Anaplastik tiroid kanseri hücre hattında BIBR1532 ajanı ile telomeraz inhibisyonunun anti-kanser etkinliğinin araştırılması
Investigation of the anti-cancer effectiveness of telomerase inhibition with BİBR1532 agent in anaplastic thyroid cancer cell line
Yazar: ECEM TÜRKMEN
Danışman: DOÇ. DR. ÇIĞIR BİRAY AVCI
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Hücre dizisi = Cell line ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prognoz = Prognosis ; Telomeraz = Telomerase ; Tiroid hastalıkları = Thyroid diseases ; Tiroid neoplazmları = Thyroid neoplasms

Özet:
Tiroid kanseri (TK), endokrin sistemin en sık görülen malignitelerinden birini temsil etmekte ve insidansı son yıllarda dünya çapında hızla artmaktadır. Oldukça agresif TK'ler dahil olmak üzere birçok tümörün başlangıcına ve evrimine telomer ve telomeraz düzenlemesinin katkısının bulunduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Telomeraz ters transkriptaz (TERT) promotöründeki mutasyonlar, TK'larda saldırganlığın en belirgin prognostik belirteçleri arasındadır. TERT promotör mutasyonları, transkripsiyon faktörleri için bağlanma bölgeleri oluşturarak TERT ekspresyonunu ve telomeraz aktivitesini arttırmaktadır.
Telomer homeostazının kanser tedavilerine yanıta aracılık etmedeki olası rolünü ve telomeraz inhibitörlerinin kullanımını yeniden değerlendirmek için epigenetik ilaçların kullanım sıklıkları gün geçtikçe artmaktadır. Telomeraz enzimini inhibe eden seçici bir anti-kanser ajanı olan BIBR1532, hTERT'in aktif bölgesine spesifik olarak bağlanmaktadır. Klinik çalışmalarda kullanılan genel kemoterapötik ilaçların birçoğu yan etki göstermektedir ve telomeraz inhibitörlerinin avantajı ise normal dokularda toksik etkisinin az olmasıdır. Bu veriler yeni terapötik hedeflerin tanımlanmasını, TK gelişimi ve ilerlemesinin ilgili sürücüleri olarak telomeraz düzenleyici yolların araştırılmasını teşvik etmektedir. 
Tiroid kanseri hücrelerinde telomerazın baskılanarak önemli bir anti-kanser etkinlik göstereceği çalışmamızın hipotezini oluşturmaktadır. Çalışmamızda, proliferasyon deneyi ile her kuyucuk için uygun SW1736 hücre sayısı belirlenmiştir. SW1736 tiroid kanseri hücresinde WST-1 analizi ile telomeraz inhibitörü BIBR1532'nin sitotoksik etkisi doza ve zamana bağlı olarak değerlendirilmiştir. Ardından, belirlenen IC50 dozunda ilaç uygulanmış ve ilaç uygulanmayan hücreler kontrol olarak değerlendirilmiş, apoptoz analizi Annexin V ile gerçekleştirilmiştir. Yara iyileşme testiyle BIBR1532'nin hücrelerin migrasyon hızına etkisi incelenmiştir. Son olarak kanserle ilişkili genlerin ekspresyonları gerçek zamanlı qRT-PCR ile analiz edilmiştir.
SW1736 hücreleri için uygun hücre konsantrasyonu 5x105 - 3,91x103 hücre/ml olarak belirlenmiş, ardından sitotoksisite testleri yapılmıştır. SW1736 hücreleri için IC50 değeri 39,55μM olarak belirlenmiştir. Etken maddenin SW1736 hücresi üzerinde apoptotik etkisi kontrole kıyasla %32,7 oranında görülmüş olup, apoptozu 3,1 kat arttırdığı görülmektedir. Yara iyileşme deneyindeki sonuçlarımız da kontrol grubuna kıyasla BIBR1532'nin SW1736 hücre hattında %13 oranında migrasyon hızını azaltıcı etkisini göstermiştir. BIBR1532 uygulanan hücre hattında kanserle ilişkili genlerin ekspresyon değişimleri ise telomeraz inhibisyonunun kanser mekanizmasını etkilediğini göstermektedir. 
Yüksek telomeraz aktivitesiyle korele tiroid kanserinde, proliferasyonun önlenmesi ve kanser relapsının önüne geçilebilmesi açısından BIBR1532 ile tedavi umut verici bir adım olabilir.

Abstract:
Thyroid cancer (TC) represents one of the most common malignancies of the endocrine system and its incidence has been increasing rapidly worldwide in recent years. Studies have shown that telomere and telomerase regulation contribute to the initiation and evolution of many tumors, including highly aggressive TCs. Mutations in the telomerase reverse transcriptase (TERT) promoter are among the most prominent prognostic markers of aggression in TCs. TERT promoter mutations increase TERT expression and telomerase activity by creating binding sites for transcription factors.
The frequency of use of epigenetic drugs is increasing to re-evaluate the possible role of telomere homeostasis in mediating response to cancer treatments and the use of telomerase inhibitors. BIBR1532, a selective anti-cancer agent that inhibits the telomerase enzyme, specifically binds to the active site of hTERT. Many of the general chemotherapeutic drugs used in clinical studies have side effects, and the advantage of telomerase inhibitors is that they are less toxic in normal tissues. These data encourage the identification of new therapeutic targets and exploration of telomerase regulatory pathways as relevant drivers of TC development and progression.
The hypothesis of our study is that telomerase will be suppressed in thyroid cancer cells and will show a significant anti-cancer activity. In our study, the appropriate number of SW1736 cells was determined for each well with the proliferation assay. The cytotoxic effect of telomerase inhibitor BIBR1532 in SW1736 thyroid cancer cell was evaluated depending on dose and time by WST-1 analysis. Then, the drug was administered at the determined IC50 dose and the cells that did not receive the drug were considered as controls, and apoptosis analysis was performed with Annexin V. The effect of BIBR1532 on the migration rate of cells was investigated by the wound healing test. Finally, the expressions of cancer-related genes were analyzed by real-time qRT-PCR.
The appropriate cell concentration for SW1736 cells was determined as 5x105-3,91x103 cells/ml, followed by cytotoxicity tests. The IC50 value for SW1736 cells was determined as 39,55μM. The apoptotic effect of the active substance on the SW1736 cell was observed at a rate of 32.7% compared to the control, and it was seen that it increased apoptosis by 3.1 times. Our results in the wound healing experiment also showed the effect of reducing the migration rate of BIBR1532 by 13% in the SW1736 cell line compared to the control group. The expression changes of cancer-related genes in the BIBR1532 applied cell line show that telomerase inhibition affects the cancer mechanism.
Treatment with BIBR1532 may be a promising step in the prevention of proliferation and cancer relapse in thyroid cancer correlated with high telomerase activity.