İnsan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerinin ve K2 vitamininin osteosarkom hücreleri üzerine etkilerinin WNT/β-katenin yolağı hedeflenerek araştırılması
Investigation of the effects of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and vitamin K2 on osteosarcoma cells by targeting WNT/β-catenin pathway
Yazar: BÜŞRANUR ÖZALPER
Danışman: PROF. DR. HABİBE MELTEM ÖZGÜNER
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Histoloji = Histology ; Katenin = Catenin ; Kemik iliği = Bone marrow ; Kemik iliği nakli = Bone marrow transplantation ; Kemik ve kemikler = Bone and bones ; Kök hücreler = Stem cells ; Osteosarkom = Osteosarcoma ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Vitamin K = Vitamin K

Özet:
Histolojik olarak malign osteoid varlığı ile karakterize olan osteosarkom (OS), çocuklarda ve gençlerde en sık görülen primer kemik tümörüdür. Agresif ve metastatik yapıya sahip olan OS, genelde akciğere metastaz yaparak hastalığın ölümcül seyrine neden olur. Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MKH), mikroçevrede önemli rol oynadığı bilinmesine karşın osteosarkom hücreleri sağkalımına etkisi tartışmalıdır. Tümör mikroçevresindeki iletişim salgılanan sitokinler, kemokinler ve ekstraselüler veziküller aracılığıyla farklı yolakların aktivasyonu/inhibisyonu ile sağlanmaktadır. Ayrıca mikroçevrede var olan K2 vitamini ile kemik metabolizması arasındaki ilişkinin araştırılması, K2 vitamininin osteogenez modülasyonundaki olası rollerinin aydınlatılmasında önemlidir.

Çalışmamızda, sağlıklı kemik iliği MKH'lerinin ve K2 vitamininin Saos-2 hücreleri üzerindeki apoptotik etkileri in vitro ortamda hücre-hücre teması olmadan (membranlı/insert) yapılan ko-kültür deneyleriyle incelendi. Saos-2 hücrelerinin apoptotik özellikleri akım sitometri yöntemiyle analiz edildi. Saos-2 hücrelerinin osteoblastik olgunlaşmayı indükleme yeteneğini değerlendirmek için Alkalen fosfataz (ALP) enzim aktivitesi spektrofotometrik olarak ölçüldü. Kültür sonrası süpernatanta salınan sitokinlerin (IL-6 ve TGF-β1) tayini ELİSA yöntemi ile belirlendi. Saos-2 hücrelerinde β-katenin proteinin ekspresyon çalışmaları ise immünositokimyasal olarak belirlendi.  

Ko-kültür sonuçlarımıza göre Saos-2 hücrelerinin MKH'ler ile etkileşiminde apoptotik hücre sayısının arttığı ancak istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı belirlendi. Kültür süpernatantlarından elde edilen ALP enzim aktivitesi ölçümlerinde azalma tespit edilmesine rağmen sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. Kültür süpernatantlarından elde edilen ELİSA sonuçlarına göre salgılanan IL-6 ve TGF-β1 sitokin miktarlarında azalma tespit edildi ancak istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı. Saos-2 hücrelerinde immünohistokimyasal yöntemlerle boyanan β-katenin ekspresyonunun ko-kültür gruplarında hücre çekirdeklerinde anlamlı olarak azaldığı saptandı.

Bu bulgular ışığında MKH'lerin ve K2 vitamininin osteosarkom mikroçevresine Wnt sinyal yolağı aracılığıyla etkili olduğu saptandı. K2 vitamininin tümorojeniteyi azaltabileceği ancak terapotik amaçlı kullanım için farklı doz ve süreleri içeren in vivo ve in vitro pre-klinik çalışmalarla desteklenmesi gerektiği sonucuna varıldı.

Abstract:
Osteosarcoma (OS), which is histologically characterized by the presence of malignant osteoid, is the most common primary bone tumor in children and adolescents. OS, which has an aggressive and metastatic structure, usually metastasizes to the lung and causes the fatal course of the disease. Although bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) are known to play an important role in the microenvironment, their effect on osteosarcoma cell survival is controversial. Communication in the tumor microenvironment is provided by the activation/inhibition of different pathways via secreted cytokines, chemokines and extracellular vesicles. In addition, investigating the relationship between vitamin K2 in the microenvironment and bone metabolism is important in elucidating the possible roles of vitamin K2 in the modulation of osteogenesis.

In our study, the apoptotic effects of healthy bone marrow MSCs and vitamin K2 on Saos-2 cells were investigated in co-culture experiments in vitro without cell-cell contact (membrane/insert). Apoptotic properties of Saos-2 cells were analyzed by flow cytometry. Alkaline phosphatase (ALP) enzyme activity was measured spectrophotometrically to evaluate the ability of Saos-2 cells to induce osteoblastic maturation. The cytokines (IL-6 and TGF-β1) released into the supernatant after culture were determined by the Elisa method. Expression studies of β-catenin protein in Saos-2 cells were determined immunocytochemically.

According to our co-culture results, it was determined that the number of apoptotic cells increased in the interaction of Saos-2 cells with MSCs, but there was no statistically significant difference. Although a decrease was detected in ALP enzyme activity measurements obtained from culture supernatants, the results were not statistically significant. According to Elisa results obtained from culture supernatants, a decrease in the amount of secreted IL-6 and TGF-β1 cytokines was detected, but no statistically significant difference was found. It was determined that the expression of β-catenin, stained by immunohistochemically, in Saos-2 cells was significantly decreased in the cell nuclei of the co-culture groups.

In the light of these findings, it was determined that MSCs and vitamin K2 were effective in the osteosarcoma microenvironment via the Wnt signaling pathway. It was concluded that vitamin K2 can reduce tumorigenicity, but it should be supported by in vivo and in vitro pre-clinical studies with different doses and durations for therapeutic use.