Saponin içerikli lipozom formülasyınlarının geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterization of the saponin containing liposome formulations
Yazar: SİBEL BARBAROS
Danışman: YRD. DOÇ. DR. RÜKAN GENÇ
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Canlı hücre zarının yapıtaşı olan lipidler sulu ortamda ikili katman oluşturarak lipozom denilen taşıyıcı kapasitesi yüksek vesiküller oluştururlar. Bu sistemler, hidrofilik ve hidrofobik birçok molekülü taşıyabildme yetisi gösterebildikleri gibi yüzeyleri de antikor, polimer ve biyomarker proteinlerle kolayca işlevselleştirilebilinmektedir. Bu tez çalışmasında, biyoyararlanımı oldukça düşük olan ve telomeraz aktivitesi ile bilinen doğal ürün grubundaki saponin türlerinin (Astragalus IV (AstIV), Astragalus VII (AstVII) ve Cycloastragenol (CG)) lipozomların membran yapısının bipolarlığı kullanılarak, lipozom membranıyla bütünleştirilmesi ile oluşturulan lipozomların, morfolojik ve fiziksel karakterizasyonları üzerine çalışılmış sonuç olarak tek katmanlı küçük veziküler yapıda 200 nm altında lipozomlar elde edilmiştir. Çalışmalara ilk olarak lipozom formülasyonunun belirlenmesi ile başlanmıştır. Bunun için, hidrofilik floresan model boya olarak seçilen, Rhodamine B içeren lipozomların bu molekülü yükleme verimi belirlenmiş ve sonuç olarak, kolesterol eklenmiş örneklerde daha yüksek enkapsülasyon değerlerine ulaşılmıştır. Ardından, saponin eklenerek yapılan lipozomların saponin ve boya yükleme kapasiteleri belirlenmiş ve saponin çeşidine göre boya yükleme veriminin değiştiği belirlenmiştir ve saponinlerin membran yapısında farklılıklar oluşturduğu gösterilmiştir. Yapılan geçirimli elektron mikroskobu görüntülemelerinde AstIV ve AstVII ile yapılan lipozomların şekilsel olarak düzgün, tek membranlı ve homojen dağılımda olduğu gözlenmiş, CG ile yapılan lipozomların ise jelimsi yapılar oluşturmasından dolayı görüntülenmeleri sağlanamamıştır.
Rhodamine B yüklü lipozomlar ile yapılan diyaliz yöntemi ile in vitro salım deneylerinde pH'a duyarlılık pH 7.4 ve pH 5.5'de 48 saat boyunca 37ºC'de ölçülmüş ve tüm lipozom formülasyonlarında, her iki pH değerinde de % 30'un altında salım gözlenmiştir. Bu sonuçlara göre lipozomların farklı yapılarının farklı pH değerlerinde salım yüzdelerinin az da olsa değiştiği, saponinlerin salıma etkisi incelendiğinde DOPG:DOPE:Chol'e kıyasla, saponin içeren lipozom sistemlerinin daha az Rhodamine B salımı yaptığı, yani saponinlerin membran porlarına ve lipozomal yapının içine girerek salımda baskılayıcı bir rol oynadığı gözlenmiştir.
Son olarakta, hem hidrofobik bir model boya olan hem de membranın polaritesindeki değişimi gösterebilecek etkin bir prob olan Nile Red'in lipozomlar içerisine yüklenmesi çalıĢılmıĢtır. Ġçinde bulunduğu çözgenin polar karakterine bağlı olarak floresan değişikliği gösteren Nile Red su gibi polar çözgenlerde renksizken ve 600-680 nm de sinyal verirken, apolar çözeltilerde ise mavi bölgede kayma göstererek, 500-600 nm arasında artan floresans şiddetine sahiptir. Saponinlerin varlığı beklenildiği gibi lipozomal membranın polaritesini değiştirmiş ve bu da hem hidrofobik hem de hidrofilik model boyaların yüklenme kapasitesini büyük oranda etkilemiştir. Lipozomların membrana Nile Red'in yüklenme kapasitesi floresans spektrofotometresi tekniği ile incelendiğinde, saponin varlığında %73 gibi oranlarda model boyanın lipozomlara yüklenebildiği belirlenmiştir.
Sonuç olarak, bu tez çalışmasında, Türkiye florasından elde edilen saponin türevlerinin lipozom membrana hapsedilmesi ve buna bağlı olarak, bu moleküllerin lipozomlar üzerinde morfolojik ve fizyolojik etkileri incelenmiş olup, bu tezi takiben, elde edilen lipozomların telomeraz aktivitelerinin çalışılmasına odaklanmış projelerin önünü açabilecek veriler elde edilmiştir.

Abstract:
Lipid molecules which are main constituents of the bio cell membrane forms high loading capacity vesicles called ―liposome‖ by generating double layer in aqueus solution. Besides these systems could load either hydrophilic or hydrophobic molecules, also their surface could be easily functionalized by antibody, polymer and biomarker protein molecules. By integration of liposomes with saponin species which known by their telomerase activity and their low bioutility function ((Astragalus IV (AstIV), Astragalus VII (AstVII) and Cycloastragenol (CG)), in this thesis development and characterization of liposomes which can increase activity of telomerase were studied and resulted with homogeneously distributed liposomal populations with a size below 200 nm was achieved.
To begin with, studies were conducted to evaluate the most efficient liposomal formulation which was specified as the liposomal membrane built by addition of amphipatic cholesterol to lipidic skeleton of the membrane. Rhodamine B as a florescent model dye was used to assess encapsulation capacity of liposomes. pH sensitivity of liposomes encapsulating Rhodamine B was measured by in vitro release experiments with dialysis method for pH sensivity at 7.4 and 5.5 for a period of 48 hours at 37 ºC, and all the liposomes studied have shown a release under 30%. This results have demonstrate that different liposomal formulations show little difference in response to changing pH environment, however, integration of the saponine to the liposomal membrane decreased the release rate.
Lastly, encapsulation of Nile Red as hydrophobic model dye and polarity prob for liposomal membrane to the liposomes in the presence of saponine was studied via floresans spectroscopy. Nile Red, quenches in polar solvents like water however, in non-polar solutions, the floresans intensity increases with a blue shift. From 600-680 nm to 500 to 600 nm band. Integration of saponines with different polar characteristics effected the overall polarity of the lipid membrane leading encapsulation capasities for hydrophobic and hydrophilic model dyes paralel to their polar environment. Moreover, Nile Red loading capacity on liposomes have been measured with floresans spectrometer was revealed that decreased polarity of the membrane resulted in a increased loading efficiency up to 73%.
In this thesis, saponine derivatives from Turkish natural flora have been integrated on liposoml membrans of negativily charged lipids and accordingly, morphological and physiological properties have studied, and with these results, sufficient data for the future coming projects focusing on their telomerase activity have been achieved.