Tunceli ilindeki alabalıklarda Aeromonas türlerinin MALDI-TOF MS yöntemiyle identifikasyonu
Identification of Aeromonas species in trout in Tunceli province by MALDI-TOF MS method
Yazar: ÇİLEM SEVGÜL TÜTMEZ
Danışman: PROF. DR. ÜLKÜ ÖZBEY ; PROF. DR. GÖKBEN ÖZBEY
Munzur Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Aeromonas = Aeromonas ; Gökkuşağı alabalığı = Rainbow trout ; Tunceli = Tunceli

Özet:
Aeromonas cinsi, son 20 yılda bir dizi taksonomik ve terminoloji revizyonlarından geçmiştir ve sürekli olarak yeni (alt) türler ve biyogruplar tanımlanmıştır.Aeromonas cinsi, çoğunlukla fırsatçı mikroorganizmalar olarak işlev gören otuzdan fazla Gram-negatif bakteri türünü içerir.Bu bakteriler, balık ve kabuklular gibi hayvanlardan kolayca izole edildikleri çeşitli su ekosistemlerinde doğal olarak dağılmıştır.Biyokimyasal karakterizasyon gibi standart tanımlama yöntemlerinin eksiklikleri vardır ve taksonomik konumun netleştirilmesine izin vermez.Bu çalışma, klinik ve çevresel Aeromonas izolatlarının hızlı bir şekilde tanımlanması için bir matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-uçuş süresi kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) tanımlama veri tabanının geliştirilmesini açıklamaktadır.
Bu çalışmada Nisan, Mayıs, Aralık, Ocak aylarında Tunceli ili Mazgirt, Ovacık, Çemişgezek ve Pertek ilçelerinde ağ kafesler ve beton havuzlarda bulunan 16 tesisten temin edilen 200 adet Gökkuşağı alabalığının karaciğer, bağırsak, dalak ve böbreklerinden alınan doku örnekleri, 64 adet su numunesi analiz edilmiştir.
Bu çalışmanın amacı, Tunceli ilindeki tatlı su balık çiftliklerinde Aeromonas türlerinin prevalansını ve prevalansını etkileyen faktörleri belirlemektir.Ayrıca Aeromonas'ın tür sınıf tayini için kullanılan MALDI-TOF MS, 16S rDNA dizileme ve housekeeping gen dizileme (gyrB) gibi farklı yöntemlerin karşılaştırılması amaçlanmıştır.Geleneksel yöntemle izole edilen 526 şüpheli izolatın MALDI TOF-MS ile analizi sonucunda; Basillaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Erwiniaceae, Moraxellaceae, Nocardiaceae, Pseudomonadaceae, Sthaphylococcaceae, Streptococcaceae, Xanthomonadaceaea, Yersiniaceae ve Aeromonadaceae olmak üzere 13 familyaya ait 526 bakteri tanımlanmıştır.Tunceli ili Mazgirt, Ovacık, Çemişgezek ve Pertek ilçelerinde ağ kafeslerde ve beton göletlerde yetiştirilen dört ilçedeki 16 çiftlikte yapılan kesitsel çalışmada, Aeromonas'ın 5 türü 16S rDNA ve gyrB sekanslama ile teşhis edildi.Balık çiftliklerinde beş Aeromonas türü daha yaygındı, A. sobria %47,52) en yüksekti, bunu A. veronii (%26,95), A. media (%12,06) ve A. hydrophila (%7,80) izledi. Daha az yaygın olan tür ise A. salmonicida (%5,67) idi. Aeromonas türlerinin prevalansında mekansal varyasyon gözlendi. Çalışmamızda,  Aeromonas türü olarak identifiye edilen 141 adet izolatın MALDI-TOF MS sonucunun doğruluk saptama oranı, cins düzeyinde tanımlamada %100 (141 izolat) ve tür düzeyinde tanımlamada %92,2 (130 izolat) olduğu tespit edildi.MALDI-TOF MS yönteminin moleküler analizlerde doğru ve hızlı sonuç vermesi nedeniyle kullanılması önerilmektedir. Ancak, Aeromonas cinsinin filogenetik çalışmalarında türler arasında ayrım yapmak için daha yüksek kapasite göstermeleri nedeniyle tür düzeyinde tanımlamada ayrım yapılamadığı noktada 16S rDNA ve gyrB gen dizileme yöntemlerinin daha güvenilir yöntemlerolduğu kanısına varılmıştır. Ülkemizde, Yukarı Fırat havzasında ve Tunceli ilinde gökkuşağı alabalıklarında MALDI-TOF MS yöntemiyle Aeromonas türlerinin tanımlanmasına yönelik yapılan bu çalışma, konusu itibariyle öncü çalışmalardan biri olma niteliğini taşımaktadır.Çalışmamız bu alanda ileride yapılacak araştırmalar için yol gösterici olacaktır.Bu, tatlı su balık çiftliklerinde Aeromonas türlerinin prevalansını belirleyen ve prevalansını etkileyen faktörleri belirleyen ilk çalışmadır.Bu bilgi, balıklardaki Aeromonas enfeksiyonunun ve bunların halk sağlığı üzerindeki risklerinin yönetilmesinde faydalı olacaktır.

Abstract:
The genus Aeromonas has undergone a number of taxonomic and nomenclature revisions over the past 20 years, and new (sub)species and biogroups are continuously described. The genus Aeromonas comprises more than thirty Gram-negative bacterial species which mostly act as opportunistic microorganisms. These bacteria are distributed naturally in diverse aquatic ecosystems, where they are easily isolated from animals such as fish and crustaceans. Standard identification methods such as biochemical characterization have deficiencies and do not allow clarification of the taxonomic position. This study describes the development of a matrix-assisted laser desorption/ionisation–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) identification database for a rapid identification of clinical and environmental Aeromonas isolates. 
In this study tissue, samples taken from the liver, intestine, spleen and kidneys of 200 rainbow trout obtained from 16 facilities rainbow trout in net cages and concrete ponds in Mazgirt, Ovacık, Çemişgezek and Pertek districts in Tunceli province in April, May, December, January and 64 water samples were analysed.
The aim of this study was to determine the prevalence of Aeromonas species in freshwater fish farms and factors affecting their prevalence in Tunceli province.  In addition, it was aimed to compare the ldifferent methods such as MALDI-TOF MS, 16S rDNA sequencing and housekeeping gene sequencing (gyrB), method for species class identification of Aeromonas. As a result of the analysis with MALDI-TOF MS of 526 suspected isolates isolated by the traditional method; 526 bacteria belonging to 13 families including Basillaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Erwiniaceae, Moraxellaceae, Nocardiaceae, Pseudomonadaceae, Sthaphylococcaceae, Streptococcaceae, Xanthomonadaceaea, Yersiniaceae and Aeromonadaceae were identified. In a cross-sectional study from 16 farms in four districts of raised in net cages and concrete ponds in Mazgirt, Ovacık, Çemişgezek and Pertek districts in Tunceli province, 5 species of Aeromonas were identified by 16S rDNA and gyrB sequencing. Five species of Aeromonas were more prevalent (MP) in fish farms, A. sobria (%47,52) was the highest, followed by A. veronii (%26,95), A. media (%12,06) and A. hydrophila(%7,80). The less prevalent species were A. salmonicida (%5,67). Spatial variation in the prevalence of Aeromonas species was observed. In our study, the accuracy of MALDI-TOF MS results of 141 isolates identified as Aeromonas species was found to be %100 (141 isolates) at genus level and%92,2 (130 isolates) at species level. It is recommended to use the MALDI-TOF MS method because it gives accurate and fast results in molecular analysis. However, it has been concluded that 16S rDNA and gyrB gene sequencing methods are more reliable methods at the point where no distinction can be made in identification at the species level due to the higher capacity to distinguish between species in phylogenetic studies of the genus Aeromonas. This study, conducted in our country for the identification of Aeromonas species by MALDI-TOF MS method in rainbow trout in the Upper Euphrates basin and Tunceli province, is one of the pioneering studies in terms of its subject. Our study will be a guide for future research in this field. This is the first study that determined the prevalence and identified the factors that affect the prevalence of Aeromonas species in freshwater fish farms. This information will be useful in managing Aeromonas infection in fish and their risks to public health.