Pichia pastoris etanol metabolizması üzerine çalışmalar
Studies on Pichia pastoris ethanol metabolism
Yazar: MERT KARAOĞLAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Pichia pastoris, biyoteknoloji, ilaç endüstrisi ve akademik araştırmacılar tarafından rekombinant protein üretimi kullanılan bir ekspresyon sistemidir. P. pastoris, bakteriler gibi, tek karbon kaynağı olarak metanol, glukoz, gliserol veya etanol içeren ucuz besiyerlerinde hızla gelişme gösterebilmektedir. Ayrıca, insanlar gibi, ökaryotik bir organizmadır ve böylece hücre içi ortamı ökaryotik proteinlerin katlanması bakterilere göre daha uygundur. Buna ilaveten proteolitik işlemler, disülfit köprüsü oluşumu ve glukozilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonları gerçekleştirme yeteneğine sahiptir.

Son zamanlarda, iki akademik araştırma laboratuvarı tarafından, iki farklı P. pastoris suşunun genom sekansı belirlenmiştir. P. pastoris GS115 genom sekansında ADH3 geni ile yapılan homoloji analizi, etanol metabolizmasında rol oynayan altı muhtemel ADH genini ortaya koymuştur. Literatürde bu genlerin hiçbiri üzerine moleküler düzeyde çalışmaya rastlanmamıştır.

Bu çalışmada, P. pastoris etanol metabolizmasında rol oynadığı düşünülen ADH3 geni inaktif edilerek, glukoz ve etanol içeren minimal besiyerinde üreme davranışları izlenmiştir. ADH3 mutant suşunun etanol içeren besiyerinde üremediği ancak glukoz içeren besiyerinde hala etanol ürettiği tespit edilmiştir. Sonuçlar, ADH3 geninin etanolün tüketiminden sorumlu tek gen olduğunu göstermiştir. Çalışmalara etanol üretiminden sorumlu olması muhtemel beş gen ile devam edilmiştir. Glukoz ve etanolde geliştirilen yabani suş ve adh3 suşunda bu muhtemel genlerin qRT-PCR metodu ile gen ekspresyon seviyesine bakılmış ve öne çıkan üç gen ile çalışmalara devam edilmiştir (adhI, adhII ve adhV). Bu genlerin zeosin antibiyotik dayanıklılık geni kullanılarak adh3 suşunda ikili mutantları elde edilmiştir. Elde edilen suşlar glukoz içeren minimal besiyerinde geliştirilerek etanol üretme yetenekleri test edilmiş ve etanol üretiminden sorumlu olan gen adhII olarak tespit edilmiştir. Tespit edilen gen ADH2 olarak isimlendirilmiştir. ADH2 geni karakterizasyonu için yapılan analizler sonucu, ADH2 geninin P. pastoris etanol metabolizmasında etanol üretiminden sorumlu majör gen olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, ADH2 geninin inaktif olduğu suşta etanol üretiminde ADH3 geninin de minör rol oynadığı tespit edilmiştir. Buna ilaveten, ADH3 ve ADH2 promotorları ile erlenmayer ve fementör ortamında rekombinant ksilanaz üretimi denemeleri yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar, ADH3 promotorunun fermentör ölçeğinde rekombinant protein üretimi için AOX1 ve GAP promotorlarına alternatif bir promotor olarak kullanılabilineceğini göstermiştir.
ANAHTAR KELİMELER: Pichia pastoris, Alkol dehidrogenaz, Etanol metabolizması, Ksilanaz, Fermentasyon, Rekombinant protein üretimi

Abstract:
Pichia pastoris is an expression system for the production of recombinant proteins used by the biotechnology and pharmaceutical industries and by academic researchers. Like bacteria, P. pastoris grows rapidly on inexpensive media containing methanol, glucose, glycerol or ethanol as a sole carbon source. Furthermore, like humans, it is also a eukaryotic organism with a subcellular environment more conducive to the folding of eukaryotic proteins and with an ability to perform post-translational modifications such as proteolytic processing, disulfide bridge formation and glycosylation.

Recently, the genomes of two different strains of P. pastoris have been sequenced by two academic research laboratories. Six possible genes that might play role in ethanol metabolism was identified based on the homology to ADH3 gene. In literature, none of them has been studied at the molecular level.

In this study,  ADH3 gene thought to be involved in P. pastoris ethanol metabolism was inactivated and growth characteristics were monitored in minimal medium containing glucose and ethanol. It was determined that ADH3 mutant strain failed to grow on ethanol, but it was able to produced ethanol in minimal medium containing glucose. This showed that the ADH3 gene is the only gene responsible for ethanol consumption. Thus, studies proceeded with five possible ADH genes. Expression levels of these genes in wild-type and adh3 strain on glucose and ethanol medium were analyzed by qRT-PCR method, and three possible ADH genes (adhI, adhII and adhV) were further studied. These genes were inactivated by zeocin resistance gene in adh3 strain, and double knock-out mutants were generated. The mutant strains were tested for their ability to produce ethanol on minimal medium containing glucose. The gene responsible for production of ethanol was determined and named as ADH2. Studies on characterization of ADH2 showed that ADH2 is major gene responsible for ethanol production. Also it was determined that ADH3 gene plays minor role in ethanol production in case ADH2 is inactive. Furthermore, the recombinant xylanase production under control of the ADH3 and ADH2 promoters was tested in shake-flask and fermenter conditions. The xylanase production yield with the ADH3 promoter was higher than that of the AOX1 and GAP promoter at fermentor scale. These results showed that the ADH3 promoter can be utilized to produce recombinant proteins at large scale as an alternative to the AOX1 and GAP promoters.
KEYWORDS: Pichia pastoris, Alcohol Dehydrogenase, Ethanol metabolism, Xylanase, Fermentation, Recombinant protein production