Çeşitli peynirlerdeki bakteriyel ekosistemin PZR-DGJE yöntemi kullanılarak mikrobiyal biyoçeşitliliğinin tanımlanması
Identification of bacterial diversity in different type of traditional Turkish cheeses by using PCR-DGGE method
Yazar: AYTÜL BAYRAKTAR SOFU
Danışman: DOÇ. DR. F. YEŞİM EKİNCİ
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Moleküler biyoloji = Molecular biology

Özet:
Yapılan doktora tez çalışmasında, özel üreticilerden alınan geleneksel olarak üretilen çeşitli peynirlerdeki (ezine tipi beyaz peynir, dil peyniri, tulum peyniri, kaşar peyniri, eski kaşar peyniri) geniş ölçüde tanımlanmamış mikroorganizma toplulukları, direk DNA izolasyonu, 16S rRNA gen amplifikasyonu ve kültüre dayalı olmayan denatüre edici gradyan jel elektroforez (DGJE) analizi kullanılarak tespit edilmiştir. Yeni yaklaşımlardan olan DGJE analizi kompleks mikrobiyal populasyonlardan genomik DNA'nın izolasyonu, 16S rDNA dizisinin enzimatik gen amplifikasyonu temeline dayanmaktadır.Tez çalışmasında kullanılan numuneler, farklı firmalardan çeşitli peynirlerin üretimdeki aşamalarından (süt, teleme, olgunlaşma öncesi ve sonrası) temin edilmiştir. Ayrıca peynir örneklerinin iç ve dış yüzey bölgelerindende numune alınarak mikrabiyal populasyonlardaki farklılıkların ortaya konması amaçlanmıştır.Tez çalışmasının ilk aşamasında, klasik ekim yöntemiyle besiyeri ortamında bakteri grupları geliştirilmiş, miktarları incelenmiş ve görülen koloniler DNA izolasyonu için toplanmıştır.İkinci aşamada, numunelerden direk DNA izolasyonu yapılmış, 16S rRNA V3 bölgesine yönelik dizilimlere sahip primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyon (PZR) ile gen amplifikasyonu gerçekleşmiştir. PZR ürünlerinin DGJE'de bant profili belirlenmiş ve yoğun populasyona sahip bantlar tespit edilerek tekrar PZR ile amplifikasyonu sağlanan bölgelerin sekansları `BLAST Search' programında var olan veri bankasındaki DNA dizilimleri ile karşılaştırılmış ve BLAST gen bankasına bağlı bakteri türleriyle homoloji/benzerlik grafikleri ve akrabalık derecelerini gösteren filogenetik haritaları oluşturulmuştur.Hem kültür ekim hem de peynirden direk DNA izolasyonuyla gerçekleşen PZR-DGJE metoduyla yapılan çalışma sonucunda genel florayı oluşturan bakteri gruplarının lactococcus, lactobacillus ve enterocci türlerinden oluştuğu tespit edilmiştir. Tüm peynirlerde baskın florayı Lc. lactis subsp. lactis (%95 homoloji), ve Lc. lactis subsp. cremoris (%95 homoloji) türlerinin oluşturduğu görülmüştür. Ezine tipi beyaz peynirin tüm aşamalarında mikroflorada %96 homoloji ile lactoccus lactic subsp. bv. diacetylactis bakterisi bulunmuştur. Ayrıca, çalışmada tüm peynirlerde lactobacillus türlerinden olan Lb. pentosus (%98 homoloji) türleri çiğ süt aşaması dahil olmak üzere tüm aşamalarda baskın olarak tespit edilmiştir. Bununla birlikte ezine tipi beyaz peynir, dil peyniri ve eski kaşar peynirlerinde olgunlaşma aşamalarında mikroflorada Lb. helveticus (%96), Lb. fermentum (%96) ve Lb. plantarum (%95) yer alırken, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus bakteri türleri sadece ezine tipi beyaz peynirin olgunlaşma öncesi ve sonrası aşamalarında mikroflorada belirlenmiştir.Çalışılan geleneksel peynirlerin mikroflorasında yer alan bir başka bakteri grubu Enterococcus ailesinden Ec. durans (%95 homoloji) türleridir. Üretimin tüm aşamalarında bulunan bu türler hem klasik kültür hem de peynirin direk DNA izolasyonuyla gerçekleşen PZR-DGJE metoduyla yapılan analizlerde baskın flora içerisinde yer almışlardır. Ayrıca, tüm peynirlerde olgunlaşma süreleri boyunca Str. thermophilus spp. (%97), Ln. mesenteriodes (%93) baskın florada yer almıştır.DGJE analizi kültüre dayalı olmayan floradaki mikrobiyal çeşitliliğin yoğunluğu hakkında bilgi vermesi ve baskın mikroorganizmaların tanımlanmasında klasik yöntemlere alternatif hızlı bir yöntemdir.Bu doktora tezi çalışması, DGJE ekipmanı kullanılarak Türkiye'de üretimi yapılan peynirlerde bulunan mikrobiyal farklılıkların belirlenmesi, peynir ürününün tadında, aromasında ve tekstüründe çeşitlilik göstermesini sağlayan bakteriyel populasyonlar dinamiklerinin tespit edilmesi, sistem performansına yönelik verilerle desteklenerek starterin etkililiğinin belirlenmesi ile prosesin kontrol altına alınabilmesini sağlamada büyük önem taşımaktadır.Anahtar Kelimeler: 16 S rDNA, beyaz peynir, DGJE, biyoçeşitlilik

Abstract:
In this Ph.D. thesis, the microbial populations of different type of cheeses (traditional Turkish ezine type white cheese, string cheese, tulum cheese, kashar cheese, old kashar cheese) were identified by PCR? Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) analysis of the V3 region of the bacterial 16S rRNA gene. DGGE analyses are new techniques employed for the separation of double-stranded DNA fragments that are identical in length, but differ in sequence.In the first step, cheese samples were obtained from (milk, curd, cheese before and after ripening) different local companies and prepared for analysis. Bacterial cultures from cheese samples were grown by using conventional culturing methods to collect colonies for DNA isolation. Samples were obtained from the inside and the surface of fresh and ripe cheeses were examined in the same way. In the second step, total DNA from the cheese milk and cheese samples was used as a template to amplify the V3 region of the bacterial 16S rRNA gene. Bacterial population profiles were examined by using the PCR?DGGE technique. Dominant the bands taken from DGGE amplified again by PCR before sequence. Sequencing was successfully performed from all the amplified DNA fragments and the sequences were compared with the data from NIH by BLAST search program. By using classical culture methods and DGGE analysis, species belong to lactococcus, lactobacillus and enterocci found as general microflora in all type of cheeses. While Lc. lactis subsp. lactis (95 % homology) and Lc. lactis subsp. cremoris (95 % homology) were dominant flora for all cheeses, Lactoccus lactic subsp. bv. diacetylactis with %96 homology was only found in ezine type white cheese. Also, Lb. pentosus (98 % homology) was prevailing flora for all cheeses including in unpasteurized milk samples. As Lb. helveticus (96 %), Lb. fermentum (96 %) and Lb. plantarum (95 %) were originated in maturation step of string, tulum, and old kashar cheese, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus only found in ezine type white cheese before and after maturation.Another bacterial species found in these traditional cheeses was Ec. durans with 95 % homology in all steps of cheese production. While Str. thermophilus spp. (97 % homology) and Ln. mesenteriodes (93 % homology) were found as dominant flora in all cheeses, only in ezine type white cheese contained unculturable rumen type bacterial (100 % homology) species during maturation. DGGE analyses could be used to complete the culture independent study of microbial diversity to give information on concentration ratios among species occurring in a particular environment and can be proposed for a rapid identification of dominant microorganisms in alternative to traditional tools.In this Ph.D thesis, the DGGE technique is shown to be a powerful method for rapidly identifying a broad range of microorganisms which are effective on taste, aroma and texture from different traditional Turkish cheeses. As a result, to obtain information useful for making choices regarding starter cultures for these traditional cheeses, or for designing specific starter cultures, the microbial diversity and succession of the dominant populations needs to be examined over the entire cheese making process.Key Words: 16 S rDNA, cheese, DGGE, microbial diversity.