Fare sperminin dondurulabilirliği üzerine ferulik asit, triptofan ve L-Glutamine'in etkisi
The effects of ferulic acid, tryptophan, and L-Glutamine on mouse sperm freezability
Yazar: GÖKHAN KOÇAK
Danışman: PROF. DR. CENGİZ YILDIZ
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum,Jinekoloji ve Suni Tohumlama (Veterinerlik) Anabilim Dalı / Veteriner Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Fareler = Mice ; Ferulik asit = Ferulic acid ; Glutamin = Glutamine ; Sperm = Spermatozoa ; Triptofan = Tryptophan

Özet:
Sunulan çalışmada, fare spermatozoon hücrelerinin dondurulabilirliği üzerine %18 raffinoz+%3 yağsız süt tozu sperma sulandırıcısına ilave edilen farklı dozlardaki Ferulik asit (0.1mM, 1mM ve 10mM), Triptofan (5mM, 25mM ve 50mM) ve L-Glutamin (10mM, 50mM ve 100mM) etkinlikleri araştırıldı. Çalışmada %18 Rafinoz+%3 yağsız süt tozu kombinasyonu kontrol olarak tutuldu. 
Araştırmada 12-24 haftalık yaşta 60 adet CD-1 ırkı erkek fareler kullanılmıştır. Fareler biri kontrol ve  dokuzu deneme grubu olacak şekilde 10 gruba ayrıldı. Her grup 6 adet fareden oluşturuldu. Fareler servikal dislokasyon yöntemi ile sakrifiye edilerek, kauda epididimislerden spermatozoa elde edildi. Kontrol grubu farelerden elde edilen spermatozoa,  %18 raffinoz+%3 yağsız süt tozundan oluşan sperma sulandırıcısı ile sulandırıldı. Deneme gruplarına %18 raffinoz+%3 yağsız süt tozu sperma sulandırıcısına 0.1, 1 mM ve 10 mM ferulik asit, 5 mM, 25 mM  ve 50 mM Triptofan  ve 10 mM, 50 mM ve 100 mM L-Glutamin  ilave edildi.  Sulandırılmış sperma 10 dakika inkube edildikten sonra 0.25 ml'lik payetlere çekilerek sıvı azot buharında donduruldu. Dondurulmuş sperma 37oC'lik su banyosunda 30 saniyede çözdürüldü. Dondurma çözdürme sonrası sperma örneklerinin motilite, ölü spermatozoon oranı, plazma membran bütünlüğü, anormal akrozom oranı, HTF (Human Tubal Fluid) içerisinde 4 saat süresince motilite dayanıklılık, ve hücre apoptozu testleri yapıldı. Dondurma çözdürme sonrası kontrol grubu ile karşılaştırıldığında en yüksek motilite ve plazma membran bütünlüğü sırası ile %56.67±2.11 ve %77.83±0.87 ile 10 mM L-Glutamin grubunda elde edildi (P<0.05). Ayrıca, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında en düşük ölü spermatozoon oranı ve anormal akrozom oranı ise sırası ile %26.00±1.46 ve %6.33±1.09 olarak 10 mM L-Glutamin grubunda belirlendi (P<0.05). Dondurma ve çözdürme sonrası motilite dayanıklılık (longevity) süresi, kontrol gurubu ile karşılaştırıldığında 4. saate kadar 10 mM ve 50 mM L-Glutamin grubunda belirlendi (P<0.05). Sperma örneklerinde apoptozun   değerlendirilmesinde  kontrol,  0.1 mM Ferulik asit ve 10 mM L-Glutamin grupları arasında önemli bir fark bulunmadı (P>0.05).
Sonuç olarak, sperma sulandırıcısına 10 mM L-Glutamin ilavesinin dondurup çözdürme sonrası motilite, canlı spermatozoon, fonksiyonel membran bütünlük oranı, anormal akrozom oranı veya motilite dayanıklığını arttırdığı ve fare sperma dondurma sulandırıcılarında başarılı bir şekilde kullanılabileceği belirlendi.

Anahtar kelimeler: Fare, dondurulmuş çözdürülmüş sperma, ferulik asit, triptofan, L-glutamin.

Abstract:
In the present study, the activities of Ferulic acid (0.1mM, 1mM ve 10mM), Tryptophan (5mM, 25mM ve 50mM)  and L-Glutamine (10mM, 50mM ve 100mM) at different doses added to 18% raffinose + 3% skimmed milk powder semen extender on the freezing of mouse spermatozoa cells were investigated. The group of 18% raffinose + 3% skimmed milk powder combination was used as the control group.
In the study, 60 male CD-1 mice aged 12-24 weeks were used. Mice were divided into 10 groups, including one control group and nine experimental groups. Each group consisted of 6 mice. Mice were sacrificed by cervical dislocation method and spermatozoa were obtained from cauda epididymis. The spermatozoa obtained from the control group mice were diluted with a semen extender consisting of 18% raffinose + 3% skimmed milk powder. To the experimental groups, 18% raffinose + 3% skimmed milk powder semen extender was added to 0.1, 1 mM and 10 mM ferulic acid, 5 mM, 25 mM and 50 mM Tryptophan and 10 mM, 50 mM and 100 mM L-Glutamine. After incubating for 10 minutes, diluted semen was drawn into 0.25 ml straws and frozen in liquid nitrogen vapor. Frozen semen was thawed in a 37oC water bath for 30 seconds. After freezing thawing, motility, dead spermatozoa ratio, plasma membrane integrity, abnormal acrosome ratio, motility endurance and cell apoptosis tests were performed in HTF (Human Tubal Fluid) for 4 hours. Compared with the control group after freeze-thaw, the highest motility and plasma membrane integrity were obtained in the 10 mM L-Glutamine group with 56.67±2.11% and 77.83±0.87%, respectively (P<0.05). In addition, when compared to the control group, the lowest rate of dead spermatozoa and abnormal acrosome were found in the 10 mM L-Glutamine group as 26.00±1.46% and 6.33±1.09%, respectively (P<0.05). The duration of longevity after freezing and thawing was determined in the 10 mM and 50 mM L-Glutamine group up to the 4th hour compared to the control group (P<0.05). In the evaluation of apoptosis in semen samples, there was no significant difference between control, 0.1 mM Ferulic acid and 10 mM L-Glutamine groups (P>0.05).
As a result, it was determined that the addition of 10 mM L-Glutamine to the semen extender increased the motility after freeze-thaw, viable spermatozoa, functional membrane integrity ratio, abnormal acrosome ratio or motility resistance and could be used successfully in mouse semen freezing extenders.

Keywords: Mouse, frozen-thawed semen, ferulic acid, tryptophan, L-glutamine.