Gümüş nanopartikül (AgNP) uygulamalarının oğulotu (Melissa officinalis L.) bitkisinde doku kültürü ve sekonder metabolit birikimi üzerine etkileri
Effects of silver nanoparticle (AgNP) applications on tissue culture and secondary metabolite accumulation in lemon balm (Melissa officinalis L.)
Yazar: GONCAGÜL KAPDAN
Danışman: PROF. DR. YASEMİN COŞKUN
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Botanik = Botany
Dizin: Doku kültürü = Tissue culture ; Gümüş nanopartiküller = Silver nanoparticles ; Melissa officinalis = Melissa officinalis ; Oğul otu = Melissa officinalis L.

Özet:
Nanopartiküller (NP), bitki biyoteknolojisinde bilinen biyoelisitörlerdir ve bitkilerin sahip oldukları fiziksel özellikleri iyileştirmek amaçlı kullanılarak bitkiler üzerinde olumlu etkiler göstermektedir. Bitki doku kültürü tekniğinin son yıllarda popülaritesini koruyan nanoteknoloji alanıyla iç içe olup NP'lerin uygulanması, kallus indüksiyonunda, organogenezde, somatik embriyojenezde, somaklonal varyasyonda, genetik transformasyonda, ikincil metabolit üretiminde ve mikrobiyal kontaminantların eksplantlardan başarıyla uzaklaştırılmasına yol açmış ve NP'lerin olumlu rolünü göstermiştir. 

Bu çalışmada, tıp, eczacılık, parfümeri, kozmetik ve gıda sanayinde çok sayıda kullanım alanına sahip olan oğulotunun (Melissa officinalis L.), çoğaltımı sırasında oluşan sorunların giderilmesi ve tohumlarının çok küçük yapıda olması nedeniyle tarlada düzenli bir ekime imkân vermemesi sorununa karşın kallus kültürü yöntemleriyle içerdiği sekonder metabolit miktarlarının artırılması amaçlanmıştır. Denemelerde kalluslar, oğulotu yaprak eksplantlarından farklı miktarlarda (0, 25, 50, 75 ve 100 µg/l) gümüş nanopartikülü (AgNP) ve 2.0 mg/l BAP ve 1.0 mg/l NAA içeren MS besin ortamlarından elde edilmiştir. Kalluslar iki kez aynı ortamda alt kültüre alındıktan sonra kallus oluşum oranları (%), ağırlıkları (g) ve çapları (cm) ölçülüp, ayrıca yapıları ve renkleri tespit edilmiştir. Oğulotuna ait bazı önemli fenolik bileşikler (rosmarinik asit, kafeik asit, klorojenik asit, proto-kateşik asit, hesperidin ve p-kumarik asit) HPLC, neral, geranial gibi aromatik yağlar ise GC-MS cihazları ile tespit edilmiştir.

Elde edilen sonuçlara göre, kallus oluşum oranları tüm AgNP uygulamalarında kontrol grubuna göre artış göstermiştir. En yüksek kallus oluşum oranı 50 µg/l (% 97.8) AgNP içeren ortamlarda olmuştur. Kontrol grubuna (0.051 g - 0.8 cm) göre en fazla kallus ağırlığı (0.196 g) ve kallus çapı (1.1 cm) yine 50 µg/l AgNP uygulamasında görülmüştür. Bu uygulamada kallus yapısı sıkı ve rengi ise yeşil olarak tespit edilmiştir. Ayrıca neral ve geranial gibi bazı aromatik bileşiklerin ve diğer önemli fenolik bileşiklerin üretimi üzerine AgNP uygulamalarının olumlu etkilerde bulunduğu, kontrol grubuna kıyasla çoğu AgNP uygulamalarında daha yüksek değerlerin elde edildiği tespit edilmiştir. Bununla birlikte, aromatik bileşiklerden neral ve geranial bileşiklerinin 25 µg/l AgNP uygulamasında önemli derecede arttığı belirlenmiştir. Kafeik asit, klorojenik asit, proto-kateşik asit, hesperidin ve p-kumarik asit gibi fenolik bileşiklerde de en fazla artış 75 µg/l AgNP uygulamasında görülmüştür. Rosmarinik asit bileşiğinde ise en fazla artış 50 µg/l AgNP uygulamasında tespit edilmiştir.

Sunulan bu çalışmamızda, M. officinalis L. bitkisi kallus kültüründe uygulanan farklı AgNP konsantrasyonlarının, kallus oluşumu ve oranlarında, fenolik ve aromatik bileşik miktarlarında artışa sebep olduğundan olumlu etkiler sergilediği görülmüştür. Bu çalışma ile AgNP uygulamalarının oğulotu gibi tıbbi ve aromatik bitkilerin in vitro çalışmalarında sekonder metabolitlerinin istenilen kalite ve miktarda üretimini artırmada kullanılabilecek etkili bir yöntem olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Nanoparticles (NP) are bio elicitors known in plant biotechnology and show positive effects on plants when used to improve the physical properties of plants. The application of NPs, intertwined with the field of nanotechnology, which has maintained its popularity in plant tissue culture technique in recent years, has led to the successful removal of microbial contaminants from explants in callus induction, organogenesis, somatic embryogenesis, somaclonal variation, genetic transformation, secondary metabolite production, and demonstrated the positive role of NPs.

In this study, it is aimed to eliminate the problems that occur during the reproduction of lemon balm (Melissa officinalis L.), which has many uses in medicine, pharmacy, perfumery, cosmetics and food industries. At the same time, it is aimed to increase the amount of secondary metabolites it contains by callus culture methods, despite the problem that it does not allow regular planting in the field due to its very small structure. In the experiments, calli were obtained from lemon balm leaf explants from MS nutrient media containing different amounts (0, 25, 50, 75 and 100 µg/l) of silver nanoparticle (AgNP) and 2.0 mg/l BAP and 1.0 mg/l NAA. After the calli were subcultured twice in the same medium, the rate of callus formation (%), their weight (g) and diameter (cm) were measured, and their structures and colors were determined. Some important phenolic compounds (rosmarinic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, proto-catechic acid, hesperidin and p-coumaric acid) belonging to the lemon balm were detected by HPLC, and aromatic oils such as neral and geranial were detected by GC-MS devices.

According to the results obtained, callus formation rates increased in all AgNP applications compared to the control group. The highest rate of callus formation was in media containing 50 µg/l (97.8%) AgNP. Compared to the control group (0.051 g - 0.8 cm), the highest callus weight (0.196 g) and callus diameter (1.1 cm) were observed in 50 µg/l AgNP application. In this application, the callus structure was determined as compact and its color was green. In addition, it was determined that AgNP applications had positive effects on the production of some aromatic compounds such as neral and geranial and other important phenolic compounds, and higher values were obtained in most AgNP applications compared to the control group. However, it was determined that neral and geranial compounds of aromatic compounds increased significantly in 25 µg/l AgNP application. The highest increase in phenolic compounds such as caffeic acid, chlorogenic acid, proto-catechic acid, hesperidin and p-coumaric acid was observed in 75 µg/l AgNP application. The highest increase in rosmarinic acid compound was detected in 50 µg/l AgNP application.

In our present study, it was observed that different AgNP concentrations applied in the callus culture of M. officinalis L. plant had positive effects on callus formation and rates, causing an increase in the amount of phenolic and aromatic compounds. In this study, it was determined that AgNP applications are an effective method that can be used to increase the desired quality and amount of secondary metabolites in in vitro studies of medicinal and aromatic plants such as lemon balm.