Vankomisine dirençli Enterococcus faecium klinik izolatlarında  CRISPR-Cas sistemi kullanılarak, glikopeptid direnci ile ilgili gen düzenlenmesinin yapılması
Gene editing of glycopeptide resistance in vancomycin-resistant Enterococcus faecium clinical isolates using the CRISPR-Cas system
Yazar: GÜLŞEN GÜNEL
Danışman: PROF. DR. ZERRİN AKTAŞ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı /  Tıbbi Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada, klinik örneklerden izole edilen vankomisine dirençli ve Van A direnç geni pozitif Enterococcus faecium izolatlarında, CRISPR-Cas tekniği kullanılarak, Van A direnç geninin inaktive edilmesi amaçlanmıştır.
E. faecium oldukları saptanan, disk difüzyon ve gradient test yöntemi ile vankomisine dirençli oldukları belirlenen bakteri izolatları çalışmaya alındı. Vankomisin ve kloramfenikolün minimum inhibisyon konsantrasyon (MİK) değerlerinin belirlenmesinde mikrodilüsyon yöntemi uygulandı. Vektör olarak Cas9 endonükleazı ve gRNA bağlama bölgesini taşıyan pCas9 plazmiti kullanıldı. Plazmit aktarımında elektroporasyon yöntemi uygulandı. Transformantların seçiliminde, zamana bağlı optik yoğunluk ölçümü ve spot deneyi uygulandı. Genetik yapısı değiştirilmiş izolatlarda (transformantların) fenotipik değişikliğini kontrol edildi.
Mikrodilüsyon yöntemiyle tüm izolatların vankomisin için MİK değeri ≥ 1024 µg/mL olarak saptandı. PZR yöntemiyle Van A direnç geni tüm izolatlarda pozitif olarak bulundu. Gen düzenlemesi yapılarak elde edilen Ef3_pCas_g1 plazmitini içeren transformanın, vankomisin MİK değerlerinde (128 µg/mL) azalma saptandıktan sonra, spot deneyleri ile yapılan alt kültürlerde, vankomisin (10 μg/mL) içeren besiyerinde, Ef3_pCas_g1_6, Ef3_pCas_g1_27 ve Ef3_pCas_g1_44 olarak tanımlanan üç ayrı transformantın üremediği gözlendi. Mikrodilüsyon yöntemi ile bu transformantların vankomisin için MİK değerlerinin 2 µg/mL olduğu saptandı. Gen düzenleme çalışmalarında genom düzenlemesi yapılmış en iyi yapı grubunun Ef3_pCas_g1 plazmiti olduğu saptandı. Fenotipik değişikliklerin gözlenmesi amacıyla yapılan deneylerde, Ef3_WT göre Ef3_pCas_g1, Ef3_pCas_g2, Ef3_pCas_g3 transformantlarında koloni çapının küçüldüğü ve kolonilerin morfolojilerinde değişiklik olduğu saptandı.
Sonuç olarak, Van A direnç genini taşıyan beş izolattan sadece biri ile çalışmaya devam edildi. Elde edilen üç ayrı transformantın vankomisine (2 µg/mL) duyarlı hale döndüğü tespit edildi. Bu çalışma vankomisine dirençli E. faecium izolatlarında ülkemizde yapılan ilk gen düzenleme çalışmasıdır ve başarılı olmuştur.

Abstract:
The aim of this study was to inactivate the Van A resistance gene in vancomycin-resistant and Van A resistance-positive Enterococcus faecium isolates using the CRISPR-Cas technique.
Bacterial isolates, which were determined to be E. faecium and resistant to vancomycin by disk diffusion and gradient test methods, were included in the study. The microdilution method was used to determine the minimum inhibition concentration (MIC) values of vancomycin and chloramphenicol. The pCas9 plasmid carrying Cas9 endonuclease and gRNA binding site was used as a vector. The electroporation method was used for plasmid transfer. Time-dependent optical density measurement and spot assay were used for the selection of transformants. Phenotypic changes in genetically modified isolates (transformants) were checked.
By microdilution method, the MIC value of all isolates for vancomycin was determined as ≥ 1024 µg/mL. Van A resistance gene was found to be positive in all isolates by PCR method. After the decrease in vancomycin MIC values (128 µg/mL) of the transformant containing Ef3_pCas_g1 plasmid obtained by gene editing, it was observed that three different transformants identified as Ef3_pCas_g1_6, Ef3_pCas_g1_27 and Ef3_pCas_g1_44 did not grow on medium containing vancomycin (10 μg/mL) in subcultures performed by spot experiments. The MIC values of these transformants for vancomycin were found to be 2 µg/mL by microdilution method. In gene editing studies, the Ef3_pCas_g1 plasmid was found to be the best genome-edited construct. In the experiments performed to observe phenotypic changes, it was found that the colony diameter of Ef3_pCas_g1, Ef3_pCas_g2, and Ef3_pCas_g3 transformants decreased, and the morphology of the colonies changed compared to Ef3_WT.
As a result, the study was continued with only one of the five isolates carrying the Van A resistance gene. Three transformants obtained were found to be sensitive to vancomycin (2 µg/mL). This study is the first gene editing study conducted in Turkey in vancomycin-resistant E. faecium isolates, and it was successful.