Kolon kanser hücreleri için altın kaplı manyetik yüklü transfeksiyon ajanlarının kullanılması
Use of gold coated magnetically loaded nanoparticles in transfection of colon cancer cells
Yazar: DUYGU DENİZ USTA
Danışman: PROF. DR. ERHAN BİŞKİN ; DOÇ. DR. MUSTAFA TÜRK
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Kanser, hala insanoğlunun ölümüne yol açan en önemli sağlık problemlerinden biridir. Sağlık sektöründeki harcamaların önemli bir kısmı bu alana yapılmaktadır. Kanserin erken tanı ve tedavisine yönelik yapılan çalışma bütçelerinin büyüklüğü konunun önemini kavramada en önemli göstergelerdendir. Tedavide kullanılan cerrahi yöntem, kemoterapi, radyo terapi gibi geleneksel yöntemlerin yanında, bugün artık nanoteknoloji tabanlı yaklaşımlarda da oldukça yol katedilmiştir. Bu yaklaşımlar sayesinde bugün tanı ve tedaviyi aynı anda gerçekleştirebilecek sistemler kullanılabilmektedir. Bu nanoteknolojik ürünlerden bir tanesi de nanopartiküller olup, görüntüleme sistemlerinden, kontrollü ilaç salımına, gen susturmadan, gen aktarımına kadar oldukça geniş bir yelpazede kullanımları bulunmaktadır. Gen terapi ilaç olarak genlerin kullanıldığı gelecek vaat eden bir tedavi yöntemidir. Fakat gen terapide en büyük problem ilgili genin aktarımını sağlayacak vektörlerdir. Geniş bir kullanıma sahip viral vektörler yüksek transfeksiyon verimi sağlamalarının yanında, ciddi yan etkileri barındırmaktadır. Bu yüzden daha emniyetli ve yüksek transfeksiyon verimi sağlayacak vektörlerin geliştirilmesi en çok çalışılan konulardandır.
Sunulan tez kapsamında, bu eksiklikler göz önünde bulundurularak non-viral bir vektörün üretimi ve bu vektör aracılığıyla en fazla ölüme yol açan kanser türlerinden olan kolon kanseri hücre hattına (DLD-1) TP53 geninin aktarımı gerçekleştirilmiştir. Bu genin seçilme sebebi; kolon kanserlerinin %60'ında mutasyona uğramış p53'ün görev kaybının tanımlanmış olmasındandır. Bu genin aktarımı kanser gen terapisi açısından kritik bir öneme sahiptir.
Non-viral vektör olarak; altın takılı silika kaplı manyetik nanopartiküllerin üretimi gerçekleştirilmiştir. Partiküller, negatif yüke sahip hücre zarından, negatif yüklü pDNA'nın geçişini sağlamak amacıyla pozitif hale getirilmiştir. Bu amaçla APTES ve 2-aminoetantiyol gibi "kendiliğinden tek tabaka oluşturan" moleküllerden yararlanılmıştır. Partiküllerin karakterizasyon çalışmaları TEM (transmisyon elektron mikroskobu), Zeta Sizer, XRD (X-ışını Kırınımı) ve FTIR (Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi) ile yapılmıştır. Daha sonra, yeşil floresans protein ve p53 genlerini taşıyan plazmitler, E.coli bakterisi içerisinde çoğaltılıp, bu plazmitlerin Axygen, AxyPrep Midi Plazmit saflaştırma kiti aracılığıyla saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılan plazmitler belirli konsantrasyonlarda partiküllerle etkiştirilip, bu etkileşim agaroz jel elektroforezi aracılığıyla izlenmiş ve pDNA-partikül konjugatlarının yükleri Zeta Sizer ile saptanmıştır. Uygun olduğuna karar verilen konsantrasyonlar ile in-vitro çalışmalara devam edilmiştir. Hücreler üzerindeki toksik sınırın belirlenebilmesi için L929 (fare fibroblast hücreleri) hücrelerinden yararlanılmıştır. Hücreler üzerindeki sitotoksitite çalışmalarında WST-1 (4-[3-4-iyodofenil]-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazoliyum)-1,3-benzen disülfonat) testinden yararlanılmıştır. Son olarak; p53 mutant insan kolorektal adenokarsinoma hücreleri (DLD-1) kullanılarak pDNA-nanopartikül kompleksinin magnet aracılı transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. WST-1 testiyle DLD-1 hücreleri üzerindeki sitotoksitite, pDNA üzerindeki GFP geni sayesinde üretilen yeşil floresans protein aracılığıya floresans mikroskobu yardımıyla gen ekspresyon durumu, ikili boyama aracılığıyla da apoptoz-nekroz durumu belirlenmiştir

Abstract:
Cancer is still one of the most important problems of mankind's health that cause to death. There is a significant portion of spendings in the health sector. The early diagnosis and treatment of cancer and the budgets spent on this filed are the most important indicators to understanding of the size of the work. Nowadays in the treatment of cancer, besides the traditional methods such as surgical techniques, chemotherapy, radiation therapy, nanotechnology based approach has been covered the way. Thanks to these new approach, diagnosis and treatment can be perform simultaneously. Nanoparticles, one of the nanotechnological products, have a wide range of applications such as imaging systems, controlled drug delivery, gene silencing as well as gene delivery systems. Gene therapy is one of the promising methods that used genes as a drug. But the biggest problem in the gene therapy is the vectors that transfer the genes. Besides the high transfection efficiency of viral vectors, this systems have significant side effects. Therefore, the development of safer and high transfection efficiency systems provide the interest of scientists and became one of the most studied topics.
The aim of this study is the considering of the above mentioned deficiencies and production of non-viral transfection vector by transfer of TP53 gene through the colon cancer cell line (DLD-1) that is one of the highest death of cancer type. The selection of this gene type is because of the loss of p53 gene function in 60% of the colon cancer during the mutation. This gene transfection has a critical role in cancer gene therapy.
In this study, we carried out gold attached silica coated magnetite nanoparticles as a non-viral vectors. This particles have been positively charged by APTES and 2-aminoethan thiol to transfer of negatively charged pDNA through the cell membrane. The chemical and physical properties of the nanoparticles was carried out by FTIR, TEM, XRD and ζ-sizer respectively. Then, the plasmids that carrying the green fluorescence protein and p53 was replicated in E.coli bacteria. Purification process of this plasmids were performed by Axygen, AxyPrep and Midi plasmid purification kits. As prepared positively charged gold attached silica coated magnetite nanoparticles were interacted with several concentration of plasmids and the interaction between pDNA-nanoparticte conjugations was followed by agarose gel electrophorese and the charge of this conjugates measured by ζ-sizer so, the appropriate concentrations were selected to start the in-vitro studies. L929 cell lines (mouse fibroblast cells) were used to measure the toxicity board of the nanoparticles into the cells by applying the WST-1(4-[3-4-iodophenyl]-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolium)-1,3-benzen disolfonate) assay. Finally, pDNA-nanoparticle complexes were transfected by using a magnetic field into the p53 mutated DLD-1 cells. The cytotoxicity of the as prepared complex onto the DLD-1 cells was carried out by WST-1 assay. The gene expression was followed fluorescence microscope by pDNA that carrying GFP genes which produced green fluorescence protein. Apoptosis and necrosis situation of the cancer cells were carried out by double staining.