Hipoksik MCF 7 meme kanseri hücre kültüründe glukoz katabolizmasının araştırılması
The investigation of glucose catabolism in hypoxic MCF-7 breast cancer cell culture
Yazar: İREM BAYAR
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL BİLDİK
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veteriner Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzimler = Enzymes ; Glükoz = Glucose ; Hipoksi = Hypoxia ; Hücre kültürü = Cell culture ; Meme = Breast ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Oksijen = Oxygen

Özet:
Bu çalışmada hipoksinin MCF-7 kanser hücrelerinin glukoz katabolizması üzerine olan etkilerinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Normoksi ve hipoksi ortamlarına yerleştirilen kanser hücreleri belirli inkübasyon süreleri (3, 6, 12, 24 ve 48 saat) boyunca farklı konsantrasyonlarda (0, 5.5, 15 ve 55 mM) glukoza maruz bırakılmıştır. Oksijen gerilimi ve glukoz miktarının hücrelerin canlılığı üzerine etkisini belirleyebilmek adına tüm uygulama gruplarında WST-1 canlılık analizi gerçekleştirilmiştir. Normoksik ortamda konsantrasyona bağlı olarak 12. saatten sonra canlılık oranlarının arttığı tespit edilmiştir. Hipoksik ortamda hem zamana hem de konsantrasyona bağlı bir şekilde canlılık oranlarının kademeli olarak artış gösterdiği belirlenmiştir. Hücre lizatlarındaki glikolitik metabolizmayı yansıtan kilit enzimlerin (hekzokinaz-2 ,fosfofruktokinaz P, piruvat kinaz M2, laktat dehidrogenaz A, glukoz-6-fosfat dehidrogenaz) ELISA yöntemi ile miktar tayini gerçekleştirilmiştir. Ekstrasellüler laktat düzeyleri ve glukoz miktarları kolorimetrik yöntemle tayin edilmiştir. Glukoz ve oksijen düzeylerinin hücrelerin göç etme potansiyelleri üzerine etkisini görebilmek adına ise yara iyileşmesi testi yapılmıştır. Yüksek konsantrasyonda glukoz içeren grupların hipokside normoksiye kıyasla glukoz tüketiminin daha fazla olduğu (12. saat hariç) (p<0,001) ve bu sonucun hücre canlılığı sonuçları ile paralellik gösterdiği tespit edilmiştir. Hem normoksik hem de hipoksik ortamdaki hiperglisemik (55 mM glukoz) hücrelerde 6. saatten itibaren hücre migrasyonu hızlanmış, yara açıklığı yüzdeleri azalmıştır. Ayrıca glukozsuz ortamda hücrelerin morfolojik görüntüleri değişime uğramıştır. Hipoksik hücrelerde glukoz içermeyen uygulama gruplarına kıyasla artan glukoz konsantrasyonuna bağlı ekstrasellüler laktat seviyelerinin yükselmesi (p<0,05), Crabtree etkisinin baskın çalıştığını kanıtlar niteliktedir. Ortamda artan ürün miktarının enzim sentezini durdurmasına bağlı hipoksik ortamda LDHA düzeylerinin zamana bağlı anlamlı bir şekilde azaldığı tespit edilmiştir (p<0,001). Hipoksi koşullarında tüm konsantrasyonlar için (PKM2 için glukozsuz ortam haricinde) 6. saatteki PKM2 ve G6PD enzim miktarları en yüksek düzeyde tespit edilmiş (p<0,001) ve kısa süreli hipoksi maruziyetinin hem glikolitik yolağı hem de pentoz fosfat yolu (PPP)'nu çalıştırarak enzim sentezini başlattığı öngörülmüştür. G6PD enzim seviyelerinin  normokside hipoksiye göre tüm gruplar için (12. saat hariç) daha yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0,001). Bu veriler, normal oksijen koşulları altında glukozun PPP'na yönlendirildiğini göstermektedir. Uzun süreli hipoksi maruziyetinin hiperglisemik ortamda glikolitik akışı tetiklediği bilgisini doğrular nitelikte 15 ve 55 mM glukoz içeren hipoksi uygulama gruplarında 48 saatlik inkübasyon sonucunda PKM2 enzim miktarlarının artış gösterdiği sonucuna ulaşılmıştır. Glikolizin iki kilit enzimi HK2 ve PFKP'nin normoksik ortamda birbiriyle denge halinde azalan ve artan grafikler sergilediği görülmüştür. PFKP enzimi için hiperglisemik ortamda  normoksi ve hipoksi arasındaki farklılıklar daha belirgin olmakla beraber 15 mM glukoz ortamında 6. ve  24. saatlerde hipokside normoksiye göre sırasıyla 14,91 ve 56,5 kat artış gözlenmiştir (p<0,001).  Bu durum yukarıda belirtilen inkübasyon sürelerinde, hipoksi ile glikolitik akının indüklendiğini göstermektedir.  Farklı düzeyde elde edilen glikolitik enzim miktarları, oksijen gerilimine uyumlanmada hücrelerin birbirinden ayrı potansiyel kapasitelere ve değişen mekanizmalara sahip olduğunu kanıtlamıştır. Bu çalışma genel itibariyle hipoksi ile glikolitik profil arasında önemli bir etkileşim olduğunu göstermiş ve hipoksi tarafından aktive edilen metabolik süreçlerin terapötik hedefleme potansiyeli sunarak literatüre önemli bir katkı sağlayacağı kanaatine varılmıştır.

Abstract:
In this study, it was aimed to show the effects of hypoxia on glucose catabolism of MCF-7 cancer cells. Cancer cells placed normoxia and hypoxia environments were exposed to glucose at different concentrations (0, 5.5, 15 and 55 mM) for certain incubation times (3, 6, 12, 24 and 48 hours). WST-1 viability analysis was performed in all application groups to determine the effect of oxygen tension and glucose amount on cell viability. In the normoxic environment, viability rates increased after 12th hour depending on the concentration. In the hypoxic environment, a gradual increase in viability rates depending both on time and concentration was determined. Quantification of key enzymes (hexokinase-2, phosphofructokinase P, pyruvate kinase M2, lactate dehydrogenase A, glucose-6-phosphate dehydrogenase) reflecting glycolytic metabolism in cell lysates was performed by ELISA method. Extracellular lactate levels and glucose levels were determined by colorimetric method. To see the effect of glucose and oxygen levels on the migration potential of cells, a wound healing test was performed. It was determined that the groups containing high concentrations of glucose had higher glucose consumption in hypoxia compared to normoxia (except 12th hour) (p<0.001) and this result was found to be in parallel with cell viability results. From the 6th hour, cell migration has accelerated and wound opening percentage has decreased in hyperglycemic (55 mM glucose) cells in both normoxic and hypoxic environment. In addition, morphological images of the cells undergo a change in glucose free medium. The increase in extracellular lactate levels (p<0.05) due to increased glucose concentration in hypoxic cells compared to glucose-free administration groups is evidence that the Crabtree effect is predominant. It was determined that LDHA levels decreased significantly depending on time in the hypoxic environment due to stopping enzyme synthesis by increasing amount of product in the environment (p<0.001).
PKM2 and G6PD enzyme levels at the 6th hour for all concentrations (except glucose-free medium for PKM2) were determined at the highest level in hypoxia conditions (p<0.001) and short-term exposure to hypoxia has been predicted to initiate enzyme synthesis by operating both the glycolytic pathway and pentose phosphate pathway (PPP). It has been determined that enzyme levels of G6PD in normoxia are higher for all groups (except 12th hour) than hypoxia (p<0.001). These data show that glucose is directed to PPP under normal oxygen conditions. It was concluded that PKM2 enzyme amounts increased after 48 hours incubation in hypoxia application groups containing 15 and 55 mM glucose, which confirms the knowledge that long-term hypoxia exposure triggers glycolytic flow in hyperglycemic environment. Two key enzymes of glycolysis, HK2 and PFKP in balance with each other, were shown to exhibit decreasing and increasing graphs in a normoxic environment. Although the differences between normoxia and hypoxia in hyperglycemic environment for PFKP enzyme are more pronounced, at the 6th and 24th hours, at hypoxia increased 14.91 and 56.5 times compared to normoxia in the 15 mM glucose environment, respectively (p<0,001). This indicates that glycolytic flux is induced by hypoxia in during the incubation times mentioned above. The amounts of glycolytic enzymes obtained at different levels proved that the cells have different potential capacities and changing mechanisms in adapting to oxygen tension. This study showed that there was a significant interaction between hypoxia and glycolytic profile in general, and it was concluded that the metabolic processes activated by hypoxia would make a significant contribution to the literature by offering therapeutic targeting potential.