Multiple Myeloma'da bortezomibe karşı gelişen direnç mekanizmasında toll like reseptörlerin rolünün araştırılması
Research of toll like reseptors in resistance mechanism against bortezomibe in Multiple Myeloma
Yazar: MEHTAP TARHAN
Danışman: DOÇ. DR. KAMİLE ÖZTÜRK
Aksaray Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
MULTİPLE MYELOMA'DA BORTEZOMİBE KARŞI GELİŞEN DİRENÇ MEKANİZMASINDA TOLL LİKE RESEPTÖRLERİN ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI
Multiple myeloma (MM) kemik iliğindeki plazma hücrelerinin anormal proliferasyonu ve invazyonu ile karakterize edilen, tedavi edilemeyen hematolojik bir kanserdir. Günümüzde MM tedavisi için kullanılan en etkin tedavi yöntemlerinden birisi proteazom inhibitörü bortezomibin yer aldığı kemoterapötik rejimlerdir. Ancak bortezomibe karşı gelişen direnç mekanizması tedavinin başarısızlığına neden olmaktadır. Literatürde dirençlilik mekanizmasında rol aldığı bilinen birçok mekanizma çalışılmasına karşın, TLR'in ilaç dirençlilik mekanizmasındaki rolleri henüz aydınlatılmamıştır. Bu nedenle, bu tez çalışması ile MM hücre hatlarında bortezomibe karşı gelişen direnç mekanizmasında TLR'lerin rolünün araştırılması amaçlanmıştır. 
Bu amaç için, bortezomibe dirençli (KMS-20) ve hassas (KMS-28BM) MM hücre hatları kullanılmıştır. İlk olarak, bortezomibin doza ve zamana bağlı hücre canlılığına etkisi, MTT testi kullanılarak saptanmıştır. İkinci olarak, hücre hatları farklı bortezomib konsantrasyonları ile 12, 24 ve 48 saat muamele edildikten sonra total RNA izolasyonu ve ardından cDNA sentezi yapılmıştır. TLR 2, 3, 4, 7, 9 ve MyD88 genlerinin mRNA düzeyleri her gene özgü primer ve TaqMan problar kullanılarak real time RT-PCR yöntemi ile saptanmıştır.
KMS-20 hücre hattında bortezomibin 12, 24 ve 48 saat için IC50 dozları sırasıyla 31.62nM; 15.85nM; 5.89nM olarak ve KMS-28BM hücre hattında ise 12, 24 ve 48 saat için IC50 dozları sırasıyla 11.84nM; 5.30nM; 3.66nM olarak saptanmıştır. KMS-20 için 12, 24 ve 48 saatlik dirençlik indeksleri (RI) sırasıyla 2.67; 2.99 ve 1.61 olarak hesaplanmıştır. Gen ifade düzeylerine bakıldığında, TLR2 ifade düzeyinin dirençli hücrede hassas hücreye göre doz ve zaman bağlı olarak çok anlamlı azalış gösterdiği bulunmuştur. TLR3 ve TLR4 gen ifadesi hassas hücrede doz ve zamana bağlı azalış gösterirken, dirençli hücrelerde tamamen baskılanmıştır. TLR7 ifadesi hassas hücrede doza ve zaman bağlı azalış gösterirken, dirençli hücrede anlamlı bir artışa neden olmuştur. TLR9 hassas hücrede doz ve zamana bağlı anlamlı azalış gösterirken, dirençli hücrede sadece yüksek konsantrasyonlarda anlamlı azalma göstermiştir. MyD88 dirençli hücrede sadece 48 saatte anlamlı artış, hassasta özellikle 24 ve 48 saatte doza ve zamana bağlı azalma göstermiştir. Sonuçta, dirençli ve hassas hücrelerdeki tüm gen ifade düzeyleri karşılaştırıldığında, dirençli hücrelerde TLR2, TLR3 ve TLR4 mRNA düzeylerindeki azalmanın ya da tamamen baskılanmanın, buna karşın TLR7 ve MyD88 mRNA düzeylerindeki artışın bortezomibe karşı gelişen direnç mekanizmasında rol alabileceği görülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Multiple myeloma, İlaç dirençliliği, Toll Like Reseptörler, qRT-PCR, Bortezomib.

Abstract:
RESEARCH OF TOLL LIKE RECEPTORS IN RESISTANCE MECHANISM AGAINST BORTEZOMIBE IN MULTIPLE MYELOMA
Multiple myeloma (MM) is a hematologic malignancy that is characterized as an abnormal proliferation and invasion of plasma cells into the bone marrow. The most effective treatment method currently available for MM therapy is chemotherapeutic regimens in which the proteasome inhibitor bortezomibin is involved. However, resistance mechanism against bortezomib causes failure of treatment. Despite the study of many mechanisms known to play a role in the resistance mechanism in the literature, the role of TLR in drug resistance has not yet been elucidated. Therefore, this thesis study aimed to investigate the role of TLRs in the resistance mechanism against bortezomib in MM cell lines.
For this purpose, bortezomib-resistant (KMS-20) and sensitive (KMS-28BM) MM cell lines were used. Firstly, it was determined the dose and time dependent effects of bortezomib for two cell lines on cell viability by using MTT test. Secondly, cell lines were treated with different concentrations of bortezomib for 12, 24 and 48 hours, followed by total RNA isolation followed by cDNA synthesis. mRNA levels of TLR 2, 3, 4, 7, 9 and MyD88 genes were determined by real-time RT-PCR using primers specific for each gene and TaqMan probes.
IC50 doses in the 12, 24 and 48 hours for KMS-20 cell line were, respectively; 31.62 nM; 15.85nM; 5.89 nM and IC50 doses in the 12, 24 and 48 hours for KMS-28BM cell line were, respectively; 11.84 nM; 5.30nM; 3.66 nM. The resistance index (RI) of KMS-20 cell line for 12, 24 and 48 hours were 2.67; 2.99 and 1.61 respectively. When gene expression levels were examined, TLR2 expression levels were found to be significantly decreased in resistant cells compared to sensitive cells, depending on dose and time. While TLR3 and TLR4 gene expression showed dose and time dependent decrease in sensitive cells, they were completely suppressed in resistant cells. While the TLR7 expression showed a dose-dependent and time-dependent decrease in the sensitive cell, it was shown a significantly increase in the resistant cell. TLR9 showed a significant decrease in dose and time in sensitive cells, while a significant decrease in only high concentrations in resistant cells. A significant increase in only 48 hours in the MyD88 resistant cell showed, while a significantly decrease showed at 24 and 48 hours in sensitive cells.
Finally, when all gene expression levels in resistant and sensitive cells are compared, the decrease or complete suppression of TLR2, TLR3 and TLR4 mRNA levels, but the increase of TLR7 and MyD88 mRNA levels in resistant cells may play a role in the resistance mechanism against bortezomib.

Keywords: Multiple myeloma, Drug Resistance, Toll Like Receptors, qRT-PCR,  Bortezomib.