Frajil X sendromu tanısında mikronukleus-FISH yöntemi
The application of micronucleus-FISH assay in diagnosis of fragile xX syndrome
Yazar: LEYLA ÖZER
Danışman: DOÇ. DR. HATİCE ILGIN RUHİ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Frajil x sendromu = Fragile x syndrome ; Mikroçekirdek = Micronucleus ; X kromozomu = X chromosome

Özet:
Frajil X sendromu kalıtsal mental retardasyonun en yaygın nedenlerindendir (erkeklerde 1:4000 , kadınlarda 1:7000). Xq27.3'de yerleşik FMR1 geninin 5'UTR bölgesindeki CGG tekrar sayısının artışı sonucu meydana gelmektedir. Frajil X tekrar dizisi hastalıkları içinde ilk tanımlanan ve bu hastalıklar için prototip oluşturan bir hastalıktır. Asıl olarak erkekler hasta olarak gözlenirken, kadın taşıyıcı bireylerin üçte birinde de hastalık gözlenir, ancak bunlardaki mental retardasyonun şiddeti erkeklerden daha düşüktür.Mikronukleuslar hücre mitozda iken metafaz/anafaz geçişi sırasında oluşan küçük , nukleus dışı cisimciklerdir. Hücre stoplazması içinde ana nukleus dışında ancak onunla aynı şekil,yapı ve boyanma özelliği gösteren küçük küresel yapılardır. Mikronukleus bölünen hücrelerde tüm kromozomun/kromatid (anojenik olay sonucu) veya asentrik kromozom/kromatid fragmanının (klastojenik olay sonucu) nukleus dışında kalması sonucunda oluşur. Nükleustaki kromozomal fragmanlar çift zincir DNA kırığı, tek zincirli kırığın çift zincirli kırığına dönüşümü veya DNA sentezinin baskılanması sonucu ortaya çıkar. Bu sebeple mikronükleus testi DNA hasarının ve hasara yanıtın değerlendirilmesinde kullanılan bir testtir. MN ve FISH yöntemlerinin birleştirilmesi ile oluşturulan mikronükleus-FISH yöntemi hasarlı kromozom fragmanlarının kromozoma özgü prob kullanılarak gösterilmesini sağlamaktdır. Bu amaçla DNA hasarı sonucu sitogenetik olarak X kromozomunda frajilitenin ifade olduğu bilinen Frajil X sendromunda, hasta ve normal bireylerin Mikronükleus-FISH bulgularını karşılaştırarak DNA hasarınının değerlendirilmesinde Mikronükleus-FISH yönteminin kullanılabilirliliğini test etmek için bu çalışma planlanmıştır.Bu çalışmaya sitogenetik ve/veya moleküler genetik yöntemlerle Frajil X sendromu tanısı almış 10-17 yaş arası 5 hasta, kontrol grubu olarak da bu hastaların anne ve babaları dahil edilmiştir. Hastalardan ve konrol grubundan alınan kan örneklerinden iki farklı besiyerine ekim yapılarak mikronukleus-FISH yöntemi ile mikronukleus-FISH bulguları karşılaştrılmıştır. Bu besiyerlerinden biri Frajil X sendromunda sitogenetik olarak ifade olan FRAXA'daki frajiliteyi ortaya çıkaran folik asit yoksun besiyeri diğeri ise folik asitli besiyeri olarak seçilmiştir. Hastaların anne ve babalarının kontrol grubu olarak seçilmesinin nedeni ise mikronukleus-FISH yöntemi ile olası premutasyon taşıyıcılarında da anlamlı bir fark oluşup oluşmadığını test edilmesidir.Bulgularımız kontrollerle hasta grubu arasında ve folik asit yoksun ve folik asitli besiyerleri arasında mikronukleus-FISH bulguları açısından anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir. Elde edilen sonuçlar mikronukleus-FISH yönteminin Frajil X sendromunun tanısında ve taşıyıcıların tespitinde uygun bir yöntem olmadığını düşündürmektedir.

Abstract:
Fragile X syndrome (FXS) is is the most common cause of inherited mental retardation (MR)(with a prevalence of 1/4000 in males and with a prevalence of 1/7000 in females) . FXS is caused by the expansion of CGG trinucleotide repeats in the 5?UTR of the FMRI gene on the Xq27.3. In addition, since FXS is the first reported trinucleotide repeat disorder, FXS stands as the prototype of these disorders. Although primarily male are affected by FXS, female carriers exhibit the disease with proportion of 1:3. In female FXS patients the severity of MR is less compare to male FXS patients.Micronuclei (MN) is a small and extranuclear body that arises in dividing cells at the metaphase/anaphase transition. Although MN is located outside the main nucleus in the cytoplasm, it has the same form, structure and staining pattern as the main nucleus. In dividing cells, MNs are formed as a consequence of whole chromosome/chromatide breaks or acentric chromosome/chromatid fragments which are left outside of the main daughter nuclei. The chromosomal fragments in MNs may result from double-stranded DNA breakage, conversion of single-stranded breaks (SSBs) into double-stranded breaks (DSBs) or inhibition of DNA synthesis. As a result of its mechanism, testing for MNs is used for evaluation of DNA damage. The combination of MN and FISH methods (MN-FISH) is used for the demonstration of the damaged chromosome fragments using the probes spesific for these chromosomes. In this study, we compared the MN-FISH method results of five FXS patients and their parents. Since the fragility is cytogenetically expressed on X chromosome in the FXS patients, we aimed to test whether the MN-FISH method is suitable method for the evaluation of DNA damage or not.Five FXS patients who are diagnosed with cytogenetic and/or molecular methods and their parents (as controls) are included to our study. Since folate deficiency induces the fragility at FRAXA, collected heparinised blood samples from two groups were cultured in two different cell culture media (with/without folate) in order to compare the MN-FISH results. Patients?s parents were selected to test whether the MN-FISH method evaluates the significant difference in potential premutation carriers or not.Our MN-FISH results demonstrate no signigicant difference between FXS patients and their parents, the cultures with/without folate. Our method seeems to be noneffective method for the diagnosis of FXS patients and carriers.