Bakır tayini için yüzey plazmon rezonans temelli biyosensörlerin hazırlanması
Preparation of surface plasmon resonance based biosensor for determination of copper
Yazar: VOLKAN SAFRAN
Danışman: PROF. DR. NECDET SAĞLAM
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Wilson hastalığı (WH) bakırın böbrek, beyin ve korneada aşırı depolanmasıyla karakterize kalıtsal bakır metabolizma bozukluğuyla ilgili otozomal resesif bir hastalıktır. Hastalık teşhis edilmez ve semptomları giderilmezse genellikle ölümcüldür. Kanda serbest (bağlı olmayan) bakır konsantrasyonları artar ve hücrelerde oksidatif hasara neden olabilir. WH hastalığı ilk olarak 1912 yılında Kinnear Wilson tarafından siroza yol açan karaciğer hastalığının da eşlik ettiği ölümcül nörolojik hastalık olarak tanımlandı [1]. 1993 yılında ise WD'da anormal ATP7B geni tespit edildi [2]. Bu gen bakırın taşınmasından sorumlu P-tip adenozin trifosfataz (ATPaz) enzimini kodlar. ATP7B protein'in yokluğunda ya da fonksiyonlarının azalmasıyla bakırın karaciğer hücrelerinden safraya atılması azalır. Buda hepatik bakır birikmesi ve biriken bakırın nihayetinde kana karışarak özellikle beyin, böbrek ve korneada birikerek hasara sebep olması demektir.
Yapılan çalışmada, Cu+2 iyonu baskılanmış SPR temelli biyosensör hazırlayarak bakır (II) iyonunun (Cu+2) sulu çözeltiden, eklenmiş izotonik çözeltisi ve sentetik idrardan tayini amaçlanmıştır. Bu hedef doğrultusunda, özellikle Moleküler baskılanmış polimerler (MIP) hazırlanması kolay, ucuz, kararlı, moleküler tanıma yeteneği olan ve ayrıca büyük miktarlarda üretilebilen ve tekrar kullanılabilen malzemelerdir. Bu yüzden, MIP'ler yapay molekül tanıyan malzemeler olarak tanımlanabilir. Adsorpsiyon temelli moleküler tanıma teknikleri hedef molekülleri için gösterdikleri yüksek seçicilikten dolayı bazı alanlarda dikkatleri üzerine çekmiştir.  
Biyolojik cevabı, elektriksel sinyallere dönüştüren cihazlar "Biyosensörler" olarak tanımlanırlar. Yüzey plazmon rezonans (SPR) yöntemi, biyomoleküler etkileşimlerden kaynaklanan metal yüzeye yakın kırılma indisindeki değişiklikleri ölçmede kullanılan kusursuz bir yöntemdir. SPR biyosensörlerin eş-zamanlı ölçüm yapabilme, yüksek hassasiyet ve sipesifiklik, herhangi bir işaretleyici ajana ihtiyaç duymama gibi üstün özelliklerinden dolayı son zamanlarda bir çok değişik analit türünün araştırılması uygulamalarında oldukça popüler olmuştur [3]. MIP'lar son zamanlarda SPR biyosensörlerin yüzeyinde biyotanıma yüzeyleri oluşturmak için kullanılmaktadır [4].
Sunulan çalışmada, Cu+2 iyonu baskılanmış SPR temelli biyosensör hazırlayarak bakır (II) iyonunun (Cu2+) sulu çözeltiden, spike edilmiş izotonik çözeltisi ve sentetik idrardan tayini amaçlandı. Bu amaçla öncelikle Cu+2 iyonları ile koordinasyon yapabilecek N-Metakroil-(L)-Sistein (MAC) monomeri sentezlendi. Sonrasında, MAC monomeri, kalıp molekül olarak kullanılan Cu2+ iyonu ile etkileştirilerek MAC-Cu2+ ön-kompleksi hazırlandı. Optimum kalıp molekül Cu2+ iyonu, MAC monomer oranı Cu2+ iyonunun farklı oranlarda MAC monomeri ile karıştırılarak UV-görünür bölge spektrofotometre kullanılmasıyla tespit edildi. Daha sonra hazırlanan MAC-Cu2+ ön-kompleksi 2-hidroksietil metakrilat (HEMA) ve çapraz bağlayıcı etilenglikol dimetakrilat (EDMA) monomerleri varlığında karıştırılarak polimerizasyon için monomer fazı hazırlandı. Polimerizasyon sonunda Cu+2 iyonu baskılanmış PHEMAC-Cu+2 nanopartiküller elde edildi. Cu+2 iyonu baskılanmış PHEMAC-Cu+2 nanopartiküller iki-fazlı miniemülsiyon polimerizasyon yöntemi ile hazırlandı. Faz I; PVA (100 mg), SDS (15 mg) ve NaHCO3'ın (12.5 mg) 5.0 mL deiyonize su içinde çözülmesiyle hazırlandı. Faz II; PVA (50 mg) ve SDS'in (50 mg) 100 mL deiyonize suda çözülmesiyle hazırlandı. MAC-Cu2+ ön-kompleksi (0.10; 0.05 mmol) 2-hidroksietil metakrilat (HEMA; 0.05 mmol) ve çapraz bağlayıcı etilenglikol dimetakrilat' dan (EDMA; 0.10 mmol) oluşan monomer fazında çözülerek yağ fazı elde edilmiştir. Yağ fazı faz I'e yavaşça eklenmiştir. Karışım, 25 000 rprarm de homojenizatörde homojenize edildikten sonra Faz II ile karıştırılmıştır. Sodyum bisülfit (125 mg) ve amonyum persülfat (125 mg) başlatıcılarının eklenmesinden sonra polimerizasyon işlemi 40 °C de 24 süreyle gerçekleştirilmiştir. Ayrıca kontrol deneyi için kalıp molekül olan Cu2+ iyonu kullanılmadan, baskılanmamış PHEMAC nanopartiküller SPR biyosensör için hazırlanmıştır.
Hazırlanan naopartiküllerin karakterizasyonu Fourier transform- Attenuated total reflektans (FTIR-ATR) spekstroskopi, zeta boyut analizi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve elementel analiz ile yapılmıştır. Hazırlanan PHEMAC-Cu2+ ve PHEMAC SPR biyosensörleri atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elipsometre ve temas açısı (CA) ölçümleriyle karakterize edilmiştir. Parçacık boyut analizi ve Cu2+ baskılanmış PHEMAC-Cu2+ nanopartiküllerin polidispersite değerinin (Pdı= 0.059) küçük olması sebebiyle boyut dağılımının oldukça homojen olduğu (46.10 nm) görüldü. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntülerinden elde edilen nanopartiküllerin farklı oranlarda büyütülmüş fotoğraflarından anlaşıldığı üzere ortalama boyut dağılımının 40-50 nm arasında olduğu görüldü. AFM görüntülerinden Cu+2 iyonu baskılanmış PHEMAC-Cu+2 ve baskılanmamış PHEMAC biyosensörlerin ortalama yüzey pürüzlülüğü sırasıyla 5.51 nm ve 4.33 nm olarak bulunmuştur. Cu+2 iyonu baskılanmış PHEMAC-Cu+2 ve baskılanmamış PHEMAC biyosensörlerin pürüzlülük değerlerindeki farklılık; Cu+2 iyonunun PHEMAC-Cu+2 SPR biyosensörün yüzeyine başarılı bir şekilde baskılandığını göstermektedir.
Adsorpsiyon çalışmaları için sırasıyla  0.1 nM, 0.25 nM, 1.0 nM, 2.5 nM, 10 nM, 25 nM ve 100 nM Cu+2 iyonlarını içeren çözeltiler 10 mM pH 5.0 fosfat tamponu kullanılarak hazırlandı. Desorpsiyon çalışmaları için de metal-şelatör ajanı içeren 0.005 M  etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ) çözelti kullanılmıştır. PHEMAC-Cu2+ ve PHEMAC SPR biyosensörlerin Cu2+  tayin seçiciliği, Ni+2 ve Zn+2 iyonlarının bulunduğu çözeltiler kullanılarak araştırılmıştır. PHEMAC-Cu2+ SPR biyosensörü, PHEMAC SPR biyosensörüne göre Cu2+ 'ye karşı daha fazla seçicilik göstermiştir. Doğal kaynaktan alınan sentetilk idrar ve izotonik serum örneklerine Cu+2 iyonu spike edilmesiyle hazırlanan örneklerle de kinetik çalışmalar yapılmıştır. PHEMAC-Cu2+ SPR biyosensör ile Cu2+  çözeltisi arasındaki etkileşim modelini belirlemek amacıyla Scatchard, Langmuir; Freundlich ve Langmuir-Freundlich (LF) olmak üzere dört farklı izoterm modeli uygulanmıştır. Langmuir adsorpsiyon modeli, bu afinite sistemi için en uygun model olarak bulunmuş ve sonuçlar PHEMAC-Cu2+ SPR biyosensör yüzeyindeki Cu2+ bağlanma bölgelerinin homojen dağılımlı ve tek tabakalı olduğunu göstermiştir. PHEMAC-Cu+2 SPR biyosensörün tekrar kullanılabilirliğini incelemek amacıyla Cu+2 iyonunu içeren çözeltiler SPR sistemine tekrarlı (4 kez) bir şekilde enjekte edilmiş reflektansları ölçülmüştür. Ölçümlerin kesinlik değerini tespit etmek için PHEMAC-Cu+2 SPR biyosensörün gün içi ve günler arası Cu+2 iyonuna karşı verdiği sinyal şiddetinin tekrarlanabilirlik çalışmaları istatiksel olarak değerlendirilmiş ve % RSD değerleri olarak verilmiştir. Kesinlik çalışmaları %RSD değerinin <1.5 olması sebebiyle metodunun tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. Sonuçlar, PHEMAC-Cu2+ SPR biyosensörün Cu2+ için yüksek seçiciliğe ve duyarlılığa sahip olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Wilson disease is a rare autosomal recessive inherited disorder of copper metabolism that is characterized by excessive deposition of copper in the liver, brain, and cornea. Wilson disease is often fatal if not recognized and treated when symptomatic. Free copper (unbounded) increased in blood and can cause oxidative damage to cells. Wilson disease (WD) was first described in 1912 by Kinnear Wilson as a familial, lethal neurological disease accompanied by chronic liver disease leading to cirrhosis [1]. In 1993, the abnormal ATP7B gene in WD was identified [2]. This gene, , encodes a metal-transporting P-type adenosine triphosphatase (ATPase), which is expressed mainly in hepatocytes and functions in the transmembrane transport of copper within hepatocytes. Absent or reduced function of ATP7B protein leads to decreased hepatocellular excretion of copper into bile. This results in hepatic copper accumulation and injury. Eventually, copper is released into the bloodstream and deposited in other organs, notably the brain, kidneys, and cornea.
Molecularly imprinted polymers (MIP) have been  the most populer materials due to materials that are easy to prepare, less expensive, stable, have talent for molecular recognition and also can be manufactured in large quantities with good reproducibility. MIPs are used for creation of biorecognitive surfaces on the SPR biosensors. Therefore, MIPs can be considered as artificial recognition media. Molecular recognition-based adsorption techniques have received much attention in several fields because of their high selectivity for target molecules. 
Devices which biological response convert to electrical signals are defined as ''Biosensors''. Surface plasmon resonance (SPR) biosensors are used to measure changes in the refractive index due to the biomolecular interaction occurring at the surface of the SPR sensor. Because of unique properties of SPR biosensors, i.e., real-time measurement, high specificity and sensitivity, no need to labeling, the applications of them have been getting more popular for investigation of several analyte molecules [3]. Recently, MIPs are used for creation of biorecognitive surfaces on the SPR biosensors [4]. 
In this study preparation of copper (II) ion (Cu2+) imprinted SPR based biosensors to determine Cu2+ ion both from aqueous, spiked isotonic serum and artificial urine solution was aimed. For this purpose, N-Metakriloil-(L)-cysteine (MAC) monomer which has capability of coordination binding to Cu2+ ion was synthesized. After then, MAC-Cu2+ precomplex was synthesized by interacting of MAC monomer with template Cu2+ İon. To define optimum ratio between template Cu2+ ion and MAC monomer, Cu2+ ion and MAC monomer were mixed in a different ratios and optimum ratio was determined by using UV-visible region spectrophotometry. 
MAC-Cu2+ precomplex was mixed in the presence of crosslinker ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) and secondary monomer 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) to prepare monomer phase. At the end of the polymerization Cu+2 ion imprinted PHEMAC-Cu+2 nanoparticles were attained.
Cu+2 ion imprinted PHEMAC-Cu+2 nanoparticles were prepared by two-phase mini-emulsion polymerization method. The first aqueous phase was prepared by dissolving of PVA (100 mg), SDS (15 mg) and NaHCO3 (12.5 mg) in 5.0 mL deionized water. The second phase was prepared by dissolving of PVA (50 mg) and SDS (50 mg) in 100 mL of deionized water. Prepared MAC-Cu2+ pre-complexed (0.10; 0.05 mmol) was dissolved in a monomer mixture of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA; 0.05 mmol) and ve ethylene glycol dimethacrylate (EDMA; 0.10 mmol) to form oil phase. The oil phase was slowly added to the first aqueous phase. In order to obtain mini-emulsion, the mixture was homogenized at 25 000 rpm by a homogenizer.  After homogenization, mixture was added to the phase II. Then, initiators, sodium bisulfite (125 mg) and ammonium persulfate (125 mg), were added into the solution. Polymerization was continued for 24 h. Besides this, for control experiment, the non-imprinted PHEMAC nanoparticles were synthesized by applying same procedure with imprinted nanoparticles except addition of template Cu2+ ions.
Prepared nanoparticles were characterized by Fourier transform infrared-attenuated total reflectance (FTIR-ATR) spectroscopy, zeta sizer analysis, scanning electron microscopy (SEM) and elemental analysis. Prepared Cu+2 ion imprinted PHEMAC-Cu2+ and non imprinted PHEMAC SPR biosensors were characterized by atomic force microscope (AFM),  ellipsometer, contact angle (CA) measurements. Size distrubution of Cu2+ imprinted PHEMAC-Cu2+ nanoparticles was estimated by  Zeta sizer measurements and because of low polydispersity index value (Pdı=0.059) homogeneous average nanoparticle size  distrubition was attained (46.10 nm). Size of nanoparticles was determined by Scanning electron microscopy measurements betwenn 40-50 nm. Surface rougness measurements were obtained by Atomic force microscopy (AFM) and images showed that roughness of Cu2+ imprinted PHEMAC-Cu2+ and non imprinted nanoparticles was estimated as 5.51 and 4.33 nm respectively. Rougness difference between Cu2+ imprinted PHEMAC-Cu2+ and non imprinted PHEMAC nanoparticles show that imprinting process of Cu2+ ions was performed successfully. 
Adsorption studies were performed by 0.1 nM, 0.25 nM, 1.0 nM, 2.5 nM, 10 nM, 25 nM ve 100 nM Cu+2 ion solutions prepared by 10 mM pH 5.0 phosphate buffer solution. Desorption studies were carried out by using 0.005 M etilendiamin tetraasetic asid (EDTA) solution which was used as metal-chelator agent. Selectivity studies of PHEMAC-Cu2+ ve PHEMAC SPR biosensors for Cu2+ determination, were investigated by using solutions of Ni+2 ve Zn+2 ions as a samples. PHEMAC-Cu2+ SPR biosensor showed higher selectivity than PHEMAC SPR biosensor for Cu2+ion. Adsorption studies were made for samples prepared by Cu+2 ion spiked artificial urine solution taken from natural sources and isotonic serum solutions. To determine the adsorption model of interactions between Cu2+ solution and PHEMAC-Cu2+ SPR biosensor, four different adsorption models such as Scatchard, Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich (LF) were performed. Langmuir adsorption model was found most applicable model for this affinity system and results showed that Cu2+ affinity regions on surface of PHEMAC-Cu2+ SPR biosensor were homogeneously distributed and have monolayer structure. 
Repeatability experiments of PHEMAC-Cu+2 SPR biosensor was performed four times (4 times) by uing Cu+2 ion containg solutions and reflectance values were measured. Precision studies were carried out to ascertain the reproduciblity of the proposed method. The results of intraday and interday precision studies was reported as %RSD and showed a good reproducibility with percent relative standard deviation less than <1.5. Results showed that, PHEMAC-Cu2+ SPR biosensor had high selectivity and sensitivity for Cu2+ ion.