Rekombinant bacillus subtilis hücreiçi tepkime sisteminin genom-seviyede araştırılması
Genome-scale investigation of recombinant bacillus subtilis intracellular reaction system
Yazar: PINAR KOCABAŞ
Danışman: PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Doktora tez araştırmasının ilk basamağında B. subtilis'in yeni genom dizin analizi (Belda vd. 2013) ve anotasyonuna dayanan 719 genle ilişkili 1083 tepkime ve 743 metabolitten oluşan üçüncü- nesil genom seviye model (GEM) iBsu1144 oluşturulmuştur. iBsu1144'nin doğruluğu belirlendikten sonra iBsu1144 Kunst vd. (1997) ve Barbe vd.(2009)'nin genom anotasyonlarına dayalı, sırasıyla birinci- ve ikinci- nesil GEM'lerle karşılaştırılmıştır. iBsu1144'nin serin alkali proteaz fermentasyon prosesinin karakteristik üçüncü periyodu için düşük, orta, ve yüksek oksijen aktarım koşullarına (LOT, MOT, ve HOT) ait verilerle (Çalık vd. 1999) işletilerek elde edilen tepkime hızları 102 metabolit ve 133 tepkimeyle oluşturulan BsBRM-1999 (Çalık vd. 1999) modelinin tepkime hızlarıyla karşılaştırılmış; BsBRM-1999 ile farklı akı değerlerine sahip tepkime sayısının en çok MOT, sonra HOT'ta olduğu bulunmuştur. Buna rağmen sonuçlar BsBRM-1999'nin doğru tepkimelerle oluşturulduğunu ve akı analizi için kullanılabilir bilgiler verdiğini; ancak, iBsu1144 ile daha kesin akı sonuçlarıyla birlikte, oluşturulan gen-enzim-tepkime verileriyle metabolik mühendislik tasarımları için güçlü bir bilgi platform oluşturmaktadır. Böylece, akı-değişkenliği analiziyle rekombinant protein üretiminde konak hücre oluşturmak için silinebilecek genler belirlenmiştir. Yeni üçüncü- nesil GEM iBsu1144 kullanılarak bulunan SAP üretimi sonuçları, ikinci- nesil GEM iBsu1103V2 kullanılarak hesaplanan sonuçlarla da kıyaslanmıştır. Doktora çalışmasının ikinci kısmında, konak hücre B. subtilis ile rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH) üretim biyoprosesi için oksijen aktarımının gen ekspresyonları ve tepkime hızlarına etkileri mikrodizin ve akı analizleriyle düşük- (LOT), orta- (MOT), ve yüksek- (HOT) oksijen aktarım koşullarında  biyoprosesin karakteristik üçüncü periyodu için belirlenmiştir. %99.5'den yüksek güven aralığıyla gerçekleştirilen tek yönlü varyans analizi sonucu oksijen aktarımından etkilenen 50 gen birimi belirlenmiştir. Gen ekspresyonları ve akı değerlerinin oksijen aktarımıyla değişimlerinin farklı olduğu yaaE, gdh, ydjL, yisZ, yloI, kbl, pksK, ve mmgD genlerinin metabolik mühendislik hedef genleri olduğu bulunmuştur. Akı-değişkenliği analiziyle rhGH üretiminin MOT koşulunda kapalı-tepkimelerin enzimlerini kodlayan genler konak hücre oluşturmak için hedef konumlar olarak seçilmiştir. Üçüncü- nesil GEM iBsu1144-rhGH'nin birinci- ve ikinci- nesil GEM'ler ile rhGH üretimi için karşılaştırmalı analizleri, iBsu1144-rhGH'nin gen-enzim-tepkime verileriyle birlikte oluşturulması ve bağlantısız tepkimeler içermemesi nedenleriyle doğru sonuçlar ürettiğini transkriptom analizleri destekleyerek göstermiştir. Son olarak ise, rhGH üretiminin MOT koşulunda Period II'den Periyod III'e geçişin transkriptoma ve tepkime hızlarına dinamik etkileri belirlenmiştir.

Abstract:
The third- generation genome-scale model (GEM) iBsu1144 for B.subtilis based on its recent resequencing (Belda et al. 2013) and reannotation was reconstructed. After its validation iBsu1144 linked to 719 genes, 1083 reactions, and 743 metabolites was compared with the first- and second- generation GEMs which were based on the genome annotations of Kunst et al. (1997) and Barbe et al. (2009), respectively. The reaction fluxes were calculated at three oxygen transfer conditions for serine alkaline protease fermentation using iBsu1144 and compared with those of the biochemical-reactions based model, so-called BsBRM-1999, containing 102 metabolites and 133 reactions (Çalık et al. 1999) to make an assessment on the predictive power of the two models. The number of divergent fluxes in BsBRM-1999 are the highest at MOT and then at HOT. Common reactions of the central metabolism shows that BsBRM-1999 was constructed with accurate reactions; therefore, BsBRM-1999 can give reliable information for flux analyses. Nevertheless, more precise and elaborate results obtained with iBsu1144 based on gene-enzyme-reaction data can be used for creative metabolic designs to generate host cells. Further, the reaction fluxes of the central carbon metabolism of the third- generation GEM iBsu1144 were compared with those of the second- generation GEM (Tanaka vd. 2013) for SAP production. In the second part of the thesis, influences of oxygen transfer on the gene expressions and reaction fluxes of rhGH producing B.subtilis were elucidated for the characteristic third period of the fermentation process. Microarray analysis revealed 50 probe sets to be significantly affected by oxygen transfer with one-way analysis of variance with the confidence greater than %99.5. yaaE, gdh, ydjL, yisZ, yloI, kbl, pksK, and mmgD genes which had inconsistent transcriptional and metabolic responses were revealed as metabolic engineering sites. Genes of blocked reactions in Period III at MOT were determined using flux variability analysis, as candidates for deletion to construct improved host cells. The overview of the comparison of the third generation GEM iBsu1144-rhGH with the second and first generation GEM reveals that due to the recent re-sequencing and related annotations, the third- generation GEM, so called iBsu1144-rhGH reports precise results due to the absence of unconnected reactions based on the updated gene-enzyme-reaction data, supported by transcriptome data. Lastly the effects of transition from Period II to Period III on the transcriptome and reaction fluxes of rhGH producing B.subtilis were evaluated at MOT.