LNCaP hücrelerinde makrofaj kaynaklı enflamatuar çevresel stresle indüklenen entegre stres yanıtının tümör progresyonu ve antiandrojen terapötik yanıtları üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of M1 polarized macrophages-mediated inflammatory environmental stress induced integrated stress response on tumor progression and antiandrogen therapeutic efficacy in LNCaP cells
Yazar: FATİH HUNÇ
Danışman: PROF. DR. MELTEM ÖZLEN DİLLİOĞLUGİL ; DR. ÖĞR. ÜYESİ KEREM TEKE
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Makrofajlar = Macrophages ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Oksidatif hasar = Oxidative damage ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Prostat neoplazmları = Prostatic neoplasms ; Reseptörler-androjen = Receptors-androgens ; Tümör mikroçevresi = Tumor microenvironment ; İlaçlara direnç-neoplazm = Drug resistance-neoplasm ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Bu tez çalışmasında, M1 polarize tümör ilişkili makrofaj (TAM) kaynaklı enflamatuar tümör mikroçevresinin (TM) LNCaP hücrelerinde tetiklediği endoplazmik retikulum (ER) stresi, katlanmamış protein yanıtı (KPY) ve selüler entegre stres yanıtının, hormon duyarlı prostat kanserinde (PK) antiandrojen (apalutamid) terapötik etkinliği, tümörogenez ve kanser progresyonu üzerine olan etkileri araştırılmaktadır. Öncelikle, U937 monosit hücreleri iki aşamalı kimyasal indüksiyonla M1 polarize TAM'lara farklılaştırıldı. M1 polarize TAM'lardan kaynaklanan enflamatuar TM'nin in vitro modellenmesi, U937 hücrelerinin PMA uyarısıyla nonpolarize M0 makrofajlara farklılaştırılmaları ve akabinde Th1 sitokinler aracılığıyla M1 polarize TAMs farklılaşmasının uyarımı neticesinde elde edilen makrofaj hücre kültür ortamının, koşulu besiyeri (KB, kondisyonlanmış ortamın) olarak hazırlanması ve ilgili deney gruplarında kültür ortamı olarak 24 saat süresince uygulanması ile gerçekleştirildi. PK tümör biyolojisine ilişkin deneyler, hormon duyarlı metastatik prostat adenom hücresi olan LNCaP hücre hattı kullanılarak gerçekleştirildi. KB'nin metabolik karakterizasyonu, sitokin profillerinin ELİSA yönteminde, nitrojen oksitler ve hidrojen peroksit düzeylerinin ise kolorimetrik biyokimyasal analizlerden elde edilen verilerle desteklenmesiyle gerçekleştirildi. Tümör hücresi entegre stres yanıtları, tümörogenez, epitelyal mezenkimal geçiş (EMT), köklülük, anjiojenez ve intraselüler redoks dengesine ilişkin gen ifadelerinin analizleri qRT-PCR ile, oksidatif hasar ve antioksidan savunma mekanizmalarına ilişkin biyokimyasal belirteçlerin tayini kolorimetrik deneylerle, oksidatif DNA hasarı ve hasar tamir yanıtı ve apoptotik aktivitedeki değişim, sırasıyla western blot, immünfloresan kaspaz-3 aktivite deneyi ve qRT-PCR'da gen ifade analizleri ile, hücre canlılık, proliferasyon ve sitotoksisite düzeyleri WST-1 ve LDH deneyleri ile belirlendi. M1 polarize TAMs'dan kaynaklanan enflamatuar çevresel stresin LNCaP hücre canlılıklarında artma, selüler sitotoksisitede azalma ile proliferasyonda artışa neden olduğu bulundu. Ayrıca tümör hücre sağkalımında ve karsinogenezin desteklenmesinde rol oynayan KPY, entregre stres yanıtı ile antioksidan savunma mekanizmalarının dahil olduğu selüler sinyal yolaklarının enflamatuar stresin modellediği deney grubunda en yüksek düzeyde aktive olduğu, diğer taraftan reaktif oksijen türlerinin neden olduğu oksidatif DNA hasarı ve DNA hasar tamir yanıtlarında artış ile kaspaz-3 aracılı apoptozisin de indüklenmiş olduğu gösterildi. Moleküler analizlerden elde edilen deneysel veriler, enflamatuar çevresel stresin aracılık ettiği selüler değişimlerin, apalutamidin hormon duyarlı PK hücreleri üzerindeki antiproliferatif ve sitotoksik etkinliğinin yitirilmesine neden olduğunu göstermektedir. Buna karşın, apalutamidin LNCaP tümör biyolojisinde adaptif selüler sinyal yollaklarında meydana gelen AR sinyalinin uyarılması, anjiyogenez, EMT, tümör köklülüğü ve karsinogenezin indüksiyonunu içeren enflamatuar stresin aracılık ettiği tümör progresyonuyla ilişkili olan değişiklikler üzerindeki baskılayıcı etkiler sergilemeye devam ettiği gösterildi. Sonuç: Enflamatuar çevresel stres uyarısının tümör biyolojisinde meydana getirdiği etkilerin kanser progresyonunda ve tedavi direncindeki önemine işaret eden araştırma bulguları, preklinik ve klinik araştırmalarla desteklenen mevcut literatürle uyum göstermektedir. Hormon duyarlı PK'de enflamatuar TM, tümör progresyonu ve antiandrojen ilaç direnci gelişiminde önemli rol oynamaktadır. M1 polarize TAM kaynaklı enflamatuar çevresel stresin in vitro modellendiği bu çalışmada, LNCaP hücrelerinde enflamatuar stresle indüklenen KPY ve selüler adaptif entegre stres yanıtı ile karsinojenik sinyal yolaklarının aktivasyonu, tümör hücre sağkalımı ve agresif tümör karakteri gelişimini desteklemektedir. Enflamatuar stres, LNCaP hücrelerinde invazyon, migrasyon ve metastatik potansiyeliyle ilişkili EMT ve tümör hücre köklülüğünü uyarmakta, anjiojenez ile antioksidan savunma mekanizmalarını aktive ederek hücre kurtuluşunu sağlamaktadır. Nihai olarak, selüler ve nonselüler bileşenleriyle kompleks ve dinamik bir yapı olan TM'nin terapötik yaklaşımlar açısından önemine ilişkin vurgusuyla bu tez çalışmasının translasyonel tıp alanına katkı sunacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Objective: This thesis study explores the effects of endoplasmic reticulum (ER) stress, unfolded protein response (UPR), and cellular integrated stress response in LNCaP cells, which are triggered by the inflammatory tumor microenvironment, composed of M1 polarized tumor-associated macrophage (TAM), on the antiandrogen therapeutic efficacy, tumorigenesis and cancer progression in hormone-sensitive prostate cancer. Method: Primarily, U937 monocytic cells were differentiated into M1 polarized TAMs using with two-step chemical induction protocol, which included macrophage differentiation and polarization processes. In the first step, U937 cells were treated with PMA in order to differentiate promonocytic cells into the M0 nonpolarized mature macrophages. In the second step of the protocol, M0 macrophages were treated with Th1 cytokines to obtain M1 polarized macrophages differentiation. Afterward, M1 polarized macrophages culture media was collected and brought into cell free supernatant, that termed as conditioned medium (CM), in order to establish in vitro inflammatory tumor microenvironment model. Thereafter, metabolic characterization of CM was carried out with determination of its content, that composed of miscellaneous bioactive substances e.g. cytokines, chemokines, nitrogen oxides, hydrogen peroxide molecules. For that purpose, pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines were analyzed using with ELISA kits, while nitrogen oxides and hydrogen peroxide levels were determined by using colorimetric analysis. LNCaP cell line was used in carrying out the research on hormone-sensitive metastatic prostate adenocarcinoma cells. Concisely, M1 polarized TAMs mediated in vitro inflammatory TM model was conducted using with CM for 24 hour, as LNCaP cell culture medium in inflammatory stress groups. Changes in integrated stress response, carcinogenesis, epithelial mesenchymal transition (EMT), stemness, angiogenesis, and intracellular redox balance and activation of UPR due to perturbation of ER homeostasis were evaluated with qRT-PCR analysis of related genes expression levels in LNCaP cells. Moreover, biochemical markers of oxidative cell damage and antioxidant defense mechanisms were determined by colorimetric analysis. DNA damage repair response and apoptotic activity were determined by western blot, immunofluorescent caspase-3 activity assay, and gene expression analysis with qRT-PCR; cell viability, proliferation and cytotoxicity levels were determined by WST-1 and LDH activity assays, respectively. Results: The data obtained from this study shown that inflammatory environmental stress stimulus, which originated from M1 polarized TAMs, increased LNCaP cell viability and proliferation, besides decreased cellular cytotoxicity. Furthermore, UPR, integrated stress response and antioxidant defense mechanisms with concominant cellular signaling pathways, which play a salient role in tumor cell survival and support carcinogenesis, were were found to be activated at the highest level in experimental group modeling of inlammatory stress. On the other hand, reactive oxygen species mediated oxidative DNA damage and DNA damage repair responses were found to be increased, compatible with the data which demonstrated activation of caspase-3-mediated apoptosis. Experimental data obtained from molecular analysis shows that inflammatory environmental stress mediated cellular alterations caused loss of anti-proliferative and cytotoxic effects of apalutamide on hormone-sensitive prostate cancer cells. Notwithstanding the finding, apalutamide remained to exhibite of suppressive effects on the adaptive cellular signaling pathways regarding inflammatory stress mediated changes which comprised of stimulation of AR signaling, induction of angiogenesiss, EMT, stemness, and carcinogenesis in LNCaP tumor biology, which associated with tumor progression. Conclusions: Research findings pointing to the salient role of inflammatory environmental stress stimulus in cancer progression and therapy resistance on account of its effects on tumor biology, are in line with the existing literature supported by preclinical and clinical studies. In hormone-sensitive prostate cancer, inflammatory tumor microenvironment plays a significant role in tumor progression and acquisition of antiandrogen drug resistance. In this study, in which M1 polarized TAMs mediated inflammatory environmental stress was modelled in vitro, activation of carcinogenic signaling pathways by inflammatory stress-induced UPR and adaptive cellular integrated stress response in LNCaP tumor cells supports tumor cell survival and formation of aggressive tumor characteristics. Inflammatory stress activates tumorigenesis, angiogenesis, and antioxidant defense mechanisms and also stimulates stemness and EMT which is associated with invasion, migration, and metastatic potential in LNCaP cells, thus increase cell survival and rescue tumor cells from apoptosis. Ultimately, ıt is thought that this study would contribute to the field of translational medicine with its emphasis on the importance of TM, which is a complex and dynamic structure with its cellular and noncellular components, in terms of therapeutic approaches.