Over kanserlerinde tümör dokusunda T hücre reseptörü yeniden düzenlenmesinin  multipleks PCR yöntemi  kullanılarak  araştırılması
Investigation of T-cell receptor rearrangement in tumor tissues in ovarian cancers by means of multiplex PCR method
Yazar: SULTAN ÖZKAN
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA COŞAN TEREK
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology
Dizin: Neoplazmlar = Neoplasms ; Over neoplazmları = Ovarian neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Reseptörler-antijen-T hücre = Receptors-antigen-T cell

Özet:
Amaç:  Bu çalışmada over karsinomlarında T hücre reseptör yeniden düzenlenmesi   çalışılarak olgulardaki klonal seleksiyon araştırılacaktır.. İlerideki immünolojik çalışmalarla olgulardaki klonal duruma göre tedaviye yön verilmesi ve her hastaya özgü bir tedavi tipi geliştirilebilmesi sağlanabilecektir.
Yöntem:  Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı'na Kasım 2010-Kasım 2012 tarihleri arasında başvuran 24 malign ve 23 benign adneksiyal kitlesi olan olgu çalışmaya dahil edilmiştir. Over karsinomu tanısı konmuş hastalardan (n=24) cerrahi sırasında primer over tümör dokusundan taze doku örnekleri alınmıştır. Uterusa ait nedenlerle cerrahi geçiren ve profilaktik oooforektomi yapılan non-neoplasik overlerden (n=23) alınan taze doku örneklerinden de çalışılan hücre tipine uygun ticari kit kullanılarak beta, gama ve delta genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. İzole edilen genomik DNA örneklerinin miktarı Nano Drop cihazında 260 nm. dalga boyunda ölçülmüştür. Seçilen kaliteli DNA örnekleri T-hücre gen klonalitesini belirlemek için Biomed-2 primerleri kullanılarak multipleks PCR yöntemi ile belirlenmiştir.  PCR'ın ardından tüm örneklere yalancı pozitifliği önlemek amacıyla heterodubleks analizi yapılmış, poliakrilamid jel elektroforezi sistemine yüklenmiştir. Daha önceden optimize edilmiş uygun voltaj ve sürelerde poliakrilamid jel elektoforezinde örneklerin yürütülmesinin ardından, EtBr ile jeli boyama ve distile suda yıkama işlemleri gerçekleştirilmiştir. Daha sonra jel görüntüleme sisteminde jel görüntülenmiş ve fotoğrafı çekilmiştir. Çekilen fotoğraftaki bantların büyüklüklerine ve analiz aralıklarına bakılarak her hasta için T hücre klonalitesi değerlendirilmiştir. Hastalardaki yaş, evre, tümör histopatolojik tipi, tümör derecesi, tümör çapı gibi prognostik değişkenler ile T hücre yeniden düzenlenmesi arasındaki ilişki değerlendirilmiştir.
Bulgular: Çalışma ve kontrol grubunda TCRB-A pozitiflik oranı anlamlı (p˃0,05) farklılık göstermemiştir. Çalışma grubunda TCRB-B pozitiflik oranı kontrol grubundan anlamlı (p<0,05) olarak yüksek bulunmuştur. Çalışma ve kontrol grubunda TCRB-C anlamlı (p˃0,05) farklılık göstermemiştir.  Çalışma ve kontrol grubunda TCRG-A pozitiflik oranı anlamlı (p ˃ 0,05) farklılık göstermemiştir. Çalışma ve kontrol grubunda TCRG-B pozitiflik oranı anlamlı (p ˃ 0,05) farklılık göstermemiştir. Çalışma grubunda TCR-D pozitiflik oranı kontrol grubundan anlamlı (p < 0,05) olarak daha yüksek bulunmuştur.
Sonuç: Over kanseri olgu serisinde TCR'nün alt grupları gösterilmiştir. TCRB-B ve TCR-D alt gruplarında saptanan anlamlı farklılık immün tedavilere ışık tutacaktır.

Abstract:
Object: In this study, clonal selection in patients will be investigated by searching the T-cell receptor rearrangement in over carcinomas. Through the future immunologic studies, the treatment to be applied will be directed depending on the clonal status of patients and a treatment type specific to each patient will be developed.
Method:  24 patients with malign adnexal mass and 23 patients with benign adnexal mass who have applied to Ege University Medical Faculty Department of Obstetrics and Gynecology between the dates of November 2010 and November 2012 were included in the study. Fresh tissue samples were taken from primary ovary tumor tissue of the patients diagnosed with over carcinoma (n=24) during the operation. However, beta, gamma and delta genomic DNA was isolated from fresh tissue samples  taken from non-neoplastic ovary which have been operated due to the causes related with uterus and underwent prophylactic oophorectomy (n=23) by means of appropriate commercial kits for the cell type. The amount of the isolated genomic DNA samples was measured at a wavelength of 260 nm. The selected high quality DNA samples were determined by PCR method by using Biomed-2 primaries in order to specify T-cell gene clonality. After PRC, heterodublex analysis was made on all samples in order to prevent false positivity and loaded to Polyacrylamide gel electrophoresis system. After the samples were subjected to Polyacrylamide gel electrophoresis with previously optimized voltage and periods, gel dying with EtBr and distilled water wash operations were carried out. Then, the gel was displayed in the gel imaging system and its photo was taken. Size of bands in the photo  and analysis ranges were examined and T-cell clonality was evaluated for each patient. Relationship between T cell rearrangement and prognostic variables such as age of patient, stage, histopathological type of tumor, tumor grade, tumor diameter etc. was evaluated. 
Findings: TCRB-A positivity ratio showed no significant difference (p˃0,05) in the study and control groups. TCRB-B positivity ratio was found to be significantly higher in the study group compared to the control group (p<0,05). However, TCRB-C showed no significant difference in control and study groups (p˃0,05). In the control and study groups, TCRG-A positivity ratio showed no significant difference (p ˃ 0,05). In the control and study groups, TCRG-B positivity ratio showed no significant difference (p ˃ 0,05).  TCR-D positivity ratio was found to be significantly higher in the study group compared to the control group (p<0,05). 
Result: Sub-groups of TCR were shown in the ovary cancer case series. The significant difference in TCRB-B and  TCR-D sub-groups will provide an insight to immunotherapy.