Lactobacillus reuteri E81'de kodlanan glukansükraz ve glukanotransferaz enzimlerinin biyokimyasal karakterizasyonu, bu enzimler ile özgün prebiyotikoligosakkaritlerin üretimi
Biochemical characterization of glucansucrase and glucanotransferase enzymes encoded in Lactobacillus reuteri E81, production of unique prebiotic oligosaccharides with these enzymes
Yazar: HÜMEYRA İSPİRLİ
Danışman: PROF. OSMAN SAĞDIÇ ; DOÇ. DR. ENES DERTLİ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria

Özet:
Laktik asit bakterilerinin (LAB) starter kültür olarak işlevlerine ilave olarak son dönemde bu önemli mikrobiyal grubun ürettiği fonksiyonel metabolitler üzerinde durulmaktadır. Bu metabolitlerin başında da LAB türleri tarafından in situ olarak üretilip gıda maddelerinin fizikokimyasal niteliklerini geliştirebilen ekzopolisakkaritler gelmektedir. LAB türlerinde homopolimerik EPS üretimi ucuz substrat ve yüksek miktarda üretim nedeniyle temel olarak α-glukan üretimi çerçevesinde şekillenmektedir ve sükrozun substrat olarak kullanılması ile α-glukan üretiminden glukansükrazlar sorumludur. Son dönemde LAB türlerinde ortaya çıkartılan α-glukan üretebilen bir diğer enzim grubu da sükrozda inaktif ancak amiloz gibi α-1-4 glikozidik bağı içeren substratlara etki edip açığa çıkan glukoz ünitelerini farklı bağlar ile bağlayabilen glukanotransferazlardır. Her iki enzim grubu ile de farklı yapılarda oligo/polisakkari tlerin üretimi gerçekleştirilebilmektedir. Bu bağlamda bu tez çalışması ile ekşi hamurdan izole edilen ve alternan üreticisi olduğu gösterilen L. reuteri E81'de alternan üretiminin ekşi hamur üretimi açısından fonksiyonel etkilerini ortaya koymak, alternan üretiminden sorumlu glukansükrazın ve yine aynı bakteride açığa çıkartılan 4,6-α-glukanotransferazın aktivitesinin sırasıyla verici-alıcı reaksiyonları ve farklı substratlarda üretebildikleri oligosakkaritlerin karakterizasyonu ve bu oligosakkaritlerin baağışıklık düzenleyici ve prebiyotik potansiyellerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Tez kapsamında kullanılan L.reuteri E81'in genom analizi bu bakteri de glukansükraz ve 4,6-α-glukanotransferaz enzimlerini kodlayabilecek genin yer aldığını göstermiştir. Tez çalışmasında ilk olarak ekşi hamur ve ekmeğinin nitelikleri açısından alternan üretiminin fonksiyonel etkilerinin anlaşılabilmesi için gtfA geni L. reuteri E81'den silinmiş, L. reuteri E81 ve
alternan üretemeyen L. reuteri E81 ΔgtfA suşu ile ekşi hamur üretilip ekşi hamurun fizikokimyasal özellikleri ve ekşi hamur ekmeğinin yapısal karakteristikleri üzerine alternan üretiminin etkileri açığa çıkartılmış. İkinci olarak L. reuteri E81'den gtfA ve gtfB genleri E. coli BL21 hücrelerinde üretilip glukansükraz ve 4,6-α-glukanotransferaz enzimlerinin aktivitesi ortaya konmuş ve ürettikleri α-glukanların yapıları NMR spektroskopisi ile belirlenmiştir. Takiben glukansükraz enziminin sükroz ve farklı şeker alıcılarla ve 4,6-α-glukanotransferaz enziminin ise α bağı içeren farklı substratlardan üretebildikleri oligosakkaritler TLC, NMR ve LC/MS analizleri ile karakterize edilmiştir. Son olarak GTFA ve GTFB ile üretilen bu oligosakkaritlerin fonksiyonel etkileri in vitro olarak HT-29 kolon hücrelerinde IL-10, IL-4, IL-12 ve TNF-α sitokinlerini indüklenme potansiyelleri ve probiyotik ve patojen bakterilerin gelişimi üzerine potansiyel etkileri ortaya konmuş ve oligosakkarit düzeyinde fonksiyonel etkinin değişiklik gösterebildiği açığa çıkartılmıştır.

Abstract:
Recently the production of functional metabolites by lactic acid bacteria (LAB) gained special interests in addition to their main functions as starter cultures. One of the main metabolites of LAB is exopolysaccharides that can be produced in situ during fermentation process which can affect the physicochemical properties of food
products. Homopolymeric α-glucan production has a higher role for LAB due to the higher production levels and the production of this polymer from a cheap substrate and glucansucrases are responsible for the α-glucan production using sucrose as the substrate. Recently another enzyme group found in LAB as an α-glucan producer is the glucanotransferases that are inactive on sucrose but able to use different α-1-4 glycosidic linkages containing substrates such as amylose to produce α-glucans. Both enzyme groups can be used for the production of different poly/oligosaccharides. This respect, the aims of this thesis were to determine the functional roles of alternan
type EPS production in Lactobacillus reuteri E81 during sourdough production, to determine the activities of glucansucrase and the glucanotransferase harbored in the genome of E81 and to characterize the oligosaccharides produced these enzymes in donor-acceptor reactions and with different substrates, and to determine the functional roles of these oligosaccharides in terms of immune-modulation and prebiotic effects. The analysis of the genome of Lactobacillus reuteri E81 used in the thesis revealed the presence of a 4,6-α-glucanotransferase together with a glucansucrase in its genome. Firstly, in order to understand the role of alternan production in the physicochemical properties of sourdough, the gtfA gene was deleted from the genome of E81 and a ΔgtfA mutant was obtained that was deficient of alternan production and then sourdough was produced with both strains to test the
effects of alternan on sourdough and sourdough bread. Secondly, both gtfA and gtfB genes were cloned from strain E81 and expressed in Escherichia coliBL21 and the activities of glucansucrase and 4,6-α-glucanotransferase were determined and the structures of α-glucans produced by these enzymes were determined by NMR analysis. Than oligosaccharides produced by glucansucrase enzyme in donor-acceptor reactions with sucrose and different sugars and by 4,6-α-glucanotransferase enzyme with different substrates containing α-1-4 linkages were characterised by TLC, NMR and LC-MS analysis and both enzymes were shown to be able to produce novel oligosaccharides. Finally, the functional roles of oligosaccharides produced by GTFA and GTFB were determined by testing the in vitro cytokine induction of IL-10, IL-4, IL-12 and TNF-α cytokines in HT-29 colon cells and by testing the prebiotic functions
of these oligosaccharides and these oligosaccharides were found to be effective as functional compounds and this effect was pronounced at oligosaccharide level.