Hepatosellüler karsinomada plexin C1'in etkileşim partnerlerinin belirlenmesi
Identification of plexin C1 interaction partners in hepatocellular carcinoma
Yazar: MELİKE BİNNUR BAHÇEKAPILI
Danışman: PROF. DR. TAMER YAĞCI
Gebze Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Karaciğer kanseri tanılarının ve ölümlerinin çoğunluğundan sorumlu olan Hepatoselüler karsinoma (HCC), dünyada en sık görülen altıncı, ölümle sonuçlanan kanserler içerisinde üçüncü sırada yer almaktadır. Bu da kötü prognoza ve sınırlı mevcut tedavilere işaret etmektedir. Plexin C1 (PLXNC1), sinir siteminde hücre yüzey molekülleri olarak keşfedilmiştir. PLXNC1'in ifade düzeyi HCC dahil farklı kanser türleri özelinde araştırılmıştır. Ancak PLXNC1'in etkileşim partnerleri ve HCC hücrelerinde aktin dinamiklerine etkisi bilinmemektedir. PLXNC1 biyolojisini, etkileşimde bulunduğu partnerleri ve bunlar sayesinde etkileşimde bulunduğu yolakları anlamak önemli bir araştırma konusudur.
Bu amaçla iki farklı HCC hücre hattı kullanılarak PLXNC1 ifadesi baskılanmış hücreler oluşturuldu. Ardından hücre klonlarına PLXNC1'in bilinen ligandı Semaforin 7A (SEMA7A) verilerek PLXNC1-SEMA7A etkileşiminin aktin dinamiklerine etkisi araştırılmıştır. Gözlemlediğimiz sonuçlara göre, PLXNC1 varlığında SEMA7A Kofilin fosforilasyonuna yol açmakta ve Kofilin inaktivasyonu üzerinden F-aktin birikimine neden olmaktadır. Hep3B-shPLXNC1 ve PLC/PRF/5-shPLXNC1 hücrelerinde azalmış PLXNC1 ifadesi SEMA7A uygulamasına bağlı Kofilin fosforilasyonunu baskılamakta ve böylelikle aktif kalan Kofilin aktin depolimerizasyonuna neden olmaktadır. PLXNC1'in etkileşim partnerlerini bulmak amacıyla birlikte immün çöktürme (CO-IP) yöntemiyle proteinler çöktürüldü ve Kütle Spektroskopisine gönderildi. Analiz sonucunda edilen proteinlerden birkaçı aday proteinler olarak seçildi. Bu aday proteinlerden MUC13, NALP2, Alix ve IPO5 deneysel olarak doğrulamak için western blot yöntemi ile kontrol edildi. Sonucu pozitif olarak değerlendirilebilir olan NALP2 ve MUC13 aday olarak netleşti. Bu tez çalışmasındaki bulgular PLXNC1 tarafından düzenlenen EMT, sitoiskelet modellenmesi ve çoklu-kinaz inhibitörlerine yanıtın olası düzenleyici moleküllerinin tanımlanmasında yol gösterici katkısı olacaktır.

Abstract:
Hepatocellular carcinoma (HCC), which is accountable for the majority of liver cancer diagnoses and deaths, is the sixth most common cancer in the world and the third among the cancers that result in death. This indicates a poor prognosis and limited available treatments. Plexin C1 (PLXNC1) has been discovered as cell surface molecules in the nervous system. The expression level of PLXNC1 has been investigated in different types of cancer, including HCC. However, the effect of PLXNC1 on actin dynamics in interaction partners and HCC cells is unknown. Understanding the biology of PLXNC1, the partners it interacts with, and the pathways through which it interacts is an important research topic.
For this purpose, cells with suppressed PLXNC1 expression were created using two different HCC cell lines. Then, the effect of PLXNC1-SEMA7A interaction on actin dynamics was investigated by giving the known ligand of PLXNC1 Semaphorin 7A (SEMA7A) to cell clones. Hence, in the presence of PLXNC1, SEMA7A causes Cofilin phosphorylation and causes F-actin accumulation through Cofilin inactivation. Decreased PLXNC1 expression in Hep3B-shPLXNC1 and PLC/PRF/5-shPLXNC1 cells suppresses Cofilin phosphorylation due to SEMA7A administration, thus causing actin depolymerization of Cofilin, which remains active. To find interaction partners for PLXNC1, the proteins were precipitated by co-immunoprecipitation (CO-IP) and submitted to Mass Spectroscopy. Given the analysis few candidate proteins were selected. Of these candidate proteins, MUC13, NALP2, Alix and IPO5 were checked by western blot to experimentally confirm. NALP2 and MUC13, whose results could be evaluated as positive, were clarified as candidates. The findings in this thesis study will contribute to the identification of possible regulatory molecules of EMT regulated by PLXNC1, cytoskeleton modelling and response to multi-kinase inhibitors.