Türk hemofili A hastalarında faktör VIII geninin I. intronundaki inversiyonun araştırılması
Recurrent inversion breaking intron I of the factor VIII gene in Turkish hemophilia A patients
Yazar: MUSTAFA PEHLİVAN
Danışman: PROF. DR. FİLİZ BÜYÜKKEÇECİ
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Hematoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2003
Konu: Hematoloji = Hematology

Özet:
E.) TÜRKÇE ÖZET Hemofili A, X kromozomuna bağlı resesif geçiş gösteren ve koagülasyon faktörü VIIFin aktivite eksikliği sonucu oluşan bir kanama bozukluğudur. Xq28 bölgesinde yer alan Faktör VIII geninde yaklaşık olarak 280 farklı mutasyonun bulunduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada, aralarında akrabalık olmayan 44 Türk Hemofili A hastasında (ağır form 30, orta form 11, hafif form 3); Faktör VIII geninde yer alan İntron 1 bölgesindeki inversiyon tipi mutasyonunun bulunup-bulunmadığı araştırılmıştır. Kırkdört hastanın 9'unda (%20.4) inhibitor saptanırken, 25 (%56.8) hastada aile öyküsü belirlenmiştir. EDTA'lı tüpe alınan 37 hasta ile sitratlı tüpe alınan 7 hastaya ait periferik kandan tuzla çötürme yöntemiyle DNA izole edilmiştir. Faktör VIII geninin 1. intronundaki mutasyonunu belirleyecek şekilde düzenlenmiş primerler (9F, 9cR, Intlh-2F, Intlh-2R) ile ilgili bölge PCR yardımıyla hem hastalarda hem de hemofili olmayan 30 erkek DNA'smda (kontrol grubu) çoğaltılmış (55°C annealing, 35 döngü) ve %2 agaroz jel elektroforezinde yürütülerek değerlendirilmiştir. Hemofili A hastalara ve kontrol grubuna ait DNA' lar kullanılarak Faktör VIII geni 13. intronundaki mikrosatellit bölgesine (Intl3F ve Intl3R) ve 5. kromozomda yer alan Survival Motor Nöron (SMN) genine (SMN7F ve SMN7R) ait primerler kullanılarak amplifiye (içsel kontrol olarak) edilmişlerdir. Sonuç olarak; a) Her zaman laboratuarda kullanılan EDTA'lı kandan DNA izolasyonu ile birlikte sitratlı tüpe alınan kandan da DNA izole edilip kullanılabileceği (modifiye ettiğimiz tuzla çöktürme yöntemi ile) gösterilmiş ve rutin olarak kullanılmaya başlanmıştır, b) Aralarında akrabalık olmayan 44 Hemofili A hastasına ait DNA örneklerinde Faktör VIII geninin 1. İntronunda bir mutasyonun olmadığı belirlenmiştir. c)Faktör VIII geninin 1. intronunda inversiyon tipi mutasyon saptanmamasına karşın 1 hastada bu bölgenin de içinde yer aldığı en az 2 farklı mutasyonun bulunabileceği indirekt yolla belirlenmiştir. İki hastada İntron 13 bölgesinde amplifikasyon gözlenmezken, bir hastada hem İntron 1 hem de İntron 13 bölgesinde amplifikasyon gözlenmemiş ve örneklerin tümünde içsel kontrol olarak kullanılan SMN geni 7. ekzonunda amplifikasyon gerçekleşmiştir. Faktör VIII geni İntron 1 bölgesinde ve SMN geni Ekzon 7 bölgesinde amplifikasyon olan ama Faktör VIII geni İntron 13 bölgesinde amplifikasyon gözlenmeyen 2 hasta DNA'smdan bir tanesinde intron 22 inversiyonu var iken diğerinde indirekt olarak bu bölgede bir mutasyonun olabileceği belirlenmiştir. 35

Abstract:
F.) ingilizce özet Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene in Turkish hemophilia A patients. Hemophilia A (HA) is an X-linked bleeding disorder caused by a deficiency in the activity of coagulation factor VIII (FVIII) gene. Approximately 280 different mutations (deletion type) has been identified in the factor VIII gene, which maps to Xq28 locus. In this study we have undertaken to identify the inversion involving intron 1 of the FVIII gene in the 44 unrelated Turkish patients (severe 30, moderate 11, mild 3). In 9 patients (%20.4) inhibitor positivity and family-history in 25 (%56) patients were determinated. DNAs are isolated from EDTA-anticogulated (37 patients) and citrate peripheral blood samples (7 patients) using salting-out procedure. In order to detection of intron 1 of the FVIII gene, designed primers (9F, 9cR, Int lh-2F, Int lh-2R) used to amplify both hemophilia A patients and the 30 non-hemophilia A male and final amplification products were analysed on a %2 agarose gel electrophoresis. Hemophilia patients and control group DNA amplified (as a kontrol) by specific primers designed for microsatellite region the intron 13 of the factor VIII gene and Survival Motor Neuron (SMN) gene, which are located in chromosome 5q. In conclusion addition to DNA extraction from the blood with EDTA, indicated that DNA extraction could be done from blood with citrate (with modify salt-out procedure) and this method can be use routine. In 44 unrelated hemophilia patients, no mutation was determinated at intron 1 of factor VIII gene. Three patients have determinated by indirect mutation and the one of those patients has intron 22 inversion. 36