Hava yolu epitel hücrelerinde alerjen proteazların matriks proteazların salımı üzerine olan etkileri
The effect of allergen proteases on matrix proteases release in airway epithelial cells
Yazar: DİLARA KARAGÜZEL
Danışman: DOÇ. DR. İBRAHİM ÇAĞATAY KARAASLAN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Astım, çocuklarda daha yüksek sıklıkta olmakla birlikte tüm yaş gruplarında görülen, son yıllarda ülkemizde de görülme sıklığı artmış olan önemli bir solunum yolu hastalığıdır. Astımı tetikleyen çevresel etkenlerin başında alerjenler gelmektedir. Alerjenlerin proteaz özellikte olanları 6 ana gruba (serin, sistein, treonin, aspartat, glutamat ve metalloproteaz) ayrılırken, proteaz özellikte olmayanları da mevcuttur.
Alerjenlerin epitel hücre bariyerindeki reseptörler aracılığı ile veya meydana gelen hasar sonucu epitel bariyeri geçip vücuda girmesiyle başlayan inflamasyon durumu, epitel hücre hiperplazisi, epitel altı fibrosizi ve düz kas hücre hiperplazisi gibi çeşitli mekanizmaları aktifleştirerek hava yolu yeniden yapılanmasına (airway remodeling) neden olmaktadır. 
Hava yolu yeniden yapılanmasında, epitel hücre, fibroblast ve düz kas hücresinde görülen değişikliklerin yansıra ekstraselüler matriksin içeriğinde ve yapısında da bozulmalar meydana gelir. Bu bozulmalar kolajen, fibronektin, laminin ve agrekan gibi moleküllerin yıkımı ile gerçekleşir. Hava yolu yeniden yapılanmasında bu moleküllerin kesiminde rol alan proteaz grubu matriks metalloproteazlardır.
Çinko ile aktifleşen endopeptidazlar olan matriks metalloproteazlar (MMP'ler), ekstraselüler matriks elemanlarının üzerindeki parçalama etkilerinin yanında sitokin ve büyüme faktörleri gibi hücresel aktiviteyi düzenleyen moleküller üzerinde de etkilidir. Bu nedenle epitel hücre, fibroblast ve düz kas hücresi gibi farklı hücrelerde gerçekleşen metabolik olaylarda görev almaktadırlar. Günümüze kadar tanımlanan 28 matriks metalloproteaz arasından jelatin molekülünü kesen MMP-2 ve MMP-9'un ve kolajen molekülünü kesen MMP-12'nin astımda önemli rol oynadığı kanıtlanmıştır. MMP'lerin kaynak hücreler tarafından yeterli düzeyde ifade olmaması veya molekülleri parçalayarak gerçekleştirdikleri proteaz etkinliklerini tam olarak yerine getirememesi, ekstraselüler matriks üretimi ve akciğer fibrillerinin parçalanması arasındaki dengenin bozulmasına ve akciğerde yapısal bozulmaların görülmesine neden olur. Literatürde bronş epitel hücreleri ve MMP-9 ilişkisini gösteren yayınlar bulunmakla birlikte alerjen ile karşılaşma sonrası hava yolu epitel hücrelerinden salınan MMP-2 ve MMP-12 ile ilgili bilgiler son derece yetersizdir. 
Bu tez çalışmasında BEAS-2B bronş epitel hücreleri, Dermatophagoides pteronyssinus kaynaklı sistein proteaz özellikteki Der p 1, serin proteaz özellikteki Der p 6 ve proteaz özellikte olmayan Der p 2 alerjenleri ile ayrı ayrı uyarılmış ve uyarılma sonucu değişen MMP-2, MMP-9 ve MMP-12 seviyelerinde meydana gelen ifade farklılıkları gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) kullanılarak RNA düzeyinde ve ELISA yöntemi kullanılarak protein düzeyinde araştırılmıştır.
Sistein proteaz olan Der p 1'in, proteaz özellikte olmayan Der p 2'ninve serin proteaz özellikteki Der p 6'nın bronş epitel hücrelerine 24 saat uyarımı sonucunda MMP-2, MMP-9 ve MMP-12 gen ifadesini etkilendiği gösterilmiştir. Ayrıca ısı ile denatürasyona uğrayan alerjenlerin de MMP genleri üzerinde etkili olduğu görülmüştür. Der p 1 ve Der p 2 alerjenlerinin 24 saat uyarımı sonrasında hücre dışına salınan MMP-9 protein miktarını konsantrasyona bağlı olarak arttırdığı ancak Der p 6 alerjeninin düşürdüğü görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlar doğrultusunda bronş epitel hücrelerin maruz kaldığı alerjenlerin, proteaz aktiviteleri ve/veya epitel hücre reseptör etkileşimleri vasıtasıyla MMPlerin salımı üzerine etkili olarak hava yolu yeniden yapılanmasında rol oynadıkları sonucunu çıkarmak mümkündür.

Abstract:
Asthma is an important respiratory disease that has a higher incidence in children and has increased in recent years in our country. Allergens are the main environmental factors which trigger asthma. While allergens with protease activity are categorized into 6 main groups (serine, cysteine, threonine, aspartate, glutamate, and metalloprotease), there also allergens with no proteolytic activity.
Inflammation, which begins when allergens enter the body through the receptors on epithelial cells or disrupted epithelial barrier, leads to airway remodeling by activating various mechanisms such as epithelial cell hyperplasia, sub-epithelial fibrosis, and smooth muscle cell hyperplasia.
In airway remodeling, in addition to changes in epithelial cell, fibroblast, and smooth muscle cell, there are also deteriorations in the content and structure of extracellular matrix. These deteriorations occur by degradation of molecules such as collagen, fibronectin, laminin, and aggrecan. The protease group responsible for the cleavage of these molecules in airway remodeling is matrix metalloproteases.
Matrix metalloproteases (MMPs), zinc-activated endopeptidases, are effective on molecules that regulate cellular activity such as cytokines and growth factors, as well as exerting destructive effects on extracellular matrix components. Thus, they participate in metabolic events taking place in different cells such as epithelial cells, fibroblasts and smooth muscle cells. Of the 28 matrix metalloproteases identified to date, MMP-2 and MMP-9, which breaks the gelatin molecule, and MMP-12, which breaks the collagen molecule, have been shown to play an important role in asthma. Inadequate expression of MMPs by the source cells or failure to fully perform protease activity by degrading molecules leads to disruption of the balance between extracellular matrix production and lung fibrillation breakdown and eventually causes structural disruption in the lung. Although there are publications in the literature indicating the association between bronchial epithelial cells and MMP-9, information on MMP-2 and MMP-12 released by airway epithelial cells in response to allergen exposure is extremely inadequate.
In this study, BEAS-2B bronchial epithelial cells were stimulated separately with cysteine protease allergen Der p 1, serine protease allergen Der p 6, and Der p 2 allergen with no protease activity, allergens derived from Dermatophagoides pteronyssinus. Changes in expression of MMP-2, MMP-9, and MMP-12 levels occurring after allergen stimulation were investigated at RNA level by using PCR and at protein level by using ELISA method.
It has been established that cysteine protease Der p 1 is effective on MMP-2 and MMP-9 gene expression, while non-proteolytic Der p 2 has an impact on MMP-2, only. Also, Der p 6 has been shown to be effective on MMP-2, MMP-9, and MMP-12 after 24 hour allergen exposure. Besides, heat inactivated allergies are also shown to be effective in MMP genes. Amount of MMP-9 protein released from cells are shown to be increased after both Der p 1 and Der p 2 stimulation, whereas stimulation with Der p 6 decreased the release of MMP-9. According to these results, it can be concluded that allergens exposed to bronchial cells play a role in airway remodeling by affecting MMP release through their protease activities and/or epithelial cell receptor interactions.