Begonvil (Bougainvillea spectabilis Willd.) bitkisindeki boganin protein geninin klonlanması, bakteriyel ekspresyonu, antiviral ve antimikrobiyal aktivitesinin araştırılması
Cloning of boganin protein from Bougainvillea spectabilis Willd., bacrerial expression, investigation of antiviral and antimicrobial activities
Yazar: ABDULLAH GÜLLER
Danışman: PROF. DR. HİKMET MURAT SİPAHİOĞLU
Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Botanik = Botany

Özet:
Ribozom inaktive eden proteinler (RIP), rRNA'nın büyük biriminin sarcin/licin halkasından spesifik bir adenin bazını çıkaran N-glikosidaz aktivitesi gösterirler. Böylece protein sentezini translokasyon aşamasında durdurma yeteneğindedirler. Bougainvillea spectabilis Willd. bitkisinden izole edilen Boganin antiviral proteini (BAP) de ribozom inaktive eden proteinler grubunda yer almakta ve depürinasyon sağlamaktadır.  
Balıkesir ilinden temin edilen begonvil bitkisinden izole edilen total RNA kalıp olarak kullanılarak komplementer DNA (cDNA) sentezlenmiş ve gen spesifik primerler kullanılarak RT-PCR yöntemi ile Boganin geni izole edilmiş, pGEM-T Easy vektörüne klonlaması gerçekleştirilerek dizilemesi yapılmıştır. Dizileme sonrası Boganin geninin dizisi NCBI veri tabanına KP096226 giriş numarası ile kaydedilmiştir. Boganin geninin nükleotid dizisinin intron içermediği, 893 bazdan oluştuğu ve gen bankasındaki diğer Boganin dizileri ile % 85 homoloji gösterdiği belirlenmiştir. Boganin geni bünyesinde kesim enzimi dizisi içeren gen spesifik primerler ile çoğaltılarak pETDuet-1 vektörüne klonlanmış ve Escherichia coli BL21 bakterisinde histidin etiketli olarak eksprese edilmiştir. Boganin proteinin 297 amino asit içerdiği ve yaklaşık 28 kDa molekül ağırlığında olduğu doğrulanmıştır.  
Purifiye edilen rekombinant Boganin ile ilgili antimikrobial deneyler kabak sarı mozaik virüsü (zucchini yellow mosaic virus, ZYMV), çeşitli fungal (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani ve Trichoderma harzianum) ve bakteriyel (Pseudomonas putida, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Pseudomonas syringae pv. tomato, Erwinia amylovora ve Xanthomonas  axonopodis pv. phaseoli) patojen olan ve olmayan etmenlere karşı test edilmiştir.
Boganin antiviral proteinin (46.8 µg/ml konsantrasyondaki proteinden 2 µl, 4 µl, 8µl) antiviral aktivitesi mekanik inokulasyon testi ile araştırılmıştır. Yüzde hastalık şiddeti, uygulamadan 1 hafta sonra 0-5 skalasına göre hesaplanmıştır. İki µl BAP kullanılan kabak bitkilerindeki hastalık şiddeti %68.2, dört µl BAP kullanılan bitkilerdeki hastalık şiddeti %61.4 ve sekiz µl BAP uygulanan bitkilerdeki hastalık şiddeti ise %58.7 olarak belirlenmiştir. Pozitif kontrol olarak kullanılan kabak bitkisindeki hastalık şiddeti ise %72.9 olarak bulunmuştur. Çalışmada protein uygulanan tüm kabak bitkilerinde, negatif kontrol bitkilerine göre gelişme geriliği ve cüceleşme belirtileri tespit edilmiştir. Protein uygulanan bitkilerin taze ve kuru ağırlığında değişen oranlarda kayıplar yaşandığı belirlenmiştir. 
Boganin antiviral protein PDA ortamına ilave edildiğinde, R. solani fungusunun gelişimini %30.7 ve T. harzianum fungusunun gelişimini ise %20 oranında inhibe etmiştir. F. oxyporum fungusunun gelişimini inhibe etmemiştir.
BAP proteini altı bakteri türüne karşı test edilmiştir. Yürütülen bu çalışmada sadece P. syringae pv. lachrymans bakterisinin bulunduğu petri kabında inhibisyon bölgesi oluşmuştur.

Anahtar kelimeler: Bougainvillea spectabilis Willd., antiviral protein, BAP geni, ekspresyon, karakterizasyon

Abstract:
Ribosome-inactivating proteins (RIPs) are N-glycosidases that remove a specific adenine from the sarcin/ricin loop of the large rRNA, thus arresting protein synthesis at the translocation step. Boganin antiviral protein (BAP) that isolated Bougainvillea spectabilis Willd. is also belongs to a group of ribosome-inactivating proteins (RIPs) and it is inactivate ribosomes by depurinating rRNA at a specific site. 
In this work, total RNA was extracted from the mature leaves of Bougainvillea spectabilis Willd. Obtained from Balıkesir province using mRNA as template, complementary DNA (cDNA) was synthesized and amplified by PCR using gene specific primers. The Boganin gene was cloned into pGEM-T Easy vector and sequenced. After sequencing, nucleotide sequence of Boganin was deposited as KP096226 in the NCBI database. The nucleotide sequences of BAP gene contained no introns, an open reading frame (ORF) consisted of 893 nucleotides and the deduced nucleotide sequence showed maximum %85 homology to the other Boganin sequences in gene bank. On the other hand, the coding region of the cDNA was cloned in pETDuet-1 vector after amplification with end to end gene specific primers designed to encompass the unique endonuclease restriction sites and expressed in Escherichia coli BL21 strain. The analysis revealed that the Boganin gene contained 297 amino acids encoded for a protein of about 28 kDa.
Antimicrobial assays using highly purified recombinant Boganin (46.8 μg mL-1) have been tested against various fungal pathogens and nonpathogen (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Trichoderma harzianum), bacterial pathogens and nonpathogen (Pseudomonas putida, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Pseudomonas syringae pv. tomato, Erwinia amylovora ve Xanthomonas  axonopodis pv. phaseoli) and zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). 
Antiviral activity of Boganin (2 µl, 4 µl, 8µl of 46.8 µg/ml protein) was assayed by a mechanical inoculation test. A 0 to 5 rating scale was used to score the incidence and diseases severity of ZYMV infections after a week from inoculations. Disease severity of 2 µl, 4 µl and 8 µl BAP treatment in pumpkin plants are found % 68.2, % 61.4 and % 58.7, respectively. Disease severity of positive control (infected pumpkin plants) was found to be %72.9. The all plants treated with antiviral proteins exhibited severe growth reduction compared with negative control (no treatment) plants. Fresh and dry weights of antiviral protein treated plants were decreased compared to control plants.
When the Boganin antiviral protein (50 μl) was added to PDA medium, it inhibited the growth of R. solani by %30.7 and of T. harzianum by %20 after 72 h compared to control. No growth inhibition was observed for F. oxyporum. 
The antibacterial activity of BAP were tested against six pathogenic or non pathogenic bacteria. Antibacterial activity was observed only Pseudomonas syringae pv. lachrymans as a zone of inhibition.

Key words: Bougainvillea spectabilis Willd., antiviral proteins, BAP gene, expression, characterization