Kafeik asit fenetil esterinin antioksidan kapasitesinin belirlenmesi ve insan karbonik anhidraz izoenzimleri (HCA-I ve HCA-II) üzerine inhibisyon etkisinin incelenmesi
Determinaton of antioxidant capacity of caffeic acid phenethyl ester and investigation of its inhibition effect on human carbonic anhydrase izoenzymes (HCA-I ve HCA-II)
Yazar: HÜLYA GÖÇER
Danışman: DOÇ. DR. İLHAMİ GÜLÇİN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Bölümü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants

Özet:
Bu çalışmada kafeik asit fenetil esterinin (CAPE) muhtemel antioksidan ve radikal giderme aktiviteleri değerlendirildi. Ayrıca CAPE'nin insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimleri I ve II (hCA-II ve hCA-II) üzerine inhibisyon etkisi incelendi.CAPE'nin antioksidan ve radikal giderme aktivitelerini değerlendirmek için tiyosiyanat metoduna göre total antioksidan aktivite, 2,2´-azino-bis(3-etilbenztiyoazolin-6-sülfonik asit) radikal (ABTS?+) giderme aktivitesi, 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil serbest radikal (DPPH?) giderme aktivitesi, N,N-dimetil-p-fenilendiamin radikal (DMPD?+) giderme aktivitesi, süperoksit anyon radikali (O2?-) giderme aktivitesi, potasyum ferriksiyanit indirgeme metodu ile indirgeme kuvveti, kuprak metodu ile kuprik iyonları (Cu2+) indirgeme kapasitesi, FRAP metodu ile ferrik iyonları (Fe3+) indirgeme kuvveti, ferozin ve bipirdil reaktifleri ile ferröz iyonları (Fe2+) şelatlama aktivitesi çalışıldı. Ayrıca her metot için BHA, BHT, ?-tokoferol ve troloks referans antioksidan olarak kullanıldı. CAPE'nin çalışılan bütün metotlarda kuvvetli antioksidan ve radikal giderme aktivitesi sergiledi.Çalışmanın ikinci kısmında ise CAPE'nin insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimleri I ve II (hCA-II ve hCA-II) üzerine in vitro olarak inhibitör etkisi araştırıldı. Öncelikle hCA-I ve hCA-II izoenzimleri sırasıyla Sepharose-4B-L-Tirozin afinite kolon kromatografisi ile %69,12, %58,0 verimle 206,93 ve 787,18 kat saflaştırıldı. Enzim saflığını belirlemek için, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapıldı ve tek bant gözlendi. Daha sonra I50 değerlerini bulmak için, hidrataz aktivitesi kullanılarak CAPE'nin karbonik anhidraz izoenzimleri I ve II (hCA-I ve hCA-II) üzerine inhibisyon etkileri araştırıldı. Ayrıca kinetik çalışmalar için CAPE'nin hCA-I ve hCA-II üzerine inhibisyon etkileri 4-nitrofenil asetat substratı ile esteraz aktivite metodu kullanılarak da araştırıldı. Ki değerleri sırasıyla hCA-I için 115?M ve hCA-II için de 47.3 ?M olarak bulundu. CAPE'nin hCA-I ve hCA-II izoenzimleri üzerindeki inhibisyon türünün yarışmasız inhibisyon olduğu gözlendi. Kuvvetli antioksidan ve radikal giderme aktivitesine sahip olan CAPE'nin bu özelliklerinden dolayı hCA-I ve hCA-II için daha güvenli bir inhibitör olarak kullanılabilir.2011, 116 sayfaAnahtar Kelimeler: CAPE, antioksidan aktivite, karbonik anhidraz, enzim inhibisyo

Abstract:
The possible antioxidant and radical scavenging activities of caffeic acid phenethyl ester were evaluated in this study. Also the inhibition effect of CAPE was determined on human erythrocyte izoenzymes I and II (hCA-I and hCA-II).In order to evaluate the antioxidant and radical scavenging activities of CAPE, different in vitro methods such as total antioxidant activity by thiocyanate method, 2,2´-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) radical (ABTS?+) scavenging activity, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl free radical (DPPH?) scavenging activity, N,N-dimethyl-p-phenylenediamine radical (DMPD?+) scavenging activity, superoxide anion radical (O2?-) scavenging activity, reducing power by potassium ferricyanide reduction method, cupric ion (Cu2+) reduction capacity by Cuprac method, ferric ion (Fe3+) reducing power by FRAP method and ferrous ions (Fe2+) chelating activities by ferrozine and bipyrdyl reagent were performed separately. Also, BHA, BHT, ?-tocopherol and trolox, a water-soluble analogue of ?-tocopherol, were used as the reference antioxidant compounds for each method. CAPE exhibited powerful antioxidant and radical scavenging effects in all of used methods.In the second part of this study, the in vitro inhibitory effect of CAPE on the human erythrocyte carbonic anhydrase isoenzymes (hCA-I and hCA-II) was investigated. Firstly, hCA-I and hCA-II were purified by Sepharose-4B-L-Tirozine affinity column chromatography with a yield of 69.12, 58.0% and 206.93 and 787.18-fold purification of each isoenzyme, respectively. For determination of enzyme purity, sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed and single band was observed. Then, for determination of I50 values, the inhibitory effects of CAPE on human carbonic anhydrase isozymes (hCA-I and hCA-II) were investigated by using hidratase assay. Also, for determination of kinetic studies, the inhibition effect of CAPE on hCA-I and hCA-II, was investigated by using the esterase assay, with 4-nitrophenyl acetate as substrate. KI values were found as 115 ?M for hCA-I and of 47.3 ?M for hCA-II, respectively. exhibited competitive inhibitory effect. CAPE demonstrated non-competitive inhibition type on hCA-I and hCA-II with 4-nitrophenylacetate substrate. CAPE, which had powerful antioxidant and radical scavenging activities can be used as safer inhibitor for hCA I and hCA II izoenzymes.2011, 116 pagesKeywords: CAPE, antioxidant activity, carbonic anhydrase; enzyme inhibition