Konvansiyonel ve ITS-PCR yöntemleriyle tanısı yapılan yarrowia lipolytica strainlerinin diğer moleküler biyolojik yöntemlerle tanısının kesinleştirilmesi ve ekstrasellüler enzimlerinin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Confirmation of the ıdentifıcation of the yarrowia lipolytica strains ıdentified with conventional and ITS-PCR methods by using other molecular biological methods, and the production, purification and characterization of extracellular enzymes
Yazar: ONUR AKPINAR
Danışman: PROF. DR. FÜSUN BAHRİYE UÇAR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu tez çalışmasında, daha önceki çalışmalarda çeşitli yöntemlerle tanısı yapılan 22 Yarrowia lipolytica straininin tanısını kesinleştirmek için üç farklı moleküler biyolojik yöntem kullanılmıştır. İlk olarak, ITS1?5.8S?ITS2 bölgesi PCR ile çoğaltılarak ve HaeIII, HinfI ve RsaI restriksiyon enzimleri ile kesilerek farklı RFLP profilleri elde edilmiştir. Benzer şekilde,  18S rDNA bölgesi PCR ile çoğaltılıp HaeIII, RsaI ve TaqI restriksiyon enzimleri ile kesilerek farklı RFLP profilleri elde edilmiştir. Hem ITS1?5,8S?ITS2 hem de, 18S rDNA bölgelerinin RFLP analizi sonuçları 22 Y. lipolytica strainlerinde birbirleri ile uyumlu olduğu bulunmuştur. Son olarak, 26S rDNA bölgesinin D1/D2 domaini PCR ile çoğaltılmış ve çoğaltılan bölgenin sekans analizi yaptırılmıştır. Sonuç olarak, üç farklı moleküler biyolojik yöntemle bütün Yarrowia lipolytica strainlerinin tanıları kesinleştirilmiştir. 
Gerçekleştirilen enzim taramaları sonucunda, denenen 22 Yarrowia lipolytica ribonükleaz (RNaz) enzimi üretirken, bu strainlerden sadece 6 tanesi alkalin ekstrasellüler proteaz (AEP) enzimini ürettiği saptanmıştır. Enzim tarama sonuçlarına göre, en yüksek aktivite gösteren birer Yarrowia lipolytica straini seçilmiş ve AEP ve RNaz enzimlerinin üretiminde bu iki Y. lipolytica straini kullanılmıştır.
Y. lipolytica TEM YL 5 straininden GPP besiyerinde AEP enzimi üretilmiş ve saflaştırma işlemlerine alınmıştır. Gerçekleştirilen saflaştırma işlemleri sonucunda AEP enzimi, DEAE-selüloz kromatografisi ile % 29,05 verimle 16,46 kat saflaştırılırken Sephadex G-75 kromatografisi ile % 57,76 verimle 4,56 kat saflaştırılmıştır. AEP enziminin karakterizasyon çalışmaları sonucunda, AEP enziminin molekül ağırlığının 30,50 kDa; optimum sıcaklık ve sıcaklık stabilitesinin 30°C; optimum pH ve pH stabilitesinin pH 10,50; N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA peptidini hidrolizleyerek bir kemotripsin tip aktivite gösterdiği; en iyi kazein ve süt tozunu hidrolizlediği; PMSF ile inhibe olarak bir serin proteaz olduğu; aktivitesinin en fazla Mn+2 iyonu ile arttığı; SDS ile aktivitesinin yarısını kaybettiği bulunmuştur. AEP enziminin LC-MS/MS analizi sonucunda veritabanındaki Y. lipolytica alkalin ekstrasellüler proteaz enzimi olduğu doğrulanmıştır. 
Y. lipolytica TEM YL 21 straininden GPP-sitrat besiyerinde RNaz enzimi üretilmiş ve saflaştırma işlemlerine alınmıştır. Gerçekleştirilen saflaştırma işlemleri sonucunda RNaz enzimi, DEAE-selüloz kromatografisi ile % 37,90 verimle 62,58 kat saflaştırılırken Sephadex G-75 kromatografisi ile % 66,10 verimle 27,23 kat saflaştırılmıştır. RNaz enziminin karakterizasyon çalışmaları sonucunda, RNaz enziminin molekül ağırlığının 40,97 kDa; optimum sıcaklık ve sıcaklık stabilitesinin 30°C; optimum pH ve pH stabilitesinin pH 5,0; poly(A) ribohomonükleotidini en fazla hidrolizleme kapasitesinde olmasından dolayı ribonükleazlarının T2 ailesine mensup olduğu; sodyum azid ile inhibe olduğu; aktivitesinin en fazla Mg+2 iyonu ile arttığı bulunmuştur. RNaz enziminin LC-MS/MS analizi sonucunda veritabanındaki Y. lipolytica T2-benzeri ribonükleaz enzimi olduğu doğrulanmıştır.

Abstract:
In this thesis study, three different molecular biology methods were used to confirm the identification of 22 Yarrowia lipolytica identified with conventional and ITS-PCR Methods in previous studies. Firstly, RFLP profiles were obtained by amplifying the ITS1-5.8S-ITS2 region with PCR and then cutting them with HaeIII, HinfI and RsaI restriction enzymes. Similarly, RFLP profiles were obtained by amplifying the 18S rDNA region with PCR and then cutting them with HaeIII, RsaI and TaqI restriction enzymes. After the RFLP analyses, it was determined that both the ITS1-5, 8S-ITS2 and the 18S rDNA regions in the 22 Y. lipolytica strains were compatible with each other. Finally, the D1/D2 domain of the 26S rDNA region was amplified with PCR and then the sequence analysis of the amplified region was performed. As a result, identifications of all the Yarrowia lipolytica strains were confirmed with the three different molecular biological methods.
After the screening of the enzymes, it was determined that while all the Y. lipolytica strains produced the ribonuclease (RNase) enzyme, only 6 of these strains produced the alkaline extracellular protease (AEP) enzyme. According to enzyme screening results, Y. lipolytica strains with the highest activity were selected and then these two strains were used in the production of AEP and RNase enzymes. 
The AEP enzyme was produced from the Y. lipolytica TEM YL 5 strain in the GPP medium underwent the purification procedures. After the purification procedures, the AEP enzyme was purified 16.46 fold through the DEAE-cellulose chromatography with the 29.05% yield and 4.56 fold through the Sephadex G-75 chromatography with the 57.76% yield. After the characterization of the AEP enzyme, it was determined that the molecular weight of the AEP enzyme was 30,50 kDa, that its optimum temperature and temperature stability were 30° C, that its optimum pH and pH stability were pH 10.50, that it had chymotrypsin type activity since it hydrolyzed the N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA peptide, that it best hydrolyzed casein and milk powder, that it was inhibited by the PMSF resulting in a serine protease and that it achieved the maximum activity with the Mn+2 ion and lost half of its activity with SDS. After the LC-MS/MS analysis, of, it was confirmed that the AEP enzyme was the one of the Y. lipolytica alkaline extracellular protease enzymes in the database. 
The RNase enzyme was produced from the Y. lipolytica TEM YL 21 strain in the GPP medium underwent the purification procedures. After the purification procedures, the RNase enzyme was purified 62.58 fold through the DEAE-cellulose chromatography with the 37.90% yield and 27.23 fold through the Sephadex G-75 chromatography with the 66.10% yield. After the characterization of the RNase enzyme, it was determined that the molecular weight of the RNase enzyme was 40.97 kDa, that its optimum temperature and temperature stability were 30° C, that its optimum pH and pH stability were pH 5.0, that it belonged to the T2 family of the ribonucleases since it has the maximum capacity to hydrolyze poly (A) ribohomoribonucleotide, that it was inhibited by the sodium azide and that it achieved the maximum activity with the Mn+2 ion. After the LC-MS/MS analysis, of, it was confirmed that the RNase enzyme was the one of the Y. lipolytica ribonuclease T2-like enzyme in the database.