Deneysel hepatik lipidozis oluşturulan tavşanlarda kekik otu (thymus vulgaris) yağı ve thymol'ün immunojenik aktivitelerinin araştırılması
Investigation of the immunogenic activities of thyme (thymus vulgaris) oil and thymol in rabbits with experimental hepatic lipidosis
Yazar: GENCAY EKİNCİ
Danışman: PROF. DR. VEHBİ GÜNEŞ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İç Hastalıkları (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases
Dizin: Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hepatit = Hepatitis ; Karaciğer yağlanması = Fatty liver ; Kekik = Thyme ; Kekik yağı = Thyme oil ; Kolesterol = Cholesterol ; Tavşanlar = Rabbits ; Thymus vulgaris L. = Thymus vulgaris L. ; Timol = Thymol

Özet:
Farklı beslenme veya diyet rejimlerinin kromatin ve gen ekspresyonu üzerinde epigenetik değişiklikler olarak bilinen etkileri vardır. Hiperkolesterolemi, hipertrigliseridemi ve viseral yağ birikimi non-alkolik yağlı karaciğer hastalığına yol açan faktörlerdendir. Non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAYKH) basit steatozdan non-alkolik steatohepatite (NASH) ve fibrozise ilerleyen kronik bir karaciğer hastalığıdır. Bu tez çalışmasında deneysel olarak oluşturulan hepatik lipidozis tavşan modelinde bitkisel tedavi amacıyla kullanılan kekik yağı ve thymol'ün metabolik parametrelerle birlikte inflamasyonla ilişkili genlerin mRNA ekspresyon düzeyleri üzerindeki etkisinin araştırılması amaçlandı. Araştırmada ortalama 3.41±0.56 kg ağırlığında, 10-12 haftalık ve sağlıklı, toplam 48 adet, Yeni Zelanda ırkı, erkek tavşan kullanıldı. Tavşanlar standart tavşan yemiyle beslenen normal diyet grubu ve % 1 kolestrol ilave edilmiş yüksek kolesterol diyet grubu olarak iki ana gruba ayrıldı. Normal diyet ve yüksek kolestrol diyet grupları da 3 alt gruba (n= 8) ayrılarak; I. gruba standart tavşan diyeti, II. gruba standart tavşan diyeti+thymol (6 mg/kg, oral), III. gruba standart tavşan diyeti+kekik yağı (20 mg/kg, oral), IV. gruba yüksek kolesterol diyeti, V. gruba yüksek kolesterol diyeti+thymol (6 mg/kg, oral), VI. gruba yüksek kolesterol diyeti+kekik yağı (20 mg/kg, oral) verildi. Çalışma süresince 0, 4, 8 ve 11. haftalarda kan örnekleri alındı ve canlı ağırlıkları tartılarak kaydedildi. Karaciğerdeki yangısel sürecin izlenmesi amacıyla proinflamatuvar sitokinler (TNF-α, IL-1β, IL-6) ve akut faz proteini (C-Reaktif Protein) analizleri yapıldı. Karaciğer dokusundan inflamasyonla ilişkili hedef genlerin [STAT4, IFNγ, Tbet (tbx), IL-4, IL-5, IL-13, Gata3, IL-17A, GMCSF, RORγ (RORC), IL-9, IL-10, IL-18, Foxp3, IL-8] mRNA ekspresyon düzeyleri Real-Time PCR yöntemiyle analiz edildi. Oluşturulan deneysel hepatik lipidozis tavşan modelinde karaciğerlerde; sarımtırak renk değişimleri, hacimce artış, kenarlarda kütleşme, balonumsu dejenerasyon, yağ vakuolleri, hepatositlerde hemosiderin pigmenti, portal bölgelerde lenfositten zengin mononüklear hücre infiltrasyonları ve kupffer hücrelerinde sayıca artış görüldü. Yüksek kolesterol diyet gruplarında glukoz, trigliserid, total kolesterol ve LDL-kolesterol düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artış görüldü (p <0.05). Normal diyetle beslenen tavşanlarda thymol ve kekik yağının IFNγ geninin mRNA ekspresyonunu azalttığı (p <0.05) ve böylece makrofaj hücrelerinin inflamatuvar yanıtını inhibe edebileceği görüldü. Thymol ve kekik yağı uygulamalarının IL-4 geninin mRNA ekspresyonunu upregüle ederek T ve B lenfositlerin çoğalmasını artırabileceği ve humoral ve adaptif immuniteyi düzenleyebileceği ifade edilebilir. Özellikle kekik yağı verilen tavşanlarda Tbet geninin ekspresyonunundaki 7 katlık bir artış kekik yağının antiinflamatuvar özelliğini destekler niteliktedir.
Sonuçta; yüksek kolesterol diyeti verilerek oluşturulan non-obez hepatik lipidozis tavşan modelinde thymol ve/veya kekik yağının metabolik ve immun parametreleri etkileyebileceği, hepatik lipidozise bağlı yangısel süreçlerin düzeltilesinde gen düzeyinden itibaren olumlu yönde epigenetik etkileri olabileceği ifade edilebilir. Ayrıca bitkilerin çeşitli bileşikler içerdiği ve ekstraktın her farklı dozunda farklı etkilere sahip çeşitli bileşiklerin dominant olabileceği gerçeği hesaba katıldığında bu veriler kekik yağı ve thymol'ün belirtilen dozlarda immunmodülatör etkilerini destekler niteliktedir.

Abstract:
Different diet or diet regimens can bring about epigenetic changes; which are visible as differences in chromatin and gene expression. Hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia and visceral fat accumulation are precursors that can lead to non-alcoholic fatty liver disease. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a chronic liver disease that progresses from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and fibrosis. In this study, experimentally induced hepatic lipidosis rabbit model was used to investigate the effect of herbal remedies such as Thyme oil and thymol; along with metabolic parameters, on mRNA expression levels of inflammation-inducing genes. A total of 48 healthy New Zealand rabbits, aging 10-12 weeks and having an average weight of 3.41 ± 0.56 kg were selected for this study. Rabbits were divided into two main groups: Group-ND and Group-HCD; i.e. a normal diet group fed with standard rabbit feed and a high cholesterol diet group with 1% added cholesterol respectively. Group-ND and Group-HCD also were divided into 3 subgroups (n = 8). Group-ND comprised of group-1, group-2 and group-3 i.e. a standard rabbit diet, standard rabbit diet + thymol (6 mg/kg, oral) and a standard rabbit diet + thyme oil (20 mg/kg, oral) respectively. Group-HCD further comprised of group-4, group-5 and group-6 i.e. a high cholesterol diet, high cholesterol diet + thymol (6 mg/kg, oral) and a high cholesterol diet + thyme oil (20 mg/kg, oral) respectively. Blood samples and body weights both were recorded at intervals of 0, 4, 8 and 11 weeks respectively. Proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6) and acute phase protein (C-Reactive Protein) analyzes was performed to monitor the inflammatory process in the liver. Real-Time PCR method was used to evaluate the mRNA expression levels of the target genes [STAT4, IFNγ, Tbet (tbx), IL-4, IL-5, IL-13, Gata3, IL-17A, GMCSF, RORγ (RORC), IL-9, IL-10, IL -18, Foxp3, IL-8], associated with inflammation of the liver tissue. Grosspathological findings included yellowing, increase in size, thickening and rounding of the liver edges. Histopathological findings revealed balloning degeneration, pressence of oil vacuoles and hemosiderin pigment in hepatocytes. Alongwith lymphocyte-rich mononuclear cell infiltrations in the portal areas and an increase in the number of kupffer cells was recorded. In all high cholesterol diet groups there was a statistically significant (p <0.05) increase in glucose, triglyceride, total cholesterol and LDL-cholesterol levels. In the groups where the rabbits were fed on a normal diet, thymol and thyme oil were shown to reduce the mRNA expression of the IFNγ gene (p <0.05), thereby inhibiting the inflammatory response of macrophage cells. It can be stated that thymol and thyme oil applications upregulate mRNA expression of the IL-4 gene, which exerts its effects as an increase in T and B lymphocyte proliferation and also regulate humoral and adaptive immunity. A 7-fold increase in the expression of the Tbet gene was seen in rabbits fed on a normal diet supplemented with thyme oil. Which depicts its role as an anti-inflammatory agent. Thus, it can be inferred that in an in-vitro induced non-obese hepatic lipidosis rabbit model, thymol and/or thyme oil plays a positive role on the affects of metabolic and immune parameters and may even have a positive epigenetic effect at the gene level in the correction of inflammatory processes associated with hepatic lipidosis. Taking into account the fact that plants contain various natural compounds and the affects of these on the body is usually directly related to their dosage. Therefore, results of this study supports the immunomodulatory effects of thyme oil and thymol at the specified doses only.