Reddellomyces parvulosporus ve Reddellomyces westraliensis türlerinden sekonder metabolitlerinin izolasyonu, yapılarının aydınlatılması ve biyolojik aktivitelerinin incelenmesi
Isolatıon of secondary metabolites from Reddellomyces parvulosporus and Reddellomyces westraliensis species, structure elucidation and investigation of biological activities
Yazar: FATİH ÇAYAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET EMİN DURU
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu doktora tez çalışmasında, daha önce üzerinde hiçbir araştırma yapılmamış, ülkemizde doğal olarak yayılış gösteren, yenilebilir ve ticari potansiyeli olan Reddellomyces parvulosporus ve Reddellomyces westraliensis trüf mantarlarının kimyasal bileşenleri ve biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Her iki trüf türünden oda koşullarında ekstraksiyon ile elde edilen hekzan, kloroform, aseton, metanol ve su ekstrelerinin toplam fenolik miktarı pirokatekole eşdeğer olarak tayin edildikten sonra her bir ekstrenin -karoten renk açılımı, DPPH serbest radikali giderim, ABTS katyon radikali giderim, CUPRAC ve metal kelat etki yöntemleri ile antioksidan aktiviteleri belirlenirken, Ellman metodu ile asetilkolinesteraz (AChE) ve bütirilkolinesteraz (BChE) enzim inhibisyon aktiviteleri belirlendi. Ayrıca, aynı ekstrelerin akciğer (H1299), meme (MCF-7) ve prostat (PC-3) kanser hücre hatlarına ve fibroblast (L929) hücre hatlarına karşı sitotoksik aktiviteleri de in vitro koşullarda belirlendi. Bunlara ilaveten her iki trüf türünün HPLC-DAD sistemiyle fenolik bileşikleri, GC-MS sistemi ile yağ asitleri ve SPME-GC/MS tekniği ile aramo bileşenleri kalitatif ve kantitatif olarak araştırıldı. Ayrıca iki trüf türünün polisakkaritlerinin karakterizasyonu ve ortalama molekül ağırlıkları çeşitli teknik ve yöntemlerle belirlendi. Bunlara ilaveten teze konu olan trüflerin polisakkaritlerinin antioksidan aktiviteleri 5 farklı yöntemle araştırıldı. 
Yüksek antioksidan aktivite gösteren ekstreler silikajel, sefadeks LH-20 gibi dolgu maddeleri kullanılarak kolon kromatografisi ile fraksiyonlandırıldı ve elde edilen fraksiyonların da antioksidan aktiviteleri incelendi. Aktivitesi en yüksek olan fraksiyonlardan kolon kromatografisi, preparatif ince tabaka kromatografisi ve recycle HPLC sisteminde çeşitli adsorbanlar kullanılarak R. westraliensis mantarından yedi, R. parvulosporus mantarından dört bileşik saflaştırılmış ve bu bileşiklerin yapısı (1D, 2D) NMR teknikleri FTIR, EI-MS ve ESI-MS gibi spektroskopik yöntemlerle aydınlatılmıştır. R. westraliensis'ten elde edilen bileşikler Brassikasterol, Ergosta-7,9,22-trien-3β-ol, Ergosterol peroksit, Adenozin, D-Ribitol, Fumarik asit ve Mannitol iken; R. parvulosporus'tan elde edilen bileşikler Brassikasterol, Ergosterol peroksit, Fumarik asit ve Mannitol'dür. Saflaştırılan ve miktarları yeterli olan bileşiklerin antioksidan, antikolinesteaz, sitotoksik, anti-tirozinaz, anti-üreaz ve anti-diyabetik aktiviteleri belirlenmiştir. Buna göre; R. westraliensis'den izole edilen adenozin, BHA'dan daha yüksek DPPH ve ABTS radikali giderim aktivitesine sahiptir. Teze konu olan her iki trüfden izole edilen ergosta-7,9,22-trien-3β-ol'ün Meme kanseri (MCF-7) (IC50: 24,93±0,80 µg/mL) ve Akciğer kanseri (IC50: 38,62±0,46 µg/mL) hücre hatlarına karşı, izole ettiğimiz diğer bileşenlere göre en yüksek sitotoksik aktiviteye sahip olduğu in vitro testlerle belirlendi. Bunlara ilaveten brassikasterol (IC50: 5,85±0,16 µg/mL) ve ergosterol peroksit (IC50: 6,98±0,24 µg/mL) bileşiklerinin standart olarak kullanılan tiyoüreye kıyasla daha yüksek anti-üreaz aktiviteye sahip olduğu belirlendi.  
Bu tez çalışması ile R. parvulosporus ve R. westraliensis trüf türlerinin biyoaktivite kontrollü saf bileşiklerin izolasyonu ilk kez gerçekleştirilmiştir. Bu türlerden elde edilen ekstre ve saf bileşiklerin detaylı olarak biyolojik aktiviteleri aynı zamanda bu iki trüf türünün içerdikleri yağ asidi bileşenleri, aroma bileşenleri ve fenolik profilleri yine ilk kez bu tez çalışmasıyla belirlendi.

Abstract:
In this PhD thesis, it was aimed to determine the chemical composition and biological activities of Reddellomyces parvulosporus and Reddellomyces westraliensis truffle mushrooms, which have not been researched before, naturally spread in our country, have edible and commercial potential.
After determining the total phenolic amount of hexane, chloroform, acetone, methanol and water extracts obtained from both truffle species by extraction under room conditions as equivalent to pyrocatechol, the antioxidant activities of each extract were determined by the β-carotene bleaching, DPPH free radical scavenging, ABTS cation radical scavenging, CUPRAC and metal chelating assays, while acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) enzyme inhibition activities were determined by Ellman method. Also, cytotoxic activities against lung (H1299), breast (MCF-7) and prostate (PC-3) cancer cell lines and fibroblast (L929) cell lines of same extracts were determined under in vitro conditions. In addition, phenolic compunds, fatty acids and aroma components both truffle species were investigated qualitatively and quantitatively by using HPLC-DAD, GC-MS and SPME-GC-MS techniques, respectively. Also, characterization of polysaccharides of two truffle species and average molecular weights were determined by various techniques and methods. In addition to these the antioxidant activities of the polysaccharides obtained from truffle species in this thesis were investigated using 5 different methods.
Extracts with high antioxidant activity were fractionated by column chromatography using adsorbents such as silica gel, sephadeks LH-20, and antioxidant activities of the fractions obtained were examined. From the most active fractions, seven compounds from R. westraliensis and four compounds from R. parvulosporus were purified by column chromatography, preparative thin layer chromatography and recycle HPLC system with various adsorbents and the chemical structures of isolated compounds were elucidated by spectroscopic methods such as (1D, 2D) NMR, FT-IR, EI-MS and ESI-MS techniques. The compounds obtained from R. westraliensis were Brassicastrol, Ergosta-7,9,22-trien-3β-ol, Ergosterol peroxide, Adenosine, D-Ribitol, Fumaric acid and Mannitol while compounds from R. parvulosporus were Brassicasterol, Ergosterol peroxide, Fumaric acid and Mannitol. The antioxidant, anticholinesterase, cytotoxic, anti-tyrosinase, anti-urease and anti-diabetic activities of purified compounds with sufficient amount were determined. According to this the adenosine isolated from R. westraliensis has higher DPPH and ABTS radical scavenging assays than the used standard, BHA. The ergosta-7,9,22-trien-3β-ol compound isolated from both truffles subject to the thesis had the highest cytotoxic activity against breast cancer (MCF-7) (IC50: 24.93±0.80 µg/mL) and lung cancer (IC50: 38.62±0.46 µg/mL) cell lines compared to other components that we isolated. In addition, brassicastrol (IC50: 5.85±0.16 µg/mL) and ergosterol peroxide (IC50: 6.98±0.24 µg/mL) compounds showed higher anti-urease activity than the standard thiourea.
With this thesis, the bioassay guided isolation of pure compounds of R. parvulosporus and R. westraliensis truffle species was investigated for the first time. The detailed biological activities of the extracts and pure compounds obtained from these species, and fatty acid components, aroma components and phenolic profiles of these two truffle species were also determined for the first time in this thesis.