Kompozit ve non-kompozit manyetik partiküllerin hazırlanması ve taşıyıcı olarak kullanıldıkları immobilize enzim sistemlerine uygulanması
Preparation of composite and non-composite magnetic particles and application for immobilized enzyme systems as carriers
Yazar: YASEMİN İSPİRLİ DOĞAÇ
Danışman: DOÇ. MUSTAFA TEKE
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry

Özet:
Enzim immobilizasyonu, endüstriyel ve klinik açıdan oldukça geniş uygulama alanına sahiptir. Serbest enzimlerle kıyaslandığında, immobilize enzimler, operasyon kontrolü, kararlılık ve tekrar kullanılabilirlik gibi birçok avantaj sunarlar. İmmobilizasyondan sonra enzimin kazandığı kararlılık, enzimin üç boyutlu yapısına, kullanılan immobilizasyon tekniğine, kullanılan taşıyıcı tipine göre değişebilmektedir. 
Sunulan bu çalışma dört bölümden oluşmaktadır. Birincisi, non-kompozit manyetik taşıyıcıların (IM ve INM) sentezlenmesi, bunların üreaz immobilizasyonu için kullanılması, immobilizasyon koşullarının optimizasyonu ve karakterizasyonudur. İkincisi, doğal polimer içerikli kompozit manyetik taşıyıcıların (AIM, AINM, CIM, CINM, ACIM ve ACINM) sentezlenmesi, bunların üreaz immobilizasyonu için kullanılması, immobilizasyon koşullarının optimizasyonu ve karakterizasyonudur. Üçüncüsü, sentetik polimer içerikli kompozit manyetik taşıyıcıların (PIM ve PINM) sentezlenmesi, bunların üreaz immobilizasyonu için kullanılması, immobilizasyon koşullarının optimizasyonu ve karakterizasyonudur. Son bölüm ise, üreaz immobilize sistemlerin uygulamasıdır.
Bu amaçla, 10 farklı manyetik özellikli taşıyıcı (IM, INM, AIM, AINM, CIM, CINM, ACIM, ACINM, PIM ve PINM) sentezlenip, tümüne üreaz immobilizasyonu uygulandı. İmmobilize üreaz sistemlerinin optimizasyonu için manyetik partikül miktarı, adsorpsiyon süresi, enzim miktarı, çapraz bağlayıcı derişimi, immobilizasyon pH'ı, kullanılan taşıyıcı miktarı temel parametreler olarak araştırıldı. 
Optimum koşullarda hazırlanan immobilize üreaz sistemlerinin karakterizasyonu için.ise; optimum sıcaklık, optimum pH, termal kararlılık, pH kararlılığı, operasyonel kararlılık, tekrar kullanılabilirlik ve depo kararlılığı parametreleri incelendi. İmmobilize üreaz sistemlerinin kinetik parametrelerinin belirlenmesi için Lineweaver-Burk diyagramları kullanıldı. Ayrıca gerekli sistemler için FTIR, TEM ve SEM analizleri yapıldı. Son olarak, en iyi aktivite ve kararlılığa sahip olan üreaz immobilize AIM boncukların geri döngülü kolon sistemiyle yapay serum örneğinden üre giderim performansının araştırıldı.
Aktivite açısından değerlendirildiğinde, hazırlanan 8 farklı manyetik üreaz immobilize sistemi serbest üreazla kıyaslandığında, %85 ve üzeri performans gösterdi. En iyi aktivite performansını, %98 %aktivite değeri AIM ve AINM'de görüldü. Diğer 2 immobilize sistem ise (PIM ve PINM) yaklaşık %60 %aktivite değerine ulaştı. Serbest üreazın Km ve Vm değerleri sırasıyla 0.071 mM ve 1.22 U/mg protein olarak hesaplandı. Buna göre en iyi kinetik parametrelere sahip sistemlerimiz, IM (0.101 mM ve 0.907 U/mg protein), AIM (0.103 mM ve 1.117 U/mg protein) ve AINM (0.101 mM ve 1.121 U/mg protein) oldu. 
Tüm immobilize üreaz sistemleri, 20-70°C aralığında termal kararlılıklarını, pH 4-9 aralığında ise pH kararlılıklarını geliştirdi. Yarılanma ömürlerine bakılarak değerlendirildiğinde, operasyonel kararlılık açısından en iyi sistemler, IM, AIM, AINM ve CINM oldu.Hazırlanan tüm üreaz immobilize sistemler, literatür verileri ile kıyaslandığında oldukça iyi tekrar kullanılabilirlik değerlerine ulaştı. En yüksek tekrar kullanım sayısı, AIM (28 tekrar), AINM (27 tekrar) ve IM (25 tekrar) sistemlerinde gerçekleşti. PIM ve PINM taşıyıcılarının kullanıldığı sistemler hariç olmak üzere, diğer 8 sistemin, en az 14 hafta depolanabilirlik özelliğine sahip olduğu belirlendi

Abstract:
Enzyme immobilization has fairly large area for industrial and clinical applications. Immobilized enzymes give many advantages like operation control, stability, reusability compared with free enzymes. The stability which enzyme gains after immobilization can change due to three dimensional structure of enzyme, the immobilization method and the type of carrier. 
The present study consists of four sections.  The first section is the synthesis of non-composite magnetic carriers (IM and INM), using for these carriers for urease immobilization, optimization and characterization of immobilization conditions. The second section is the preparation of composite magnetic carriers with natural polymers (AIM, AINM, CIM, CINM, ACIM and ACINM), using for these carriers for urease immobilization, optimization and characterization of immobilization conditions. The third section is the preparation of composite magnetic carriers with synthetic polymers (PIM and PINM), using for these carriers for urease immobilization, optimization and characterization of immobilization conditions. The last one is application of urease immobilized systems.
For this purpose, 10 different magnetic featured carriers (IM, INM, AIM, AINM, CIM, CINM, ACIM, ACINM, PIM and PINM) were synthesized and urease immobilization was applied to all of them. For optimization of immobilized urease systems, the amount of magnetic particles, adsorption time, the amount of enzyme, concentration of cross-linking, the pH of immobilization, the amount of carrier were investigated as the basic parameters. For the characterization of immobilized urease systems, the optimum temperature, optimum pH, thermal stability, pH stability,  operational stability, reusability and storage stability parameters were examined. Lineweaver-Burk plotss were used to determination the kinetic parameters of 
immobilized urease systems. In addition to this, FTIR, TEM and SEM analysis were performed for required immobilized systems.  Finally, the urea removal performance of urease immobilized AIM beads which have the best activity value and stability was investigated with back loop column system.
When evaluated in terms of activity, 8 different magnetic urease immobilized systems reached 85% (and above) activity. The best activity performances were urease immobilized AIM and AINM beads (98%). The other 2 urease immobilized system (PIM and PINM) reached 60% activity value. The Km and Vm values of free urease were calculated as 0.071 mM and 1.22 U/mg proteins, respectively. Accordingly, the urease immobilized systems which had the best kinetic parameters values were IM (0.101 mM ve 0.907 U/mg protein), AIM (0.103 mM ve 1.117 U/mg protein) and AINM (0.101 mM ve 1.121 U/mg protein). 
The all urease immobilized systems increased thermal stability (20-70°C) and pH stability (pH 4-9). According to half time values, the best systems were IM, AIM, AINM and CINM. The all urease immobilized systems reached quite good reusability values compared with literature values. The best reuse number were 28 (AIM), 27 (AINM) and 25 (IM). 8 urease immobilized systems (except PIM and PINM) had 14 weeks (least) storage stability values