Nanopartikül-glukantim ve nanopartikül-Nigella sativa yağ kombinasyonlarının Leishmania tropica'ya  karşı antileishmanial etkilerinin in vitro ve in vivo incelenmesi ve Kütanöz leishmaniasis'in tedavisinde yeni yaklaşımlarının geliştirilmesi
Investigation of antileishmanial effects of nanoparticle-glucantime and nanoparticle-Nigella sativa herbal oil combinations against Leishmania topica and development of new approaches in treatment of Cutaneous leishmaniasis
Yazar: EMRAH ŞEFİK ABAMOR
Danışman: PROF. DR. ADİL ALLAHVERDİYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Parazitoloji = Parasitology

Özet:
Leishmaniasis dünyanın ve ülkemizin önemli halk sağlığı problemlerinden birisidir.  Dünyada 350 milyon kişi Leishmaniasise yakalanma riski altındadır. Hastalık dünyanın 98 ülkesinde endemik olup, enfekte kişilerin sayısı ise 12 milyondur. Hastalığın klinik olarak kütanöz, mukokütanöz ve visseral formları bilinmektedir.  Türkiye'de hastalığın visseral ve kütanöz formları yaygın olup, 20 milyondan fazla insan KL'nin tehdidi altındadır. Kütanöz Leishmaniasis (KL), genellikle yüz ve el gibi açık bölgelerde yıllarca iyileşmeden kalabilen ve ciddi estetik kaygılara yol açan yara izlerinin oluşmasına neden olan tedavisi oldukça zor endemik bir hastalıktır. Hastalık uzun yıllar boyunca kronik olarak devam edebilmektedir.  Hastalık sırasında oluşan yara izlerinin kalıcı olması nedeniyle hastalarda psikolojik ve travmatik rahatsızlıklar da görülmekte, hatta bazı hastaların intihara sürüklendiği bilinmektedir. Bölgemizde son yıllarda yaşanan savaşlar nedeniyle artan göç hareketlerine bağlı olarak hastalığın epidemiyolojik durumu daha da ciddi hale gelmiştir. KL'nin tedavisinde çeşitli tedavi yöntemleri kullanılmasına rağmen, tedavide her zaman başarılı sonuçların elde edilmesi mümkün olmamaktadır. Mevcut antileishmanial ilaçların yüksek toksisiteye neden olması en büyük dezavantajlarıdır. Bunun yanında, son yıllarda hastalık etkenlerinde kullanılan ilaçlara karşı direnç geliştiği bildirilmektedir. Ülkemizde de özellikle Çukurova Bölgesi'nde KL'nin tedavisinde kullanılan antimonial ilaçlara karşı klinik açıdan dirençlilik geliştiği tespit edilmektedir. Ayrıca günümüze kadar Kütanöz Leishmaniasis'e karşı aşı geliştirilmesinde de başarılı sonuçlar elde edilememiştir.  
Böylece Gerek dünyada gerekse de ülkemizde hastalık ile mücadelede etkin bir ilacın ve aşının bulunmaması, aynı zamanda son yıllarda dünyada ve ülkemizde Leishmania parazitlerinde kullanılan antileishmanial ilaçlara karşı dirençliliğin gelişmesi problemi daha da güncel hale getirmiştir. Bu nedenle DSÖ KL ile mücadele için acilen yeni yaklaşımların geliştirilmesini önermektedir (WHO,2010). Günümüzde KL'nin tedavisine yönelik çalışmaların temelini sentetik ve bitkisel ilaçlar oluşturmaktadır. Ancak sentetik ilaçlardan biri olan pentavalent antimonların tedavideki başarılarını arttırmak ve mevcut dezavantajlarını giderebilmek için, diğer antileishmanial ilaçlarla ve bileşiklerle birlikte kombinasyon halinde uygulanması önerilmektedir.   Kombinasyon terapilerinin avantajı düşük dozlarda uygulanan ilaçların birbirlerinin etkinliklerini arttırmaları, buna karşılık toksisitelerini de azaltmalarıdır.  Ancak,  uygulanan bu kombinasyon terapilerinde de her zaman yeterli sonuçlar elde edilememektedir.  
Antimikrobiyal uygulamalarda kemoterapinin etkinliğinin temelini, herhangi bir enfeksiyona karşı olan ajanın hücre içerisine yeterli düzeyde dahil olması oluşturmaktadır. Buna göre de, antileishmanial ilaçların ister tek başına isterse de kombinasyon halinde daha etkin olabilmesi ajanların hücre içerisine yüksek miktarda dahil olmasıyla mümkün olabilir. Bu nedenle, bahsi geçen kombinasyon uygulamalarının tedavideki yetersizliğinin esas nedenlerinden birisi; hücre içerisine yeterli miktarda antileishmanial ajanın girememiş olması olabilir. Ayrıca, uygulanan kombinasyonları oluşturan komponentlerin antileishmanial etkinliklerinin düşük olması da kombinasyon terapilerinin başarısını azaltabilir. Buna göre de kombinasyon terapilerinin etkinliğini arttırmak amacıyla, kombinasyonu oluşturan bileşiklerin hücre içerisine yüksek konsantrasyonlarda dahil olması ve yüksek antileishmanial etkinlik gösteren komponentlerden oluşması oldukça önemlidir. Son yıllarda Leishmaniasisin tedavisinde bitkisel yağların kullanımı alternatif tedavi yaklaşımı olarak önem kazanmaktadır. Ancak bitkisel yağların tek başlarına toksik olması ve yeterince etkin olmaması bu yönde yapılan çalışmaların değerini düşürmektedir.   Ayrıca son yıllarda nanoteknoloji alanındaki gelişmeler ve nanoteknolojinin mikrobiyolojide uygulamaları kemoterapi alanında yeni ümitlere yol açmaktadır. Nano boyuttaki partiküller sahip oldukları geniş yüzey alanları ve mikro boyutlarına göre oldukça farklı özellikleri nedeniyle tıp alanında tanıda ve özellikle de tedavide kullanılmaya başlanmıştır. TiO2-Ag nanopartiküllerinin sahip oldukları geniş yüzey alanları sayesinde hücre membranlarının geçirgenliğini bozarak ilaçların ve antileishmanial bileşiklerin hücre içerisinde yoğun miktarda birikmesine neden olabileceği düşünülmektedir. Daha önce yaptığımız ön çalışmalarda, ilk kez olarak içerdikleri antimikrobiyal özellikli gümüş iyonları ve Leishmania parazitlerinin duyarlı oldukları bilinen reaktif oksijen türlerini (ROS) üretmelerine bağlı olarak, TiAgNp'nin yüksek düzeyde antileishmanial aktivite gösterdikleri belirlenmiştir. Ancak bu nanopartiküllerin de Leishmania parazitleri üzerinde etkin olan konsantrasyonları hücreler üzerinde sitotoksik etki gösterdiğinden tek başına kullanılması mümkün değildir.
Böylece, nanopartiküllerin yukarıda bahsedilen özelliklere sahip olması (membran geçirgenliğini arttırması, yüksek düzeyde antileishmanial özelliğe sahip olması) ve aynı zamanda bitkisel yağların da yüksek antimikrobiyal özelliğe sahip olması Leishmaniasisin tedavisinde büyük bir potansiyel oluşturmaktadır. Ancak, bu bileşiklerin tedavide uygulanabilmesi onların toksik özelliklerinin giderilebilmesi şartıyla mümkün olabilir. Bu açıdan, düşük konsantrasyonlarda bu bileşiklerin kombinasyon halinde uygulanmasıyla toksisite sorununun önüne geçilebilir. Literatürde ise konuyla ilgili herhangi bir çalışmaya rastlanmamaktadır.  
Bu nedenle bu tez çalışmasının amacı; L.tropica parazitlerinin in vitro promastigot, amastigot-makrofaj kültürlerinde, in vivo olarak ise KL modeli oluşturulmuş deney hayvan modellerinde nanopartikül-antileishmanial ilaç ve nanopartikül-bitkisel yağ kombinasyonlarının ilk kez olarak antileishmanial etkinliklerinin incelenmesi ve Kütanöz Leishmaniasis'in tedavisinde nanoteknolojiye dayalı yeni yaklaşımların geliştirilmesidir.
Nanopartiküllerin sahip oldukları geniş yüzey alanları sayesinde hücre membranlarının geçirgenliğini arttırarak ilaçların ve bitkisel yağ gibi bileşiklerin hücre içerisinde yoğun miktarda birikmesine neden olabilmeleri, ayrıca serbest radikalar gibi antimikrobiyal özeliğe sahip bileşikleri üretmelerini göz önünde bulundurularak, hem nanopartiküllerin hem de antileishmanial bileşiklerin kullanılan miktarlarını minimuma indirmek suretiyle KL'nin tedavisinde nanopartikül-antileishmanial ilaç ve nanopartikül-bitkisel yağ içeren kombinasyonların geliştirilmesi çalışmanın hipotezini oluşturmaktadır.  Hipotezin gerçekleşmesi durumunda,  mevcut antileishmanial ilaçların etkinliğinin arttırılması, parazitlerde ilaçlara karşı gelişen direncin minimum seviyeye indirilmesi,  nanopartiküllerin, bitkisel yağların ve ilaçların toksisitesinin azaltılması öngörülmektedir.
Bu amaç doğrultusunda; öncelikle sentezlenen TiAgNp'nin SEM, TEM ve Zeta-Sizer kullanılarak karakterizasyonu yapılmıştır. Daha sonra, sentezlenen TiAgNp'nin, ticari olarak elde edilen N.sativa yağlarının ve bir antileishmanial ilaç olan glukantimin J774 makrofaj hücreleri üzerindeki sitotoksisiteleri belirlenmiştir. Bunu takiben, ajanların toksik olmayan konsantrasyonları kullanılarak, TiAgNp-glukantim ve TiAgNp-N.sativa kombinasyonları hazırlanmıştır. Hazırlanan kombinasyonların etkinlikleri öncelikle L.tropica promastigotlarının in vitro kültürü üzerinde incelenmiştir. MTT, thoma lamında sayım ve Flow sitometrik analiz yöntemleri kullanılarak, kombinasyonların L.tropica promastigotlarının metabolik aktiviteleri, proliferasyonları ve canlılıkları üzerindeki etkinlikleri araştırılmıştır. Daha sonra, TiAgNp-glukantim ve TiagNp-N.sativa yağ kombinasyonlarının L.tropica amastigot-makrofaj kültüründeki etkinliği makrofajların enfeksiyon indekslerinin hesaplanmasıyla ve amastigot MTT yöntemiyle belirlenmiştir. Ayrıca kombinasyonlara maruz kalan enfekte makrofajların ürettikleri Nitrik Oksit (NO) miktarı Griess reaksiyonuyla hesaplanmıştır. Bunu takiben TiAgNp-glukantim ve TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyonlarının KL modeli oluşturulmuş Balb/C deney hayvanları üzerindeki in vivo antileishmanial etkinlikleri incelenmiştir. Farelerde KL modelinin oluşturulması için 1 x108 L.tropica promastigotu farelerin sol ayak tabanlarına enjekte edilmiştir. KL modelinin oluşturulduğu farelerin ayaklarının çapı tedavi öncesinde ve sonrasında kapiler yardımıyla ölçülmüş, enfeksiyon bölgesinden elde edilen aspirat örneklerindeki parazit varlığı ise Mikro Kültür Yöntemi (MKY) kullanılarak mikroskobik olarak incelenmiştir. Veriler, SPSS version 19.0 for Windows programı ile belirlenmiş ve p < 0,05 değeri istatistiki olarak anlamlı kabul edilmiştir.     
Sonuç olarak; TiAgNp-glukantim kombinasyonunun Leishmania promastigotlarının proliferasyonunu ve metabolik aktivitesini 2 ila 6 kat arasında azalttığı, hücreleri % 53 oranında apoptoza sürüklediği gösterilmiştir (p<0.05). Aynı zamanda, kombinasyon uygulamasının parazitlerle enfekte makrofajların enfeksiyon indeksinde kontrol grubuna göre 20 kata varan azalmalara neden olduğu, L.tropica amastigotlarının metabolik aktivitesini ise kontrol grubuna göre 5 kat azalttığı tespit edilmiştir. Bununla birlikte, enfekte makrofajların ürettikleri NO miktarını 2 ila 5 kat arasında değişen değerlerde arttırdığı tespit edilmiştir. Tez kapsamında kullanılan bir diğer kombinasyon olan TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyonu ise, L.tropica promastigotlarının proliferasyonunda ve metabolik aktivitesinde %96'ya varan oranda azalmaya neden olmuştur. Aynı kombinasyon L.tropica amastigotlarıyla enfekte makrofajların enfeksiyon indeksi değerini kontrol grubuna göre 20 kat, amastigotların canlılığını ise yaklaşık 6 kat azaltmıştır. TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyonlarına maruz kalan enfekte makrofajların ürettikleri NO miktarının ise yaklaşık 9 kat arttığı gözlenmiştir (p<0.05). 
TiAgNp-glukantim ve TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyon uygulamalarının farelerde oluşan KL'e özgü lezyonların iyileşmesine, ayaklarındaki şişliklerin ise azalmasına neden olduğu gösterilmiştir. TiAgNp-glukantim kombinasyonunun, KL'e özgü yaraların iyileştirilmesinde, mevcut konvansiyonel ilaç uygulamalarından daha yüksek etkinliğe sahip olduğu, TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyonlarının ise konvansiyonel ilaç uygulamasıyla aynı düzeyde etkinlik gösterdiği belirlenmiştir.   
Böylece bu tez çalışması kapsamında; literatürde ilk kez olarak, mevcut antileishmanial ilaçların dezavantajlarını barındırmayan, toksik özellik göstermeyen, yüksek antileishmanial özelliğe sahip nanopartikül-glukantim ve nanopartikül-bitkisel yağ kombinasyonları gibi farklı modeller kullanılarak KL'nin tedavisinde nanoteknolojiye dayalı yeni yaklaşımların geliştirilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Antileishmanial etkinliği yapılan in vitro ve in vivo çalışmalarda belirlenen kombinasyonların gelecekte pre-klinik çalışmalarda kullanılmasının, KL'e karşı yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesinde oldukça önemli olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
Leishmaniasis is the one of the most important health problems of Turkey and the world.  Approximately 350 millions of people all around the world are at risk of being caught Leishmaniasis. The disease is endemic at 98 countries and the number of people that were infected with the disease is estimated as 12 million at worldwide. There are three clinical forms of the disease: cutaneous, visceral and mucocutaneous. In Turkey, cutaneous and visceral forms of Leishmaniasis have been commonly seen and more than 20 millions of people are under threat of the infection in our country. Cutaneous Leishmaniasis (CL) is known as an endemic disease which causes non-healing lesions in open regions of the body such as hands and faces. CL can maintain its chronic effect through the years. Permanent lesions, generally occurred in chronic cases lead to psychological and traumatic discomforts and in some cases drive patients to suicides. Due to enhanced movement of migration as a result of wars occur at neighboring countries, epidemiological status of the disease has recently become more serious for our country. Although, there are many treatment methods that are used to treat CL, applied treatment regimens do not always Show successful results in healing of the disease. The most important disadvantages of the conventional drugs are their toxicities. Furthermore, it has been recently reported that causative agents of the disease developed resistance against used antileishmanial drugs. Moreover, no effective vaccine has been developed until today in order to fight against Leishmaniasis.    
Hence, due to the lack of effective vaccines and antileishmanial drugs and rapidly developed resistance in Leishmania parasites against used drugs, have increased the actuality of the disease. For these reasons, World Health Organization (WHO) urgently suggests the development of new approaches in order to fight against CL (WHO,2010). Today, synthetic and herbal drugs compose the basis of the studies in terms of CL treatment. However, due to its ineffectiveness, pentavalent antimonials, which are categorized as synthetic drugs, are recomended to use in combination with the other antileishmanial drugs and compounds in order to enhance their efficacy in treatment and cope with their disadvantages. The major advantages of the combination therapies are to increase efficacy of each agent that is used at low dosages, on the contrary to decrease their toxicities. However, combination therapies do not always give sufficient results.    
Sufficiently inclusion of agents within microbial cells compose the basis of efficacy of chemotherapy against any infections in antimicrobial applications. Therefore, applications of antileishmanial drugs either in single use or in combination therapy could be successful by inclusion of antileishmanial drugs within parasite cells at sufficient levels. The main reason of failure of combination therapy may be related to uptake of low dosages of the drugs by parasite cells. Additionally, it can be thought that components of combination with low antileishmanial efficacy may decrease success rate of combination therapy. Hence, in order to increase the effectiveness of combination therapies, use of combinations including components with high antileishmanial properties and inclusion of agents within parasite cells with high dosages are very important. In recent years, use of essential oils are gaining importance as an alternative treatment aproach. However, their toxicity and low efficacy decrease the values of these studies.  On the other side, advances in nanotechnology field and applications of nanotechnology in microbiology are very promising. Nano-sized particles have been started to use especially in diagnose and treatment according to their wide surface areas and unique properties. Silver doper TiO2 nanoparticles (TiAgNp) are thought to induce accumulation of drugs and antileishmanial compounds since they disrupt cellular membrane due to their wide surface areas. In our previous studies, it was exhibited that TiAgNp possessed antileishmanial effects depending on including silver ions with antimicrobial features and producing reactive oxygen species (ROS) to whom Leishmania parasites are sensitive. However, seperately use of nanoparticles is not possible since their concentrations that are effective against Leishmania parasites are toxic for human cells.
As it can be easily seen, since nanoparticles possess unique properties and essential oils demonstrated high antimicrobial activities, these agents consititute a critical potential in treatment of Leishmaniasis. However, use of these agents in treatment can be only possible by overcoming their toxic features. It can be thought that toxicity problem can be prevented by usage of these agents in combinations at low concentrations. However, there is no study present in literature about this subject. 
For this reason, the main goal of the present thesis is to investigate antileishmanial efficacy of nanoparticle-antileishmanial drug and nanoparticle-essential oil combinations on in vitro promatigote and amasgite-macrophage cultures of L.tropica parasites and on in vivo Balb/C mice with CL and to develop new approaches based on nanotechnology in the treatment of CL.   
As a brief, nanoparticles can lead to accumulation of high amounts of antileishmanial drugs and herbal oils within cells by increasing permeability of cellular membranes by the help of their wide surface areas and can produce free radicals with antimicrobial features. Considering all of these information, development of formulations including non-toxic concentrations of nanoparticle-antileishmanial drug and nanoparticle-herbal oil combinations for treatment of CL constitute the hypothesis of the present study. If the hypothesis is succeeded, we propose that antileishmanial effects of current drugs will increase, resistance against antileishmanial drugs in parasites will be pulled to minimal levels, and toxicities of nanoparticles, herbal oils and antileishmanial drugs will be decreased.
In accordance with this aim, synthetized TiAgNps were characterized by using SEM, TEM and Zeta-Sizer at first step. Then, cytotoxicities of synthetized TiAgNps, Nigella sativa herbal oils and glucantime as an antileishmanial drug were investigated on J774 macrophage cell line. Afterwards, non-toxic concentrations of each agent were determined and TiAgNp-glucantime and TiAgNp-N.sativa oil combinations were prepared by using these concentrations. Antileishmanial efficacies of prepared combinations were first investigated on in vitro culture of L.tropica promastigotes. Effects of combinations on metabolic activities, proliferation and viabilities of L.tropica promastigotes were examined by using MTT, counting with Thoma slide and flow cytometric analysis. Afterwards, antileishmanial effects of TiAgNp-glucantime and TiAgNp-N.sativa oil combinations on in vitro amastigote-macrophage culture were investigated by evaluation of infection index of macrophages and by MTT method. Furthermore, nitric oxide (NO) productions of infected macrophage sthat were exposed to different concentrations of combinations were assessed by Griess reaction. After that, in vivo antileishmanial efficacies of TiAgNp-glucantime and TiAgNp-N.sativa oil combinations were examined on Balb/C mice with CL model. In order to develop CL model in Balb/C mice, 1 x108 L.tropica promastigotes were subcutaneously injected on left footpads. The foot dimensions of mice with CL were evaluated by a caliper before and after the treatment. The parasite existence in aspirate specimens that were obtained from CL lesions were microscopically determined by using Micro Culture Method (MCM). Data were determined by SPSS version 19.0 for Windows program and p < 0,05 value was accepted as meaningful.     
As a result, TiAgNps-glucantime combinations were demonstrated to decrease the proliferation and metabolic activities of L.tropica promastigotes 2-6 fold and to cause apoptotic cellular death (p<0.05). Moreover, it was exhibited that this combination application leaded to 20-fold decrease on infection indexes of infected macrophages and 5-fold decrease in metabolic activities of L.tropica amastigotes in contrast to control. Furthermore, it was determined that combination increased NO production by infected macrophages 2-5 fold. The other combination, TiAgNps-N.sativa oil combination decreased metabolic activity and proliferations of parasites at a rate of 96%. Same combination decreased infection index values of infected macrophages at 10 fold and metabolic activities of L.tropica amastigotes at 6 fold. TiAgNps-N.sativa oil combination increased NO production of infected macrophages at 9 fold (p<0.05). 
Both combinations were demonstrated to heal CL lesions in Balb/C mice and decrease dimensions of footpads to normal levels. It was also determined that TiAgNps-glucantime combination was better in healing of lesions than conventional drug application, while TiAgNps-N.sativa oil combination showed nearly same healing capacity compared to current drugs. Thereby, as a first time in this study, it was demonstrated that it was possible to develop new approaches based on nanotechnology in the treatment CL by using nanoparticle-glucantime and nanoparticle-herbal oil combinations that are non-toxic, do not include disadvantages of current antileishmanial drugs and show high antileishmanial efficacy. According to obtained result, it is thought that further use of prepared combinations in pre-clinic studies will be very important for developing new approaches in treatment of CL.