Deneysel hipotiroidizm oluşturulan erişkin sıçanların hipokampüsünde otofajinin araştırılması
Investigation of autophagy in the hippocampus of adult rats with experimental hypothyroidism
Yazar: URAL KEMAL KAVRAAL
Danışman: PROF. DR. NARİN LİMAN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hipokampus = Hippocampus ; Hipotiroidizm = Hypothyroidism ; Otofaji = Autophagy ; Sıçanlar = Rats ; Tiroid hastalıkları = Thyroid diseases

Özet:
Hipotiroidizm hipoglisemiye neden olan çeşitli hormonal, biyokimyasal ve sinir sistemi anormallikleriyle bağlantılıdır. Sinir sistemi dışındaki dokularda glikoz eksikliğine bağlı olarak AMP/ATP oranında artışa neden olur. Bu oranın yükselmesi AMPK'nın fosforile olarak aktifleşmesine neden olur. Aktifleşen AMPK ise çeşitli yollarla otofajiyi indükler. Hipotiroidizmin hipokampüste AMPK aktivitesini değiştirip değiştirmediği ve hipotiroidizmin  otofajiyi indükleyip indüklemediği bilinmemektedir. 
Çalışmada  hipotiroidizm oluşturulan erişkin sıçan modelinde, tiroid hormonu yoksunluğunun hipokampüs dokusunda otofaji ile ilişkili çeşitli proteinlerin ekspresyon düzeylerini değiştirip değiştirmediğinin; eğer değiştiriyorsa bu değişimin otofajinin indüklenmesi veya baskılanması yönünde olup olmadığının ve otofajinin indüklenmesinde AMPK sinyal yolağının rol oynayıp oynamadığının araştırılması hedeflendi.
Çalışmada 48 adet Wistar albino sıçan kullanıldı. Sıçan rastgele kontrol, hipotiroidili ve Levotiroksin ile tedavi edilmiş hipotiroidili grup olmak üzere 3 gruba, her grupta 16 adet sıçan bulunacak şekilde ayrıldı. Kontrol grubundaki sıçanlara 1 ml serum fizyolojik ve hipotiroidi grubundaki sıçanlara 28 gün boyunca 6-n-propil tiyourasil (PTU) 10 mg/kg/gün dozunda intraperitoneal olarak enjekte edildi. Levotiroksin ile tedavi edilmiş gruba ise hipotiroidi oluşturulmasının ardından 15 gün boyunca 5 μg levotiroksin 1 ml NaCl içinde sulandırılarak intraperitoneal olarak uygulandı. 
Çalışmanın biyokimyasal bulguları PTU'nun primer hipotiroidizmi oluşturabildiğini, ancak hipotiroidili sıçanlarda glikoz seviyesini anlamlı olarak düşürmesine rağmen hipoglisemi oluşturmadığını gösterdi. İmmünohistokimyasal sonuçlar sıçan hipokampüsünün kornu ammonis (CA) ve dentat girus (DG) bölgelerindeki nöronlarda AMPK'nın  çekirdeklerde, p-AMPKα1/2-Thr183/Thr172'nın ise genellikle sitoplazmada yerleştiğini ve bazı nöronlarda çekirdek lokalizasyonu sergilediğini  ortaya koydu. ULK1 ve p-ULK1-S556'in genellikle sitoplazmik ekspresyon sergilediği, ancak bazı nöronlarda ULK1'in intranüklear ekspresyon gösterdiği tespit edildi. mTOR'un CA bölgesindeki piramidal hücrelerin sitoplazmalarında orta yoğunlukta eksprese olduğu, dentat girüstaki granüler hücrelerde ise daha zayıf ekspresyon sergilediği, p-mTOR-Se2448'in ise nüklear immünreaksiyon gösterdiği belirlendi. TSC2'nin CA bölgesinde piramidal nöronların sitoplazmalarında orta yoğunlukta, DG'de ise daha zayıf ekspresyon sergilediği gözlendi. p-TSC2-Thr1462 için, granüler sitoplazmik boyanmanın TSC2'ye göre daha yoğun olduğu ve dentat girus bölgesinde de p-TSC2-Thr1462'nin eksprese olduğu saptandı. Beclin1 ve p62'nin ise nöronlarda sitoplazmik immunreaksiyon sergilediği görüldü. MAPLC3α/β ve MAPLC3A'nın CA ve DG bölgesindeki nöronlarda kuvvetli ve homojen bir boyanma gösterdiği dikkati çekti. Western blot (WB) analiz sonuçları hipotiroidili grupta katalitik AMPKα1/2'nin  aktifleşmediğini, bu nedenle mTOR'un aktifleşmesini baskılamadığını, aktifleşen mTOR'un AMPK'nın ULK1 ile etkileşmesini önlediği ve dolayısı ile otofajiyi inhibe ettiğini gösterdi. Levotiroksin ile tedavi edilen hipotiroidili grupta ise WB sonuçları katalitik AMPK'nın aktifleştiğini, bu nedenle mTOR'un aktifleşemediğini ortaya koydu. Ancak bu grupta hem ULK1 ile p-ULK1-S556 ve hem de TSC2 ile p-TSC2-Thr1462 ekspresyon düzeylerinin diğer gruplara göre düşük bulundu. Çalışma gruplarında Beclin 1, LC3 ve p62'nin ekspresyon düzeylerinin gruplar arasında farklılık göstermediği tespit edildi. 
Sonuç olarak bu bulgular PTU ile indüklenmiş hipotiroidizmin otofaji ile ilişkili çeşitli proteinlerin ekspresyonlarını AMPK sinyal yolağı üzerinden önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir.  
Anahtar Kelimeler: Deneysel Hipotiroidizm, Hipokampüs, Otofaji, Sıçan

Abstract:
Hypothyroidism is associated with a variety of hormonal, biochemical, and nervous system abnormalities that cause hypoglycemia. It causes an increase in AMP / ATP ratio due to glucose deficiency in tissues other than the nervous system. Increasing this ratio causes AMPK to be activated as phosphorylated. Activated AMPK induces autophagy in various ways. Whether hypothyroidism alters AMPK activity in the hippocampus and whether hypothyroidism induces autophagy is unknown.
In this research, it was aimed to investigate whether thyroid hormone deprivation changes the expression levels of various autophagy-related proteins in the hippocampus tissue in an adult rat model with hypothyroidism, if it does, whether this change is in the direction of inducing or suppressing autophagy and if the AMPK signaling pathway plays a role in inducing autophagy. 
In the study, 48 Wistar albino male rats were used. The rats were randomly divided into 3 groups as control, hypothyroid and Levothyroxine-treated hypothyroid group, with 16 rats in each group. The rats in the control group were injected with 1 ml of saline. 6-n-propyl thiouracil (PTU) at a dose of 10 mg/kg/day intraperitoneally injected to the rats in the hypothyroid group for 28 days. For the rats in the Levothyroxine-treated group, after inducing hypothyroidism, 5 μg of levothyroxine was diluted in 1 ml of NaCl and intraperitoneally administered for 15 days.
The biochemical findings of the study indicated that PTU could cause primary hypothyroidism, but although it significantly decreased glucose level in hypothyroid rats, it did not cause hypoglycemia. Immunohistochemical results revealed that AMPK is located in the nuclei of neurons in the corn ammonis (CA) and dentate gyrus (DG) regions of the rat hippocampus, whereas p-AMPKα1 / 2-Thr183 / Thr172 is located in the cytoplasm and exhibits nuclear localization in some neurons. It was observed that ULK1 and p-ULK1-S556 generally exhibited cytoplasmic expression, but intranuclear expression of ULK1 in some neurons. It was determined that mTOR was expressed at moderate immunostaining intensity in the cytoplasm of pyramidal cells in the CA region, while the granular cells in the DG showed a weaker expression, and p-mTOR-Se2448 displayed nuclear immunreaction. It was observed that TSC2 exhibited moderate immunostaining intensity in the cytoplasm of pyramidal neurons in the CA region and weaker expression in the DG. It was detected that granular cytoplasmic immunostaining for p-TSC2-Thr1462 was more intense than that of TSC2, and p-TSC2-Thr1462 was also expressed  in the DG. Beclin1 and p62 were observed to exhibit cytoplasmic immunoreactions in neurons. It was noticed that MAPLC3α / β and MAPLC3A showed a strong and homogeneous immunostaining in the neurons in the CA and DG regions. The Western blot (WB) analysis results showed that the catalytic AMPKα1/2 was not activated in the hypothyroid group, therefore it did not suppress the activation of mTOR, the activated mTOR prevented AMPK from interacting with ULK1 and thus inhibited autophagy. In the hypothyroid group treated with Levothyroxine, WB results also revealed that catalytic AMPK was activated, therefore mTOR could not be activated. However, expression levels of both ULK1 and p-ULK1-S556 and TSC2 and p-TSC2-Thr1462 were found to be lower in this group compared to the other groups. The expression levels of Beclin 1, LC3 and p62 in the study groups did not differ between the groups. 
In conclusion, these findings show that PTU-induced hypothyroidism does not significantly alter the expression of various autophagy-related proteins through the AMPK signaling pathway.
Keywords: Autophgy, Experimental Hypothyroidism, Hippocampus, Rat