Arabidopsis thaliana'da kükürt teşvikli bor toleransının incelenmesi
Investigation of sulfur induced boron tolerance in Arabidopsis thaliana
Yazar: SEDA YİRMİBEŞ
Danışman: PROF. DR. YASEMİN EKMEKÇİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Botanik = Botany
Dizin: Arabidopsis thaliana = Arabidopsis thaliana ; Bor toksisitesi = Boron toxicity ; Fotosentetik parametreler = Photosynthetic parameters ; Gen ifadesi = Gene expression ; Tolerans = Tolerance

Özet:
Bor elementi, bitkiler için mutlak gerekli olan bir mikrobesin maddesi olmasına rağmen, yüksek konsantrasyonları toksik olup, bitki büyüme ve gelişmesi üzerine olumsuz etkiye sahiptir. Bu tez kapsamında, model bitki Arabidopsis thaliana'da sülfat uygulamaları ile bor toksistesine karşı tolerans kazanımının;
1) bazı fizyolojik, fotokimyasal ve antioksidan enzim aktiviteleri ve 2) bor alımı ile sülfat alımı/atımında rol oynayan taşıyıcılarla ilişkili genlerin ifade değişimleri araştırılması amaçlanmıştır.
Arabidopsis tohumları besiyeri ortamı içeren petri kapları içerisinde 3 gün +4°C'de karanlık koşullarda stratifikasyon işlemine tabi tutulduktan sonra çimlenen tohumlar kontrollü iklim kabininde (22± 1 °C sıcaklık, 16/8 sa fotoperiyot, 200 µmol.m-2s-1 ışık şiddeti ve %50-60 nem koşullarında) 12 gün boyunca yetiştirilmiştir. Ardından sülfat ön uygulama grupları (PS-B) 3 gün boyunca MgSO4- tipi sülfat içeren besi yerlerine aktarılmış, 3 günün sonunda ön uygulamasız ve birlikte (S+B) uygulama grupları ile beraber farklı bor konsantrasyonları içeren (3 ve 5 mM H3BO3) petri kaplarına transfer edilerek 10 gün süre ile bor toksisitesine maruz bırakılmışlardır. 
Arabidopsis bitkisinde kökten alınıp yapraklara taşınan bor birikimine bağlı olarak, bitki biyokütlesi ve yaprak yüzey alanı anlamlı düzeyde azalmıştır. Bunun yanı sıra, toksik bor koşullarında bitkilerin yapraklarındaki SO-4 miktarının da azaldığı belirlenmiştir. Yapraklara taşınan borun toksik seviyeleri, fotosentetik aygıtları ve fotokimyasal aktiviteyi olumsuz etkilemiştir. Bor toksisitesi, bitkilerin tilakoid membranlardaki klorofil a fluoreans yayılımlarında (OJIP eğrisi), spesifik ve fenomenolojik enerji akışlarında, kuantum veriminde, PSII'nin donor ve PSI'in akseptor kısımlarının etkinliğinde değişimlere neden olmuştur. Bu değişimler bitkilerin fotosentetik performanslarında azalmalara yol açmıştır. Toksik bor uygulaması ile bitkilerin  fotokimyasal verimliliğindeki azalışın,  tilakoid membranın bütünlüğünde bozulma, QA redükte edemeyen reaksiyon merkezindeki (inaktif RC) artış ve enerjinin ısı şeklinde yayılımı ile ilişkili olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrıca B toksisitesi her iki fotosistem arasındaki işbirliğini bozmuş ve PSII'in PSI'e göre daha fazla etkilendiği belirlenmiştir. Arabidopsiste bor toksisitesinin membran bütünlüğü ile anten ve reaksiyon merkezlerindeki fotosentetik pigment miktarlarını olumsuz etkilese de, bu etkinin, fotosistemlerin fonksiyonellikleri tamamen bloke edecek düzeyde olmadığı ve sülfat uygulamaları ile bu olumsuz etkilenmenin hafifletilebildiği saptanmıştır.
Arabidopsis bitkisinde, sülfat uygulamaları ile antioksidan enzimlerin aktivitelerinde ve fenolik bileşiklerin (antosiyanin ve flavonoid) içeriğindeki artışlar, savunma sistemlerini düzenleyerek bor toksisitesine karşı tolerans sağlamıştır. Toksik bor seviyelerinde peroksidaz ve glutatyon-S-transferaz aktivitelerindeki artışlar, oluşan oksidatif hasarlara karşı bitkiyi korumada etkin yer aldıklarını ortaya koymaktadır. İncelenen enzimlerin aktiviteleri ve fenolik bileşiklerdeki birikim sülfat ön uygulamalı gruplarda daha yüksek düzeyde bulunmuştur.
Sülfat alımı ve taşınımında ve kükürt metabolizmasında yer alan bazı metabolitlerin sentezinde görev alan genlerin oransal ifade değişimleri incelenmiştir. Bor toksisitesine karşı sülfat ön-uygulaması ile 3. grup sülfat taşıyıcılarından özellikle SULTR 3;1, SULTR 3;3, SULTR 3;5 genleri daha fazla ifade olmuştur. SULTR3 ve SULTR4 grubu genlerinin ifadelerindeki artış, ön uygulama gruplarında vakuolden sitozole geçen sülfatın, sonrasında kloroplast üzerinde lokalize olan SULTR3 taşıyıcılar ile alınarak kükürt asimilasyonuna katılmış olabileceği düşünülmektedir. Glutatyon sentez yolağının ilk ve son basamağını katalize eden sırası ile glutamat sistein ligaz ve GSH sentaz enzimleri, GSH1 ve GSH2 genleri tarafından kodlanır ve bu genlerin uygulama gruplarında kontrole göre oransal ifade artışları B toksisitesinin glutatyon biyosentezini indüklendiğini göstermektedir.
Bitkiler, sülfat uygulamaları (özellikle sülfat ön uygulaması) ile bünyesine aldığı sülfatı, ya sülfat metabolizmasında asimile ederek ya da vakuollerinde depolayarak bor toksisitesine karşı tolerans sağlamış olabilirler.

Abstract:
Boron (B) is a micronutrient element that is essential for plant growth and development and its high concentrations have highly toxic effect. Within the scope of this thesis, the acquirement of tolerance to boron toxicity by sulphate applications in the model plant Arabidopsis thaliana; 1) some physiological, photochemical, and antioxidant enzyme activities, and 2) the expression changes of genes associated with transporters that play a role in boron uptake and sulfate uptake/excretion were aimed to investigate.
After the Arabidopsis seeds were subjected to stratification in petri dishes containing nutrient medium (MS) for 3 days at +4°C in dark, then the germinated plants were grown in a controlled growth cabinet (22± 1 °C temperature, 16/8 h photoperiod, 200 µmol.m-2s-1 light intensity and 50-60 % humidity) for 12 days. And then, sulphate pre-treatment groups (PS-B) were transferred to MgSO4- type sulphate-containing media for 3 days, and at the end of 3 days, combined (S+B) and un-treated application groups were transferred to petri dishes containing boron with different concentrations (3 and 5 mM H3BO3) to be exposed to boron toxicity for 10 days.

Plant biomass and leaf surface area decreased significantly depending on the accumulation of boron which was uptake from the root and transported to the leaves in the Arabidopsis plant. In addition, it was determined that the amount of SO4- in the leaves of the plants decreased under toxic boron conditions. Toxic levels of boron transported to the leaves adversely affected the photosynthetic apparatus and photochemical activity. Boron toxicity caused the changes in chlorophyll a fluorescence transients (OJIP curve) in thylakoid membranes of plants, specific and phenomenological energy fluxes, quantum yields, and the efficiencies of PSII's donor and PSI's acceptor sides. These changes have led to decreases in the photosynthetic performance of plants. It has been proved that the decrease in photochemical efficiency of plants with toxic boron application is associated with the thylakoid dissociation, increase in the non-QA-reducing reaction center (inactive RC), and dissipation of energy in the form of heat. In addition, B toxicity disrupted the cooperation between both photosystems, and it was determined that PSII was affected more than PSI. Although boron toxicity in Arabidopsis adversely affects the integrity of the membrane and the amount of photosynthetic pigment in the antenna and reaction centers, it has been determined that this effect is not at a level to completely block the functionality of the photosystems, and this negative effect can be alleviated by sulphate applications.
In the Arabidopsis plant, the increase in the antioxidant enzyme activities and the content of phenolic compounds (anthocyanin and flavonoid) with sulphate applications provided tolerance against boron toxicity by regulating the defense systems. Increases in peroxidase and glutathione-S-transferase activities at toxic boron levels reveal that they play an active role in protecting the plant against oxidative damage. The activities of the investigated enzymes and the accumulation of phenolic compounds were found to be higher in sulfate pre-treatment groups.
Relative expression changes of genes that synthesize some metabolites involved in sulphate uptake and transport and sulfur metabolism were investigated. Against boron toxicity, with sulfate pre-application, the 3rd group sulfate carriers, especially SULTR 3;1, SULTR 3;3, SULTR 3,5 genes, were more expressed. It is thought that the increase in the expression of the SULTR3 and SULTR4 group genes may have contributed to the sulfur assimilation by taking the sulfate from the vacuole to the cytosol in the pre-treatment groups with the SULTR3 transporters localized on the chloroplast. Glutamate cysteine ligase and GSH synthase enzymes, which catalyze the first and last step of the glutathione synthesis pathway respectively, are encoded by the GSH1, and GSH2 genes, respectively, and the relative expression increases of these genes in the treatment groups compared to the control indicate that B toxicity induced glutathione biosynthesis.
Plants may have acquired tolerance against boron toxicity by either assimilating the sulphate taken by sulphate applications (especially sulphate pre-treatment) in sulphate metabolism or by storing them in their vacuoles.