Farklı bitkisel kaynaklardan üretilen kombucha'nınmikrobiyolojik özelliklerinin belirlenmesi ve üründe bulunanprobiyotik mikroorganizmaların tanılanması
Determination of microbiological properties of kombucha producedfrom different plant sources and identification of probioticmicroorganisms found in the product
Yazar: GÜLDEN KILIÇ
Danışman: PROF. DR. İLKİN ŞENGÜN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada, Anadolu alıcı ve ısırgan otu yapraklarının Kombucha içeceği üretiminde kullanımı ve üretilen Kombucha örneklerinden izole edilen asetik asit bakterisi (AAB) ve mayaların probiyotik özelliklerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, Anadolu alıcı (KA), ısırgan otu (KI) ve siyah çay (kontrol grubu-KK) hammadde olarak kullanılarak 12 farklı Kombucha içeceği üretilmiştir. Kombucha örneklerinin mikrobiyolojik [AAB, laktik asit bakterisi (LAB) ve maya sayıları] ve kimyasal (pH, toplam asitlik, °Briks) özellikleri fermentasyon süresince incelenmiş, elde edilen son üründe ve 4℃'de 120 günlük depolama süresince örneklerde ilave bazı fiziksel, kimyasal ve mikrobiyolojik analizler (renk, toplam fenolik ve flavonoid madde, antioksidan ve antimikrobiyal aktivite analizleri) ve duyusal değerlendirmeler yapılmıştır. Çalışmanın bir sonraki aşamasında, Kombucha örneklerinden AAB ve maya izolasyonu yapılmış, elde edilen izolatların biyogüvenlik özellikleri (hemolitik aktivite, antibiyotiklere karşı direnç), zorlu koşullar altında canlı kalabilme özellikleri (düşük pH değerlerinde ve safra tuzu , %0.4 fenol, pepsin ve pankreatin varlığında gelişebilme), teknolojik özellikleri (proteaz, amilaz ve β-Galaktosidaz enzim aktivitesi, farklı tuz konsantrasyonlarında gelişim), antimikrobiyal ve antioksidan aktiviteleri ve in vitro tutunma (otoagregasyon, koagregasyon ve hücre yüzey hidrofobisitesi) özellikleri belirlenmiş, son aşamada ise probiyotik olduğu tespit edilen izolatlar moleküler düzeyde tanılanmıştır. 
Kombucha içeceklerinin fermentasyon süresince AAB ve maya sayıları, KA örneklerinde sırasıyla 3.08-6.15 ve 3.30-6.21 log KOB/mL aralığında, KI örneklerinde sırasıyla 3.74-6.02 ve 3.85-6.85 log KOB/mL aralığında ve KK örneklerinde sırasıyla 3.63-6.13 ve 3.86-6.70 log KOB/mL aralığında belirlenmiştir. Depolamanın sonunda (4℃'de 120 gün), örneklerin AAB ve maya sayılarının genellikle başlangıca kıyasla daha düşük olduğu, bununla birlikte KA ve KI örneklerinin AAB sayılarının KK örneklerine kıyasla daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Örneklerin fermentasyon süresince toplam asitlik, pH ve °Briks değerlerinin sırasıyla 0.90-3.82 g asetik asit/L, 2.73-5.38 pH, 2.83-9.23 °Briks arasında olduğu belirlenirken, depolama süresince bu değerlerin sırasıyla 0.71-4.43 g asetik asit/L, 2.73-3.73 pH, 2.60-8.85 °Briks arasında olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, depolama süresince örneklerin toplam fenolik madde miktarının 445.00-2602.83 mg GAE/L, toplam flavonoid miktarının 55.34-255.16 mg kateşin/L ve antioksidan aktivite değerinin ABTS yöntemine göre %62.50-94.84 ve DPPH yöntemine göre %14.94-93.43 aralığında değiştiği tespit edilmiştir. Ayrıca, örneklerin minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) değerlerinin 15.63 µg/mL ve 125.00 µg/mL aralığında değiştiği ve KI örneklerinin KA ve KK örneklerine kıyasla genellikle test kültürlerine karşı daha yüksek inhibitif etki gösterdiği belirlenmiştir. Duyusal özellikler açısından örneklerin depolama süresince ortanın üzerinde beğeni puanları aldığı belirlenmiş, depolama süresine bağlı olmakla birlikte renk açısından KK örnekleri daha çok beğenilirken, koku, berraklık, tat ve genel beğeni açısından ise KA örnekleri daha çok beğenilen örnekler olmuştur. Sonuç olarak, bu çalışma kapsamında Anadolu alıcı ve ısırgan otu yapraklarının Kombucha üretiminde hammadde olarak başarılı bir şekilde kullanılabileceği belirlenmiştir.
Ayrıca, Kombucha örneklerinden elde edilen 170 adet AAB ve 194 adet maya izolatının probiyotik özellikleri incelenmiş ve biyogüvenlik açısından risk oluşturmayan, zorlu ortam koşullarında yüksek düzeyde canlılık gösteren ve teknolojik özellikler, antimikrobiyal/antioksidan aktivite ve in vitro tutunma özellikleri açısından kabul edilebilir izolatlar moleküler düzeyde tanılanmıştır. Elde edilen sonuçlar, Gluconobacter sp. A21, Komagataeibacter sp. A33, Komagataeibacter sp. A88, Komagataeibacter sp. A139, Gluconobacter sp. A141, Komagataeibacter sp. A146, Komagataeibacter sp. A190, Komagataeibacter sp. A191, Zygosaccharomyces bailii M36, Z. bailii M40, Brettanomyces anomalus M66, B. anomalus M94, B. anomalus M98, B. anomalus M99, B. anomalus M104, B. anomalus M180 ve Pichia kudriavzevii M195 olarak tanılanan izolatların probiyotik kültür olarak değerlendirilebileceğini ortaya koymuştur.

Abstract:
In this study, it was aimed to use Anatolian hawthorn and nettle leaves in the production of Kombucha beverage, and to examine the probiotic properties of the acetic acid bacteria (AAB) and yeasts isolated from Kombucha samples produced. For this aim, twelve different Kombucha beverage was produced by using Anatolian hawthorn (KH), nettle (KN) and black tea (control group-KC) as raw material. Microbiological [AAB, lactic acid bacteria (LAB) and yeast counts] and chemical properties of Kombucha samples were examined during fermentation period, additional physical, chemical and microbiological analyses (color, total phenolic and flavonoid content, antioxidant and antimicrobial activity analyses) and sensory evaluations were also carried out in the final product and during storage at 4ºC for 120 days. In the next stage of the study, AAB and yeast isolation from Kombucha samples were made, the isolates were investigated in terms of biosafety properties (hemolytic activity, resistance to antibiotics), the ability to survive under the harsh conditions (at low pH values and in the presence of bile salts, 0.4% phenol, pepsin and pancreatin), technological properties (protease, amylase and β-Galactosidase enzyme activity, growth at different salt concentrations), antimicrobial and antioxidant activities and in vitro adhesion (autoaggregation, coaggregation and cell surface hydrophobicity) properties, at the final stage, the isolates determined as probiotic were identified at the molecular level.
AAB and yeast counts of Kombucha beverages during fermentation period were determined in the range of 3.08-6.15 and 3.30-6.21 log CFU/mL in KH samples, 3.74-6.02 and 3.85-6.85 log CFU/mL in KN samples, and 3.63-6.13 and 3.86-6.70 log CFU/mL in KC samples, respectively. At the end of the storage (at 4℃ for 120 days), AAB and yeast counts of the samples were generally lower than the beginning, while AAB counts of KH and KN samples were found higher than KC samples. During the fermentation period, total acidity, pH and °Brix values of the samples were determined in the range of 0.90-3.82 g acetic acid/L, 2.73-5.38 pH, 2.60-8.85°Brix, respectively, while these values were detected in the range of 0.71-4.43 g acetic acid/L, 2.73-3.73 pH, 2.60-8.85°Brix, respectively, during the storage times. During storage period, it was determined that the values of the samples were changed in the range of 445.00-2602.83 mg GAE/L for total phenolic content, 55.34-255.16 mg catechin/L for total flavonoid content, 62.50-94.84% according to ABTS method and %14.94-93.43 according to DPPH method for antioxidant activity. Also, it was determined that the minimum inhibitory concentration (MIC) values of the samples varied in the range of 15.63 µg/mL and 125.00 µg/mL and when compared to KH and KC samples, KN samples were generally exhibited higher inhibitory effects against the test cultures. The samples were received medium-above acceptance scores for sensory properties during storage period. Depending on the storage time, KK samples were more preferred samples in terms of color properties, while KA samples were more preferred in terms of aroma, clarity, taste, and general acceptance. As a result, within the scope of this study it was determined that Anatolian hawthorn and nettle leaves can be successfully used as raw materials in Kombucha production. 
Also, the probiotic properties of 170 AAB and 194 yeast isolates obtained from Kombucha samples were examined and isolates with no biosafety risk, high viability in harsh environmental conditions and acceptable in terms of technological properties, antimicrobial/antioxidant activity and in vitro adhesion properties were identified at the molecular level. The results showed that the isolates identified as Gluconobacter sp. A21, Komagataeibacter sp. A33, Komagataeibacter sp. A88, Komagataeibacter sp. A139, Gluconobacter sp. A141, Komagataeibacter sp. A146, Komagataeibacter sp. A190, Komagataeibacter sp. A191, Zygosaccharomyces bailii M36, Z. bailii M40, Brettanomyces anomalus M66, B. anomalus M94, B. anomalus M98, B. anomalus M99, B. anomalus M104, B. anomalus M180 and Pichia kudriavzevii M195 could be evaluated as probiotics.