FMOC-AA türevleri ve MTX molekülünün tek duvarlı karbon nanotüp ile etkileşimlerinin moleküler dinamik simülasyonları kullanılarak incelenmesi
FMOC-AA derivatives and investigation of the interactions of MTX molecule with single wall carbon nanotubes using molecular dynamic simulations
Yazar: SILA KILIÇ
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE ÖZGE KÜRKÇÜOĞLU LEVİTAS
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kimya Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Karbon nanotüp = Carbon nanotube ; Moleküler dinamik benzetimi = Molecular dynamic simulation

Özet:
1991 yılında keşfedilen tek duvarlı karbon nanotüpler (TDKNT'ler) üstün kimyasal, mekanik ve termo-fiziksel özellikleri nedeniyle son yıllarda oldukça ilgi görmektedir. Karbon nanopartiküllerin hareketliliği ve yüksek penetrasyonu, KNT'leri ilaç, protein ve genetik materyel taşımak için ve aşıların geliştirilmesinde doğru bir aday haline getirmektedir. Farmasötik bileşikler yüksek yüzey alanına sahip KNT'lerin yüzeyine veya içine yüklenebilirler. İlaç taşıyıcı uygulamalar dışında TDKNT'ler kemik iskelesi, hücresel görüntüleme, tümör yıkımı gibi biyomedikal uygulamalarda gelecek vadeden malzemelerden biridir. Sentetik bir karbon allotrop olan KNT'lerin karakterizasyonu ve biyouyumluluklarının arttırılması için nanotüpler kaplanarak fonksiyonelleştirilmektedir. KNT'lerin toksitelerini düşürmek, biyouyumluluğunu ve sudaki dağılımını artırmak için kaplamada hidrofilik fonksiyonel gruplar kullanılmaktadır.
Bu tez çalışmasında, KNT'lerin non-kovalent kaplanmasında 9-florenilmetil kloroformat (Fmoc) – amino asit türevlerinin uygunluğu hesaplamalı ve deneysel çalışmalar ile araştırılmıştır. Deneysel çalışmalara yön vermek ve deneysel bulguları moleküler seviyede yorumlamak için Monte Carlo ve moleküler dinamik simülasyonları yapılmıştır. Deneysel veri ile uyumlu olarak (6,6) TDKNT'ler 8,14 Å çapında 24,6 Å uzunluğunda modellenmiştir. İlk aşamada, nanotüpler Materials Studio (MS) paket programında Fmoc - amino asit yapısının 6 farklı türeviyle kaplanarak fonksiyonelleştirilmiştir. Amino asit grupları olarak, glisin (Gly), histidin (His) fenil alanin (Phe), triptofan (Trp), tirozin (Tyr), ve sistein (Cys(Trt)) çalışılmıştır. Yapıdaki Fmoc aromatik grubu TDKNT aromatik yüzeyine kovalent olmayan bağlar ile adsorplanırken, amino asitler ile nanotüplerin biyouyumlulukların geliştirilmesi hedeflenmiştir. Ayrıca, çalışılan amino asitlerin Gly hariç hepsinin nanotüp yüzeyine adsorplanmayı destekleyecek aromatik grupları vardır. Monte Carlo simülasyonları ile Fmoc-amino asit türevleri nanotüp yüzeyine adsorplanmıştır. Elde edilen konfigürasyonların minimum enerjileri art arda enerji minimizasyonu  ve moleküler dinamik simülasyonlarını izleyen bir protokol ile araştırılmıştır. Buradan, Fmoc-amino asit türevleri ve TDKNT arasındaki etkileşim enerjileri hesaplanmıştır. En iyi etkileşimi gösteren Fmoc-Cys(Trt)-OH (-34,58 kkal/mol), Fmoc-Trp-OH (-30,95 kkal/mol) ve kontrol grubu olarak Fmoc-Gly-OH (-25,41 kkal/mol) klasik moleküler dinamik simülasyonları ile incelenmiştir. Simülasyonlar Forcite modülünde COMPASS güç alanında NVT topluluğu ve periyodik sınır şartlarında 10 ns uzunluğunda açık çözücü modeli ile gerçekleştirilmiştir. Adsorplanan moleküllerin her biri için KNT yüzeyi ve birbirleri arasında yapmış oldukları etkileşimlerin çeşitleri ve boyutları, ve ayrıca su ile etkileşimleri incelenmiş; KNT'den desorplanma yatkınlıkları simülasyon süresi boyunca ölçülmüştür. Bu çalışmalar sonucunda, Fmoc-Cys(Trt)-OH)-TDKNT kompleksinin araştırılan yapılar arasında en stabil olduğu sonucuna varılmıştır.  
Devamında, moleküler dinamik simülasyonları sonucu elde edilen (Fmoc-Cys(Trt)-OH)-TDKNT kompleksine kanser ilacı olan Mitoxantrone (MTX)'in yüklenmesi araştırılmıştır. Bu doğrultuda, farklı ilaç konsantrasyonuna sahip iki ayrı ilaç – nanopartikül kompleksi sistemi oluşturulmuştur. Fonksiyonelleştirme çalışmalarındaki parametreler takip edilerek gerçekleştirilen simülasyonların sonucu elde edilen bulgular değerlendirilerek ilaç konsantrasyonun KNT yüzeyine ilaç yükleme üzerindeki etkisi tartışılmıştır. 
MS paket programında gerçekleştirilen fonksiyonelleştirme çalışmalarından elde edilen veriler doğrultusunda iki Fmoc-amino asit, Cys ve Trp belirlenmiş, NAMD yazılımı ile moleküler dinamik çalışmaları CHARMM güç alanında 200 ns uzunluğunda NVT topluluğu ve periyodik sınır şartlarında yürütülmüştür. Amino asitlerin serbest bağlanma enerjileri AMBER yazılımında MM-GBSA ile hesaplanmış ve TDKNT'ye olan adsorplanma/desorplanma yatkınlıkları simülasyon süresi boyunca ölçülmüştür. Çalışmanın devamında simülasyon sonucu oluşan yapıların susuz konfigurasyonları alınmış ve Fmoc-amino asit konsantrasyonu ile aynı olacak şekilde ilaç molekülü her iki sistemde de oluşturulan f-KNT'lerin etrafına konumlandırılmıştır. NAMD yazılımında gerçekleştirilen fonksiyonelleştirme işlemindeki prosedür takip edilerek klasik MD simülasyonları koşulmuş, ilaç moleküllerinin KNT'ye uzaklıkları hesaplanarak f-KNT yapılarının ilaç taşıyıcı sistemlerdeki kullanılabilirliği tartışılmıştır. 
İki farklı kuvvet alanı olan COMPASS ve CHARMM aynı sistemler için karşılaştırılmış; NAMD yazılımı ile sistemin kararlılığı daha uzun simülasyonlar ile ölçülmüştür. İki kuvvet alanından ve simülasyonlardan elde edilen bulgular birbiriyle uyumludur. Fmoc-Cys(Trt)-OH molekülleri TDKNT'yi istenilen seviyede en iyi etkileşim enerjisi (COMPASS, etkileşim enerjisi -34,58 kkal/mol) ve serbest bağlanma enerjisi (CHARMM, MM-GBSA -17,17 kkal/mol) ile kaplamıştır. Bunu, -30,95 kkal/mol etkileşim enerjisi (COMPASS) ve -14,84 kkal/mol serbest bağlanma enerjisi (CHARMM) ile Fmoc-Trp-OH molekülleri takip etmektedir. Kompleksler sulu ortamda stabildir. 
Eş zamanlı olarak yürütülen deneysel çalışmalarda ise, TDKNT simülasyonların önerdiği Fmoc-Cys(Trt)-OH ve Fmoc-Trp-OH ile fonksiyonelleştirilmiştir. İlk etapta, kaplama veriminin hesaplanması için TGA analizi yapılmıştır. Fonksiyonelleştirilmiş TDKNT'ler ve kaplanmamış TDKNT'ye kanser ilacı MTX 9,1 pH ve oda sıcaklığında yüklenmiş ve salım çalışmaları 5,5 pH ve 37 OC sıcaklıkta gerçekleştirilmiştir. Yükleme verimleri ve kümülatif salım ilaç miktarları hesaplanmıştır. Fmoc-Cys ve Fmoc-Trp ile fonksiyonelleştirilmiş KNT'ye sırasıyla %99,20 ve %98,63, fonksiyonelleştirilmemiş KNT'ye ise %98,26 ilaç yüklenmiştir. Bu yapıların ilaç salım sonuçlarını sırasıyla %36,67, %35,31 ve %34,91 değerler takip etmektedir.
Hesaplamalı ve deneysel sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, Fmoc-Cys(Trt)-OH moleküllerinin TDKNT'lerin sudaki dispersiyonunu arttırdığı; kanser ilacı MTX'in fonksiyonelleştirilmiş TDKNT'ye yüklenebildiği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
Discovered in 1991, single-walled carbon nanotubes (SWNTs) have attracted a lot of attention in recent years due to their superior chemical, mechanical and thermo-physical properties. The mobility and high penetration of carbon nanoparticles make CNTs a good candidate for the delivery of drugs, proteins and genetic material, and for the development of vaccines. Pharmaceutical compounds can be loaded onto or into the surface of high surface area CNTs. Apart from drug delivery applications, TDCNTs are one of the promising materials in biomedical applications such as bone scaffolding, cellular imaging, and tumor destruction. In order to characterize CNTs, which is a synthetic carbon allotrope, and to increase their biocompatibility, nanotubes are functionalized by coating. Hydrophilic functional groups are used in the coating to reduce the toxicity of CNTs, increase their biocompatibility and dispersion in water.
In this thesis, the suitability of 9- fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc) - amino acid derivatives in non-covalent coating of CNTs was investigated by computational and experimental studies. Monte Carlo and molecular dynamics simulations were performed to guide experimental studies and to interpret experimental findings at molecular level. Consistent with the experimental data, (6.6) SWNTs were modeled with a diameter of 8.14 Å and a length of 24.6 Å. In the first stage, nanotubes have been functionalized by coating with 6 different derivatives of Fmoc - amino acid structure in Materials Studio (MS) package program.  As amino acid groups, glycine (Gly), histidine (His), phenyl alanine (Phe), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), and cysteine (Cys(Trt)) have been studied.  While the Fmoc aromatic group in the structure is adsorbed on the SWNT aromatic surface with non-covalent bonds, it is aimed to improve the biocompatibility of amino acids and nanotubes.  In addition, all of the studied amino acids, except Gly, have aromatic groups that will support adsorption to the nanotube surface. With Monte Carlo simulations, Fmoc-amino acid derivatives were adsorbed on the nanotube surface. The minimum energies of the resulting configurations have been investigated with a protocol that followed sequential energy minimization and molecular dynamics simulations.  From this, the interaction energies between Fmoc-amino acid derivatives and SWNT were calculated.  Fmoc-Cys(Trt)-OH (-34.58 kcal/mol) showing the best interaction; Fmoc-Trp-OH (-30.95 kcal/mol) and Fmoc-Gly-OH (-25.41 kcal/mol) as control group were investigated by classical molecular dynamics simulations. 
The simulations were carried out in the Forcite module with the NVT ensemble in the COMPASS power field and a 10 ns long open solver model in periodic boundary conditions. For each of the adsorbed molecules, the CNT surface and the types and dimensions of their interactions with each other, as well as their interactions with water, have been investigated; the susceptibility to desorption from CNT has been measured during the simulation period.  As a result of these studies, it was concluded that the Fmoc-Cys(Trt)-OH)-SWNT complex was the most stable among the investigated structures.
Subsequently, the loading of the cancer drug Mitoxantrone (MTX) into the (Fmoc-Cys(Trt)-OH)-SWNT complex obtained as a result of molecular dynamics simulations was investigated.  Accordingly, two separate drug nanoparticle complex systems with different drug concentrations were created. The effect of drug concentration on drug loading on the CNT surface was discussed by evaluating the results obtained from the simulations performed by following the parameters in the functionalization studies.
Two Fmoc-amino acids, Cys and Trp, were determined in line with the data obtained from the functionalization studies carried out in the MS package program, and molecular dynamics studies were carried out with NAMD software in the CHARMM power field with a 200 ns long NVT ensemble and periodic boundary conditions. The free binding energies of amino acids have been calculated by MM-GBSA in AMBER software and their adsorption/desorption susceptibility to SWNT has been measured during the simulation period.  In the continuation of the study, the non-aqueous configurations of the structures formed as a result of the simulation were taken and the drug molecule was positioned around the f-CNTs formed in both systems so that the Fmoc-amino acid concentration was the same.  By following the procedure in the functionalization process performed in NAMD software, classical MD simulations were run, and the usability of f-CNT structures in drug delivery systems was discussed by calculating the distances of drug molecules to CNT.  Two different force fields, COMPASS and CHARMM, have been compared for the same systems; With the NAMD software, the stability of the system was measured with longer simulations.  Findings from the two force fields and simulations are in agreement.  Fmoc-Cys(Trt)-OH molecules coated SWNT with the best interaction energy (COMPASS, interaction energy -34.58 kcal/mol) and free binding energy (CHARMM, MM-GBSA -17.17 kcal/mol) at the desired level. This is followed by Fmoc-Trp-OH molecules with -30.95 kcal/mol interaction energy (COMPASS) and -14.84 kcal/mol free binding energy (CHARMM). The complexes are stable in aqueous media.
In simultaneous experimental studies, SWNT was functionalized with Fmoc-Cys(Trt)-OH and Fmoc-Trp-OH suggested by simulations. In the first step, TGA analysis was performed to calculate the coating efficiency. The cancer drug MTX has been loaded to the functionalized SWNTs and uncoated SWNTs at 9.1 pH and room temperature, and the release studies have been carried out at 5.5 pH and 37 °C.  Loading efficiencies and cumulative release drug amounts have been calculated. Fmoc-Cys and Fmoc-Trp functionalized CNT has been loaded with 99.29% and 98.71%, respectively, and unfunctionalized CNT has been loaded with 98.24% drug. This corresponds to drug loading amounts of 1.98 mg for Fmoc-Cys, 1.97 mg for Fmoc-Trp and 1.96 mg for uncoated SWCNT, respectively, versus 1 mg of SWCNT. The drug release results of these structures are followed by values of 36.67%, 35.31% and 34.91% respectively. 
Cumulative release drug amounts If it is desired to give the amount of drug released into the environment per 1 mg of CNT, these values were calculated as 0.73 mg, 0.70 mg and 0.69 mg of released drug amounts for Fmoc-Cys(Trt)-OH and Fmoc-Trp-OH functionalized SWCNT and unfunctionalized SWCNT, respectively. As a result of the drug loading and release study, no significant difference was detected between the values of the three samples studied in the experimental calculations.
The functionalization efficiency of the Fmoc-Cys(Trt)/SWCNT complex is higher than the other samples, thanks to the stacking of the aromatic rings in the side chains to the structure. When the computational and experimental results are evaluated together, it was found that Fmoc-Cys(Trt)-OH molecules increased the dispersion of SWNTs in water; It has been concluded that the cancer drug MTX can be loaded on functionalized SWNT.