Çeşitli kanser hücreleri üzerinde sitotoksik etkili paladyum türevlerinin moleküler etki mekanizmalarının aydınlatılması
Elucidation of molecular action mechanisms of cytotoxic palladium derivatives on various cancer cells
Yazar: ÖMER KAÇAR
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA ; DOÇ. DR. CEYDA AÇILAN AYHAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Kanser, dünyadaki ilk üç ölüm biridir. Sağlık sistemleri ve araştırma merkezlerinde kanserle mücadeleye gereken önem verilmesine rağmen, kemoterapide kullanılan antikanser ilaçların düşük etkinliği ve normal dokular üzerindeki toksisitesi çözümlenememiş en önemli sorunlardandır. Platin (Pt)-temelli ilaç Cisplatin, 40 yıldan fazla süredir pek çok solid tümörün tedavisinde kullanılan ve oldukça iyi bilinen kemoterapötik bir ilaçtır. Cisplatin'in keşfi metal temelli alternatif ilaçların araştırılmasına hız kazandırmıştır. Paladyum (Pd)-temelli metal bileşikler,, Pt-temelli olanlara göre suda daha yüksek çözünürlük ve daha düşük nefrotoksisite özellikleriyle potansiyel antikanser ilaçlar olarak önerilmektedir. 
Bu tezde, [PdCl(terpy)](sac).2H2O (Bileşik 1) ve [Pd(sac)(terpy)](sac).4H2O (Bileşik 2) (terpy = 2,2':6', 2''-terpiridin ve sac=sakkarinat) adı verilen iki yeni paladyum bileşiğinin antikanser özellikleri araştırıldı. Bileşik 1 için moleküler etki mekanizması aydınlatıldı ve her iki bileşik için sitotoksik etkinin hücre döngüsü özgüllüğü araştırıldı. İlk olarak, Bileşik 1 ve Bileşik 2'nin değişik kanser hücre hatları (MDA-MB-231, MCF-7, PC-3, MDA-MB-435, HeLa ve SH-SY5Y) üzerindeki sitotoksik etkileri IC50 değerleri şeklinde belirlendi. IC50 değerlerini hesaplamak için Pd(II) bileşikleri uygulanmış hücrelerin canlılığı MTT (3-(4, 5-dimetilltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolium bromit) ve WST-1 (4-[3-(4-iodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzen disülfonat sodyum tuzu) testleriyle belirlendi. Her iki bileşiğin de 24, 48 ve 72 saat için, sırasıyla                      25.7±4.3 – 50< µM, 3.1±0.1 – 50< µM ve 2.41±0.1 – 44.61±5.3 µM aralığındaki IC50 değerleriyle kanser hücreleri üzerinde toksik etki gösterdiği bulundu. 
MDA-MB-435 ve HeLa hücreleri, Bileşik 1 ile etkileşime cevap olarak ortaya çıkan ölüm mekanizmasının aydınlatılması için seçildi. Bileşik 1 ile etkileştirildikten sonra hücrelerde ışık mikroskobuyla büzüşme ve tomurcuklanma gibi morfolojik değişikliklerin yanı sıra yoğunlaşmış/fragmente olmuş çekirdekler gözlendi. Bu bulgulara ek olarak, Bileşik 1 uygulanmış hücrelerde ApoTox-Glo™ Triplex kiti kullanılarak belirlenen kaspaz 3 aktivitesinin arttığı bulundu. Bu sonuçlar, hücre ölümünde ana mekanizmanın apoptoz olduğunu gösterdi. Apoptozun hangi mekanizmalarla indüklendiğinin araştırılması amacı ile öncelikle bir in vitro deney gerçekleştirildi. DNA ile doğrudan etkileştirilen Bileşik 1'in plazmit DNA'sını rastgele olarak kırabildiği gözlendi. Apoptozda çift zincir kırıkları (ÇZK)'nın rolü olup olmadığını anlamak için bir ÇZK belirteci olan γ-H2AX birikmesi immünofloresans tekniği ile incelendi. Sonuçlar, hücrelerde Bileşik 1 uygulaması ile ÇZK meydana geldiğini destekledi. 
Bileşik 1 tarafından indüklenmiş DNA hasarının yol açtığı apoptozun meydana gelmesinde rol oynayan proteinleri araştırmak amacı ile kaspaz 3, p53 ve Bax gibi apoptozla ilişkili bazı proteinlere ait genler siRNA teknolojisi ile tek tek veya kombine şekilde susturuldu. Bu genlerin susturulması ile apoptoz engellenemedi. Bileşik 1 ile işleme sokulmuş hücrelerde kaspaz 3 aktivitesi yükselirken, geninin susturulması apoptozu durdurmadı. Kaspaz 3 aktivitesinin spesifik inhibitörü olan DEVD ile inhibisyonu da apoptoz üzerinde olumsuz bir etki göstermedi. Bu sonuçlar Bileşik 1'in kaspaz 3, p53 veya Bax'tan bağımsız şekilde apoptozu indükleyebildiğini ve bu genler için mutant olan kanser hücrelerinde dahi sitotoksik bir ajan olarak kabul edilebileceğini düşündürdü. 
Hücre döngüsüne özgüllüklerini ortaya koymak için Pd(II) bileşikleri, senkronize edilmiş hücrelerin üzerine de uygulandı. Hücreleri farklı fazlarda senkronize etmek için çeşitli ajanlar (mimozin, afidikolin G1/S için, çift timidin bloğu S için, nokodazol ve kolsemid G2/M için) kullanıldı. Senkronizasyon, morfolojik gözlemler ve akış sitometrisi ile kontrol edildi. Hücrelerin, hücre döngüsü fazlarında tutulması başarıyla sağlandı; devamında bu hücreler Pd(II) bileşikleri ile işleme sokuldu. HCT-116 ve MDA-MB-231 hücreleri için ölüm fazında hiçbir belirgin varyasyon bulunmadığı halde G1/S fazındaki HeLa hücrelerinin her iki bileşiğe 24 saatlik uygulama için az da olsa duyarlı olduğu gözlemlendi. 
Sonuç olarak bu çalışmada araştırılan Pd(II) bileşikleri, HeLa, MCF-7, MDA-MB-231, PC-3, MDA-MB-435 ve SH-SY5Y hücre hatlarında apoptozu indükledikleri için, servikal, meme, prostat ve beyin kanserlerine karşı potansiyel antikanser ajanlar olarak kabul edilebilir. Yeni kemoterapötiklerin keşfi veya değişik antikanser ilaçların kombine olarak kullanılması kanser tedavisine olumlu katkı yapabilir. Dolayısıyla, bu tez çalışmasında araştırılan Pd(II) bileşiklerinin de konvensiyonel antikanser ilaçlarla kombine edilerek kullanıldığında kanser tedavisine olumlu katkı yapıp yapmayacağı gelecek çalışmaların konusu olabilir. Her durumda, daha ileri araştırmalar için bu Pd(II) bileşiklerinin fazla miktarlarda sentezlenmesine ihtiyaç vardır.

Abstract:
Cancer is one of the top three causes of death in the world. Despite the importance of combating cancer in healthcare systems and research centers, the toxicity in normal tissues and the low efficiency of anticancer drugs are of the major problems in chemotherapy. Platinum (Pt)-based drug cisplatin is a well-known chemotherapeutic drug, which has been used against a wide variety of solid tumors for over 40 years. The discovery of cisplatin has accelerated the research for alternative metal based drugs. Palladium (Pd)-based metal complexes are proposed as potential anticancer drugs with higher solubility and lower nephrotoxicity than Pt-based counterparts.
In this thesis, the anticancer properties of two novel Pd(II) complexes, namely [PdCl(terpy)](sac).2H2O (Compound 1) and [Pd(sac)(terpy)](sac).4 H2O (Compound 2) (terpy = 2,2':6', 2''-terpyridine and sac=saccharinate), were investigated. The molecular mechanism of action was elucidated for Compound 1, and the cell cycle specificity of cytotoxic effect was examined for both compounds. Initially, the cytotoxic effect of Compound 1 and Compound 2 were assessed on various cancer cell lines (MDA-MB-231, MCF-7, PC-3, MDA-MB-435, HeLa and SH-SY5Y), and IC50 values were determined. In order to calculate the IC50 values, the viability of the cells, which were treated with the Pd(II) compounds, was employed using MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) and WST-1 (4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate sodium salt) assays. Both compounds were found to be toxic for the cancer cells, with IC50 values in the range of 25.7±4.3 – 50< µM, 3.1±0.1 – 50< µM and 2.41±0.1-44.61±5.3 µM for 24, 48 and 72 hours, respectively. 
Two cell lines (MDA-MB-435 and HeLa) were chosen for further investigation of the mechanism of death in response to Compound 1 treatment. Morphological changes, such as cellular shrinkage and blebbing were observed, as well as condensed/fragmented nuclei following Compound 1 treatment of the cells. In addition to these findings, caspase 3 activity, which was determined using ApoTox-Glo™ Triplex kit, was found to increase in Compound 1-treated cells. These results demonstrated that apoptosis was the primary mechanism of the cell death. For the purpose of investigating by which mechanisms the apoptosis was induced, first an in vitro assay was employed. Compound 1, which was directly interacted with DNA caused non-spesific breaks on plasmid DNA. To understand whether any role of the double strand breaks for the apoptosis, the γ-H2AX foci formation was examined by immunofluorescence technique. The results supported that the double strand breaks occured via Compound 1 treatment in the cells. 
In order to investigate the roles of proteins in the apoptosis triggered by complex 1, selected proteins such as CASP-3, P53, and BAX alone or their combinations were silenced using siRNA technology. The data indicated that cell death could not be blocked by silencing any of these genes individually, or combinatorially. While caspase 3 activity was increased in cells treated with Compound 1, neither silencing, nor inhibiting caspase 3 activity (via addition of its specific inhibitor, DEVD) had an effect on apoptosis. These results suggested that Compound 1 could induce apoptosis independent of caspase 3, p53 or Bax, and would be regarded as a cytotoxic agent even in cancer cells that are mutant for these genes. 
Pd(II) compounds were also added onto the synchronized cells to reveal their cell cycle specificity. Various agents (mimosine and aphidicolin for G1/S phase, double thymidine block for S phase, nocodazole and colcemid for G2/M phase) were exploited to synchronize the cells in different phases. Synchrony was tested via both morphological observations under the microscope and by flow cytometry analysis. Following successful arrest at the intended cell cycle stage, cells were treated with the Pd(II) compounds.  While HeLa cells were arrested in S/G1 phase were slightly sensitive to both compounds for 24 h treatment, there was no significant variation in cell death for HCT-116 or MDA-MB-231 cells in any of the cell cycle phases.
In conclusion, since Pd(II) compounds investigated in this study induce apoptosis in HeLa, MCF-7, MDA-MB-231, PC-3, MDA-MB-435, and SH-SY5Y cancer cell lines, they can be regarded as potential anticancer agents against various cancer types such as cervical, breast, prostate and brain cancers. The discovery of novel chemotherapeutics or the combined use of various anti-cancer drugs may improve the cancer treatment. Thus, whether the combined use of Pd(II) compounds with the conventional anticancer drugs will be synergistically effective in anticancer therapy may be the subject of the future studies. In any case, these Pd(II) compounds need to be synthesized in larger quantities for further studies.