Eğirdir (Isparta)'de yetiştirilen elmalardan polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması için alternatif bir yöntem geliştirilmesi
Characterization, purification of polyphenol oxidase enzyme from apples which are grown in eğirdir (Isparta) and development an alternative method for purification of polyphenol oxidase enzyme
Yazar: ESRA ÇELİK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ DUDU DEMİR
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Yumuşak çekirdekli meyveler içerisinde yer alan elma (Malus communis L.) gerek dünyada gerekse Türkiye'de en çok üretilen ve tüketilen meyve türleri arasında yer almaktadır. Dünya elma üretiminde Türkiye dördüncü sıradadır. Türkiye'de ise Isparta ili elma üretiminde ilk sıradadır. Türkiye'de elma üretiminde Isparta ilinin Eğirdir İlçesi önemli bir yere sahiptir. İlçede ağırlıklı olarak Golden Delicious, Starking Delicious ve Granny Smith elma çeşitleri yetiştirilmektedir. 
Polifenol oksidaz enzimi (PPO) aktif merkezinde bakır bulunduran oksidoredüktaz sınıfında yer alan bir enzimdir. PPO, fenolaz, tirozinaz, katekolaz, katekoloksidaz, o-difenoloksidaz, mono fenoloksidaz ve kresolaz olarak da bilinmektedir. PPO'lar substrat spesifikliklerine ve etki mekanizmalarına göre başlıca üç tip sınıflandırılmışlardır. Bunlar; tirozinaz (EC 1.14.18.1), katekolaz (EC 1.10.3.1) ve lakkaz (EC 1.10.3.2)'dır. 
Bu çalışmada; Eğirdir ilçesindeki Golden Delicious, Starking Delicious ve Granny Smith elma çeşitlerinden Sepharose 4B-L-tirozin-p-aminobenzoik asit afinite jeli kullanılarak PPO enzimi saflaştırılmıştır. Golden Delicious, Starking Delicious ve Granny Smith elma çeşitlerinden sırası ile 45.92, 128.95 ve 25.60 saflaştırma derecesine ulaşılmıştır. Ayrıca, PPO enzimini saflaştırmak için alternatif bir yöntem de geliştirilmiştir. PPO enzimini saflaştırmak için geliştirilen yeni afinite jeli, Siyanojen Bromür (CNBr) ile aktifleştirilen Sepharose-4B'ye, L-tirozin uzantı kolu bağlandıktan sonra ligand olarak o-aminobenzoik asitin L-tirozine kenetlenmesi sonucu sentezlenmiştir. Bu jel kullanılarak da PPO enzimi aynı kaynaklardan saflaştırılmıştır. Golden Delicious, Starking Delicious ve Granny Smith elma çeşitlerinden sırası ile 12.81, 101.59 ve 22.69 saflaştırma derecesine ulaşılmıştır.
Saflaştırılan PPO enzimlerinin katekol substratına karşı KM ve Vmax değerleri Linewear-Burk yöntemi ile Golden Delicious, Starking Delicious ve Granny Smith elma çeşitleri için sırasıyla; 50 mM ve 5000 U/mLdak; 20 mM ve 25000 U/mLdak; 40 mM ve 20000 U/mLdak olarak belirlenmiştir.

Abstract:
Apple (Malus communis L.), a pome fruit is among the most widely produced and consumed fruit species both around the world and in Turkey. Turkey is the fourth largest apple producer in the world. Isparta is number one apple producing province of Turkey. Eğirdir district has an important place in apple production in Turkey and Golden Delicious, Starking Delicious and Granny Smith varieties are grown widely in Eğirdir district. 
Polyphenol oxidase (PPO) is a member of oxidoreductase enzymes with a copper in its active site. PPO is also known as phenolase, tyrosinase, catecholase, catecholoxidase, o-difenoloxidase, mono phenoloxidases and kresolase. PPOs are classified in to three groups including tyrosinase (EC 1.14.18.1), catecholase (EC 1.10.3.1) and laccase (EC 1.10.3.2) based on their subsrate specificities and action mechanisms. 
In this study, polyphenol oxidase enzyme was purified from Golden Delicious, Starking Delicious and Granny Smith apple varieties grown in Eğirdir. Using affinity gel prepared from Sepharose 4B-L-tyrosine-p-aminobenzoic acid, 45.92, 128.95 and 25.60 purification folds were achieved in Golden Delicious, Starking Delicious and Granny Smith varieties respectively. In addition, an alternative method was developed to purify the PPO enzyme. A novel affinity gel was synthesized by coupling L- tyrosine to Sepharose-4B by Cyanogen bromide (CNBr) activated, then o-aminobenzoic acid was coupled to L-tyrosine as a ligand for purifing PPO enzyme. By using the new gel PPO enzyme was also purified from the same sources. 12.81, 101.59 and 22.69-fold puriﬁcations were achieved from Golden Delicious, Starking Delicious and Granny Smith varieties, respectively.
The KM and Vmax values of purified PPO enzyme towards catechol substrate determined by Lineweaver–Burk method were found to be 50 mM and 5000 U/mLmin; 20 mM and 25000 U/mLmin; 40 mM and 20000 U/mLmin for Golden Delicious, Starking Delicious, Granny Smith varieties, respectively.