Bazı gram negatif bakterilerin bakteriyosin üretimlerinin araştırılması
Investigation of bacteriocin production from some gram negative bacteria
Yazar: SEBAHAT TEKCAN DÜĞENCİ
Danışman: DOÇ. DR. IŞIL SEYİS BİLKAY
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada, çeşitli klinik örneklerden izole edilen Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ve Klebsiella pneumoniae suşlarının antibakteriyel aktiviteleri araştırıldı. En yüksek antibakteriyel aktiviteye sahip suşlar E.coli 26S, E. coli 14, E. coli 27, P. aeruginosa 8, P. aeruginosa 15 ve P.
aeruginosa 22 olarak bulundu. Bu suşlardan elde edilen antibakteriyel maddelerin proteolitik enzimlere kısmen ya da tamamen hassas olduğu saptandı.
Antibakteriyel aktivite belirlenmesi için damlatma, disk difüzyon ve kuyucuk yöntemleri karşılaştırılarak en uygun yöntem seçilen disk difüzyon yöntemi ile bakteriyosin üreten en verimli suşlar olarak E. coli 26S ve P. aeruginosa 8 seçildi. Optimum bakteriyosin üretimleri her iki bakteri suşu için de Luria Bertani Broth besiyerinde, pH 7.0' de 37 oC'de ve 21. saatte olduğu
saptandı. Çalkalamalı ya da statik koşullar bakteriyosin üretimlerini etkilemedi. E. coli 26S' den elde edilen bakteriyosinin 75 oC' de 30 dk ve P. aeruginosa 8' den elde ettiğimiz bakteriyosinin ise 90 oC' de 30 dk kararlılığını koruduğu bulundu.
Metanol, butanolün her iki suşun bakteriyosin aktiviteleri üzerine etkileri olmadığı belirlendi. Etanol, aseton, SDS ve Tween 80' in E. coli 26S bakteriyosinine sırasıyla %25, %30, %10, %20; P. aeruginosa 8 bakteriyosinine ise sırasıyla %32, %37, %5, %21 oranlarında etkili olduğu saptandı. Kloroformun, E. coli 26S bakteriyosini üzerine etkisi olmadığı, P. aeruginosa 8 bakteriyosini üzerine %16 kayba neden olduğu bulundu. 4 oC' de 180.günde E. coli 26S' in bakteriyosin
aktivitesini %70 ve P. aeruginosa 8' in bakteriyosin aktivitesini ise %41 oranında
koruduğu belirlendi. – 20 oC' de 6. ayda bakteriyosin aktivitelerinde herhangi bir
kayıp saptanmadı. E. coli 26S ve P. aeruginosa 8 bakteriyosinlerinin saflaştırılması
için %80 oranında amonyum sülfat çöktürmesinin uygun olduğu saptandı. E.
coli 26S ve P. aeruginosa 8' in bu çalışmada kullanılan tüm antibiyotiklere duyarlı
olduğu belirlendi. E. coli 26S ve P. aeruginosa 8' den yapılan plazmid DNA
izolasyonu sonucu plazmid varlığı saptanmadı. Sonuç olarak, E. coli 26S ve P.
aeruginosa 8' den antibiyotiklere alternatif olabilme potansiyeli olan bakteriyosinler
elde edildi.
Anahtar Kelimeler: Bakteriyosin, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
antibakteriyel aktivite, bakteriyosin karakterizasyonu

Abstract:
In this study, strains of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella
pneumoniae, which were isolated from several clinical samples, were investigated
for their antibacterial activities. Strains of E. coli 26S, E. coli 14, E. coli 27, P.
aeruginosa 8, P. aeruginosa 15, and P. aeruginosa 22 were found to have the
highest activity. It was established that the antibacterial substances obtained from
these strains were partially or completely sensitive to proteolytic enzymes. E. coli
26S and P. aeruginosa 8 were selected as the most efficient strains producing
bacteriocin by disk diffusion method which was found to be the optimal method
when spot-on-lawn, disc diffusion and well-diffusion methods were compared for
determining antibacterial activity. Optimal bacteriocin production was established
in Luria Bertani Broth medium at pH 7.0 and 37 oC in 21 hours for both strains. It
was observed that agitated and static conditions did not affect the bacteriocin
production. It was also found out that the bacteriocin produced by E. coli 26S
remained stable at 75oC for 30 minutes while bacteriocin produced by P.
aeruginosa 8 remained stable at 90oC for the same time period. Moreover, it was
determined that methanol and buthanol had no effect on the bacteriocin activities
of both strains. It was observed that ethanol, acetone, SDS and Tween 80 caused
25%, 30%, 10% and 20% loss, respectively, on E. coli 26S bacteriocin and, 32%,
37%, 5% and 21% loss on P. aeruginosa 8 bacteriocin. It was also investigated
that chloroform had no effect on E. coli 26S bacteriocin while it caused 16% loss
on P. aeruginosa 8 bacteriocin. It was determined that E. coli 26S bacteriocin
maintained 70% of its activity and P. aeruginosa 8 bacteriocin maintained 41% of
its activity at 4oC after 180 days. No loss on bacteriocin activities were observed at
-20oC after 180 days. It was found that precipitation of amonium sulfate at the rate
of 80% was appropriate for purification of E. coli 26S and P. aeruginosa 8
bacteriocins. It was determined that E. coli 26S and P. aeruginosa 8 were
sensitive to all antibiotics used in this study. The existence of plasmid was not
observed as a result of plasmid DNA isolation on E. coli 26S and P. aeruginosa 8.
In conclusion, bacterocins obtained from E. coli 26S and P. aeruginosa 8 had a
potential of being alternatives to antibiotics.
Keywords: Bacteriocin, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, antibacterial
activity, bacteriocin characterization