L-asparaginaz geninin (ansB) farklı gram negatif bakterilere klonlanması, izolasyonu ve ekspresyonu
Cloning, isolation and expression of L-asparaginase gene (ansB) in different gram-negative bacteria
Yazar: ŞEBNEM ÖZALP ERENLER
Danışman: DOÇ.DR. HİKMET GEÇKİL
İnönü Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Kanser kemoterapisinde yaygın olarak kullanılan L-asparaginaz enzimi sadecebirkaç gram-negatif bakteri tarafından sentezlenmektedir. Bu enzimin sitotoksik etkimekanizması L-asparagin bakımından oksotrof olan kanser hücrelerini bu amino asitten yoksunbırakmasına dayanır. Kanser hücrelerinin L-asparagin gereksinimi tamamen eksojen kaynaklıolup, bu kaynak kesildiğinde protein sentezi durur ve hücreler apoptosise sürüklenir. Normalhücreler L-asparagin bakımından prototrof olduklarından böyle bir uygulamadan etkilenmezler.Buradaki çalışmada L-asparaginaz sentezi ile bilinen üç tür gram-negatif bakteri veonların Vitreoscilla hemoglobin geni (vgb) veya L-asparaginaz geni (ansB) klonlanmışrekombinantları kullanılmıştır. Ayrıca, bu çalışmada ansB klonladığımız Enterobacteraerogenes rekombinantı Ea[pB-PGA] olarak adlandırılmış ve tüm konakçı ve rekombinantlarınçeşitli besinsel ortamlarda L-asparaginaz sentezleri çalışılmıştır. Oksijen ve çeşitli azot vekarbon kaynakları ile ileri derecede regüle olduğu bilinen ansB geninin farklı bakterilerde veonların rekombinant suşlarında farklı regülasyonu konusunda bu detayda yapılan ilk çalışmadır.Çalışılmış olan çeşitli karbon kaynakları arasında en yüksek L-asparaginaz senteziE. aerogenes'de glukozla sağlanırken, bu bakterinin rekombinantları gliserol ortamında glukozagöre 3 kata varan fazla L-asparaginaz aktivitesi göstermişlerdir. Escherichia coli ve onun ansBsuşunda en yüksek enzim sentezi laktoz içeren ortamda görülürken, Pseudomonas aeruginosave onun vgb rekombinantı (PaJC)'nda en yüksek enzim aktivitesi gliserollü ortamdakaydedilmiştir. PaJC suşu bu ortamda konakçı hücreye göre 2 kat fazla enzim aktivitesigöstermiştir. Tüm bakterilerde mannitol en elverişsiz karbon kaynağı olarak belirlenmiştir. Azotkaynakları bakımından genel olarak tüm bakteriler ve rekombinantları için L-asparagin ve Lglutaminiçeren ortamlar L-asparaginaz sentezi için en elverişli ortamlar iken, en elverişsiz azotkaynağı olarak amonyum klorür kaydedilmiştir.Endüstriyel atıklar arasında vinas ve melas genel olarak tüm bakterilerde enzimsentezini en iyi destekleyen ortamlar olmuşlardır. Tarafımızdan oluşturulan klonun (Ea[pBPGA])konakçısına göre bu ortamlarda 3 kat fazla enzim sentezi yaptığı kaydedilmiştir. Benzerşekilde E. coli'nin ansB klonu konakçısına göre melas ortamında yaklaşık 7 kat fazla enzimaktivitesi göstermiştir. P. aeruginosa'da vinas ortamında kaydedilen L-asparaginaz aktivitesi tezkapsamında kullanılan tüm ortamlar içinde ölçülmüş olan en yüksek değer olarak kaydedilmiştir.Bu ortamdaki enzim aktivitesi diğer atıklarda belirlenenin 14 katına varan oranlardabulunmuştur.Kullanılmış olan zengin besi ortamları arasında tüm bakteriler için en yüksekenzim sentezi Terrific Broth (TB) ortamında olmuştur. E. coli ve onun ansB suşu bu ortamdadiğer iki zengin ortama göre 2.5-7 kat fazla enzim aktivitesi göstermiştir. Üç ortamda da (TB,LB ve SOB) Ea[pB-PGA] ve PaJC rekombinantı konakçılarından sırası ile 2-10 ve 2-4 kat fazlaL-asparaginaz aktivitesi göstermişlerdir.

Abstract:
L-asparaginase, an enzyme widely used in cancer chemotherapy, is synthesized byseveral gram-negative bacteria. The cytotoxic effect of this enzyme resides on its clearance ofL-asparagine amino acid for which cancer cells are auxotroph. When cancer cells are deprivedof L-asparagine amino acid, which is acquired exogenously only, the protein synthesis in thesecells is blocked and they are destined for apoptosis. Since normal cells are prototroph for Lasparaginethey are not affected form such treatment.In this study three gram-negative bacteria known for L-asparaginase synthesis and theirVitreoscilla hemoglobin gene (vgb) or L-asparaginase gene (ansB) cloned recombinants wereused. An ansB carrying Enterobacter aerogenes, constructed in this study, was named Ea[pBPGA]and all bacterial hosts and their recombinants were studied with respect to L-asparaginasesynthesis in various nutrient media. Given the tight regulation of ansB by oxygen and it carboncatabolite repression and nitrogen regulation, this is the first study in this detail to showdifferential regulation of this gene in different bacteria and in their recombinant strains.Among carbon sources studied the highest L-asparaginase synthesis in E. aerogenes wasachieved with glucose, while the recombinants of this bacteria had 3-fold higher enzymesynthesis in glycerol containing medium than in glucose. Escherichia coli and its ansB strainshowed the highest enzyme synthesis in lactose medium. This was the case in glycerolcontaining medium for Pseudomonas aeruginosa and its vgb recombinant (PaJC). The PaJCstrain showed 2-fold higher enzyme activity than the host strain in this medium. Mannitol wasdetermined to be the poorest carbon source with respect to L-asparaginase synthesis in allbacteria. Regarding the nitrogen sources, L-asparagine and L-glutamine were determined as themost suitable sources, while ammonium chloride was the least appropriate one.Molasses and vinasse were the most suitable industrial wastes supporting L-asparaginasesynthesis in all bacteria. The ansB recombinant (Ea[pB-PGA]) constructed in this study had 3-fold higher enzyme levels than the host strain in these media. Similarly, ansB clone of E. colihad 7-fold higher L-asparaginase activity in molasse than that of host strain. L-asparaginaselevel of P. aerugionosa in vinasse was the highest level determined throughout the study. In thismedium the enzyme activity was up to 14-fold higher than in other industrial wastes.The enzyme synthesis for all bacteria was highest in Terrific Broth (TB) compared toother rich media used. E. coli and its ansB strain had 2.5-7-fold higher activity in TB than inother rich media. In all three media used, Ea[pB-PGA] recombinant showed 2-10-fold and PaJCrecombinant strain 2-4-fold higher activity than their hosts, E. aerogenes and P. aeruginosa,respectively.