Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ilaç analizlerinde yeşilleştirme
Greening pharmaceutical analysis using high performance liquid chromatography
Yazar: AYŞEGÜL DOĞAN
Danışman: PROF. DR. NURSABAH ELİF BAŞCI
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Fenazopiridin hidroklorür = Phenazopyridine hydrochloride ; Kromatografi = Chromatography ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Plazma = Plasma ; Tadalafil = Tadalafil ; İlaçlar = Drugs

Özet:
Çevre ve insan sağlığı açısından güvenli analizlerin yapılabilmesi için geliştirilen yeşil kromatografi tekniği günümüz bilimsel çalışmaları arasında yer almaktadır. HPLC tekniklerinde yeşilleştirme süreçleri; toksik çözücü kullanımının azaltılması ve/veya daha çevre uyumlu organik çözücülerle değiştirilmesi temelli olabilmektedir. Bu çalışmada, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip 30 ilaç molekülü  önce geleneksel organik çözücü kullanılarak, sonra propilen karbonat içeren hareketli faz ile analiz edilmiş ve en iyi kromatografik ayırımların görüldüğü üç molekül tablet ve plazmadan analiz edilmek üzere model moleküller olarak tespit edilmiştir. Belirlenen model moleküller olan vorikonazol, tadalafil ve fenazopiridin (iç standart) için geliştirilen yeşil kromatografik yöntemlerle tabletten ve "spiked" plazma numunelerinden vorikonazol ve tadalafilin yeşilleştirilmiş HPLC analiz yöntemleri geliştirilmiştir. Bu amaçla, toksik olmayan propilen karbonat ile etanol çözücü olarak kullanılmış, küçük partikül çaplı ve kısa kolon seçimi, yeni nesil kolonlar ile mikroakışlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanımı yaklaşımları denenmiştir. İç standart fenazopiridin ile vorikonazol ve tadalafilin analizleri için, Shim-Pack XR-ODS (100 x 2.0 mm, 2.2 µm) analitik kolon kullanılmış ve dizi diyot dedektör dalga boyları vorikonazol için 256 nm, tadalafil için 284 nm olarak ayarlanmıştır. Analizlerde kullanılan hareketli faz bileşimi; PC/(% 70 NaH2PO4 (50 mM, pH: 3.0) + % 30 EtOH) (10:90, h/h) ve akış hızı: 0.3 mL dk-1' dir. Geliştirilen yöntemler, kararlılık, doğrusallık, duyarlılık, doğruluk, kesinlik, özgünlük, tutarlılık ve sağlamlık parametrelerine göre valide edilmiştir. Doğrusallık vorikonazol ve tadalafil için sırasıyla; tabletten analizlerde, 0.10 - 100.00 mg mL-1, 0.10 - 80.00 mg mL-1 ve plazmadan analizlerde, 0.50 - 100.00 mg mL-1 ve 0.50 - 80.00 mg mL-1 derişim aralıklarındadır. Gözlenebilirlik sınırı tabletten analizde vorikonazol için 0.05 mg mL-1  ve tadalafil için 0.08 mg mL-1  bulunurken plazmadan  analizde her iki madde için de 0.1 mg mL-1'dir. Alt tayin sınırı tabletten analizde her iki etken madde için 0.1 mg mL-1 iken plazmadan analizde  0.5 mg mL-1 olarak bulunmuştur. Geliştirilerek optimize edilen yöntemlerin tablet ve plazmadan analizlere uygunluğu ve güvenirliği analitik/biyoanalitik yöntem validasyon çalışması ile değerlendirilmiş olup, bulgulara göre yöntemler doğru, kesin, özgün, duyarlı, tutarlı, sağlam ve uzun dönem kullanım için güvenilirdir.

Abstract:
Green chromatography techniques are a developing area in the scientific research studies due to their security for environment and human health. Greening procedures in HPLC techniques may be based on reduction of toxic solvent usage and/or the replacement of toxic solvents with less or non-toxic ones which were friendly to the environment. In this study; 30 drug molecules having different physicochemical properties analyzed using firstly with conventional organic modifiers, then with propylene carbonate included mobile phases and three of the molecules with the best chromatographic separation were selected for analyzing from tablets and plasma. Green HPLC methods of voriconazole, tadalafil and phenazopyridine (internal standart) was developed and applied in the light of model molecules, voriconazole and tadalafil, to the analysis from their tablets and spiked plasma samples. For this purpose, non-toxic propylene carbonate and ethanol was used as solvents, and new generation low particle sized small column and microflow high performance liquid chromatography technique approaches was also tested. Shim-Pack XR-ODS (100 x 2.0 mm, 2.2 µm) analytical column was utilized for the analysis of voriconazole and tadalafil by using phenazoprydine as internal standart, and diode array dedector was set to 256 nm for voriconazole and  284 nm for tadalafil. Mobile phase composition was constracted as PC/(% 70 phosphate buffer (50 mM, pH: 3.0) + % 30 EtOH) (10:90, v/v) at a flow rate 0.3 mL min-1. Developed analysis methods were validated  in terms of stability, linearity, accuracy, precision, specificity, ruggedness and robustness from tablets. Linearity for voriconazole and tadalafil were found as 0.10 - 100.00 mg mL-1, 0.10 - 80.00 mg mL-1 in analysis from tablets and 0.50 - 100.00 mg mL-1 and 0.50 - 80.00 mg mL-1 in the analysis from plasma samples, respectively. Limit of detection in tablets were 0.05 mg mL-1  for voriconazole ve 0.08 mg mL-1 for tadalafil while 0.1 mg mL-1 in plasma for both of them. Limit of quantification in tablet analysis for both active substances were found to be 0.1 mg mL-1 in tablets and 0.5 mg mL-1 in plasma analysis. Developed and optimized methods were tested for their applicability and relaibility in pharmaceutical and plasma analysis by analytical/bioanalytical method validation strategies and according to the findings the methods were found to be accurate, precise, specific, sensitive, rugged, robust and reliabile in long term use.