Polen alerjeni metiyonin sentazın biyoteknolojik üretimi üzerine çalışmalar
Studies on biotechnological production of pollen allergen methionine synthase
Yazar: YUNUS AKSÜT
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Morus alba L. = Morus alba L. ; Schizosaccharomyces pombe = Schizosaccharomyces pombe

Özet:
Alerji günümüzün temel sağlık sorunlarından biridir. Bu hastalıklar ülkemizdeki bireylerin %20-30 kadarını etkileyerek, kişilerin yaşam kalitesini düşürmekte ve oluşturduğu iş gücü kaybı ile de maddi zarara yol açmaktadır. Alerjik duyarlılığa ve alerjik hastalık bulgularının ortaya çıkmasına neden olan en önemli aeroalerjenlerden biri polenlerdir. Polenlerin alerjenik özellikleri, kimyasal bileşenleri ve atmosferdeki yoğunlukları, iklime, coğrafi lokasyona ve çevresel koşullara göre değişir. Muhtemelen bu varyasyonların bir sonucu olarak polen alerjisinin tanı ve tedavisinde bazı sorunlar yaşanmaktadır. 

Rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesi ile birçok biyolojik ürün ortaya çıkmıştır. Tanı ve tedavide kullanılma potansiyeline sahip rekombinant alerjenler de bu teknoloji ile üretilebilmektedir. Yapısal, fonksiyonel ve immünolojik olarak doğal alerjenleri taklit eden bu spesifik moleküller, biyoteknolojik yöntemleri kullanarak prokaryotik veya ökaryotik sistemler aracılığıyla çok hızlı bir şekilde, sabit kalitede, yeterli miktarda elde edilebilirler. 

Bu tez çalışmasının temel hedefi yerel Morus alba (ak dut) poleninde bulunan potasiyel alerjen metiyonin sentazı Schizosaccharomyces pombe'de rekombinant olarak üretmektir.

Çalışmanın ilk aşamasında M. alba'daki metiyonin sentaz geninin dizisini belirlemek için polenlerden total RNA izolasyonu yapıldı. Total RNA kullanılarak cDNA kütüphanesi oluşturuldu ve ilgili gen bu cDNA kütüphanesinden polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltıldı. PZR ürününün nükleotit dizilemesi yapıldı, metiyonin sentazın tam gen dizisi belirlendi.

İkinci aşamada ise metiyonin sentaz geninin mekik tipi bir vektör olan pSLF1007 ile ligasyonu sağlandı. Daha sonra S.pombe'ye bu ligasyon ürününün transformasyonu yapıldı. Seçici besiyerine ekilen transforme kolonileri belirmek için koloni PZR yapıldı. Pozitif çıkan kolonilerden biri, protein analizleri için sıvı besiyerinde üretildi. Bu hücrelerden protein izolasyonu gerçekleştirildi ve rekombinant proteinin saptanması için elektroforezi takiben Western blot analizi yapıldı. Rekombinant protein histidin etiketine özgü antikor kullanılarak membranda saptandı. 

Sonuç olarak, M. alba poleninde bulunan metiyonin sentaz proteini S.pombe'de başarıyla rekombinant olarak üretildi. Bu çalışmada S. pombe'nin rekombinant allerjen üretimi için alternatif bir sistem olduğu gösterildi. Rekombinant metiyonin sentaz ileri klinik çalışmalarda kullanılma, saflaştırıldıktan ve alerjik özellikleri doğrulandıktan sonra piyasada biyoteknolojik bir ürün olarak yer alma potansiyeline sahiptir.

Abstract:
Allergy is one of major health problems of today. By affecting the 20-30% of the individuals in our country, these diseases reduce the life quality and evoke economical detriment by causing loss of workforce. One of the most important aeroallergens which causes allergic sensitivity and allergic disease symptoms is pollens. The allergenic properties, chemical constituents and atmospheric concentrations of pollens change by climate, geographic location and environmental conditions. There are some troubles in diagnosis and treatment of pollen allergy, probably due to these variations.

Many biological products emerge by the development of recombinant DNA technology. Recombinant allergens having potential to be used in diagnosis and treatment, also can be produced by this technology. These specific molecules mimic natural allergens structurally, functionally and immunologically, can be obtained very fast in consant quality and sufficient quantity, by using biotechnological methods through prokaryotic and eukaryotic systems.

The main purpose of this thesis is recombinant production of methionine synthase, a potential allergen found in local Morus alba (white mullberry) pollen, in Schizosaccharomyces pombe.

In the first step of the study, total RNA isolation was performed from the pollens to detect the sequence of methionine synthase gene in M. alba. cDNA library was set up by using total RNA and related gene was propagated from this cDNA library. PCR product was then subjected to nucleotide sequencing and whole gene sequence of methionine synthase was determined.
 
In the second step, methionine synthase gene was ligated with a shuttle type vector, pSLF1007. Then this ligation product was transformed to S.pombe. Colony PCR was applied to detect the transformant colonies in selective media. One of the positive colonies was grown in liquid media for protein analyses. Protein isolation was performed from these cells and Western blotting analysis was done followed by electrophoresis to detect the recombinant protein. This recombinant protein was detected on the membrane by using an antibody specific to the histidine tag. 

As a result, methionine synthase protein found in M. alba was successfully produced in S. pombe recombinantly. In this study, S. pombe has been shown to be an alternative system for the production of recombinant allergens. Recombinant methionine synthase has a potential to be used further clinical studies, and to become a biotechnological product in the market after purification and approval of its allergenic properties.