Salatalıkta ısı şoku proteinlerinin biyoinformatik analizleri ve abiyotik stres koşullarına tepkisinin omiks yaklaşımlar kullanılarak incelenmesi
Bioinformatics analysis of cucumber heat shock proteins and investigation of response to abiotic stress conditions by using omics approaches
Yazar: NECDET MEHMET ÜNEL
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET CENGİZ BALOĞLU
Kastamonu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Abiyotik faktörler = Abiotic factors ; Absisik asit = Abscisic acid ; Gen ifadesi = Gene expression ; Moleküler genetik = Molecular genetic

Özet:
Isı şoku proteinleri ailesi organizmalarda hem normal koşullarda hem de stres faktörlerinin etkili olduğu koşullarda önemli bir role sahip bir protein ailesidir. Bitkilerde, özellikle stres koşullarına maruz kalındığında proteinlerin fonksiyonlarını kaybetmemeleri ve canlılığın korunması açısından çok önemli bir yere sahiptirler.
Salatalık (Cucumis sativus) ülkemizin her bölümünde üretimi yapılan bir bitkidir. Özellikle besin ve vitamin içeriği açısından değerlendirildiğinde insan diyetinde önemli bir yere sahiptir. Ayrıca uzun mesafeli sinyal olaylarını kapsayan vasküler biyoloji çalışmaları ve cinsiyet belirlenmesi çalışmaları gibi birçok çalışmada model organizma olarak kullanılmaktadır.
Üç bölümden oluşan bu tez kapsamında ilk olarak 6 ısı şoku protein ailesine (sHsp, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100) mensup genler biyoinformatik yöntemler kullanılarak salatalık genomunda belirlenmiştir. Daha sonra genlerin ve bu genlerin ürünü olan proteinlerin karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. Yapılan analizler sonucunda salatalık genomunda kodlanan 36 adet sHsp, 100 adet Hsp40, 28 adet Hsp60, 14 adet Hsp70, 7 adet Hsp90 ve 17 adet Hsp100 geni tanımlanmıştır. CsHsp genlerinin ve proteinlerinin moleküler karekterizasyonu belirlemek için biyoinformatik analizleri yapılmıştır. Bunlar arasında, CsHsp' lerin kromozomal dağılımları, gen yapıları, korunmuş motifleri, filogenetik ilişkileri, gen ontolojisi sınıflandırmaları, farklı organizmalardaki ortologlarının belirlenmesi gibi biyoinformatik analizler yer almaktadır.
Tezin ikinci bölümünde ise, ilk olarak salatalık bitkisine ait transkriptom verileri (RNA-seq) ilgili veri tabanlarında bulunmuştur. Ardından bu verilerin ileri biyoinformatik analizleri yapılarak, gerçek zamanlı-PZR ile ifadesi çalışılacak genler seçilmiştir. Seçilen genlerin yüksek sıcaklık, düşük sıcaklık, tuzluluk, kuraklık stresleri ve ABA uygulaması durumlarında ifade seviyelerindeki değişimler incelenmiştir. Analizlerde salatalığın kök ve yaprak dokuları, stres muamelesinden sonra 1., 3., 6. ve 12. saatlerde toplanarak kullanılmışlardır. Yapılan analizler
v sonucunda, CssHsp-08, CsHsp40-70 ve CsHsp70-06 genlerinin ifadelerinin farklı stres koşulları karşısında büyük ölçüde arttığı belirlenmiştir. Bu genler arasından CssHsp-08 geninin ifadesinin kuraklık, tuzluluk, düşük sıcaklık stresleri ve ABA uygulaması karşısında büyük artış göstermesi, bu genin stres koşullarında direncin sağlanabilmesi açısından önemli bir gen olduğunu işaret etmektedir.
Tezin son bölümünde ise, aynı stres koşullarında metabolit düzeyindeki değişimlerin belirlenmesi amacıyla bitki ekstraktları türevlendirmenin ardından GC-MS ile analiz edilmiştir. Amino asitlerin, şekerlerin, şeker alkollerinin ve TCA döngüsü elemanlarının stres faktörlerine karşı gösterdikleri tepkiler değerlendirilmiştir. Yapılan analizler sonucunda, yaprakta belirlenen amino asitlerin özellikle yüksek sıcaklık altında, kökte belirlenen amino asitlerin ise kuraklık karşısında birikimlerinin daha fazla olduğu dikkat çekmektedir. Çalışmamızda, çoklu doymamış bağ içeren yağ asitlerinin miktarları ile doymuş yağ asitlerinin miktarları karşılaştırıldığında; tuzluluk, kuraklık ve ABA uygulamalarında miktarlarının yakın olduğu ancak, yüksek sıcaklık ve düşük sıcaklık uygulamalarında doymuş yağ asitlerinin daha yüksek miktarda bulunduğu belirlenmiştir. Uygulanılan stres faktörlerinin büyük bölümünde, her iki dokuda da sükroz birikimi olduğu da gözlenmiştir.
Çalışmamız önemli bir aile olan ısı şoku proteinleri ailesinin yapısının, organizasyonunun, evriminin ve ifade profillerinin anlaşılması açısından önem arz etmektedir ve gelecekte yaşanabilecek muhtemel gıda problemlerine karşı alınacak önlemler açısından kazançlı olacaktır. Ayrıca çalışmamız, bitki stres mekanizmalarının anlaşılmasında omiks yaklaşımlarının kullanılması açısından temel niteliğindedir ve önemli bilgiler açığa çıkartmıştır.

Abstract:
Heat-shock proteins are a family of proteins that play an important role in organisms both under normal conditions and under conditions that stressors are effective. In plants, they have a very important place in terms of preserving the vitality and functionality of proteins, especially when exposed to stress conditions.
Cucumber (Cucumis sativus) is a plant that is produced in every part of our country. Especially when it is evaluated in terms of nutritional and vitamin content, it has an important place in human diet. It is also used as a model organism in many studies.
In this three-part thesis, genes belonging to 6 heat shock protein families (sHsp, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100) were first identified in the cucumber genome using bioinformatic methods. Characterization of genes and proteins was then carried out. As a result of the analysis, 36 sHsp, 100 Hsp40, 28 Hsp60, 14 Hsp70, 7 Hsp90 and 17 Hsp100 genes were coded in the cucumber genome. Bioinformatics analyzes of CsHsp genes and proteins were performed to determine the molecular characterization. These include bioinformatics analyzes such as chromosomal distributions of CsHsps, gene structures, conserved motifs, phylogenetic relationships, gene ontology classifications, and identification of orthologs in different organisms.
In the second part of the thesis, firstly transcriptomic data (RNA-seq) of cucumber plant were found in the related databases. Next, advanced bioinformatics analyzes of these data were performed to select genes to be expressed in real time-PCR. Changes in expression levels of selected genes in high temperature, low temperature, salinity, drought stress, and ABA application conditions were investigated. In the analyzes, root and leaf tissues of cucumber were collected at 1st, 3rd, 6th and 12th hours after stress treatment. As a result of the analyzes made, it was determined that the expression of CssHsp-08, CsHsp40-70 and CsHsp70-06 genes greatly increased in response to different stress conditions. Among these genes, the expression of the CssHsp-08 gene shows a large increase in drought, salinity, low temperature stresses and ABA application, indicating that this gene is an important gene for resistance to stress conditions.
vii In the last part of the thesis, plant extracts were analyzed by GC-MS after derivatization in order to determine changes in metabolite level under the same stress conditions. The responses of amino acids, sugars, sugar alcohols and TCA cyclic elements to stress factors were evaluated. As a result of the analyzes made, it is noteworthy that the accumulation of the amino acids determined in the leaf, especially at high temperature, and the amino acids determined at the root, are more in the face of drought. When we compare the amounts of saturated fatty acids with the amounts of fatty acids containing polyunsaturated bonds, salinity, drought and ABA applications, but higher amounts of saturated fatty acids were found in high temperature and low temperature applications. It has also been observed that for most of the applied stress factors, sucrose accumulates in both tissues.
Our work is important for the understanding of the structure, organization, evolution and expression profiles of the family of heat shock proteins, which is an important family, and will be beneficial in terms of measures to be taken against possible future food problems. In addition, our work is fundamental to the use of omics approaches to understanding plant stress mechanisms and has yielded important information.