Kolesterol taşıyıcı ABCG1'in insan makrofajlarındaki rolü
The role of the cholesterol transporter ABCG1 in human macrophages
Yazar: DUYGU ÜNÜVAR PURCU
Danışman: DOÇ. DR. DUYGU SAĞ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology
Dizin: Fenotip = Phenotype ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Kolesterol = Cholesterol ; Makrofajlar = Macrophages

Özet:
ABCG1, ters kolesterol transportu yolu ile hücredeki kolesterolün, HDL parçacıklarına akmasına aracılık eden bir taşıyıcı proteindir. Farelerde ABCG1 ekspresyonu baskılanmış tümörle ilişkili makrofajların, tümörü destekleyici M2 fenotipinden tümörle savaşan M1 fenotipine doğru içsel bir eğilim gösterdiği ve in-vivo'da mesane kanseri büyümesini baskıladığı gösterilmiştir. ABCG1 ekspresyonunun, makrofaj polarizasyonunun yönlendirilmesi üzerindeki etkisi, onu kanser tedavisinde cazip bir hedef molekül haline getirmektedir. Amacımız; ABCG1 ekspresyonunun baskılanmasının, insan makrofaj polarizasyonu üzerine etkilerini araştırmaktır. Tip 2 diyabet hastalarında, makrofajların ABCG1 ekspresyonunun düşük olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle diyabet hastalarından elde edilen makrofajları, ABCG1 ekspresyonunun doğal olarak susturulduğu modeller olarak ele aldık. 
İn-vitro'da makrofaj polarizasyonunda kullanılan stimülanların uygulama süresi, polarizasyon belirteçlerinin ekspresyonlarını dramatik bir şekilde değiştirmektedir, ancak literatürde bu konuda bir fikir birliğinin olmaması, çalışmaların sonuçlarını ve doğruluğunu olumsuz etkilemektedir. Çalışmamızda kullanacağımız uyarım süresinin belirlenmesi ve makrofaj polarizasyonunun doğrulanması için makrofajlar; stimülanlarla altı farklı zamanda uyarıldı ve M1/M2 polarizasyon belirteçlerinin ekspresyonundaki değişim RT-qPCR, akış sitometrisi ve ELISA ile belirlendi. Ardından siRNA kullanılarak ABCG1 ekpresyonu baskılanmış primer insan makrofajları, tip 2 diyabet hastalarından elde edilmiş ABCG1 ekspresyonu doğal olarak düşük olan makrofajlar ve tüm kontrol grupları dört saat süre ile polarize edildi. Polarizasyon belirteçlerinin gen ekspresyonundaki değişim RT-qPCR ile belirlendi.
Çalışmamız makrofaj polarizasyonunda kullanılan belirteçler için uygun uyarım süresinin belirlenmesinde ve belirteç seçiminde, araştırmacılara yol gösterici niteliktedir ve literatürdeki büyük bir boşluğu doldurmaktadır. ABCG1 ekspresyonu siRNA ile baskılanmış, M1 makrofajlarda CXCL9, CXCL10, TNF ve IDO1 ekspresyonu artarken, M2 makrofajlarda MRC1 ve CCL22 ekspresyonu azalmaktadır. Diyabet hastalarından elde edilmiş ve M1 makrofajlarda CXCL10 ve IDO1 ekspresyonu artarken, M2 makrofajlarda MRC1, TGM2, CCL17, CCL22, IL-10 ve CD163 ekspresyonları azalmaktadır. Ayrıca, insan makrofajlarında ABCG1 ekspresyonu ile M1 belirteçlerinin ekspresyonu arasında negatif korelasyon bulunmuştur. Sonuçlarımız, ABCG1 eksikliğinin, insan makrofajlarında da M1 polarizasyonuna eğilim yarattığını göstermektedir. Bulgularımız ABCG1'ın, makrofajların önemli rol aldığı çeşitli hastalıkların tedavisi için makrofaj polarizasyonunu modüle etmede yeni bir hedef olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
ABCG1 mediates the influx of cholesterol in the cell to HDL particles via reverse cholesterol transport. Tumor-associated macrophages with suppressed ABCG1 expression in mice have been shown to have an intrinsic trend from the tumor-promoting M2 to the tumor-fighting M1 phenotype and suppress bladder cancer growth in vivo. The effect of ABCG1 expression on macrophage polarization makes it an attractive target in cancer therapy. Hence, our aim is to investigate the effects of suppressed ABCG1 expression on human macrophage polarization. It has been shown that macrophages have low ABCG1 expression in patients with type-2 diabetes. Therefore, we considered macrophages obtained from diabetic patients as models in which ABCG1 expression is naturally silenced.
The application time of the stimulants used in macrophage polarization in-vitro dramatically changes the expressions of polarization markers, and the lack of consensus in the literature negatively affects the results and accuracy of the studies. To determine the stimulation time used in this study and to determine the macrophage phenotypes; primary macrophages were polarized at six different times and the change in expression of M1/M2 polarization markers was determined by RT-qPCR, flow cytometry, and ELISA. Then, primary macrophages with suppressed ABCG1 expression using siRNA, macrophages with naturally low expression of ABCG1 obtained from type-2-diabetes patients and all control groups were polarized for four hours. The change in gene expressions of polarization markers were determined by RT-qPCR.
Our study provides a guide for researchers in determining the appropriate stimulation time and selection of markers used in macrophage polarization and fills a large gap in the literature. While the expression of CXCL9, CXCL10, TNF and IDO1 was increased in ABCG1 suppressed M1 macrophages, MRC1 and CCL22 expression were decreased in ABCG1 suppressed M2 macrophages. Furthermore, while the expression of CXCL10 and IDO1 is increased in M1 macrophages obtained from diabetic patients, the expressions of MRC1, TGM2, CCL17, CCL22, IL-10 and CD163 are decreased in M2 macrophages. In addition, we showed that there is a negative correlation between ABCG1 expression and the expression of M1 markers in human macrophages. Therefore, according to our results, ABCG1 deficiency predisposes human macrophages to M1 polarization. Our findings suggest that ABCG1 may be a novel target for modulating macrophage polarization for the treatment of various diseases in which macrophages play an important role.