Çoklu ligasyonla prob amplifikasyonu (MLPA) yönteminin prenatal tanıdaki yeri ve önemi
The role and validity of  multiple prob amplification (MLPA) technique in prenatal diagnosis
Yazar: ELİF ARİ
Danışman: PROF. DR. ÖZTÜRK ÖZDEMİR
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Amnion = Amnion ; Embriyo = Embryo ; Fetüs = Fetus ; Genotip = Genotype ; Ligasyon = Ligation ; Mikrodelesyon = Microdeletion ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Prenatal teşhis = Prenatal diagnosis

Özet:
Prenatal tanı; doğum öncesi dönemde fetus veya embriyodaki olası hastalıkların tespit edilmesi yöntemidir. Prenatal tanının en temel amacı; yaşamla bağdaşabilen trizomik ve monozomik fetusların doğum öncesi olabildiğince erken evrede tespit edilmesi esasına dayanır. Anabilim dalımıza bağlı sitogenetik ve moleküler genetik laboratuvarlarında 2010 yılından beri prenatal tanı, kantitatif floresan polimerz zincir reaksiyonu (QF-PCR) ve amniyon hücre kültürü-full karyotip analiz yöntemleri ile  hizmet vermektedir. Bu projemizde laboratuvarımızda daha önce QF-PCR ile genotiplendirilen amniyon örnekleri ve düşük materyallerine ait deoksiribonükleik asit (DNA) bankası kullanılarak çoklu ligasyonla prob amplifikasyonu (MLPA) tekniği ile genotiplendirilmesi varsa olası mikrodelesyon/duplikasyonların tespit edilmesi amaçlandı. Elde edilen sonuçlar QF-PCR tekniği ile daha önce elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı.
Çalışmamızda anöploidi ve mikrodelesyon/duplikasyon olmak üzere iki farklı MLPA kiti kullanıldı. 67 amniyon ve 10 adet düşük materyali olmak üzere toplam 77 örnek 36 farklı prob içeren MLPA anöploidi kiti ile genotiplendirildi. 33 amniyon, 11 adet düşük materyali olmak üzere toplam 44 örnek ise 50 adet farklı prob içeren MLPA mikrodelesyon/duplikasyon kiti ile çoklu ligasyonla prob amplifikasyonu ve kapiller elektroforez tekniği ile genotiplendirildi. 
MLPA anöploidi kiti ile genotipledirilen örneklerde; 57 adet amniyon normal olarak değerlendirilirken, 10 amniyon ve 7 adet düşük materyali örneklerinde sayısal kromozom anomalileri saptandı.  Daha önce OF-PCR ile tanı alan 3 adet triploidi ve  1 adet tetraploidi örneğine MLPA anöploidi kiti ile bu araştırmada tanı konulamadı. Bir adet uninformatif örnek normal olarak değerlendirilirken, paternal uniparental izodizomi tanısı alan diğer amniyon örneği ise Triple X olarak değerlendirildi. QF-PCR ile normal değerlendirilen 2 örnekte kromozom 18 ve 21 de kısmi duplikasyon saptandı. Bunların dışında sayısal anomali tanısı konulmuş diğer tüm örneklerin QF-PCR sonuçları ile uyumlu olduğu görüldü. MLPA mikrodelesyon/duplikasyon kiti ile analiz edilen örneklerde; 11 amniyon normal (%33.3) değerlendirilirken, 22  amniyon örneğinde ise (%66.7) mikrodelesyon  ve/veya duplikasyon  saptandı. Değerlendirilen toplam 11 adet düşük materyalin tamamında (%100)  mikrodelesyon ve/veya duplikasyon saptandı.
Elde edilen sonuçlar MLPA anöploidi ve mikrodelesyon/duplikasyon tekniğinin prenatal tanı amaçlı genel olarak başarılı bir yöntem olduğunu gösterdi. MLPA anöploidi kiti ile iki tahliye materyali örneğinde başka teknikle belirlenemeyen kromozom 18 ve 21' e ait 18q11.2, 21q22.3 ve 21q11.2 bölgelerinde duplikasyon olduğu belirlendi. MLPA mikrodelesyon/duplikasyon ile analiz edilen ve daha önce normal değerlendirilen örneklerin tamamında mikrodelesyon ve/veya duplikasyon saptanmıştır. 
Sonuç olarak, araştırmamızda çalışılan her iki MLPA yönteminin insanda prenatal tanı amaçlı başarı ile kullanılabileceği ortaya konmuştur. Bunun yanı sıra her iki kitin prenatal amaçlı tek başına kullanılması yerine diğer tekniklerle birlikte kullanılmasının kesin ve doğru sonuç için daha etkili ve geçerli olacağı tartışılmıştır.

Abstract:
Prenatal diagnosis is a technique that aim to detect the possible trisomic and/or monosımic chromosomal abnormalities in embryo and fetal cells before birth. In our laboratory the quantitative fluorescent polymerase chain reaction  (QF-PCR) and karyotype analysis after amnion cell culture techniques that well esatblished for the prenatal diagnosis. In the current project it was aimed to check the possible advantage of the multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) technique in prenatal diagnosis. The aneuplody (36 probs) and microdeletion/duplication (50 probs) MLPA kits and capillary electrophoresis technique were used for that purpose and results were compared to the QF-PCR technique retrospectively. 
In a total of 67 amnion and 10 aboted materials were genotyped by aneuplody kit and 33 different amnion and 11 aborted material samples were genotyped by microdeletion/duplication kit in the current retrospective case - control study. Three aneuplodic and one tetraploidic samples that diagnosed by QF-PCR technique were not diagnosed by MLPA aneuploidic kit in the current study. One uninformatic amniotic sample was normal and the other paternal uniparental isodisomy was diagnosed as triple X syndrome by MLPA technique. Microdeletions were detected in chromosomes 18 and 21 in two different samples that diagnosed as normal by QF-PCR technique in the current results. The rest of other samples were diagnosed as the same as QF-PCR technique. The amniotic samples that diagnosed by microdeletion/duplication kit showed; 11 (33%) normal structure and microdeletion and/or duplications were detected in 22 samples (66.7%) that evalutaed by 50 different probs. Microdeletion and/or duplications were detected in all 11 aborted materials (100%) that evalutaed by 50 different probs in the current results. Two regional chromosomal duplication were detected in chromosome 18 (18q11.2) and 21(21q22.3) of different aborted samples in the current study. In general, the current case-control results showed that MLPA technique is valid and successfully technique in prenatal diagnosis of amnion and/or aborted materials genotyping.
In conclusion, the current results confirmed that both MLPA kits can be use for the prenatal diagnosis successfully, but it is better used with combination of other techniques or need to be confirme by another valid techniques such as QF-PCR, fully karyotyping, sanger sequencing and/or microarray in the prenatal diagnosis.