SARS COV-2 PCR pozitif olgularda viral subgenomik RNA'ların ve antijen varlığının değerlendirilmesi
Evaluation of viral subgenomic rna's and antigen presencein SARSCOV-2 PCR positive cases
Yazar: KAZIM BATIHAN BÜYÜKZENGİN
Danışman: PROF. DR. ALPER AKÇALI
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antijenler = Antigens ; COVID 19 = COVID 19 ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA ; SARS virüsü = SARS virus ; Virüsler = Viruses

Özet:
SARS-CoV-2'nin pandemi ilan edilmesiyle virüsün hızlı tanı ve tedavisi önem kazandı. Laboratuvarlarda tanı amacıyla yaygın olarak PCR ve antijen testleri kullanılmaktadır. Tanı testleri, virüs genomuna yönelik tespit yapabilmektedir. Bu nedenle virüsün enfeksiyöz olup olmadığı bilinemez. Hastalarda enfeksiyöz virüsü gösterebilmek karantina süresine, tedaviye çeşitli sağlık ve ekonomik kazanımlar sunabilir. Replikatif virüsün varlığı hücre kültürü ile gösterilebilse de pandemi koşullarında bunu rutin olarak gerçekleştirmek mümkün değildir. Sadece virüsün replikasyon döneminde üretilen subgenomik RNA tespiti, aktif viral enfeksiyonu tespit edebilir ve klinisyene fikir verebilir. Antijen testleri de belli bir yük miktarından itibaren virüs tespiti yapabildiği için enfeksiyözite göstergeci olabileceği tartışılmaktadır.
Amaç: Tezin amacı PCR yöntemi kullanılarak genomik RNA yerine subgenomik RNA tespiti edilebileceğini göstermek, bu tespitin klinik önemini irdelemektir. Ayrıca antijen testi de kullanılarak subgenomik RNA pozitifliği arasındaki ilişkiyi değerlendirmektir. Hücre kültürü esasına dayanan sitopatolojiyi incelemek, replikasyonu göstermek açısından altın standart görünse de sürekli uygulanabilir değildir. Araştıracağımız bu yöntem viral bulaşıcılığı ve aktif enfeksiyonu göstermede çok farklı bir bakış açısı sunmaktadır. Ayrıca PCR yöntemleriyle replikatif/replikatif olmayan mikroorganizma ayrımı yapılamayacağı düşünülmekte olup, viral antijen saptama testi de kullanılarak hastada virüs replikasyonu olup olmadığının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Antijen testinin de viral bulaşıcılığı gösterebileceği için bunun subgenomik RNA ile birlikte değerlendirilmesi, antijen testinin önemi hakkında fikir verebilecektir.
Yöntem: Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı'na SARS-COV-2 PCR tespiti için gönderilmiş pozitif sonuçlu -80 °C'de saklanmış 109 hasta numunesi çalışmaya alındı. Bu örneklere PCR pozitifliğini doğrulama amacıyla E gen PCR gerçekleştirildi. Antijen testi, E ve N sgRNA qPCR tespiti yapıldı.
Bulgular: SARS-COV-2 PCR pozitif 109 numunenin 83'ünde (%76,14) antijen testi, 88'inde (%80,73) E gen sgRNA, 96'sında (%88,07) N gen sgRNA, 97'sinde (%89) en az bir sgRNA pozitif saptanmıştır. En az bir sgRNA tespit edildiği örneklerin %77,3'ünde, negatif olanların %66,7'sinde antijen testi pozitif bulunmuş olup bu fark istatistik olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0,475). E sgRNA ile antijen testi pozitifliği arasındaki fark anlamlı bulunmuştur (p=0,023). E sgRNA pozitif örneklerin %98,9'unda, negatif örneklerin ise %42,9'unda N sgRNA pozitif bulunmuş olup bu fark istatistiksel olarak anlamlıdır (p=0,0001). Ct değeri ≤25 için antijen testi pozitifliği oranı %98,15 (53/54), Ct 25-30 için  %57,14 (12/21), Ct ≥30 için %52,94 (18/34) bulunmuştur. E gRNA Ct değeri ≤25 ve >25 için en az bir sgRNA pozitifliği ile antijen testi pozitifliği ile arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır (p=1,0; p=0,112).
Sonuç: E gRNA Ct değeri ≤25 ve >25, ≤29 ve >29, <30 ve ≥30 arasında antijen testi pozitifliğinde bulunan fark istatistik olarak anlamlı bulunmuştur (p=0,0001). Antijen testi pozitifliği, beklendiği gibi viral yük ile ilişkili saptanmıştır. Antijen testi pozitifliği enfeksiyözite varlığının da bir yansıması olduğu için viral yük ile enfeksiyözite arasında da ilişki olabileceği gösterilmiştir. Ancak antijen testi ile subgenomik RNA pozitifiği arasında anlamlı bir fark görülmediğinden antijen testi de enfeksiyözite tespitinde önemli bir göstergeç olabilir. Enfeksiyözite göstergeci olarak sgRNA'ların kullanılabileceğini göstermek için ileri ve geniş kapsamlı çalışmalar (örn. NGS, sonuçların viral kültürle desteklenmesi gibi) gerekli görünmektedir. Subgenomik RNA tabanlı ileri çalışmalar, hastanede kalış ve sosyal izolasyon süresini kısaltabilecektir. Antijen testi ve sgRNA'ların pozitiflik oranı benzer görülmektedir, bu açıdan antijen testleri enfektiviteyi değerlendirmeye elverişli olabilir.

Abstract:
With the declaration of SARS-CoV-2 as a pandemic, importance of rapid diagnosis and treatment of the virus increased. PCR and antigen tests are widely used for diagnostic purposes in laboratories. Diagnostic tests could detect the virus genome. Therefore, it is not known whether the virus is infectious or not. Being able to indicate the infectious virus in patients could provide various health and economic benefits to the quarantine period and treatment. Although the presence of replicative virus could be demonstrated by cell culture, it is not possible to apply this routinely under pandemic conditions. Detection of subgenomic RNA which is produced only during the replication period of the virus could detect active viral infection and provide insight to the clinician. It is argued that the antigen tests could also be an indicator of infectiousness, since they could detect viruses from a certain load amount.
Aim: The aim of the thesis is to show that subgenomic RNA can be detected instead of genomic RNA using PCR method and to examine the clinical importance of this detection. It is also to evaluate the relationship between subgenomic RNA positivity by using antigen test. Examining cytopathology based on cell culture seems to be the gold standard for demonstrating replication, but it is not consistently applicable. This method, which we will explore, offers a very different perspective in demonstrating viral contagion and active infection. In addition, it is thought that it is not possible to distinguish between replicative and non-replicative microorganisms by PCR methods, and it is aimed to evaluate whether there is virus replication in the patient by using the viral antigen detection test. Since antigen test can also show viral infectivity, evaluating it together with subgenomic RNA will give an idea about the importance of antigen test.
Methods: 109 patient samples with positive results sent to Çanakkale Onsekiz Mart University Medical Microbiology Laboratory for SARS-COV-2 PCR detection and stored at -80 °C were included in the study. E gene PCR was performed on these samples to confirm their PCR positivity. Antigen testing, E and N sgRNA qPCR detection were performed.
Findings: Of 109 SARS-COV-2 PCR positive samples, 83 (76.14%) antigen testing, 88 (80.73%) E gene sgRNA, 96 (88.07%) N gene sgRNA, 97 (89%) at least one sgRNA positive was detected. The antigen test was found to be positive in 77.3% of the samples in which at least one sgRNA was detected and in 66.7% of the negative samples, and this difference was not statistically significant (p=0.475). The difference between E sgRNA and antigen test positivity was significant (p=0.023). N sgRNA was positive in 98.9% of E sgRNA positive samples and 42.9% of negative samples, and this difference was statistically significant (p=0.0001). The antigen test positivity rate was found to be 98.15% (53/54) for Ct value ≤25, 57.14% (12/21) for Ct 25-30, and 52.94% (18/34) for Ct ≥30. There was no significant difference between at least one sgRNA positivity and antigen test positivity for E gRNA Ct value ≤25 and >25 (p=1.0; p=0.112).
Result: The difference in antigen test positivity between E gRNA Ct value ≤25 and >25, ≤29 and >29, <30 and ≥30 was statistically significant (p=0.0001). Antigen test positivity was found to be associated with viral load, as expected. Since antigen test positivity is also a reflection of the presence of infectiousness, it has been shown that there may be a relationship between viral load and infectiousness. However, since there is no significant difference between antigen test and subgenomic RNA positivity, antigen test may also be an important indicator for detecting infectiousness. Further and large-scale studies (eg NGS, supporting results with viral culture) seem necessary to demonstrate that sgRNAs can be used as markers of infectiousness. Further studies based on subgenomic RNA may shorten the length of hospital stay and social isolation. The positivity rate of antigen test and sgRNAs seems to be similar, in this respect, antigen tests may be suitable for evaluating infectivity.