Arpa (Hordeum vulgare L.) doku kültüründe retrotranspozon hareketlerinin ve ürünlerinin belirlenmesi
Determination of retrotransposon movements and products in barley (Hordeum vulgare L.) tissue culture
Yazar: SİBEL YILMAZ
Danışman: PROF. DR. NERMİN GÖZÜKIRMIZI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Bu tez çalışması kapsamında, arpa (Hordeum vulgare L. cv. Golden Promise) kallus ve sürgünlerinde, kültürü süresine bağlı olarak meydana gelen BAGY2 retrotranspozonunun hareketinden kaynaklanan insersiyonel polimorfizm araştırıldı. Çalışmada doku kültürü örneği olarak tek bir embriyodan köken alan 45 ve 90 günlük kalluslar ve bu kalluslardan rejenere olan sürgünler kullanıldı. Bu örnekler bir çalışma grubu olarak değerlendirildi ve tüm moleküler çalışmalar üç çalışma grubu ile tekrarlandı. Bununla birlikte çalışmada kontrol amaçlı olarak, kültüre alınmamış embriyo (Kontrol 1), filtre kağıdında çimlendirilmiş fidelerin yaprakları (Kontrol 2) ve MS besi yerinde çimlendirilen fidelerin yaprakları (Kontrol 3) kullanıldı. Bireyler arasında doğal olarak meydana gelen bir BAGY2 polimorfizmi olup olmadığını belirlemek için her kontrolde dört farklı birey ile deneyler tekrarlandı. BAGY2 polimorfizminin belirlenmesi için IRAP marker tekniği kullanıldı. IRAP sonuçlarının doğruluğunu kontrol etmek amacı ile örnekler arasındaki BAGY2 ara domenlerinin kopya sayısı değişimleri qPCR ile belirlendi. Bununla birlikte çalışmada kullanılan arpa varyetesinde tüm BAGY2 ara domenlerinin tam kopya halinde bulunduğunu göstermek için Kontrol 1 örneklerinde ara domenlerin dizi analizleri gerçekleştirildi. Elde edilen diziler ve BAGY2 protein dizileri, tblastn ile karşılaştırılarak benzerlik oranları belirlendi.
 
Kontrol 1 örnekleri ile yapılan IRAP-PCR sonucunda bireyler arasında doğal bir BAGY2 insersiyonel polimorfizmi olmadığı görüldü. Buna karşın Kontrol 1 / Kontrol 2 ve Kontrol 1 / Kontrol 3 örnekleri arasında %8 polimorfizm olduğunun tespit edilmesi, farklı organlar arasındaki BAGY2 insersiyonel profilinin farklı olabileceğini gösterdi. Doku kültürü örnekleri arasında %0-20 oranında polimorfizm tespit edildi. Sürgünlerdeki polimorfizm oranının kallus örneklerine göre düşük olması genomu daha kararlı olan hücrelerin rejenerasyon şansının yüksek olabileceğini gösterdi. qPCR analizleri ile kallus ve sürgünlerdeki BAGY2 ara domenlerinin kopya sayısının değişiklik gösterdiği belirlendi. Bu sonuçlar IRAP tekniği ile belirlenen polimorfik bantların BAGY2 kopya sayısı artışından kaynaklanabileğini doğruladı. BAGY2 ara domenlerinin dizi analizleri sonucunda ise GAG %90, PR %86, RT %92, RH %94 ve INT ise %92 oranında BAGY2 protein dizisi ile benzerlik gösterdi. Bu sonuçlar, çalışmada kullanılan arpa varyetesinde tüm BAGY2 ara domenlerinin tam kopya halinde bulunduğunu kanıtladı. 

Bu tez çalışmasından elde edilen sonuçlar, doku kültürü süresinin BAGY2 retrotranspozonunun hareketinden kaynaklanan insersiyonel polimorfizme neden olduğunu ve retrotranspozonların somaklonal varyasyon kaynağı olabileceğini göstermiştir. Bu sonuçlar, doku kültürü süresinin retrotranspozonların insersiyonel hareketlerine olan etkisinin belirlenmesine katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, hayvan kök hücreleri ile yapılan çalışmalarda doku kültürü sürecinin retrotranspozon hareketleri üzerine olan etkilerinin belirlenmesi için bir model olabilir. Retrotranspozonların insersiyonel hareketlerinden kaynaklanan polimorfizmlerin belirlenmesine yönelik çalışmalar, retrotranspozon kaynaklı hastalıkların anlaşılması için temel oluşturabilir.

Abstract:
In this study, the insertional polymorphism deriving from BAGY2 retrotransposon movement in barley (Hordeum vulgare L. cv. Golden Promise) calli and shoots due to culturing duration was investigated. In the study, 45- and 90-day-old calli deriving from the same embryo and their regenerants were used as tissue culture samples. These samples were considered as study a group and all molecular studies were replicated with 3 study groups. At the same time, uncultured embryo (Control 1), seedling leaves germinated between filter papers (Control 2) and seedling leaves germinated on MS medium (Control 3) were used as control in the study. The experiments were replicated with 4 individuals in each control to determine if there was any naturally occurring BAGY2 polymorphism between the individuals. IRAP marker technique was employed to detect BAGY2 polymorphism. To verify the IRAP results, copy number alterations of BAGY2 internal domains between individuals were analyzed by qPCR. In addition, to confirm that all the BAGY2 internal domains were present as a complete copy, internal domains of Control 1 samples were sequenced. The obtained sequences and BAGY2 protein sequences were compared by tblastn and the similarity rates were determined. 

IRAP-PCR results with control samples showed no natural BAGY2 insertional polymorphism between individuals. However, the detection of 8% polymorphism between Control 1/Control 2 and Control 1/Control 3 samples showed that the BAGY2 insertional profile might vary between different organs. 0-20% polymorphism was detected between tissue culture samples. The lower polymorphism rate in the shoots compared to the calli samples showed that the cells with more stable genome had an elevated chance to regenerate. By qPCR analyses, it was determined that the copy number of BAGY2 internal domains in calli and shoots showed alterations. These results confirmed that the polymorphic bands detected by IRAP technique could result from the increase in BAGY2 copy number. The sequencing results of BAGY2 internal domains revealed similarity rates by GAG 90%, PR 86%, RT 92%, RH 94%, and INT 92% with BAGY2 protein sequence. These results proved that all the BAGY2 internal domains were present as a complete copy in the barley variety used in the study.

The results obtained from this study indicated that tissue culture duration lead to insertional polymorphism due to the movement of BAGY2 retrotransposon and that the retrotransposons could be the source of somaclonal variation. These results might contribute to the detection of the tissue culture duration effects on insertional movements of retrotransposons. Besides, it could be a model to define the effects of tissue culture duration on retrotransposon movements in animal stem cells studies. The studies for the detection of polymorphisms derived from insertional movements of retrotransposons could provide a basis to understand the retrotransposon-based diseases.