Timolol maleat içeren ticari farmasötik preparatlardaki etkin maddelerin spektrofotometrik ve kromatografik ölçümlere dayalı kemometrik yöntemlerle miktar tayinleri
Quantitative analysis of  timolol maleate and active compounds in commercial pharmaceutical preparations based on spectrophotometric and chromatographic measurements with chemometric methods
Yazar: EDA BIYIK
Danışman: PROF. DR. ERDAL DİNÇ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Brimonidin = Brimonidine ; Dorzolamid = Dorzolamide ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Miktar tayini = Determination ; Timolol maleat = Timolol maleate ; İlaç formülleri = Formularies ; İlaçlar = Drugs

Özet:
Bu doktora tezinde, Timolol Maleat içeren ticari farmasötik preparatlardaki aktif bileşiklerin miktar tayinleri için spektrofotometrik ve kromatografik ölçümlere dayanan yeni metotlar geliştirildi.
Bu bağlamda, Timolol maleat (TIM)-Brimonidin tartarat (BRI) ve TIM-Dorzolamid hidroklorür (DOR) içeren iki farklı ticari ürün (göz damlası) yeni önerilen analitik yöntemlerin uygulaması için dikkate alındı.
İlk olarak, TIM-BRI ve TIM-DOR karışımlarını içeren kalibrasyon seti ve sentetik karışım numuneleri için 210.0-360.0 ve 200.0-350.0 nm, sırasıyla, spektral bölgesindeki UV absorbanslarının ölçümü ile spektrofotometrik veriler elde edildi ve bu verilere temel bileşen regresyon (principal component regressionPCR) ve kısmi en küçük kareler regresyonu (partial least squares regressionPLS) algoritmaları uygulandı.
Yöntem validasyon işlemlerinde, spektral PLS ve PCR yöntemlerinin geçerlilik ve uygulanabilirlilikleri sentetik karışımlar, gün içi ve günler arası deneyleri ve standart ilave numuneleri kullanılarak gerçekleştirildi. Validasyon numunelerinin analiz sonuçları istenilen aralıkta çıktığı belirlendi.
Örneğin; TIM-BRI karışımının analizinde, % ortalama geri kazanım ve standart sapma değerleri PCR modelde TIM için % 100.9 ve % 0.28, BRI için % 100.0 ve % 0.93, PLS modelde TIM için %101.1 ve % 0.42, BRI için % 99.9 ve % 0.71 olarak bulundu. Aynı şekilde, TIM-DOR kombinasyonlarının analizi için % ortalama geri kazanım ve bağıl standart sapma değerleri PCR modelde TIM için % 103.2 ve % 1.60, DOR için % 101.8 ve % 1.80, PLS modelde TIM için % 100.8 ve % 0.90, DOR için % 101.3 ve % 1.81 olarak elde edildi.
İkinci olarak, TIM-BRI ve TIM-DOR kombinasyonlarının ticari farmasötik dozaj formlarının eş zamanlı miktar analizleri için yeni UPLC (Ultra performance  Liquid Chromatography UPLC) yöntemleri geliştirildi. UPLC yöntemlerinin geliştirlmesinde 33tam faktöriyel tasarım ve Box-Behnken tasarımı optimal kromatografik koşulların bulunması için kullanıldı. 
TIM-BRI karışımının analizi için UPLC yöntem optimizasyonunda 33 tam faktöriyel tasarımın uygulanmasında mobil fazdaki 0.1 M CH3COOH (%, x1), kolon sıcaklığı  (0C, x2), akış hızı (mL/dakika, x3) faktör değişkenleri olarak seçildi. Seçilen faktörlerin seviyeleri; x1: 35(-1), 55(0) ve75 (+1),x2: 35(-1), 50 (0) ve 65 (+1) ve x3: 0.2 (-1), 0.3 (0) olarak belirlendi. Bu UPLC optimizasyon prosedüründe, optimal kromatografik koşullar; akış hızı 0.38 mL/dakika, kolon sıcaklığı 49.2 0C ve mobil fazdaki  % 0.1 M CH3COOH değeri 56.70 olarak hesaplandı. Bu optimal UPLC koşulları altında, TIM ve BRI için kalibrasyon eğrisi, sırasıyla 8.0 – 72.0 µg/mL ve 5.0 – 25.0 µg/mL konsantrasyon aralığında 298.0 nm ve 246.0 nm'de pik alanlarında konsantrasyon regresyonu ile hesaplandı. BRI ve TIM'ın analizi için optimize edilen UPLC yöntemi sentetik karışım, gün içi ve günler arası numuneleri ve standart ekleme çözeltileri ile valide edildi. Optimize ve valide edilen bu UPLC yöntemi TIM ve BRI içeren göz damlası numunelerinin kantitatif analizine başarı ile uygulandı. Analiz sonuçları BRI için 2 mg/mL ve TIM için 5 mg/mL olarak bulundu. Bu sonuçlar yeni optimize ve valide edilen UPLC yönteminin TIM-BRI ticari numunelerinin rutin analizi için çok uygun olduğunu gösterdi. 
TIM-DOR karışımının analizi için UPLC yöntemi optimizasyonunda Box- Behnken tasarımı uygulanmasında, mobil fazdaki 4x10-4 M CCl3COOH bileşeni (%, x1), kolon sıcaklığı (0C, x2) ve akış hızı (mL/min, x3) faktör değişkenleri olarak seçildi. Seçilen faktörlerin seviyeleri sırasıyla; x1: 12 (-1), 38 (0) ve64 (+1), x2: 30(-1), 45 (0) ve 60 (+1), x3: 0.2(-1), 0.3(0) ve0.4 (+1) olarak belirlendi. Bu UPLC optimizasyon prosedüründe optimal kromatografik koşul olarak akış hızı 0.32 mL/dakika, kolon sıcaklığı 45.0 0C ve mobil fazdaki 4x10-4 M CCl3COOH bileşeni % 40.0 olarak bulundu. Bu optimal UPLC koşulları altında, TIM ve DOR için kalibrasyon eğrileri 5.0 – 40.0 µg/mL konsantrasyon aralığında 275.0 nm'de pik alanlarındaki konsantrasyonun regresyonu ile hesaplandı.  DOR ve TIM'ın analizi için optimize edilen UPLC yöntemi sentetik karışımlar, gün içi ve günler arası numuneleri ve standart ekleme çözeltilerinin analizi ile valide edildi. Optimize ve valide edilen bu UPLC yöntemi TIM ve DOR maddelerini içeren göz damalası numunelerinin miktar tayininde başarı ile uygulandı. Analiz sonuçları DOR için 20 mg/mL ve TIM için 5 mg/mL olarak bulundu. Bu sonuçlar yeni optimize ve valide edilen UPLC yönteminin TIM-DOR ticari numunelerinin rutin analizi için çok uygun olduğunu gösterdi.
Sonuç olarak, bahsedilen PCR ve PLS yöntemleri UV-spektral verilerine ilk karışımda TIM ve BRI ve ikinci karışımda TIM ve DOR karışımlarının miktar tayini için uygulandı. Bu spektral kemometrik analizde, Ar-Ge çalışmaları ve ilaç endüstrisi açısından başarılı ve faydalı sonuçlar elde edildi.
Günümüzde ilaç maddelerinin analizi için UPLC yöntemi en yaygın kullanılan tekniktir. Bu yaklaşıma göre bu doktora tezinde iki farklı ticari göz damlası olan TIM-BRI ve TIM-DOR kombinasyonlarının miktarsal değerlendirmeleri için optimize edilen ve geliştirilen yeni bir UPLC yöntemi elde edildi.

Abstract:
In this doctorate thesis, new methods based on the spectrophotometric and chromatographic measurments were developed for the quantitative analysis of active compounds in commercial pharmaceutical preparations containing timolol maleate. 
In this context, two different commercial products (eye drops) containing Timolol Maleate (TIM)-Brimonidine Tartrate (BRI) and TIM-Dorzolamide hydrochloride (DOR) combinations were considered for the application of the newly proposed analytical methods.
Firstly, the spectrophotometric data obtained by measuring the UV absorbances in the spectral region of 210-360 nm and 200-350 nm for the calibration set and samples containing TIM-BRI and TIM-DOR mixtures were processed by the principal component regression (PCR) and partial least squares regression (PLS) algorithms, respectively.
In the method validation treatments, the validity and applicability of the spectral PLS and PCR methods were performed by using the synthetic mixtures, inter-day and intra-day experiments and standard addition samples. A good agrement was reported for the analysis results of the validation samples. 
For example; in the analysis of the TIM-BRI mixture percent mean recovery results and standard deviations were found as 100.9 % and 0.28 % for TIM and 100.0 % and 0.93 % for BRI using PCR model and as 101.1 % and 0.42 % for TIM and 99.9 % and 0.71 % for BRI using PLS model for the analysis. In the same way, mean recoveries and correspondind relative standard deviations for the analysis of TIM-DOR combinations were obtained as as 103.2 % and 1.60 % for TIM and 101.8 % and 1.80 % for DOR using PCR model and as 100.8 % and 0.90 % for TIM and 101.3 % and 1.81 % for DOR using PLS model for the analysis.
Secondly, new UPLC methods were developed for the simultaneous quantitative analysis of the combined pharmaceutical dosage forms of TIM-BRI and TIM-DOR combinations. In the developmet of new UPLC methods, 33 full factorial design and Box-Behnken design were used to find the optimal chromatographic conditions. 
In the application of a 33full factorial design to the UPLC method optimization for the analysis of TIM-BRI, flow rate (mL/min, x1), column temperature (0C, x2) and 0.1 M CH3COOH (%, x3) in mobile phase were selected as factor variables with three levels; x1: 0.2 (-1), 0.3 (0) and 0.4 (+1), x2: 35(-1), 50 (0) and 65 (+1), x3: 35(-1), 55(0) and 75 (+1), respectively. In this UPLC optimization procedure, optimal chromatographic conditions were found to be 0.38 mL/min for the flow rate, 49.2 0C for column temperature and 56.70 % for 0.1 M CH3COOH in mobile phase. Under this optimal UPLC conditions, calibration curves for TIM and BRI in the concentration range of 8.0 – 72.0 µg/mL and 5.0 – 25.0 µg/mL were computed by regressing the concentration on the peak areas measured at 298.0 nm and 246.0 nm, respectively. The optimized UPLC method for the analysis of BRI and TIM were validated by analysing various synthetic mixture, intra-day and inter-day samples and standard addition solutions. This optimized and validatedUPLC approach was succesfully applied the quantitative analysis of eye drop samples containing TIM and BRI substances. Assay results were found to be 2 mg/mL for BRI and 5 mg/mL for TIM. This results indicated that the newly optimized and validated UPLC method was very suitable for the routine analysis of TIM-BRI commercial samples.
In the application of a Box-Behnken design to the UPLC method optimization for the analysis of TIM-DOR, 4x10-4 M CCl3COOH(%, x1) in mobile phase column temperature (0C, x2) and flow rate (mL/min, x3) were selected as factor variables with three levels; x1: 12 (-1), 38 (0) and 64 (+1), x2: 30(-1), 45 (0) and 60 (+1), x3: 0.2(-1), 0.3(0) and 0.4 (+1), respectively. In this UPLC optimization procedure, optimal chromatographic conditions were found to be 0.32 mL/min for the flow rate, 45.00C for column temperature and 40.0 % for 4x10-4 M CCl3COOH in mobile phase. Under this optimal UPLC conditions, calibration curves for TIM and DOR in the concentration range of 5.0 – 40.0 µg/mL were computed by regressing the concentration on the peak areas measured at 275.0 nm. The optimized UPLC method for the analysis of DOR and TIM were validated by analysing various synthetic mixture, intra-day and inter-day samples and standard addition solutions. This optimized and validatedUPLC approach was succesfully applied the quantitative analysis of eye drop samples containing TIM and DOR substances. Assay results were found to be 20 mg/mL for DOR and 5 mg/mL for TIM. This results indicated that the newly optimized and validated UPLC method was very suitable for the routine analysis of TIM-DOR commercial samples.
As a consequence, the newly proposed PCR and PLS were applied to the UV-spectral data for the quantitations of TIM and BRI in first mixture and TIM and DOR in second mixture. In this spectral chemometric analysis, succesful and useful results were obtained in terms of pharmaceutical industry and R&D studies.
Nowadays UPLC method is the most commonly used technique for the analysis of drug substances. According to this approach, this doctorate thesis was gained newly optimized and developed UPLC methods for the quantitative estimation of TIM-BRI and TIM-DOR combinations which were two different commercial eye drops.