Yumurtaya verilen Monosodyum Glutamat'ın tavuk embriyolarında merkezi sinir sistemi organlarının embriyonik gelişimi üzerindeki etkilerinin belirlenmesi
The determination of the effects of in ovo administrated Monosodium Glutamat on the embryonic development of central nervous system organs in chicken embryos
Yazar: FERHAN BÖLÜKBAŞ
Danışman: PROF. DR. YASEMİN ÖZNURLU
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Beyin = Brain ; Embriyo = Embryo ; Embriyo gelişimi = Embryonic development ; Merkez sinir sistemi = Central nervous system ; Serebellum = Cerebellum ; Sodyum glutamat = Sodium glutamate ; Tavuklar = Chickens ; Toksisite = Toxicity ; Yumurtalar = Eggs

Özet:
Bu çalışmada, lezzet arttırıcı gıda katkı maddesi olarak oldukça fazla kullanılan monosodyum glutamatın (MSG), beyin ve beyincik dokusunun embriyonik gelişimi üzerindeki etkilerinin histolojik, histometrik ve immunohistokimyasal metodlarla belirlenmesi amaçlanmaktadır.
Bu çalışmada 410 adet döllü tavuk yumurtası kullanıldı. Yumurtalar kontrol, distile su, 0,12, 0,6 ve 1,2 mg/g yumurta MSG olmak üzere beş gruba ayrıldı ve enjeksiyonlar kuluçka başlangıcında yumurta sarısına yapıldı. Kuluçkanın 15, 18, 21. günlerinde her gruptan rastgele seçilen 10'ar adet yumurta açılarak, elde edilen embriyoların gelişme evreleri Hamburger-Hamilton skalası'na (H-H) göre belirlendi. Embriyolar hassas terazi ile tartıldı ve tepe-kıç uzunlukları (Crown-Rump Length, CRL) dijital kumpasla ölçüldü. Embriyoların rölatif ağırlıkları [(embriyo ağırlığı/yumurta ağırlığı)x100] tespit edildi. Embriyolardan beyin ve beyincik doku örnekleri alınarak %10'luk formolde tespit edildikten sonra rutin histolojik yöntemlerle parafinde bloklandı. Bloklardan alınan 6 μm kalınlığındaki kesitler Hematoksilen Eozin, Toluidine Blue, Kluver-Barrera, Periyodik Asit Schiff ve Crossmon'ın üçlü boyama yöntemi ile boyandı. Ayrıca alınan kesitlerde PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) immünohistokimyasal yöntemle demonstre edildi. Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobu altında incelendi. Beyin ve beyincik dokularının histopatolojik değerlendirmeleri yapılarak, beyincik dokusunda histometrik ölçümler gerçekleştirildi.
MSG gruplarındaki mortalitenin kontrol ve distile su gruplarına göre yüksek olduğu, en yüksek mortalitenin ise 0,6 mg/g yumurta MSG grubunda olduğu tespit edildi (p<0,05). MSG gruplarında, embriyonik gelişme geriliği ve abdominal herni, unilateral anoftalmia, hemoraji, beyin malformasyonu, bacak ve parmaklarda kıvrılma gibi farklı yapısal anomaliler gözlendi. Kuluçkanın 18 ve 21. günlerinde rölatif embriyo ağırlığı ve civciv ağırlığının MSG gruplarında kontrol grubuna göre önemli derecede düşük olduğu tespit edildi (p<0,05).
Yapılan histopatolojik değerlendirmelerde beyin dokusunda tüm embriyonik dönemlerde MSG'nin hiperpaliumda, optik tektumda ve hipokampuste; nöronlarda dejenerasyon, nöronofaji, gliozis, nekroz,  damarlarda hiperemi ve ödem gibi histopatolojik değişikliklere neden olduğu tespit edildi. Beyin ve beyincik preparatlarında yapılan semikantitatif değerlendirmelere göre MSG gruplarında nöronal nekrozun artmış olduğu dikkati çekti (p<0,05).
Beyincik dokusunda tüm embriyonik dönemlerde Purkinje hücre sayısının MSG gruplarında kontrol ve distile su gruplarına göre azaldığı tespit edildi (p<0,05). Yapılan histometrik ölçümler sonucunda inkübasyonun 15. ve 21. gününde MSG gruplarında dış granüler ve iç granüler katman kalınlığının belirgin bir şekilde azaldığı, 15. günde hem tepe hem dip ölçümlerinde, 21. günde ise sadece tepe ölçümlerinde moleküler katman kalınlığının arttığı dikkati çekti (p<0,05). İnkübasyonun 18. gününde elde edilen embriyolarda yapılan histometrik ölçümler sonucunda dış granüler katman kalınlığının foliumların hem tepe hem de dip kısmında belirgin bir şekilde azaldığı, moleküler katman kalınlığının ise sadece folyumların tepe kısmında MSG gruplarında artmış olduğu dikkati çekti (p<0,05).
Beyin ve beyincik dokusunda PCNA pozitif hücrelere inkübasyonun 15, 18 ve 21. günlerinde rastlandı. Beyinde PCNA pozitif hücreler hiperpaliumda, optik tektumda ve hipokampuste gözlenirken, MSG gruplarında PCNA (+) hücre yoğunluğunun daha fazla olduğu dikkati çekti. Beyincikte ise PCNA pozitif hücrelere dış ve iç granüler katmandaki hücrelerde, Purkinje hücrelerinde ve moleküler katmandaki hücrelerde rastlandı. MSG gruplarında dış granüler katmandaki kompakt yapının bozulduğu, Purkinje hücrelerinin organizasyonunun bozuk olduğu ve Purkinje hücrelerindeki PCNA pozitivitesinin çekirdeğin yanında sitoplazmada da bulunduğu dikkati çekti.
Sonuç olarak kuluçka başlangıcında yumurta sarısına verilen MSG'nin embriyoların gelişimini olumsuz yönde etkileyebileceği, çeşitli malformasyonlara ve merkezi sinir sitemi üzerinde histopatolojik değişikliklere neden olabileceği tespit edilmiştir. MSG'nin gıda katkı maddesi olarak kullanımının kontrol altına alınması, yüksek dozlarda uzun süreli tüketilmemesi ve özellikle de gebelik döneminde kullanılmaması canlının ileriki yaşamı açısından önemlidir. Elde edilen bilimsel veriler gıda katkı maddelerinin kullanımıyla ilgili yasal düzenlemelerin yeniden gözden geçirilmesine katkıda bulunabilecektir.

Abstract:
The aim of this study is to the determination of effects of MSG, flavor enhancer food additive that is commonly used, on embryonic development of brain and cerebellum by means of histological, histometrical and immunohistochemical methods. 
For this purpose, 410 fertilized chicken eggs were used for this study. The eggs were divided into 5 groups as control distilled water, 0,12, 0,6 and 1,2 mg/g egg MSG, and injections were performed via the egg yolk just before the incubation. On the 15th, 18th and 21st days of incubation, 10 eggs were opened from each group. Development stages were determined according to Hamburger-Hamilton scale. Embryos are weighed with precision scales and crown-rump lengths (CRL) were measured with a digital callipers. Relative embryo weights [(Embryo weight/egg weight)x100] were determined.  Brain and cerebellum tissue samples were taken from the obtained embryo and fixed 10% formol. Tissue samples were embedded in the paraffin after routine histological procedures. Cross-sections of the blocks were stained with, Hematoxylin-Eosin, Toluidine blue, Kluver-Barrera, Periodic Acid Schiff and Crossmon's Triple staining method was performed. Also, sections taken from tissue samples were stained with PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) immunohistochemical staining method. The slides were examined under a light microscope. Histopathological evaluations of brain and cerebellum tissues were performed and histometric measurements were made in cerebellum tissue. 

The mortality in the MSG-treated groups was found to be significantly (p<0,05) higher than control and distilled water, and mortality of 0.6 mg/g egg MSG-treated group was found the highest. In the MSG-treated groups showed the embryonic growth retardation and various structural abnormalities such as abdominal hernia, unilateral anophthalmia, hemorrhage, brain malformation, curling of legs and fingers. The the relative embryo weights and body weights of the MSG-treated groups were significantly lower than that of the control group on days of incubation 18 and 21, respectively (p<0,05). 
Histopathological evaluations revealed that MSG caused histopathological changes such as degeneration in neurons, neuronophagia, gliosis, necrosis, vascular hyperemia and edema in brain all embryonic periods. According to the semiquantitative evaluations of brain and cerebellum, there was a significant increase in neuronal necrosis in MSG-treated groups (p<0,05).
In all embryonic periods, the number of Purkinje cells in the cerebellum tissue decreased in MSG-treated groups (p<0,05). As a result of the histometric measurements, it was observed that the thickness of the outer granular and inner granular layers significantly decreased in the MSG groups on the 15th and 21st days of the incubation, and the molecular layer thickness increased on the 15th days both in the summit and fissure of the folium. On the 21st day, only the summit measurements showed an increase in the molecular layer thickness (p<0,05). Histometric measurements of embryos obtained on the 18th day of the incubation showed that the thickness of the outer granular layer significantly decreased on both the summit and fissure of the folium, while the molecular layer thickness increased only in the MSG-treated groups at the summit of the foliums (p<0,05).
PCNA positive cells in brain and cerebellum tissue were detected on days 15, 18 and 21 of incubation. PCNA positive cells in the brain were found in hyperpalium, optic tectum and hippocampus and PCNA (+) cell density was higher in MSG-treated groups. In the cerebellum, PCNA positive cells were found in both outer and inner granular layer cells, Purkinje cells, and molecular layer cells. It was observed that the compact structure of the outer granular layer was disrupted in MSG-treated groups, the organization of Purkinje cells was impaired. Also, PCNA positivity in Purkinje cells was observed in both nucleus and cytoplasm in all MSG-treated groups.  
In conclusion, it was determined that in ovo administrated MSG just before incubation may adversely affect the development of embryos and may cause various malformations and histopathological changes on central nervous system organs in chicken embryos. It is suggested that the use of MSG as a food additive for a long time should be limited at least during pregnancy. The scientific data obtained from this study may contribute to the revision of the legal regulations on the use of the other food additives.