Kolorektal kanser hastalarında kazein zimografi ve ın situ kazein zimografi yöntemi ile matriks metalloproteinaz-7 aktivitesinin ve lokalizasyonunun belirlenmesi
Determination of matrix metalloproteinase-7 activity and localization with casein zymography and in situ casein zymography in colorectal cancer
Yazar: DİDEM KELEŞ
Danışman: PROF. DR. GÜLGÜN OKTAY
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Giriş: %80'i kolonda, %20'si rektumda meydana gelen kolorektal kanser (KRK); başta endüstriyel batı dünyası olmak üzere dünya genelinde akciğer, prostat ve meme kanserinden sonra ölüme neden en büyük kanserdir. Yapılan pek çok çalışmada Matriks metalloproteinaz-7'nin (MMP-7) diğer MMP'lere göre tümör progresyonunda daha önemli bir rol oynadığı ileri sürülmektedir.Amaç: Bu çalışmanın amacı; KRK hastalarından alınan tümörlü ve eşlenik normal doku örneklerinde MMP-7 ekspresyon (protein ve mRNA) düzeylerini ve MMP-7'nin aktif-latent formlarını incelemek ve MMP-7'nin lokal endojen aktivasyonunu In Situ Kazein Zimografi yöntemiyle gösterebilmektir.Materyal ve Yöntemler: Çalışma, 31 KRK hastasından alınan kolorektal tümör ve eşlenik normal dokularında gerçekleştirildi. MMP-7 mRNA ve protein ekspresyon düzeyleri Real Time PCR ve ELISA teknikleriyle, MMP-7 lokalizasyonu ise immünohistokimyasal boyama ve görüntüleme analizi ile belirlendi. MMP-7'nin proteolitik aktivitesini belirlemek amacıyla Kazein zimografi, lokal kazeinolitik aktiviteyi değerlendirmek amacıyla in situ kazein zimografi tekniği kullanılmıştır. Ayrıca elde edilen sonuçlar, tümörün klinikopatolojik değişkenleri ile (cinsiyet, yaş, tümör yerleşimi, tümör boyutu, tümör diferansiyasyonu, histolojik tip, uzak metastaz, T-evre, N-evre, patolojik evre, perinöral invazyon, lenfatik invazyon, vasküler invazyon) ayrı ayrı karşılaştırıldı.Bulgular: MMP-7 mRNA ekspresyonu tümöral dokuda normal dokulara oranla istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulundu (p = 0,001). Ayrıca mRNA ekspresyon düzeyleri, T evre ve P evre ile pozitif korelasyon (r = 0,687 p = 0,005 ve r = 0,536 p = 0,04), yaş ile negatif korelasyon (r = -0,588 p = 0,021) gösterdi. Buna karşılık tümör ve normal dokularda MMP-7 protein ekspresyon düzeyleri arasında anlamlı bir fark belirlenmemiştir (p = 0,636). MMP-7 protein düzeyleri ve klinikopatolojik değişkenler arasındaki ilişki incelendiğinde perinöral invazyon ile arasında pozitif korelasyon belirlenmiştir (r = 0,462 p = 0,010). İmmünohistokimyasal boyama sonucu, tümör dokularında hücre sitoplazması ve membranında boyama görülürken, normal dokularda herhangi bir MMP-7 boyaması görülmedi. Ek olarak, tümör dokularında normal dokulara göre daha yüksek kazeinolitik aktivite görüldü ve bu aktivitenin epitel bölgede daha yoğun olduğu belirlendi.Sonuç: Elde edilen sonuçlar MMP-7'nin kolorektal kanser gelişimde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bundan dolayı, kolorektal kanserde yeni kemopreventif terapi geliştirilmesinde MMP-7'nin hedef molekül olarak seçilebileceğini göstermektedir.Anahtar Kelimeler: Kolorektal Kanser, Matriks Metalloproteinaz-7, Kazein Zimografi, In Situ Kazein Zimografi.

Abstract:
Background: Colorectal cancer (CRC) that occurs at the percent in 80% of colon and 20% in rectum is now the most common cause of cancer related deaths after lung, prostate and breast cancer in Western world. There is increasing evidence to indicate that matrix metalloproteinase (MMP)-7 plays a more important role in tumor progression than other MMPs.Aim: The aim of this study is to analyze MMP-7 expression (protein and mRNA) levels and active-latent forms of MMP-7 in tumor and paired normal tissue samples that are taken from colorectal cancer patients and to develop In Situ Casein Zymography technique for detection of local endogen activation of MMP-7.Material and Methods: Thirty-one colorectal tumor and paired normal tissue samples were taken from patients with CRC. MMP-7 mRNA and protein expression levels were detected by Real Time PCR and ELISA whereas MMP-7 localization was examined by immunohistochemical staining and image analysis. Casein Zymography and In Situ Casein Zymography methods were used to detect proteolytic activity of MMP-7 and to estimate local caseinolytic activity, respectively. The results were compared with clinicopathological variables (such as gender, age, tumor localization, tumor size, tumor differentiation, histological type, distant metastasis, T-stage, N-stage, pathological stage, perineural invasion and vascular invasion).Results: MMP-7 mRNA expressions in tumor tissues were statistically higher than paired normal tissues (p = 0.001). Furthermore mRNA expression levels were positively correlated with T stage and P stage (r = 0.687 p = 0.005 and r = 0.536 p = 0.04) and negatively correlated with age (r = -0.588 p = 0.021). In the results of immunohistochemical staining, it was observed that there were cytoplasm and cell membrane staining in tumor tissues whereas there was no MMP-7 staining in paired normal tissues. Unlike there were no significant differences between tumor and paired normal tissues in MMP-7 protein expression levels (p = 0,636). When it was analyzed the correlations between MMP-7 protein expression levels of tumor tissues and clinicopathological variables, it was determined that protein expression levels positively correlated with perineural invasion (r = 0.462, p = 0.010). In addition, it was found that caseinolytic activity, localize epithelium region, was higher in tumor tissues than the paired normal tissues.Conclusions: Our results suggest that MMP-7 plays an important role in the progression of human colorectal cancer. Therefore MMP-7 may be selected as a target molecule in the use of new chemopreventive therapy in colorectal cancer.Key Words: Colorectal Cancer, Matrix Metalloproteinase-7, Casein Zymography, In Situ Casein Zymography.