Akciğer adenokarsinomlarında ros1 mutasyonunun floresan in situ hibridizasyon ve immünohistokimyasal yöntemlerle tespit edilmesi
Determination of ros1 mutation in lung adenocarcinomas by fish and immunohistochemical methods
Yazar: ÖZLEM KARA
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM CANÖZ
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Giriş ve Amaç: Akciğer kanseri dünya genelinde kanser bağımlı ölümlerin en sık sebebidir. Akciğer kanserinin en önemli sebebi sigara olsa da, akciğer kanseri yaşamları boyunca sigara içmemişlerde de görülmektedir. Bu vakaların %70'i adenokarsinom olup, moleküler sınıflaması nedeniyle ayrı bir antite olarak kabul edilmektedir. Son gelişmelerle, hedefe yönelik tedavi onkolojide temel yön gösterici haline gelmiştir. Erlotinib gibi EGFR tirozin kinaz inhibitörlerinin ve crizotinib gibi ALK tirozin kinaz inhibitörlerinin başarısı, tedavinin genetik olarak uygun hasta popülasyonuyla eşleşmesine bağlıdır. Dolayısıyla küçük hücre dışı akciğer kanserinde gen mutasyonlarının hızlı ve etkin tespit edilmesi daha da önemli hale gelmiştir. ROS1 reseptör tirozin kinaz geninin kromozomal yeniden düzenlenmesi, küçük hücre dışı akciğer kanserlerinin yakın zamanda tanımlanmış bir alt grubudur. Akciğer kanserli hastalarda ROS1 yeniden gen düzenlenmesinin tespit edilmesi, bu hasta grubunun hedef tedaviden fayda görmesine imkan tanımaktadır. 
Çalışmamızda akciğer adenokarsinomlu hastalarda ROS1 mutasyonu tespit edilmesinde daha kolay ve daha az maliyetli bir metot olan immünohistokimya (İHK) ile Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH) yöntemini kıyaslamayı amaçladık.
Materyal ve Metot: EÜTF patoloji bölümünde 2010-2015 yılları arası tanı alan 112 akciğer adenokarsinomu olgusu çalışmaya alındı. Çalışma için hastaların tümörlü parafin blokları kullanıldı. Parafin bloklardan elde edilen kesitlere ROS1 D4D6 klonu belirteci immünohistokimyasal olarak boyandı. Sitoplazmik boyanan hücrelerin yüzde oranı (yaygınlık) ve boyanma şiddeti (yoğunluk) birlikte değerlendirilerek, H-skoru hesaplandı. H-skoru 0'ın üstünde olan 24 ve H-skoru 0 olan 10 olmak üzere toplamda 34 vakaya FISH uygulandı. FISH yöntemi ile İHK yönteminin ROS1 yeniden gen düzenlenmesini tespit etmedeki korelasyonu kappa uyum testi ile değerlendirildi. ROS1 mutasyonunu saptamada altın standart olarak kabul edilen bir yöntem olan FISH'e göre İHKnın pozitif ve negatifleri ayırmak için optimum H-skore cut-off değerinin belirlenmesinde ROC (receiver operating characteristics) analizi kullanıldı.  ROS1 pozitifliğinin cinsiyet, sigara içme durumu, evre, tümör histolojik alt tipi, lenfovasküler invazyon durumu, plevra invazyonu durumu gibi kategorik verilerin karşılaştırmalarında Pearson χ2 analizi kullanıldı. Yaş ile ilişkisini araştırmak için Mann-Whitney U testi uygulandı Anlamlılık düzeyi p<0.05 olarak kabul edildi.
Bulgular: FISH ile ROS1 pozitif 7 vakanın yaş ortalaması 45.7 olup ROS1 pozitifliğiyle yaş arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulunmuştur (p=0.038). 7 vakanın 6'sı (%85.7) kadın, biri (%14.3) erkek olup istatistiksel analizlerde ROS1 pozitifliğiyle cinsiyet arasında anlamlı ilişki bulunmamıştır (p=0.104). Bir vakada (%14.3) sigara öyküsü mevcutken diğer 6 vakada (%85.7) sigara öyküsü bulunmamaktadır. Ancak istatistiksel analizlerde ROS1 pozitifliğiyle sigara öyküsü arasında anlamlı ilişki bulunmamıştır (p=0.088). Vakalardan  biri (%14.3) evre II, biri (%14.3) evre III, 5'i (%71.4) evre IV idi. İstatistiksel olarak klinik evre ile ROS1 pozitifliği arasında anlamlı ilişki bulunmadı (p=0.127). Histopatolojik olarak iki vaka (%28.6) solid, iki vaka (%28.6) asiner, bir vaka (%14.3) müsinöz, bir vaka (%14.3) kribriform, bir vaka (%14.3) papiller paternde idi. İstatistiksel olarak histopatolojik alt tip ile ROS1 pozitifliği arasında anlamlı ilişki bulunmadı (p=0.427). Vakalardan biri lobektomi olup bu vakada damar invazyonu ve plevra invazyonu mevcut değildi. Üç vaka transtorakal iğne biyopsisi iki vaka metastatik lenf nodu biyopsisi, bir vaka metastatik beyin dokusu eksizyonu olup bu vakalarda damar invazyonu ve plevra invazyonu değerlendirilememiştir. ROS1 pozitifliğiyle damar invazyonu (p=1.0) ve plevra invazyonu (p=0.471) arasında anlamlı ilişki bulunmamıştır.
İHK uygulanan 112 vakada, H-skoru 17 vakada 0-50, iki vakada 50-100, iki vakada 100-200, üç vakada 200-300 arasındaydı, 88 vakanın H-skoru ise sıfırdı. H-skoru 80'in üstünde olan 7 vakada FISH ile ROS1 pozitif bulundu (duyarlılık %100, özgüllük %100) ve H-skoru limiti 80 alındığı durumda istatistiksel olarak FISH pozitifliği ile güçlü ilişkisi olduğu görüldü (p<0.001).
Sonuç: Çalışmamızdaki ROS1 yeniden gen düzenlenmesi pozitif hastalar, negatif hastalara göre daha gençtir. ROS1 pozitifliği ile cinsiyet, sigara öyküsü, evre, tümör histolojik alt tipi, damar invazyonu ve plevra invazyonu arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamsızdır. ROS1 İHK H-skoru 80'in üstünde olduğu vakalarda FISH pozitifliği arasında güçlü bir korelasyon mevcuttur. Sonuç olarak akciğer adenokarsinomu vakalarında ROS1 yeniden gen düzenlenmesi araştırmak için İHK kullanılanarak, H-skoru 80'in üstünde bulunan vakalara FISH uygulanarak zaman ve maliyet kazancı elde edilebilir.

Anahtar kelimeler: Akciğer adenokarsinomu, immünohistokimya, FISH, ROS1

Abstract:
Introduction and Purpose: Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide. Although the majority of cases occur in those with a personal history of tobacco smoke exposure, lung cancer also occur in never smokers. About %70 of never smokers have adenocarcinoma. Lung cancer in never smokers is regarded as a distinct disease entity with a distinct molecular subclassification. Recent advances with targeted therapies have led to a major paradigm shift in onkology. The success of epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors (TKIs), such as erlotinib and, more recently, the ALK/MET TKI crizotinib, highlights the need to match targeted therapies to the appropriate genetically defined patient population. Thus, rapid and efficient identification of key driver genes in non-small-cell lung cancer (NSCLC) is becoming increasingly important. Chromosomal rearrangements involving the ROS1 receptor tyrosine kinase gene have recently been described in a subset of non-small-cell lung cancers. Identification of ROS1 rearrangements in patients with lung cancer allows them to benefit from targeted therapy. 
We compared immunohistochemistry (IHC) which is more easy and more inexpensive method with FISH (fluorescence in situ hybridization) for identification of ROS1 rearrangements in patients with lung adenocarcinoma.
Materials and methods: 112 lung adenocarcinoma cases got into study which got diagnosis between 2010 and 2015 in the Pathology Department of the Medical Faculty of Erciyes University. Paraffin blocks with tumor were used for study. Immunohistochemical D4D6 marker was performed for thick-cuts getting from parafin blocks. Immunostained slides were scored using the H-score method, which is based on the percentages of cells stained with intensities. FISH were performed 34 cases; 24 cases which H-score were >0 and 10 cases which H-score is 0. Kappa test was used for measure agreement between ROS1 FISH and ROS1 immünohistochemistry. ROC (receiver operating characteristics) analysis was used for determination the value of immunohistochemicaly H-skore cut-off to distinguish positive from negative specify according to the FISH, which is considered to be the gold standard method for determine ROS1 rearrangement. Chi-square test was used for for measure agreement between ROS1 rearrangement and categorical data (like sex, cigarette smoke, clinical stage, histopathological subtype, lymphovascular invade and pleural invade). Mann-Whitney U test was used for for measure agreement between ROS1 rearrangement and age. We accepted significant the result when p<0.005.
Results: Median age of 7 cases which positive with FISH was 45.7 and statistically significant difference was found between ROS1 positivity and age (p=0.038). 6 of 7 (%85.7) cases were female, one of them (%14.3) was male but statistically significant difference was not found between ROS1 positivity and sex (p=0.104). one of 7 case (%14.3) was smoker, 6 of them (%85.7) were never smoker. But statistically significant difference was not found between ROS1 positivity and smoking history (p=0.088). One of 7 case (%14.3) was stage 2, one of 7 cases (%14.3) was stage 3, 5 of 7 events was stage 4 (%71.4). Statistically there was no significant difference between ROS1 positivity and clinical stage (p=0.127). Histologically; two of them (%28.6) were solid, two of them (%28.6) were acinar, one of them (%14.3) was mucinous,  one of them (%14.3) was cribriform, one of them (%14.3) was papillary. Statistically significant difference was not found between ROS1 positivity and histological subtypes (p=0.427). One of 7 cases was lobectomy and there wasn't lymphovascular invasion and pleural invasion in this patient. Lymphovascular invasion and pleural invasion were inevaluable the other 6 cases; because of three of them were transthorascic lung biopsy, two of them were metastatic lymph node biopsy, one of them was metastatic brain tissue. Statistically there was no significant difference between ROS1 positivity and lymphovascular invasion and pleural invasion (p=0.471).
17 of 112 cases H-skore were between 0-50, two of them H-skore were between 50-100, two of them H-skore were between 100-200, three of them H-skore were between 200-300. 88 events H-skore were 0. 7 cases that H-skore of more than 80 were positive with FISH (sensitivity %100 and specificity %100). There is statistical significant relationship when the criteria were defined as H-score of 80 or more with FISH.
Conclusion: In this study, ROS1 positive patients more younger than ROS1 negative patients. Statistically there was no significant difference between ROS1 positivity and sex, cigarette smoking, clinical stage, histopathological subtype, lymphovascular invasion and pleural invasion. There is statistical significant relationship When the criteria were defined as H-score of 80 or more with FISH. As a result, we can gain time and cost by using immunohistochemistry and using FISH when H-score 80 or more, for search ROS1 rearrangement in cases with lung adenocarcinoma.

Keywords: Lung adenocarcinoma, immunohistochemistry, FISH, ROS1