Zoledronat imatinib'e duyarlı kronik myeloid lösemi hücre hattı olan k562'de stat yolağı üzerinden apoptozisi indüklemektedir
Zoledronate induces apoptosis via stat pathway in imatinib-sensitive chronic myeloid leukemia cell line K562
Yazar: HATİCE DEMET KİPER
Danışman: PROF. DR. GÜRAY SAYDAM
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Difosfonatlar = Diphosphonates ; JAK 2 = JAK 2 ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Zoledronik asit = Zoledronic acid

Özet:
AMAÇ:İmatinib direnci ve yanıtsızlığı, Kronik Myelositer Lösemi (KML) tanılı hastalarda ciddi bir sorundur. Mutasyonların yanı sıra, moleküler mekanizma olarak bcr/abl'nin bazı yan yolakları kullanarak kendi fosforilasyonunu arttırdığı da saptanmıştır. Bu yolaklardan bir tanesi geranil geranil transferaz enzimidir ve yapılan çalışmalar bu enzimin zoledronat ile inhibe edilebileceğini göstermiştir. Bu çalışmada; zoledronatın bu enzim dışında, hücre içi STAT yolağıyla da etkileşimi olabileceği teorisine istinaden İmatinib-duyarlı K562 [ Ph(+) KML hücre dizisi] kullanarak; Zoledronat'ın KML hücre hattında STAT yolağı üzerinden apopitozisi indüklediğinin gösterilmesi hedeflenmiştir.YÖNTEMLER:K562 hücre dizisi 24 saatlik zaman dilimlerinde zoledronat ile muamele edilmiş ve ilacın IC50 değeri XTT proliferasyon analizi ile bulunmuştur. Daha sonra, IC50 dozunda zoledronat ile muamele edilen hücrelerde Annexin V kiti kullanılarak apopitozis değerlendirilmiştir. Aynı zamanda, potansiyel hedef olan STAT yolağı üyelerinden STAT 3, STAT 5a ve STAT 5b'nin mRNA düzeyinde transkripsiyonu gerçek zamanlı PCR ile zamana bağımlı olarak ve kantitatif olarak değerlendirilmiştir. Verilerin doğrulanması amacıyla hücrelerde sitozolik fraksiyon ekstraksiyonu yapılmış ve western blot metodu ile protein ekspresyonları değerlendirilmiştir.SONUÇLAR:XTT sonuçlarına göre, zoledronat'ın K562 hücreleri üzerine doza bağımlı olarak sitotoksik etkileri olduğu belirlenmiş ve IC50 değeri 60 mikroM olarak saptanmıştır. Annexin V ile 60 mikroM zoledronat uygulanan hücrelerde apopitoz oranları 48-72-96. saatlerde sırasıyla %31-%34-%35 olarak bulunmuş ve %10 apopitozis saptanan kontrol grubuna göre anlamlı artış olarak değerlendirilmiştir. PCR verilerine göre STAT 3 ekspresyonunun zamana bağımlı olarak 96.saatte %70 baskılandığı, STAT 5a ekspresyonunun 72. saatten sonra baskılanmaya başlayarak 96. saatte %85 ile belirgin olarak baskılandığı ve STAT 5b ekspresyonunun yine zamana bağımlı olarak %72 düzeyinde baskılandığı gözlenmiştir. Western blot analizlerine göre, STAT 3, 5a ve 5b'nin protein ekspresyonlarında zamana bağımlı olarak, özellikle 72 ve 96.saatte belirgin azalma izlenmiştir.TARTIŞMA:Elde edilen sonuçlar zoledronat'ın KML'de STAT yolağı üzerinden STAT 3,5a ve 5b ekspresyonlarını baskılayarak apoptozisi indüklediğini göstermektedir. Bir bifosfonat olan zoledronat'ın in vitro koşullarda STAT yolağı üzerinden apotozisi indüklediğinin gösterilmesi, geniş klinik çalışmalar ile de doğrulanabilirse, KML tedavisine katkıda bulunacak bir terapötik ajan olarak umut verici gözükmektedir.

Abstract:
Background. Although development of tyrosine kinase inhibitors have revolutionized the CML therapy, resistance to targeted drugs is a frequent clinical problem. To overcome this, targeting alternative downstream regulators of BCR-ABL is probably the best therapeutic strategy. In this study, we aimed to evaluate the cytotoxic and apoptotic effects of Zoledronate on Imatinib-sensitive K562 human chronic myeloid leukemia cells and to examine the roles of signal transducers and activator of transcription proteins (STATs) on zoledronate-induced apoptosis.Methods. Cell viability and cytotoxicity tests were conducted by using Trypan blue dye exclusion and XTT assays, respectively. Apoptotic analyses were performed by AnnexinV-EGFP staining method and fluorescence microscopy. Expression levels of STAT3, -5A and -5B genes were analysed in Zoledronate-treated K562 cells by qRT-PCR. To confirm the data, protein expressions of mentioned genes were evaluated by Western Blot analysis.Results. The results showed that zoledronate decreased viability and proliferation and induced apoptosis in K562 cells in a dose- and time-dependent manner as compared to untreated controls. Concurrently, the expressions of STAT3, STAT5A and STAT5B genes both in m(RNA) and protein levels have significantly reduced in zoledronate-treated K562 cells as compared to untreated controls.Conclusion. These data indicated that STAT inhibition by zoledronate may be therapeutic or supportive in IM-sensitive CML patients. More importantly, we have shown for the first time that zoledronate triggers apoptosis through inhibiting the expression levels of STATs in a malignancy. If it may be confirmed with large clinical studies, zoledronate may contribute to the treatment of CML as a therapeutic agent seems promising.