Akciğer kanseri hücrelerinde TGF-β ile indüklenen EMT ve invazyonuna SATB2'nin rolünün moleküler mekanizmalarıyla araştırılması
Investigation of the role of SATB2 with molecular mechanisms in TGF-β-induced EMT and invasion in lung cancer cells
Yazar: HAKAN KÜÇÜKSAYAN
Danışman: PROF. DR. HAKAN AKÇA
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Transforme edici büyüme faktörü-beta = Transforming growth factor-beta

Özet:
Epitelden mezenkimale geçiş (EMT), kanser invazyonunun kilit olaylarından biridir. EMT'nin indüklenmesinden sorumlu birçok düzenleyici moleküllerin aydınlatılmasına rağmen altında yatan mekanizmalar hala belirsizdir. SATB2, osteoblastik farklılaşma ve yüz-kafatası oluşumuna katılan nüklear matriks ile ilişkili bir kromatin yeniden modelleyici ve transkripsiyon faktördür. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) hücrelerinin TGF-β tarafından indüklenen EMT ve invazyonunda SATB2'nin etkileri tam olarak bilinmemektedir. Bu nedenle, SATB2'nin TGF-β ile indüklenen KHDAK hücre EMT ve invazyon için düzenleyici bir rolünün olup olmadığını moleküler mekanizmalarıyla tespit etmeyi amaçladık ve TGF-β ile indüklenen EMT sürecinde SATB2 ekspresyon kaybının önemli bir belirteç olduğunu gözledik. Akabinde, siRNA-aracılı SATB2 susturulmasının KHDAK hücrelerinde EMT ve invazyonu indüklemek için yeterli olduğunu ve bu süreçlerdeki TGF-β'nın indükleyici etkisini artırdığını gösterdik. Dahası, A549 hücrelerindeki SATB2'nin aşırı ifadesinin TGF-β ile indüklenen EMT ve invazyonu kısmi olarak inhibe ettiği gözlendi. Mekanistik olarak, SATB2'nin doğrudan SNAI2 ve ZEB1 gibi EMT düzenleyicilerinin regüle edebildiğini, fakat SMAD transkripsiyonel kompleksinin üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığını tespit ettik. Bu, SATB2'nin SMAD yolağından bağımsız olarak SNAI2 ve ZEB1 transkripsiyon faktörlerini regüle ederek TGF-β-aracılı EMT ve invazyona karıştığını göstermiştir. Ayrıca, TGF-β'nın SATB2 ekspresyonunu nasıl regüle ettiğini araştırdık ve biyoenformatik analizlerimiz aracılığıyla SATB2 promotorunun E-box, CTCF and SBE motiflerini içerdiğini bulduk. Daha sonra, TGF-β-aracılı SATB2 baskılanmasından hangisinin sorumlu olduğunu tespit etmek için A549 hücrelerinde SNAI1, SNAI2, ZEB1, CTCF and SMAD4 ekspresyonlarını siRNA aracılı olarak baskıladık. SNAI1 ve SMAD4 transkripsiyon faktörlerinin susturulmasının TGF-β-aracılı SATB2 downregülasyonunu baskıladığını gösterdik. ChIP-PCR sonuçları, TGF-β uyarımına yanıt olarak SATB2 ekspresyonunun, SNAI1 ve SMAD4 aracılığıyla transkripsiyonel olarak doğrudan düzenlendiğini doğrulamıştır. Ayrıca, KHAK hücrelerindeki SATB2 ekspresyonunun, KHDAK hücrelerine kıyasla dramatik bir şekilde yüksek seviyede olduğunu ve EGFR, CK7, NCAM1 ve ENO2 gibi akciğer kanserinde nöroendokrin fenotipin tespit edilmesinde kullanılan KHAK belirteçlerinin ekspresyonları ile anlamlı bir korelasyona sahip olduğunu bulduk. Mikroarray ve qPCR sonuçlarımız, SATB2'nin miR-1243 ve miR4779 ekspresyonları üzerinde baskılayıcı bir etkisinin olduğunu gösterdi. Sonuç olarak çalışmamız, SATB2'nin EMT, invazyon ve KHAK-benzeri nöroendokrin farklılaşma süreçlerini regüle ederek KHDAK karsinogenezinde kritik bir öneme sahip olduğunu açıkça ortaya koymaktadır.

Abstract:
EMT (Epithelial–mesenchymal transition) is a key event in invasion of cancer. There are lots of regulator molecules responsible for inducation of EMT, but underlying mechanisms are still unclear. SATB2 is a nuclear matrix-associated chromatin remodeling and transcription factor that is involved in osteoblastic differentiation and craniofacial patterning. It is completely unknown that the effects of SATB2 on TGF-β-induced EMT and invasion of NSCLC cells. Therefore, we aimed to determine whether SATB2 has a regulatory role for TGF-β-induced EMT and invasion of NSCLC cells with underlying molecular mechanisms and observed that loss of SATB2 is a significant marker for TGF-β-induced EMT process. Then, we demonstrated that siRNA-mediated knockdown of SATB2 is sufficient to induce EMT and invasion, and promotes the inducing effects of TGF-β on EMT and invasion in NSCLC cells. Furthermore, it was observed that SATB2 overexpression slightly inhibited TGF-β-induced EMT and invasion in A549 cells. Mechanistically, we established that SATB2 directly regulated EMT-mediating transcription factors SNAI2 and ZEB1 whereas it hadn't regulatory effect on SMAD trnacriptional complex, indicating that SATB2 implicated in TGF-β-induced EMT and invasion by regulating transcription factors such as SNAI2 and ZEB1 in SMAD pathway independent manner. We further investigated how TGF-β regulates SATB2 expression and observed that SATB2 promoter contains E-box, CTCF and SBE motifs by bioinformatics analyses. Next, we knockdowned expressions of SNAI1, SNAI2, ZEB1, CTCF and SMAD4 to determine which one is responsible for TGF-β-mediated SATB2 repression in A549 cells and showed that siRNA-mediated repressions of SNAI1 and SMAD4 ablolished TGF-β-mediated SATB2 downregulation. ChIP-PCR results verified that SATB2 is transcriptionally regulated by SNAI1 and SMAD4 in response to TGF-β. Also, we found that SATB2 is dramatically upregulated in SCLC cells compared to NSCLC cells, and had a significant correlation with the expressions of SCLC markers such as EGFR, CK7, NCAM1 and ENO2, which are used to detect the neuroendocrine phenotype in lung cancer. Microarray and qPCR results showed that SATB2 has a repressive effect on miR-1243 and miR-4779 expression. Consequently, our study clearly indicated that SATB2 plays a crucial role for NSCLC carcinogenesis by regulating EMT, invasion and SCLC-like neuroendocrine differentiation.