Dişi köpeklerde kan progesteron hormonu ölçümleri amacıyla radioimmunoassay kiti üretilmesi ve kalibrasyonu
Production and calibration of radioimmunoassay kit for progesterone hormone assay in the bitch
Yazar: SERHAN SERHAT AY
Danışman: PROF.DR. EROL ALAÇAM
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Disi Köpeklerde Kan Progesteron Hormonu Ölçümleri AmacıylaRadioimmunoassay Kiti Üretilmesi ve KalibrasyonuSunulan tez çalısmasının amacı, disi köpeklerin farklı siklik evrelerinde, gebelik ve yalancıgebeliklerinde, progesteron hormonu düzeylerini türe spesifik (KK), insanlarda kullanılan (BK)ve bu çalısma için olusturulan RIA kitleri (SGK) ile arastırarak tanı yönünden uyum, olası farkve benzerlikleri ortaya koymaktır.Bu amaçla çesitli muayene yöntemleri kullanılarak östrus siklunun proöstrus, östrus,diöstrus ve anöstrus dönemlerinde oldukları belirlenen, ayrıca yalancı gebelik ve gebelikbulunan hayvanlardan, her grupta 7 adet olmak üzere toplam 42 adet disi köpekten kanalınmıstır. Ayrıca, çalısma süresince 6 adet erkek Yeni Zelanda tavsanı da antikor üretmekamacıyla kullanılmıstır.Antikor üretmek amacıyla; immunojen olarak ?11a-OH-Hemisuccinate:BSA?, adjuvatolarak Freund's complete ve incomplete adjuvantı kullanılmıstır. mmunizasyon süreci olarakiki hafta aralıklar ile tavsanlara deri altı immunizasyonlar yapılmıstır. Üçüncü enjeksiyondansonra kulak venalarından kan alınmıs ve titre tayinleri yapılmaya baslanmıstır. Titre tayinlerisonucunda bir miktar antikor üretilebildigi ancak baglanma oranı %50'nin altında oldugu için,istenilen duyarlılıkta, karakterde, özgüllükte ve affinitede olmadıgı görülmüstür. Polisterentüpleri antikor ile kaplama islemi için dısarıdan temin edilen ?7a-OH-progesteronhemisuccinate?ve ?6-OH-progesteron-hemisuccinate? iki farklı antikor ve yedi farklı yöntemkullanılmıstır. Ancak, çalısmanın bu sürecinde istenilen düzeyde baglanma saglanamamıstır.Disi köpeklerden toplanan kan serumlarından BK (mmunotech®), KK (mmunotech®)ve SGK kullanılarak progesteron düzeyleri ölçülmüstür. Progesteron ölçümlerine kullanılanBK ve KK ile ölçümler üretici firmanın belirtmis oldugu yönteme göre yapılmıstır. SGK ileölçüm yapabilmek için öncelikle standart aralıgı genisletilmis ve standart noktalar olarak 0ng/ml, 2.5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 80 ng/ml ve 100 ng/ml düzeylerikullanılmıstır. Bu kit ile yapılan ölçümlerde takip eden süreç önceki iki kit ile aynı sekildeyapılmıstır.Beseri kit ile yapılan ölçümlerde elde edilen ortalama degerler su sekildedir. Proöstrusdöneminde 0,83 ng/ml; östrusda 4,91 ng/ml; diöstrusta 29,71 ng/ml; anöstrusta 0,37 ng/ml;yalancı gebelikte 3,01 ng/ml ve gebelikte 22,71 ng/ml. Aynı dönemlerde KK ile yapılanölçümlerde ise sırasıyla 0,65 ng/ml; 6,72 ng/ml; 30,70 ng/ml; 0,15 ng/ml; 3,96 ng/ml ve 25,20ng/ml düzeyleri bulunmustur. SGK ile yapılan ölçümlerde aynı dönemlere ait progesterondüzeyleri ise sırasıyla 0,51 ng/ml; 7,28 ng/ml; 40,78 ng/ml; 0,31 ng/ml; 4,93 ng/ml ve 28,41ng/ml olarak bulunmustur.Ölçümlerden elde edilen sonuçlar degerlendirildiginde; tüm gruplardan her üç kitkullanılarak elde edilen sonuçlar arasında istatistiksel yönden önemli bir farklılıgın olmadıgı(p>0,05) ortaya konmustur. Her siklus döneminin verilerinin elde edildigi test yöntemleri kendiaralarında karsılastırılmıs ve istatistiksel yönden bir fark bulunamamıstır (p>0,05). Kitlerdenelde edilen sonuçların korelasyonu yapıldıgında ise r=0,994 ve 0,998 düzeyinde bir iliskibulunmustur.Sonuç olarak, disi köpeklerde progesteron ölçümü amacıyla türe spesifik kitler yerinebeseri kitlerin saglıklı biçimde kullanılabilecegi kanısına varılmıstır.Anahtar kelimeler: Disi köpek, radioimmunoassay, progesteron kiti

Abstract:
Production and Calibration of Radioimmunoassay Kit for Progesterone HormoneAssay in The BitchThe aim of this study was to investigate blood progesterone levels by using humanprogesterone RIA kit, canine progesterone RIA kit and validaded human progesterone kit indifferent stages of the sexual cycle, pregnancy and pseudopregnancy in the bitch.A total of 42 bitches were used in the study. Dogs were assigned in to six groupsaccording to the reproductive status as follows proestrus (n=7), estrus (n=7), diestrus (n=7),anestrus (n=7), pregnancy (n=7) and pseudopregnancy (n=7). In adition, six male NewZelland rabbits were used in antibody production.11a-OH-Hemisuccinate:BSA and Freund?s complete and incomplete adjuvant wereused as immunogen and adjuvant for antibody production, respectively. Rabbits wereimmunizated by s.c. injections in two week intervals. Following the 3rd injention, bloodsamples were collected via auricular venapuncture and antisera were tested. Although anamount of antibody were obtaind, the binding ratio was < 50% resulting in undesirablesensitivity, spesifity and affinity.Two different antibodies ?7a-OH-progesteron-hemisuccinate? and ?6-OHprogesterone-hemisuccinate: BSA?were used in antibody coating of polysteren tubes.Nonetheless,efficient antibody binding could not been reached. Progesterone levels in bloodsamples of the dogs were measured by human progesterone RIA kit (immunotech®), canineprogesterone RIA kit (immunotech®) and a validated human RIA kit. Measurement madeinstructures with minor modifications to SGK. For that; standart interval was extendedstandart points were set to 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 and 100 ng/ml.Mean values obtained using by human RIA kit were as follows ; proestrus 0.83 ng/ml,estrus 4.91 ng/ml, diestrus 29.71 ng/ml, anestrus 0.37 ng/ml, pseudopregnancy 3.01 ng/mland pregnancy 22.71 ng/ml. Mean values obtained by using canine progesterone kit were0.65 ng/ml; 6,.2 ng/ml; 30.70 ng/ml; 0.15 ng/ml; 3.96 ng/ml and 25.20 ng/ml. Mean valuesobtaind by using validated human RIA kit were 0.51 ng/ml; 7.28 ng/ml; 40.78 ng/ml; 0.31ng/ml; 4.93 ng/ml and 28.41 ng/ml for the same reproductive stages, respectively .There was no statistically important difference between the mean progeterone valuesobtained by using different test kits (p>0.05). The results were correlated at the level of r=0.994 and 0.998.In conclusion, human progesterone RIA kit can be use safely instead of speciesspecific test kits for the blood mesurement in the bitch.Key words: Bitch, radioimmunoassay, progesterone kit.