Mitokondri hasarı ile ilişkili nöromüsküler hastalıklarda mitokondriyal protein import mekanizmasının araştırılması
Investigation of mitochondrial protein import mechanism in neuromuscular diseases associated with mitochondrial damage
Yazar: EVRİM AKSU MENGEŞ
Danışman: PROF. DR. BURCU BALCI
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Mitokondriler = Mitochondria ; Mitokondriyal proteinler = Mitochondrial proteins ; Nöromusküler hastalıklar = Neuromuscular diseases ; Protein tayini = Protein determination

Özet:
Mitokondrilerin işlevlerini doğru olarak yerine getirebilmeleri için, gDNA tarafından kodlanan ve sitozoldeki serbest ribozomlarda sentezlenen mitokondriyal proteinlerin organele taşınımının hatasız gerçekleşmesi gerekmektedir. Anormal mitokondri morfolojisinin, membran potansiyeli ve ATP üretimi azalışının, ROS artışının mitokondriyal protein importunu etkilediği gösterilmiştir. Bunun yanı sıra, nadir nöromüsküler hastalıklarda gözlenen sekonder mitokondri hasarının düzenlenmesinde rol alan ortak miRNA'ların olası hedef genlerinin mitokondriyal protein importu ile ilişkili olduğu saptanmıştır. Bu amaçla tez çalışmasında DMD, Megakoniyal KMD ve Ullrich KMD etiyopatogenezinde ortak ve sekonder bir bulgu olarak iskelet kasında gözlenen mitokondri hasarının mitokondriyal protein import mekanizması ile ilişkisi araştırılmıştır. İlk aşamada; mitokondriyal sinyal dizisi içeren pcDNA3/Mito-GFP plazmidi kontrol ve hasta gruplarına ait primer miyoblastlarına transfekte edilmiş ve tüm hastalarda MitoGFP-TOM20 eş yerleşiminde istatistiksel olarak anlamlı şekilde azalma gözlenmiştir. Sekonder mitokondri hasarı ile direkt ilişkilendirdiğimiz miR-382-5p, pcDNA3/mito-GFP ile birlikte C2C12 hücrelerine transfekte edildiğinde, MitoGFP-TOM20 eş yerleşiminde kontrole kıyasla anlamlı şekilde azalma saptanmıştır. İkinci aşamada; primer miyoblastlardan mitokondri izolasyonu sonrasında, LC-MS/MS ile proteomik analizler gerçekleştirilmiştir. Aday proteinler arasında, ATP/ADP transporter olarak görev yapan SLC25A4'ün total hücrede RNA ve protein seviyesinde ifadesinin değişmediği, ancak mitokondriyal fraksiyondaki miktarının tüm hastalarda azaldığı qRT-PCR ve Western Blot ile gösterilmiştir. Hastalara ait primer miyoblastlarda SLC25A4'ün mitokondrilerde yerleşiminin azaldığı SLC25A4-TOM20 eş immünfloresan boyaması ile doğrulanmıştır. Tez çalışması ile, patogenezinde sekonder mitokondri hasarının görüldüğü nadir nöromüsküler hastalıklarda mitokondriyal import mekanizmasının potansiyel rolü aydınlatılmış, organel hasarının önlenmesi/geriye döndürülmesi amacıyla yeni ve farklı hastalık grupları için ortak tedavi hedefleri tanımlanabilmesine olanak sağlanmıştır.

Abstract:
The transport of mitochondrial proteins, which are encoded by gDNA and synthesized by free ribosomomes in the cytosol, to the organelle must be error-free  for the proper functioning of mitochondria. It has been shown that abnormal mitochondrial morphology, decreased membrane potential and ATP production, and increased reactive oxygen species (ROS) affect mitochondrial protein import. Also, possible target genes of common microRNAs (miRNAs), which are involved in the regulation of secondary mitochondrial damage observed in rare neuromuscular diseases, have been found to be associated with mitochondrial protein import. For this purpose, the relationship between mitochondrial protein import mechanism and mitochondrial damage observed as a common and secondary finding in the etiopathogenesis of DMD, Megaconial CMD, and Ullrich CMD was investigated. As the first step, the pcDNA3/Mito-GFP plasmid containing a mitochondrial targeting signal sequence was transfected into primary myoblasts of the control and patient groups, and a significant decrease in MitoGFP-TOM20 co-localization was observed in all patients. When miR-382-5p, which we directly associate with secondary mitochondrial damage, was co-transfected with pcDNA3/mito-GFP into C2C12 cells, a significant reduction in MitoGFP-TOM20 co-localization was detected compared to the control. As the second step, proteomic analyzes were performed by LC-MS/MS after isolation of mitochondria from primary myoblasts. Although the amount of SLC25A4, which acts as an ATP/ADP transporter, decreased in the mitochondrial fraction, it was determined that its expression at the RNA and protein level was preserved in total cell by qRT-PCR and Western Blot. Decreased localization of SLC25A4 in mitochondria in primary myoblasts of patients was confirmed by SLC25A4-TOM20 co-immunofluorescence staining. With this thesis, the potential role of the mitochondrial import mechanism in rare neuromuscular diseases in which secondary mitochondrial damage is seen in the pathogenesis has been elucidated, allowing the identification of common therapeutic targets for new and different disease groups to prevent/reverse organelle damage.