Influenza A tanısına yönelik IgY antikoruna dayalı ELISA yönteminin geliştirilmesi
Development of ELISA method based on IgY antibody for influenza A diagnosis
Yazar: BÜŞRA ÖZKAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. RABİA ÇAKIR KOÇ ; DR. YASEMİN BUDAMA KILINÇ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Konjugasyon = Conjugation ; Tanı koyma =   ; İmmünoglobülin Y = Immunoglobulin Y

Özet:
İnfluenza A, her yıl dünya nüfusunun %5 ile 20'sini etkileyen, binlerce insanın ölümüne sebep olan önemli bir viral hastalıktır. İnfluenza A, damlacık ve solunum yolu salgılarına temas ile yayılmasından ve de bir metrelik mesafe bulaşı için riskli alan olmasından dolayı, yüksek mortalite ve morbidite ile seyreden bir enfeksiyona neden olmaktadır. 
Bu viral hastalığın özellikle klinik teşhisinde, diğer solunum yolu hastalıkları ile karıştırılması nedeniyle, tedavisinde yanlış ilaç kullanımı söz konusu olmaktadır. Bu durum enfeksiyon ile mücadelede dezavantaj oluşturmaktadır. Epidemilerin ve pandemilerin önlenmesi için, hastalık riski olan bireylere hızlı ve doğru tanının konulması, enfeksiyonun kontrolü için büyük bir önem taşımaktadır. Ancak influenza A virüsünün yapısında meydana gelen değişimler, bu virüsün etkin bir şekilde hızlı ve doğru tanısına yönelik yöntemlerin geliştirilmesini zorlaştırmıştır. 
İnfluenza A virüsünün yapısındaki, virüsün zarfından arınması esnasında protonların viriyona girişini sağlayan iyon kanalı olarak işlev gören M2 proteini, normalde virüs partikülleri üzerinde düşük miktarda bulunmaktadır. Ancak, virüsün bu bileşeni infekte hücre yüzeyinde oldukça bol miktarda salgılanmaktadır. Neredeyse tüm influenza A alt türlerinde korunmuş olduğu bilinen virüse ait bu bileşeninin, influenza A virüsü tanısına yönelik yeni yöntem geliştirmek amacıyla kullanılması son zamanlarda araştırmacıların ilgisini çekmiştir.
Bu tez çalışmasında; influenza A virüsünün korunmuş antijenik bölgesi olan M2e proteininin 24 amino asitten oluşan M2e peptidine spesifik influenza A'ya karşı üretilen immunoglobulin Y antikoru kullanılmıştır. M2e peptidine spesifik IgY antikoru, ELISA testinde kullanılmak üzere alkalin fosfataz enzimi ile kovalent konjugasyon yöntemiyle gluteraldehit varlığında konjuge edilmiştir ve karakterizasyonu spektroskopik yöntemlerle yapılmıştır. 2015-2016 sürveyans sezonunda, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji ve Temel İmmunoloji Bilim Dalı Ulusal İnfluenza Referans Laboratuarı'nda "İnfluenza Benzeri Hastalık-(İBH)" ön tanısı ile toplanan nazofrangeal sürüntü örneklerinden, influenza A tanısında altın standart olarak kabul edilen eş zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (real-time reverse transcription polymerase chain reaction, rRT-PCR) yöntemi ile 11 adet pozitif ve 3 adet negatif olduğu belirlenen toplam 14 adet örnek kullanılmıştır. Bu nazofrangeal sürüntü örnekleri, sentezlenen M2e spesifik IgY-ALP konjugatı kullanılarak geliştirilen ELISA testi ile değerlendirilmiştir ve elde edilen sonuçların rRT-PCR yöntemi ile elde edilen sonuçlarla örtüştüğü belirlenmiştir. 
Bu tez çalışması ile dünyada ilk kez M2e peptidine spesifik IgY antikoruna dayalı influenza A virüsünün tanısında kullanılmak üzere serolojik tanı yöntemi geliştirilmiştir. 

Anahtar Kelimeler: Alkalin fosfataz, IgY, İnfluenza A, Kovalent Konjugasyon, Sandviç-ELISA, Tanı.

Abstract:
Influenza A is an important viral disease affects 5 to 20% of the world population each year and causes the death of thousands of people. Influenza A causes an infection associated with high mortality and morbidity because spreading respiratory tract secretions by contact and droplets and also being the risk area for a meter transmission distance.
The use of the wrong drug treatment is concerned due to mixing with other respiratory diseases, especially the clinical diagnosis of this viral disease. This constitutes a disadvantage in fighting infection. For the prevention of epidemics and pandemics, rapid and correct diagnosis for individuals with risk of disease have great importance for the control of infection. However, due to the changes occurring in the structure of the influenza A virus, effective development of methods for rapid and accurate diagnosis of this virus become difficult.
M2 protein that in the structure of the Influenza A virus and function as an ion channel that allows the entry of protons to the virion during purification of the virus from its envelope, is normally in lower amount on the virus particles. However, this component of the virus is secreted quite abundant on the surface of infected cells. This component of the virus is known to be preserved in almost all of the Influenza A virus subtypes recently attracted the attention of researchers to develop new methods for the diagnosis of Influenza A virus.
In this thesis, immunoglobulin Y antibody that specific to M2e peptide which consists of 24 amino acid of M2e protein, conserved antigenic region of the influenza A virus, was used. M2 peptide-specific IgY antibody were conjugated with alkaline phosphatase enzyme in the presence of the glutaraldehyde by covalent conjugation method to be used in ELISA test and characterization was performed by spectroscopic methods. In the 2015-2016 surveillance season, nazofrangeal swab samples with the diagnosis of "Influenza-like Diseases (ILD)" in Istanbul University, Istanbul Faculty of Medicine, Medical Microbiology Department, Division of Virology and Basic Immunology Department, National Influenza Reference Laboratory were collected and 11 positive and 3 negative swab identified with real-time reverse transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR) method which is golden standard in diagnosis of Influenza A, total 14 swab were used. This nazofrangeal swab samples were evaluated with ELISA test developed by using synthesized M2-specific IgY-ALP conjugate and obtained the results was determined to coincide with the results obtained with rRT-PCR method.
Serological diagnostic method based on M2 peptide-specific IgY antibody have been developed for use in the diagnosis of the Influenza A virus with this study for the first time in the World.

Keywords: Alkaline phosphatase, IgY, Influenza A, Covalent Conjugation, Sandwich-ELISA, Diagnosis.