Peynirlerden izole edilen peptitlerin ace-inhibitör ve antioksidan aktivitesi üzerine kullanılan enzimin ve süte uygulanan işlemlerin etkisinin araştırılması
Determination of effect of coagulating enzyme and dairy processing on ace-inhibitor and antioxidant activity of peptides isolated from cheese
Yazar: ESRA UĞUR
Danışman: PROF. DR. ZÜBEYDE ÖNER
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Teknolojisi Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Süt ve süt ürünleri, biyoaktif peptitlerin en iyi kaynaklarından birisi olarak bilinmektedir. Özellikle peynirlerde, olgunlaşma süresince kullanılan pıhtılaştırıcı enzimin özelliği ve peynir sütüne uygulanan işlemler sonucunda açığa çıkan biyoaktif peptit profili farklılık göstermektedir. Bu çalışmada ultrafiltrasyon (UF) ve pastörizasyon olmak üzere iki farklı proses uygulanmış sütlerin iki farklı kaynaktan elde edilen pıhtılaştırıcı enzim (mikrobiyal ve şirden) ile pıhtılaştırılması yoluyla üretilen Beyaz peynirlerin olgunlaşma sürecine ve açığa çıkan peptitlerin biyoaktif özelliklerine olan etkisi bu çalışmada birlikte değerlendirilmiştir. Peynirlerin üretimi; UF süt+mikrobiyal enzim (M-UF), UF süt+şirden mayası (Ş-UF), pastörize süt+mikrobiyal rennet (M-PAS) ve pastörize süt+şirden mayası (Ş-PAS) olmak üzere 4 farklı grupta gerçekleştirilmiş ve üretilen peynirler 4ºC'de 90 günlük olgunlaşmaya bırakılmıştır. 

Olgunlaşma süresi boyunca peynirlerin kurumadde (KM), titrasyon asitliği, yağ, tuz, toplam protein ve azot ile KM'de protein değerlerinin pastörize sütten üretilen peynirlerde daha yüksek olduğu ve bu sonuçlar üzerinde sütün proses farklılığı ile depolamanın önemli düzeyde etki gösterdiği belirlenmiştir. Bu sonuca benzer olarak, proteoliz nedeniyle peynirlerde olgunlaşma süresince artış gösteren suda çözünen azot (SÇA) ve SÇA'ya göre olgunlaşma indeksi ile %12 trikloroasetik asitte (TCA) çözünen azota göre olgunlaşma indeksi değerlerinde sütün proses farklılığı ile depolamanın etkisi önemli bulunmuştur. Toplam serbest amino asit, %12 TCA'da çözünen azot, %5 PTA'da çözünen azot ve %5 PTA'da çözünen azota göre olgunlaşma indeksi değerlerinde ise depolama ve sütün proses farklılığı ile birlikte enzim farklılığının da etkisinin önemli düzeyde olduğu görülmüştür (p<0,05). 

SDS-PAGE jel görüntüsünde olgunlaşmanın sonunda kazein bant yoğunluklarında gözlenen azalışların, UF sütten yapılan peynirlerde daha fazla olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte toplam serbest amino asit ile <3kDa peptit ekstraktlarının protein değerlerindeki artışın bu peynirlerde daha fazla olduğu gözlenmiştir. Peynirlerin RP-HPLC pikleri incelendiğinde, olgunlaşma süresinin sonunda mikrobiyal enzimin UF sütte, şirden mayasının ise pastörize sütte hem SÇE hem <3kDa peptitlere ait pikleri arttırdığı belirlenmiştir (p<0,05). Olgunlaşma sonunda hem SÇE hem <3kDa peptitlerin ACE-inhibisyonundaki artışın, en az Ş-UF peynirinde olduğu gözlenmiştir (p<0,05). Olgunlaşma süresi boyunca <3kDa peptit ekstratlarına ait ACE-inhibitör aktivite, ABTS ve TEAC antioksidan aktivite sonuçlarının SÇE örneklerine göre daha yüksek olduğu belirlenirken, DPPH antioksidan aktivite sonuçlarının ise SÇE örneklerinde daha yüksek olduğu görülmüştür. Depolama süresi ile birlikte sütün prosesi ve enzimin farklılığının SÇE ve <3kDa peptitlerin ACE-inhibitör ve ABTS antioksidan aktivitesinde önemli etki gösterdiği belirlenmiştir (p<0,05). Fraksiyonların ACE-inhibitör aktivitelerinin %6,4–68,9 arasında değiştiği ve <3kDA ekstraktların sonuçlarına göre daha düşük olduğu gözlenmiştir. Peynirlerin in vitro sindirim sonuçlarında olgunlaşma süresi boyunca, tüm peynirlerin gastrik sindiriminin ardından intestinal sindirimine ait İÇ fazında ACE-inhibisyonunun düşüş gösterdiği, ABTS ve TEAC antioksidan aktivite sonuçlarının ise artış gösterdiği belirlenmiştir. Depolama ve enzim farklılığnın tüm sindirim fazlarının ACE-inhibisyonunu etkilediği, sütün prosesinin ise yalnızca intestinal fazlar üzerinde etkili olduğu belirlenmiştir. Sindirim fazlarının hem ABTS hem TEAC antioksidan aktivitesi üzerinde sütün prosesinin tüm sindirim fazlarında, enzim farklılığının SS ve DIŞ fazlarında, depolamanın ise yalnızca DIŞ fazda önemli düzeyde etki gösterdiği belirlenmiştir. DPPH antioksidan aktivitesinde ise sütün prosesinin SS ve DIŞ faza etki ettiği, İÇ fazında ise varyasyon kaynaklarının etkisinin olmadığı görülmüştür (p<0,05). MALDI-TOF/TOF Kütle Spektrometresi sonuçlarında, M-UF ve M-PAS peynirlerine ait <3kDA fraksiyonlardan ACE-inhibisyonu yüksek iki fraksiyonun birbirine benzer peptit profili gösterdiği, M-PAS peynirinden elde edilen bir diğer fraksiyonun farklı peptit profili ve daha düşük ACE-inhibisyonu sergilediği belirlenmiştir. Orbitrap Fusion Yüksek Çözünürlüklü Nano LC-MS/MS analizi sonuçları incelendiğinde, toplam peptit sayısı ile β-kazein ve αS1-kazein türevli peptitlerin sayısının en fazla Ş-PAS peynirinde olduğu gözlenmiştir. Bunun yanı sıra, M-UF ve M-PAS peynirlerinde tanımlanan peptitlerin sayısının ve profilinin birbirine benzediği anlaşılmıştır. Bu çalışma sonucunda, şirden enziminin pastörize sütte oluşan <3kDa peptitlerin sayısı ve ACE-inhibitör aktivitesini arttırdığı gözlenmiştir. UF sütte şirden mayasının daha fazla proteolitik etki gösterdiği belirlenirken, TEAC ve DPPH antioksidan aktivitesinin artışında etkili olduğu görülmüştür.

Abstract:
Milk and dairy products are known as one of the best sources of bioactive peptides. In particular, the characteristics of the coagulating enzyme used during the ripening process of cheeses, as well as the processes applied to cheese milk, result in variations in the profile of bioactive peptides released. In this study, producing Beyaz cheese by the two different processes, ultrafiltration (UF) and pasteurization, and by coagulating with coagulating enzymes obtained from two different sources (microbial and animal-sourced) were evaluated together in Beyaz cheese on the ripening process and the bioactive properties of the peptides. Production of cheeses; UF milk and microbial enzyme (M-UF), UF milk and animal-sourced enzyme (Ş-UF), pasteurized milk and microbial enzyme (M-PAS), pasteurized milk and animal-sourced enzyme (Ş-PAS) were carried out in 4 different groups and these cheeses left to mature for 90 days at 4ºC. During the ripening period, it was determined that the dry matter, titratable acidity, fat, salt, total protein, total nitrogen, protein in dry matter content were higher in the cheese produced from pasteurized milk, and it was found that milk processing and storage significantly affected these results. Similarly, the effect of milk processing and storage on water-soluble nitrogen (WSN), ripening index relative to WSN, ripening index nitrogen soluble in 12% trichloroacetic acid (TCA) values was found to be significant due to proteolysis in cheese the ripening period during. Additionally, it was observed that the effect of storage and milk processing differences, as well as enzyme differences, was significant on the nitrogen soluble in 5% phosphotungstic acid (PTA), the ripening index relative to nitrogen soluble in 5% PTA, nitrogen soluble in 12% TCA, and total free amino acids (p<0,05). In SDS-PAGE gel images, it has been observed that the decrease in the density of the casein bands at the end of ripening is higher in cheese made from UF milk. However, it has been determined that the increase in total free amino acid and <3kDa peptide extracts in protein values is higher in these cheeses. In the RP-HPLC peaks of the cheeses, it was determined that the microbial enzyme in UF milk and the rennet enzyme in pasteurized milk increased the peaks belonging to both WSE and <3kDa peptides at the end of the ripening period (p<0,05). It was observed that the increase in ACE inhibition of both WSE and <3kDa peptides at the end of ripening is the lowest in the Ş-UF cheese (p<0,05). During the ripening period, it was determined that ACE inhibitor activity, ABTS and TEAC antioxidant activity results belonging to <3kDa peptide extracts were higher than WSE samples, while DPPH antioxidant activity results were higher in WSE samples. It has been determined that the process of milk and the difference in enzyme, as well as storage time, have significant effects on ACE inhibitor and ABTS antioxidant activity of WSE and <3kDa peptides (p<0,05). It was observed that the ACE inhibitor activities of the fractions varied between 6.4-68.9% and were lower than the results of <3kDa extracts. During the ripening period, it has been determined that all cheeses show a decrease in ACE-inhibition in the İÇ phase of intestinal digestion after gastric digestion in in vitro digestion results, while an increase has been observed in ABTS and TEAC antioxidant activity results. It was determined that storage and enzyme differences affected ACE inhibition of all digestion phases, and the milk process only affected the intestinal phases. It was determined that the milk process had a significant effect on both ABTS and TEAC antioxidant activities in all digestion phases, while the enzyme difference had an effect in SS and DIŞ phases, and storage had a significant effect only in DIŞ phase. On the DPPH antioxidant activity, it was observed that the process of milk had an effect on the SS and DIŞ phases, while the sources of variation had no effect on the İÇ phase (p<0,05). In MALDI-TOF/TOF mass spectrometry results, it has been determined that two high ACE-inhibition fractions from <3kDA fractions of M-UF and M-PAS cheeses showed similar peptide profiles, while another fraction obtained from M-PAS cheese exhibited a different peptide profile and lower ACE-inhibition. According to the results of the Orbitrap Fusion High-Resolution Nano LC-MS/MS analysis, it was observed that the total peptide count and the count of peptides derived from β-casein and αS1-casein were highest in Ş-PAS cheese. Additionally, it was observed that the number and profile of identified peptides in M-UF and M-PAS cheeses were similar to each other. In this study, it was observed that the animal-sourced enzyme increased the number of <3kDa peptides and ACE-inhibitory activity in pasteurized milk. It was determined that the animal-sourced enzyme exhibited a greater proteolytic effect in UF milk, while it was found to be effective in increasing TEAC and DPPH antioxidant activities.