Pankreatik genlerin CRISPR yöntemi ile aktivasyonu esnasında farklı dCas9-aktivatör komplekslerinin karşılaştırılması
Comparison of different dCas9-activator complexes during activation of the pancreatic genes by CRISPR method
Yazar: ADEM KABA
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET FATİH CENGİZ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ERSİN AKINCI
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Moleküler biyoloji = Molecular biology

Özet:
Diyabet (Diabetes mellitus) insülin hormonunun olmaması ya da etkisindeki yetersizlik sonucu oluşan, hiperglisemi ile karakterize edilen, metabolik bir hastalıktır. İnsülin bağımlı tip 1 ve insülin bağımsız tip 2 diyabet olmak üzere iki çeşittir. Her iki diyabet çeşidinde de sonuçta insülin üreten pankreatik β hücreleri hasar gördüğü için insülin yetmezliği görülmektedir. Günümüz tedavi yöntemlerine alternatif olarak farklı hücre tiplerinden β hücresi üretilmesi ve üretilen bu hücrelerin kişiye transplantasyonu sonucunda diyabet hastalığının kalıcı bir şekilde tedavi edilmesi planlanmaktadır. β hücresi olmayan hücrelerin insülin üreten hücrelere yeniden programlanması diyabetin tedavisi için potansiyel olarak yeni rejeneratif yaklaşımlar sunmaktadır. Bu kapsamda Pdx1 geniyle beraber Ngn3 ve MafA genlerinin β hücresinin oluşturulmasında ve farklılaşmasında esas transkripsiyon faktörleri olduğu gösterilmiştir. 
Son yıllarda gen düzenlemede kullanılmaya başlanılan CRISPR/Cas sistemiyle beraber bir genin aktivasyonunun arttırılması/azaltılması ya da genin susturulması çok daha kolay hale gelmiştir. Bir genin aktivasyonunu arttırmak için dCas9 proteini ve aktivatör domain yapıları kullanılmaktadır. VP64, VPR ve p300 bu aktivatör domainlerden en sık kullanılanlarıdır. Ancak bu aktivatörlerin aktivasyon verimleri her bir gen için farklılık göstermektedir. Aktivatörlerin yönlendirildikleri promotor bölgesinin transkripsiyon başlama noktasına uzaklığı da aktivasyon verimini etkileyen diğer bir parametredir ve yine her bir gen için farklılık göstermektedir. Bu tez çalışmasında amaç CRSIPR/dCas9 aktivasyon sisteminde Pdx1 ve Ngn3 genlerinin aktivasyonu için en ideal gRNA promotor bölgelerinin ve aktivatör domaininin (VP64, VPR ve p300) belirlenmesidir. Sonrasında en ideal gRNA ve aktivatör domain kombinasyonu ile endogenik genlerin aktivasyonu yoluyla β hücresi programlamaktır. Yapılan çalışmalar sonucunda Pdx1 ve Ngn3 geninin aktivasyonu için hedeflenmesi gereken promotor bölgeleri belirlenmiştir. Ayrıca her iki gen için aktivasyonu en çok arttıran aktivatör domainin VPR olduğu belirlenmiştir. Endogenik genlerin CRISPR-dCas9 ile aktivasyonu sonucu yoluyla insülin üretebilen β hücre benzeri hücrelerin oluştuğu görülmüştür.

Abstract:
Diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by the absence of insulin hormone or inadequate effect, characterized by hyperglycemia. There are two types of insulin-dependent type 1 and insulin-independent type 2 diabetes. In both diabetes, insulin deficiency is seen as the pancreatic beta cells that produce insulin are damaged. As an alternative to today's treatment methods, it is planned to produce β cells from different cell types and to permanently treat diabetes disease as a result of the transplantation of these cells to the person. Reprogramming non- β cells to insulin-producing cells offer potentially new regenerative approaches for the treatment of diabetes. Ngn3 and MafA genes, along with the Pdx1 gene, have been shown to be essential transcription factors in beta cell formation and differentiation.
With the CRISPR/Cas system, which has been used in gene regulation in recent years, it has become much easier to increase/decrease the activation of a gene or to silence the gene. To increase activation of a gene, dCas9 protein and activator domain structures are used. VP64, VPR and p300 are the most frequently used activator domains. However, the activation efficiencies of these activators differ for each gene. The distance of the promoter region from which the activators are directed to the transcription start point is another parameter that affects the activation efficiency and again differs for each gene. The aim of this thesis is to determine the most ideal gRNA promoter regions and the most ideal activator domain (VP64, VPR and P300) for activation of Pdx1 and Ngn3 genes in the CRISPR/dCas9 activation system. Then the most ideal gRNA and activator domain combination is to program the β cell through the activation of endogenic genes. As a result of the studies, the promoter regions to be targeted for the activation of the Pdx1 and Ngn3 gene were determined. In addition, it was determined that the activator domain that increases activation most for both genes is VPR. It has been observed that β cell-like cells that can produce insulin are formed through the activation of endogenic genes with CRISPR-dCas9.