Baş boyun kanseri hücre hatlarında borik asitin tümör supressör gen ekspresyonlarına etkisinin incelenmesi /
Yazar: KÜBRA FAKIOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. ESRA GÜNDÜZ
Turgut Özal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Borik asit = Boric acid ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler-P53 = Genes-P53 ; Genler-tümör baskılayıcı = Genes-suppressor-tumor ; Hücre dizisi = Cell line ; Kafa ve boyun neoplazmları = Head and neck neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Amaç: Bu çalışmada son zamanlarda bir çok alanda kullanılan ve alternatif tedavide yeni bir bakış açısı olabilecek olan borik asitin baş boyun kanseri hücre hatlarında proliferasyon ve tümör supressör gen ekspresyonlarına etkisi araştırılmıştır
Materyal ve Metod: baş boyun kanseri hücre hattı olan UT-SCC 6A, 6B, 9A, 16A, 16B,24A, 54C, 74A, ve 74B hücre hatları 200ug/ml ile 1800ug/ml dozları arasında borik asit ile muamele edildi ve XTT assay ile uygun doz tayini yapıldı. Ardından uygun doz ile muamele edilen hücrelerden trizol ile RNA izolasyonu yapıldı. Elde edilen RNA lar cDNA'ya çevrildi. P53, RB1, ING1 ve ING3 primerlerinin çalışma sıcaklığını tespit etmek için gradient PCR yapıldı. Real-time PCR da kullanılmak üzere standart hazırlamak için gradient PCR sonrası jel ekstraksiyonu yapıldı. Uygun çalışma programı ayarlanarak elde edilen örneklerin ekspresyon analizi real-time PCR İle yapıldı.
Bulgular: Kullandığımız hücre hatlarında UT-SCC UT-SCC 6A, 6B, 9A, 16A, 16B,24A, 54C, 74A ve 74B hücre hatlarının hepsinde de borik asit proliferasyonu önemli oranda düşürdüğü tespit edilmiştir. UT-SCC 6A hücre hattında en etkin doz  1000ug/ml, UT-SCC 6B hücre hattında en etkin doz 1800ug/ml, UT-SCC 16A hücre hattında en etkin doz  800ug/ml, UT-SCC 16B hücre hattında en etkin doz  1000ug/ml, UT-SCC 24A hücre hattında en etkin doz  1600ug/ml, UT-SCC 54C hücre hattında en etkin doz  1800ug/ml, UT-SCC 74A hücre hattında en etkin doz  800ug/ml, UT-SCC 74B hücre hattında en etkin doz  800ug/ml ve UT-SCC 9A hücre hattında en etkin doz  800ug/ml olarak bulunmuştur. Bu değerler borik asit ve kontrol grupları arasında anlamlı bir farklılık olup olmadığı istatistiksel olarak Mann Whitney U testi ile kontrol edildi. Ve p değerleri 0,05'den küçük bulundu. Bu sonucun anlamlı olduğu tespit edilmiştir. Etkin dozlar bulunduktan sonra bu hücre hatlarında p53, Rb, ING 1 ve ING 3 gen ekspresyonları incelenmiştir. Bu ekspresyon çalışması sonucunda UT-SCC 6A, 54C ve 24A hücre hatlarında Rb gen ekspresyonu yaklaşık 2 kat azalmıştır. UT-SCC 16A ve 74A hücre hatlarında p53 gen ekspresyonu yaklaşık 2 kat azalmıştır. ING ailesi sonuçları ise ING 1 gen ekspresyonu için UT-SCC 16B ve 54C hücre hatlarında yaklaşık 2 kat azalma görülmüştür. ING 3 geni için ise UT-SCC 54C hücre hattında yaklaşık 5 kat azalma görülmüştür. Hücre hatlarında kontrol ile borik asit uygulanmış hücre hatları arasında anlamlı bir azalma olup olmadığını anlamak için istatistiksel test yapıldı ve p değeri 0.05'den küçük bulundu ve ekspresyon azalmaları anlamlılığa en yakın olarak Mann Whitney U testi ile karar verilmiştir. 
Sonuç: Sonuç olarak borik asitin prostat kanseri üzerinde proliferasyonu inhibe edici etkisi baş boyun kanseri hücre hatlarında da görülmüştür. Bu etkinin hücre döngüsünde ciddi rolü olan önemli tümör supressör genler üzerindeki etkisinde ekspresyon azalmaları görülmüştür. Bu sonuçlar ışığında borik asit alternatif kanser tedavi şekli olmaya aday bir maddedir denebilmesi için ileri düzeyde çalışmalar gereklidir.

Anahtar Kelimeler: Baş boyun kanserler, hücre proliferasyonu, tümör supressör gen, p53, Rb, ING 1 ve ING3

Abstract:
Aim: Boric acid is a very common chemical used in a wide variety of industries and applications.  In this study, the use of boric acid as a potential alternative cancer therapy was investigated by examining its effect on  head and neck cancer cell line proliferation and tumor suppressor gene expression.
Materials and Methods: Head and neck cancer cell lines UT-SCC 6A, 6B, 9A, 16A, 16B, 24A, 54C, 74A, and 74B were treated with varying doses of boric acid, ranging from 200 ug/mL to 1800 ug/mL and XTT assay was used to measure the dose response.  Subsequently, RNA was isolated from treated cells using the Trizol method.  cDNA was made from the isolated RNA and then, using gradient PCR, primer melting temperature was determined for P53, RB1, ING1 and ING3 genes.  Following gradient PCR, gel extraction of PCR product was performed for use as standards in real-time PCR.  Real-time PCR was then performed to analyze gene expression in the samples.  
Results: Boric acid treatment caused a significant decrease in proliferation in all of the head and neck cancer cell lines investigated, including UT-SCC 6A, 6B, 9A, 16A, 16B,24A, 54C, 74A, and 74B. The most effective doses for the cell lines were as follows: UT-SCC 6A 1000 ug/mL, UT-SCC 6B 1800 ug/mL, UT-SCC 16A 800 ug/mL, UT-SCC 16B 1000 ug/mL, UT-SCC 24A 1600 ug/mL, UT-SCC 54C 1800 ug/mL, UT-SCC 74A and 74B 800 ug/mL, UT-SCC 9A 800 ug/mL.  Results from boric acid treatment and untreated controls were analyzed for statistical significance using Mann Whitney U test.  The results approached statistical significance with p value of 0.05.    After determining the effective doses, cell lines were treated with boric acid and gene expression of P53, RB, ING1 and ING3 were analyzed.  RB gene expression was decreased in several of the cell lines examined including UT-SCC 6A, 54C and 24A (2-fold decrease) Also, p53 gene expression was found to be decreased in two of the cell lines: UT-SCC 16A (2-fold decrease) and UT-SCC 74A (2-fold decrease).  ING1 gene expression was decreased in UT-SCC 16B (1.5-fold) and UT-SCC 54C (3-fold). ING3 gene expression was also decreased in one cell line: UT-SCC 54C (5-fold decrease).  The changes in gene expression levels were tested for statistical significance using Mann Whitney U test and the results are significant at p ≤ 0.05. 
Conclusion: In short, similar to results seen in prostate cancer in terms of inhibition of proliferation, boric acid reduced levels of cell proliferation in head and neck cancer cell lines.  These results strongly indicate that several tumor suppressor genes important in cell cycle control play a significant role in the observed effect.   In light of these results, boric acid appears to be a candidate alternative therapeutic agent for cancer.  Of course, further experiments are necessary in order to strengthen this conclusion.  

Keywords: head and neck cancer, cell proliferation, tumor suppressor gene, p53, Rb, ING1, ING3