Miyofibroblast farklılaşmasının düzenlenmesi ve bazı LncRNA'ların etkisinin araştırılması
The regulation of myofibroblast differentiation and the investigation of effect of some LncRNAs
Yazar: MERVE YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. FÜSÜN ÖZTAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
İdiyopatik pulmoner fibrozis, ilerleyici tipte, kronik ve ölümcül bir interstisiyel akciğer hastalığıdır. Miyofibroblastlar aşırı miktarda ekstrasellular matriks (ECM) elemanlarını üretip hücre dışına salgılayarak ECM elemanlarının interstisiyumda birikmelerini sağlayan,  İPF moleküler patogenezinde etkili başlıca hücrelerdir. Bu nedenle,  mevcut anti-fibrotik yaklaşımlarda fibroblast/miyofibroblast proliferasyonunun, farklılaşmasının önlenmesi, miyofibroblastların veya matrikste biriken ECM elemanlarının yok edilmesine yönelik uygulamalar yapılmaktadır. Pulmoner fibroziste, apoptoza direnç gösteren miyofibroblastların otofaji ile yok edilmesi hakkında çok az şey bilinmektedir. Çalışmada, bilinen anti-fibrotik yaklaşımlara alternatif olarak,  kolşisin (CLC) kullanımıyla ECM elemanlarını taşıyan sekresyon vesiküllerinin hücre içinde mikrotübül aracılı taşınmalarının engellenmesi ve hücre içinde birikimlerinin sağlanması hedeflenerek, insan akciğer miyofibroblastlarında hücresel bir stresin yaratılması ve bu stresin hücrelerde anti-fibrotik bir yanıt oluşturulması amaçlandı. Ayrıca, anti-fibrotik yanıtı miyofibroblast farklılaşması, proliferasyonu ve ölüm mekanizmaları yönünden açıklamak ve fibrozisle ilişkili olduğu bilinen CD99P1, LINC00941, TUG1  ve TP53TG1 LncRNA'larının bu anti-fibrotik yanıta muhtemel katkılarını belirlemek amaçlandı.
İnsan akciğer fibroblast hücrelerinden (MRC-5 hücreleri) 4 deney grubu oluşturuldu: I-kontrol grup; II- tek doz transforme edici büyüme faktörü (TGF)-β  (5 ng/ml) ile miyofibroblast farklılaşması uyarılan grup; III- deneyin 0 ve 24. saatinde CLC (0,01 µM)  uygulamaları yapılan grup ve IV-TGF-β+CLC uygulamaları yapılan grup. Madde uygulamalarını takiben deneyin 24, 48 ve 72. saatlerinde hücreler toplandı. CLC'nin etkin dozu MTT testi, mikrotübül depolimerizasyonu anti-α-tubulinin immunofloresan işaretleme yöntemi ve hücrelerin proliferatif yanıtı BrdU proliferasyon testi belirlendi. Miyofibroblast farklılaşması (α-SMA, hücre içi ve dışı kollagen ve fibronektin miktarları), miyofibroblastlarda apoptotik (aktif-kaspaz3, Bax ve survivin) ve otofajik yanıt (Beklin1, ATG-5, LC3BI-II çevrimi ve LAMP2), ve hücresel stres (Hsp70 ve Hsp90) ile ilişkili proteinlerin miktarlarındaki değişimler Western blot analizlerle saptandı. Nötral kırmızı boyası alımı ile lizozomal aktivite ve flörometrik yöntem ile hücre içi reaktif oksijen türlerinin miktarı analiz edildi. CD99P1, LINC00941, TUG1 ve TP53TG1 LncRNA'larının ve COL1A, FN1 ve ACTA2 genlerinin gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile ekspresyon analizleri yapıldı. Ayrıca,  hücrelerde meydana gelen ultrastrüktürel değişimler geçirimli elektron mikroskobik analizler ile saptandı. 
TGF-β, MRC-5 hücrelerinde  α-SMA protein miktarını (p<0,05), kollagen-1α (48 ve 72. saatler için p<0,05 ve p<0,01)  ve fibronektin (24 ve 48. saatler için p<0,01)  gibi ECM elemanlarının üretimini ve hücre dışına (p<0,01) salgılanmalarını zamana bağlı olarak arttırdı. İlaveten, TGF-β, hücrelerin proliferasyon kapasitesini sınırlayarak (24, 48  ve 72. saatler için p<0,01, p<0,05 ve p<0,05)  ve hücrelerde apoptotik ve otofajik sinyalleri azaltarak hücrelerdeki fibrotik yanıtı kuvvetlendirdi. TGF-β ile uyarılan MRC-5 hücreleri üzerinde yapılan CLC uygulamaları, mikrotübül depolimerizasyonunu sağlayarak,  hücre içinde kollagen ve fibronektin gibi ECM elemanlarının birikimine ve böylece, özellikle deneyin 72. saatinde, onların hücre dışına salgılanmalarının azaltılmasına neden oldu (p<0,05).  Bu birikim hücrelerde ROS (p<0,05) ve Hsp90 stres proteininin (p<0,001) miktarını arttırdı, hücresel stresi tetikledi ve bu hücrelerde çok yönlü bir anti-fibrotik yanıtın gelişmesini sağladı. TGF-β+CLC uygulamaları, Smad4 protein miktarını düşürerek (24, 48 ve 72. saatler için p<0,05, p<0,01 ve p<0,001) Smad bağımlı TGF-β sinyal yolu aktivasyonunu azalttı ve miyofibroblast farklılaşmasını geriletti. TGF-β+CLC uygulamaları, TGF-β  tarafından proliferasyon kapasitesi azaltılan MRC-5 hücrelerinde farklılaşmanın en düşük seviyede olduğu deneyin 72. saatinde, mevcut hücrelerde proliferasyon yanıtının oluşmasını ve yeniden proliferasyon kapasitesi kazanmalarını engelledi (p<0,05). TGF-β+CLC uygulamaları, TGF-β  tarafından apoptoza direncin teşvik edildiği MRC-5 hücrelerinde Smad bağımlı TGF-β sinyal yolu aktivasyonunun azaltılmasına rağmen, bu hücrelerde apoptoza karşı gelişen direnci kıramadı. TGF-β+CLC uygulamaları yapılan MRC-5 hücrelerinde aktif kaspaz-3 (48 ve 72. saatler için p<0,001), Bax (24, 48 ve 72. saatler için p<0,05, p<0,01 ve p<0,01) ve survivin ( 72. saat için p<0,05) protein seviyelerinin düşük olduğu belirlendi.  TGF-β+CLC uygulamaları, TGF-β  tarafından otofajik yanıtın azaltıldığı MRC-5 hücrelerinde deneyin 24. saatinden itibaren LC3BI-LC3BII çevrimini uyarmak suretiyle bu hücrelerde otofajik yanıtın gelişmesine neden oldu (24, 48 ve 72. saatler için p<0,001, p<0,05 ve p<0,01). Elektron mikroskobik analizler, bu hücrelerde salgı vesiküllerinin birikmesine paralel olarak otofajik vakuol oluşumunun artış gösterdiğini ortaya koydu. Her ne kadar lizozomal aktivitede bir düşüş tespit edilmiş olsa da, bu hücrelerde lizozom-otofagozom etkileşimlerinin saptanması ve hücre ölümlerinin gözlenmesi otofajik ölümün sınırlı olsa da gerçekleştiğini işaret etmektedir. Üstelik, hücresel stresin en üst seviyeye ulaştığı deneyin 72. saatinde ERK (p<0,05) ve AKT (p<0,05) sinyal yollarının uyarılan aktivasyonu bile bu hücreleri hayatta tutmada başarılı olamadı. 
TGF-β ve TGF-β+CLC uygulamalarının yapıldığı MRC-5 hücrelerinde,  CD99P1, LINC00941, TUG1 ve TP53TG1 LncRNA'larının ekspresyon profilleri dikkate alındığında, miyofibroblast farklılaşmasının uyarıldığı durumlarda CD99P1 ekspresyonunun düzenli bir artış gösterdiği (p<0,05) ve farklılaşmanın geriletildiği durumlarda ise ekspresyonunun düştüğü (24. saat için p<0,01; 48 ve 72. saatler için p<0,05) belirlendi. Bu veri, CD99P1'in miyofibroblast farklılaşma derecesinin belirlenmesinde ve pulmoner fibrozis gelişiminin takibinde kullanılabilecek iyi bir belirteç olabileceğini işaret etmektedir. TGF-β+CLC uygulamalarıyla miyofibroblast farklılaşmasının kuvvetli olarak geriletildiği, salgı vesiküllerinin birikimi nedeniyle hücresel stresin en yüksek olduğu, lizozom aktivitesindeki düşüşe rağmen otofajik yanıtın uyarıldığı deneyin 72. saatinde deneyin 48. saatine göre LINC00941 LncRNA ekspresyonun artmasının (p<0,01) otofajik yanıtın sınırlandırılmasına katkı sağlayabileceğini, TUG1 LncRNA ekspresyonun artmasının (p<0,05) bu hücrelerde otofajik yanıtı kuvvetlendirme yönünde etki gösterebileceğini düşündürmektedir.
Çalışmadan elde edilen verilere dayanarak, CLC'nin miyofibroblast proliferasyonu ve farklılaşmasını azaltan, miyofibroblastlarda otofajik hücre ölümünü uyararak miyofibroblastları ortadan kaldıran çok yönlü-güçlü bir anti-fibrotik ajan olarak kulanılabileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a progressive, chronic and fatal interstitial lung disease. Myofibroblasts are the main cells involved in the molecular pathogenesis of IPF by producing and secreting excessive amounts of extracellular matrix (ECM) elements and allowing their accumulation in the interstitium. Therefore, current anti-fibrotic approaches are aimed at preventing fibroblast/myofibroblast proliferation and differentiation, and eliminating myofibroblasts or ECM elements accumulated in the matrix. In pulmonary fibrosis, little is known about the autophagy-mediated destruction of apoptosis-resistant myofibroblasts. In the present study, as an alternative to known anti-fibrotic approaches, colchicine (CLC) was used to prevent microtubule-mediated intracellular transport of secretory vesicles carrying ECM elements and to ensure their accumulation in the cell. It was aimed to create a cellular stress and to induce an anti-fibrotic response in human lung myofibroblasts. It was also aimed to explain the anti-fibrotic response in terms of myofibroblast differentiation, proliferation and death mechanisms and to determine the possible contribution of CD99P1, LINC00941, TUG1 and TP53TG1 LncRNAs, which are known to be associated with fibrosis, to this anti-fibrotic response.
Four experimental groups were established from human lung fibroblast cells (MRC-5 cells): I - control group; II - myofibroblast differentiation stimulated with a single dose of transforming growth factor (TGF)-β (5 ng/ml); III - CLC (0.01 µM) treated group at 0 and 24 h of the experiment; and IV - TGF-β+CLC treated group. Cells were harvested at 24, 48 and 72 h of the experiment following the substance treatments. The effective dose of CLC was determined by MTT assay, microtubule depolymerization by anti-α-tubulin immunofluorescent labeling method and proliferative response of cells by BrdU proliferation assay. Myofibroblast differentiation (α-SMA, intracellular and extracellular collagen and fibronectin levels), apoptotic (active-caspase3, Bax and survivin) and autophagic response (Beklin1, ATG-5, LC3BI-II cycle and LAMP2), and cellular stress (Hsp70 and Hsp90) related proteins were determined by Western blot analysis. Lysosomal activity was analyzed by neutral red dye uptake and intracellular ROS content was analyzed by fluorometric method. Expression analysis of CD99P1, LINC00941, TUG1 and TP53TG1 LncRNAs and COL1A, FN1 and ACTA2 genes were performed by RT-qPCR. In addition, ultrastructural changes in the cells were detected by transmission electron microscopy (TEM) analysis. 
In MRC-5 cells, TGF-β stimulated the production of α-SMA protein (p<0.05),  and ECM elements such as collagen (p<0.05 and p<0.01 for 48 and 72 h) and fibronectin (p<0.01 for 24 and 48 h) and their secretion to the outside of the cell (p<0.01) in a time-dependent manner. In addition, TGF-β potentiated the fibrotic response in cells by limiting the proliferation capacity of cells (p<0.01, p<0.05 and p<0.05 for 24, 48 and 72 h) and decreasing apoptotic and autophagic signaling in cells. CLC treatments on TGF-β-stimulated MRC-5 cells induced microtubule depolymerization, leading to the accumulation of ECM elements such as collagen and fibronectin inside the cell and thus reducing their secretion out of the cell, especially at 72 h of the experiment (p<0.05).  This accumulation triggered cellular stress due to increased amounts of ROS (p<0.05) and Hsp90 stress protein (p<0.001) and induced a multifaceted anti-fibrotic response in these cells. TGF-β+CLC treatments decreased Smad4 protein levels (p<0.05, p<0.01 and p<0.001 for 24, 48 and 72 h), decreased Smad-dependent TGF-β signaling pathway activation and regressed myofibroblast differentiation. TGF-β+CLC treatments prevented the establishment of a proliferation response in MRC-5 cells whose proliferation capacity was reduced by TGF-β and prevented them from regaining proliferation capacity at 72 h, when differentiation was at its lowest level (p<0.05). Although TGF-β+CLC treatments reduced Smad-dependent TGF-β signaling pathway activation in MRC-5 cells in which resistance to apoptosis is promoted by TGF-β, they failed to break the resistance to apoptosis in these cells. The protein levels of active caspase-3 (p<0.001 for 48 and 72 h), Bax (p<0.05, p<0.01 and p<0.01 for 24, 48 and 72 h) and survivin (p<0.05 for 72 h) were lower in MRC-5 cells treated with TGF-β+CLC.  TGF-β+CLC treatment induced an autophagic response in MRC-5 cells, in which the autophagic response was reduced by TGF-β, by stimulating the LC3BI-LC3BII cycle from the 24th hour of the experiment (p<0.001, p<0.05 and p<0.01 for 24, 48 and 72 h). TEM microscopic analysis revealed that autophagic vacuole formation increased in parallel with the accumulation of secretory vesicles in these cells. Although a decrease in lysosomal activity was detected, the detection of lysosome-autophagosome interactions and the observation of cell death in these cells suggest that autophagic death occurs, albeit limited. Moreover, even the activation of ERK (p<0.05) and AKT (p<0.05) signaling pathways failed to keep these cells alive at 72 h, when cellular stress peaked. 
Considering the expression profiles of CD99P1, LINC00941, TUG1 and TP53TG1 LncRNAs in MRC-5 cells treated with TGF-β and TGF-β+CLC, it was observed that CD99P1 expression increased steadily when myofibroblast differentiation was stimulated (p<0.05) and decreased when differentiation was regressed (p<0.01 for 24. p<0.01 for 24 h; p<0.05 for 48 and 72 h) suggests that CD99P1 may be a good marker for determining the degree of myofibroblast differentiation and for monitoring the development of pulmonary fibrosis. In the 72nd hour of the experiment, in which myofibroblast differentiation was strongly reversed by TGF-β+CLC treatment, cellular stress peaked due to the accumulation of secretory vesicles, and autophagic response was stimulated despite the decrease in lysosome activity, the expression of CD99P1 increased compared to  48 h, increased LINC00941 LncRNA (p<0.01)  can contributed to the limitation of autophagic response, while increased TUG1 LncRNA expression (p<0.05) can be  effect on strengthening the autophagic response in these cells.
Based on the data obtained from the  study, we suggest that CLC can be used as a versatile and potent anti-fibrotic agent that reduces myofibroblast proliferation and differentiation and eliminates myofibroblasts by inducing autophagic cell death in myofibroblasts