Ekşi hamurdan izole edilen laktik asit bakterileri ve mayaların fitaz aktivitelerinin belirlenmesi
Determination of phytase activities of lactic acid bacteria and yeast isolated from sourdough
Yazar: RUŞEN METİN YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. MUHAMMET ARICI
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Bilimleri Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Ekmek mayası = Bakers yeast ; Ekşi hamur = Sour dough ; Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria

Özet:
Tam buğday ekmeği mineraller, vitaminler, fenolik bileşenler, steroller ve tokoferoller gibi birçok fitokimyasalı içermektedir. Aynı zamanda divalent mineralleri bağlayıp ince bağırsakta mineral alımını olumsuz yönde etkileyen fitik asidi de bünyesinde barındırmaktadır. Bu çalışma kapsamında fitaz aktivitesi yüksek laktik asit bakterileri ve mayalar belirlenip çeşitli kombinasyonlar oluşturulmuş ve farklı sıcaklıklarda ekşi hamur fermentasyonu gerçekleştirilerek ekmek üretimi yapılmış ve kullanılan sıcaklık ve suş kombinasyonunun fitik asit ve mineral içeriği üzerine etkilerinin yanında ekmek kalitesi üzerine etkileri de incelenmiştir. Bu amaçla farklı işletmelerden ekşi hamur toplanarak ve laboratuvarda ekşi hamur üretilerek laktik asit bakterileri ve mayalar izole edilmiş ve ekstraselüler fitaz aktiviteleri belirlenmiştir. Fitaz aktif olan izolatların FT-IR ile spektrumları alınarak sınıflandırma analizi yapılmış, farklı kollardan seçilen izolatlar genetik olarak tanımlanmıştır. En yüksek fitaz aktivitesi, laktik asit bakterilerinden 803,95 U/mL ile HEB33 kodlu Lactobacillus brevis ve 797,88 U/mL ile ELB78 kodlu Lactobacillus plantarum'da, mayalarda ise 582,12 U/mL ile TGM38 kodlu Saccharomyces cerevisiae'da tespit edilmiştir. Bu izolatlardan üç farklı starter kombinasyonu oluşturulmuş ve bunlara ilaveten spontan ekşi hamur üretimi gerçekleştirilmiştir. Starter kullanılan her üç kombinasyonda TGM38 Saccharomyces cerevisiae kullanılmıştır. Ekşi hamur örnekleri 25°C, 30°C, 35°C'de fermentasyona bırakılmış ve ekmek üretiminde kullanılmıştır. Ekşi hamur örneklerinde fermentasyonun 0.saati ve 20.saatinde pH ve toplam titrasyon asitlik (TTA) oranları ölçülmüş ve laktik asit bakteri (LAB) sayımı ve maya sayımı yapılmıştır.  Fermentasyonun başlangıcında örneklerin pH ve TTA'ları benzerlik göstermekle beraber fermentasyon sonunda ekşi hamur örneklerinin pH'sı 3,71-4,06 aralığında, TTA'sı ise 6,30-8,80 aralığında olduğu belirlenmiştir. Fermentasyon sonundaki LAB ve maya sayımları ise sırasıyla 6,99-9,47 log kob/g ve 5,54-7,25 log kob/g aralığında bulunmuştur. Ekmek hamurlarında yapılan reolojik analiz sonuçlarında tüm ekmek hamuru örnekleri benzer reolojik davranış sergilemiş, tüm örneklerde frekansa bağlı olarak elastik modülü, viskoz modülü ve bunların bir fonksiyonu olan kompleks modülü değerleri artış sergilemiştir. Üretilen ekmeklerin spesifik hacim değerleri 1,39-2,01 arasında değiştiği belirlenmiştir. Ekmeklerin tekstür parametreleri incelenmiş ve tüm sıcaklıklarda üretilen spontan ekşi hamur eklenmiş ekmek örneklerinin sertlik değerleri, suş eklenerek yapılanlara göre belirgin düzeyde yüksek olduğu tespit edilmiştir. Ekmek örneklerinin duyusal analiz sonuçlarına göre genel değerlendirmede en yüksek beğeniyi 25°C'de Lactobacillus plantarum ELB78+ Saccharomyces cerevisiae TGM38 suşlarıyla üretilen ekşi hamurundan elde edilen ekmek almıştır. Ekmek örneklerinde fitik asit oranı 2,88-6,40 mg/g aralığında farklılık göstermiş, belirlenen sonuçlara göre fitik asit parçalanma oranı %30,47-69,76 arasında değiştiği bulunmuştur. En yüksek oranın (%69,76) 25°C'de fermente edilen, Lactobacillus brevis HEB33, Lactobacillus plantarum ELB78 ve Saccharomyces cerevisiae TGM38 suşlarının birlikte kullanıldığı ekşi hamurdan üretilen ekmek örneğinde olduğu görülmüştür. Ekmek örneklerinin Ca, Mg, Fe ve Zn değerleri de belirlenmiş ve en yüksek Ca ve Mg oranlarının da yine aynı ekmek örneğinde olduğu bulunmuştur. Yüksek fitaz aktivitesi gösteren bazı Saccharomyces cerevisiae izolatları ve aktivite göstermeyen ticari maya izolatının fitaz geninin belirlenmesine yönelik primer geliştirilerek Real Time PCR ile fitaz geninin ekspresyonu incelenmiş ve aktivite gösteren izolatların ekspresyonunun daha yüksek olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Whole wheat bread contains many phytochemicals such as minerals, vitamins, phenolic compounds, sterols and tocopherols. However, it also contains phytic acid, which binds divalent minerals and negatively affects mineral intake in the small intestine. In this study, lactic acid bacteria and yeasts with high phytase activity were determined and sourdough productions were performed with these isolates at different temperatures. The whole wheat breads were produced with sourdough samples and the effects of strains and temperature used in sourdough fermentation were investigated on the bread quality, phytate and mineral content of the bread samples. For this purpose, the sourdough samples were collected from different companies and produced in the laboratory. Lactic acid bacteria and yeast were isolated from these sourdough samples and extracellular phytase activities of the isolates were determined. The spectral measurement of the phytase active isolates was taken by FT-IR spectroscopy and cluster analysis was performed from the spectra. The isolates were selected from different branches of the dendogram and identified genotypically. The highest extracellular phytase activities were determined to be 803.95 U/mL and 797.88 U/mL, observed with Lactobacillus brevis HEB33 and Lactobacillus plantarum ELB78 among lactic acid bacteria, respectively and 582.12 U/mL observed with Saccharomyces cerevisiae TGM38 among yeast. Three different starter combinations were formed from these isolates and in addition, spontaneous sourdough production was performed. Saccharomyces cerevisiae TGM38 was used in all three starter combinations. The sourdough samples were fermented at 25°C, 30°C, 35°C and used in bread production.  The pH, total titratable acidity, yeast and LAB counts of the sourdough samples were determined at the beginning and after 20h of fermentation. At the beginning of fermentation, pH and TTA values of the samples were similar. At the end of fermentation, pH and TTA of the sourdough samples were determined in the range of 3.71-4.06 and 6.30-8.80, respectively. LAB and yeast contents of the sourdough samples were in the range of 6.99-9.47 log CFU/g and 5.54-7.25 CFU/g, respectively. In the results of the rheological analysis of the bread dough, all bread dough samples showed similar rheological behaviour, values of storage modulus, loss modulus and complex modulus which is a function of storage and loss modulus increased according to frequency. The specific volume values of the bread samples varied between 1.39-2.01. The texture parameters of the breads were also studied and it was found that the hardness values of the bread samples with spontaneous sourdough produced at all temperatures were significantly higher than those produced by adding the starter cultures.  Considering the overall acceptability scores of the bread samples, the highest score was assigned to the bread sample produced with Lactobacillus plantarum ELB78 and Saccharomyces cerevisiae TGM38 fermented at 25 °C. The phytic acid content of the bread samples varied between 2.88-6.40 mg/g. The phytic acid degradation ratio was in the range of 30.47–69.76%, with the highest value found in bread sample fermented at 25 °C, using both Lactobacillus brevis HEB33 and Lactobacillus plantarum ELB78. Ca, Mg, Fe ve Zn content of the bread samples were determined and the highest Ca and Mg contents were found in the same bread sample. The primer was developed in order to determine the phytase gene of some Saccharomyces cerevisiae isolates with high phytase activity and non-active commercial baker's yeast. The phytase gene expression of the isolates was studied by Real Time PCR and the expression of the isolates with high phytase activity was determined to be higher.