Glutamat toksisitesi oluşturulmuş glioma hücre dizilerinde MgSo4 ve lazaroid U-83836E'nin hücre yaşam oranına etkisi
The effects of MgSo4 and lazaroid U-83836E against glutamate-induced toxicity on glioma cell lines survival
Yazar: SELDA KABADERE
Danışman: PROF.DR. RUHİ UYAR
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2002
Konu: Fizyoloji = Physiology

Özet:
ÖZET L-glutamat merkezi sinir sisteminde ana uyarıcı nörotransmiter olmasına ek olarak aynı zamanda önemli bir nörotoksin ve glial toksindir. Hücredışı ortamda glutamatın artması nöronlarda ölüme neden olduğu gibi astroglial hücrelerin şişmesine ve ardından parçalanmasına öncülük ederek bir dizi yıkıcı olayları başlatır. Nörodejeneratif hastalıklar sonrası, nöronların yaşamını sürdürmesi ve iyileşmesinde astrositlerin rolü giderek önem kazanmaktadır. Bir kez hasar oluşunca astrosit fonksiyonlarındaki azalma, merkezi sinir sistemindeki daha ileri kayıplara katılabilir. Bu nedenle astrosit yaşamının uzamasının daha ileri bir nöron korumaya olanak sağlayacağı düşünülmektedir. Lazaroidler (21 aminosteroidler) lipid peroksidasyon inhibitörü olarak geliştirilen antioksidan ilaçlardır. Özellikle travma, subaraknoid hemoraji ve iskemiye maruz kalmış beyin dokusunda güçlü bir antioksidan kapasitelerinin olduğu gösterilmiştir. Yine MgSO4'ün iskemi ve travma nedeniyle oluşan nöronal hasarı önlediği gösterilmiştir. Glial hücrelerde Mg'un ve lazaroidlerin glutamat toksisitesi üzerindeki etkisini gösteren herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Sıçan glioma hücre dizisinden elde edilen C6 hücreler, glia hücre özellik ve fonksiyonlarının tanımlanmasında kullanılmaktadır. C6 hücreleri ve iki adet insana ait glioblastoma multiforme hücreleri % 5 CO2, 37 °C ve % 100 nem içeren inkübatörde çoğaltıldı. Öncelikle hücreler üzerinde L-glutamatın % 50 öldürücü dozu belirlendi. Elde edilen dozda L-glutamat 24 saat süreyle uygulandı ve ardından uzaklaştırılarak, MgSÜ4 veya U-83836E dozları besiyerine eklendi. 24 saat sonra hücrelerin yaşama oranlarını gösteren 3-(4,5-Dimethylthyazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue (MTT) testi uygulandı. Elde edilen veriler tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey'in çok yönlü karşılaştırma testi ile istatistiksel olarak değerlendirildi. Ayrıca L-glutamat ile birlikte ve ardından Ca2+ içermeyen besiyeri, inositol trifosfat (IP3) kapılı kalsiyum kanallarını bloklayan heparin, hücre dışındaki Ca2+'u tutan 111etilen diamin tetra asetikasit (EDTA), 10 veya 50 mM CaCl2 kullanılarak L-glutamat toksisitesinde Ca2+ iyonlarının rolü ortaya konmaya çalışıldı. Yine L-glutamat ile birlikte ardından Mg2+ bulunmayan besiyeri ve 2, 5, 10, 50 veya 100 mM MgSO4 kullanılarak, eksitotoksisitede Mg iyonlarının rolü araştırıldı. C6 ve insan glioma hücrelerinde sırasıyla 0.01 mM MgSO4'ün % 17, % 15 ve % 5; 1 uM U-83836E'nin % 12, % 13 ve % 4.9 oranında hücre yaşam oranında artışa neden olduğu ortaya kondu. Üç hücrenin canlı hücre yoğunluğunda, Ca2+'suz besiyeri grubunda % 23, 17 ve 21, EDTA grubunda % 44, 30 ve 34, heparin grubunda %23, % 10 ve % 17, 10 mM CaCl2 grubunda % 34, % 17 ve % 22, 50 mM CaCl2 grubunda % 44, % 24 ve % 27 oranında azalma görüldü. Mg 'suz besiyeri grubunda ise canlı hücre miktarında % 13, % 20 ve % 18'lik bir azalma belirlendi. Sadece 2 mM MgSO4 hafif bir koruma sağlarken, besiyerine MgSO4 'ün artan dozlarda eklenmesi ise toksisiteyi daha da arttırdı. Sonuç olarak, MgSO4 ve U-83836E glutamatın neden olduğu hücre ölümünü 9+ tam olarak engelleyememesine rağmen, verilerimiz Mg iyonları ve serbest radikal oluşumunun olayda küçük de olsa rolü olduğunu önermektedir. Oysa L-glutamat toksisitesi ile Ca2+ iyonları arasında doğrudan bir ilişki kurulamamıştır. Anahtar kelimeler: L-glutamat, MgSO4, lazaroid U-83836E, glioma, hücre çoğalması.

Abstract:
SUMMARY L-glutamate is the major excitatory neurotransmitter as well as an important neurotoxin and gliotoxin in the central nervous system (CNS). Elevated extracellular L- glutamate levels have been shown to change astrocytic volume. Furthermore, L- glutamate induces a sequence of degenerative events that leads to the lysis of the cultured astrocytes. The role of astrocytes in promoting neuronal survival and recovery following cerebral insult is becoming increasingly appreciated. Once damaged, the resulting reductions in astrocyte function may further contribute to CNS losses. In concert with improving astrocyte survival, advanced neuroprotection would be expected. The 21-aminosteroids, or lazaroids, are potent inhibitors of lipid peroxidation in neural tissue and have been developed for the acute treatment of CNS injury, ischemia or subarachnoid hemorrhage. It has been shown that MgSC>4 also improves neuronal injury after ischemia and trauma. The possible effect of MgSC>4 and lazaroids on glutamate toxicity on glial cells has not been studied yet. C6 rat glioma and human glioblastoma multiforme cells were grown in an incubator atmosphere of 5 % CO2, 37 °C and 100 % humidity. First, the determined IC50 value of L-glutamate was given for 24 hours and removed, and then MgSÛ4 or U- 83836E doses were added to the culture medium. After 24 hours 3-(4,5- Dimethylthyazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue (MTT) test was done. For the statistical analysis one-way ANOVA following Tukey's multiple comparison tests were used. In addition we have tried to show the role of Ca2+ on L-glutamate toxicity by using Ca2+ free medium, heparin which blocks inositol triphosphate (IP3) gated calcium channels, ethilendiamine tetraaceticacid (EDTA) which blocks extracellular Ca2+, 10 mM or 50 mM CaCİ2. We have also attempted to show the role of Mg2+ ions by using Mg2+ free medium, 2, 5, 10, 50 or 100 mM MgS04.We have found that MgS04 at the dose of 0.01 mM increased C6 and human glioma cell growth by 17, 15 and 5 %, respectively. At the dose of 1 uM U-83836E also increased C6 and human glioma cell growth by 12, 13 and 4.9 %, respectively. The medium used without Ca2+decreased the survival of C6 and two human glioma by 23, 17 and 21 %, respectively. EDTA decreased the cell survival of C6 and two human glioma by 44, 30 and 34 %, respectively. The heparin caused a decrease of the survival of C6 and two human glioma cell by 23, 10 and 17 %, respectively. 10 and 50 mM CaCb decreased the cell survival of C6 and two human glioma cells by 34, 17 and 22 %, and by 44, 24 and 27 %, respectively. It is found that Mg2+ free medium declined the cell survival of the three sources by 13, 20 and 18 %, respectively. Although MgS04 at the dose of 2 mM slightly increased the cell survival, addition of increased amount of MgSC>4 to the cultures increased the toxicity. In conclusion, although MgSC>4 and U-83836E do not strongly block glutamate- induced cell death, it is suggested that Mg2 + ions and free radical production may have a small role. It is also suggested that L-glutamate toxicity does not related directly with Ca2+ ions. Key words: L-glutamate, MgSC>4, lazaroid U-83836E, glioma, cell proliferation.