Kemik dokusunun rejenerasyonunda hücre tabakalarının farklı uygulamaları
Different applications of cell sheets in regeneration of bone tissue
Yazar: ÜLKÜ BOZOĞLU
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Gerçekleştirilen bu çalışma, 17055 No'lu Hacettepe Üniversitesi, Kapsamlı Araştırma Projesi ile desteklenmiştir. Ayrıca, tezi gerçekleştiren Ülkü BOZOĞLU, doktora çalışması boyunca TÜBİTAK-2211-A Genel Yurt İçi Doktora Bursu ile desteklenmiştir. Sunulan tez çalışması kapsamında halihazırda diş implantı olarak yaygın bir şekilde kullanılan titanyum (Ti) metalik implantlara alternatif kullanım potansiyeli olan polietereterketonun (PEEK) diş implantı olarak kullanım potansiyelinin artırılmasına yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir.
Çalışmanın ilk kısmında, kimyasal yapısı nedeniyle hücre adezyonu ve kemik entegrasyonu sınırlı olan PEEK malzemesinin biyoaktivitesini artırmaya yönelik iki farklı yöntem gerçekleştirilmiştir. Bunlar kimyasal bir yöntem olan sülfolama ve PEEK yüzeylerinin sentetik osteokondüktif hidroksiapatit (HAp) ile kaplanması şeklinde uygulanmıştır. Sülfolama işlemi ile PEEK yüzeylerinde nanoyapıda birbirleriyle bağlantılı gözenenekli bir yapı oluşturulmuştur (SPEEK). Ayrıca PEEK ve SPEEK örnekleri nanoyapıda bor içeren HAp ile mikrodalga destekli yöntem ile kaplanmıştır. PEEK yüzeylerinde oluşan gözeneklilik ve HAp birikimi, taramalı elektron mikroskobu (scanning electron microscopy, SEM), X-ışın kırınımı (X-ray diffraction, XRD), Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (Fourier Transform Infrared spectroscopy, ATR-FTIR) ile belirlenmiştir. PEEK biyomalzemesi üzerinde periodontal ligament hücrelerinin (PDL) canlılığı ve osteojenik farklılaşmaları gerçekleştirilen in vitro ortam hücre kültürü analizleri ile değerlendirilmiştir. Çalışma sonuçları PEEK malzemesinin sülfolama işleminin uygulanmasının ve B-nHAp kaplanmasının ikili bir etki yaparak PDL hücrelerinin osteojenik farklılaşmasını artırdığı ortaya koyulmuştur.
Çalışmanın ikinci kısmında, PDL hücre tabakaları ve PDL ve insan göbek kordonu veni endotel hücrelerinden oluşan (human umblical vein endothelial cell, HUVEC) ko-kültür hücre tabakaları kullanılarak PEEK-PDL/ko-kültür hücre tabakaları kompleksinin oluşturulmasıdır. İnsan kaynaklı PDL ve PDL-HUVEC hücre tabakaları vitamin C ve yüksek hücre ekimi metotlarıyla (cm2'ye 100,000 hücre) elde edilmiş ve SPEEK ve SPEEK- B-nHAp yüzeylerle birleştirilmiştir. Hücre tabakaları ve modifiye edilmiş PEEK malzemelerinden oluşan bu yüzeyler 21 hafta boyunca osteojenik ortamda tutulmuştur. Hücre tabakaları malzeme yüzeyine kuvvetli bir şekilde tutunmuş ve 3 hafta boyunca canlılıklarını devam ettirmişlerdir. Modifiye edilmiş PEEK örnekler üzerindeki hücre tabakalarının kemik ve vasküler belirteçlerinin değerlendirilmesi ALP aktivitesi analizi, RT- PCR, Western blot ve immunositokimya boyama analizleri kullanılarak değerlendirilmiştir. PDL hücre tabakalarının osteojenik farklılaşmasının yüksek olduğu belirlenmiştir. Ayrıca HUVEC ile ko-kültürün özellikle geç dönem osteojenik farklılaşma üzerinde etkili olduğu gösterilmiştir. Hücre tabakalarının, SPEEK ve SPEEK-B-nHAp malzemeleri ile birleştirilmesi PEEK'in biyoaktivitesinin ve diş implantı olarak entegrasyonunun artırılması yönünde yeni bir yaklaşım olarak ortaya koyulmuştur.

Anahtar Kelimeler: poli(etereterketon), bor, hücre tabakası, diş implant, nanohidroksiapatit

Abstract:
This study was supported by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit (Project Number: 17055) and Ülkü Bozoğlu was also supported by TÜBİTAK (TÜBİTAK-2211-A). Within the scope of the presented thesis, studies have been carried out to increase the potential of the use of polyetheretherketone (PEEK), which has the potential of alternative use to titanium (Ti) metallic implants, which are widely used , as a dental implant.
However, PEEK is inherently inert material and that characteristic limits cellular adhesion and bone integration of PEEK. There are a number of methods that have been offered to enhance the bioactivity of PEEK including coating PEEK with synthetic osteoconductive hydroxyapatite (HAp) and sulfonation. In this work, a nanostructured porous surface is created on PEEK surfaces by sulfonation (SPEEK). Then, PEEK and SPEEK samples were coated nanostructured B doped HAp (B-nHAp) from 10xSBF by microwave-assisted method. Scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD) and Fourier Transform Infrared spectroscopy (ATR-FTIR) reveal the formation of nanopores and nanostructured HAp on the PEEK surface. In vitro cell viability assay and osteogenic differentiation analyses disclose improved adhesion, proliferation and osteo-differentiation of periodontal ligament cells (PDL). Our results indicate that sulfonation and B-nHAp modifications have dual effects on the osteogenic differentiation of PDL and increase of osteointegration of PEEK dental implant.
In the second part of the study, PDL cell sheets and PDL and human umbilical cord vein endothelial cells (human umblical and endothelial cell, HUVEC) co-culture cell sheets using the PEEK-PDL / co-culture cell sheets complex was formed. Human-derived PDL and PDL- HUVEC cell sheets were obtained by vitamin C and high cell seeding methods and combined with SPEEK and SPEEK-B-nHAp samples. These complex, consisting of cell sheets and modified PEEK materials, were kept in the osteogenic environment for 21 weeks. The cell sheets were firmly attached to the surface of the material and maintained their vitality for 3 weeks. Evaluation of bone and vascular markers of cell sheets on modified PEEK samples were evaluated using ALP analysis, RT-PCR, Western blot and immunocytochemistry staining analyzes. The osteogenic differentiation of PDL cell sheets was found to be high. In addition, co-culture with HUVEC has been shown to be particularly effective on late- stage osteogenic differentiation. The combining of cell sheets with SPEEK and SPEEK-B- nHAp materials has been demonstrated as a new approach to increase the bioactivity and complementarity of PEEK as dental implant.

Keywords: poly(etheretherketon), boron, cell sheets, dental implants, nanohydroxyapatite