Fenoksodiol'ün 5-florourasil ve okzaliplatin ile uygulanmasının metastatik kolorektal kanser hücre hatlarında hücre ölüm cevabına etkisi
Apoptotic effect of the treatment with 5-fluorouracil and oxaliplatin followed by phenoxodiol treatment in metastatic colorectal cancer cell lines
Yazar: ESRA YAYLACI
Danışman: DOÇ. DR. ATİYE SEDA YAR SAĞLAM
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Fenoksodiol = Phenoxodiol ; Flüorourasil = Fluorouracil ; Hücre dizisi = Cell line ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Oksaliplatin = Oxaliplatin

Özet:
Kolorektal kanser (KRK) dünyada kadın ve erkeklerde gözlenen en yaygın kanser tiplerinden biridir. Kemoterapi çoğu ilerlemiş KRK'da ana rejim olarak sıklıkla kullanılır. Fenoksodiol (Pxd), doğal olarak oluşan bir bitki izoflavonu olan genisteinin sentetik bir analoğudur. In vitro ve in vivo çalışmalar, Pxd'nin bir dizi kanser için sitotoksik etkileri doğrudan ortaya çıkartmakla kalmayıp, aynı zamanda platin ve taksanlar gibi kemoterapötik ajanlara karşı dirençli olan kanser hücrelerini duyarlı hale getirdiğini göstermiştir. Bu çalışmada, KRK hücre serilerinde [yabanıl HCT-116 p53+/+ ve mutant HCT-116 p53-/-] belirli konsantrasyon ve sürelerde Pxd ön koşullamasının ardından 5-florourasil (5-Fu) ve okzaliplatin (Oxa)'in birlikte uygulanması sonucunda hücrelerde görülen olası apoptotik, antiproliferatif ve sitotoksik etkileri araştırmayı amaçladık. Pxd, 5-Fu ve Oxa'nın hücre canlılığı ve sitotoksik etkilerini belirlemek amacıyla sırasıyla 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromit (MTT) ve laktat dehidrojenaz (LDH) testleri uygulandı. Apoptotik ve nekrotik hücre oranları floresan mikroskop yöntemi ile belirlendi. Bunun yanı sıra ELISA yöntemi ile aktif Kaspaz-3 düzeyi ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) analizi ile apoptotik genlerin mRNA ifade düzeyleri belirlendi. KRK hücrelerine Pxd ön koşullamasının ardından 5-Fu ve Oxa'nın birlikte uygulamasının, 5-Fu ve Oxa'nın tek başlarına uygulanmaları karşılaştırıldığında anlamlı ölçüde hücre canlılığınının düştüğü ve apoptotik aktivitenin arttığı belirlendi. Buna ilaveten, Pxd ön koşullamasının ardından 5-Fu ve Oxa'nın birlikte uygulamasının, tek başına 5-Fu ve Oxa uygulamalarına göre Kaspaz 3 (CASP3) ve Kaspaz 9 (CASP9) genlerinin mRNA düzeylerini anlamlı ölçüde arttırdığı belirlendi. Bulgularımız diğer preklinik in vitro ve in vivo modeller ve klinik araştırmalar ile desteklenmelidir. Bulgularımıza göre, Pxd'nin ileri evre KRK'larda potansiyel aday bir ajan olabileceğini önermekteyiz.


Anahtar Kelimeler : Fenoksodiol, 5-Florourasil, okzaliplatin, apoptoz, kolorektal
 Kanser

Abstract:
Colorectal cancer (CRC) is one of the most common types of cancer seen in the world in both sexes. Chemotherapy is frequently used as the main regimen in most advanced CRCs. Phenoxodiol (Pxd) is a synthetic derivative of genistein, which is a naturally occurring plant isoflavone. In vitro and in vivo studies showed that Pxd not only directly elicited cytotoxic effects to a range of cancers, but also to sensitize chemoresistant cancer cells to chemotherapeutics including platinum and taxanes. In this study, we aimed to investigate possible apoptotic, antiproliferative and cytotoxic effects of Pxd preconditioning with 5-Fluorouracil (5-Fu) in combination with Oxaliplatin (Oxa) at specific doses and durations in CRC cell lines [wild type HCT-116 p53+/+ and mutant HCT-116 p53-/-]. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) tests were performed to determine the effects of Pxd, 5-Fu and Oxa on cell viability and cytotoxicity. The percentage of apoptotic and necrotic cells were determined by fluorescence microscopy analysis. Besides, active Caspase-3 levels by ELISA and relative mRNA levels of apoptotic genes were determined by quantitative Real-time PCR method (qPCR). The viability of CRC cells decreased significantly after treatment with 5-Fu and Oxa followed by Pxd treatments, compared to 5-Fu with Oxa alone. When compared to 5-Fu with Oxa alone treatment, Pxd pretreatment overwhelmingly increased apoptotic activity in CRC cells. Moreover, real-time PCR analyses showed that Caspase 3 (CASP3) and Caspase 9 (CASP9) mRNA levels increased after treatment with 5-Fu and Oxa followed by Pxd treatments, compared to 5-Fu with Oxa alone. Our findings are needed to confirmed by other preclinical in vitro and in vivo models and clinal trials. According to our results, we suggested that Pxd may be a potential candidate agent in advanced CRC.


Key words : Phenoxodiol, 5-Fluorouracil, oxaliplatin, apoptosis, colorectal
 Cancer