Peptit ve protein-PEG konjugatlarının sentezi ve kütle spektrometrik analizi
Synthesis and mass spectrometric analysis of peptide and protein-PEG conjugates
Yazar: ÖYKÜ ÜLKÜ
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Polimer Bilim ve Teknolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kimya = Chemistry ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Tedavi edici proteinler farmakoloji alanında oldukça fazla kullanılmalarının yanı sıra, bu alanda tedavi edici protein yapılarını içeren hibrit moleküllerin kullanıldığı birçok klinik uygulama da bulunmaktadır. Polietilen glikol (PEG) kullanılarak, sadece tedavi edici proteinler ile değil tedavi edici diğer bir takım biyomoleküller ve ilaçlarla da pegilasyon adı verilen konjugasyon işlemi gerçekleştirilip hibrit moleküller oluşturulmaktadır. Bu çalışmalarda karşılaşılan en büyük zorluklardan biri, pegilasyon işlemi sonucunda elde edilen moleküllerin analiz edilmeleri, bağlanma bölgelerinin ve bağlanma oranlarının doğru şekilde belirlenebilmesidir. Oluşturulan polimer esaslı bu tedavi edici hibrit moleküllerin analizleri ve karakterizasyonları analitik açıdan oldukça zorlu olmaktadır. 

Bu tez kapsamında hibrit peptit-polimer ve protein-polimer molekülleri sentezlenerek, bu hibrit moleküllerin analizi ve karakterizasyonları için daha kolay ve zaman almayan analitik yöntemlerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. 
Bu amaç doğrultusunda PEG ile konjugasyona girmesi hedeflenen örnek polipeptit yapıları olarak insan anjiyotensin II ve insan insülini molekülleri kullanılmıştır. Konjugasyon reaksiyonu için farklı molekül ağırlığı dağılımına sahip PEG örnekleri kullanılmıştır.  Kullanılan bazı PEG zincirlerinin uç grupları türevlendirilerek farklı reaktif gruplar haline getirilmiştir. Konjugasyon reaksiyonları hem organik çözücü içerikli hem de fizyolojik ortam koşullarında gerçekleştirilmiştir. Son ürün olarak elde edilen hibrit moleküllerin yani konjugatların MALDI-MS sistemi kullanılarak kütle spektrometrik analizleri yapılmıştır. PEG zincirlerinin biyomoleküle bağlanma bölgelerinin ve bağlanma oranlarının direkt belirlenebilmesi amacıyla MALDI-MS/MS yöntemi kullanılmıştır. İnsülinin kullanıldığı büyük yapılı hibrit moleküllerin karakterizasyonu için parçadan-bütüne (bottom-up) proteomik analiz yaklaşımına gidilmiş ve daha sonra MALDI-MS/MS yöntemi ile PEG zincirlerinin bağlanma bölgeleri ve oranları belirlenmiştir. Bu tez çalışması sonucunda, PEG zincirlerinin uç grupları farklı şekillerde modifiye edilebilmiş ve bu PEG zincirleri kullanılarak yapılan konjugasyon reaksiyonlarının başarılı bir şekilde gerçekleştirildiği MALDI-MS yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. PEG zincirlerinin biyomolekül üzerindeki bağlanma bölgelerinin yeri ve oranının belirlenmesi, tez kapsamında geliştirilen örnek hazırlama ve MALDI-MS/MS analiz yöntemleri ile pratik ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
Therapeutic proteins are widely used in the field of pharmacology, and there are many clinical applications in this area that use hybrid molecules containing therapeutic protein structures. With polyethylene glycol (PEG), not only the therapeutic proteins, but also other therapeutic biomolecules and drugs, the conjugation process called pegylation is performed and hybrid molecules are formed. One of the biggest challenges encountered in these studies is the analysis of the molecules obtained as a result of the pegylation process, the determining of the binding sites and their binding rates correctly. Analysis and characterization of these polymer-based therapeutic hybrid molecules is analytically quite tough. 

In this thesis, it is aimed to develop analytical methods which are easier and do not take time for the analysis and characterization of these hybrid molecules by synthesizing hybrid peptide-polymer and protein-polymer molecules. 
For this purpose, human angiotensin II and human insulin molecules have been used as exemplary polypeptide structures which are intended to be conjugated with PEG. For the conjugation reaction, PEG samples were used at different molecular weights distribution. The end groups of some of the PEG samples used were derivatized into different reactive groups. The conjugation reactions were carried out under both organic and physiological conditions. Mass spectrometric analyzes of the hybrid molecules, ie conjugates were performed by using the MALDI-MS system. The MALDI-MS / MS method was used to determine the biomolecule binding sites and binding rates of PEG chains. The bottom-up proteomic analysis approach was carried out for the characterization of large structure hybrid molecules containing insulin and then the binding regions and binding rates of PEG chains were determined by the MALDI-MS / MS method. As a result of this thesis, PEG chains' end groups was modified differently and caried out successfully the conjugation reactions in which used these PEG chains have been determined by using MALDI-MS method. The determination of the site and ratio of the PEG chains on the biomolecule was carried out in a practical and rapid manner by using sample preparation and MALDI-MS / MS analysis methods developed within the scope of the thesis.