Difteri toksini alt birimlerinin eldesi ve farklı hücre soyları üzerine etkileri
Seperation of the sub-units of diphtheria toxin and effects on different cell lines.
Yazar: BAŞAK VAROL
Danışman: PROF. DR. RÜSTEM NURTEN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyofizik = Biophysics

Özet:
Difteri toksini(DT) gerek yapı ve gerekse etkisi açısından oldukça iyi tanımlanmış bakteri toksinlerinden biridir. N-terminal kesimine denk gelen Kesim A (FA) (21 kDa) NAD'nin ADP-riboz grubunu ökaryotik elongasyon faktör 2'ye (eEF-2), aktarımını katalizleyerek protein sentezini durdurur. Protein sentezinin durması ile ortaya çıkan sitotoksik etkinin tek başına enzimatik etkinlik ile açıklanamaması, diğer yandan bazı hücre soylarında protein sentezinin durmasına karşın sitotoksik etki göstermemesi ayrı bir yolağın aktifleşebileceğini düşündürmüştür. Bu nedenle DT alt birimleri tripsin kısmi sindirimi sonrası saflaştırılarak, DT'nin dirençli (3T3) ve dirençsiz (HUVEC, K562) hücre soylarına apoptotik ve sitotoksik etkileri araştırıldı. Toksinin ölümcül etkinliği nükleaz etkinliği ve DNA kırılmasına etkisi sırasıyla tripan mavisi ile boyama, hiperkromasite, difenilamin yöntemleri ile gösterildi. Toksinin dirençsiz hücreler üzerine etkisi olduğu gözlenirken dirençsiz 3T3'leri etkilemediği görüldü. Ayrıca ADP-ribozillenme ve protein sentezine etkisi in vitro poli-phe sisteminde çalışıldı. Hücre içi aktin-FA etkileşimleri ve aktin iskeletinin yıkılması ultrasantrüfüjleme sonrası birlikte çöktürme, immünfloresans tekniklerle gösterildi. Toksinin 6.saaten itibaren hücre iskeletini yıkmaya başladığı görüldü. Sitokalasin varlığında iskelet yıkımı ve FA'nın hücre içi trafiği araştırıldı. Ayrıca toksinin hücre içine giriş hızı ve miktarı test edildi. Toksinin hücre içine çok hızlı bir şekilde girdiği ancak sitokalasin D varlığında çekirdeğe daha geç ulaştığı görüldü. Toksinin bazı apoptotik, anti-apoptotik protein düzeylerine etkileri kolorimetrik ve bağışık emdirim yöntemleri ile belirlendi. Kaspaz-3, sitokrom c' de artış Mcl-1'de azalış tespit edilirken, Bcl-2 ve PARP düzeyinin değişmediği görüldü. Sonuçta difteri toksininin sitotoksik etkisinin protein sentezinin durması yanında hücre iskeleti ile ilişkili olarak apoptotik süreçte rolü olabileceği görüşünü desteklediği ortaya kondu.

Abstract:
Diphtheria toxin (DT) is one of the well-characterised bacterial toxins, both in terms of its structure and mode of action. Fragment A (FA) (21 kDa) catalyzes transfer of ADP-ribose moiety of NAD to eukaryotic elongation factor 2 (eEF2) and inhibits protein synthesis. Since the cytotoxic effect could not be explained as the primary reason of inhibition of protein synthesis and inbition of protein synthesis did not show cytotoxic effect, activation of another pathwaycan be possible. In this context DT fragments were purified with the partial trypsin digestion and either apoptotic or cytotoxic effects of DT was explored in the resistance (3T3) and sensitive cell lines to (HUVEC, K562) to DT. Death efficiency of toxin, nuclease activity and DNA fragmentation was determined with the trypan blue dying, hyperchromasite and diphenylamine techniques respectively. The effect of toxin was observed in sensitive cells not in the resistance 3T3 cell line. Besides, ADP-ribosylation and its protein synthesis activity was studied with in vitro poly-phe system. Actin- FA interaction in the cell and degredation of actin filaments was shown either with the co-precipitation after ultracentrifuge or immunfluoresence techniques. Cytoskeleton degredation was observed from the sixth hour. In the presence cytochlasin cytoskeleton degredation and FA traffic in the cell was investigated. Toxin entry rate and amount was also tested. It was concluded that the toxin entry rate was faster comparing with the cytochlasin presence. Both with colorimetric and western-blot techniques the effect of toxin on apoptotic and anti-apoptotic protein amounts was established. It observed that caspase-3 and cytochrome c amount was raised and in contrast the Mcl-1 amount was decreased. However either Bcl-2 or PARP amounts were stayed constant. As a result it was gave rise to thought that, besides the inhibition of protein synthesis cytotoxic effect could be associated with the cell cytoskeleton leading the apoptotic process.