Exophiala türlerinin tanısında rca (rolling circle amplification -yuvarlanan çember amplifikasyonu) yönteminin ıts rdna gen bölgesi hedeflenerek değerlendirilmesi
Evaluation of rca (rolling circle amplification) method by targeting its rdna gen region for identification of exophiala species
Yazar: ENGİN KAPLAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET MACİT İLKİT
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Amplifikasyon = Amplification ; Exophiala = Exophiala ; Kimliklendirme = Identification ; Mantarlar = Fungi ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Exophiala cinsi başta olmak üzere esmer mantarların tanısında moleküler tanı yöntemleri başarılı bir şekilde uygulanmaktadır. Bu yöntemler esmer mantarların tanısından tedavisine kadar epidemiyolojik özelliklerine bakış açımızı geliştirmektedir.
Bu çalışmada, Exophiala cinsi esmer mantarların tür düzeyinde tanısı için rDNA ITS bölgesi hedef alınarak yuvarlanan döngü amplifikasyonu (RCA) ve ligaz-bağımlı reaksiyon (LDR) olmak üzere iki ayrı ligaz-bağımlı prob amplifikasyon yöntemi geliştirildi. Çalışmada, ITS dizi analizi ile daha önceden tür tanısı doğrulanmış Exophiala dermatitidis, E. phaeomuriformis, E. heteromorpha, E. xenobiotica ve E. crusticola türlerine ait 57 referans izolat RCA ve LDR yöntemiyle incelendi. 
RCA prob duyarlılıklarının %100 ve özgüllüklerinin %4.7–85.7 (ortalama %45.2) arasında olmasına karşılık, LDR prob duyarlılıklarının %91.6–100 (ortalama %95.8) ve özgüllüklerinin %95.4–100 (ortalama %97.7) arasında olduğu saptandı. Bu veriler doğrultusunda, ayrıca, aynı Exophiala türlerini temsil eden ve tür tanısı ITS dizi analizi ile doğrulanmış 198 çevresel izolat LDR yöntemi ile incelendi. LDR problarıyla hedeflenen toplam 255 izolat değerlendirildiğinde, prob duyarlılıklarının %88.9-100 (ortalama 94.1),   özgüllüklerinin ise %93.7-100 (ortalama 96.8) arasında olduğu belirlendi. SYBR® Green I temelli qPCR yöntemi ile yapılan performans ve validasyon değerlendirilmelerinde LDR reaksiyonlarının yüksek oranda tekrar üretilebilir ve Avrupa GDO Laboratuvarları Ağı kılavuz limitleri içerisinde olduğu görüldü. 
Sonuç olarak, Exophiala cinsi esmer mantarların tür düzeyinde tanısında LDR'nin RCA yöntemine göre daha güvenilir ve üstün bir yöntem olduğu belirlendi. Bilgilerimize göre, bu çalışma, tıbbi mikoloji alanında özellikle Exophiala cinsi esmer mantarların tanısında LDR yönteminin etkinliğinin değerlendirildiği ilk çalışmadır.

Abstract:
Molecular diagnostics are succesfully applied for the identification of black yeasts, particularly for the genus Exophiala. These techniques are also improve our understanding their epidemiological characteristics from bench to the bedside. 
We developed two ligase-dependent probe amplification assays based on the rolling circle amplification (RCA) and ligase-dependent reaction (LDR) methods to differentiate the species from the Exophiala genus by targeting the rDNA internal spacer transcribed (ITS) region. We evaluated Exophiala dermatitidis, E. phaeomuriformis, E. heteromorpha, E. xenobiotica, and E. crusticola, as these species had been previously distinguished using ITS sequencing. We investigated 57 reference isolates representing these five species using RCA and LDR methods. 
Depending on the RCA probes used, the reaction sensitivity was 100% and the specificity ranged from 4.7% to 85.7% (median: 45.2%). In contrast, the sensitivity and specificity of the LDR probes targeting the same isolates were 91.6–100% (median: 95.8%) and 95.4–100% (median 97.7%), respectively. We also assessed 198 additional environmental isolates that represented the same Exophiala species and had been previously identified using ITS sequencing. The overall sensitivity and specificity of the LDR probes that targeted the 255 isolates ranged from 89.9% to 100% (median: 94.1%) and from 93.7% to 100% (median 96.8%), respectively. The assessment of the performance and validation of the LDR probes based on qPCR with SYBR Green revealed high reproducibility and an acceptable range limit in line with the guidelines of the European Network of GMO Laboratories.
In conclusion, LDR was found to be more reliable and inexpensive than RCA for species-level identification of Exophiala isolates. To the best our knowledge, this study comprises the first analysis of the efficacy of LDR in the medical mycology field, particularly for the black yeast genus Exophiala identifications.