Probiyotik kaynaklı paraprobiyotik ve postbiyotiğin yara iyileşmesi ve moleküler inflamasyon mekanizmasındaki rolü
The role of probiotic-derived paraprobiotic and postbiotic in wound healing and the mechanism of molecular inflammation
Yazar: MERVE İÇİN
Danışman: PROF. DR. BELMA ASLIM
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Yara enfeksiyonu = Wound infection ; Yaralar-delici olmayan = Wounds-nonpenetrating

Özet:
Yaralar, normal anatomik yapıda bir dizi işlev kaybıyla birlikte oluşan doku bozulmalarıdır. Mevcutta bulunan tedavi yöntemleri, yara iyileşme sürecinde yardımcı olsa da çoğu zaman yetersiz kalmaktadır. Bu durum göz önüne alındığında, özellikle kronik yaraları hedef alacak yeni ajanlara ve tedaviye yönelik yeni yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. Dolayısı ile son dönemde, kronik yaraları hedefleyen terapötik doğal biyoaktif bileşiklere yönelik çalışmalara ilgi artmıştır. Bu yüksek lisans tez çalışmasında, probiyotik Lactiplantibacillus plantarum GD2 suşundan elde edilen paraprobiyotik ve postbiyotiklerin deri yaralarının iyileşmesindeki potansiyel rollerinin birçok mekanizma üzerinden ortaya konulması amaçlanmaktadır. Paraprobiyotik ve postbiyotik uygulamalarının fibroblast migrasyonu üzerine etkisi L929 fare fibroblast hücreleri ile oluşturulan in vitro yara modelinde incelenmiştir. Paraprobiyotik ve postbiyotiklerin yarada yaygın olarak bulunan patojenler üzerindeki antimikrobiyal etkinlikleri broth mikrodilüsyon yöntemi ile belirlenmiştir. Yapılan uygulamaların, L929 hücrelerinde TGF-β1/Smad sinyal yolağı ile ilişkili genler (TGF-β1 ve Smad-2/3/4) ile ekstrasellüler matriks (ECM) proteinlerinden kollajen tip 1 alfa 1 (COL1A1), fibronektin (FN); Raw264.7 hücrelerinde anti-inflamatuar sitokinler ve lipopolisakkarit (LPS) ile indüklenerek oluşturulan inflamasyon modeli ile pro-inflamatuar sitokinlerin mRNA ekspresyon düzeyleri q-RT PCR yöntemi ile belirlenmiştir. In vitro yara modelinde, paraprobiyotiklerin yara iyileşmesinde postbiyotiklerden daha etkin olduğu, yarayı 12. saat itibari ile kapatarak iyileşme sürecini olumlu yönde etkilediği tespit edilmiştir (p<0,05). Her iki probiyotik kaynaklı ürünün de antimikrobiyal özelliğe sahip olduğu, patojen gelişimini durdurduğu ve inhibe ettiği belirlenmiştir. Postbiyotiklerin düşük dozlarda dahi paraprobiyotiklerden daha etkili antimikrobiyal özellik gösterdiği tespit edilmiştir. Postbiyotiklerin inhibisyonunun ağırlıkla asitliğe bağlı düşen pH ile ilişkili olduğu düşünülmüştür. Buna bağlı olarak, paraprobiyotik ve postbiyotikler patojenlerin gelişimini inhibe ederek yaranın kronikleşmesini önleyebilmektedirler. Postbiyotiklere kıyasla paraprobiyotik uygulamaları TGF-β1/Smad sinyal yolağında TGF-β1, Smad-2/3/4 genlerinin ekspresyon seviyelerini arttırarak yara iyileşmesinde oldukça etkilidir (p<0,05). Paraprobiyotik ve postbiyotiklerin COL1A1 ve FN gen ekspresyonu seviyelerini arttırarak ECM oluşumunda etkili olabilecekleri gösterilmiştir (p<0,05). Paraprobiyotik ve postbiyotiklerin pro-inflamatuar sitokinlerin aşırı üretimlerini baskılayarak yaranın kronikleşmesini önledikleri tespit edilmiş olup, anti-inflamatuar sitokinlerin ekspresyon seviyelerini arttırarak da pro-inflamatuar sitokin üretimini baskılayabildikleri belirlenmiştir (p<0,05). Ek olarak, bu iki probiyotik kaynaklı ürün, kronik yara oluşumunu engellerken aynı zamanda iyileşme sürecinde etkili pro-inflamatuar sitokinlerin oluşumunda da etkilidirler (p<0,05). Sonuçta, probiyotik kaynaklı paraprobiyotik ve postbiyotiklerin yara iyileşmesinin farklı mekanizmalarında her ikisinin de etkili olduğu ancak paraprobiyotiğin daha iyi sonuç verdiği belirlenmiştir. Sonuçlarımıza göre, yara iyileşme sürecinin tüm fazlarında etkili TGF-β1/Smad moleküler sinyal yolağı üzerinde etkili olması, ECM oluşumu ve yara kapatmada da aynı ölçüde başarı göstermesi ile özellikle paraprobiyotikler yara iyileşmesinde kullanılacak alternatif yeni terapötik bir ajan olarak önerilebilir. Aynı zamanda, paraprobiyotik ve postbiyotiklerin inflamasyondaki regülatör etkisi, patojen bakterileri inhibe ederek kronik yaraları önleyici ve tedavi edici özellikleriyle iyileşme sürecinde etkili oldukları belirlenmiştir. Bu durum, probiyotik kaynaklı paraprobiyotik ve postbiyotiklerin yara iyileşmesinde kullanılacak alternatif yeni ajanlar olabileceklerini göstermektedir.

Abstract:
Wounds are tissue disruptions that occur with a series of loss of functions in the normal anatomical structure. Although current treatment methods help in the wound healing process, they are often insufficient. Considering this situation, there is a need for new agents to specifically target chronic wounds and new approaches to treatment. Therefore, recently, there has been an increased interest in studies on therapeutic natural bioactive compounds targeting chronic wounds. In this master thesis, it is aimed to reveal the potential roles of paraprobiotics and postbiotics obtained from the probiotic Lactiplantibacillus plantarum GD2 strain in the healing of skin wounds through many mechanisms. The effects of paraprobiotic and postbiotic treatments on fibroblast migration were investigated in an in vitro wound model created with L929 mouse fibroblast cells. The antimicrobial activities of paraprobiotics and postbiotics on pathogens commonly found in the wound were determined by the broth microdilution method. The applications were made in L929 cells with genes associated with TGF-β1/Smad signaling pathway (TGF-β1 and Smad-2/3/4) and extracellular matrix (ECM) proteins collagen type 1 alpha 1 (COL1A1) and fibronectin (FN); the mRNA expression levels of pro-inflammatory cytokines in the inflammation model induced by lipopolysaccharide (LPS) and anti-inflammatory cytokines in Raw264.7 cells were determined by q-RT PCR method. In the in vitro wound model, it was determined that paraprobiotics were more effective than postbiotics in wound healing, and had a positive effect on the healing process by closing the wound as of the 12th hour (p<0.05). It has been determined that both probiotic-derived products have antimicrobial properties, stop and inhibit the development of pathogens. It has been determined that postbiotics show more effective antimicrobial properties than paraprobiotics even at low doses. The inhibition of postbiotics was thought to be predominantly related to the decreasing pH due to acidity. Accordingly, paraprobiotics and postbiotics can prevent the chronicity of the wound by inhibiting the development of pathogens. Compared to postbiotics, paraprobiotic treatments are highly effective in wound healing by increasing the expression levels of TGF-β1, Smad-2/3/4 genes in TGF-β1/Smad signaling pathway (p<0.05). It has been shown that paraprobiotics and postbiotics can be effective in ECM formation by increasing COL1A1 and FN gene expression levels (p<0.05). It was determined that paraprobiotics and postbiotics prevented the wound from becoming chronic by suppressing the excessive production of pro-inflammatory cytokines, and it was determined that they could suppress pro-inflammatory cytokine production by increasing the expression levels of inflammatory cytokines (p<0.05). In addition, these two probiotic-derived products are effective in the formation of pro-inflammatory cytokines that are effective in the healing process, while preventing the formation of chronic wounds (p<0.05). As a result, it was determined that both probiotic-derived paraprobiotics and postbiotics were effective in different mechanisms of wound healing, but paraprobiotic gave better results. According to our results, especially paraprobiotics can be recommended as an alternative new therapeutic agent to be used in wound healing, as they are effective on TGF-β1/Smad molecular signaling pathway, which is effective in all phases of the wound healing process, and with the same success in ECM formation and wound closure. At the same time, it has been determined that paraprobiotics and postbiotics are effective in the healing process with their regulatory effect on inflammation, inhibition of pathogenic bacteria, and preventive and therapeutic properties of chronic wounds. This shows that probiotic-derived paraprobiotics and postbiotics can be alternative new agents to be used in wound healing.