Epidermal büyüme faktörünün sığır oositlerinin in vitro maturasyonu ve fertilizasyonuna etkisi
The influence of epidermal growth factor on in vitro maturation and fertilization of bovine oocytes
Yazar: BÜLENT POLAT
Danışman: PROF.DR. RIFAT SALMANOĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu çalışmanın amacı, farklı dozlardaki epidermal büyüme faktörünün, sığır oositlerinin in vitro maturasyonu ve in vitro fertilizasyonu üzerindeki etkinliğinin araştırılmasıdır. Çalışma materyalini Ankara ili Çubuk İlçesi Belediyesi'ne ait mezbahada kesilen sığırlardan alınan 701 adet ovaryum oluşturdu. Bu ovaryumlardan 5319 adet follikül aspirasyonu ile 1209 adet A kalite oosit toplandı. Çalışmanın grupları, TCM 199+6 mg/ml BSA vasatına katılan EGF miktarlarına (1 ng/ml EGF Grubu, 10 ng/ml EGF Grubu, 100 ng/ml EGF Grubu, 1000 ng/ml EGF Grubu) göre belirlendi. Ayrıca aynı vasata hCG (1 lU/ml) eklenerek kontrol (+) grubu ve TCM 199 vasatına hiçbir katkı maddesi katılmayarak kontrol (-) grubu oluşturuldu. Maturasyon işlemi %5 C02 içeren maksimum neme sahip ortamda 39°C'de 24 saatte gerçekleştirildi. Maturasyon sonrası altı grubun maturasyon oranını belirlemek amacıyla KOK'ların kumulus ekspansiyonu ve kumulus hücreleri soyulduktan sonra 1. kutup hücresi incelendi. Fertilizasyona alınan gruplardaki KOK'lara bu işlemler uygulanmadı. Fertilizasyonu gerçekleştirilecek oositler, swim-up işlemi sonucu elde edilen motil spermatazoonlar ile fertilizasyon vasatına (fert-TALP) aktarıldı. Bu vasata ayrıca 10 (ig/ml heparin ve 25 \ı\ PHE katılarak %5 C02 içeren maksimum neme sahip ortamda 39 °C'de 20 saat inkübasyona bırakıldı. Çıplaklaştırman oositler %1'Iik aseto-orcein ile boyanarak fertilizasyon sonuçlan değerlendirildi. Maturasyon sonrası değerlendirilen oositlerde sırasıyla, 1 ng/ml EGF grubunda %95,52; %71,64, 10 ng/ml EGF grubunda %92,16; %76,47, 100 ng/ml EGF grubunda %92,42; %77,27, 1000 ng/ml EGF grubunda %89,47; %55,26, K(+) grubunda %79,49; %64,10 ve K(-) grubunda %67,85; %42,15 oranında kumulus ekspansiyonu ve 1. kutup hücresi saptandı. Yapılan değerlendirmede kumulus ekspansiyonu yönünden EGF grupları arasında fark olmadığı K(+) ve K(-) gruplarının ise hem kendi aralarında hem de EGF gruplarıyla farklı olduğu tespit edildi. Oositler 1. kutup hücresi yönünden incelendiğinde, 1000 ng/ml EGF grubu ile pozitif kontrol ve negatif kontrol grupları arasında farklılığın gözlenmediği, ancak 1 ng/ml EGF, 10 ng/ml EGF ve 100 ng/ml EGF gruplarıyla farklı olduğu tespit edildi. Fertilizasyon sonrası değerlendirilen oositlerde sırasıyla 1 ng/ml EGF grubunda %41,90; %3,81, 10 ng/ml EGF grubunda %58,54; %4,07, 100 ng/ml EGF grubunda %66,02; %7,77, 1000 ng/ml EGF grubunda %49,15; %5,09, K(+) grubunda %36,13; %5,88 ve K(-) grubunda %28,22; %7,26 oranında monospermik ve polispermik fertilizasyon saptandı. Yapılan değerlendirmede monospermik fertilizasyon yönünden 1 ng/ml EGF grubu, K(+) ve K(-) grupları arasındaki fark önemli bulunmadı. 10 ng/ml EGF, 100 ng/ml EGF ve 1000 ng/ml EGF gruplarının hem kendi aralarında hem de K(+), K(-) ve 1 ng/ml EGF grupları arasındaki farklılığın önemli olduğu belirlendi. Sonuç olarak sığır oositlerinin in vitro maturasyonda vasat katkısı olarak kullanılan epidermal büyüme faktörünün 100 ng/ml dozunun in vitro fertilizasyon açısından daha başarılı olduğu kanısına varıldı.Anahtar Sözcükler: Epidermal büyüme faktörü, in vitro fertilizasyon, in vitro maturasyon, sığır

Abstract:
The aim of the present study was to evaluate the efficacy of various doses of epidermal growth factor on in vitro maturation and in vitro fertilization of bovine oocytes. The material of the study included 701 ovaries taken from slaughtered cattle in the municipality of Çubuk town, Ankara city. Of those ovaries 1209 oocytes at "A" quality were collected within aspiration of 5319 follicles. The groups were designed according to the EGF amount (1 ng/ml EGF group, 10 ng/ml EGF group, 100 ng/ml EGF group, 1000 ng/ml EGF group) added in to the TCM 199+6 mg/ml BSA media. Besides hCG (1 Ill/ml) was added in to the same media for constitution of (+) control and no additive was added to the TCM 199 media for constitution of (-) control group. Maturation at 39°C in an atmosphere of 5% C02 in air with maximum humidity for 24 hours was verified. After maturation, for detection of the maturation rate of the 6 groups, cumulus expansion of the COCs and after cumulus cells were removed, first polar body was examined. This proceses were not applied to the COCs taken into fertilization. The oocytes that will undergone to fertilization, were added to the fertilization medium (fert-TALP) within motile spermatozoa that were obtained by swim-up process. Into the same medium, 10 ^ig/ml heparin and 25 \ı\ PHE were also added and left for incubation at 39°C for 20 hours with 5% C02 with maximum humidity. Denuded oocytes were evaluated through the fertilization results within 1% aceto-orcein staining. Following maturation, cumulus expansion and 1st polar body were detected in the evaluated oocytes as 95.52%; 71.64% in 1 ng/ml EGF group, 92.16%; 76.47% in 10 ng/ml EGF group, 92.42%; 77.27% in 100 ng/ml EGF group, 89.47%; 55.26% in 1000 ng/ml EGF group, 79.49%; 64.10% in C (+) group and 67.85%; 42.15% in C (-) group respectively. Throughout the evaluation, no significant difference was round between the EGF groups, however significant difference was found both between C (+) and C (-) groups and in EGF groups in regard to the cumulus expansion. Throughout the examination of oocytes in regard to the 1st polar body no significant difference was found between the 1000 ng/ml EGF group within positive and negative control groups, however significant difference was found within 1 ng/ml EGF, 10 ng/ml EGF and 100 ng/ml EGF groups. Monospermic and polyspermic fertilization were detected in the evaluated oocytes following fertilization respectively as 41.90%; 3.81% in 1 ng/ml EGF group, 58.54%; 4.07% 10 ng/ml EGF group, 66.02%; 7.77% 100 ng/ml EGF group, 49.15%; 5.09% 1000 ng/ml EGF group, 36.13%; 5.88% in C (+) group and 28.22%; 7.26% in C (-) group. Through the evaluation monospermic fertilization no significant difference was found between the 1 ng/ml EGF group, C (+) and C (-) groups. Significant differences were found both between the 10 ng/ml EGF group, 100 ng/ml EGF group and 1000 ng/ml EGF group and both between the C (+), C (-) and 1 ng/ml EGF groups. In conclusion, epidermal growth factor used as a media additive on in vitro maturation of cattle oocytes, was considered in vitro fertilization as more successive at a 100 ng/ml dose.Key Words: Bovine, epidermal growth factor, in vitro fertilization, in vitro maturation