Moleküler baskılama yöntemi ile CEC (kapiler elektrokromatografi) sisteminde hidrofobik amino asit enantiyomerlerinin ayrılması
Separation of hydrophobic amino acid enantiomers in CEC (capillary electrochromatography) system by molecular imprinting technique
Yazar: KORAY ŞARKAYA
Danışman: PROF. DR. HANDAN YAVUZ ALAGÖZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Farklı biyolojik aktiviteler gösterebilmeleri sebebiyle enantiyomerlerin ayırımları kimya biliminde kromatografi araştırma konuları içerisinde önem taşımaktadır.   Amino asit enantiyomer çiftleri, gerek ticari açıdan artan önemleri ve gerekse de kolaylıkla ulaşılabilmeleri gibi etmenler dolayısıyla son yıllardaki önemli araştırma konularından bir tanesi haline gelmiştir. Aminoasitlerin yüksek çözünürlüklü ayrımlarının başarılması, amino asit analizinde önemli bir uygulama noktasını oluşturmaktadır. Aminoasit enantiyomerlerinin birçoğu, biyolojik olarak aktif bileşiklerin sentezlenme sürecinde başlangıç maddesi olarak ya da farklı görevler kapsamlı gerekli bileşikler olarak kullanılabilmektedir.
Kiral bileşiklerin ayrılması için çeşitli yöntemler bulunur. Tez kapsamında bu yöntemlerden elektroforez tekniklerinden bir tanesi olarak Kapiler Elektrokromatografi (CEC)  yöntemi kullanılmıştır. CEC yöntemi, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)'nin yüksek seçiciliği ve Kapiler Elektroforez (CE)'in etkin ayrımlılığı yönlerini temel almış ve bu iki yöntemin bileşke teknolojisi olarak son yıllardaki en verimli yöntemlerden bir tanesidir. Sahip olduğu farklı hidrodinamik özellikler sebebiyle CEC sisteminde son dönemlerde monolitik kolonlar, dolgulu kolonlara göre daha fazla tercih edilmektedir. Monolitik kolonların gruplarından olan polimer kolonlar çeşitli organik monomerler ile hazırlanabilmektedir. Moleküler baskılanmış polimerler (MIP), moleküler tanımaya elverişli malzemeler olarak pratik olarak uygun şartlarda kolayca hazırlanabilmektedir.  Ayrıca bu polimerlerin sahip olduğu mekaniksel özellikler, ısıya ve basınca karşı sağlam dirençlilik, fiziksel sağlamlıkları, asidik, bazik, metal iyonları ve organik çözücüler gibi ortamlardaki yüksek kararlılıkları sebebiyle birkaç yıl boyunca performansında değişim gözlenmeksizin saklanabilmektedir. 
Sunulan bu tez çalışmasında hidrofobik amino asitlerin enantiyomerik formlarının CEC sisteminde birbirinden moleküler baskılama tekniği ile ayrılması hedeflendi. Bu hedef doğrultusunda amino asidin L-formu baskılanacak kalıp molekül olarak seçilirken, fonksiyonel monomer olarak hidrofobik karakterli N-Metakriloil-(L)-fenilalanin monomeri tercih edildi ve hidrofobik karakterli monolitik CEC kolonu hazırlandı. Hazırlanan metakrilat bazlı monolitik kolonun geçirgenlik özelliklerinin arttırılabilmesi için; monomer oranı, sıcaklığın etkisi, kalıp molekül oranı, çapraz bağlayıcı oranı, porojen oranı ve çeşidi gibi farklı parametrelerde denendi. Hazırlanan CEC kolonunun karakterizasyon çalışmaları, FTIR-ATR, SEM ve BET analizleri ile değerlendirildi. Optimum geçirgenlik elde edilmesi sonrasında alkil benzen türevli bileşikler kullanılarak monolitlerin kromatogarfik performansları tayin edildi. Optimum koşulları belirlemek üzere akımın, basıncın, organik çözücünün derişiminin etkisi ve enantiyomerik türün tespitine yönelik farklı koşullar altında enantiyomerik ayırımlar gerçekleştirildi. Sonuçların desteklenmesi bakımından teorik tabaka değerleri ve teorik tabaka yükseklikleri hesaplandı. Tekrar kullanılabilirlik çalışmalarının yapılmasının ardından, moleküler baskılanmış kolon ile baskılanmamış (boş) kolonun ayırma performansı elektrokromatografik olarak karşılaştırıldı. Hidrofobik karakterli monolitik CEC kolonu kullanımıyla birlikte hidrofobik kararkterli amino asitler triptofan, tirozin ve fenilalaninin CEC sisteminde enantiyomerik ayırımları başarıyla gerçekleştirildi.

Abstract:
Because of their ability to show different biological activities, the separation of enantiomers is of importance in the field of chromatographic research in chemistry. Amino acid enantiomer pairs have become one of the important research topics in recent years due to factors such as increasing commercial importance and being easily accessible. The achievement of high resolution separations of amino acids is an important application point in amino acid analysis. Many of the amino acid enantiomers can be used as starting materials in the synthesis process of biologically active compounds or as complements of various tasks. There are various methods for separating of chiral compounds. 
There are various methods for separating chiral compounds. Capillary electrochromatography (CEC) method was used as one of the electrophoresis techniques. The CEC method is based on the high selectivity of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and the efficient discrimination of capillary electrophoresis (CE) and is one of the most efficient methods in recent years as the resultant compounding technology. Because of the different hydrodynamic properties that it possesses, monolithic columns in the CEC system are preferred over filled columns. Polymer columns from groups of monolithic columns can be prepared with various organic monomers. Molecularly imprinted polymers (MIPs) can be easily prepared in practical terms as materials suitable for molecular identification. In addition, these polymers have mechanical properties, robustness against heat and pressure, physical stability, acidic, basic, metal-ions and organic solvents.
In this thesis, it was aimed to separate the enantiomeric forms of hydrophobic amino acids by molecular imprinting technique in CEC system. In this target, the hydrophobic N-Methacryloyl-(L) -phenylalanine monomer was preferred as the functional monomer, while the monolithic CEC column with hydrophobic character was prepared, while the L-form of amino acid was selected as the template molecule to be imprinted. In order to increase the permeability properties of the prepared methacrylate-based monolithic column, monomer ratio, temperature effect, template molecule ratio, crosslinking ratio, porogen ratio and type was examined. Characterization studies of the prepared CEC column were evaluated by FTIR-ATR, SEM and BET analyzes. After obtaining optimal permeability, the chromatographic performance of the monoliths was determined using alkyl benzene-derived compounds. To determine the optimum conditions, enantiomeric separations were carried out under different conditions for the effect of the concentration of the stream, the pressure, the organic solvent and the determination of the enantiomeric stream. Theoretical plate values and theoretical plate heights were calculated to support the results. After carrying out the reusability studies, the separation performance of the molecularly imprinted column and the non-imprinted column was compared electrochromatographically.

With the use of monolithic CEC column with hydrophobic character, the enantiomeric separations of the hydrophobic amino acids tryptophan, tyrosine and phenylalanine in CEC system were successfully carried out.