Kolorektal kanser hücrelerinde siRNA aracılı NILCO inhibisyonunun MDR1 geni üzerine olası etkisinin araştırılması
Investigation of potential effect of siRNA-mediated NILCO inhibition on MDR1 gene in colorectal cancer cells
Yazar: AYSEL GÜLTEKİN
Danışman: PROF. DR. NİLÜFER ERKASAP
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Kolon hastalıkları = Colonic diseases ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Leptin = Leptin ; Paklitaksel = Paclitaxel ; RNA = RNA ; Çentik = Notch ; İlaçlara direnç-çoklu = Drug resistance-multiple ; İnterlökin 1 = Interleukin 1

Özet:
Amaç: Kolorektal kanser (KRK), dünya çapında kanser türleri arasında erkek ve kadınlarda ikinci sırada ölüme neden olmaktadır. KRK tedavisinde kemoterapi önemli rol oynar ve bunun etkinliğini kemoterapötik ajana karşı gelişen çoklu ilaç direnci (Multidrug Resistance, MDR) etkiler. Çoklu ilaç direnci kemoterapi tedavisinin önünde bir engel oluşturarak kanser gelişimi ve hastanın sağ kalım oranını büyük ölçüde etkiler. Bu direnci açıklayan ana mekanizmalardan birisi ABC transmembran proteinleri ile ilişkilidir. Bu transmembran proteinleri kemoterapötik ajanların hücre dışına doğru akışına neden olarak hücrenin hayatta kalmasını sağlar. ABC transmembran ailesinden birisi olan MDR1 geni birçok kanserde kötü prognoz ile ilişkilendirilmiştir. Kanser hücrelerinin gelişiminde ve kemorezistansında rol oynayan çok sayıda farklı gen ve sinyalizasyon yolağı vardır. Kanser hücrelerinin proliferasyon, migrasyon, anjiyojenez ve metastazında etkili olduğu gösterilen Notch, IL-1 ve leptin (NILCO) genleri arasındaki etkileşim ve aşırı ekspresyonlarının KRK dahil birçok kanser türünde önemli olduğu bildirilmiştir. Endometriyal kanserde yapılan bir çalışmada kanser hücrelerine leptin inhibitörü verildiğinde leptin tarafından indüklenen NILCO'nun baskılanması sonucu bu hücrelerde kemoduyarlılığın arttığı bildirilmiştir. Ancak yapmış olduğumuz literatür incelemesinde kolorektal kanserde NILCO ve MDR1 ilişkisini moleküler düzeyde inceleyen bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu bilgilerin ışığı altında çalışmamızda Caco-2 ve HT-29 KRK hücre hatlarında, Notch, IL-1 ve leptin genleri siRNA ile tek tek susturulup NILCO ve kemorezistansta rol oynayan MDR1 gen ekspresyonlarındaki değişimi göstermeyi hedefledik. Aynı zamanda, NILCO ilişkili genlerin çeşitli kanser türlerinde MMP2 ve VEGFA'nın aşırı ekspresyonuna neden olarak hücre invazivliği ve anjiyojenezini indüklediği bildirilmiştir. Bu nedenle çalışmamızda MMP2 ve VEGFA mRNA düzeylerinin analizi de hedeflenmiştir. 
Yöntem: Hücre kültürü çalışmamızda Caco-2 ve HT-29 hücre hattı kullanıldı. DMEM/High Glucose Medium (%89), FBS (%10) ve Penisilin/Streptomisin (%1)  içeren besi ortamı ile hücreler çoğaltıldı. Kemoterapötik ajan olan Paclitaxel'in deneyde kullanılacak dozuna MTT yöntemi ile karar verildi. Hücreler gruplara ayrılarak Notch, IL-1 ve leptin genlerine ait siRNA dozları hücrelere verildi ve hedeflenen genler qRT-PCR yöntemi ile analiz edildi.
Bulgular: Yaptığımız çalışmada; NILCO etkileşiminde rol oynayan genlerin siRNA ile susturulması sonucunda kemoterapötik ajan olarak Paclitaxel uyguladığımız hücrelerdeki MDR1 gen ekspresyonu, NILCO genlerinin siRNA ile susturulduğu hücrelerde azalmıştır.
Sonuç: Sonuçlarımıza göre; NILCO genlerinin baskılanması MDR1 gen ekspresyonunun düzenlenmesinde etkilidir. Elde ettiğimiz sonuçlar, kolorektal kanser gelişimi üzerinde rol oynayan NILCO'nun MDR1 ekspresyonu üzerindeki etkisine dair literatüre bilgi kazandıracağı gibi kolon kanserinde gelişen kemorezistans ile başa çıkabilmek için bu hedef yolakların inhibisyonu ve MDR ilişkisi göz önüne alınarak yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilebilmesine olanak sağlayacaktır.
Anahtar Kelimeler: Kolorektal kanser, KRK, Notch, Leptin, IL-1, NILCO, çoklu ilaç direnci, MDR, Paclitaxel, PTX

Abstract:
Aim: Chemotherapy is the most commonly used treatment in management of CRC and multidrug resistance (MDR) reduces the effectiveness of chemotherapeutic agents. Development of MDR causes shorter patient survival along with relapse in treatment. One of the main mechanisms explaining this resistance is associated with ABC transmembrane proteins. These transmembrane proteins ensures cell survival by causing chemotherapeutic agents to flow out of the cell. Increased expression levels of the MDR1 gene has been associated with poor prognosis in many cancers. Many different genes and signaling pathways are involved in the development of resistance to chemotherapeutics.It has been reported that the interaction and overexpression of Notch, IL-1 and leptin (NILCO) genes, which have been shown to be effective in proliferation, migration, angiogenesis and metastasis of cancer cells, are important in many cancer types, including CRC. The relationship between Notch, IL-1, leptin and MDR, which may cause chemoresistance in colorectal cancer, has not been fully understand. We aimed to show the changes in MDR1 and NILCO gene expressions, which play a role in chemoresistance, by silencing the Notch, IL-1 and leptin genes one by one with siRNA in Caco-2 and HT-29 colorectal cancer cell lines. At the same time, it has been reported that NILCO-related genes induce cell invasiveness and angiogenesis by causing overexpression of MMP2 and VEGFA in various cancer types. Therefore, the analysis of MMP2 and VEGFA mRNA levels was also targeted in our study.
Method: We used Caco-2 and HT-29 cell lines in our cell culture study. CRC cells were grown in medium containing DMEM/High Glucose Medium (%89), FBS (%10) and Penicillin/Streptomycin (%1). The dose of Paclitaxel (PTX) to be used in the experiment was determined by the MTT method. Cells were divided into groups. siRNA doses of Notch, IL-1 and leptin genes were given to cells and targeted genes were analyzed by qRT-PCR method.
Results: Knockdown of NILCO genes with siRNA decreased MDR1 gene expression in cells treated with Paclitaxel. 
Conclusion: Based on our results; NILCO is a potantial biomarker for chemoresistance considering NILCO-knockdown regulates MDR expression and targeting NILCO may be a promising approach for overcoming resistance to thereapies in colorectal cancer.
Keywords: Colorectal cancer, CRC, Notch, Leptin, IL-1, NILCO, multidrug resistance, MDR, Paclitaxel, PTX