Mide adenokarsinom'unda; yeni serum anti-tümör antikor paneli & hastalığın klinik belirteçleri ve tümör histopatolojisi ile ilişkisi
In stomach adenocarcinoma; new serum anti-tumor antibody panel & relationship with clinical markers of disease and tumor histopathology
Yazar: İSMAİL GÖMCELİ
Danışman: PROF. DR. ERDAL BİROL BOSTANCI
Sağlık Bakanlığı / Ankara Türkiye Yüksek İhtisas Eğt. ve Arş. Hastanesi / Gastroentoroloji Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Yan Dal Uzmanlık, 2011
Konu: Gastroenteroloji = Gastroenterology ; Genel Cerrahi = General Surgery ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Giriş ve Amaç
	Mide kanseri, en sık dördüncü kanser ve tüm dünyada kanser ilişkili ölümlerin en sık ikinci nedenidir. Bu yüksek mortalite oranları, kanserin asemptomatik doğası ve erken kanser tanısı için güvenilir biyogöstergelerin olmamasının bir sonucudur.
	İnsanlarda tümör oluşumu ve progresyonunun önlenmesinde immün sistemin rolüne ilişkin kanıtlar mevcuttur. İmmün yanıt oluşturan tümör hücrelerine ait otolog proteinler genel olarak tümör ilişkili antijenler (TAAs) olarak adlandırılır ve bu proteinlerin alternatif bir yoldan immünojenik reaksiyon oluşturdukları düşünülür. Birçok çalışma; kanser hastalarının, tümör-ilişkili antijenlere karşı tespit edilebilir otoantikorlar ürettiklerini göstermiştir. Bu immünreaksiyonlar'ın kanser gelişimi için zorunlu olabileceği üzerine hipotezler mevcuttur. İmmün sistem tarafından "yabancı" olarak algılanan tümör-ilişkili antijenlere karşı humoral immün cevap tespit edilmesi, tümör durumuna ilişkin bilgiler verebilir. Kanser antijen-ilişkili otoantikorların belirlenmesi, potansiyel bir kanser erken tanı aracı olabilir.
	Bu çalışmada yetkin bir tarama tekniği kullanarak, mide adenokarsinomlarına karşı gelişen antikor yanıtlarının tesbit edilmesi hedeflenmiştir. Tesbit edilecek yüksek titreli antikor yanıtlarının kanser erken teşhisi, prognozun takibi ve tedaviye yönelik modalitelerin geliştirilebilmesi alanlarında önemli katkılar sunacağı öngörülmektedir.
	Çalışmanın birinci amacı, kanser dokusundaki proteinlere karşı mide adenokarsinom'lu hastaların oluşturduğu antikor yanıtlarını yüksek çıktılı bir yöntemle tanımlamak, böyle yanıtların mide adenokarsinomu için duyarlılık ve özgüllüklerini saptamaktır.
	Çalışmanın ikinci amacı, tümör'e karşı başarılı bir immun yanıtı yansıttığı düşünülen antikor yanıtlarının, hastalığın klinik belirteçleri ve tümör dokusunun histopatolojik özellikleri ile olan ilişkilerini saptamaktır.
	Gereç ve Yöntem
	Çalışmaya mide tümörü ön tanısı olan ve cerrahi tedavi uygulanan, ardışık 50 hasta dahil edildi. Çalışmaya dahil edilen hastalardan periferik kan örnekleri alındı, cerrahi rezeksiyon uygulandıktan sonra bir adet tümör materyalinden ve bir adet tümör komşusu normal dokudan örnekler alınarak tümörün histolojik tipi, diferansiyasyonu, tümör çapı, tümör lokalizasyonu, vasküler invazyon, nöral invazyon, tümor invazyon derinliği, metastatik lenf nodları, tümör dışı patolojiler  raporlandı.
	Çalışmada; protein arraylerden, fetus beyin cDNA'sı kullanılarak üretilen protein arrayler kullanılmıştır. İki protein array paralel olarak taranmıştır. Bu protein arraylerden biri mide kanserli hasta serum havuzu ile diğeri de gönüllülerden elde edilen sağlıklı serum havuzu ile taranmıştır.
	İstaistiksel analizler SPSS for Windows 15.0 (Chi., Il., USA) paket programı ile yapılmıştır. Tanımlayıcı istatistikler ortalama, standart sapma, en küçük, en büyük, frekans, yüzde olarak verilmiştir. Klinik özellikler incelendiğinde alt gruplar arasında klon pozitifliği yönünden istatistiksel olarak anlamlı fark olup olmadığı ki-kare testi ile değerlendirilmiştir. İstatistiksel önemlilik için p<0.05 değeri önemli kabul edilmiştir.
	Bulgular
	Çalışmaya dahil edilen 46 hastanın 31' erkek (% 67,4), 15'i kadın'dı (%32,6). Yaş ortalaması 63,28 ± 11,42 (Min: 38, Maks: 85) idi.
	Histopatolojik değerlendirmelerin sonrasında ve hasta serumlarının protein array taramalarının öncelikli değerlendirilmesinde; antikor yanıtı veren 75 protein tespit edildi. Bu 75 protein'in %100 ile %54 arasında değişen özgüllük değerlerine ulaştığı görüldü ve % 100 özgüllük gösteren 40 tanesi, herhangi birine karşı antikor varlığı geliştiği düşünülerek birlikte değerlendirildiğinde; tüm panel % 100 özgünlüğe ve % 52 duyarlılığa ulaştı. 65 tanesinin birlikte değerlendirilmesi halinde ise özgüllük değerinin %96'ya düştüğü ancak duyarlılık değerinin %78'e çıktığı gözlendi.
	160, 164, 42, 70, 125, 146, 162 No'lu klonlara ait proteinlere karşı T2 evre tümörlerde istatistiksel anlamlılık düzeyine ulaşan antikor yanıtı oluştuğu gözlendi.
	Tespit edilen proteinlerin tümörün N evresi ile olan ilişkileri değerlendirildiğinde ise; 9, 45, 154, 158, 174, 178 ve 1 No'lu klonlara ait proteinlerde N1 evreli tümörlerde, istatistiksel olarak sınırda anlamlılık kazanan antikor yanıtı gözlendi. Antikor yanıtları tümör'ün hücre diferansiyasyonları açısından incelendiğinde; 27 ve 34 No'lu klonlara ait proteinlerde medüller yapıdaki tümörlere karşı, 108 No'lu klonda ise indiferansiye yapıdaki tümöre karşı istatistiksel anlamlılık kazanan antikor yanıtı gözlendi.
	Tartışma
	Hasta serumlarının custom array taramasında, %100 özgüllüğe sahip 40 protein'in birlikte değerlendirilmesinden elde edilen panel'in %52 duyarlılığa ulaştığı görüldü. Daha önemlisi 40 hasta serumu yerine 65 hasta serumu değerlendirildiğinde, özgüllük %96'ya düşmesine rağmen duyarlılığın %78'e çıktığı gözlendi. Toplum taraması için kullanıldığında sağlıklı hastaların %96'sını tespit edebileceğimiz ancak, kanserli 100 hastadan 22'sini tespit edemeyeceğimiz anlamına gelir. Buna rağmen, sonuçlarımızın sağlıklı hastaları taramak konusunda güvenilir sayılabilmesi yanı sıra günümüzde mide kanseri teşhisinde bu ölçüde yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip non-invazif başka bir yöntem bulunmaması önemlidir.
	Tümörün klinikopatolojik verileri ile pozitif antikor yanıtı arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki tespit edilememiş olması, bu kadar belirgin pozitif antikor yanıtları göz önüne alındığında, 'farklı evrelerdeki tümörler farklı antikor yanıtlarını tetikliyor' olabilir.
	Bu çalışma ile hem mide adenokanserinin erken tanısında kullanılabilecek olan non-invazif bir yöntemin geliştirilmesine zemin hazırlanmış hem de erken tanıda kullanılabilecek otolog antikorların keşfi için yapılabilecek bir çalışma için aday otolog antikorlar belirlenmiştir. Hasta sayısının arttırılması ve survival analizleri ile birlikte  yapılacak olan ileri çalışmalarla, tümörün klinikopatolojik özellikleri ile olan pozitif antikor yanıt ilişkisinde anlamlı sonuçlar elde edilebilir. En önemlisi bu otolog antikorların bağlandığı proteinlerin tespiti, yeni immünoterapi hedeflerinin temelini oluşturabilir.

Abstract:
Introduction and Purpose
	Stomach cancer is the fourth most common cancer and the second most common cause of cancer-related death worldwide. This high mortality rate is caused by the asymptomatic nature of the cancer and also by the lack of reliable biomarkers for early cancer detection.
	There are evidences for the formation of tumour in human beings and for the role of the immune system in limiting tumor growth. Autologous proteins of tumour cells that form an immune response are usually named as tumour associates antigens (TAAs), and it is thought that these proteins form an immunogenic reaction through an alternative way. Many studies have shown that patients suffering from carcinoma produce detectable autoantibodies against tumour-related antigens. There are some hypotheses about the inevitability of these immune reactions for the development of carcinoma. The detection of humoral immune response against tumour-related antigens perceived as 'foreign' by the immune system might give some information on the state of the tumour. The definition of autoantibodies to carcinoma-related antigen could be a potential means for the early diagnosis of carcinoma.
	In this study, the aim has been to identify by using an efficient scanning method the antibody responses developing against gastric carcinoma. It is estimated that the high-titer antibody responses to be determined will make significant contributions to the early diagnosis of cancer, the follow up of prognosis, and to the development of therapeutic modalities.
	The first purpose of this study is to define the antibody responses obtained by patients with gastric carcinoma against the proteins in the tumour tissues through a high-throughput method, and to determine the sensitivities and specificities of such responses for gastric carcinoma.
	The second purpose of this study is to identify the antibody responses that are thought to reflect a successful immune response against the tumour, and to determine the relationship between the clinical indicators of the disease and the histopathologic characteristics of the tumour.  

	Materials and Method
	Fifty consecutive patients with gastric carcinoma pre-diagnosis and receiving surgical treatment have been included in the study. The peripheral blood samples of those patients included in the study have been taken, and after the application of surgical resection, the histological type of the tumour, its differentiation, tumour diameter, tumour localization, vascular invasion, perineural invasion, the depth of tumour invasion, metastatic lymph nodes, and non-tumoural pathologies have been reported by taking one sample from the tumour material and one from the normal tissue adjacent to the tumour.
	In the study, among the protein arrays, the protein array produced by using fetus brain cDNA has been used. Two protein arrays have been used as parallel to each other. One of these protein arrays has been scanned with the serum pool for patients with gastric carcinoma and the other with the healthy serum pool formed by the volunteers. 
	Statistical analyses have been made using the SPSS for Windows (Chi., I1., USA) package programme. Descriptive statistics are given as average, standard deviation, minimum, maximum, frequency and per cent. When clinical features were examined, the presence of a statistically significant difference between the sub-groups in terms of clone positivity was assessed using the chi-square test. For statistical significance p<0.05 was accepted as a significant value.


            Findings
	31 (67.4 %) of the 46 patients included in this research were male and 15 (32.6 %) of them were female. Average age was 63. 28 ± 11.42 (min: 38, max: 85).
	Following the histopathological evaluations and in the antecedent assessment of the protein array scans of the serums of the patients, 75 proteins giving antibody responses were detected. It was seen that these 75 proteins reached specificity levels ranging between 100 % and 54 %, and when 40 of them revealing 100 % specificity were evaluated concomitantly with the consideration that an antibody presence developed against any of them, "full panel" reached 100 % specificity and 52 % sensitivity levels. When 65 of them were evaluated together it was observed that specificity value dropped to 96 % whereas sensitivity value reached 78 %.
	It was observed that against the proteins that belonged to clones number 160, 164, 42, 70, 125, 146, and 162, antibody response at the level of statistical significance was formed in the T2 tumours.
	When the relationship of the detected proteins to the N phase of the tumour were assessed, in the proteins of the clones number 9, 45, 154, 158, 174, 178 and 1 in the N1 tumours an antibody response that statistically gained significance at the limit value was observed. When the antibody responses were examined in terms of tumour's cell differentiations, in the proteins of the clones number 27 and 34 an antibody response against the tumours with a medullar structure, and in clone number 108 an antibody response that gained statistical significance against the tumour with an undifferentiated structure was observed.



            Discussion
	It has been seen that in the custom array scanning of the serums of patients, the panel obtained from the concurrent assessment of the 40 proteins with 100 % specificity reached 52 % sensitivity level. More importantly, when serums of 65 patients instead of 40 were evaluated, it was observed that despite the decrease of specificity to 96 %, sensitivity level increased up to 78 %. This means that when used for public scanning, we can detect 96 % of healthy patients, but we cannot detect 22 of 100 patients with carcinoma. Yet, despite this, besides the acceptable reliability of our results in the scanning of healthy patients, it is significant that there is no other non-invasive method in the diagnosis of gastric carcinoma which has a high rate of specificity and sensitivity to this extent. 
	When such distinct positive antibody responses are taken into consideration, the lack of any finding in terms of a statistically significant relationship between the clinicopathologic data of the tumour and positive antibody response can lead us to think that "tumours at different stages induce different antibody responses."
	With this study, both the ground for the development of a non-invasive method in the early diagnosis of gastric carcinoma has been prepared and the candidate antibodies for a study to be conducted for the discovery of autologous antibodies, which can be used in early diagnosis, have been determined. In further studies that can be made by increasing the patient number and with survival analyses, significant results can be obtained in the relationship between positive antibody response and clinicopathologic characteristics of the tumour. Most importantly, the detection of these proteins to which autologous antibodies bind might be the basis for new immunotherapy targets.