Alphaherpesvirinae alt ailesine mensup viruslarda CRISPR//CAS9 aracılı eş zamanlı virülens gen silinmesi ve heterolog gen eklenmesi
Simultaneous deletion of virulence genes and heterologous gene insertions into the viruses belonging to alphaherpesvirinae subfamily using CRISPR/Cas9 system
Yazar: MUSTAFA OZAN ATASOY
Danışman: PROF. DR. ŞÜKRÜ TONBAK ; DR. ÖĞR. ÜYESİ HAKAN IŞIDAN
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı / Viroloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Aşılama = Vaccination ; Aşılar = Vaccines ; Genler = Genes ; Herpesvirüs enfeksiyonları = Herpesviridae infections ; Herpesvirüsler = Herpesviridae ; Virülans faktörleri = Virulence factors

Özet:
CRISPR aracılı hassas gen düzenleme, prokaryotik konakçı-virüs ilişkisi
üzerine yapılan araştırmalar neticesinde keşfedilmiş, devrim niteliği taşıyan, önemli
bir teknoloji olarak kabul edilmiştir. Biyoloji biliminin birçok alanında olduğu
üzere günümüzde viroloji ve antiviral terapide sıklıkla başvurulan, güvenilir ve
etkin bir araç haline gelmiş, özellikle viral gen knockout ve knock-in çalışmalarında
kullanım alanı bulmasıyla öne çıkmıştır. Bu tez çalışmasında, Alphaherpesvirinae
familyasına mensup Bovine alphaherpesvirus 1 (BHV-1) ve Gallid
alphaherpesvirus 1 (GaHV-1) model olarak alınmış, bu virüsler için sırasıyla
timidin kinaz (tk) ve dUTPaz genleri CRISPR hedef bölgesi olarak seçilmiştir.
Sözkonusu bölgelere BHV-1 için bir kırmızı floresan protein geni (rfp) olan DsRed,
GaHV-1 için ise DsRed ve Newcastle hastalığı virüsüne ait füzyon (F) geninin
insersiyonu hedeflenmiş, bu amaçla insersiyon kasetleri donör plazmid üzerine
yerleştirilen tuzak sekansları üzerinden aynı yöntem ile kesilerek serbest
bırakılmıştır. Neticede GaHV-1 için DsRed ve F insersiyonu gerçekleştirilmiştir.
Ardından Cre-Lox Rekombinasyon metotu kullanılarak reporter geni çıkarılmış,
geriye kalan heterolog F gen kasedinin başarılı bir biçimde eksprese olduğu
ispatlanmıştır. Ayrıca son ürün rekombinant virüsün, tk defektif ve çift heterolog
gen taşıyan virüslere göre plak oluşturma ve zamana bağlı çoğalma kapasitesinde
azalmanın olmadığı ortaya konulmuştur. Sonuç olarak çalışmada CRISPR-Cre-Lox
metodolojisi birlikte kullanılarak, GaHV-1 üzerinde eşzamanlı gen delesyon ve
insersiyon gerçekleştirilmiş, böylelikle virüsün virülens faktörü silinerek attenüe
edilirken aynı zamanda heterolog gen (F geni) taşıyan bir multivalan viral vektör
elde edilmiştir. Bununla beraber BHV-1'de CRISPR aracılı gen düzenlemenin gerçekleştirilebilmesi için yöntemin geliştirilerek uyarlanacağı yeni çalışmalara
ihtiyaç olduğu ortaya çıkmıştır.

Abstract:
CRISPR-mediated precision genome editing is considered as a revolutionary
technology, which was discovered as a result of intensive studies on prokaryotic
host-bacteriophage interactions. Along with other branches in biology science,
CRISPR comes forward a highly efficient, versatile tool frequently implementing
in virology and antiviral therapy, especially in gene knock-out and knock-in studies.
The main goal of this thesis study was to modify two members of
alphaherpesvirinae subfamily, Bovine alphaherpesvirus 1 (BHV-1) and Gallid
alphaherpesvirus 1 (GaHV-1). For this purpose, thymidine kinase (tk) and
dUTPase genes were targeted for BHV-1 and GaHV-1, respectively. A red
fluorescent protein (rfp) gene, DsRed was aimed to insert in tk position of BHV-
1, while DsRed and fusion (F) gene of Newcastle disease virus were chosen for the
insertion of GaHV-1. A donor plasmid construction carrying desired gene
sequences was excised via CRISPR bait sequences to release linear expression
cassettes. As a result, both DsRed and F genes were successfully inserted into
desired position of GaHV-1 genome. Next, DsRed reporter gene was erased from
the viral genome with using Cre-Lox recombination system, and the F gene
expression was proven to remain intact and functional. Finally, obtained
recombinant virus possessed insignificant features in the aspects of plaque forming
capacity and growth properties than tk deleted and double heterologous gene