Türkiye'nin çeşitli bölgelerinde yetişen Hypericum türlerine özgü bileşikler açısından kimyasal içeriğinin LC-MS/MS ile miktar tayini ve metot validasyonu; biyolojik aktivitelerinin araştırılması ve kemometrik değerlendirilmesi
Screening of chemical content specific to Hypericum species growing in different parts of Turkey by LC-MS/MS and method validation; investigation of their biological activities and chemometric evaluation
Yazar: MEHMET AKDENİZ
Danışman: PROF. DR. FIRAT AYDIN ; DOÇ. DR. ABDULSELAM ERTAŞ
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Hypericum = Hypericum

Özet:
Bu çalışmada daha önce birçok parametresi çalışılmamış 50 farklı bölgeden toplanmış ve bir kısmı endemik olan 16 farklı Hypericum türünün (H. triquetrifolium, H. scabrum, H. ternatum, H. perforatum, H. retusum, H. empetrifolium subsp. empetrifolium, H. helianthemoides, H. linarioides, H. orientale, H. pruinatum, H. lysimachioides var. spathulatum, H. hyssopifolium var. elongatum, H. confertum subsp. confertum, H. armenum, H. pseudolaeve, H. lydium) yağ asidi, uçucu yağı, aroması, fenolik bileşenleri ile antioksidan, sitotoksik, antikolinesteraz, üreaz ve tirozinaz inhibisyon aktiviteleri çalışılarak 16 türün kimyasal ve biyolojik olarak taranmaları amaçlanmıştır. Bitkiler, tarihin eski çağlarından beri çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmışlardır. Zengin bitki örtüsüne sahip olan ülkemizde de hastaları tedavi etmek amacıyla kullanılan bitkiler, kimyasal ve biyolojik olarak incelenmektedir. Hypericum türleri, Clusiaceae (Guttiferae, Hypericaceae) familyasına ait bitkiler olup dünyada yaklaşık 500 türle temsil edilmektedir. Bu cinsin Türkiye'de 97 türü bulunmaktadır ve bunların 48'i endemiktir. Türkiye'de sarı kantaron, binbirdelik otu, koyunkıran ve kılıç otu adlarıyla bilinmektedirler. Hypericum türlerinden elde edilen özütler; depresyon tedavisinde, mide rahatsızlıklarında (gastrit, ülser), iştah açıcı, sarılıkta, haricen yaralarda iltihap kurutucu olarak (merhemi yapılarak veya zeytinyağında bekletilerek), pekmezde antioksidan katkı, ayak mantarında, diş eti iltihaplanmasında (gargara yaparak), balgam söktürücü, sinüzitte, bağırsak iltihabında, basurda, ateşli hastalıklarda ateş düşürücü ve kan yapıcı özellikleri ile geleneksel olarak birçok hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Hypericum türleri, çok sayıda biyoaktif bileşik içermektedirler. Bunların başlıcaları; naftodiantron grubu bileşikleri olarak bilinen hiperisin ve psödohiperisin, floroglusinol türevleri olarak bilinen hiperforin ve adhiperforin flavonoidler, ksantonlar ve prosiyanidin bileşikleridir. Hem kimyasal içerik hem de biyolojik aktivite bakımından Hypericum türlerinin çeşitli tıbbi özellik gösterdikleri görülmektedir. Literatürde hem dünyada hem de ülkemizdeki Hypericum türleri hakkında oldukça fazla çalışma mevcuttur. Fakat Literatürdeki çalışmalar bu kadar kapsamlı ve detaylı değildir.
Bu çalışmada, Türkiye'nin daha çok doğu bölgesinden toplanmış 16 farklı Hypericum türünün kök ve toprak üstü kısımlarının etanol ve petrol eteri ekstreleri hazırlanmıştır. Etanol ekstrelerinde, LC-MS/MS kullanılarak özellikle Hypericum türlerine özgü bileşiklerin kalitatif tayini yapılmış ve bu bileşenlerden hesperidin, protokateşik asit, klorojenik asit, luteolin-7-glikozit, hiperozit, rutin, apigetrin, kersitrin, astragalin, kersetin, luteolin, apigenin, hiperforin, psödohiperisin ve hiperisin gibi bileşiklerin LC-MS/MS ile nicel tayinleri için metot geliştirilmiş ve metodun validasyonu yapılmıştır. Petrol eteri ekstrelerinin yağ asidi bileşenleri nitel ve nicel olarak GC-MS ile belirlenmiştir. Bu türlerin aroma içerikleri Headspace-GC-MS/FID cihazı ile tespit edilmiştir. Bunun yanı sıra Clevenger aparatı kullanılarak hidrodistilasyon yöntemi ile elde edilen uçucu yağlar GC-MS ile çalışılarak aroma içeriği ile karşılaştırılmıştır. Kimyasal çalışmalara ilaveten, türlerin uçucu yağlarının sağlıklı fibroblast, kanserli meme (MCF-7) ve kanserli kolon (HT-29) hücre hatlarına karşı sitotoksik aktivitesi araştırılmıştır. Ayrıca tüm türlerin toprak altı ve toprak üstü etanol ekstreleri ile uçucu yağlarının antioksidan, antikolinesteraz aktiviteleri ile üreaz ve tirozinaz inhibisyon aktiviteleri de belirlenmiştir. Son olarak kimyasal çalışmaların sonuçları PCA, HCA gibi kemometrik teknikler ile irdelenmiştir.
Genel olarak GC-MS ile yapılan uçucu yağ analiz sonuçlarına bakıldığında çalışılan birçok örnekte α-pinen bileşiğinin major bileşen olması major olmasa bile önemli derecede bulunması dikkat çekicidir. Ayrıca çalışılan tüm türlerin monoterpen bakımından zengin olduğu tespit edilmiştir. Çalışılan Hypericum türlerinde α-pinen, trans-β-osimen, karyofilen, humulen, germakren D, β-selinen, karyofilen oksit ve α-kadinol monoterpenleri ön plana çıkmaktadır. LC-MS/MS sonuçlarına bakıldığında ise genel olarak çalışılan tüm türlerin çalışılan tüm bileşikleri belli bir oranda içerdiği ve bazı bileşenler içinde kaynak tür olabileceği söylenebilir. Özelllikle Hypericum türlerinin oldukça yüksek oranlarda hiperozit, kersitrin, rutin ve klorojenik asit içerdiği görülmüştür. Hypericum türlerinin CUPRAC, DPPH serbest radikali giderim aktivitesi ve ABTS katyon radikali giderim aktivitesi yöntemlerinde yüksek bir antioksidan potansiyelinin olduğu söylenebilir. Ayrıca özellikle Hypericum türlerine ait uçucu yağ örneklerinin yüksek bir antikolinesteraz enzim aktivitesi potansiyeline sahip olduğu görülmektedir. H. scabrum, H. retusum ve H. linarioides türlerinin uçucu yağ örneklerinin antitirozinaz enzim aktivitesinin oldukça yüksek olduğu tespit edilmiştir. Buna ilaveten H. lydium türünden elde edilen uçucu yağın canlı hücre üzerinde düşük toksik etki göstermesi ve MCF-7 ile HT-29 hücre serileri üzerinde ise yüksek sitotoksik etki göstermesi dikkat çekicidir.

Abstract:
In this study, chemical and biological screening of 16 Hypericum species (H. triquetrifolium, H. scabrum, H. ternatum, H. perforatum, H. retusum, H. empetrifolium subsp. empetrifolium, H. helianthemoides, H. linarioides, H. orientale, H. pruinatum, H. lysimachioides var. spathulatum, H. hyssopifolium var. elongatum, H. confertum subsp. confertum, H. armenum, H. pseudolaeve, H. lydium) collected from 50 different sites were studied. Some of the studied Hypericum species were endemic and most of their parameters were not studied before. Within this context, their fatty acid, essential oil, aromatic and phenolic contents, antioxidant, cytotoxic, anticholinesterase, urease and tyrosinase inhibitory activities were investigated. Plants have been used in the treatment of various diseases since ancient times. In our country, which has a rich flora, plants used to treat various diseases are being studied chemically and biologically. Hypericum species belong to the family Clusiaceae (Guttiferae, Hypericaceae) and are represented by about 500 species in the world. In Turkey there are 97 species of this genus and 48 of them are endemic. Extracts from Hypericum species is commonly used in the treatment of many diseases in folk medicine; depression, stomach disorders (gastritis, ulcers), as an appetizer, jaundice, (as an antiseptic), external injuries as an inflammatory desiccant (with ointment or in olive oil), as an antioxidant additive in molasses, athlete's foot, gingivitis (by mouthwash), as an expectorant, sinusitis, intestinal inflammation, hemorrhagic fever, as fever-reducing. Hypericum species contain a large number of bioactive compounds. The main ones are; hypericin and pseudohypericin, known as the naftodiantron group compounds, hyperforine and adhyperforine flavonoids known as fluoroglucinol derivatives, xanthones and procyanidin compounds. Hypericum species exhibit various medicinal properties, both in terms of chemical content and biological activity. There are a lot of studies in literature about Hypericum species both in the world and in our country. However, the studies in the literature are not so comprehensive and detailed.
In this study, ethanol and petroleum ether extracts of root and aerial parts of 16 Hypericum species mostly collected from Eastern Turkey were prepared. Qualitative and quantitative determination of compounds specific to Hypericum species in their ethanol extracts such as hesperidin, protocatechuic acid, chlorogenic acid, luteolin-7-glycoside, hyperoside, rutin, apigetrin, quercitrin, astragalin, quercetin, luteolin, , pseudohypercine and hyericine were determined by LC-MS/MS was performed and the developed method was validated. Fatty acid composition of petroleum ether extracts were qualitatively and quantitatively determined by GC-MS. The aroma contents of these species were determined by Headspace-GC-MS/FID system. In addition, volatile oils obtained by hydrodistillation using Clevenger aparatus were analyzed by GC-MS and compared with the aroma content. In addition to chemical studies, the cytotoxic activities of essential oils of the studied species against healthy fibroblast, cancerous breast (MCF-7) and cancerous colon (HT-29) cell lines have been investigated. Besides, the antioxidant, anticholinesterase activities and urease and tyrosinase inhibitory activities of essential oils and ethanol extracts of aerial and root parts of all species were investigated. Finally, the results of chemical studies were analyzed by chemometric techniques such as PCA and HCA.
In general, when looking at the results of volatile oil analysis performed by GC-MS, it is noteworthy that in many of the samples studied, the α-pinene compound was found to be the major component, even if not major, at a significant level. It was also found that all the species studied were rich in monoterpenes. Trans-β-ocimene, α-pinene, caryophyllene, humulene, germacrene D, β-selinene, caryophyllene oxide and α-cadinol monoterpenes were predominant in Hypericum species. When we look at the results of LC-MS/MS, it can be said that in general, all species studied contain all the compounds studied and that they may be the source species for some components. Specifically, it was observed that Hypericum species contained high amounts of hyperoside, quercitrin, rutin and chlorogenic acid. It can be noted that, Hypericum species have high antioxidant potential in CUPRAC, DPPH free radical scavenging activity and ABTS cation radical scavenging activity. Furthermore, volatile oil samples of Hypericum species seem to have high anticholinesterase enzyme activity potential. It was also determined that antitryrosinase enzyme activities of essential oil samples of H. scabrum, H. retusum and H. linarioides species were quite high. Additionally, it is noteworthy that the volatile oil obtained from H. lydium showed low toxicity on living cells and high cytotoxic effect on MCF-7 and HT-29 cell lines.