Over kanseri tespiti için dolaşımdaki tümör DNA'sı ile metilasyon panelinin geliştirilmesi
Development of methylation panel with circulating tumor DNA for ovarian cancer detection
Yazar: TUĞÇE ŞENTÜRK KIRMIZITAŞ
Danışman: PROF. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; DNA = DNA ; DNA dizileme = DNA sequencing ; DNA metilasyon = DNA methylation ; Metilasyon = Methylation ; Over = Ovary ; Over hastalıkları = Ovarian diseases ; Over kistleri = Ovarian cysts ; Over neoplazmları = Ovarian neoplasms

Özet:
Over kanseri (OK), dünya genelinde kadınlar arasında en sık teşhis edilen yedinci kanser türü olup, kanserle ilişkili ölümlerin altıncı önde gelen nedenidir. OK'nin %75'i ileri evrede teşhis edilir ve beş yıllık sağkalım oranı sadece %20 civarındadır. OK'nin moleküler alt tipleri, epigenetik ve genetik değişikliklerle ilişkilidir. Bu çalışmada, OK hastaları ve sağlıklı bireyler arasındaki hücre dışı DNA (cfDNA)'da metilasyon değişiklikleri analiz edilmiştir. OK'ni sağlıklı bireylerden ayırabilecek ve OK hasta prognozunu takip edebilecek metilasyon spesifik biyobelirteçler tanımlanmıştır.
Tez çalışması kapsamında, farklı metilasyon veri setleri (vs) kullanılarak OK hastaları ile sağlıklı bireyler arasındaki farklı metilenmiş bölgeler (DMR) tanımlanmış ve bu bölgelerin yer aldığı farklı metillenmiş genler (DMG)'ler karşılaştırılmıştır. Pilot VS'nin çalışma grubu, 5 OK hasta ve 19 kontrol örneğinden oluşmaktadır. Bu çalışma grubundaki 5 epitelyal OK ve 5 kontrol örneği, İstanbul Üniversitesi-Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum A.B.D.- Jinekolojik Onkoloji Bölümü'nden toplanmıştır. 14 kontrol ise Erasmus Tıp Merkezi'nden elde edilmiştir. Bu örneklerin izolasyonu ve metilasyon dizilemesi daha önce gerçekleştirilmiş olup, Pilot VS'ne yalnızca ham dizileme sonuçları eklenmiştir. İstanbul Üniversitesi-Tıp Fakültesinde, 5 epitelyal OK hastasından ve 5 kontrol örneğinden toplanan periferal kan örnekleri EDTA'lı tüplerde en geç 4 saat içerisinde soğuk zincir yöntemi ile İstanbul Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümüne aktarılmıştır. Periferik kandan santrifüj ile elde edilen plazma örneklerinden cfDNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Dolaşımdaki cfDNA'daki metillenmiş bölgeleri tespit etmek ve dizilemek için kullanılan Metillenmiş DNA İmmunopresipitasyon ve Dizileme (cfMEDIP-Seq) yöntemi ile metillenmiş DNA, metilasyon spesifik 5-mC monoklonal antikorlarla seçilerek zenginleştirilmiştir. Dizileme sonrası elde edilen 5OK ve 19 kontrol örneğine ait ham veriler DESeq2 ve Metilasyon Z-puanı normalizasyon yöntemleri ile normalize edilmiştir. Tanımlanacak DMR'ların güvenilirliğini artırmak amacıyla, Pilot VS haricinde üç farklı "in silico" metilasyon veri seti daha biyoinformatik yöntemlerle analiz edilmiştir. Açık Erişim Veri Seti (AE VS) örnekleri, Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanında GSE243474 erişim koduyla paylaşılan 8 OK hastasına ait cfDNA örneğinin cfMEDIP yöntemi kullanarak dizilenmesi sonucunda elde edilen ham verilerden oluşmaktadır. Tez kapsamında bu ham veriler, DESeq2 ve Metilasyon Z-puanı normalizasyon yöntemleri ile normalize edilmiş ve DMR'lar tanımlanmıştır. cfMEDIP Veri Listesi, Liu ve arkadaşlarının OK cfDNA'sında cfMEDIP yöntemi ile gerçekleştirdikleri çalışmanın DMR listesidir. Son olarak MeDSeq VL, OK hastalarının cfDNA örneklerinde MeD-Seq yöntemi kullanılarak Erasmus Tıp Merkezi'nde yapılan bir çalışmadan elde edilen DMR listesidir. Dört farklı veri seti kullanılarak, OK hastaları ile sağlıklı kontroller arasında değişiklik gösteren DMR'ları n bulunduğu genler karşılaştırılmıştır. Metilasyon veri setlerinin en az iki tanesinde ortak olarak tanımlanan potansiyel hiper ve hipo aday DMG grup olarak belirlenmiştir. HiperGrup ve HipoGrup içerisindeki DMG'lerin OK patogenezindeki rolü ve karakterizasyonu, TCGA ve GTEx projelerinden elde edilen transkripsiyon verileri (TCGA VL) ile Kanser Somatik Mutasyon Kataloğu'ndan elde edilen kanser öncü gen listesi (Kanser ÖGL) kullanılarak değerlendirilmiştir. Karakterizasyon sonrasında tanı ve prognostik adat DMG biyobelirteç listeleri oluşturmuştur. Aday tanı DMG'lerin ayrım güçleri cfDNA'da ısı haritası analizi ile TCGA OK tümör dokusunda ise temel bileşen analizi (PCA) ile değerlendirilmiştir. Aday prognostik DMG'ler ise TCGA OK klinik verileri kullanılarak genel sağkalım analizi ile değerlendirilmiştir.
Dört farklı metilasyon veri setiyle yapılan analizler sonucunda elde edilen bulgular, OK hastalarında farklı DMR'leri açığa çıkarmıştır. Pilot VS'nde 4,584 adet DMR tanımlanmış olup, bu DMR'lerin %94'ü hipometile (%4,331), %6'sı ise hipermetile (%253) bölgeler olarak belirlenmiştir. AE VS ise 34,638 DMR içermekte olup, bunların %59'u hipermetile (20,458), %41'i ise hipometile (14,180) bölgelerdir. cfMEDIP (600 DMR) ve MeDseq VL'nde (59 DMR) ise literatürde belirtilen DMR sayıları kullanılmıştır. En az iki farklı metilasyon veri setinde tespit edilen hipermetile DMR'ları içeren 254 DMG HiperGrup'ta ve hipometile DMR'leri içeren 2740 DMG HipoGrup'ta sınıflandırılmıştır. HiperGrup ve HipoGrup DMG'lerinin TCGA VL ile karşılaştırılması sonucu döt farklı patern belirlenmiştir. Her bir patern, belirli bir metilasyon durumu (hipometilasyon veya hipermetilasyon) ile belirli bir gen anlatım durumu (artan veya azalan) arasındaki ilişkiyi tanımlar. Bu paternlerden hipo-artan paternde 242 DMG, Hiper-Azalan Paternde 41 DMG, Hipo-Azalan Paternde 458 DMG ve son olarak Hiper-Artan Paternde 18 DMG belirlenmiştir. Dört farklı paternde yer alan toplamda 759 DMG, metilasyon kat değişimlerine (2'den büyük ve küçük) ve istatistiksel anlamlılık derecelerine (q<0.01) göre filtrelenmiş ve filtreleme sonrası 110 DMG elde edilmiştir. 110 DMG içerisinden, metilasyon veri setlerinde tutarlılıkla tespit edilen 13 hipometile DMG ile 17 hipermetile DMG olmak üzere toplamda 30 DMG belirlenmiştir. 30 DMG içerisinden Pilot ve AE VS'nde ortak olan 18 DMG ise aday tanı biyobelirteç listesini oluşturmuştur. Aday tanı biyobelirteci olarak seçilen 18 DMG'den TBX3, RNF43, ZNF331 ve FLT4 kanser öncü gen olarak tanımlandığı için önemli bulunurken MUC5B ve NXF DMG'leri de OK patogenezinde ve tedavisinde önemli olabilir.
Aday tanı biyobelirteci olarak seçilen 18 DMG'nin PCA ve ısı haritası analizleri ile tanı ayrım güçleri değerlendirilmiştir. Metilasyon Z-puanları kullanılarak gerçekleştirilen ısı haritası analizi OK örneklerinin çoğunun sınıflanarak, kontrol grubundan ayrıldığı gösterülse de, hem OK hem de sağlıklı metilasyon deseninde fark edilen heterojenite dikkat çekici bulunmuştur. PCA analizi, OK tümör dokularının ve normal dokulardan belirgin bir şekilde kümelenerek ayrıldığını göstermiştir. 
HiperGrup ve HipoGrup DMG'lerinin TCGA OK sağkalım ile ilişkili en önemli genler ile karşılaştırılması sonrasında, toplamda 40 farklı DMG'nin sağkalım ile ilişkili bulunmuştur. 4 farklı patern ile karşılaştırılma sonucunda ise 17 DMG'de istatiksel olarak anlamlı metilasyon seviyelerindeki değişikliklerin yanı sıra gen anlatımı değişiklikleri de tespit edilmiştir. 40 DMG içerisinden sadece MUC4 kanser öncü gen olarak tanımlanmıştır. 18 prognostik DMG, metilasyon kat değişimlerine (2'den büyük ve küçük) ve istatistiksel anlamlılık derecelerine (q<0.01) göre filtrelenmiş ve bu süreç sonucunda 3 DMG listelenmiştir. Ek olarak, 18 DMG'nin TCGA veri setindeki tüm kanser türlerinde taranarak OK spesifikliği değerlendirilmiştir. Bu değerlendirme sonucunda, TPCN1 geni OK'ye spesifik olarak tespit edilmiştir.  TRPM2 ve SLC4A11 aday prognostik biyobelirteç olarak belirlenmiştir.  NR2F1, TRPM2, SLC4A11 ve TPCN1 DMG listesi, OK prognostik biyobelirteçler olarak önemlidir.
Sonuç olarak, bu çalışma, OK özgül epigenetik bilgilerin anlaşılmasına katkıda bulunmakta ve mevcut literatürle entegre olarak, DNA metilasyon profillerinin OK yönetiminde tanısal ve prognostik araçlar olarak potansiyelini vurgulamaktadır. Belirlenen biyobelirteçlerin klinik kullanılabilirliğini sağlamak için gelecekte prospektif çalışmalar ve bağımsız kohortlar üzerinde doğrulama gereklidir.

Abstract:
Ovarian cancer (OC) is the seventh most commonly diagnosed cancer among women globally and ranks as the sixth leading cause of cancer-related mortality. Notably, 75% of OC cases are diagnosed at an advanced stage, with a five-year survival rate of only around 20%. The molecular subtypes of OC are associated with epigenetic and genetic alterations. This study focuses on analyzing methylation changes in circulating cell-free DNA (cfDNA) between OC patients and healthy individuals. In this thesis, methylation-specific biomarkers were identify which they are capable of distinguishing OC patients from healthy individuals as well as monitoring OC patient prognosis.
Within the scope of this thesis, different methylation datasets were used to identify differentially methylated regions (DMRs) between OC patients and healthy individuals, comparing differentially methylated genes (DMGs) within these regions. The Pilot dataset included samples from 5 OC patients and 19 controls. Specifically, 5 epithelial OC and 5 control samples were collected from the Istanbul University Faculty of Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Gynecological Oncology Division, while 14 controls were obtained from Erasmus Medical Center. These samples had previously undergone isolation and methylation sequencing, with only raw sequencing results incorporated into the Pilot dataset. Peripheral blood samples from the 5 epithelial OC patients and 5 controls were transferred to the Istanbul University Department of Molecular Biology and Genetics within 4 hours using the cold chain method in EDTA tubes. CfDNA was isolated from plasma samples obtained through centrifugation of peripheral blood. Methylated DNA was enriched using methylation-specific 5-mC monoclonal antibodies via the Methylated DNA Immunoprecipitation and Sequencing (cfMEDIP-Seq) method to detect and sequence methylated regions in circulating cfDNA. The raw data from sequencing the 5 OC and 19 control samples were normalized using DESeq2 and Methylation Z-score normalization methods. To increase the reliability of identified DMRs, three additional "in silico" methylation datasets were analyzed using bioinformatics methods alongside the Pilot dataset. The Open Access Dataset (OA dataset) comprised raw data obtained from sequencing cfDNA samples from 8 OC patients using the cfMEDIP method, shared under accession number GSE243474 in the Gene Expression Omnibus (GEO) database. Within the scope of this thesis, these raw data were normalized using DESeq2 and Methylation Z-score normalization methods, and DMRs were identified. Additionally, the cfMEDIP Data List contains the DMR list from a study by Liu et al. in OC cfDNA using the cfMEDIP method. Finally, the MeDSeq VL represents the DMR list derived from a study conducted at Erasmus Medical Center using the MeD-Seq method on cfDNA samples from OC patients.
The analysis conducted with four different methylation datasets revealed distinct DMRs in OC patients. In the Pilot dataset, 4,584 DMRs were identified, with 94% being hypomethylated (4,331 regions) and 6% hypermethylated (253 regions). The OA dataset contained 34,638 DMRs, with 59% being hypermethylated (20,458 regions) and 41% hypomethylated (14,180 regions). For cfMEDIP (600 DMRs) and MeDseq VL (59 DMRs), the reported numbers of DMRs in the literature were used. Hyper-methylated DMRs identified in at least two different methylation datasets comprised 254 DMGs in the HyperGroup, while hypomethylated DMRs included 2,740 DMGs in the HypoGroup. Comparison of DMGs in the HyperGroup and HypoGroup with the TCGA dataset revealed four distinct patterns. Each pattern describes the relationship between a specific methylation status (hypomethylation or hypermethylation) and a particular gene expression status (up or down). In these patterns, 242 DMGs were identified in the hypo-up pattern, 41 DMGs in the hyper-down pattern, 458 DMGs in the hypo-down pattern, and 18 DMGs in the hyper-up pattern. A total of 759 DMGs present in the four different patterns were filtered based on methylation fold changes (greater than 2 and less than -2) and statistical significance (q<0.01), resulting in 110 DMGs. Among these, 30 DMGs, including 13 consistently hypomethylated DMGs and 17 consistently hypermethylated DMGs, were identified. From this set, 18 DMGs common to both the Pilot and OA datasets constituted the candidate diagnostic biomarker list.
Among the 18 candidate diagnostic biomarkers, TBX3, RNF43, ZNF331, and FLT4 were significant, as they are recognized as cancer driver genes. Additionally, MUC5B and NXF DMGs may play critical roles in OC pathogenesis and treatment. The diagnostic power of the 18 DMGs selected as candidate diagnostic biomarkers was assessed using PCA and heatmap analyses. The heatmap analysis, performed using methylation Z-scores, demonstrated that most OC samples were classified and distinguished from the control group. However, notable heterogeneity was observed in the methylation patterns of both OC and healthy samples. PCA analysis revealed that OC tumor tissues clustered distinctly and separated clearly from normal tissues.
Comparison of HyperGroup and HypoGroup DMGs with the most significant survival-associated genes in the TCGA OC dataset identified 40 different DMGs related to survival. Upon further comparison using the four distinct patterns, statistically significant changes in methylation levels, as well as gene expression changes, were observed in 17 DMGs. Among the 40 DMGs, only MUC4 was identified as a cancer driver gene. The 18 prognostic DMGs were filtered based on methylation fold changes (greater than 2 and less than -2) and statistical significance (q<0.01), resulting in a final list of 3 DMGs. Additionally, the TCGA dataset was screened for all cancer types to evaluate the OC specificity of the 18 DMGs. From this evaluation, the TPCN1 gene was identified as specific to OC. TRPM2 and SLC4A11 were identified as candidate prognostic biomarkers. The list of DMGs, including NR2F1, TRPM2, SLC4A11, and TPCN1, is significant as prognostic biomarkers for OC.
In conclusion, this study contributes to the understanding of OC-specific epigenetic information and highlights the potential of DNA methylation profiles as diagnostic and prognostic tools in OC management, integrated with existing literature. Future prospective studies and validation on independent cohorts are necessary to ensure the clinical applicability of the identified biomarkers.