Uveal melanomlarda patolojik prognostik faktörler ve braf v600e mütasyonu ile sağkalım ilişkisi
The pathological prognostic factors and braf v600e mutation in uveal melanomas and their association with survey
Yazar: MERYEM FATOŞ ÇOŞKUN
Danışman: PROF. DR. NESİMİ BÜYÜKBABANİ
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Patoloji = Pathology
Dizin: Konjonktiva = Conjunctiva ; Melanom = Melanoma ; Mutasyon = Mutation ; Patoloji = Pathology ; Prognoz = Prognosis ; Sağkalım = Survival ; Üvea = Uvea

Özet:
Koroid melanomu, yetişkinlerde görülen en sık intraoküler primer malign tümördür. Deri ve uvea melanomlarının her ikisi de melanositlerden köken alır ve benzer histolojik özellikler gösterirler. Ancak klinik, genetik ve sitogenetik özellikleri farklılıklar gösterir (1-3). Tanı ve tedavi yöntemlerindeki ilerlemeye rağmen uvea melanomu mortalite oranlarında azalma olmamıştır (4).
Uvea melanomlarında ileri hasta yaşı, büyük tümör boyutları, siliyer cisimcik/anteriyor koroid yerleşimi, epiteloid hücre varlığı, tümör hücrelerinde proliferatif indeks yüksekliği, kapalı loop/network ekstraselüler matriks paterni, monozomi 3, 8q kazanımı ya da 8p kaybı kötü prognozla ilişkili bulunan faktörlerdir (2, 5-8).
MAP (mitojen aktive protein) kinaz sinyal yolunun, insanda melanositik neoplazmlar da dahil olmak üzere kanser gelişiminde önemli rolü vardır (9, 10). Braf, otokrin ve endokrin büyüme faktörlerine karşı hücresel yanıt regülasyonunda rol oynayan mitojen aktive protein kinaz (MAP kinaz) yolu üzerinde işlevi olan bir serin-treonin kinazdır (11, 12). İnsanlarda melanositik nevüslerde %82'nin üzerinde, deri melanomlarında ise %60-80 oranlarında BRAF mütasyonları saptanmıştır (13-15). Tespit edilen mütasyonların %90'ı BRAF ekson 15 V600E mütasyonudur (13). Konjonktiva melanomlarında saptanan Braf V600E mütasyonu oranı deri melanomuna benzerdir (16). İris melanomlarında %48 oranında Braf V600E mütasyonu saptanmıştır (17). Koroid melanomu hücre dizi ve kültürlerinde, MAP kinaz sinyal yolunda aktivasyon artışı ve Braf V600E mütasyonu saptanmasına rağmen, tümör dokularında Braf V600E mütasyonu saptanmadığı bildirilmiştir (10, 18-20). Daha sonra yapılan çalışmalarda, koroid melanomu tümör dokularında, düşük oranlarda da olsa Braf V600E mütasyonu tespit edilmiştir (21-23).
Çalışmamızda, 58 primer koroid/siliyer cisimcik melanomu vakasına ait tümör dokularında, Ki-67 proliferasyon indeksi ve kapalı loop/network paterni immünhistokimyasal/histokimyasal yöntemlerle incelendi. Braf V600E mütasyon varlığı, real-time PCR ve melting curve analizi ile araştırılıp, tüm bu faktörlerle hasta sağkalımı arasındaki ilişki incelendi. Ayrıca iki iris ve bir konjonktiva melanomu tümör dokularında Braf V600E mütasyonu varlığı araştırıldı.
Klinik takipler sonunda vakaların %74.1'inin (n=43) sağ olduğu saptandı. Vakaların %19'u (n=11) melanom nedenli, %7.9'u (n=4) melanom dışı diğer nedenlerle ölmüştü.
	PAS (modifiye) histokimyasal yöntem ile incelediğimiz kapalı loop/network paterni vakalara ait kesitlerin %74.2'sinde (n=42) gözlendi. Kollagen IV immümhistokimyasal yöntemi ile yaptığımız incelemede, kapalı loop/network paterni açısından PAS (modifiye) boyası ile paralellik gözlendi.
Kapalı loop/network paterni epiteloid hücre içeren vakalarda, siliyer cisimcik lokalizasyonu olan ve evre III olan vakalarda istatistiksel olarak anlamlılık düzeyinde daha fazla oranda gözlendi (p<0.05). Melanom nedenli ölüm ile istatistiksel olarak anlamlılık düzeyinde bir ilişki tespit edilmedi.
Ki-67 indeksinin, melanom nedenli ölüm görülen vakalarda daha yüksek olduğu tespit edilmişti (p=0.003). Melanom nedenli ölüm, Ki-67 indeksi >%9 olan vakalarda anlamlılık düzeyinde daha fazla oranda görüldü. Ki-67 indeksi epiteloid hücre içeren, siliyer cisimcik yerleşimi olan ve kapalı loop/network paterni gözlenen vakalarda daha yüksekti (p<0.05). Tümör evresi ile Ki-67 indeksi arasında istatistiksel olarak anlamlılık düzeyinde bir ilişki saptanmadı.
Melanom nedenli ölüm görülen vakalarda skleraya temas eden en büyük tümör çapı ve  ilk tanı konma yaşı daha büyüktü (p<0.05). Ayrıca ilk tanı konma yaşı >75 olan vakaların melanom nedenli ölüm oranı daha yüksekti (p=0.006).
Sağkalım analizlerinde, siliyer cisimcik yerleşimi, yüksek Ki-67 indeksi (>%9), kapalı loop/network paterni ve ilk tanı yaşının >75 olması durumunda vakaların melanom spesifik kümülatif sağkalım olasılığının daha düşük olduğu tespit edildi.
Tekli cox regresyon analizlerinde, Ki-67 indeksi, kapalı loop/network paterni ve ilk tanı konma yaşının, melanom nedenli ölüm riski üzerinde etkili oldukları tespit edildi. Basamaklı çoklu cox regresyon analizinde ise yüksek Ki-67 indeksi (>%9) melanom spesifik ölüm riskini etkileyen tek risk faktörü olarak saptandı (p=0.023, ExpB: 8.032). Çoklu Cox regresyon analizlerinde, ilk tanı alma yaşının büyük olması (>75) ve kapalı loop/network paterni melanom spesifik ölüm riski açısından önemini kaybetmiştir.
Elli sekiz primer koroid melanomu ve iki iris melanomu vakasına ait tümör dokularında Braf V600E mütasyonu tespit edilmedi. Bir konjonktiva melanomu tümör dokusunda ise Braf V600K mütasyonu tespit edildi.
Sonuç olarak melanom nedenli ölüm riski açısından Ki-67 indeksi artışı en güçlü risk faktörü olarak tespit edildi. Ayrıca primer koroid melanomu tümör dokularında, real-time PCR ve melting curve analizi ile Braf V600E mütasyonu tespit edilmedi. Deri melanomunun aksine, literatürde bildirilen MAP kinaz yolu aktivasyon artışında esas rolü Braf V600E mütasyonu oynamamaktadır. Koroid melanomlarındaki MAP kinaz yolu aktivasyon artışının, başka bir mekanizma üzerinden geliştiği düşünüldü.

Abstract:
II-ABSTRACT
Choroidal melanoma is the most frequent primary intraocular malign tumour in adults. Both cutaneous  and uveal melanomas originate from melanocytes and they share similar histological features. But they show differences in terms of their clinical, genetical and cytogenetical features (1-3). In spite of the advanced diagnostic and treatment methods, the rate of the mortality has not decreased (4).
Advanced patient age, large tumor sizes, anterior/ciliary body involvement, presence of epithelioid cell, the increase of proliferative activity, presence of closed loop/network extracellular matrix patterns, monosomy 3, and 8q gain or 8p loss are the factors related to poor prognosis in uveal melanomas (2, 5-8).
The MAP (mitogen activated protein) kinase pathway is of great importance in the development of human cancers, as well as in melanocytic neoplasms (9, 10). Braf is a serin-treonin kinase in the MAP kinase  (mitogen activated protein kinase) signal pathway that mediates cellular responses to autocrine and endocrine growth signals (11, 12). Braf mutations have been detected in up to 82% of cutaneous melanocytic nevi, 60 to 80% in cutaneous melanomas, 40% to 60% in tyroid papillary carcinomas and they have been determined at lower frequencies in over carcinomas, non-small cell lung carcinomas and colorectal adenocarcinomas (13-15). Braf V600E mutation in exon 15 accounts for 90% of all the detected Braf mutations (13). The Braf mutation rates determined in conjunctival melanomas show similarity to cutaneous melanomas (16). Braf V600E mutation was detected at 48% of iris melanomas (17). Although constitutive activation of the MAP kinase signaling pathway and Braf V600E mutation in human uveal melanoma cell line and cultures were determined, the absence of the Braf V600E mutation in tumor tissues was reported (10, 18-20). In subsequent studies, though at low frequencies Braf V600E mutation was reported in choroidal melanoma tumor tissues (21-23).
In this study, the Ki-67 proliferative index and the extracellular matrix (ECM) patterns of closed loop/network have investigated by the means of histochemical/immunohistochemical methods. The frequency of Braf V600E mutation was determined by the means of real-time PCR and melting curve analysis in the 58 choroidal and ciliary body melanoma tumor tissues, and finally the relationship between all these factors and patients survival rates was examined. Additionally, Braf V600E mutation was investigated in two iris melanomas and a conjunctival melanoma tumor tissues.
At the end of the clinical follow-up, 74.1%  (n=43) of patients were alive. 19% (n= 11) of cases had died of metastatic disease or recurrent melanoma and 7.9% (n= 4) had died on account of other causes. 
Closed loop/network ECM patterns were observed in 74.2% (n=42) of the tumor tissue samples with PAS (modified) histochemical examination. In our immunohistochemical examination of Collagen IV, we observed parallel microscopical findings with the PAS examination.
Closed loop/network ECM patterns were more frequent in tumors that involved in ciliary body and in stage III tumors. There was no statistically significant association between tumor cell type or melanoma related death and closed loop/network patterns.
Ki-67 index was higher in tumors that contained epitheloid cells, in tumors that had ciliary body involvement and in tumors that contained closed loop/network ECM patterns (p<0.05). We couldn't detect any relationship between advanced tumor stage and Ki-67 index. Ki-67 index was higher at patients that died of melanoma. Melanoma related death was more frequent at patients for whom Ki-67 index was >9%.
	The largest basal diameter was larger and the age at first diagnosis was greater at patients that died of melanoma (p<0.05). Furthermore melanoma related mortality rate was more in patients whose first age at diagnosis were  >75.
	In survey analyses, the ciliary body involvement of the tumor, high Ki-67 proliferative index (>9%), the presence of closed loops/network ECM patterns and in the event of the age at first diagnosis were >75, a lower frequency probability of melanoma-spesific survival was determined.
	In univariate Cox regression analysis, Ki-67 index of the tumor cells, presence of closed loops/network ECM patterns and the first diagnosis age of patients had a statistically significant relationship with the risk of melanoma spesific death. In stepwise multivariate Cox regression analysis, high Ki-67 index (>9%) was the only risk factor that increases the risk of melanoma specific death (p=0.023, Exp B: 8.032). In multivariate Cox regression analysis, the greater age (>75) at first diagnosis and the closed loop/network patterns lost their significance for the risk of melanoma specific death.
	There were no Braf V600E mutation detected in tumor tissue samples of 58 primary choroidal melanomas and two iris melanomas. Braf V600K mutation was detected in the tumor tissue sample of a conjunctival melanoma.
	Consequently, high Ki-67 index was detected to be the strongest risk factor for melanoma related death. Additionally, Braf V600E mutation was not detected in tumor tissue samples of primary choroidal and ciliary body melanoma by real-time PCR and melting-curve analysis. Unlike cutaneous melanoma, Braf V600E mutation doesn't play a main role in constitutively activation of the MAP kinase signaling pathway in choroidal melanomas reported in previous studies. It was suggested that activation of the MAP kinase signaling pathway occurs through a different genetical mechanism in choroidal melanomas.