Farklı kültür ortamlarında aromatik bileşiklerin bakteriyel lakkaz üretimi üzerine olan etkisinin gen ve protein seviyelerinde araştırılması
Investigation of the effect of and aromatic compounds on bacterial  laccase production in  different culture media at the gene and protein levels
Yazar: SELİNAY MERVE KILIÇ
Danışman: PROF. DR. MELDA ŞİŞECİOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Bacillus licheniformis = Bacillus licheniformis

Özet:
Amaç: Multi-bakır oksidazlar olarak da bilinen lakkazlar, fenolik-aromatik organik bileşikler
ile lignoselüloz yapılı maddeleri okside etme yeteneğine sahiptirler. Endüstriyel ve
biyoteknolojik kullanımları geniş ve yaygın olan bu enzimlerin bakteriyel kaynaklı
çalışmaları sınırlı olmakla birlikte gelişmeye açıktır. Farklı fermentasyon koşullarında ve
çeşitli çevresel şartlara yanıt olarak lakkaz üretiminin ve lakkaz gen ifadesinin artabileceği
literatürde belirtilmektedir. Bu tez çalışması kapsamında amaç; termofilik Bacillus
licheniformis SO7 suşu kullanılarak lakkaz üretimini artırmaya yönelik besiyeri ortamı
optimizasyonu ve ortama eklenen farklı aromatik bileşiklerin lakkaz enziminin protein
seviyesine ve gen ifadesine etkisinin belirlenmesidir.
Yöntem: B. licheniformis SO7 (GenBank NO: MG076977) suşu kullanılarak lakkaz enzimi
üretimini artırmaya yönelik farklı substrat kaynakları (ABTS, Guaiakol, Ferulik asit, Vanilik
asit, Kafeik asit, Nikotinik asit ve Siringik asit), farklı karbon kaynakları (Glikoz, Sükroz,
Fruktoz, Gliserol, Laktoz ve Maltoz), farklı azot kaynakları (Fish Pepton, Bacteriological
Pepton, Amonyum Sülfat, Üre, Maya Ekstraktı ve Malt Ekstraktı), farklı metal iyonları
(CuSO 4 , ZnCl 2 ve MnCl 2 ), gıda ve tarım atıkları (Mısır koçanı, Ceviz kabuğu, Havuç kabuğu,
Turp kabuğu, Patates kabuğu ve Kara Lahana kabuğu) kullanılarak, farklı pH (5,6,7,8 ve 9) ve
farklı sıcaklık (45ºC, 55ºC ve 65ºC) değerleri ile farklı inkübasyon sürelerinde (12, 24, 36,
48, 60 ve 72 saat) klasik optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Oluşturulan optimum koşullar
ile aromatik substratların ortamdaki varlıklarının lakkaz üretimini ne yönde etkilediği gen
ekspresyon seviyesinde qPCR, protein seviyesinde SDS-PAGE ile incelenmiştir.
Bulgular: Elde edilen kültür optimizasyon sonuçlarına göre B. licheniformis SO7 suşu ile en
yüksek lakkaz aktivitesinin belirlendiği koşullar; pH: 8, 55°C, 50 g/L Maltoz, 1 g/L Fish
Pepton, 2,5 mM Siringik asit, 1 mM ZnCl 2 ve 36. inkübasyon süresinden oluşan besi ortamı
ile Havuç kabuğu atığı içeren kültür ortamları olarak belirlenmiştir. Optimum koşulların sabit
tutulmasıyla yedi farklı substratı içeren yedi ayrı kültür ile havuç kabuğu içeren atık kültür
ortamlarının lakkaz gen ifade seviyeleri incelendiğinde Siringik asit içeren ortamın en yüksek
gen ifadesine sahip olan besi ortamı olduğu belirlenmiştir. Protein seviyeleri tüm ortamlar için
incelendiğinde birbirleri arasında jeldeki protein bant kalınlığı bakımından anlamlı bir fark
görülememiştir.
Sonuç: Bu tez kapsamında; bakteriyel lakkaz üretimi için en uygun ortam ve koşullar
araştırılmış ve ortama eklenen aromatik susbtratların lakkaz enzimini gen ifadesi seviyesinde
nasıl etkilediği araştırılmıştır. Elde edilen gen ekspresyon sonuçlarına göre; kültür ortamına
Siringik asit eklendiğinde hem lakkaz enzim aktivitesinin hem de gen ifadesinin arttığı
gösterilmiş ve bakteriyel lakkaz üretimi için kültür ortamına aromatik organik bileşiklerin
eklenmesinin lakkaz enzimi üretimini pozitif yönde indüklediği belirlenmiştir.

Abstract:
Purpose: Laccases, also known as multi-copper oxidases, could oxidize phenolic-aromatic
organic compounds and lignocellulose-structured materials. Although the studies on these
enzymes, which have wide and widespread industrial and biotechnological uses, are limited in
terms of bacterial origin, they are open to development. It is stated in the literature that
laccase production and laccase gene expression can increase in response to different
fermentation conditions and various environmental conditions. The aim of this thesis is to
optimize the nutrient medium to increase laccase production using the thermophilic B.
licheniformis SO7 strain and to determine the effect of different aromatic compounds added
to the medium on the protein level and gene expression of the laccase enzyme.
Method: B. licheniformis SO7 (GenBank NO: MG076977) strain was used to increase the
production of laccase enzyme using different substrate sources (ABTS, Guaiacol, Ferulic
acid, Vanillic acid, Caffeic acid, Nicotinic acid and Syringic acid), different carbon sources
(Glucose, Sucrose, Fructose, Glycerol, Lactose and Maltose), different nitrogen sources (Fish
Peptone, Bacteriological Peptone, Ammonium Sulfate, Urea, Yeast Extract and Malt Extract),
different metal ions (CuSO4, ZnCl2 and MnCl2), food and agricultural wastes (Corn cob,
Walnut shell, Carrot peel, Radish peel, Potato peel and Purple Cabbage peel), different
incubation periods with different pH (5, 6, 7, 8 and 9) and different temperature (45ºC, 55ºC
and 65ºC) values. Classical optimization studies were carried out at different times (12, 24,
36, 48, 60 and 72 hours). The optimum conditions and the effects of the presence of aromatic
substrates in the medium on laccase production were investigated by qPCR at the gene
expression level, SDS-PAGE at the protein level.
Findings: According to the culture optimization results obtained, the conditions in which the
highest laccase activity was determined with B. licheniformis SO7 strain were determined as
pH: 8, 55°C, 50 g/L Maltose, 1 g/L Fish Peptone, 2.5 mM Syringic acid, 1 mM ZnCl2 and 36
incubation time and culture media containing carrot peel waste. When the protein gene
expression levels of seven different cultures containing seven different substrates and culture
media containing carrot peel waste were examined by keeping the optimum conditions
constant, it was determined that the medium containing Syringic acid was the medium with
the highest gene expression. When the protein levels were examined for all media, no
significant difference was observed between them in terms of protein band thickness in the
gel.
Results: Within the scope of this thesis; the most suitable medium and conditions for
bacterial laccase production were investigated and how aromatic substrates added to the
medium affected the laccase enzyme at the level of gene expression was investigated.
According to the gene expression results obtained; It was shown that when Syringic acid was
added to the culture medium, both laccase enzyme activity and gene expression increased, and
it was determined that the addition of aromatic organic compounds to the culture medium for
bacterial laccase production positively induced the production of laccase enzyme.