PTRE
tet off plazmit sistemine oksijen bağımlı yıkım bölgesi eklenerek  hipoksik şartlara bağımlı çalışan vektör sisteminin tasarlanması ve iskemik  şartlardaki karakterizasyonunun yapılması / Designing a vector system that works in hypoxic conditions by adding oxygen dependent degradation (ODD) domain to ptre / tet-off plasmid  system and chacterization of the system in ischemic conditions
Yazar: AYŞE ÇELİK
Danışman: DOÇ. GÜLAY GÜLEÇ CEYLAN
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen tedavisi = Gene therapy ; Hipoksi = Hypoxia ; Prolin = Proline ; Sentetik biyoloji = Synthetic biology ; Transkripsiyon-genetik = Transcription-genetic ; İskemi = Ischemia

Özet:
İskemi, dokulara giden kan akımının kesilerek dokuda hücresel metabolizma 
için gerekli olan oksijen ve glikoz desteğinin ortadan kalkmasıdır. İskemik 
semptomlar belirgin olmadığı için hastalar zamanında gerekli tedaviyi 
alamamaktadır.  Yapılan bu çalışmada, iskemi  hasarlarına karşı etkin bir tedavi 
geliştirilmesi adına, hipoksi durumunda  hedef terapötik protein  regülasyonunu 
tetikleyecek bir gen terapi sistemi geliştirilmesi amaçlanmıştır.
HIF-1α hücre içinde oksijen  homeostazisi  düzenlenmesinde görev alan temel
bir  transkripsiyon faktörüdür. Hipoksi durumunda,  oksijen bağımlı hidroksillenme
azaldığı  için hücre içi miktarı artar. Bu  vasfı,  ODD bölgesinin  varlığından kazanır. 
ODD bölgesini, TetR-VP16 transaktivatör proteini  ile hibrit hale  getirip  yeni bir gen 
sistemi oluşturmak tezin temelini oluşturmaktadır. Bu gen sistemi,  transaktivatör ve 
reportör iki plazmitten oluşmaktadır. Bir plazmitten sürekli olarak kimerik TET-ODD  proteini  üretilirken,  sadece  hipoksik durumda hücre içinde stabil kalan TET-ODD transkripsiyon faktörü hedef terapötik gen ekspresyonunu başlatacaktır.
Yapılan deneylerde,  tasarlanan ODD bağımlı gen sisteminden hipoksik 
şartlarda  hedef protein ekspresyonunda  4 kata kadar artış izlendi  (n=3, p<0.05). 
Ayrıca, western blot ile kimerik TET-ODD proteinin  hipoksi  stabilizasyonunda 6 
katlık fark gözlendi. IF antikor testi ile de TET-ODD protein lokalizasyonunun 
ağırlıklı olarak sitoplazmada olduğu belirlendi.  Ayrıca, yapılan protein 
modellemeleri ile tasarlanan kimerik proteinin  yüksek  verimde çalışacak formu 
ODD-TetR-VP16 transkripsiyon faktörü olarak belirlendi. Tasarlanan TET-ODD gen 
sisteminin  hipoksiye verdiği ilk 6 saat  içerisinde  yanıt  vermesi,  iskemik durumlarda 
gen terapisinde  kullanılmak için yararlı ve geliştirilebilir nitelikte  olduğunu 
göstermektedir.


Anahtar Kelimeler: Gen terapisi, Hipoksi, Prolin rezidüsü, Sentetik Biyoloji,
Transkripsiyon Faktörü.

Abstract:
Tissue hypoxia, or ischemia, is the condition that describes the poor 
conveyance of oxygen and other vital products to tissues and organs.  Ischemia 
progress silently, patients miss timely and proper treatments. In order to provide 
cardiovascular protection against ischemia and reperfusion, we are developing a 
vigilant gene therapy system whose expression level can be automatically up 
regulated by hypoxic ischemia. 
HIF-1α is a transcription factor that functions as a master regulator of oxygen 
homeostasis. HIF-1α protein levels increase under hypoxic conditions because of 
decreased O2 dependent prolyl-hydroxylation. ODD domain of HIF-1α was used as a 
switch to turn on the target gene expression in response to hypoxic signal.  This
hypoxia inducible plasmid system is a double plasmid system: transactivator plasmid 
and reporter plasmid. Chimeric transcription factor  (TET-ODD)  is being produced 
constantly  from transactivator plasmid. In  hypoxic  condition,  TET-ODD  can stay 
stabilized in the cell and triggers expression of target gene.
Our experiments showed that the ODD-mediated expression could quickly 
increase 4 fold within  6  hours of hypoxia  (n=3) (p<0.05).  Also, localization and 
stabilization of TET-ODD transcription factor was proved by immunofluorescence 
assay (IF) ad western blotting (WB) analysis. WB results showed that expression of 
TET-ODD protein increase 6-fold. The IF test showed that ODD linked tTA proteins 
were localized mainly in the cytoplasm.  The ODD-TETR-VP16 protein showed 
high-ranking hydroxylation stability under hypoxia in  protein modelling.  From these 
results, we concluded that this hypoxia inducible double plasmid system could be 
used therapeutically to switch on genes that have proven beneficial effects in 
ischemia.

Keywords: Gene Threapy, Hypoxia, Proline residue, Synthetic Biology,
Transcription Factor