Biyolojik uygulamalarda demir şelasyonu amacıyla kullanılabilir ligandların değerlendirilmesi
Assessment of usable ligand for iron chealating in biological applications
Yazar: GÜLÜZAR ÖZBOLAT
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH TULİ
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Demir = Iron ; Hücre kültürü = Cell culture ; Toksisite = Toxicity ; Voltametri = Voltammetry ; Şelasyon tedavisi = Chelation therapy

Özet:
Vücutta aşırı biriken demiri uzaklaştırmak amacıyla Fe(III) iyonu ile bileşik oluşturabilecek ligantların sentezi\kompleksleşme derecesini ve insan plazmasından demirin uzaklaştırılmasında etkinliğinin belirlenmesi tedavi sürecinde klinikte kullanılabilme potansiyeli olan uygulamaların ilk basamağı niteliğindedir.
Bu çalışma da ilk olarak asetilaseton üzerinde bulunan iki karbonil bileşiği arasındaki karbon atomu üzerindeki aktif hidrojen ile alkil gruplarının yer değiştirmesi ile farklı uzunluktaki zincir sayısına sahip asetilaseton türevleri olan 3-metil-2,4-pentandion ve 3-butil-2,4-pentandion başarılı bir şekilde sentezlendi ve ligand olarak kullanıldı. Kloralhidrat, hidroksilamin hidroklorür çıkış bileşiği olarak kullanılarak oksim gurubuna dahil olan anti-monokloroglioksim ve dimetilglioksim ligandları başarılı bir şekilde sentezlendi. 8-Hidroksikinolin-5-sülfonik asit, 4,5-Dihidroksibenzen-1,3-disülfonik asit, Piridin 2,6-Dikarboksilik, Nitrilotriasetik asit, Sitrik asit, Oksalat, Glisin, Salisilik asit' te ligand olarak kullanıldı.
Demir ile kompleksleri safsu ve plazmada sentezlendi. Sentezlenen bileşiklerin yapıları FT-IR, manyetik suseptibilite, elementel analiz analiz ve UV-Vis gibi spektroskopik metodlar ile aydınlatılmıştır. Kompleksleşme derecesi ICP-MS ve UV-Vis yöntemleriyle belirlenmiştir. Komplekslerin, ligandların elektrokimyasal davranışları Siklik Voltametri ile incelendi. Daha sonra hücre kültürü yöntemi ile sentezlenen komplekslerin in vitro sitotoksik etkisi belirlenmiştir. MTT testi kullanılarak 12,5, 25, 50, 100 ve 200 μM'lık 5 farklı derişim aralığında kompleksler HUVEC hücre dizisi üzerine uygulanarak sitotoksik etkiye sahip olup olmadığı ve hücre proliferasyonuna etkisi incelenmiştir. Araştırmada kullanılan komplekslerin hemen hemen hepsinde artan dozlarda yüzde sitotoksisite cevapları arasında negatif bir ilişki gözlendi. Ayrıca komplekslerin birçoğunun HUVEC üzerine sitotoksik etkiye sahip olmadığı ve hücre proliferasyonunu etkilemediği hatta iyileştirici etkisi olduğunun tespit edilmesi ilaç geliştirme aşamasında deneysel hayvan modeli araştırması için ümit verici olarak görülmektedir.
Bu çalışmada kullanılan ligandların şelasyona etkisinin araştırılması in vivo denemelerin gerçekleştirilebilmesinde ilk basamak çalışması olmuştur. İn vitro yapılan bu çalışmada bulunan sonuçlar ileriki dönemlerde in vivo çalışmalar ile de desteklenirse demir şelasyonuna uyumun optimum olacağı etkin demir şelatörlerin geliştirilmesini öngörmekteyiz.

Abstract:
In order to remove excess iron from the body, the synthesis\complexation degree of  the ligands that can form a compound with the Fe (III) ion and the efficiency of iron removal from human plasma is the first line of applications that have potential for clinical use in the treatment process. 
In this study, Initially, 3-methyl-2,4-pentanedione and 3-butyl-2,4-pentanedione which are acetylacetone derivatives with different chain lengths were successfully synthesized by displacement of alkyl groups with active hydrogen on the carbon atom between the two carbonyl compounds present on acetylacetone. Chloralhydrate, Hydroxylamine hydrochloride was used as the starting compound and the anti-monochloroglucoxime and dimethylglyoxime ligands were successfully synthesized. 8-Hydroxyquinoline-5-sulfonic acid, 4,5-Dihydroxybenzene-1,3-disulfonic acid, Pyridine 2,6-Dicarboxylic acid, Nitrilotriacetic acid, Citric acid, Sodium oxalate, Glycine and Salicylic acid were used as the ligand. Iron complexes were synthesized in pure water and plasma. The degree of complexation was determined by ICP-MS and UV-Vis methods. The electrochemical behavior of complexes, ligands was studied by CV. Platinum disk electrot, platinum counter electrode and Ag-AgCl reference electrode were used in the studies. Then the in vitro cytotoxic effect of the complexes synthesized by the cell culture method was  determined. MTT assay was used to examine whether the complexes had cytotoxic effect on HUVEC cell line at 5 different concentration ranges (12.5, 25, 50, 100 and 200 μM) and their effect on cell proliferation. Almost all of the complexes used in the study had a negative correlation between the percent cytotoxicity responses at increasing doses. Furthermore, it has been determined that many of the complexes do not have cytotoxic effect on HUVEC and they do not affect cell proliferation or even have therapeutic effect, it appears to be promising for an experimental animal model study during the drug development phase.
Investigation of the effect of chelating ligands used in this study has been the first step in the realization of in vivo assays. We anticipate the development of effective iron chelators that will be optimal for iron chelation if the results of this in vitro study are supported by in vivo studies in the future.