Hepatit B virüsü ile infekte hepatoselular karsinoma tanısı konulmuş hastalarda belirteç olarak mikrorna'ların değerlendirilmesi
Evaluation of microrna's as biomarker in hepatocellular carcinoma patients infected with Hepatitis B virus
Yazar: RECEP DEMİRGAN
Danışman: PROF. DR. ALİ KARAGÖZ ; PROF. DR. MURAT SAYAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Bu tez çalışmasında, 6 adet (hsa-miR16, hsa-miR-28, hsa-miR-122, hsa-miR-221, hsa-miR-224 ve hsa-miR-501) insan mikroRNA'sının (miRNA) hepatoselülar karsinomada biyobelirteç olarak kullanılabilirliği değerlendirilmiştir. Bu amaçla Türkiye popülasyonunda deney grupları için HBV DNA'sı pozitif ve hepatoselular karsinoma (HSK) negatif bireylerin serumları ile HBV DNA'sı ve HSK'sı pozitif bireylerin serumları ve karaciğer patoloji örnekleri arasındaki ekspresyon farklılıkları Gerçek Zamanlı PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu/ Real Time PCR) ile göreceli olarak kantite (rölatif kantitasyon) edilmiş ve ekspresyon farklılıkları belirlenmiştir. Çalışılan deney gruplarının HBV DNA log (logaritma) analizleri ile bu 6 miRNA'nın ekspresyon analizleri arasındaki ilişki ortaya konulmuştur. Yine bu tez çalışması kapsamında normalizasyon için 1 mRNA ve 2 adet snRNA hem serum hem de doku örneklerinde uygunlukları değerlendirilmiştir. Ayrıca doku örneklerinin lezyon boyutları ile miRNA'ların ekspresyon değişimleri de ortaya konulmuştur.

Gerçekleştirilen Real Time PCR sonuçları ışığında ekspresyondaki değişimler miR-16 için HBV DNA ve HSK pozitif dokuda kontrol grubuna göre 8.3 katlık bir artış; miR-28 için HBV DNA ve HSK pozitif serum ve doku örneklerinde serum için 2.3 ve doku için ise 9.6 katlık bir azalma; miR-122 için kontrol grubuna göre HBV DNA ve HSK pozitif serum ve doku örneklerinde serum için 5.9 ve doku için 6.9 katlık bir azalma yine aynı miRNA için HBV pozitif fakat HSK tanısı konulmamış serum örneklerinde ise 5,4 katlık bir azalma; miR-221 için kontrol grubuna göre HBV DNA ve HSK pozitif dokuda ekspresyonda kontrol grubuna göre 8 katlık bir artış; miR-224 için kontrol grubuna göre HBV DNA ve HSK pozitif serum ve doku örneklerinde serum için 3.3 ve doku için 4.7 katlık bir artış yine aynı miRNA için HBV pozitif fakat HSK tanısı konulmamış serum örneklerinde ise 7.6 katlık bir artış; miR-501 için ise için kontrol grubuna göre HBV DNA ve HSK pozitif serum ve doku örneklerinde serum için 4.2 ve doku için 12.6 katlık bir artış yine aynı miRNA için HBV pozitif fakat HSK tanısı konulmamış serum örneklerinde ise 4.4 katlık bir artış olarak belirlenmiştir.

Gerçekleştirilen HBV DNA logları ile miRNA'ların ekspresyon korelasyonları arasında 6 miRNA için de anlamlı bir ilişki saptanamamıştır. 

miRNA'ların normalizasyonu için 1 adet Gliseraldehit 3 fosfat dehidrogenaz (GAPDH-referans gen) mRNA'sı ve 2 adet snRNA (küçük nüklear RNA/snRNA U44 ve snRNA U6) verileri değerlendirilmiştir. GAPDH için serumda ortalama eşik döngüsü (Ct) değeri 31.18±5.98, snRNA U6 için 26.49±1.75 ve snRNA U44 için 25.94±4.3, dokuda ise GAPDH için 23.83±4.36, snRNA U6 için 18.10±1.54 ve snRNA U44 için ise 20.41±1.13 olduğu belirlenmiştir.

Ayrıca aynı 6 miRNA için doku lezyon büyüklükleri ile miRNA ekspresyon değişimlerinin korelasyonu değerlendirilmiştir. Bu analizler ışığında miR-16 ekspresyonlarında 2 cm'den büyük lezyonlarda artış; miR-28 ekspresyonlarında 0.8 cm'den büyük lezyonlarda azalış; miR-122 ekspresyonlarında 3.6 cm'den büyük lezyonlarda azalış; miR-224 ekspresyonlarında 4.2 cm'den büyük lezyonlarda artış; miR-501 ekspresyonlarında 2.1 cm'den büyük lezyonlarda artış saptanmıştır. miR-221 için ise lezyon büyüklüğüne göre ekspresyonda uyumlu bir değişim saptanmamıştır. 

Bu sonuçlar ışığında HSK için özellikle serumdan taramalarda miR-28'in biyobelirteç olarak değerlendirilebileceğini, HSK miRNA Gerçek Zamanlı PZR (Real Time PCR; rölatif kantitasyon) çalışmalarında snRNA U6'nın normalizasyon için uygun olabileceğini, HBV DNA kantitasyonu ile ilişkisi saptanamayan 6 miRNA'nın 4'ü için (miR-16, miR-28, miR-122 ve miR-224) lezyon büyüklüğüne göre yüksek oranda değişim gösterdiği, miR-501 için ise 2.1 cm ile 14 cm lezyon boyutu arasında yaklaşık 2 katlık bir artış olduğu ortaya konmuştur. Bu çalışma ışığında miR-28 için gelecekte HSK'nın erken tanısı için non-invaziv bir tarama testinin klinik validasyon aşamasında değerlendirilmesi için ön veri sunduğunu, ayrıca doku lezyon boyutları ile miRNA ekspresyonları arasındaki ilişki üzerine klinik örnek sayısı ve lezyon boyutlarının çeşitlendirilerek gerçekleştirilecek bilimsel çalışmalar sayesinde ilerleyen süreçte bu tip miRNA tarama yöntemlerinin istatistik programlar ile birlikte lezyon boyutu ile ilgili ön bir bilgi dahi sunabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
his study investigates the potential use of 6 pre-determined human microRNAs (hsa-mir-16, hsa-mir-28, hsa-miR-122, hsa-miR-221, hsa-mir-224 and hsa-mir-501) as diagnostic biomarkers in hepatocellular carcinoma. In order to evaluate this potential, miRNA expression levels on HBV positive serum samples from subjects without hepatocellular carcinoma (HCC) are compared with HBV positive serum and liver pathology samples from subjects with HCC, using Real-Time PCR and relative quantitation .All patient groups represent the epidemiology in Turkey. The correlation between the expression levels of these 6 miRNAs with HBV DNA log value is evaluated. Two snRNAs and one mRNA  were analyzed for normalization in serum and tissue samples within this research. Expression of the given miRNAs were also compared with lesion size on tissue samples.

Real-Time PCR results showed; 8,3 fold increase in mir-16 expression on tissue samples of HBV DNA positive patients with HCC; 2,3 fold decrease in mir-28 expression on serum samples of HBV DNA positive patients with HCC;  9,6 fold decrease in mir-28 expression on tissue samples of HBV DNA positive patients with HCC; 5,9 fold decrease in miR-122 expression on serum samples of HBV-HCC positive patients,  6,9 fold decrease in miR-122 expression on tissue samples of HBV-HCC positive patients, 5,4 fold decrease in miR-122 expression on serum samples of HBV positive patients without HCC, 8 fold increase in miR-221 expression on tissue samples of HBV-HCC positive patients, 3,3 fold increase in miR-224 expression of serum samples of HBV-HCC positive patients, 4,7 fold increase in miR-224 expression on tissue samples of HBV-HCC positive patients, 7,6 fold increase in miR-224 expression on serum samples of HBV positive patients without HCC, 4,2 fold increase in miR-501 expression on serum samples of HBV-HCC positive patients, 12,6 fold increase in miR-501 expression of HBV-HCC positive patients, 4,4 fold increase in miR-501 expression on serum samples of HBV positive patients without HCC diagnosis.

Based on HBV DNA log levels along with the expression values of the pre-determined miRNAs, no significant correlation has been detected. 

Data derived from Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH-reference gene) mRNA and two snRNAs (small nuclear RNA/snRNA U44 and snRNA U6)  are used for the normalization of relative quantitation results. Average cycle threshold (Ct) values in serum were found to be 31,18±5,98 for GAPDH, 26,49±1,75 for snRNA U6 and 25,94±4,3 for snRNA U44. Average Cycle Threshold (Ct) values in tissue samples were found to be 23,83±4,36 for GAPDH, 18,10±1,54 for snRNA U6 and 20,41±1,13 for snRNA U44.

The correlation between lesion size and the expressions of 6 pre-determined miRNAs is also evaluated. As a result of this analysis, a positive correlation is observed for the expressions of the following miRNAs; miR-16 on lesions larger than 2 cm, miR-224 on lesions larger than 4,2 cm and miR-501 on lesions larger than 2.1 cm. Contrarily, miR-122 and miR-28 expressions were decreased on lesions larger than 3.6 cm and 0.8 cm respectively. miR-122 on samples with a size of 3,6-4,5 cm and miR-224 on samples larger than 4,5 cm in size. Results do not indicate any correlation between the lesion size and the expression of miR-221. 

This study indicates that miR-28 can be used as a diagnostic biomarker for HCC especially on serum screening, the use of snRNA U6 is appropriate for normalization in Real-Time PCR (relative quantitation) applications and 4 of these pre-determined miRNAs (miR-16, miR-28, miR-122 and miR-224) show increased expression patterns with different lesion sizes while no such correlation is seen with HBV DNA levels, miR-501 was found to be increased almost 2-fold on lesions with size from 2.1 to 14 cm. As a result of this study, it was concluded that miR-28 provided preliminary data for the evaluation of a non-invasive screening test for the early diagnosis of HCC in the clinical validation phase. The correlation observed between the lesion sizes and miRNA expression suggests that after further scientific studies are carried out by diversifying the number of clinical specimens and lesion sizes, these types of miRNA screening methods may present a preliminary information about the size of the lesion with a statistical analysis software.