Pseudomonas putida NRRL B-13 suşu tarafından benzoik asidin biyolojik yıkımını sağlayan enzimleri kodlayan plazmitlerin stabilitelerinin belirlenmesi
Examination of stability of the plazmites encoding the enzymes responsible for biodegradation of benzoic acid using Pseudomonas putida NRRL B-13 strain
Yazar: HANDAN SARAÇ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MUSA SARI
Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Benzoik asit = Benzoic acid ; Plazmit DNA = Plasmit DNA ; Pseudomonas putida = Pseudomonas putida

Özet:
Çağdaş yaşamın bir sonucu olarak ortaya çıkan kirlilik, günümüzde üzerinde en çok durulan ancak, en az çözüm getirilebilen konulardan biridir. Bu çeşit kirlilikten bir tanesi de petrol ve onun rafine ürünleri içinde önemli oranlarda bulunan benzen ve onun alkillenmiş türevleri olan tipik aromatik halkalı bileşiklerdir. Esasen, tüm aromatik hidrokarbonlar birer benzen türevidir. Bu bileşikler her ne kadar yapı olarak halkasal alkanlara benzerlik gösterseler de, daha kararlıdırlar ve alkanların uğradıkları reaksiyonlara uğramazlar. Bu nedenle, daha tehlikeli çevresel kirleticiler olarak görülmektedirler. Canlılar tarafından yapılmayan bu maddeler dolayısı ile hemen hemen bütün canlılar için toksik özellik taşırlar. Bu maddeler ile kirlenmiş çevrelere uygulanan fiziksel ve kimyasal dekontaminasyon metotları tam ve etkili bir çözüm getirmekten uzaktır. Dolayısı ile son yıllarda bu tür işlemler için biyokimyasal metotların potansiyel kullanılabilirliği araştırılmış ve özellikle bu maddeleri daha zararsız bileşiklere yıkmak için gerekli olan gen sistemleri ile donatılmış Pseudomonas bakteri türlerinin alternatif kullanım alanı bulabileceği saptanmıştır.
Pseudomonas putida? nın toluen, benzoik asit ve ksilen gibi toksik hidrokarbon gruplarına karşı toleransa sahip olduğu görülmüştür.
Bu çalışma, önemli endüstriyel aromatik kirleticilerden birisi olan benzoik asidin biyolojik yıkımını gerçekleştiren mikroorganizmalardan biri olan Pseudomonas putida NRRL B-13 suşunda bulunan plazmitlerin stabilitelerini tespit etmek amacıyla planlanmıştır.
Bu çalışma kapsamında, Pseudomonas putida NRRL B-13 suşu önce benzoik asit içeren sıvı besiyerinde üretildi ve bir kısmı alınarak plazmit DNA izolasyonunu takiben agaroz jelde yürütüldü. Daha sonra geriye kalan bakteriler başka bir karbon kaynağı (glukoz) içeren sıvı besiyerinde çoğaltıldı. Her jenerasyon (nesil) sonrasında bu besiyerinden örnekler alındı ve plazmit DNA izolasyonu yapılarak agaroz jelde yürütme yapıldı. Glukoz içeren sıvı besiyerine alınmadan önce yapılan agaroz jel elektroforezindeki bantlar esas alınarak, glukoz içeren sıvı besiyerine alındıktan sonra yapılan agaroz jel elektroforezine ait bantlar karşılaştırıldı. Yapılan karşılaştırmada, band belirginliğinin ve kalınlığının her jenerasyon (nesil) sonrasında giderek azaldığı ve IV. jenerasyonda (nesilde) ise tamamen kaybolduğu tespit edildi. Böylece, benzoik asidin yıkımında rol oynayan plazmitlerin stabilitesini IV. nesile (jenerasyon) kadar koruduğu belirlenmiş oldu.

Abstract:
Pollution, arising as a result of modern life, is one of the issues that is discussed the most, but not so many things have been done to prevent it. Oil and its alkylated typical aromatic cyclic component which is the derivative of benzene are among these types of pollutions. In fact, all the aromatic hydrocarbons are a derivative of benzene. These compounds are similar in structure to cyclic alkanes but they are more stable than cyclic alkanes and they do not react as alkanes react. Thus, they are seen as more dangerous environmental pollutants than others. Therefore, these substances which are not generated by living things are toxic to all organisms. Physical and chemical decontamination for these polluted areas are far from a complete and an effective solution. Thus, the potential of biochemical methods are examined and it is found that there may be an area of usage for the Pseudomonas species which is equipped with gene system that is necessary for the transformation of these agents to the harmless composites.
It is seen that Pseudomonas putida has tolerance for the toxic hydrocarbon groups such as toluen, benzoic acid and xylen.
This study was planned in order to identify the plasmid stabilities which are in Pseudomonas putida NRRL B-13, one of the microorganisms that carry out the biological-degradation of benzoic acid which is one of the industrial aromatic pollutants.
First, the strain of Pseudomonas putida NRRL B-13 was produced in a liquid medium containing benzoic acid. Then, some of it was taken and following the plasmid DNA isolation, it was held in agarose gel.  Later, the remaining bacteria were replicated in a liquid medium containing another carbon source (glycose). After each generation, samples were taken from these medium and agarose gel execution was carried out by performing DNA isolation. There was a comparison between the bands of agarose gel electrophoresis before it has been taken to the glycose feed lot and after it has been taken. In the comparison that has been done, it was detected that the clarity and the thickness of the band gradually decreased and on the 4th generation, they were completely disappeared. Thus, it was analysed that the stability of plasmids involved in the breakdown of benzoic acid has remained until the 4th generation.