Serebral iskemi/reperfüzyon hasarı oluşturulan sıçanlarda otofaji üzerine melatoninin etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of melatonin on autophagy in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury
Yazar: ÜMİT YILMAZ
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN SANDAL
İnönü Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Beyin hastalıkları = Brain diseases ; Beyin iskemisi = Brain ischemia ; Melatonin = Melatonin ; Otofaji = Autophagy ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; Teşhis testleri = Diagnostic tests ; Ölçekler = Scales ; İskemi = Ischemia

Özet:
Amaç: Serebral iskemi (Sİ), beynin bir bölümünde kan akımının bir damarın oklüzyonu ile kesildiğinde oksijen ve glukoz yoksunluğu ile sonuçlanan metabolik stresin aşırı bir formu olarak tanımlanmaktadır. İskemik alanın çevresi penumbradaki hücrelerin iskemi/reperfüzyon hasarından iyileşme olasılığı bu alandaki otofajik hücreleri inme tedavisi için hedef haline getirmektedir. Otofaji, hasar görmüş proteinlerin/organellerin otofagozom içine alınması ve daha sonra otofagozomun lizozomla birleşip yıkılması sonucu oluşan esansiyel besinlerin hücreye geri kazandırılmasıdır. Sİ'de otofajinin yararlı mı yoksa zararlı mı olduğu henüz tam anlamıyla açıklığa kavuşturulamamıştır. Bu tez çalışması ile Sİ/reperfüzyon modelinde melatonin uygulamasının otofajiyi uyarıcı mı yoksa baskılayıcı mı olduğu ve otofajinin de hücre ölümü veya hücre sağkalımından hangisini indüklediğinin açıklanması amaçlanmıştır. Aynı zamanda Sİ/reperfüzyon modelinde melatonin uygulamasının nörolojik defisit skoru, rotarod ve yapışkan çıkarma test süreleri üzerine olan etkisi de açıklanmaya çalışılmıştır.
Materyal ve Metot: Çalışmada 105 adet Wistar Albino cinsi erkek sıçan kullanıldı ve sıçanlar Sham Sİ, Sİ3, Sİ3+EtOH, Sİ3+Mel, Sİ7, Sİ7+EtOH ve Sİ7+Mel olmak üzere 7 gruba ayrıldı (n=15). Sham Sİ grubundaki sıçanlarda Sİ oluşturulmadı. Sİ3, Sİ3+EtOH, Sİ3+Mel, Sİ7, Sİ7+EtOH ve Sİ7+Mel grubundaki sıçanlara intraluminal filaman tekniği kullanılarak 90 dk'lık Sİ oluşturuldu. Sİ3 grubundaki sıçanlara 3 gün reperfüzyon sağlandı ancak melatonin ve etanol (melatonin çözücüsü) uygulanmadı. Sİ3+Mel grubundaki sıçanlara 3 günlük reperfüzyon süresince intraperitoneal olarak melatonin (10 mg/kg/gün), Sİ3+EtOH grubundakilere ise aynı hacimde etanol uygulandı. Sİ7 grubundaki sıçanlara 7 gün reperfüzyon sağlandı ancak melatonin ve etanol uygulanmadı. Sİ7+Mel grubundaki sıçanlara 7 günlük reperfüzyon süresince intraperitoneal olarak melatonin (10 mg/kg/gün), Sİ7+EtOH grubundakilere ise aynı hacimde etanol uygulandı. Tüm gruplara reperfüzyon süresince nörolojik defisit skorlama, rotarod ve yapışkan çıkarma testi uygulandı. Sİ3, Sİ3+EtOH, Sİ3+Mel grupları reperfüzyonun 3. gününün sonunda ve Sham Sİ, Sİ7, Sİ7+EtOH ve Sİ7+Mel grupları da reperfüzyonun 7. gününün sonunda dekapite edilerek beyin dokuları alındı. Alınan beyin dokularının penumbra alanından otofajik proteinler olan Beclin-1, LC3, p62 ve apoptotik protein olan cleaved caspase-3 protein seviyeleri Western Blot ve immunofloresan yöntemi ile belirlendi. Ayrıca penumbra alanları transmisyon elektron mikrobu ile incelendi.
Bulgular: Gruplar nörolojik defisit skorları bakımından karşılaştırıldığında gruplar arası anlamlı bir fark bulunmadı. Gruplar rotarod ve yapışkan çıkarma test süresi bakımından karşılaştırıldığında 3 gün reperfüzyon sağlanan gruplar arasında anlamlı bir fark bulunmadı. Sİ7+Mel grubunun reperfüzyonun 5. gününden itibaren Sİ7 ve Sİ7+EtOH gruplarına göre rotarod test süresinin  yüksek olduğu, yapışkan çıkarma test süresinin ise düşük olduğu bulundu (p<0.05). Gruplar infarkt alanı bakımından karşılaştırıldığında 3 gün melatonin uygulamasının infarkt alanını azalttığı, 7 gün melatonin uygulamasının ise infarkt alanını daha fazla azalttığı belirlendi (p<0.05). 3 günlük reperfüzyon grupları karşılaştırıldığında Sİ3 ve Sİ3+EtOH gruplarının Sham Sİ grubuna göre Beclin-1 ve LC3 protein seviyesi ve pozitif hücre sayısının azaldığı,  p62 ve cleaved caspase-3 protein seviyesi ve pozitif hücre sayısının ise arttığı tespit edildi (p<0.05). Sİ3+Mel grubunun Sİ3 ve Sİ3+EtOH gruplarına göre Beclin-1 ve LC3 protein seviyesi ve pozitif hücre sayısının arttığı, p62 ve cleaved caspase-3 protein seviyesi ve pozitif hücre sayısının ise azaldığı bulundu (p<0.05). 7 günlük reperfüzyon grupları karşılaştırıldığında ise Sİ7 ve Sİ7+EtOH gruplarının Sham Sİ grubuna göre Beclin-1,  p62 ve cleaved caspase-3 protein seviyesi ve pozitif hücre sayısının yüksek olduğu tespit edildi (p<0.05). Sİ7+Mel grubunun da Sİ7 ve Sİ7+EtOH gruplarına göre, Beclin-1 ve LC3 protein seviyesi ve pozitif hücre sayısının arttığı, p62 ve cleaved caspase-3 protein seviyesi ve pozitif hücre sayısının ise azaldığı bulundu (p<0.05). Transmisyon elektron mikroskop bulgularına göre serebral iskemi gruplarının nöronlarında yer yer intrasitoplazmik ödem ve ödem alanları içinde hasarlanmış dejenere organel yapıları bulunurken, melatonin verilen gruplarda bu durumun kısmen düzeldiği belirlenmiştir.
Sonuç: Sonuçlarımıza göre melatonin uygulaması rotarod ve yapışkan çıkarma testleri üzerine olan etkisini 5. günden itibaren göstermeye başlamaktadır. Ayrıca sonuçlarımız melatonin uygulamasının Sİ'de apoptozu inhibe edip, otofajik proteinlerin sentezini uyararak koruyucu rol oynadığını göstermektedir. 

Anahtar Kelimeler: Serebral iskemi, otofaji, melatonin, nörolojik defisit skorlama, rotarod testi, yapışkan çıkarma testi

Abstract:
Aim: Cerebral ischemia (CI) is defined as an excessive form of metabolic stress in the brain caused by a sudden of blood flow due to a reduction of a vessel resulting with the deprivation of oxygen and glucose. The possibility of recovery from ischemia/reperfusion injury of the cells in the penumbra (adjacent tissue to the ischemic core) makes the autophagic cells a target for stroke treatment. Autophagy is the process of removal of damaged proteins/organelles into autophagosome and with the merge of autophagosomes with lysosomes, the recovery of the essential molecules to the cell. Whether autophagy is beneficial or harmful in cerebral ischemia  has not yet been fully clarified. In this thesis, it is aimed to explain whether melatonin administration is a stimulant or suppressor of autophagy in the CI/reperfusion model and whether autophagy induces cell death or cell survival. At the same time, the effect of melatonin administration on the neurological deficit score, rotarod and adhesive removal test times in the CI/reperfusion model was also tried to be explained.
Material and Method: In this study, 105 male Wistar Albino rats were used and the rats were divided into 7 groups as Sham CI, CI3, CI3+EtOH, CI3+Mel, CI7, CI7+EtOH and CI7+Mel (n=15). CI was not induced in the rats in the Sham CI group. A 90-min CI was induced by using the intraluminal filament technique in rats in the CI3, CI3+EtOH, CI3+Mel, CI7, CI7+EtOH and CI7+Mel groups. The rats in the CI3 group were reperfused for 3 days, but melatonin and ethanol (melatonin solvent) were not administered. The rats in the CI3+Mel group were intraperitoneally administered melatonin (10 mg/kg/day) during the 3-day reperfusion, while the same volume of ethanol was administered to the CI3+EtOH group. The rats in the CI7 group were reperfused for 7 days, but melatonin and ethanol were not administered. The rats in the CI7+Mel group were intraperitoneally administered melatonin (10 mg/kg/day) during the 7-day reperfusion, while the same volume of ethanol was administered to the CI7+EtOH group. Neurological deficit scoring, rotarod and adhesive removal test were performed to all groups during reperfusion. CI3, CI3+EtOH, CI3+Mel groups were decapitated at the end of the 3rd day of reperfusion, and Sham CI, CI7, CI7+EtOH, CI7+Mel groups were decapitated at the at the end of the 7th day of reperfusion and brain tissues were taken. Autophagic proteins Beclin-1, LC3, p62 and apoptotic protein cleaved caspase-3 protein levels were determined from the penumbra area of the brain tissues by Western Blot and immunofluorescence method. In addition, penumbra areas were examined by transmission electron microscope.
Results: Groups were compared in terms of neurological deficit scores, no significant difference was found between the groups. Groups were compared in terms of rotarod and adhesive removal test time, there was no significant difference between the groups with 3 days of reperfusion. From the 5th day of reperfusion, it was determined that the rotarod test time was higher, and the adhesive removal test time was lower in CI7+Mel group compared to the CI7 and CI7+EtOH groups (p<0.05). Groups were compared in terms of infarct area, it was determined that 3-day melatonin administration decreased the infarct area, while 7-day melatonin administration more reduced the infarct area (p<0.05). The 3-day reperfusion groups were compared, it was found that Beclin-1 and LC3-II protein levels and number of positive cells decreased, while p62 and cleaved caspase-3 protein levels and number of positive cells were increased in the CI3 and CI3+EtOH groups compared to the Sham CI group (p<0.05). CI3+Mel group compared to CI3 and CI3+EtOH groups, Beclin-1 and LC3 protein levels and number of positive cells increased, p62 and cleaved caspase-3 protein levels and number of positive cells was found to decrease (p<0.05). The 7-day reperfusion groups were compared, Beclin-1, p62 and cleaved caspase-3 protein levels and the number of positive cells were found to be higher in the CI7 and CI7+EtOH groups compared to the Sham CI group. CI7+Mel group compared to CI7 and CI7+EtOH groups, Beclin-1 and LC3 protein levels and number of positive cells increased, p62 and cleaved caspase-3 protein levels and number of positive cells was found to decrease (p<0.05). According to the transmission electron microscopy findings, while the neurons of the CI groups had degenerated organelles damaged in areas of intracytoplasmic edema and edema, it was determined that this situation partially improved in the melatonin groups. 
Conclusion: According to our results, melatonin application begins to show its effect on rotarod and adhesive removal tests from the 5th day. In addition, our results show that melatonin administration plays a protective role in CI by inhibiting apoptosis and stimulating the synthesis of autophagic proteins.

Keywords: Cerebral ischemia, autophagy, melatonin, neurological deficit score, rotarod test, adhesive removal test