siRNA yüklü ilaç taşıyıcı sistem geliştirilmesi ve anti-kanser etkisinin in vitro değerlendirilmesi
Development of a siRNA-loaded drug delivery system and evaluation of its anti-cancer activity in vitro
Yazar: EZGİ ÖNER
Danışman: PROF. DR. AYŞE GÜLTEN KANTARCI ; PROF. DR. FATMA JULİDE AKBUĞA
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; ErbB reseptörleri = ErbB receptors ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Prostat hastalıkları = Prostatic diseases ; Prostat neoplazmları = Prostatic neoplasms ; RNA = RNA ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers ; İn vitro = In vitro

Özet:
Amaç: İleri evre kanserlerde yüksek düzeyde eksprese olduğu bilinen EphA2 genini hedefleyen siRNA yüklü katyonik katı lipit nanopartiküllerin (kKLN:siEphA2) geliştirilmesi ve histon demetilaz inhibitörü JIB-04 ile birlikte uygulandığında normal prostat (RWPE-1, PWR-1E) ve prostat kanseri (LNCaP, DU145, PC-3) hücreleri üzerindeki etkilerinin araştırılmasıdır.
Gereç ve yöntem: Nanopartiküller modifiye sıcak mikroemülsiyon yöntemiyle hazırlanmış ve karakterizasyonları NanoZS, TEM ve SEM ile yapılmıştır. Nanopartiküllerin siRNA'yla kompleksleşme ve siRNA'yı nükleazlara karşı koruma kapasitesi agaroz jel elektroforeziyle değerlendirilmiştir. kKLN:siRNA komplekslerinin hücre içerisine alınma etkinlikleri akış sitometresi ve floresan mikroskopla, gen susturma etkinlikleri kantitatif PCR ve immünoblotlamayla, sitoksisiteleri WST-8 canlılık tayiniyle belirlenmiştir. Sferoidlerin oluşturulmasında polyHEMA yöntemi, migrasyonun ölçülmesinde çizik tayini, koloni oluşturmanın ölçümünde ise kristal viyole metodu kullanılmıştır.
Bulgular: EQ1, DDAB ve DOTMA katyonik lipitleri kullanılarak küçük boyutlu (<200 nm), monodispers (PDI<0,5), pozitif yüklü (>25 mV) ve stabil nanopartiküller geliştirilmiştir. EQ1 ile hazırlanan KLN'ler ve nanoyapılı lipit taşıyıcılar siRNA ile kompleks oluşturmamıştır. Buna karşın, DDAB içeren kKLN-Db ve DOTMA içeren kKLN-Dt formülasyonları siRNA ile kompleks oluşturarak, siRNA'yı nükleazlara karşı korumuştur. kKLN-Db'nin DU145 ve PC-3 hücrelerine alınma etkinliği, kKLN-Dt ve ticari transfeksiyon ajanı Dharmafect-2'ye göre daha yüksek bulunmuştur. Normal prostat hücrelerinde toksisite göstermeyen kKLN-Db:siEphA2 kompleksi, PC-3 hücrelerinde Dharmafect-2 kadar etkili bir susturma etkinliği göstermiştir (p<0,001). Ancak, bu susturma etkinliği hücrelerin canlılık, migrasyon ve koloni oluşturma potansiyelleri üzerinde anlamlı bir değişim göstermemiştir. kKLN-Db:siEphA2 ile JIB-04 birlikte uygulandığında gözlenen antikanser etkinin JIB-04 kaynaklı olduğu gösterilmiştir.
Sonuç: Bu çalışmada siRNA taşınmasında kullanılabilecek yeni bir DDAB kKLN formülasyonu geliştirilmiştir. Bu formülasyon ile JIB-04'ün prostat kanserinde kullanımına ait in vitro veriler literatüre kazandırılmıştır.

Abstract:
Aim: To develop an siRNA-loaded cationic solid lipid nanoparticles (cSLN:siEphA2) for use in the treatment of advanced cancers with high levels of EphA2 and investigate its co-administration with histone demethylase inhibitor JIB-04 in normal prostate (RWPE-1, PWR-1E) and prostate cancer (LNCaP, DU145, PC-3) cells.
Materials and Methods: Nanoparticles were prepared using modified hot microemulsion method and were characterized by NanoZS, TEM, and SEM. Complexation with siRNA and protection against nucleases were evaluated by gel electrophoresis. Cellular uptake, gene silencing efficiency, and cytotoxicity were determined by flow cytometry and fluorescence microscopy, qRT-PCR and immunoblotting, and WST-8, respectively. PolyHEMA method, scratch assay, and crystal violet staining were used to form spheroids and analyze migration potential and clonogenicity, respectively.
Results: Small-sized(<200 nm), monodisperse(PDI<0.5), cationic(>25 mV), and stabile nanoparticles were developed using EQ1, DDAB, and DOTMA cationic lipids. cSLNs and nanostructured lipid carriers including EQ1 did not form siRNA-complexes. cSLN-Db including DDAB and cSLN-Dt including DOTMA formed siRNA-complexes and protected siRNA against nucleases. Cellular uptake of cSLN-Db was higher than cSLN-Dt and Dharmafect-2 in DU145 and PC-3. cSLN-Db:siEphA2 showed effective silencing similar to Dharmafect-2 in PC-3 (p<0.001) without being toxic to normal prostate cells. No significant change in viability, migration, and clonogenicity of PC-3 was observed upon silencing(p>0.05). The anti-cancer effect of siEphA2 and JIB-04 co-administration was due to JIB-04.

Conclusion: In this study, a new DDAB-cSLN formulation was developed for siRNA delivery. In vitro data regarding the use of this formulation and JIB-04 for prostate cancer therapy were presented to the literature.