Tam genom dizilemesi ile çoklu-ilaç dirençli Acinetobacter baumannii suşunun direnç ve virülans mekanizmalarının araştırılması
Investigation of resistance and virulence mechanisms of multidrug resistant Acinetobacter baumannii strain by whole genome sequencing
Yazar: MÜBERRA ÇİMEN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AZER ÖZAD DÜZGÜN
Gümüşhane Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Acinetobacter baumannii çoklu- ilaç dirençli fırsatçı hastane patojenlerinden biridir, hastane enfeksiyonlarının ana nedenidir ve çok çeşitli antibakteriyel maddelere karşı dirençli olması nedeniyle dünya çapında endişe oluşturmaktadır. Bu çalışmanın amacı, çoklu ilaca dirençli (ÇİD) Acinetobacter baumannii'nin sergilediği antimikrobiyal direnç ve virülans faktör genlerini belirlemek, biyofilm oluşumunu analiz etmek ve izolatın klonal alt tiplerini araştırmaktır. Bu çalışmada, Trabzon Fatih Devlet Hastanesi'nden A. baumannii suşu izole edilerek
VITEK 2 Kompakt sistemi ile izolatın antibakteriyel duyarlılıkları tespit edildi. İzolatta βlaktamaz kodlayan genler ve sınıf 1 integronların varlığı PZR yöntemiyle araştırıldı. PZR sonucu pozitif örnek (blaOXA-23) pGEM-T easy vektörüne klonlanarak baz dizin analizine gönderildi ve sonuçlar biyoinformatik programlar kullanılarak analiz edildi. Tam genom dizilimi Illumina NovaSeq 6000 platformu ile yapıldı ve MLST analizi Oxford ve Pasteur tipleme şemaları kullanılarak değerlendirildi. VFDB database programı kullanılarak A. baumannii A73 suşunda var olan tüm virülans faktör genleri tanımlandı. İmipenem ve levofloksasin MİK değerleri sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle tespit edildi. Biyofilm oluşumu ve biyofilm oluşumunun indüklenmesi imipenem ve levofloksasin (1/2, 1/4, 1/8*MİK) konsantrasyonlarında 96 kuyucuklu plakalarda 3 tekrarlı olarak gerçekleştirildi. İzolatın hareket etme yeteneği petri kabında üç tekrarlı olarak yapılıp, %0,2 kristal viyole ile görselleştirildi. Suşun antibiyotik duyarlılık testine göre; karbapenemlere, penisilinlere, aminoglikozidlere ve florokinolonlara karşı direnç göstermesiyle çoklu -ilaç dirençli (ÇİD) olarak tanımlandı. Tam genom dizileme sonucuna göre izolatın blaOXA-23, blaOXA-51, blaampC ve blaTEM beta- laktamaz genlerini taşıdığı belirlendi. blaOXA-51 benzeri genin dizisi biyoinformatik programlar ile değerlendirilerek, blaOXA-66 olduğu tespit edildi. Pasteur MLST şemasına göre suş, ST2 alelik profilini gösterdi. Oxford MLST şemasında kullanılan genlerden olan gdhB de bir nükleotit değişimi tespit edildi (G189A) ve gdhB-227 olarak adlandırıldı. Oluşan yeni varyant ve diğer MLST Oxford şeması genleri kullanılarak MLST analizi yapıldığında yeni ST klonu belirlendi. Oluşan yeni klon ST2121 olarak adlandırıldı. Ayrıca gyrA geninde bir amino asit değişikliği (Met638Leu) tespit edildi. Çoklu ilaca dirençli izolatın bap, basABCDFGHIJ, suA/BABCDE, bauABCDEF, plcD, pgaABCD, entE, barAB, ompA, abaIR, piT2EAFTE/AUBl, fimADT, cvaC, bfmR, bfmS virülans faktör genleri taşıdığı belirlendi. Çalışmamızda en yüksek biyofilm oluşumunu 32 µg/mL konsantrasyonda imipenem ve 16 µg/mL konsantrasyonda levofloksasin oluşturduğu gözlemlendi. Sonuç olarak, A. baumannii'de çoklu ilaç direncinin nedeni araştırıldı. Yeni bir STOxf, ST2121 klonu tespit edildi. Bu çalışma ile blaOXA-66 genini barındıran
ST2Pas/ST2121 suşu Türkiye'de ilk kez A. baumannii'de bildirilmiştir

Abstract:
Acinetobacter baumannii is one of the multi-drug resistant (MDR) opportunistic nosocomial pathogens, ıt is the main cause of nosocomial infections and is of worldwide concern due to its resistance to a wide variety of antibacterial agents. The aim of this study was to identify antimicrobial resistance and virulence factor
genes exhibited by multidrug resistant Acinetobacter baumannii, to analyze biofilm formation and to investigate clonal subtypes of isolate. In this study, A. baumannii strain was isolated from Trabzon Fatih State Hospital and
antibacterial susceptibility of the isolate was determined with VITEK 2 Compact system. The presence of β-lactamase encoding genes and class 1 integrons in the isolate was investigated by PCR method. The sample with positive PCR result (blaOXA-23) was cloned into pGEM-T easy vector and sent for base sequence analysis and the results were analyzed using bioinformatics programs. Whole genome sequencing was performed with the Illumina NovaSeq 6000 platform and MLST analysis was evaluated using the Oxford and Pasteur typing schemes. All
virulence factor genes in A. baumannii A73 strain were identified using the VFDB database program. Imipenem and levofloxacin MIC values were determined by liquid microdilution method. Biofilm formation and induction of biofilm formation were performed at imipenem and levofloxacin (1/2, 1/4, 1/8*MIC) concentrations in 96-well plates in triplicate. The ability of the isolate to move was performed in petri dishes in triplicate and visualized with 0.2% crystal violet. According to the antibiotic susceptibility test of the strain; It was defined as multidrug resistant (MDR) with resistance to carbapenems, penicillins, aminoglycosides, and fluoroquinolones. According to the results of whole genome sequencing, it was determined that the isolate carried blaOXA-23, blaOXA-51, blaampC and blaTEM beta-lactamase genes. The sequence of the blaOXA-51-like gene was evaluated with bioinformatics programs, and it was determined to be blaOXA-66. According to the Pasteur MLST scheme, the strain showed the ST2 allelic profile. A nucleotide change was detected in gdhB, one of the genes used in the Oxford MLST scheme (G189A) and named gdhB-227. When MLST analysis was performed using the newly formed variant and other MLST Oxford scheme genes, the new ST clone was determined. The resulting new clone was named ST2121. An amino acid change (Met638Leu) was also detected in the gyrA gene. It was determined that multi-drug resistant isolate carried bap, basABCDFGHIJ,
csuA/BABCDE, bauABCDEF, plcD, pgaABCD, entE, barAB, ompA, abaIR, piT2EAFTE/AUBl, fimADT, cvaC, bfmR, bfmS virulence factor genes. In our study imipenem induced the highest biofilm formation at a concentration of 32 µg/mL and levofloxacin at a concentration of 16 µg/mL. In conclusion, the cause of multidrug resistance in A. baumannii was investigated. A new clone of STOxf, ST2121 has been detected. In this study, the ST2Pas/ST2121 strain
harboring the blaOXA-66 gene was reported for the first time in A. baumannii in Turkey.