Mastitisli inek sütlerinden izole edilen koagulaz negatif stafilokokların moleküler karakterizasyonu ve virulens genlerinin tespiti
Molecular characterization of coagulase negative staphylococci isolated from mastitis cow milks and detection of virulence genes
Yazar: DUYGU ULAŞ
Danışman: PROF. DR. HASAN HÜSEYİN HADİMLİ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Genler = Genes ; Mastit = Mastitis ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Staphylococcus = Staphylococcus ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Virülans = Virulence ; İnek sütü = Cow milk ; İnekler = Cows

Özet:
Bu çalışmada, mastitisli ineklerin sütlerinden izole edilen koagülaz negatif stafilokok (KNS) izolatlarının; fenotipik (β-laktamaz aktivitesi, kapsül varlığı, slime üretimi, hemoliz, DNase, TNase), genotipik özellikleri (16S rRNA, tuf) ile antibiyotik (mecA, blaZ, tetK, tetM, ermA, ermB, ermC, InuA) ve virülens genlerinin (icaA, icaD, sea, seb, sec, sed, see) belirlenmesi amaçlandı. 
Bu çalışma, Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Kültür koleksiyonunda bulunan 200 KNS izolatıyla gerçekleştirildi. KNS izolatlarının hemoliz özellikleri kanlı agarda, slime üretimi kongo red eklenmiş Brain-Heart Infusion besiyerinde, β-laktamaz aktivitesi ticari test strip ile, TNase aktivitesi TNase agarda, DNase aktivitesi DNase agarda, kapsül varlığı çini mürekkebi ile belirlendi. DNA ekstraksiyonu yapılan izolatlar PZR ile; 16S rRNA, tuf, mecA, blaZ, tetK, tetM, ermA, ermB, ermC, InuA, icaA, icaD, sea, seb, sec, sed, see genleri yönünden değerlendirildi. Genotipik özeliklerinde 16S rRNA için MSQ, tuf için tuf; antibiyotik dirençliliğinde metisilin için mecA, β-laktam için blaZ, linkosamid için InuA, makrolid için ermA, ermB, ermC, tetrasiklin için tetM, tetK primerleri kullanıldı. Virülens genlerin tespitinde slime için icaA, icaD, enterotoksin için sea, seb, sec, sed, see primerleri kullanıldı.
KNS izolatlarının hiç birinde kapsül varlığı görülmezken, izolatların 67'sinin (%33,5) slime oluşturduğu, 53'ünün (%26,5) β-laktamaz pozitif olduğu, 57'sinin (%28,5) alfa hemoliz, 67'sinin (%33,5) beta hemoliz, 76'sının (%38) gama hemoliz oluşturdu. İzolatların 123'ünün (%61,5) DNase pozitif, 41'inin (%20,5) TNase pozitif olduğu belirlendi. İzolatların tamamının 16S rRNA ve tuf geni taşıdığı görüldü. Slime üretiminden sorumlu icaA ve icaD genleri 184 (%92) izolatta belirlendi. İzolatlarda enterotoksin genler görülmedi. KNS izolatlarının 3'ü (%1,5) metisiline, 167'si (%83,5) β-laktama, 127'si (%63,5) linkosamide direnç gösterdi. İzolatlarda makrolid direncini kodlayan ermA, ermB, ermC genleri sırasıyla 36 (%18), 85 (%42,5), 112 (%56) belirlenirken; Tetrasiklin direncini kodlayan tetK ve tetM genleri sırasıyla 45 (%22,5), 2 (%1) saptandı. İzolatların birden fazla direnç geni taşıdığıda gözlendi. İzolatların 18'i (%9) dörtlü, 85'i (%42,5)  üçlü, 69'u (%34,5) ikili, 23'ü (%11,5) tek direnç geni taşırken; 5'i (%2,5) direnç geni bulundurmadı.
KNS izolatlarının; yüksek oranda β-laktam, linkosamid ve makrolid, düşük oranda tetrasiklin, metisilin direnç geni taşıdığı, farklı fenotipik özelliklerinin yanı sıra yüksek oranda slime geni bulundurup, enterotoksin geni bulundurmadığı saptandı. KNS türlerinin neden olduğu mastitis mücadele ve tedavisinde bu özelliklerin dikkate alınarak yapılması gerektiği kanaatine varıldı. 
Anahtar Sözcükler: Koagulaz Negatif Stafilokok; Mastitis; PZR

Abstract:
In this study, it was to aimed to determine the phenotypic (β-lactamase, slime production, hemolysis, capsule presence, DNase, TNase) and genotypic properties (16S rRNA, TUF), antimicrobial resistance genes (mecA, blaZ, tetK, tetM, ermA, ermB, ermC, InuA) and virulence genes (icaA, icaD, sea, seb, sec, sed, see) of coagulase negative Staphlylococcus spp. isolated from milk samples of dairy cows with mastitis.
This study was carried out with 200 KNS isolates in Selcuk University Faculty of Veterinary Medicine Culture Collection. Hemolysis properties of KNS isolates were determined on blood agar, slime production on Congo red supplemented Brain-Heart Infusion medium, β-lactamase activity was determined by commercial test strip, TNase activity was determined by TNase agar, DNase activity was determined by DNase agar, capsule presence was determinated with ink.DNA extracts were isolated by PCR; 16S rRNA, tuf, mecA, blaZ, tetK, tetM, ermA, ermB, ermC, InuA, icaA, icaD, sea, seb, sec, sed, see genes were evaluated.In genotypic properties, MSQ for 16S rRNA, tuf for tuf; For antibiotic resistance, mecA for methicillin, blaZ for β-lactam, InuA for linkosamide, ermA, ermB, ermC for macrolide, tetM, tetK for tetracycline primers were used. For the detection of virulence genes, icaA, icaD primers for slime, sea, seb, sec, sed, see primers for enterotoxin were used. 
While capsule formation was not observed in CNS samples, 67 (33,5%) of the isolates were slime, 53 (26,5%) were β-lactamase positive, 57 (28,5%) were alpha hemolytic, 67 (33,5%) were beta hemolytic, 76 (38%) were gamma hemolytic. 123 (61,5%) of the isolates were DNase positive and 41 (20,5%) were TNase positive. 16S rRNA and tuf genes were detected all of isolate. The icaA and icaD genes responsible for slime production were identified in 184 (92%) isolates. Enterotoxin genes were not seen in the isolates. Three (1.5%) of CNS isolates were resistant to methicillin, 167 (83.5%) were resistant to β-lactam and 127 (63.5%) were resistant to linkosamide. The ermA, ermB, ermC genes encoding macrolide resistance in the isolates were 36 (18%), 85 (42.5%), 112 (56%) respectively. The tetK and tetM genes encoding tetracycline resistance were 45 (22.5%) and 2 (1%), respectively. It was also observed that the isolates carried more than one resistance gene. While 18 (9%) of the isolates were quadruple, 85 (42.5%) were triple, 69 (34.5%) were double, 23 (11.5%) were single resistance genes. 5 (2.5%) did not have resistance gene
The isolates tested were found to have different phenotypic and genotypic properties. The majority of isolates had lincosamide, β-lactam, macrolide resistance genes, low resistance to methicillin and tetracycline. While no isolates carry enterotoxin genes, they were found to carry a high rate of slime factor gene. As a result, it was concluded that these features should be taken into consideration in the treatment and protection of infections caused by CNS species.
Keywords: Coagulase Negative Staphylococci; Mastitis; PCR