İnsan safen veninde hidrojen peroksit ile oluşturulan oksidatif stres ve doksisiklinin vasküler yanıtlar üzerine etkileri
Vascular reactivity of doxycycline and hydrogen peroxide-induced oxidative stress in human saphenous vein
Yazar: MAZEN SAEED ABDULAZIZ SAEED
Danışman: DOÇ. DR. CEREN KORKMAZ ; DOÇ. DR. BUKET REEL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Doksisiklin = Doxycycline ; Hidrojen peroksit = Hydrogen peroxide ; Koroner arter bypass = Coronary artery bypass ; Matriks metalloproteinaz 9 = Matrix metalloproteinase 9 ; Matriks metalloproteinazlar = Matrix metalloproteinases ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Safen ven = Saphenous vein ; Serbest radikaller = Free radicals ; Transplantlar = Transplants

Özet:
Amaç: Reaktif oksijen türlerinin (ROT) artan düzeyleri kardiyovasküler cerrahide önemli bir klinik problemdir. ROT'nin üretimi ve proinflamatuvar enzimler olan matriks metalloproteinazların (MMP'ler) aktivasyonu pekçok kardiyovasküler hastalık ile ilişkilidir. Doksisiklin subantimikrobiyal dozda etkin bir MMP inhibitörü ve aynı zamanda ROT tutucu olarak davranır. Bu çalışmada insan safen ven (İSV) segmentlerinde hidrojen peroksit ile stimüle edilen in vitro oksidatif strese bağlı zayıflamış vasküler reaktivitenin doksisiklin ile normalize edilebileceği hipotezini araştırmayı amaçladık.
Metodlar: İSV segmentleri koroner arter bypass graft operasyonuna alınan hastalardan toplanmıştır. Segmentlerin endotel tabakası dikkatlice kazınarak uzaklaştırılmıştır. Daha sonra, segmentler 4 gruba ayrılmış ve 10 µM hidrojen peroksit ve/veya 10 µM doksisiklin ile16 saat süre ile inkübe edilmiştir. İşlem görmemiş İSV segmentleri kontrol olarak işlem görmüştür. Vasküler reaktivitedeki değişiklikleri değerlendirmek için fonksiyonel endotelyuma sahip olmadığı doğrulanan ven halkalarında noradrenalin, potasyum klorür, serotonin ve papaverin için konsantrasyon-yanıt eğrileri gerçekleştirilmiştir. Paralel deneylerde ven halkalarındaki ROT düzeyleri lusigenin ve luminol ile amplifiye edilmiş kemilüminesans yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. Başka bir deney setinde, paralel İSV halkalarında MMP-9 ve MMP-13 ekspresyonları immünohistokimyasal olarak incelenmiştir.
Sonuçlar: İSV'nin hidrojen peroksit ile inkübasyonu ROT ve süperoksit anyon düzeylerinde sırasıyla 5 ve 4 katlık artışlara sebep olmuştur. Doksisiklin artan ROT ve süperoksit anyon düzeylerini anlamlı şekilde azaltmıştır. Hidrojen peroksit grubundan İSV segmentlerinde noradrenalin, potasyum klorür ve serotonine karşı kontraktil yanıtlar anlamlı şekilde azalmıştır. Doksisiklin ile tedavi serotonine karşı değil ancak noradrenalin ve potasyum klorüre karşı azalmış kontraktil yanıtları artırmıştır. Bu kontraktil ajanlara karşı duyarlık (pD2) değişmemiştir. Papaverine karşı gevşeme yanıtları ve pD2 değerleri hidrojen pereoksit ya da doksisiklin tedavisinden etkilenmemiştir. MMP-9 ve MMP-13 ekspresyonları İSV segmentlerinin sırasıyla adventisya ve medya tabakasında artmıştır. Doksisiklin her iki MMP'nin ekspresyonlarını etkilememiştir.
Varılan Sonuçlar: Çalışmamızda doksisiklin İSV halkalarında hidrojen peroksitle stimüle edilen oksidatif stresin neden olduğu bozulmuş vasküler reaktiviteyi düzeltmiştir. Bu sonuçlar doksisiklinin koroner arter bypass graft operasyonu sırasındaki iskeminin sebep olduğu oksidatif stresin önlenmesinde bir antioksidan olarak yararlı olabileceğini düşündürmektedir.

Anahtar Kelimeler:
Doksisiklin, Matriks metalloproteinazlar, Oksidatif stress, Reaktif oksijen türleri, Koroner arter bypass graftı, Hidrojen peroksit

Abstract:
Objective: Increased level of reactive oxygen species (ROS) is an important clinical problem in cardiovascular surgery. ROS production and activation of matrix metalloprotienases (MMPs) which are proinflammatory enzymes are associated with many cardiovascular diseases. Doxycycline at subantimicrobial dose acts as a potent matrix metalloproteinase inhibitor and also ROS scavenger. In this study, we aimed to investigate the hypothesis that impaired vascular reactivity due to in vitro oxidative stress stimulated by hydrogen peroxide can be normalized with doxycyclin in human saphenous vein (HSV) segments.
Methods: HSV segments were collected from patients who undergoing coronary artery bypass grafting operation. The endothelial layers were gently removed by scratching. Then, the segments were divided into 4 groups and incubated with 10 µM hydrogen peroxide and/or 10 µM doxycycline for 16 hs. Untreated HSV segments served as control. In order to evalute the changes in vascular reactivity, concentration-response curves for noradrenaline, potassium chloride, serotonin and papaverine were performed in vein rings which are confirmed not having functional endothelium. In parallel experiments, ROS levels in the vein rings were assessed by using lucigenin- and luminol-enhanced chemiluminescence method. In another experiment set, MMP-9 and MMP-13 expressions were examined immunohistochemically in parallel rings.
Results: Incubation of HSVs with hydrogen peroxide caused 5-fold and 4-fold increases in the levels of ROS and superoxide anion, respectively. Doxycycline significantly reduced the increased levels of ROS and superoxide anion. Contractile responses to noradrenaline, potassium chloride and serotonin significantly decreased in HSV segments from hydrogen peroxide group. Treatment with doxycycline augmented the impaired contractile responses to noradrenaline and potassium chloride but not to serotonin. Sensitivity (pD2 values) to these contractile agents remained unchanged. Relaxant responses and pD2 to papaverine were not affected by either hydrogen peroxide or doxycycline treatment. MMP-9 and MMP-13 expressions increased in adventitia and media layers of vein segments respectively. Doxycycline did not affect the expressions of both MMPs.
Conclusions: In our study, doxycycline improved impaired vascular reactivity induced by hydrogen peroxide-stimulated oxidative stress in HSV rings. These results may suggest that doxycycline may be useful as an antioxidant in the prevention of oxidative stress injury caused by ischemia during coronary artery bypass grafting operation.

Keywords:
Doxycycline, Matrix metalloproteinases, Oxidative stress, Reactive oxygen species, Coronary artery bypass graft, Hydrogen peroxide.