Mide karsinomlarında PDL-1 ve CD44 ekspresyonunun immünhistokimyasal analizi, klinikopatolojik prognostik faktörler ile ilişkisinin değerlendirilmesi
Immunhistochemical analysis of PDL-1 and CD44 expression in gastric carcinomas and evaluation of the relationship with the clinicopathological prognostic factors
Yazar: ELİF ÇELİK
Danışman: DOÇ. DR. HÜSNİYE ESRA PAŞAOĞLU
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Bağcılar Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Gen ifadesi = Gene expression ; Lenfositler = Lymphocytes ; Mide neoplazmları = Stomach neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prognoz = Prognosis ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Amaç: PDL-1 (Programlı hücre ölümü ligandı 1), aktive T hücre yüzeyindeki PD-1'e (Programlı hücre ölümü proteini 1) bağlanarak sitotoksik T hücre inaktivasyonu ile, tümör hücrelerinin immün sistemden kaçışına olanak sağlar. Son yıllarda immün kontrol noktası moleküllerinin blokajının bir çok malignitede kullanılabileceği gösterilmiştir. CD44 bir kanser kök hücre belirtecidir. CD44 ekspresyonu gösteren kanser kök hücreleri, PDL-1 ekspresyonu üzerinden mide kanser progresyonuna katkı sağlıyor olabilir. Çalışmamızda mide karsinomlarında, CD44 ve PDL-1 ekspresyonunun birbiriyle; klinikopatolojik parametrelerle ve prognozla ilişkisi araştırılmıştır. Ayrıca mide karsinomlarında PDL-1 ekspresyonu için belirlenmiş standart bir cut-off değeri bulunmadığından, literatürde en sık kullanılan cut-off değerlerinin ayrı ayrı klinikopatolojik parametrelerle ilişkileri araştırılarak, en uygun cut-off değerinin seçilmesi amaçlanmıştır.
Yöntem: Kliniğimizde 2015-2018 yılları arasında mide karsinomu tanısı alan 118 olgunun total/subtotal gastrektomi materyalleri çalışmaya dahil edildi. 118 olgudan toplam 236 tümör dokusu içeren 30 adet doku microarray bloğu oluşturuldu. Parafin bloklara, immünhistokimyasal olarak CD44, PDL-1, MLH-1, MSH-2, PMS-2 ve MSH-6 uygulandı. Tüm preparatlar küçük büyütmede (x40) tarandıktan sonra her vaka için stromal lenfosit yüzdesi belirlendi ve median s-TİL değeri cut–off noktası olarak kabul edildi. Bulunan %25 median değerin üzerindeki olgular s-TİL yüksek, altındaki olgular ise s-TİL düşük olarak iki gruba ayrıldı. CD44 ekspresyonu açısından tümör hücreleri boyanma yüzdesine göre; <%5 (skor 0), %5-10 (skor 1), 11-50 (skor 2),>%50 (skor 3) olarak; boyanma yoğunluğuna göre ise, boyanma yok (skor 0), hafif (skor 1), orta (skor 2), şiddetli (skor 3) olmak üzere dört kategoriye ayrıldı. Skor 0 ve skor 1 negatif, skor 2 ve skor 3 pozitif kabul edildi. PDL-1 için, tümör hücrelerinde (tPDL-1) ve tümörü infiltre eden lenfositlerdeki (iPDL-1) membranöz boyanma ayrı ayrı değerlendirildi. Boyanan hücre oranına göre her iki parametre; %1'in altı (skor 0), %1-5 (skor 1), %5-10 (skor 2), %10 ve üzeri (skor 3) olmak üzere 4 kategoriye ayrıldı. Ancak skor 2 ve skor 3 grubundaki olgu sayısı istatistiksel güç oluşturmaya yeterli olmadığı için, PDL-1 boyanma yüzdesine göre %1, %5 ve %10 cut-off değerleri kullanılarak, her bir değerin klinikopatolojik parametrelerle ilişkisi değerlendirildi. 
Bulgular: CD44 ekspresyonu, az diferansiye ve HER-2 negatif tümörlerde daha fazla görülmüştür. Yaş, cinsiyet, tümör boyutu, histolojik tip, T evresi, lenfovasküler/perinöral invazyon, lenf nodu metastazı, sTİL yanıtı, MSİ durumu ve sağkalım ile CD44 ekspresyonu arasında anlamlı ilişki saptanmamıştır. Tüm cut-off değerlerinde tPDL-1 ve iPDL-1 ekspresyonu ile CD44 ekspresyonu arasında anlamlı ilişki bulunmamıştır. TPDL-1 ekspresyonu tüm cut-off değerlerinde, Lauren'a göre sınıflandırılamayan grupta yer alan medüller/medüller benzeri histolojik tipte, MSİ tümörlerde ve stromal TİL yüksek grupta daha yüksek bulunmuştur. tPDL-1 ve iPDL-1 ekspresyonu %1'lik cut-off değerinde kadın cinsiyette daha yüksek bulunurken, tPDL-1 ileri yaş olgularda daha yüksek bulunmuştur. Ayrıca tPDL-1 ekspresyonu %5'lik cut-off değerinde, perinöral invazyon göstermeyen olgularda daha yüksek saptanmıştır. Tüm cut off değerlerinde; tPDL-1 ekspresyonu ile tümörün histolojik derecesi, T evresi, lenfovasküler invazyon, lenf nodu metastazı, HER-2 ekspresyon durumu ve sağkalım arasında anlamlı ilişki bulunmamıştır. Stromal TİL yüksek grupta iPDL-1 ekspresyonu tüm cut-off değerlerinde daha yüksek bulunmuştur. %1'lik cut-off değerinde, düşük T evresinde iPDL-1 ekspresyonu daha yüksek saptanmıştır. iPDL-1 ekspresyonu cut-off  %1 ve %5 olarak alındığında;, Lauren'a göre histolojik tip ve MSİ ile ilişkili bulunurken; %10'luk cut-off değerinde bu ilişki saptanmamıştır. Yaş, tümör boyutu, histolojik derece, lenfovasküler/perinöral invazyon, lenf nodu metastazı, HER-2 ekspresyonu ve sağkalım ile iPDL-1 ekspresyonu arasında anlamlı ilişki bulunmamıştır.
Sonuç: Bir kök hücre belirleyicisi olan CD44 ekspresyonunun, az diferansiye tümörlerde daha yüksek bulunması, tümör hücresinin daha primitif halini yansıtması ve tümörün diferansiasyonu azaldıkça CD44 ekspresyonunun artması ile açıklanabilir. %1 ve %5'lik cut-off değerlerinde PDL-1 ekspresyonunun klinikopatolojik değişkenlerle ilişkisi benzerlik göstermektedir. Çalışmamızda tüm cut-off değerlerinde PDL-1 ekspresyonu ile sağkalım arasında ilişki saptanmamıştır. PDL-1 ve CD44'ün prognostik önemini ve birbiriyle ilişkisini belirlemek için, daha uzun takip süreleri olan geniş hasta serilerinde yapılacak çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Objective: PDL-1 (programmed cell death protein ligand 1), provides the tumor cells' escape from immun system via inactivating cytotoxic T cell by binding PD-1 (programmed cell death protein 1) which is located on activated T cell surface. In recent years, it has been shown that blockade of immuncheck point molecules can be used in many malignancies. CD44 is a cancer stem cell marker. Cancer stem cells showing CD44 expression may contribute to gastric cancer progression through PD L-1 expression. We investigated the expression of CD44 and PDL-1 correlation with each other, with clinicopathological parameters and their relationship with prognosis in gastric carcinomas. In addition, since there is no standard cut-off value for PDL-1 expression in gastric carcinomas, it was aimed to select the most appropriate cut-off value by investigating the relationship between the most commonly used cut-off values in the literature and the clinicopathological parameters.
Method: 118 cases which were diagnosed as gastric carcinoma in total/subtotal gastrectomy materials in our pathology department between 2015-2018 were included in our study. 30 tissue microarray blocks from 236 tumor tissue from 118 cases were assembled. Immunohistochemically, CD44, PDL-1, MLH-1, MSH-2, PMS-2 and MSH-6 antibodies were applied to the paraffin blocks. After all preparations were screened at low magnification (x40), the percentage of stromal lymphocytes was determined for each case and the median s-TIL value was accepted as the cut-off point. The cases with a median value above 25% were defined as a high s-TIL group and cases below 25% are defined as low s-TIL group. Percentage and staining intensity of tumor cells were evaluated separately for CD44 expression. Cases were divided into four groups according to the staining percentage; <5% (score 0), 5-10% (score 1), 11-50 (score 2),> 50% (score 3) and according to staining intensity; No staining (score 0), mild (score 1), moderate (score 2), severe (score 3). Score 0 and score 1 were negative, score 2 and score 3 were accepted as positive. Membraneous PDL-1 staining in tumor cells (tPDL-1) and tumor infiltrating lymphocytes (iPDL-1) was evaluated separately to investigate PDL-1 expression. According to the stained cell ratio, it was evaluated in 4 categories as below 1% (score 0), 1-5% (score 1), 5-10% (score 2), 10% and above (score 3). However, since the number of cases in the score 2  and score 3 groups were not sufficient to generate statistical power, PDL-1 levels were evaluated according to the staining percentage 1%, 5% and 10% as cut-off values and the relationship between each value and clinicopathological parameters.
Results: CD44 expression was more common in poorly differentiated and HER-2 negative tumors. No significant correlation was found between CD44 expression and age, sex, tumor size, histologic type, T stage, lymphovascular/perineural invasion, lymph node metastasis, sTIL response, MSI status and survival. There was no significant relationship between tPDL-1 and iPDL-1 expression and CD44 expression in each cut-off values. TPDL-1 expression was significantly higher in all cut-off values in the medullary/medullary-like histological type which is included in "unclassified group" according to Lauren, in MSI tumors and in the group with high stromal TIL. At 1% cut-off, both tPDL-1 and iPDL-1 expression was found to be higher in female sex, while tPDL-1 was found to be higher in elderly patients. In addition, tPDL-1 expression was found to be higher in cases without perineural invasion at a cut-off value of 5%. In all cut off values; no significant correlation was found between tPDL-1 expression and histological grade of tumor, T stage, lymphovascular invasion, lymph node metastasis, HER-2 expression status and survival. IPDL-1 expression was higher in all cut-off values in the high stromal TIL group. IPDL-1 expression was found to be higher in the low T stage at a cut-off value of 1%. When cut-off is defined as 1% and 5%; iPDL-1 expression was found to be associated with histological type and MSI according to Lauren; this relationship was not found in 10% cut-off value. Age, tumor size, histologic grade, lymphovascular invasion, perineural invasion, lymph node metastasis, HER-2 expression and survival were not significantly associated with iPDL-1 expression.
Conclusion: CD44 expression, a stem cell marker, is found to be higher in poorly differentiated tumors, reflecting the more primitive state of the tumor cell, and increased CD44 expression as tumor differentiation decreased. At cut-off values of 1% and 5%, the relationship between PDL-1 expression and clinicopathologic variables was similar. In our study, no correlation was found between PDL-1 expression and survival in all cut-off values. To determine the prognostic significance of PDL-1 and CD44 and its association with each other, further studies are needed in large patient series with longer follow-up periods.