RIG-I-CARD1, RIG-I-CARD2, RNF125-Ring finger ve TRIM25-SPRY domainlerinin yapısal çalışmalarda kullanılmak amacıyla üretilmesi ve NMR ile karakterizasyonu
Production and nmr characterization of RIG-I-CARD1, RIG-I-CARD2, RNF125-Ring finger and TRIM25-SPRY for structural studies
Yazar: GÜL DEMİR
Danışman: YRD. DOÇ. DR. EMİNE SONAY ELGİN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Ubiquitin, ökaryotik organizmaların hemen hemen bütün dokularında bulunan, 76 aminoasit içeren küçük regülatör bir proteindir. Molekül ağırlığı 8,5 kilo Dalton kadardır. Ubiquitilasyon, hedef proteinlere tek veya birden fazla ubiquitin proteininin kovalent olarak ilave edilmesi ile meydana gelen yaygın bir post-translasyonel modifikasyon çeşididir. Ubiquitinin en iyi bilinen fonksiyonu hücre içindeki hedef proteinlere bağlanarak onları degredasyon için proteozoma yönlendirmektir. Bunun yanı sıra, ubiquitylasyonun hücre bölünmesi, immün yanıtı ve embriyonik gelişim gibi sayısız hücresel prosesleri düzenlemede de rol aldığı bilinmektedir. Ubiquitilasyonunun işlevi, hedef proteine kaç tane ubiquitin bağlandığına ve bu ubiquitin zincirlerinin hangi lizin vasıtası ile oluşturulduğuna bağlı olarak çeşitlilik gösterir. Ubiquitin konjugasyonu E1 aktive edici, E2 konjuge edici ve E3 ligaz olarak adlandırılan üç enzim sınıfının aktiviteleri ile gerçekleşir.
Ubiquitilasyon ile düzenlenen hedef proteinlerden birisi retinoik asit tarafından indüklenen gen-I (RIG-I) dir. Sitozolik RIG-I reseptörü, sitoplazmada 5' trifosfatlar içeren viral RNA?yı tanır ve bir antiviral sinyal kaskatını başlatır. Böylece interferonlar ve sitokin üretimi ile doğal bağışıklık yanıtı aktive edilir. İnsan RIG-I proteininin ubiquitilasyonunun işlevi, ubiquitilasyonu gerçekleştiren E3 enzimine ve ubiquitilasyonun çeşidine bağlı olarak farklılık gösterir. RIG-I?in CARDs (caspase activation and recruitment domains) olarak isimlendirilen iki domaininin TRIM25 E3 enzimi aracılığıyla ubiquitilasyonu, bu domainlerin aktivasyonuna ve viral savunma sistemindeki bir alt basamak olan MAVSa (mitokondrial antiviral sinyal) yönlendirilmesine neden olur. Böylece antiviral kaskat başlatılmış olur. Buna karşın, RIG-I?in bir diğer E3 enzimi RNF125 aracılıklı ubiquitilasyonu onu degredasyon için proteozoma yönlendirir ve bunun sonucunda RIG-I seviyesi düşer. 
RIG-I?in ubiquitilasyon ile regülasyonunun anlaşılmasında yapısal çalışmaların rolü büyüktür. NMR ile proteinlerin üç boyutlu yapılarının çalışılmasında, yüksek saflıkta ve miligram miktarlarda izotopik olarak işaretlenmiş protein örnekleri gerekmektedir. Bizde bu çalışmada, NMR ile yapısal çalışmalara zemin hazırlamak amacıyla, insan RIG-I-CARDs domainlerinin ve bu domainlerinin ubiquitilasyonunda işlev yapan E3 enzimlerinden TRIM25-SPRY ve RNF125-N76 ring finger domainlerinin bakteriyel sistemde yüksek miktarlarda üretilmesi, saflaştırılması ve NMR ile yapısal çalışmalar için uygunluklarının karakterize edilmesi üzerine çalışıldı. Bu amaçla, öncelikle RIG-I proteininin CARD1 ve CARD2 domainleri ile, RNF125?in ring finger (N76) domaini kodlayan genlerin bakteriyel ekspresyon plazmitleri içerisine klonlanması gerçekleştirildi. Daha sonra, RIG-I-CARD1, CARD2, RNF125-N76 ve TRIM25-SPRY domainlerinin Escherichia coli(E.coli) içerisinde ekspresyonu, saflaştırılması, doğal konformasyonlarına katlanması üzerine çalışıldı. Son olarak, RIG-I-CARD2?nin 15N-işaretli olarak üretilmesi,  NMR ile doğal yapısına katlanıp katlanmadığının ve yapısal çalışmalar için uygunluğunun tespit edilmesi çalışmaları gerçekleştirildi. RIG-I-CARD2?nin 15N-1H HSQC spektrumu, bu domainin kullanılan NMR koşulları altında doğal üç boyutlu konformasyonuna katlanmadığını gösterdi. 


Anahtar Kelimeler: Ubiquitilasyon, RIG-I, RNF125, TRIM25, protein ekspresyonu, İzotopik işaretleme, NMR

Abstract:
Ubiquitin is a small, 76 amino acid, regulatory protein found in almost all tissues of eukaryotic organisms. Molecular weight of ubiquitin is about 8.5 kDa. Ubiquitylation is a common post-translational modification that involves the attachment of one or more ubiquitin molecules to target proteins. The most well known function of ubiquitylation is to direct cellular proteins to proteosome for degredation. In addition to that, ubiquitin conjugation regulates numerous cellular processes such as cell division, immune response and embryonic development. The function of ubiquitylation varies depending on the number of ubiquitin molecules attached to one another and the identity of lysine residue connecting them.  Ubiquitin conjugation requires activities of three enzyme classes called E1 activating enzymes, E2 conjugating enzymes and E3 ligases.
One of the target proteins regulated by ubiquitylation is retinoic acid inducible gene-I(RIG-I). Cytosolic RIG-I receptor recognizes the 5? triphosphate containing viral RNAs and initiates the antiviral signal cascade, so that innate immune response with the production of interferons and cytokines are activated. The function of human RIG-I ubiquitylation is determined by the E3 enzyme that carries out ubiquitylation and the type of ubiquitylation. TRIM25 mediated ubiquitylation of RIG-I caspase activation and recruitment domains (CARDs) results in activation these domains. RIG-I is then directed to interact with the next component, mitochondrial antiviral signal (MAVS), in the viral defence system. This leads to the activation of an antiviral cascade. On the other hand, RNF125 mediated ubiquitylation of RIG-I-CARDs directs it to proteosome for degredation which results in reduction of RIG-I levels and termination of the antiviral signaling. 
Structural studies play an important role in understanding of regulation of RIG-I ubiquitylation. Protein NMR studies require milligram amounts of isotopically labeled protein samples with high purity. Our goal in this study was to produce various domains of E3 enzymes involved in ubiquitylation of RIG-I, namely RNF125 RİNG FİNGER and TRIM25-SPRY domains as well as the individual CARDs (CARD1 and CARD2) of RIG-I in bacterial system with high yields and purity to use for future structural studies by NMR. For this purpose, first the genes encoding human RIG-I-CARD1, RIG-I-CARD2, and RNF125 ring finger (N76) domain were cloned into bacterial expression plasmids. Then, RIG-I-CARD1, RIG-I-CARD2, RNF125-N76 and TRIM25-SPRY genes were expressed in Escherichia coli (E.Coli), purified and various renaturation conditions were tested. Finally, 15N isotopic labeling of RIG-I-CARD2 was carried out and NMR spectrum of the 15N- labeled sample was recorded to determine the folding status and suitability of the domain for structural studies. 15N-1H HSQC spectrum of RIG-I-CARD2 showed that under the NMR solution and temperature conditions used for recording the data, the domain does not fold into its native three-dimensional conformation. 

Keywords: Ubiquitylation, RIG-I, RNF, TRIM25, Protein expression, İsotopic labeling, NMR