Pseudomonas fluorescens hücrelerini temel alan I. ve II. nesil biyosensörlerin geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Mediated and non-mediated microbial sensors based on pseudomonas fluorescens cells
Yazar: FATMA YENİ
Danışman: DOÇ. DR. SUNA TİMUR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biyosensörler = Biosensors

Özet:
Bu tez projesi kapsamında I. ve II. nesil mikrobiyal biyosensör sistemleri tasarlandı. Gram negatif bakteri olan Pseudomonas fluorescens hücreleri fiziksel adsorbsiyon ile yumurta kabuğu membranına immobilize edildi. Glukozun substrat olarak kullanılmasıyla biyosensör sistemleri optimize edilerek, analitik karakterizasyonları gerçekleştirildi.I. nesil biyosensöre ilişkin, en ideal hücre miktarı 7,02×109 hücre/ml, optimum pH 7,0 ve optimize edilen koşullarda glukoz için doğrusal tayin aralığı 5µM-25µM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde 10 µM glukoz için (n=5) standart sapma (S.D) ± 0,405 µM ve varyasyon katsayısı (cv) % 4,09 olarak bulundu. Operasyonel kararlılığının belirlenmesi amacıyla 4 saat boyunca 30 dakika aralıklarla ölçümler alındı ve biyosensör cevabının sadece % 7 oranında azaldığı gözlendi. Biyosensörün substrat spesifikliği ayrıca incelendi.II. nesil biyosensör sistemleri için medyatör olarak potasyum hegzasiyanoferrat (III), (HCF) ve ferrosen kullanıldı. Daha önce I. nesil biyosensör sistemi için bulunan optimum hücre miktarı (7,02×109 hücre/ml) ve optimum tampon sistemi (pH 7,0, 50 mM'lık potasyum fosfat tamponu) kullanılarak, en yüksek sensör cevabı veren medyatör miktarları araştırıldı. Glukoz için doğrusal tayin aralıkları ferrosen medyatörlü biyosensör sistemi için 60 µM - 750 µM, HCF medyatörlü biyosensör sistemi için ise 10 µM - 40 µM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde (n=5) ferrosen için 250 µM, HCF için 25 µM glukoz standart çözeltisi kullanıldı. Ferrosen medyatörlü biyosensör için standart sapma (S.D) ± 10,18 µM ve varyasyon katsayısı (cv) % 4,57, HCF medyatörlü için ise ± 1,004 µM ve %3,99 olarak hesaplandı. Operasyonel kararlılığının belirlenmesi amacıyla 4 saat boyunca 30 dakika aralıklarla alınan ölçümler sonucunda, ferrosen kullanılan biyosensör için % 24, HCF medyatörlü biyosensör için ise sadece % 3 oranında aktivite kaybı olduğu gözlendi. Substrat spesifiklikleri medyatörlü sistemler için ayrıca incelendi.

Abstract:
In this project, mediated and non-mediated microbial biosensors were designed. Pseudomonas fluorescens which are gram negative bacterium were immobilized on to the eggshell membrane via physical adsorption. Optimization and characterization studies were carried out by glucose substrate.According to the optimization studies, for the non-mediated system, optimum cell amount and pH were found to be as 7.02×109 cell/ml and 7.0. Under these conditions, linearity for the glucose was in the range of 5 µM and 25µM. As for the repeatability, 5 subsequent measurements were taken for 10 µM glucose. Standard deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) were calculated as ± 0.405 µM and 4.09 %. For the operational stability, sensor responses were followed during 4 hours in 30 minutes intervals and only 7 % drop was observed at the end of this period. Substrate specifity of the proposed syetem was also investigated.In the second part, Potassium hexacyanoferrate III (HCF) and ferrocene mediated microbial sensors were developed and at the first, the effect of mediator amounts on the sensor response were investigated by using glucose as the substrate. In these studies biosensors with the optimum cell amount (7.02×109 cell/ml) detected for non-mediated system and potassium phosphate buffer (pH 7.0, 50 mM) were used. The lineer detection ranges of glucose were found in the range of 10 µM and 40 µM and 60 µM and 750 µM for ferrocene and HCF mediated systems, respectively. Moreover, Standart deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) values were calculated as 250 µM ± 10.18 µM and 4.57 % 25 µM ± 1.004 µM and 3.99% for ferrocene and HCF mediated biosensors. Operational stability experiments were done as mentioned before for both types of mediated biosensors, while 24 % decrease was obtaining for ferrocene mediated biosensor, only 3 % drop was found for HCF mediated system. Substrate specifities were also investigated for both types of biosensors.