İnsan diş pulpa mezenkimal kök hücrelerinin koşullu besiyeri aracılığıyla osteojenik olarak farklılaştırılması: deneysel çalışma
The osteogenic differentiation via conditioned medium of human dental pulp mesenchymal stem cells: Experi̇mantal study
Yazar: ERGÜL ERGEN
Danışman: PROF. DR. YUSUF ÖZKUL
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Dental pulpa = Dental pulp ; Dişler = Teeth ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kök hücreler = Stem cells ; Osteogenez = Osteogenesis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Bu çalışmanın amacı, osteojenik farklılaşmış hücrelerin koşullu besiyerlerinin, farklılaşmamış mezenkimal kök hücre (MKH)'ler üzerine uygulanması sonucu bu hücreleri osteojenik farklılaşmaya yönlendireceği hipotezi üzerinden yola çıkılarak, osteojenik yönde farklılaştırılmış insan diş pulpası kaynaklı kök hücre (iDPKH)'lerin koşullu besiyerlerinin iDPKH 'ler üzerindeki etkilerini araştırmaktır.  
iDPKKH'ler akım sitometri, immün boyama ve farklılaşma testleri gibi analizlere tabi tutularak karakterize edildi. Klonejenik özelliklerini göstermek amacıyla CFU-F assay yapıldı. Hücreleri karakterize etmek için CD90, CD44, CD45, CD105 ve CD34  mezenkimal kök hücre belirteçleri kullanıldı. Çalışmamızda, iDPKKH'ler osteojenik farklılaşma besiyeri ile farklılaştırıldı. 14. gün sonunda farklılaşma; alizarin red boyama, osteolmage mineralization assay kit ile (Lonza, MD, USA) ve gen ekspresyonu düzeyinde RUNX2, Osteopontin ve Osteonektin genleri β- aktin'e normalize edilerek değerlendirildi. Farklılaşmış hücre hattından 3'er gün aralıklarla koşullu besiyeri  ve RNA izolasyonu için hücre toplandı. Toplanan koşullu besiyerleri farklılaşmamış iDPKKH 'ler üzerine uygulandı. Bu gruptan da 3'er gün aralıklarla hücreler alınarak RNA izolasyonu yapıldı. 7. ve 14. günlerde hücrelerin senesense girip girmediklerini belirlemek amacıyla β-Gal boyama, canlılık aktivitesi ölçümü ve deney sürecinde hücrelerde oksidatif stres ve hasar olup olmadığını belirlemek için mitokondriyal aktiviteye bakıldı. 14 gün sonunda deney sonlandırıldı. Koşullu besiyeri uygulanan hücre grubundaki farklılaşma; alizarin red boyama, osteolmage mineralization assay kit ile (Lonza, MD, USA) ve gen ekspresyonu düzeyinde RUNX2, Osteopontin ve Osteonektin genleri β- aktin'e normalize edilerek değerlendirildi.  
Dental pulpa dokusundan elde edilen kök hücrelerin CD90+, CD44+, CD105+ ve CD45-, CD34- oldukları akım sitometri ve immünofloresan boyama ile tespit edildi. Hücrelerin klonojenik olarak çoğaldıkları CFU-F assay ile gösterildi. Ayrıca bu hücrelerin adipojenik, osteojenik ve kondrojenik olarak farklılaştırıldıkları adipo red, alizarin red, safranin O ve toluidin blue pozitif boyanmaları ile belirlendi. Osteojenik besiyeri ile 14 gün muamele sonrası ortamda biriken minerallerin alizarin red ve floresan tabanlı mineralizasyon boyama ile pozitif boyamaları gösterildi. İndüksiyon sonrası 14. gün sonunda toplanan hücrelerde RUNX2, Osteopontin ve Osteokalsin genlerinin ekspresyon seviyelerinin arttığı, kontrol grubunda ise değişmediği real time PCR analizi ile gösterildi. Gruplar arasında istatistiksel analizler sonucu anlamlı fark bulundu (p<0,05).
Osteojenik farklılaştırılmış insan  diş pulpası kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden elde edilen koşullu besiyeri, hücrelerin osteojenik yönde indüklenmesi için alternatif bir besi ortamı oluşturabilir.

Anahtar Kelimeler: 	Kök Hücre; Osteojenik Farklılaşma; Diş Pulpası Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücre; Koşullu Besiyeri

Abstract:
The aim of this study was to investigate the effect of conditioned media of osteogenic differentiated cells on undifferentiated mesenchymal stem cells, resulting from the hypothesis that these cells would lead to osteogenic differentiation, resulting in osteogenic differentiated human dental pulp derived stem cells (hDPSC) to investigate the effects of conditioned media hDPDSC.
hDPSCs were characterized by subjecting them to analyzes such as flow cytometry, immunostaining and differentiation assays. CFU-F assay was performed to demonstrate clonogenic properties. CD90, CD44, CD45, CD105 and CD34 mesenchymal stem cell markers were used to characterize the cells. In our study, hDPSCs were differentiated with osteogenic differentiation medium. At the end of 14 days, differentiation was assessed by alizarin red staining, osteolmage mineralization assay kit, and RUNX2, Osteopontin and Osteonectin genes normalized to β-actin at gene expression level. Cells were collected for conditional nutrient and RNA isolation at 3 day intervals from differentiated cell lines. Collected conditional media were applied on undifferentiated hDPSCs. Cells were removed from this group at intervals of 3 days and RNA isolation was performed. On days 7 and 14, β-Gal staining was assessed  to determine if the cells had entered senescence, and mitocondrial activity whether oxidative stress and damage were present in the cells during the experiment. After 14 days the experiment was terminated. The differentiation in the conditioned medium group was assessed alizarin red staining, osteolmage mineralization assay kit (Lonza, MD, USA) and RUNX2, Osteopontin and Osteonectin genes by normalizing to β-actin at gene expression level.
The stem cells obtained from the dental pulp tissue were CD90 +, CD44 +, CD105 + and CD45-, CD34- by flow cytometry and immunofluorescence staining. The CFU-F assay showed that the cells were clonogenic. In addition, these cells were identified by adipogenic, osteogenic and chondrogenically differentiated adipo-red with alizarin red, safranin O and toluidine blue-positive stains. After 14 days of treatment with osteogenic medium, minerals deposited on the media were positively stained with alizarin red and osteolmage mineralization assay. Real-time PCR analysis showed that expression levels of RUNX2, Osteopontin and Osteocalcin genes were increased in cells collected at the end of 14 days after induction but not in the control group. There was statistically significant difference between the groups (p <0,05). 
The conditioned medium obtained from mesenchymal stem cells derived from osteogenic differentiated human dental pulp can create an alternative medium for inducing osteogenic uptake of cells.

Key words: Stem cell; Osteogenic Differantiation; Dental Pulp Derived Stem Cell; Conditioned Medium