Fertilizasyon sonrası farklı zamanlarda yapılan gen enjeksiyonlarının transgenik koyun embriyosu üretimine etkisi
Effect of gene injection at different timing after fertilization on transgenic sheep embryo production
Yazar: NUR ERSOY
Danışman: PROF. DR. MİTHAT EVECEN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​ / Dölerme ve Suni Tohumlama Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Embriyo = Embryo ; Fertilizasyon = Fertilization ; Genetik = Genetics ; Genetiği değiştirilmiş organizmalar = Genetically modified organisms ; Genler = Genes ; Hayvanlar-transgenik = Animals-transgenic ; Koyunlar = Sheep ; Mikroenjeksiyonlar = Microinjections ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Transgenezis çalışmalarında en başarılı yöntemler uygulansa dahi, embriyoya verilen genin sitoplazmada yıkımlanma ve genoma entegre olmamama ihtimali her zaman vardır ve bu durum hücre içi biyolojik süreçlere bağlı olarak zamanlamadan etkilenmektedir. Çalışmada, transgenik koyun embriyosu üretimi esnasında farklı saatlerde elde edilen sonuçlar karşılaştırılarak, en uygun gen enjeksiyon saatini bulmak amaçlanmıştır. Bu amaçla, fertilizasyonun ardından pronüklear gelişimin ve DNA singami mekanizmalarının farklı gelişim evreleri hedeflenerek; 3., 5., 7. ve 9. saatlerde koyun zigotlarına intrasitoplazmik mikroenjeksiyon yöntemiyle, 10 μg/μL dozunda ayarlanmış Green Flöresans Protein gen (pEGFPN1) enjeksiyonu yapılmış ve hücreler in vitro kültüre edilmiştir. Kültürün 8. gününde subjektif olarak mikroskop altında kontrol edilen hücreler; gelişim aşaması ve parlama oranları üzerinden farklı saatlerde yapılan gen enjeksiyonlarının etkinliği değerlendirilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, flöresans parlama gösteren hücre (transgenik embriyo) oranları yönünden gruplar arasında istatistiki bir fark bulunmamıştır (P>0,01). Enjeksiyon gruplarındaki embriyoların parlama oranı ortalamaları karşılaştırıldığında; 7. Saat enjeksiyon grubunun parlama oranı ortalaması diğer gruplardan istatistiki olarak önemli düzeyde düşük bulunmuştur (P<0,05). En yüksek yarıklanma oranları 3. saat enjeksiyon grubunda bulunmuş (P>0,01), bununla birlikte en yüksek dejenerasyon ve lize hücre oranı da yine 3. saat grubunda gözlenmiştir (P<0,01). Bunun yanısıra, blastosiste ulaşma açısından gruplar arasında istatistiki bir fark bulunmamıştır (P>0,05). Sonuç olarak; koyunlarda embriyolarında gerçekleştirilecek gen enjeksiyonu çalışmalarında erken saatlerin kullanılabilecek olmasıyla beraber, fertilizasyon sonrası 3. ila 9. saatler arasında, zaman kısıtlaması olmaksızın enjeksiyonlara güvenle devam edilebileceği söylenebilir.

Abstract:
Even if the most successful methods are applied in transgenesis studies, there is always the possibility that the gene given to the embryo will be destroyed in the cytoplasm and not integrated into the genome, and this situation is affected by timing depending on intracellular biological processes. In the study, it was aimed to find the most appropriate intracytoplasmic gene injection time by comparing the results obtained at different times after fertilization in the production of transgenic sheep embryos. For this purpose, by targeting different developmental stages of pronuclear development and DNA syngamy mechanisms; 10 μg/μL of Green Fluorescence Protein gene (pEGFPN1) was injected into sheep zygotes at 3rd, 5th, 7th and 9th hours after fertilization by intracytoplasmic microinjection method and the development of embryos was evaluated in vitro. Embryos were checked under the invert microscope subjectively on day 8 of culture; the effectiveness of gene injections made at different times were evaluated over the developmental stage and glow rates under fluorescent light. According to the results obtained, there was no statistical difference between the groups in terms of the rates of cells showing glowing (transgenic embryos) (P>0.01). When the mean glow rate of the groups were compared, the mean glow rate of the 7th hour injection group was statistically significantly lower than the other groups (P<0.05). The highest cleavage rates were found in the 3rd hour injection group (P>0.01), while the highest rate of degeneration and lysed cells were also observed in the 3rd hour group (P<0.01). In addition, there was no statistical difference between the groups in terms of reaching the blastocyst stage (P>0.05). As a result; it was concluded that the gene injection procedure can be started as early as 3rd hours after fertilization in sheep embryos and injections can be usefully continued from 3rd to 9th hours without time restrictions.