Komet yöntemi ile 3T3 hücre hattında pozitif kontrollerin in vitro karşılaştırılması ve optimizasyonu
Comparison and optimization of positive controls using comet assay in 3T3 cell line in vitro
Yazar: SEDA İPEK
Danışman: PROF. AYLİN ÜSTÜNDAĞ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Farmasötik Toksikoloji = Pharmaceutical Toxicology
Dizin: Comet tekniği = Comet assay ; DNA hasarı = DNA damage ; Elektroforez = Electrophoresis ; Elektroforez-agar jel = Electrophoresis-agar gel ; Genotoksisite = Genotoxicity ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre kültürü = Cell culture ; İn vitro = In vitro

Özet:
Hücre düzeyinde DNA hasarını belirlemek için kullanılan Komet (Tek Hücre Jel Elektroforez) yöntemi bir genototoksisite testi olup, hassas, hızlı ve güvenilir sonuçlar vermesi ile ön plana çıkmaktadır. Bu test yöntemi sayesinde tek ya da çift DNA zincir kırıkları, baz çifti hasarları, alkali labil bölgeler, apoptotik çekirdekler belirlenebilmektedir. Komet testinde pozitif kontrol olarak uygulanan kimyasallar DNA hasarını indüklediği bilinen genotoksik maddelerdir. Pozitif kontroller hem in vitro hem de in vivo araştırmalarda bir maddenin genotoksik hasarının olup olmadığını ve DNA hasar/onarım kapasitesinin belirlenmesi açısından önemlidir. Bu yüzden komet yönteminde uygun pozitif kontrolün belirlenmesi son derece önemlidir.
Dünyada birçok farklı laboratuvarda komet testi yaygın olarak kullanılmaktadır. Fakat, yapılan her çalışmada farklı pozitif kontrollerden farklı konsantrasyonlardan alınan yanıtların değişiklik gösterdiği bilinmektedir. Bu nedenle tez çalışmamızda komet yönteminde en çok kullanılan ve genotoksik etkisi olduğu bilinen kimyasal maddelerden hidrojen peroksit (H2O2), etil metansülfonat (EMS), metil metansülfonat (MMS), N-etil-N-nitrozüre (ENU) ve etoposid farklı konsantrasyonlarda 3T3 fare embriyonik fibroblast hücresi üzerinde test edilmiştir. Ayrıca tez çalışmamızda komet testinde hücre kültürü üzerinde pozitif kontrol olarak kullanılan farklı kimyasalların DNA hasarını indükleyici etkileri maruziyet süreleri 30 dakika ve 60 dakika olmak üzere karşılaştırılmıştır.
Tezimizden elde ettiğimiz sonuçlara göre H2O2, Etoposid ve ENU'nun in vitro alkali komet test yönteminde kullanılması uygun pozitif kontrollerdir. MMS ve EMS için elde edilen sonuçlar negatif kontrole göre istatiksel olarak anlamlı olmasına rağmen, elde edilen değerler negatif kontrole yakın sonuçlar olduğu için in vitro alkali komet testinde pozitif kontrol olarak kullanımı uygun değildir.

Abstract:
Comet (Single-Cell Gel Electrophoresis) assay is a genotoxicity test used to determine DNA damage at the cell level and comes into prominence as giving sensitive, fast and reliable results. By using this test method, single or double DNA strand breaks, base pair damages, alkali labile regions, and apoptotic nuclei can be determined. In this method, chemicals applied as positive controls have genotoxic features, which are known to induce DNA damage. Positive controls are important for determining whether a substance causes genotoxic damage and DNA damage/repair capacity in both in vitro and in vivo studies. Therefore, it is highly important to determine the appropriate positive control in the 'Comet' assay.
The comet assay is widely used in many different laboratories around the world. However, it is known that the responses obtained from different positive controls at different concentrations vary in each study. Therefore, in our thesis study, hydrogen peroxide (H2O2), ethyl methanesulfonate (EMS), methyl methanesulfonate (MMS), N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) and etoposide, which are the most commonly genotoxic chemicals in the comet assay, were tested on 3T3 embryonic fibroblast cells at different concentrations. In addition, in our thesis study, the DNA damage-inducing effects of different chemicals used as a positive control on cell culture in the comet test were compared, with exposure times of 30 minutes and 60 minutes.
According to the results we obtained from our thesis, the use of H2O2, Etoposide and ENU in the in vitro alkaline comet test method are suitable positive controls. Although the results obtained for MMS and EMS are statistically significant compared to the negative control, they are not suitable for use as a positive control in the in vitro alkaline comet test as the results are close to the negative control.