Kütle spektrometrik yöntemle plazma oksisterollerinin ölçümü ve analitik validasyonun değerlendirilmesi
Evaluation of analytical validation of plasma oxysterol measurement by mass spectrometry.
Yazar: BÜŞRA ZÜLFA HARMANCIK
Danışman: PROF. DR. SADIKA HALİDE AKBAŞ
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kolesterol = Cholesterol ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Oksidasyon = Oxidation ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Oksisteroller = Oxysterols

Özet:
Amaç: Oksisteroller, kolesterolün çok sayıda kimyasal tepkime yoluyla oksidasyona uğramasıyla oluşan ve birçok fizyolojik süreçte ve çeşitli dejeneratif ve metabolik hastalıklarda, lipid metabolizması bozukluklarında önemli rol oynayan türevlerdir. Bu çalışmada, önemli oksisteroller arasında yer alan kolestan-3β-5α-6β (C-triol) ve 7-ketokolesterol (7-KC)'ün ölçümünde çeşitli ekstraksiyon ve türevlendirme basamakları denenerek, sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometrik (LC-MS/MS) yöntemin analitik validasyonunun yapılması amaçlanmıştır.
Yöntem: Optimizasyon çalışmaları, MRM (multiple-reaction monitoring) modunda, pozitif elektrosprey iyonizasyon (ESI) ile LC-MS/MS (LC-20 AD UFLC XR, Shimadzu 8040 Corporation, Japan) cihazında yapılmıştır. 25 sağlıklı bireyden elde edilen plazmalarda dimetilglisin (DMG) türevlendirmesiyle C-Triol ve 7-KC multipleks (çoklu) ölçümünün analitik validasyonu değerlendirilmiştir. Bu amaçla; linearite, doğruluk analizi, tekrarlanabilirlik, saptama ve ölçüm limitleri (LLOD ve LLOQ), geri kazanım, carry-over analizi gibi parametreler çalışılarak sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirilmiştir.
Bulgular: Analiz süresi her iki parametre için 10 dakika (dk) olarak belirlendi (C-Triol: 3.1 dk, 7-KC: 7.26 dk). C-triol ve 7-KC için oluşturulan lineer regresyon eğrisinde; C-triol r2: 0.999, 7-KC için r2: 0.994 olarak bulundu. Doğruluk analizinde en az iki düzeyde hazırlanmış olan kalite kontrol örneklerinde C-triol ve 7- KC konsantrasyonları ±%20'lik aralıkta bulundu. 25 kişiden oluşan kontrol grubunda C-triol analizi güvenilir bir şekilde gerçekleştirilerek plazmadaki konsantrasyonları hesaplandı. (min: 15.7, max: 38.61; ortalama±SD: 25.61±9.2 ng/mL). 7-KC ölçümlerinde standart sapmalar çok yüksek bulunduğu için plazma matriksinin interferans oluşturduğu veya plazmada 7-KC stabilitesinin bozulduğu düşünüldü.
Sonuç: Bu çalışma ile oksisterol ölçümü, duyarlı ve spesifik bir yöntem ile laboratuvarımızda denenmiş ve kullanıma hazır hale gelmiştir. 7-KC ise plazmadaki analit stabilitesini yansıtmada yararlı olabilecek bir parametredir.
Anahtar Kelimeler: Oksisteroller, Kolestan-3β-5α-6β, 7-Ketokolesterol, LC-MS/MS

Abstract:
Objective: Oxysterols are derivatives of cholesterol which are formed by oxidation through numerous chemical reactions and play an important role in many physiological processes and in various degenerative and metabolic diseases, lipid metabolism disorders. In this study, analytical validation of liquid chromatography-tandem mass spectrometric (LC-MS / MS) method was evaluated by using various extraction and derivation steps in the measurement of  cholestan-3β,5α,6β-triol (C-Triol)  and 7-ketocholesterol (7-KC) which are important oxysterols.
Method: Optimization studies were performed in LC-MS/MS (LC-20 AD UFLC XR, Shimadzu 8040 Corporation, Japan) with positive electrospray ionization (ESI) in multiple-reaction monitoring (MRM) mode. The analytical validation of C-Triol and 7-KC multiplex measurements with dimethylglycine (DMG) derivatization was evaluated in plasma from 25 healthy individuals. For this purpose; linearity, accuracy, repeatability, detection and quantitation limits (LLOD and LLOQ), recovery and carry-over analysis were studied and the results were evaluated statistically.
Results: The time of the analysis was 10 minutes (min) for both parameters (C-Triol: 3.2 min, 7-KC: 7.4 min). The values of r-squared (r2) were found for C-triol as 0,999, for 7-KC as 0,994 in generated calibration curves. Concentrations of C-triol and 7-KC were within ± 20% in quality control samples prepared at least two levels for accuracy analysis. Plasma C-triol levels were determined in a control group of 25 individuals (min: 15.7, max: 38.61; mean±SD: 25.61±9.2 ng/mL). The standard deviations were found high for 7-KC measurements, it was considered that the plasma matrix interfered or the 7-KC stability in the plasma deteriorated. 
Conclusion: In this study, oxysterol measurement has been developed and ready for use in our laboratory with a sensitive and specific method. 7-KC was considered to be a useful parameter to reflect the stability of the analyte in the plasma.
Key words: Oxysterols, Cholestan-3β,5α,6β-triol, 7-ketocholesterol, LC-MS/MS