Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 suşundan alkalin fosfatazın klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of alkaline phosphatase from thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 strain
Yazar: MELEK ÇOL
Danışman: DOÇ. DR. AHMET ÇOLAK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Alkalen fosfataz = Alkaline phosphatase ; Karakterizasyon = Characterization ; Klonlama = Cloning ; Protein saflaştırma = Protein purification ; Termofilik bakteriler = Thermophilic bacteria

Özet:
TÜBİTAK, 106T696 nolu proje kapsamında gerçekleştirilen bu çalışmada, yeni bir termofilik suş olan Geobacillus caldoxylosilyticus TK4'den bir genomik DNA kütüphanesi oluşturuldu. Bu kütüphaneden elde edilen verilere dayanılarak yapılan invers PCR sonucunda, 1410 bazdan oluşan bir alkalin fosfataz (AP) geninin tam DNA sırası belirlendi. Bu DNA sırasının amino asit sırasına çevrildikten sonra BLAST programı ile incelenmesi sonucunda, Bacillus türü AP'lere % 70 oranında benzediği tespit edilmiştir. pET-28a(+) vektörüne klonlanan AP geni, Escherichia coli BL21(DE3)pLysS'de ekspres edildi. Rekombinant protein, nikel afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. SDS-PAGE sonucunda, saflaştırılan proteinin ya tek bir alt birimden ya da aynı molekül ağırlığa sahip birden fazla alt birimden oluştuğu belirlendi. Enzimin optimum pH ve sıcaklığının, sırasıyla 9,5 ve 50 ºC olduğu tespit edildi. Isıl kararlılık eğrisi incelendiğinde 10-30 ºC'de aktivitenin önemli ölçüde değişmediği, 40 ºC'de ilk 60, 50 ºC'de ise ilk 30 dakikada yaklaşık olarak % 50 oranında azaldığı ve 60-70 ºC'de ilk 30 dakika da % 10 seviyesine kadar düştüğü gözlemlenmiştir. 4 ºC'de, pH 7,0-11,0 aralığındaki tamponlarda 12, 24 ve 48 saat inkübe edilmesiyle yapılan pH kararlılığı çalışmasında, enzimin özellikle pH 8,0 ve daha bazik pH değerlerinde 12 saatlik inkübasyon sonrasında, aktivitesini % 90'nın üzerinde koruduğu 24 saatlik inkübasyon sonunda ise, enzimin aktivitesini % 50 oranında kaybettiği, 48 saat sonunda ise aktivitede % 90'lara varan bir azalma olduğu görülmüştür. para-Nitrofenol fosfat (p-NPP) substratı varlığında Vmaks ve Km değerleri sırası ile 0,049 U/mg protein ve 87 µM olarak belirlendi. Metal iyonlarının aktivite üzerine etkisi incelendiğinde 1 mM Hg2+, Cd2+ ve Al3+ varlığında aktivitede sırasıyla % 85, % 55 ve % 18 oranında azalma gözlenmektedir. 1 mM'lık EDTA varlığında aktivitenin tamamen kaybolması aktif bölgesinde Mg2+ ve Zn2+ içerdiği bilinen AP'lerin gösterdiği özellikle uyumlu bir sonuçtur. Bütün bu veriler, G. caldoxylosilyticus TK4'ten klonlanan AP'nin endüstriyel uygulamalarda kullanılan AP'lere benzer özelliklere sahip olduğunu desteklemektedir.

Abstract:
In this study, supported by TUBITAK (Project number is 106T696), a genomic DNA library was made from a novel thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 strain. The whole DNA sequence of an alkaline phosphatase (AP) gene consisting of 1410 bp was determined by performing inverse PCR. Amino acid sequence alignments were done by using BLAST programme. The results indicated that the amino acid sequence of the AP was similar to Bacillus species AP in the ratio of 70%. The gene was cloned into pET28a(+) vector and expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS. The recombinant protein was purified by using nickel affinity chromatography. SDS-PAGE showed that the purified protein was composed of either one subunit or more than one subunit having the same molecular weight. pH and temperature optima of the enzyme were determined as 9.5 and 50 ºC, respectively. When thermostability data were examined, it was seen that the activity was not changed at 10-30 ºC remarkably. However, the enzyme started to lose about 50% of its initial activity at 40-50 ºC after 60 and 30 minute incubations, respectively. It was seen that the activity decreased down to 10% at 60-70 ºC after 30 minute incubation. When the enzyme was incubated at 4 °C in the buffer solutions (pHs ranging from 7.0-11.0) for 12, 24 and 48 hours, the enzyme retained 90% of its activity at basic pH values for 12 hours. The enzyme lost its activity in the ratio of 50% after 24 hours. The Vmax and Km values of the recombinant protein 0.049 U/mg protein and 87 µM, respectively in the presence of para-nitrophenol phosphate (p-NPP). Activity was decreased in the ratio of 85%, 55% and 18% in the presence of 1 mM Hg2+, Cd2+ and Al3+, respectively. In the presence of 1 mM EDTA the activity was lost completely. This result was consistent with APs, which are known to have Zn2+ and Mg2+ at the active site. All these data support the presence of an AP from G. caldoxylosilyticus TK4 with similar properties to other APs used in industrial applications.