Deneysel hiperoksi aracılı akciğer hasarı oluşturulan yenidoğan sıçanlarda trakeal yolla verilen mezenkimal kök hücre tedavisinin etkinliğinin değerlendirilmesi
Evaluation of the effectiveness of tracheally delivered mesenchymal stem cells on experimental hyperoxic lung injury in neonatal rats
Yazar: SELVİ GÜLAŞI
Danışman: PROF. DR. AYTUĞ ATICI
Mersin Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Nanoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Bronkopulmoner displazi = Bronchopulmonary dysplasia ; Hiperoksi = Hyperoxia ; Kök hücreler = Stem cells ; Mezenter = Mesentery ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Amaç: Çalışmamızda deneysel hiperoksik akciğer hasarı oluşturulan yenidoğan sıçanlara erişkin sıçanın kemik iliğinden üretilen ve trakeal yolla verilen mezenkimal kök hücrelerin histopatolojik olarak akciğerlere etkisini ve akciğer dokusuna yerleşimini göstermeyi amaçladık.Gereç ve Yöntemler: Sıçan yavrularına doğumdan sonraki 12-24. saatte başlayıp 10. gün bitimine kadar % 85-95 yoğunlukta oksijen uygulanarak hiperoksik akciğer hasarı modeli oluşturuldu. Sıçanlar doğumlarından itibaren altı gruba ayrıldı. Oda havası soluyan normoksi grubu (Grup N, n=11), oda havası soluyan cerrahi ve anestezi uygulanan sham grubu (Grup S, n=11), 10 gün hiperoksi uygulaması yapılan ve uygulama bitiminde trakeal yolla plasebo olarak serum fizyolojik (Grup P, n=9), mezenkimal kök hücrenin üretileceği sıvı besiyeri (medyum) (Grup M, n=10), mezenkimal kök hücreler üretilip kaldırıldıktan sonra kalan sıvı besiyeri (vasat) (Grup V, n=8) ve mezenkimal kök hücre (Grup MKH, n=17) verilen gruplar çalışma gruplarını oluşturdu. 10. günde ve 57. günde sıçan ağırlıkları karşılaştırıldı. 57. günde torakotomi yapılarak akciğer dokusu çıkarıldı, akciğer ağırlıkları kaydedildi ve sağ akciğerlerin orta lobları patolojik inceleme için alındı. Grup MKH'deki sekiz sıçanın akciğerleri diğer gruplar gibi 57. günde çıkarılırken, kalan dokuz sıçanın akciğerleri 10 gün hiperoksi uygulaması bitiminde birer hafta ara ile her hafta üç sıçan olacak şekilde çıkarılarak MKH'lerin akciğerlere yerleşimi değerlendirildi. Sıçanların ağırlıkları ve akciğerlerin ağırlıkları ölçüldü. Alveol sayısı, alveol çapı, ?-SMA (Smooth Muscle Actin) ekspresyonu ve ödem, konjesyon, lökosit infiltrasyonu gelişimi numerik olarak skorlandı. MKH'ler erişkin sıçanın kemik iliğinden elde edildi ve transfeksiyon yöntemiyle işaretlendi. MKH verilen sıçanlarda hücrelerin akciğere yerleşimi immünohistokimyasal yöntemlerle değerlendirildi.Bulgular ve Sonuç: Hiperoksik gruplarda 10. günde izlenen ağırlık kaybı normoksik gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı idi (p<0,001). 57. günde hiperoksik gruplar normoksik grubun ağırlığına ulaşmış olup gruplar arasında istatistiksel olarak fark bulunmadı (p=0,086).Hiperoksik gruplardan plasebo ve medyum verilen grupların akciğer ağırlığında normoksi grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı olan artış vardı (sırasıyla p=0,006 ve p=0,037) . MKH verilen grupta akciğer ağırlığı diğer hiperoksik gruplara göre azalmış olarak bulundu.Hiperoksi uygulanan gruplardan sadece MKH verilen grupta alveol sayısının arttığı, normoksi grubuyla farklılık olmadığı saptandı (p=0,126). Plasebo, medyum ve vasat verilen gruplarda ise normoksi grubuna göre istatistiksel olarak da anlamlı olan alveol sayısı azalması vardı (sırasıyla p=0,003, p<0,001 ve p=0,015). MKH verilmesi alveol sayısını arttırmıştı.Hiperoksi uygulanıp plasebo ve medyum verilen gruplarda normoksi grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı olan alveol çapı artması vardı (sırasıyla p=0,012 ve p<0,001). MKH ve vasat verilen gruplarda alveol çapı azalmış ve normoksi grubuna yaklaşmış olup gruplar arasında istatistiksel olarak fark bulunmadı (p>0,05). MKH ve vasat verilmesi alveol çapını azaltmıştı.MKH verilen grupta akciğerlerde histopatolojik olarak birinci derece ödem gelişimi diğer hiperoksik gruplara göre daha az bulundu. Konjesyon gelişimi ve lökosit infiltrasyonu açısından gruplar arasında fark yoktu.?-SMA ekspresyonu vasat ve MKH verilen gruplarda plasebo verilen gruba belirgin olarak azalmıştı (p=0,002).İşaretli MKH verilen tüm gruplarda, akciğer dokusunda yeşil floresan protein (Green Fluorescent Protein, GFP) (+) hücrelere rastlandı. En fazla GFP (+) hücrenin 10 gün hiperoksi uygulaması sonrasındaki birinci hafta bitiminde akciğerleri çıkarılan grupta olduğu, zaman ilerledikçe GFP (+) hücre sayısının azaldığı izlendi. Sürfaktan proteini-C (SP-C) ile ikili işaretlemede, GFP (+) hücrelerin bazılarının aynı zamanda SP-C'yi de eksprese ettiği gözlendi. Verilen MKH'lerin akciğerlere yerleştiği ve tip II alveolar epitelyal hücreye benzer şekilde sürfaktan ürettiği kanaatine varıldı.Sonuç olarak, hiperoksi aracılı akciğer hasarında yenidoğan sıçanlara MKH verilmesi ile akciğer dokusunda histopatolojik olarak iyileşme olduğu, verilen MKH'lerin hasarlı dokuya yerleştiği ve o dokunun hücrelerine dönüştüğü saptanmıştır.Anahtar kelimeler: Akciğer hasarı, hiperoksi, mezenkimal kök hücre, bronkopulmoner displazi

Abstract:
Aim: The aim of this study was to evaluate the effectiveness of tracheally delivered mesenchymal stem cells (MSCs) derived from adult rat bone marrow on lung histopathology and placement of MSCs in lung tissue in an experimental neonatal rat model of hyperoxic lung injury.Materials and Methods: In order to create the hyperoxic lung injury model, neonatal rat pups were exposed to 85-95 % oxygen, starting from 12-24 hours after birth until the end of the 10th day. Rats were divided into six groups from birth: (1) room air breathing rats in normoxia group (Group N, n=11), (2) room air breathing and surgery and anesthesia applied rats in sham group (Group S, n=11), (3) exposed to hyperoxia for 10 days and physiological-serum administered placebo group (Group P, n=9), (4) exposed to hyperoxia and medium (where MSCs were reproduced) administered group (Group M, n=10), (5) exposed to hyperoxia and vehicle (remaining material after harvesting MSCs) administered group (Group V, n=8), and (6) exposed to hyperoxia and MSCs administered group (Group MSC, n=17). Weights of rats were compared on the 10th and 57th days. Thoracothomy was performed and lung tissue was removed; lung weight was recorded, and right middle lobes of the lungs were obtained for pathological examination on the 57th day in all groups. Three rats were also sacrificed at the end of 1st, 2nd and 3rd weeks after the administration of MSCs to evaluate the placement of MSCs in the lungs. The number and the diameter of alveoli, ?-SMA (smooth muscle actin) expression and edema, fibrosis, congestion and leukocyte infiltration were scored. MSCs were labeled by transfection method. Placement of MCSs into the lungs was illustrated through immunohistochemistry methods.Results and Conclusion: Rats? weight decreased significantly in hyperoxic groups when compared with normoxic groups on the 10th day (p<0,001). Rats? weight of hyperoxic groups reached up to the normoxic groups? on the 57th day. There was no statistically significant difference between the groups? weight on the 57th day (p=0,086).Lung weight increased significantly in both ?hyperoxia-exposed, placebo-administered? group and the ?hyperoxia-exposed, medium-administered? group when compared with the normoxia group (p=0,006 and p=0,0037 respectively). Compared to other hyperoxic groups, lungs? weight of MSCs-administered group showed some decrease.In hyperoxic groups, the number of alveoli increased only in the MSCs-administered group and there was no statistically significant difference when compared with the normoxia group (p=0,126). The numbers of alveoli in plasebo-administered, medium-administered and vehicle-administered groups? were significantly decreased when compared with the normoxia group (p=0,003, p<0,001 and p=0,015 respectively). Administration of MSCs increased the number of alveoli in rats exposed to hyperoxia.Alveoli diameter increased significantly in ?hyperoxia exposed, placebo-administered? and ?hyperoxia exposed, medium-administered? groups when compared with the normoxia group (p=0,012 and p<0,001 respectively). On the other hand, the diameter of alveoli significantly decreased in MSCs-administered and vehicle-administered groups; and no statistically significant difference was observed when compared with the normoxia group (p>0,05). Administration of MSCs or vehicle decreased the diameter of alveoli in rats exposed to hyperoxia.Development of first degree edema in lungs in MSCs-administered group was less than other hyperoxic groups. There was no statistically significant difference between groups regarding development of congestion or leukocyte infiltration.Expression of ?-SMA decreased significantly in MSCs-administered and vehicle-administered groups when compared with the placebo-administered group (p=0,002).The green fluorescent protein (GFP) (+) cells in the lung tissue were encountered in all labeled MSCs-administered groups. The group, where lungs were removed at the end of first week after 10-day hyperoxia exposure, had the most GFP (+) cells; as time progressed the count of labeled cells decreased. Some GFP (+) MSCs did also exhibit expression of surfactant protein-C (SP-C) indicating that some of the MSCs settled in lungs transformed to type II alveolar epithelial cells and produced surfactant.In conclusion, administration of MSCs improved lung histopathology in experimental hyperoxic lung injury model in neonatal rats. MSCs were also placed in the damaged lung tissue and transformed to alveolar epithelial cells.Key words: Lung injury, hyperoxia, mesenchymal stem cell, bronchopulmonary dysplasia