İnorganik arsenik ve vanadyum bileşiklerinin detoksifikasyonunda glutatyonun rolü
The role of glutathione in detoxification of inorganic arsenic and vanadium compounds
Yazar: YELİZ ÇAKIR
Danışman: PROF. DR. DENİZ YILDIZ
Mustafa Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Eritrositler = Erythrocytes ; MRP1 proteini = MRP1 protein ; Sodyum arsenit = Sodium arsenite ; Tiyoller = Thiols ; Vanadatlar = Vanadates

Özet:
Çalışmanın amacı, inorganik arsenik ve vanadyum bileşiklerine maruz kalan insan eritrositlerinde glutatyon düzeylerindeki değişimleri, hücre dışına glutatyon çıkışı ve glutatyon çıkışını etkileyen faktörleri araştırmaktı. Eritrositler 10 mM arsenite 4 saat süreyle maruz kaldıktan sonra hücre içi NPSH konsantrasyonu 0.767 ? 0.0017 ? mol/ml eritrosit düzeyine düşmüştür. Hücre içi NPSH konsantrasyonun düşmesi ile birlikte, hücre dışı NPSH konsantrasyonu 4 saatte 0.481 ? 0.0005 ? mol/ml eritrosit seviyesine ulaşmıştır. Hücre dışı NPSH düzeylerindeki artışa paralel olarak, arsenite maruz kaldıktan sonra hücre dışı glutatyon düzeylerinde önemli artış olduğu saptanmıştır. 1, 5 ve 10 mM arsenite maruz kaldıktan sonra hücre dışı glutatyon konsantrasyonları 0.122 ± 0.0013, 0.226 ± 0.003, 0.274 ± 0.004 ? mol/ml eritrosit düzeyine ulaşmıştır. Süpernatanların meso-2,3-dimerkaptosüksinik ile muamele edilmesi hücre dışı ortamda belirlenen glutatyon konsantrasyonunun önemli oranda artmasına sebep olmuştur. MRP ve Pgp membran taşıyıcılarının inhibitörleri olan MK-571 ve verapamil gibi bileşiklerin kullanılması eritrositlerden glutatyon çıkışını azaltmıştır. Bu azalma, bahsedilen membrane taşıyıcılarının hücrelerden glutatyon çıkışında rolü olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde eritrositler 10 mM vanadata 4 saat süreyle maruz kalmaları sonucunda hücre içi NPSH düzeyi tamamen sıfırlanmıştır. Hücre içi NPSH konsantrasyonun tamamen boşalmasıyla birlikte hücre dışı NPSH konsantrasyonu 4 saatte 0.1410 ± 0.0005 ?mol/ml eritrosit seviyesine ulaşmıştır. Hücre dışı NPSH düzeylerindeki artışa paralel olarak, vanadata maruz kaldıktan sonra hücre dışı glutatyon düzeylerinde önemli artış olduğu saptanmıştır. 1, 5 ve 10 mM vanadata maruz kaldıktan sonra hücre dışı glutatyon konsantrasyonları sırasıyla 0.0150 ± 0.001, 0.0330 ± 0.001, ve 0.0576 ± 0.002 ?mol/ml eritrosit düzeyine ulaşmıştır. Süpernatanların meso-2,3-dimerkaptosüksinik ile muamele edilmesi hücre dışı ortamda ölçülen glutatyon konsantrasyonunu önemli oranda arttırmıştır. Bir MRP inhibitörü olan MK-571' in kullanılmasıda eritrositlerden glutatyon çıkışını azaltmıştır. Glutatyon çıkışında gözlenen azalma, bu membran taşıyıcılarının eritrositlerden glutatyon çıkışında rolü olduğunu göstermektedir. Yine bir metilasyon inhibitörü olan periodat ile oxide edilen adenozininde hücrelerden glutatyon çıkışının azalmasına sebep olmaktadır. Hücre dışı ortamda glutatyon seviyelerindeki bu azalma glutatyon çıkışının düzgün çalışan hücresel bir metilasyon işleminin varlığını gerektirdiğini ve hücre dışı ortamda belirlenen glutatyonun bir kısmının GSH-metilarsenik ve GSH-metilvanadyum komplekslerinden kaynaklanabileceğini göstermektedir. Bu çalışmanın sonuçları eritrositlerin arsenit ve vanadat'a maruz bırakıldıklarında hücre dışına serbest redükte glutatyon ve glutatyon komplekslerinin transport edildiğini göstermektedir.2012, 144 sayfaAnahtar Kelimeler: Arsenit, Vanadat, Glutatyon, İnsan Eritrositleri, Glutatyon transportu, MRP1, NPSH

Abstract:
The objective of the present study was to investigate the change in cellular glutathione levels, glutathione release and the factors that effect the glutathione release from human erythrocytes exposed to inorganic arsenic and vanadate. Arsenite and vanadate significantly depleted intracellular nonprotein thiol level in a time- and concentration-dependent manner. The intracellular nonprotein thiol level was decreased to 0.767 ? 0.0017 ? mol/ml erythrocyte following exposure to 10 mM of arsenite for 4 hours. Extracellular nonprotein thiol level was increased concomitantly with the intracellular decrease and reached to 0.481 ? 0.0005 ? mol/ml erythrocyte in 4 hours. In parallel with the change in extracellular nonprotein thiol levels, significant increases in extracellular glutathione levels were detected. Extracellular glutathione levels reached to 0.122 ± 0.0013, 0.226 ± 0.003, 0.274 ± 0.004 µmol/ml erythrocyte with 1, 5, and 10 mM of arsenite respectively. Dimercaptosuccinic acid treatment of supernatants significantly increased the glutathione levels measured in the extracellular media. Utilization of MK571 and verapamil, MRP and Pgp inhibitors, decreased the rate of glutathione efflux from erythrocytes suggesting a role for these membrane transporters in the process. In a similar manner, when the experiment were carried in the presence of vanadate the intracellular NPSH levels were completely depleted in erythrocytes exposed to 10 mM of vanadate for 4 hours. Extracellular NPSH level was increased concomitantly with the intracellular decrease and reached to 0.1410 ± 0.005 mmol/ml erythrocyte in 4 hours. In parallel with the change in extracellular NPSH levels, significant increases in extracellular glutathione levels were detected following exposure to vanadate. Extracellular glutathione levels reached to 0.0150 ± 0.0.001, 0.0330 ± 0.001, 0.0576 ± 0.002 µmol/ml erythrocyte with 1, 5, and 10 mM of vanadate respectively. Dimercaptosuccinic acid treatment of supernatants significantly increased the glutathione levels measured in the extracellular media. Utilization of MK571 an MRP inhibitor decreased the rate of glutathione efflux from erythrocytes suggesting a role for this membrane transporter in the process. A known methylation inhibitor periodate oxidized adenosine decreased the rate of glutathione efflux from erythrocytes. This observed decrease in extracellular GSH levels suggest that GSH release partly requires a proper cellular methylation process and that part of GSH detected in the extracellular media may arise from GSH-arsenik and GSH-vanadium complexes. The results of the present study indicate that human erythrocytes efflux glutathione in reduced free form and in conjugated form/s that can be recovered with dimercaptosuccinic acid when exposed to arsenite and vanadate.2012, 144 pagesKeywords: Arsenite, Vanadate, Glutathione, Human Erythrocytes, Glutathione efflux, MRP1, Free-SH