Gaucher hastalığının tanısı ve şiddetinin göstergesi olarak pteridin metabolitlerinin araştırılması
The research of pteridin metabolites as diagnosis of gaucher's disease and indicator of intensity
Yazar: MELİSA RABİA VURAL
Danışman: PROF. DR. ESER YILDIRIM SÖZMEN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biopterin = Biopterin ; Dihidropteridin redüktaz = Dihydropteridine reductase ; Gaucher hastalığı = Gaucher disease ; Hastalık şiddeti indeksi = Severity of illness index ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Metabolitler = Metabolites ; Neopterine = Neopterine ; Pteridinler = Pteridines

Özet:
Bu projenin amacı Gaucher hastalığının tanısında ve tedavisinin izlenmesinde pteridin metabolitleri düzeylerinin olası yararının araştırılmasıdır. Pteridinler ve türevleri, çeşitli vitamin ve kofaktörlerin metabolizmasında ara ürünler olarak işlev görür ve hastalıklarla ilgileri, hastalık biyobelirteçleri olarak rollerini incelemek için yeni araştırmalara ilham vermiştir. Bu amaçla lizozomal Gaucher tanısı ile EÜTF Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları AD Metabolizma BD polikliniğinde izlenmekte olan, 14 hasta çalışmaya alınmıştır. Hastalardan rutin izleme için kan örneği alınırken bu araştırma için de örnek toplanmış ve çalışılmıştır. Kanda ve İdrarda pterin metabolitleri neopterin düzeyleri ise LC MS MS temelli yöntemle belirlenmiştir. LC ve MS/MS koşullarının optimizasyonları sonucu elde edilen temsili kromatogramlarda pikler simetrik, gürültü ve kuyruklanma yok denecek kadar az ve sinyal/gürültü oranı ise yüksek tespit edilmiştir. Her bir metabolit için elde edilen doğrusal tayin aralığı grafiklerinin R2 değerleri ≥0,995 olarak bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik bulgularında ise gerek gün içi gerekse de günler arası yüksek seviye için  %CV değerleri %15'in altındadır. İdrar Neopterin düzeyleri hem ELISA kit hem de LC MS/MS ynötemleri ile belirlenmiştir. Kullanılan iki yöntemin karşılaştırmasında her iki yöntemin korelasyon gösterdiği bulunmuştur. Gaucher hastalarının kitotriozidaz enzim aktiviteleri kontrol grubuyla karşılatırıldığında istatistiksel olarak hastaların Kitotriozidaz düzeyleri anlamlı olarak daha yüksek bulunmuştur (p< 0,001). Hastaların idrarında Neopterin düzeyleri sağlıklı kişilere göre daha yüksek bulunurken (P=0.07) Tetrahidrobiopterin düzeyleri düşük (p=0.043) olarak bulunmuştur. Dihidropterin ve 7-biopterin (primapterin) düzeyleri de hastalarda yüksek bulunmuştur ancak bu yükseklik istatistiksel olarak anlamlı değildir. Neopterin/Tetrahidrobiopterin oranına bakıldığında hastalarda bu oran, sağlıklı kişilere göre anlamlı olarak daha yüksek bulunmuştur (p=0.000). ROC eğrisi çizildiğinde, tek başına Neopterin hastalık göstergesi olarak yeterli hassasiyete sahip değilken, Neopterin/BH4 oranının kitotrioidaz ile benzer spesifisite ve sensitivite gösterdiği belirlenmiştir. Korelasyon analizinde;  sağlıklı kişilerde kitotriozidaz aktivitesi pterin metabolitleri ile herhangi bir korelasyon göstermezken hastalarda kitotriozidaz aktivitesi idrar neopterin (p=0.018, r=0.622) ve 7-biopterin (p=0.018, r=0.622) düzeyleri ile pozitif korelasyon göstermiştir. Gaucher hastalarında idrarda oldukça yüksek değerde neopterin düzeylerine rastlanması bu hastalarda NP'nin hastalığın taranmasında, prognozunda kullanılabilecek muhtemel bir belirteç olabileceğini göstermektedir. Neopterin düzeylerinin yüksek, BH4 düzeylerinin düşük olması makrofaj aktivasyon göstergesi olarak değerlendirilmiştir. Bu çalışmada elde edilen en önemli bulgu Gaucher hastalarının idrarında Neopterin/BH4 oranının anlamlı olarak yüksek bulunması ve Kitotriozidaza eşdeğer bir sensitivite göstermesidir. Neopterin, BH4 düzeylerinin idrarda LC MS/MS ile belirlenmesinin, özellikle kitotriozidazı genetik olarak düşük olan hastalarda yararlı olacağını götermektedir. İdrar örneğinin non-invaziv olarak elde edilebilir olması, LC MS/MS ile hızlı sonuç verilebilmesi ve testin doğruluk ve kesinliğinin gösterilmiş olması nedeniyle Neopterin/BH4 oranının önemli bir gösterge olarak klinikte kullanılabileceğini düşünüyoruz.

Abstract:
The aim of this project is to investigate the potential benefit of levels of pteridine metabolites in the diagnosis and monitoring of Gaucher's disease. Pteridines and their derivatives function as intermediates in the metabolism of various vitamins and cofactors, and their relevance to disease has inspired new research to study their role as disease biomarkers. For this purpose 14 patients with a diagnosis of lysosomal Gaucher who were being followed up in the policlinic of Ege University Faculty of Medicine Child Health and Diseases Department of Metabolism were included in the study. While blood samples were taken from patients for routine monitoring samples were also collected and studied for this study. Pterine metabolites and neopterin levels in blood and urine were determined by the LC MS/ MS-based method. Representative chromatograms obtained as a result of optimization of LC and MS/MS conditions, the peaks were symmetrical, noise and tailing were almost nonexistent, and signal/noise ratio was high. The R2 values of the linear range graphs obtained for each metabolite were found to be 0.995. In the repeatability findings; CV% values are below 15% for high level both within day and between days. Urine Neopterin levels were determined with both ELISA kit and LC MS/MS methods. In the comparison of the two methods, both methods showed positive correlation. When the chitotriosidase enzyme activities of Gaucher patients were compared with the control group,  CHIT levels of the patients were found significantly higher (p <0.001) than those of control grourp. While Neopterin levels were found to be higher in the urine of the patients compared to the healthy individuals, the tetrahydrobiopterin levels were found to be low. Dihydropteridine and 7-biopterin (primapterin) levels were also found higher in patients but this elevation was not statistically significant. Considering the neopterin/tetrahydrobiopterin ratio, this ratio was found to be significantly higher in patients compared to healthy individuals. When the ROC curve was drawn, it was determined that Neopterin alone did not have sufficient sensitivity as a disease indicator while the Neopterin/BH4 ratio showed similar specificity and sensitivity with chitotrioidase. Chitotriosidase activity in healthy individuals did not show any correlation with pterin metabolites while chitotriosidase activity in patients was positively correlated with urinary neopterin (p = 0.018, r = 0.622) and 7-biopterin (p = 0.018, r = 0.622) levels. High levels of neopterin in the urine of Gaucher patients indicate that NP may be a reliable marker that can be used in screening and prognosis of the disease in these patients. High neopterin levels and low BH4 levels were evaluated as macrophage activation indicators. The most important finding obtained in this study is that the Neopterin/BH4 ratio was found to be significantly high in the urine of Gaucher patients and showed a sensitivity equivalent to Chitotriosidase. Our data suggests that the determination of BH4 an Neopterin levels in urine by LC MS/MS will be particularly useful in patients with genetically low chitotriosidase. We think that the Neopterin/BH4 ratio can be used in the clinic as an important indicator because the urine sample can be obtained non-invasively, the results can be obtained quickly with LC MS / MS and the accuracy and precision of the demonstrated test.