Bor taşıyıcısı HvBor1a geninin tütüne (Nicotiana tabacum) aktarılması ve transgenik bitkilerin analizleri
Transformation of tobacco (Nicotiana tabacum) with HvBor1a as a boron transporter gene and analysis of transgenic plants
Yazar: DOĞA SELİN GÜMÜŞEL
Danışman: DOÇ. DR. YELDA ÖZDEN ÇİFTÇİ ; PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Bor toksisitesi = Boron toxicity ; Boraks = Borax ; Transgenik bitkiler = Transgenic plants ; Tütün = Tobacco

Özet:
Bitkilerin esas mikro elementlerinden olan borun topraktaki yüksek derişimlerinin bitkilerde toksik etkiye yol açması ve tarımsal verimi ciddi şekilde düşürmesi, toksik seviyede boru tolere edebilecek genotiplerin elde edilmesinin hedeflenmesine sebep olmuştur. Bu tez çalışmasında, bor taşıyıcısı olduğu bilinen arpa kökenli HvBor1a geni ilk defa model bitki tütüne aktarılarak, bor toksisitesine toleranslı bitkilerin elde edilmesi amaçlanmıştır. HvBor1a geninin ?Samsun? ve ?Petit havana? çeşitlerinde heterolog ekspresyonunu sağlamak üzere HvBor1a ve seçici ajan higromisine direnç geni olan hpt genini taşıyan bitki transformasyon vektörü, Agrobacterium tumefaciens C58C1 soyu aracılığıyla yaprak eksplantlarına transforme edilmiştir.Transgenik hatların seçiliminde, transformasyon öncesinde yabani tip tütün eksplantları için belirlenen letal higromisin derişimi kullanılmıştır. Seçilen 317 transgenik adayının (T0) 57 tanesi toprağa aktarılmıştır. Transgenik adaylardan 44 tanesine ait yaprak örneklerinden izole edilen genomik DNA'ların polimeraz zincir reaksiyonlarında (PZR) pozitif sonuç veren 25 transgenik adayı belirlenmiştir. Bu adaylar arasından seçilen 14 örnekten izole edilen total RNA'lar kullanılarak gerçekleştirilen RT (Ters Transkriptaz)-PZR sonucunda, genin eksprese olduğu 6 transgenik adayı belirlenmiştir. Tüm adaylarda higromisin direnci görülmesiyle birlikte, adaylara ait eksplantlarda borik asit toksisitesine karşı belirgin bir tolerans gözlenmemiştir. Beş transgenik adayının tohumları (T1) higromisinsiz ve higromisinli besiyerinde çimlenip gelişme göstermiş; dolayısıyla transformasyonun gamet oluşumunu engellemediği belirlenmiştir. Borik asit toksisitesi uygulanan T1'ler ise genel olarak düşük çimlenme oranı göstermiştir. Bir transgenik adayına ait tohumların Mendel yasalarına uygun kalıtım özelliği gösterdiği belirlenmiştir.Tüm sonuçlar göz önünde bulundurulduğunda HvBor1a geninin boru hücre içine taşımada görevli olabileceği önerilmiştir. Genin olası bir tolerans mekanizmasındaki işlevinin belirlenmesinin ileride, bor stresinden etkilenen tahıl bitkilerinde bor toleransı geliştirmeye olanak sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
The development of boron tolerant genotypes is targeted as the high concentration of boron, which is an essential micronutrient for vascular plants, in soil causes toxicity for plants and limits crop production. The aim of this thesis was to develop boron-tolerant plants by transferring HvBor1a, known as a boron transporter originated from barley, first time to model tobacco plant. Therefore, plant transformation vector containing HvBor1a and resistant gene (hpt) for hygromycin as selective agent was transformed to leaf explants via Agrobacterium tumefaciens C58C1 in order to provide the heterologous expression of HvBor1a in ?Samsun? and ?Petit havana? cultivars.Already determined lethal hygromycin concentration in wild type explants was used for selection of transgenic lines. 57 of the selected 317 putative transgenic lines (T0) were transferred to the soil. 25 putative transgenic plants that gave positive result in PCR (Polymerase Chain Reaction) were identified from 44 tobacco samples. By using total RNAs of randomly selected 14 out of these samples, RT-PCR was performed and 6 putative transgenic lines that express HvBor1a were selected. Although all transgenic candidates had hygromycin resistance, boron tolerance was not significantly observed against boron toxicity. The germination and development of seeds (T1) of 5 transgenic candidates under control and antibiotic conditions showed that transformation did not cause an inhibition in the gamete formation. However, T1 had generally low germination rate under boron toxicity. Moreover, germination analysis showed that one of transgenics showed Mendelian inheritance.As a result, HvBor1a is suggested to be responsible for boron infflux transport through the cells. The determination of possible function of HvBor1a in boron tolerance mechanism would highly allow the development of boron tolerant crops in future.