Süspanse ortamda şap virüsü üretimi için optimum koşulların belirlenmesi
Determination of optimum conditions for the suspension culture of foot and mouth disease virus (FMDV) production
Yazar: GENCAY ERGİN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasının amacı; karıştırmalı biyoreaktörlerde kesikli üretim yöntemiyle, süspanse kültür şap virüsü üretiminde kilit işletim parametrelerinin saptanması, bunların tek başına ve/veya birlikte ürün kalite parametreleri üzerine etki derecelerinin belirlenmesi ve üretim optimizasyonunun yapılmasıdır. Çalışma kapsamında kritik optimizasyon parametrelerinden başlangıç hücre sayısı (BHS), pH, sıcaklık (T), çözünmüş oksijen derişimi (ÇO) ve moi dozu bağımsız değişkenler olarak ele alınmıştır. Sayılan kilit işletim parametrelerinin bağımlı değişkenler olarak belirlenen 146S partikül miktarına ve enfektif titreye (ET) etkilerinin tespiti ve değerlendirilmesi amacıyla Design Expert 7.0 (deneme sürümü) programı ile istatistiksel deney tasarımı gerçekleştirilmiş ve matematiksel modeller geliştirilmiştir.
Sunulan tez çalışması kapsamında 35 L çalışma hacmindeki karıştırıcılı biyoreaktör kullanılmış ve pH ve ÇO seviyeleri Rushton tipi impeller ve halka tarzındaki sparger ile set değerlerinde tutulmuştur. Ayrıca bulanık mantık denetleyici prensibi ile çalışan yazılım vasıtasıyla 2,50x106 hücre/mL hücre sayısı ile başlanan kültürlerde dahi proses etkin şekilde kontrol edilmiştir. Deneyler kesikli üretim yöntemiyle, BHK 21 hücreleri ve O tipi Şap virüsü kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kültür süresince belli zaman aralıklarıyla alınan numunelerde glikoz ve laktat analizleri yapılmıştır.
Design Expert cevap yüzey metodu merkezi kompozit tasarımı ile planlanan deneyler sonunda, her iki bağımlı değişken için program tarafından önerilen kuadratik model düşük p değerine (<0,0001) sahip olup istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. Design Expert tarafından yapılan ANOVA testi sonucunda 146S için pH, BHS, sıcaklık ve pHxBHS, pHxSıcaklık, BHSxSıcaklık, pH'ın karesi ve sıcaklığın karesi terimlerinin; ET için ise pH, BHS, sıcaklık, moi, pH'ın karesi ve sıcaklığın karesi terimlerinin sonuçlara en fazla etkisi olan model terimleri olduğu anlaşılmıştır. Optimizasyon amacıyla 146S ve Enfektif titre değerleri virüs kültürü verimliliği için maksimize edilmiştir.
Deneyler sonucunda ÇO ve moi dozunun çalışılan set değerlerinde 146S verimi üzerinde önemli bir etkisinin olmadığı anlaşılmıştır. ET verimleri için ise 146S sonuçlarından farklı olarak yüksek ET için moi dozu parametresinin önemli bir etken olarak modelde yer aldığı dikkat çekmektedir. Hücre kültürleri için önemli bir parametre olan ÇO miktarının çalışılan aralıkta virüs kültürleri için 146S ve ET sonuçları üzerinde etkisi olmayan bir proses parametresi olduğu görülmüştür. 
Virüs kültürleri sonucunda çalışılan proses parametrelerine bağlı olarak 146S miktarının 1,39 μg/mL ile 3,81 μg/mL arasında ve enfektif titrenin ise 7,18 log pfu/mL ile 9,83 log pfu/mL aralığında değiştiği tespit edilmiştir. 146S miktarı ve enfektif titre değerlerinin proses parametrelerinden pH:7,30, T:35,50°C ve BHS:2,50x106 hücre/mL için en yüksek ve pH:7,60, T:37°C ve BHS:1,50x106 hücre/mL için ise en düşük olduğu görülmüştür.
Design Expert tarafından önerilen deney koşullarının güvenirliğinin tespiti amacıyla pH: 7,22; ÇO:%33O2; BHS:2,42x106 hücre/mL; T:35,44°C ve moi dozu: 0,04 virüs/hücre olarak önerilen optimum deney koşulları ile doğrulama (validasyon) deneyleri yapılmıştır. Doğrulama deneyleri sonucunda 146S miktarı ortalama 2,69±0,06 μg/mL ve ET miktarı ise 8,73±0,11 log pfu/mL elde edilmiştir. Bu değerler ile program tarafından tahmin edilen değerler arasında 146S için % 29, ET için ise 1,29 log fark bulunmuştur.
Doğrulama deneyleri sonunda ortalama özgül glikoz tüketim hızı (qgli) ve ortalama özgül laktat üretim hızının (qlak) sırasıyla 0,438±0,02 μmol/106 hücre.sa ve 0,714±0,03 μmol/106 hücre.sa, olduğu hesaplanmıştır. Glikoz-laktat verim faktörü (YLak/Gli) değerinin 1,63±0,09 (mol laktat/mol glikoz) olduğu görülmüştür.
Çalışmanın sonunda, biyoreaktör işletim parametrelerinin hücre ve virüs arasındaki ilişkiyi tetikleyerek 146S miktarı ve enfektif titre üzerinde önemli etkiler oluşturabildiği ve bu ilişkilerin modellenebildiği görülmüştür. Bu veriler ışığında, virüs kültürü proses parametrelerinin şap aşısı üretiminde karlılığı doğrudan etkileyen önemli faktörler olduğu ortaya çıkmıştır.
Çalışmada elde edilen modelleme ve optimizasyon sonuçları şap virüs üretimi için literatürde bir ilk olup, bu sonuçların aşı üretim tesislerinde proses validasyonu ve optimizasyon çalışmalarında yol gösterici bir örnek olarak kullanılacağı düşünülmektedir.

Abstract:
The purposes of the submitted thesis are the determination of key operational parameters in the suspended culture of foot and mouth disease virus (FMDV) production, the determination of the impact degree of these parameters alone and/or together on product quality and optimization of the production by using a stirred bioreactor working in batch operation mode. 
In the scope of study, among the critical optimization parameters initial cell number (ICN), pH, temperature (T), dissolved oxygen concentration (DO) and moi dose were taken as the independent variables.
For the purpose of determination and evaluation of the impact of the considered key operational parameters on the 146S particles and the infectious titer (ET) which are identified as dependent variables, statistical experimental design has been carried out and mathematical models have been developed by using Design Expert 7.0 software (trial version).
In the scope of thesis, a 35 L working volume bioreactor was used and pH and DO levels were maintained in set value by using Rushton type impeller and ring style sparger. Also, the process was controlled effectively via software running on the principle of fuzzy logic controller even in the culture started with 2,50x106 cell/mL initial cell concentration. Experiments were performed with batch operation mode using BHK 21 cells and O-type FMD virus. Glucose and lactate analysis were also done by using samples taken at certain time intervals during the culture.
After the experiments planned with Design Expert® 7.0. software, surface response method with central composite design, proposed quadratic models for both of the dependent variables had low p values (<0.0001) and were found statistically significant. As a result of ANOVA test done by Design Expert®; it is indicated that the terms of pH, ICN, temperature, pHxICN, pHxTemperature, ICNxTemperature, square of pH and square of temperature for 146S; and the terms of pH, ICN, Temperature, moi, square of pH and square of temperature for infectivity titers have proven to be having most effective terms on the results. For the optimization purposes 146S and infective titer values had been maximized for viral culture productivity.
Experimental results showed that the DO and moi dose have been found not to be a significant impact on 146S yields at the studied set values. It is notable for ET yields that, unlike the results in the 146S results, the moi dose is included in the model as an important factor for high ET values. While the dissolved oxygen concentration is known an important parameter for cell cultures, it was found to be a non-effective process parameter on 146S and ET results for virus culture in the range of study. 
At the end of virus cultures, it has been detected that 146S yields and infective titers were changed in the range of 1.39 to 3.81 mg/mL and 7.18 to 9.83 log pfu/mL respectively, depending on the studied process parameters. 146S yields and infective titers were found to be the highest when the process parameters were pH: 7.30, T:35.50°C and ICN:2,50x106 cells/mL and the lowest when process parameters were pH: 7.60, T:37°C and ICN:1,50x106 cells/mL.
Verification (validation) studies carried out at the optimum experimental conditions proposed by Design Expert as pH:7,22; DO:33% O2, ICN: 2,42x106 cells/mL; T: 35,44 °C and the moi dose: 0,04 virus/cell to determine the reliability of these parameters. At the end of verification experiments 146S yields and infective titers were obtained in average 2,69±0.06 µg/mL and 8,73±0.11 log pfu/mL, respectively. The differences between these values and the values estimated by the program were 29% for 146S and 1.29 log for infective titers.
The average specific glucose consumption rate (qglu) and average specific lactate production rate (qlac) were calculated as 0,438±0.02 µmol/106 cells.h and 0,714±0.03 µmol/106 cells.h, respectively, at the end of verification tests. The glucose-lactate yield factor (YLac/Glu) was found to be 1,63±0,09 (mol lactate/mol glucose).
Eventually, it was seen that the bioreactor operating parameters could create significant effects on 146S yields and infective titers by affecting the relationship between the cells and the viruses and that these relationships could be modelled. In light of these data, virus culture process parameters have emerged as important factors that directly affect the profitability of the FMDV vaccine production.
The modelling and optimization results that obtained in this study is the first in the literature for the production of FMD virus and these results are expected to be used as a guiding example of the process validation and optimization studies in the vaccine production facilities.
Key®