Sildenafil düzeylerinin, pulmoner arteriyal hipertansiyon hasta plazmalarında kromatografik yöntemle belirlenmesi ve "bitkisel kökenli" ürünlerde ilegal varlığının araştırılması
Determination of sildenafil levels in pulmonary arterial hypertension patients'plasma, by chromatographic method and investigation of illegal assets in "plant origin" products
Yazar: EMRAH DURAL
Danışman: PROF. DR. GÜLSEREN KARABIYIKOĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Adli Bilimler Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine
Dizin: Bitkiler = Plants ; Bitkisel ürünler = Vegetable products ; HPLC yöntemi =   ; Hipertansiyon-pulmoner = Hypertension-pulmonary ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Pulmoner arter = Pulmonary artery ; Sildenafil = Sildenafil

Özet:
Sildenafil, fosfodiesteraz tip5 enziminin seçici ve potent bir inhibitörü olup pulmoner hipertansiyon hastalığının (PAH) ve erektil fonksiyon bozukluğunun idame tedavisinde kullanılmaktadır.
Bu çalışmada sildenafilin insan plazması ile piyasada "Bitkisel Ürün" ifadesiyle satılmakta olan ürünlerin içeriğindeki varlığını ve düzeyini araştırmak amacıyla yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile analiz yöntemi geliştirildi. Bu amaçla özgün, güvenilir, hassas bir metot oluşturuldu ve ilgili test uygulamaları yapılarak metot valide edildi. 
Plazmadan sildenafil (1mL) izole edilmeden önce içeriğine iç standart olarak verapamil ve 200µL hacimde 1M'lık NaOH eklenerek ortam alkali hale dönüştürülmüştür. Ardından ekstraksiyon işlemi için karışıma 3mL etil asetat konulmuştur. Ekstraksiyon sonrası organik çözücü, azot altında, 40°C'de ve sabit akışta tam kuruluğa kadar uçurulmuş, ardından 200µL mobil fazda yeniden oluşturulmuştur. Kromatografik analiz inertsil C18 ters faz kolon ile 0,8mL/dak akış hızında, %60 asetonitril %40 amonyum asetat tamponlu mobil faz sistemi kullanılarak, 100µL enjeksiyon hacmi ile gerçekleştirildi. Analiz süresi 9 dakika idi. Ekstraksiyon ürünlerinin analizleri ultraviyole dedektör (UV) ile 225nm'de yapılmıştır. Sildenafil ve verapamil'in retansiyon zamanları sırasıyla 6,76 ve 8,01 idi. Doğrusallık (linearity) plazmada 7,16–716ng/mL aralığında incelenmiştir. Gözlenebilme sınırı (LOD) 0,64ng/mL, tayin sınırı (LOQ) ise 1,93ng/mL idi. Metodun doğruluğu (accuracy), gün içinde (%RE) 6,47 ile 5,73, günler arasında ise -7,39 ile 6,45 aralığındadır. Metodun kesinliği (precision) gün içinde (%RSD) 1,74–5,68, günler arasında ise 2,58–6,23 aralığındadır.
İncelenen 6 PAH hastasına ait sildenafil plazma dağılımı 27,05–2055,43ng/mL'dir. Sildenafil düzeyleri 914,25±924,75(Ort.±SD) şeklindedir. Piyasada "bitkisel" ifadesiyle satılmakta olan 8 ürünün içeriğinde sildenafil araştırılmıştır. 4 örnekte sildenafil belirlenmiştir. Bu örneklerdeki sildenafil miktarları 10,55-621,28ng/mL aralığında bulunmuş, 176,65±297,32(Ort.±SD) olarak gözlenmiştir.

Abstract:
Sildenafil is a potent and selective inhibitor of the fosfodiesterase type-5 enzymes and is used in the treatment of pulmonary hypertension disease (PAH) and maintenance of erectile dysfunction.
In this study, a high-performance liquid chromatography (HPLC) method was developed in order to determination of sildenafil levels in human plasma and "herbal" products. For this purpose an original, specific, reliable, sensitive method was established and this method were validated.
Verapamil was used as an internal standard and plasma was made alkaline by added 200µl NaOH, 1M. 3mL ethyl acetate was added in this mixture for the extraction procedure. After the extraction, organic solvent was evaporated by nitrogen (40°C, constant flow), and then it was reconstituted by 200µL mobile phase. Analysis was 9 minutes. Analysis of extraction products were made by ultraviolet detector (UV) at 225nm. The retention time of sildenafil and verapamil were 6.76 and 8.01, respectively. Linearity was observed the range of 7.16-716 ng/mL sildenafil. Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantification (LOQ) were measured 0.64ng/mL and 1,93ng/mL, respectively. Accuracy of the method were observed between 6,47-5,73 and 6.45-7.39 within and without days, respectively. Accuracy of the method were observed between 1.74-5.68 and 2,58–6,23; within and without days, respectively. 
The plasma sildenafil distribution of 6 PAH patients were observed between 27,05(min)- 2055.43(max)ng/mL. The levels of sildenafil were observed 914.25±924.75(mean±SD). 8 products are being sold in the market were investigated. Sildenafil was determined in 4 specimens. Sildenafil levels were found between 0.55-621.28ng/mL, 176,65±297,32(Ort.±SD), and observed 176.65±297.32(mean±SD), in these specimens.