Azurinin Lactococcus lactis'te rekombinant üretimi, antimikrobiyal ve sitotoksik etkisinin araştırılması
Recombinant production of azurin in Lactococcus lactis, investigation of its antimicrobial and cytotoxic effects
Yazar: MELİKE YILDIZ
Danışman: DOÇ. DR. HAKAN AŞKIN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Son zamanlarda mikrobiyal temelli kanser tedavisi konusunda canlı bakterilerin veya bakteriyel ürünlerin incelenmesi ve geliştirilmesinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Pseudomonas aeruginosa tarafından üretilen azurin, antikanser özelliğe sahip bakteriyel bir proteindir. Bu çalışmada nisin kontrollü gen ekspresyon (NICE) sistemi kullanılarak azurin proteininin rekombinant üretimi amaçlandı. Ayrıca hücre lizatındaki veya kültür süpernatantındaki rekombinant azurinin antimikrobiyal ve sitotoksik özelliği araştırıldı. P. aeruginosa genomik DNA'sı kullanılarak PCR ile çoğaltılan azurin geni, pNZ8149 vektörüne yerleştirildi. Elde edilen muhtemel rekombinant DNA, elektroporasyon ile gıdada kullanılabilir Lactococcus lactis NZ3900 suşuna transforme edildi. Farklı nisin konsantrasyonları ile üç saat indüksiyon sonrasında rekombinant protein üretimi Western blot analiziyle doğrulandı ve optimum nisin konsantrasyonu 1 ng/ml olarak belirlendi. Bu rekombinant azurinin kuyu difüzyon metoduyla Escherichia coli, Bacillus cereus, Saccharomyces cerevisiae ve Aspergillus niger için antimikrobiyal etkisi araştırıldı. Sadece azurin içeren liyofilize kültür süpernatantının belli konsantrasyonlarında E. coli ve B. cereus için inhibisyon zonu gözlendi. MTT analiz sonuçlarına göre HUVEC, HT29, HCT116 ve MCF7 hücre hatlarına azurin içeren ve içermeyen liyofilize kültür süpernatantları uygulandığında artan konsantrasyon ile birlikte hücre canlılığında azalış belirlendi. Ancak azurin içeren süpernatantların azurin içermeyen süpernatantlardan daha fazla antiproliferatif etki gösterdiği bulundu. Yapılan bu çalışma, gıdada kullanılabilir L. lactis suşunda rekombinant azurini üretmek için uygulanabilir bir yöntem sunmaktadır. Sonuç olarak antikanser özelliğe sahip azurin proteini üretebilen gıdada kullanılabilir L. lactis suşunun tedavi edici bir probiyotik olarak araştırmalarda kullanılabileceğini ve belirli dozlarda E. coli ve B. cereus bakterilerine karşı antibakteriyal özelliğinin belirlenmesi, bu suşun gıdaların muhafazasında yararlı olabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Significant progress has been reported recently in the investigation and development of live bacteria or bacterial products for microbial-based cancer therapy. Azurin produced by Pseudomonas aeruginosa is a bacterial protein with an anticancer property. In this study, recombinant production of azurin protein was aimed using Nisin Controlled Gene Expression (NICE) System. In addition, the antimicrobial and cytotoxic properties of recombinant azurin in the cell lysate or culture supernatant were investigated. The amplified azurin gene using genomic DNA of P. aeruginosa was inserted into the pNZ8149 vector and the resulting probable recombinant DNA was transformed into food grade L. lactis NZ3900 by electroporation. After induction with different concentrations of nisin for 3 h, recombinant protein production was confirmed by Western blot analysis and it was determined that the optimum concentration of nisin was 1 ng/ml. The antimicrobial effect of this recombinant azurin was investigated using well diffusion method for Escherichia coli, Bacillus cereus, Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger. At certain concentrations of the lyophilized culture supernatant containing azurin, inhibition zones were only observed for E. coli and B. cereus. According to MTT analysis results, cell viability was decreased with increasing concentration, when HUVEC, HT29, HCT116 and MCF7 cell lines was treated with lyophilized culture supernatants with azurin or without azurin. However, it was found that the supernatants containing azurin showed more antiproliferative effect than the azurin-free supernatants. This work provides a practicable method for producing recombinant azurin in the food grade L. lactis strain. As a result, the L. lactis strain producing azurin protein with anticancer property can be used in the researches as a therapeutic probiotic. Furthermore, the determination of antibacterial properties against E. coli and B. cereus at certain doses suggests that this strain may be useful in the preservation of foods.