Deneysel nekrotizan enterokolit hücre kültürü modelinde resveratrolün intestinal mukozal hücre üzerindeki koruyucu etki ve mekanizmalarının belirlenmesi
Determining the protectve effects of resveratrol on intestinal mucosa in an experimental cell culture necrotizing enterocolitis model
Yazar: SİBEL TİRYAKİ
Danışman: PROF. DR. ORKAN ERGÜN
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Çocuk Cerrahisi = Pediatric Surgery
Dizin: Bağırsaklar = Intestines ; Enterokolit = Enterocolitis ; Hücre kültürü = Cell culture ; Hücreler = Cells ; Mukozalar = Mucous membrane ; Restitüsyon = Restitution ; Resveratrol = Resveratrol

Özet:
Bu çalışmada nekrotizan enterokolitte (NEK) resveratrol ile suplementasyonun intestinal mukoza hasarı ve restitüsyonu üzerine sonuçlarının ve etki mekanizmalarının belirlenmesi amaçlanmıştır. 
NEK, prematüre infantta enteral beslenme ve mikrobiyal antijenler tarafından aktive olan barsak kökenli mukozal immun sistemin neden olduğu sistemik inflamatuar yanıt ile karakterize, ince barsak ve kolonun sınırlı mukozal harabiyetinden total nekroza kadar değişebilen bir spektrum içinde iskemisidir. Aktive olan mukozal immun sistem sonucu proinflamatuar sitokinlerin (Tümör nekroz faktörü-alfa [TNF-?], interlökin 1-beta [IL-1ß], nitrik oksit [NO], platelet aktive edici faktör [PAF] vb) ve siklooksijenaz 2 (COX-2), indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) gibi enzimlerin salınımı artar. Inflamatuar sitokinler hücre hasarı oluşturarak enterosit apopitozuna, bunun neticesinde mukozal bariyer bütünlüğünün bozulmasına, bakteriyel translokasyona ve sonuçta sepsis gelişmesine neden olur. Ayrıca intestinal mukoza hücrelerinin yüksek  migrasyon yeteneği, dolayısıyla tetiklenen apoptoz sonucu oluşan çıplak sahaların onarımı bozulmaktadır. Sonuç olarak, bu hastalıkta intestinal mukozal bariyer bütünlüğünün korunması ve oluşan hasarın hızla onarılması hastalık sürecinin kısaltılması ve komplikasyonlarının önlenmesinde kritik önem taşımaktadır [a]. 
İntestinal epitel hücreleri üzerindeki koruyucu etkilerinin araştırılmış olan resveratrol serbest radikal giderici ve hücre siklusunda anahtar enzimler üzerinde modülatör etki gösteren bir ajandır. Çeşitli çalışmalarda antioksidan, antiinflamatuar, antimutajenik, vazorelaksan, antiagregan, kemopreventif ve hepatoprotektif etkilerinin olduğu gösterilmiştir [b,c,d].
Kliniğimizde yürütülen hayvan deneyi çalışmasında ise resveratrolün deneysel nekrotizan enterokolit modelinde epitel bütünlüğü ve mukozal bariyerin korunmasına yardımcı olduğu, NEK bulgularını morfolojik olarak engellediği gösterilmiş ve villus epitelinde iNOS enzim düzeyleri çalışılarak intraepitelyal iNOS ekspresyonunu düzenlediği ortaya konmuştur [e].
Önceki çalışmamızdaki deneysel NEK modeli üzerindeki çarpıcı etkisi göz önüne alınarak resveratrolün nekrotizan enterokolitte, hem hücre hasarını tetikleyen birden fazla enzim yolağı, hem de hücre restitüsyonunu sağlayan migrasyon üzerine etkilerinin olduğu hipotezi kurulmuş ve bu çalışmayla bu etkilerin bir kısmının ortaya konulması amaçlanmıştır.
Resveratrolün hücre migrasyonu üzerine etkilerini ortaya koymak amacıyla IEC-6 hücreleri kültür ortamında çoğaltıldıktan sonra deneysel yara oluşturulmuş ve sonrasında hücreler LPS ve sitokinler ile muamele edilmiş, bu muamele daha sonra önceden resveratrol ile muamele edilmiş hücrelerle tekrarlanmıştır. Hücrelerin migrasyon kapasitesi inverte mikroskop altında işaretlenerek alınan fotoğraflarla değerlendirilmiştir. LPS ve sitokin karışımının hücrelerin restitüsyon kapasitesinde azalmaya sebep olduğu, öncesinde resveratrol uygulanmasının bu artışı engelleyebildiği gösterilmiştir.
Resveratrolün etkilerinin belirlenmesi için hücreler değişik dozlarda resveratrol ile muamele edildikten sonra aynı şekilde LPS ve sitokin karışımı ile muamele edilmiş ve enzim ekspresyonundaki değişiklikler değerlendirilmiştir. Yapılan deneylerle LPS ve sitokin uyarısının enterositlerde  indüklenebilir nitrik oksit sentetaz, siklooksijenaz-2, fosforile fokal adhezyon kinaz ekspresyonunu arttırdığı, öncesinde resveratrol uygulanmasının bu artışı engelleyebildiği gösterilmiştir.
Sonuç olarak, resveratrolün indüklenebilir nitrik oksit sentaz ve siklooksijenazı baskılamak yoluyla abartılı inflamasyon yanıtını baskılayarak, hem de fokal adhezyon kinazdaki artışı baskılayarak restitüsyondaki bozulmayı engelleyerek nekrotizan enterokolitten korumada etkin olabileceği söylenebilir.

Abstract:
The aim of this study was to reveal effects of resveratrol suplementation to mucosal injury and restitution in necrotising enterocolitis (NEC).
NEC is a spectrum of ischemia in bowel wall from focal mucosal injury to total ischemia of the whole bowel which is caracterized with a systemic inflammatory response initiated with mucosal immune system and activated by microbial antigens and enteral feeding.  
After stimulation of mucosal immune system, an increase in production of proinflammatory sytokines (Tumour necrosis factor-alfa  [TNF-?], interleukin1-beta [IL-1ß], nitric oxide [NO], platelet activating factor [PAF]) and some inflammatory enzymes like cyclooxigenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) happens. 
Inflammatory cytokines induce cell injury, enterocyte apoptosis, defect in mucosal integrity and therefore bacterial translocation and sepsis.  They also impair restitution and therefore healing of mucosal defects. Therefore, supression of inflammatory cytokines and preserving ability of migration has a critical role for prevention and treatment of this fatal disease.
Resveratrol, is a radical scavenger and a modulator for some fundamental enzymes in cell cycle. Many studies revealed its antioxidant, antiinflammatory, antimutagenic, vasorelaxant, antiaggregant, chemopreventive and hepatopreventive features.
In a former animal study held in our clinic, it was shown to be effective in preservation of mucosal integrity, being able to prevent morphologic changes in NEC and increase in iNOS expression. 
In the light of this study?s findings, it was hypothesized that resveratrol can be effective in some important pathways which induce cell injury and replacement of restitution. 
To reveal effects of resveratrol, IEC-6 culture cells were grown to confluenc, scratch wounds were constructed, application of lipopolysaccharide was used to constitute an experimental necrotizing enterocolitis model. To evaluate migration serial images were taken after application and analysed. LPS and cytokine mixture were found to significantly impair migration and resveratrol was found to prevent this impairment. Nitric oxide synthase-2(iNOS) and cyclooxygenase-2(COX-2) levels were assessed to reveal inflammation. iNOS and COX-2 levels were found to be increased with both LPS and cytokine mixture and levels near control groups were found with resveratrol pretreatment.
In conclusion, resveratrol, being known for the antioxidant and vaso-relaxant features, was found to suppress excessive inflammatory response and help preservation of mucosal integrity in necrotizing enterocolitis by conservation of epithelial restitution.