Titanyum dioksit(TiO2), çinko oksit(ZnO) ve gümüş (Ag) nanopartiküllerinin TK-6 lenfoblast hücrelerindeki toksik etkilerinin belirlenmesi
Determination of toxic effects of titanium dioxide (TiO2) zinc oxide (ZnO) and silver (Ag) nanoparticles on TK-6  lymphoblast cells
Yazar: BURCU AKSOY
Danışman: PROF. DR. TUNCAY ORTA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Genel Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gümüş = Silver ; Mikroçekirdek = Micronucleus ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Titanyum dioksit = Titanium dioxide ; Çinko oksit = Zinc oxide

Özet:
Nanoteknolojik ürünler olan nano metal ve nano metal oksitler, pek çok tüketim ürününde  çeşitli amaçlar ve durumlar için günümüzde çok fazla oranda kullanılmaktadır. Örneğin Çinko oksit (ZnO); boyacılık, deterjan ve antibakteriyel ürünlerde, lastik sanayi, kauçuk üretimi, kozmetik, çeşitli biyomedikal kremler, petrol ürünleri, seramik sektörü, cam ürünleri, kaplama endüstrisi gibi çok çeşitli alanlarda hammadde olarak kullanılırken, Gümüş (Ag); yazıcı mürekkeplerinde,  fotoğraf endüstrisi, elektronik parçalar, bozuk para üretimi, süs eşyası ve takılar, alaşımlar, dişçilik ve su saflaştırma endüstrisinde kullanılmaktadır. Ayrıca elektronik, tıp, kimya alanında, yakıt üretimi ve katkı maddelerinde nanopartiküller olarak kullanılmaktadır.
Titanyum dioksit (TiO2), kozmetik sanayisi, kişisel bakım ürünleri, güneş kremleri, diş macunları, boya  ve  gıda  boyaları,  elektronik  ve  fotokataliz  için  sensör  yapımı,  kağıt,  plastik  ve farmasötik tabletlerde yaygın şekilde kullanılan, doğal olarak toksik olmamasına rağmen, nanoebatlarda çok küçük boyutlu ve düşük çözünürlük özelliği bulundurmasından, çeşitli bitki ve hayvan hücrelerinde ve kültürdeki hücrelerde toksik etkili olabilen bir metal oksittir.
Tüketimi hızla yaygınlaşan ve gittikçe farklılaşan bu ürünlerin, gerek kullanıldıktan sonra gerekse de üretim aşamasında nano aygıtlarca oluşan atıkları bilinçsiz bir şekilde çeşitli ortamlardan doğal ekosistemlere bırakabilmektedir. Oluşan  bu nanokirlilik sonucu, yeryüzünde yaşayan organizmalar ve yapay olarak üretilmiş materyaller  insan yapımı bu nanopartiküllere direkt ya da dolaylı olarak maruz kalabilmektedir. Havada yüzen bu maddeler, daha önce bu tür maddelere maruz kalmayan canlı türlerinin  hücrelerine tutunabilirler ve hücresel düzeyde; proteinlerle, hücre membranlarıyla, DNA ve organeller ile iletişime geçebilirler.
Ağır metallerin sitotoksik ve genotoksik etkileri kullanılan  elemente göre değişiklik gösterebilir. Ancak temelde toksisite mekanizmaları direkt ve indirekt olmak üzere  iki başlık altında toplanabilir. Etki olarak bakıldığında; membran yapı/fonksiyon değişimi,  antioksidan enzimlere karışma,  enerji metabolizmasında inhibisyon, DNA yapısında değişim ve stres  genlerinin  expresyonunun indüklenmesi  ve  bazı  enzimatik aktivite etkilerinde önemli rol oynamaları örnek olarak verilebilir.
Çinko Oksit Nanopartikülü (ZnONP),  Gümüş Nanopartikülü (AgNP) ve Titanyum dioksit Nanopartikülü (TiO2NP) nün TK-6 lenfoblast  hücreleriyle etkileşiminin incelendiği bu çalışmada, bu metallerin distile suda  çözülebilen formları olan Çinko Oksit NP, Gümüş NP ve Titanyum dioksit NP kullanılmıştır. Çözücü olarak distile suyun tercih edilme nedeni, olası toksik etkilerin deney sonuçlarını etkileme olasılığının göz önünde bulundurulmasından kaynaklanmaktadır.
Çalışma yönteminin amacı, laboratuvar ortamında inkübe edilmiş TK-6 lenfoblast hücrelerinin, çeşitli dozlarda nanopartikül ile muamele edilmesi sonucunda elde edilen preparatların değerlendirilmesi için çeşitli sitotoksik ve genotoksik (kromozom hasarı, mikronükleus, apoptotik ve mitotik indeks, hücre apoptozu vb.) hasarlarının tespitini in vitro ortamda sağlamaktır. Kullanılacak metallerin, farklı dozlarına karşılık gelen mikronükleus sıklıklarına regresyon analizi uygulanarak elde edilen doz-cevap eğrilerinden yararlanılarak, kullanılan  nanopartiküllerin  toksik doz seviyeleri incelenmiştir.
Günümüzde pek çok kullanım yeri olan bu metal nanopartiküllerin toksik seviyelerinin insan lenfositleri üzerinde oluşturduğu hasarların çalışılması, bu partiküllerin insan sağlığı üzerindeki etkilerinin farklı açılardan  değerlendirilmesine olanak sağlayacaktır.
Bu çalışmada, insan  kökenli  TK-6  lenfoblast  hücreleri  kullanılmıştır. Her bir deney grubu için hücre flasklarına 5 ml de 1 x 106   tane olacak şekilde TK-6   hücreleri ekilmiştir. Kullanılacak her bir madde için 5 farklı doz belirlenmiş 1'er tane de kontrol grubu flaskı ekimi yapılmıştır. Her doz için 2000 binükleat (BN) hücre sayılmaya çalışılmış, genotoksik etkiler mikronükleus tekniği kullanılarak saptanmıştır. Hücrelere verilen kimyasal maddeler sonucunda  oluşan mikronukleusların doz cevap eğrileri  karşılaştırılmıştır. Kullanılan istatistik programı ile metallerin TK-6 hücrelerini etkileme oranları hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlar,bu metaller ile yapılan diğer çalışmalar ile karşılaştırılmıştır.
Doz olarak Çinko Oksit Nanopartikülü için 5,10,20,30 ve 50 µg/ml kullanılmıştır. Gümüş Nanopartikülü için 2.5,5,10,25 ve 50 µg/ml kullanılmıştır. Titanyum Dioksit nanopartikülü için ise 25,50,75,100 ve 125 µg/ml uygulanmıştır. Doz başına 2000 binükleat hücrenin sayıldığı bu çalışmada her bir doz, kendi kontrol grubuyla beraber regresyon analizi uygulanarak karşılaştırılmıştır. Tüm dozlar için proliferatif indeksler (Pİ) de ayrıca değerlendirilmiştir. 
Yapılan bu çalışma ile;Titanyum Dioksit Nanopartikülü (TiO2 NP) , Çinko Oksit Nanopartikülü (ZnONP) ve Gümüş  Nanopartikülü  (AgNP) için TK-6 lenfoblast hücrelerindeki genotoksik ve sitotoksik hasarları irdelenmiştir. Uygulanan dozlarda; TiO2NP ve AgNP nin artan dozlarla birlikte anlamlı bir hasar oluşturduğu, ZnO NP nin ise uygulanan dozlarda hücrelerde yeterli hasara ulaşmadığı regresyon analizi ile tespit edilmiştir.

Anahtar kelimeler:  Mikronükleus, Çinko Oksit NP, Gümüş NP, Titanyum dioksit NP, Genotoksik hasar, Sitotoksik hasar

Abstract:
Nano-metal and nano-metal oxides, which are nanotechnological products, are used in many cases for arrival and prediction. For example, Zinc oxide (ZnO); It is used as a raw material in various fields such as paint, detergent and antibacterial products, tire industry, rubber production, cosmetics, various biomedical creams, petroleum products, ceramics industry, glass products, coating industry. Silver (Ag); It is used in printer inks, photographic industry, electronic components, coin making, ornaments and jewelry, alloys, dentistry and water purification industries. It is also used as nanoparticles in electronics, medicine, chemistry, fuel production and additives.
Titanium dioxide (TiO2) is widely used in the cosmetics industry, personal care products, sunscreens, toothpastes, paints and food dyes, sensor making for electronics and photocatalysis, paper, plastic and pharmaceutical tablets. Although it is not naturally toxic, it is a metal oxide that can be toxic to various plant and animal cells and cells in culture due to its very small size and low solubility in nanoscales.
These products, the consumption of which is rapidly spreading and increasingly differentiated, can unconsciously leave the wastes generated by nano devices from various environments to natural ecosystems, both after use and during production. As a result of this nanopollution, organisms which are living on earth and artificially produced materials can be directly or indirectly exposed to man-made nanoparticles.These substances floating in the air can attach to the cells of living species that have not been exposed to such substances before, and at the cellular level; They can communicate with proteins, cell membranes, DNA and organelles.
The cytotoxic and genotoxic effects of heavy metals may vary depending on the element used. However, basically, toxicity mechanisms can be grouped under two headings as direct and indirect. When viewed as an effect; Membrane structure/function changes, interaction with antioxidant enzymes, inhibition of energy metabolism, changes in DNA structure and induction of expression of stress genes and playing an important role in some enzymatic activity effects can be given as examples.
In this study, in which the interaction of Zinc Oxide Nanoparticle (ZnONP), Silver Nanoparticle (AgNP) and Titanium Dioxide Nanoparticle (TiO2NP) with TK-6 lymphoblast cells was investigated, Zinc Oxide NP, Silver NP and Titanium dioxide NP, which are soluble forms of these metals in distilled water, were used. The reason why distilled water is preferred as a solvent is due to the possibility of possible toxic effects to affect the test results.
The aim of the study method is to detect various cytotoxic and genotoxic (chromosome damage, micronucleus, apoptotic and mitotic index, cell apoptosis, etc.) damages in vitro for the evaluation of the preparations obtained by treating TK-6 lymphoblast cells incubated in vitro with various doses of nanoparticles. By using the dose-response curves obtained by applying regression analysis to the micronucleus frequencies corresponding to different doses of the metals to be used, the toxic dose levels of the nanoparticles used.
Studying the damage caused by the toxic levels of these metal nanoparticles, which have many uses today, on human lymphocytes will allow the effects of these particles on human health to be evaluated from different perspectives.
In this study, human TK-6 lymphoblast cells were used. For each experimental group, TK-6 cells were inoculated into cell flasks as 1 x 106 in 5 ml. For each substance to be used, 5 different doses were determined and 1 control group flask was planted. 2000 binucleate (BN) cells were counted for each dose, and genotoxic effects were determined using the micronucleus technique. The dose response curves of the micronuclei formed as a result of the chemical substances given to the cells were compared. The effect rates of metals on TK-6 cells were calculated with the statistical program used.The results obtained were compared with other studies with these metals.
For Silver Nanoparticle, 2.5,5,10,25 and 50 µg/ml were used. For Titanium Dioxide nanoparticle, 25,50,75,100 and 125 µg/ml were applied. 5,10,20,30 and 50 µg/ml were used for Zinc Oxide Nanoparticle as doses. In this study, in which 2000 binucleate cells were counted per dose, each dose was compared with its own control group by applying the regression analysis. Proliferative indices (PI) for all doses were also evaluated.
In this study, genotoxic and cytotoxic damages of Titanium Dioxide Nanoparticle (TiO2 NP), Zinc Oxide Nanoparticle (ZnONP) and Silver Nanoparticle (AgNP) in TK-6 lymphoblast cells were investigated. In applied doses; It was determined by the regression analysis  that TiO2NP and AgNP caused significant damage with increasing doses, while ZnO NP did not reach sufficient damage to the cells at the applied doses.

Keywords:  Micronucleus, Zinc Oxide NP, Silver NP, Titanium dioxide NP, Genotoxic damage, cytotoxic damage