Yeni bir afinite jeli ile katalaz enziminin saflaştırılması ve bazı pestisitlere karşı afinitesinin araştırılması
Purification of catalase enzyme with a novel affinity gel and investigation of its affinity against some pesticides
Yazar: KÜBRA ÇIKRIKCI
Danışman: PROF. DR. NAHİT GENÇER
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; Antioksidan enzimler = Antioxidant enzymes ; Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method

Özet:
Katalaz (E.C 1.11.1.6), hidrojen peroksiti su ve oksijene parçalayan antioksidan enzimdir. Bu enzim hücreleri reaktif oksijen türlerine karşı koruyarak oksidatif streste önemli rol oynamaktadır. Bu enzim, hemen hemen tüm aerobik organizmalarda bulunmaktadır. Pestisitler, tarımsal verimliliği artırmak ve zararlı organizmaları kontrol altına almak için kullanılan kimyasallardır. Söz konusu pestisitler, su, toprak ve hava kirliliğine yol açarak canlı organizmaları etkilemektedir. Bu nedenle, pestisitlerin çevreye yayılmalarını önlemek için bazı önlemlerin alınması ve etkilerinin kontrol altına alınması gerekmektedir.
Bu çalışmada, yeni bir afinite jeli sentezlenerek (ω-aminoheksil agaroz-3-amino-1,2,4-triazol-5-karboksilik asit), katalaz enzimi insan kan eritrositlerinden saflaştırılmıştır. Sentezlenen afinite jeli üzerinde saflaştırmaya etki eden parametreler (pH, iyonik şiddet, sıcaklık) optimize edilmiştir. Katalaz enzimi, sentezlenen yeni afinite jel ile %0,421 verim ile 529,60 kat saflaştırılmıştır. Enzim saflığını ve molekül kütlesini kontrol etmek için SDS-PAGE yöntemi kullanılmıştır. Katalaz enziminin molekül kütlesi yaklaşık 60 kDa olarak tespit edilmiştir.  Söz konusu enzimin, H2O2 ve o-fenilendiamin substratı için Km ve Vmax kinetik sabitleri belirlenmiştir. Ayrıca katalaz enzim aktivitesi üzerine on beş farklı pestisitin etkileri araştırılarak Ki ve inhibisyon türleri belirlenmiştir.

Abstract:
Catalase (E.C 1.11.1.1.6) is an antioxidant enzyme that breaks down hydrogen peroxide into water and oxygen. The enzyme plays an important role in oxidative stress by protecting cells against reactive oxygen species. The enzyme is found in virtually all aerobic organisms. Pesticides are chemicals used to increase agricultural productivity and control harmful organisms. These pesticides lead to water, soil and air pollution and affect living organisms. Therefore, some measures need to be taken to prevent the spread of pesticides into the environment and to control their effects. 
In this study, a new affinity gel (ω-aminohexyl agarose-3-amino-1,2,4-triazole-5-carboxylic acid) was synthesized to purify catalase enzyme from human erythrocytes. The parameters affecting the purification (pH, ionic strength, temperature) were optimized on the synthesized affinity gel. Catalase enzyme was purified 529.60-fold with 0.421% yield with the synthesized novel affinity gel. SDS-PAGE method was used to control enzyme purity and molecular mass. The molecular mass of the catalase enzyme was determined to be approximately 60 kDa. Km and Vmax kinetic constants of the enzyme were calculated for H2O2 and o-phenylenediamine substrate. In addition, the effects of fifteen different pesticides on catalase enzyme activity were investigated and Ki and inhibition types were determined.