Amniyon membran ekstrakt eldesinde verimliliğin artırılması ve liyofilizasyonu sürecinde stabilizasyonun sağlanması
Increasing efficiency in obtaining amnion membrane extract and ensuring stabilization in the lyophilization process
Yazar: SEYFİ ANIL KANBUR
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM BARUT SELVER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı / Kök Hücre Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Amnion = Amnion ; Göz hastalıkları = Eye diseases ; Liyofilizasyon =   ; Standartlaşma = Standardization

Özet:
Giriş ve Amaç: İnsan amniyon membranı (iAM) oftalmoloji başta olmak üzere tıpta birçok alanda kullanılmakta olup içerdiği büyüme faktörü (BF) ve benzeri biyolojik aktif molüküller sayesinde özellikle yara iyileşmesi üzerindeki etkinliği uzun yıllardır bilinmektedir. Cerrahi nakil (amniyon membran transplantasyonu=AMT) şeklinde yapılan bu tedavinin daha pratik şekilde uygulanabilmesi amacıyla ve aynı zamanda iAM eldesi ve saklanmasındaki kısıtlılıklar nedeniyle bu biyolojik materyalin ekstraktının eldesi fikri ortaya çıkmıştır. Tüm dünyada bu konuyla ilgili çalışmalar yürütülmekte ancak hem en iyi ekstrakt elde yöntemi hem de uygulama dozu konusunda fikir birliği bulunmamaktadır. Bu çalışmada amaç, kendi üniversitemiz Tıp Fakültesi Hastanesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı bünyesinde yapılan AR-GE çalışmaları nihayetinde standart protein içeriği tanımlanmış yöntem geliştirilerek elde edilen AME'nin ekstraksiyonu ve liyofilizasyon süreci sırasında yüksek biyolojik aktif içeriği koruyan yöntemler bütünü ile en yüksek etkinlikte üretilmesinin parametrelerini tanımlamaktır. 
Yöntem: Varyasyonu azaltmak için beş iAM'dan oluşturulan havuz oluşturuldu. Ekstraksiyon süreci için pulverizasyon, sonikasyon, santrifüj ve liyofilizasyon aşamaları kullanıldı. Protein konsantrasyonu ve BF analizleri, Ege Üniversitesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı'nda yer alan Oküler Yüzey Araştırma Laboratuvarında gerçekleştirildi. Ekstraksiyon sürecinde pH, filtrasyon, proteaz-fosfataz inhibitörü ve liyoprotektan kullanımının, son üründeki protein ve BF kosantrasyonları üzerindeki etkileri araştırıldı. Protein konsantrasyonu Bikinkoninik asit (BCA) yöntemi ile, BF (EGF, FGF, HGF, KGF, NGF ve TGF-β) konsantrasyonları  ise Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA) tekniği ile ölçüldü. 
Bulgular: AME içeriğindek ortalama protein konsantrasyonu 2,52 mg/ml olarak bulundu. İzotonik tuz tamponu ve proteaz-fosfataz inhibitörü kullanımının daha yüksek BF seviyeleri elde edilmesine yardımcı olduğu gözlenirken, filtrasyon ve liyoprotektan kullanımının ise BF düzeyleri üzerine negatif etkisi olduğu belirlendi. 
Sonuç: AME, iAM'dan ekstraksiyonla elde edilen biyolojik kökenli bir tedavi ürünüdür. Hazırlanma, saklanma ve doz konularında globalde konsensus bulunmayan bu ürün için, en yüksek biyolojik aktif içeriğe sahip ektsraksiyon yöntemler bütünün tanımlanması önemlidir. Yüksek biyoaktif içerik, daha iyi klinik sonuçlar için anahtar rol oynama potansiyeline sahip olduğu için, bu içeriği maksimuma çıkaracak yöntem optimizasyonu AME eldesinde büyük önem taşımaktadır.

Abstract:
Introduction and Purpose: Human amniotic membrane (hAM) is used in many fields of medicine, especially ophthalmology, and its effectiveness on wound healing has been known for many years, thanks to biologically active molecule content such as growth factor (GF). Requirement of surgical application (amniotic membrane transplantation = AMT) and limitations in obtaining and storing hAM, the idea of obtaining the extract of this biological material has emerged. Studies on this subject are being carried out all over the world, but there is no consensus on both the best extract extraction method and application dose. The aim of this study is to define the parameters of the production of AME at the highest efficiency with a set of methods that preserve the high biological active content during the extraction and lyophilization process of the AME obtained by developing a method with defined standard protein content because of the R&D studies carried out within the Department of Ophthalmology of the Faculty of Medicine Hospital of our own university. 
Method: A pool of five hAMs was created to reduce variation. Pulverization, sonication, centrifugation and lyophilization steps were used for the extraction process. Protein concentration and BF analyzes were carried out in the Ocular Surface Research Laboratory at Ege University, Department of Ophthalmology. The effects of pH, filtration, protease-phosphatase inhibitor and lyoprotectant use during the extraction process on protein and BF concentrations in the final product were investigated. Protein concentration was measured by the Bicinchoninic acid (BCA) method, and GF (EGF, FGF, HGF, KGF, NGF and TGF-β) concentrations were measured by the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) technique. 
Results: The average protein concentration was found to be 2,52 mg/ml. The positive effects of using isotonic salt buffer and protease inhibitor on obtaining GF levels were observed during the procedures. It was determined that filtering and lyoprotectant had a negative effect in this sense. 
Conclusion: AME is a treatment product of biological origin obtained by extraction from hAM. For this product, for which there is no global consensus on preparation, storage and dosage, it is important to define the extraction methods with the highest biological active content. Since high bioactive content has the potential to play a key role in better clinical outcomes, method optimization to maximize this content is of great importance in achieving AME.