Akrilamid ve kurkuminin leydig hücrelerinde sitotoksisite, genotoksisite ve hücre sinyal yolakları üzerindeki etkileri
Effects of acrylamide and curcumin on cytotoxicity, genotoxicity and cell signaling pathways in leydig cells
Yazar: NEBAHAT YILDIZBAYRAK
Danışman: PROF. DR. MELİKE BELKIZ ERKAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology
Dizin: Genotoksisite = Genotoxicity ; Hücre içi sinyal peptidleri ve proteinleri = Intercellular signaling peptides and proteins ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Ökaryotik hücreler = Eukaryotic cells

Özet:
Bu çalışmanın amacı akrilamid kaynaklı toksik etkiler ve kurkuminin TM3 Leydig hücreleri üzerindeki olası terapötik etkileriyle ilgili mekanizmaları incelemektir. Akrilamid ile muamele edilmiş hücreler, sitotoksisite, reaktif oksijen türleri, antioksidan ile ilişkili enzim seviyeleri, apoptoz / nekroz oranları, hücre iskeleti, mitojenle aktive olan protein kinazlar ve genotoksisite açısından değerlendirildi. Kurkumin uygulamasının olası iyileştirici etkisi araştırıldı.
Endüstriyel alanda yaygın olarak kullanılan akrilamidin, son yıllarda yüksek sıcaklıkta pişirilen gıdalarda kendiliğinden oluştuğu bulunmuştur. Dünyada ve ülkemizde beslenme alışkanlıkları sebebiyle akrilamid içeren besinler çokça tüketilmektedir. Akrilamid, yüksek sıcaklık uygulanmış (120°C) gıdalarda, karbonhidratların ve aminoasitlerin tepkimesi sonucu oluşan bir bileşiktir. Özellikle tahıllı ve nişastalı gıdalar yüksek miktarda akrilamid içermektedir. Ayrıca, akrilamid kağıt, tekstil ve kozmetik endüstrisinde ve su arıtma sistemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda insan hastalıklarını tedavi etmek için tıbbi bitkilerin kullanımı oldukça yaygınlaşmıştır. Çoğunlukla baharat ve gıda renklendirici olarak kullanılan zerdaçal bitkisinin aktif bileşeni olan kurkumin, polifenolik bir bileşik olarak nitelendirilmektedir. Yapılan çalışmalar ile kurkuminin antioksidan, antiinflamatuar, antibakteriyal, antikanserojenik ve antimutajenik özelliklere sahip olduğu bulunmuştur.
TM3 Leydig hücreleri, 24 saat boyunca kurkumin (2,5 µM) varlığında ve yokluğunda dört farklı konsantrasyonda akrilamide (1, 10, 100, 1000 µM) maruz bırakılmıştır. Oksidatif stres belirteçleri ve antioksidan savunma sistemi parametreleri spektrofotometrik yöntemle ölçüldü, apoptoz ve nekroz oranları propidium-iyodür-Hoechst boyası ile belirlendi ve hücre iskeleti proteinlerinin işaretlenmesi için immünofloresan boyama gerçekleştirildi. MAPK'lerin fosforilasyonunu belirlemek için Western blot analizleri yapıldı ve ayrıca genotoksisitesinin değerlendirilmesi için komet testi ve mikronükleus testi uygulandı.
Yapmış olduğumuz çalışmanın sonuçlarına göre akrilamidin Leydig hücresinin hücresel fonksiyonlarında ve hücre iskeletinde hasara sebep olduğunu, ROS oluşumunu tetikleyerek lipid peroksidasyonuna yol açtığı böylelikle Leydig hücrelerinde antioksidan-oksidan dengesini bozduğunu göstermektedir. Ayrıca oksidatif stresi uyarması ve MAPK yolağını aktive etmesiyle ilişkili olarak Leydig hücrelerinde apoptozu tetiklediğini ve genotoksisiteye neden olduğunu göstermektedir. Bunlara ek olarak sonuçlar, kurkuminin akrilamidin zararlı etkilerini bastırdığını göstermiştir. Sonuçlar birlikte ele alındığında, akrilamidin, MAPK sinyal yolunun aktivasyonu ile apoptozun indüklendiğini ve genotoksisiteye neden olduğunu, ayrıca kurkuminin Leydig hücrelerinde akrilamid kaynaklı hasara karşı koruyucu bir etkiye sahip olduğunu ortaya koymaktadır.

Abstract:
The aim of this study is investigating the mechanism related to acrylamide induced toxic effects and possible therapeutic effects of curcumin on TM3 Leydig cells. Acrylamide treated cells were evaluated for cytotoxicity, reactive oxygen species (ROS), antioxidant related enzyme levels, apoptosis/necrosis rates, cytoskeletal damage, phosphorylation status of mitogen activated protein kinases (MAPKs) and genotoxicity. The possible ameliorative effect of curcumin administration was investigated.
Acrylamide, which is widely used in industrial field, has been found to occur in foods prepared in high temperature in recent years. Due to the nutritional habits in the world and in our country, foods containing acrylamide are consumed a lot. Acrylamide is a compound formed by the reaction of carbohydrates and amino acids in foods with high temperatures (120°C). Particularly grain and starchy foods contain high amounts of acrylamide. In addition, acrylamide is widely used in the paper, textile and cosmetic industry and in water treatment system. In recent years, the use of medicinal plants to treat human diseases has become widespread. Curcumin, which is the active ingredient of the turmeric plant, is mostly used as a spice and food colorant, and characterized as a 
polyphenolic compound. Studies have shown that curcumin has antioxidant, antiinflammatory, antibacterial, anticarcinogenic and antimutogenic properties.
TM3 Leydig cells were exposed to four different concentrations of acrylamide (1, 10, 100, 1000 µM) in the presence and absence of curcumin (2,5 µM) for 24 hours. Oxidative stress markers and antioxidant defense system parameters measured by spectrophotometric method, apoptosis and necrosis rates determining by propidium iodide-Hoechst stain and for mark the cytoskeletal proteins immunofluorescent staining was performed. Western blot analyzes were performed for determining the phosphorylation of MAPKs further Comet assay and micronucleus test applied for evaluate the genotoxicity.
According to the results of our study, acrylamide causes detrimental effect on cell function of Leydig cell and damage to the cytoskeleton, it causes lipid peroxidation by triggering ROS formation and thus deteriorates antioxidant-oxidant balance in Leydig cells. Results also showed that acrylamide induces apoptosis and causes genotoxicity in Leydig cells associated with stimulating oxidative stress and activating MAPK pathway. Moreover, results showed that curcumin suppressed the detrimental effects of acrylamide. Taken together, we suggest that acrylamide, induced apoptosis through activation of MAPK signaling pathway and caused genotoxicity furthermore curcumin has a protective effect against the acrylamide induced damage in Leydig cells