Antimikrobiyal peptit ve antibiyotik kombinasyonu içeren lipozom formülasyonlarının geliştirilmesi
Development of liposome formulations containing combination of antimicrobial peptide and antibiotic
Yazar: DİLEK GÜNGÖR
Danışman: PROF. DR. İPEK EROĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Epidermal özellikler = Epidermal characters ; Farmasötik nanoteknoloji = Pharmaceutical nanotechnology ; Nanobiyoteknoloji = Nanobiotechnology

Özet:
Mikroorganizmaların neden olduğu enfeksiyonların tedavisinde kullanılan etkin maddeler, antimikrobiyal terapötikler olarak adlandırılır. Son yıllarda antimikrobiyal terapötiklere karşı gelişen direnç nedeniyle, alternatif olarak antimikrobiyal peptitler (AMP) kullanılmaya başlanmıştır. AMP'ler, hücre membranı ile etkileşerek hızlı bir şekilde bakteri ölümüne neden olmaktadır. Lipozom formülasyonları, hücre membranına benzer yapıları nedeniyle dermal penetrasyonu artırır. Bu nedenle, AMP yüklü lipozom formülasyonları ile penetrasyonun artırılması ve etkin maddenin çevresel faktörlerden korunması hedeflenmiştir. Nisin, Gram pozitif ve Gram negatif patojenlere karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip bir peptittir. Özellikle dermal enfeksiyonların en yaygın patojeni olan Staphylococcus aureus (S. aureus)'un inhibisyonunda oldukça etkilidir.

Antimikrobiyal ilaçlar tek başına kullanıldığında direnç gelişimine neden olmakta ve uzun süreli tedavilerde etkinlik bakımından yetersiz kalmaktadır. AMP ve ilaç kombinasyon yaklaşımları, direnç gelişimi olasılığını azaltmakta ve klinik sonuçları anlamlı bir şekilde iyileştirmektedir. Azitromisin (AZM), geniş spektrumlu makrolid grubu bir antibiyotik olup, düşük çözünürlüğe sahiptir. Ayrıca, S. aureus'un en fazla direnç geliştirdiği antibiyotiklerden biridir ve oral yolla alındığında birçok istenmeyen yan etkiye yol açmaktadır. Bu nedenle enfeksiyon tedavisinde topikal uygulamanın avantaj sağlayabileceği düşünülmüştür.

Tez çalışmasının ilk aşamasında, nisin ve AZM içeren lipozomlar farklı lipitler (Egg PC, Soy PC, Lipoid S100, Fosfolipon 90G, DPPC ve Lipoid S75) kullanılarak hazırlanmış ve karakterizasyon çalışmaları (partikül büyüklüğü, polidispersite indeksi, zeta potansiyeli, morfolojik özellikler, enkapsülasyon etkinliği ve stabilite) gerçekleştirilmiştir. Optimize edilen formülasyon ile in vitro salım (IVRT), ex vivo permeasyon (IVPT) ve floresan mikroskop görüntüleme çalışmaları yapılmıştır. Egg PC ve Lipoid S75 ile hazırlanan AZM yüklü lipozom formülasyonlarının sırasıyla 127,5 ± 10,22 nm ve 88,13 ± 1,82 nm boyutlarında homojen dağılım gösterdiği (PDI yaklaşık 0,2) ve 1 ay boyunca stabil kaldığı (yaklaşık -30 mV) belirlenmiştir. IVRT çalışmaları sonucunda, 24 saat sonunda Egg PC lipozomlarından yaklaşık 200 µg/cm² ve Lipoid S75 lipozomlarından 250 µg/cm² AZM salındığı gözlenmiştir.

İkinci aşamada, optimize edilen lipozomların dermal hücre hatlarında (HaCat ve HDF) biyouyumluluk analizleri yapılmıştır. Sonuçlar, kombine lipozomların biyouyumluluk artışının, formülasyonda yer alan nisin varlığına bağlı olduğunu göstermiştir. Üçüncü aşamada, lipozom formülasyonlarının deri ile etkileşimleri insan kadavra derisinden izole edilen Stratum Corneum (SC) kullanılarak Kuartz Kristal Mikrobalans-Dissipasyon (QCM-D) tekniği ile değerlendirilmiştir. İlaç yüklü lipozomlarda, boş formülasyonlara kıyasla anlamlı bir kütle artışı (Δf) tespit edilmiştir. Nisin yüklü lipozomların SC ile etkileşimi sonucunda yüzeyin viskoelastik özelliklerinin (ΔD) arttığı belirlenmiştir.

Son aşamada, S. aureus'a karşı antimikrobiyal aktivite ve biyofilm eradikasyonu değerlendirilmiştir. Kombine lipozom formülasyonunun, serbest nisin ve AZM içeren kontrol çözeltilerine kıyasla mikrobiyal inhibisyon zonunu artırdığı gözlenmiştir. Ayrıca, AZM içeren lipozom formülasyonlarının, serbest etkin madde içeren kontrollere kıyasla antibiyofilm etkisini iyileştirdiği saptanmıştır.

Sonuç olarak, antimikrobiyal etkinlik ve güvenilirlik çalışmaları ile değerlendirilmiş, nisin ve AZM yüklü kombine lipozom formülasyonları geliştirilmiştir. Bu formülasyonlar sinerjik etkili ve yenilikçi bir çözüm sunmaktadır. İnsan kadavra derisi ile etkileşim mekanizmaları hakkında bilgi sağlayacak QCM-D analizi, literatüre yeni bir yöntem olarak kazandırılmıştır ve nanoformülasyonların dermal etkileşim performanslarının klinik öncesi ex vivo çalışmalarla değerlendirilmesinde önemli bir teknik olarak öne çıkmıştır.

Abstract:
In the treatment of infections caused by microorganisms, active substances are referred to as antimicrobial therapeutics. Due to the increasing resistance to antimicrobial therapeutics in recent years, AMPs have emerged as an alternative. AMPs interact with the cell membrane, causing rapid bacterial death. Liposomal formulations, due to their structural similarity to cell membranes, enhance dermal penetration. Therefore, AMP-loaded liposomal formulations aim to increase penetration and protect the active substance from environmental factors. Nisin is a peptide with antimicrobial activity against both Gram-positive and Gram-negative pathogens. It is particularly effective in inhibiting S. aureus, the most common pathogen intra dermal infections. When used alone, antimicrobial drugs often lead to resistance development and show limited efficacy during prolonged treatments.
Combination approaches involving AMPs and drugs have been shown to reduce the likelihood of resistance development and significantly improve clinical outcomes. AZM, a broad-spectrum macrolide antibiotic, has low solubility and is one of the antibiotics with the highest resistance rates developed by S. aureus. Additionally, oral administration of AZM often results in undesirable side effects, making its topical application advantageous in infection treatment.

In the first stage of this thesis study, liposomal formulations containing nisin and AZM were prepared using different lipids (Egg PC, Soy PC, Lipoid S100, Phospholipon 90G, DPPC, and Lipoid S75). Characterization studies, including particle size (PS), polydispersity index (PDI), zeta potential (ZP), morphological properties, encapsulation efficiency, and stability, were performed. With the optimized formulation, studies on in vitro release, ex vivo permeation, and fluorescence microscopy imaging were conducted. It was determined that AZM-loaded liposomes prepared with Egg PC and Lipoid S75 showed homogeneous distribution (127.5 ± 10.22 nm and 88.13 ± 1.82 nm, respectively, with PDI ∼0.2) and remained stable (∼ -30 mV) for 1 month. IVRT studies revealed that approximately 200 µg/cm² AZM was released from Egg PC liposomes, and 250 µg/cm² from Lipoid S75 liposomes after 24 hours. In the second stage, the biocompatibility of optimized liposomal formulations was analyzed using dermal cell lines (HaCat and HDF). Results indicated that the high biocompatibility of the combined liposomes was attributed to the presence of nisin. In the third stage, the interaction of liposomal formulations with the skin was evaluated using QCM-D technology, with the stratum corneum (SC) isolated from human cadaver skin. Drug-loaded liposomes showed a significant mass increase (Δf) compared to empty formulations. Nisin-loaded liposomes demonstrated increased surface viscoelastic properties (ΔD) upon interaction with the SC. Finally, antimicrobial activity and biofilm eradication against S. aureus were evaluated. The combined liposomal formulation showed increased microbial inhibition zones compared to control solutions containing free nisin and AZM. Additionally, AZM-loaded liposomal formulations demonstrated enhanced antibiofilm effects compared to controls containing free active substances.

In conclusion, synergistic and innovative nisin- and AZM-loaded liposomal formulations were developed, validated by antimicrobial efficacy and safety studies. QCM-D analysis, introduced for the first time, offers insight into the interaction of topical formulations with human cadaver skin. This technique is a key tool for assessing nanoformulations' dermal interactions in preclinical ex vivo studies.