Bacillus subtilis'ten hyaluronik asit üretim koşullarının optimizasyonu
Optimization of hyaluronic acid production conditions from Bacillus subtilis
Yazar: NOUHAN DOUMBOUYA
Danışman: PROF. DR. NURDAN PAZARLIOĞLU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Günümüzde, hyaluronik asit (HA) pazar piyasasının dünya genelinde 1 milyar doların üzerinde olduğu tahmin edilmektedir. Bu makromolekül, hücre davranışını etkilemekte ve vücutta kayda değer derecede yapısal, reolojik, fizyolojik ve biyolojik fonksiyonlara sahiptir. İmmünojenisite veya toksisiteye neden olmamasının yanı sıra sahip olduğu karakteristik viskoelastik özelliği sayesinde cilt nemlendiricileri, osteoartrit tedavisi, göz cerrahi, karın cerrahisi sonrası adezyon önleyici ve yara iyileştirme gibi kozmetik ve farmasötik endüstrilerinde yaygın bir şekilde kullanılmasını sağlamaktadır. 
HA, ticari olarak horoz ibiğinden ve dış kapsüllerinin bir parçası olarak bu bileşiği doğal olarak sentezleyen C grup Streptococcus suşlarından elde edilmektedir. Ancak bunlar ideal kaynaklar değildir. Horoz ibiği temelli HA üretimlerinin tamamı, kuş ürünlerine karşı alerjiye sahip olanlar için risk teşkil etmektedir ve enjeksiyon sonrası enflamatuar reaksiyonlara sebep olduğu rapor edilmiştir. Streptokoklardan fermentasyon ile HA üretimini gerçekleştirmek zor ya da pahalı olmasının yanı sıra bu mikroorganizmalar ekzotoksin üretme potansiyellerine sahiptirler. Bu yüzden, bu tehlikelerden arınmış alternatif kaynakların geliştirilmesi oldukça önemlidir.
Bacillus türleri, proteazlar ve alfa-amilazlar gibi hidrolitik enzimlerden, aminoasitler ve vitaminler gibi özel kimyasallara kadar pek çok ürünün üretilmesinde endüstriyel olarak kullanılmaktadır. Bu organizmalar, yüksek oranda gelişmiş biyosentetik kapasitelerinin bir göstergesi olan bol miktarda ürün salgılama kabiliyetine sahiptirler ve endüstriyel fermentörlerde büyütülmeleri oldukça ekonomiktir. 
Bacillus subtilis ekzotoksin ve endotoksin üretmemektedir. Buna ek olarak, B. subtilis HA'i degrade eden hiyaluronidaz enzimini üretmez ayrıca böyle bir enzimi kodlayan genom sekansına da sahip değildir. Son olarak B. subtilis, en iyi karakterize edilmiş gram-pozitif mikroorganizmalardan bir tanesidir, genomu tamamen aydınlatılmış ve bu organizmada genetik manipülasyon için uygun pek çok araç bulunmaktadır.
B. subtilis'in yukarıda bahsedilen özellikleri dikkate alındığında, HA üretimi için birçok avantaja sahip olduğu görülmektedir. Bu nedenle bu tez çalışmasında, gen kaynağı olarak Streptococcus familyasına ait bir çeşit gram pozitif bakteri Streptococcus equi subsp. zooepidemicus'ta hyaluronik asit biyosentezinden sorumlu HasA operonu rekombinant DNA teknikleri kullanılarak B. subtilis bakterisine aktarılmış ve geliştirilen rekombinant B. subtilis ile hyaluronik asit üretiminin gerçekleştirilmesi ve üretim koşullarının optimizasyonu incelenmiştir.

Abstract:
At present the worldwide market for HA is estimated at over $1 billion. This macromolecule influences cell behavior and has significant structural, rheological, physiological, and biological functions in the body. Its distinctive viscoelastic properties, coupled with its lack of immunogenicity or toxicity, have led to a wide range of applications in the cosmetic and pharmaceutical industries, including skin moisturizers, osteoarthritis treatment, ophthalmic surgery, adhesion prevention after abdominal surgery, and wound healing.
HA is obtained commercially from rooster combs and certain attenuated strains of group C Streptococcus which synthesize this compound naturally as part of their outer capsule. However, these are less-than-ideal sources. All rooster comb-based HA products carry warnings directed to those who are allergic to avian products, and at least one has been reported to cause inflammatory reactions upon injection, while streptococci can be difficult or expensive to ferment, are challenging to genetically manipulate, and have the potential to produce exotoxins.
Thus, it would be advantageous to develop an alternative source of HA that avoids these serious pitfalls. Bacillus species have long been established as industrial workhorses for the production of products ranging from hydrolytic enzymes, such as proteases and alpha-amylases, to specialty chemicals, such as amino acids and vitamins. These organisms are capable of secreting copious amounts of product, indicative of their highly developed biosynthetic capacity, and are very economical to grow in industrial fermentors. 
Bacillus subtilis is free of exotoxins and endotoxins. In addition, B. subtilis does not produce, nor does the genome sequence encode, a hyaluronidase which could degrade HA. Finally, B. subtilis is one of the most well characterized gram-positive microorganisms, its genome has been sequenced, and there are wide arrays of tools available for genetic manipulation. 
Therefore, in this study HasA operon, responsible for the production of hyaluronic acid, was amplifield from Streptococcus equi subsp. zooepidemus genomic DNA and by the recombinant DNA technology this gene was cloned to Bacillus subtilis. This recombinant B. subtilis strain was used for production of HA and optimization of culture conditions.