Histon deasetilaz inhibitörlerinin (HDACi) glioblastoma multiforme (GBM) hücre hatlarında apoptotik yolak üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of histone deacetylase inhibitors (HDACi) on apoptotic pathway in glioblastoma multiforme (GBM)
Yazar: LEVENT ELMAS
Danışman: PROF. DR. GÜLSEREN BAĞCI ; DOÇ. DR. TUĞBA BAĞCI ÖNDER
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Glioblastoma multiforme, genellikle yetişkinlerde görülen merkezi sinir sisteminin en yaygın ve agresif primer beyin tümörüdür. Cerrahi müdahele, radyoterapi ve kemoterapi gibi tedavilere rağmen hastalığın sağ kalım 14.6 aydır. Konvansiyonel kemoterapi düşük kan-beyin bariyeri penetrasyonu, tümör içi heterojenite, intrinsik GBM direnci ve spesifik olmayan toksisite nedeniyle sınırlı etkiye sahiptir. TRAIL normal hücrelere herhangi bir etki yapmadan, kanser hücrelerini hedeflemesi yönünden oldukça ilgi çekici bir ajandır. GBM'in TRAIL-aracılı apoptoza direnç gösterdiği bilinmektedir. Bu nedenle HDACi gibi ajanların TRAIL ile birlikte kombine olarak uygulanması GBM tedavisi için güncel bir stratejidir. Bu çalışmanın amacı, Vorinostat, MS-275, Belinostat ve Romidepsin HDACi'lerinden TRAIL-aracılı ölümü en iyi şekilde arttıran 2 HDAC'yi belirlemek ve bu HDACi'lerin GBM hücrelerinde apoptotik yolak üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Bu sebeple, LN18, T98G, U87MG ve U373 hücrelerinde TRAIL'in etkisi, HDACi'lerin sitotoksik etkisi ve TRAIL ile kombine uygulaması CellTiter-Glo yöntemi ile belirlenmiş ve GraphPad Prism programı ile IC50 değerleri hesaplanmıştır. Belinostat ve Romidepsin'in TRAIL ile kombine uygulamasının apoptoza olan etkisi akım-sitometri yöntemi ile hesaplanmıştır. Belinostat ve Romidepsin'in pro-apoptotik ve anti-apoptotik genlerin ekspresyonuna olan etkisi kantitatif gerçek-zamanlı PCR yöntemi ile belirlenmiştir. Apoptozda rol oynayan kaspaz-8, -9, Bcl-2 ve Bax proteinlerinin ekspresyonu western blot yöntemi ile belirlenmiştir. Sonuçlarımıza göre; Vorinostat, Romidepsin ve Belinostat GBM hücrelerinde diğer HDACi'lere göre daha fazla sitotoksik etki göstermiştir. Belinostat ve Romidpesin'in diğer HDACi'lere göre TRAIL-aracılı ölümde daha etkili olduğu bulunmuştur. Akım-sitometri analizlerine göre, Belinostat ve Romidepsin'in TRAIL ile kombine uygulamayla apoptozu ciddi şekilde arttırdığı, gerçek-zamanlı PCR sonucuna göre de pro-apoptotik genlerin ekspresyonunu arttırırken, anti-apoptotik genlerin ekspresyonunu azalttığı bulunmuştur. Protein seviyesinde ise anlamlı bir fark görülememiştir. Bu sonuçlar bize, Belinostat ve Romidepsin'in GBM tedavisi için potansiyel birer ajan olduklarını göstermektedir.

Abstract:
Glioblastoma multiforme is the most common central nervous system and aggressive brain tumour mainly occur in adults. Despite surgical, radiotherapy and chemotherapy, survival of the disease is 14.6 months. Conventional chemotherapy has limited effect due to blood-brain-barrier, intrinsic heterogeneity of tumor, intrinsic GBM resistance and non-specific toxicity. TRAIL which has no effect for normal cells but targets tumour cells, is a promising agent. It is known that GBM shows resistance to TRAIL-mediated apoptosis. Therefore, combined treatment agents such as HDACi combined with TRAIL is current strategy for GBM therapy. The aim of this study to determine the best two HDACi enhancing the TRAIL-mediated cell death among Vorinostat, MS-275, CBHA, Belinostat and Romidepsin and to invstigate the effects of these HDACis upon apoptotic pathway on GBM. For this reason, effects of TRAIL, cytotoxic effects of HDACis and effects of combined TRAIL treatment on LN18, T98G, U87MG and TRAIL was determined with CellTiter-Glo method and IC50 doses of HDACis were calculated via GraphPad Prism program. Effects of the combination of TRAIL either Belionstat or Romidepsin to apoptosis were calculated by flow-cytometry. Expression changes of pro-apoptotic and anti-apoptotic genes were analyzed by real-time PCR. Additionally, protein expressions of Bcl-2, Bax, caspase-8 and caspase-9 were determined by western blot analysis. According to our results, Vorinotat, Romidepsin and Belinostat have more cytotoxic effect on GBM compared with other HDACis. It is found that compared to other HDACis, Belinostat and Romidepsin are more effective for TRAIL-induced cell death. By flow-cytometry analysis, combined treatment of Belinostat and Romidepsin with TRAIL enhanced apoptosis significantly. According to real-time PCR results, Romidepsin and Belinostat increased pro-apoptotic gene expression but decreased anti-apoptotic expression. There isn't any siginificant changes on protein levels. This results suggest and indicated that Belinostat and Romidepsin is a potential agent for GBM treatment.