Tavuklarda İnfeksiyöz Bronşitis Virüs (IBV) suşlarının Real Time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) kulllanılarak araştırılması.
Investigation of Infectious Bronchitis Virus (IBV) Strains by Real Time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
Yazar: ENGİN ALP ÖNEN
Danışman: PROF. DR. N. YAKUT ÖZGÜR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Bronşit = Bronchitis ; Bronşiyal hastalıklar = Bronchial diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Tavuklar = Chickens

Özet:
Bu çalışmada, real time RT-PCR kullanılarak, tavuklardan alınan trakeal svab örneklerinden infeksiyöz bronşitis virusunün (IBV) saptanması ve S1 geninin çok değişken gen bölgelerini (HVR) dizilimleyerek, filogenetik ilişkilerin belirlenmesi amaçlanmıştır.Tesadüfi örnekleme ile solunum sistemi semptomları gösteren 120 tavuktan (broyler) trakeal svab ile örnek alındı. Virüs miktarını ve dolayısı ile genetik materyali arttırmak amacıyla SPF embriyolu tavuk yumurtalarının allantoik kesesi içine inokulasyon yapıldı ve 24 - 72 saat arayla iki pasaj daha gerçekleştirildi. Allantoik sıvılar toplanarak viral RNA ekstraksiyon işlemi için High Pure Viral RNA kiti (ROCHE) kullanıldı. Sonrasında Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis kiti (ROCHE) kullanılarak RNA lardan cDNA elde edildi. cDNA lar elde edildikten sonra Light Cycler 2.0 (ROCHE) ile Taqman çift işaretli prob ve IBV5_GU391 ve IBV5_GL533 primer çifti ile real time RT-PCR işlemi gerçekleştirildi. Real time RT-PCR ile 120 örneğin 33 (%27.5) sinde IBV pozitifliği saptandı. Pozitif örneklere ait cDNA lar S1 genindeki çok değişken bölgelerinin (HVR) amplifikasyonu için, C2U ve Ag0723 primerleri ile amplifiye edilip, amplifikasyon ürünleri %1 agaroz jelde elektroforeze tabi tutuldu, ethidium bromid ile boyanarak UV ışığında incelendi. Elektroforez sonrası 33 örnekten pozitif kontrollere ait bantlar High Pure PCR Product Purification kiti (ROCHE) ile agaroz jelden elde edilip saflaştırıldı. Örneklere ait bant elde edilmedi. Daha sonra S1 5'mod ve CK2 primerleri ile de bir amplifikasyon gerçekleştirildi ve buradaki bantlarda High Pure PCR Product Purification kiti (ROCHE) ile agaroz jelden elde edilip saflaştırıldı. Saf PCR ürünleri direkt olarak otomatik bir dizilim cihazı ile dizilimlendir. Dizilimleme sonuçları gen bankası veritabanı ile karşılaştırıldı. H120 ve M41 kontrol suşlarına ait bantlar gen bankası verileri ile eşleşmdi. Örneklere ait dizilimlerin ise eşleşmediği gözlendi.Bu çalışma göstermiştir ki sürüler aşılanmış olsalar dahi varyant suşlar tarafından hastalığa yakalanabilmektedirler. Bu sonuç, klasik aşı suşları ile yapılan aşılamanın varyant suşlara karşı çapraz koruma sağlamadığını göstermektedir.

Abstract:
In this study, detection of IBV from chicken tracheal swab samples by real time RT-PCR, which was reported as a rapid and sensitive virus detection method, was aimed. Also determination of phylogenetic relations in different field and variant strains of IBV by sequencing of hyper variable regions (HVRs) of S1 gene of IBV was also aimed.Tracheal swab samples were taken from 120 broiler chickens with respiratory signs, randomly. Then, samples were inoculated into the allantoic sacs of SPF embryonated chicken eggs to increase the infectious bronchitis virus and its genetic materials quantity. Two more passages were performed at 24 - 72 hours intervals. Allantoic fluids were harvested and perform RNA extraction processes by High Pure Viral RNA kit (ROCHE). Then, RNA`s were translated to cDNA?s by Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis kit (ROCHE). After the cDNA?s were obtained, real time RT-PCR was performed with double labelled Taqman probe, IBV 5 GU391 and IBV5 GL533 primers pair in Light Cycler 2.0 (ROCHE). Positive results were obtained in 33 samples of 120 (%27.5) by real time RT-PCR. cDNA?s from positive samples were used for amplification HVRs in S1 gene region with C2U and Ag0723 primers, then electrophoresis of the products were run in 1% agarose gel. After electrophoresis, the gels were stained in ethidium bromide and viewed on ultraviolet light. Any samples? bands have not been detected by C2U and Ag0723 primers. After electrophoresis, positive controls bands were extracted and purified from gel by High Pure PCR Product Purification Kit (ROCHE). Also samples were amplified by S1 5?mod and CK2 primers and then samples bands were extracted and purified from gel by High Pure PCR Product Purification Kit (ROCHE). Then, purified PCR products were sequenced directly by a sequencing device. Sequencing results have been compared with Gen Bank?s database.Gene sequence which belongs to M41 and H120 have been matched with Gen Banks data. But, gene sequence which belongs to samples couldn?t been matched with Gen Banks data.This study shows that birds can be infected by IBV variant strains, although they were vaccinated. These results demonstrade that vaccination by clasical vaccine strains of IBV doesn?t provide cross proteciton against variant strains