Diabetes insipidus'lu hastaların AVPR2 geninde tanımlanan yeni mutasyonların fonksiyon analizleri
Functional analysis of novel mutations in AVPR2 gene in patients with diabetes insipidus
Yazar: BERİL ERDEM
Danışman: PROF. DR. HATİCE MERGEN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Diabetes i̇nsipidus (DI) 25.000 bireyde 1 görülen nadir kalıtsal bir hastalıktır. Bu hastalık idrarın konsantre edilememesi nedeniyle sıvı dengesinin düzenlenememesinden ötürü şiddetli seyreder. DI, arjinin vazopressin (AVP, ADH, antidiüretik hormon) yetersizliğine bağlı olarak santral (CDI) veya böbreklerde AVP'nin fonksiyon bozukluğuna bağlı olarak nefrojenik (NDI) tipte olabilir. Santral DI, AVP üretiminden sorumlu nöronların anormal gelişimi veya tahribatı sonucu meydana gelir. Nefrojenik DI, genetik kaynaklı olabileceği gibi sonradan da meydana gelebilir.

Vücuttaki su dengesi birçok mekanizma tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilir. Kanda bulunan maddelerin konsantrasyonundaki herhangi bir değişim çeşitli duyu sistemleri tarafından algılanır. Endoteliyal baroreseptörler azalan kan hacmini (hipovolemi) algılarken, hipotalamik ozmoreseptörler kandaki yükselen elektrolit konsantrasyonuna (hipernatremi) karşı duyarlıdırlar. Hem kan hacminin azalması hem de kandaki elektrolit konsantrasyonunun artması, AVP'nin hiptalamustaki sentezinden sonra depolandığı arka hipofizden salınmasını tetikler. AVP salındıktan sonra reseptörü olan ve böbrekte bulunan arjinin vazopressin reseptör 2'ye (AVPR2, V2R) bağlanır. Bir G protein bağlı reseptör (GPCR) olan AVPR2, temel olarak böbrekteki toplama kanallarının esas hücrelerinin bazolateral kısmında ifade olur. AVP'nin AVPR2'ye bağlanması akuaporin 2 su kanallarının (AQP2) toplama kanalı ana hücrelerinin apikal membranına doğru gitmesine neden olur. AQP2 su kanallarının bu yer değişimi, hücre membranının su geçirgenliğini değiştirir. Bunun sonucunda da, ozmotik gradiyentin de etkisiyle su geri emilir. AVP'nin sentezindeki herhangi bir sorun ya da AVP'nin antidiüretik etkisine karşı böbreklerin hassas olmaması, aşırı derecede su atılmasına neden olur. AVP (santral tip) ve AVPR2 ya da AQP2 (nefrojenik tip) genlerindeki herhangi bir mutasyon diabetes insipidus'a yol açabilir. AVPR2 geninde meydana gelen mutasyonlar değişen fenotiplerde mutant AVPR2 reseptörleri meydana getirebilir.

Bu çalışmanın amacı, nefrojenik DI hastalığında AVPR2 geninde tanımlanan ve literatürde yer almayan R67_G69del/G107W, R68W, V162A ve T273M mutasyonlarının fonksiyon analizinin yapılması ve gelecekteki tedavi çalışmalarında kullanılabilecek bilgiler sunmaktır. 

Bu amaçla yapılan deneysel çalışmalarda, yabanıl tip AVPR2 içeren memeli ifade vektörü üzerinde ilgili mutasyonlar site-directed mutagenez yöntemi ile oluşturulmuş ve COS-7 hücrelerine transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. Mutant AVPR2 aktivitesi transfekte hücrelerin AVP ile uyarımı sonucu cevap olarak sentezleyeceği cAMP düzeyinden faydalanarak değerlendirilmiştir. Yabanıl ve mutant tip AVPR2'lerin hücre içi ve hücre yüzeyindeki ifadeleri ise ELISA ve Western Blot deneyleri ile tespit edilerek, hücre içindeki yerleşimi immunofloresan ve/veya floresan yöntemlerle araştırılmıştır. 

Sonuç olarak, tez kapsamında çalışılan tüm mutant tip AVPR2'leri içeren COS-7 hücrelerinin yabanıl tipe göre farklı düzeylerde fonksiyon kaybına uğradığı belirlenmiştir.

Abstract:
Diabetes insipidus (DI) is a rare disease which can be seen in 1 person among 25.000 people and it is a disorder characterized by severe liquid-balance impairment because of the inability to concentrate urine. DI can be central (CDI), due to deficiency of arginine vasopressin (AVP), or it can be nephrogenic (NDI), due to a defect in AVP action in the kidneys. CDI results from the destruction or abnormal development of the neurones that produce AVP. NDI is genetic or acquired. 

Water homeostasis of the body is rigidly controlled by several mechanisms. Changes in blood composition are sensed by evolved various sensor systems. While endothelial baroreceptors detect the reduced blood volume (hypovolemia), hypothalamic osmoreceptors detect increased blood electrolyte concentration (hypernatremia). Both the reduced blood volume and increased blood electrolyte concentration trigger the release of arginine vasopressin (AVP) from the pituitary gland, where the hormone is stored after its synthesis in the hypothalamus.  After its release, AVP binds to its receptor, AVPR2, which is located in the kidney. AVPR2 is a G protein-coupled receptor (GPCR) and is mainly expressed at the basolateral site of the collecting duct principal cells. The binding of AVP to the AVPR2 leads to translocation of akuaporin 2 (AQP2) water channels to the apical membrane of the collecting duct principal cells. The translocation of AQP2 water channels changes the water permeabilty of the membrane. This results in water reabsorption from the pro-urine into the medullary interstitium following an osmotic gradient. Problems with the secretion of the AVP or renal insensitivity to the antidiuretic effect of AVP causes excessive water excretion. Any mutation in either AVP (central type) or AVPR2 and AQP2 (nephrogenic type) genes can cause diabetes insipidus (DI). Mutations in AVPR2 gene can cause mutant AVPR2 receptors with different phenotypes.

The main purpose of this thesis is to do functional analyses of R67_G69del/G107W, R68W, V162A, T273M mutants of AVPR2 receptors which are new in literature that are cause of nephrogenic DI and make important conclusions which are informative for future therapeutic studies. 

For this purpose, the identified novel mutations were re-created by site-directed mutagenesis and were expressed in COS-7 cells. Mutant AVPR2 activity was assessed by the ability of transfected cells to produce cAMP in response to stimulation with AVP. The expression of cell surface of AVPR2 will be determined by using ELISA and Western blotting and the location of AVPR2 will be investigated by using immunofluorescence and/or fluorescence methods. 

In conclusion, all mutant AVPR2 receptors showed loss of function compared to the wild type receptor.