30 InDel lokusunun zamana ve sıcaklığa bağlı stabilitesinin araştırılması
Investigation of the time and temperature stability of 30 InDel locus
Yazar: TOYGÜN ANIL ÖZESEN
Danışman: PROF. DR. BEHNAN ALPER
Çukurova Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Adli Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine
Dizin: DNA = DNA ; DNA analizi = DNA analysis ; DNA hasarı = DNA damage ; DNA parmak izi = DNA fingerprinting ; Mutasyon = Mutation ; Olay yeri inceleme = Crime scene experts

Özet:
Amaç: DNA profilleme teknikleri, adli kimliklendirme gerektiren ya da delil ile kişi arasında direkt bağlantının araştırıldığı olayların tamamında kullanılabilmektedir. Adli amaçlı DNA incelemeleri için birçok farklı materyal (saç/kıllar, kan, idrar, semen ve diğer biyolojik sıvılar ile bunlara ait lekeler) kullanılmaktadır. Adli DNA laboratuvarlarında çalışılan olay yeri kaynaklı biyolojik örnekler, çoğunlukla idealden çok daha az miktarda ve çevresel koşullardan olumsuz etkilenmiş şekilde olmaktadır. Bazı durumlarda olay yerinin tespiti saatler, günler hatta yıllar sürebilmektedir. Bu nedenle olay yerinde bulunan biyolojik materyaller hem zamana hem de olay yerinin olumsuz çevresel koşullarına maruz kalmaktadır. Bu çalışma ile üzerinden uzun süre geçen biyolojik materyaller üzerinde 30 InDel lokusu genotiplendirilerek, bu lokuslarının zamana ve sıcaklığa bağlı stabilitelerinin belirlenmesi ve diğer DNA profilleme yöntemleriyle karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada sıcaklık ve zamanın Indel lokuslarınının stabilitesine etkisini araştırmak amacıyla, 25 yıl önce sağlık çalışanlarından oluşan sağlıklı gönüllülerden alınmış kan örneklerinden, steril gazlı bez üzerine damlatılarak hazırlanmış; +4°C, oda sıcaklığı (22-25°C) ve +37°C (Etüv)'de saklanmış, toplam 33 adet kan lekesi ve referans olarak güncel tarihli kan örnekleri kullanılmıştır.
Bulgular: Örnekler üzerinde yapılan kantitasyon çalışmasında; oda sıcaklığı için ortalama DNA miktarının 0,168 ng/μl, +4°C'için ortalama DNA miktarının 0,205 ng/μl olduğu, referans örnekleri için ortalama DNA miktarının 0,938 ng/μl olduğu, 37 °C için ise çalışılan tüm örneklerde DNA miktarının tespit edilebilir düzeyin altında olduğu görüldü. Çalışmamızda, tek tek lokus bazında incelediğimizde bazı lokusların diğerlerine göre daha az stabil olduğu görülmektedir. Stabilite fragman uzunluğu ile doğrudan etkili olduğundan daha spesifik değerlendirme için aynı uzunlukta olanlar arasında bir karşılaştırma yaptığımızda, çalışılan örneklerden sadece ikisinde 140bp altında fragmana sahip lokus saptanamamıştır. Bunlardan biri fragman uzunluğu 108-113 bp olan HLD99 lokusu, diğeri ise fragman uzunluğu 113-121 bp olan HLD128 lokusudur. Tanımlama yapılamayan diğer lokusların tamamı 140 bp ve üzerinde fragman uzunluğuna sahiptir. Bu durum örneklerde fragmantasyonun 140bp uzunluğuna kadar azaldığını göstermektedir. Kit içinde bulunan 140-158 bp uzunluğundaki nispeten daha uzun fragmanlı lokuslar incelendiğinde, en fazla kaybın HLD 67, ardından HLD81 ve üçüncü olarak HLD84 olduğu görülmektedir.
Sonuç: 25 yılın üzerinde uzun yıllar eski kan lekelerinde, özellikle doğrudan uzun süre herhangi bir yapay ısıya veya güneş ışığına maruz kalmamışsa ve özellikle kapalı alanlarda kalmış örneklerde genel olarak Investigator Diplex kit ile 30 Indel lokusunun başarılı bir şekilde analiz edilebileceği anlaşılmaktadır.

Abstract:
Objective: DNA profiling techniques can be used in all cases that require forensic identification or where a direct link between the evidence and the person is investigated. Many different materials (hair/hairs, blood, urine, semen and other biological fluids and their stains) are used for forensic DNA analysis. Crime scene-derived biological samples studied in forensic DNA laboratories are often much less than ideal and negatively affected by environmental conditions. In some cases, the detection of the crime scene can take hours, days or even years. For this reason, biological materials found at the crime scene are exposed to both time and adverse environmental conditions of the crime scene. In this study, it was aimed to genotype 30 InDel loci on biological materials that have passed for a long time, to determine the time and temperature stability of these loci and to compare them with other DNA profiling methods.
Materials and Methods: In this study, blood samples taken from healthy volunteers in 1996, dried on gauze and stored in 3 different ambient conditions were used to investigate the effects of temperature and time on the stability of Indel loci. These blood samples were stored at +4°C, room temperature (22-25°C) and +37°C (oven) for 25 years. Among the stored samples, those whose current dated reference samples could be accessed were included in the study. A total of 33 blood stains and current dated blood samples were used as reference.
Results: In the quantitation study on the samples; At room temperature, the average DNA amount is 0.168 ng/μl, for +4°C the average DNA amount is 0.205 ng/μl, for reference samples the average DNA amount is 0.938 ng/μl, and for 37 °C, the DNA amount can be detected in all samples studied. was found to be below the level. In our study, when we analyze it on the basis of loci one by one, it is seen that some loci are less stable than others. When we make a comparison between the stability fragment length and those of the same length for more specific evaluation, since it is directly effective, loci with fragments below 140bp could not be detected in only two of the studied samples. One is the HLD99 locus with a fragment length of 108-113 bp, and the other is the HLD128 locus with a fragment length of 113-121 bp. All other unidentified loci have fragment lengths of 140 bp or more. This indicates that the fragmentation in the samples is reduced up to 140bp length. Examining the 140-158 bp long fragmented loci with relatively longer fragments included in the kit, it is seen that HLD 67 lost the most, followed by HLD81 and thirdly by HLD84.
Conslusion: It is understood that 30 Indel loci can be successfully analyzed with the Investigator Diplex kit in blood stains that have been kept for more than 25 years, especially if they have not been directly exposed to any artificial heat or sunlight for a long time (especially in samples left in closed areas).