Gliomlarda cdkn2a/b homozigot delesyonu, P53, PS6 ve PD-L1 ekspresyonu
CDKN2A/B- homozygous deletion, P53, PS6 and PD-L1 expression in gliomas
Yazar: AYŞEGÜL GÖRMEZ
Danışman: PROF. DR. NAGİHAN YALÇIN
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Delesyon = Deletion ; Genler-P53 = Genes-P53 ; Glioma = Glioma ; Homozigot = Homozygote ; PD-L1 = PD-L1 ; İn situ hibridizasyon = In situ hybridization

Özet:
Gliomlar, nöroepitelyal tümörlerin prognostik ve biyolojik olarak farklı özelliklere sahip oldukça heterojen bir alt grubudur. Dünya Sağlık Örgütü'nün (WHO) en son 2021 santral sinir sistemi (SSS) tümörleri sınıflamasına göre gliomlar, yetişkin tip gliomlar başlığı altında "Astrositom, IDH-mutant", "Oligodendrogliomlar, IDH-mutant ve 1p19q kodelesyonu gösteren" ve "Glioblastom, IDH-wild tip" olarak sınıflandırılmaktadır. Gradeleme ise yeni moleküler değişikliklerin entegrasyonu ile birlikte 2016 WHO SSS tümörleri sınıflamasına göre farklılıklar göstermektedir. CDKN2A/B homozigot delesyonu varlığı, IDH-mutant astrositomların nekroz ve/veya vasküler endotelyal proliferasyon (VEP) izlenmese dahi Grade 4 astrositom tanısı almasını sağlamaktadır.
İmmünoterapi, çok çeşitli kanser türlerinde etkinliği araştırılan bir tedavi şeklidir. İmmünoterapi kararında tümör hücrelerindeki PD-L1 ekspresyonuna bakılmaktadır. Gliomlardaki denemeler şimdilik çok başarılı görünmese de, bazı hastaların tedaviye iyi yanıt vermesi gliomların ne kadar heterojen olduğunu kanıtlar niteliktedir. Dolayısıyla immünoterapiye iyi yanıt verebilecek hasta grubunu belirleme açısından moleküler düzeyde araştırmaların yapılması önem arz etmektedir. p53 ekspresyonu, gliomlarda sıklıkla bakılan prognostik ve tanımlayıcı belirleyicilerden biridir. pS6 antikoru, mTOR yolağı aktivasyonunu göstermesi için total protein seviyesi hakkında bilgi vermektedir.
Bahsedilen belirteçler arasında çeşitli yolaklar aracılığıyla bağlantılar olduğu bilinmektedir. Örneğin; akciğer küçük hücreli dışı karsinomlarda CDKN2A/B homozigot delesyonunun, immünohistokimyasal olarak PD-L1'in negatifliği ile anlamlı şekilde ilişkili olduğunu bildiren çalışma mevcuttur. Bir diğer örnek olarak mezotelyomalarda ve küçük hücreli dışı akciğer karsinomlarında p53 etkisinde miRNA'lar aracılığı ile PD-L1 ekspresyonunun baskılandığının gösterilmesi verilebilir. Literatürde bu belirteçlerin birbirleriyle ilişkisini gliomlarda araştıran çalışmaya rastlanmamıştır.
Çalışmamızın amacı; Grade 2,3 ve 4 gliomlarda CDKN2A/B homozigot delesyonu, PD-L1, pS6 ve p53'ün ekspresyonları, bunların daha önce araştırılmamış olan birbirleri ile korelasyonları ve sağkalım üzerine etkilerini incelemek ve başta immünoterapi olmak
xiv
üzere tedavi seçimlerinde spesifik hasta gruplarını belirmeye yarayabilecek belirteç/belirteçler bulmaktır.
Çalışmamızda 2016-2020 yılları arasında Pamukkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı'nda WHO Grade 2,3 ve 4 gliom tanısı almış 141 yetişkin hasta alınmıştır. 8 olgunun ilk tanı alan biyopsi materyallerine ek olarak nüks tümörlerine ait biyopsi materyalleri de dahil edilerek toplam 149 biyopsi materyali üzerinde çalışılmıştır. 141 hastanın 32'sinin biyopsi materyali rekürren tümöre aittir. Vakalara ait klinikopatolojik parametreler, sağkalım parametreleri, CDKN2A/B homozigot delesyonu, PD-L1, pS6 ve p53 ekspresyonları arasındaki ilişki incelenmiştir. Floresan İn Situ Hibridizasyon (FISH) incelemesinde ≥%20 canlı tümör hücresinde 2 yeşil sinyal görülüp hiç turuncu sinyal görülmemesi CDKN2A/B homozigot delesyonu lehine değerlendirilmiştir. 2 biyopsi örneğinde kaliteli sinyal elde edilemediğinden CDKN2A/B delesyonu değerlendirilememiştir. PD-L1 ekspresyonu için SP263 klonu; p53 ekspresyonu için DO-7 klonu, pS6 ekspresyonu için 5G10 klonu kullanılarak immünohistokimyasal inceleme yapılmıştır. PD-L1 membranöz ve diffüz/fibriler boyanma yüzdeleri ayrı ayrı değerlendirildikten sonra iki yüzde değeri toplanarak toplam PD-L1 boyanma yüzdesi elde edilmiştir. Tek başına ≥%5 canlı tümör hücresinde membranöz boyanma ve tek başına ≥%25 canlı tümör hücresinde diffüz/fibriler boyanma pozitif ekspresyon olarak kabul edilmiştir. Membranöz ve diffüz/fibriler boyanma yüzdesi toplamı ≥%5 olduğunda toplam PD-L1 ekspresyonu pozitif şeklinde değerlendirilmiştir. %40 eşik değeri kullanılarak tümör hücrelerinde güçlü nükleer boyanma pozitif p53 ekspresyonu olarak not edilmiştir. pS6 antikoru, bütün vakalarda seçici olarak tümör hücrelerinde aynı alanlarda aynı yoğunlukta sitoplazmik boyanma izlendiğinden histopatolojik tanı grupları ve diğer incelenen parametreler arasında karşılaştırma yapılamamıştır.
CDKN2A/B homozigot delesyonu; IDH-wild tip glioblastomların %41,8'inde (38/91), IDH-mutant gliomların %12,5'inde (7/56) tespit edilmiştir. IDH-wild tip glioblastomların %32,6'sında (30/92), IDH-mutant gliomların %5,3'ünde (3/57) PD-L1 membranöz ekspresyonu tespit edilmiştir. Diffüz/fibriler PD-L1 ekspresyonu IDH-wild tip glioblastomların %8,7'sinde (8/92), IDH-mutant gliomların %7'sinde (4/57) gözlenmiştir. Toplam PD-L1 ekspresyonu ise IDH-wild tip glioblastomların %42,4'ünde (39/92), IDH-mutant gliomların %14'ünde (8/57) saptanmıştır. p53 ekspresyonu IDH-wild tip glioblastomların %25'inde (23/92), IDH-mutant gliomların %22,8'inde (13/57)
xv
tespit edilmiştir. CDKN2A/B homozigot delesyonu, PD-L1 ve p53 ekspresyonları arasında korelasyon saptanmamıştır.
Tek değişkenli genel sağkalım analizlerinde CDKN2A/B homozigot delesyonu varlığı (14,1±1,3 ay vs 15,2±3,7 ay), membranöz PD-L1 ekspresyonu (9,2±1 ay vs 18±4,2 ay) ve toplam PD-L1 ekspresyonu (9,6±1,62 ay vs 18,5±4,98 ay) daha kötü genel sağkalım (OS) ile ilişkili bulunmuştur (sırasıyla p=0,024, p<0,001 ve p<0,001). CDKN2A/B homozigot delesyonu varlığı (9,4±2,1 ay vs 17,7±5,1 ay), membranöz PD-L1 ekspresyonu (6±0,4 ay vs 18±4,2 ay), toplam PD-L1 ekspresyonu (6±0,46 ay vs 20,5±3,58 ay) ve bunlara ek olarak diffüz/fibriler PD-L1 ekspresyonunun (4,9±0,2 ay vs 13,8±3,26 ay) progresyonsuz sağkalım (PFS) üzerinde negatif etkisi gözlenmiştir (sırasıyla p=0,015, <0,001, 0,024 ve 0,009). Yaş, uygulanan cerrahi yöntem, adjuvan tedavi alıp almaması ve IDH mutasyon durumu değişkenleri ile birlikte Cox regresyon yöntemiyle çok değişkenli sağkalım analizi yapıldığında ise hiçbir belirtecin genel sağkalıma ve progresyonsuz sağkalıma etkisinin olmadığı görülmüştür.
Sonuç olarak; IDH-wild tip glioblastomlarda CDKN2A/B homozigot delesyonu, membranöz ve toplam PD-L1 ekspresyonu daha sık görülmektedir. Diğer kanser türlerinde yapılan literatürdeki çalışmalardan farklı olarak gliomlarda bu beliteçler arasında korelasyon bulunmamaktadır. Literatürün aksine çok değişkenli sağkalım analizlerinde CDKN2A/B homozigot delesyonu ve PD-L1 ekspresyonlarının sağkalım üzerinde istatiksel olarak anlamlı etkisinin olmaması, tek değişkenli sağkalım analizlerindeki anlamlı sonuçların IDH mutasyon durumundan kaynaklandığını düşündürmektedir.

Abstract:
Gliomas are a highly heterogeneous subgroup of neuroepithelial tumors with different prognostic and biological features. According to the latest 2021 World Health Organization (WHO) Central Nervous System (CNS) Tumors Classification, gliomas are classified as "Astrocytoma, IDH-mutant", "Oligodendroglioma, IDH-mutant and 1p19q codeleted", and "Glioblastoma, IDH-wild type", under the title of adult-type gliomas. Grading, on the other hand, differs from the 2016 WHO CNS tumors classification, with the integration of new molecular changes. The presence of CDKN2A/B homozygous deletion enables IDH-mutant astrocytomas to be diagnosed as Grade 4 astrocytomas even if necrosis and/or vascular endothelial proliferation (VEP) is not observed. Immunotherapy is a form of treatment whose effectiveness has been investigated in a wide variety of cancer types. PD-L1 expression in tumor cells is considered in the immunotherapy decision. Although trials on gliomas do not seem very successful for now, good treatment response of some patients proves how heterogeneous gliomas are. Therefore, it is important to conduct studies at the molecular level in order to determine the patient group that can respond well to immunotherapy. p53 expression is one of the prognostic and diagnostic markers frequently examined in gliomas. The pS6 antibody provides information about the total protein level to indicate mTOR pathway activation. It is known that there are connections between the mentioned markers through various pathways. For example, there is a study reporting that homozygous deletion of CDKN2A/B in non-small cell carcinomas of the lung is significantly associated with negativity of PD-L1 immunohistochemically. As an another example, the demonstration of suppression of PD-L1 expression by miRNAs under the effect of p53 in mesotheliomas and non-small cell lung carcinomas can be given. No study has been found in the literature investigating the relationship between these markers in gliomas. The aim of our study is to examine CDKN2A/B homozygous deletion, PD-L1, pS6 and p53 expressions in Grade 2, 3 and 4 gliomas, their correlation with each other, which has
xvii
not been investigated before, their effects on survival, and to find marker/markers that can help determine spesific patient groups in treatment choices especially immunotherapy.
In our study, 141 adult patients diagnosed with WHO Grade 2, 3 and 4 gliomas in Pamukkale University Faculty of Medicine, Department of Medical Pathology between 2016 and 2020 were recruited. A total of 149 biopsy materials were studied by including biopsy materials from recurrent tumors in addition to the biopsy materials of 8 cases that were first diagnosed. The biopsy material of 32 of 141 patients belonged to the recurrent tumor. The relationship between clinicopathological parameters, survival parameters, CDKN2A/B homozygous deletion, PD-L1, pS6 and p53 expressions of the cases were investigated. In the Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) examination, 2 green signals and no orange signals in ≥20% viable tumor cells were evaluated in favor of CDKN2A/B homozygous deletion. In 2 biopsy samples, CDKN2A/B deletion could not be evaluated because sufficient signal could not be obtained. Clone SP263 for PD-L1 expression; clone DO-7 for p53 expression and clone 5G10 for pS6 expression were used for immunohistochemical examination. After the PD-L1 membranous and diffuse/fibrillary staining percentages were evaluated separately, the two percentage values were added to obtain the total PD-L1 staining percentage. Membrane staining in ≥5% viable tumor cells alone and diffuse/fibrillary staining in ≥25% viable tumor cells alone were considered positive expression. Total PD-L1 expression was considered positive when the sum of the percentage of membranous and diffuse/fibrillary staining was ≥5%. Strong nuclear staining was noted as positive p53 expression in tumor cells using the 40% cutoff value. A comparison could not be made between the histopathological diagnostic groups and other investigated parameters, since the same intensity of cytoplasmic staining of pS6 antibody was observed in the same areas selectively in tumor cells in all cases.
CDKN2A/B homozygous deletion was detected in 41.8% (38/91) of IDH-wild type gliomas (glioblastomas) and 12.5% (7/56) of IDH-mutant gliomas. PD-L1 membranous expression was detected in 32.6% (30/92) of IDH-wild type gliomas and 5.3% (3/57) of IDH-mutant gliomas. Diffuse/fibrillary PD-L1 expression was observed in 8.7% (8/92) of IDH-wild type gliomas and 7% (4/57) of IDH-mutant gliomas. Total PD-L1 expression was detected in 42.4% (39/92) of IDH-wild type gliomas and 14% (8/57) of IDH-mutant gliomas. p53 expression was detected in 25% (23/92) of IDH-wild type gliomas and 22.8% (13/57) of IDH-mutant gliomas. No correlation was found between CDKN2A/B
xviii
homozygous deletion, PD-L1 and p53 expressions.
In univariate overall survival analyzes; presence of CDKN2A/B homozygous deletion (14.1±1.3 months vs 15.2±3.7 months), membranous PD-L1 expression (9.2±1 months vs 18±4.2 months) and total PD-L1 expression (9.6±1.62 months vs 18.5±4.98 months) were related with worse overall survival (OS) (p=0.024, p<0.001 and p<0.001, respectively). Presence of CDKN2A/B homozygous deletion (9.4±2.1 months vs 17.7±5.1 months), membranous PD-L1 expression (6±0.4 months vs 18±4.2 months), total PD-L1 expression (6±0.46 months vs 20.5±3.58 months) plus diffuse/fibrillary PD-L1 expression (4.9±0.2 months vs 13.8±3.26 months)'s negative effects on progression free survival (PFS) was observed (p=0.015, <0.001, 0.024 and 0.009, respectively). When multivariate survival analysis was performed with the Cox regression method, together with the variables of age, surgical method, adjuvant treatment, and IDH mutation status, it was observed that none of the prognostic parameters had an effect on overall survival nor progression-free survival.
As a result; CDKN2A/B homozygous deletion, membranous and total PD-L1 expression are seen more frequently in IDH-wild type gliomas. Unlike studies in the literature in other cancer types, there is no correlation between these markers in gliomas. Contrary to the literature, the lack of a statistically significant effect of CDKN2A/B homozygous deletion and PD-L1 expressions on survival in multivariate survival analyzes suggests that the significant results in univariate survival analyzes are due to the IDH mutation status.