İn vitro şartlarda üretilen Inula helenium L. bitkisinde elisitör ve stresör uygulamalarının etken madde üretimine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of elicitor and stressor applications over active substance production in Inula helenium L. plant regenerated in vitro condition
Yazar: GÖKHAN AKÇURA
Danışman: PROF. DR. MUSA TÜRKER
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyoaktif bileşikler = Bioactive compounds ; Inula helenium L. = Inula helenium L. ; Kallus oluşumu = Callus formation ; Stres = Stress

Özet:
Bu çalışmada tıbbi açıdan önemli bir bitki olan Inula helenium L. bitki tohumları çimlendirilmiştir. İn vitro ortamlarda çimlenen bitkilerden elde edilen eksplantlar, farklı Bitki Büyüme Düzenleyicileri (BBD) kullanılarak, organogenez yöntemiyle tam bitki ve kallus hücre serileri elde edilmiştir. İn vitro koşullarda rejenere edilen Inula helenium L. bitkilerine ve kalluslara farklı konsantrasyon ve kombinasyonlarda BBD, stres faktörleri ve elisitörler uygulanarak bitkinin biyoaktif bileşiklerinin değişimleri karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Yaprak, yaprak ayası, gövde ucu ve kotiledon eksplantlarında en iyi kallus oluşumu gösteren ortamın 30±2 günün sonunda karanlık koşullarda, 25±2 oC'de 1 mg/L 2,4-D + 0,3 mg/L KN ile desteklenmiş MS besin ortamı; kök için en iyi kallus oluşumu gösteren ortamın 16/8 fotoperiyotta 1 mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA ile desteklenmiş MS besin ortamı olduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca 1 mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA ile desteklenmiş MS besin ortamında gövde ucu eksplantlarından organogenez yoluyla sürgün gelişimi görülmüştür.
İn vitro BBD'den yoksun ortamda tohumdan gelişen bitkilere ve 1 mg/L 2,4-D + 0,3 mg/L KN ile desteklenmiş MS ortamında gelişen kallus hücre serilerine, Bakır Sülfat (25 µM), Bakır Klorür (25 µM), Gümüş Nitrat (25 µM), Absisik Asit (100 µM), azaltılmış MS besin ortamı (½, ¼ MS) ve Melatonin (35 µM) stresör ve elisitörleri uygulanarak diğer bitki ve kallus örneklerine göre toplam fenolik bileşik (TFB), klorojenik asit, kafeik asit, rutin ve kuersetin konsantrasyonlarının karşılaştırmalı olarak değişimleri incelenmiştir. En yüksek toplam TFB, 16/8 fotoperiyotta 1 mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA ile desteklenmiş MS besin ortamında rejenere olan kalluslarda görülmüştür. En yüksek klorojenik asit konsantrasyonu, karanlık koşullarda 1 mg/L 2,4-D + 0,3 mg/L KN ile desteklenmiş ve 35 μM melatonin içeren MS besin ortamında rejenere olan kalluslarda gözlemlenmiştir. En yüksek kafeik asit konsantrasyonu, toprakta çimlendirilen bitkilerde olup bütün İn vitro koşullarda elde edilen bitki, sürgün ve kalluslarda kafeik asit oranının düştüğü görülmüştür. En yüksek rutin konsantrasyonu, karanlık koşullarda 1 mg/L 2,4-D + 0,3 mg/L KN ile desteklenmiş ve 25 μM gümüş nitrat stresi içeren MS besin ortamında rejenere olan kalluslarda gözlemlenmiştir. En yüksek kuersetin konsantrasyonu ise karanlık koşullarda 1 mg/L 2,4-D + 0,3 mg/L KN ile desteklenmiş ve 35 μM melatonin içeren MS besin ortamında rejenere olan kalluslarda görülmüştür. Stres ve elisitör uygulanmış, in vitro şartlarda geliştirilen Inula helenium L. bitki ve kallus hücre serilerindeki biyoaktif maddelerin doğal ortamda yetiştirilen Inula helenium L. bitki örneklerinden elde edilen biyoaktif maddelerden yüksek olması, biyoaktif maddelerin tabiat koşullarına bağlı kalınmadan kontrollü ortamlarda kitlesel miktarda üretilerek eczacılık sektörüne kazandırılabilme potansiyeli taşımaktadır.

Abstract:
In the present study, the seeds of Inula helenium L., a noteworthy medical plant, were germinated. Whole plant and callus cell line were regenerated from explant in MS medium supplemented with different Plant Growth Regulators (PGR). İn vitro regenerated plants and callus cell lines were exposed to different concentrations and combinations of PGR, stress factors and elicitors and the changes in the concentration of bioactive compounds were compared.  The best callus growth on leaf, petiole, shoot tip and cotyledon explants was determined in MS medium supplemented with 1 mg/L 2,4-D + 0,3 mg/L KN at 25±2 oC in dark condition; meanwhile, the best callus growth on root explants was determined in MS medium supplemented with 1 mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA in daylight condition. In addition, whole plant regeneration was provided from shoot tip explant via direct organogenesis in MS medium supplemented with 1 mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA.
Copper Sulphate (25 µM), Copper Chloride (25 µM), Silver Nitrate (25 µM), Abscisic Acid (100 µM), reduced MS nutrient medium (½, ¼ MS) and Melatonin (35 µM) stressor and elicitors were applied on callus grown in MS medium supplemented with 1 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L KN and on plants germinated in vitro PGR-free MS medium. The changes in concentration of total phenolic compound (TPC), chlorogenic acid, caffeic acid, rutin and quercetin were evaluated under different stress condition. The highest TPC concentration was determined at callus samples that regenerated in MS nutrient medium supplemented with 1 mg/L BAP + 0.1 mg/L NAA in daylight condition. The highest chlorogenic acid concentration was determined at callus samples that regenerated in MS nutrient medium supplemented with 1 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L KN and 35 μM melatonin stress in dark condition. The highest concentration of caffeic acid was determined at plant samples that germinated in soil. It was found that the concentration of caffeic acid decreased at all in vitro seedling, regenerated plants and callus samples. The highest rutin concentration was determined at callus samples that regenerated in MS nutrient medium supplemented with 1 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L KN and 25 μM silver nitrate stress in dark condition. The highest quercetin concentration was determined at callus samples that regenerated in MS nutrient medium supplemented with 1 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L KN and 35 μM melatonin stress in dark condition. It was discovered that the bioactive substances in plant and callus cell lines of Inula helenium L. regenerated in vitro conditions were in higher concentration than that of bioactive substances in Inula helenium L. plants grown in nature. Thanks to this discovery, it was understood that mass production of bioactive substances of Inula helenium L. in vitro environment has the potential to be used at the pharmaceutical industry without being dependent on natural conditions.