SERPINA1 geninde alfa-1 antitripsin eksikliğine (A1ATD) neden olan allellerin ARMS tekniği ile genotiplenmesi
Genotyping of alleles causing alpha-1 antitrypsin deficiency (A1ATD) in SERPINA1 gene by ARMS technique
Yazar: RABİA HANDE ŞAHİNGÖZ
Danışman: PROF. DR. ALİ İRFAN GÜZEL
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer hastalıkları-obstrüktif = Lung diseases-obstructive ; Alfa 1-antitripsin = Alpha 1 antitrypsin ; Amfizem = Emphysema ; Genler = Genes ; Genotip = Genotype ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Alfa-1-antitripsin eksikliği (AATD), SERPINA1 olarak adlandırılan gendeki mutasyonlardan kaynaklı serumda normal sınırlardan düşük AAT seviyeleriyle karakterize otozomal ko-dominant bir hastalıktır. AAT hepatositlerde üretilerek kana salınır ve primer görevi vücudu nötrofil elastaz aktivitesinden korumaktır (antiproteaz). Serum AAT seviyesindeki eksiklik, nötrofil elastaz ve diğer proteolitik enzimlerin akciğer dokusunda hasar oluşturmasına ve buna bağlı olarak da amfizem, kronik bronşit, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), bronşektazi ve astım gibi hastalıklara neden olabilmektedir. SERPINA1 geninde bugüne kadar 100'den fazla farklı mutasyon tanımlanmıştır. Bunlar arasında hastalıkla ilişkili en yaygın varyantlar S ve Z allelleri olarak belirlenmiştir. Normal AAT proteaz inhibitörü (PI) 'M' harfi ile gösterilmektedir. Varyantların tespitinde immünoassay yöntemler, izoelektrik odaklama (IEF) ve moleküler genotipleme (PCR ve PCR-RFLP) gibi yöntemler kullanılmaktadır. Amplifikasyon-refrakter mutasyon sistemi (ARMS), tek baz değişiklikleri veya küçük delesyonlar içeren herhangi bir mutasyonu tespit etmek için basit, hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Literatüre bakıldığında KOAH ve Amfizemli hastalarda ARMS metodu kullanılarak yapılmış bir genotipleme çalışması mevcut değildir. Planlan bu çalışmada ARMS-PCR yöntemiyle hastalıkla en sık ilişkili olan 'S' ve 'Z' varyantları ile bunların normal allellerinin genotiplenmesi amaçlanmıştır. KOAH ve amfizem tanısı konmuş hasta grubu (53 kişi) ile kontrol grubundan (33 kişi) periferik kan alınıp DNA'ları izole edilmiş ve tasarlanan özgün primer dizileri ile de PCR amplifikasyonları yapılmıştır. ARMS-PCR sonuçlarını doğrulamak amacıyla da tüm örneklerin ilgili bölgelerinin dizi analizi yapılmıştır. Sonuç olarak; bu yöntem ile Normal allel ve 'S' varyantı belirlenebilmiş ancak üç farklı primer kullanılmasına rağmen 'Z' varyantı ve normal alleli özgün olarak belirlenememiştir.

Abstract:
Alpha-1-antitrypsin deficiency (AATD) is an autosomal co-dominant disease characterized by low-than-normal serum AAT levels caused by mutations in the gene called SERPINA1. AAT is produced in hepatocytes and released into the blood, and its primary function is to protect the body from neutrophil elastase activity (antiprotease). Deficiency in serum AAT level can cause damage to lung tissue by neutrophil elastase and other proteolytic enzymes, and consequently diseases such as emphysema, chronic bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), bronchiectasis and asthma. More than 100 different mutations have been identified in the SERPINA1 gene to date. Among these, the most common variants associated with the disease were identified as S and Z alleles. Normal AAT protease inhibitor (PI) is denoted by the letter 'M'. Methods such as immunoassay methods, isoelectric focusing (IEF) and molecular genotyping (PCR and PCR-RFLP) are used to detect variants. The amplification-refractory mutation system (ARMS) is a simple, fast and reliable method to detect any mutation containing single base changes or small deletions. When we look at the literature, there is no genotyping study using the ARMS method in patients with COPD and Emphysema. In this planned study, it was aimed to genotype the most commonly associated 'S' and 'Z' variants and their normal alleles with the ARMS-PCR method. Peripheral blood was taken from the patient group (53 individuals) diagnosed with COPD and emphysema and the control group (33 individuals), their DNA was isolated, and PCR amplifications were performed with the designed specific primer sequences. Sequence analysis of the relevant regions of all samples was performed to confirm the ARMS-PCR results. In conclusion; With this method, normal allele and 'S' variant could be determined but 'Z' variant and normal allele could not be detected specifically despite using three different primers.