Okzalat oksidaz elektrodu hazırlanması ve fizyolojik sıvılarda okzalat tayininde kullanılması /
Yazar: ERHAN DİNÇKAYA
Danışman: PROF.DR. AZMİ TELEFONCU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 1991
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Oksalat oksidaz = Oxalate oxidase ; Oksalatlar = Oxalates

Özet:
ÖZET Özellikle hiperokzalüri ve okzalosis gibi okzalat metabolizması hastalıkları, çeşitli fizyolojik sıvılar- daki okzalatın klinik analizini zorunlu kılar. Bazı du rumlarda gıda maddelerinin okzalat içeriğini de tayin etmek gerekmektedir. Bu nedenle, günümüze kadar çeşitli okzalat tayin yöntemleri geliştirilmiştir. Ancak kimya sal okzalat tayin metodlarının çoğu zor ve zaman alıcı dır. Son yıllarda, daha çok enzimatik okzalat tayin yöntemleri üzerinde çalışılmaktadır. Enzimatik metodlar, kimyasal yöntemlere karşın daha pratiktir, daha az zaman alıcıdır ve daha doğru sonuçlar verir. Fakat enzimler çok pahalı maddelerdir ve rutin analizlerde, kullanılmaları ekonomik değildir. Bu nedenle çeşitli immobilizasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Günümüzde okzalat oksidaz immobilizasyonu ve immobilize enzimin uygun bir sensörle birleştirilmesiyle okzalat oksidaz elektrodları gelişti rilmektedir. Sonuç olarak pratik, ekonomik ve basit okzalat tayini amaçlanmaktadır. Bu çalışmada okzalat oksidaz (EC 1.2.3.4), arpa (Hordeum vulgare) çimi köklerinden izole edildi. Arpa çimi kökleri soğuk fosfat tamponunda (pH: 7,5; 5 mM) homojenize edildi. Homojenizat tülbent benzinden süzüldü. Filtrat santrifüj lendi (10 dak. 3000 rpm. 'de) ve çökelek atıldı. Yabancı proteinler termal denatürasyonla (3 dak., 80 C'de) çöktürüldü. Çözelti soğutuldu ve santrifüj- lendi (10 dak., 3000 rpm'de). Süpernatantin içerdiği protein fraksiyonu amonyum sülfat (%70 doygunlukta) ile çöktürüldü. Çökelek celitte adsorplandı ve fosfat tamponu (pH: 7.5; 5 mM) ile geri kazanıldı. Okzalat oksidaz çözel tisinin içerdiği renkli pigmentler çözeltinin silikajelkolondan (1,0x25 cm) geçirilmesiyle protein fraksiyonun dan ayrıldı. Kolonu terkeden protein fraksiyonu 280 nm'- deki absorbans ölçümleriyle izlendi. Eluat saf suya karşı soğukta(+4 °C) 48 saat süreyle diyalizlendi. Diyalizden sonra oluşan çökelek santrifüj lenerek uzaklaştırıldı. Supernatant liyofilize edildi. Sonunda, kısmen saflaştı- rılmış okzalat oksidaz preparatı elde edildi. Preparat, ticari okzalat oksidaz preparatlarma benzer özelliklere sahiptir ancak onlardan daha kararlıdır. Okzalat oksidaz preparatı ile jelatin, jelatin-BSA ve selüloz asetat tabanlı okzalat oksidaz elektrodları hazırlandı. Hepsinde temel elektrod olarak YSI çözünmüş oksijen probları kullanıldı. Jelatin tabanlı okzalat ok sidaz elektrodu hazırlanmasında, jelatin ve okzalat oksi daz, glutaraldehid ($2,5 ' luk ; fosfat tamponu içinde (50 mM ; pH: 7,5)) çapraz bağlanarak immobilize edildi. Selüloz asetat tabanlı elektrod için, öncelikle çeşitli selüloz asetat membranlar hazırlandı. En uygun selüloz asetat membran, çözünmüş oksijen probuyla birleştiril dikten sonra membran, sırasıyla seryum IV sülfat (100 mM ; 0,1 N nitrik asitte) ve BSA (10 mg/ml; borat tamponunda (0,1 M; pH: 9,0)) ile muamele edildi. Sonra, BSA çözel tisine sodyum siyanoborhidrür ilave edildi ve prob 2 saat süreyle bu çözelti içinde bekletildi. Fosfat tamponunda (50 mM ; pH: 7.5) çözülmüş olan okzalat oksi daz, selüloz asetat membran üzerine yayıldı. Enzimin kovalent bağlanmasında bif onksiyonel bir reaktif olan glutaraldehitten (%6,25 'lik; fosfat tamponunda (50 mM ; pH: 7,5)) yararlanıldı. Jelatin-BSA tabanlı okzalat oksidaz elektrodunda ise, jelatin, okzalat oksidaz ve BSA birlikte, glutaraldehid (%2, 5' luk; fosfat tamponunda (50 mM ; pH: 7,5)) yardımıyla çapraz bağlanarak immobilize edildi.Jelatin ve selüloz asetat tabanlı okzalat oksidaz elektrodlarına ilişkin çeşitli parametreler incelendi. Optimum pH (3,2) optimum sıcaklık (35 O, optimum tampon konsantrasyonu (50 mM) ve uygun tampon sistemi (suksinat) belirlendi. Sonuçta, çalışma tamponu olarak suksinat tamponu (50 mM; pH: 3,2; 1 mM EDTA ve 0,65 mM 8-Hidroksi- kinolin) kullanılmasına karar verildi. Depo kararlılıkları, substrat spesif iklikleri belirlendi. Okzalat oksi daz elektrodlarmın %100'e varan bir substrat spesifikliğine sahip oldukları tesbit edildi. Her iki elektrodun da, 3 aylık bir süre zarfında ve çalışma sınırları göz önüne alındığında, aktivitelerinin %90'mdan fazlasını korudukları belirlendi. Okzalat oksidaz elektrodları ile idrar okzalat dü zeyleri ölçüldü. İdrar okzalatı ölçümlerinde, porsiyon idrarlarla ve ayrıca 24 saatlik idrar örnekleriyle çalışıldı. İdrarın ölçüme hazırlanması için basit ön işlemler geliştirildi. Tüm ölçümler özel olarak geliştirilen termostatik ölçüm hücrelerinde yapıldı. İdrardan gelen ve girişim yapan maddelerin etkilerini önlemek için EDTA (1 mM) ve 8-Hidroksikinolin (0,65 mM), çalışma tam ponu katkı maddesi olarak kullanıldı. Jelatin ve selüloz asetat tabanlı okzalat oksidaz elektrodlarıyla alınan idrar okzalatı ölçüm sonuçları karşılaştırıldı. Olumlu sonuçlar bulundu. Hazırlanan enzim elektrodları ile alınan sonuçlar farklı spektrofoto- metrik yöntemlerin sonuçlarıyla karşılaştırıldı. Bu amaçla Sigma Okzalat Tayin Kiti ile, ve modifiye kolon yöntemiyle spektrof otometrik temelli idrar okzalatı ölçümleri yapıldı.Jelatin ve selüloz asetat tabanlı okzalat oksidaz elektrodlarıyla alınan idrar okzalatı ölçüm sonuçları karşılaştırıldı. Olumlu sonuçlar bulundu. Hazırlanan enzim elektrodları ile alınan sonuçlar farklı spektro- fotometrik yöntemlerin sonuçlarıyla karşılaştırıldı. Bu amaçla Sigma Okzalat Tayin Kiti ile, ve modifiye kolon yöntemiyle spektrof otometrik temelli idrar okzalatı ölçümleri yapıldı. Sonuç olarak, okzalat oksidaz elektrodları idrar okzalatı tayin yönteminin çok pratik ve ekonomik olduğu ve ayrıca doğru sonuçlar verdiği tesbit edildi. Özel likle jelatin tabanlı okzalat oksidaz elektrodunun daha iyi niteliklere sahip olduğuna karar verildi. Geliştirilen yöntemde, söz konusu enzim elektrodu için, -6 -4 5x10 - 2x10 M konsantrasyon aralığında doğrusal cevap alınabildiği belirlendi.

Abstract:
- 199 - SUMMARY Oxalate levels of various phsyological fluids must be necessary to determine in oxalate metabolism diseases especially like hyperoxaluria and oxalosis, in some situations, it may be also necessary to determine content of oxalate in foodstuffs. Therefore, various techniques for determination of oxalate have been developed. But, most of the chemical oxalate determina tion methods are difficult and require long periods of time. Recently, scientists have been studying on especially enzymatic determination methods of oxalate. Enzymatic methods are more practical, more accurate and require shorter times than chemical methods. Since enzymes are very expensive and not economic for routine measurements, some immobilization methods have been improved. At present, oxalate oxidase electrodes are being prepared by oxalate ovidase immobilization and its combination with an appropriate sensor. Consequently, the aim of these studies is to determine oxalate in an economic, simple and pratic way. In this study, oxalate oxidase (E.C 1.2.3.4) was isolated from barley (Hordeum vulğare) seedling roots. Barley seedling roots were homogenized in cold phosphate buffer (pH: 7.5; 5 mM). The homogenizate was filtered through a cheese clot. The filtrate was centrifugated (10 min., at 3000 rpm) and, precipitate was removed. Undesirable proteins were precipitated by thermal denaturation (3 min., 80 °C). solution was cooled and centrifugated (10 min., at 3000 rmp. ). Protein fraction of supernatant was precipitated by ammonium sulphate (70% saturated). Precipitate was adsorbed on cellite200 - and than recovered with phospata buffer (pH: 7.5; 5 mM). Pigment contents of supernatant was separated from pro tein fraction by means of a silicagel column (1.0x25 cm) The protein fraction, relased from column, was detected by absorbance measurements at 280 nm. Eluant was diali- zed agains water at 4 C for 48 hrs. and than precipi tated was removed by centrifugation. Supernatant was lyophilized. At the end of this prosess, partially purified oxalate oxidase preparate was obtained. The preparate has similar properties with commercial prepa rate, but it has got much more stability. Jelatine, jelatin-BSA and celluose acetate based oxalate oxidase electrodes were constructed by the oxalate oxidase preparate. In all of them, YSI dissol ved oxygen probes were used as basic electrode. In preparation of gelatine based oxalate oxidase electrode, oxalate oxidase was immobilized with gelatin by glutaraldehyte (2.5 %; in phosphate buffer (pH: 7.5; 50 mM)). First of all, various cellulose acetate membranes were prepared for the celluose acetate based electrode. After the most suitable cellulose acetate membran was chosen, it was fixed with dissolved oxygen probe, and this membran was treated with serium (IV) sulphate (100 mM; in 0,1 N nitric acid) BSA (10 mg/ml; in borate buffer (0,1 M; pH: 9,0), respectively. After that, natrium cyanoborhydrur was added to BSA solution and electrode was waited for 2 hours in this mixture. Oxalate oxidase solution, which is dissolved in phosphate buffer(50 mM ; pH: 7,5), was spread over cellulose acetate membran. As bifunctional reagent, glutaraldehyte (6.25 %; in phosphate buffer 50 mM ; pH: 7,5)) was used in covalent binding of enzyme. But, in preparation of gel.atine-BSA based oxalate oxidase- 201 - electrode, immobilization process was carried out in the presence of gelatine, oxalate oxidase and BSA, using glutaraldehyte (2.5%, in phosphate buffer (50 mM; pH: 7,5) as a cross-linking agent. Some parameters for gelatine and cellulose acetate based oxalate oxidase electrodes, were examined. The optimum values of these parameters were defined such as optimum pH (3.2), optimum temparature (35 C), optimum buffer concentration (50 mM) and appropriate buffer system (succinate). Consequently, using of succinate buffer was decides as studying buffer system. Storage stabilities and substrate specif icty were defined. Substrate specificty of oxalate oxidase electrode was determined almost 100% considering the studying range. More than 90 percent of the activities remained for 3 months. Oxalate levels of urine samples were determined by oxalate oxidase electrodes. The determination of urine oxalate levels were carried out using collected urine for 2 4 h and portion urines. In addition, some pretreatments were developed on urine to make ready for oxalate determinations. All of the determinations were made in a specifically developed thermostatic cell. To prevent effect of interferences coming from urine samples, EDTA (1 mM) and 8-Hydroxykinoline were added to studying buffer solutions. The similar results were obtained for gelatine and gelatine-BSA based oxalate oxidase electrodes. Therefore, the studies were focused on gelatin and cellulose acetate based oxalate oxidase electrodes.- 202 The obtained results of the both electrodes were compa red and they were found being positive. The comparison of these results were also performed with the spectrophotometry referance methods. For this aim, oxalate levels of urine were also determined by modified column methods and Sigma Oxalate Determination Kit. Consequently, the determination method of urine oxalate by oxalate oxidase electrodes was confirmed as a practical, economical and more accurate methods than the others. Especially, gelatine based oxalate oxidase electrode was decided to have better properties than the other electrodes. In this developed method, linear -6 -4 response range were found as 5x10 -2x10 M, for the mentioned enzyme electrode.