Pektin liyaz enziminin mikroorganizmalardan saflaştırılması ve karakterize edilmesi, enzimin Ca2+-hibrit nanoçiçek yapısının hazırlanması ve meyve suyu durultmasında kullanımının araştırılması
Purification and characterization of pectin lyase enzymes from microorganism, preparation of enzymic Ca2+-hybrid nanoflower structure and the investigation of use in fruit juice clarification
Yazar: AYNUR BABAGİL
Danışman: PROF. DR. HAYRUNNİSA NADAROĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
Pektin liyaz (PL) enzimi (polimetilgalakturonat liyaz; EC 4.2.2.10, PMGL) metille esterleşmiş poligalakturonatları α-(1, 4) bağlarını trans-eliminasyonla parçalayan bir enzimdir. Bu çalışmada; elma ve domatesde pektin liyaz enzimi üreten mikroorganizmalar arandı. Bu mikroorganizmalar izole edildikten sonra 16S rRNA geni ve 16S-23S rRNA genler arası ayırıcı bölge (ISR) dizi analizi ile tanılandı. Bu mikroorganizmalardan, pektin liyaz enzimi üçlü faz ayırma (ÜFA) tekniği kullanılarak saflaştırıldı ve karakterize edildi. Saflaştırılan PL enzimlerinden, nanoçiçek PL Ca2+- hibrit yapısı sentezlenip SEM, FT-IR, XRD ve TEM karakterizasyon analizleri yapıldı. Çalışmanın son aşamasında ise; serbest ve hibrit PL enzimleri kullanılarak bazı meyve sularının durultma işleminde uygulanabilirliği araştırıldı.
Streptococcus sanguinis, Bacillus licheniformis ve Bacillus pumilus mikroorganizmaları izole edildi ve tanılandı. Tanılanan bu bakterilerden, ilk kez ÜFA yöntemi ile PL enzimi üretildi ve sırasıyla, %76,71-78,9-78,2 verim ve 126,7-181,2-191,8 kat saflaştırıldı. SDS poliakrilamid jel elektroforezleri (SDS-PAGE) yapılarak PL enzimlerinin molekül ağırlıkları tespit edildi. S. sanguinis, B. licheniformis ve B. pumilus'e ait molekül ağırlıkları sırası ile 35,42- 32,32 ve 32,88 kDa olarak belirlendi. Saflaştırılan PL enzimleri ile, nanoçiçek kitosan/kalsiyum pirofosfat hibrit nanopartikülleri iyonotropik jelasyon ile kolay ve tek adımda ilk kez tarafımızdan sentezlendi. Çalışmanın son aşamasında ise serbest ve hibrit PL enzimlerinin üzüm (siyah), nar, kızılcık, şeftali, elma (kırmızı) ve erik meyve sularında berraklık ve parçalanma oranı etkileri araştırıldı. Bu araştırmalara göre; en yüksek verim, B. licheniformis bakterisinden saflaştırılan, hibrit PL enziminin meyve suyu durultma denemesinde, optik dansite değeri %80,1 oranında şeftali meyve suyunda belirlendi. Nanoçiçek hibrit PL enzimlerinin daha yüksek kararlılıkta tüm meyve suyu proseslerinde başarıyla, kontaminasyona neden olmadan ve güvenle kullanılabileceği sonucuna varıldı.

Abstract:
Pectin lyase (PL) enzyme (polymethylgalacturonate lyase; EC 4.2.2.10, PMGL) is an enzyme that breaks down the ligaments α-(1,4) by trans-elimination of metihyl esterified poligalacturations. In this study, microorganisms that produce pectin lyase enzyme were searched for in apples and tomatoes. After these microorganisms were isolated, the 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA gene were ıdentified intergenic spacer region (ISR) sequence analysis. These from microorganisms, pectin lyase enzyme was characterized and fist time purified using triple phase partitioning (TPP)) technique. Purified PL enzymes, nanoflower PL Ca2+ - hybrid structure was synthesized and SEM, FT-IR, XRD and TEM characterization analyzes were performed. In the last stage of the study, the applicability of some fruit juices using free and hybrid PL enzymes was investigated.
Streptococcus sanguinis, Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus microorganisms were isolated and identified. From these bacteries identified, the PL enzyme was obtained from us for the first time by TTP method, respectively, purified 76,71-78,9-78,2% yield and 126,7-181,2-191,8 fold. The molecular weight of the PL enzymes were determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The molecular weights of S. sanguinis, B. licheniformis and B. pumilus were determined 35,42-32,32 and 32,88 kDa, respectively. With the purified PL enzymes, nanoflower chitosan/calcium pyrophosphate hybrid nanoparticles were easily synthesized with ionotropic gelation for the first time in one step. In the last phase of the study, the effects of free and hybrid PL enzymes on the clarity and cleavage rate of grape (black), pomegranate, cranberry, peach, apple (red) and plum fruit juices were investigated. According to these researches; the highest yield was determined in the fruit juice clarification experiment of hybrid PL enzyme purified from B. licheniformis bacteria, and the optical density value was determined in 80.1% peach juice. It has been concluded that the nanoflower hybrid PL enzymes can be used successfully, in all fruit juice processes with higher stability, without causing contamination and safely.