Primer ve metastatik insan kolon kanseri hücre hatlarındaα-laktalbumin ve sulindac'ın mitokondriyal apoptotik yolaküzerinden etkisinin immünohistokimya ve elektronmikroskobik yöntemlerle değerlendirilmesi
Evaluation of effects of α-lactalbumin and sulindac on primaryand metastatic human colon cancer cell lines via mitochondrialapoptotic pathway by immunohistochemistry and electronmicroscopy assays
Yazar: IŞIL AYDEMİR
Danışman: DOÇ. DR. HAFİZE SEDA VATANSEVER
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Kanserin neden olduğu ölümlerde kolon kanseri ikinci sıradadır. Kolorektal
kanser görülme sıklığı erkelerde üçüncü sırada iken kadınlarda dördüncü sırada yer
almaktadır. Tedavisi için cerrahi yöntem yanında ilaç tedavileri uygulanmakta ve uygun
protokoller oluşturulmaya çalışılmaktadır. HAMLET (human α-lactalbumin made lethal
to tumor cells) ve Sulindac, bu amaçla kullanılan etken maddelerdendir.
HAMLET insan anne sütünden elde edilen Ca+2 bağlayıcı protein α-laktalbumin
ve yağ asidinden (oleik asit) oluşan bir maddedir. İn vivo ve in vitro ortamlardaki tümör
hücrelerinin yüzeyine tutunarak hücre içersine girer ve nukleusta histon proteinleri ile
kromatine bağlanır. Kromatini dönüşümsüz bir hasara uğratır, mitokondriyi hedef alarak
kaspazları aktive eder ve böylece apoptozisi indükler.
 Sulindac ise non-steroidal anti-inflamatuar ilaçlar (NSAIDs) dandır. Büyüme
inhibitörü olup pro-apoptotik etkiye sahiptir. Bazı kanser türlerinde (barsak, baş ve
boyun) tümör hücrelerinin apoptozise yönelmelerini indükleyerek tedavilerini
sağlamaktadır.
Apoptozis, memeli hücrelerinde ölüm sinyalinin kaynağına bağlı olarak
intrensek ve ekstrensek olmak üzere iki yolla gerçekleştirilir. Ekstrensek yol, apoptozu
tetikleyen sinyal moleküllerinin hücre zarında bulunan ilgili reseptörlere bağlanması ile
aktive edilirken, intrensek yol hücreden kaynaklanan çok çeşitli sinyaller tarafından
(onkogen aktivasyonu, DNA hasarı gibi) tetiklenen bir yoldur ve merkezi rolü mitokondri
oynamaktadır.
 Bu çalışmada COLO-320 Primer ve COLO-741 Metastatik insan kolon
karsinomu hücre hatları RPMI-1640, %10 FBS, 2 mM L-glutamin ve %1 penisilinstreptomisin içeren kültür ortamında, 37o
C ısı ve %5 CO2 sağlayan inkübatörde kültüre
edildi. Hücreler 4' erli gruplara ayrıldı. Her bir hücre hattının 1. gruplarına hiçbir ilaç uygulanmadı ve kontrol grubu olarak kabul edildi. 2. gruplarına α-Laktalbumin, 3.
gruplarına Sulindac ve 4. gruplarına α-Laktalbumin+ Sulindac kombinasyonu
uygulandı. İlaç etkileri 24., 48. ve 72. saatlerde incelendi. Sitotoksite analizi için, MTT
ve laktik dehidrogenaz düzeyi, ultrastrukturel inceleme için elektron mikroskobi
tekniği, apoptotik hücre dağılımı için TUNEL yöntemi, kaspaz-3, kaspaz-9 ve sitokromC dağılımları için ise indirekt immunoperoksidaz yöntemi kullanıldı.
Elektron mikroskobik inceleme sonrasında, her iki hücre hattının kontrol
gruplarında hücre ve çekirdek konturlarının düzgün olduğu, tedavi alan tüm gruplarda
apoptotik cisimciklerin gözlendiği, fakat kombine tedavi uygulanan COLO-320
grubundaki hücrelerde apoptotik cisimciklerin daha fazla olduğu saptandı. TUNEL
pozitif hücre sayısının tedavi alan grupların hepsinde ve özellikle COLO-320
grubundaki hücrelerde daha fazla olduğu izlendi. Kaspaz-3, kaspaz-9 ve sitokrom-C
dağılımlarının tedavi uygulanan gruplarda pozitif olduğu gözlenir iken, özellikle kombine
ilaç uygulanan gruplarda her üç immunoreaktivitenin daha fazla olduğu saptandı.
Çalışmamız sonucunda α-Laktalbumin ve Sulindac' ın primer ve metastatik
insan kolon karsinoma hücre hatlarında apoptotik mekanizmaları tetiklendiği, primer
insan kolon karsinoma hücre hattında metastatik hücre hattına oranla daha fazla
olduğu tespit edildi. Çalışmanın in vivo çalışmalara öncülük edebileceğini
düşünmekteyiz. 
Anahtar Kelimeler: Kanser, Apoptozis, α-Laktalbumin, Sulindac

Abstract:
Colon cancer is the second reason of death which is caused by cancer.
Colorectal cancer prevalence is fourth order in women whereas it is third in men.
Although surgery is applied to treatment the cancer drug treatments are applied and
appropriate protocols are tried to build. HAMLET (human α-lactalbumin made lethal to
tumor cells) and Sulindac are active ingredients which are used to treatment of
cancers.
HAMLET consists of Ca+2 binding protein α-lactalbumin, which is obtained from
female human milk, and fatty acid (oleic acid). In in vivo and in vitro conditions, it
attaches to surface of tumor cells and get in inside of the cells. It connects to the
chromatin by histone proteins in nucleus. It damages the chromatin irreversibly, and
activates the caspases by effecting the mitochondria and that induces apoptosis.
Sulindac is one of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). It is inhibitor
of growth and induces apoptosis. It cures some cancers (intestine, head and neck) by
inducing apoptosis of tumor cells.
Apoptosis is triggered by two ways in mammalian cells depending on the source
of death signals: Intrinsic and extrinsic pathway. Intrinsic pathway is triggered by
various signals (activation of oncogenes, DNA damages) which comes from cytosol
and the mitochondria plays major role whereas extrinsic pathway is activated by
binding the signal molecules to the receptors where are on cell membrane.
In this study, COLO-320 Primary and COLO-741 Metastatic human colon
carcinoma cell lines were cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine
serum, 1% L-glutamine and 1% penicillin-streptomicin at 37°C and 5% CO2 in air
condition. Each cell lines were divided in four groups. The first groups are control
groups and there were not treated with any drugs. The second groups were treated with α-Lactalbumin, the thirds with Sulindac and the fourth groups were exposed to αLactalbumin and Sulindac. Effects of drugs were determined at 24., 48. and 72. hours
of culture. For cytotoxic analyses MTT and level of lactic dehyrogenase, for
ultrastructure of the cells electron microscopy technique, for distribution of apoptotic
cells TUNEL and indirect immunuperoxidase assays for intensity of caspase-3,
caspase-9 and cytochrom-c were analyzed.
After electron microscopic analyses, it was observed that contours of cell and
nucleus were normal in control groups of each cell lines, in treated groups apoptotic
blebs were detected, but the number of apoptotic blebs were more in group which were
treated with both drugs . The number of TUNEL positive cells were increased in all
treated groups especially in COLO-320 cell line. Immunoreactivities of caspase-3,
caspase-9 and cytocrom-C were detected in all treated groups, these
immunoreactivities were increased in groups which were treated with both drugs.
After our study, we suggest that α-Lactalbumin and Sulindac may be trigggered
mechanisms of apoptosis in both primary and metastatic colon carcinoma cell lines and
primary colon carcinoma cell line was affected much more than metastatic colon
carcinoma cell line. We suppose that these results will lead the in vivo experiments.
Key words: Cancer, Apoptosis, α-Lactalbumin, Sulindac.