Türk toplumunda Ege bölgesinde EGFR ve ALK  mutasyonu ve klinikopatololojik özellliklerin korelasyonu
Egfr and alk mutation in The aegean region in turkish society and correlation of clinicopathological properties
Yazar: GAMZE KARAKURT
Danışman: DOÇ. DR. BERNA KÖMÜRCÜOĞLU
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İzmir Dr.Suat Seren Göğüs Hastalıkları ve Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Göğüs Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Göğüs Hastalıkları = Chest Diseases
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Ege bölgesi = Aegean region ; Eksonlar = Exons ; Epidermal büyüme faktörü = Epidermal growth factor ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sağkalım = Survival ; Türk toplumu = Turkish society ; İlaç dağıtım sistemleri = Drug delivery systems ; İlaç hedefleme = Drug targeting

Özet:
Giriş ve Amaç: Bu araştırmada Türk toplumunda Ege Bölgesi'nde yaşayan
KHDAK hastalarında EGFR ekzon 18, 19, 20, 21 ekzon mutasyonları ve ALK
analizi ile klinikopatolojik özellikleri ve prognozun kıyaslanması amaçlanmıştır.
Hastalar ve Yöntem: EGFR ekzon 18,19,20 ve 21 mutasyonları hastalara ait
parafin bloklardan (her hasta için yaklaşık 5 µ büyüklüğünden en az 3 kesit) alınan
örneklerden "QIAamp DNA FFPE Tissue kit" (Qiagen, ABD) kullanılarak her bir
reaksiyon tüpü başına 15-20 ng olacak şekilde DNA izolasyonu yapıldı. Elde edilen
örnekler ile Rotor Gene sistemi kullanılarak RT-PCR aşaması gerçekleştirildi.
Mutasyon saptama aşamasında her bir örnek için EGFR G719x, EGFR T790M,
EGFR S768I, EGFR ex20ins, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR ex19del ve
EGFR ctrl olmak üzere 8 farklı karışım çoğaltıldı. RT-PCR aşaması Rotor gene
sistemi ile gerçekleştirildi. Analiz aşamasında değerlendirme kit içeriğinde yazdığı
şekilde ΔCt değerleri hesaplanarak üretici firmanın önerilerine göre gerçekleştirildi.
ALK için ise Tümörün parafin bloğundan 4-5 mikronluk kesitler alınıp
Mikroskopta dual filtreyle bakıldığında yeniden düzenlenme olmayan nükleuslarda
yan yana yeşil ve kırmızı sinyal veya üst üste binmiş sarı görünen yakın sinyaller
izlenir. Eğer birbirinden ayrı yeşil- kırmızı sinyallerin "break apart" ve tek kırmızı
sinyallerin oranı %15'in üzerindeyse ALK rearrangement'ı pozitif kabul edildi.
EGFR ve ALK mutasyon durumu ile klinikopatolojik özellikleri ve
prognozu analiz edilmiştir.
Sonuçlar: 593 hastadan 63 hastada (%10.6) EGFR mutasyonu saptanmıştır.
Mutasyonların dağılımı 2 hastada ekzon 18, 34 hastada ekzon 19, 3 hastada ekzon 
X
20, 24 hastada ekzon 21 olarak görülmüştür. EGFR mutasyonu olan 63 hastanın 36 sı
kadın (%57,14) oranında bulunmuştur, tüm çalışmaya katılan hastaların %21, 6 sının
kadın olduğu göz önünde bulundurularak anlamlı fark olduğu görülmüştür
(P=0,086). Bizim çalışmamızda mutasyonu olmayan grupta sigara içme yüzdesi
%95,5 iken, EGFR mutasyonu olan hastalar arasında ise %11,1 de kalarak anlamlı
bir fark olduğu, yani sigara öyküsü ile EGFR mutasyonu arasında negatif korelasyon
varlığı saptanmıştır(P=0.005). EGFR mutasyonu ile metastatik bölgeler ve nüks
arasında ilişki saptanmamıştır.
Yine 593 hasta arasında 19 hastada(%3,2) ALK mutasyonu olduğu
görülmüştür. ALK mutasyonu olan 19 hastanın 8 i erkek (%42,1) oranında
bulunmuştur. Bizim çalışmamızda mutasyonu olmayan grupta sigara içme yüzdesi
%95,5 iken, ALK mutasyonu olan hastalar arasında ise %33,3 de kalarak anlamlı bir
fark olduğu, yani sigara içmeyen hastalarda ALK mutasyonunun daha sık olduğu
görülmüştür. ALK mutasyonu ile de mutasyonu olmayan veya EGFR mutasyonu
olan hastalar arasında metastatik bölgeler veya nüks açısından herhangi bir fark
görülmemiştir.
Tartışma: Ülkemizde Ege bölgesinde referans göğüs hastalıkları eğitim
araştırma hastansinde yapılan çalışmamızda EGFR mutasyon pozitifliği ve ALK
mutasyonu pozitifliği Avrupa beyaz ırk ile benzer oranlarda tesbit edildi. EGFR
mutasyonu kadın, sigara içmeyenlerde ve adenokarsinom histolojisinde daha sıktır.
ALK mutasyonu da çalışmamıza göre aynı şekilde genç yaşta, kadınlarda ve sigara
içmeyenlerde daha sık saptanmıştır. EGFR ve ALK mutasyonu olan hastalar
mutasyonu olmayanlara göre daha iyi prognoza sahiptir. Sonuçta seçilmiş hastalarda
hedefe yönelik tedaviler belirgin yaşam süresi avantajı sağlamasıyla ilk hattan
itibaren tedavide yerini almıştır.

Abstract:
Introduction and Purpose: In this study, it was aimed to compare clinical
features and prognosis of EGFR exon 18, 19, 20, 21 exon mutations and ALK
analysis in NSCLC patients.
Patients and Methods: EGFR exon 18, 19, 20 and 21 mutations were screened
using the "QIAamp DNA FFPE Tissue kit" (Qiagen, USA) from samples taken
from diseased paraffin blocks (at least 3 sections from approximately 5 μ size for
each patient) DNA isolation was performed as 15-20 ng per tube. For mutation
screening, "Easy EGFR" (Diatech, Italy) kit was used. For the first step of the
study, the mixture was prepared by pipetting and spin-centrifuging to prepare 10 μL
of Taq Premix 920, 4 μL of water and 1 μL of EGFR ctrl mix for each reaction for
DNA control.
Distribute 15 μl of the mixture to the reaction tubes and dispense 5 μl of
distilled water for negative control and 5 μl of EGFR Pos for positive control. Ctrl II
and 5 μl of sample DNA for patients. RT-PCR steps were performed using the Rotor
Gene system with the samples obtained. According to this, the samples with Ct
values 20-31 in the green channel were taken to the second stage by considering the
DNA quality as appropriate. Eight different mixtures of EGFR G719x, EGFR
T790M, EGFR S768I, EGFR ex20ins, EGFR L858R, EGFR L861Q, EGFR ex19del
and EGFR ctrl were amplified for each sample during the mutation detection step.
Negative control distilled water and positive control EGFR Pos. Ctrl II was added to
work. The RT-PCR step was performed with the Rotor gene system. In the analysis
phase, the ΔCt values were calculated as described in the evaluation kit, and were
performed according to the manufacturer's recommendations.
XII
For ALK, 4-5 micron sections were taken from the paraffin block and treated
with different temperatures in the solutions in the special kits after the sections were
removed with the oven, xylene and alcohol phases. In the so-called special hybrid
probe, the DNA chain-stained probes were combined in the nucleus at the tissue
section waiting overnight with the probes, and then the preparations were closed with
the material to be washed and the nuclei for several hours. After the treatment, the
preparations were stored in the dark and minus cold. When viewed with a dual filter
in the microscope, non-reoriented nuclei show adjacent green and red signals or
close-up yellow appearing in the nucleus. If more than 15% of the green-red signals
and the single red signals are separated from each other, the ALK rearrangement is
considered positive.
EGFR and ALK mutation status and clinicopathologic features and prognosis
were analyzed.
Results: EGFR mutation was detected in 63 patients (10.6%) from 593
patients. The distribution of mutations was exon 18 in 2 patients, exon 19 in 34
patients, exon 20 in 3 patients and exon 21 in 24 patients. EGFR was found in 36
patients (57.14%) of 63 patients with mutation and it was found that 21.6% of the
patients who participated in the study had a significant difference (P = 0.086). In our
study, there was a significant difference (95.5%) between smoking and non-mutation
group and 11.1% among patients with EGFR mutation, ie negative correlation
between smoking history and EGFR mutation (P = 0.005). There was no relationship
between EGFR mutation and metastatic regions and recurrence.
Among the 593 patients, ALK mutation was found in 19 patients (3.2%).
Eight of the 19 patients with ALK mutation were male (42.1%). In our study, the
percentage of smoking was 95.5% in the non-mutation group, while it was 33.3% in
the ALK mutation patients, meaning that the ALK mutation was more frequent in
non-smokers. There was no difference in metastatic regions or recurrence between
ALK mutation and patients with no mutation or EGFR mutation.
XIII
Discussion: EGFR mutation is more frequent in women, non-smokers and
adenocarcinoma histology. ALK mutation is also more frequent in young, women
and non-smokers, according to this study. Patients with EGFR and ALK mutations
have good prognosis. Targeted treatment should be used in selected patients.