Akrilamidin hek293 hücre hattında genotoksik ve sitotoksik etkilerinin araştırılması
Investigation of genotoxic and cytotoxic effects of acrylamide  
in hek293 cell line
Yazar: FATMA SEÇER ÇELİK
Danışman: PROF. DR. TÜLÜN ÇORA
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Akrilamitler = Acrylamides ; Genotoksisite = Genotoxicity ; Hücre dizisi = Cell line ; Nörotoksinler = Neurotoxins ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Akrilamid insan için sitotoksik, genotoksik ve nörotoksik bir kimyasaldır. Gıdaların yüksek sıcaklık derecelerinde pişirilmesi sırasında düşük düzeylerde akrilamid oluşmakta ve gıdalarla birlikte vücuda alınmaktadır. Akrilamidin yüksek miktarda alınımı genotoksik ve nörotoksik etki oluşturmaktadır ancak az miktarda fakat uzun süreli alımının hangi hücresel mekanizmalar ile zarar verdiği henüz tam bilinmemektedir.
Mevcut çalışmada HEK293 hücrelerine akrilamid uygulanarak oluşan sitotoksik ve genotoksik etkiler araştırılmıştır. Mikronükleus oluşumu ile oluşan genotoksik etkisi incelenmiş, MTT redüksiyon testi ile canlılığa olan etkisi ölçülmüştür. Her iki çalışmamıza göre akrilamid canlılığı anlamlı oranda düşürmüştür.  Akrilamid uygulanan HEK293 hücrelerinde akrilamid uygulanmayan kontrole göre canlılığın 24 (p=0,0004), 48 (p=0,0060) ve 72 (p=0,0220) saat sonunda azaldığı tespit edilmiştir. Genotoksisiteyi ve oluşan mikronükleusların kaynağını tespit etmek amacıyla FISH (Floresan In Situ Hibridizasyon) tekniği uygulanmıştır. FISH sonuçların göre oluşan   mikronükleuslardaki sentrik fragmentlerin asentrik fragmentlere oranı 1/3 tür. Buna göre akrilamidin DNA kırıklarına sebep olduğu tespit edilmiştir, ayrıca üçte bir oranında oluşan genotoksisitenin akrilamidin iğ ipliklerine etki ederek anöploidiye sebep olduğunu da göstermiştir. Akrilamidin oksidatif strese olan etkisi, aynı zamanda oksidatif stres yolağı belirteçleri olan glutatyon (GSH),  süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) miktarlarına olan etkisi ölçülerek araştırılmıştır. Akrilamidin metabolize olmasıyla oluşan radikal oksijen ürünleri hücrede oksidatif stresi arttırmış, SOD miktarı anlamlı şekilde azalmıştır. Hidrojen peroksit miktarının artmasıyla orantılı olarak GSH miktarı düşmüş ve okside GSH (GSSG) miktarı azalmıştır. Ayrıca aynı görevi üstlenen CAT ise IC50 dozuna kadar miktarı artmış daha sonra düşmüştür. Bu durumda oluşan hidrojen peroksitin öncelikle glutatyonla etkisiz hale getirildiği ancak glutatyon kapasitesinin yetersiz olduğu durumda katalaz ile etkisizleştirildiği tespit edilmiştir. Oksidatif stresin artması hücrede DNA'nın, proteinlerin ve lipitlerin oksidasyonuna sebep olmaktadır. Bu durum hücre canlılığının düşmesine, ölümüne ve kanserleşmesine neden olur. Yapmış olduğumuz çalışmamızda oksidatif stresin uyarılması hücre ölümlerinin ve kanserleşmesinin sebebi olduğunu düşündürmektedir.

Sonuç olarak akrilamid, HEK293 hücre hattında sitotoksik, genotoksik ve oksidatif stresi arttırıcı etki göstermiştir.

Abstract:
Acrylamide is a cytotoxic, genotoxic and neurotoxic chemical for human. During the cooking process at high temperatures, lower amount of acrylamide is formed and taken into the human body. High level of acrylamide uptake causes genotoxic and neurotoxic effects, however the cellular damage mechanisms of long-term low-dose acrylamide uptake is not fully known yet.
The present study investigated the cytotoxic and genotoxic effects of acrylamide on the HEK293 cells. Genotoxic effects of acrylamide were examined by micronuclei formation assay and its impact on the cell viability was measured by MTT reduction assay. According to the results of both studies, viability of the cells decreased significantly. The viabilty of acrylamide treated HEK293 cells decreased  after 24h (p = 0.0004), 48h (p = 0.0060) and 72h (p = 0.0220) as compared to non-treated control cells. For studying genotoxicity and determining the source of the micronucleus, FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) assay was applied. According to FISH assay results, the ratio of centric fragments to acentric fragments is 1/3 in micronuclei. Accordingly, it has been shown that the acrylamide causes DNA breaks and the genotoxicity of acrylamide causes aneuploidy by acting on a third spindle. 
The effect of acrylamide on oxidative stress, as well as oxidative stress pathway markers such as glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were investigated. Radical oxygen species formed by the metabolism of acrylamide has increased oxidative stress in cells and the amount of SOD significantly decreased. The amount of GSH decreased in proportion to the increase in the amount of hydrogen peroxide and the level of oxidized GSH (GSSG) has declined. Moreover, CAT which has the same function as GSH is also increased upto IC50 dose level then the amount decreased. It was determined that the hydrogen peroxide formed is first neutralized by glutathione however if the capacity glutathione is insufficient catalase inactivated the hydrogen peroxide. Increased oxidative stress in cells leads to oxidation of DNA, proteins and lipids. This causes decrease in cell viability, increase in cell death and tumorigenesis. Our work has supported that the induction of oxidative stress causes cell death and carcinogenesis.
Consequently acrylamide, for the HEK293 cell line is shown to be a cytotoxicity, genotoxicity, and oxidative stress enhancer.