Akkaraman koçlarda spermanın kolesterol ve 7-dehidrokolesterol ile dondurulması ve değerlendirilmesi
Cryopreservation and evalution akkaraman ram semen with cholesterol and 7-dehydrocholesterol
Yazar: MUHAMMED ENES İNANÇ
Danışman: PROF. DR. ONGUN UYSAL ; PROF. DR. AYHAN ATA
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2016
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Akkaraman koyunları = Akkaraman sheep ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Kolesterol = Cholesterol ; Koyunlar = Sheep ; Koçlar = Rams ; Sperm = Spermatozoa ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques

Özet:
Bu araştırmada, ülkemize özgü bir ırk olan Akkaraman koç spermasının dondurulması ve çözdürülmesinde, kolesterol (ch) ve kolesterolün oluşumunda ara ürün olan 7- dehidrokolesterolün (7-dhc) tris sulandırıcısına eklenerek hazırlanmış solüsyonlarla elde edilecek in vitro sonuçların değerlendirilmesi amaçlandı. Araştırmada üç baş koç kullanıldı. Koçlardan haftada iki defa suni vajen yardımıyla sezon içinde sperma alındı. Her bir koçtan alınan nativ ejakülatlar birleştirildi.  Birleştirilen ejekülatlar 7 eşit gruba bölündü (split ejekulat); biri kontrol grubu olarak ayrıldı; üçü ch'nin; diğer üçü de 7-dhc'nin farklı konsantrasyonları (1,5, 2,5, 3,5 mg/120x106) ile hazırlanarak tris sulandırıcısı oluşturuldu. Deneydeki sulandırıcı grupları ile dozlanan spermalar + 4 derecede 2 saat alışıma bırakıldı. Alışım süresi sonunda payetler sıvı azot buharında – 120oC 'de 15 dakikada dondurulduktan sonra sıvı azot içinde saklandı. Dondurulduktan 2 ay sonra her deneydeki gruplar için payetler 37oC'deki su banyosunda 35 saniyede çözdürüldü. Çözdürme sonrası spermatozoa motilitesi, anormal spermatazoa oranı sperma analiz cihazında (CASA) değerlendirildi. Plazma membran bütünlüğünün değerlendirilmesi için HOS test,  DNA fragmentasyonu için COMET, spermatazoa canlılığı SYBR-14/PI, akrozom bütünlüğü FITC-PNA/PI, mitokondriyel aktivitasyon JC-1/PI; apoptozisin tespiti için Annexin V/PI yöntemi uygulandı. Ayrıca, antioksidan etkisinin değerlendirilmesi için lipit peroksidasyona (LPO) bakıldı.Çözüm sonrası motilite, ölü/canlı, akrozom hasarı, ve HOS test yönünden 7dhc grupları ile ch grupları arasında istatistiksel olarak aralarında bir fark bulunmazken; kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak fark bulunmuştur (p<0,001). Anormal spermatozoa oranı, lipit peroksidasyon, DNA hasarı ve mitokondrial aktivasyon yönünden gruplar arasında istatistiksel bir fark bulunamamıştır (p>0,05).  Ayrıca, apoptosis yönünden veriler incelendiğinde canlı ve erken apoptosis hücrelerinde istatistiksel farklılıklar görülürken (p<0,001);  diğer veriler arasında (sayılan hücre, geç apoptozis, nekrotick hücre)  istatistiksel olarak bir fark bulunmamıştır (p>0,05).
Sonuç olarak; Ch ve 7-dhc'nin koç spermasını dondurma (soğuk şoku) ve çözdürme prosedürlerine karşı koruduğu, 7-dhc'nin ch yerine koç spermasının sulandırılması ve dondurulmasında kullanılabileceği; ayrıca, ch ve 7-dhc ile elde edilen in vitro sonuçların dölverimlerinin de alınarak sağlamasının yapılması gerektiği sonucuna varıldı.

Abstract:
In this research the evaluation of in vitro results of cholesterol (ch) and 7-dehydrocholesterol (7-dhc) which intermediates formation of cholesterol added to tris extenders in freezing-thawing of Akkaraman ram semen, a particular breed in our country, was aimed. In this reseasrch 3 rams were used. Semen was collected from the bucks by artificial vagina, twice a week, during the breeding season. The native ejaculates from each ram were mixed. The mixed ejaculates were divided into seven groups (split ejaculates). One of these was seperated as control, three were diluted with tris which have different concentrations of ch,and the other three were diluted with tris which have different 7-dhc concentrations (1,5, 2,5, 3,5). Extender groups in the experiment were equilibrated in +4°C Straws were frozen in liquid nitrogen vapour (-120 °C) and kept in liquid nitrogen at the end of equilibration period. 2 months after the straws were frozen, they were thawed in 37°C water bath for 35 seconds. Post-thaw spermatological parameters (motility, abnormal spermatozoa) were evaluated with the sperm analyser (CASA). HOS test for evaluating plasma membrane integrity, COMET for detecting DNA fragmentation, SYBR-14PI for detecting live/dead spermatozoa ratio, FITC-PNA/PI for evaluating acrosomal integrity, JC-1 with fluorescent stains for determining mitochondrial activity and Annexin V/PI method with flow cytometry for detecting apoptosis were performed. Besides, antioxidant effect was examined by lipid peroxidation. After thawing, there was no significant difference between 7-dhc and ch groups in terms of motility, live/dead spermatozoa ratio, acrosome defect, mitochondrial activation, and HOS tests; however statistically significant difference was detected when these were compared with control groups (p<0,01). No statistical difference was determined in terms of abnormal spermatozoa rate, lipit peroxidation and DNA fragmentation between groups. Although statistical differences were seen in live and early apoptotic cells when the apoptosis data was analysed (p<0,01); there was no statistical difference within the other data (counted cells and late apoptotic cells) (p>0,05). 
As a result, it was concluded that ch and 7-dhc protect ram semen from freezing (cold shock) and thawing procedures; 7-dhc can be used instead of ch for extending and freezing ram semen. In vitro results obtained with ch and 7-dhc should be double-checked with fertility results.