Epetraborole antibiyotiği ve escherichia coli ilişkisinin omik yaklaşımlarla araştırılması
Investigation of the relationship between epetraborole antibiotic and escherichia coli by omics approaches
Yazar: ANARA BABAYEVA
Danışman: DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bor, birçok açıdan önemli bir elementtir. Mikroorganizmalar dahil birçok canlı için az miktarda esansiyel veya yararlıyken, yüksek dozlarda zararlı etkileri vardır. Ayrıca borik asit ve diğer bazı bor içeren bileşiklerin antibakteriyel etkileri vardır. Bununla birlikte son zamanlarda bor içeren çeşitli antibiyotikler sentezlenmeye ve kullanılmaya başlanmıştır. Bu tez çalışmasında, bu antibiyotiklerden biri olan epetraborole (EP) antibiyotiği kullanılmıştır. Tez kapsamında, moleküler biyoloji yaklaşımları ve omik teknolojileri kullanılarak, EP etkisinin hücrede hangi genler ile ilişkili olduğu araştırılmıştır. Bunun için, Fonksiyonel Genomik, Proteomik, Transkriptomik, Metabolomik ve gen ekspresyon analizleri kullanılmıştır. Tamamlanan bu tez çalışması ile, gram negatif model bakteride, binlerce gen, protein ve yüzlerce metabolit arasından, EP antibiyotiğine karşı direnç sağlayan ve hücresel cevap sürecinde seviyesi değişen genler, proteinler ve metabolitler tespit edilmiş ve ilgili moleküler mekanizma, metabolik yolaklar ve hücresel sistemler ile ilgili değerlendirmeler ve yorumlar yapılmıştır. 
Tez çalışmasının birinci aşamasında, Escherichia coli bakterisinin ASKA klon setinde bulunan 4123 adet klonun artan EP ve 50 µM IPTG konsantrasyonlarında Genom Boyu Tarama (GBT) deneyleri gerçekleştirilmiştir. GBT deneyleri sonucunda, overekspres edildiğinde, EP'ye karşı direnç sağlayan 188 adet suş tespit edilmiştir. Suşlardan 62 adet suşun onaylama çalışmaları sonucu göreceli olarak yüksek EP konsantrasyonlarında toleranslı oldukları teyit edilmiştir. Kontrol suşuna göre en yüksek EP konsantrasyonu olan 4 µg/ml konsantrasyonda bile üreme gösteren 14 adet klon (gen) belirlenmiştir. EP'ye en fazla seviyede direnç  sağlayan genlerin leuS, glyQ, psiF, yeaQ, ydcH, ykgM, ygbF, yjbO, ykgI, dinJ, yrbB, ycfK, mntR, cfa olduğu görülmüştür. Bu genlerin fazla ifade edilmesi sonucu EP antibiyotiğine direnç sağlaması ilginçtir ve bunun muhtemel nedenleri tezde tartışılmıştır.
Tezin ikinci aşamasında, 3 farklı ASKA klon kütüphane havuzu oluşturulup, kullanılarak (AG1(ASKA kütüphane havuzu), DH10b(ASKA kütüphane havuzu), ve AG1(ASKA kütüphanesi -AG1(pCA24N::leuS))), artan EP konsantrasyonlarında gradient yöntemi ile seleksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Göreceli olarak yüksek EP konsantrayonunda üreme gösteren koloniler seçilmiş ve elde edilen EP tolerant klonların rekombinant plazmidlerinde yer alan genler, Sanger sekanslama yöntemi ile belirlenmiştir. AG1(ASKA kütüphane havuzu) ile yapılan gradient ekim sonucu, seçilen tolerant klonların içerdiği plazmidlerin insert Blast analizlerinin hepsinde EP hedefi olan leuS gen bilgisine ulaşılmıştır. DH10b(ASKA kütüphane havuzu) ile yapılan gradient ekim seleksiyonu sonucu seçilen tolerant klonların içerdiği plazmidlerin insertlerinin Blast analizleri sonucu 4 farklı gen (mdtK, recA, leuS ve acpT) bilgisine ulaşılmıştır. leuS klonunun kütüphane havuzundan çıkarıldıktan sonra elde edilen, AG1(ASKA kütüphane havuzu -AG1(pCA24N::leuS) havuzu ile yapılan seleksiyon sonucunda ise 5 farklı gen (mdtK, aroK, rcbA, yceQ ve hda) tespit edilmiştir. Bu genlerin aşırı ekspresyonu bakteriye EP direnci kazandırmaktadır ve bunun muhtemel nedenleri tartışılmıştır.
Çalışmanın üçüncü aşamasında, hem jel tabanlı hem de LC-MS/MS yöntemi kullanılarak, proteomik analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu iş paketi için, yabanıl tip E. coli AG1 suşu, yüksek EP konsantrasyonlarında üreme gösteren AG1(pCA24N::leuS) suşu ve klonların kontrol suşu olan AG1(pCA24N) seçilerek, EP'ye maruz kalma sonucu, bakterinin protein profillerinde olan değişiklikler incelenmiştir. AG1 suşunun jel tabanlı proteomik analizi değerlendirildiğinde, EP'ye maruz kalma sonucu 11 proteinde regülasyon farklılığı görülmüştür. Bu proteinlerden, TalB, TufA, Mdh, LeuA, FrmB ve EnvZ proteinlerinin upregüle, Tsf, PykF, HolE ve LolB proteinlerinin ise downregüle olduğu görülmüştür. AG1(pCA24N) suşu üzerine EP etkisi sonucu, Tig, TufA, FrmB, LeuA ve GlpK proteinlerinin upregüle, FumA, SucD, SodA, LeuA, CysI, FrmB, Bla, YabP ve NrdD proteinlerinin ise downregüle olduğu tespit edilmiştir. AG1(pCA24N::leuS) suşu üzerine EP etkisi sonucu, LeuA proteininin upregüle, DeoA proteinin ise downregüle olduğu belirlenmiştir. LC-MS/MS yaklaşımı ile gerçekleştirilen proteomik analizi sonuçları incelendiği zaman, yüzlerce protein tanımlanmıştır ve her bir suş için upregüle ve downregüle olan proteinler liste halinde verilmiştir. Örneğin, AG1 suşunda EP etkisi değerlendirildiğinde, biyoinformatik ve istatistiksel analizler sonucu, FC>5 kat değişikliği baz alındığında, QueE, YbhC, LeuC, Lpp ve YajC proteinlerinin upregule, Efp ve AsnB proteinlerinin ise downregüle olduğu görülmüştür. Diğer suşlar ve farklı karşılaştırma sonuçları tezin diğer kısımlarında açıklanmıştır ve çok sayıda protein verisi sunulmuştur.
Tezin dördüncü aşamasında, EP etkisi sonucu model bakteride seviyesi değişen mRNA'ları belirlemek için, mikrodizin temelli Transkriptomik analizleri gerçekleştirilmiştir. Dört adet E. coli suşunun (AG1, AG1(pCA24N), AG1(pCA24N::leuS) ve AG1(pCA24N::glyQ) EP içeren ve içermeyen ortamda değişen mRNA seviyeleri bulunmuştur. Upregülasyon ve downregülasyon gösteren genlerin listeleri verilmiş ve sonuçlar yorumlanmıştır. Örneğin AG1 suşu için, FC>5 kat değişikliği baz alındığında, torC, bcsE, mrcA, pabC, pepD, yefM ve yeaE genlerinin mRNA seviyelerinin artttığı, escN, thiC ve yihR genlerinin ise mRNA seviyelerinin azaldığı tespit edilmiştir.
Tez çalışmasının beşinci aşamasında, AG1 suşunun 2 farklı EP konsantrasyonunda 4 tekrarlı 1H-NMR temelli metabolomik analizleri yapılmıştır. Antibiyotik etkisi sonucu, yabanıl tip suşta 54 farklı metabolit tespit edilmiştir. İstatistiksel ve biyoinformatik analiz sonuçları değerlendirildiği zaman, antibiyotik etkisi sonucu bu metabolitlerden ADP, AMP, asetat, betain ve malat'ın metabolitlerinin seviyesinde artış, glukoz, histidin, treonin, metionin, lizin, serin, beta-alanin ve trehaloz metabolitlerinin seviyesinde azalma görülmüştür. Bu sonuçların metabolik yolaklara ve hücresel sisteme yansımaları yorumlanarak, tezde anlatılmıştır.
Tezin son aşamasında, Real-Time PCR ile kontrol geni dahil, 19 genin gen ekspresyon analizleri gerçekleştirilmiştir. GBT, Proteomik ve Transkriptomik analizleri sonucu seçilen genlerin yüksek EP konsantrasyonlarında mRNA seviyelerinin değişimi analiz edilmiştir. PCR analizi sonucu, clpB, leuA, dnaK, leuC, lpp, ynfA, talB, queE ve tuf1 genlerinin EP'ye bağlı olarak mRNA seviyelerinde artış, yihR, tnaA, efp, flgC, torC, asnB, trpS, tsf ve yajC genlerinin mRNA seviyesinde azalma olduğu dikkat çekmiştir. Bu veriler tezin ilgili yerlerinde tartışılmıştır.
Bu tez çalışması, Omik yaklaşımlar ve gen ekspresyon analizleri ile EP antibiyotiğinin, hücre üzerindeki etkilerini birçok açıdan araştıran, önemli veriler üreten, kapsamlı ve özgün bir tez olarak, birçok gen, protein ve metabolit bilgisini bilim dünyasına ve literatüre sunmuştur.

Abstract:
Boron is a significant element with a multitude of functions. While boron is essential or useful in small amounts for a wide range of living organisms, including microorganisms, it has been demonstrated to have adverse effects when consumed in high doses. Furthermore, boric acid and other boron-containing compounds have been demonstrated to possess antibacterial properties. However, recently, various boron-containing antibiotics have been synthesised and employed in clinical practice. In this thesis, one of these antibiotics, epetraborole (EP), was employed as a research tool. The thesis employed molecular biology approaches and omics technologies to ascertain which genes within the cell are associated with the effect of EP. To this end, functional genomics, proteomics, transcriptomics, metabolomics and gene expression analyses were employed. The objective of this thesis study was to identify, among the thousands of genes, proteins and hundreds of metabolites present in gram-negative model bacteria, those that provide resistance to EP antibiotic and whose levels change during the cellular response process. Furthermore, evaluations and comments were made on the related molecular mechanism, metabolic pathways and cellular systems.
In the primary phase of the thesis study, Genome-Wide Screen (GWS) experiments were conducted on 4123 clones of the ASKA Escherichia coli bacterial clone set at varying EP concentrations and 50 µM IPTG. The GBT experiments yielded 188 strains that exhibited resistance to EP when overexpressed. Subsequently, 62 strains were confirmed to exhibit tolerance at relatively high EP concentrations, as a result of confirmation studies. In comparison to the control strain, 14 clones (genes) were identified that demonstrated growth even at the highest EP concentration of 4 µg/ml. The genes that conferred the highest resistance to EP were leuS, glyQ, psiF, yeaQ, ydcH, ykgM, ygbF, yjbO, ykgI, dinJ, yrbB, ycfK, and mntR, as well as cfa. It is noteworthy that the overexpression of these genes resulted in resistance to the EP antibiotic. The potential reasons for this phenomenon are discussed in the thesis.
In the second stage of the thesis, several ASKA clone library pools (AG1(ASKA library pool), DH10b(ASKA library pool), and AG1(ASKA library - AG1(pCA24N::leuS))) were generated and employed for EP selection by gradient method at progressively elevated EP concentrations. Colonies exhibiting growth at relatively higher EP concentrations were selected, and the genes present within the recombinant plasmids of the EP-tolerant clones were determined by Sanger sequencing. Blast analyses of the insert of the plasmids contained in the selected tolerant clones, performed as a result of gradient cultivation with AG1 (ASKA library pool), revealed the EP target leuS gene information. The Blast analyses of the inserts of the plasmids containing the tolerant clones selected as a result of gradient selection with DH10b (ASKA library pool) revealed the presence of four different genes (mdtK, recA, leuS and acpT). Following the removal of the leuS clone from the library pool, five different genes (mdkT, aroK, rcbA, yceQ and hda) were identified as a result of EP selection with the AG1(ASKA library pool -AG1(pCA24N::leuS) pool. The overexpression of these genes confered EP resistance to the bacterium. The possible explanations for this phenomenon are given in discussion.
In the third stage of the study, proteomic analyses were conducted using both gel-based and LC-MS/MS methods. In this part of the study, the wild-type E. coli AG1 strain (AG1(pCA24N::leuS)), which exhibits growth at elevated EP concentrations, and the AG1(pCA24N) strain, which serves as the control for the clones, were selected for analysis. The alterations in the protein profiles of the bacteria in response to EP exposure were then examined. The gel-based proteomic analysis of the AG1 strain revealed that 11 proteins exhibited differential regulation in response to EP exposure. Among the identified proteins, TalB, TufA, Mdh, LeuA, FrmB and EnvZ exhibited increased expression levels, while Tsf, PykF, HolE and LolB displayed decreased expression levels. As a consequence of the EP effect on the AG1(pCA24N) strain, the Tig, TufA, FrmB, LeuA and GlpK proteins were upregulated, while the FumA, SucD, SodA, LeuA, CysI, FrmB, Bla, YabP and NrdD proteins were downregulated. As a consequence of the EP effect on the AG1(pCA24N::leuS) strain, the expression of the LeuA protein was increased while that of the DeoA protein was decreased. Upon analysis of the proteomics data obtained via the LC-MS/MS approach, hundreds of proteins were identified, and the list of upregulated and downregulated proteins for each strain was compiled. To illustrate, the EP effect on the AG1 strain was evaluated through bioinformatics and statistical analyses, which demonstrated that QueE, YbhC, LeuC, Lpp and YajC proteins exhibited upregulation, while Efp and AsnB proteins demonstrated downregulation with a fold change exceeding five. The results for other strains and comparisons are presented in other sections of the thesis, along with a substantial amount of protein data.
In the fourth step of the thesis, microarray-based transcriptomic analyses were conducted to ascertain the mRNAs whose levels were altered in the model bacteria as a consequence of the EP effect. The mRNA levels of four E. coli strains (AG1, AG1(pCA24N), AG1(pCA24N::leuS) and AG1(pCA24N::glyQ)) were analysed with and without EP, in order to ascertain the effect of EP on the mRNA levels of these strains. The lists of the genes exhibiting upregulation and downregulation are provided, and the results are subsequently interpreted. To illustrate, for the AG1 strain, the mRNA levels of the torC, bcsE, mrcA, pabC, pepD, yefM and yeaE genes were found to be increased based on a fold change of greater than five, while the mRNA levels of the escN, thiC and yihR genes were observed to decrease.
In the fifth stage of the thesis, 1H-NMR-based metabolomic analyses of the AG1 strain at different EP concentrations were conducted. As a consequence of the EP antibiotic effect, a total of 54 metabolites were identified in the wild-type strain. Upon evaluation of the results of the statistical and bioinformatic analyses, an increase in the levels of ADP, AMP, acetate, betaine and malate metabolites was observed, accompanied by a decrease in the levels of glucose, histidine, threonine, methionine, lysine, serine, beta-alanine and trehalose metabolites. The implications of these findings for metabolic pathways and cellular systems were elucidated and discussed in the thesis.
In the final stage of the thesis, gene expression analyses were conducted on 19 genes, including the control gene, using real-time polymerase chain reaction (qPCR). The alterations in mRNA levels of the selected genes, as identified through GBT, proteomics and transcriptomics analyses, were examined at elevated EP concentrations. The results of the PCR analyzes indicated that the mRNA levels of the clpB, leuA, dnaK, leuC, lpp, ynfA, talB, queE and tuf1 genes increased, while the mRNA levels of the yihR, tnaA, efp, flgC, torC, asnB, trpS, tsf and yajC genes decreased as a consequence of EP. Discussion of these results is given  in the relevant sections of the thesis.
In concllusion, this thesis represents a comprehensive and original investigation into the effects of EP antibiotic on E. coli from a range of different perspectives. It employed omics approaches and gene expression analyses and generated significant results. The thesis presents to the scientific community and the academic literatüre, a wealth of information regarding the genes, proteins and metabolites associated with EP effect on E. coli.