Leishmania infeksiyonlarının tanısında kinetoplast DNA'yı saptamaya yönelik real-time pcr tabanlı bir sistem geliştirilmesi
Development of real-time PCR based system that detect kinetoplast dna for diagnosis of leishmania infections
Yazar: YAĞMUR EYLÜL DOĞANTÜRK
Danışman: PROF. DR. HRİSİ BAHAR TOKMAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: DNA = DNA ; Leishmania = Leishmania ; Leishmaniasis = Leishmaniasis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Leyişmanyaz, visseral, kutanöz ve mukozal tipte olup, tatarcıklar tarafından bulaştırılan Leishmania türlerinin neden olduğu bir hastalıktır. Sağlık Bakanlığı verilerine göre, 1990-2010 yılları arasında ülkemizde toplam 46,000 yeni vaka saptanmıştır. Leishmania vakalarının prevalansının en yüksek olduğu yerler Şanlıurfa, Çukurova bölgesi ve Diyarbakır'dır.
İklim değişikliği ve toplu nüfus hareketlerine paralel olarak, bölgemizde Leishmania infeksiyonlarının sıklığı ve önemi artmaktadır. Bu durum, hızlı tanı testlerini gerekli kılmaktadır. 
Kinetoplastida sınıfına ait türler kinetoplast DNA (kDNA) içerirler. kDNA, küçük ve sirküler bir yapıya sahip olan ekstrakromozomal bir moleküldür. Her bir Leishmania hücresi 100-200 kopya kDNA barındırmaktadır. Bu özellikleri nedeniyle kDNA, Leishmania türlerinin saptanmasında hedef olarak kullanılır. Bu çalışmada, amplifikasyon için gerekli olan tüm Leishmania türleri için kDNA'yı hedef alan PCR primerleri tasarlandı. Farklı Leishmania türlerine ait kDNA dizileri GenBank'tan elde edildi. Geliştirilen testin performansı Leishmania tropica üzerinde test edildi. Yapılan bir dizi dilüsyon ile 1-104 arasındaki parazit sayısı Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) besiyeri kullanılarak hazırlandı. Nükleik asit ekstraksiyonu Chelex metoduyla gerçekleştirildi. Real-time PCR reaksiyonları ise LightCycler 2.0 cihazı ile yapıldı. Reaksiyonlara SYBR Green boyası eklenerek floresan sinyalleri monitörize edildi.
Bu çalışmada alt saptama sınırı tek bir parazit olarak belirlendi ve varyasyon katsayısı (CV) 0,98 ve üzerinde bulundu. Regresyon analiz (R2) değeri ise 0,9589 olarak belirlendi.  
Real-time PCR metodu uyumlu, nesnel ve duyarlı sonuçlar veren tanısal test olarak iyi bir seçimdir. Geliştirilen bu protokol; basitliği, hızlı oluşu, yüksek duyarlılığı ve her laboratuvara kolayca adapte edilebilmesi nedeniyle Leishmania tanısı için alternatif bir araç olabilir.

Abstract:
The leishmaniasis are visceral, cutaneous and mucosal infections transmitted by sandflies and caused by the genus Leishmania. According to Turkish Ministry of Health data, a total of 46.000 new cases were detected between the years 1990-2010 in our country. Leishmania cases have highest prevalence in Şanlıurfa, Çukurova region and Diyarbakır. 
Parallel to climate change and mass population movements prevalence and importance of Leishmania infections also increased in our region. This situation necessitates rapid diagnostic tests. 
The species of Kinetoplastida class has a kinetoplastic DNA (kDNA). kDNA is a small, circular structured, extrachromosomal molecule. Each parasite cell harbours 100-200 copies of kDNA. Because of these properties,  the kDNA has often been target of detection of Leishmania species. In this study, we designed concensus PCR primers for amplification of kDNA that recognise kinetoplast DNA for all Leishmania species. We obtained kDNA sequences which belong diferent Leishmania spp. from GeneBank. The performance characteristics of devoloped method was tested with Leishmania tropica. Serial dilutions containing 1-104 parasites were prepared using from Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) culture. Nucleic acid extraction was performed by Chelex method. Real-time PCR reactions were performed by LightCycler 2.0 instrument. For detection of PCR products, SYBR-Green Dye added to the reaction and the fluorescence signals were monitored. 
In this study, the lower detection limit was found single parasite and intertest coefficient of variation (CV) was 0,98 and regression analysis (R2) was 0,9589.
Real-time PCR method is a good alternative as diagnostic test that allow the automation, objective and sensitive result interpretation. The developed protocol can be applicable for any molecular laboratory for detection of Leishmania spp. because of it's simplicity, rapidness and sensitivity.