Ovariektomize sıçan arka kök ganglion TRPV1 kanalları üzerinde östrojenin etkisinin patch-clamp tekniği ile araştırılması
Investigation of the effect of estrogen on ovariectomized rat dorsal root ganglion TRPV1 channels by patch-clamp technique
Yazar: YENER YAZĞAN
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA NAZIROĞLU
Süleyman Demirel Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Ağrı = Pain ; Ganglion = Ganglia ; Kalsiyum kanalları = Calcium channels ; Overektomi = Ovariectomy ; Östrojenler = Estrogens

Özet:
Arka kök gangliyon (AKG) hücrelerine aşırı kalsiyum iyonu (Ca+2) girişi, periferik ağrıyı tetikler. AKG nöronlarında çok miktarda eksprese edilen transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1), Ca+2 için geçirgen bir katyon kanalıdır. Bu kanallar AKG hücrelerinde oksidatif stres ve kapsaisini (CAP) de içeren farklı uyaranlarla aktive edilebilir. 17β-estradiol (E2)'nin beyinde nörolojik sistem üzerinde antioksidan etkilere sahip olduğu iyi bilinmektedir. Sıçanların sinir hücrelerinde E2'nin voltaj kapılı kalsiyum kanallarını güçlü bir şekilde inhibe ettiği gösterilmiştir. Bu bağlamda antioksidan E2, güçlü bir TRPV1 kanal antagonisti olarak ovariektomi uygulanan  sıçanların AKG hücrelerine Ca+2 girişini bu kanal aracılığıyla düzenleyebileceği düşünüldüğünden bu çalışmada ovariektomi (OVX) uygulanan sıçanların primer AKG hücre kültüründe, hücre içine Ca+2 girişi ile ilgili E2'nin etkileri  path-clamp tekniği ile araştırılmıştır. 
Otuz dört adet dişi sıçan rastgele üç gruba ayrıldı. Birinci grup (n=10) kontrol grubu, ikinci grup (n=12) OVX uygulanan grup olarak belirlenirken, üçüncü gruba (n=12) OVX uygulamasından sonra, 14 gün süreyle deri altına (80 µg/kg/gün) E2 verildi. Tüm deneylerin tamamlanmasının ardından, üç deney grubunun primer AKG hücrelerinin whole cell patch-clamp tekniğiyle kayıtları alındı. Ayrıca bu hücrelerde hücreiçi ROT üretimi ve mitokondriyal depolarizasyon düzeyleri analiz edildi.
Kapsazepin (CPZ), TRPV1'e özgü reseptör antagonisti iken, CAP TRPV1'e özgü  reseptör agonistidir.  TRPV1 reseptörünün AKG'de Ca+2 birikimine katıldığını göstermek amacıyla AKG hücreleri, CAP ile uyarılırken CPZ ile inhibe edildi. CAP normal AKG hücrelerinde bir akımı indükledi, patch çemberi medyumuna CAP ilavesini takiben artan şiddette 0.52 nA üzerinde akımlar aşamalı olarak gelişti  (0.83 ± 0.20 dakika). Akım CPZ ve NMDG+ tarafından geri dönüşümlü ve kısmi olarak bloke edildi. CAP yokluğunda akım oluşmadığını gözlendi. AKG hücrelerinde akım yoğunlukları kontrol+CAP ve OVX+CAP gruplarında CPZ uygulamasıyla önemli derecede (p<0.001) azaldı. OVX grubunda akım yoğunlukları OVX+E2 grubu ile karşılaştırıldığında önemli derecede (p<0.001) daha yüksek bulundu. Ek olarak, OVX'in indüklediği hücreiçi ROT üretimi ve mitokondriyel depolarizasyonun tamamen azaldığı belirlendi.
Sonuç olarak, bu çalışmanın bulguları, sıçanların AKG hücrelerinde OVX nedeni ile artan TRPV1 kanal aktivasyonu aracılığıyla yükselen akımların, E2 uygulamasıyla azaldığını göstermiştir. Elde edilen bu bulgular, OVX sonucu oluşan ROT ve oksidatif stres ajanların nöronal ölüm ve periferik ağrının oluşumunu tetiklediği, E2 uygulamasının Ca+2 girişi üzerinde etki etmesi açısından büyük öneme sahiptir. OVX kaynaklı TRPV1 aktivasyonu üzerindeki inhibitör etkisi ile AKG hasarlarının ve ağrının azaltılmasında  E2 potansiyel farmakolojik hedef olarak düşünülmelidir.

Abstract:
Overload calcium ion (Ca2+) entry into dorsal root ganglion (DRG) neuron induce peripheral pain. Transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) is Ca2+ permeable cation channels and they are many expressed in DRG. The channel is activated in the DRG by different stimuli including oxidative stress and capsaicin (CAP). It is well known that 17β-estradiol (E2) has an antioxidant role on neurological systems in the brain. E2 was recently demonstrated to potently inhibit voltage gated calcium channels in the neurons of rats. Therefore, it is hypothesized that antioxidant E2 as a potent TRPV1 channel antagonist may modulate Ca2+ entry via TRPV1 channel in the DRG of ovariectomized (OVX) rats. Hence, in the current study, we investigated the neuroprotective properties of E2 in primary DRG neuron cultures of OVX rats by using path-clamp technique. 
Thirty-four female rats were divided into three groups. The first group (n=10) was used as a control group. The second group was the OVX group (n=12) although the third was OVX+E2 (n=12). E2 (80 µg/kg/day) was given subcutaneously to the third group for 14 days after the ovariectomy. At the end of the experiments, whole cell patch-clamp experiments were performed in the primary DRG of three groups. Intracellular ROS production and mitochondrial depolarization levels were analyzed in cells also.
Capsazepine (CPZ) is a specific TRPV1 receptor-antagonist although capsaicin is TRPV1 receptor-agonist. In order to identify the TRPV1 receptor involved in Ca2+ accumulation in the DRG neurons, they were stimulated by capsaicin (CAP) although they were inhibited by CPZ. CAP induced a current in native DRG neurons. Reaching amplitudes of well above 0,52 nA, the currents induced by CAP developed gradually (0.83 ± 0.20 minute) following the addition of CAP to the patch chamber medium. These currents were reversibly and partially blocked by CPZ and NMDG+. We observed no current in the absence of CAP. Current densities and cytosolic Ca2+ accumulation the neurons of the DRG neurons were significantly (p<0.001) decreased in the control+CAP and OVX+CAP groups by CPZ treatments. The current densities and cytosolic Ca2+ accumulation were also significantly (p<0.001) lower in the OVX+E2 group compared to the OVX-only group. In addition, E2 completely reduced ovariectomy-induced intracellular ROS production and mitochondrial membrane depolarization.
In conclusion, results of current study suggest that OVX-induced intracellular Ca2+ signaling and mitochondrial oxidative stress through activation of TRPV1 channels is decreased in the DRG neurons of rats by E2 treatment. These findings hold particular significance and may provide an explanation for OVX-induced neuronal death and peripheral pain and E2 treatment may account for their Ca2+ entry. Its inhibitory effect on OVX-induced TRPV1 activation should be considered a potential pharmacological target for itching caused by OVX-mediated activation of pain and DRG oxidative injuries.