Benign MS hastalarının B hücre immünfenotiplenmesi ve B hücresine özgü moleküllerin ekspresyon analizi
B cell immunophenotyping and expression analysis of B cell specific molecules of benign MS patients
Yazar: MELİS ŞEN
Danışman: PROF. DR. ERDEM TÜZÜN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı / Sinirbilim Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Nöroloji = Neurology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: B lenfositleri = B lymphocytes ; Biliş = Cognition ; Gen ifadesi = Gene expression ; Moleküller = Molecules ; Multipl skleroz = Multiple sclerosis ; Teşhis testleri = Diagnostic tests ; İmmünofenotip tayini = Immunophenotyping

Özet:
Multipl Skleroz (MS);aksonal dejenerasyona,demiyelinizasyona ve inflamasyona bağlı olarak gelişen,merkezi sinir sistemini etkileyen progresif bir hastalıktır. MS immün aracılı inflamatuar bir hastalıktır ve patogenezinde B ve T hücreleri rol oynamaktadır. MS plaklarında plazma B hücrelerinin, miyeline spesifik antikorların ve bu antikorlarca etkinleştirilmiş kompleman faktörlerinin varlığı tespit edilmiştir. Ayrıca B hücre yüzey belirteci olan CD20'ye karşı geliştirilen monoklonal antikor tedavilerinin progresif evredeki MS olgularında iyileşmeye yol açtığı bilinmektedir. Bu bulgular B lenfosit temelli immünolojik parametrelerin hastalığın prognozunun tayininde belirteç olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Çalışmaya, benign MS'te B hücrelerinin rollerini değerlendirmek amacıyla, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalı, MS polikliniğine gelen 20 Benign MS hastası ile 16 Benign olmayan MS hastası ve kontrol grubu olarak 28 sağlıklı gönüllü dahil edildi. PKMH'deki B hücresine yönelik spesifik belirteçler akım sitometresi ve gen ekspresyon analizi ile değerlendirildi. Mikroarray analizi ile tanımlanan B lenfosit ilişkili genlerin gerçek zamanlı PCR ile periferik kan hücrelerindeki ekspresyon düzeyleri belirlendi. Kognitif ve motor işlevlerin değerlendirilmesi için hastalara geniş bir panel uygulandı. Klinik, kognitif ve motor işlevlerle gen ekspresyon düzeyleri arasındaki korelasyon analiz edildi.
Benign MS olgularının periferik kan örneklerinde efektör hücreler olan bellek B ve plazma hücrelerinin düşük, anti-inflamatuar özellikli düzenleyici B hücrelerinin ise yüksek bulunduğu saptandı. Mikroarray analizi sonucunda benign ve benign olmayan MS olgularının arasındaki en büyük farkın B hücresi ile ilişkili genlerde görüldüğü saptandı. Gerçek zamanlı PCR çalışmalarında benign ve benign olmayan MS olguları arasında gen ekspresyon düzeyleri açısından anlamlı fark saptanmadı. Motor işlevlerle ilgili olan 9 delikli test ve 25 ayak yürüme testinde benign MS'te benign olmayan MS'e göre daha iyi performans saptanırken kognitif işlevlerde anlamlı fark saptanmadı. Korelasyon analizi sonucunda ise; gen ekspresyon düzeyleri ile demografik veriler ve B hücre alt tip oranları ile gen ekspresyon düzeyleri arasında korelasyon saptanmadı. Gen ekspresyon düzeyleri ve kognitif testler arasında ise BANK1 ile yürütücü işlevlerle ilgili olan pasat ve cowat testleri arasında ters korelasyon belirlendi
Benign MS olgularında pro-inflamatuar B hücre tipleri azalmakta ve anti-inflamatuar B hücreleri ise artmaktadır. Ayrıca anti-inflamatuar özelliği olduğu bilinen sitokinlerden TGFb'nın ekspresyon düzeyleri benign MS olgularında artma eğilimi göstermekte idi. Bu bulgular B hücrelerinin MS progresyonunda önemli bir yere sahip olduğunu ve TGFb başta olmak üzere çeşitli B hücre ilişkili moleküllerin MS progresyon belirteci olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Anahtar Kelimeler :  Benign multipl skleroz, immünfenotipleme, ekspresyon analizi, kognitif testler

Abstract:
Multiple Sclerosis (MS) is a progressive disease that affects the central nervous system due to axonal degeneration, demyelination and inflammation. MS is an immune-mediated inflammatory disease and B and T cells play a role in its pathogenesis. The presence of plasma B cells, myelin-specific antibodies and complement factors activated by these antibodies in MS plaques were determined. In addition, monoclonal antibody therapy against CD20, which is a B cell surface marker, is known to lead to improvement in MS cases in the progressive phase. These findings suggest that immunological parameters based on B lymphocytes can be used as a marker for the prognosis of the disease.
In order to evaluate the roles of benign MS cells, 20 patients with benign MS and 16 patients with non-benign MS and 28 healthy volunteers were included in the study. Specific markers for B-cell in PKMH were evaluated by flow cytometry and gene expression analysis. Expression levels of B lymphocyte-related genes in peripheral blood cells were determined by microarray analysis. A wide panel was applied to the patients to evaluate cognitive and motor functions. The correlation between clinical, cognitive and motor functions and gene expression levels were analyzed.
In peripheral blood samples of benign MS, memory B and plasma cells were found to be low and anti-inflammatory regulatory B cells were found to be high. As a result of microarray analysis, the biggest difference between benign and non-benign MS cases was observed in B cell related genes. In real-time PCR studies, no significant difference was found in terms of gene expression levels between benign and non-benign MS cases. In the 9-hole test and 25-foot walk test which are related to motor functions, better performance was found in benign MS than in non-benign MS, but no significant difference was found in cognitive functions. Also, there was no correlation between gene expression levels and demographic data and B cell subtype ratios and gene expression levels. Between gene expression levels and cognitive tests, inverse correlations were determined between BANK1 and pasat and cowat tests related to executive functions.
In benign MS cases, pro-inflammatory B cell types decrease and anti-inflammatory B cells increase. In addition, the expression levels of TGF from cytokines known to have anti-inflammatory properties tend to increase in benign MS cases These findings suggest that B cells have an important role in the progression of MS and that various B cell related molecules, especially TGF, can be used as a marker of MS progression.

Key words; Benign MS, immunophenotyping, expression analysis, cognitive tests