Sığırlarda coronavirusların izolasyonu, moleküler karakterizasyonu ve potansiyel aşı genotiplarinin araştırılması
Isolation, molecular characterisation and investigation of potential vaccine genotypes of bovine coronaviruses
Yazar: SEMAHA GÜL YILMAZ
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN YILMAZ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Sığır coronavirusları (BCoV) solunum ve sindirim sistemlerinin ayrı veya birlikte
infeksiyonlarına yol açmakla birlikte genel olarak yeni doğanlarda buzağı ishali (neonatal calf
diarrhea-NCD), ergin sığırlarda kış dizanterisi (Winter dysanteria-WD) ve her yaş grubundaki
sığırlarda solunum yolu bozukluklarına (Bovine respiratory disease complex=kompleks
solunum yolu hastalığı-BRDC) neden olmakta ve ülkemiz dahil tüm ülkelerde sık
görülmektedir.
Bu tez çalışmasında Marmara bölgesi Trakya ve Uşak şehrinden toplanan örneklerde
moleküler analizler ile virus RNA'sı saptanarak bölgede sirküle olan BCoV'un moleküler
prevalansının belirlenmesi, virusun izolasyonu ve potansiyel aşı genotiplerinin araştırılması
planlandı. Bu amaçla, Marmara Bölgesi Trakya'da ve Uşak ilinde lokalize olan çiftliklerden
ishalli buzağılardan dışkı svabı, solunum sistemi bozukluğu semptomları gözlenen
buzağılardan nazal/orofaringeal svablar toplandı. Bu hayvanlardan daha sonraki çalışmalarda
serolojik amaçla kullanılmak üzere kan örnekleri de alındı. Toplanan örneklerden, real time
RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction=RT-PCR) ile BCoV RNA'sı
saptanan örneklerin, BCoV-S1 genlerinin sekans verileri ile filogenetik ve Heatmap analizleri
yapıldı. BCoV RNA'sı saptanan ve RT-PCR ile bant gözlemlenen örneklerle, HRT-18
hücrelerinde BCoV'un izolasyon çalışması yapıldı.
Yapılan çalışmalar sonucunda 189'u nazal/orofaringeal svab, 92'si dışkı svabı olmak
üzere 281 adet örnek toplandı. Toplamda 62 örnekte BCoV RNA'sı saptandı. Bunlardan 41
adedi nazal/orofaringeal svab, 21 adedi dışkı svabı olarak bulundu. Yaş gruplarına göre
semptom gösterme oranı ve pozitiflik durumları değerlendirildiğinde, ishal semptomu en yoğun
olarak 8-30 günlük buzağılarda gözlemlendi ve en yüksek pozitiflik oranı da (%28,84) yine bu
yaş döneminde tespit edildi. Solunum sisteminde hastalık semptomu gösteren buzağılar ise en
yoğun olarak 61-180 günlük buzağılarda gözlendi ancak en yüksek pozitiflik oranı (%40) 0-7
günlük yaş aralığında tespit edildi.
Aşısız çiftliklerden alınan 74 adet örnekten 18 adedinde ve aşılı çiftliklerden alınan 207
örneğin 44'ünde BCoV-RNA'sı tespit edildi. Klasifikasyon olarak aşı ve real time RT-PCR'ın
baz alınarak, pozitiflik saptanan aşılı ve aşısız çiftlikler ile yapılan istatistik çalışmasından elde
edilen 0,147 Ki-Kare değeri ile aşı durumunun PCR test sonuçlarını anlamlı bir şekilde
etkilemediği belirlendi.
S1 genine spesifik primerlerle 14 adet örneğin sekans analizi yapılarak gen dizilimleri
elde edildi. GenBank'tan elde edilen, dünyanın çeşitli bölgeleri ve ülkemizden BCoV'a ait olan
S1 genine ait diğer gen dizilimleri, aşı suşları ve referans gen dizilimleri ile filogenetik analiz
yapıldı ve soy ağacı oluşturuldu. Filogenetik ve Heatmap sonuçlarına göre çalışmamızda elde
edilen gen dizilimleri Avrupa suşları ile birlikte GIb sub-grupları arasında kümelendi ve
dünyanın diğer bölgelerinden seçilen gen dizilimlerine göre en fazla benzerliği Avrupa suşları
ile gösterdi (%97,6-%100). Tez çalışması kapsamında toplanan örnekler kendi aralarında
%97,8-%100 oranında benzerlik gösterdiler. Ayrıca, bu tez çalışmasında elde edilen örnekler,
Betacoronavirus cinsi içersinde yer alan Embecovirus alt cinsindeki betacoronavirus-1 cinsine
dahil olan CRCoV, DcCoV_HKU23, Yak-coronavirus, ve HECV_4408 ile birlikte
kümelenmiştir. Diğer hayvan CoV'larından en benzer olarak DcCoV-HKU23 %97,85-99,14
ve insan CoV'larından en benzer olarak HECV-4408 (%98,28-99,14) suşu bulundu.
Real time RT PCR ve RT-PCR ile pozitif olarak tespit edilen örneklerden HRT-18 hücre
kültüründe izolasyon çalışması yapılarak bir buzağının nazal/orofaringeal svab ve bir buzağının
da dışkı svabından BCoV izole edildi.
Sonuç olarak, tez çalışmasının yapıldığı bölgede GIb subgrubuna dahil suşların sirküle
olduğu belirlendi. Ayrıca saptanan BCoV'lar ile bazı insan coronaviruslarının genotipik olarak
benzer bulunması zoonotik açıdan dikkat çekilmesi gereken bir noktadır. Elde edilen veriler
ışığında kolostrum ile sağlanmaya çalışılan bağışıklığın yetersiz olduğu görülmektedir.
Aşılamalara rağmen buzağılarda BCoV'un yaygın olarak sirküle olması, BCoV ile daha
kapsamlı bir mücadele için, biyogüvenlik uygulamalarının iyileştirilmesiyle birlikte, genotipik
olarak değişen saha suşlarına uygun aşı suşlarının kullanılmasını ve buzağıların düşen meternal
antikorlar sonucu infeksiyona yakalanmaması için bu kritik dönemde aşılanmasını
gerektirmektedir.
Aralık 2023 , 158 sayfa.
Anahtar kelimeler: Sığır Coronavirusu, Real time RT-PCR, RT-PCR, Virus İzolasyonu,
Filogenetik analiz

Abstract:
Bovine Coronaviruses (BCoV) cause respiratory and digestive system infections in
cattle results in the neonatal calf diarrhea (NCD), winter dysanteria (WD), and in all age groups
of cattle, bovine respiratory disease complex (BRDC) and are frequently seen in many countries
including Turkey.
In this thesis, the investigation of potential vaccine genotypes, isolation of virus and
determination of the molecular prevalance of BCoV circulating in the region by detecting the
viral RNA with molecular analyses in samples from Trace district (Marmara region) and Uşak
province were planned. For this purpose, faecal swabs were collected from calves with diarrhea
and nasal/oropharyngeal swabs were collected from calves with respiratory symptoms from
farms located in Thrace district and Uşak province. Blood samples were also collected from
these animals for later use in serology. Phylogenetic and Heatmap analyses were performed
with the sequence data of BCoV-S1 genes of the samples in which BCoV-RNA was detected
by real time RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction=RT-PCR) from the
collected samples. BCoV isolation study in HRT-18 cell was performed using the samples
positive for BCoV-RNA by PCR and amplification seen in RT-PCR.
Result of this study has shown that amongst 281 samples, 189 nasal/oropharyngeal
swabs and 92 faecal swabs, BCoV-RNA was detected in 62 samples in total. Of these, 41 were
nasal/oropharyngeal swabs and 21 were faecal swabs. When symptom rate and positivity status
were evaluated according to age groups, diarrhea was observed most intensely in 8-30 days old
calves and the highest positivity rate (28.84%) was also detected in this age period. Calves with
xvii
respiratory symptoms were most frequently observed in calves aged 61-180 days, but the
highest positivity rate (40%) was detected in the 0-7 days old calves.
BCoV-RNA was detected in 18 of 74 samples from unvaccinated farms and in 44 of
207 samples from vaccinated farms. Based on vaccinations and real time RT-PCR positivity, it
was determined that vaccination status did not significantly affect the PCR test results with a
Chi-Square value of 0.147 obtained from the statistical study conducted with vaccinated and
non-vaccinated farms where positivity was detected.
Sequence analyses of 14 samples were performed with S1 gene specific primers and
gene sequences were obtained. Phylogenetic analysis was performed with gene sequences of
the S1 gene belonging to BCoV from various regions of the world including our country,
vaccine strains and reference S1 gene sequences obtained from GenBank and a phylogenetic
tree was constuctured. According to the phylogenetic and Heatmap results, the gene sequences
obtained in our study were clustered among the GIb sub-groups together with the European
strains and showed the highest similarity with the European strains (97.6%-100%) compared to
the gene sequences selected from other regions of the world. The samples collected within the
scope of this study showed 97,8%-100% similarity among themselves. Furthermore, the
samples obtained in this study were clustered together with CRCoV, DcCoV-HKU23, Yakcoronavirus, and HECV-4408, which belong to the genus Betacoronavirus-1 in the subgenus
Embecovirus within the genus Betacoronavirus. Among the other animal CoVs, DcCoVHKU23 was the most similar strain (97,85-99,14%) and among the human CoVs, HECV-4408
was the most similar strain (98,28-99,14%).
BCoV was isolated from nasal/oropharyngeal swab of a calf and faecal swab of another
calf by performing isolatixon studies using HRT-18 cell culture from the samples detected
positive by real time RT PCR and RT-PCR.
In conclusion, it was determined that strains belonging to GIb subgroup were circulating
in the region where this study was conducted. Furthermore, detected BCoVs and some human
coronaviruses showing similarities genotypically is a point that requires attention from a
zoonotic perspective. In the light of the data obtained, it is seen that the immunity provided by
colostrum is inadequate. The widespread circulation of BCoV in calves despite vaccination
requires the use of vaccine strains suitable for genotypically varying field strains, along with
the improved biosecurity practices for a more comprehensive mitigation against BCoV, and
vaccination of calves during this critical period to prevent infection as a result of decrease in
meternal antibodies.
December 2023, 158 pages.
Keywords: Bovine Coronavirus, , Real time RT-PCR, RT-PCR, Virus Isolation, Phylogenetic
Analysis