Flukonazol dirençli candida parapsilosis kompleks izolatlarında virülans özellikleri ve çeşitli ilaç kombinasyonlarının etkileri
Virulence characteristics and effects of various drug combinations in fluconazole-resistant candida parapsilosis complex isolates
Yazar: HELİN JASAD
Danışman: DOÇ. DR. FETHİYE FERDA YILMAZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Candida'lar insanlarda patojen olan fungal etkenler arasında en sık görülen organizmalardır ve önemi giderek artmaktadır. Candida türleri arasında C. parapsilosis kandidemiye en sık neden olan dört etkenden biridir. Bağışıklık sistemi baskılanmış hastaların sayısındaki artışla birlikte, fırsatçı mantar enfeksiyonları ve buna bağlı olarak antifungal ilaç kullanımı artmıştır. Özellikle tek ilaç tedavisine cevap vermeyen hastalarda ya da dirençli suşların varlığında kombinasyon tedavisi düşünülebilir. Çalışmamızda, klinik örneklerden izole edilen Candida parapsilosis kompleks izolatlarında bazı virülans faktörleriyle flukonazol direnci arasında ilişki olup olmadığı ve flukonazol ile asetilsalisilik asit, kortikosteroidlerden deksametazon ve metilprednizolon kombinasyonlarının etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. 
Aralık 2018-Mart 2022 tarihleri arasında, İzmir Katip Çelebi Üniversitesi Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı'na gelen kan örneklerinden izole edilen ve flukonazole dirençli olduğu tespit edilen 45 C. parapsilosis kompleks izolatı çalışmaya dahil edildi. Çalışmamızda izolatların flukonazole duyarlılıkları ayrıca Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri Komitesi (EUCAST) önerileri doğrultusunda sıvı mikrodilüsyon testi ile de belirlendi. Virülans özelliklerinden biyofilm üretimi spektrofotometrik mikroplak kristal viyole yöntemi ile, esteraz aktivitesi Tween 80 agar, proteinaz aktivitesi sığır serum albümini katkılı agar, fosfolipaz aktivitesi yumurta sarılı agar, hemolitik aktivite koyun kanı ve glikoz ilaveli Sabouraud dekstroz agar besiyeri kullanılarak incelendi. Ayrıca seçilen bazı izolatlarda ilaç kombinasyonlarının etkisi dama tahtası (chequerboard) ve zaman-ölüm (time-kill) yöntemleriyle değerlendirildi. İlaç kombinasyonlarının biyofilm üzerine etkisi dama tahtası ve kristal viyole yöntemleriyle belirlendi. Virülans özellikleri ve flukonazol duyarlılıkları ile edilen verilerin normal dağılıma uygunluğu Shapiro-Wilk normallik testi ile, değerlerin korelasyon analiz Spearman testi ile araştırıldı.
Mikrodilüsyon testi verilerine göre 45 C. parapsilosis kompleks izolatından 38'i flukonazole dirençli bulundu. Diğer çalışmalara sadece bu testle dirençli bulunan izolatlarla devam edildi. Virülans özellikleri araştırıldığında, esteraz aktivitesinin %92,11; proteinaz aktivitesinin %39,47; hemolitik aktivitenin %34,21; biyofilm oluşturma yeteneğinin %84,21 oranında olduğu görülürken, izolatların hiçbirinde fosfolipaz aktivitesi görülmedi. İstatistiksel değerlendirmede flukonazol MİK değerleri ile esteraz aktivitesi arasında negatif yönlü, orta düzeyde anlamlı bir ilişki bulunduğu, diğer yandan proteaz aktivitesi, hemolitik aktivite ve biyofilm oluşumu ile flukonazol MİK değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olmadığı tespit edilmiştir. Biyofilm oluşturma kapasitesi ile esteraz ve proteaz aktiviteleri arasında ise negatif yönlü, orta düzeyde anlamlı bir ilişki olduğu gözlenmiştir.
Flukonazol ile diğer ilaçların kombinasyonları, seçilen beş izolat üzerinde dama tahtası yöntemiyle test edildiğinde, hesaplanan fraksiyonel indeks değerlerine göre etkisiz bulundu. Aynı mikroplakların inkübasyon süreleri uzatılarak absorbans değerleri izlendiğinde bazı izolatlarda ilerleyen saatlerde, içinde kombine ilaç olan kuyucuklarda inhibisyon etkisinin devam ettiği gözlendi. Zaman-ölüm yöntemine göre çalışılan iki izolatta ise flukonazolün tek başına kullanıldığında oluşturduğu inhibisyon etkisine hiçbir kombinasyon ile ulaşılamadı. Güçlü biyofilm oluşturan dört izolatta, ilaç kombinasyonlarının biyofilm oluşumu üzerine etkileri değerlendirildiğinde, ilaç kombinasyonu etkisiyle bazı izolatların farklı zamanlarda, zayıf veya orta düzey biyofilm oluşturduğu gözlendi.
Sonuç olarak, özellikle yoğun bakım ünitelerinde ve immün sistemi baskılanmış bireylerde giderek daha fazla soruna yol açan C. parapsilosis kompleks izolatlarında virülans özelliklerinin, etkili yeni ilaç kombinasyonları ve tedavi seçeneklerinin araştırıldığı az sayıda araştırmaya rastlanmıştır. Bu çalışmanın literatüre katkı sağlaması ve bu alanda yapılacak yeni çalışmaları teşvik etmesi beklenmektedir.

Abstract:
Candida are the most common organisms among fungal pathogens in humans and their importance is increasing. Among Candida species, C. parapsilosis is one of the four most common causative agents of candidemia. With the increase in the number of immunocompromised patients, opportunistic fungal infections and consequently the use of antifungal drugs have increased. Combination therapy may be considered especially in patients who do not respond to single drug treatment or in the presence of resistant strains. The aim of this study was to investigate whether there is a relationship between some virulence factors and fluconazole resistance in Candida parapsilosis complex isolates from clinical specimens and the effects of fluconazole in combination with acetylsalicylic acid, dexamethasone and methylprednisolone from corticosteroids. 
Between December 2018 and March 2022, 45 fluconazole-resistant C. parapsilosis complex isolates isolated from blood samples received to the Department of Microbiology Laboratory of İzmir Katip Çelebi University Atatürk Training and Research Hospital were included in the study. In our study, fluconazole susceptibilities of the isolates were also determined by liquid microdilution test in accordance with the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) recommendations. Biofilm production was determined by spectrophotometric microplate crystal violet method, esterase activity by Tween 80 agar, proteinase activity by bovine serum albumin supplemented agar, phospholipase activity by egg yolk agar, haemolytic activity by sheep blood and glucose supplemented Sabouraud dextrose agar media. In addition, the effect of drug combinations on some selected isolates was evaluated by chequerboard and time-kill methods. The effect of drug combinations on biofilm was determined by checkerboard and crystal violet methods. Virulence characteristics and fluconazole susceptibility data were analysed by Shapiro-Wilk normality test and correlation analysis was performed by Spearman test.
According to the microdilution test data, of 45 C. parapsilosis complex isolates were resistant to fluconazole. Further studies were continued only with isolates found resistant by this test. When virulence properties were investigated, esterase activity was 92.11%, proteinase activity was 39.47%, haemolytic activity was 34.21%, biofilm forming ability was 84.21% and no phospholipase activity was observed in any of the isolates. In the statistical evaluation, it was determined that there was a negative, moderately significant relationship between fluconazole MIC values and esterase activity, while there was no statistically significant relationship between protease activity, haemolytic activity and biofilm formation and fluconazole MIC values. It was observed that there was a negative, moderately significant relationship between the capacity to form biofilm and esterase and protease activities.
The combinations of fluconazole and other drugs were found to be ineffective according to the calculated fractional index values when tested by checkerboard method on five selected isolates. When the incubation times of the same microplates were prolonged and the absorbance values were monitored, it was observed that in some isolates, the inhibition effect continued in the wells containing the combined drug in the following hours. In two isolates studied according to the time-death method, the inhibition effect of fluconazole when used alone could not be reached with any combination. When the effects of drug combinations on biofilm formation in four isolates that formed strong biofilms were evaluated, it was observed that some isolates formed weak or moderate biofilms at different times with the effect of drug combinations.
In conclusion, there are few studies investigating virulence properties, effective new drug combinations and treatment options in C. parapsilosis complex isolates, which cause more and more problems especially in intensive care units and immunocompromised individuals. This study is expected to contribute to the literature and encourage new studies in this field.