REV 1 geninin DT40 hücrelerinde "knock out" edilerek somatik hipermutasyona etkisinin incelenmesi
The analysis of REV1 gene for somatic hypermutation by knock-out in DT40 cells
Yazar: NESİBE NUR SARIBAŞAK
Danışman: PROF.DR. İSMAİL PEKER
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2005
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Radyoloji ve Nükleer Tıp = Radiology and Nuclear Medicine

Özet:
ÖZETREV1 GENİNİN DT40 HÜCRELERİNDE ?KNOCKOUT?EDİLEREK SOMATİK HİPERMUTASYONA ETKİSİNİNİNCELENMESİİmmünoglobulin (Ig) çeşitliliğine sebep olan başlıca 3 tane B lenfosit mekanizmasıvardır. Bunlar somatik hipermutasyon (SHM), Ig gen konversiyonu (GC) ve class switchrekombinasyonudur (CSR). Bu üç önemli mekanizmanın AID (Activation InducedCytidine Deaminase) denilen bir protein ile kontrol edildiği yakın zamandagösterilmiştir.Bu çalışmada, transversiyon mutasyonlarına sebep olduğu düşünülen REV1 genininsomatik hipermutasyonda görevi olup olmadığını anlamak için, DT40 hücrelerinde??knock out?? edildi. Tavuk B lenfosit hücresi olan DT40 hücreleri; yüksek oranlardahedef integrasyonu yaptığı için, genlerin diğer hücrelere göre daha kolay ??knock out??edildiği, daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir.Öncelikle Rev1 geninin ekzonların yoğun olduğu bölge ?knock out? için seçildi vePCR yöntemi ile ?knock out? vektörünün hedef kolları hazırlandı. Hedef kollar veplazmiti hücrenin içerisinde ayırt edebilmek için ilaç direnç kasetleri, pBluescriptplazmitine klonlandı ve daha sonra plazmitler linerize edilerek AID-/-RÎ¨Vr-E IgM (+)hücrelere transfer edildi. REV1 geninin ??knock out?? edilip edilmediği hedef genigörüntüleme PCR reaksiyonu, FACS analizi ve dizi reaksiyonu ile kontrol edildi.Yapılan ??knock out?? sonucunda, bu hücrelerin normal DT40 hücrelerine göre çokyavaş büyüdüğü gözlendi. FACS analizleri, somatik hipermutasyonun AID-/-RÎ¨Vr-E IgM (+)hücrelere göre yaklaşık 3 kat azaldığını gösterdi. Azalan mutasyonların hangi tür mutasyonlarolduğunu anlamak için DNA dizi analizi yapılarak, analizlerin sonucunda REV1 genininsebep olduğu düşünülen CâG veya GâC transversiyon mutasyonlarının çok büyük orandaazaldığı gözlendi.Bu sonuçlar REV1 geninin, DT40 hücrelerindeki SHM'da en fazla görülen transversiyonmutasyonlarının, hemen hemen tamamını azaltarak bu mekanizmada önemli olduğunugösterdi.Haziran 2005 Nesibe Nur SARIBAŞAK

Abstract:
ABSTRACTTHE ANALYSIS OF REV1 GENE FOR SOMATICHYPERMUTATION BY KNOCK-OUT IN DT40 CELLSThere are three B cell specific processes; somatic hypermutation (SHM),immunoglobulin gene conversion (GC) and class switch recombination (CSR) whichcreate the repertoire of antigen receptors. It has been recently showed that these threeimportant mechanisms are controlled with Activation Cytidine Deaminase (AID)protein.In this thesis, we knocked out REV1 gene in DT40, a chicken B cell line, that isthought to be cause for transversion mutations in somatic hypermutation. In previousstudies it has been showed that DT40 integrates transfected gene constructs at high ratiosinto the endogenous loci. This high frequency of targeted integration in DT40 is apowerful tool to test the function of candidate genes by gene disruption.The exon rich region of Rev1 was chosen on the gene and the target arms of knock-out construct were prepared by PCR. The target arms and drug resistance markercassettes were cloned into the pBluescript plasmid. These plasmids were then linearizedfor transfection into the AID-/-RÎ¨Vr-E IgM (+) cells. It was checked by targetingscreening PCR, FACS analysis and sequence reaction if the REV1 gene was knockedout or not.After knocking out of REV1 gene, it was observed that these cells were growingslowly as compared to normal AID-/-RÎ¨Vr-E IgM (+) cells. The FACS analysis showedthat somatic hypermutation was approximately 3 times less than AID-/-RÎ¨Vr-E IgM (+)cells. To understand which mutations became less in knocked out cells, the sequencereaction was made and the results of sequences showed that CâG or GâC transversionmutations that is thought to be caused by Rev1, decreased with high ratio.These results showed that REV1 gene is required for somatic hypermutation in chickenDT40 B cell line by decreasing transversion mutations with very high ratio.Haziran 2005 Nesibe Nur SARIBAŞAK