Gökkuşağı alabalık (Oncorhynchus mykiss) eritrositlerinden 6-fosfoglukonat dehidrogenaz enziminin saflastırılması, karakterizasyonu ve bazı metallerin enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification and characterization of 6-phosphogluconate dehydrogenase (E.C. 1.1.1.44) enzyme from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) erytrocyte and investigation of the effects of some metals on enzyme activity
Yazar: AYŞEGÜL TARANCI
Danışman: PROF. DR. MEHMET ÇİFTCİ
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method

Özet:
Bu çalısmada, metabolizma için büyük öneme sahip olan 6-fosfoglukonat dehidrogenaz (6PGD; E.C. 1.1.1.44) enzimi, Gökkuşağı Alabalık (Oncorhynchus mykiss) eritrositlerinden saflaştırıldı. Saflaştırma işlemi hemolizatın hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi ve 2', 5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi olmak üzere üç basamakta gerçekleştirildi. Saflaştırılan enzim için yüzde verim, spesifik aktivite ve saflaştırma katsayısı sırasıyla %19,89, 68,46 EÜ/mg protein, 17553,8 olarak hesaplandı. Enzimin saflığını kontrol etmek ve alt birim molekül kütlesini tespit etmek amacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve enzimin alt birim molekül kütlesi 58,52 kDa olarak belirlendi. Gökkuşağı alabalık 6PGD enziminin doğal halinin molekül kütlesi ise Sephadex G-150 jel filtrasyon kromatografisi kullanılarak 118,34 kDa olarak belirlendi. Ayrıca enzimin optimum sıcaklığının 40ºC, optimum pH'sının 7,5, optimum iyonik şiddetinin 160 mM ve stabil pH'sının ise 7,0 olduğu saptandı. Aynı zamanda NADP+ ve 6PGA substratları için KM değerleri sırası ile 0,00279 mM ve 0,207 mM hesaplanırken, Vmax değerleri ise 0,0417 EÜ/ml ve 0,257 EÜ/ml olarak bulundu. Bazı metallerin (bakır, kadmiyum, demir, civa, aliminyum, gümüş, çinko, nikel) gökkuşağı alabalık eritrositi 6PGD enzim aktivitesi üzerine etkileri incelendi. İnhibisyon etkisi gösteren metaller için IC50 değerleri ve Ki sabitleri belirlendi.

Abstract:
In this study, 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD; E.C. 1.1.1.44) enzyme, which is of great importance for the metabolism was purified from Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) erythrocyte. The purification consisted of three steps; preparation of homogenate, ammonium sulphate fractionation and 2?, 5?-ADP Sepharose 4B affinity chromatography. For purified enzyme; yield, specific activity and purification fold were obtained 19.89%, 68.46 EÜ/mg protein, 17553,8 respectively. To check the purity and determine subunit molecular weights of enzyme, SDS-PAGE was performed which showed a single band and MW of approximately 58.52 kDa for Rainbow Trout 6PGD. The molecular weight of native enzyme in rainbow trout was estimated to be approximately 118.34 kDa by Sephadex G-150 gel filtration chromatography. The optimum temperature of 6PGD enzyme was determined to be 40ºC and its optimum pH to be 7.5, its optimum ionic violence to be 0.8 mM and its stable pH to be 7.0. At the some time, KM values for NADP+ and 6PGA substrats were calculated as 0,00279 mM ve 0,0207 mM and Vmax values were found to be 0.0417 and 0.257 EU/ml respectively. In addition, the effects of different some metals (copper, cadmium, iron, mercury, aluminum, silver, zinc, nickel) on rainbow trout erytrhrocyte 6PGD activities were investigated. IC50 value and Ki constants calculated for the metals which show inhibition effects.