Spontan hipertansif ve normotansif rat aortası vasküler düz kas hücrelerinden yapılan primer hücre kültüründe Ang II uyarımının NAD(P)H Oksidaz enzim kompleksi üzerinden süperoksit anyonu üretimine etkisi ve bu metabolik yolda Src'nin rolü
Effect of Ang II on the generation of superoxide anion via NAD(P)H Oxidase enzyme complex in primary cultured vascular smooth muscle cells isolated from spontaneously hypertensive and normotensive rat aortas, and role of Src in this metabolic pathway
Yazar: FATİH UZUNER
Danışman: PROF. DR. AKIN YEŞİLKAYA
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Süperoksit anyonunun hipertansiyonun gelişiminde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Anjiyotensin II (Ang II), hipertansiyon, aterosikleroz ve diyabette görülen vasküler hasarın karakteristik özellikleri olan değişen vasküler tonüs, endoteliyal disfonksiyonu, yapısal yeniden yapılanma ve vasküler inflamasyonun oluşmasına katılır. Ang II uyarımı, G protein bağımlı membran reseptörleri olan Ang II reseptörü 1 (AT1R) ve Ang II reseptörü 2 (AT2R) üzerinden gerçekleşir. Ang II reseptörü 1 (AT1R)'in fizyolojik rolü AT2R'ne göre daha önemlidir. Vasküler hücrelerde en iyi tanımlanan sistem, hipertansiyonun düzenleyicisi gibi düşünülen, Ang II-uyarımlı NAD(P)H oksidaz ilişkili süperoksit anyonu oluşumudurBu çalışmamızda, vasküler düz kas hücreleri (VDKH) spontan hipertansif (SHR) ve normotansif wistar kyoto (WKY) ratların torasik aortalarından elde edilmiştir. Vasküler düz kas hücreleri, AT1R-ilişkili NAD(P)H oksidaz aktivasyonu üzerinden Src fosforilasyonu ve süperoksit anyonu oluşumunun belirlenmesi için Ang II ile uyarıldı ve/veya Losartan (AT1 reseptör blokörü), difenil iodonium (DPI; NAD(P)H oksidaz inhibitörü), PP1 (Src inhibitörü) ve GF109203X (PKC inhibitörü) ile inkübe edildi. Src fosforilasyunu western blot metoduyla, süperoksit anyonu oluşumu sitokrom C redüksiyon yöntemi ile ölçüldü.Src fosforilasyonu, Ang II uyarımı sonrasında hem SHR hem de WKY gruplarında kontrole göre artış gösterdi. Diğer taraftan, DPI dışındaki bütün inhibitör uygulamaları Src fosforilasyonunu her iki grupta da azalttı. Ang II-uyarımlı hücrelerde, her iki grupta da, süperoksit anyonu oluşumunda artış olduğu belirlendi. Ancak süperoksit anyonu oluşumunun SHR grubunda, WKY grubuna göre anlamlı derecede yüksek olduğu gözlemlendi. Ang II uyarımına rağmen, tüm inhibitor uygulamalarında her iki grupta da oluşan süperoksit anyonu miktarlarında azalma tespit edildiSonuçlarımıza göre, Src ve PKC fosforilasyonunun NAD(P)H oksidaz aktivasyonundan önce meydana geldiğini söyleyebiliriz. Ang II uyarımlı NAD(P)H oksidaz aktivasyonunun Src üzerinden gerçekleştiği çalışmamızda gösterilmiştir ve bu mekanizma antihipertansif ilaçların geliştirilmesinde önemli olabilir.

Abstract:
It is known that superoxide anion has an important role in progressing hypertension. Ang II contributes to altered vascular tone, endothelial dysfunction, structural remodeling and vascular inflammation, characteristic features of vascular damage in hypertension, atherosclerosis and diabetes. Ang II induces its effects via at least two G-protein-coupled transmembrane receptors, Ang II receptor 1 (AT1R) and Ang II receptor 2 (AT2R), of which the former is considered to be more physiologically important. The best characterized system in vascular cells is Ang II-stimulated NAD(P)H oxidase-mediated generation of superoxide anion, which appears to be upregulated in hypertension.In our present study, vascular smooth muscle cells (VSMC) were isolated from thoracic aortas of spontaneously hypertensive rats (SHR) and normotensive Wistar Kyoto rats (WKY). Vascular smooth muscle cells, to determine the AT1R-mediated Src phosphorylation and superoxide anion production via NADPH oxidase, were stimulated with Ang II with or without Losartan (AT1 receptor blocker), diphenyl iodonium (DPI; NAD(P)H oxidase inhibitor), PP1 (a selective Src inhibitor) and GF109203X (PKC inhibitor). Src phosphorylation was determined by western blot method. Superoxide anion production was measured by cytochrom c reduction method.Src phosphorylation increased both SHR and WKY groups after Ang II stimulation compared with controls. On the other hand, Src phosphorylations were decreased both SHR and WKY groups after Ang II stimulation with inhibitors except DPI. Superoxide anion production was enhanced in both two groups in Ang II-stimulated cells. However superoxide anion production in SHR was significantly greater than WKY. All inhibitors reduced superoxide anion production both SHR and WKY groups in spite of Ang II stimulation.According to our results, we found that Src and PKC phosphorylation may occur before the NAD(P)H activation. We showed that Ang II induced NADPH oxidase via Src and this mechanism may be important in developing drugs and medicine against hypertension.