Hippo sinyal yolağının spermatogenezis sürecindeki varlığının belirlenmesi
Determining the presence of the hippo signal pathway in the spermatogenesis process
Yazar: İREM İNANÇ
Danışman: PROF. DR. ESRA ERDEMLİ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Histolojik teknikler = Histological technics ; Hücre içi sinyal peptidleri ve proteinleri = Intercellular signaling peptides and proteins ; Sertoli hücreleri = Sertoli cells

Özet:
Testis seminifer tübülüsleri adı verilen Sertoli ve çeşitli gelişim aşamalarında bulunan germ hücrelerinden oluşmaktadır. Bu epitelde mitoz ve mayoz bölünmeler, proliferasyon ve farklılaşmalar meydana gelmektedir. Sertoli hücreleri kendi aralarında ve germ hücreleriyle benzersiz bağlantı birimleriyle tutunmaktadır. Özellikle ektoplazma özelleşmeleri adı verilen bu bağlantı birimleri testise özgüdür. Sperm salınımı sırasında hücre iskeleti, aktin içerikli proteinler ve ektoplazma özelleşmelerinin etkin olduğu bilinmektedir. Fakat bu salınım mekanizması tam anlamıyla aydınlatılamamıştır.  İlk kez Drosophila' da keşfedilmiş ve memelilerde de korunduğu belirlenen Hippo sinyal yolağı; hücrelerin bölünmesi, ölümü ya da proliferasyonu gibi hücrelerin kaderinin belirlendiği birçok aşamada oldukça önemlidir. Yapılan araştırmalarda aktin proteinleri ve hücre iskeletinden oldukça etkilenen bir sinyal yolağı olarak ortaya konmuştur fakat bu sinyal yolağının testis üzerindeki etkisi tam olarak bilinmemektedir. Bu sebeple çalışmamızda Wistar albino erişkin erkek sıçanlarda  Hippo sinyal yolağının etkinliğini belirlenmeye çalışılmıştır. Bunun için aktin hücre iskeletinin ve aktin ilişkili proteinlerin etkilendiği adjudinin verildiği bir deney modeli oluşturulmuştur (n:10). Bu deney modelini karşılaştırmak için herhangi bir madde verilmeyen kontrol (n:10) ve adjudinin çözüldüğü madde olan metilselüloz grubu (n:10) da yapılandırılmıştır. Literatürle uyumlu olması açısından her gruptan  0., 6., 12., 24. ve 96. Saatlerde ikişer hayvan sakrifiye edilip testisler toplanmıştır. Çalışmamız immünohistokimyasal, immünfloresan, Western blotlama ve QRT-PCR yöntemleriyle Hippo sinyal yolağı açısından değerlendirilmiştir. Kontrol ve metilselüloz grupları her saatte birbirlerine benzer özellikler göstermiştir böylelikle adjudinin etkisini kanıtlanmış ve deney grubu oluşturulmuştur. Deney grubu 0.saat ise kontrol ve metilselüloz gruplarına benzer özellikler göstermiştir. Deney grupları kontrol ve metilselüloz gruplarıyla karşılaştırıldığında 6.saat itibariyle aktin ilişkili proteinlerden Arp3 ve EPS8'in ve F-aktinin dağılımının bozulmaya başladığı immünfloresan işaretlemelerle belirgindir. 96. saatte ise bu dağılımın bozulduğu oldukça nettir. Deney gruplarında özellikle 96. Saatte YAP ve p-YAP'ın immünohistokimyasal, immünfloresan ve Western blot analizlerinde ifadesinin azaldığı belirlenmiştir. QRT-PCR deneylerimiz de bu sonuçlarımıza paralel bir özellik göstermektedir. Bu sonuçlar bizlere özellikle ektoplazma özelleşmelerinde ve sperm salınımı sırasında Hippo sinyal yolağının testiste etkin olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
In the seminiferous tubule of mammalian testis consists of germ cells at various stages of development and Sertoli cells. Mitosis and meiosis, proliferation and differentiation occur in this epithelium. Sertoli cells are attached to both each other and to germ cells by unique junctional units. Especially, these connecting junctions, called ectoplasmic specializations, are specific to the testis. It is known that cytoskeleton, actin-containing proteins and ectoplasmic are effective during sperm secretion. However, the mechanism of this secretion has not been fully elucidated. The Hippo signaling pathway, which was discovered for the first time in Drosophila and also preserved in mammals, has been demonstrated that it is very important in many stages where the fate of cells is determined, such as cell division, death or proliferation. Studies have shown that it is a signaling pathway that is highly influenced by actin proteins and cytoskeleton. However, the effect of this signaling pathway on the testis is not fully known. For this reason, we tried to determine the effectiveness of the Hippo signaling pathway in adult Wistar albino male rats in our study. Therefore, we created an experimental model in which the actin cytoskeleton and actin-associated proteins are affected by adjudine (n=10). In order to compare this experimental model, the control group that without any substance administration  (n=10)  and the methylcellulose group, which is dissolved in the adjudine, were formed (n=10).
In order to be compatible with the literature, two animals from each group were sacrificed at 
0 th, 6th, 12th, 24 th and 96 th hours, and the testicles were collected. Our study was evaluated in terms of Hippo signaling pathway by immunohistochemistry, immunofluorescence, Western blotting and QRT-PCR methods. Control and methylcellulose groups showed similar characteristics at each hour, thus proving the effect of adjudin and achieving success in creating an experimental group. The experimental group showed similar properties to the control and methylcellulose groups at the 0th hour. When the experimental groups are compared with the control and methylcellulose groups, it is evident that the distribution of actin-related proteins Arp3 and EPS 8 and F-actin begin to deteriorate as of the 6th hour with immunofluorescent techniques. At the 96th hour, it is quite clear that this distribution has declined. In the experimental groups, especially at the 96th hour, the expression of YAP and p-YAP was decreased in immunohistochemical, immunofluorescent and Western blot analyzes. The QRT-PCR experiments also show a parallel features to these results. In conclusion these data show us that the Hippo signaling pathway may be effective in the testis, especially in ectoplasmic specialization and sperm secretion.