Polihidroksialkanoatların genetiği değiştirilmiş bakterilerde üretimi, karakterizasyonu ve matematiksel modellenmesi
Production, characterization and mathematical modeling of polyhydroxyalkanoates by genetically modified bacteria
Yazar: MURAT AKDOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kimya Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Fosil yakıt türevli plastikler, doğada parçalanmalarının uzun sürmesi, ayrıca içerdikleri kanserojen bileşenler nedeniyle, insan ve çevre üzerinde ciddi sağlık sorunları oluşturmaktadır. Fosil yakıt rezervlerinin tükenmeye başlamasıyla birlikte bu tür plastiklerin yerini alabilecek alternatif malzemelerden birisi de biyoparçalanabilirlik ve biyouyumluluk gibi avantajları nedeniyle polihidroksialkanoatlar (PHA)'dır. Polihidroksialkanoatlar (PHA), çeşitli mikroorganizmalarda, fosfor, azot ve oksijen gibi belirli bileşenler yönünden zayıf, fakat karbon açısından zengin bir besi yerinde, hücre içi enerji ve karbon rezervi olarak sentezlenen polyesterlerdir. 

Tez kapsamında, Bacillus megaterium mikroorganizması kullanılarak bakteriyel yolla biyopolimer üretimi ve biyopolimer üretiminde etkili biyoproses tasarım parametrelerinin incelenmesiyle, Bacillus megaterium NRRL B-14308 suşundan PHA'nın yüksek verimlilikte üretimi amaçlanmıştır. Ayrıca, B. megaterium'un genomunda PHA sentezinden sorumlu phaC geni bir ekspresyon vektörüne klonlanarak, PHA-sentaz enziminin (PhaC) üretiminin arttırılması ve bu sayede PHA üretiminin arttırılması hedeflenmiştir. Elde edilen rekombinant suşlar ile laboratuvar ölçekli biyoreaktörde PHA üretiminin optimizasyonu, genomik ölçekte metabolik modellemesi, üretilen biyopolimerlerin saflaştırılması ve karakterizasyonu çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Çözücü ekstraksiyonu ile saflaştırılan PHA biyopolimerlerinin yapısal ve termal özellikleri Fourier Transform Infrared Spektroskopisi (FTIR), Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR), Gaz Kromatografisi (GC-FID), Gaz Kromatografisi-Kütle Spektroskopisi (GC-MS), Termogravimetrik Analiz (TGA) ve Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) analizleri ile karakterize edilmiştir. Karakterizasyon çalışmaları sonucunda elde edilen PHA biyopolimerlerinin kopolimer (PHB-co-PHV) yapısında olduğu ve 3-hidroksibütirat (3HB) ve 3-hidroksivalerat (3HV) monomer birimlerinden meydana geldiği belirlenmiştir. PHA üretim verimini arttırmak için kontrollü biyoreaktörde yarı kesikli besleme çalışmaları, önceden belirlenmiş 3 farklı üstel besleme hızında (µ=0,05; µ=0,075 ve µ=0,1 sa-1) gerçekleştirilmiştir. Buna göre, rekombinant B. megaterium hücrelerinden µ=0,1 sa-1 besleme hızında en yüksek hücre derişimine (7,7 g/L) ve PHA derişimine (6,15 g/L) ulaşılmış; üstel yarı kesikli besleme stratejisi ile kesikli sisteme göre 2,2 kat daha fazla PHA üretilmiştir. Ayrıca, B. megaterium için literatürde yer alan güncel iJA1121 modeline 7 gen, 6 metabolit ve 7 reaksiyon eklenerek genomik ölçekte yeni bir metabolik model (iBM1128) oluşturulmuş ve model akı denge analizi (FBA) yöntemi ile çözülmüştür.

Sonuç olarak, bu tez çalışmasında, tanımlanmış ortamda ve herhangi bir öncül metabolit ilave etmeksizin, Bacillus suşlarında yüzde mol bazında en yüksek 3HV monomer içeriğine sahip (%58 3HV) PHB-co-PHV kopolimerleri üretilmiştir. Ayrıca bu çalışma, yüksek ürün verimine sahip (YP/X = 0,74 g g-1) B. megaterium NRRL B-14308 suşunda daha da gelişmiş bir biyopolimer üretim sürecine giden yolu açmıştır.

Anahtar Kelimeler: Biyopolimer, polihidroksialkanoat, rekombinant B. megaterium, biyoproses, karakterizasyon, metabolik modelleme

Abstract:
Owing to their poor degradation rates and their carcinogenic components, fossil-resource based plastics pose serious health problems on humans and the environment. Along with the depletion of fossil fuel reserves, polyhydroxyalkanoates (PHAs) are one of the eco-friendly alternatives to conventional plastics, because of their advantages such as biodegradability and biocompatibility. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are polyesters accumulated in a wide variety of microorganisms as intracellular carbon and energy storage material for the cells, under nutrient-limited conditions such as phosphorus, nitrogen and oxygen, and excess carbon source in the growth medium. 
The present study aims to produce PHA biopolymers from Bacillus megaterium NRRL B-14308 strain with a higher production efficiency, by investigating the bioprocess design parameters. Also, phaC gene was cloned into an expression vector, aiming to increase the production of PHA-synthase enzyme (PhaC) and thereby, increase the PHA production. Additionally, optimization of PHA production, metabolic modeling, purification and characterization studies were investigated using the recombinant strains. Structural and thermal properties of PHA purified by solvent extraction were characterized by FTIR, 1H-NMR, GC-FID, GC-MS, TGA and DSC analyses. The PHA characterization studies revealed that the PHA biopolymers were in PHB-co-PHV copolymer structure, consisted of 3-hydroxybutyrate (3HB) and 3-hydroxyvalerate (3HV) monomer units. Fed-batch cultivations were performed in controlled bioreactors at pre-determined specific growth rates (µ=0.05, µ=0.075 and µ=0.1 h-1) to achieve a higher PHA yields. Accordingly, rec-B. megaterium cells in fed-batch fermentation with a pre-determined growth rate µ=0.1 h−1 produced the highest CDW (7.7 g L−1) and PHA concentration (6.15 g L−1). Moreover, an exponential glucose feeding profile resulted in 2.2-fold increase in PHA yield compared to batch cultivation. Also, the reconstructed genomic scale metabolic model for B. megaterium named iBM1128, with 7 genes, 6 metabolites, and 7 reactions added to the current iJA1121 model, was solved using metabolic flux balance analysis (FBA) technique.
As a result, this study is signifcant for the production of PHB-co-PHV copolymer with a high 3HV content (58 mol% 3HV) by Bacillus strains from an unrelated, simple carbon source, glucose, with a defined medium and no need for precursor addition. Overall, this study paves the way to an enhanced biopolymer production process in B. megaterium cells, where the highest product yield on cell was obtained as YP/X = 0.74 g g−1.

Keywords: Biopolymer, polyhydroxyalkanoate, recombinant B. megaterium, bioprocess, characterization, metabolic modeling