İnsan hepatosellüler karsinoma hücrelerine (HepG2) farklı pH ortamlarında uygulanan sorafenibin antikanser etkinliğinin değerlendirilmesi
Evaluation of the anticarcinogenic effect of sorafenib on human hepatocellular carcinoma cells (hepg2) in different pH environments
Yazar: SEDAT GÖKMEN
Danışman: DOÇ. DR. DİLEK GÜVENÇ
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Hidrojen iyon konsantrasyonu = Hydrogen-ion concentration ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Sorafenib = Sorafenib

Özet:
Hepatosellüler karsinoma (HCC) karaciğer tümörleri arasında en yaygın karşılaşılan türdür. HCC dünyada kanser nedenli ölümlerin üçüncü sırasında yer almaktadır. İleri seviye HCC tedavisinin ilk basamağını FDA tarafından onaylanmış antianjiyojenik ve antiproliferatif özellikler gösteren çoklu kinaz inhibitörü olan sorafenib oluşturmaktadır. Kanser hücrelerinin mikroçevresinin pH değeri Warburg Etkisinden dolayı asidik karakter (6.6-6.9 pH) göstermektedir. Asidik mikroçevre kanser hücrelerinin başta hücre canlılığını olmak üzere proliferasyon, invazyon, metastaz ve kemoterapötiklere karşı direnç oluşturma yeteneğini arttırmaktadır. Bu tez çalışmasında farklı pH ortamlarında sorafenibin in vitro sitotoksik ve proliferasyon üzerindeki inhibe edici etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla 6.6, 6.8, 7.2, 7.6 ve 7.8 pH değerindeki medyumla hazırlanan sorafenibin insan hepatosellüler karsinoma (HepG2) hücrelerine IC50, IC50/5, IC50/10 ve IC50/20 konsantrasyonları 24, 48 ve 72 saat uygulanmıştır. Hücre canlılığı belirlenen konsantrasyon ve sürelerde WST-8 sitototoksisite testi kullanılarak mikroplaka okuyuculu spektrofotometrede değerlendirilmiştir. Proliferasyon testi ilacın IC50/20 konsantrasyonu ve 24 saatlik maruziyet periyodunda canlı hücre analiz ve görüntüleme sistemi ile analiz edilmiştir.  Sorafenibin WST-8 sitotoksisite testine göre 24 saatlik IC50 konsantrasyonu 13.40 µM olarak belirlenmiştir. İlacın 24 saat maruziyet periyodu sonrasında tüm konsantrasyonları için HepG2 hücrelerinde en güçlü sitotoksik etkisini pH 7.6 değerinde (IC50; %19.76±0.61, IC50/5; %20.90±1.39, IC50/10; %26.10±1.65 ve IC50/20; %31.35±1.86) gösterdiği saptanmıştır (p<0.05). İlacın en düşük konsantrasyonda, pH 7.6' daki güçlü sitotoksik etkisi 48 saat maruziyet periyodu uygulamasında da (IC50/20; %66.28±1.39) devam ettiği belirlenmiştir. Sorafenibin en düşük iki (IC50/10 ve IC50/20) konsantrasyonun 72 saat maruziyet periyodu sonrasında güçlü sitotoksik etkisini (IC50/10; %51.56±1.98, IC50/20; %61.09±1.13) pH 7.8 grubunda meydana getirdiği tespit edilmiştir. Proliferasyon testi sonucunda 7.6 pH değerinde hazırlanan sorafenibin hem kontrol grubu hem de 7.2 ve 6.6 pH değerinde hazırlanan sorafenibe göre proliferasyonu istatistiksel olarak anlamlı derece azalttığı (15.84±0.53) belirlenmiştir (p<0.001). Sonuç olarak alkali mikroçevrenin sorafenibin sitotoksik ve antiproliferatif etkisini arttırdığı belirlenmiştir. Sorafenib kullanan ileri seviye HCC' li hastaların sistemik ya da lokal alkalileştiriciler kullanması ilacın etkinliğini arttırabileceği düşünülmüştür.

Abstract:
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common hepatic tumor. It is the third among tumors to cause cancer related deaths worldwide. First step of advanced stage HCC treatment is sorafenib, which is an FDA approved multiple kinase inhibitor with antiangiogenic and antiproliferative properties. The microenvironment of cancer cells is acidic (6.6-6.9 pH) due to the Warburg effect. This acidic environment primarily promote cell viability as well as proliferation, invasiveness, metastasis and chemotherapeutic resistance. The aim of this thesis is to determine the cytotoxicity of sorafenib and its inhibitory effect on proliferation in different pH levels in vitro. For this purpose, IC50, IC50/5, IC50/10, IC50/20 concentrations of sorafenib were applied to hepatocellular carcinoma (HepG2) cells for 24, 48 and 72 hours in 6.6, 6.8, 7.2, 7.6, and 7.8 mediums. Cell viability was evaluated with WST-8 cytotoxicity test using a spectrophotometer with microplate reader for each concentration and duration. The proliferation test was evaluated with live cell analysis and imaging system at IC50/20 concentration and 24-hour exposure duration. According to the WST-8 cytotoxicity test, the IC50 concentration of sorafenib at 24-hour exposure was found as 13.40 µM. The most powerful cytotoxic effect of the drug on HepG cells at pH 7.6 (IC50; 19.76 ±0.61%, IC50/5; 20.90 ±1.39, IC50/10; 26.10 ±1.65, IC50/20; 31.35 ±1.86%) was at the 24 hour exposure period (p<0.05). The strong cytotoxic effect of the drug at its lowest concentration carried on to the 48 hour exposure (IC50/20; 66.28 ±1.39%) at pH 7.6. The most cytotoxic effect of sorafenib's two lowest dosages (IC50/10; 51.56±1.98%, IC50/20; 61.09±1.13%) were seen at the pH 7.8 group. According to the proliferation test, the sorafenib prepared at  pH 7.6 had statistically significant decrease (15.84±0.53, p<0.001) in proliferation when compared to control, and sorafenib prepared at pH 7.2 and 6.6. As a result an alkaline microenvironment increases the cytotoxic and antiproliferative  effects of sorafenib. It may be possible to increase the effectiveness of sorafenib with local alkalizing agents in patients with advanced stage HCC.