Tekrarlayan genetik anormalliklerle ilişkili akut miyeloid lösemi (AML) vakalarında genetik anormallikler ile blastik hücrelerin rölatif floresan ekspresyon seviyeleri arasındaki ilişkinin araştırılması
Investigation of the relationship between genetic abnormalities and the relative fluorescence expression levels of blastic cells in acute myeloid leukemia (AML) cases associated with recurrent genetic abnormalities
Yazar: NURULLAH AYDOĞAN
Danışman: PROF. DR. FATMA MERİÇ YILMAZ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Ankara Bilkent Şehir Hastanesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics ; Hematoloji = Hematology
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Lösemi-miyeloid-akut = Leukemia-myeloid-acute

Özet:
Amaç: Akut miyeloid lösemilerin tanısı kemik iliği örneğinin morfolojik, genetik ve immünfenotipik incelemeleri ile gerçekleşir. WHO son olarak 2022 yılında sınıflandırma kriterlerini güncellemiştir. Sınıflandırmada 'Tekrarlayan Genetik Anormalliklerle İlişkili AML' çok önemli bir yer kaplamaktadır. Kemik iliğinin immünfenotipik incelemeleri tanıya yardımcı olsa da kesin tanı için genetik incelemeler gerekmektedir. Biz bu çalışmada akım sitometrik AML panelinde kullandığımız antikorların (CD117, CD34, CD33, CD13, HLA-DR, CD64, CD14, CD4, CD38, CD11b, CD123, CD7, CD56, CD2, CD16, CD65, CD10, CD19, CD36, CD99, CD24, CD15, CD25, TDT, MPO, cCD22, cCD3, CD3) rölatif floresan ekspresyon seviyelerini hesaplayarak, bu değerler yardımıyla belirlediğimiz pozitiflik sınır değerleri ile tekrarlayan genetik anormallikler ile ilişkili AML'nin alt tiplerinin ayrımına yönelik objektif ve kantitatif kriterler belirlemeyi amaçladık.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada Mayıs 2019-Aralık 2022 tarihleri arasında T.C. Sağlık Bakanlığı Ankara Bilkent Şehir Hastanesi Hematoloji Kliniği'ne başvuran, kemik iliği histopatolojik incelemesi, genetik testler ve akım sitometrik immünfenotipleme tetkikleri yardımıyla tekrarlayan genetik anormalliklerle ilişkili AML grubu içerisinde sınıflandırılabilen hastalara ait veriler retrospektif olarak incelendi. Çalışmada, genetik anormallik gruplarındaki blast hücrelerinin antijen ekspresyon seviyeleri incelendi. Bu ekspresyon seviyeleri, sağlıklı hücre grubu olarak değerlendirilen lenfositlerin antijen ekspresyon düzeylerine oranlanarak rölatif ortanca floresan yoğunluk (RMFI) değerleri hesaplandı. Elde edilen RMFI değerleri kullanılarak, genetik anormalliklerin antijen ekspresyon düzeyleri karşılaştırıldı ve ROC analiziyle bu anormallikleri ayırt edebilecek pozitiflik sınır değerleri belirlendi. 
Bulgular: Çalışmada belirlenen pozitiflik sınır değerleriyle, HLA-DR negatif hasta popülasyonunda PML::RARA füzyonu ve NPM1 mutasyonlarının ayrımına yönelik en değerli parametreleri CD13 RMFI ve CD36 RMFI olarak tespit ettik. Bu parametrelere ait pozitiflik sınır değerleri CD13 RMFI için 2,28, CD36 RMFI için ise 1,44 olarak belirlendi. HLA-DR pozitif hasta popülasyonunda yapılan analizlerde ise RUNX1::RUNX1T1 füzyonunu diğer genetik anormalliklerden ayırmada HLA-DR RMFI ve CD56 RMFI en değerli parametreler olarak saptandı ve bu iki parametreye ait pozitiflik sınır değerleri HLA-DR RMFI için 14,8, CD56 RMFI için ise 1,15 olarak belirlendi. Yine HLA-DR pozitif hasta grubunda yapılan analizlerde NPM1 mutasyonunu diğer genetik anormalliklerden ayırmada ise CD33 RMFI ve CD34 RMFI en değerli parametreler olarak belirlendi. Bu iki parametre için pozitiflik sınır değerlerini ise CD33 RMFI için 18,0, CD34 RMFI için ise 1,58 olarak belirlendi. Diğer genetik anormalliklerin ayrımına yönelik yapılan analizlerde belirgin ayrım sağlanmadı. 
Sonuç: Bu çalışmayla, Akut Miyeloid Löseminin immünfenotiplendirme verileri kullanılarak tekrarlayan genetik hastalıklarla ilişkili AML alt tiplerinin ayrımına yönelik ön değerlendirme sağlayabilecek bir algoritma geliştirildi. Genetik testlere ulaşımın zor olduğu ya da genetik testler sonuçlanana kadar geçen sürede uygun tedavinin başlanmasının amaçlandığı durumlarda bu algoritmanın yardımcı olabileceğini ve bunun yanında genetik inceleme sırasında uzmanlara bir fikir verebileceğini düşünüyoruz.

Abstract:
Objective: The diagnosis of acute myeloid leukemia (AML) is based on morphological, genetic, and immunophenotypic examinations of bone marrow samples. WHO last updated the classification criteria in 2022. AML associated with recurrent genetic abnormalities occupies a very important place in the classification. Although immunophenotypic analysis of bone marrow is helpful for diagnosis, genetic analysis is required for definitive diagnosis. In this study, we aimed to establish objective and quantitative criteria to differentiate AML subtypes associated with recurrent genetic abnormalities by calculating the relative fluorescence expression levels of antibodies used in our AML flow cytometry panel (CD117, CD34, CD33, CD13, HLA-DR, CD64, CD14, CD4, CD38, CD11b, CD123, CD7, CD56, CD2, CD16, CD65, CD10, CD19, CD36, CD99, CD24, CD15, CD25, TDT, MPO, cCD22, cCD3, and CD3) and determining positivity cut-off values based on these values.
Materials and Methods: In this study, we retrospectively analyzed the data of patients who were admitted to the Hematology Clinic of the Ministry of Health, Ankara Bilkent City Hospital between May 2019 and December 2022 and who could be classified into the AML group associated with recurrent genetic abnormalities with the help of bone marrow histopathological examination, genetic tests and flow cytometric immunophenotyping examinations. In the study, antigen expression levels of blast cells in the genetic abnormality groups were examined. Relative median fluorescence intensity (RMFI) values were calculated by proportioning these expression levels to the antigen expression levels of lymphocytes considered as healthy cell group. Using the RMFI values, antigen expression levels of genetic abnormalities were compared and positivity cut-off values that could distinguish these abnormalities were determined by ROC analysis.
Results: With the positivity cut-off values determined in the study, we identified CD13 RMFI and CD36 RMFI as the most valuable parameters for distinguishing PML::RARA fusion and NPM1 mutations in the HLA-DR negative patient population. The positivity cut-off values for these parameters were determined as 2.28 for CD13 RMFI and 1.43 for CD36 RMFI. In the analyses performed in the HLA-DR positive patient population, HLA-DR RMFI and CD56 RMFI were found to be the most valuable parameters in distinguishing RUNX1::RUNX1T1 fusion from other genetic abnormalities and the positivity cut-off values for these two parameters were determined as 14,80 for HLA-DR RMFI and 1,15 for CD56 RMFI. In the analysis performed in the HLA-DR positive patient group, CD33 RMFI and CD34 RMFI were determined as the most valuable parameters in distinguishing NPM1 mutation from other genetic abnormalities. The positivity cut-off values for these two parameters were determined as 18,04 for CD33 RMFI and 1,58 for CD34 RMFI. Analyses for distinguishing other genetic abnormalities did not yield definitive differentiation.
Conclusion: In this study, an algorithm was developed to provide a preliminary assessment for the distinguishing of AML subtypes associated with recurrent genetic diseases using immunophenotyping data of Acute Myeloid Leukemia. We believe that this algorithm could be helpful in cases where genetic testing is difficult to access or where the aim is to initiate appropriate treatment until the results of genetic testing are available, as well as to give specialists an idea during genetic examination.