Kör farelerde hipoksi ve normoksinin TRAIL aracılı hücre ölümünde rol oynayan ligand, reseptör ve anti-apoptotik yapılar üzerindeki etkilerinin araştırılması ve DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG, cIAP-1, cIAP-2, XIAP ve FLIP genlerinin moleküler karakterizasyonu
Investigation of the effects of hypoxia and normoxia on ligand, receptor and anti-apoptotic structures in TRAIL-mediated cell death in blind mole rats and molecular characterization of DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG, cIAP-1, cIAP-2, XIAP and flip genes
Yazar: BARIŞ YILDIZ
Danışman: PROF. DR. NADİDE NABİL KAMİLOĞLU ; YRD. DOÇ. DR. CEM ÖZİÇ
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Fareler = Mice ; Hipoksi = Hypoxia ; Kemiriciler = Rodentia ; Nannospalax nehringi = Nannospalax nehringi ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Tümör nekroz faktörleri = Tumor necrosis factors ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Yeraltı yaşamının yüksek derecede hipoksik olan koşullarına uyum sağlamış rodentler olan kör fareler, hipoksinin apoptotik süreçler üzerindeki etkilerinin anlaşılabilmesi için kullanılabilecek benzersiz organizmalardır. Kör farelerin birçok anti-kanser özelliklerinin ortaya çıkarılmış olmasına karşı, p53 denetiminden ayrı olarak seçici bir şekilde kanser hücrelerini hedef alabilen TRAIL aracılı hücre ölümü doğaları ise henüz ortaya çıkartılmamıştır. Buna yönelik olarak, sunulan çalışmada, Nannospalax nehringi'de TRAIL aracılı hücre ölümünde rol alan ligand (TRAIL), reseptör (DR4, DR5, DcR1, DcR2 ve OPG) ve bazı anti-apoptotik proteinlerin (FLIP, cIAP-1, cIAP-2 ve XIAP) hipoksi altında mRNA seviyelerinde meydana gelen değişimlerin belirlenmesi ve biyoinformatik yöntemler yardımıyla bu proteinlere ait aminoasit dizilerinin ortaya çıkartılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, Kars'ın farklı popülasyonlarıdan toplanan erkek kör fareler Hipoksi Grubu (n=5) ve Normoksi Grubu (n=4) olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. Hipoksi Grubu'ndaki kör fareler, 52 saat boyunca tam karanlık koşullarda (24K:0A) %7 oksijen + %93 azot gaz karışımına maruz bırakılmıştır. Normoksi Grubu'ndaki kör fareler, tam karanlık koşullarda (24K:0A) normokside tutulmuştur. Deney sonunda kör farelerin beyin ve akciğer dokularından TRIzol yöntemiyle RNA izolasyonu yapılarak RT-PCR yöntemi ile TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG, FLIP, cIAP-1, cIAP-2 ve XIAP mRNA ekspresyonlarına bakıldı ve elde edilen PCR ürünlerinden sekans analizleri yapılmıştır. Agaroz jel elektroforez görüntülerinden elde edilen bant yoğunluklarının istatistiksel analizi sonucunda, gruplar arası anlamlı bir farka rastlanmamıştır. Fakat bant görüntüleri gözlemsel olarak karşılaştırıldığında hipoksinin beyin dokusu DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG, FLIP, XIAP, cIAP-1 ve cIAP-2 mRNA ekspresyonlarında belirgin bir artışa neden olduğu görülmüştür. Yapılan biyoinformatik analizlerde ise Nannospalax nehringi'ye ait TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG, FLIP, cIAP-1, cIAP-2 ve XIAP proteinlerini kodlayan aminoasit bilgilerinde insan ve diğer türlerden farklı aminoasit dizilerinin yer aldığı belirlenmiştir. Sonuç olarak, ortaya çıkardığımız bu proteinlere özgü farklılıkların, kör farelerin hipoksik koşullarda yaşamak için evrimleşmiş bir takım adaptasyonlar olduğunu düşünmekteyiz. Ayrıca, Nannospalax nehringi'de bu proteinlerin aminoasit dizilerindeki farklılıkların biyolojik önemine yönelik olarak yapılacak çalışmaların, tümör kitleleri üzerindeki hipoksi stresi sonucunda TRAIL aracılı hücre ölümüne karşı oluşan direncin aşılabilmesi açısından yeni bir adım olabileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Blind mole rats, the rodents that adapt to the highly hypoxic conditions of underground life, are unique organisms that can be used to understand the effects of hypoxia on apoptotic processes. Although many anti-cancer properties of blind mole rats are discovered, TRAIL-mediated cell death, which is able to selectively target cancer cells separately from p53 control, is inherently unexplored. In the present study, it was aimed to determine the changes in the mRNA levels of ligand (TRAIL), receptor (DR4, DR5, DcR1, DcR2 and OPG) and some anti-apoptotic proteins (FLIP, cIAP-1, cIAP-2 and XIAP) involved in TRAIL-mediated cell death in Nannospalax nehringi under hypoxia and to identify amino acid sequences of these proteins employing bioinformatics methods. For this purpose, the male blind mole rats collected from different populations of Kars were divided into two groups; Hypoxic Group (n=5) and Normoxic Group (n=4). The blind mole rats in the Hypoxic Group were exposed to a mixture of 7% oxygen + 93% nitrogen gas under full dark conditions (24K:0A) for 52 hours. The blind mole rats in the Normoxic Group were kept under normoxia in full darkness (24K:0A). Later on, RNA of the brain and lung tissues of blind mole rats were isolated by TRIzol method and expressions of TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG, FLIP, cIAP-1, cIAP-2 and XIAP mRNA were investigated through RT-PCR and sequence analyzes of the obtained PCR products were performed. No significant difference was found between the groups after statistical analysis of the band densities on the agarose gel electrophoresis images. However, when the band images are compared visually, it was found that hypoxia caused a significant increase in DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG, FLIP, XIAP, cIAP-1 ve cIAP2 mRNA expression levels in brain tissue. In the bioinformatics analysis it was determined that amino acid sequences encoding TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG, FLIP, cIAP-1, cIAP-2 and XIAP proteins of Nannospalax nehringi have different amino acid sequences from human and other species. In conclusion, we think that the differences between these proteins are a number of adaptations that blind mole rats have evolved to live in hypoxic conditions. In addition, we also think that further studies on biological importance of the differences in the amino acid sequences of these proteins in Nannospalax nehringi may be a new step in terms of overcoming resistance to TRAIL mediated cell death as a consequence of hypoxia stress on tumor cell masses.