Katekolün parental ve epurubicin dirençli akciğer kanseri hücrelerinde apoptozisi hangi sinyal yolu ile uyardığının araştırılması
Investigation by which signal way cathecol stimulates apoptosis in parental and epurubic-resistant lung cancers
Yazar: ZEYNEP DEMİR
Danışman: PROF. DR. AYSUN ÖZKAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Apoptozis = Apoptosis ; Katekol = Catechol ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Bu çalışmada bir benzen türevi olan katekolün parental akciğer kanseri (PH1299), epirubicin-HCl dirençli akciğer kanseri (R-H1299) ve sağlıklı fibroblast (Bj) hücreleri üzerine olan sitotoksik, antiproliferatif, hücre döngüsü bloke edici ve apoptotik etki mekanizmaları araştırılmıştır. Her bir hücrede, apoptotik sinyal yolunun en fazla hangi mekanizma ile uyarıldığı ortaya konulmuştur. Katekolün hücreler üzerine sitotoksik etkisi Cell Titer-Blue® Cell viability assay kiti ile belirlenmiştir. Katekolün P-H1299, R-H1299 ve Bj hücrelerindeki IC50 değeri (hücrelerin %50 sini öldüren konsantrasyon) sırasıyla 58 µg/ml, 90 µg/ml ve 207 µg/ml olarak hesaplanmıştır. Katekolün P-H1299 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi hem R-H1299 hem de Bj hücrelerinden daha yüksek bulunmuştur. Çalışmamızda kaspaz 3/7 aktivitesi ve mRNA ekspresyonları katekolün IC50 konsantrasyonu ile 24 saat muamele edilen hücrelerde çalışıldı. Hücrelerde apoptotik yolağın anahtar enzimlerinden biri olan kaspaz-3/7 aktivitesi ApoTox-Glo Triplex Assay (Promega) kiti kullanılarak ölçüldü. Hücrelerdeki kaspaz 3/7 aktivitesi kontrol hücrelerle karşılaştırıldığında P-H1299 hücrelerinde 2,8 kat, R-H1299 hücrelerinde 2,3 kat ve Bj hücrelerinde 1,6 kat fazla bulundu. P-H1299 hücrelerinin kaspaz 3/7 aktivitesi, R-H1299 hücrelerinden 1,2 kat, Bj hücrelerinden 1,75 kat daha yüksek bulundu. Katekolün hücrelerde apoptozisi hangi sinyal yolu ile uyardığını araştırmak için RT-PCR (ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu) ile Bax (Bcl-2 Associated X Protein), Bcl-2 (B-Hücre Lösemi 2), ATM (Ataxia telangiectasia mutated kinase), ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3-related), siklin D1, PCNA (prolifere hücre nükleer antijeni) genlerinin mRNA ekspresyonları araştırılmıştır. Katekol uygulanan tüm hücreler karşılaştırıldığında, antiproliferatif etkiyi ortaya koyan PCNA ve hücre 
döngüsü belirteci olan siklin D1 mRNA ekspresyonları en düşük P-H1299 hücrelerinde bulunmuştur. Katekolün hücrelerdeki apoptotik sinyal yolunu uyarma mekanizmalarından biri de pro-apoptotik bir gen olan Bax'ın mRNA ekspresyonunun
antiapoptotik bir gen olan Bcl-2'nin mRNA ekspresyonuna oranının ölçülmesidir. Katekole 24 saat maruz kalan P-H1299, R-H1299 ve Bj hücrelerinde Bax/Bcl-2 oranları sırasıyla 1,5 kat, 2,0 kat ve 0,8 kat olarak hesaplanmıştır. Bax/Bcl-2 sinyal yolu en fazla R-H1299 hücrelerinde uyarılmıştır. Katekol P-H1299 ve R-H1299 hücrelerinde Bax/Bcl-2 oranının artmasına neden olarak apoptotik etki göstermiştir. Ancak Bj hücrelerinde Bax/Bcl-2 oranının azalmasına neden olarak antiapoptotik bir etki göstermiştir. Katekolün hücrelerde meydana getirdiği DNA hasarını ortaya koymak için ATM ve ATR genlerinin mRNA ekspresyon düzeyleri ölçülmüştür. Katekol ile muamele edilen P-H1299, R-H1299 ve Bj hücrelerinde hem ATM hem de ATR mRNA ekspresyonu kontrole göre artmıştır bu artış katekolün hücreler üzerinde DNA hasarına neden olduğunu göstermektedir. Sağlıklı hücrelerle kıyaslandığında R-H1299 hücrelerinde ATM ve ATR mRNA ekspresyonu P-H1299 hücrelerinden daha düşük bulunmuştur. Ancak tüm hücrelerdeki PCNA, siklin D1, Bax, Bcl-2, ATM ve ATR mRNA ekspresyonu seviyeleri kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında en fazla ATM ve ATR genlerinin mRNA ekspresyonunun arttığı görülmüştür. Sonuç olarak katekolün her ne kadar çoklu sinyal yolu ile apoptotik etkiye neden olduğu görülse de en etkili uyarılan sinyal yolunun DNA'da tek ve çift zincir kırıklarının varlığı ile açıklanan ATM ve ATR sinyal yolu olduğu ortaya konmuştur.

Abstract:
In this study, cytotoxic, antiproliferative, cell cycle blocking and apoptotic effect of catechol, a benzene derivative, on parental lung cancer (P-H1299), epirubicin-HCl resistant lung cancer (R-H1299) and healthy fibroblast (Bj) cells were investigated. The mechanism by which the apoptotic signaling pathway is most stimulated in each cell has been revealed. Cytotoxic effects of catechol on cells were determined by Cell TiterBlueR Cell Viability. IC50 values (concentration that kills 50% of cells) of catechol in PH1299, R-H1299 ve Bj were calculated respectively for catechol 58 µg/ml, 90 µg/ml ve 207 µg/ml. The cytotoxic effect of catechol on P-H1299 cells was higher than on both R-H1299 and Bj cells. In our study, caspase 3/7 activity and mRNA expressions were studied in cells treated with IC50 concentration of catechol for 24 hours. Caspase-3/7 activity, one of the key enzymes of the apoptotic pathway in cells, was measured using 
the ApoTox-Glo Triplex Assay (Promega) kit. Caspase 3/7 activity in cells was 2,8 times higher in P-H1299 cells, 2,3 times higher in R-H1299 cells and 1,6 times higher in Bj cells compared to control cells. Caspase 3/7 activity of P-H1299 cells was found 1,2 times higher than R-H1299 cells and 1,75 times higher than Bj cells. In order to investigate which signal pathway catechol stimulates apoptosis in cells, mRNA expressions of Bax (Bcl-2 Associated X Protein), Bcl-2 (B-Cell Lymphoma 2), ATM (Ataxia telangiectasia mutated kinase), ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3-related), cyclin D1, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) genes were investigated by RT-PCR (reverse transcriptase polymerase polymerase chain reaction). When all cells treated with catechol were compared, PCNA, which shows the antiproliferative effect, and cyclin D1 mRNA, which is a cell cycle marker, were found the lowest in P-H1299 cells. The apoptotic effect of catechol in cells was demonstrated by looking at the mRNA expression rates of Bax, a pro-apoptotic gene, and Bcl-2, an antiapoptotic gene. Bax/Bcl-2 ratios in P-H1299, R-H1299 and Bj cells exposed to catechol for 24 hours were calculated as 1,5 times 2,0 times and 0,8 times respectively. The Bax/Bcl-2 signaling pathway was most stimulated in R-H1299 cells. Catechol showed an apoptotic effect by increasing the Bax/Bcl-2 ratio in P-H1299 and R-H1299 cells. However, it showed an antiapoptotic effect by causing a decrease in the Bax/Bcl-2 ratio in Bj cells. In order to reveal the DNA damage caused by catechol in cells, mRNA expression levels of ATM and ATR genes were measured. Both ATM and ATR mRNA expression were increased in P-H1299, R-H1299 and Bj cells treated with catechol, indicating that catechol causes DNA damage on cells. When compared to healthy cells, ATM and ATR mRNA expression was lower in R-H1299 cells than in P-H1299 cells. However, when PCNA, cyclin D1, Bax, Bcl-2, ATM and ATR mRNA expression levels in all cells were compared with control cells, it was observed that mRNA expression of ATM and ATR genes increased the most. As a result, although it is seen that catechol causes apoptotic effect through multiple signaling pathways, it has been revealed that the most effective signaling pathway is ATM and ATR signaling pathway, which is explained by the presence of single and double strand breaks in DNA.