İmmobilize metal afinite kromatografisi için TiO2 bazlı sabit fazların sentezi ve biyomolekül izolasyonunda kullanımı
Synthesis of TiO2 based stationary phases for immobilized metal affinity chromatography and their usage for isolation of biomolecules
Yazar: SEZGİ ALPASLAN
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN ALİ TUNCEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
İmmobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile histidin etiketli protein saflaştırılması için titanyum dioksit bazlı yeni bir sorbent geliştirilmiştir. Monodispers gözenekli formda, 5 m boyutundaki titanyum dioksit mikrokürelerinin sentezi, kalıp malzemesi olarak poli (3-kloro-2-hidroksipropil metakrilat-ko-etilen glikol dimetakrilat) (poli (HPMA-Cl-co-EDMA)) mikroküreleri kullanılarak, sol-jel kalıplama yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Silanizasyon reaksiyonu ile, iminodiasetik asit-3-glisidoksipropil trimetoksisilan kompleksi (IDA-GLYMO) titanyum dioksit mikrokürelerinin üzerine kovalent olarak bağlanmıştır. Bu mikroküreler üzerinde bulunan karboksil grupları üzerinden metal-şelat kompleksi oluşumu ile Ni2+ iyonları mikrokürelere bağlanmıştır. Geliştirilen sorbent, histidin açısından zengin proteinlerin kesikli sistemde immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) yöntemiyle izolasyonu için kullanılmıştır. Bu amaçla, histidin açısından zengin bir protein olan bovin hemoglobinin (BHb) ve referans protein olarak seçilen bovin serum albümin (BSA)'in izolasyonu, Ni2+ bağlı-monodispers gözenekli titanyum mikrokürelerin (Ni2+-IDA-GLYMO@TiO2) sorbent olarak kullanılmasıyla kesikli sistemde karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Maksimum denge BHb adsorpsiyon kapasitesi, 140 mg BHb/g mikroküre olarak belirlenmiştir. BHb, sulu tampon ortamında kantitatif desorpsiyon verimi ile izole edilmiştir. Referans olarak seçilen BSA, sınırlı bir denge adsorpsiyonu göstermiş olmasına rağmen, sorbentten yüksek verimle desorplanmamıştır. Geliştirilen sorbent aynı zamanda kesikli ve sürekli formdaki mikro-immobilize metal affinite kromatografisi (MIMAC) sistemlerinde insan kanından hemoglobin izolasyonu için kullanılmış, kesikli ve MIMAC sistemlerde sırasıyla ≥95 ve %85 saflık oranında Hb izole edilmiştir. Sonuçlar, geliştirilen sorbentin histidin açısından zengin protein olarak seçilen BHb için yüksek seçicilik ve yüksek verimle izolasyona imkan verdiğini ortaya koymuştur.

Abstract:
A titania based sorbent was developed for His-tagged protein purification by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The synthesis of monodisperse porous titania microbeads ca 5 m in size was performed by a staged shape template sol-gel method using poly(3-chloro-2-hydroxypropyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate)  poly(HPMA-Cl-co-EDMA) microbeads as the template material.  Iminodiacetic acid-3-glycidoxypropyl trimethoxysilane complex (IDA-GLYMO) was covalently attached onto the titania microbeads via silanization reaction. Ni2+ ions were then attached to the derivatized microbeads via metal-chelate complex formation with the carboxyl groups on the microbeads. The developed sorbent was used for the isolation of histidine-rich proteins in batch affinity system. For this purpose, the isolation of bovin hemoglobin (BHb) as a histidine-rich protein and bovine serum albumin (BSA) as a reference protein were comparatively investigated using Ni2+ attached-monodisperse-porous titania microbeads as the sorbent in batch fashion. The maximum equilibrium BHb adsorption was determined as 140 mg BHb per g sorbent. BHb could be isolated with quantitative desorption yield in the aqueous buffer medium. Although the selected reference, BSA exhibited a limited equilibrium adsorption, it could not be eluted from the sorbent with high yield. The developed sorbent was also used for isolation of hemoglobin from human blood in micro-immobilized metal affinity chromatography (MIMAC) systems in batch and continuous system, and Hb was isolated with ≥95 and 85% purity, respectively, in batch and MIMAC systems. The results show that the developed sorbent allows isolation with high selectivity and high efficiency for histidine-rich protein BHb.