Headspace gaz kromatografi kütle spektrometresi kullanarak pediyatrik şurup ve süt örneklerinde benzoik asit tayini
Determination of benzoic acid in pediatric syrup and milk samples by headspace gas chromatography mass spectrometer
Yazar: NESLİHAN MÜDERRİSOĞLU KEFELİ
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ÖZCAN ; DR. ORHAN DESTANOĞLU
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Kimya = Chemistry
Dizin: Benzoik asit = Benzoic acid ; Gaz kromatografisi = Gas chromatography ; Gıda katkı maddeleri = Food additives ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Süt = Milk ; Şuruplar = Syrups

Özet:
Çok uzun yıllardır gıdaların bozulmasını önlemek için organik bir asit olan benzoik asit (BA) kullanılmaktadır. Günümüzde de sıklıkla kullandığımız tarçın, karanfil gibi baharatlarda, kuru erik gibi meyvelerde doğal olarak bulunur. BA kendi formunda da sodyum benzoat gibi çeşitli gıda ve ilaçlarda koruyucu madde olarak kullanılır. BA'in aktif bileşeni ayrışmamış asittir ve maya ve küf gibi istenmeyen mikroorganizmaların üremesine engel olur. Her gün sıklıkla tüketilen asitli ve asitsiz içeceklerde ve çok geniş yelpazede gıdalarda kullanılır. Hazır gıdaların ambalajları üzerinde, gıda katkı maddelerinin (GKM) kullanım amaçlarına göre kategoriler mevcuttur ve Avrupa Birliği ülkelerinde GKM için "E" harfi ve bir sayı sistemi ile mevcuttur. Örneğin, renklendiriciler E harfinde 100-180 sayıları arasında kodlanmaktadır. Koruyuculara bakıldığında E harfinde 200-297 sayıları arasında, antioksidanlar E harfinde 300-321 sayıları arasında, emülgatörler ile stabilizatörler E harfinde 222-500 sayıları arasında, asit-baz düzenleyicileri E harfinde 500-578 sayıları arasında, tatlandırıcılar ve kokular ise E harfinde 620-637 sayıları arasında kodlanmaktadır. BA ise koruyucular grubundan E210 kodlu kimyasal bir maddedir. 
Günümüzde tüketiciler, gıdaların yıl boyunca hazır bulunmasını, gıda kaynaklı patojenlerden uzak olmasını ve yeterli ölçüde uzun raf ömrüne sahip olmasını beklemektedir. Yiyeceklerin üretildiği andan tüketilene kadar birkaç gün, aylar ve hatta yıllar geçebilir. Böyle bir sistem için gerekli olan uzun vadeli raf ömrünü elde etmek için, çoğu zaman birden fazla etkili koruma yöntemi gerekir. Bu nedenle, gıdaların hem kimyasal hem de biyolojik olarak bozulmasını önlemek veya geciktirmek için koruyucular kullanılmaktadır. Gıda katkı maddeleri 4 ana başlıkta incelenmektedir. Bunlardan ilki, koruyucu maddeler; ikincisi, gıdanın kullanım özelliklerini iyileştiren maddeler; üçüncüsü, aroma ve renk sağlayan maddeler ve son olarak dördüncüsü, besin değerini koruyucu ve geliştirici maddelerdir.
Gıdalarda kullanılan koruyucular 6 grupta toplanmaktadır. Organik asitler en çok kullanılan grup olmakla beraber, kükürtdioksit ve sülfitler, nitrit ve nitratlar, dimetil dikarbonat, koruyucu gazlar ve antibiyotikler de diğer grupları oluşturmaktadır. Mikrobiyal inhibisyon için BA pH 4'ün altındayken en etkin haldedir. BA'in koruyucu yanının olmasının sebebi, mikroorganizmalardaki hücre duvarı ve enzimleri etkisiz hale getirebilmesidir. 
BA maddesinin izin verilen konsantrasyon limitleri üzerinde kullanılması zehirleyici olması sebebiyle tehlikelidir. Kullanım miktarının artması kilo kaybı, ishal, iç kanama, felç gibi bazı sağlık sorunlarına ve hatta ölüme dahi sebep olabilmektedir. Bu sebeple gıdalarda bulunan koruyucu maddelerin miktarlarına dikkat edilmelidir.
Bu çalışmada, pediatrik şurup ve süt örneklerinde BA tayini için yeni bir Headspace Gaz Kromatografi-Kütle Spektrometresi (HS-GC-MS) yöntemi geliştirmeyi amaçladık. 
 
BA, HS-GC-MS ile doğrudan ölçülemediğinden metil benzoat esterine türevlendirilmiştir. Hem tam türevlendirme hem de güvenilir sonuçlar elde etmek için optimum sıcaklık ve inkübasyon süresi değerleri bulunmaya çalışıldı. HS sıcaklık değerinin arttırılmasına bağlı olarak analit ve iç standarta ait pik alanlarının da arttığı tespit edildi, fakat, 120 °C, 130 °C ve 140 °C'de de BA de iç standart olarak kullanılan salisilik asit (SA) pikinde de çatallanmalar görüldü. 110 °C'de yapılan çalışmalarda ise piklerde çatallanmanın görülmediği belirlendi. Bu sıcaklıkta yapılan termostat süresindeki çalışmalar sonucunda headspace fırınında vial içinde esterleşme reaksiyonunun başarıyla meydana geldiği ve piklerde çatallanmanın görülmediği optimum koşullar 110 °C ve 30 dakika olarak belirlenmiştir. HS fırınının sıcaklık ve süre optimizasyon çalışmalarının ardından son olarak esterleşme reaksiyonunu katalizleyen asit miktarının optimizasyonu yapıldı. Bu noktada ise en uygun çözeltinin 5 M H2SO4 olduğu belirlenmiştir. BA ve iç standart olarak kullanılan SA optimize edilmiş headspace koşulları altında metil esterine türevlendirildikten sonra ölçüldüler. Esterlerin sentez yöntemi, karboksilik asit ve alkollerin asit katalizli bir ortamda reaksiyon vermesidir. 
Örnek hazırlama kısmında, numuneler önce metanol ile seyreltildi. Daha sonra 50 µL seyreltilmiş numune, 50 µL 10 mg/L SA (metanol içinde) ve 200 µL 5 M H2SO4, 20 mL'lik bir HS viali içine konuldu. HS viali, politetrafloroetilen (PTFE) kaplı kauçuk septumlu ve alüminyum kıvrımlı kapaklarla sıkıca kapatıldı ve HS otoörnekleyiciye yüklendi. Numunelerin analizi, bir Turbomatrix HS40 otoörnekleme cihazı ile donatılmış bir Perkin Elmer Clarus 500 GC-MS sistemi ile gerçekleştirilmiştir. Kromatografik ayırmalar, çapraz bağlı bir carbowax-PEG yapısına sahip bir Perkin Elmer FFAP GC kolonu (30 m x 0,25 mm i.d. x 0,50 um df.) kullanılarak sağlandı. 
Geliştirilen yeni yöntemin seçicilik, doğrusallık, tespit sınırı (LOD) ve tayin sınırı (LOQ), kesinlik ve doğruluk parametreleri de incelendi. Sonuç olarak, şurup ve süt numunelerinde BA tayini için oldukça doğru, kesin ve güvenilir bir HS-GC-MS yöntemi geliştirilmiştir. BA doğrudan ölçülemediğinden metil esterine türevlendirildi. Doğrusallık aralığı belirlenerek kalibrasyon grafiği çizildi. Gözlenebilen ve tayin edilebilen minimum değerler bulundu. Daha sonra süt ve şurup numunelerinden 6'şar örnek hazırlanarak tekrarlanabilirlik parametresine bakıldı. Son olarak, geliştirilen metodun validasyon parametreleri tamamlanıp numunelerin konsantrasyonları hesaplandı.
Tez kapsamında ilk bölümde tezde amaçlanan koruyucu madde analizleri ve HS-GC-MS metotları hakkında genel bilgiler ve daha önce yapılmış çalışmalar hakkında bilgiler mevcuttur. Ardından ikinci bölümde gıda katkı maddeleri tanıtılmıştır. Gıda katkı maddelerinin kullanım amaçları, gıdalara katılacak gıda katkı maddelerinin belirlenme şartları ve belirleyen komiteler, gıda katkı maddelerinin sınıflandırılması, antimikrobiyal katkı maddeleri, koruyucuların genel özellikleri ve etki mekanizmaları, gıdalarda kullanılan koruyucu maddeler ve gıda katkı maddelerinin insan sağlığı üzerine etkilerinden literatürden yararlanılarak anlatılmıştır. Daha sonra üçüncü bölümde, tezde kullanılan HS-GC-MS cihazı hakkında kapsamlı bilgiler verilmiştir. Dördüncü bölümde, kullanılan kimyasallar, optimizasyonlar, kromatografik koşullar, metot validasyon parametreleri ve numune hazırlıkları anlatılmıştır. Son olarak beşinci bölümde ise oluşturulan metot ve yöntem kullanılarak sütlerde ve çocuk şuruplarında bulunan BA konsantrasyonlarının sonuçları, örnek kromatogramları ve değerlendirilmesi verilmiştir.
JECKA'ya göre bir insanın günlük alabileceği maksimum miktar, 5 mg/kg (vücut ağırlığı başında) olarak belirlenmiştir. Elde edilen verilere göre, sütlerde BA eser miktarda, şuruplarda ise bulunan konsantrasyon süte göre daha fazla ancak günlük alım limitine göre oldukça düşük kalmaktadır. Bu da verilen bilgilere göre sağlık açısından bir tehlike oluşturmadığını göstermektedir.
Son olarak, bir yöntemin yeşil kimyaya uygun olması ve çevreye zarar vermemesi günümüzde en önemli konulardan birisidir. O yüzden geliştirdiğimiz yöntemin çevre dostluğunu objektif değerlendirmek için bazı literatür bilgileri ile karşılaştırarak bu yöntemin yeşil kimya açısından zararsız ve basit bir yöntem olduğu konusunda değerlendirmeler yapıldı.

Abstract:
For many years, benzoic acid (BA), an organic acid, has been used to prevent food spoilage. It is found in its natural form in spices such as cinnamon and cloves, and in fruits such as prunes, which we frequently use today. In its own form, BA is used as a preservative in various foods and medicines, such as sodium benzoate. The active component of benzoic acid is undissociated acid and prevents the growth of unwanted microorganisms such as yeast and mold. It is used in acidic and non-acidic beverages that are requently consumed every day and in a wide range of foods. There are categories on the packages of ready-made foods according to the purpose of use of food additives, and in European Union countries, food additives are made with the letter "E" and a number system. For example, colorants are encoded in the letter E between the numbers 100-180. Preservatives are between the numbers 200-297 in the letter E, the antioxidants between the numbers 300-321 in the letter E, the emulsifiers and stabilizers between the numbers 222-500 in the letter E, the acid-base suppliers between the numbers 500-578 in the letter E, the sweeteners and fragrances between the numbers 620-637 in the letter E are coded. BA, on the other hand, is a chemical substance with the code E210 from the group of preservatives.
Consumers today expect food to be available year-round, free from foodborne pathogens, and have a sufficiently long shelf life. It can take several days, months or even years from the time food is produced to consumption. To achieve the long-term shelf life required for such a system, more than one effective preservation method is often required. Therefore, preservatives are used to prevent or delay the deterioration of food, both chemically and biologically. Food additives are examined under 4 main headings. The first of these is preservatives; secondly, substance that improve the use properties of food; the third is the substances that provide flavor and color, and lastly, the substances that protect and improve the nutritional value.
Preservatives used in foods are grouped into 6 groups. Although organic acids are the most used group, they are sulfur dioxide and sulfites, nitrites and nitrates, dimethyl dicarbonate, shielding gases and antibiotics. Benzoic acid is most effective below pH 4 for microbial inhibition. The reason why benzoic acid has a protective side is that it can inactivate the cell wall and enzymes in living things.
The use of benzoic acid above the permissible concentration limits is dangerous because it is toxic. Increasing the amount of use can cause some health problems such as weight loss, diarrhea, internal bleeding, paralysis and even death. For this reason, attention should be paid to the amount of preservatives in foods. 
In this study, we aimed to develop a new Headspace Gas Chromatography-Mass Spectrometer (HS-GC-MS) method for the determination of benzoic acid in pediatric syrup and milk samples. BA is derivatized to methyl ester as it cannot be measured directly bu HS-GC-MS. Optimum temperature and incubation time values were tried to be found in order to obtain both full derivatization and reliable results. It was determined that the peak areas of the analyte and internal standard increased depending on the increase in the headspace temperature value, but bifurcations were also observed in the salicylic acid (SA) peak used as the internal standard in BA at 120 °C, 130 °C and 140 °C. In the studies carried out at 110 °C, it was determined that no bifurcation was observed in the peaks. As a result of the studies carried out at this temperature during the thermostat period, the optimum conditions were determined as 110 °C and 30 minutes, in which the esterification reaction occured successfully in the vial in the headspace furnace and no bifurcation was observed in the peaks. After the temperature and time optimization studies of the HS furnace, the amount of acid that catalyzes the esterification reaction was finally optimized. At this point it was determined that the most suitable solution was 5 M H2SO4. BA and SA used as internal standard were measured after derivatization to its methyl ester under optimized headspace conditions.
The common synthesis method of esters is the formation of a carboxylic acid and an alcohol as a result of the hydrolysis reaction in an acid-catalyzed occurence. 
In the sample preparation part, the samples were diluted with methanol. Then, 50 µL of diluted sample, 50 µL of 10 mg/L SA (in methanol) and 200 µL of 5.00 M H2SO4 were placed in a 20 mL vial of HS. The HS vial was tightly closed with polytetrafluoroethylene (PTFE) coated rubber septum and aluminum crimp caps and loaded into the HS autosampler. Analysis of samples was performed with a Perkin Elmer Clarus 500 GC-MS equipped with a Turbomatrix HS40 autosampler. Chromatographic separations were achieved using a Perkin Elmer FFAP GC column (30 m x 0.25 mm i.d. x 0.50 µm df.) with a cross-linked carbowax-PEG construct.
In this thesis, 1000 mg/L stock solutions were prepared by taking 25 mg of BA and SA standards and dissolving them with methanol in a 25 mL flask for preperation of the standard and samples. Then Standard calibration solutions of 0.05, 0.50, 1.00, 2.50, 5.00, 10.00, 20.00, 40.00, 60.00, 80.00 mg/L were prepared using a micropipette by diluting the benzoic acid stock solution. After that, SA, which is the internal standard solution, was diluted to 10 mg/L from a 1000 mg/L stock solution in a flask with methanol. The samples were diluted 1/5 in methanol. The acid medium was prepared as 5M by diluting 10.7 mL of sulfuric acid to 40 mL with distilled water. For quantitation, the standards were first given to the device by vials in volumes of 50 µL BA, 50 µL 10 mg/L SA and 200 µL 5 M H2SO4. Then, 50 µL was taken from the samples and 50 µL of 10 mg/L SA and 200.00 µL of 5 M H2SO4 volumes of internal standard and acid solution were added to them and given to the device. The common synthesis method of esters is the formation of a carboxylic acid and an alcohol as a result of the condensation reaction in an acid-catalyzed environment. Since benzoic acid is not seen in its own form, measurements were made under optimized conditions by derivatizing it to methyl benzoate ester using methanol and sulfuric acid concentrations.
Selectivity, linearity, limit of detection (LOD) and limit of qualification (LOQ), precision and accuracy parameters of the developed new method were also investigated. As a result, a highly accurate, precise and reliable HS-GC-MS method was developed for the determination of BA in syrup and milk samples. Since BA could not be measured directly, it was derivatized to its methyl ester. The linearity range is the concentration range in which the developed method yields results with acceptable sensitivity and repeatability. In order to show this linear relationship, mixtures containing different concentrations of BA were prepared and analyzed concentrations versus peak areas obtained from chromatograms.
The BA concentration values prepared for the calibration chart and the BA and SA ratios taken in SIR mode were used. By using this parameter, the minimum values that can be seen and determined were calculated. The concentrations of the prepared samples were found by using the equation of the graph obtained. Then, 6 samples were prepared from milk and syrup samples and the reproducibility parameters were checked. This part was repeated 3 days and calculated relative standard deviation between these days. In addition, accuracy analyzes were done in milk and syrup samples according to 3 different concentrations. Finally, the validation parameters of the developed method were completed and the concentrations of the samples were calculated.
Within the scope of the thesis, in the first part of the thesis, there are general information about the preservative analyzes and HS-GC-MS methods aimed in the thesis and information about the previous studies. Then, in the second part, food additives were introduced. The purpose of use of food additives, the conditions of determination of food additives to be added to foods and the determining committees, classification of food additives, antimicrobial additives, general properties and mechanisms of action of preservatives, preservatives used in food and the effects of food additives on human health are explained using the literature. Then, in the third chapter, comprehensive information about the HS-GC-MS device used in the thesis is given. In the fourth chapter, the chemicals used, optimizations, chromatographic conditions, method validation parameters and sample preparation are explained. Finally, in the fifth chapter, the results, sample chromatograms and evaluation of BA concentrations in milk and pediatric syrups are given using the new generated method.
According to JECKA, the maximum amount a person can take daily is 5 mg/kg (per body weight). According to the data obtained, BA is found in trace amounts in milk, and the concentration in syrups is higher than milk, but it is quite low compared to the daily intake limit. This shows that it does not pose a health hazard according to the information given.
Finally, one of the most important issues today is that a method is suitable for green chemistry and does not harm the environment. Therefore, in order to objectively evaluate the environmental friendliness of the method we developed, the values obtained by subjecting it to some measurements were examined and this method can be accepted as a harmless and simple method in terms of green chemistry.
One of the most important issues today is that a method is suitable for green chemistry and does not harm the environment. That's why we looked at the values obtained by subjecting the method we developed to some measurements in order to evaluate the environmental friendliness objectively. Generally recommended environmentally friendly solvents are water, alcohol and some ethers. In our study, water and methyl alcohol were used as solvents. BA, SA and sulfuric acid used as chemical reagents are odorless and not hazardous. During the analyses, 25 mg of benzoic acid, 25 mg of salicylic acid and 10.70 mL of sulfuric acid were used. Since HS-GC-MS is used, the waste product of these chemicals, which are used in very small amounts, is very low. Contrary to the mobile phases used in HPLC, the device uses inert gas as carrier gas and the use of He gas in this analysis has a very harmless effect on the environment. Considering that the daily electricity consumption of the HS-GC-MS device is ≤ 1.50 kW/h, this method can be accepted as a harmless and simple method in terms of green chemistry.