PHEMA-Jelatin kriyojel kemik doku iskelelerinin sentezi, karakterizasyonu ve biyolojik aktivite kazandırılması
Synthesis, characterization and bringing biological activity of PHEMA-Gelatin bone scaffolds
Yazar: DİLARA PERVER
Danışman: PROF. DR. HANDAN YAVUZ ; PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, kemik doku rejenerasyonuna yönelik olarak Testosteron (TST) ve 17-β estradiol (E2) yüklü poli (laktik-ko-glikolik asit) PLGA nanopartikül-PLGA/Jelatin kriyojel doku iskelesi sistemi geliştirilmesi ve oluşturulan sistemin in-vitro etkinliğinin adipoz kökenli mezenşimal kök hücre (ADMSC) kültürlerinde araştırılması amaçlanmıştır.
Tez çalışmasının ilk kısmında salım çalışmaları ve in-vitro hücre kültür çalışmaları için kullanılmak üzere uygun kriyojel doku iskele yapısı belirlenmiştir.  %8-10-12 ve 15 (v/v) HEMA (2-hidroksietil metakrilat) ile %1-2 ve 4 Jelatin monomer bileşimlerine sahip iskeleler tüp içinde ve cam arasında olmak üzere iki farklı yolla sentezlenmiştir. 1/6 PEGDA poli(etilenglikol diakrilat) ve 1/20 gluteraldehit çapraz bağlayıcı derişimine sahip PHEMA poli(2-hidroksietil metakrilat) iskeleler kriyojelleşme yöntemi ile elde edilmiştir.  Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonrası %10 HEMA %4 Jelatin içerikli PHEMA-Jelatin kriyojel doku iskelesinin kullanımına karar verilmiştir. 
Tez çalışmasının diğer aşamasında PLA/PGA 65:35 bileşimine sahip poli-laktik asit/poli-glikolik asit kopolimerlerinden, boş ve ayrı ayrı olacak şekilde TST ve E2  yüklü nanopartiküller, emülsiyon-çözücü-buharlaştırma yöntemi ile hazırlanmıştır. Nanopartiküllerin karakterizasyonu sonucu, boş ve hormon yüklü partikül büyüklüklerinin sırasıyla yaklaşık 200 ve 250 nm olduğu saptanmıştır. Üretilen nanopartiküllerin TST enkapsülasyon veriminin %63, E2 enkapsülasyon veriminin ise %53 olduğu, belirlenmiştir. Nanopartiküllerden TST salım çalışması 62 gün sürdürülmüş ve nanopartiküllere yüklenen TST'nin %75'inin salındığı saptanmıştır. 
TST veya E2 yüklü nanopartiküller önceden hazırlanan doku iskelelerine emdirilerek yüklenmiş ve SEM görüntüleri alınarak yapıya başarılı bir biçimde katıldıkları gözlemlenmiştir. Doku iskelelerinden salım çalışması TST için 62 gün, E2 için 35 gün sürdürülmüştür.  62 günde TST'nin %62'si, 35 günde E2'nin %45'inin salındığı saptanmıştır.
Tezin son aşamasında, TST ve/veya E2 içeren PLGA nanopartikül-PHEMA/Jelatin kriyojel doku iskelesi sisteminin osteojenik aktivitesi ADMSC'ler kullanılarak in-vitro koşullarda hücre kültürü çalışmaları ile incelenmiştir. Doku iskelelerinde hücre üremesi MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analizi ile hücrelerin doku iskelesi içerisindeki morfolojileri ise SEM (taramalı elektron mikroskobu) ile belirlenmiştir. Erken dönem osteojenik farklılaşma, ALP (alkalen fosfataz) aktivitesinin ölçümü ile belirlenmiştir. RT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) ile ADMSC'lerin kollajen I, RunX2, osteokalsin, osteopontin, ve ß-aktin ekspresyon (ifade) seviyeleri tespit edilmiştir. 
Analiz sonuçlarına göre hücrelerin yapışması, üremesi ve farklılaşmaları üzerinde testosteron ve 17-β estradiol yüklü PLGA emdirilen doku iskelelerinin ayrı ayrı, nanopartikülsüz doku iskelelerine göre daha etkili olduğu bulunmuştur. Ayrıca iki hormonun birden yüklü olduğu doku iskelelerindeki ADMSC'lerin yapışma, üreme ve farklılaşma özelliklerinin diğer gruplardan daha üstün olduğu belirtilmiştir.

Abstract:
The aim of the present study was to develop a system of testosrerone (TST) and 17-β estradiol (E2) loaded poly (lactic-co-glycolic acid) PLGA nanoparticles-PHEMA-Gelatin tissue scaffold and to investigate the in-vitro effectiveness of this system in adipose derived mesenchymal stem cell (ADMSC) cultures for bone tissue regeneration.
 In the first part of the study, structure of cryogel tissue scaffolds was determined for the studies of hormone release and in vitro cell culture. Scaffolds which have different monomer concentrations (v/v) of HEMA (8-10-12-15%) and gelatin (1-2-4%) were synthesized in two different ways: one of them is inside the glass tube and the other is between glass blocks. PHEMA poly(2-hydroxyethyl methacrylate) scaffolds were prepared by the method of cryogelation with the concentration of 1:6 PEGDA and 1:20 glutaraldehyde crosslinkers. After several characterization studies, content of 10% HEMA- 4% Gelatine was decided to use in PHEMA-gelatin cryogel as bone tissue scaffolds.
On the next phase of experiments, testosterone and 17-β estradiol loaded PLGA nanoparticles were prepared from the compositions of PLA/PGA (65:35) by using emulsion-solvent evaporation technique. Characterization studies showed that free and TST or E2 loaded particle sizes were approximately 200 nm and 240 nm, respectively. Encapsulation efficiency of nanoparticles was calculated as 63% and 53% for TST and E2, respectively by using UV spectrophotometer and HPLC.  Release study from nanoparticles was continued up to 62 days and cumulative release (%) of TST from nanoparticles was determined as 75 %. TST and E2 loaded PLGA nanoparticles in the aqueous phase were loaded into the PHEMA-Gelatin scaffolds by embedding. SEM (scanning electron microscope) analysis observed that PLGA nanoparticles were successfully loaded into the scaffolds. İn-vitro release studies indicated that 62 % of TST and 45 % of E2 was released from the scaffolds loaded with PLGA nanoparticles by embedding, during 62 and 35 days respectively.  
In the last part of the study, osteogenic activities of TST and/or E2 loaded PLGA nanoparticles-PHEMA/Gelatin tissue scaffold were determined in-vitro cell culture studies by using ADMSCs. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT (3-[4,5-dimethylthiazoyl-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium-bromide) assay and morpho-logical examination was performed with SEM (scanning electron microscopy). Early cell differentiation was quantified by the determination of ALP (alkalene phosphatase) activity. Collagen I, RunX2, osteocalcin, osteopontin and ß-actin expression levels were determined using RT-PCR (real time polymerase chain reaction). According to the results, it was observed that nanoparticle loaded systems supported the osteogenic differentiation of ADMSCs and extracellular matrix mineralization much more than other scaffolds. Also, PHEMA-Gelatin tissue scaffolds which sorbed PLGA nanoparticles loaded with TST and E2 separately were found to be more effective on cell adhesion, proliferation and differentation than the nanoparticles-free PHEMA-Gelatin tissue scaffolds. Additionally, superior properties at adhesion, proliferation and differentation of the ADMSCs were noted on tissue scaffolds which loaded TST and E2 hormones both.