Asetilkolin biyosensörünün hazırlanması, alzheımer tedavisi için yeni asetilkolinesteraz inhibitörlerinin sentezi, spektrofotometrik ve elektrokimyasal yöntemlerle inhibisyon özelliklerinin incelenmesi
Preparation of acetylcholine biosensor, synthesis of novel acetylcholine inhibitors for alzheimer treatment, investigation of inhibition properties with spectrophotometric and electrochemical methods
Yazar: ELİF AYNACI
Danışman: PROF. DR. AHMET YAŞAR
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tez çalışması üç bölümden oluşmaktadır; birinci bölümde, polipirol-polivinilsülfonat (PPy-PVS) filme asetilkolinesteraz (AChE) ve kolin oksidaz (ChO) enzimlerinin immobilize edilmesiyle yeni bir asetilkolin (ACh) biyosensörü başarıyla hazırlandı. AChE ve ChO enzimleri PPy-PVS filme gluteraldehit ve sığır serum albumin (SSA) kullanılarak çapraz bağlama ile immobilize edildi. ACh tayini enzimatik olarak açığa çıkan H2O2'in +0,3 V'da yükseltgenmesi ile yapıldı. pH ve sıcaklık etkisi araştırıldı ve optimum parametreler sırası ile 9,0 ve 65 °C olarak bulundu. 1,0x10-8-1,0x10-7 M (R2=0,994) ve 1,0x10-7-1,0x10-6 M (R2=0,994) aralıklarında iki doğrusal çalışma bölgesi gözlendi. Biyosensörün tayin sınırı 5,0x10-9 M ve cevap süresi 200 s'dir. Enzim elektrodun ayrıca tekrar kullanılabilirliği ve depolama kararlılığı çalışıldı. Tekrar kullanılabilirlik sonuçları biyosensörün 18 ölçüm sonunda başlangıç aktivitesinin % 83,1'ini koruduğunu gösterdi ve bağıl standart sapması % 4,4 olarak bulundu. Hazırlanan ACh biyosensörünün +4 °C'de ve 0,1 M pH 9,0 glisin tamponu içerisinde 35 gün sonunda başlangıç aktivitesinin % 31'ini muhafaza ettiği gözlendi. Tezin ikinci bölümünde, takrinin (9-amino-1,2,3,4-tetrahidroakridin) farklı aldehitler (salisilaldehit ve türevleri) ile meydana getirdiği yeni Schiff bazı türevleri (serisi) sentezlendi. Takrin Alzheimer hastalığı tedavisinde ilaç olarak kullanılmış bir ilaçtır ve tersinir bir AChE inhibitörüdür. Sentezlenen bileşiklerin yapıları elementel analiz, TGA, FT-IR, 1H-NMR, 13C-NMR spektroskopisi ile karakterize edildi. Tezin üçüncü bölümünde, sentezlenen bileşiklerin AChE aktivitesi hem spektrofotometrik hem de elektrokimyasal olarak araştırıldı. Spektrofotometrik Ellman yöntemi kullanılarak yapılan deneyler sonucunda inhibitörlerin IC50, Ki, Km, Vmax değerleri hesaplandı ve inhibisyon türleri belirlendi. Tüm bileşiklerin tersinir AChE inhibitör özelliğine sahip olduğu görüldü. Spektrofotometrik çalışmalar sonucunda sentezlenen bileşiklerin takrinden daha iyi AChE inhibisyon özelliği gösterdiği sonucuna ulaşıldı. Bileşiklerin IC50 değerleri birinci bölümde hazırlanan ACh biyosensörü ile elektrokimyasal olarak da tayin edildi ve sonuçlar karşılaştırıldı.

Abstract:
This study consists of three parts. In the first part, a novel amperometric acetylcholine (ACh) biosensor with immobilization of acetylcholinesterase-choline oxidase (AChE-ChO) on polypyrrole-polyvinylsulphonate (PPy-PVS) film has been successfully prepared. AChE and ChO enzymes were immobilized on PPy-PVS film by cross-linking with glutaraldehyde and bovine serum albumine (BSA). Determination of ACh was carried out by oxidation of enzymatically produced H2O2 at +0.3 V The effects of pH and temperature were investigated and optimum parameters were found to be 9.0 and 65 °C, respectively. Two linear parts in the region between 1.0x10-8-1.0x10-7 M (R2 =0.994) and 1.0x10-7-1.0x10-6 M (R2=0.994) were observed. The detection limit of the biosensor was 5.0x10-9 M and response time of the biosensor was 200 s. Storage stability and reproducibility of the enzyme electrode were also studied. Reproducibility results showed that 83.1% of the response current was retained after 18 activity assays and relative standart deviation was found out as 4.4%. It was observed that the prepared ACh biosensor retained 31% of its initial activity after 35 days storage in 0.1 M pH 9.0 glycine buffer solution at 4 °C. In the second part of the study, new Schiff base derivatives of tacrine (9-amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine) were synthesized with different aldehydes (salicylaldehyde and its derivatives). Tacrine has been used as a drug for the treatment of Alzheimer's disease and is a reversible AChE inhibitor. Compounds were characterized by elemental analysis, TGA, FT-IR, 1H-NMR, 13C-NMR spectroscopy. In the third part of the study, AChE activity of the synthesized compounds were investigated both spectrophotometrically and electrochemically. Inhibitors' IC50, Ki, Km, Vmax values were calculated by the spectrophotometric Ellman method as a result of the experiments and inhibition types were determined. It was seen that all compounds had the property of a reversible AChE inhibitor. As a result of spectrophotometric studies, it was concluded that synthesized compounds showed a greater property of AChE inhibition than tacrine. Compounds' IC50 values were also determined electrochemically by an ACh biosensor which was prepared in the first part of the study and results were then compared.