Çevresel şartlara maruz kalmış kan lekelerinin miRNA biyobelirteçleri kullanılarak belirlenmesi /
Yazar: NİLAY LERZAN DALKIRAN
Danışman: PROF. DR. EMEL HÜLYA YÜKSELOĞLU
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Genetik = Genetics
Dizin: Adli bilimler = Forensic sciences ; Kan = Blood ; Kimliklendirme = Identification ; Mikro RNA = Micro RNA ; Vücut sıvıları = Body fluids

Özet:
Adli bilimlerde kimliklendirme suçun tanımlanması ve aydınlatılması, olay yerini ve mağduru 
belirlemede temel kavram denebilecek kadar önemlidir. Bir olay yerinin çevresel koşullarının
yeniden canlandırılması ve olayın aydınlanmasına katkıda bulunması açısından kan ve tükürük 
örneklerinin kimliklendirilmesi önemlidir. Fakat bazı durumlarda kimliklendirme, olay 
yerindeki örneklerin degrade olması nedeniyle ve/veya örnek miktarının eser miktar denecek 
kadar az olması sebebi ile mümkün olmamaktadır. DNA, maruz kaldığı olumsuz çevresel 
koşullar karşısında büyük bir molekül olması sebebiyle daha fazla degrade olmaktadır. Olay 
yerinde karşılaşılan bazı biyolojik örneklerde nükleer DNA'ya ulaşılamadığı durumlarda RNA 
üzerinden kimliklendirmeye gidilebilmektedir. RNA molekülü DNA'ya kıyasla daha korunaklı 
bir molekül olması sebebiyle olay yerinde uzun süre korunmaktadır. Adli bilimler alanında 
vücut sıvılarının tayini için mRNA belirteçleri yerine çevresel koşullarının stabilitesini daha az 
etkilediği düşünülen ve dokuya spesifik olarak tanımlanabilen miRNA belirteçlerinin 
kullanılması üzerine çalışılmalar yapılmaktadır. Ayrıca adli bilimlerde olay yerinden gelen 
örneğin eser miktarda olması sebebi ile miRNA profillemesi ile DNA profillemesi eş zamanlı 
olarak yapılabilmesine imkân sağlamakta ve bu sayede örnek israfı olmadan diğer gerekli 
biyolojik ve kimyasal incelemenin de yapılmasına imkân sağlanmış olmaktadır. Aynı zamanda 
farklı vücut sıvılarının ekspresyon profillerinin farklı olması nedeniyle aynı materyalde birçok 
vücut sıvısı eş zamanlı olarak analiz edilebilmektedir. Adli bilimlerde miRNA profillemesinin 
avantajları olarak miRNA profillemesi ile örnek kaybı önlenirken aynı zamanda birkaç vücut 
sıvısı analizinin eş zamanlı gerçekleştirilebilmesini ve miRNA'nın degradasyona karşı 
mRNA'dan daha dayanıklı olması sayılmaktadır. Dünya genelinde yapılan çalışmalar 
kapsamında miRNA'ların adli bilimler alanına ölüm sonrası geçen zamanı belirleme, biyolojik 
lekenin yaşını belirleme, monozigot bireyleri birbirinden ayırma gibi katkıları olmaktadır. Bu 
çalışmanın amacı ise olay yerinden gelen farklı çevresel koşullara maruz kalmış ve ileri 
derecede degrade olmuş kan lekelerinin hsa-miR-203a-3p ve hsa-miR-451a miRNA 
biyobelirteçleri ile tanımlanmasıdır. Modelleme yöntemi ile olası olay yeri çevresel şartları 
yaratılarak örnekler bu koşullarda 45 gün bekletilmişve bu biyolojik örneklerden miRNA 
biyobelirteçleri ile tanımlanarak adli bilimlere katkısı araştırılmıştır. Analiz için RNA 
İzolasyonu; Purezol İzolasyon Reaktifi ile, cDNA Eldesi; The Mir-X miRNA First-Strand 
Synthesis Kit ile ikiside manuele uygun gerçekleştirilmiştir. Ekspresyon Analizi; kit 
prosedürlerine uygun olarak (Denatürasyon 95°C'de 10 sn; qPCR x 40 döngü 95°C'de 5 sn, 
60°C'de 20 sn; Ayrışma Eğrisi 95°C'de 60 sn, 55°C'de 30 sn, 95°C'de 30 sn) parametreler ile 
gerçekleştirilmiştir. Kantitatif analiz için snRNA U6 geni referans gen olarak kullanılmıştır.
Delta Ct (Cycle threshold) yöntemi (ΔCt) miRNA ifadesinin niceliğini ölçmek için 
kullanılmıştır. [ΔCt = Ct (U6) − Ct (miRNA)]. İstatistiksel analiz olarak ANOVA SPSS analizi 
yapılmıştır. +4 derecede bekletilmiş gruba göre diğer gruplar farklı bulunmuştur (p<0.01)
Elde edilen bulgular incelendiğinde; -20°C ve +4 °C'de ve ağzı kapalı poşette bekletilmiş örnek 
grubunda hsa-miR-203a-3p ifadesi görülmemiştir, fakat hsa-miR-451a ifadesi görülmektedir
(p<0.01). Toprakta bekletilmiş, göl suyunda ve deniz suyunda bekletilmiş örnek gruplarında
hsa-miR-203a-3p ve hsa-miR-451a ifadesi elde edilememiştir. Tam konsantre çamaşır suyunda, 
1/10 oranında seyreltilmiş çamaşır suyunda bekletme ve Çamaşır makinesinde sıcak ayarda 
(60°C), çamaşır makinesinde soğuk ayarda (20°C) yıkama + 24 saat oda sıcaklığında kurutulan 
örnek gruplarında hsa-miR-203a-3p ve hsa-miR-451a gen ifadeleri ortam genetik materyale 
zarar verdiğinden çalışılamamıştır. Sonuç olarak, suç mahallinde -20°C ve +4 °C'de ve ağzı 
kapalı poşette muhafaza edilmiş üzerinde kana benzeyen bir leke gözlemlenen kot kumaşı
bulunduğunda lekenin kan olup olmadığının ayrımı hsa-miR-451a miRNA ifadesi ile 
yapılabilmektedir.

Abstract:
Identification in forensic sciences is so important that it can be called a basic concept in defining 
and clarifying the crime, determining the crime scene and the victim. Identification of blood 
and saliva samples is important in terms of recreating the environmental conditions of a crime 
scene and contributing to the clarification of the event. However, in some cases, identification 
is not possible because the samples found at the crime scene are excessively degraded and/or 
because the sample amount is so small that it can be called a trace amount. Since DNA is a 
large molecule in the face of adverse environmental conditions it is exposed to, it degrades 
more. In some biological samples encountered at the crime scene, in cases where nuclear DNA 
cannot be reached, identification can be made via RNA. Since the RNA molecule is a more 
protected molecule compared to DNA, it is preserved for a long time at the crime scene. In the 
field of forensic sciences, instead of mRNA markers for the determination of body fluids, 
studies are carried out on the use of miRNA markers, which are thought to affect the stability 
of environmental conditions less and can be defined specifically for tissue. In addition, due to 
the trace amount of the sample from the crime scene in forensic sciences, it allows miRNA 
profiling and DNA profiling to be performed simultaneously, and thus, other necessary 
biological and chemical examinations are provided without wasting samples. At the same time, 
due to the different expression profiles of different body fluids, many body fluids can be 
analyzed simultaneously in the same material. The advantages of miRNA profiling in forensic 
sciences are that while miRNA profiling prevents sample loss, several body fluid analyzes can 
be performed simultaneously and miRNA is more resistant to degradation than mRNA. Within 
the scope of studies conducted around the world, miRNAs contribute to the field of forensic 
sciences such as determining the time passed after death, using them as a biomarker for body 
fluids, determining the age of biological stains, and distinguishing monozygotic individuals 
from each other. The aim of this study is to profiling highly degraded blood stains from the 
4
crime scene, exposed to different environmental conditions, with hsa-miR-451a and hsa-miR203a-3p miRNA biomarkers. With the modeling method, possible crime scene environmental 
conditions will be created and the samples will be exposed to these conditions, and these 
biological samples will be profiling with miRNA biomarkers. For analysis, RNA Isolation; 
Purezol Isolation Reagent; Obtaining cDNA with The Mir-X miRNA First-Strand Synthesis 
Kit.both were performed manually. Expression Analysis; in accordance with kit procedures 
(Denaturation 10 sec at 95°C; qPCR x 40 cycles 5 sec at 95°C, 20 sec at 60°C; Dissociation 
Curve 60 sec at 95°C, 30 sec at 55°C sec, 30 sec at 95°C). The snRNA U6 gene was used as a 
reference gene for quantitative analysis. The Delta Ct (Cycle threshold) method (ΔCt) was used 
to quantify miRNA expression. [ΔCt = Ct (U6) − Ct (miRNA)]. Anova spss analysis was 
performed as statistical analysis. Other groups were found to be different compared to the group 
kept at +4 degrees. (p<0.01).
When the findings are examined; Hsa-miR-203a-3p expression was not observed in the sample 
group kept at -20°C and +4 °C and in a sealed bag, but hsa-miR-451a expression was observed
(p<0.01). The expression of hsa-miR-203a-3p and hsa-miR-451a could not be obtained in the 
sample groups kept in soil, lake water and sea water. Hsa-miR-203a-3p and hsa-miR-451a gene 
expressions in fully concentrated bleach, soaking in bleach diluted 1/10 and washing in the 
washing machine at hot setting (60°C), washing machine at cold setting (20°C) + drying at 
room temperature for 24 hours, could not be studied because the environment damages the 
genetic material. As a result, when there is a denim fabric on which a blood-like stain is 
observed, stored at -20°C and +4°C and in a sealed bag at the crime scene, it is possible to 
distinguish whether the stain is blood or not by expression of hsa-miR-451a miRNA (p<0.01).