Anoxybacillus gonensis PDF21 suşunun hücre duvarı litik enziminin optimum sıcaklık, pH ve ısıl kararlılığının iyileştirilmesi
The improvement of optimum temperature, pH and thermal stability of cell wall lytic enzymes from Anoxybacillus gonensis PDF21
Yazar: ESMA CEYLAN
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, Anoxybacillus gonensis PDF21 bakterisinin hücre duvarı litik enzimi (AgCWL) ve aynı enzimin C-terminalinde prolince zengin bir dizi taşıyan rekombinant formu olan AgCWL-Pro, pET-28a(+) vektörüne klonlanarak ekspres edilmiş ve Co+2 afinite kromatografisi ile saflaştırılarak karşılaştırmalı olarak biyokimyasal karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. Baz dizi analizi sonucu 597 bç büyüklüğünde olduğu ve 192 amino asiti kodladığı görülen yaban tip proteine ait genin (AgCWL) nükletotit ve amino asit dizileri NCBI veri tabanına sırası ile KX840343 ve ASW27133 numaraları ile kaydedilmiştir. Biyokimyasal karakterizasyonları sonucu prolince zengin dizinin, AgCWL enziminin optimum sıcaklığını 45°C'den 50°C'ye, optimum pH sını 6,5' dan pH 7'ye yükseltirken, kararlılığı üzerinde önemli bir etkide bulunmadığı belirlenmiştir. Belirli iyonların aktiviteler üzerindeki etkileri incelendiğinde, KCl, LiCl2 ve MnCl2 AgCWL'nin aktivitesini arttırırken, sadece MnCl2 AgCWL-Pro'nun aktivitesini arttırmış, KCl ve LiCl2 ise, AgCWL-Pro'nun aktivitesini etkilememiştir. CaCl2, AgCWL'nin aktivitesini azaltırken, AgCWL-Pro'ninkini ise tamamen inhibe etmiştir. Bu sonuçlara göre prolin kuyruğu aynı zamanda metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine olan etkilerini de değiştirmiştir. Sonuç olarak, C-terminaline takılan prolince zengin kuyruğun, CWL enziminin optimum sıcaklık ve optimum pH özelliklerini iyileştirdiği gözlenmiştir. Ayrıca, bu çalışma ile literatürde ilk defa Anoxybacillus cinsinde hücre duvarı litik enzim ailesine ait bir enzim rekombinant olarak üretilerek, biyokimyasal karakterizasonu gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
In this study, a cell wall lytic enzyme (AgCWL) of Anoxybacillus gonensis PDF21 bacterium and it's recombinant form AgCWL-Pro carrying the proline-rich sequence at the C-terminus of the same gene was generated. Both were cloned into the pET-28a(+) vector and expressed, purfied by Co+2 affinity chromatography for comparative biochemical characterization. The base sequence analysis showed that the result is 597 bç in size and 192 amino acids. The wild-type gene (AgCWL) nucleotide and amino acid sequences were registered with the NCBI database sequence with the accession numbers KX840343 and ASW27133, respectively. Comparative biochemical characterization of the resulting proline-rich tail fusion did not show any significant effect on stability, while raising the optimum temperature of AgCWL enzyme from 45°C to 50°C, optimum pH from 6.5 to pH 7.0 The effects of certain ions on the activity were examined, KCl, LiCl2 and MnCl2 increased the activity of AgCWL-Pro, while MnCl2 increased the activity of AgCWL-Pro only, whereas KCl and LiCl2 did not affect the activity of AgCWL-Pro. While CaCl2 reduced the activity of AgCWL, it completely inhibited AgCWL-Pro. According to these results, proline tag also changed the effect of metal ions on enzyme activity. As a result, it has been observed that attaching the C-terminal proline tail can improve the optimum temperature and optimum pH properties of the enzymes. In this study, for the first time in literature, an enzyme belonging to the cell wall lytic enzyme family, Anoxybacillus, was recombinantly produced and biochemical characterization was carried out.