İn-vitro köpek meme tümörü modelinde siklooksijenaz inhibitörü ve kemoterapi kombinasyonunun antitümöral etkinliğinin değerlendirilmesi
Evaluation of the antitumoural efficacy of a combination of cyclooxygenase inhibitor and chemotherapy in an In vitro canine mammary tumour model
Yazar: MERVE BİŞKİN TÜRKMEN
Danışman: PROF. DR. OĞUZ KUL
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Patoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Meme kanseri =

Özet:
Köpek ve kedilerde meme kanseri, tüm kanser olgularının %52'sini oluşturmaktadır.
Köpek ve insan meme tümörleri arasındaki; moleküler, histolojik, klinik ve
epidemiyolojik benzerlikler nedeniyle tanı, patogenez ve tedaviye yönelik
karşılaştırmalı çalışmalar devam etmektedir. Kanser hücre hatları, kanser biyolojisinin
incelenmesi, moleküler yolakların ortaya konulması ve antitümöral ilaçların
etkinliğinin test edilmesinde in-vitro bir model olarak başarıyla kullanılmaktadır.
Meme kanserine yönelik güncel çalışılan konulardan birisi de, COX-2 ifadesine sahip
tümörlerde siklooksijenaz (COX) aktivitesinin non-steroidal antiinflamatuar ilaçlar ve
standart kemoterapinin kombine edildiği tedavi stratejileri üzerinedir. Bu araştırmanın
temel amacı, COX-2 ifadesi pozitif insan ve köpek meme tümör hücre kültürlerinde,
seçici COX-2 inhibitörü selekoksib ile doksorubisin veya siklofosfamid
kombinasyonu yapılarak, tek başına kullanımlarına göre daha yüksek antitümöral
etkinlik elde edilip edilemeyeceği ve tümör hücrelerinin COX-2 ifade seviyeleri ile
selekoksibin antitümöral etkinliği arasında korelasyon bulunup bulunmadığının
araştırılmasıdır. Çalışmada; yüksek COX-2 ifadesine sahip CMT-U27 (köpek), P114
(köpek), MDA-MB-231 (insan) ve düşük COX-2 ifadesine sahip CMT-U309 (köpek)
meme tümörü hücre hatları 96 kuyucuklu plakalara RealTime-Glo™ MT için herbir
kuyucuğa 200 hücre ve MTT testi için her bir kuyucuğa 7x103 hücre olacak şekilde
ekilip 17 farklı çalışma grubu oluşturuldu. Bu gruplara sırasıyla: meme tümörü
kontrol, meme tümörü taşıt kontrol, 25 µM selekoksib, 50µM selekoksib, 75 µM
selekoksib, 100 µM selekoksib, siklofosfamid (IC50 dozda), siklofosfamid+25 µM
selekoksib, siklofosfamid+50 µM selekoksib, siklofosfamid+75 µM selekoksib,
siklofosfamid+100 µM selekoksib, doksorubisin (IC50 dozda), doksorubisin+25 µM
selekoksib, doksorubisin+50 µM selekoksib, doksorubisin+75 µM selekoksib,
doksorubisin+100 µM selekoksib grubu şeklinde ilaç uygulandı. İnkübasyonun
24'üncü saatinde selekoksib ve kemoterapötik ajanların ilk uygulaması yapıldı ve
RealTime-Glo™ MT ile 24 ve 48'inci saat bulguları değerlendirildi. 72'nci saat
bulguları için aynı gruplar oluşturuldu ve MTT testi kullanılarak sonuçlar
değerlendirildi. Bu çalışma da, selekoksibin tek başına kullanımının hücre canlılığı
üzerinde doza ve hücre hatlarına bağlı olarak farklı etkileri olduğu ortaya konuldu.Özellikle yüksek COX-2 ifadesine sahip P114 ve MDA-MB-231 hücre hatlarında 72
saat süreyle 50 µM selekoksib uygulaması tümör hücresi proliferasyonunu sırasıyla %
60 ve %55 azalttığı gösterildi. Ancak düşük COX-2 ifadesine sahip CMT-U309 hücre
hattında düşük doz selekoksib uygulamasının antiproliferatif etki göstermediği
görüldü. Doksorubisinin 25,50,75 ve 100 µM'lık selekoksib ile yapılan tüm
kombinasyonlarında 24, 48 ve 72 saat sonrasında hücre canlılığını, tek başına
doksorubisin uygulanan gruba göre önemli ölçüde azalttığı görüldü. Buna karşılık,
siklofosfamidin 25,50 ve 75 µM selekoksib ile kombinasyonunda CMT-U27, CMTU309, P114 ve MDA-MB-231 hücre hatlarının hepsinde, hücre canlılığı tek başına
siklofosfamid uygulanan gruba göre daha yüksek bulundu. Sonuç olarak, doksorubisin
ile COX-2 selektif inhibitörü selekoksib kombine kullanımı ile in-vitro koşullarda
meme kanseri hücrelerinde önemli düzeyde antitümöral etkinlik şekillendiği, bu
etkinin her iki ilacın tek başına kullanıldıklarında görülen etkinlik seviyelerine göre
additif özellik gösterdiği ve artan selekoksib dozu ile doğru orantılı olduğu ortaya
konulmuştur. Bu araştırmada elde edilen önemli sonuçlardan bir diğeri ise yüksek
COX-2 ifadesine sahip meme tümör hücrelerinde, selekoksib uygulaması ile düşük
COX-2 ifadesi gösteren meme tümör hücrelerine göre 24, 48 ve 72'nci saatlerde daha
yüksek antitümöral etkinlik elde edilebileceğinin gösterilmesidir. Bu çalışma,
doksorubisin ve selekoksib kombinasyonunun antitümöral etkisini destekler
nitelikteyken, selekoksib ve siklofosfamid kombinasyonunun farklı sonuçlar
doğurabileceğini göstererek ilaç kombinasyonlarının karmaşıklığını ortaya
koymaktadır.

Abstract:
Mammary cancer in dogs and cats accounts for 52% of all cancer cases. Due to the
molecular, histological, clinical and epidemiological similarities between canine
mammary tumours and human breast cancer, comparative studies on diagnosis,
pathogenesis and treatment are ongoing. Cancer cell lines are successfully used as an
in-vitro model to study cancer biology, reveal molecular pathways, and test the
efficacy of anticancer drugs. One of the current topics in breast cancer is the treatment
strategies combining cyclooxygenase (COX) activity with non-steroidal
antiinflammatory drugs and standard chemotherapy in COX-2-expressing tumours.
The main aim of this study was to investigate whether higher antitumoural efficacy
can be obtained by combining the selective COX-2 inhibitor celecoxib with
doxorubicin or cyclophosphamide in COX-2 expression positive human and canine
mammary tumour cell cultures and whether there is a correlation between COX-2
expression levels of tumour cells and antitumoural efficacy of celecoxib. In the study,
CMT-U27 (dog), P114 (dog), MDA-MB-231 (human) and CMT-U309 (dog) breast
tumour cell lines with high COX-2 expression and low COX-2 expression were seeded
in 96-well plates with 200 cells per well for RealTime-Glo™ MT and 7x103 cells per
well for MTT assay and 17 different study groups were formed. These groups were,
respectively, mammary tumour control, mammary tumour vehicle control, 25 µM
celecoxib, 50 µM celecoxib, 75 µM celecoxib, 100 µM celecoxib, cyclophosphamide
(IC50 dose), cyclophosphamide+25 µM celecoxib, cyclophosphamide+50 µM
celecoxib, cyclophosphamide+75 µM celecoxib, cyclophosphamide+100 µM
celecoxib, doxorubicin (IC50 dose), doxorubicin+25 µM celecoxib, doxorubicin+50
µM celecoxib, doxorubicin+75 µM celecoxib, doxorubicin+100 µM celecoxib group.
At the 24th-hour of incubation, the first application of celecoxib and chemotherapeutic
agents was performed and 24th and 48th hour findings were evaluated by RealTimeGlo™ MT. For 72nd-hour findings, the same groups were formed and the results were
evaluated using MTT assay. This study demonstrated that the use of celecoxib alone
had different effects on cell viability depending on the dose and cell lines. Especially
in P114 and MDA-MB-231 cell lines with high COX-2 expression, 50 µM celecoxibtreatment for 72 hours decreased tumour cell proliferation by 60% and 55%,
respectively. However, in CMT-U309 cell line with low COX-2 expression, low dose
celecoxib application did not show antiproliferative effect. All combinations of
doxorubicin with 25, 50, 75 and 100 µM celecoxib significantly decreased cell
viability after 24, 48 and 72 hours compared to doxorubicin alone. On the other hand,
in the combination of cyclophosphamide with 25, 50 and 75 µM celecoxib, cell
viability was higher in CMT-U27, CMT-U309, P114 and MDA-MB-231 cell lines
compared to cyclophosphamide alone. In conclusion, it was demonstrated that the
combined use of doxorubicin and COX-2 selective inhibitor celecoxib resulted in
significant antitumoural activity in mammary cancer cells under in-vitro conditions,
this effect was additive compared to the activity levels seen when both drugs were
used alone and was directly proportional to the increasing dose of celecoxib. Another
important result obtained in this study is the demonstration that higher antitumoural
activity can be obtained at 24, 48 and 72 hours in breast tumour cells with high COX-
2 expression compared to breast tumour cells with low COX-2 expression with
celecoxib administration. While this study supports the antitumoural effect of
doxorubicin and celecoxib combination, it reveals the complexity of drug
combinations by showing that the combination of celecoxib and cyclophosphamide
may produce different results.