İn vitro enflamasyon modelinde hiperpolarizasyon ile aktive olan siklik nükleotid kapılı (HCN) kanalların moleküler düzeyde araştırılması
Investigation of hyperpolarization-activated cyclic nucleotid-gated (HCN) channels in vitro inflammation model at molecular level
Yazar: YEŞİM CİVİL ÜRKMEZ
Danışman: PROF. DR. BAHATTİN AVCI
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Endotelyum-vasküler = Endothelium-vascular ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Gen ifadesi = Gene expression ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Makrofajlar = Macrophages ; Polarizasyon = Polarization ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Tümör nekroz faktörü-alfa = Tumor necrosis factor-alpha ; İnflamasyon = Inflammation ; İnterlökinler = Interleukins

Özet:
Amaç: Çalışmamızda nöroenflamasyon ve nörodejenerasyonda ekspresyonlarının değiştiği bilinen hiperpolarizasyonla aktive olan siklik nükleotid-kapılı (HCN) kanalların oluşturduğumuz enflamasyon modelinde makrofaj ile endotel hücre hatlarındaki ekspresyon düzeylerinin incelenmesi amaçlandı. 
Yöntem: Çalışmamızda HUVEC ve RAW hücre hatları kullanıldı. Hücrelere 1µg/ml Lipopolisakkarit (LPS) uygulandı. Altı saat sonra hücre vasatları alındı. TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-10 konsantrasyonları ELISA yöntemiyle ölçüldü. LPS uygulaması sonrası hücre vasatları 24 saat boyunca hücrelere çapraz olarak uygulandı. HCN1/HCN2 protein düzeyleri Western-Blot yöntemiyle belirlendi. HCN-1/HCN-2 gen ekspresyonları RT-qPCR yöntemiyle belirlendi. 
Bulgular: Enflamasyon modelinde RAW hücre vasatında kontrole kıyasla TNF-α, IL-1 ve IL-2 seviyelerinde anlamlı artış gözlendi. IL-4 seviyesinde anlamlı fark görülmezken, IL-10 seviyesinde anlamlı azalma olduğu gözlendi. HUVEC hücre vasatında TNF-α düzeyinde anlamlı artış gözlenirken, diğer sitokinlerde fark gözlenmedi. Enflamasyon modelimizde HUVEC hücrelerinde HCN1 gen ekspresyonunda kontrol grubuna göre 8,44 kat anlamlı artış gözlendi. HCN2 gen ekspresyonunda anlamlı değişim gözlenmedi. RAW hücrelerinde HCN1 gen ekspresyonunda kontrole göre 6,71 kat anlamlı artış gözlendi. HCN2 ekspresyonundaki değişim istatistiksel olarak anlamlı değildi. Western-Blot analizinde HUVEC hücrelerinde LPS grubunda kontrole göre HCN1 düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı artış gözlenirken; HCN2 düzeyinde anlamlı artış gözlenmedi. RAW hücrelerinde LPS grubunda kontrole göre HCN1 düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı artış gözlenirken; HCN2 düzeyinde anlamlı artış gözlenmedi. İmmunfloresan incelemede HUVEC ve RAW hücrelerinde HCN1 ve HCN2 proteinlerinin hücre membranındaki ekspresyonunun LPS grubunda kontrol grubuna göre arttığı gözlendi.
Tartışma ve Sonuç: Enflamasyon modelinde RAW ve HUVEC hücrelerinde HCN1 gen/protein ekspresyonları artarken, HCN2 gen/protein ekspresyonlarında anlamlı değişiklik gözlenmedi. Elde ettiğimiz veriler endotel ve makrofajlarda HCN1 alt tipinin hakim olduğunu ve enflamasyonda kritik rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Aim: In our study, we aimed to create an inflammation model in endothelial and macrophage cell lines and to examine the changes in the expression of hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated (HCN) channels at the molecular level.
Material and Method: HUVEC and RAW cell lines were used in our study. 1µg/m LPS was applied to the cells. Cell media were taken six hours later. TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-10 concentrations were measured by ELISA method. Cell media were cross-applied to cells for 24 hours after LPS. HCN1/HCN2 protein levels were determined by Western-Blot method. HCN-1/HCN-2 gene expressions were determined by RT-qPCR method.
Results: In the inflammation model, a significant increase in TNF-α, IL-1 and IL-2 levels was observed in RAW cell media compared to the control. While no significant difference was observed in IL-4 level, a significant decrease was observed in IL-10 level. While a significant increase in TNF-α level was observed in HUVEC cell medium, no difference was observed in other cytokines. In our inflammation model, an 8,44 fold increase in HCN1 gene expression was observed in HUVEC cells compared to the control group. No significant change was observed in HCN2 gene expression.  6,71 fold increase in HCN1 gene expression was observed in RAW cells compared to the control. The change in HCN2 expression was not statistically significant. In the Western-Blot analysis, a statistically significant increase in HCN1 level was observed in the LPS group in HUVEC cells compared to the control; no significant increase in HCN2 level was observed. While a statistically significant increase in HCN1 level was observed in the LPS group in RAW cells compared to the control; no significant increase in HCN2 level was observed. In immunofluorescence examination, it was observed that the expression of HCN1 and HCN2 proteins in the cell membrane of HUVEC and RAW cells increased in the LPS group compared to the control group.
Discussion and Conclusion: While HCN1 gene/protein expressions were increased in RAW and HUVEC cells in the inflammation model, no significant change was observed in HCN2 gene/protein expressions. Our data suggest that the HCN1 subtype is dominant in endothelium and macrophages and may play a critical role in inflammation.