Karpuz (Citrullus lanatus (thumb.) matsum. et naksi) rizosferinden Streptomyces bakterilerinin izolasyonu, teşhisi ve moleküler karakterizasyonu
Isolation, identification and characterisation of streptomyces spp. isolated from rhizosfere soils watermelon (Citrullus lanatus (thumb.) matsum. et naksi)
Yazar: VEYSİ KIZMAZ
Danışman: PROF. DR. EKREM ATALAN
Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu araştırmanın amacı Diyarbakır havzasında yetişen karpuz bitki rizosferinde yaşayan Streptomyces bakterilerini izolasyonu, koloni sayımı, nümerik taksonomisi, bilgisayar yardımı ile bazı suşları teşhisi ve 16S rDNA geninin PCR ile çoğaltıp DNA baz dizilerine göre uluslararası gen bankalarındaki verilerle kıyaslayarak teşhis edildi. Bu amaç için iki selektif besi ortamı kullanılarak bakterilerin izolasyonu yapıldıktan sonra renk gruplandırması yapıldı. İzolatları temsilen seçilen 24 Streptomyces izolatı nümerik taksonomisi yapıldıktan sonra bilgisayar yardımı ile teşhisleri yapıldı. Akabinde toplam 10 Streptomyces izolatının genomik DNA ektraksiyonundan sonra PCR ile hem kısmi hem de tüm 16S rDNA geni çoğaltıldı. Üç izolatın PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ürünlerinin DNA baz dizileri tespit edilerek NCIB (National Centre for Biotechnology Institute) gen bankası verileri ile kıyaslanarak hem filogenetik dendogram oluşturuldu hem de teşhisleri yapıldı. İzolatların baz dizileri NCBI Gen bankasına kaydedildi.İzolasyon petrilerindeki Streptomyces koloni sayıları 0,5x104 ile 37,76x104 cfu/gr kuru toprak arasında değişti. Streptomyces ve actinomycetes koloni saysısı ile toprakların fizikokimyasal karakterleri arasında korelasyon belirlenemedi. Toplam 85 Streptomyces izolat saflaştırılarak renk gruplandırması sonucu 12 renk grubuna ayrıldı. Numerik analiz sonucu oluşturulan dendogramda 24 izolat 3 büyük küme (2'den fazla suş içerdi) ve 3 tek üyeli küme oluşturdu. Farklı karpuz bitki rizosferinden izole edilen Streptomyces suşları genelde aynı kümede yer alamadılar ve heterojen kümeler oluşturdular. Tüm test suşları bilgisayar yardımı ile fenetik veri içeren (PIBWin) Bakteryal Teşhis Programı kullanılarak 24 Streptomyces test suşundan 16'sı doğru olarak teşhis edildi. Yine toplam 10 temsilci izolat Sm5r ve Sm6f primerleri kullanılarak 16S rDNA geni kısmi olarak PCR ile çoğaltılması sonucu 570 bp uzunluğunda DNA segmenti elde edildi. Baz dizilerinin NCBI GenBank verileri ile ChromasPro ve Vector-NTI programları kullanılarak analizleri sonucu İzolatlarımızdan biri (YB6B4) %99 benzerlik oranıyla Streptomyces sp. ve YA2B2 izolatı %99 benzerlik oranı ile Streptomyces collinus olduğu tesbit edildi. Tüm 16S rDNA PCR ürünü tek organizma için elde edildi ve baz dizisinin analizi sonucu bu türün (YB10B4) Acinetobacter calcoaceticus olduğu belirlendi. Çalışmalarımız farklı coğrafik alanlarda yetişen Karpuz bitkilerinin rizosferi çoğunlukla benzer Streptomyces suşlarını ihtiva ettiği belirlendi. Özellikle 16S rDNA geninin kısmi çoğaltılması sonucu 2 izolatımızın Streptomyces türü olarak belirlenmesi çalışmanın güvenilir olduğunu ortaya koymuştur.

Abstract:
The aim of this study is to isolate Streptomyces from rhizphere of watermelon grown in Diyarbakır basin, counting total bacterial colonies, carring out numeric analysis, identification of some strains by computer assisted identification system and analysing DNA base sequences of partial and whole 16S rDNA gene amplified by PCR (Polimeraz Chain Reaction). For this aim, colour grouping of isolates were carried out after isolation of bacterial colonies on two different selective isolation plates. 24 Streptomyces isolates were identified using computer assisted program after numeric taksonomy of these organisms. Partial and whole 16S rDNA amplification genomic DNA of 10 organisms were carried out after genomic DNA extraction of microorganisms. Both phyligenetic dendogram and identification of three isolates were carried out by comparing DNA sequences of PCR product of three isolate with NCBI (National Center for Biotechnology Information) Genbank. Base sequences of isolates were accesesed into NCBI Genbank.The number of Streptomyces were ranged from 0,5x104 to 37,76x104 cfu/gr dry soil. No corelation found between Streptomyces and actinomycetes colonies count with physicochemical characters of soils. Total 85 Streptomyces strains were purified and they assigned to 12 colour groups. 24 isolates were assigned to 3 major cluster (included 2 or more organisms) and 3 single member cluster on dendogram of numeric analysis. In general, strains isolated from different watermelon rhisophere were not in same cluster and generated heterojen clusters. 16 out of 24 test microorganisms were identified with Bacterial Identification Program (PIBWin) containing phenetic data of bacteria. 570 bp DNA segment of 2 out of 10 representative strains were observed when Sm5r and Sm6f primer used in PCR amplification of partial 16S rDNA. One of our isolate (YB6B4) was identified as Streptomyces spp with 99% similarity while other strain YA2B2 identified as Streptomyces collinus with 99% similarity using ChromasPro ve Vector-NTI software to compare DNA sequences with NCBI Genebank data. PCR amplification of 16S rDNA was yielde for one strains (YB10B4) and identified as Acinetobacter calcoaceticus after analysis of DNA sequence with the gene bank. Our findings show that different rhisopheres of watermelon plants grown various geographic fields contain similar Streptomyces strains. Identification of two isolate as Streptomyces spp using particularly partial DNA sequences of 16S rDNA show the study is reliable.