Klorokin, curcumin ve paklitaksel'in meme tümörlü farelerde otofajik ve apoptotik etkilerinin histolojik ve immunohistokimyasal yöntemlerle incelenmesi
Investigation of the autophagic and apoptotic effects of chloroqui̇ne, curcumin, and paclitaxel in mice with breast tumor by histological and immunohistochemical methods
Yazar: AYŞEGÜL MİNE AKKAYA
Danışman: PROF. DR. ELİF İLKAY ARMUTAK
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Günümüzde meme kanseri, kadınlar arasında en yaygın görülen kanser tipi olmasının yanı sıra, morbidite, mortalite ve tedavi masrafları açısından sağlık alanında en önemli konulardan biri olma özelliğini devam ettirmektedir. Son yıllarda çalışmalardan elde edilen sonuçlarda, otofaji anormalliklerinin kanser, enfeksiyon hastalıkları ve nörodejeneratif hastalıklar gibi önemli sağlık sorunlarının sebepleri arasında yer aldığı belirtilmektedir. Yakın dönemde araştırmacılar antimalaryal bir ilaç olan Klorokin'in (CQ) lizozomal proteazları ve otofagozom-lizozom kaynaşmasını inhibe ederek otofajiyi durdurduğunu göstermişlerdir. Klorokin (CQ) bu özelliğinden dolayı özellikle diğer bir alanda, kanser tedavisinde otofaji inhibitörü olarak kullanılmaktadır. Doğal bileşiklerden biri olan Curcumin (CUR), değişik sitotoksik ajanlarla, bu ajanların etkinliğini arttırmak amacıyla çeşitli tümör tiplerinde kombine edilerek çalışılmıştır. Bu tez çalışmasında, öncelikle deneysel kanser modelinde anti-otofajik ajan olan Klorokin (CQ), aktivitesi arttırılmış Curcumin (CUR) ve Paklitaksel (PCX) kombinasyonunun, tümör büyüklüğü, proliferasyon, apoptozis, otofaji  ve hücre sağ kalım yolağı arasındaki ilişkinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu amaçla, fare EAC meme tümöründe immünohistokimya yöntemiyle PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), aktif kaspaz-3, aktif kaspaz-7, Atg5 (Autophagy protein 5), LC3-A, LC3-B, AKT/PTEN incelendi ve böylece tümör büyüklüğü ile apoptozis, proliferasyon,  otofaji, hücre sağkalım yolağı ilişkisi değerlendirilmiştir. Ayrıca, apoptozis TUNEL yöntemiyle de gösterilmiştir. 
Klorokin (CQ), Curcumin (CUR), ve Paklitaksel (PCX) uygulaması yapılan gruplarda da kombinasyon gruplarına benzer şekilde kontrol grubuna göre tümör hacimleri küçültmüştür (P<0.001). Kombinasyon grupları incelendiğinde, Paklitaksel (PCX) verilen tüm kombinasyon gruplarının, en düşük tümör hacmine sahip olduğu belirlenmiştir. Tüm gruplardaki 0. ve 14. gün ağırlık artışlarına bakıldığında bir anlamlılık görülmemiştir. Ayrıca bu gruplarda ağırlık kaybından ya da ilaç uygulamasından kaynaklı bir ölüme rastlanmamıştır.
Aktif kaspaz-3 sonuçlarına bakıldığında kontrol grubuna göre tüm gruplarda bir artış görülmektedir. En yüksek değer üçlü kombinasyon yapılan grupta görülmüştür.  Benzer şekilde aktif kaspaz 7 sonuçlarında da izlenmektedir. PCNA sonuçlarında kombinasyon grupları arasında belirgin bir fark olmamakla birlikte tüm deney gruplarında kontrol grubuna göre proliferasyonda azalma tespit edilmiştir. Bu bulgu tümör volümü ile karşılaştırıldığında uyumlu olduğu görülmüştür. Otofaji belirteci LC3A düzeyinin Curcumin (CUR) ve Paklitakselin (PCX) tek olarak uygulandığı gruplarda kontrole benzer şekilde ve istatistiksel olarak anlamsız oldukları  bulunmuştur. Kombinasyon gruplarında ise LC3A değerlerindeki artışın Klorokin(CQ)+Curcumin (CUR) uygulanan grupta P<0,01 diğer kombinasyon gruplarında ise P<0,001 olarak anlamlı olduğu tespit edilmiştir. LC3B değerleri incelendiğinde Curcumin (CUR) uygulanan grup hariç tüm gruplarda anlamlı artış gözlenmiştir. Yine otofaji ile ilgili bir belirteç olan Atg5 düzeylerine bakıldığında tek başına Curcumin (CUR) ve Klorokin (CQ) uygulanan gruplar hariç kontrole göre anlamlı bir artış görülmüştür. AKT ve PTEN verileri değerlendirildiğinde AKT değerlerinin kontrole göre tüm gruplarda azaldığı ve PTEN değerlerinin ise kontrol grubuna göre yükseldiği görülmüştür. Sonuç olarak; in vivo'da EAC meme tümöründe,CUR 'un biyoyararlanımının yüksek olması ve düşük dozda kullanımına rağmen gerek tekli gerek kombinasyon gruplarında etkili antikanser aktivite gösterdiği, CQ+CUR+PCX üçlü kombinasyon olarak ilk kez çalışıldığı ve diğer ikili gruplarla sonuçları arasında etkili bir farklılık olmadığı fakat kontrol grubuna göre tümör büyüklüğünü azalttığı, otofajinin baskılanması ile apoptozu ve hücre ölümünü indüklediği ve  sağkalım yolağı ve proliferasyonu baskıladığı gösterilmiştir. Daha önce bu üçlü kombinasyon hiç çalışılmadığı göz önüne alındığında, bu kombinasyonun çeşitli kanser türlerinde in vitro ve in vivo tekniklerle araştırma yapılmasına ve çalışmamızda kullanılan aktive edilmiş CUR'un antikanser mekanizmasının farklı yöntemlerle araştırılmasına ihtiyaç olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
Today, breast cancer, in addition to being the most common type of cancer among women, continues to be one of the most important issues in the field of health in terms of morbidity, mortality and treatment costs. The results obtained from studies in recent years, stated that autophagy abnormalities is one of the reason which causes important health problems such as cancer, infectious diseases and neurodegenerative diseases. Recently, researchers have shown that Chloroquine which is an antimalarial drug, stops autophagy  by inhibiting lysosomal proteases and autophagosome-lysosome fusion. Because of this feature, chloroquine, especially in another field, is used as an autophagy inhibitor in cancer treatment. Curcumin (CUR), one of the natural compounds, has been studied with various cytotoxic agents and by combining them  various tumor types in order to increase the effectiveness of these agents. In this thesis, firstly, it was aimed to reveal the relationship between the combination of anti-autophagic agent Chloroquine, icreased activity Curcumin (CUR) and an anti-autophagic agent Paclitaxel and the tumor size, proliferation, apoptosis, autophagy and cell survival pathway in an experimental cancer model.Curcumin (CUR),effects on the relationship between tumor size, proliferation, apoptosis, autophagy and cell survival pathway in an experimental cancer model. For this purpose, PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), active caspase-3, active caspase-7, Atg5 (Autophagy protein 5), LC3-A, LC3-B, Akt/PTEN were examined in mouse EAC mammary tumor by immunohistochemistry method and thus, the relationship between tumor size and apoptosis, proliferation, autophagy cell survival pathway was evaluated. In addition, apoptosis was demonstrated by the TUNEL method. 
Tumor volumes decreased compared to the control group, in the groups treated with Chloroquine, Curcumin (CUR) and Paclitaxel, similar to the combination groups (P<0.001). When the combination groups were examined, it was determined that all the combination groups given Paclitaxel had the lowest tumor volume. When the weight gains on the 0th and 14th days in all groups were examined, no significance was observed. In addition, no deaths due to weight loss or drug administration were found in these groups.
When the active caspase-3 results are examined, an increase is observed in all groups compared to the control group. The highest value was seen in the triple combination group. 
Similarly, same results are observed in caspase 7. Although there was no significant difference between the combination groups in PCNA results, compared to the control group a decrease in proliferation was detected in all experimental groups. This finding was consistent with the tumor volume. It was found that the autophagy marker LC3A was similar to the control and statistically insignificant in the groups in which treated Curcumin (CUR) and Paclitaxel were administered alone. In the combination groups, the increase in LC3A values was found to be significant as P<0.01 in the Chloroquine+Curcumin (CUR) group and as P<0.001 in the other combination groups. When the LC3B values were examined, a significant increase was observed in all groups except the Curcumin (CUR) group. When the levels of Atg5, which is also a marker related to autophagy, were examined, a significant increase was observed compared to the control, except for the groups treated with Curcumin (CUR) and Chloroquine alone. Compared to the control group a significant increase was observed in the paclitaxel group. When AKT and PTEN data are evaluated, it is seen that compared to the control group AKT values decreased and PTEN values increased in all groups. In conclusion; Despite its high bioavailability and low-dose use, CUR showed effective anticancer activity in both single and combination groups in EAC breast tumor in vivo. It was shown that CQ+CUR+PCX was studied for the first time as a triple combination and there was no effective difference between the results with other binary groups, but it reduced tumor size compared to the control group, CQ+CUR+PCX  combination induced apoptosis and cell death by suppressing autophagy, and suppressed the survival pathway and proliferation. Considering that this triple combination has never been studied before, it is thought that this combination needs to be researched in various cancer types with in vitro and in vivo techniques, and the anticancer mechanism of activated CUR used in our study needs to be investigated with different methods.