Susam küspesindeki proteinin enzimatik hidrolizinin, çözünürlüğünün, enzim inaktivasyon kinetiğinin ve fonksiyonel özelliklerinin incelenmesi
Investigation of enzymatic hydrolsis, solubilization, enzyme inactivation kinetic and functional properties of sesame cake protein
Yazar: ELÇİN DEMİRHAN YILMAZ
Danışman: PROF. DR. BELMA KIN ÖZBEK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Proteinin yapı taşları olan amino asitlerine parçalanması doğal bir prosestir. Enzimlerle hidroliz işlemi sonucunda diğer hidroliz proseslerine göre daha güvenli ve istenen hidrolizat ürünleri elde edilir. Proteinin peptidlere parçalanması ile çözünür ve sindirimi kolay ürünler elde edilir ve tat, viskozite, karıştırılabilirlik, emulsifiye edici ve köpük yapıcı gibi diğer fonksiyonel özellikler de etkilenir. Bitkisel kaynaklı proteinlerin ucuz olmasına ve bol bulunmasına rağmen gıdalarda istenen fonksiyonel performanslarının düşük olmasından dolayı, gıda ürünlerinde kullanımı sınırlıdır. Ancak, enzimatik modifikasyonlarla proteinlerin fonksiyonel özelliklerinin geliştirilebileceği belirtilmiştir ve bu şekilde elde edilen ürünler gıda katkı maddeleri olarak değerlendirilmektedir.Yağ endüstrisinde atık olarak elde edilen susam küspesi yaklaşık olarak % 40 oranında protein içerir. Günümüzde, daha çok hayvan yemi olarak kullanılan susam küspesinin, gıda katkısı olarak kullanılabilmesinde en büyük dezavantajı çözünürlüğünün çok düşük olmasıdır. Ancak bu dezavantaj proteinin modifiye edilmesi ile ortadan kaldırılabilir. Susam küspesi proteininin gıda katkısı olarak kullanımını geliştirmek amacı ile bu çalışmada, susam küspesinin enzimatik hidrolizi, kapsamlı bir biçimde incelenmiştir.Bu tez kapsamında gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda; ilk olarak beş farklı ticari enzim (Alcalase, Neutrase, Protamex, Flavourzyme ve PTN) kullanılmış ve bunların arasından susam küspesi hidrolizi için en uygun enzimin Alcalase olduğu belirlenmiştir. Daha sonra, hidroliz derecesini belirlemek için kullanılan pH-stat yöntemi susam küspesi proteininin Alcalase enzimi ile hidolizi için kalibre edilmiş ve susam küspesi hidrolizatları için pK değerleri; 40°C, 50°C ve 600C sıcaklıklarda sırasıyla 6.88, 6.65 ve 6.42 olarak bulunmuştur. Kesikli sistemde, hidroliz paremetrelerinin optimizasyonu için, farklı substrat konsantrasyonlarında (10-30 g protein/L), enzim konsantrasyonlarında (% 0.20-0.40 (hacim/hacim)), pH (6.5-9) ve sıcaklık (45-650C) değerlerinde deneyler gerçekleştirilerek hidroliz derecesi, protein çözünürlüğü ve enzim stabilitesi zamana karşı incelenmiştir. Farklı proses şartlarında gerçekleştirilen bu deneyler sonucunda hidroliz için optimum proses şartları; 15 g protein/L substrat konsantrasyonu, % 0.30 (hacim/hacim) enzim miktarı, 50°C sıcaklık ve pH 8.5 olarak belirlenmiştir. Optimum proses şartlarında, 120 dakika süreyle gerçekleştirilen hidroliz reaksiyonu sonucunda, % 26.3 hidroliz derecesi, % 82.1 protein çözünürlüğü elde edilmiş ve enzimin aktivitesini yaklaşık % 56 oranında kaybettiği saptanmıştır.Çalışmada hidroliz ürünlerinin, kademeli enzim ilavesinin ve susam küspesine uygulanan; ısıl, mikrodalga ve sonikasyon ön işlemlerinin hidroliz reaksiyonu üzerindeki etkileri ayrıca incelenmiştir. Optimizasyon deneyleri sonucunda elde edilen tüm veriler analiz edilerek; hidroliz, çözünürlük ve enzim inaktivasyonu için kinetik modeller elde edilmiştir. Susam küspesi proteininin hidrolizinin Michelis Menten Kinetiğine uygunluğu, başlangıç hız deneyleri gerçekleştirilerek ayrıca incelemiştir. Hidroliz reaksiyonu için Michelis Menten Kinetik parametreleri; Km= 41.17 g/L, Vmax= 9.24 meqv/L.dak olarak elde edilmiş, bu parametrelerin sıcaklık ve pH ile değişimi ayrıca incelenmiştir. Alcalase enzimi için ürün inhibisyon türünün unkompetitiv olduğu belirlenmiş ve inhibisyon sabiti Ki= % 38.24 (hidrolizat hacmi/reaksiyon çözeltisi hacmi) olarak hesaplanmıştır.Susam küspesi proteininin hidrolizatlarının fonksiyonel özellikleri (su tutma kapasitesi, yağ tutma kapasitesi, köpürme ve emülsiyon özellikleri) incelenmiştir. Enzimatik hidroliz, susam küspesi protein hidrolizatlarının fonksiyonel özelliklerini geliştirmiştir. Susam küspesi protein hidrolizatlarının bu fonksiyonel karakteristikleri, endüstriyel gıda uygulamalarında doğal katkı olarak hidrolizatların kullanımını sağlamaktadır. Sonuç olarak, gıda sanayi atığı olan susam küspesi değerli bir gıda katkısı haline dönüşebilmektedir.

Abstract:
The breakdown of a protein to constituent amino acids is a natural process. Protein hydrolysis can be achieved by a number of chemical processes, in acidic and basic conditions and most importantly by enzymes for example proteases. The more soluble and easily digestible products can be obtained by the break down the proteins to peptides; and some functional properties such as flavour, viscosity, emulsifying and foaming are also affected. Although, the plant proteins are cheap and superabound, the use of these proteins in food industry is limited because of their low functional performances. However, the functional properties of plant proteins can improve by enzymatic modifications; and then these products can be considered as foodstuff in the food industry.The sub-product of the oil extraction process is sesame cake, which has 40 % protein content. The main use of sesame cake is animal feed. The low water solubility of sesame cake limits its use for human food products, but it can be increased by modification. In the present work, a comprehensive study on the hydrolysis of sesame cake prtotein was performed to improve its utilization in food products.In the present study, first of all a general survey of enzymatic hydrolysis and solubilization of sesame cake protein was performed with five commercial enzyme preparations (Alcalase, Neutrase, Flavourzyme, Protamex and PTN) in order to choose appropriate enzyme; and Alcalase gave the highest performance among the other enzymes used. Then, the calibration of pH-stat was performed; and the pK values of the sesame cake protein hydrolysates were determined as 6.88, 6.65 and 6.42 for the temperatures of 40°C, 50°C and 600C respectively. For optimization of the process parameters, hydrolysis reactions were performed at different substrate concentrations (10-30 g protein/L), enzyme concentrations (0.20-0.40 % v/v), pH values (6.5-9) and temperatures (45-650C); and the degree of hydrolysis, solubility of sesame cake protein and residual enzyme activity were investigated depending on the processing time. The optimum process conditions for hydrolysis and solubilization were obtained as 15 g/L substrate concentration, 0.30 % v/v enzyme concentration, 50 °C and pH 8.5. Under these conditions, the values of degree of hydrolysis and solubilization were found as 26.3 % and 82.1 % respectively; and enzyme lost its activity by approximately 56 % at the end of 120 min processing time.The effect of hydrolysis products and pretreatments applied to substrate; such as termal treatment, microwave irridation, and sonic treatment; on hydrolysis were also investigated. Modeling studies were performed to determine the kinetics of hydrolysis, solubilization and enzyme inactivation. The Michelis Menten kinetics was exmined with initial rate assays, and the kinetic parameters, Km and Vmax were estimated as 41.17 g/L and 9.24 meqv/L.min. The effects of temperature and pH on Michelis Menten parameters were also examined. The type of inhibition for Alcalase determined as uncompetitive; and the inhibition constant Ki was estimated as 38.24 % (hydrolysate/substrate mixture).The functional properties (water holding capacity, oil holding capacity, foaming and emulsion properties) were investigated. It was found that the functional properties of sesame cake protein hydrolysates could be modified by enzymatic hydrolysis. The results suggested that the functional characteristics of sesame cake protein hydrolysates make them good substrates to be used in food industry as a natural additive for many industrial food applications; and also for cosmetic and personal care products. So, the by-product sesame cake can be processed into a value-added product.