LPS indüklü HMC3 mikroglia nöroinflamasyon modelinde Topo IIß gen ifadesinin susturulmasının incelenmesi
Investigation of silencing of Topo IIß gene expression in LPS-induced HMC3 microglia neuroinflammation model
Yazar: MELİKE CANSEL EREN
Danışman: PROF. DR. SEVİM IŞIK
Üsküdar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Nörobilim Ana Bilim Dalı / Nörobilim Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Nöroloji = Neurology
Dizin: DNA Topoizomerazlar = DNA Topoisomerases ; Gen ifadesi = Gene expression ; Mikroglia = Microglia ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases ; Parkinson hastalığı = Parkinson disease

Özet:
DNA topoizomeraz enzimi DNA'nın çift sarmal yapısındaki topolojisinin kontrolü ve korunmasından, olası bir zararın ortadan kaldırmakt etkin role sahiptir enzimdir. DNA replikasyonu, transkripsiyon, rekombinasyon, kromozom yoğunlaşması ve ayrılması, DNA tamiri gibi çeşitli genetik olaylarde etkin ve hayati değer taşır. Memeli hücrelerinde DNA topoizomeraz II (topo II)'nin iki izoformu (topo IIa ve topoIIß) bulunmaktadır. Topo IIα mitotik süreçlerde görev alır ve dolayısıyla çoğalan hücrelerde bulunurken, Topo IIβ ise bütün dokularda özellikle farklılaşmış dokularda bulunur. Ayrıca bazı nöronal genlerin transkripsiyonlarının başlamasını kontrol eder. Topo IIβ aktivitesinin in vivo ve in vitro ortamda baskılanması nöron hücrelerinde akson uzunluğunun kısa olmasına, dentritik dikenlerde hasara ve olası sinaptik bozunmalara sebep olmaktadır. Bu bulgular topo IIβ'nın aksonogenezde ne kadar önemli bir rolü olduğunu göstermektedir. 
Aktif nöral bağlantıların kaybı ve akson dejenerasyonu, nörodejeneratif hastalıklarda görülen ortak özelliklerdir. Nörodejenerasyonun nöron bozunması ayağında topo IIß 'nın etkinliği grubumuzun geçmiş çalışmalarında kanıtlanmıştır. Topo IIβ geni susturulmuş mezenkimal kök hücrelerde, hücreler nöral farklılaşmaya indüklendiğinde  nörodejeneratif hastalıklarla alakalı genlerde artış gözlemlendiği rapor edilmiştir. Yapılan invivo ve invitro Alzheimer modellerinde, Alzheimer sonrası topo IIβ'nın ifade düzeyinde azalma olduğu gözlemlendi. Benzer bir şekilde Parkinson hastalığında da Topo IIß geninin ifadesinin susturulmasının nörit gelişiminde bozulmalara sebep olduğu rapor edilmiştir. 
Nöronlardaki bu etkiler göz önünde bulundurularak bu çalışmada nörodejeneratif hastalıkların bir başka parametresi olan nöroinflamasyon üzerinde durulmuştur. Zira son yıllarda pek çok grubun çalışmaları göstermektedir ki, nörodejeneratif hastalıklarda nöronun çevresini oluşturan mikrogliaların ve dolayısyla nöroinflamasyonun katkısı büyüktür. Kronik ve tekrarlayıcı inflamasyon mekanizmasının doğal sonucu olan hücre yıkım mekanizması nörodejenerasyon ile doğrudan ilişkili görünmektedir. Üstelik nörodejeneratif hastalıklarda nöronlarda mutasyona uğradığı bilinen pek çok genin mikroglialarda da mutasyona uğradığı yapılan çalışmalarca saptanmıştır. 
Mikroglialar iki temel fenotipe sahiptir M1 aktif inflamatuar mikroglilar ve M2 antiinflamatuar koruyucu mikrogalilar. M1 ikroglialar akut inflamasyonda ortaya çıkarak hasar bölgesinde patojene karşı katif savaşırken ,M2 fenotipi bölgeyi koruyan ve tekrar yapılandırn özellikler göstermektedir. Dolayısıyla hücrelerin popülasyonunda ki polarizasyonu doğrudan hastalık sürecini etkilemektedir.
Tüm bunların ışığında bu çalışmada Topo IIß gen ifadesinin susturulmasının inflamasyon sürecine etkisi araştırılması amaçlanmıştır. Topo II ß gen ifadesi susturulmuş HMC3 insan mikroglia hücrelerinde LPS, LPS ve Interferon gama, İnterferon gama ile inflamasyon modeli oluşturulmuştur. Popülasyondaki polarizasyon değerlendirilmiştir. 
Elde edilen sonuçlarda HMC3 mikroglia hücre hattında Topo IIß gen ifadesi başarılı bir şekilde susturulmuş bu durum  m RNA ve protein düzeyinde teyit edilmiştir. Nöroinflamasyon modeli optimize edilerek flow sitometri sayesinde fenotip ayırımı yapılmıştır. CD206 yüzey belirteçine sahip hücreler M2, CD86 ve CD 16 yüzey belirteçlerine sahip olan hücreler M1 olarak işaretlenmiştir. Elde ettiğimiz verilere göre Topo IIß gen ifadesinin susturulması M2 mikroglia fenotipinde artışa, M1 mikroglia tipinde ise azalmaya sebep olmaktadır ayrısca ,kontrol grubuna kıyasla aktif inflamasyonu baskılamaktadır. Bu durum da mikroglialarda Topo II ß gen ifadesinin susturulmasının kronik inflamasyon sürecininin bozunmasına iyileşmeye teşvikte etkin olabileceğini düşündürmektedir. 
Ancak bu fenotip değişimi mekanizması henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu çalışma daha ziyade öncül veri niteliği taşımaktadır. Mikrogliaların immun sistem için birincil önem taşıdığı bilinse de başka pek çok farklı komplemanla birlikte çalışarak (astrositler,oligodentrositler,ependim hücreleri vb) nöron refahini ve hayatta kalımını dolayısyla sinir sistemi hemoastazını sağlamaktadır. Dolayısıyla bu hücreler arasındaki ilişkinin inflamasyon süreçlerine etkisi ve topoIIß bu duruma katkısı daha yakından araştırılmalı. Fenotip değişikliğine hangi yolakların neden olabileceği üzerine çalışılmalı,mitokondrial deformasyonların bu sürece etkisi daha ayrıntılı olarak çalışmalıdır. Bu çalışma bu yolda öncül bir çalışma niteliği taşımaktadır.Bu bağlamda nöroinflamasyon mekanizmanın anlaşılması adına ve olası töropotik hedeflerin anlaşılması adına umut vericidir.

Abstract:
Summary
Investigation of Silencing TopoIIß Gene Expression in LPS Induced HMC3 Microglia Neuroinflammation Model Thesis Summary ,DNA topoisomerases have an active role in controlling and maintaining the topology of DNA in the double-helix structure and eliminating possible damage. DNA replication is effective and vital in various genetic events such as transcription, recombination, chromosome condensation and separation, DNA repair. Mammalian cells have two isoforms of DNA topoisomerase II (topo II) ; topo IIa and topoIIß . Topo IIα is involved in mitotic processes and is therefore found in proliferating cells, while Topo IIβ is found in all tissues, especially differentiated tissues. It also controls the initiation of transcriptions of certain neuronal genes. Suppression of Topo IIβ activity in vivo and in vitro causes short axon length in neuron cells, damage to dendritic spines and possible synaptic degradation. These findings show how important a role topo IIβ has in axonogenesis.
Loss of active neural connections and axon degeneration are common features seen in neurodegenerative diseases. The efficacy of topo IIß in the neuron degradation leg of neurodegeneration has been proven in past studies of our group. In mesenchymal stem cells with the Topo IIβ gene silenced, an increase in genes associated with neurodegenerative diseases has been reported when the cells are induced to neural differentiation. In invivo and invitro Alzheimer's models, a decrease in the expression level of topo IIβ was observed after Alzheimer's. Similarly, in Parkinson's disease, silencing the expression of the Topo IIß gene has been reported to cause impairments in the development of neuritis.
Considering these effects on neurons, this study focuses on neuroinflammation, another parameter of neurodegenerative diseases. In recent years, the studies of many groups have shown that the microglia that form the environment of the neuron and therefore neuroinflammation have a great contribution in neurodegenerative diseases. The mechanism of cell destruction, which is the natural consequence of the chronic and repetitive inflammatory mechanism, seems to be directly related to neurodegeneration. Moreover, it has been determined by studies that many genes known to mutate in neurodegenerative diseases in neurons are also mutated in microglia. Microglia have two basic phenotypes, M1 active inflammatory microglilar and M2 anti-inflammatory protective microgalilar. While M1 icroglia occur in acute inflammation and fight solidly against the pathogen in the damage area, the M2 phenotype shows properties that protect and reconstruct the site. Therefore, the polarization of the cells in the population directly affects the disease process.
In this study, it was aimed to investigate the effect of silencing Topo IIß gene expression on the inflammation process. Topo II ß gene expression was silenced HMC3 human microglia cells with LPS, LPS and Interferon gamma, Interferon gamma to model inflammation. Polarization in the population was evaluated. In the results obtained, Topo IIß gene expression was successfully silenced in the HMC3 microglia cell line and this was confirmed at the m RNA and protein level. The neuroinflammation model was optimized and phenotype discrimination was made thanks to flow cytometry. Cells with the CD206 surface marker were marked M2, while cells with CD86 and CD 16 surface markers were marked as M1. According to our data, silencing the Topo IIß gene expression causes an increase in the phenotype of M2 microglia and a decrease in the M1 microglia type, as well as suppressing active inflammation compared to the control group. This suggests that silencing Topo II ß gene expression in microglia may be effective in promoting healing to the disruption of the chronic inflammatory process. However, this phenotype replacement mechanism has not yet been fully elucidated. This study is rather a preliminary data. Although microglia are known to be of primary importance for the immune system, they work with many other complements to promote neuron well-being and survival, and therefore to promote hemoastasis of the nervous system. Therefore, the effect of the relationship between these cells on inflammation processes and the contribution of topoIIß to this situation should be investigated more closely. The pathways that can cause phenotype change should be studied, and the effect of mitochondrial deformations on this process should be studied in more detail. This study is a pioneering study on this path. In this context, it is promising for the understanding of the mechanism of neuroinflammation and the understanding of possible teropotic targets.