Fk-16-frenatin 2.1s hibrit peptidin hepatoselüler karsinomada antikanser etkilerinin araştırılması
Investigation of the anticancer effects of fk-16-frenatin 2.1s hybrid peptide in hepatocellular carcinoma
Yazar: TUBA ÇAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SERAP SANCAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Antimikrobiyal peptitler bakterilerden memelilere kadar pek çok canlıda tanımlanan doğal immün sistemin unsurudur. Bu peptitlerin iki veya daha fazla hibrid kombinasyonları, antimikrobiyal özelliklerini arttırdığı gözlenmiştir. Son çalışmalar bazı antimikrobiyal peptitlerin kanser hücreleri üzerinde de sitotoksik etkisini göstererek bu peptitlerin antikanser aktiviteli olduğunu ortaya koymuştur. Bu çalışmanın amacı ilk kez tasarlanan bir hibrit peptitin hepatosellüler karsinoma hücreleri olan HepG2 hücre soyundaki antikanser etkilerini araştırmaktır. Tasarlanan hibrit peptit, epidermal antimikrobiyal peptit olan insan katelisidin hCAP-18 ailesine ait peptiti LL-37'nin, 17- 32 amino asit aralığındaki aktif bölgesini temsil eden FK-16 peptiti ile kurbağa derisinden elde edilen Frenatin 2.1S antimikrobiyal peptitinin prolin aminoasidine bağlı hibridizasyonu sonucu elde edilen toplam 35 amino asitli bir peptittir. FK-16-Frenatin 2.1S hibrit peptitin, en yaygın karaciğer kanseri olan hepatoselüler karsinom hücre hattı olan HepG2 hücrelerinde sitotoksik etkisi ilk kez araştırılmıştır. Hibrit peptitin farklı konsantrasyonlarda uygulanmasına bağlı HepG2 hücrelerinde etkileri ilk olarak hücre canlılık testi ve laktat dehidrogenaz salınımına dayanan sitotoksisite testi ile ölçüldü. Ayrıca normal hücre soyu olarak insan göbek kordonu ven endotel hücreleri (HUVEC) kullanıldı ve hibrit peptitin hücre canlılığına etkisi de araştırıldı. Hücre ölümü ile ilişkili morfolojik değişiklikler başta ışık mikroskobunda, akridin oranj/etidyum bromür ikili boyama yöntemi ve monodansilkadaverin boyama yöntemi sonrası floresan mikroskopta gözlenmesi ile araştırıldı. Hücre canlılığındaki azalmanın apoptoz ile ilişkisi AnnexinV-FITC/PI boyaması ile akım sitometrisinde analiz edildi ve hibrit peptit uygulanan hücrelerde hücre içi ROS miktarındaki değişiklikler spektroflorometre ile ölçüldü. Ayrıca in vitro çizik testi ile hücre hareketliliğine olan olası etkiler araştırıldı ve koloni oluşturma verimliliği testi ile tek bir hücrenin proliferatif etkinliği üzerine hibrit peptitin etkileri incelendi. Bir antineoplastik ajan olan 5-florourasil ile peptitin düşük konsantrasyonlarda sinerjistik etkisinin olup olmadığı hücre canlılık testi ile araştırıldı. FK-16-Frenatin 2.1S peptidinin kanser hücrelerinden IL-1β, TNF-α ve IL-8 salınımı üzerine olan etkileri ise bu sitokinlerin hücre kültür medyumunda ELISA yöntemi ile ölçülmesi ile belirlendi. 
Elde ettiğimiz sonuçlar FK-16-Frenatin 2.1S hibrit peptidinin doza ve zamana bağlı olarak HepG2 hücrelerinde canlılığı azalttığını göstermiştir. Hücre canlılığındaki azalma HUVEC'lerde de gerçekleşmiştir, ancak HepG2 hücrelerine kıyasla hücre canlılığı HUVEC'lerde daha az azalma gözlenmiştir. Laktat dehidrogenaz salınımında doza bağlı bir artış gözlenmemiştir. Akım sitometrisi ve AO/EB boyası ile apoptotik hücre sayısında doza bağlı bir artış ve fragmente nukleus sayısında da bir artış gözlenmiştir. Ayrıca hibrit peptit uygulanan hücrelerde hücre içi ROS seviyelerinin de kontrol hücrelere kıyasla arttığı belirlenmiştir. Diğer taraftan uygulanan FK-16-Frenatin 2.1S hibrit peptidinin dozuna bağlı olarak MDC ile boyanmış otofajik vakuollerde anlamlı bir artış da gözlenmiştir. Migrasyon testi, toksik olmayan düşük peptit konsantrasyonunda hücre hareketliliğinin baskıladığını göstermiştir. FK-16-Frenatin 2.1S'in artan konsantrasyonu HepG2 hücrelerinde koloni oluşturma verimliliğini azaltmıştır. Antineoplastik ajanlar ile olası sinerjistik etkileri araştırmak için, düşük konsantrasyonlarda FK-16-Frenatin 2.1S (10 µg/ml) ile bir antineoplastik ajan olan 5-FU (10 µg/ml) ile uygulandığında tek başına daha yüksek konsantrasyonlardaki 5-FU uygulamasına kıyasla hücre canlılığının azaldığı gözlenmiştir. Farklı konsantrasyonlarda peptite maruz bırakılan HepG2 hücrelerinden IL-1β, TNF-α ve IL-8 sitokinlerinin arttığı ELISA yöntemi ile belirlenmiştir ve peptit maruziyetinin, immün cevapları indükleyebileceğini göstermektedir.
Çalışmamız FK-16-Frenatin 2.1S hibrit peptidinin hepatoselüler karsinoma için terapötik bir molekül olarak potansiyel taşıdığını göstermektedir. Bununla birlikte, kanser hücreleri üzerindeki etkilerin daha ayrıntılı çalışılması ve peptitin immün hücreler üzerindeki olası etkilerinin araştırılması önem taşımaktadır.

Abstract:
Antimicrobial peptides are elements of the innate immune system defined in many living things, from bacteria to mammals. Hybrid combinations of two or more of these peptides have been observed to increase their antimicrobial properties. Recent studies have shown that some antimicrobial peptides have cytotoxic effects on cancer cells, revealing that these peptides have anticancer activity. The aim of this study is to investigate the anticancer effects of a hybrid peptide designed for the first time in the HepG2 cell line, which are hepatocellular carcinoma cells. The designed hybrid peptide is the result of the proline amino acid-dependent hybridization of the FK-16 peptide, which represents the active site between 17 and 32 amino acids, of the human cathelicidin hCAP-18 family peptide LL-37, which is an epidermal antimicrobial peptide, and the Frenatin 2.1S antimicrobial peptide obtained from frog skin. The resulting peptide is a peptide with a total of 35 amino acids. The cytotoxic effect of FK-16-Frenatin 2.1S hybrid peptide was investigated for the first time in HepG2 cells, the hepatocellular carcinoma cell line, the most common liver cancer. The effects of the hybrid peptide on HepG2 cells due to application at different concentrations were first measured by cell viability test and cytotoxicity test based on lactate dehydrogenase release. In addition, human umbilical cord vein endothelial cells (HUVEC) were used as a normal cell line, and the effect of the hybrid peptide on cell viability was also investigated. Morphological changes related to cell death were investigated initially under a light microscope, followed by the acridine orange/ethidium bromide double staining method and the monodansylcadaverine staining method, under a fluorescent microscope. The relationship between the decrease in cell viability and apoptosis was analyzed by flow cytometry with AnnexinV-FITC/PI staining, and changes in the amount of intracellular ROS in hybrid peptide-applied cells were measured by spectrofluorometer. In addition, possible effects on cell motility were investigated with the in vitro scratch test, and the effects of the hybrid peptide on the proliferative activity of a single cell were examined with the colony formation efficiency test. Whether the peptide has a synergistic effect at low concentrations with 5-fluorouracil, an antineoplastic agent, was investigated by cell viability test. The effects of FK-16-Frenatin 2.1S peptide on the release of IL-1β, TNF-α and IL-8 from cancer cells were determined by measuring these cytokines in cell culture medium by ELISA method.
Our results showed that FK-16-Frenatin 2.1S hybrid peptide reduced the viability of HepG2 cells in a dose- and time-dependent manner. The reduction in cell viability occurred in HUVECs, but less reduction in cell viability was observed in HUVECs compared to HepG2 cells. No dose-dependent increase in lactate dehydrogenase release was observed. A dose-dependent increase in the number of apoptotic cells and an increase in the number of fragmented nuclei were observed by flow cytometry and AO/EB staining respectively. In addition, it was determined that intracellular ROS levels in cells treated with hybrid peptide increased compared to control cells. On the other hand, a significant increase in MDC-stained autophagic vacuoles was observed depending on the dose of FK-16-Frenatin 2.1S hybrid peptide administered. Migration testing showed suppression of cell motility at low non-toxic peptide concentration. Increasing concentration of FK-16-Frenatin 2.1S decreased colony formation efficiency in HepG2 cells. To investigate possible synergistic effects with antineoplastic agents, it has been observed that cell viability decreases when FK-16-Frenatin is administered with 2.1S (10 µg/ml) at low concentrations with 5-FU (10 µg/ml), an antineoplastic agent, compared to 5-FU administration at higher concentrations alone. It was determined by ELISA method that IL-1β, TNF-α and IL-8 cytokines increased in HepG2 cells exposed to different concentrations of peptide, indicating that peptide exposure can induce immune responses.
Our study shows that the FK-16-Frenatin 2.1S hybrid peptide has potential as a therapeutic molecule for hepatocellular carcinoma. However, it is important to study the effects on cancer cells in more detail and to investigate the possible effects of the peptide on immune cells.