Kefir danesinden izole edilen Kluyveromyces marxianus'dan üretilen β-galaktosidaz enziminin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu
Partial purification and characterization of β-galactosidase enzyme produced by Kluyveromyces marxianus isolated from kefir grains
Yazar: SEDA ÖZARSLAN
Danışman: DOÇ. DR. TUĞBA KÖK TAŞ
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Son yıllarda enzim endüstrisine olan ilgi birçok alanda kullanılmalarından dolayı giderek artmaktadır. Gerçek kefir, kefir daneleri kullanılarak üretilmektedir. Kefir danesi, geniş bakteri grubu ve mayaları kapsayan çok özel kompleks bir yapıdır. Kluyveromyces marxianus kefirde bulunan önemli bir mayadır ve birden fazla enzim üretme yeteneğine sahiptir. Bu enzimlerden biri olan β-galaktosidaz, son yıllarda uygulama alanı artan ve ticari olarak önemli olan enzimlerden birisidir.
Bu tez çalışmasında kefir danesinden izole edilen Kluyveromyces marxianus kullanılarak β-galaktosidaz üretimi; sıcaklık (25-27-30-33-35-37 °C ), pH ( 4.0-7.0-8.0) ve süre (12-24-36-48-60 saat) bakımından optimize edilmiştir. Enzim üretimi boyunca fermantasyon ortamında laktoz, glukoz, galaktoz, laktik asit ve etanol konsantrasyonlarında meydana gelen değişim yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak tespit edilmiştir. Optimum şartlarda üretilen β-galaktosidaz, iyon değişim (HiTrap DEAE Sepharose FF) ve afinite kromatografisi (HisTrap FF) yöntemleri ile kısmi olarak saflaştırılmıştır. Kısmi saflaştırılan enzim optimum pH ve sıcaklık, pH ve sıcaklık stabilitesi ve Km-Vmax sabitleri yönünden karakterize edilmiştir.
β-galaktosidaz üretimi için optimum koşullar pH 8.0, 30°C ve 48. saat olarak belirlenmiştir. Fermantasyonun başında ortamda bulunan laktozun fermantasyon boyunca kullanıldığı ve 60. saatte en düşük konsatrasyona ulaştığı görülmüştür. Fermantasyonun başında tespit edilemeyen glukoz, 36. saatte en yüksek konsantrasyona ulaşmış ve daha sonra giderek azalmıştır. Galaktoz ise 24. saatten sonra tamamen tüketilmiştir. Laktik asit 24. saatinde en yüksek konsantrasyona ulaşmış ve fermantasyon boyunca azalmaya devam etmiştir. Etanol ise en yüksek konsantrasyonuna 36. saatte ulaşmış ve diğer saatlerde tüketilmeye devam etmiştir.
Saflaştırma işlemlerinden sonra enzim % 87.77 verimle 6.27 kat saflaştırılmış ve spesifik enzim aktivitesi 296.87 U/mg olarak belirlenmiştir. Enzimin optimum pH'sı 6.0 ve sıcaklığının 40°C olduğu aynı pH ve sıcaklık değerlerinde stabilitesini koruduğu görülmüştür. Subtrat olarak ONPG kullanılarak, enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0.116 mM, 129.87 U/ml olarak belirlenmiştir. Enzim molekül ağırlığı SDS-PAGE tekniği ile belirlenmiştir. Elde edilen veriler değerlendirildiğinde bu çalışmada saflaştırdığımız β-galaktosidaz 15 dakikalık reaksiyon sonrasında % 83.1 verimle çalışarak laktozu hidrolize etmiştir.
Doğal bir maya olan Kluyveromyces marxianus'un optimum pH ve sıcaklık parametreleri ile β-galaktosidazın süt ve süt ürünleri endüstrisinde kullanılabileceği ve biyo-etanol üreticisi olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
In recent years, interest in the enzyme industry has been increasing due to the use of enzymes in many areas. The authentic kefir is produced using kefir grains. Kefir grain has a very complex structure containing a wide range of bacteria and yeasts. Kluyveromyces marxianus is an important yeast found in kefir and is capable of producing more than one enzyme. One of these enzymes, β-galactosidase has broadened its area of use and has gained commercial importance in recent years.
In this dissertation study, β-galactosidase production using Kluyveromyces marxianus isolated from kefir grains was optimized in terms of temperature (25-27-30-33-35-37°C), pH (4.0-7.0-8.0) and duration (12-24-36-48-60 hours). The changes in lactose, glucose, galactose, lactic acid and ethanol concentrations in the fermentation medium during the enzyme production was determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). β-galactosidase that was produced under optimum conditions was partially purified by ion exchange (HiTrap DEAE Sepharose FF) and affinity chromatography (HisTrap FF) methods. The partially purified enzyme was characterized in terms of optimum pH and temperature, pH and temperature stability, and Km-Vmax constants.
Optimum conditions for β-galactosidase production were determined to be pH 8.0, 30 °C and 48 hours. It was determined that lactose found in the medium at the beginning of the fermentation was used during fermentation and reached the lowest concentration at the 60th hour. Glucose, which could not be detected at the beginning of the fermentation, reached the highest concentration at the 36th hour and then gradually decreased. Galactose was completely metabolized after 24 hours. Lactic acid reached its highest concentration at the 24th hour and continued to decrease throughout the fermentation. Ethanol reached the highest concentration at the 36th hour and continued to be metabolized at the further hours.
Following the purification, the enzyme was purified 6.27-fold with 87.77% yield and specific enzyme activity was determined to be 296.87 U/mg. The optimum pH and temperature were 6.0 pH and 40°C, respectively, and the enzyme maintained its stability at these values. Using ONPG as substrate, the Km and Vmax values of the enzyme were
determined to be 0.116 mM, 129.87 U/mL, respectively. The enzyme molecular weight was determined by SDS-PAGE method. Evaluating the obtained data, it was seen that the β-galactosidase purified in this study hydrolyzed lactose by 83.1% yield after 15 minutes of reaction.
It was concluded that, with the optimum pH and temperature parameters for Kluyveromyces marxianus, a natural yeast, β-galactosidase produced can be used in the dairy industry and it that it is a bio-ethanol producer.