HPV pozitif bireylerde miR-519d, HPV16-miR-H1 ve DVL-1 ifadelerinin RT-PCR ile araştırılması
Investigation of miR-519d, HPV16-miR-H1 and DVL-1 expressions in HPV positive individuals by RT-PCR
Yazar: ASLIHAN ESRA BİLDİRİCİ
Danışman: DOÇ. DR. NİLGÜN ÇEKİN
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Gen ifadesi = Gene expression ; Mikro RNA = Micro RNA ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Papillomavirüs enfeksiyonları = Papillomavirus infections ; Papillomavirüsler = Papillomaviridae ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Uterin servikal hastalıklar = Uterine cervical diseases ; Uterin servikal neoplazmlar = Uterine cervical neoplasms

Özet:
Rahim ağzı kanseri ya da servikal kanser, kadınlarda en sık görülen dördüncü kanser türü olup 2018'deki 570.000 yeni vakayla birlikte tüm kadın kanserlerinin %6,6'sını oluşturduğu tahmin edilmektedir. İnsan papilloma virüsü (human papillomavirus, HPV) enfeksiyonları, rahim ağzı kanserinin yerleşik nedenidir ve kadın ve erkeklerin çeşitli anatomik bölgelerindeki diğer kanserlerle de ilişkilidir. Ülkemizde HPV enfeksiyonuyla ilgili çalışmalar belirli gruplarda ve sınırlı popülasyonlarda yapıldığından gerçek prevelansı belirlemek zordur, ancak %2-6 arasında olduğu tahmin edilmektedir. 
Epigenetik mekanizmalardan miRNA'ların, virüs-konak ilişkisinde ve virüs patogenezinde etkili olduğu bilinmektedir. HPV ile insan ve virüs-kodlu miRNA'lar, bu miRNA'ların hedef genleri ve yer aldıkları sinyalizasyon yolakları arasındaki ilişkilerin aydınlatılması hastalığın tanı ve tedavisine yönelik yenilikçi yaklaşımlar getirebilir. Kromozom 19 kümesinde yer alan miR-519d, çeşitli kanserlerde farklı genleri hedefleyerek hem tümör baskılayıcı hem de onkogenik özellikler gösterir. Bununla birlikte, rahim ağzı kanseri gelişiminde ve ilerlemesindeki desteği ve HPV suşlarıyla olan etkileşimi yapılan bazı çalışmalara rağmen hala bilinmezliğini korumaktadır. Hem DNA hem de RNA virüsleri, viral yaşam döngülerinin lehine, hücresel miRNA'ları degrade edecek, azaltacak ya da artıracak mekanizmalar geliştirmiştir. Bu mekanizmalardan biri de virüs kodlu miRNA'lardır. HPV-kodlu miRNA'ların işlevine dair araştırmalar hala devam etmektedir. Kalıcı yüksek riskli HPV enfeksiyonu hücresel dönüşümde çok önemli bir olaydır, ancak malign fenotipi tamamlamak için çoklu hücresel sinyalizasyon yolaklarının da dahil olduğu ek olaylar gerekir. Bazı çalışmalarda HPV'nin transformasyon aktivitesinden sorumlu olan proteinlerin Wnt/β- katenin yolağının düzenlenmesine dahil olduğu gösterilmiştir. Wnt/β-katenin yolağının ana elemanlarından biri olan Dvl-1, Wnt sinyallerinin β-katenine dönüştürülmesine katılır ve daha sonra down-stream efektör genleri aktive eder. 
Hem kan hem de servikal hücrelerde karşılaştırılabilir bir ifadeye sahip güvenilir bir miRNA ve mRNA panelinin belirlenmesi, yüksek riskli grupların etkin bir şekilde izlenmesini sağlayacaktır. Bu nedenle bu çalışmada, farklı servikal lezyonları olan kadınlardan alınan sitolojik örneklerde, konağa ve virüse ait miRNA'ların ve Wnt/β-katenin yolağı elemanlarından birinin mRNA seviyesinde ekspresyonlarının karakterize edilmesi ve bunların servikal kanser ve HPV enfeksiyonları için tanı/tedavi biyomarkerları olarak etkisinin değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Örneklerden total RNA izolasyonu yapılmış ve daha sonra Real Time-PCR kullanılarak bu miRNA'ların ifade düzeylerine bakılmıştır.
Yapılan son ifade analizleri ve istatistiksel değerlendirmeler sonucunda hem kan hem de smear örneklerinde, hasta grubunun kontrol grubu ile kıyaslanması sonucu, miR-519d ifadesi azalırken (fold change sırasıyla; 0,07 kat ve 0,024 kat) Dvl-1 ifadesinde artış (fold change sırasıyla; 1,76 kat ve 2,09 kat) gözlenmiştir. Hem kan hem de smear örnekleri için miR-519d ifadesindeki azalış istatistiksel olarak anlamlıyken (sırasıyla; p=0,0125 ve p=0,04), Dvl-1 ifadesindeki artış istatistiksel öneme sahip değildir (sırasıyla; p=0,51 ve p=0.31). Aynı genler, HPV-pozitif bireyden alınan hasta-sağlıklı doku örneklerinde de karşılaştırılmıştır ve hem miR-519d hem de Dvl-1 geni, hasta dokularda sağlıklı doku örneklerine göre azalış göstermiştir (fold change sırasıyla; 0,79 kat ve 0,41 kat). Her iki gen için de bu azalma miktarları istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (sırasıyla; p=0,99 ve p=0.05).
HPV kodlu miRNA ekspresyonu için hasta grubunun Cq değerleri kendi içinde; HPV tipine ve CIN seviyelerine göre değerlendirilmiştir. Karşılaştırma sonuçlarına göre; HPV16-miR-H1'in kan örneklerindeki ortalama Cq değerleri smear örneklerine göre daha yüksektir, yani HPV16-miR-H1 kan örneklerinde daha düşük ekspresyon göstermektedir. Kan ve smear örnekleri arasındaki bu farklılık istatistiksel olarak da anlamlı bulunmuştur (p=0.009). Hasta ve sağlıklı dokular arasında yapılan kıyaslamaya göre ise Cq değerleri hasta doku örneklerinde istatistiksel olarak anlamlı derecede düşük gözlenmiştir (p<0.0000001).
Çalışma sonuçlarımıza göre; ister konakçı tarafından kodlanan ister virüs tarafından kodlanan miRNA'lar enfeksiyon durumunu belirli ölçülerde ve doğrulukta tahmin etmeye olanak verebilir. Yani servikal lezyonların her aşaması ve herhangi bir HPV tipi ile ilişkisi, invaziv olmayan yöntemlerle spesifik miRNA seviyelerine bakılarak tespit edilebilir. Bu nedenle bu miRNA'lar, invaziv olmayan bir yaklaşım kullanılarak olası prognostik biyobelirteçler olarak daha fazla araştırılmaya adaydırlar. Kanser tedavisinde kemoterapötik ajanların kullanımı, genellikle sinyal yolağı aktivasyonu aracılığıyla ilaç direnciyle sonuçlanır. Bu nedenle "kemoterapi+hedefe yönelik tedavi" kombinasyonu daha etkili olabilir. Wnt sinyalizasyonunun karmaşıklığından dolayı bu yolağın tek bir strateji kullanılarak hedeflenemeyeceği açıktır. Normal hücreleri etkilemeden rahim ağzı kanser hücrelerinde başarılı terapötik müdahaleler için Wnt'in hedefleri olarak olası sinyal dönüşümlerini belirlemek için ek çalışmalara ihtiyaç vardır. Konvansiyonel tedaviler, ilerlemiş kanserli hastaların %40-50'sinde gözlenen kalıntı tümörler nedeniyle optimalin altında kalmaktadır. Birlikte ele alındığında, klinik öncesi ve klinik veriler, kombinatoryal terapilerin, ileri ve/veya tekrarlayan servikal enfeksiyonlu hastalarda sonuçları iyileştireceğini ve bu konudaki ilerlemenin gelecekte bu hastaları idare etmede yardımcı olacağını göstermektedir. Bazı yeni moleküler hedefleme ilaçlarının başarılı olduğu gösterilmiş olsa da "önleme" her zaman en iyi tedavi olacaktır. Bu nedenle erken serviks kanseri teşhisi gelecekteki araştırmaların temel amacını oluşturabilir.

Abstract:
Cervical cancer is the fourth most common cancer in women and is estimated to account for 6.6% of all female cancers, with 570.000 new cases in 2018. Human papillomavirus (HPV) infections are an established cause of cervical cancer and are also associated with other cancers in various anatomical regions of men and women. Since studies on HPV infection in our country are carried out in certain groups and limited populations, it is difficult to determine the true prevalence, but it is predicted to be between 2-6%. 
It is known that miRNAs, one of the epigenetic mechanisms, are effective in virus-host relationship and virus pathogenesis. Clarifying the relationships between HPV and human- and virus-encoded miRNAs, the target genes of these miRNAs and the signaling pathways in which they are involved may bring innovative approaches to the diagnosis and treatment of the disease. MiR-519d, located in the chromosome 19 cluster, displays both tumor supressör and oncogenic properties by targeting different genes in various cancers. However, its support in the development and progression of cervical cancer and its interaction with HPV strains still rmain unknown despite some studies. Both DNA and RNA viruses have evolved mechanisms to degrade, decrase or increase cellular miRNAs in favor of their viral life cycle. One of these mechanisms is virus-encoded miRNAs. Research into the function of HPV-encoded miRNAs is still ongoing. Persistent high-risk HPV infection is a pivotal event in cellular transformation, but additional events, including multiple cellular signaling pathways, are required to complement the malignant phenotype. In some studies, it has been shown that the proteins responsible for the transformation activity of HPV are involved in the regulation of the Wnt/β-catenin pathway. One of the key elements of the Wnt/β-catenin pathway, Dvl-1, participate in the conversion of Wnt signals to β-catenin and then activates down-stream effector genes. 
Identifying a relibale panel of miRNA and mRNA with comparable expression in both blood and cervical cells will enable effective monitoring of high-risk groups. Therefore, in this study, levels of host and viral miRNA and one of the Wnt/β-catenin pathway elements and their effects as diagnostic/therapeutic biomarkers for cervical cancer and HPV infections were evaluated in cytological samples from women with different cervical lesions. Total RNA was isolated from the samples and then the expression levels of these miRNAs were examined using Real Time-PCR. 
As a result of the final expression analyzes and statistical evaluations, in both blood and smear samples, when the patient group was compared with the control group, the expression of miR-519d decreased (fold change; 0.07-fold and 0.024-fold, respectively) and Dvl-1 expression increased (fold change; 1.76-fold and 2.09-fold). For both blood and smear samples, while the decrase in miR-519d expression was statistically significant (p=0,0125 and p=0.04, respectively) the increase in Dvl-1 expression was not statistically significant (p=0.51 and p=0.31, respectively). The same genes were also compared in patient and healthy tissue samples from HPV-positive individuals, and both miR-519d and Dvl-1 genes were decreased in patient tissues compared to healthy tissue samples (fold change; 0.79-fold and 0.41-fold, respectively). These reduction were not statistically significant for both genes (p=0.99 and p=0.05, respectively). 
For HPV-encoded miRNA expression, Cq values of the patinet group evaluated according to HPV type and CIN levels. According to the comparison results; the mean Cq values of HPV16-miR-H1 in blood samples are higher than in smear samples, that is HPV16-miR-H1 shows lower expression in blood samples. This difference between blood and smear samples was also statistically significant (p=0.009). According to the comparison made between patient and healthy tissues, Cq values were found to be statistically significantly lower in patient tissue samples (p<0.0000001). 
As regards our study results; miRNAs, whether encoded by the host or encoded by the virus, may allow to predict the infection status to a certain extent and accuracy. In other words, each stage of cervical lesions and their association with any HPV type can be determined by looking at specific miRNA levels with non-invasive methods. Therefore, these miRNAs are candidates for further investigation as possible prognostic biomarkers using a non-invasive approach. The use of chematherapeutic agents in cancer treatment often results in drug resistance through signaling pathway activation. Therefore, the combination of "chemotherapy + targeted therapy" may be more effective. It is clear that Wnt/β-catenin pathway cannot be targeted using a single strategy, due to the complexity of signaling pathway. Additional studies are needed to identify possible signaling transformations as targets of Wnt for successful therapeutic interventions in cervical cancer cells without affecting normal cells. Conventional treatments reain sub-optimal due to residual tumors observed in 40-50% of patients with advanced cancer. Taken together, preclinical and clinical data suggest that cobinatorial therapies will improve outcomes in patient with advanced and/or recurrent cervical infections and that progress in this area will be helpful in managing these patients in the future. Although some new molecular targeting drugs have been shown to be successful, "prevention" will always be the best treatment. Therefore, early cervical cancer diagnosis may be the main goal of future research.