Yonuz erik (Prunus divaricata var) polifenol oksidazının biyokimyasal özelliklerinin incelenmesi
Investigation of biochemical properties of Yonuz plum (Prunus divaricata var) polyphenol oxidase
Yazar: SAKİNE GÜNDOĞAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ELİF DUYGU KAYA
Iğdır Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Polifenol oksidaz = Polyphenol oxidase ; Saflaştırma = Purification ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Bu çalışmada polifenol oksidaz enzimi Yonuz erikten (Prunus divaricata var)
afinite kromatografisi metodu ile Sepharose-4B-L-tirosin-p-aminobenzoik asit afinite
jeli kullanılarak %5,97 verimle 12,80 kat saflaĢtırıldı. Enzimin saflığının kontrolü ve
molekül ağırlığının tespiti SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ile gerçekleĢtirildi.
Saflaştırılan polifenol oksidazın SDS-PAGE ile tek bant halinde, 83,06 kDa ağırlığında
olduğu belirlendi. Enzimin monofeolik ve difenolik substratları varlığında aktivite
tayini yapıldı ve en iyi aktiviteyi 4-metil katekol varlığında gösterdiği belirlendi. Yonuz
erikten saflaĢtırılan, polifenol oksidaz enziminin kinetik karakterizasyonu en yüksek
aktivite gösterdiği, 4-metil katekol, katekol ve DHPPA substratları varlığında
gerçekleĢtirildi. Enzimin optimum pH değeri 4-metil katekol ve DHPPA substratları
kullanıldığında 7,0, katekol substratı kullanıldığında 6,0 olarak belirlendi. Optimum
sıcaklık 4-metil katekol, katekol ve DHPPA substratları varlığında sırası ile 20 ℃, 40
℃ ve 30 ℃ olarak belirlendi. Polifenol oksidazın Km ve Vmax değerleri ile substrat
spresifikliğinin bir göstergesi olan Vmax/Km değerleri Lineweaver-Burk grafiklerinden
faydalanarak belirlendi. En etkili substratının en yüksek olan Vmax/Km değerine sahip
olan 4-metil katekol (1666,67 EU/mL/mM) olduğu, bunu DHPPA (1253,13
EU/mL/mM) ve katekol (452,08/ EU/mL/mM) substratlarının izlediği tespit edildi.
Polifenol oksidazının inhibisyonu amacı ile yaygın kullanılan esmerleşme karşıtı
kimyasal ajanlar incelendi. Bu amaçla askorbik asit, sitrik asit, sodyum metabisülfit, L-
sistein, kafeik asit, fumarik asit, maleik asit ve tartarik asit için PFO aktivitesini yarıya
düĢüren inhibitör konsantrasyonu (IC50) değerleri belirlendi. Enzimin en etkili
inhibitörünün en düşük IC50 değerine sahip askorbik asit (IC50: 0,0564 mM) olduğu en
zayıf inhibitörünün ise en yüksek IC50 değerine sahip sitrik asit (IC50: 17,465 mM)
olduğunu belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, polyphenol oxidase enzyme was purified 12.80 times with 5.97%
yield by affinity chromatography method and Sepharose-4B-L-tyrosine-p-aminobenzoic
acid affinity gel from Yonuzu plum (Prunus divaricata var). Control of the purity of the
enzyme and determination of its molecular weight were carried out by SDS-
polyacrylamide gel electrophoresis. The purified polyphenol oxidase was determined by
SDS-PAGE to be a single band, weighing 83.06 kDa. The activity of the enzyme was
determined in the presence of monopheolic and diphenolic substrates and it was
determined that it showed the best activity in the presence of 4-methyl catechol. Kinetic
characterization of the polyphenol oxidase enzyme purified from plum was performed
in the presence of the substrates 4-methyl catechol, catechol and DHPPA, where it
showed the highest activity. The optimum pH value of the enzyme was determined as
7.0 when 4-methyl catechol and DHPPA substrates were used, and 6.0 when the
catechol substrate was used. The optimum temperature was determined as 20 ℃, 40 ℃
and 30 ℃ in the presence of 4-methyl catechol, catechol and DHPPA substrates,
respectively. Km and Vmax values of polyphenol oxidase and Vmax/Km values, which are
an indicator of substrate specificity, were determined using Lineweaver-Burk graphs.
The most effective substrate was 4-methyl catechol (1666.67 EU/mL/mM), which had
the highest Vmax/Km value, followed by DHPPA (1253.13 EU/mL/mM) and catechol
(452.08/EU/mL). /mM) substrates were detected. Commonly used anti-browning
chemical agents for the inhibition of polyphenol oxidase were examined. For this
purpose, inhibitor concentration (IC50) values that reduce PFO activity by half were
determined for ascorbic acid, citric acid, sodium metabisulfite, L-cysteine, caffeic acid,
fumaric acid, maleic acid and tartaric acid. It was determined that the most effective
inhibitor of the enzyme was ascorbic acid (IC50: 0.0564 mM) with the lowest IC50 value,
and the weakest inhibitor was citric acid (IC50: 17.465 mM) with the highest IC50 value.