Multipl miyelomda T regulatuar hücrelerin (TREG) tedaviye etkinliğine etkisinin ex vivo araştırılması
Ex vivo evaluation of the effect of regulatory T cells (TREG) on multiple myeloma therapy
Yazar: AYŞE PINAR ERÇETİN
Danışman: PROF. DR. SAFİYE AKTAŞ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Hematoloji = Hematology ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Bortezomib = Bortezomib ; Homeostaz = Homeostasis ; Kan hastalıkları = Hematologic diseases ; Multipl miyelom = Multiple myeloma ; T lenfositleri-düzenleyici = T lymphocytes-regulatory

Özet:
Multipl miyelom (MM) plazma hücrelerinin ve öncülerinin malign proliferasyonu ile karakterize olan hematolojik bir kanser türüdür. MM hücreleri konak T hucreleri tarafından tanınabilecek antijenler eksprese etmesine rağmen immün sistem tarafından nadiren yok edilebilmekte olup bu durum tümör mikroçevresi tarafindan gerçekleştirilen immunsüpresyon ile ilişkilendirilmektedir. Otoimmun kontrolde, T-hücre homeostazinde, tüm immün yanıtının immünmodulasyonunda önemli rolu olan immünsüpresif CD4+CD25+Foxp3+ fenotipindeki düzenleyici T hücrelerin (Treg) MM hastalarının periferik kanında yüksek düzeylerde olduğu ilgili literatürde tespit edilmiştir. Bu bilgiler ışığında bu projenin amacı, CD4+CD25+Foxp3+ Treg hücrelerinin birinci basamak tedavide ve relaps hastalarının tedavisinde hedefe yönelik tedavi seçeneği olarak kullanılan bir proteozom inhibitörü olan bortezomibin malign miyelom hücreleri üzerindeki öldürücü etkinliğine olan etkisinin ex vivo değerlendirilmesidir. 
Yeni tani almis olan 20 MM olgusundan periferik kan ve kemik iligi örnekleri topladiktan sonra CD4+CD25+ Treg hücrelerini periferik kan mononukleer hucrelerinden (PBMC) manyetik yolla izole edilip, safligi akim sitometrik analiz ile konfirme edilmiştir. Olguların kemik iliği aspirasyon örneklerinden ficoll dansite gradient santrifuju yoluyla izole edilen kemik iliği mononükleer hücreleri (BMMC) 72 saat boyunca RPMI ortaminda 37°C 'de %5 CO2 'lik etüvde inkübe edilmiştir. Daha sonra her hasta için ayrı ayrı tespit edilen LD50 dozundaki bortezomib, izole edilen Treg hücreleri ve kombinasyonu ayrı kuyucuklara ilave edilmiştir. 24 saatlik inkübasyon ardından CD138+ miyelom hücrelerinin canlılığı alt gruplarda kontrolleri ile kıyaslayarak ve her gruptaki total hücre sayıları göz önünde bulundurulup uygun hesaplamalarla her hasta için değerlendirilmiştir. Bulgular SPSS 15.0 programı ile Mann Whitney U non-parametrik testi ve ki-kare testleri ile istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Sağ kalım analizleri Kaplan-Meier testi ile gerçekleştirilmiştir. P<0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.  
Bu çalışmada Treg hücreler %90 üzerinde saflıkla izole edilebilmiştir ve MM temsil eden primer kültür yapılabilmiştir. Klinik bortezomibe direnç göstermeyen 2 olguda in vitro bortezomib duyarlılığı düşük çıkmıştır. İn vitro hastadan elde edilen malign miyelom hücrelerine aynı hastanın Treg hücreleri verildiğinde çok geniş bir hücre ölüm yanıt dağılımı saptanmıştır. Treglere in vitro hücre ölümü şeklinde yanıt veren MM olgularımızda bortezomib direnci olmaması ile istatistiksel anlamlı ilişki saptanmıştır (p=0,024). Klinikte bortezomib direnci olmayan hastalarda ex vivo Treg ekspansiyonunun malign miyelom hücrelerine bortezomible verildiğinde bortezomibin öldürücü etkisini arttırmasının korele olduğu görülmüştür (p=0,022).
MM ex vivo hasta örneklerini içeren bu çalışmaya göre, hastaların periferik kanından elde edilen Treg hücrelerin klinikte bortezomibe yanıt veren olgularda bortezomibin in vitro anti-tumor etkisini arttırdığı ve yanıt vermeyen olgularda azalttığı saptanmıştır. Bu durum bortezomib yanıtında Treglerin etkisi olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Multiple myeloma (MM) is a hematological cancer which is characterized by malign proliferation of plasma cells and their precursors. Although MM cells express antigens which can be recognized by host T cells they can be rarely eradicated by the immune system because of the immunsupression by tumor microenvironment. It is determined in the literature that the immunsuppressive regulatory T cells (Treg) with CD4+CD25+Foxp3+ fenotype are increased in peripheral blood of MM patients which have key roles on oto-immune control, T-cell homeostasis, immunmodulation of all the immune response. According to this knowledge, we aimed to evaluate the ex vivo effect of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells on the cytotoxic effect of proteosome inhibitor bortezomib on malign myeloma cells which is being used for the first-line therapy and also for relaps patients as a targeted therapy. 
We collected peripheral blood and bone marrow samples from newly diagnosied 20 MM cases and isolated CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and the purity of the isolation was confirmed by flowcytometric analysis. The bone marrow mononuclear cells (BMMC) were isolated from the bone marrow aspiration samples of each patient by ficoll density gradient centrifugation and incubated in RPMI under 37 °C  5% CO2 conditions for 72 hours. The LD50 dose of bortezomib which is detected for each patient, isolated Treg cells and their combinations were added seperate wells for each patient. After 24 hours of incubation we evaluted the viability of CD138+ myeloma cells in subgroups, compared to their controls in primary bone marrow cultures of each patient. We performed Mann-Whitney U non-parametric test and ci-square test for statistical analysis of the results by SPSS 15.0. We also performed survival analysis by Kaplan-Meier test. P values <0.05 were considered as statistically significant. 
In this study Treg cells were isolated with more than 90% purity and we also could achieve to demonstrate a primary cell culture representing MM. In 2 cases which did not show bortezomib resistance clinically, were significantly sensitive to bortezomib in vitro.  When we expanded Treg cells of each patient isolated from their own peripheral blood samples, the malign myeloma cell death responses were found to be in a wide range. In MM cases without in vivo bortezomib resistance responded to Treg cell expansion by in vitro cell death and this relationship was found to be statistically significant (p=0,024). In MM cases without in vivo bortezomib resistance, the Treg cell expansion enhanced the anti-tumor effect of bortezomib on malign myeloma cells when applied in combination which was found to be statistically correlated (p=0,022).  
This study including ex vivo MM patient samples showed that the Treg cells obtained from peripheral blood samples of each patient enhanced the in vitro anti-tumor effect of bortezomib in cases responding bortezomib in vivo and reduced in cases not responding bortezomib in vivo. These results were suggesting that Treg cells might be effective on bortezomib resistance.