İcariinin vasküler gevşetici etkisinde Sfingozin-1-fosfat reseptör 1(S1PR1)'in rolünün araştırılması
Investigation Of The role of Sphingosine-1-Phosphate 1 (S1P1) Receptors in the vascular relaxant rffect of Icariin
Yazar: OZAN MERT
Danışman: DOÇ. DR. GÜLNUR SEVİN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı / Farmakoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Aort = Aorta ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Sfingozin 1-fosfat = Sphingosine 1-phosphate ; Vazodilatör ajanlar = Vasodilator agents

Özet:
Sfingozin-1-Fosfat (S1P), sfingozin kinaz (SK) enzimleri aracılığıyla, sfingozinin fosforilasyonuyla üretilen biyoaktif bir sfingolipit metabolitidir. S1P'nin birçok fizyolojik süreçte görevli olduğu ve S1P sinyal yolağındaki bozuklukların, ateroskleroz, diyabet, hipertansiyon gibi hastalıkların patolojisinde yer aldığı bildirilmektedir. S1P, özellikle vasküler gelişim ve stabilite, anjiyogenez ve vasküler tonusun düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. S1P'nin, G proteinine kenetli sfingozin-1-fosfat 1-5 reseptörleri(S1PR1-5) olarak adlandırılan beş farklı reseptörü bulunmaktadır. SK enzimleri tarafından sfingozinin fosforillenmesiyle oluşan S1P; vazodilatasyon ve vasküler geçirgenlik üzerinden etkilerini S1PR1 ve S1PR3'leri aracılığıyla göstermektedir. Düz kas gevşetici, nöroprotektif, kardiyovasküler hastalıklara karşı koruyucu, anti-oksidan, anti-enflamatuvar etkileri olan icariin; düz kas gevşetici ve anti-aterosklerotik etkilerini S1P ile benzer şekilde PI3K/Akt-eNOS-NO yolağını aktive ederek göstermektedir. İcariinin (İCA), S1PR1 ve S1PR3 agonistlerinin santral sinir sistemi hastalıklarında NF-κB, AKT, ERK1/2, p38, c-Jun ve MEK gibi ortak alt-mekanizmalar üzerinden tedavi edici etki gösterdikleri bildirilmektedir. Literatürde İCA ve S1PR1 agonistlerinin miyokardiyal iskemi/reperfüzyon hasarı ve Parkinson-Alzheimer gibi inflamatuar tabanlı nörodejeneratif hastalıklarda ortak etki mekanizmalarını paylaşması nedeniyle "İcariin vasküler gevşetici etkisini S1PR1 ve/veya S1PR3 aracılığıyla gösterebilir mi?" sorusunu aklımıza getirmiş ve bu tez kapsamında, ilk kez icariinin aorta üzerindeki gevşetici etkisine S1PR1 ve S1PR3'ün katkısını biyokimyasal ve farmakolojik çalışmalar ile araştırmak amaçlanmıştır.
İCA'nın vasküler gevşetici etkisinde, S1P sinyal yolağının rolünün aydınlatılması için her cinsiyetten sprague dawley sıçanların aorta dokuları izole organ banyosu deneyleri kullanılarak ve western blot deneyleri ile araştırılmıştır. İCA'nın gevşetici etkilerinin endotele bağlı ve/veya NO aracılı olduğunu kanıtlamak üzere çalışmamızda endoteli sıyrılmış aortalar ve nitrik oksit sentaz inhibitörü olan L-NAME (100 µM, 30dk.) inkübasyonu varlığında yanıtlar alınmıştır. Bunun yanı sıra, İCA'nın sfingozin yolağı ile ilişkisi yolak üzerinde yer alan enzim ve reseptör inhibitörleri kullanılarak fonksiyonel çalışmalarla incelenmiştir. İcariinin, seramidaz enzimi ile ilişkisi, seramidaz enzim inhibitörü olan D-erythro-MAPP (MAPP) (3-10 µM, 30dk.) ile, sfingozin kinaz enzimiyle ilişkisi, sfingozin kinaz enzim inhibitörü olan N,N-Dimethylsphingosine (DMS) (10-30 µM, 30dk.) ile, S1PR1 ile ilişkisi, S1PR1 reseptör antagonisti olan W146 (1-3 µM, 30dk.) ile ve S1PR3 ile ilişkisi, S1PR3 reseptör antagonisti olan CAY10444 (10-30 µM, 30dk.) aracılığıyla araştırılmıştır. İnhibitörler varlığında/yokluğunda aorta dokularından fenilefrin (10-7 M) ile ön kastırma sonrası kümülatif İCA (3x10−7M -10−4 M) gevşeme yanıtları alınmıştır. Fonksiyonel yanıtlarda, İCA'nın SK-1, S1PR1 ve S1PR3 üzerindeki etkisi belirlendikten sonra bu proteinlerin ekspresyon düzeyleri üzerindeki etkisini araştırmak üzere western blot deneyleri gerçekleştirilmiştir. Yapılan izole organ banyosu deneylerinde elde edilen İCA'nın EC50 değeri (3 µM); doku kültürün de inkübasyon konsantrasyonu olarak kullanılmış ve aorta dokuları 3 µM İCA ve İCA'nin çözücüsü olan DMSO ile 24 saat, 37 °C' %5 CO2 ile gazlandırılan inkübatörde bekletilmiştir. İnkübasyondan sonra dokular CryoMill ile homojenize edilmiş ve homojenatlardaki protein miktarı BCA ile belirlenerek, western blot deneylerinde SK-1, S1PR1 ve S1PR3 protein ekspresyon düzeyleri araştırılmıştır. Bunun yanında İCA'nın nitrik oksit (NO) miktarı üzerindeki etkileri griess reaksiyonu ile spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Bu amaçla homojenatlar kit protokülüne uygun şekilde, İCA, L-NAME, W146 ve DMS ile 30 dk. süreyle inkübe edilmişlerdir. Sonuç olarak çalışmamızda İCA gevşeme yanıtları endotele bağlıdır ve NO aracılı olarak gerçekleşmektedir. Aortadaki İCA gevşeme yanıtları DMS ve W146 varlığında istatistiksel olarak anlamlı şekilde azalırken, MAPP ve CAY10444 varlığında ise herhangi bir değişiklik görülmemiştir. SK-1 ve S1PR1 protein ekspresyon düzeyleri İCA inkübasyonu varlığında artarken, S1PR3 ekspresyon düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik görülmemiştir. İCA, toplam nitrat ve nitrit düzeylerini arttırırken, bu artış inhibitörler (W146, DMS, L-NAME) varlığında bu artış geri dönmüştür.  Bu çalışmanın sonucunda, İCA'nın sıçan aortasında S1P üretiminden sorumlu SK enzimlerinin ve/veya S1PR1, S1PR3leri aracılığıyla gevşetici etki oluşturduğu gösterilmiştir. Erektil disfonksiyon tedavisinde olduğu gibi NO yetmezlik durumlarında, fosfodiesteraz inhibitörleri (örn:sildenafil) gibi NO biyoyararlanımını artıran ajanlarla tedavide klinikte yeterli sonuçlar alınamamaktadır. Bu durum, NO ilişki patolojik koşullarda NO üretiminden hangi sinyal yolağının sorumlu olduğunu ve tedavide seçilecek ajanın bozulan bu sinyal yolağı ile ilişkisinin önemli olacağını aklımıza getirmiştir. Dolayısıyla sfingozin sinyal yolağının bozulduğu ve bu yolak ilişkili NO yetmezlik durumlarında özellikle endotel disfonksiyonuyla ilişkili hipertansiyon ve ateroskleroz gibi vasküler hastalıkların tedavisinde İCA'nın kullanılması yeni ve etkili bir ilaç adayı olma potansiyeli klinik olarak önem taşıyacaktır. Anahtar Kelimeler; İcariin; Sfingozin-1-Fosfat; Aorta; Nitrik Oksit

Abstract:
Sphingosine-1-Phosphate (S1P) is a bioactive sphingolipid metabolite produced through the phosphorylation of sphingosine via the enzymes sphingosine kinases (SK). S1P is reported to be involved in numerous physiological processes, and disruptions in the S1P signaling pathway have been implicated in the pathogenesis of diseases such as atherosclerosis, diabetes, and hypertension. S1P plays a particularly significant role in vascular development and stability, angiogenesis, and regulation of vascular tone. S1P has five different receptors known as G protein-coupled sphingosine-1-phosphate receptors (S1PR1-5). S1P, generated through the phosphorylation of sphingosine by SK enzymes, exerts its effects primarily via S1PR1 and S1PR3 receptors, leading to vasodilation and regulation of vascular permeability. Icariin, which has smooth muscle relaxant, neuroprotective, cardiovascular protective, antioxidant, and anti-inflammatory effects, demonstrates its smooth muscle relaxant and anti-atherosclerotic effects similar to S1P by activating the PI3K/Akt-eNOS-NO pathway.It has been reported that icariin, S1PR1, and S1PR3 agonists exhibit therapeutic effects in central nervous system diseases through common sub-mechanisms such as NF-κB, AKT, ERK1/2, p38, c-Jun, and MEK. The aim of our study is to investigate, for the first time, the relationship between the vascular relaxant beneficial effect of icariin and the S1P signaling pathway. To elucidate the role of the S1P signaling pathway in the vascular relaxant effect of ICA, experiments were conducted using isolated organ bath assays on aortic tissues from Sprague Dawley rats of both genders. Additionally, Western blot experiments were performed. In our study, responses were obtained from aortas with endothelium removed and in the presence of the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME (100 µM, 30 minutes) incubation to demonstrate that ICA's relaxing effects are endothelium-dependent and/or mediated by NO. Furthermore, the relationship of ICA with the sphingosine pathway was investigated through functional studies using enzyme and receptor inhibitors present along the pathway. The interaction of icariin with the seramidase enzyme was examined using D-erythro-MAPP (MAPP), a seramidase enzyme inhibitor (3-10 µM, 30 minutes). Its relationship with the sphingosine kinase enzyme was investigated using N,N-Dimethylsphingosine (DMS), a sphingosine kinase enzyme inhibitor (10-30 µM, 30 minutes). The interaction with S1PR1 was explored using W146, an S1PR1 receptor antagonist (1-3 µM, 30 minutes), and its relationship with S1PR3 was studied using CAY10444, an S1PR3 receptor antagonist (10-30 µM, 30 minutes). In the presence/absence of inhibitors, cumulative relaxation responses to icariin (3x10-7 M - 10-4 M) were obtained from aortic tissues following pre-contraction with phenylephrine (10-7 M). After determining the effect of ICA on SK-1, S1PR1, and S1PR3 in functional responses, Western blot experiments were conducted to investigate the impact on the expression levels of these proteins. The EC50 value of ICA obtained from isolated organ bath experiments (3 µM) was used as the incubation concentration in tissue culture. Aortic tissues were incubated with 3 µM ICA and the solvent of ICA, DMSO, for 24 hours at 37°C in a 5% CO2-gassed incubator. After incubation, the tissues were homogenized using a CryoMill, and the protein content in the homogenates was determined using the BCA assay. In Western blot experiments, the protein expression levels of SK-1, S1PR1, and S1PR3 were investigated. Additionally, the effects of ICA on nitric oxide (NO) levels were measured spectrophotometrically using the Griess reaction. For this purpose, homogenates were incubated with ICA, L-NAME, W146, and DMSO for 30 minutes according to kit protocols. In conclusion, our study demonstrates that ICA relaxation responses are endothelium-dependent and mediated through NO. The aortic relaxation responses to ICA are significantly reduced in the presence of DMS and W146, while no changes were observed in the presence of MAPP and CAY10444. SK-1 and S1PR1 protein expression levels increase in the presence of ICA incubation, while there is no statistically significant change in S1PR3 expression levels. ICA increases total nitrate and nitrite levels, but this increase is reversed in the presence of inhibitors (W146, DMS, L-NAME). As a result of this study, it has been demonstrated that ICA generates a relaxing effect in rat aortas through the SK enzymes responsible for S1P production and/or via S1PR1 and S1PR3 receptors. In conditions of insufficient nitric oxide (NO), such as in the treatment of erectile dysfunction, clinical results with agents that enhance NO bioavailability, like phosphodiesterase inhibitors (e.g., sildenafil), may not always be sufficient. This situation highlights the importance of identifying which signaling pathway is responsible for NO production under specific pathological conditions and how the chosen therapeutic agent interacts with the compromised signaling pathway. Therefore, the use of ICA as a novel and effective drug candidate holds significant clinical potential in the treatment of vascular diseases such as hypertension and atherosclerosis, particularly those associated with endothelial dysfunction, where the sphingosine signaling pathway is impaired and NO deficiency is prevalent.
Keywords; Icariin; Sphingosine-1-Phosphate; Aorta; Nitric Oxide