Nevşehir yöresindeki atlarda Strongylus vulgarıs'in moleküler prevalansı ve filogenetik karakterizasyonu
Molecular prevalence and phylogenetic characterization of strongylus vulgaris in horses from Nevsehir region
Yazar: MEHMET BİLGİN
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
NEVŞEHİR YÖRESİNDEKİ ATLARDA STRONGYLUS VULGARIS'İN MOLEKÜLER PREVALANSI VE FİLOGENETİK KARAKTERİZASYONU

Mehmet BİLGİN

T.C. Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Veteriner Parazitoloji Anabilim Dalı
Yüksek Lisans Tezi, Ekim 2017
Danışman: Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM

ÖZET
Bu çalışmada Nevşehir yöresindeki atlarda strongyle enfeksiyonlarının ve S. vulgaris prevalansının sırasıyla konvansiyonel dışkı muayenesi ve real time PCR yöntemleri ile ortaya çıkarılması ve belirlenen izolatların moleküler karakterizasyonlarının yapılması amaçlanmıştır. Çalışmada, 2016 yılının Mart-Haziran ayları arasında Nevşehir'in farklı bölgelerindeki çiftliklerde bulunan toplam 150 arap atından tekniğine uygun olarak dışkı örnekleri toplanmıştır. Laboratuvarda dışkı örnekleri strongyle yumurtaları yönünden analiz edilmiş ve pozitif belirlenen örneklerde gram dışkıdaki yumurta sayısı (EPG) belirlenmiştir. Strongyle pozitif örneklerden yüzdürme yöntemi ile yumurta süspansiyonları elde edilmiş ve genomik DNA izolasyonları yapılmıştır. Örneklerde genomik DNA izolasyon etkinliği rRNA PCR analizleri ile belirlenmiştir. Yumurta pozitif örneklerde S. vulgaris'in araştırılması amacıyla ribozomal ITS-2 gen bölgesini hedef alan standart TaqMan prob bazlı ve bu çalışma ile yeni geliştirilen sybergreen tabanlı real time PCR analizleri gerçekleştirilmiştir. Çalışmada incelenen atların 98'inde sytrongylid yumurtaları belirlenmiş ve strongyle enfeksiyonlarının prevalansı %65,3 olarak tespit edilmiştir. Yumurta pozitif atlarda ortalama EPG değeri 551,9±119,9 bulunmuştur. Her iki real time PCR analizinde strongyle yumurta pozitif 98 atın 19'unun S. vulgaris için spesifik amplifikasyon gösterdiği belirlenmiş ve ilgili nematodun moleküler prevalansı %12,7 olarak saptanmıştır. S. vulgaris pozitifliği tespit edilen örneklere ait ITS-1/5.8S rRNA amplikonlarından Ct değerlerine göre seçilenler sekans ve filogenetik analizler amacıyla klonlanmıştır. Bu amaçla S. vulgaris koloni real time PCR analizleri ile amplifikasyon gösteren ve göstermeyen 10'ar koloni belirlenmiş ve rekombinant plazmid pürifikasyonu yapılmıştır. Rekombinant plazmitlerin sekans analizleri sonucu S. vulgaris için iki haplotipin varlığı belirlenmiş ve filogenetik analizler sonucu S. vulgaris'in ilgili gen bölgesine göre diğer tüm strongylid türlerden genetik olarak daha uzak olduğu saptanmıştır. S. vulgaris amplifikasyonu göstermeyen rekombinant plazmidlerin sekans analizleri ile Cyathostominae aile altındaki küçük strongyle türlerinden C. nassatus, C. ashworthi ve Cy. tetracanthum'a ait oldukları belirlenmiş ve bu türlere ait haplotiplerin tür bazlı olarak monofiletik küme oluşturdukları görülmüştür.  
Sonuç olarak bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez atlarda enfeksiyona yol açan strongyle türleri üzerine moleküler veriler sağlanmış ve S. vulgaris'in moleküler prevalansı belirlenmiştir. 
Anahtar kelimeler: Strongylus vulgaris, moleküler prevalans, filogenetik karakterizasyon, at, Nevşehir

Abstract:
MOLECULAR PREVALENCE AND PHYLOGENETIC CHARACTERIZATION OF STRONGYLUS VULGARIS IN HORSES FROM NEVSEHIR REGION

Mehmet BILGIN

Erciyes University, Graduate School of Health Science
Department of Veterinary Parasitology
M.Sc. Thesis, October 2017
Supervisor: Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM

ABSTRACT
In this study, it was aimed to reveal the prevalence of strongyle infections and S. vulgaris in horses in Nevsehir region by conventional stool examination and real time PCR methods and to perform molecular characterization of the determined isolates. A total of 150 stool specimens from Arabic horses were collected with sutiable technique from the farms located in different regions of Nevşehir in March-June 2016. Fecal samples were analyzed for the strongyle eggs and egg per gram of feces (EPG) values were determined in the egg positive samples in the laboratory. Egg suspensions were obtained from stronglye positive specimens by the flotation technique and genomic DNA isolations were performed. The efficiency of genomic DNA isolation in the samples was determined by rRNA PCR analyzes. A standard TaqMan probe based and a newly developed sybergreen-based real time PCRs both targeted the ribosomal ITS-2 gene region were performed in order to investigate S. vulgaris in egg-positive samples. Sytrongylid eggs were detected in 98 of the examined horses in this study and the prevalence of strongyle infections was found to be 65.3%. The average EPG value in egg positive horses was determines as 551.9 ± 119.9. In both real-time PCR analyzes, 19 out of 98 egg positive horses exhibited specific amplification for S. vulgaris, and the molecular prevalence of the related nematode was determined as 12.7%. The amplicons those selected from ITS-1/5.8S rRNA PCR products of S. vulgaris positive samples according to Ct values were cloned for sequence and phylogenetic analyzes. For this purpose, each of 10 colonies with and without amplification of S. vulgaris DNA by colony real time PCR analysis were selected and recombinant plasmid purifications were performed. Sequence analysis of recombinant plasmids revealed the presence of two haplotypes for S. vulgaris, and according to the phylogenetic analysis of the related gene region it was found that S. vulgaris was genetically more distant from all other strongylid species. According to sequence analysis, the recombinant plasmids without S. vulgaris amplification were identified as C. nassatus, C. ashworthi and Cy. tetracanthum, and haplotypes of these species formed monophyletic cluster. 
In conclusion, this study provided the first molecular data on strongyle species that causes infection in horses in Turkey and the molecular prevalence of S. vulgaris was determined.  
Key words: Strongylus vulgaris, molecular prevalence, phylogenetic characterization, horse, Nevsehir