Çapraz bağlı etoksile akrilat reçinesine enzim immobilizasyonu
Enzyme immobilization on cross-linked ethoxylate achrylate resin
Yazar: GAREN KARABURUN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ EFE BATURHAN ORMAN ; PROF. DR. AYŞE OGAN
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Enzim immobilizasyonu, enzimlerin bir katı destek veya matris üzerine fiziksel veya kimyasal olarak bağlanması sürecidir, bağlanma işlemi emilim, kovalent bağlanma, afiniteli immobilizasyon, hapsolma gibi yöntemlerle gerçekleştirilir. Bu işlemler, enzimlerin optimum çalışma koşullarını, pH ve sıcaklık gibi özelliklerini değiştirebilir. İmmobilize edilmiş enzimler serbest enzimlerden farklı olarak endüstriyel süreçlerde birden fazla kez kullanılabilir.
α-amilaz, nişasta moleküllerindeki α-(1,4)-glikozidik bağları hidrolizleyen, özgüllüğü yüksek bir enzimdir. Bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalar gibi çeşitli kaynaklardan elde edilebilir. Amilazlar dünya enzim pazarının yaklaşık %30'unu oluşturur. Gıda, deterjan, kağıt, tekstil, klinik ve tıbbi, biyo-alkol üretimi, atık su arıtma gibi çeşitli endüstrilerde yaygın olarak kullanılırlar. Özellikle gıda endüstrisinde amilazlar; glukoz, fruktoz ve çikolata şurupları üretimi, ekmek ve kek yapımı sırasında dokuyu ve hacmi değiştirme, mayalanmış alkollü içeceklerin üretimi gibi birçok alanda kullanılır.
Çalışmamızda, gıdalarda kullanılabilen yüksek güvenlikli bir malzeme oluşturma amacıyla monomerleri biyolojik olarak uyumlu ve düşük toksisite seviyelerine sahip olan  CLEAR-epoksi tabanlı bir fotopolimer sentezlenmiş ve FT-IR ile karakterize edilmiştir. Karakterizasyon işleminin ardından α-amilaz fotopolimer yüzeyine kimyasal olarak immobilize edilmiştir. İmmobilizasyon verimliliği, immobilize enzimin aktivitesi ve aktivite üzerindeki pH ve sıcaklık etkisi, tekrar kullanılabilirliği, depolama kararlılığı ile enzim kinetiği belirlenmiş ve serbest enzimle kıyaslanmıştır. İmmobilize edilmiş α-amilazın aktivitesi serbest enzime göre yaklaşık 10 kat daha azdır. Sonuçlarımıza göre, α-amilazın % 27'si immobilize edilmiştir. Asidik ortamda immobilize enzim, serbest enzime göre daha iyi bir aktiviteye sahiptir ve maksimum verimliliğe pH 6.5'te ulaşmıştır. Bulgular bize CLEAR-epoksi tabanlı foto-polimerle immobilize edilmiş α-amilazın asit ortamlı endüstriyel koşullarda kullanılabileceğini göstermektedir. Tekrar kullanılırlığı değerlendirmek için art arda 15 kullanımın sonunda, ılımlı koşullar altında (30°C) immobilize enzimin bağıl aktivitesinin %80.36 olduğu, ekstrem koşullarda (60°C) ise %75.66 olduğu görülmüştür. Depolama kararlılığı denemeleri sonucunda ise 60. gün sonunda immobilize α-amilaz aktivitesinin %68.43'ünü koruduğu bulunmuştur. İmmobilize α-amilaz için Km ve Vmax değerleri sırasıyla, 0,735 mg.ml-1 ve 27,624 µmol.ml-1.dk-1 olarak bulunmuştur. 
Bu tez çalışmasında, elektrokimyasal temelli biyosensörlerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bunun için indiyum kalay oksit (ITO) elektrodunun yüzeyine değişik kaplama teknikleri ile α-amilaz, immobilize edilmiştir. Modifiye elektrot yüzeyinde kaydedilen ölçümler; söz konusu polimer ile modifiye edilmiş ITO elektrodunun elektrokimyasal olarak aktif olduğunu ve potansiyel bir biyo-algılama ünitesi olarak kullanılabileceğini göstermiştir.

Abstract:
Enzyme immobilization is a process of physically or chemically attaching enzymes on a solid support or matrix via absorption, covalent binding, affinity immobilization, entrapment. These processes may modify the optimum working conditions of enzymes such as pH and temperature. Immobilized enzymes can be used several times unlike free enzymes in industrial processes. These properties make the immobilization of enzymes a favorable technique to the industry.
Α-amilase is a highly specific hydrolytic enzyme that breaks down α-1,4-glycosidic linkage in starch molecules. As a cofactor α-amilaz has a calcium ion (Ca2+) which stabilizes the three-dimensional structure and works as an allosteric activator. They can be obtained from several sources, such as plants, animals and microorganisms. Amylases account for approximately 30% of the world's enzyme market. It is commonly used in various industries such as food, detergent, paper, textile, clinical and medical, production of fuel alcohol, treatment of waste water. Significantly in the food industry, amilazs find numerous uses including; production of glucose, fructose and chocolate syrups, changing texture and volume when baking breads and cakes, production of fermented alcoholic beverages.
In our study, α-amilaz was chemically immobilized to a photo-cured polymeric surface with the intent of creating a rapidly-producible material that is food grade. Photo-curing polymerization technique acquires a quick transformation of a liquid monomer into a solid film. Monomers of the studied polymer are biocompatible and have low toxicity levels. The CLEAR-epoxy-based photo-curable polymer was synthesized and characterized by FT-IR. Immobilization efficiency, effect of pH and temperature on activity, kinetics, reusability and storage stability were determined. According to our results, 27% of α-amilaz was immobilized. Immobilized α-amilaz showed better activity in acidic conditions than free enzymes, with maximum efficiency at pH 6.5. This indicates that α-amilaz immobilized to CLEAR-epoxy-based photocurable polymer can be utilized in industrial processes with acidic conditions. After 15 consecutive uses, it was observed that under moderate conditions (30°C), the relative activity of the immobilized enzyme was 80.36%, while under extreme conditions (60°C), it was 75.66%. Regarding storage stability, it was found that the immobilized α-amylase retained 68.43% of its activity on the 60th day. The Km and Vmax values for immobilized α-amylase were found to be 0.735 mg.ml-1 and 27.624 µmol.ml-1.min-1, respectively.
In this thesis work, the development of electrochemical-based biosensors is aimed. For this purpose, alpha-amylase has been immobilized on the surface of indium tin oxide (ITO) electrode using different coating techniques. Measurements recorded on the modified electrode surface showed that the polymer modified ITO electrode is electrochemically active and has the potential to serve as a biosensing unit.