İnsan eklem kıkırdağından kondrosit ve kondroprojenitör/kök hücre izolasyonu, kültürü, bu iki hücre hattının kondrogenez kapasitesi yönünden karşılaştırılması
Isolation of the chondrocyte and chondroprogenitor/stem cell from human articular cartilage, comparison of the chondrogenic capacity of these two cell lines
Yazar: ÖZLEM ÖZBEY
Danışman: PROF. DR. İSMAİL ÜSTÜNEL
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Eklemler = Joints ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kondrositler = Chondrocytes ; Kök hücreler = Stem cells ; Kıkırdak-artiküler = Cartilage-articular

Özet:
Eklem kıkırdağı ile ilgili yapılan kök hücre çalışmalarında, yetişkin eklem kıkırdağında projenitör/kök hücre özelliğine sahip hücrelerin mevcut olabileceğini ve bu hücrelerin bazı teknikler kullanılarak izolasyonlarının gerçekleştirilebileceği belirtilmektedir. Bu nedenle çalışmamızda, erişkin insan femuru distal eklem kıkırdağından kondrosit ve projenitör/kök hücre izolasyonu ve  kültürlerinin yapılmasının ardından, in vitro ortamda, kök hücre belirteci ekspresyonlarının, farklı dokulara yönlenebilme kapasitelerinin ve ultrastrüktürel yapılarının  araştırılması  amaçlandı.
Çalışmamızda, erişkin insan eklem kıkırdağı örneklerinden pronaz/kollagenaz sindirimi ile kondrositlerin izolasyonu gerçekleştirildi. Tam kat kondrositlerin kültür ortamında çoğalmasına izin verilirken, projenitör/kök hücre özelliğini taşıdığını düşündüğümüz hücrelerin fibronektin adhezyon testini takiben koloniler seçilerek planlanan parametrelerin uygulanabilmesi için kültürasyonlarına devam edildi. Çalışmada incelenen parametreleri özetlemek gerekirse; kültürü yapılan kondrosit ve koloni hücre süspansiyonlarında, CD90, STRO-1, CD105, CD166 gibi kök hücre belirteci expresyonlarının immunohistokimyasal ve flow sitometrik yöntemle belirlenmesi, kondrosit ve koloni kültür hücrelerinin kondrogenez, adipogenez ve osteogenez'e yönlendirilmesi, bu iki hücre hattına ait hücrelerin ultrastrüktürel yapılarının araştırılması parametreleri gerçekleştirilmiştir.
Çalışmada elde ettiğimiz bulgular şöyle özetlenebilir; kondrosit ve koloni kültür hatları flow sitometrik yöntemler ile karşılaştırıldığında, CD90, STRO-1, CD105 ve CD166 ekspresyon düzeylerinin benzer olduğu belirlendi. Kondrosit ve koloni kültür hücreleri uzun süreli kültürasyon sonrasında immunohistokimyasal olarak incelendiğinde, her iki grup hücrenin de bu belirteçlerin tümünü eksprese ettikleri, bununla birlikte koloni kültür hücrelerinde immunoboyanma yoğunluğunun daha fazla olduğu gözlemlendi. Yönlendirme deneylerinde, koloni hücrelerinin adipogenez ve osteogenez sürecinde, primer hücrelerin ise kondrogenez sürecinde daha iyi sonuçlar verdiği belirlendi. Bu iki hücre hattının ince yapıları incelendiğinde, koloni hücrelerinin kondrositlere göre daha bol miktarda genişlemiş granüllü endoplazmik retikulum (GER) ve ribozom, daha az miktarda da lizozom içerdiği tesbit edildi.
Sonuç olarak, bu çalışmada elde edilen bulgulardan yola çıkılarak, erişkin insan eklem kıkırdağında mevcut olan progenitor/kök hücrelerin mezenkimal kök hücre (MKH) özelliği taşıyabileceği söylenebilir. Ayrıca, kondrosit kültür hücrelerinin de  uzun süreli kültürasyonu takiben MKH özelliğine yakın karakterler kazanabileceği de belirtilebilir.

Abstract:
It has been reported that progenitor / stem cells might be present in human articular cartilage. In articular cartilage stem cell studies it is stated that cells with stem cell properties can be isolated with some techniques. Therefore, we aimed to isolate and culture the chondrocytes and progenitor/stem cells from adult human femoral distal articular cartilage, and investigate the expression of stem cell markers, differentiation capacities and ultrastructural features of these cells.
In our study, chondrocytes were isolated from adult human articular cartilage biopsies with pronase/collagenase digestion. Full-depth chondrocytes were cultured in different culture plates and single cell suspension were seeded on the fibronectin coated petri dishes for isolation of colony cells. Following seeding of chondrocytes, colony cells were selected and seeded on a different culture dish. Briefly, the parameters of this study were; determining the expression of stem cell markers such as CD90, STRO-1, CD105, C166 with flow cytometry and immunofluorescence techniques, induction of chondrocytes and colony cell lines to chondrogenesis, adipogenesis and osteogenesis, investigation of ultrastructure of these two cell lines.
Our findings can be summarized as; expression levels were similar between chondrocyte and colony culture cell lines. Our immunofluorescence studies showed that, expressions of all markers were observed in two cell lines, and expression intensity of colony culture cell line was higher than chondrocyte culture cell line after a long-term culture period. On cell differentiation assay results, while chondrocyte culture cell lines were more efficient in the process of chondrogenesis, colony cells were effective in the process of adipogenesis and osteogenesis. When we analyzed the ultrastructure of these two cell lines, we observed more expanded rough endoplasmic reticulum (RER) and ribosomes but less lysosomes in colony culture cell line cells than chondrocyte cell line.
In conclusion, according to the results of this study we can say that, there are progenitor/stem cells within the adult articular cartilage which are capable of mesenchymal stem cells (MSC) properties. Moreover, following the long-term culture period, chondrocytes may gain similar features with colony cells.