Metotreksat kullanımı sonrası alimenter sistemde oluşan mukozit üzerine ghrelinin etkileri
Effects of ghrelin on gastrointestinal mucositis due to methotrexate
Yazar: ZATİGÜL ŞAFAK TAVİLOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. SU GÜLSÜN BERRAK
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2009
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases

Özet:
Çalışmamızda gastrointestinal sistemde kemoterapiye bağlı mukozit oluşumu ve busüreçte eşzamanlı olarak verilen, endojen bir peptid olan ghrelinin mukozit üzerindeoluşturduğu etkiyi araştırdık.GirişKanseri tedavi etmek ve hastaların hayat kalitesini arttırmak için kemoterapiverilmektedir. Ancak kemoterapinin çeşitli yan etkileri de mevcuttur. Mukozit bu yan etkileriçinde ciddi morbidite ve mortaliteye yol açanlardan biridir. Mukozit, kemoterapininbaşlanmasında gecikmeye, kemoterapinin kesilmesine veya doz azaltılmasına, neden olacakkadar önemlidir. Mukozit insidansının verilen ağır kemoterapiler neticesinde artıyor olmasınarağmen halen daha oluşumunu engelleyecek etkili bir tedavi geliştirilememiştir. Buçalışmadaki amacımız, kanser tedavisinde çok sık kullanılan bir antimetabolit olanmetotreksatı kullanarak mukozit oluşturmak ve bu tedaviyle birlikte uygulanan ghrelininmukozit üzerindeki etkilerini araştırmaktır.Konuyla İlgili LiteratürBu konuyla ilgili yayınlanmış literatür kemoterapinin ince barsak üzerindeoluşturduğu etki, mukozit, apoptoz, ghrelinin yapısı, dağılımı, işlevleri ve ghreliningastroprotektif etkisini araştırmaya yönelik çalışmalardan oluşmaktadır.Yöntem ve SonuçlarBu çalışmada sıçanlar 4 gruba ayrıldı. Her biri sekizer sıçandan oluşan ilk 2 gruba tekdoz intraperitoneal metotreksat enjeksiyonunu (20 mg/kg) takiben 5 gün boyuncaintraperitoneal yolla serum fizyolojik veya ghrelin (10 ?g/kg) verildi. Geriye kalan iki grubaise metotreksata eşit hacimde intraperitoneal %0.9'luk NaCl enjekte edilmesini takiben 5 günboyunca intraperitoneal salin veya intraperitoneal 10 ?g/kg dozunda ghrelin uygulandı. Kiloalımı/kaybı açısından sıçanlar her gün tartıldı. Geçiş indeks ölçümü için dekapitasyondanönce orogastrik ile sıçanlara aktif kömür verildi. Dekapitasyon sonrasında gövde kanıtoplandı. Jejenum ve karaciğerden alınan dokular, dokularda serbest oksijen radikallerinin yolaçtığı lipid peroksidasyonun en önemli son ürünü olan malondialdehit, çok önemli birhücresel antioksidan olan glutatyon düzeyleri ve dokudaki nötrofil infiltrasyonunun göstergesiIIIolan miyeloperoksidaz aktivite ölçümü, DNA fragmantasyonu ve histolojik inceleme içinayrıldı. Sonuçta gruplar arasında birinci ve beşinci gün tartılar ve gastrointestinal geçişindeksleri açısından fark saptanılmadı.(sırasıyla p=0.081, p=0.064 ve p= 0.332, Anova tekyönlü varyans analizi). Barsaktaki apoptozun göstergesi olan DNA fragmantasyonununmetotreksat kullanımı sonrasında ince barsakta arttığını saptadık. Metotreksatın ince barsakmukozasında apoptoza yol açtığını ve ghrelin tedavisi uyguladığımız grupta bu hasarın geriyedöndüğünü tespit ettik. Jejenum kesitlerinde yapılan histopatolojik incelemede kontrolgruplarında normal epitel morfolojisi saptanırken, metotreksat verilen grupta villusyüksekliğinde azalma ve yassılaşma, yüzey epitelinde dökülme ve ciddi inflamatuar hücreinfiltrasyonu tespit ettik. Ghrelin tedavili metotreksat grubunun histopatolojik incelemesindeise villus morfolojisinde düzelme, yüzey epitelinde yenilenme ve inflamatuar hücreinfiltrasyonunda azalma saptadık (p=0.0001, Tukey Çoklu Karşılaştırma Testi). Kandaapoptoz tayininde, kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında ghrelin tedavili metotreksatgrubunda hücre nekrozu ve geç apoptozda anlamlı artış saptadık (p= 0.008 ve p= 0.002,Anova tek yönlü varyans analizi). Böylece metotraksatın kemoterapötik etkisinin göstergesiolan -kandaki nötrofil apoptozundaki artışın, verdiğimiz ghrelin tedavisi nedeniyleazalmadığını göstermiş olduk.Sonuç olarak çalışmamızda ghrelin tedavisinin metotreksatın kanser tedavisindekietkinliğini değiştirmeden, meydana getirdiği yan etkilerden biri olan mukoziti geridöndürmekte olduğunu anlamış bulunuyoruz. Ek olarak ghrelin tedavisinin kontrol grubundaglutatyon düzeylerini metotreksat gruplarına göre anlamlı olarak arttırdığını, fakat aynı etkiyimetotreksat ile birlikte verildiğinde göstermediğini tespit ettik (0.00001, Tukey ÇokluKarşılaştırma Testi). MPO düzeyinin ise karaciğer dokusunda arttığını fakat ince barsakta buetkinin görülmediğini ortaya koyduk. Çalışmamızda metotreksat kullanımı sonrasındadokularda MDA düzeyinin arttığını saptadık.SonuçMukozit bir çok hastada semptomatik olarak görülmektedir. Mukoziti önleyebilmekiçin tedavi edici yeni ajanlar geliştirilmelidir. İnce barsak mukozasında metotreksat sonrasıgösterdiğimiz artmış DNA fragmantasyonu, ve histopatolojik incelemede metotreksat sonrasıIVoluşan mukozal hasar metotreksatın etkin olduğunu ve ghrelin tedavisinden sonra dokudagösterilen DNA fragmantasyonundaki azalma ve mukozal hasarın anlamlı olarak gerilemesiise hedef dokuda oluşan hasarı ghrelin tedavisinin azalttığını göstermektedir. Bu durumdaghrelinin ince barsakta etkisini antiapoptotik yolaklar üzerinden etkisini gösterdiğidüşünülebilir. Zira ghrelin tedavisinin tek başına verildiğinde ince barsaklar üzerindegösterdiği antioksidan etkisini metotreksat ile birlikte uygulandığında ortaya çıkmadığınısaptadık. Bu noktada doku hasarı üzerine anti oksidan etkisinin ortaya çıkabilmesi için ghrelintedavisinin daha yüksek dozlarda verilmesinin uygun olabileceğini varsaymaktayız.Metotreksat sonrası karaciğerde saptadığımız MPO artışının ise ön planda nötrofilinfiltrasyonuna bağlı olabileceğini düşündük. İnce barsaklarda benzer bir etkinin ortayakonulamaması ince barsaktaki hasar mekanizmasında nötrofil infiltasyonundan ziyadeapoptotik yolaklarının etkin olmasındandır diye düşünülebilir.ANAHTAR SÖZCÜKLER: Mukozit, metotreksat, ghrelin, apoptoz, barsak hasarı

Abstract:
In this study, we investigated the effect of an endogenous peptide ghrelin, onmethotrexate induced mucositis in gastrointestinal tract of rats.IntroductionChemotherapy is used to cure cancer and to improve quality of life in patients.However, while achieving this goal it also has side effects. Mucositis is one of the leadingdose limiting toxicities of chemotherapy causing mortality and morbidity in patients.Mucositis results in dose reductions in regimens, delays and even cessation of chemotherapy.Despite the increasing incidence of mucositis, an effective therapeutic agent against it has yetto be developed. The aim of this project is to create mucositis using methotrexate, a widelyused antimetabolite chemotherapeutic and to investigate the co-administered effects of ghrelinon mucositis.Literature ReviewThe written literature on ghrelin covers mucositis, effects of chemotherapy on smallintestine, apoptosis, structure, distribution, functions and studies in the literature about itsgastroprotective effects.Research PlanIn this study, 32 rats were assigned into 4 groups, each consisting of 8 rats. In 2groups, following single dose of intraperitoneal methotrexate (20 mg/kg) injection eithersaline or ghrelin (10 ?g/kg) was administered for 5 days intraperitoneally. The other 2 groupswere injected 0.9 % NaCl, having the exact volume of methotrexate used in the previousgroups, then either saline or ghrelin (10 ?g/kg) was administered intraperitoneally for 5 days.Body weight of each rat was measured every day. Before decapitation charcoal wasadministered via orogastric tube for the measurement of transit time index. After decapitation,trunk blood was obtained. Jejenum and liver were removed to measure malondialdehyde, amajor degradation product of lipid peroxidation, glutathione, a major cellular antioxidantlevels and myeloperoxidase activity, an indicator of tissue neutrophil infiltration, and also forthe histologic examination.VIBody weight of rats on the first and last days of experiment, and the gastrointestinaltransit time index were all found to be similar between groups (p= 0.081, p= 0.064, p= 0.332consecutively, Anova one way variance test).The indicator of cell death by apoptosis, DNA fragmentation was found to beincreased after methotrexate administration. And this effect of mehtotrexate was found to bereversed with co-administration of ghrelin. In addition to that following methotrexatetreatment, severe degeneration of surface epithelium and jejunal inflammatory cell infiltrationwas found in histopathologic examination. However in ghrelin treated methotrexate group,epithelial layer of jejenum was found to be close to normal with mild inflammation(p=0.00001 when compared to methotrexate group, Tukey HSD). Flow cytometricmeasurements of blood neutrophil apoptosis revealed that cell death and late leukocyteapoptosis were significantly increased in ghrelin treated methotrexate group (consecutively,p= 0.008 and p=0.002 Anova one way variance test). The increase in blood leukocyteapoptosis that is an indicator of methotrexate effectiveness as an anticancer drug, was notfound to be reversed by ghrelin co-administration. Therefore ghrelin could easily be said tohave no effect on chemotherapeutic efficacy of methotrexate while it prevents mucositis as aside effect. In our study, ghrelin raised GSH levels significantly in the control group whencompared to methotrexate groups (p=0.0001, Tukey HSD), but we could not get the sameresults when ghrelin was co-administered with methotrexate. MPO activity was found to beincreased in liver but not in small intestines after methotrexate administration. MDA levelswere shown to be increased in both tissues due to methotrexate. As a result of our study, weunderstand that ghrelin is able to reverse mucositis that occurs as a side effect of methotrexatein cancer chemotherapy without interfering its efficacy.ConclusionMucositis occurs symptomatically in many patients. New agents should be studied toprevent mucositis. We assume that ghrelin has to be given in higher doses with methotrexatein order to have the antioxidant effect it has when administered as a single agent. Aftermethotrexate administration there is a considerable increase in MPO activity in liver, mostprobably due to neutrophil infiltration. However the same result could not be obtained inintestines, which is thought to be the preference of intestines for the antiapoptotic pathwaysVIIrather than neutrophil infiltration as the mechanism that leads to injury. However the increasein DNA fragmantation and mucosal changes detected at histopathological examination aftermethotrexate administration show that the applied methotrexate dose cause mucositis. Andthe reversal of DNA fragmantation levels and near normalization of mucosal changes afterghrelin treatment implies that ghrelin prevents mucositis in small intestine. On the other hand,increased blood leukocyte apoptosis after methotrexate treatment that could not be reversedby ghrelin treatment also has shown that ghrelin has no interference with methotrexate?seffectiveness. All these findings suggest that ghrelin deserves to be tested as a drug againstone of the most frequent chemotherapy side-effect mucositis.KEYWORDS: Mucositis, methotrexate, ghrelin, apoptosis, intestestinal injury