Sistemik lupus eritematozis (sle) tanısında anti ds-dna elısa testinin optimal cut-off değerinin belirlenmesi
Determination of optimal cut-off value of anti ds-dna elisa in the diagnosis of systemic lupus erithematosis
Yazar: ABDUH MURSHED
Danışman: YRD. DOÇ. DR. YAVUZ DOĞAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: Sistemik Lupus Eritematozus birçok organı tutan otoimmun sistemik bağ dokusu
hastalığıdır. Hastalık farklı klinik evrelerde kadınlarda çok daha sık olmakla birlikte her yaş döneminde görülebilir. SLE'li hastalarda dolaşımda birçok otoantikor varlığı gösterilmiştir. Bu otoantikorlar arasında dsDNA'ya karşı ortaya çıkan otoantikor yanıtı SLE'nin klinik gelişimiyle doğrudan ilişkilidir. Anti-ds DNA testi hastalığın tanısı ve hastalığın seyrinin takip edilmesi için en sık kullanılan test yöntemidir. Günümüzde anti-ds DNA tespitinde en sık kullanılan yöntem EIA yöntemidir. Anti-dsDNA IgG tespitinde kullanılan ticari kitler incelendiklerinde karar sınır değerlerinin (cut-off) birbirlerinden farklı oldukları görülmektedir. Tanısal testlerin kullanımında ortaya çıkan hatalı kullanımlar ve laboratuvarlar arasında ortaya çıkan uyumsuzluklar otoantikor testlerin standardize edilmesi gerekliliğini ortaya koymuştur. Bu amaçla, Uluslararası Otoimmünite Standardizasyon Komitesi bazı öneriler yayınlamışlardır. Anti-ds DNA test için ortaya koyulan önerilerden birisi de her laboratuvarın ROC analizi ile kendi referans sınır değerini belirlemesidir. Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Merkez Laboratuvarı İmmünoloji biriminde 2013 yılında yeni bir ticari anti-dsDNA IgG EIA testi kullanılmaya başlanmıştır. Bu testin tanısal sınır değerinin daha önceki kullanılan testin sınır değerinden daha düşük olması nedeni ile pozitif test sonuçlarının sayısında bir artış gözlenmiştir. Bu çalışmanın amacı anti-ds DNA IgG EIA testinin SLE tanısında tanısal karar vermede yardımcı olacak optimal cut-off değerinin belirlenmesi ve klinisyenlerin karar vermelerinde daha etkin rol oynayarak gereksiz test istem ve tedavi kayıplarını önlemesinin sağlanmasıdır.
Yöntem: Dokuz Eylül Üniversitesi Merkez Laboratuvarı İmmunoloji birimine Aralık 2014-Eylül
2015 tarihleri arasında başvuran anti-dsDNA EIA istemi yapılan klinik olarak SLE tanısı almış 274 hasta ve farklı hastalık tanıları ile gönderilen 627 hastanın anti-ds DNA EIA sonuçları geriye doğru tarandı. Kontrol grubu olarak sağlıklı kan donörlerinden elde edilen
serum örnekleri kullanıldı. Sistemik Lupus Eritematozis (SLE) hasta grubunda anti-ds DNA
EIA testini tanısal performansı diğer gruplarla karşılaştırılarak incelendi. Anti-ds DNA EIA sonuçları ile Crithidia IFA (CLIFT) testi arasındaki ilişki incelendi.
Testin tanısal karar verme yeterliliği anti-ds DNA değerleri kullanılarak İşlem Karakteristik(ROC) Eğrisi ile belirlendi. ÇalıĢmada Anti-ds DNA EIA testinin duyarlılığı, seçiciliği, pozitif ve negatif prediktif değer, pozitif ve negatif olabilirlik oranı farklı tanısal sınır değerleri ile karşılaştırıldı.
Bulgular: Çalışmada toplam 924 serum örneğine ait sonuçlar incelendi. Orgentec® anti-dsDNA
EIA kitin referans sınır değeri olan 20 IU/mL dikkate alındığında bu değerin altında
negatif bulunan 507 örneğin (% 54.87) EIA ortalamaları 11.36 IU/mL (1.58-19.83 ± SE 0.17),
≥ 20 IU/mL üzerinde bulunan pozitif 417 örneğin (% 45.13) EIA ortalamaları 82.12 IU/mL
(20-969.79 ± SE 5.81) olarak belirlendi. SLE tanısı alan 274 örneğin 254'ünde (%92,71) EIA
sonuçları pozitif olup EIA değerlerinin ortalaması 113,04 IU/mL bulundu. Çalışmaya alınan
diğer grupların ağırlıklı EIA ortalamaları ise 30,48 IU/mL olarak belirlendi. SLE tanısı alan gruptaki hastaların EIA ortalamaları diğer gruplarla karşılaştırıldığında istatiksel olarak anlamlılık olduğu belirlendi. Çalışmaya alınan toplam 924 hastada anti-ds DNA EIA pozitif örnek oranı % 45,13'olarak belirlendi. Bu grupta %60,91'i SLE tanısı alanlar iken diğer farklı klinik tanı alanlarda pozitiflik oranı %39,09 olarak bulundu.
CLIFT test istemi yapılan toplam 142 serum örneğinden toplam 67 örnek sonucu (%47,18)
birbirleriyle uyumsuz bulunmuştur. Sonuçları uyumsuz örneklerde 3 serum örneğinde
sonuçlar CLIFT pozitif EIA negatif iken 64 serum örneğinde sonuçlar CLIFT negatif EIA
pozitif olarak belirlenmiştir. EIA test sonuçlarıyla karşılaştırıldığında CLIFT testinin
duyarlılığı %51,14 seçiciliği ise %72,72 olarak belirlenmiştir.
ROC analizi sonrası eğrinin altında kalan alan 0,911 ile %95 güven aralığı içerisinde yöntemin tanısal yeterliliği anlamlı bulundu (p:<0,001). Üretici firmanın tanısal eşik değeri dahil olmak üzere en ideal duyarlılık ve seçiciliğe ait farklı kesim noktaları duyarlılık, seçicilik pozitif ve negatif prediktif değer, pozitif ve negatif olabilirlik oranları gibi tanısal bir testin değerlendirilmesinde kullanılan belirteçler birbirleriyle karşılaştırıldı. Üretici firmanın önerdiği 20 IU/mL eşik değer dikkate alındığında testin duyarlılığı %92,70, seçiciliği %74,92 pozitif olabilirlik oranı 3,69 olarak bulundu. Referans olarak 30 IU/mL tanısal eşik değer alındığında değerler sırasıyla %73,35, %88,76 ve 6,63 olarak belirlendi.
Sonuç: Anti-ds DNA EIA pozitifliği SLE tanı alan grupta diğer farklı klinik tanıyla gelen
gruplarla karşılaştırıldığında anlamlı düzeyde daha yüksektir. Buda anti-ds DNA testinin SLE hastaları için anlamlı olduğunu göstermektedir. Ancak SLE dışında diğer bağ dokusu
hastalıkları tanısı almış veya farklı klinik tanı almış hasta gruplarında da anti-ds DNA EIA pozitifliğinin görülmesi bu testin özgül olmadığını göstermektedir. Tanısal algoritmalarda pozitif bulunan EIA sonuçlarının CLIFT ile doğrulanması önerilmektedir ancak çalışmamızda EIA ile CLIFT testinin uyumluluğunun %50 bulunması CLIFT testinin EIA sonuçlarını doğrulamak için kullanılamayacağını göstermektedir. Orgentec® anti-dsDNA EIA testinin ROC analizi sonrası tanısal karar vermede yeterli bir test yöntemi olduğuna karar verildi. SLE dışındaki hasta gruplarında yalancı pozitiflik oranının yüksek olması nedeniyle testin eşik değerinin daha yüksek bir değer ile yeniden değerlendirilmesinin yararlı olacağı düşünüldü.
Sonuç olarak laboratuvarlar kullanılan test yöntemi ve performansı konusunda klinisyeni
mutlaka bilgilendirmeli ve anti-ds DNA EIA testi için tanısal performansı arttırmak
için kendi eşik değerlerini belirleyerek bunu klinisyenlerle paylaşmalıdır. Klinisyen
açısından ise test istemleri hastanın klinik olarak SLE şüphesi olduğu durumda istenmelidir
ve test sonuçları bunlar göz önünde bulundurularak değerlendirilmelidir. Hastalığın kliniğine göre farklı tanısal eşik değerlerin kullanılabilmesi klinik ile işbirliği içerisinde belirlenmesi gereksiz test istemlerini ve gereksiz tanı ve tedavi uygulanmasını azaltarak sağlık harcamalarının düĢürülmesinde katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Objective: Systemic Lupus Erythematosus is an autoimmune systemic connective tissue disease that affects many organs. The disease can be seen at any age period with more frequent females at different clinical stages. Many autoantibodies are shown in blood circulation in patients with SLE. Among these autoantibodies, the autoantibody response to dsDNA is directly related to the clinical development of SLE. Anti-ds DNA test is the most commonly used test method for the diagnosis of the disease and the follow-up of the disease. Nowadays, the most commonly used method for detecting anti-dsDNA is the EIA method. When the commercial kits used for the detection of anti-dsDNA IgG were examined, it was seen that the cut-off values were different from each other. Incorrect use of diagnostic test and inconsistencies between laboratories were demonstrated the necessity of standardizing autoantibodies tests. For this purpose, the International Committee on Standardization of Autoimmunity had published some recommendations. One of the proposal for anti-dsDNA testing was to determine each laboratory's own reference cut-off value by ROC analysis. A new commercial anti-ds DNA IgG EIA test was started to be used in the Immunology Unit of Central Laboratory of Dokuz Eylül University Hospital in 2013. An increase in the number of positive test results was observed for the reason that the
diagnostic cut-off value of this test was lower than the cut-off value of the previous test used. The aim of this study is to determine the optimal cut-off value of the anti-ds DNA IgG EIA test to assist in diagnostic accuracy in SLE and to prevent unnecessary test request and unsuccessful treatment by playing a more effective role in clinician's decision Method:Study samples of 274 patients who admitted to the Immunology Unit of Dokuz Eylül University Central Laboratory from December 2014 to September 2015 and were clinically diagnosed with SLE and 627 patients who were referred withdifferent disease diagnoses were retrospectively screened for anti-dsDNA EIA. Serum samples from healthy blood donors were used as the control group. The diagnostic performance of the anti-ds DNA EIA test in the Systemic Lupus Erythematosus (SLE) patient group was examined to comparing with other groups. The relationship between anti-dsDNA EIA results and the Crithidia IFA (CLIFT) test was examined. The ability of diagnostic accuracy was determined by the Receiver Operating Characteric(ROC) curve using anti-dsDNA values. In this study, the sensitivity, specificity, positive and negative predictive value, positive and negative likelihood ratio of anti-ds DNA EIA test were compared different diagnostic cut-off value.
Results: A total of 924 serum samples results were examined in this study. According to the
reference cut-off value 20 IU/mL in Orgentec® anti-ds DNA EIA kit, the EIA average of 507
(54.87%) negative samples which were < 20 IU/mL was determined 11.36 IU/mL (1.58-19.83
± SE 0.17) and the EIA average of 417 (45.13%) positive samples which were ≥ 20 IU/mL
was determined 82.12 IU/mL (20-969.79 ± SE 5.81). EIA results were positive in 254
(92.71%) of 274 samples diagnosed with SLE and the average of EIA values was 113.04
IU/mL. The average EIA values of other groups in study was 30.48 IU/mL. The EIA averages
of the patients diagnosed with SLE were statistically significant when compared with the other groups. The anti-ds DNA EIA positive sample rate was determined as 45.13% in total of 924 patients in this study. While in this group, 60.91% were SLE patients, the positivity rate was 39.09% in patients with different clinical diagnosis.
A total of 67 (47.18%) sample results were found to be incompatible with each other in 142
serum samples which requested to CLIFT test. While the results of three serum samples were
CLIFT positive and EIA negative in incompatible sample results, the results of 64 serum
samples were determined CLIFT negative EIA positive. The sensitivity of CLIFT test was
51.14% and the specificity was 72.72% when compared with EIA test results.
The area under the ROC curve was 0.911 and the diagnostic accuracy of the test was detected
as statistically significant 95% confidence intervals (p:<0,001). The markers used to assess a diagnostic test such as sensitivity, specificity, positive and negative predictive value, positive and negative likelihood ratios, were compared with different cut-off values for optimal susceptibility and specificity, incluiding the manufacturer's diagnostic threshold value. Considering the threshold value of 20 IU/mL recommended by the manufacturer, the sensitivity of the test was 92.70%, the specificity was 74.92% and positive likelihood ratio was 3,69. When the threshold value was evaluated 30 IU/mL as reference, the values were determined as 73.35%, 88,76% and 6.63, respectively.
Conclusion: Anti-dsDNA EIA positivity was significantly higher in the SLE-diagnosed group
when compared to other groups with different clinical diagnosis. This showed that anti-ds
DNA test was valuable for SLE patients. However, the presence of anti-ds DNA EIA positivity in patients with other connective tissue disorders except SLE or in patients with different clinical diagnosis suggest that this test was not specific. Confirmation of positive EIA results by diagnostic algorithms with CLIFT is recommended, but in our study because of the compatibility of EIA and CLIFT test was detected 50%, indicates that the CLIFT test could not be used to validate EIA results. Orgentec® anti-ds DNA EIA test was decided to be an adequate test method for diagnostic accuracy after ROC analysis. Because of the high rate of false positives in patient groups except SLE, it was considered useful to re-evaluated the threshold value of test with a higher value.
As a conclusion, laboratories should inform the clinicians about the used test method and
performance and should share with the clinicians by setting their threshold values to increase the diagnostic performance fort he anti-ds DNA EIA test. From the clinician point of view, the test requirements should be reguested when the patient has clinical SLE suspicion and the test results should be considered accordingly this. The ability to use different diagnostic thresholds according to the clinic of disease and the determination in cooperation with the clinic will help to reduce unnecessary test requirements, diagnosis and treatment, thereby reducing health expenditures