Tümör tanı ve izlemi için dolaşımdaki serbest DNA'nın tayinine yönelik spesifik bir biyosensör sistemi geliştirilmesi
Development of A specific biosensor system for the determination of circulating free DNA for tumor diagnosis and monitoring
Yazar: ZİHNİ ONUR UYGUN
Danışman: PROF. DR. FERHAN GİRGİN SAĞIN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Biyosensörler = Biosensors ; DNA = DNA ; Elektrotlar = Electrodes ; Hasta takibi = Follow up studies ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; RNA = RNA ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Dünya çapında ölüme yol açan nedenler arasında kanser, kalp hastalıklarından sonra ikinci sırayı almaktadır. Kanser tedavilerindeki önemli gelişmelere rağmen, morbidite ve mortalite hala çok yüksektir. Bu durumun nedenleri ise kanser erken tanısında sensitivitesi ve spesifisitesi yüksek biyobelirteçlerin yetersizliği, tümör heterojenitesi, özellikle intratümöral heterojenite nedeniyle tümör tedavisinde güçlüklerin sürmesi, tümör hücrelerinin klonal evrim teorisi doğrultusunda adaptif değişiklikler göstererek ilaçlara karşı direnç geliştirmesi ve hastalığın kontrol edilemeyerek özellikle kan yoluyla metastazların gelişmesidir. Bu güçlükleri ortadan kaldırmak için kanser tanı ve izlemini hızlı, spesifik, pratik ve ekonomik olarak yapmamızı sağlayacak biyobelirteçlere olan gereksinim devam etmektedir. Bu kapsamda, halihazırda kullanılan kan biyobelirteçleri yanı sıra "sıvı biyopsi" olarak tanımlanan ve tümör dokusundan salınan tümör hücrelerini (Circulating Tumor Cells-CTC) ve dolaşımdaki hücre dışı tümör DNA'sını (circulating tumor DNA-ctDNA) saptamaya yönelik kan tabanlı analizler noninvaziv, spesifik, pratik ve ekonomik olmaları nedeniyle son yıllarda ilgi çekmektedirler. ctDNA'nın tümör yükü ve tedavi yanıtını doğru bir şekilde gösterdiği, zararlı adjuvan kemoterapi ihtiyacını azalttığı ve nüksün daha çabuk tespit edilmesini sağladığını gösteren sonuçların da yayımlanmasıyla bu biyobelirtecin kanda pratik ve düşük maliyetli bir şekilde ölçülmesine yönelik çalışmalar artmıştır.
Biyosensörler, hedeflenen molekülü spesifik olarak tanıyan bir algılayıcı ve bu yapının hedef molekülü bağlamasıyla oluşan bağlanma ya da tepkimeyi ileten bir fizikokimyasal iletici içeren, pratik, taşınabilir, ekonomik ve hızlı ölçüm sistemleridir. Bu tez çalışmasının amacı da, tümör tanı ve izleminde ctDNA'yı tayin etmek üzere, bir ön işleme gerek duymadan spesifik, hızlı ve ekonomik ölçüm yapabilen bir biyosensör sisteminin geliştirilmesidir. Projede bu temelden yola çıkılarak, şimdiye kadar hiç uygulanmamış bir şekilde, örneklerdeki ctDNA'ya yönelik çok spesifik bir algılayıcı, biyotanıma ajanı olarak kullanılmış ve işaretçi bir moleküle gerek duymadan impedimetrik tabanlı yenilikçi bir sistem geliştirilmiştir. Bu çalışmada, hedef ctDNA'yı dizi spesifik olarak tanıyacak bu biyomolekül, CRISPR-Cas9 temellidir. Geliştirilen bu yeni biyosensör sisteminde, ctDNA'yı endonükleaz ile kesmeden sadece spesifik olarak bağlayarak tayinini sağlayacak, kısaca endonükleaz aktivitesi olmayan deaktive Cas9 (dCas9) proteinleri ile birlikte kompleks halinde sentetik kılavuz RNA (synthetic guide RNA-sgRNA) kullanılmıştır. Dizi spesifik tanıma ile gerçekleşen ctDNA-sgRNA bağlanması, elektrokimyasal impedans spektroskopi ile ölçülerek biyosensör geliştirilmiştir.
Bu çalışmada ctDNA'nın doğrudan tespiti için, grafen oksit ekran baskılı elektrotlar (GPHOXE), biyolojik tanıma reseptörü olarak dCas9 proteinleri ve sgRNA ile modifiye edilmiştir. Biyosensörün temelinde yer alan diziye özgü tanımanın örnekte hedeflediği yapı ise, meme kanserinde en sık görülen tümöre bağlı mutasyon olan PIK3CA ekson 9 mutasyonudur. Geliştirilen sistemde, CRISPR-dCas9-sgRNA ile modifiye edilmiş elektrotların yüzeyinde bu mutasyonun varlığında gerçekleşen bağlanma ise, elektrokimyasal impedans spektroskopisi (Electrochemical Impedance Spectroscopy-EIS) ile analiz edilmiştir. Tek nükleotit uyuşmazlığı da dahil olmak üzere hedef mutasyon dışındaki ctDNA dizileri için son derece seçici özellik gösteren sistemin ölçüm süresi son derece hızlı (40 saniye) olarak saptanmıştır. Analiz, 120 bp ctDNA'lar için 2-20 nM arasında doğrusal saptama sınırlarında olup en düşük tespit limiti (LOD) 0,65 nM ve en düşük tayin limiti (LOQ) 1,92 nM olarak hesaplanmıştır. Gerçek kan örneklerinde seçicilik ve tekrarlanabilirlik çalışmaları yapılmış ve geri elde oranı % 96'dan yüksek olmuştur. Aynı metot, doğrulama amaçlı olarak altın elektrot ile de denenmiş ve ctDNA analizi başarı ile yapılabilmiştir.
Sonuç olarak bu tez çalışmasında grafen oksit elektrotlarda geliştirilen ve altın elektrot ile doğrulama çalışmaları yapılan dCas9 temelli impedimetrik biyosensör sistemi, ctDNA ölçümünde yüksek seçicilik, hız, tekrar üretilebilirlik ve ekonomik olma avantajları sağlamaktadır. Ön çalışmaları sağlam verilerle kanıtlanmış olan bu düzeneğin geliştirilerek multipleks bir sistem çerçevesinde diğer önemli mutasyonlara yönelik olarak da uygulanması, kanserin erken teşhisinde umut verici bir alan olarak ortaya çıkmaktadır.

Abstract:
Cancer is the second most deadly disease after heart diseases among the causes of death worldwide. Despite significant advances in cancer treatments, morbidity and mortality are still very high. The reasons for this situation are the insufficiency of biomarkers with high sensitivity and specificity in the early diagnosis of cancer, the ongoing difficulties in tumor treatment due to tumor heterogeneity, especially intratumoral heterogeneity, the development of tumor cells resistance to drugs by showing adaptive changes in the clonal evolution theory, and out of control to the disease that leads development of metastases, especially through blood. In order to overcome these difficulties, it still continues to research biomarkers that will enable us to make cancer diagnosis and prognosis quickly, specifically, practically and economically. Therefore, in addition to the currently used blood biomarkers, blood-based analyzes to detect the tumor cells (Circulating Tumor Cells-CTC) and circulating extracellular tumor DNA (ctDNA), which are defined as "liquid biopsy" that released from the tumor tissue, have attracted attention in recent years due to their specific, practical and economical nature. The increasing published results of the ctDNA shows tumor burden, treatment response that reduces the need for harmful adjuvant chemotherapy and enables to be detected more quickly, practical and low-cost.
Biosensors are practical, portable, economical and fast measurement systems that contain a biorecognition receptor that specifically shows affinity to the target molecule and a physicochemical transducer that transfer the signal formed by the binding or reaction of biorecognition receptor and analyte molecule. The aim of this thesis study was to develop a biosensor system that can perform specific, fast and economical measurement without the need for a pre-treatment in order to determine ctDNA in tumor diagnosis and monitoring. Fundamental of the project, a very specific biorecognition receptor agent, which has never been applied until now, was used for ctDNA detection in the samples was used with an impedimetric system was developed for label-free ctDNA detection. In this study, this biomolecule is CRISPR-dCas9 that will sequentially recognize the target ctDNA. The novel biosensor system employed a synthetic guide RNA (synthetic guide RNA-sgRNA) is used in complex with deactivated Cas9 (dCas9) proteins that do not have endonuclease activity, which will enable the determination of ctDNA by binding only specifically without cutting it with endonuclease. The biosensor was developed by measuring ctDNA-sgRNA binding with sequence specific recognition by electrochemical impedance spectroscopy.
In this study, graphene oxide screen printed electrodes (GPHOXE) were modified with dCas9 proteins and sgRNA as biorecognition receptor for direct detection of ctDNA. The sequence-specific recognition targeted PIK3CA exon 9 mutation which is the most common tumor-related mutation in breast cancer, in the sample. In the developed system, the presence of this mutation that binds on the surface of the electrodes modified with CRISPR-dCas9-sgRNA was analyzed by electrochemical impedance spectroscopy (Electrochemical Impedance Spectroscopy-EIS). The detection time of the system, which is highly selective for ctDNA sequences other than the target mutation, including single nucleotide mismatch, was determined to be extremely fast (40 seconds). The analysis was carried out within the linear detection range between 2 and 20 nM for 120 bp ctDNAs with the lower limit of detection (LOD) 0.65 nM and the lower limit of quantification (LOQ) 1.92 nM. Selectivity and reproducibility studies were performed on real blood samples, and the recovery was higher than 96%. The same method was tried with the gold electrode for verification purposes and ctDNA analysis was successfully performed.
In conclusion to this thesis, the dCas9 based impedimetric biosensor system, which was developed on graphene oxide electrodes and verified with gold electrode, provides the advantages of high selectivity, fast detection, reproducibility and economic efficiency in ctDNA measurement. The development of this mechanism, whose preliminary studies have been proven with solid data, and its application for other important mutations within the framework of a multiplex system, is a promising area in the early diagnosis of cancer.