Endoplazmik retikulum (ER) stresinin absans epileptik sıçanlarda katlanmamış protein yanıtına (KPY) etkisinin araştırılması
Investigating the impact of endoplasmic reticulum stress (ERS) on unfolded protein response (UPR) in absance epilectic rats
Yazar: SABRİYE KARADENİZLİ
Danışman: PROF. DR. DENİZ ŞAHİN
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Davranış = Behavior ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Epilepsi = Epilepsy ; Epilepsi-absans = Epilepsy-absence ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Katlanmış proteinler = Folded proteins ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Sıçanlar = Rats ; Talamus = Thalamus ; Öğrenme = Learning

Özet:
Amaç: Endoplazmik Retikulum (ER), transkripsiyon sonrası modifikasyonlardan başlayarak, proteinlerin doğru katlanmasına kadar birçok hücresel fonksiyonla ilişkilidir. Hücre içi kalsiyum dengesindeki bozulmalar, ER'in fizyolojik dengesini bozarak ER stresi oluşmaktadır. Nörodejenaratif hastalıkların patolojisinin ER stresi ile ilişkili olduğu söylenmekle birlikte epilepsi ile ER stres arasında ilişkiyi gösteren çalışmalar çok sınırlıdır. Çalışmamızın amacı, düşük ve yüksek doz Tapsigargin (Tg) uygulayarak uyarılan ER stresinin, Wistar Albino Glaxo/Rijswick (WAG/Rij) ırkı sıçanlarda davranış-öğrenme, epileptik aktivite üzerine etkilerinin, korteks ve talamus dokularında moleküler düzeyde etkilerinin araştırılmasıdır.
Yöntem: Çalışmamızda 6-8 aylık WAG/Rij ırkı erkek sıçanlar kullanıldı. Epileptik aktivite, davranış-öğrenme testleri ve moleküler çalışmalar için ayrı gruplar oluşturuldu. Tg ve/veya Serum Fizyolojik(SF), Dimetil-sülfoksit(DMSO)'nun intraserebroventriküler uygulanabilmesi için kanüller ve/veya EEG kayıtları için elektrotlar yerleştirildi. Epileptik aktiviteyi değerlendirmek için EEG kayıtları alındı. Davranış-öğrenme deneyleri için lokomotor aktivite, pasif kaçınma ve water-maze testi yapıldı. Moleküler çalışmalar için GRP78 ve ERp57 protein değişimleri western blot tekniği, PERK, XBP-1, ATF6, CACNA1H mRNA ifadelerini incelemek için RT-PCR tekniği kullanıldı. 
Bulgular: 20 ng ve 200 ng Tg uygulaması lokomotor aktivite ve pasif sakınma üzerine etkili bulunmadı, water-maze testinde 200 ng Tg uygulaması, naif ve 20 ng Tg uygulanan gruba göre anlamlı düşüş görüldü. 20 ng Tg uygulamasında SWD aktivitesinin, 24. Saatte SF, DMSO ve 200 ng Tg gruplarına göre yüksek olduğu ve 48.saatte yüksek kaldığı tespit edildi. 20 ng Tg uygulanan grupta, talamus dokusunda GRP78 protein miktarı, Eif2ak3, CACNA1H ve XBP-1 mRNA ifadesinin arttığı gözlendi. 200 ng Tg uygulamasında talamus dokusunda ATF6 mRNA ifadesinde artış görüldü. 
Sonuç: Düşük doz ER stres koşullarında artan GRP78 protein miktarı, Eif2ak3, XBP-1 ve CACNA1H mRNA ifadesi, talamik nöronların hayatta kalma süreçlerini tetikleyerek SWD aktivitesi üzerine artırıcı etki gösterebilir. Yüksek doz ER stress koşullarında artan ATF 6 mRNA ifadesi pro-apoptotik süreçleri tetikleyerek SWD aktivitesini düşürmüş olabilir. 
Anahtar sözcükler: Absans epilepsi, ER stresi, GRP78, ATF6, EIF2AK3, CACNA1H

Abstract:
Objective: Endoplasmic Reticulum(ER) is associated with many cellular functions, from post-transcriptional modifications to the correct folding of proteins. Disturbances in intracellular calcium balance disrupts the physiological balance of ER. Although studies have shown that the pathology of neurodegenerative diseases is associated with ER stress, studies showing a relationship between epilepsy and ER stress are very limited. The aim of our study was to investigate the effects of ER stress induced by low and high doses of Thapsigargin(Tg) on behavioral learning, epileptic activity, and molecular levels in cortex and thalamus tissues of Wistar Albino Glaxo/Rijswick (WAG / Rij) rats.
Methods: 6-8 month old WAG/Rij male rats were used in this study. Separate groups were created for epileptic activity, behavioral-learning tests, and molecular studies. Electrodes for EEG recordings and cannulas for applying Tg, SF(Saline) and DMSO(Dimethyl sulfoxide) intracerebroventricularly, were placed on skull. EEG recors were taken to assess epileptic activity. Locomotor activity, passive avoidance and water-maze test were performed for behavior-learning experiments. RT-PCR technique was used to examine the expression of PERK, XBP-1, ATF6, CACNA1H mRNA and western blot technique to examine GRP78 and ERp57 protein changes.
Results:  20 ng and 200 ng Tg administration were not effective on locomotor activity and passive avoidance, 200 ng Tg administration showed a significant decrease in water-maze test compared to naive and 20 ng Tg group. It was found that the activity of SWD in 20 ng Tg administration was higher than SF(Saline), DMSO and 200 ng Tg groups at 24th hour and had remained to be high in 48th hour. In the group treated with 20 ng Tg increased GRP78 protein amount, Eif2ak3, CACNA1H and XBP-1 mRNA expression in the talamus were observed. An increase in expression of ATF6 mRNA in the thalamus tissue was observed with 200 ng Tg administration.
Conclusions: Increased level of GRP78 protein amount EIF2AK3, XBP-1 and CACNA1H mRNA expression in low-dose ER stress conditions may exert an enhancing effect on SWD activity by triggering survival processes of thalamic neurons. Increased ATF 6 mRNA expression in high-dose ER stress conditions may have reduced SWD activity by triggering pro-apoptotic processes.
Keywords: Absance epilepsy, ER stress, GRP78, ATF6, EIF2AK3, CACNA1H