Kronik myeloid lösemi hücre hattında tirozin kinaz inhibitörlerine karşı direnç mekanizmalarının araştırılması
Investigation of resistance mechanisms against tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia cell line
Yazar: SEDA BAYKAL KÖSE
Danışman: DOÇ. DR. ZEYNEP YÜCE
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Hematoloji = Hematology ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Fenotip = Phenotype ; Fosfotransferazlar = Phosphotransferases ; Lösemi-miyeloid = Leukemia-myeloid ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Protein-tirozin kinaz = Protein-tyrosine kinases ; Tirozin = Tyrosine ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İmatinib mesilat = Imatinib mesilat

Özet:
Kronik myeloid lösemi (KML), kimerik Bcr-Abl onkoproteininin sentezlenmesinden sorumlu t(9;22)(q34;q11) translokasyonu ile karakterize bir hematopoetik kök hücre hastalığıdır. KML tedavisinde, imatinib gibi tirozin kinaz inhibitörlerinin Bcr-abl'in işlevini engelleyerek sağladıkları önemli başarıya rağmen ilaç direnci bugün hala hastaların %20-30'unu etkileyen ciddi ve belki de en önemli sorundur. 
      İlaç direncinin altında yatan sebepleri anlamak üzere in vitro olarak tasarlanan çalışmalarımızı, laboratuarımızda daha önce imatinib baskısı altında doğal seçilimle elde ettiğimiz, BCR-ABL mutasyonu/amplifikasyonu bulunmayan, yaşam sinyalleri Bcr-Abl'den bağımsız, tirozin kinaz inhibitörlerine dirençli bir K562 alt-klonu (K562-Ir) üzerinde yaptık. Tez kapsamında hücre ölümü çalışmaları, senesens çalışmaları, akım sitometrisi ile yüzey belirteç molekülleri taraması, üç-boyutlu hücre kültürü çalışmaları, farklı TKI'lerle dozaj denemeleri, proliferasyon deneyleri, Western blot, immünofluoresans teknikleri  ile gen ifadesi çalışmaları, hücre farklılaştırma deneyleri, mRNA mikrodizin (transkriptom) analizi, Q-PCR ile amplifikasyon varlığının saptanması ve ekspresyon doğrulama çalışmaları, microRNA mikrodizin analizi gerçekleştirildi. 
      K562-Ir hücrelerinin atasal hücrelerden farklı olarak yapışkan (adherent) özellik kazandığı gözlendi. Dirençli hücrelerin daha yavaş çoğaldıkları, tedavide kullanılan TKI'lerden imatinib'e olduğu kadar nilotinib, dasatinib, bosutinib ve ponatinib'e de dirençli oldukları; hücre ölüm sinyallerinin azaldığı, embriyonik yüzey markerları kazandıkları, birçok hücre-doku-organ farklılaşmasında rol oynayan genleri yeniden regüle ettikleri; üç boyutlu hücre kültürü ortamında tümör sferoidleri oluşturabildikleri gözlemlendi. Ayrıca İlaç direnci, hücre çoğalması, apoptoz direnci, hücre farklılaşmasından sorumlu tutulan mikroRNA'ların ifadesinde artış olduğu izlendi. 
     Tüm verilerimiz bir arada değerlendirildiğinde, lösemik popülasyondaki bazı hücrelerde imatinib yanıtının transkripsiyonel instabilite ile sonuçlanmasıyla fenotipik adaptasyon gösteren, Bcr-Abl-bağımsız, agresif bir popülasyonun ortaya çıktığını ileri süren yeni bir TKI direnç modeli sunulmuştur.

Abstract:
Chronic myeloid leukemia (CML) is a hematopoietic stem cell disease characterized by the t(9;22)(q34;q11) translocation resulting in the  chimeric BCR-ABL oncogene. Despite the significant success of tyrosine kinase inhibitors (such as imatinib) inhibiting Bcr-Abl oncoprotein function in the treatment of CML, drug resistance is still a serious and maybe the most important problem affecting 20-30% of patients.
       Our in vitro studies are designed using a TKI resistant K562 subclone (K562-Ir) which does not harbour any BCR-ABL amplification or kinase domain mutation. The K562-Ir subclone was developed in our laboratory by natural selection under imatinib pressure, to understand the underlying causes of drug resistance. We performed immunofluorescence, Western blot and mRNA microarray (transcriptome) techniques for gene expression analyses; three-dimensional cell culture studies; cell differentiation experiments; different TKIs applications with cell death analysis; flow cytometric cell membrane marker screening; proliferation assays; senescence assays; Q-PCR for amplification and expression confirmation studies.
       We observed that unlike K562 wild type cells, K562-Ir cells were adherent and resistant to nilotinib, dasatinib, bosutinib and ponatinib in addition to imatinib. K562-Ir cells are more resistant to cell death and proliferate slowly. They are capable of forming tumor spheroids in three-dimensional cell culture studies. We also showed a significant differences in the expression of genes that regulate cell-tissue-organ differentiation and development processes in K562-Ir cells. There is an increase in the expression of embryonic and cancer stem cell surface markers. There is also  an increase in the expression of microRNAs that regulate the expression of genes involving cell differentiation, drug resistance, proliferation and apoptosis resistance.
     In conclusion, we present a new TKI resistance model suggesting that under imatinib stress a sub-clone of the leukemic cells develop transcriptional instability resulting in a Bcr-Abl-independent/aggressive population with phenotypic adaptation capacity