Çapraz bağlı baskılanmış glukoz oksidazın hazırlanması ve karakterizasyonu
Preparation and characterization of crosslinked imprinted glucose oxidase
Yazar: YALÇIN EGİ
Danışman: PROF. DR. AZMİ TELEFONCU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Glükoz oksidaz = Glucose oxidase ; İmmobilizasyon = Immobilization

Özet:
Enzimlerin katalitik özelliklerinin geliştirilmesinde kullanılan ve iyi bilinen stratejilerden biride biyobaskılamadır. Son zamanlarda, baskılamanın ve enzim immobilizasyon metotlarının bir kombinasyonu olan, çapraz bağlı baskılanmış proteinler (CLIP) tekniği tanımlanmıştır. Bu teknik, enzimde önceden kararlaştırılmış seçicilikte, tanıma bölgelerinin oluşturulmasında kullanılabilir. CLIP formundaki enzimler, substrat veya ürün spesifikliğinde değişim; termal, pH ve organik çözücü stabilitelerinde de artış gösterirler.Bu çalışmada çapraz bağlı baskılanmış glukoz oksidaz (GOD) hazırlanarak (CLI-GOD), GOD enziminin termal ve pH stabilitesi ile substrat affinitesinin arttırılması amaçlanmıştır. Çapraz bağlı baskılanmış GOD, kombinasyonel çapraz bağlı baskılama yaklaşımı (CLIP) kullanılarak üç adımda hazırlanmıştır. CLIP tekniğindeki ilk adım, glukoz oksidaz üzerinde polimerize olabilir vinil gruplarının oluşturulmasıdır. İtakonik anhidrit esas olarak proteinlerdeki lizin aminoasitlerinin primer amino gruplarıyla ve çok daha az oranda da tirozin aminoasitlerinin hidroksil grupları ve sistein aminoasitlerinin sülfhidril gruplarıyla açillenme reaksiyonu vermektedir. Daha sonraki adımda ise türevlendirilmiş GOD, fosfat tamponu içerisinde kosubstratsız (oksijen) ortamda kendi substratı olan D-glukoz ile muamele edildi. GOD-Glukoz kompleksi n-propanol ile çöktürüldü. Elde edilen protein pelleti liyofilize edildi. Bu ikinci adımda, kontrol örneği de glukoz olmaksızın aynı işleme tabii tutuldu. Son adımda ise GOD-Glukoz kompleksi, kuru siklohekzan içerisinde çapraz bağlayıcı olarak etilen glikol dimetilakrilat (EGDMA) ve başlatıcı olarak ta 2,2'-azo-bis-izobütirilnitril (AIBN) kullanılarak radikal polimerizasyona sokuldu. Spesifik glukoz-GOD etkileşimleriyle oluşturulan, indüklenmiş baskılanmış kalıbın, çöktürme süresince korunduğu ve sonuçta oluşan modifiye aktif kısmın, organik çözücü içerisinde, kovalent çapraz bağlama ile ?kararlaştırıldığı? gösterilmiştir. Saf GOD enzimi, çapraz bağlı baskılanmış GOD enzimi ve kontrol örneğinin (çapraz bağlı baskılanmamış GOD) aktiviteleri dinitrosalisilik asit (DNSA) metoduyla belirlenmiştir.Doğal glukoz oksidaza kıyasla, çapraz bağlı baskılanmış glukoz oksidazın termal ve pH stabilitesinde, ve ayrıca substrat affinitesinde (Km saf-GOD: 140,9 mM; Km CLI-GOD: 83,3 mM) bir artışın olduğu gösterilmiştir. Çapraz bağlı baskılanmış GOD ve kontrol örneğinin aktivitelerinin sırasıyla 3,52 U/mg.protein ve 1,81 U/mg.protein olduğu gösterilmiştir. Saf enzim iki ay sonunda başlangıç aktivitesinin % 68'ini yitirirken, CLI-GOD enzimi ise başlangıç aktivitesinin sadece % 5'lik kısmını yitirmiştir. Biyoteknolojik uygulamalar açısından, elde edilen bu sonuçlar büyük ekonomik önem taşımaktadır.

Abstract:
Bioimprinting is one of the well-known strategies to manipulate the catalytic properties of the enzymes. Recently, a technique of crosslinked imprinted proteins (CLIP) has been described with a combination of imprinting and enzyme immobilization methods. This technique can be used for the production of recognition sites with predetermined selectivity in the enzyme. The CLIP enzymes show altered substrate or product specificity, enhanced thermal, pH and organic solvents stability.The aim of this study is preparation of crosslinked imprinted glucose oxidase (CLI-GOD) for improving its thermal and pH stability, and also substrate affinity. Crosslinked imprinted GOD is prepared in three steps by combinatorial crosslinked imprinting approach (CLIP). The first step of the CLIP technique is to introduce polymerizable vinyl groups into glucose oxidase. Itaconic anhydride acylate mainly primary amino groups of lysine residues of proteins and to much lesser extent hydroxyl groups of tyrosine and sulfhydryl groups of cysteine residues. Subsequently, derivatized GOD was treated with D-glucose, enzymes substrate, in the absence of cosubstrate (oxygen) in phosphate buffer. The GOD-glucose complex was precipitated by using n-propanol. The resulting protein pellet was lyophilized. In this second step, control is subjected to the same process without glucose. In the final step, GOD-glucose complex was polymerized radically in dry cyclohexane by using ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as a crosslinker and 2,2'-azo-bis-izobütirilnitril (AIBN) as the initiator. It was demonstrated that the induced imprinted memory created for specific glucose?GOD interactions was preserved during precipitation and the resultant modified active site was ?frozen? by covalent cross-linking carried out in organic solvent. The activities of native enzyme, crosslinked imprinted GOD enzyme and control sample (crosslinked non-imprinted GOD) are determined by dinitrosalicylic acid (DNSA) assay.We demonstrated an important increase of thermal and pH stability, and also substrate affinity (Km native-GOD: 140.9 mM; Km CLI-GOD: 83.3 mM) of crosslinked imprinted glucose oxidase compared to native glucose oxidase. Crosslinked imprinted glucose oxidase and control activities are found as 3.52 U/mg.proteins and 1.81 U/mg.proteins respectively. After two months, while pure enzyme lost 68 % of it?s initially activity, the CLI-GOD lost only 5 % of it?s initially activity. The economical outcomes of the results which we obtained may be very promising in terms of biotechnological applications.