Aras havzası ve Kars platosu sivrisineklerinde batı nil virusu varlığının moleküler yöntemlerle araştırılması
The research of the existence of west nile virus in mosquitoes of Aras basin and Kars plateau by molecular methods.
Yazar: ÖZGE KUÇLU
Danışman: PROF. DR. ATİLA AKÇA ; YRD. DOÇ. DR. CEM ÖZİÇ
Kafkas Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zooloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Zooloji = Zoology
Dizin: Batı nil virüsü = West nile virus ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sivrisinekler = Culicidae

Özet:
Batı Nil Virusu'nun hayat döngüsü, kuşlar ile bu kuşlardan kan emerek beslenen sivrisinekler arasındadır. Kuşlardan kan emerek virusu alan sivrisinekler yine kan emme yolu ile virusu insan, at, evcil ve yabani kanatlılara bulaştırmaktadır. Daha önce yapılan çalışmalar Kars Platosu ve Aras Havzası'nın göçmen kuşların göç yolu güzergâhında olduğunu ve virusun vektörlüğünü yapabilecek olan sivrisinek türlerini bulundurduğunu göstermektedir. Türkiye sınırları içerisinde Aras Havzası'nda virusun varlığına yönelik herhangi bir çalışma bulunmazken, Kars Platosu'nda BNV'nin ördeklerde var olduğu bilinmektedir. Ancak her iki bölgede de virusun vektörlerine yönelik herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Her iki bölgenin de kuş göç yolu üzerinde olması, BNV'nin vektörü olabilecek sivrisinekleri barındırması, yörede kaz, ördek ve at yetiştiriciliğinin yaygın olması bu bölgeleri Batı nil ateşi hastalığı bakımından riskli kılmaktadır. 
Bu çalışmada, 2013-2014 yıllarına ait Haziran-Ağustos aylarında hem iklimsel hem de coğrafi olarak birbirinden farklılık gösteren Kars Platosu ve Aras Havzası sivrisineklerinde Batı Nil Virusu varlığının moleküler yöntemlerle araştırılması amaçlandı. Çalışmada Haziran-Ağustos aylarında ergin sivrisinekler New Jersey ışık tuzakları ve ağız aspiratörleri ile toplandı ve laboratuvara canlı olarak getirildi. Buz üzerinde morfolojik olarak tür teşhisleri yapıldıktan sonra toplandıkları tarih ve yerleşim birimlerine göre ayrılarak 2-50'şerlik gruplar olacak şekilde ependorf tüplere alındı ve laboratuvar çalışmalarının başlamasına kadar   -80 oC'de saklandı. BNV'ye ait nükleik asitlerin saptanması için standart RT-PZR yöntemi uygulandı. RT-PZR sonucu elde edilen ürünlerden uygun olan bantlar jelden kesilip alınarak saflaştırıldı ve dizi analizi yapıldı. Elde edilen dizilere BLAST analizi yapıldı ve virusun hangi kökene ait olduğu belirlendi. Belirlenen türler çeşitli biyoinformatik programlarla karşılaştırıldı ve filogenetik ağaç oluşturuldu. Türlerin, yılların ve bölgelerin enfeksiyon oranları PooledInfRate, version 4.0 programı ile hesaplandı.
Çalışma sonucunda Kars Platosu ve Aras Havzası'ndan toplam 15.287 sivrisinek toplandı (Kars Platosu 3355, Aras Havzası 11.932) ve 376 havuz oluşturuldu. RT-PZR sonucunda test edilen 376 havuzdan 128 (%34.04)'i BNV nükleik asitleri açısından pozitif bulundu. Enfeksiyon oranları, bu konuda kabul edilen yöntemler ile hesaplandığında MIR (Minimum Infection Rate) 8,37/1000 sivrisinek, MLE (Maximimum Likelihood of Infection) 10,22/1000 sivrisinek olarak belirlendi. Kars Platosu'nda enfeksiyon oranları MIR 6.56/1000 sivrisinek ve MLE 7.49/1000 sivrisinek oldu. Aras Havzası'nda ise enfekisyon oranları MIR 8.88/1000 sivrisinek ve MLE 11.03/1000 sivrisinek olarak bulundu.
Çalışmada pozitif bulunan türler Ochleratatus caspius, Culex theileri, Culex pipiens ssp., Anopheles maculipennis kompleks ve Anopheles hyrcanus türleri oldu. Ochleratatus caspius, Culex theileri, Culex pipiens ssp. ve Anopheles maculipennis kompleks hem Kars Platosu, hem de Aras Havzası'nda enfekte bulundu. BNV nükleik asitleri en çok Ochleratatus caspius türüne ait havuzlarda bulunmasına rağmen, MLE enfeksiyon oranları sayıca az olan Culex pipiens türünde daha yüksekti.
Kars Platosu ve Aras Havzası'nda pozitif bulunan 8 havuza ait bantlar saflaştırılarak dizi analizi yapıldı. Yapılan analiz sonucunda tespit ettiğimiz BNV'nin, daha önce Orta Afrika ve Eskişehir'de tespit edilen virusla %99 oranında benzerlik gösterdiği ve bunlarla birlikte Köken 1'de yer aldığı belirlendi. 
Sonuç olarak bu çalışma ile Kars Platosu ve Aras Havzası sivrisineklerinin BNV nükleik asitlerini taşıdığı, BNV nükleik asitlerini taşıyan en yaygın türün sırasıyla Ochleratatus caspius, Culex theileri, Culex pipiens ve Anopheles maculipennis olduğu, en yüksek enfeksiyon oranının ise Culex pipiens'de olduğu, yörelerdeki virusun Köken 1'e ait olduğu ve en çok Türkiye'den Eskişehir ilinde attan izole edilen virus ve Orta Afrika Cumhuriyeti'nden insandan izole edilen virus ile benzerlik gösterdiği belirlendi.

Abstract:
The lifecycle of the West Nile Virus is perpetuated by migratory birds and the mosquitoes which feed by sucking blood from those birds. Mosquitoes which take the virus while sucking blood from migratory birds transmit it to people, horses and domestic fowl, again through sucking blood. Previously conducted studies suggest that the Kars Plateau and Aras Basin are on the flightpath of migratory birds and virus in the harbour those species of mosquitoes which can be vectors of the virus. Although no studies have been undertaken aimed at determining the presence of the virus in the Aras Basin, the West Nile Virus (WNV) is known to the present in ducks in the Kars Plateau. Nonetheless, no studies on the viral vectors are available in either region. Since both of these regions are on the migration route of the birds, harbour the mosquitoes which may be vectors of WNV and have extensive goose, duck and horse breeding, they are at risk of WNV. 
In this study, it is aimed to investigate that the presence of WNV in mosquitoes on Kars Plateau and Aras Basin which are differential both climatically and geographically in the year 2013-2104 of June-August by molecular methods. In the study, adult mosquitoes were collected with New Jersey light-traps and mouth aspirators and conveyed in June-August to the laboratory alive. After species diagnosis had been made morphologically, mosquitoes were kept on ice, classified in respect of collection date and locations, placed in eppendorf tubes in groups of 2-50 and kept in -80 oC till starting to laboratory studies. The standart RT-PCR method was used to identify the nucleic acids characteristic of WNV. Convenient bands were cut from the products acquired as a result of RT-PCR removed from the gel and, purified sequence analysed. BLAST analysis was performed on the sequences obtained and the origins of the vırus were determined. The species identified were compared to various bioinformatics programs and incorporated into the phylogenetic tree. Infection rate of species, years and locality was calculated by PooledInfRate program, version 4.0. 
In the result of study, 15.287 mosquitoes samples have been collected in Kars Plateau and the Aras Basin (Kars Plateau 3355, Aras Bain 11.932) and 376 pools have been created. 128 (%34.04) from 376 from tested pool of RT-PCR results were found positive for WNV nucleic acids. Infection rate, as calculated by acknowledged methods, MIR (Minimum Infection Rate) was determined as 8.37/1000 mosquitoes, MLE (Maximum Likelihood of Infection) was determined as 10.22/1000. Infection rate on the Kars Plateau was MIR 6.56/1000 mosquitoes and MLE 7.49/1000 mosquitoes. Infection rate in Aras Basin was found as MIR 8.88/1000 mosquitoes and MLE 11.03/1000 mosquitoes. 
The positive found species in the study were Ochleratatus caspius, Culex theileri, Culex pipiens ssp., Anopheles maculipennis complex and Anopheles hyrcanus. In both Kars Plateau and Aras Basin, Ochleratatus caspius, Culex theileri, Culex pipiens ssp. and Anopheles maculipennis complex were found infected. Although the presence of WNV nucleic acids were found the most in the pools belong to Ochleratatus caspius species, MLE infection rates were higher than outnumbered Culex pipiens ssp.
Bands which belong to positive found eight pools were purified and sequence analyses have been carried out. WNV, which has been determined as a result of the analysis, resemble to the virus which previously has been detected in Central Africa and Eskişehir with %99 similarity and after all has been determined that takes place in Lineage 1.
As a result, with this study, it has been determined that mosquitoes of Kars Plateau and Aras Basin contain WNV's nucleic acids, the most common species that carry the WNV nucleic acid are Ochleratatus caspius, Culex theileri, Culex pipiens ve Anopheles maculipennis, the highest infection rate is in Culex pipiens, virus in regions belongs to Lineage 1 and it is the most similar to virus isolated from horse from Eskişehir Province (Turkey) and from human from Central African Republic.