Hepatosellüler karsinom hücre hattında n-asetilgalaktozamin ile konjuge oligonükleotit aracılı abcb1-mdr1 gen ifadesinin baskılanmasının in vitro araştırılması
In vitro investigation of n-acetylgalactosamine conjugated oligonucleotide mediated suppression of ABCB1-MDR1 gene expression in hepatocellular carcinoma cell line
Yazar: BURCU HASTÜRK
Danışman: PROF. DR. FATİH EREN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: DNA-antisense = DNA-antisense ; Hepatoselüler karsinom = Hepatocellular carcinoma ; İlaç dağıtım sistemleri = Drug delivery systems

Özet:
Amaç: İleri evre hepatosellüler karsinom (HCC) tedavisinin önündeki engellerden birisi olarak kabul edilen kanser-çoklu ilaç direncinden (MDR), özellikle sorumlu tutulan ABCB1-MDR1 geninin aşırı ekspresyonunun N-asetilgalaktozamin (GalNAc) konjuge antisens oligonükleotitler (ASOs) ile baskılanması amaçlanmaktadır.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada, ABCB1-MDR1 mRNA'sını hedefleyen üç (GalNAc-ASO1, GalNAc-ASO2, ve GalNAc-ASO3) ve bir negatif kontrol (GalNAc-ASO4) ASO dizileri tasarlandı. Tasarlanan ASO'ların inhibitör etkinliği hesaplamalı yöntemlerden faydalanarak değerlendirildi. ASO dizilerinin 5′ ucuna GalNAc C3 fosforamit ligandı ve DNA omurgasına fosforotiyoat (PS/PTO) modifikasyonları eklendi. HepG2 hücrelerine farklı dozlarda GalNAc-ASO konjugatları uygulandı. GalNAc-ASO konjugatlarının inhibitör etkisini değerlendirmek için ABCB1-MDR1'in gen ekspresyonu ve protein düzeyi, sırasıyla, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve western blot yöntemleri ile ölçüldü. GalNAc-ASO4 konsantrasyonlarının HepG2 üzerindeki hücre canlılık analizleri kolorimetrik (MTT) ve florometrik (resazurin) yöntemler ile değerlendirildi.
Bulgular: HepG2 hücrelerine uygulanan GalNAc-ASO4 konsantrasyonlarının (0,625 μM, 1,125 μM, 2,5 μM, 5 μM, 10 μM ve 20 μM), 144 saate kadar MTT ve resazurin testlerine göre hücre canlılığı üzerine sitotoksik etkisi bulunmamaktadır. HepG2 hücrelerinde, 20 μM GalNAc-ASO konsantrasyonlarının, tedavi edilmemiş kontrol grubuna göre 24, 48 ve 72 saat sonra ABCB1-MDR1 gen ekspresyonunu azaltan istatistiksel anlamlı etkisi bulunmaktadır. GalNAc-ASO konsantrasyonlarının, 72 saat sonra ABCB1-MDR1 protein ekspresyonunu istatistiksel olarak azalttığı western blot ile gösterilmiştir. GalNAc-ASO4'ün ise ABCB1-MDR1'in ekspresyonunu etkilemediği gösterilmiştir.
Sonuç: Hepatosit hücrelerindeki asialoglikoprotein reseptörlerine (ASGP-Rs) bağlanarak karaciğeri spesifik olarak hedefleyen GalNAc ligandı ile konjuge ASO'ların, hücrelere gimnotik iletimi sayesinde ABCB1-MDR1 genini inhibe ederek, anti-kanser tedavilerin etkisini arttırabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Objective: The aim is to suppress the overexpression of the ABCB1-MDR1 gene, which is responsible for cancer-multidrug resistance (MDR), a significant challenge in the treatment of advanced hepatocellular carcinoma (HCC), through the utilization of N-acetylgalactosamine (GalNAc)-conjugated antisense oligonucleotides (ASOs).
Materials and Methods: In this study, ASO sequences (GalNAc-ASO1, GalNAc-ASO2, and GalNAc-ASO3) were designed and evaluated for their inhibitory activity against ABCB1-MDR1 mRNA using computational methods. The ASO sequences were modified with a GalNAc C3 phosphoramide ligand and phosphorothioate (PS/PTO) modifications to the DNA backbone at the 5′ end. HepG2 cells were treated with varying doses of GalNAc-ASO conjugates, and the results were analyzed. To evaluate the inhibitory effect of GalNAc-ASO conjugates, the gene expression and protein levels of ABCB1-MDR1 were measured using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and western blot methods, respectively. The effect of different concentrations of a negative control (GalNAc-ASO4) on HepG2 cell viability was assessed using colorimetric (MTT) and fluorometric (resazurin) methods.
Results: The study found that treatment with GalNAc-ASO4 concentrations (0,625 μM, 1,125 μM, 2,5 μM, 5 μM, 10 μM, and 20 μM) did not affect the cell viability of HepG2 for up to 144 hours, as determined by MTT and resazurin assays. However, in HepG2 cells, 20 μM GalNAc-ASOs concentrations resulted in a decrease in ABCB1-MDR1 gene expression after 24, 48, and 72 hours compared to the untreated control group. Additionally, the study found that GalNAc-ASO concentrations decreased ABCB1-MDR1 protein expression after 72 hours, as determined by western blot analysis. GalNAc-ASO4 did not affect ABCB1-MDR1 expression.
Conclusion: By inhibiting the ABCB1-MDR1 gene through gimnotic delivery to cells, ASOs conjugated with the GalNAc ligand, which binds to asialoglycoprotein receptors (ASGP-Rs) in hepatocyte cells and specifically targets the liver, are considered to enhance the effectiveness of anti-cancer therapy.