Şeker pancarı melasından immobilize rekombinant E.coli KO11ile biyoetanol üretiminin araştırılması
Investigation of bioethanol production from sugar beetmolasses by immobilised recombinant E.coli KO11
Yazar: NUR KEVSER DOĞAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MEHMET KALENDER
Fırat Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışmada, karbon kaynağı olarak şeker pancarı melası kullanılarak rekombinant
E. coli KO11'den sürekli sistemde biyoetanol üretimi incelenmiştir. Çalışmalar hidroliz,
kesikli fermantasyon (serbest ve immobilize hücrelerle) ve sürekli (immobilize hücrelerle)
olmak üzere üç aşamada yürütülmüştür. Melas, içeriğinde yaklaşık % 50 sakkaroz bulunun
şeker endüstrisinin bir yan ürünüdür. Yapıdaki sakkarozu yapı taşları olan glikoz ve
fruktoza dönüştürmek için iki asidik ve bir enzimatik hidroliz yöntemleri uygulanmıştır.
Enzimatik hidroliz diğer hidroliz yöntemlerinden daha iyi sonuç vermiştir. Bu nedenle,
enzimatik hidroliz şartları Merkezi Kompozit Dizayn (MKD) ile optimize edilmiştir.
Hidroliz deneyleri 50 ml çalışma hacmindeki 250 ml'lik erlenlerde, 55 °C ve pH 4.5'da
gerçekleştirilmiştir. MKD ile toplamda 20 deney tasarlanmıştır. Optimizasyon
çalışmalarında invertaz enzimi kullanılmıştır ve optimum koşullar 87,77 g/L melas
konsantrasyonu, 0,45 (%,v/v) enzim konsantrasyonu ve 15,93 saat süre olarak
belirlenmiştir.
Tez çalışmasının ikinci aşamasında kesikli reaktörde serbest ve immobilize hücreler
kullanarak biyoetanol üretim verimi araştırılmıştır. Serbest ortamda 50 ml çalışma
hacmindeki 250 ml'lik erlenler kullanılmıştır. 37 °C sıcaklık ve 100 rpm inkübasyon
şartlarında yapılan deneyler sonucunda % 96'lık teorik verimle biyoetanol üretilmiştir.
Kesikli immobilize mikroorganizmalarla gerçekleştirilen çalışmalar için uygun boncuk
yapısını elde etmek amacıyla farklı aljinat ve CaCl2 miktarları denenmiştir. En uygun
boncuk
VII
yapısı % 3 (w/v) aljinat ile % 5 (w/v) CaCl2 çözeltileri kullanılarak elde edilmiştir. Bu
boncukların kullanıldığı kesikli fermantasyon deneyinde % 93'lük teorik verime
ulaşılmıştır.
Çalışmanın son aşamasında kesikli sitemdeki uygun immobilizasyon şartlarında
üretilen immobilize E. Coli KO11 suşları kullanılarak sürekli fermantasyon tekniği ile
biyoetanol üretimi incelenmiştir. Bu amaçla, kullanılan sürekli sistem kolonu 3 mm
kalınlık, 3 cm iç çap ve 20 cm uzunluğuna sahip borosilikat camdan yapılmıştır. Sürekli
sistem kolonu dıştan bir ısıtma ceketine sahip olup, deneyler boyunca kolon sirkülasyonlu
su banyosu ile 37 °C çalışma sıcaklığında tutulmuştur. Çalışmalarda hidrolizat pH'ları ise
E. coli, KO11' in canlılık faaliyetlerini gösterebildiği 6'ya ayarlanmıştır. Farklı seyrelme
hızlarının (kolon akış hızı/kolon hacmi) denendiği sürekli fermantasyon deneylerinde ise
1.68 sa-1 seyrelme hızında, % 89 teorik verim elde edilmiştir. Kesikli immobilizasyon ile
elde edilen % 93'lük teorik verim ile karşılaştırıldığında, sürekli sistem ile de yüksek
oranda biyoetanol üretildiği söylenebilir. Sürekli sistemde maksimum etanol üretildiği
sürede kesikli (36 saat) ve sürekli (60 saat) sistemlerin verimliliği karşılaştırıldığında ise,
sürekli sistemin açık bir şekilde daha avantajlı olduğu düşünülmektedir.
Anahtar kelimeler: Biyoetanol, Şeker Pancarı Melası, E.coli KO11, optimizasyon,
İmmobilize Hücre Reaktörü.

Abstract:
In this study, bioethanol production from sugar beet molasses as a carbon source
has been investigated by using E. coli KO11 in continuous system. The studies have been
conducted in three stages: hydrolysis, batch fermentation (with free and immobilized
cells), and continuous (with immobilized cells). Sugar beet molasses is a by-product of the
sugar industry with about 50 % sucrose in its content. Two acidic and one enzymatic
hydrolysis methods were applied to convert glucose and fructose, which are the building
blocks of sucrose existing in the structure. It has been determined that enzymatic
hydrolysis is better than other hydrolysis methods used. Thus, the enzymatic hydrolysis
conditions have been optimized by central composite design (CCD). The hydrolysis
experiments have been carried out at 55 °C, in 50 ml working volume of 250 ml flasks, and
at pH 4.5. Total 20 experiments have been designed by CCD. İnvertase enzyme has been
used in the optimization experiments. The results of enzymatic hydrolysis have been
determined as 87.8 g/L molasses concentration, 0.45 (%, v/v) enzyme concentration, and
15.93 h time.
The stage of second, yield of bioethanol production have been investigated by using free
and immobilization cells in a batch reactor. In free media, working volume of 50 ml has
been used flasks with volume of 250 ml. As a results of experiments under conditions
carried out incubation at 37 °C and 100 rpm, bioethanol was produced with a theoretical
yield of 96 %. To obtain suitable bead structure for studies performed by immobilized
microorganisms
IX
in the batch system, different alginate and CaCl2 quantities were tried. The best available
bead structure has been obtained by using solution with alginate concentration of 3 %
(w/v) and CaCl2 concentration of 5 % (w/v). Theoretical fermentation yield of 93% was
achieved in the batch fermentation experiment using these beads.
The final stage of this work, the continuous bioethanol production has been
investigated by using immobilized E.coli KO11 strain obtained at the suitable
immobilization conditions in the batch system. For this purpose, the continuous system
column made of borosilicate glass has 3 mm of thick, 3 cm of inner diameter, and 20 cm of
length. The continuous system column has a heating jacket from the outside. The working
temperature of the column has been kept at 37 °C during the experiments. The pH of
hydrolysates has been adjusted to 6, where E.coli KO11 can show activity. In continuous
fermentation experiments, the effect of different dilution rates (column flow rate/column
volume) on the bioethanol yield has been examined. 89 % of yield has been obtained from
the experiments carried out at dilutin rate of 1.68 h-1. Compared with the theoretical yield
of 93 % obtained by batch immobilization experiment results, it can be said that bioethanol
is produced at high rate by continuous system. It is thought that the continuous system is
clearly advantageous when the productivity of the continuous (36 hours) and continuous
(60 hours) systems is compared while the maximum ethanol is produced in the continuous
system.
Keywords: Bioethanol, Sugar Beet Molasses, E.coli KO11, Optimization, Immobilized
Cell Reactor.