Aşırı aktif mesaneli hastalarda ADRB3, ARHGEF10, ROCK2 gen polimorfizmlerinin ve bu genlerle ilgili mikroRNA'ların klinik bulgular ile ilişkisi
Relation of ADRB3, ARHGEF10, ROCK2 gene polymorphisms and miRNAs related to these genes to clinical findings in overactive bladder patients
Yazar: ELİF FIRAT
Danışman: PROF. DR. HÜLYA AYBEK
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Mesane = Urinary bladder ; Mesane hastalıkları = Urinary bladder diseases ; Mikro RNA = Micro RNA ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic

Özet:
Mesanedeki adrenerjik ve muskarinik reseptörler işeme fizyolojisinde önemli rol oynar. Adrenerjik beta 3 ve muskarinik 3 reseptörlerin işlevi aşırı aktif mesane (AAM) sendromunun patogenezinde önemlidir. Tek nükleotid polimorfizmlerinin, çeşitli hastalıklara yol açmasının yanı sıra AAM patofizyolojisinde de rol aldığı çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Plazmada, tespit edilebilen ve potansiyel olarak bir hastalığa özgü olan, birçok kararlı mikroRNA (miRNA) varlığı gösterilmiştir. Bazı miRNA'ların plazma düzeylerindeki değişikliklerin, adrenerjik ve muskarinik reseptörlerin işlevinin düzenlenmesini moleküler düzeyde etkilediği ve klinik bulguların değerlendirilmesinde yararlı olabileceği ileri sürülmektedir. AAM hastalığı ile ilişkili olabilecek miRNA çalışması çok azdır. Bu çalışmanın amacı, AAM sendromlu kadınlarda ADRB3, ARHGEF10 ve ROCK2 gen polimorfizmlerinin detrüsör kasılma ve gevşemesi üzerindeki etkisi olup olmadığını ve bu genleri hedef alarak AAM patogenezinde rol alabileceği öngörülen let-7b-5p, miR-92a-3p, miR-98-5p, miR-139-5p, miR-142-3p ve miR-200c-3p miRNA'larının plazma düzeylerinin AAM tanısı için yardımcı parametreler olarak kullanılıp kullanılamayacağını araştırmaktır. 
Çalışmamızda idiyopatik AAM tanısı alan 60 hasta ve 60 kontrol bireyinin tam kan örneğinden DNA izolasyonu sonrası ADRB3 genindeki rs4994 polimorfizmi, ARGHEF10 genindeki rs4376531 polimorfizmi ve ROCK2 genindeki rs2230774 polimorfizmi kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) ile tespit edildi. Aynı hasta ve kontrol grubunda plazmadan qRT-PCR yöntemi ile ADRB3 gen bölgesini hedef alan hsa-let-7b-5p, hsa-miR-98-5p; ARHGEF10 gen bölgesini hedef alan hsa-miR-92a-3p; ROCK2 gen bölgesini hedef alan hsa-miR-139-5p, hsa-miR-142-3p ve hsa-miR-200c-3p miRNA'larının plazma ekspresyon düzeylerine bakıldı. Plazma miRNA'larının tanısal yeterliliğini değerlendirmek üzere alıcı işletim karakteristikleri eğrileri (ROC) oluşturuldu.
Hasta ve kontrol grubunda ortalama ağırlık, boy ve vücut kütle indeksi benzerdi. Her üç SNP için hastalar ve kontroller arasındaki allel frekanslarındaki dağılım istatistiksel olarak farklı değildi. AAM hastalarında ADRB3, ARHGEF10 ve ROCK2 genlerinin genotipik dağılımı da kontrol grubundan farklı değildi. AAM hastalarında ADRB3 ve ARHGEF10 gen polimorfizmleri ile AAM semptom skoru arasında ilişki bulunmazken, ROCK2 geninde heterozigot polimorfik bireylerde AAM semptom skoru, homozigot polimorfik bireylerden anlamlı olarak yüksekti (p<0,05). AAM semptom skoru ile miRNA ekspresyon düzeyleri arasında bir korelasyon olmasa da; let-7b-5p, miR-92a-3p, miR-98-5p, miR-142-3p ve miR-200c-3p ifadeleri AAM hastalarında kontrollere göre anlamlı olarak yüksekti. Plazma miR-139-5p düzeyi ise AAM hastalarında kontrollere göre anlamlı olarak azalmıştı.  Yapılan ROC eğrisi analizleri tüm miRNA'lar için anlamlı idi. Tek başına en iyi ayırt edicilik kestirim değeri 0,1091'de %94,3 duyarlılık ve %62,3 özgüllüğe sahip olan ve hastalarda hasta olmayan bireylere göre anlamlı olarak yüksek eksprese edilen hsa-miR-98-5p'ye aitti (AUC=0,79). Kombinasyon şeklinde ROC eğrileri değerlendirildiğinde en iyi tanısal performansı miR-98-5p+miR-139-5p kombinasyonu gösterdi (AUC: 0,839, Duyarlılık: %84, Özgüllük: % 86,5).
Çalışmada, idiyopatik AAM'li hastalarda adrenerjik beta 3 ve muskarinik 3 reseptör genlerine ait polimorfizmlerin var olduğu fakat bu polimorfizmlerin klinik semptomların oluşmasında etkili olmadığı sonucuna varılmıştır. AAM hastalarında ADRB3 ve ARHGEF10 gen polimorfizmleri, klinik bulguların şiddetini anlamlı olarak değiştirmezken, ROCK2 geninin heterozigot polimorfik yapıya sahip olanlarda hastalığın klinik şiddeti yüksek bulunmuştur.  MiRNA analiz sonuçlarına göre, AAM hasta plazmalarında let-7b-5p, miR-92a-3p, miR-98-5p, miR-142-3p, miR-200c-3p ekspresyonları önemli ölçüde artmış ve miR-139-5p ekspresyonu da azalmıştır. Bu miRNA'lar arasında tek başına tanısal performansı en yüksek olan miR-98-5p (AUC=0,79) idi. Tek başına miR-98-5p'nin tanısal performansı etkili olmakla birlikte miR-98-5p+miR-139-5p kombinasyonunun AAM hastalarındaki tanısal performansı her bir miRNA'nın tek başına gösterdiği tanısal performanstan daha yüksekti (AUC=0,839). Bu sonuçlar bu miRNA'ların AAM hastalarında tanıda etkili yardımcı parametreler olarak kullanılabileceğini göstermektedir. 
Anahtar Kelimeler: Aşırı aktif mesane, polimorfizm, mikroRNA

Abstract:
In human urinary bladder, adrenergic and muscarinic receptors play an important role in voiding physiology. The function of β3 adrenergic and muscarinic 3 receptors are important in the pathogenesis of overactive bladder (OAB) syndrome. Single nucleotide polymorphisms have been shown to play a role in the pathophysiology of OAB, in addition to causing various diseases. It has been demonstrated that there are abundant stable microRNAs (miRNAs) in plasma, which can be detected and are potentially disease specific. Alterations in the levels of miRNAs thought to influence the regulation of function of these receptors at the molecular level and may be useful in the evaluation of clinical findings. In the literature, there are very few miRNA studies that may be associated with OAB disease. The aim of this study was to determine the impact of ADRB3, ARHGEF10 and ROCK2 gene polymorphisms on detrusor contraction-relaxation harmony in women with OAB syndrome and investigate whether plasma miRNAs which target these three genes can be used as diagnostic parameters for the detection of OAB.
In this study 60 women with idiopathic OAB and age-matched control women without OAB were enrolled. Genomic DNA was isolated from all patients and subjected to PCR for amplification. The rs4994 polymorphism in ADRB3 gene, rs4376531 polymorphism in ARGHEF10 gene and rs2230774 polymorphism in ROCK2 gene releated with muscarinic receptors were detected by qRT-PCR. The expression of let-7b-5p, miR-92a-3p, miR-98-5p, miR-142-3p, miR-200c-3p and miR-139-5p which target β3 adrenergic and muscarinic 3 receptor genes were examined in plasma by comparing 60 patients with 60 healthy volunteers by quantitative reverse-transcription PCR. Receiver operating characteristics curves (ROC) were generated to evaluate the diagnostic qualification of plasma miRNAs. 
The mean weight, height and body mass index in the OAB group were not significantly different from those in the non-OAB group and also we found no statistically significant difference in the genotype and allele frequencies between the patients and controls for all three SNPs. Genotypic distribution of ADRB3, ARHGEF10 and ROCK2 genes in OAB patients is not different from the control group. While there was no relationship between ADRB3 and ARHGEF10 gene polymorphisms and OAB score in OAB patients, the OAB score in heterozygous polymorphic individuals in the ROCK2 gene was significantly higher than in homozygous polymorphic individuals (p<0,05). Although there was no correlation between the levels of miRNA expression with OAB symptom score, the expression of let-7b-5p, miR-92a-3p, miR-98-5p, miR-142-3p and miR-200c-3p was significantly higher in OAB patients compared to controls. The plasma level of miR-139-5p was significantly lower in OAB patients compared to controls. ROC curve analyzes were significant for all miRNAs. Hsa-miR-98-5p was upregulated in the blood of OAB patients significantly. AUC value of hsa-miR-98-5p was 0.79 (94,3% sensitivity, 62,3% specificity, cut off= 0,1091).
As a result of our study, we found that the polymorphisms of the β-adrenoceptors and releated proteins of muscarinic receptor genes were present in both OAB group and healthy subjects, but the polymorphisms were not associated with OAB syndrome. Although the polymorphism of gene in the ADRB3 and ARHGEF10 did not significantly differ the severity of clinical findings, OAB patients also have a heterozygous polymorphic structure of the ROCK2 gene which increases OAB symptom score in muscarinic pathway. The results of this study suggest that let-7b-5p, miR-92a-3p, miR-98-5p, miR-142-3p, miR-200c-3p are significantly upregulated and miR-139-5p is significantly downregulated in the plasma of OAB patients. Among the miRNAs, hsa-miR-98-5p provided the highest diagnostic accuracy (AUC=0,79). Even though the diagnostic accuracy of single miRNA was quite satisfactory, the combination (miR-98-5p+miR-139-5p) is a better indicator for OAB diagnosis due to its higher AUC and as compared with single miRNA (AUC=0,839). These results indicate that these miRNAs can be used as diagnostic parameters for the detection of OAB.
Key words: Overactive bladder, polymorphism, microRNA