Hatay biberi'nde saf hatların üretilmesi amacıyla uygun androgenesis yönteminin geliştirilmesi
Development of appropriate androgenesis method for pure lines breeding in Hatay pepper
Yazar: PINAR ÇOKLUK
Danışman: PROF. DR. SEBAHATTİN ÇÜRÜK
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Androgenez = Androgenesis ; Biber = Pepper ; Capsicum annuum = Capsicum annuum ; Haploitler = Haploids

Özet:
Hatay biberinin bilhassa meyve özellikleri bakımından farklı tiplere sahip, karışık genotiplerden oluşması ve çok sayıda hastalık ve zararlıya karşı olan duyarlılığı, üreticilerin en önemli sorunlarındandır. Araştırmanın amacı, Hatay biberi köy popülasyonunun androgenesis yöntemiyle saflaştırılmasını sağlayabilecek bir protokol geliştirmektir. Bu araştırmada; Hatay biberi popülasyonlarından seçilen 4 biber hattı ile iki aşamalı ve çift katmanlı anter/mikrospor (shed-mikrospor) kültürü yöntemleri kullanılmıştır.
İki aşamalı yöntemde anterler, aktif kömür (AC) (%0.0 veya 0.5) ve sefotaksim (0.0 veya 250 mg/L) içeren DDV-C C (Dumas de Vaulx temel ortamı, 0.01 mg/L 2,4-D, 0.01 mg/L kinetin) ortamında inkübe edilmiş, 12. günde DDV-R (Dumas de Vaulx temel ortamı, 0.1 mg/L kinetin) ortamına aktarılmışlardır. Bu çalışmalardan embriyo elde edilememiştir.
Çift katmanlı sistemde rejenerasyon ortamı olarak %2 maltoz, %1 AC ve %0.6 agar içeren yarı katı alt tabaka ile %2 maltoz, 2.5 μM zeatin ve 5 μM IAA içeren sıvı üst tabakadan oluşan NN ortamı kullanılmıştır. Farklı biber hatlarında androgenesis etkinliğini arttırmak için rejenerasyon ortamına eklenen farklı sefotaksim (0 veya 250 mg/L), agar miktarı (%0.6 veya %0.8) ve agar kaynağı (Sigma, Duchefa) ile sıvı ortam miktarı (1.5 mL veya 3 mL), sıvı ortamın çalkalanması (0 veya 100 rpm), katı ortam miktarı (3 mL veya 5 mL) gibi faktörlerin etkisi incelenmiştir. Rejenerasyon ortamında oluşan embriyolar, 0.1 μM BA, %2 sakkaroz ve %0.6-0.9 agar içeren MS ortamında çimlendirilmiş ve aynı ortamda köklendirilmiştir.
Çift katmanlı kültür ortamının katı tabakasına eklenen %0.8 agar (36.81 embriyo/100 anter), %0.6 agara (19.54 embriyo/100 anter) kıyasla daha yüksek embriyo üretmiş ve her iki uygulamada 3 genotipten toplam 12 bitki gelişerek saksılara dikilmiştir. Ortamlara eklenen 250 mg/L'lik sefotaksim konsatrasyonunun kontaminasyonları azalttığı ve dolayısıyla embriyo üretimini arttırdığı, sıvı ortam miktarı ile çalkalama kombinasyonu uygulamalarından çalkalanmayan ve 1.5 mL sıvı ortam kullanılan kültürlerden embriyo (33.74 embriyo/100 anter) ve ÜçHat1 hattından 1 bitki elde edilmiştir. Farklı katı ve sıvı ortam miktarı ile farklı agar kaynağının kombine edildiği çalışmada, Duchefa agarı embriyo oluşumunda önemli bir fark yaratmamış, bitki üretiminde ise daha olumlu sonuçlar vermiştir. ÜçHat1 hattında oluşan 4 bitkinin tümü Duchefa agarı kullanılan uygulamalardan üretilmiştir.
Çift katmanlı androgenesis yöntemi ile üretilen toplam 18 androjenik bitkinin stoma bekçi hücrelerinde yapılan kloroplast sayımları ile bitki çiçek, yaprak, meyve ve tohum gözlemleri sonucu 5 bitkinin haploid, 13 bitkinin ise diploid/dihaploid (DH) olduğu tespit edilmiştir. Haploid bitkilerin sürgün ucu ve tomurcuklarına 22.2 µM BAP içeren MS ortamında %0.04, 0.2 veya 0.4 kolhisin dozlarının 3 veya 6 gün süreyle uygulanması DH bitkilerin üretilmesini sağlayamamıştır.

Abstract:
The most important problems for growers of Hatay local pepper are the non-uniform fruit production and sensitivity to some diseases and pests. The objectives of this investigation are improving an efficient adrogenesis protocol for Hatay local pepper, and producing some pure lines. In this research, 4 pepper lines selected from Hatay pepper, two-stage anther culture and shed-microspore culture methods were used. 
In the two-stage anther culture, the anthers were incubated in the DDV-C medium (Dumas de Vaulx basal medium, 0.01 mg/L 2,4-D, 0.01 mg/L kinetin) supplemented with active coal (AC) (0.0 or 0.5%) and cefatoxime (0.0 or 250 mg/L), and transferred to the DDV-R medium on the 12th day. Ebmryo was not obtained in these experiments.
In shed-microspore culture, NN medium consisting of semi-solid lower layer containing 2%maltose, 1%(AC) and 0.6%agar and liquid top layer containing 2%maltose, 2.5 µM zeatin and 5 µM IAA were used as regenation medium. In order to increase the efficiency of androgenesis in different pepper lines, the effects of sefotaxime (0 or 250 mg/L), agar (0.6 or 0.8%) and agar source (Sigma or Duchefa) added to the regeneration medium, and of the factors such as amount of liquid medium (1.5 or 3 mL), agitation of liquid medium (0 or 100 rpm) and amount of solid medium (3 or 5 mL) were examined. The embryos obtained in the regeneration media were germinated in MS medium containing 0.1 µM BA, 2%sucrose and 0.6-0.9%agar, and rooted in the same medium. 
The 0.8%agar in the solid layer of the shed-microspore culture medium produced more embryo (36.81 embryo/100 anther) than that of 0.6%agar (19.54 embryo/100 anther), and 12 plants were obtained from 3 genotypes in both agar concentration. It was determined that the 250 mg/L cefotaxime added to the media reduced contamination and thus increases embryo production. Embryos (33.74 embryo/100 anther) were obtained from the 1.5 mL liquid medium that not agitated among the applications created by combination of agitation with different amounts of liquid media, and 1 plant was regenerated in ÜçHat1. In the other experiment in which different solid medium (soliditied with different agar sources) amounts and liquid medium amounts have been combined, Duchefa agar has not made a significant effect on embryo formation; however, it had positive effects on plant production. All the 4 androgenic plants of ÜçHat1 were produced from the media with Duchefa agar.
As a result of chloroplast counting made in the stomatal guard cells and observation of plant flower, leaf size, fruit and seed formation of 18 androgenic plants obtained from the shed-microspore culture, it was determined that 5 plants were haploid and 13 plants were diploid/dihaploid (DH). Application of the 0.04, 0.2 or 0.4%colchicine concentrations in MS medium containing 22.2 µM BAP to shoot tips and lateral buds of haploid pepper plants for 3 or 6 days failed to produce DH plants.