Mikroalglerin kozmetik amaçlı skualen üretim potansiyelinin incelenmesi
Investigation of the squalene production potential of microalgae for cosmetic purposes
Yazar: ÇAĞLA YARKENT
Danışman: PROF. DR. SUPHİ ŞURİŞVAN ÖNCEL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
Skualen, yüksek antioksidan etkisi nedeniyle kozmetik, farmasötik ve kozmesötik ürünlere eklenmektedir. Skualen üretiminde önemli bir alternatif olan mikroalgler mevsimsel değişikliklerden etkilenmeden kapalı sistemlerde sürdürülebilir bir skualen üretimi avantajı sunmaktadır.

Tez kapsamında, Schizochytrium limacinum mikroalg kültüründen 7 günde skualen üretilmiştir. S. limacinum'a antioksidan bütil hidroksi tolüenin (BHT) farklı günlerde (2., 3. ve 4. gün) 2 g L-1 eklenerek 7 günde skualen üretimi incelenmiştir. Biyoreaktörde 150 rpm, 300 rpm ve 450 rpm karıştırma hızlarında ve 0,5 vvm, 1 vvm ve 1,5 vvm havalandırma hızlarında kesikli üretim modunda 5 saatlik kültürasyonla S. limacinum'un skualen üretimi belirlenmiştir. 150 rpm karıştırma ve 0,5 vvm havalandırma hızlarında S. limacinum kesikli, kesikli-beslemeli, yarı-sürekli ve sürekli üretim modlarında 36 saat üretilerek skualen üretimi araştırılmıştır. Mikroalgal skualenin Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (High Performance Liquid Chromatography-HPLC) ve Sıvı Kromatografisi/Kütle Spektrometrisi (Liquid Chromatography/Mass Spectrometry-LC/MS) aracılığıyla analizleri gerçekleştirilmiştir. ImageJ (version 1.54k) kullanılarak yeni bir İnce Plaka Kromatografi (Thin Layer Chromatography-TLC) metodu ortaya konmuştur. Mikroalgal skualen ekstraktının ve yarı-katı krem formülasyonunun (i) antioksidan kapasitesi ve (ii) sitotoksisite tayinleri 25-0,195 µg mL-1 konsantrasyonda L929 fare fibroblast hücre hattı, HepG2 insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı ve HaCaT insan keratinosit hücre hattı kullanılarak MTT analizi ile tespit edilmiştir. Krem formülasyonunun 30 gün süreli stabilite takibi yapılmıştır.

S. limacinum standart besin ortamında 4. günde en yüksek miktarda 10,44±0,39 g L-1 biyokütle ve 6,01±0,02 mg L-1 skualen üretmiştir. S. limacinum 4. günde BHT beslendiğinde en yüksek miktarda 2. günde 7,86±0,06 g L-1 biyokütle ve 5. günde 17,80±0,01 mg L-1 skualen üretmiştir. Biyoreaktörde kesikli üretimlerde S. limacinum'un en yüksek biyokütle miktarı 391.4 mg L-1 300 rpm ve 1,5 vvm, en yüksek skualen miktarı 13,02 µg L-1 300 rpm ve 0,5 vvm çalışma koşullarında rapor edilmiştir. Biyoreaktörde 702,93 mg L-1 biyokütle ve 48,16 µg L-1 skualen üretimi ile sürekli beslemeli üretim modu en uygun koşulu sunmuştur. Skualenin tespitinde HPLC analizi ile %99,67 korelasyon oranına sahip TLC metodu geliştirilmiştir. Skualen ekstraktının %96,04±0,57 ve skualen içeren kremin %93,54±0,08 antioksidan aktivitesi gösterdiği tespit edilmiştir. Skualen ekstraktının L929 hücrelerinde 24. saatte IC50 değeri 8,152±3,088 µg mL-1, 48. saatte IC50 değeri 8,307±1,983 µg mL-1 ve 72. saatte IC50 değeri 6,952±3,478 µg mL-1 olarak hesaplanmıştır. Krem formülasyonu 24. saatte toksik etki göstermezken 48. saatte ve 72. saatteki IC50 değerleri 9,868±2,332 µg mL-1 ve 11,270±2,800 µg mL-1 olmuştur. Aynı örnekler HepG2 hücresi üzerinde 24. saatte toksik etki göstermezken 48. saatte skualenin IC50 değeri 15,500±4,730 µg mL-1, kremin ise 19,620±2,760 µg mL-1 olmuştur. 72. saatte skualenin IC50 değeri 8,786±2,934 µg mL-1, kremin ise 19,300±6,820 µg mL-1 olmuştur. Aynı örneklerin HaCaT üzerinde hücre proliferasyonuna olumlu yönde etki ettiği tespit edilmiştir. Krem formülasyonunun stabilite test süresi boyunca yapısında herhangi bir değişiklik olmadığı saptanmıştır. 

Tez kapsamındaki çalışmalara göre S. limacinum iyi bir skualen üreticisi olduğu belirlenmiştir. Kültürün üretim sürecinin besin ortamı içeriği, biyoreaktörde işletim parametrelerinde ve üretim modlarında yapılan değişiklikler ile yönetilebileceği ispatlanmıştır. Yeni TLC metodolojisi, HPLC'ye göre daha düşük miktarda solvent kullanılarak daha hızlı ve daha pratik olarak skualen analizine olanak sunmuştur. Skualenin deri hücrelerinin büyümesinde olumlu etkisi olduğu ispatlanmıştır. Mikroalgal skualenin yarı-katı krem formülasyonlarına dahil edilebilir olduğu ispatlanmıştır.

Abstract:
Squalene is used in cosmetics, pharmaceutics, and cosmeceutics due to its high antioxidant activity. Microalgae provide the advantage of sustainable squalene production. 

In the thesis, Schizochytrium limacinum, a microalga, was produced for 7 days in standard medium and standard medium supplied with an antioxidant 2 g L-1 butyl hydroxytoluene (BHT) on 2nd, 3th and 4th days. S. limacinum was cultivated (batch mode, 5 hours) at 150 rpm, 300 rpm and 450 rpm stirring speeds and 0.5 vvm, 1 vvm and 1.5 vvm aeration rates. S. limacinum was produced (36 hours) in batch, fed-batch, semi-continuous and continuous production modes (150 rpm and 0.5 vvm). Microalgal squalene was analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Liquid Chromatography/Mass Spectrometry (LC/MS). A new Thin Layer Chromatography (TLC) method was developed using ImageJ (version 1.54k). Microalgal squalene and semi-solid cream formulation were evaluated for their (i) antioxidant capacities and (ii) cytotoxicity effects on L929 mouse fibroblast cell line, HepG2 human hepatocellular carcinoma cell line and HaCaT human keratinocyte cell line at 25-0.195 µg mL-1 concentration. The stability of the cream was monitored for 30 days.

S. limacinum produced 10.44±0.39 g L-1 biomass and 6.01±0.02 mg L-1 squalene (4th day) in the standard medium. S. limacinum produced 7.86±0.06 g L-1 biomass (2nd day) and 17.80±0.01 mg L-1 squalene (5th day) when fed with BHT on day 4. In batch productions, the highest biomass and squalene amounts of S. limacinum were reported as 391.4 mg L-1 at 300 rpm and 1.5 vvm, and 13.02 µg L-1 at 300 rpm and 0.5 vvm. Continuous fed production mode provided the most suitable condition with 702.93 mg L-1 biomass and 48.16 µg L-1 squalene production. TLC method presented 99.67% correlation rate with HPLC analysis. Squalene and the cream showed 96.04±0.57% and 93.54±0.08% antioxidant activity. The IC50 value of squalene in L929 cells was 8.152±3.088 µg mL-1 at 24 hours, 8.307±1.983 µg mL-1 at 48 hours and 6.952±3.478 µg mL-1 at 72 hours. The cream did not show toxic effect at 24 hours, the IC50 values at 48 hours and 72 hours were 9.868±2.332 µg mL-1 and 11.270±2.800 µg mL-1. The samples did not show any toxic effects on HepG2 cells at 24 hours. The IC50 values of squalene and the cream were 15,500±4,730 µg mL-1 and 19,620±2,760 µg mL-1 at 48 hours. The IC50 values of squalene and the cream were 8,786±2,934 µg mL-1 and 19,300±6,820 µg mL-1 at 72 hours. The samples had a positive effect on HaCaT cell proliferation. There was no structural change in the cream formulation during the stability test period.

According to the studies, S. limacinum can be reported as a good squalene producer. The production process of the culture can be managed by changes in the nutrient medium content, operating parameters in the bioreactor and production modes. The new TLC methodology allows faster and more practical squalane analysis using lower amounts of solvent than HPLC. Squalene has a positive effect on skin cell growth. Microalgal squalene can be incorporated into semi-solid cream formulations.