Pichia kudriavzevii JD2 maya suşunun bazı probiyotik özelliklerinin ve suştan izole edilen ekzopolisakkaritin prebiyotik aktivitelerinin belirlenmesi
Determination of some probiotic properties of Pichia kudriavzevii JD2 yeast strain and the prebiotic activities of exopolisacharitin isolated from the strain
Yazar: JAAFAR NOZAD AAKEF AAKEF
Danışman: PROF. DR. ZEHRANUR YÜKSEKDAĞ
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Probiyotik mayalar, sağlığı teşvik edici ve biyo-terapötik etkiler, nutrasötik yetenekler ile geliştirilmiş gıda kalitesi ve güvenliği dahil olmak üzere birçok önemli potansiyele sahiptir. Bu çalışmada, hurmadan izole edilen Pichia kudriavzevii JD2 suşundan elde edilen ekzopolisakkaritler (EPS), hücresiz süpernatanlar (CFS) ve kültür filtratlarının in vitro etkileri araştırılmıştır. Suşun EPS üretim yetenekleri fenol-sülfürik asit yöntemine göre belirlenmiştir. Suş, liyofilize EPS "prebiyotik" olarak etiketlenmiş ve "EPSJD2" kodu ile çalışmalarda kullanılmıştır. Araştırmada, probiyotik (JD2) ve prebiyotik (EPSJD2) suşlarının farklı konsantrasyonlarda safra içeren ortamlarda kolesterolü giderimi (sırasıyla %62 ve %65) ve presipitasyonu (sırasıyla 38,2 ve 41,2 μg/mL) yeteneğine sahip oldukları gözlenmiştir. Pichia kudriavzevii JD2 suşu, hekzon solventinde %85, polar nötral çözücü toluen %79 ve monopolar bazik çözücü aseton %73 hidrofobik aktivite göstermiştir. Maya probiyotiği (JD2) yapay bağırsak sıvısında 0 dakika ve %0,06 safra konsantrasyonunda (5,95 log cfu/mL) en yüksek canlılık göstermiş ve suşun 1 ve 240 dakika inkübasyonları ile canlı hücre sayısında azalma olduğu gözlenmiştir. Suşun, inkübasyondan 60 ve 180 dakika sonra pH 3'te yapay mide sıvısında canlı hücre sayısı sırasıyla; 5,48 ve 4,98 log cfu/mL olarak tespit edilmiştir. Liyofilizasyon sonrası suşun toplam EPSJD2 miktarı 246 mg/L, molekül ağırlığı 94454 kDa olarak belirlenmiştir. Suşun, EPS'sinin HPLC, NMR ve SEC analizleri ile glikoz yapısında ve hidrojen kimyasal kayma değerlerinin genel olarak üç bölgeye ayrıldığı karakterize edilmiştir. L. plantarum subsp plantarum DSM20246, 24 ve 48 saatte sırasıyla 1,33 ve 2,44 log cfu/mL prebiyotik aktivite skoru gösterirken, S.cerevisiae BU19, 48 saatte 1,17 log kob/mL prebiyotik aktivite skoru göstermiştir. EPSJD2'nin en yüksek hidrolizi, 3 saatlik inkübasyonun ardından pH 3'te mide suyunda %4,88 olarak tespit edilmiştir. Hücresiz süpernatantda (CFSJD2) HPLC ve GC analizi sonucunda farklı türde amino ve yağ asitleri, fenoller, vitaminler ve şekerler içerdiği bulunmuştur. Prebiyotik (EPSJD2), L. plantarum subsp. plantarum DSM20246 ve S. cerevisiae BU19'un fermantasyon kapasitesi sırasıyla 6,4 ve 7,6 log CFU/mL, ticari inülinde ise sırasıyla 6,0 ve 6,4 log CFU/mL olarak belirlenmiştir. Çalışmada, üç farklı metot (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), süperoksit anyon ve hidroksil radikalini süpürücü aktivitesi) probiyotik ile (JD2), postbiyotik (CFSJD2), farklı konsantrasyonlarda (0,5, 1, 5, 10 mg/mL) prebiyotik (EPSJD2), sinbiyotik (JD2+EPSJD2), postbiyotik+prebiyotik (CFSJD2+EPSJD2) uygulamanın, bitkisel kaynaklı ticari prebiyotik inülinin ve pozitif kontrol olarak askorbik asidin antioksidan aktiviteleri tespit edilmiştir. Sonuçlar genel olarak değerlendirildiğinde, en yüksek antioksidan aktivite DPPH metodunda 10 mg/mL'lik CFSJD2+EPSJD2 (postbiyotik+prebiyotik) uygulamasında %86,6, en düşük aktivite ise süperoksit anyon radikali süpürücü aktivitesi metodunda 0,5 mg/mL'lik EPSJD2'de %44,2 olarak bulunmuştur. Deneyler, DPPH radikal süpürme aktivitesi, süperoksit anyon radikal süpürme aktivitesi ve hidroksil radikal süpürme aktivitesi dahil olmak üzere inülinin antioksidan aktivitelerinin, araştırmada incelenen tüm uygulamalara kıyasla zayıf olduğunu göstermiştir (p<0,05). Biyofilm inhibisyon oranları, artan prebiyotik konsantrasyonu (EPSJD2) ile artmıştır. Escherichia coli için en yüksek anti-biyofilm aktivite 10 mg/mL konsantrasyonda postbiyotik+prebiyotik uygulamada olmuştur. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda EPSJD2'nin prebiyotik olarak kullanılma potansiyeline sahip olduğu düşünülmüştür.

Abstract:
Probiotic yeasts as promising cellular factories and transporters of nutrients have several pivotal potentials including health-promoting and bio-therapeutic effects, nutraceutical capabilities and improved food quality and safety. Therefore, this study aims to investigate the in vitro effects of using exopolysaccharides (EPS), cell-free supernatants (CFS) and culture filtrates obtained from Pichia kudriavzevii JD2 strain isolated from dates. EPS production capacities of the strain was determined according to the phenol-sulphuric acid method and lyophilized EPS was labeled "prebiotic" and used in studies with code "EPSJD2". The study revealed the ability of the used probiotics (JD2) and prebiotics (EPSJD2) to remove and precipitate cholesterol in a medium containing different concentrations of bile. The highest cholesterol removal (62% and 65%, respectively) and precipitation activity (38.2 and 41.2 μg/mL, respectively) were determined in a bile-free dietary medium. The strain Pichia kudriavzevii JD2 showed higher hydrophobic activity in the acidic chloroform solvent (79%) compared to the neutral solvent p-xylanene (63%) and the base solvent ethyl acetate (71%). As well as the yeast probiotic (JD2) showed the highest viability in artificial intestinal fluid at 0 min and 0.06% bile concentration (5.95 log cfu/mL), with a decrease in the number of viable cells at 1 and 240 min after incubation. While the number of viable cells in artificial gastric juice at pH 3 was (5,48, 4,98 log cfu/mL, respectively) after 60 and 180 minutes of incubation. The total amount of EPSJD2 after lyophilization was determined to be 246 mg/L, and characterized by HPLC, NMR, and SEC analyses. Its molecular weight was 94454 kDa. The hydrogen chemical shift values in the glucose structure are generally divided into three regions. The yeast cell-free suspension (CFSJD2) was also characterized by HPLC and GC analysis, and it was found to contain different types of amino and fatty acids, phenols, vitamins and sugars. The study also revealed the activities of the applications of probiotics (JD2), prebiotics (EPSJD2) at different concentrations (0.5, 1, 5 and 10 mg/mL), postbiotics (CFSJD2/CFSJD2+EPSJD2) and synbiotics (JD2+EPSJD2) as antioxidants and antibiofilms. The highest radical removal effect DPPH method was found in 10 mg/ml of postbiotic+prebiotic application (86.6%), while the highest superoxide removal anion and hydroxyl radical was obtained at the same concentration in the synbiotic application (78.4 and 74.4%, respectively). Biofilm inhibition rates increase with increasing concentration of prebiotics (EPSJD2). The highest anti-biofilm for Escherichia coli was at a concentration of 10 mg/mL in postbiotic+prebiotic application. As well as, the highest fermentation capacity of EPSJD2 was obtained in S. cerevisiae BU19 (7.6 log kob/mL), and the highest growth regulating effect of CFSJD2 was also obtained in S. cerevisiae BU19 (8.7 log kob/mL). The strain L. plantarum subsp. plantarum DSM20246 had the highest activity of the prebiotic scores at (1.33 and 2.44 log CFU/mL) at 24 and 48 hours, respectively, while the activity of the yeast S. cerevisiae BU19 prebiotic scores was at 48 hours (1.17 og kob/mL). The highest hydrolysis of EPSJD2 was detected in gastric juice (4.88%) at pH 3 after 3 hours of incubation. It was suggested that EPSJD2 obtained from Pichia kudriavzevii JD2 has the potential to be used as a prebiotic.