Pankreas nöroendokrin tümörlerinde proliferasyon indeksinin değerlendirilmesinde dijital patolojinin önemi
The importance of digital pathology in the evaluation of proliferation index in pancreas neuroendocrine tumors
Yazar: INGA ADANIR
Danışman: PROF. DR. BERNA SAVAŞ
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Patoloji = Pathology

Özet:
Amaç: Çalışmamızda, pankreasın nöroendokrin tümörlerinde diferansiyasyonun belirlenmesi ve gradeleme yapılabilmesi için gerekli olan Ki67 proliferasyon aktivite indeksinin üç ayrı sayım yöntemi kullanılarak hesaplanması ve rutin uygulamada hangi yöntemin daha uygun olacağının belirlenmesi hedeflenmiştir. Ayrıca pankreatik nöroendokrin tümörlerin anatomik lokalizasyon, histomorfolojik özellikler ile ilişkisinin gösterilmesi ve bunların prognoz üzerindeki etkilerini araştırmak amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Ocak 2000 – Ağustos 2023 tarihleri arasında pankreatik nöroendokrin neoplazi ön tanısı ile ameliyat edilen ve bölümümüzde yapılan histopatolojik inceleme ve immünhistokimyasal değerlendirme sonucunda nöroendokrin tümör veya karsinom tanısı alan hastalar Avicenna programı üzerinden taranmıştır. Buna göre pankreas kaynaklı endokrin tümör olguları değerlendirmeye alınmıştır. Dahil edilme kriterlerine sahip olan olgulara ait bölümümüz arşivinde bulunan hematoksilen-eozin kesitleri, nöroendokrin belirteç (Sinaptofizin ve Kromogranin A) ve Ki67 boyalı immünhistokimyasal kesitler yeniden değerlendirmeye alınmıştır.
Daha önce hematoksilen ve eozin ile boyanmış preparatları değerlendirirken, tanıyı doğrulamak için gerekli mitoz sayısı da dahil olmak üzere pankreas nöroendokrin neoplazisinin histomorfolojik özellikleri tanımlanmıştır.
İmmünohistokimyasal olarak boyanmış kesitler, önce ışık mikroskobunda incelenecek, Ki67 proliferasyon indeksi ışık miroskobunda boyanmanın yoğun olduğu "hot spot" alanlarda x40 büyütme ile 2000 tümör hücresinde pozitif nükleer boyanan tümör hücreleri sayılarak hesaplanmıştır.
İkinci olarak sayım x40 objektifli 3DHistech Pannoramic Scanner (P250 Flash III) kullanılarak yapılmıştır. Ki67 immünhistokimya boyalı kesitler 3DHistech Pannoramic Scanner (P250 Flash III)'da taranmıştır. Taranan slayt görüntüleri üzerinde patolog tarafından manuel olarak en yüksek Ki67 immünoreaktivite yoğunluğuna sahip alanlar ("hot spot"), 400x büyütmede seçilmiştir. Bu alanların yarı otomatik dijital analiz softwere (Case Viewer 2.5 rtm) kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntü formatında dışa aktarılması yapılmıştır. Tüm olgular için Ki67 immünoreaktivitesi, pozitif tümör hücrelerinin sayısının minimum 2000 toplam tümör hücresine bölünmesiyle verilen nükleer boyanan tümör hücrelerinin yüzdesi olarak ifade edilmiştir.
Daha sonra patolog tarafından seçilen aynı sıcak nokta alanlarını otomatik program (Quant Center, Cell Quant rejim) değerlendirecek ve ardından yüzde olarak ifade edilen, pozitif olarak boyanmış hücrelerin sayısı ve toplam hücre sayısının sonucundan oluşacak olan sonucu verilmiştir.
Toplam 87 Pankreatik nöroendokrin neoplazi olgusunun değerlendirilmesi yapılmıştır. Hastaların yaş, cinsiyet, ameliyat türü, tanı, evre, tümör lokalizasyonu, tümör boyutu, cerrahi rezeksiyon alanında tümör varlığı, nekroz varlığı, lenfovasküler ve/veya perinöral invazyon varlığı, lenf nodu metastazı ve uzak metastaz varlığı değerlendirilecek, hastalara ait gibi klinik bilgiler "Hastane Bilgi Sistemi" sisteminden elde edilmiştir. Tanıları doğrulamak veya değiştirmek için seçilen hematoksilen-eozin boyalı kesitler en son 2017 Dünya Sağlık Örgütü Endokrin sınıflandırmasına göre yeniden belirlenmiştir.
Bulgular: Çalışmaya yaş ortalaması 51,6 olan 52 kadın (%59,8) ve 35 (%40,2) erkek hasta dahil edildi. Tüm vakaların tanı anındaki ortalama yaşı 51,60 olarak bulundu. Yaş aralığı 24-83 yaş arasında değişmekteydi. Işık mikroskopla manuel Ki67 sayma yöntemi ile 25 G1 PNET olgusu, 43 G2 PNET olgusu ve 19 G3 PNET ve PNEK olgusu tanımlandı. Dijital görüntü üzerinde manuel değerlendirmede, 32 olgu G1 PNET, 36 olgu G2 PNET ve 19 olgu G3 PNET ve PNEK olarak değerlendirildi. Dijital görüntüde otomatik değerlendirmede, 23 olgu G1 PNET, 32 olgu G2 PNET ve 19 olgu G3 PNET ve PNEK olarak değerlendirildi Çalışmamızda her olgu için ışık mikroskopla manuel değerlendirme, dijital görüntü üzerinde manuel değerlendirme ve dijital görüntüde otomatik değerlendirme olmak üzere üç farklı yöntemle elde edilen Ki67 proliferasyon indeksi sonuçları arasındaki uyum değerlendirildi. İstatistiksel olarak sınıf içi korelasyon katsayısı (Intraclass Correlation Coefficient-ICC) 0,964 ile 0,983 (ortalama 0,975) arasında saptandı. Ki67 proliferasyon indeksini hesaplamaya yönelik üç yöntemin arasında yüksek düzeyde bir korelasyon olduğu görüldü. Çalışmamızda kullanılan Ki67 proliferatif indeksi hesaplama yöntemlerinin sonuçlarının birbiri ile istatistiksel olarak anlamlı ve uyumlu olduğu tespit edildi (p<0,0001). Ki67 sonuçları ile tümör derecesinin belirlenmesinde dijital görüntüde otomatik değerlendirme ve dijital görüntü üzerinde manuel değerlendirme yöntemleri kullanıldığında, tümör derecesinin daha düşük tespit edildiği; ışık mikroskopla manuel hesaplama yöntemi kullanıldığında ise tümör derecesinin daha yüksek belirlendiği görüldü.
Mitoz sayısına ilişkin elde edilen sonuçlar ile ışık mikroskobunda değerlendirilen Ki67 proliferatif indeks sonuçları karşılaştırıldığında mitoz sayısı ile Ki67 arasında yüksek bir korelasyon bulunduğu saptandı (p<0,0001).
Karşılaştırmalı analizlerde, olgularda cinsiyet (p<0,05), tümör sınırları (p<0,001), TNM evresi (p<0,001), histolojik patern (p<0,001), nekroz varlığı (p<0,05), mitoz sayısı (p<0,001), ek invazyon varlığı (p<0,001), PNİ (p<0,05), LVİ  (p<0,001), metastatik LN (p<0,05) ve uzak metastaz (p<0,001) varlığı açısından istatistiksel farklılıklar olduğunu saptandı (p<0,05). Yaşı, tümörün fonksiyonel olması veya sendromik tümör varlığı, tümör lokalizasyonu, pozitif cerrahi sınır ve tümör boyutunun istatistiksel olarak anlamlı olmadığı görüldü (p>0.05).
Düşük ve orta dereceli PNEN olgularında ortalama yaşam süresinin tanıdan sonra 160 ay olduğu belirlendi. NET derece 3 olgularda ortalama yaşam süresinin tanıdan sonra 18 ay olduğu saptandı. Az diferansiye NEK tanısı olan hastaların ortalama yaşam süresinin tanıdan sonra 25 ay olduğu belirlendi.
Sonuç: Çalışmamız grade 1 ve 2 PNET'lerde kadın baskınlığını; grade 3 PNET'lerde ve PNEK'de ise erkek baskınlığını ortaya çıkardı. Çalışmamızda yer alan 14 hastada (%16) PNEK tanısı bulunmakta ve bu hastalarda ortalama yaşın 54 olduğu saptandı. Çalışmamızda 79 (%95,41) tümör sporadikti. 4 (%4,59) kalıtsal sendrom vakası tespit edildi. Çalışmamızda 13 (%85) fonksiyonel tümör vakası belirlendi.
Çalışmamızda Ki67 proliferatif indeksi ve mitoz sayısı sonuçlarına göre evreleme sonuçları karşılaştırıldığında yüksek bir korelasyon bulunduğu görüldü. Çalışmamızda Ki67 proliferatif indeksi değerlendirirken üç sayma yöntemini (ışık mikroskobu kullanılarak manuel sayma, dijital görüntü kullanılarak manuel sayma ve otomatik program) kullanıldı ve ICC ortalaması 0,975 olarak saptandı.  Sonuçta Ki67 proliferasyon indeksini hesaplamaya yönelik üç yöntem arasında yüksek düzeyde bir korelasyon bulunduğu görüldü.
PNEN'in differansiyasyon derecesini etkileyen parametreleri değerlendirirken 9 parametre tanımlandı: morfolojik diferansiyasyonun kaybı, tümör sınırlarının karakteri, komşu dokulara/organlara invazyon varlığı, nekroz varlığı, mitoz sayısı, lenfovasküler ve perinöral invazyon varlığı, lenf nodülerinde ve/veya uzak organlarda metastaz. Hastanın yaşı, fonksiyonel tümör veya sendromik tümör varlığı, tümör lokalizasyonu, pozitif cerrahi sınır ve tümör boyutu parametreleri PNEN farklılaşmasının tanımıyla bir ilişki göstermedi.
Genel sağkalım değerlendirilirken, cerrahi rezeksiyondan sonraki ortalama sürenin, PNET grade 1 ve PNET grade 2'nin, PNET grade 3 ve PNEK grade 3'e kıyasla yüksek bir genel sağkalım gösterdiği ortaya çıktı.  PNET grade 3 ve PNEK grade 3'nün genel sağkalım karşılaştırıldığında, benzer değerlere rağmen PNEK grade 3, PNET grade 3'ye göre daha yüksek genel sağkalım gösterdi.
Çalışmamızın sonuçları, Ki67 proliferatif indeksinin belirlenmesinde dijital görüntü üzerinde otomatik sayıma dayanan programların, PNEN tanısı ve sınıflaması için rutin uygulamada kullanılabileceğini gösterilmiştir. Bununla birlikte; her üç yöntem kullanılarak yapılan değerlendirmede, pozitif boyanan hücrelerin tümör hücresi olduğundan emin olunarak sayım yapılmasının sonucu değiştirebileceği de göz önünde bulundurulmalıdır.

Anahtar Kelimeler: Pankreas, Nöroendokrin Neoplazi, Ki67,  Dijital analiz

Abstract:
Aim: In our study, it was aimed to calculate the Ki67 proliferation activity index, which is necessary for determining the differentiation and grading in neuroendocrine tumors of the pancreas, using three separate counting methods and to determine which method would be more appropriate in routine practice. In addition, it was aimed to show the relationship between pancreatic neuroendocrine tumors and their anatomical localization, histomorphological features and to investigate their effects on prognosis.
Materials and methods: Patients who underwent surgery with the preliminary diagnosis of pancreatic neuroendocrine neoplasia between January 2000 and August 2023 and were diagnosed with neuroendocrine tumor or carcinoma as a result of the histopathological examination and immunohistochemical evaluation performed in our department were scanned through the Avicenna program. Accordingly, cases of endocrine tumor originating from the pancreas were evaluated. Hematoxylin-eosin sections, neuroendocrine marker (Synaptophysin and Chromogranin A) and Ki67 stained immunohistochemical sections in our department's archives of cases that met the inclusion criteria were re-evaluated.
When evaluating preparations previously stained with hematoxylin and eosin, histomorphological features of pancreatic neuroendocrine neoplasia were described, including the number of mitoses required to confirm the diagnosis.
Immunohistochemically stained sections will first be examined under a light microscope, and the Ki67 proliferation index was calculated by counting tumor cells with positive nuclear staining in 2000 tumor cells at x40 magnification in the hot spots where staining is intense in the light microscope.
Secondly, counting was done using 3DHistech Pannoramic Scanner (P250 Flash III) with x40 objective. Ki67 immunohistochemistry stained sections were scanned in 3DHistech Pannoramic Scanner (P250 Flash III). The areas with the highest Ki67 immunoreactivity intensity ("hot spots") were manually selected by the pathologist on the scanned slide images at 400x magnification. These areas were exported in high resolution image format using semi-automatic digital analysis software (Case Viewer 2.5 rtm). For all cases, Ki67 immunoreactivity was expressed as the percentage of nuclear-staining tumor cells given by the number of positive tumor cells divided by a minimum of 2000 total tumor cells.
Then the automatic program (Quant Center, Cell Quant regime) will evaluate the same hotspot areas selected by the pathologist, and then the result will be given, which will consist of the number of positively stained cells and the total number of cells, expressed as a percentage.
A total of 87 cases of pancreatic neuroendocrine neoplasia were evaluated. Patients' age, gender, surgery type, diagnosis, stage, tumor localization, tumor size, presence of tumor in the surgical resection area, presence of necrosis, presence of lymphovascular and/or perineural invasion, lymph node metastasis, and distant metastasis are evaluated. Clinical information such as that of the patients was obtained from the "Hospital Information System" system. To confirm or modify diagnoses, selected hematoxylin-eosin stained sections were redetermined according to the latest 2017 World Health Organization Endocrine classification.
Results: The study included 52 female (59.8%) and 35 (40.2%) male patients with an average age of 51.6 years. The age range ranged from 24 to 83 years. 
25 G1 PNET cases, 43 G2 PNET cases and 19 G3 PNET and PNEC cases were identified by manual Ki67 counting method with a light microscope. In manual evaluation on digital images, 32 cases were evaluated as G1 PNET, 36 cases as G2 PNET, and 19 cases as G3 PNET and PNEC. In automatic evaluation on digital images, 23 cases were evaluated as G1 PNET, 32 cases as G2 PNET, and 19 cases as G3 PNET and PNEC.
When the results obtained regarding the number of mitosis were compared with the Ki67 proliferative index results evaluated under the light microscope, a high correlation was found between the number of mitosis and Ki67 (p<0.0001). In our study, the consistency between the Ki 67 proliferation index results obtained by three different methods for each case: manual evaluation with a light microscope, manual evaluation on a digital image, and automatic evaluation on a digital image was evaluated. Statistically, the intraclass correlation coefficient (ICC) was determined between 0.964 and 0.983 (average 0.975). There appeared to be a high level of correlation between the three methods for calculating the Ki67 proliferation index. The results of the Ki67 proliferative index calculation methods used in our study were found to be statistically significant and compatible with each other (p<0.0001). When automatic evaluation on the digital image and manual evaluation methods on the digital image were used to determine the tumor degree with Ki67 results, the tumor degree was detected to be lower; It was observed that the tumor grade was determined higher when the manual calculation method was used with a light microscope.
In comparative analyses, it was determined that there were statistical differences in gender (p<0.05), tumor borders (p<0.001), TNM stage (p<0.001), histological pattern (p<0.001), presence of necrosis (p<0.05), number of mitosis ( p<0.001), presence of additional invasion (p<0.001), PNI (p<0.05), LVI (p<0.001), metastatic LN (p<0.05) and distant metastasis (p<0.001). Age, functional tumor or syndromic tumor presence, tumor localization, positive surgical margin and tumor size were not statistically significant (p>0.05). The average life expectancy in low and moderate PNEN cases was determined to be 160 months after diagnosis. The average survival time in NET grade 3 cases was found to be 18 months after diagnosis. The average life expectancy of patients diagnosed with poorly differentiated NEC was determined to be 25 months after diagnosis.
Conclusions: In our study, female predominance in grade 1 and 2 PNETs; It revealed male predominance in grade 3 PNETs and PNEC. In our study, 14 patients (16%) were diagnosed with PNEC and the average age was found to be 54 years. In our study, 79 (95.41%) tumors were sporadic. 4 (4.59%) cases of hereditary syndrome were detected. In our study, 13 (85%) functional tumor cases were identified. 
In our study, a high correlation was observed when staging results were compared according to Ki67 proliferative index and mitotic count results. 
In our study, three counting methods (manual counting using a light microscope, manual counting using a digital image and automatic program) were used to evaluate the Ki67 proliferative index, and the ICC average was found to be 0.975. As a result, it was observed that there was a high level of correlation between the three methods for calculating the Ki67 proliferation index. 
When evaluating the parameters affecting the degree of differentiation of PNEN, 9 parameters were defined: loss of morphological differentiation, character of tumor borders, presence of invasion into neighboring tissues/organs, presence of necrosis, number of mitosis, presence of lymphovascular and perineural invasion, metastasis in lymph nodes and/or distant organs. The patient's age, presence of functional tumor or syndromic tumor, tumor localization, positive surgical margin, and tumor size parameters did not show a relationship with the definition of PNEN differentiation.
When evaluating overall survival, the median time after surgical resection revealed that PNET grade 1 and PNET grade 2 showed a high overall survival compared to PNET grade 3 and PNEC grade 3. When the overall survival of PNET grade 3 and PNEC grade 3 was compared, PNET grade 3 showed higher overall survival than PNEC grade 3, despite similar values.
The results of our study show that programs based on automatic counting on digital images in determining the Ki67 proliferative index can be used in routine practice for the diagnosis and classification of PNENs.
With this; In the evaluation made using all three methods, it should be taken into consideration that counting the positively stained cells to ensure that they are tumor cells may change the result.

Keywords: Pancreas, Neuroendocrine Neoplasia, Ki67, Digital analysis