Spermatogenezin tasarlanmış farklı üç boyutlu fare epididimal beyaz yağ dokusu - testis kokültüründe değerlendirilmesi
Assesment of spermatogenesis on differently designed three dimentional mouse epididymal white adipose tissue - testis co-culture
Yazar: OYA ELİF DALDAL
Danışman: PROF. DR. PETEK KORKUSUZ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ NİLGÜN YERSAL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Kısırlık-erkek = Infertility-male ; Organ kültürü = Organ culture ; Spermatogenez = Spermatogenesis

Özet:
Çocukluk çağı kanser hastalarında uygulanan tedaviler testis germ hücreleri ve mikroçevresine hasar vererek hastaların %46'sının infertil hale gelmesine neden olmaktadır. Hava sıvı interfaz (HSİ) ve U plak (UP)  teknikleri üç boyutlu kültür platformlarıdır ve in vitro spermatogenez ile fonksiyonel sperm eldesini destekleyebilir. Epididimal beyaz yağ dokusunun (EBYD) spermatogenez için gerekli olan adipokinleri ürettiği ve uzaklaştırıldığında spermatogenezin inhibe olduğu bilinmektedir. Epididimal beyaz yağ dokusu in vitro koşulda üç boyutlu UP ve HSİ kültür teknikleri ile testis kokültüründe spermatogonyal kök hücre (SKH) havuzunu sayı ve işlev olarak koruyabilir ve spermatogenezi destekleyebilir. Bu tez çalışmasında HSİ ve UP teknikleri ile sinjeneik C57BL/6 fare yetişkin EBYD uygulanan yenidoğan testis kokültürlerinde EBYD'nin, 1, 3, 4 ve 6. haftalarda in vitro spermatogeneze etkisi histomorfometrik ve immünohistokimyasal olarak değerlendirilmiştir. Epididimal beyaz yağ dokusu uygulanan ve uygulanmayan HSİ kokültür ve kültür platformunda seminifer tübül epitel alanı 3. haftaya kadar artmış (p=0,0001) sonra sabit olarak gözlenirken, UP kültür ve kokültür platformlarında 1. haftadan 6. haftaya kadar değişiklik gözlenmemiştir. Bir (p<0,0001), üç (p=0,0009), dört (p=0,0001) ve altıncı (p<0,0001) haftalarda EBYD uygulanan HSİ kokültür platformunda tübül lümen alanı EBYD uygulanan UP kokültür platformuna göre anlamlı olarak daha yüksek bulunmuştur. Seminifer tübül lümen alanının HSİ tekniği ile 3. ve 4. haftalarda UP tekniğine göre yüksek olduğu gözlenmiştir (p<0,0001). HSİ tekniğinin UP tekniğiyle karşılaştırıldığında ID4(+) SKH sayısı üzerinde 3. ve 6. haftalarda arttırıcı etkisi olduğu görülmüştür (p<0,0001). Epididimal beyaz yağ dokusunun HSİ kokültür platformunda 3. haftadan sonra ID4(+) SKH havuzunu koruyucu etkisi gözlenmiştir. HSİ tekniğiyle c-Kit(+) farklılaşan spermatogonyumların sayısı UP tekniğine göre 1, 3, 4 ve 6. haftalarda artmış ve EBYD'nin olumlu etkisi 6. haftada HSİ tekniğiyle kokültür platformlarında ve 4. haftada UP tekniğiyle kokültür platformlarında gözlenmiştir. Epididimal beyaz yağ dokusu, HSİ kokültür platformlarında 1, 3, 4 ve 6. haftalarda SCP3(+) spermatosit sayısını kontrol grubuna göre değiştirmezken, EBYD uygulaması UP kokültür platformlarında 3. haftada SCP3(+) spermatosit sayısını kontrol grubuna göre anlamlı olarak azaltmıştır (p=0,0348). Epididimal beyaz yağ dokusu, HSİ kokültür platformlarında ACR(+) spermatid sayısını kontrol grubuna göre 3. (p=0,0006) ve 4. (p=0,0203) haftalarda anlamlı olarak arttırırken UP kokültür platformlarında ACR(+) spermatid sayısını arttıcı etkisi gözlenmemiştir.  UP tekniği ile ACR(+) spermatid sayısı 3, 4 ve 6. haftalarda HSİ tekniğine göre azalmış olarak gözlenmiştir (p<0,0001). Bu tez çalışması kapsamında EBYD'nin SKH havuzu ve in vitro spermatogenez üzerine HSİ tekniği ile olumlu etkisi ortaya konduğundan, çocukluk çağı kanser hastalarında sperm eldesini sağlayacak üç boyutlu testis organ kültürlerine iyi bir aday olabileceği değerlendirilmiştir.

Abstract:
Gonadotoxic treatments in childhood cancer patients damage the testicular germ cells and microenvironment, causing 46% of the patients to become infertile. Air-liquid interphase (ALI) and U-plate (UP) techniques are three-dimensional culture platforms and can support in vitro spermatogenesis and production functional sperm. The epididymal white adipose tissue (EWAT) produces adipokines required for spermatogenesis and spermatogenesis is inhibited when it is removed. Epididymal white adipose tissue can preserve the spermatogonial stem cell (SSC) pool in number and function, and support spermatogenesis in testicular coculture with three-dimensional UP and ALI techniques in vitro. This thesis evaluated the in vitro spermatogenesis histomorphometrically and immunohistochemically from week 1 to 6, in neonatal testicular cocultures treated with syngenic C57BL/6 mouse adult EWAT by using ALI and UP techniques. The ALI platform with and without EWAT increased the seminiferous tubular epithelial area up to week 3 (p=0,0001), while no change was observed with UP culture and coculture platforms from week 1 to 6. Tubular lumen area was higher in EWAT applied ALI coculture platform on weeks 1 (p<0,0001), 3 (p=0,0009), 4 (p=0,0001) and 6 (p<0,0001) compared to UP with EWAT. The seminiferous tubule luminal area was higher with the ALI technique on weeks 3 and 4 compared to UP (p<0,0001). The ALI technique increased the number of ID4(+) SSCs on weeks 3 and 6 (p<0,0001) when compared to UP. The protective effect of the EWAT on the ID4(+) SSC pool was observed from week 3 in the ALI coculture platform. The number of c-Kit(+) differentiating spermatogonia increased from weeks 1 to 6 with the ALI technique when compared to UP, and the positive effect of EWAT was observed in ALI coculture platform on week 6 and the UP platform on week 4. While EWAT did not change the number of SCP3(+) spermatocytes in ALI coculture platforms from week 1 to 6 when compared control, EWAT decreased the number of SCP3(+) spermatocytes on week 3 in UP coculture platform compared to control  (p= 0,0348). EWAT increased the number of ACR(+) spermatids in ALI coculture platform on weeks 3 (p=0,0006) and 4 (p=0,0203); and increased the number of ACR(+) spermatids in UP coculture platforms compared to control. UP technique decreased the number of ACR(+) spermatids on weeks 3, 4 and 6 compared to the ALI (p<0,0001). The overall data revealed the positive effect of EWAT on the SSC pool and in vitro spermatogenesis by ALI technique, which could be a good model for three-dimensional testicular organ cultures in terms of providing sperm production for childhood cancer patients.