Ankara'daki çeşitli hastanelerde değişik yöntemler ile toksin pozitifliği saptanan dışkı örneklerinden elde edilen clostridium difficile izolatlarının toksin genlerinin araştırılması, pcr ribotiplendirimi ve ribotipler ile antimikrobiyal duyarlılıkları arasındaki ilişkinin ortaya çıkarılması
Molecular characterization of toxin genes in clostridium difficile isolates from  toxin positivite stool samples obtained by different methods from several hospitals in ankara and association between PCR ribotypes and antimicrobial susceptibility among clostridium difficile isolates
Yazar: EMRAH SALMAN
Danışman: PROF. DR. ZEYNEP CEREN KARAHAN
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Ankara = Ankara ; Clostridium difficile = Clostridium difficile ; Dışkı = Feces ; Genler = Genes ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Toksinler = Toxins ; Virülans = Virulence ; İlaç alerjisi = Drug hypersensitivity ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Clostridium difficile günümüzde en yaygın nozokomiyal enfeksiyonlardan birisidir. Yüksek düzeyde toksin üreten hipervirülan C. difficile suşları (PZR ribotip 027) daha yüksek sporlanma oranı ve florokinolonlara direnç ile karakterizedir. C. difficile PZR ribotip 027 nedeniyle oluşan enfeksiyon ayrıca daha yüksek morbidite ve mortalite, komplikasyonlar ve relaps oranları ile seyretmektedir. C. difficile PZR 027 veya oldukça patojenik suş etkilenmemiş bir ülkeye giriş yapmışsa, ağır bir C. difficile bir salgınına yol açmadan önce identifiye edilmelidir aksi takdirde kolektomilere, ölümlere ve sağlık servislerinde olağanüstü maliyetlere neden olabilmektedir. Etkilenmemiş ülkelerde riski azaltmak ve gelecek salgınların sonuçlarını hafifletmek için kanıta dayalı bir yaklaşım ile etkenin araştırılmasına yönelik sürveyans çalışmaları uygulanmalıdır. Bu amaçla Ankara'daki çeşitli hastanelerde (AÜTF ve HÜTF hastaneleri) yatan ve ishal şikayeti olan hastalardan C. difficile enfeksiyonu şüphesi ile özel laboratuvara (DLG) gönderilen dışkı örnekleri toplanmıştır. Dışkı örneklerinden C. difficile izolasyonunu takiben elde edilen kökenlerden DNA ekstraksiyonu yapılmış ve antimikrobiyal duyarlılıkları ve toksin genleri varlığı araştırılmıştır.
Suşların hepsinin vankomisin ve metronidazole duyarlı olduğu saptanmıştır. Üç izolatın moksifloksasin için MİK değerleri >4µg/ml olarak belirlenmiş ve dirençli kabul edilmiştir. Bir izolat klindamisine dirençli bulunurken (MİK değeri >256 µg/ml), iki izolatta eritromisin direnci (MİK değeri >256 µg/ml) tespit edilmiştir. On yedi izolatın klindamisin için MİK değeri 2-8 µg/ml olarak belirlenmiş ve orta duyarlı kabul edilmiştir. Beş izolatın eritromisin için MİK değeri 2-8 µg/ml olarak belirlenmiş ve orta duyarlı kabul edilmiştir.
Suşların hepsi tcdA ve tcdBgenleri pozitif bulunmuştur. Altmış bir C. difficile suşunun birinde(%1,6) cdtA ve cdtB genleri tespit edilmiştir. tcdCgeninde C. difficile PZR ribotip 027 için tanımlanmış delesyon ve diğer nadir tek nükleotit polimorfizmlerinin varlığının araştırılması için iki yönlü DNA dizi analizi gerçekleştirilmiş ve birinde 54 bç'lik bir delesyon saptanmıştır. Ayrıca 12 suşta çeşitli tek nükleotid polimorfizmleri saptanmıştır. Değerlendirilen suşlar içerisinde PZR ribotip 027'ye rastlanılmamıştır ancak ülkemizde ilk hipervirülan suş tespit edilmiştir. 

Anahtar Kelimeler: Clostridium difficile, antimikrobiyal direnç, gradyent test, toksin genleri, ribotip

Abstract:
Clostridium difficile infection is one of the most common hospital-acquired infections. Hypervirulent strains of C. difficile which produce toxins at high levels (PCR ribotype 027) and are characterized by a high sporulation ratio and higher resistance rates for fluoroquinolones. Infections caused by C. difficile PCR ribotype 027 also have higher morbidity and mortality, more complications and relapses. If highly pathogenic strains of C. difficile such as ribotype 027 arise in a country, it should be identified before causing a severe outbreak. Otherwise it can lead to the serious morbidities such as colectomies, increase in mortalities and remarkable costs in health services. To reduce the risk in the unaffected countries and mitigate the consequences of future outbreaks, surveillance activities should be implemented in order to investigate the factors thorough evidence based medicine. 
In this study fecal samples were collected from inpatients hospitalized at different hospitals in Ankara (Ankara University School of Medicine and Hacettepe University School of Medicine) and from who applied to a Private Laboratory (Düzen Laboratory Groups) in Ankara. After isolating C. difficile from fecal samples, DNA of the isolates were extracted. Antimicrobial susceptibility and presence of toxin genes were investigated. 
All of the strains were found to be susceptible to vancomycin and metronidazole. Three strains had a minimum inhibitory concentration (MIC) of >4 µg/ml and were resistant to moxifloxacin. One strain had a minimum inhibitory concentration (MIC) of >256 µg/ml and was resistant to clindamycin  also two strains had a minimum inhibitory concentration (MIC) of >256 µg/ml and were resistant to erythromycin. Seventeen isolates had a minimum inhibitory concentration (MIC) of 2-8 µg/ml and were intermediate to clindamycin also five strains had a minimum inhibitory concentration (MIC) of 2-8 µg/ml and were intermediate to erythromycin.
All of the strains were found to carry tcdA and tcdB genes. On the other hand, only one C. difficile strain (1.6%) was found to carry the "binary" toxin  (cdtA and cdtB) genes in 61 strains.  
Bi-directional DNA sequence analysis was performed on the amplified tcdC gene in order to investigate the presence of deletion which defines the PCR ribotype 027 strains and other rare single nucleotide polymorphisms. One C. difficile strain was found to carry a 54 bp deletion also 12 strains were found to carry various single nucleotide polymorphisms. In the evaluated strains, PCR ribotype 027 wasn't detected but there was the first hypervirulent strain in Turkey.

Key Words: Clostridium difficile, antimicrobial resistance, gradient test, toxin genes, ribotype.