Biyokompozit substratlarda kültürün mezenkimal kök hücre - kaynaklı ekstrasellüler veziküllere olan etkilerinin incelenmesi
Evaluation of the infuence of culture on biocomposite substrates on mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles
Yazar: NEZİHA AYŞENUR KURT
Danışman: PROF. DR. YAŞAR MURAT ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Kök Hücre ve Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Biyokompozit substrat = Biocomposite substrates ; Eksozomlar = Exosomes ; Elektromanyetik alanlar = Electromagnetic fields ; Hidrojeller = Hydrogels ; Kök hücreler = Stem cells ; Substrat = Substrate ; Vezikül = Blister

Özet:
Bu çalışmada, ilk önce kemik hücre dışı matriksi (K-HDM) kaynaklı hidrojeller ile biyokompozit substrat yüzeyler hazırlanmıştır. K-HDM, sığır femur kemiğinden elde edilen spongiyöz dokunun deselülerizasyonu ile elde edilmiş ve liyofilizasyon ile işlenebilir hale getirilmiştir. Bundan sonra, asidik pepsin çözeltisinde gerçekleştirilen sindirme işlemi sonrasında çözelti nötralleştirilerek pH değeri 7,4 olarak ayarlanmıştır.Fizyolojik sıcaklıkta jelasyon davranışı gösteren hidrojelin, farklı oranlarda [%50 ve %100; (a:a)] hidroksiapatit ile katkılanmak suretiyle biyokompozitleri (BH50 ve BH100) oluşturulmuştur. Elde edilen hidrojellerin fizikokimyasal karakterizasyonu basamağında, SEM analizleri ile yüzey morfolojileri, FT-IR analizleri ile fonksiyonel grupları ve kimyasal bağ bilgileri elde edilmiştir. Biyokompozit substratların in vitrositotoksisite özelliği, ISO 10993-5 indirekt yöntemine dayalı MTT analizi ile 
belirlenmiştir. Hücre kültürü çalışmaları, insan adipoz mezenkimal kök hücreleri (iAMKH'leri) ile yürütülmüştür. iAMKH'lerin karakterizasyonu, invert mikroskobik incelemeler, immünfenotiplendirme, farklılaşma çalışmaları ve CFU-f oluşturma yeteneğinin incelenmesine dayalı olarak gerçekleştirilmiştir. Hücreler biyokompozit substratlar üzerine ekildikten sonra, standart koşullar altında ve şartlandırma etkisi amacıyla düşük frekanslı darbeli elektromanyetik alan (EMA) maruziyetinde kültürleri sürdürülmüştür. In vitro hücre canlılığı ve proliferasyon durumu, mitokondriyel dehidrojenaz aktivitesine dayalı Alamar mavisi yöntemi kullanılarakincelenmiştir. Farklı substrat yüzeyler üzerinde ve farklı koşullar altındaki sürdürülen hücre kültürlerinin besiyerleri toplanarak ekstrasellüler veziküller (EV'ler) izole 
edilmiştir. İzole edilen EV'lerin, zetasizer parçacık boyut dağılımları ve zeta potansiyelleri belirlenmiş, SEM analizi ile morfolojileri incelenmiştir. Bunların yanısıra, spesifik yüzey belirteçlerinin varlığı ELISA yöntemi ile, toplam protein 
içerikleri ise bikinkoninik asit (BCA) yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Çalışmada elde edilen bulgular, farklı bileşim ve özelliklere sahip substrat yüzeylerin ve EMA maruziyetinin, iAMKH'lerin EV içeriği üzerinde etkilere yol açtığını göstermektedir.

Abstract:
In this study, firstly, biocomposite substrate surfaces were prepared using bone extracellular matrix (bECM)-derived hydrogels. bECM was obtained by decellularization of the cancellous tissue of the bovine femur and rendered 
workable by lyophilization. The product was digested in acidic pepsin, then neutralized and the pH value was adjusted to 7.4. This hydrogel, which shows  gelling behavior at physiological temperature, was blended with different ratios of hydroxyapatite [50% and 100%; (w:w)] to obtain BH50 and BH100 biocomposites. For the physicochemical characterization of the obtained hydrogels, surface morphology was investigated by SEM analysis, and functional groups and chemical bond information were obtained by FT-IR analysis. In vitro cytotoxicity of  biocomposite substrates was determined by an indirect MTT method based on ISO  10993-5. Cell culture studies were conducted with human adipose mesenchymal  stem cells (hAMSCs). hAMSCs were characterized by inverted microscopy, 
immunophenotyping, differentiation studies and the ability to generate CFU-f. After the cells were seeded on biocomposite substrates, they were cultured under  standard conditions and under exposure to a low frequency pulsed electromagnetic field (EMF) for creating a mechano-transductive conditioning effect. In vitro viability and proliferation status of cells were examined using Alamar blue method based on mitochondrial dehydrogenase activity. Extracellular vesicles (EVs) were isolated by collecting the media of cell cultures maintained on different substrates 
and under different conditions. Zetasizer particle size distributions and zeta potentials of isolated EVs were determined and their morphology was examined by SEM analysis. In addition, the presence of specific surface markers was determined by ELISA, and the total protein contents were determined using the bicinchoninic  acid (BCA) method. The findings obtained in the study support the notion that substrate surfaces with different composition and properties, and EMF exposure cause effects on the EV content of hAMSCs.