Vaccınıum arctostaphylos L.'da antosiyanin üreten kallusların ince yapısı
The ultrastructure of anthocyanin-producing callus in vaccinium arctostaphylos L.
Yazar: ELİF ONAN
Danışman: PROF. DR. HATİCE ÇÖLGEÇEN
Zonguldak Bülent Ecevit Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Botanik = Botany

Özet:
Vaccinium L. cinsi yaklaşık 450 tür içermektedir. Vaccinium arctostaphylos L. meyvesinin gentamisine bağlı böbrek bozukluklarına karşı koruyucu etkileri bulunmaktadır. Antosiyanin içeriği nedeniyle, antienflamatuar, antiprotozoal, antitümör özelliğine sahiptir. Alzheimer, tip II diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, kanser ve obeziteye karşı koruyucu etkileri bulunmaktadır. Bu çalışmada V. arctostaphylos L. bitkisinin yaprak, apikal meristem ve nod eksplantı kullanılarak doku kültürü yöntemi ile antosiyanince zengin kallus üretimi gerçekleştirilmiştir. Gelişen kallus hücrelerinin ince yapısı incelenmiştir. Kallus üretmek için sterilize edilmiş eksplantlar farklı konsantrasyonlarda IAA (indol asetik asit) veya ZEA (zeatin) içeren WPM (Woody Plant Medium) kültür ortamına ekilmiştir. En fazla antosiyanin üreten kalluslar 2 mg/L IAA içeren ortamda, apikal meristem eksplantı ile elde edilmiştir. Antosiyanin üretimini ve kallus biyokütlesini artırmak için 2 mg/L IAA içeren ortamlara sükrozun farklı konsantrasyonları eklenerek ortam modifiye edilmiştir. En iyi kallus üretimi 50 g/L sükroz içeren ortamda apikal meristem eksplantı ile gerçekleşmiştir. 50 g/L sükroz içeren ortamda gelişen pembe kalluslar floresan mikroskopta 525 nm yeşil ve 610 nm kırmızı dalga boylarında incelenmiştir. Kalluslar otofloresan özellik göstermiştir. Nukleusta, hücre duvarlarında ve vakuol çevresinde floresan ışımalar gözlenmiştir. Elde ettiğimiz pembe kallusların TEM (geçirimli elektron mikroskobu) görüntülerinde özellikle hücre duvarına yakın kısımlarında, vakuol çevresinde ve vakuol içinde veziküller göze çarpmaktadır. Benzer bölümlerde floresan ışıma gözlenmesi bu veziküllerin antosiyanin yüklü olduğu düşüncesini desteklemektedir. 50 g/L sükroz içeren ortamda gelişen pembe ve sarı kalluslar preperasyon işleminden sonra TEM kullanılarak hücre yapıları incelenmiştir. Sarı kalluslardan gelişen ve Tip 1 olarak adlandırılan hücreler eliptik veya uzun, köşeli yapıda şekle ve büyük bir vakuole sahiptir. Vakuollerin çevresinde veziküller bulunmaktadır. Vakuol içerisinde tonoplast iç yüzeyine bağlı elektronca yoğun veziküller ve AVI'ler (antosiyanik vakuolar inklüzyon) görülmüştür. Sitoplazma ve organeller, vakuol ile hücre duvarı arasında sıkışmıştır. Hücreler arası boşluk yok denecek kadar azdır. Pembe kalluslardan gelişen ve Tip 2 olarak adlandırılan hücrelerin sıklıkla eliptik şekle sahip oldukları gözlenmiştir. Tip 1 hücrelerle benzer şekilde büyük bir vakuole sahiptir, sitoplazması hücre duvarı ve vakuol arasında sıkışmış durumdadır, hücreler arası boşlukları çok azdır. Tip 1 hücreye göre vezikül sayıları çok fazladır ve vakuol çevresinde yoğunlaşmaktadır. Bir kısmı yoğun ve küresel görünümlü olup APV (antosiyanin prevakuolar vezikül) özelliklerine sahiptir. Veziküllerin bir kısmı vakuol içerisinde AVI görünümlüdür. Sitoplazmik veziküllerle vakuol arasında makrootofaji benzeri bir birleşme gerçekleşmektedir. Tonoplast iç yüzeyine bağlı AVI görünümlü inklüzyonlar degradasyona uğramakta ve içeriğini vakuol içerisine bırakmaktadır. Bu gözlemler, V. arctostaphylos L. bitkisinin antosiyanin üreten hücrelerinin, veziküler taşıma yöntemi kullanarak antosiyaninleri vakuole taşıdığını göstermektedir.

Abstract:
The genus Vaccinium L. includes about 450 species. The fruit of Vaccinium arctostaphylos L. has protective effects against gentamicin-induced kidney disorders. It has anti-inflammatory, antiprotozoal, antitumor properties due to its anthocyanin content. It has protective effects against Alzheimer's, type II diabetes, cardiovascular diseases, cancer and obesity. In this study, callus containing anthocyanin were produced by tissue culture method using leaf, apical meristem and node explants of V. arctostaphylos L. plant. The ultrastructure of the developing callus cells was investigated. To generate callus, sterilized explants were seeded in WPM (Woody Plant Medium) containing different concentrations of IAA (indole acetic acid) or ZEA (zeatin). The most callus containing anthocyanin were obtained from the apical meristem explant in 2 mg/L IAA. The medium containing 2 mg/L IAA was modified with different sucrose concentrations were prepared to increase anthocyanin production and callus biomass. The best callus production were determined with the apical meristem explant in a medium containing 50 g/L sucrose, and was seen pink callus. The pink callus were  examined under fluorescence microscope, with 525 nm green and 610 nm red wavelengths. The callus were had autofluorescent. Fluorescent radiations were observed in the nucleus, cell walls and around the vacuole. In the TEM (transmission electron microscopy) images of the pink calluses we obtained, vesicles stand out especially near the cell wall, around the vacuole, and inside the vacuole. The observation of fluorescent radiation in similar sections supports the idea that these vesicles are loaded with anthocyanins. The cell ultrastructures of the pink and yellow calli growing in medium containing 50 g/L sucrose were examined using TEM after the preparation process. Cells that develop from yellow calli and are called Type 1 have an elliptical or long, angular shape. It has a large vacuole. There are vesicles around the vacuoles, electron dense vesicles attached to the inner surface of the tonoplast and AVI-like inclusions were seen in the vacuole. The cytoplasm and organelles are trapped between the vacuole and the cell wall. It has been observed that cells develop from pink calli called Type 2 often have an elliptical shape. Similar to type 1 cells, it has a large vacuole, its cytoplasm is trapped between the cell wall and the vacuole, with very few intercellular spaces. Compared to type 1 cells, the number of vesicles is very high and they are concentrated around the vacuole. Some of them are dense and spherical in appearance and have the properties of APV (anthocyanin prevacuolar vesicles). Some of the vesicles have an AVI (anthocyanic vacuolar inclusion) appearance within the vacuole. A macroautophagy-like fusion has place between the cytoplasmic vesicles and the vacuole. AVI-like inclusions attached to the inner surface of the tonoplast degrade and leave their contents inside the vacuole. These observations show that the anthocyanin-producing cells of the V. arctostaphylos L. plant transport anthocyanins to the vacuole using the vesicular transport method.