Termofilik Geobacillus sp. TF14'ten endüstriyel öneme sahip α-amilazın saflaştırılması, immobilizasyonu ve karakterizasyonu
Purification, immobilisation and characterization of indutrially important α-amylase  from a thermophilic bacteria Geobacillus sp. TF14
Yazar: ŞABAN KESKİN
Danışman: DOÇ. DR. NAGİHAN SAĞLAM ERTUNGA
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada endüstriyel önemi olan α-amilaz enzimi yeni tanımlanmış bir termofilik bakteri türü olan Geobacillus sp. TF14 suşundan amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değişim kromatografisi ve hidrofobik etkileşim kromatografisi teknikleri ile 17,11 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzim SDS-PAGE ile analiz edildiğinde 54 kDa molekül ağırlığına sahip tek bir protein bandı tespit edildi. Doğal elektroforez sonucu yapılan aktivite boyamasında tek aktivite bandı belirlendi. Saflaştırılan enzim nişasta substratı varlığında 55 °C'de pH 5,00 ve pH 9,00 olan iki pH optimumuna sahip olduğu ve bu pH'larda 48 saat inkübasyon sonucu enzimin aktivitesini sırasıyla %64 ve %44 oranında koruduğu belirlendi. pH 9,00 da enzimin en yüksek aktiviteye 75 °C'de sahip olduğu ve bu sıcaklıkta 72 saat inkübsyon sonunda aktivitesini tamamen koruduğu belirlendi. Çözünür nişasta substratı için enzimin kinetik parametreleri olan Vmaks ve Km değerlerinin sırasıyla 5000 U/mg ve  %0,35 olduğu hesaplandı. Ca2+ enzim aktivitesini %70 oranında artırırken, Mn2+ ve Cu2+'nin enzim aktivitesini tamamen inhibe ettiği, EDTA'nın ise zayıf bir inhibisyona neden olduğu tespit edildi. SDS, Triton X100, Triton X114 ve Tween 20 deterjanlarının %1 (a/v)'lik çözeltilerinde enzimin sırasıyla %55, %52, %45 ve %48 oranlarında kalan aktiviteye sahip olduğu belirlendi. Saflaştırılan enzim Dowex 1*8 Cl- iyon değiştirici katı desteğe %21 ve kitin yüzeyine %45 verimle immobilize edildi. Dowex'e ve kitine immobilize enzimin sırasıyla pH 4,00, pH 10,00 ve pH 5,00, pH 9,00  olan iki pH optimumuna sahip olduğu belirlendi. Dowex'e ve kitine immobilize enzimin en yüksek aktiviteye 95 °C'de sahip olduğu ve bu sıcaklıkta Dowex'e immobilize enzimin 72 saat sonunda   %80 oranında, kitine immobilize enzimin ise %70 oranında aktivitesini koruduğu belirlendi. Dowex'e ve kitine immobilize enzim için Vmaks ve Km değerleri sırasıyla 3333,33 U/mg, % 0,067 ve 2500 U/mg, %  0,5 olarak hesaplandı. Mn2+ ve Cu2+  her iki katı desteğe immobilize edilen enzimi tamamen inhibe ederken, Hg2+ varlığında ise aktivitenin korunduğu belirlendi. Dowex'e immobilize enzimin deterjanlar varlığında aktivitesini büyük oranda koruduğu da belirlendi.

Abstract:
İn this study, α-amylase, an industrial enzyme, was purified by amonnium sulphate presipitation, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography from newly isolated Geobacillus sp. TF14 strain. The overall purification of 17,11 fold was achieved. Molecular weight of purified enzyme was estimated as 54 kDa by SDS-PAGE. Purified enzyme showed one activity bond on native PAGE. Purified enzyme showed two pH optimum of pH 5.00 and pH 9.00. After incubation at these pH over a period of 48 h, 64% and 48% remaining activity was observed. Purified enzyme showed maximal activity at 75 °C and stablity in this temperature over a period of 72 h. Kinetic constant of purified enzyme were calculated from the lineavawer-Burk plots as 5000 U/mg for Vmax and 0.35 % for Km. It was observed that Ca2+ activated the enzyme at about 70%, Mn2+ and Cu2+ complately inhibited the enzyme activity at 5 mM final consantration and EDTA had little inhibiton of 10%. In the precense of SDS, Triton X100, Triton X114 and Tween 20 at a final consantration of %1(w/v), 55%, 52%, 45% and 48% remaining activity was assayed respectivly. Purified enzyme was immobilized on the surface of Dowex 1*8 Cl- form and chitin and the overall immobilization yield of 21% and 45% was achieved respectively. While Dowex immobilized enzyme showed pH optimum of pH 4.00 and pH 10.00, where as no change of pH optima was detected for the immobilized enzyme on chitin. Both of the immobilised enzyme had temperature optimum of  95 °C and stable at this temperature over a period of  72 h incubation. Vmax and Km values of immobilised enzyme was calculated as 3333,33 U/mg, % 0,067 for Dowex and 2500 U/mg, %  0,5 for chitin respectively. Mn2+ and Cu2+ complately inhibited both of the immobilized enzymes on the other hand in the precense of Hg2+ enzyme activity was conserved. It was observed that Dowex immobilized enzyme maintained most of its initial activity in the precense of SDS, Triton X100, Triton X114 and Tween 20 at a consantration of 1%.