Toplum kökenli pnömonilerden soyutlanan Streptococcus pneumoniae suşlarının moleküler yöntemler ile tanısı
Identification of isolates of Streptococcus pneumoniae recovered from community acquired pneumonia with molecular methods
Yazar: MÜCAHİDE ESRA KOÇOĞLU
Danışman: Y.DOÇ.DR. AYŞEN BAYRAM
Gaziantep Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Streptococcus pneumoniae toplum kökenli pnömoni etyolojisinde ilk sırada yer almakta olup, aşı ve antimikrobiyal tedaviye rağmen mortalite ve morbiditenin önemli bir sebebi olmaya devam etmektedir. Toplum kökenli pnömoni halen sık rastlanan, tedavi maliyeti yüksek ve ölümcül bir infeksiyon hastalığıdır. Günümüzde ileri tam olanaklarına karşın, toplum kökenli pnömonilerin yarısından çoğunda etken mikroorganizma saptanamamaktadır. Pnömokokların tanısında geleneksel olarak kültür, optokine duyarlılık testi, safrada erime deneyi ve serolojik testler kullanılmaktadır. Son yıllarda etkenin tanımlanmasında nükleik asitlerin in vitro şartlarda replikasyonu temeline dayanan moleküler tam yöntemlerinden de yararlanılmaktadır. Konvansiyonel polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) yanında, örnekte bulunan DNA/RNA miktarım kantitatif olarak gösteren bir yöntem olan real-time PCR da S. pneumoniae 'mn. identifikasyonunda kullanılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada, toplum kökenli pnömoni hastalarına ait alt solunum yolu örneklerinden soyutlanıp, klasik tam yöntemleri ile S. pneumoniae olduğu düşünülen klinik izolatların konvansiyonel PCR ve real-time PCR yöntemleri ile tanımlanması ve bu yöntemlerin duyarlılık ve seçicilik yönünden karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda, Ocak 2004-Ocak 2005 tarihleri arasında alt solunum yollan infeksiyonu öntanısı alan erişkin hastalara ait balgam, trakeal aspirasyon sıvısı, bronş aspirasyon sıvısı ve plevral sıvı örnekleri değerlendirildi. Gram boyamada S. pneumoniae' 'nin tipik görünümüne sahip olan örnekler, %5 koyun kanlı ağara ekilerek kültürleri yapıldı. Kanlı besiyerinde alfa hemoliz oluşturan kolonilere optokin duyarlılık deneyi ve safrada erime deneyi yapıldı. Klasik tam yöntemleriyle pnömokok olduğu düşünülen suşlar konvansiyonel PCR ve real-time PCR yöntemleri ile çalışıldı ve sonuçlar karşılaştırıldı. Çalışmamızda 180 adet alt solunum yolu örneği incelendi; örneklerin 139'u (% 77.2) balgam, 16'sı (% 8.9) bronşiyal aspirasyon sıvısı, 16'sı (% 8.9) trakeal aspirasyon sıvısı ve 9'u (% 5) plevra sıvısı idi. Örnek alman hastaların % 46.6'sı erkek, % 53.3'ü kadın idi. Balgam örneklerinin 91'i (% 65.5), bronşiyal aspirasyon sıvısı örneklerinin 3'ü (% 18.7), trakeal aspirasyon sıvısı örneklerinin 6'sı (% 37.5), plevra sıvısı örneklerinin 4'ü (% 44.5) alfa hemolitik olup, pnömokokların tipik koloni morfolojisini gösterir nitelikteydi. Bu örnekler kültür pozitif olarak kabul edilerek, bunlara optokine duyarlılık ve safrada erime testleri yapıldı. Optokin testi yapılan toplam 104 kültür pozitif izolatın 65'i (% 62.5) optokine duyarlı, 12'si (% 11.5) optokine düşük derecede duyarlı, 27' si (% 26) optokine dirençli olarak bulundu. Safrada erime deneyinde 104 susun 73 'ünde (% 70.2) test sonucu pozitif bulunurken, 31 (% 29.8) susta negatif bulundu. Optokine duyarlı bulunan 65 susun tamamında safrada erime deneyi pozitifti. Optokine düşük derecede duyarlı olan 12 izolatın 8'inde (% 66.7) safrada erime deneyi pozitif bulunurken, 4'ünde (% 33.3) negatif olarak bulundu. Optokine dirençli olan 27 izolatın tamamında safrada erime deneyi negatifti. Kültür pozitif suşların moleküler yöntemlerle tanısında konvansiyonel PCR'da kültür pozitif balgam örneklerinin 55'i (% 60.4) pozitif, 36'sı (% 39.6) negatif, plevra sıvısı örneklerinin 3'ü (% 75) pozitif, li (% 25) negatif bulundu. Bronşiyal aspirasyon sıvısı ve trakeal aspirasyon sıvısı ömelderinin tamamı konvansiyonel PCR'la pozitif bulundu. Real-time PCR'da balgam örneklerinin 61 'i (% 67) pozitif, 30'u (% 33) negatif, plevra sıvısı örneklerinin 3'ü (% 75) pozitif, li (% 25) negatif bulundu. Bronşiyal aspirasyon sıvısı ve trakeal aspirasyon sıvısı örneklerinin tamamı real-time PCR'la pozitif bulundu. Kültür pozitif 104 susun 67'si (% 64.4 ) hem konvansiyonel PCR'da hem de real-time PCR'da pozitif bulunurken, 31 (% 29.8 ) suş her iki yöntemle de negatif bulundu. Altı ( % 5.8) suş konvansiyonel PCR ile negatif, real-time PCR ile pozitif bulundu. Sonuç olarak; S. pneumoniae' ına tanımlanmasında konvansiyonel PCR ve real-time PCR yöntemlerinin en az diğer klasik tam yöntemleri (mikroskopi, kültür, optokine duyarlılık testi, safrada erime deneyi) kadar duyarlı olduklarına karar verildi. Real-time PCR yönteminin pnömokoklaınn tanısında konvansiyonel PCR yönteminden daha duyarlı ve seçici olduğu ve laboratuarda güvenle kullanılabileceği kanısına varıldı.

Abstract:
Streptococcus pneumoniae is the leading microorganism in the etiology of community acquired pneumonia and continues to be an important cause of morbidity and mortality despite vaccination and antimicrobial therapy. Community acquired pneumonia is a frequent and potentially fatal infectious disease with a high cost of therapy. In spite of the sophisticated diagnostic procedures today, the etiologic microorganisms can not be determined in more than half of the patients with community acquired pneumonia. Traditional methods used for the identification of pneumococci are optochin susceptibility test, bile solubility test, and serologic tests. Recently, molecular diagnostic methods, which are based on the replication of nucleic acids in vitro conditions, are being used for the diagnosis of etiologic agents in community acquired pneumonia. Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR), a method quantifying the amount of DNA/RNA in the specimen, is being increasingly used for the identification of S. pneumoniae in addition to conventional polymerase chain reaction (PCR). The aim of this study was to identify the S. pneumoniae with PCR and real time PCR from isolates of samples from lower respiratory tracts of patients with community acquired pneumonia and diagnosed to be S. pneumoniae with classical diagnostic methods, and also to compare these methods from the aspect of sensitivity and specificity. In this study, samples of sputum, tracheal aspiration, bronchoalveolar lavage (BAL), and pleural effusion that were obtained from adult patients with probable lower respiratory tract infection between January 2004 and January 2005, were assessed. Specimens that had typical appearance of S. pneumoniae in Gram staining XIwere cultivated onto 5% sheep blood agar. Optochin susceptibility test and bile solubility test were applied to the colonies causing alpha hemolysis on blood agar. Those isolates that were thought to be pneumococci with classical methods were analyzed again with PCR and real-time PCR, and the results were compared. A total of 180 lower respiratory tract samples were assessed, of which 139 (77.2%) were sputum, 16 (8.9%) were BAL, 16 (8.9%) were tracheal aspirates and 9 (5%) were pleural fluid. Of the patients, 46.6% were men, and 53.3% were women. Ninety one (65.5%) sputum samples, 3 (18.7%) BAL samples, 6 (37.5%) tracheal aspiration samples, 4 (44.5%) pleural effusion samples were alpha hemolytic specimens, and showed typical morphologic appearance of pneumococci. These samples were accepted as culture positive, and optochin susceptibility test and bile solubility test were applied. Sixty five (62.5%) of 104 culture positive isolates were optochin sensitive, 12 (11.5%) had low sensitivity, and 27 (26%) were optochin resistant. Of the 104 isolates, 73 (70.2%) isolates were found to be positive with bile solubility test, and 31 (29.8%) were negative. Bile solubility test was found to be positive in all of the 65 optochin sensitive isolates. Eight (66.7%) of the 12 isolates with low sensitivity to optochin were positive with bile solubility test, and 4 (33.3%) of them were negative. All of the 27 optochin resistant isolates were negative in bile solubility test. Of the culture positive isolates, 55 (60.4%) sputum samples were positive with conventional PCR, and 36 (39.6%) were negative. Three (75%) pleural fluid samples were positive, and 1 (25%) sample was negative with conventional PCR. All of the samples of BAL and tracheal aspiration were found to be positive with conventional PCR. Sixty one (67%) of sputum samples were positive, and 30 (33%) were negative with real-time PCR. Of the pleural fluid samples, 3 (75%) were positive, and 1 (25%) was negative with real-time PCR. All of the BAL samples and tracheal aspiration samples were positive in real-time PCR too. While 67 (64.4%) of 104 culture positive isolates were found to be positive with both PCR and real-time PCR, 31 (29.8%) isolates were found to be negative with both tests. Six (5.8%) isolates that were negative with PCR, were found to be positive with real-time PCR.In conclusion, conventional PCR and real-time PCR were observed to be as sensitive as other classical methods (microscopy, cultivation, optochin susceptibility test, bile solubility test) in the diagnosis of S. pneumoniae. Real-time PCR method is more sensitive and specific than conventional PCR in the diagnosis of pneumococci, and can be used safely in daily laboratory practice. xm