Lactococcus lactis'te 4,6 alfa-glukanotransferaz enziminin hücre dışı rekombinant üretimi
Extracellular recombinant production of 4,6 alpha-glucanotransferase enzyme in Lactococcus lactis
Yazar: AYŞE BIYIKLI
Danışman: DOÇ. DR. ÖMER ŞİMŞEK
Pamukkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Gen klonlama = Gene cloning

Özet:
Laktik asit bakterileri (LAB) tarafından sentezlenen, GH70 enzim ailesi içinde karakterize edilmiş enzim olan 4,6 α-glukanotransferazlar (4,6-AGTaz), dünyada karbonhidrat kaynağı olarak selülozdan sonra en fazla miktarda bulunan nişasta ve maltodekstrinler üzerinde katalitik etkiye sahip olması açısından son yıllarda önem kazanmıştır. Bunun yanı sıra 4,6-AGTaz enziminin nişasta üzerindeki spesifik katalitik etkisinin olması teknolojik açıdan fonksiyonel amaçlı kullanılabileceğini de göstermektedir. Yapılan bu çalışmada 4,6-AGTaz enziminin heterolog hücre dışı rekombinant üretilmesi ve elde edilen enzimin aktivitesinin tespiti amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda Lactobacillus reuteri E81 suş genomunda 4,6-AGTaz enzimini kodlayan gtfB (4860 bç) geni, eritromisin dirençlilik geni ve usp45 sinyal serisini içeren pLEB825 plazmidine PnisA promotörü altına yerleşecek şekilde eklenmiştir. Elde edilen rekombinant plazmidin Lactococcus lactis NZ9000'e elektroporasyonu başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. 4,6-AGTaz enziminin ilk defa Lactococcus lactis'te in vitro üretimi, elde edilen rekombinant suş Lactococcus lactis PLAC39 ile başarılmıştır. Hücre dışı üretilen 4,6-AGTaz enziminin moleküler ağırlığının yaklaşık 160 kDa olduğu tespit edilmiştir. Saflaştırılan 4,6-AGTaz enziminin bulunduğu reaksiyonlarda maltodekstrin ve amiloz substratları varlığında çeşitli oligosakkaritlerinin oluştuğu ancak söz konusu enzimin maltoz ile reaksiyonları sonrasında çok çeşitli α-glukan yapılarının oluşmadığı TLC analizinde gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, 4,6-AGTaz enziminin endüstriyel üretimde kullanılmak üzere gıda güvenli üretici rekombinant Lactococcus lactis suşunun eldesi sağlanmıştır.

Abstract:
The enzyme 4,6 α-glucanotransferases (4,6-AGTase), which is characterized in the GH70 enzyme family synthesized by lactic acid bacteria (LAB), has gained importance in recent years in terms of its catalytic effect on starch and maltodextrins, which are the most carbohydrate source in the world, after cellulose. In addition, the fact that 4,6-AGTase enzyme has a specific catalytic effect on starch shows that it can be used technologically for functional purposes. In this study, it was aimed to produce heterologous extracellular recombinant of 4,6-AGTase enzyme and to determine the activity of the obtained enzyme. For this purpose, firstly, the gtfB gene (4860 bp) encoding the 4,6-AGTase enzyme in the Lactobacillus reuteri E81 strain genome was inserted into the pLEB825 plasmid containing the erythromycin resistance gene and the usp45 signal sequence, located under the PnisA promoter. Electroporation of the obtained recombinant plasmid to Lactococcus lactis NZ9000 has been successfully performed. The in vitro production of 4,6-AGTase enzyme in L. lactis was achieved for the first time with the obtained recombinant strain Lactococcus lactis PLAC39. The molecular weight of the extracellular 4,6-AGTase enzyme was found about 160 kDa. In the reactions involving the purified 4,6-AGTase enzyme, it was observed in TLC analysis that various oligosaccharides were formed in the presence of maltodextrin and amylose substrates, but no various α-glucan structures were formed after the reaction of the enzyme with maltose. As a result, a food-safe producer of recombinant Lactococcus lactis strain was obtained for use in industrial production of 4,6-AGTase enzyme.