Biyomimetik yöntemle bor katkılı doku iskelelerinin geliştirilmesi ve kemik doku mühendisliğindeki etkinliklerinin araştırılması
Development of boron containing tissue scaffolds by biomimetic method and investigation of their effectiveness in bone tissue engineering
Yazar: ÖZGE EKİN TUNÇAY
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışma 112M705 numaralı ?Mikrodalga desteği ile Biyomimetik Hidroksiapatit (HAp)-Bor Katkılı HAp Oluşumu ve Kitosan-HAp Kemik Doku İskelelerinin Geliştirilmesi? adlı TÜBİTAK Projesi desteği ile hazırlanmıştır.Sunulan tez çalışmasının amacı, mikrodalga uygulaması ile desteklenmiş biyomimetik yöntemi kullanarak, osteoindüktif özelliğe sahip bor katkılı hidroksiapatit (B-HAp) üretilmesi ve kemik doku rejenerasyonunu destekleyen, bor katkılı hidroksiapatit ile kaplanmış kitosan (B-HAp/kitosan) doku iskelelerinde hücrelerin kemik doku oluşturma potansiyellerinin incelenmesidir.
Tez çalışmasının ilk aşamasında, farklı miktarlarda borik asit içeren 10xSBF (yapay vücut sıvısı)?den bor katkılı hidroksiapatit elde etmek amacıyla, sodyum hidroksit ilavesi ile çökelmenin gerçekleşeceği pH değeri ayarlanmıştır. B-HAp, borik asit içeren SBF?deki iyonların mikrodalga enerjisiyle etkileşimleri sonucu üretilmiştir. Borun hidroksiapatitin yapısına katılması, fosfat ya da hidroksil gibi iyonların borat iyonlarıyla yer değiştirmesiyle gerçekleşir. Farklı mikrodalga güçleri ve uygulama süreleri ile denemeler yapılarak B-HAp?nin üretildiği en uygun koşullar belirlenmiştir. Sonuç olarak, %1.15±0.11  (w/w) bor içeren, 1.40 (w/w) Ca/P oranına ve %4.30±0.07  (w/w) karbonat içeriğine sahip, 30±4 nm boyutlarında çubuk benzeri morfolojide ve kemik benzeri amorf yapıda B-HAp     10 mg/mL borik asit içeren 10xSBF?den 600 W mikrodalga gücü kullanılarak üretilmiştir.
Çalışmanın sonraki aşamasında, 100 µm gözenek çapına sahip kitosan doku iskeleleri dondurarak kurutma yöntemiyle hazırlanmıştır. Hazırlanan bu iskeleler, mekanik ve biyoaktif özelliklerinin iyileştirilmesi için mikrodalga ışımasının etkisiyle B-SBF kullanılarak B-HAp ile kaplanmıştır. Yüzeydeki ve gözeneklerin içerisindeki apatit yapısının varlığı, taramalı elektron mikroskobu (SEM), Fourier dönüşümlü toplam yansıması azaltılmış kızılötesi spektroskopisi (ATR-FTIR) ve X ışını kırınımı (XRD) analizleri ile gösterilmiştir. İskelelerin fiziksel özelliklerindeki değişimin incelenmesi amacıyla, kontrol grubu olarak bor içermeyen hidroksiapatit kaplı kitosan iskeleler aynı koşullarda üretilmiştir. Sonuç olarak, her bir B-HAp/kitosan iskelede bulunan bor miktarı yaklaşık 20 µg olarak hesaplanmıştır. İskelelerin şişme oranının 28.9±1.4, gözenekliliğinin %85.7±2.5 olduğu belirlenmiştir. Mikrodalga ışımanın etkisiyle kitosan doku iskelesinin gözeneklerine nüfuz eden etkin bir kaplamanın yapılabildiği ve bu kaplamanın doku iskelelerinin kararlılığını arttırdığı gözlemlenmiştir. 
Tez çalışmasının son aşamasında, borun L929 fare fibroblast hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi, her bir iskeleye yüklenen bor miktarı dikkate alınarak 9-300 µg/mL konsantrasyon aralığında incelenmiştir. B-HAp/kitosan iskelelerin biyoaktivitesi ise MC3T3-E1, preosteoblastik hücre hattı ile in vitro koşullarda incelenmiştir. Hücre canlılığı ve üremesi MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analizi, hücrelerin morfolojik özellikleri ise taramalı elektron mikroskobisi (SEM) ile değerlendirilmiştir. Hücrelerin osteojenik farklılaşma belirteçleri olan, kolljen Tip I, RunX2, osteokalsin ve osteopontin gen ifadeleri RT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) ile tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlar B-HAp/kitosan iskelelerin hücre yapışmasını, çoğalmasını ve farklılaşmasını kitosan ve HAp/kitosan iskelelerden daha fazla desteklediğini göstermiştir. 
Sonuç olarak, bor katkısının MC3T3-E1 hücrelerinin çoğalma ve kemik hücrelerine farklılaşma özelliklerini arttırdığı ve bor katkılı kitosan doku iskelesinin kemik doku mühendisliği uygulamaları için alternatif bir yapı olarak kullanılabileceği düşünülmüştür.

Anahtar kelimeler: Bor, yapay vücut sıvısı, mikrodalga, hidroksiapatit, kitosan, 
kemik doku mühendisliği.

Abstract:
This thesis was prepared with the support of TÜBİTAK Project, entitled ?Mikrodalga desteği ile Biyomimetik Hidroksiapatit (HAp)-Bor Katkılı HAp Oluşumu ve Kitosan-HAp Kemik Doku İskelelerinin Geliştirilmesi? with the code number 112M705. The aim of the present study is to produce boron doped hydroxyapatite (B-HAp), which has an osteoinductive property, using biomimetic method supported by different microwave energies and to investigate in-vitro osteogenesis potential of B-HAp coated chitosan (B-HAp/chitosan) scaffolds.
In the first part of the study, different amounts of boric acid was added into 10xSBF (simulated body fluid) and pH was adjusted by using sodium hydroxide to obtain proper pH value for precipitation. B-HAp was produced by means of the interaction of the ions within the boron containing 10xSBF (B-SBF) and microwave energy. Boron incorporation into HAp structure consists of substitution of borate ions with such as phosphate and hydroxyl ions. Experiments were carried out in different microwave powers and exposure times, and optimum conditions for the production of B-HAp were determined by evaluating the results of characterization studies. B-SBF precipitated from 10 mg/mL boric acid (H3BO3) solution by 600 W microwave power has 1.15±0.11 % (w/w) boron, 1.40 (w/w) Ca/P ratio, 4.30±0.07 % (w/w) carbonate content, 30±4 nm rod-like morphology and bone-like amorphous structure.
Chitosan scaffolds, which have approximately 100 ?m pore diameter, were prepared by freeze-drying technique. Then, these scaffolds were coated with B-HAp in the presence of B-SBF and microwave radiation in order to improve their bioactivities and mechanical properties. The formation of apatite layer and the penetration of apatites into the pores were observed morphologically by scanning electron microscopy (SEM). Fourier Transform Infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and X-ray diffraction (XRD) analysis also confirmed the presence of boron doped hydroxyapatite layer. Only hydroxyapatite coated chitosan scaffolds (HAp/chitosan) were also produced by using same conditions to compare the physical properties of the scaffolds. For each B-HAp/chitosan scaffolds; amount of doped boron, swelling ratio and porosity was found to be 20 µg, 28.91±1.41 and 85.7±2.57 %, respectively. It was observed that, B-HAp coating with microwave radiation increased the stability of chitosan scaffolds.
In the last part of the study, boron cytotoxicity on L929 fibroblastic cell line was performed between 9-300 µg/mL boron concentrations. Then, the bioactivity of B-HAp/chitosan scaffolds was investigated by cell culture studies which were carried out with a mouse preosteoblastic cell line, MC3T3-E1, under static conditions. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) assay and morphological examination was done with scanning electron microscopy (SEM). Osteogenic differentiation markers, collagen-I, RunX2, osteocalcin and osteopontin expression levels of the cells were determined using RT-PCR (real time polymerase chain reaction).  Results demonstrated that cells attached, proliferated and differentiated on B-HAp/chitosan scaffolds much more than other scaffolds. 
In conclusion, it was determined that boron enhances proliferation and osteoblastic differentiation of MC3T3-E1 cells and B-HAp/chitosan scaffold could be considered as a potential scaffold for bone tissue engineering applications


Keywords: Boron, simulated body fluid, microwave, hydroxyapatite, chitosan, 
bone tissue engineering.