Nicotiana benthamiana bitkisinde ın vivo endo H ile deglikozile edilmiş PA83'ün diğer PA83 formları ile karşılıklı stabilite çalışmaları
Comparative stability studies of endo H in vivo deglycosylated PA83 with other PA83 forms in Nicotiana benthamiana plants
Yazar: DENİZ SAY
Danışman: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Blotting-western = Blotting-western ; DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Glikoproteinler = Glycoproteins ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production

Özet:
Şarbon hastalığının etken organizması olan Bacillus anthracis, genellikle otçul hayvanların yaygın şekilde aşılanamadığı ülkelerde ortaya çıkmaktadır. Bu bakteri insanlara kutanöz, gastrointestinal veya sporlarının solunması ile ortaya çıkan inhalasyon formu ile bulaşabilmektedir. Bakterinin spor formu, sahip olduğu yüksek ölüm oranları ve uzun zamandır potansiyel bir biyolojik savaş ajanı olarak kabul edilmesiyle bilim adamlarını hızlı ve etkili bir şekilde koruyucu bağışıklık sağlayan, gelişmiş bir güvenlik profiline sahip, rekombinant aşılar geliştirmeye yöneltmiştir. Rekombinant protein ekspresyon sistemleri arasında yer alan bitkiler, diğer ekspresyon sistemlerine kıyasla düşük maliyetleri ve uygun güvenlik profilleri ile umut verici bir platformunu temsil etmektedir. Ancak B. anthracis PA'sı, ökaryotik sistemlerde ekspresyon sırasında anormal şekilde glikozile olabilen potansiyel N-bağlı glikozilasyon bölgeleri içermektedir. Daha önceki çalışmalar, glikozile edilmemiş bir pp-PA83 formunu, peptit-N-glikosidaz F (PNGase F) enzimi ile birlikte ekspresyonuna dayanan bir In vivo deglikozilasyon yaklaşımını Nicotiana benthamiana'da tasarlayarak üretmişlerdir (Mamedov vd. 2016). Laboratuvarımızda gerçekleştirilen çalışmaların sonraki aşamalarında başka bir deglikozile edici enzim olan Endo-β-N-asetilglukosaminidaz H (Endo H)'in, PNGase F enziminin katalizi sırasında meydana gelen deaminasyona sebebiyet vermeden proteini katalizlediği bulunmuştur (Mamedov vd. 2017).  Bu tez çalışmasında Endo H tarafından bu şekilde In vivo olarak üretilen deglikozile PA83 proteini, PNGase F ile deglikozile edilen muadili ve proteinin  glikozile formu saflaştırma deneylerinden sonra farklı zaman periyotlarında ve sıcaklıklarda uzun stabilite testlerine tabii tutulmuştur. Endo H ile deglikozile edilen PA83, uzun zaman dilimlerinde dahi diğer PA83 formlarından daha iyi bir stabilite gösterdiği kanıtlanmıştır. Elde edilen bu sonuçlar, bitki üretimli deglikozile PA83'ün şarbona karşı güvenli, etkili ve düşük maliyetli bir rekombinant alt ünite aşısı için iyi bir aday olabileceği göstermektedir.

Abstract:
Bacillus anthracis, the causative organism of anthrax, usually occurs in countries where herbivorous animals cannot be widely vaccinated. These bacteria can be transmitted to humans by cutaneous, gastrointestinal or inhalation form, which is caused by inhalation of  spores. The spore form of the bacterium has led scientists to develop recombinant vaccines with an improved safety profile that quickly and effectively protects immunity, with its high mortality rates and  acceptance as a potential biological warfar reagent for a long while. Plants among the recombinant protein expression systems represent a promising platform with low costs and appropriate safety profiles compared to other expression systems. However, B. anthracis PA contains potential N-linked glycosylation sites that can be abnormally glycosylated during expression in eukaryotic systems. Previous studies have produced a non-glycosylated form of plant produced PA83 by using an in vivo deglycosylation approach based on its co-expression with the peptide-N-glycosidase F (PNGase F) enzyme in Nicotiana benthamiana (Mamedov et al. 2016). Recently, for production of non-deglycosylated proteins another strategy, Endo H (Endo-β-N-acetylglucosaminidase) in vivo deglycosylation strategy was developed (Mamedov et al., 2017), which causes no amino acid change in the resulted proteins. In this thesis, the deep stability analysis of PA83 protein produced by Endo H in vivo degycosylation strategy was performed. Thus, deglycosylated PA83 proteins, produced by PNGase F or Endo H strategy were subjected to long stability tests at different time periods and temperatures after purification experiments. Endo H deglycosylated PA83 has been shown to show better stability than other forms of PA83, even over long periods of time. These results show that plant produce dPA83 can be a good candidate for safe, effective and low cost recombinant anthrax subunit vaccine development.