Asmada (Vitis vinifera) taç gali hastalık etmeni Rhizobium vitis'in LNA probe kullanılarak real-tıme PCR ile tanısı ve tespiti
Identification and detection of rhizobium vitis casual agent of crown gall disease of grapevine (Vitis vinifera L.) by real-time PCR using LNA probe
Yazar: ALİ TURGUT
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN BASIM
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Bu çalışmada, asmada (Vitis vinifera) önemli kayıplara neden olan Taç Gali hastalık etmeni Rhizobium vitis'in LNA (Locked Nucleic Acid) prob kullanılarak hem direkt bakteri hücresinden hem de hastalıklı bitki dokularından Real-Time PCR yöntemi ile hassas ve seçici olarak tanısı ve tespiti gerçekleştirilebilmiştir.
Oktopin katabolize eden ve Rhizobium vitis strainlerine ait ocs (oktopin sentaz) geninin 475 bç'lik kısmı, nopalin katabolize eden nos (nopalin sentaz) geninin 394 bç'lik kısmı klasik PCR ile çoğaltılmış, PCR ürünlerinin dizi analizi gerçekleştirilerek Real-Time PCR için primer ve prob setleri geliştirilmiştir. Vitopin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerine spesifik primer ve prob setleri ise, vis (vitopin sentaz), vitopin iaaM (indol asetik sentaz) ve vitopin virD2 genlerine ait gen bankasındaki diziler kullanılarak geliştirilmiştir. Geliştirilen primer setleri ve probların spesifikliği, farklı Rhizobium vitis strainleri, farklı bitki patojeni bakteriler, asma genomik DNA'sı, baz materyal ve tümör dokularından hazırlanan süspansiyonlar kullanılarak test edilmiştir. Oktopin ve nopalin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerinde sırasıyla, 62 ve 78 baz çifti uzunluğunda DNA fragmentleri çoğaltılabilmesine rağmen, farklı bitki patojeni bakterilerde ve asma genomik DNA'sında hiçbir amplifikasyon meydana gelmemiştir. Oktopin ve nopalin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerinin tanıları ve tespitleri, bu çalışmada geliştirilen primer ve prob setleri kullanılarak Real-Time PCR yöntemi ile 20-25 dakikada gerçekleştirilebilmiştir. Oktopin ve nopalin straini için geliştirilen Real-Time PCR yönteminin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı 1 bakteri hücresi olarak belirlenmiştir. Oktopin ve nopalin strainleri için DNA düzeyindeki hassasiyet sınırı ise 10 pg olarak tespit edilmiştir. Rhizobium vitis'in enfekteli asma baz materyalinden elde edilen bitki özsuyundan ve tümör dokularından hazırlanan süspansiyonlardan tanı ve tespiti gerçekleştirilmiştir. 
Sonuç olarak, Taç Gali hastalık etmeni, Rhizobium vitis'in oktopin, nopalin ve vitopin katabolize eden strainlerinin her birine özel geliştirilen primer ve prob setleri ve Real-Time PCR yöntemi kullanılarak hem direkt bakteriyel hücreden, hem asma bitki özsuyundan, hem de asma ve domates tümör dokularından hızlı ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği ortaya çıkarılmıştır.

Abstract:
In this study, a Real-Time PCR method using LNA (Locked Nucleic Acid) probe which was sensitive and selective were developed for identification and detection of Rhizobium vitis, a causal agent of Crown Gall Disease of grapevine from both bacterial cells and diseased plant material.
The 475 bp of ocs (octopine synthase) gene belong to Rhizobium vitis strains catabolising octopine, and 394 bp of nos (nopaline synthase) gene belong to Rhizobium vitis strains catabolising nopaline were amplified by conventional PCR. The amplified PCR product were sequenced in order to develop primer and probe sets for Real-Time PCR. Spesific primer and probe sets for Rhizobium vitis strains catabolising vitopine were developed from the gene sequences of vis (vitopine synthase), vitopine iaaM (indole acetic acid synthase) and vitopine virD2 genes from the GenBank. Different Rhizobium vitis strains, other plant pathogenic bacteria from different genus and species, vine total genomic DNA and basal material and tumor tissue were tested in order to determine the sensitivity of primer sets and probes. Although the DNA fragment amplified from the Rhizobium vitis strains catabolising octopine and nopaline were 62 and 78 base pairs respectively, no amplified product was detected from the other bacterial pathogens and vine genomic DNA. The primer and probe sets developed in this Real-Time PCR method for the detection and identification of Rhizobium vitis strains catabolising octopine and nopaline were identified within 20-25 minutes. The sensitivity of detection limit by the developed Real-Time PCR methods for octopine and nopaline strains was 1 bacterial cell. The sensitivity limit of DNA level was 10 pg. The pathogenic bacterium obtained from bleeding sap of basal material and tumor tissues were identified and detected.
In conclusion, Real-Time PCR method using primer and probe sets specific for each of Rhizobium vitis strains catabolising octopine and nopaline were sensitive and quick for identification and detection of Rhizobium vitis from bacterial cell, bleeding sap of grapevine, tumor tissues from grapevine and tomato