Küçükbaş hayvan ağız sütlerinden izole edilen bakteriyosin üreticisi laktik asit bakterilerinin fonksiyonel özellikleri ve güvenlik değerlendirmesi
Functional properties and safety evaluation of bacteriocin producer lactic acid bacteria isolated from small cattle colostrum
Yazar: HÜSEYİN ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. YASİN TUNCER
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Bakteriyosinler = Bacteriocins ; Enterococcus = Enterococcus ; Fonksiyonel özellikler = Functional properties ; Keçiler = Goats ; Kolostrum = Colostrum ; Koyunlar = Sheep

Özet:
Bu çalışmada, koyun ve keçi ağız sütünden bakteriyosin üreticisi Laktik asit bakterilerinin izolasyonu, izolatların fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi ve güvenlik değerlendirilmesinin yapılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda 189 ağız sütünden izole edilen 194 izolattan 13'ünün bakteriyosin üreticisi olduğu belirlenmiştir. Moleküler tanı yöntemleri ile izolatların 11'i E. mundtii, 2'si ise E. faecium olarak tanımlanmışdır. Bakteriyosinlerin geniş pH aralığında aktivite gösterdiği ve ısıya dirençli oldukları, proteolitik enzimler ve α-amilaz ile aktivite kaybına uğradığı ancak deterjanlara karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir. Suşların tamamında munKS geni varlığı tespit edilirken, E. faecium HC121.4, HC161.1, E. mundtii HC147.1, HC166.5 ve HC166.8 suşlarının çoklu enterosin geni içerdiği belirlenmiştir. Trisin-SDS-PAGE analizleri ile E. faecium HC121.4 suşunda yaklaşık 5.1 ve 5.5 kDa ağırlığında 2 aktif protein bantı, diğer izolatlarda ise yaklaşık 4.96 kDa ağırlığında 1 aktif protein bantı tespit edilmiştir. E. mundtii suşları ve E. faecium HC161.1 mundtisin KS, E. faecium HC121.4 ise enterosin A ve B üreticisi olarak tanımlanmıştır. Suşların yağsız süt ortamında asit üretiminin 6 saatte zayıf, 24 saatte ise E. mundtii HC166.8 suşu (hızlı) hariç orta düzeyde olduğu,  hiçbirinin hücre dışı proteolitik ve lipolitik aktivite göstermediği belirlenmiştir. Suşların esteraz, esteraz lipaz, lösin arilamidaz, asit fosfataz ve naftol-AS-Bl-fosfohidrolaz aktivitesine sahip oldukları, proteaz aktivitelerinin düşük, peptidaz aktivitelerinin ise yüksek olduğu bulunmuştur. Yalnız E. mundtii HC26.1, HC56.3, HC73.1, HC73.2, HC147.1 ve HC166.5 suşlarının pH 3'de 3 saat sonunda hayatta kaldıkları, ancak hiçbirinin yapay mide suyunda hayatta kalamadıkları belirlenmiştir. Suşların tamamının safra tuzuna dirençli oldukları, lizozim içeren besi ortamında gelişme gösterdiği ve fenol varlığını ise tolere ettikleri belirlenmiştir. Suşların tamamı TDC ve GDC (E. faecium HC161.1 hariç) hidrolaz aktivitesi göstermiştir. E. faecium HC161.1 hariç suşların tamamı yüksek hidrofobisite özelliği göstermiştir. Suşların otoagregasyon ve koagregasyon değerlerinin 24 saat sonunda sırasıyla % 34.33-49.17 ve % 24.78-46.47 arasında olduğu belirlenmiştir. Enterococcus suşları klinik olarak önem taşıyan antibiyotiklere duyarlı bulunmuştur. Suşlarda en sık rastlanan antibiyotik direnç geninin tetL ve aph(3ʹ)-IIIa olduğu belirlenmiştir. Yalnız E. mundtii HC166.3 suşunda β-hemolitik aktivite tespit edilmiştir. Suşların hiçbirinde jelatinaz aktivitesi belirlenmemiştir. Enterococcus suşlarının düşük sıklıkla virülens faktör geni içerdiği saptanmıştır. En yüksek virülens faktör geni varlığı E. mundtii HC112.1 (efaAfm, ccf, acm) ve E. mundtii HC73.2 (gelE, efaAfs, cpd, ccf) suşlarında tespit edilmiştir. Suşların hiçbirinin histidini, ornitini ve lizini dekarboksile etmediği, diğer taraftan E. faecium suşlarının tirozini dekarboksile ettiği, E. mundtii suşlarının ise zayıf dekarboksile ettikleri belirlenmiştir. Suşların hiçbirinde hdc, odc ve ldc geni varlığı tespit edilmez iken, tamamında tdc geni varlığı belirlenmiştir. 
Sonuç olarak koyun ve keçi ağız sütünden izole edilen bakteriyosin üreticisi 13 Enterococcus suşunun starter kültür kombinasyonlarında yer alabilme potansiyellerinin olduğu belirlenmiştir. Ancak suşların probiyotik kültür olarak kullanılmaları için midenin oluşturduğu sert çevresel koşullara dayanımlarının mikroenkapsülasyon ile arttırılması gerekmektedir. Güvenlik değerlendirmesi testleri sonucu, E. mundtii HC56.3 ve HC73.1 suşlarının gıda proseslerinde starter veya yardımcı starter kültür olarak kullanımlarının güvenli olduğu belirlenmiştir. Diğer 11 suşun ise canlı kültür olarak gıda üretim proseslerinde kullanılması tüketici sağlığı için risk teşkil edebilir. Ancak bu suşlar tarafından üretilen bakteriyosinlerin saflaştırılmış preparatlarının gıda muhafazası amacıyla kullanım potansiyeli bulunmaktadır.

Anahtar Kelimeler: Koyun, Keçi, Ağız sütü, Bakteriyosin, Enterococcus, Fonksiyonel özellikler, Güvenlik değerlendirmesi

Abstract:
In this study, it was aimed to isolate bacteriocin producer lactic acid bacteria (LAB) from sheep and goat colostrum, characterize the produced bacteriocins, determine the functional properties of the isolates and evaluate their safety. In this context, it was determined that 13 of 194 isolates from 189 colostrum were bacteriocin producers. The eleven of the isolates were identified as E. mundtii and 2 as E. faecium by molecular identification methods. It has been determined that bacteriocins show activity in a wide pH range and are resistant to heat, lose their activity with proteolytic enzymes and α-amylase, but are resistant to detergents. While the presence of munKS gene was detected in all of the strains, it was determined that E. faecium HC121.4, HC161.1, E. mundtii HC147.1, HC166.5 and HC166.8 strains contained multiple enterocin genes. Trisin-SDS-PAGE analyzes revealed 2 active protein bands of approximately 5.1 and 5.5 kDa in E. faecium HC121.4 and 1 active protein band with a weight of approximately 4.96 kDa in other isolates. E. mundtii strains and E. faecium HC161.1 were identified as mundtisin KS producer, and E. faecium HC121.4 was idefined as enterosin A and B producer. It was determined that the acid production of strains in skimmed milk was weak at 6 hours and moderate at 24 hours, except for E. mundtii HC166.8 strain (fast), and none of them showed extracellular proteolytic and lipolytic activities. It was found that the strains had esterase, estarease lipase, leucine arylamidase, acid phosphatase and naphthol-AS-Bl-phosphohydrolase activities, while protease activities were low and peptidase activities were high. It was determined that only E. mundtii HC26.1, HC56.3, HC73.1, HC73.2, HC147.1 and HC166.5 strains survived after 3 hours at pH 3, but none of them survived in artificial gastric juice. It was determined that all of the strains were resistant to bile salt, developed in a medium containing lysozyme, and tolerated the presence of phenol. All of the strains showed TDC and GDC (except for E. faecium HC161.1) hydrolase activities. All strains except E. faecium HC161.1 showed high hydrophobicity. The autoaggregation and coaggregation values of the strains were found to be between 34.33-49.17 % and 24.78-46.47 %, respectively, after 24 hours. Enterococcus strains were found to be sensitive to clinically important antibiotics. It was determined that the most common antibiotic resistance genes in the strains were tetL and aph(3ʹ)-IIIa. β-hemolytic activity was detected only in E. mundtii HC166.3 strain. Gelatinase activity was not detected in any of the strains. It was determined that Enterococcus strains contain virulence factor gene with low frequency. The highest virulence factor gene presence was detected in E. mundtii HC112.1 (efaAfm, ccf and acm) and E. mundtii HC73.2 (gelE, efaAfs, cpd and ccf) strains. It was determined that none of the strains decarboxylated histidine, ornithine and lysine, on the other hand, E. faecium strains decarboxylated tyrosine, while E. mundtii strains weakly decarboxylated. While hdc, odc and ldc genes were not detected in any of the strains, the presence of tdc gene was determined in all of them. 
As a result, it was determined that bacteriocin producer 13 Enterococcus strains isolated from sheep and goat colostrum have the potential to be included in starter culture combinations. However, resistance of strains to the harsh environmental conditions created by the stomach should be increased by microencapsulation for the strains to be used as probiotic cultures. As a result of safety evaluation tests, it was determined that E. mundtii HC56.3 and HC73.1 strains are safe for use as starter or adjunct cultures in food processes. The use of the other 11 strains as live cultures in food production processes may pose a risk for consumer health. However, purified preparations of bacteriocins produced by these strains have the potential to be used for food preservation.

Keywords: Sheep, Goat, Colostrum, Bacteriocin, Enterococcus, Functional properties, Safety evaluation