Hiperterminin dişi germ hücrelerine etkisinin yapısal düzeyde incelenmesi
The analysis of the effect of hyperthermia in female germ cells at structural level
Yazar: İREM İNANÇ
Danışman: PROF. DR. DENİZ ERDOĞAN
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Germ hücreleri = Germ cells ; Hipertermi = Hyperthermia ; Kaspazlar = Caspases ; Over = Ovary ; Süperoksit dismutaz = Superoxide dismutase ; Sıcaklık şoku proteinleri = Heat shock proteins

Özet:
Hipertermi vücut sıcaklığının 41° C ya da daha yüksek bir değere ulaşmasıyla ortaya çıkan ve sıcak çarpmasına yol açabilen bir durumdur. Sıcak stresi ovaryum üzerinde çeşitli anomalilere neden olur. Bunlar düşük kalitede oosit üretimi, oosit membran bozukluğu, kromozomal anomaliler ve embriyonal gelişim bozuklukları olarak sıralanabilir. Hipertermi, ovaryum üzerinde yaptığı bu olumsuzlukları oksidatif stres ve apoptozis yoluyla gerçekleştirmektedir. Süperoksit dismutaz (SOD) ise serbest oksijen radikallerini ortadan kaldırarak, oksidatif stresi engelleyebilen ve apoptotik süreci geri döndürebileceği düşünülen antioksidan bir maddedir.Tüm bu nedenlerden ötürü çalışmamızda; hipertermi ile oluşturulan ısı stresinin ve stres öncesinde kullanılan SOD' un, ovaryum üzerindeki koruyucu ve tedavi edici etkilerinin apoptotik ve oksidatif stres belirteçleri kullanılarak belirlenmesi amaçlanmıştır.Çalışmada kullanılan 54 adet Wistar-albino cinsi dişi sıçan, her grupta 6 denek olacak şekilde 9 gruba ayrılmıştır. Kontrol grubu olarak belirlenen birinci gruptaki denekler sıcaklığı 22° C'ye ayarlanmış havuzda 20 dakika süre ile tutulmuş ve 24 saat sonra kesilerek ovaryum dokuları alınmıştır. İkinci gruptaki deneklere hipertermi uygulamasından bir saat önce NaCl+Katalaz uygulanmış daha sonra 42ºC' de sıcak su banyosunda 20 dakika bırakılmış ve hipertermi uygulamasından 30 dakika sonra dokuları alınmıştır. Üçüncü gruptaki denekler hipertermi uygulamasından bir saat önce NaCl+Katalaz uygulanmış, daha sonra 42ºC' de sıcak su banyosuna 20 dakika bırakılmış ve hipertermi uygulamasından 6 saat sonra dokuları alınmıştır. Dördüncü gruptaki deneklere hipertermi uygulamasından bir saat önce NaCl+Katalaz uygulanmış, 42ºC' de 20 dakika su banyosuna bırakılmış ve hipertermi uygulamasından 24 saat sonra dokuları alınmıştır. Beşinci gruptaki deneklere, hipertermi uygulamasından bir saat önce NaCl+Katalaz uygulanmış, ardından 42ºC' de 20 dakika sıcak su banyosuna bırakılarak hipertermi uygulamasından 72 saat sonra dokuları alınmıştır. Altıncı gruptaki deneklere, hipertermi uygulaması öncesi NaCl+ Katalaz+ SOD enjeksiyonu yapılarak 42ºC' de 20 dakika sıcak su banyosuna bırakılmış ve hipertermi uygulaması sonrası 30. dakikada dokuları alınmıştır. Yedinci gruptaki deneklere, hipertermi uygulamasından bir saat önce NaCl+ Katalaz+ SOD enjeksiyonu yapılmış, 42ºC' de 20 dakika sıcak su banyosuna bırakılmış ve hipertermi uygulaması sonrası 6. saatte dokuları alınmıştır. Sekizinci gruptaki deneklere, hipertermi uygulamasından bir saat önce NaCl+ Katalaz+ SOD enjeksiyonu yapılarak 42ºC' de 20 dakika sıcak su banyosuna bırakılmış ve hipertermi uygulama sonrası 24. saatte dokuları alınmıştır. Dokuzuncu grup deneklere hipertermi uygulamasından bir saat önce NaCl+ Katalaz+ SOD enjeksiyonu yapılarak, 42ºC' de 20 dakika sıcak su banyosuna bırakılmış ve hipertermi sonrası 72. saatte dokuları alınmıştır. Alınan dokular alışılagelmiş ışık mikroskobik izleme yöntemlerinden geçirilerek parafin bloklar oluşturulmuştur. Hiperterminin neden olduğu apoptozise, sitozolik bir antioksidan olan süperoksit dismutazın (SOD) koruyucu ve tedavi edici etkilerinin belirlenmesi amacıyla Kaspaz 3, HSP 70 protein düzeylerine etkisinin belirlenebilmesi amacıyla HSP 70 ve proliferasyonu belirlemek amacıyla PCNA immünreaktiviteleri değerlendirilmiştir.PCNA immünreaktivitesinin kontrol gruplarında granuloza ve teka interna hücrelerinde, oositte ve korpus luteumda çekirdeklerde kuvvetli tutulum gösterdiği belirlenmiştir. SOD uygulamasıyla birlikte, sekonder follikül granüloza ve teka interna hücrelerindeki immünreaktivitenin diğer gruplara karşın biraz daha az olduğu saptanmıştır.HSP 70 immünreaktivitesinin kontrol ve katalaz verilen sham kontrol gruplarında, folliküllerin granüloza ve teka interna hücreleri ile korpus luteum hücrelerinde belirgin olduğu görülmüştür. Ancak SOD' un koruyucu etkisiyle HSP 70 tutulumunun daha azaldığı belirlenmiştir.Kaspaz-3 immünreaktivitesi ise kontrol gruplarında orta dereceli olarak belirlenirken, SOD uygulanmış gruplarda apoptozisin engellediğini simgeleyen görünüm belirlenmiştir. Özellikle 24. ve 72. saatlerde gelişen follikül granüloza ve teka interna hücreleri ile oositte son derece az Kaspaz-3 immunreaktivitesi dikkati çekmiştir.Sonuç olarak hiperterminin sıçan ovaryum dokusu, oosit, granüloza ve teka interna hücreleri ile korpus luteumda belirgin hasara neden olduğu saptanmıştır. Hasar, özellikle tek sıralı ve çok sıralı primer folliküllerde ve sekonder folliküllerde izlenmiştir. Kontrol ve hipertermi gruplarında PCNA, HSP 70 ve Kaspaz-3 belirteçlerinin boyanmasının daha yoğun olduğu gözlemlenirken, SOD uygulanan gruplarda bu bulguların zayıfladığı belirlenmiştir. SOD' un koruyucu etkisi tüm gruplarda belirgin olarak izlenmiştir. SOD uygulamasının genelde 24 saate kadar etkili olduğu, 72. saatte etkisinin göreceli olarak azaldığı belirlenmiştir. Bu bulgulara koşut olarak, hiperterminin ovaryum dokusu üzerinde oluşturduğu olumsuz etkisinin SOD ile engeleyebileceği kanısına varılmıştır.

Abstract:
Hyperthermia is a state that the body temperature reaches at 41 ºC or higher values that causes heat shock.Heat stress causes abnormalities on ovary. These can be listed as low-quality oocytes producing, oocyte membrane disorder, chromosomal abnormality and abnormality at embryonic development .The damage that hyperthermia makes on ovary through oxidative stres and apoptosis way. Superoxide dismutase (SOD) which can prevent oxidative stres by eliminating the oxygen free radicals, and it is considered as an antioxidant substances that it could return the apoptotic process.All of these reasons,we try to determine that superoxide dismutases?,which was given before hyperthermia, preventive and curative effect on ovary at heat stress and stress-induced hyperthermia by using apoptosis and oxidative stress markers.In this study we use 54 Wistar-albino rats that was divided into nine group which was divided into six rats in each group. The first group was identified as the control group and this group rats set for 20 minutes in a pool which was 22ºC temperature and after that, 24 hours later rats were afflicted and ovarian tissues were taken. The second group of rats one hour prior to the application of hyperthermia applied NaCl + Catalase and then for 20 minutes 42 ° C hot water bath was applied and then abandoned 30th minutes after application of hyperthermia and then tissues were taken. The third group of rats one hour prior to the application of hyperthermia applied NaCl + catalase, then for 20 minutes 42 º C hot water bath was applied and then abonded 6 hours after application of hyperthermia and then tissue were taken. The fourth group of rats one hour prior to the application of hyperthermia applied NaCl+ catalase, then for 20 minutes 42ºC hot water bath was applied and then abonded 24 hours after application of hyperthermia and then tissues were taken.The fifth group of rats one hour prior to the application of hyperthermia applied NaCl+catalase, then for 20 minutes 42ºC hot water bath was applied and then abonded 24 hours after application of thyperthermia and then tissues were taken.The sixth group of rats one hour prior to the application of hyperthermia applied NaCl+catalase+SOD,then for 20 minutes 42ºC hot water bath was applied and then abonded 30 minutes after application of hyperthermia and then tissues were taken. The seventh group of rats one hour prior to the application of hyperthermia applied NaCl+catalase+SOD, then for 20 minutes 42ºC hot water bath was applied and then abonded 6 hoursafter application of hyperthermia and then tissues were taken. The eighth group of rats one hour prior to the application of hyperthermia applied NaCl+catalase+SOD, then for 20 minutes 42ºC hot water bath was applied and then abonded 24 hours after application of hyperthermia and then tissues were taken. The ninth group of rats one hour prior to the application of hyperthermia applied NaCl+catalase+SOD, then for 20 minutes 42ºC hot water bath was applied and then abonded 72 hours after application of hyperthermia and then tissues were taken. The tissues obtained from conventional monitoring methods of light microscopyand then paraffin blocks were created. In our study we try to determine superoxide dismutases?(SOD),which is a cytosolic antioxidant, protective features at hyperthermia induced apoptosis by using caspas 3 marker, to determine the proliferation we used PCNA marker and for heat stres we use HSP70 marker.Strong PCNA immunoreactivity were seen in the nuclei of granulosa cells, teca interna cells, oocytes and corpus luteum at the control group. It is determined that PCNA immunoreactivity in secondary follicles granulosa cells and teca interna cells was weaker than other groups by SOD apply.In our study an intense HSP70 staining was observed in follicles granulosa cells, teca interna cells and corpus luteum cells at the control group and catalase+NACl apply control group. But we have noticed that HSP70 staining diminished because of SOD?s protective effect.In our study while the intensity of caspase-3 staining was moderate in the ovarian tissue at the control group and catalase+NACl apply control group, it is determined that SOD prevented apoptosis at the SOD apply group.As a result it was determined that hyperthermy caused marked damage in rat ovarian tissue, oocytes, granulosa cells, teca interna cells and corpus luteum. Damage was especially seen in single layer and multilayer primary follicles and secondary follicles. While staining with PCNA, HSP70 and caspase-3 were more intense at the control group and hyperthermy group, it was significantly weaker at the SOD apply group. SOD?s protective effects were observed clearly at all groups. It is determined SOD apply?s effect lasts 24 hours and decreases relatively after 72 hours. In this way it is concluded that SOD can prevent the negative effect caused by hyperthermy in ovarian tissue.