Meme kanserinde PKİ-402'nin PI3K/AKT/mtor yolağı ve radyo duyarlılık üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of PKI-402 on pi3k/AKT/MTOR pathway and radio sensitivity in breast cancer
Yazar: ROYA GASIMLI
Danışman: PROF. DR. CUMHUR GÜNDÜZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Fosfoinositid 3-kinaz = Phosphoinositide 3-kinase ; Mammalian target of rapamycin = Mammalian target of rapamycin ; Meme = Breast ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Radyasyon = Radiation ; Radyasyon etkileri = Radiation effects ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Meme kanseri kompleks kanser türü olup, dünya üzerinde kadınlarda görülme sıklığına göre birinci, kansere bağlı ölümler arasında ikinci sıradadır. Meme kanseri klinik özelliklerine, eksprese edilen tümör markerlarına ve histolojik tipine göre alt tiplere ayrılan heterojen bir hastalıktır. Duktal ve lobular karsinomalar en yaygın histolojik tiplerini oluşturmaktadır. Her alt tipin farklı prognozu ve tedaviye yanıtı vardır.
Meme kanserinin oluşumunda birçok risk faktörü tanımlanmıştır. Mutasyonlar meme kanseri oluşumunda önemli rol oynamaktadır. PI3K/Akt/mTOR yolağının mutasyonlara bağlı anormal aktivasyonu meme kanserinde sık gözlenmektedir. Bu yolağın inhibisyonunun meme kanseri gelişimini önlemeye yardımcı olduğu yapılan çalışmalarda bildirilmiştir.
Meme kanserlerinin tedavisinde cerrahi müdahale, kemoterapi ve radyoterapi uygulamaları sonucu başarı elde edilmekle birlikte genellikle tedavilere karşı direnç gelişimi ya da nüks görülmektedir. Kök hücreler terapi direnci ve nüksten sorumlu olan, kanser kitlesini yeniden oluşturma potansiyeline sahip hücrelerdir. Bu nedenle güncel araştırmalar tümör kitlesini oluşturan hücrelerin yanısıra kanser kök hücrelerinin de elimine edilmesini sağlayacak mekanizmaların aydınlatılmasına odaklanmıştır.   
Bu doğrultuda tez kapsamında, PI3K/Akt/mTOR inhibitörü PKI-402'nin farklı meme kanseri alt tiplerindeki ve meme kanseri kök hücrelerindeki sitotoksik, apoptotik etkinliği normal hücrelerle kıyaslanarak araştırılmıştır. Bu amaçla Sitoksisite, Apoptoz, -H2AX  deneyi, Klonojenik sağkalım deneyi ve Fosforilasyon deneyi gerçekleştirilmiştir. 
Çalışmalar sonucunda, 48.saatte MCF-7 hücre hattında 109 nM, MDA-MB-231 hücre hattında 2.44 µM, BCSC hücre hattı için 5.941 µM ve MCF-10A hücre hattı için 142 nM IC50 dozuyla bu hücreler için PKI-402 sitotoksik bulunmuştur. İleri deneylere bu dozlarla devam edilmiş ve bu IC50 dozunun radyasyonla kombine edildiğinde MCF-7, BCSC ve MCF-10A hücre hatlarında apoptozu indüklediği,  MDA-MB-231 hücre hattında apoptotik etki göstermediği bulunmuştur. -H2AX deneyi sonucunda ise MCF-7, MDA-MB -231 hücre hatlarında kontrole kıyasta ve gruplar arasında (İyonize radyasyon (IR) ve PKI-402+ İyonize radyasyon (IR)) anlamlı çift kırık yüzdesi gözlemlenmiştir. MCF-10A ve BCSC hücre hatlarındaki çift kırık yüzdesi ise anlamlı olarak değerlendirilmemiştir. Uygulamalardan sonraki sağ kalım kapasitesi klonojenik analizle değerlendirilmiştir. MCF-7 ve BCSC hücre hatlarında sağkalım yüzdesinde IR ve PKI-402+IR grupları arasında ve kontrole kıyasta anlamlı bir değişim gözlemlenmiştir. Fosforilasyon deneyi sonucunda, MCF-7, MDA-MB-231 ve BCSC hücre hatlarında PI3K/Akt/mTOR yolağının baskılanmasının göstergesi olan önemli 16 proteinden bazılarının baskılandığı gözlemlenirken, normal meme epiteli hücre hattı MCF-10A'da sadece 4E-BP1 (Thr37/46) fosforillenmesinin baskılandığı gözlemlenmiştir. Tüm bu sonuçlara dayanarak, PKI-402'nin Radyasyona duyarlılığı arttırdığını düşünmekle birlikte, ileri deneylerde bunun teyit edilmesi gerektiğini düşünmekteyiz.

Anahtar kelimeler: Meme Kanseri, PI3K/Akt/mTOR yolağı, PKI-402, Radyo Duyarlılık

Abstract:
Breast cancer is a complex type of cancer and is ranked first among women worldwide and second among cancer-related deaths worldwide. Breast cancer is a heterogeneous disease that is divided into subtypes according to clinical features, exposed tumor markers and histological type. Ductal and lobular carcinomas are the most common histological types. Each subtype has a different prognosis and treatment response.
Many risk factors have been identified in the formation of breast cancer. Mutations play an important role in the development of breast cancer. The abnormal activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway due to mutations is frequently observed in breast cancer. Studies have shown that inhibition of this pathway helps prevent breast cancer development.
Surgical intervention, chemotherapy and radiotherapy in breast cancer treatments are usually successful, but resistance to treatment or recurrence is usually seen. Stem cells are potentially responsible for the resistance and reccurence, cells that have potency regenerating cancer cell bulk. For this reason, current research has focused on the elucidation of the mechanisms by which cancer cells, as well as cancer stem cells, are eliminated.
In this thesis, the cytotoxic, apoptotic activity of PI3K/Akt/mTOR inhibitor PKI-402 was investigated in different breast cancer subtypes and breast cancer stem cells in comparison with normal cells. For this purpose, cytoxicity, apoptosis, -H2AX  assay, clonogenic survival assay and phosphorylation assay were performed.
PKI-402 cytotoxicity was found for these cells at a dose of 109 nM in the MCF-7 cell line, 2.44 μM in the MDA-MB-231 cell line, 5.941 μM in the BCSC cell line and 142 nM in the MCF-10A cell line at 48 hours. Advanced experiments were continued with these doses and it was found that when this IC50 dose was combined with radiation, apoptosis was induced in the MCF-7, BCSC and MCF-10A cell lines and not in the MDA-MB-231 cell line. As a result of the -H2AX  , MCF-7, MDA-MB-231 cell lines showed a significant percentage of -H2AX  between controls and between groups (IR and PKI-402 + IR). The percentage of -H2AX  in the MCF-10A and BCSC cell lines was not significantly assessed. The survival capacity after the treatments was assessed by clonogenic assay. A significant change in survival percentages difference between MCF-7 and BCSC cell lines was observed between IR and PKI-402 + IR groups and control. As a result of the phosphorylation assay, it was observed that some of the important 16 proteins repressing the PI3K/Akt/mTOR pathway inhibition in MCF-7, MDA-MB-231 and BCSC cell lines were observed to suppress the phosphorylation of only 4E-BP1(Thr37/46) in normal mammary epithelial cell line MCF-10A . Based on all these results, we think PKI-402 should be confirmed in further experiments, considering that it enhances radiation sensitivity.

Key Words: Breast Cancer, PI3K/Akt/mTOR pathway, PKI-402, Radiosensitivity