Çeşitli kanser hücre dizilerinde CCT3 genini hedef alan miRNA'ların terapötik etkilerinin araştırılması
Investigation of the therapeutic effects of miRNAs targeting CCT3 gene in various cancer cell lines
Yazar: EBRU TEMİZ
Danışman: PROF. DR. EMEL ŞAHİN
Gaziantep Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Genler = Genes ; Hücre dizisi = Cell line ; Kanser =   ; Mikro RNA = Micro RNA ; Neoplazmlar = Neoplasms ; RNA = RNA

Özet:
Moleküler şaperon proteinleri ve hatalı protein katlanması kanser patogenezinde kritik bir rol oynamaktadır. Ökaryotik şaperonların sekiz alt ünitesinden biri olan CCT3, hücre bölünmesi, proliferasyon ve apoptozis yolağında görevli proteinlerin doğru katlanmasını katalizler. Ayrıca, CCT3 ifadesi karsinogenez ile uyumlu bir biçimde artmaktadır. Bununla birlikte, CCT3'ün kanserleşme sürecine nasıl etki ettiği henüz bilinmemektedir. Bu çalışmada, CCT3'ün apoptotik yolaklar ve hücre stresörleri ile arasındaki mekanistik ve fonksiyonel ilişki araştırılmıştır. İlk olarak, 16 farklı hücre hattının CCT3 gen ekspresyonu seviyeleri belirlenmiş ve CCT3 ifadesinin CRL-2329 ve PC-3 hücre hatlarında anlamlı olarak arttığı bulunmuştur. Daha sonra, miR-24-3p, miR-128-3p ve miR-149-5p mimikleri aracılığı ile CRL-2329 ve PC-3 hücre hatlarının CCT3 gen ekspresyonu baskılanmış ve acridin orange/ethidium bromide (AO/EB) ve AnnexinV/PI boyaması, hücre döngüsü ve mitokondri membran potansiyeli (MMP) analizi, hücre içi reaktif oksijen seviyesi (ROS) ölçümü ve apoptotik modülatör gen ekspresyon analizleri ile hücrelerin CCT3 baskılanmasına karşılık gelişen apoptotik yanıtlar ölçülmüştür. CCT3'ün baskılanmasından sonra, hücre döngüsünün G0/G1 fazında tutulduğu, MMP'nin bozulduğu ve hücre içi ROS seviyesinin arttığı görülmüştür. Bu apoptotik akış işaretleri morfolojik görüntülerle, apoptotik genlerin (FADD, CAS8, CAS3, P53, BAX, BCL-2, NOXA, CAS9, APAF1 ve CYCS) istatistiksel olarak artan ifadeleri ile ve hücre içi serbest amino asit profilindeki değişimlerle doğrulanmıştır. Çarpıcı bir şekilde, CCT3'ün baskılanması, enerji metabolizmasında rol alan glutamin, beta-alanin, glisin, serin, asparagin ve sarkozin aminoasit seviyelerinde değişikliğe yol açmıştır. Sonuç olarak, CCT3'ün miRNA mimik transfeksiyonu ile baskılanması, hücre içi ROS homeostazını ve enerji metabolizmasındaki serbest aminoasit profilini değiştirerek apoptozisi tetiklemiştir. Birlikte ele alındığında, CCT3'ün miRNA-aracılı baskılanmasının, ROS-aracılı geleneksel hücre toksisitesi yaklaşımının yanında enerji yoksunluğu etkisiyle "ikili terapötik strateji" sağlayabileceği ön görülmektedir.

Abstract:
Molecular chaperone proteins and protein misfolding play a critical role in cancer pathogenesis. CCT3, one of the eight subunits of eukaryotic chaperons, catalyzes the correct folding of proteins involved in cell division, proliferation, and apoptosis pathways. Moreover, CCT3 expression is increased responsively with carcinogenesis. However, how CCT3 drives the cancerous process has not been known. In this study, the mechanistic and functional interactions among CCT3, apoptotic pathways and cell stressors were probed. First, CCT3 expression levels of different 16 cell lines were profiled and CCT3 expressions of CRL-2329 and PC-3 were found to be significantly increased. Then, CCT3 expressions of CRL-2329 and PC-3 lines were suppressed by miR-24-3p, miR-128-3p, and miR-149-5p mimics, and the apoptotic responses of the cell lines to the knockdown of CCT3 were measured by acridine orange/ethidium bromide and Annexin V/PI staining, cell-cycle and mitochondria membrane potential (MMP) analyses, intracellular reactive oxygen species (ROS) measurement and expression levels of the apoptotic gene. After having suppressed CCT3, the cell cycle was arrested in the G0/G1 phase, MMP was impaired, and the intracellular ROS level was increased. These signs of apoptotic flux were corroborated by morphological images, statistically enhanced expression levels of the apoptotic genes (FADD, CAS8, CAS3, P53, BAX, BCL-2, NOXA, CAS9, APAF1, and CYCS), and intracellular free amino acids profile. Strikingly, the suppressed-CCT3 shifted intracellular levels of glutamine, beta-alanine, glycine, serine, asparagine and sarcosine, which are employed in energy metabolism. Consequently, suppression of CCT3 by miRNA mimic transfection spurs apoptosis by unbalancing the homeostasis of intracellular ROS and the profile of free amino acids in energy metabolism. Taken together, it was anticipated that miRNA-mediated inhibition of CCT3 might provide "dual therapeutic strategy" through the conventional ROS-mediated cellular toxicity approach as well as energy withdrawal effect.