Escherichia coli O157:H7 litik fajının çeşitli muhafaza koşullarında stabilitesinin araştırılması
Investigation of the stability of escherichia coli O157:H7 lytic phage under various storage conditions
Yazar: NAZLI FİRDEVS AŞILIOĞLU
Danışman: PROF. DR. NAİM DENİZ AYAZ
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Gıda Hijyeni ve Teknolojisi (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bakteriyel patojenler halk sağlığı açısından ciddi önem taşımaktadır. Bu patojenler kesim, sağım, fermentasyon, paketleme, depolama gibi tüm üretim aşamalarında gıdayı kontamine edebilmektedir. Patojen bakterileri kontrolünde İyi Üretim Uygulamaları (Good Manufactoring Practices - GMP), Kritik Kontrol Noktalarında Tehlike Analizleri (Hazard Analysis Critical Control Points – HACCP) ve diğer risk değerlendirme uygulamalarının yetersiz kalmaktadır. Uygun olmayan antibiyotik kullanımının antibiyotiğe dirençli bakterilerin oluşmasına sebep olduğu için mevcut antibiyotikler bu bakterilerin tedavisinde etkili olmamıştır. Hem halk sağlığını korumak hem de "minimum işlem görmüş ve kimyasal madde içermeyen ürün" talep eden tüketicinin talebini karşılamak için alternatif kontrol yöntemlerine ihtiyaç duyulmuştur. Bakteriyofajlar ile bakteriyel patojenlerin biyokontrolü bu alternatif yöntemler arasında yer almaktadır. 
Bu tez çalışmasında daha önceki çalışmalar kapsamında izole ve karakterize edilmiş Escherichia coli O157:H7'ye litik etkili M8AEC16 bakteriyofajının kriyoprotektanlardan gliserin, yağsız süt tozu ve karregen kullanılarak +4°C, -20°C ve -85°C'deki muhafazası esnasında 6 ay süresince stabilitesinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, Escherichia coli O157:H7'nin biyokontrolüne yönelik geliştirilmiş olan M8AEC16 bakteriyofajı Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895 aktive edilerek zenginleştirilmiştir. Çoğaltılan fajların titresi faj süspansiyonunun seri dilüsyonları yapıldıktan sonra çift katlı LB agara spot ekimler yapılarak belirlenmiştir. Elde edilen faj süspansiyonlarına ayrı ayrı 3 farklı kriyoprotektan madde katılarak (gliserol, yağsız süt tozu ve jelleştirici olarak karregen) hazırlanan faj süspansiyonları 3 farklı muhafaza sıcaklığında (+4°C, -20°C ve -85°C) 6 ay boyunca gözlemlenmiştir. Muhafaza süresince 0.gün, 1.ay, 2.ay, 3.ay, 4.ay, 5.ay ve 6.aylarda faj süspansiyonlarından seri dilüsyonlar yapılarak çift katlı LB agarda faj titreleri belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar pob/ml olarak hesaplanarak başlangıç titreleriyle karşılaştırılmış ve faj sayısında meydana gelen değişiklikler kaydedilerek fajların muhafaza süresince stabiliteleri araştırılmıştır. 
Çalışma sonucunda ilk iki ay boyunca tüm gruplarda tüm sıcaklıklarda stabilitenin korunduğu görülmüştür. Ancak gliserol eklenen grupta -85°C'de üçüncü ve dördüncü aylarda bakteriyofaj sayısında azalma gözlenmiştir. Kontrol grubunun yanı sıra beşinci ayda tüm sıcaklıklarda en yüksek korumayı karregen sağlamıştır. Altıncı ayda karregen ve yağsız süt tozu eklenmiş faj stoklarına göre +4°C gliserol en iyi korumayı sağlarken, diğer sıcaklıklarda en yüksek korumayı karregen sağlamıştır.
Sonuç olarak E. coli O157:H7 litik fajı M8AEC16'nın muhafazasında; maliyet, kullanışlılık ve etkinlik göz önüne alındığında en başarılı sonucun +4°C'de kriyoprotektansız grupta elde edildiği görülmüştür. Kriyoprotektanlı gruplarda ise en iyi muhafazanın gliserol varlığında +4 ve -20°C'de olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Bacterial pathogens are of serious importance to public health. These pathogens can contaminate food at all production stages such as slaughtering, milking, fermentation, packaging and storage. The inadequacy of Good Manufacturing Practices (GMP), Hazard Analysis Critical Control Points (HACCP) and other risk assessment practices in controlling pathogenic bacteria, inappropriate antibiotic use and antibiotic-resistant bacteria. Since existing antibiotics are not effective in the treatment of these bacteria, alternative control methods are needed to both protect public health and meet the demand of consumers who demand "minimally processed and chemical-free products". Biocontrol of bacterial pathogens with bacteriophages is among these alternative methods. In this thesis study, bacteriophage M8AEC16, which is lytic to Escherichia coli O157:H7, isolated and characterized within the scope of our previous studies, was used to determine the stability during 6 months of storage at +4°C, -20°C and -85°C using glycerol, skimmed milk powder and carrageenan as cryoprotectants. For this purpose, bacteriophage M8AEC16, was enriched by with E. coli O157:H7 ATCC 43895 and then phage suspension groups were prepared by adding three different cryoprotectants (test groups) in addition to without cryoprotectant (control). Bacteriophage suspensions were stored at 3 different storage temperatures (+ 4°C, -20°C and -85°C) for six mount period. During storage, phage titers were determined on double-layer LB agar by making serial dilutions of phage suspensions on the 0th day and at the end of each month. As a result of the study, it was observed that stability was maintained at all temperatures for all groups during the first two months. However, in the third and fourth months, a decrease in the number of bacteriophage was observed at -85°C in glycerol added group. In addition to the control group, in the fifth month, carrageenan provided the highest preservation at all temperatures. In the sixth month, +4°C glycerol provided the best preservation, while carrageenan provided the highest preservation at other temperatures compared to the other test groups. In conclusion considering the cost, usefulness and effectiveness in protecting E. coli O157:H7 phage M8AEC16, the most successful result was obtained in the group without cryoprotectant at +4°C. In the cryoprotectant groups, glycerol was determined to be at +4 and -20°C.