Yüzey plazmon rezonans temelli trombin biyosensörünün geliştirilmesi
Development of a surface plasmon resonance based thrombin biosensor
Yazar: DEMET ATAMAN SADIK
Danışman: PROF. DR. İSMAİL HAKKI BOYACI
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology

Özet:
Biyosensörlerin performansını arttırmak önemli bir hedef haline gelmiştir. Biyosensörlerin hassasiyetini, seçiciliğini arttırmak için, yüzeyde oluşabilecek sterik engellemelerin ve spesifik olmayan bağlanmaların azaltılması, kararlı biyolojik tanıyıcı tabaka oluşumu ve biyolojik tanıyıcı ajanın doğru pozisyonda bağlanması ve bu arada biyolojik aktivitesinin korunması gerekmektedir.  Tiyol ile modifiye edilmiş biyolojik tanıyıcı ajanların yüzeye bağlanmaları sırasında, kendiliğinden düzenlenen karışık tek tabakalar (mSAMs) ile yüzey üzerindeki yoğunluklarının azaltılması, hedef molekülü bağlama olasılıklarının arttırılması için sıklıkla kullanılan bir yöntem haline gelmiştir.  Çalışma kapsamında trombin ölçümü için altın yüzey üzerinde 3,3'Dithiodipropionik asit di(N-hidroksisuccinimid ester) (DSP):6-merkapto-1-hekzanol (MCH) mSAMs oluşturularak, yüzey plazmon rezonans (YPR) temelli trombin sensörü geliştirmiştir.  Yüzey immobilizasyonu gerçekleştirilirken, DSP ile birlikte kullanılan MCH ile yüzeye daha sonradan eklenecek trombin aptameri /antikorunun (biyolojik tanıyıcı ajan) yoğunluğunun azaltılması ve hedef molekülü yakalama hassasiyetinin arttırılması ve yüzeye nonspesifik ve raslantısal şekilde immobilizasyonunun ve böylece aktivitesinin azalmasının önüne geçilmesi hedeflenmiştir. Altın yüzeyin kimyasal aktivasyonu için, farklı DSP:MCH oranları (2.0:2.5, 2.0:5.0, 2.0:10.0) kullanılarak, mSAMs oluşturulmuş ve bundan sonraki aşamada DSP sayesinde trombin antikoru veya  trombin aptamerinin altın yüzey üzerine bağlanması sağlanmış ve son aşamada da oluşturulan sistemin sensör özelliği denenmiştir. Yüzey üzerinde kimyasal ve biyolojik aktivasyon ve biyosensör performansının trombin ile test edilmesi, akış hücresine bağlı YPR sistemi ile gerçekleştirilmiştir. Trombin aptamer ve trombin antikor sensörlerinin artan konsantrasyonlarda trombine verdiği sensör cevabı (∆RU), kalibrasyon grafiği olarak elde edilmiştir. Trombin aptamer sensöründe doğrusal aralık, 0.0-20.0 nM ve 20.0-100.0 nM olmak üzere iki ayrı bölgede gözükmektedir. R2 değeri birinci bölge için 0,998, ikinci bölge için 0,961 olarak hesaplanmıştır. Trombin antikor sensöründe doğrusal aralığın 22.0-100.0 nM arasında olduğu gözlemlenmiştir. R2 değeri trombin antikor sensörü için 0,992 olarak hesaplanmıştır. Bu konsantrasyon aralıkları, pıhtılaşma sırasında trombinin serum içerisinde bulunabileceği konsantrasyon aralığı (1-500 nM) içerisinde bulunmaktadır. Ölçüm sınırı (limit of detection, LOD) trombin aptamer sensörü için 9.5 nM, trombin antikor sensörü için 6.0 nM olarak hesaplanmıştır. Tayin alt sınırı (limit of quantification, LOQ) ise trombin aptamer sensörü için 30.0 nM, trombin antikor sensörü için 22.0 nM olarak hesaplanmıştır. Geliştiren her iki sensör de trombin eklenmiş gerçek serum örnekleri ile denenmiş ve trombin eklenmiş PBS örnekleri ile karşılaştırılmıştır. Trombin aptamer sensöründe, trombin eklenmiş serum örneklerinden alınan ∆RU'nun, trombin eklenmiş PBS örneklerinden alınan ∆RU' ya göre iki katı daha fazla olduğu görülmüştür. Trombin antikor sensöründe ise, trombin eklenmiş serum örneklerinden alınan ∆RU'nun ve trombin eklenmiş PBS örneklerinden alınan ∆RU'nun, birbirine yakın sonuçlar verdiği görülmüştür. Bu sonuçtan yola çıkarak, DSP:MCH (2.0:2.5) arayüzeyi ile hazırlanan biyosensör sisteminde, biyolojik tanıyıcı ajan olarak antikor kullanılımının kompleks serum matriksinde trombin ölçümü için daha doğru bir tercih olduğu düşünülmektedir. Her iki sensörün de birden fazla kullanılabilme (rejenerasyon) özelliği test edilmiştir. Trombin aptamer sensöründe, trombin aptamerinin, trombini yakalaması sonucundaki ∆RU  beş devir boyunca sabit kalmış, beşinci devirden sonra ∆RU'da azalma görülmüştür. Trombin antikor sensörünün rejenere edilemediği görülmüştür. Altın yüzey üzerinde 2mM DSP ve 20 mM MCH ile oluşturulan kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar (SAMs),  DSP:MCH (2.0:2.5) ve DSP:MCH (2.0:10.0) oranlarıyla oluşturulan mSAMs, X-ray fotoelektron spektroskopi (XPS) ve attenuated total reflectance-fourier dönüşümlü infrared spektroskopi (ATR-FTIR) ile karakterize edilmiştir. Altın yüzey, DSP:MCH (2.0:2.5) molar oranıyla modifiye ve  BSA bağlanmış  DSP:MCH (2.0:2.5) modifiye altın yüzeylerin morfolojileri, tapping mod atomik kuvvet mikroskop (AFM) ile incelenmiştir. Yüzeylerin pürüzlülük dereceleri karşılaştırılmıştır. Altın yüzeyin yüzey pürüzlülük değeri, 1.20 nm olarak hesaplanmıştır. DSP:MCH (2.0:2.5) mSAMs ile modifikasyon sonrasında, ortalama yüzey pürüzlülük değerinin  1.20 nm'den  2.20 nm'ye yükseldiği ve BSA bağlanması sonrasında 1.81 nm'ye düştüğü görülmüştür. Tez çalışmasının sonucunda, DSP:MCH arayüzeyinin biyolojik tanıyıcı ajanların bağlanması ve biyosensör geliştirilmesi için yeni bir immobilizasyon platformu olarak kullanılabileceği gösterilmiştir.

Abstract:
Enhancing the performance of biosensors has become an important task. Some of the requirements for improving the sensitivity and selectivity of these systems includes overcoming the steric hinderance issue, providing resistance to nonspecific binding, stable biological recognition layer formation and providing upright position while retaining the biological activity of the biological recognition element during the surface immobilization process.  Formation of mixed self-assembled monolayers (mSAMs) is a commonly used procedure for diluting thiol modified biological recognition elements, so that target recognition is enhanced due to reduction in steric hinderance.  In this study, a surface plasmon resonance (SPR) based sensor was developed for thrombin detection via forming 3,3' Dithiodipropionic acid di (N-hydroxysuccinimide ester) (DSP) :6-mercapto-1-hexanol (MCH) mSAMs on gold surface. During the development of the sensor surface, DSP was utilized together with MCH 1) To decrease the biological recognition element density and hence the steric hinderance effect for improving the target recognition sensitivity. 2) To minimize the risk of a loss in the biological activity of the biological recognition element by decreasing the chance of its random and nonspesific immobilization on the surface. For the chemical activation of the gold surface, different molar ratios of DSP:MCH (2.0:2.5, 2.0:5.0, 2.0:10.0) has been used for the formation of mSAMS and thrombin antibody or thrombin aptamer was immobilized on gold surface via DSP. The biosensor capability of the modified surface was tested by using the target molecule thrombin. The chemical and biological activation on the gold surface and the performance of the biosensor was tested using a flow-cell coupled SPR system. Both thrombin aptamer and thrombin antibody sensors' performance were tested with increasing trombin concentrations and calibration curves were obtained. For the thrombin aptamer sensor, the linearity was observed in two different concentration regions, namely 0.0-20.0 nM and 20.0-100.0 nM range. R2 values for the first concentration region and the second concentration region were calculated as 0,998 and 0,961 respectively. The linear range for the thrombin antibody sensor was 22.0-100.0 nM. R2 value for the antibody sensor was calculated as 0,992. These ranges are within the physiological thrombin concentration range (1-500 nM) in serum during the coagulation process. Limit of Detection (LOD) for thrombin aptamer and thrombin antibody sensors were found to be 9.5 nM and 6.0 nM respectively. Limit of Quantification (LOQ) for thrombin aptamer and thrombin antibody sensors were found to be 30.0 nM and 22.0 nM respectively. Both sensors were also tested with thrombin spiked serum samples and compared with thrombin added PBS samples. For thrombin aptamer sensor, the sensor response (∆RU) obtained for the thrombin spiked serum samples was twice as that obtained from thrombin spiked PBS samples. As for the thrombin antibody sensor, sensor response (∆RU) obtained from thrombin spiked serum samples and thrombin spiked PBS samples were similar. In the light of these results, for the biosensor system prepared using DSP:MCH (2.0:2.5) as an intermediate layer, antibody usage as a biological recognition element is thought to be a better choice for the detection of thrombin in the complex serum matrixs.  The regeneration capability of both sensors were also tested. For the aptamer based sensor, thrombin aptamer could be regenerated for five cycles. The change in the sensor response (∆RU) remained constant for five cycles and there was a decline afterwards. The antibody based sensor could not be regenerated.  X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and attenuated total reflectance-fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy were used for surface characterization of 2.0 mM DSP and 20.0 mM MCH self-assembled monolayers (SAMs), DSP:MCH (2.0:2.5) and DSP:MCH (2.0:10.0) mSAMs formed on gold surfaces. Tapping mode atomic force microscope (AFM) was utilized for the examination of surface morphology of DSP:MCH (2.0:2.5), BSA immobilized DSP:MCH (2.0:2.5) and blank surfaces. The roughness values of surfaces were determined and compared. The  average surface roughness value for the gold surface were calculated as 1.20 nm. Following the formation of DSP:MCH (2.0:2.5) mSAMs on the surface, average surface roughness value increased from  1.20 nm to   2.20 nm and decreased to  1.81 nm following BSA binding.  Based on the results of this thesis, it was shown that DSP:MCH interface could be used as a new immobilization platform for binding biological recognition elements for the development of biosensors.