Embriyo atık kültür sıvısı örneklerinde humanin ve SMN ekspresyonlarının mitokondriyal kalite açısından karşılaştırılması
Comparison of humanin and smn expression levels indicative of mitochondrial qualifications in waste embryo culture media samples
Yazar: DUYGU KÜTÜK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ÇAĞRI ÖNER
Maltepe Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Embriyo = Embryo ; Embriyo kültür teknikleri = Embryo culture techniques ; Gen ifadesi = Gene expression ; Humanin = Humanin ; Kısırlık = Infertility ; Mitofaji = Mitophagy ; Mutasyon = Mutation ; Spinal musküler atrofi = Spinal muscular atrophy

Özet:
Humanin apoptozu ve stresi engelleyen, yaşam süresi ve sağlığı düzenleyen, yaşla birlikte azalan ve eksikliği ile patogenez oluşturan mitokondriyal türevli bir peptittir. Erken embriyonik gelişimde mitokondri, oositten embriyoya geçişte önemli bir organeldir. İmplantasyon öncesi embriyo gelişim sürecinde oosit hem fonksiyonel olarak hem de mtDNA içeriği açısından önemli olan mitokondrileri temel enerji kaynağı olarak kullanır. Mitokondriyal disfonksiyon, enerji ve metabolik değişiklikler Spinal müsküler atrofi 5. kromozomdaki SMN1 ve SMN2 genlerindeki mutasyonların neden olduğu otozomal resesif geçişli bir kas-motor nöron hastalığıdır. Tez çalışmasının amacı, normoresponder, polikistik over sendromu, genç ve ileri yaş düşük over rezervli hastaların embriyolarının geliştiği ve takibinin yapıldığı kültür sıvısında mitofaji markerlarının, humanin geninin ve SMA ile alakalı olduğu bilinen genlerin ekspresyon düzeylerinin karşılaştırılmasıdır.
Bahçeci Umut Tüp bebek merkezine başvuran Normoresponder (NR; Kontrol), Polikistik Over Sendromlu (PKOS), İleri (DOR-İ) ve Erken Yaş (DOR-G) Düşük Over Rezervli 50'şer hastanın 2-6 gün arasında gelişen embriyolarının içinde bulunduğu atık embriyo kültür sıvısı toplandı. Atık embriyo kültür sıvısı alınan örneklerden sırasıyla total RNA izolasyonu, revers transkripsiyon ve Real Time-PCR ile gen ekspresyonları belirlendi. Elde edilen veriler istatistiksel olarak SPSS 21.0 programı ile değerlendirildi. Elde edilen gen ekspresyonları NR (kontrol) grubuna göre, DOR-G grubunda MFN1, SMN2 (p<0,05), Humanin ve p53 gen ekspresyonlarında artma (p<0,001), PINK1 gen ekspresyonunda da azalma gözlendi (p<0.05). PKOS grubunda MFN2, PARKIN (p<0.05) ve PINK1 gen ekspresyonlarında ise kontrol grubuna göre azalma belirlendi (p<0.001). Sadece DOR-İ grubunun yaş ortalaması kontrol grubuna göre yüksek olduğu belirlendi (p<0.001). MFN2, PINK1 (p<0.001) ve Humanin gen ekspresyonlarında kontrol grubuna göre azalma gözlendi (p<0.05).
Atık olan bir sıvının non-invaziv olarak kadın infertilitesi tiplerindeki mitokondriyal disfonksiyon gibi önemli hücresel parametrelerin profilinin çıkartılabileceğini, embriyoya herhangi bir müdahale olmadan değerlendirilebileceğini ve çeşitli nadir hastalıkların çok önceden belirlenebileceğini kanıtlamaktadır.

Abstract:
Humanin is a mitochondrial derived peptide which prevents apoptosis and stress, regulates lifespan and health but its decrease with age and deficiency causes pathogenesis as well. Mitochondria is an important organelle in the oocyte to embryo transition in early embryonic development period. Since, in the embryo development at preimplantation stage oocyte uses mitochondria, that are significant both functionally and its mtDNA content as the main energy source. Mitochondrial dysfunction, energy and metabolic changes that leads to spinal muscular atrophy is an autosomal recessive muscle-motor neuron disease caused by mutations in the SMN1 and SMN2 genes on chromosome 5. The aim of this study is to compare the expression levels of mitophagy markers, humanin gene and genes these are known to be related to SMA of normoresponder (NOR), polycystic ovary syndrome (PKOS), young and older patients with low ovarian reserve (DOR) in the culture medium fluid in which embryos are developed and monitored. In order to obtain the samples for the project, waste embryo culture fluid was used, that include developing embryos between 2-6 days collected 50 of each group from Normoresponder (NR; Control), Polycystic Ovary Syndrome (PKOS), Advanced (DOR-I) and Early Age (DOR-G) which has low ovarian reserve who are applied to Bahçeci Umut IVF Center. Gene expressions were determined by applying the total RNA isolation, reverse transcription and Real Time-PCR, respectively to the samples which are taken from waste embryo culture fluid.The obtained data were evaluated statistically with SPSS 21.0 program. Gene expressions data compared to the NR (control) group showed that, while the MFN1, SMN2 (p<0.05),
Humanin and p53 gene expressions (p<0.001) increased the PINK1 gene expression decreased in the DOR-G group (p<0.05). A decrease in MFN2, PARKIN (p<0.05) and PINK1 gene expressions was determined in the PKOS group compared to the control group (p<0.001).In addition, only the average age of the DOR-I group was determined to be higher than the control group (p<0.001). Moreover, a decrease was observed in MFN2, PINK1 (p<0.001) and Humanin gene expressions compared to the control group (p<0.05). These mentioned results proves that, using waste embryo culture fluid non-invasively could be a profile of important cellular parameters such as mitochondrial dysfunction in female infertility. Therefore, the evaluation of significant various rare cellular parameters of such diseases can be done much earlier without any intervention to the embryo as well.