Klonlama ile transgenik koyun üretiminde donör hücrelerin nanopartiküller kullanılarak transfeksiyonu, Roscovitine ve Trichostati-A ile yeniden programlanması
Transfection of donor cells using nanoparticles and reprogramming with Roscovitine and Trichostatin A for the production of transgenic sheep by cloning
Yazar: SELİN YAĞCIOĞLU
Danışman: PROF. DR. SERHAT PABUCCUOĞLU
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Klonlama = Cloning ; Koyunculuk işletmeleri = Sheep farming enterprises ; Koyunlar = Sheep ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Oositler = Oocytes ; Roscovitine = Roscovitine ; Trikostatin A = Trichostatin A

Özet:
Transgenik teknolojide başarıyı artıran klonlama (SCNT) yönteminin, çiftlik hayvanlarının üretiminde etkinliğinin düşük olması donör hücrenin yeniden programlanmasında yaşanan aksaklıklardan kaynaklıdır. Donör hücre DNA'sının oosit tarafından metilasyon seviyeleri düşürülerek oluşturulan yeniden programlamada, oosite bağlı yetersizliklerden kaynaklı kayıplar şekillenmektedir. Bu çalışmada; transgenik teknolojide SCNT yönteminin etkinliğinin artırılması amaçlı sağlıklı transgenik hücre eldesinde yüksek başarı sergileyen gen taşıyıcı nanopartiküler sistemlerin kullanılması ve donör nükleusun SCNT öncesinde yeniden programlanması amaçlı Roscovitine ve Trichostatin A inhibitörlerinin kullanılabilirliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Sunulan çalışmada, poli(β-amino ester) (PBAE), çift tabakalı hidroksit bileşiği (LDH), modifiye kitosan (mChi), Lipofectamine® polimerleri koyun primer erişkin (PKF) ve embriyonik (PKEF) fibroblast hücrelerinde transgenik etkinlikleri, apoptotik aktiviteleri membran bütünlüğü analizleri ile karşılaştırılmıştır. Çalışmada, transfekte PKF ve PKEF hücrelerinde, 15 µM Roscovitine veya 50 nM Trichostatin A ile 24 saat muamele etme, kontakt inhibisyon ve serum açlığına bırakma yöntemleri uygulanmış, hücre siklus dağılımları, apoptotik aktivite oranları ve DNA metilasyon oranları yönünden karşılaştırılmıştır. Çalışmanın sonucunda; transgenik hücre üretiminde PBAE'nin (%80,88) Lipofectamine®'e (%51,35) göre daha iyi sonuç verdiği (p<0,05), Roscovitine inhibitörünün koyun SCNT çalışmalarına yönelik hücre siklusunu senkronize etmeye uygun olmadığı (%58,51), serum açlığının iki hücre grubunda da erken ve geç apoptoz oranlarının yüksek olduğu (p<0,05), kontakt inhibisyon ve Trichostatin A gruplarının G0/G1 hücre(%87,33, %83,49) ve canlı hücre (%94,20, %92,58)  oranları açısından en iyi sonuçları verdiği (p<0,05), PKF hattında 50 nM Trichostatin A ile en düşük DNA metillenme oranı (%16,79, p<0,05) görülmüştür. Sonuç olarak SCNT ile transgenik çiftlik hayvanı üretiminde PBAE'in gen transferinde başarılı şekilde kullanılabileceği ve 50 nM Trichostatin A ile muamelenin somatik hücre senkronizasyonunu sağlayacağı belirlenmiştir.

Abstract:
The cloning (SCNT) method which increases the success in transgenic technology, has a low efficiency in farm animals because of the problems in the reprogramming of the donor cell. In the reprogramming of donor cell DNA, the methylation level decreases using oocyte. There are losses depending on oocyte deficiencies. In this study, it was aimed to increase the efficiency in transgenic technology by using nanoparticular gene carrier systems, which have high efficiency for transgenic cell production, and to investigate the usability of Roscovitine and Trichostatin A inhibitors for reprogramming donor nucleus for SCNT. Poly(β-aminoester) (PBAE), layered double hydroxide compound (LDH), modified chitosan (mChi) and Lipofectamine® have been used for transfection in sheep primary adult (PKF) and embryonic (PKEF) fibroblast cells. To synchronize the cells to G0/G1 phase and to decrease the methylation of the DNA, 24-hour treatment with 15 µM Roscovitine or 50 nM Trichostatin A, contact inhibition and serum starvation methods were used. PBAE (80.88%) showed better results than the Lipofectamine®(51.35%) in transgenesis (p<0.05). Roscovitine had no effect in synchronization(58.51%), high level of early and late apoptosis was obtained in serum starvation(p<0.05). The contact inhibition and Trichostatin A exhibited the best results in G0/G1 (87.33%,83,49%) and live cells (94.20%, 92.58%,p<0.05). The lowest DNA methylation rate(16.79%, p<0.05) was found in the PKF with 50 nM Trichostatin A. Consequently, PBAE could be an effective gene carrier for transfection of primary fibroblast cells and, the best results in synchronization and demethylation of DNA could be obtained by 50 nM Trichostatin A treatment.