Farklı kaynaklı Skualen'in in vivo podosit hasarı üzerine etkisi
Effect of different source of Squalene on in vivo podocyte damage
Yazar: RESMİYE IRMAK YÜZÜGÜLDÜ
Danışman: PROF. DR. SÜLEN SARIOĞLU
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Doksorubisin = Doxorubicin ; Podositler = Podocytes ; Skualen = Squalene ; Zeytinyağı = Olive oil ; İn vivo = In vivo

Özet:
Amaç: Podositler glomerüllerin visseral epitelyal hücreleri olup, süzme işlevinde önemli rolleri vardır. Podosit hasarı; minimal değişiklik hastalığı, fokal segmental glomerüloskleroz (FSGS) ve diyabetik nefropati gibi proteinürik glomerülopatiler için ana mekanizmadır. Türkiye'de primer glomerüler hastalıkların ve nefrotik sendromun en sık nedenleri arasında; membranöz nefritin ardından, ikinci sırada yer alan FSGS tedavisinde tüm hastalarda remisyon sağlayabilen bir tedavi rejimi olmadığı gibi, remisyon sağlanan hastalarda tekrarlama oranı %40'lara kadar çıkabilmektedir. Skualen isoprenoid bir bileşik olup, köpek balığı karaciğeri ile zeytinyağı en önemli kaynaklarındandır. Skualen ile ilgili yapılan çalışmalar antioksidan ve antitümöral etkilerine odaklı olup; aşılarda adjuvan olarak, bazı hastalıklarda koruyucu ve önleyici etkileri nedeniyle, ayrıca ilaç ve gen taşıyıcısı olarak da çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Bu çalışma, köpek balığı karaciğer ve zeytinyağı kaynaklı skualenin, deneysel hayvan modelinde, podosit hasarı üzerindeki etkilerini biyokimyasal ve histopatolojik düzeyde araştırmayı hedeflemektedir.
Gereç ve yöntem: Benzer ağırlıklara (300-350 gr) sahip Wistar sıçanlar ile; kontrol, adriyamisin (ADR), zeytinyağı kaynaklı skualen (SQ-Z), köpek balığı kaynaklı skualen (SQ-KK), ADR ile birlikte SQ-Z ve ADR ile birlikte SQ-KK uygulanan toplam altı adet deneysel grup oluşturuldu. Sıçanlara intravenöz ADR (7,5 mg/kg) uygulamasından 1 hafta önce başlanıp, toplam 14 gün boyunca 0.4 ml/gün dozunda SQ (zeytinyağı veya köpek balığı kaynaklı) uygulandı. Adriyamisin uygulamasının yapıldığı gün deney 1. gün olarak kabul edilip, 14. günde ve sakrifizasyondan 1 gün önce 24 saatlik idrarları toplanarak idrar proteinüri, kreatinin ve üre; sakrifizasyon sırasında alınan kan örneklerinde ise kreatinin, kan üre nitrojeni (BUN), total protein ve albümin değerleri analiz edildi. Sıçanlar 23. günde sakrifiye edilerek, böbrek dokularından elde edilen kesitler, hematoksilen eozin (H&E), Periodik asit schiff (PAS), Masson Trikrom, Gümüş metanamin (PAMS) histokimya ve Wilms tümör 1 proteini (WT-1) immünhistokimya boyaları uygulanarak, ışık mikroskopisi ile değerlendirildi. Tüm glomerüller incelenerek, segmental skleroz skor ortalamaları, en yüksek segmental skor değerleri, tübüler atrofi, interstisyel fibrozis ve enflamasyon, tübüler hasar bulguları, TMA bulguları, WT-1 ortalamaları, en yüksek / en düşük WT-1 değerleri araştırıldı. Morfometrik olarak analiz programı yardımı ile 50 adet glomerülün Bowman ve glomerüler yumak alan ölçümleri yapılarak, en yüksek alana sahip %25 glomerülün ortalama değerleri hesaplandı. Gruplar arası sonuçlar istatiksel olarak değerlendirilerek, anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edildi.
Bulgular: Adriyamisin uygulamasına eklenen SQ-KK ve SQ-Z ile, sıçanların ishal bulgularının şiddetinde ve süresinde azalma, genel durumlarında iyileşme, hareketliliklerinde artma olduğu izlendi. Skualen eklenen sıçanların, serum kreatinin ve idrar proteinüri değerlerinde zeytinyağı kaynaklı skualen ile daha belirgin olmak üzere azalma gözlenirken; idrarda üre ve kreatinin atılımının arttığı, glomerüler segmental skleroz şiddeti / yaygınlığı, tübüler hasar ve interstisyel enflamasyon bulgularının varlığı/ şiddeti ile Bowman ve glomerüler yumak alanlarındaki küçülme miktarının azaldığı saptandı. Adriyamisin uygulamasına eklenen her iki kaynaklı skualen uygulaması ile, yine zeytinyağı kaynaklı skualen ile anlamlı olmak üzere (p=0.031); glomerüllerde podosit farklılaşma belirteci olan WT-1 pozitif hücre sayısında artış olduğu gösterildi. Ayrıca SQ uygulanan gruplarda daha az sayıda sıçanda tubuler atrofi ve interstisyel fibrozis gözlendi. Adriyamisin ile SQ-KK'nın birlikte uygulandığı sıçanların yarısında, yaygın ve şiddetli akut TMA bulguları ve erken ölüm dikkati çekti.
Sonuç: Çalışmamızda SQ-KK ve SQ-Z uygulanan sıçanlarda, biyokimyasal ve histopatolojik böbrek hasar bulgularının önemli kısmında iyileşme olduğu saptanmıştır. Ayrıca podositopatinin temel hasar mekanizması olduğu FSGS'de, son yıllarda podosit farklılaşması ve korunmasına yönelik yoğunlaşan çalışmalarla paralel şekilde, mevcut araştırmamızda skualen uygulaması ile spesifik podosit belirteci olan WT-1 pozitif hücre sayısında anlamlı düzeyde fazlalık saptanmış olması skualenin podosit hasarını azaltıyor olabileceğini desteklemektedir.

Abstract:
Objective: Podocytes are visceral epithelial cells of glomeruli and have important roles in filter function. Podocyte damage is the main mechanism for proteinuric glomerulopathies such as minimal change disease, focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) and diabetic nephropathy. Among the most common causes of primary glomerular disease and nephrotic syndrome in Turkey; after membranous nephritis, FSGS takes the second place. In FSGS treatment, there is no treatment regimen that can provide remission in all patients, and the rate of recurrence can be up to 40% in patients with remission. Squalene is an isoprenoid compound, the main sources of which are shark liver and olive oil. Studies related to squalene are focused on antioxidant and antitumoral effects. Squalene is used as an adjuvant in vaccines, because of its protective and preventive effects in some diseases, and also in various fields as a drug and gene carrier. This study aims to investigate the effects of shark liver and olive oil-based squalene on podocyte damage in experimental animal model.
Materials and methods: Six experimental Wistar rat groups with similar weights (300-350 g) were created, with control, adriamycin (ADR), olive oil-derived squalene (SQ-Z), shark-derived squalene (SQ-KK), SQ-Z with ADR, and SQ-KK with ADR. Squalene (from olive oil or shark) was administered at a total dose of 0.4 ml / day for a total of 14 days to rats. One week after the start of SQ application to rats, intravenous ADR (7.5 mg / kg) was started. The day of the application of ADR was accepted as the first day of the experiment. Urine proteinuria, creatinine and urea values were analyzed by collecting 24-hour urine on the 14th day and 1 day before sacrification. Creatinine, blood urea nitrogen (BUN), total protein and albumin values were analyzed in blood samples taken during sacrifization. Rats were sacrificed on the 23rd day. Sections obtained from the kidney tissues of rats were evaluated by light microscopy in hematoxylin eosin (H&E), Periodic acid schiff (PAS), Masson Trichrome, Silver metanamine (PAMS) histochemistry and Wilms tumor 1 protein (WT-1) immunhistochemistry stains. All glomeruli were examined, and the mean segmental sclerosis score, the highest segmental sclerosis score values, tubular atrophy, interstitial fibrosis and inflammation, tubular damage findings, TMA findings, mean number of WT-1 positive glomerular cells, the highest / lowest WT-1 values were investigated. Bowman and glomerular tuft area measurements of 50 glomeruli were measured with morphometric analysis program, and the average values of 25% glomeruli with the highest area were calculated. The inter-group results were evaluated statistically and the significance level was accepted as p <0.05.
Results: When SQ-KK and SQ-Z added to Adriyamycin application, it was observed that the severity and duration of the diarrhea findings of the rats decreased, their general condition improved and their mobility increased. In rats supplemented with SQ, serum creatinine and urinary proteinuria decreased (more pronounced with olive oil-derived SQ), urine and creatinine excretion increased in urine, glomerular segmental sclerosis severity / extensiveness, tubular damage and interstitial inflammation findings / severity, and the amount of shrinkage in Bowman and glomerular tuft areas decreased. An increase in the number of WT-1 positive cells, which is a podocyte differentiation marker in glomeruli, has been shown in two different source squalene applications added to the Adriyamycin application. This increase was significant with olive oil-derived squalene (p = 0.031). In addition, tubular atrophy and interstitial fibrosis were observed in a smaller number of rats in SQ- supplemented groups. Widespread and severe acute TMA findings and early death were noted in half of the rats in which Adriyamycin and SQ-KK were administered together.
Conclusion: In our study, significant improvement in biochemical and histopathological kidney damage findings was found in rats treated with shark and olive oil-derived squalene forms. In addition, in parallel with the studies focused on podocyte differentiation and protection in FSGS, where podocytopathy is the main damage mechanism, the fact that a significant excess in the number of WT-1 positive cells, which is a specific podocyte marker, has been found in our current study supports that squalene may reduce podocyte damage.