Çipura (Sparus aurata L., 1758) beyin dibenzilfloresein o-debenzilaz enziminin karakterize edilmesi
Characterization of brain dibenzylfluorescein o-dibenzylase in gilthead seabream (Sparus Aurata L., 1758)
Yazar: DEMET HANÇER
Danışman: PROF.DR. ALAATTİN ŞEN
Pamukkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Aromataz, sitokrom P450 süper ailesinin üyesi olan CYP19 geni tarafından kodlanmakta veandrojenlerin ösrojenlere dönüsümünü katalizlemektedir. Dogal aromatazın katalitik aktivitesi veenzim kinetikleri hakkında bilgi balıklarda çok azdır ve bu tür içi ve türler arasında farklıorganlardan elde edilen aromataz aktivitesinin karsılastırılmasını engellemektedir. Bu çalısmada,floresans aromataz metodu, florometrik bir substrat olan O-benzilfloresein benzil ester (DBF)kullanılarak çipura (Sparus aurata L., 1758) beyin ve karaciger mikrozomlarında DBFODaktivitesini ölçmek için karakterize edilmistir. Optimize edilen metot degiskenleri, doku miktarı,pH, inkübasyon sıcaklıgı, inkübasyon zamanı ve substrat konsantrasyonunu içermektedir. Beyinve karaciger DBFOD aktivitesi 30 dak reaksiyon zamanı boyunca sırasıyla 20 ?g ve 40 ?g proteinmiktarına kadar dogrusallık göstermistir. Beyin ve karacigerde enzimin optimum pH'sı sırasıyla6,50 ve 8,25 olarak ve optimum sıcaklıgı her iki doku için 30 °C olarak bulunmustur. Beyin vekaraciger DBFOD aktivitesinin 2 ?M DBF konsantrasyonu üzerinde doyuma ulastıgı gözlenmistir.Lineweaver-Burk grafigi kullanılarak yapılan saptamalarda beyin ve karaciger DBFOD enzimiiçin Vmax ve Km degerleri belirlendi ve sırasıyla 8,054±0,550 pmol/dak/mg protein, 8,389±0,543pmol/dak/mg protein ve 0,840±0,161 ?M, 0,959±0,152 ?M olarak hesaplandı. TestosteronounSparus aurata beyin ve karaciger DBFOD enzimini yarısmalı bir sekilde inhibe ettigi gözlenmistir.Çesitli yöresel Türk bitkisel gıdalarının DBFOD aktivitesi üzerine etkileri belirlenmis ve bulgularbize bu gıdaların yeni aromataz inhibitörleri için potansiyel gıda kaynagı olabileceginigöstermistir. Western blot analizleri anti-rat aromataz antikoru kullanılarak çalısılmıstır. Çipuradabeyin ve karaciger aromatazı için ilk defa rapor edilmis bu metodun parametreleri diger türlerde dearomataz aktivitesini ölçmek için faydalı olabilecektir.

Abstract:
Aromatase is encoded by the CYP19 gene, a member of the cytochrome P450 superfamily, andcatalyzes the conversion of androgens into estrogens. Data on native aromatase enzyme kineticsand thus actual catalytic activity are scarce in fish, impeding comparison of aromatase activity(AA) from different organs within and between species. In the present study, fluorescencearomatase assay was optimized to measure DBFOD activity in the gilthead seabream (Sparusaurata L., 1758) using O-benzylfluorescein benzyl ester (DBF) as a fluorometric substrate in brainand liver microsomes. Optimized assay variables included amount of tissue, pH, incubationtemperature, incubation time and substrate concentration. Brain and liver DBFOD activity haveshowed lineerity until 20 and 40 ?g protein concentration throughout 30 minutes, respectively. Inbrain and liver optimum pH of the enzyme have found to be 6.50 and 8.25, respectively andoptimum temperature have found to be 30°C for both tissues. It has been observed that brain andliver enzyme activities have saturated at and above 2 ?M DBF concentrations. Vmax and Km valuesof brain and liver DBFOD enzyme was determined using Lineweaver-Burk graph, and calculated8.054±0.550 pmol/min/mg protein, 8.389±0.543 pmol/min/mg protein and 0.840±0.161 ?M,0.959±0.152 ?M, respectively. Testosterone appeared to inhibit the Sparus aurata brain and liverDBFOD enzyme competitively. The effects of a variety of Turkish traditional dietary plants onDBFOD activity was also determined and these results could lead us to identify the diets that couldbe potential dietary source for novel aromatase inhibitors. Western blot analysis performed usinganti-rat aromatase antibodies. In conclusion, the parameters of this assay that are reported for brainand liver aromatase in gilthead seabream could be useful to measure aromatase activity in otherspecies.