Esansiyel trombositemi ve primer miyelofibrozis olgularında ASXL1, IDH1, IDH2 gen mutasyonları ve JAK2V617F allel yükü ile klinik seyir arasındaki ilişki
Impact of ASXL1, IDH1, IDH2 mutations and JAK2V617F allele burden in essential thrombocythemia and primary myelofibrosis on clinical course
Yazar: İPEK YÖNAL
Danışman: PROF. DR. FATMA DENİZ SARGIN
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Alleller = Alleles ; Birincil miyelofibroz = Primary myelofibrosis ; JAK 2 = JAK 2 ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prevalans = Prevalence ; Prognoz = Prognosis ; Trombositemi-hemorajik = Thrombocythemia-hemorrhagic

Özet:
Amaç: Philadelphia-negatif (Ph-negatif) miyeloproliferatif neoplaziler (MPN), başlıca polisitemia vera (PV), esansiyel trombositemi (ET) ve primer miyelofibrozisden (PMF) oluşan kronik seyir ile karakterize bir grup hastalıktır. PV, başlıca eritrositoz ve ET, başlıca trombositoz ile karakterizedir. PMF, başlıca anormal sitokin ekspresyonu, kemik iliği fibrozisi, ekstramedüller hematopoez ve kısa yaşam süresi ile karakterizedir. 2005 yılında JAK2V617F mutasyonunun keşfi sonrasında PV?lı olguların %95?inden fazlasında ve ET veya PMF?li olguların yaklaşık %50-60?ından fazlasında temeldeki moleküler olay anlaşılmıştır. 2006 yılında ET ve PMF?de MPL mutasyonu ve 2007 yılında PV?da JAK2 ekzon 12?de ek bir mutasyon tanımlanmıştır. ET ve PMF olgularının yaklaşık %40?ında moleküler bir belirteç olmamasından yola çıkarak ek mutasyonların varlığı düşünülmüştür. Ph-negatif MPN?de 2009 yılında ASXL1 gen mutasyonu ve 2010 yılında IDH1/IDH2 gen mutasyonları tanımlanmıştır. Bazı çalışmalarda, yüksek JAK2V617F allel yükünün ET olgularında agresif fenotipe işaret eden hematolojik ve klinik göstergelerle ilişkili olduğu bildirilmiştir. Diğer yandan bazı çalışmalarda, PMF?de düşük allel yükünün kısa yaşam süresi ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. JAK2V617F allel yükünü araştıran çalışmaların kısıtlayıcı özellikleri, çoğunluğunun retrospektif olmasıdır. Bu çalışmada İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları ABD, Hematoloji BD?ında takip edilmekte olan 107 ET ve 77 PMF olgusunda ASXL1 ve IDH1/IDH2 gen mutasyonlarının klinik önemi, prevelansı ve potansiyel prognostik önemi araştırılmıştır. Ayrıca çalışmamızda ET ve PMF olgularında JAK2V617F mutasyonunun allel yükü ile komplikasyonlar ve tüm yaşam süresi (OS) arasındaki ilişki ve JAK2V617F allel yükü ile ASXL1 mutasyonu ve IDH1/IDH2 gen mutasyonları arasındaki ilişkinin araştırılması hedeflenmiştir.
Gereç ve Yöntem: Çalışmamıza 2008 Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) kriterleri esas alınarak Ph-negatif MPN tanısı konmuş olan 184 olgu (107 ET, 77 PMF) dahil edilmiştir. Olguların demografik özellikleri, klinik ve laboratuar bilgilerine ek olarak OS taranmıştır.  Venöz kandan DNA izolasyonu yapılarak ASXL1 (ekzon 12) mutasyonlarını tespit etmek için DNA çift taraflı olarak dizilenmiştir. IDH1 ve IDH2 mutasyonlarını (ekzon 4) tespit etmek için gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) cihazında yüksek çözünürlüklü melting (YÇM) yöntemine dayalı olarak örnekler gruplandırılmıştır. Sonuçlar çift yönlü DNA dizileme ile konfirme edilmiştir. Çalışmamızda ticari diagnostik kit kullanılarak gerçek zamanlı semi-kantitatif PZR metodu ile JAK2V617F mutasyon analizi gerçekleştirilmiş ve eş zamanlı olarak mutant allel yükü tespit edilmiştir. Klinik ve laboratuar verileri içeren parametreler SPSS istatistik programına (Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, 2008) yüklenmiştir. p değeri <0.05 olan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. ET ve PMF?de yaşam eğrileri, `Kaplan-Meier? analizi kullanılarak OS?ni hesaplamak için oluşturulmuştur ve gruplar arası sağkalım oranlarının karşılaştırılması log rank testi ile yapılmıştır. Buna ek olarak PMF?de yaşam analizi, lösemi ilişkisiz sağkalımı (LFS) hesaplamak için yapılmıştır. Bağımsız değişkenler ile yaşam süresi arasındaki ilişkinin incelenmesi için Cox regresyon modeli kullanılarak çok değişkenli analiz yapılmış ve ölümün kümülatif riskini hesaplamak için odds ratio (OR) kullanılmıştır. 
Bulgular: ET olgularının 58?i kadın, 49?u erkekdir ve yaş ortalaması 56.3 (SD 14.5) bulunmuştur. PMF olgularının ise 43?ü kadın, 34?ü erkek olup yaş ortalaması 60.8?dir (SD 14.5). ET ve PMF olgularının tanıdan itibaren ortalama takip süresi (TS) sırasıyla 69.91 ay (SD 60.8) ve 45.61 ay (SD 47.52) olarak bulunmuştur.  PMF tanılı 77 olgunun 19?unda (%24.7) ve ET tanılı 107 olgunun 9?unda (%8.4) ASXL1 mutasyonu (ekzon 12) saptanmıştır. PMF tanılı olgularda ASXL1 mutasyonu (ekzon 12) sıklığı, ET tanılı olgulara göre anlamlı derecede yüksek saptanmıştır (p=0.005). Çalışmamızda, 184 Ph-negatif MPN tanılı olgunun 28?inde (%15.2), toplam 29 ASXL1 mutasyonu saptanmıştır (bir PMF tanılı olgumuza çift ASXL1 mutasyonu eşlik etmiştir). Çalışma grubumuzun 19?unda (%10.3) nonsense mutasyonlar (çerçeve kayması mutasyonları dahil), 8?inde (%4.3) missense mutasyonlar ve birinde (%0.5) nonsense ve missende mutasyon birlikteliği görülmüştür. ET olgularının birinde (%0.9) ve PMF olgularının 4?ünde (%5.2) IDH1 mutasyonu tespit edilmiştir. ET tanılı bir olguda (%0.9) ve PMF tanılı bir olguda (%1.3) IDH2 mutasyonu saptanmıştır. Sonuç olarak toplam 2 ET (%1.9) ve 5 PMF (%6.5) olgusunda IDH mutasyonuna rastlanmıştır. ET tanılı IDH2 mutasyonu taşıyan olguya (R140Q), allel yükü %5 olan JAK2V617F mutasyonu eşlik etmiştir. Diğer IDH mutasyonu taşıyan ET tanılı olguda ise (IDH1 R132C) JAK2V617F mutasyonu saptanmamıştır. PMF?de 5 IDH mutasyonu taşıyan olgulardan 3?ünde (1 IDH1 R132C, 1 IDH1 R132S ve 1 R140Q), eş zamanlı JAK2V617F mutasyonu saptanmıştır (JAK2V617F allel yükü sırasıyla %31-50, %5-12.5 ve %31-50). IDH1 R132C mutasyonu taşıyan 2 PMF olgusunda ise JAK2V617F mutasyonu saptanmamıştır. ET ve PMF olgu grupları arasında IDH mutasyon sıklığı açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (p=0.131). PMF?de JAK2V617F mutasyon sıklığı, ET?ye göre anlamlı derecede yüksek saptanmıştır (sırasıyla %75.3, %59.8; p=0.028). Bunun yanında, PMF?de yüksek JAK2V617F allel yüküne sahip olgu sıklığı (allel yükü>%50), ET grubuna göre belirgin yüksek saptanmıştır (sırasıyla %23.4, %4.7; p=0.001). ET?de ASXL1 mutasyonunu taşıyan olgularda tanı sırasındaki yaşın ileri olma eğiliminde olduğu ve tanı sırasındaki ortalama lökosit değerinin yüksek olma eğiliminde olduğu gösterilmiştir (sırasıyla p=0.073; p=0.06). ET?de ASXL1 mutasyonu varlığında kemik iliğinde ileri derecede fibrozis saptanmıştır (p=0.003). ASXL1 mutasyonunu taşıyan ET tanılı olgularda total tromboz, arteriyel tromboz ve venöz tromboz sıklığında değişiklik saptanmazken ASXL1 mutasyonu taşıyan grupta SVO eğiliminin yüksek olduğu gösterilmiştir (sırasıyla p=0.73; p=0.416; p=1 ve p=0.059). ET?de ASXL1 mutasyonu OS üzerine etkisiz bulunmuştur (p=0.737). ASXL1 mutasyonunu taşıyan PMF grubunda yaş ortalaması anlamlı derecede yüksek olmakla beraber, ASXL1 mutasyonu varlığında kanama komplikasyonunda artış gözlenmiştir (sırasıyla p=0.037; p=0.008). Ayrıca, ASXL1 mutasyonunu taşıyan PMF grubunda kanamanın hayati organlarda görülme sıklığının yüksek olduğu gösterilmiştir (p=0.001). Korelasyon analizi sonucunda PMF olgu grubunda ASXL1 mutasyonu varlığı ile kanama sıklığı arasında pozitif yönde hafif dereceli bir ilişki saptanmıştır (r=0.327). ASXL1 mutasyonunu taşıyan PMF olgularında ölüm oranı, ASXL1 mutasyonunu taşımayan PMF olgularına göre anlamlı derecede yüksek saptanmıştır (sırasıyla %42.1, %10.3; p=0.004). JAK2V617F mutasyonu olan 58 PMF olgusunun 14?ünde (%24.1) ve JAK2V617F mutasyonunu taşımayan 19 PMF olgusunun 5?inde (%26.3) ASXL1 mutasyonu saptanmıştır (p=0.535). JAK2V617F mutasyonunu taşıyan 64 ET olgusundaki ASXL1 sıklığı %9.4 (n=6) iken JAK2V617F mutasyonunu taşımayan ET olgularındaki sıklığı %7 (n=3) olarak bulunmuştur (p=0.738). ASXL1 mutasyonunu taşıyan 19 PMF olgusunun 14?ünde (%73.7) ve ASXL1 mutasyonunu taşıyan 9 ET olgusunun 6?sında (%66.7) JAK2V617F mutasyonu saptanmıştır. Sonuç olarak ASXL1 mutasyonunu taşıyan PMF olguları ile taşımayan olgular arasında JAK2V617F mutasyon sıklığı açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (p=1). Ayrıca, ASXL1 mutasyonunu taşıyan ve mutasyon olmayan ET olguları arasında JAK2V617F mutasyon sıklığı benzer bulunmuştur (p=0.738). IDH mutasyonunu taşıyan PMF olgularında kadın cinsiyeti sıklığında artışa eğilim olduğu gösterilmiştir (p=0.063). IDH mutasyonunu taşıyan PMF olgularında kanama sıklığının, mutasyon taşımayan gruba göre anlamlı derecede yüksek olduğu ve IDH mutasyonu olan olgularda kanamanın hayati organlarda görülme eğiliminin daha yüksek olduğu görülmüştür (sırasıyla p=0.048; p=0.061). Buna benzer şekilde, PMF olgu grubunda IDH mutasyonu ile kanama komplikasyonu arasında pozitif yönde zayıf bir ilişki saptanmıştır (r=0.27). IDH mutasyonunu taşıyan PMF olgularında ölüm oranı, IDH mutasyonu olmayan PMF olgularına göre anlamlı derecede yüksek saptanmıştır (sırasıyla %60, %15.3; p=0.039). IDH mutasyonunu taşıyan PMF olgularında lösemiye dönüşüm oranı, IDH mutasyonu olmayan olgulara göre yüksek olmakla beraber istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (sırasıyla %20, %4.2; p=0.24). ASXL1 mutasyonunu taşıyan PMF grubunda IDH1 mutasyon sıklığı, ASXL1 mutasyonunu taşımayan gruba göre belirgin yüksek saptanmıştır (sırasıyla %15.8, %1.7, p=0.044). Fakat ASXL1 mutasyonu olan ile mutasyon taşımayan PMF grubu arasında IDH2 mutasyon sıklığı açısından anlamlı fark saptanmamıştır (p=1). Sonuç olarak ASXL1 mutasyonu olan PMF grubunda mutasyon olmayan grup ile karşılaştırıldığında IDH mutasyon (IDH1 veya IDH2) sıklığı yüksek olma eğilimindedir (sırasıyla %15.8, %3.4; p=0.093). PMF?de ASXL1 mutasyonu ile IDH mutasyonu arasında pozitif yönde zayıf bir ilişki saptanmıştır (r=0.216). PMF?de ASXL1 mutasyonu ve IDH mutasyonu birlikteliği ile kanama komplikasyonu ve ölüm arasında pozitif yönde zayıf bir ilişki saptanmıştır (sırasıyla r=0.240; r=0.255). Çalışmamızda, JAK2V617F mutasyonunu taşıyan ET grubunda tanı sırasındaki Hgb ve Htc düzeyi anlamlı olarak yüksek saptanırken, ortalama trombosit değeri anlamlı olarak düşük saptanmıştır (sırasıyla p=0.001; p=0.001 ve p=0.043). Ayrıca JAK2V617F mutasyonunu taşıyan ET olgularında masif splenomegali oranı belirgin yüksek saptanmıştır (p=0.044). ET olgu grubunda JAK2V617F mutasyonu ile tanı sırasındaki lökosit ve Htc değerleri arasında pozitif yönde hafif dereceli bir ilişki saptanmıştır (sırasıyla r=0.324; r=0.362). Buna ek olarak ET?de JAK2V617F mutasyonu ve IDH mutasyonu birlikteliği ile venöz tromboz arasında pozitif yönde zayıf bir ilişki saptanmıştır (r=0.203). ET tanılı olgular JAK2V617F mutasyonunu taşımayan (n=43), düşük JAK2V617F allel yüküne sahip (allel yükü ?50%, n=59) ve yüksek allel yüküne sahip grup (allel yükü >%50, n=5) olarak üçe ayrılmıştır. ET?de yüksek JAK2V617F allel yüküne sahip olgu grubunda, diğer iki grup ile karşılaştırıldığında kanama sıklığında, ciddi kanama insidensinde, kan transfüzyon ihtiyacında ve masif splenomegali oranında artış saptanmıştır (p=0.003; p=0.001; p=0.022 ve p=0.015). Yüksek JAK2V617F allel yüküne sahip ET grubunda, düşük allel yükü olan gruba göre Hgb ve Htc düzeyleri anlamlı derecede düşük ve LDH düzeyi yüksek saptanmıştır (sırasıyla p=0.002; p=0.011 ve p=0.012). ET olgularında JAK2V617F allel yükü ile tanı sırasındaki lökosit arasında pozitif yönde zayıf bir ilişki saptanmıştır (r=0.238). Bunun yanında ET olgu grubunda JAK2V617F allel yükü ile kanama komplikasyonu ve venöz tromboz arasında pozitif yönde zayıf bir ilişki saptanmıştır (sırasıyla r=0.213; r=0.201). JAK2V617F mutasyonunu taşımayan PMF grubunda kadın cinsiyet oranı belirgin yüksek saptanmıştır (p=0.009). JAK2V617F mutasyonunu taşıyan PMF grubunda ortalama Hgb, Htc düzeyi ve lökosit sayısı, mutasyonu taşımayan gruba göre anlamlı derecede yüksek saptanmıştır (sırasıyla p=0.005; p=0.034 ve p=0.046). Ayrıca, JAK2V617F mutasyonunu taşıyan PMF grubunda kanamaya eğilim olduğu ve masif splenomegali oranının yüksek olma eğiliminde olduğu gösterilmiştir (sırasıyla p=0.098 ve p=0.096). PMF tanılı olgular JAK2V617F mutasyonunu taşımayan (n=19), düşük JAK2V617F allel yüküne sahip (n=40) ve yüksek allel yüküne sahip grup (n=18) olarak üçe ayrılmıştır. Yüksek JAK2V617F allel yüküne sahip grupta, tanı sırasındaki ortalama lökosit değeri diğer 2 gruba göre anlamlı derecede yüksek saptanmıştır (p=0.001). Ayrıca, yüksek JAK2V617F allel yüküne sahip grupta mutasyon taşımayan grupla karşılaştırıldığı zaman tanı sırasındaki Hgb ve Htc değeri anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (sırasıyla p=0.001 ve p=0.002). Korelasyon analizi sonucunda PMF olgu grubunda JAK2V617F allel yükü ile tanı sırasındaki lökosit ve Htc değeri arasında pozitif yönde hafif dereceli bir ilişki saptanmıştır (sırasıyla r=0.396; r=0.318). `Kaplan-Meier? analizinde ASXL1 mutasyonunu taşıyan PMF olgularında OS, taşımayan gruba göre anlamlı derecede kısa saptanmıştır (sırasıyla ortalama 108 ay; %95 CI: 62-153 ve 202 ay; %95 CI: 123-282; p=0.025). ASXL1 mutasyonunu taşıyan PMF olguları, mutasyon tiplerine göre gruplandırıldığı zaman nonsense mutasyon tipinde OS?nin diğer gruplara göre düşük olma eğiliminde olduğu görülmüştür (p=0.09). PMF olguları `DIPSS-plus? kriterlerine göre düşük, orta-1, orta-2 ve yüksek riskli olarak gruplandırıldığı zaman yüksek riskli grupta diğerlerine göre OS anlamlı derecede kısa bulunmuştur (p=0.007). IDH mutasyonunu taşıyan ve IDH mutasyonu olmayan PMF olguları arasında ve JAK2V617F mutasyonunu taşıyan ve taşımayan PMF olguları arasında OS açısından anlamlı farkılık gözlenmemiştir (sırasıyla p=0.351 ve p=0.589). Bunun yanında PMF olgu grubunda JAK2V617F allel yükü ile OS arasında ilişki saptanmamıştır (p=0.857). Cox regresyon modeline yukarıda bahsedilen değişkenler dahil edilerek çok değişkenli yaşam analizi yapılmıştır. Bunun sonucunda, `DIPSS-plus? kriterlerine göre yüksek riskli olan grubun ve ASXL1 mutasyonunun OS üzerindeki olumsuz etkisinin sürdüğü gösterilmiştir (sırasıyla OR: 3.19; %95 CI: 1.09-9.2; p=0.002 ve OR: 2.75; %95 CI:1.37-5.5; p=0.033). Sonuç olarak çok değişkenli analiz sonucunda bu iki faktörün bağımsız prognostik önemi ortaya konmuştur. Tek değişkenli analizde ASXL1 mutasyon tipine göre yapılan yaşam analizinde nonsense mutasyon varlığında OS?nin düşük olma eğiliminde olduğu görülmesine rağmen çok değişkenli analizde önemini yitirmiştir (sırasıyla p=0.09; p=0.131). Olgu sayısı az olmasına rağmen IDH mutasyonunu taşıyan PMF grubunda LFS, IDH mutasyonunu taşımayan gruba göre anlamlı derecede kısa saptanmıştır  (sırasıyla ortalama 169 ay; %95 CI: 159-180 ve 214 ay; %95 CI: 95-332; p=0.024). Bunun yanında `DIPSS-plus? kriterlerine göre yüksek riskli olan grupta LFS anlamlı derecede kısa bulunmuştur (p=0.032). ASXL1 mutasyonu ve JAK2V617F mutasyonu varlığında LFS?da farklılık gözlenmemiştir (sırasıyla p=0.207 ve p=0.934). Ayrıca PMF grubunda JAK2V617F allel yükü ile LFS arasında ilişki saptanmamıştır (p=0.997). ET olgularında ise ASXL1 mutasyonu, ASXL1 mutasyon tipi, IDH mutasyonu, JAK2V617F mutasyonu ve JAK2V617F allel yükü ile OS arasında bir ilişki saptanmamıştır (sırasıyla p=0.737; p=0.945; p=0.845; p=0.958; p=0.249). 
Tartışma: Sonuç olarak çalışmamız, ASXL1 mutasyonunun PMF olgularında ET?ye göre daha sık görüldüğünü göstermiştir (sırasıyla %24.7 ve %8.4). Çalışmamızda JAK2V617F negatif ET olgularının %7?sinde ve JAK2V617F negatif PMF olgularının %26.3?ünde ASXL1 mutasyonu saptanmıştır. Bu bulgulara dayanarak ASXL1 gen analizinin yapılması sonucunda, ET olgularının %7?sinde ve PMF olgularının %26.3?ünde ek klonal moleküler gelişimin gösterilebileceği düşünülebilir. Çalışmamız sonucunda PMF olgularında JAK2V617F mutasyonu sonrasında görülen en sık ikinci genetik mutasyonun ASXL1 mutasyonu olduğu düşünülebilir. PMF?de ASXL1 mutasyonu varlığında ölüm oranında artış görülmüştür. Ayrıca, çalışmamız rölatif olarak büyük bir PMF kohortunda bu mutasyonun kısa OS ile ilişkili olduğunu desteklemektedir. Tüm bu gözlemler, ASXL1 mutasyonunun PMF patogenezinde kritik rol oynadığını, hastalığın değerlendirilmesine yardımcı olacağını ve belki de rutin pratikte bakılmasının gerekli olabileceğini desteklemektedir. Bu çalışmada ET olgularında yüksek JAK2V617F allel yükünün düşük Hgb, Htc değeri, yüksek LDH düzeyi, kanama sıklığında, ciddi kanama insidensinde, kan transfüzyon ihtiyacında ve masif splenomegali oranında artış ile ilişkisi gösterilmiştir. Buna ek olarak ET?de yüksek JAK2V617F allel yükü ile venöz tromboz arasında zayıf ilişki bulunmuştur. Ayrıca çalışmamız, PMF olgularında yüksek JAK2V617F allel yükünün yüksek Hgb, Htc ve lökosit değerleri ile ilişkisini ve düşük JAK2V617F allel yükünün kan transfüzyon ihtiyacında artış ile olan ilişkisini ortaya koymuştur.  Böylelikle, iyi tanımlanmış ve kategorilere ayrılmış MPN olgularında JAK2V617F mutant allel yükünün kantitatif ölçümünün klinik hakkında önemli bir bilgi sağlayacağını düşünmekteyiz. Çalışmamız, hem IDH1 hem IDH2 mutasyonunun kronik faz ET veya PMF?de nadir de olsa görülebileceği göstermiştir (IDH sıklığı sırasıyla %1.9, %6.5). Çalışmamız, MPN?de IDH mutasyonlarının tespit edilmesinde YÇM analizinin, güvenilir, hızlı ve etkili bir tarama yöntemi olduğunu desteklemektedir. PMF olgularımızın 5?inde (%6.5?inde) IDH mutasyonu saptanmıştır (3 IDH1 R132C, 1 IDH1 R132S, 1 IDH2 R140Q). Kronik faz PMF?de IDH mutasyonu saptanan bir olguda seyir sırasında lösemik transformasyon gelişmiştir. Çalışmamızda, PMF?de IDH mutasyonu varlığında ölüm oranında artış gözlenmiştir. Ayrıca PMF?de IDH mutasyonu varlığında LFS?da kısalma görülmüştür. Bundan yola çıkarak PMF?de IDH mutasyonlarının, lösemik transformasyonun öngörülmesine neden olabileceği düşünülebilir. Günümüzde, MPN?de farklı IDH mutasyonlarının farklı prognostik anlamlarının olup olmadığı bilinmemektedir.     Çalışmamızda IDH mutant olgu sayısı az olduğu için bu konu araştırılamamıştır. Bunun yanında çalışmamızda kombine mutasyonların hastalık fenotipi ve seyri üzerine etkisi araştırıldığında PMF olgu grubunda ASXL1 mutasyonu ve IDH mutasyonu birlikteliği ile ölüm ve kanama komplikasyonu arasında ve JAK2V617F mutasyonu ve ASXL1 mutasyonu birlikteliği ile kanama komplikasyonu arasında bir ilişki gösterilmiştir. ET?de ise JAK2V617F mutasyonu ve IDH mutasyonu birlikteliği ile venöz tromboz arasında bir ilişki gözlenmiştir. Mutasyon kombinasyonlarının hastalık seyri ve komplikasyonlar üzerine net etkilerini ortaya koymak için ek çalışmalara ihtiyaç vardır. Çalışmamızda PMF?de JAK2V617F mutasyonu ve JAK2V617F allel yükü ile OS ve LFS arasında ilişki saptanmamıştır. Bu çalışmada diğer bir önemli özellik, PMF olgularında IDH mutasyonu varlığında anormal karyotip veya kötü karyotip anormalliklerinin eşlik etmemiş olmasıdır. IDH mutasyonunu taşıyan PMF olgularımızın hepsi normal karyotipe sahip olarak bulunmuştur. Buna ek olarak ASXL1 mutasyonunu taşıyan PMF olgularında kötü karyotip anormalliğinde artış saptanmamıştır. Buna rağmen çalışmamızda, ASXL1 mutasyonunun OS ve IDH mutasyonunun LFS ile ilişkisi gösterilmiştir. Bu verilere dayanarak ASXL1 ve IDH mutasyonlarının PMF olgularında bağımsız prognostik biyobelirteçler olduğu düşünülebilir. Çalışmamız, PMF olgu grubunda ASXL1 ve IDH mutasyonu gibi yüksek riskli mutasyon varlığında, orta-2 veya yüksek riskli hastalarda önerildiği gibi deneysel ilaç tedavisi veya allogeneik hematopoetik kök hücre naklinin (AHKHN) uygulanmasını desteklemektedir. Sonuç olarak, çalışmamızın sonuçları, önceki verilerle benzer şekilde MPN?de JAK-STAT sinyal yolağından ziyade epigenetik düzenlemeyi etkileyen mutasyonların prognostik önemine işaret etmektedir.

Abstract:
Aims: Philadelphia-negative (Ph-negative) myeloproliferative neoplasms (MPN) are a sub-category of MPN including polycthemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF). All three disorders show a chronic disease course. PV and ET are primarily characterized by erythrocytosis and thrombocytosis, respectively. PMF is primarily characterized by abnormal cytokine expression, bone marrow fibrosis, extramedullary hematopoiesis and shortened survival. After discovery of the JAK2V617F mutation in 2005, molecular basis was unleashed in >95% of PV patients and >50-60% of PMF patients. In 2006, MPL gene mutations have been described in ET and PMF followed by the definition of a mutation in exon 12 of JAK2 in PV one year later. The fact that almost 40% of ET or PMF patients lack a molecular marker strongly supports the involvement of additional mutations in pathogenesis. ASXL1 gene mutations were described in Ph-negative MPN in 2009. Mutations were described in IDH1/IDH2 in 2010. Several studies reported that presence of higher V617F allele burden in ET is associated with defined haematological and clinical markers indicative of a more aggressive behavior while, in PMF, low allele burden was reported to be associated with shortened survival. Most studies examining V617F allele burden have limitations due to retrospective nature. The purpose of this research is to determine ASXL1 and IDH1/IDH2 gene mutations and their clinical importance, prevelance and potential prognostic significance in 107 ET and 77 PMF patients under follow up in Istanbul University Istanbul Medical Faculty, Department of Internal Medicine, Division of Hematology. In addition, our study aimed at assessing the predictive value of  burden of V617F allele on  complications and overall survival (OS) of ET and PMF and the relationship with V617F allele burden and ASXL1 and IDH1/IDH2 gene mutations.   
Material and methods: Our study group consisted of 184 patients (107 ET and 77 PMF) diagnosed as Ph-negative MPN according to the WHO criteria in 2008. Patients? demographic data, clinical, laboratory findings and OS were registered. Exon 12 of ASXL1 was amplified from genomic DNA and bidirectionally sequenced. High-resolution melting was performed using the LightCycler 480 real-time polymerase chain reaction (PCR) system for IDH1 mutations (R130) and IDH2 mutations (R140 and 172) followed by bidirectional sequencing confirmation. We used a real-time semiquantitative PCR with `JAK2 MutaScreen kit? to screen JAK2V617 mutation and the mutant allele burden. All statistical analysis including clinical and laboratory parameters was performed using SPSS (Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, 2008). All p-values<0.05 were considered statistically significant. OS curves of ET and PMF were prepared by the `Kaplan-Meier? method and compared by the long-rank test. In addition, leukemia free survival (LFS) in PMF patients was estimated using `Kaplan-Meier? method. Multivariable analyses were conducted with the Cox proportional hazards regression model to determine the relationship between independent variables and OS. The odds ratio (OR) is used to estimate the relative risk of dead. 
Results: A total of 107 ET patients (54.2% female; mean age 56.3 [SD 14.5] and 77 PMF patients (55.8% female; mean age 60.8 [SD 14.5]) were included. The mean follow-up time of ET and PMF patients was 69.91 months (SD 60.8) and 45.61 months (SD 47.52), respectively. The frequency of ASXL1 mutations (exon 12) was significantly higher in PMF patients (19 of 77 patients, 24.7%) compared to ET (9 of 107 patients, 8.4%; p=0.005). Our analysis identified 29 different mutations of ASXL1 in 28 out of a total 184 patients, (15.2%) (one PMF patient presented with two simultaneous mutations). Nonsense mutations, including frameshift mutations were detected in 19 patients (10.3%), 8 (4.3%) showed missense mutations and one (0.5%) showed concurrent missense and nonsense mutations. The frequency of IDH1 mutation for ET and PMF patients was 0.9% (1 out of 107 cases) and 5.2% (4 out of 77 cases), respectively. Mutant IDH2 was detected in 1 out of 107 ET patients (0.9%) and 1 out of 77 PMF patients (1.3%). Overall, 2 (1.9%) ET and 5 (6.5%) PMF patients displayed IDH mutations. The ET patient with IDH2 mutation (R140Q) harbored JAK2V617F mutation with an allele burden of 5% while the other patient with IDH1 mutation (R132C) did not harbor JAK2V617F mutation. 3 of 5 IDH mutated PMF patients (1 IDH1 R132C, 1 IDH1 R132S and 1 R140Q) concurrently carried JAK2V617F mutation with an allel burden of 31-50%, 5-12.5% and 31-50%, respectively. 3 of 5 IDH mutated PMF patients (1 IDH1 R132C, 1 IDH1 R132S and 1 R140Q) concurrently carried JAK2V617F mutation with an allel burden of 31-50%, 5-12.5% and 31-50%, respectively. The remaining 2 PMF patients (2 IDH1 R132C) did not carry JAK2V617F mutation. ET and PMF patients demonstrated no significant difference for the frequency of IDH mutation (p=0.131). The frequency of JAK2V617F mutation was higher in PMF compared to ET patients (75.3%, 59.8%, respectively; p=0.028). Moreover, the frequency of JAK2V671F positive patients with mutant allele burden in upper quartile ranges (allele burden >50%) was higher in PMF with respect to ET (23.4%, 4.7%, respectively; p=0.001). There was a trend towards older age and higher leukocyte counts in ASXL1-mutated ET patients compared to wild-type patients (p=0.073 and p=0.06, respectively). There was a trend towards older age at initial diagnosis and higher leukocyte counts in ASXL1-mutated ET patients compared to wild-type patients (p=0.073 and p=0.06, respectively). ASXL1 mutated ET patients had significantly more severe bone marrow fibrosis (p=0.003). Although the prevelance of total thrombosis, arterial thrombosis and venous thrombosis did not differ among ASXL1-mutated and wild-type ET patients, ASXL1-mutated patients showed a trend towards an increase in the incidence of cerebrovascular events (p=0.73; p=0.416; p=1 and p=0.059, respectively). ASXL1 mutation did not predict OS in ET patients (p=0.737). Among PMF patients, ASXL1 mutation was associated with older age and a higher incidence of bleeding complications (p=0.037 and p=0.008, respectively). Also in PMF patients, the incidence of severe bleeding increased in the presence of ASXL1 mutation (p=0.001). Similarly, in PMF, a mild positive correlation was observed between ASXL1 mutation and bleeding complications (r=0.327). Higher incidence of death was observed in ASXL1-mutated PMF patients than in wild-type patients (42.1% and 10.3%, respectively; p=0.004). ASXL1 mutation was detected in 14/58 JAK2V617F mutant (24.1%) and 5/19 JAK2 wild-type (26.3%) PMF patients (p=0.535). ASXL1 mutation was present in 6/64 JAK2V617F mutant (9.4%) and 3/43 JAK2 wild-type (7%) ET patients (p=0.738). Reciprocally, 73.7% (14/19) ASXL1-mutated PMF and 66.7% (6/9) ASXL1-mutated ET patients carried JAK2V617F mutations. In summary, ASXL1-mutant and wild-type PMF patients demonstrated no difference for the frequency of JAK2V617F mutation (p=1). Also, the incidence of JAK2V617F mutation did not differ among ASXL1-mutated and wild-type ET patients (p=0.738). IDH mutated PMF patients showed a trend towards female gender (p=0.063). The incidence of bleeding complications was significantly higher for ASXL1-mutated PMF patients than wild-type patients (p=0.048). Also, there was a trend towards severe bleeding in IDH mutated PMF patients as compared to wild-type patients (p=0.061). Similarly, a weak positive correlation was observed between IDH mutation and bleeding complications (r=0.27). The incidence of death was higher in PMF patients with IDH mutation (60% and 15.3%, respectively; p=0.039). The incidence of leukemic transformation was higher in IDH mutated PMF patients than IDH wild-type patients but with no statistical significance (20% and 4.2%, respectively; p=0.24). There was a higher incidence of IDH1 mutation in ASXL1-mutated PMF patients with respect to ASXL1 wild-type PMF patients (15.8% and 1.7%, respectively; p=0.044). Yet, the incidence of IDH2 mutation among ASXL1-mutated and wild-type PMF patients showed no difference (p=1). In conclusion, PMF patients with ASXL1 mutation showed a trend towards a higher frequency of IDH (IDH1 or IDH2) mutations (15.8%, %3.4, respectively; p=0.093). In PMF, a weak positive correlation was observed between ASXL1 mutation and IDH mutation (r=0.216). In PMF patients, there was a weak positive correlation between bleeding complications and the combined ASXL1 and IDH mutation (r=0.240). Also, a weak positive correlation was observed between the combined ASXL1 and IDH mutation and death (r=0.255). In our study, JAK2V617F mutation positive ET patients had significantly higher Hgb and Htc levels and lower platelet counts at initial diagnosis (p=0.001; p=0.001 and p=0.043, respectively). Also,  massive splenomegaly was significantly more prevalent in JAK2V617F mutation positive ET patients (p=0.044). There was a mild positive correlation between JAK2V617F mutation and leukocyte and Htc levels in ET (r=0.324 and r=0.362, respectively). In addition, in ET, a weak positive correlation was observed between venous thrombosis and the combined JAK2V617F and IDH mutation (r=0.203). ET patients with JAK2V617F allele burden data available were divided into three groups: JAK2V617F mutation negative (n=43), V617F positive with mutant allele burden in the lower quartile (allele burden?50%, n=59) and upper quartile ranges (allele burden>50%, n=5 ). As compared to other groups, ET patients with upper quartile JAK2V617F allele burden had a significantly higher incidence of bleeding complications (p=0.003), higher incidence of severe bleeding (p=0.001), greater need for blood transfusions (p=0.022) and a higher incidence of massive splenomegaly (p=0.015). ET patients with upper quartile JAK2V617F allele burden had significantly lower Hgb levels (p=0.002), lower Htc levels (p=0.011) and higher LDH levels (p=0.012) as compared to patients with lower quartile JAK2V617F allele burden. The load of JAK2V617F mutant allele in ET patients positively correlated with leukocyte count, bleeding complications and venous thrombosis (r=0.238; r=0.213 and r=0.201, respectively). JAK2V617 mutation negative PMF group consisted of a significantly higher number of female patients (p=0.009). In PMF patients, the presence of JAK2V617F mutation was significantly associated with higher Hgb levels (p=0.005), higher Htc levels (p=0.034) and higher leukocyte counts (p=0.046). Also, JAK2V617F positive PMF patients showed a trend towards an increase in the incidence of bleeding complications(p=0.098) and massive splenomegaly (p=0.096).With regard to the JAK2V617F status, PMF patients were divided into three groups: JAK2V617F mutation negative (n=19), JAK2V617F positive with mutant allele burden in the lower quartile (n=40) and upper quartile ranges (n=18). Comparison across all three groups revealed significant associations between upper quartile allele burden and higher leukocyte counts (p=0.001). Also, PMF patients with upper quartile JAK2V617F allele burden had significantly higher Hgb (p=0.001) and Htc levels (p=0.002) as compared to JAK2V617F wild-type patients. Likewise, in PMF patients, there was a mild positive correlation between the load of JAK2V617F mutant allele and leukocyte counts and Htc levels (r=0.396 and r=0.318, respectively). `Kaplan-Meier? plots revealed significantly shortened OS in ASXL1-mutated PMF patients as compared to ASXL1 wild-type PMF patients (mean 108 months; 95% CI: 62-153 and 202 months; 95% CI: 123-282, respectively; p=0.025). Also, univariate analysis revealed a trend towards shorter OS in the presence of ASXL1 nonsense sequence variations with respect to other sequence variations (p=0.09). `DIPSS-plus? with high risk group significantly predicted worse OS (p=0.007). OS did not differ between IDH mutant and wild-type PMF patients and JAK2V617F mutant and wild-type PMF patients (p=0.351 and p=0.589, respectively). Also, JAK2V617F allele burden in PMF did not predict OS (p=0.857). A multivariate survival analysis using cox regression model included all aferomentioned variables. This model confirmed independent prognostic value of ASXL1 mutations (OR: 2.75; %95 CI:1.37-5.5; p=0.033) and `DIPSS-plus? with high risk group (OR: 3.19; %95 CI: 1.09-9.2; p=0.002). Prognostic significance was not sustained for ASXL1 nonsense sequence variations in multivariable analysis (p=0.131). Although the number of IDH mutated PMF patients was small, we observed a significantly shorter LFS in IDH mutated patients as compared to IDH wild-type patients (mean 169 months; 95% CI: 159-180 and 214 months; 95% CI: 95-332, respectively; p=0.024). In addition, LFS was significantly shorter in the high risk group as defined by `DIPSS-plus? criteria (p=0.032). In PMF patients, the presence of ASXL1 mutation and JAK2V617F mutation showed no difference in terms of LFS (p=0.207 and p=0.934, respectively). Also, JAK2V617F allele burden in PMF did not predict LFS (p=0.997). In ET patients, the presence of ASXL1, IDH, JAK2V617F mutations, ASXL1 sequence variations and JAK2V617F allele burden were not relevant to OS (p=0.737; p=0.845; p=0.958; p=0.945 and p=0.249, respectively).	
Conclusion: In conclusion, our results demonstrate that the frequency of ASXL1 mutation was significantly higher in patients with PMF than ET (24.7% and 8.4%, respectively). In our study group, approximately 7% of JAK2V617F-negative ET (3/43) and 26.3% of PMF patients (5/19) showed the ASXL1 mutations. Based on our findings, it may be deduced that analysis of the ASXL1 genes provided an additional 7% increase in ET and a 26.3% increase in PMF patients with a detected molecular marker of clonality. Our findings implies that ASXL1 mutations seem to be the most prevalent genetic mutations in PMF after JAK2V617F mutation. In PMF, an increase in mortality has been demonstrated  in presence of ASXL1 mutation. In our relatively large cohort of PMF patients, ASXL1 mutation was associated with shortened OS. The aferomentioned findings support that ASXL1 mutations may be a key factor  in the pathogenesis of PMF. Systematic detection of ASXL1 mutations could enable better disease assessment and should be considered to be included in routine disease evaluation. We showed that the ET patients with upper quartile JAK2V617F allele burden is associated with lower Hgb and Htc levels, higher LDH levels, increased frequency and severity of bleeding complications and an increased frequency of massive splenomegaly. Also, a weak correlation between  JAK2V617F allele burden and venous thrombosis was observed in ET patients. In PMF, our data demonstrated the association of upper quartile JAK2V617F allele burden with higher Hgb, Htc levels and leukocyte counts and lower quartile allele burden with increased transfusion requirement. Thus, our results support the contention quantification of JAK2V617F allele burden might reveal relevant clinical information in well-defined categories of MPN patients. This study showed that both IDH1 and IDH2 mutations can occur in chronic-phase ET or PMF, yet infrequently. The frequency of IDH mutations were 1.9% in ET and 6.5% in PMF patients. Our findings confirm high resolution melting (HRM) as a reliable, rapid and efficient screening tool for IDH1/IDH2 mutation detection in MPN. The mutant IDH was detected in 5 PMF patients (6.5%): 3 IDH1 R132C, 1 IDH1 R132S and 1 IDH2 R140Q. One of our chronic phase PMF patients harboring IDH mutations showed leukemic transformation. We observed an increase in mortality and a decrease in LFS in IDH mutated PMF patients. Thus, it can be suggested that IDH mutations may play a role in prediction of leukemic transformation. It has not not been yet elucidated whether various IDH mutations portend different prognostic relevance in MPN. This issue was not addressed in our study due to our limited number of IDH mutant cases. Our study also addressed the relationship between combined mutations on disease phenotype and course. In PMF, death and bleeeding complications were associated with combined ASXL1 and IDH mutations while combined JAK2V617F and ASXL1 mutation was associated with bleeding compliacations. In ET, a relationship between venous thrombosis and combined JAK2V617F and ASXL1 mutation was observed. Additional studies are needed to clearly assess the impact of mutation combinations on disease course and severity. According to our results, in PMF, OS and LFS had no relationship with   JAK2V617F mutation and V617F allele burden. An important characteristic feature of IDH mutated PMF in this study was the paucity of abnormal or unfavorable karyotype. All IDH mutated PMF patients had normal karyotype. Also, ASXL1 mutated PMF patients did not show an increase in poor karyotype features. Yet, despite these observations, our study determined a relationship between ASXL1 mutation and OS and IDH mutation and LFS. Thus, it seems that ASXL1 mutations and IDH mutations represent independent prognostic biomarkers in PMF. This study implies that, in PMF, the use of an investigational drug therapy or allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) may be justified as proposed in the management of intermediate-2 or high-risk disease in the presence of a mutationaly high risk status such as ASXL1 and IDH mutations. In conclusion, in PMF, our findings support the previous observations that mutations affecting epigenetic regulation might be prognostically more relevant than those involving JAK-STAT signaling.