Ketojenik diyetin GATOR1 yolağına etkisi
The effect of ketogenic diet on the GATOR1 pathway
Yazar: ASLI CAN ARABACI
Danışman: PROF. DR. DİLŞAD TÜRKDOĞAN
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases

Özet:
Giriş ve Amaç: Ketojenik diyet (KD) ve kalori kısıtlaması (KK) epilepsi hastalarında medikal tedaviye alternatif olarak uygulanan bir tedavi şeklidir. Her iki yöntemin epilepsi üzerindeki nöbet durdurucu etki mekanizması net aydınlatılamamıştır. KD ve KK'nin nöbet durdurucu etki mekanizmalarından en çok araştırma konusu olan yolaklardan bir tanesi memeli rapamisin hedefi (mTOR) yolağıdır. Bu sebeple mevcut çalışmanın inceleme konusu, farklı yağ asitleriyle oluşturulmuş ketojenik diyetin ve uygulanan kalori kısıtlamalarının mTOR sinyal yolağı üzerinde olan etkisini, mTOR'u inhibe edici etkiye sahip Rag 1'e yönelik GAP aktivitesi (GATOR) protein kompleksi ifadesinde meydana gelen değişimler ile açıklamaktır.
Gereç ve Yöntem: Dr. Şeyda KARABULUT'un Prof. Dr. Dilşad TÜRDOĞAN danışmanlığında 2019 yılında yapmış olduğu Ketojenik Diyet ve Kalori Kısıtlı Diyetin Anti-inflamatuar Etkilerinin İncelenmesi isimli tez çalışmasında 50 adet Winstar dişi sıçan (6 haftalık), 7 alt gruba ayrılmış ve 7 hafta boyunca farklı beslenme koşullarına maruz bırakılmıştır. Tüm ele alınan deney gruplarında ketojenik diyet (KD) etkinliğini doğrulamak için serum beta-hidroksibütirat seviyeleri ölçülmüştür. 7 haftanın sonunda her bir alt grupta 3 sıçana karaciğer biyopsisi yapılmıştır. Örnekler hemen dondurularak işlem yapılana kadar -80°C'de bekletilmiştir. Bu tez kapsamında temel amaçların doğrulanmasına yönelik önceki tezde kullanılan farklı diyet uygulamaları yapılan sıçan örnekleri kullanılmıştır. Farklı diyet modifikasyonları uygulanan farelerin karaciğer biyopsi preparatlarında mTOR ve GATOR yolağına ait proteinlerin ekspresyonu incelenmiştir. Bulgular: Ketojenik diyet-zeytinyağı, ketojenik diyet-hurma çekirdeği yağı, kalorisi kısıtlı ketojenik diyet-zeytinyağı, kalorisi kısıtlı ketojenik diyet-hurma çekirdeği yağı, kalori kısıtlaması ve standart diyet beslenme gruplarında mTOR sinyal yolağında adenozin monofosfat ile aktive edilmiş protein kinaz (AMPK) ve GATOR1 kompleks proteinlerinin karşılaştırılmalı olarak irdelenmesi amacıyla farklı protein örnekleri seçilerek hedefler en az 3 kez tekrarlanmıştır. Ketojenik diyet- zeytin yağı ve ketojenik diyet- hurma çekirdeği yağı beslenme gruplarında, özellikle hurma çekirdeği yağı uygulanan grupta mTOR ifadesinde azalma ile birlikte p- AMPK thr172 fosforilasyonu gözlenmiştir. Benzeri şekilde sadece kalori kısıtlaması yapılan grupta ketojenik diyet- hurma çekirdeği yağı uygulanan gruba göre mTOR fosforilasyonundaki artış ile beraber p-AMPK seviyesindeki artış görülmüştür. Standart diyet grubu ile karşılaştırdığımızda ketojenik diyet-zeytinyağı ve ketojenik diyet-hurma çekirdeği yağı gruplarında özellikle zeytinyağı uygulanan grupta daha belirgin olmak üzere p-mTOR ifadesinde artış görülmüştür. GATOR1 kompleksinin üyesi ve mTOR inhibisyonundan sorumlu olan NPRL2 hurma çekirdeği yağı uygulanan ketojenik örneklerde artarken, kalori azaltımında NPRL2 değişimi diğer örneklerde farklılık göstermemektedir. Kontrol grubunda ise NPRL2 ifadesi görülmemiştir. RagC ve pACC örneklerinin birleştirilen protein örneklerinde ifade düzeylerinin belirlenmesi ve GATOR kompleks sinyal yolağında hedef proteinlerin değerlendirilmesi amacıyla beslenme gruplarına LPS ile indüklenmiş standart diyet grubu örnekleri eklenmiştir. Sadece kalori azalması yapılan örnek grubunda ve LPS ile indüklenmiş standart diyet grubunda RagC fosforilasyonu ve pACC ifadesi artmış olarak görülmüştür. Standart diyet grubu ile diğer tüm diyet grupları karşılaştırıldığında GATOR2 belirteci ve mTOR üzerinde aktive edici etkiye sahip olan olan WDR59 ve Mios proteinlerinin ifadesinde artış görülmüştür.
Sonuçlar: Elde ettiğimiz bulgularda ketojenik diyette mTOR ifadesinde azalma ve pAMPK artışı olması hipotezimizle uyumlu sonuçlanmıştır. p-AMPK ifadesinin artışı olduğu durumlarda mTOR ifadesindeki azalma beklenirken, p-AMPK ifadesindeki artışa eşlik eden p-mTOR artışı, mTOR üzerinde AMPK dışında farklı faktörlerinde etkili olduğunu düşündürmektedir. NPRL2 ifadesinde artış olması kalori kısıtlaması ve ketojenik diyet uygulamasında mTOR'u inhibe edici etkisi olan GATOR1 yolağında artışı göstererek hipotezimizi desteklemektedir. Kalori kısıtlaması grubunda gözlenen pACC ifadesindeki artış mTOR ifadesindeki artış ile açıklanabilir. Standart diyet grubu dışında diğer gruplarda GATOR2 belirteci olan WDR59 ve Mios ifadesinde artış görülmesi GATOR yolağına etki eden başka mekanizmaların da olduğuna işaret etmektedir.
Anahtar Kelimeler: Ketojenik diyet, kalori kısıtlaması, mTOR, GATOR, AMPK

Abstract:
Introduction and Aim: Ketogenic diet (KD) and calorie restriction (CR) are treatment methods applied as alternatives to medical therapy in epilepsy patients. The seizure-suppressing mechanisms of both methods on epilepsy have not been clearly elucidated. One of the most researched pathways regarding the seizure- suppressing mechanisms of KD and CR is the mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway. Therefore, the aim of the present study is to examine the effects of a ketogenic diet prepared with different fatty acids and the applied calorie restrictions on the mTOR signaling pathway, explained through changes in the expression of the GATOR protein complex, which has GAP activity toward Rag 1 and inhibitory effects on mTOR.
Materials and Methods: In the thesis study titled Examination of the Anti- inflammatory Effects of Ketogenic Diet and Calorie-Restricted Diet, conducted by Dr. Şeyda KARABULUT under the supervision of Prof. Dr. Dilşad TÜRDOĞAN in 2019, 50 female Wistar rats (6 weeks old) were divided into 7 subgroups and subjected to different dietary conditions for 7 weeks. Serum beta-hydroxybutyrate levels were measured in all experimental groups to confirm the effectiveness of the ketogenic diet (KD). At the end of the 7 weeks, liver biopsies were performed on 3 rats from each subgroup. The samples were immediately frozen and stored at -80°C until further processing. In this thesis, the liver biopsy samples from rats subjected to different dietary interventions in the previous study were used to verify the primary objectives. The expression of proteins related to the mTOR and GATOR pathways was examined in liver biopsy preparations from the mice subjected to different diet modifications.
Findings: In the ketogenic diet-olive oil, ketogenic diet-palm oil, calorie-restricted ketogenic diet-olive oil, calorie-restricted ketogenic diet-palm oil, calorie restriction, and standard diet groups, different protein samples were selected to comparatively examine AMPK and GATOR1 complex proteins in the mTOR signaling pathway,
and the targets were repeated at least three times. In the ketogenic diet-olive oil and ketogenic diet-palm oil groups, particularly in the group treated with palm oil, a decrease in mTOR expression was observed along with p-AMPK Thr172 phosphorylation. Similarly, in the group subjected solely to calorie restriction, an increase in mTOR phosphorylation and p-AMPK levels was observed compared to the ketogenic diet-palm oil group. When compared to the standard diet group, an increase in p-mTOR expression was observed in the ketogenic diet-olive oil and ketogenic diet-palm oil groups, with a more pronounced effect in the olive oil group. NPRL2, a member of the GATOR1 complex and responsible for mTOR inhibition, increased in ketogenic diet-palm oil samples but showed no significant changes in calorie-restricted samples. NPRL2 expression was absent in the control group. To determine the expression levels of RagC and pACC in combined protein samples and evaluate target proteins in the GATOR complex signaling pathway, standard diet group samples induced with LPS were included in the dietary groups. Increased RagC phosphorylation and pACC expression were observed in the calorie-restricted group and the LPS-induced standard diet group. When the standard diet group was compared with all other diet groups, an increase was observed in the expression of WDR59 and Mios proteins, which are GATOR2 markers and have an activating effect on mTOR.
Conclusions: The findings indicate that the decrease in mTOR expression and the increase in p-AMPK levels in the ketogenic diet are consistent with our hypothesis. While a decrease in mTOR expression is expected in cases of increased p-AMPK expression, the observed concurrent increase in both p-AMPK and p-mTOR suggests that factors other than AMPK also influence mTOR. The increase in NPRL2 expression supports our hypothesis by indicating an enhancement in the GATOR1 pathway, which inhibits mTOR, during calorie restriction and ketogenic diet interventions. The observed increase in pACC expression in the calorie restriction group can be explained by the increase in mTOR expression.The increase in the expression of WDR59 and Mios, which are GATOR2 markers, in groups other than
the standard diet group suggests the involvement of other mechanisms affecting the GATOR pathway.
Keywords: Ketogenic diet, calorie restriction, mTOR, GATOR, AMPK