Kütinaz üreticisi mikroorganizmaların polietilenterafitalat (PET) film yüzeylerinden izolasyonu, filogenetik yöntemlerle tanısı ve kütinaz enziminin karakterizasyonu
Isolati̇on and i̇denti̇fi̇cati̇on of cuti̇nase produci̇ng mi̇croorgani̇sms hylogeneti̇c methods from polyethyleneterephthalate (PET) fi̇lm surfaces and characteri̇zati̇on of cuti̇nase enzyme.
Yazar: ALİ OSMAN ADIGÜZEL
Danışman: PROF. DR. MÜNİR TUNÇER
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Plastik atıklardan (73 adet) yaklaşık 400 bakteriyel suş izole edilmiştir.İzole edilen bak-teri suşlarından 19'unun hem tributirini hem de polikaprolaktonu katı besiyerinde parçalayabil-dikleri tespit edilmiştir. Bunlar arasından Streptomyces sp. FP0104, Rhodococcus sp EK0501, Brevibacillus sp. DD0202 ve Bacillussp. KY0701'in kütinaz enzimi için model substrat olarakta kullanılabilen polikaprolaktonu sırasıyla %48,4, %52,1, % 56,7 ve % 77,4 oranında parçaladığı ağırlık kaybı testi ile belirlenmiştir. Üretim çalışmaları neticesinde, en yüksek kütinaz üretimi (15,01 ± 1,81 U/mL) Bacillus sp. KY0701'in % 1,5 (w/v) kütin ve % 0,1 (w/v) pepton ilave edilmiş MSM besiyerinde (besiyeri başlangıç pH'sı 7,0) 50 °C ve 200 rpm çalkalamalı koşullarda 4 gün süresince inkübe edilmesiyle elde edilmiştir. 
Bacillus sp. KY0701 ile optimum koşullar altında üretilen kütinaz enzimi amonyum sül-fat ile çökeltilmiş, iyon değiş-tokuş ve jel filtrasyon kromatografisi teknikleri saflaştırılan enzi-min moleküler ağırlığı 32 kDa olarak hesaplanmıştır. Saf enzimin aktivite gösterdiği optimum sıcaklık ve pH, sırasıyla 50 °C ve 7,5 olarak belirlenmiştir. Enziminin pH 6,0-8,0 arasında önemli ölçüde kararlı kaldığı belirlenmiştir.Mg2+ ve Ca2+ iyonları enzim aktivitesini arttırırken Hg2+ ve Cu2+ iyonları ise azaltmıştır. Tween20, Tween80 ve Triton X-100 gibi kimyasalların ortamdaki varlığı enzim aktivitesini düşük de olsa arttırmıştır. Bunun yanı sıra, PMSF'nin enzim aktivitesi üzerine şiddetli inhibe edici etkisinin olduğu gözlemlenmiştir. Aseton (% 20) varlığında enzim aktivitesinin %3,7 oranında arttığı gözlemlenirken etanol, propanol, kloroform, DMSO, benzen ve metanol (%20) gibi çözücüler varlığında ise görece aktivitesinin % 70'in üzerinde olduğu be-lirlenmiştir. Enzimin pNPB'ye karşı KmveVmax değerleri sırasyla 0,72 mM ve 336,8 μmol pNP/h/g olarak belirlenmiştir. Ayrıca, enziminin ticari detarjanlarla hazırlanan çözeltiler içerisindeki ak-tivitesindeki azalmanın% 25'i aşmadığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak, Bacillus sp. KY0701'den elde edilen kütinazın biyokimyasal özellikleri enzime başta deterjan endüstrisi olmak üzere bir-çok endüstride kullanılma olanağı sağlamaktadır

Abstract:
Approxmately 400 bacterial strains were isolated from plastic wastes. It was found that 19 isolates degraded both tributyrin and polycaprolactone in solid medium. The degradation rate of polycaprolactone, which is used as model substrate for kutinase, caused by Brevibacillus sp. DD0202, Rhodococcussp. EK0501 and Streptomyces sp. FP0104 were 56.7%, 52.1% and 48.4%, respectively.As a result of production studies, the highest cutinase production (15,01 ± 1,81 U/mL) was obtained by incubation of Bacillus sp. KY0701 in MSM medium supplemented with 1.5 % (w/v) kutin and 0.1 % (w/v) peptone at 50 °C and 200 rpm for 4 days. 
The cutinase fromBacillus sp. KY0701 was precipitated by ammonium sulphate and pu-rified using ion exchange and gel filtration chromatographyc techniques. It was determined that the moleculer mass of purified enzyme produced by Bacillus sp. KY0701 was 32 kDa. The opti-mum temperature and pH of the pure enzyme was 50 °C ve 7,5, respectively. Enzyme was stable at pH 6.0-8.0. Hg2+ and Cu2+ ions cause significant loss of enzyme activitywhile enzyme activity stimulated by Mg2+ ve Ca2+. Some chemicals such as Tween20, Tween80 and Triton X-100 slig-htly stimulated activity of enzyme. However, PMSF strongly inhibited activity of enzyme. The enzyme activity increased by 3.7 % in the presence of acetone (20 %). The relative activity of enzyme was determined to be over 70 % after enzyme incubated with ethanol, propanol, chlo-roform, DMSO, benzene ve methanol (%20).The Km and Vmax values of the cutinase for pNPB were 0.72 mM and 336.8 μmol pNP/h/g, respectively. It has also been found that decrese in the cutinase in different commercial detergent solutions did not exceed 25 %.As a result, the cutina-se from Bacillus sp KY0701 provides possible use in many industries, mainly the detergent in-dustry.