Dişi sığırlarda Q hummasının moleküler (Real-time PCR) ve serolojik (ELISA) yöntemlerle araştırılması
Investigation of q fever in cattle by molecular (Real-time PCR) and serological (ELISA) tests
Yazar: ZEHRA SEDA MAVİLİ
Danışman: DOÇ. DR. SERKAN İKİZ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Coxiella = Coxiella ; Coxiella burnetii = Coxiella burnetii ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Kan sayımı = Blood cell count ; Kan testleri = Hematologic tests ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sığırlar = Cattles

Özet:
Bu tez çalışmasında, İstanbul ili ve Trakya yöresinde yetiştirilen, farklı işletmelere ait süt sığırlarının kan ve süt örneklerinde Coxiellla burnetii'nin varlığının real-time PCR tekniği ile moleküler düzeyde araştırılması ve aynı hayvanlara ait spesifik antikor titrelerinin ELISA ile değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Araştırmada, ayrıca reprodüktif problemlerin varlığı, kan sayımı, yaş, yetiştirildiği şehir, mastit varlığı ve kene enfestasyonu gibi etkenlerin istatistiki önemlerinin saptanması amaçlanmıştır.
Bu amaçla, reprodüktif problemleri olan (infertil, metrit, abort) ile bu problemlerin görülmediği hayvanlar seçilerek karşılaştırıldı. Çalışmada toplam 200 hayvanın 20 (%10)'si ELISA ile pozitif saptanırken, reprodüktif problemi olan ineklerden alınan 100 serum örneğinin 11 (%11)'i ve reprodüktif problemi olmayan ineklerden alınan 100 serum örneğinin 9 (%9)'u seropozitif bulundu. Toplam 12 adet abort yapmış ineğin 4 (%33)'ü seropozitif olarak belirlendi. Abort görülen hayvanlardaki seropozitiflik oranı diğer gruplara göre daha yüksek olarak saptanmış olup, fark istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0,05). ELISA sonuçlarına göre, İstanbul'da %8,4, Tekirdağ'da %8,6, Kırklareli'nde %10,5, Edirne'de %17,9 oranında pozitiflik saptandı. En yüksek pozitiflik oranı Edirne ilinde yetiştirilen hayvanlarda görülmekle birlikte, illere göre fark istatistiksel olarak önemli saptanmadı. Ayrıca, seropozitif sığırların oranları yaşlarına, mastit ve kene varlığına göre karşılaştırıldığında, aradaki fark istatistiksel olarak önemli bulunmadı.
Hayvanların antikoagulantlı tüplere alınan venöz kan örneklerinden tam kan sayımı tayini yapılarak, ELISA seropozitif olan sığırların seronegatif olan sığırlara göre RBC, HCT ve HGB ortalama değerlerinin yüksek olduğu; WBC ve PLT ortalama değerlerinin ise düştüğü ancak bu farklılıkların hiçbirinin istatistiki olarak anlamlı olmadığı belirlendi. ELISA seropozitif saptanan reprodüktif sorunları olan sığırların; reprodüktif sorunu olmayan sığırlara göre RBC, HCT, HGB ve PLT ortalama değerlerinin yükseldiği; WBC ortalama değerlerinin ise düştüğü ancak bu farklılıklardan sadece HGB değerinin istatistiksel önemli olduğu saptandı (p<0,05). 
Aynı hayvanların kan ve sütlerinden elde edilen genomik DNA ürünlerinden, IS1111 primerleri kullanılarak, 260 bp uzunluğundaki bölge amplifiye edildi ve SYBR Green hidrolizine bağlı floresan artışı görülen inceleme örnekleri Coxiella burnetii yönünden pozitif olarak saptandı. İncelenen 200 süt örneğin 2 (%1)'sinde Coxiella burnetii DNA'sı saptanırken, kan örneklerinde spesifik DNA saptanmadı. Reprodüktif problemi olan ineklerden alınan 100 süt örneğinin 1 (%1)'i ve reprodüktif problemi olmayan ineklerden alınan 100 süt örneğinin 1 (%1)'i PCR pozitif saptandı. Abort yapan toplam 12 hayvana ait süt örneklerinin 1 (%8,3)'i PCR pozitif olarak belirlendi. 
Sonuç olarak, bu çalışmada, İstanbul ili ve Trakya yöresinde yetiştirilen, farklı işletmelere ait süt sığırlarında Q hummasının seroprevalansı % 10 olarak saptanmış olup abort olgularında mutlaka akla getirilmesinin önemli olduğu kanısına varılmıştır. Sütle saçıcılık real-time PCR tekniği %1 olarak belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, presence of Coxiella burnetii in blood and milk samples of dairy cattle raised in Istanbul province and Trakia district by real-time PCR was aimed. And specific antibody titers of matching animals were also investigated by ELISA. Furthermore, statistical significances of obtained data such as presence of reproductive problems, total blood count, age, city, presence of mastitis and presence of tick infestation were studied.
For this purpose, cattle with and without reproductive problems (infertil, metritis and abortus) were chosen and compared. In total, 20 of 200 (10%) sera were found to be positive by ELISA. Eleven of 100 (11%) sera from cattle with reproductive problems were positive while 9 of 100 (9%) sera were positive from cattle without reproductive problems. Four of 12 (33%) sera of the aborted cattle were found to be positive. Seropositivity of aborted cattles rate was higher than the other groups and the difference was statistically significant (p<0.05). Seropositivity rates were 8.4% in Istanbul, while 8.6% in Tekirdağ, 10.5% in Kırklareli and 17.9% in Edirne. The highest positivity rate was seen in cattle reared in Edirne, although there were no statistically significant difference according to the provinces. Also seropositive rates of cattle according to age, presence of mastitis and presence of ticks were examined and differences were not found statistically significant.
Complete blood counts were determined from the matching animals. RBC, HCT and HGB mean values in ELISA seropositive cattles were found to be higher than mean values in seronegative ones, while WBC and PLT mean values were lower. These differences were found to be statistically insignificant. RBC, HCT, HGB and PLT mean values in ELISA seropositive cattles with reproductive problems were found to be higher than mean values in ELISA seronegative ones, while WBC mean values were lower. Only HGB mean value difference was found to be statistically significant (p<0.05).
Genomic DNAs extracted from milk and blood samples of the animals were amplified using with IS1111 primers (260 bp) and samples with flourescence increase due to SYBR Green dye were consedered as C. burnetii DNA positive. In total, 2 of 200 (1%) milk samples were positive by real- time PCR (one with reproductive problems and one without). One of 12 (8.3%) milk samples of the aborted cattle were positive by PCR while none of the blood samples were found to be positive.
In conclusion, in this study, seroprevalence of Q fever in dairy cattle belonging to different farms in Istanbul and Thracia district is determined as 10% and the infection should be considered in abortion cases. Spreading of the agent by milk was found 1% by real-time PCR technique.