Glukoz-6-fosfat dehidrogenazın koyun beyninden saflaştırılması ve bazı özelliklerinin saptanması
Purification and characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase from sheep brain.
Yazar: CİHANGİR ŞENGEZER
Danışman: PROF. DR. NURİYE NURAY ULUSU
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Glükozfosfat dehidrogenaz = Glucosephosphate dehydrogenases ; Kinetik = Kinetics

Özet:
Koyun beyin korteksi glukoz-6-fosfat dehidrogenazı (D-glukoz-6-fosfat: NADP+ oksidoredüktaz, E.C. 1. 1. 1. 49) 2', 5'-ADP Sepharose 4B afinite ve DEAE Sepharose Fast Flow iyon değiştirici kromatografisi kullanılarak % 68.33 verimle 9439.61 kez saflaştırıldı. Enzimin molekül ağırlığı, Sephadex G-200 jel elemesi yöntemiyle 64.5 kDa olarak saptandı. SDS poliakrilamid slab jel elektroforezi yöntemi kullanıldığında 61.2 kDa'lık bir tek band elde edildi. Arrhenius eşitliğinden, enzimin aktivasyon entalpisi (?H) 6.026 kcal/mol, aktivasyon enerjisi (Ea) 6.689 kcal/mol, sıcaklık artma faktörü Q10 ise 1.442 olarak saptandı. Enzimin değişik pH'larda hızları ölçüldüğünde pH 8.0'de maksimum aktivite gösterdiği bulundu. Enzimin kinetik mekanizmasının ?Ordered Bi Bi?ye uyduğu belirlenerek, KmNADP+ ve KmG6P sırasıyla 0.0128 ± 0.001 mM, 0.11978 ± 0.010 mM olarak saptandı. Enzimi, NADPH'nin NADP+ ile kompetetif tipte, G6P ile kompetetif tipte; 6-PGA'nin de NADP+ ile nonkompetetif tipte, G6P ile kompetetif olarak inhibe ettiği ve Ki'lerinin sırasıyla 0.024 ± 0.008 mM, 0.042 ± 0.002 mM ve 1.96 ± 0.001 mM, 3.579 ± 0.024 mM olduğu saptandı. Ayrıca, koyun beyin korteksi glukoz-6-fosfat dehidrogenazının Cd+2, Hg+2, Pb gibi ağır metal iyonlarından ve Zn+2, Cu+2, Ni+2 gibi metal iyonlarından nasıl etkilendiği araştırıldı. Son olarak, Rosmarinik Asit, İmatinib ve Kolşisin gibi ilaç etken maddelerinin enzimi nasıl etkilediği de araştırıldı.

Abstract:
Glucose-6-phosphate dehydrogenase (E.C. 1. 1. 1. 49., D-glucose-6-phosphate: NADP+ oxidoreductase) was purified from sheep brain cortex, using 2?, 5?-ADP Sepharose 4B affinity and DEAE Sepharose Fast Flow ion-exchange chromatography with an overall yield 68.33 % and about 9439.61 fold. The molecular weight of the enzyme was found to be 64.5 kDa by Sephadex G-200 gel filtration chromatography. The purified enzyme gave a single band on SDS polyacrylamide slab gel electrophoresis which corresponded to a molecular weight of 61.2 kDa. From Arrhenius plot; Ea, ?H and Q10 were found to be 6.689 kcal/mole, 6.026 kcal/mole and 1.442, respectively. The enzyme was assayed at different pH and found to be the most active at pH 8.0. The enzyme displayed ?Ordered Bi Bi? mechanism; KmNADP+ and KmG6P were found to be 0.0128 ± 0.001 mM, 0.120 ± 0.010 mM, respectively. The inhibition of G6PD by NADPH was found to be competitive with respect to NADP+, competitive with respect to G6P whereas 6-PGA inhibition with respect to NADP+ was noncompetitive, competitive with respect to G6P and Ki values for NADPH and 6-PGA were 0.024 ± 0.008 mM, 0.042 ± 0.002 mM and 1.96 ± 0.001 mM, 3.579 ± 0.024 mM, respectively. In addition, effects of heavy metal ions as Cd+2, Hg+2, Pb and effects of metal ions Zn+2, Cu+2, Ni+2 on sheep brain cortex glucose-6-phosphate dehydrogenase activity were investigated. Finally, effects of some active ingredients in drugs like Rosmarinic Acid, Imatinib and Colchicine on purified enzyme activity were investigated also.