Kurutulmuş nohut granüllerinden (Cicer arietinum) β-galaktosidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of β-galactosidase enzyme from dry chick pea granules (Cicer arietinum)
Yazar: ERDEM KAYA
Danışman: YRD. DOÇ. DR. YONCA DUMAN
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Beta galaktosidaz = Beta galactosidase ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification

Özet:
β-D-Galaktosidaz (EC 3.2.1.23, laktaz) laktozu, glikoz ve galaktoza hidrolizini katalizleyen enzimdir. Doğada yaygın olarak bulunur ve bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan izole edilir. Bu çalışmada, nohuttan β-galaktosidaz saflaştırılması üç fazlı ayırma (TPP) yöntemi kullanılarak ilk defa uygulandı. pH 6,8'de, 1:0,5 ham enzim çözeltisi:t-bütanol oranı ve %60 doygun amonyum sülfat kullanarak uygulanan TPP yöntemi sonucunda enzim, %133 verim ile 10,1 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin, SDS-PAGE analizi ile molekül ağırlıkları 48 ve 38 kDa olan iki alt birim içerdiğini gösterdi.  Native-PAGE ve zimogram analizi ile enzimin molekül ağırlığı 85 kDa olarak bulundu. Saflaştırılan enzimin optimal pH ve sıcaklığı, sırasıyla 2,8 ve 50oC olarak bulundu. Arrheius aktivasyon enerjisi (Ea) 28,63 kJ/mol olarak hesaplandı. Saflaştırılan enzim, 45oC'de 30 dakika inkübasyon sonunda aktivitesinin %60'ını korurken, bununla birlikte, 60oC'de 30 dakika inkübasyon sonunda aktivitesinin %80'ini kaybettiği gözlemlendi. 37oC'de pH 2,8'de enzimin, Michaelis-Menten sabiti (Km) ve maksimum hızı sırasıyla 1,1 mM ONPG ve 0,90 U/ml/dk olarak bulundu. Saflaştırılan enzimin turnover sayısı (kcat) ve katalitik performansı (kcat/Km) sırasıyla 212,26 dk-1 ve 193 dk-1mM-1 olarak bulundu. Enzimin termodinamik parametreleri; ΔG#, 62,21 kJ/mol; Δ#E-T, -13,56 kJ/mol; Δ#E-S, 0,25 kJ/mol; ΔH#, 26,06 kJ/mol; ΔS#, -0,12 kJ/mol.K olarak hesaplandı.

Abstract:
β-Galactosidase (Lactase, E:C 3.2.1.23) is an enzyme which catalyze the hydrolysis of lactose to glucose and galactose. The enzyme is widespread in nature and can be isolated from herbal, animal and microbial sources. In this study, the purification of β-galactosidase from chick pea (Cicer arietinum) was carried out first time by three phase partitioning method (TPP). Enzyme was 10.1 fold purified with 133% activity recovery by the method of TPP obtained by using 60% saturated ammonium sulphate and crude enzyme extract:t-butanol in 1:0.5 ratio at pH 6.8. SDS-PAGE analysis of purified enzyme showed that enzyme has consisted two subunits in 48 and 38 kDa molecular weight. The molecular weight of native enzyme was found to be 85 kDa as results of Native-PAGE and zymogram analysis. Optimal pH and temperature of purified enzyme were found to be 2.8 and 50oC, respectively. Arrhenius activation energy (Ea) was determined as 28.63 kJ/mol. Purified enzyme is retained the 60% of its activity after 30 minutes incubation at 45oC, however, 80% activity loss was observed at 60oC. Michaelis-Menten constant (Km) and maximal velocity of enzyme were found to be 1.1 mM ONPG and 0.90 U/ml/min at 37oC and pH 2.8. Turnover coefficient (kcat) and catalytic efficiency (kcat/Km) of purified enzyme were found to be 212.26 min-1 and 193 min-1mM-1 in order. Thermodynamic parameters of enzyme were calculated as ΔG#, 62.21 kJ/mol; Δ#E-T, -13.56 kJ/mol; Δ#E-S, 0.25 kj/mol; ΔH#, 26.06 kj/mol; ΔS#, -0.12 kJ/mol K.