Galaktoziltransferaz-ı etkileşim yüzeyinin yönlendirilmiş mutagenez ve in vivo FRET (förster rezonans enerji transfer) analizi yöntemiyle karakterizasyonu
Identification of galactosyltransferase-i interaction surface by site directed mutagenesis and i̇n vi̇vo FRET (förster resonance energy transfer) analysis
Yazar: BATUHAN YEŞİLYURT
Danışman: DOÇ. DR. GÖKHAN CESUR
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Fizyoloji = Physiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Galaktoz = Galactose ; Glikobiyoloji = Glycobiology ; Glikozilasyon = Glycosylation ; Mikroskopi = Microscopy ; Mutagenez = Mutagenesis ; Proteinler = Proteins

Özet:
Glikozilasyon, protein ve lipidlerin geçirdiği en iyi bilinen sentez sonrası modifikasyonlardan biridir. Doğru bir glikozilasyon, hücresel tanıma, immünolojik aktivite, hücre sinyalizasyonu ve biyolojik çeşitlilik için son derece önemlidir. Glikan dallanması ve bu süreçte şeker eklenmesi glikozilasyonun temelidir ve şekerleri transfer eden glikoziltransferaz enzimleri tarafından kontrol edilen bir olaydır. Bu enzimlerde oluşan bozukluklar tüm organizma tipleri için hayati sorunlara yol açmaktadır. Fakat henüz glikoziltransferaz enzimlerinin patolojik koşullarda ve sağlıkta nasıl çalıştıkları detaylı olarak belirlenememiştir. 1960' lardan günümüze, çok sayıda glikoziltransferaz enzimlerinin homomerik ve heteromerik çalışma biçimlerine dair araştırmalar yapılmıştır. Biyoinformatik, moleküler biyoloji, ve hücre fizyolojisi alanındaki yeni gelişmeler, protein – protein etkileşimi ile ilgili daha çok veri elde etmemizi sağlamıştır. Tüm bunların ışığında çalışmanın amacı, Beta 1 - 4 Galaktoziltransferaz ezminin etkileşim yüzeyini yönlendirilmiş mutagenez ve FRET analizi ile belirlemektir. Bu doğrultuda, aday amino asitleri belirlemek için bir web sunucusu olan ClusPro kullanılmıştır. Belirlenen aday amino asitler (282 Try, 283 Val, 284 Glu, 359 Ile) Agilent mutagenez kiti kullanılarak teker teker glisin ve aspartik asite çevrilmek üzere mutasyona uğratılmıştır. Mutant cDNA lar mCherry ve mVenus FRET vektörlerine yerleştirilmiştir. Cos-7 hücre hattına transfekte edilen plazmidlerin ürettiği mutant proteinlerin hücre içi yerleşimi LSM konfokal mikrokop kullanılarak doğrulanmıştır. FRET analizi Operetta PerkinElmer cihazında gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak; elde edilen FRET analiz verilerine göre; 282. , 283. ve 359. bölgeler etkileşim yüzeyinden sorumlu olması muhtemel bölgelerdir. Özellikle 283. bölgede yer alan valin amino asidi, homomerik etkileşimde önemli rol oynuyor olabilir.

Abstract:
Glycosylation is one of the most known post translational modification of proteins and lipids. Proper glycosylation is essential for many biological events such as cell recognition, immunological activity, cell signalling and biological diversity. Glycan branching and sugar addition are the backbone of glycosylation. The regulation of glycan branching is under control of glycosyltransferase enzymes. It is known that any defects of these enzymes leads to severe consequences for all organisms. Yet, the working mechanism and details of glycosyltransferases in both health and diseases remain unclear. Since 1960s, many of articles has been published that glycosyltransferases may form homomeric and heteromeric complexes with each other. The recent developments in bioinformatics, molecular biology and cell physiology, let us to know much more information about protein – protein interactions. The aim of this study is, to find out Beta 1-4 Galactosyltransferase-I enzyme interacting surface by using site directed mutagenesis and FRET technique. Therefore, we used ClusPro web server to predict protein – protein docking positions and relevant amino acids. After that, candidate amino acids (282 Try, 283 Val, 284 Glu, 359 Ile) which they have potentially responsible for homomeric interaction have been mutated into glycine and aspartic acid via using Agilent Site-Directed Mutagenesis Kit. The mutant cDNAs are inserted mCherry and mVenus FRET plasmid contructs then transfected to Cos-7 mammalian cell line. The localization of mutant enzymes confirmed by LSM confocal microscopy. FRET measurements performed in Operetta, PerkinElmer. As result, 282nd, 283rd and 359th regions might be possibly responsible for interacting surface. According to FRET ratios, particularly 283rd region valine could be a good interaction point between two GalT-1 homomers.