Kimyasal mutagen (etil metansülfonat) uygulamasıyla patateste (Solanum tuberosum L.) varyasyonun oluşturulması ve moleküler markırlarla tanımlanması
Induction of variation using chemical mutagene (ethyl methanesulfonate) treatment and characterization by molecular markers in potato (Solanum tuberosum L.).
Yazar: NÜKET ALTINDAL
Danışman: PROF. DR. TAHSİN KARADOĞAN
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Bu çalışmada, 3 adet patates çeşidi (Agria, Marfona ve Lady Olimpia) kullanılmıştır. Araştırmada etil metansülfonat (EMS) uygulamaları iki aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada, patates çeşitlerine ait sürgün uçlarına 3 farklı süre (30, 60 ve 90 dk) ve 4 farklı dozda (0, 100, 200 ve 300 mM) EMS uygulanmış ve bu sürgünler in vitroda bitki rejenerasyonu için modifiye edilmiş MS ortamında 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlıkta 22±2 oC sıcaklık ve 2000-3000 lüks ışık altında inkübe edilmiştir. EMS uygulanan sürgün uçlarından rejenere olan bitkiciklerin morfolojik gözlemleri 1 ay sonra alınmış ve dış ortama aktarımı yapılmıştır. Araştırmanın bir diğer aşamasında patates çeşitlerine ait yumru gözlerine % 0.0 (kontrol), 0.2, 0.4 ve 0.6'lık EMS daldırma ve 3 saatlik süre ile uygulanmış, daha sonra viyollere aktarılan gözlerden çıkan fideler tarlaya şaşırtılmış ve morfolojik özellikleri incelenmiştir. Ayrıca, çalışmanın her iki aşamasında da genetik farklılıkları belirlemek için ISSR DNA moleküler işaretleyici tekniği kullanılmıştır. 

Araştırmada in vitroda incelenen morfolojik gözlemler ele alındığında bitkicik boyu 3.01-5.02 cm, boğum sayısı 6.56-12.17 adet, sap sayısı 1.00-1.44 adet, yan dal sayısı 0.78-1.56 adet, yaprakçık sayısı 6.00-14.06 adet ve kök sayısı 0.50-2.33 adet arasında, tarla koşullarda ise bitki boyu 29.10-54.20 cm, bitki başına sap sayısı 1.0-1.1 adet, ocak başına küçük yumru sayısı 1.1-4.0 adet, ocak başına küçük yumru verimi 18.13-176.16 g, ocak başına orta yumru sayısı 0.0-2.0 adet, ocak başına orta yumru verimi 0.0-171.33 g, ocak başına büyük yumru sayısı 0.0-2.1 adet, ocak başına büyük yumru verimi 0.0-425.94 g, ocak başına toplam yumru sayısı 2.5-7.0 adet ve ocak başına toplam yumru verimi 98.46-773.39 g arasında değişiklik göstermiştir. In vitro koşullarda sürgün ucuna EMS uygulamasında bitkicik boyu, boğum sayısı, yaprakçık sayısı, kök sayısı ve yan dal sayısı bakımından en iyi tepki Lady Olimpia çeşidinde belirlenmiştir. Araştırmada olumlu yönde en etkili dozun 100 mM EMS olduğu gözlenmiştir. Uygulanan EMS sürelerinde ise morfolojik özelliklere etkisi bakımından 30 dk uygulama süresinin daha etkili olduğu ortaya konulmuştur. Eksplantların EMS solusyonunda 90 dk bekletilmesi incelenen özelliklerde olumsuz sonuçların elde edilmesine neden olmuştur. Yumru gözlerine artan dozlarda EMS uygulaması genellikle bitki gelişiminde gerilemeye neden olmuştur. EMS'nin uygulama süresinin bitki gelişimine etkisi birçok incelenen özellikte önemli olmamakla birlikte değişkenlik göstermiştir. Araştırmada EMS'nin 3 saat uygulamasında bitki boyunda artış, ocak başına orta yumru veriminde ise azalmalar gözlenmiştir. Morfolojik özellikler bakımından yumru gözlerine EMS uygulamaları çeşitlere göre tüm klonlarda varyasyonlara neden olmuştur. En yüksek toplam yumru verimi Agria çeşidinde % 0.2 EMS + daldırmada elde edilmiştir. Marfona çeşidinde EMS uygulamaları toplam yumru verimini düşürmüş, en yüksek verim % 0.6 EMS+ daldırma uygulamasında gözlenmiştir. Lady Olimpia çeşidinde 6 klon normal değerin çok üzerinde yumru verimini oluşturmuş, % 0.6 EMS + daldırma, % 0.2 ve 0.4 EMS + 3 saat uygulamaları toplam yumru veriminde artışa neden olmuştur. 

İncelenen morfolojik gözlemler yanında moleküler belirleyicilere de araştırmada yer verilmiştir. ISSR-PCR analizinde 24 adet primer kullanılmış bunlardan sadece sürgün uçlarına EMS uygulamalarında 11 adet, yumru gözlerine EMS uygulamalarında ise 9 adet primer polimorfizm göstermiştir. Araştırmada, EMS uygulanan çeşitlere göre polimorfizm oranları değişmiş, en yüksek polimorfizm Agria çeşidinde belirlenmiştir. UPGMA ve PCA analizinde EMS uygulanan çeşitlerin bir kısmı ile kontrol çeşitlerinin farklı gruplarda yer aldığı belirlenmiştir. Aynı zamanda, EMS uygulanan patates çeşitlerinde ortak bir ataya sahip olanların aynı grupta yer aldığı bunun aksine bazılarının da farklı grupları oluşturduğu gözlenmiştir. Benzerlik matriksi bakımından, in vitroda çeşitlerin sürgün uçlarına EMS uygulamalarının kontrol gruplarına en düşük benzerlik oranları; Agria'da 200 mM EMS + 60 dk (% 42), Marfona'da 200 ve 300 mM EMS + 60 dk (% 75) ve Lady Olimpia çeşidinde ise 100 mM EMS + 90 dk (% 75) uygulamalarında tespit edilmiştir. Yumru gözlerine EMS uygulamalarının kontrol gruplarına en düşük benzerlik oranı ise Agria'da % 0.4 EMS + 3 saat (% 50), Marfona'da % 0.2 ve 0.4 EMS + daldırma (% 39) ve Lady Olimpia çeşidinde % 0.2 EMS + daldırma (% 47) uygulamalarında belirlenmiştir. 

Sonuç olarak, farklı doz ve sürelerde farklı eksplantlara EMS uygulaması incelenen karakterleri etkilemiştir. Araştırmada morfolojik gözlemlerden ve ISSR yönteminden elde edilen veriler; mutasyon ıslahı çalışmalarında varyasyon yaratmada yarayışlı olabilecektir. EMS'nin uygun doz ve uygulama süresi dikkate alınarak yapılan mutasyon ıslahı çalışmalarında, patates bitkilerinde genetik varyasyonun oluşturulması ve bu bitkilerin bitki ıslahında anaç olarak kullanılması mümkün olabilecektir.

Abstract:
In this study, three potato cultivars (Agria, Marfona and Lady Olimpia) were used. In this study, ethyl methanesulfonate (EMS) applications consist of two stage. In first stage, shoot tips of potato cultivars were treated with four doses (0, 100, 200 and 300 mM) and time periods (30, 60 and 90 min) of ethyl methanesulfonate. To produce plant regeneration, these shoot tips were incubated on a modified MS medium at the temperature of 22±2 oC and 16/8 h day/night photoperiod under light conditions that were 2000-3000 lux. After one month, the morphological observations of the regenerated plantlets from the shoot tips that received EMS treatment were recorted. In the other stage of the study, tuber eyes of patato cultivars were treated with 0.0, 0.1, 0.2, 0.4 ve 0.6 % doses and 60, 120, 150 and 180 min time periods of EMS. Then, seedlings from shoot primordia planted into viols were transfered to field and morphological observations were recorted. In addition to, genetic diversities were investigated using ISSR DNA molecular marker technique in the both stage of the study.

In the study, according to observed morphological observations in vitro, the plantlet height (cm), the number of internode, stem, sub branch, flake and root were 3.01-5.02, 6.56-12.17, 1.00-1.44, 0.78-1.56, 6.00-14.06 and 0.50-2.33, respectively. In field conditions, the plant height (cm), the number of stem per plant, the number of sub branch per plant, the number and yield (g) of small tuber per hole, the number and yield (g) of middle tuber per hole, the number and yield (g) of great tuber per hole, the number and yield (g) of total tuber per hole were 29.10-54.20, 1.0-1.1, 1.0-4.8, 1.1-4.0, 18.13-176.16, 0.0-2.0, 0.0-171.33, 0.0-2.1, 0.0-425.94, 2.5-7.0 and 98.46-773.39, respectively. The reaction of Lady Olimpia cultivar in vitro was the best in plantlets from shoot tips in terms of the plantlet height, the number of internode, leaf, root and sub branch. The most possitive effective of EMS dose and time period was 100 mM and 30 min respectively in the morphological observations in vitro soaking explants in EMS solution for 90 min negative affected the morphological characteristics. Generally, treatment of increasing EMS doses on tuber eyes led to declining plant growth. The effect to plant growth in relation to time period of EMS treatment wasn't significantly different in the morphological characteristics. In the study, the plant height increased and the yield of midle tuber per hole decreased with treatment for 3 hours. In terms of the morphological characteristics, EMS treatments to tuber eyes led to variation in all clones according to cultivars. The total tuber yield in Agria cultivar was the highest in 0.2 % EMS + dipping treatment. EMS applications in Marfona cultivar decreased the total tuber yield, the highest tuber yield was recorded in 0.6 % EMS + dipping application. In Lady Olimpia cultivar, 6 clones produced the tuber yield higher than normal data and 0.6 % EMS + dipping, 0.2 and 0.4 % + 3 hours treatments increased total tuber yield.

In this research, in addition to morphological observations, the molecular markers were also used. In ISSR-PCR analysis, 24 primer were used. Primer numbers idendificated polymorphism were 11 and 9 (in EMS- treated shoot tips and tuber eyes, respectively). In reserach, polymorphism rations altered in used cultivars and the highest polymorphism was found in Agria cultivar. Some of EMS applied cultivars with control cultivars were in different groups. In EMS-applied potato cultivars, cultivars belonging share parent were in same group or visa versa. In terms of similarity metric, the lowest similarity ratio (50 %) of calli of Agria cultivar to control group was determined in 0.1 % EMS + 120 min application The lowest similarty ratios to control groups of patoes cultivars obtained from shoot tips and in Agria (42 %), Marfona (75 %) and Lady Olimpia (75 %) were obtained in the treatments of 200 mM EMS + 60 min, 200 and 300 mM + 60 dk and 100 mM EMS + 90 min, respectively. Additionally, this ratios in cultivars obtained from tuber eyes in vivo conditions were in the applications of 0.4 % EMS + 3 hours in Agria (50 %), 0.2 and 0.4 % EMS + dipping (39 %) in Marfona and 0.2 % EMS + dipping (47 %) in Lady Olimpia cultivar. 

In conclusion, EMS applications in different doses and time periods affected the plant variables investigated. characters. In this study, data obtained of the morphological observations and ISSR method can be beneficial in creating variation in mutation breeding studies. In mutation studies executed according to eligible treatment doses and time period of EMS, induction of genetic variation in potato plants and using as rootstock of these plants in plant breeding can be possible.