Süne (Eurygaster spp.) proteolitik enzimlerinin izolasyonu, karakterizasyonu, saflaştırılması ve gluten proteinleri üzerine etkilerinin belirlenmesi
Isolation, characterization, purfication of wheat bug (Eurygaster spp.) proteases and determination of its effects on gluten proteins
Yazar: DİLEK SİVRİ
Danışman: DOÇ. DR. HAMİT KÖKSEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 1998
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Buğday = Wheat ; Enzimler = Enzymes ; Glutenler = Glutens ; Proteinler = Proteins ; Süne = Shield bug

Özet:
Ülkemizde ve çevre ülkelerde buğdayda hasat öncesi süne (Eurygaster spp.) ve kımıl (Aelia spp.) zararı oldukça yaygın olarak görülmektedir. Zarar görmüş buğday, böcek salgısında bulunan proteazları içerir. Bu buğdaylardan yapılan ekmeklerin hacimleri ve ekmek içi özellikleri düşüktür. Bu çalışmada süne proteazı, süne zararı (Eurygaster spp.) görmüş buğdaydan izole, karakterize ve purifiye edilmiştir. Saflaştırılmamış enzim ekstraktı üzerindeki çalışmalar bu enzimin pH 8.5 ve 35 °C de optimum aktivite gösteren ve su ile ekstrakte edilebilen bir alkali proteaz olduğunu göstermektedir. İzoelektrik odaklama yöntemi ile pl 8.0' de proteaz aktivitesi gösteren bir bant elde edilmiştir. Enzimin jel filtrasyon (Sephadex G-75) ile belirlenen molekül ağırlığı (Mr) 15 kDa dır. Süne proteazı su ekstraktından amonyum sülfat ile çöktürme, jel filtrasyon ve iyon değişim (QAE Sephadex A-50) kromotografisi gibi tekniklerle 365 kat saflaştırılmıştır. Süne proteazı, serin proteazlarda aktif bölgeyi inhibe eden tripsin inhibitörü ve SH- grubunu modifiye eden p-kloromerküribenzoik asit (p CMB) tarafından inhibe edilmiş olup, bu durum enzimin serin proteazların SH- grubu içeren bir alt grubunda yer aldığını göstermektedir. Modifiye Zeleny ve SDS Modifiye Sedimentasyon testleri, bilinen substratlar (kazein, azokazein ve hemoglobülin) ile uygulanan genel proteaz aktivitesi metotları ve SDS-protein jel metodu süne proteaz aktivitesini belirlemek amacıyla denenmiştir. En uygun metot olarak daha önce Yeni Zellanda' da Nyshts proteazı için geliştirilmiş olan modifiye SDS-protein jel metodu tespit edilmiştir. Ayrıca süne proteaz aktivitesini belirlemek için süne zararı görmüş buğday unlarda, 37 °C de 2 saat inkübasyon sonucunda %50 1-Propanolde çözünmeyen glütenin miktarının azalması esasına dayanan bir mikro yöntem geliştirilmiştir. Altı adet ekmeklik buğday çeşitinin (Bezostaya, Lancer, Kırkpınar, Ankara, Kıraç ve Gün) gluten proteinleri üzerine süne (Eurygaster maura) proteazının etkisi asit poliakrilamid jel elektroforez (A-PAGE) ve sodyum dodesil sülfat (SDS-PAGE) jel elektrofbrez teknikleri ile incelenmiştir. Elektroforez sonuçları süne proteazının gliadin ve glutenin proteinlerinin elektroforetik desenlerini etkilediğini açıkça göstermektedir. Orjinal gliadin ve glutenin desenlerinde mevcut olan bantların çoğuinkübasyon süresi arttıkça kaybolmuştur. Özellikle yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) glütenin alt birimlerinin enzimden daha fazla etkilendiği tespit edilmiştir. Bu altı adet buğday çeşitinin %50 1-Propanolde çözünmeyen glutenin (50PI) ve alt birimlerinin (HMW ve LMW) süne proteazı (Eurygaster matua) tarafından degradasyonu ters faz yüksek performanslı likid kromotografisi (RP-HPLC) ile kantitatif olarak incelenmiştir. Toplam glütenin (50PI), HMW ve 1MW glutenin ah birimlerinin yaklaşık %80 oranında azalması glutenin proteinlerinin süne proteazı tarafından önemli düzeyde parçalandığını göstermektedir. Aynı proteaz aktivitesine sahip bazı buğday çeşitlerinin süne proteazından nicel olarak farklı düzeylerde etkilendikleri belirlenmiştir. Buğday çeşitlerinin süne (Eurygaster integriceps) proteazının etkisine karşı duyarlılıklarındaki farklılıklar RP-HPLC tekniği ile saptanmıştır. Genellikle ekmeklik kalitesi yüksek olan çeşitlerin (Bezostaya, Lancer ve Gün) süne proteazının hidroliz etkisine karşı, düşük kaliteli çeşitten (Kırkpınar) daha dayanıklı olduğu tespit edilmiştir. Emgi noktası görülebilen, zarar görmüş taneler çeşitli tabakaları görülecek şekilde kesilerek SEM ile incelenmiştir. Zararın emgi noktası etrafında sınırlı bir bölgede etkili olduğu ve tanenin diğer kısımlarının normal göründüğü belirlenmiştir. Zarar görülen kısımlarda protein ağının hemen hemen tamamıyla tahrip olduğu ve nişasta granüllerinin açıkça görülebildiği tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Süne {Eurygaster spp.), süne zararı görmüş buğday, proteaz, gluten, gliadin, glütenin, yüksek molekül ağırlıklı (HMW) glütenin alt birimleri, düşük molekül ağırlıklı (LMW) glütenin alt birimleri

Abstract:
Preharvest damage to cereal grains by wheat bugs (Eurgaster spp. and Aelia spp.) is widespread in Turkey and surrounding countries. The bug damaged wheat contains bug salivary proteases. Bread made from this wheat has a characteristically poor loaf volume and inferior crumb properties. In this study the bug protease isolated from suni bug {Eurgaster spp.) damaged wheat was characterized and purified. Various protease assays were examined for measurement of bug protease activity. Studies on crude enzyme extract have shown that the enzyme is a water-extractable alkaline protease with optimum activity at pH 8.5 and 35 "C. Isoelectric focusing (IEF) revealed one enzyme activity band (pi 8.0). The enzyme had an Mr of 15 kDa as determined by gel filtration chromotography on Sephadex G-75. The protease was purified 365 fold from the water extract of the bug damaged (Eurygaster integriceps) wheat by amonnium sulphate precipitation, gel filtration and ion exchange chromotography (QAE Sephadex A-50) techniques. The protease activity was inhibited by an active-site inhibitor of serine protease, tyripsin inhibitor and also by an SH-modifiying reagent p-chloromercuribenzoic acid, suggesting that the protease is one of a subfamily of SH- containing serine proteases. Modified Zeleny and modified SDS sedimentation tests, general protease activity methods with known substrates (casein, azocasein and hemoglobin) and SDS-protein gel method were examined in order to measure bug protease activity. The most suitable method was found to be modified SDS-protein gel method which was developed orginally for Nysius protease in New Zealand. A new microassay was also developed for the determination of bug protease activity based on the decrease in the amount of 50% 1-propanol insoluble glutenin in bug damaged wheat flours incubated for2hoursat37°C. The effects of bug protease (Eurygaster maura) on gluten proteins of six bread wheat cultivars (Bezostaya, Lancer, Kirkpinar, Ankara, Kirac and Gün) were investigated by acid polyacryilamide gel electrophoresis (A-PAGE) and sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Electrophoresis results showed that the bug protease clearly affected electrophoretic patterns of gliadin and glutenin proteins. Most of the bands in the original gliadin and glutenin patterns disappeared¥11 with increasing incubation time. Especially, high molecular weight (HMW) glutenin subunits seemed to be the most strongly affected by the enzyme. The degradation of 50% 1-propanol insoluble glutenin (50P1) of the six bread wheat cultivars by wheat bug (Eurygaster maura) protease was also investigated using RP- HPLC quantitatively. 50PI glutenin was substantially degraded as evidenced by around 80% decrease in total glutenin, HMW and low molecular weight (LMW) glutenin subunits. Some wheat cultivars with the same level of protease activity had significantly different quantitative responses to the bug protease. The variations in the susceptibility of wheat cultivars to the effects of bug protease (Eurygaster integriceps) were confirmed by using reversed phase high performance liquid chromotography (RP-HPLC). Generally, high quality bread wheat cultivars (Bezostaya, Lancer and Gun) resisted to the hydrolyzing effects of bug protease more than the lower quality bread wheat cultivar (Kirkpinar). Kernels of bug damaged wheat showing bite marks were cut to expose the various layers at the point of piercing and viewed with SEM. The damage was observed in a small area around the bite mark. Other parts of the kernel except affected area looked normal. In damaged parts, the protein matrix was almost completely destroyed and starch granules were observed clearly. Keywords: wheat bug, (Eurygaster spp.), bug damaged wheat, protease, gluten, gliadin, glutenin, high molecular weight glutenin subunits (HMW), low molecular weight glutenin subunits (LMW)