Bacillus circulans m34'ten proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of protease from Bacillus circulans m34
Yazar: ESMA SARİ
Danışman: PROF. DR. ATİLLA ÖKTEMER
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Dimetil sülfoksit = Dimethyl sulfoxide ; Dithiothreitol = Dithiothreitol ; EDTA = EDTA ; Sodyum dodesil sülfat = Sodium dodecyl sulphate ; Trikloroasetik asit = Trichloroacetic acid

Özet:
Bu çalışmada topraktan izole edilen Bacillus circulans M34'ten proteaz enzimi saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Proteaz enzimi; (NH4)2SO4 çöktürmesinden sonra Q-Sepharose anyon değişim kromatografisi ve Sepharose 4B-bacitracin afinite kromatografisiyle, sırasıyla %47,29 ve %41,05 verimle saflaştırılmıştır. Saflaştırma katsayısı ise her bir kromatografi için sırasıyla 9,48 ve 102,88 olarak tespit edilmiştir. Enzimin molekül kütlesi; SDS-PAGE ve Jel filitrasyon kromatografisi ile 27,5 kDa olarak bulunmuştur. Enzimin optimum sıcaklığının ve pH'ının sırasıyla 50oC ve 11 olduğu tespit edilmiştir. Enzim; 8'den 11'ye kadar olan geniş bir pH aralığında 40oC'de bir saatlik inkübasyon sonrasında aktivitesinin %97'sini koruyarak büyük ölçüde kararlı kalmıştır. pH 6-7, pH 4-5 ve pH 12'de ise enzim aktivitesinin sırasıyla %85, %75 ve %60'ı korunmuştur. Enzimin; 40 oC ve 50 oC sıcaklıklarda 1 saat kararlılığını koruduğu ancak 60 oC ve 70 oC sıcaklıkta aktivitesini çok çabuk kaybettiği görülmüştür. Enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde Zn2+, Cu2+ ve Co2+ enzim aktivitesini arttırırken Sn2+,Fe2+,Ba2+,Fe3+, Mn2+ ve Mg2+ varlığında aktivitede kayıp gözlenmiştir. K1+, Ca2+ ve Na1+ iyonlarının ise enzim aktivitesi üzerine bir etkisi olmamıştır. Etanol çözeltisi ile enzim aktivitesinde artış gözlenirken ksilen varlığında enzim aktivitesinde düşüş gözlemlenmiştir. DMSO, toluen, bütanol ve benzen varlığında enzim aktivitesinde sırasıyla %6, %6, %14 ve %22'lik bir düşüş gözlenmiştir. Enzimin yüzey aktif maddelere ve yükseltgenlere karşı kararlılığını koruduğu ancak yüzey aktif bir madde olan SDS varlığında aktivitesinin %80'ini kaybettiği görülmüştür. Enziminin; kazein, jelatin, keratin, ovalbumin ve BSA gibi doğal substratlar karşısında en yüksek aktiviteyi kazein substratına karşı gösterdiği görülmüştür. Enzimin serin spesifik inhibitörü olan PMSF ile neredeyse tamamen inhibe edilmiştir. EDTA varlığında aktivitede görülen %27'lik kayıpda enzimin metal bağlama bölgesine sahip olduğunu göstermiştir. Bu inhibisyon profili, bu proteazın serin proteaz sınıflandırılması ile tutarlı olduğunu göstermiştir. Enzimin Lineweaver-Burk grafiğinden yararlanılarak tespit edilen Km ve Vm değerleri sırasıyla 0,96 mg/ml ve 9,548 µmol ml-1 dk-1 olarak bulunmuştur.

Abstract:
In this work, purification and characterization of a protease produced by Bacillus circulans M34 isolated from a soil sample. The protease was purified by Q-Sepharose anion exchange chromatography and Sepharose?bacitracin affinity chromatography followed by (NH4)2SO4 precipitation with a yield of 47,29% and 41,05%, respectively. Purification fold obtained by using Q-Sepharose anion exchange chromatography and Sepharose?bacitracin affinity chromatography were 9,48 and 102,88, respectively. The molecular mass of the purified enzyme determined by using SDS?PAGE and gel filtration chromatography were approximately 27,5 kDa. The optimum pH and temperature of protease was 11 and 50 oC, respectively. The purified enzyme was stable temperatures of 40 °C and 50 °C after incubation for one hour but rapidly deactivated at temperatures of 60 °C and 70 °C. The purified protease was stable over a wide pH range, maintaining 97% of its original activity at pH 8.0?11.0 after incubation at 40 oC for 60 min. The enzyme retained 85%, 75% and 60% of its original activity at pH 6-7, pH 4-5 and pH 12, respectively. The effect of various metal ions on protease activity was tested. While Zn2+, Cu2+ and Co2+ increased protease activity, some other metals such as Sn2+,Fe2+,Ba2+,Fe3+, Mn2+ ve Mg2+ inactivated enzyme activity. K1+, Ca2+ and Na1+ showed no effect on protease activity. Xylene were inhibitory to the protease activity whereas ethanol were stimulatory. DMSO, toluene, butanol and benzene had fewer inhibitory effects, bringing about 6%, 6%, 14% and 22% decreases in activity, respectively. The purified protease was found to be stable in the surfactants and oxidizing agent, but more than 80% inactivation was observed in the presence of SDS. The proteases showed highest activity towards casein relative to other native proteins such as gelatin, ceratin, egg albumin and BSA. The protease was almost completely inhibited by the serine protease inhibitor PMSF (up to 95%). The enzyme has metals binding site since 27% of the activity was retained in the presence of EDTA. This inhibition profile is consistent with the classification of this protease as serine proteases. The kinetic parameters, Vmax and Km, of the purified protease were determined by using Lineweaver-Burk plot 0,96 mg/ml and 9,548 µmol ml-1 dk-1, respectively.