Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşmalı kütle spektrometrisinde yapılacak proteolitik parçalanma temelli proteomik çalışmaları için, enzim immobilize edilmiş sol-jel yüzeylerin geliştirilmesi
Development of proteolytic enzyme immobilized sol-gel target surfaces for digestion based proteomic studies in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
Yazar: ÖZLEM DEMİREL
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Sol-jel yöntemi = Sol-gel method ; Tripsin = Trypsin

Özet:
Proteomiks, proteinlerin kapsamlı bir şekilde araştırılması olarak tanımlanmakta ve proteinlerin yapıları, fonksiyonları, ifade ve etkileşimleri ile kompleks biyolojik sistemlerdeki yerleşimlerini çözümlemeyi amaçlamaktadır. Bu tür analizlerden elde edilen bilgi, protein-protein etkileşimlerinin tanımlanmasıyla, her bir proteinin tek başına fonksiyonunun anlaşılmasına yardımcı olabilir. Tek başına genomik (DNA) veya transkriptomik (mRNA) yaklaşımlar, protein kararlılıklarını, yerleşimlerini ve sıkça protein fonksiyonlarının kritik belirleyici etkenlerinden olan post-translasyonel modifikasyonları dikkate almazlar.Son yıllarda Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon/İyonlaşmalı-Kütle spektrometresi, proteinlerin tanımlanmasında ve biyolojik işlemlerdeki rollerinin belirlenmesinde önemli bir analitik araç haline gelmiştir. Proteomiks çalışmalarında etkin bir protokol, proteinin çeşitli yöntemlerle ayrılıp, saflaştırılması, enzimatik parçalanması ve MALDI-Kütle spektrometresinde `'peptid kütle parmakizi'' analizinin gerçekleştirilmesi işlemlerini içerir. Peptid kütle parmakizi analizi için anahtar faktör, proteinlerin genellikle tripsin gibi bir proteaz tarafından parçalanması işlemidir. Bu nedenle proteomiks çalışmalarının sonucu, enzimatik parçalama basamağının başarısı ile doğrudan ilgilidir. Protein karışımlarının parçalanması genellikle çözeltide serbest halde bulunan tripsin enzimi kullanılarak gerçekleştirilir, ancak bu yaklaşımın birçok dezavantajı bulunmaktadır. Çözeltide serbest halde bulunan tripsinin birçok istenmeyen etkisi göz önüne alındığında, immobilize tripsin enziminin kullanımı, proteomiks çalışmaları için daha avantajlı bir yöntemdir. Serbest tripsin ile karşılaştırıldığında sol-jel materyallere immobilize edilen otokatalitik ürünler oluşturmayan tripsin enzimi, yüksek enzimatik parçalama etkinliği, yüksek kararlılık ve otomasyon kolaylığı gibi üstünlüklere sahiptir.Bu çalışmada, başlatıcı madde olarak kullanılan metal alkoksitlerin derişimleri değiştirilerek, farklı katkı maddeleri kullanılarak, alkol miktarı, pH ve jelleşme zamanları değiştirilerek çok çeşitli tripsin-tutuklanmış sol-jel malzemeleri üretilmiştir. Sentezlenen bu tripsin-tutuklanmış sol-jel malzemeler, BSA, sitokrom C ve ubiquitin gibi bazı proteinlerin enzimatik parçalanması işleminde kullanılmıştır. Sonuçta elde edilen enzimatik parçalanma ürünü peptidler, MALDI-Kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilmiş ve veritabanlarındaki sonuçlar ile karşılaştırılmıştır. Bu materyallerin yüzey morfolojilerinin ve termal kararlılıklarının anlaşılabilmesi için SEM fotoğrafları, FT-IR spektrumları ve TGA termogramları da elde edilmiştir. Tripsin-tutuklanmış sol-jellerin sentezindeki her parametrenin `'peptid kütle parmakizi'' analizine etkileri araştırılmıştır.Anahtar kelimeler: Proteomiks, sol-jel, tripsin enzimi ile parçalama, MALDI-Kütle spektrometresi

Abstract:
Proteomics represents the comprehensive study of proteins and is aimed at analyzing their structure, function, expression, interactions, and localization in complex biological systems. The information obtained from these types of analyses can contribute to our understanding of the function of individual proteins by identifying protein-protein interactions. Genomic (DNA) or transcriptomic (messenger RNA) approaches alone do not take into account changes in protein stability, localization, and posttranslational modifications that are often critical determinants of protein function.Recently, Matrix-Asisted Laser Desorption/Ionization-MS has become an important analytical tool in the identification of proteins and evaluation of their role in biological processes. In proteomic studies, an efficient protocol consists of sample purification, separation of proteins by several methods, enzymatic digestion and identification of proteins by MALDI-MS analysis to peptide mass fingerprint. A key element for peptide mass fingerprint analysis is the digestion of protein mixtures by a protease, in most cases, by trypsin. Thus the success of proteomics study is concerned with the achievement of enzymatic digestion step. The protein mixture is often digested by free trypsin in solution however, there are several disadvantages for this approach. Because of all unfavorable effects of free trypsin are taken into account, immobilized trypsin enzyme access is more favored method for proteomics analysis. Compared with free trypsin, the trypsin immobilized on sol-gel materials has the advantages of high digestion efficiency, high stability and easy to automation.In this study, different trypsin-encapsulated sol-gel materials were fabricated by changing the concentration of the starting metal alkoxides, using different additives, changing the amount of alcohol, pH and the gelation time. Synthesized these materials were used to perform the enzymatic digestion of some proteins namely BSA, cytochrome C and ubiquitine. The resulting peptides were analyzed by MALDI- mass spectrometer and compared with database results. SEM micrographs, FT-IR spectra and TGA thermograms of these materials were also obtained for understanding of their surface morphologies and thermal stabilities. Every parameters in trypsin-encapsulated sol-gel synthesis and their effects on `?peptide mass fingerprint analysis?? have been investigated.Keywords: Proteomics, sol-gels, trypsin digestion, MALDI-MS