Doğal peptit antibiyotiklerden esinlenerek yeni etkin antibakteriyellerin geliştirilmesi
The development of new effective antibiotics by inspiring from natural peptide antibiotics
Yazar: NİHAN ÜNÜBOL
Danışman: PROF. DR. ADİL ALLAHVERDİYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Böceklerden insanlara kadar geniş bir organizma grubu tarafından üretilen antimikrobiyal peptitler, klasik antimikrobiyallere dirençli organizmaların neden olduğu enfeksiyonlara karşı önemli alternatif tedavi ajanları olan doğal antibiyotiklerdir. Bu bilgiler doğrultusunda doğal antimikrobiyal peptitlerin korunmuş motiflerinden esinlenilerek, antibakteriyel aktivite gösteren kısa, üretilmesi kolay peptitler tasarlamayı hedefledik. Doğal antimikrobiyal peptitlerin korunmuş bölgelerini belirleyerek üç boyutlu yapılarını inceledik. Bu incelemeler bize, kısa peptit bölgelerinin, alfa sarmal yapıları oluşturan tekrarlanan hidrofobik ve pozitif yüklü amino asitlerden oluştuğunu ve sarmalın bir tarafında pozitif yüklü amino asitler bulunduğunu gösterdi. Bu yapılara benzer peptitler tasarlayarak bunları sentezletip, farklı bakteri türleri üzerindeki antibakteriyel aktivitelerini belirledik. Peptitlerin etki mekanizmalarını anlamak için ise moleküler dinamik modelleme yöntemi kullanarak, peptitlerin bakteriyel zarlarla olan ilişkilerini inceledik. 
Pozitif yüklü bir amino asit olan argininin peptitlere dahil edildiğinde, lizine kıyasla daha iyi antibakteriyel aktivite gösterdiğini ve her iki uçta pozitif yüklü amino asitlere sahip olan peptitlerin, Staphylococcus aureus'a (MİK 16.0 μg / ml) kıyasla E. coli (MİK 2.0 μg / ml) üzerinde daha iyi aktivite gösterdiğini saptadık. Sadece bir uçta pozitif yüklü amino asit olduğunda, organizmaların her ikisinde de eşit düzeyde etki gözlemledik (MIC 4.0 μg / ml). Pozitif yüklü argininlerin molekülün bir tarafında zikzak şeklinde konumlandırılması doğrusal bir eksende konumlandırmasına kıyasla molekülün daha yüksek aktivite göstermesini sağladı. Molekülün bir ucunda hidrofobik amino asit sayısının 3'ten 6'ya arttırılması, moleküllerin birbirlerine bağlanmasına ve peptitin antibakteriyel aktivitesinin tamamen ortadan kalkmasına neden oldu. Moleküler dinamik simülasyonlar, hidrofobik ve pozitif yüklü amino asitlerin asimetrik konumlandırılmasının gerektiğini, hidrofobik kısmın zarlardaki yağ ikili katmanına gömdüğünü ve pozitif yüklü kısımların yağ iki katmanının her iki tarafındaki fosfolipidlerin negatif yüklü fosfat gruplarına sabitlediğini gösterdi. Böylece, tek bir molekülün hidrofilik kanal oluşturarak hücre içine su geçişlerini sağlayabildiği anlaşıldı.  Bu peptitlerle muamele edilen stafilokokların elektron mikroskobik incelemesi sonucunda, aktif hücre duvar sentezinin gerçekleştiği kısımdan bakterilerin hemen hemen iki eşit parçaya ayrıldığı gözlendi. Bu çalışmaya ek olarak yapılan moleküler birleşme yöntemi ile peptitlerin, peptidoglikan sentezleyici zar proteini olan glikoziltransferazın aktif bölgelesine kuvvetli bir şekilde bağlandığından hücre duvarı sentezini de engelleyebildiğini göstermektedir. 
Bu çalışmada geliştirdiğimiz antimikrobiyal peptitlerin hepsinin proteinaz K'ya duyarlı oluğunu saptadık. Proteazlara dirençli sentetik benzer türevlerinin geliştirilmesi, bu peptitlerin tedavi amaçlı kullanılmalarıd durumunda dayanıklılıklarını arttıracaktır. Bu peptitlerin hayvan çalışmaları ile güvenilirliği kanıtlandıktan sonra diğer antibiyotiklere dirençli organizmalara karşı umut verici ilaç adayları olabilirler.

Abstract:
Antimicrobial peptides produced by a wide spectrum of organisms from insects to humans, are natural antibiotics, which may be important alternative therapy agents for infections caused by organisms resistant to classical antimicrobials. Inspired from conserved motifs of natural antimicrobial peptides we aimed to design short, easy to produce peptides, which show antibacterial activity. We have determined the conserved regions of natural antimicrobial peptides and analyzed their three-dimensional structure. This revealed that these short peptide regions consisted of repeating hydrophobic and positively charged amino acids that form alpha-helix structures and position positively charged amino acids on one side of the helix. We have designed and obtained peptides similar to these structures and determined their antibacterial activity on different species of bacteria and studied their relation to bacterial membranes by molecular dynamics modeling, which helped us to understand their mechanism of action. Including arginine in peptides as a positively charged amino acid produced better antibacterial activity compared to lysine. Having positively charged amino acids at both ends created better activity to E. coli (MIC 2.0 μg/ml) compared to Staphylococcus aureus (MIC 16.0 μg/ml). Having positively charged amino-acid only at one end created equal activity to both of these organisms (MIC 4.0 μg/ml). The positioning of arginines on one side of the molecule in a zigzag form increased the activity prominently compared to positioning on an almost linear axis. Increasing the number of hydrophobic amino acids from 3 to 6 at one end resulted to self-binding and eliminated completely the antibacterial activity of the peptide. Molecular dynamic simulations suggested that asymmetric positioning of hydrophobic and positively charged amino acids buries the hydrophobic part into the lipid bilayer of the membranes and positively charged parts fix it to the negatively charged phosphate groups of phospholipids on both sides of the lipid bilayer. Thus, a single molecule is able to create hydrophilic channel, which results the leak of water and hydrophilic molecules. Electron microscopic examination of staphylococci treated with these peptides revealed that the bacteria split into almost two equal halves from the middle where active cell wall synthesis occur. Additionally, docking studies revealed that there was strong binding of the peptides to major peptidoglycan synthesizing zare protein, transglycosylase, indicating that they may also be inhibiting the cell wall synthesis.  All peptides were susceptible to proteinase K. Development of their synthetic similar derivatives resistant to proteases, will increase their clinical usefulness. Once their safety is proven, these peptides may be promising drugs against organisms resistant to other antibiotics.