Yerel Bacillus izolatlarından alfa amilazların klonlanması ve rekombinant amy28 alfa amilazının enzim özelliklerinin belirlenmesi
Cloning of amylases from local Bacillus isolates and determination of enzyme characteristics of recombinant amy28 alpha amylase
Yazar: MERVE TUZLAKOĞLU ÖZTÜRK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Alfa Amilaz (EC 3.2.1.1) nişasta ve benzeri karbohidratlardaki alfa-1,4 glikozidik bağlarının hidrolizini katalizleyerek oligosakkarit ve glukoz oluşturan, önemli endüstriyel enzimlerden biridir. Gıda, tekstil, kağıt, deterjan ve farmasötik endüstrilerinde yaygın olarak kullanılan amilazlar, dünya enzim pazarının yaklaşık  % 30'unu oluşturmaktadır. Bitki, hayvan ve mikroorganizma gibi çeşitli kaynaklardan elde edilebildiği halde endüstriyel uygulamalarda genellikle mikrobiyal olanları tercih edilir. Bu çalışmada, Türkiye'deki çeşitli kaynaklardan izole edilmiş Bacillus soylarının alfa amilaz genleri iki PCR basamağı kullanılarak ligaz bağımlı olmayan bir yöntemle klonlandı ve E. coli'de eksprese edildi. Elde edilen klonlardan, en yüksek alfa amilaz aktivitesine sahip olanı enzim saflaştırma ve nitelendirme çalışmalarına alındı. Rekombinant enzim % 22 verimle 16 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin biyokimyasal nitelendirme çalışmaları sonucu, enzimin 70oC'ta ve pH 6.0'da optimal aktivite gösterdiği görüldü. Rekombinant alfa amilaz,pH 5.0-12.0 aralığında ve 70oC'a kadar olan sıcaklıklarda kararlılık gösterdi.2-merkapto etanolün enzimin 50oC'taki kararlılığını arttırdığı, bununla birlikte 10 mM EDTA ve PMSF, % 30 gliserol, etilen glikol ve DMSO'nun enzimi inhibe ettiği görüldü.

Anahtar Kelimeler: α-amilaz, Bacillus, Ligaz-bağımlı Olmayan Klonlama, 
Saflaştırma, Biyokimyasal Nitelendirme.

Abstract:
Alpha amylase (EC 3.2.1.1) is one of the most important industrial enzymes which catalyze the hydrolysis of alpha-1,4 glycosidic bonds in starch components and related carbohydrates, yielding oligosaccharides and glucose as end products. Amylases constitute a class of industrial enzymes representing approximately 30 % of the world enzyme production. They have wide number of applications in food, textile, paper, detergent and pharmaceutical industries. Although amylases can be derived from a several sources, including plants, animals and microorganisms, microbial enzymes generally have been preferred to industrial applications. In this work, the alpha amylase genes from Bacillus strains which have been isolated from various sources in Turkey was cloned with a ligase-independent method via two-step PCR and expressed in Escherichia coli. Among the clones, higher alpha amylase producing strain was selected for enzyme purification and characterization studies. The recombinant enzyme was purified ~16 fold with 22 % yield. Biochemical characterization studies of purified enzyme showed that the enzyme had an optimal activity at 70oC and at pH 6.0. The amylase was stable at pHs ranging from 5.0 to 12.0 and temperature up to 70oC. 2-ME was increased the stability of the enzyme at 50 oC. However, it can be partially inhibited by 10 mM EDTA and PMSF, as well as 30 % of glycerol, ethylene glycol and DMSO.
 
Keywords: α-amylase, Bacillus, Ligase-independent Cloning, Purification, 
Biochemical Characterization