Investigation of the role of LAP1B in transcriptional regulation of muscle cells
LAP1B proteinin kas hücrelerinin transkripsiyon regülasyonundaki rolünün araştırılması
Yazar: GÜLSÜM KAYMAN KÜREKÇİ
Danışman: PROF. DR. PERVİN RUKİYE DİNÇER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücreler = Cells ; Kar farklılaşması = Profit differentiation ; Kaslar = Muscles ; LAP 1 = LAP 1 ; Proteinler = Proteins ; Transkripsiyon faktörleri = Transcription factors ; Transkripsiyon-genetik = Transcription-genetic ; Transkriptomlar = Transcriptomics

Özet:
Çekirdek iç membran proteini LAP1B'nin (lamina-ilişkili polipeptit 1, izoform B)
işlev kaybı insanda kas distrofisi ve kardiyomiyopatiye neden olmaktadır. LAP1B'nin
kas dokusundaki işlevi henüz bilinmemektedir. Tezin amacı, LAP1B'yi ifade etmeyen
kas hücrelerinin farklılaşma sürecinde transkriptom düzeyindeki değişikliklerin
belirlenmesi ile, insanda neden olduğu kas distrofisinin moleküler patogenezinin
anlaşılmasına katkı sağlamaktır. Bu amaçla in vitro model olarak kullanılmak üzere
kontrol ve bir LAP1B-ilişkili kas distrofisi hastasına ait primer fibroblastlar
ölümsüzleştirilmiş ve uyarılabilir MyoD gen transferi gerçekleştirilmiştir. Kontrol
hücrelerin sekiz günde olgun miyotüpler oluşturduğu gözlenirken, mutant hücrelerin
füzyon kapasitelerinin çok düşük olduğu ve farklılaşmayı tamamlayamadıkları
bulunmuştur. Ayrıca C2C12 fare miyoblastlarında LAP1A/B ifadesinin
baskılanmasına neden olan mutasyonlar oluşturulmuş ve aynı bulgular gözlenmiştir.
RNA dizileme yöntemi ile kontrol ve mutant hücrelerde tüm transkriptom içerisinde
ifadesi değişen genler ve görev aldıkları yolaklar belirlenmiştir. Bu yolaklar arasından
kas kasılması, hücre döngüsü, mitozda kromatit segregasyonu ve hücre dışı matriks
organizasyonu öne çıkmıştır. Mutant hücrelerin p21 ifadesinin baskılanmış olmasına
rağmen hücre döngüsünden çıktıkları hücre döngüsü analizi ile belirlenmiştir. Son
olarak mutant hücrelerde p53 ifadesinde ve mikroçekirdek sayısında gözlenen artışın,
hücresel stres ve DNA hasarı ile ilişkili olduğu görülmektedir. Bu çalışmadan elde
edilen bulgular, LAP1B'nin kas farklılaşmasının erken evresinde hücre döngüsü
çıkışında rolünün olmadığı ancak miyogenin ifadesinin uyarılması için DNA hasarının
tamirinde görevli olabileceğine işaret etmektedir. LAP1'in yeni yolaklardaki olası
rolünün tanımlanması, tedavide hedeflenebilir yolakların keşfedilmesine de olanak
sağlayacaktır.

Abstract:
The loss-of-function of
the inner nuclear membrane protein LAP1B (lamina-associated polypeptide 1, isoform
B) causes muscular dystrophy and cardiomyopathy in humans. The function of LAP1B
in muscle is still unknown. The goal of this thesis is to contribute to the understanding
of the molecular pathogenesis underlying muscular dystrophy caused by LAP1B, by
determining transcriptional changes occurring throughout differentiation of muscle
cells lacking LAP1B. For this purpose, primary fibroblasts isolated from healthy and
one patient affected by LAP1B-related muscular dystrophy were immortalized and
myoconverted with inducible MyoD gene transfer. Whereas control cells formed
mature myotubes within eight days, mutant cells demonstrated very low fusion
potential and failed to fully differentiate. Mutations causing knockdown of LAP1A/B
expression were created in C2C12 mouse myoblasts and similar results were observed.
By RNA sequencing, genes differentially expressed in control and mutant cells within
the transcriptome and enriched pathways were identified. Muscle contraction, cell
cycle, mitotic chromatid segregation and extracellular matrix organization were among
the most significantly enriched pathways. It was shown by cell cycle assay that despite
downregulation of p21 expression, mutant cells withdrew from the cell cycle. Finally,
upregulation of p53 expression and increase in the number of micronuclei in mutant
cells were related to cellular stress and DNA damage. These findings demonstrated
that LAP1B is not involved in cell cycle exit but might suggest a role in DNA damage
repair necessary for the induction of myogenin expression. Identification of previously
unknown pathways for LAP1 will contribute to the discovery of novel targets for
therapy.