Ankara tekesi spermasının nanopürifiye edilerek dondurulması
Nanopurification and Freezing of Angora Buck Semen
Yazar: HAVVA ALEMDAR
Danışman: YRD. DOÇ. MEHMET BORGA TIRPAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2018
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Ankara keçisi = Angora goat ; Demir oksit = Iron oxide ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Keçiler = Goats ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Sperm = Spermatozoa ; Tekeler = Billygoats ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Tez çalışmasının amacı, güncel bir yöntem olan nanopartiküller ile sperm seleksiyonunun Ankara tekesi spermasında uygulanabilirliğinin araştırılmasıdır. Nanopartiküller ile sperm seleksiyonu, ya da diğer adıyla nanopürifikasyon işlemi, günümüze kadar 37ºC sıcaklıkta; insan, boğa ve domuz sperması üzerinde denenmiş bir yöntemdir. Tez çalışması kapsamında, nanopürifikasyon yönteminin saha koşullarına adapte edilebilmesi açısından farklı sıcaklıklarda (37ºC, 21ºC ve 4ºC) uygulanmasının sperma kalitesi üzerindeki etkilerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Ön çalışma olarak doz optimizasyonu (1µg/ml, 5µg/ml, 10µg/ml ve 20µg/ml) yapılmıştır. Doz optimizasyon çalışmasının sonucunda, bilgisayar-destekli sperm analiz (CASA) ekipmanı parametreleri (total motilite-TM, progresif motilite-PM, eğrisel hız-VCL, doğrusal hız-VSL, eğrisel yol doğrusallığı-LIN, ortalama yol doğrusallığı-STR, kararsızlık-WOB, sperm başının sapma mesafesi-ALH, çapraz geçiş frekans ritmi-BCF ve hiperaktivite) açısından herhangi bir farklılık belirlenmemiştir (p>0,05). Bu nedenle, farklı sıcaklıklarda nanopürifikasyon çalışması aşamasında, daha önce nanopürifikasyon hakkında çalışma yapmış olan araştırıcılardan elde edilen bilgiler doğrultusunda 10µg/ml dozunda nanopartikül kullanılmıştır. Tez çalışması kapsamında kullanılan 3 Ankara tekesinden elektro ejakülatör yardımı ile 7'şer tekrar oluşturulacak şekilde sperma örnekleri toplanmış; bu örneklerin her biri taze sperma muayeneleri gerçekleştirildikten ve sulandırıldıktan sonra 4 gruba bölünmüştür. İlk grup kontrol grubu olarak belirlenmiş ve rutin prosedürler ile ekilibrasyon sonrası sıvı azot buharında dondurularak sıvı azot içerisinde saklanmıştır. İkinci gruba 37ºC'de, 3. gruba 21ºC'de ve 4. gruba 4ºC'de nanopürifikasyon işlemi uygulanmış; sonrasında bu gruplar da rutin prosedür doğrultusunda ekilibrasyonu takiben sıvı azot buharında dondurularak sıvı azot içerisinde saklanmıştır. Sperma örneklerinin çözüm-sonu motilite ve morfolojik parametreleri analiz edilmiştir. Elde edilen bulgulara göre; 37ºC'de nanopürifikasyon işlemi sonrası kontrol grubuna göre TM (37ºC, %72,75; Kontrol, %60,48), PM (37ºC, %9,76; Kontrol, %5,15), VCL (37ºC, 58,31 µm/s; Kontrol, 39,80 µm/s), VSL (37ºC, 26,90 µm/s; Kontrol, 15,84 µm/s), LIN (37ºC, %45,42; Kontrol, %38,08) ve akrozom bütünlüğü (37ºC, %65,29; Kontrol, %32,02) parametreleri yüksek bulunurken (p<0,05); 21ºC'de nanopürifiye edilen sperma örneklerinin kontrol grubundan PM (21ºC, %9,82; Kontrol, %5,15), VCL (21ºC, 53,19 µm/s; Kontrol, 39,80 µm/s), VSL (21ºC, 26,17 µm/s; Kontrol, 15,84 µm/s), VAP (21ºC, 38,05 µm/s; Kontrol, 24,97 µm/s), LIN (21ºC, %47,61; Kontrol, %38,08), STR (21ºC, %68,03; Kontrol, %62,24), WOB (21ºC, %69,00; Kontrol, %62,10) ve akrozom bütünlüğü (21ºC, %49,10; Kontrol, %32,02) parametreleri açısından üstün olduğu belirlenmiştir (p<0,05). Kontrol grubu ile 4ºC grubu arasında anlamlı bir farklılık oluşmamıştır (p>0,05). Bu bulgulara göre, teke spermasında nanopürifikasyon işleminin fertiliteyi etkileyen parametreler açısından faydalı olduğu ve nanopürifikasyon işleminin saha koşullarına adapte edilmesi açısından 37ºC'nin yanı sıra 21ºC sıcaklıkta da uygulanabileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
The aim of the thesis study was to investigate the applicability of an up-to-date method, sperm selection with nanoparticles, on Angora buck semen. Sperm selection with nanoparticles, alias nanopurification, has been tried on human, bull and boar semen at 37ºC until today. Within the scope of the thesis study, determining the effects of application of the nanopurification method on the semen quality at different temperatures (37ºC, 21ºC and 4ºC) was targeted, in order to adapt the method to field conditions. Dose optimization (1µg/ml, 5µg/ml, 10µg/ml and 20µg/ml) was performed as a preliminary study. As a result of the döşe optimization study; no difference was observed in terms of computer-aided sperm analysis (CASA) equipment parameters (total motility-TM, progressive motility-PM, curvilinear velocity-VCL, straight line velocity-VSL, linearity-LIN, straightness-STR, wobble-WOB, amplitude of lateral head displacement-ALH, beat cross frequency-BCF and hyperactivity). Therefore, in the nanopurification in different temperatures stage of the study; in accordance with the information obtained from researchers who had previously studied nanopurification a nanoparticle dose of 10µg/ml was used. Semen samples were collected from 3 Angora bucks used in the thesis study to form 7 repetitions; each of these samples were divided into 4 groups after fresh semen analyses and dilution were completed. The first group was determined as control group and was preserved in liquid nitrogen after routine procedures of equilibration and freezing in liquid nitrogen vapour. Nanopurification procedure was applied to 2nd group at 37ºC, 3rd group at 21ºC and 4th group at 4ºC; and then these groups were preserved in liquid nitrogen after routine procedures of equilibration and freezing in liquid nitrogen vapour. Post-thaw motility and morphology parameters of the sperm samples were analysed. According to the findings; after nanopurification at 37ºC TM (37ºC, %72,75; Control, %60,48), PM (37ºC, %9,76; Control, %5,15), VCL (37ºC, 58,31 µm/s; Control, 39,80 µm/s), VSL (37ºC, 26,90 µm/s; Control, 15,84 µm/s), LIN (37ºC, %45,42; Control, %38,08) and acrosome integrity (37ºC, %65,29; Control, %32,02) parameters were higher than the control group (p<0.05); while the semen samples nanopurified at 21ºC were superior than control group in terms of PM (21ºC, %9,82; Control, %5,15), VCL (21ºC, 53,19 µm/s; Control, 39,80 µm/s), VSL (21ºC, 26,17 µm/s; Control, 15,84 µm/s), VAP (21ºC, 38,05 µm/s; Control, 24,97 µm/s), LIN (21ºC, %47,61; Control, %38,08), STR (21ºC, %68,03; Control, %62,24), WOB (21ºC, %69,00; Control, %62,10) and acrosome integrity (21ºC, %49,10; Control, %32,02) (p<0.05). There was no significant difference between the control group and 4ºC group (p>0.05). According to the findings it was concluded that, nanopurification procedure on buck semen was useful in terms of parameters that affect fertility and that nanopurification can be performed at 21ºC, as well as 37ºC, in order to adapt the procedure to field conditions.