Covid-19 hastalarının takibinde hastalık şiddeti ile dolaşımdaki T ve B lenfosit alt gruplarının ilişkisinin multiparametrik immünfenotiplendirme aracılı belirlenmesi
Determination of the relationship between disease severity and circulating T and B lymphocyte subgroups in the follow-up of Covid-19 patients by means of multiparametric immune phenotyping
Yazar: ULVIYYA ABISHOVA
Danışman: PROF. DR. BEHİCE KURTARAN
Çukurova Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Enfeksiyon ve Klinik Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji = Infectious Diseases and Clinical Microbiology

Özet:
Amaç: Bu çalışmada SARS-CoV-2 PCR pozitifliği ile COVID-19 enfeksiyonu tespit edilen erişkin hastalarda tanı sırasında ve izlemde T ve B hücre alt tiplerinde akım sitometri ile saptanan değişiklikleri ve hastalık şiddeti ile ilişkisini irdelemeyi amaçladık.
Gereç ve Yöntem: Çalışma Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalında prospektif olarak yapıldı. Çalışmaya etik kurul onayı ve katılımcıların yazılı onam belgeleri alındıktan sonra 1.10.2021-9.9.2022 tarihleri arasında 18 yaş üzeri COVID-19 tanısı alan hastalar dahil edildi. Tanı konulmuş hastalardan başvuru sırasındaki klinik özelliklerine göre hastalık şiddeti için DSÖ'nün COVID-19 için şiddet tanımlarına esasen hafif, şiddetli ve kritik olarak sınıflandırıldı ve takip durumuna göre ayaktan, serviste takip edilen ve YBÜ'de takip edilen olmakla 3 grupa ayrıldı. Her gruba 30 hasta alındı. Ayaktan takip edilen hastalarda tanı günü ve takibinde 7.günde, serviste yatan hastalardan hastaneye yattığı ilk gün ve takibinin 5-10. gününde veya taburculuk gününde, YBÜ'de yatan hastalardan hastaneye yattığı ilk gün ve takibinin 7-14. gününde veya servise çıktığı gün veya taburculuk gününde kan örnekleri alındı. Alınan örneklerden önce tam kan sayımı ve daha sonra akım sitometri çalışmaları yapıldı. Her hasta grubu için akım sitometri ile 20 hücre tipi çalışıldı. 
Çalışmamızda akım sitometri kullanılmak üzere T lenfositlerin alt gruplarının belirlemek için CD3, CD4, CD8 gibi sık kullanılan T lenfosit belirteçleri ve timustan yeni çıkmış hücreleri, naif T hücreleri, santral hafıza hücreleri, efektör hafıza hücreleri gibi alt grupların tayini için CCR7, CD45RA, CD62L, CD31 gibi belirteçleri kullanıldı. B lenfositler için ise CD19 ile beraber transisyonel hücreler, naif hücreler, hafıza hücreleri, sınıf değiştirmiş hücreler, plazmablast hücreleri gibi alt grupların tayini için CD21, CD24, CD27, CD38, IgM gibi belirteçler kullanıldı. Yapılan analizlerde CD45/SSC (Side scatter channel) nokta grafiğinde tüm lökositler üzerinden lenfositler kapılanarak lenfosit yüzdesi ve sayısı; T hücreler için lenfositler üzerinden CD3/SSC grafiğinden CD3+ hücreler seçilerek T lenfosit yüzde ve sayısı; B lenfositler için lenfositler üzerinde CD19/SSC grafiğinden CD19+ hücreler seçilerek B lenfosit yüzde ve sayısı belirlendi. Daha sonraki aşamada ise T ve B lenfositleri için ayrı akım sitometri çalışmaları yapıldı. 
Verilerin istatistiksel analizinde SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 25.0 paket programı kullanıldı.
Bulgular: Çalışmaya COVID-19 tanılı 90 hasta dahil edildi. Hastaların yaş ortalamaları 56,7±17,9 (minimum:18, maksimum: 95) yıl iken, 46 (% 51,1)'sı erkek, 44 (% 48,9)'u kadın idi. Sigara kullanımı hastaların 15 (% 16,7)'inde tespit edildi. 21 (% 23,3)'ü eski kullanıcı idi. Hastalardan 66 (% 73,3)'sında komorbidite tespit edildi. En sık gözlenen komorbidite sırasıyla 33 (% 50)'ünde HT, 22 (% 33,3)'sinde DM, 22 (% 33,3)'sinde kalp hastalığı, 17 (% 25,8)'sinde malignite, 8 (% 12,1)'inde KOAH-astım, 7 (% 10,6)'sinde böbrek hastalığı, 6 (% 9,1)'sında immünsüpresyon (aktif kemoterapi alan hasta, nötropenik hasta), 5 (% 7,6)'inde otoimmünite, 1 (% 1,5)'inde kronik karaciğer hastalığı, 13 (% 19,7)'ünde ise diğer komorbidite bulgularına rastlanıldı. DSÖ skalasına göre hastalardan 39 (% 43,3)'unda hafif, 33 (% 36,7)'ünde şiddetli, 18 (% 20,0)'inde ise kritik hastalık saptandı. Kritik hastalık oranı erkeklerde (% 26,1; n:12), kadınlara (% 13,6; n:6) göre daha yüksek iken; şiddetli hastalık oranı ise kadın (% 21,1; n:47,7) hastalarda, erkek (% 26,1; n:12) hastalara göre daha yüksek olduğu gözlenmesine karşın aradaki fark istatistiksel açıdan anlamlı bulunmadı. Cinsiyete göre sağkalım ve ölüm ilişkisinin sonuç bulgularına bakıldığında hastalardan 72 (% 80)'sinde şifa bulgularına rastlanırken, 18 (% 20)'sinde eksitus varlığı tespit edildi. Kadın ve erkek oranında eksitus bulgularının ise benzer olduğu tespit edildi. DSÖ skalasına göre şiddetli olmayan hastalarda komorbidite oranı daha düşük bulundu. Başvuru ve takip anında naif B hücre oranları YBÜ'de takip edilen hastalarda daha düşük saptandı. IgM+ hafıza B hücreleri ise ayaktan takip edilenlerde, servis ve YBÜ'de takip edilenlere göre anlamlı derecede daha düşük tespit edildi. Ayaktan takip edilen hastaların CD4+ santral, hafıza B hücre ve plazmablast oranlarında zamanla yükselme; sadece IgD+ hafıza B hücreleri ve naif B hücre oranlarında ise zamanla anlamlı azalma tespit edildi. Serviste takip edilen hastalarda CD4+ santral, CD4+efektor ve sınıf değiştirmiş hafıza B hücre oranlarında zamanla artış, sadece IgM+ hafıza B hücre oranlarında ise zamanla azalma tespit edildi. YBÜ'de takip edilen hastalarda CD4 yenigöçeden, CD4+efektor, transisyonel ve sınıf değiştirmiş hafıza B hücre oranlarında zamanla yükselme; sadece IgM+ hafıza B hücreleri ve plazmablast oranlarında ise zamanla azalma tespit edildi. 
Sonuç: Çok çeşitli çalışmalar, T ve B hücre yanıtlarının SARS-CoV-2'ye karşı bağışıklık korumasının kritik bir bileşeni olduğunu göstermiştir. Çalışmamızda T ve B hücre alt popülasyonlarında ayaktan, servis ve YBÜ olmakla her 3 grupta anlamlı farklılıklar tespit edildi. Çalışmamız SARS-CoV-2'nin normal adaptif bağışıklık tepkisini indükleyebileceğini göstermektedir. Toplu olarak, bu veriler, hastalık şiddetinin bir fonksiyonu olarak T hücresi yanıtlarındaki potansiyel varyasyonlara ışık tutmaktadır; bu, immünopatolojinin hastalıktaki potansiyel rolünü anlamanın yanı sıra aşı tasarımını ve değerlendirmesini bilgilendirmek için anahtar bir konu olduğunu ve benzer çalışmalar olmasına rağmen T ve B lenfositlerin zamansal değişikliklerine dair kısıtlı çalışmalar olmasından dolayı literatüre katkı sağlayacağını düşünmekteyiz.

Abstract:
Objective: In this study, we aimed to examine the changes detected by flow cytometry in T and B cell subtypes during diagnosis and during follow-up in adult patients with COVID-19 infection with SARS-CoV-2 PCR positivity and its relationship with disease severity.
Materials and Methods: The study was conducted prospectively in Çukurova University Faculty of Medicine, Department of Infectious Diseases and Clinical Microbiology. Patients over the age of 18 who were diagnosed with COVID-19 between 1.10.2021 and 9.9.2022 were included in the study after the approval of the ethics committee and the written consent of the participants. According to the clinical features of the diagnosed patients at the time of admission, they were classified as mild, severe and critical according to the WHO's severity definitions for COVID-19 and were divided into 3 groups according to the follow-up status: outpatient, followed-up in the service and followed in the ICU. 30 patients were included in each group. In outpatients, on the day of diagnosis and on the 7th day of follow-up, the first day of hospitalization and 5-10th day of follow-up among inpatients. On the day of discharge or on the day of discharge, the first day of hospitalization from the patients in the ICU and the 7-14th day of the follow-up. Blood samples were taken on the day of the service or the day of discharge. Complete blood count and flow cytometry studies were performed before the samples were taken. For each patient group, 20 cell types were studied by flow cytometry.
In order to determine the subgroups of T lymphocytes to be used in flow cytometry in our study, frequently used T lymphocyte markers such as CD3, CD4, CD8 and CCR7, CD45RA, CD62L, Markers such as CD31 were used. For B lymphocytes, together with CD19, markers such as CD21, CD24, CD27, CD38, IgM were used for the determination of subgroups such as transitional cells, naive cells, memory cells, declassified cells, plasmablast cells. In the analyzes performed, lymphocytes were gated on all leukocytes in CD45/SSC (Side scatter channel) dot plot, and the percentage and number of lymphocytes; For T cells, CD3+ cells were selected from the CD3/SSC graph over lymphocytes, and the percentage and number of T lymphocytes; For B lymphocytes, CD19+ cells were selected from the CD19/SSC graph on lymphocytes and the percentage and number of B lymphocytes were determined. In the next step, separate flow cytometry studies were performed for T and B lymphocytes.
SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 25.0 package program was used for statistical analysis of the data.
Results: 90 patients with a diagnosis of COVID-19 were included in the study. While the mean age of the patients was 56.7±17.9 (minimum: 18, maximum: 95) years, 46 (51.1%) were male and 44 (48.9%) were female. Smoking was detected in 15 (16.7%) of the patients. 21 (23.3%) were former users. Comorbidity was detected in 66 (73.3%) of the patients. The most common comorbidities were HT in 33 (50%), DM in 22 (33.3%), heart disease in 22 (33.3%), malignancy in 17 (25.8%), 8 ( 12.1% had COPD-asthma, 7 (10.6%) kidney disease, 6 (9.1%) immunosuppression (patient receiving active chemotherapy, neutropenic patient), 5 (7.6%) Autoimmunity was found in 1, chronic liver disease in 1 (1.5%) and other comorbidity findings in 13 (19.7%) patients. According to the WHO scale, 39 (43.3%) patients had mild disease, 33 (36.7%) severe disease, and 18 (20.0%) critical disease. While the rate of critical illness was higher in men (26.1%; n:12) than in women (13.6%; n:6); Although the rate of severe disease was higher in female (21.1%; n:47.7) patients than in male (26.1%; n:12) patients, the difference was not statistically significant. Considering the outcome findings of the relationship between survival and death by gender, 72 (80%) of the patients had healing findings, while 18 (20%) had theAccording to the WHO scale, the comorbidity rate was found to be lower in non-severe patients. At admission and at the time of follow-up, naive B cell rates were found to be lower in patients followed in the ICU. IgM+ memory B cells were found to be significantly lower in outpatients than those followed in the service and ICU. Increase in CD4+ central, memory B cell and plasmablast ratios in outpatients over time; only IgD+ memory B cells and naive B cells were significantly decreased over time. In the patients followed up in the service, CD4+ central, CD4+ effector and class-changed memory B cell ratios increased over time, while only IgM+ memory B cell ratios decreased over time. Increase over time in CD4 neo-immigration, CD4+effector, transitional and class-changed memory B cell ratios in patients followed up in the ICU; only IgM+ memory B cells and plasmablast ratios decreased over time.
Conclusion: A wide variety of studies have demonstrated that T and B cell responses are a critical component of immune protection against SARS-CoV-2. In our study, significant differences were found in T and B cell subpopulations in all 3 groups, being outpatient, ward and ICU. Our study shows that SARS-CoV-2 can induce normal adaptive immune response. Collectively, these data shed light on potential variations in T-cell responses as a function of disease severity; We think that this is a key topic for understanding the potential role of immunopathology in the disease, as well as informing vaccine design and evaluation, and will contribute to the literature due to the limited number of studies on temporal changes of T and B lymphocytes, although there are similar studies. presence of death. It was found that the death findings in the ratio of women and men were similar.