Primer anti-tüberküloz ilaçlara dirençli ve duyarlı mycobacterium tuberculosis  izolatlarında Pirazinamid direnci ile ilişkili PNCA, RPSA ve  PAND gen mutasyonlarının araştırılması
Investigation of PNCA, RPSA and PAND Gene mutations associated with pyrazinamide resistance in primary anti-tuberculosis drug resistant and susceptible mycobacterium tuberculosis isolates
Yazar: DİDEM ÖZGÜR
Danışman: PROF. DR. GÖNÜL ASLAN
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antitüberküloz ajanlar = Antitubercular agents ; Mutasyon = Mutation ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; Pirazinamid = Pyrazinamide ; Tüberküloz = Tuberculosis

Özet:
Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis)'in neden olduğu tüberküloz (TB) halen tüm dünyada sağlığı tehdit eden en önemli enfeksiyöz hastalıklardan biridir. Özellikle Çok İlaca Dirençli ve Yaygın İlaç Dirençli TB'nin ortaya çıkışı, TB kontrol faaliyetlerini ciddi ölçüde engellemektedir. TB tedavi rejiminde,  Rifampisin (RIF), İzoniyazid (INH), Pirazinamid (PZA) ve Etambutol (EMB) birinci seçenek ilaçlardır. PZA'nın persistan haldeki basilleri ortadan kaldırarak tedavi süresini 9-12 aydan 6 aya kısaltabilme yeteneği göz önüne alındığında bu rejimin önemli bir taşını oluşturduğu görülmektedir. PZA direncine neden olan temel mekanizma %70-97 oranında pncA mutasyonları iken, rpsA ve panD mutasyonlarının da dirence neden olduğu tespit edilmiştir. Ülkemizde PZA direncine neden olan gen mutasyonları ile ilgili sınırlı veriler bulunmaktadır. Yaptığımız bu çalışmada; PZA dirençli M.tuberculosis izolatlarında pncA, rpsA ve panD gen mutasyonlarının, Pirazinamidaz (PZAse) enzim testinin etkinliğinin, ilaç duyarlılıklarına göre PZA direnç oranlarının araştırılması ve izolatların ait oldukları kümelerin belirlenmesi amaçlanmıştır. 
Çalışmaya 46 PZA dirençli M.tuberculosis izolatı dahil edilmiştir. PZA direncine neden pncA, rpsA, panD mutasyonları in-house PZR yöntemi ile araştırılmıştır. İlaç duyarlılıkları Bactec MGIT 960 sistemi, PZAsevarlığı PZAse enzim testi, kümelerin belirlenmesinde Spoligotipleme yöntemikullanılmıştır. PZA dirençli M.tuberculosis izolatlarının %73,9'unda mutasyon tespit edilmiştir. İzolatların %71,7'sinde pncA, %28,2'sinde rpsA ve %4,3'ünde panD mutasyonu saptanmıştır. pncA geninde srasıyla en sık A226C, A152C ve C69G; rpsA geninde A636C ve G1318A; panD geninde C66G ve A145G mutasyonları saptanmıştır. PZAse enzim varlığı sadece 9 izolatta tespit edilmiştir. Spoligotiplendirme sonuçlarına göre izolatların en sık T1 kümesinde yer aldığı; bunu sırasıyla Beijing, H3, TUR ve LAM 9 ailelerinin takip ettiği görülmüştür.
Sonuç olarak yaptığımız bu çalışmada, PZA direncinin temel mekanizması olan pncA mutasyonunun prevalansı dünyanın diğer bölgelerinde bildirilen prevalans oranına benzer bulunmuştur. Ayrıca PZA direncinde yeni bir mekanizma olarak tanımlanan panD mutasyonu da tespit edilmiştir. PZA direnci ile ilgili epidemiyolojik araştırmalar, PZA direnç mekanizmasının aydınlatılmasında önemli katkılar sağlayacaktır.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is caused by Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), still one of the most common life-threatening infectious diseases worldwide. The emergence of drug resistant TB, particularly multidrug resistant and extensive drug resistant TB seriously hampers TB control activities.  Rifampicin (RIF), Isoniazid (INH), Pyrazinamide (PZA) and Ethambutol (EMB) are the first line drugs in TB treatment. Considering the PZA's unique ability to eradicate persister bacilli and decrease the treatment process from 9-12 months to 6 months, it's obvious the PZA forms a critical cornerstone of this regimen.The fundamental mechanism causing the PZA resistance (by 70-97%), is pncA mutation but rpsA and panD mutations are also determined to cause resistance. In our country the available data about genetic mutation causing PZA resistance is rather limited.In this study we aimed to investigate the pncA, rpsA and panD gene mutations of PZA resistant M.tuberculosis isolates, the effectiveness of the pyrazinamidase (PZAse) enzyme assay, PZA resistance rates according to drug susceptibility and to determine the clade of the isolates.
Totally 46 PZA resistant M.tuberculosis isolates were included in the study.  pncA, rpsA, panD mutations caused by PZA resistance were investigated by in-house PCRmethod. Drug susceptibility was determined with Bactec MGIT 960 system, the presence of PZAse evaulated by PZAse enzyme assay and the clades was determined by the Spoligotyping method.In PZA resistant M. tuberculosis isolates, 73,9% mutation was detected.pncA, rpsA and panD mutations were found in 71,7%, 28,2% and 4,3% of isolates, respectively. A226C, A152C and C69G mutations in the pncA gene; A636C and G1318A mutations in the rpsA gene; C66G and A145G mutations were detected in the panD gene. The presence of PZAse enzyme was detected only in 9 isolates. According to the spoligotypingresults, the most common isolates were found in T1 clade; followed by the families of Beijing, H3, TUR and LAM 9, respectively.
As a result of this study, the prevalence of pncA mutation, which is the main mechanism of PZA resistance, was found to be similar to the prevalence rates in other regions of the world. In addition, the panD mutation which was defined as a new mechanism in PZA resistance was detected. The epidemiological studies related to PZA resistance will contribute significantly to the clarification of PZA resistance mechanism.