Pichia pastoris alkol oksidaz (AOX1 ve AOX2) genlerinin inaktif edilmesi ve elde edilen suşun rekombinant protein üretiminde kullanılması
Inactivation of alcohol oxidase genes (AOX1 and AOX2) in Pichia pastoris and utilization of the AOX-defective strain in recombinant protein production
Yazar: MERT KARAOĞLAN
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Pichia pastoris, biyoteknoloji, ilaç endüstrisi ve akademik araştırmacılar tarafından rekombinant protein üretimi için ihtiyaç duyulan bir ekspresyon sistemidir. P. pastoris, bakteriler gibi, tek karbon kaynağı olarak metanol, glukoz, gliserol veya etanol içeren ucuz besiyerlerinde hızla gelişme gösterebilmektedir. Ayrıca, insanlar gibi, ökaryotik bir organizmadır ve böylece hücre içi ortamı ökaryotik proteinlerin katlanması bakterilere göre daha iyi olanak sağlamaktadır. Buna ilaveten proteolitik işlemler, disülfit köprüsü oluşumu ve glikozilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonları gerçekleştirme yeteneğine sahiptir.P. pastoris'in genomunda alkol oksidaz geninin iki kopyası bulunmaktadır. AOX1 geni hücrede alkol oksidaz aktivitesinin %85'inin regülasyonundan sorumlu iken, AOX2 geni alkol oksidaz aktivitesinin %15'inden sorumludur. Bu sebeple, rekombinant protein üretiminde AOX1 promotoru daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Metanol kullanım yeteneklerine göre 3 tip P. pastoris konukçu suşu bulunmaktadır. Çoğu suş metanolde doğal tip oranında gelişir (Mut+, metanol kullanımı pozitif fenotip). Diğer konukçu suşların (Muts ve Mut-) bir veya iki AOX geni de silinmiştir. Bazen AOX genleri silinmiş suşlar, rekombinant protein üretiminde doğal tip suşlardan daha iyi olabilmektedir. Ayrıca bu suşlar ekspresyon tetiklemesi için daha az metanol gerektirmektedir. Büyük ölçekli fermentasyonlar için az miktarda metanol gereksinimi, Mut- suşunu diğer suşlara göre avantajlı kılmaktadır.Çalışma iki bölümden oluşmaktadır. İlk bölümü, P.pastoris'te AOX genlerinin (AOX1 ve AOX2) inaktif edilmesidir. AOX1 ve AOX2 genleri, sırası ile ADE1 ve HIS4 genlerinin entegrasyonu ile inaktif edilmiştir. ADE1 ve HIS4, aynı zamanda seçici markırlardır. Bu bölümün sonucu olarak, P. pastoris MK321 (his4::PHIS4, aox1::ADE1), MK431 (ade1::PADE1 aox2::HIS4) ve MK500 (aox1::ADE1 aox2::HIS4) suşları elde edilmiştir.İkinci bölümde, bu suşların protein üretimi üzerine çalışılmıştır. EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) 'nin hücre dışında üretimi için suşlara pPICZ?A vektörü kullanılarak model protein olan EGFP geni aktarılmıştır. Ayrıca, rekombinant protein üretiminde sık kullanılan, P. pastoris X33 ve KM71H ticari suşlarına da aynı gen aktarılmıştır. Protein üreten X33, KM71H, MK321, MK431 ve MK500 suşlarından tek kopya plazmid içeren klonlar Southern Blot tekniği ile seçilmiş ve bu klonlarda protein üretimleri karşılaştırılmıştır.Bu çalışmada elde edilen P. pastoris MK500 suşunun rekombinant protein üretimlerinde yaygın olarak kullanılan P. pastoris X33 suşundan daha yüksek spesifik verimlilikle protein üretme (FU/OD) yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. EGFP 'nin hücre dışına salgılandığı SDS-PAGE ve Western Blot teknikleri ile doğrulanmıştır.Sonuç olarak, yeni geliştirilen konukçu sistem olan P. pastoris MK500, metanolü metabolize edememektedir ve bu yüzden metanole sadece tetikleyici olarak ihtiyaç duymaktadır. Böylece bu suş, endüstriyel ölçekte rekombinant protein üretimlerinin çok düşük miktarda metanol ile gerçekleştirilmesine olanak sağlayacaktır.

Abstract:
Pichia pastoris is an expression system for the production of recombinant proteins needed by the biotechnology and pharmaceutical industries and by academic researchers. Like bacteria, P. pastoris grows rapidly on inexpensive media containing methanol, glucose, glycerol or ethanol as a sole carbon source. Furthermore, like humans, it is also a eukaryotic organism with a subcellular environment more conducive to the folding of eukaryotic proteins and with an ability to perform post-translational modifications such as proteolytic processing, disulfide bridge formation and glycosylation.The genome of P. pastoris contains two copies of the alcohol oxidase gene. The AOX1 gene is responsible for 85% of alcohol oxidase regulation within the cell while AOX2 gene is responsible for %15. Therefore if is the AOX1 promoter which is more widely used in recombinant protein production. P. pastoris has three different phenotypes depending on methanol utilization ability. Mut+ strain is indistinguishable from wild-type methanol utilizing strain. Muts (AOX1 gene is defective) and Mut- (AOX1 and AOX2 genes are defective) strains can be better than wild-type in recombinant protein production. In addition, these strains require less methanol for induction of expression. Less methanol requirement is an advantage of Mut- strains in large scale fermentation.This research consists of two parts. In the first part the objective was the inactivation of AOX genes (AOX1 and AOX2) in P. pastoris. AOX1 and AOX2 were inactivated by inserting ADE1 and HIS4 genes, respectively. ADE1 and HIS4 genes were also selection markers. As a result of this part, P. pastoris MK321 (his4::PHIS4, aox1::ADE1), MK431 (ade1::PADE1 aox2::HIS4) and MK500 (aox1::ADE1 aox2::HIS4) strains have been developred.In the second part, recombinant protein production of these strains was studied. Therefore, model protein EGFP gene was transformed into the strains by using pPICZ?A as a vector for extracellular expression. Commercial strains P. pastoris X33 and KM71H which are mostly-used in recombinant protein production were also transformed with EGFP, simultaneously. Single copy gene containing clones were selected from protein producing X33, KM71H, MK321, MK431 and MK500 strains using Southern Blot method and protein production of these strains were compared.Results showed that P. pastoris MK500 is capable of producing higher specific yield of protein (FU/OD) compared to P.pastoris X33 which is the most commonly used in recombinant protein production. Extracellular production of EGFP have been confirmed using SDS-PAGE and Western Blot methods.As a result, P. pastoris MK500 which is newly developed host system is unable to metabolize methanol so requires methanol only as inducer. Consequently, this strain allows to carry out large scale protein production with small amounts of methanol.