Glikozaminoglikan tayini için moleküler baskılanmış kromatografik kolon dolgu materyali geliştirilmesi
Development of molecularly imprinted chromatographic column material for glycosaminoglycan analysis
Yazar: ZİHNİ ONUR UYGUN
Danışman: PROF. DR. FERHAN GİRGİN SAĞIN ; DOÇ. DR. BURCU OKUTUCU
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Glikozaminoglikanlar = Glycosaminoglycans ; Heparin = Heparin ; Kondroitin = Chondroitin ; Kromatografi = Chromatography ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis-ayırıcı = Diagnosis-differential

Özet:
Hücrelerarası alanın en yaygın moleküllerinden olan proteoglikanların temel yapısında, 'core protein'e (çekirdek protein) kovalan olarak bağlanmış bir ya da daha fazla glikozaminoglikan (GAG) zinciri bulunmaktadır. İdrarla eksrete edilen GAG düzeyleri, lizozomal depo hastalıklarının, özellikle de mukopolisakkaridozların tayin ve izleminde kullanılırlar. Son yıllarda ise idrar GAG tayininin değişik hastalıklarda (kronik böbrek rahatsızlıkları, renal fibroz, glomerüler filtrasyon sorunları, mesane taşı, meme ve akciğer kanserleri, hipertansiyon ve diabet, vb.) bir belirteç olarak kullanılabileceğini gösteren çalışmalar yayımlanmıştır. Bu gelişmelere karşılık, GAG yapısının yüksek polaritesi ve mikroheterojenitesi idrar GAG analizlerinin oldukça zor olmasına yol açmaktadır. Bu nedenle GAG analizi için yeni, spesifik ve kolay uygulanabilir yöntemler geliştirilmesine gereksinim bulunmaktadır. Bu çalışmada, biyolojik olarak tayinleri büyük öneme sahip Glikozaminoglikan türlerinden Heparan sülfat, kondroitin sülfat ve dermatan sülfat tayini ve ayırımı için kromatografik kolon materyali geliştirildi. Öncelikle bu üç Glikozaminoglikan kimyasal olarak parçalanmış elde edilen fragmanlar kütle spektrometresinde, Multiple Reaction Monitoring(MRM) ve Surface Induced Reaction(SIR) ile incelendi. Bu analizler ile elde edilen fragmanların bir kütüphanesi oluşturuldu. Bu ölçümlere göre polimerler karakterize edilmiştir. Moleküler baskılanmış polimer materyalleri de sadece bu üç moleküle karşı seçicilik gösteren, glikozamioglikanların negatif yüklü sülfat gruplarına non-iyonik ilgi gösteren akrilamid monomerinden elde edildi. Bu polimeri elde edebilmek için presipitasyon polimerizasyon tekniğinde termal polimerizasyon ile hazırlanmış moleküler baskılama tekniği kullanıldı. Bu teknikle elde edilen polimerler, çelik HPLC kolonu içerisine doldurulmuş, sonrasında yıkanarak içerisinde baskılanmış, Glikozaminoglikanlar uzaklaştırılmış sonrasında ise bu baskılanmış polimerler örnek uygulamasından sonra,  tutma kapasitelerine bağlı olarak karakterize edildiler. Ölçümlerde kolon elüsyon zamanı her onbeş dakikada bir toplanan fraksiyonlara göre yapılmış ve farklı baskılanmış kolonlara göre farklı zamanlar bulunmuştur. Farklı zamanlara göre pompa sisteminde elüsyon uygulanarak örnek uygulaması yapılmış ve karakterizasyonu buna göre gerçekleştirildi. Standart grafiklerin oluşturulmasında 1000ng/mL'nin altındaki düzeylerde seri dilüsyon ile standart grafikleri oluşturulmuştur. İdrar örneklerinde ise ölçümdeki doğruluk gücünü artırmak için idrara 500ng/mL miktarıda her bir glikozaminoglikandan eklenmiştir. Baskılanmamış kör polimer ile yapılan çalışmalarda ise glikozaminoglikanlara seçimlilik gösterilmemiştir. Gerçekleştirilen bu çalışma, idrar ile atılan GAG'ların seçimli bir şekilde ayrılması ve böylelikle daha doğru, daha hızlı ve daha ekonomik tayini için moleküler damgalama yöntemiyle kromatografik kolon dolgu materyali geliştirilmesi hipotezine dayanmış ve başarılı bir şekilde bu hipotez kanıtlanmıştır. Bu yeni metodolojik yaklaşımla hazırlanan GAG seçimli polimerle, analiz edilen idrar örneklerinde GAG molekülleri kromatografik olarak daha doğru ve daha hızlı ve ekonomik bir şekilde ayrıştırılacaktır. Böylelikle idrar GAG analizinde yeni ve kolay bir yöntem geliştirildi ve bu polimer GAG ile ilişkili hastalıkların izlenmesindeki eksikliği/kısıtlılıkları gidererek GAG tayini çalışmalarında kromatografik kolon dolgu materyali olarak rutinde kullanılabilecektir.

Abstract:
Proteoglycans which are among the most abundant molecules of the inter-cellular structure contain one or more glycosaminoglycan (GAG) chains that are covalently attached to the core protein. The levels of GAG excreted via urine is used as a marker to monitor and detect lysosomal storage diseases, especially mucopolysaccharidoses. Recently, studies that report GAG as a useful biomarker in different diseases (chronic renal disease, renal fibrosis, glomerular filtration abnormalities, bladder stones, breast and lung cancers, hypertension and diabetes etc.) have been published. However, GAG analysis is not simple due to the high polarity and microheterogenity of GAG structure. Therefore there is a need to develop new, specific and easily applicable methods for GAG analysis. In this study, determination of biologically important species of glycosaminoglycans, heparan sulfate, chondroitin sulfate and dermatan sulfate determination was carried out by an improved material for chromatographic column separation. First of all, these three glycosaminoglycans were chemically broken into fragments, afterwards these fragments were characterized by mass spectrometry, which were Multiple Reaction Monitoring (MRM) and Surface Induced Reaction (SIR) were evaluated, specifically, then a library was created from obtained fragments. Polymers based on these measurements have been characterized. Molecularly imprinted polymer material can only exhibiting selectivity against these three molecules to glycosaminoglycans negatively charged sulfate groups of those showing non-ionic interest was derived from acrylamide monomer. The polymers prepared by the precipitation polymerization technique as a molecular imprinting technique obtained by thermal polymerization. By using this technique, the resulting polymers were filled to steel HPLC column, after quenched washing, and after the removal of glycosaminoglycans from these imprinted polymers, the sample application were characterized based on the retention capacity. According to different retention times, the characterization was carried out by considering these results. Standard graphics creation was carried out in the serial dilution at 1000ng / ml the highest level. Glycosaminoglycan detection in urine was also carried out and to increase the accuracy 500 ng/mL GAGs were added to each urine samples. In studies with non-imprinted polymers, glycosaminoglycan selectivity was not shown. By performing this assay development to design a chromatographic column solid state material on the selection of discharged GAGs in urine was performed more accurate, faster and more economical. This new methodological approach prepared by selective polymers for GAGs, GAG molecules in urine samples analyzed more accurately and faster and they will be used in chromatographic separation in an economical manner. Thus, we developed a new and easy method of urine GAG analysis and monitoring of of these diseases associated with GAG determination by polymers overcoming limitations/shortcomings and they could be used in routine chromatographic column packing material.