Sığır böbrek korteksi glutatyon redüktazın saflaştırılması ve bazı özelliklerinin saptanması
Purification and characterization of bovine kidney cortex glutathione reductase
Yazar: BERİVAN TANDOĞAN ERESER
Danışman: PROF. DR. N. NURAY ULUSU
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Böbrek = Kidney ; Böbrek korteksi = Kidney cortex ; Glütatyon redüktaz = Glutathione reductase ; Kinetik = Kinetics ; Sığırlar = Cattles ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
. Glutatyon redüktaz (GR, NADPH: okside glutatyon oksidoreduktaz, EC 1.6.4.2) antioksidan metabolizmada önemli rol oynayan bir flavoenzimdir. Bu çalışmada sığır böbrek korteks GR' si yüksek verim ve saflaştırma oranıyla saflaştırılıp, moleküler ve kinetik özelliklerinin belirlenmesi ve metal iyonları, ilaç ve doğal maddeler ile inhibisyonunun incelenmesi amaçlanmıştır. Glutatyon redüktaz ısı bozunumu, 2 ? , 5 ? - ADP- Sepharose 4B afinite ve DEAE-Sepharose Fast Flow iyon değiştirici kromatografik yöntemler kullanılarak sığır böbrek korteksinden 34 806 kez ve % 85 verimle, 727 U/mg protein özgül aktivite ile saflaştırıldı. Enzimin alt birim molekül ağırlığı, Sephadex G-200 ve SDS poliakrilamid jel elektroforezi yöntemleri ile 56 ± 2 kDa olarak bulundu. Enzimin optimum sıcaklık ve pH' sı 50 ? C ve 7,2 olarak saptandı. Enzimin izoelektrik noktası kromatofokuslama yöntemi kullanılarak 6,8 olarak belirlendi. Kinetik mekanizmasının dallı mekanizmaya uyduğu belirlenerek, KmNADPH 18 ± 3 ?M ve KmGSSG 65 ± 5 ?M olarak hesaplandı. NADP+ nın NADPH' ye karşı inhibisyonunun kompetitif ve Ki değerinin 115 ± 7 ?M olduğu, GSSG' ye karşı NADP+' nın enzimi unkompetitif olarak inhibe ettiği sonucuna varıldı ve Ki= 298 ? 10 ?M olarak hesaplandı. GSH inhibisyonunun NADPH ve GSSG' ye karşı non-kompetitif tipte sırasıyla Ki 8,055 ± 0,33 olarak Ki=7,203 ± 0,36 olarak hesaplandı. Ayrıca Cd2+, Zn2+ ve Ni2+ iyonları; Echium vulgare, Sideritis brevibracteata, Asphodelus aestivus, Eremostachys laciniata gibi bitkilerden elde edilen bileşikler ve imatinib ve kolşisin gibi ilaçların enzim üzerindeki etkisi incelendi.

Abstract:
Glutathione reductase (GR, NADPH: oxidized glutathione oxidoreductase, EC 1.6.4.2) is a flavoenzyme which play important role in antioxidative system. The aim of this study is; purification of bovine kidney cortex GR with a high yield and purification fold, determination of molecular and kinetic properties and investigation of inhibition with metal ions, drugs and natural products. Glutathione reductase was purified from the bovine kidney cortex 34 806-fold with a final yield of 85 % and specific activity of 727 U/mg by 2 ? , 5 ? - ADP- Sepharose 4B affinity and DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography steps and a heat denaturation step. The subunit molecular weight of the enzyme was found to be 56 ± 2 kDa by Sephadex G-200 gel filtration chromatography and SDS Poliacrylamide gel electrophoresis. Optimum temperature and pH were 50 °C and 7.2 respectively. The isoelectric point of the enzyme was found to be 6,8 by chromatofocusing. Kinetic characterization of bovine kidney cortex GR is branched mechanism, KmNADPH 18 ± 3 ? M and KmGSSG 65 ± 5 ? M were determined. The inhibition by NADP+ was competitive with respect to NADPH and (Ki) of NADP+ as 115 ± 7 ? M. NADP+ inhibition type was found to be uncompetitive with respect to GSSG, and Ki was calculated as 298 ± 10 ? M. GSH was found to be a noncompetitive inhibitor with respect to both substrates, GSSG and NADPH and Ki was calculated as 8.055 ± 0.33 mM, 7.203 ± 0.36 respectively. Effects of Cd2+, Zn2+ and Ni2+ ; compounds isolated from Echium vulgare, Sideritis brevibracteata, Asphodelus aestivus, Eremostachys laciniata and drugs such as imatinib and colchicine on bovine kidney cortex GR was also investigated.