Manyetik silika partiküllerle manyetik alan varlığında boya afinite temelli albümin saflaştırılması
Dye-affinity based albumin purification with magnetic silica particles under magnetic field
Yazar: NURHAK TATAR
Danışman: PROF. DR. HANDAN YAVUZ ALAGÖZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
İnsan serum albümini dolaşım sisteminde en fazla bulunan proteindir. Kanın ozmotik basıncının ayarlanması, safra asitleri, bilirubin, uzun zincirli yağ asitleri, amino asitleri, steroidler, metal iyonları ve ilaçlar gibi çok sayıda endojen ve eksojen maddenin taşınması, dağıtılması ve metabolizması gibi pek çok fizyolojik işlevi yerine getirir. Aşırı kan kaybı ve böbrek rahatsızlığı ile protein kayıpları durumunda tedavi amaçlı kullanılır ve kan türevli temel ürünlerden bir tanesidir. Plazmadan saflaştırma için genellikle Cohn fraksiyonlama yöntemi kullanılır. Ancak bu yöntem seçici değildir ve protein denatürasyonuna neden olabilir. Proteinlerin saflaştırılması için boya ligand adsorbentler, basit, hızlı ve ucuz ayırma olanağı sağladıkları için tercih edilirler ve tek seferde 20-80 kat saflaştırma ve ön işlem olmaksızın ham özütten yüksek oranda geri kazanım sağlayabilirler. Bu çalışmada manyetik silika partiküllerle albümine ilgisi bilinen Cibacron Blue F3GA ligand olarak bağlanmış ve manyetik sistemde albümin saflaştırması gerçekleştirilmiştir. Spesifik yüzey alanı 222 m2/g olan silika partiküllerdeki magnetit varlığı ESR ve VSM yöntemleri ile gösterilmiş ve adsorbentin spektroskopik yarılma çarpanı, g, değeri 2.3153 olarak hesaplanmıştır. Manyetik partiküllere bağlanan Cibacron Blue F3GA miktarının, boya derişiminin artırılması ile arttığı elementel analiz yöntemi ile belirlenmiş ve boyanın yapıya kovalent olarak bağlandığı FTIR ile gösterilmiştir. Farklı koşullarda gerçekleştirilen HSA adsorpsiyonu çalışmalarında en yüksek adsorpsiyonun pH 5.5'de 27.82 mg/g olarak gerçekleştiği ve 3.0 mg/mL HSA derişiminde plato değerine ulaştığı gözlenmiştir. Sıcaklık ve tuz derişiminin artmasının HSA adsorpsiyonunu azaltıcı yönde etkisi olduğu gösterilmiştir. Yapılan hesaplamalar boya bağlı manyetik partiküllere HSA adsorpsiyonunun Langmuir adsorpsiyon izotermine uyduğunu göstermiştir. Kinetik hesaplamalar adsorpsiyonun kimyasal olarak gerçekleştiğini göstermiştir. Desorpsiyon ajanı olarak 1.0 M NaCl çözeltisi kullanılmış ve 10 kez tekrarlanan adsorpsiyon-desorpsiyon işleminin ardından adsorbentin kapasitesinde yalnızca %5 oranında bir azalma olmuştur. Yapay plazmadan yapılan adsorpsiton çalışmalarında ise albümin adsorpsiyonu 48.6 mg/g'dır ve plazmadan toplam protein adsorpsiyonunun %97'si albümin olarak gerçekleşmiştir.

Abstract:
Human serum albümin is the most abundant protein in the circulatory system. It performs many physiological functions such as the regulation, distribution and metabolism of a large number of endogenous and exogenous sunstances such as adjusting the osmotic pressure of the blood, bile acids, bilirubin, long cahin fatty acids, amino acids, steroids, metal ions and drugs. It is used for therapeutic purposes in case of excessive blood loss and kidney disease and protein losses and is one of the basic products derived from blood. Cohn fractionation method is generally used for purification from plasma. However, this method is not selective and can cause protein denaturation. Dye ligand adsorbents for purification of proteins are preferred beacuse they provide simple, fast and inexpensive separation and can provide high recovery from crude extract 20-80 times in one time without purifications and pretreatment. In this study, Cibacron Blue F3GA ligand, known to be associated with the albumin of magnetic silica particles, was ligated and albumin purificaiton was carried out in the magnetic system. The presence of magnetite in the silica particles with a 222 m2/g surface area was shown by ESR and VSM techniques and the spectroscopic splitting factor, g, was calculated as 2.3153. The amount of Cbacron Blue F3GA bound to the magnetic particles was increased with the increasing dye concentration and was determined by elemental analysis. The covalent binding of the dye was also shown by FTIR. The HSA adsorption studies were performed under different conditions. The maximum HSA adsorption was achieved at pH 5.5 as 27.82 mg/g and reached a plateu value at 3.0 mg/mL HSA concentration. The increase in the medium temperature and ionic strength was decreased the HSA adsorption. The mathematical calculations have shown that the adsoption of HSA onto the magnetic silica particles is consistent with the Langmuir isotherm and adsorption occured chemically. 1.0 M of NaCl solution was used as a desorption agent and after 0 adsorption-desorption cycle the adsorption capacity of the adsorbend decreased only 5%. The adsorption of albumin from artificial plasma occured as 48.6 mg/g and the 97% of total protein adsorption from plasma occured as albumin.