Biyofilm tabakasına uygulanan çeşitli stres faktörlerinin bakteriler üzerindeki etkilerinin incelenmesi
Investigaton the effects of various stress factors on to bacteria implemented biofilm layer
Yazar: CANSU VATANSEVER
Danışman: PROF. DR. İRFAN TÜRETGEN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Biyofilmler, mikroorganizmaların canlı veya cansız yüzeylere tutunarak kendi ürettikleri hücre dışı polimerik matriks içinde yaşaması ile meydana gelen bakteri topluluklarıdır. Biyofilm yapısında bulunan pek çok mikroorganizma içinde özellikle Legionella pneumophila önemli bir yer tutmaktadır. Soğutma kuleleri, biyofilm tabakasının meydana geldiği ve L. pneumophila'nın yaygın olarak bulunabildiği cihazların başında gelmektedir. Biyofilm yapısında bulunan mikroorganizmalar olumsuz çevresel koşullar karşısında daha dayanıklıdırlar. Çalışmanın amacı biyofilm ve planktonik bakterilerle mücadele en etkili eliminasyon stratejilerinin en güvenilir teknikler ile tespit edilmesidir. Bu yolla sağlık ve ekonomik açıdan önemli olan biyofilm kaynaklı sorunların önlenmesi hedeflenmektedir.
Çalışma kapsamında şebeke suyuna L. pneumophila ATCC 33152 suşu aşılanması ile soğutma kulesi model sisteminde bulunan cam kupon yüzeylerinde meydana getirilen 14 haftalık biyofilm ve planktonik faz bakterileri üzerine 1, 4 ve 24 saat süreyle olmak üzere 4°C, 37°C, 65°C gibi farklı sıcaklıklar; pH 3 ve pH 11 gibi farklı pH değerleri, hipotonik (% 0,01 NaCl) ve hipertonik tuz (% 3 NaCl)  ortamı, 2 ve 10 ppm klor ve 2 ve 10 ppm monokloramin gibi dezenfektanlar, açlık, kuruluk ve 1 ve 4 saat süreyle olmak üzere 254 nm dalga boyundaki UV ışık stres koşulları uygulanmıştır. Stres koşullarının ardından biyofilm yapısında bulunan ve planktonik fazdaki aerobik heterotrofik bakteriler ve L. pneumophila bakterisinin canlılık durumları klasik kültür, CTC-DAPI boyama yöntemi, LIVE/DEAD canlılık tayin kiti, Alamar blue boyama yöntemi ve EMA-qPCR yöntemleri kullanılarak tespit edilmiştir.
Çalışma sonucunda biyofilm yapısında bulunan bakterilerin stres koşulları karşısında planktonik faz bakterilerinden daha dirençli oldukları tespit edilmiştir. 65°C sıcaklık, asidik pH uygulaması, 10 ppm monokloramin, hipertonik tuz, kuruluk ve UV uygulamalarının biyofilm tabakasının ve planktonik bakterlerin eliminasyonunda en etkili teknikler olduğu belirlenmiştir. Epifloresan mikroskop ve klasik kültür tekniğinden elde edilen sonuçlar kıyaslandığında, epiloresan mikroskop tekniği ile klasik kültür tekniğine oranla daha yüksek sayıda canlı bakteri elde edilmiştir. Bu durum stres koşulları altında bulunan mikroorganizmaların VBNC (viable but non culturable) fazına girerek kültüre edilebilirliklerini kaybettiklerini göstermektedir. Bu sebeple sadece klasik kültür metodunun analiz amacıyla kullanılmasının yeterli olmadığı, bu tekniğin mikroskopi gibi tekniklerle desteklenmesi gerektiği bulunmuştur. Epifloresan mikroskop teknikleri içinde LIVE/DEAD kit ile CTC-DAPI boyasına oranla daha yüksek sayıda canlı ve toplam mikroorganizma varlığı tespit edilmiştir. Bu sebeple canlı ve toplam mikroorganizma tespitinde LIVE/DEAD kit kullanımının daha güvenilir olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Alamar Blue boyama yöntemi ile elde edilen sonuçların pek çok analizde epifloresan mikroskop tekniği ile elde edilen sonuçlarla tutarlılık göstermesi dolayısıyla canlılığın yüzde cinsinden belirlenmesinde kullanılabilecek bir teknik olduğu tespit edilmiştir. EMA-qPCR tekniğinin, uygun optimizasyon aşamalarının ardından elde edilen prosedür ile örnekteki canlı mikroorganizma varlığının tespitini sağlayabilmesi açısından PCR teknikleri içinde avantajlı bir hale gelebileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
Biofilm is a population of microorganisms that is formed by microorganisms which lives in produced their own extracellular polymeric matrix by attaching to living or inert surfaces. Among the many pathogenic microorganisms located in biofilm structure, especially Legionella pneumophila holds an important place. Cooling towers are the primary devices which biofilm layer is occurred and Legionella pneumophila can be found widely. Microorganisms found in a biofilm structure are quite strong against adverse environmental conditions. The aim of this study was identify the most effective elimination strategies for combating biofilm and planktonic bacteria with using most reliable techniques. In this way, it was aimed to prevent biofilm-related problems which are important in terms of health and economics.
In this study, L. pneumophila ATCC 33152 was inoculated in the cooling tower model system with potable water and formed biofilm on surfaces of glass coupons for 14 weeks. 14 weeks biofilm and planktonic phase bacteria were treated with various stress factors including different temperature such as 4°C, 37°C and 65°C, different pH such as pH 3 and pH 11; hypotonic salt (% 0,01 NaCl) and hypertonic salt (% 3 NaCl), 2 and 10 ppm chlorine and 2 and 10 ppm monochloramine solutions, dryness, starvation for 1, 4 and 24 hours and 254 nm UV radiation conditions for 1 and 4 hours. Following the treatment with stress factors, it was aimed that viability of both the biofilm structure and planktonic phase L. pneumophila and aerobic heterotrophic bacteria were determined conventional culture, CTC-DAPI staining, LIVE/DEAD viability kit, Alamar blue staining and EMA-qPCR methods.
Results of study indicated that bacteria in biofilm structure are more resistant than planktonic phase bacteria against stress conditions. It was identified that temperature of 65°C, acidic pH, 10 ppm monochloramine, hypertonic salt, dryness ve UV treatments are the most effective techniques for elimination of biofilm and planktonic phase bacteria. When the results obtained from the epifluorescence microscope and the conventional culture technique were compared, a higher number of live bacteria were obtained with the epifluorescence microscope technique than the conventional culture technique. These results indicated that microorganisms under stress conditions enter the VBNC (viable but non culturable) phase by losing their culturability. For this reason, it was found that it is not enough to use only conventional culture method for analysis, so this technique should be supported by some different techniques such as microscopy. In epifluorescence microscope techniques, with the LIVE / DEAD kit a higher number of live and total microorganisms were detected than with CTC-DAPI dye. Therefore, it was reached that the use of LIVE / DEAD kit is more reliable in detecting live and total microorganisms. The results obtained with the Alamar Blue staining method were consistent with the results obtained with the epifluorescence microscope technique in many analyzes. Hence it was found that Alamar Blue staining method can be used to determine the percentage of viability. It was reached that the EMA-qPCR technique may become advantageous in PCR techniques in order to enable the detection of the presence of viable microorganisms in the sample following the appropriate optimization steps.