Array platformlarında hassasiyeti arttırmak üzere diatomların kullanılması
Using diatoms in array platforms to increase sensivity
Yazar: EBRU ÖZKAN
Danışman: PROF. DR. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışmada, diatom temelli biyolojik ve moleküler sistemler için kullanılabilecek potansiyel uygulamalarda eş zamanlı ve etiketsiz analize olanak sağlamak amacıyla diatom temelli biyomoleküler tanı platformları geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir. Coscinodiscus wailesii türü morfolojik, optik ve früstül yapısındaki nanoboyutlu uygun por yapısından dolayı amaca uygun olarak tercih edilmiştir. Aynı zamanda Coscinodiscus wailesii nano-uygulamalarda en çok kullanılan ve en uygun dairesel diatomdur. Coscinodiscus wailesii maksimum 500 µm çapında, pervalvar ekseni 350 µm boyunda ve hacmi yaklaşık 6,9x10 7 µm3 ile en büyük diatomlardandır. Pastörize ve filtre edilmiş deniz suyu ve distile su diatom besiortamı hazırlamada kullanılmıştır. Coscinodiscus wailesii'nin optimum gelişimi besiortamı pH 8'de gözlenmiştir. C.wailesii distile suyla hazırlanmış besi ortamına göre deniz suyuyla hazırlanmış ortamda daha iyi gelişim göstermiştir. Işığa maruz kalma süresi mevsimlere bağlı olarak değişmektedir, en uygun gelişimi sağlamak amacıyla deneylerde fluoresan lamba ve karanlık-aydınlık döngüsü uygulanmıştır. Kültürler horizontal fluoresan lambanın 10-20 cm uzaklığında gelişime bırakılmıştır. Diatomun inokülasyonundan sonra, besiortamı steril havalandırma sistemiyle beraber 20-24 oC inkübe edilmiştir. Geliştirilmiş C.wailesii türünün nanoporöz yapısı SEM ve floresan mikroskopla görüntülenmiştir. SPR destekli elipsometrik array çalışmalarında öncelikle taşıyıcı destek materyali olarak kullanılacak cam slaytlar öngürülmüş uygun yöntemle temizlenmiştir. Üretilen diatomlar 6-Merkaptopropilmetoksisilan (MPTS) çözeltisiyle silanize edilmiş, tiyol uç grubundan kimyasal olarak yüzeye immobilizasyonu sağlanmıştır. Üretilen diatomlar, kendiliğinde bağlanan yardımcı moleküllerle fonksiyonalize edildikten sonra cam yüzeyine immobilize edilerek SPR destekli elipsometrik ölçümlerle optimum immobilizasyon koşulları belirlenmiştir. M. tuberculosis complex (MTB) ve M. gordonea (GOR) gibi SH ve 15T uzatma kolunu içeren tek zincirli oligonükleotid prob ve hedeflerin etkileşimi esnasında kaydedilen elipsometrik değerler olan (? ve ?) açılarının değişimiyle veri elde edilmiştir. Optimum oligonükleotid prob konsantrasyonu belirlenmiştir. Altın kaplı, 200 ?m çaplı spotlara desenlendirilmiş diatom immobilize cam slaytlara pH 3.8 tampon çözelti ile değişik derişimlere seyreltilmiş spesifik oligonukleotid problar mikrospotlama yöntemi ile immobilize edilmiş ve probun yüzeyde dizilimin kontol edilmesi amacıyla, 1mM Merkaptohekzanol (MCH) ile bloklanmıştır. Tanı platformu, Yüzey Plazmon Rezonans destekli elipsometre sisteminde kullanılmış ve hassas nükleik asit platformları olarak uygulanmıştır. 0.25?4 ?M arasında farklı prob derişimlerinde bulunan kalınlık ölçümleri sonucunda oligonükleotid immobilizasyonu adımında MTB için 1.0 ?M ve GOR için 1.0 ?M derişimleri optimum derişimler olarak tespit edilmiştir. Bu işlem sonrası, pH 7.4 tampon çözelti ile değişik derişimlere seyreltilmiş spesifik hedef oligonükleotidler, optimum derişime sahip platformlar üzerine gönderilerek hibridizasyonları sonucu, bağlanma kinetikleri doğrultusunda array platformlarının performansları belirlenmiştir. Ayrıca çoklu oligonükleotid dizi analiz performansının değerlendirilmesi için, 1.0 ?M GOR ve 1.0 ?M MTB probları, spotlanmış paltformlar üzerine bu molekülleri taşıyan sıvılar bağımsız mikroskobik damlacıkları şeklinde yüzeye spotlanmıştır. Hedef olarak sırasıyla 1?M MTB hedef, 1?M GOR hedef ve karışım hedefler gönderilmiştir. Belli probların immobilize edildiği bölgeden, belli hedeflerin etkileşimiyle elde edilen delta değişimi, tekli analiz platformunda alınan delta değişimine benzer yakın değerler göstermiştir. Platform yüzey üzerine adsorblanmış tek tabakaların SPR etkisine bağlı olarak düşük konsantrasyonlarda yüksek hassasiyet göstermektedir.ANAHTAR KELİMELER: Diatom, Coscinodiscus wailesii, Yüzey Plazmon Rezonans (SPR), elipsometre, oligonükleotid, array platformları.

Abstract:
In this study, diatom based biomolecular sensing platforms have developed and characterized for enabling real time analysis, and provide label-free diagnosis due to their potential applications in biological and medical systems. Coscinodiscus wailesii species were choosen for this purpose because of its morphological, optical, and suitable properties with nano pore size frustule structure. Coscinodiscus wailesii is most used and most proper centric diatom species for nano-applications. In cell volume, Coscinodiscus wailesii is one of the largest diatoms: for a cell of 500 µm in maximum diameter and a pervalvar axis of 350 µm, the volume is about 6,9x10 7 µm3. Pasteurized and filtered seawater and distilled water were used for preparing medium. The optimum growth of C.wailesii was observed in growth medium with pH8. C.wailesii exhibited better growth in medium containing pasteurized seawater than distilled water. Light exposure time can be changed due to seasons, dark-light cycles were applied for optimal growth and fluorescent lamp was used in the experiments. Cultures were placed on shelves parallel to 10-20 cm. distant from, horizontal fluorescent lamps (40 W.). After inoculation of diatom, medium was incubated 20-24 oC. Sterile aeration system was used . Grown C.wailesii species nanopore structure were screened with SEM and fluorescent microscopy. Glass slides were cleaned and used as support material in SPR based elipsometric array studies. Spots with different size a number were formed on the array platforms. Diatoms were immobilized onto the spots using thiol carrying self-assemblying molecules. Grown diatoms were silanized by Mercaptopropylmethoxisilane (MPTS), immobilized to surface via thiol end group. Grown diatoms were immobilized to glass slide and optimum immobilization conditions were determined by SPR based elipsometrik measurements. These sensing platforms were used as surface plasmon resonance enhanced total internal reflection ellipsometric systems (SPRe-TIRE) and performed as sensitive nucleic acid platforms. SPR enhanced ellipsometer shows high sensitivity for low concentration of assembled layers adsorbed on surface due to SPR effects. The data, expressed in ellipsometric values as in angles (? and ?) and recorded during the interaction of single strand oligonucleotide probe and targets, having SH and 15T as spacer arm, such as M. tuberculosis complex (MTB) and M. gordonea (GOR). Optimum oligonucleotid prob concentration were determined. Oligonucleotide probes were immobilized onto diatom modified slides which have 200 ?m spotted pattern, by microspotting method and blocking was performed with 1mM Mercaptohexanol (MCH) for surface orientation. Oligonucleotide probes of different concentrations, prepared in pH 3.8 buffer solution. Regarding to the thickness values that were observed by Surface Plasmon Resonance enhanced Ellipsometer at different concentrations (0.25-4 ?M). The optimum immobilization concentration of GOR was determined as 1 ?M and also for MTB, the optimum immobilization concentration was determined as 1 ?M, respectively. The hybridization of target oligonucleotides at different concentrations, that prepared in pH 7.4 buffer solution, were determined by SPR enhanced ellipsometer system and recorded as array platform performances as in specific responses of binding kinetics. Those results are recorded as change of ellipsometric values which are ? and ? as in angles. Multi-detection on the diatom immobilized array platform has observed by different probe molecules that were spotted on the same platform as separate microscopic drops. The optimized immobilization concentrations of probe molecules, as 1?M for GOR and 1 ?M for MTB, were spotted and the target solutions were 1?M GOR target, 1?M MTB target and mixed solution to observe the interaction and performed as in same characteristic regarding to the binding kinetics. SPR enhanced ellipsometer shows high sensitivity for low concentration of assembled layers adsorbed on surface due to enhangement via SPR effects.KEYWORDS: Diatom; Coscinodiscus wailesii, Surface Plasmon Resonance(SPR), elipsometry, oligonucleotide, array platforms