İnsan karbonik anhidraz-ı izoenziminin alternatif bir metot ile immobilizasyonu
Immobilization of human carboni̇c anhydrase-i isoenzyme with an alternative method
Yazar: İSMAİL KÖSEOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. NAHİT GENÇER
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Karbonik anhidraz (CA) (E.C. 4.2.1.1) enzimi, tüm canlılarda CO_2'in hidratlanarak HCO_3^- ve H^+'ya dönüşümünü terisinir olarak katalizleyen oldukça önemli bir enzimdir. Bu çalışmada, karbonik anhidraz enzimi izoenzimlerinden olan insan CA-I izoenzimi, Sepharore-4B-L-tirozin-sülfonamid yapısına sahip afinite jeli ile saflaştırılmıştır ve SDS-PAGE ile saflık derecesi kontrol edilmiştir.

Saflaştırılan CA-I izoenziminin -aminoheksil agaroz jeli üzerine gluteraldehit ile immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. İmmobilizasyon işleminden sonra serbest ve immobilize CA-I enzimi için çeşitli tayinler yapılmıştır.  Serbest ve immobilize CA-I izoenziminin sırasıyla optimum pH'leri 10 ve 9.5 olarak bulunmuştur, aktivitelerini ise sırasıyla 768; 1096 saat korumuşlardır, optimum sıcaklıkları 35; 25 oC bulunmuştur, termal stabiliteleri 35; 50 oC'lerde koruduğu görülmüştür. 

 CA-I'in klasik inhibitörlerinden sülfonamid, asetazolamid, brinzolamid, dorzolamid ve topiramat ilaçları ile inhibisyon çalışmaları gerçekleştirildi. Serbest ve immobilize CA-I izoenzimi için sırasıyla IC50 değerleri, sülfonamid için 19.083; 8.1059 M, asetazolamid için 0.7922; 0.6655 M, brinzolamid için 8.383; 9.539M, dorzolamid için 11.592; 16.618M, topiramat için 10.661; 16.575M olarak bulunmuştur.  Brinzolamid, dorzolamid ve topiramat serbest enzimi, sülfonamid ve asetazolamid ise immobilize enzimi daha çok inhibe etmiştir.

Abstract:
Carbonic anhydrase (CA) (E.C. 4.2.1.1), which reversibly catalyses the transformation of CO2 in all living things to HCO_3^- and H^+ by hidration, is a substantially significant enzyme. In this study, human CA-I, which is one of the isoenzymes of CA, was purified by an affinity gel in the structure of Sephorore-4B-L-tyrosine-sulfonamide, and the purity degree is checked with SDS-PAGE.

The immobilization of the purified CA-I isoenzyme is performed on -aminohexyl agarose gel with glutaraldehyde. After the immobilization procedure, various analysis are made on free and immobilized CA-I enzymes. It is observed that for free and immobilized CA-I isoenzymes,  optimum pH degrees are 10 and 9,5; active periods are 768h and 1096h; optimum temperatures are 35 oC and 25 oC; and thermal stabilities are 35 and 50 oC  respectively.

Classic CA inhibitors, sulfonamide, acetazolamide, brinzolamide, dorzolamide and topiramate preparations, medicines are utilized in the study. The inhibition effects of these preparations on free and immobilized CA-I isoenzymes are investigated. For free and immobilized CA-I isoenzymes, the IC50 values for effective inhibition are  19.083M and  8.1059M for sulfonamide; 0.7922M and  0.6655M for acetazolamide;  8.383M and  9.539M for brinzolamide; 11.592M and  16.618M for dorzolamide; 10.661M and  16.575M for topiramate respectively. It is found that while brinzolamide, dorzolamide and topiramate inhibited the free enzyme more, sulfonamide and acetazolamide inhibited the immobilized enzyme more effectively.