Normoksik ve iskemik koşullarda inkübe edilen sıçan kortikal dilimlerinin ttc ile boyanması: Inkübasyon koşullarının boyanma üzerine etkisi
Staining of the rat cortical slices with 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride (ttc) either in normoxic and ischemic conditions: Effect of incubation conditons on staining of the slices
Yazar: ZÜLFİYE GÜL
Danışman: PROF. DR. RİFAT LEVENT BÜYÜKUYSAL
Uludağ Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Beyin iskemisi = Brain ischemia ; Malondialdehit = Malondialdehyde ; Menadion = Menadione ; Serbest radikaller = Free radicals ; Serebral enfarktüs = Cerebral infarction ; Serebrovasküler dolaşım = Cerebrovascular circulation ; Teşhis teknikleri ve prosedürleri = Diagnostic techniques and procedures ; Teşhis testleri = Diagnostic tests ; İn vitro = In vitro ; İskemi = Ischemia

Özet:
Normoksik ve İskemik Koşullarda İnkübe Edilen Sıçan Kortikal Dilimlerinin TTC İle Boyanması: İnkübasyon Koşullarının Boyanma Üzerine Etkisi
Amaç: Deneysel iskemi ve benzeri durumlarda meydana gelen beyin hasarının büyüklüğünün doğru bir şekilde gösterilmesi, hasar mekanizmasının açıklanması ve yeni terapötik yaklaşımlar geliştirilmesi açısından oldukça önemlidir. İnfarkt alanının belirlenmesi amacı ile en fazla tercih edilen yöntemlerden biri beyin kesitlerinin 2,3,5-trifeniltetrazolium klorür (TTC) ile boyanmasıdır. Ancak, değişik deneysel prosedürler kullanılması ile bu boyamada farklı sonuçlar elde edildiği literatürde görülmektedir. Biz bu çalışmayı; inkübasyon ortamındaki dilim sayısının TTC boyama yoğunluğu üzerine etkisini ve bunun hasarlanma ile ilgili diğer parametreler için de söz konusu olup olmadığını incelemek amacıyla planlandık.

Metod: Dişi Sprague Dawley sıçanlardan hazırlanan kortikal dilimler (0,4 mm) 2 ml inkübasyon ortamına 1,3,6 dilim olacak şekilde yerleştirildiler. 60 dakikalık preinkübasyon periyodundan sonra dilimler normoksik koşullar yanında, in vitro iskemi, H2O2 (1 mM), FeSO4 (0,1 mM) + askorbik asid veya menadion (1 mM) içeren 4 farklı oksidatif stres modellerinde inkübe edildiler. İnkübasyon sonunda dilimler %0,5 TTC ile boyandı. Doku hasarının tespiti için aynı deney koşullarında, ortama salıverilen LDH yanında, doku MDA ve ROS düzeyleri ölçüldü.

Bulgular: Normoksik koşullarda inkübe edilen dilimlerin TTC boyanma yoğunluğunun ortamdaki dilim sayısı arttıkça fazlalaştığı gözlendi. Benzer şekilde hasarlanma ile ilgili diğer parametreler de dilim sayısı artışından olumlu etkilendi.Dört farklı oksidatif stres modeli ile indüklenen TTC boyanma yoğunluğundaki azalma, 1 dilim inkübe edilen grupta en yüksek iken 6 dilim içeren grupta bu azalma anlamlılık düzeyine ulaşmadı. Doku MDA ve ROS düzeyleri ile ortama salınan LDH
düzeylerindeki değişikliklerin de, TTC boyanma yoğunluğundaki değişikliklerle yüksek derece korelasyon gösterdiğini tespit edildi.
Sonuç: Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, inkübasyon ortamındaki dilim sayısının, normoksik ve oksidatif stres koşullarda deney sonuçlarını etkileyebileceğini açıkca göstermektedir. Bu etkinin mekanizmasını tez çalışması kapsamında çalışılmamış olmakla birlikte, etkinin inkübasyon ortamına salınan endojen nöroprotektif maddelerin konsanstrasyonlarındaki değişiklik ile ilişkili olduğunu düşünmekteyiz.
Anahtar sözcükler: İn vitro iskemi, H2O2, Menadion, TTC boyaması, ROS

Abstract:
Staining of the Rat Cortical Slices with 2,3,5 Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) either in Normoxic and Ischemic Conditions: Effect of Incubation Conditons on Staining Of The Slices

Objective: The accurate quantitation of tissue damage produced under in vivo or vitro conditions is important to the investigation of injury mechanisms and therapies. Although 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride (TTC), a marker of the mitochondrial enzyme activity, is widely used to assess the effects of cerebral ischemia, many controversial results, probably due to experimental models used, are easily seen in the literature. In present study we aimed to demonstrate whether number of the brain slices in the medium alters their staining intensities with TTC and if present, whether changes in the other parameters related to tissue damage also show a close similarity under in vitro conditions.

Methods: 1, 3, 6 cortical slices (0.4 mm) prepared from female Sprague Dawley rats were placed into the incubation plates containing 2 ml oxygenated physiological medium. After 60 min of preincubation period, cortical slices were incubated either in normoxic or four different oxidative stress conditions; namely in vitro ischemia or H2O2, (1 mM), FeSO4 (0.1 mM) + ascorbic acid or menadione (1 mM) models. At the end of each oxidative stress models, slices were stained with 0.5% TTC. Tissue MDA and ROS levels and the leakage of LDH into the medium were also studied for determination of the tissue damage occurred under these experimental conditions.

Results: When incubated in normoxic medium, staining intensities of the slices were highly correlated with the number of slices in the medium. Similarly, other parameters related to tissue damage were also affected in a positive way by the increasing the slice number in the medium. Whereas all oxidative stress models used here caused significant declines in TTC staining intensities in one slice containing group, neither in vitro ischemia nor other models-induced declines reach to statistically significant level in six slices containing group. Alterations in LDH leakage from the slices and tissue MDA ROS levels, on the other hand, were found to be highly correlated with the changes observed in TTC staining intensities.Conclusion: These results clearly indicate that experimental conditions such as slices quantity or incubation volume significantly alters the results observed under normoxic or ischemia-like conditions. Although the mechanism(s) remained to be determined, increasing the slice quantity or decreasing the incubation volume probably causes an increase in the concentration of endogenous substance(s) in the medium which are
probably involved in neuroprotection as seen in present study.

Key words: In vitro ischemia, H2O2, menadione, TTC staining, ROS