Bir grup açilaminoalkanamit bileşiğinin sentezi ve biyoaktivitelerinin araştırılması
Synthesis and bioactivity ınvestigation on a group of acylaminoalkanamide derivatives
Yazar: GÜNEŞ ÇOBAN
Danışman: PROF. DR. VAROL PABUÇCUOĞLU
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Prostaglandinler E = Prostaglandins E ; Talidomid = Thalidomide ; İnflamasyon = Inflammation ; İnhibitör = Inhibitor ; İzoenzimler = Isoenzymes ; İzonikotinamid = Isonicotinamide

Özet:
İnflamasyon, farklı hücre tiplerine ve faktörlerine gerek duyan, patojenik, travmatik ya da toksik yaralanmalara karşı doku hasarını kontrol eden kompleks bir süreçtir. İnflamasyon, vücudun yaralanmalara karşı doku hasarını kontrol eden savunma mekanizması olmasına rağmen kronik inflamasyon kanser, diabet, kardiyovaskuler, pulmoner, nörolojik ve otoimmün hastalıkların gelişim sürecine katkıda bulunabilmektedir. İnflamasyon, araşidonik asit kaskatı ile oluşan eikosanoidler tarafından meydana gelmektedir. COX izoenzimleri tarafından sentezlenen prostaglandinler (örn: PGE2) inflamasyondan sorumlu eikosanoidlerdendirler. COX-l izoenzimi vücutta birçok dokuda yaygın olarak bulunan, memeli hücre ve dokularında prostaglandinlerin temel seviyesini düzenlemek için üretilen bir enzimdir. COX-2 izoenzimi ise proinflamatuvar ve mitojenik uyarılarla indüklenerek inflamasyon görülen dokular ve neoplastik dokularda eksprese olan bir enzimdir. COX-2 enzimi kanserli dokularda eksprese olarak göğüs kanseri, kolon kanseri, prostat kanseri, özafögal adenokarsinom ve akciğer kanserinin apoptozis, proliferasyon, anjiyogenez, invasyon ve metastaz süreçlerine katkıda bulunmaktadır. COX-2 izoenzimi, nöroinflamasyon görülen nörodejeneratif hastalıklarda inflamasyonu ve oksidatif stresi indükleyerek hastalıkların gelişim sürecine katkıda bulunmaktadır.Çalışmamız, inflamasyon oluşumunu kısmen ya da tamamen önleyerek inflamasyonun neden olduğu veya gelişim sürecine katkıda bulunduğu hastalıklar hedef alınarak, bu hastalıkların tedavi süreçlerine katkı sağlamak amacıyla daha güvenli ilaç moleküllerin geliştirilmesini hedefleyen bir çalışma olarak tasarlandı. Bu amaçla çalışmamızda zayıf COX-2 inhibitör aktivitesi taşıyan nonselektif COX inhibitör etkinlik gösteren rasem talidomit model olarak alındı.Talidomit, 1950'lerden 1960'lara kadar ise sedatif-hipnotik ve antiemetik olarak kullanılmış, daha sonra ise teratojenik etkisinden dolayı 1960'larda tedaviden kaldırılmış bir bileşiktir. Bu bileşik için FDA'den 1998 yılında Hansen hastalığı ve 2006 yılında ise multiple miyelom tedavisinde kullanılmak üzere onay alınmıştır. Talidomit, antikaşesik, antiinflamatuvar, antitümöral, antianjiyogenik, antiviral, hipoglisemik ve tümör hücreleri istilasını inhibe edici etki gibi çeşitli yararlı farmakolojik etkiler göstermektir. Talidomit bileşiğinin iskelet yapısı TNF-? regulatörleri, androjen antagonistleri ve siklooksijenaz inhibitörleri gibi birçok biyolojik aktif bileşiğin geliştirilmesinde kullanılmıştır.Çalışmamızda doğal ya da sentetik yapıların biyolojik aktiviteleri korunarak veya geliştirilerek moleküller yapının küçültülmesi ya da basitleştirilmesini amaçlayan bir ilaç tasarım yöntemi olan moleküler basitleştirme kullanılarak talidomitin rijit olmayan analogların sentezi düşünüldü. Bu amaçla talidomit bileşiği üzerindeki ftalimit halkası ve piperidin-2,6-dion yapısı üzerinde çeşitli modifikasyonlara gidildi. Ftalimit halkası üzerinde gerçekleştiren modifikasyonda halka, benzen, 2-piridin, 3-piridin, 4-piridin ve 2-tiyofen halkalarını içeren bir açil grubu ile değiştirildi. Diğer modifikasyonda ise piperidin-2,6-dion yapısında bulunan halka açılarak amit azotu üzerine küçük alkil grupları ve bir aromatik halkanın yerleştirildiği türevler ile amit azotun halka içerisinde kaldığı türevler tasarlandı.Tasarlanan bu bileşiklerden 2-benzamidoasetamit ve 2-(tiyofen-2-karboksamido)asetamit türevi bileşiklere ait sentez çalışmaları Singh ve arkadaşlarının 1994 yılında, 2-nikotinamidoasetamit, 2-izonikotinamidoasetamit ve 2-(2-pikolinamido)asetamit türevi bileşiklere ait sentez çalışmaları Singh ve arkadaşlarının 1994 yılında yayınladıkları araştırma makalesi ile Kurita ve arkadaşlarının 2002 yılında yayınladıkları araştırma makalesinde bildirdikleri yöntemler üzerinde değişikler yapılarak 4 basamakta gerçekleştirildi. Sentezlenen bileşiklerin yapıları spektral analiz yöntemlerinden UV, IR, MASS ve 1H NMR ve elementel analiz yöntemi ile belirlendi. Bileşiklerimizin COX-2 izoenzimi ekspresyonuna karşı biyolojik inhibitör potansiyeli ve PGE2 biyosentezi üzerine inhibitör etkileri değerlendirildi.Biyolojik aktivite çalışmaları hücre kültürü yöntemi kullanılarak yapıldı. Bu kapsamda A-549 adlı insan akciğer adenokarsinom epitelyal hücre hattı kullanıldı. Sentezlediğimiz bileşiklerin in vitro olarak hücre düzeyinde COX-2 enzim miktarı üzerine etkileri immünoblotlama yöntemi ile ve PGE2 miktarı üzerine etkileri ise Prostaglandin E2 Enzyme Immuno Assay Kit (Cayman) kullanılarak değerlendirildi.Bileşiklerimizden N-(2-morfolino-2-oksoetil)tiyofen-2-karboksamit, N-[2-(izopropilamino)-2-oksoetil]tiyofen-2-karboksamit, N-(2-morfolino-2-oksoetil)nikotinamit, N-[2-(izopropilamino)-2-oksoetil]nikotinamit, N-[2-(dimetilamino)-2-oksoetil]nikotinamit, N-[2-(fenilamino)-2-oksoetil]izonikotinamit, N-(2-morfolino-2-oksoetil)izonikotinamit, N-[2-okso-2-(pirolidin-1-il)etil]izonikotinamit, N-[2-okso-2-(piperidin-1-il)etil]pikolinamit, N-(2-morfolino-2-oksoetil)pikolinamit ve N-[2-(izoproilamino)-2-oksoetil]pikolinamit PGE2 düzeyini önemli oranda düşürmekle birlikte N-[2-okso-2-(pirolidin-1-il)etil]izonikotinamit bileşiği 50nM konsantrasyonda PGE2 düzeyini %50,02'ye düşürmesi ile referans bileşik DUP-697'nin PGE2 düzeyi üzerine etkisine en yakın değere sahip bileşik olarak tespit edildi. Bileşiklerimizden N-[2-(dimetilamino)-2-oksoetil]tiyofen-2-karboksamit, N-[2-okso-2-(pirolidin-1-il)etil]tiyofen-2-karboksamit, N-[2-(izopropilamino)-2-oksoetil]tiyofen-2-karboksamit, N-[2-(izopropilamino)-2-oksoetil]izonikotinamit, N-[2-(dimetilamino)-2-oksoetil]izonikotinamit, N-(2-morfolino-2-oksoetil)pikolinamit ve N-[2-(izopropilamino)-2-oksoetil]pikolinamit'in kullanılan hücre hattında COX 2 izoenzim düzeyini önemli oranda azalttıkları belirlendi. N-[2-(izopropilamino)-2-oksoetil]izonikotinamit bileşiğinin kontrol grubuna göre enzim düzeyini % 82 oranında düşürmüş olduğu bulundu.Bu çalışmada, bir seri bileşikten elde edilen veriler değerlendirildiğinde, 2-izonikotinoil-N-sübstitüeasetamit genel yapısının yeni PGE2 biyosentez inhibitörlerinin geliştirilmesinde önemli bir başlangıç noktası olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Inflammation is a complex process that requires distinct cell types and factors, which act in a coordinated manner to control tissue damages against pathogenic, traumatic or toxic injury. However, chronic inflammation can contribute to development of cancer, diabetes, cardiovascular, pulmonary, neurological and autoimmune diseases. Inflammation is mediated by eicosanoids generating by arachidonic acid cascade. Prostaglandins are eicosanoids which are responsible of inflammation process, are produced by cyclooxygenase (COX) enzymes. COX enzymes have three isoforms as COX-1, COX-2 and COX-3. COX-1 isoenzyme is called as house-keeping enzyme and it is widespread in mammalian cells and tissues. On the contrary, COX-2 isoenzyme is expressed in inflamed and neoplastic tissues inducing by proinflammatory and mitogenic signals. COX-2 isoenzyme has been implicated several cancer types including in esophageal adenocarcinoma, breast, colon, prostate and lung cancers and leads to apoptosis, proliferation, angiogenesis, invasion and metastasis. Also, COX-2 isoenzyme can contribute to neuroinflammation in neurodegenerative disorders by inducing inflammation and oxidative stress.This study was designed to develope more effective and safe drug molecule candidates to use in treatment of disorders which are caused or contributed by inflammation. For this purpose, rasem thalidomide molecule was chosen as the leader compound for its non-selective COX inhibitor and weak COX-2 selective inhibitor activity.Thalidomide had been used as sedative/hypnotic and antiemetic drug from 1950s to 1960s, then it had been withdrawn from market for its teratogenic activity in 1960s. It was approved by FDA for the treatment of Hansen disease in 1998 and multiple myeloma in 2006. Thalidomide has various beneficial pharmacological activities as anticachexia, anti-inflammatory, antitumor, anti-angiogenic, tumor cell invasion-inhibiting activity and hypoglycemic effect. The skleton of thalidomide has been used for development of various biological active compounds such as TNF-? regulators, androgen antagonists and cyclooxigenase inhibitors.Molecular simplification is performed by diminution or simplification of the molecular structure to protect or develop the biological activities of natural or synthetic structures. In our study, molecular simplification was used for designing thalidomide?s non-rigit analogs. For this purpose, certain molecular modifications were realized on thalidomide?s phthalimide and piperidin-2,6-one rings. First modification was the replacement of phthalimide ring with benzamide, 2-pyridinecarboxamide, 3-pyridinecarboxamide, 4-pyridinecarboxamide and 2-thiophenecarboxamide. Second modification was the replacement of piperidin-2,6-dione with an N-substituted acetamide group.For this purpose, five different general structures, namely 2-benzamidoacetamide, 2-(thiopene-2-carboxamido)acetamide, 2-nicotinamidoacetamide, 2-isonicotinamidoacetamide and 2-(2-picolinamido)acetamide were designed. 2-Benzamidoacetamide and 2-(thiopene-2-carboxamido)acetamide derivatives were prepared by modifying study of Singh and co-workers. 2-nicotinamidoacetamide, 2-isonicotinamidoacetamide and 2-(2-picolinamido)acetamide derivatives were prepared by modifying study of Singh and co-workers and study of Kurita and co-workers.The structures of the synthesized compounds were confirmed by elemental analysis and UV, IR, MASS and 1H NMR data. The biological inhibitor potency of the title compounds on COX-2 isoenzyme expression and PGE2 biosynthesis were evaluated with cell culture techniques. A-549 human lung adenocarcinoma epithelial cell line were used. The inhibitor activity of the compounds on COX-2 enzyme expression was evaluated by immunoblotting technique and IC50 values were recorded. And also, the activity of the compounds on in vitro PGE2 biosynthesis was evaluated by Prostaglandin E2 Enzyme Immuno Assay kit and IC50 values were recorded.N-(2-morpholino-2-oxoethyl)thiopene-2-carboxamide, N-[2-(isopropylamino)-2-oxoethyl]thiopene-2-carboxamide, N-(2-morpholino-2-oxoethyl)nicotinamide, N-[2-(isopropylamino)-2-oxoethyl]nicotinamide, N-[2-(dimethylamino)-2-oxoethyl]nicotinamide, N-[2-oxo-2-(phenylamino)ethyl]isonicotinamide, N-(2-morpholino-2-oxoethyl)isonicotinamide, N-(2-oxo-2-(pyrolydine-1-yl)ethyl)isonicotinamide, N-(2-oxo-2-(piperidin-1-il)ethyl)picolinamide, N-(2-morpholino-2-oxoethyl)picolinamide and N-[2-(isopropylamino)-2-oxoethyl]picolinamide compounds decreased the PGE2 level at considerable rate. N-[2-oxo-2-(pyrolydine-1-yl)etyl]isonicotinamide compound decreased PGE2 level to 50,02 % at 50?M concentration. And also, its inhibitor activity on PGE2 level was comparable to the reference compound DUP-697.N-[2-(dimethylamino)-2-oxoethyl]thiopene-2-carboxamide, N-[2-oxo-2-(pyrolydine-1-yl)ethyl]thiopene-2-carboxamide, N-[2-(isopropylamino)-2-oxoethyl]thiopene-2-carboxamide, N-[2-(isopropylamino)-2-oxoethyl]isonicotinamide, N-[2-(dimethylamino)-2-oxoethyl]isonicotinamide, N-(2-morpholino-2-oxoethyl)picolinamide and N-[2-(isopropylamino)-2-oxoethyl]picolinamide compounds decreased COX-2 isoenzyme level by considerable rate in A-549 human lung adenocarcinoma epithelial cell line. N-[2-(isopropylamino)-2-oxoethyl]isonicotinamide was the most active compound since it decreased the expression of COX-2 isoenzyme with the ratio 82 % by comparing to the control group.The results of this study suggest that under the set of the compounds studied, 2-isonicotionyl-N-substitutedacetamide structure presents a new starting point in order to design new potent inhibitors of PGE2 biosynthesis.