ALS ile ilişkili C9ORF72 mutasyonu taşıyan hasta kökenli uyarılmış pluripotent kök hücrelerden farklılaştırılan kardiyomiyosit ve duyu nöronlarının karakterizasyonu
Characterization of als associated C9ORF72 mutation carrying cardiomyocytes and sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells
Yazar: AYLİN NEBOL
Danışman: PROF. DR. ESRA ÇAĞAVİ
İstanbul Medipol Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Amyotrofik lateral skleroz = Amyotrophic lateral sclerosis ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Miyosit-kardiyak = Myocytes-cardiac ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells

Özet:
Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), motor nöronların ilerleyici dejenerasyonu ile karakterize, yıkıcı bir nörodejeneratif hastalıktır. Birçok çalışma ALS'nin motor nöronlar ve astrositler gibi merkezi sinir sistemi bileşenlerini araştırmaya odaklanmış olmakla beraber, motor nöronların mikroçevresini oluşturan ve etkileşim halinde oldukları hücre tiplerinin ALS patogenezine etkileri yeterince araştırılmamıştır. Son yıllarda deney hayvanlarında yapılan çalışmalar ve klinik gözlemler, ALS hastalığı ile ilişkili olarak duyu nöronlarında dejenerasyon ve kardiyak disfonksiyona işaret etmiştir. Bu sebeplerle tez çalışması kapsamında sağlıklı birey, ALS hasta kökenli C9ORF72 mutasyonu taşıyan ve mutasyonu düzeltilmiş izogenik hatlarda üretilen uyarılmış pluripotent kök (uPK) hücrelerin duyu nöronu ve kardiyomiyositlere farklılaştırılarak moleküler ve fonksiyonel araştırmalar yapılması amaçlanmıştır. Moleküler karakterizasyonların sonucunda, C9ORF72 mutasyonu taşıyan hücrelerde sağlıklı kontrollere kıyasla ALS ile ilişkili olduğu gösterilmiş ER stres genlerinin (CHOP1, XBP1) mRNA seviyelerinde artış, mitokondriyel fonksiyon (ATP5A1, SIRT3) ile ilişkili genlerin ifadelerinde azalma olduğu tespit edilmiştir. Hasta kökenli hücrelerde TDP43 sitoplazmik mislokalizasyonu immün boyamalar ile tespit edildi, DNA hasarı ile ilişkili pATM protein seviyesinde ve oksidatif stres seviyelerinde anlamlı artışlar saptandı. Fonksiyonel analizlerde, farklılaştırılan duyu nöronlarının kimyasal uyaranlara verdiği yanıtlarda deneysel gruplar arasında farklılık gözlenmedi. C9ORF72 mutasyonu taşıyan kardiyomiyositlerin taşikardik aritmi fenotipi ve kasılma frekansında anlamlı fark gösterildi. Sonuç olarak, tez çalışmasında C9ORF72 mutasyonu taşıyan insan uPK hücreleri kullanılarak duyu nöronları ve kardiyomiyositlerin gen ifade değişimleri, protein mislokalizasyonu ve oksidatif stres artışı gibi ALS ile ilişkili hücresel patolojiler sahip olduğuna dair ilk in vitro delilleri sunmaktadır.

Abstract:
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a devastating neurodegenerative disease characterized by the progressive degeneration of motor neurons. While much research has focused on understanding the central nervous system components of ALS, the peripheral cell types are unfathomed. The aim of this thesis study is to elucidate the pathogenic mechanisms of ALS by characterizing the molecular and functional effects of the C9ORF72 mutation in induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived sensory neurons and cardiomyocytes. To achieve this, iPSC-derived sensory neuron and cardiomyocyte cultures were generated from a healthy control, two patients with G4C2 repeat expansions, and an isogenic control line. Functional characterizations were performed using Ca2+ imaging to measure the intracellular Ca2+ levels and a moving pixel-based contraction analysis to compare the contraction patterns of healthy and mutation-carrying cardiomyocytes. Molecular characterizations involving comparative analysis of multiple ALS-related gene expressions, evaluation of TDP43 cytoplasmic mislocalization, DNA damage levels, and assessment of oxidative stress levels were also conducted. The results showed that, mutation-carrying cardiomyocytes exhibited a tachyarrhythmia-like beating pattern. Both cardiomyocytes and sensory neurons demonstrated significant variation in the expression of mitochondrial genes, along with increased expression endoplasmic reticulum (ER) stress response genes. Interestingly, as a hallmark of ALS, TDP43 cytoplasmic mislocalization was observed in both cell types. Moreover, mutation-carrying cells exhibited significantly elevated levels of oxidative stress compared to healthy controls. In conclusion, our study provides the first evidence on the direct impact of the ALS-associated C9ORF72 mutation on the functional and molecular characteristics of human sensory neurons and cardiomyocytes.