Klinik analizlere yönelik aptamer tabanlı elektrokimyasal biyosensör tasarımı
Aptamer based electrochemical biosensor design for clinical analysis
Yazar: EZGİ KIVRAK
Danışman: PROF. DR. PINAR KARA KADAYIFCILAR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomedikal Teknolojiler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyosensörler = Biosensors

Özet:
Bu çalışmada, kanser hücresi tayinine yönelik aptamer tabanlı bir nanobiyosensör tasarımı yapılmıştır. Sensör yüzeyleri olarak elektroeğirme yöntemiyle oluşturulmuş iletken PAN (poliakrilonitril) ve PPy (polipirol) kompozit nanofiberleri geliştirilmiştir. Aptamer ile modifiye edilmiş nanofiber sensör yüzeyleri model hücre olarak kullanılan A549 akciğer kanser hücresinin tayinine olanak sağlamıştır.
Çalışmada tek kullanımlık grafit elektrotlar (PGE) kullanılmıştır. Elektrot yüzeyinde oluşturulan nanofiberlerin (NFPGE) nitril gruplarını karboksil gruplarına çevirmek için elektrot bir NaOH sulu çözeltisi ile kısmen hidroliz edilmiştir. Aptamer dizisi, karbodimid (kovalent bağlanma) kimyası aracılığıyla fonksiyonelleştirilmiş nanofiber modifiyeli elektrot (f-NFPGE) yüzeyine tutturulmuştur. Kanser hücrelerinin 37.5 oC sıcaklıkta aptamer modifiye edilmiş elektrot yüzeyi ile olan etkileşimi, 5mM [Fe(CN)6]3-/4- varlığında Elektrokimyasal Empedans Spektroskopisi (EIS) yöntemi ile izlenmiştir.
Tasarlanan aptasensörün seçiciliği HeLa hücreleri kullanılarak sağlanmıştır. Aptasensörün en uygun çalışma koşullarının belirlenmesi için optimum aptamer ve hücre konsantrasyonları ve yıkama zamanı koşulları optimize edilmiştir. Belirlenen optimum koşullar altında tasarlanan sensörün seçiciliği sırasıyla, biyolojik tanıma molekülü olarak başka hedefe özgül aptamer ve hedef molekül olarak deforme olmuş hücreler kullanılarak doğrulanmıştır.
Kanser teşhisinde kullanılan diğer yöntemlere kıyasla hızlı teşhis imkanı sunan düşük maliyetli bir aptasensör geliştirilmiştir. Ayrıca tek kullanımlık elektrot sistemi ile bir mikrçip tasarmının temeli olduğu kanıtlanmıştır.Yapılan çalışmada tayin limiti 3.41 hücre/mL olarak hesaplanmıştır ve tasarlanan aptasensörün yüksek hassasiyette tayin yapabildiğini göstermiştir.

Abstract:
In this work, an aptamer-based nanobiosensor for cancer cell detection was developed. A composite nanofiber that consists of conductive PAN (polyacrylonitrile) and PPy (polypyrrole) polymers were used as sensor surfaces. The aptamer modified nanofiber sensor surfaces allowed the determination of the A549 lung cancer cell used as the model case.
Disposable pencil graphite electrodes (PGE) were used as a working electrode. Nanofibers were electrospun directly onto PGE surfaces in order to obtain nanofiber modified electrodes (NFPGE) for the first time. The NFPGE electrode was partially hydrolyzed with a NaOH aqueous solution to convert the nitrile groups of the nanofiber into carboxyl groups. Aptamer sequence was immobilized onto functionalized-NFPGE (f-NFPGE) surface covalently via carbodiimide chemistry. The binding of cancer cells onto Aptamer/ f-NFPGE surfaces at 37.5 oC were monitored by Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) transduction of the Rct in the presence of 5mM [Fe(CN)6]3-/4-.
The designed aptasensor's selectivity was performed by using HeLa cells. Optimization of the aptasensor's performance was performed by the detection of optimum probe and target concentrations and washing time conditions. Under the optimized conditions, the selectivity was further investigated by using non-specific aptamer as a recognition molecule and deformed cells as target molecules, respectively.
The developed aptansor is related to a low–cost and fast detection methodology in comparison to other cancer monitoring techniques. On the other hand disposable electrode system technique proved applicability of the system to microchip technology. With the detection limit of 3.41 cell /mL shows that the designed aptasensor is capable to perform a highly sensitive detection.