Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinde PKNOX2 proteinin ATM ve RNF8 ile etkileşimlerinin incelenmesi
Investigation of PKNOX2 protein interactions with ATM and RNF8 in bone marrow derived mesenchymal stem cells
Yazar: NESLİHAN DÖNMEZ
Danışman: PROF. DR. AYŞEN ÖZCAN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: DNA hasarı = DNA damage ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Kemik iliği = Bone marrow ; Kök hücreler = Stem cells ; Proteomikler = Proteomics

Özet:
Son araştırmalar transkripsiyon faktörü PKNOX2'nin tümör baskılayıcı bir protein olduğunu ve Fanconi anemisi hastalarının kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinde (Kİ-MKH'lerinde) azaldığını göstermiştir. Günel-Özcan grubunun yayınlanmamış çalışmasında PKNOX2 ko-immunopresipitasyon sonrası proteom analiz listesinde PKNOX2'nin etkileştiği proteinler arasında ATM ve RNF8 proteinlerinin düşük 'coverage' değeri ile saptanmış olması PKNOX2'nin DNA onarım yolağında rol oynayabileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmanın amacı bu hipotezi test etmek için, PKNOX2 proteini ile ATM ve RNF8 proteinlerinin etkileşimini doğrulamak ve bu etkileşimin DNA hasarı ile durumunu Kİ-MKH'lerinde araştırmaktı. Etkileşimlerin doğrulanması için Kİ-MKH'lerine PKNOX2 overekspresyon plazmidi elektroporasyon ile aktarıldı ve protein izolasyonu sonrası, ko-immunopresipitasyon ve Western blotlama yapıldı.  Ko-IP sonrası Western Blot analizleriyle PKNOX2 ile ATM etkileşimi doğrulanırken, IgG heavy chain kirliliği olabileceği değerlendirmesi PKNOX2 ile ATM veya RNF8 etkileşiminin varlığı in situ proximity ligation assay (PLA) ile gerçekleştirilmiştir. PLA yöntemiyle bu etkileşimlerin hem sitoplazma hem çekirdek içinde olduğu saptanmıştır. DNA hasarı durumunda etkileşimleri incelemek için ɣ-irradiye edilen Kİ-MKH'lerde DNA hasarı oluştuğu akım sitometri yöntemiyle doğrulanmıştır. PI boyaması ile yapılan akım sitometri analizlerinde hücre döngüsü piklerinde keskin ayrışma olmadığından kesin sonuca varılamamakla birlikte DNA hasarına uğrayan hücrelerin G2 fazında tutuklandığı bulunmuştur. ɣ-irradyasyon ile DNA hasarına uğrayan hücrelerde PLA, PKNOX2 ile ATM etkileşimini gösterememiştir ancak PKNOX2-RNF8 etkileşimi artmıştır.  Sonuç olarak PKNOX2 transkripsiyon faktörünün ATM ve RNF8 ile etkileştiği literatürde ilk kez olarak gösterildi. DNA hasarı ile etkileşimlerdeki değişim daha ileri çalışmalar ile doğrulanmalıdır.

Abstract:
Recent research has shown that the transcription factor PKNOX2 is a tumor suppressor protein and decreases in bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) of Fanconi anemia patients. In the previous unpublished study of Günel-Özcan Group, it was suggested that PKNOX2 may play a role in the DNA repair pathway due to the low 'coverage' of ATM and RNF8 proteins in the proteome analysis list obtained after PKNOX2 co-immunoprecipitation. The aim of this study was to confirm the interaction of PKNOX2 protein with ATM and RNF8 proteins in order to investigate the DNA damage and status of this interaction in BM-MSCs. To confirm the interactions, the PKNOX2 overexpression plasmid was transferred to BM-MSCs by electroporation, protein isolation was performed from these cells and, co-immunoprecipitation and Western blotting were performed. While PKNOX2 and ATM interaction was confirmed by Western Blot analysis after co-IP, PKNOX2 and ATM or RNF8 interactions was also confirmed by in situ proximity ligation assay (PLA) due to IgG heavy chain contamination possibility. These interactions were determined by PLA method both in the cytoplasm and in the nucleus. In order to examine the changes in the interactions with DNA damage, DNA damage was detected by flow cytometry in ɣ-irradiatiated. In the flow cytometry analyses performed with PI staining, it was thought that the cells damaged DNA were arrested in the G2 phase, although it was not possible to conclude that there was no sharp dissociation in the cell cycle peaks. In situ proximity ligation assay did not detect PKNOX2 and ATM interaction in ɣ-irradiated cells but increase in PKNOX2-RNF8 interaction was observed. In conclusion, it was shown for the first time in the literature that PKNOX2 transcription factor interacts with ATM and RNF8. Changes in interactions with DNA damage should be confirmed by further studies.