Alt-birim protein antijenlerinin immunojenitesini artırmakamacıyla yeni adjuvant/taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi
Development of a novel adjuvant/delivery system to enhance the immunogenicity of sub-unit protein antigens
Yazar: MERT PEKCAN
Danışman: PROF. DR. SEVDA ŞENEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Adjuvanlar-immünolojik = Adjuvants-immunologic

Özet:
Dünyada bir yıl içinde karşılaşılan ölümlerin yaklaşık %25'i enfeksiyon hastalıklarından kaynaklanmaktadır. Bunların önlenmesinde, en etkin ve güçlü bir yöntem aşılamadır. Ancak günümüzde, birçok enfeksiyon hastalığı için ne yazık ki aşı ya da aşılar mevcut değildir. Bu nedenle, etkinliği ve koruyuculuğu yüksek olan aşıların geliştirilmesi üzerinde çalışmalar yoğun olarak sürdürülmektedir. Yakın zamanda geliştirilen aşıların büyük bir kısmı rekombinant moleküller ya da patojenik organizmaların alt-birimlerinden oluşmaktadır. Bu yaklaşımın nedeni, elde edilen antijenlerin güvenliliği yüksek olması aynı zamanda da kolay ve büyük ölçekte üretilebilir olmalarıdır. Tercih edilen bu yaklaşım, her ne kadar yukarda bahsedilen üstünlüklere sahip olsa da anılan antijenik yapıların immünojenisitelerinin zayıf olması nedeniyle, etkin ve uzun süreli bağışıklık sağlanması için adjuvant kullanımı gerekmektedir. İmmün sistemin ve immün yanıt mekanizmalarının daha iyi anlaşılması ile adjuvant araştırmaları yeni bir boyut kazanmıştır. Adjuvantlar içeriklerine dayalı olarak, spesifik patojenle ilişkili moleküler paternler gibi davranarak, farklı mekanizmalarla doğal immün yanıtı tetiklemektedir. 

Bu çalışmada, yüksek oranda saflaştırılmış antijenlerin immunojenisitesini arttırma hedefli yeni bir adjuvant sistemi geliştirmek amacıyla Salmonella Typhi porinleri ve kitosanın birlikte kullanımı incelenmiştir. Bu amaçla porinlerle yükleme etkinliği yüksek kitosan bazlı jel ve nanopartiküller sistemler geliştirilmiştir. Hazırlanan formülasyonların, hücresel alımı konfokal lazer mikroskopi tekniği ile incelenmiştir. Makrofaj aktivasyonu, in vitro olarak, J774A.1 fare makrofaj hücre hattında, yüzey belirteçleri ve sitokin salımı belirlenerek incelenmiştir. Porinler tek başına makrofaj hücreleri tarafından alınmazken, kitosan ile kombine edildiğinde önemli düzeyde alım gerçekleştiği görülmüştür. Porinler+kitosan kombine sistemlerinin CD80 ve MHC-II (p<0.1)  ekspresyonlarını ve TNF-α ve IL-6 seviyelerini indüklediği in vitro olarak gösterilmiştir. Ayrıca, porinler+kitosan kombinasyonunun   IgG ve IgM seviyelerini arttırdığı in vivo olarak BALB/c farelerde gösterilmiştir.  

Sonuç olarak, porinler+kitosan kombinasyonu ile elde edilen kombine sistemin  immün yanıtı önemli düzeyde artırdığı gösterilmiş olup, geliştirilmiş olan bu kombine sistemin alt birim aşılar için ümit verici bir adjuvant olarak önerilmektedir.

Abstract:
Infectious diseases encompass 25% of deaths in the world per year. The most effective approach in preventing deaths is vaccination. However, at present, the availability of vaccines for many infectious diseases is still scarce. For this reason, intensive studies are being carried out for the development of vaccines with high efficacy and protection rates. Current vaccines developed mainly are based on recombinant molecules or protein subunits of pathogenic organisms. In this approach, the antigens are safer and their manufacturing in large scale is possible. In spite of these advantages, they require adjuvants to provide effective and long-term immunity because of the inheritance of weak immunogenicity of the aforementioned antigenic structures. Adjuvant research has gained an extra dimension after better understanding of the immune system and immune response mechanisms. Depending on their structure, adjuvants trigger the innate immune response through different mechanisms by behaving or acting like specific pathogen associated molecular patterns. 

In this study, we combined Salmonella Typhi porin proteins and chitosan to develop a new adjuvant system to increase the immunogenicity of highly purified antigens. For this purpose, chitosan-based gel and nanoparticles having high porin proteins loading efficiency are prepared. The cellular uptake of the formulations was examined by confocal laser microscopy. In-vitro macrophage activation studies were performed by determining surface markers and cytokine release in the J774A.1 mouse macrophage cell line. A significant uptake of porins was observed when combined with chitosan, whilst the porins alone were not taken up by macrophage cells. Further, it was demonstrated in vitro that the porins+chitosan combination systems induced CD80 and MHC-II (p<0.1) expressions as well as TNF-α and   IL-6 levels. Furthermore, in vivo studies performed in in BALB/c mice demonstrated that IgG and IgM levels were increased.  In conclusion, we have demonstrated that the combination of chitosan+porins significantly increases the immune response, suggesting the developed combined system as a promising adjuvant for subunit vaccines.