Termofilik Geobacillus caldoxylolyticus TK4 suşundan maltojenik amilaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of a maltogenic amylase of Geobacillus caldoxylolyticus TK4
Yazar: YAKUP KOLCUOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. AHMET ÇOLAK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Bölümü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
TUBİTAK, 106T696 nolu proje kapsamında gerçekleştirilen bu çalışmada, yeni bir termofilik suş olan Geobacillus caldoxylolyticus TK4'den bir genomik DNA kütüphanesi oluşturuldu. Bu kütüphaneden elde edilen veriler ve bu verilere dayanılarak yapılan invers PCR'lar sonucunda, 1740 bazdan oluşan bir maltojenik amilaz (Gca TK4 MA) geninin tam DNA sırası belirlendi. Bu DNA sırasının, amino asit sırasına çevrildikten sonra BLAST programı ile incelenmesi sonucunda, Bacillus thermoalkalophilus MA'ına %86 ve Geobacillus stearothermophilus MA'ına %77 oranında benzediği tespit edildi. pET-28a(+) vektörüne klonlanan Gca TK4 MA geni, Escherichia coli BL21(DE3)pLysS'de ekspres edildi. N-ucunda histidin kuyruğu (6xhis tag) içeren rekombinant protein, Nikel afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. SDS-PAGE sonucunda, saflaştırılan proteinin tek bir cins polipeptitten oluştuğu belirlendi. Yapılan teorik hesaplamada, histidin kuyruğu içeren rekombinant proteinin alt birim molekül ağırlığının 70,03 kDa olduğu bulundu. Enzim aktivitesi ? -siklodekstrin substratı varlığında belirlendi. Enzimin optimum pH ve sıcaklığının, sırasıyla 7,0 ve 50 ? C olduğu tespit edildi. Rekombinant enzimin, 4 ve 50 °C'lerde, pH 3,0-9,0 aralığındaki tamponlarda ayrı ayrı 7 gün inkübe edilmesiyle yapılan pH kararlılığı çalışmasında, enzimin 50 °C'de daha yüksek bir kararlılığa sahip olduğu görüldü. Enzimin, 90 ? C'de 7 gün inkübe edildiğinde aktivitesini %20 oranında koruduğu gözlendi. Reaksiyon ortamına nihai konsantrasyonları 5 mM olacak şekilde Li+, Co2+, Fe2+ ve Cu2+ ilave edildiğinde aktivitede kısmen bir azalma olduğu, Mn2+ ilave edildiği durumda ise aktivitede önemli ölçüde artış olduğu tespit edildi. Ayrıca, reaksiyon karışımlarına %1 nihai konsantrasyonda SDS ve EDTA ilave edildiğinde enzim aktivitesinin önemli ölçüde azaldığı gözlendi. Bu sonuçlar, elde edilen rekombinant Gca TK4 MA'ın, ısıl ve pH kararlılığı ve diğer özellikleri açısından endüstriyel uygulamalarda kullanılabilecek bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Abstract:
In this study, supported by TUBITAK (Project number is 106T696), a genomic DNA library was made from thermophilic Geobacillus caldoxylolyticus TK4 strain. The whole DNA sequence of a maltogenic amylase (Gca TK4 MA) gene consisting of 1740 bp was determined by performing inverse PCRs. Amino acid sequence alignments were done by using BLAST programme. The results indicated that the amino acid sequence of the Gca TK4 MA was highly similar to Bacillus thermoalkalophilus MA and Geobacillus stearothermophilus MA in the ratios of 86% and 77%, respectively. The gene was cloned into pET28a(+) vector and expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS with his-tagged (6xhis tag) at the N-terminus. The protein was purified by using one-step nickel affinity chromatography. SDS-PAGE showed that the purified protein was only one kind of polypeptide chain. The calculated subunit molecular weight of the his-tagged recombinant protein was 70.03 kDa. The enzyme activity was determined by using ? -cyclodextrine as a substrate. pH and temperature optima of the enzyme were determined as 7.0 and 50 ? C, respectively. When the enzyme was separately incubated at 4 °C and 50 °C in the buffer solutions (pHs ranging from 3.0-9.0) for 7 days, it showed higher stability at 50 °C than 4 °C. When the enzyme was incubated at 90 °C for 7 days, enzyme retained about 20% of its original activity. The activity of recombinant Gca TK4 MA was partially inhibited by Li+, Co2+, Fe2+, and Cu2+metal ions at 5 mM final concentration. When Mn2+ was used, the activity highly increased. Moreover, enzyme activity was significantly inhibited by SDS and EDTA at the final concentration of 1%. It is clear from the present results that the pH- and thermo- stabilities and other biochemical features of the recombinant enzyme make it potential for industrial applications.