Selektif MAO-B inhibitörü selejilin yüklü PLGA-b-PEG nanopartiküllerin hazırlanması ve beta-amiloid fibrillerle etkileşiminin incelenmesi
Preparation of selective MAO-B inhibitor selegiline loaded PLGA-b-PEG nanoparticles and evaluation of their interaction with beta-amyloid fibrils
Yazar: İPEK BAYSAL
Danışman: PROF. DR. GÜLBERK UÇAR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Alzheimer hastalığı (AH), beynin hipokampüs ve korteks bölgelerinde geri dönüşümsüz nöron kaybı ile ortaya çıkan nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın moleküler mekanizması açık olmamakla birlikte AH'nda, neokorteksin ekstraselüler sinaptik boşluklarında amiloid beta proteinlerinin birikerek plaklar oluşturduğu ve nöron dejenerasyonuna yol açtığı öne sürülmektedir. AH'nda monoamin oksidaz-B (MAO-B) düzeyinin arttığı; bu aktivite sonucu açığa çıkan oksidanların nörodejenerasyona yol açtığı; MAO-B inhibitörlerinin nörodejeneratif hastalıklarda sinirsel dejenerasyonu engellediği bildirilmiştir. Bir MAO-B inhibitörü olan selejilinin, AH'nda beynin dopamin reseptörlerince zengin olan bölgesinde etkiyerek hastalığın gelişimini yavaşlattığı öne sürülmekte; ancak periferik yan etkileri bulunan bileşiğin doğrudan beyne hedeflenmesi ile ilgili yeterli çalışma bulunmamaktadır. MAO-B inhibitörlerinin AH'ında ß-amiloid fibril ve plak oluşumunu engellediği konusunda da yeni çalışmalar vardır. Bu çalışmanın amacı, selektif MAO-B inhibitörü olan Selejilini kan beyin engelini aşmak üzere hazırlanan PLGA-b-PEG nanopartiküllerine yüklemek; yüklü partiküllerin ß-amiloid fibrilleri destabilize edici etkisini in vitro koşullarda incelemek; partiküllerin in vivo ortamda kan beyin engelini aşabilme yeteneğini ve beyindeki dağılımını saptamaktır.Bu çalışmada selejilin yüklenmiş PLGA-b-PEG nanopartiküller, çift emülsiyon yönteminin modifiye edilmesiyle hazırlanmış; yükleme etkinliği in vitro etkin madde salım deneyleriyle belirlenmiştir. En yüksek verim, 5 mg selejilin kullanılan seri ile elde edilmiştir. Bu seri için partikül boyutları ve polidispersite indeksi sırasıyla 217±15.5 nm ve 0.321 olarak saptanmıştır. Nanopartiküllerin ß-amiloid fibrilleri (Aß1-40 ve Aß 1-42) destabilize edici etkisi in vitro koşullarda ThT fluoresans şiddetindeki azalmanın ölçülmesiyle incelenmiştir. Bu sonuç, TEM ve AFM görüntüleriyle de doğrulanmıştır. Her iki fibril tipi için de altıncı saate kadar inkübasyon süresinin artmasıyla destabilize edici etkinin arttığı, altıncı saatten sonra ise etkinin platoya ulaştığı saptanmıştır. İn vivo deneylerde Wistar Albino sıçanlar kullanılmıştır ve selejilin yüklü nanopartiküllerin selejiline kıyasla daha yüksek verimle korteks ve hipokampüse gittikleri saptanmıştır. Bu tez kapsamında elde edilen bulgular doğrultusunda gelecekte bu nanopartiküllerin yüzeyine doğrudan ß amiloid fibrillere hedeflemeyi sağlayacak ligand/antikorların takılması ve Alzheimer modeli oluşturulmuş farelerde in vivo çalışmaların tekrarlanması planlanmaktadır.

Abstract:
Alzheimer's disease (AD) is an irreversible and progressive neurodegenerative disease that is caused by the irreversible loss of neurons in the hippocampus and cortex regions of the brain. Although the molecular mechanism of the disease is still unclear, the deposition of the amyloid beta proteins (senile plaques) in the extracellular synaptic spaces of the neocortex is suggested to play a major role in progress of AD. The increased activity of monoamine oxidase-B (MAO-B) in AD brains was suggested to cause oxidative demage, and MAO-B inhibitors have been reported to inhibit the neuronal degeneration. Selegiline, a selective MAO-B inhibitor, known to have beneficial effects in the brain regions which are rich by dopamine receptors, however, studies based on brain targetting of selegiline are limited. There have been some recent studies showing the possible Aß-fibril destabilizing effects of MAO inhibitors. The aim of the present study is to prepare the selective MAO-B inhibitor selegiline loaded PLGA-b-PEG nanoparticles; to investigate the in vitro Aß-fibril destabilizing effect of the loaded particles; to determine the blood brain barrier (BBB) crossing ability of the loaded particles and their distribution in brain in vivo. Selegiline loaded PLGA-b-PEG nanoparticles were prepared by a modified double emulsion method; loading efficiency was determined by in vitro drug releasing method. Particule serie prepared with 5 mg selegiline was found to be the one with highest efficiency. Particule dimensions and polydispersity index for this serie were determined as 217±15.5 nm and 0.321, respectively. Destabilizing effect of these particules on the ß-amiloid fibril (Aß1-40 and Aß 1-42) formation was determined in vitro by evaluating the decrease in ThT fluorescence intensity. This result was also verified by TEM and AFM images. For both fibril types, destabilizing effect were found to be increased by increasing incubation time until sixth hours; and reached a plateau after the sixth hour. Wistar Albino rats were used in in vivo experiments and selegiline loaded nanoparticules were determined to get access to cortex and hippocampus with a higher efficiency compared to selegiline alone. According to these results, it has planning in future to design in vivo studies concerning to target the nanoparticles with specific ligands/antibodies on their surfaces to directly to ß-amiloid fibrils in AD transgenic mice.