Candida izolatlarında kan kültürü şişesinden hızlı antifungal yöntemi güvenilir mi?
Is the rapid antifungal testing from blood culture bottles reliable for candida isolates?
Yazar: DAMLA KÖKLÜ
Danışman: DR. DENİZ TURAN
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Haydarpaşa Numune Eğt. ve Arş. Hastanesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Kan kültürü, uzun sonuç süresine ve düşük hassasiyet oranına rağmen kandidemide altın standart tanı yöntemidir. Tedavide gecikme, artmış mortalite ile ilişkili olduğundan erken tanı ve tedavi hayat kurtarıcıdır. Bu çalışmada, pozitif kan kültür şişelerinden direkt antifungal duyarlılık test yöntemlerinin uygulanabilirliğinin değerlendirmesini amaçladık.
İstanbul SBÜ Haydarpaşa Numune EAH servislerinde yatan hastaların , 01.06.2022 30.12.2023 tarihleri arasında laboratuvarımıza gönderilmiş olan kan kültürleri kullanılmıştır. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarında BacT/Alert™ kan kültür sistemi (bioMérieux, Durham, NC) pozitif sinyal verdiğinde yapılan Gram boyama sonucu maya görülen kan kültürü şişeleri dahil edilmiştir.
Kan kültürü şişesinden CHROMagar Candida ve Sabouraud Dekstroz Agar (RTA Lab, Gebze/Kocaeli), (SDA) besiyerlerine pasajlar yapılarak plaklar 37°C'de 24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası CHROMagar Candida besiyerinde, her izolatın kendine özgü renk değişikliği ve morfolojik özelliklerine göre tür tayini yapılmıştır. Ayrıca izolatların hızlı tanımlanmasında germ tüp testi (GTT), direkt ve standart olmak üzere iki ayrı yöntem de uygulanmıştır. Türlerin kesin tanımlanması SDA'da üreyen mayalardan Matrix Assisted Laser Desorption İonization Time of Flight Mass Spectrometry [MALDI TOF MS (bio Mérieux, France)] ile yapılmıştır.
Flukonazol, vorikonazol, kaspofungin için direkt, standart, SDA disk difüzyon (DD) ve broth mikrodilüsyon (BMD) yöntemleri ile antifungal duyarlılık testleri gerçekleştirilmiştir. Direkt DD için, maya üremiş kan kültürü şişesinden alınan kan, direkt olarak metilen mavili MHA'a steril swab ile ekilip antifungal diskler yerleştirilmiştir. Standart DD için, CLSI M44 kurallarına göre DD yöntemi uygulanmış ve ek olarak SDA'ya da ekim yapılarak SDA DD yöntemi uygulanmıştır. CLSI M27-A3 rehberine göre BMD çalışılıp tüm duyarlılık sonuçları CLSI M27M44S ED3 rehberine göre yorumlanmıştır.
Elde edilen sonuçlarda, aynı duyarlılık profilindeki mikroorganizmalar kategorik olarak uyumlu, farklı profildekiler ise uyumsuz olarak nitelendirilmiştir.
Çalışmamız kapsamında 64 Candida suşu içerisinde en sık izole edilen tür C. albicans (%48,4, 31 suş) olup, bunu C. parapsilosis (11), C. glabrata (10), C. tropicalis (altı), C. auris (üç), C. kefyr (iki) ve C. krusei (bir) izlemiştir.
CHROMagar Candida ekim yöntemiyle tanımlanan bütün Candida türleri, MALDI--TOF MS tanımlama sonuçları ile %100 uyumlu bulunmuştur.
Direkt GTT ile %90,62 doğruluk oranı saptanırken; standart GTT ile %96,87 doğruluk oranı bulunmuştur. Standart GTT ve direkt GTT arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (p>0,05). Direkt GTT için kappa değeri 0,87 olarak hesaplanmış ve güvenilir bir yöntem olduğu gösterilmiştir.
Direkt DD yöntemi, flukonazol için bir küçük hata ile BMD yöntemiyle uyumlu bulunmuş, büyük ve çok büyük hata gözlenmemiştir. Vorikonazol için hiçbir hata türü tespit edilmemiş olup, kaspofungin için, iki küçük, bir büyük hata saptanmıştır.
Direkt DD yönteminin, pozitif sinyal alınmasından duyarlılık sonuçlarının ön raporlanmasına kadarki süreçte, zaman kazandırıcı bir seçenek olarak değerlendirilebileceği; ancak özellikle kaspofungin gibi antifungallerde standart yöntemlerle desteklenmesi gerektiği düşünülmüştür.

Abstract:
Blood culture remains the gold-standard diagnostic method for candidemia, despite its prolonged turnaround time and low sensitivity. Early diagnosis and treatment are critical, as delays are associated with increased mortality. This study evaluated the applicability of direct antifungal susceptibility testing methods from positive blood culture bottles.
Blood cultures were collected from hospitalized patients at Istanbul SBÜ Haydarpaşa Numune Training and Research Hospital between June 1, 2022 and December 30, 2023. Blood culture bottles signaling positive for yeast growth via the BacT/Alert™ system (bioMérieux, Durham, NC) and confirmed by Gram staining were included.
Samples from the blood culture bottles were inoculated onto CHROMagar Candida and Sabouraud Dextrose Agar (SDA) plates (RTA Lab, Gebze/Kocaeli) and incubated at 37°C for 24 hours. Candida species were identified based on characteristic color changes and morphological features on CHROMagar Candida. Rapid identification was also performed using germ tube testing (GTT) with both direct and standard methods. Definitive species identification was carried out using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS, bioMérieux, France) from yeasts grown on SDA.
Antifungal susceptibility testing was performed for fluconazole, voriconazole, and caspofungin using direct, standard, SDA disk diffusion (DD), and broth microdilution (BMD) methods. For direct DD, blood from yeast-positive culture bottles was directly inoculated onto MHA with methylene blue plates using a sterile swab, and antifungal disks were applied. For standard DD, the CLSI M44 guidelines were followed, and SDA DD testing was conducted as an additional method. All susceptibility results were interpreted based on CLSI M27M44S ED3 guidelines after performing BMD according to CLSI M27-
Microorganisms were classified as categorically concordant if their susceptibility profiles matched and discordant if they did not. Among 64 Candida isolates, C. albicans was the most commonly isolated species (48,4%, 31 isolates), followed by C. parapsilosis (11), C. glabrata (10), C. tropicalis (six), C. auris (three), C. kefyr (two), and C. krusei (one).
All Candida species identified through CHROMagar Candida were 100% concordant with MALDI-TOF MS results. Direct GTT demonstrated an accuracy rate of 90,62%, while standard GTT showed an accuracy of 96,87%. Ther was no statistically significant difference between direct and standard GTT (p > 0,05). The kappa value for direct GTT was calculated as 0,87; indicating its reliability as a diagnostic method.
The direct DD method was found to be compatible with the BMD method for fluconazole, with one minor error observed, while no major or very major errors were detected. For voriconazole, no error types were identified, whereas for caspofungin, two minor errors and one major error were observed.
The direct DD method can be considered a time-saving option for reporting preliminary susceptibility results after a positive signal. However, it should be supported by standard methods, particularly for antifungals such as caspofungin.