Aktin modelinde protein-ligand etkileşimlerinin yeni yaklaşımlar çerçevesinde incelenmesi
Investigation of protein-ligand interactions using new approaches on actin model
Yazar: KEMAL ALPER ÖNSÜ
Danışman: PROF. DR. MUHAMMET BEKTAŞ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Aktinler = Actins ; Cucurbitacin = Cucurbitacin ; Ligandlar = Ligands ; Proteinler = Proteins

Özet:
Ökaryotik hücrelerde en çok bulunan protein olan aktin; globular (G-monomer) ve flamentoz (F-zincir) olmak üzere iki farklı formda bulunmaktadır. Monomer aktin 43 kDa ağırlığında olup, birincil yapısı 375 aminoasit ve dört ayrı alt ünite (subdomain) içermektedir. G-aktin sentez sonrası; asitillenme, ADP-ribozillenme ve fosforillenme gibi modifikasyonlara uğrayabilir. Aktin draglarla (falloidin, cucurbitacin, kolşisin), membran, sitoiskelet ve plazma proteinleriyle ve protein sentez faktörlerinden elongasyon faktörü 1 ve 2, ribozomlar, tRNA ve apoptoz ile bağlantılı DNaz I ile etkileşime girdiği bilinmektedir. Aktin bu etkileşimler sonrası birçok hücresel fonksiyonda (hücre iskeleti, hareket, bölünme, taşıma, sinyalizasyon, apoptoz ve protein sentezi) işlev görmektedir.
Protein-ligand etkileşimlerinin incelenmesi; ilaç moleküllerinin hücresel hedeflerle etkileşimi, süresi ve dışarı atılımı süreçlerinin belirlenmesi amacıyla hücresel termal kayma (CETSA ve TSA) yöntemleri kullanılmaktadır. Bu yöntemler hedef ve kişiye yönelik ilaç tasarımında ve protein-ligand bağlanma afiniteleri konusunda kullanılabilir. Proteinlerin termal stabilitesi, ligand ve drag bağlanmasıyla artmakta ve denatürasyon eğrileri (erime ısısı; Tm) sağa kaymaktadır. 
Cucurbitacin kabakgiller ailesinden saflaştırılan triterpenoid formlu bir moleküldür. F-aktin ve G-aktin ile etkileştiği gösterilmiş fakat bağlanma bölgesi ve afinitesi saptanamamıştır. Ayrıca dogal veya sentetik cucurbitacinin kanser tedavisinde kullanılabilecektir. Bu çalışmada, protein-ligand etkileşimleri yeni bir yaklaşım olan TSA, aktin modelinde incelenmiştir. Cucurbitacin I-aktin arasındaki ilişki immüm floresan tekniklerle de gösterildi; hücre iskeletininde bozulduğu, aktin kümelenmelerinin olduğu görüldü. Cucurbitacin I üzerine yoğunlaşan çalışmanın TSA sonuçları G-aktinin termal kalımlılıgının (Tm) artması ve toplam floresan şiddetindeki azalmayla aralarındaki etkileşimi göstermektedir.
İn vitro ve in vivo etkileşimler ilaç tasarlanmasında veya ilaç etkileşim mekanizmalarının anlaşılmasında önemli bir husus teşkil ettiğinden çalışmalarımızın klinik öncesi çalışmalarda fayda sağlaması mümkündür.

Anahtar Kelimeler: Aktin, bağlanma kinetiği, protein-ligand etkileşimleri, termal kayma
deneyi, cucurbitacin I

Abstract:
Actin, the most abundant protein in eukaryotic cells, can be found in two forms; globular (G-monomer) or filamentous (F-chain). Monomer actin with molecular weight 43 kDa consists of 375 aminoacids and four subunits (subdomain). Post-synthesis, G-acin undergoes modifications like ADP-ribosilation, acetilation and phosphorilation. Actin interacts with; drug molecules (phalloidin, cucurbitacin, colchicines), many proteins of membrane, cytoskeleton and plasma and protein synthesis factors (elongation factors 1 and 2, ribosomes, tRNA and apoptose related DNAse I). Globular and filamentous actin takes part in many cellular functions (cytoskeleton, mobility, division, transportation, signalization, apoptosis and protein synthesis) after such interactions.
Cellular thermal shift assay (CETSA and TSA) are methods used for researching protein-ligand interactions. They can be utilized to determine intracellular interactions, time of effect and disposal periods of drugs, to design drugs and reveal data on protein-ligand binding affinities. Protein thermal stability increases with ligand/drug binding and a righ shift in denaturation curves (melting point; Tm).
Cucurbitacins are triterpenoid formed molecules extracted from family cucurbitaceae.  Actin is shown to interact with cucurbitacins however the binding sites are mostly unknown. Natural or synthetic cucurbitacins can be used in cancer treatment.  This study examines protein-ligand interactions with TSA, a novel approach, in actin model, specificially G-actin with cucurbitacin. immunofluorescence techniques revealed that cytoskeleton degrades and aggregates with cucurbitacin I. TSA results show increase in Tm and decrease in fluorescence intensity showing interactions between actin and cucurbitacin I.
In vivo and in vitro interactions are used for drug design and to research drug activity mechanisms so the results can ve used for potential pre-clinic research.

Keywords: Actin, binding kinetics, protein-ligand interactions, thermal shift assay,
cucurbitacin I.