Bacillus mojavensis ve Bacillus vallismortis'ten alfa-amilaz üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Alpha amylase production, purification and characterization of Bacillus mojavensis and Bacillus vallismortis
Yazar: ADEM KARAKAYA
Danışman: DOÇ. DR. SADİN ÖZDEMİR ; YRD. DOÇ. DR. ERDAL ÖĞÜN
Siirt Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada, Şırnak (Meryemderesi) sıcak su kaynağı çamurundan izole edilen termotolerant Bacillus vallismortis ve  Bacillus mojavensis kullanıldı. İnkübasyon zamanı, sıcaklık, pH, karbon ve azot kaynakları, farklı metal iyonları, tarımsal atıklar (muz, elma ve portakal kabuğu, arpa kepeği ve fasulye küsbesi), tuz konsantrasyonu, farklı surfaktanlar gibi çeşitli parametrelerin α-amilazların üretimi üzerine etkisi çalışıldı. B. vallismortis ile α-amilaz üretimi için optimum inkübasyon zamanı, sıcaklık ve pH sırasıyla 36. saat, 35 °C ve 7.0 olarak bulunurken, B. mojavensis ile α-amilaz üretimi için optimum inkübasyon zamanı, sıcaklık ve pH sırasıyla 36. saat, 35 °C ve 6.0 olarak bulundu. Kontrol ile karşılaştırıldığında, B. vallismortis'te Mn(II) ve Ca(II) varlığında α-amilaz üretimi yaklaşık %10 ve Triton-X100 ve Tween-20 ile sırasıyla %8.2 ve %12.4 yükseldi. Optimum koşullarda fermentasyon ortamına %0.05 Tween-20 eklendiğinde, B. mojavensis için en yüksek α-amilaz üretimi 4282.6 U/mg olarak belirlendi. B. vallismortis ve B. mojavensis'ten elde edilen α-amilazlar sırasıyla amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve dietilaminoetil (DEAE) selüloz iyon değiştirici kromatografisi ile saflaştırıldı. α-Amilazlar B. vallismortis için 51 kat ve  %30 verimle ve B. mojavensis için 34 kat ve  %18 verimle saflaştırıldı. Saflaştırılmış  α-amilazların molekül ağırlığı B. vallismortis ve B. mojavensis için sırasıyla 74 kDa ve 73 kDa olarak saptandı. B. vallismortis'ten elde edilen α-amilaz sırasıyla amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve dietilaminoetil (DEAE) selüloz iyon değiştirici kromatografisi ile saflaştırıldı. Saflaştırılmış α-amilazların molekül ağırlıkları B. vallismortis ve B. mojavensis için sırasıyla 74 kD ve 73 kD olarak bulundu. Saflaştırılmış enzimlerin aktivitesi üzerine sıcaklık ve sıcaklık stabilite, pH ve pH stabilite, inhibitörler ve metaller etkisi denendi. Bu α-amilazların ham mısır ve buğday nişastalarına karşı iyi bir hidroliz oranı gösterdiği belirledi. Çözünür nişasta son hidroliz ürünleri ince tabaka kromatografisi (TLC) ile analiz edildi. Hidroliz ürünlerinde glukoz (G1), maltoz (G2), maltotrioz (G3), maltotetroz (G4) ve maltooligosakkaritler vardı. Bunlara ilaveten saflaştırılmış α-amilazların elma suyu berraklaştırılması ve ev tipi çamaşır deterjanları endüstrilerinde kullanımı test edildi.

Abstract:
In this study, a novel thermotolerant Bacillus vallismortis and Bacillus mojavensis was isolated from thermal springs mud sample in Sirnak (Meyremderesi), Turkey. Influences of various parameters such as incubation time, temperature and pH, carbon and nitrogen sources, various metal ions, agriculture wates (banana, apple, and orange husk, barley bran, and bean pulp), NaCl concentration, different surfactants on α-amylases production were examined. The optimum incubation time, temperature and pH for production of α-amylase was found 36th, 35 °C and 7.0, respectively by B. vallismortis while the optimum temperature and pH for amylase production was found to be 35°C at pH 6.0 by B. mojavensis. When compared with control, the amylase production increased approximately 10% in presence of Mn(II) and Ca(II) and 8.2% and 12.4% with Triton-X100 and Tween-20, respectively for B. vallismortis. The highest α-amylase production was determined as 4282,6 U/mg for B. mojavensis when 0.05% Tween-20 was added to fermentation medium under the optimum conditions. Thermostable α-amylases obtained from B. vallismortis and B. mojavensis, were purified using 70% ammonium sulfate precipitation, dialysis, and diethylaminoethyl (DEAE) cellulose ion exchange chromatography, respectively. The α-amylases were purified with a 51-fold and 30% yield for B. vallismortis and 34-fold and 18% yield for B. mojavensis, respectively. The molecular masses of purified α-amylases were found as 74 kD and 73 kD for B. vallismortis and B. mojavensis, respectively. Effect of temperature and temperature stability, pH and pH stability, inhibitors and some metal ions on purified α-enzymes activity were experimented. It was revealed good hydrolyzing rate towards to raw starches of corn and wheat for both α-amylases. The end-yields of soluble starch hydrolysis were analyzed by thin-layer chromatography (TLC). The hydrolysis products were glucose (G1), maltose (G2), maltotriose (G3), maltotetraose (G4), and maltooligosaccharides. In addition to these, the usage of purified α-amylases in clarifacation of apple juice and domestic washing detergents industries were tested.