Bağ alanlarında ölükol hastalığı etmeni phomopsis viticola (Sacc.) sacc. izolatlarındaki DSRNA'nın tanılanması, moleküler ve biyolojik karakterizasyonu ile hipovirülent etkisi
Identification, molecular and biological characterization of DSRNA in the isolates of phomopsis viticola (Sacc.) sacc, the causal agent of phomopsis cane and leaf spot disease, and hypovirulent effect
Yazar: SAHRA HOSSEINALIZADEH
Danışman: PROF. DR. SERAP AÇIKGÖZ
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı / Bitki Koruma Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Amaç: Ege Bölgesinin bağ alanlarında Phomopsis sürgün ve yaprak lekesi (ölükol) hastalığı etmeni Phomopsis viticola izolatlarında dsRNA'nın tanılanması, moleküler ve biyolojik karakterizasyonu ile hipovirülent etkisisinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
Materyal ve Yöntem: 2018 yılında Ege Bölgesinin en fazla asma yetiştiriciliği yapılan il ve ilçelerden ölükol hastalığı belirtisi sergileyen asmaların sürgün örneklerinden elde edilen fungal izolatların morfolojik ve kültürel özellikleri değerlendirilerek P. viticola etmeni moleküler yöntemlerle tanılanmıştır. P. viticola izolatlarından Balijja vd. (2008) yöntemi ile dsRNA analizi yapılıp, dsRNA içeren izolatlar dsRNA içermeyen 3 izolat ile biyolojik özellikleri yönünden karşılaştırılmıştır. Seçilen dsRNA içeren 50 izolatın dikey taşınma kapasitesi en iyi performans gösteren izolatlar ile asma fidanların üzerinde virülenslik testleri yapılmıştır. dsRNA içeren izolatların vegetatif uyum grupları belirlenmiş ve yatay taşınım kapasiteleri değerlendirilmiştir. Yatay taşınım ile dsRNA pozitife dönüştürülen virülent P. viticola izolatlarında dsRNA virüslerin hipovirulenslik etkisi asma fidanları üzerinde belirlenmiştir. Tüm uygulanan biyolojik testlerde en iyi performans göstermesi nedeniyle biyolojik mücadelede kullanılabilme özelliği taşıyan 6 adet izolat arasından seçilen 2 izolata ait dsRNA'ları tüm genom dizi analizi yeni nesil dizileme teknolojisi (YND) Illumnia sekanslayıcıda yapılmıştır. Çift yönlü okumaların birleştirlmesiyle de novo tüm genom dizisi belirlenmiş ve filogenetik analizleri yapılmıştır.
Bulgular: Asma sürgün örneklerinden elde edilen toplam 214 P. viticola izolatın 125'inde tek segmentli veya iki segmentli ~2,5-9,4 kb uzunlugunda dsRNA'lar belirlenmiştir. dsRNA içeren ve içermeyen izolatların koloni renk farklılığı olmadığı ve dsRNA içermeyen izolatların içerenlere göre daha hızlı koloni gelişimi ile petrinin tamamını kaplayarak çok sayıda piknit oluşturduğu belirlenmiştir. Dikey taşınım performansı en iyi olan dsRNA içeren 12 izolatın asma fidanlarının sürgün ve yapraklarında virülenslik yönünden farklılıklar saptanmıştır. dsRNA içeren izolatlarda 5 farklı vejetatif uyum grubu saptanmış ve yatay taşınım testinde 12 izolatın 10'unda dsRNA'nın alıcı izolata taşınabildiği saptanmıştır. Virülenslik testinin ikinci aşamasında 884Ç/962M, 884Ç/961M, 884Ç/780Se, 884Ç/889G ve 884Ç/861Ç izolatları asma fidanlarının hem yapraklarında (%26,32-49,37) hem sürgünlerinde (%14,11-16,33) düşük virülenslik göstermiştir. Yapılan tüm biyolojik testler sonucu en iyi performansı gösteren 6 izolatın miktar ve kalite yönünden en uygun olan 961M ve 962M numaralı izolatlarının dsRNA'ları genom dizi analizinde sırasıyla toplam 24 ve 33 milyon okuma elde edilmiştir. Ardından 961M den 9,7 ve 2,5 kb büyüklüğünde 2 konting, 962M den ise, 9,5, 2,5 ve 2,5 kb uzunluğunda 3 konting elde edilmiş ve 3 (961M) ile 6 (962M) CDS saptanmıştır. Hypothetical ile RdRp proteinlerini kodlayan 2 (961M) ve 5 (962M) ORF bölgeleri tesbit edilmiştir. Hypothetical ve RdRp protein amino asit dizilerinin BLASTp sonucunda en yüksek özdeşlik oranı (%41-44) Fusagraviridae familyasından Fusarium poae dsRNA virus 2 ile olmuştur. Filogenetik analizde aynı yerde kümelenen 961M ve 962M sadece Fusarium poae dsRNA virus 2 ile en yakın kümelenme oluşturmuştur. Bu nedenle bu iki dsRNAnın yeni bir mikovirüs familyasının üyesi olabileceği düşünülmüştür. 961M ve 962M dsRNA genom dizileri NCBI da kayıt altına alınmıştır.
Sonuç: Ege Bölgesi bağ alanlarında izole edilen P. viticola izolatlarında belirlenen mikoviral dsRNA'lar arasında yapılan tüm biyolojik testlerde en iyi performans gösteren ve dsRNA kalite/miktarı en iyi olan 961M ve 962M nolu izolatların fungal konukçusunun virülenslik etkisini kayda değer oranda azalttığı belirlenmiştir. Biyoenformatik analizler sonucu yeni bir mikoviral dsRNA familyasının üyesi olabileceği düşünülen 961M ve 962M dsRNA'nın genom organizasyonu konusunda daha derinlikli çalışmaların yapılması gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: dsRNA, Mikovirüs, Phomopsis viticola, Yeni nesil dizileme

Abstract:
Objective: This study was aimed to identify dsRNA in the isolates of Phomopsis viticola, which is the causal agent of Phomopsis cane and leaf spot disease, in the vineyard areas of the Aegean Region, and to determine its hypovirulent effect by molecular and biological characterization.
Material and Methods: In 2018, the fungal isolates were obtained from the shoot samples of the grapevines that had the signs of Phomopsis cane and leaf spot disease. Sampling was done in the districts of the grapevine-growing provinces of the Aegean Region, where the majority of grapevines are cultivated. The samples were evaluated and the P. viticola was identified by molecular methods. dsRNA analysis of P. viticola isolates was performed according to Balijja's method and the dsRNA containing isolates were compared with three dsRNA-free isolates in terms of their biological properties. The virulence assay was carried out on the two-years old grapevine seedlings using 50 selected dsRNAs containing isolates that had the best performance in vertical transmission assay. The vegetative compatibility groups of the isolates containing dsRNA were determined and their horizontal transmission capacities were evaluated. The hypovirulent effect of dsRNA viruses was determined by comparing the virulence of a virulent P. viticola isolates with its converted form that is generated by horizontal transmission. The six isolates showing the best performances in all applied biological tests were selected for whole genome sequence analysis. whole genome sequences were determined by next generation sequencing (NGS) in the Illumnia sequencer. Bidirectional sequence reading were assabled de nova to obtain whole genome sequence and phylogenetic analyses were performed.
Results: Single-segmented and two-segmented dsRNAs of ~ 2.5-9.4 kb were determined in 125 of a 214 P. viticola isolates obtained from grapevine shoot samples. It was determined that dsRNA-containing and dsRNA-free isolates did not have any difference in colony color. dsRNA-free isolates covered the entire petri with faster colony growth than the ones containing dsRNA and formed a large number of pycnidia. The 12 dsRNA isolates, which had the best vertical transmission rate, exhibited varying degree virulence in the virulence test. Among the isolates containing dsRNA, 5 different vegetative compatibility groups were determined. In the horizontal transmission test, dsRNA's in 10 of 12 isolates were succesfully transferred to the recipient virus free P. viticola isolate. The results of the second virulence assay showed that converted isolates, 884Ç/962M, 884Ç/961M, 884Ç/780Se, 884Ç/889G ve 884Ç/861Ç, had low virulence in both the leaf (26.32-49.37%) and shoot (14.11-16.33%) inoculation of grapevine samplings. Among 6 dsRNA containing isolates with the best performance according to results of all biological tests, the dsRNAs of 961M and 962M isolates, which are the most suitable in terms of the quantity and quality and produced a total of 24 and 33 million readings, respectively, in the genome sequence analysis. Then, two contings of 9.7 and 2.5 kb from 961M and 3 contings of 9.5 and 2.5 kb were obtained from 962M and 3 (961M) and 6 (962M) CDS were determined. There were two ORF regions in 961M and 5 in 962M encoding an RdRp and hypothetical proteins. As a result of BLASTp, hypothetical and RdRp amino acid sequences showed the highest identity (41-44%) with Fusarium poae dsRNA virus 2 from the Fusagraviridae family. In the phylogenetic analysis, 961M and 962M clustered in the same place and formed the closest cluster with Fusarium poae dsRNA virus 2. Therefore, it is thought that these two dsRNA may be members of a new mycovirus family. 961M and 962M dsRNA genome sequences were recorded in the NCBI databases. 
Conclusion: It was determined that among the isolates with mycoviral dsRNAs, which were detected in the P. viticola isolates collected from the Aegean region vineyards, 961M and 962M showed the best performance in all biological tests applied, and had the best dsRNA quality/ quantity, significantly reduced the virulence of the fungal host. It is necessary to carry out more studies on the genome organization of 961M and 962M dsRNAs, which are thought to be a member of a new mycoviral dsRNA family as a result of bioinformatics analysis.
Key Words: dsRNA, Mycovirus, Next Generation Sequencing, Phomopsis viticola