Fibrinojenin in vitro oksidasyonuna bağlı olarak yapısal değişimlerinin incelenmesi
Examination of the structural alterations due to in vitro fibrinogen oxidation
Yazar: KURTULUŞ KAYA
Danışman: Y.DOÇ.DR. ŞERMİN SAVAŞ TETİK
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
1. ÖZETProteinlerin oksidasyonunun bir bölümü, proteinin reaktif oksijen türleri iledirekt olarak veya oksidatif stresin ikincil ürünleri ile indirekt indüklenmesi ile meydanagelen bir kovalent modifikasyondur.Bu çalışmada Fe+3/askorbat oksidatif sistemi kullanılarak in vitro fibrinojenoksidasyonu gerçekleştirildi. Fibrinojen modifikasyonu, oksidatif sistemin üç farklıkonsantrasyonlarında (100ÂµM/25mM, 200ÂµM/50mM, 300ÂµM/75mM) ve 6 farklı zamanaralıklarında (2, 6, 12, 18, 24, 48 saat, 37oC' de) fibrinojen solüsyonunun inkübasyonuile gerçekleştirildi.Spektrofotometrik analizle, Fe+3/askorbat oksidatif sistemi ile modifiye edilenfibrinojen, doğal fibrinojen ile karşılaştırıldı. Yüksek konsatrasyonda (300ÂµM/75mM)Fe+3/askorbat ile 2, 6 ve 12 saat inkübe edilen örneklerde hızlı bir fibrinojenmodifikasyonu ve buna bağlı olarak giderek artan dalga boyu ve optik dansite gözlendi.18 saat ve üzeri inkübasyonlarda konsantrasyon farkının modifikasyon üzerindekietkilerinin benzer olduğu spektrofotometrik değerlendirmelerle belirlendi. In vitroçalışmada fibrinojendeki trozin kaybı ile meydana gelen o-o-ditrozin yapısının, 48saatlik inkübasyonun yarattığı modifikasyona bağlı olarak maksimum Î»cm 308nm' dekarakteristik emisyonuyla oksidasyonun etkileri tespit edildi. nkübasyon süresi ilemodifikasyon şiddeti doğru orantılı olarak bulundu.HPLC analizinde doğal fibrinojen Î»cm 280 nm' de rt 5. dakikada elue edilirken,modifiye fibrinojen örneklerinin rt 7. ve 10. dakikalarda ana pikten ayrılma gösterdiğisaptandı.SDS-PAGE analizinde doğal fibrinojene göre modifiye fibrinojende yapısaldeğişikliğe bağlı önemli bir degredasyon gözlenmedi.Tripsin ile metabolize edilen doğal ve modifiye fibrinojen massspektrofotometre ile analiz edildi. Doğal fibrinojende gözlenen 527.4162 m/z dominantiyon-kütle spektrumu, oksidatif formlarda 402.4464 m/z olarak bulundu. Düşükmolekül ağırlıklı ve yüksek molekül ağırlıklı mass spektrum range' leri incelendiğinde,doğal fibrinojene göre Fe+3/askorbat oksidatif sistemine maruz bırakılan örneklerde çoksayıda yüksek yoğunluklu iyon-kütle intensity tespit edildi.1

Abstract:
2. SUMMARYEXAMINAT ON DF THE THE STRUCTURAL ALTERATIONS DUE TOin vitro FIBRINOGEN OXIDATIONProtein oxidation is defined as the covalent modification of a protein inducedeither directly by reactive oxygen species or indirectly by reactions with secondary byproducts of oxidative stress. In this study, we analysed in vitro exposure of fibrinogen toFe+3/ascorbate oxidative system resulted in structural modifications. Treatment offibrinogen in three different concentrations (100ÂµM/25mM, 200ÂµM/50mM,300ÂµM/75mM) and in 6 different incubation times (2, 6, 12, 18, 24, 48 hours), at 37oCby oxidative system was evaluated.In spectrophotometric analysis differencies between native fibrinogen andmodified fibrinogen upon exposure to the Fe+3/ascorbate oxidative system weredetected. Fibrinogen which was exposed to 2, 6 and 12h incubation times and highFe+3/ascorbate concentration (300ÂµM/75Mm) was rapidly modified. We foundincreased exitation and optical density of modified fibrinogen when compared withnative fibrinogen. No difference was found in fibrinogen modification exposed to 18 hand over incubation times with oxidative system. In vitro the presence of o-o-ditryosinein a protein molecule which is formed from fibrinogen by the loss of tyrosine wasindicated potein modification of the characteristic emission at maximum Î»cm 308nm.We observed that the incubation times and modification intensities were lineer.In the HPLC analysis, the elution of native fibrinogen was detected in one peakwithin rt:5th min. After modification of fibrinogen, two peaks were eluted at rt:7th and10th minutes, completely resolved from the native fibrinogen.SDS-PAGE studies showed that the fibrinogen bands were not changesignificantly upon oxidation.The native and modified fibrinogen were analyzed on mass spectrum upondigestion with tyripsin. The dominant ion-mass spectum of the native fibrinogen wasfound 527.4162 m/z but this spectrum was detected at 402.4464 m/z in oxidized forms.1Low moleculer weight and high moleculer weight mass spectra ranges were compared.Oxidized fibrinogen had more ion-mass intensities at high rather than native fibrinogen.Key words: fibrinogen, oxidized fibrinogen, metal ion oxidation, mass spectrum.2