Rejenere selüloz esaslı taşıyıcı sistemlerle insan kanser hücrelerinde apoptoz indüksiyonu
Induction of apoptosis in human cancer cells by regenerated cellulose-based carier systems
Yazar: ELİF YİĞİT
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AYDAN GÜLSU
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Çok hücreli organizmalarda, hastalıkların önlenmesinde, doku ve organlarda uygun hücre sayısının devam etmesi, yani hücre sayısındaki denge önem arz etmektedir. Hücre sayısındaki anomaliler sonucu kanser, otoimmün, dejeneratif hastalıklar gibi birçok hastalık ortaya çıkabilmektedir. Dokularda bu hassas dengenin sürdürülmesi amacıyla apoptoz sürecine müdahale edilmesi, hücre sayısındaki artış veya azalmaya bağlı olarak gelişen hastalıklar için   yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine olanak sağlamaktadır. 
Dünyadaki ölüm sebeplerinin başında yer alan, proliferasyon artışı ile karakterize edilen kanser hastalığının, apoptozda azalmaya bağlı olarak geliştiği bilinmektedir. Kanser tedavi yöntemlerinden biri olan kemoterapide, antikansorejen ajanlar tümör hücre DNA sentezi ve hücre bölünmesi sürecine etki ederek apoptoz indüksiyonuna neden olmaktadır.
Konvansiyonel ilaç salım sistemleri, uzun dönem tedavilerdeki bazı kısıtlayıcı sebeplerden dolayı günümüzde pek çok alanda yetersiz kalabilmektedir. Son yıllarda etken maddelerin aktivitesini istenilen oranda, istenen bölgeye lokalize etmeyi amaçlayan ve daha az yan etki ile arttırılmış aktivite sergileyen kontrollü ilaç salım sistemleri giderek önem kazanmaktadır.  Kontrollü ilaç salım sistemleri uygulamaları ile etken maddenin yarılanma ömrünün artması, daha düşük lenf drenaj ve daha yüksek kan dolaşımı süresi gibi avantajlar sağlanmaktadır. Bu amaçla farklı taşıyıcı sistemler ile çeşitli hastalıkların tedavisi için alternatif biyomalzemeler geliştirilebilmektedir. İlaç taşıyıcı sistemlerin hazırlanmasında biyomalzeme olarak çok çeşitli polimerler kullanılmaktadır. Bunlardan selüloz, doğal biyopolimerik malzemeler arasında çeşitli avantajları bakımından en çok tercih edilen biyopolimerlerdendir. 
Çalışma kapsamında yüksek selüloz içeriğine sahip (%95-99) atık pamuktan selüloz esaslı taşıyıcı eldesi hedeflenmiştir. Atık pamuktan selüloz esaslı taşıyıcı elde edilerek değerlendirilmesinin, ülke ekonomisi ve atıkların çevreye olan olumsuz etkilerinin giderilmesi açısından önem arz etmektedir.  Bu amaçla atık pamuk, ön işlemler (yıkama, öğütme) saflaştırma (hemiselüloz ve ligninin uzaklaştırılması) ve asit hidrolizi olmak üzere, çeşitli işlem basamaklarından geçirilerek selüloz esaslı taşıyıcı elde edilmiştir. Elde edilen selüloz esaslı taşıyıcının boy/boy dağılımı SEM analizi, yapı analizi ise FTIR analiz yöntemi kullanılarak karakterizasyon çalışmaları                 tamamlanmıştır. Daha sonra, selüloz esaslı taşıyıcıya apoptoz indüksiyonu için proteazomal inhibitörlerden biri olan ve enzimatik Neddilasyon kademesinin ilk adımını yöneten Nedd8 aktive edici enzimin (NAE) inhibitörü olan MLN4924'ün (Pevonedistat) yükleme çalışmalarına geçilmiştir.  Bunun için, MLN4924'ün selüloz esaslı taşıyıcıya adsorbsiyonu yöntemi kullanılarak, yükleme işlemleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen MLN4924 yüklü selüloz esaslı taşıyıcının MTT testi, taşıyıcının sitotoksisitesi ve etken madde yüklü selüloz esaslı taşıyıcının U87 (Glioblastoma) hücre hattı üzerinde etkinliği incelenmiştir. Ayrıca kristal viyole boyama yöntemi ve floresan mikroskobu ile görüntüleri alınmıştır. 
Elde edilen sonuçlara göre 0.7- 1.1 µm selüloz esaslı taşıyıcı eldesi başarı ile gerçekleştirilmiştir. Elde edilen taşıyıcılara etken madde (MLN4924) %50 verim ile yüklenmiştir. Salım çalışmaları, MLN4924'ün kontrollü bir şekilde 38 saat sonunda selüloz esaslı taşıyıcıdan salımının tamamlandığını göstermiştir. Yapılan hücre canlılık testlerinde selüloz esaslı taşıyıcıya yüklenmesi ile apoptoz indüksiyonu %97 oranında başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Kristal viyole ve floresan mikroskobu ile alınan görüntüler ile sonuçlar desteklenmiştir.

Anahtar kelimeler: Apoptoz, Selüloz, Kanser, Biyopolimer, MLN4924

Abstract:
In multicellular organisms, maintaining the appropriate number of cells in tissues and organs, i.e. the balance in cell number, is important for disease prevention. Anomalies in cell number can lead to many diseases such as cancer, autoimmune and degenerative diseases. Intervening in the apoptosis process to maintain this delicate balance in tissues enables the development of new treatment strategies for diseases that develop due to an increase or decrease in cell number. 
It is known that cancer, which is one of the leading causes of death in the world and characterized by increased proliferation, develops due to a decrease in apoptosis. In chemotherapy, one of the cancer treatment methods, anticancer agents cause apoptosis induction by affecting tumor cell DNA synthesis and cell division process.
Conventional drug delivery systems may be inadequate in many fields today due to some limitations in long-term treatments. In recent years, controlled drug delivery systems, which aim to localize the activity of active substances to the desired site at the desired rate and exhibit increased activity with fewer side effects, have gained increasing importance.  Controlled drug delivery systems provide advantages such as increased half-life of the active substance, lower lymph drainage and higher blood circulation time. For this purpose, alternative biomaterials can be developed for the treatment of various diseases with different carrier systems. A wide variety of polymers are used as biomaterials in the preparation of drug carrier systems. Among these, cellulose is one of the most preferred biopolymers in terms of its various advantages among natural biopolymeric materials. 
Within the scope of the study, it was aimed to obtain cellulose-based carrier from waste cotton with high cellulose content (95-99%). In addition, it is important to obtain and utilize cellulose-based carriers from waste cotton in terms of national economy and eliminating the negative effects of wastes on the environment.  For this purpose, cellulose-based carrier was obtained by passing the waste cotton through various process steps including pre-treatments (washing, milling) purification (removal of hemicellulose and lignin) and acid hydrolysis. The characterization studies of the cellulose-based carrier were completed by using SEM analysis for length/length distribution and FTIR analysis for structure analysis. Then, the cellulose-based carrier was loaded with MLN4924 (Pevonedistat), an inhibitor of Nedd8 activating enzyme (NAE), which is one of the proteasomal inhibitors for apoptosis induction and manages the first step of the enzymatic Neddylation step.  For this purpose, the adsorption of MLN4924 on cellulose-based carrier was used for the loading process. The cytotoxicity of the obtained MLN4924 loaded cellulose based carrier was examined by MTT test and the activity of the active substance loaded cellulose based carrier on U87 (Glioblastoma) cell line. 
According to the results obtained, 0.7- 1.1 µm cellulose based carriers were successfully obtained. The active substance (MLN4924) was loaded onto the obtained carriers with 50% efficiency. Release studies showed that MLN4924 was released from the cellulose-based carrier in a controlled manner after 38 hours. In the cell viability tests, apoptosis induction was successfully achieved by 97% by loading on cellulose-based carrier. The results were supported by images taken with crystal violet and fluorescence microscopy.

Keywords: Apoptosis, Cellulose, Cancer, Biopolymer, MLN4924