PNPLA1 geninde mutasyon saptanan konjenital iktiyoz vakalarında yağ damlacıklarının lipofaji aracılı regülasyonunun incelenmesi
Investigation of lipophagy mediated regulation of lipid droplets in autosomal recessive congenital ichthyosis patients with PNPLA1 gene mutations
Yazar: GİZEM ÖNAL
Danışman: PROF. DR. SERAP DÖKMECİ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Fibroblastlar = Fibroblasts ; Genler = Genes ; Malformasyonlar = Abnormalities ; Mutasyon = Mutation ; İktiyozis = Ichthyosis

Özet:
Patatin benzeri fosfolipaz domain içeren protein 1 (PNPLA1) gen mutasyonları Otozomal Resesif Konjenital İktiyoz (ORKİ) patolojisine neden olmaktadır. Hücrede yağ damlacıklarının üzerinde yerleşim gösteren PNPLA1 proteininin fosfolipit metabolizmasında rol oynadığı bilinmektedir. Proteinin mutant olması durumunda hücredeki yağ damlacığı regülasyonunun nasıl etkilendiğinin araştırılması hastalık patolojisine sebep olan yolakların aydınlatılması için katkı sağlayacaktır. Bu amaçla, tez kapsamında ilk aşamada PNPLA1 gen mutasyonu görülen hastaların ve kontrol bireylerin primer fibroblast kültürlerinde yağ damlacıkları birikimi karşılaştırıldı. Hasta fibroblast hücrelerinde yağ damlacıklarının anormal birikimi ve boyutlarında artış tespit edildi. Ek olarak, hasta fibroblast hücrelerinde PNPLA1 gen mutasyonlarının proteinin hücre içi yerleşimine etkisinin olmadığı ve proteinin hücrelerde ifade edildiği belirlendi. Yağ damlacıklarının lipofaji aracılı regülasyonunun araştırılması amacıyla ise, yağ damlacıklarının otofajik belirteçler (Atg5, LC3, LAMP1, Lysotracker® Red-DND-99) ile eş yerleşimi araştırıldı. Kontrol hücrelerinde yağ damlacıklarının otofajik belirteçlerle eş yerleşiminin belirlenmesi, yağ damlacıklarının bazal seviyede otofaji mekanizması ile yıkımını göstermektedir. Fizyolojik koşullarda, hasta fibroblast hücrelerinde ise yağ damlacıklarının otofajik belirteçler ile belirgin olarak eş yerleşimi saptanmadı. Elde edilen bulgular, PNPLA1 mutasyonlarının hücrede otofajik akışın otofagozom oluşumu aşamasında aksaklıklar meydana getirebileceğini düşündürmektedir. Sonuç olarak, hasta fibroblast hücrelerinde anormal yağ birikimi ve otofaji mekanizmasında aksaklıklar görülmesi, PNPLA1 proteininin yağ damlacıklarının regülasyonunda önemli rolü olduğunu göstermektedir. Bu proteinin ileri fonksiyon analizlerinin gerçekleştirilmesi hastalık patolojisine neden olan mekanizmaların aydınlatılabilmesine katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Patatin Like Phospholipase Domain Containing Protein-1 (PNPLA1) gene mutations are shown to be linked with Autosomal Recessive Congenital Ichthyoses (ARCI). PNPLA1 protein located on phospholipid membrane structure of lipid droplets plays crucial roles in biosynthesis and regulation of phospholipids. Investigating the effects of PNPLA1 gene mutations on the regulation of lipid droplets will help to enlighten the pathways that cause the pathology of this disease. For this purpose, in the scope of this thesis firstly the accumulation of lipid droplets were compared between the primer fibroblast cultures of patient and control individuals. According to the results, an abnormal increase in number and size of lipid droplets of patient fibroblast cells compared to control cells was detected. In addition, it was determined that PNPLA1 gene mutations have no effect on the cytoplasmic localization of the protein.  In order to investigate lipophagy mediated regulation, colocalization of lipid droplets with designated autophagic markers (Atg5, LC3, LAMP1, Lysotracker® Red-DND-99) was studied using fluorescence staining methods. Discovery of colocalization of lipid droplets with autophagic markers is an indicator of degradation of lipid droplets with autophagy at basal levels. However, there was no colocalization of lipid droplets with autophagic markers was detected for patient fibroblast cells. As a result, finding of abnormal lipid accumulations and defects in autophagy mechanisms of patients fibroblast cells is an indicator of crucial role that PNPLA1 protein playing in lipid droplet regulation.  Advanced functional analysis of this protein will definitely help us to shed light on the prevailing mechanisms of the pathology of this disease.