Sağlıklı kemik iliği donörlerinde granülosit koloni stimüle edici faktörün mezenkimal kök hücre toll-lıke reseptör sunumuna etkisi
The effect of granulocyte colony-stimulating factor on mesenchymal stem cell toll-like receptor in the healthy bone marrow donors
Yazar: TEKİN AKSU
Danışman: PROF. DR. FAHRİYE DUYGU ÇETİNKAYA
Sağlık Bakanlığı / Ankara Çocuk Sağlığı ve Has. Hematoloji Onkoloji Eğt. Arş. Hastanesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Çocuk Hematolojisi Bilim Dalı
Derece: Tıpta Yan Dal Uzmanlık, 2013
Konu: Hematoloji = Hematology

Özet:
Mezenkimal kök hücreler (MKH) hasarlı ve inflamatuvar dokulara hedeflenerek ve immün düzenleyici sitokin, kemokin ve hücre dışı matriks proteinleri salgılayarak doku tamirine katkıda bulunurlar. Ancak; MKH'nin mobilizasyonunu, dokuda toplanmasını, engrafmanını ve akibetini belirleyen mekanizmalar hakkındaki bilgiler yeterli değildir.
Toll-like reseptörler (TLR), doğal immün cevabı başlatan ve özgül immün cevabı yönlendiren reseptör ailesidir. TLR ligand uyarıları, inflamatuvar veya antiinflamatuvar sitokinlerin artışına ve uyarılmış hücrelerin kemotaksisine neden olmaktadır. TLR ligandları ile aktive olan MKH'ler; farklılaşma, mobilizasyon ve göç, çoğalma, toplanma ve immün baskılayıcı fonksiyonlarını değiştirebilmektedirler.
Granülosit koloni stimüle edici faktör (G-CSF), hematopoetik kök hücrelerin mobilizasyonunu, çoğalmasını ve farklılaşmasını uyarır. G-CSF, T hücre ve antijen sunan hücrelerin fonksiyonlarını etkilemekte ve adaptif immün sistemi baskılamaktadır. G-CSF'in sağlıklı insanların immün sistemini nasıl etkilediği konusunda literatürde yeterli bilgi bulunmamaktadır. İmmün düzenleyici ve/veya immün baskılayıcı etkilerinin MKH'ler üzerinden olabileceği düşünülmektedir.
Mezenkimal kök hücrelerin; dejeneratif hastalıklarda, kronik inflamatuvar ve otoimmün hastalıklarda veya allograft rejeksiyonlarında, hücresel bir tedavi şekli olup olmayacağı, güncelliğini korumaktadır. Allojenik MKH tedavileri göz önüne alındığında; MKH fenotipinin G-CSF veya TLR ligandları ile değiştirilebilmesi önem arz etmektedir. TLR yolakları uyarılmış MKH'nin nakledilmesiyle; MKH'nin, hasarlı dokuya dağılımının artırılabileceği ve fonksiyonlarının değiştirilebileceği düşünülmektedir.
G-CSF ile uyarılmış kemik iliğinden izole edilen MKH'lerin TLR ifadelerinde değişiklikler olacağı, bunun da immün sistem/inflamatuvar cevabın yönlendirilmesinde rolü olduğu düşünülerek bu çalışma planlanmıştır. Bu amaçla; dokuz sağlıklı kemik iliği vericisinden elde edilen, G-CSF ile uyarılmış ve dokuz sağlıklı kemik iliği vericisinden elde edilen, G-CSF ile uyarılmamış MKH'ler, in-vitro kültür ortamında çoğaltılmıştır.
Tüm örneklerden, in-vitro kültür ortamında hücreler çoğaltılarak çalışmalar için yeterli sayıda MKH elde edilebilmiş, in-vivo G-CSF uygulamasının MKH'lerin kültürde çoğaltılmasına olumsuz etkisi olmadığı gözlenmiştir. Hücrelerin morfolojik iğsi yapılarının korunduğu, yüzey belirteçleri ile stromal karakter taşıdıkları, adipojenik ve osteojenik farklılaşma kapasitelerinin korunarak MKH karakterizasyonuna ait standart özellikleri taşıdıkları gösterilmiştir. Böylelikle, G-CSF verilmiş sağlıklı insanlarda kemik iliği MKH'lerinin morfolojik, immünfenotipik ve farklılaşma özelliklerinin korunduğu gösterilmiştir.
Kemik iliği kaynaklı insan MKH'lerinin TLR ekspresyonlarının analizi sonucunda TLR 2 ve 4 moleküllerinin düşük oranda ve şiddette (floresan parlaklığı/MFİ-mean floresence intensity), TLR3 reseptörünün ise yüksek oranda ve şiddette ifade edildiği gösterilmiştir. İn-vivo G-CSF uygulanan örneklerde de TLR 2 ve TLR 4'ün düşük, TLR3'ün ise yüksek düzey ve şiddette ifade edildiği gösterilmiştir. Bu durum, kemik iliği kaynaklı MKH'lerin hem bazal durumda, hem de G-CSF ile in-vivo uyarıldıktan sonra TLR aracılı immün cevap ve inflamasyon modülasyon kapasitesine sahip olduğunu düşündürmüştür.
MKH'lerin TLR ligandları ile muamele sonrası TLR eskpresyonlarının incelenmesiyle bu hücrelerde bulunan TLR'nin fonksiyonel kapasitesi hakkında fikir edinilmek amacıyla farklı dozlar ve sürelerde spesifik ligand uyarıları yapılmıştır. MKH'lerde TLR2 ve TLR4 ligandı olduğu bilinen lipopolisakkarit (LPS) ile yapılan in-vitro uyarılar sonucunda zaten düşük oranda ekspresyonu bulunan bu reseptörlerin ligand uyarısı sonucu da ifade düzeylerinde ve şiddetinde önemli bir değişiklik tespit edilmemiştir. Bu durum in-vivo G-CSF uygulanan örneklerde de benzer bulunmuştur. Böylelikle, bazal seviyeleri düşük bulunan TLR2 ve TLR4'ün in-vitro LPS uyarısı sonucunda önemli bir değişiklik göstermemesiyle insan kemik iliği MKH'leri fonksiyonlarında TLR2 ve 4'ün kritik önemi olduğuna dair bulgu gözlenmemiştir. Ancak LPS dışındaki diğer uyaranlarla gözlenebilecek olası cevaplar olabileceği de düşünülmelidir.
Bu çalışmada insan MKH'lerinde yüksek oranda ve şiddette bulunduğu tespit edilen TLR3 uyaranı olarak da polyinosinic-polycytidylic acid (Poly(I:C)) kullanılmıştır. Dört saatlik düşük doz poly(I:C) uygulaması ile MKH'lerin TLR3 reseptör ifadelerinde %67, ifade şiddetinde ise %57 azalma tespit edilmiş, bu durum insan kemik iliği MKH'lerin fonksiyonlarında TLR3 'ün önemine işaret etmiştir. Bu durum, hücre migrasyonu üzerine ilişkisi bilinen TLR3'ün kemik iliği MKH'lerin bu fonksiyonları üzerine katkısını düşündürmüştür. İn-vivo G-CSF uygulanan MKH'lerde de 4 saatlik düşük doz uygulamasıyla TLR3 reseptör ifadesinde %63, MFİ değerinde ise %19 azalma tespit edilmiştir. G-CSF uygulanan MKH'ler ile kontrol grubu arasında TLR3 ligand uyaranına olan cevap arasındaki fark istatistiksel anlamlı bulunmuştur. Bu durum; G-CSF'in MKH'lerin TLR profilini değiştirmese de, TLR uyaranlarıyla oluşan MKH cevabını değiştirebileceğini düşündürmektedir. Önceki çalışmaların sonuçlarına göre, TLR3'ün MKH'lerin migrasyonu üzerinde etkisi olduğu bilinmektedir. Bu çalışma ile TLR3 ligand uyarısı sonucu G-CSF uyarılı olan ve olmayan MKH'ler arasında TLR3 ifadesinde fark saptanması, kemik iliğinden hücre mobilizasyon ve migrasyonunda rolü olduğu bilinen G-CSF'in bu etkisinin TLR3 aracılı olabileceğini veya TLR3'ün katkısı olabileceğini düşündürmüştür. G-CSF'in MKH'lerin TLR profiline etkisi hakkında, ulaşılabilen ingilizce literatür (pubmed, web of science…) tarandığında, karşılaştırma yapılabilecek çalışmaya rastlanılmamıştır. Ayrıca, in-vivo G-CSF'in kemik iliği kaynaklı insan MKH'leri üzerine etkisini inceleyen başka bir çalışmaya da rastlanmamıştır.
İlerleyen çalışmalarda, TLR ligandları ile muamele edilen MKH'lerin kültür mediumunda (supernatant) proinflamatuvar, immün baskılayıcı, mobilizasyon ve invazyonu gösteren belirteçlerin çalışılmasının G-CSF'in TLR-MKH ilişkisine etkisi hakkında ilave bilgiler verebileceği düşünülmüştür. Bu alanda bilhassa TLR3 uyarılması ile yapılacak çalışmaların G-CSF'in en temel biyolojik etkilerinden birisi olan hücre migrasyonu, mobilizasyonunda rolü olan mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına katkı sağlayacaktır. Ek olarak, TLR3 ifadelerinin modülasyonu ile MKH terapötik etkinlikleri artırılabilecektir.

Abstract:
Mesenchymal stem cells (MSCs) home to damaged tissues and contribute to the repair process by secretion of cytokines, chemokines, and extracellular matrix proteins. However, the precise mechanisms governing stem cell fate, mobilization, and recruitment to the sites of engrafment are not fully understood.
Toll-like receptors (TLRs) belong to a family of receptors that promote the activation of innate immunity and appear to regulate adaptive immune responses. TLR agonist stimulation leads to the expression of inflammatory or anti-inflammatory cytokines and promotes chemotaxis of the stimulated cells. MSCs, activated by TLR ligands, lead modulation of the differentiation, mobilization, migration, proliferation, recruitment, and immunosuppression capacities.
Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) induces mobilization, proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells. G-CSF also effects T-cell and antigen presenting cell function and suppresses the adaptive immune system. The mechanisms of G-CSF induced immunomodulation in humans is not clearly defined in the literature. Immunomodulatory or immune suppressive effects of G-CSF may be attributed at least, partially, to its interaction with the MSCs.
MSCs have aroused interest as a new cellular therapy method for degenerative, chronic inflammatory, autoimmune diseases, and allograft rejection. In that context, modulation of the MSCs phenotypes with G-CSF or TLR agonists may be noteworthy in allogeneic MSC therapies. It could be possible to augment MSC functions and recruitment to injured tissue by transplantation of MSCs with stimulated TLR pathways.
The present study aims to study TLR profiles of bone marrow MSCs obtained from nine healthy bone marrow donors exposed to in-vivo G-CSF and to compare them with those of G-CSF untreated controls (n=9) in order to have baseline information to assess the immunomodulatory/inflammatory state to be induced by modulation of TLR expressions.
MSCs were obtained from bone marrow samples and expanded in-vitro to achieve sufficient number of cells for intended studies. In-vivo G-CSF-exposed MSCs were readily expanded as control cells, and their spindle shaped morphology were maintained. In addition, the adipogenic and osteogenic differentiation capacities of G-CSF-exposed cells were preserved as well as the surface markers indicating stromal phenotype.
Bone marrow derived MSCs isolated from healthy human bone marrow showed low TLR2, TLR4 expression and mean florescence intensity (MFI), and high TLR3 expressions and MFI. Similarly, in vivo G-CSF treated MSCs showed low TLR2, 4 expressions and MFI, and high TLR3 expressions and MFI, indicating their susceptibility to TLR mediated modulatory effects in immune and inflammatory responses as the control cells.
MSCs were stimulated by TLR agonists in order to study functional properties of the TLRs. TLR agonists were used in different dosages and period of time. LPS was used as an agonist for TLR2 and TLR4. No significant difference was observed in the steady state levels of TLR2 and TLR4, both in the study and control groups. These results were at least partially attributed to the baseline low levels of these receptors and might indicate that TLR2 and TLR4 have not any crucial importance in regard to MSCs functions. However, it should be kept in mind that MSCs may respond to different agonists other than LPS which were not tested in the present study.
Polyinosinic-polycytidylic acid (Poly(I:C)) agonist was used for TLR3 stimulation, which has showed high expression and MFI in human MSCs.TLR3 expression and MFI of MSCs were decreased as 67% and %57 respectively, by application of low dose agonist for 4 hours. High baseline expression of TLR3 and inducibility with its agonist poly(I:C) is may indicate a role for TLR3 in determination of MSC functions. It may be speculated that TLR3 which is linked with cell migration, may potentially effect migratory function of bone marrow MSCs, thus contributing to hematopoesis and regeneration. TLR3 expressions and MFI of in vivo G-CSF treated MSCs were decreased as 63% and %19, respectively by application of low dose poly(I:C) agonist for 4 hours. These results suggested that G-CSF exposure does not effect MSCs TLR expression and MFI significantly, however it may modulate MSCs response to agonists. The changes in TLR3 expression and MFI after TLR3 ligand stimulation was significantly different between G-CSF treated or untreated MSCs. This finding may suggest a role for TLR3 in G-CSF-induced migration and mobilization from bone marrow. To our knowledge, the present study is novel to study the effect of in-vivo G-CSF on healthy human bone marrow- derived MSCs and their TLR profiles.
Further investigations may reveal the proinflammatory, immune suppressive, migratory and invasive state of TLR agonist and/or G-CSF stimulated MSCs by studying the secretory factors in MSCs supernatants. TLR3 agonist applications to MSCs may enlighten the mechanism of G-CSF mediated cell migration and mobilization. Additionally MSCs therapeutic efficiency may be augmented by TLR3 modulations.