Modifiye dekstransükraz kullanarak prebiyotik sentezi
Prebiotic synthesis using modified dekstransükraz
Yazar: MAHMUT PARLAK
Danışman: PROF. DR. AZİZ TANRISEVEN ; DOÇ. DR. DURAN ÜSTEK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Prebiyotikler, glikozidik bağlarla bağlı 2-10 monosakkarit biriminden oluşan oligosakkaritlerdir. İzomaltooligosakkaritler yaygın olarak kullanılan ve binlerce ton üretilen prebiyotiklerdendir. İnsanlar tarafından sindirilemeyen bu karbohidratlar bağırsakta yaşayan Bifidobakterium, Laktobacillus gibi yararlı bakteriler tarafından fermente edilebilebilir. Bu oligosakkaritlerin diş çürümesinin önlenmesi, kabızlık ve ishal gibi hastalıkların giderilmesi, kemik erimesinin önlenmesi ve kolesterolün düşürülmesi gibi çok önemli faydaları vardır.Bu prebiyotikler B-512F Dekstransükraz'ın akseptör reaksiyonlarıyla ticari olarak üretilmektedir. Endüstriyel öneme sahip olan bu enzim aynı zamanda dekstran üretiminde de kullanılmaktadır. Prebiyotik üretiminin ekonomik olabilmesi için enzim immobilize olarak kullanılmalıdır. Bu enzimin kovalent olarak immobilizasyonu üzerine yapılan çalışmalarda enzimin yapısından kaynaklanan sebeplerden dolayı başarılı sonuçlar alınamamıştır. Enzimin yapısında bulunan dekstranın enzim üzerindeki reaktif grupların reaksiyonlarını önlemesi ve enzim aktif bölgesinde bulunan amino asitlerin immobilizasyon matriks reaktif gruplarıyla reaksiyonları bu enzimin kovalent immobilizasyonunu etkilemektedir. Bu tez çalışmasında immobilizasyonda karşılaşılan problemleri çözmek için, biyo-mühendislik metodları kullanılarak yeni bir B-512F dekstransükraz üretilmiştir. Dekstransükraz sinyal peptit, değişken gölge, katalitik bölge ve glukan bağlama bölgesi olmak üzere dört bölgeden oluşmaktadır. Yeni dekstransükrazın üretiminde, sinyal peptit, değişken bölge ve glukan bağlama bölgeleri gen mühendisliği ile kırpıldı ve kovalent immobilizasyonun gerçekleşebilmesi için enzimin N-terminaline vektör kaynaklı Glutatyon S-transferaz ilave edildi. Bu enzim ticari bir immobilizasyon matriksi olan Eupergit C 250L üzerine başarılı bir şekilde (%100 immobilizayon verimi, %83.3 aktivite verimi) kovalent olarak immobilize edildi. İmmobilize enzim karakterize edildi ve dekstran/prebiyotik üretimlerinde başarılı olarak kullanılabileceği gösterildi. Prebiyotik üretimlerinde glukoz ve maltoz akseptor olarak kullanıldı. Endüstriyel kullanım potansiyeli olan yeni enzimin doğal dekstransükraza göre daha fazla prebiyotik üretimini gerçekleştirdiği belirlendi.

Abstract:
Prebiotics are oligosaccharides consisting of 2-10 monosaccharide units. One of the prebiotics is isomaltooligosaccharides that are widely used and produced in large quantities. Despite not being digested by humans, these carbohydrates can be fermented by such beneficial bacteria as Bifidobacteria and Lactobacillus living in the human large intestines. These oligosaccharides have important biological functions such as preventing tooth decay and osteolysis, alleviating constipation and diarrhea and reducing cholesterol level.These prebiotics have been commercially produced using acceptor reactions of B-512F Dextransucrase. This industrially important enzyme is also used in dextran production. In order to produce prebiotics economically, this enzyme must be used in immobilized form. Due to the structure of the enzyme, successful results have not been attained in its covalent immobilization. Covalent immobilization of dextransucrase is hindered by the dextran associated with the enzyme preventing reactive groups on the enzyme from reacting with immobilization matrix. In addition, the essential amino acids at the active site of the enzyme react with the reactive groups of matrix, resulting in low activity yields. In this dissertation, a novel B-512F dextransucrase was produced using bio- engineering methods to overcome the problems faced in the immobilization process. Dextransucrase is composed of four regions, namely signal peptide, variable region, catalytic region, and glucan binding region. In producing the novel dextransucrase, signal peptide, variable region, and glucan binding regions are truncated. To enable covalent immobilization of dextransucrase, vector-originated glutathione S-transferase was added to the N-terminal of the enzyme. This novel enzyme was successfully immobilized covalently onto a commercial immobilization matrix called Eupergit C 250L, yielding 100% immobilization and 83.3% activity yields. The immobilized enzyme was characterized and it was shown that it could be used successfully in dextran and prebiotics productions. Glucose and maltose were used as acceptors in the prebiotic production. The novel enzyme, having a potential to be used industrially, produces more prebiotics than the native dextransucrase.