Makrofaj hücrelerinde karabaş otu (Lavandula stoechas) özüt ve ikincil metabolitlerinin anti-inflamatuar etkisinin moleküler düzeyde incelenmesi
Investigating anti-inflammatory effect of Lavandula stoechas extract and its secondary metabolites in macrophage cells at the molecular level
Yazar: HANDE İPEK
Danışman: DOÇ. DR. TUĞBA TÜMER
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Tüm dünyada esansiyel yağı aromaterapide yaygın olarak kullanılan Karabaş otu (Lavandula stoechas) Anadolu halkı arasında farklı terapötik kullanımlara sahip bir lavanta türüdür. Anadolu'da bu türün sulu demlemesi metabolik sendromun tüm bileşenlerine karşı tedavi edici olarak kullanılmaktadır. Metabolik sendromun bileşenleri ölümcül dörtlü olarak da bilinen obezite, insülin direnci, yüksek kolesterol ve tansiyon olarak sıralanmaktadır. Tüm bu bileşenlerin altında yatan ortak faktör kronik düşük seviye inflamasyondur. Bu çalışmada, karabaş otunun potansiyel anti-inflamataur etkisi ve etken anti-inflamatuar bileşenleri biyoaktivite rehberli fraksiyonlama yöntemi kullanılarak lipopolisakkarit (LPS) uygulaması ile inflamasyon modeli oluşturulan RAW 264.7 makrofaj hücre hattında ilk defa aydınlatılmıştır. Bu bileşenlerin biyoaktivite rehberli ayrımsallaştırılmasında kullanılan tüm moleküler biyolojik çalışmalar tez kapsamında gerçekleştirilmiştir. Kimyasal ayrımsallaştırma, saflaştırma ve yapı aydınlatma çalışmaları laboratuarımızda yürütülmüş olan TUBİTAK 112T442 no'lu proje kapsamında Çankırı Karatekin Üniversitesi Kimya Bölümü'nde Prof. Dr. İbrahim Demirtaş ve ekibi tarafından gerçekleştirilmiştir. Bitkiden hazırlanan sulu özüt ilk önce etil asetat (EA) ve n-bütanol kullanılarak ekstraksiyon işlemine tabi tutulmuştur. Daha sonra, bu iki özütün inflamasyon modeli oluşturulan RAW 264.7 hücre hattında nitrik oksit (NO) salınımı üzerine etkileri Griess yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. Sonuç olarak, EA özütünün inflamasyonla indüklenen NO seviyesini baskılamada en etkin özüt olduğu belirlenmiştir. EA özütü kolon kromatografi yöntemi kullanılarak 11 fraksiyona (E1-E11) ayrılmıştır. NO tarama sonuçlarına göre E6 fraksiyonu en aktif fraksiyon olarak seçildi ve yapısında bulunan etken maddelerin saflaştırılması için sephadeks kromatografisi tekniği kullanılmıştır. Saflaştırılan bileşiklerin yapı aydınlatma çalışmaları NMR, IR, ve UV analizleri kullanılarak yapılmıştır. Buna göre E6 fraksiyonundan apigenin, luteolin ve p-kumarik asit saflaştırılmıştır. p-kumarik asit NO üretimini baskılamada etkin bulunmazken apigenin ve luteolin bileşikleri için IC50 değerleri sırasıyla 56 ve 26 µM olarak hesaplanmıştır. Apigenin ve luteolin bileşikleri inflamatuar şartlar altında, NO üretiminden sorumlu indüklenebilir NO sentaz (iNOS) enziminin ekspresyon seviyesini 50 µM dozda mRNA düzeyinde sırasıyla % 80 ve % 92 oranında baskılarken, protein düzeyinde sırasıyla % 94 ve % 99 oranında baskılamıştır (p<0.05).  Ayrıca, apigenin ve luteolin düşük dozlarda (25-50 µM), inflamatuar yanıtta anahtar rol oynayan COX-2 ve IL-1β moleküllerinin ekspresyon seviyelerinde anlamlı baskılamalara neden olmuştur. L. stoechas bitkisinin içeriğinde bulunan anti-inflamatuar özellikte etken saf maddelerin tanımlanması yan etkisi düşük, yeni nesil terapötiklerin ve standardize diyetsel takviye ürünlerinin geliştirilebilmesi için önemlidir.

Abstract:
Lavandula stoechas, in the genus of lavender, has distinct therapeutic uses among Anatolian people. Rather than worldwide use of its essential oil in aromatherapy, specifically the aqueous portion has been traditionally used in Anatolia against the components of metabolic syndrome, all of which share a state of chronic inflammation as an underlying cause. In the current study, the anti-inflammatory constituents of L. stoechas were isolated by using a bioassay guided fractionation techniques in lipopolysaccharide (LPS) inflamed RAW 264.7 macrophage cell line for the first time. All the molecular biology studies used in bioactivity guided separation were carried out in the scope of current thesis. Chemical separation, purification and identification studies were carried out in the scope of a TUBİTAK (112T442) project in Çankırı Karatekin University, Department of Chemistry, by Prof. Dr. İbrahim Demirtaş and his team. An aqueous extract was partitioned into ethyl acetate (EA) and n-butanol fractions. The EA, determined as bioactive extract, was seperated into 11 subfractions by column chromatography. E6 was identified as active sub-fraction subjected to sephadex column to get pure compounds which were then applied to NMR, IR, and UV analyses for structure determination. In RAW 264.7 cells, the effects of extracts/fractions/subfractions/compounds on LPS induced NO (nitric oxide) production was determined by using Griess method. The potential inhibitory effects of each compound on LPS induced iNOS expression were determined by qPCR and Western blot. p-coumaric acid, apigenin and luteoline were found in the E6, and the last two compounds appeared to be primarily responsible for the anti-inflammatory activity. Apigenin and luteoline at 50 µM decreased NO production 66 and 80%- IC50: 56 and 26 µM-by inhibiting iNOS gene expression 84 and 88% as well as protein expression 94 and 99%, respectively (p<0,05). Besides, both apigenin and luteoline at low concentrations caused significant downregulations at the mRNA levels of COX-2 and IL-1β. Identifying active anti-inflammatory compounds among the constituents of effective folk medicines is important task for the development of new generation therapeutic agents with multi-target properties and less side effects as well for the development of standardized dietary supplements.