Aort onarımı için deselülerize ve hibrit matrikslerin geliştirilmesi
Development of decellularized and hybrid matrices for aorta repair
Yazar: SELCAN GÜLER
Danışman: DOÇ. DR. HALİL MURAT AYDIN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasının amacı kardiyovasküler sistemin sert hemodinamik çevresinde dayanımı yüksek, gelişebilen, bağışıklık sistemi tarafından reddedilmeyen hücresizleştirilmiş (deselülerize/aselüler) doğal kaynaklı aort damar greftlerinin elde edilmesidir. Bu doğrultuda insan aort dokusuna yapısal ve işlevsel olarak benzerliğiyle öne çıkan koyun ve domuz aortu uygun model olarak belirlenmiştir. Tez çalışması kapsamında hem fiziksel ve hem kimyasal iki ayrı deselülerizasyon protokolü geliştirilmiş ve son aşamada deselülerize edilmiş aort grefti PGS (Poli(gliserol-sebakat)) elastomeri ile kombine edilerek esnekliği ve dayanımı arttırılmış hibrit aort grefti elde edilmiştir. Tezin ilk aşamasında süperkritik karbondioksit (sc-CO2) ekstraksiyonuna dayanan fiziksel deselülerizasyon yöntemi uygulanarak intakt tübüler formdaki koyun aort greftleri 37 °C'de iki ayrı basınç noktasında hücresizleştirilmiştir ve ardından histolojik ve taramalı elektron mikroskop (SEM) analizleri yapılarak karakterizasyon testleri gerçekleştirilmiştir. Her iki ayrı basınç değerinde de sc-CO2 uygulamasıyla hücrelerin dokudan uzaklaştırıldığı gözlenmiştir.  

Tezin ikinci aşamasında kimyasal deselülerizasyon protokollerinin geliştirilmesi için SDS tabanlı bir protokol oluşturularak domuz aort grefti 3 saat içerisinde deselülerize edilmiştir. Kimyasal deselülerizasyon protokolünün optimizasyonu sürecinde protokolde kullanılan temel deselülerizasyon ajanına maruz kalma süresinin, karıştırıcı hızının, işlem sonrası yıkama süresinin ve protokole ilave edilen DMSO‟nun (dimetil sülfoksit) deselülerizasyon işlemi üzerine etkisi değerlendirilmiştir. Deselülerizasyon başarısının tespiti için hematoksilen ve eozin (HE), artık nükleusların tepiti için DAPI, doku iskelesindeki kolajen miktarının belirlenmesi için PicroSirius Red ve son olarak doku iskelesindeki elastik fiber ve kolajen tayini için Verhoff-Van Gieson boyamalarıyla histolojik analizler gerçekleştirilmiştir. Deselülerizasyon işlemi sonrası dokuda kalan artık DNA miktarının sayısal olarak belirlenmesi için PicoGreen testi, dokuda kalan glikozaminoglikan miktarının sayısal olarak belirlenmesi için dimetil metilen mavisi testi (DMMB) yapılarak biyokimyasal analizler gerçekleştirilmiştir. PicoGreen testi sonucu geliştirilen protokol ile domuz aort greftinin %99.08 hücresizleştirildiği belirlenmiştir. Ayrıca deselülerizasyon işleminin dokunun yaş ağırlık ve kalınlığı üzerine etkisi belirlenmiştir. Deselülerizasyon işleminin doku iskelesinde oluşturduğu etkiler SEM analizi yapılarak da değerlendirilmiş ve geliştirilen protokol ile yapının korunduğu gözlenmiştir. Yapılan bütün analizler ile etkinliği belirlenen en iyi deselülerizayon protokolüyle üretilen aort greftinin sitotoksik etkisi kalp kapakçığından izole ettiğimiz VIC (Valvular Interstitial Cells) hücreleriyle Canlı/Ölü testi ve Alamar mavisi hücre aktivite testi yapılarak değerlendirilmiş ve herhangi bir sitotoksik etki gözlenmemiştir. Geliştirilen deselülerizasyon protokolü ile elde edilen aselüler damar grefti yeniden hücrelendirilerek (reselülerizasyon) konfokal mikroskopisiyle görüntülenmiştir.  

Tezin son aşamasında deselülerize edilmiş aort grefti Poli(gliserol-sebakat) (PGS) elastomeri ile kombine edilerek esnekliği ve dayanımı arttırılmış hibrit aort grefti elde edilmiştir. Bu doğrultuda  mikrodalga prepolimerizasyonunu takiben 150 C sıcaklık ve  50 mbar‟lık vakum altında çapraz bağlama suretiyle sentezlenen PGS elastomerinin karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla yapının çapraz bağlanma karakteri Hidrojen Nükleer Manyetik Rezonans (1H-NMR) ve Fourier Transform Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) ile incelenmiştir. Termal özellikler ise Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) ile gözlenmiştir. Aselüler damar grefti prepolimerize PGS‟ye tamamen gömülerek 10 saat boyunca 50 mbar ve 150 °C‟de çapraz bağlanmaya 
maruz bırakılmıştır. Elde edilen PGS-aselüler aort hibrit damar greftinin mekanik çekme testi ile aselüler grefte göre esnekliğinin arttığı görülmüştür. Histolojik analiz, SEM analizi ile yapısal olarak değerlendirilmiştir. İnsan abdominal aort düz kas hücreleri ile gerçekleştirilen hücre kültür çalışmalarında Canlı/Ölü testi ve Alamar mavisi hücre metabolik aktivite testi yapılmış ve sitototoksik etkiye rastlanmamıştır. PGS-aselüler aort hibrit grefti reselülerize edilerek konfokal mikrokopisi ve SEM analiziyle değerlendirilmiştir. 
  
Anahtar Kelimeler: Aort, Deselülerizasyon, sc-CO2 (süperkritik karbondioksit), SDS (sodyum dodesil sülfat), DMSO (dimetil sülfoksit), PGS (Poli(gliserol-sebakat)), Reselülerizasyon.

Abstract:
The aim of the presented study is to create durable and decellularized (acellular) biocompatible aorta grafts. Therefore sheep and porcine aortas were defined as appropriate model due to their structural and functional similarities with human aorta tissue. In the study, two physical and chemical decellularization protocols were developed. In the last phase, hybrid aorta grafts with increased flexibility and strength were obtained by combining decellularized aorta grafts with Poly(glycerol-sebacate) (PGS) elastomer. In the first stage of the thesis, intact tubular sheep aorta grafts were decellularized by using two different pressure regimes at 37 °C by using supercritical carbon dioxide (sc-CO2) and then characterization tests were performed through histological and scanning electron microscope (SEM) analyses. It is observed that cells were removed from tissue by using sc-CO2 application at both pressures.  

In the second stage of the thesis, porcine aorta grafts were decellularized in 3 hours in order to develop chemical decellularization protocols based on SDS. In the chemical decellularization optimization process, the effects of exposure time to decellularization agent, agitator speed, the washing times after treatment and DMSO (dimethyl sulfoxide) effects were evaluated. Histological analysis were performed by using Haematoxylin and Eosine (HE) analysis to reveal the success of decellularization, DAPI for residual nucleus, PicroSirius Red for amount of collagen, and Verhoff-Van Gieson staining for definition of elastic fibers and collagen. Biochemical analyses were realized by using PicoGreen test for quantifying the residual DNA content in the samples after decellularization process, while dimethyl methylen blue (DMMB) test used to quantify the remaining glycosaminoglycan. PicoGreen test revealed a decellularization up to %99.08. In addition, the effects of decellularization process on wet weight and thickness were determined. The effect of decellularization process on samples was also evaluated by scanning electron microscopy; and it was observed that the samples were protected by the protocol developed in this study. The cytotoxic effect of the aorta grafts produced by using this novel protocol was further evaluated through live/dead and AlamarBlue Assay by using VIC cells (Valvular Interstitial Cells) isolated from cardiac valve. These assays showed no cytotoxic effect. Acellular vein grafts obtained via novel decellularization protocol of this study were then recellularized and visualized by using confocal microscopy.      

In the last stage of the thesis, hybrid aorta grafts with increased mechanical properties were obtained by combining decellularized aorta grafts with PGS (Poly(glycerolsebacate)) elastomer. These hybrid structures were obtained by cross-linking of PGS elastomer within a chemically decellularized aorta samples. Polymer crosslinking was evaluated by using Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). Thermal properties were observed through Differential Scanning Calorimetry (DSC). Acellular aorta hybrid grafts were exposed to dehydrothermal cross linking for 10 hours at 50 mbar and 150 °C. Tensile test showed that the flexibility of PGS-acellular hybrid aorta grafts were increased compared to acellular grafts. Histological and microscopic analyses were conducted to evaluate the
structural changes. Cell culture assays (live/dead and Alamar Blue) performed by using human abdominal aorta smooth muscle cells proved that there was no cytotoxic effect. PGS-acellular hybrid aorta grafts recellularized and evaluated via confocal microscopy and SEM analysis.  

Key Words: Aorta, Decellularization, sc-CO2 (supercritical carbondioxide), SDS (sodium dodecyl sulfate), DMSO (dimethyl sulfoxide), PGS (Poly(glycerol-sebacate)), Recellularization.