Moleküler doking ve farmakokinetik yöntemler ile Sars-CoV-2 ana proteaz 3clpro  için potansiyel inhibitörlerin araştırılması
Investigation of potential inhibitors of Sars-CoV-2  main protease 3clpro  by molecular docking and pharmacokinetic methods
Yazar: NİDA ULULAR
Danışman: PROF. DR. VİLDAN GÜRSOY
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Organik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
30 Aralık 2019'da Çin'in Hubei eyaleti, Wuhan şehrinde yeni bir virüs ortaya çıkarak hızla 150'den fazla ülkeye yayıldı [2]. Bilim insanları tarafından bu yeni virüs üzerinde yapılan çalışmalar sonucu, virüsün Sars Cov virüsü genleri ile <%80 nükleotid özdeşliği ve %89,10 nükleotit benzerliği paylaştığını [9]  ve sekans çeşitliliğine rağmen ortaya çıktıkları sonucuna varıldı [1]. 
12 Şubat'ta Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) tarafından bu yeni virüse şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs'ü 2  (Sars-CoV-2) ve buna neden olan hastalığa ise 2019 Koronavirüs Hastalığı (Covid-2019, Covid-19) adı verildi [2].
Koronavirüsler, yüzeylerinde sahip oldukları uzantılar ve içlerinde barındırdıkları genetik materyal (genom) 'ları ile yaklaşık 26-32 kilobaz (kb) aralığında en büyük genom boyutuna sahip [3] küre şeklinde, büyük, tek sarmallı, pozitif duyarlı, yüzeylerinde bir zarf bulunan [4] ve virüs partiküllerinin çapı 60-140 nm aralığında değişen RNA virüsleridir [5].
Sars-CoV-2, segmentsiz, 9860 amino asidi kodlayan, 29.903 (~30.000) nükleotit içeren [21] , zarflı, pozitif duyarlı, tek sarmallı, yüzeylerinde var olan çıkıntılar ve içlerinde barındıkları genetik materyal (genom) 'ları ile 28 kilobaz (~30) genom boyutuna sahip B beta koronavirüs cinsine ait RNA virüsleridir [1].
Sars-CoV-2'nin genomik RNA'sı (gRNA), 14 adet açık okuma çerçevesine (ORF'ler) sahiptir. (-1) ribozomal çerçeve kaydırma mekanizması yolu ile 2 ana ORF (ORF1a ve ORF1b açık okuma çevresi) 2 viral replikaz poliprotein'e (pp1a ve pp1ab) çevrilir.[37] Bu 2 poliprotein toplam genomun üçte ikisini oluşturur [1], [23] ,[24]. Bu poliproteinler de 2 adet önemli viral proteazlar (papain benzeri protez (PL pro ) ve 3 kimotripsin benzeri proteaz(3CL pro )) tarafından yapısal olmayan proteinleri(Nsps1-16) oluşturmak için parçalanır [1],[25].Eğer 3-kimotripsin benzeri proteaz enziminin aktivitesi engellenir ise virüs işlevsiz hale gelecektir. Bu nedenden dolayı, 3-kimotripsin benzeri proteaz (3CL pro ) iyi bir potansiyel hedeftir.
Bilim insanları tarafından yoğun çabalar sarf edilmesine rağmen, şu anda sars cov 2 hastalığı tedavisi için herhangi bir spesifik ilaç bulunmamaktadır.
Amacımız, ani meydana gelen, spesifik bir ilacı olmayan, insandan insana bulaşarak hızla yayılan, yeni olan COVİD 19 salgınına karşı yapı temelli ilaç tasarım yöntemlerini (doking, sanal ligand taraması) kullanarak in vitro, ön klinik ve klinik çalışmalar sonucunda sars cov 2 hastalığına iyi gelen ilaçlar içindeki etken maddeler ve çeşitli bitkiler içindeki fitokimyasallardan yararlanarak 3-kimotripsin benzeri proteaz enzimi inhibitörleri olabilecek aday bileşiklerin araştırılmasıdır.
Çalışmanın ilk aşamasında AutoDock Vina programının validasyonu 7C6S için yapıldı. Hesaplama sonucunda RMSD değeri 1.978 Å olarak bulundu. Bu değer 2 Å 'dan küçük olduğundan dolayı bu programın seçilen sistem için uygun olduğu belirlendi.
İkinci aşamada in vitro ve klinik çalışmalar sonucunda COVİD 19 hastalığına iyi gelen ilaçlar (Lumakaftor, Aprepitant, Konivaptan …v.s) içindeki etken maddeler ve 8 adet bitki (Hypericum Perforatum L, Anacardium Occidentale, Camellia Sinensis …v.s) içindeki bazı fitokimyasalların (Hiperisin, Teaflavin, Psödohiperisin, Amentoflavon, Agathisflavon…v.s) 3CL pro enzimi'nin aktif bölgesine bağlanmaları AutoDock Vina programı ile gerçekleştirildi. 2 adet ilaç etken maddesi (Lumakaftor(-9.0 kcal/mol) ve Aprepitant(-8.9 kcal/mol)) ve Hypericum perforatum L (Sarı Kantaron) ve Camellia sinensis (Çay)) bitkileri içindeki 4 adet fitokimyasal (Hiperisin(-9.4 kcal/mol), Psödohiperisin(-9.2 kcal/mol), Amentoflavon(-9.2 kcal/mol), Teaflavin(-9.3 kcal/mol)) en iyi bağlanmayı göstermektedir. 

Çalışmanın üçüncü aşamasında Molinspiration Cheminformatics Programı aracılığı ile 19 adet bitki fitokimyasalı için Biyolojik Aktivite(Herhangi bir besin maddesinin bir organizmadaki etki derecesi) varlıkları ile Lipinski Kuralı uygunluklarının saptanması sağlanmıştır.
Çalışmanın dördüncü aşamasında, AdmetSar 1.0 Programı aracılığı ile 19 adet bitki fitokimyasalı için Admet/Sar (emilim, dağılım, metabolizma, atılım ve toksisite) analizleri yapılmıştır.
Çalışmanın son aşamasında ise ZINC15 Veri Tabanı kullanılarak (Lumakaftor(-9.0 kcal/mol) ve Aprepitant(-8.9 kcal/mol)) ilacı etken maddeleri ve Hypericum perforatum L (Sarı Kantaron) (Hiperisin(-9.4 kcal/mol) bitkisinden yola çıkılarak potansiyel ligand olabilecek bileşiklerin sanal ligand taraması yapılmıştır. Bu hesaplamalar sonucu en iyi bağlanma afinitesi gösteren ilk 5 adet bileşiğin sars cov 2 hastalığı için ümit verici aday bileşikler olabilecekleri bulunmuştur.
Bu tezde yapılan çalışmalar sonucunda elde edilen veriler 3-kimotripsin benzeri proteaz (3CL pro) için etkili olabilecek yeni aday bileşiklerin tasarımına katkıda bulunacaktır.

Abstract:
On December 30, 2019, a new virus emerged in the city of Wuhan, Hubei province of China, and quickly spread to more than 150 countries [2]. As a result of the studies carried out by scientists on this new virus, it was concluded that the virus shares <80% nucleotide identity and 89.10% nucleotide [9] similarity with Sars Cov virus genes, and they occur despite sequence diversity[1].
On February 12, the World Health Organization (WHO) named this new virus as severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (Sars-CoV-2) and the disease causing it as 2019 Coronavirus Disease (Covid-2019, Covid-19) [2] .
Coronaviruses are spherical, large, single-stranded, positively sensitive, have an envelope on their surface [4] and have the largest genome size in the range of approximately 26-32 kilobases (kb) with the extensions they have on their surface and the genetic material (genome) they contain [3]  Virus particles ranging in diameter from 60 to 140 nm [5].
Sars-CoV-2 is a non-segmented, 9860 amino acid encoding, 29.903 (~30.000)  nucleotide-containing, enveloped [21], positive-sense, single-stranded, RNA viruses belonging to the B beta coronavirus genus, with extensions on their surface and a genome size of 28 kilobases (~30) with the genetic material they contain [1].
The genomic RNA (gRNA) of SARS-CoV-2 has 14 open reading frames (ORFs). The 2 main ORFs (ORF1a and ORF1b open reading circle) are translated into 2 viral replicase polyproteins (pp1a and pp1ab) via the (-1)  ribosomal frameshift mechanism [21]. These 2 polyproteins make up two-thirds of the total genome [1], [23] ,[24]. These polyproteins are also processed by 2 important viral proteases (papain-like prosthesis(PL pro ) and 3 chymotrypsin-like proteases(3CL pro )) to form nonstructural protein(Nsps1-16)'s [1],[25]. If the activity of the 3-chymotrypsin-like protease enzyme is inhibited, the virus will become dysfunctional. For this reason, the 3-chymotrypsin-like protease (3CL pro ) is a good potential target.
Despite intensive efforts by scientists, there is currently no specific drug for the treatment of sars cov 2 disease.
Our aim is to analyze the active ingredients and various plants in drugs that are good for sars cov 2 disease as a result of in vitro, preclinical,clinical studies, using structure-based drug design methods (docking, virtual ligand screening) against a new epidemic that occurs suddenly, does not have a specific drug, and spreads rapidly from person to person. It is the search for candidate compounds that can be 3-chymotrypsin-like protease enzyme inhibitors by utilizing the phytochemicals in it.
In the first phase of the study, validation of the AutoDock Vina program was performed for 7C6S. As a result of the calculation, the RMSD value was found to be 1.978 Å. Since this value is less than 2 Å, it was determined that this program is suitable for the selected system.
In the second stage of the study,as a result of in vitro,preclinical,clinial studies, the binding of active ingredients in drugs (Lumacaftor, Aprepitant, conivaptan …etc) that are good for sars cov 2 disease and some phytochemicals (Hypericin, Theaflavine, Pseudohypericin, Amentoflavone, Agathisflavone …etc) in 8 plants (Hypericum Perforatum L, Anacardium Occidentale, Camellia Sinensis …v.s)  to the active site of 3CL pro  enzyme was carried out with the AutoDock Vina program.
2 active drug (Lumakaftor(-9.0 kcal/mol) ve Aprepitant(-8.9 kcal/mol)) substances and 4 phytochemicals (Hypericin(-9.4 kcal/mol), Theaflavine(-9.3 kcal/mol), Pseudohypericin(-9.2 kcal/mol), Amentoflavone(-9.2 kcal/mol)) in Hypericum perforatum L and Camellia sinensis plants show the best binding.
In the third stage of the study, the compatibility of the biological activity(the degree of efficacy of any nutrient in an organism) assets and Lipinski rule for 19 plant phytochemicals was determined by the Molinspiration Cheminformatics Program.
In the fourth stage of the study, Admet (absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity) analyzes were performed for 19 plant phytochemicals via AdmetSar 1.0 Program.
At the last stage of the study, using the ZINC15 database, potential ligands were searched for virtual ligands based on the active ingredients of (Lumakaftor(-9.0 kcal/mol) ve Aprepitant(-8.9 kcal/mol)) and Hypericum perforatum L (Sarı Kantaron) (Hiperisin(-9.4 kcal/mol) herb. As a result of these calculations, it was found that the first 5 compounds with the best binding affinity could be promising candidate compounds for COVİD 19.
The data obtained as a result of the studies in this thesis will contribute to the design of new candidate compounds that may be effective for 3-chymotrypsin-like protease.