Diş çevresinde oluşan siyah lekelerin kompozisyonu ve mikroflorasının Yeni Nesil Dizileme (NGS) yöntemi ile saptanması
Detection the composition and microflora of black stains around the teeth with Next Generation Sequencing Method (NGS)
Yazar: ZEYNEP CEREN ÇELİK
Danışman: PROF. DR. FUNDA YANIKOĞLU
Marmara Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Restoratif Diş Tedavisi Ana Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2018
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Anketler = Questionnaires ; Ağız florası = Mouth flora ; Dental plak = Dental plaque ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Diş çürükleri = Dental caries ; Dişler = Teeth ; Mikrobiyota = Microbiota

Özet:
Amaç: Dişlerin siyah lekelenmeleri (SL), klinik olarak çoğunlukla diş eti marjinine paralel yerleşmiş, dairesel ve koyu renkli siyah oluşumlardır. Çalışmamızın amacı, daimi dişlenmede SL oluşumundan sorumlu bakterileri NGS yöntemi ile saptamak ve leke oluşumunun çürük ile ilişkisini belirlemektir. 
Gereç ve Yöntem: Sistemik olarak sağlıklı 52 erişkin birey SL'li-çürüksüz, SL'li-çürüklü, lekesiz-çürüksüz ve lekesiz-çürüklü olmak üzere 4 grup (n=13) halinde çalışmaya dahil edilmiştir. Hastaların beslenme alışkanlıkları ve demir eksikliği durumları anket formu şeklinde kaydedilmiştir. Çürük sınıflandırmaları Uluslararası Çürük Tanıma ve Değerlendirme Sistemi ICDAS II kodlamasına uygun yapılmıştır. 08:00-10:00 saatleri arasında en az 8-12 saatlik supragingival plak örneklerinden DNA izolasyonları elde edilmiştir. Bakteriyel 16S ribozomal RNA geni hedeflenmiş dizileme, Quick-16S™ NGS Kütüphane Hazırlık Kiti kullanılarak yapılmıştır (Zymo Research, Irvine, ABD). Kullanılan bakteri 16S primerleri, 16S rRNA geninin V3-V4 bölgesini genişletmiştir. Biyoinformatik analiz usegalaxy.org üzerinden NGS Mothur yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Verilerin istatistiksel değerlendirmesinde STATA 15.1 yazılımı kullanılmış olup Pearson Ki-kare, Fisher testleri uygulanmıştır. 
Bulgular: SL'li dişlerde çürüksüzlük (ICDAS 0, 1, 2) miktarı lekesizlere oranla daha yüksektir (p=0,003). Çürük faktörü göz ününde bulundurulmaksızın SL'li plakta en yüksek sırasıyla Capnocytophaga (%4,8), Corynebacterium (%3,9), Neisseria (%5,4) cinsi bakteriler bulunmaktadır (p<0,05). Çürüksüz hastalar değerlendirildiğinde SL'li plakta en yüksek Capnocytophaga (%10,8), Cardiobacterium (%3,6), Rothia (%1,72) cinsi bakteriler tespit edilmiştir (p<0,05). 
Sonuç: Bu çalışma erişkin hastalarda SL'li ve lekesiz çürüklü ve çürüksüz bireylerin plak mikrobiyomunu NGS yöntemiyle inceleyen öncüller arasındadır. SL'nin çürüklü ve çürüksüz ağızlarda farklı kompleks mikrobiyom yapısı vardır. Siyah lekeli bireylerde daha az çürük bulunduğu saptanmıştır.

Abstract:
Aim: The black stains (BS) are circular and dark black formations that are clinically located parallel to the gingival margin. The aim of our study was to determine the etiologic bacteria of BS in permanent dentition using Nest Generation Sequencing (NGS) method and to determine the relation caries and BS.
Materials and Methods: A total of 52 systemically healthy patients with BS&caries-free (n=13), BS&carious (n=13), stainless&caries-free (n=13), stainless&carious (n=13)  were included in the study. After informed consent was signed by all patiens, nutritional habits and iron deficiency were recorded as a questionnaire. International Caries Detection and Assessment System (ICDAS II) was used for caries classification. Between 08:00-10:00, at least 8-12 hours of supragingival plaque samples were collected, DNA isolations were completed. The samples were processed by ZymoBIOMICS™ Service - Targeted Metagenomic Sequencing (Zymo Research, Irvine, CA). Bacterial 16S ribosomal RNA gene targeted sequencing was performed using the Quick-16S™ NGS Library Preparation Kit. The bacterial 16S primers used amplified the V3-V4 region of the 16S rRNA gene. Bioinformatics analysis was performed using NGS Mothur in open source usegalaxy.org. Data were analyzed statistically using STATA 15.1 software and Pearson Chi-Square and Fisher tests.
Results: Number of caries-free teeth (ICDAS 0, 1, 2) was statistically higher in patients with BS (p = 0,003). Capnocytophaga (4.8%), Corynebacterium (3.9%) and Neisseria (5.4%) were found to be highest in BS plaques neglecting presence of caries (p<0.05). Capnocytophaga (10,8%), Cardiobacterium (3,6%) and Rothia (1,72%) species were detected in BS plaques of caries-free patiens (p <0,05).
Conclusion: This study is one of the pioneer studies by examining plaques with BS in carious and caries-free adult patients using NGS method. BS plaque has ultimate complex microbial structure. Patients with BS are seem to have less caries.