Glukansükraz E81'de L933I-L935F mutasyonlarının üretilen glukan ve oligosakkaritlerin karakteristikleri üzerine etkisi
Effect of L933I-L935F mutations in glucansucrase E81 on the characteristics of produced glucans and oligosaccharides
Yazar: HANDE GÖKCAN
Danışman: PROF. DR. ENES DERTLİ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ HÜMEYRA İSPİRLİ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Ekzopolisakkarit = Exopolysaccharide ; Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria ; PCR =

Özet:
Ekzopolisakkaritler (EPS), laktik asit bakterileri (LAB) başta olmak üzere mikroorganizmalar tarafından üretilen, teknolojik ve fonksiyonel özelliklere sahip polimerlerdir. Fermente gıdaların görünümünü, reolojik özelliklerini, tadını ve dokusunu iyileştirdiği bilinen EPS'ler gıda endüstrisi tarafından stabilize edici, yapıştırıcı, emülsifiye edici ve jelleştirici olarak kullanılmaktadır. EPS biyosentezinin hemen hemen tüm adımlarından enzimler sorumludur ve yapılan çalışmalarda EPS sentezinden sorumlu çok sayıda glukansükraz enzimi bulunmuştur. Glukansükraz enzimleri çeşitli ürünler sentezler ve bu ürünler, farklı zincir uzunluğuna, dallanma derecesine, glikozidik bağların tipine, moleküler kütleye ve polimerlerin konformasyonuna sahiptir. Tüm bu özelliklerden gelen çeşitlilik, ürünlerin teknolojik ve fonksiyonel özelliklerine güçlü bir şekilde katkıda bulunur. Bu farklılık glukansükraz enzimlerinin 4 bölgesinden biri olan, N-terminal ve C-terminal bölgesi arasında kalan yüksek oranda korunmuş 1000 aminoasit içeren katalitik bölgeden kaynaklanmaktadır. Yüksek oranda korunmuş katalitik bölge enzim özgüllüğü açısından önemli olup yapılan enzim mühendisliği çalışmaları ile EPS biyosentez mekanizmasının anlaşılmasını ve yeni özelliklere sahip EPS üretilmesi sağlanmaktadır. Bu bağlamda, enzim mühendisliği ile
xiv
mikrobiyal polisakkaritlerin biyoteknolojik üretiminde kullanılması umut verici bir alternatif olmakla birlikte, ticari ölçekli üretimi ve çeşitli alanlarda uygulama olanaklarını geliştirmeye odaklanan bir süreçtir. EPS'lerin yapısal çeşitliliğinin artırılması, teknolojik ve fonksiyonel kullanımında artış ve çeşitlilik sağlayacaktır.
Bu çalışmada, L933I-L935F iki nokta mutasyonunun L. reuteri E81 suşuna ait glukansükraz (GTFA) E81 enzimi üzerindeki ve üretilen (α1→6), (α1→3) bağlarından oluşan alternan üzerindeki etkisi incelenmiştir. Mutasyon çalışmaları ile elde edilen L933I-L935F mutant enziminin biyokimyasal karakterizasyonları ile ve bu enzimden elde edilen polisakkarit ve oligosakkaritlerin karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Çalışmanın ilk basamağını mutasyon çalışmaları oluşturmaktadır. Mutasyon işlemleri için mutasyon kiti kullanılmış olup işlemler üretici firmaların prosedürleri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Mutasyon işlemlerinin ardından mutant glukansükraz genleri E. coli BL21 (DE3) 'de eksprese edilmiş, çoğaltılmış ve saflaştırılmıştır. Saflaştırılan mutant enzimin ve GTFA E81'in enzim aktiviteleri karşılaştırılmış olup mutant enzimin aktivitesinin, Km ve Vmax değerlerinin çok daha yüksek olduğu görülmüştür. Aynı zamanda, enzimlerin optimum pH ve sıcaklık çalışma değerleri belirlenmiştir. Ardından iki enzim tarafından üretilen glukanların yapısal olarak karşılaştırılması amacıyla NMR, FTIR, XRD; termal özelliklerinin belirlenmesi amacıyla DSC, TGA ve morfolojik olarak karşılaştırılabilmesi için SEM ve AFM analizleri gerçekleştirilmiştir. Aynı zamanda, farklı şeker alıcıları ile akseptör reaksiyonları kurulmuş olup NMR ve kütle analizleri gerçekleştirilmiştir. NMR analizlerine göre mutant enzim tarafından üretilen glukanın bağ yapısında (α1 → 3) bağlı glukoz ünitesi bulunmadığı; DSC ve TGA analizlerine göre erime noktasının ve degradasyon sıcaklığının daha yüksek olduğu görülmüştür. Morfolojik analizlerden elde edilen görüntülerde de iki glukan arasında oldukça fark görülmektedir. Yapılan analizler ile GTFA E81'de gerçekleştirilen L935I-L935F mutasyonunun enzim ve üretilen poli/oligosakkaritler üzerindeki etkisi görülmüş olup farklılıklar ortaya konmuştur.

Abstract:
Exopolysaccharides (EPS) produced by lactic acid bacteria (LAB) are polymers with technological and functional properties. EPSs, which are known to improve the appearance, rheological properties, taste, and texture of fermented foods, are used by the food industry as stabilizers, adhesives, emulsifiers, and gels. Enzymes are responsible for almost all steps of EPS biosynthesis and many glucansucrase enzymes responsible for EPS synthesis have been found in studies. Glucansucrase enzymes synthesize various products, and these products have different chain lengths, degrees of branching, types of glycosidic bonds, molecular mass, and conformation of polymers. The diversity of all these features contributes strongly to the technological and functional properties of the products. This difference is due to the highly conserved 1000 amino acid catalytic region between the N-terminal and C-terminal regions, which is one of the 4 regions of glucansucrase enzymes. The highly conserved catalytic region is important in terms of enzyme specificity, and with the enzyme engineering studies, the understanding of the EPS biosynthesis mechanism and the production of EPS with new properties are provided. In this context, the use of enzyme engineering in the biotechnological production of
xvi
microbial polysaccharides is a promising alternative, but it is a process that focuses on improving commercial-scale production and application possibilities in various fields. Increasing the structural diversity of EPSs will increase and diversify their technological and functional use.
In this study, the effect of two-point mutations L933I-L935F on glucansucrase E81 of L. reuteri E81 and alternan formed by (α1→6), (α1→3) bonds produced by this enzyme were investigated. The biochemical characterizations of the L933I-L935F mutant enzyme obtained by mutation studies and the characterization studies of polysaccharides and oligosaccharides obtained from this enzyme have been performed. The first step of the study is mutation studies. A mutation kit was used for mutation processes, and the processes were carried out in accordance with the procedures of the manufacturers. After mutation processes, mutant glucansucrase genes were expressed, amplified, and purified in E. coli BL21 (DE3). The enzyme activities of the purified mutant enzyme and GTFA E81 were compared, and it was observed that the activity, Km and Vmax values of the mutant enzyme were much higher. At the same time, the optimum pH and temperature operating values of the enzymes were determined. NMR, FTIR, XRD; DSC, and TGA analyzes were performed to determine their thermal properties and SEM and AFM analyzes were performed to compare them morphologically. At the same time, acceptor reactions with different sugar acceptors were established and NMR and mass analyzes were performed. According to NMR analysis, the glucan produced by the mutant enzyme does not have (α1 → 3) attached glucose unit in its bond structure; It was observed that the melting point and degradation temperature were higher than DSC and TGA analyses. The images obtained from the morphological analyzes also show a significant difference between the two glucans. With the analyzes made, the effect of the L935I-L935F mutation in GTFA E81 on the enzyme and the produced poly/oligosaccharides were observed and differences were revealed.