Kopigmentasyon ile Hibiskus sabdariffa'dan stabil antosiyanin bazlı gıda renklendiricilerinin üretimi ve model gıdalara uygulanması
Production of stable anthocyanin based food colorants from Hibiscus sabdariffa by copigmentation and their application to model foods
Yazar: VİLDAN EYİZ
Danışman: PROF. DR. SELMAN TÜRKER ; DOÇ. DR. İSMAİL TONTUL
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Bilimleri Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmada bezelye protein izolatı, pirinç protein izolatı, gluten ve peynir altı suyu protein izolatlarından farklı şartlarda (distile su veya NaCl çözeltileri içinde 24, 36 ve 48 saat asidik ısıtma ile) düz ve kıvrımlı nanofibriller elde edilmiştir. Elde edilen nanofibrile proteinler Hibiscus sabdariffa antosiyaninleri ile kopigmente edilerek elde edilen örneklerde batokromik kayma, hiperkromik etki ve termal stabilite testleri yapılmıştır. Kontrol amaçlı hiçbir ön işleme tabi tutulmayan doğal protein izolatları ile de kopigmentasyon gerçekleştirilerek aynı analizler gerçekleştirilmiştir. Termal stabilite testi için toplam monomerik antosiyanin (TMA) ve polimerik renk tayini gerçekleştirilmiştir. Analiz sonuçları kinetik hesaplamalar da kullanılmış ve bozulma kinetiğinin parametreleri belirlenmiştir. Kinetik hesaplamalar sonucunda elde edilen aktivasyon enerjisi (Ea) ve termal direnç sıcaklığı (z) değerlerine göre en uygun kopigmentasyon ajanları belirlenmiştir. Kopigmentasyonun gerçekleştiğini kanıtlamak ve oluşan bağları daha detaylı incelemek amacıyla Fourier Dönüşümlü Kızılötesi (FTIR) Spektroskopi ve Floresans Spektroskopi analizleri gerçekleştirilmiştir. Seçilen kopigmentasyon ajanları ile kopigmente edilen hibiskus ekstrakları kırınım pencereli kurutucuda kurutularak toz haline getirilmiştir. Toz ürünlerde toplam fenolik madde (TFM), TMA, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radikalinin inhibisyonu (DPPH), Demir İndirgeme Antioksidan Gücü (FRAP) ve Bakır (II) İyonu İndirgeme Esaslı Antioksidan Kapasitesi (CUPRAC) analizleri gerçekleştirilerek örneklerin bazı kimyasal özellikleri belirlenmiştir. Elde edilen toz kopigmente örnekler belirli oranlarda yoğurt (%1.5) ve yumuşak şekerleme ürünlerine (%1) katılarak depolama stabilitesi de belirlenmiştir. Bu aşamada kontrol olarak doğal renk maddesi (siyah havuç özütü) ve sentetik renk maddesi (allura red) kullanılmıştır. Yumuşak şekerleme örnekleri 32 gün, yoğurt örnekleri ise 16 gün depolanarak belirli günlerde TMA ve renk tayini yapılmıştır. Yapılan analizler sonucunda depolamaya en dayanıklı kopigmente örnekler belirlenmiştir.
Kopigment eklenmiş hibiskus ekstraktlarının maksimum dalga boyundaki absorbans artışı (hiperkromik etki) ve maksimum dalga boyunda kaymanın meydana gelmesi (batokromik kayma) kopigmentasyonun gerçekleştiğini göstermektedir. Kontrol örneğinin maksimum dalga boyu 519 nm iken düz nanofibrillerle kopigmente edilmiş örneklerinin dalga boyları 519-524 nm değerleri arasında bulunmuştur. Pozitif yönde 1-6 birim arasında bir kayma meydana gelmiştir. Düz nanofibriller ile kopigmente edilmiş örnekler %0.23-33.84 değerleri arasında hiperkromik etki göstermiştir. Kıvrımlı nanofibriller ile kopigmente edilmiş örneklerin dalga boyları ise 519-522 nm değerleri arasında bulunmuştur. Pozitif yönde 1-4 birim arasında bir kayma meydana gelmiştir. Kıvrımlı nanofibriller ile kopigmente edilen örnekler %5.79-40.32 değerleri arasında hiperkromik etki sağlamıştır.
Düz nanofibrillerle kopigmente edilen örneklerde protein çeşidine göre polimerik renk yüksekten düşüğe sırasıyla gluten (NG), peyniraltı suyu proteini (NPAS), bezelye (NB) ve pirinç (NP) örneklerine ait bulunmuştur. Kıvrımlı nanofibrile pirinç proteini ile kopigmente edilen hibiskus ekstraktlarının polimerik renk değerleri bezelye (CB) ve peynir altı suyu proteini ile kopigmente edilen örneklerden (CPAS) daha yüksek bulunmuştur. Polimerik renk değerinin yükselmesi antosiyaninlerin parçalanmasına bağlı olarak kahverengi bileşenlerin meydana geldiğinin bir göstergesidir. Hem düz hem de kıvrımlı nanofibrillerle kopigmente edilen örneklerde sıcaklık artışı ile polimerik renk değerlerinde artış meydana gelmiştir. 24 saat boyunca nanofibrilasyona tabi tutulan proteinlerle kopigmente edilen örneklerin polimerik renk değerleri 36 ve 48 saat nanofibrilasyona tabi tutulanlara oranla daha düşük bulunmuştur.
Kinetik hesaplamalar sonucundan antosiyanin değişiminin parçalanma hız sabitleri (k), korelasyon katsayıları (R2), z değerleri ve Ea belirlenmiştir. Farklı kopigmentasyon ajanları ile kopigmente edilen hibiskus ekstraktlarının kinetiğine ait regresyon denkleminin R2 değerleri 0.90'ın üzerinde bulunmuştur. Kopigmente hibiskus örneklerinde antosiyanin degradasyonu beklenildiği gibi sıcaklığın artmasıyla beraber hızlanmıştır. Çalışmanın devamında kullanılacak örnekler seçilirken z ve Ea değerleri yararlanılmıştır. Hesaplamalar sonucunda yüksek z değerleri nedeniyle 24NP (24 saat fibrilasyona tabi tutulmuş düz nanofibrile pirinç proteini ile kopigmente edilen hibiskus ekstraktı), 24NG (24 saat fibrilasyona tabi tutulmuş düz nanofibrile gluten ile kopigmente edilen hibiskus ekstraktı), 24CB (24 saat fibrilasyona tabi tutulmuş kıvrımlı nanofibrile bezelye proteini ile kopigmente edilen hibiskus ekstraktı) ve 48CP (48 saat fibrilasyona tabi tutulmuş kıvrımlı nanofibrile pirinç proteini ile kopigmente edilen hibiskus ekstraktı) örnekleri, yüksek Ea değerleri ve uygun parçalanma hız sabiti (k) değerleri nedeniyle 24NPAS (24 saat fibrilasyona tabi tutulmuş düz nanofibrile peynir altı suyu proteini ile kopigmente edilen hibiskus ekstraktı) ve 48CPAS (48 saat fibrilasyona tabi tutulmuş kıvrımlı nanofibrile peynir altı suyu proteini ile kopigmente edilen hibiskus ekstraktı) örnekleri seçilmiştir. 
Nanofibrile edilmiş proteinler ve antosiyaninler arasında gerçekleşen bağ oluşumunu izlemek ve doğrulamak amacıyla FTIR analizi gerçekleştirilmiştir. 3000-3500 cm-1 (-OH gerilimi) ve 1600-1650 (C=O gerilimi) cm-1 dalga boylarında büyük pikler görülürken, 2000-2200 (N-H gerilimi) cm-1 ve 600-1000 cm-1 (C=C gerilimi) aralığında da bazı dalgalanmalar meydana gelmiştir. Kopigmentasyon ile oluşan bu dalgalanmalar protein ve antosiyanin arasında oluşan bağlara atfedilmektedir Özellikle proteinlerin yapısında meydana gelen konformasyonel değişimleri incelemek amacıyla 1600-1700 cm-1 arası bölgeye bakılmaktadır. Nanofibrilasyon işlemi ile bu bölgede kaymalar meydana gelmiştir. Bu kayma α-heliks yapılarının azalarak, antosiyaninler ile asil etkileşimin gerçekleştiğini ve β-plaka yapılarının artması ile pik kaymasının meydana geldiğini göstermektedir.
Kopigmentasyon ajanlarının hibiskus antosiyaninleri ile etkileşimini incelemek amacıyla floresan spektroskopisi analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu analiz sonuçlarına göre kopigmente örneklerin floresans yoğunluğu düz ve kıvrımlı nanofibrile proteinlere oranla çok düşüktür. Yani kopigmentasyon floresans yoğunluğunu oldukça fazla miktarda sönümlemiştir. Bu da iki molekül arasında (düz nanofibrile protein-antosiyanin) güçlü bir etkileşim olduğunu göstermektedir. Bunun yanında nanofibrile proteinler doğal protein izolatlarına oranla, nanofibrile proteinlerle kopigmente edilen örneklerde doğal protein izolatları ile kopigmente edilen örneklere oranla daha yüksek floresans emisyonu sağlamıştır. Sonuçlar antosiyaninler ve proteinler arasındaki etkileşimin, proteinlerin floresan kromoforlarının mikro ortamını değiştirdiği, bunun da ikincil yapıyı değiştirerek kompleksin stabilitesini arttırdığını göstermiştir.
Seçilen nanofibrile proteinlerle kopigmente edilen hibiskus ekstraktları kırınım pencereli kurutucuda 90 oC sıcaklıkta yaklaşık 30 dakika boyunca kurutularak toz haline getirilmiştir. Toz ürünlerde yapılan analizlere göre kontrolle kıyaslandığında 24CB en yüksek toplam monomerik antosiyanin miktarına sahip bulunurken, FRAP sonuçlarına göre 24NP, CUPRAC sonuçlarına göre 48CP'nin antioksidan aktivitesi daha yüksek bulunmuştur. 
Hem yumuşak şekerleme hem de yoğurt örneklerinde denenen kopigmente hibiskus ekstraktı tozları arasında 48CP örneğinin toplam monomerik antosiyanin miktarını diğer örneklere kıyasla daha iyi koruduğu gözlenmiştir.
Tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlar genel olarak incelendiğinde düz ve kıvrımlı nanofibriller ile kopigmente edilen hibiskus ekstraklarının antosiyanin ve renk değerlerinin stabilitesini doğal protein izolatları ile kopigmente edilenlere oranla daha iyi koruduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca nanofibrile kopigmente örneklerin model gıdalarda sentetik renk maddeleri yerine uygulanabilir olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, straight and curved nanofibrils were obtained from pea protein isolate, rice protein isolate, gluten protein isolate and whey protein isolates with different applications (by keeping them in a water bath for 24, 36 and 48 hours). The resulting nanofibrillated proteins were copigmented with Hibiscus Sabdariffa anthocyanins and bathochromic shift, hyperchromic effect and thermal stability tests were performed on the samples obtained. For control purposes, co-pigmentation was carried out with natural protein isolates that were not subjected to any pre-treatment and were subjected to all analyses. Total monomeric anthocyanin (TMA) and polymeric color were determined for thermal stability testing. Kinetic calculations were carried out according to the analysis results. The most suitable copigmentation agents were determined according to the Activation energy (Ea) and z (thermal resistance temperature) values obtained as a result of kinetic calculations. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy and Fluorescence spectroscopy analyzes were performed to prove that copigmentation had occurred and to examine the bonds formed in more detail. Hibiscus extracts mixed with selected copigmentation agents were dried in a diffraction window dryer and turned into powder.. Total phenolic content (TFM), TMA, DPPH radical scavenging capacity, Iron Reduction Antioxidant Power (FRAP) and Copper (II) Ion Reduction Based Antioxidant Capacity (CUPRAC) analyzes were performed on powder products and some chemical properties were determined. The obtained powder copigmented samples were added to yoghurt (1.5%) and soft confectionery products (0.3%) in certain proportions to check their storage stability. 0.3% natural colorant (black carrot extract) and 50 ppm synthetic colorant was used for control. Soft candy samples were stored for 32 days and yoghurt samples were stored for 16 days, and total monomeric anthocyanin and color were determined on certain days. As a result of the analyses, the copigmented samples that were most resistant to storage were determined.
The increase in absorbance at the maximum wavelength (hyperchromic effect) and the occurrence of a shift in the maximum wavelength (batochromic shift) of hibiscus extracts with added copigment indicate that copigmentation has occurred. While the maximum wavelength of the control sample was 519 nm, the wavelengths of the samples copigmented with flat nanofibrils were found to be between 519-524 nm. There was a shift between 1-6 units in the positive direction. Samples copigmented with flat nanofibrils increased the hyperchromic effect between 0.23-33.84%. While the maximum wavelength of the control sample was 518 nm, the wavelengths of the samples copigmented with folded nanofibrils were found to be between 519-522 nm. There was a shift of 1-4 units in the positive direction. Samples copigmented with curved nanofibrils increased the hyperchromic effect by 5.79-40.32%.
In the samples copigmented with straight nanofibrils, the polymeric color was found to belong to gluten (NG), whey protein (NPAS), pea (NB) and rice (NP) samples, in order from largest to smallest, depending on the protein type. The polymeric color values of hibiscus extracts (CP) copigmented with folded nanofibrillated rice protein were found to be higher than those copigmented with pea (CB) and whey protein (CPAS). An increase in the polymeric color value is an indication that anthocyanins are broken down and brown components are formed. In samples copigmented with both straight and curved nanofibrils, polymeric color values increased with increasing temperature. The polymeric color values of the samples copigmented with proteins subjected to nanofibrillation for 24 hours were found to be lower than those subjected to nanofibrillation for 36 and 48 hours.
As a result of kinetic calculations, fragmentation rate constants (k), correlation coefficients (R2), z values and Ea of anthocyanin change were determined. The R2 values of the regression equation of the kinetics of hibiscus extracts copigmented with different copigmentation agents were found to be above 0.90. As expected, anthocyanin degradation in copigmented hibiscus samples accelerated with increasing temperature and the reaction occurred in accordance with second-order kinetics. Z and Ea values were used when selecting the samples. By determining the samples with the highest z value and Ea value, copigmented hibiscus extracts suitable for use in the future stages of the study were determined. As a result of the comparisons, due to their high z values, 24NP (hibiscus extract copigmented with straight nanofibrillated rice protein subjected to 24 hours of fibrillation), 24NG (hibiscus extract copigmented with straight nanofibrillated gluten protein subjected to 24 hours of fibrillation), 24CB (folded hibiscus extract subjected to 24 hours of fibrillation) samples (hibiscus extract copigmented with nanofibrillated pea protein) and 48CP (hibiscus extract copigmented with curly nanofibrillated rice protein subjected to 48 h fibrillation) samples were classified as 24NPAS (straight fibrillated for 24 h) due to their high Ea values and appropriate fragmentation rate constant (k) values. samples were selected.
FTIR analysis was performed to monitor and verify the bond formation between nanofibrillated proteins and anthocyanins. While large peaks are seen at wavelengths of 3000-3500 cm-1 (-OH tension) and 1600-1650 (C=O voltage) cm-1, 2000-2200 (N-H tension) cm-1 and 600-1000 cm-1 (C= Some fluctuations also occurred in the C voltage range. These fluctuations caused by copigmentation are attributed to the bonds formed between protein and anthocyanin. In order to examine the conformational changes that occur in the structure of proteins, the region between 1600-1700 cm-1 is examined. Shifts occurred in this region with the nanofibrillation process, indicating that the α-helix structures decreased, the acyl interaction with anthocyanins took place, and the peak shift occurred as the β-sheet structures increased.
Fluorescence spectroscopy was performed to examine the interaction of copigmentation agents with hibiscus anthocyanins. When the graphs are examined, the fluorescence intensity of copigmented samples is very low compared to straight and curved nanofibrillated proteins. In other words, copigmentation dampened the fluorescence intensity considerably. This shows that there is a strong interaction between the two molecules (flat nanofibrillated protein-anthocyanin). In addition, nanofibrillated proteins provided higher fluorescence emission in samples copigmented with nanofibrillated proteins than in samples copigmented with natural protein isolates, compared to natural protein isolates. The results showed that the interaction between anthocyanins and proteins changes the microenvironment of the fluorescent chromophores of the proteins, which increases the stability of the complex by changing the secondary structure.
Hibiscus extracts copigmented with selected nanofibrillated proteins were dried in a diffraction window dryer at 90 oC for approximately 30 minutes and turned into powder. According to the analysis performed on powder products, 24CB was found to have the highest total monomeric anthocyanin amount compared to the control, while the antioxidant activity of 24NP was found to be higher according to FRAP results, and 48CP was found to be higher according to CUPRAC results.
Determination of total monomeric anthocyanin by adding 1% copigmented hibuscus powder to soft candy, 0.3% commercially purchased natural coloring agent (black carrot extract) and 50ppm synthetic coloring agent (Allura Red) for the control sample and keeping it at room temperature (25±5ºC) for 32 days. Color analyzes were carried out. It was observed that 48 CP sample preserved the total amount of monomeric anthocyanin better than other samples throughout storage.
It was prepared by adding copigmented hibiscus powder to yoghurt (1.5%), and 0.3% natural colorant (black carrot extract) and 50ppm synthetic colorant (Allura Red) for control, and was stored for 16 days at 8 ⁰C for total monomeric anthocyanin and color analysis. has been carried out. It is seen that the most stable samples in terms of total monomeric anthocyanin amount during 16 days of storage are 48CP sample.
When the results obtained within the scope of the thesis study were examined in general, it was observed that hibiscus extracts copigmented with straight and curved nanofibrils preserved the stability of anthocyanin and color values better than those copigmented with natural protein isolates. It has also been determined that nanofibrillar copigmented samples can be applied instead of synthetic colorants in model foods.