Antisens oligonükleotid taşıyan sistem geliştirilmesi ve in vitro tayini
Development of a novel delivery system for antisense oligonucleotides and its in vitro investigation
Yazar: BURCU ENNELİ
Danışman: PROF.DR. JÜLİDE AKBUĞA
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Kitosan = Chitosan ; Kompleksler = Complexes ; Nanopartiküller = Nanoparticles

Özet:
Antisens oligonükleotidler (AS ODN), hedef mRNA veya pre-mRNA'yakomplementer dizilise sahip olan ve selektif hibridizasyon ile gen ekspresyonunudurduran, kısa, sentetik, tek zincirli DNA molekülleri olup; kanser, AIDS gibi pekçokhastalıgın tedavisi için gelecek vaad etmektedirler. Ancak bu moleküllerin tedavidekullanılmalarında en büyük sorun; stabilitelerinin ve hücreye penetrasyonlarının düsükolması ve bu nedenle de uygun bir tasıyıcı sisteme ihtiyaç duyulmasıdır.Bu çalısmada katyonik bir polimer olan kitozanla AS ODN'lerin kompleks venanopartikül formları hazırlanmıs; yüzey yükü, partikül büyüklügü gibi fizikokimyasalözellikleri incelenmis ve uygun formülasyonların in vitro hücre kültüründe antisensetkinlikleri arastırılmıstır. Yaklasık 200 nm boyutunda oldukları belirlenen 1:20 ve 1:100(AS ODN: Kitozan) kompleksler ile nanopartiküllerin antisens özellikleri, HeLahücresinde pSV-Beta-Gal plazmidi tarafından kodlanan Beta-galaktozidazekspresyonunun AS ODN tasıyıcı sistemlerin verilmesinden sonraki inhibisyonu ileölçülmüstür.Sonuçta, her iki formda da kitozan, AS ODN'leri enzimatik parçalanmadankoruyabilmistir ancak nanopartiküllerde, AS ODN ile kitozan arasında çok güçlüelektrostatik bagların olusması sonucunda AS ODN salınımı gerçeklesmemistir veantisens özelliginin de düsük oldugu saptanmıstır. 1:100 (-/+) komplekslerinde iseözellikle pDNA'nın transfeksiyonundan 24 saat sonra hücrelere AS ODN verilmesiyleyüksek antisens etkinlik saptanmıstır.Kitozanın özellikle fosforotiyoat modifikasyonlu AS ODN için iyi bir tasıyıcı oldugugörülmüstür. Bu çalısma, gelecekte kitozan polimeri ile yapılacak antisens oligonükleotidtasıyıcı sistem arastırmaları için temel olusturmaktadır.Anahtar sözcükler: Antisens oligonükleotid, Kitozan, Kompleks, Nanopartikül, n vitro.

Abstract:
Antisense oligonucleotides (AS ODNs) are short, single-stranded, synthetic moleculesthat have complementary sequences of targeted mRNA or pre-mRNA by which theselective hybridization yields the inhibition of gene expression. These molecules arepromising molecules in the treatment of diseases such as cancer, AIDS, etc. However, themajor problems in using such molecules in the treatment of the diseases mentioned above,are lack of stability and poor penetration into the cell, therefore; a spesific carrier isneeded.In this thesis, the complex and nanoparticle forms of AS ODNs were prepared byusing a cationic polymer called chitosan. Afterwards, the physicochemical properties suchas zeta-potential and particle size of these formulations were measured and the antisenseactivity of the appropriate formulations were investigated in vitro. The antisense activityof 1:20 and 1:100 (AS ODN: Chitosan) complexes and nanoparticles which haveapproximately 200 nm particle size, were measured based on the inhibition of Betagalactosidasecoded by pSV-Beta-Gal plasmid followed by the addition of antisensecontaining formulations into the HeLa cells.Eventually, both forms protected AS ODNs from potential enzymatic degredations.However, due to the strong electrostatic bonds between chitosan and AS ODN innanoparticle formulations, AS ODN failed to be released and consequently, the antisenseactivity of nanoparticles were observed to be poor. In 1:100 (-/+) complex formulations,high antisense activity was observed especially in the case of adding AS ODNs after 24hours from pDNA transfection into the cell.As a result, chitosan can be considered as a suitable carrier especially forphosphorothioate modified AS ODNs. This study can form the basis for the forthcomingstudies related with carrier systems of AS ODNs that will be done with chitosan polymer.Keywords: Antisense oligonucleotide, Chitosan, Complex, Nanoparticle, In vitro.