Farklı sentetik polimerler ile kaplanan manyetik demir oksit (manyetit) nanopartiküllerinin sitotoksik ve genotoksik etkilerinin araştırılması
Investigation of cytotoxic and genotoxic effects of magnetic iron oxide (magnetite) nanoparticles coated with different synthetic polymers
Yazar: BURÇİN YALÇIN
Danışman: PROF. DR. BÜLENT KAYA
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Manyetik nanopartiküllerin (NP'lerin) medikal alanlarda kullanımlarının sağladığı avantajlarının yanında bu materyallerin çevre ve insan sağlığına karşı gösterebilecekleri potansiyel toksik etkileri endişe yaratmaktadır. Biyouyumlulukları bilinen bu materyallerin potansiyel toksisitesi hakkında literatürde kısıtlı bilgi bulunmaktadır. Bu bağlamda, çalışmada manyetik demir oksit (Fe3O4) NP'lerinin kaplamasız ve sentetik polimerlerden olan poli etilen glikol (PEG), poli vinil alkol (PVA) ve poli vinil prolidon (PVP) ile kaplanmış formlarının olası toksik etkilerinin farklı test sistemleri ile in vitro ve in vivo olarak araştırılması hedeflenmiştir. 
In vivo çalışmalarda Drosophila kanat somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) ve alkali tek hücre jel elektroforezi testi (KOMET) yöntemleri ile kaplamasız ve kaplamalı Fe3O4 NP'lerin potansiyel genotoksisitesi araştırılmıştır. Ayrıca indüklenen oksidatif DNA hasarının analizi için modifiye edilmiş enzim KOMET, indüklenen süperoksit radikal ölçümü için nitroblue tetrazolium redüksiyon (NBT) analizi, indüklenen apoptotik etkinin ölçümü için kaspaz aktiviteleri (kaspaz 3/7, 8 ve 9) deneyi, larva bağırsaklarında hücre ve doku hasarının belirlenmesi için tripan mavisi deneyi gerçekleştirilmiştir. Bunlara ek olarak Drosophila'da DNA tamir gen ifadelerinin araştırılması amacıyla gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT2-PCR) yöntemi ile 36 genin ifadeleri araştırılmış ve in silico yaklaşımla da desteklenmiştir. SMART sonuçlarına göre sadece kaplamasız Fe3O4 NP'lerinin ve PVA- Fe3O4 NP'lerinin en yüksek konsantrasyonunda (1500 μg/ml) toplam klon bakımından istatistiksel olarak anlamlı genotoksisiteye neden olduğu belirlenmiştir. Drosophila hemositlerinde gerçekleştirilen KOMET sonuçlarına göre sadece PEG- Fe3O4 NP ve PVP- Fe3O4 NP'lerinde 500, 1000 ve 1500 μg/ml konsantrasyonlarda DNA hasarının arttığı gözlenmiştir. Enzim KOMET sonuçlarına göre ise sadece PEG kaplı Fe3O4 NP'lerinin çalışılan yüksek konsantrasyonlarda % DNA hasarını FPG uygulanan grupta anlamlı düzeyde arttırdığı bulunmuştur. Bu durum oluşan oksidatif hasarın pürin bazlarında olduğu sonucuna işaret etmektedir.  Fe3O4 NP'lerinin 1000 ve 1500 μg/ml, PVA- Fe3O4 NP 1500 μg/ml ve PVP- Fe3O4 NP 1000 μg/ml konsantrasyonda kaspaz 9 aktivitesinin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde arttığı belirlenmiştir. NBT analizinde PVP- Fe3O4 NP'lerinin en yüksek konsantrasyonunda ROS miktarının arttığı belirlenmiştir. Ayrıca Drosophila larva bağırsaklarında doku hasarının en çok PVP- Fe3O4 NP'lerinde olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Gen aktivasyonunun incelendiği RT2-PCR analizinde kaplamasız Fe3O4 NP'lerin her iki konsantrasyonunun (250 ve 1500 μg/ml) uygulamasından sonra ortak olarak Xpac, Cdk7, PCNA, DNApol-eta, Rad51C, dap, vtd ve stg genlerinin ifadesinde istatistiksel olarak anlamlı artış gözlenmiştir. PVA- Fe3O4 NP'lerin 1500 µg/ml'de kaplamasız Fe3O4 NP'lerindeki gibi ifadesi artan genlerin pek çoğunun ortak (Xpac, Fen1, mus101, Cdk7, PCNA, DNApol-eta, XRCC1, Rad51C, Hus1-like, p53, dap, DNA-ligl, vtd, mei-41, Pms2 ve stg) olduğu belirlenmiştir. PEG- Fe3O4 NP'lerin 250 µg/ml'de kaplamasız Fe3O4 NP'lerine benzer şekilde Xpac, Cdk7, PCNA, DNApol-eta, Rad51C, dap, vtd ve stg genlerinin ifadesi anlamlı düzeyde artmıştır. Bunun aksine 1500 µg/ml'de ifadesi artan gen bulunmamış sadece Ogg1 ve RpLP2 genlerinin ifadesinde anlamlı bir azalış görülmüştür. PVP- Fe3O4 NP'lerin uygulamasından sonra kaplamasız Fe3O4 NP'lerine göre ifadesi artan gen sayısında azalma olsa da benzer şekilde Xpac, Cdk7, PCNA, Rad51C, dap ve stg genlerinin ifadesi anlamlı düzeyde artmıştır. Bu genler, yapılan in silico yaklaşım sonucuna göre, %40.72 tahmini etkileşim (genler ve proteinler arasındaki ilişki), %36.09 birlikte ekspresyon (ifadeleri benzer), %7.43 paylaşılan protein domaini (aynı protein alanına bağlı), %6.72 fiziksel etkileşim (protein-protein etkileşimleri), %4.57 birlikte lokalizasyon (aynı hücresel lokalizasyonda tanımlanan aynı doku ve gen ürünleri) ve %4.48 genetik etkileşim (işlevsel olarak ilişkili) göstermektedir. Ayrıca RT2-PCR sonucuna göre ifadesi değişen genlerle ilişkili bulunan genlerin 15 tanesi DNA metabolik süreçlerde (GO:006259), 10 tanesi DNA tamirinde (R-DME-73894), 23 tanesi hücre döngüsünde (GO:0007049 ve R-DME-16401), 6 tanesi DNA rekombinasyonunda (GO:0006310), 4'er tanesi fanconi anemisi yolağında (dme03460) ve UV yanıt olarak (GO:0009411) ve 3'er tanesi de DNA replikasyonu (GO:0006261), homolog rekombinasyon (dme03440) ve p53-bağımlı hasar yolağında (R-DME-69563) bulunmaktadır.
In vitro çalışmalarda HUVEC hücrelerinde WST-1 hücre canlılık testi ve tripan mavisi testi ile kaplamasız ve kaplamalı Fe3O4 NP'lerin sitotoksik etkileri araştırılmıştır. Ayrıca potansiyel genotoksisitesi için KOMET yöntemi ve modifiye edilmiş enzim KOMET yöntemi ve apoptotik etkinin ölçümü için kaspaz aktiviteleri (kaspaz 3/7, 8 ve 9) deneyi gerçekleştirilmiştir. Tripan sonuçlarına göre kaplamasız Fe3O4 NP'lerinin üç inkübasyon süresinde (24, 48 ve 72 saat) de en yüksek konsantrasyonda (500 µg/ml) sitotoksisitenin indüklendiği görülmüştür. PVA- Fe3O4 NP'lerinin 24 saatlik inkübasyonda sitotoksik etki gözlenmezken inkübasyon süresi arttıkça düşük konsantrasyonlarda sitotoksik etkinin arttığı gözlenmiştir. PEG- Fe3O4 NP'lerinin ve PVP- Fe3O4 NP'lerinin 72 saatlik inkübasyonda sitotoksik etkinin ortaya çıktığı gözlenmiştir. WST-1 deneyinden elde edilen sonuçlarda kaplamasız Fe3O4 NP'leri inkübasyon süresi arttıkça artan konsantrasyonla birlikte hücre canlılığında istatiksel olarak anlamlı düzeyde azalma görülmüştür. PVA- Fe3O4 NP'lerinde ise 24 ve 72 saatlik inkübasyon sürelerinde yüksek konsantrasyonlarda (300 ve 500 μg/ml) hücre canlılığında istatiksel olarak anlamlı düzeyde azalma görülmüştür. PEG- Fe3O4 NP'lerinde genel olarak hücre canlılığında istatiksel olarak anlamlı düzeyde azalma görülmemiştir. PVP- Fe3O4 NP'lerinde tüm inkübasyon sürelerinde ve konsantrasyonlarda hücre canlılığında istatiksel olarak anlamlı düzeyde azalma görülmemiştir. KOMET sonuçlarına göre kaplamasız Fe3O4 NP'lerinde yüksek konsantrasyonlarında DNA hasarını istatistiksel olarak anlamlı düzeyde indüklendiği gösterilmiştir. PVA- Fe3O4 NP'leri ise % DNA bakımından DNA hasarı anlamlı düzeyde indüklenmemiştir. PEG- Fe3O4 NP'lerinde ve PVP- Fe3O4 NP'lerinde DNA hasarının konsantrasyona bağlı olarak arttığı gösterilmiştir. Enzim KOMET sonuçlarına göre kaplamasız ve kaplamalı Fe3O4 NP'lerinin uygulamasında FPG enziminde yüksek hasar gözlenmiştir. Bu durum oluşan oksidatif hasarın pürin bazlarında olduğu sonucuna işaret etmektedir.  Kaspaz aktiviteleri ölçümünde ise PVA- Fe3O4 NP ve PEG- Fe3O4 NP'lerinde düşük konsantrasyonlarda tüm kaspaz gruplarının aktivitelerinde istatistiksel olarak anlamlı artış gözlenmiştir. Tüm gruplarda Kaspaz- 3/7, 8 ve 9 aktivitelerinin birbiriyle paralel bir şekilde değiştiği görülmüştür.

Abstract:
Despite the advantages of using magnetic nanoparticles in medical areas, the potentially toxic effects of these materials on the environment and human health are a concern. There is limited information in the literature about the potential toxicity of this material, whose biocompatibility is known. In this context, it was aimed to investigate the possible toxic effects of magnetic Fe3O4 NPs and coated with uncoated and synthetic polymers polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), and polyvinyl pyrrolidone (PVP) in vitro and in vivo with different test systems.
In vivo studies investigated the potential genotoxicity of uncoated and coated Fe3O4 NPs by Drosophila wing somatic mutation and recombination test (SMART) and alkaline single cell gel electrophoresis test (COMET). In addition, a modified enzyme COMET assay for the analysis of induced oxidative DNA damage, nitroblue tetrazolium reduction (NBT) assay for the measurement of induced superoxide radical, caspase activities (caspase 3/7, 8 and 9) assay for the measurement of induced apoptotic effect, trypan blue assay for the determination of cell and tissue damage in larval intestines were performed. In addition, in order to investigate DNA repair gene expressions in Drosophila, the expressions of 36 genes were investigated by real-time polymerase chain reaction (RT2-PCR) method and supported by in silico approach. According to SMART results, only uncoated Fe3O4 NPs and the highest concentration of PVA-Fe3O4 NPs (1500 μg/ml) caused statistically significant genotoxicity in terms of total clones. According to the COMET results in Drosophila hemocytes, it was observed that DNA damage increased only in PEG-Fe3O4 NPs and PVP-Fe3O4 NPs at concentrations of 500, 1000 and 1500 μg/ml. According to the enzyme KOMET results, it was found that only PEG-coated Fe3O4 NPs significantly increased the % DNA damage in the FPG-treated group at the high concentrations studied. This indicates that the oxidative damage occurred in purine bases. It was determined that caspase 9 activity increased statistically significantly at concentrations of 1000 and 1500 μg/ml of Fe3O4 NPs, 1500 μg/ml of PVA- Fe3O4 NP and 1000 μg/ml of PVP- Fe3O4 NP. In NBT analysis, it was determined that the amount of ROS increased at the highest concentration of PVP-Fe3O4 NPs. In addition, it was concluded that tissue damage in Drosophila larval intestines was mostly observed in PVP-Fe3O4 NPs. In RT2-PCR analysis of gene activation, a statistically significant increase in the expression of Xpac, Cdk7, PCNA, DNApol-eta, Rad51C, dap, vtd and stg genes was observed after the application of both concentrations (250 and 1500 μg/ml) of Fe3O4 NPs. It was determined that most of the genes whose expression increased in PVA-Fe3O4 NPs at 1500 µg/ml as in uncoated Fe3O4 NPs were common (Xpac, Fen1, mus101, Cdk7, PCNA, DNApol-eta, XRCC1, Rad51C, Hus1-like, p53, dap, DNA-ligl, vtd, mei-41, Pms2 and stg). The expression of Xpac, Cdk7, PCNA, DNApol-eta, Rad51C, dap, vtd and stg genes were significantly increased in PEG-Fe3O4 NPs at 250 µg/ml, similar to uncoated Fe3O4 NPs. On the contrary, there were no genes whose expression increased at 1500 µg/ml, only a significant decrease in the expression of Ogg1 and RpLP2 genes was observed. Although there was a decrease in the number of genes whose expression increased after the application of PVP-Fe3O4 NPs compared to uncoated Fe3O4 NPs, the expression of Xpac, Cdk7, PCNA, Rad51C, dap and stg genes increased significantly. These genes show 40.72% predicted interaction (relationship between genes and proteins), 36.09% co-expression (similar expression), 7.43% shared protein domain (linked to the same protein domain), 6.72% physical interaction (protein-protein interactions), 4.57% co-localization (same tissue and gene products identified in the same cellular localization) and 4.48% genetic interaction (functionally related) according to the in silico approach. In addition, according to RT2-PCR results, 15 of the genes associated with genes whose expression changed according to RT2-PCR results were found to be involved in DNA metabolic processes (GO:006259), 10 in DNA repair (R-DME-73894), 23 in cell cycle (GO:0007049 and R-DME-16401), 6 in DNA recombination (GO: 0006310), 4 each in the fanconi anemia pathway (dme03460) and UV response (GO:0009411) and 3 each in DNA replication (GO:0006261), homologous recombination (dme03440) and p53-dependent damage pathway (R-DME-69563).
In vitro, the cytotoxic effects of uncoated and coated Fe3O4 NPs were investigated by WST-1 cell viability assay and trypan blue assay in HUVEC cells. In addition, COMET method and modified enzyme COMET method for potential genotoxicity and caspase activities (caspase 3/7, 8 and 9) assay were performed to measure the apoptotic effect. According to the trypan results, the highest concentration (500 µg/ml) of uncoated Fe3O4 NPs induced cytotoxicity at all three incubation times (24, 48 and 72 hours). While no cytotoxic effect was observed at 24 h incubation of PVA-Fe3O4 NPs, it was observed that the cytotoxic effect increased at low concentrations as the incubation time increased. The cytotoxic effect of PEG-Fe3O4 NPs and PVP-Fe3O4 NPs was observed at 72 hours of incubation. In the results obtained from the WST-1 experiment, uncoated Fe3O4 NPs showed a statistically significant decrease in cell viability with increasing concentration as the incubation time increased. In PVA-Fe3O4 NPs, a statistically significant decrease in cell viability was observed at higher concentrations (300 and 500 μg/ml) at 24 and 72 hours incubation times. PEG-Fe3O4 NPs generally showed no statistically significant decrease in cell viability. PVP-Fe3O4 NPs showed no statistically significant decrease in cell viability at all incubation times and concentrations. According to the COMET results, it was shown that high concentrations of uncoated Fe3O4 NPs induced DNA damage at a statistically significant level. PVA-Fe3O4 NPs did not induce DNA damage at a significant level in terms of % DNA. DNA damage was shown to increase in PEG-Fe3O4 NPs and PVP-Fe3O4 NPs in a concentration-dependent manner. According to the enzyme COMET results, high damage to the FPG enzyme was observed in the application of uncoated and coated Fe3O4 NPs. This indicates that the oxidative damage occurred in purine bases.  In the measurement of caspase activities, statistically significant increases were observed in the activities of all caspase groups at low concentrations in PVA-Fe3O4 NPs and PEG-Fe3O4 NPs. Caspase-3/7, 8 and 9 activities changed in parallel with each other in all groups.