Hindilerde (Meleagris gallopavo) pilorik tonsil bölgesi üzerine histokimyasal ve immunohistokimyasal çalışmalar
Histochemical and immunohistochemical studies on pyloric tonsil region in Turkeys (Meleagris gallopavo)
Yazar: NUH YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. HİKMET ALTUNAY
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Gastrointestinal sistem = Gastrointestinal system ; Hindiler = Turkeys ; Histokimya = Histochemistry ; Lenfositler = Lymphocytes ; Meleagris gallopavo = Meleagris gallopavo ; Pilor = Pylorus ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Hayvansal gıdalar içerisinde kolesterol seviyesinin düşüklüğü, protein/kalori oranının yüksek olması ve içerdiği düşük sodyum miktarı ile insan sağlığı açısından önemli bir protein kaynağı olan ve tavuklara göre hastalıklara karşı daha az dirençli olan hindilerin savunma sisteminin araştırılması önem arz etmektedir. Yapılan bu çalışma ile kanatlılardaki GALT'ın önemli bir parçası olan ve kanatlılarda pilorik tonsil olarak adlandırılan alanın hindilerdeki şekil ve yapısal özellikleri ortaya konulmaya çalışılmıştır.
Bu amaçla çalışmada Ankara ilinde hindi yetiştiriciliği ve kesimi yapan işletmelerden 5 adet erkek 5 adet dişi olmak üzere toplam 10 adet erişkin hindi kullanılmıştır. Alınan bu materyallere %10 tamponlanmış formol, Bouin ve Maksimow tespit solüsyonları kullanılarak doku takip prosedürü gerçekleştirilmiştir. Dokuların bloklanması ve kesit alınması işlemlerinden sonra kesitler çeşitli boyalarla boyanarak incelenmiş ve tonsiler bölgenin histolojik yapısı ortaya konulmuştur.
İmmunolojik yönden fonksiyonel olduğu varsayılan bu yapının genel özelliklerini ortaya koymak için histokimyasal, immunohistokimyasal ve immunofloresan boyamalar uygulanmıştır. Pilorik tonsil bölgesinin genel histolojik yapısını gösterebilmek için Crossman'ın modifiye üçlü boyası kullanılırken, mukus sentezleyen kadeh hücrelerinin yoğunluğunu ortaya koymak adına PAS (Periyodik asit-Schiff), foliküllerin etrafındaki kapsülü belirleyebilmek amacıyla ise Safranin O boyaması yapılmıştır. Işık mikroskobik düzeyde bu geçiş bölgesinin daha detaylı değerlendirilmesi amacıyla 1 μ'luk yarı ince kesitler incelemeye alınmıştır. İmmunohistokimyasal ve immunofloresan boyama yöntemleriyle de T-lenfositlerin bölgedeki varlığının belirlenmesi için CD3, foliküler dendritik hücrelerin belirlenmesi için Vimentin, germinal merkezin etrafındaki kapsül varlığını ortaya koymak ve böylece ilgili bölgenin lenfosit infiltrasyonundan ayrımının gösterilebilmesi için Collagen III antikoru, B-lenfositlerin belirlenmesi için CD79A ile CD268 antikoru ve M hücrelerinin varlığını belirleme denemesi için CK18 antikoru kullanılmıştır.
Üçlü boyama sonucunda duodenumun bir parçası olan ve literatürde pilorik tonsil bölgesi olarak adlandırılan alanın hindilerde hem villus hem de kriptlere sahip olması nedeniyle normal bağırsak histolojisi gösterdiği tespit edildi. Savunmada görevli lenf foliküllerinin kriptler veya daha alt seviyelerde değil villusların içinde yerleşim gösterdiği gözlendi. Bahsi geçen ve eşit büyüklükte olmayan foliküllerin bir villus içerisinde tek ya da daha çok sayıda (5-6) olabileceği ortaya konuldu. Folikül sayısının sadece villus içerisindeki lokalizasyonu etkilemediği bunun yanısıra villusların hacimsel genişlemesini tetikleyerek çok sayıda folikülü içinde barındıracak kadar büyümesine yol açtığı anlaşıldı. Foliküllerin mevcut literatürden farklı olarak villusa lokalize olması bölgenin adlandırılmasında kullanılan klasik tonsil tanımına uymadığı ve bu yüzden bölgenin İntravillöz lenfoid doku (İVLD) olarak adlandırılmasının daha uygun olacağı düşünüldü. Üçlü boyamalardan elde edilen diğer önemli bulguda villusların farklı seviyelerde bazı noktalardan birbirleriyle kaynaşması ve hatta bu villusların tabana yakın yerlerde bir uçtan diğerine kadar uzanması olmuştur. Bu kaynaşmaların bölgeye has kendi içinde bir ağın oluşmasına yol açtığı ve bunun da savunma görevini yerine getiren yapının bünyesindeki hücrelerin daha hızlı ve etkili yanıt vermesine yardımcı olabileceği düşünüldü. Bunun haricinde villusun lümenle ilişkili olan herhangi bir yerinde örtü epitelinin şekil değiştirerek lenfoepitelyum oluşturduğu gözlemlendi. Yapılan PAS boyamasında lenfoepitelyal bölge içerisinde az sayıda da olsa kadeh hücreleri tespit edildi. Üçlü boyama bulgularıyla uyumlu olarak Safranin O boyamalarında germinal merkezlerin etrafında bir kapsül olduğu gösterildi. İmmunohistokimyasal boyamalarda ise bölgenin sıradan bir lenfosit infilitrasyon kümelerinden oluşmadığı ve organize bir lenfoid doku ihtiva ettiği ortaya kondu. Yarı ince kesitlerin incelenmesi sonucunda da tek katlı prizmatik epitelin lenfoepitelyuma dönüşmeden önce yapısal karakterini değiştirmesi sonucu farklı renkte boyandığı ve sonrasında boylarını kısaltma yoluna gittikleri gösterildi.

Sonuç olarak yapılan bu çalışma ile kanatlılarda pilorik tonsil olarak adlandırılan bölgenin hindilerde hem tonsil tanımına uymadığı hem de literatürde açıklanan tavuk, kınalı keklik ve ördek pilorik tonsilinden yapısal olarak farklı özelliklere sahip olduğu tespit edildi. Araştırmanın sonucunda elde edilen ve mevcut literatürden farklı olan bulguların bu alandaki literatür bilgisine katkı sağlayacağı ve kanatlı sindirim kanalı immunolojisi üzerine çalışma planlayacak araştırıcılara yardımcı olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Turkeys, which are less resistant to disease than chickens, are an important source of protein with low cholesterol levels, high protein/calorie ratio, and low sodium content for human health among animal foods and therefore it is crucial to investigate the defense system of turkeys. A special area called pyloric tonsil is an important part of GALT in poultry. In this study, shape and structural features of this region have been tried to be revealed in turkeys.
For this purpose, a total of 10 adult turkeys, 5 of which are male, 5 of which are female, were taken from farms engaged in turkey breeding and slaughtering in Ankara province. The tissues are fixated by 10% neutral buffered formalin, Bouin, and Maksimow solutions and then they were performed tissue preparation protocol. After embedding and sectioning steps, slides were stained by applying various dyes and were examined. Thus, structure of tonsillar region was demonstrated histologically.
It is assumed that forementioned structure is immunologically functional. Histochemical, immunohistochemical, and immunofluorescent stainings were applied to reveal the general characteristic of immunocompetent region. While Crossman's modified triple staining was put into practice to demonstrate the general histological structure, PAS (Periodic acid-Schiff) was performed to detect the density of goblet cells that synthesize mucus, and Safranin O was implemented to determine the capsule around the follicles. Semi-thin sections (1 μ) were examined in order to evaluate this transition region in a more detailed way at light microscopic level. By using immunohistochemical and immunofluorescent method, we aimed at demonstrating the presence of T cells, B cells and follicular dendritic cells in the lymphoid follicles. While CD3 antibody was chosen for detecting T-lymphocytes, Vimentin antibody was applied in order to reveal dendritic cells in pyloric region. CD79A and CD268 antibodies were used for finding out existence of B-lymphocytes in follicles. Moreover, we sought a specific marker for M cells in pyloric tonsil of turkeys and tried to stain capsule around the germinal centers. CK18 antibody was put into practice to determine whether it is a specific antibody for M cells or not. Collagen III antibody was chosen to dye the capsule surrounding germinal zone. In this way, the staining of collagen III would explain that the relevant area was an organized unit instead of lymphocyte infiltration.
As a result of triple staining, it was found that the area, which is a part of the duodenum and called the pyloric tonsil region in the literature, showed normal intestinal histology in turkeys since it is composed of both villi and crypts. It was observed that the lymph follicles involved in defense system were located in the villi, but not in the crypt regions or at lower levels. It was demonstrated that the aforementioned and different sized follicles may be present single or multiple (5-6) in a villus. It was understood that the number of follicles did not only affect the localization within the villi, but also triggered the volumetric expansion of the villi. According to this phenomenon, amount of follicles into villi forces villi to enlarge enough and thus villi can contain a number of follicles. Unlike the current literature, it was thought that the term pyloric tonsil is used to refer to this region did not conform with classical tonsil definition due to presence of the follicles into villi. Correspondingly, it was considered that it would be more appropriate to be called the region as intravillous lymphoid tissue (IVLD) instead of pyloric tonsil. Another important finding obtained from triple staining was the fusion of villi at different levels. According to this evidence, villi fused with each other at some points. Apart from that, villi extended from one end to the other near the base level. It was suggested that villi fusion enable the region to form a specific internal network and that this network could help the cells responsible for defense mechanism to deal with pathogens more quickly and effectively. Furthermore, it was noticed that the epithelial layer which settles in any part of the villus changed shape and transformed the lymphoepithelium. This transformation was detected at some locations where villi were in contact with luminal surface. In the PAS staining, a small number of goblet cells were detected in the lymphoepithelial area. In accordance with triple staining findings, Safranin O staining disclosed a capsule around the germinal centers. Immunohistochemical staining revealed that the region did not consist of ordinary lymphocyte infiltration clusters and contained an organized lymphoid tissue. When examined semi-thin sections, it was shown that some of columnar epithelial cells were stained differently from other epithelial cells. The reason why they were dyed distinctively is that these cells alter its structural features before turning into lymphoepithelium. Later, it was detected that length of the cells whose structural properties modified also decreased.

To sum up, it was determined in this study that the region referred to as pyloric tonsil in turkeys is not conformed with tonsil concept commonly used for description of avian pyloric area. Present data show here that pyloric region in turkeys is structurally dissimilar to pyloric tonsil described in chicken, chukar partridge, and duck. Findings obtained from this research are different from the existing literature data. These results will contribute to the knowledge of literature in this scope and will also help researchers who will plan a study on poultry digestive tract immunology.