Zeytinyağı distilatındaki biyoaktif bileşenlerin monolitik kolonlarla incelenmesi
The investigation of bioactive compounds in olive oil distillate using monolithic columns
Yazar: İSMAİL TARHAN
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN KARA
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Sunulan bu çalışmada, zeytinyağının rafinasyonu esnasında deoderizasyon kademesinde elde edilen zeytinyağı deoderize distilatının (OODD), fiziksel ve kimyasal özellikleri titrimetrik, kromatografik ve spektroskopik metotlarla incelenmiş ve deoderizasyon kademesinin yüksek sıcaklık, düşük basınç ve su buharı etkisiyle yağdan uzaklaşarak deoderize distilatına geçen serbest yağ asitleri (FFA), tokotrienol, tokoferol, sterol ve skualen gibi katma değeri yüksek ve insan sağlığı açısından son derece önemli biyoaktif bileşenlerin, üstün ayırma özelliklerine sahip monolitik kolonlar kullanılarak tek bir analizle tayin edilebilmelerine imkan veren yeni metotlar geliştirilmiştir. 
Çalışmanın birinci aşamasında, temin edilen OODD numunesinin fiziksel ve kimyasal özellikleri uluslararası standart metotlar kullanılarak incelenmiş ve sırasıyla nem miktarı, FFA miktarı, iyot sayısı, As232 ve As270 değeri, peroksit sayısı, anisidin sayısı ve totoks sayısı tespit edilmiştir. Ayrıca kromatografik teknikler kullanılarak yağ asidi kompoziyonu, trigliserit (TG) kompoziyonu, polar ve apolar madde tayini, polimerik madde tayini, tokoferol-tokotrienol tayini, sterol tayini ve skualen tayinin gerçekleştirilmiştir. 
Çalışmanın ikinci basamağında OODD numunesinin FFA miktarının ve iyot sayısının tayini için kemometrik yöntemlerden faydalanılarak yeni IR spektroskopik metotlar geliştirilmiştir. FFA miktarının tayini için Fourier dönüşümlü yakın infrared (FT-NIR) tekniğinin; iyot sayısının tayinin için ise tekli zayıflatılmış toplam yansıma fourier dönüşümlü infrared (SB-ATR-FT-IR) tekniğinin uygun olduğu görülmüştür. Natürel sızma zeytinyağlarının (EVOO) %FFA miktarının kantitatif olarak tayini için kemometrik metotlardan ve farklı ölçüm modlarına sahip FT-IR spektroskopisi tekniğinden faydalanılmış ve bu amaçla geliştirilen 12 farklı kısmi en küçük kareler metodu (PLS) kalibrasyon modelinden en iyi kalibrasyon değerlerine sahip olanının normal spektrumun kullanıldığı transmisyon modu olduğu tespit edilmiştir. EVOO için IR spektroskopisinin kullanıldığı bir diğer çalışmada ise EVOO'nın normal zeytinyağlarından ve diğer yenilebilir yağlardan kolay ve hızlı bir şekilde ayırt edilebilmesi için PLS-diskriminant analizi (PLS-DA) kalibrasyon modellerinden faydalanılarak orta, yakın ve raman IR spektroskopik teknikleri karşılaştırılmıştır. Elde edilen dendrogram ve benzerlik haritaları verilerine göre EVOO'nın normal zeytinyağlarından ve diğer yenilebilir yağlardan ayırt edilebilmesi için en başarılı tekniğin FT-NIR tekniği olduğu tespit edilmiştir. 
Çalışmanın son aşamasında ise monolitik kolon kullanılarak herhangi bir ön işlem yapmadan sadece aseton içerisinde çözülmüş olan bitkisel yağların direk yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) sistemine enjeksiyonu ile sterol, FFA, tokotrienol, tokoferol, skualen, monogliserit, digliserit ve TG türlerinin tek bir analizle tayin edilebilmesine imkan veren yeni bir monolitik ayırma metodu (MA1) önerilmiştir. Geliştirilen MA1 metodu ile herhangi bir yenilebilir yağ ya da distilatının TG kompoziyonu yüzdeleri tespit edilmiştir. MA1 metodunun kromatografik parametreleri sırasıyla hareketli faz bileşimi için %40-60 aseton-asetonitril; hareketli faz akış hızı için 2.00 mL/dk ve kolon fırını sıcaklığı için ise 30.00 oC olarak belirlenmiştir. Monolitik kolon kullanılarak ilk kez geliştirilen ikinci ve en önemli metot monolitik ayırma2 (MA2) ile de her biri ayrı bir standart metotla tayin edilen sterol, tokotrienol, tokoferol ve skualen türleri, tek bir analiz metoduyla tayin edilebilmiştir. İlgili metodun kromatografik parametreleri kemometrik yöntemlerden faydalanılarak optimize edilmiş ve optimum değerler sırasıyla hareketli faz akış hızı için 2.50 mL/dk ve kolon fırını sıcaklığı için ise 38.41 oC olarak tespit edilmiştir. Hareketli faz olarak farklı oranlarda metanol-su karışımı kullanılmış ve bu şekilde analiz esnasında hareketli fazın polaritesi değiştirilebilmiştir. Geliştirilen MA2 metodunun validasyonu ise OODD numunesi ile yapılmış ve MA2 metodunun sabunlaştırılmış bir deoderize distilat numunesinde bulunan tüm biyoaktif türleri başarılı bir şekilde, tek bir analizle, kısa bir zamanda ve yüksek bir doğrulukla tespit edebildiği görülmüştür.

Abstract:
In this study, physical and chemical properties of olive oil deodorized distillate (OODD) obtained in deoderization stage during refining of olive oil have been examined using titrimetric, chromatographic and spectroscopic methods and new methods that allow to determine with a single analysis of high value-added bioactive components such as free fatty acids (FFA), tocotrienol-tocopherol, sterol, and squalene, which move away from oil due to conditions such as high temperature, low pressure and water vapor of deodorisation stage have been developed using monolithic columns with superior separation properties.
In the first stage of the study, the physical and chemical properties of OODD sample obtained have been examined using international standard methods and the moisture content, the amount of FFA, iodine number, the value of As232 and As270, peroxide number, the number of anisidine, and the number of totox of OODD have been determined. In addition, determination of fatty acid composition, triglyceride (TG) composition, polar and nonpolar substance, polymeric substance, tocopherol-tocotrienol, sterol and squalene have been performed using chromatographic techniques.
In the second stage of the study, new IR spectroscopic methods have been developed by using chemometric methods for the determination of FFA amount and the iodine number of OODD sample. It was seen that the single bounce attenuated total reflectance fourier transform infrared (SB-ATR-FT-IR) technique was suitable for the determination of the iodine number while the fourier transform near infrared (FT-NIR) technique was suitable for the determination of FFA amount of OODD. For quantitative determination of %FFA content of extra virgin olive oils (EVOO), FT-IR spectroscopy technique with different measurement modes and chemometric methods has been used and it was determined that the method which have the best calibration values from 12 different calibration models of partial least squares method (PLS) developed for this purpose is transmission mode using the normal spectrum. In another study using IR spectroscopy for EVOO, medium, near and raman IR spectroscopic techniques have been compared using calibration models of PLS-discriminant analysis (PLS-DA) in order to distinguish extra virgin olive oils from normal olive oils and other edible oils easily and quickly. According to the data obtained from dendrogram and similarity maps, it was determined that FT-NIR technique was the most successful technique in order to distinguish extra virgin olive oils from normal olive oils and other edible oils. 
In the last stage of the study, monolithic separation1 (MA1) method have been proposed which allows the determination of sterols, FFA, tocotrienols, tocopherols, squalene, monoglycerides, diglycerides, and TG structures of edible oils dissolved in acetone by injection into directly the high performance liquid chromatography (HPLC) system without any pretreatment using monolithic column. With the developed MA1 method, TG composition percentages of any edible oil or distillate have been determined. The compound of mobile phase, the flow rate of mobile phase, and the temperature of the column oven of MA1 method have been determined as %40-60 acetone-acetonitrile; 2.00 mL/minute and 30.00 oC, respectively. Sterol, tocotrienol, tocopherol and squalene species determined by standard methods separately have been determined with thanks to monolithic separation2 (MA2) the second and most important method developed using a monolithic column at the first time. The chromatographic parameters of the method have been optimized using chemometric methods and the optimum values of the flow rate of mobile phase, the temperature of the column oven have been determined as 2.50 mL/minute and 38.41 oC, respectively. Different amounts of methanol-water mixture have been used as mobile phase and thus the polarity of the mobile phase has been changed during the analysis. The validation of the developed MA2 method has been done with the OODD sample and it was found that the MA2 method could successfully detect all bioactive species found in a saponified deoderized distillate sample with a single analysis, in a short time and with high accuracy.