Sulardaki Escherichia coli'nin tayini için paramanyetik küreler kullanarak immunolojik analiz yönteminin geliştirilmesi
Development of an immunoassay for the determination of Escherichia coli by using paramagnetic beads
Yazar: FAHRİYE CEYDA DUDAK
Danışman: DOÇ.DR. İSMAİL HAKKI BOYACI
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Gıdaların ve suların mikrobiyolojik kalitesinin saptanması amacıyla gerçekleştirilecekmikrobiyolojik kontrollerin olabildiğince basit ve hızlı bir şekilde yapılabilmesi amacıyla birçokyeni analiz yöntemi geliştirilmektedir. Bu çalışmada sulardaki Escherichia coli'nin hızlı,güvenilir, hassas ve seçici bir şekilde saptanabilmesi için yüzeyi antikor kaplı paramanyetikkürelerden yararlanılan bir florometrik analiz yönteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmakapsamında; paramanyetik kürelerin yüzeyi E. coli'ye özgü antikorlarla kaplanmış ve kürelerörnekle karıştırılarak E. coli'nin immunomanyetik ayırımı gerçekleştirilmiştir. E. colihücrelerinin Î²-galaktosidaz enzimini sentezlemeleri sağlandıktan sonra hücre duvarlarılizozim enzimiyle parçalanarak Î²-galaktosidaz enzimi serbest hale getirilmiştir. Î²-galaktosidaz enziminin aktivitesi 4-metilumbelliferil-Î²-D-galaktosid (MUG) substratıkullanılarak 355 nm uyarma ve 460 nm emisyon dalga boylarında florometrik olaraksaptanmış ve enzim için optimum reaksiyon koşulları (sıcaklık, pH ve substratkonsantrasyonu) belirlenmiştir. Son aşamada ise, geliştirilen analiz yöntemi E. coli'ninflorometrik tayininde kullanılmıştır.Çalışmanın sonucunda, logaritmik E. coli derişimi ile logaritmik Î²-galaktosidaz reaksiyon hızıarasında doğrusal bir ilişki görülmüş ve hazırlanan kalibrasyon grafiğinin ilişki katsayısı (R2)0.99 olarak bulunmuştur. İmmunolojik analiz yönteminin çalışma aralığı 4Ã101 ile 4Ã106kob/ml ve toplam analiz süresi 200 dakika olarak belirlenmiştir. Analiz yönteminin seçiciliğininsaptanabilmesi için yöntem farklı mikroorganizmalar kullanılarak tekrarlanmış ve bumikroorganizmaların varlığının analiz yöntemi üzerinde girişimde bulunmadığı saptanmıştır.Geliştirilen analiz yöntemiyle gerçek su örneklerinde E. coli tayini yapılmış ve elde edilencevapların kültürel sayım yöntemiyle benzerlik gösterdiği belirlenmiştir.Geliştirilen analiz yöntemi, E. coli'nin yapısal enziminin aktivitesine dayandığı için yalnızcacanlı hücrelerin tayini mümkün olmaktadır. Ayrıca bu yöntemde işaretli ikinci bir antikoragerek duyulmaması bir yandan analiz maliyetini azaltırken diğer yandan da analiz süresinikısaltmaktadır. Analiz yönteminde herhangi bir ön zenginleştirme veya filtrasyon işlemineihtiyaç duyulmamaktadır.Anahtar kelimeler: Escherichia coli, Paramanyetik küre, İmmunolojik analiz, FlorometrikölçümDanışman: Doç. Dr. İsmail Hakkı BOYACI, Hacettepe Üniversitesi, Gıda MühendisliğiBölümü, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı

Abstract:
In order to make the microbiological controls, which would be realized to determine themicrobiological quality of the food and the water, in a much more rapid and easier way, lotsof novel methods are developed. The present study describes the development of afluorometric analysis method, utilizing paramagnetic beads whose surface is coated byantibodies, in order to determine Escherichia coli in the water in a rapid, dependable,sensitive and selective manner. The immunoassay was based on coating the surface ofparamagnetic beads with antibodies specific to E. coli and the immunomagnetic separationof E. coli by mixing these beads with the sample. To enhance immunomagnetic separationefficiency, the effects of immunoreaction time, pH, buffer concentration and immunoreactionvolume of the reaction medium on the capturing efficiency of bacterial cells on paramagneticbeads were determined. After Î²-galactosidase enzyme was obtained to be induced by E. colicells, Î²-galactosidase enzyme is released by lysing the bacterial cells. Activity of Î²-galactosidase enzyme was fluorometrically detected by using 4-methylumbelliferyl-Î²-D-galactoside (MUG) substrate at 355 nm excitation and 460 nm emission wavelengths andoptimum enzymatic reaction conditions (temperature, pH and substrate concentration) weredetermined. At the last stage, the developed analysis method was used in the florometricdetermination of E. coli.As a result of this work, a good linear correlation (R2=0.99) was obtained betweenlogarithmic E. coli concentration and logarithmic Î²-galactosidase activity. The working rangeof the developed immunological analysis method was 4Ã101 to 4Ã106 cfu/ml with a totalanalysis time of 200 min. To determine the selectivity of the developed method, the analysiswas repeated with different coliform microorganisms and obtained results were seen to be atnegligible levels. E. coli determination was realized for real water samples with thedeveloped analysis method and the obtained results showed similarities with the platecounting method.An important advantage of the technique, based on the activity of the intrinsic enzyme of E.coli, is the possibility of detecting viable cells. In addition, the technique does not requiresecondary labeled antibody that reduces analysis costs and time. The developedimmunoassay does not require any enrichment or filtration steps.Keywords: Escherichia coli, Paramagnetic bead, Immunological analysis, FulorometricmeasurementAdvisor: Assoc. Prof. Dr. İsmail Hakkı BOYACI, Hacettepe University, Department of FoodEngineering, Food Engineering Section