Süt ürünleri ve zeytinde bozulmaya neden olan maya türlerinin "real-time PCR yüksek çözünürlüklü erime analizi" ile tanımlanması
Identification of spoilage yeasts in dairy products and olives with real-time PCR high resulotion melting analyses
Yazar: MİNE ERDEM
Danışman: DOÇ. DR. ZÜLAL KESMEN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bozulma = Degradation ; Gıdalar = Foods ; Mayalar = Yeasts

Özet:
Mayalar, tek hücreli ökaryotik mikroorganizmalar olup günümüzde endüstriyel öneme sahip birçok ürünün, ekmek, bira ve şarap gibi çeşitli fermente gıdaların üretiminde büyük ölçüde yararlanılmaktadır. Bununla birlikte birçok maya türü, gıdalarda gelişerek arzu edilmeyen değişikliklere neden olmakta ve sonuçta bu ürünlerin değişik şekillerde bozulmalarına yol açmaktadır. Gıda üretim hattında ve üründe bozulma ya da kalite düşmesine neden olan maya türlerinin hızlı ve doğru bir şekilde tespit edilerek bozulma etkeni türe özgü, koruyucu tedbirlerin alınması, kaliteli bir üretim için zorunludur. Ancak günümüzde mayaların tanımlanmasında yaygın olarak doğruluğu ve tekrarlanabilirliği oldukça düşük olan fenotipik testlere dayalı tanımlama yöntemleri kullanılmaktadır. Dolayısıyla gün geçtikçe gıda mikrobiyolojisi açısından önemleri daha iyi anlaşılan mayaların hızlı ve doğru bir şekilde tespiti için genotipik testlere dayalı alternatif tanımlama yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır.

Bu nedenle bu tez çalışmasında maya türleri arasında değişkenlik gösteren DNA dizilerine ait yüksek çözünürlüklü erime dereceleri (Tm) ve erime eğrilerinin (HRM analizi) analizini sağlayacak real-time PCR'a dayalı bir tanı yönteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla çalışmanın ilk aşamasında, kaymak, yoğurt, peynir ve zeytin gibi çeşitli gıda ürünlerinden izole edilen mayalar (GTG)5 rep-PCR analizi ile tiplendirildikten sonra ITS bölgesini hedef alan dizi analizi ile tanımlanmıştır. Analiz edilen gıda örneklerinin maya florasında Kluyveromyces marxianus ve Debaryomyces hansenii türleri baskın olmakla birlikte bunların dışında Pichia membranifaciens, Pichia fermentans, Pichia kluyveri, Pichia kudriavzevii, Candida zeylanoides, Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania servazzii, Kluyveromyces lactis, Saturnispora sp., Kazachstania naganishii, Pichia anomala, Ustilago hordei, Torulaspora delbrueckii, Yarrowia. lipolytica, Clavispora lusitaniae, Candida diversa, Candida sake ve Kazachstania exigua olmak üzere toplam 20 farklı maya türü tanımlanmıştır.

Tanımlanan 20 maya türüne ait izolatlar 26S rRNA geni üzerinde D1/D2 bölgesini hedef alan universal NL1-LS2 ve U1-U2 primer setleri kullanılarak real-time PCR HRM ve Tm analizine tabi tutulmuşlardır. Analiz edilen maya izolatlarının U1-U2 bölgesine ait ortalama Tm değerleri 81.482–91.332 °C aralığında, NL1-LS2 bölgesine ait Tm değerleri ise 81.116–88.087 °C aralığında tespit edilmiştir. NL1-LS2 bölgesinin Tm analizi sonucunda 12 maya türünün, U1-U2 bölgesinin analizi sonucunda ise 16 maya türünün Tm değerlerinin istatistiki olarak birbirinden önemli derecede farklı olduğu saptanmıştır. Tm analiz sonuçlarına paralel olarak NL1-LS2 bölgesine ait HRM eğrilerinin 16 maya türü, U1-U2 bölgesine ait HRM eğrilerinin ise 20 maya türü için türe spesifik olduğu belirlenmiştir. 

Sonuç olarak, real-time PCR HRM ve Tm analizinin, gıdalarda bozulma yapan mayaların karakterizasyonunda kullanılabilecek hızlı ve kolay uygulanabilen bir yöntem olmasının yanı sıra sadece gıdalarda bozulma yapan maya türlerinin değil birçok mikroorganizma grubunun tanımlanmasında kullanılabilecek potansiyel bir analiz yöntemi olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Yeasts are eukaryotic microorganisms with single-celled and nowadays they play important role in producing a variety of products which have industrial importance and a variety of fermented foods such as bread, beer and wine. However, a lot of yeast species leads to undesirable changes like spoilage in foods in different ways. The detection of yeast species, which cause decomposition in food products or reduction in quality, accurately and quickly results in taking species-specific precautions. But current identification systems based on phenotypic tests have poor repeatability, expensive and time-consuming. Therefore, it is necessary to develop alternative identification methods depending on genotypic methods, which give fast and reliable results.

For this reason, in this study we aim to develop a method depends on the real-time PCR analysis, which enables to analyze the high resolution melting temperature (Tm) and melting curves (HRM) of the DNA sequences. For this purpose, after typing via (GTG)5 rep-PCR analysis, the yeasts isolated from some food products like cream, yoghurt, cheese, and olives were identifed by sequencing using ITS region.  Although Kluyveromyces marxianus and Debaryomyces hansenii among yeast species analysed were dominant, 20 different yeast species including, Pichia membranifaciens, Pichia fermentans, Pichia kluyveri, Pichia kudriavzevii, Candida zeylanoides, Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania servazzii, Kluyveromyces lactis, Saturnispora sp., Kazachstania naganishii, Pichia anomala, Ustilago hordei, Torulaspora delbrueckii, Yarrowia. lipolytica, Clavispora lusitaniae, Candida diversa, Candida sake and Kazachstania exigua were also identified. 

The isolates belong to yeast species were subject to real-time PCR HRM and Tm analyses using NL1-LS2 and U1-U2 primers targeting of sequence of D1/D2 region of 26S rDNA.  The Tm values of the yeast isolates that produced by U1-U2 primer pair were between 81.482–91.332 °C while the Tm values obtained with NL1-LS2 primer pair were between 81.116–88.087 °C. A total 12 yeast species which were analysed based on the NL1-LS2 region and 16 yeast species which were analysed based on U1-U2 region were showed significantly different Tm values. In similar with Tm analysis results, HRM curves of 16 yeast species belong to NL1-LS2 region and HRM curves of 20 species obtained with analysis of U1-U2 region were found as species specific.

As a result it was concluded that the real-time PCR HRM and Tm analyses is a rapid and easy method to be used in the characterization of the spoilage yeasts. It was also a potential analysis that can be used not only to identify the spoilage yeasts but also in the identification of the many of the microorganism groups.