Forbol miristat asetat ve selektif v1a reseptör antagonisti SR49059'un aquaporin-4 ve beyin ödemi rezolüsyonu üzerine etkilerinin incelenmesi
The effect of aquaporin supression on resolution of brain edema in intracerebral infusion model in rats.
Yazar: PINAR AKDEMİR ÖZIŞIK
Danışman: PROF. DR. NEJAT AKALAN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Nöroloji Ana Bilim Dalı / İleri Nörolojik Bilimler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Nöroloji = Neurology ; Nöroşirürji = Neurosurgery

Özet:
Travmatik beyin hasarı ve beyinödemi için elimizde bulunan tedavi seçeneklerinin çok kısıtlı olması, beyindeki suakümülasyonunu ve klerensini inceleyen çalısmaları hızlandırmıstır. Aquaporinailesinin bir üyesi olan Aquaporin-4 (AQP4), beyinde iki yönlü su transportu yapanmajör su kanalıdır. Son yayınlar AQP4'ün arginin-vasopressin (AVP) tarafındanregüle edildigini ve in vitro AQP4 yoluyla olan su akımının, vasopressin V1areseptör agonistleri ile kolaylastırıldıgını göstermistir. Ayrıca in vitro AQP4 aktiviteve ekspresyonu, protein kinaz C (PKC) aktivasyonu-bagımlı yolaklar üzerindenforbol esteri, forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) tarafından inhibe edilmektedir. Buçalısmada PMA ve SR49059'un AQP4 ekspresyonu üzerine etkileri incelenerek,AQP4 su kanalı downregülasyonunun ekstraselüler sıvı akümülasyonunu engelleyipengellemedigi arastırılacaktır. 24 eriskin Sprague Dawley sıçan (350-400 gr) randomolarak asagıdaki gruplara ayrılmıstır. Kontrol (intraserebral infüzyon+iv salin) (n=6),intraserebral infüzyon+ iv PMA 720 ?L/hr (n=6), intraserebral infüzyon+iv SR49059720 ?L/hr (n=6), ve intraserebral infüzyon+tasıyıcı (1% dimetilsülfoxid (DMSO))(n=6). Hayvanlar entübe ve mekanik ventile edildiler. Ekstraselüler beyin ödemi,beyine stereotaktik koordinatlar kullanılarak yerlestirilen bir igne ile yapay beyinomuriliksıvısı (mock CSF) infüze edilerek (40 ?L/sa) yapılmıs ve beyin infüzyonu90 dk sürmüstür. v salin, tasıyıcı (vehicle), PMA ve SR49059 infüzyonları ise beyininfüzyonu basladıktan 30 dk sonra baslamıs ve kesintisiz 5 saat sürmüstür. Denekler%5 halotan kullanılarak sakrifiye edilmis ve dekapite edilmislerdir. Beyin su içerigigravimetrik metod ile, beyin sodyum ve potasyum konsantrasyonları da flamefotometre kullanılarak ölçülmüstür. AQP4 ekspresyonu ise iv SR49059 (n=6) vesalin (n=6) infüze edilen gruplarda ayrıca çalısılmıstır. Sakrifikasyon vedekapitasyonu takiben western blotlama yöntemi ile AQP4 bantları tespit edilmis,dansitometre kullanılarak ölçümler yapıldıktan sonra tüm sayısal veriler AQP4/Cyclophilin A oranı hesaplanarak verilmistir. v SR49059 infüzyonu, AQP4ekspresyonunda belirgin azalmaya neden olmaktadır (p=0.02 infüze hemisfer,p=0.006 kontrol hemisfer). Fakat bu azalma her iki hemisferde bir miktar ödemartısına neden olmakla birlikte istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıstır (infüzehemisferde p=0.62; kontrol hemisferde p=0.07). PMA infüzyonu ise her ikihemisferde su içeriginde azalma yapmakla birlikte buradaki fark da istatistikselolarak anlamlı degildir (infüze hemisferde p=0.23; kontrol hemisferde p=0.65). Heriki bilesigin verilmesi de beyin iyon konsantrasyonlarında belirgin bir degisikligeneden olmamıstır. Bu sonuçlar, AQP4 downregülasyonu ve/veya fonksiyonundaazalma yaparak beyin ödemi olusumunu azaltan ilaçların, ödem rezolüsyonunuengellemedigini göstermekte ve bunların klinik kullanım için yeni bir hedefolusturabilecegine isaret etmektedir.Anahtar Kelimeler: Beyin ödemi, vazopressin, su kanalları, SR-49059, forbolesterleri

Abstract:
Thesis in Advanced Neurological Sciences, Ankara, 2006.Since there is minimal repertoire of existing therapies for traumatic brain injury andbrain edema, it is strongly endorse the need for further investigation of wateraccumulation and clearence in brain. A member of the aquaporin family, Aquaporin-4 (AQP4) is the major water channel in the brain, facilitates bi-directional watertransport across the plasma membrane. Recent evidence suggests that AQP4 may beregulated by arginine-vasopressin (AVP). In addition, in vitro, AQP4 activity andexpression is inhibited by the phorbol ester, phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA),through a PKC activation dependent pathway. But the role of AQP4 on the clearanceof primary extracellular fluid accumulation in brain is still unclear. The aim of thisstudy was to determine if a downregulation of AQP4 channels by SR49059 and PMAimpairs clearance of infusion edema in the rat brain. 24 adult Sprague Dawley rats(350 to 400 gr) were randomly assigned to the following groups: Control(intracerebral infusion + iv saline) (n=6), intracerebral infusion + iv PMA 720 ?L/hr(n=6), intracerebral infusion + iv SR49059 720 ?L/hr (n=6), and intracerebralinfusion + iv vehicle (1% DMSO in saline) (n=6). Animals were intubated andmechanically ventilated. Extracellular fluid accumulation in brain was induced by aninfusion needle inserted into the left hemisphere using rat stereotactic device.Continuous intravenous infusion of saline, vehicle, SR49059, or PMA began 30 minafter brain infusion started (Mock CSF, 40 ?L/hr for 1.5 hr), then continued for 4hours after stopping intracerebral infusion. The animals were sacrified and the brainswere removed. The brain tissue water was determined by the gravimetric method,and the concentrations of sodium and potassium were determined using a flamephotometer. AQP4 expression was analyzed by immunoblotting in groups of controland SR49059. Quantification was performed by densitometry usingAQP4/Cyclophilin ratio. Intravenous administration of SR49059 causes significantreduction in AQP4 expression (p=0.02 in infused hemisphere, p=0.006 in noninfusedhemisphere), and but this reduction does not cause a significant increase inbrain water content in both hemispheres (p=0.62 in infused hemisphere and p=0.07in non-infused hemisphere). Also PMA administration causes minimal decrease inthe brain water content in both hemispheres, but it was not statistically significant(p=0.23 in infused hemisphere, p=0.65 in non-infused hemisphere). After SR49059and PMA treatments, the ion (sodium and potassium) shift caused by intracerebralinfusion was not changed significantly in both hemispheres. Our findings showedthat the intravenous administation of SR49059 and PMA do not impair the resolutionof edema without a consecutive sodium shift. The experimental evidence suggeststhat the therapeutic effect of the drugs that downregulate or cause reduced functionof AQP4 to prevent the formation of brain edema has no effect on the resolution ofthe edema. Thus such drugs have potential for useage of clinical experiments afterdetailed dosing /timing studies and evaluating systemic and side effects.Key words: Brain edema, brain infusion, vasopressin, aquaporin4, SR-49059,phorbol esters