Sağlıklı ve fenilketonürili çocuklarda fonksiyonel B12 vitamin eksikliğinin plazma metilmalonik asit ve homosistein düzeyleri ile araştırılması
Investigation of functional vitamin B12 deficiency in healthy and phenylketonuria children with plasma methylmalonic acid and homocysteine levels
Yazar: MERVE AKIŞ
Danışman: PROF. DR. HÜRAY İŞLEKEL
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Fenilketonüri = Phenylketonuria ; Homosistein = Homocysteine ; Kromatografi = Chromatography ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Metilmalonik asit = Methylmalonic acid ; Vitamin B 12 = Vitamin B 12 ; Vitamin B 12 eksikliği = Vitamin B 12 deficiency

Özet:
Giriş ve amaç: Fenilketonüri (FKÜ) hastaları fenilalaninden zengin doğal proteinlerden kısıtlı diyetleri nedeniyle fonksiyonel B12 vitamin eksikliği riski altındadırlar. B12 vitamin eksikliğinin belirlenmesinde B12 vitamin konsantrasyonlarından daha duyarlı fonksiyonel belirteçler olan metilmalonik asitin (MMA) ve/veya homosisteinin (Hcy) kandaki yüksek konsantrasyonları bozulmuş hücre içi B12 vitamin durumunun göstergesi olarak kabul edilmektedir. Ancak, literatürde bu parametrelerin tanı değeri ile ilgili yapılmış yeterli çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmanın amacı; kısıtlı diyet alan FKÜ hastalarının fonksiyonel B12 vitamin eksikliği açısından sağlıklı kontroller ile karşılaştırılması ve B12 vitamin eksikliğinde MMA ölçümünün B12 vitamini ölçümüne göre tanı değerinin ortaya konmasıdır.Gereç ve yöntem: Çalışmaya 5-18 yaşları arasındaki fenilalaninden kısıtlı diyet alan 31 FKÜ hastası ve 26 sağlıklı çocuk dahil edildi. Serum B12 vitamini, ferritin ve folik asit düzeyleri kemilüminesans immünoassay yöntemiyle, fenilalanin düzeyi fluorimetrik bir yöntemle belirlendi. MCV değerleri hemogram cihazında çalışıldı. Plazma Hcy düzeyi ise HPLC ile ölçüldü. Plazma MMA düzeyi stabil izotop dilüsyon-çoklu reaksiyon izleme sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (SID-MRM LC-MS/MS) yöntemi ile belirlendi. MMA yönteminin analitik performansının değerlendirilmesinde doğruluk, doğrusallık, gün içi ve günler arası kesinlik, tespit limiti, kantitasyon limiti ve geri kazanım çalışmaları yapıldı. Verilerin istatistiksel analizlerinde SPSS 15.0 programı kullanıldı. p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.Bulgular: 0.05-2.5 ?mol/L aralığındaki kalibrasyon standartları ile değerlendirilen MMA yönteminin doğruluğu %100 ± 4 olarak bulundu. Yöntem 100 ?mol/L'ye kadar doğrusaldı. Gün içi ve günler arası %CV sırasıyla 4.0 ve 6.0'dan küçük bulundu. Plazma MMA ölçümü için tespit ve kantitasyon limitleri sırasıyla 0.021 ?mol/L ve 0.085 ?mol/L olarak belirlendi. Düşük ve yüksek konsantrasyonda MMA içeren plazma örneklerine eklenen MMA'nın geri kazanımı sırasıyla %87.6 ve %86.4 bulundu. FKÜ ve kontrol grupları karşılaştırıldığında; iki grup arasında serum B12 vitamini, plazma MMA ve Hcy düzeyleri açısından anlamlı fark bulunamadı. FKÜ'li olgular arasında, serum B12 vitamini düşük olanlar grubun %12.9'unu, plazma MMA ve Hcy düzeyleri yüksek olanlar ise sırasıyla %29'unu ve %9.7'sini oluşturmaktaydı. Kontrol grubunun ise %30.7'sinde ve %11.5'inde sırasıyla plazma MMA ve Hcy konsantrasyonları yüksek bulundu. Folik asit ve MCV düzeylerinin FKÜ grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek olduğu belirlendi (p<0.01). İncelenen parametreler arasındaki korelasyonlar değerlendirildiğinde; FKÜ grubunda plazma Hcy ile fenilalanin ve MCV düzeyleri arasında anlamlı pozitif korelasyonlar, folik asit ile anlamlı negatif korelasyon saptandı (p<0.05). Kontrol grubunda ise plazma MMA ile Hcy konsantrasyonları arasında anlamlı pozitif korelasyon bulundu (p<0.05). FKÜ ve kontrol gruplarının verileri birlikte ele alındığında, serum B12 vitamin konsantrasyonları ile plazma MMA ve MCV düzeyleri arasında anlamlı negatif korelasyonlar belirlendi (p<0.01). Yukarıdaki bulgulara ek olarak, B12 vitamin eksikliği tanısının konmasında, plazma MMA ölçümünün serum B12 ölçümüne göre 5.33 kat (%95 GA=1.62-17.49) daha fazla tanı koydurucu olduğu bulundu.Sonuç: Çalışmamız, hem sağlıklı kontrollerde hem de potansiyel B12 vitamin eksikliği riski olan FKÜ grubunda, B12 vitamin düzeyleri referans değerler içinde olsa da fonksiyonel B12 vitamin eksikliğinin olabileceğini göstermektedir. Ayrıca bu çalışma ile FKÜ'li olgularda ve sağlıklı çocuklarda MMA'nın B12 vitaminine göre daha yüksek tanı değeri ilk kez ortaya konmuştur.Anahtar kelimeler: B12 vitamini, metilmalonik asit, homosistein, fonksiyonel B12 vitamin eksikliği, fenilketonüri, çoklu reaksiyon izleme-sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (MRM-LC-MS/MS)

Abstract:
Introduction and aim of study: Phenylketonuria (PKU) patients are at risk for functional vitamin B12 deficiency, based on their diet restricted of natural protein rich from phenylalanine. Elevated concentrations of methylmalonic acid (MMA) and/or homocysteine (Hcy), which are more sensitive functional markers of deficiency than vitamin B12 concentrations in the blood, are considered as measures of impaired intracellular vitamin B12 status. However, the diagnostic value of these parameters are not studied extensively. The aims of this study are to investigate functional vitamin B12 deficiency in treated PKU patients and healthy subjects as control group and to compare the diagnostic value of methylmalonic acid and vitamin B12 measurements in vitamin B12 deficiency.Materials and methods: 31 PKU patients on phenylalanine-restricted diet and 26 healthy children aged 5-18 years were included in the study. Serum vitamin B12, ferritin and folate levels were determined by chemiluminescence immunoassay. Phenylalanine levels were measured by a fluorometric method. MCV values were studied with hemogram analyzer. HPLC was used for plasma Hcy assay. Plasma MMA was determined using a stable isotope dilution-multiple reaction monitoring liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SID-MRM LC-MS/MS) method. Accuracy, linearity, intra-assay and inter-assay precision, limit of detection and quantification, and recovery were evaluated to validate this method. Statistical analyses of data were performed using SPSS 15.0. Analyses were considered significant at p<0.05.Results: Accuracy for MMA assay calculated with calibration standards in the range of 0.05 to 2.5 ?mol/L was within 100 ± 4%. The MMA assay was linear up to 100 ?mol/L. Intra-assay and inter-assay CVs% were smaller than 4.0 and 6.0, respectively. The limit of detection was 0.021 ?mol/L and limit of quantification was 0.085 ?mol/L. Recoveries of MMA added to plasma samples with low and high levels of MMA were 87.6% and 86.4%, respectively. When PKU and control groups were compared in terms of vitamin B12 deficiency, no significant differences were found for serum vitamin B12, plasma MMA and Hcy concentrations between the groups. 12.9% of patients with PKU were found with low serum vitamin B12 concentrations. 29% of patients with PKU had elevated plasma MMA and 9.7% had high Hcy levels. In the controls, 30.7% and 11.5% had elevated also plasma MMA and Hcy levels, respectively. PKU patients had significantly elevated folate and MCV values than controls (p<0.01). Regarding the correlations between the parameters investigated; in PKU patients, plasma Hcy were correlated with phenylalanine and MCV values and negatively correlated with folate (p<0.05). In control group, we have found a positive correlation between plasma MMA and Hcy concentrations (p<0.05). Taking data of PKU and control subjects together, plasma MMA and MCV were negatively related to serum vitamin B12 concentrations (p<0.01). We have additionally found that, in vitamin B12 deficiency plasma MMA measurement is significantly 5.33 times (95% CI=1.62-17.49) more diagnostic than serum vitamin B12 measurement.Conclusions: Our study clearly demonstrated that; even with serum vitamin B12 concentrations within reference ranges, functional vitamin B12 deficiency may be seen in both healthy subjects and PKU patients who are at risk for potential vitamin B12 deficiency. Additionally, the significantly higher diagnostic value of plasma MMA measurement compared to serum vitamin B12 in vitamin B12 deficiency, has been shown for the first time in PKU and healthy children.Key words: Vitamin B12, methylmalonic acid, homocysteine, functional vitamin B12 deficiency, phenylketonuria, multiple reaction monitoring-liquid chromatography-tandem mass spectrometry (MRM-LC-MS/MS)