Alfa-galaktozidaz a eksikliği tanı ve takibinde kullanılmak üzere lizo-globotriozilseramid (LYSO-GB3) düzeyi ölçümü için likit kromatografisi -ardışık kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) metodu geliştirilmesi ve validasyonu
Development and validation of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for measurement of LYSO-globotriaosylceramide (LYSO-GB3) level for use in diagnosis and follow-up of ALPHA-galactosidase a deficiency
Yazar: ELİF ERKAN KURDOĞLU
Danışman: PROF. DR. YEŞİM ÖZKAN
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Ecz) Ana Bilim Dalı / Eczacılık Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Fabry hastalığı = Fabry disease ; Galaktosidazlar = Galactosidases ; Genler = Genes ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Mutasyon = Mutation

Özet:
Fabry hastalığı, α-galaktozidaz A (α-Gal A) enzim eksikliği ile sonuçlanan GLA genindeki mutasyonların neden olduğu, X'e bağlı nadir bir lizozomal depo hastalığıdır. Yetersiz α –galaktozidaz A aktivitesi glikosfingolipidler, globotriozilseramidin (Gb3) ve globotriozilsfingozinin (Lizo-Gb3) lizozomlar içinde vasküler endotel, podositler, arteriyel düz kas hücreleri ve kardiyomiyositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde ilerleyici birikimine yol açar. Bu çalışmada Fabry hastalığı için en umut vadeden biyobelirteç, ikincil tarama hedefi olan Lizo-Gb3'ün plazma ve kuru kanda (DBS) ölçümü için basit, hızlı ve hassas bir yöntem önerilmiştir. Ön işlem olarak basit protein çöktürme metodu uygulanarak plazma ve kuru kan Lizo-Gb3 konsantrasyonları, UPLC-MS/MS'te pozitif elektrosprey iyonizasyonunda, Multiple reaction monitoring (MRM) kullanılarak ölçülmüştür.Yöntem geçerli kılma çalışmalarında, kalibrasyon aralığını 0,50 -100 ng/mL olarak elde edilmiştir. Gün- içi ve günler arası doğruluk ve kesinlik (%CV) <%10 olarak hesaplanmıştır. Tespit limiti (tayin alt sınırı) ve ölçüm limiti (teşhis sınırı) sırasıyla 0,1 ng/mL ve 0,3 ng/mL olarak saptanmıştır. Geri kazanım %95'in üzerinde saptanmıştır. Yöntem 97 adet sağlıklı kontrol grubunda ve 88 adet Fabry Hastalığı tarama grubunda uygulanmıştır. Lizo-Gb3 konsantrasyonları hem erkek hem de kadın Fabry hastalarında, sağlıklı kontrollere kıyaslandığında oldukça yüksek saptanmıştır (p< 0,001). Bu veriler yöntemin Fabry hastalarında plazma ve kuru kan örneklerinde Lizo-Gb3 tespiti için uygun olduğunu, tarama, tanı ve terapötik monitörizasyon için kullanılabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Fabry disease is a rare X-linked lysosomal storage disease caused by mutations in the GLA gene resulting in α-galactosidase A (α-Gal A) enzyme deficiency. Insufficient α-galactosidase A activity leads to the progressive accumulation of glycosphingolipids, globotriaosylceramide (Gb3) and globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) within lysosomes in various cell types, including vascular endothelium, podocytes, arterial smooth muscle cells, and cardiomyocytes. In this study, a simple, rapid and sensitive method is proposed for the measurement of Lyso-Gb3, the most promising biomarker for Fabry disease, the secondary screening target, in plasma and dry blood (DBS). Plasma and dried blood sample (DBS) Lyso-Gb3 concentrations were measured using multiple reaction monitoring (MRM) in positive electrospray ionization in UPLC-MS/MS using the simple protein precipitation method as a pretreatment. In method validation studies, calibration range was obtained as 0.50 -100 ng/mL. Intra-day and inter-day accuracy and precision (%CV) were calculated as <10%. Limit of detection and limit of quantification were determined as 0.1 ng/mL and 0.3 ng/mL, respectively. Recovery was over 95%. The method was applied in 97 healthy control group and 88 Fabry Disease screening group. Lyso-Gb3 concentrations were found to be quite high in both male and female Fabry patients compared to healthy controls (p< 0.001). These data show that the method is suitable for detection of Lyso-Gb3 in plasma and dried blood samples (DBS) from Fabry patients and can be used for screening, diagnosis and therapeutic monitoring.