Kimyasalların radyoaktif olmayan lokal lenf düğümü yöntemi ile rölatif temas alerjisi potansiyelinin araştırılması ve yama testi sonuçları ile karşılaştırılması
Estimation of relative contact allergenic potency of the chemicals by using non-radioactive local lymph node assay and comparison with the patch test results
Yazar: ÖZGE ÜLKER
Danışman: PROF. DR. ASUMAN KARAKAYA
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Alerjenler = Allergens ; Alerji ve immünoloji = Allergy and immunology ; Dermatit-kontak = Dermatitis-contact ; Hipersensitivite = Hypersensitivity ; Lenf = Lymph ; Lenfatik sistem = Lymphatic system ; Sitokinler = Cytokines ; Testler = Tests

Özet:
Lokal Lenf Düğümü Yöntemi (LLNA), temas alerjenlerinin sensitize edici aktivitelerinin uygulama yerinde bulunan lenf düğümlerindeki artan indüklenmiş proliferatif cevap olarak ölçüldüğü ve bu şekilde bu alerjenlerin tespit edilerek sınıflandırılmasında kullanılan bir test metodudur. LLNA, ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods) tarafından validasyonu tamamlanmış bir metod olmasına karşın iki dezavantajına dikkat çekilmektedir. Bunlardan ilki lenfosit proliferasyonunun radyoaktif bir yöntemle (H3 timidin işaretlenmesi) ölçülmesi, ikincisi de irritasyon ile alerjinin tam olarak ayrılamamasıdır. Bu nedenle çalışmamızda, hücre proliferasyonu, radyoaktif olmayan bir yöntem olan BrdU işaretlenmesi ölçülmüştür. BrdU ile işaretleme, hem in vivo ortamda I.P. enjeksiyon ile hem de hayvan refahını gözetmesi açısından ex vivo ortamda eklenerek, iki farklı şekilde yapılmıştır. Referans madde olarak çok güçlü bir alerjen olan DNCB ve ayrıca formaldehit, parafenilendiamin, fragrans karışımı ve peru balsamı AOO içerisinde değişik konsantrasyonlarda hazırlanarak 8-12 haftalık dişi Balb/c farelere uygulanmış ve sensitizasyon potansiyelleri ölçülmüştür. Ayrıca irritasyon ile gecikmiş tip alerji arasındaki ayırımı yapabilmek için kulak kalınlığının ölçülmesi ile ?Ayrım İndeksi? hesaplanmıştır. Th1 hücrelerinden salıverilen IL-2, IFN-? ve Th2 hücrelerinden salıverilen IL-4, IL-5 sitokinlerinin lenf düğümü hücre kültürü süspansiyonundaki düzeyleri ölçülmüştür. Referans madde olarak kullanılan DNCB' in in vivo ve ex vivo radyoaktif olmayan LLNA ile bulunan EC3 sonuçları, daha önce yapılmış olan radyoaktif LLNA sonuçları ile uyumludur. Karışımların alerjik potansiyelleri ilk kez bizim tez çalışmamızda tespit edilmiştir. Diğer kimyasal maddelerin sensitizayon potansiyelleri de ilk kez ex vivo radyoaktif olmayan LLNA yöntemi ile tespit edilmiştir. Ayrım indeksi, bütün maddelerin uygulanan konsantrasyonlarda 1 den büyük çıktığı için, bu konsantrasyonlarda uygulanan maddeler sadece alerjik etki göstermis, irritan etki göstermemişlerdir. Kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde artış gösteren sitokin düzeyleri, alerjik temas dermatiti oluşumuna hem Th1 sitokinlerin hem de Th2 sitokinlerin beraber katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Ayrıca yukarıda belirtilen bu kozmetik kimyasalları retrospektif olarak 3 yıl süreli insan yama testi sonuçları taranmış ve değerlendirilmiştir.

Abstract:
The murine local lymph node assay (LLNA) has been developed to detect chemical allergens, and international validation studies have been conducted (ECVAM, ICCVAM). In spite of the validity of the LLNA, attention was drawn to two disadvantages; radioactive in vivo measurement of lymph node cell proliferation (3H-thymidine labeling) and possibility of false positive results caused by non-specific cell activation as a result of inflammatory processes in the skin (irritation). In the present study, we investigated the development of non-radioactive endpoint of LLNA based on 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) (NR-LLNA) and compared in vivo and ex vivo BrdU incorporation by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in order to improve animal welfare. 8-12 weeks old female BALB/c mice were treated by the topical application of these chemicals; 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB), formaldehyde, paraphenylenediamine, balsam of peru, fragrance mix in acetone:olive oil (4:1 v/v) (AOO) at the different concentrations. Ear thickness was also measured to determine the differentiation index (DI) which demonstrates the proportion of non-specific activation due to irritating properties of test compounds. In our study we also investigate, Th1 cytokines (IL-2, IFN-?) and Th2 cytokines (IL-4, IL-5) response following sensitization of Balb/c mice. It was found that in vivo NR-LLNA and also ex vivo NR- LLNA EC3 results of DNCB and the other chemicals were good agreement with previous radioactive LLNA data. The sensitization potency of the mixtures was investigated in our study for the first time. As the differentiation index was >1 for each test compounds, irritant effect was not detected for all applied concentrations. Cytokine analyses results indicate that both Th1 and Th2 cytokines are involved in the regulation of murine contact allergy. On the other hand to evaluate the allergic potency of these cosmetic produts, a retrospective study was aso taken and evaluated the patch test results of patients with contact dermatitis.