İnsan safen veninde TNF-alfa indüksiyonu ve alfa lipoik asidin vasküler yanıtlar üzerine etkileri
Effect of TNF-alpha induction and alpha lipoic acid on vascular responses in human saphenous vein
Yazar: TAŞKIN KALKAN
Danışman: PROF. DR. BUKET REEL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı / Farmakoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Kalp hastalıkları = Heart diseases ; Koroner arter bypass = Coronary artery bypass ; Lipoik asit = Lipoic acid ; Matriks metalloproteinazlar = Matrix metalloproteinases ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Safen ven = Saphenous vein ; Sitokinler = Cytokines ; Tümör nekroz faktörü-alfa = Tumor necrosis factor-alpha

Özet:
Amaç: Koroner arter baypas greft (KABG) cerrahisinde kullanılan greftlerin uzun dönem açıklık oranı; inflamatuvar sitokinlerin aşırı salınımı, çinko-bağımlı proteolitik ve inflamatuvar enzimler olan matriks metalloproteinazların (MMP'ler) artmış ekspresyon/aktivitesi, ekstraselüler matriks (ESM) birikimi ve oksidatif stres indüksiyonu gibi bir takım patolojik süreçlere bağlı olarak gelişen restenoz nedeniyle düşüktür. Çalışmamızda insan safen ven (İSV) segmentlerinde proinflamatuvar bir sitokin olan Tümör Nekrozis Faktör-α (TNF-α)' nın oksidatif stres, pro ve aktif MMP-2, MMP-9, MMP-14 ve TIMP-2 ekspresyonları, proliferasyon ve vasküler disfonksiyonu üzerindeki etkileri ile evrensel bir antioksidan olarak kabul edilen alfa-lipoik asit (ALA)' in bu etkiler üzerinde oluşturduğu değişikliklerin araştırılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: KABG operasyonuna alınan hastalardan alınan İSV segmentleri (n=7), endotelyum tabakası ipek iplikle nazikçe uzaklaştırıldıktan sonra 4 halkaya ayrılmıştır. Halkalar 24 saat boyunca 20 ng/ml TNF-α ve/veya 2 mM ALA içeren RPMI 1640 ortamında inkübe edilmiştir. İşlem görmemiş halkalar kontrol olarak adlandırılmıştır. Süperoksit anyon (O2-) ve diğer reaktif oksijen türleri (ROT) düzeyleri lusigenin/luminol kemilüminesans yöntemiyle; MMP-2 ve MMP-9 ekspresyon/aktiviteleri jelatin zimografi yöntemiyle; MMP-14, TIMP-2 ve α-düz kas aktini (α-SMA) ekspresyonları ise immünohistokimyasal olarak incelenmiştir. İSV halkalarında izole organ banyosu sistemi kullanılarak potasyum klorür (KCl), noradrenalin (NA), serotonin (5-HT) ve prostaglandin F2α (PGF2α)' ya karşı kasılma yanıtları ve asetilkolin (ACh) ile papaverin hidroklorüre karşı gevşeme yanıtları alınmıştır.
Bulgular: TNF-α, O2- ve diğer ROT düzeylerini artırarak oksidatif stresi indüklemiştir. Ayrıca TNF-α, MMP-2 ekspresyon/aktivitesi ile MMP-14 ve α-SMA ekspresyonlarını arttırırken; TIMP-2 ekspresyonunu azaltmıştır. Bununla birlikte ALA, TNF-α aracılı etkileri önemli ölçüde inhibe etmiştir. İSV halkaları kullanılarak yapılan organ banyosu deneylerinde TNF-α KCl, NA, 5-HT ve PGF2α' ya karşı kontraktil yanıtları anlamlı şekilde azaltmıştır. 24 saat boyunca tek başına ALA uygulanan halkalarda tüm kontraktil ajanlara karşı kasılma yanıtları istatistiksel olarak anlamlı şekilde azalmış ve belirgin bir gevşeme yanıtı oluşmuştur. Buna karşın TNF-α' ya ilave olarak ALA uygulanan İSV halkalarında ALA' nın tek başınayken oluşturduğu gevşeme yanıtları maskelenerek azalmıştır. İSV halkalarında papaverin hidroklorüre karşı oluşan gevşeme yanıtları TNF-α ve/veya ALA' dan etkilenmemiştir. Diğer yandan TNF-α ve/veya ALA ile birlikte yapılan inkübasyon İSV halkalarının tüm kontraktil ajanlara karşı duyarlılığında istatistiksel olarak anlamlı bir etki oluşturmamıştır.
Sonuç: KABG cerrahisi geçiren hastalarda (özellikle diyabet öyküsü bulunan) ALA, greft vazospazmının, inflamatuvar süreçlerin ve oksidatif hasarın neden olduğu erken greft restenozunun önlenmesine, greft açıklığının ve fonksiyonel performansın korunmasına katkıda bulunabilir.
	
Anahtar Kelimeler: alfa-lipoik asit; tümör nekrozis faktör-α; inflamasyon; matriks metalloproteinazlar; oksidatif stres; insan safen veni; koroner arter baypas greft operasyonu

Abstract:
Objective: Long-term patency rate of grafts used in coronary artery bypass graft (CABG) surgery is low due to restenosis depending on a number of pathological processes such as excessive release of inflammatory cytokines, increased expression/activity of matrix metalloproteinases (MMPs) which are zinc-dependent proteolytic and inflammatory enzymes, extracellular matrix (ECM) deposition and induction of oxidative stress. The aim of the present study was to investigate the effect of Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), a proinflammatory cytokine, on oxidative stress, expressions of pro- and active-MMP-2, MMP-9, MMP-14 and TIMP-2, proliferation and vascular dysfunction, and the changes caused by alpha-lipoic acid (ALA) which is known as universal antioxidant in human saphenous vein (HSV) grafts.
Materials and Methods: HSV grafts (n=7) obtained from patients undergoing CABG surgery were divided into 4 rings after the endothelium layer was gently removed. The rings were incubated in RPMI 1640 medium containing 20ng/ml TNF-α and/or 2 mM ALA for 24hrs. Untreated rings were called as controls. Levels of superoxide anion and other reactive oxygen species (ROS) were determined by lucigenin/luminol chemiluminescence assay. MMP-2 and MMP-9 expression and/or activities were examined by gelatin zymography and MMP-14, TIMP-2 and α-Smooth Muscle Actin (α-SMA) expressions were studied by immunohistochemistry in the HSV rings. Contractile response to potassium chloride (KCl), noradrenaline (NA), serotonine (5-HT) and prostaglandin F2α (PGF2α) and relaxation responses to acetylcholine (ACh) and papaverine hydrochloride were performed by using an isolated organ bath system in HSV rings.
Results: TNF-α induced oxidative stress by increasing superoxide anion and other ROS levels. Furthermore, while TNF-α increased MMP-2 expression/activity and expressions of MMP-14 and α-SMA, it reduced TIMP-2 expression. However, ALA significantly inhibited TNF-α-mediated effects. TNF-α significantly reduced contractile responses to KCl, NA, 5-HT and PGF2α in organ bath experiments using HSV rings. In the rings treated with ALA for 24 hours, responses to all contractile agents were significantly decreased and a distinct relaxation response occurred. On the other hand, when ALA and TNF-α were co-incubated, the relaxation responses induced by ALA in HSV rings were masked and reduced. Papaverine hydrochloride-induced relaxation were not affected by TNF-α and/or ALA treatment. Moreover, incubation with TNF-α and/or ALA did not have a significant effect on the susceptibility of HSV rings to all contractile agents.
Conclusion: In patients undergoing CABG surgery (especially those with a history of diabetes), ALA may contribute to the prevention of graft vasospasm, early graft restenosis caused by inflammatory processes and oxidative damage, and preservation of graft patency and functional performance.	
Key Words: alpha-lipoic acid; tumor necrosis factor-α; inflammation; matrix metalloproteinases; oxidative stress; human saphenous vein; coronary artery bypass graft surgery