İzoniazid dirençli mycobacterium tuberculosis izolatlarında eflüks pompa genlerinin araştırılması
Investigation of efflux pump genes in isoniazid resistant mycobacterium tuberculosis isolates
Yazar: HAMİDE KAYA
Danışman: PROF. DR. GÖNÜL ASLAN
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antitüberküloz ajanlar = Antitubercular agents ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; İzoniyazid = Isoniazid

Özet:
Tüberküloz (TB) tüm dünyada insan sağlığını tehdit eden en önemli enfeksiyöz hastalıklardan biridir. Özellikle birincil ve ikincil seçenek ilaçlara direnç gelişmesi TB kontrol faaliyetlerini ciddi ölçüde engellemektedir. MTBC'nin olası direnç mekanizmaları; ilaç direnci ile ilgili enzimleri ve transkripsiyon faktörleri kodlayan genlerdeki mutasyonlar, hücre duvarı geçirgenliğindeki değişiklikler ve eflüks pompa genlerinin aşırı ekspresyonudur. MTBC'de "major facilitator superfamily" (MFS), "small multidrug resistance", "ATP-binding casette" ve "resistance-nodulation-division" ailelerine ait eflüks pompalarının varlığı gösterilmiştir. İlaca dirençli olgularda eflüks pompa inhibitörlerinin de tedaviye girmesi ile tedavi başarı şansının artabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada INH dirençli 10 ve tüm anti-TB ilaçlara duyarlı 10 klinik MTBC izolatında INH minimum inhibitör konsantrasyonlarının (MİK) belirlenmesi ve verapamilin (VR) INH MİK üzerine etkisi ile ilaç direnci ile ilişkili olduğu düşünülen 21 eflüks pompa gen ekspresyonunun araştırılması amaçlanmıştır. Saklamaya alınan örneklerden seçilen izolatlar canlandırılarak INH ve VR için ilaç duyarlılıkları resazurin mikrotitre plak yöntemi ile çalışılmış ve MİK belirlenmiştir. Ayrıca 21 gen bölgesi için kantitatif Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile mRNA gen ekspresyonları araştırılmıştır. INH dirençli 10 izolattan 6'sında (%60) VR ile birlikte INH MİK'inde düşme saptanmıştır. Duyarlı izolatlarda VR ile birlikte bakıldığında INH MİK'lerinde değişim olmamıştır. Duyarlı olan izolatlar ile karşılaştırıldığında dirençli izolatlarda VR'in anlamlı şekilde direnci azalttığı görülmüştür (p<0,05). Dirençli izolatlarda MFS ailesinden Rv1634 gen bölgesinde INH stresi altında ekspresyon artışı saptanmıştır (p<0,05). Rv1634 gen bölgesinin ekspresyonu 2,85 kat artış göstermiştir (p=0,029). Diğer gen bölgelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim saptanmamıştır. Bulgularımız Rv1634 gen bölgesi için literatürde yapılmış bazı çalışmalarla uyumlu bulunmuştur. Diğer gen bölgelerinde literatürde belirtildiğinin aksine ekspresyon artışı saptanmamıştır. Eflüks pompa inhibitörü VR'nin dirençli MTBC izolatlarında INH MİK düzeylerini düşürmesi umut vadeden sonuçlar olmasına rağmen eflüks pompa genlerin etkinliklerini ortaya koymada daha fazla dirençli suş ile yapılacak çalışmalara ihtiyaç olduğunu düşüncesindeyiz.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is one of the most important infectious diseases threatening human health all over the world. Especially the development of resistance to first and second line drugs seriously hinders TB control activities. Possible resistance mechanisms of MTBC; mutations in genes encoding enzymes and transcription factors related to drug resistance, changes in cell wall permeability, and overexpression of efflux pump genes. The existence of efflux pumps belonging to the "major facilitator superfamily" (MFS), "small multidrug resistance", "ATP-binding casette" (ABC) and "resistance-nodulation-division" families have been demonstrated in MTBC. It is thought that the chance of treatment success may increase with the introduction of efflux pump inhibitors in drug-resistant cases. In this study, it was aimed to determine the minimum INH inhibitor concentrations (MIC) in 10 clinical MTBC isolates resistant to INH and 10 clinical MTBC isolates sensitive to all anti-TB drugs and to investigate the effect of verapamil (VR) on INH MIC and the expression of 21 efflux pump genes that are thought to be associated with drug resistance. The isolates selected from the stored cultures were revived, and their drug susceptibility for INH and VR was studied with the resazurin microtiter plate method, and MIC were determined. In addition, mRNA gene expressions were investigated by quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction for 21 gene regions. A decrease in INH MIC was found with VR in 6 of 10 INH resistant isolates. There was no change in INH MICs when viewed together with VR in susceptible isolates. It was observed that VR significantly reduced resistance in resistant isolates when compared with susceptible isolates (p<0.05). Overexpression was detected in the Rv1634 gene region under INH stress in resistant isolates (p<0.05). The expression of the Rv1634 gene region increased 2.85 fold change (p=0.029). No statistically significant change was detected in other gene regions. Our findings were found to be compatible with some studies in the literature for Rv1634 gene regions. Contrary to the literature, no increase in expression was detected in other gene regions. Although the efflux pump inhibitor VR has promising results in reducing INH MIC levels in resistant MTBC isolates, we think that studies with more resistant strains are needed to reveal the efficiency of efflux pump genes.