Deneysel PKOS modelinde mıf antagonisti ıso-1'in olası tedavi edici etkilerinin histolojik ve moleküler olarak incelemesi
Histologic and molecular investigation of possible therapeutic effects of mif antagonist iso-1 in an experimental PCOS model
Yazar: İLAYDA KAYA
Danışman: PROF. DR. ALTUĞ YAVAŞOĞLU
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Polikistik over sendromu (PKOS), üreme çağındaki kadınlarda yaygın görülen bir endokrin sistem bozukluğudur. Son 20 yılda PKOS üzerine yapılan çalışmalar, bu durum hakkındaki bilgileri arttırarak ilerlemeler sağlanmasında ve daha iyi tedavi yöntemleri geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Tüm ilerlemelere karşın PKOS'un patogenezi hala belirsiz olma durumunu korumaktadır.

PKOS üzerinde çok sayıda tedavi yaklaşımı geliştirilmesine rağmen, altta yatan moleküler mekanizmaların eksik anlaşılması ve birden fazla sinyal yolağını etkilemesi nedeniyle olumlu sonuçlar vermemiştir. Bununla birlikte, PKOS'tan etkilenen sinyal yolaklarını anlamak ve bu yolaklar için tedavi edici alternatifler oluşturmak çok önemlidir. PKOS patogenizinde işlev gördüğü bilinen yolaklardan bir tanesi hem hormonal hem de ovaryum morfolojisinde özellikle foliküler gelişim ve ovulasyon üzerinde etkili olduğu bilinen inflamasyon yolağıdır. Bu yolağa aracılık eden birçok farklı yolak ve moleküler mekanizma söz konusudur. Bunlardan bir tanesi çalışmada üzerinde durulan MIF proteini ve bu proteinin ovaryum üzerine etkisidir. 

Bu çalışmada, Balb-c türü dişi farelere (n=10 olacak şekilde 4 grup oluşturulmuştur) 21 gün boyunca 1 mg/kg Letrozol gavaj yöntemiyle verilerek oluşturulan PKOS modelinde, MIF inhibitörü ISO-1'in etkilerini incelemek üzere 14 gün boyunca 4 mg/kg ISO-1 intraperitonel olarak uygulanmıştır. Deney sonunda sakrifiye edilen deneklerden alınan ovaryum dokularında, histokimyasal olarak Hematoksilen-Eozin (H.E.), Masson Trikrom boyamaları ve immünohistokimyasal olarak TGF-β1, TNF-α, IL-6, MIF ve NF-κβ biyobelirteçleri analiz edilmiştir. Dokularda Real Time–PCR ile inflamasyona ve MIF genine yönelik RNA seviyesinde analizler gerçekleştirilmiştir. Deneklerden alınan serumlarda hormon seviyelerinin tespiti için LH ve FSH, ELISA tekniği uygulanmıştır. 


Deney sonucunda, kontrol ve deney grupları ovaryum dokuları stromal (fibrozis, stromal hücreler ve vasküler değişiklikler v.b) ve parankimal (ovaryan folikül, korpus luteum, kistik folikül, granüloza hücreleri, teka hücreleri, oosit v.b) alanlar genel histolojik parametreler açısından değerlendirilmiştir. H.E. boyaması ile kontrol ve ISO-1 gruplarında gelişmekte olan foliküller, granüloza hücreleri ve oluşturduğu tabakalar, teka hücreleri ve tabakaları ile korpus luteum yapılarının normal görünümde oldukları izlenmiştir. PKOS grubunda ovaryan foliküllerin yerine çok geniş bir lümen, kalın ve katlanmış granüler bir tabakayla karakterize kistik foliküllerin yaygın olduğu gözlenmiştir. PKOS+ISO-1 grubu histolojik olarak değerlendirildiğinde kontrol grubuna yakın histolojik özellikler görülmüştür. Bunlara ek olarak, tüm gruplarda normal ve kistik folikül sayımı yapılarak sayısal olarak ifadelendirilmiştir. Masson Trikrom boyamasında ise stromal alanlarda gruplar arasında histolojik farklılıklar görülmemiştir. İmmünohistokimyasal boyamalar ve RT-PCR analizlerinden elde ettiğimiz sonuçlar karşılaştırıldığında, PKOS oluşturulan deneklerde MIF inhibisyonunun ISO-1 ile gerçekleştirilmesi sonucunda ovaryumlarda folikülogenezi etkilediği ve bu etkileşimi MIF, TGF-β1, TNF-α ve IL-6 gibi proteinler aracılığıyla yaptığı düşünülmüştür.  Tüm sonuçlar dahilinde ISO-1'in deneysel PKOS modelinde folikülogenezi teşvik ettiği görülmektedir. 

Bu çalışma MIF inhibisyonunun sağlanmasına bağlı elde ettiğimiz sonuçlar ile PKOS hastalarında inflamatuar süreç üzerindeki etkisinin ortaya konulması açısından önemli bir çalışmadır.

Abstract:
Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common endocrine system disorder in women of reproductive age. Studies on PCOS over the last 20 years have increased knowledge about this condition, allowing for advances and the development of better treatment methods. Despite all these advances, the pathogenesis of PCOS remains unclear.
Although numerous treatment approaches have been developed for PCOS, they have not yielded positive results due to the lack of understanding of the underlying molecular mechanisms and the fact that they affect multiple signaling pathways. However, it is very important to understand the signaling pathways affected by PCOS and to develop therapeutic alternatives for these pathways. One of the pathways known to function in the pathogenesis of PCOS is the inflammation pathway, which is known to have an effect on both hormonal and ovarian morphology, especially follicular development and ovulation. There are many different pathways and molecular mechanisms that mediate this pathway. One of these is the MIF protein, which is emphasized in the study, and the effect of this protein on the ovary.
In this study, 1 mg/kg of Letrozole was administered to Balb-c type female mice (n=10, 4 groups were formed) for 21 days by gavage method in order to investigate the effects of MIF inhibitor ISO-1 in a PCOS model. At the end of the experiment, 4 mg/kg of ISO-1 was administered intraperitoneally for 14 days in order to investigate the effects of MIF inhibitor ISO-1. At the end of the experiment, ovarian tissues taken from the subjects who were sacrificed were analyzed histochemically by Hematoxylin-Eosin (H.E.), Masson Trichrome staining and immunohistochemically for TGF-β1, TNF-α, IL-6, MIF and NF-κβ biomarkers. RNA level analyses were performed in the tissues for inflammation and MIF gene by Real Time-PCR. LH and FSH ELISA technique was applied to determine hormone levels in the sera taken from the subjects.
At the end of the experiment, stromal (fibrosis, stromal cells and vascular changes etc.) and parenchymal (ovarian follicle, corpus luteum, cystic follicle, granulosa cells, teka cells, oocyte etc.) areas of ovarian tissues of control and experimental groups were evaluated in terms of general histological parameters. H.E. staining showed normal appearance of developing follicles, granulosa cells and their layers, theca cells and their layers and corpus luteum structures in the control and ISO-1 groups. In the PCOS group, cystic follicles characterized by a very large lumen and a thick and folded granular layer were observed instead of ovarian follicles. When the PCOS+ISO-1 group was evaluated histologically, histologic features similar to the control group were observed. In addition, normal and cystic follicles were counted in all groups and expressed numerically. Masson Trichrome staining showed no histologic differences between the groups in the stromal areas. When the results obtained from immunohistochemical staining and RT-PCR analysis were compared, it was concluded that MIF inhibition by ISO-1 affected folliculogenesis in the ovaries of PCOS-induced subjects and this interaction was thought to be mediated by proteins such as MIF, TGF-β1, TNF-α and IL-6.  In all results, ISO-1 appears to promote folliculogenesis in an experimental PCOS model. 
This study is an important study in terms of demonstrating the effect of MIF inhibition on the inflammatory process in PCOS patients.