Çocuk ve yenidoğan yoğun bakım ünitelerinden izole edilen karbapenem dirençli klebsiella suşlarının moleküler epidemiyolojisi
Molecular epidemiology of carbapenem resistant klebsiella species isolated from pediatric and neonatal intensive care units
Yazar: AYŞE HANDE TÜRK
Danışman: PROF. DR. DEVRAN GERÇEKER
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Karbapenemaz = Carbapenemase ; Karbapenemler = Carbapenems ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Yoğun bakım üniteleri = Intensive care units ; Yoğun bakım üniteleri-neonatal = Intensive care units-neonatal ; Yoğun bakım üniteleri-pediyatrik = Intensive care units-pediatric ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-çoklu = Drug resistance-multiple

Özet:
AMAÇ: Bu çalışmada; Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Yoğun Bakım ve
Yenidoğan Yoğun Bakım Ünitelerinde yatmakta olan hastalardan Kasım 2020-2021 arasında
çeşitli kültür örneklerinden üreyen ve karbapenem dirençli Klebsiella izolatlarının moleküler
epidemiyolojik özellikleri incelenmiştir. İzolatların taşıdığı beta-laktam, aminoglikozit,
kinolon grubu antimikrobiyallere ve kolistine direnç oluşumuna neden olan aktarılabilir
antimikrobiyal direnç genlerinin ve kolistin direncine neden olan kromozomal
mekanizmaların açığa çıkarılarak, bu izolatların epidemiyolojik ilişkilerinin ortaya konması
amaçlanmıştır.
GEREÇ VE YÖNTEM: Tanımlaması MALDI-TOF MS ile yapılan izolatların
antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesinde disk difüzyon yöntemi kullanılmıştır.
Karbapenem, aminoglikozit ve kinolon minimum inhibitör konsantrasyonlarının (MİK)
saptanmasında gradiyent şerit test ve kolistin duyarlılığının belirlenmesi için sıvı
mikrodilüsyon yöntemi uygulanmıştır. Karbapenemaz üretiminin fenotipik olarak
belirlenmesi için karbapenem inaktivasyon yöntemi (CIM) kullanılmıştır. Beta-laktamlara
dirence neden olan genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL), AmpC beta-laktamaz ve
karbapenemaz, aminoglikozit direncine neden olan 16S rRNA metiltransferazlar, kinolon
direncine neden olan plazmit aracılı kinolon direnci (PAKD) genleri, ve kolistin direncine yol
açan mobil kolistin direnci genleri polimeraz zincir reaksiyonları (PZR) ile araştırılmıştır.
Kapsüler polisakkarit tiplerini belirlemek için wzi geni dizilemesi yapılmıştır. İzolatların
arasındaki benzerlik ve farklılıkları ortaya koymak için pulsed field jel elektroforezi (PFGE)
uygulanmıştır. İzolatların klonal yayılımını belirlemek amacıyla multilokus sekans
tiplendirme (MLST) yapılmıştır.
BULGULAR: K. pneumoniae olarak tanımlanan 36 örneğin tamamı amoksisilin klavulonat,
piperasilin tazobaktam, sefotaksim, seftazidim ve sefepim dirençliyken, 24'ü (%66,66)
sefoksitine, 31'i (%86,11) ertapeneme, 21'i (%58,33) imipeneme, 16'sı (%44,44)
meropeneme, 10'u (%27,77) amikasine, 28'i (%77,77) gentamisine, 31'i (%86,11)
tobramisine, 29'u (%80,55) siprofloksasine, 19'u (%52,77) levofloksasine, 11'i (%30,56)
kolistine dirençli olduğu saptanmıştır. CIM testi OXA-48 benzeri karbapenemaz üreten
izolatlarda pozitif tespit edilirken NDM tipi karbapenemaz üreten bir izolatın karbapenemaz
üretimi negatif bulunmuştur. Tüm izolatlarda bla SHV geni bulunurken; buna ek olarak 12
(%33,33) izolatta bla CTX-M pozitif saptanmıştır. On dokuz (%52,7) izolatta bla SHV , bla CTX-M ve
bla TEM birlikte pozitif saptanmıştır. CIT grubu AmpC beta-laktamaz iki (%5,56) örnekte
bulunmuştur. Karbapenemaz genlerinden bla OXA-48 33 (%91,67), bla NDM 1 (%2,78) ve bla KPC 1
(%2,78) izolatta pozitif bulunurken, bir izolatta karbapenemaz geni bulunmamıştır. 16S rRNA
metiltransferaz genleri armA ve rmtC sırasıyla, 3 (%8,33) ve 2 (%5,56) izolatta saptanmıştır.
PAKD genlerinden qnrB 19 (%52,78), qnrS 6 (%16,67), qnrB ve qnrS iki (%5,56) izolatta
pozitif bulunmuştur. Aktarılabilir kolistin direncine neden olan mcr genleri saptanmazken,
kolistine dirençli tüm izolatlarda kromozomal mgrB geni mutasyonları bulunmuştur.
İzolatlarda dokuz farklı kapsül tipi belirlenirken en sık K2 bulunmuştur. PFGE ile 15 farklı
patern saptanmış, 17 izolatın (%47,22) tek bir paternde toplandığı görülmüştür. MLST ile 18
(%50,00) izolat ST 14 olarak belirlenmiştir. 3 izolat (%8,33) ST 2096, 3 (%8,33) izolat ST
661, ikişer izolat ST 147 ve ST 985, birer izolat ise; ST 37, ST 152, ST 101, ST 17, ST 307 ve
ST 39 olarak bulunmuştur.
SONUÇ: Karbapenem dirençli K. pneumoniae suşları, çok sayıda aktarılabilir antimikrobiyal
direnç genini bir arada taşımakta ve yüksek riskli klonlarının yayılımı nedeniyle yenidoğan
ve çocuk yoğun bakım hastalarında önemli bir sağlık sorunu oluşturmaktadır. K. pneumoniae
izolatlarının antimikrobiyal direnç özelliklerinin ve klonlarının yayılımlarının belirlenmesi;
tedavi seçimine yol gösterebilecek, enfeksiyon kontrol önlemlerinin etkin bir şekilde
uygulanmasına ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine ışık tutabilecektir.

Abstract:
AIM: In this study, molecular epidemiological characteristics of carbapenem resistant
Klebsiella isolates grown in various cultures of patients hospitalized in Ankara University
School of Medicine Neonatal and Pediatric Intensive Care Units were investigated. It is aimed
to demonstrate the transferable antimicrobial resistance genes harbored by isolates which
cause resistance to beta-lactam, aminoglycoside, quinolone group antimicrobials and colistin
also to determine the chromosomal mechanisms that cause colistin resistance. In addition, it is
aimed to search epidemiological relationships among the isolates.
MATERIALS AND METHODS: Antimicrobial susceptibility tests of the K. pneumoniae
isolates, identified by MALDI-TOF MS were performed using disk diffusion method.
Minimum inhibitory concentrations (MIC) for carbapenems, aminoglycosides and quinolones
were determined using gradient strip test and broth microdilution method was used for
colistin susceptibility. Carbapenemase production was screened phenotypically by
carbapenemase inactivation (CIM) method. Extended spectrum beta-lactamase (ESBL),
AmpC beta-lactamase and carbapenemase enzymes causing resistance to beta-lactams, 16S
rRNA methyltransferases causing resistance to aminoglycosides, plasmid mediated quinolone
resistance (PMQR) genes causing quinolone resistance, and mobile colistin resistance genes
causing colistin resistance were investigated by polimerase chain reactions (PCR). In order to
determine the types of capsular polysaccharides, wzi gene sequencing was performed. Pulsed
field gel electrophoresis (PFGE) was performed to find out similarities and differences among
the isolates. Multilocus sequence typing (MLST) was used to determine the clonal spread of
the isolates and their antimicrobial resistant genes.
RESULTS: All 36 isolates identified as K. pneumoniae were resistant to amoxicillin
clavulanate, piperacillin tazobactam, cefotaxime, ceftazidime and cefepime. Resistance rates
to cefoxitine, ertapenem, imipenem, meropenem, amikacin, gentamicin, tobramycin,
ciprofloxacin, levofloxacin and colistin were 66.67% (n=24), 86.11% (n=31), 58.33% (n=21),
44.44% (n=16), 27.78% (n=10), 77.78% (n=28), 86.11% (n=31), 80.56% (n=29), 52.78%
(n=19) and 30.56% (n=11), respectively. OXA-48 like carbapenemase producing isolates
were found to be positive with CIM test while single isolate producing NDM type
carbapenemase was negative. bla SHV gene was detected in all isolates, in addition, 12 (33.33%)
isolates were harboring bla CTX-M . Nineteen (52.7%) isolates were bla SHV , bla CTX-M and bla TEM  positive. CIT group AmpC beta-lactamase was found in two (5.56%) isolates. The
carbapenemase genes bla OXA-48 was found in 33 (91.67%) isolates, bla NDM in one (2.78%) and
bla KPC in one (2.78%) isolate. No carbapenemase gene was detected in one of the isolates. The
16S rRNA methyltransferase genes armA was found in three (8.33%) and rmtC in two
(5.56%) isolates. The PMQR genes qnrB was found in 19 (52.78%), qnrS in six (16.67%),
and qnrB and qnrS in two (5.56%) isolates. No mcr genes causing transferable colistin
resistance were detected in any of the isolates while chromosomal mgrB gene mutations were
found in all colistin resistant isolates. Nine different capsule types with K2 being the most
prevalent one were determined in the isolates. PFGE revealed 15 different pattern for the
isolates. Seventeen (47.22%) isolates had one single pattern. MLST showed 18 (50.00%)
isolates were ST14, three (8.33%) isolates were ST2096. Two isolates were observed as
ST661, ST147 and ST985 and only one isolate was identified as ST37, ST152, ST101, ST17,
ST307 and ST39.
CONCLUSIONS: Carbapenem resistant K. pneumoniae strains cause important health
problem in neonatal and pediatric intensive care units due to their ability to harbor multiple
transferable resistance genes and spread of high risk clones. Determining the antimicrobial
resistance properties and the clonal spread of the isolates will guide the treatment choice,
effective implementation of infection control measures and the development of new
antimicrobial strategies.