Fusarium graminearum izolatlarının mitokondriyal DNA varyasyon analizi
Mitochondrial DNA variation analysis of fusarium graminearum isolates
Yazar: AYLİN GAZDAĞLI
Danışman: DOÇ. DR. GÜLRUH ALBAYRAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: DNA-mitokondrial = DNA-mitochondrial ; Mitokondriler = Mitochondria

Özet:
Bu yüksek lisans tez çalışmasında; filamentli mantarlardan biri olan Fusarium graminearum'un izolatları arasındaki filogenetik ilişki, mitokondri genlerinin çeşitliliği belirlenerek kuruldu. Bu amaçla Kore Cumhuriyeti'nden sağlanan 2 referans ırkla birlikte Türkiye ve İran'ın farklı coğrafi bölgelerinden saflaştırılmış 45 izolatın mitokondri genomunda kodlanan cox3, atp9, rnl ve nad2 genlerinin moleküler karakterizasyonu yapıldı. Genlerin özgün bölgeleri polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltıldıktan sonra Sanger yöntemine göre dizilendi. Elde edilen nukleotid dizilimleri CLUSTALW programı kullanılarak hizalandı ve kodlama bölgelerindeki mitokondri DNA (mtDNA) varyasyonları tarandı. İzolatlar arasındaki filogenetik ilişkiler maksimum olabilirlik (ML) ve maksimum sıkılık (MP) metotlarına göre hizalama verileri temel alınarak oluşturuldu. Ayrıca, kodlama bölgeleri ile ilişkili olan mutasyonların açık okunma çerçevesinde (ORF) neden olduğu varyasyonlar ORF-TARAMA ile analiz edildi. 
cox3 genine ait 527 bç'lik fragmentler 46 izolattan elde edildi. atp9'a ait 603 bç'lik ürünler 21 izolattan çoğaltılırken rnl'ye ait 1547 bç'lik amplikonlar 45 izolattan elde edildi. 44 izolatta nad2 genine ait beklenen tek bir ürün (5192 bç) yerine, boyutları 250 bç-5 kb arasında değişen polimorfik bantlar çoğaltıldı. Bu nedenle nad2 geni, varyasyon analizi çalışmasından çıkartıldı. cox3, atp9 ve rnl genlerine ait kısmi dizilimler hizalandıktan sonra, BLASTN analizi ile her üç gende de kodlama bölgelerinde transisyon ve transversiyon tipindeki tek nükleotid değişimlerine ek olarak delesyonlu ve insersiyonlu bölgelerin varlığı gösterildi. Mutasyonların çoğunlukla 1 kodonun değişimi ile sonuçlandığı, ayrıca çerçeve kaymasına yol açarak birden fazla kodonu de değiştirebileceği gösterildi. Nukleotid varyasyonlarının ML ve MP analizi izolatlar arasındaki filogenetik ilişkinin kurulmasını sağladı. Oluşturulan filogenetik ağaçlarda, izolatların uzaklıkları ile genlerde taşınan nukleotid varyasyonlarının uyumlu olduğu gösterildi. İzolatlar arasındaki benzerlik "neighbor-joining" (NJ) algoritması ile hesaplandı. Karakter ve mesafe temelli analizlerle elde edilen verilerin uyumlu olduğu da gösterildi. Ek olarak F. graminearum'un uniparental kalıtımı nuklear DNA'da (nDNA) taşınan MAT lokuslarının analizi ile ilişkilendirildi. Bu amaçla 47 izolatta MAT-1 idiomorfunun 210 bç boyutundaki α-kutu domeni ve MAT-2 idiomorfunun 260 bç boyutundaki HMG kutu domeni PZR ile çoğaltılarak gösterildi. 
Bu yüksek lisans tezi filogenetik ilişkinin mitokondri genlerinin dizilenmesi ile Fusarium türlerinde ortaya konması bakımından özgün değere sahiptir. Uygulanan metodoloji diğer fitopatojonlerin karakterizasyonunun yapılmasına örnek oluşturacaktır.

Abstract:
The phylogenetic relationship among Fusarium graminearum isolates, one of the filamentous fungi, was constructed by the determination of mitochondrial genes. For this purpose the cox3, atp9, rnl and nad2 genes coded in mitochondrial genome of 45 isolates purified from different geographic regions of Turkey and Iran together with 2 reference strains obtained from the Republic of Korea were molecularly characterised. After specific gene regions were amplified by polymerase chain reaction (PCR), they were sequenced according to the Sanger method. The obtained nucleotide sequences were aligned by using CLUSTALW programme, and mitochondrial DNA (mtDNA) variations in coding regions were scanned. The phylogenetic relationships among isolates were constructed using the maximum likelihood (ML) and maximum parsimony (MP) methods based on alignment data. Moreover, variations caused by mutations, related to coding regions, on open reading frame (ORF) were analysed by ORF-FINDER.
527 bp fragments, belonging to cox3 gene, were obtained from 46 isolates.  603 bp products, belonging to atp9, were amplified from 21 isolates, whereas 1547 bp amplicons, belonging to rnl, were obtained from 45 isolates. In lieu of only one expected 5192 bp product belonging to nad2, polymorphic bands whose lengths varied from 250 bp to 5 kb were amplified in 44 isolates. Therefore, the nad2 gene was discarded from the variation analysis study. After the alignment of partial sequences of cox3, atp9 and rnl genes, the existence of single nucleotide polymorphisms, types transition and transversion, as well as the existence of regions with deletions and insertions in the coding regions of all the three genes were revealed via BLASTN analysis. It was demonstrated that mutations mostly result in one codon change, and also can change more than one codon by leading to frame shift. The ML and MP analysis of nucleotide variations provided the establishment of phylogenetic relationships among isolates. The compatibility between isolate distances and nucleotide variations, carried inside the genes, is shown on the constructed phylogenetic trees. Similarities among isolates were calculated with the "neighbor-joining" (NJ) algorithm. The compatibility of the data obtained from character and distance based analysis was also shown. Moreover, F. graminearum's uniparental inheritance was correlated with the analysis of MAT locus found in nuclear DNA (nDNA). For this purpose, the 210 bp α-box domain of the MAT-1 idiomorph, and the 260 bp HMG box domain of the MAT-2 idiomorph were demonstrated in 47 isolates by PCR amplification.
This master thesis is the first study where the phylogenetic relationship is revealed via the sequencing of mitochondrial genes in Fusarim species, thus rendering the study original. The applied methodology will exemplify the characterisation of other phytopathogens.