Tirozinaz bağlı polimerik nanofiberler kullanılarak dopamin tayini için elektrokimyasal biyosensör üretimi
Fabrication of an electrochemical biosensor for detection of dopamine, employing tyrosinase immobilized polymeric nanofibers
Yazar: UĞUR DAĞLI
Danışman: PROF. DR. ABDÜLKADİR SEZAİ SARAÇ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Enzimler sahip oldukları yüksek katalitik etkinlik ve yüksek selektivite gibi özelliklerinden dolayı biyosensör, biyokataliz, biyoremediasyon, gıda prosesleri ve farmasötik sentez gibi birçok biyokimyasal uygulamada geniş kullanım alanı bulmaktadır. Fakat, düşük stabiliteleri ve geri kazanımlarındaki zorluklar enzimlerden yararlanılan çalışmalarda önemli bir sorun teşkil etmektedir. Bu sorunun üstesinden gelmeye yönelik bir çözüm olarak, özellikle son yıllarda, enzimlerin çözünmeyen katı destekler üzerine immobilizasyonu büyük önem kazanmıştır. Bu sayede enzimin geri kazanımını kolaylaştırmak ve dolayısıyla tekrar kullanılabilirliğini arttırmak hedeflenmektedir.
Enzim immobilizasyonu için katı destek olarak nanomalzemelerin kullanımı giderek daha da önem kazanmakta ve yaygınlaşmaktadır. Nanomalzemeler, özellikle sahip oldukları yüksek yüzey alanı/hacim oranının getirisi olarak enzim yükleme kapasitesini ve katalitik verimi büyük ölçüde arttırdığından dolayı tercih edilmektedir. Özellikle polimerik nanofiberler, diğer nanomalzemeler kullanıldığında karşılaşılabilen sınırlı kütle transferi ve elektrolik çözeltide dispersiyona uğrama gibi sorunlara yol açmadığından nanomalzemeler arasında ön plana çıkmaktadır. Bunun yanı sıra, farklı özelliklere sahip polimer karışımları hazırlanarak, biyouyumluluk, iletkenlik ve mekanik güç gibi istenen niteliklerin biraraya getirildiği nanofiberler elde edilebilir ve bu şekilde sistem optimize edilebilir.
Kullanılan malzemenin elektriksel iletkenliği, özellikle biyosensör uygulamalarında büyük önem arz eder. Bu durum göz önünde bulundurularak, elektrokimyasal nitelikleriyle ön plana çıkan poli(m-antranilik asit) tercih edilmiştir. Poli(m-antranilik asit)'in sağladığı bir başka avantaj da enzimin kovalent bağlanabileceği serbest karboksil gruplarına sahip olmasıdır.  Kullanılan bir diğer polimer olan poliakrilonitril de güçlü adezyon özelliğinen dolayı tercih edilmiştir. Poliüretan ile de  nanofiberlerlerin mekanik gücünü arttırmak hedeflenmiştir. Bunun yanı sıra poliakrilonitril ve poliüretan, fiber oluşturmadaki üstün nitelikleriyle ön plana çıkmaktadır.
Bu çalışmada ilk olarak poliakrilonitril (PAN) ve poliüretan (PU) ağırlıkça 1:1 oranında karıştırılarak dimetilformamid (DMF) içerisinde ağırlıkça %6'lık homojen çözelti elde edildi. Aynı şekilde üç farklı çözelti daha hazırlanarak her birine sırasıyla 0.075 g, 0.150 g, vs 0.300 g poli(m-antranilik asit) (P3ANA) ilave edildi. Daha sonra bu polimer çözeltileri elektrospin yöntemiyle nanofiber üretiminde kullanıldı. Elde edilen nanofiberler ilk olarak ultraviyole (morötesi) ve görünür bölge spektroskopisiyle karakterize edildi. Her bir polimerin nanofiber yapısına katılımı UV -görünür bölge spektrumunda görüntülenen spesifik absorpsiyon bantları tarafından doğrulandı. Ardından yapılan Fourier dönüşümlü infrared (kızılötesi) (FTIR-ATR) spektroskopik analizi de poliakrilonitril, poliüretan ve poli(m-antranilik asit)'in spesifik absorpsiyon bantlarını görüntülemenin yanı sıra, farklı örneklerde giderek artan poli(m-antranilik asit) miktarının yansıması olarak bu polimere ilişkin absorpsiyon bantlarının intensitesinde kademeli bir atış göstererek artan miktarlarda poli(m-antranilik asit)'in yapıya başarılı bir şekilde katıldığını onayladı. 
Spektroskopik analiz sonrasında en yüksek miktarda (0.300 g) poli(m-antranilik asit) içeriğine sahip olan nanofiberler enzim immobilizasyonunda kullanılmak üzere alındı. Poli(m-antranilik asit)'in yapısında bulunan serbest karboksil grupları, enzimin yapısında bulunan amino grupları ile kovalent bağ oluşturarak enzim immobilizasyonunu sağladığından, yüksek miktarda poli(m-antranilik asit) içeriğinin enzim yükleme kapasitesini arttıracağı dikkate alınarak en fazla poli(m-antranilik asit) içeriğine sahip olan nanofiberler tercih edildi. Enzimin (tirozinaz) kovalent immobilizasyonu için 1-etil-3-(dimetil-aminopropil) carbodiimid hidroklorid (EDC)/N-hidroksil süksinimid (NHS) aktivasyon presüdürü uygulandı. Nanofiber matları, fosfat tampon tuzu (PBS) çözeltisinde (0.1 M, pH 7.4) 1:1 molar oranda karıştırılan EDC/NHS çözeltisine 2 saat boyunca maruz bırakılarak oda sıcaklığında 2  saat boyunca karıştırıldı. 2 saatin sonunda fiberler alınarak fazla EDC/NHS'i uzaklaştırmak üzere 2 defa PBS ile yıkandı ve bu şekilde aktive edilmiş olan fiberler bu kez biri 0.5 mg/mL, diğeri 2 mg/mL olan 2 farklı tirozinaz çözeltisine maruz bırakıldı. 4°C'de 2 saatlik inkübasyonun ardından fiberler yine 2 defa PBS ile yıkanarak kovalent bağlanmayan enzimlerin uzaklaştırılması sağlandı. Yıkamalardan arda kalan çözeltiler sonrasında enzim miktarının tayininde kullanılmak üzere alındı.
Enzim immobilizasyonu bu şekilde gerçekleştirildikten sonra enzim bağlı nanofiber matlar ilk olarak FTIR-ATR spektroskopisiyle karakterize edildi. Oluştuğu gözlenen yeni absorpsiyon bantları, daha önceki bantlarda gözlenen kaymalar ya da spesifik bantların intensitesindeki azalmalar, nanofiberlere tirozinazın bağlanmasından kaynaklanan yapısal değişiklikleri doğruladı. Tirozinazın kovalent bağlanması bu şekilde doğrulandıktan sonra, bağlı olan enzim miktarını tayin etmek üzere bikinkoninik asit (BCA) yöntemi uygulandı. Enzim bağlama ve sonrasındaki yıkama adımlarından arda kalan solüsyonlara BCA çalışma solüsyonu ilave edilerek 37°C'de 30 dakika inkübe edildi ve ardından UV-görünür bölge spektrofotometresi kullanılarak 562 nm'deki absorbans değerlerine bakıldı. Kovalent bağlanmayan enzimlerin ortamdan uzaklaştırılması sonucunda yıkama solüsyonlarında kalan tirozinaz miktarının giderek azaldığı gözlendi ve başlangıç solüsyonundaki enzimin %87'sinin kovalent bağlandığı hesaplandı. 
Enzim immobilizasyon sürecinin başarıyla gerçekleştirildiği bu şekilde doğrulandıktan sonra nanofiberlerin morfolojik karakterizasyonuna geçildi. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak elde edilen görüntülerden nanofiber çapları PAN/PU blendi için 103±11 nm, artan miktarlarda P3ANA içeren PAN/PU/P3ANA blendleri içinse sırasıyla 144±24 nm (0.075 g P3ANA), 111±17 nm (0.150 g P3ANA) ve 119±22 nm (0.300 g P3ANA) olarak bulundu. PAN/PU blendine ait nanofiberler düzgün bir yüzey morfolojisine sahipken artan miktarlarda P3ANA içeren nanofiberlerin giderek daha pürüzlü bir yüzey morfolojisi sergilediği gözlendi. 0.5 mg ve 2 mg tirozinaz bağlanan nanofiberlerin çapları ise sırasıyla 131±22 nm ve 141±21 nm olarak ölçüldü. Nanofiber çaplarındaki artışların yanı sıra, enzim immobilizasyon sürecinin nanofiberlerin yüzey pürüzlülüğünü belirgin şekilde azalttığı gözlemlendi. 
İmmobilize edilen tirozinazın nanofiberler üzerindeki dağılımını görüntülemek üzere, bir başka morfolojik karakterizasyon yöntemi olan enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi  (EDX) uygulandı. Tirozinazın yapısında bulunan, ancak polimerik nanofiberlerin yapısında bulunmayan bakır atomunun dağılımına yönelik bu elemental analiz, doğrudan tirozinazın dağılımı hakkında bilgi sahibi olmaya olanak tanıdı. Sonuçta tirozinazın nanofiberler üzerinde homojen dağılım gösterdiği, bu dağılımın özellikle P3ANA'nın yapısında bulunan karboksil gruplarının dağılımıyla örtüştüğü gözlendi. 
Son olarak nanofiberlerin elektrokimyasal davranışları elektrokimyasal empedans spektroskopisiyle analiz edildi ve özellikle enzim immobilizasyonunun nanofiberlerin elektrokimyasal özelliklerini ne şekilde etkilediği karşılaştırmalı olarak incelendi. Nyquist ve Bode faz açısı grafiklerinden elde edilen deneysel veriler eşdeğer devre modelleri üzerinden değerlendirildi. Enzim içermeyen nanofiberlerin elektrot olarak, PBS'in ise elektrolit olarak kullanıldığı sistem R(CR)(QR)W eşdeğer devresiyle tanımlandı. Bu eşdeğer devre tasarlanırken elektrolitten gelen çözelti direnci (Rs), çözeltiyle nanofiber yüzeyi arasındaki yük transfer direnci (Rct), fiberler üzerindeki çift tabaka kapasitansı (Cdl), sabit faz elemanı (Q) ve Warburg empedansı göz önünde bulunduruldu. Tirozinaz immobilizasyonu sonrasında elde edilen sisteme karşılık gelen eşdeğer devre ise, nanofiberlerle çözelti arasına giren enzim tabakası ve bundan kaynaklanan yeni direnç ve kapasitans elemanları dikkate alınarak R(CR)(CR)(QR)W şeklinde tanımlandı. Tirozinaz immobilizasyonu sonucunda arayüz yapısında meydana gelen değişikliklere bağlı olarak çözelti direnci ve yük transfer direncinde bir düşüş olduğu tespit edildi.

Abstract:
Nanofibers of polyacrylonitrile (PAN)/polyurethane (PU)/poly(m-anthranilic acid) (P3ANA) blend were fabricated by the electrospinning process. UV-Visible spectroscopy was performed to confirm the incorporation of each individual polymer into the nanofibers. This is followed by a  Fourier Transform Infrared Spectroscopy – Attenuated Total Reflectance (FTIR-ATR) analysis, which displayed an increasing intensity in the bands specific to  poly(m-anthranilic acid), in correlation with its increasing amounts in the blend. Nanofibers with the highest amount of P3ANA were then used for enzyme immobilization, considering it provides more carboxyl groups for enzymes to bind onto. Next, tyrosinase immobilization on these nanofibers was carried out by 1-ethyl-3-(dimethyl-aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)/N-hydroxyl succinimide (NHS) activation procedure. Covalent binding of tyrosinase onto nanofiber mats was confirmed by FTIR-ATR analysis, and a subsequent bicinchoninic acid (BCA) assay revealed the amount of enzyme immobilized. Morphology and composition of nanofibers before and after enzyme immobilization were characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM)/Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX). The surface morphology of the tyrosinase immobilized PAN/PU/P3ANA nanofibers became smoother and the diameters of the fibers increased. Elemental analyses and EDX-mapping of nitrogen and copper atoms showed that the enzyme was evenly distributed on the surface of the nanofibers.Then, Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) analysis was performed to observe the effects of immobilized enzyme on electrochemical properties of nanofibers and the data were fitted with an equivalent electrical circuit model. The changes in structure, composition and morphology of nanofibers after tyrosinase immobilization affected their electrochemical behavior. The solution resistance and charge transfer resistance of nanofibers decreased after enzyme immobilization.