Yabanıl tip parkin ifade eden insan nöroblastoma hücrelerinde fosfoproteom analizi
Phosphoproteome analysis of  wild type parkin expressing  human neuroblastoma  cells
Yazar: MEHİN ZULFİGAROVA
Danışman: DOÇ. DR. GÜRLER AKPINAR
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Fosforilasyon = Phosphorylation ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Hücre dizisi = Cell line ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; Parkinson hastalığı = Parkinson disease ; Proteomikler = Proteomics

Özet:
Amaç
Bu çalıĢmanın amacı; SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattında Yabanıl tip (WT) ve
mutant Parkin proteinlerinin (Q311R ve A371T) ifadesi sonrasında oluĢan fosforilasyon
düzeyindeki değiĢiklikleri proteomik yaklaĢımlarla araĢtırmak, ubikitinlenme ve
fosforilasyon arasındaki çapraz etkileĢime ıĢık tutmaktır.
Yöntem
Hücrelerden elde edilen protein özütleri iki boyutlu jel elektoforezi ile ayrıĢtırıldı.
Fosforile olmuĢ proteinler ProQ Diamond boyası ile tayin edilerek protein spotları
jellerden kesildi ve ardından, proteinler MALDI-TOF/TOF analizi ile tanımlandı.
Bulgular
WT ve mutant tetrasiklin indüksiyonu yapılmıĢ ve yapılmamıĢ hücrelerden elde
edilen proteinlerden 2D tabanlı karĢılaĢtırmalı spot analizi yapıldı. Fosfoprotein boyaması
sonrasında jellerde 35±3 fosforillenmiĢ protein spotu, toplamda ise Sypro boyaması
sonrasında 215±15 protein spotu gözlenmiĢtir. WT Parkin ifade eden hücrelerde 10,
mutant Parkin ifade eden hücrelerde ise 6 proteinin fosforilasyon seviyelerinde indüksiyon
sonrası artıĢ olduğu görüldü.
Sonuç
Beklentimiz WT Parkin indüksiyonunun ubikuitinlasyonunu arttırarak ubikitinlenme
ve fosforilasyon arasındaki çapraz etkileĢimi baskın hale getirmesi ve dolayısıyla dolaylı
yoldan fosforilasyon iliĢkili yolakların düzenlenmesi yönündedir. Nitekim STRING
analizinin PI3K-AKT yolağını iĢaret etmesi ubikuitin bağımlı fosforilasyon Ģemasının
değiĢtiğini göstermektedir. Diğer taraftan mutant Parkin indüksiyonu sonrasında
tanımlanan fosforile proteinlerin ise Parkinson hastalığı ve endoplazmik retikulumda
protein iĢlenmesi ile ilgili sonuçlar alınmıĢtır. WT ve mutant Parkin eksprese eden
hücrelerdeki farklı hücresel yolakların ön plana çıkması mutant Parkin'in normal WT'e
göre farklı fonksiyonu olduğunu göstermiĢtir.
Anahtar Sözcükler: Parkin, SH-SY5Y, 2DE, Protein Fosforilasyonu, ProQ Diamond,
MALDI-TOF/TOF.

Abstract:
Objective
The purpose of this thesis was to investigate the changes in phosphorylation levels
in SH-SY5Y neuroblastoma cell line after expression of the Wild-type and the mutant
Parkin proteins (Q311R and A371T ). Determination of the changes in phosphorylation
levels upon Parkin expression should allow elucidation of the cross-talk between
ubiquitinilation and phosphorylation.
Methods
The protein extracts prepared from Parkin expressing and non-expressing cells were
prepared and subjected to 2D gel electrophoresis. Phosphorylated proteins were detected
by ProQ Diamond stain and differentially regulated protein spots were excised from the
gels. Then, the proteins were identified by MALDI-TOF/TOF analysis.
Results
Consequtive phosphoprotein and total protein staining of the gels revealed the
precense of 35±3 phosphoprotein spots and 215±15 total protein spots on the gels. A total
of 16 phosphoprotein spots of which 10 belonged to the WT Parkin expressing cells and of
6 beloged to the mutant Parkin expressing cells were identified as differantially regulated.
Conclusions
The induction of the WT Parkin expression should increase ubiquitinilation events in
the cells and stimulate the cross-talk between ubiquitination and phosphorylation. Indeed,
STRING analysis linked the regulated proteins to PI3K-AKT pathway, which is one of the
most important signaling pathways regulating cell division. On the other hand, the results
of phosphorylated proteins which had been identified after an induction of the mutant
Parkin protein were found to be related to Parkinson's disease and endoplasmic reticulum
protein processing. Observation of such difference in indicated pathways upon either the
WT or the mutant Parkin expressions may imply that the mutant Parkin protein is
functionally different then the WT Parkin protein.
Key words: Parkin, SH-SY5Y, 2DE, Protein Phosphorilation, ProQ Diamond, MALDITOF/TOF