Steroid'in HL-60 (insan akut miyeloid lösemi) hücre hattında, apoptoz ve farklılaşma üzerindeki etkisi
The effect of steroid on the apoptosis and differentiation in HL-60 (human acute myeloid leukemia) cell line
Yazar: AHMET ÖZÇİMEN
Danışman: PROF.DR. AHMET KART
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Hematoloji = Hematology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
viÖZETAhmet, Ö. Steroid'in HL-60 (insan akut miyeloid lösemi) hücre hattındaapoptoz ve farklılaşma üzerindeki etkisi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık BilimleriEnstitüsü Tıbbi Biyoloji Programı Doktora Tezi, Ankara 2005. Akut miyeloidlösemi (AML), kemik iliğindeki normal hücrelerin azalmasıyla tanınan lösemitipidir. Hem çocuk hem de erişkinlerde görülebilen AML, çocukluk çağılösemilerinin %15'ini oluşturur. Bu olguların %25-30'u 10-15 yaş arasındakiçocuklardır. AML, French-American-British (FAB) sınıflandırmasına göre sekiz altgrupta (M0-M7) sınıflandırılmaktadır. AML'nin oluşumunda apoptoz ve farklılaşmamekanizmalarındaki bozukluklar önemli yer tutmaktadır. Tedaviye yönelikçalışmalarda, all-trans retinoik asit (ATRA), vitamin-D türevleri, histon deasetilaz(HDAC) inhibitörleri, arsenik tri-oksit (ATO) ve steroid türevleri gibi ajanlar çok sıkkullanılmaktadır. ATRA, AML'nin M3 alt grubuna özel bir farklılaşma yaratırken,vitamin-D ve ATO monositik farklılaşma yaratmaktadır. HDAC inhibitörleri isefarklılaşma tedavilerinde son yıllarda kullanılmaya başlanmış ve çalışmalar devametmektedir. Ancak, kesin bir tedavi henüz netlik kazanmamıştır. Bu çalışmada, birsteroid türevi olan 6Î±-metilprednizolonun, HL-60 (insan akut myeloid lösemi)hücrelerindeki apoptotik ve farklılaşma etkileri araştırıldı. HL-60 hücrelerinesitotoksisite ve apoptozu göstermek için 12, 24 ve 48 saat sürelerde 10-4 M, 5x10-4 Mve 10-3 M derişimlerde 6Î±-metilprednizolon uygulandı. İnkübasyon sonucu sayım veakım sitometrik incelemelerde, 10-3 M derişimde uygulanan metilprednizolonun 48.saatte sitotoksik etkili, 5x10-4 M derişimdeki metilprednizolonun ise 24. saatte erkenapoptozu uyardığı ve 48. saatte geç apoptozu uyardığı bulundu. Daha sonrafarklılaşmanın gösterilebilmesi için hücreler 48, 72 ve 96 saat sürelerde 10-6 M, 10-5M ve 10-4 M 6Î±-metilprednizolon ile inkübe edildiler. İnkübasyonun ardındanmonositik, granülositik ve makrofaj yüzey belirleyicilerinden CD14, CD11-b veCD15 ile boyanıp akım sitometrede incelendiler. İnceleme sonucunda 10-5 M ve 10-4M derişimdeki 6Î±-metilprednizolonun 72. ve 96. saatlerde granülositik farklılaşmayıuyardığı ancak uygulanan bütün derişimlerin bu saatler içinde monositik birfarklılaşma oluşturmadığı gözlenmiştir. Sonuç olarak, 6Î±-metilprednizolonunsitotoksisite, apoptoz ve granülositik farklılaşma üzerindeki etkileri istatistikselolarak anlamlı bulunmuştur. Monositik ve makrofaj farklılaşmasının gösterilebilmesiiçin HL-60 hücrelerine metilprednizolonun vitamin-D veya retinoik asit gibi birajanla verilmesi sinerjistik etki yapabilir. Bulunan bu sonuçlar, gelecekte yapılacakin-vitro apoptoz ve farklılaşma çalışmaları için bir temel oluşturacaktır. Gelecekçalışmalarda, AML'nin diğer alt gruplarından olan K562 (eritrolösemik hücre hattı),NB4 (APL hücre hattı), U937 (miyelomonositik hücre hattı) ve Kasumi-1 (AML-M2hücre hattı) gibi önemli hücrelerde metilprednizolonun apoptoz, farklılaşma,çoğalma ve sinyal iletimi üzerine etkilerinin mikroarray çalışmaları ile incelenmesiyeni tedavi çalışmalarını daha da hızlandırıp, zaman kazanımı sağlayacaktır.Anahtar Kelimeler: Akut miyeloid lösemi, metilprenizolon, sitotoksisite, apoptoz,farklılaşma tedavisi, akım sitometre.Destekleyen Kurum:TÜBİTAK; SBAG-2515 (101S215)

Abstract:
viiABSTRACTAhmet, Ö. The Effect of steroid on the apoptosis and differentiation in HL-60(human acute myeloid leukemia) cell line. Hacettepe University Institute ofHealth Sciences, Ph.D. Thesis in the programme of Medical Biology, Ankara,2005. Acute myeloid leukemia (AML) is a major type of leukemia which is knownabout decreasing the normal cells in the bone marrow. It is seen in both children andadult. AML is the 15% range in the childhood leukemia. The 25-30% of these casesis among the children between 10-15 years old. AML is classified in eight subgroups(M0-M7) as a French-American-British (FAB) classification. The defects onapoptosis and differentiation mechanisms are play a major role in occuring AML. Inthe therapy studies, all-trans retinoic acid (ATRA), vitamin-D analogs, histondeacetylase (HDAC) inhibitors, arsenic tri-oxide (ATO) and steroid analogs are usedin frequent. ATRA causes a specific differentiation in AML-M3 sub-group. Vitamin-D and ATO cause monositic differentiation in HL-60 cells. HDAC inhibitors iscurrently used for AML therapy studies. But all of these agents are not satisfied forthe therapy studies yet. In the recent study, the effect of apoptosis and differentiationof 6Î±-methylprednisolone, an analog of steroid, on HL-60 cells was investigated. Forthis purpose, HL-60 cells were cultured with 10-4-10-3 M concentrations of 6Î±-methylprednisolone for 12-48 hours. Cytotoxic effects of 6Î±-methylprednisolone inthese cells were analysed either tyripan blue dye exclusion method or annexin-VFITC by flow cytometric method. The cytotoxic and late apoptotic effects of 6Î±-methylprednisolone on HL-60 cells were observed at a concentration of 10-3 M and5x10-4 M in 48th hours respectively. The effect of early apoptosis were observed at aconcentration 5x10-4 M in 24th and 48th hours. For differentiation assay, HL-60 cellswere treated with 6Î±-methylprednisolone at a concentration of 10-6-10-4 M between48-96 hours. Following incubation, cells were applied with CD14, CD11-b andCD15 cell surface markers. After analysed by flow cytometry, CD11-b markerexpression was increased at a concentration 10-5 M and 10-4 M in 72th and 96thhours. Never any significant change was observed on the expresion of CD14 markerfor these concentrations and times. But in the level of CD15 marker was observed aslight changes. As a result of CD11-b increasing, confirm that 6Î±-methylprednisolone differentiate the HL-60 cells to granulocytic form. In order toshow synergistic changes on the expresion of monocytic and macrophage marker,HL-60 cells could be applied with 6Î±-methylprednisolone and vitamin-D or ATRAtogether. All of these data will be lead for the future works. In investigating of theapoptotic, differentiation, proliferation and signal transduction effect of 6Î±-methylprednisolone on other AML cells such as K562, NB4, U937 and Kasumi-1,will be bring novel approach for the therapy.Key Words: Acute myeloid leukemia, methyleprednisolone, cytotoxicity, apoptosis,differentiation therapy, flow cytometry.Supported by TUBITAK, SBAG-2515 (101S215)