Histon 3 metillenmesinin yeniden programlanmadaki etkisinin incelenmesi
The analysis of histone 3 methylation effects on reprogramming
Yazar: AYYUB EBRAHİMİ
Danışman: PROF. DR. ŞULE ARI ; DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Uyarılmış pluripotent kök hücreleri (uPKH) temel tıp araştırmaları için çok değerli araçlar olmakla kalmayıp, uzun vadede hücre temelli tedaviler, hastalık modellenmesi ve ilaç geliştirmesi için de büyük umutlar vaad etmektedirler. Bu tez çalışmasında, insan ve bitki sistemine ait somatik hücrelerin yeniden programlanması, uPKH oluşum mekanizması aydınlatılması ve insanda bu süreçte rol oynayan genlerin tanımlanması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda kromatin modifikasyonu yapan proteinlerden, özellikle Histon 3'ün, 9. lizin bakiyesini (H3K9) metilleyen bir metil-transferaz enzimi olan SUV39H1'in yeniden programlanmaki rolü araştırıldı. SUV39H1'in uPKH oluşumundaki etkisi,  insan fibroblast hücrelerine Suv39H1'i hedefleyen retroviral RNA interferansı (shRNA) içeren vektörlerleri ile susturarak incelendi. Bu hücreler daha sonra Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc (OSKM) faktörlerin aktarılmasıyla yeniden programlamaya tabi tutuldu. Negatif kontrol olarak insan genomunda karşılığı olmayan shFF vektörü kullanıldı. Oluşan hücre kolonileri pluripotent kök hücre belirteci olan Tra-1-60 antikoru ile boyandı ve koloni sayıları tespit edildi. Verilerin analizi, ImageJ programında negatif kontrole göre yapıldı, Suv39H1 shRNA aktarılan fibroblastların kontrol grubuna göre anlamlı bir şekilde daha fazla koloni oluşturduğu belirlendi (P≤0,05). Diğer taraftan, Suv39H1'in fibroblastlarda yüksek miktarda anlatımının, uPKH oluşumunu negatif yönde etkilediği gösterildi. Böylece yeniden programlanmada SUV39H1 genin susturulmasında elde edilen artışın, enzimin susturulmasından kaynaklı olduğunu kanıtladı. Kontrol ve SUV39H1 geni susturulmuş fibroblastlardan elde edilen uPK hücre hatlarının karakterizasyonu için, pluripotensi genlerinin anlatım analizi, qRT-PZR ile test edildi. SUV39H1'in susturulmasının yeniden programlanma faktörlerinin herhangi birinin yerine geçebilme potansiyeli olup olmadığı test edildi ve bu deneyler sonucunda Suv39H1 geninin susturulmasının c-Myc olmadığı zaman uPKH oluşumu verimini arttırdığı gözlendi. Memeli ve bitki sistemi yeniden programlanma için ayrıca, H3K9 metillenmesinden sorumlu olan enzimin inhibitörü olan "kaetosin" kullanıldı. Kaetosinin insan hücrelerinin yeniden programlanmasının erken ve orta evresinde (1-14 gün) ve bitki sisteminde, bitki gelişim sürecinde eklenmesinin yeniden programlanmayı (uPKH ve kallus oluşumu) olumlu olarak etkilediği gözlendi. Daha sonra yeniden programlanmanın yedinci gününde kontrol ve SUV39H1 geni susturulmuş hücrelerde H3K9me3 antikoru ile pluripotenside önemli genlerin (Sox2, Lin28 ve Occludin) promotörlerine karşı ChIP-PZR yapıldı. PZR sonuçlarına göre, yeniden programlanmanın 7. gününde kontrol hücrelerinin bu genlerin promotor bölgelerinde H3K9 üç metillenmesi olduğundan, yeniden programlanmayı engellediği belirlendi. Elde edilen bu sonuçlar, yeniden programlanmanın kromatin temelli epigenetik mekanizmasının aydınlatılması, uPKH oluşum veriminin artırılması, ve faktörlerden (OSKM) bir veya bir kaçının kimyasal bileşiklerle değiştirilmesinde kullanılacaktır.

Abstract:
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) offer great promise as tools for basic biomedical research, disease modeling and drug screening. In this study, it was aimed to elucidate the molecular mechanisms of iPSCs generation by mammalian (human fibroblasts) and plant (Nicotiana tabacum's leaf discs) somatic cell reprogramming, iPSC generation molecular mechanisms and specify the genes that play in this process in humans. In accordance to that purpose, the role of chromatin modifying enzymes (CMEs), specifically the histone H3 lysine K9 methyl-transferase Suv39H1, on somatic cell reprogramming was studied. To examine the role of Suv39H1 in reprogramming, retroviral short hairpin RNAs (shRNAs) to suppress this methyltransferase in human fibroblasts was used and then reprogram the resulting cells with ectopic expression of embryonic transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc – OSKM). A non-targeting shRNA was used (shFF) as a control. After reprogramming of human fibroblasts, cell colonies were stained with Tra-1-60 antibodies to identify iPSCs (P≤0,05). iPSC colonies were then counted using ImageJ and compared with control group. Suv39H1 knock-down cells generated significantly more iPSC colonies than control cells indicating that suppression of Suv39H1 increases reprogramming efficiency. On the other hand, overexpression of Suv39H1 had a negative effect on reprogramming efficiency. To characterize the control and SUV39H1-KD iPSCs, pluripotency genes expression analysis performed by qRT-PCR. Then OSKM replacement analysis for control and SUV39H1-KD performed and SUV39H1 silencing can replace the need for c-Myc with high efficienct against negative control. To enhance the reprogramming efficiency as an alternative method, "Chaetocin" was used to inhibit SUV39H1 in mammalian and plant systems. The result of these experiment showed that, chaetocin can enhance reprogramming (iPSCs and callus induction) by early and middle stage treatment in human fibroblasts and in seed development treatment of plants. To understanding the molecular mechanisms of H3K9me3 effects on reprogramming, ChIP-PCR was performed to important pluripotency genes promotors such as "Sox2, Nanog and Lin28" at 7th day of reprogramming. The results of ChIP-PCR showed that H3K9me3 presence at pluripotency genes promotors such as Sox2 and Lin28 genes suppress these genes expression and block reprogramming. The results of the current study will contribute to our understanding of the chromatin-based epigenetic mechanisms of reprogramming, improve efficiency of iPSCs generation, and eliminate or replace one or more reprogramming factors (OSKM) with chemical compounds.