Modifiye TCM-199 medyumunda olgunlaştırılarak in vitro üretilen sığır embriyolarının dondurulması
Vitrification of in vitro produced bovine embryos matured in modified TCM-199
Yazar: ASİYE İZEM SANDAL
Danışman: DOÇ. DR. ÖZEN BANU ÖZDAŞ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Donma = Freezing ; Embriyo kültür teknikleri = Embryo culture techniques ; Olgunlaşma = Maturation ; Sisteamin = Cysteamine ; Sığırlar = Cattles ; Vitrifikasyon yöntemi = Vitrification method

Özet:
İn vitro sığır embriyosu üretiminde antioksidan maddeler, gamet hücrelerini reaktif oksijen türevlerine (ROS) karşı koruma amacıyla tercih edilmektedirler. Çalışmada modifiye TCM-199 medyumunda olgunlaştırılarak in vitro üretilen sığır embriyoları 7. ve 8. günde dondurulmuş, eritme sonrası 48. saatteki gelişimleri kaydedilmiştir. Mezbahadan getirilen ovaryumlardan kesme metoduyla kazanılan oositler seçilerek iki gruba ayrılmıştır. Birinci gruptaki oositler antioksidan bir madde olan sisteamin ilave edilen TCM-199 medyumunda (Grup A), ikinci gruptaki oositler ise sisteamin içermeyen TCM-199 medyumunda (Grup B) 38,8 ºC'de, %5 CO2 içeren inkübatörde 24 saat süreyle olgunlaşmaya bırakılmışlardır. Olgunlaşan oositler IVF-TALP medyumuna aktarılmışlar ve Sperm-TALP medyumuyla yıkanan donmuş boğa sperması ile 1-2x106/mL olacak şekilde 18-22 saat süreyle 38,8 ºC'de, %5 CO2 içeren inkübatörde döllenmeye bırakılmışlardır. Bu süre sonunda Grup A ve B'ye ait embriyolar karıştırma metoduyla denude edilmişlerdir. Her bir gruba ait embriyolar farklı 2 kültür medyumunda, Sentetik Ovidukt Sıvısında (SOF) ve CR1aa-Charles Rosencrans (CR1aa) geliştirilmek üzere 2 alt gruba bölünmüştür. Bu amaçla Grup AI-SOF, Grup AII-CR1aa, Grup BI-SOF ve Grup BII-CR1aa olmak üzere 4 grup oluşturulmuştur. 38,8 ºC'de, %5 CO2, %5 N2 ve %90 nem içeren inkübatörde kültüre edilen embriyolar camlaştırma (vitrifikasyon) metoduyla dondurulmuşlardır. Eritilen embriyolar kendi gruplarına ait CR1 ve SOF kültür medyumlarında 48 saat kültüre edilmişlerdir. Blastosiste ve genişlemiş blastosiste ulaşma oranları sırasıyla %20 %18,1, %24,6 ve %22,5 olarak bulunmuştur. Eritme sonrası gelişimleri sırasıyla %5,5, %23,6, %0 ve %5,2 olarak bulunmuş ve Grup AII-CR1aa lehine olmak üzere P<0,05 düzeyinde istatistiksel önem saptanmıştır. Sonuçta sisteamin, eritme sonrası CR1aa medyumunda gelişimi pozitif yönde etkilemiştir.Anahtar Kelimeler: Sığır, Embriyo, Sisteamin, Olgunlaşma, VitrifikasyonBu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir Proje No: 9564.

Abstract:
Antioxidant substances for in vitro embryo production are preferred to protect the gamete cells against reactive oxygen species. In this study, in vitro produced cattle embryos matured in modified TCM-199 media were frozen at the 7th and 8th days, and their development in the 48th hour after thawing were saved. The selected oocytes, obtained from the ovaries brought from slaughterhouse with slicing method, divided into two groups. Cysteamine was added to the first group oocytes in TCM-199 media (Group A), in second group it did not contain cysteamine in its TCM-199 media (Group B), and they were incubated at 38.8 ºC under 5% CO2 for 24 hours. Matured oocytes were transferred into the IVF-TALP media for fertilization with1-2x106/mL frozen bull semen washed with Sperm-TALP media were incubated at 38.8 ºC under 5% CO2 for 18-22 hours. At the end of this period embryos belonging to Group A and Group B were denuded by vortex method. Embryos of each group in two different culture media, Synthetic Oviduct Fluid (SOF) and CR1aa-Charles Rosencrans (CR1aa) were divided into two sub-groups in order to be developed. For this purpose; four groups, Group AI-SOF, Group AII-CR1aa, Group BI-SOF and Group BII-CR1aa were established. Cultured embryos at 38.8 ºC under 5% CO2, 5% N2 and 90% humidity were frozen with vitrification method. Thawed embryos were incubated in CR1aa and SOF culture medias of their groups for 48 hours. The rate of reaching to the blastocyst and expanded blastocyst stages were detected as 20%, 18.1%, 24.6% and 22.5%, respectively. The development after thawing was detected as 5.5%, 23.6%, 0% and5.2%, respectively and in favor of Group AII-CR1aa statistical significance was detected at the level of P<0.05. In conclusion, cysteamine had a positive effect on development after thawing in CR1aa media.Key Words: Cattle, Embryo, Cysteamine, Maturation, VitrificationThis study was supported by the Research Fund of Istanbul University with the project number: 9564.