GFP geni aktarılmış mezenkimal kök hücre davranışlarının 4 boyutlu kültürde yapay zeka kullanılarak analizi
Analysis of GFP gene transduced mesenchymal stem cell behaviors using artificial intelligence in 4D cultures
Yazar: CEREN ÖZDEMİR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ HAKAN DARİCİ
İstinye Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre ve Doku Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kök Hücre Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Genler = Genes ; Hücre kültür teknikleri = Cell culture techniques ; Kök hücreler = Stem cells ; Makine öğrenmesi = Machine learning ; Yapay zeka = Artificial intelligence

Özet:
Hücrelerin moleküler mekanizmalarını ve davranışlarını incelemek için kullanılan iki 
boyutlu (2B) konvansiyonel hücre kültür sistemleri ucuz ve kolay uygulanabilir olmasına 
karşın hücrelerin vücut içindeki 3 boyutlu (3B) davranışlarını uygun şekilde taklit
edememektedir. Bu eksikliği giderip hücrelerin vücut içerisindeki doğal ortamlarını taklit 
etmek amacıyla 3B kültür sistemleri geliştirilmiştir. Araştırmalar, 3B kültür ile 
gerçekleştirilen deneylerin, standart 2B kültüre göre daha doğru sonuçlar verdiğini işaret 
etmektedir. 
Sferoid oluşturma ve 3B biyobaskı (3D bioprinting), 3B kültür ortamı oluşturmak için 
yaygın olarak kullanılan yöntemlerdendir. Ancak tüm bu 3B kültür tekniklerinde,
özellikle mikroskobik analizlerde ulaşılması gereken bazı teknolojik ilerlemelere ve yeni
yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç bulunmaktadır. 
Time-lapse görüntüleme yöntemi ile, hücrelerdeki zamana bağlı çoğalma, ölüm, hücre 
hareketi gibi değişiklikler izlenebilmektedir. Ancak bu yöntemdeki görüntülerin 
sayısallaştırılarak kantitatif analiz yapılması özellikle 3B kültürlerde çok zorludur. Ek 
olarak, deney gruplarının sayısı, elde edilen fotoğrafların adedi ve inceleme süresi arttıkça 
analiz edilecek datanın miktarı da katlanarak artmakta ve analiz yapmayı
zorlaştırmaktadır. 
Yapay Zeka (YZ), insan beyninin çalışma prensibini taklit edebilen ve çok sayıdaki veriyi 
işleyebilen donanım ve yazılımlar bütünüdür. Son yıllardaki YZ çalışmaları, tıbbi 
görüntülerin analizinde oldukça olumlu sonuçlar vermiştir.
Bu tez çalışmasında; 2B ve 3B kültürlerde, mezenkimal kök hücrelerin (MKH) 
davranışlarının yapay zeka yazılımları ile zamana bağlı incelenmesi amaçlandı. Hücreleri 
takip etmeyi kolaylaştırmak için ilk etapta MKH'lere viral transfeksiyonla yeşil florasan 
protein (GFP) geni aktarıldı. Ardından MKH'ler 3B biyoyazıcıda basıldı veya hidrojeller 
ya da 2B kültür kapları üzerine ekildi. Hücreler inverted florasan mikroskopta yer alan xiv
inkübasyon düzeneği içerisinde, time-lapse kamera sistemi ile 24 saat boyunca 
görüntülendi. Bu şekilde X, Y, Z düzlemlerindeki analize ek olarak 4. boyut (4B) olan
zamana bağlı görüntüler elde edildi. Seçme fotoğraflar ile eğitim verdiğimiz YZ destekli
ZIESS ZEN Intellesis sistemi kullanılarak 200.000'den fazla fotoğraf segmente edildi. 
Segmentasyon datasındaki alanlar ölçülerek, hücrelerin konfluensi, hareketlilik, 
tutunma/yüzeyden kalkma, canlılık/hücre ölümü, GFP miktarında değişim gibi içinde 
bulundukları farklı durumlara dair sayısal verilerin eldesinde kullanılabilecek orijinal 
formüller geliştirildi.
Çalışmamızda, normal insan işgücü ile tamamlanamayacak kadar fazla sayıdaki analizin, 
geliştirdiğimiz YZ destekli analiz yöntemleri ve formülasyonlar sayesinde çok daha 
hassas şekilde ve düşük maliyetle yapılabileceği ortaya konmuştur.

Abstract:
Two-dimensional (2D) conventional cell culture systems are used to study the molecular 
mechanisms and behavior of cells. Despite being cheap and easy to apply, 2D cultures are 
inadequate to mimic the 3D behavior of cells within the body. 3D culture systems have 
been developed to overcome this deficiency and to imitate the natural environment of 
cells in the body. Research indicates that experiments performed within 3D culture give 
more accurate results than standard 2D culture.
Spheroid formation and 3D bioprinting are some of the methods frequently used to create 
3D cultures. However, there is a need for some technological advances and the 
development of new methods in all 3D culture techniques, especially in microscopic 
analysis.
Time-lapse imaging method allows observation of changes in cells such as proliferation, 
death and cell movement, over time. However, quantitative analysis of the images 
especially in 3D cultures is quite difficult. Additionally, as the number of experimental 
groups, the number of photographs obtained and the observation period increase, the 
amount of data to be analyzed increases exponentially, rendering analysis more difficult. 
Artificial Intelligence (AI) is a combination of hardware and software which can imitate 
the working principle of the human brain and can rapidly process huge amount of data. 
Recent studies on AI have yielded very promising results in the analysis of medical 
images.
In this thesis study; we examined the behavior of mesenchymal stem cells (MSCs) in 2D 
and 3D cultures over time, using artificial intelligence. For the purpose of cell tracking, 
the GFP gene was transferred to the MSCs by viral transfection. MSCs 3D bioprinted or 
seeded onto hydrogels or 2D culture plates. Cells were observed with time-lapse camera xvi
system of an inverted fluorescent microscope for 24 hours. In this way, in addition to the 
analysis in the X, Y, Z planes, time-dependent images the 4th dimension (4D), were 
obtained. The AI-empowered ZIESS ZEN Intellesis system was first trained with selected 
examples and 200,000+ photos from all experiments were segmented with Intellesis 
software. By measuring the areas in the segmentation data, novel formulas were 
developed that can be used to obtain numerical data on different conditions such as 
confluency, cell mobility, attachment/detachment, viability/cell death, and change of GFP
signal intensity.
In our study, we have showed that multiple analyzes that cannot be completed with a 
normal human labor can easily be done with AI more precisely and at lower cost.