Preadipositlerde (3T3-L1) estrojen ve progesteronun adipositokin salıverilmesi ve diferansiyasyon üzerine etkisi: Rho/Rho-kinaz yolağının olası katkısı
Effects of estrogen and progesteron on adipocyte diferentiation and adipocytokine release in preadipocyte cell line, 3T3-L1: Possible involvement of Rho/Rho-kinase signaling
Yazar: MEHTAP PEKTAŞ
Danışman: PROF. DR. KANSU BÜYÜKAFŞAR
Mersin Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Adipokinler = Adipokines ; Adipoz doku = Adipose tissue ; Cinsiyet hormonları = Sex hormones ; Hormonlar = Hormones ; Progesteron = Progesterone ; Rhokinaz = Rhokinase ; Östrojenler = Estrogens

Özet:
Bu tezde seks hormonları, estrojen ve progesteronun, preadipositlerin (3T3-L1) olgun yağ hücrelerine diferansiyasyonuna ve bu hücrelerden leptin, rezistin, adiponektin, TNF-?, IL-6 gibi adipostokinlerin salıverilmesine olan etkilerini incelemeyi ve ayrıca bu etkilere, eğer varsa, Rho/Rho kinaz yolağının katkısını araştırmayı amaçladık.Bu amaçla estradiol (10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 ve 10-4 M), hücre içine giremeyen bir estrojen anoloğu olan sığır serum albumini (BSA) ile konjuge edilmiş estradiol (E2-BSA, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 ve 10-4 M), progesteron (10-8, 10-7 ve 10-6 M), Rho kinaz inhibitörü Y-27632 (10-5 M) ve klasik estrojen reseptör blokörü, ICI 182,780 (10-5 M) tek başlarına veya kombine olarak 3T3-L1 hücrelerine 2, 4, 6 ve 8 gün boyunca uyguladık. Bu hormonların adiposit diferansiyasyonu üzerine olan etkisi, lipid spesifik bir boya olan Oil red O ile değerlendirildi.Başka bir deney serisinde diferansiye olmuş adipositlerde estrojen (10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 ve 10-4 M), E2-BSA (10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 ve 10-4 M) ve progesteronun (10-8, 10-7, 10-6 ve 10-5 M) leptin, adiponektin, rezistin, TNF-? ve IL-6 gibi sitokinlerin salıverilmesi üzerine etkileri, Y-27632 (10-5 M) ve ICI 182,780 varlığında ve yokluğunda, araştırıldı.Diğer taraftan, seks hormonlarının adiposit diferansiyasyonu üzerine etkilerine Rho/Rho-kinaz yolağının katkısını sorgulamak amacıyla, ROCK inhibitörü Y-27632 kullanımına ek olarak, RhoA, ROCK-1 ve ROCK-2 protein ekspresyon düzeyleri Western-blot yöntemi araştırıldı.Estrojen ve membran impermeabl estrojen analoğu olan E2-BSA, adiposit diferansiyasyonuna farklı günlerde farklı şekilde etki etmektedir. Şöyle ki; diferansiyasyon sürecinin başlangıcında gerek 17 ? -estradiol gerekse E2-BSA diferansiyasyonu azaltmaktadır. 4-6. günlerde ise tam tersine bu estrojenik maddeler diferansiyasyonu artırıyor gibi görünmektedir. Buna karşılık 8. günde ise etkisiz bulunmuşlardır. Y-27632, estrojenin etkilerini değiştirmedi. Ancak, tek başına uygulandığında adiposit diferansiyasyonunu 2. günde arttırmaktadır. Diğer taraftan ICI 182,780 de 17 ? -estradiolün diferansiyasyon üzerine etkisini değiştirmedi. Ancak Y-27632 gibi ICI 182,780 de tek başına adiposit diferansiyasyonunu arttırdı. 8. günde ise, ilginç olarak, ICI 182,780 adiposit diferansiyasyonunu azalttığı gözlendi.ROCK inhibitörü Y-27632, E2-BSA'nın adiposit diferansiyasyonu üzerine etkisini değiştirmedi. Ancak tek başına uygulanmasının adiposit diferansiyasyonunu arttırdığı gözlendi. Aynı şekilde, klasik estrojen reseptör blokörü ICI 182,780, E2-BSA'nın 3T3-L1 hücre diferansiyasyonu üzerine etkisini değiştirmedi. Buna karşılık, tek başına uygulandığında ise diferansiyasonu arttırdı. Ancak 8 gün boyunca uygulandığında ise tam tersi diferansiyasyonu azalttığı bulundu.Diğer bir seks hormonu olan progesteron, kullanılan konsantrasyonlarda ve uygulanan süre boyunca, adiposit diferansiyasyonu üzerine anlamlı bir etki oluşturmadı.3T3-L1 preadipositlerde 17ß-estradiol, progesteron ve ICI 182,780, leptin salıverilmesini değiştirmedi. Ancak, Y-27632 ve onun 17ß-estradiol ile kombinasyonu, leptin salıverilmesini anlamlı olarak artırdı.17ß-estradiol, 10-8, 10-7 ve 10-6 M konsantrasyonlarda rezistin salıverilmesini arttırırken diğer konsantrasyonlarda anlamlı bir etki bulunmadı. İlginç olarak ROCK inhibitörü Y-27632, 17ß-estradiolün bu etkisini antagonize etti. Ancak klasik estrojen reseptör blokörü ICI 182,780 17ß-estradiolün rezistin salıverilmesi üzerine etkisini değiştirmedi fakat tek başına uygulanan ICI 182,780 rezistin düzeylerini anlamlı olarak azalttı. Diğer taraftan, progesteron rezistin salıverilmesi üzerine etki göstermedi.17ß-estradiol, genel olarak adiponektin salıverilmesini anlamlı olarak azalttı. İlginç olarak Y-27632, bu etkiyi tersine çevirdi. ICI 182,780, 17ß-estradiol'ün etkisini değiştirmezken, tek başına uygulanması adiponektin düzeylerini arttırdı. Progesteron ise, uygulanan konsantrasyonlarda, adiponektin düzeylerini arttırırken, Y-27632 ve 17ß-estradiol ile kombinasyonu bu etkiyi tersine çevirmedi.17ß-estradiol (10-9-10-5 M), TNF- ? salıverilmesini değiştirmezken, 10-4 M konsantrasyonda salıverilmeyi anlamlı olarak artırdı. Rho-kinaz enzim inhibitörü Y-27632, TNF- ? düzeylerini arttırdığı bulundu. Bununla birlikte 17ß-estradiol'ün ICI 182,780 ile kombinasyonu TNF-? salıverilmesi üzerine etki göstermedi. Diğer taraftan progesteron da TNF- ? salıverilmesi üzerine anlamlı bir etki oluşturmadı. Ayrıca progesteronun 17ß-estradiol ve Y-27632 ile kombinasyonları da, TNF- ? salıverilmesi üzerine her hangi bir etki meydana getirmedi.17ß-estradiol, kullanılan hiçbir konsantrasyonda IL-6 salıverilmesini etkilemedi. Ancak klasik estrojen reseptör blokörü ICI 182,780, IL-6 düzeylerini anlamlı bir şekilde azalttı. Diğer taraftan, progesteron, uygulanan konsantrasyonlarda IL-6 düzeylerini azaltırken, Y-27632 ve 17ß-estradiol kombinasyonu bu etkiyi değiştirmedi.17ß-estradiol (10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 ve 10-4 M) ve progesteron (10-8, 10-7 ve 10-6 M) kullanılan konsantrasyonlarda ve uygulanan sürede ROCK-1, ROCK-2 enzimi ve RhoA protein ekspresyon düzeylerini anlamlı olarak değiştirmedi.Özet olarak, 17ß-estradiol ve hücre içine giremeyen analoğu olan E2-BSA'nın adiposit diferansiyasyonu üzerine farklı sürelerde farklı etkiler meydana getirmektedir. Erken dönemde 17ß-estradiol ve E2-BSA (2. günde) diferansiyasyonu azaltırken ara dönemlerde (4-6. günlerde) diferansiyasyonu arttırdı. Daha geç dönemde ise (8. günde) adiposit diferansiyasyonu üzerine bir etki oluşturmadı. Rho kinaz enzim inhibitörü Y-27632 ve klasik estrojen reseptör blokörü ICI182,780 17ß-estradiolün etkilerini değiştirmedi ancak tek başlarına uygulandığında her iki madde de adiposit diferansiyasyonunu genellikle artırdı. Progesteronun adiposit diferansiyasyonuna bir etkisi yoktu. 17ß-estradiol ve progesteron, leptin ve TNF- ? düzeylerini değiştirmedi. Ayrıca, 17ß-estradiolün, IL-6 düzeylerini etkilemediği buna karşılık, rezistin düzeylerini arttırdığı ve adiponektin seviyelerini ise azalttığı bulundu. Progesteron ise rezistin seviyelerini değiştirmezken adiponektin düzeylerini arttıdı ancak IL-6 düzeylerini azalttı.Sonuç olarak, başlıca estrojenik hormon olan 17ß-estradiol, preadiposit diferansiyasyon sürecine farklı zaman dilimlerinde farklı etkilerle katkı sağlamaktadır. Ancak, bu etkilere Rho/Rho-kinaz yolağının ve klasik estrojen reseptörlerinin aracılığı görünmemektedir. Buna karşılık, Rho-kinaz inhibisyonu adipogenezi artırmaktadır. Klasik estrojen reseptör blokörü olarak bilinen ICI 182780'in tek başına adipogenezisi artıyor olması onun başka bir etkisinden (örneğin GPER reseptörleri üzerinden agonistlik etkisinden) kaynaklanabilir. Progesteronun diferansiyasyon üzerine bir etkisi görünmemektedir. Diğer taraftan olgun yağ hücrelerinden adipositokin salıverilmesi üzerine de bu iki hormonun farklı etkileri bulunmaktadır ve bu şekilde çeşitli metabolik olaylara katkı sağlayabilir.

Abstract:
In this study we aimed to investigate possible effects of sex hormons, estrogen and progesterone on the differantiation of preadipocyte (3T3-L1) to mature adipocyte on the synthesis and release of adipocytokines from these cells such as leptin, resistin, adiponectin, TNF-? and IL-6, and the involvement of a novel signaling pathway, if any Rho/Rho-kinase in both of effects.For these purposes estradiol (10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 and 10-4 M), a membrane-impermeabl form of estradiol, which is conjugated with bovine serum albumin (estradiol-BSA, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 and 10-4 M) and progesterone (10-8, 10-7 and 10-6 M), a Rho kinase inhibitor Y-27632 (10-5 M), and to assess the role of estrogen receptor ICI 182,780 (10-5 M) alone or in combination treated to 3T3-L1 cells during day 2, 4, 6 and 8. To evaluate the effect of these hormones on adipocyte differentiation, lipid-specific Oil Red O, a dye was used.In another set of experiments in differentiated adipocytes effect of estrogen (10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 and 10-4 M), estradiol-BSA (10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 and 10-4 M) and progesterone (10-8, 10-7 and 10-6 M) on leptin, adiponectin, resistin, TNF-? and IL-6 release were assessed at the presence and absence of Y-27632 (10-5 M) and ICI 182,780.On the other hand to investigate the contribution of Rho/Rho-kinase pathway on the sex hormones induced adipocyte differentiation, a ROCK inhibitor Y-27632 and RhoA protein and its downstream effectors ROCK-1 and ROCK-2 expression levels were assessed by Western-blot.Estrogen and a membrane impermeabl estrogen analog E2-BSA has diverse effect on adipocyte differentiation at different day of differentiation. That is; at the beginning of the differentiation process both 17 ? -estradiol and E2-BSA decrease the differentiation. In contrary of this estrogenic substances seems to increase differentiation on the day 4-6. However, they were found ineffective in the day 8. Y-27632 did not changed the estrogens effecs. However increased adipocyte differentiation on the day 2 when applyed alone. On the other hand also ICI 182,780 did not changed effect of 17 ? -estradiol on adipocyte differentiation. But, similar to Y-27632, also ICI 182,780 alone increased adipocyte differentiation. Interestingly, ICI 182,780 decreased adipocyte differentiation on the day 8.ROCK inhibitor Y-27632 did not changed effect of E2-BSA on adipocyte differentiation. But alone administration of Y-27632 increased adipocyte differentiation. In a similar manner classical estrogen blocker ICI 182,780, did not changed effect of E2-BSA on 3T3-L1 cell differentiation. In contrast when applyed alone increased differentiation. But when apllyed during 8 days decreased differentiation.However progesterone which is another sex hormone did not any significant effect on adipocyte differentiation during applying time course at the concentrations tested.17ß-estradiol, progesteron and ICI 182,780 did not changed leptin release from 3T3-L1 preadipocytes. However Y-27632 alone or combination with 17ß-estradiol significantly increased leptin release. While 17ß-estradiol, increased resistin release at the 10-8, 10-7 ve 10-6 M concentrations it did not create any significant effect at the other concentrations tested. Interestingly, a ROCK inhibitor Y-27632, antagonised this effect of 17ß-estradiol. Bu a classical estrogen receptor blocker ICI 182,780 did not changed effect of 17ß-estradiol on resistin release. But ICI 182,780 decreased resistin levels when applyed alone. On the other hand progesterone, showed no effect of on the release of resistin.In general 17ß-estradiol significantly decreased adiponectin release. Interestingly Y-27632 reversed this effect. While ICI 182,780, did not changed 17ß-estradiol effect, increased adiponectin levels when applyed alone. Progesterone increased adiponectin levels at the concentration used but its combination with Y-27632 and 17ß-estradiol did not reversed this effect.While 17ß-estradiol (10-9-10-5 M), did not changed TNF- ?? release it significantly increased release at 10-4 M concentration. Rho kinase enzym inhibitör Y-27632 increased TNF- ? levels. But combination of 17ß-estradiol with ICI 182,780 did not have any effect on TNF- ?? release. On the other hand progesterone did not have any significant effect on TNF- ?? release. In addition also the combination of 17ß-estradiol and Y-27632 did not have any significant effect on TNF- ?? release.17ß-estradiol did not changed IL-6 release at any concantrations tested. But classical estrogen receptor blocker ICI 182,780 significantly decreased IL-6 levels. On the other hand while progesteron decreased IL-6 levels at the concentrations tested combination of Y-27632 and 17ß-estradiol did not changed this effect.17ß-estradiol (10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 and 10-4 M) and progesteron (10-8, 10-7 and 10-6 M) did not significantly changed ROCK-1, ROCK-2 and RhoA protein expression levels during experimental time course at the concentrations tested.In summary 17ß-estradiol and E2-BSA have ediverse effect on adipocyte differentiation at different stages of differentiation. 17ß-estradiol and E2-BSA decrease differentiation in early stages (day 2), increase differentiation in middle stages (day 4-6) heve no effect in more late stages (day 8). Rho-kinase inhibitor Y-27632 and ICI 182,780 did not changed effect of 17ß-estradiol but when applyed alone both of them generally increased adipocyte differentiation. Progesteron have no effect on adipocyte differentiation. 17ß-estradiol and progesteron did not changed leptin and TNF- ? levels. In addition 17ß-estradiol did not changed IL-6, increased resistin and decreased adiponectin levels. Progesterone did not changed adiponectin levels but decreased IL-8 levels.In conclusion 17ß-estradiol which is main estrogenic hormone has diverse effect on adipocyte differentiation at different stages of differentiation. But these effects appear to be not mediated via Rho/Rho-kinase pathway and classical estrogen receptor. In contrast, inhibition of Rho-kinase increases adipogenesis. Adipogenes increase by classical estrogen receptor blocker ICI 182780 might come from another property of it other than calssical blockage such as GPER receptor agonism. Progesterone does not appear to have an effect on differentiation. On the other hand these two hormones have ediverse effect on adipocytokine release from mature adipocytes. In this way these hormones can contribute to a variety of metabolic events.