EMS mutageni kullanılarak klorosulforon (su grubu) herbisitine karşı dayanıklı soya (Glycine max L.) mutantlarının geliştirilmesi ve ALS geninin dizi analizi
Development of soybean (Glycine max L.) mutants resistant to chlorsulfuron (su group) herbicide through EMS mutagen and ALS gene sequence analyses
Yazar: RÜSTEM ÜSTÜN
Danışman: PROF. DR. BÜLENT UZUN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Soya (Glycine max L.) yağ bitkileri içerisinde en fazla üretime sahip olan bir baklagil bitkisidir. Dünyada hem yağ hem de protein kaynağı olarak kullanılmaktadır. Her bir kültür bitkisinde olduğu gibi soyada da verimi kısıtlayan en önemli unsurlardan bir tanesi yabancı otlardır. Dünyada ve ülkemizde transgenik olmayan soya yetiştiriciliğinde kullanılabilecek soyaya ruhsatlı herbisit sayısı çok kısıtlı düzeydedir. Sürekli aynı türden herbisit kullanımı, yabancı otlarda direnç oluşumuna neden olmakta ve mücadelesi bu nedenle her geçen gün zorlaşmaktadır. Dar yapraklıların yanında, geniş yapraklı yabancı otların tek bir herbisit aracılığıyla soyaya zarar vermeden kontrol edilebilmesi önemli bir konu olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu çalışmada sülfonilüre (SU) gurubu yabancı ot ilaçlarına dayanıklı soya mutantlarının geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda Arısoy soya çeşidinin 10.000 adet tohumuna %0.1 oranında EMS uygulanmış ve 4150 adet M1 bitkisi yetiştitirilmiştir. M1 popülasyonundan elde edilen 300.000 M2 bitkisi SU grubu herbisite karşı dayanıklılık bakımından test edilmiştir. Testlemelerde sürat ve güvenilirliği sağlamak için M2 bitkileri tarla yanında hidroponik sistem altında da gözlemlenmiştir. Tarla testlemelerinde 7, hidroponik sistemde 3 bitki olmak üzere toplam 10 potansiyel dayanıklı bitki seçilmiştir. Hidroponik sistem altında yapılan konfirmasyon testlemelerinde tarladan seçilen 1 bitkinin dayanıklı olduğu teyit edilmiştir. Dayanıklı bitkide herbisitin önerilen dozunun 2 (60 ppm) ve 3 (90 ppm) katları ile tekraren testlemeler yapılmış ve kontroller ölürken, dayanıklı bitkide hiç bir semptomun oluşmadığı bir kez daha görülmüştür. Elde edilen bu dayanıklılığın ALS geninde meydana getirmiş olduğu değişikliklerin incelenmesi için moleküler seviyede analizler yapılmıştır. Bu amaçla dayanıklı bitki kendilenmiş ve 8 döl yetiştirilmiştir. 8 dölün 2 si hassas ve 6 sı dayanıklı olarak açılım göstermiştir. Bu altı dayanıklı bitkiden elde edilen DNA'larda yapılan sekans analizleri neticesinde 8 nokta mutasyonu tespit edilmiş ve bunların 7 tanesinde anlamlı amino asit değişikliği bulunmuştur. Arabidopsis thaliana model bitkisinin ALS gen protein sekans dizilimi baz alındığında, dayanıklı mutant döllerinde tirozin-154 serin (Tyr154-Ser), alanin-155 valin (Ala155-Val), valin-163 aspartat (Val163-Asp), prolin-197 serin (Pro197-Ser), glisin-609 valin (Gly609-Val), threonin-616 metiyonin (Thr616-Met) ve glutamin-644 histidin (Gln644-His) amino asit değişiklikleri tespit edilmiştir. Dayanıklılık gösteren 6 mutant dölde ortak olan tek mutasyon Arabidopsis thaliana ALS gen sekansına göre 197. noktadaki prolin-197 serin değişikliğidir. Bu veriler ışığında soyadaki herbisit dayanıklılığı hem moleküler hem de fenotipik olarak gösterilmiştir. EMS mutasyon yöntemi ile elde edilen bu dayanıklılığın genetik dayanıklılık olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Soybean (Glycine max L.) is a legume plant that has the highest production among oilseed plants. It uses as a source of both oil and protein in the world. As in other crop plants, weeds are one of the most important factors reducing yield in soybean. The number of herbicides registered for soybean is very limited for the non transgenic production in the world as in Turkey. Consecutive applications of herbicides with the same mode of action in the same field may cause herbicide resistance in weeds and thus struggling with weeds are getting difficult gradually. Applying only one herbicide to control broad-leaf weeds along with narrow-leaf ones without damaging soybean is an important issue. From this perspective, it is aimed to develop soybean mutants resistant to sulfonylurea (SU) herbicides. For this purpose, 0.1% EMS was applied to 10.000 seeds of the Arısoy soybean variety and 4150 M1 plants were grown. 300.000 M2 plants obtained from the M1 population were tested for resistance to the SU group herbicide. In order to accelerate the process and ensure reliability in the tests, M2 plants were also screened under the hydroponic system beside the field conditions. 7 plants from open field conditions and 3 plants from hydroponic system were selected as potential herbicide resistant mutants. These were furher evaluated for confirmation in hydroponic system and 1 mutant come from open field condition confirmed as a herbicide resistant. This resistant source were also exposed to 60 ppm and 90 ppm doses which were 2 and 3 times more than the optimum dose of herbicide to see the resistance level and the mode. The resistant mutant showed no symptoms again in this higher dosess. Analyses at molecular level were conducted to determine changes in the ALS gene of the resistant source. For this purpose, the resistant plant was selfed and 8 progenies were grown. 2 out of 8 progenies were susceptible to the herbicide while the remains were resistant to the herbicide. DNA sequence analysis indicated that 8 point mutations were detected and 7 sense amino acid changes were found in these six resistant progenies. According to the ALS gene protein sequence of the Arabidopsis thaliana model plant, tyrosine-154 serine (Tyr154-Ser), alanine-155 valine (Ala155-Val), valine-163 aspartate (Val163-Asp), proline-197 serine (Pro197-Ser), glycine-609 valine (Gly609-Val), threonine-616 methionine (Thr616-Met) and glutamine-644 histidine (Gln644-His) amino acid changes were founded in these resistant plants. Only one common mutation in six mutant progenies is the proline-197 serine alteration at point 197 according to the Arabidopsis thaliana ALS gene sequence. By these data, herbicide resistance was confirmed by both molecularly and phenotypically. It has been determined that the resistance obtained by EMS mutation provided target site resistance.