Endoplazmik retikulum aracılı yıkım yolu (ERAD)'nun meme ve prostat kanserinde kritik rol oynayan steroid hormon reseptörlerine etkisinin ve kimyasal/biyolojik inhibitörlerinin terapötik potansiyellerinin değerlendirilmesi
Evaluation of the effect of endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) on steroid hormone receptors that play a critical role in breast and prostate cancer and the therapeutic potential of chemical / biological inhibitors
Yazar: ESRA ATALAY ŞAHAR
Danışman: PROF. DR. PETEK BALLAR KIRMIZIBAYRAK
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Hormon duyarlı prostat ve meme kanserlerinde heterojenitenin oldukça fazla olması yeni terapötik yolakların keşfi açısından önem taşımaktadır. Kanser hücrelerinde endoplazmik retikulum stresinin artmasına karşı proteostazı korumak için bulunan Endoplazmik Retikulum Aracılı Yıkım Yolu (ERAD) ve Katlanmamış Protein Yanıtı (UPR) dikkat çekici hedefler haline gelmiştir. ERAD, endoplazmik retikulum stresinin önemli ölçüde azaltan yanlış katlanmış veya birleştirilmemiş polipeptitleri yıkan önemli bir degredasyon yolağıdır. 
Bu tez çalışmasında ise ilk olarak meme kanseri hücre hatlarında ERAD protein seviyeleri belirlenmiştir. Daha sonra ise meme kanserinde ERAD ile östrojen arasındaki ilişki araştırılmıştır ve östrojen ile ERAD arasında bir regülasyonun olmadığı saptanmıştır. SVIP proteininin ekspresyonu meme kanseri hücre hatlarında tümörijenik olmayan epitel hücre hatlarına kıyasla önemli ölçüde daha yüksekken, Hrd1 dışında gp78 aracılı ERAD'nin anahtar proteinlerinin çoğu böyle bir ifade modeli sergilememiştir. ERAD ve UPR' ın kanser hücrelerinde oldukça aktif kullanıldığı gösterilmiştir. Bu sebeple ERAD ve UPR inhibitörlerinden GSK2606414 ve 16F16 kullanılarak sırasıyla prostat ve meme hücre hatlarında fonksiyonel testler ile etkinlikleri araştırılmıştır. Meme kanseri için 16F16, prostat kanseri için GSK2606414 uygulamasının hücrelerin yara kapanması, koloni oluşturması ve migrasyon yeteneklerinde azalmaya neden olduğu belirlenmiştir. 
ERAD endojen inhibitörü SVIP'in (small VCP/97-interacting protein), özellikle glioma, prostat ve baş-boyun kanserlerinin progresyonunda rol oynadığı gösterilmiştir. Bu tez çalışmasında ise in silico yöntemlerle RNA dizilimi (RNA-seq) ve gen dizisi çalışmalarına ait veriler ile özellikle meme kanserine odaklanarak çeşitli kanser türlerinde SVIP gen ifede değişimleri değerlendirilmiştir. SVIP'nin mRNA seviyesinin primer meme tümörlerinde önemli ölçüde daha yüksek olduğu, bu durumun SVIP promotör metilasyon durumu ve genetik değişiklikler ile korelasyon gösterdiği bulunmuştur. Fakat ilgi çekici bir şekilde meme tümörlerinde normal dokulara göre artan mRNA seviyelerine rağmen SVIP protein seviyesi düşük bulunmuştur. 
Tez kapsamında yapılan in vitro çalışmalarda, SVIP'in susturulması, p53 yabanıl tip MCF7 ve ZR-75-1 hücrelerinin proliferasyonunu artırmıştır. Ancak p53 mutant T47D ve SK-BR-3 hücrelerinin proliferasyonlarında kontrole göre bir değişikliğe neden olmamıştır. Bununla birlikte, hem MCF7 hem de T47D hücre hattının migrasyon yeteneklerini artırmıştır. Verilerimiz MCF7 hücrelerinde SVIP' in Hrd1 aracılı p53 bozulmasını önleyerek p53 protein seviyelerini artırabileceğini göstermektedir. Genel olarak verilerimiz, SVIP' in meme kanseri hücre hatlarındaki diferansiyel ifadesini ve işlevini in silico veri analiziyle birlikte ortaya koymaktadır.

Abstract:
The high heterogeneity in hormone-sensitive prostate and breast cancers gives importance to the new tasks of therapeutic pathways. The Endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD) and the Unfolded Protein Response (UPR) have become attractive targets to protect proteostasis against increased endoplasmic reticulum stress in cancer cells. ERAD is an important degradation pathway that degrades misfolded or unassembled polypeptides significantly reducing endoplasmic reticulum stress. 
In this thesis, firstly, ERAD protein levels were determined in breast cancer cell lines. After further research into the relationship between ERAD and estrogen in breast cancer, it was discovered that there was no regulation between estrogen and ERAD. While the majority of the essential proteins of gp78-mediated ERAD, with the exception of Hrd1, did not show this pattern of expression, the expression of the SVIP protein was much higher in breast cancer cell lines as compared to non-tumorigenic epithelial cell lines. It has been shown that ERAD and UPR are used quite actively in cancer cells. Therefore, efficacy of the inhibitors GSK2606414 and 16F16 were examined in prostate and breast cell lines along with the functional studies. It was determined that 16F16 for breast cancer and GSK2606414 for prostate cancer cells showed a decrease in wound closure, colony formation, and migration.
SVIP, an endogenous inhibitor of ERAD, has been shown to play a role in the progression in glioma, prostate and head and neck cancers. In this thesis, SVIP gene expression was evaluated in various cancer types, focusing especially on breast cancer with in-silico methods. It was found to be significantly higher SVIP mRNA level and correlated with the promoter methylation status and genetic alterations in breast tumors. However, SVIP protein level was found to be low in breast tumors despite increased mRNA levels compared to normal tissues.  
In vitro studies, silencing of SVIP increased proliferation of p53 wt MCF-7 and ZR-75-1 cells, although it did not cause a change in p53 mutant T47D and SK-BR-3 cells. On the other hand, it increased the migration abilities of both cell lines. Our data revealed that SVIP may increase p53 protein levels by preventing Hrd1-mediated p53 degradation in MCF7 cells. Overall, our data demonstrated the differential expression and function of SVIP in breast cancer cell lines together with in silico data analysis