Transferrin saflaştırılması için manyetik immünoafinite mikrokürelerin hazırlanması
Preparation of magnetic immunoaffinity microbeads for transferrin purification
Yazar: DİLARA SAÇLIGİL
Danışman: PROF. DR. SERAP ŞENEL ; PROF. DR. HANDAN YAVUZ ALAGÖZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Hücresel demir dengesini korumak amacıyla neredeyse tüm organizmalarda hücre içi demir alımını, saklanmasını ve taşınmasını sağlayan transferrin adı verilen taşıyıcılar bulunmaktadır. Transferrin protein ailesi, 670-700 aminoasitten oluşan tek polipeptid zincirli ve 80 kDa molekül ağırlığına sahip monomerik bir glikoproteindir. Kötü huylu tümörler yüksek oranda transferrin reseptörü içerdiğinden anti-kanser ilaçlar, proteinler ve genler için hedef ligand olarak transferrin kullanımı oldukça yaygındır. Transferrinin proteinlerle, ilaçlarla, makromolekül içeren hibrid sistemlerle konjugasyonu bu durumu mümkün kılmaktadır.Transferrinin anti-kanser ilaçlarla konjugasyonu ile seçicilik ve toksisite üzerinde olumlu gelişmeler sağlanmış ve ilaç direncini düşürmesinden dolayı daha etkin bir tedavi yöntemi oluşturulmuştur. Bu özelliklerinden dolayı transferrin saflaştırma çalışmaları önem kazanmıştır.
Manyetik ayırma, biyoayırma alanında kullanılmak üzere geliştirilmiş oldukça yeni bir tekniktir. Bu yöntemin prensibi bir ligand yardımıyla hedef moleküle bağlanan manyetik partikülün yığın çözeltiden manyetik alan gradyenti uygulanarak ayrılmasıdır. Geleneksel ayırma ile karşılaştırıldığında, hız, kesinlik ve basitliği önemli avantajlarındandır. Bu tez çalışmasında dispersiyon polimerizasyonu tekniği ile Fe3O4 nanoparçacık varlığında sentezlenmiş eş boyutlu manyetik poli-glisidil metakrilat (m-PGMA) mikrokürelere anti-transferrin antibadi immobilize edilerek transferrin adsorpsiyonu için yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir. Elde edilen mikroküreler Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR-ATR), taramalı elektron mikroskobu (SEM), elektron spin rezonans (ESR), termogravimetrik analiz (TGA-DTA) ve zeta boyut analizi ile karakterize edilmiştir. Kürelerin şişme özellikleri incelenmiş ve maksimum şişme oranları %52 olarak hesaplanmıştır. Yoğunluk ölçümü ile mikroküre yoğunluğu 1.08 g/cm3'tür. Destek maddesi olarak sentezlenen m-PGMA mikrokürelere anti-transferrin immobilizasyonu, GMA epoksi gruplarına anti-transferrin amino gruplarının nükleofilik saldırısı ile gerçekleitirilmiştir. İmmobilze olan optimum anti-transferrin miktarını bulmak amacıyla deriĢim taraması yapılmıĢ ve optimum immobilize anti-transferrin çözeltisinin derişimi 1 mg/ml olarak bulunmuştur. Transferrin adsorpsiyonu optimum şartların belirlenmesi için pH, derişim, sıcaklık ve zaman taramaları yapılmıştır. Maksimum transferrin adsorpsiyon kapasitesi pH 6'da 1.65 mg/ml olarak bulunmuştur. Adsorpsiyon-desorpsiyon döngüsü tekrarlanarak m-PGMA mikrokürelerin tekrar kullanılabilir oldukları bulunmuştur. Yapay plazmadan transferrin adsorpsiyonu manyetik ortamda incelenmiştir. Ortamdaki transferinin %52'sinin adsorbe olduğu hesaplanmıştır.Desorpsiyon işleminin transferrinin yapısında herhangi bir denatürasyona neden olmadığını ve elüe edilen transferrinin saflığını göstermek üzere SDS-PAGE çalışmaları yapılmıştır.

Abstract:
In order to maintain cellular iron homeostasis, nearly all organisms have the iron transporters called transferrin that provide cellular iron uptake, storage and transportation. The transferrin protein family is 80 kDA monomeric glycoprotein of 670-700 aminoacids with single polipeptid chain. As cancer cells include lots of transferrin receptor on their surface, transferrin is widely used as target ligand for anti-cancer drugs, proteins and genes. The conjugation of transferrin with proteins, drugs and hybrid systems containing macromolecule makes this situation possible. Positive developments on selectivity and toxicity are provided by conjugation of transferrin with anti-cancer drugs. Because of these properties, transferrin purification studies are imported.Magnetic seperation is a novel method developed for using in bioseperaiton field. The main principle of this method is seperation of magnetic particule bonded to target molcule from bulk solution by magnetic field gradient. Compared to conventional seperation, rapidity, precision and easiness are the main advantages. In this study, a new approach is developed for transferrin adsorption by immobilizing anti-transferrin antibody on monosize magnetic poli-glycidyl methacrylate microspheres with Fe3O4 nanopowder by dispersion polymerization. Synthesized micropspheres are characterized by Fourier Transform Infrared Spectroscopy, scanning electron microscope (SEM), electron spin resonance (ESR), thermogravimetric analysis (TGA-DTA), zeta sizer analysis. Swelling ratio of microspheres is investigated and calculated as %52. Microsphere density is calculated as 1.08 g/cm3 by density analysis. Immobilization of anti-transferrin antibody on m-PGMA microspheres as a matrix is done by nucleofilic attack on amino groups of anti-transferrin. Effect of concentration is investigated for determining the optimum immobilized anti-transferrin amount and is found as 1 mg/ml. Effect of pH, concentration and temperature is investigated for determining the optimum conditions for transferrin adsorption. Maximum adsorption capacity is found as 1.65 mg/ml at pH 6.0. m-PGMA microspheres are found to be reusable by repeating adsorption-desorption cycle. Transferrin adsorption from artificial plasma is studied in magnetic environment and adsorption capacity is calculated as 0.12 mg/g. In order to show that the desorption studies made no denaturation and to determine the purity of eluated transferrin, SDS-PAGE studies are performed.