Taenia multiceps ve t. hydatigena anneksin genlerinin moleküler karakterizasyonu ve koyunlarda Coenurus cerebralis'in teşhisinde anneksin b12 b-cell epitopunun serodiagnostik etkinliğinin araştırılması
Molecular characterization of taenia multiceps and t. hydatigena annexin genes and serodiagnostic efficacy of annexin b12 b-cell epitope in the diagnosis of Coenurus cerebralis in sheep
Yazar: ZEKİ ERGENE
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Veteriner Parazitoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
TAENİA MULTİCEPS ve T. HYDATİGENA ANNEKSİN GENLERİNİN MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU VE KOYUNLARDA COENURUS CEREBRALİS'İN TEŞHİSİNDE ANNEKSİN B12 B-CELL EPİTOPUNUN SERODİAGNOSTİK ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI
Zeki ERGENE

T.C. Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Veteriner Parazitoloji Anabilim Dalı
Doktora Tezi, Nisan 2024
Danışman: Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM

ÖZET
Bu çalışmada, oluşturduğu patojenite ile koyunlar başta olma üzere ruminantlarda yüksek ekonomik kayıplara yol açan Taenia multiceps metcestodu Coenurus cerebralis ile yine koyunlarda oldukça yaygın olan T. hydatigena metacestodu Cysticercus tenuicollis izolatlarında hücre zarı taşınması, sinyal iletimi ve kalsiyum kanalı oluşumu gibi çeşitli biyolojik faaliyetler ile enflamasyonla ilgili biyolojik tepkilerde ve immunitede önemli rolleri olan üç anneksin homoloğu B2, B3 ve B12'yi kodlayan genler ve  ifade ettikleri proteinlerin moleküler karakterizasyonun sağlanması, Coe. cerebralis enfeksiyonlarının teşhisinde anneksin B12'nin B Hücre epitopunu içeren peptid bazlı ELISA geliştirilmesi ve Coe. cerebralis'in İç Anadolu yöresinden örneklenen koyunlarda geliştirilen bu teknikle seroprevalansının araştırılması amaçlanmıştır.  Bu kapsamda koyunlardan elde edilen Coe. cerebralis ve C. tenuicollis izolatlarından total RNA ekstraksiyonu yapılarak cDNA sentezi gerçekleştirilmiş ve sonrasında özgün primerlerle her üç anneksinin kodlama gen bölgeleri PCR'da çoğaltılmıştır. PCR ürünleri uygun plasmid vektöre klonlanarak rekombinant plazmid DNA'lar elde edilmiş ve sonrasında Sanger platformunda çift yönlü olarak sekanslanmıştır. Elde edilen kromotogramlar biyoinformatik araçlarla işlenerek izolatlara ait nükleotid ve amino asit konsensüs sekansları elde edilmiş ve nükleik asitler ile kodladıkları amino asitler ve protein düzeyinde moleküler karakterizasyonları sağlanmıştır. Her iki Taenia türüne ait anneksin genlerinin filogenetik analizleri gerçekleştirilmiştir. T. multiceps anneksin B12 amino asit sekansları içerisinden biyoinformatik araçlarla optimum özellikte B hücre epitopu belirlenmiş ve peptid olarak sentezletilerek ELISA platformunda Coe. cerebralis enfeksiyonlarının teşhisinde etkinlik değerlendirmeleri yapılmıştır. Geliştirilen bu teşhis yaklaşımıyla İç Anadolu Yöresinden farklı bölgelerden örneklenen koyunlarda Coe. cerebralis'in seroprevalansı araştırılmış ve epidemiyolojik değerlendirmeleri yapılmıştır. Her iki Taenia türüne ait anneksin B2, B3 ve B12 genlerinin açık okuma çerçevesi sekanslarının sırasıyla 1065 bp , 933 bp ve 957 bp büyüklüğünde olduğu ve 310, 318 ve 354 aminoasit zinciri içeren anneksin B3 ve B12 için yaklaşık 35,5 kDa, anneksin B2 için ise yaklaşık 40,0 kDa büyüklüğünde proteinleri kodladıkları belirlenmiştir. Hem T. multiceps hem de T. hydatigena için elde edilen biyoinformatik sonuçlar her üç anneksin bölgesinin de anneksin ailesi üyelerinin tipik özelliklerini paylaştığını ve amino asit sekansı içerisinde dört motif sergilediğini göstermiştir. Her üç anneksin geni için de türlerin filogenetik ağaçta monofiletik olarak topoloji sergilediği belirlenmiş ve filogenetik analiz sonuçları karakterize ettiğimiz anneksinlerin Clade I'de konumlandığını göstermiştir. T. multiceps anneksin B12 amino asit sekanslarından belirlenen pTmulAnxB12 B- hücre epitopunun diğer Taenia türleri ve E. granulosus dizilimleri ile 1-4 amino asit farklılığı gösterdiği, ayrıca suda iyi çözündüğü ve uygun biyokimyasal özellikler taşıdığı tespit edilmiştir. ELISA tabanlı analizde saptanan OD değerlerine göre ROC analizleri gerçekleştirilmiş ve 1.100 cut-off değerinde pTmulAnxB12 B-hücre epitopu tabanlı ELISA'nın Coe. cerebralis enfeksiyonunun tanısındaki duyarlılığı %100,00 ve özgüllüğünün de %80,95 olduğu belirlenmiştir. Geliştirilen pTmulAnxB12 tabanlı ELISA'da Kayseri, Yozgat, Sivas, Nevşehir ve Niğde illerinden toplam 250 koyun serum örneğinin analizi sonucunda Coe. cerebralis sero-prevalansı %18,0 olarak tespit edilmiştir.
Anahtar kelimeler: Taenia muticeps, Taenia hydatigena, anneksin, moleküler karakterizasyon, B hücre epitopu, ELISA.

Abstract:
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF TAENIA MULTICEPS AND T. HYDATIGENA ANNEXIN GENES AND SERODIAGNOSTIC EFFICACY OF ANNEXIN B12 B-CELL EPITOPE IN THE DIAGNOSIS OF COENURUS CEREBRALIS IN SHEEP
Zeki ERGENE
Erciyes University, Graduate School of Health Science
Department of Veterinary Parasitology
PhD Thesis, April 2024
Supervisor: Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM
ABSTRACT
In this study, it was aimed to provide molecular characterization of the genes encoding three annexin homologs B2, B3, and B12, which have important roles in various biological activities such as cell membrane transport, signal transmission, calcium channel formation, and biological responses related to inflammation and immunity, in Taenia multiceps metacestode Coenurus cerebralis and Taenia hydatigena metacestode Cysticercus tenuicollis isolates that cause high economic losses especially in ruminants such as sheep, and to develop a peptide-based ELISA containing B cell epitope of annexin B12 in the diagnosis of Coenurus cerebralis infection and investigate its seroprevalence in sheep samples collected from the Central Anatolia region. Total RNA extraction was performed from Coe. cerebralis and C. tenuicollis isolates obtained from sheep, followed by cDNA synthesis with specific primers and PCR amplification of the coding regions of all three annexins. PCR products were cloned into the appropriate plasmid vector to obtain recombinant plasmid DNAs and then sequenced in both directions using the Sanger platform after processing chromotograms with bioinformatics tools to obtain consensus sequences of nucleotides and amino acids specific to the isolates and provide their molecular characterization at the nucleic acid and protein levels. Phylogenetic analyses of annexin genes from both Taenia species were performed. Optimal B cell epitope in T. multiceps annexin B12 amino acid sequences was determined using bioinformatics tools, and a peptide was synthesized and evaluated for its efficacy in the diagnosis of Coe. cerebralis infections by ELISA. With this diagnostic approach, the seroprevalence of Coe. cerebralis was investigated in sheep samples collected from different regions of the Central Anatolia region, and epidemiological evaluations were carried out. The open reading frame sequences of Annexin B2, B3, and B12 genes for both Taenia species were found to be 1065 bp, 933 bp, and 957 bp, respectively, encoding proteins of approximately 35.5 kDa for Annexin B3 and B12, and approximately 40.0 kDa for Annexin B2 which contain 310, 318, and 354 amino acid chains. Bioinformatic results obtained for both T. multiceps and T. hydatigena showed that all three annexin regions shared typical characteristics of annexin family members and exhibited four motifs within their amino acid sequences. It was determined that all three annexin genes exhibited monophyletic topology in the phylogenetic tree, and the phylogenetic analysis results showed that the characterized annexins were located in Clade I. The B-cell epitope pTmulAnxB12 identified from T. multiceps annexin B12 amino acid sequences was found to have 1-4 amino acid differences with other Taenia species and E. granulosus sequences, as well as being highly soluble in water and having suitable biochemical properties. ROC analyses were performed based on the OD values determined in ELISA, and it was found that pTmulAnxB12 B-cell epitope-based ELISA at a cut-off value of 1,100 had a sensitivity of 100.00% and specificity of 80.95% in the diagnosis of Coe. cerebralis infection. Using the developed pTmulAnxB12-based ELISA, the seroprevalence of Coe. cerebralis was determined to be 18.0% in a total of 250 sheep serum samples collected from Kayseri, Yozgat, Sivas, Nevşehir, and Niğde provinces.

Key words: Taenia muticeps, Taenia hydatigena, Annexin, molecular characterization, B cell epitop, ELISA.