Sığırlarda patojen leptospira türlerinin gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile saptanması
Determination of pathogenic leptospira species using real time polymerase chain reaction (PCR)
Yazar: ALİ SERDAR
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM BÜYÜKTANIR YAŞ
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Genler = Genes ; Hayvan hastalıkları = Animal diseases ; Leptospira = Leptospira ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Patojenler = Pathogens ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sığırlar = Cattles ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Amaç: Sığırlarda Leptospira hastalığına neden olan patojen Leptospira türlerinin sığır
kan serumlarından lipL32 ve lfb1 genlerine dayalı kantitatif gerçek zamanlı Polimeraz
Zincir Reaksiyonu (qRT-PZR) tekniğiyle saptanması amaçlandı.

Materyal ve Metot: Bu çalışmada, Kars ili ve çevresinde abort yapmış 64 inek kan
serum örneği ve Samsun ili Tekkeköy ilçesinde bulunan mezbahanede kesilen sağlıklı
sığırlardan alınan 25 adet kan örneği olmak üzere toplam 89 örnek kullanıldı. Serum ve
kan örneklerine ait genomik DNA'lar kalıp olarak kullanılarak, lipL32 ve lfb1 genleri
qRT-PZR ve konvansiyonel PZR yöntemleri ile çoğaltıldı. Referans L. hardjo ve L.
grippotyphosa serovarlarına ait DNA'lar pozitif kontrol, L. biflexa serovarına ait DNA
negatif kontrol olarak kullanıldı. PZR koşulları optimize edildi ve qRT-PZR ürünlerinin
saptanma limiti belirlendi. DNA örneklerinin qRT-PZR'de elde edilen Ct değerlerine
göre sonuçlar değerlendirildi ve pozitif örnekler DNA elektroforezinde doğrulandı.

Bulgular: Kan serum örneklerine ait DNA'larda lipL32 ve lfb1 genlerini hedefleyen
qRT-PZR analizi sonucunda, MAT pozitif bulunan toplam 27 kan serumunun 14'ü
(%51,85) lipL32 ve/veya lfb1 genlerine dayalı gerçek zamanlı PZR ile pozitif, 13'ü
(%48,15) negatif olarak belirlendi. MAT negatif bulunan 37 serumdan 1'i (%2,7) lipL32
geni pozitif, 1'i (%2,7) hem lipL32 hem de lfb1 genleri pozitif, 35'i (%94,6) negatif
bulundu. Mezbahane kan örneklerinde pozitiflik belirlenmedi. qRT-PZR testinin
sensitivitesi %51,85, spesifitesi %94,6 olarak hesaplandı. Hedef DNA'ların saptanma
limitleri analizleri testin analitik sensitivitesinin yüksek olduğunu gösterdi. Patojen ve
apatojen Leptospira serovarları ve farklı bakteri türlerinin uygulanması sonucunda testin
analitik spesifitesinin yüksek olduğu saptandı.

Sonuç: Abort yapmış sığır kan serumlarında patojen Leptospira türlerinin varlığı MAT
ile karşılaştırmalı olarak spesifik lipL32 ve lfb1 genlerine dayalı qRT-PZR tekniğiyle
belirlendi. Bu tekniğin Leptospirozis tanısında kullanılabilir olduğu benzer çalışmalarda
olduğu gibi ortaya kondu.
Anahtar Kelimeler: Leptospirozis; lipL32; lfb1; qRT-PZR

Abstract:
Aim: It was aimed to detect the pathogenic Leptospira species that cause Leptospirosis
in cattle from cattle blood sera by quantitative real-time Polymerase Chain Reaction
(qRT-PZR) technique based on lipL32 and lfb1 genes.

Material and Method: In this study, a total of 89 samples constituted of 64 blood sera
from aborted cows from Kars province and the surrounding regions and 25 blood
samples taken from healthy cows in a slaughterhouse located in the district of Tekkeköy
in Samsun province were used. Genomic DNAs extracted from blood and blood serum
samples were used as the template and lipL32 and lfb1 genes were amplified by qRTPCR
and conventional PCR methods. DNA's from reference L. hardjo and L.
grippotyphosa serovars were used as positive control, L. biflexa DNA was used as
negative control. PCR conditions were optimized and detection limit of qPCR products
were defined. The results were evaluated according to Ct values of qRT-PCR and the
positive samples were confirmed by DNA electrophoresis.

Results: As a result of the qRT-PCR analysis of DNA from the blood sera, 14 (51.85%)
out of 27 MAT-positive blood sera were found positive based on lipL32 and / or lfb1
genes, 13 (48.15%) of them were negative. From MAT negative sera, 1 sample (2.7%)
was lipL32 gene positive, 1 (2.7%) was both lipL32 and lfb1 genes positive, 35(94.6%)
of the samples were negative. Positivity was not determined from slaughterhouse blood
samples. Sensitivity and specificity of qRT-PCR test were calculated as 51.85% and
94.6% respectively. Analytical sensitivity of the test was found high based on limit of
detection of target DNAs. Analytical specificity of the test was high by evaluation of
pathogen and apathogen Leptospira serovars and different bacteria species.

Conclusion: In conclusion, the presence of pathogen Leptospira species in blood serum
samples from aborted cattle were determined by qRT-PCR targeting lipL32 and
lfb1genes. The potential use of this technique for Leptospirosis diagnosis was presented
as shown in previous studies.

Keywords: Leptospirosis; lipL32; lfb1; qRT-PCR