Türkiye yerli sığır ırklarında doğal dirençlilik ilişkili makrofaj protein 1 (NRAMP1) gen polimorfizminin araştırılması
Investigation of natural resistance associated macrophage protein 1 (NRAMP1) gene polymorphism in native cattle breeds in Turkey
Yazar: BURCU EKİM
Danışman: PROF. DR. K. SERDAR DİKER
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: DNA analizi = DNA analysis ; Genler = Genes ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; Sığırlar = Cattles ; Türkiye = Turkey ; İmmünite-doğal = Immunity-natural

Özet:
Bu çalışmanın amacı Türkiye'nin yerli sığır ırklarında hücre içi patojenlere dirençlilik ile ilişkili NRAMP1 gen polimorfizimini belirleyerek, genetik dirençlilik kavramına temel oluşturacak bilgilerin sağlanmasıdır. Bu araştırmada Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden toplanan, kesin ırk özelliklerini taşıyan sığırlara ait tam kan örnekleri kullanıldı. Saf kan 4 yerli sığır ırkı (Boz, Güney Anadolu Kırmızısı [GAK], Doğu Anadolu Kırmızısı [DAK], Yerli Kara) ve iki adet kültür sığır ırkına (Holştayn, Simental) ait toplam 200 adet kan örneği incelendi.İncelenen kan örneklerinden fenol-kloroform?izoamilalkol yöntemi ile DNA izole edildi. PCR ile amplifiye edilen DNA'lara sığır NRAMP1 geni 3'UTR bölgesinde (GT)n sayısındaki varyasyonlar nedeniyle oluşan polimorfizmlerin araştırılması amacıyla tek zincir konformasyon polimorfizmi (SSCP), fragment analizi ve DNA dizi analizi yöntemleri uygulandı. İstatistiksel analizler için allelik varyasyon ve allelik zenginlik karşılaştırmaları F istatistikleri ile yapıldı.Kültür sığır ırklarına ait örneklerde 175 bp uzunluğunda homozigot yapı, yerli sığır ırklarında 173 bp, 175 bp, 179 bp, 181 bp uzunluklarında homozigot yapı ve %13 oranında heterozigot yapı gözlendi. DNA dizi analizi sonuçlarına göre fragment uzunluğu 173 bp, 175 bp, 177bp, 179 bp, 181 bp olan örnekler sırasıyla (GT)13, (GT)14, (GT)15, (GT)16 ve (GT)17 tekrarı gösterdi. NRAMP1 geni lokusları ile homolojileri açısından yerli ve kültür sığır ırklarından seçilen sekanslar gen veri tabanlarındaki aynı bölgeye ait DNA dizileri ile BLAST programı kullanılarak karşılaştırıldığında %96 - %100 arasında homoloji gösterdikleri tespit edildi.İstatistiksel analizler sonucunda yerli ve kültür sığır ırklarında toplamda beş farklı allel örneklendirildi ve yerli ırklardan Güney Anadolu Kırmızısı, Doğu Anadolu Kırmızısı ırklarında bu beş allelin tamamı gözlenirken, Yerli Kara ırkında 4 allel, Boz ırka ait örneklerde ise bu allelerden 3'ü gözlendi. Kültür sığır ırkları olan Holştayn ve Simental'e ait örneklerde ise bu allellerin sadece ikisi gözlendi. Sığır NRAMP1 geninin araştırılan lokusunun allelik zenginlik açısından yerli sığır ırkları ile kültür sığır ırklarının karşılaştırılması yapıldığında ise yerli sığır ırklarının kültür sığır ırklarına göre allelik zenginlik oranlarının ve gen çeşitliliğinin daha yüksek oranda olduğu ve sığır NRAMP1 geninin 3'UTR bölgesinin yerli sığır ırklarında daha polimorfik bir yapı gösterdiği görüldü.Bu çalışmada elde edilen bulgular; Türkiye sığır ırklarında genetik dirençlilik kavramına yardımcı olacak bilgiler sağlayarak, bazı hücre içi patojenlerden kaynaklanan infeksiyonlara karşı dirençliliğin değerlendirilmesine ve bunun sonucunda infeksiyonlara karşı daha dirençli çiftlik hayvanların yetiştirilmesine katkı sağlayacaktır.

Abstract:
The aim of this study was to investigate the polymorphism of the NRAMP1 gene in Turkish cattle breeds which was associated with the resistance to intracellulare pathogens and to provide data which will form a basis of the term ?genetic resistance?. In this study, whole blood samples of cattle from different regions of Turkey wer included. A total of 200 blood samples belonging to four Turkish native cattle breeds (Turkish Grey, South Anatolian Red, East Anatolian Red, Anatolian Black) and two egzotic cattle breeds (Holstein, Simental) were used. DNA was isolated by phenol-chloroform-isoamlyalcohol method and DNA samples were amplified by PCR. Single stranded conformation polymorphism (SSCP) analysis, fragment analysis, DNA sequencing methods were applied to DNA amplicons for the investigations of polymorphism caused due to the variations of (GT)n numbers in the 3?UTR region of bovine NRAMP 1 gene. Allelic diversity and allelic richness comparisons were performed by F statistics.As homozygous 175bp of DNA amplicons were observed in egzotic cattle breeds, homozygous 173bp, 175bp, 179bp and 181bp of DNA amplicons were observed in native Turkish breeds and DNA sequencing analysis revealed that 173bp, 175bp, 177bp, 179bp, 181bp of DNA fragments were carried (GT)13, (GT)14, (GT)15, (GT)16 and (GT)17 repeats, respectively. NRAMP1 gene loci of the selected sequences of native and egzotic cattle breeds were compared with the gene databases for the same region of NRAMP1 3?UTR by using BLAST software. This comparison demonstrated 96%-100% of homology between the DNA sequences of the same region.Five different allelles were found in 6 cattle breeds investigated. While all of these alleles were observed in South Anatolian Red and East Anatolian Red, Anatolian Black had 4 and Turkish Grey had 3 of these alelles. In Holstein and Simental populations only two of these alleles were observed. When the investigated locus of the bovine NRAMP1 gene was compared in terms of allelic diversity and allelic richness, allelic diversity and allelic richness ratios of native Turkish breeds were found higher. In addition, native Turkish breeds were demonstrated more polymorphic structure for 3?UTR region of the bovine NRAMP1 gene.The results obtained in this study will make contributions to the evaluation of the resistance to the infections caused by intracellular pathogens and also breeding of more resistant farm animals to the infections by providing information about the term of ?genetic resistance of the Turkish cattle breeds?.