Yeni viral etmenlerin narlarda [Punica granatum L.] yüksek kapasiteli dizileme ile saptanması, biyolojik ve epidemiyolojik özelliklerinin araştırılması, organik nar bahçelerinde taranması
Investigation of new viral agents in pomegranates [Punica granatum L.] by high throughput sequencing, their biological and epidemiological characteristics, screening in organic pomegranate orchards
Yazar: HAMİDE DENİZ KOCABAĞ
Danışman: PROF. DR. KADRİYE ÇAĞLAYAN
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Epidemiyoloji = Epidemiology ; Nar = Pomegranate ; Yeni nesil dizileme = High throughput sequencing

Özet:
Kültür tarihi oldukça eskilere dayanan, dünyada ve ülkemizde önemi gittikçe artan nar ağaçlarını etkileyen virüs ve virüs benzeri hastalıklar hakkında son yıllara kadar sınırlı sayıda araştırma yapılmıştır. Ülkemizde yapılan bir çalışmada narların grapevine leafroll virüs-1 (GLRaV-1)'in doğal konukçusu olabileceğinin tespit edilmesi ve nar plantasyonlarında yoğun virüs benzeri simptomların gözlenmesi bu çalışmanın kurgulanmasında önemli rol oynamıştır. Çalışma kapsamında Adana, Antalya, Aydın, Hatay, Kilis, Kocaeli, Mersin, Osmaniye ve Şanlıurfa illerinden klorotik ve mozaik lekeler, damar bantlaşması ile meşe yaprağı simptomu gözlenen 200 nar örneği ile simptomsuz 87 örnek GLRaV-1'e karşı RT-PCR analizleriyle testlenmiştir. Ayrıca, GLRaV-1 negatif bulunan fakat yoğun simptomlu 2 nar örneği seçilerek olası yeni virüslere karşı Yüksek Kapasiteli Dizileme (YKD) analizleri ile araştırılmıştır. Toplam 287 örneğin GLRaV-1'in 3 farklı gen bölgesini (p24, CP ve CPd2) hedef alan primerler kullanılarak yapılan RT-PCR analizleri sonucunda GLRaV-1'in en az bir gen bölgesi için pozitif bulunan örneklerin oranı %22,99 olarak tespit edilmiştir. Yoğun simptom gözlendiği halde GLRaV-1 açısından negatif bulunan Hatay ilindeki 2 Hicaz çeşidi nar örneğinde YKD analizleri yapılmıştır. Analizler sonucu elde edilen viral genomun, son yıllarda çarkıfelek (Passiflora edulis) bitkisinde saptanan ve Potyviridae familyasının yeni bir üyesi olarak Roymovirus cinsine dahil edilen "passiflora edulis symptomless virus (PeSV)" olduğu belirlenmiş olup bu virüs narlarda ilk kez tespit edilmiştir. PeSV saptanan nar örnekleri elektron mikroskopta incelenmiş ve Potyviridae üyeleri ile uyumlu 760-780 nm uzunluğundaki esnek filamentli viral partiküllerin gözlenmesiyle virüsün narlardaki varlığı doğrulanmıştır. PeSV için tanı primeri olarak tasarlanan  PeSV/NIa-Pro genine spesifik 6564F/7030R primeri ve PeSV-CP gen bölgesine spesifik 8985F/9753R primer çiftleri kullanılarak 287 nar örneği testlenmiş ve her iki primerden en az biriyle 214 örnek pozitif bulunmuştur (%67,59). PeSV pozitif bulunan örneklerin sekans sonuçları İsrail'den bildirilen PeSV çarkıfelek izolatı ile %86-94 oranında benzerlik göstermiştir
Narlarda YKD analizi ile tespit edilen PeSV'nin biyolojik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla doğadaki olası vektörleri, otsu ve odunsu konukçulara taşınabilme özellikleri araştırılmıştır. PeSV, denemede kullanılan hiçbir otsu indikatör bitkiye mekanik inokulasyon yöntemiyle taşınamamıştır. PeSV ile enfekteli narlardan sağlıklı narlara göz aşısı yoluyla taşınma etkinliğinin saptanmasına yönelik yürütülen çalışmalarda ise iki yıl boyunca yapılan gözlemlerde herhangi bir taşınma olmamıştır. PeSV ile enfekteli nar ağaçlarından toplanarak Aphis punicae Passerini olarak teşhis edilen 565 yaprak biti RT-PCR ile testlenmiş ve PeSV-CP primeri ile 2, PeSV/NIa-Pro primeri ile 5 yaprak biti pozitif bulunmuştur. Yapılan bu çalışmada yaprak bitinin bünyesinde PeSV tespit edilmesine karşın otsu konukçulara taşınamamıştır. PeSV'nin gerek mekanik, gerek enfekteli aşı gözü kullanımı gerekse olası vektör yaprak bitleri yoluyla otsu bitkilere ve sağlıklı nar bitkilerine etkin bir taşınmanın olmaması nedeniyle virüsün nar plantasyonlarında yaygın bulunmasının ana nedeninin enfekteli bitkilerden alınan çelikler yoluyla olabileceği sonucuna varılmıştır.
Organik nar üretiminin yapıldığı Kilis ilindeki organik ve organiğe geçiş yapan nar bahçelerinden toplanan örnekler GLRaV-1 ve PeSV'ye karşı testlendiğinde toplanan 36 örneğin tamamı PeSV, 9 tanesi de GLRaV-1 ile pozitif bulunmuştur. Organik nar bahçelerinin yüksek oranda virüsle bulaşık bulunmasının olası nedenleri, her iki virüsün de son yıllarda saptanmasından dolayı organik nar bahçesi tesisinde kullanılan fidanların dikim öncesi virüslere karşı testlenme olanağının bulunmaması ve enfekteli nar bitkilerinden alınan çeliklerle yapılan fidan  üretimi olarak değerlendirilmiştir.

Abstract:
A limited number of studies have been conducted until recent years about viruses and virus-like diseases affecting pomegranate trees, whose cultural history dates back to ancient times and whose importance is increasing in the world and in our country. Recently, determination of pomegranates as a natural host of grapevine leafroll virus-1 (GLRaV-1) and the observation of intense virus-like symptoms in pomegranate plantations in Turkey played an important role in the construction of this study. Within the scope of the study, 200 pomegranate samples from Adana, Antalya, Aydın, Hatay, Kilis, Kocaeli, Mersin, Osmaniye and Şanlıurfa provinces with chlorotic and mosaic spots, vein banding and oak leaf on the leaves, and 87 asymptomatic samples were collected and tested for GLRaV-1 by RT-PCR. Among these samples GLRaV-1 free but symptomatic 2 samples were selected and analyzed by High throughput sequencing (HTS) technology for possible new viruses. When 287 pomegranate samples were tested by RT-PCR using primers that amplify 3 different gene regions of GLRaV-1 (p24, CP and CPd₂), the infection rate was found as 22.99%for at least one gene region. According to HTS analyzes of 2 pomegranate samples, cv. Hicaz collected from Hatay province, "passiflora edulis symptomless virus (PeSV)", which has been recently reported in the passion flower plant (Passiflora edulis) included in the Roymovirus genus as a new member of the Potiviridae family, has been first time detected in pomegranates.
Pomegranate samples infected with PeSV were also examined under an electron microscope and the presence of the virus in pomegranates was confirmed by observing 760 to 780 nm long flexible filamentous viral particles compatible with viruses belonging to the Potyviridae family. In order to see the the prevalence of PeSV in important pomegranate plantations, 287 pomegranate samples were collected and tested by using the PeSV/NIa-Pro gene specific 6564F/7030R primer and the PeSV-CP gene specific 8985F/9753R primer pairs. Among tested samples 214 were found positive (67.59%) by at least one of these primers. Sequencing results showed 86-94%similarity between pomegranate PeSV isolates together with PeSV- passion fruit isolate obtained from Israel. In order to determine the biological properties of PeSV detected by HTS analysis in pomegranates, its possible vectors in nature and its transmissibility to herbaceous and woody hosts were investigated. PeSV could not be transmitted to any herbaceous indicator plant used in the experiment by mechanical inoculation. In the studies carried out to determine the efficiency of PeSV transmission from infected to healthy pomegranates via graft bud, there was no transmission during two years observation. Aphid species collected from PeSV infected pomegranate trees were identified as Aphis punicae Passerini. When 565 aphids collected from PeSV-infected pomegranate trees were tested by RT-PC, 2 samples were found positive with PeSV-CP primer and 5 samples with PeSV/NIa-Pro primer. Although PeSV was detected in the aphids, it could not be transferred to herbaceous hosts by using these aphids. In the light of the data obtained in this study, it was concluded that the main reason for high infection rate of PeSV in pomegranate plantations could only  be due to  using cuttings taken from infected pomegranate plants. No effective transmission of PeSv was observed by mechanical inoculation, using infected graft buds or possible vector aphids . When the samples collected from organic and in transition to organic pomegranate orchards in the province of Kilis, where organic pomegranate production is present, were tested against GLRaV-1 and PeSV, all 36 samples were found positive with PeSV and 9 of them were positive with GLRaV-1. The possible reason why organic pomegranate orchards are infected by viruses at a high infection  rate was evaluated as saplings produced by cuttings taken from virus infected pomegranate plants due to lack of testing possibilities for new emerging viruses before planting in organic pomegranate orchards.