Histon deasetilaz inhibitör aktivitesinin florometrik yöntemle gösterilmesi
Investigations of histone deacetylase inhibitory activity with fluorescence-based technique
Yazar: GAMZE BORA
Danışman: PROF.DR. HAYAT ERDEM YURTER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
ÖZETBORA, G. Histon Deasetilaz nhibitör Aktivitesinin Florometrik Yöntemle Gösterilmesi.Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Programı YüksekLisans Tezi, Ankara, 2006. DNA paketlenmesinin temel birimi olan histonların aminokuyruklarında bulunan lizin amino asitlerinin asetilasyonu, en önemli post-translasyonelmodifikasyonlardan birisidir. Histon asetil transferazlar (HAT) histonlara asetil grubu takarakkromatinde lokal bir gevşemeye neden olmakta, böylece transkripsiyonun gerçekleşmesinisağlamaktadır. Histon deasetilaz enzimleri (HDAC) ise histonlardan asetil grubunu çıkartarakkromatinin sıkı paketlenmesini sağlamakta ve transkripsiyonu baskılanmaktadır. HDAC'larınhiston olmayan proteinlerin de deasetilasyonundan sorumlu olması ve büyük proteinkompleksleriyle birlikte bulunmaları biyolojik fonksiyonlarının çeşitliliğini göstermektedir.Son yıllarda, HDAC'ları inhibe edebilen farklı yapıda bileşikler tanımlanmış ve hücrebölünmesini durdurucu, apoptoz ve farklılaşmayı indükleyici etkilerinin olduğu, ayrıca genekspresyonunu %2-5 oranında değiştirdiği gösterilmiştir. Bu nedenle HDAC inhibitörleri tümdünyada çeşitli kalıtsal hastalıkların ve kanserin tedavisine yönelik çalışmalarda araştırılmayabaşlanmıştır. Laboratuvarımızda yürütülmekte olan ?RNA Splicing Hatalarının Neden OlduğuKalıtsal Hastalıklarda laç Araştırma Geliştirme Çalışmaları? başlıklı proje kapsamındaHDAC inhibitörlerinin modifikasyonu ve sentezi ile splicing hatalarını düzeltebilecek etkilibileşikler araştırılmaktadır. Tez çalışmamız bu projenin bir parçası olup, inhibitör olarakbilinen trikostatin A (TSA), 4-fenil bütirik asit (FBA), 4-fenil bütirik asit sodyum tuzu(NaFBA) ve sodyum bütirat (NaBA)'ın inhibisyon aktivitelerinin hücre dışı bir sistemde tayinedilmesini böylece ileriki aktivite tayini çalışmaları için tarama sisteminin hazır halegetirilmesini amaçlamıştır. ?HDAC nhibitör laç Tarama Kiti? kullanılarak gerçekleştirilenaktivite tayini deneylerinde HeLa çekirdek özütüne 11,75 ÂµM, 23,5 ÂµM, 47 ÂµM, 1000 ÂµM,2000 ÂµM TSA ile 23,5 ÂµM, 47 ÂµM, 500 ÂµM, 1000 ÂµM, 2000 ÂµM, 5000 ÂµM FBA, NaFBA veNaBA uygulanmış ve floresan değerlerde TSA: %92,8 NaBA: %29,6, FBA: %25,5 veNaFBA: %24,8 oranında azalma sağlamıştır. Floresans değerlerdeki azalma HDACaktivitesindeki azalmayı dolayısıyla inhibisyonun gücünü göstermektedir. Analizlerimizinhibisyon aktivitesi en yüksek bileşiğin TSA, sonra sırasıyla NaBA, FBA ve NaFBAolduğunu, ayrıca inhibisyon aktivitesinin doza bağlı olarak arttığını göstermiştir. Buinhibitörlerle sistemin hazır hale getirilmesini takiben inhibitör adayı olarak düşünülen dörtbileşiğin (2-fenil-vinil boronik asit (B L 1), 3-morfolin-propen-sülfonik asit (B L 2), gallikasit (B L 3), 4-kinolin karboksilik asit (B L 4)) inhibisyon aktiviteleri 11,75 ÂµM, 23,5 ÂµM, 47ÂµM, 1000 ÂµM, 2000 ÂµM, 5000 ÂµM konsantrasyonda araştırılmış, floresan değerlerde B L 1:%9,5, B L 2: %2,2, B L 3: %46,5, B L 4'ün ise %11,2 oranında azalmaya neden olduğusaptanmıştır. B L 1, 2 ve 4'ün inhibisyon aktivitelerinin bilinen inhibitörlerden daha fazlaolmadığı gösterilmiştir. B L 3'ün inhibisyon aktivitesi istatistiksel olarak anlamlıbulunmasına karşın, 47 ÂµM konsantrasyondan sonra meydana gelen mavi-yeşil rengin sağlıklıokumayı engellemesi nedeniyle farklı bir tarama sisteminde araştırılmasının uygun olacağınakarar verilmiştir. Gerçekleştirilen aktivite tayinleri, etkili inhibitör geliştirilmesi için yapılançalışmalarda ön tarama sistemi oluşturarak araştırmalara hız kazandıracaktır.Anahtar sözcükler: Histon deasetilaz inhibitörleri, HDAC inhibisyon aktivite tayiniDestekleyen kuruluş: TÜB TAK (105G014 no'lu projenin bir parçasıdır)

Abstract:
ABSTRACTBORA, G. Investigations of Histone Deacetylase Inhibitory Activity with Fluorescence-based Technique. Hacettepe University Institute of Health Sciences, MSc. Thesis inMedical Biology, Ankara, 2006. Histones are major proteins of chromatin and aminoterminal tails of histones are subject to acetylation, which is the most important post-translational modification of chromatin. Histone acetyl transferases (HAT) transfer acetylgroup to the histones, which results in local expansion of chromatin so transcription occurs.Histone deacetylases (HDAC) catalyze the removal of acetyl groups from histones leading tochromatin condensation and transcriptional repression. These enzymes function inmultiprotein complexes and they also regulate the acetylation pattern of non-histon proteinsso they possess diverse biological activities. Recently, many compounds have beenindentified and shown to inhibit the activities of HDACs. These inhibitors induce cell growtharrest, differentiation and/or apoptosis and they alter the expression of small number of genes(%2-5). Several studies have been initiated for the treatment of some inherited diseases andcancer as well. Our laboratory participated in a project which is called ?Drug Research andDevelopment Studies for Hereditary Diseases Caused by RNA Splicing Defects?. This projectproposes to modify and synthesize HDAC inhibitors and to develop potential HDAC inhibitorcompounds to correct splicing defects. This thesis is a part of the project and we proposed totest and compare activities of known inhibitors such as trichostatin A (TSA), 4-phenylbutyricacid (PBA), 4-phenylbutyric acid sodium salt (NaPBA), sodium butyrate (NaBA) in a cell-free, fluoresence-based system and to make the system ready for further investigations. Weutilized ?HDAC Inhibitor Drug Screening Kit? for screening and applied TSA (11,75 ÂµM,23,5 ÂµM, 47 ÂµM, 1000 ÂµM and 2000 ÂµM), PBA, NaPBA and NaBA (23,5 ÂµM, 47 ÂµM, 500ÂµM, 1000 ÂµM, 2000 ÂµM and 5000 ÂµM) on HeLa nuclear extract. We observed thatfluorescence signals decreased as TSA: 92,8 %, NaBA: 29,6 %, PBA: 25,5 % and NaPBA:24,8 % after applying the inhibitor. Decreasing fluorescence signal shows HDAC activity soif the inhibitor is effective, fluoresence signal should decrease. According to our analysis, weshowed that TSA is the most effective inhibitor and decreasing HDAC inhibitory activities areNaBA, PBA and NaPBA, respectively. We also showed that the HDAC inhibitory activitiesincreased at higher concentrations of inhibitors. After screening activities of known inhibitors,we investigated four candidate compounds such as 2-phenyl vinyl boronic acid (Comp 1), 3-morpholine-propene-sulphonic acid (Comp 2), gallic acid (Comp 3), 4-quinoline carboxylicacid (Comp 4). 11,75 ÂµM, 23,5 ÂµM, 47 ÂµM, 1000 ÂµM, 2000 ÂµM and 5000 ÂµMconcentrations of these compounds were applied and decreasing fluorescence signals wereobserved as Comp 1: 9,5 %, Comp 2: 2,2 %, Comp 3: 46,5 %, Comp 4: 11,2 %. Comp 1,2 and 4 were found less effective than known HDAC inhibitors.Unexpected blue-green colorwere seen after 47ÂµM concentration with Comp 3 so, in contrast to the statistical analyses,which is significant for Comp 3 among candidate compounds, we decided to test the activityby using another non-fluorescence-based system. Screening the activities ofinhibitors/compounds by using this system will contribute to the investigations of effectivedrug development.Key Words: Histone deacetylase inhibitors, HDAC inhibitory activity screeningSupported by: TÜB TAK (This thesis is a part of a project no 105G014)