İnsan dermal fibroblast ve keratinositlerini içeren kitosan-jelatin/fibrin yapıştırıcı esaslı iki tabakalı yapay deri sisteminin geliştirilmesi
Development of bilayer artificial skin based on chitosan-gelatin/fibrin glue system containing human dermal fibroblasts and keratinocytes
Yazar: MÜŞRA ZEREN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasında iki tabakalı yapay deri eşleniği oluşturulması amacıyla kitosan-jelatin süpergözenekli hidrojel (SPH) doku iskelelerinde kültive edilen insan dermal fibroblast hücreleri (Detroit 551) ve TISSEEL®, fibrin yapıştırıcı içerisinde süspanse edilen insan keratinosit hücreleri (HS2) ile ko-kültür sistemi oluşturulmuştur.
Kitosan-jelatin doku iskelelerinin üretimi mikrodalga-destekli gaz köpükleştirme yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Gaz köpükleştirici ajan olarak NaHCO3, çapraz bağlayıcı olarak ise glioksal kullanılmıştır. Kitosan-jelatin hibrid doku iskelelerinin mikroyapısı SEM (taramalı elektron mikroskobu) kullanılarak incelenmiş ve ortalama gözenek çapları 509±101 μm olarak bulunmuştur. Sıkıştırma testi ile doku iskelelerinin elastik modül değeri 0.01 MPa olarak belirlenmiştir. Doku iskelelerinin su tutma kapasitesi, şişme oranı ve denge şişme değerine ulaşma süresi sırasıyla; %48, 42.4±2.9 ve 60 s olarak hesaplanmıştır. Boşluk kesri 0.22±0.08 mL/g olarak bulunan hidrojellerin yoğunlukları 0.07±0.00 g/mL olarak hesaplanmıştır. Kitosan-jelatin yapıya ait moleküler grupların gösterilmesi amacıyla Fourier dönüşümlü toplam yansımalı azaltılmış kızılötesi spektroskopisi (ATR-FTIR) kullanılmıştır. Hidrojellerin termal davranışı termogravimetrik analiz ile belirlenmiştir.
ii
Sunulan çalışmada iki tabakalı yapay deri eşleniğinin oluşturulması amacıyla 4 farklı hücre kültür sistemi kurulup 28 gün sürdürülmüştür. İlk sistem olarak, kitosan-jelatin doku iskelelerine dermal fibroblast hücreleri ekilerek doku iskelesi-fibroblast etkileşimi araştırılmıştır. Kitosan-jelatin doku iskeleleriyle kurulan dermal fibroblast ve keratinosit ko-kültür sisteminde ise fibroblast-keratinosit etkileşimi görülmüştür. Üçüncü sistem olarak keratinosit hücreleri fibrin jel içerisinde kültive edilerek fibrin jelin keratinosit büyümesine etkisi incelenmiştir. Dördüncü sistemde, kitosan-jelatin doku iskeleleri dermal fibroblast hücreleri ile 7 gün boyunca kültive edildikten sonra keratinosit hücreleri ile süspanse edilen TISSEEL® fibrin yapıştırıcı doku iskelesi üzerinde bir tabaka halinde birleştirilmiştir. Hücre canlılığı ve çoğalması MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) analizi ile gösterilip hücrelerin biyomalzeme üzerinde gösterdikleri morfolojik davranışlar SEM ile incelenmiştir. kollajen 1 (COL1), fibronektin (FN), lorikrin (LOR) ve keratin 14 (KRT14) gen ifadeleri RT qPCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) ile belirlenmiştir.
Sonuç olarak, HS2 ve Detroit 551 hücrelerinin ayrı iki tabakada kültive edilmesinin hücresel canlılığı ve aktiviteyi desteklediği, önerilen deri eşleniği sisteminin geliştirilerek deri doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere uygun bir deri modeli olacağı düşünülmüştür.

Abstract:
In this study, we aimed to obtain an artificial bilayer skin substitute by combining human dermal fibroblasts (Detroit 551) cultured on chitosan-gelatin superporous hydrogels (SPHs) as a dermal layer and human keratinocytes (HS2) suspended in fibrin gel as an epidermal layer.
A novel chitosan-gelatin scaffold was prepared in superporous hydrogel (SPH) form by microwave irradiation-supported gas foaming method. Sodium bicarbonate was used as gas blowing agent and crosslinking was achieved by means of glyoxal. Average pore diameters of the scaffolds were calculated from SEM (Scanning Electron Microscope) photographs as 509±101 μm and elastic modulus determined by compression test was 0.01 MPa. The water uptake capacity, swelling ratio and time to reach equilibrium for chitosan-gelatin SPHs were found to be 48%, 42.42±2.94, and 60 sec, respectively. Void fraction and density of the SPHs were calculated as 0.22±0.08 mL/g, 0.07±0.00 g/mL, respectively. Molecular structure and interactions of chitosan-gelatin SPHs were characterized by attenuated total reflection Fourier transformed infrared spectroscopy (ATR-FTIR). Thermal characterization of SPHs were done by thermogravimetric analysis.
In cell culture studies, four types of cell culture systems were established and incubated for 28 days, in vitro. In the first group, chitosan-gelatin scaffolds were seeded with only Detroit 551 cells to determine the cell-material interactions and biocompatibility. In the second group, HS2 cells were inoculated into the chitosan-gelatin SPHs after 7 days culture of Detroit 551 cells on these scaffolds. In the third group, HS2 cells in fibrin glue were incubated on tissue culture plate. In the fourth group, HS2 cells suspended in fibrin glue were carried onto the scaffolds which were
iv
seeded with Detroit 551 cells. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) assay and morphological examination was carried out with scanning electron microscopy (SEM). Collagen I (COL1), fibronectin (FN), loricrin (LOR) and keratin14 (KRT 14) gene expressions were quantified by real time quantitative polymerase chain reaction (RT qPCR).
In conclusion, cultivation of HS2 and Detroit 551 cells in bilayer skin tissue substitute supported the cell viability and activity. Presented bilayer artificial skin system could be considered as a potential skin substitute in skin tissue engineering applications.