Farklı kültür ortamlarında MDCK hücrelerinde osteopontin düzeyleri ve böbrek taş oluşumu ile ilişkileri
Osteopontin levels in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells grown under different culture conditions and their reletionships with kidney stones
Yazar: NESLİHAN TAŞÇENE
Danışman: PROF. DR. HİLAL KARAGÜL
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Çalısmada, böbrek epitel hücrelerinden idrara salgılanan ve üriner sistemdetas olusumuna karsı özellikle de kalsiyum okzalat tası olusumuna karsısavunma mekanizmasında önemli bir rolü oldugu düsünülen osteopontinintas olusumunu indükleyen CaCl2, MgSO4, Sodyumsitrat, Na2HPO4, Kalsiyumokzalat solusyonları kullanılarak farklı kültür ortamları olusturulan MDCK(Köpek Böbrek Hücre Kültürü) hücrelerindeki ve vasata salınandüzeylerindeki degisikliklerin incelenmesi, olusturulan farklı kültürortamlarındaki hücrelerde osteopontinin lokalizasyonunun arastırılması veçalısmada kullanılan kimyasalların MDCK hücreleri üzerine etkilerinin fazkontrast mikroskop ile görüntülenmesi amaçlanmıstır.Bu çalısmada, MDCK hücrelerinde RT-PCR ve agar jel elektroforezmetotları kullanılarak osteopontin ekspresyonu gösterilmistir. MDCKhücrelerine CaCl2, MgSO4, Sodyumsitrat, NaHPO4, Kalsiyum okzalatsolusyonları eklenerek MDCK hücrelerinin ölmeden 1 hafta yasayabildikleridozlar tespit edilmis ve bu solusyonların eklenmesi sonucunda farklı kültürortamları olusturulmustur. Olusturulan bu farklı kültür ortamlarındaosteopontin düzeyleri, kontrol hücrelerindeki düzeylerle karsılastırılmıstır.Osteopontinin hücre içerisinde sentezlenip hücre dısına sekrete edilen birprotein olması nedeniyle farklı kültür ortamlarındaki vasata salgılanandüzeyleri ile kontrol grubundaki düzey arasındafark olup olmadıgına bakılmıstır. Endo-H ve Endo-F testleri ile osteopontininizoformları tespit edilmistir. MDCK hücreleri üzerine CaCl2, MgSO4,Sodyumsitrat, NaHPO4, Kalsiyum okzalat solusyonlarının etkileri, faz kontrastmikroskopla görüntülenmistir. Farklı kültür ortamlarındaki ve kontrolgrubundaki MDCK hücrelerinde osteopontinin yerlesimi gösterilmistir.MDCK hücrelerine Kalsiyum klorür (CaCl2), Sodyumhidrojen fosfat(Na2HPO4), Magnezyum sülfat (MgSO4), Sodyum sitrat (Na3C6H5O7) veSodyum okzalat (NaOx) çözeltileri eklenerek elde edilen farklı kültürortamlarındaki ve ekstrasellüler matrikse salınan osteopontin düzeylerindekontrol gruplarıyla karsılastırılmaları sonucunda herhangi bir farklılık tespitedilememistir. Osteopontin düzeylerinde fark tespit edilememesiyle birlikteCaCl2 eklenmis grubun faz kontrast mikroskobik görüntüsünde yer yerkalsiyum birikintilerinin, kalsiyum okzalat eklenen grupta ise hücreleretutunmus halde kalsiyum okzalat kristallerinin olustugu gözlenmistir. AyrıcaNa-sitrat ve Kalsiyum okzalat eklenen gruplarda immunofloresans metoduylaosteopontin antijeniyle isaretlenmis preparatların konfokal lazer mikroskobikincelemesinde osteopontinin hücre içi lokalizasyonlarında kontrol grubunagöre farklılıklar tespit edilmistir. Her ikisin de osteopontinin hücre içi homojendagılımının bozuldugu ve fibriler kümelenmeler tarzında hücre zarına dogrubiriktigi gözlenmistir.Osteopontinin post translasyonel modifikasyonları tam olarak anlasılmısolmamakla beraber fosforilize olmus osteopontinin, böbrekte hidroksi apatitve kalsiyum okzalat kristallerinin gelisip tutunmasını engelledigi tespitedilmistir. Osteopontinin tas olusumuyla ilgili yapılacak çalısmalardadüzeylerden çok fosforile ve glikozile formlarla ilgili olarak yapılacakarastırmalar daha faydalı olacaktır.Osteopontinin fonksiyonlarını açıklayabilmek amacıyla osteopontinizoformlarının yapıları ve modifikasyonları hakkında daha çok arastırmayaihtiyaç duyulmaktadır. Böylelikle osteopontinin izoformları ve hastalıklarınolusum mekanizmaları arasındaki iliskinin açıklanabilecegi düsünülmektedir.Anahtar kelimeler: Osteopontin, MDCK hücre hattı, RT-PCR, Western blot,Böbrek tası

Abstract:
Osteopontin is synthesized within the kidney and secreted into the urine byepithelial cells and can inhibit forming the kidney stones especially calciumoxalate stones. The aim of this study is to compare levels of osteopontin incontrol grup and different MDCK (Canine Kidney) culture conditions thatmade with CaCl2, MgSO4, Sodiumcitrate, Na2HPO4 and NaOx/ CaCl2solutions, also levels of secreted osteopontin in control grup and differentMDCK culture conditions. Another objective of the study is determination ofosteopontin localization in different culture conditions and monitorize effectsof chemicals that used in the study on MDCK cells with phase contrastmicroscope.In this study, osteopontin expression in MDCK cells was investigatedwith RT-PCR and agar gel electrophoresis methods at Hannover VeterinaryHighscholl Institute of Biochemistry. MDCK cells that were treated withCaCl2, MgSO4, Sodiumcitrate, Na2HPO4 and NaOx/ CaCl2 solutions anddoses arranged that MDCK cells could live at least one week in thissolutions. As a result it has been made different MDCK cell cultureconditions. Osteopontin levels were compared in different MDCK cells andcontrol MDCK cells. Osteopontin produce in MDCK cells and than secretesout of the cells. Because of this, secreted osteopontin levels in differentMDCK cell culture and control grup were investigated. Endo-F and Endo-Htests for discovering isoforms of OPN were done. Effects of CaCl2, MgSO4,Sodiumcitrate, Na2HPO4 and NaOx/ CaCl2 solutions on MDCK cells weremonitorized with phase contrast microscope. Osteopontin localization indifferent culture conditions and control MDCK cells were determined.Osteopontin levels in different MDCK (Canine Kidney) cultureconditions that made with CaCl2, MgSO4, sodium citrate, Na2HPO4 andNaOx/ CaCl2 solutions and secreted in extracelluler matrix were comparedwith control grups. As a result, there wasn?t found any differences betweenthe groups. Although this results, calcium islets were observed in cells thattreated with CaCl2 and calcium oxalate crystals which binded to the cellswere observed in cells that treated with NaOx/CaCl2 solution. Additionally,intracellular distribution of OPN in cells that made with sodium citrate andNaOx/CaCl2 solutions were monitored by confocal microscopy onpreparations immunolabeled with anti-OPN antibodies and were indicatedthat groups have differences from control and other groups. Although there isa homogen distribution of osteopontin in cells of control MgSO4 andNa2HPO4 groups, osteopontin conglomerates near the cell membran weremonitored in cells which were treated with sodium citrate and NaOx/CaCl2.Although the precise post translational modifications of the osteopontinare unknown, it can inhibit crystal nucleation and growth of hydroxyapatiteand calcium oxalate in kidney. In the future studies about osteopontin role inkidney stones, osteopontin forms (phosphorilated and glycosylated forms)are more usefull than levels of osteopontin.In order to explain functions of OPN, it is necessary that making moreresearches about structures and modifications of OPN isoforms. It isnecessary to determine the relation between OPN isoforms and diseases.Key Words: Osteopontin, MDCKcell line, RT-PCR, Western blot, KidneyStone.