Nitrik oksit donörü olarak s-nitrosoglutatyon sentezi ve antibiyofilm etkilerinin araştırılması
Synthesis of s-nitrosoglutathione as a nitric oxide donor and investigation of antibiofilm effects
Yazar: ABDULLAH MASOOD KAMAL
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ FATİH SEVGİ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Laboratuvar Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antibakteriyel ajanlar = Anti-bacterial agents ; Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Biyofilmler = Biofilms ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; S-nitrosoglutatyon = S-nitrosoglutathione

Özet:
Uzun yıllar boyunca çevresel bir kirletici olarak bilinen Nitrik oksit (NO) molekülünün 1987 yılında vücutta doğal olarak üretildiğinin gösterilmesiyle bu basit ama hayati molekül birçok araştırmanın odağı haline gelmiştir. Memeli hücrelerinde NO sentaz (NOS) enzimi tarafından üretilen radikalik yapıdaki bu gaz molekülü başta endotel hücre-damar düz kasları arasında vazodilatör etkili sinyal molekülü olmak üzere, düzenleyici, koruyucu ve sitotoksik etkilere sahiptir. Bununla birlikte nitrik oksitin in-vivo şartlarda yarı ömrü çok kısa olduğundan biyokimyasal süreçlerdeki etki mekanizmalarının aydınlatılmasında zorluklarla karşılaşılmaktadır. Bu sorunu aşmak için düşük hızlarda NO salınımı yaparak daha uzun süre etkili olabilen çeşitli NO vericisi bileşikler sentezlenmiştir. Bu donör bileşikler içerisinde; S-nitrosoglutatyon (GSNO), endojen olarak bulunan nispeten düşük toksiteli ve NO salıverme yeteneklerinden dolayı muazzam terapötik potansiyele sahip kararlı bir molekül olarak dikkat çekmektedir.
Biyofilmler, canlı ya da cansız yüzeylere tutunarak kendi ürettikleri polimerik bir matriks içerisinde yaşayabilen mikroorganizma topluluklarıdır. Biyofilm içindeki bakteriler planktonik bakterilere göre çok daha sağlam bir savunma mekanizmasına sahiptirler. Bu nedenle, ilaca dirençli enfeksiyonlarla mücadele etmek için, sadece planktonik bakterileri hedef alan antimikrobiyal ajanlar yeterli değildir ve biyofilm oluşumunun önlenmesi için yeni stratejilere gereksinim vardır.
Bu çalışmayla, kararlı ve suda çözünebilen endojen bir nitrik oksit donörü olan GSNO'nun bakteriyel biyofilmlerin oluşumu üzerindeki inhibisyon etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda GSNO, literatürde verilen metotlar takip edilerek kolayca ve yüksek verimle sentezlenerek karakterize edilmiştir. Başlangıç maddesi olan glutatyon (GSH), sentezlenen GSNO ve  NO salınımını artırması için GSNO'ya eklenen 250 μM'lık N-asetilsistein+askorbik asit karışımı (GSNO/NAC+AA) biyofilm üreten üç standard bakteri (Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) ve Escherichia coli JM109) suşu üzerinde antibakteriyel ve antibiyofilm etkileri araştırılmıştır. Maddelerin antibakteriyel aktiviteleri mikrodilüsyon broth yöntemiyle minumum inhibitör konsantrasyonları (MİK) bulunarak, antibiyofilm aktiviteleri ise kristal viyole mikro plaka boyama tekniğiyle spektrofotometrik olarak bulunmuştur. Ayrıca kullanılan maddelerin NO üretme potansiyelleri Griess metoduyla nitrit ölçülerek dolaylı olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak GSNO'nun bakteriyel biyofilmlerin oluşumunu doza bağımlı olarak inhibe ederek antibiyofilm etki gösterdiği  ve GSNO çözeltisine düşük konsantrasyonlarda eklenen NAC+AA karışımının oldukça kararlı olan GSNO'nun nitrik oksit salıvermek üzere bozunmasını uyararak inhibisyon potansiyelini arttırdığı bulunmuştur.

Abstract:
Nitric oxide (NO), known as an environmental pollutant for many years, was shown to be produced naturally in the body in 1987. Despite its simplicity, it is quite vital and the molecule has become the focus of many researches. This radical gas molecule produced by the NO synthase (NOS) enzyme in mammalian cells has regulatory, protective and cytotoxic effects, primarily being a vasodilator-acting signal molecule between endothelial cell-vascular smooth muscles. However, since the half-life of nitric oxide is very short under in-vivo conditions, difficulties are encountered in elucidating the mechanisms of action in biochemical processes. In order to overcome this problem, various NO donor compounds have been synthesized, which can be effective for a longer time by releasing NO at a lower speed. Among these donor compounds; S-nitrosoglutathione (GSNO) stands out as a stable molecule with enormous therapeutic potential due to its endogenously found, relatively low toxicity and NO-releasing abilities. 
	Biofilms are communities of microorganisms that can adhere to living or non-living surfaces and live in a self-produced polymeric matrix. Bacteria in a biofilm have a much more robust defense mechanism than planktonic bacteria. Therefore, antimicrobial agents targeting planktonic bacteria alone are not sufficient to combat drug-resistant infections and new strategies are needed to prevent biofilm formation.
	In this study, it was aimed to investigate the inhibition effects of GSNO on the formation of bacterial biofilms, which is a stable and water-soluble endogenous nitric oxide donor. For this purpose, GSNO was synthesized easily and with high yield by following the methods given in the literature and then characterized. Antibacterial and antibiofilm effects were investigated on three standard biofilm-producing bacteria (Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) and Escherichia coli JM109) strains, by using the starting material glutathione (GSH), the synthesized GSNO, and 250 μM N-acetylcysteine+ascorbic acid (GSNO/NAC+AA) mixture that was added to GSNO for increasing NO-releasing. The antibacterial activities of the substances were evaluated by finding the minimum inhibitory concentrations (MIC) using the microdilution broth method, then antibiofilm activities were determined spectrophotometrically by the crystal violet microplate staining technique. In addition, the NO-releasing potentials of the substances used were indirectly determined by measuring nitrite with the Griess method. As a result, it was found that GSNO performs antibiofilm effects by inhibiting the formation of bacterial biofilms in a dose-dependent manner and the NAC+AA mixture that was added to the GSNO solution at low concentrations increased the inhibition potential by stimulating the degradation of the highly stable GSNO to release nitric oxide.