HEP3B hücrelerinde vegf sitokininin adamts-1 geni üzerine etkilerinin belirlenmesi
Determination the effect of vegf cytokines on the adamts-1 gene in the HEP3B cells
Yazar: KUBİLAY TUĞRUL GÜNERHAN
Danışman: PROF. DR. FERAY KÖÇKAR
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
ADAMTS-1 (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-1), Trombospondin tip I motifleri ile ADAM ailesi üyelerinden ayrılmakta ve günümüzde ADAMTS ailesinin ilk üyesi olarak tanımlanmaktadır. Yapılan çalışmalar ADAMTS-1'in VEGF'i (Vascular Endothelial Growth Factor) baskılayan bir protein olduğunu göstermektedir. Bir sitokin olan VEGF165'in oluşturduğu sinyalin baskılanması anjiyogenezi inhibe eder ve aynı zamanda tümör şiddetini azaltır. Çalışmamızın amacı, VEGF sitokininin normal oksijen ve kimyasal indüklenmiş düşük oksijen koşullarında, ADAMTS-1, VEGF ve HIF1α  gen ifadesi üzerinde etkilerinin araştırılmasıdır. 
VEGF165 sitokininin karaciğer kanser hücreleri üzerinde, geç saatlerde proliferatif etki gösterdiği, MTT analizi ile belirlenmiştir. Hipoksik koşullar ADAMTS-1 gen ifadesini karaciğer hücrelerinde arttırmaktadır. VEGF165 sitokini ise, ADAMTS-1 mRNA'sını her iki koşulda da arttırmaktadır. Bu artış,  immunflorasan analizleri ile protein düzeyinde de doğrulanmıştır. ADAMTS-1 promotor parçaları, HEP3B hücrelerine geçici olarak transfekte edilmiş ve VEGF165 sitokin uygulanarak traskripsiyonel aktivite belirlenmiştir. VEGF165 sitokini normal oksijen şartlarında  -1415/+419 ADAMTS-1 promotor parçasında transkripsiyonel aktivitede etki göstermemiştir, ancak hipoksik şartlarda -129/+419 promotor parçasında transkripsiyonel aktivite artış göstermiştir. VEGF165 sitokinin ADAMTS-1 üzerinde etkisi, kemik kanseri modelinde mRNA düzeyinde araştırılmış, farklı bir dokuda da benzer etki gösterdiği saptanmıştır. VEGF165, HIF1α mRNA'sını normal oksijen koşullarında bir miktar, düşük oksijen koşullarında daha fazla arttırdığı belirlenmiştir. Ayrıca, VEGF165 sitokinin, kendi mRNA'sında önemli bir artış göstermemektedir. VEGF165'in hangi hücre içi sinyal iletim yolundan etkisini gösterdiğinin anlaşılması için, farklı yolak inhibitörleri uygulanmış ve ADAMTS-1 üzerinde etkileri araştırılmıştır. Buna göre VEGF165, ADAMTS-1 mRNA'sını, normal oksijen koşullarında, MAPK, PI3K ve JNK yolları üzerinden düzenlemektedir. Hipoksik koşullarda PI3K yolunu kullanmaktadır.

Abstract:
ADAMTS-1 (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-1) was identified as the first member of ADAMTS family. Previous studies show that ADAMTS-1 that is a matrix metaloprotein inhibits VEGF165 (Vascular Endothelial Growth Factor). Therefore, the inhibition of VEGF165 signal that is main regulator of angionegenes supresses angiogenesis and consequently reduces the tumorigenesis. Therefore, the aim of the study is to investigate the effects of VEGF on ADAMTS-1, HIF1α and VEGF gene expression under normal (normoxic) and low (hypoxic) oxygen conditions. 
VEGF165 exhibits the proliferative effect at the late time in the HEP3B cells determined by MTT cells. Hypoxic conditions increase the ADAMTS-1 gene expressions in HEP3B cells. VEGF165 also upregulates ADAMTS-1 mRNA in normoxia and hypoxia. This incresae was confirmed by Immunfloresence analysis at the protein level. Transcriptional activity of ADAMTS-1 promoter fragments by VEGF165 was determined by transient transfection assay followed by reporter assays. VEGF165 cytokine dont give any effect for -1415/+419 ADAMTS-1 promoter constructs in normoxic condition. However, VEGF165 mediated trancriptional activity of ADAMTS-1 was increased for -129/+419 promoter construct. In addition, the effect of VEGF165 on ADAMTS-1 mRNA was also investigated in different cancer model, osteosarcoma model (SAOS-2). Similar increasing effect was observed. VEGF165 cytokine led to increase HIF1α mRNA to some extent, in normoxic condition whereas, drastic increase in hypoxic condition. Interestingly, VEGF165 does not give any effect on VEGF mRNA level. Different pathway inhibitors have been used for identifying which pathway is important for VEGF165 mediated ADAMTS-1 regulation. VEGF165 regulates ADAMTS-1 gene expression via MAPK, PI3K and JNK pathways in normoxic conditions whereas, PI3K is important pathway in hypoxic condition.