At yetiştiriciliği işletmelerinde EHV-2 ve EHV-5 enfeksiyonlarının araştırılması ve tanısal EHV-5 real tıme PCR tekniğinin geliştirilmesi
The investigation of EHV-2 and EHV-5 infections in stud farms and development of the diagnostic EHV-5 taqman real time PCR
Yazar: AYŞE ZEYNEP AKKUTAY
Danışman: PROF. DR. FERAY ALKAN ; DOÇ. DR. KERSTİN BORCHERS
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Atlar = Horses ; Herpesvirüs enfeksiyonları = Herpesviridae infections ; Herpesvirüsler = Herpesviridae ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Bu çalışmada, Türkiye'de kamuya ait üç büyük işletmedeki arap yarış atlarında nested PCR tekniği kullanılarak EHV-2 ve EHV-5 enfeksiyonlarının varlığı ve yaygınlığının belirlenmesi, yerel saha izolatlarının elde edilmesi ve tanısal EHV-5 real-time PCR geliştirilmesi amaçlandı. Eskişehir, Malatya ve Bursa 'da yerleşik kamuya ait 3 at yetiştiriciliği işletmesinde bulunan 165 erişkin at ve taya ait kan, gözyaşı ve burun akıntısı örneği (toplam 495 örnek) araştırma materyalini oluşturdu. Tanı materyallerinin tümü nested PCR metoduyla EHV-2 ve EHV-5 yönünden test edildi. Kan örneklerinden elde edilen periferal kan mononükleer hücrelerin ED ve RK-13 hücre hatları ile kokültivasyonları gerçekleştirilerek, virus izolasyonu çalışması yapıldı. Bu çalışmada ayrıca EHV-5 tanısına yönelik hızlı ve duyarlı bir teşhis metodu olan EHV-5 real-time PCR geliştirildi.Araştırmada örneklenen atlarda EHV-2 ve EHV-5 için pozitiflik oranı sırasıyla %58,78 ve %62,42 olarak belirlendi. Örneklenen atların %45,45'nin her iki etken ile enfekte olduğu saptandı. Örneklenen işletmelerde, kullanılan tanı materyallerinde, örneklenen hayvanların yaşlarına göre EHV-2 ve EHV-5 pozitiflik oranları belirlendi ve literatür verilerine göre yorumlandı. Virus izolasyon çalışmasına alınan kan örneklerinden 37 adedi ED ve RK-13 hücre hatlarında CPE oluşturdu. İzolatların tümü EHV-2 olarak identifiye edildi. EHV-5 tanısına yönelik tasarlanan primerler ve MGB probe'un, klonlanan plazmidlerle EHV-5 real-time PCR için optimizasyonun gerçekleştirilmesinin ardından tespit limiti, spesifisite ve relatif sensitivite çalışmaları yapılarak geliştirilen real time PCR'ın saha örneklerinde yüksek duyarlıkta ve güvenle kullanılabileceği belirlendi. Saha örneklerinde real time PCR ve nested PCR pozitiflik oranı sırasıyla %54,9 ve %33,3 olarak saptandı.Elde edilen veriler EHV-2 ve EHV-5 enfeksiyonlarının örneklenen at yetiştiriciliği işletmelerinde yüksek prevalansa sahip olduğunu, enfeksiyonun taylarda daha yüksek oranda seyrettiğini ortaya koydu. Ayrıca EHV-5 enfeksiyonu tanısı için geliştirilen EHV-5 TaqMan real time PCR'ın günümüzde kullanılan moleküler tekniklerin yerine/beraber kullanılabilecek güvenli, hızlı ve hassas bir teknik olduğu sonucuna varıldı.Anahtar Kelimeler: EHV-2, EHV-5, nested PCR, real-time PCR, kokültivasyon.

Abstract:
In this study it was aimed to investigate EHV-2 and EHV-5 presence/ prevalence by type specific nested PCR in three state owned stud farms that have the arabian race horses, obtain local field isolates and evaluate diagnostic EHV-5 TaqMan real time PCR. For this purpose, from three stud farms in Eskişehir, Malatya, and Bursa 165 horses and foals sampled. From each animal blood, tears and nasal swap were collected and totaly 495 sample used as thesis material. Viral load of EHV-2 and EHV-5 in whole materials was determined by nested PCR assay. 165 PBMCs are isolated from blood samples and inoculated to ED and RK-13 cell lines with cocultivation method. Second part within this study, EHV-5 TaqMan real time PCR evaluated for sensitive, rapid and reliable detection of EHV-5.In the study EHV-2 and EHV-5 determined as positive at a rate of 58.78% and 62.42% respectively. For both agents the positivity rate determined as 45,45%. Moreover, 37 blood sample formed CPE in ED and RK-13 cell lines. Isolates were obtained as EHV-2 by using nested PCR. For diagnosis of EHV-5 by real time PCR primers and MGB probes were designed. After optimizing EHV-5 real time PCR; detection limit, specificity and relative sensitivity reactions made by using clonned plazmids. In the optimized spesific reaction 51 field samples tested and real time PCR and nested PCR positive ratio determined as 54,9% and 33,3%, respectively. It was shown that designed EHV-5 real time PCR can be used in the field strains as a reliable method.The data showed EHV-2 ve EHV-5 infections of race horses with and without symptoms in the state owned stud farms have high prevalence ratio which is similiar with the data worlwide. Also foals showed higher prevalance than adults. Additionally it is concluded that EHV-5 TaqMan real time PCR is a rapid, reliable and sensitive technique which can be used instead of /or together with the molecular techniques using today.Key words: EHV-2, EHV-5, nested PCR, real-time PCR, cocultivation.