NAD+/ ADP riboz metabolizmasına ilişkin çalışmalar
Studies on AND/ ADP ribose metabolism
Yazar: LEMAN YALÇINTEPE
Danışman: PROF.DR. DEMİR TİRYAKİ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 1998
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Adenozin difosfat-riboz = Adenosine diphosphate ribose ; NAD = NAD

Özet:
6. ÖZET Hücresel NAD+ tüketimine ait çalışmalarda, CHO-K1 hücreleri bir radiomimetic antitumor ajanı olan Bleomisin ile muamele edilerek hücrelerde DNA kırıkları oluşturuldu. DNA kırıklarının oluşmasıyla birlikte DNA onarım mekanizması ve bu mekanizmada rol oynayan ve NAD*'yi substrat olarak kullanan poli(ADP-riboz) polimeraz (PADPR) enzimi aktiflenmesi sağlandı. Enzimin aktif hale geçmesiyle birlikte, NAD+ tüketimi başladı. Bleomisin derişimine ve Bleomisine maruz kalma zamanına göre artan NAD* tüketimleri gösterildi. Hücresel NAD+ tüketimini durdurabilmek ve bu NAD+ tüketiminden PADPR enziminin sorumlu olduğunu gösterebilmek için, nikotinamid analoğu olan ve PADPR inhibitörleri olarak bilinen 3AB ve BZ Bleomisin ile birlikte hücrelere verildi. Normal (kontrol) ve kanserli hasta serum NAD+ glikohidrolaz aktiviteleri arasında fark görülmesi üzerine, bu enzim karakterize edilmeye çalışıldı. Normal kontrol ve CEA değeri yüksek hasta serum örneklerinde, [C14]NAD derişimine ve zamana bağlı enzim kinetikleri yapıldı. Normal (kontrol) ve kanserli hasta serumlarında Km ve Vm değerleri hesaplandı. Km değerlerinin aynı Vm değerlerinin farklı olduğu saptandı. CEA değerleri ile NAD+ glikohidrolaz aktivitesi değerleri arasında bir korelasyon saptandı. Serum örnekleri PAGE'yi takiben CD38 spesifik monoklonal antikorlar varlığında Western emdirimi yapıldığında, ~45 kDa ve -21 kDa molekül ağırlıklarında iki protein bandı belirlendi. CD38 molekül ağırlığına da tekabül eden 45 kDa'luk protein, kanserli hastalarda daha yoğundu. Serum örneği anti-CD38 bağlı kolonda geçirildikten ve bağlananlar alınıp NAD+ glikohidrolaz aktivitesi tayin edildikten sonra, aktivite olarak zengin bir kesim elde edildi. 75

Abstract:
7.SUMMARY CHO-KI cells were reacted with Bleomycin which is an anti tumor-agent to produce DNA strand breaks in cellular NAD depletion studies. Following the formation of DNA strand breaks DNA repair mechanism and enzyme poly (ADP- riboz) polimerase which also has an active role in this mechanism by using NAD was depletion was activated. According to Bleomycin concentration and the incubation time an increase in NAD depletion was observed. To stop the NAD depletion and to show the responsibility of enzyme PARP for this event, 3 AB and BZ which are PARP inhibitors and nikotinamid anologues were given to the cells together with Bleomycin. The difference in the enzyme NAD glycohydrolase activities between normals and cancer patients lead us to the characterization of this enzyme. Enzyme kinetics was performed as a function of NAD concentration and incubation time in normals and cancer patients with high CEA levels in the serum sampies.Km and Vm values were determined. It was observed that although the Km values were the same, the Vm values were different in normal and cancer patient's serums also there was a correlation between the CEA values and NAD glycohydrolase activities. After the PAGE the western blot of serum samples was performed in the presence of monoclonal antibodies specific for CD 38. Two protein bands approximately at the 45 kD and 21 kD region were observed. 45 kD protein band which corresponds the molecular weight of CD 38 was more dense in cancer patients. Following the application of serum samples to the CD 38 affinity chromotography column, NAD glycohydrolase activity was determined in column bind fraction. As a result a fraction which has rich enzyme activity was obtained. 76