Likit biyopsi ile elde edilen over kanseri kök hücrelerinde piRNA anlatım profili
piRNA expression profile in ovarian cancer stem cells obtained by liquid biopsy
Yazar: ECE GÜMÜŞOĞLU ACAR
Danışman: PROF. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Biyopsi = Biopsy ; Epigenetik = Epigenetic ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Over neoplazmları = Ovarian neoplasms

Özet:
Over kanseri (OK), dünya çapında kadınlar arasında kansere bağlı ölümlerin beşinci önde gelen nedenidir ve kadınlar arasında kansere bağlı tüm ölümlerin %5'ini oluşturmaktadır. OK hastaları genelde ilk aşamada platin temelli kemoterapiye yanıt verirken, büyük çoğunluğunda kemoterapiye direnç gelişmekte ve hastalık nüks etmektedir. 
Son yıllarda diğer kanser türlerinde olduğu gibi OK'de de kemoterapi direnci, metastaz ve nüks olgularının temelinde kendini yenileme ve multipotent farklılaşma özellikleri olan tümör hücre gruplarının yer aldığı bulunmuştur. Tümör başlatıcı ve heterojenite kaynağı olan hücre grupları kök hücre özelliği göstermeleri nedeniyle kanser kök hücreleri (KKH) olarak tanımlanmıştır. KKH'lerin hastalığın nüksetmesine neden olduğu ve kendini yenileme özellikleri olduğu için hastalığın daha agresif ve ilaca dirençli olmasına yol açtığı belirtilmiştir Kökenlendiği tümör ile benzer genetik anomalileri içeren KKH'lerin yine de birbirinden farklı olması durumu epigenetik değişikliklerle açıklanabilir. Epigenetik düzenlemelerden biri de kodlanmayan RNA'lardır.  Kodlanmayan RNA grubundan piRNA'lar 26–30 nt uzunluğundadır ve 3' uçlarında 2'-O-metilasyon bulunur. PiRNA'lar, Piwi proteinleri ile etkileşerek transpozon susturmada etkilidir. Böylece gen bütünlüğünün korunmasını destekler. PiRNA'ların aynı zamanda gen anlatımının düzenlenmesinde de önemli roller oynadıkları gösterilmiştir.
Epigenetik değişimler farklılaşma, kendini yenileme ve pluripotensiyi sürdürme yeteneklerini kontrol ederek KKH'lerin işlevlerinde çok önemli bir rol oynar. PiRNA'lar KKH'ler ile ilişkili bulunmuş fakat henüz over kanser kök hücrelerinde (OKKH) rolleri ile oldukça az çalışma yapılmıştır.
Bu çalışmada amaçlanan piRNA'ların OKKH'lerde anlatım seviyelerinde değişiklik olup olmadığının gösterilmesi ve etkilerinin ortaya koyulmasıdır. Araştırmanın hedefi doğrultusunda over kanseri hücre hatları (OVSAHO, PT412 ve PT340) ile over kanseri hasta peritonal sıvı örnekleri kullanılmış ve piRNA anlatım seviyeleri bakımından karşılaştırılmıştır. Hastaların periton sıvılarından elde edilen hücre pelleti ile 3B sferoid kültürler karşılaştırılmıştır. PiRNA'ların farklı hücre hatları karşılaştırmalarında sferoid analizleri, KKH belirteçleri (CD133 / ALDH (+/+), (+/-) vs (-/-)) ve proliferasyon analizi (BR vs DIM) gerçekleştirilmiştir. 
PiRNA anlatımlarının analizi qRT-PCR ile tüm gruplar için yapılmıştır. Her bir örnek ∆CT ve 2-∆∆Ct yöntemiyle belirlenen mutlak ve relatif anlatım değerleri içermektedir. Mutlak anlatım analizlerinde hasta örneklerinde anlamlı farklılık bulunan 2 piRNA tespit edilmiştir. Buna göre piR-823 ve piR-36712 deney grubu olan hasta 3B sferoidlerde kontrol pellet hücrelere göre anlamlı bir değişime uğramıştır. Relatif karşılaştırmalarda ise piR-36712 deney grubu olan hasta 3B sferoidlerde anlamlı şekilde artmıştır. Hücre hatlarında yapılan çoklu t-test sonuçlarına göre gruplar arası mutlak anlatım analizlerinde anlamlı farklılık bulunan piRNA'lar tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre piR-36712, piR-651, piR-7832, piR-52207, piR-33733, piR-8041 sferoid analizinde, piR823 ise KKH belirteçleri (CD133 / ALDH (+/-)) analizinde her üç hücre hattında da anlamlı olarak artmıştır.
Bu verilere dayanarak piRNA'ların OKKH'lerde etkili olduğu gösterilmiştir. Özellikle piR-823 ve piR-36712 hem hücre hatlarında hem de hasta örneklerinde anlatımları anlamlı şekilde artmış olan bu piRNA'ların over KKH için spesifik olabileceği ve KKH hedefli terapiler için yeni bir perspektif sağlayabileceği ileri sürülebilir.

Abstract:
Ovarian cancer (OC) is the fifth leading cause of cancer-related death among women worldwide, accounting for 5% of all cancer-related deaths among women. While OC patients generally respond to platinum-based chemotherapy in the first phase, the majority of them develop resistance to chemotherapy and the disease relapses.
In recent years, it has been found that tumor cell groups with self-renewal and multipotent differentiation properties are the basis of chemotherapy resistance, metastasis and recurrence in OC, as in other types of cancer. Tumor-initiating and heterogeneous cell groups have been defined as cancer stem cells (CSC) because of their stem cell characteristics. It has been stated that CSCs cause a relapse of the disease and cause even more aggressive, drug-resistant disease because of their self-renewal properties. One of the epigenetic regulations is non-coding RNAs. The piRNAs from the non-coding RNA group are 26–30 nt long and have 2'-O-methylation at their 3' ends. PiRNAs are effective in transposon silencing by interacting with Piwi proteins. Thus, it supports the preservation of gene integrity. PiRNAs have also been shown to play important roles in the regulation of gene expression.
Epigenetic changes play a crucial role in the function of CSCs by controlling their ability to differentiate, regenerate, and maintain pluripotency. PiRNAs have been associated with CSCs, but few studies have been done on their role in ovarian cancer stem cells (OCSC).
The aim of this study is to show whether there are changes in expression levels of piRNAs in OCSCs and to reveal their effects. In line with the aim of the study, ovarian cancer cell lines (OVSAHO, PT412 and PT340) and peritoneal fluid samples from ovarian cancer patients were used and compared in terms of piRNA expression levels. Cell pellets obtained from patients' peritoneal fluids and 3D spheroid cultures were compared. Spheroid assay, CSC markers (CD133 / ALLDH (+/+), (+/-) vs (-/-)) analysis and proliferation analysis (BR vs DIM)" were performed for comparison of piRNAs in different cell lines.
Analysis of piRNA expressions was performed for all groups by qRT-PCR. Each sample contains absolute and relative expression values determined by the ∆CT and 2-∆∆Ct methods. Absolute expression analysis revealed 2 piRNAs with significant differences in patient samples. Accordingly, the patient in the piR-823 and piR-36712 experimental group underwent a significant change in 3D spheroids compared to the control pellet cells. In relative comparisons, the patient in the piR-36712 experimental group increased significantly in 3D spheroids. According to the results of multiple t-tests performed in cell lines, piRNAs with significant differences in absolute expression analysis between groups were detected. According to these results, piR-36712, piR-651, piR-7832, piR-52207, piR-33733, piR-8041 were analyzed in spheroid analysis, and piR823 in CSC markers (CD133 / ALDH (+/-)) analysis in all three cell lines. increased significantly.
Based on these data, piRNAs have been shown to be effective in ovarian CSC. It can be suggested that these piRNAs may be specific for ovarian CSC and provide a new perspective for CSC-targeted therapies, especially since piR-823 and piR-36712 are significantly increased in both cell lines and patient samples.