Türkiye'de patojenik Yersinia enterocolitica izolasyonu ve in vivo koşullardaki lipopolisakkarit genlerinin ekspresyonu
Isolation of pathogenic Yersinia enterocolitica in Turkey and expression of lipopolysaccharide genes in vivo
Yazar: ELİF BOZÇAL
Danışman: PROF. DR. ATAÇ UZEL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Kentsel atık sular = Municipal waste waters ; PCR =   ; Yersinia enterocolitica = Yersinia enterocolitica

Özet:
Yersinia enterocolitica Türkiye'de çok nadiren karşılaşılan gıda kaynaklı bir patojendir. Bu çalışmada Türkiye'nin İzmir bölgesinden toplanan çeşitli insan, domuz ve çevresel örnekler farklı kültivasyon ve zenginleştirme metotları kullanılarak Y. enterocolitica varlığı açısından test edilmiştir. Toplam olarak dokuz adet patojenik Y. enterocolitica suşu izole edilmiştir; 5 suş domuz dışkısı ve gübre örneklerinden,  4 suş ise atık su örneklerinden saptanabilmiştir. Diğer taraftan, diyare teşhisi konulmuş 102 hastanın dışkı örneklerinden ve körfez, kanal, belediye havuz ve çeşme suyu olmak üzere 12 örnekten Y. enterocolitica suşları izole edilememiştir.  Dokuz adet Y. enterocolitica suşunun biyokimyasal ve serolojik karakterizasyonu sonucu suşların üç farklı biyoserotipe ait olduğu ortaya konulmuştur: 4/O:3, 2/O:9 ve 2/O:5,27.  Saptanan Y. enterocolitica suşları; ystA, ystB, yadA, virF/lcrF ve ail virulens faktörlerine özgü PCR ve fenotipik patojenite analizlerine dayandırılarak patojen olarak belirlenmişlerdir. İzmir bölgesinden; domuz ve atık su örneklerinde, patojenik Y. enterocolitica suşlarının tespit edilmesi Y. enterocolitica suşlarının halk sağlığı için potansiyel risk olduğunu göstermektedir.
Lipopolisakkarit Y. enterocolitica suşları için en önemli virülens belirteçlerinden biridir. Sıcaklık Y. enterocolitica suşlarının çoğu serotipinde olmasa bile birçok virülens faktör genlerinin regülasyonunu sağlamaktadır. Dolayısı ile lipopolisakkarit genlerinin in vivo koşullardaki regülasyonunu anlamak; konak ve patojen arasındaki etkileşimin çözülmesine yardımcı olacaktır. Reporter genler, ilgili promotorların kontrolü altında analiz edilecek bir proteini kodlayan genlerin transkripsiyonunu endirekt olarak anlamak için kullanılmaktadır. Bu kapsamda, Y. enterocolitica O:3 serotipine ait lusiferaz reporter suşları dizayn edilmiştir. Öncelikle lusiferaz substrat biyosentezini yöneten luxCDE genlerini içeren YeO3-LuxCDE suşu oluşturulmuştur. Daha sonra lusiferaz kodlayan luxAB kasedi YeO3-LuxCDE genomuna, O-antijen ve outer core gen bölgelerinin promotorlarının akışaşağı bölgesine yerleşecek şekilde eklenmiştir. İn vitro koşullarda, outer core reporter suşu, oda sıcaklığına göre 37°C'de daha fazla ifade olurken, O-antijen reporter suşunun ise oda sıcaklığında daha fazla ifade edilmektedir. Balb/c fare modelleri bu reporter suşlar ile outer core ve O-antijen genlerinin enfeksiyon sırasında hangi dokularda ifade olduğunu belirlemek için enfekte edilmişlerdir. Ölçümler IVIS spektrum cihazı ile yapılmış ve enfeksiyonun 5. güne kadar endirekt mRNA ifadesi gözlemlenmiştir. Enfeksiyon sonrasında outer core ve o-antijenin özellikle sindirim sisteminde aktif olarak ifadesinin gerçekleştiği ve 5. gün sonrasında reporter suşlarının kemik iliğine kadar yayıldıkları gözlenmiş ve LPS'in patogenezdeki önemi vurgulanmıştır. 

Anahtar sözcükler: Yersinia enterocolitica, domuz çiftliği, atık su, LPS, diyare, PCR, LuxCDABE, IVIS spektrum, Outer core, O-antijen, in vivo gen ifadesi

Abstract:
Yersinia enterocolitica is a food-borne pathogen that is very rarely encountered in Turkey. In this work, several human, porcine and environmental samples collected from Izmir region in Turkey were examined for the presence of Y. enterocolitica using different cultivation and enrichment methods. A total of nine pathogenic Y. enterocolitica strains were isolated; five strains from pig stool and manure samples and four strains from waste water samples. On the other hand, no Y. enterocolitica was isolated from human diarrheal stool samples (n=102) and from 12 gulf, canal, municipal pool and well water samples. Biochemical and serological characterization of the 9 Y. enterocolitica strains revealed that they belonged to three different bioserotypes: 4/O:3, 2/O:9, and 2/O:5,27. All the strains were deemed pathogenic based on based on ystA, ystB, yadA, virF/lcrF and ail virulence factors specific PCR and phenotypic pathogenicity analysis. Detection of pathogenic Y. enterocolitica strains from the pig and waste water samples from the Izmir region indicates that Y. enterocolitica is a potential risk for public health.
Lipopolisaccharide is one of the most significant virulence determinants of Y. enterocolitica strains. Temperature regulates most if not all virulence factor genes of Y. enterocolitica including lipopolysaccharide and working of the expression of LPS genes in vivo during infection is essential to get understanding and  solving on the interactions between a bacterium and host. Reporter genes are used to monitor transcription indirectly by inserting genes that encode an assayable protein under the control of promoters of interest. In our project, we constructed luciferase reporter strains of Y. enterocolitica serotype O:3. We first constructed a strain YeO3-LuxCDE where the luxCDE genes direct the biosynthesis of luciferase substrate. Then the luciferase-encoding luxAB cassette was introduced into the YeO3-LuxCDE genome fused downstream of the O-antigen and outer core gene cluster promoters. While the outer core reporter strain was expressed at 37°C than at room temperature, the O-antigen reporter strain was expressed at room temperature than 37°C.  Balb/c mice were infected by these reporter strains to determine in which tissues the luxAB genes were expressed during infection. The measurements were done by IVIS spectrum and indirect mRNA expression was screened until 5. days of post-infections. The outer core and O-antigen were expressed in intestinal system especially followed by the infection and it was observed that the reporter strains spread even bone marrow after 5. days-post infection and the importance of LPS was emphasized in pathogenesis. 

Keywords: Yersinia enterocolitica, pig farm, wastewater, LPS, diarrhea, PCR, LuxCDABE, IVIS spectrum, Outer core, O-antijen, in vivo gene expression