İn vitro hemoliz sürecinde etkilenen hücre tipi ve sayısının bazı biyokimyasal test sonuçları üzerine etkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of the effects of hemolysed cell type and number on biochemical test results during the in vitro hemolysis process
Yazar: BURCU ÜNLÜ
Danışman: DOÇ. DR. TUNCAY KÜME
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Beta tromboglobülin = Beta thromboglobulin ; Biyokimya = Biochemistry ; Hemoliz = Hemolysis ; Laboratuvarlar = Laboratories ; Miyeloperoksidaz = Myeloperoxidase ; Testler = Tests ; İn vitro = In vitro ; İnterferometri = Interferometry

Özet:
Klinik laboratuvarların en sık preanalitik hata kaynağı olan hemoliz, biyokimyasal test sonuçlarına etkisi çok değişken olabilen bir interferanstır. Bu çalışmanın amacı, hemolizdeki değişkenliğin bir sebebi olarak düşünülen, hemolize uğrayan hücre tipi ve sayısının etkisini deneysel bir modelle ortaya koymaktır. 
Gönüllü 10 bireyden elde edilen 1'er ünite tam kandan 4'lü kan torba sistemiyle önce RBC ve PLT süspansiyonları; ardından, ana torbada kalan kandan dansite gradient santrifügasyonu yöntemi ile WBC süspansiyonları elde edildi. Hücre süspansiyonları serum fizyolojik ile yıkandı, yedi ayrı konsantrasyonda seri olarak dilüe edildi ve dondurup çözme yöntemi ile hücrelerin tam hemolizi sağlandı. Gönüllü 3 bireyin serumlarından havuzlanarak elde edilen serum örneklerine; bazal ölçüm için serum fizyolojik ve deney grupları için hazırlanan hücre hemolizatları, 1:20 oranında eklendi. Tüm örneklerde, 12 adet biyokimya test parametresi (LDH, potasyum, AST, demir, CK, magnezyum, total protein, total kolesterol,  inorganik fosfor, glukoz, kalsiyum ve BUN) ve serum indeksleri Beckman Coulter AU5800 otoanalizöründe ölçüldü. Lizis belirteci olarak RBC için fHb spektrofotometrik olarak; WBC için MPO ve PLT için β-TGB ELISA yöntemleriyle manuel olarak ölçüldü. Her hücre tipi ve konsantrasyon seviyesi için; biyokimyasal test parametrelerinin düzeyi, "Wilcoxon İşaretli Sıralar Testi" kullanılarak serum fizyolojik içeren bazal konsantrasyon seviyesi ile karşılaştırıldı. Ayrıca, biyokimyasal test parametrelerinin bazal konsantrasyon seviyesine göre yüzde değişimi hesaplandı. Her parametre için, istatistiksel olarak anlamlı farklılığa yol açan hücre sayısı analitik eşik ve klinik açıdan anlamlı biasa yol açan hücre sayısı klinik eşik olarak tanımlandı. 
Ölçülen biyokimyasal parametrelerin klinik açıdan anlamlı eşik değeri aştığı RBC sayıları (adet/µL); LDH için 50000, AST için 100000, potasyum için 200000, magnezyum ve inorganik fosfor için 400000, total protein için 800000, CK ve total kolesterol için 1620000 olarak belirlendi. PLT açısından bakıldığında ise bu sayıların (adet/µL); LDH ve total protein için 90000 olduğu saptandı. Ayrıca LDH testi için 12000 adet/µL PLT ve potasyum için 90000 adet/µL PLT içeren seviyelerde analitik olarak anlamlı eşiğin aşıldığı tespit edildi. WBC süspansiyonları yeterince saf elde edilemediğinden net etkisi değerlendirilemedi. Belirteçler değerlendirildiğinde; RBC sayısı ile fHb arasında anlamlı bir korelasyon saptanmasına (r=0.999, p=0,001) rağmen, WBC sayısı ile MPO ve PLT sayısı ile β-TGB arasında anlamlı bir ilişki saptanmadı (sırasıyla p=0,436; p=0,277).
Bu çalışma bulguları, hemolize uğrayan değişik hücre tipi ve sayısının hemolize katkısının farklı olduğunu ve dolayısıyla, hemolizde biyokimyasal test sonuçlarındaki değişkenliğin bir sebebi olabileceğini ortaya koymaktadır. İleriye yönelik hemoliz mekanizmasının daha iyi anlaşılmasını sağlayan bu tür araştırmalar, klinik laboratuvarlarda sık görülen bu interferansın çözümünde önemli ipuçları sağlayacaktır.

Abstract:
Hemolysis, the most frequent preanalytical error in clinical laboratories, is an interference which has very variable effects on biochemical test results. The aim of this study is to examine the effects of the hemolysed cell type and number as a reason for this variability using an experimental design. 
One unit of blood was obtained from 10 volunteers and RBC and PLT suspensions were prepared using quadruple blood bag system, WBC suspensions were prepared from the blood left in the primary bag from each subject. Cell suspensions were washed with serum physiological followed by serial dilutions  to obtain seven different concentrations and then the hemolysis of cells was achieved by freeze-thaw cycle. Serum physiological and cell hemolysates were added (1:20) to the serum pool prepared from the serum samples of 3 volunteers to obtain the basal and seven different concentrations respectively. The 12 biochemical test parameters (LDH, potassium, AST, iron, CK, magnesium, total protein, total cholesterol,  inorganic phosphorus, glucose, calcium ve BUN) and serum indices were measured by Beckman Coulter AU5800 autoanalyser. As cell lysis markers, free hemoglobin for RBC was measured by spectrophotometrically; MPO for WBC and β-TGB for PLT were measured by ELISA methods manually. The levels of biochemical test parameters were compared to basal sample using  "Wilcoxon Signed Rank Test". Additionally, the relative change of each parameter according to the basal sample was calculated. The cell number which caused statistically significant difference was defined as the analytical threshold and the cell number which caused clinically significant bias was defined as the clinical threshold for each parameter. 
The RBC concentrations (number/µL) defined as the clinical threshold were 50000 for  LDH, 100000 for AST, 200000 for potassium, 400000 for magnesium and inorganic phosphorous, 800000 for total protein, 162000 for CK and total cholesterol. The PLT concentration (number/µL) defined as the clinical threshold was 90000 for LDH and total protein while the analytical threshold was 12000 for LDH and 90000 for potassium. The effect of WBC lysis could not be evaluated since WBC suspensions were contaminated by other cell types. As a cell lysis marker, fHb was significantly correlated with RBC number (r=0.999, p=0,001), while MPO and β-TGB showed no significant correlation to WBC and PLT numbers respectively ( p=0,436 and p=0,277).
The findings of this study point out that the hemolysed cell type and number contribute  to the influence of hemolysis in a variable manner and thus may be a reason for the variability of the biochemical test results in hemolysed samples. Further studies that explain the mechanisms of hemolysis will provide important findings to solve this common interference in clinical laboratories.