Özgün heterosiklik bileşiklerin glutatyon transferaz P1-1 inhibitörleri olarak araştırılması ve insan meme kanser hücreleri üzerine etkilerinin değerlendirilmesi
The investigation of heterocyclic compounds as inhibitors of Glutathione transferase P1-1 and evaluation the effects on human breast cancer cells
Yazar: YAMAN MUŞDAL
Danışman: DOÇ. DR. YASEMİN AKSOY
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Glütatyon transferaz = Glutathione transferase ; Hücre döngüsü = Cell cycle ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Bu çalışmanın amacı GST P1-1'e yönelik inhibitör bileşiklerin tasarlanması ve bu moleküllerin meme kanseri hücrelerinde in vitro etkinliğinin incelenmesidir. Bu amaçla lipofilik özellikte benzoksazol, benzimidazol, benzotiyazol türevi bileşikler sentezlendi. İnhibisyon kinetiği çalışmalarında E.coli'de eksprese edilip saflaştırılan rekombinant hGST P1-1 kullanıldı. Bileşikler içerisinden yaklaşık 10 µM IC50 değeri ile en etkili inhibitör olarak bileşik-75 (N-[2-(4-kloro-benzil)-benzooksazol-5-il]-4-nitro-benzensülfonamit) seçildi. Kinetik çalışmaları sonucunda bileşik-75'in GSH'a göre karışık (KiGSH= 6.05 µM), CDNB'ye göre unkompetitif tip inhibisyon (KiCDNB= 11.83 µM) gösterdiği saptandı. Hücre grubu olarak GST P1-1 eksprese eden MCF-12A ve MDA-MB-231 ve etmeyen MCF-7 ve MDA-MB-468 hücre dizileri seçildi. Bu hücrelerde etken bileşiğin ve referans molekül dosetakselin tek ve kombine olarak değişik hücre tiplerindeki subtoksik dozu belirlendikten sonra apoptoz, hücre siklusu, ve proliferasyonu üzerine etkileri incelendi. Bunun yanısıra hücrelerde GST aktivitesi değerlendirildi. Bileşik-75 ve dosetakselin tüm hücrelerde canlılığı azalttığı, bileşik-75'in subtoksik dozlarda dosetaksel ile birlikte uygulamalarında ise yalnızca MCF-12A ve MCF-7'de aditif bir etkisinin olduğu gözlendi. Hücre döngüsü deneylerinde ise, yalnız başına dosetaksel ve kombine uygulamalarının MDA-MB-468 hariç tüm hücrelerde, bileşik-75'in ise MCF-12A ve MCF-7'de G1 ve S basamaklarını etkileyerek hücre döngüsünde duraklamaya neden olduğu saptandı. Dosetaksel'in MDA-MB-231 hücrelerinde %19.7, kombine uygulamaların ise MDA-MB-231'de %20 ve MCF-7'de %21 oranında apoptotik etki gösterdiği bulundu. Bu sonuçlar apoptotik etkinin GST P1-1'den bağımsız olarak farklı yollardan meydana geldiğinin göstergesi olarak kabul edildi. Bileşik-75 ile inkübe edilen hücrelerde kontrole göre total protein miktarında % 45'lik, enzim spesifik aktivitesinde ise % 40'lık bir azalma saptandı. Hücre lizatı enzim spesifik aktivitesindeki bu değişimin gözlenmesiyle etken bileşiğin hücre içine girerek GST ile etkileşime girdiği sonucuna varıldı.

Abstract:
The aim of this project is to design inhibitors for GST P1-1 and test their effectiveness on breast cancer cells. For this purpose benzoxazole, benzimidazole, benzothiazole derivative compounds were synthesized. Recombinant hGST P1-1 expressed in E.coli were purified and used in the inhibiton kinetics studies. The most effective inhibitor for hGST P1-1 was selected and named as compound-75 (N-[2-(4-Chloro-benzyl)-benzooxazol-5-yl]-4-nitro-benzene-sulfonamide) with an approximately 10 µM IC50 value. This compound shows mixed inhibition for GSH and uncompetitive inhibiton for CDNB with the Ki 6.05 µM and 11.83 µM respectively. For the cell culture studies, GST P1-1 expressing MCF-12A and MDA-MB-231 and not expressing MCF-7 and MDA-MB-468 cell lines were selected. After determining the subtoxic dose of compound-75 and reference molecule docetaxel for each cell, apoptosis, cell cycle and proliferation effects and GST activities were observed. In all cell lines, compound-75 and docetaxel decreased cell viabilities and in combined use of compound-75 with subtoxic dose of docetaxel there is additive effect on MCF-12A and MCF-7 cells. In cell cycle experiments, cell cycle arrest is detected for docetaxel and combined use of drugs in all cell lines except MDA-MB-468 and for the compound-75 in MCF-12A and MCF-7. According to apoptosis results, single use of docetaxel in MDA-MB-231 and combined use of docetaxel-effective compound in MCF-7 showed %19.7 and %21.35 apoptosis in sub G1 peaks, respectively. These results suggest that apoptosis is occured in different ways independantly from the GST P1-1. The total protein content of cells incubated with the active compound was decreased %45 and the enzyme specific activities were also decreased %40 compared to controls. To observe this change in specific activity of enzyme cell lyzate, the effective-compound should enter the cell, accumulate and effect GST P1-1 level.