E2F1 transkrı̇psı̇yon faktörü'nün aktı̇vasyonunda proteı̇n kı̇naz-A'nın rolünün araştırılması
Investigation of the role of protein kinase-a in E2F1transcription factor activation
Yazar: MUSTAFA GÖKHAN ERTOSUN
Danışman: PROF. DR. OSMAN NİDAİ ÖZEŞ
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: E2F1 = E2F1 ; Fosforilasyon = Phosphorylation ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Hücre döngüsü = Cell cycle ; Hücreler = Cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Protein kinazlar = Protein kinases

Özet:
Adenoviral E1 ve E2 genlerinin, transkripsiyondan sorumlu olduğunun gösterilmesi ile keşfedilen E2F1 geni, 20. kromozomun uzun kolunda yer almaktadır. Translasyon ürünü ise 437 aminoasitlik bir proteindir. Dimerizasyon partneri ile dimer oluşturduktan sonra E2F1 hücre siklusunun G1 aşamasında aktif hale geçmekte ve hücre bölünmesi ile ilgili DNA Polimeraz gibi birçok sayıda genin transkripsiyonunu kontrol etmektedir. Transkripsiyonel olarak kontrol edilebilen E2F1 aktivitesinin post-translasyonel modifikasyonlar ile de kontrol edildiği görülmektedir. Translasyon sonrası E2F1, P/CAF aracılığıyla asetilasyona, Set 9 ile metilasyona ve CHK2 aracılığıyla da fosforilasyona uğrayabilmektedir. Set 9-aracılı metilasyonu E2F1'in parçalanmasına yol açarken, CHK2 ve P/CAF modifikasyonları ise metilasyonu engelleyerek proteinin stabilizasyonunu sağlamaktadır. DNA Hasarı, UV maruziyeti gibi patolojik koşullarda post-translasyonel modifikasyonlara uğrayan E2F1'in, fizyolojik koşullarda da çeşitli moleküller tarafından post- translasyonel modifikasyonlara uğratılması mümkündür. Epinefrin, adrenalin, endotelin-1 ve çok sayıda kemokin hücre fizyolojisinde hayati fonksiyonlar görürler ve etkinliklerini GPCR (G-protein coupled receptors) olarak isimlendirilen reseptörlere bağlanarak gösterirler. Bu reseptörlerin bahsedilen ligantları tarafından aktive edilmeleri durumunda pek çok yolak aktive edilir ve bu yolaklardan biri de Adenilat Siklaz dır. Aktive edilen Adenilat siklaz ATP'den cAMP oluşturur. Bunun yanı sıra cAMP seviyesi hücre içi glukoz miktarının azaldığı durumlarda da yükselir. cAMP ilk keşfedilen ikincil mesajcı olup hücrede biyolojik etkinliğini PKA enzimini aktive ederek gösterir. Aktive olan PKA biyolojik aktivitesini hedef proteinlerinde RxxS/T konsensus dizisinde yer alan Serin (S) veya Treonin (T) amino asitlerini fosforile ederek gösterir. Genel olarak hücre içi cAMP seviyesinin artmasına bağlı PKA aktivasyonu hücre proliferasyonunu negatif olarak etkiler. Bu gerçekler ışığında, aktive edilen PKA enziminin hücre döngüsünün başlamasını kontrol eden E2F1 aktivitesini negatif etkileyeceğini düşündük. Bu bilgiler doğrultusunda, E2F1'in PKA substratı olup olmayacağını görmek için E2F1'in aminoasit dizisini incelediğimizde E2F1 proteininde üç adet muhtemel PKA konsensus fosforilasyon bölgesi saptadık. Bu fosforilasyon noktaları, 127-130, 232-235 ve 361-364 pozisyonlarında lokalize olan RYET, RLLS ve RMGS amino asit dizileridir. Bu bölgelerdeki Treonin ve Serin amino asitlerinin PKA tarafından fosforile edilebileceğini ve bu fosforilasyonların E2F1 aktivitesini etkileyeceğini düşünerek ilgili amino asitlerin kodonlarını yarattığımız ökaryotik E2F1 ekspresyon vektöründe fosforile edilemeyen Alanin ve fosforilasyonu taklit eden negatif yüklü Glutamik Asit kodonlarına çevirdik. Elde ettiğimiz sonuçlara göre, PKA-aracılı E2F1 fosforilasyonunun hücre proliferasyonu, apoptozis indüksiyonu, glukoz alımı ve Sisplatin-aracılı hücre ölümüne etki ettiğini gösterdik.

Abstract:
E2F1 gene, which was discovered by the demonstration that adenoviral E1 and E2 genes were responsible for transcription of viral genome, resides on the long arm of 20th chromosome. Its product is a protein comprising 437 aminoacids. After dimerizing with its partner, E2F1 becomes active during G1 phase of cell cycle and induces the transcription of numerous cell cyle-associated genes such as that of DNA Polymerase. As well as being transcriptionally controlled, E2F1 activity is modulated by means of post-translational modifications. Post-translationally, E2F1 is acetylated by P/CAF, methylated by Set 9 and phosphorylated by CHK2. While Set 9-mediated methylation leads to degradation of E2F1, CHK2 and P/CAF-mediated modifications prevent Set9-mediated methylation and prevents its degradation. In addition to post-translational modifications occurring in response to pathological situations like UV exposure and DNA damage, E2F1 can also undergo post- translational modifications by various molecules under physiological conditions. Epinefrin, adrenalin, endotellin-1 and numerous chemokines play pivotal role in cell physiology, and these transmit their signals by binding to GPCR (G-protein coupled receptors). Activation of these receptors by above mentioned ligands induces activation of several pathways one of which is Adenylate cyclase. Activated adenylate cyclase produces cAMP from ATP. In addition to these, cellular cAMP levels is also increased when glucose level goes down. cAMP is the first second messenger discovered and elicits its biological effect by activating PKA enzyme. Activated PKA elicits its biological effect by phosphorylating target proteins which contain Serin or Treonin amino acids in concensus RXXS/T motif. In general, increase of cellular cAMP level and resulting PKA activation negatively regulate cell proliferation. Under the light of these we thought that activated PKA would negatively affect the activity of E2F1 which controls initiation of cell cycle. In this regard, to see whether E2F1 can be a substrate for PKA we looked at the amino acid sequence of E2F1 and found three hypothetical consensus PKA phosphorylation sites. These phosphorylation sites are RYET, RLLS ve RMGS amino acid sequences and these are localized at 127-130, 232-235 ve 361-364 positions. By assuming the fact that Serin and Treonin at these sites will be phosphorylated by PKA, and these phosphorylations would affect the activity of E2F1, we converted codons of Serine and Treonin to non-phosphorylatable Alanin and phosphorylation mimicking Glutamic acid codon on eukaryotic E2F1 expression vector we created. According to our results, PKA-mediated phosphorylation of E2F1 seems to have an effect on cell proliferation, induction of apoptosis, glucose uptake and cisplatin-induced cell death.