Deneysel fekal peritonit modeli oluşturulan sıçan beyinlerinde apoptotik değişikliklerin incelenmesi
Investigation of the apoptotic changes within experimental faecal peritonitis rat brains
Yazar: MURAT UYSAL
Danışman: DOÇ. DR. M. AYBERK KURT
Uludağ Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Anatomi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2008
Konu: Fizyopatoloji = Physiopathology ; Morfoloji = Morphology ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Peritonit = Peritonitis ; Sepsis = Sepsis ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Sepsis, yogun bakım ünitelerinde yatan hastaların %14-37'sindegörülmekte ve günümüzdeki ilerlemis tıbbi tedavi olanaklarına ragmen halakorkulan bir saglık problemi olma özelligini sürdürmektedir. Sepsis tanısıkonan yogun bakım hastalarının %8 ila 70'inde ise sepsisle iliskiliensefalopati (SE) gelismektedir. Çalısmamızda yaygın bir sepsis modeliolarak uygulanan çekal ligasyon ve perforasyon (ÇLP) yöntemi kullanılaraksıçanlarda olusturulan septik tabloda vital parametrelerin, kan tablosu ve kankültürü sonuçlarının, beyin elektriksel aktivitesinin ve beynin degisik bölgeleriüzerinde apoptotik hücre ölümleri açısından olusturdugu etkilerinarastırılması ve insanlarda görülen tablo ile olan benzerlik ve farklılıklarınirdelenmesi amaçlandı. Bu amaçla 24 erkek Wistar sıçanı kullanıldı ve ÇLP,sham-opere ve opere edilmeyen kontrol grubu olmak üzere üç ayrı grubaayrıldı. Vital parametreler her üç deney grubunda 0, 2, 6, 12 ve 24. saatlerikapsayacak sekilde non invaziv olarak monitorize edildi. Es zamanlı olarak,beyin elektriki aktivitesinin degerlendirilmesi amacı ile her üç gruptaki deneyhayvanlarının Elektrokortikografik (ECoG) ve Somatosensoriyel UyarılmısPotansiyel (SEP) kayıtları alındı. Ayrıca operasyon sonrası 24. saatteçıkarılan beyinlerden elde edilen parafin kesitler, TUNEL yöntemine ek olarakkaspaz-3 ve transglutaminaz immunohistokimya yöntemleri ile isaretlenerekgyrus dentatus (DG), cornu ammonis (CA), subventriküler bölge (SVZ) veçesitli otonomik merkezlerdeki apoptotik degisiklikler arastırıldı.ÇLP grubunda, kontrol ve sham grublarıyla karsılastırıldıgındaçalısmanın 24. saatinde kan basıncında belirgin bir düsme ve kalp atımhızında ise bunun tersi olarak artıs gözlendi. Deney hayvanlarından eldeedilen ECOG kayıtları, ÇLP grubunda spektral edge frekansı (SEF95) vemedyan frekans (MF) degerlerinde bir miktar azalmayı ve delta aktivitesindeartısı gösterirken; SEP kayıtlarında ise U-P1 ve N1-P2 mesafelerinde uzamave P1 dalgasına ait amplitüdde düsüs gözlendi. ÇLP grubunda pozitif kankültürü sonuçlarının yanı sıra trombositopeni ve artmıs kan laktat seviyelerigözlendi. mmünohistokimyasal boyama sonuçlarına bakıldıgında ise ÇLPgrubunda TUNEL yöntemiyle isaretlenen apoptotik hücre sayısının median9preoptik nükleus (MnPO), subventriküler bölge (SVZ), gyrus dentatus (DG),cornu ammonis-1 (CA1) ve cornu ammonis-3 (CA3) alanlarında anlamlıoranda yüksek oldugu belirlendi. Bununla birlikte nucleus tractus solitarius(NTS), ventroposterior parvosellüler nükleus (VPPC), anteroventralperiventriküler nükleus (AVPC), granüler insular korteks (GI), agranülerinsular korteks (AGI), perifornikal nükleus (PeF), zona inserta (ZI),dorsomedial hipotalamik nükleus (DMD) ve rostral ventrolateral medulla(RVLM)'da ise TUNEL pozitif hücre sayısı açısından gruplar arasında anlamlıbir farklılık saptanmadı. Kesitlerin kaspaz-3 immünohistokimya boyamasısonucu ÇLP grubunda, TUNEL boyamasını destekler sekilde SVZ, medianpreoptik nükleus, CA1 ve CA3 alanlarında kaspaz-3 ve transglutaminazimmünohistokimya yöntemiyle pozitif boyanmanın oldugu görüldü.Bu çalısmadan elde edilen sonuçlar, sıçanlarda uygulanan ÇLPmodelinin yaklasık olarak 24 saatlik dönem açısından sepsisli hastalardaortaya çıkan klinik sepsis tablosuna benzerlik gösterdigini ortayakoymaktadır. Buna ek olarak immünohistokimyasal yöntemlerle boyanmıshistolojik kesitlerden elde edilen veriler dogrultusunda SE'deki patofizyolojikdegisikliklerde en azından SVZ, DG, CA1, CA3 ve MNPO alanları içinapoptotik hücre ölümlerinin de rol oynayabilecegine iliskin önemli deliller eldeedilmistir. Mevcut çalısmanın sonuçları, beyinde gerçeklesen apoptotik hücreölümlerinin engellenmesine yönelik tedavi yaklasımları sayesinde sepsislihastaların beyin fonksiyonlarında düzelme ve mortalitede ise azalmasaglayabilecegini düsündürmektedir.Anahtar kelimeler: Sepsis, sepsisle iliskili ensefalopati, ECoG, SEP,apoptoz, TUNEL, kaspaz-3, çekal ligasyon ve perforasyon

Abstract:
Sepsis occurs in 14-37% of patients admitted to non-cardiac intensivecare units and despite substantial recent progress in medical treatment; itcontinues to be a serious clinical challenge. Sepsis AssociatedEncephalopathy (SAE) occurs in 8 to 70% of all critically ill patients sufferingfrom sepsis. The primary aim of this study is to characterize the cecal ligationand puncture (CLP) model, which is one of the most widely used models ofsepsis, and define its similarities to and differences in human disease usingthe vital and hematologic parameters, blood cultures and brain electricalactivity as well as investigating the apoptotic effect of CLP on the differentbrain regions. For this aim, 24 male Wistar rat divided into the three groups;CLP, sham operated and non-operated control groups, were used.Noninvasive methods were used for the monitorization of vital parameters at0, 2, 6, 12 and 24 hours for all three groups. Electrocorticographic (ECoG)and somatosensorial evoked potentials (SEP) were further recorded foranalysis of the brain electrical activity at corresponding times. Furthermore,apoptotic cell death in the dentate gyrus (DG), cornu ammonis (CA),subventricular zone (SVZ) and central autonomic centers were investigatedusing TUNEL, caspase-3 and transglutaminase immunohistochemistrymethods.A significant reduction in mean arterial pressure and an increase inheart rate was observed in CLP group compared the sham-operated and unoperatedgroups at the 24 hours of the experimental period. ECOGrecordings revealed a slight decrease in median frequency (MF) and spectraledge frequency (SEF95) and an increase in delta activity while decreased P1amplitude and elongated U-P1 and N1-P2 latencies observed within SEPrecordings for CLP group. In addition to positive blood culture results,thrombocytopenia and increased blood lactate levels also found in CLPgroup. Immunohistochemical examination of brain tissues from CLP groupshowed significantly higher number of TUNEL positive apoptotic cells in themedian preoptic nucleus, SVZ, DG, CA1 and CA3. However, there were nosignificant difference between the groups at nucleus tractus solitarius (NTS),ventroposterior parvocellular nucleus (VPPC), anteroventral periventricularnucleus (AVPC), granular insular cortex (GI), agranular insular cortex (AGI),perifornical nucleus (PeF), zona incerta (ZI), dorsomedial hypothalamicnucleus (DMD) and rostral-ventrolateral medulla (RVLM) for the TUNELpositive cells. Caspase-3 and transglutaminse positive cells further detectedat the SVZ, median preoptic nucleus, DG, CA1 and CA3 within CLP group inline with the results obtained using TUNEL staining.The results of the current study have demonstrated that the CLP ratsclosely resemble the clinical condition of human sepsis in a period of 24hours following CLP procedure. Furthermore, immunohistochemicalobservations support the hypothesis that apoptotic cell deaths wouldcontribute to the pathophysiology of the SE observed at least in the SVZ,DG, CA1, CA3 and MNPO regions. The results of the current study wouldsuggest that the therapeutic strategies that would specifically inhibit theapoptotic cell death in various brain regions may improve clinical outcome ofpatient with sepsis.Key words: Sepsis, sepsis associated encephalopathy, ECoG, SEP,apoptosis, TUNEL, caspase-3, cecal ligation and puncture