İzmir Körfezi'nden biyolüminesen bakterilerin izolasyonu, fenotipik ve moleküler karakterizasyonu
Isolation, phenotypic and molecular characterization of bioluminescent bacteria from Izmir bay
Yazar: ESRA ERSOY ÖMEROĞLU
Danışman: PROF. DR. İSMAİL KARABOZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada, İzmir Körfezi'nin biyolüminesen bakteri çeşitliliğini belirlemek amacıyla 15 farklı istasyondan (0-10 metre; iç, orta ve dış körfez) belirli zamanlarda deniz suyu ve sediment örnekleri alınmıştır. Deniz canlılarından biyolüminesen bakterilerin izolasyonu amacıyla ise İzmir Dış Körfezi'nde bulunan Foça-Uzunada arası (67 metre), Uzunada (50-55 metre), Uzunada-Gediz arası (42-44 metre) ve Gülbahçe Körfezi (50-55 metre) örnekleme noktaları olarak belirlenmiş ve bu bölgede bulunan balık ve mürekkep balığı örnekleri alınmıştır. İzolasyon sonrasında 51 biyolüminesen izolat elde edilmiştir.Biyolüminesen özellikli izolatların fenotipik tanılamalarını yapmak amacıyla, koloni morfolojisi, pigmentasyon, çeşitli sıcaklık dereceleri ve farklı NaCl konsantrasyonlarında üreme özellikleri gibi kültürel karakteristikleri, mikroskobik özellikleri, birçok enzim aktivitesini, çeşitli karbon ve azot kaynaklarını kullanma kapasitelerini ve Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS) ortamında üreme özelliklerini içeren biyokimyasal karakteristikleri, biyofilm oluşturma yetenekleri ve 14 farklı antibiyotiğe ve 2 farklı konsantrasyonda vibriostat 0/129 ajanına karşı direnç profilleri belirlenmiştir. Moleküler tanılama aşamasında türe-özgü PCR'ları ve 16S rRNA PCR'ları gerçekleştirilmiş ve baz sırasının belirlenmesiyle tür tanıları yapılmıştır. En son aşama olarak aynı türe ait suşların genetiksel ilişkisinin ortaya çıkarılması amacıyla pulsed-field jel elektroforez (PFGE) tekniği kullanılmış ve yakınlıklar belirlenmiştir.Çalışmanın sonucunda, deniz suyundan 9, sediment örneklerinden 9 ve deniz canlısı örneklerinden 33 biyolüminesen izolat elde edilmiş ve yapılan fenotipik testlerde, hepsinin gram negatif, hareketli, spor oluşturmayan, oksidaz ve katalaz pozitif türler olduğu tespit edilmiştir. Suş farkına bağlı olarak yapılan diğer fenotipik ve biyokimyasal denemelerde farklı sonuçlar elde edilmiştir. Suş, ortam ve inkübasyon süresinin farkına bağlı olarak oluşturulan biyofilm miktarında da değişkenlik olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca tüm izolatların vibriostat 0/129 (150 µg)'a karşı duyarlı olduğu ve genel olarak birçok biyolüminesen suşun novobiosin ve amikasine karşı dirençli iken siprofloksasin, imipenem, kloramfenikol ve tetrasikline karşı tüm suşların oldukça duyarlı olduğu bulunmuştur. Genel olarak tüm biyolüminesen suşların ekstrasellüler enzim aktivitelerinin (proetaz,, jelatinaz, amilaz, lipaz ve esteraz) oldukça fazla olduğu tespit edilmiştir. 16S rRNA baz sırasının belirlenmesi neticesinde biyolüminesen türlerin 20'sinin Vibrio gigantis, 11'nin Shewanella woodyi, 4'ünün Vibrio harveyi, 3'ünün Vibrio crassostreae, 4'ünün Aliivibrio fischeri, 3'ünün Vibrio azureus, 2'sinin Vibrio orientalis, 2'sinin Aliivibrio logei, 1'inin Vibrio lentus ve 1'inin de Photobacterium kishitanii türü olduğu tespit edilmiştir. Oluşturulan PFGE dendogramlarına bağlı olarak türler arasındaki atasal benzerlikler, V.gigantis türlerinde %70-94, S.woodyi türlerinde %67-%89, V.harveyi türlerinde %65-83 ve diğer tanılanan Vibrio ve Aliivibrio türlerinde %69-%97 arasında değişiklik göstermiştir. Bu çalışma Türkiye'de bu konudaki ilk veriler olması açısından önem arz etmektedir.

Abstract:
In this study, with a view to determining bioluminescent bacteria diversity of Izmir Bay, seawater and sediment samples were collected from 15 different stations (0-10 metre; internal, middle and exterior bay) at separate times. So as to isolation of bioluminescent bacteria from the marine lives, Foca-Uzunada (67 metre), Uzunada (50-55 metre), inter Uzunada-Gediz (42-44 metre) and Gulbahce Bay (50-55 metre) in Izmir Bay were designated as points of sampling and fish and squid samples in these regions were received. After isolation, a total of 51 bioluminescent isolates were obtained.On the purpose of phenotypic identification of bioluminescent isolates, cultural characteristics such as colony morphology, pigmentation, growth properties at various temperatures and concentration of NaCl; microscopic features; biochemical properties containing many enzyme activities, capacities of using various carbon and nitrogen sources and characteristics of growth on Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS); abilities of biofilm formation and resistance profiles against 14 different antibiotics and vibriostat 0/129 at 2 distinct concentrations were determined. At the step of molecular identification, their species-specific PCR and 16S rRNA PCR were performed and identification of species was made by means of detection of base sequence. As the last step, pulsed-filed gel electrophoresis technique (PFGE) was used for ascertaining genetical relationship and propinquities were determined.In consequence of study, bioluminescent isolates 9 from seawater, 9 from sediment samples and 33 from the marine lives were obtained and at phenotypic tests performed, it was determined that all bioluminescent isolates were gram negative, motile, non-spore forming, oxidase and catalase positive. Depending on strain variation, different results were acquired from other phenotypic and biochemical assays performed. Based on strain, medium and incubation time, the variation was determined on amount of biofilm formed, too. Furthermore, it was searched out that all isolates were sensitive against vibriostat 0/129 (150 µg) and generally, although many of bioluminescent strains were resistant against novobiocin and amikacin, it was detected that all strains were sensitive against ciprofloxacin, imipenem, chloramphenicol and tetracycline. In general, it was revealed that extracellular enzyme activities (protease, gelatinase, amylase, lipase and esterase) of all bioluminescent strains were quite a lot. As a result of determination of their 16S rRNA base sequences, it was detected that 20, 11, 4, 3, 4, 3, 2, 2, 1 and 1 of bioluminescent species were Vibrio gigantis, Shewanella woodyi, Vibrio harveyi, Vibrio crassostreae, Aliivibrio fischeri, Vibrio azureus, Vibrio orientalis, Aliivibrio logei, Vibrio lentus and Photobacterium kishitanii, respectively. Depending on PFGE dendrograms formed, genetical propinquities among species were showed an alteration between 70-94%, 67-89%, 65-83% and 69-97% within species of V.gigantis, S.woodyi, V.harveyi and other identified Vibrio and Aliivibrio species, respectively. This study is important from the point of the first data from Turkey related to this subject.