fark yoktur (anti-CCP: %80, RF: %79). CCP'ye karşı oluşan antikorlar, çoğunlukla IgG sınıfındandır. Hastaların %70 ile %80'inde hastalığın erken aşamasında, çoğunlukla hastalığın semptomları ortaya çıkmasından çok önce tespit edilebilir.
Moleküler baskılanmış polimerler (MIP) hazırlanması kolay, ucuz, kararlı, moleküler tanıma yeteneği olan ve ayrıca büyük miktarlarda üretilebilen ve tekrar kullanılabilen malzemelerdir. Bu yüzden, MIP'ler yapay molekül tanıyan malzemeler olarak tanımlanabilir. Adsorpsiyon temelli moleküler tanıma teknikleri hedef molekülleri için gösterdikleri yüksek seçicilikten dolayı bazı alanlarda dikkatleri üzerine çekmiştir.  
Yüzey plazmon rezonans (SPR), metal yüzeye yakın kırılma indisindeki değişiklikleri ölçmede kullanılan kusursuz bir yöntemdir. SPR temelli biyosensörler, herhangi bir işaretlemeye gerek olmaksızın biyomoleküller arasındaki etkileşimleri ölçmede kullanılabilir. Etkileşimleri eş zamanlı, doğrudan ölçebilmek kinetik veya termodinamik parametrelerin, derişimin veya ligand-analit arasındaki etkileşimlerin belirlenebilmesini sağlamaktadır. SPR temelli biyosensörler, hızlı cevap süresine ve yüksek seçiciliğe sahip olduğu için enzim veya radyoişaretleme yöntemleri gibi diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, protein-protein, antikor-antijen, reseptör-ligand etkileşimlerinden, düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin tanımlanmasına kadar çok çeşitli biyomoleküler mekanizmaların anlaşılmasında kullanılabilir.
Sunulan çalışmanın amacı, anti-CCP antikor tayini için anti-CCP baskılanmış yüzey plazmon rezonans temelli biyosensör hazırlamaktır. Bu amaçla, SPR biyosensör allil merkaptan ile modifiye edilmiş ve allil gruplarının yönlenmesi sağlanmıştır. İlk basamakta, akrilamid (AAm) monomeri, kalıp monomer olarak kullanılan anti-CCP ile etkileştirilerek anti-CCP/AAm ön-kompleksi sentezlenmiştir. Optimum kalıp molekül ve monomer oranını belirlemek için anti-CCP ve farklı oranlarda AAm karıştırılmış ve optimum oran UV-görünür bölge spektrofotometre kullanılarak tespit edilmiştir. Daha sonra anti-CCP molekülleri çapraz bağlayıcı metilen bisakrilamid (MBAAm) varlığında anti-CCP/AA ön-kompleks ile reaksiyona sokularak moleküler baskılanmış (anti-CCP/PAAm) SPR biyosensörü elde edilmiştir. Baskılamada amonyum persülfat (APS) ve N,N,N',N'-tetrametilendiamin (TEMED) işleminde başlatıcı çifti olarak kullanılmıştır. Ayrıca kontrol deneyi için kalıp molekül olan anti-CCP molekülü kullanılmadan, baskılanmamış (PAAm) SPR biyosensörü de hazırlanmıştır. Hazırlanan anti-CCP/PAAm ve PAAm SPR biyosensörler, FTIR-ATR, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elipsometre ve temas açısı ölçümleriyle karakterize edilmiştir. Kalınlık ölçümleri ve AFM görüntüleri, anti-CCP moleküllerinin biyosensör yüzeyine hemen hemen tek tabakalı olarak baskılandığını göstermektedir. Adsorpsiyon çalışmaları için 10 mM pH 7.0 fosfat tamponu kullanılırken, desorpsiyon çalışmaları için de %1 Tween 20, %10 asetik asit (HAc) içeren çözelti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Anti-CCP/PAAm ve PAAm SPR biyosensörlerin anti-CCP tayin seçiciliği, anti-CCP, immunoglobulin M (IgM)ve sığır serum albümin (BSA) çözeltileri (pH 7.0 fosfat tamponunda) ve seyreltilmiş plazma örnekleri ile araştırılmıştır. Anti-CCP/PAAm SPR biyosensörü, PAAm SPR biyosensörüne göre IgM ve BSA'ya daha fazla seçicilik göstermiştir. Anti-CCP/PAAm SPR biyosensör ile anti-CCP çözeltisi arasındaki etkileşim modelini belirlemek amacıyla Scatchard, Langmuir; Freundlich ve Langmuir-Freundlich (LF) olmak üzere dört farklı izoterm modeli uygulanmıştır. Langmuir adsorpsiyon modeli, bu afinite sistemi için en uygun model olarak bulunmuş ve sonuçlar anti-CCP/PAAm SPR biyosensör yüzeyindeki anti-CCP bağlanma bölgelerinin homojen dağılımlı ve tek tabakalı olduğunu göstermiştir. Sonuçlar, anti-CCP/PAAm SPR biyosensörün anti-CCP için yüksek seçiciliğe ve duyarlılığa sahip olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Rheumatoid arthritis (RA) suffers up to 1% of the world's population, affecting females to a greater extent (3–5 fold) than males. RA mainly affects joints, also has systematic effects on body.  The most commonly performed serological test in suspected RA cases is the determination of rheumatoid factors (RF). RF are antibodies (predominantly of class IgM) which react with gamma globulins and occur in 60-80% of RA patients. RF are a sensitive, but not very specific marker for RA since they also occur in healthy individuals or patients with autoimmun diseases.
In 40-60% of RA patients autoantibodies against epidermal filaggrin are exhibit in their serum. In recent years it has been shown that the rare amino acid citrulline, which is present in filaggrin, is asubstantial component of the antigenic epitope. It has been reported in studies that cyclic peptide containing citrullune antibodies (anti-cyclic citrullinated peptide, anti-CCP) reported as more specific test than RF parameter (Anti-CCP: 96-100%, RF: 63%) for RA diagnosis. Beside this, there is no significant difference in sensitivity (Anti-CCP: 80%, RF: 79%). Antibodies against CCP are predominantly of IgG class. They can be found in the serum of 70%-80% of patients very early during the development of the disease, often even many years before the onset of the first symptoms.
Molecularly imprinted polymers (MIP) are materials that are easy to prepare, less expensive, stable, have talent for molecular recognition and also can be manufactured in large quantities with good reproducibility. MIPs are used for creation of biorecognitive surfaces on the SPR biosensors. Therefore, MIPs can be considered as artificial recognition media. Molecular recognition-based adsorption techniques have received much attention in several fields because of their high selectivity for target molecules. 
Surface plasmon resonance (SPR) biosensors use a special mode of the metal-dielectric waveguide to measure changes in the refractive index due to the biomolecular interaction occurring at the surface of the SPR biosensor. SPR biosensors show the most advanced and mature label-free optical biosensor technology. Because of unique properties of SPR biosensors, such as real-time measurement, high specificity and sensitivity, no need to labeling, the applications of them have been getting more popular for investigation of several analyte molecules. 
The aim of the study, to prepare anti-CCP imprinted SPR based biosensors to diagnose anti-CCP antibodies. For this purpose, SPR biosensors were modified with allyl mercaptan, thus allyl groups are orientated. At first step, anti-CCP/AAm precomplex was synthesized by interacting acrylamid (AAm) monomer with template molecule anti-CCP. To define optimum template molecule and monomer ratio, anti-CCP and AAm mixed in different ratios and optimum ratio was determined by using UV-visible region spectrophotometry. Then, molecular imprinted (anti-CCP/PAAm) SPR biosensor was obtained by reacting anti-CCP with anti-CCP/AAm precomplex in presence of crosslinker methylene bisacrylamide (MBAAm). During imprinting process ammonium persulfate (APS) and N,N,N',N'-tetramethylenediamine (TEMED) were used as initiator and activator couple. Besides this, for control experiment, nonimprinted (PAAm) SPR biosensor was prepared without using anti-CCP template molecule. Prepared anti-CCP/PAAm and PAAm SPR biosensors were characterized with FTIR-ATR, atomic force microscope (AFM), ellipsometer and contact angle measurements. Thickness measurements and AFM images showed that anti-CCP molecules were almost imprinted as monolayer. While 10 mM pH 7.0 phosphate buffer was used for adsorption studies, desorption studies was carried out by using 1% Tween 20 and 10% acetic acid (HAc) containing solution. Selectivity of anti-CCP/PAAm and PAAm SPR biosensors for anti-CCP determination, were investigated by using immunoglobulin M (IgM) and bovine serum albumin (BSA) solutions (in pH 7.0 phosphate buffer) and diluted plasma samples. Anti-CCP/PAAm SPR biosensor showed higher selectivity than PAAm SPR biosensor for IgM and BSA. To determine the adsorption model of interaction between anti-CCP solution and anti-CCP/PAAm SPR biosensor, four different adsorption models such as Scatchard, Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich (LF) were performed. Langmuir adsorption model was found most applicable model for this affinity system and results showed that anti-CCP affinity regions on surface of anti-CCP/PAAm SPR biosensor were homogeneously distributed and hada monolayer structure. Results also showed that, anti-CCP/PAAm SPR biosensor had high selectivity and sensitivity for anti-CCP antibodies.