Lipopolisakkaritle oluşturulan nöroinflamasyon modelinde pro-inflamatuar sitokinlerin ve yolaklarının glia limitans üzerine etkileri
The effects of lipopolysaccharide induced pro-inflammatory cytokines and their pathways on glia limitans in mice neuroinflammation model
Yazar: İLKAN TATAR
Danışman: PROF. DR. MÜGE YEMİŞCİ ÖZKAN ; PROF. DR. YASEMİN ÖZDEMİR
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Nörolojik ve Psikiyatrik Temel Bilimler Ana Bilim Dalı / Temel Nörolojik Bilimler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Nöroloji = Neurology
Dizin: Glia limitans = Glia limitans ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Mikroskopi-elektron = Microscopy-electron ; Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases ; Sitokinler = Cytokines ; Tümör nekroz faktörü-alfa = Tumor necrosis factor-alpha ; İnterleukin 6 = Interleukin 6 ; İnterlökin 1 = Interleukin 1

Özet:
Nöroinflamasyon (Nİ) merkezi sinir sistemi (MSS)'ne özgü, herhangi bir hasara veya şiddetli uyarana maruziyet sonucu esas olarak mikroglia ve astrositlerin inflamasyon benzeri cevaplarıyla oluşan karmaşık hücresel ve hücreler arası ilişkileri içeren bir süreçtir. Nörodejeneratif (ND) hastalıklar, travmatik beyin hasarı, inme ve nöropatik ağrı gibi pek çok hastalığın etyopatogenezinde rol oynadığı düşünülmektedir. Nİ'de aktive olan mikroglialar ve astrositler pek çok potansiyel nörotoksik kemoatraktan molekülün ve sitokinlerin ifadelerini arttırırlar. Nöral dokunun en dış tabakası olan, astrosit son ayakları ile vasküler yapıları çevreleyen parenkimal bir bazal membrandan oluşan glia limitans (GL), küçük moleküller ve hücrelerin beyin parankimine doğru olan hareketlerinin denetlenmesinde modifiye bir kan-beyin bariyeri gibi rol alır. Diğer dokularda organ parenkimi ile onu çevreleyen adventia tabakası arasındaki ilişki çalışılmış ve nöral dokuda bu ilişkinin adventia'dan (beyin zarları ve GL) parenkime olan yönü incelenmiş olmasına karşın, kronik Nİ'da önemli olduğunu düşünülen parenkimden adventisya'ya doğru olan etkileri çalışılmamıştır. Bu tez çalışmasında, intraserebroventriküler (İSV) lipopolisakkarit (LPS) ile indüklenen Nİ fare modelinde -ND hastalıklardakine benzer ama farklı olarak- hiperakut dönemde (2. ve 4. saatlerde) pro-inflamatuar sitokinler (İnterlökin 1 beta - IL1β, İnterlökin 6 - IL6, Tümör nekrosis faktör alfa - TNFα) ve reseptörleri (tümör nekrosis faktör reseptörü 1, 2 - TNFR1, TNFR2, interlökin 1 reseptörü 1 - IL1R1), moleküler (Western blotlama) ve görüntüleme (immünohistokimyasal işaretlemeler, aşırımlı (transmission) ve immunogold elektron mikroskopi) yöntemleriyle ilk defa GL'nin hem perivasküler (GLp), hem de teknik zorluklar nedeniyle daha zor görüntülenebilen süperfisiyal (GLs) kısımlarında araştırılmıştır. İSV LPS ile indüklenen Nİ farede modelinde 2. ve 4. saatlerde astrositik son ayaklarda şişme, bu yapıların distal kutuplarına doğru enerji kullanımının artışını destekleyen sinsityal oluşum gösteren mitokondriyonlar aşırımlı elektron mikroskobu (TEM) ile görüntülenmiştir. Aktive olan astrositlerden salgılanacak olan sitokinleri içeren veziküller TEM, veziküllerin sitokin içeriği ise TEM immünogold tekniği ile izlenmiştir. İmmünohistokimya (İHK) görüntülemelerinde aynı saatlerde astrositik aktivasyona uygun olarak IL1β yüzeyel kortikal alanlarda daha çok bulunan yüzey bağlantılı astrositlerin hem GLs'de, hem de parankime doğru inen kısımlarında gözlenmiştir. GLp'de astrosit son ayaklarının perivasküler yerleşimlerine uygun olarak aktivite artışı saptanmıştır. TNFα hem GLs hem GLp'de noktasal, sitoplazmik ve yaygın olarak gözlenmiştir. IL6 ise hem inflamatuar hem nöroprotektif özelliklerinden ve muhtemelen diğer 2 sitokine göre biraz daha geç ve az ifade edilmesinden dolayı GL'de belirgin bir paternde görüntülenememiştir. IL1R1, IL1β dağılımına benzer şekilde hem GLs hem de GLp'de izlenmiştir. Nİ'nun 4. saatinde, farelerin GL'sini içeren yüzeyel kortekslerinde Western blotlama ile IL6 ve IL1β'nın anlamlı olarak arttığı saptanmıştır. Bu bulgular, İSV LPS ile indüklenen Nİ'nin erken döneminde astrositlerde ve GL'de inflamatuar değişikliklerin ortaya çıktığını ve ND hastalık süreçlerinde astrositlerin de önemli olduğunu düşündürmektedir.

Abstract:
The term Neuroinflammation (NI) that is unique for Central Nervous System (CNS), defines a process that includes complex cellular and intercellular relationships. The inflammatory responses of microglia and astrocytes formed after damage or intensive stimulus might fortify the effects of acute injury or contribute to activation of neurodegenerative mechanisms. Microglia and astrocytes activated by NI increase the expression of many potential neurotoxic chemo-attractant molecules and cytokines. Glia limitans (GL) is the outermost layer of cortex and is formed by astrocytic end feet and basal membrane surrounding vascular structures, thereby functioning like modified blood-brain barrier for the regulation of the movement of small molecules and cells to the brain parenchyma. Although the relationship between neural tissue and its adventia layer was investigated in other tissues, the similar interaction between the brain parenchyma and its adventia layer, which is composed of GL and meninges, is not studied. In this study, we investigated the expression of pro-inflammatory cytokines (Interleukin 1 beta - IL1β, Interleukin 6 - IL6, Tumor necrosis factor alfa - TNFα) and their receptors (tumor necrosis factor receptor 1, 2- TNFR1, TNFR2, interleukin1 receptor1- IL1R1) in both superficial and perivascular GL, in a mice model of neuroinflammation induced by bacterial lipopolysaccharide (LPS) in 2th and 4th hour. We used molecular (Western blotting) and imaging (immunohistochemistry, immuno-gold and transmission electron microscopy) techniques. Swelling on the astrocytic end feet as an indicator of NI and syncytial mitochondria supporting increased energy demand on the distal poles of these structures were seen with transmission electron microscopy (TEM) images in intracerebroventricular (ICV) LPS induced NI mice model. Vesicles filled with cytokines, which were ready to be secreted from activated astrocytes, were visualized by TEM and immune-gold TEM. IL1β were determined in GLs of surface associated astrocytes and descending parts, directed towards parenchyma, which mainly found in superficial cortical areas, fitting the astrocytic activity occurred at the same time period of immunocytochemistry findings. TNFα visualized as patchy, cytoplasmic and diffuse both in GLs and GLp. IL6, which has both inflammatory and neuroprotective features and maybe secreted later and less than other two cytokines, could not be visualized in a distinct pattern on GL. IL1R1 were detected in both GLs and GLp with the distribution resembling IL1β. Western blotting of GL of mice containing the superficial cortex showed a significant increase of IL6 and IL1β at the 4th hour of NI. These findings indicate that, inflammatory changes occur in astrocytes and GL at the hyper-acute period of ICV LPS induced NI and is thought that astrocytes are important for processes of neurodegenerative diseases.