Amantadinin ratlarda hepatik iskemi reperfüzyon hasarında akciğer ve karaciğer üzerindeki koruyucu etkilerinin araştırılması
The investigation of protective effects of amantadine on lung and liver tissue after hepatic ischemia/reperfusion injury in rats
Yazar: FATİH ŞAHİN
Danışman: DOÇ. DR. AYÇA TAŞ TUNA
Sakarya Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Anesteziyoloji ve Reanimasyon Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Anestezi ve Reanimasyon = Anesthesiology and Reanimation
Dizin: Akciğer = Lung ; Amantadine = Amantadine ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer hastalıkları = Liver diseases ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; Sıçanlar = Rats ; İskemi = Ischemia

Özet:
İskemi/reperfüzyon hasarı, karaciğer cerrahisinin olası bir komplikasyonudur. N-Metil D-Aspartat (NMDA) antagonistlerinin çeşitli doku ve organlarda, iskemi/reperfüzyon (İ/R) hasarına karşı koruyucu olduğu bilinmektedir. Biz bu çalışmada, bir NMDA antagonisti olan amantadinin ratlarda karaciğer İ/R hasarı sonrasında akciğer ve karaciğer dokusu üzerindeki koruyucu etkilerinin araştırılmasını amaçladık.

Etik kurul onayı alındıktan sonra, ağırlıkları 250-330 g. arasında değişen toplam 24 adet wistar cinsi rat rastgele 4 gruba ayrıldı. Gruplar; grup sham (Grup S, n=6), grup amantadin (Grup A, n=6), grup iskemi/reperfüzyon (Grup İ/R, n=6), grup iskemi/reperfüzyon amantadin (Grup İ/R-A, n=6) olarak adlandırıldı. Anestezi uygulanmadan önce tartılan tüm ratlara 100 mg/kg ketamin, 15 mg/kg ksilazin intraperitoneal (i.p) uygulanarak anestezileri sağlandı ve abdominal bölgeleri cerrahi insizyondan önce tıraş edildi. Grup S'de ratlara işlem yapılmadan 15 dakika beklendi. Orta abdominal insizyon yapıldı fakat karaciğere herhangi bir müdahale yapılmadı. Grup A'da amantadin 45 mg/kg i.p yolla verildi. İşlem yapılmadan 15 dakika beklenildi. Orta abdominal insizyon yapıldı fakat karaciğere herhangi bir müdahale yapılmadı. Grup İ/R'de ratlarda yeterli anestezi derinliği sonrasında 15 dakika beklenildi. Ratlara orta abdominal insizyon yapılarak sol portal triaddaki yapılara 45 dakika süreyle atravmatik vasküler klemp uygulandı. 45 dakikalık iskemi süresinden sonra atravmatik vasküler klemp uzaklaştırıldı ve 2 saatlik reperfüzyon uygulandı. Grup İ/R-A'da amantadin 45 mg/kg i.p yolla uygulandı. İşlem yapılmadan 15 dakika beklenildi. Orta abdominal insizyon yapıldı, sol portal triaddaki yapılara 45 dakika süreyle atravmatik vasküler klemp uygulandı. 45 dakikalık iskemi süresinden sonra atravmatik vasküler klemp uzaklaştırıldı ve 2 saatlik reperfüzyon uygulandı. Deneyin sonunda ratlar sakrifiye edilerek akciğer ve karaciğer doku örnekleri alındı. Akciğer ve karaciğer dokularında, malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) düzeyleri çalışıldı. Ayrıca akciğer ve karaciğer dokusu histopatolojik olarak incelendi.

Akciğer dokusu MDA düzeylerinin Grup A'da Grup S'ye göre artmış olduğu Grup İ/R ve Grup İ/R-A'da ise Grup S'ye göre azalmış olduğu saptandı. Grup İ/R-A'da ise en düşüktü. Karaciğer dokusu MDA düzeylerinin Grup İ/R-A'da Grup S, Grup A, Grup İ/R'ye göre artmış olduğu saptandı. Ayrıca Grup A ve Grup İ/R'de Grup S'ye göre azalmış olduğu gözlendi. Akciğer dokusu SOD düzeylerinin Grup İ/R'de Grup S'ye ve Grup A'ya göre artmış olduğu görüldü. Grup İ/R-A'da ise Grup S, Grup A, Grup İ/R'ye göre artmış olduğu saptandı. Karaciğer dokusu SOD düzeylerinin Grup İ/R'de Grup S'ye ve Grup A'ya göre artmış olduğu görüldü. Grup İ/R-A'da ise Grup S, Grup A, Grup İ/R'ye göre artmış olduğu saptandı. Akciğer dokusu CAT düzeylerinde Grup A ve Grup İ/R-A'da Grup S'ye göre artış varken Grup İ/R'de CAT düzeyi en düşüktü. Karaciğer dokusu CAT düzeylerinde gruplar arasında CAT medyanları bakımından benzer bulundu. Ancak enzim düzeyleri açısından hiçbir grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu (p>0,05). 

Histopatolojik incelemede; akciğer dokusunda, Grup İ/R'de nötrofil/lenfosit infiltrasyon skoru Grup S'ye göre istatiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0,007). Alveol duvar kalınlaşma skoru bakımından istatiksel olarak anlamlı fark bulundu (p=0,006). Grup İ/R'de alveol duvar kalınlaşma skoru Grup S ve Grup A'ya göre istatiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0.008, 0.028; sırasıyla). Nötrofil/lenfosit infiltrasyon skoru bakımından istatiksel olarak anlamlı fark bulundu (p=0,004). Grup İ/R'de alveol duvar kalınlaşma skoru Grup S ve Grup A'ya göre istatiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0.011, 0.040; sırasıyla). Karaciğer dokusunda, hepatosit dejenerasyon skoru bakımından istatiksel olarak anlamlı fark bulundu (p=0,004). Grup İ/R'de karaciğer hepatosit dejenerasyon skoru Grup S ve Grup A'ya göre istatiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0.03, 0.044; sırasıyla). Sinüzoidal dilatasyon skoru bakımından istatiksel olarak anlamlı fark bulundu (p=0,020). Grup İ/R'de sinüzoidal dilatasyon skoru Grup S'ye göre istatiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0,017). Piknotik çekirdek skoru bakımından istatiksel olarak anlamlı fark bulundu (p=0,009). Grup İ/R'de piknotik çekirdek skoru Grup S'ye göre istatiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0,006). Nekroza giden hücre skoru bakımından istatiksel olarak anlamlı fark bulundu (p=0,002). Grup İ/R'de nekroza giden hücre skoru Grup S, Grup A ve Grup İ/R-A'ya göre istatiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0.010, 0.010, 0.010; sırasıyla). PMN hücre infiltrasyon skoru bakımından istatiksel olarak anlamlı fark bulundu (p=0,050). Grup İ/R'de PMN hücre infiltrasyon skoru Grup S'ye göre istatiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0,044).

Bu çalışmada, denek sayısının azlığından dolayı akciğer ve karaciğer dokusu biyokimyasal değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulamasak da akciğer ve karaciğer dokusunun histopatolojik olarak İ/R hasarından etkilenmiş olduğunu ve bu hasarın amantadin kullanımıyla geri döndürülebildiğini gözlemledik. Amantadinle ile ilgili İ/R hasarına bağlı uzak organ hasarı çalışmalarının sayısı yetersiz olup bu konuyla ilgili daha çok çalışmaya ihtiyaç vardır.

Abstract:
Ischemia/reperfusion injury is one of the potential complications of liver surgery. It is very well known the fact that N-Methyl D-Aspartate (NMDA) antagonists protect against ischemia/reperfusion (I/R)  injuries in the various tissues and the organs. In this study, we have aimed to examine the protective effects of amantadine, which is known as an NMDA antagonist, on lung and liver tissues following liver I/R injury in rats.

The total number of 24 Wistar rats weighting between 250-330 g  randomly divided into 4 groups after getting acknowledgement of the ethical commitee . The groups are named as following; the group of Sham (Group S, n=6),  the group of Amantadine (Group A, n=6), the group of Ischemia/Reperfusion (Group İ/R, n=6), and the group of Ischemia/Reperfusion Amantadine (Group İ/R-A, n=6). The all types of rats identified above, which are weighted before putting the prcatice of anesthesia, got anesthetized by injecting intraperitoneal 100 mg/kg ketamine and 15 mg/kg xylazine and then the abdominal parts of their bodies are shaved before surgical incision. The 45 mg/kg of amantadine has been given with the way of intraperitoneal in the Group A.  It has been waited 15 minutes without doing any operations to the rats located in the Group S.  Median abdominal incision has been performed but no interventions has been made to the liver. It has again taken 15 minutes following reaching the sufficient surgical depth on the rats classified in the Group I/R.  Having been implemented median abdominal incision to the rats, the patterns placed on the left portal triad have been exposed to the atraumatic vascular clamping during 45 minutes. Following the 45 minutes of ischemia duration, atraumatic vascular clamp is moved away and then, reperfusion taken 2 hours time has been performed .The 45 mg/kg of amantadin in the group İ/R-A has been carried out with the way of the intraperitonel. It has been waited for 15 minutes before exercising any procedure. Median abdominal incision has been performed and atraumatic vascular clamping has been done to the patterns on the left portal triad through out 45 minutes. After 45 minutes of   ischemia duration, atraumatic vascular clamp moved away and 2 hours of reperfusion had performed. After the 45 minutes of ischemia duration, atraumatic vascular clamp is remowed away, and then two hours reperfusion has been carried out. At the end of the experiment, the rats have been sacrificed and lung and liver tissue specimens have been taken so as to be analyzed. The levels of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in lung and liver tissues have been studied. In addition to that knowledge, lung and liver tissue have been investigated histopathologically. MDA levels in the lung tissues have been found to be increased in Group A compared to Group S, whereas Group I/R and Group I/R-A MDA levels decreased compared to Group S.  The Group I/R-A has the lowest level. MDA levels in the liver tissues in Group I/R-A have been found to be increased according to Group S, Group A, Group I/R. It has also been observed that MDA levels have gone down in Group A and Group I/R as it is compared to Group S. SOD levels in the lung tissues have gone up in Group I/R than the Group S and Group A. Moreover, in Group I/R-A, it has been found to have increased when it has been checked against Group S, Group A, Group I/R. SOD levels in the liver tisses have increased in the Group I/R compared to Group S and Group A, while the levels of SOD in Group I/R-A have risen rather than Group S, Group A, Group I/R. The CAT levels in the Group I/R were the lowest when there was an increase in Group A and Group I/R-A compared to Group S at lung tissue CAT levels. Liver tissue at CAT levels was similar in terms of CAT medians among the groups, but there was no statistically significant difference among the groups in terms of enzyme levels (p>0.05). 

Histopathological examination of the lung tissue has revealed the fact that the neutrophil/lymphocyte infiltration score in Group I/R was statistically and significantly higher than the Group S (p=0.007). There was a statistically significant difference in alveolar wall thickening score (p=0.006). The alveolar wall thickening score in Group I/R was statistically and crucially higher than the Group S and the Group A (p=0.008, 0.028, respectively). There was a statistically substantial distinctness in neutrophil/lymphocyte infiltration score (p=0.004). The alveolar wall thickening score in the Group I/R was statistically and outstandingly higher than the Group S and the Group A (p=0.011, 0.040, respectively). There was a statistically prominent difference in hepatocyte degeneration score in the liver tissues (p=0.004). Liver hepatocyte degeneration score in Group I/R has been appeared statistically higher than the Group S and the Group A (p=0.33, 0.044, respectively) in a certain extent. There was also a statistically and chiefly difference in sinusoidal dilatation score  (p=0.020). The sinusoidal dilatation score in Group I/R was statistically significantly higher than Group S (p=0.017).There has been a statistically significant difference in terms of the pyknotic core score (p=0.009).In Group I/R, the pyknotic core score was found statistically significantly higher than Group S (p=0.006). There was a statistically significant difference in necrosis leading cell score (p=0.002). The cell score of necrosis in Group I/R was found statistically significantly higher than Group S, Group A and Group I/R-A (p=0.010, 0.010, 0.010, respectively). There was a statistically significant difference in PMN cell infiltration score (p=0.050). PMN cell infiltration score in Group I/R was found to be statistically and  substantially higher than the Group S (p = 0.044).

In this study, we have not determined a statistically significant difference between the biochemical values of the lung and the liver tissues due to the insufficiency of the number of the subject we have analzed so far now, and we observed that lung and liver tissue was histopathologically affected by I/R injury and that this damage could be reversed by amantadine usage. The number of studies on amantadine and I/R injury remote organ injury is quite insufficient and there is  extremely need for more studies to be done.