E vitamininin sıçan C6 glioma hücreleri üzerindeki apoptoz indükleyici etkisi
Apoptosis inducing effect of vitamin E on rat C6 glioma cells
Yazar: ZEYNEP OKTAY
Danışman: PROF. DR. NAZLI ARDA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
E vitamininin çeşitli analogları ve türevleri destekleyici kanser tedavisinde kullanılmaktadır. E vitamininin antioksidan aktiviteye ek olarak, anti-karsinojenik etkiye de sahip olduğu bildirilmektedir. Anti-karsinojenik etkisini apoptozu indükleyerek ve/veya proliferasyonu baskılayarak gösterdiği öne sürülmektedir.?Programlı hücre ölümü? olarak tanımlanan apoptoz, son yıllarda önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Özellikle kanser hücrelerinin farklı ilaçlar ve ajanlarla apoptoza yönlendirilebildiğinin anlaşılması, kanser tedavisine ilişkin yeni yöntemlerin geliştirilmesi açısından çok önemlidir. Dolayısıyla E vitamininin kanser hücreleri üzerindeki apoptoz indükleyici etkisi çok önemlidir. Bir E vitamini türevi olan ? -tokoferol süksinat ( ? -TOS)'ın apoptoz indükleyici etkisi, kolon, mide, karaciğer ve meme kanseri gibi farklı tipte kanser hücreleri üzerinde araştırılmış, ancak glioma hücrelerinde bugüne kadar floresan mikroskopisine ve kaspaz enzim aktivitesi tayinine dayalı hiçbir çalışma yürütülmemiştir.Bu çalışmada ? -TOS'un apoptoz indükleyici etkisi, sıçan C6 glioma hücrelerinde araştırıldı. Hücrelere farklı inkübasyon süreleri (24, 32, 40 ve 48 saat) boyunca ? -TOS'un 5 farklı konsantrasyonu (10, 30, 50, 70 ve 100 ?M) uygulandı. Hücrelerde apoptozla ilişkili morfolojik değişimler Hoechst boyaması ile floresan mikroskobunda incelendi ve mikroskobik canlı video kaydı ile görüntülendi. Hücre ölümü, apoptozun kilit (son) enzimi kaspaz-3'ün aktivitesi ölçülerek moleküler düzeyde doğrulandı. Bu analizlere ek olarak, hücrelerde mitokondriyal apoptotik yolağın göstergesi olan kaspaz-9 aktivitesi ölçüldü.10 ve 30 ?M ? -TOS uygulamalarının denenen hiçbir inkübasyon süresinde apoptozu indüklemediği gösterildi. Denenen dozlar içinde 50, 70 ve 100 ?M ? -TOS'un 40 ve 48 saatlik uygulamalarda, hücreleri apoptoza götürdüğü belirlendi. Bunun yanı sıra 48 saat süreyle 50 ?M ? -TOS uygulanmış hücrelerde meydana gelen apoptoz, mikroskobik canlı video kaydı ile elde edilmiş gerçek zamanlı görüntülerle izlendi.Kaspaz-3 aktivitesi 100 ?M-32 saat, 50 ?M-40 saat, 70 ?M-40 saat, 100 ?M-40 saat, 50 ?M-48 saat, 70 ?M-48 saat ve 100 ?M-48 saatlik örneklerde kontrolün, sırasıyla 8.5, 5, 6.6, 4, 3.15, 4.65, 1.13 katı olarak belirlendi. Kaspaz-9 aktivitesi, 100 ?M-32 saat, 50 ?M-40 saat, 70 ?M-40 saat, 100 ?M-40 saat, 50 ?M-48 saat, 70 ?M-48 saat ve 100 ?M-48 saatlik örneklerde kontrolün, sırasıyla 1.18, 1.10, 2.09, 5.62, 1.67, 7.23 ve 12.63 katı olarak belirlendi.Sonuç olarak, ? -TOS'un sıçan C6 glioma hücrelerinde doza ve zamana bağlı olarak apoptozu indüklediği ve mitokondriyal apoptotik yolağın göstergesi kaspaz-9 enzimini aktive ettiği ortaya konuldu.

Abstract:
Several vitamin E analogues and derivatives are used in adjuvant cancer therapy. In addition to antioxidant activity, anti-carcinogenic effect of vitamin E is reported. It is suggested that it shows anti-carcinogenic effect by inducing apoptosis and/or inhibiting proliferation.Apoptosis, which is defined as ?programmed cell death?, has become an important research area in recent years. Particularly, the understanding of cancer cells? inducibility to apoptosis by various drugs and agents is very important for developing new methods related to cancer therapy. Thus, apoptosis inducing effect of vitamin E on cancer cells is quite important. Apoptosis inducing effect of alpha-tocopherol succinate (?-TOS), a derivative of vitamin E, has been investigated on several cancer cells, such as colon, gastric, liver and breast cancer cells, but no study has been performed on glioma cells, so far.In this study, the apoptosis inducing effect of ?-TOS on C6 rat glioma cells was investigated. The cells were treated with 5 different concentrations (10, 30, 50, 70 and 100 ?M) of ?-TOS for different (24, 32, 40 and 48 hours) incubation periods. Morphological changes related to apoptosis in the cells were detected with Hoechst staining in fluorescence microscopy and monitored by live cell imaging. Cell death was verified on molecular basis by measuring caspase-3, key enzyme of apoptosis, activity. In addition to these analyses, caspase-9 activity as a marker of intrinsic apoptotic pathway in the cells was measured.It has been shown that 10 and 30 ?M ?-TOS did not show any apoptotic effect for non of tested incubation periods. Apoptosis was detected in the cells, which treated with 50, 70 and 100 ?M ?-TOS for 40 hours and 48 hours. In addition, apoptosis in the cells, which treated with 50 ?M ?-TOS for 48 hours was shown on the real-time images recorded with live cell imaging.Caspase-3 activity was 8.5, 5, 6.6, 4, 3.15, 4.65 and 1.13 fold of control in the 100 ?M-32 h, 50 ?M-40 h, 70 ?M-40 h, 100 ?M-40 h, 50 ?M-48 h, 70 ?M-48 h and 100 ?M-48 h samples, respectively. Caspase-9 activity was 1.18, 1.10, 2.09, 5.62, 1.67, 7.23 and 12.63 fold of control in the 100 ?M-32 h, 50 ?M-40 h, 70 ?M-40 h, 100 ?M-40 h, 50 ?M-48 h, 70 ?M-48 h and 100 ?M-48 h samples, respectively.In conclusion ?-TOS was found to induce apoptosis in a dose- and time-dependent manner in C6 glioma cells and activate caspase-9 enzyme, a marker of mitochondrial apoptotic pathway.