Selülaz enziminin sulu ikili-faz ekstraksiyon sistemleri ile saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purifacation and characterization of cellulase enzyme by aqueous two-phase extraction systems
Yazar: YELİZ TÜRKEL
Danışman: PROF. DR. SEÇİL ÖNAL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Endoglukanaz = Endoglucanase ; Enzimler = Enzymes ; Glukanaz = Glucanase ; Karakterizasyon = Characterization ; Pisum sativum = Pisum sativum ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Selülazlar (endoglukanaz, ekzoglukanaz ve β-glukozidaz, EC 3.2.1.4) endüstriyel alanda özellikle tekstil, kâğıt, deterjan ve gıda endüstrisinde kullanılan hidrolitik enzimlerdir. Protein ve enzim saflaştırılması işlemlerinde kullanılan pek çok biyokimyasal izolasyon ve saflaştırma metodu mevcut olmasına rağmen afiniteye dayalı yeni bir teknik olan sulu ikili-faz sistemleri (Aqueous two-phase systems, ATPS) son yıllarda enzim saflaştırılmasında sıklıkla kullanılmaktadır.
Bu çalışmada, selülaz enzimi bezelyeden (Pisum sativum ) ekstrakte edilerek PEG/Tuz sulu ikili faz sistemi ile saflaştırıldı ve karakterize edildi. Sulu ikili-faz sisteminin optimizasyonu gerçekleştirilmiş, enzim aktivitesine etki eden bazı parametrelerin etkisi incelenerek kararlılık testleri (termal, pH, depo) yapılmıştır. Enzim aktivitesi dinitrosalisilik asit (DNS) metodu ile, protein tayini ise Bradford metodu ile gerçekleştirilmiştir. 
%15 (w/w) PEG-6000, %10 (w/w) Na2SO4 (pH 6,0, 25 ⁰C) kullanılarak hazırlanan sulu ikili-faz sisteminde selülaz enzimi tuzca zengin alt fazda toplandı ve 2 kat saflaştırıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklığı ise sırasıyla pH 4.5 ve 55⁰C olarak belirlendi. Enzimin KM ve Vmax değerleri sırasıyla 1,7 g/mL ve 37,2 U olarak belirlendi. Polimer-tuz tabanlı ATPS ile saflaştırılan bezelye selülazı geniş bir pH ve sıcaklık aralığında oldukça kararlı bir enzimdir. Geleneksel metodlara kıyasla, selülazın saflaştırılmasında kullanılan bu tek adımlı ekstraksiyon metodu basit, ekonomik ve etkili bir metod olup hazırlanan enzim preparatı ise sahip olduğu katalitik özellikleri bakımından gıda ve yem sanayindeki uygulamalarında kullanılabilecek uygun bir preparattır.

Abstract:
Cellulases (endoglucanase, exoglucanase and β-glucosidase, EC 3.2.1.4) are hydrolytic enzymes that used in the industrial area, especially in the textile, paper, detergent and food industry. Although there are many biochemical isolation and purification methods used in protein and enzyme purification processes, Aqueous two-phase systems (ATPS), a new technique based on affinity, has been frequently used in enzyme purification in recent years.
In this study, cellulase was extracted from pea (Pisum sativum) and purified by using a PEG/Salt aqueous two-phase system and characterized. Optimization of the aqeous two-phase system was carried out and stability tests (thermal, pH and storage) were performed by examining the effect of some parameters affecting enzyme activity. The enzyme activity and protein amount were determined by the dinitrosalicilic acid and Bradford methods, respectively.
The cellulase enzyme was partitioned in the salt-rich bottom phase of % 15 (w/w) PEG-6000, % 10 (w/w) Na2SO4 (pH 6.0, 25⁰C) aqueous two-phase system and purified with 2 fold. The optimum pH and temperature were determined as to be pH 4.5 and 55⁰C, respectively. The KM ve Vmax values were found as 1,7 g/mL and 37,2 U, respectively. The pea cellulase purified with a polymer-salt based ATPS is a very stable enzyme over a wide range of pH and temperature. Compared to the traditional methods this single-step extraction method used in purification of cellulase is a simple, economical and effective method. The enzyme is a suitable preparation that can be used in food and feed applications due to its catalytic properties.