Fare oositlerinde optimum partenogenetik aktivasyon protokolünün belirlenmesi
Determination of optimum parthenogenetic activation protocol in mouse oocytes
Yazar: ABDULLAH FATİH ERGİN
Danışman: PROF. DR. SERHAT ALKAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2009
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Embriyo = Embryo ; Embriyo kültür teknikleri = Embryo culture techniques ; Fareler = Mice ; Oositler = Oocytes ; Partenogenez = Partenogenesis

Özet:
Oosit aktivasyonu deneysel olarak uygulanmasının yanı sıra özellikle klonlama, ICSI gibi yardımcı üreme tekniklerinde zorunlu olarak kullanılan bir deney basamağıdır. Partenogenetik aktivasyon ise oositin fiziksel, kimyasal ya da mekanik metotlarla aktive edilerek yapay yolla embriyonal gelişimin başlatılmasını sağlayan önemli bir metodolojidir.Sunulan çalışmada dokuz değişik aktivasyon protokolü; genç ve yaşlı oositlere, KSOM - G1/G2 medyumlarında ve inbred CD1 - Hibrid CB6F1 fare ırklarından elde edilen oositlere uygulanmıştır. Aktivasyon sonrası oositte meydana gelen değişimler; fragmantasyon, dejenerasyon, bölünme ve embriyonal gelişim değerleri olarak kayıt altına alınarak değerlendirme yapılmıştır.Çalışmamızda, aktivasyon protokolleri tekli, ikili ve üçlü kombinasyonlar şeklinde uygulanmıştır. Tekli protokollerde; kalsiyum ionofor, etanol ile stronsiyum klorid kullanılmıştır. İkili protokoller tekli protokollerin siklohekzimid ile kombinasyonu ile yapılmıştır. Üçlü protokoller ise ikili protokollerin sitohalasin D ile kombinasyonu ile oluşturulmuştur.Elde edilen bulgulara göre fare ırkının ve farklı kültür medyumlarının oosit aktivasyonu, fragmantasyonu ve dejenerasyonu üzerine etkisi bulunmamaktadır. Oosit yaşının ise aktivasyon protokollerinde belirgin farklılıklar oluşturduğu tespit edilmiştir. Yaşlı oositlerde yüksek aktivasyon ve dejenerasyon oranları gözlenirken, genç oositlerde yüksek fragmantasyon oranları görülmüştür. Çalışmamızda Et, CaI, Sr-CHX, Sr-CHX-CD aktivasyon grupları uygun protokoller olarak tespit edilmiştir.Sonuç olarak; aktivasyon basamağına ihtiyaç duyulan çalışmalarda partenogenetik aktivasyon deneyleri ile öncelikli olarak optimizasyon çalışmaları yapılmalıdır. Uygun protokolün belirlenmesi için bu çalışmalarda uygulanacak aktivasyon protokolünün dozu, uygulama süresi, oosit yaşı, oosit kaynağı ve kullanılacak ortam dikkate alınmalıdır. Bununla birlikte değerlendirme yapılırken yalnız aktivasyon oranları değil oosit hasarları, bölünme ve embriyonal gelişim gibi verilerin tümü değerlendirilmelidir.Anahtar Kelimeler: Fare, oosit, partenogenetik aktivasyon, embriyo, in vitro kültürBu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir.Proje No: T-832.

Abstract:
Oocyte activation is a mandatory step for some artificial reproduction techniques like nuclear transfer cloning, ICSI and also used for researching of mechanisms releated with preimplantation embryo development. Parthenogenetic activation is an important tool for monitoring of embryo development with activating artificially varying methods on the absence of paternal genom.In the presented study, nine different activation protocols were examined with old and young oocytes obtained from inbred CD1 and hybrid CB6F1 mice and cultured in KSOM and G1/G2 media. Changes in oocytes following activation like fragmentation, degeneration, cleavage and embryo development were noted to analyse.Activation protocols were performed as single, double and triple combination in our study. Calcium ionophore, ethanol and strontium chloride were used as a single activation protocols which mimics spermatozoon effect after oocyte penetration. In double activation protocols, single activation protocols were combined with cycloheximide and triple activation protocols were established with combining a microfilament inhibitor Cytochalasin D.Our results show that different oocyte recipient and different culture conditions do not affect oocyte activation, fragmentation and degeneration. However it was found that oocyte aging causes significant differences on activation protocols. While older oocytes showed higher activation and degeneration ratio, younger oocytes showed higher fragmentation ratio. Et, Cal, Sr-CHX, Sr-CHX-CD groups were found acceptable protocol in our study.As a conclusion, in studies which require an oocyte activation step, one should first perform optimization studies with using partenogenetics activation experiments. In order to determine the best protocol; dosage of protocol, application time, oocyte age, oocyte source and culture conditions should be taken into consideration. Additionally, not only the activation ratio but also certain data like the oocyte damages, cleavage and embryonal development should also be noted while choosing the best protocol.Key Words: Mouse, oocyte, parthenogenetic activation, embryo, in vitro culture.The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University.Project No. T-832