Kayseri yöresindeki kedilerde Toxocara catı'nin moleküler prevalansı ve karakterizasyonu
Molecular prevalence and characterization of Toxocara cati in cats in Kayseri
Yazar: SONER DEMİRPOLAT
Danışman: DOÇ. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu çalışmada, Kayseri yöresindeki sahipli ve sahipsiz kedilerden toplanan dışkı örneklerinde Toxocara cati'nin moleküler olarak araştırılması ve filogenetik analizlerinin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, 2019-2020 yılları arasında 115 kediden toplanan örnekler, Toxocara cati varlığı yönünden mikroskobik ve moleküler olarak incelenmiştir. Dışkı örneklerinden genomik DNA ekstraksiyonunu takiben izolatların moleküler prevalansının ve filogenetik karakterlerinin ortaya konulması için mt-COI gen bölgesininin 426 bp'lik kısmını amplifiye eden primerlerle PCR analizleri gerçekleştirilmiştir. Mt-COI gen bölgesinin PCR analizlerinde pozitif belirlenen ve uygun konsantrasyonda olan izolatlardan seçilmiş amplikonlar aynı primerlerle sekans analizine tabii tutulmuş ve hedef gen bölgesi dizilimleri elde edilmiştir. Sekans kromotogramları De Novo Assemble üzerinden işlenerek izolatlara ait konsensüs sekanslar elde edilmiştir. İlgili sekanslar GenBank veri tabanında Blastn analizlerine tabii tutularak moleküler identifikasyonları sağlanmış ve filogenetik analizler için elde edilen izolatlara ait sekansla birlikte Türkiye'den ve Dünyanın farklı ülkelerinden GenBank veri tabanına kaydedilmiş T. cati, T. canis, T. vitulorum ve Toxascaris leonina izolatlarını içeren 24 sekanstan oluşan mt-COI data seti oluşturulmuştur. Data set içerisinde haplotip çeşitliliği, inter ve intra spesifik nükleotid farklılıkları DnaSP ve Mega X üzerinden Tamura-Nei modeli ile analiz edilmiştir. Filogenetik ağaç oluşturulmasında Maximum Likelihood (ML) analizleri 1000 tekrarlı bootstrap kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 
Çalışmada, Kayseri yöresinden toplanan 115 dışkı örneğinin mikroskobik olarak 17'sinde (%14,8), moleküler olarak ise 21'inde (%18,3) T. cati pozitifliği tespit edilmiştir. Filogenetik analizlerde, Kayseri yöresindeki kedilerden izole edilen T. cati izolatları arasında ERUTcat1, ERUTcat3, ERUTcat12, ERUTcat30 ve ERUTcat34 olmak üzere beş haplotip saptanmış ve bu izolatların T. cati grubu içerisinde üç farklı dalda kümelendikleri belirlenmiştir. Beş haplotip arasında toplam dokuz nokta mutasyonu tespit edilmiştir. Ortalama haplotip diversitesi 1.000±0,126 olarak belirlenmiştir. ERUTcat1, ERUTcat3, ERUTcat12, ERUTcat30 ve ERUTcat34 arasındaki genetik benzerlik %98,2-99,7 bulunmuştur. Kayseri yöresindeki kedilerden izole edilen T. cati izolatlarıyla dünyadaki diğer T. cati izolatları arasında ise ortalama %1,1±0,3 genetik farklılık saptanmıştır. Toxocara cati, T. canis, T. vitulorum ve T. leonina grupları arasındaki genetik farklılık incelendiğinde; T. cati ile T. canis arasında %13,0±2,0, T. cati ile T. vitulorum arasında %9,6±1,7, T. cati ile T. leonina arasında ise %9,7±1,7 genetik farklılık görülmüştür. 
Sonuç olarak, bu çalışmayla Kayseri yöresindeki kedilerden izole edilen T. cati türlerinin moleküler prevalansı ve mt-COI gen bölgesinin moleküler karakterleri ortaya çıkarılmış, dünyadaki benzer izolatlarla filogenetik yakınlıkları belirlenmiş ve mt-COI gen bölgesi yönünden Türkiye'den ilk GenBank kayıtları (MW094215-MW094219) gerçekleştirilmiştir.
Anahtar Kelimeler:	Toxocara cati, moleküler prevalans, filogenetik karakterizasyon, Kayseri

Abstract:
In this study, it was aimed to molecularly investigate Toxocara cati in fecal samples collected from owned and stray cats in Kayseri region, and to perform phylogenetic characterization of the isolates. For this purpose, samples collected from 115 cats between 2019-2020 were examined microscopically and molecularly for the presence of Toxocara cati. Following genomic DNA extraction from fecal samples, PCR analyses were performed with primers that amplify 426 bp of the mt-COI gene region to reveal the molecular prevalence and phylogenetic characters of the isolates. Amplicons in the appropriate concentration selected from the positive isolates in the PCR analyses of the mt-COI gene region were sequenced with the same primers and target gene region sequences were obtained. The consensus sequences of the isolates were obtained by processing the sequence chromatograms on De Novo Assemble. Related sequences were subjected to BLAST analysis in the GenBank database, and mt-COI data set consisting of 24 sequences belonging to T. cati, T. canis, T. vitulorum and Toxascaris leonina isolates recorded in the GenBank database from Turkey and in different countries was created. In the data set, haplotype diversity, inter and intra-specific nucleotide differences were analyzed with Tamura-Nei model over DnaSP and Mega X softwares. Maximum Likelihood (ML) analyzes were performed by using 1000 repetitive bootstrap in phylogenetic tree construction.
In this study, T. cati positivity was detected in 17 (14.8%) and 21 (18.3%) out of 115 fecal samples collected from Kayseri region by microscopic and molecular analyses, respectively. Five haplotypes (ERUTcat1, ERUTcat3, ERUTcat12, ERUTcat30 and ERUTcat34) were identified among T. cati isolates in cats in Kayseri region, and these isolates were clustered in three different branches within the T. cati group in phylogenetic analyses. A total of nine point mutations were identified among the five haplotypes. Mean haplotype diversity was determined as 1,000±0,126. The genetic similarity between ERUTcat1, ERUTcat3, ERUTcat12, ERUTcat30 and ERUTcat34 was 98.2-99.7%. On the other hand, an average of 1.1±0.3% genetic difference was found between T. cati isolates isolated from cats in Kayseri region and other T. cati isolates in the world. When the genetic difference between T. cati, T. canis, T. vitulorum and T. leonina groups was examined, genetic difference was observed as 13.0±2.0% between T. cati and T. canis, 9.6±1.7% between T. cati and T. vitulorum, and 9.7±1.7% between T. cati and T. leonina. 
In conclusion, molecular prevalence and phylogenetic characteristics of mt-COI genes of T. cati isolates from cats in Kayseri region were revealed, the phylogenetic identity with similar isolates around the world was determined, and the first GenBank records (MW094215-MW094219) from Turkey was performed for mt-COI gene of T. cati with this study. 
Key words:	Toxocara cati, molecular prevalance, phylogenetic characterization, Kayseri