Lökosit sistin düzeyinin belirlenmesi için bir lc ms/ms metodu geliştirilmesi
Development an lc ms ms method for the determination of leukocyte cystine level
Yazar: ERHAN CANBAY
Danışman: DOÇ. DR. EBRU SEZER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Metabolik hastalıklar = Metabolic diseases

Özet:
Sistinozis lizozomlarda sistin birikimiyle karakterize,  başta böbrek olmak üzere birçok organda geri dönüşümsüz hasara neden olan otozomal resesif kalıtılan bir hastalıktır. Sistinozisin teşhisi ve sisteaminle tedavisinin takip edilmesi için lökosit içi sistin konsantrasyonunun ölçümü gerekmektedir. Lökosit içi sistin düzeyinin belirlenmesi için sistin bağlayıcı protein assay, iyon değişim kromatografisi, HPLC ve son yıllarda ise LC MS MS yöntemi kullanılmaktadır. Lökosit içi sistin düzeyi belirlenmesi için birkaç yöntem olmasına rağmen kan toplama tüplerinin ve örnek hazırlama işlemlerinin lökosit sistin düzeyi tayinine etkisine yönelik bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu tez çalışmasının birincil amacı lökosit içi sistin tayininine yönelik yeni bir LC MS MS yöntemi geliştirmek, yöntemi valide etmek ve kan alma tüpleri ve ön işlemlerin ölçüme etkisini incelemektir. İkincil amacı ise intrasellüler düzeyde çok az bulunan ve yapı olarak sistine benzeyen homosistin molekülünün internal standart olarak kullanılabilirliğinin test edilmesidir. 
Geliştirilen yöntemde optimizasyonlar sonucu %0,05 formik asit içeren %50/50 Asetonitril/Su çözgen sistemleri mobil faz olarak kullanılmıştır. Akış programı izokratik, akış hızı 0,2 ml/dakika, toplam ölçüm süresi ise 3 dakikadır. Protein çöktürme ajanının ölçüme etkisi duyarlılık ve matriks etkisi yönünden incelenmiştir. %12'lik sülfosalisilik asit(SSA), %12'lik trikloroasetik asit (TCA) ve asetonitrilin (ACN) protein çöktürme ajanları olarak denendiği çalışmada en duyarlı sonuçlar %12'lik TCA ile elde edilmiştir. Kan alma tüplerinin sistin ölçümüne etkisi geri-elde, matriks etkisi ve protein miktarları yönünden değerlendirilmiştir. Bu amaçla laboratuvarlarda kan almada en fazla kullanılan antikoagulanlardan Li- Heparin, K2-EDTA, Na-Sitrat içeren tüpler kullanılmıştır. 
Metot validasyon parametreleri kapsamında seçicilik, linearite, tayin ve kantitasyon limitleri, taşıma etkisi, tekrarlanabilirlik, geri elde, matriks etkisi, referans aralık doğrulama, lizat stabilitesi çalışmaları yapıldı. Linearite çalışmasında geliştirilen yöntem lökosit lizatında sistin için 0,078-100 M  aralığında lineer olarak bulundu. Tayin limiti 0,0192 M, kantitasyon limiti ise 0,0582 M olarak bulunmuştur. Hem d6-sistinin internal standart olarak kullanıldığı yöntemde hem de homosistinin internal standart olarak kullanıldığı yöntemde  gün içi ve günler arası tekrarlanabilirlik çalışmasından elde edilen %CV değerleri %15'in altındadır ve validasyon kriterlerine uygundur. d6-sistinli yöntem için geri elde %95-103 arasında iken homosistinli yöntemde bu değerler %94-106 arasındadır. 40 sağlıklı, 6 hasta ile gerçekleştirilen referans aralık doğrulama çalışmasında d6-sistinli ve homosistinli yöntemden elde edilen sonuçlar birbiriyle karşılaştırılmış, elde edilen grafiğin R2 değeri 0,9838 bulunmuştur. Lizat stabilitesi 4 ay boyunca oda sıcaklığında,  +4⁰ C'de ve -20⁰C'de çalışılmıştır. Her üç sıcaklık için de lizatın 4 ay boyunca stabil olduğu belirlenmiştir

Abstract:
Cystinosis is an autosomal recessive disorder characterized by the accumulation of cystine in lysosomes,  causing irreversible damage to many organs, especially to the kidneys. In order to diagnose cystinosis and to monitor the treatment with cysteamine, leukocyte cystine concentrations must be measured. Cystine binding protein assay, ion exchange chromatography, HPLC and LC MS MS are among the methods used to determine the leukocyte cystine levels. Although there are several methods for determining leukocyte cystine concentration, no studies have been conducted to determine the effect of blood collection tubes and sample preparation on leukocyte cystine levels. The principal aim of this thesis is to develop a new LC MS MS method for the determination of leukocyte intracellular cystine concentration, validate the method and examine the possible influence of the type of blood collection tubes and pretreatments on the measurement. The secondary aim is to test the use of homocystine molecule as an internal standard, which is very rarely found at the intracellular level and resembles cystine.
In the developed method, 50/50%  acetonitrile/water solvent system containing 0.05% formic acid were used as the mobile phase. The flow program is isocratic, the flow rate is 0.2 ml / min and the total measurement time is 3 minutes. Influence of the protein precipitation agent on the measurement was investigated in terms of sensitivity and matrix effect. As protein precipitation agents, 12% sulphosalicylic acid (SSA), 12% trichloroacetic acid (TCA) and acetonitrile (ACN) were tested and the most sensitive results were obtained with 12% TCA The effect of blood collection tubes on cystine measurement was assessed in terms of recovery, matrix effect, and protein content. For this purpose, tubes containing most commonly used anticoagulants Li-Heparin, K2-EDTA, Na-Citrate were used for comparison.
In the scope of method validation parameters, selectivity, linearity, determination and quantitation limits, transport effect, reproducibility, recovery, matrix effect, reference interval validation and lysate stability studies were carried out. The method developed was found to be linear in the range of 0.078-100 M for leukocyte lysate cystine. The limit of detection was found as 0.0192 M and the limit of quantification was found as 0.0582 M. In both methods using D6-cystine as the internal standard and the method using homocystine as the internal standard, % CV values obtained  from the intra-day and inter-day reproducibility studies are below 15% which is suitable for validation criteria. While recovery rate was found 94-106 % for the D6-cystine method, these values are between 94%-106% in the homocystine method. The results obtained from the D6-cystine and homocystine method are compared with each other, and the R2 value of the obtained graph is 0.9838. Lysate  stability was studied for 4 months at room temperature at + 4 ° C and -20 ° C. For all three temperatures, the lysate was found to be stable for 4 months.