Sıçanlarda oluşturulan oksijenin indüklediği retinopati modelinde uygulanan intravitreal nintedanib ve ranibizumab tedavilerinin etkilerinin histopatolojik ve immunohistokimyasal olarak değerlendirilmesi ve REAL-time PCR ile westernblot yöntemleri kullanılarak incelenmesi
Histopathological and immunohistochemical evaluation of the effects of intravitreal nintedanib and ranibizumab treatments in the oxygen-induced retinopathy model in rats and investigation using REAL-time PCR and westernblot methods
Yazar: ECE BAŞARAN EMENGEN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ DİLARA PİRHAN ŞAHİN
Kocaeli Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Göz hastalıkları = Eye diseases ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Nintedanib = Nintedanib ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Prematüre retinopatisi = Retinopathy of prematurity ; Ranibizumab = Ranibizumab ; Retina hastalıkları = Retinal diseases ; Sıçanlar = Rats ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors

Özet:
Amaç: Oksijenin indüklediği retinopati (OİR) modelinde intravitreal olarak uyguladığımız multikinaz inhibitörü Nintedanibin terapötik etkinliğini araştırmak ve sonuçları Ranibizumab ile karşılaştırmak

Gereç ve Yöntem: Çalışmada her grupta 8 denek olmak üzere toplam 48 adet Sprague Dawley cinsi sıçan kullanıldı. Grup 1 kontrol grubu olarak belirlendi ve OİR modeli oluşturulmadı. Grup 1 dışındaki 40 adet sıçan Postnatal 7.gün (P7) ile 12.günler(P12) arasında hiperoksiye (%75±2) maruz bırakılarak OİR modeli oluşturuldu. P12'de sıçanlar oda havasına alınarak tedavi gruplarına iv enjeksiyon uygulandı. Grup 2'de OİR modeli oluşturularak tıbbi ve cerrahi bir müdahale yapılmadı. Grup 3'de OİR modeli oluşturuldu ve intravitreal Fosfat tamponlu salin uygulandı. Grup 4, 5 ve 6'ya sırasıyla Ranibizumab, 100 nM Nintedanib, 200 nM Nintedanib uygulandı. P17'de gözler enüklee edilerek retina diseksiyonu yapıldı. Neovaskülarizasyonun kantitatif değerlendirmesi için, iç limitan membranın vitreal yüzeyindeki vasküler endotelyal hücre çekirdekleri (VECs) sayıldı. Glial fibriler asidik protein (GFAP) ve Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) antikoru ile immunfloresan boyama yapıldı ve konfokal mikroskopta incelendi. VEGF, GFAP, TNF-α, eNOS ve IL1-β mRNA ekspresyonları Real-Time PCR ile analiz edildi. VEGF, GFAP, TNF-α protein ekspresyonları Westernblot ile analiz edildi. Retinalar wholemount olarak konfokal mikroskopta incelendi. Retina damarları, avasküler alanlar, vasküler yoğunluk, dallanma noktaları indeksi ve tortuosite değerlendirildi.
 
Bulgular: Grup 1, 2, 3, 4, 5, 6'da ortalama VEC sayısı sırasıyla 0.18±0.44, 7.68±3.68,
6.79±2.75, 2.04±0.87, 3.45±1.00, 1.54±0.82 idi. Grup 4 ve 6'da ortalama VEC sayısı hem Grup 2 hem Grup 3'e göre anlamlı oranda düşüktü (p<0.001). Grup 5'te de ortalama VECs, Grup 2 ve 3'e göre anlamlı oranda azaldı (sırasıyla p=0.001, p=0.007). İmmunfloresan boyamada Grup1 normal morfolojide izlenirken, Grup 2 ve 3'te VEGF ve GFAP boyanmasında artış görüldü. Grup 4, 5 ve 6'da ise boyanma miktarı az saptandı. PCR sonuçlarına göre anjiogenik faktör olan VEGF, glial aktivite göstergesi GFAP ile inflamatuar moleküllerin (TNFα, eNOS, IL1-β) ekspresyonları Grup 2 ve 3'te belirgin olarak yükselmiş, Grup 4, 5, 6'da kontrol grubuna yakın olarak düşük saptandı (p<0.05). VEGF düzeyi en çok baskılanan 1.043±0.036 (Ort±SS) ile 200nM Nintedanib grubu idi. GFAP, IL1-β, eNOS düzeyleri en düşük 100nM nintedanib grubu idi. TNFα ekspresyonu Grup 4, 5, 6'da kontrol grubuna yakın izlendi ve aralarında belirgin fark izlenmedi. Retinal wholemount incelemede avasküler alan, damar yoğunluğu ve dallanma noktaları sayısında 200 nM Nintedanib ve Ranibizumab gruplarında istatiksel olarak anlamlı azalma izlendi (p<0.05).

Sonuç: Nintedanibin preretinal neovaskülarizasyon üzerindeki ve PR patogenezinde etkili normal vaskülarizasyonun hızlanması üzerindeki etkinliğini ortaya koymaktadır. Nintedanib, prematüre retinopatisi tedavisinde, tek başına veya adjuvan olarak anti-VEGF tedavisine umut verici bir alternatiftir olarak gözükmektedir.

Abstract:
Aim: To investigate the therapeutic efficacy of intravitreal multikinase inhibitor Nintedanib in the oxygen-induced retinopathy (OIR) model and to compare the results with Ranibizumab.

Materials and Methods: 48 Sprague Dawley rats, 8 of which were in each group, were used in the study. Group1 was determined as the control group and received normal partial oxygen pressure. OIR model was created by exposing to hyperoxia (75±2%) between postnatal 7th day (P7) and 12th day (P12). At P12, the rats were taken to the room air and iv injection was applied to the treatment groups. In Group 2, no medical or surgical intervention was performed. The rats in groups 3, 4, 5 and 6 were received intravitreal injections of either vehicle (PBS), ranibizumab or nintedanib (100 nM and 200 nM respectively) at P12. At P17, eyes were enucleated and retinal dissection was performed. Cross-sections of the retina were stained with hematoxylin and eosin (HE). For the quantitative assessment of neovascularization, vascular endothelial cell nuclei (VECs) breaking the internal limiting membrane were counted. Immunofluorescent staining was performed with glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Vascular endothelial growth factor (VEGF) antibodies and evaluated under a confocal microscope. VEGF, GFAP, TNF-α, eNOS and IL1-β mRNA expressions were analyzed by Real-Time PCR. VEGF, GFAP, TNF-α protein expressions were analyzed by Westernblot. The retinas were whole-mounted and imaged with a confocal microscopy. Avascular area, vessel density, branching index and tortuosity were evaluated.

Results: The mean  number of VECs  in  group  1,  2,  3,  4,  5,  6  was  0.18±0.44, 7.68±3.68,
6.79±2.75,  2.04±0.87,  3.45±1.00,  1.54±0.82,  respectively.  The  mean  number  of  VECs in
 
Groups 4 and 6 was significantly lower than both Group 2 and Group 3 (p<0.001). Mean VECs in Group 5 also decreased significantly compared to Groups 2 and 3 (p=0.001, p=0.007, respectively). Group 1 was observed in normal morphology in immunofluorescent staining, there was an increase in VEGF and GFAP staining in Groups 2 and 3. In Groups 4, 5 and 6, staining is markedly decreased. The mRNA expressions of VEGF, GFAP and the inflammatory molecules (TNFα, eNOS, IL1-β) were significantly increased in Groups 2 and 3, and were decreased in Groups 4, 5, 6 like as the control group (p<0.05). In 200nM Nintedanib group, the most suppressed VEGF level was 1.043±0.036 (Mean±SD). GFAP, IL1-β, eNOS levels were the lowest in the 100nM nintedanib group. TNFα expression was observed close to the control group in Group 4, 5, 6 and no significant difference was observed between them. In the retinal wholemount examination, avascular area, vessel density and branching points significantly decreased in the 200 nM Nintedanib and Ranibizumab groups (p<0.05).

Conclusion: It demonstrates the effectiveness of nintedanib on preretinal neovascularization and acceleration of normal vascularization, which is effective in the pathogenesis of PR. Nintedanib appears to be a preferable alternative to anti-VEGF therapy alone or as an adjuvant in the treatment of retinopathy of prematurity.