Bir grup oksidatif stres biyogöstergesinin eş zamanlı tayini için izokratik ve gradient HPLC yöntemlerinin geliştirilmesi ve analitik yöntem geçerliliği çalışmaları
Isocratic and gradient HPLC method development and analytical method validation studies for the simultaneous determination of A group of oxidative stress biomarkers
Yazar: AYŞE ŞENGÜL
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA EMRAH KILINÇ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: 8-hidroksi deoksiguanozin = 8-hydroxy deoxyguanosine ; Analitik kimya = Analytical chemistry ; Analitik yöntem = Analytical method ; Biyobelirteçler = Biomarkers ; Deoksiadenosinler = Deoxyadenosines ; Hidroksimetil = Hydroxymethyl ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Nitrotirozin = Nitrotyrosine ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Urasil kompleksleri = Uracil complexes

Özet:
Birçok patofizyolojik olgunun temelinde yatan önemli sebeplerden olan oksidatif stresin tespiti ve izlenmesi için uzun yıllardır çalışmalar sürmektedir.  Bu bağlamda analitik olarak ölçülebilecek deneysel değişkenler olarak özellikle oksidatif stres biyogöstergelerinin keşfi ve düşük derişim aralıklarında ve matriks ortamlarda tayinlerinin yapılması son yılların önemli çalışma konularındandır. Tez çalışmamız esnasında bir grup oksidatif stres biyogöstergenin eş zamanlı sıvı kromatografik tayini için yöntem geliştirilmiş ve geliştirilen yöntemin analitik yöntem geçerliliği çalışmaları ICH Q2(R1) kılavuzuna göre gerçekleştirilmiştir. Tayini gerçekleştirilen 6 adet biyogösterge 8-hidroksi-2'-deoksiguanozin (8OHdG); 2'-deoksiuridin (2dU); 2'-deoksiadenozin (2dA); 2'-deoksisitidin (2dC); 5-hidroksimetilurasil (5HMU) ve 3-nitrotrozin (3NLT)'dir. Geliştirilen 5 farklı HPLC yöntemi HPLC-DAD yöntemleri olup, gradient koşullarda, 40OC kolon sıcaklığında, 0,3-0,7mL/dakikalık akış hızı aralığında, 200-450nm aralığında DAD spektrumu kaydedilerek, analitik kolon olarak C18 Thermo Hypersil Gold, 100x2,1mm, 3µm partikül büyüklüğüne sahip kolon kullanılarak, mobil faz (MF) olarak MFB: metanol ve MFA: 10mM H3PO4 (pH 2,5) varlığında, 20µL enjeksiyon hacmi ve otomatik örnekleyiciye ait 5OC tepsi sıcaklığında tayinler gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen her yöntemin gradient programı farklı olup optimum koşullar ayrıca saptanmıştır. Çalışılan biyogöstergelere ait standartların ekimi ile hazırlanan yapay vücut sıvılarına ait örneklerde kullanılmak üzere bir katı faz özütlemesi (solid phase extraction – SPE) yöntemi de AccuBOND II ODS-C18 SPE kartuşları kullanılarak geliştirilmiştir.

Anahtar sözcükler : 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, 8-hidroksi-2'- deoksiguanozin (8OHdG); 2'-deoxyuridine, 2'-deoksiuridin (2dU); 2'- deoxyadenosine, 2'-deoksiadenozin (2dA); 2'-deoxycytidine, 2'-deoksisitidin
(2dC); 5-hydroxymethyluracil, 5-hidroksimetilurasil (5HMU); 3-nitrotyrosine,
3-nitrotrozin (3NLT); HPLC-DAD; method validation, yöntem geçerliliği.

Abstract:
Studies are ongoing for decades for the determination and monitoring of oxidative stress, as one of the basic reasons of various pathophysiological phenomenons. Detection and quantification of oxidative stress biomarkers, as measurable analytical parameters, in low quantities in matrix environments is an important topic of the recent years. During our thesis studies methods were developed for the simultaneous liquid chromatographic determination of a group of oxidative stress biomarkers and analytical method validation studies of the developed methods were performed in accordance to the ICH Q2(R1) validation guidance. The biomarkers determined were 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8OHdG); 2'-deoksiuridin (2dU); 2'-deoxyadenosine (2dA); 2'-deoxycytidine (2dC); 5-hydroxymethyluracil (5HMU) and 3-nitrotyrosine (3NLT). The 5 different developed HPLC methods were HPLC-DAD methods in gradient conditions, assays were performed at 40OC coulumn temperature, in 0.3-0.7 mL/min flow rate range, by recording DAD spectrum in the range 200-450nm, by using C18 Thermo Hypersil Gold, 100x2,1mm, 3µm as the analytical column, mobile phases (MP) as; MPA: methanol and MPB: 10mM H3PO4 (pH 2.5), at 20µL loop volume and at 5OC rack temperature of the autosampler. Each developed method has its unique and optimized gradient programme. A solid phase extraction (SPE) method was also developed by using AccuBOND II ODS-C18 SPE cartidges for the quantifications done in the artificial body fluids prepared by spking desired amount of standards of the studied biomarkers.

Keywords: 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8OHdG); 2'-deoxyuridine (2dU); 2'-deoxyadenosine (2dA); 2'-deoxycytidine (2dC); 5-hydroxymethyluracil (5HMU);HPLC;LC-MS/MS;LC-MS.