Salmonella enterica serovar typhimurium (S.typhimurium) ATCC 14028 suşuna ait antijenik FliC geninin klonlanması ve protein üretimi
Cloning and protein production of the antigenic FliC gene of Salmonella enterica serovar typhimurium ATCC 14028 strain
Yazar: SELDA KILIÇ
Danışman: PROF. DR. ORHAN ERDOĞAN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Amaç: Patojen bir bakteri olan Salmonella enterica serovar typhimurium ATCC 14028 suşuna ait antijenik FliC geninin ilk defa pET SUMO vektörüne klonlanması ve rekombinant protein üretimi amaçlanmıştır.
Yöntem: Bu çalışmada S. typhimurium ATCC 14028 suşuna ait  FliC geni izole edilip PCR yardımıyla amplifikasyonu sağlandı. Ardından  elde edilen PCR ürünün pET SUMO vektörüne ligasyonu gerçekleştirildi. Ligasyon ürünü One Shot® Mach1TMT1R E. coli hücrelerine transforme edildi. Elde edilen pozitif kolonilerden plazmit izolasyonu gerçekleştirildi. Rekombinant plazmit kompotent E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transforme edilerek transformasyon basamağı PCR ile doğrulandı. İndükleyici içeren bir ortamda inkübe edilen bakteriler lizis tamponu kullanılarak çözdürüldü ve ısı şoku ile protein içeriği hücre dışına çıkarıldı. Üretilen protein SDS-PAGE analizi ile doğrulandı ve protein bantları Commassie Brillant Blue G-250 ile görüntülendi. Üretilen rekombinant proteinler nikel (Ni+2) afinite kromatografi yöntemi kullanılarak saflaştırıldı.
Bulgular: Çalışmamızda rekombinant FliC rekombinant proteini E. coli ekspresyon sisteminde üretimi gerçekleştirilmiştir. 1 mM IPTG konsantrasyonu ile indüklenen kültürden elde edilen protein üretiminin en iyi üretim olduğu belirlendi. Afinite kolon kromatografisi yapıldıktan sonra SDS-PAGE ile analizi gerçekleştirilen protein bantları Commassie Brillant Blue G-250 ile boyanarakgörüntülendi. Rekombinant FliC proteinin  yaklaşık 70 kDa moleküler ağırlığa sahip olduğu belirlendi.
Sonuçlar: S. typhimurium FliC antijenik geni A-T klonlama yöntemi ile ilk kez pET-SUMO vektörüne aktarılarak başarılı bir şekilde rekombinant FliC protein üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretilen bu proteinin terapötik/profilaktik amaçlar için kullanılabileceği öngörülmektedir. 

Anahtar Kelimeler: Salmonella typhimurium, FliC, Klonlama, Rekombinant protein üretimi

Abstract:
Purpose: This study is aimed to clone the antigenic FliC gene of Salmonella enterica serovar typhimurium ATCC 14028, a pathogenic bacterium, into pET SUMO vector for the first time and produce recombinant protein.
Method: In this study, the FliC gene of S. typhimurium ATCC 14028 strain was isolated and amplified by PCR. Then, ligation of the obtained PCR product into the pET SUMO vector was performed. The ligation product of One Shot®Mach1TMT1R was transformed into E. coli cells. Plasmid isolation was performed from the positive colonies obtained. The recombinant plasmid was transformed into competent E. coli BL21 (DE3) cells, and the transformation step was confirmed by PCR. Bacteria incubated in an inducer-containing medium were thawed using lysis buffer and the protein content was removed from the cell by heat shock. Produced protein was confirmed by SDS-PAGE analysis and protein bands were visualized with Commassie Brilliant Blue G-250. Produced recombinant proteins were purified using nickel (Ni+2) affinity chromatography method.
Findings: In our study, recombinant FliC recombinant protein was produced in the E. coli expression system. It was determined that the protein production obtained from the culture induced with 1 mM IPTG concentration was the best production. Protein bands analyzed by SDS-PAGE after affinity column chromatography were visualized using Commassie Brilliant Blue G-250. The recombinant FliC protein was determined to have a molecular weight of approximately 70 kDa.
Results: S. typhimurium FliC antigenic gene was transferred to the pET-SUMO vector for the first time with the A-T cloning method, resulting in successful production of recombinant FliC protein. It is envisaged that this produced protein can be used for therapeutic/prophylactic purposes.

Keywords: Salmonella typhimurium, FliC, Cloning, Recombinant protein production