Over kanserinde miR-200 ailesinin epitelyal-mezenkimal geçişdeki rolü
The role of the miR-200 family in epithelial-mesenchymal transition in ovarian cancer
Yazar: MERVE ŞENTÜRK
Danışman: PROF. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Over kanseri, jinekolojik malignitelerin en ölümcül olanıdır. Tarama yönteminin olmaması ve erken evrede asemptomatik olması nedeniyle, hastalık ileri evrelerde teşhis edilebilir. Over kanserindeki ölümlerin başlıca nedeni ileri evrelerde yaşanan uzak metastazlardır. Metastaz ise epitel fenotipten mezenkimal fenotipe (EMT) geçiştir. Hastalığın başlangıcı ve progresyonunun moleküler genetiği hakkında nispeten az şey bilinmektedir. 
Tez kapsamında, epitelyal over kanserli hastalarda miRNA'ların epitelyal mezenkimal geçiş ile ilişkisini gösterebilmek ve erken tanı için metastaz mekanizmasını aydınlatabilmek amacıyla miRNA'ların hedef genleri ve bu genlerin düzenlenmesi ile anlatımları değişen proteinler incelenmiştir.
MikroRNA'lar (miRNA), kodlanmayan, yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda, düzenleyici gen sınıfında yer alan tek iplikli RNA dizileridir. Hedef mRNA'larına bağlanarak, translasyonel baskılamaya yol açar veya mRNA'nın stabilitesini azaltırlar. Hücre farklılaşması, hücre proliferasyonu, apoptoz, stres direnci ve yağ metabolizması dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri kontrol ederler. Bazı miRNA'lar onkojenik veya tümör baskılayıcı aktiviteye sahiptirler. Farklı kanserlerdeki miRNA ekspresyon profilleri benzersizdir. Bu da bazı miRNA'ların tanısal ve prognostik belirteçler olarak kullanılabileceğinin önemli bir göstergesidir.
Epitel hücrelerinin mezenkimal hücrelere dönüşümü, embriyonik gelişimde, kanser hücrelerinin çoğalması ve metastazında önemli bir rol oynar. Epitelyal-mezenkimal transizyon (EMT) geçiren hücreler epitel özelliklerini kaybederler. Hücre iskeletleri yeniden düzenlenir. Hücreler arası bağlantı proteinleri ve mezenkimal belirteçlerle birlikte birçok molekülün aşağı ve yukarı regülasyonu sağlanarak hareketli bir fenotip kazanırlar.
Tez kapsamında epitelyal-mezenkimal geçişte rol oynadığı düşünülen hsa-miR-200c-3p'nin sağlıklı ve ileri evre epitelyal over kanserli bireylerin dokuları kullanılarak anlatım analizi yapılmıştır. Over kanserli bireylerde hsa-miR-200c-3p'nin anlatımının büyük oranda arttığı gösterilmiştir (p<0,05). Hsa-miR-200c-3p'nin hedeflediği genler "insilico" yöntemlerle tespit edilmiş ve bu hedef genlerden biri olan ZEB1 (Zinc finger E-box binding homeobox 1)'in sağlıklı ve ileri evre kanserli over dokularında gen anlatım analizi yapılmıştır. ZEB1 mRNA'sının gen anlatımı, kanserli dokularda sağlıklılara kıyasla istatistiksel olarak anlamlı azalmıştır (p<0,05). Yapılan korelasyon analizi sonucunda hsa-miR-200c-3p ile ZEB1 geni arasında negatif yönde güçlü korelasyon tespit edilmiştir (r=-0,75; p<0,001). Bunların yanı sıra ZEB1 proteini ve EMT'de rol aldığı düşünülen proteinler olan vimentin ve e-kadherin'in sağlıklı ve over kanserli dokulardaki yüzey antijenleri immunohistokimyasal olarak incelenmiştir. Yapılan immunohistokimyasal boyama sonucunda ZEB1 ve e-kadherin'in kanserli dokulardaki boyanma yoğunluğu ve yaygınlığının sağlıklılara göre daha fazla olduğu tespit edilmiştir (p<0,05). Buna karşılık vimentin proteininin kanserli dokularda boyanma yoğunluğu ve yaygınlığının azaldığı gösterilmiştir (p<0,05). ZEB1 mRNA'sı ve proteinin arasında pozitif yönde bir korelasyon tespit edilememiştir.
Hsa-miR-200c-3p'nin, hedef geni olan ZEB1'in promotör bölgesine bağlanarak anlatımını baskıladığını ve miktarı azalan ZEB1'in de e-kadherini kodlayan CDH1 genine yeterince bağlanamadığını ve e-kadherin miktarında artış olabileceği hipotezini öne sürmekteyiz. Over kanserli dokularda mezenkimal biyobelirteç olan vimentin proteininin azalan miktarı mezenkimalden epitele geçiş için uyumlu bulunmuştur. Sonuçlarımıza göre, hsa-miR-200c-3p'yi over kanseri tanısında yeni bir aday biyobelirteç olarak tanımlayabiliriz.

Abstract:
Ovarian cancer has the highest mortality among gynecological cancers. The lack of a screening method and being asymptomatic at an early stage cause the disease to be diagnosed in advanced stages. The main cause of deaths from ovarian cancer is distant metastasis in advanced stages. Metastasis is the transition of cells from epithelial phenotype to mesenchymal phenotype (EMT). Relatively little is known about the molecular genetics of disease onset and progression.
Within the scope of the thesis, the target genes of one specific microRNA (miRNA) and the proteins whose expressions are changed by the regulation of these genes were examined. The aim is to show the relationship of miRNAs and the epithelial mesenchymal transition process in patients with epithelial ovarian cancer and to elucidate the metastasis mechanism for early diagnosis.
MiRNAs are non-coding small RNAs about 22 nucleotides long, single-stranded RNA sequences that belong to the regulatory gene sequences. By binding to target mRNAs, they lead to translational suppression or decrease the stability of the mRNA. They control a variety of biological processes, including cell differentiation, cell proliferation, apoptosis, stress resistance, and fat metabolism. Some miRNAs have oncogenic or tumor suppressor activity. The miRNA expression profiles differ in different cancer types. Therefore, some miRNAs can be used as diagnostic and prognostic markers of various cancer types
The transformation of cells from epithelial to mesenchymal characteristics plays an important role in embryonic development, proliferation, and metastasis of cancer cells. Cells undergoing epithelial-mesenchymal transition (EMT) lose their epithelial properties. Cell skeletons are rearranged. They acquire a motile phenotype by up and down regulation of many molecules including intercellular junction proteins and mesenchymal markers.
Within the scope of this thesis, the gene expression analysis of hsa-miR-200c-3p, which is a miRNA considering to play a role in the epithelial-mesenchymal transition, has been performed using the ovarian tissues obtained from healthy individuals and advanced epithelial ovarian cancer patients. It has been shown that the expression of hsa-miR-200c-3p was significantly increased in ovarian cancer patients (p <0.05). The genes targeted by hsa-miR-200c-3p were determined by in-silico methods and gene expression analysis of one of these target genes, which is ZEB1 (Zinc finger E-box binding homeobox 1), was performed in healthy and advanced stage cancerous ovarian tissues. The expression of ZEB1decreased significantly (p <0.05) in cancerous tissues compared to healthy ones. As a result of the correlation analysis, a strong negative correlation was found between hsa-miR-200c-3p and the ZEB1 gene (r=-0,75; p<0,001). In addition, immunohistochemical analysis of ZEB1 protein and vimentin and e-cadherin cell surface antigens has been performed, in healthy and ovarian cancer tissues because they are considered to play a role in EMT, as a result of immunohistochemical staining, the staining intensity and prevalence of ZEB1 and e-cadherin proteins were higher in cancerous tissues than healthy ones (p <0.05). However, it has been showed that the intensity and extent of staining of vimentin protein decrease in cancerous tissues (p <0.05). There was no positive correlation between ZEB1 mRNA and protein.
We hypothesize that hsa-miR-200c-3p binds to the promoter region of its target gene, ZEB1, and suppresses its expression. Thus, the expression of ZEB1 decreased and ZEB1 cannot sufficiently bind to the mRNA of e-cadherin coding gene, CDH1, and as a result, the expression of e-cadherin increased. The decreasing level of vimentin protein, a mesenchymal biomarker in ovarian cancer tissues, was found to be compatible with the transition from mesenchymal to epithelial. According to our results, we suggest that hsa-miR-200c-3p as a novel candidate biomarker in the diagnosis of ovarian cancer.