Çoklu ilaca dirençli kanser hücre hattına nanopartiküllerle ilaç aktarımı
Drug delivery with nanoparticles to multi-drug resistance cancer cell line
Yazar: SEMA TUNCER
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ ONUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Disiplinlerarası bir bilim olan Nanoteknoloji ve Nanotıp uygulamaları giderek yaygınlaşarak geleneksel tedavilerin yerini almaya başlamıştır. Bilindiği üzere  kemoterapi, radyoterapi ve/veya cerrahi yöntemlerle iyileştirilmeye çalışılan kanser gibi pekçok hastalık tedavinin başarısını ve etkinliğini son derece azaltmaktadır. Klasik kemoterapi ilaçlarının vücutta istenen bölgeye gidememesinin yanısıra, kanserli hücrelerde terapötik dozlara da ulaşılamamaktadır. Böylece nanoteknolojinin önemli çalışma alanlarından olan biyouyumlu taşıyıcılardan (nanopartiküllerden) yararlanılarak kanser teşhis ve tedavisinde ciddi çalışmalar yapılmaktadır.
Bu tez çalışmasında, bir kanser ilacının (doksorubisin) polimerik nanopartiküllere yüklenmesi ve salımının belirlenmesi, ilaç dirençli Küçük Hücreli Akciğer Kanser Hücresi (KHAKH) ve Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanser Hücresi (KHOAKH) hattında (H69AR ve H1299); nanopartikül ile birlikte hücrelere verilerek apoptoza uğrayan hücre oranının, hücre proliferasyonunun ve sitotoksisitesinin belirlenmesi, son olarak ortamda kuersetin (bir biyoflavonoid) varlığında ilaç yüklü partiküllerin hücrelere verildiğinde apoptoz, proliferasyon ve toksisitesinin karşılaştırmalı olarak tespit edilmesi amaçlanmaktadır.
Tez çalışmasında kuersetin ile ilaç dirençli küçük hücreli akciğer kanser hücrelerinde ilaç direncinin yıkılarak ve nanopartiküllerle bu hücrelere etkin dozda ilaç aktarımının sağlanarak apoptoza yönlendirilmesi hedeflenmektedir.
Bu amaçla, çalışmanın ilk kısmında kitosan nanopartiküllerin sentezi, karakterizasyonu ve ilaç salım çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
Bunun için öncelikle düşük molekül ağırlıklı kitosan polimerinin, bir zayıf asit olan asetik asit içerisinde çözünmesi sağlanmış, daha sonra uygun pH'ya ayarlanarak  kitosanın çapraz bağlayıcısı olan Tripolifosfat (TPP) ile etkileştirilmiş, böylelikle kitosan nanopartiküller elde edilmiştir.
Hazırlanan nanopartiküllerin fizikokimyasal özelliklerinin belirlenmesi amacıyla boy dağılımı, parçacık yüzey yükü analizlerine bakılmış ve morfolojik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla AFM ( Atomik Kuvvet Mikroskobu) tekniğinden yararlanılmıştır.
Elde edilen nanopartiküllerin optimizasyonu sağlandıktan sonra doksorubisin kanser ilacı, in-vitro salım profilinin belirlenmesi amacıyla partiküllere yüklenmiş ve ilaç salımının zamana bağlı olarak kontrollü salım grafiği çıkarılmıştır.
Çalışmanın ikinci aşamasında ise, hazırlanan ilaçlı nanopartiküllerin kuersetin ile birlikte hücreye verilerek, hücrelerdeki sitotoksisite, proliferasyon  oranları karşılaştırılmalı olarak incelenmiştir. Ölen hücrelerin morfolojik değerlendirmelerinin yapılması amacıyla ikili boyama metodu kullanılarak hücrelerin apoptotik-nekrotik indeksleri çıkartılmıştır. Ve hücre proliferasyonlarının zamana bağlı değişimleri RTCA (Tam Zamanlı Hücre Analizi) sistemiyle desteklenmiştir. Elde edilen sonuçlar kuersetin yüklü ilaçlı nanopartikülün kanser tedavisinde olası bir kemoterapötik seçenek olduğunu göstermiştir.

Abstract:
Nanotechnology and Nanomedicine applications are interdisciplinary sciences that began to take the place of traditional treatments increasingly widespread. As is known, chemotherapy, radiotherapy and / or surgical methods extremely reduce the success and effectiveness of the treatment of many diseases like cancer. Classical chemotherapy drugs are incapable of reaching the desired site in the body, also they can not achieve to therapeutic doses in cancer cells. So novel studies is focused on cancer diagnostic and treatment utilizing biocompatible carrier (of nanoparticles) which are important study fields of nanotechnology.
In this thesis, loading  of a cancer drug (doxorubicin) into polymeric nanoparticles and determination of its releasing studies, treating the drug-resistant  Small  Cell
Lung Cancer Cells (SCLC) and Non-Small Cell Lung Cancer Cells (NSCLC) (H69AR and H1299) with these nanoparticles and evaluation the apoptotic cell rate, cell proliferation and cytotoxicity and finally comparative apoptosis, proliferation and toxicity studies of the drug-loaded particles in the presence of quercetin (a bioflavonoid) were aimed.
Moreover, it was intended to direct the cells to apoptosis reducing the resistance of the drug resistant Small Cell Lung Cancer Cells via quercetin and releasing the drug at effective dose to cells via nanoparticles. 
For this purpose, in the first part of the study, synthesis and characterization of chitosan nanoparticles and the drug release studies were performed. 
Firstly dissolution of the low molecular weight chitosan polymer in a weak acetic acid was achieved, and then interaction of chitosan with tripolyphosphate (TPP) which is a crosslinker was carried out adjusting the appropriate pH of chitosan solution, and finally chitosan nanoparticles were obtained. 
For purpose of determining of  physicochemical properties, size distribution, particle surface charge analysis of prepared nanoparticles were evaluated and for determination of morphological properties, AFM (Atomic Force Microscopy) technique was utilized. After optimization has been accomplished, cancer drug doxorubicin was loaded into the resulted nanoparticles for in vitro release profile and the graphic of time-dependent controlled release was obtained. In the second part of the study, prepared drug loaded nanoparticles with quercetin were interacted with cells then the cytotoxicity and the proliferation rates were assessed comparatively. For morphological evaluation of dying cells, the apoptotic-necrotic index of cells have been obtained using the double staining method. And the time-dependent changes in cell proliferation in the RTCA (Real-Time Cell Analyzer) system have been analysed. Obtained results show that drug loaded nanoparticles with quercetin is a possible chemotherapeutic option for cancer therapy.