Nanopore dizileme teknolojisi ile SNP panelinin geliştirilmesi
Development of SNP panel with nanopore sequencing technology
Yazar: VEYSEL SAPAN
Danışman: DOÇ. ÖZLEM BÜLBÜL ERCAN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine
Dizin: DNA dizileme = DNA sequencing ; Nükleotid = Nucleotide ; Paneller = Panels

Özet:
Moleküler biyoloji tekniklerinin gelişmesi ve 2001 yılında insan genom projesinin tamamlanması yeni bir dönemin başlamasına yol açmıştır. Adli genetik alanında da insan biyolojisi ile ilgili yeni bilgiler, genetik belirteçler, yeni nesil yüksek verimli genom teknolojiler kullanılmaya başlanmıştır. Adli bilimlerde klasik DNA analizlerinin yanında kanıt DNA'sından failin fiziksel özellikleri hakkında bilgi veren SNP markırları ile ilgili birçok çalışma yapılmıştır. Aynı zamanda dizileme teknolojilerinde de ikinci ve üçüncü nesil dizileme teknolojileri geliştirilmiş ve adli genetik uygulamaları mevcuttur. Ancak üçüncü nesil dizileme olan Oxford Nanopore Teknolojisi (ONT) ile ilgili adli genetik çalışmaları oldukça kısıtlıdır. Bu çalışmada, fenotipe (göz, saç ve ten rengi) ait bilgi veren 41 SNP markırından oluşan HIrisPlex-S panelinin (Walsh ve ark.) ONT MinION dizileme ile test edilmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmada dört pozitif kontrol örnği (2800M, 9947A, K562 ve Taqman) kullanıldı. Her örnek ligasyonlu ve ligasyon yapılmadan Nanopore dizileme gerçekleştirildi. Nanopore dizileme sonucu elektrik değişim bilgiler Guppy 6.1 programı ile fastq dosyalarına dönüştürüldü. BWA, Samtools, BFCtools ve Python programları ile örneklerin profili elde edildi. Genetik profiller NGS ve kapiler elektroforez sonuçları ile karşılaştırıldı. İstatistiksel analizler için RStudio programı kullanılarak ligasyonlu ve ligasyonsuz örneklerin alel düşmesi ve fragman sayısı incelendi. Ligasyonsuz örneklerden toplam 108.084 fragman dizilendi. Ligasyonlu örneklerde fragman ayrım işleminden sonra toplamda 1.817.076 fragman elde edildi. Bütün örneklerde ortak olarak 2 lokusta alel düşmesi gözlemlendi. ONT dizilemede toplamda %60 doğru genotipleme elde edilebildi. Elde edilen sonuçlara göre, Nanopore ile dizilemenin yüksek hata oranı sorunundan dolayı adli bilimlerde kullanılabilmesi için geliştirilmesi gerektiği tespit edilmiştir.

Abstract:
The development of molecular biology techniques and the completion of the human genome project in 2001 led to the beginning of a new era. In the field of forensic genetics, new information about human biology, genetic markers, new generation high-efficiency genome technologies have been started to be used. In forensic sciences, besides classical DNA analysis, many studies have been conducted on SNP markers that provide information about the physical characteristics of the perpetrator from the evidence DNA. At the same time, second and third generation sequencing technologies have been developed and forensic genetic applications are available in sequencing technologies. However, forensic genetic studies on the third generation sequencing, Oxford Nanopore Technology (ONT), are very limited. In this study, it was aimed to test the HIrisPlex-S panel (Walsh et al.) consisting of 41 SNP markers that provide information about the phenotype (eye, hair and skin color) by ONT MinION sequencing. Four positive control samples (2800M, 9947A, K562 and Taqman) were used in this study. Nanopore sequencing was performed for each sample with and without ligation. The electrical exchange information as a result of nanopore sequencing was converted into fastq files with the Guppy 6.1 program. Profiles of the samples were obtained with BWA, Samtools, BFCtools and Python programs. Genetic profiles were compared with NGS and capillary electrophoresis results. For statistical analysis, allele reduction and fragment number of ligated and unligated samples were analyzed using the RStudio program. A total of 108,084 fragments were sequenced from non-ligation samples. A total of 1,817,076 fragments were obtained after fragment separation in ligated samples. Allele reduction was observed in 2 alleles in common in all samples. In ONT sequencing, a total of 60% correct genotyping could be obtained. According to the results obtained, it has been determined that sequencing with Nanopore should be further developed in order to be used in forensic sciences due to the high error rate problem.