Serum androstenedion ölçümünde immunoassay ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometre (LC-MS/MS) metodlarının karşılaştırılması
Comparison of immunoassay and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (Lc-MS/MS) methods in the measurement of serum androstenedione levels
Yazar: KAMİLE YÜCEL
Danışman: PROF. DR. ALİ ÜNLÜ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Adrenal bezler = Adrenal glands ; Androstendion = Androstenedione ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Kromatografi = Chromatography ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Spektrofotometri = Spectrophotometry ; İmmünoassay = Immunoassay

Özet:
Adrenal bez, üreme çağındaki ve menapoz dönemindeki kadınlarda androjen ve androjen kaynaklı hormonların major kaynağıdır. Androstenedionun aşırı üretimi adrenal steroid biyosentez eksikliğinden, adrenal ve over kökenli tümörlerden, polikistik over sendromundan, androjenlere karşı artan periferal duyarlılıktan ve üretiminden kaynaklanabilir. İlaveten LC-MS/MS gibi doğru hassas steroid ölçüm yöntemi geliştirmek kompleks bileşikleri ayırabilir ve tek numuneden çoklu steroidlerin ayrımında kullanılabilir. 
Bu çalışmada CLSI kurallarına göre yeni likid kromatografi tandem mass kütle spektrometre metodu geliştirildi. Geliştirilen bu metod enzim linked immunoassay (ELISA) ve radioimmuno assay (RIA) metodlarıyla mukayese edildi. 
Metod validasyon parametreleri içinde linearite, analitik ölçüm limitleri, tekrarlanabilirlik, gerielde, interferans, taşıma, referans aralık doğrulama, numune stabilitesi, matriks etkisi ve dondurma çözmenin etkisi çalışmaları yapılmıştır. 
Androstenedion 50 ng/mL ye kadar lineer bulunmuştur. Kantitasyon limiti 0,195 ng/mL, deteksiyon limiti 0,097 ng/mL dir. Bu metod steroid hormonların interferansından ve matriks etkisiden etkilenmemektedir. Taşıma çalışması için düşük konsantrasyonlu numuneler, yüksek kosantrasyonlu numunelerin önüne ve arkasına sırasıyla dizilip ölçüm yapıldı. Grupların ortalamaları ve standart sapmaları hesaplandı. Bu çalışmada elde edilen taşıma değeri 0,026 ng/mL  olarak bulundu. Androstenedion için herhangi bir taşıma etkisine rastlanmadı. Androstenedion interferans çalışmasının sonuçları izin verilen % bias sınırları içindeydi ayrıca geri elde yüzdesi de % 88,7 olarak bulundu. Yapılan LC-MS/MS metodu CLSI metod validasyon kurallarına göre kabul edilebilir bulunmutur. 
LC-MS/MS ve ELISA karşılaştırma çalışmasında slope değeri 18,412, intercept -22,87 ve r2 değeri 0,1033 olarak bulunmuştur. LC-MS/MS ve RIA karşılaştırma çalışmasında slope değeri 1,085, intercept O,4541 ve r2 değeri 0,3712 olarak bulunmuştur. RIA ve ELISA karşılaştırma çalışmasında slope değeri 9,57, intercept -15,5 ve r2 değeri 0,19 olarak bulunmuştur. 
Karşılaştırma çalışmaları, kromatografik metodla androstenedion ölçümünün daha doğru sonuçlar verdiğini göstermiştir. Polikistik over sendromlu hastalarda kromatografik metodlar immuno assaylarla kıyaslandığında daha iyi tanı ve teşhis sağlamaktadır. 
Bu yöntemle, LC-MS/MS ile androstenedionun doğru, güvenilir ve hassas ölçümü gerçekletirildi. Elde ettiğimiz kalibrasyon eğrileri verileri bu yöntemin rutinde kullanılabilir olduğunu göstermiştir.

Abstract:
Adrenal glands are the major source of androgens and androgen hormones in reproductive-age and postmenopausal women. Androstenedione is produced in large vast by both the adrenal glands and gonads. Overproduction of androstenedione can be caused by the lack of adrenal steroid biosynthesis, tumors of ovarian and adrenal origin, polycystic ovarian syndrome, increased peripheral sensitivity to androgens, and increased peripheral production of androgens. In addition to improved accuracy and sensitivity for steroid measurements, liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) can distinguish compounds and can therefore be used to quantify multiplesteroids from one sample. 
In this study, a new liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed according to CLSI rules. The developed method was compared with two immunoassay methods which are enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA). 
Linearity, determination of limit of detection and limit of quantification, repeatability, recovery, interference, carry over, reference internal verification, carry over, sensitivity, specificity, stability of samples, effect of matrix, freezing-thawing studies were done within a context of method validation. 
The androstenedione assay was linear up to 50 ng/mL. Lower limit of quantitation and lower limit of detection were 0.195 ng/mL and 0.097 ng/mL , respectively. This method was not affected by matrix effect and other steroid hormones interferences. For caryyover studies, low concentrations samples was sequentially injected before and after placing at high concentration samples. Averages and standart deviations of the group were calculated. In this study, the obtained carryover value was determined as 0.026 ng/mL . No significant carryover was obtained for androstenedione. According to results of interference study androstenedione bias % did not exceed the limit of allowable bias % and 88,7 % recovery was acquired for androstenedione. LC-MS/MS method was found acceptable in evaluation of performance according to acceptable rules of method determined by CLSI.
Method comparison between LC-MS/MS and ELISA was found slope value 18,412, intercept value -22,87 and r2 value 0,1033. Method comporison between LC-MS/MS and RIA was found slope value 1,085, intercept value 0,4541 and r2 value 0,3712. Method comparison between RIA and ELISA was found slope value 9,57, intercept value -15,5 and r2 value 0,19. 
Comparative studies show that chromatographic methods measure amount of androstenedione more correctly. Chromatographic methods provide better diagnostic value for diagnosis of polycystic ovary syndrome compared to immunoassay methods.
By this method, accurate, reliable and sensitive measurement of androstenedione was analyzed with LC-MS/MS system. Data from calibration curves reveal that this method can be used in routine procedure.