Böceklere dayanıklı transgenik korunga (Onobrychis sativa Lam.) bitkilerinin elde edilmesi
Production of insect-resistant transgenic sainfoin (Onobrychis sativa Lam.) plants
Yazar: SATI ÇÖÇÜ
Danışman: PROF. CENGİZ SANCAK
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Agrobacterium tumefaciens = Agrobacterium tumefaciens ; Bacillus thuringiensis = Bacillus thuringiensis ; Gen aktarımı = Gene transfer ; Korunga = Sainfoin ; Transgenik bitkiler = Transgenic plants

Özet:
Bu araştırmada, çok yıllık önemli bir yem bitkisi olan korungada (Onobrychis sativa Lam.) adventif sürgün rejenerasyonu, Agrobacterium tumefaciens ile gen aktarımı ve böceklere dayanıklı transgenik bitkilerin elde edilmesine yönelik çalışmalar yürütülmüştür.Adventif sürgün rejenerasyonun optimizasyonu ile ilgili çalışmalarda eksplant olarak yaprakçık, yaprak sapı, hipokotil ve kotiledon kullanılmıştır. En yüksek sürgün rejenerasyonu, 4 mg/l 6-benzilaminopurin (BAP) ve 0.5 mg/l ??naftalenasetik asit (NAA) içeren MS (Murashige and Skoog,1962) besin ortamında yaprakçık eksplantından elde edilmiştir.Korungaya gen aktarımını optimize etmek için hipokotil, kotiledon, yaprakçık ve yaprak sapı eksplantları, in vitro'da gelişen bitkiciklerden izole edilerek, neomisin fosfotransferaz (NPT-II) ve ß-glukuronidaz (GUS) genlerini taşıyan GV2260 p35S GUS-INT Agrobacterium tumefaciens hattı ile inoküle edilmiştir. 1:50 oranında seyreltilmiş A. tumefaciens hattı ile yarım saat inoküle edilen yaprak eksplantlarından, 48 saatlik ko-kültüvasyon süresinde transgenik adayı GUS pozitif bitkicikler elde edilmiştir. Hem inokülasyon hem ko-kültüvasyon ortamına 100 ?M asetosringon eklenmiştir. GUS pozitif bitkiler dış koşullara alıştırılmış ve bu bitkilerde NPT-II ve GUS genlerinin varlığı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile doğrulanmıştır. Transgenik bitkilerden elde edilen tohumlar çimlendirilerek transgenik T1 bitkilerinin seleksiyonu yapılmıştır.Bitkilerde böceklere dayanıklılığı kodlayan cry genleri (cry1Ac, cry1Ab, cry2A, cry1C ve cry1Ba/cry1Ia hibrit geni SN19) taşıyan A. tumefaciens hatları ile yapılan gen aktarım çalışmaları sonucunda ise kanamisin antibiyotiğine dayanıklı sürgünler elde edilmiştir. Bu sürgünler MS besin ortamında köklendirilerek iklim dolabına alınmıştır. İki ay sonra, farklı cry genlerini taşıyan toplam 37 adet böceklere dayanıklı olduğu beklenen transgenik korunga bitkisi NPT-II genine yönelik PCR çalışması ile belirlenmiştir.

Abstract:
In this thesis, the studies related to adventitious shoot regeneration, gene transformation via Agrobacterium tumefaciens and obtaining insect resistant transgenic plants in sainfoin, which is an important perennial forage legumes, have been carried out.In adventitious shoot regeneration studies leaflets, petioles, hypocotyls and cotyledons were used as explants. The highest adventitious shoot regeneration was obtained from leaflet explants on MS medium containing 4 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP) and 0.5 mg/l ??naphthaleneacetic acid (NAA).For optimization of methods, in vitro grown hypocotyl, cotyledon, leaflet and petiole explants were inoculated with Agrobacterium tumefaciens strain GV2260 (p35SGUS-INT) harbouring neomycin phosphotransferase (NPT-II) and ß-glucuronidase (GUS) gene. GUS positive plantlets were obtained from the leaf explants which were inoculated with 1:50 dilution of A. tumefaciens for 30 min and 48 h co-cultivation period. 100 ?M acetosyringone was added both inoculation and co-cultivation medium. The GUS positive plantlets were successfully acclimatized and existence of NPT-II and GUS genes for these plants were confirmed by Polymerase Chain Reaction (PCR). Transgenic T1 plants were selected by germinating the seeds.Furthermore, kanamycin resistant shoots were obtained as the result of the transformation studies via A. tumefaciens strains harbouring cry (cry1Ac, cry1Ab, cry2A, cry1C and cry1Ba/cry1Ia hybrid SN19) genes which encode insect resistance. These shoots were rooted and transferred to growth cabinet. After 2 months, total 37 transgenic sainfoin plants which are expected to be resistant against insects were confirmed using NPT-II primers by PCR analysis.