Ankaferd ve Defibrotid'in endotel hücre modelinde Endotelyal Protein C Reseptörü (EPCR), Plazminojen Aktivatör İnhibitör 1 (PAI-1) ve Trombin reseptörü (PAR-1) gen ekspresyonları üzerindeki etkisinin araştırılması
Studying of the effects of Ankaferd and Defibrotide on EPCR, PAI-1 and PAR-1 gene expressions inside the endothelial cells
Yazar: AFİFE KARABIYIK
Danışman: DOÇ. DR. ERKAN YILMAZ
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Ankaferd; Thymus vulgaris, Glycyrrhiza glabra, Vitis vinifera, Alpinia officinarum, Urtica dioica bitkilerinden oluşan bir karışımdır ve kanamayı durdurucu ve pleyiotropik etkilerinden dolayı bir topikal hemostatik ajan olarak kullanılmaktadır. ABS, vital eritroid agregasyonuyla protein ağı oluşumunu indükler. Defibrotid ise antitrombotik, profibrinolitik, antiiskemik, antikoagülan ve antiadezif özelliklere sahip DNA bazlı polidispers bir oligonükleotiddir. Trombin Reseptörü olan PAR1, hemostaz, tümör oluşumu, enfeksiyon, apoptozis ve inflamasyon kesişim noktalarında yer almaktadır. Endotelyal Protein C Reseptörü (EPCR), birçok hemostatik, vasküler ve immünolojik olayda yer alır. Aynı şekilde Plazminojen Aktivatör İnhibitör-1 de fibrinolizis, enfeksiyon, neoplazia, obezite ve yara iyileşmesi için çok önemli bir biyolojik mediyatördür.Bu çalışmanın amacı, ABS ve Defibrotid'in İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücre (HUVEC) modelinde Lipopolisakkarit (LPS) varlığı ya da yokluğunda EPCR, PAI-1 ve PAR1 gen ekspresyonları üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu amaçla, 5 dakika (dk), 25 dk, 50 dk, 6 saat (s) ve 24 s'lik zaman periyotlarında ABS (10 ?L ve 100 ?L) ve 1 s, 6 s, 24 s, 48 s ve 72 s'lik periyotlarda Defibrotid (12,5?g/mL, 50 ?g/mL, 200 ?g/mL and 800 ?g/mL) 10 ?g/mL LPS varlığında ve yokluğunda HUVEC'lere uygulandı. HUVEC'lerden total RNA'lar izole edildi ve sonra EPCR, PAI-1 ve PAR1 mRNA ekspresyon seviyeleri incelendi.Yapılan mikroskobik incelemede HUVEC'lere Ankaferd uygulamasından sonra hücrelerin yüzeyden kalkıp toplanarak birbirlerine yapıştıkları gözlendi. 24 saat sonra ise hücreler normal büyüme ve gelişmelerine geri döndüler. HUVEC'lere yalnızca LPS verildiğinde, LPS azalmış PAR1 ekspresyonu ve artmış EPCR ve PAI-1 ekspresyonuna neden oldu. Biz insane umbilical ve endotel hücrelerinde ABS aracılı doz bağımlı geri dönüşümlü EPCR, PAI-1 ve PAR1 downregülasyonu ve Defibrotid aracılı EPCR ve PAR1 upregülasyonunu gözlemledik. Bu bulgular doğrultusunda, ABS ve Defibrotid'in hemostazın birçok basamağında role sahip olabilecekleri düşünülmektedir.

Abstract:
Ankaferd Blood Stopper (ABS) comprises a mixture of the plants including Thymus vulgaris, Glycyrrhiza glabra, Vitis vinifera, Alpinia officinarum, Urtica dioica and has been used as a topical haemostatic agent because of its antihaemorrhagic effect and pleiotropic actions. ABS induced formation of the protein network with vital erythroid aggregation. Defibrotide, a DNA base polydisperse oligonucleotide, has antithrombotic, profibrinolytic, anti-ischemic, anticoagulan and antiadhesive properties. Protease-activated receptor 1 (PAR-1) is located in the crossroads of hemostasis, inflammation, infection, apoptosis and tumorigenesis. Endothelial Protein C Receptor (EPCR) is involved in numerous hemostatic, vascular and immunological actions. Likewise, plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is a very important biological mediator for fibrinolysis, infection, neoplasia, obesity and wound healing.The aim of this study is to assess the effects of ABS and Defibrotide on EPCR, PAI-1 and PAR-1 gene expressions with and without Lipopolysaccharides (LPS) in the Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) model. For this purpose, ABS (10 ?L and 100 ?L) and Defibrotide (12,5?g/mL, 50 ?g/mL, 200 ?g/mL and 800 ?g/mL), had been applied to HUVECs within for 5 minutes (min), 25 min, 50 min, 6 hours (h) and 24 h time periods of ABS and 1 h, 6 h, 24 h, 48 h and 72 h time periods of Defibrotide with and without 10 ?g/mL LPS. Total RNAs were isolated from HUVECs and then EPCR, PAR1 and PAI-1 mRNA expression levels were investigated.It was microscopically observed that cells arised from the surface and adhered to each other after the ABS application to the HUVECs. Also, after 24 hours cells returned the normal growth and physiology. When LPS was given alone to HUVEC, it caused decreased PAR1 expression and increased EPCR and PAI-1 expressions. We observed dose-dependent reversible EPCR, PAI-1 and PAR-1 down-regulation mediated by ABS and dose-dependent EPCR and PAR-1 up-regulation by Defibrotide inside the human umbilical vein endothelial cells. According to this findings, ABS and Defibrotide might have a role on numerous steps of hemostasis is supposed.