HIV-1 T transaktivasyonunun antisens oligonükleotid teknolojisi kullanılarak inhibe edilmesi
Inhibition of HIV-1 transactivation by antisense  
olignucleotide technology
Yazar: ÖMER FARUK ARICI
Danışman: PROF. DR. İLHAN DEMİRHAN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Eczacılık Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Asetiltransferaz = Acetyltransferase ; HIV I = HIV I ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kloramfenikol = Chloramphenicol ; Mikro RNA = Micro RNA ; Oligonükleotidler = Oligonucleotides ; RNA = RNA ; Tedavi = Treatment ; İmmün yetmezlik = Immun deficiency

Özet:
HIV-1'in yüksek oranda mutajeneze bağlı olarak antiretroviral ilaçlara karşı geliştirdiği direnç nedeniyle ilaç etkinliğinin ortadan kalkması, alternatif viral hedeflerin araştırılmasına yol açmıştır. Bu hedefler arasında gösterilen HIV-1 Tat proteini, enfekte hücrelerin nükleusunda trans-acting transkripsiyonel aktivatör olarak etki eder. Ayrıca tüm HIV-1 transkriptlerinin 5' ucunda yer alan iyi korunmuş TAR saç tokası yapısı ve bazı hücresel proteinler ile kompleks etkileşimlere girerek transkripsiyonun başlatılması ve RNA zincirinin uzamasında görev alır.
Bu çalışma, farklı dizilim ve modifikasyonlar içeren antisens oligonükleotid (ASO) dizileri kullanılarak, HIV-1 transaktivatör proteini, Tat'ın oluşumunun dolayısıyla aktivitesinin inhibe edilmesi amacıyla yapıldı. ASO'lerin dizilimi, direnç gelişimini minimum düzeyde tutabilmek amacıyla tat mRNA'nın 5' ucu yakınındaki iyi korunmuş bölgenin farklı sekansları hedeflenerek belirlendi.
Transaktivasyon modeli oluşturmak amacıyla, Jurkat hücrelerine HIV-1 tat ve rev geni içeren pCV1 plazmidi ile HIV-1 LTR ve CAT raportör genini içeren pC15CAT plazmidleri DEAE-dekstran metodu kullanılarak transfekte edildi. ASO'lerin Tat aktivitesi üzerine etkilerini araştırmak amacıyla, ASO'ler plazmid transfeksiyonu yapılmış jurkat hücre kültürüne 1 μM, 3 μM ve 5 μM konsantrasyonlarda ilave edildikten sonra hücre kültürü 48 saat inkübe edildi. İnkübasyon süresi sonunda oluşan CAT enzim ekspresyonu CAT ELISA kiti aracılığıyla tespit edildi.
En yüksek CAT ekspresyonu inhibisyonu, 5 μM dozda CAT ekspresyonunu %43 inhibe eden Anti-Tat-1 dizisi ile elde edilmiştir. Sitotoksisite testi sonucu hücreler üzerinde toksik etki yarattığı tespit edilen Anti-Tat-2 ise aynı dozda CAT ekspresyonunu %35 inhibe etmiştir. Sonuç olarak bu çalışmada, antisens oligonükleotid teknolojisi kullanılarak Tat aktivitesinin inhibe edilebileceği gösterilmiştir. Tat geninin farklı korunmuş bölgeleriyle etkileşim gösterebilecek farklı dizilime ve modifikasyonlarla sahip sitotoksik olmayan ASO'lerin dizayn edilmesinin, tat aktivitesinin daha efektif olarak inhibe edilmesinde ve alternatif AIDS tedavilerinin geliştirilmesinde önemli olacağı düşünülmektedir.

Anahtar kelimeler: HIV, TAT, CAT, TAR, antisens

Abstract:
The elimination of antiretroviral drug efficacy due to drug resistance developed by high-rate HIV-1 mutagenesis has led to the investigation of alternative viral targets. One of these targets is the    HIV-1 Tat protein, which functions as a trans-acting transcriptional activator in the nucleus of infected cells. Tat is also involved in the initiation of transcription and RNA chain elongation by a complex process involving interactions with cellular proteins and a hairpin loop called TAR which is a highly conserved stem-loop structure located at the 5' end of all HIV-1 transcripts.
In this study, we aimed to inhibit Tat activity by using antisense oligonucleotides with different sequences and modifications. To reduce risk of resistance development, ASO sequences were selected by targeting well conserved region near the 5' end of the Tat mRNA.
To create transactivation model, pCV1 plasmid containing tat and rev genes and pC15CAT plasmid containing HIV-1 LTR and CAT reporter genes were transfected in jurkat cells by DEAE-dextran method. In order to investigate the effects of ASOs on Tat activity in vitro, ASOs were added to the plasmid-transfected cell culture at concentrations of 1 μM, 3 μM and 5 μM and cell culture was subsequently incubated for 48 hours. At the end of incubation period, the expression level of the CAT reporter gene was measured using the CAT ELISA Kit.
Highest inhibition of CAT expression obtained with Anti-Tat-1 at the dose of 5 μM was %43. Anti-Tat-2, which inhibited expression of CAT at the same dose by %35, was found cytotoxic according to cytotoxicity assay. Consequently, we have shown that Tat activity can be inhibited by using antisense oligonucleotide technology. Designing non-cytotoxic ASOs with different sequences and modifications that target different conserved regions of tat mRNA is thought to be important for inhibiting tat activity more effectivly and for development of alternative treatments of AIDS.

Key words: HIV, TAT, CAT, TAR, antisense