Bacıllus fitazının klonlanması ve ekspresyonu
Bacillus fitazinin klonlanmasi ve ekspresyonu
Yazar: ORKIDEH HAJIPOUR
Danışman: PROF. DR. SADIK DİNÇER
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Bacillus subtilis = Bacillus subtilis

Özet:
Fitaz enzimi fitatın fosfomonoester  bağını hidrolize ederek myo-inositol fosfat ve  inorganik fosfatın ortaya çıkmasına sebep olur. Hayvanların büyümeleri, üremeleri ve kemiklerinin şekillenmesi için önemli minerallerden biri  fosfordur. Yapılan bu araştırmada fitaz  aktivitesine sahip olan doğal Bacillus sp. biyokimyasal ve 16srDNA sekans analizi ile Bacillus subtilis olarak tanımlanmıştır. Primerler NCBI sitesinde olan Bacillus subtilis bakterisinin fitazına göre dizayn edilmiştir. PCR amplifikasyonundan sonra fitaz geni ekspresyon vektörü olan pET22b vektörüne ligasyonu yapılmıştır ve Rekombinanat vektör ısı şoku metodu ile E. coli Rosetta 2(DE3) pLysS bakterisine aktarılmıştır. Kullanılan PCR ürünü ve vektör ligasyonu yapılmadan önce Hind III ve BamH1  enzimleri ile kesimleri gerçekleştirilmiştir. 
Rekombinant fitaz 37oC, pH 7'de optimum aktivite göstermiştir. Enzimin 60oC'de aktivitesinin %73'nü ve 100 oC'de ise aktivitesinin %5'ni korumuştur. Enzim pH 5.8-8 aralığında stabildir. Rekombinant enzimin aktivitesi 5mM CoCl2 ile artmıştır ama MgCl2, CuCl2, HgCl2, NiCl2, MnCl2, FeCl2 ve EDTA ile aktivitesi düşmüştür.  Rekombinant fitazın moleküler ağırlığı SDS-PAGE analizi ile 45 kDa olarak belirlenmiştir. Bu araştırmanın sonuçlarına göre elde edilen rekombinant fitazın  yem katkısı olarak kullanılabilirliği ortaya konulmuştur.
Anahtar Kelimeler: Fitaz, pET22b, Bacillus subtilis, klonlama

Abstract:
Phytases catalyze the hydrolysis of phosphomonoester bonds of phytate (myo-inositol hexakisphosphate), thereby creating lower forms of myo-inositol phosphates and inorganic phosphate. Phosphorus is one of the necessary mineral nutrients for animals during their growth, reproduction and calcification of the bones. In this research, one native Bacillus sp. isolate containing phytase activity was identified as a Bacillus subtilis by biochemical and 16srDNA sequence analysis. Primer pairs were designed according to phytase gene sequence of Bacillus subtilis present in NCBI web site. After amplification by PCR the gene was ligated to pET22b vector as expression vector and transformed to E. coli Rosetta 2(DE3) pLysS by heat shock method. In preparation of PCR product and vector for ligation two restriction enzymes (Hind III and BamH1) were used. 
The optimum activity of recombinant phytase was emerged at 37oC and pH 7. Thermo stability with more than 73% residual activity at 60oC, and about 5% residual activity at 100∘C. The enzyme was stable over the pH range of 5.8 to 8. Recombinant phytase activity significantly stimulated with 5mM CoCl2, but decreased activity with MgCl2, CuCl2, HgCl2, NiCl2, MnCl2, FeCl2 and EDTA. Molecular weight of recombinant phytase was estimated as 45 kDa on SDS-PAGE analysis. These results of this study showed that, recombinant phytase could be an interesting candidate for feed applications.
Key words:	phytase, pET22b, Bacillus subtilis, cloning