Hepatit c virüs (HCV) genotiplerinin "reverse hybridisation strip assay" ve DNA dizi analizi yöntemleriyle araştırılması
Investigation of hepatitis c virus (HCV) genotypes by "reverse hybridisation strip assay" and DNA sequencing analysis methods
Yazar: PELİN ÖZMEN
Danışman: PROF. DR. SELMA GÖKAHMETOĞLU
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Hepatit C Virüsü (HCV),  tüm dünyada yaklaşık 185 milyon insanı enfekte ettiği tahmin edilen  ve  her yıl  350 bin kişinin  ölümüne sebep olan bir virüstür. HCV'nin 7 genotipi ve 100'den fazla subtipi bulunmaktadır. HCV tedavisinde  hedef, kalıcı virolojik yanıt (KVY) olup, KVY'yi belirleyen en önemli faktörler, genotip ve başlangıçtaki HCV-RNA düzeyleridir. HCV genotiplerinin belirlenmesinde LIPA, RFLP, RT PCR ve dizi analizi yöntemleri uygulanmaktadır.
Bu araştırma ile, LIPA yöntemiyle saptanan HCV genotiplerinin ve subtiplerinin, dizi analiziyle karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Erciyes Üniversitesi Sağlık Uygulama ve Araştırma Merkezi  poliklinik/kliniklerine başvuran Kronik HCV tanısı almış, HCV RNA viral yükü 10⁴ IU/ml  ve üzeri olan  212 hasta örneğinde LIPA  (NLM analytica, İtalya) ve dizi analizi yöntemleriyle HCV genotip ve subtipleri araştırıldı. LIPA yönteminde  5'UTR ve kor bölgeleri, dizi analizi yönteminde ise NS5B gen bölgesi çalışıldı. NS5B gen bölgesinde 340 bp'lik bölge heminested PCR yöntemiyle çoğaltıldıktan sonra, GENKÖK merkezinde (ABI 3500 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, ABD) dizi analizi işlemleri yapıldı.İstatistiksel analizler, TURCOSA Analytics programı kullanılarak yapıldı.
  Çalışmada, LIPA yöntemiyle HCV genotip ve subtipleri araştırılan 212 hastanın  40 (%18,8)'ında Gn 1a,  97 (%45,75)'sinde Gn 1b, 7 (%3,3)'sinde Gn 2, 12 (%5,6)'sinde Gn 2a/c, 2(%0,94)'sinde Gn 2b,19 (%8,96)'unda Gn3, 16 (%7,55)'sında Gn 4, birinde (%0,47) Gn 4a, 15(%7,5)'inde Gn 4c/d, birinde  (%0,47) Gn 4h ve 2 (%0,94)'sinde Gn 5 bulundu. Dizi analizi yöntemiyle  değerlendirilen 212 hastanın 20 (%9,43)'sinde Gn1a, 118 (%55,6)'inde Gn 1b, 16 (%7,55)'sında Gn 2a, 4 (%1,89)'ünde Gn 2b, birinde (%0,47) Gn 2k, 21 (%9,91)'inde Gn 3a, 2 (%0,94)'sinde Gn 4a, 28 (%13,21)'inde Gn 4d ve 2 (%0,94)'sinde Gn 5a saptandı.  İki yöntem arasındaki sonuç farklılığı istatistiksel olarak anlamlı bulundu  (p< 0.001 ). Viral yük- genotip ilişkisine göre, en yüksek viral yük Gn 1a hastalarında saptanmıştır  (Shapiro Wilk normallik testi, p<0,001).  Kadın hastaların yaş dağılımı, erkek hastalarınkinden  daha yüksek bulunmuştur ( p<0,001 ).
Sonuç olarak, çalışmamızda HCV genotip ve subtiplerinin belirlenmesi amacıyla,  LIPA yöntemi ile  dizi analizi yöntemi karşılaştırılmış ve iki yöntem arasındaki genotip uyumu; genotip bazında %97,5, subtip bazında %19 olarak saptanmıştır.
HCV enfeksiyonu tedavisi,  genotipe göre belirlendiği için  rutin laboratuvarlarda sıklıkla çalışılan LIPA yönteminde elde edilen sonuçların dizi analizi yöntemiyle uyumsuz olması önemli olup, bu sonuçların daha fazla sayıda örnek içeren çalışmalarla desteklenmesi gerektiği kanaatine varılmıştır. 
Anahtar Kelimeler:  HCV, revers hibridizasyon, dizi analizi,  genotip, subtip

Abstract:
Hepatitis C Virus (HCV) is a virus that is estimated to infect approximately 185 million people worldwide and causes  350,000 deaths each year. HCV has 7 genotypes and more than 100 subtypes. The main target in HCV treatment is permanent virological response, the most important factors determining permanent virological response are genotype and initial HCV-RNA levels.  LIPA, RFLP, real-time PCR and sequence analysis methods are used to identify HCV genotypes. In this research, it was aimed to compare HCV genotypes and subtypes determined by LIPA method with sequence analysis.
HCV genotypes and subtypes were investigated by LIPA (NLM analytica, Italy) and sequence analysis methods in 212 patients with chronic HCV diagnosis and with HCV RNA viral load of 10⁴ IU / ml and above. 5'UTR and core regions were studied in LIPA method and NS5B gene region was studied in sequencing method.  After amplifying340 bp region in the NS5B gene region with the heminested PCR method, sequence analysis  (ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) was performed in GENKÖK center. Statistical analysis of the study was done by using TURCOSA Analytics program.
In the study, HCV genotypes and subtypes were investigated by LIPA method as 40 (18.8%) of 212 patients were Gn 1a, 97 (45.75%) were Gn 1b, 7 (3.3%) were Gn 2, 12 (% 5,6) Gn 2a / c, 2 (0,94%) Gn 2b, 19 (8,96%) Gn3, 16 (7,55%) Gn 4, 1 (0% , 47) Gn 4a, Gn 4c/d in 15 (7.5%), Gn 4h in one (0.47%) and Gn 5 in 2 (0.94%). By sequencing; Gn1a was found in 20 (9.43%) of 212 patients, Gn 1b in 118 (55.6%), Gn 2a, in 16 (7.55%). Gn 2b in 4(1.89%), Gn 2k in one (0.47%), Gn 3a in 21 (9.91%), Gn 4a in 2 (0.94%), Gn4d in 28 (13.21%) Gn 5a in  2 (0.94%) was detected of 212 patients. The result difference between the two methods was found statistically significant (p <0.001). According to the viral load-genotype relationship, the highest viral load was detected in Gn 1a patients (Shapiro Wilk normality test,  p<0.001).  The age distribution of female patients was higher than that of male patients (p <0.001).
As a result, in order to determine HCV genotypes and subtypes in our study, LIPA method and sequence analysis method were compared and genotype compatibility between the two methods; It was determined as 97.5% on genotype basis and 19% on subtype basis.
 Since the treatment of HCV infection is determined according to the HCV genotype, it is very important that the results obtained in the LIPA method, which are frequently studied in routine laboratories, are discrepant with the sequence analysis method, and it was concluded that these results should be supported by studies containing more samples.
Key words: HCV, reverse hybridization, sequence analysis, genotype, subtype