Lösemilerdeki füzyon genlerinin taranmasına yönelik yeni nesil dizileme panellerinin geliştirilmesi
Development of next generation sequencing panels for screening fusion genes in leukemia
Yazar: SADIK ÇİĞDEM
Danışman: DOÇ. DR. EMRE KESKİN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Hematolojik malignitelerin tanısı sitolojik, sitogenetik ve moleküler genetik analizleri içeren multidisipliner yaklaşımlara dayanır. Kanser genomiğindeki ilerlemeler çeşitli kanserlerde belirgin prognostik değere sahip tekrarlayan mutasyonların tanımlanmasını sağlamıştır. Şimdiye kadar akut lösemilerde kromozomal yeniden düzenlemeler sonucu oluşan yüzlerce füzyon gen tespit edilmiştir. Lösemilerdeki bu tür mutasyonların test edilmesi kişiselleştirilmiş tedaviler için zorunludur. Geleneksel klinik tanıda kullanılan birçok yöntem füzyon genleri tam olarak saptayamamaktadır. Mevcut teknik sınırlamaların üstesinden gelmek için bu çalışmada hedefe yönelik yeni nesil dizileme yaklaşımı test edildi. Füzyon genlerin birleşme noktalarını içeren bölgelerin multipleks PZR bazlı paneller ile oluşturulan kütüphaneleri Illumina platformu kullanılarak dizilendikten sonra biyoinformatik yaklaşımlarla analiz edildi. 20 adet KMT2A füzyon transkripti için uyarlanmış AmpliSeq (Illumina) füzyon paneli ile bu füzyon transkriptleri taklit eden DNA parçaları kullanılarak yapılan mPZR ile 19 amplikon oluşturulabildi. NGS işlemleri ve biyoinformatik analizlerle 17 amplikon için belirgin bir sonuç alınırken, geriye kalan 3 tanesi için az sayıda füzyon olayını kesin bir şekilde tanımlayan bağlantı okumaları elde edildi. Yapılan titrasyon çalışmalarında, füzyon panelin 1 pg kadar eser miktarlardaki kalıp DNA parçalarını tespit edebildiği gösterildi. Bu sonuçlar, füzyon panelin klinik örnekler üzerinde denendikten sonra, kapsamındaki füzyon transkriptler için klinik tanıda kullanılabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Diagnosis of hematologic malignancies is based on multidisciplinary approaches including cytological, cytogenetic, and molecular genetic analyzes. Advances in cancer genomics have enabled the identification of recurrent mutations with the apparent prognostic value for various cancers. To date, hundreds of fusion genes resulting from chromosomal rearrangements have been identified in acute leukemia. Testing such mutations in leukemias is essential for personalized treatments. Many methods used in conventional clinical diagnosis could not fully detect fusion genes. To overcome the limitations of existing techniques, targeted next generation sequencing approach was tested in this study. The libraries of the regions containing the junctions of the fusion genes, formed by multiplex PCR-based panels, was deep-sequenced using Illumina platform, thereafter the results were analyzed by bioinformatics approaches. Using AmpliSeq (Illumina) fusion panel adapted for 20 KMT2A fusion transcripts and DNA fragments mimicking these fusion transcripts, 19 amplicons could be obtained with mPZR. With NGS procedures and bioinformatics analyses, significant results were obtained for 17 amplicons, while few junction reads that precisely describe the fusion event were obtained for the remaining 3. In titration studies, it was shown that the fusion panel can detect the template DNA fragments in trace amounts up to 1 pg. These results show that the fusion panel can be used in clinical diagnosis for the fusion transcripts in its scope, after testing on clinical specimens.