Akciğer karsinomlarında lenfovasküler invazyonun belirlenmesi ve metastazların öngörülebilirliği: Çift antikorlu bir immünohistokimyasal çalışma
Determination of lymphovascular invasion and predictability of metastases in lung carcinomas: A double antibody immunohistochemical study
Yazar: CELAL ORHUN EGİLMEZ
Danışman: PROF. DR. OLGUN KONTAŞ
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Patoloji = Pathology

Özet:
Giriş ve amaç: Akciğer kanserleri, yüksek mortalite oranına sahiptir. Küçük hücreli karsinomlar sıklıkla erken dönemde metastaz yaptıkları için ancak ileri evrede tanı alırlar. Küçük hücreli dışı akciğer kanserleri, akciğer kanserlerinin %80'lik kısmını oluşturur. En sık görülen küçük hücreli dışı akciğer kanseri histolojik tipleri adenokarsinomlar, skuamöz hücreli karsinomlar ve büyük hücreli karsinomlardır. Küçük hücreli dışı akciğer karsinomu tanısı alan hastalarda tedavi planı için evreleme önemlidir. Bu amaçla başvurulan ilk yöntem radyolojik görüntüleme çalışmaları olmaktadır. Gerek görüldüğü durumlarda evreleme amaçlı mediastinal lenf nodu örneklemesi yapılır. Mediastinal lenf nodu örneklemesi için ultrasonografi kılavuzluğunda transbronşiyal lenf nodu ince iğne aspirasyonu yapılabilirse de altın standart mediastinoskopik lenf nodu eksizyonudur. Ancak, medistinoskopi ile mediastinal lenf nodu örneklemesi ameliyathane şartlarında yapılması gereken invaziv bir yöntemdir. 
Bu çalışmanın amacı mediastinoskopi ile lenf nodu örneklemesinin vereceği değerli bilgilere daha az invaziv yöntemlerle ulaşmanın ne oranda mümkün olabileceğinin belirlenmesidir. Bu amaçla tümü bölgesel lenf nodlarına metastaz yapmış olan küçük hücreli dışı akciğer kanseri olguları seçildi. Tanı verilmiş çoğunluğu bronkoskopik veya transtorakal akciğer iğne biyopsileri CD34-pankeratin ve D2.40-pankeratin çift immünohistokimya boyaları ile değerlendirilerek, metastatik olguların ne kadarlık kısmında ilk tanı verilen dokuda lenfovasküler invazyonun tespit edilebileceği araştırıldı. 
Materyal ve Metod: Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı'nda 2010-2020 yılları arasında küçük hücreli dışı akciğer kanseri tanısı alan ve bölgesel lenf nodlarına metastaz yapmış olan 49 vaka çalışmaya alındı. Vakaların 47'sinde mediastinal lenf nodlarına, ikisinde ise hiler/interlobar bölge lenf nodlarına metastaz tespit edilmişti. Mediastinal lenf nodlarına metastaz yapan olguların beşinde uzak organ metastazı lehine bulgu vardı. Tümör tipi, yaş, cinsiyet, metastaz yaptığı lenf nodu bölgesi ve varsa görüntülemelerde uzak organ metastazı olup olmadığı bilgisi elde edildi. Vakaların formalinde tespit edilmiş parafine gömülü dokularından alınan kesitlerine D2.40-pankeratin ve CD34-pankeratin çift antikorları immünohistokimyasal olarak boyandı. D2.40-pankeratin ikili immün boyamasında D2.40 antikoru için DAB kromojen kiti kullanılırken pankeratin için AP red kromojen kiti kullanıldı. Sonuç olarak ışık mikroskobuyla kahverengi boyanan lenfatikler içeresinde kırmızı renkle işaretlenen tümör hücreleri arandı. Lenfatikler içerisinde yer alan ve damar duvarına tutunduğu görülen tümör hücreleri lenfovasküler invazyon açısından pozitif kabul edildi. CD34-pankeratin ikili immün boyamasında da CD34 antikoru için DAB kromojen kiti, pankeratin için de AP red kromojen kiti kullanıldı. Kahverengi boyanan lenfatik ve kan damarları içerisinde kırmızı renkle işaretlenen tümör hücreleri arandı. Lenfatik ve kan damarı içerisinde yer alan ve damar duvarına tutunduğu görülen tümör hücreleri lenfovasküler invazyon açısından pozitif kabul edildi. Çalışmaya alınan metastatik küçük hücreli dışı akciğer kanserli olguların ne kadarında tanı verilmiş küçük biyopsilerde lenfovasküler invazyonun tespit edildiği belirlendi.Lenfovasküler invazyon ile histolojik tümör tipleri arasındaki ilişkisi ki-kare testi uygulanarak değerlendirildi. P değerinin 0.05'in altında olduğu durumlar istatistiksel açıdan anlamlı kabul edildi.
Bulgular: Çalışmaya alınan 49 küçük hücreli dışı akciğer karsinomlu hastanın yaş ortalaması ve yaş dağılımının 57,22±7,20 (36-75) olduğu görüldü. Hastaların %83,7'si erkek ve %16,3'ü kadındı. Olguların %85,7'sinde mediastinal lenf nodu metastazı, %10,2'sinde mediastinal lenf nodu metastazına ek olarak uzak organ metastazı vardı. %4,1'inde ise hiler/interlobar bölge lenf nodu metastazı vardı. Biyopsilerin %98'i bronş biyopsisi ve transtorasik iğne biyopsilerinden oluşuyordu. %2'lik kısmı oluşturan bir vaka ise ameliyat sırasında frozen incelemeye gönderilen kitle parçasıydı. 
Adenokarsinomlar %51, skuamöz hücreli karsinomlar %42,9, sarkomatoid karsinomlar %4,1 oranındaydı. Adenoskuamöz karsinom ise bir vaka ile %2'lik kısmı oluşturdu. D2.40-pankeratin ile 13 vakada (%26,5) lenfovasküler invazyon tespit edildi. CD34-pankeratin ile 9 vakada (%18,4) lenfovasküler invazyon görüldü. İki boya birlikte değerlendirildiğinde tüm olguların 15'inde (%30,6) lenfovasküler invazyon bulundu. 
Yalnızca mediastinal lenf nodu metastazı olan 42 vakanın 12'sinde (%28,6), mediastinal 
lenf nodu metastazına ek olarak uzak organ metastazı bulgusu olan beş vakanın ikisinde 
(%40) lenfovasküler invazyon tespit edildi. Hiler/interlobar lenf nodu metastazı olan iki 
vakadan birinde lenfovasküler invazyon görüldü.
Vakaların çoğunluğunu oluşturan adenokarsinom ve skuamöz hücreli karsinomlarda 
lenfovasküler invazyonun tespitinde histolojik tip açısından anlamlı fark olmadığı 
görüldü.
Sonuç: Çalışmaya alınan metastatik küçük hücreli dışı akciğer karsinomlu tüm vakaların 
%30,6'sında küçük biyopsi örneklerinde yapılan çift immünohistokimyasal yöntemle 
lenfovasküler invazyon tespit edildi. Tümör tipi ile lenfovasküler invazyon arasında 
anlamlı fark bulunmadı. Akciğer küçük hücreli dışı karsinomlarında lenfovasküler 
invazyonu değerlendiren çalışmaların çoğu rezeksiyon materyallerinde yapılmıştır ve bu 
çalışmalarda tespit edilen lenfovasküler invazyon oranı büyük değişkenlik 
göstermektedir. Hem küçük akciğer biyopsi örnekleri üzerinde çalışılması hem de 
lenfovasküler invazyonun çift antikorlu immünohistokimyasal yöntemle aranmasının 
duyarlılığı artırması açısından bu çalışmanın özgün bir değeri olacağını düşünmekteyiz. 
Bu gibi vakalarda mediastinoskopi altın standart olarak kalmaya devam etse de hastaya 
ek bir yük getirmeyen tanı materyalinde lenfovasküler invazyon belirlenmesinin klinik 
takip ve prognozu öngörme açısından değerli bilgiler sağladığı kanaatindeyiz. 
Anahtar kelimeler: Çift immünohistokimya, lenfovasküler invazyon, küçük hücreli dışı akciğer karsinomu, D2.40-pankeratin, CD34-pankeratin

Abstract:
Introduction and Purpose: Lung cancers have a high mortality rate. Small cell carcinomas are diagnosed only in advanced stages because they often metastasise in the early stages. Non-small cell lung cancers constitute 80% of lung cancers. The most common histological types are adenocarcinomas, squamous cell carcinomas and large cell carcinomas. Staging is important for the treatment plan in patients diagnosed with non-small cell carcinoma. The first method used for this purpose is radiological imaging studies. When necessary, mediastinal lymph node sampling is performed for staging purposes. Although ultrasonography-guided transbronchial lymph node fine needle aspiration can be used for mediastinal lymph node sampling, the gold standard is mediastinoscopic lymph node excision. However, mediastinal lymph node sampling by mediastinoscopy is an invasive method that should be performed under operating theatre conditions. 
The aim of this study was to determine to what extent it is possible to access the valuable information provided by mediastinoscopic lymph node sampling with less invasive methods. For this purpose, non-small cell lung cancer cases, all of which had metastasised to regional lymph nodes, were selected. Diagnosed bronchoscopic or transthoracic lung needle biopsies were evaluated with CD34-pankeratin and D2.40-pankeratin double immunohistochemistry stains to determine the proportion of metastatic cases in which lymphovascular invasion could be detected in the initially diagnosed 
tissue. 
Material and Methods: Between 2010 and 2020, 49 cases of non-small cell lung cancer diagnosed in Erciyes University, Faculty of Medicine, Department of Pathology and metastasised to regional lymph nodes were included in the study. Metastasis to mediastinal lymph nodes was detected in 47 cases and to hilar/interlobar lymph nodes in two cases. Five of the cases metastasised to mediastinal lymph nodes had findings in favour of distant organ metastasis. Information on tumour type, age, sex,lymph node site of metastasis and the presence of distant organ metastasis on imaging, if any, were obtained. D2.40-pankeratin and CD34-pankeratin double antibodies were immunohistochemically stained on sections of paraffin embedded tissues fixed in formalin. 
In D2.40-pankeratin double immunostaining, DAB chromogen kit was used for D2.40 antibody and AP red chromogen kit was used for panceratin. As a result, tumour cells marked with red colour were searched in the lymphatics stained brown by light microscopy. Tumour cells located in the lymphatics and seen to be attached to the vessel wall were considered positive for lymphovascular invasion. In CD34-panceratin double immunostaining, DAB chromogen kit was used for CD34 
antibody and AP red chromogen kit was used for pankeratin. Tumour cells marked with red colour were searched in brown stained lymphatic and blood vessels. Tumour cells located in the lymphatic and blood vessels and seen to be attached to the vessel wall were considered positive for lymphovascular invasion. The proportion of patients with metastatic non-small cell lung cancer in whom lymphovascular invasion was detected in diagnostic small biopsies was determined. The relationship between lymphovascular invasion and histological tumour types and metastasis sites was evaluated using the Chi-square test. P values below 0.05 were considered statistically significant.
Results: The mean age and age distribution of 49 patients with non-small cell lung 
carcinoma was 57.22±7.20 (36-75) years. 83.7% of the patients were male and 16.3% were female. Mediastinal lymph node metastasis was present in 85.7% of the patients, distant organ metastasis in addition to mediastinal lymph node metastasis was present in 10.2%, and hilar/interlobar lymph node metastasis was present in 4.1%. Bronchial biopsies and transthoracic needle biopsies accounted for 98% of the biopsies. 2% of the biopsies consisted of a mass fragment sent for frozen examination during surgery. Adenocarcinomas were 51%, squamous cell carcinomas 42.9%, sarcomatoid carcinomas 4.1%. Adenosquamous carcinoma constituted 2% with one case.
D2.40-pankeratin showed lymphovascular invasion in 13 cases (26.5%). With CD34-pankeratin, lymphovascular invasion was seen in 9 cases (18.4%). When both stains were evaluated together, lymphovascular invasion was found in 15 cases (30.6%). Lymphovascular invasion was detected in 12 of 42 cases (28.6%) with mediastinal lymph node metastases only and in two of five cases (40%) with distant organ metastases in addition to mediastinal lymph node metastases. Lymphovascular invasion was seen in one of two cases with hilar/interlobar lymph node metastasis.There was no significant difference in the detection of lymphovascular invasion in adenocarcinoma and squamous cell carcinoma in terms of histological type.
Conclusion: Lymphovascular invasion was detected in 30.6% of all cases of metastatic non-small cell lung carcinoma by double immunohistochemistry on small biopsy specimens. No significant difference was found between tumour type and lymphovascular invasion. Most of the studies evaluating lymphovascular invasion in non-small cell carcinomas of the lung have been performed on resection materials and the rate of lymphovascular invasion detected in these studies varies widely. We think that this study will have a unique value in terms of both studying on small lung biopsy specimens and increasing the sensitivity of lymphovascular invasion by double antibody immunohistochemistry. Although mediastinoscopy remains the gold standard in such cases, we believe that determination of lymphovascular invasion in the diagnostic material, which does not impose an additional burden on the patient, provides valuable information in terms of clinical follow-up and prognosis prediction.
Keywords: Double immunohistochemistry, lymphovascular invasion, non small cell lung cancer, D2.40-pankeratin, CD34-pankeratin