Doksorubisin yüklü mikroköpükçüklerin meme kanserine etkisinin in-vitro iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) değerlendirilmesi
In vitro two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) evaluation of the effect of doxorubicin-loaded microbubbles on breast cancer
Yazar: MELEK AYDIN
Danışman: PROF. DR. SAFİYE AKTAŞ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Doksorubisin = Doxorubicin ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kapsüller = Capsules ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Üç boyutlu görüntüleme = Three dimensional imaging ; İlaç formülleri = Formularies ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers

Özet:
Amaç: Meme kanserinde kullanılan kemoterapötiklerin sistemik yan etkileri vardır. Bu yan etkilerin bertaraf edilmesi ya da azaltılması için son yıllarda hedeflendirilmiş tedavi stratejileri araştırılmaktadır. Ultrason kontrast ajanı mikroköpükçüklerin meme kanseri hücrelere hedeflendirilmesi ve bunlara meme kanseri tedavisinde kullanılan Doksorubisin (DOX) yüklenmesi, bu ajanların patlatılarak ilacın sonoporasyon etkisiyle doğrudan kanserli hücrelere aktarılması, ve kanserli hücrelerin bertaraf edilmeleri amaçlanmaktadır. Daha önceki çalışmalarımızda ultrason kontrast ajanı mikroköpükçüklerin üretilmiş, kemoterapötik ilaç olan DOX'un lipozomlar içerisine hapsedilmiş, DOX yüklü lipozomların mikroköpükçüklere bağlanmıştır. Bu çalışmada DOX yüklü mikroköpükçüklerin ve liposomal doksorubisinin in vitro meme kanseri hücre hatlarına iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) etkisi araştırılmıştır. Yöntem: Bu çalışmada DOX, LipoDOX ve DOX yüklü mikroköpükcüklerin meme kanseri üzerine etkileri in vitro iki ve üç boyutlu düzeyde araştırılmıştır. Bu amaçla farklı özelliklerdeki meme kanseri hücre hatları (4T1, MDA-MB231, MCF-7) iki ve üç boyutlu (matrijel tabanlı) üretilerek, değişik koşul, süre ve dozlarda sitotoksik ve hücre ölümü etkisi WST-1, tripan mavisi, koloni sayımı, Annexin V-PI İmmunhistokimyasal (Ki-67, kaspaz 3, 8,9) yöntemleri ile araştırılmıştır. Elde edilen bulgular non-parametrik testlerle p<0,05 düzeyinde istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır.
Bulgular: DOX uygulandıktan sonra her üç hücre hattında da proliferasyon indeksinin azaldığı ve intrinsik ve ekstrensik yolakların her ikisinin de aktiflendiği hem 2D hem de3D modelde tespit edilmiştir. Ancak bu etki 3D modelde DOX'un sferoidlerin içine difüzyonunun daha güç olması nedeniyle daha düşük düzeyde görülmüştür. Ayrıca 3D modellemenin meme kanseri hücre kültürü modeli açısından uygun olduğu oluşan duktus yapıları ve sferoidler ile desteklenmiştir. Mikroköpükçük deneylerin, mikroköpükçüklerin yüzeye çıkması ve 3D modelde büyük olmaları nedeniyle matrijelin altında kalmaları sonucu deneylere devam edilememiştir.
Sonuç: DOX, meme kanseri hücre kültüründe anti-proliferatif ve apoptoz indükleyici etki göstermektedir. Ancak bu etki; hücre hatlarının birbiri arasında ve 2D ile 3D modelleme türüne
göre değişmektedir. Bu nedenle 3D sferoid modellemesi özellikle ilaç etkinliği çalışması için oldukça önemlidir.
Anahtar Kelimeler: 3D hücre kültürü, meme kanseri, mikroköpükçük, ilaç taşınımı

Abstract:
Aim: Chemotherapeutics used in breast cancer have systemic side effects. In recent years, targeted treatment strategies have been investigated in order to eliminate or reduce these side effects. Mainly it is aimed to target ultrasound contrast agent micro-bubbles to breast cancer cells by loading doxorubicin (DOX) which is used in the treatment of breast cancer. In our previous studies, the ultrasound contrast agent was bound to the microbubbles were produced; DOX, a chemotherapeutic drug, was encapsulated in liposomes in the liposomes of DOX, and this structure was attached to microbubbles. In this study, two - dimensional (2D) and three - dimensional (3D) effects of DOX-loaded microbubbles and liposomal doxorubicin were investigated in in vitro breast cancer cell lines.
Method: In this study, the effects of DOX, LipoDOX and DOX-loaded microbubbles on breast cancer were investigated in in vitro two and three dimensional levels. For this purpose, breast cancer cell lines of different characteristics (4T1, MDA-MB231, MCF-7) were produced in two and three dimensions (matrijel-based). The cytotoxic effects of different doses and duration were evaluated by WST-1, trypan blue, colony forming assay, Annexin V-PI, and immunohistochemistry (Ki-67, caspase 3,8,9). The results obtained were statistically compared with nonparametric tests at p <0.05 level.
Results: After the DOX administration, both in the 2D and 3D models proliferation index were decreased and both intrinsic and extrinsic apoptotic pathways were activated in all three breast cancer cell lines. However, these effects were lower in the 3D model due to the insufficient diffusion of DOX into spheroids. However, 3D modeling was found suitable for breast cancer cell culture model as supported by formation of ductal structures and spheroids. Microbubble experiments could not be continued due to the fact that the floading of microbubbles in 2D and remaining above the matrigel as a result of their big sizes in 3D.
Conclusion: DOX shows anti-proliferative and apoptosis inducing effects in breast cancer cell culture. But this effect vary among different characterized cell lines and also according to 2D
and 3D modeling type. Therefore, 3D spheroid modeling is found to be important especially for drug efficacy studies.
Keywords: 3D cell culture, breast cancer, microbubbles, drug delivery