Mersin yöresi'nde Ixodid cinsi kenelerde Anaplasma phagocytophilum'un moleküler yöntemle araştırılması
Investigation of anaplasma phagocytophilum by molecular method in Ixodid ticks in Mersin region
Yazar: OSMAN SEZER
Danışman: PROF. DR. NURAN DELİALİOĞLU
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Anaplasma phagocytophilum = Anaplasma phagocytophilum ; Ixodidae = Ixodidae ; Keneler = Ticks ; Mersin = Mersin ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Prevalans = Prevalence

Özet:
Mersin Yöresi'nde Ixodid Cinsi Kenelerde Anaplasma phagocytophilum'un Moleküler Yöntemle Araştırılması
Anaplasma phagocytophilum, Rickettsiales takımından Anaplasmataceae ailesi üyesi, zorunlu hücre içi Gram negatif pleomorfik bir bakteridir. İnsanlarda granülositleri enfekte ederek İnsan Granülositik Anaplazmozu (HGA)'na neden olmaktadır. A. phagocytophilum, insanlara ve rezervuar konakçılara İxodid kenelerle nakledilmektedir. HGA, grip benzeri klinik belirtilerle başlar, immun sistemi sağlıklı bireylerde hastalık kendini sınırlama eğilimindedir. Bağışıklığı baskılanmış bireyler ve 60 yaş üstü hastalarda HGA şiddetlenerek; pansitopeni, çoklu organ yetmezliği ve ölüme neden olabilmektedir. ABD'de 1994'te ilk vaka bildirimi yapılmış, hastalığın etkeni 2001 yılında Anaplasma soyu içerisinde Anaplasma phagocytophilum olarak tanımlanmıştır. ABD'de her yıl vaka bildirim sayısı artış göstermiş, 2019'da 5655 yeni vaka bildirimi olmuştur. Anaplazmoz, ABD'nin Hastalık Kontrol ve Önlem Merkezi (CDC) raporlarında önem kazanan hastalıklar arasında değerlendirilmektedir. 
Çalışmamızda, Mersin Yöresi'nde ixodid kenelerde Anaplasma phagocytophilum'un moleküler yöntemle araştırılması amaçlanmıştır. Tarsus, Erdemli ve Silifke ilçelerindeki üç bölgede 6 yerleşim biriminde 1 Nisan 2020 – 30 Kasım 2020 tarihleri arasında kene toplama çalışması yapıldı. Araştırma alanlarımız farklı iklim özellikleri gösteren bölgelerden seçildi. Belirlediğimiz odaklarda, kenelerin doğal yaşam alanlarından ve evcil hayvanlar (Sığır, Koyun, Keçi)'dan 1497 adet ergin ixodid kene toplandı.
Stereo mikroskopta morfolojik tanımlama çalışmasıyla örneklemimize dahil edilen kenelerin 4 soy içerisinde 11 türde dağılım gösterdiği tespit edildi.  Tüm odaklardan yıl içerisinde; Hyalomma excavatum 581 adet, H. marginatum 102 adet, H. anatolicum 16 adet, H. impeltatum 3 adet, H. detritum supense 2 adet, Rhipicephalus sanguineus 258 adet, R. bursa 256 adet, R. turanicus 100 adet, Haemaphysalis sulcata 115 adet,  Dermacentor marginatus 59 adet ve D. reticulatus 5 adet türü kene tespit edildi. Çalışma odaklarımızın iklim yapısının kene tür dağılımına etkili olduğu gözlemlendi. Mevsimlere göre kene yoğunluğunun farklılıklar gösterdiği belirlendi. Örneklemimizdeki keneler; soy, tür, cinsiyet (dişi/erkek), toplandığı odak ve toplanma tarihlerine göre ayrıştırıldı. Hacim ve kütleleri eşitlenmiş 210 adet havuz oluşturuldu. 
Tüm kene havuzlarından DNA ekstraksiyonları gerçekleştirildi. Anaplasma/Ehrlichia soylarının ortak gen bölgesine hedeflenmiş PZR uygulanarak, 9 (9/210) kene havuzunda soy DNA tespit edildi. A. phagocytophilum DNA'sına özgü hazırlanan Nested PZR ve Real time PZR protokolleri tüm kene havuzlarına uygulandı. Çağbaşı- Çiçekli (Tarsus) odağından Temmuz ayında toplanan; Hyalomma excavatum türü dişi ergin kenelerden oluşturduğumuz bir havuz ve Rhipicephalus sanguineus türü dişi ergin kenelerin bulunduğu bir havuzda olmak üzere 2 (2/210) A. phagocytophilum DNA'sı tespit edilirken, diğer 208 kene havuzunda etken DNA'sına rastlanmadı. Çalışmamızda 210 kene havuzunda A. phagocytophilum prevalansı %0,95(2/210) olarak tespit edilmiştir. Türkiye'den daha önce bildirilen bazı çalışmalarla uyumlu bulunmuştur. 
  Kappa istatistiğine göre Nested PZR ve Real time PZR yöntemlerinin duyarlılıkları karşılaştırıldığında, kappa sayısı 1,0 (κ=+1) olarak tespit edilmiş ve iki yöntemin sonuçları birbiri içinde uyumlu (p<0,001) bulunmuştur.
Sonuç olarak bu çalışmada Mersin Yöresi'nde Ixodid kenelerde A. phagocytophilum'un varlığı tespit edilmiştir. Çalışmamızda tanımlanan kene soyları ve türler, daha önce Mersin Yöresinden bildirilen keneler arasındaydı. Çalışma odaklarımızda kene türlerinin ve yoğunlukları mevsime bağlı olarak değişim gösterdiği tespit edilmiştir. Farklı iklimsel özellikler gösteren alanlarda planlanan çalışmamızda elde edilen verilerin; kene kaynaklı patojenlerin yayılımı için risk düzeyinin belirlenmesinde ve risk haritalarının oluşturulmasında katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Kenelerde A. phagocytophilum DNA'sı tespiti için Real time PZR yönteminin, Nested PZR yöntemlerine göre daha kolay uygulanabildiği, daha hızlı sonuç verdiği ve kontaminasyon riskinin daha az olduğu değerlendirilmektedir. Genetik karekterizasyon çalışmaları için Nested PZR yönteminin daha duyarlı olduğu ve diğer yöntemlere göre tercih edilebileceği değerlendirilmektedir. Çalışmamızda elde edilen veriler, bölgemizde A. phagocytophilum ve ixodid kenelerde daha sonra yapılacak çalışmalar için ön bilgi sağlamaktadır. Granulositik Anaplazmoz ve diğer kene kaynaklı hastalıkların risk düzeyinin ortaya konulması için; geniş alanları kapsayan, daha fazla kene türü ile daha uzun süreli çalışmalar yapılmasına ihtiyaç olduğu kanısına varılmıştır. 
Anahtar Kelimeler: Anaplasma phagocytophilum, İxodid kene, Prevalans, Mersin Yöresi

Abstract:
Investigation of Anaplasma phagocytophilum by Molecular Method in Ixodid Ticks in Mersin Region

Anaplasma phagocytophilum is an obligate intracellular Gram-negative pleomorphic bacterium, member of the Anaplasmataceae family of the order Rickettsiales. It causes Human Granulocytic Anaplasmosis (HGA) by infecting granulocytes in humans. A. phagocytophilum is transmitted to humans and reservoir hosts by ixodid ticks. HGA begins with flu-like clinical symptoms, and the disease tends to be self-limiting in individuals with healthy immune systems. HGA intensifies in immunocompromised individuals and patients over 60 years of age; It can cause pancytopenia, multi-organ failure and death. The first case was reported in the USA in 1994, and the causative agent of the disease was identified as Anaplasma phagocytophilum in the Anaplasma strain in 2001. The number of case reports has increased every year in the USA, with 5655 new cases reported in 2019. Anaplasmosis is considered among the diseases that gain importance in the US Centers for Disease Control and Prevention (CDC) reports.
In our study, it was aimed to investigate Anaplasma phagocytophilum by molecular method in ixodid ticks in Mersin Region. Tick collection study was carried out between 1 April 2020 and 30 November 2020 in 6 settlements in three regions in Tarsus, Erdemli and Silifke districts. Research focuses were selected from regions with different climatic characteristics. In the foci we determined, 1497 adult ixodid ticks were collected from the natural habitats of ticks and domestic animals (Cattle, Sheep, Goat). It was determined that the ticks included in our sample, by morphological identification study under stereo microscope, were distributed in 11 species within 4 lineages. During the year from all foci; 581 Hyalomma excavatum, 102 H. marginatum, 16 H. anatolicum, 3 H. impeltatum, 2 H. detritum, 258 Rhipicephalus sanguineus, 256 R. bursa, 100 R. turanicus, 115 Haemaphysalis sulcata, 59 Dermacentor marginatus and 5 D. reticulatus ticks were detected. It was observed that the climate structure of our study focuses on the distribution of tick species. It was determined that the tick density varies according to the seasons. Ticks in our sample; ancestry, species, gender (female/male), the focus and date of collection. 210 pools with equal volumes and masses were created.
DNA extractions were performed from all tick pools. By applying targeted PCR to the common gene region of Anaplasma/Ehrlichia strains, strain DNA was detected in 9 (9/210) tick pools. Nested PCR and Real time PCR protocols prepared specifically for A. phagocytophilum DNA were applied to all tick pools. It was collected from Çağbaşı-çiçek (Tarsus) focus in July; While 2 (2/210) A. phagocytophilum DNAs were detected in a pool of Hyalomma excavatum female adult ticks and in a pool containing Rhipicephalus sanguineus female adult ticks, no causative DNA was found in the other 208 tick pools. In our study, the prevalence of A. phagocytophilum was found to be 0.95%(2/210) in 210 tick pools. It was found to be compatible with some previously reported studies from Turkey.
  When the sensitivities of Nested PCR and Real time PCR methods were compared according to the kappa statistics, the kappa number was found to be 1.0 (κ=+1), and the results of the two methods were found to be compatible with each other (p<0.001).
As a result, in this study, the presence of A. phagocytophilum was detected in Ixodid ticks in Mersin Region. Among the strains and species belonging to the Ixodida family previously reported in our region, 11 ticks belonging to 4 genera were identified in our study. It has been determined that the distribution of tick species and the seasonal distribution of numerical densities in our study focus are different. 
It is evaluated that the Real-time PCR method for the detection of A. phagocytophilum DNA in ticks can be applied more easily than the Nested PCR methods, gives faster results and has a lower risk of contamination. It is considered that the Nested PCR method is more sensitive and can be preferred over other methods for genetic characterization studies.
The data obtained in our study provide preliminary information for future studies in A. phagocytophilum and ixodid ticks in our region. The data obtained in our study, which was planned in areas with different climatic characteristics; It is thought that it will contribute to the determination of the risk level for the spread of tick-borne pathogens and the creation of risk maps. To determine the risk level of granulocytic anaplasmosis and other tick-borne diseases; It was concluded that there is a need for longer-term studies with more tick species covering large areas.
Keywords: Anaplasma phagocytophilum, Ixodid tick, Prevalence, Mersin Region