Ratlarda karbon tetraklorür ile oluşturulan kronik karaciğer hasarı üzerine üzüm çekirdeği yağı ve biberiye ekstraktının etkisi ve kaspaz aktivitesi ile hepatik apoptozisin belirlenmesi
Effect of grape seed oil and rosemary extract on chronic liver damage induced by carbon tetrachloride in rats and determination of hepatic apoptosis and activity of caspase
Yazar: AHMET ALPAY
Danışman: PROF. DR. AYHAN ATASEVER
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Patoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Patoloji = Pathology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu çalışmada, karbon tetraklorür (CCl4) ile kronik karaciğer hasarı oluşturulan ratlarda Biberiye (BE) ve Üzüm çekirdeği yağının (ÜÇY) karaciğer dokusunda oluşabilecek lezyonlar üzerine olası koruyucu etkisi, hücresel apoptozun immunohistokimyasal yöntemle (kaspaz 3, 8 ve 9 antikorları ile) değerlendirilmesi ve serum ALT (alanin amino transferaz) aktivitesi, Trigliserit, Total protein, Albümin, total Kolesterol,  karaciğer MDA (malondialdehit) düzeyleri ile Total antioksidan kapasitesi belirlendi.  
Çalışmada, 72 adet (200-250 gr) Wistar albino ırkı erkek rat, her grupta 12 hayvan olmak üzere 6'şar gruba ayrıldı. İlk grup kontrol olarak belirlendi ve % 0.9 NaCl (0.2 mL/kg/canlı ağırlık) uygulandı. İkinci ve üçüncü gruplara 12 hafta boyunca her gün sırası ile 200 mg/kg/canlı ağırlık dozunda biberiye ekstraktı ve 4 ml/kg canlı ağırlık dozunda üzüm çekirdeği yağı gavaj ile verildi. Dördüncü gruba 8 hafta boyunca haftada 2 kez 1:1 oranında mısır yağı ile dilüe edilen CCl4 (İP) 0.2 mL/kg/canlı ağırlık dozun da enjekte edildi. Beşinci ve altıncı gruplara ise 12 hafta boyunca her gün sırası ile 200 mg/kg/canlı ağırlık dozunda biberiye ve 4 ml/kg canlı ağırlık dozunda üzüm çekirdeği yağı gavaj ile verildi. Aynı gruplara (V ve VI)  beşinci hafta dahil 8 hafta boyunca intraperitoneal (İP) 0,2 mL/kg/canlı ağırlık, 1:1 oranında mısır yağı ile dilüe edilen haftada iki doz CCl4 uygulandı.
Kontrol gruplarında normal karaciğer doku yapısı gözlenirken; CCl4 grubu hepatositlerinde yoğun makro ve mikroveziküler yağlanma, portal bölgede ve parankimde mononüklear çoğunluğu lenfositlerden oluşan hücre infiltrasyon alanları ile nekrotik değişiklikler ile portal bölgelerde hafif fibrozis ile tam olmayan lobulasyon formasyonları görüldü. Karaciğer hasarı oluşturulan CCl4+Biberiye (Grup 5) ve CCl4 + Üzüm Çekirdeği Yağı verilen (Grup 6) gruplarda bulgular da hafif azalma görülmesine rağmen CCl4 grubundakine benzerdi. Deney gruplarında özellikle (Grup 5 ve Grup 6)  fibröz doku oluşumu minimal sevideydi.  Kontrol gruplarında kaspaz 3, kaspaz 9 pozitif ve kaspaz 8 negatifti. CCl4 uygulanan gruplarda kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9 pozitifti. Üzüm çekirdeği yağı ve biberiye uygulamalarına bağlı olarak kaspaz-3 aktivitesinin sınırlı sayıda azaldığı saptandı. Kaspaz-9 aktivitesinin de kaspaz-3 gibi kısmen azalmış olması, Üzüm çekirdeği yağı ve biberiye uygulamalarının sınırlı da olsa karaciğer dokusunu koruyabileceğini düşündürmüştür.
Karbon tetraklorür uygulamaları ile artmış serum ALT aktivitesi sadece biberiye uygulaması ile normal değerlere yaklaştı. Üzüm çekirdeği yağı uygulamasının bu enzim aktivitesi üzerine etkisi olmadı. CCl4 uygulanan grupta azalmış olan serum Total protein düzeyleri biberiye ve üzüm çekirdeği uygulamalarından etkilenmedi. Serum albumin düzeyleri yönünden deneme grupları arasındaki fark istatistiksel olarak önemli bulunmadı (P>0,05). Karaciğer hasarı ile artmış olan serum total kolesterol düzeyleri, biberiye ve üzüm çekirdeği yağı ilavesiyle değişmedi. CCl4 ile karaciğer hasarı oluşturulan ratlarda serum trigliserit düzeylerindeki artışlar (P=0,001), biberiye ve üzüm çekirdeği yağı uygulaması ile sayısal olarak azaldı.
Karbon tetraklorür grubunun MDA seviyeleri diğer gruplardan yüksek bulundu (P<0,05). CCl4'lü gruplara biberiye ve üzüm çekirdeği yağı uygulamaları MDA seviyelerini önemli düzeyde düşürdü (P<0,001). Sadece Üzüm çekirdeği yağı verilen grubun karaciğer dokusu TAK seviyeleri diğer gruplardan daha yüksek bulundu (P<0,001). Karbon tetraklorür uygulanan ratlara üzüm çekirdeği yağı ve Biberiye uygulamasının total antioksidan kapasitesi üzerine etkisi olmadığı saptandı.
Sonuç olarak; CCl4 ile birlikte 200mg/kğ Biberiye ekstresi ve CCl4 ile birlikte Üzüm çekirdeği yağı verilen gruplarda karaciğer hasarı üzerinde her iki antioksidanın iyileştirme yönünden etkisi biyokimyasal veriler ile belirlenirken, histopatolojik lezyonlar üzerine olumlu etkisi gözlenmemiştir. CCl4 ile birlikte Biberiye ekstresi ve Üzüm çekirdeği yağı verilen gruplarda biyokimyasal parametreler kontrol grubu değerlerine yaklaştığından, ÜÇY ve BE kısmen iyileştirici etkileri olabileceği, biberiye ve üzüm çekirdeği yağının farklı sürelerde ve yan etki oluşturmaksızın en iyi sonucu verecek yüksek dozlarda kullanılarak, kesin etkilerinin belirlenmesine yönelik yeni araştırmalara ihtiyaç olduğu kanaatine varıldı.

Abstract:
The present study determined the possible protective effects of grape seed oil and rosemary extract on lesions and cellular apoptosis detection by immunohistochemical method (with caspase 3, 8 and 9 antibodies) in liver tissue and some biochemical parameters; serum ALT (alanin aminotransferase) activity, triglyceride, total protein, albumin and cholesterol activity,  and liver MDA (malondialdehyde) levels along with total antioxidant capacity on chronic liver injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) in rats.
Seventy two Wistar albino rats (200-250 g) were divided into six groups (n:12/group). In the first group of control rats (control group), the rats were administered with %0,9 NaCl (0.2 mL/kg). The second and the third groups were administered daily with 200 mg/kg rosemary extract and 4 mg/kg grape seed oil for twelve weeks throuhg gastric gavage, respectively. Fourth group of animals were administered with CCl4 (which was diluted with corn oil, 1:1) i.p. (0,2 mL/kg) twice for 8 weeks. Fifth and sith groups of rats were also daily with 200 mg/kg rosemary extract and 4 mg/kg grape seed oil, respectively, for twelve weeks through gastric gavage. Animals in the fifth and sixth groups were also given CCl4 (which was diluted with corn oil, 1:1) i.p. (0,2 mL/kg) twice for 8 weeks, starting from the 5th week.
The control group of livers had normal architecture, while an intensive macro and microvesicular steatosis, mononuclear inflammatory cell infiltrations mostly lymphocytes in portal area and paranchyma with necrotic alterations, mild to severe fibrosis with lobulation formation were observed in the CCl4 treated group. While the groups treated with CCl4 + rosemary extract (Group 5) and CCl4 + grape seed oil (Group 6) demonstrated slight reductions in the findings, the findings in the group 5 and 6 were similar to those of treated with the CCl4. Fibrous tissue formation was minimal in experimental groups (5 and 6). In the control groups, while caspase-3 and caspase-9 were positive, caspase-8 was negative. In the group treated with CCl4 alone, caspase 3, caspase 8 and caspase 9 were positive. There was a limited reduction in caspase 3 activity in groups receiving rosemary extract and grape seed oil. Similar to caspase 3, partial reduction observed in caspase 9 activity suggest that rosemary extract and grape seed oil administrations may have a partial protective effect on the liver tissue.
Increased serum ALT acitivity level due to CCl4 administration was close normal only in rosemary extract received group and grape seed oil did not have any effect on the activity of this enzyme. Grape seed oil application had no effect on this enzyme activity.	 Reduction in serum total protein levels observed in CCl4 group was not affected in rosemary extract and grape seed oil administrated groups. Compared to control group, total protein levels were found to be higher in other groups (P=0.001) except rosemary received ones. There was no ststistically significant difference in serum albumin levels among experimental groups (P>0.570). Increased serum cholesterol levels due to liver damage, compared to the control ones, were changed in the CCl4 groups which also received rosemary extract and grape seed oil. Compared to controls, serum triglyceride levels in CCl4 groups were determined to be higher (P=0.001). Upon administration of rosemary extract and grape seed oil, these values were reduced to lower numbers. 
MDA levels in CCl4 only group was higher than other groups (P<0.05). Administration of rosemary extract and grape seed oil to CCl4 only groups reduced MDA levels significantly (P<0.001). Liver tissue total antioxidant capacity level was determined to be higher in grape seed oil group compared to other groups P<0.001). There was no effect of rosemary extract administration on total antioxidant capacity.
In conclusion, while when given with CCl4, both 200 mg/kg rosemary extract and 4 mg/kg grape seed oil, both antioxidant compund determined by biochemical data and no positive effect on histopathological lesions was observed. Since biochemical parameter values were close to normal values in groups which received rosemary extract and grape seed oil along with CCl4,  both compounds may have have healing effects. Therefore, new research strategies and approaches where both compounds may be tried with different periods with high doses without side effects are needed to evaluate their effects.