Amniyosit kültürlerinde gestasyonel yaş ve hücre pasaj sayısına göre kök hücre belirteçlerinin ve ekspresyon değişimlerinin incelenmesi
The examination of stem cell markers and their expression changes in amniocyte cell cultures depending on the gestational age and number of cell passage
Yazar: EZGİ ÇOKAKLI
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM İZCİ AY
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Amniotik sıvı = Amniotic fluid ; Amniyosit = Amniocyte ; Embriyo = Embryo ; Kök hücreler = Stem cells ; Rejeneratif tıp = Regenerative medicine

Özet:
Amniyotik sıvı içerisindeki heterojen hücre popülasyonu farklı seviyelerde kendini yenileyebilen hücre gruplarından oluşmaktadır ve bu hücrelerin kök hücre özellikleri henüz tam olarak karakterize edilmemiştir. Multipotent özellikte olması ve etkili yeniden programlama kapasiteleri nedeniyle amniyotik sıvı hücreleri (AFC) son yıllarda rejenaratif tıp için umut veren hücre kaynakları olarak görülmektedir. AFC'ler transfeksiyonel ve kimyasal stratejiler ile indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC)'ler oluşturmak için terminal olarak farklılaşmış hücrelerden daha kolay ve etkili bir şekilde yeniden programlanabilirler. Fakat AFC'lerin kök hücre potansiyelleri ve farklı hücre soylarına farklılaşma kapasitesi tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmada, 17 hastadan alınan örnekler yardımıyla pluripotensi belirteçlerinin AFC'lerdeki ekspresyon profilleri Real-Time PCR ile araştırılmıştır. Ayrıca gestasyonel yaş, maternal yaş, pasaj sayısı ve cinsiyetin AFC kültürlerindeki bu ekspresyon değişimleri ile ilişkili olup olmadığı incelenmiştir. Son olarak, pluripotensi belirteçlerinin zaman içerisinde pasaj sayıları arasındaki ekspresyonel değişimleri kantitatif olarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, farklı hastalardan alınan AFC örneklerinde incelenen bütün pluripotensi belirteçlerinin (OCT3/OCT4, SOX2, KLF4, MYC, KIT, NANOG, DPPA3, DPPA5, FUT4, SALL4) eksprese olduğunu göstermiştir. Klinopatolojik özelliklere göre ekspresyon seviyeleri karşılaştırıldığında SOX2, DPPA3 ve DPPA5 gen ekspresyonlarının düşük gestasyonel yaşlarda anlamlı derecede yüksek olduğu ama sadece SOX2 ve DPPA5'in maternal yaşı 30'dan küçüklerde daha yüksek olduğu görülmüştür (p<0.05). Ayrıca, daha uzun kültüre edilen izolatlarda KIT, NANOG, SALL4, SOX2 ekspresyonlarının anlamlı derecede yüksek olduğu gözlenmiştir. Aynı izolatın bütün pasajları kantitatif olarak karşılaştırıldığında, KIT, DPPA5 ve SOX2 belirteçlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim görülmüştür. Pasajlama süresince KIT pozitif hücrelerin selektif seçilime uğrayarak hayatta kaldığı fakat proliferasyon ve sağkalımdaki potansiyel rolleri sebebiyle DPPA5 ve SOX2 ekspresyon seviyelerinin pasajlama ile azaldığı gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, elde edilen bulgular AFC'nin kendine özgü bir kök hücre profiline sahip olduğunu ve gestasyonel, maternal yaş ve bireysel belirteçlerin yeniden programlama ve rejeneratif tıp uygulamaları için hücre seçiminde etkili olabileceğini ortaya koymuştur.

Abstract:
As being a heterogenous population but having different pools of self-renewing cells, amniotic fluid cells (AFCs) have been considered as promising cell sources for regenerative medicine owing to their multipotency and effective reprogramming capacity. AFCs can more easily and effectively be reprogrammed than terminally differentiated cells to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) by transfectional and chemical strategies. But stem cell dynamics and differentiation capacity of AFCs into multiple lineages were poorly understood. In this study, the expression profile of pluripotency markers in AFCs taken from 17 patients were investigated by Real-Time PCR. Moreover; whether the gestational age, maternal age, culture time or gender could account for expressional changes among AFC cultures was also questioned. Finally, effect of time as passage number on expression of pluripotency markers was analyzed quantitatively. The results showed that all the pluripotency markers (OCT3/OCT4, SOX2, KLF4, MYC, KIT, NANOG, DPPA3, DPPA5, FUT4, SALL4) were expressed in AFCs from different patients. When the expression levels were compared according to clinopathological properties, SOX2, DPPA3 and DPPA5 expressions were found as significantly higher in low gestational ages while only SOX2 and DPPA5 as higher in younger maternal ages (p<0.05). Additionally, a strong correlation was observed for higher expression of KIT, NANOG, SALL4, SOX2 in longer-cultured isolates. When all passages of same isolate were quantitatively compared, a significant change for KIT, DPPA5 and SOX2 was found. KIT positive cells were seemed as selectively survived during passaging, but DPPA5 and SOX2 were found as decreased suggesting their potential role for proliferation and maintenance. Consequently, our results revealed that AFCs have a unique stem cell profile and gestational, maternal age and expression of individual markers may be impactful when choosing cells for reprogramming and regenerative medicine applications.