Pirenil türevleri ile modifiye edilmiş floresan karakterli peptid ve protein substratlara proteaz etkisinin florometrik yöntemlerle incelenmesi
Examination of protease effects on fluorescent peptid and protein substrates modified with pyrenyl derivatives by fluorometric methods
Yazar: İBRAHİM ETHEM ÖZYİĞİT
Danışman: DOÇ. DR. EMİNE KARAKUŞ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Spektroflorometrik yöntemler çok sayıda değişik enzimlerin aktivitelerinin incelenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Enzim aktivitesinin florometrik olarak gösterilmesi, doğrudan enzimlerin substratlarından ya da substratlarının floresan türevlerinden elde edilen emisyon sinyallerinin yorumlanmasıyla gerçekleştirilir. Böylece enzim-substrat komplekslerinin oluşumu, konformasyonel değişimleri, enzim faaliyetinin durdurulması ve enzimatik reaksiyon kinetiği florometrik verilerle hassas olarak izlenebilmektedir.
Piren, floresein, rodamin, antrasen vb. floresan karakterli çok sayıda organik madde; yapılarında gerçekleştirilen uygun kimyasal değişikliklerle, proteinleri oluşturan L-α-amino asitlerin alkil yan zincirlerinde bulunan –COOH, -NH2, -OH, -SH gibi işlevsel gruplara kovalent olarak bağlanabilmektedir.
Bu çalışmada, kimotripsin ve tripsin enzimlerinin aktivitelerinin, N-(1-pirenil)maleimid ile modifiye edilmiş sığır serum albumininin floresans ömür dağılımları üzerindeki etkileri incelendi. Floresans ömür dağılımlarındaki değişimleri elde etmek amacıyla Eksponansiyel Seriler Yöntemi (ESM) ile analiz edilen floresans bozunma verilerini görüntülemek için zaman ayrımlı spektroflorometre kullanıldı. Sentezlenen substrat PM-BSA'nın proteazlara maruziyeti sonrası floresans ömür dağılımları, proteazların farklı aktivitelerine atfedilen özgün yapılar sergiledi. Bu olgu fizyolojik etkinliklerinin yanısıra kanser, AIDS, SARS vb. birçok hastalıkta kilit rolü olan proteazların aktivitelerinin belirlenmesi ve birbirlerinden ayrıştırılması için geliştirilebilecek yeni tetkik yöntemlerine kapı aralamaktadır.

Abstract:
Spectrofluorometric methods are widely used for examination of activities of many various enzymes. Monitoring of enzyme activity in fluorometric examinations are performed by evaluation of changes of the emission signals obtained directly from the substrates of enzymes or from the fluorescent derivatives of their substrates. Thus it can sensitively be succeeded that the formation of Enzyme – Substrate complexes, conformational changes and enzymatic reaction kinetics by evaluation of fluorometric data.
Many fluorescent organic substances, such as pyrene, fluorescein, rhodamin, anthracene, etc. can be covalently bound to the functional groups such as  –COOH, -NH2, -OH, -SH existing in alkyl side chains of L-α-amino acids by the way of proper chemical changes performed in their structures.
In this study, the effects of activities of chymotrypsin and trypsin enzymes on fluorescence lifetime distributions of the substrat Bovine Serum Albumin (BSA) modified with N-(1-pyrenyl)maleimide (PM) were examined. The time resolved spectrofluorometer was used to monitor fluorescence decays, which were analysed by using the Exponential Series Method (ESM) to obtain the changes of fluorescence lifetime distributions. After the exposure of the synthesized substrat PM-BSA to the proteases, the fluorescence lifetime distributions exhibited specific structures, which are attributed to the different activities of the proteases. This phenomenon opens the door to new assay methods which would be developed to determine and to distinguish the activities of proteases which have key roles in many diseas like cancer, AIDS, SARS, etc.