İnsan plasenta ve endotel hücre hatları ile 3b kriyojel ortak kültür sisteminin oluşturulması ve etkinliğinin araştırılması
Construction of a 3d cryogel co-culture system using human placental and endothelial cell lines and investigating its efficiency
Yazar: MERVE DEMİR
Danışman: DOÇ. DR. AYSUN KILIÇ SÜLOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Fibronektinler = Fibronectins ; Folik asit = Folic acid ; Kollajen = Collagen ; Kriyojeller = Cryogels ; Vortioksetin = Vortioxetine

Özet:
Gebelik ile birlikte oluşan plasenta bariyeri, yapısı ve transfer kapasitesi ile besin maddelerinin maternal-fetal geçişini, geçiş gradiyentini, feto-plasental ve utero-plasental kan akışını belirlemektedir. Gebelik boyunca kimyasal madde ve ilaç kullanımına maruz kalma oranlarında büyük bir artış meydana gelmiştir. İnsanlar üzerinde etik kısıtlamalar sebebi ile testler yapılamamaktadır. Plasenta bariyerinin geçirgenliği hakkındaki eksikliği tamamlamak için güncel plasenta bariyer modelleri oluşturularak yapılacak olan çalışmalara ihtiyaç artmıştır. 
Bu tez çalışmasında, insan plasenta koryokarsinom hücreleri (BeWo) ve insan göbek kordonu ven hücreleri (HUVEC) ile birlikte üç boyutlu (3B) ortamda farklı özellikler ile hazırlanmış kriyojel üzerinde mono ve ortak kültür sistemleri oluşturulmuştur. Kriyojeller, hücrelerin tutunmasını ve çoğalmasını sağlayabilecek birbirleriyle bağlantılı makro gözeneklerden oluşmaktadırlar. Tez çalışmasında, 3B por yapısına sahip biyouyumlu poli (2-hidroksietil metakrilat) (PHEMA) kriyojeller, hücre dışı maddeler (HDM) açısından desteklenerek in vivo'ya daha yakın bir sistem oluşturulmuştur. PHEMA temelli kriyojel kullanılarak jelatin içeren kriyojeller (PHEMAGEL) sentezlenmiştir. Tüm PHEMA ve PHEMAGEL kriyojellere folik asit (FA) bağlanmıştır, ayrıca fibronektin (FN) veya kolajen tip IV (KOL Tip IV) yapıya katılarak plasenta dokusuna yakın bir ortam oluşturulmuştur. Farklı içerikler ile sentezlenmiş olan 4 kriyojel grubunun PHEMA, PHEMA+KOL Tip IV, PHEMAGEL ve PHEMAGEL+FN'in karakterizasyon çalışmaları kapsamında şişme testleri yapılarak jellerin şişme özellikleri değerlendirilmiştir. Jelatin, FA, FN ve KOL Tip IV'ün kriyojellerin yapısına katılıp katılmadığı fourier dönüşümlü kızılötesi (FTIR) spektrometresi ile incelenmiştir. Mikro bilgisayarlı tomografi (Mikro-CT) ile kriyojellerin 3B karakterizasyon analizleri yapılmıştır. Kriyojellerin gözenek boyutlarını ve hücrelerin tutunma potansiyelleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir. FA bağlanan kriyojellere in vitro salım analizleri yapılmıştır. Sentezlenen kriyojel gruplarının sito-uyumluluğunu ve hücrelerin proliferasyon yeteneklerini inceleyebilmek için 2, 4 ve 7 gün boyunca hücreler ile birlikte inkübe edilmiştir ve hücrelerin canlılıkları değerlendirilmiştir. Gebelikteki kullanımı ile ilgili literatürde yeterli bilgiye rastlanmamış bir antidepresan etken maddesi olan Vortioksetin, oluşturulan 3B kriyojel ortak-kültür sisteminde değerlendirilmiştir. 30 μM ve 60 μM'lık konsantrasyonlarda 2, 4 ve 7 gün boyunca hücrelerle inkübe edilmiştir. 3-(4,5-dimetiltiyazol2-yl)-2,5-difeniltetrazolyum-bromür (MTT) canlılık analizi ile etkinliği incelenmiştir. İnsan koryonik gonadotropin (β-hCG) hormon üretim miktarı ve matriks metalloproteinaz-2 (MMP-2) ile matriks metalloproteinaz-9 (MMP-9) protein seviyeleri ölçülmüştür. 
Kriyojellerin şişme özellikleri incelendiğinde PHEMA temelli kriyojellerde makrogözenek derecesinin daha yüksek olduğu görülmüştür. Jelatine bağlı olarak makrogözeneklilik derecesi, şişme derecesi ve şişme oranlarında düşüş gözlenmiştir. FTIR analizi sonucuna göre jelatinin, FA'nın, FN'nin ve KOL Tip IV'ün kriyojellerin yapısına başarılı bir şekilde katıldıkları görülmüştür. Mikro-CT sonucu kriyojellerin farklı gözenek boyutlarında dağılıma sahip olduğunu göstermiştir. Bu durum hücrelerin tutunmasında ve çoğalmasında artış sağlamıştır. SEM görüntüleri ile birbiriyle bağlantılı oldukça geniş gözeneklere sahip kriyojellerin sentezlendiği görülmüştür. FA'in in vitro salımında inkübasyon süresine bağlı olarak azalma görülmüştür. Kriyojellerin sito-uyumluluğunu anlayabilmek için yapılan MTT analizi sonucunda hücrelerin çeşitli özellikler ile sentezlenen kriyojellere uyumlu olduğu, hücreler üzerinde toksik bir etki yaratmadığı gözlenmiştir. 3B kriyojel ortak kültür sistemine Vortioksetinin yüksek dozlarında mono kültürlerde hücre canlılığında azalma görülmüştür ancak ortak kültürün aynı dozlarındaki hücre canlılığında beklenen azalma görülmemiştir. BeWo ve ortak kültür grubunda β-hCG hormon miktarı ölçülmüştür ve PHEMA+KOL Tip IV'ün BeWo hücresinde en fazla hormon salımı görülmüştür. MMP-2 ve MMP-9 protein seviyelerinde Vortioksetin doz uygulamasına bağlı olarak anlamlı azalma görülmemiştir. 
Bu tez çalışmasında, yapısında jelatin, FN ve KOL Tip IV içeren kriyojeller sentezlenerek FA ile bağlanmıştır. Plasental BeWo ve endoteliyal HUVEC hücreleriyle biyouyumlulukları gösterilmiş ve ortak kültür ortamında ilk kez PHEMA kriyojeller üzerinde üretilmiştir. Oluşturulan 3B sistem ile gebelikte kullanılan Vortioksetin antidepresan etken maddesinin toksisitesi değerlendirilmiştir. Sonuçlar kriyojel sisteminin mono ve ortak kültürler için biyouyumlu olduğunu, sitotoksisite açısından ise mono kültürlere kıyasla ikili ortak kültür gruplarında canlılığı düşürmek için dozların daha yüksek olması gerektiğini göstermiştir. Bu 3B kriyojel sistemi yeni ilaç, kozmetik madde, gıda toksisitesi gibi alanlarda in vivoyu yansıtan ve benzer cevaplar veren bir sistem olarak kullanılabileceğini göstermiştir.

Abstract:
The placental barrier, which is formed with pregnancy, determines the maternal-fetal passage of nutrients, the transition gradient, feto-placental and utero-placental blood flow by its structure and transfer capacity. A large increase in the rates of exposure to the use of chemicals and drugs has occurred during pregnancy. Tests cannot be performed on people due to ethical restrictions. In order to complete the lack of information about the permeability of the placental barrier, the need for studies to be conducted by creating current models of the placental barrier has increased.
In this thesis, human placental choriocarcinoma cells (BeWo) and human umbilical vein cells (HUVEC) with three-dimensional (3D) environment in kriyojel prepared with different properties on mono and co-culture systems have been established. Cryogels consist of interconnected macropores that can ensure the adhesion and proliferation of cells. In the thesis study, biocompatible poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) cryogels with a 3D pore structure were supported in terms of extracellular substances (HDM) and a system closer to in vivo was established. Gelatin containing cryogels (PHEMAGEL) were synthesized using a PHEMA-based cryogel. Folic acid (FA) was attached to all PHEMA and PHEMAGEL cryogels, and fibronectin (FN) or collagen type IV (KOL Type IV) joined the structure, creating an environment close to the placenta tissue. Within the scope of the characterization studies of PHEMA, PHEMA+KOL Type IV, PHEMAGEL and PHEMAGEL+FN of the 4 cryogel groups synthesized with different ingredients, swelling tests were performed and the swelling properties of the gels were evaluated. The involvement of gelatin, FA, FN and KOL Type IV in the structure of cryogels was investigated by fourier transform infrared (FTIR) spectrometer. 3D characterization analyses of cryogels were performed with micro computed tomography (Micro-CT). The pore sizes of cryogels and the adhesion potentials of the cells were examined by scanning electron microscopy (SEM). In vitro release analyses were performed on FA-bonded cryogels. In order to study the cytocompatibility of the synthesized cryogel groups and the proliferation abilities of the cells, they were incubated together with the cells for 2, 4 and 7 days and the viability of the cells was evaluated. Vortioxetine, an antidepressant active ingredient that doesn't have sufficient information in the literature about its use in pregnancy, was evaluated in the 3D cryogel co-culture system created. It was incubated with cells for 2, 4 and 7 days at concentrations of 30 µM and 60 µm. The effectiveness of MTT was examined by vitality analysis. Human chorionic gonadotropin (β-hCG) hormone production and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and protein levels were measured.
When the swelling properties of cryogels were examined, it was seen that the degree of macroscopicity was higher in PHEMA-based cryogels. A decrease in the degree of macroscopicity, degree of swelling and swelling rates have been observed due to gelatin. According to the result of the FTIR analysis, it was found that gelatin, FA, FN and KOL Type IV successfully participate in the structure of cryogels. The micro-CT result showed that cryogels have a distribution in different pore sizes. This has led to an increase in the retention and proliferation of cells. It has been observed that cryogels with fairly large pores connected with each other by SEM images have been synthesized. There was a decrease in the in vitro release of FA depending on the incubation period. As a result of the MTT analysis performed to understand the cytocompatibility of cryogels, it was observed that the cells are compatible with cryogels synthesized with various properties, and they do not have a toxic effect on the cells. A decrease in cell viability was observed in mono-cultures at high doses of Vortioxetine to the 3D cryogel common culture system, but the expected decrease in cell viability at the same doses of the common culture was not observed. The amount of β-hCG hormone was measured in BeWo and common culture group, and the greatest hormone release was observed in BeWo tuesday of PHEMA+KOL Type IV. There was no significant decrease in MMP-2 and MMP-9 protein levels due to the dose administration of Vortioxetine.
In this thesis study, cryogels containing gelatin, FN and KOL Type IV in their structure were synthesized and bound with FA. Their biocompatibility with placental BeWo and HUVEC cells has been demonstrated and they have been produced on PHEMA cryogels for the first time in a common culture medium. The toxicity of the active ingredient of the antidepressant Vortioxetine used in pregnancy was evaluated with the created 3D system. The results showed that the cryogel system is biocompatible for mono- and common cultures, and in terms of cytotoxicity, doses should be higher to reduce viability in dual common culture groups compared to mono-cultures. This 3D cryogel system has shown that it can be used as a system that reflects and gives similar answers in vivo in areas such as new medicine, cosmetics, food toxicity.