Tavşanlarda limbal eksplanttan çıkan limbal kök hücrelere farklı büyüme ortamlarının ve eksplantın ekildiği farklı yüzey materyallerinin etkisi
The effects of different cell growth media and surface materials on rabbit limbal stem cells during limbal explant culture
Yazar: MEHMET GÜRDAL
Danışman: PROF. DR. KEMAL BAYSAL ; PROF. DR. İSMET DURAK
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Floresan antikor tekniği = Fluorescent antibody technic ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kornea = Cornea ; Kök hücreler = Stem cells ; Tavşanlar = Rabbits

Özet:
Gözümüzün ön yüzeyini oluşturan kornea, görebilmemizi sağlayan bir dokudur. Kornea epitelinin sürekli yenilenerek işlevsel olmasını limbusta yer alan kök  hücreler sağlamaktadır Herhangi bir nedenle kök hücrelerin fonksiyon gösterememesi, korneanın tamamen opaklaşarak ciddi görme kaybına neden olmaktadır. Limbal kök hücre yetmezliği olarak tanımlanan bu patoloji için günümüzde en geçerli tedavi yaklaşımı limbal epitelyal eksplant kültürü ile çoğaltılan limbal kök hücre naklidir ve klinik başarı nakledilen limbal kök hücrelerin yüksek sayıda olmasına bağlıdır. Eksplanttan çıkan limbal kök hücrelerinin oranının artırılması, maksimal kök hücre çoğalmasını sağlayan hücre kültür ortamının ve eksplantın yerleştirildiği yüzey materyalinin optimizasyonu ile sağlanabilir, bu konuda kapsamlı yayınlar yoktur. Bu çalışmada biz, farklı büyüme ortamlarının ve farklı yüzey materyallerinin Yeni Zelanda tavşan limbal epitelyal eksplant kültüründen çoğaltılan hücre popülasyonu içerisindeki kök hücre oranı üzerine etkisini araştırdık.
Çalışmada hücre büyüme ortamı olarak, DMEM-F12 kontrol grubunu oluşturmak üzere karşılaştırma amacıyla pluripotin, otolog serum, Epilife, KSFM, D-KSFM ve hücre büyüme ortamları olarak seçilmiştir. Yüzey materyali olarak, insan amniyotik membranı kontrol grubunu oluşturmak üzere karşılaştırmak amacıyla kollajen I ve poröz PET membran seçilmiştir. Kültür sonrası elde dilen hücrelerin protein ekspresyonu immünfloresan metod ile ve gen ekspresyonu real time PZR ile belirlenip farklı koşullar karşılaştırılmıştır.   
Büyüme ortamları içerisinde en yüksek hücre sayısı elde edilen ve protein ekspresyonu düzeyinde sitokeratinler bakımından yüksek limbal kök hücre oranı sağlayan KSFM'dir. Farklılaşmış hücre işaretleyicilerinin protein ekspresyonları, Epilife dışında diğer büyüme ortamlarında anlamlı olarak düşmektedir. Bir yüzey materyali olarak PET, iAM ile benzer kök hücre oranı sağlarken, Kollajen I Jel limbal epitelyal eksplant kültüründe limbal kök hücrelerinin çoğalmasını desteklememektedir.

Abstract:
Decreased limbal stem cell function results in decreased vision. Currently the treatment for limbal stem cell deficiency is growing limbal stem cells in explant culture followed by their transplantation. The clinical success depends on the number of transplanted stem cells. The effect of different cell culture media and the nature of surface material on which the explants are maintained on the number of stem cells obtained from an explant have not been investigated in detail. In this study, we have used limbal explants from New Zealand White rabbits and have aimed to investigate the effect of different cell culture media and the nature of surface material on which the explants are maintained on the number of stem cells obtained from an explant.
We used DMEM-F12-media as a control and compared Pluripotin, autologous serum Epilife, KSFM, D-KSFM. As surface materials, we used hAM as a control group and compared type I collagen, PET membrane. We analyzed the effect of different media and surfaces on cells from explants through quantifying protein expression and gene expression. 
Comparing the effect of media, KSFM provided the highest number of total cells and higher ratio of limbal stem cells based on cytokeratin protein expression. Differentiated cell protein marker expressions were significantly decreased in all media tested except Epilife. As a surface material, PET was shown to provide similar ratio of limbal stem cells from explant culture relative to hAM. Collagen I gel does not support the growth of limbal stem cells from limbal explants in culture.