pRTA, yeni bir vektör ve TA klonlama: Bilinmeyen antibiyotik direnç genlerinin karakterizasyonu için yöntem
pRTA, a new vector and TA cloning: A method for characterization of novel antibiotic resistance genes
Yazar: HANİFE SALİH
Danışman: PROF. DR. BÜLENT BOZDOĞAN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotik dirençliliği =   ; Gen klonlama = Gene cloning ; Moleküler klonlama = Molecular cloning

Özet:
Antibiyotikler en yaygın kullanılan ilaçlar arasındadır. Enfeksiyonların tedavisinde kullanıldığı gibi besi hayvanları ve bitkilerin büyümelerini hızlandırmak amacı ile de kullanılmaktadır. Genellikle vücuttan atıldıktan sonra da aktif halde kalan antibiyotiklerin bilinçsiz kullanımı antibiyotik direncinin gelişmesinde önemli bir faktördür. Son yıllarda çoklu antibiyotik direncine sahip suşların görülme sıklığı ve yaygınlığı artmaktadır. Antibiyotik direncine sebep olan genlerin karakterizasyonu direnç sorununun ortaya konması ve mücadele yollarının belirlenebilmesi açısından önemlidir. Bu çalışmanın temel amacı antibiyotik direncine neden olan bilinen veya bilinmeyen genlerin klonlanmasına imkan veren bir yöntem geliştirmektir. Bu amaçla, antibiyotik direnç genlerinin klonlanmasında oryantasyon sorunu yaşanmaması için çoklu klonlama bölgesinin her iki yönünden de ekspresyon sağlanabileceği vektör geliştirilmesi hedeflenmiştir. Oluşturulan pRTA vektörünün omurgası pUC19 vektöründen faydalanılarak invers PCR yoluyla elde edilmiştir. Dizayn edilen promotör ve RBS sekansı, vektör omurgasında hedeflenen lokasyona yerleştirilmiştir. Dual promotöre sahip vektörde promotör ve RBS'nin yerleşmesi ve fonksiyon gördüğünün belirlenmesi sekans analizi ve klonlama çalışmaları ile tespit edilmiştir. Geliştirilen klonlama yönteminde kullanılan 3'uçlarınında tek adenin bazı uzantısı bulunduran vektör, pRTA vektöründen PCR yoluyla elde edilen bir vektördür ve "AT vektörü" olarak adlandırılmıştır.  Eritromisin direncine sahip S. aureus suşunun total DNA'sı fragmentaz enzimi ile rasgele parçalanıp istenen boyutlarda fragmentler oluşturulmuştur. Fragmentlerin 3' uçlarına AT vektörüne bağlanabilmesi için timin bazı eklendikten sonra fragmentler ve vektör ligasyonla bağlanmıştır. Oluşan ligand E. coli DH10B suşuna aktarılmış ve 200 μg/ml eritromisin içeren besi yerinde seçilmiştir. Çoğalan kolonilerdeki insertlerin sekans analizi yapıldığında direnç sağlayan genin ermC olduğu ve plazmid üzerinde taşındığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak dual promotöre sahip ve mavi-beyaz seçilime imkan veren bir vektör geliştirilmiştir. Geliştirilen bu vektörden elde edilen AT vektörü plazmid izolasyonuna kıyasla daha verimli şekilde PCR yoluyla elde edilmiştir. Klonlanacak direnç genlerini içeren fragmanlar fragmentaz enzimi ile rasgele lokasyonlardan parçalanarak direnç geninin içinden kesilme ihtimalini düşürmüştür. Ayrıca direnç geninin klonlanabilecek boyutta fragmanlar oluşturmasını sağlayarak klonlama başarısını arttırmıştır. Bu tezde, yeni bir vektör ve bilinen ve bilinmeyen direnç genlerinin klonlanması için yeni bir yöntem geliştirilmiştir.

Abstract:
Antibiotics are among the most widely used drugs. They are used in the treatment of infections as well as in order to accelerate the growth of livestock and plants. Unconscious use of antibiotics, which remain active after excreted from the body, is an important factor in the development of antibiotic resistance. Over time, the frequency and prevalence of strains with multiple antibiotic resistance increases. The identification of the genes that cause antibiotic resistance is important to reveal the importance of the hazard. The main aim of this study is to develop a method that allows cloning of known or unknown genes that cause antibiotic resistance.  For this purpose, it is aimed to develop a vector in which the expression can be obtained from both orientations in the multiple cloning region in order to avoid orientation problems in the cloning of antibiotic resistance genes. The backbone of the pRTA vector generated was obtained by inverse PCR using the pUC19 vector. The promoter and RBS sequence designed in this study were placed at the targeted location in the vector backbone.The placement of the promoter and RBS into the vector which has dual promoter was determined by sequence analysis and cloning studies. The vector which carries adenin base at 3' overhang used in the developed cloning method was obtained by amplifiying pRTA vector and it is called AT vector. The total DNA of S. aureus, which is known to have erythromycin resistance, was randomly fragmented with the fragmentase enzyme and fragments of desired sizes were created. After adding thymine base to 3' overhang of fragments, the fragments become complementary to AT vector and fragments and vector were ligated. The ligand was transferred to the E. coli DH10B strain and the colonies were selected on the agar that contains 200 μg/ml erythromycin. The inserts at the transformants were sequenced and it was found that the gene providing resistance was ermC and it was carried on the plasmid. As a result, the vector constructed has been developed with a dual promoter that provides expression of the multiple cloning site and allows for blue-white selection. The AT vector amplified from developed pRTA vektor is more fruitful compared to plasmid isolation. The fragments containing the resistance genes to be cloned were cleaved from random locations with the fragmentase enzyme, thereby reducing the possibility of being cut through the resistance gene. It also increased the cloning success by allowing the resistance gene to produce fragments that can be cloned. In this thesis, a new vector and a new method for cloning known and unknown resistance genes have been developed.