Leucojum aestivum N4OMT geninin izolasyonu ve klonlanması
Leucojum aestivum N4OMT gene isolation and cloning
Yazar: ASLI HİLAL ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. SEMRA HASANÇEBİ
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu araştırmada, Leucojum aestivum bitkisinden norbelladine 4'-O-metiltransferaz (N4OMT) enzimini kodlayan genin, izolasyonu ve klonlanması yapılmıştır. 
L. aestivum, Trakya bölgesinde yayılım gösteren çok önemli bir tıbbi bitkidir ve özellikle likorin ve galantamin olmak üzere farmakolojik açıdan önemli bazı alkaloitlerin doğal üreticisidir.
Bitkinin ürettiği bir Amarylldacaea alkoloidi olan galantamin, sinir sistemini etkileyen, başta Alzheimer olmak üzere önemli bazı nöredejeneratif hastalıkların tedavi sürecinde kullanılan değerli bir sekonder metabolittir.
Norbelladin 4'-O-metiltransferaz (N4OMT), galantamin sentez yolağında, başlangıç aşamasındaki önemli adımlardan biri olan norbelladini, 4'-0-metilnorbelladine katalizleyen enzimdir. Bu nedenle N4OMT geni, galantamin üretiminin artırılmasına yönelik metabolik mühendisliği çalışmaları için hedef niteliğindedir ve genin izolasyonu, klonlanması ve karakterize edilmesi önemlidir.
Tez kapsamında, önce galantamin üreticisi yakın akraba türlerden N4OMT genine ait DNA dizilerinden ve 2022 yılında yayınlanan L. aestivum N4OMT (LuaN4OMT) gen dizisinden yararlanılarak gene özgü primerler tasarlanmıştır. Ardından bitkinin çiçek dokularından total RNA izole edilmiş, elde edilen total RNA'lardan ters transkripsiyon işlemi ile cDNA sentezlenmiştir. Tasarlanan primerler kullanılarak cDNA'dan LuaN4OMT geni çoğaltılmış ve bir klonlama vektörü olan pJET.Blunt/1.2'ye bağlanmıştır. Ardından hazırlanan rekombinant vektör, E. coli'ye transfer edilmiş ve olası transformant koloniler, PCR ile doğrulanmıştır. PCR ürünleri, jelden geri kazanılarak, Sanger dizileme yapılmıştır. Dizileme sonucu, klonlanan genin LuaN4OMT olduğunu doğrulamıştır.

Abstract:
In this study, the gene encoding the norbelladine 4'-O-methyltransferase (N4OMT) enzyme from the 
Leucojum aestivum plant was isolated and cloned.
L. aestivum is a very important medicinal plant distributed in the Thrace region and is a natural producer of some pharmacologically important alkaloids, especially lycorine and galantamine. aestivum is a very important pharmaceutical plant that grows in the Thrace region and is a natural producer of some pharmacologically important alkaloids, especially lycorine and galantamine. Galantamine, an Amarylldacaea alkaloid produced by the plant, is a valuable secondary metabolite used in the treatment of some important neurodegenerative diseases, especially Alzheimer's, affecting the nervous system.
Norbelladine 4'-O-methyltransferase (N4OMT) is the enzyme that catalyzes norbelladine, which is one of the important initial steps in the galantamine synthesis pathway, to 4'-O-methylnorbelladine. Therefore, the N4OMT gene is a target for metabolic engineering studies to increase galantamine production, and isolation, cloning and characterization of the gene are important.
Within the scope of the thesis, firstly, gene-specific primers were designed using the DNA sequences of the N4OMT gene, a closely related species that produces galantamine, and the L. aestivum N4OMT (LuaN4OMT) gene sequence published in 2022. Then, total RNA was isolated from the flower tissues of the plant, and cDNA was synthesized from the obtained total RNAs by reverse transcription. The Lua.N4OMT gene was amplified from the cDNA using the designed primers and ligated into a cloning vector, pJET.Blunt/1.2. The recombinant vector prepared was then transferred to E. coli and possible transformant colonies were confirmed by subsequent colony PCR. The PCR products, the resulting DNA fragments recovered from the gel, were Sanger sequencing. The sequencing result confirmed that the cloned gene was LuaN4OMT. It was used to determine the nucleotide sequence of the gene and confirm that the gene was cloned.