İlaç etken maddelerinin deneysel tasarım kullanılarak yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile analizi
High pressure liquid chromatography analysis of drug-active ingredients using experimental design
Yazar: GİZEM YARKADAŞ
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM AKSU DÖNMEZ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada soğuk algınlığı preparatlarında etken madde olarak kullanılan fenilefrin hidroklorür, guaifenesin, pirilamin maleat ve parasetamolün bir arada tayini için gradient HPLC yöntemi geliştirildi. Deneysel tasarım yöntemlerinden 4 faktörlü, 3 seviyeli Box-Behnken tasarımı kullanılarak yöntemin optimizasyonu yapıldı. pH, akış hızı ile gradient 1 ve gradient 2'deki asetonitril : fosfat tamponu hareketli faz sisteminin % fosfat tamponu miktarları olmak üzere 4 faktör belirlendi. Seviyeler pH için 2,5 – 3,0 – 3,5; akış hızı için 0,8 – 1,0 – 1,2 mL/dak, gradient 1 için 85 – 90 – 95, gradient 2 için ise 70 – 75 – 80 % fosfat tamponu olarak belirlendi. Faktörlerin düşük seviyeleri için (–1), orta seviyeleri için (0) ve yüksek seviyeleri için (+1) kodları kullanıldı ve toplam 27 deney yapıldı. İncelenen faktörlerin HPLC kromatogramındaki piklerin ayırma gücü üzerine bireysel ve birbirleri ile olan etkileşimlerinin etkileri incelendi.  Optimizasyon tasarımı ile elde edilen verilere regresyon analizi yapıldı. Sonuçların doğruluğunu test etmek için ANOVA yapıldı. Elde edilen sonuçlardan iki gradient basamağında fosfat tamponu oranının ve bunların ikili etkileşimlerinin ayırma gücü üzerinde etkili olduğu görüldü. Ayırma gücüne ait matematiksel bir model regresyon sonuçları kullanılarak elde edildi. Bu modelden teorik ayırma gücü değerleri bulundu. Teorik ayırma gücü değerleri ile deneysel ayırma gücü değerleri arasındaki ilişki incelenerek modelin uygunluğu test edildi ve bulunan korelasyon katsayısına göre (0,9820) modelin uygun olduğuna karar verildi.
Elde edilen modele göre kromatografik şartlar; hareketli fazın pH'ı 3,5; gradient 1 için %95 fosfat tamponu; gradient 2  için %80 fosfat tamponu ve akış hızı 0,8 mL/dak olarak belirlendi. Belirlenen optimum şartlarda parasetamol için 250 nm, diğer etken maddeler için ise 220 nm'de spektrofotometrik dedektör kullanılarak kromatogramlar kaydedildi.
Geliştirilen yöntem doğrusallık, tekrarlanabilirlik, doğruluk (% geri kazanım), tanıma – hesaplanabilirlik limiti (LOD-LOQ) parametreleri incelenerek valide edildi. Doğrusallık için yapılan çalışmalarda regresyon katsayıları (R2) fenilefrin hidroklorür, guaifenesin, pirilamin maleat ve parasetamol için sırasıyla 0,9997; 0,9998; 0,9998 ve 0,9999 olarak bulundu. Gün içi tekrarlanabilirlik testlerinde %RSD değerleri fenilefrin hidroklorür için 0,99 – 1,94; guaifenesin  için 0,25 – 1,89; pirilamin maleat için 0,66 – 1,92 ve parasetamol için  0,18 – 0,66 aralığında;  günler arası tekrarlanabilirlik testlerinde ise %RSD değerleri fenilefrin hidroklorür için 1,38 – 1,92; guaifenesin için 0,33 – 1,06; pirilamin maleat için  1,29 – 1,82 ve parasetamol için 0,89– 1,98 aralığında bulundu. Doğruluk için, incelenen maddeleri içeren örnek çözeltisi içine 3 farklı konsantrasyonda fenilefrin hidroklorür, guaifenesin, pirilamin maleat ve parasetamol ilave edilerek analiz yapıldı. Fenilefrin hidroklorür  için %99,20 – %101,53; guaifenesin için  %103,13 – %104,30; pirilamin maleat için %98,72 – %99,42 ve parasetamol için %101,60 – %102,80 aralığında geri kazanım değerleri elde edildi. Fenilefrin hidroklorür, guaifenesin pirilamin maleat ve parasetamol için sırası ile tanıma limiti; 0,42; 0,25; 0,34; 0,32 μg/mL, hesaplanabilirlik limiti;  1,41; 0,83; 1,14; 1,07 μg/mL olarak hesaplandı. 
Fenilefrin hidroklorür, guaifenesin, pirilamin maleat ve parasetamolün bir arada analizi için geliştirilen HPLC yöntemi Peditus adlı şurup preparatına başarıyla uygulandı. Fenilefrin hidroklorür  için %98,33; guaifenesin için %101,70; pirilamin maleat için %98,66 ve parasetamol için %102,15 geri kazanım değerleri elde edildi.

Abstract:
In this study, a gradient HPLC method was developed for simultaneous analysis of phenylephrine hydrochloride, guaifenesin, pyrilamine maleate and paracetamol used as active ingredient in cough-cold syrup preparations. The experimental design method was used to optimize the method using 3 levels 4 factors Box-Behnken design. pH, flow rate, % phosphate buffer ratio in mobile phase system were selected as factors. The levels were determined as pH 2.5 – 3.0 – 3.5, flow rate 0.8 – 1.0 – 1.2, gradient 1 85% – 90% – 95%, gradient 2 70% – 75% – 80%. The codes; (-1), for low levels, (0) for intermediate and (+1) for high levels of the factors were used. 27 experimental runs were randomly carried out. Effects of these factors and the interactions between them on resolution between peaks in HPLC chromatogram were analyzed. Regression analysis was performed on data obtained by the optimization design. ANOVA was performed to test reliability of the results. In studies, it was determined that mobile phase ratio for gradient 1, gradient 2 and quadratic contribution of mobile phase ratio can influence the resolution significantly.  A mathematical model related to resolution was obtained using regression results. According to the data obtained from regression results, a model was created with respect to the resolution. Theoretical resolution values were obtained from the model. The relationship between these values and the experimental values has been examined to test the suitability of the model. Corelation coefficient was found 0.9820 and the model was determined to be appropriate. 
According the model chromatographic conditions were found as pH 3.5; flow rate 0.8 mL min-1, gradient 1 95% phosphate buffer and gradient 2 80% phosphate buffer. 
The chromatograms were recorded by using spectrophotometric detector at 250 nm for paracetamol and 220 nm for other active substances at the optimum conditions.
Analytical method validation was made by the examination of linearity, repeatability, accuracy (recovery %), limit of quantification, limit of detection parameters. In studies for linearity, the regression coefficients (R2) for phenylephrine hydrochloride, guaiphenesin pyrilamine maleate and paracetamol were found 0.9997; 0.9998; 0.9998 and 0.9999 respectively. 
The RSD% values of the intra-day repeatability analysis were found in the range of 0.99 – 1.94 for phenylephrine hydrochloride; 0.25 – 1.89 for  guaiphenesin; 0.66 – 1.92 for pyrilamine maleate; 0.18 – 0.66 for paracetamol and inter-day repeatability analysis were found in the range of  1.38 – 1.92 for phenylephrine hydrochloride; 0.33 – 1.06 for  guaiphenesin; 1.29 – 1.82 for pyrilamine maleate and 0.89 – 1.98 for paracetamol. In order to calculate accuracy, analyses were performed by the addition of 3 different concentrations of pyrilamine maleate, guaiphenesin, phenylephrine hydrochloride and paracetamol into the examined samples which contain the substances.
The recovery percentage values were obtained in the range of 99.20% – 101.53% for phenylephrine hydrochloride; 103.13% –104.30% for guaifenesin; 98.72% –99.42% for pyrilamine maleate and 101.60% –102.80%  for paracetamol. Limit of detection values were calculated for phenylephrine hydrochloride, guaifenesin, pyrilamine maleate  and paracetamol as 0.42; 0.25; 0.34; 0.32 μg/mL and the limit of quantification values were calculated for phenylephrine hydrochloride, guaifenesin, pyrilamine maleate  and paracetamol as  1.41; 0.83; 1.14; 1.07 μg/mL.
The developed HPLC method for the simultaneous determination of phenylephrine hydrochloride, guaiphenesin, pyrilamine maleate and paracetamol was applied to Peditus syrup preparations, successfully. The recovery percentage values were obtained respectively 98.33% for phenylephrine hydrochloride; 101.70% for guaiphenesin, 98.66% for pyrilamine maleate and 102.15% for paracetamol.