Yeni bir metodla hyalüronidaz enziminin saflaştırılması ve bazı bileşiklerin bu enzim üzerine etkilerinin araştırılması
A new method for the purification of hyaluronidase enzyme and investigation the effects of some compounds on this enzyme
Yazar: MUSTAFA OĞUZHAN KAYA
Danışman: PROF. DR. OKTAY ARSLAN
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Hyalüronidaz enzimi, terapötik ve çeşitli tıbbi alanlarda bir yayılma faktörü olarak uygulanmaktadır. Geniş substrat özgüllüğünden dolayı, zincir uzunlukları değişen glikozaminoglikan oligosakaritlerinin hazırlanması gibi glikoteknolojik uygulamalar için oldukça önemlidir. Ayrıca sığır testis hyalüronidazı (BTH) suni tohumlamada da önemli derecede etkili olduğu bilinmektedir.
Bu çalışmada sığır testis hyalüronidazını saflaştırmak için yeni bir afinite kromatografisi jeli sentezlenmiştir. CNBr ile aktifleştirilen Sepharose-4B? ye uzantı kolu olarak L-tirozin bağlanmıştır. Oluşan Sepharose-4B-l-tirozin yapısına ligand olarak BTH enziminin spesifik bir inhibitörü olan m-anisidin kenetlenmiştir. Sonuç olarak Sepharose-4B-l-tirozin-m-anisidin kimyasal yapısına sahip afinite jeli elde edilmiştir.
Amonyum sülfat çöktürmesi ve afinite kromatografisi ile saflaştırılan sığır testis hyalüronidaz enzimi %16.95 verimle ve 881.78 saflaştırma derecesi ile elde edilmiştir. Enzimin saflığı SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile kontrol edilmiş ve 55 kDa civarında tek bant gözlenmiştir.
Sığır testis hyalüronidazının kinetik sabitleri (KM ve Vmax) hyalüronik asit substrat olarak kullanılarak belirlenmiştir. Linewear-Burk grafiğinden elde edilen  KM ve Vmax değerleri sırasıyla 2.23 mM ve 19.85 U/mL  olarak bulunmuştur.
Bu çalışmada, ticari antibiyotiklerin etken maddeleri olan kanamisin sülfat, sodyum ampisilin, oksitetrasiklin, linkomisin-HCl, gentamisin sülfat, penisilin G-potasyum, trimetoprim ve sülfametaksazol; Cu(OAc)2.H2O, Cu(NO3)2.3H2O, CuSO4.5H2O, CuCl2.2H2O, Hg(NO3)2.H2O ve HgCl2 ağır metalleri ve 1,1-dimetilpiperidinium klorür, ß-naftoksiasetik asit, giberallik asit etken maddeli            bazı kimyasalların, saflaştırılmış BTH üzerindeki in vitro etkisi belirlenmiştir. Söz konusu kimyasallardan giberallik asit etken maddesi, ağır metallerden HgCl2 ve antibiyotik etken maddelerinden ise trimetoprim BTH enzimini en iyi inhibe eden maddeler olarak saptanmıştır.

ANAHTAR KELİMELER: Sığır testis hyalüronidaz (BTH), afinite 
kromatografisi, antibiyotik, ağır metal, inhibisyon

Abstract:
Hyaluronidase enzyme is used as a spreading factor on therapeutic and various medical fields. Because of wide substrate specificity it is quite important for glucotechnological applications such as preparation of varying chain lengths glycosaminoglycan oligosaccharides. Bovine testicular hyaluronidase is also known to be substantially effective in the delivery of artificial insemination.
In this study, a new affinity chromatography gel for the purification of bovine testicular hyaluronidase was synthesized. L-tyrosine was added as the extension arm to the Sepharose-4B activated with CNBr. m-Anisidine, a specific inhibitor of bovine testicular hyaluronidase enzyme, was clamped to the newly formed Sepharose-4B-L-tyrosine as a ligand. As a result an affinity gel having the chemical structure of Sepharose-4B-L-tyrosine-m-anisidine was obtained.
Bovine testicular hyaluronidase purified by ammonium sulfate precipitation and affinity chromatography was obtained with %16.95 yield and 881.78 degree of purity. Purity of the enzyme was checked by using SDS polyacrylamide gel electrophoresis and a single band was observed around 55 kDa.
Kinetic constants (KM and VMax) for bovine testicular hyaluronidase were determined by using hyaluronic acid as a substrate. KM and Vmax values obtained from the Lineweaver-Burk graph were found to be 2.23 mM and 19.85 U/mL,  respectively.
The in vitro effects of some chemical and antibiotic active ingredients, and heavy metals were determined on purified BTH enzyme.  Antibiotic active ingredients were kanamycin sulfate, sodium ampicillin, oxytetracycline, lincomycin-HCl, gentamicin sulfate, penicillin G- potassium, trimethoprim and sulfamethoxazole. Heavy metals were Cu(OAc)2.H2O, Cu(NO3)2.3H2O, CuSO4.5H2O, CuCl2.2H2O, Hg(NO3)2.H2O and HgCl2.  Some chemical active ingredients were 1,1-dimethyl piperidinium chloride, ß-naphthoxyacetic acid and gibberellic acid. The best inhibiton effects shown by the compounds on BHT enzyme were determined as trimethoprim, HgCl2 and gibberellic acid, respectively.


KEYWORDS: Bovine testicular hyaluronidase (BTH), affinity chromatography, 
antibiotic, heavy metal, inhibition