Alabalıklarda (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) viral hemorajik septisemi (VHS) hastalığının teşhisi için ELISA yönteminin geliştirilmesi
The development of ELISA for diagnosis of viral hemorrhagic septicemia (VHS) disease in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum)
Yazar: UĞUR DEĞİRMENCİ
Danışman: PROF. DR. HAŞMET ÇAĞIRGAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Bu araştırmada enfekte alabalık doku homejenizatından ve hücre kültüründen VHS virüsünü tespit etmek için bir enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) yöntemi geliştirildi.VHS, enfekte balık dokusundaki virüsün duyarlı doku kültürlerinde izolasyonundan sonra ELISA, virüs nötralizasyon, immunofloresans, immunoperoksidaz ve complement fiksasyon gibi serolojik testlerle identifiye edilmektedir. ELISA, tekrarlanabilir olması, kullanımının basit olması, çabuk yapılabilmesi ve ucuz olmasıyla diğer serolojik testlerden daha üstündür.ELISA bir çok şekilde uygulanabilir. Bu çalışmada VHS antijenini tespit edebilecek tavşandan elde edilen sadece bir antikor kullanılmıştır. Üretilen anti-VHSV F1 ?-globulin fraksiyonunun protein konsantrasyonu 28 mg/ml'dir. Mikroplak kuyucukları 10 µg/ml anti-VHSV ?-globulin fraksiyonu ile kaplandı. Daha sonra şüpheli örnek ilave edildi. Eğer örnekler virus içeriyorsa biotinlenmiş anti-VHSV ?-globulin fraksiyonu antijenle bağlanır ve biotinlenmiş ?-globulin fraksiyonu, HRP ile işaretli avidin ile reksiyona girer. TMB substrat eklenmesiyle renk şekillenir ve okuyucuda okutturulur.Bu doktora çalışması projesinde geliştirilen VHS antijen ELISA bilinen tüm VHSV subtiplerini (strain F1, HE, 23.75) ve 1/10 dilüsyondaki enfekte balık dokusu homojenizatında etkeni tespit edebilmektedir. Geliştirilen biotin-avidin ELISA VHSV'ye oldukça spesifiktir ve IHNV, PFR, PR ve bilinen tüm IPNV serotipleriyle çapraz reaksiyon vermemektedir. Geliştirilen biotin-avidin antijen ELISA'nın duyarlılığı DKID50 104,75/0,1 ml'dir.

Abstract:
In this research an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method was developed for detection of VHS virus antigens in diseased rainbow trout fry whole fish homogenisate and in tissue culture supernatant.VHS can be diagnosed by the isolation of virus from infected fish in an appropriate cell line then identified by different serological techniques such as ELISA, virus neutralization, immunofluorescence, immunoperoxidase and complement fixation tests. ELISA is over to the other serological tests by the repeatability, simplicity, rapidity and cheapness.ELISA can be performed in many formats. In this research only one antibody which raised in rabbit was used for the detection of VHSV antigen. Estimated protein concentration of produced anti-VHSV F1 ?-globulin fraction was 28 mg/ml. The microwells were coated with 10 µg/ml anti-VHSV ?-globulin fraction. Then the suspected samples were reacted. If the samples were containing virus, biotinylated anti VHSV ?-globulin fraction binds to the antigen and biotinylated ?-globulin fraction react with HRP labeled avidin. The colour is developed and read by a reader fallowing addition of TMB substrate.In this Ph D research project developed VHS antigen ELISA was detecting all known VHSV Subtypes (strain F1, HE, 23.75) and 1/10 diluted diseased whole fish homogenizat. The developed biotin avidin ag ELISA was highly specifique to VHSV and was not giving the cross reaction with other fish viruses such as IHNV, PFR, PR and all known IPN serotypes. The sensitivity of developed biotin-avidin ag ELISA was DKID50 104,75/0,1 ml