Glikoz ve insülin tayini için karbon destekli mezoporoz silika ve altın elektrotlar kullanılarak enzimatik ve aptamer temelli elektrokimyasal biyosensör geliştirilmesi
Development of enzymatic and aptamer-based electrochemical biosensors using carbon supported mesoporous silica and gold electrodes for the determination of glucose and insulin
Yazar: ŞEVVAL KAYA
Danışman: DOÇ. DR. SAMET ŞAHİN ; DOÇ. DR. VELİ ŞİMŞEK
Bilecik Şeyh Edebali Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Diyabet, kan şekerinin düzenlenmesinde bozukluklara yol açan kronik ve metabolik bir hastalıktır. Kan şekerinin düzenlenmesi, pankreas tarafından salgılanan ve kandaki glikozun hücrelere alınarak enerjiye dönüştürülmesini sağlayan insülin hormonu ile gerçekleşir. Tip 2 diyabette hücreler insüline karşı duyarsızlaşır, Tip 1 diyabetli hastalarda ise pankreas yeterli insülini salgılayamaz ve Tip 2 diyabetli hastalarda görüldüğü gibi hücreler insüline karşı duyarsızlaşır. Tip 1 diyabetli hastalarda, pankreas yeterli insülin salgılayamaz, Tip 2 diyabette olduğu gibi hücreler insüline karşı duyarsızlaşır. Bu durumda, kan şekerinin normal seviyelerde tutulması için dışarıdan müdahale edilmesi gerekebilir. Bu nedenle kanda hem glikozun hem de insülinin aynı anda izlenmesi ve takibi önem kazanır. Bu çalışmada glikoz tayini için enzimatik bir biyosensör ve insülin tayini için bir aptasensör geliştirilmesi amaçlanmıştır. İlk aşamada, silika kaynaklı mezogözenekli malzemelerin enzim immobilizasyonu için uygunluğu ve elektrokimyasal biyoelektronik sistemlerdeki performansı incelenmiştir. Bu amaçla, silika kaynaklı mezogözenekli malzemelere iletken ve yüksek yüzey alanına sahip bir tabaka olan grafen oksit (GO) katılarak iletkenlik kazandırılmıştır. İletkenlik kazandırılmış mezogözenekli malzeme (MGM) baskı devre karbon elektrotlar (SPE) üzerine kaplanarak elektrokimyasal
karakterizasyonları yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmalarında doğrusal taramalı voltametri (LSV) ve dönüşümlü voltametri (CV) yöntemleri kullanılmıştır. Elektrokimyasal karakterizasyon çalışmaları sonucu iyi performansı gösteren hacimce (1:1) GO/MCM-41 çözeltisi seçilerek biyosensör uygulamasındaki performansı incelenmiştir. Redoks aktif bir bileşik olan ve elektrokimyasal sinyal sağlayan ferrosen (Fc), SPE üzerine kaplanan GO/MCM41 üzerine kaplanarak uygulanmış ve GO/MCM-41/Fc modifiye elektrotu elde edilmiştir. Daha sonra, glikozun oksidasyonunu katalize eden bir enzim olan glikoz oksidaz (GOx) enzimi GO/MCM-41/Fc modifiye elektrot üzerine tutuklanmıştır. Enzimin yüzeye koyulması sonrasında kitosan (Chit) kullanılarak polimer film oluşturulmuştur (GO/MCM41/Fc/GOx/Chit). Hazırlanan biyosensörün glikoz tayini için lineer çalışma aralığı, tespit sınırı, seçiciliği, tekrar üretilebilirliği, raf ömrü ve gerçek numune analizi gerçekleştirilmiştir.
Biyosensörün glikoz tayini için lineer çalışma aralığı 1- 10 mM olarak bulunmuştur. Tespit sınırı (LOD) ise 0,516 mM olarak hesaplanmıştır. Biyosensörün tekrar üretilebilirliği 5 mM glikoz konsantrasyonuna on farklı zamanda vermiş olduğu yanıtın bağıl standart hatası (RSD) hesaplanarak değerlendirilmiştir. RSD %5,84 olarak bulunmuştur. Biyosensörün raf ömrü deneylerinde ise, 5 mM glikoz için 3, 7 ve 27. Gün yaşlandırılmış elektrotlarda alınanncevapların 1. gün cevabına göre standart RSD'leri sırasıyla %6,44 %9,82 ve %5,86 olarak bulunmuştur. Biyosensörün seçiciliği ise potansiyel girişim yapabilecek ürik asit, askorbik asit ve insülin gibi maddelerin cevaba etkisi ile değerlendirilmiştir. Bu maddelerin cevaba anlamlı bir etki etmediği sonucuna varılmıştır. Gerçek numune analizi için vişne, çilek ve kayısı reçellerinde bulunan glikoz miktarı kalibrasyon eğrisinden hesaplanmıştır. Hesaplanan glikoz kısmi bir şekilde KOSKA firmasının vermiş olduğu değerler ile uyumlu bulunmuştur. Çalışmanın diğer kısmında insülin tayini için yeni bir aptasensör geliştirilmesi amaçlanmıştır. İlk aşamada, aptamer bazlı bir elektrokimyasal biyosensör sistemi tasarlanmıştır. Bu sistemde, SPE üzerine elektrodepozisyon yöntemiyle altın (Au) kaplanmış ve yüzeye metilen mavisi aptameri bağlanmıştır. Aptamerin bağlanma koşulları ve yüzey doluluğu karakterize edilmiştir. Daha sonra, aptamer, merkaptohekzanol (MCH) ve insülin inkübasyon süreleri Design Expert progamı kullanılarak cevap yüzey yöntemiyle 180 dk., 60 dk. ve 25 dk. olarak belirlenmiştir. Aptamerin farklı insülin miktarları için verdiği tepki elektrokimyasal kare dalga voltametrisi (SWV) yöntemi kullanılarak incelenmiş ve aptasensör zemin cevabına göre oluşan farklar alınarak kalibrasyon eğrisi elde edilmiştir. Geliştirilen aptasensörün sulu çözeltide lineer çalışma aralığı 25 – 150 pM ve LOD 18.45 pM (%95 güven aralığında) olarak belirlenmiştir. Son olarak, aptasensöre potansiyel girişim yapabilecek maddeler belirlenmiş (streptavidin, glikoz, trombin ve ürik asit) ve aptasensör validasyonu sağlanmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, aptasensör için belirlenen girişimlerden anlamlı bir etki görülmemiştir. Aptasensör cevabının en düşük RSD sapma değeri ve yüzde hassasiyeti %9,5 ve %6,4 olarak bulunmuştur. Raf ömrü deneyleri sonucunda ise 10 gün içerisindeki kararlılık kaybı %8 olarak bulunmuştur.

Abstract:
Diabetes is a chronic and metabolic disease that causes disorders in regulating blood sugar. Blood sugar regulation occurs with the hormone insulin, secreted by the pancreas. It enables glucose in the blood to be taken into the cells and converted into energy. In patients with Type
1 diabetes, the pancreas cannot secrete enough insulin, as in Type 2 diabetes, the cells become insensitive to insulin. In this case, external insulin may be required to keep blood sugar at normal levels. For this purpose, electrochemical and aptamer-based biosensors can be used in
insulin therapy. This study aimed to develop two new biosensors for the determination of glucose and insulin. In the part of the biosensor developed to determine glucose, the suitability of silica-derived mesoporous materials for enzyme immobilization and its performance in
electrochemical bioelectronic systems were investigated. For this purpose, conductivity has been gained by adding graphene oxide (GO), a thin, flexible and conductive layer, to silicasourced mesoporous materials. MCM-41, a regular porous and high surface area mesoporous
material, was used as the silica-derived mesoporous material. GO/MCM-41 solution consisting of a mixture of GO and MCM-41 (1:1) by volume was prepared. Electrochemical characterizations were made by coating this solution on printed circuit carbon electrodes. Linear
scanning voltammetry and alternating voltammetry methods were used in characterization studies. As a result of electrochemical characterization studies, the GO/MCM-41 solution, which showed good performance, was selected, and its performance in biosensor application was examined. GO/MCM-41/Fc modified electrode was obtained by coating 75 mM ferrocene on GO/MCM-41 coated on SPE. Ferrocene is a redox-active compound and provides an electrochemical signal. Then, the glucose oxidase (GOx) enzyme was arrested on the
GO/MCM-41/Fc modified electrode. GOx is an enzyme that catalyzes the oxidation of glucose. During the immobilization of the enzyme, a polymer film was formed using chitosan. The optimal enzyme arrest time was determined for GO/MCM-41/Fc/Chit. The determined enzyme
arrest time is four days at +4 °C; for glucose determination of the prepared biosensor, linear operating range, detection limit, selectivity, reproducibility, shelf life and real sample analysis were performed. The linear operating range of the biosensor for glucose determination was
found to be 1 - 10 mM. The limit of detection (LOD) was calculated as 0.516 mM. The reproducibility of the biosensor was evaluated by the relative standard error of its response to 5 mM glucose concentration at ten different times. The relative standard error was found to be
5.84%. The shelf life of the biosensor was evaluated with the relative standard mistake of the 1st-day response of the shelf life responses on the 3rd, 7th and 27th days, respectively. The standard relative error was 6.44%, 9.82% and 5.86%. The selectivity of the biosensor was
evaluated by the effect of substances such as uric acid, ascorbic acid and insulin that could potentially interfere with the response. It was concluded that these items did not significantly affect the response. For real sample analysis, the amount of glucose in sour cherry, strawberry
and apricot jams was calculated from the calibration curve. The calculated glucose was partially compatible with the values given by KOSKA.
An aptamer-based electrochemical biosensor system was designed in the other part of the study. In this system, gold (Au) is coated on the printed circuit carbon electrodes (SPE) by electroplating and insulin-recognizing aptamer is attached to the Au surface. The binding
conditions and surface occupancy of the aptamer were characterized. Then, the interaction of aptamer with insulin was investigated by signal on-off measurement method. The incubation times of aptamer, mercaptohexanol and insulin were then determined as 180 min, 60 min and
25 min by response surface method using the Design-Expert program, respectively. The response of the aptamer for different insulin concentrations was determined using the electrochemical square-wave voltammetry method and the calibration curve was obtained by
taking the differences according to the aptasensor background response. The linear working range of the developed aptasensor in aqueous solution was determined as 25 - 150 pM and the detection limit value was 18.45 pM (at 95% confidence interval). Finally, interfering substances were identified (streptavidin, glucose, thrombin, and uric acid) and aptasensor was validated. No significant interfering effect was observed for the aptasensor. The lowest relative standard deviation and accuracy of the aptasensor response were found to be 9.5% and 6.4%. The stability loss of the aptasensor within 10 days was found to be 8%.