Salmonella typhimurium'da CsrA regülasyonunun AI-2 sentezine ve hücre içine alımına etkisinin belirlenmesi
Determination of the effect of CsrA regulation on AI-2 synthesis and uptake in Salmonella typhimurium
Yazar: NASRINE BEKHEDDA
Danışman: DOÇ. DR. NEFİSE AKÇELİK
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Glükoz = Glucose ; Salmonella = Salmonella

Özet:
Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium), her yıl çok sayıda gıda kaynaklı salgınlardan sorumlu olan ve biyofilm oluşturma yeteneğine sahip bir patojendir. Biyofilm; biyotik veya abiyotik bir yüzeye tutunmuş ve hücre dışı polimerik matriks içerisine gömülü olan hücre popülasyonudur. Biyofilm yapısı, antibiyotikler de dahil olmak üzere çeşitli stres koşullarına karşı bakterilerin yüksek derecede direnç göstermesini sağlar. Bu nedenle biyofilm oluşumu, patojenlerin bir virülans özelliği olarak kabul edilir ve günümüzde bu yapılarla mücadele etmek için etkili stratejiler geliştirmek önemli bir araştırma konusudur. Biyofilm oluşumunun son basamağı olan dispersiyon aşamasında biyofilm yapısından dağılan hücreler, antimikrobiyal ajanlara karşı daha duyarlıdır. Bu nedenle dispersiyon mekanizmalarının anlaşılması, biyofilm eradikasyonu için potansiyel bir strateji olarak kabul edilir. Global karbon düzenleyici protein CsrA, siklik di-GMP seviyesini kontrol eder ve flagella biyosentezini aktive ederek S. Typhimurium'un biyofilm dispersiyonunu pozitif olarak düzenler. Ayrıca LuxS tarafından sentezlenen ve hücre içine Lsr taşıyıcısı tarafından taşınan evrensel Quorum Sensing (QS) sinyal molekülü otoindüktör-2 (AI-2), S. Typhimurium biyofilm oluşumunda önemli rol oynamaktadır. S. Typhimurium'da glukozun, hem CsrA hem de AI-2 seviyelerini etkilediği ve biyofilm oluşumunu engellediği bilinmektedir. Bu tez çalışmasında, S. Typhimurium'da CsrA regülasyonunun AI-2 sentezi ve hücre içine alımı üzerindeki etkisinin araştırılması amaçlandı. Aynı zamanda bu etkiler, biyofilm dağılımını indükleyen optimum glukoz konsantrasyonunda değerlendirildi. AI-2 aktivitesi üzerindeki CsrA etkisi, Vibrio harveyi BB170 raportör suşu kullanılarak incelendi ve CsrA'nın hücre dışı AI-2 birikimi üzerinde olumlu bir etkisi olduğu gözlendi. Biyofilm dağılımını indüklemek için optimum glukoz konsantrasyonu, kristal viyole boyamasına dayanan yöntem ile belirlendi ve test edilen koşullarda, 12 saatlik inkübasyonun ardından % 0,5 glukoz konsantrasyonunun en yüksek biyofilm dağılımını (% 38,33) indüklediği belirlendi. Sonuçlar, beklenmeyen bir şekilde, csrA mutasyonunun S. Typhimurium biyofilm oluşumu üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olduğunu gösterdi. qRT-PZR denemeleri ile hem csrA mutasyonunun hem de aşırı ekspresyonunun AI-2'nın sentezi ve taşınmasında görevli luxS, lsrA, lsrK ve lsrR genlerini pozitif olarak düzenlediği belirlendi. Ek olarak, glukozun, araştırılan genlerin ekspresyonu üzerinde de olumlu bir etkiye sahip olduğu tespit edildi. Bu çalışmada ilk kez glukoza bağlı olarak, CsrA ve AI-2'yi kapsayan bir regülasyon modeli önerildi. Bu model, glukozun csrA ekspresyonunu aktive ettiğini ve csrA'nın AI-2 sentezini pozitif olarak düzenlediğini ve AI-2'nin hücre içine alımını negatif olarak düzenlediğini öne sürmektedir. S. Typhimurium biyofilmlerini yok etmek için yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olması amacıyla önerilen bu model, biyofilm dağılımının düzenleyici yolları hakkında yeni fikirler sunmaktadır.

Abstract:
Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium) is a biofilm-forming pathogen responsible for many foodborne outbreaks annually. Biofilms are cell populations attached to a surface and encased in a protective extracellular polymeric matrix, which provides these cells high resistance to stress conditions including antibiotics. Therefore, biofilm formation is considered a virulence trait of these pathogens, and developing effective strategies to combact these structures is a vital reseach topic. Biofilm dispersal, the last step of the biofilm development cycle, was shown to be a potential strategy for biofilm eradication since it releases planktonic cells that can be controlled by conventional treatments. The global carbon regulator protein CsrA is a positive regulator of S. Typhimurium biofilm dispersal by controlling cyclic di-GMP levels and activating flagella biosynthesis. In addition, the universal Quorum Sensing (QS) signal molecule autoinducer-2 (AI-2), which is synthesized by LuxS and transported into the cell by the Lsr transporter, plays an important role in S. Typhimurium biofilm formation. Glucose was found to affect both CsrA and AI-2 levels and to inhibit biofilm formation by S. Typhimurium. This thesis aimed at investigating the effect of CsrA on AI-2 synthesis and uptake into the cell. This effect was then evaluated at the optimum glucose concentration that induces biofilm dispersion. CsrA effect on AI-2 activity was evaluated using the reporter strain Vibrio harveyi BB170 and it was found that CsrA has a positive effect on extracellular AI-2 accumulation. The optimum glucose concentration to induce biofilm dispersion was determined by cristal violet assay and in the tested conditions, it was reported that 0.5 % glucose concentration induced the higher biofilm dispersal (38.33 %) after 12 hours of treatment. The results of this study showed that, surprisingly, csrA mutation had a negative effect on S. Typhimurium biofilm formation. qRT-PCR experiments showed that both csrA mutation and overexpression positively regulated luxS, lsrA, lsrK and lsrR genes which are involved in AI-2 synthesis and transport into the cell, respectively. In addition, glucose had also a positive effect on the expression of the studied genes. In this work, a regulation model encompassing glucose, CsrA and AI-2 was suggested for the first time. This model proposed that glucose activates csrA expression and csrA positively regulates AI-2 synthesis and negatively regulates AI-2 transport into the cell. This model may provide new insights into the regulatory pathways of biofilm dispersal, helping in developing novel strategies to eradicate S. Typhimurium biofilms.