İnsan büyüme hormonu salgılatma sinyal dizisinin Tetrahymena thermophila tarafından rekombinant protein üretiminde kullanımı
Use of human growth hormone secretory signal sequence in recombinant protein production by Tetrahymena thermophila
Yazar: SERKAN DERELİ
Danışman: DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
Anadolu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Büyüme hormonu = Growth hormone ; DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Sinyal peptidleri =

Özet:
Tetrahymena thermophila ökaryotik, silli ve tek hücreli bir organizma olup, kısa bölünme süresi ve kolay kültürizasyona sahip bir model organizmadır. Organizmanın rekombinant kapasitesi, insan DNazI enzimi ile insan alkalin fosfataz proteinlerinin rekombinant üretim çalışmaları ile tanımlanmıştır. Günümüzde ilaç sektöründe ihtiyaç duyulan terapötik proteinlerden biri olan ve büyüme bozukluğu olan bireylerin tedavisinde kullanılan insan büyüme hormonunun üretimi maya, E. coli ve insan kücre kültüründe gerçekleştirilmektedir. Daha önce bu proteinin üretiminde kullanılmamış T. thermophila'nın insan büyüme hormonunun E.R sinyal dizisini tanıyarak işleyebileceği ve rekombinant proteini dışarıya salgılayarak üretebileceği çalışmanın hipotezini oluşturmaktadır. Bu amaç doğrultusunda, E.R sinyal dizisi ile birlikte hGH geni dizisinin kodonları organizmaya uyumlu hale getirilerek sentetik olarak ürettirilmiştir. Oluşturulan hGH üretim gen kasetleri, 45 kopyalı genom entegrasyonunu sağlayan pNeo4 ve 10.000 kopyalı ekstrakromozomal dairesel pIGF vektörlerine klonlanarak, biyolistik silah ile konjugatif/vejetatif T. thermophila hücrelerine transforme edilmiştir. Pozitif transformantlar ısı şoku veya CdCI2 ile indüklendikten sonra hücre içi ve hücre dışı ortamdan saflaştırılan proteinlerin iki bağımsız SDS-PAGE ve Western Blot analizi, hücre içi ve hücre dışı ortamda yaklaşık 23 kDa'lık sinyali kesilmiş bir proteinin varlığını göstermiştir. Sonuç olarak; T. thermophila'nın insan hGH'nin E.R. sinyal dizi bölgesini tanıyıp kullandıktan sonra kesip uzaklaştırdığı ve rekombinant proteini hücre dışına salgılayabildiği anlaşılmıştır.

Abstract:
Tetrahymena thermophila is a eukaryotic, ciliated, single-celled model organism with short division time and easy cultivation features. The recombinant capacity of the organism demonstrated by recombinant production studies of human DNaseI and human alkaline phosphatase proteins. The production of human growth hormone, which is one of the therapeutic proteins needed in the pharmaceutical sector and used to treat individuals with the growth disorder, is carried out in yeast, E. coli, and the human cell culture. It is hypothesized that T. thermophila, which is not used to produce this protein before, can recognize the E.R signal sequence of human growth hormone and secrete the recombinant protein outside of the cell. For this purpose, the codon sequence of the hGH gene with hGH E.R signal sequence was adapted to the organism and produced synthetically. The generated hGH gene cassettes were cloned into pNeo4 vectors providing genome integration over 45 copies and extrachromosomal pIGF circular vectors containing origin with 10.000 copy number, were transformed into conjugative/vegetative T. thermophila cells by biolistic particle gun. After inducing positive transformants by heat shock or CdCl2, two independent SDS-PAGE and Western Blot analyses of purified proteins from the cells showed recombinant protein has approximately 23 kDa molecular mass and the signal sequence was processed. As a result; it is understood that T. thermophila recognizes human hGH E.R signal sequence, uses the signal sequence, cuts it away and secretes the recombinant protein outside the cell.