Allojenik kemik iliği nakli yapılan hastalarda CMV DNA antijenemi durumunun değerlendirilmesi
Evaluation of CMV dna antigenemia during allogenic bonerelevant patients
Yazar: MERVE KESKİNKILIÇ
Danışman: PROF. DR. İNCİ ALACACIOĞLU ; PROF. DR. GÜNER HAYRİ ÖZSAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Hematoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: C reaktif protein = C reactive protein ; DNA = DNA ; Engrafman = Engraftment ; Hematopoetik kök hücre transplantasyonu = Hematopoietic stem cell transplantation ; Hematopoetik kök hücreler = Hematopoietic stem cells ; Kemik iliği = Bone marrow ; Kemik iliği nakli = Bone marrow transplantation ; Nötrofiller = Neutrophils ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sitomegalovirüs = Cytomegalovirus

Özet:
ALLOJENİK KEMİK İLİĞİ NAKLİ YAPILAN HASTALARDA CMV DNA ANTİJENEMİ DURUMUNUN DEĞERLENDİRİLMESİ

Dr. Merve KESKİNKILIÇ

Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı 

Hematopoetik kök hücre nakli (HKHN), hematopoetik sistemin yeniden yapılanmasını sağlamak amacıyla kişinin kendinden veya doku grubu uyumlu kişilerden kök hücrelerin toplanarak uygun koşullarda alıcıya nakledilmesidir. HKHN hasta ve donör arasındaki ilişki ve kök hücrelerin anatomik kaynağı arasındaki ilişkiye göre otolog HKHN, singeneik HKHN ve allojenik HKHN olarak üç gruba ayrılır. Allojenik HKHN, HLA doku grubu uyumlu vericiden alıcıya kök hücrelerin hazırlama rejimi sonrası transfer edilmesidir. Allojenik HKHN (AHKHN) sonrası sitomegalovirüs (CMV) reaktivasyon riski %30-50 gibi değerlere ulaşmakta olup  nakil sonrası gelişen CMV enfeksiyonları en önemli viral morbidite ve mortalite nedenidir. CMV enfeksiyonunun tespiti için viral kültür ve serolojik yöntemler gibi tarama testleri kullanılmaktadır. CMV 65 kDa fosfoprotein (pp65) antijenemisini saptamaya çalışan serolojik  yöntemin duyarlılığı daha düşüktür. CMV DNA'sının polimerize zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile saptanması, daha duyarlı bir test olup, düzey kantitatif olarak hesaplanabilmektedir. Bu çalışmada Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı'nda takip edilen AHKHN yapılan hastalarda CMV DNA Antijenemisinin uygulanan immunsupresif tedavi, nötropeni, lenfopeni, hemoglobin düzeyi, trombositopeni, mobilizasyon ve hazırlık rejimi, c-reaktif protein (CRP) düzeyi, greft versus host hastalığı (GVHH), alıcıdaki galaktomannan (GM) durumu, alıcı ve vericinin CMV immunitesi, yaş, cinsiyet ile bağlantısının incelenmesi ve diğer ölçüm yöntemi olan PCR ile karşılaştırılması hedeflendi.
Çalışmaya Haziran 2009- Ekim 2016 tarihleri arasında AHKHN yapılmış olan 39 hastadan bakılan 138 örnek dahil edildi. Hastaların demografik özelikleri, klinik durumu, engrafman zamanları, transplant hazırlık rejimleri, graft versus host hastalığı (GVHH) gelişme durumu, CMV  enfeksiyon durumu, alıcı ve vericinin CMV immunitesi, CMV enfeksiyonu geliştiği andaki GVHH derecesi, aldığı immunsupresif tedavi, beyaz küre, nötrofil ve lenfosit değerleri retrospektif incelendi.
K/E; 1.05/1 olup medyan yaş 38 ±11(18-64) idi. Hastaların transplant anındaki labaratuvar degerleri incelendiğinde ortalama hemoglobin (hb) 10g/dL  (5,5-15g/dL ), beyaz küre sayısı 5100 x 103/µL (200 x 103/µL  – 30900x103/µL), ortalama trombosit sayısı 69 x10 3/µL (4 x 103/µL-373 x 103/µL), nötrofil (neu) 3200 x 103/µL (100x103/µL – 4500x103/µL), lenfosit 1200 x 103/µL (10 x 103/µL – 1360 x 103/µL) idi. Transplant anındaki CMV Ig G % 68' inde pozitif , % 23 ünde negatifti, % 9 olguda ulaşılamadı. Dönörlerin % 17'sinde CMV Ig G negatif , %83'ünde Ig G pozitifti. Tüm hastalar GVHH profilaksi olarak Metotrexat-siklosporin , antiviral profilaksi olarak valasiklovir almıştı. İnfüze edilen CD34 + hücre miktarı ortalama 5,9 x10 6/kg (2-12 x10 6/kg) olup nötrofil engrafmanı ortalama  12 günde,  trombosit engrafmanı ortalama  15,7 günde oldu. % 23,2 sinin ( n:32) trasplant sonrası CMV enfeksiyonu geçirdiği tespit edildi. CMV enfeksiyonu gelişen 7 hastanın 6' sında GİS enfeksiyonu, 1' inde ise CMV pnönonisi görüldü. Tümüne antiviral gansiklovir tedavisi verildi, ancak 3 hastada valgansiklovir ile devam edildi. 7 hastaya aktif enfeksiyonu nedeniyle ve diğer hastalara ise preemptif amaçlı antiviral tedavi uygulandı. 1 hastada gansiklovire direnç düşünülerek  sidefovire geçildi. CMV enfeksiyonu tespit edilmiş hastaların tespit anındaki GVHH durumları incelendiğinde % 42,8'inde cilt GVHH, % 19,5'inde cilt ve gis GVHH, % 10,2' sinde cilt ve akciğer GVHH, % 7,2'sinde cilt ve hepatik GVHH mevcuttu, % 20,3 ünde ise GVHH yoktu. İmmunsupresif tedavi olarak % 54.4'ü steroid-siklosporin, % 19,2' si siklosporin, % 10,3'ü steroid, % 9,5'i steroid-siklosporin-MMF, % 6,6'sı prednol-takrolimus almaktaydı. 1 hastaya fotoforez tedavisi, 2 hastaya da mezenkimal kök hücre tedavisi uygulanmıştı. Medyan 30 aylık izlem sonucunda allogenik nakil yapılan olgularımızın % 76,8' u ölmüş , % 23,2 yaşıyordu.
CMV antijenemi ve CMV DNA eş zamanlı pozitifliği olan 138 epizod incelendi. O dönemdeki beyaz küre, nötrofil ve lenfosit değerlerine bakıldı. Engrafman sonrası lenfosit değeri ile CMV DNA titresi arasında istatistiksel anlamlılık yoktu  (p=0,07). Hastalar lenfosit sayısı <500 ve >500 üstü olarak ikiye ayrıldığında lenfosit değeri <500 olan hasta grubunda istatistiksel olarak anlamlı şekilde CMV DNA poztiflik oranı daha yüksekti (p=0,017). Lenfosit sayısı ile CMV antijenemi arasında istatistiksel anlamlılık saptandı (p=0,038). Lenfosit arttıkça antijenemi pozitifliği daha yüksekti. Beyaz küre değeri ve nötrofil değeri ile CMV DNA arasında korelasyon tespit edildi (p=0,003, p=0,002).  Nötrofil değeri <1000, 1000-2000, >2000 ile CMV DNA arasında da korelasyon izlendi, nötrofil değeri arttıkça CMV DNA titresi artıyordu (p=0,027). Ayrıca nötrofil değeri ve CMV antijeni ile arasında da istatistiksel ilişki vardı (p=0,034). Yine,  CMV antijenemi ile nötrofil değerleri <1000 ve >1000 olarak incelendiğinde istatistiksel ilişkinin belirginleştiği izlendi (p=0,005). Nötrofil değeri >1000 olan hasta grubunda CMV antijenemi pozitifliği yüksekti. CMV antijenemi ve CMV DNA değerleri arasında anlamlı bir korelasyon tespit edildi (p=0,033). Örneklerin 8' inde ( % 5,8) CMV pp65 antijenemi ve CMV DNA PCR negatif; 49' unda (% 35.5) ise her iki test de pozitif sonuçlanmıştır. CMV antijenemi negatif/ CMV pozitif örnek sayısı 81 (% 58,7) iken, antijnemi pozitif/ CMV PCR negatif örnek yoktu. İki testte de pozitif gelen 49 örneğin CMV PCR ortalama değeri 57.887 kopya/ml'di ( 70 - 1.213.633 kopya/ml). Her iki test ile pozitif saptanan örnekler arasında anlamlı korelasyon saptandı (p=0,018). ROC analizi ile bakıldığında plazmada 322 kopya/ml CMV viral yükün ≥ 1 antijen pozitif hücre/200 bin lökosite karşılık geldiği görüldü (Duyarlılık % 68,5; Özgüllük % 31,5).
Sonuç olarak, CMV tespitinde kullanılan pp65 ve PCR tetkikleri arasında anlamlı ilişki bulunmaktadır. Beyaz küre ve nötrofil değerleri CMV antijenemi ve DNA sonuçlarını etkilemektedir. Nötrofil ve platelet engrafmanı ile CMV antijenemisi arasında da anlamlı ilişki bulunmakta olup geç engrafmanı olanlarda CMV pozitiflik oranı yüksektir ve CMV klinik sıklıkla bu olgularda görülmektedir. 

ANAHTAR KELİMELER: Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli, CMV Enfeksiyonu, CMV Antijenemisi (pp65), CMV DNA PCR, Nötrofil Engrafman.

Abstract:
EVALUATION OF CMV DNA ANTIGENEMIA DURING ALLOGENIC BONE RELEVANT PATIENTS

Merve KESKİNKILIÇ, MD

Dokuz Eylul University School of Medicine, Department of Internal Medicine 

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCN) is the collection of stem cells from a person's or tissue-group-compatible individuals to restore the hematopoietic system to the recipient under appropriate conditions. According to the relationship between the HSCN patient and the donor and the relationship between the anatomical source of the stem cells, three groups are distinguished as autologous HSCN, syngeneic HSCN and allogeneic HSCN. Allogeneic HSCN is the post-regulatory transfer of stem cells to the HLA donor-recipient donor recipient. The risk of cytomegalovirus (CMV) reactivation after allergen HSCN (AHSCN) reaches 30-50 % and CMV infections after transplantation is the most important cause of viral morbidity and mortality. Screening tests such as viral culture and serological methods are used to detect CMV infection. The serological method is less sensitive to CMV 65 kDa phosphoprotein (pp65) antigenemia. The detection of CMV DNA by the polymerase chain reaction (PCR) method is a more sensitive test and the level can be calculated quantitatively.
In this study, immunosuppressive therapy, neutropenia, lymphopenia, hemoglobin level, thrombocytopenia, mobilization and preparation regimen, c-reactive protein (CRP) level, graft versus host disease (GVHD), the presence of galactomannan (GM) in the recipient, the investigation of CMV immunity, age, sex with the recipient and donor, and comparison with other measurement method PCR.
The study included 138 specimens from 39 patients who had AHSCN between June 2009 and October 2016. Demographic characteristics of patients, clinical status, time of engraftment, transplant preparation regimens, graft versus host disease (GVHD) development status, CMV infection status, CMV immunity of the donor and donor, GVHD degree at the time of CMV infection, immunosuppressive therapy, white blood cell, neutrophil and Lymphocyte values were analyzed retrospectively.
Female/ male rate was 1.05/1 and the median age was 38 ± 11 (18-64). When the laboratory values of the patients were examined, the mean hemoglobin (hb) was 10g / dL (5,5-15g / dL), the white blood cell count was 5100 x103/µL (200x103 / µL - 30900 x 103 / µL), and the mean platelet count was 69 x 103( 4 x 103 / µL-373x103 / µL), neutrophil (neu) 3200 x 103 / µL (100 x 103 / µL – 4500 x 103/ µL), lymphocyte 1200 x 103/ µL (10 x 103 / µL – 1360 x 103 / µL). CMV IgG at the time of transplantation was positive in 68 %, negative in 23 %, could not be reached in 9 %. In 17 % of the rotors  CMV Ig G was negative and 83 % was IgG positive.
All patients received methotrexate-cyclosporine as GVHD prophylaxis and valaciclovir as antiviral prophylaxis. The mean CD34 + cell count was 5,9 x 10 6 / kg (2-12 x 10 6 / kg), and the mean time to neutrophil engraftment was 12 days and the mean platelets engraftment was 15.7 days. 23,2 % (n: 32) were found to have undergone CMV infection after transplantation. Of the 7 patients who developed CMV infection, 6 had GIS infection and 1 had CMV pneumonia. All of them were given antiviral ganciclovir treatment, but 3 patients were treated with valganciclovir. Seven patients were treated with antiviral treatment for active infection and preemptive therapy for other patients. In 1 patient, sidefovir was switched to ganciclovir resistance
Skin GVHD was found to be 42,8 %, skin and gastric GVHD 19,5 %, skin and lung GVHD 10.2 %, skin and hepatic GVHD 7,2 %, and 20.3 % GVHD were not found to have GVHD when the detected GVHD cases of CMV infected patients were examined . Immunosuppressive therapy was 54,4 % for steroid + cyclosporine combination, 19,2 % for cyclosporine 10,3 % for steroid, 9,5 % for steroid-cyclosporine-MMF combination and 6,6 % for prednol- tacrolimus combination. One patient underwent photopheresis treatment and two patient had mesenchymal stem cell therapy. As a result of the median 30-month follow-up, 76,8% of our cases who had allogeneic transplantation died and 23,2 % were alive.
138 episodes with CMV antigenemia and CMV DNA concurrent positivity were examined. White blood cell count, neutrophil and lymphocyte levels were evaluated. There was no statistical significance between the post-engraftment lymphocyte and CMV DNA titer (p = 0,07). When the lymphocyte count was divided into two as <500 and> 500 over, the patients with lymphocytes <500 had a significantly higher CMV DNA positivity rate (p = 0,017). There was statistically significant difference between lymphocyte count and CMV antigenemia (p = 0,038). As lymphocytes increased, antigenemia was higher. White blood cell count and neutrophil value were correlated with CMV DNA (p = 0,003, p = 0,002). Neutrophil value <1000, 1000-2000, > 2000 was also correlated with CMV DNA, as the neutrophil value increased CMV DNA titer increased (p = 0,027). There was also a statistical relationship between neutrophil value and CMV antigen (p = 0,034). Again, when the neutrophil values were examined with <1000 and > 1000 as CMV antigenemia, it was observed that the statistical relation was significant (p = 0,005). CMV antigenemia positivity was high in patients with neutrophil values> 1000. There was a significant correlation between CMV antigenemia and CMV DNA values (p = 0,033). In 8 of the samples (5.8%) CMV pp65 antigenemia and CMV DNA were PCR negative; In 49 (35.5 %) both tests were positive. The number of CMV antigenemia negative / CMV positive samples was 81 (58.7 %), whereas the positive / CMV PCR negative sample was not available. The mean value of the CMV PCR of 49 samples, which were positive in both tests, was 57.887 copies / ml (70 - 1.213.633 copies  / ml). A significant correlation was found between the two tests and the positive samples (p = 0,018). ROC analysis showed that 322 copies / ml of CMV viral load corresponds to ≥ 1 antigen-positive cell / 200 thousand leukocytes (Sensitivity 68.5 %; Specificity 31.5 %).
As a result, there is a significant relationship between pp65 and PCR tests used in CMV detection. White blood cells and neutrophil values affect CMV antigenemia and DNA results. There is a significant relationship between neutrophil and platelet engraftment and CMV antigenemia, and CMV positivity rate is higher in patients with late engraftment and CMV is seen in these cases.

KEY WORDS: Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation, CMV Infection, CMV Antigenemia (pp65), CMV DNA PCR, Neutrophil Engraftment