Kayseri yöresindeki sığırlardan toplanmış kene türlerinde babesıa bovıs ve babesıa bıgemına'nın real time PCR yöntemi ile araştırılması
Investigation of babesia bovis and babesia bigemina in tick species collected from cattle in Kayseri province by real time PCR
Yazar: TUĞBA MEYİLLİ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Babesia = Babesia ; Kayseri = Kayseri ; Keneler = Ticks ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sığırlar = Cattles ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; İnekler = Cows

Özet:
Bu çalışma, Kayseri yöresindeki sığırlardan toplanmış ergin ixodid kenelerden oluşturulan DNA havuzlarında Babesia bovis ve B. bigemina'nın Real Time PCR ile araştırılması ve saptanan izolatların moleküler karakterizasyonlarının belirlenmesi amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla, daha önce Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından "Sığırlarda Görülen Theileria ve Babesia Türlerinin Vektör Kenelerde Moleküler Biyolojik Teşhisi" isim ve 2824 koduyla desteklenmiş araştırma projesi kapsamında sığırlardan toplanmış toplam 1115 ergin ixodid keneden oluşturulmuş genomik DNA havuzlarının nanodrop spektrofotometre ile konsantrasyonları belirlenmiş ve moleküler analizler için optimal konsantrasyonlar hazırlanmıştır. Genomik DNA ekstraktlarının B. bovis ve B. bigemina için sırasıyla msa2c ve rap-1 gen bölgelerini amplifiye eden spesifik primerlerle Sybergreen ve TaqMan prob bazlı Real Time PCR analizleri gerçekleştirilmiştir. İncelemesi yapılan 38 adet genomik DNA havuzunun 8'inde (%21,0) B. bigemina, 2'sinde (%5,2) B. bovis pozitifliği saptanmıştır. İncelenen örneklerde miks enfeksiyona rastlanmamıştır. B. bigemina pozitif örneklerin 4'ü Rhipicephalus (Boophilus) annulatus, 1'i Hyalomma marginatum marginatum, 2'si Rhipicephalus turanicus ve 1'i H. anatolicum anatolicum havuzlarında saptanırken, B. bovis pozitif örneklerin her ikisi de H. m. marginatum havuzunda tespit edilmiştir. Ct (dR) değerleri B. bovis pozitif örneklerde ortalama 37,71,  B. bigemina pozitif örneklerde ise 35,75 saptanmıştır. Moleküler karakterizasyon amacıyla pozitif belirlenen örneklerde B. bovis ve B. bigemina için sırasıyla msa2c ve rap-1a gen bölgelerini amplifiye eden spesifik primerler ile konvansiyonel PCR ve nested PCR analizleri yapılmıştır. B. bovis pozitif izolatlarda parazitemi çok düşük olduğundan dolayı uygun DNA bant profilleri belirlenemezken, B. bigemina pozitif 8 örnekten ise sadece 2'sinin agaroz jel üzerinde sekans analizleri için uygun DNA bant profilleri gösterdiği saptanmıştır. Söz konusu izolatların pürifiye edildikten sonra rap-1a gen bölgesi filogenetik analizler için sekanslanmıştır. B. bigemina izolatlarının (BbigrapKys1-BbigrapKys2) rap-1a gen bölgesinin filogenetik analizi sonucunda kendi aralarında %100 identiklik, dünyadan alignmenta dahil edilen diğer izolatlarla aralarında %1,0±0,5 ve Türkiye'den daha önce girilmiş izolatlarla aralarında %0,7±0,4 genetik farklılık belirlenmiştir.
Sonuç olarak bu çalışma ile Kayseri yöresindeki sığırlarından toplanmış kenelerden oluşturulmuş genomik DNA havuzlarında B. bovis ve B. bigemina'nın varlığı ve yaygınlığı, diğer moleküler tabanlı teşhis yöntemlerine göre sensitivite ve spesifitesi oldukça yüksek olan Real Time PCR tekniği ile ortaya konmuştur. Elde edilen Ct (dR) değerlerine göre enfekte sığırlarda her iki türün de düşük parazitemiye sahip olduğu görülmüştür. Bu açıdan özellikle rezervuar hayvanların ortaya konmasında Real Time PCR'ın oldukça avantajlı ve güvenilir bir yöntem olduğu dikkati çekmiştir. Ayrıca bu çalışma, Türkiye ve dünyada B. bovis ve B. bigemina'nın kenelerde Real Time PCR ile araştırıldığı ilk çalışmadır. 
Anahtar kelimeler: Babesia bovis, Babesia bigemina, kene, Real Time PCR, moleküler karakterizasyon, Kayseri

Abstract:
This study was carried out to investigate Babesia bovis and B. bigemina in genomic DNA pools consisted from adult ixodid ticks collected from cattle in Kayseri region by Real Time PCR and to determine the molecular characterization of the isolates. For this aim, the concentrations of the obtained DNA pools consisted from totally 1115 adult ixodid ticks collected from cattle with a previous project called "Molecular Biological Diagnosis of Cattle Theileria and Babesia species in Vector Ticks" financially supported by Erciyes University Research Fund (EUBAP-Project Number 2824) were analyzed by nanodrop spectrophotometry and optimal concentrations were prepared for the molecular analyses. Sybergreen and TaqMan probe based real time PCR analyses were carried out with B. bovis and B. bigemina specific primer pairs which amplify msa-2c and rap-1a gene regions, respectively. Totally 8 (21.0%) and 2 (5.2%) of the 38 genomic DNA pools were found to be infected with B. bigemina and B. bovis, respectively. No mix infection was detected in the examined samples. Of the B. bigemina positive samples four, one, two and one were determined in Rhipicephalus (Boophilus) annulatus, Hyalomma marginatum marginatum, Rh. turanicus and H. anatolicum anatolicum pools whereas both two positive B. bovis samples were detected in H. m. marginatum pools. The Ct (dR) values were determined as average 37.71 and 35.75 in B. bovis and B. bigemina positive samples, respectively. For the molecular analyses, conventional and nested PCR analyses were performed with B. bovis and B. bigemina specific primer pairs which amplify msa-2c and rap-1 gene regions in positive samples. It was detected that 2 of 8 for B. bigemina positive samples exhibited suitable DNA band profiles in the agarose gel for sequence analyses and no B. bovis positive samples showed suitable DNA bands because of the weak parasitemia level. These isolates were sequenced with respect to rap-1a gene region for phylogenetical analyses after gel purification. According to the phylogenetic analyses of rap-1a gene region of B. bigemina isolates (BbigrapKys1-BbigrapKys2), 100.0% identity with each other and average 1,0±0,5%, and 0,7±0,4 % genetic distance were detected with some other isolates in the world and in Turkey, respectively.
In conclusion, the presence and prevalence of B. bovis and B. bigemina in genomic DNA pools consisted from ticks collected from cattle from Kayseri province were exhibited by Real Time PCR, which is more sensitive and more specific than the other molecular based diagnostic techniques, in this study. According to the Ct (dR) values, it was seen that both B. bovis and B. bigemina species have low parasitemia in cattle. Real Time PCR technique was found to be quite advantageous and reliable in the diagnosis of reservoir animals. In addition, this was the first study in Turkey and in the world about the molecular investigation of B. bovis and B. bigemina in ticks by Real Time PCR.

keywords: Babesia bovis, Babesia bigemina, tick, Real Time PCR, molecular characterization, Kayseri