Kimyasal çağraz bağlama yöntemi kullanılarak peroksidaz-protein konjugatlarının hazırlanması
Preparation of peroxidase-protein conjugates by chemical crosslinking
Yazar: ÖZDEN TACAL
Danışman: PROF.DR. İNCİ ÖZER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2001
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
ÖZET Tacal, Ö., Kimyasal çapraz bağlama yöntemi kullanılarak peroksidaz-protein konjugatlarının hazırlanması, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyokimya Programı Doktora Tezi, Ankara, 2001. Enzim immunoassay sistemlerinde kullanılan enzim-protein konjugat hazırlama yöntemlerini karşılaştırmak amacıyla; sığır serum albumini (BSA), insan serum albumini (HSA) ve insan otı-proteinaz inhibitörü (otı-PI), "horseradish" peroksidazı (HRP) ile, 1-etil- 3~(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid (EDC), periodat oksidasyonu ve N- süksinimidil 4-(N-maleimidometil) siklohekzan-1-karboksilat (SMCC) kullanılarak konjuge edildi. Ayrıca SMCC ile konjugasyondan önce albumin ve aı-PI'de serbest -SH grubu meydana getirmek üzere 2-iminotiyolan (2-İT) veya redükte glutatyondan (GSH) yararlanıldı. Oluşan ürünlerdeki molekül ağırlığı dağılımı ve ürün bileşimi SDS-PAGE ve Sephadex G200 kromatografısi ile saptanarak, konjugasyon yöntemleri birbirleri ile karşılaştırıldı. BSA'nın EDC, periodat oksidasyonu yöntemi ve SMCC aracılığı ile HRP'ye konjugasyonunda total konjugasyon verimi sırasıyla % 16, 46 ve 28 bulundu. EDC ile kayda değer bir heterolog konjugasyon gözlenmedi. Periodat oksidasyonu yöntemi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında; total konjugasyon veriminin daha yüksek olduğu (% 46), ancak yüksek molekül ağırlıklı polimerik konjugatlar da içeren heterojen konjugat karışımı meydana getirdiği görüldü. aı-PI'nin SMCC aracılığıyla HRP'ye konjugasyonunda total konjugasyon verimi % 16 olup, tek konjugat verdiği bulundu. Ayrıca SMCC ile hazırlanan otı-PI-HRP konjugatının Ouchterlony immunodiffüzyon yöntemi ile antijenik özelliğini koruduğu gözlendi. Sonuç olarak; BSA-HRP ve aı-PI-HRP konjugatını meydana getirmek üzere SMCC ile konjugasyonun, diğer yöntemlere göre çok daha seçici ve etkili olduğu bulundu. Anahtar kelimeler: Enzim-protein konjugatı, konjugasyon metodu, bifonksiyonel çapraz bağlayıcı reaktifler.

Abstract:
VI ABSTRACT Tacal, Ö., Preparation of peroxidase-protein conjugates by chemical cross- linking, Hacettepe University Health Sciences Institute PhD Thesis in Biochemistry, Ankara, 2001. To compare different methods used in the preparation of enzyme-protein conjugates for use in enzyme immunoassay systems, l-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), periodate oxidation, N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) were used to conjugate bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA) and cti-proteinase inhibitor (oti-PI) with "horseradish" peroxidase. Also before conjugation with SMCC, 2-iminothiolane (2-IT) and reduced glutathione (GSH) were used to obtain free -SH groups on albumin and cti-PI. The molecular weight distribution and composition of the resultant products were analyzed by SDS-PAGE and Sephadex G200 chromatography and the conjugation methods were compared with each other. Total yields in the conjugation of BSA to HRP via the EDC, periodate oxidation and SMCC methods were found to be 16, 46 and 28 %, respectively. Significant heterologous conjugation with EDC could not be achieved. Compared with other methods, the total conjugation efficiency of the periodate oxidation method was higher (46 %), but a heterogeneous mixture with high-molecular-weight polymeric conjugates was formed by this method. During conjugation of oti-PI with HRP via SMCC, the total conjugation efficiency was 16 % and yielded a single conjugate. Also it was found that the oti-PI-HRP conjugate prepared with SMCC preserved its antigenic property as determined by the Ouchterlony immunodiffusion method. In conclusion, conjugation with SMCC in order to obtain BSA-HRP and cti-PI-HRP conjugates was much more selective and effective than the other methods. Key words: Enzyme-protein conjugate, conjugation method, bifunctional cross-linking reagents.