Peroksidazın üç fazlı ayırma yöntemi ile pazıdan (Beta vulgaris L.var. cicla) saflaştırılması
Purificaton of peroxidase from chard (Beta vulgaris L. var. cicla) by three phase partitioning method
Yazar: MEHMET YAMAN
Danışman: PROF. DR. REFİYE YANARDAĞ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Pazı = Chard ; Peroksidaz = Peroxidase

Özet:
Peroksidazlar (E.C: 1.1.11.7) biyoteknoloji ve tıpta geniş bir alanda kullanılan enzimlerdir. Peroksidazlar doğada bitki hücrelerine, hayvan organ ve dokularına yaygın bir şekilde dağılmış hemoproteinlerdir. Pazı (Beta vulgaris L. var. cicla) dünyanın birçok bölgesinde besin olarak kullanılan bir sebzedir. 

Üç fazlı ayırma (TPP) yöntemi, enzim gibi doğal ürünlerin özütlenmesi, konsantre edilmesi ve saflaştırılması için kullanılan biyo-ayırma tekniğidir. Bu metod üç faz elde etmek için ham enzim çözeltisine tersiyer bütanol ve amonyum sülfat ilave edilmesini içerir. Bu teknik, biyomoleküllerin özütlenmesi ve saflaştırılması için kullanılan yeni bir ayırma prosesidir. 

Bu çalışmada, tek adımlı TPP yöntemi ile pazıdan peroksidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu ilk defa yapılmıştır. Enzimin optimum pH ve optimum sıcaklık değerleri belirlenmiştir. Km ve Vmax değerleri Lineweaver – Burk grafiklerinden hesaplanmıştır. Bazı organik ve inorganik maddelerin pazı peroksidazı aktivitesi üzerine etkileri incelenmiştir.

Bu çalışmada, 37oC, %60 (w/v) amonyum sülfata doyurulmuş ham enzim çözeltisi : tersiyer bütanol oranı 1:1 optimum koşulları ile saflaştırma 7.4 kata erişmiştir.  Enzim aktivitesi için optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 40oC ve pH 6.0 olarak belirlenmiştir. Km ve Vmax değerleri sırasıyla 2.597mM ve 480.800mU olarak saptanmıştır. 

Bu sonuçlara göre, TPP peroksidazın pazıdan saflaştırılması için ilgi çekici bir metoddur. TPP yöntemi, endüstride peroksidazın saflaştrılmasnda basit, tek adımlı, hızlı ve ekonomik olması bakımından önemli bir proses olarak düşünülebilir.

Abstract:
Peroxidases (E.C:1.11.1.7) is one of the most widely used enzymes in biotechnology and medicine. Peroxidases are hemoproteins widely distributed in nature, which are found in plant cells, animal organs and tissues. Chard (Beta vulgaris L. var. cicla) is a vegetable appreciated in many parts of the world for its nutritional properties. Three phase partitioning (TPP) is a bioseperation technique, which has been used for the extraction, concentration and purification of enzymes as well as natural products. The method consists of simultaneous addition of ammonium sulfate and tertiary butanol to the crude enzyme extract in order to obtain the three phases. The technique is a novel separation process used for the extraction and purification of biomolecules. In this study, the purification and characterization of peroxidase from chard was carried out first time by using a single step TPP method.

The optimum temperature and pH were determined. The Km and Vmax values were calculated from Linewear-Burk graph. In addition, the inhibitory effect of different organic and inorganic substances on chard peroxidase activities were investigated.

In this study, at optimum conditions of 37oC and 60 % (w/v) ammonium sulfate along with 1:1 ratio of t-butanol to crude extract, the purification is enhanced 7.4 fold. The optimum temperature and pH for enzyme activity were determined as 40oC and pH 6.0, respectively. The Km and Vmax values were calculated as 2.597mM and 480.800mU respectively.   
 
In ındustry TPP can be considered as an attractive method for purification of peroxidase due to its quick, single step and economic features.