Faj reseptör bağlayıcı proteinin rekombinant eldesi ve hedefli terapötik nanopartikül tasarımı
Recombinant production of phage receptor binding protein and design of targeted therapeutic nanoparticles
Yazar: SENANUR DOKUZ
Danışman: DOÇ. DR. TÜLİN ÖZBEK ; PROF. DR. SERAP DERMAN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotik dirençliliği =   ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Reseptörler = Receptors ; Rifampisin = Rifampicin ; Terapötik yöntemler = Therapeutics

Özet:
Staphylococcus aureus, salgıladığı birçok toksin ve virülans faktörü ile fırsatçı bir patojen özelliği göstererek konukçusunu istila eder. İmmün sistemden kaçarak pnömoni, deride enfeksiyon, impertigo, toksik şok sendromu gibi çeşitli hastalıklara sebep olabilen S.aureus, uzun yıllar antibiyotiklerle tedavi edilmiştir. Ancak yoğun ve bilinçsiz antibiyotik kullanımınıyla gelişen dirençli S.aureus suşları günümüzde nozokomiyal enfeksiyonların en önemli nedenlerindendir. Bakterileri özgül bir şekilde tanıyarak enfekte eden bakteriyofajların terapötik kullanımı, antibiyotik direnciyle mücadele için çeşitli stratejilerin bir parçası olmaya uygundur. Bakteriyofajların bakterileri enfekte etmesi, fajların reseptör bağlayıcı proteinleri (RBP) ile konakçı bakteriler üzerindeki reseptörüne spesifik ve geri döndürülemez şekilde bağlanması ile başlar. Reseptör bağlayıcı proteinlerin bakteriyi tanımadaki bu özgüllüğü, hedeflendirilmiş nanopartikül temelli ilaç taşıma sistemlerinde kullanılabilirliğinin anahtarı olmuştur. Nanotaşıyıcılar, özellikle hedeflenebilir oluşlarıyla içerdikleri etkin maddenin etki bölgesine ulaşan konsantrasyonunu arttırarak tedavide gerekli dozajı düşürme, hedefleri dışındaki bölgelere etkin madde maruziyetini azaltarak yan etkileri indirgeme, biyobozunur ve biyouyumlu oluşu ile güvenli kullanımı, kontrollü ve sürekli salım yapabilme, etkin madde çözünürlüğünü iyileştirme gibi avantajlara sahiptirler. 
Sunulan tez çalışmasında konakçısı S. aureus olan fajın reseptör bağlayıcı proteini rekombinant DNA teknolojisi tekniklerinden faydalanılarak eksprese edilmiş, western blot tekniği ile protein üretimi doğrulanmış ve beklenildiği üzere 53 kDa boyutunda protein tespit edilmiştir. S. aureus-rRBP etkileşimi ELISA yönteminde 450 nm'de alınan absorbans değerlerlerinin bakteri ve protein konsatrasyonları arttıkça anlamlı bir şekilde artışı ile ve mikroskobik analizlerde floresan işaretli proteinin S. aureus yüzeyindeki görüntüsü ile kanıtlanmıştır. Devamında, rifampisin antibiyotiği yüklü PLGA nanopartikülün sentezi ve karakterizasyonu çalışmaları yapılarak sentezlenen yaklaşık 250 nm, zeta potansiyeli -30 mV ve PDI değeri 0.3 olan nanopartiküllerin yüzeyine rRBP'nin konjugasyonu gerçekleştirilmiştir. Konjugasyon sonrası üretilen nanopartiküllerin boyutlarının 300 nm'ye yükseldiği, zeta potansiyellerinin -10 mV ve PDI değerlerinin 0.5 olduğu tespit edilmiştir. Enkapsülasyon etkinliği %35 ve ilaç yükleme kapasiteleri %26 değerlerinde olan nanopartiküllerin konjugasyon sonrası FT-IR incelemeleri sonucunda 1650 ve 1550 cm-1 bölgelerinde var olan ana amid bantlarına sahip oluşları ile proteinin nanopartikül yüzeyine dekorasyonu gösterilmiştir.  Salım profilleri belirlenen ve antimikrobiyal etkinlikleri incelenen nanopartiküllerin S. aureus suşlarına karşı MİK değerlerinin serbest rifampisin ile kıyaslandığında daha düşük olduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
Staphylococcus aureus invades its host by showing an opportunistic pathogen feature with many toxins and virulence factors it secretes. S.aureus, which can escape from the immune system and cause various diseases such as pneumonia, skin infection, impertigo, toxic shock syndrome, has been treated with antibiotics for many years. However, resistant S.aureus strains, which developed with the excessive and unconscious use of antibiotics, are one of the most important causes of nosocomial infections today. The therapeutic usage of bacteriophages that specifically recognize and infect bacteria is appropriate to be part of a variety of strategies to fray antibiotic resistance. Infection of bacteriophages to bacteria begins with the specific and irreversible binding of phages with their receptor binding proteins (RBP) to their receptor on host bacteria. This specificity of receptor-binding proteins in recognizing bacteria has been key to their usability in targeted nanoparticle-based drug delivery systems. Nanocarriers have advantages such as being particularly targetable, decreasing the required dosage in the treatment by increasing the concentration of the active substance they contain, reaching the effect area, reducing the exposure of the active substance to the non-target sites, being biodegradable and biocompatible, being able to make controlled and continuous release, and improving the solubility of the active substance. In the presented thesis, the receptor binding protein of the phage, whose host is S. aureus, was expressed using recombinant DNA technology techniques, protein production was confirmed by western blot technique, and 53 kDa protein was detected as expected. The interaction of S. aureus-rRBP was proven by the ELISA method, with the increase in absorbance values at 450 nm as the bacterial and protein concentrations increased, and the appearance of the fluorescent labeled protein on the surface of S. aureus in microscopic analyzes. Afterwards, rRBP conjugation was carried out on the surface of the synthesized nanoparticles with a zeta potential of -30 mV and a PDI value of 0.3 by performing synthesis and characterization studies of PLGA nanoparticle loaded with rifampicin antibiotic. It was determined that the sizes of nanoparticles produced after conjugation increased to 300 nm, their zeta potential was -10 mV and PDI values were 0.5. As a result of post-conjugation FT-IR examinations of nanoparticles with encapsulation efficiency of 35% and drug loading capacity of 26%, the presence of main amide bands in the 1650 and 1550 cm-1 regions and the decoration of the protein on the nanoparticle surface were shown. It was determined that the MIC values of the nanoparticles, whose release profiles were determined and whose antimicrobial activities were examined, were lower than the free rifampicin against S. aureus strains.