A1 tip inek sütü ve süt ürünlerinde Beta-kazomorfin-7 için HPLC' ye dayalı tayin yöntemi geliştirilmesi
Development of RP-HPLC method for the determination of bovine Beta-casomorphin-7 peptide in A1 type milk and milk products
Yazar: AYSEL ERASLAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. EBRU SAATÇİ
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada A1 tip inek sütü ve süt ürünlerinde bulunan beta-kazomorfin-7 (ß-kazomorfin-7, BKM-7) peptiti HPLC' de analiz edilmiştir. Bunun için öncelikle BKM-7 aminoasit sekansına sahip olan standartların 220 nm dalga boyunda maksimum absorbans verdiği belirlendikten sonra alıkonma zamanları tayin edilmiştir. BKM-7' nin 36-38. dk arasında pik verdiği gözlenmiştir. Elde edilen BKM-7 piklerinin konsantrasyonu, 0.0312-1.25 mM derişim aralığında bir seri standart BKM-7 eğrisine karşı hesaplanmıştır. Enzimatik kesim sonrası süt örneklerinde BKM-7 piki görülmemiştir. Filtre edilen yoğurt örneklerinde de BKM-7 piki görülmemiştir. 10000 ve 30000 MWCO ile filtre edilen peynir örnekleri de HPLC' ye yüklenmiştir. K ve L marka peynirlerde BKM-7 piki görülmemiştir. 10000 MWCO ile filtre edilen M marka peynirde alanı 0.043 ve 0.046 olan BKM-7 pikleri görülmüştür. Bu alanlara karşılık gelen konsantrasyonlar BKM-7 standart kalibrasyon eğrisi kullanılarak sırasıyla 5.3 ve 5.7 ?M olarak hesaplanmıştır. 30000 MWCO ile filtre edilen M marka peynirde ise alanı 0.076 ve 0.1 olan BKM-7 pikleri görülmüştür. Bu alanlara karşılık gelen konsantrasyonlar BKM-7 standart kalibrasyon eğrisi kullanılarak sırasıyla 9.4 ve 12.3 ?M olarak hesaplanmıştır. 10000 MWCO ile filtre edilen N marka peynirde alanı 0.11 ve 0.17 olan BKM-7 pikleri görülmüştür ve alanlara karşılık gelen konsantrasyonlar sırasıyla 13.6 ve 21 ?M olarak hesaplanmıştır. 30000 MWCO ile filtre edilen N marka peynirde ise alanı 0.23 ve 0.27 olan BKM-7 pikleri görülmüştür ve alanlara karşılık gelen konsantrasyonlar sırasıyla 28.4 ve 33.3 ?M olarak hesaplanmıştır. Kullanılan filtrelerin geri kazanım katsayılarına göre (10000 MWCO için 0.6 ve 30000 yapılan MWCO için 0.9) yapılan iyileştirme ile M marka peynir suyundaki ortalama BKM-7 miktarı 10.61 ± 2.04 ?M ve N marka peynir suyundaki ise 31.56± 3.85 ?M olarak bulunmuştur.Bu çalışma, sağlık açısından her yönden önem ihtiva eden biyoaktif bir peptit olan BKM-7' nin tespiti ve buna bağlı olarak A1 tip sütün tespitine olanak sağlayan, Türkiye' deki bu konu ile ilgili taramayı gerçekleştiren özel bir çalışma niteliği taşımaktadır. Ayrıca BKM-7' nin miktar tayini yapılabilmesi ile de sütte A1 tip süt biyobelirteci olarak analitik yönden günlük hayata uygulanabilirliği kuvvetli ve özgüldür.Anahtar Kelimeler: A1 tip inek sütü, beta-kazomorfin-7, ters-faz HPLC

Abstract:
In this study, beta-casomorphin-7 (ß-casomorphin-7, BCM-7) bioactive peptide in Type A1 bovine milk in the dairy products is analysed by cromatographic separation methods. Therefore, the standards, having the bovine BCM-7 aminoacid sequence, are injected to RP-HPLC system and the absorbance in 220 nm was detected in the chromatogram. The retention time was detected between 36-38. min. for BCM-7. The area of BCM-7 standards? peaks (0.0312-1.25 mM in concentrations) were taken from the Class-VP software calculation and the standard graphic was drawn by using concentration vs area. The concentration of the sample peaks were calculated by using standard calibration curve. BCM-7 peak was not seen in the samples of milks after enzymatic release. BCM-7 peak was not seen in the samples of the filtered yoghurt as well. On the other hand, BCM-7 peaks were seen in some of the cheese whey samples. The cheese wheys, filtered with 10000 and 30000 MWCO filter units, were loaded into RP-HPLC system. BCM-7 peak was not seen in K and L cheese whey, but were seen in M and N white cheese wheys. The amount of BCM-7 peaks in 10000 MWCO filtered M cheese whey were calculated by using their area as 0.043 and 0.046 and the concentrations were calculated as 5.3 and 5.7 ?M for each double injections. The amount of BCM-7 peaks in 30000 MWCO filtered M cheese whey were calculated by using their area as 0.076 and 0.1 and the concentrations were calculated as 9.4 and 12.3 ?M for each double injections. The amount of BCM-7 peaks in 10000 MWCO filtered N cheese whey were calculated by using their area as 0.11 and 0.17 and the concentrations were calculated as 13.6 and 21 ?M for each double injections. The amount of BCM-7 peaks in 30000 MWCO filtered N cheese whey were calculated by using their area as 0.23 and 0.27 and the concentrations were calculated as 28.4 and 33.3 ?M for each double injections. By considering of the recovery coefficient of each filter units (0.6 for 10000 MWCO and 0.9 for 30000 MWCO), the average concentration of BCM-7 peptide for M and N cheese wheys were calculated as 10.61 ± 2.04 ?M and 31.56 ± 3.85 ?M, respectively.This study is a crucial and analytical study in which bovine bioactive peptide BCM-7 can be detected by quantitative results. By this method, A1 bovine milk can also be detected and BCM-7 determination can be used as a significant milk marker in daily life to determine BCM-7 in bovine milk.Keywords: Type A1 bovine milk, beta-casomorphin-7, RP-HPLC