Yeni sentezlenen nanotaşıyıcıların gen salım amacıyla dna ile etkileşimlerinin incelenmesi
Characterization of interactions between newly synthesized nanocarriers and dna for gene delivery
Yazar: SEMRA ZUHAL FİCEN
Danışman: DOÇ. DR. ŞEBNEM ERÇELEN ; PROF. DR. ŞEHNAZ BOLKENT
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Gen tedavisi = Gene therapy ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Plazmit DNA = Plasmit DNA ; Transfeksiyon = Transfection

Özet:
Gen salımı uygulamaları başta kanser olmak üzere, kardiyovasküler sistem hastalıkları, tek gen bozukluğuna bağlı hastalıklar, nörolojik ve immunolojik hastalıklar gibi pek çok hastalığın tedavisinde; terapötik geni hedeflenen doku ve hücrelere başarıyla taşımayı amaçlamaktadır. Terapötik geni hedeflenen bölgeye taşımada uygun vektör kullanımı oldukça önem taşımaktadır. Gen salımı uygulamalarında kullanılan taşıyıcılar viral ve viral olmayan vektörler olarak iki alt sınıfa ayrılmaktadır. DNA'yı hücreye taşımada, viral vektörler viral olmayan vektörlerden daha önce kullanılmaya başlanmıştır, fakat viral vektörlerin sahip olduğu immün yanıtı uyarma, konak genomuna katılma, DNA taşıma kapasitesi azlığı gibi dezavantajlarından dolayı viral olmayan doğal ve sentetik DNA taşıyıcıları tasarlanmaya başlanmıştır. Nano boyutta tasarlanan bu vektörler, hücresel alım, hücre içinde taşınma, doğru zamanda endozomdan kurtularak DNA'yı endozomal/lizozomal enzimlere karşı yıkımdan koruma ve terapötik geni hücre nukleusuna ulaştırma gibi hücresel bariyerlerin üstesinden gelirken aynı zamanda ucuz ve kolay üretilebilir olmalı, immün sistemi uyarmamalı, sitotoksik olmamalı, in vivo'da kararlı yapıda kalarak dolaşımda uzun süre kalabilmeli ve biyouyumlu olmalıdır.Bu tez çalışmasında, yeni sentezlenen BG-2 oligoelektrolit kopolimerinin gen salımı amacıyla kullanıma uygun olup olmadığını belirlemek açısından, fizikokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu yapıldı. Ayrıca fizikokimyasal ve biyofiziksel açıdan incelenen molekülün DNA ile etkileşim deneylerinden elde edilen sonuçlar hücre kültüründe transfeksiyon ve sitotoksisite çalışmalarıyla desteklenmiştir.BG-2 oligoelektrolit molekülünün DNA ile etkileşiminden önce, molekülün fizyolojik ortamda nasıl bir davranış gösterdiğini anlamak amacıyla kritik misel konsantrasyonu floresans spektroskopi yöntemiyle çalışıldı. BG-2/pDNA komplekslerinin fizikokimyasal özellikleri olan boyut ve zeta potansiyel ölçümü lazer tekniğiyle, kararlı yapıda kompleks oluşumunun gösterilmesi ise agaroz jel elektroforezi tekniğiyle çalışıldı. DNA paketlenmesi, anyonik ve nötral model membranlar ile etkileşimi floresans spektroskopi yöntemiyle incelendi. Daha sonra in vitro ortamda HeLa hücre soyunda, molekülün transfeksiyon verimini belirleme amacıyla, GFP ekspresyonu floresans mikroskopta görüntülendi. Son olarak, BG-2 oligoelektrolit molekülünün HeLa hücre soyu üzerindeki sitotoksisitesini belirlemek amacıyla, spektrofotometrik yöntemlere dayanan MTT ve BCA testleri yapılmıştır.Yapılan bu incelemeler sonucunda, BG-2 oligoelektrolit molekülünün kritik misel konsantrasyonu deney sonucuna göre, misel benzeri yapı oluşturduğu belirlendi. Boyut incelemeleri sonucunda, oluşan kompleks boyutlarının 150 nm'nin altında olması molekülün hücreye girişi açısından verimli olarak değerlendirildi. Zeta potansiyel ölçüm sonuçları, (+) yük dağılımına sahip molekülün (-) yüklü pDNA'yı nötralize edip paketlediğini ortaya koydu. Kompleks oluşumu deneyinde, kompleks şeritlerinde serbest pDNA bantlarına rastlanmaması kompleksin kararlı yapıda olduğunu gösterdi. DNA paketlenmesi deney sonuçlarına göre, molekülün sığır DNA ve pDNA'yı paketlediğini ve belli oranlarda ticari olarak elde edilen jetPEI'ya göre daha başarılı olduğunu ortaya koydu. Anyonik ve nötral model membranlarla etkileşimin gösterilmesinde ise, pozitif yüklü kompleks beklenildiği gibi anyonik model membranla etkileşime girerken, nötral model membranla etkileşime girmemiştir. Hücre transfeksiyonunda her ne kadar çok verimli sonuç alınamasa da, az da olsa transfeksiyonun gerçekleşmesi umut vaadedici olarak değerlendirildi. Toksisite profiline bakıldığında ise, molekülün HeLa hücre soyu üzerindeki toksisitesi kabul edilebilir düzeyde bulundu. Bütün bu deney sonuçları çerçevesinden bakıldığında, BG-2 oligoelektrolit molekülünün gen salımı amacıyla kullanılabilir olacağı, fakat transfeksiyon verimini arttırmak için molekül üzerinde bazı modifikasyonların yapılması gerektiği düşünülmektedir. Molekülün yeni sentezlenmiş olmasına rağmen, gen salımı amacıyla anlamlı sonuçlar vermesi, in vivo araştırmalardaki başarısından sonra, gelecekte klinik uygulamalarda da kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Gene delivery approaches intend to carry the therapeutic gene to targeted tissues and cells in treatment of cardiovascular system diseases, monogenic diseases, neurological and immunological diseases. Use of proper vector while carrying the therapeutic gene to targeted sites is crucial. Gene delivery vectors are divided into two classes as viral and non-viral. By carrying DNA to the cell, viral vectors have been used earlier than non-viral vectors, but due to disadvantages of viral vectors, such as inducing immune response, recombination of host genome, lack of DNA carrying capacity, natural and synthetic DNA carriers have been already started to design instead of viral carriers. These vectors that are designed at nanosize must overcome cellular barriers such as cellular uptake, trafficking within cell, protection of DNA from degradation against endosomal/lysosomal enzymes by releasing at right time and reaching of the therapeutic gene to nucleus, also they must be cheap, easy to produce, biocompatible, less cytotoxic and less immunogenic and must remain long period of time in circulation by staying stable in vivo.In this thesis, physicochemical and biophysical characterization of newly synthesized BG-2 oligoelectrolyte copolymer has been performed for gene delivery. The transfection conditions were optimized based on these characterizations and transfection and cytotoxicity studies in cell culture were performed.The critical micelle concentration have been determined by fluorescence spectroscopy method to understand how BG-2 oligoelectrolyte molecule acts in physiological environment before interaction with DNA. Afterwards, the measurement of BG-2/pDNA complexes in terms of physicochemical characteristics; size and zeta potential were performed by laser technique and demonstration of stable complex formation agarose gel electrophoresis technique was used. DNA condensation of BG-2/DNA complex and the interaction with anionic and neutral model membranes have been examined by fluorescence spectroscopy. GFP expression has been imaged in fluorescence microscope to determine the transfection efficiency of the molecule of HeLa cell in in vitro. Finally, the cytotoxic effects of BG-2 oligoelectrolyte on HeLa cell were studied by MTT and BCA tests based on spectrophotometric methods.Depending on these studies, it has been stated that BG-2 oligoelectrolyte molecule forms micelle-like structure according to critical micelle concentration experiment results. In size measurement, complex size being under 150 nm has been evaluated quite prospective in terms of cellular uptake and transfection efficiency. Zeta potential measurement results showed that (+) charged BG-2 molecule neutralizes and condensates the (-) charged pDNA. At complex formation experiment by electrophoresis, determining no free pDNA bands in agarose gel lanes indicated that the complex is at stable structure. According to DNA condensation experiment results, it has been indicated that molecule condensates bovine DNA and pDNA and at certain concentrations are more successful than commercial jetPEI. As for that demonstration of interaction between DNA and anionic and neutral model membranes, positive charged complex has interacted with anionic model membrane, but did not interact with neutral model membrane as expected. Even if in transfection much efficient results could not be obtained, images with little transfection were considered as promising. Examining toxicity profile, BG-2 toxicity profile on HeLa cell was evaluated as reasonable. Considering all these experimental results, BG-2 oligoelectrolyte molecule could be used for gene delivery but to improve transfection efficiency some modifications should be made on the molecule. Despite the molecule was newly synthesized, it is considered to be used in clinical implementations because of yielding significant results, after in vivo studies in the future.