Bor hiperakümülatör bitkilerde mir408 ve bor2 genlerinin yüksek düzeyde ifadesinin bor fitoremediasyonuna etkileri
Effects of mir408 and bor2 overexpression in boron hyperaccumulator plants for boron phytoremediation
Yazar: İBRAHİM ERTAN ERKAN
Danışman: DOÇ. DR. UFUK ÇELİKKOL AKÇAY
Isparta Uygulamalı Bilimler Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada miR408 geninin pamuk ve karanfil bitkilerine Agrobacterium
aracılığıyla genetik transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Transgenik bitkilerin
rejenerasyonu her iki bitki içinde gerçekleştirilmiştir. Ancak F1 eldesi yalnızca
pamuk bitkisinde gerçekleştirilebilmiştir. miR408 geninin bor fitoremediasyon
potansiyeli F1 jenerasyon transgenik pamuk bitkilerinde moleküler ve biyokimyasal
seviyede incelenmiştir. Bu amaçla transgenik ve kontrol pamuk bitkilerine 1. gün ve
5. gün 7.5 mM olmak üzere iki farklı süreyle şiddetli bor stresi uygulanmış ve
tepkiler karşılaştırılmalı olarak incelenmiştir.
mir408 geninin varlığının transgenik bitkilerde artan bor stresi altında PIP1;1 gen
ifade seviyesini artırdığı belirlenmiştir. Benzer şekilde PIP2;1 gen ifade seviyesi
transgenik bitkilerde artan bor stresi ile birlikte artmaktadır. MDA ve iyon sızıntısı
miktarları, transgenik bitkilerin bor uygulamaları altında bor uygulanan kontrol
bitkilere göre üstün dayanım özelliği gösterdiğini ve daha az strese girdiğini
göstermektedir.
Transgenik bitkiler bor stresinin ilk gününde aşırı borla karşılaştığında Boron
transporter 1 geninin ifadesini azaltarak bitkilere bor girişini azaltmıştır. Ancak 5
günlük stres sonunda, bu genin ifadesinin artarak bitkilere bor girişinin arttığı tespit
edilmiştir. miR408 geninin, boron transporter 1 geninin ifade seviyesini
düzenleyerek bitkilerin bor dengesinin sağlanmasında görev aldığı belirlenmiştir.
Transgenik bitkilerde Boron transporter 2 gen ifadesinin, stres süresi uzadıkça arttığı
belirlenmiştir. Birinci stres gününde Boron transporter 2 gen ifadesinin transgenik
bitkilerde düşük olmasının bir nedeninin Boron transporter 1 geninin ifade
seviyesini düşürerek bitki içerisine bor alınımını azaltması nedeniyle olduğu tespit
edilmiştir.
Bağıl su içerikleri, transgenik bitkilerde 1. stres gününde kontrol bitkilerden daha
yüksek yüzdeye sahip ve istatistiksel olarak önemli iken, 5. stres gününde bu
yüzdenin düşerek bor uygulanan kontrol bitkileri ile aynı seviyeye geldiği
belirlenmiştir. Prolin içerikleri transgenik bitkilerde 1. stres gününde bor uygulanan
kontrol bitkilerin seviyesinin altındayken, 5. stres gününde artmıştır. Bu sonuçlar Boron transporter 1 ve Boron transporter 2 genleri arasındaki ilişkiyi destekler
niteliktedir.
Plastosiyanin gen ifadesinin stresle birlikte arttığı belirlenmiştir. Birinci stres
gününde transgenik bitkilerde plastosiyanin gen ifadesi bor uygulanan kontrol
bitkilerine göre daha düşük seviyede kalırken, 5. stres gününde kontrol bitkilerinden
daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Plastosiyanin‟in bakır eksikliğinde ifade edilen
bir gen olduğu bu nedenle artan stres koşullarında bitkinin bakır ihtiyacı duyması
nedeniyle arttığı belirlenmiştir. miR408 geni, artan bor stresi (5. gün) altında
transgenik bitkilerde plastosiyanin gen ifadesini düzenleyerek bor uygulanan kontrol
bitkilerine kıyasla %11 artırmıştır.
Transgenik bitkilerin toplam klorofil içerikleri, 1.stres gününde bor uygulanan
kontrol bitkilerinden yüksek olmasına rağmen istatistiksel olarak önemli
bulunmamıştır. Beşinci gün bor stresinde transgenik bitkilerin toplam klorofil
içerikleri, bor uygulanan kontrol bitkilerden daha yüksek seviyede olup istatistiksel
olarak önemli bulunmuştur. Transgenik bitkilerin toplam klorofil içeriklerini artan
bor stresiyle birlikte, kontrol bitkilerine kıyasla daha iyi düzeyde koruduğu tespit
edilmiştir. miR408 geninin bor stresi altında MAPK ve CPR2 gen ifadelerinin
düzenlenmesinde etkin bir rol oynamadığı anlaşılmıştır. EF1A8‟in bor stresi altında
kullanılabilecek uygun bir referans gen olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, genetic transformation of miR408 gene to cotton and carnation plants
was carried out via Agrobacterium. The regeneration of transgenic plants was
performed successfully in both plants. However, F1 seed production could only be
achieved in cotton plants. Boron phytoremediation potential of miR408 gene was
investigated at the molecular and biochemical level by the use of F1 generation
transgenic cotton plants. For this purpose, severe boron stress was applied to the
transgenic and control cotton plants at two different durations, namely 1 day and 5
days at the rate of 7.5 mM B and the responses were examined comparatively.
The mir408 gene was found to increase the expression level of PIP1;1 gene under
long term boron stress in transgenic plants. Similarly, the PIP2;1 gene expression
level increased with increasing boron stress in transgenic plants. Levels of MDA and
ion leakage indicated that transgenic plants were more tolerant to boron stres when
compared to control plants.
Boron transporter 1 gene expression level decreased in transgenic plants when
encountered with excesss boron on the 1st day of stress. However, at the end of the
5th stress day, increased expression of this gene was found to increase boron input to
the plants. The miR408 gene was determined to regulate the expression level of
boron transporter 1 gene in the provision of boron balance in plants. Similarly boron
transporter 2 gene expression was increased with the exposure of longer stress
duration in transgenic plants. The reason for the lower Boron transporter 2 gene
expression in transgenic plants on the 1st day of stress might be resulted from the
decrease of Boron transporter 1 gene expression and eventually decreased boron
intake of plant tissues.
Plant relative water content percentages (%) were higher and statistically significant
in transgenic plants compared to control plants under boron stress on the 1st day of
stress, while this percentage decreased and found to be statistically insignificant
between transgenic and boron stressed control plants on the 5th day of stress. Plant
proline contents did not exhibit statistically significant difference in transgenic plants
when compared to boron stressed control plants on the first day of stress; however
the difference increased at the duration of five days. These results also supported the
relationship between Boron transporter 1 and Boron transporter 2 genes.
The expression of plastocyanin gene was increased with the duration of stress. On
the 1st day of stress, plastocyanin gene expression in transgenic plants was found to
be lower than boron stressed control plants, whereas it was found to be higher on the
5th day of stress when compared to boron stressed control plants. Plastocyanin is a
gene expressed in the lack of copper; however plants are unable to absorb essential
copper under increased stress conditions. This might be the reason for the
plastocyanin gene expression increase under long stress duration. miR408 gene
seems to regulate plastocyanin gene expression under long stress duration in
transgenic plants with 11% more expression compared to boron stressed control
plants.
Although the total chlorophyll content of transgenic plants was higher than boron
stressed control plants at the 1st day of stress, the difference was not statistically
significant. However, at the 5th day of boron stress, increase in the total chlorophyll
content of transgenic plants compared to boron stressed control plants was
statistically significant. Therefore, transgenic plants have been found to maintain
their total chlorophyll contents under severe boron stress when compared to boron
stressed control plants. The miR408 gene was found to play no effective role in the
regulation of MAPK and CPR2 gene expressions under boron stress. EF1A8 was
found to be a suitable referance gene which can be used under boron stres.