Farklılaştırılmış kök hücre uygulamarının over hasarındaki yeri
Place of differential stem cell applications in ovary damage
Yazar: FATMA FIRAT
Danışman: PROF. DR. MEHMET İBRAHİM TUĞLU
Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Modernleşen dünyada çevresel faktörler üreme hücreleri üzerine gittikçe artan bir şekilde olumsuz etki göstermektedir. Özellikle Avrupanın Kuzey bölgesinde ciddi bir sorun haline gelen bu problem ülkemizde de artmaktadır. Birçok farklı hücrenin etkileşmesi sonrasında gerçekleşen fertilizasyon bu hücrelerden aldığı sinyaller sonrasında embriyonun gelişmesini sağlayan birçok farklı mekanizmayı gerçekleştirmektedir. İnfertilizasyon dediğimiz durum bu hücrelerin etkileşmesindeki eksikliklere bağlı olarak oluşmaktadır. Kök hücre uygulaması ile amaçlanan kök hücrenin kendi oluşturduğu sinyaller ve çevreye gönderdiği uyarılar sonucu bu eksik olan etkileşmelerin yeniden sağlanmasıdır. Bu çalışmada over dokusunda oluşan yara sonrasında iyileşme periyodu ve bu sırada gerçekleşen oogenezin etkileşmesi ve kök hücrenin hem kendi farklılaşması hem de oluşturacağı niş denilen mikroçevre sayseinde katkıları incelencektir.
Metod: Hücre kültüründe in vitro olarak kültüre ettiğimiz kemik iliği stromal kök hücrelerini fare overlerine genel anestezi altında ppd enjektörü yardımıyla enjekte ederek yara modeli oluşturduk. Kurgulanan gün aralıklarını takip ederek hayvanları servikal dislokasyon yöntemi ile öldürerek overlerini çıkardık. %10'luk formalinfiksasyonunu sağladık ve parafin bloklama yöntemi ile blokladık. 5 micron inceliğinde rodajlı ve polilizin kaplı lamlara alıdığımız doku kesitlerini bir gece 37 ºC' de etüvde beklettikten sonra ertesi gün hematoksilen boyaması ve indirekt immünohistokimyasal boyama protokolünü takip ederek e-NOS, i-NOS ve STRO 1A antikorları ile boyadık ve TUNEL boyaması yaptık.
Sonuç: Bu çalışmada biyopsi modellemesi ile over dokusunda hasar oluşturulup oluşan hasara KİSKH uygulaması yapılıp tedavi sürecine katkısı 3. Günde en aktif yara oluşumu gözlenirken 14. Günde iyileşmenin gerçekleştiği saptandı ve kök hücrenin yedinci gün gruplarında anlamlı bir şekilde iyileşmeyi hızlandırdığı ve olumlu katkılar sağladığı saptandı.
Kök hücre varlığı STRO-1 boyaması ile ortaya konulup kemik iliği stromasından alınan mezenkimal kök hücrelerin 4. Pasaja geldiğinde hoöojen bir yapıya kavuştuğu ve klasik kök hücre gibi davrandığı bulundu. 
Kök hücrenin over dokusundaki hasara katkısı hem parankimin tamiri hemde oogenez sürecinde folikül oluşumuna katılan hücrelere verdiği destek saptandı. primer oositten graaf folikülüne ve teka ile granüloza hücrelerine olumlu katkılar sağladığı izlendi. 
NOS boyamaları ile sürecin oksidatif hasar ile gerçekleştiği e-NOS daha belirgin olmak kaydı ile i-NOS immun boyamalarının bazale göre çok fazla arttığı saptandı.
Oksidatif stresin hücre ölümü üzerine ilişkilsi ve etkili olduğuda TUNEL boyamalarındaki artışla belirlendi. 
Kök hücrenin serbest radikal oluşumunu azaltıp hasarı engellediği ve buna bağlı olarak apoptozun gerilediği düşünüldü. 
Kök hücrenin bu olumlu etkilerinin günümüz kadınının beslenme, teknoloji ve ilgil faktörler nedeniyle bozulan over sağlığının ve buna bağlı azalan üreme yeteneğinin yeniden kazandırılmasında önemli olabileceğini düşündürdü. 
Kök hücrenin overdeki olumlu etkilerine niş faktörünün eklenmesi, folikül yapımına ve atılmasına katkısının belirlenmesi, graaf folikülünün oluşume ve atılmasını sağlayan tüm destek hücrelerle bu hücrelere katkı sağlayan bağ dokusu hücrelerinin kök hücreler ile tekileşimlerinin ortaya konması ve burada kullanılan mekanizmaların ortaya konması çalışmadan çıkarılan sonuçların getirdiği önerilerdir. 
Kök hücrenin kullandığı mekanizmalar olan oksidatif stres ve proglanmış hücre ölümü akıllıca kullanıldığı taktirde önleyici ve tedavi edici olarak klinik tıpta yerini alacak önemli bir silah olarak gözükmektedir. Bu ifadenin her geçen gün azalan üreme yeteneğine katkısı gelecekteki fonksiyonu açısından en önemli yorumdur (Stimpfell M. ve ark. 2013).

Abstract:
Objective: In the modernizing world, environmental factors are increasingly showing negative effects on reproductive cells. This problem, which has become a serious problem especially in the Northern part of Europe, is also increasing in our country. Fertilization, which takes place after the interaction of many different cells, realizes many different mechanisms that enable the development of the embryo after the signals it receives from these cells. The situation we call infertilization occurs due to the deficiencies in the interaction of these cells. The aim of stem cell application is to restore these missing interactions as a result of the signals that the stem cell creates and the stimulus it sends to the environment. In this study, the healing period after the wound in the ovarian tissue, the interaction of oogenesis and the contribution of the stem cell to both its own differentiation and the microenvironment called niche will be examined.
Method: We created a wound model by injecting bone marrow stromal stem cells, which we cultured in vitro in cell culture, into mouse ovaries with the help of ppd injector under general anesthesia. Following the established day intervals, we killed the animals with the cervical dislocation method and removed their ovaries. We provided 10% formalinfixation and blocked with paraffin blocking method. TUNEL staining was performed on the tissue sections, which were taken on 5 micron-thin milled and polylysine-coated slides, after they were kept in an oven at 37 ºC overnight, and then stained with e-NOS, i-NOS and STRO 1A antibodies, following the hematoxylin staining and indirect immunohistochemical staining protocol the next day.
Conclusion: In this study, the most active wound formation was observed on the 3rd day, while the most active wound formation was observed on the 14th day, and it was determined that the stem cell accelerated the healing significantly and provided positive contributions in the seventh-day groups.
The presence of stem cells was revealed by STRO-1 staining and mesenchymal stem cells taken from the bone marrow stroma were found to have a homogeneous structure when they reached the 4th passage and behaved like classical stem cells.
It was determined that the contribution of the stem cell to the damage in the ovarian tissue, both the repair of the parenchyma and the support it gives to the cells that participate in the formation of the follicle during the oogenesis process. It was observed that it made positive contributions from primary oocyte to graaf follicle and to theca and granulosa cells.
It was determined that i-NOS immunostaining increased much more than basal, with NOS staining being more pronounced, e-NOS, in which the process was caused by oxidative damage.
The relationship and effect of oxidative stress on cell death was determined by the increase in TUNEL staining.
It was thought that the stem cell reduced the formation of free radicals and prevented the damage, and accordingly apoptosis regressed.
It made us think that these positive effects of stem cells may be important in regaining the ovarian health of today's women, which has been deteriorated due to nutrition, technology and related factors, and the associated decreased reproductive ability.
Adding the niche factor to the positive effects of stem cells in the ovary, determining its contribution to the formation and removal of follicles, revealing the interaction of all the support cells that provide the formation and removal of the graaf follicle and the connective tissue cells that contribute to these cells, and revealing the mechanisms used here are the suggestions brought by the results obtained from the study.
Oxidative stress and programmed cell death, which are the mechanisms used by stem cells, seem to be an important weapon that will take its place in clinical medicine as preventive and therapeutic if used wisely. The contribution of this expression to the decreasing reproductive ability is the most important interpretation in terms of its future function (Stimpfell M. et al. 2013).