Hysterangium inflatum mantarının antioksidan, antikanser ve enzim inhibisyon aktivitelerinden sorumlu bileşiklerin izolasyonları ve yapılarının aydınlatılması
Izolations of responsġble compounds from activities of enzyme inhibition, anticancer and antioxidant of hysterangium inflatum mushroom and determination of their structure
Yazar: MELTEM TAŞ
Danışman: PROF. DR. MEHMET EMİN DURU
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Makromantarlar = Macrofungi

Özet:
Bu tez çalışmasında, daha önce üzerinde hiçbir bilimsel araştırma yapılmamış, Anadolu'da doğal olarak yayılış gösteren, zehirli olmayan ve trüf olarak bilinen Hysterangium inflatum mantarının kimyasal bileşenleri ve çeşitli aktiviteleri araştırıldı. H. inflatum sırasıyla hekzan, kloroform, aseton ve metanol ile oda koşullarında ekstre edildi. Metanol ekstresinden arda kalan mantarın 80˚C'deki su ile ekstraksiyonu yapılarak farklı polaritelerde ekstreler elde edildi. H. inflatum'un tıbbi aktiviteleri; antioksidan, enzim inhibisyon aktivitesi (antikolinesteraz ve üreaz) ve in vitro koşullarda çeşitli kanser [Akciğer Kanseri (H1299), Meme Kanseri (MCF-7), Prostat Kanseri (PC-3)] hücrelerine karşı toksisiteleri belirlemek suretiyle üç farklı temelde araştırıldı. Antioksidan aktivite testleri β-karoten linoleik asit renk açılımı, DPPH radikal giderimi, ABTS katyon radikal giderimi, metal bağlama ve CUPRAC indirgeme gücü yöntemleri kullanılarak standart antioksidanlar eşliğinde belirlendi. Antikolinesteraz enzim aktivitesi ise asetilkolinesteraz (AChE) ve bütirilkolinesteraz (BChE) enzim inhibisyon aktiviteleri kullanılarak belirlendi. Bu çalışmada H. inflatum'un kimyasal bileşenlerinin antioksidan aktivite kontrollü olarak kromatografik yöntemlerle izolasyonları yapıldı. Aynı zamanda mantarın fenolik bileşik profili HPCL-DAD sistemiyle belirlenirken, lipid fraksiyonun kimyasal bileşenleri GC ve GC-MS yöntemleri kullanılarak aydınlatıldı. H. inflatum'un metanol ekstresi antioksidan aktivite yöntemlerinin tümünde diğerlerine göre en yüksek inhibisyona sahiptir. Metanol ekstresinin 800µg/ml DPPH serbest radikal giderim aktivitesi %84,64, ABTS katyon radikali giderimi %91,18 ve CUPRAC indirgeme gücü kapasitesi %1,90 olarak belirlendi. Üreaz enzim inhibisyonu aktivitesi bakımından da metanol ekstresi diğer ekstrelerden daha yüksek ve standart olarak kullanılan tiyoüre ile yarışır düzeyde aktivite göstermektedir. Asetilkolinesteraz enzimi kloroform %36,35 inhibe ederken, bütirilkolinesteraz enzimini ise su ekstresi %60,95 inhibe etmektedir. 200µg/ml konsantrasyonda metanol ekstresi Prostat Kanseri (PC-3) hücresine karşı %78,10 oranında toksisite gösterirken, Meme Kanseri (MCF-7) hücresine karşıda da %76,2 oranında toksisite göstermektedir. Antioksidan aktivite kontrollü olarak sırasıyla metanol, kloroform ve su ekstrelerinden biyoaktif bileşiklerin izolasyonları yapıldı. Saflaştırılan bileşiklerin 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, FTIR ve MS spektrumları alınarak yapıları aydınlatıldı. Buna göre, H. inflatum'dan toplam 7 bileşiğin yapısı tam olarak aydınlatıldı. Bu bileşikler, "Ergosta- 7,9,22-trien-3-O-β-D-glukozit, β-Ergosta-5,22-dien, Mannitol, Ergosterol D, Triakontanoik asit, Ergosterol peroksit ve Seramid yapısındaki Hysteringin"dir.

Abstract:
In this thesis, the chemical components and various activities of Hysterangium inflatum mushroom known as truffle which is non-toxic and naturally spread in Anatolia have been investigated. Best of our knowledge, no scientific research has been done on that mushroom before. H. inflatum extracted with n-hexane, chloroform, acetone and methanol respectively in room conditions. After methanol extraction, the mushroom residue was extracted with distilled water at 80˚C. The medicinal activities of H.inflatum were investigated on three different bases: antioxidant, enzyme inhibition activities (anticholinesterase and urease) and cytotoxicity tests [Lung cancer cell line (H1299), Breast cancer cell line(MCF-7) and Prostate cancer cell line(PC-3)] in vitro conditions. Antioxidant activity tests performed in the presence of standards antioxidants using by β-Carotene linoleic acid bleaching assay, DPPH radical scavenging activity, ABTS radical scavenging activity, Metal chelating ability and CUPRAC (Cupric ion reducing antioxidant capacity) methods. Anticholinesterase enzyme activity was determined using enzyme inhibition activities of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE). In this study, the chemical components of H. inflatum were isolated by chromatographic methods with antioxidant activity guided. At the same time, the chemical compositions of the lipid fraction were elucidated using GC and GC-MS methods, while the phenolic compound profile of the mushroom was determined by HPLC-DAD system. The methanol extract of H. inflatum exhibited the highest activity of all antioxidant activity methods compared to other extracts. Methanol extract showed 84.64% inhibition in the DPPH free radical scavenging activity, ABTS cation radical scavenging was 91.18% inhibition and CUPRAC reducing capacity was found 1.90 with absorption value at the concentration of 800 μg/ml. Regarding urease enzyme inhibition activity, methanol extract is higher than the other extracts and exhibits activity at a level comparable to the thiourea used as a standard. Chloroform extract showed inhibition against acetylcholinesterase enzyme 36.35% while water extract inhibits butyrylcholinesterase enzyme 60.95% at 200 μg/ml concentration. Methanol extract showed 78.10% toxicity against Prostate Cancer (PC-3) cell line and 76.2% toxicity against Breast Cancer (MCF-7) cell line at 200μg / ml concentration. Isolation of bioactive compounds from methanol, chloroform and water extracts, respectively, with antioxidant activity guided. Purified compounds were elucidated chemical structures using by 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, FTIR and MS techniques. Accordingly, the chemical structures of 7 compounds from H. inflatum was fully elucidated. These compounds are namely; Ergosta -7,9,22 trien- 3-O-β-D-glucoside, β-Ergosta -5,22-dien, Mannitol, Ergosterol D, Triacontanoic acid, Ergosterol peroxide ve Ceramide.