Hücre kültüründe aromataz/sirtuin-1 etkileşiminin miRNA ifade düzeyine olan etkisinin araştırılması"
Investigation of the effect of aromatase / sirtuin-1 interaction on mirna expression level in cell culture
Yazar: YASEMİN KARTAL
Danışman: DOÇ. DR. MURAT TİMUR BUDAK
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Aromataz = Aromatase ; Hücre kültür teknikleri = Cell culture techniques ; Mikro RNA = Micro RNA ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Sirtuin-1 = Sirtuin-1

Özet:
Birçok fizyolojik ve patolojik süreçte yer alan Sirtuin-1ʹin (SIRT1) ve aromatazın aktivasyon/inhibisyonlarındaki değişiklikler nörodejeneratif hastalıklarda önemli rol oynar. MikroRNA'lar (miRNA'lar), gen ekspresyonunun temel düzenleyicileridir ve birçok hastalıkta yer alan birden fazla moleküler yolağı düzenler. Bu çalışmanın amacı, insan nöroblastoma hücrelerinde aromataz ve SIRT1 arasındaki etkileşimi ve bu etkileşim ile miRNA ekspresyonu arasında nasıl bir bağlantı olduğunu araştırmaktır. İnsan nöroblastoma hücreleri, serumdan yoksun besiyerinde 6, 12 ve 24 saat süreyle inkübe edildi ve aromataz ile SIRT1 ekspresyonu Western blot yöntemi ile değerlendirildi. SIRT1 aktivatörü (SRT1720), SIRT1 inhibitörü (EX527) ve aromataz inhibitörlerinin (letrozol ve fadrozol) IC50 konsantrasyonu XTT yöntemi kullanılarak tespit edildi. SIRT1 siRNA, IC50 konsantrayonunda SRT1720, EX527, letrozol ve fadrozol uygulamalarının aromataz ile SIRT1 üzerine etkileri değerlendirildi. Son olarak, SIRT1, aromataz ekspresyonu ve miRNA hedef gen analizleri biyoinformatik yaklaşımlar ve istatistiksel parametrelerle tüm gruplarda değerlendirildi. Sonuçlara göre, serumdan yoksun ortamda 24 saat inkübe edilen hücrelerde aromataz ve SIRT1 protein seviyeleri önemli ölçüde arttı (p ≤ 0,05). Ayrıca, SH-SY5Y hücrelerinde SIRT1 FBS içeren/içermeyen ortamlarda CYP19A1'i pozitif olarak regüle etti. Ek olarak, SIRT1 siRNA transfeksiyonu, insan nöroblastoma hücrelerinde LC3, ATG5 ve LAMP2 ekspresyonlarının azalmasına neden oldu. Bu çalışmada, fenol kırmızısı içermeyen besiyeri ortamındaki SH-SY5Y hücrelerinde IC50 değeri SRT1720 için 13,55 μM, EX527 için 308,22 μM, letrozol için 26,81 μM, fadrozol için 3 μM, fenol kırmızısı varlığında ise IC50 değeri SRT1720 için 14,45 μM, EX527 için 316,10 μM, letrozol için 23,92 μM ve fadrozol için 4,57 μM olarak belirlendi. Ek olarak 6, 12, 24 ve 48 saat serum yoksunluğu oksidan/antioksidan sistemde de değişikliğe neden oldu. Oksidatif Stres İndeksi (OSI), 24 saat FBS yokluğunda azalma eğiliminde iken, 48 saat serum yokluğunda kontrole kıyasla anlamlı bir azalma gösterdi (p ≤ 0,001). Biyoinformatik analizler sonucunda, SIRT1 ve CYP19A1'i potansiyel olarak düzenleyebilecek 3 miRNA belirlendi. Hedef genler kullanılarak yapılan yolak zenginleştirme analizi sonucunda sinir sistemi veya bu sistemle ilişkili hastalıklarla ilgili birçok yolak tespit edildi. Ek olarak, hsa-miR-27a-3p ve hsa-miR-181a-5pʹnin 24 saat ve 12 saatteki ifade değişimlerinin birbiri ile korele olduğu tespit edildi ve bu miRNA'ların ifadesinde önemli bir azalma olduğu belirlendi. Öte yandan, hsa-miR-30c-5p ifadesi, 12 saat uygulamaya kıyasla 24 saatte önemli ölçüde artış gösterdi. Bu sonuçlar, gelecekteki çalışmalarda mevcut tedavilerle tamamlayıcılık açısından daha fazla araştırma stratejisi için yeni bir yaklaşım sağlayabilir ve nöroloji ile ilişkili hastalıkların anlaşılmasında katkıda bulunabilir.

Abstract:
Sirtuin-1 (SIRT1) and aromatase are involved in many physiological and pathological processes and changes in their activation/inhibition play an important role in neurodegenerative diseases. MicroRNAs (miRNAs) are fundamental regulators of gene expression and modulate multiple molecular pathways involved in many diseases. The purpose of this study was to investigate the interaction between aromatase and SIRT1 in human neuroblastoma cells and connection between this interaction and miRNA expressions. In this study, cultured human neuroblastoma cells were incubated in serum-deprived media for 6, 12, 24 h and aromatase and SIRT1 expression were evaluated by Western blot. The IC50 concentration of SIRT1 activator (SRT1720), SIRT1 inhibitor (EX527) and aromatase inhibitors (letrozole and fadrozole) were determined using XTT method. Then, aromatase and SIRT1 levels were evaluated in the presence of SIRT1 siRNA or IC50 values for each of SRT1720, EX527, letrozole and fadrozole. Finally, SIRT1, aromatase expression and miRNA target gene analyzes were assessed with bioinformatics approaches and statistical parameters in all groups. According the results, aromatase and SIRT1 protein levels were significanty elevated in the cells incubated at 24 h in serum-deprived media (p ≤ 0,05). SIRT1 also positively regulated CYP19A1 in SH-SY5Y cells in media with/without FBS. Additionally, SIRT1 siRNA transfection resulted in decreased LC3, ATG5 and LAMP2 expressions in human neuroblastoma cells. In this study, IC50 value as 13.55 μM for SRT1720, 308.22 μM for EX527, 26.81 µM for letrozole and 3 µM for fadrozole in SH-SY5Y with medium phenol red free and in the presence of phenol red, the value of IC50 as 14.45 μM for SRT1720, 316.10 μM for EX527, 23.92 μM for letrozole and 4.57 μM for fadrozole for 24 h were determined. Serum deprivation for 6, 12, 24 and 48 hours caused changes in the oxidant/antioxidant system. Oxidative Stress Index (OSI) tend to decrease in the absence of FBS at 24 h compared to the control and it significantly decreased in the 48 h serum deprived manner (p ≤ 0,001). As a result of bioinformatic analysis, 3 miRNAs which could potentially regulate the SIRT1 and CYP19A1 were determined. As a result of the pathway enrichment analysis using target genes, many pathways related to the nervous system or diseases were detected. In addition, hsa-miR-27a-3p and hsa-miR-181a-5p correlated in terms of their expressions at 24 h compared to 12 h and there was a significant decrease in the expression of these miRNAs. On the other hand, the expression of hsa-miR-30c-5p was significantly increased at 24 h compared to 12 h. These results may provide novel approach for further investigation strategy in terms of complement with existing therapies in future studies and contributed an actual framework in neurology-associated diseases.