İndometasin uygulanmış U87 glioma hücrelerinde endoplazmik retikulum stresi ile ilişkili miRNA'ların analizi
Analysis of miRNA's associated with endoplasmic reticulum stress in indomethacin treated U87 glioma cells
Yazar: OZANCAN ULAŞ
Danışman: DOÇ. DR. MURAT PEKMEZ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Endoplazmik retikulum stresi = Endoplasmic reticulum stress ; Glioma = Glioma ; Mikro RNA = Micro RNA ; Protein değeri = Protein value ; İndometazin = Indomethacin

Özet:
Kanser, dünyada ve ülkemizde kardiyovasküler hastalıklardan sonra en çok ölüme sebep olan hastalıktır. Bununla birlikte kanserin tanısı ve tedavisi için kullanılan yöntemler her geçen gün değişmekte ve gelişmektedir. Tanı ve tedavideki gelişmeler dünya genelinde yapılan in vivo ve in vitro kanser çalışmalarının bir sonucudur. Bu yüzden kanserin oluşması ve gelişmesinde görevli mekanizmaların anlaşılması hastaların sağkalım sürelerini uzatabilmek ve yaşam kalitesi yüksek tutabilmek için oldukça önemlidir.
Beyin ve merkezi sinir sistemiyle ilişkili kanserler yetişkin bireylerde az görülen tümörler olarak değerlendirilse de ölümle sonuçlanan kanserler arasında üçüncü sırada yer almaktadır. Beyin ve merkezi sinir sistemiyle ilişkili kanserlerdeki tümör tipleri arasında en agresif yapıda olan ve en bilineni glioblastoma olup hastalığın tanısının koyulmasının ardından ortalama hayatta kalma süresi 12-15 ay olarak bilinmektedir.
Endoplazmik retikulumun (ER) fizyolojik ve/veya patolojik sebeplerle homeostazının bozulması, lümende katlanmamış veya yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine sebep olmakta ve bu durum ER stresi olarak adlandırılmaktadır. ER stresinin oluştuğu durumlarda hücre, stresin azaltılması veya tamamen ortadan kaldırılması için katlanmamış protein cevabı (UPR) adı verilen bir mekanizma kullanmaktadır. Bu mekanizmada ER membranında bulunan protein kinaz RNA (PKR) benzeri ER kinaz (PERK), inositol gerektiren kinaz 1  (IRE1) ve aktive edici transkripsiyon faktörü 6 (ATF6) isimli moleküller görev almakta ve sinyal mekanizması oluşturmaktadır. Bu mekanizma sonucu hücre, içinde bulunduğu duruma göre hayatta kalabilmekte veya kontrollü hücre ölümü olan apoptoz yoluna gitmeyi seçebilmektedir. 
ER stresinin kanser hücreleri üzerindeki etkileri iki şekilde gerçekleşebilmektedir. Bu etkilerden ilki, uzun süreli ve aşılamayan ER stresi durumlarında UPR'nin apoptozu indükleyerek kanser hücresinin apoptoza gitmesini sağlaması şeklindedir. ER stresinin kanser hücrelerine olan ikinci etkisi ise ortaya çıkan UPR'nin bazı durumlarda tümör büyümesine ve gelişmesine katkı sağlaması olarak bilinmektedir. Kanser hücrelerinin ER stresi yoluyla apoptoza gitmesi endojen sebeplerle olabildiği gibi dışarıdan müdahale edilerek de sağlanabilmektedir.
Non-steroidal anti-inflamatuar (NSAİİ) bir ilaç olan indometasin indolasetik asitten türevlenmiş terapötik bir ajandır. Kanser hücreleri üzerindeki anti-proliferatif etkileri birçok çalışma ile gösterilmiştir. Bu anti-proliferatif etkinin glioma hücrelerinde ER stresi oluşturması yoluyla olduğu ile ilgili de bazı çalışmalar mevcuttur.
MiRNA'lar, 19-24 nükleotid uzunluğunda bulunan ve kodlama yapmayan küçük RNA molekülleridir. Bu moleküller birçok genin anlatımında kritik rol oynamaktadır. Endoplazmik retikulum stresi sonucu oluşan UPR'de görevli olan PERK, IRE1 ve ATF6 ile UPR sürecinde bu moleküllerin etki ettiği C/EBP homolog protein (CHOP) gibi farklı moleküllerin anlatım seviyelerinin miRNA'lar tarafından düzenlenebildiği bilinmektedir. 
Bu tez kapsamında, U-87 malign glioma hücrelerine uygulanan indometasinin, glioma hücrelerinde bir ER stresi oluşturarak, ER stresi sonucu ortaya çıkan katlanmamış protein cevabında görevli proteinlerin anlatımını düzenleyen miRNA'ların moleküler biyobelirteç olarak kullanılmasının mümkün olup olmadığı araştırılmıştır. U -87 MG hücrelerine uygulanan indometasinin etkinliğini değerlendirmek amacıyla hücre ve RNA düzeyinde çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda bazı konsantrasyonlarda indometasin uygulamasının canlı hücre sayısını anlamlı olarak azalttığı görülmüştür. Kontrol grubu, IC20 ve IC50 dozları uygulanan hücrelerden yapılan miRNA izolasyonu sonrası ER stresiyle ilişkili olduğu yapılan çalışmalarla gösterilen; miR-17, miR-221, miR- 455 ve miR-708 gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu tekniğiyle incelendi. İstatistiksel değerlendirmeler sonucunda MiR-17, miR-221, miR-455 ve miR-708'in referans gene göre anlatımının arttığı belirlendi. Bu tez kapsamında elde edilen bulgular, indometasinin glioma hastalarında kullanılabilecek bir terapötik ajan olabileceğini ve indometasin ile indüklenmiş ER stresinde görevli miRNA'ların moleküler biyobelirteçler olarak kullanılabilme potansiyelinin olduğunu göstermiştir.

Abstract:
Cancer is the leading cause of death after cardiovascular diseases in the world and in our country. However, the methods used for the diagnosis and treatment of cancer are changing and developing day by day. Advances in diagnosis and treatment are the result of in vivo and in vitro cancer studies worldwide. Therefore, it is very important to understand the mechanisms involved in the formation and development of cancer in order to prolong the survival of patients and to keep the quality of life high.
Although cancers associated with the brain and central nervous system are considered as rare tumors in adults, they are in the third place among cancers that result in death. Glioblastoma is the most aggressive and well-known tumor type among the cancers associated with the brain and central nervous system, and the average survival time after the diagnosis of the disease is known as 12-15 months.
Disruption of homeostasis of the endoplasmic reticulum (ER) for physiological and/or pathological reasons causes the accumulation of unfolded or misfolded proteins in the lumen, and this situation is called ER stress. In cases where ER stress occurs, the cell uses a mechanism called the unfolded protein response (UPR) to reduce or completely eliminate the stress. In this mechanism, molecules called protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase (PERK), inositol-requiring kinase 1 (IRE1) and activating transcription factor 6 (ATF6) take part in the ER membrane and form a signaling mechanism. As a result of this mechanism, the cell can survive depending on the situation it finds in it, or it can choose to go the way of apoptosis, which is controlled cell death.
The effects of ER stress on cancer cells can occur in two ways. The first of these effects is that the UPR induces apoptosis in cases of prolonged and insurmountable ER stress, enabling the cancer cell to undergo apoptosis. The second effect of ER stress on cancer cells is that the resulting UPR contributes to tumor growth and development in some cases. Apoptosis of cancer cells through ER stress can be caused by endogenous reasons or by external intervention.
Indomethacin, a non-steroidal anti-inflammatory (NSAID) drug, is a therapeutic agent derived from indolacetic acid. Its anti-proliferative effects on cancer cells have been demonstrated by many studies. There are also some studies about this anti-proliferative effect by creating ER stress in glioma cells.
MiRNAs are small non-coding RNA molecules that are 19-24 nucleotides in length. These molecules play a critical role in the expression of many genes. It is known that miRNAs can regulate the expression levels of different molecules such as PERK, IRE1 and ATF6, which are involved in the UPR resulting from endoplasmic reticulum stress, and C/EBP homologous protein (CHOP), which these molecules act on during the UPR process.
In this thesis, it was investigated whether indomethacin applied to U-87 malignant glioma cells could be used as a molecular biomarker of miRNAs that regulate the expression of proteins involved in the unfolded protein response resulting from ER stress by creating an ER stress in glioma cells. Cell and RNA level studies were performed to evaluate the efficacy of indomethacin administered to U-87 MG cells. As a result of these studies, it was observed that the application of indomethacin at some concentrations significantly reduced the number of viable cells. After miRNA isolation from cells in the control group, IC20 and IC50 doses were shown to be associated with ER stress; miR-17, miR-221, miR-455 and miR-708 were analyzed by real-time polymerase chain reaction technique. As a result of various statistical evaluations, it was determined that the expression of miR-17, miR-221, miR-455 and miR-708 increase compared to the reference gene. Findings from all the studies performed have shown that indomethacin can be a therapeutic agent that can be used in glioma patients, and miRNAs involved in indomethacin-induced ER stress can be used as molecular biomarkers.