Arı sütü ve rosmarinik asitin yara iyileştirme potansiyelinin araştırılması
Investigation of wound healing potential of royal jelly and rosmarinic acid
Yazar: YUNUS AKSÜT
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Arı sütü = Royal jelly ; Hiperglisemi = Hyperglycemia

Özet:
Yara iyileşmesi, hasarlı/yaralı dokuların onarıldığı, oldukça karmaşık bir mekanizmaya sahip, dinamik ve çok aşamalı bir süreçtir. Bazı sistemik ve lokal faktörler yara iyileşmesinde gecikmelere veya bozulmalara yol açabilmektedir. Diyabet başta olmak üzere çeşitli hastalıklar ya da dışsal etmenler sebebiyle bozulmuş yara iyileşmesi süreci hastanın yaşam kalitesini düşürmekte, hatta ampütasyon veya ölümle sonuçlanabilmektedir. Glukoz homeostazisinin düzenlenmesindeki hatalarla gelişen hiperglisemi (yüksek kan şekeri) yara iyileşmesi sürecini olumsuz etkileyen önemli sistemik faktörlerden biridir. Ultraviyole (UV) ışınları ise insan derisini etkileyen en önemli çevresel lokal faktörlerden biridir. 
Farklı yara türlerinde iyileşme sürecini desteklemek için birçok araştırma yapılmış ve çeşitli ürünler geliştirilmiş olsa da, daha etkili yenilikçi ürünlere hâlâ ihtiyaç vardır. Doğal bileşikler geniş terapötik etkinlikleri ve hafif yan etkileriyle yara iyileşmesinde umut vericidir. Bitki özleri ya da bunların aktif bileşenlerinin yanı sıra bal arısı ürünleri de yara iyileştirme potansiyeli yüksek alternatiflerdir.
Bu tez çalışmasında, doğal bir bileşik olan rosmarinik asitin (RA), biyoaktif peptidlerce zengin bir bal arısı ürünü olan arı sütünün (RJ) ve bu maddeleri içeren yeni bir kombine ürünün (RA+ RJ) yara iyileştirme potansiyelleri, UVB ışınlarına ve hiperglisemi-benzeri yüksek glukoza maruz bırakılan hücresel sistemlerde araştırıldı. Bu kapsamda çalışma, yara iyileşmesinin en önemli hücrelerinden fibroblastlar (HFF hücre hattı) ve keratinositler (HaCaT hücre hattı) üzerinde yürütüldü. Maddelerin anjiyogenez üzerine etkisini belirlemek için insan umbilikal ven endotel hücre hattı (HUVEC) kullanıldı. 
RA ve RJ'nin yara iyileştirici etkilerini incelemeden önce, örneklerin deri hücreleri üzerindeki sitotoksik veya proliferatif etkileri MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazolyum bromür) testi ile araştırıldı. Ardından en uygun kombine ürün bileşimini ve uygulama dozunu belirlemek için farklı kombinasyonlarla hücre canlılık testleri (MTT) yürütüldü. Örneklerin artan hücre göçü ile karakterize akut yara iyileşmesi üzerindeki etkileri, çizik yara deneyi ile araştırıldı. Ayrıca, bu deneyden sonra toplanan hücrelerde proliferasyon göstergesi protein anlatımları Western blot yöntemiyle analiz edildi. İleri deneyler için en uygun konsantrasyonların RA için 10 μM ve RJ için 100 μg/mL olduğu belirlendi ve bu maddeler tek tek ve kombine halde UVB- ve yüksek glukoz-hasarlı hücrelere uygulandı. Örneklerin yara iyileştirme potansiyelleri canlılık testi ve çizik yara deneyi gibi hücresel yöntemlerle ve qRT-PCR, Western blotlama, immünoloresan işaretleme, spektroflorometri, spektrofotometri gibi moleküler analizlerle değerlendirildi. UVB ve yüksek glukoz uygulamaları için yürütülen doz ve zaman optimizasyonu çalışmalarında hücre canlılık testlerinin yanı sıra, hücre içi artan oksidasyon ve apoptoz bulguları dikkate alındı ve hücrelere UVB hasarı için 100 mJ/cm2 UVB uygulanmasına, hiperglisemi-benzeri koşul içinse 50 mM glukoz uygulanmasına karar verildi. RA, RJ ve RA+RJ'nin UVB ve yüksek glukoza bağlı hasarları ortadan kaldırma kapasitesi, hücrelerin proliferasyon ve migrasyon yeteneğinin yanı sıra, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi, protein hasarları, lipit peroksidasyonu, inflamasyon, apoptoz, hücre sinyalleşmesi, ER stresi, kök hücre farklılaşması gibi anahtar metabolik süreçler üzerinden değerlendirildi. Ek olarak, uygulamaların anjiyogenik potansiyeli in vitro endotel tüp oluşumu deneyi ile analiz edildi. 
Deneysel verilere göre, UVB ve yüksek glukoz uygulamaları, HFF ve HaCaT hücrelerinde oksidatif stresi, inflamasyonu ve hücre ölümünü artırdı. Üç örneğin (RA, RJ ve RA+RJ) de UVB ve yüksek glukoz uygulamalarından sonra azalan proliferasyon ve migrasyonu artırdığı; artan oksidatif hasarı, inflamasyonu ve apoptozu düşürdüğü belirlendi. En etkin test materyalinin 10 μM RA ve 100 μg/mL RJ içeren kombine ürün olduğu belirlendi. 
Test edilen tüm maddeler, büyüme faktörlerinden FGF2 ve VEGFA ile proliferasyon göstergesi Ki67'nin anlatımlarını arttırdı. Ayrıca AKT fosforilasyonunu ve NF-κB anlatımını azaltırken ERK1/2 fosforilasyonunun artmasına da yol açtılar. UVB ve yüksek glukoz maruziyetine bağlı olarak artan ROS üretimi, oksidatif protein hasarları ve lipit peroksidasyonunun, doğal maddelerle işlem sonrasında önemli ölçüde azaldığı tespit edildi. Doğal madde uygulamaları sonucu azalan inflamasyon, IL-1β, IL-6 ve TNF-α mRNA düzeylerindeki düşüş ve IL-10 mRNA düzeyindeki artış ile gösterildi. İnflamasyondaki düşüşün, aşağı regüle NUDT6/AKT/NF-κB yolu ile ilgili olabileceğine dair dikkat çekici veriler elde edildi. Doğal maddeler NF-κB p65'in anlatımı yanında nükleer translokasyonunu da azalttı. Test materyalleri ile işlem görmüş hücrelerde inflamasyondaki düşüşe paralel olarak matriks metalloproteazların (MMP2 ve MMP9) anlatımları da azaldı ve kollajen I düzeyi yükseldi. Hasarlı hücrelerdeki artmış apoptozun (Bax/Bcl2 oranı, kaspaz-3 ve PARP1 protein düzeylerinin) doğal maddelerle azaltılabildiği saptandı. Bu bulgu ölü, apoptotik ve canlı hücreleri belirlemeyi sağlayan HO/PI ikili boyaması ile de doğrulandı. Benzer şekilde, hasarlı hücrelerde artan ER stresi ile ilişkili Grp78, PERK ve IRE1α protein düzeyleri de doğal maddelerle işlem sonucunda düşüş gösterdi. Test maddeleri E-kaderin/N-kaderin oranını, Twist1, Snail1 ve TGF-β protein düzeylerini artırdı, dolayısıyla epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) hızlandırdı. Ayrıca uygulamalar kök hücre göstergelerinin (CD44, CD133 ve Nanog) anlatımında artışa yol açtı. 
Sonuç olarak, RA ve/veya RJ uygulamaları, NUDT6/AKT/NF-κB yolunun aşağı regülasyonunu ve FGF2/ERK/EMT yolunun yukarı regülasyonunu sağlayarak yara iyileşmesini hızlandırmaktadır. Böylece, oksidatif stresi, inflamasyonu ve apoptozu azaltmakta, proliferasyonu ve migrasyonu artırmaktadır. Test maddeleri arasında en umut verici ürün RA+RJ kombinasyonudur.
Bu tezde elde edilen veriler, rosmarinik asit ve arı sütünün tek başlarına veya kombine halde, akut ve kronik yara tedavisinde kullanılma potansiyellerinin yüksek olduğunu vurgulamaktadır. Bununla birlikte, in vitro çalışmalara dayanan bu veriler in vivo deneylerle de desteklenmelidir. Özellikle RA+RJ kombinasyonu, gelecekte yürütülebilecek preklinik ve klinik çalışmalardan sonra yara iyileştirici topikal ilaçların bileşimine girebilir. Genel sonuçların, yara iyileşmesine yönelik yenilikçi doğal ürünlerin ve/veya araştırma stratejilerinin geliştirilmesine katkıda bulunması beklenmektedir. Dahası, bu çalışma, inflamasyon ve oksidatif stresin eşlik ettiği diğer sağlık sorunlarının tedavisine yönelik yeni ürünlerin ve yaklaşımların geliştirilmesine rehberlik edebilir.

Abstract:
Wound healing is a dynamic and multi-stage process with a highly complex mechanism in which damaged/injured tissues are repaired. Some systemic and local factors may cause delays or deterioration in wound healing. Due to various diseases or external factors, especially diabetes, an impaired wound-healing process reduces the patient's quality of life and may even result in amputation or death. Hyperglycemia (high blood sugar), which develops due to errors in regulating glucose homeostasis, is one of the important systemic factors that adversely affect the wound-healing process. Ultraviolet (UV) rays are one of the most crucial environmental and local factors affecting human skin.
Although much research has been conducted and various products have been developed to support the healing process in different wound types, more effective innovative products are still needed. Natural compounds are promising in wound healing with their wide scale of therapeutic efficacy and mild side effects. In addition to plant extracts or their active ingredients, honey bee products are also alternatives with high wound-healing potential.
In this thesis study, the wound-healing potential of rosmarinic acid (RA), which is a natural compound, and royal jelly (RJ), which is a honey bee product rich in bioactive peptides, and a new combined product containing these substances was investigated in the cellular systems subjected to UVB and hyperglycemia-like high glucose. In this context, the study was conducted on fibroblasts (HFF cell line) and keratinocytes (HaCaT cell line), the most crucial cells in wound healing. To determine the effect of substances on angiogenesis, the human umbilical vein endothelial cell line (HUVEC) was used.
Before examining the wound-healing effects of RA and RJ, cytotoxic or proliferative effects of the samples on skin cells were investigated by MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) test. Then, a cell viability test (MTT) was conducted with different combinations to determine the most appropriate combined product composition and application dose. The effects of the samples on acute wound healing, characterized by increased cell migration, were investigated by scratch-wound assay. In addition, proliferation indicator protein expressions in the cells collected after this experiment were analyzed by the Western blotting method. The most convenient concentrations for further experiments were determined as 10 μM for RA and 100 μg/mL for RJ, and these substances, individually and in combination, were applied to UVB- and high glucose-damaged cells. Wound healing potentials of the samples were evaluated using cellular methods such as viability test and scratch-wound assay and molecular analyses such as qRT-PCR, Western blotting, immunofluorescent labeling, spectrofluorometry, and spectrophotometry. In addition to cell viability tests in the dose and time optimization studies for UVB and high glucose applications, the increased intracellular oxidation and apoptosis findings were taken into consideration, and it was decided to apply 100 mJ/cm2 UVB for UVB damage and 50 mM glucose for hyperglycemia-like condition. The capacity of RA, RJ, and RA+RJ to eliminate UVB and high glucose damage was evaluated by examining the proliferation and migration ability of the cells as well as key metabolic processes, such as production of reactive oxygen species (ROS), formation of protein, lipid peroxidation, inflammation, apoptosis, cell signaling, ER stress, and stem cell differentiation. In addition, the angiogenic potential of the samples was analyzed by the in vitro endothelial tube formation test.
According to experimental data, UVB and high glucose manipulations increased oxidative stress, inflammation, and cell death in HFF and HaCaT cells. All three samples (RA, RJ, and RA+RJ) were determined to increase proliferation and migration, which decreased after UVB and high glucose applications and reduced excess oxidative damage, inflammation, and apoptosis. It was determined that the most effective test material was the combined product containing 10 μM RA and 100 μg/mL RJ.
All tested substances increased the expression of the growth factors FGF2 and VEGFA and the proliferation indicator Ki67. These also led to increased ERK1/2 phosphorylation while decreasing AKT phosphorylation and NF-κB expression. It was detected that ROS production, oxidative protein damage, and lipid peroxidation, which increased due to UVB and high glucose exposure, decreased significantly after the treatment with natural substances. The reduced inflammation resulting from natural substance applications was demonstrated by the decrease in IL-1β, IL-6, and TNF-α mRNA levels and the increase in IL-10 mRNA level. Remarkable data were obtained that the decrease in inflammation may be related to the down-regulated NUDT6/AKT/NF-κB pathway. Natural substances decreased the expression as well as nuclear translocation of NF-κB p65. In parallel with the decrease in inflammation in cells treated with test materials, the expression of matrix metalloproteases (MMP2 and MMP9) also decreased, and the level of collagen I increased. It was determined that increased apoptosis (Bax/Bcl2 ratio, caspase-3, and PARP1 protein levels) in damaged cells could be reduced with natural substances. This finding was further confirmed by HO/PI dual staining, which allowed the identification of dead, apoptotic, and living cells. Similarly, Grp78, PERK, and IRE1α protein levels, associated with increased ER stress in damaged cells, decreased due to natural substances' treatment. The test substances increased the E-cadherin/N-cadherin ratio, Twist1, Snail1, and TGF-β protein levels, thus accelerating the epithelial-mesenchymal transition (EMT). The applications also led to an increase in the expression of stem cell indicators (CD44, CD133 and Nanog).
In conclusion, RA and/or RJ treatments accelerate wound healing by down-regulating the NUDT6/AKT/NF-κB pathway and up-regulating the FGF2/ERK/EMT pathway. Thus, it reduces oxidative stress, inflammation, and apoptosis and increases proliferation and migration. The most promising product among the test substances is the RA+RJ combination.
The data obtained in this thesis emphasize that rosmarinic acid and royal jelly, alone or in combination, have a high potential to be used in acute and chronic wound treatment. However, these data based on in vitro studies should also be supported by in vivo experiments. In particular, the combination of RA+RJ may be included in the composition of wound-healing topical drugs after future preclinical and clinical studies. The overall results are expected to contribute to developing innovative natural products and/or research strategies for wound healing. Furthermore, this study may guide the development of new products and approaches for treating other health problems accompanied by inflammation and oxidative stress.