Kemik yenilenmesine yönelik otolog bileşenli kompozit yapı iskelelerinin geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterization  of composite scaffolds with autologous component for bone regeneration
Yazar: DİLARA ARAL
Danışman: PROF. DR. YAŞAR MURAT ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Kök Hücre ve Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyomalzemeler = Biomaterials ; Doku iskeleleri = Tissue scaffolds ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kemik rejenerasyonu = Bone regeneration ; Kompozit malzemeler = Composite materials ; Osteoblastlar = Osteoblasts ; Osteogenez = Osteogenesis ; Trombositten zengin plazma = Platelet rich plasma ; İn vitro = In vitro

Özet:
Bu çalışmada; tam kandan çeşitli santrifüj aşamalarının ardından elde edilen trombosit lizatı (TL), sentezlenen çapraz bağlayıcı ajan okside dekstran (OD) ile karıştırıldı ve kriyojelleşme tepkimesinin sonunda TL/OD kriyojel iskeleler elde edildi. Elde edilen bu iskeleler yapay vücut sıvısı (SBF) içerisinde farklı sürelerde inkübe edilerek biyomineralize olmaları sağlandı. İskeleler fiziksel, kimyasal ve biyolojik özellikleri bakımından karakterize edildi. SEM analizinde, morfolojik açıdan, iskelelerin makro gözeneklerinin iç yüzeylerinde ve çeperlerindeki hidroksiapatit çekirdeklenmeleri; EDS analizinde iskelelerdeki kalsiyum birikimi, FTIR ve XRD spektrumlarında hidroksiapatite ait pikler iskelelerin biyomineralizasyonunun başarıyla gerçekleştiğini göstermiştir. TGA analizinde, SBF içindeki inkübasyon süresinin uzamasıyla birlikte kütle kaybının azaldığı ve dayanıklılığının arttığı ortaya konulmuştur. Cıva porozimetresi analizi ve etil alkol yer değiştirme testi ile gözenek boyutu ve yoğunluğunun SBF içindeki inkübasyon süresiyle ters orantılı olduğu bulunmuştur. Yapılan su tutma (şişme) testinin sonuçları gözenekli yapıyı destekler niteliktedir. Tripsin/EDTA içinde gerçekleştirilen enzimatik biyobozunma testi sonucunda yapı iskelelerinin 10 günde tamamen bozunduğu; hemoliz testi sonucunda iskelelerin %2'nin altında hemolize neden olduğu; in vitro sitotoksisite testi sonucunda iskelelerin hücre canlılığını %90'ın altına düşürmediği gözlemlenmiştir; bu sonuçlarla biyomineralize yapı iskelesinin, in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun gözeneklilik, mukavemet ve biyouyumluluk özelliklerine sahip olduğu bulunmuştur. Biyomineralize edilmiş ve edilmemiş iskeleler üzerine osteoblast tohumlanması sonrasında, hücreli iskeleler standart besiyeri ve osteojenik indüksiyon besiyeri içerisinde 7-14-21-28 gün kültürde tutulmalarının ardından SEM ile morfolojik açıdan, EDS ile kalsiyum birikimi açısından, Alamar mavisi testiyle canlılık takibi açısından, kalsiyummiktar tayini ve ALP aktivite analizi ile osteojenik özellik yönünden karakterize edilmiştir.
Çalışma sonucunda potansiyel olarak rejeneratif kapasitesi en yüksek ve kemik oluşturma potansiyeli en iyi olan kompozit yapı iskelesinin; 14 günlük osteojenik indüksiyon besiyeri içerisinde inkübe edilmiş biyomineralize osteoblast tohumlanmış TL/OD iskele olduğu bulunmuştur.

Abstract:
In this study, first thrombocyte lysate (TL) was obtained from whole blood via centrifugation steps, then synthesized oxidized dextran (OD) was mixed into TL as crosslinking agent and at the end of cryogelation reaction TL/OD cryogel scaffolds were obtained. Those scaffolds were biomineralized via incubating in simulated body fluid (SBF) at different time intervals. The scaffolds were characterized with respect to their physical, chemical, and in vitro biological properties. Hydroxyapatite nucleation on and inside the surface of macroporous scaffolds was determined by morphological SEM analysis, calcium deposits in scaffolds was confirmed by EDS analysis, and successful biomineralization was determined from the hydroxyapatite-specific peaks in the FTIR and XRD spectra.
TGA confirmed that as incubation time in SBF increased, the weight loss of the scaffolds decreased thus the mechanical stability improved. With the help of mercury intrusion porosimetry and ethanol replacement test, it was found that pore size and porosity were inversely proportional to incubation time in SBF. Swelling test results supported macroporous structure. After 10 days in Trypsin/EDTA the scaffolds entirely degraded. Scaffolds neither had in vitro hemolytic (< 2% hemolysis) nor in vitro cytotoxic (> 90% cell viability) effects. These results showed that the scaffolds had macroporous structure, stability, and biocompatibility. Osteoblast seeded biomineralized and non-biomineralized scaffolds were cultured in standard or osteogenic induction medium for 7-14-21-28 days, then the cell seeded scaffolds were characterized via SEM morphologically, calcium deposition via EDS, cell viability using Alamar blue assay and in terms of osteogenic differentiation via quantification of calcium and ALP activity.
This study has shown that, the scaffold, with the highest potential regenerative capacity and bone forming potential is the biomineralized, cell seeded TL/OD scaffold, incubated in osteogenic induction medium for 28 days.