Tanımlanmış Lactobacillus plantarum suşlarının plazmit profilleri ve bunların bazı özelliklerinin belirlenmesi
Plasmid profiles of the identified strains of Lactobacillus plantarum and determination of their some properties
Yazar: HİDAYET SAĞLAM
Danışman: PROF. DR. AYNUR GÜL KARAHAN ; DOÇ. DR. GÜLGÜN TINAZ
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmada, dışkı kökenli 20 adet L. plantarum suşunun ve kıyaslama amacıyla 2 adet referans suşun (L. plantarum LMG 21677 ve L. plantarum LMG 21684) karbonhidrat fermantasyon ve antibiyotik direnç özelliklerinin plazmitlerle ilişkisi incelenmiştir. Karbonhidrat fermantasyon testi sonuçlarına göre, tüm suşların L. plantarum'a özgü nitelikleri taşıdığı belirlenmiştir. Tüm suşların duyarlı olduğu antibiyotikler, eritromisin (15 µg), penisilin (10 U), kloramfenikol (30 µg) ve tetrasiklindir (30 µg). Buna karşılık suşlar vankomisin (30 µg) ve kanamisine (30 µg) dirençlidir. Referans suşlardan LMG 21677 tetrasikline, LMG 21684 ise tetrasiklin ve eritromisine dirençlidir.Klasik yöntemle ve ticari kit kullanılarak referans ve doğal suşların plazmit DNA profilleri çıkarılmıştır. Klasik yöntemle çıkarılan plazmit DNA profillerinin incelenmesi sonucunda; suşların 2'sinde plazmit DNA'ya rastlanmazken, diğer suşlarda 1?3 adet, değişen büyüklüklerde (16, 14, 12, 10 ve 8 kb) plazmit DNA belirlenmiştir. Ticari kitle yapılan izolasyon çalışması ile 20 adet suşun 1?4 adet plazmit DNA içerdiği, bu plazmitlerin molekül ağırlıklarının ise 16, 12, 10, 7 ve 6 kb olduğu tespit edilmiştir. Plazmitlerin taşıdığı özelliklerin belirlenmesi amacıyla akriflavin (10?200 µg/ml), novobiyosin (0,125?40 µg/ml), yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon (43°C) ve yapay mide sıvısı (pH 2, 2,5, 3) uygulamaları ile plazmit giderim çalışması yapılmıştır. Uygulama parametreleri suşa bağlı olarak değişkenlik göstermiştir. Akriflavin uygulamasında 20?100 µg/ml'lik, novobiyosinde ise 8?40 µg/ml'lik düzeyler plazmitlerin gideriminde etkili olmuştur. Plazmit giderimi açısından yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyonun 48 saat uygulanması 24 saat uygulanmasından daha etkili sonuç vermiştir. Yapay mide sıvısında ise pH 2,5'te 90 dakika, pH 3'te 90 ve 180 dakika bekletme sonucunda suşların canlılığını koruduğu ve bazı plazmitlerini yitirdiği gözlenmiştir. Ancak pH 2'de 90 ve 180 dakika bekletme sonucunda suşların tamamen canlılığını kaybettiği belirlenmiştir. LMG 21677'nin pH 3'te 90 dakika bekletilmesinden sonra elde edilen mutantların %99'u tetrasiklin plazmidini kaybetmiştir. Aynı koşullarda LMG 21684 suşu mutantlarının %70'i tetrasikline direnç plazmidini ve %53'ü eritromisine direnç plazmidini yitirmiştir. Tüm uygulamalar suşlarda plazmit DNA kaybına yol açarken, bazı mutantlarda yeni plazmitlerin varlığı da belirlenmiştir.Bütün plazmitleri giderilmiş AB16?65, AK7?35, AK4?11 ve BK10?48 ile doğal suşların karbonhidrat fermantasyon özellikleri ve antibiyotik direnç özellikleri karşılaştırılmıştır. Elde edilen bulgular, mutant ve doğal suşlar arasında karbonhidrat fermantasyon ve antibiyotik direnç özellikleri açısından herhangi bir farklılık olmadığını göstermiştir.Çalışmada kullanılan suşlar, probiyotik ve başlatıcı kültür olarak kullanılabilme açısından üstün özelliklere sahiptir. Bu nedenle içerdikleri plazmitlerde önemli bazı özelliklerin kodlanmış olması kaçınılmazdır. Suşların ticari kullanımından önce bu özelliklerin belirlenmesi ve plazmitlerin yitirilmesinin önlenmesi gerektiği sonucuna varılmıştır.Anahtar Kelimeler: L. plantarum, plazmit, akriflavin, novobiyosin, yükseltilmişgelişme sıcaklığı, yapay mide sıvısı.

Abstract:
In this study, the association between plasmids and carbohydrate fermentation characteristics and antibiotic sensitivity properties of 20 L. plantarum strains that fecal origin and 2 reference strains (L. plantarum LMG 21677 and L. plantarum LMG 21684) have been investigated. According to carbonhydrate fermentation results, it was detected that strains are able to use carbonhydrate, pecular to L. plantarum. All of the strains are sensitive to erytromycin (15 µg), penicillin (10 U), chloramphenicol (30 µg), tetracycline (30 µg), while resistant to vancomycin (30 µg) and kanamycin (30 µg). LMG 21677 is resistance to tetracycline, LMG 21684 is resistance to tetracycline and erytromycin.Plasmid DNA profile of reference and natural strains has been revealed by using classical method and commercial kit. According to the results obtained from classical method, there was no plasmid DNA in 2 strains and 1?3 pcs plasmids with 16, 14, 12, 10 and 8 kb were found in remaining strains. According to the results obtained from commercial kit, 1?4 pcs plasmids were found in all of the strains with 16, 12, 10, 7 and 6 kb sizes. In order to determine the properties of plasmids, acriflavine (10?200 µg/ml), novobiocin (0,125?40 µg/ml) containing media, elevated incubation temperature (43°C) and artificial gastric juice (pH 2, 2,5, 3) applications have been used to cure plasmids. Application parameters were varied depending on the strain. 20?100 µg/ml acriflavine, and 0,125?40 µg/ml novobiocin levels were determined effective to cure plasmids. Incubation at elevated temperature (43°C) for 48 hours gave more effective results than incubation for 24 hours. The strains preserved their viability after 90 minutes of artificial gastric juice (pH 2,5) and 90?180 minutes of artificial gastric juice (pH 3) applications and the lost of some plasmid DNA was determined. However, strains were completely inactivated after 90 and 180 minutes applications at pH 2. 99% of the mutants obtained with the incubation of LMG 21677 strain for 90 minutes at pH 3 lost their tetracycline resistance plasmids. Under the same condition, 70% and 53% of LMG 21684 mutants have lost their tetracycline resistance and eritromycin resistance plasmids, respectively. All applications led to the loss of plasmid DNAs in strains, and presence of the new plasmids were determined in some of the mutants.AB16?65, AK7?35, AK4?11 and BK10?48 strains were compared with natural strains for their carbohydrate fermentation and antibiotic resistance properties after curing all the plasmids. Results showed that there was no difference among mutants and natural strains in terms of their carbohydrate fermentation or antibiotic resistance properties.Strains used in this study have superior properties to be used as probiotics and starter cultures. For this reason, some of the important properties to be encoded in plasmid are inevitable. It is concluded that determination of these properties and preventation of plasmid curing are necessary before commercial use of these cultures.Keywords: L. plantarum, plasmid, acriflavine, novobiocin, elevated incubation temperature, artificial gastric juice.