Prokaryotik yeni (novel) P450 Monooksigenazların klonlanması, rekombinant ekspresyonu, enzimatik karakterizasyonu
Cloning, recombinant expression and charactezation of novel prokaryotic P450 monooxygenases
Yazar: DİDEM YILDIRIM
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ YUNUS ENSARİ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ CEM ÖZİÇ
Kafkas Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Bakteriler = Bacteria ; Enzimler = Enzymes ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production ; Sitokrom P 450 = Cytochrome P 450

Özet:
Enzimler proteinlerin büyük bir grubunu oluşturan biyopolimerlerdir. Günümüzde gıda, ilaç, kağıt ve kağıt hamuru, deterjan ve biyoteknoloji gibi birçok alanda yaygın olarak başarılı bir şekilde kullanılırlar. Sitokrom P450 monooksigenazların katalize edebildiği reaksiyonlar sayesinde biyoteknolojideki rolleri oldukça büyüktür. Bu zamana kadar tanımlanmış ve endüstride kullanılan P450 monooksigenaz enzimleri substratlara karşı düşük aktivite gösterirler. Bu olumsuzlukları ortadan kaldırmak için yeni P450 monooksigenaz enzimlerinin tanımlanması ve aktif protein olarak ifade edilmesi biyoteknolojik çalışmalar için büyük bir öneme sahiptir.
Bu tez çalışmasında Azorhizobium caulinodans bakterisinde yer alan ve endüstriyel öneme sahip P450 monooksigenaz enziminin Escherichia coli'ye aktarılıp recombinant protein olarak üretilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla PZR yöntemi ile çoğaltılan Azorhizobium caulinodans P450 monooksigenaz geni pQE30 ve pET28a vektörlerine klonlamıştır. Elde edilen rekombinant plazmitler iki farklı E.coli ırkına aktarılarak P450 monooksigenaz için en uygun ırk E.coli Rosetta ırkı, başarılı sonuç veren klonlama ise pET28a vektörü ile sağlanmıştır. Bu belirlemelerden sonra P450 monooksigenaz enziminin daha verimli bir şekilde üretilebilmesi için sıcaklık, besiyeri, IPTG, ALA ve FeCl3 konsantrasyonu, ekspresyon süresi gibi optimizasyon çalışmaları gerçekleştirilerek daha iyi verim elde edilmiştir.

Abstract:
Enzymes are biopolymers that make up a large group of proteins. Today, they are widely used in many fields such as food, medicine, paper and pulp, detergent and biotechnology. Cytochrome P450 monooxygenases have a major role in biotechnology due to the reactions catalyzed by them. The enzymes P450 monooxygenase that have been identified so far and used in industry show low activity towards substrates. In order to eliminate these drawbacks, the identification of new P450 monooxygenase enzymes and their expression as active proteins are of great importance for biotechnological studies.
In this thesis study, it is aimed to produce industrially important Azorhizobium caulinodans P450 monooxygenase enzyme in Escherichia coli as recombinant protein. For this purpose, the Azorhizobium caulinodans P450 monooxygenase gene was propagated by PCR method and cloned into pQE30 and pET28a vectors. The obtained recombinant plasmids were transformed into two different E.coli strains and the most appropriate vector was pET28a and the most appropriate strain was E.coli Rosetta for the production of P450 monooxygenase. Afterwards, recombinant protein expression conditions including temperature, medium, IPTG, ALA and FeCl3 concentration, expression time were optimized in order to produce P450 monooxygenase enzyme more efficiently.