Penisilinle oluşturulan epileptiform aktivite üzerine ghrelinin gösterdiği inhibitör etkide kanabinoid CB1 reseptörünün rolü
The role of the cannabinoid CB1 receptors in the inhibitor effect of ghrelin on penicilin-induced epileptiform activity
Yazar: GÖKHAN ARSLAN
Danışman: PROF. DR. ERDAL AĞAR
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Epilepsi = Epilepsy ; Ghrelin = Ghrelin ; Kanabinoidler = Cannabinoids ; Penisilinler = Penicillins

Özet:
Epilepsi, sinir sistemini etkileyen tekrarlayan nöbetlerle karakterize olan en yaygın nörolojik hastalıklardan birisidir. Yapılan çalışmalarda ghrelin ile epilepsi arasında bir ilişkinin olduğu belirtilmiştir. Ghrelinin epileptik aktivite üzerine antikonvulsan etkisi bulunmaktadır. Kanabinoidler ise, bağımlılık yapıcı etkileri başta olmak üzere merkezi sinir sisteminde birçok fonksiyona sahip kimyasal bileşiklerdir. Kanabinoidlerin de epileptik nöbetlerin düzenlenmesinde rol oynadığı çok uzun zamandır bilinmektedir. Ancak, ne ghrelinin ne de kanabinoidlerin epileptiform aktiveyi hangi yollarla azalttığı bilinmemektedir. Sunulan çalışmanın amacı, sıçanlarda ghrelin ve kanabinoidlerin, birlikte uygulandığında epileptiform aktivite üzerine nasıl etki gösterdiklerini araştırmaktır. Yapılan deneylerde ağırlıkları 200-250 gr arasında değişen 168 adet Wistar albino erkek sıçan kullanıldı.
    Uyanık sıçanlarda, ghrelin ve kanabinoid etkileşimini bulmayı amaçladığımız bu çalışmada, 300 IU penisilin-G i.s.v. kanül aracığıyla lateral ventriküle enjekte edildi. Penisilin enjeksiyonundan sonra 2 dakika içinde spike aktivitesi başladı. Spike dalga deşarjlarının iktal ve interiktal olmak üzere 2 farklı formda olduğu gözlendi. İktal nöbetler esnasında hayvanlarda jeneralize tonik-klonik nöbetler gözlenirken, interiktal dönemde klonik kasılmalar tespit edildi. AM-251 (0.25 µg) ve ACEA (7.5 µg) dozlarında uyanık sıçanlara uygulandı. Hayvan davranışları, iktal ve interiktal deşarjlar ayrı ayrı hesaplanarak kontrol grubuyla karşılaştırıldı. AM-251 (0.25 µg) grubu kontrol grubuyla karşılaştırıldığında nöbet evresini, iktal nöbet sayısını, iktal spike sayısını ve interiktal spike sayısını anlamlı oranda arttırırken, ACEA (7.5 µg) bu değerlerin hepsini anlamlı olarak azalttı. Uyanık sıçan deneylerinde, hayvanların mortalitesinin çok yüksek olması (% 34), çalışmanın gidişatını önemli ölçüde etkiledi. Bu yüzden, anestezili sıçana AM-251 (0.25 µg) ve ACEA (7.5 µg) dozları uygulanarak uyanık sıçan deneyleriyle karşılaştırıldı. AM-251 (0.25 µg) her iki grupta da yüzde spike frekansını kontrol grubuna göre 30. dakikada istatistiksel açıdan anlamlı biçimde artırdı. ACEA (7.5 µg) ise uyanık sıçan grubunda 70. dakikada yüzde spike frekansını anlamlı düzeyde azaltırken, anestezi altındaki sıçanlarda bu düşüş 60. Dakikada anlamlı hale geldi. Uyanık sıçan deneyleri ile anestezi altındaki deneyler arasında büyük bir korelasyon tespit edildikten sonra, ghrelin ve kanabinoidler arasındaki etkileşim deneylerini anestezili sıçanlarda uygulamaya karar verildi.
    Anestezili sıçanlarda ghrelin 1 µg dozu 60. dakikadan itibaren spike frekansını anlamlı düzeyde düşürürken, ghrelin 0.5 µg dozu 180 dk boyunca anlamlı bir düşüş oluşturamadı. Kanabinoid reseptör antagonisti AM-251?in 0.5 µg dozunda ise 40. dakikadan itibaren anlamlı bir artış meydana geldi. Bu doz etkileşim çalışmalarında yüksek doz olarak seçildi. Ghrelin (1 µg) ve AM-251 (0.25 µg) birlikte uygulandığında ghrelin (1 µg), AM-251 (0.25 µg)?in prokonvulsan etkisini baskıladı. Ancak ACEA (7.5 µg) ile birlikte AM-251 (0.25 µg) birlikte verildiğinde, ACEA (7.5 µg), AM-251 (0.25 µg)?in prokonvulsan aktivitesini engelleyemedi. Yine ghrelin (1 µg) ile AM-251 (0.5 µg) beraber uygulandığında, ghrelin (1 µg), AM-251 (0.5 µg)?in prokonvulsan aktivitesini bloklayarak kontrol grubuna yaklaştırdı. ACEA?nın etkisiz dozu (2.5 µg) ile ghrelinin etkisiz dozu (0.5 µg) birlikte verildiğinde antikonvulsan etki ortaya çıktı. Bu iki etkisiz dozla birlikte AM-251 (0.25 µg) uygulandığında ise ghrelin (0.5 µg) + ACEA (2.5 µg) kombinasyonu, AM-251 (0.25 µg)?in prokonvulsan etkisini bloklayarak kontrol grubuna yaklaştırdı. Bunun yanında, ghrelin (0.5 µg) + ACEA (2.5 µg) kombinasyonu AM-251 (0.5 µg)?in etkisini tamamen bloklayamasa da, AM-251 (0.5 µg)?in kontrol grubuna göre 40. dakika başlayan spike yüzde frekansını artırıcı etkisini 120. dakikaya kadar uzamasına neden oldu. Ghrelin (1 µg) ile ACEA (7.5 µg) beraber uygulandığında ise, ne tek başına uygulanan ghreline (1 µg) göre, ne de tek başına uygulanan ACEA (7.5 µg)?ya göre anlamlı bir fark ortaya çıkaramadı. Yani ghrelin ve ACEA sinerjist etki göstermedi. Buradan yola çıkarak, ghrelin ve ACEA?nın aynı reseptör için yarışma halinde olduğu düşünülmektedir. Ghrelin (1 µg) + ACEA (7.5 µg) kombinasyonu hem AM-251 (0.25 µg)? in hem de AM-251 (0.5 µg)?in prokonvulsan etkisini blokladı ancak tersine çeviremedi. 
    Sonuç olarak, literatürde ghrelin ile kanabinoid etkileşimini gösteren çok az sayıda çalışma mevcuttur. Besin alımı ve metabolizma çalışmalarında ghrelinin protein kinaz-C üzerinden endokanabinoid sentezini arttırdığı gösterilmiştir. Ghrelinin, AM-251?in prokonvulsan aktivitesini bloklaması, etkisiz doz ghrelin (0.5 µg) ile etkisiz doz ACEA (2.5 µg) kombinasyonunun birlikte verildiğinde antikonvulsan aktiviteye neden olması ve ghrelin (1 µg) + ACEA (7.5 µg) grubunun sinerjist etki göstermemesi, ghrelin hormonunun endokanabinoid salgısını arttırarak, kanabinoid reseptör sistemi üzerinden antikonvulsan etki gösterdiğini düşündürmektedir. Ancak, ghrelinin endokanabinoid sistem üzerindeki etkisinin kanıtlanabilmesi için ileri düzey moleküler çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Epilepsy is a common neurological disorder which is characterized by repetitive seizures affecting nervous system. The relationship between ghrelin and epilepsy had been specified by previous works. Ghrelin has an anticonvulsant effect on epileptic activity. On the other hand, cannobinoids are chemical compounds that have numerous effects on central nervous system, especially addictive effect. The role of cannobinoids on the regulation of epileptic seizures had been known for a long time. Nevertheless, it is not known neither ghrelin nor cannobinoids reduce epileptiform activity by which mechanisms. The purpose of this study is to investigate the effect of ghrelin and cannobinoids on epileptiform activity in rats when used together. 168 number of male wistar albino rats weighing from 200-250 g were used in the experiments.
    In this study, we aimed to find the interaction of ghrelin and cannabinoids on awake rats. 300 IU penicilin-G was injected into the lateral ventricle by a i.c.v cannula. The spike activity started within two minutes after the penicillin injection. It has been observed that the spike-wave discharges were in two different forms as ictal and interictal. Generalized tonic-clonic seizures were observed during the ictal seizures and clonic seizures were detected in interictal period. AM-251 (0.25 µg) and ACEA (7.5 µg) were applied to the awake rats. Behavior of animals and discharges in ictal and interictal periods were calculated separately and compared with the control group. When compared with the control group, it was seen that the seizure degree, the number of ictal seizures, the number of ictal spikes and the number of interictal spikes were significantly increased by AM-251 (0.25 µg), whether ACEA (7.5 µg) reduced all of these values significantly. The high mortality rates (%34) of animals in the awake rat experiments affected the course of the study significantly. Therefore AM-251 (0.25 µg) and ACEA (7.5 µg) doses were applied to the anesthetized rat and were compared by the awake rat experiments. AM-251 (0.25 µg) increased the percentage of spike frequency at 30 minutes in both groups significantly when compared with the control group. On the other hand ACEA (7.5 µg) decreased the percentage of spike frequency at 70 th minutes in the awake rat group significantly. This reduction became significant at 60 th minutes in the anesthetized rat group. After establishing a great correlation between awake rat experiments and anesthetized rat experiments, we decided to make the interaction experiments between ghrelin and cannabinoids in the anesthetized rats.
    Although, 1 µg dose of ghrelin decreases the spike frequency significantly since 60th minutes, 0.5 µg dose of ghrelin was unable to create a significant decrease through 180 minutes in the anesthetized rats. At the dose of AM-251 0.5 µg, a significant increase occured from 40th minutes on and AM-251 0.5 µg was decided the highly effective dose of cannabinoid receptor antagonist. When Ghrelin (1 µg) and AM-251 (0.25 µg) were given together, ghrelin (1 µg) supressed the proconvulsant effect of AM-251 (0.25 µg). However, ACEA (7.5 µg) did not show an effect on the proconvulsant activity of AM-251 (0.25 µg). Nevertheless, ghrelin (1 µg) blocked the proconvulsant activity of AM-251 (0.5 µg) and brought closer to the control group. When the ineffective doses of gherelin (0.5 µg)  and ACEA (2.5 µg) were applied together, an anticonvulsant effect occured. If, AM-251 (0.25 µg) was administered with this two ineffective doses,  ghrelin (0.5 µg) + ACEA (2.5 µg) combination  blocked the proconvulsant effect of AM-251 (0.25 µg) and brought closer to the control group. Beside this, ghrelin (0.5 µg) + ACEA (2.5 µg) combination could not completely block the effect of AM-251 (0.5 µg), but it caused of AM-251 (0.5 µg) showing its effect since 120 th minutes by extending its effect 80 minutes more, of which effect began at 40 th minutes before. When Ghrelin (1 µg) and ACEA (7.5 µg) were applied together, there was not a significant compared when they were used alone. In other words ghrelin and ACEA did not show a synergistic effect. The Ghrelin (1 µg) + ACEA (7.5 µg) combination blocked the proconvulsant effect of both AM-251 (0.25 µg) and AM-251 (0.5 µg) but could not reverse.
    As a result, there are few studies in the literature showing interaction between ghrelin and cannabinoids. In food intake and metabolism studies, it was shown that ghrelin increases the synthesis of endocannabinoid via protein kinase-C. Blocking of proconvulsant activity of AM-251 by ghrelin, causing of ineffective dose of ghrelin (0.5 µg) + ACEA (2.5 µg) combination to anticonvulsant activity and ineffectiveness of ghrelin (1 µg) + ACEA (7.5 µg) combination on synergistic activity suggest that the hormone ghrelin acts through cannabinoid receptor system via endocannabioid release. However, advanced molecular studies are needed to confirm the effect of ghrelin on the endocannabinoid system.