İnsan trombositleri ile Gas6 (Growth arrest specific protein-6) proteini arasındaki ilişki
The relationship between Gas6 (Growth arrest specific protein-6) and human platelets
Yazar: ÖZLEM BİNGÖL ÖZAKPINAR
Danışman: PROF. DR. FİKRİYE URAS
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Gas6 = Gas6 ; Kan trombositleri = Blood platelets ; Megakaryosit = Megakaryocyte ; Megakaryosit = Megakaryocyte ; Vitamin K = Vitamin K

Özet:
İnsan trombositlerinde Gas6 proteininin var olup olmadığı hakkında literatürdeki bilgiler birbiriyle çelişkilidir. Bu tezin amacı, insan trombositlerinde Gas6'nın var olup olmadığını araştırmaktır. Bu amaca ulaşmak için sadece trombositlerde araştırma yapmanın yeterli olamayacağı kanısına vararak, hem trombositler hem de onların öncül hücresi olan megakaryositlerde Gas6 varlığını incelemeyi planladık; hematopoetik kök hücrelerin megakaryosit ve trombositlere farklılaşma sürecinde Gas6'yı inceledik. Allojenik kemik iliği transplantasyonu yapılacak hasta donörlerinden alınan mononüklear hücrelerden, CD 34+ hematopoetik kök hücreler izole edildi. İzole kök hücreler, kendi geliştirdiğimiz iki aşamalı likit kültür yöntemiyle 21 gün boyunca megakaryositlere farklılaştırıldı. Bu farklılaştırma sürecinde Gas6'nın gen ekspresyonu ve protein varlığı incelendi. Ayrıca, kültür medyumuna çeşitli konsantrasyonlarda Gas6 eklenerek, hücre farklılaşması üzerindeki etkileri gözlemlendi. Hücreler kültürün 7, 14 ve 21. günlerinde morfolojik, immünolojik ve akım sitometrik olarak incelendi. Akım sitometrik analizler sonucu, CD 34+ hücrelerin zamana bağlı olarak azalıp, megakaryosit oluşumunun belirteci olan CD 41+ hücrelerin arttığı gözlendi. Morfolojik gözlemler sonucunda, 7. günden itibaren megakaryositlerin olgunlaşmaya başladığı saptandı. İnsan megakaryosit ve trombositlerinde Gas6 varlığı RT-PZR, Western Blot, Dot Blot ve ELISA yöntemleriyle gösterildi. Ayrıca kültür ortamına eklenen Gas6'nın, konsantrasyona bağlı olarak hematopoetik kök hücre ve megakaryosit progenitor hücre sayısını istatistiksel anlamlı olarak arttırdığı tespit edildi. Sonuç olarak bu çalışmada elde edilen bulgular, Gas6'nın insan trombositlerinde ve megakaryositlerde var olduğunu göstermektedir. Ayrıca kültür medyumuna çeşitli seviyelerde eklenen Gas6'nın, megakaryopoezin erken döneminde etkili olabileceği gözlendi. Megakaryopoezin erken döneminde Gas6'nın konsantrasyona bağlı etkisi konusunda kesin birşey söylemek için henüz çok erkendir. Bu konuda ileride yapılacak daha kapsamlı in vivo ve in vitro çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
The presence of Gas6 in human platelets remains contravertial. The purpose of this study is to investigate whether Gas6 is present in human platelets. We planned to investigate the presence of Gas6 in both human platelets and megakaryocytes as we believed that it would be inadequate if we only study with platelets. For this purpose we developed a two stage liquid culture system to expand megakaryocytes from mobilized peripheral blood stem cells. CD 34+ hematopoietic stem cells were isolated from mononuclear cells taken from donors of patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation. Isolated CD34+ cells were induced to differentiate into megakaryocytes for 21 days. During this process, we observed the presence of Gas6 as gene and protein. Besides, we observed the effects of Gas6 on the cell differentiation by adding it at different concentrations. Expanded cells were taken from the culture on day 7, day 14 and day 21, and were evaluated as morphologic, immunologic and flow cytometric. We observed that the number of CD 34+ cells decreased and the number of CD 41+ cells, which are the indicators of the formation of megakaryocytes, increased along the processes of expansion. Moreover, the numbers of hematopoietic stem cells and megakaryocyte progenitors cells were statistically increased depending on the concentration of Gas6. According to morphologic observations, the initiation of megakaryocyte maturation began at day 7. The presence of Gas6 in human megakaryocytes and platelets was demonstrated by the methods of RT-PCR, Western Blot, Dot Blot and ELISA. In conclusion, the presence of Gas6 was demonstrated in human platelets, megakaryocytes and their progenitors. In addition to this result, we observed that the effect of Gas6 was effective in the early megakaryocytopoiesis. We believed that it is too early to say the definitive Gas6?s concentration dependent effects in early magakaryopoiesis. Further comprehensive in vitro and in vivo studies will be necessary to determine the precise role of Gas 6 on the megakaryocytopoiesis development.