Endüstriyel kullanıma uygun, termostabil rekombinant alfa amilaz ve beta amilaz enzimlerinin eş zamanlı bakteriyel ekspresyon ile üretilmesi
Production of recombinant thermostable alpha and beta amylase enzymes via dual expression suitable for industrial usage
Yazar: DİLEK ÖZCAN
Danışman: PROF. DR. HİKMET MURAT SİPAHİOĞLU
Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Alfa amilaz = Alpha amylase

Özet:
Sıcaklığa dayanıklı amilazlar nişasta endüstrisi başta olmak üzere; gıda, yem, kağıt, tekstil, deri ve deterjan üretimi gibi alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte termostabil amilaz enzimlerinin üretimi, birçok hipertermofilik mikroorganizmada endüstriyel kullanım için düşük miktardadır. Yürütülen bu çalışmada termostabil α ve β amilaz enzimlerinden sorumlu genler spesifik gen kaynaklarından izole edilerek iki farklı klonlama bölgesine sahip pET-Duet-1 ekspresyon vektörüne aktarılmış ve elektroporasyon yöntemi ile Escherichia coli BL21 kompetan hücrelerine transforme edilmiştir. Gen kaynağı olarak, α amilaz geni için Bacillus stearothermophilus DSM 22 ve β amilaz geni için ise Thermoanaerobacterium (Clostridium) thermosulfurogenes DSM 2229 suşlarının genomik DNA'ları kullanılmıştır. Rekombinant BL21/αAmy ve BL21/βAmy bakterileri nişasta içeren ampisilinli katı LB ortamlarda geliştirilerek iyot buharı ile boyanması sonucunda rekombinant bakterilerde amilaz enzimlerinin aktif olduğu tespit edilmiştir. Her iki enzimin daha çok üretilmeleri IPTG indüksiyonu ile gerçekleştirilmiş ekspresyonu arttırılan rekombinant BL21/αAmy ve BL21/βAmy bakterilerinden, Ni-NTA kullanılarak α ve β amilaz proteinleri saflaştırılmıştır. Saflaştırılan histidin ile işaretli proteinler SDS-PAGE ve western blot yöntemleri ile tespit edilmiştir. Saflaştırılan rekombinant proteinlerden α amilazın yoğunluğu 4,59 µg/ml ve β amilazın yoğunluğu ise 3,17 µg/ml olarak hesaplanmıştır. Her iki enzimi eşzamanlı aynı bakteride ekspresyonu amacı ile rekombinant BL21/αAmy bakterilerinden kompetan hücreler hazırlanmış ve bu hücrelere rekombinant pETDuet/β plazmidi aktarılmıştır. Her iki rekombinant plazmidin aynı bakteride bulunduğunu doğrulamak için elde edilen kolonilere koloni-PCR testi gerçekleştirilmiş ve kolonilerden bazılarının hem α hem de β amilaz genine sahip olduğu tespit edilmiştir. Eş zamanlı eksprese edilen enzimlerden α amilazın 60 kDa, β amilazın ise 55kDa büyüklüğünde olduğu teyit edilmiştir.

Abstract:
Thermostable α and β amylase enzymes have been used widely in starch industry and other many fields such as feed, food, paper, textile, leather and detergent manufacturing. These enzymes are produced in little amounts for industrial usage by many hyperthermophilic microorganisms. In this study, thermostable α and β amylase genes were transferred to pET-Duet-1 expression and resulting recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 competent cells by electroporation. Genomic DNA of Bacillus stearothermophilus DSM 22 strain for α amylase and, Thermoanaerobacterium (Clostridium) thermosulfurogenes DSM 2229 strain for β amylase were used as gene sources. Enzymatic activities of recombinant BL21/αAmy and BL21/βAmy bacteria were detected on LB agar with ampicilin and starch and also with staining with iodide steam. The both enzymes were more produced by IPTG induction in recombinant BL21/αAmy and BL21/βAmy bacteria and the recombinant α and β amylase proteins were purified by Ni-NTA agarose column. Histidine labelled both proteins were analyzed by SDS-PAGE and western blot methods. Concentration of the purified proteins were calculated as 4,59 µg/ml for α amylase and 3,17 µg/ml for β amylase. For dual expression of both enzymes, recombinant BL21/αAmy were prepared as competent cells and purified pETDuet/β plasmids were transformed into this cells. Transformed bacteria containing two recombinant plasmids were tested by colony PCR and few colonies were determined comprising both recombinant plasmids. Dual expressed enzymes were analyzed by SDS-PAGE and the molecular mass of the enzymes were confirmed as 60 kDa for α amylase and 55kDa for β amylase.