Aeribacillus pallidus C10'dan alkalin proteaz enziminin saflaştırılması,karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulanabilirliği
Purification, characterization and investigation of biotechnological applications of alkaline protease enzyme from Aeribacillus pallidus C10
Yazar: VİLDAN YILDIRIM
Danışman: DOÇ. DR. MELDA ŞİŞECİOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Alkali proteaz = Alkaline protease ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Termofilik bakteriler = Thermophilic bacteria

Özet:
Bu çalışmada; termofilik bakteri olarak tanımlanan Aeribacillus pallidus C10'dan  ekstra selüler alkalin proteaz enzimi saflaştırıldı ve karakterize edildi. Enzim amonyum sülfat çöktürmesi-diyaliz sonrasında DE52 anyon değişim kromotografisi ve ProbondTM afinite kromotografisi teknikleri ile sırasıyla %26,9 verimle 4,85 kat ve %19,56 verimle 17,32 kat saflaştırıldı. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile yaklaşık 38,35 kDa olarak tayin edildi. Enzim için optimum pH ve sıcaklık sırasıyla 9 ve 60°C olarak belirlendi. Enzimin 20-80°C sıcaklıkları arasında 1 saat sonunda aktivitesinin %80'den fazlasını özellikle 60, 70 ve 80°C sıcaklıklarda kararlılığını büyük oranda koruduğu tespit edildi. A. pallidus C10'dan saflaştırılan proteaz enzimin aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde Mg+2, K+, Ca+2, Zn+2 ve Ag+  iyonları varlığında enzimin aktiviteyi artırdığı gözlenirken, Fe+2, Mn+2 ve Co+2 iyonları varlığında ise enzimin yüksek kararlılık sergilediği gözlendi. Enzimin oksidantlar, yüzey aktif maddeleri varlığında aktivite kaybettiği fakat %5 SDS varlığında enzimin aktivitesinde %16'lık bir artış olduğu belirlendi. Organik çözücüler varlığında enzimin aktivitesinin %70'den fazlasını koruduğu tespit edildi. Enzim, en yüksek aktiviteyi kazein subsratı için gösterdi. Enzimin serin proteaz inhibitörü PMSF ile tamamen inhibe olduğu belirlendi. EDTA varlığında ise enzimin aktivitesini koruduğu gözlemlendi. Bu enzim için KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,197 mg/ml ve 7,29 µmol.ml-1.dk-1 olarak hesaplandı.

Abstract:
In this study, an extracellular alkaline protease was purified and characterized by Aeribacillus pallidus C10 identified as thermophilic bacteria. After ammoniumsulfate precipitation-dialysis, protease was purified by DE52 anion-exchange chromatography and ProbondTM affinity chromatography with 26,9% a yield and 4,85 fold, with 19,56% a yield and 17,32 fold respectively. The molecular weight of purified enzyme determined by using SDS-PAGE was approximately 38,35 kDa. The optimum pH and temperature for enzyme was 9 and 60°C respectively. The enzyme activity remained more than 80% of its orginal activity for 1 h between 20-80°C and was stable especially 60, 70 and 80°C. The effects of various metal ions (Mg2+, Mn2+, K+, Ag+  , Fe2+, Zn2+, Ca2+) on the protease enzyme activity were examined. This results showed that enzyme activity was increased in the presence of Mg2+, K+, Ca2+, Zn2+ ve Ag+  ions and it was maintain stability in the presence of  Fe+2, Mn+2 ve Co+2 . The enzyme wasn't stable in the presence of surfactants and oxidizing agent but in the presence of 5% SDS the enzyme activity was increased %16. The enzyme activity was found to retain more than %70 in the presence of organic solvents. The protease enzyme showed highest activity together with casein. The protease was almost completely inhibited by the serine protease inhibitor PMSF. The enzyme was preserve its activity in the presence of  EDTA. The kinetic parameters, Vmax and KM of the purified protease were determined by using Lineweaver-Burk plot 0,197 mg/ml and 7,29 µmol.ml-1.dk-1 respectively.