Osteogenezis imperfektalı hastalarda yeni nesil dizi analizi yöntemi ile hedeflenmiş moleküler genetik tanı ve sorumlu yeni genlerin araştırılması
Targeted molecular genetic diagnosis by next generation sequence analysis method and investigation of responsible candidate genes in patients with osteogenesis imperfecta
Yazar: SAMİM ÖZEN
Danışman: PROF. DR. MUHSİN ÖZGÜR ÇOĞULU
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Dizi analizi = Sequence analysis ; Genetik = Genetics ; Osteogenez = Osteogenesis ; Osteogenez-imperfekta = Osteogenesis-imperfecta ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Giriş: Osteogenezis imperfekta (Oİ), kemik kırılganlığına ve deformasyona neden olan benzer iskelet anomalilerini paylaşan fenotipik ve moleküler olarak heterojen bir herediter bağ dokusu bozuklukları grubudur. Osteogenezis imperfektaya  neden olan 17 gen tanımlanmıştır. Klinik olarak dört tipe ayrılır.  Ancak son yıllarda tanımlanan genlere paralel olarak alt tiplerin sayısı 19'a kadar artmıştır. Etiyolojinin yaklaşık %70-80'sini tip I kollajen proteinini kodlayan COL1A1 ve COL1A2 genlerindeki mutasyonlar oluşturur. Bu genler haricinde Tip I kollajenin posttranslasyonel modifikasyonunda ve intrasellüler taşınmasında görev yapan diğer genler de hastalıktan sorumludur.  Çalışmamızda Oİ kliniği olan olgularda hedeflenmiş yeni nesil dizi analizi ile moleküler genetik nedenin araştırılması ve genotip-fenotip ilişkisinin saptanması amaçlandı. 
Yöntem: Osteogenezis imperfekta tanısıyla takipte olan ve genetik çalışmaları daha önce yapılmamış olgular çalışmaya alındı. Öncelikle hastaların klinik tiplendirilmeleri yapıldı. Demografik ve klinik özellikleri hastane dosyalarından elde edildi. İlk aşamada, Oİ'den en sık sorumlu olduğu bilinen COL1A1 ve COL1A2 genlerindeki varyantlar dizi analizi ile araştırıldı.  İkinci aşamada ise bu genlerde anlamlı varyant bulunmayan olgularda kollagen/kemik yapımında görev alan genleri kapsayan hedeflenmiş yeni nesil dizi analiz paneli (Illumina TruSight One) ile Illumina Nextseq550 cihazında yapıldı. Oİ'den sorumlu olan ve çalışılan panelde bulunan genler incelendi. Bulunan varyantların patojeniteleri ACMG/AMP kriterlerine göre belirlendi.
Bulgular: Çalışmaya alınan 30 olgunun (Erkek/Kız:16/14) 8'inde  (%26.6) anne ve babası arasında akraba evliliği var idi.  Ailede etkilenmiş başka birey öyküsü 13'ünde (%43.3) saptandı. Hastaneye başvuru anında ortalama yaş:4.0±3.9 yıl, vücut ağırlığı SDS: -1.6 (-16.1+2.5) SD ve boy SDS: -2.3 (-15.4 - +1.2) SD olarak belirlendi. Klinik tiplendirme yapıldığında; olguların 12'si (%40) Tip I, 3'ü (%10.0) Tip II, 11'i (%37) Tip III ve 4'ü (%13.3) ise Tip IV olarak saptandı. Olguların 17'sinde (%56.6) kemik deformitesi saptanırken, 16'sı (%53.3) bağımsız mobil olarak değerlendirildi.  Olguların 22'sinde (%73.3)  mavi sklera, 6'sında skolyoz  (%20), 4'ünde dentinogenezis imperfekta  (%13.3), 2'sinde işitme kaybı (%6.6) saptandı. 
COL1A1 geninde 16  (%53.3)  ve COL1A2 geninde ise 3 (%10.0) hastada    hastalık ile ilişkili varyant saptandı. Bir (%3.3) olguda ise her iki gende de varyant mevcuttu. Bu genlerde herhangi bir patojenik varyant bulunmayan 10 hastanın 5'inde (%16.7) hedeflenmiş dizi analizi sonucunda 3 farklı gende (SERPINF1, FKBP10 ve P3H1) varyant bulundu. Araştırılan tüm genlerde saptanan varyantların 12'si (%40) daha önce literatürde bildirilmemiş olup in-silico analiz programlarına göre hastalık yapıcı olarak değerlendirildi. Klinik olarak OI olan 5 (%16.7) hastada ise Oİ ile ilişkili olduğu bilinen ve panel listesinde bulunan toplam 15 gende hastalık yapıcı bir varyant saptanmadı. Herhangi bir gende varyant saptanmayan olgularda ileri genetik analizler devam etmektedir. 
Sonuç: Çalışmamızda 30 olgunun 25'inde (%83.3) genetik etiyoloji belirlenmiştir. Ayrıca panelin içerdiği Oİ genlerinin çalışılması ile  12 olguda i hastalık ile ilişkili olduğu düşünülen yeni varyant saptanarak literatüre önemli katkı sağlanmıştır. Osteogenezis imperfekta gibi genetik heterojen hastalıklarda hedeflenmiş dizi analizi çalışmaları mutasyon saptama oranının yükseltilmesi açısından kritik öneme sahiptir.

Abstract:
Introduction: Osteogenesis imperfecta (OI) is a phenotypically and molecularly heterogeneous group of inherited connective tissue disorders that share similar skeletal abnormalities causing bone fragility and deformity.  About 17 genes responsible for OI have been identified to date. Osteogenesis imperfecta was divided into 4 types clinically, the number of subtypes has increased to 19 in parallel with the genes defined over the years. Mutations in the COL1A1 and COL1A2 genes encoding type I collagen are responsible for approximately 70-80% of the etiology. Apart from these genes, genes involved in posttranslational modification and intracellular transport of type I collagen were also responsible for the disease. The aim of this study was to investigate the molecular genetic etiology and to determine the relationship between genotype and phenotype with targeted next-generation sequence analysis for cases with OI phenotype.
Method: Patients with a diagnosis of OI and who had no molecular genetic cause were included in the study. Clinical typing of all patients was performed. Demographic and clinical characteristics were recorded. In the first step, mutations in COL1A1 and COL1A2 genes which are known to be the most responsible for OI were investigated. In the second step, a targeted next-generation sequence analysis panel (Illumina TruSight One) containing genes involved in collagen/bone synthesis was performed on the Illumina Nextseq550 platform in cases with no mutation in these genes. Genes responsible for OI and found in the panel were examined. Pathogenicity of determined variants was determined according to ACMG/AMP criteria.
Results: Of the 30 patients (Female/Male: 14/16) included in the study, 8 (26.6%) had a consanguineous marriage between their parents and 13 (43.3%) had a family history of affected individuals. The mean age at admission was 4.0 ± 3.9 years, and the body weight was evaluated as SDS: -1.6 (-16.1 - 2.5) SD and height as SDS: -2.3 (-15.4 - 1.2) SD. When the cases were grouped according to clinical types; 12 patients (40%) were evaluated as type 1, 3 (10.0%) as type 2, 11 (37%) as type 3, and 4 (13.3%) as type 4. While bone deformity was detected in 17 (56.6%) of the cases, 16 (53.3%) were evaluated as independently mobile. Blue sclera was detected in 22 (73.3%) patients, scoliosis in 6 (20%), dentinogenesis imperfecta in 4 (13.3%) and hearing loss in 2 (6.6%). 
Mutation on COL1A1 gene was shown in 16 patients (53.3%), and on COL1A2 gene in 3 patients (10.0%). One (3.3%) patient existed a mutation in both genes. In 5 (16.7%) of 10 patients who possessed no mutations in these genes, 3 different genes' (SERPINF1, FKBP10, and P3H1) mutations were determined through targeted sequence analysis. Twelve (40%) of the mutations revealed in all analysed genes were not formerly reported in the literature and were assessed to be disease-specific with respect to in-silico analysis programs. In five (16.7%) patients, a disease-related mutation was not assessed  in a total of 15 genes, which were accepted to be related with OI and were contained  in the panel list. Advanced genetic analyzes are continuing in cases where no mutation is defined in any gene.
Conclusion: This study is a comprehensive analysis that indicates the clinical and molecular characteristics of OI disease and the genetic etiology was demonstrated in 25 (83.3%) of 30 cases by targeted sequence analysis method. Morever, 12 new mutations were determined in OI genes and a remarkable contribution was provided to the literature.