Proprotein konvertaz subtilisin/keksin Tip 9 (PCSK9) proteininin damar düz kas hücrelerindeki reseptörlere, gen ve protein ekspresyonuna olan etkilerinin gösterilmesi
Demonstration of the effects of proprotein convertase subtilisin/kexin Type 9 (PCSK9) protein on receptors, gene, and protein expression in vascular smooth muscle cells.
Yazar: ECE YURTSEVEN
Danışman: PROF. DR. OĞUZ ÖZTÜRK
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı / Moleküler Tıp Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kardiyoloji = Cardiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: LRP1 = LRP1 ; PCSK9 = PCSK9

Özet:
Proprotein Konvertaz Subtilisin/Keksin Tip 9 (PCSK9), hiperlipidemiye neden olan, ancak damar duvarı hücrelerine yaptığı etkiler son zamanlarda dikkat çeken bir moleküldür. PCSK9'un damar düz kas hücrelerine (DDKH) inflamatuar ve proliferatif etkilerini hangi reseptör ve mekanizmayla yaptığı belirsizdir. Çalışmamızda susturucu RNA (siRNA) ile PCSK9'un DDKH'deki olası reseptörleri LDL ilişkili reseptör1 (LRP1) ve çok düşük molekül ağırlıklı reseptör (VLDLR)'leri susturarak inflamasyonda önemli rolü olan bir transkripsiyon faktörü, nükleer faktör kappa b'nin (NF-kB) nükleer translokasyonunu, immunoflorasan yöntemle değerlendirdik. PCSK9'un siRNA uygulanmamış, kontrol siRNA ve LRP1 siRNA uygulanmış insan aortik düz kas hücrelerinde (iADKH) NF-kB translokasyonuna neden olduğunu, VLDLR siRNA ile NF-kB translokasyonunun engellendiğini, ancak VLDLR siRNA LRP1 siRNA ile beraber uygulandığında PCSK9 ile yeniden NF-kB nükleer translokasyonu olduğunu gözlemledik. İkinci aşamada iADKH'de PCSK9 ve NF-kB protein ekspresyonuna, aterojenik maddeler uygulanan insan umblikal ven hücreleri (HUVEC)'lerinin etkisini değerlendirdik. HUVEC'ler 300 μM H2O2, 40μg/ml okside LDL (Ox-LDL) ve %5 sigara duman ekstraktı (SDE) ile 24 saat inkübe edilerek süpernatantları alındı, iADKH bu süpernatantlarla 48 saat inkübe edildi. Takiben iADKH'den protein ekstraksiyonu ve Western Blot analizi yapıldı. SDE, H202 ve Ox-LDL uygulanmış HUVEC süpernatantı ile inkübe edilen iADKH'de PCSK9 (p= 0.034, p=0.0137, p=0.037) ve NFkB ekpresyonunun arttığı (p=0.024, p=0.043) ancak Ox-LDL ile NF-kB artışının anlamlı düzeye ulaşmadığı (p=0.089) saptandı. Sonuç olarak PCSK9'un iADKH'inde inflamasyonu tetiklediğini, bu etkinin VLDLR'ünün inhibisyonu ile engellenebileceğini, HUVEC'lerin aterojenik uyaranlara maruz kaldıklarında iADKH'deki PCSK9 ve NF-kB protein ekspresyonunu arttırdığını gösterdik. Bu bulgular aterokleroz mekanizmasında PCSK9 ve DDKH'nin ilişkisinin rolünü anlamaya katkıda bulunacaktır.

Abstract:
Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9's (PCSK9) direct atherosclerotic effects have been recently recognised; however, its receptors on vascular smooth muscle cells (VSMCs) remain unclear. We silenced the potential receptors of PCSK9, LDL receptor-related protein1 (LRP1) and very low-density lipoprotein receptor (VLDLR) with siRNA, treated human aortic smooth muscle cells (HASMCs) with PCSK9, and evaluated the nuclear translocation of nuclear factor kappa B (NF-kB). We observed NF-kB translocation with PCSK9 in HASMCs without siRNA, with control siRNA and with LRP1 siRNA. NF-kB translocation was inhibited in VLDLR siRNA applied HASMCs, but when VLDLR siRNA and LRP1 siRNA were co-applied, nuclear translocation was observed again. We evaluated the effect of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) on PCSK9 and NF-kB protein expression in HASMCs. HUVECs were incubated with 300 μM H2O2, 40 μg/ml oxidised LDL (Ox-LDL), and 5% cigarette smoke extract (CSE) for 24 hours, and the supernatants were collected. Then, the HASMCs were incubated with supernatants for 48 hours. Western Blot analysis were performed to analyse the protein expressions in HASMC. Increased PCSK9 (p=0.034, p=0.0137, p=0.037) and NF-kB expression (p=0.024, p=0.043) was recognised; however, the increase in NF-kB with Ox-LDL did not reach a significant level (p=0.089). In conclusion, we demonstrated that PCSK9 triggers inflammation in HASMCs which can be inhibited by VLDLR inhibition. We also showed that exposure of HUVECs to atherogenic stimuli, increased PCSK9 and NF-kB protein expression in HASMCs. These findings will contribute to our understanding the relationship of PCSK9 and VSMC in the mechanism of atherosclerosis.