Staphylococcus epidermidis biyofilmlerine karşı antimikrobiyal aktivite gösteren bakteriyofajların izolasyon ve karakterizasyonu
Isolation and characterization of bacteriophages with antimicrobial activity against S. epidermidis biofilms
Yazar: ESRA NURTEN ÇECE
Danışman: PROF. DR. TÜLİN KUTSAL ; YRD. DOÇ. NUNO MİGUEL DİAS CERCA
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Staphylococcus epidermidis, kateter gibi tıbbi yüzeylere tutunabilme ve biyofilm oluşturma yeteneğine sahip, hastane enfeksiyonlarının dünya çapında en önemli etkenlerinden biri sayılan patojen bir bakteridir. Antibiyotik direnci birçok insan patojenine karşı ciddi bir problemdir. Antibiyotiklerin uzun süredir kullanımı ile birlikte, bu mikroorganizma, önemli direnç mekanizmaları geliştirmiştir. Biyofilmlerin antibiyotiklerle kontrolü çok etkili değildir. Yüksek hastalık ve ölüm oranına sebep olan S. epidermidis biyofilm tabakası ile kaplanmış, vücut içine implante edilebilen tıbbi cihazlar üzerinde oluşan biyofilmlerin kontrolü için acil alternatif antimikrobiyal çözüm geliştirilmesi gereklidir. Bu çözümler arasında gelecek vaad eden yeni bir yaklaşım ise bakterilere spesifik bakteriyofaj olarak bilinen virüs kulanımıdır. Patojenik bakterilerden oluşan enfeksiyonları kontrol etmek için, bilim adamları tarafından bakteriyofaj terapisi önerilmektedir. Bakteriyofajlar dünyadaki en çeşitli biyolojik yapılar olarak adlandırılır. Faj terapisi, implant, kateter gibi tıbbi malzemelerin üzerinde oluşan bakteri kaynaklı insan hastalıklarını en aza indirmek için antibiyotiklere sunulan yeni bir alternatiftir.Sunulan çalışma, Erasmus Programı kapsamında, Portekiz'de `` IBB-CEB: The Biofilm Group and The Phage Group'' Braga, Portekiz'de yürütülmüştür. Bu çalışmanın amacı, S. epidermidis türlerine karşı yeni bakteriyofajlar izole etmek ve S.epidermidis biyofilm aktivitesine karşı test etmektir. Ayrıca bu bakteriyofajlar, lytic aktivite ( hücre tahrip edici) spektrumu açısından da karakterize edilmiştir.Bakteriyofajlar, 41 bakteri suşu kullanılarak kirli atık sulardan izole edilmiştir. Sunulan çalışmada izole edilen 5 fajdan, konakçıya spesifik olanı seçilerek yalnız biri kullanılmıştır. Bakteriyofajların konsantrasyonunu arttırabilmek amacıyla birçok optimizasyon basamağı gerçekleştirilmiştir. Alınan en iyi sonuca göre izolasyon yapılmıştır. Buna göre Tris tamponu, % 0.4 yumuşak agar, CsCl2 ile saflaştırma ve 100.000 g' de, +4ºC` de 1 saat ultra santrifüj ile başarı sağlanmış ve 10E8-10E9 pfu/ml yoğunluğunda fajlar elde edilmiştir.Üretilen faj, litik spektrum yöntemi ile karakterize edilmiştir. Faj; üzerinde çalışılan 41 suştan 13'ünde pozitif olarak hücre yıkımını göstermiştir. Bu 13 suşun da 10 tanesinin biyofilm oluşturabilme yeteneği 96 mikro kuyucuklu tabaklarda % 1'lik glukoz içeren TSB (Tryptic soy broth) ile saptanmıştır. Çalışmanın son aşamasında ise bakteriyofajların litik aktivitelerini bu 10 bakteri suşuna ait biyofilmler üzerinden değerlendirmek üzere biyofilmlerdeki kütle azalması saptanmıştır.Çalışmanın gelecekte, DNA dizi analizi ile bu fajın litik veya lizojeni geçirmiş profaj (temperate faj) niteliği yönünden incelenmesiyle sürdürülmesi öngörülmektedir.Anahtar Kelimeler: S.epidermidis , Bakteriyofaj , Biyofilm , Faj Terapisi

Abstract:
Staphylococcus epidermidis is now among the most important nosocomial pathogenic agents owing its virulence to the adhesion and biofilm-forming abilities on medical surfaces, such as catheters. Biofilm control by antibiotics is often innefective and new strategies of biofilm control are being sought. One promising strategy is the use of bacteria-specific virus, known as bacteriophages, to control infections by pathogenic bacteria. Bacteriophages, also know as phages, have been suggested to be one of the most abundant biological agents on the planet. Phages are currently suggested as possible alternatives to antibiotics for the treatment of bacterial diseases in humans to minimize the pathogen loads in medical devices . The goal of this study was to isolate new phages with potential bactericidal activity against S. epidermidis clinical isolates.Bacteriophages were isolated from an effluent from Waste Water Treatment Plants or from Hospital efluents, using a set of 40 bacterial strains as background. Five phages were isolated but when determining the phage titer the achieved concentration was around 10E5 pfu/ml and this titer was reduced 1 fold in two week`s time.In order to increase the concentration of bacteriophages, since the obtained concentration was not sufficient to use in biofilm assays, severall optimization steps were performed, using previous described isolation protocols, namelly: using different concentrations of CaCl2, using different concentrations of top agar, using different buffers, and using different phage filtration systems.For the optimization protocols we selected the bacteriophage with the higher titters and found that an optimized protocol was achieved by using Tris Buffer, Top Agar at 0.4%, and purification with CsCl2 gradient with ultracentrifugation at 100,000g for 1 h at 4?C. This phage titter was determined to be around 10E8-10E9 pfu/ml.The optimized produced phage was then characterized by determining the lytic spectrum. The phage was able to lyse 13 strains, and of these strains 10 had the biofilms genes present. Finally, the 10 selected strains were tested for biofilm formation, using the microtiter assay, and it was confirmed that they formed biofilms in TSB supplemented with 1% glucose. At the final stage of this work, bacteriophage?s antimicrobial activity was tested against these selected 10 bacterial strain?s biofilm formations. The biomass reduction was evaluated and recorded.For future work; we need to determine if we have lytic or temperate phages with DNA sequence analyses and to test the Phage against to the Biofilm formation of relevant bacterial strains.Keywords : S. epidermidis; Bacteriophage ; Biofilms ; Phage Therapy