Geobacillus kaustaphilus alfa-galaktosidaz enziminin rekombinant protein olarak E. coli'de ifadesi ve karakterizasyonu
Expression and characterization of geobacillus kaustophilus alfagalactosidase enzyme as a recombinant protein in E. coli
Yazar: ASLI KUŞ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ YUNUS ENSARİ
Kafkas Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Son zamanlarda enzimler birçok endüstriyel alanda sıklıkla kullanılmaya başlanmıştır. Ilımlı koşullarda yaşayan mikroorganizmalardan elde edilen enzimlerin aksine, endüstrinin zorlu koşullarına dayanabilen ve ekstrem koşullarda yaşayabilen mikroorganizmalardan elde edilen enzimler daha çok tercih edilmektedir. Geobacillus kaustophilus, optimum üreme sıcaklığı 60 ºC olan ve kaplıcalarda üreyen ekstremofilik bir bakteridir. Organizmaya ait genom projesinin sonuçları ve CAZY veri tabanı incelendiğinde, genomda bir (1) adet α-galaktosidaz enziminin varlığı görülmüştür. Bu çalışmada, Geobacillus kaustophilus genomunda kodlanan α-galaktosidaz enziminin klonlanması, heterolog ekspresyonu, saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu amaçlanmıştır. Bu amaçla, α -galaktosidaz enzimini kodlayan gen, pQE-30 vektörüne klonlanmış ve E. coli BL21'de heterolog olarak ifade edilmiştir. Saflaştırılmış enzimin biyokimyasal karakterizasyonu, Geobacillus kaustophilus α-galaktosidaz enziminin pH 6.0 sitrat tamponunda ve 40 ºC'de optimum aktivite gösterdiğini ortaya koymuştur. α–galaktosidaz enziminin para-Nitrofenil-α-D-galaktopiranozid substratına karşı Vmax değeri 41,09 U/mg, Km değeri ise 0,248 mM olarak bulunmuştur. Elde edilen rekombinant enzimin enzimatik özellikleri geliştirilirse lignoselülozik biyokütlelerin enzimatik hidrolizinde yüksek verimle kullanılabilecek bir aksesuvar enzim olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Recently, enzymes have been used frequently in many industrial areas. In contrast to the enzymes obtained from microorganisms living in mild conditions, enzymes obtained from microorganisms that can withstand the harsh conditions of the industry and that can live in extreme conditions are more preferred. Geobacillus kaustophilus is an extremophilic bacterium with an optimum growth temperature of 60 degrees and grows in hot springs. When the results of the genome project of the organism and the CAZY database were examined, the presence of 1 α-galactosidase enzyme in the genome was observed. In this study, it was aimed to clone, heterologous expression, purification and biochemical characterization of α-galactosidase enzyme encoded in Geobacillus kaustophilus genome. For this purpose, the gene of the α-galactosidase enzyme was cloned into the pQE-30 vector and expressed heterologously in E. coli BL21. Biochemical characterization of the purified enzyme revealed that the enzyme Geobacillus kaustophilus α-galactosidase showed optimum activity at 40 ºC and pH 6 in citrate buffer. Ethanol added to the reaction was the chemical that increased the activity of the α-galactosidase enzyme the most with 255% activity and the Vmax value of the α-galactosidase enzyme was 41.09 U/mg, and the Km value was 0.248 mM. If the enzymatic properties of the recombinant α-galactosidase enzyme produced are improved, it is thought that it can be an accessory enzyme that can be used with high efficiency in the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomasses.