İndüklenmiş mezenşimal kök hücrelerden elde edilen eksozomların in vitro yara modelinde iyileşme üzerine etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of exosomes obtained from induced mesenchymal stem cells on healing in in vitro wound model
Yazar: ELİF HATİCE AYTEN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ESİN AKBAY ÇETİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Fizyoloji = Physiology

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, UV ışığı ile indüklenmiş ve indüklenmemiş adipoz ve kemik iliği türevli mezenşimal kök hücre (MKH) eksozomlarının iki ve üç boyutlu yara modellerindeki iyileşme potansiyelleri tartışılmıştır. Bu amaçla, adipoz doku kaynaklı (AK) ve kemik iliği kaynaklı (Kİ) MKH'ler üzerinde farklı dozlarda (10, 25, 50, 100 ve 200 mJ/cm2) UV-B uygulaması yapılmıştır. Hücre canlılığı analizi için MTT yöntemi ve hücre ölümünü göstermek için Akridin Turuncusu / Propidyum İyodür ikili boyama yöntemi kullanılmıştır. Yapılan bu analizler sonucunda hücreler üzerinde toksik olmayan en uygun UV-B dozunun 25 mJ/cm2 olduğu tespit edilmiştir. Seçilen UV-B dozunun uygulandığı ve uygulanmadığı MKH'lerden eksozom izolasyonları yapılmıştır. Elde edilen eksozomların çeşitli yöntemlerle karakterizasyonları gerçekleştirilmiş, ardından içerdikleri büyüme faktörleri ve sitokin (IL-6, PDGF-BB, VEGF-A, TGF-Ꞵ) seviyelerinin tespiti için Elisa analizleri gerçekleştirilmiştir. İn vitro iki ve üç boyutlu yara modellerinin oluşturulması için, öncelikle insan keratinosit (HaCaT) ve insan fibroblast (HDF) hücre hatları çoğaltılmıştır. İki boyutlu yara modeli oluşturmak için fibroblast ve keratinosit hücreleri ko-kültürlendikten sonra 'çizik yara modeli' oluşturulmuş ve elde edilen eksozomların farklı dozları (1, 5 ve 10 µg/ml) yara modeline uygulanmıştır. Hücre proliferasyonu takibi için 12, 24, 36 ve 48. saatlerde Alamar Blue analizi, yara kapanma miktarı analizi için ise inverted mikroskop ile çekilen fotoğraflar üzerinden Image J programı kullanılarak ölçümler yapılmıştır. Çizik testi sonuçlarına göre AKMKH eksozomlarından yara iyileşme analizlerindeki en etkin dozun 10 µg/ml, KİMKH eksozomlarında ise 5 µg/ml olduğu sonucuna varılmıştır.  Son olarak, üç boyutlu yara modeli için, transwell sistemde 'Hava-Sıvı Arayüzü' yöntemi ile önce deri modeli sonrasında yaralar oluşturulmuştur. Üç boyutlu yara modellerine uygulanan eksozom dozları, çizik yara modeli sonuçlarından elde edilen dozlar olmuştur. Bu modelde iyileşme aşamalarının incelenmesi için histolojik kesitlerden Image J ile rastgele alınan ölçümlerden iyileşme oranları elde edilmiştir. Sonuçlar iki boyutlu modeli destekler nitelikte bulunmuştur. Özellikle UV'li AKMKH eksozomlarının 10 µg/ml dozunda en yüksek yara kapanması gözlenirken, negatif kontrol grubunda en düşük yara kapanma oranı gözlenmiştir. 
Sonuç olarak, UV-B ile indüklenen MKH eksozomlarının hem iki boyutlu hem de üç boyutlu in vitro yara modellerinde iyileşme üzerindeki potansiyellerinde artış olduğu görülmüştür. UV ışığının MKH eksozomları üzerindeki etkilerinin daha detaylı incelenmesi için moleküler düzeyde analizler ile yara iyileşmesindeki etkisinin incelenebilmesi için in vivo deneyler yapılması bu alandaki çalışmalara ışık tutacaktır.

Abstract:
The presented thesis discusses the healing potentials of UV light-induced and uninduced adipose and bone marrow-derived mesenchymal stem cell (MSC) exosomes in two- and three-dimensional wound models. For this purpose, different doses of UV-B (10, 25, 50, 100, and 200 mJ/cm2) were applied to MSCs originating from adipose tissue (AD) and bone marrow (BM). MTT method was used for cell viability analysis and Acridine orange / Propidium iodide dual staining method was used to show cell death. As a result of these analyses, it was determined that the most suitable non-toxic UV-B dose on cells was 25 mJ/cm2. Exosome isolations were made from MSCs to which the selected UV-B dose was applied or not. The exosomes obtained were characterized by various methods, and then ELISA analyses were performed to determine the growth factors and cytokine (IL-6, PDGF-BB, VEGF-A, TGF-Ꞵ) levels they contain. Firstly, human keratinocyte (HaCaT) and human fibroblast (HDF) cell lines were amplified to create in vitro two- and three-dimensional wound models. After co-culturing the fibroblast and keratinocyte cells to create a two-dimensional wound model, a 'scratch wound model' was created and different doses (1, 5, and 10 µg/ml) of the obtained exosomes were applied to the wound model. For cell proliferation monitoring, Alamar Blue analysis at 12, 24, 36, and 48 hours, and for wound closure analysis, measurements were made on photographs taken with an inverted microscope using the Image J program. According to the results of the scratch assay, it was concluded that the most effective dose in wound healing analyses from ADMSC exosomes was 10 µg/ml, and 5 µg/ml in BMMSC exosomes. Finally, for the three-dimensional wound model, first, the skin model and then the wounds were created with the 'Air-Liquid Interface' method in the transwell system. The exosome doses applied to the three-dimensional wound models were the doses obtained from the scratch wound model results. In this model, recovery rates were obtained from measurements taken randomly with Image J from histological sections to examine the healing stages. The results were found to support the two-dimensional model. In particular, the highest wound closure was observed at 10 µg/ml of UV-induced ADMSC exosomes, while the negative control group had the lowest wound closure rate.
In conclusion, it was observed that UV-B-induced MSC exosomes have increased potential for healing in both two-dimensional and three-dimensional in vitro wound models. In order to examine the effects of UV light on MSC exosomes in more detail, molecular level analyses and in vivo experiments to examine its effect on wound healing will shed light on the studies in this field.