Pulmoner nöroendokrin hücrelerin akciğer fibrozisi üzerinde muhtemel rolleri
Possible roles of pulmonary neuroendocrine cells on pulmonary fibrosis
Yazar: ÖZGECAN KAYALAR
Danışman: PROF. DR. FÜSUN ÖZTAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Göğüs Hastalıkları = Chest Diseases

Özet:
Pulmoner fibrozis, alveolar epitelde şiddetli hasar sonrası inflamasyonun artışı, geri dönüşümsüz olarak fibroblast ve miyofibroblast sayısında artış ve ekstrasellular matriks elemanlarının aşırı birikimi ile karakterize edilir. Pulmoner nöroendokrin hücreler havayollarının dallanma bölgelerinde epitelde yerleşirler ve akciğer fizyolojisinde ve biyolojisinde fonksiyon gösteren hücrelerdir. Etkilerini ürettikleri biyoamin ve peptid tabiatli moleküller ile gerçekleştirirler. Bu hücrelerden salgılanan en önemli peptidler gastrin serbestleştirici peptid (GRP) ve kalsitonin geniyle ilişkili peptid (CGRP)'dir. Bu peptidleri içeren PNEC'lerin pulmoner fibrozisli hastaların akciğerlerinde arttığı bilinmektedir. Ancak her iki peptidin pulmoner fibrozis patogenezindeki etkileri (hücre proliferasyonu, epiteliyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve fibroblast-miyofibroblast farklılaşması) moleküler düzeyde araştırılmamıştır. Bu çalışmanın amacı, GRP ve CGRP'nin hem epitel (insan A549 epitel hücre hattı) hem de fibroblast (MRC5 insan akciğer fibroblastları) hücrelerinde proliferasyon,  EMT ve fibroblast-miyofibroblast farklılaşma sürecine etkilerini tespit etmek ve bu patolojik süreçlere etkilerini hangi fibrotik sinyal yolları ve molekülleri üzerinden gerçekleştirdiklerini göstererek pulmoner fibrozisteki etkilerini ortaya koymaktır. 
İnsan A549 ve MRC5 hücreleri PBS'de çözündürülmüş GRP (10-5, 10-6, 10-7 M) , CGRP (10-6, 10-7, 10-8 M) ve 5 ng/ml TGF-β ile uyarıldılar. Hücreler, uyarımı takip eden 24, 48 ve 72. saatlerde toplandılar. Proliferatif ve fibrotik etkili dozların belirlenmesi için hücreler üzerinde MTT hücre canlılık testi ve BrdU proliferasyonu testi gerçekleştirildi. A549 hücrelerinde EMT ve MRC5 hücrelerinde miyofibroblast farklılaşması, bu süreçlerde etkili moleküllerin ve transforme edici büyüme faktörü-β (TGF-β) ve Wnt sinyal yollarında görevli moleküllerin protein (Western emdirim) ve gen ekspresyon analizleri (qRT-PCR) ile değerlendirildi.
GRP ve CGRP'nin üç dozununda A549 ve MRC5 hücre canlılıkları üzerine toksik etkili olmadıkları belirlendi. Hücre proliferasyonu sonuçlarına göre,  GRP ve CGRP'nin üç dozu da A549 hücrelerinde BrdU  miktarını arttırdı. Bu petidler, MRC5 hücrelerinde ilk 24 saatte BrdU miktarını artırırlarken, 72. saate doğru azalttılar. GRP ve CGRP,  A549 hücrelerinde EMT'yi uyarmazken,  MRC5 hücrelerinde fibroblastların-myofibroblastlara farklılaşmasını uyardı. GRP, Smad4 ve Smad2/3 protein seviyelerini ve Smad2/3 aktivasyonunu arttırarak fibroblast-miyofibroblast farklılaşmasını uyardı. CGRP, Smad4 protein seviyelerini ve Smad2/3 aktivasyonunu arttırıp Smad 7 protein seviyelerini azaltarak fibroblast/miyofibroblast farklılaşmasını uyardı. GRP, fibrotik sürecin başlangıcında Wnt5a protein seviyelerini azaltıp fibrotik sürecin başından itibaren Wnt4, Wnt7a ve total β-katenin protein seviyelerini arttırarak β-katenin aktivasyonunu uyardı. CGRP, fibrotik sürecinde Wnt4, Wnt5a ve Wnt7a protein seviyelerini dengeleyerek β-katenin aktivasyonunu uyardı. GRP, ACTA2, VIM ve COL1A1 genlerinin ekspresyonlarını uyarırken CGRP ise ACTA2 ve COL1A1 gen ekspresyonunu uyardı. GRP, SMAD2 geninin transkripsiyonunu değiştirmezken TGFB1, SMAD4 ve SMAD3 genlerinin transkripsiyonunu uyardı. SMAD7 transkripsiyonunu azalttı. CGRP, TGFB1, SMAD2, SMAD3 ve SMAD4 genlerinin transkripsiyonunu arttırırken SMAD7 geninin transkripsiyonunu azalttı. GRP, CTNNB1 gen ekspresyonunu arttırıp DKK1 gen ekspresyonunu azalttı. CGRP, CTNNB1, GSK3B, AXIN ve LEF1 gen ekspresyonunu değiştirmezken DKK1 transkripsiyonunu azalttı. GRP'nin kendi ligand (GRP) gen ekspresyonunu artırırken reseptör (GRPR) gen ekspresyonunu değiştiremedi. CGRP, CALCB gen ekspresyonunu değiştirmezken CALCA ve CALCB gen ekspresyonlarını arttırdı. TGF-β, GRP'nin ligand ve reseptör gen ekspresyonlarını artırırken CGRP'nin ligand ve reseptör gen ekspresyonları üzerinde etkili değildi. GRP uygulamaları MRC5 hücrelerinde, protein kinaz C-delta (PKCD) ve  PKCZ genlerinin ekspresyonlarını etkilerken, protein kinaz A (PKA) ve CREB1 gen ekspresyonu üzerinde anlamlı bir değişikliğe sebep olmadı. CGRP uygulamaları MRC5 hücrelerinde, PKA ve PKCZ genlerinin ekspresyonu üzerinde anlamlı bir değişikliğe sebep olmazken, deneyin 0. saatiyle karşılaştırıldığında PKCD gen ekspresyonunu 72. saatte (p<0,05) anlamlı düzeylerde arttırdı.
Bulgularımız, GRP ve CGRP'nin, MRC5 fibroblast hücrelerinde doza bağlı olarak hücre proliferasyonu ve bu hücrelerin miyofibroblastlara farklılaşmasını uyarırken, A549 hücrelerinde sadece hücre proliferasyonunu uyarma yönünde etkisini göstermektedir. GRP ve CGRP, MRC5 fibroblast miyofibroblast farklılaşması yanısıra, zamana bağlı olarak kollajen (gen ve protein) ve fibronektin protein sentezini uyarmaktadır. Ek olarak, GRP ve CGRP, MRC5 fibroblast hücrelerinde miyofibroblast farklılaşması ve ECM elemanlarının üretimini Smad bağımlı TGF-β ve Wnt sinyal aktivasyonu aracılığı ile gerçekleştirmektedir. Ayrıca, GRP ve CGRP, MRC5 hücrelerinde Wnt4, Wnt5a ve Wnt7a ligandları aracılığıyla miyofibroblast farklılaşmasını kontrol etmektedir. Tüm bu sonuçların yanında, GRP ve CGRP ile uyarılan MRC5 hücrelerinde PKCZ gen ekspresyonunda anlamlı artışlar ve PKA gen ekspresyonunda anlamlı azalışlar, bu hücrelerde TGF-β ve Wnt sinyallerinin aktivasyonuna katkı sağlar. Sonuç olarak, GRP ve CGRP pulmoner fibrozisin tedavisinde hedef moleküllerdir. GRP ve CGRP sinyallerinin inhalasyon yoluyla verilen çeşitli spesifik inhibitörler, antagonistler ve siRNA uygulamaları tarafından azaltılmasını pulmoner fibrozisin geriletilmesinde potansiyel bir terapi olarak önermekteyiz. In vitro deneylerden elde ettiğimiz sonuçların in vivo deneyler ile doğrulanması bu moleküllerin terapötik olarak kullanılma şansını arttıracaktır.

Abstract:
Pulmonary fibrosis is characterized by increased inflammation after a severe injury in the alveolar epithelium, an increase in the number of fibroblasts and myofibroblasts irreversibly and excessive accumulation of extracellular matrix components. Pulmonary neuroendocrine cells are located in the epithelium at the branching regions of the airways and function in lung physiology and biology. They occur their effects via bioamines and peptide-based molecules. The most important peptides released from these cells are the gastrin releasing peptide (GRP) and the calcitonin gene associated peptide (CGRP). It is known that the PNECs containing these peptides increase in the lungs of patients with pulmonary fibrosis. However, the effects of both peptides on the pathogenesis of pulmonary fibrosis (cell proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT) and fibroblast-myofibroblast differentiation) have not been investigated at the molecular level. The purposes of this study were to determine the effects of GRP and CGRP on the proliferation, EMT and fibroblast-myofibroblast differentiation processes in both epithelium (human A549 epithelial cell line) and fibroblast (MRC5 human lung fibroblasts) cells and to explain their effects on these pathological processes. Additionally, it was to show their effect on pulmonary fibrosis.

Human A549 and MRC5 cells were stimulated with GRP (10-5, 10-6, 10-7 M),   CGRP (10-6, 10-7, 10-8 M) and 5 ng /ml TGF-β dissolved in PBS. Cells were harvested at 24th, 48th and 72th hours following stimulation. For the determination of proliferative and fibrotic effective doses, the tests of MTT cell viability and BrdU proliferation were performed on the cells. We were evaluated myofibroblast differentiation in MRC5 cells  and EMT in A549 cells by protein (s) and gene expression analyses (qRT-PCR) of the molecules that are active in these processes, and transforming growth factor-β (TGF-β) and Wnt signaling pathways.

Thrree doses of GRP and CGRP were not toxic on cell viability of A549 and MRC5. According to cell proliferation results, three doses of GRP and CGRP increased the amount of BrdU in A549 cells. These peptides increased the amount of BrdU in MRC5 cells in the first 24 hours while decreasing to 72 hours. While GRP and CGRP did not stimulate EMT in A549 cells, they stimulated the differentiation of MRC5s into myofibroblasts. GRP induced fibroblast-myofibroblast differentiation by increasing Smad4 and Smad2/3 protein levels, and Smad2/3 activation. CGRP stimulated fibroblast/myofibroblast differentiation by increasing Smad4 protein levels and Smad2/3 activation and decreasing Smad7 protein levels. GRP decreased Wnt5a protein levels at the beginning of the fibrotic process and has stimulated β-catenin activation by increasing Wnt4, Wnt7a and total β-catenin protein levels since the beginning of the fibrotic process. CGRP induced β-catenin activation by balancing Wnt4, Wnt5a and Wnt7a protein levels in the fibrotic process. GRP stimulated the expression of ACTA2, VIM, and COL1A1 genes, while CGRP induced ACTA2 and COL1A1 gene expression. GRP did not alter the transcription of the SMAD2 gene but stimulated the transcription of TGFB1, SMAD4, and SMAD3 genes. Furthermore, it reduced the transcription of SMAD7. CGRP enhanced the transcription of TGFB1, SMAD2, SMAD3, and SMAD4 genes while reducing the transcription of the SMAD7 gene. GRP increased CTNNB1 gene expression and reduced DKK1 gene expression. CGRP did not alter CTNNB1, GSK3B, AXIN, and LEF1 gene expression while reducing DKK1 transcription. GRP increased  the own ligand (GRP) gene expression while it did not change the receptor (GRPR) gene expression. CGRP did not alter CALCB gene expression but increased CALCA and CALCB gene expression. TGF-β increased the ligand and receptor gene expression of GRP, but not the ligand and receptor gene expression of CGRP. GRP applications did not cause a significant change in protein kinase A (PKA) and CREB1 gene expressions while affecting the expression of PKCD and PKCZ in MRC5 cells. In the study, CGRP significantly increased gene expression of PKCD in the 72th h (p <0.05) when compared to the 0th h. Hovewer, it did not significantly change in the gene expressions of PKA, PKCZ and CREB1.

Our results show that GRP and CGRP induce cell proliferation and differentiation of MRC5 into myofibroblasts, whereas they only affect cell proliferation in A549 cells. GRP and CGRP stimulate myofibroblast differentiation, as well as time-dependent collagen (gene and protein) and fibronectin protein synthesis  in MRC5 fibroblast. In addition, GRP and CGRP perform myofibroblast differentiation and production of ECM elements in MRC5 fibroblast cells via Smad-dependent TGF-β and Wnt signal activation. Furthermore, GRP and CGRP regulate myofibroblast differentiation through Wnt4, Wnt5a and Wnt7a ligands in MRC5 cells. In addition to all these results, significant increases in PKCZ gene expression in MRC5 cells induced by GRP and CGRP and significant decreases in PKA gene expression contribute to the activation of TGF-β and Wnt signals in these cells. In conclusion, GRP and CGRP are target molecules in the treatment of pulmonary fibrosis. Reduction of GRP and CGRP signals by various specific inhibitors, antagonists and siRNA administration by inhalation is recommended as a potential therapy in the regression of pulmonary fibrosis. Verification of the results, we obtained from in vitro experiments, by in vivo experiments would increase the chances of these molecules to be used therapeutically.