Polifenol oksidaz enziminin miskali üzümünden (Vitis Vinifera L.) saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı gıda katkı maddelerinin enzim aktivitesi üzerine inhibisyon etkilerinin araştırılması
Purification and characterization of polyphenol oxidase enzyme from mi̇skali̇ grape (Vitis Vinifera L.) and investigation of some food additives' inhibition effects on enzyme activity
Yazar: FUNDA BEDER
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ UĞUR GÜLLER
Iğdır Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Karakterizasyon = Characterization ; Polifenol oksidaz = Polyphenol oxidase ; Saflaştırma = Purification ; Üzüm = Grape ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Bu çalışmada Iğdır ilinin yerel bir üzüm çeşidi olan Miskali üzümünden (Vitis Vinifera L.) polifenol oksidaz (PFO) enzimi aseton çöktürmesi ve Sepharose-4B-L-tirosin-p-aminobenzoik asit afinite kromatografisi olmak üzere iki basamakta saflaştırıldı ve enzimin kinetik özellikleri incelendi. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yardımı ile eluatlarda PFO enziminin varlığı tek bir bant halinde ortaya konuldu. PFO'nun substrat özgüllüğü 4-metil katekol, P-Cresol, fenol, katekol, L-Tirozin ve DHPPA substrat olarak kullanılarak belirlendi. Enzimin optimum pH'sı, 4-metilkatekol substratı varlığında 5,0 olarak tespit edildi. PFO'nun substrat olarak kullandığı 4-metilkatekol, katekol ve DHPPA için Michaelis-Menten sabiti (KM) ve maksimum reaksiyon hızı (Vmax) hesaplandı. KM ve Vmax değerleri 4-metil katekol için 3,45 mM ve 2,36 EÜ/mL olarak, katekol için 25,71 mM ve 3,99 EÜ/mL, DHPPA için ise 11,90 mM ve 7,05 EÜ/ml olarak belirlendi. PFO enziminin pH kararlılığı, optimum sıcaklık, optimum iyonik şiddet, enzim aktivitesi üzerine bazı inhibitörlerin (askorbik asit, sodyum metabisülfit, sitrik asit, L-sistein) etkisi gibi özellikleri 4-metil katekol substratı varlığında incelendi. Miskali üzümünden saflaştırılan PFO enziminin stabil pH'sı 6,0; optimum sıcaklığı 10ºC, optimum iyonik şiddeti 50 mM Na-Asetat olarak belirlendi. Dört farklı inhibitör için IC50 ve Ki değerleri ve inhibisyon türleri tespit edildi. Miskali üzümünden saflaştırılan PFO enzimine Askorbik asitin en güçlü inhibitör etkisi gösterdiği tespit edildi.

Abstract:
In this study, polyphenol oxidase (PPO) enzyme from Miskali grape (Vitis vinifera L.), one of the local grape species of Iğdır province, was purified in two steps, as acetone precipitation and Sepharose-4B-L-tyrosine-p-aminobenzoic acid affinity chromatography. The kinetic properties of purified PPO were investigated. In eluates, the presence of PPO enzyme was revealed as a single band with the help of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Substrate specificity of PPO activity was determined by using 4-methyl catechol, P-Cresol, phenol, catechol, L-Tyrosine, and DHPPA as substrates. The optimum pH of the enzyme was found to be 5.0 in the presence of 4-methylcatechol substrate. Michaelis-Menten constant (KM) and maximum reaction rate (Vmax) were calculated for 4-methylcatechol, catechol and DHPPA substrates. KM and Vmax values were determined as 3.45 mM and 2.36 EU/mL for 4-methyl catechol, 25.71 mM and 3.99 EU/mL for catechol, 11.90 mM and 7.05 EU/mL for DHPPA. Some properties of PPO such as pH stability, optimum temperature, optimum ionic strength, the effects of some inhibitors (ascorbic acid, sodium metabisulfite, citric acid, L-cysteine) on enzyme activity were investigated in the presence of 4-methyl catechol substrate. The stable pH of Miskali grape PPO enzyme was determined as 6.0, the optimum temperature was 10ºC, and the optimum ionic strength was 50 mM Na-Acetate. For four different inhibitors, IC50 and Ki values and inhibition types were determined. It was observed that Ascorbic acid showed the strongest inhibitory effect on the Miskali grape PPO enzyme.