Klotho proteininin NHEJ tamir yolağındaki Ku70, Ku80 ve DNA-PK genlerinin ifadesi ve proteinlerinin işleyişi üzerine etkilerinin araştırılması
The investigation of effect of the klotho protein on the expression of NHEJ repair pathway genes  Ku70, Ku80 and DNA-PK  and on the working of their proteins.
Yazar: SİBEL DEMİR ÖZTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. AYDIN RÜSTEMOĞLU
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: DNA = DNA ; Endosülfan = Endosulfan ; Gen ifadesi = Gene expression ; Klotho = Klotho ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Proteinler = Proteins ; Yaşlanma = Aging

Özet:
Yaşlanma, zaman içerisinde canlının çevre ile olan ilişkilerinde dengelerinin
çevre lehine sonuçlandığı bir süreçtir. Bu sürecin ilerleyiş hızı canlının çevre ile olan
etkileşimi ve kendi kalıtsal özelliklerine bağlı olarak değişir. Bu çalışmamızda,
yaşlanma ile ilgili olduğu saptanan genetik faktörlerden Klotho ( Kl ) geni ele alınmıştır.
Klotho geni ilk kez farelerde tanımlanan, insanda 13. kromozomun q kolunda yer alan
ve plazma membranında ve golgi aparatında bulunan tip 1 tek geçişli transmembran
glikoproteinini kodlayan bir gendir. Klotho'nun hücre içi moleküler mekanizmaları
nasıl etkilediğine yönelik bazı çalışmalar bulunsa da, özellikle yaşlanma sürecinde de
etkisi bilinen DNA çift zincir kırıklarının (DSB) onarım mekanizmalarında rolü
aydınlatılamamıştır. Bu çalışmada Klotho'nun DSB onarımında görevli, özellikle de
Homolog Olmayan Uç Birleştirme (NHEJ) onarımında görevli bazı genlerin ifadesini
nasıl etkilediğini araştırmayı amaçladık.
Çalışmada fare hipokampal kökenli hücre serisi olan HT22 hücreleri
kullanılmıştır. DNA'da çift zincir kırığı oluşturduğu bilinen Endosülfan ile öncellikle
IC50 dozu belirlenmiş, daha sonra bu doz kullanılarak farklı deney protokollerinde
muamele edilen HT22 hücrelerinden RNA ve protein izolasyonu yapılmıştır. Elde
edilen total RNA'dan cDNA oluşturulmuş ve daha sonra Ku70, Ku80, DNA-PK
genlerinin ifadelerindeki değişimler RT-PCR ile belirlenmiştir. Protein seviyesindeki
değişimler Western Blotlama yöntemleri ile belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar
çalışılan genlerin ekspresyon seviyelerinin sadece endosülfanla muamele edilen
hücrelerde önemli ölçüde yükseldiğini, ama Klotho proteini de verilen hücrelerde
yükselişin olmadığını göstermiştir. Bu sonuçlar, Klotho'nün Endosülfanın zararlı
etkisini minimize ettiğini ve NHEJ yolağını baskıladığını düşündürmektedir. Böylece
literatürde ilk defa Klotho proteininin NHEJ tamir yolağındaki rolü araştırılmıştır.

Abstract:
Aging is a process in which the balance of the organism's relations with the
environment over time results in favor of the environment. The rate of progress of this
process depends on the interaction of the organism with the environment and its
inherited characteristics. In this study the Klotho (Kl) gene, which is one of the genetic
factors associated with aging was discussed. The Klotho gene, which first described in
the mice located in the q-arm of chromosome 13 in the human, and encodes the type 1
single-pass transmembrane glycoprotein located in the Golgi apparatus. Athough there
are some studies suggesting how Klotho affects intracellular molecular mechanisms, the
role of this protein on the DNA double strand brekage (DSB) repair mechanisms, which
are also known to have an effect on the aging process, cannot be elucidate yet. In this
study, we aimed to investigate how Klotho affects the expression of some genes,
especially known to work in the non-homologous end joint (NHEJ) repair, one of the
repair mechanisms in the DNA DSB repair.
In the study, the mouse hippocampal cell lines HT22 cells were used. First, the
IC50 dose of Endosulfan, which is known to produce double-chain fracture in DNA,
was determined. Then, using this dose the HT22 cells were treated in different
experimental protocols, and finally RNA and protein isolation was performed in those
cells. From obtained total RNAs the cDNAs were generated, and then changes in the
expressions of the Ku70, Ku80 and DNA-PK genes were determined by RT-PCR.
Changes in protein level were determined by Western Blotting methods. The results
showed that the expression levels of studied genes increased significantly only in
endosulfan-treated cells, but was not increased in the cells which also treated with
Klotho protein. These results suggest that Klotho minimizes the harmful effect of
Endosulfan and suppresses the NHEJ pathway. Thus, for the first time in the literature,
the role of Klotho protein in the NHEJ repair pathway was investigated.