Koyun böbreğinden aldoz redüktaz ve sorbitol dehidrogenaz enzimlerinin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı ilaçların enzim aktiviteleri üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification, characterization of aldose reductase and sorbitol dehydrogenase enzymes from sheep kidney and investigation of some drugs' effects on enzymes activity
Yazar: BÜLENT ŞENGÜL
Danışman: PROF. DR. ŞÜKRÜ BEYDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Diyabetik komplikasyonların gelişiminde, önemli rol oynayan poliol yolağı enzimlerinden Aldoz redüktaz (AR) (Alditol: NADP+ 1- oksidoredüktaz, E.C. 1.1.1.21) ve Sorbitol dehidrogenaz (SDH) (L-İditol: NAD+ oksidoredüktaz, EC 1.1.1.14) koyun böbreğinden saflaştrıldı, karakterize edildi ve bazı ilaçların enzimlerin aktiviteleri üzerine etkileri incelendi. AR enziminin saflaştırması homojenatın hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sephadex iyon değişim kromatografisi, Sephadex G-100 jel filtrasyon kromatografisi ve 2', 5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi olmak üzere 5 basamakta gerçekleştirildi. SDH enzimini saflaştırma işlemi ise homojenatın hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sephadex iyon değişim kromatografisi ve CM-Selüloz C-50 iyon değişim kromatografisi olmak üzere 4 basamakta gerçekleştirildi. 22,77 EÜ/mg protein spesifik aktivitesine sahip olan AR enzimi %1,54 verimle, yaklaşık 219 kat saflaştırıldı. 3 EÜ/mg protein spesifik aktivitesine sahip olan SDH enzimi %4,26 verimle, yaklaşık 484 kat saflaştırıldı.  Enzimlerin saflığını kontrol etmek ve alt birim molekül kütlelerini tespit etmek amacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı. Her iki enzim için optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, stabil pH'lar belirlendi. Enzimlerin alt birimlerinin mol kütleleri ise SDS-PAGE ile sırasıyla 35,5 kDa ve 34,66 kDa olarak bulundu. Ayrıca iki enziminde substratları için KM ve Vmax değerleri hesaplandı. Daha sonra koyun böbrek AR enzimi ve SDH enzimi aktivitesi üzerine bazı antibiyotiklerin inhibisyon etkileri incelendi. İnhibisyon gösteren ilaçlar için Lineweaver-Burk grafikleri yardımıyla Ki sabitleri ve inhibisyon tipleri tespit edildi.

Anahtar Kelimeler: Aldoz redüktaz, sorbitol dehidrogenaz, koyun böbreği, ilaç, 
inhibisyon

Abstract:
Aldose reductase (Alditol: NADP+ 1- oxidoreductase, E.C. 1.1.1.21) and Sorbitol dehydrogenase (L-iditol: NAD+ oxidoreductase, EC. 1.1.1.14), are the enzymes of polyol pathway playing an important role in the development of diabetic complications. The both enzyme were purified from sheep kidney, characterized and effects of some drugs on these enzymes activities were investigated. The purification of AR consists of five steps; They were preparation of homogenate, ammonium sulphate precipitation, DEAE-Sephadex ion exchange chromatography, Sephadex G-100 gel filtration chromatography and 2',5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography. The four steps of purification of SDH are preparation of homogenate, ammonium sulphate precipitation, DEAE-Sephadex ion exchange chromatography and CM-Cellulose C-50 ion exchange chromatography. AR enzyme was obtained having a specific activity of 22.77 EU/mg proteins with a yield of 1.54% and approximately 219 fold. SDH enzyme was obtained having a specific activity of 3 EU/mg proteins with a yield of 4.26% and approximately 484 fold. SDS-PAGE was carried out to check the purity of both enzymes and to determine molecular weight of subunits. Optimal pH, optimal ionic strength, optimal temperature and stable pH were determined for both enzymes. The molecular weight of subunits determined by SDS-PAGE were calculated as; 35.5 kDa and 34.66 kDa respectively. Besides, KM and Vmax values for each substrates of two enzymes were calculated. Then the effects of some antibiotics on sheep kidney AR and SDH activities were examined. For drugs that exhibit inhibitory effect, Ki constants were calculated and inhibition types were determined by using Lineweaver-Burk curves.

Keywords: Aldose reductase, sorbitol dehydrogenase, sheep kidney, drug, inhibition