Periodontal hastalığa sebep olan periodontal patojenlerin klorhekzidin karbon dot bağlı kitosan nanopartiküller ile antibakteriyel etkinliğinin incelenmesi
Investigation of the antibacterial effectiveness of chlorhexidin carbon dot loaded chi̇tosan nanoparticles agai̇nst periodontal pathogens to cause periodontal disease
Yazar: KUDRET SARI
Danışman: PROF. DR. VAROL ÇANAKÇI
Ordu Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Periodontoloji Ana Bilim Dalı / Periodontoloji Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2023
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry

Özet:
Amaç: Periodontitis, halk sağlığını tehdit eden yaygın bir oral enfeksiyon hastalığıdır. Gerek mekanik tedavi gerekse mekanik tedaviye ek olarak uygulanan yardımcı tedavi yöntemleri ile periodontitis hastaları tedavi edilmeye çalışılmakta olmasına rağmen mevcut durum henüz net bir başarı sağlama noktasına varmaktan uzaktır.
       Altın standart olan mekanik tedaviye ek olarak bugüne kadar sistemik antibiyotikler, antiseptik gargaralar, lokal antimikrobiyal ajanlar, konak modülasyon yöntemleri gibi birçok tedavi yöntemi üzerinde durulmuş ve bunlardan belirli ölçülerde yarar sağlanmıştır. Ancak hem bazı tedavi yöntemlerinin istenmeyen yan etkilere neden olması hem de başka etkenlerden dolayı istenen antimikrobiyal etkinlik seviyesine çıkılamaması, günümüzde yeni tedavi yöntemi arayışına sebep olmuştur.
       Birçok alanda olduğu gibi nanoteknoloji, diş hekimliği ve özellikle periodontitis ile mücadele alanında da artık kendisine oldukça büyük bir yer bulmaya başlamıştır. Klasik medikamanların bakteriye direnç gelişimi, istenmeyen sistemik etkiler, ilacın hedef bölgede yeterli konsantrasyona ulaşamaması gibi bilinen birçok dezavantajı, nanopartiküller ile uygulanan tedavilerde ortadan kalkmış durumdadır.
       Biz yaptığımız bu çalışma ile nano düzeyde sentezlemiş olduğumuz Klorheksidin Karbon Dot bağlı Kitosan nanopartiküllerini, periodontal yıkımlara sebep olan mikroorganizmalara karşı antibakteriyel ajan olarak kullanmayı, bu sayede klasik medikamanların zayıf terapötik etki, istenmeyen yan gibi dezavantajlarını devre dışı bırakmayı amaçladık. 
       
       Gereç ve Yöntem: Öncelikle nihahi antibakteriyel ajanımız olan Klorheksidin Karbon Dot bağlı Kitosan Nanopartikül sentezi gerçekleştirildi.
       Bunun için ilk olarak %0,02 gr Klorheksidin Glukonat ve 0,2 g Sodyum Sitrik Asit, belirli işlemlere tabi tutularak Klorheksidin Karbon Dot sentezi gerçekleştirildi.   
       Kitosan nanopartiküllerin bottom-up sentezi, daha önce Calvo ve arkadaşları (Calvo ve ark.. 1997) tarafından tarif edildiği gibi iyonik jelleşme yöntemi kullanılarak ancak üzerinde küçük modifikasyonlar yapılarak gerçekleştirildi. Kitosan nanoparçacıkları, iyonotropik jelleşme yönteminde bir iyonik çapraz bağlayıcı kullanılarak tasarlandı. Genel olarak, iyonik çapraz bağlayıcı olarak tripolifosfat (TPP) kullanıldı. Bu işlem yapılırken ortama daha önce sentezlenmiş olan Klorheksidin Karbon Dot bileşeni de koyuldu ve Kitosanın nano boyuta geçerken Klorheksidin Karbon Dot bileşiklerini de içinde ya da yüzeyinde hapsetmesi sağlandı. Böylece Klorheksidin Karbon Dot bağlı Kitosan (CHX-CD/CS) nanopartiküller sentezlenmiş oldu.
       Ardından Streptococcus salivarius ATCC 13419, Streptococcus mutants ATCC 35668: Aggregatibacter actinomycetemcomitans DSM 111263, Provetella intermedia DMS 20706 izolatları kullanıldı. Standart bakteri izolatları derin dondurucudan çıkartılarak oda ısısında bekletilerek çözüldü. Kanlı agar (Merck) ve Eosin Methylene Blue Agar (EMB, Merck) besiyerleri kullanılarak 37°C'de bir gece inkübe edilerek bakteriler canlandırıldı ve saflık kontrolleri yapıldı.
              Sentezlemiş olduğumuz CHX-CD/CS nanopartiküllerinin,  bu bakteriler üzerindeki antibakteriyel etkinliğini ve her bir bakteri için Minimum İnhibitör Konsantrasyon değerlerini öğrenmek için Muller–Hinton Broth (MHB, Merck,) sıvı besiyeri kullanılarak çift kat seri sulandırım mikrodilüsyon sıvı test metodu (Broth Mikrodilüsyon Yöntemi) kullanıldı.
       Bulgular: CHX-CD/CS nanopartiküllerin karakterizasyon analiz bulgularına erişmek için öncelikle nanopartiküllerin karakteristik UV-vis spektrumlarına bakılmıştır. Hem CHX-CD hem de CHX-CD/CS nanopartiküllerinin ayrı ayrı UV-vis absorbsiyon spektrumları karşılaştırılmış ve elde edilen sonuçlar nano malzememizin, iki malzemenin karışımı olan tek dağılımlı bütün bir nanomalzeme olduğunu göstermiştir.
       Malzememizin Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) analiz sonuçları elde edilmiş ve ilgili verilerle SEM-EDX Element analizi ve SEM Elemental Haritalandırma yapılmıştır. Bu teknikler ile malzememizde bulunan C,O,N,Cl elementlerinin oran ve dağılım bulguları elde edilmiştir.
       Geçirmeli Elektron mikroskobuna (TEM) göre, esas olarak tek dağılmış CHX-CD/CS nanopartiküllerinin küresel yapıda oldukları ve çaplarının 20-30 nm arasında olduğu görülmüştür. Sonuç olarak sentezlenen nanopartiküllerin nano boyutta başarılı bir şekilde sentezlendiği doğrulanmıştır.
       
       Sonuç: Streptococcus Salivarius, Streptococcus Mutans ve Prevotella İntemedia bakterilerinin bulunduğu oyuntu sıralarında, oyuntulara uygulanan CHX-CD/CS nanopartikül solüsyon konsantrasyonları 10. oyuntudan 1. oyuntuya doğru düzenli olarak artmış olmasına rağmen, ancak 2. oyuntuda MİK değerine ulaşılabilmiştir.
       Bu üç bakteri için, bizim sentezlemiş olduğumuz CHX-CD/CS nanopartiküler antibakteriyel ajanın MİK değeri 2500 μg/ml olarak bulunmuştur.
       Aggregatibacter Actinomyhetemcomitans (A.a) bakterisinin bulunduğu sırada ise MİK değeri 19,5 μg/ml olarak saptanmıştır.
       Elde edilen bulgular, nano düzeyde sentezlemiş olduğumuz terapötik ajanımızın Aggregatibacter Actinomyhetemcomitans bakterisine karşı oldukça etkili olduğunu göstermektedir.
       Anahtar Kelimeler: periodontitis, periodontal patojen bakteriler, periodontal tedavi, klorheksidin, nano partikül, karbon dot nanopartikül, kitosan nanopartikül

Abstract:
Aim: Periodontitis is a common oral infectious disease that threatens public health. Although efforts are being made to treat periodontitis patients with both mechanical treatment and auxiliary treatment methods applied in addition to mechanical treatment, the current situation is far from achieving a clear success.
       In addition to the gold standard mechanical treatment, many treatment methods such as systemic antibiotics, antiseptic mouthwashes, local antimicrobial agents, and host modulation methods have been discussed and some benefit has been obtained from them. However, the fact that some treatment methods cause undesirable side effects and that the desired antimicrobial activity level cannot be reached due to other factors has led to the search for new treatment methods today.
       As in many fields, nanotechnology has started to find a place for itself in dentistry and especially in the fight against periodontitis. Many of the known disadvantages of classical medicaments, such as the development of bacterial resistance, undesirable systemic effects, and the inability of the drug to reach sufficient concentration in the target region, have disappeared in the treatments applied with nanoparticles.
       In this study, we aimed to use Chlorhexidine Carbon Dot-linked Chitosan nanoparticles, which we synthesized at the nano level, as an antibacterial agent against microorganisms that cause periodontal destruction, thus eliminating the disadvantages of classical medicaments such as weak therapeutic effect and undesirable side effects.
    
Material and Methods: First of all, our final antibacterial agent Chlorhexidine Carbon Dot loaded Chitosan Nanoparticle synthesis was performed. 
       For this, firstly, 0.02% g Chlorhexidine Gluconate and 0.2 g Sodium Citric Acid were subjected to certain processes and Chlorhexidine Carbon Dot synthesis was carried out.
       Bottom-up synthesis of chitosan nanoparticles was performed using the ionic gelation method as previously described by Calvo ve ark.. (Calvo ve ark.. 1997), but with minor modifications. Chitosan nanoparticles were designed using an ionic crosslinker in the ionotropic gelation method. Generally, tripolyphosphate (TPP) was used as the ionic crosslinker. While this process was being done, the previously synthesized Chlorhexidine Carbon Dot component was also added to the environment and it was ensured that the Chlorhexidine Carbon Dot compounds were trapped inside or on the surface while Chitosan went to nano size. In this way, Chlorhexidine Carbon Dot loaded Chitosan (CHX-CD/CS) nanoparticles were synthesized.
       Then, isolates of Streptococcus salivarius ATCC 13419, Streptococcus mutants ATCC 35668: Aggregatibacter actinomycetemcomitans DSM 111263, Provetella intermedia DMS 20706 were used. Standard bacterial isolates were removed from the freezer and thawed at room temperature. Bacteria were revived and purity controls were made by incubating overnight at 37°C using blood agar (Merck) and Eosin Methylene Blue Agar (EMB, Merck) media.
       In order to learn the antibacterial activity of the CHX-CD/CS nanoparticles we synthesized on these bacteria and the Minimum Inhibitory Concentration values for each bacteria, a double-layer serial dilution microdilution liquid test method using Muller–Hinton Broth (MHB, Merck,) broth (Broth Microdilution Method) ) was used.
       Results: In order to reach the characterization analysis findings of CHX-CD/CS nanoparticles, the characteristic UV-vis spectra of the nanoparticles were examined first. The UV-vis absorption spectra of both CHX-CD and CHX-CD/CS nanoparticles were compared and the results showed that our nanomaterial is a monodisperse whole nanomaterial that is a mixture of two materials.
       Scanning Electron Microscopy (SEM) analysis results of our material were obtained and SEM-EDX Elemental Analysis and SEM Elemental Mapping were performed with the relevant data. With these techniques, the ratio and distribution findings of C,O,N,Cl elements in our material were obtained.
       According to the Transmission Electron Microscopy (TEM), it was observed that mainly monodispersed CHX-CD/CS nanoparticles were spherical in shape and their diameters were between 20-30 nm. As a result, it was confirmed that the synthesized nanoparticles were successfully synthesized at the nanoscale.
       Conclusions: Although the concentrations of CHX-CD/CS nanoparticle solution applied to the grooves in the gully lines where Streptococcus Salivarius, Streptococcus Mutans and Prevotella Intemedia bacteria were found regularly increased from the 10th to the 1st gully, the MIC value could only be reached in the 2nd gully.
        For these three bacteria, the MIC value of the CHX-CD/CS nanoparticulate antibacterial agent we synthesized was found to be 2500 μg/ml.
       The MIC value of Aggregatibacter Actinomyhetemcomitans (A.a) bacteria was determined as 19.5 μg/ml.
       The findings show that our therapeutic agent, which we have synthesized at nano level, is highly effective against Aggregatibacter Actinomyhetemcomitans bacteria.
       Keywords: periodontitis, periodontal pathogenic bacteria, periodontal therapy, chlorhexidine, nanoparticle, carbon dot nanoparticle, chitosan nanoparticles