Ağız yıkama çözeltisindeki candida türlerinin belirlenmesi için multiplex PCR tanı kitlerinin geliştirilmesi
Development of multiplex PCR diagnostic kits for detection of candida species in oral rinse solution
Yazar: PETEK ÇÜRÜK
Danışman: PROF. DR. MEHMET MACİT İLKİT
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Ağız = Mouth ; Candide = Candide ; Kandida = Candida ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
AMAÇ: Sağlıklı insanların ağız florasında maya mantarları da dahil olmak üzere birçok mikroorganizma denge ve uyum içerisinde bulunur. Bu denge halinin bozulması maya mantarlarının kolonizasyonuna veya ağız içi kandidoza sebep olabilir. Ağız boşluğunda sık görülen beş Candida türü (Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida parapsilosis ve Candida dubliniensis) bilinmektedir. Candida türlerinin doğru belirlenmesi antifungal tedavi ve epidemiyolojik yönden çok önemlidir. Sunulan çalışmada, tıbbi önemi olan Candida türlerinin belirlenmesi ve tanımlanması için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) temeline dayalı yeni bir Real-time PCR yönteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır.
GEREÇ VE YÖNTEM: Çukurova Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesinden yaşları 19–36 arasında olan 200 öğrenci bu çalışmaya katıldı. Gönüllü öğrencilerin her biri 15 ml distile su ile ağzını çalkaladı, örnekler 3000 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Çökelti 200 µL steril distile su içinde karıştırılarak CHROMAgar Candida besiyerine inoküle edildi. Genomik DNA izolasyonu Fungal Mini prep kiti ile yapıldı. İzolatların identifikasyonunda CHROMAgar Candida besiyeri, MALDI-TOF MS ve RT-PCR yöntemleri kullanıldı. Gen amplifikasyonu için iki çift spesifik primer kullanıldı. Analiz 7 farklı Candida referans suşunun ITS-2 dizileri üzerinden gerçekleştirildi. Sunulan çalışmada, Candida türlerini belirlemek için real-time polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve erime sıcaklığı analizi (MCA) ile çalışan yeni bir RT PCR-MCA yöntemi geliştirildi.
BULGULAR: Toplam 52 (%26) klinik örnekten 71 maya izole edildi. Bu 71 maya mantarından 64'ü (%90.1) Candida spp. olup izole edilen türler, sıklığa göre, 22 C. albicans (%34.4), 16 C. parapsilosis (%25), 9 C. dubliniensis (%14.1), 6 C. lusitaniae (%9.4), 5 C. kefyr (%7.8), 2 C. lambica ve 4 (%6.9) diğer Candida türleri [1 C. krusei, 1 C. tropicalis, 1 C. inconspicua ve 1 C. pararugosa] idi. Toplam 64 Candida izolatına ilişkin MALDI-TOF MS verileri CAC ve iki ayrı RT-PCR sonuçları ile karşılaştırıldı. CAC besiyerinde 1 C. tropicalis kökeni yeşil koloni oluşturdu ve yanlış olarak C. albicans olarak identifiye edildi. RT-PCR yöntemi ile çalışmada izole edilen altı Candida türü MCA yöntemi ile tanımlandı, ancak iki tür, C. albicans ve C. kefyr, Tm sıcaklığına göre birbirinden ayırt edilemedi. Ayrıca, MALDI-TOF MS ile C. lambica olarak belirlenen iki izolat RT-PCR ile amplifiye edilemedi.
TARTIŞMA: Candida türlerinin geleneksel yöntemler ile belirlenmesi ve birbirinden ayırt edilmesi 2–3 gün sürebilmektedir. Candida türlerinin bir gün içerisinde real-time PCR'ı takiben erime sıcaklığı (MCA) analizi basit, ucuz ve çabuk bir yöntemdir. Ancak, bu çalışmada Candida türlerinin kesin tanısı için yeterli olmadığı anlaşılmıştır. 

Anahtar kelimeler: Candida, chromogenic agar, identifikasyon, MALDI-TOF MS, PCR, Real-time PCR

Abstract:
AIM: Various amount of microogranism live in healthy human flora containing yeast fungi. Disturbance in the balance of colonization can cause yeast colonisation or intraoral candidiasis. Candida species (Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida parapsilosis and Candida dubliniensis) are the most frequent species known in oral microflora. Antifungal treatment and epidemiological aspects are very important in the correct assessment of Candida. In the presented research the design of a new Real-time PCR method is aimed in order to detect the medically important Candida species by polymerase reaction (PCR).
MATERIAL METHOD: 200 students aged between 19 and 36 from Çukurova University Faculty of Medicine participated in this study. Each student rinsed their mouth with 15 ml of distilled water, samples were centrifuged 10 times at 3000 rpm. The pellets were suspensed in 200 µL sterile distilled water and inoculated into CHROMAgar Candida medium. Genomic DNA isolation was done with the Fungal Mini preparation kit. CHROMAgar Candida medium, MALDI TOF MS and RT-PCR  was used for the identification of isolations. Two pairs of specific primers were used for gene amplification. Analysis was performed targeting ITS-2 sequences of 7 different Candida reference strains. In the presented study, a new method of RT PCR-MCA method that works with real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and melting curve analysis (MCA) was developed for the detection of Candida species.
Results: A total of 71 yeasts were isolated from 52 (26%) clinical specimens. Of these 71 yeasts, 64 (90.1%) were Candida spp. and the isolated species, by frequency, were 22 C. albicans (34.4%), 16 C. parapsilosis (25%), 9 C. dubliniensis (14.1%), 6 C. lusitaniae (9.4%), 5 C. kefyr (%) 7.8), 2 C. lambica and 4 (6.9%) other Candida species [1 C. krusei, 1 C. tropicalis, 1 C. inconspicua and 1 C. pararugosa]. MALDI-TOF MS data for a total of 64 Candida isolates were compared with CAC and two separate RT-PCR results. On CAC medium, 1 strain of C. tropicalis formed a green colony and was incorrectly identified as C. albicans. Six Candida species isolated in the study were identified by MCA method by RT-PCR method, but two species, C. albicans and C. kefyr, could not be distinguished from each other according to Tm temperature. In addition, two isolates identified as C. lambica by MALDI-TOF MS could not be amplified by RT-PCR.
Conclusion : It may take 2-3 days for Candida species to be identified and differentiated from each other by traditional methods. Melting temperature (MCA) analysis of Candida species after real-time PCR within one day is a simple, inexpensive and fast method. However, in this study, it was understood that it was not sufficient for the definitive diagnosis of Candida species.

Key words: Candida, chromogenic agar, identification, MALDI-TOF MS, PCR, Real time PCR