Cinsiyet gelişim bozuklukları ile ilişkili genlerin yeni nesil dizileme tekniği ile araştırılması
Evaluation of disorders of sexual development associated genes by next generation sequencing technology
Yazar: AGHARZA AGHAYEV
Danışman: PROF. DR. ZEHRA OYA UYGUNER ; DR. GÜVEN TOKSOY
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases ; Genetik = Genetics ; Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Cinsiyet = Gender ; Cinsiyet gelişim bozuklukları = Disorders of sex development ; Cinsiyet kromozom anomalileri = Sex chromosome abnormalities ; DNA = DNA ; Dizi analizi-DNA = Sequence analysis-DNA ; Genler = Genes ; Konjenital anomaliler = Congenital abnormalities ; Kromozom düzensizlikleri = Chromosome aberrations ; Kromozomlar = Chromosomes

Özet:
Cinsiyet gelişim bozuklukları (CGB) tek gen veya kromozom anomalilerine bağlı olarak gonadal ve anatomik cinsiyetin uyumsuz olarak geliştiği konjenital durumları tanımlamakta olup, hafif hipospadiastan gonad gelişim anomalilerine bağlı tam cinsiyet dönüşümüne kadar geniş spektrumda gözlenir ve insidansı 1/5500'dir. CGB gonadal gelişim bozukluğunda, androjen sentezi veya etkisindeki kusurlardan, çevresel faktörlerin de içinde yer aldığı birçok etmenin rolü olduğu bildirilmektedir. CGB'ler yenidoğanın acil sorunları arasında olup, erken tanı, yaşam kalitesi, ruhsal durum ve genetik danışma açısından önem taşımaktadır. Kuşkulu dış genital yapı ile doğan bebeklerde cinsel kimliğin belirlenmesinde dış genital görünümün yanı sıra kromozomal cinsiyet, gonadların over veya testis yönünde farklılaşmış olması, iç genital yapı ve hormonların etkisinin araştırılması önemlidir. CGB'nin klinik ve genetik heterojenliği, kesin tanı için sorumlu genlerin eş zamanlı ve kısa sürede dizilenmesini, delesyon/duplikasyon analizlerinin yapılmasını gerektirmektedir. Bu çalışmada, klinik tanısında CGB düşünülen, kromozomal cinsiyeti belirlenmiş ve kromozom anomalileri dışlanmış, MLPA analizinde herhangi bir delesyon/duplikasyon saptanmamış 44 olguda, ilişkili 31 genin tüm kodlayan ekzon, ekzon-intron sınır bölgelerini kapsayan, ekibimizce tasarlanmış panel-gen testi ile Ion Torrent platformunda yapılan incelemeden elde edilen varyantlar değerlendirildi. Klinik önemi belirlenen değişimler özgün primerler tasarlanarak Sanger dizi ile doğrulandı, olanaklı olan ailelerde segregasyon analiz sonuçları irdelendi, herhangi bir mutasyon/varyant ilişkisi saptanmayanlarda panelin tasarım gereği kapsam dışı bıraktığı bölgeler Sanger dizileme ile incelendi. 17 olguda 8 farklı gende (HSD17B3, DHH, NR5A1, LHCGR, WT1, POR, ZFPM2 ve HOXA4) altısı daha önce tanımlanmış ve 13'ü literatürde bildirilmemiş olası ilişkili varyantlar saptandı ve tanı oranı % 38,6 olarak belirlendi. Ayrıca serimizdeki tüm örneklerde, YND platformunda biyoinformatik istatistiksel hesaplamaya dayalı kopya sayı varyant (KSV) analiz program kullanılarak büyük delesyon ve duplikasyonlar dışlandı. Kodlayan bölgede yeni mutasyon saptanan bir örnek için üç boyutlu modelleme ile protein yapısında oluşturması beklenen yapısal farklılıklar simülasyon programları yardımıyla incelendi. Bildiğimiz kadarıyla ülkemiz için ilk tasarlanmış panel uygulaması olan çalışmamız sonuçlarının, toplumumuzda CGB ilişkili genlerin ve mutasyon frekanslarının saptanmasına, gonadal tümörler açısından erken dönemden itibaren takip olanağının sağlanmasına, taşıyıcı bireylerin belirlenerek aile planlamasına yardımcı olmasına katkı sağlaması beklendi.

Abstract:
Disorders of sexual development (DSD) are defined as congenital conditions covering a wide spectrum of clinical expressions from mild hypospadias to gonad abnormalities causing complete sex reversal. The incidence of DSD is one in approximately 5,500 births. It occurs when the development of the chromosomal and anatomical sex is incompatible with the assigned gender. This can be the result of a single gene mutation or chromosomal abnormality, gonadal development anomalies or defects occurring within androgen biosynthesis. Environmental factors are also known to be among the causative components of DSD.Early diagnosis is vital as it will impact the individual's mental well-being and overall life quality, including the advisability for genetic counseling. In the gender assignment of newborns with ambiguous genitalia, it is important to consider the effect of hormones, chromosomal sex, and the presence of testis or ovary, the phase of external genitalia along with the rearing of the child. The clinical and genetic heterogeneity of DSD requires rapid, accurate parallel sequencing, as well as copy number changes of associated genes to determine its proper diagnosis. In this study, we evaluated the results of 44 DSD cases for gross deletion/duplication with MLPA and for sequence alteration with in-house-designed next generation sequencing (NGS) targeted gene panel, using an Ion Torrent platform, covering all exon and exon-intron boundaries of 31 DSD associated genes. Chromosomal sex in each of the cases was previously revealed and structural chromosomal abnormalities excluded before the admission of molecular genetic analysis. Screening of targeted regions that were missed by AmliSeq primer design is covered by Sanger sequencing. Segregation analysis was performed only for consented family members for novel missense alterations suspected to be causative. According to our results, six previously described and 13 possible DSD associated rare variants not associated with this phenotype, was identified in eight different genes (HSD17B3, DHH, NR5A1, LHCGR, WT1, POR, ZFPM2 and HOXA4), within a total of 17 cases, a diagnostic rate of 38.6 percent. Gross deletions and duplications were excluded in all samples in our cohort using the bioinformatic statistical calculation for copy number variant (CNV) in Ion Reporter copy number analysis program. The structural alteration in one novel coding region was simulated in three dimensional in silico protein modeling program. Our technical approach, which a literature search shows to be the first of its kind conducted in Turkey, provides new research data for DSD mutation frequencies occurring in the country. It further underscores the critical role of early diagnosis, and in cases of gonadal tumors, expedient treatment. Individuals identified as DSD carriers are advised to receive genetic counseling for family planning.