Epitelyal-mezenşimal geçişin insan A549 hücrelerinde metastaz ve ilaç direnci üzerine etkileri
Effects of epithelial-mesenchymal transition on metastasis and drug resistance in human A549 celss
Yazar: NAZLI SARE TAYYAN
Danışman: PROF. DR. FÜSÜN ÖZTAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Antikanser = Anticancer ; Biyobelirteçler = Biomarkers ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Sisplatin = Cisplatin ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
İlaç direnci, kanserle mücadele açısından çözümlenmesi gereken önemli problemler arasında yer almaktadır. Yapılan çalışmalar, epiteliyal-mezenşimal geçiş (EMT) ile akciğer kanserinde gelişen ilaç direnci arasında doğrusal bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. Sisplatin (DDP) kanser tedavisinde yaygın kullanılan bir kemoterapötik ajandır. Ancak DDP'ye karşı gelişen ilaç direnci tedaviyi kısıtlamaktadır. Bu nedenle, DDP ilaç direncine neden olan mekanizmaların aydınlatılması ve sorumlu moleküllerin saptanarak tedavi yaklaşımının belirlenmesi önemlidir. EMT uyarımı ile DDP direncine sebep olan moleküllerin saptanması, kanser araştırmalarında ön plana çıkmaktadır. Çalışmamızda kanserin malign progresyonuna ve ilaç direncine katkı sağladığı bilinen EMT süreci A549 hücrelerinde TGF-β ile uyarılarak, bu hücrelerde DDP aracılı hücre ölümüne karşı bir direnç gelişip gelişmediğinin belirlenmesi ve CARLo-5 ve CD99P1 lncRNA'ların bu süreçteki ekspresyon profilindeki değişimlerinin saptanması amaçlanmıştır.
Transforme edici büyüme faktörü-beta (TGF-β, 5 ng/ml) ile EMT uyarımı yapılan A549 hücreleri, 48 saat sonra 2, 4, 6 ve 32 µg/ml DDP ile uyarıldılar. DDP uyarımından 48 saat sonra, hücrelerde MTT yöntemi ile hücre canlılık analizi yapıldı ve IC50 değeri hesaplandı. A549 hücrelerinden üç deney grubu oluşturuldu: (Grup 1) 4,8 µg/ml DDP ile muamele edilen hücreler, (Grup 2) TGF- β ile uyarılan hücreler, (Grup 3) TGF-β uyarımından 48 saat sonra DDP ile muamele edilen hücreler. Tüm hücreler uyarımları takip eden 48 ve 96. saatlerde toplandılar. EMT (E-Kaderin, α-SMA, TWIST, DKK1) ve apoptoz (Aktif Kaspaz-3) ile ilişkili proteinlerin miktarı Western Emdirim yöntemi ile belirlendi. Ayrıca, hücrelerde CDH1, ACTA2, CARLo-5 ve CD99P1 genlerinin ekspresyonu qRT-PCR ile analiz edildi. 
DDP ile muamele edilen hücrelerde IC50 değeri 4,8 μg/ml iken, TGF-β ile uyarılan hücrelerde 23,6 μg/ml'ye yükseldi. DDP ile muamele edilen hücrelerde deneyin 96. saatinde Aktif Kaspaz-3, α-SMA, TWIST, CARLo-5 ve CD99P1 seviyelerinde artış, E-Kaderin ve DKK1 protein seviyelerinde azalma tespit edildi. TGF-β ile uyarılan hücrelerde deneyin 96. saatinde α-SMA, TWIST, CARLo-5 ve CD99P1 seviyelerinde artış, E-Kaderin ve DKK1 protein seviyelerinde azalma tespit edilirken Aktif Kaspaz-3 seviyesinde bir değişiklik gözlenmedi. TGF-β+DDP uygulaması yapılan grupta ise Aktif Kaspaz-3, E-Kaderin, DKK1 protein seviyeleri azalırken, α-SMA, CARLo-5 ve CD99P1 seviyelerinde artış gözlenmiştir. 
DDP uygulamaları, A549 hücrelerinde Aktif kaspaz-3 protein seviyesinde artışa neden olarak bu hücrelerin apoptozla ölmesini sağlar. DDP, TGF-β kadar olmasa da A549 hücrelerinde EMT'yi uyarabilmektedir. TGF-β, A549 hücrelerinde güçlü bir şekilde EMT'yi uyarırken, hücrelerin apoptotik yol ile ölmelerine neden olmaz. TGF-β aracılı EMT uyarımı A549 hücrelerinde 96 saat boyunca devam etmektedir. TGF-β ile uyarılan A549 hücrelerinde Aktif Kaspaz-3 seviyelerinde anlamlı bir değişim saptanmamıştır. TGF-β ile uyarıldıktan sonra DDP uygulaması yapılan A549 hücrelerinde, DDP IC50 değerinin 4,8 µg/ml den 23,6 µg/ml'ye yükselmesi, A549 hücrelerinde, güçlü bir EMT varlığında, DDP aracılı apoptoza karşı bir direncin geliştiğinin açık bir göstergesidir. DDP aracılı apoptoza direncin geliştiği A549 hücrelerinde güçlü EMT sinyali varlığında ve EMT ile ilişkili CARLo-5 ve CD99P1 lncRNA'larının ekspresyonu artar. Özellikle CD99P1 ekspresyonundaki artış, bu lncRNA'nın A549 hücrelerinde DDP aracılı hücre ölümüne karşı kazanılan direncin belirlenmesinde güçlü bir biyobelirteç adayı olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Drug resistance is one of the important problems to be solved in the fight against cancer. Studies have revealed a linear relationship between epithelial-mesenchymal transition (EMT) and drug resistance in lung cancer. Cisplatin (DDP) is a widely used chemotherapeutic agent in cancer treatment. However, drug resistance to DDP limits the treatment. Therefore, it is important to elucidate the mechanisms causing DDP drug resistance and to determine the treatment approach by identifying the responsible molecules. Determination of the molecules that cause DDP resistance by EMT stimulation comes to the prominence in cancer research. In our study, the EMT process, which is known to contribute to malignant progression of cancer and drug resistance, was stimulated by TGF-β in A549 cells to determine whether a resistance to DDP-mediated cell death develops in these cells and to investigate the changes in the expression profile of CARLo-5 and CD99P1 lncRNAs in this process.
A549 cells stimulated with transforming growth factor-beta (TGF-β, 5 ng/ml) to EMT induction were treated with 2, 4, 6 and 32 µg/ml DDP 48 hours after TGF-β stimulation. At 48 hours after DDP stimulation, cell viability was analysed by MTT method and IC50 value was calculated. Three experimental groups were formed from A549 cells: (Group 1) cells treated with 4.8 µg/ml DDP, (Group 2) cells stimulated with TGF- β, (Group 3) cells treated with DDP 48 hours after TGF-β stimulation. All cells were harvested at 48 and 96 hours following stimulation. The amount of proteins associated with EMT (E-Cadherin, α-SMA, TWIST, DKK1) and apoptosis (Activated Caspase-3) were determined by Western Blotting. In addition, the expression of CDH1, ACTA2, CARLo-5 and CD99P1 genes in cells was analysed by qRT-PCR. 
While the IC50 value was 4.8 μg/ml in DDP-treated cells, it increased to 23.6 μg/ml in DDP-treated cells stimulated with TGF-β. Active Caspase-3, α-SMA, TWIST, CARLo-5 and CD99P1 levels increased and E-Cadherin and DKK1 protein levels decreased in DDP-treated cells at 96 h of the experiment. In TGF-β-stimulated cells, an increase in α-SMA, TWIST, CARLo-5 and CD99P1 levels, a decrease in E-Cadherin and DKK1 protein levels, and no change in Active Caspase-3 levels were observed at 96 hours of the experiment. In the TGF-β+DDP treated group, Active Caspase-3, E-Cadherin, DKK1 protein levels decreased, while α-SMA, CARLo-5 and CD99P1 levels increased.
DDP treatment causes an increase in the level of activated caspase-3 protein in A549 cells and results in the death of these cells by apoptosis. DDP can stimulate EMT in A549 cells, although not as much as TGF-β. While TGF-β strongly stimulates EMT in A549 cells, it does not cause cells to die by apoptotic pathway. TGF-β-mediated EMT stimulation continues for 96 hours in A549 cells. No significant change was detected in Active Caspase-3 levels in A549 cells stimulated with TGF-β. The increase in the IC50 value of DDP from 4.8 µg/ml to 23.6 µg/ml in A549 cells treated with DDP after stimulation with TGF-β is a clear indication that A549 cells develop a resistance to DDP-mediated apoptosis in the presence of a strong EMT. In A549 cells in which resistance to DDP-mediated apoptosis develops, the expression of EMT-related CARLo-5 and CD99P1 lncRNAs increases in the presence of strong EMT signalling. Especially the increase in CD99P1 expression suggests that this lncRNA may be a strong biomarker candidate in determining the acquired resistance to DDP-mediated cell death in A549 cells.