Mitokondriyal türevli peptid (MOTS-C)'in insan kolon kanseri hücre hattında sitotoksik ve genotoksik etkilerinin araştırılması
Investigation of cytotoxic and genotoxic effects of mitochondrial derived peptide (MOTS-C) on human colon cancer cell line
Yazar: SEVİLAY GÜNAY
Danışman: DOÇ. DR. YAVUZ ERDEN ; PROF. DR. KEMAL BÜYÜKGÜZEL
Bartın Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Genotoksisite = Genotoxicity ; Mitokondriyal proteinler = Mitochondrial proteins ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Otofaji = Autophagy ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Mitokondriyal-türevli peptid (MOTS-c), mitokondriyal DNA tarafından kodlanan bir hormondur. MOTS-c'nin de novo purin biyosentezini ve hücrede folat siklusunu inhibe ettiği bildirilmektedir. MOTS-c'nin çekirdeğe yerleştiği ve metabolik stresin ardından 5'-adenosin monofosfatla aktifleştirilmiş protein kinaza (AMPK) bağımlı bir şekilde nükleer gen ekspresyonunu düzenlediğini gösterilmiştir. AMPK'nın, başta kanser dahil olmak üzere metabolik hastalıklar için potansiyel bir terapötik hedef olduğu bildirilmektedir. Bu çalışmada MOTS-c'nin kolorektal kanser hücre serisi üzerine sitotoksik ve genotoksik etkilerini araştırmayı amaçladık. Çalışmada MOTS-c ve 5-Fluorourasil (5-FU)'in farklı konsantrasyonları insan kolon kanseri hücre serisi (Caco-2) ve sağlıklı kolon epitel hücre serisine (FHC) değişik zaman periyotlarında uygulandı. Uygulamalar sonrası hücrelerde canlılık düzeyindeki değişimler MTT analizi ile belirlendi. Bileşiklerin genotoksik etkisi tek hücre jel elektroforez (Comet) analizleriyle ortaya kondu. Apoptotik hücre ölümü düzeyi TUNEL boyama sonucu belirlendi. Ayrıca çalışmada bileşiklerin apoptoz ve otofaji süreçlerinde görev alan proteinler üzerine etkileri Western blot analizleriyle belirlendi. MOTS-c uygulaması Caco-2 hücrelerinde canlılığı 24. saatte önemli düzeyde azalttı (p<0.05).  MOTS-c uygulamasından sonra hücrelerde DNA hasar seviyesi ve TUNEL pozitif hücre sayısı kontrol grubu ile benzer seviyedeydi. Buna karşın uygulanan 5-FU DNA hasarını indükledi ve TUNEL pozitif hücre sayısını kontrol grubuna kıyasla artırdı (p<0.05). MOTS-c uygulaması Caco-2 hücrelerinde TSC2 ve ULK1 protein düzeylerinde artışa neden olurken (p<0.05), Bcl-2, Bax, kaspase-3 ve p53 protein düzeylerinde anlamlı değişime neden olmadı. Bunun aksine 5-FU uygulaması p53 ve Bax protein seviyesini arttırdı, anti-apoptotik Bcl-2 ifadesini azalttı. Bu sonuçlar MOTS-c'nin ULK1 ve TSC2 protein ifadelerini arttırarak Caco-2 hücrelerinde hücre ölümüne aracılık ettiğini göstermektedir.

Abstract:
Mitochondrial-derived peptide (MOTS-c) is a hormone encoded by mitochondrial DNA. It is reported that MOTS-c inhibits de novo purine biosynthesis and folate cycle in the cell. It has been shown that MOTS-c localizes to the nucleus and regulates nuclear gene expression in a 5'-adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)-dependent manner following metabolic stress. AMPK has been shown to be a potential therapeutic target for metabolic diseases, particularly cancer. In this study, we aimed to investigate the cytotoxic and genotoxic effects of MOTS-c on colorectal cancer cell line. In the study, different concentrations of MOTS-c and 5-Fluorouracil (5-FU) were applied to human colon cancer cell line (Caco-2) and non-tumorigenic colon epithelial cell line (FHC) at different time periods. The changes in the viability level of the cells after the treatments were determined by MTT analysis. The genoroxic effect of the compounds was demonstrated by single cell gel electrophoresis (Comet) analyzes. Apoptotic cell death level was determined by TUNEL staining. In addition, the effects of compounds on proteins acted role in apoptosis and autophagy processes were determined by Western blot analysis. MOTS-c application significantly decreased the viability of Caco-2 cells at 24 hours (p<0.05). After MOTS-c application, the DNA damage level and TUNEL positive cell count in the cells were similar to the control group. In contrast, administered 5-FU induced DNA damage and increased TUNEL positive cell count compared to the control group (p<0.05). While MOTS-c administration caused an increase in TSC2 and ULK1 protein levels in Caco-2 cells (p<0.05), it did not cause a significant change in Bax, Bcl-2, caspase-3, and p53 protein levels. In contrast, 5-FU administration increased p53 and Bax protein levels and decreased anti-apoptotic Bcl-2 expression. These results show that MOTS-c mediates cell death in Caco-2 cells by increasing ULK1 and TSC2 protein expressions.