Bacillus megaterium M22'den lipaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of the lipase enzyme from Bacillus megaterium M22
Yazar: REFİYE TEKİNER
Danışman: DOÇ. DR. ELİF LOĞOĞLU
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Lipazlar (triaçilgliserol açilhidrolaz, EC. 3.1.1.3), mikro-sulu çevrede rol oynamaları ve hidroliz, esterifikasyon, transesterifikasyon (interesterifikasyon, aminoliz, asidoliz, alkoliz) reaksiyonlarını katalizleme yeteneklerine bağlı olarak endüstride geniş bir uygulama alanına sahiptir. Kimyasal olarak sentezi zor olan özel bileşiklerin üretimini stereo ve bölgesel spesifik özellikleri ile kolaylaştırmaları, ester bağına spesifik olmaları, geniş spektrumdaki substratları kullanabilme kabiliyetleri, yan ürün oluşumunu önlemeleri, hidrolitik reaksiyonları katalizlemek için kofaktöre ihtiyaç duymamaları ve organik çözücülerde aktifliklerini korumaları gibi özelliklerinden dolayı lipazlar, son yıllarda özel ilgi kazanmıştır. Yapılan bu çalışmada topraktan izole edilmiş yeni bir Bacillus megaterium M22'den lipaz enzimi saflaştırılarak karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Lipaz enzimi, amonyum sülfat çöktürmesi ve DEAE-selüloz anyon değiştirme kromatografisi ile % 34,42 verim ile 4 kat saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ile lipaz enziminin molekül kütlesi 45 kDa olarak tespit edilmiştir. Bacillus megaterium M22'den saflaştırılan lipaz enziminin optimum sıcaklığı 40 °C, optimum pH değeri ise 7,0 olarak belirlenmiştir. Metanol, toluen, benzen ve klorobenzen lipaz aktivitesini büyük ölçüde arttırmıştır. Çeşitli metallerin ise lipaz aktivitesini azalttığı gözlenmiştir. Lipaz enzimi üzerine ayrıca çeşitli reaktiflerin etkisi de incelenmiştir. Bacillus megaterium M22'den saflaştırılan lipaz enziminin Michaelis-Menten kinetik sabitleri olan Km ve Vmaks değerleri ise sırasıyla 4,74 µM ve 8,13 U/ml olarak tespit edilmiştir.

Abstract:
Lipases (triacylglycerol acylhydrolase, EC. 3.1.1.3), have a wide application field in industry depending on to act in micro-aqueous environment and the capabilities of catalyze esterification, transesterification (interesterification, aminolysis, acidolysis, alcoholysis) reactions. Lipases have gained special interest in recent years because of their features such as the facilitations production of special compounds which has chemically diffucult to synthesis with stereo and regional specific features, being specific to ester bond, the capabilities of using a wide spectrum of substrates, preventing the formation of side products, not to need cofactor to catalyze hydrolytic reactions and protections activity in organic solvents. In this study, lipase enzyme from a new Bacillus megaterium M22 isolated from soil was purified and made characterization studies. The lipase enzyme was purified 4 fold with % 34,42 yield using ammonium sulfate precipitation and DEAE-cellulose anion exchange chromatography. The molecular mass of lipase enzyme was identified 45 kDa with SDS-PAGE. The lipase was purified from Bacillus megaterium M22, were determined as the optimum temperature is 40 °C and the optimum pH value is 7,0. Methanol, toluene, benzene and chlorobenzene greatly enhanced the activity of lipase. Various metals were observed to reduce the activity of the lipase. The effect of various reagents on the lipase enzyme also was examined. Michaelis-Menten kinetic constants of the lipase enzyme which were purified from Bacillus megaterium M22, Km and Vmax values of 4.74 µM and 8.13 U/ml respectively were determined.