Escherichia coli'de aşırı ifade edilen genlerin bor toleransına etkisinin araştırılması ve bora bağlı gen ekspresyon analizleri
Investigating the effects of over expressed genes on boron tolerance in Escherichia coli and gene expression analyzes pertaining to boron
Yazar: ESRA DİBEK
Danışman: DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bor, birçok açıdan stratejik ve enigmatik bir elementtir. Borik asit ve bor bileşiklerinin birçoğu çeşitli bakteri hücrelerini öldürmekte veya üremesini inhibe etmektedir. Ancak bunu, hücredeki hangi molekülleri etkileyerek yaptıkları ve bu bileşiklere karşı kullanılan hücresel cevap mekanizmaları yeterince bilinmemektedir. Bundan dolayı, uygun model organizmalar kullanılarak, bor ile ilgili biyomoleküller, özellikle genler, proteinler ve metabolitler bulunmalıdır. Bu hedeflere ulaşabilmek için bu tez çalışmasında, genomik, proteomik, metabolomik ve gen ekspresyon analizlerini içeren yaklaşımlar kullanılmıştır.
Bu tez çalışmasının ilk basamağında genomik yaklaşımı esas alınmıştır. Escherichia coli ASKA klon setinde yer alan 4123 adet suş, artan borik asit ortamında, genom boyu tarama deneylerine tabii tutulmuştur. Plazmitlerdeki genlerin ekspresyonunu indüklemek için 100 µM ve 33 µM IPTG kullanılmıştır. Kontrol suşuna kıyasla göreceli olarak yüksek borik asit konsantrasyonlarında yaşayan suşlar seçilmiştir. 100 µM IPTG kullanılarak yapılan genom boyu taramalardan 17 adet suşun göreceli olarak yüksek borik asit ortamında üreme gösterdiği bulunmuş ve sonuçlar çeşitli ek tekniklerle onaylanmıştır. 33 µM IPTG kullanılarak yapılan taramalardan bulunan ve onaylanan suşlar ise 52 adet olup, bu suşların içerdikleri genlerin fazla ifadesiyle, göreceli olarak yüksek borik asit konsantrasyonlarında üreyebildikleri belirlenmiştir. Göreceli olarak yüksek bor toleransına sahip suşlar, aceK, rfaQ, yjcF, ymdE, bdm, yeeY, yddV, recQ, ygcU, ptsA, ydeE, lacI, lacA, cobT, gatD, paaE, ugpC, prfH, yaiB, nusB, cbpM, malI, ydhD, yeaC, yeeT, yfjL, hcaD, ,elaB, hypC, yfjU, yqeK, yhiJ, rep, thiC, yifB, aceA, sgbE, fre, ytfG, sgcQ, rpsJ, yhcE, yhdL, tnaC, ytfA, ulaB, yjgX, yjhX, sgcA, chpS, yceP, yjhD, yrbB, gatR, yoeF, arpB, hybF, ygeM, ymfP, yicR, hpt, frlC, menD, yadI, ydiA, yfcT, arsB, yeiQ ve yddK genlerini taşımaktadır.
Çalışmanın ikinci basamağında, 4123 gen klonunu içeren, "ASKA klon genomik kütüphane havuzu" elde edilmiş ve yüksek borik asit içeren ortamlarda zenginleştirme yöntemiyle seleksiyon yapılmıştır. Ayrıca, ASKA klon genomik kütüphane havuzunun, 'in vitro' plazmid kütüphanesi oluşturulmuştur. Plazmitler DH10b suşuna transforme edildikten sonra, yine zenginleştirme yöntemi ile seleksiyona tabii tutulmuş ve tolerant koloniler seçilmiştir. Her iki çalışmadan elde edilen tolerant klonların rekombinant plazmidlerinde yer alan genler Sanger sekanslama yöntemi ile belirlenmiş ve 9 adet gen bilgisine ulaşılmıştır. Bu genlerin isimleri dtd, yedL, yjbO, elfC, yfjK, yfiC, sufD, yecF, idnR'dir.
Üçünçü aşamada proteomik teknolojisine başvurulmuştur. 2-DE (iki boyutlu jel elektroforezi) analizleri için, göreceli olarak yüksek borik asit ortamında üreme gösteren AG1(pCA24N::aceK) ve AG1(pCA24N::ptsA) suşları seçilmiştir. Plazmitte ifade edilen genden dolayı borik asit stresi ile baş edebilen ve bu ortamda yaşayabilen klonların protein profilleri karşılaştırılmıştır. Bu çalışma sonucu AG1(pCA24N::aceK) suşu için up-regüle olduğu gözlenen 8 adet protein spotı, AG1(pCA24N::ptsA) suşu için ise up-regüle olan 7 protein spotı seçilmiştir. Borik asite cevap oluşturmada görevli olduğu düşünülen proteinleri içeren bu spotların MALDI-TOF-TOF analizi ile protein kimlikleri belirlenmiştir. AG1(pCA24N::aceK) suşunun proteomik analizi sonucu, PykF, Pgk, EftS, OmpA, CysK, KduD, AtpA, PrpD proteinleri, AG1(pCA24N::pstA) suşunun proteomik analizi sonucu, PykF, MalE, G3P1, AhpC, Alf, Mdh, KduI proteinleri belirlenmiştir.
Tezin dördüncü aşamasında daha önceki çalışmalardan elde edilen gen bilgileri değerlendirilerek, gen ekspresyon analizleri yapılmıştır. Seçilen genler üzerinde, gerçek-zamanlı PCR deneyleri yapılmış ve kontrol dahil 30 adet genin farklı borik asit konsantrasyonlarında göreceli mRNA seviyeleri ortaya çıkarılmıştır. Test edilen genlerden özellikle, kduD, kduI, sodA, ompR, deoB, yoaC ve icd genlerinin transkript seviyelerinin, borik asit stresine bağlı olarak, dramatik bir şekilde arttığı bulunmuştur.
Son olarak metabolomiks yaklaşımı kullanılarak, bor stresi ile ilgili metabolitlerin belirlenebilmesi için, NMR (nükler manyetik rezonans) analizlerine başvurulmuştur. Borik asit içermeyen ve artan 3 farklı borik asit konsantrasyonuna maruz bırakılarak yetiştirilen AG1(pCA24N::aceK) ve E. coli DH10b suşlarından metabolit ekstraktları elde edilmiş ve 1H-NMR deneyleri yapılmıştır. AG1(pCA24N::aceK) suşu için borik asit ortamında Adenine, Galactarate, Gluconate, Glutamate, Guanidoacetate, Guanosine, Inosine, Lactulose, Oxypurinol, Putrescine, Pyroglutamate, Threonine, Uridine metabolitlerinin seviyeleri artmış, Erythritol ve Saccharopine metabolitlerinin seviyeleri azalmıştır. E. coli (DH10b) suşunun borik asit ortamında Oxypurinol, Uracil, Xanthine, Glucarate, Putrescine, Thymine, Galactonate, Hypoxanthine, Maleate, Adenosine, Pantothenate, 1,6-Anhydro-β-D-glucose, Galactarate, Nicotinate, Nicotinurate, Pyridoxine, Thymidine, Uridine, Xanthosine metabolitlerin seviyeleri artmıştır. Seviyeleri azalan metabolitler ise Inosine, Niacinamid, Saccharopine, Glycine ve Lactate'dır.
Bu tez çalışması, genomik, proteomik, metabolomik, moleküler genetik ve mikrobiyolojik yaklaşımları kullanarak, bor (tolerans)-bakteri ilişkisinde rol alan genlerin, proteinlerin ve metabolitlerin belirlenebilmesi adına, değerli veriler üretmiş olan önemli ve kapsamlı bir çalışmadır. 

Anahtar Kelimeler: Bor, Tolerans, E. coli, Gen, Genomik, Proteomik, Metabolomik

Abstract:
Boron (B) is a strategic and enigmatic element in many aspects. Boric acid and most boron compounds cause death or inhibit the growth of various bacterial cells. However, it is not well understood which biomolecules are targeted in the cell and response mechanisms are used against these boron compounds. Consequently, boron-related biomolecules, particularly genes, proteins and metabolites should be investigated using appropriate model organisms. Towards reaching these goals, the approaches of genomics, proteomics, metabolomics and gene expression analyzes were applied. 
In the first part of this thesis, genomic approach was used and a number of 4123 strains of the ASKA clone set belonging to Escherichia coli were subjected to genome-wide screening experiments in the presence of increasing boric acid concentrations. In order to induce the expression of the genes contained in the plasmids, 100 µM and 33 µM IPTG were used. Comparing to the control, the strains surviving at relatively high boric acid concentrations were selected. As a result of genome-wide screens using 100 µM IPTG, a number of 17 strains were found to grow in relatively higher levels of boric acid and the results were confirmed by various additional methods. The number of strains that were selected using 33 µM IPTG was 52, which were shown to grow in the presence of relatively higher boric acid concentrations owing to the over-expressed genes that they contain. The strains that have relatively higher boron tolerance possess the following cloned genes: aceK, rfaQ, yjcF, ymdE, bdm, yeeY, yddV, recQ, ygcU, ptsA, ydeE, lacI, lacA, cobT, gatD, paaE, ugpC, prfH, yaiB, nusB, cbpM, malI, ydhD, yeaC, yeeT, yfjL, hcaD, ,elaB, hypC, yfjU, yqeK, yhiJ, rep, thiC, yifB, aceA, sgbE, fre, ytfG, sgcQ, rpsJ, yhcE, yhdL, tnaC, ytfA, ulaB, yjgX, yjhX, sgcA, chpS, yceP, yjhD, yrbB, gatR, yoeF, arpB, hybF, ygeM, ymfP, yicR, hpt, frlC, menD, yadI, ydiA, yfcT, arsB, yeiQ ve yddK.
In the second part of the study, "ASKA clone genomic library pool" containing 4123 gene clones was generated and selection was carried out by the enrichment method under the conditions of high boric acid levels. In addition, the "in vitro" plasmid library of the ASKA clone genomic library pool was obtained. After the plasmids were transformed into strain DH10b, the enrichment method was used again for selection and the tolerant colonies were chosen. The genes in the recombinant plasmids of the tolerant clones obtained from both studies were identified by the Sanger sequencing method. A number of 9 genes were found namely dtd, yedL, yjbO, elfC, yfjK, yfiC, sufD, yecF and idnR.
In the third part, proteomic technology was applied. For 2-DE (two-dimensional gel electrophoresis), the strains AG1(pCA24N::aceK) and AG1(pCA24N::ptsA), which showed growth in the medium containing relatively high boric acid concentrations, were selected. Due to the gene(s) expressed in the plasmid(s), the clones could cope with boric acid stress and the protein profiles of them subjected to boric acid stress were compared. As a result of the study, 8 protein spots were observed to be up-regulated for the strain AG1(pCA24N::aceK) and for AG1(pCA24N::ptsA) strain, 7 up-regulated protein spots were selected. Identification of the proteins within the spots were determined by MALDI-TOF-TOF analysis. Proteomic analyzes of the strains AG1(pCA24N::aceK) and AG1(pCA24N::pstA) revealed PykF, Pgk, EftS, OmpA, CysK, KduD, AtpA, PrpD proteins and PykF, MalE, G3P1, AhpC, Alf, Mdh, KduI proteins, respectively. 
In the fourth part of the thesis, by evaluating the gene information obtained from previous studies, gene expression analyzes were conducted. Real-time PCR experiments were performed on selected genes and including the control, relative mRNA levels of 30 genes at different boric acid concentrations were revealed. Of the genes tested, in particular, the transcript levels of kduD, kduI, sodA, ompR, deoB, yoaC and icd genes were found to increase dramatically in response to boric acid stress.
At last, metabolomics approach was used and NMR (nuclear magnetic resonance) analyzes were used to search for boron stress related metabolites. Metabolite extracts were obtained from AG1(pCA24N::aceK) and E. coli DH10b strains exposed to none as well as 3 different boric acid concentration and 1H-NMR experiments were performed. The results indicate that, for AG1(pCA24N::aceK), the levels of Adenine, Galactarate, Gluconate, Glutamate, Guanidoacetate, Guanosine, Inosine, Lactulose, Oxypurinol, Putrescine, Pyroglutamate, Threonine, Uridine metabolites increased, whereas Erythritol and Saccharopine levels decreased in the boric acid media. For E. coli(DH10b) however, the levels of Oxypurinol, Uracil, Xanthine, Glucarate, Putrescine, Thymine, Galactonate, Hypoxanthine, Maleate, Adenosine, Pantothenate, 1,6-Anhydro-β-D-glucose, Galactarate, Nicotinate, Nicotinurate, Pyridoxine, Thymidine, Uridine, Xanthosine metabolites increased and the levels of Inosine, Niacinamid, Saccharopine, Glycine ve Lactate decreased.
In conclusion, this thesis study is a significant and comprehensive study that has provided valuable information by identifying genes, proteins and metabolites involved in boron (tolerance)-bacterial relationship using genomics, proteomics, metabolomics, molecular genetics and microbiological approaches.

Keywords: Boron, Tolerance, E. coli, Genomics, Proteomics, Metabolomics