Moleküler mikrobiyolojik tanı testlerinde kullanım için kağıt bazlı hızlı nükleik asit izolasyon yönteminin geliştirilmesi ve validasyonu
Development and validation of paper based rapid nucleic acidisolation method for use in molecular microbiologicaldiagnostic tests
Yazar: ESRANUR TÜRK
Danışman: DOÇ. DR. MERT AHMET KUŞKUCU
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Nükleik asit izolasyonu ve amplifikasyonu; günümüzde bilim, sağlık, endüstri ve daha birçok alanda yaygın olarak kullanılmaktadır. Sağlık alanında nükleik asit izolasyonu ve amplifikasyonu tanı için oldukça önemlidir. Tanıda kullanılan moleküler tabanlı yöntemler için ilk basamak nükleik asidin saflaştırılmasıdır. Bu basamak kapsamlı ekipman, donanımlı laboratuvar ve deneyimli eleman gerektirmektedir. Bu durum özellikle Hasta Başı Testlerin (HBT) uygulanmasını sınırlamaktadır. Bu nedenle nükleik asit izolasyonunu hızlı, basit, ekipmansız ve düşük maliyetli gerçekleştirmek önem kazanmıştır.  
Bu Yüksek Lisans çalışmasında, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa suşlarından ve hastalardan SARS-CoV-2 testi için alınan sürüntü örnekleri kullanılmıştır. Örneklerin nükleik asit izolasyonu için özel liziz solüsyonu, yıkama solüsyonu ve parafin mum kaplı Whatman® No. 1 filtre kağıdı kullanılmıştır. İzole edilen nükleik asitlerin hedef bölgeleri Gerçek-Zamanlı Polimereaz Zincir Reaksiyonu (Real-Time PCR) ile çoğaltılmıştır. Real-Time PCR sonucunda Eşik Değer Döngüsü (CT) değerleri incelenmiştir. Stabiliteyi görmek için çalışmalar farklı günlerde birden fazla kez denenmiştir.  SARS-CoV-2 hasta sürüntü örneklerinde sonuçlar GenMark geneMAPTM 2019-nCov kiti ile benzer sonuçlar vermiştir. Mikropipet kullanılan ile mum kaplanmış kağıt çubuk kullanılan çalışmada CT değerleri neredeyse aynıdır. Virüsler için kağıt bazlı nükleik asit izolasyon yöntemi daha valide görülmüştür. Bakteriler için yapılan kağıt bazlı nükleik asit izolasyon yöntemi tam valide görülmese de anlamlı sonuçlar elde edilmiştir. Bakteriler için en iyi CT değerleri Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae'de görülmüştür.
Bu çalışmada kağıt bazlı hızlı nükleik asit izolasyon yönteminin validasyonu ve geliştirilmesi için çalışmalar yapılmış ve anlamlı sonuçlar elde edilmiştir. Fakat Hasta Başı Testler gibi hızlı sonuç gerektiren noktalarda ve rutin laboratuvarda kullanılması için daha çok çalışmaya gerek duyulmaktadır. Kağıt bazlı hızlı nükleik asit izolasyon yöntemi gelecek için umut vadedicidir.

Abstract:
Nucleic acid isolation and amplification is widely used in science, health, industry and many other fields. In the healthcare field, nucleic acid isolation and amplification are very important for diagnosis. The first step for molecular based methods used in diagnosis is the purification of nucleic acid. This step requires extensive equipment, well equipment laboratory and experienced staff. This situation especially limits the application of Point-of-Care tests (PoC). Therefore, it has bacome important to perform nucleic acid isolation quicly, simply, without equipment and at low cost.
In this master's study, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa strains and swab samples taken from patients for SARS-CoV-2 test were used. Special lysis solution, washing solution and paraffin wax coated Whatman® No. 1 filter paper were used for nucleic acid isolation. The target regions of the isolated nucleic acids were amplified by Real-Time Polymerease Chain Reaction (Real-Time PCR). Threshold Value Cycle (CT) values were analysed as a result of Real-Time PCR. Studies were run multiple times on different days to see the stability.
In SARS-CoV-2 patient swab samples, the results were similar to the GenMark geneMAPTM 2019-nCov kit. CT values were almost identical for the micropipette and wax-coated paper swab. For viruses, the paper-based nucleic acid isolation method was more validated. Although the paper-based nucleic acid isolation method for bacteria was not fully validated, significant results were obtained. The best CT values for bacteria were observed in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae.
In this study, studies were carried out for the validation and development of a paper-based rapid nucleic acid isolation method and significant results were obtained. However, more studies are needed for its use in routine laboratory and at points requiring rapid results such as Point-of-Care. Paper-based rapid nucleic acid isolation method is promising for the future.