Çilekte (Fragaria x Ananassa) yüksek sıcaklık stresinde farklı ifade edilen genlerin belirlenmesi
Determination of differentially expressed genes during heat stress in strawberry (Fragaria x Ananassa)
Yazar: MÜGE KESİCİ ZENGİN
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜLEN
Uludağ Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Çilekte (Fragaria x ananassa Duch.) yüksek sıcaklıklarda farklı ifade edilen genlerin araştırıldığı bu çalışmada yüksek sıcaklığa tolerant (R. Hope) ve hassas (Festival) iki çilek çeşidi kullanılmıştır. Çeşitlere ait frigo fideler perlit, torf ve elenmiş bahçe toprağı karışımı (1:1:1) içeren 1412 cm çapındaki saksılarda, 30/15°C sıcaklıkta ve ortalama % 65 oransal nemde 5-6 yapraklı döneme kadar yetiştirilmiştir. Daha sonra bu çeşitlere kademeli olarak yüksek sıcaklık (35, 40, 45, 50°C) uygulanarak yapraklardan örneklemeler yapılmıştır. Yüksek sıcaklık uygulamalarını takiben hücrede meydana gelen zararlanmaları belirlemek için iyon sızıntısı testi uygulanmıştır. Çalışma iki temel prensipte yürütülmüştür. Yüksek sıcaklık ile birlikte farklı ifade edilen genlerin belirlenmesi amacıyla yüksek sıcaklık uygulamalarını takiben toplam RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve tasarlanan primerler ile QRT-PCR çalışmaları yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre R. Hope çeşidinde "LMW heat shock protein mRNA" geninin anlatımının 35°C'ye göre 45ºC'de 4582,09 kat arttığı Festival çeşidinde ise "18.1 kDa class I heat shock protein-like" geninin anlatımının 35ºC'ye göre 45ºC'de 337 kat artarak Festival çeşidi için anlatımı en yüksek gen olduğu belirlenmiştir. Yüksek sıcaklığın protein metabolizmasına olan etkisini ve toleransla ilişkili proteinleri belirlemek amacıyla toplam protein izolasyonunun ardından SDS-PAGE analizi yapılmıştır. Burada stres ile değiştiği belirlenen protein bantları izole edilerek dizi analizine gönderilmiştir. Dizi analizi sonuçlarına göre, R. Hope çeşidinde "Translationally-controlled tumor protein homolog" ve "Heat shock cognate 70 kDA protein 2" proteinlerinin toleransta etkili proteinler olabileceği, Festival çeşidinde ise "Small heat shock protein, chloroplastic, HSP22", "Translationally-controlled tumor protein homolog", "Oxygen-evolving enhancer protein 1, chloroplastic", "Calmodulin-2", "Ribulose bisphosphate carboxylase large chain (Fragment)", "60S ribosomal protein L23" ve "Profilin" proteinlerinin yüksek sıcaklıklara olan duyarlılık ile ilişkilendirilebileceği görülmüştür. Ardından 2D-PAGE analizi ile proteinler izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılmıştır. Burada da 35, 40 ve 45°C'de ifade edilen proteinlerin ifade düzeyleri belirlenmiştir. 
Sonuç olarak, bu tez çalışmasında R. Hope ve Festival çilek çeşitlerinin yüksek sıcaklıklara olan tepkilerindeki temel farklar gen ve protein metabolizması incelenerek ortaya konulmuştur. Toleranslı R. Hope çeşidinin HSP70 gibi yüksek sıcaklık stresine cevapta merkezi görevi olan protein ve "LMW heat shock protein mRNA" gibi düşük moleküler ağırlıklı transkriptlerin koordineli çalışmasıyla bu strese cevap verebildiği ancak duyarlı olan Festival çeşidinde ise yüksek sıcaklık stresine cevapta merkezi rol üstlenmeyen sadece düşük moleküler ağırlıklı protein ve genlerin bu strese cevapta yeterli olamadığı saptanmıştır.

Abstract:
In this study, the mechanism of tolerance to high temperatures was investigated in strawberry plants (Fragaria x ananassa Duch) using two strawberry cultivars which were high temperature tolerant (R. Hope) and sensitive (Festival). Seedlings were planted in 14x12 cm pots using perlite, peat and garden mold mix (1:1:1) and grown for 2 months at 30/15°C and 65% relative humidity. Plants were transferred to climate chamber to expose high temperature stepwise to 35, 40, 45 and 50ºC for 24 hours and then samples were taken. Following the treatments ion leakage test was performed in order to determine the membrane injury. The experiment had two principles. Following the heat treatments, total RNA isolation, cDNA synthesis and QRT-PCR studies were done with designed primers to determine the differentially expressed genes with the high temperature stress. According to the results, the expression of "LMW heat shock protein mRNA" transcript was 4582,09 fold higher at 45°C than 35°C as the highest expressed transcipt in R. Hope and the expression of "18.1 kDa class I heat shock protein-like" transcript was 337 fold higher at 45°C than 35°C as the highest expressed transcipt in Festival. To investigate protein metabolism and identify proteins related to tolerance to high temperature of strawberry, total soluble protein profiles were determined using SDS-PAGE analyse. Stress related bands were isolated then send to sequence analyse. According to protein sequence analyse results, "Translationally-controlled tumor protein homolog" and "Heat shock cognate 70 kDA protein 2" proteins were thought to be effective in tolerance in R. Hope cultivar. "Small heat shock protein, chloroplastic, HSP22", "Translationally-controlled tumor protein homolog", "Oxygen-evolving enhancer protein 1, chloroplastic", "Calmodulin-2", "Ribulose bisphosphate carboxylase large chain (Fragment)", "60S ribosomal protein L23" and "Profilin" proteins were also thought to be related with sensitivity to high temperature stress in Festival cultivar. Then the proteins were separated due to their isoelectric points and expression levels were determined at 35, 40 and 45°C. 
As a conclusion, basic differences between R. Hope and Festival were explained in the meaning of high temperature stress responses by examining gene and protein metabolism in this thesis study. R. Hope cultivar's tolerance can be explained with the coordination of HSP70 that as a central role in stress response and "LMW heat shock protein mRNA" that has a low molecular weight transcript and supplementary role for a complete response to high temperature stress. However, it's determined that sensitive cultivar Festival can respond only with the low molecular weight protein and transcripts that don't have a central role  in high temperature stress response.