Kolinesterazlarda yapı-katalitik etki ilişkisinin triarilmetan ve fenoksazin yapılı ligandlar aracılığıyla araştırılması
The study of structure-effect relations in cholinesterases by use of triarylmethane and phenoxazine dyes
Yazar: ZEKİYE TUBA TÜYLÜ KÜÇÜKKILINÇ
Danışman: PROF. DR. NAZMİ ÖZER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Asetilkolinesteraz = Acetylcholinesterase ; Boyama maddeleri = Coloring Agents ; Butirilkolinesteraz = Butyrylcholinesterase ; Kolinesteraz inhibitörleri = Cholinesterase inhibitors ; Kolinesterazlar = Cholinesterases ; Ligandlar = Ligands ; Metilen mavisi = Methylene blue ; Nil mavisi = Nile blue ; İnhibitör aktivitesi = Inhibitor activity

Özet:
Triarilmetan (pararozanilin (PR), malakit yeşili (MG) ve metil yeşili (MeG)), fenoksazin (meldola mavisi (MB), nil mavisi (NB)) ve fenotiyazin (metilen mavisi (MetB)) yapılı bileşiklerin insan plazma bütirilkolinesterazın (BChE) ve yılanbalığı asetilkolinesteraz (eAChE) aktivitesi üzerindeki inhibitör etkileri, 25°C'de, 50 mM MOPS (pH 8), 0.125 mM 5, 5'-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit), 0.05-0.4 mM bütiriltiyokolin (BTC) ve asetiltiyokolin (ATC) ve 0-25 uM ligand içeren ortamda, spektrofotometrik olarak araştırıldı. MG ve PR, insan plazma bütirilkolinesterazı üzerinde lineer karışık tipte inhibitör etki gösterirken ( MG: Ki = 0.28 ± 0.037 uM, a = 23 ± 7.4 ; PR: Ki = 1.9 ± 0.23 uM, a = 13 ± 4.8) , MeG kompetitif tipte inhibisyona yol açtı (Ki = 0.12 ± 0.017 uM). MB, NB ve MetB ise, aynı enzim üzerinde nonlineer inhibisyona neden oldu ve çoklu bağlanma olduğu düşünüldü. Sırasıyla Ki değerleri MB, NB ve MetB için; 0.64 ± 0.05uM; 0.085 ± 0.026 uM; 0.42 ± 0.04 uM'dı. Çalışılan tüm ligandlar, karşılaştırma yapmak amacıyla yılanbalığı asetilkolinesterazı üzerinde denendi. Tüm bileşikler, mekanizma açısından benzerlik göstererek eAChE'ı lineer- veya düşük b değerli hiperbolik-karışık tipte inhibe ettiler. MG ve PR lineer inhibisyona yol açarken (MG: Ki = 1.9 ± 0.51 uM, a = 4.8 ± 1.8; PR: Ki = 8.4 ± 0.67 uM, a = 5.8 ± 2.0) ; hiperbolik karışık inhibisyona neden olan MeG, MB, NB ve MetB için inhibisyon parametreleri sırasıyla Ki = 0.27 ± 0.017 uM, a = 2.7 ± 0.32, b = ? 0.20 ± 0.011; Ki = 0.035 ± 0.010 uM,a= 1.9 ± 0.37, b = 0.28 ± 0.080; Ki = 0.026 ± 0.0034 uM, a = 2.4 ± 1.1, b = ? 0.18 ± 0.014'dü. Ligandların BchE ve eAChE'e olan farklı ilgileri ve inhibisyon mekanizmalarındaki değişikliğe enzimlerin aktif bölge oyuğu ve periferal anyonik bölgelerindeki (PAB) farklılıkların neden olduğu düşünüldü.

Abstract:
The inhibitory effects of triarylmethane [pararosaniline (PR), malachite green (MG), methyl green (MeG)], phenoxazine [meldola blue (MB), nile blue (NB)] and phenothiazine [methylene blue (MetB) compounds on human plasma cholinesterase (BChE) and eel acetylcholinesterase (eAChE) were examined spectrophotometrically at 25°C in the assay mixture containing 50 mM MOPS buffer (pH 8), 0.125mM 5,5?-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), 0.05-0.4mM butyryltiocholine (BTC) and asetylthiocholine (ATC) and 0-25 µM ligand. MG and PR caused linear mixed type inhibition on human plasma cholinesterase ( MG: Ki = 0.28 ± 0.037 uM, a = 23 ± 7.4 ; PR: Ki = 1.9 ± 0.23 uM, a = 13 ± 4.8) , while MeG resulted in competitive inhibition (Ki = 0.12 ± 0.017 uM). MG, NB and MetB caused nonlinear inhibition suggesting cooperative binding at two sites. Ki values for MG, NB and MetB were 0.64 ± 0.05 uM; 0.085 ± 0.026 uM; 0.42 ± 0.04 uM respectively. Ligands were also tested on eel acetylcholinesterase for comparison. All compounds showed linear or low b ? valued hyperbolic mixed type inhibition an eAChE with similar mechanisms. MG and PR caused linear mixed type inhibition (MG: Ki = 1.9 ± 0.51 uM, a = 4.8 ± 1.8; PR: Ki = 8.4 ± 0.67 uM, a = 5.8 ± 2.0) ; while MeG, MB, NB and MetB acted as hyperbolic mixed type inhibitors with parameters Ki = 0.27 ± 0.017 uM, a = 2.7 ± 0.32, b = ? 0.20 ± 0.011; Ki = 0.035 ± 0.010 uM, a = 1.9 ± 0.37, b = 0.28 ± 0.080; Ki = 0.026 ± 0.0034 uM, a =1.8 ± 0.21, b = 0.15 ± 0.006 ve Ki = 0.017 ± 0.0063 uM, a = 2.4 ± 1.1, b = ? 0.18 ± 0.014 respectively. Variety in inhibition mechanisms and affinities of the ligands to BChE and eAChE were thought to be originate from the differences at the active site gorge and peripheral anionic site (PAB) of the enzymes.