Kanser tedavisinde kullanılmak üzere peptit nanotaşıyıcıların hazırlanması ve karakterizasyonu
Preparation and characterization of peptide nanocarriers for cancer therapy
Yazar: FATMA DEMİR
Danışman: PROF. DR. EMİR BAKİ DENKBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Moleküler kendiliğinden düzenlenme moleküllerin spesifik ve lokal etkileşimleri sonucu termodinamik ve kinetik koşullar altında düzenli yapıların oluşumlarının spontane sürecidir. Bu süreç bütün kimya ve yaşam bilimlerinin temelini oluşturur. Bu süreçle oluşan peptit nanopartiküller kontrollü ilaç salımı ve gen terapisi gibi alanlarda yüksek biyouyumluluğu gibi nedenlerle çeşitli hastalıklarda uygulama alanı oluşturması açısından büyük umut vaat etmektedir. Dünya çapında ölüm sebebi olan kanser için günümüzdeki tedavi yöntemleri cerrahi müdahaleler, kemoterapi, radyasyon terapisi ve bunların kombinasyonu şeklindeki tedavilerdir. Ancak bu müdahaleler ilaçların kanser hücrelerine yetersiz etkisi, sağlıklı hücrelere olan yan etkileri, cerrahi müdahale sonucunda gelişen metastaz gibi sebeplerle etkili olamamaktadır. Gen terapisi bu alanda araştırmacılar ve klinisyenler için bugün yeni bir bir yaklaşım haline gelmiştir. Kanser gen terapisinde üzerinde en çok durulan gen insan kanserlerinin %50 den fazlasında görülmesi nedeniyle p53 olmuştur. Bu genin tamiri veya sağlıklısıyla değiştirilmesi kanser gen terapisi için kritik öneme sahiptir.Tüm bu nedenlerle çalışmada kendiliğinden düzenlenen iki çeşit difenilalanin peptit nanopartikül sentezlenmiş ve bunlardan in vitro çalışmalar açısından en uygun olanı peptit nanopartiküllerin farklı koşullarda aldıkları yapılar ve stabiliteleri göz önünde bulundurularak seçilmiştir. Partiküllerin morfolojileri Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile incelenmiştir. Boyut ve zeta potansiyel analizleri Zeta-Sizer cihazı ile gerçekleştirilmiştir. Partiküllerin karakterizasyonuna paralel olarak yeşil floresans protein (GFP) ve p53 genlerini içeren plazmit, E. coli bakterilerinde çoğaltılmış ve bakterilerden izole edilmiştir. pDNA, farklı oranlardaki partiküller ile etkileştirilmiş ve oluşan komplekslerin zeta potansiyellerindeki değişim analiz edilmiştir. Plazmit yüklü peptit nanopartiküller p53 mutant kolorektal adenokarsinoma hücreleri ile (in vitro) etkileştirilmiş, partiküllerin hücreler tarafından alımı ve plazmitin performansı plazmit üzerindeki GFP geninin ekpresyonu ile üretilen yeşil floresans proteinler sayesinde takip edilmiştir. Sitotoksisite çalışmaları WST yöntemiyle, apoptoz-nekroz oranı ikili boyamalarla belirlenmiş ve peptit nanopartiküllerin normal ve kanserli hücrelerdeki etkinliği incelenmiştir.

Abstract:
Molecular self-assembly is a process of orientation of the molecules into well-organized structures by specific and local interactions under strictly controlled thermodynamic and kinetic conditions. This process is organizing the fundamentals of chemistry and life sciences. Peptide nanoparticles forming by this process hold promise for applications in various areas like controlled drug delivery and gene therapy because of their great biocompability. Cancer is a leading cause of death worldwide, and current treatments are surgical operations, chemotherapy, radiation therapy and combination of these methods. However, these treatments could be ineffective because of insufficient effect of the drugs into cancer cells, side effects on healthy cells and metastases arising from surgical operations. Gene therapy is a new approach for the researchers and clinicians in this field. Mostly investigated gene is p53 which seen on more then 50% of human cancers. Repair or replacement of the gene that lost its function has critical importance for cancer gene therapy.According to all of these reasons, in this study two types of self-assembled diphenylalanine nanoparticles were synthesized and selected the most favorable nanoparticles in terms of in vitro studies considering the forming structures and stability in different conditions of peptide nanoparticles. Morphology of the particles are investigated using Scanning Electron Microscopy (SEM) and Atomic Force Microscopy (AFM). Size and zeta potential analyses are carried out by using Zeta-Sizer instrument. In parallel to characterization of particles, green fluorescence protein (GFP) and p53 gene involved plasmid is cultured in E. coli and extracted from bacteria. The pDNA are loaded into selected peptide nanoparticles with various concentrations and change of the zeta potential are analysed by Zeta-Sizer instrument. Plasmid loaded peptide nanoparticles put into interaction with p53 mutant adenokarsinoma cells (in vitro). Cellular uptake of the particles and plasmid performance are investigated by observation of GFP expression by green fluorescence protein on plasmid. Cytotoxicity studies are carried out by WST assay and apoptosis-necrosis ratio is determined by dual dyeing methods and effectivity of peptide nanoparticles for healthy and cancer cells are investigated.