CRISPR-Cas9 aracılı PIK3CA gen modifikasyonunun kanser hücreleri üzerindeki terapötik etkilerinin araştırılması
CRISPR-Cas9 mediated PIK3CA modification as a novel treatment modality in cancer
Yazar: ÖZGE SÖNMEZLER
Danışman: DOÇ. DR. ATIL BİŞGİN
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: CRISPR = CRISPR ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Terapötik yöntemler = Therapeutics ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Genom düzenleme metotlarında birinci sırada yer alan CRISPR-Cas teknolojisi en çok kanser etyogenezi, ilaç etkinlik çalışmaları, tümör mikroçevresi çalışmaları ve yeni biyobelirteç tespiti ile yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yönelik çalışmalarda kullanılmaktadır. Meme kanserinde kanser hücrelerinin apoptozdan kaçması, hücre büyümesi ve sınırsız proliferasyonunda PI3K/Akt/mTOR yolağının etkisi bilinmekte olup literatürde bu yolağın özellikle hedefe yönelik ilaç çalışmalarında büyük bir öneme sahip olduğu ve hedefe yönelik tedaviler için yüksek potansiyel taşıdığı öngörülmektedir. Yapılan bu tez çalışmasında da Çukurova Üniversitesi AGENTEM ve Çukurova Teknokent İnfoGenom altyapısı kullanılarak, karsinogenezde etkinliği bilinen bu yolak üzerindeki PIK3CA geninin CRISPR-Cas9 aracılı modifikasyonun tüm yolak üzerindeki etkisinin ortaya konması ve bu etki altında kanser hücrelerinin davranışının değerlendirilmesi hedeflenmiştir. MCF-7 hücre hattı ile gerçekleştirilen çalışmalarda transfeksiyon metodu olarak elektroporasyon yöntemi kullanılmış olup elektroporasyonun optimizasyonu, floresan mikroskobu ve akım sitometri aracılığıyla hücre canlılığı ve transfeksiyon etkinliği değerlendirilerek yapılmıştır. Etkinliği kanıtlanan protokoller ile CRISPR-Cas9 aracılı PIK3CA gen modifikasyonunun kanser hücreleri üzerindeki etkisi ise invert mikroskop, akım sitometri, gerçek zamanlı PZR aracılı ekspresyon çalışması ve ile gösterilmiştir. Elde edilen sonuçlar CRISPR-Cas9 aracılı PIK3CA geninin susturulmasının hücre ölümünü indüklediği ve yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için potansiyel taşıdığını göstermiştir. Bu tez çalışması ile özellikle PIK3CA geninin CRISPR-Cas9 temelli modifikasyonu ilişkili yeni tedaviler için literatüre katkı sağlanması amaçlanmıştır.

Abstract:
CRISPR-Cas9 is the leading technology among all genome modification methods. It has been utilized in cancer etiology, tumor pathogenesis, tumor microenvironment, drug efficiency studies, and developing new strategies via novel biomarker discoveries. PI3K/Akt/mTOR signaling pathway have great impact on cancer cell growth and proliferation as well as cancer cells' escape from immune system and apoptosis. Thus, it is especially promising for targeted anti-cancer therapies.   In this study, CRISPR-Cas9 induced knockdown was performed on PIK3CA gene which is located on this important cellular pathway, and the impacts of this gene modification on both the behavior of cancer cells and whole PI3K pathway were investigated using Cukurova University AGENTEM and Cukurova Technopolis InfoGenom infrastructure. Experiments were carried on MCF-7 cell line, and electroporation was used for all transfection steps. Electroporation optimization for this cell line was performed by tracking cell viability and transfection efficiency under florescence microscope together with flow cytometry assays. CRISPR-Cas9 mediated modification of PIK3CA gene was made by the most efficient electroporation protocols and showed using Sanger and next-generation sequencing methods. Also, impacts of gene modification were shown via invert microscope, flow cytometry and real-time PCR expression assay. The results of this study indicates knockdown of PIK3CA gene via CRISPR-Cas9 induces cell death and has potential for the new therapeutic approaches. Finally, with this thesis, we aimed to contribute to the literature for novel treatments associated to CRISPR-Cas9-based modification of PIK3CA gene.