Prothioconazole'ün Fusariumun referans suşları üzerindeki etkilerinin hücresel gösterimi
Cellular display of the effects of prothioconazole on Fusarium reference strains
Yazar: MEHMET ARSLAN
Danışman: PROF. DR. GÜLRUH ALBAYRAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Fusarium = Fusarium

Özet:
Bu yüksek lisans tezi kapsamında azol fungusit aktif bileşeni protiokonazolün çeşitli bitki türlerinde hastalıklara neden olan F. graminearum PH1 ve F. culmorum UK99 referans suşları üzerindeki etkileri hücresel düzeyde (oksidatif stres, apoptoz, hücre canlılığı ve mikotoksin üretimi) araştırılmıştır.
Protiokonazolün minimum inhibitör konsantrasyonları (MIK) PH1 ve UK99 için sırasıyla 1,2 μg/ml ve 1 μg/ml olarak belirlendi. Deneylerde PDA besi ortamında yetiştirilen kültürler kontrol grubu olarak kullanılırken, protiokonazolün çözücüsü olan asetonu içeren besi ortamında yetiştirilen kültürler ise normalizasyon grubu olarak kullanıldı. Protiokonazolün IC25 ve IC50 dozları PH1 için sırasıyla 0,3 μg/ml ve 0,6 μg/ml, UK99 için ise 0,25 μg/ml ve 0,5 μg/ml olarak hesaplandı. Bu dozların her iki referansta da radyal büyüme oranlarını azalttığı belirlendi (p<0,001). Bu aktif bileşiğin spor üretimi üzerine etkisi, UK99 referansının czapek dox broth (CDB) besi ortamı kültürlerinde gözlendi. IC50 dozu, kontrole göre makrokonid uzunluğunda (% 66) ve çapında (%123) artışa neden oldu (p<0,001). Protiokonazol tarafından tetiklenenen oksidatif stres ve apoptotik etkiler sırasıyla 2′,7′-diklorodihidrofloresein diasetat (H2DCFDA) boyaması ve akridin turuncusu/etidyum bromür (at/etbr) ikili boyaması kullanılarak ters floresan mikroskobunda hücresel düzeyde görüntülendi. Protiokonazol dozundaki artışa bağlı olarak PH1'de katalaz (IC25 için %105; IC50 için %278) ve süperoksit dismutaz (IC25 için %48; IC50 için %103) aktivitesinin arttırdığı belirlendi (p<0,001). Benzer şekilde, bu iki dozun UK99'da süperoksit dismutaz (IC25 için %38; IC50 için %84) aktivitesinde artışa neden oldukları saptandı (p<0,001). IC25 dozu bu referansda katalaz aktivitesinde anlamlı artışa (%52) neden oldu (p<0,001). Protiokonazolün hücre canlılığına etkileri WST-1 kullanılarak belirlendi. PH1 referansı için, protiokonazolün IC25 ve IC50 dozları hücre canlılığını sırasıyla %40,2 ve %53,82 oranında azalttı (p<0,001). IC25 ve IC50 protikonazol dozları da UK99'un canlı hücre sayısını %25,33 ve %41,93 oranında azalttı (p<0,001). Ayrıca, protiokonazolün UK99 referans suşunda deoksinivalenol (DON) üretim miktarını azalttığı ince tabaka kromotografisinde (ITK) gösterildi.
Yüksek lisans tezi kapsamında, protiokonazolün F. graminearum PH1 ve F. culmorum UK99 referansları üzerindeki etkilerinin hücresel düzeyde gösterilmesi, fungisidal kimyasal bileşenlerin aktive ettiği farklı mekanizmaların bir hücrede gerçek zamanlı olarak izlenebileceğini ortaya koymuştur. Ek olarak, protiokonazolün DON üretimini baskıladığına ilişkin bulgular, halk sağlığının korumasında Fusarium fitopatojenleri ile mücadelede kullanılacak fungisit aktif bileşenlerinin içeriğinde mikotoksin üretimini baskılayan bir ajanın bulunmasının önemini göstermesi bakımından önemlidir.

Abstract:
In the context of this master thesis, the effects of the azole fungicide active ingredient prothioconazole on F. graminearum PH1 and F. culmorum UK99 reference strains causing diseases in various plant species were investigated at the cellular level (oxidative stress, apoptosis, cell viability and mycotoxin production).
The minimum inhibitory concentrations (MIC) of prothioconazole were determined as 1,2 μg/ml and 1 μg/ml for PH1 and UK99, respectively. In the experiments, reference cultures grown on PDA medium were represented as control group, while cultures grown on PDA containing acetone, the solvent of prothioconazole, were used as normalization group. The IC25 and IC50 doses of prothioconazole were calculated as 0,3 μg/ml and 0,6 μg/ml for PH1, 0,25 μg/ml and 0,5 μg/ml for UK99, respectively. These doses were determined to reduce radial growth rates in both references (p<0,001). The effect of this active ingredient on spore production was observed in UK99 reference grown on czapek dox broth (CDB) medium. The IC50 dose caused an increase in macroconidia size (%66) and diameter (%123) compared to the control (p<0,001). Oxidative stress and apoptotic effects triggered by protioconazole were visualized at cellular level under inverted fluorescence microscope using 2′,7′dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) staining and acridine orange/ethidium bromide (ao/etbr) dual staining.. It was determined that catalase (for IC25: %105; for IC50: %278) and superoxide dismutase (for IC25: %48; for IC50: %103) activities increased in PH1 due to the increase in the concentration of prothioconazole (p<0,001). Similarly, it was determined that these two prothioconazole doses caused an increase in superoxide dismutase (for IC25: %38; for IC50: %84) activity in UK99 (p <0,001). The IC25 dose caused a significant increase in catalase activity (%52) in this reference strain (p<0,001). The effect of prothioconazole on cell viability were detected by using WST-1. For PH1 reference, IC25 and IC50 protioconazole doses reduced cell viability at the rate of 40.2% and 53.82%, respectively. IC25 and IC50 doses of proticonazole also reduced the viable cell count of UK99 by 25.33% and 41.93% (p <0.001). In addition, protioconazole has been shown in thin layer chromatography (TLC) to reduce the amount of deoxynivalenol (DON) production in UK99 reference strain.
Within the scope of the master's thesis, demonstration of the influences of prothioconazole on F. graminearum PH1 and F. culmorum UK99 references in cellular level revealed that different mechanisms activated by fungicidal chemical compounds can be monitored in a cell, in real time. In addition, the findings that protioconazole inhibits the DON production are important in terms of demonstrating the importance of the presence of an agent that suppresses mycotoxin production in the composition of fungicidal active ingredients to be used in the fight against Fusarium phytopathogens in protecting public health.