İnsan kolanjiokarsinoma hücre hattında silibinin'in antikanserojen etkinliğinin ve epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) ile olan ilişkisinin araştırılması
Investigation of silibinin's anticancer activity and its relationship with epithelial mesenchymal transition (EMT) in human cholangiocarcinoma cell line
Yazar: MERVE ÖZEL
Danışman: PROF. DR. GÜLDEN BAŞKOL
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Apoptozis = Apoptosis ; Epitel hücreleri = Epithelial cells ; Hücre dizisi = Cell line ; Karsinoma = Carcinoma ; Kolanjiokarsinoma = Cholangiocarcinoma ; Silibinin = Silibinin

Özet:
Kolanjiokarsinom (KK), safra kanalının epitel hücrelerinden kaynaklanan malign bir tümördür. Tümör metastazı hastaların kötü prognozu ve kısa süreli sağkalım ile ilişkili olduğundan, KK için alternatif terapötik yaklaşımlara acil ihtiyaç vardır. 
Epitelyal mezenkimal geçiş (EMT), kanserde epitelyal hücrelerin mezenkimal bir fenotip kazanmasını sağlayan çoklu biyokimyasal değişikliklere izin veren, biyolojik bir süreçtir. Bu geçiş sırasında epitel hücreler, E-kaderin (E-kad) ve keratinler gibi tipik epitelyal belirteçlerin ekspresyonunu aşamalı olarak kaybederek Vimentin (Vim), α-düz kas aktin (α -SMA) ve N-kaderin (N-kad) olmak üzere tipik mezenkimal belirteçlerin ekspresyonunu kazanırlar. 
Bu tez projesinde; insan kolanjiokarsinoma hücre hattında (TFK-1) Silibinin'in antikanserojen etkinliğini ve epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) ile olan ilişkisini  araştırdık.
Çalışmada, in vitro ortamda KK hücre hattı olan TFK-1 hücrelerine  farklı konsantrasyonlarda (5µM, 10µM, 25μM, 50µM, 75 μM, 100μM, 200µM) 48 saat süreyle Silibinin uyguladık. Silibinin'in doza bağlı bir şekilde hücre proliferasyonunu anlamlı olarak azalttığını(p<0.001) ve  IC50 değerini 200 μM olarak bulduk. Silibinin'in 200 μM konsantrasyonda, kontrol grubuna göre koloni oluşumunu anlamlı olarak inhibe ettiğini(p<0.05), kanser hücrelerinde hücre göçünü engellediğini(p<0.001), erken ve geç apopitozun indüklenmesine bağlı olarak total apopitozu indüklediğini (p<0.05) ve hücre döngüsünde kanser hücrelerini G0/G1 fazında tuttuğunu, S evresini arttırdığını bulduk (p<0.001). 
Silibinin verilen grupta, kontrol grubuna göre E-kad, N-kad, Vim ve α-SMA protein seviyelerinin anlamlı olarak azaldığını bulduk (p<0.001, p<0.05p<0.001,p<0.001).

Sonuç olarak, çalışmamızda TFK-1 hücre hattında Silibinin'in hücre proliferasyonunu, koloni oluşumunu azalttığını, migrasyonu engellediğini, apopitozu indüklediğini ve kanser hücrelerini G0/G1 evresinde tutarak kanser progresyonunun engellenmesinde etkili olabileceğini gösterdik.Bununla birlikte, N-kad, Vim ve -SMA protein konsantrasyonlarını azaltarak EMT sürecini engelleyebileceğini de gösterdik. Ancak, Silibinin'in TFK-1 hücre hattında,  E-kad protein konsantrasyonunu azaltması kanser türüne göre değişen dual etkiler gösterdiğini kanıtlar niteliktedir. Her ne kadar E-kad'ın TFK-1'deki rolü belirsiz olsa da Silibinin'in KK tedavisinde kullanımı için E-kad mekanizmalarının aydınlatılması ile kullanımının faydalı olabileceğini düşünmekteyiz.

Anahtar Kelimeler: Apopitoz; E-kad; EMT; N-kad; Silibinin; TFK-1

Abstract:
Cholangiocarcinoma (CCA) is a malignant tumor originating from bile duct epithelial cells. Since tumor metastasis is associated with poor prognosis and short-term survival of patients, there is an urgent need for alternative therapeutic approaches for CCA.
Epithelial mesenchymal transition (EMT) is a biological process in cancer that allows multiple biochemical changes that enable epithelial cells to acquire a mesenchymal phenotype. During this transition, epithelial cells progressively lose expression of typical epithelial markers such as E-cadherin (E-cad) and keratins while gaining expression of typical mesenchymal markers such as Vimentin (Vim), α-smooth muscle actin (-SMA) and N-cadherin (N-cad).
In this thesis project; we investigated the anticarcinogenic effectiveness of Silibinin and its relationship with epithelial mesenchymal transition (EMT)in the human cholangiocarcinoma cell line (TFK-1).
In the study, we applied Silibinin at different concentrations (5µM, 10µM, 25µM, 50µM, 75 µM, 100µM, 200µM) to TFK-1 cells, a cholangiocarcinoma cell line, for 48 hours in vitro. We found that Silibinin significantly reduced cell proliferation in a dose-dependent manner (p<0.001) and the IC50 value was 200 μM.We found that Silibinin, at 200 μM concentration, significantly inhibited colony formation(p<0.05), inhibited cell migration of cancer cells(p<0.001), induced total apoptosis due to the induction of early and late apoptosis (p<0.05), arrest cancer cells in the G0/G1 phase of the cell cycle, and increased the S phase compared to the control group (p<0.001).
We found that E-cad, N-cad, Vim and α-SMA protein levels were significantly decreased in the Silibinin group compared to the control group(p<0.001, p<0.05p<0.001,p<0.001).
In conclusion, in our study, we showed that Silibinin reduces proliferation, colony formation, inhibits migration, induces apoptosis and, can be effective in preventing cancer progression by arresting cancer cells in the G0/G1 phase in the TFK-1 cell line. Besides, we also showed that Silibinin can inhibit the EMT process by reducing N-kad, Vim and -SMA protein concentrations. However, the fact that Silibinin reduces E-cad protein concentration in TFK-1 cell line proves that it has dual effects that vary according to the cancer type. Although the role of E-cad in TFK-1 is unclear, we think that the use of Silibinin in the treatment of CCA can be beneficial by elucidating the mechanisms of E-cad.

Key Words: Apoptosis; E-cad; EMT; N-cad; Silibinin; TFK-1