Hipoksi altında üretilmiş mezenkimal kök hücre sekretomunun osteoartritik kondrositler üzerine etkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of the effect of mesenchemal stem cell secretom on osteoartritic condrosites
Yazar: HABİP KARATÜRK
Danışman: DOÇ. DR. RECEP SARAYMEN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Tıp) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
HİPOKSİ ALTINDA ÜRETİLMİŞ MEZENKİMAL KÖK HÜCRE SEKRETOMUNUN OSTEOARTRİTİK KONDROSİTLER ÜZERİNE ETKİSİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ

Habip KARATÜRK

Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Tıbbi Biyokimya
Yüksek Lisans Tezi, Haziran 2021
Danışman: Doç. Dr. Recep SARAYMEN

ÖZET
Çalışmanın amacı kıkırak matriksini üreten osteoartritik kondrosit hücre hattı üzerine uygulanan hipoksi kültür altında üretilmiş mezenkimal kök hücre eksozomunun, kıkırdak onarımı ve yenilenmesindeki rolünü incelemektir. Uygulanan bu eksozomların osteoartiritik kondrositler üzerinde canlılık, apoptoz gibi biyolojik karakteristiklerinin de nasıl değiştiğini pro-inflamtuvar sitokinler ve glikozaminoglikan seviyesinde değerlendirilmiştir.
Hipoksik ve normoksik koşullarda akım sitometri aracılığıyla immünofenotipik analizi yapılan dental pulpa kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden (DP-MKH) eksozomlar izole edilmiş olup, bu eksozomların miktar tayini gerçekleştirilerek Western Blot ve Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) ile karakterizasyonu yapılmıştır. Hipoksik ve normoksik koşullarda elde edilen eksozomlar osteoartritik kondrosit hücre hatları (OA) üzerine uygulanıp 48. Saat sonrasında proliferasyonu için MTT deneyi, ilgili kitler ile Apoptoz, Canlılık, Glikozaminoglikan (GAG) ve İnflamatuvar Sitokin deneyleri ile değerlendirilmiştir. İstatiksel analizleri GraphPad Prism programı ile yapılmıştır ve p<0,05 olan veriler anlamlı kabul edilmiştir.
Sonuçlarımız hipoksik ortamda üretilen DP-MKH eksozomlarının osteoartritik kondrositlerde apoptozu artırdırdığını, normoksik ortamda elde edilen eksozomların ise apoptozu azaltığını göstermiştir. Kıkırdağın avasküler yapısı göz önüne alındığında hipoksinin MKH eksozom içeriğini kartilaj onarımı için daha etkili hale getirdiğini göstermektedir. Kıkırdak onarımında eksozomların apoptozu azalttığı ve proliferasyonu artırdığı bilgisi sağlıklı kondrositler için oldukça önemlidir ancak buradaki durum patolojiktir ve patolojik osteoartritik kondrosit hücrelerinde apoptozu artırmak ve proliferasyonu azaltmak o mikroçevrede sağlıklı kondrositlerin tekrar farklılaşması için daha önemli olacaktır. Bunu destekler nitelikte çalışmamızda hipoksik ortamda üretilen DP-MKH eksozomları osteoartritik kondrositlerde apoptozu artırmış ve proliferasyonu anlamlı derecede azaltmıştır. Hipoksi altında DP-MKH'lerden ürettiğimiz eksozomlar hem kontrol grubu osteoartirik kondrositlere göre hem de normoksi altında üretilen DP-MKH eksozomlarına göre kıkırdak dokunun temel ekstraselüler bileşenlerinden birisi olan GAG'ı anlamlı bir şekilde artırmıştır. Bu durum da yine hipoksi altında üretilen MKH eksozomlarının osteoartrit onarımı veya rejenerasyonunda daha kullanışlı olabileceğini gösterir niteliktedir. Pro-inflamatuvar sitokin analizinde ise hipoksi altında ürettiğimiz DP-MKH eksozomlarının osteoartritik kondrositlerde IL-8, IL-1β ve IL-6 pro-inflamatuvar sitokinlerini baskıladığını bize göstermiştir. Aynı etki normoksi grubunda görülse de hipoksi ortamında elde edilen DP-MKH eksozomları inflamatuvar sitokinleri daha fazla baskılamıştır. Normoksik ortamda üretilen DP-MKH eksozomları IL-10 ifadesini yaklaşık 2 kat artırmış olup buna karşın hipoksi altında üretilen DP-MKH eksozomu uygulanan osteoartritik kondrositlerde IL-10 inflamatuvar sitokininin artmasına izin vermediği ve sabitlediği tespit edilmiştir. TNF ifadesi hipoksi grubunda artış gösterdi ve bu artış apoptoz bulgularımızla da desteklenerek hipoksi altında üretilen DP-MKH eksozomlarının osteoartritik kondrositlerde apoptotik etkiler yarattığı bulunmuştur.
Edinilen sonuçlar kliniğe uyarlanabilirliği düşünülebilir, özellikle osteoartrit patolojik durumunda teröpatik bir hücresiz-hücresel ürün olarak kullanılabilir.
Anahtar Kelimeler: Hipoksi; Osteoartritik Kondrosit; Sekretom; Mezenkimal Kök Hücre

Abstract:
EVALUATION OF THE EFFECT OF MESENCHEMAL STEM CELL SECRETOM ON OSTEOARTRITIC CONDROSITES

Habip KARATÜRK

Erciyes University, Graduate School of Health Sciences
Deparment of Medical Biochemistry
M. Sc. Thesis, June 2021
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Recep SARAYMEN

ABSTRACT

The purpose of the study is to examine the role of mesenchymal stem cell exosome produced under hypoxia culture on the osteoarthritic chondrocyte cell line that produces the cartilage matrix, in cartilage repair and regeneration. How the biological characteristics of these applied exosomes such as viability and apoptosis on osteoarthritic chondrocytes changed, were evaluated at the level of pro-inflammatory cytokines and glycosaminoglycans.
Exosomes were isolated from dental pulp-derived mesenchymal stem cells (DP-MSC), whose immunophenotypic analysis was performed by flow cytometry in hypoxic and normoxic conditions, and these exosomes were quantified and characterized by Western Blot and Scanning Electron Microscope (SEM). Exosomes obtained under hypoxic and normoxic conditions were applied to OA chondrocyte cell lines and evaluated after 48 hours with MTT assay, Apoptosis, Viability, Glycosaminoglycan (GAG) and Inflammatory Cytokine assays with related kits. Statistical analyzes were performed with the GraphPad Prism program and data with p<0.05 were considered significant.
Our results showed that DP-MSC exosomes produced in hypoxic environment increased apoptosis in osteoarthritic chondrocytes, while exosomes obtained in normoxic environment decreased apoptosis. Considering the avascular nature of cartilage, it shows that hypoxia makes MSC exosome content more effective for cartilage repair. The knowledge that exosomes reduce apoptosis and increase proliferation in cartilage repair is very important for healthy chondrocytes, but the situation here is pathological and increasing apoptosis and reducing proliferation in pathological osteoarthritic chondrocyte cells will be more important for the redifferentiation of healthy chondrocytes in that microenvironment. In support of this, in our study, DP-MSC exosomes produced in hypoxic environment increased apoptosis in osteoarthritic chondrocytes and significantly decreased proliferation. The exosomes we produced from DP-MSCs under hypoxia increased significantly compared to both control group osteoarthric chondrocytes and DP-MSC exosomes produced under normoxia. This indicates that MSC exosomes produced under hypoxia may be more useful in osteoarthritis repair or regeneration. In the pro-inflammatory cytokine analysis, it has been shown to us that DP-MSC exosomes produced under hypoxia suppressed IL-8, IL-1β and IL-6 pro-inflammatory cytokines in osteoarthritic chondrocytes. Although the same effect was observed in the normoxia group, DP-MSC exosomes obtained in the hypoxia environment suppressed inflammatory cytokines more. DP-MSC exosomes produced in normoxic conditions increased IL-10 expression approximately 2-fold, whereas DP-MSC exosomes produced under hypoxia did not allow the increase of IL-10 inflammatory cytokine and fixed it in osteoarthritic chondrocytes. TNF expression increased in the hypoxia group, and this increase was supported by our apoptosis findings, and it was found that DP-MSC exosomes produced under hypoxia had apoptotic effects in osteoarthritic chondrocytes.
As the results obtained may be clinically relevant, it can be used as a therapeutic acellular-cellular in the spesific osteoartritis pathological condition.
Key words: Hypoxia; Osteoarthritic Chondrocyte; Secretome; Mesenchymal Stem Cell