İtakonatın epileptik sıçanların beyinleri üzerine etkileri
Effects of itaconate on the brains of epileptic rats
Yazar: SUMAYYAH SALAHEDDIN SALIM ABU NNAJA
Danışman: DOÇ. DR. AYŞEGÜL KAPUCU
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Epilepsi, hastalar ve aileleri üzerinde maddi ve manevi açıdan ciddi etkiler ve baskılar yaratan en önemli nörolojik bozukluklardan biridir. Dünya genelinde yaklaşık 50 milyon kişi epilepsi hastasıdır. Mevcut tedavi seçeneklerinin çeşitliliğine rağmen, bu hastaların önemli bir kısmı mevcut tedavilere direnç göstermektedir. Bu durum, epilepsi tedavisinde yeni ve etkili alternatiflerin araştırılmasını zorunlu kılmaktadır. İtakonat, makrofajların çeşitli hasar uyaranlarla aktive edilmesi sonucu üretilen bir mitokondriyal metabolittir. Bu molekül, inflamatuar sinyal yollarını inhibe etme ve antioksidan yanıtları artırma konusunda güçlü bir potansiyele sahiptir. İtakonatın çeşitli hastalık modellerindeki etkilerine olan büyük ilgiye rağmen, bu çalışmanın sunulduğu tarihe kadar epilepsi modeli üzerindeki etkilerini değerlendiren bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle, itakonatın diğer modellerde gösterdiği olası koruyucu potansiyeli epilepsi modelinde incelemek ve antiinflamatuar ve antioksidan etkileri aracılığıyla epileptik nöbetleri ve bunların hipokampusa olan zararlarını hafifletme etkisini test etmek amaçlanmaktadır.
Toplamda 44 sıçan kullanılarak gerçekleştirilen çalışmamız, her biri 11 hayvandan oluşan dört farklı gruba ayrılmıştır: Kontrol grubuna 24 gün boyunca (i.p) 0,5 ml %0.9 Fizyolojik tuzlu su (FTS) uygulanmıştır. İtakonat grubuna 24 gün boyunca sadece (i.p) 25 mg/kg dimetil itakonat (DI) uygulanmış ve nöbet tetiklenmemiştir. Pentilentetrazol (PTZ) grubunda, hasar grubu olarak, kindling nöbeti tetiklemek için 24 gün boyunca gün aşırı (i.p) 30 mg/kg PTZ uygulanmıştır. PTZ+DI grubunda ise hayvanlara her gün DI ve gün aşırı PTZ uygulanmıştır. PTZ enjeksiyonları 12 doz olacak şekilde gerçekleştirilmiş ve hayvanlar her PTZ enjeksiyonundan sonra 30 dakika süresince gözlemlenerek nöbet davranışları skorlanmıştır. Son dozdan önce pasif kaçınma testi uygulanarak hafıza işlevleri değerlendirilmiş, deney sonunda hayvanlardan kan alınarak dekapite edilerek biyokimyasal ve histolojik çalışmalar için beyin dokuları alınmıştır. Histolojik incelemeler kapsamında, hipokampal CA1 bölgesinin nöronal yoğunluğu Nissl boyama yöntemi ile değerlendirilmiştir. Ayrıca, çalışmada plazmadaki IL-1β ve TNF-α düzeyleri ile birlikte hipokampustaki NeuN, NLRP3, Nrf2 ve pAkt/Akt protein düzeyleri analiz edilmiştir.
Araştırmamızda, itakonatın epileptik nöbetlerin şiddetini azaltma ve nöbet latansını uzatma gibi koruyucu etkiler gösterdiği belirlenmiştir. İtakonatın öğrenme testlerinde anlamlı bir fark yaratmamasına rağmen, hipokampusta bilişsel ve hafıza işlevlerine olumlu etkileri olabileceği saptanmıştır. DI, epileptik sıçanların hipokampal CA1 bölgesinde nöronal yoğunluğu koruyarak doku bütünlüğünü artırmıştır. Antiinflamatuar etkileri bakımından, DI plazma IL-1B düzeylerini düşürmüş ancak TNF-alfa seviyelerinde bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Ayrıca, DI'nın hipokampusta NeuN protein seviyelerini artırarak nörogenez ve nöronal hücre kaybına karşı koruma sağladığı ve Nrf2 ile pAkt yollarını aktive ettiği tespit edilmiştir.
Sonuç olarak, çalışmamızda epilepsi üzerine itakonatın etkileri, türevi olan DI formunda ilk kez incelenmiş ve itakonatın nöbetlere karşı koruyucu etki ile nöbet kaynaklı hasarlara karşı nöroprotektif etkileri ortaya konmuştur.

Abstract:
Epilepsy is among the most critical neurological disorders, imposing significant financial and emotional burdens on patients and their families. Globally, it is estimated that approximately 50 million individuals are diagnosed with epilepsy. Despite the diversity of treatment options available, a substantial portion of these patients exhibit resistance to existing therapies, underscoring the urgent need for innovative and effective alternative treatments. Itaconate, a mitochondrial metabolite produced in response to macrophage activation by various damage stimuli, holds considerable promise for inhibiting inflammatory signaling pathways and boosting antioxidant responses. Although there is substantial interest in the effects of itaconate across different disease models, no study has yet assessed its impact on epilepsy models as of the submission date of this study. Consequently, our study aims to explore the potential protective properties of itaconate in an epilepsy model, building on the effects demonstrated in other contexts, and to evaluate its efficacy in reducing the severity of epileptic seizures and mitigating damage to the hippocampus, mediated by its anti-inflammatory and antioxidant effects. 
Our research utilized a cohort of 44 rats, divided into four distinct groups, each comprising 11 subjects. The control group was administered 0.5 ml of 0.9% saline intraperitoneally (i.p.) daily for a duration of 24 days. The itaconate group received an i.p. injection of 25 mg/kg dimethyl itaconate (DI) daily. The Pentylenetetrazol (PTZ) group, designated as the disease model, was treated with 30 mg/kg of PTZ i.p. every other day for 24 days to elicit kindling seizures. In the combined PTZ+DI group, animals were administered DI daily and PTZ on alternate days. A total of 12 PTZ injections were administered, with each animal being observed for 30 minutes following each injection to assess seizure behavior. Prior to the administration of the final dose, the passive avoidance test was conducted to evaluate memory functions. At the conclusion of the experimental protocol, blood was collected from the animals before decapitation, and their brain tissues were subsequently harvested for biochemical and histological analyses. Histological evaluations included assessing the neuronal density in the hippocampal CA1 region via Nissl staining. Moreover, the study analyzed levels of IL-1β and TNF-α in the plasma, alongside NeuN, NLRP3, Nrf2, and pAkt/Akt protein levels in the hippocampus. 
Our research has demonstrated that itaconate confers protective effects, notably in diminishing the severity of epileptic seizures and prolonging seizure latency. Furthermore, while itaconate did not yield statistically significant differences in learning assessment, findings suggest it may exert beneficial influences on cognitive and memory functions within the hippocampus. DI has preserved neuronal density and enhanced tissue integrity in the hippocampal CA1 region of the epileptic rats. In terms of its anti-inflammatory effects, DI reduced plasma IL-1β levels, although no change was observed in TNF-α levels. Additionally, it was found that DI increased NeuN protein levels in the hippocampus, supporting neurogenesis and providing protection against neuronal cell loss, while also activating the Nrf2 and pAkt pathways.
In conclusion, our study is the first to investigate the effects of itaconate on epilepsy in its derivative form, DI, and has reported that itaconate exhibits protective effects against seizures and neuroprotective effects against seizure-induced damage.