Yüksek bor toleransı gösteren bacıllus ve staphylococcus cinsine ait bazı izolatların genomlarının fragmentize edilerek kısmi klonlanması ve bor direnci ile ilgili genlerin araştırılması
Fragmentizaton and partial cloning of genomes of highly boron tolerant bacillus and staphylococcus isolates and investigation of boron tolerance genes
Yazar: MERVE SEZER
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bor, her geçen gün önemi gittikçe artan, birçok sektörde kullanılan ve doğada göreceli olarak az bulunan bir yarı metaldir. Ülkemizin, dünya Bor rezervlerinin %72?sine sahip olması Bor üzerinde yapılan çalışmaları daha da değerli kılmaktadır. Bunun yanında özellikle sayıları son yıllarda daha da artan çalışmalar Bor?un biyolojik açıdan da önemli olduğunu göstermiştir. Bor?un biyokimyasal ve moleküler rollerinin araştırılmasında model organizma olarak kullanılabilecek en uygun organizmalardan biri de bakterilerdir. Çünkü doğada ilk olarak Bor ile karşı karşıya gelen, sürekli Bor ortamında bulunan ve başka canlılar için barınılması imkansız olan ekstrem Bor koşullarında yaşayabilen bakterilerdir.
Bu çalışmada, asıl hedeflenen yüksek Bor konsantrasyonunda yaşamını devam ettirebilen bakteri örnekleri içerisinde gen kaynaklarının ve Bor tolerans mekanizmalarının anlaşılması için veriler sunmaktırdır. Bu hedefe ulaşabilmek için, daha önceden Türkiye?deki Bor madenlerinden izole edilen Bacillus ve Staphylococcus cinsine ait bakteri izolatları, model organizmalar olarak kullanılmıştır. Bu bakteriler 200?300 mM borik asit içeren ortamda üreyebilen, yüksek Bor toleransına sahip izolatlardır.
Uygun ortamlarda yetiştirilen bakteri izolatlarından ilk olarak genomik DNA?lar izole edilmiştir. Daha sonra elde edilen genom, uygun restriksiyon endonükleazlar ile parçalara ayrılarak plazmid içerisine klonlanmıştır. Plazmid içerisine klonlanan bu DNA fragmentleri Escherichia coli içerisine transforme edilerek Bor bakterilerinin genomik kütüphaneleri oluşturulmuştur. Bu bakterilerin genomik kütüphane kolonileri artan Bor konsantrasyonlarına maruz burakılarak, yani seleksiyona tabi tutularak, normalden daha fazla Bor toleransına sahip E. coli kolonileri seçilmiştir.  Bu şekilde yüksek Bor toleransına sahip kolonilerdeki direnci sağlayan rekombinant plazmidler tespit edilmiş ve içerdikleri insertlerde yer alan genler, DNA dizi analizleri ile belirlendikten sonra, biyoinformatik analizler ile bakterilerdeki Bor toleransı ile ilgili aday genler belirlenmiştir.
Bu çalışmada sonuç olarak, altı adet Bor toleransı yüksek bakteri izolatının genomik kütüphanesi hazırlanarak stoklanmıştır. Binlerce koloni içerisinden yapılan Bor seleksiyonları sonucu, 42 adet Bor toleransına sahip bakteri kolonisi ve rekombinant plazmid elde edilmiştir. Bunlardan seçilen 32 tanesinin insert bölgeleri sekanslanmıştır. Elde edilen Bor tolerans gen adaylarının isimleri, siyanat hidrataz, peptid ABC taşıyıcı ATP-bağlanıcı protein, hipotetikal protein, ATPaz, glikozil transferaz familyasına ait UDP-fosfat N-asetilglukozaminil 1-fosfat transferaz, gliserol 3 fosfat dehidrogenaz, disülfit oksidoredüktaz, spor germinasyon proteini GerPA ve GerPC, phi13 familya faj major kuyruk proteini, L-laktat dehidrogenaz, ribozom ile birleşik GTPase, antisigma W faktörü, bifonksiyonel 5,10-metilen-tetrahidrofolat dehidrogenaz/ 5,10-metilen-tetrahidrofolat siklohidrolaz, ekzodeoksiribonükleaz VII büyük alt birim,  terminaz, fosfat ABC taşıyıcı protein,  ATP bağımlı DNA helikaz (RecG), kromozomal replikasyon başlatma proteini, kinon oksidoredüktaz, C4 dikarboksilat ABC taşıyıcı protein, DctP ailesinden TRAP taşıyıcı solute reseptör, çinko taşıyıcı ailesinden protein, piruvat oksidaz, arjinin kullanan regülatör protein RocR, oligopeptid taşıyıcı ATP bağlayıcı protein OppF, Hsp33 benzeri şaperon, XRE ailesinden transkripsiyon regülatör aktiviteleri bulunmuştur. Belirlenen bu aday aktiviteler hakkında bilgiler verilerek Bor toleransı ile ilişkileri tartışılmıştır.
Anahtar Kelimeler: Bor, Bacillus, Staphylococcus, genomik kütüphane, bakteri, tolerans, gen

Abstract:
Boron is a semi metal that is increasingly important, widely used in numerous sectors and relatively low abundant in nature. The fact that our country possesses 72% of the Boron reserves in the world makes the scientific studies on Boron even more important. Besides, the studies especially increasing even more in the recent years show that Boron is important from the biological perspective as well. One group of the model organisms that can be used to elucidate biochemical and molecular roles of Boron is the bacteria. Because, the bacteria are the first in nature that have come into contact with Boron and can survive in the extreme Boron conditions, in which biological life is otherwise impossible.         
In this study, the main objective is to provide new information in order to understand genes and Boron tolerance mechanisms employed in the bacteria isolates that can survive under extremely high Boron concentrations. To reach this goal, the bacteria previously isolated from the Boron mines belonging to Bacillus and Staphylococcus genus were used as the model organisms. These bacteria are highly Boron tolerant isolates that can grow in the presence of 200-300 mM boric acid.
First, the genomic DNAs were isolated from the bacteria isolates grown properly. Then, the genomes were fragmented using appropriate restriction enzymes and cloned into plasmids. The cloned DNA fragments in the plasmids were then used to transform Escherichia coli to have the genomic libraries of the isolates. The colonies of the genomic libraries of the bacteria were subject to increasing concentrations of Boron (selection) and the colonies that show relatively more Boron tolerance were chosen. So, the plasmids in these Boron tolerant colonies were isolated, the genes present in the insert regions were sequenced and the candidate Boron tolerance genes in the bacteria were found with the use of bioinformatics analyzes.
In conclusion, the genomic libraries of six highly boron tolerant bacteria isolates were prepared and stored into the glycerol stocks in this study. Following Boron selection experiments on thousands of colonies, a total of 42 colonies having relatively higher Boron tolerances and the recombinant plasmids were obtained. Among them, the insert regions of the selected 32 plasmids were sequenced. The candidate Boron tolerance genes were determined and their names are as follows: cyanate hydratase, peptide ABC transpoter ATP-binding protein, hypothetetical protein, ATPase, glycerol family UDP-phosphate N-acetylglucosaminyl 1-phosphate transferase, glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GlpD), disulfate oxidoreductase, spor germinasion protein GerPA and GerPC, phi13 family faj major tail protein, L-lactate dehydrogenase, ribosome-associated GTPase, antisigma W faktör, bifunctional 5,10-methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase/5,10-methylene-tetrahydrofolate cyclohydrolase, exodeoksiribonuclease VII large subunit, terminase, phosphate ABC transpoter protein, ATP dependent DNA helicase (RecG), chromosomal replication initiation protein, uinone oxidoreductase, C4 dicarboxylate ABC transporter, DctP family TRAP transporter solute receptor, Zinc transporter family protein, pyruvate oxidase, arginine utilization regulatory protein rocR, oligopeptide transport ATP binding protein (OppF), Hsp33-like chaperonin, XRE family transcriptional regulator activities. Some information and interpretation were provided about these candidate activities and their potential connection to Boron tolerance was discussed.
Keywords: Boron, Bacillus, Staphylococcus, genomic library, bacteria, tolerance, gene