Üç farklı kabak türünün antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi
Determination of antioxidant activities of three different cucurbita  species
Yazar: SELİN TÜMER
Danışman: PROF. DR. GÜLNUR ARABACI
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Canlı sistemlerdeki metabolik reaksiyonlar sırasında yaşam için tehlikeli olan zararlı serbest radikaller meydana gelebilir bunlara karşı organizmalarda doğal bir savunma mekanizması bulunmaktadır. Bu savunma mekanizmasında önemli rol oynayan bileşiklere "antioksidan" adı verilir. Antioksidanlar, serbest radikal türlerini stabil tutan, metabolizmada hücrelere zarar vermeksizin verebilecekleri zararı minimum düzeye indiren moleküllerdir.
Antioksidanların canlı yaşamı üzerindeki temel etkisi, serbest radikalleri süpürme ve zincir kırma mekanizmaları aracılığıyla gerçekleşir. Son yörüngesinde bir adet veya eşleşmemiş elektron bulunduran molekül yapıları genellikle kararsızdır ve oldukça reaktiftir. Bunlar serbest radikaller olarak adlandırılırlar.  Serbest radikaller oksijen ve azot içerikli olabilirler. Bu gruptaki oksijen radikalleri hücre zarlarından kolayca geçtikleri için hücrelerdeki lipitlerin, proteinlerin ve nükleik asitlerin yapısında değişikliklere neden olup etkili bir şekilde hücrelerde zararlı etki etme yeteneğine sahiptirler. Bu radikalller "reaktif oksijen türleri (ROS)"olarak adlandırılırlar. Antioksidanlar, bu zararlı ROS'ları özelliklede zincir oluşturmakta olan radikalleri çok az reaktif formlara dönüştürerek hidrojen atomu vericisi olarak işlev görür. Ortaya çıkan antioksidan radikal, aromatik halkadaki oksijen atomunun eşleşmemiş bir elektronla değiştirilmesiyle stabilize edilir. Bu sebepten ötürü antioksidan moleküller genellikle yapılarında fenolik fonksiyonları yerine getirirler. Antioksidanların insan sağlığındaki rolü son zamanlarda daha da iyi idrak edilmiştir. Araştırmalar, antioksidanların; katarakt, kanser, kardiyovasküler hastalık veya oksidatif stresin neden olduğu diğer birçok hastalığı önlemede daha etkin bir rol oynadığını göstermiştir. Antimutajenik, antitümör ve yaşlanma karşıtı etkiler, canlı organizmalarda bulunan antioksidan özelliklere sahip maddelerden kaynaklanır. Antioksidanların yokluğunda reaktif olan oksijen veya nitrojen grupları kanser, diyabet, artrit, Parkinson hastalığı, AIDS, beyin veya kalp rahatsızlığı vb. çeşitli hastalıklara sebep olmaktadır. 
Antioksidanlar enzimatik ve enzimatik olmayanlar olarak üzere canlı hücrelerin savunma sisteminde yer almaktadır. Canlı sistemlerde enzimatik antioksidanlar olarak Süperoksit dismutaz (SOD), Katalaz (CAT), Askorbat Peroksidaz (APX), Glutatyon peroksidaz (GPx) ve Glutatyon redüktaz (GR) gibi enzimler bulunurken, enzimatk olmayan antioksidanlar arasında ise melatonin, glutatyon, bilurubin, ürik asit, albümin, selenyum, koenzim Q10, α-lipoik asit ve transferrin bulunmaktadır.
Antioksidanlar ayrıca bir çok endüstriyel alanda kullanılmaktadır. Özellikle gıda sektöründe yaygın olarak kullanılan antioksdanlar yapay olarak üretilmiş antioksidanlardır. Bu amaçla kullanılan yapay antioksidan grubu içinde bütillenmiş hidroksitoluen (BHT), bütillenmiş hidroksianisol (BHA), üçüncül bütilhidrokinon (TBHQ) ve etoksigin  yaygın olanlarıdır. Bu antioksidanlar çok kararlı, etkili ve ucuzdur. Bu grupta bulunan  antioksidanların diğer antioksidan sınıfına göre daha ucuz olması, dayanıklılığının ve etkinliğinin fazla olması sebebiyle kullanımı daha da yaygınlaşmıştır. Gıdalarda doğal olarak bulunduklarından, gıda sektöründe gıdaların yapısını ve besin değerlerini korumak için daha sonra eklenirler. Bu, acılaşmaya ve gıda bozulmalarına karşı çalışan kimyasaldır. Antioksidanlar vücut hücreleri tarafından üretilir ve yiyeceklerden de elde edilebilir. Gıdaların içinde bulunup insan bedenini radikallerin faydasız etkisinden korumaya çalışan belli başlı doğal antioksidanlar öncelikle vitamin grupları (A, C, E vitaminleri), flavonoid, karotenoid ve polifenoller olarak adlandırılırlar. 
Antioksidanların enzim aktiviteleri incelenirken Polifenol oksidaz (PPO), peroksidaz (POD), askorbat peroksidaz (APX) ve katalaz (CAT) enzimleri seçilmiştir. Polifenol oksidaz (PPO), kesilmiş meyve ve sebzelerin yüzeyindeki oksidasyon ürünlerinden kahverengimsi renk oluşturan belirli bir enzim grubunun adıdır. Bunlar esas olarak bakteri, mantar, bitki ve hayvanlarda bulunmaktadır. PPO enzimi oksidoredüktaz sınıfı bir enzim olup (EC 1.14.18.1) oksijen varlığında monofenolik bileşiklerin o-difenollere hidroksilasyonu (kresolaz aktivitesi) ve o-difenollerin o-kinonlara oksidasyonunu (katekolaz aktivitesi) katalizler. PPO enzimi meyve ve sebzelerde karamaya sebep olurken, aynı zamanda vücutta koyu renkli pigmentlerin birlikte oluşturulması, melanin pigmentlerinin biyosentezi, polifenol gruplarının başlatılması ve korunmasında da görev alır. Peroksidaz (POD) enzimi (EC:1.11.1.7), oksitleyici olarak hidrojen peroksiti (H2O2) kullanarak ikinci bir substrat varlığında indirgeyip su oluştururken diğer substratı da yükseltgemeyi katalizleyen bir oksidaoredüktaz sınıfı  antioksidan enzimidir. Peroksidazlar iki etkin gruba ayrılabilir. Bunlar; hayvan peroksidazları ve bitki, mantar, bakteri peroksidazları olarak gruplandırılabilirler. Askorbat peroksidaz (APX) H2O2'yi suya indirger ve bu sırada  asidi (AsA) elektron verici olarak kullanır. APX'ler (askorbat peroksidazlar) bitkilerin antioksidan savunma mekanizmalarında önemli rola sahiptir. Katalaz (CAT) enzimi  (E.C.1.11.1.6), hidrojen peroksitin (H2O2) suya ve oksijene dönüşümünü katalize eden, aerobik hayvanlarda, bitkilerde ve mikroorganizmalarda bulunan bir oksidreduktaz sınıfı enzimdir. Hücrenin içinde bulunan metabolizmayla ilgili süreçlerle üretilen hidrojen peroksit, katalaz enzim tarafından hidrolize edilmezse, hücrelerde vücutta kalıcı hasara neden olan oldukça zararlı ve zehirli bir radikal üretilir.                 
Bu çalışmada, Sakarya'da yetiştirilen üç farklı kabak türünün (bal kabağı, spagetti kabak, sakız kabak) kabuk ve iç kısımlarının antioksidan aktiviteleri araştırılmıştır. Antioksidan aktiviteleri, üç farklı antioksidan analiz yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Bu amaçla kullanılan yöntemler; Demir (II) İyonlarını Şelatlama Aktivitesi, DPPH Serbest Radikali Giderim Aktivitesi ve İndirgenme Kapasitesidir. Aynı zamanda üç farklı kabak türünün kabuk ve iç kısımlarının antioksidan enzim (Polifenoloksidaz, Peroksidaz, Katalaz ve Askorbat peroksidaz) aktiviteleri incelenmiştir. Analiz sonuçlarında; analizi yapılan kabakların kabuğu ve iç kısımlarından çıkan sonuçlar en yüksek DPPH aktivitesi, etil asetatta bal kabağının kabuk kısmında %94,93 (±0,12) değeri ile  belirlenmiş olup, metanolde ise en yüksek DPPH giderim aktivitesi spagetti kabağın kabuk kısmında % 94,40 (±0,18) olarak belirlenmiştir. En yüksek İndirgeme kapasitesi tayininde etil asetat ekstratlarında çalışılan kabak çeşitlerinde görülmüştür. Demir (II) İyonlarını Şelatlama yönteminde etil asetat ekstratlarında en fazla bal kabağının kabuk kısmında belirlenmiş olup, metanol ekstratlarında ise en fazla bal kabağının iç kısmında belirlenmiştir. 
Kabakların antioksidan enzim aktivitelerini belirlerken dört adet enzim için aktiviteler belirlenmiştir. Bu enzimler polifenol oksidaz, peroksidaz, katalaz ve askorbat peroksidazdır. Kabaklarda polifenol oksidaz enzim değerleri analiz edildiğinde en yüksek enzim aktivitesi spagetti kabağın kabuk kısmında bulunurken, en düşük enzim aktivitesi bal kabağının kabuk kısmında bulunmuştur. Peroksidaz enzim aktivitesi incelendiğinde ise en yüksek enzim aktivitesi balkabağının kabuk kısmında bulunurken, en düşük enzim aktivitesi sakız kabağının iç kısmında belirlenmiştir. Katalaz enzim aktvitesi incelendiğinde 100 µL için; en yüksek değer bal kabağının kabuk kısmında bulunrken, en düşük değer sakız kabağının kabuk kısmında bulunmuştur. Katalaz  enzim aktivitesi ayrıca 500 µL'lik hacimde denendiğinde ise maksimum aktivite değeri spagetti kabağın kabuk kısmında görülürken, en düşük enzim aktivite değeri sakız kabağının iç kısmında görülmüştür. Askorbat peroksidaz için en fazla enzim aktivite değeri bal kabağının kabuk kısmında bulunurken, en düşük enzim aktivite değeri spagetti kabağın iç kısmında bulunmuştur. Böylece elde edilen tüm veriler ışığında, Sakarya'da yetişen üç farklı kabağın farklı kısımlarındaki enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidan aktiviteleri değerlendirildiğinde en yüksek antioksidan aktivitenin balkabağının kabuk kısmıda olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
There is a natural defense mechanism in the body against free radicals formed as a result of certain metabolic reactions. The molecules that play crucial role in the defense mechanism are called "antioxidants". Antioxidants are molecules that keep free radical species stable and minimize the damage they can cause in metabolism without damaging the cells.
The main effect of antioxidants on living life is through the mechanisms of scavenging free radicals and breaking chains. Molecular structures with one or an unpaired electron in their final orbital are usually unstable and highly reactive. These are called free radicals. Free radicals can contain oxygen and nitrogen. Since oxygen radicals in this group easily pass through cell membranes, they have the ability to cause changes in the structure of lipids, proteins and nucleic acids in cells and have an effective harmful effect on cells. These radicals are called "reactive oxygen species (ROS)". Antioxidants act as hydrogen atom donors by converting these harmful ROS, especially chain-forming radicals, into slightly reactive forms. The resulting antioxidant radical is stabilized by replacing the oxygen atom in the aromatic ring with an unpaired electron. For this reason, antioxidant molecules generally perform phenolic functions in their structures. The role of antioxidants in human health has recently been better understood. Research shows that antioxidants; It has been shown to play a more effective role in preventing cataracts, cancer, cardiovascular disease or many other diseases caused by oxidative stress. Antimutagenic, antitumor and anti-aging effects are due to substances with antioxidant properties found in living organisms. Oxygen or nitrogen groups that are reactive in the absence of antioxidants can cause cancer, diabetes, arthritis, Parkinson's disease, AIDS, brain or heart disease, etc. cause various diseases.
Antioxidants play important roles in the defense system of living cells as enzymatic and non-enzymatic. While there are enzymes such as Superoxide dismutase (SOD), Catalase (CAT), Ascorbate Peroxidase (APX), Glutathione peroxidase (GPx) and Glutathione reductase (GR) as enzymatic antioxidants in living systems, non-enzymatic antioxidants include melatonin, glutathione, bilirubin, uric acid, albumin, selenium, coenzyme Q10, α-lipoic acid and transferrin.
Antioxidants are also used in many industrial areas. Antioxidants, which are widely used in the food industry, are artificially produced antioxidants. Among the artificial antioxidant group used for this purpose, butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), tertiary butylhydroquinone (TBHQ) and ethoxygin are the common ones. These antioxidants are very stable, effective and inexpensive. The use of antioxidants in this group has become more widespread due to the fact that they are cheaper than the other antioxidant class, their durability and effectiveness are higher. This is the chemical that works against rancidity and food spoilage. Antioxidants are produced by body cells and can also be obtained from food. The main natural antioxidants found in foods and trying to protect the human body from the useless effects of radicals are primarily called vitamin groups (vitamins A, C, E), flavonoids, carotenoids and polyphenols.
While examining the enzyme activities of antioxidants, the enzymes Polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) were selected. Polyphenol oxidase (PPO) is the name of a particular group of enzymes that creates a brownish color from oxidation products on the surface of cut fruits and vegetables. They are mainly found in bacteria, fungi, plants and animals. PPO enzyme is an oxidoreductase class enzyme (EC 1.14.18.1) and catalyzes the hydroxylation of monophenolic compounds to o-diphenols (cresolase activity) and oxidation of o-diphenols to o-quinones (catecholase activity) in the presence of oxygen. While the PPO enzyme causes darkening in fruits and vegetables, it also takes part in the co-creation of dark pigments in the body, the biosynthesis of melanin pigments, and the initiation and protection of polyphenol groups. Peroxidase (POD) enzyme (EC:1.11.1.7) is an oxidaoreductase class antioxidant enzyme that uses hydrogen peroxide (H2O2) as an oxidizer, reducing it in the presence of a second substrate and forming water while catalyzing the oxidation of the other substrate. Peroxidases can be divided into two active groups. These; they can be grouped as animal peroxidases and plant, fungal and bacterial peroxidases. Ascorbate peroxidase (APX) reduces H2O2 to water and uses acid (AsA) as an electron donor. APX (ascorbate peroxidases) have an important role in the antioxidant defense mechanisms of plants. Catalase (CAT) enzyme (E.C.1.11.1.6) is an oxidreductase class enzyme found in aerobic animals, plants and microorganisms that catalyzes the conversion of hydrogen peroxide (H2O2) to water and oxygen. If the hydrogen peroxide produced by the metabolic processes inside the cell is not hydrolyzed by the enzyme catalase, a very harmful and toxic radical is produced in the cells that causes permanent damage to the body.
In this study, the antioxidant activities of the skin and inner parts of three different zucchini species (pumpkin, spaghetti squash, gum zucchini) grown in Sakarya were investigated. Antioxidant activities were determined using three different antioxidant analysis methods. The methods used for this purpose; Iron (II) Ions Chelating Activity, DPPH Free Radical Removal Activity and Reducing Capacity. At the same time, the antioxidant enzyme (Polyphenoloxidase, Peroxidase, Catalase and Ascorbate peroxidase) activities of the skin and inner parts of three different pumpkin species were investigated. In the analysis results; The results obtained from the peel and inner parts of the squash analyzed were the highest DPPH activity, % 94.93 (±0.12) in the skin of the pumpkin in ethyl acetate, and the highest DPPH removal activity in methanol was % 94.40 in the skin of the spaghetti squash. (±0.18). The highest reducing capacity was observed in pumpkin cultivars studied in ethyl acetate extracts. In the Chelating of Iron (II) Ions method, it was determined the most in the shell of the pumpkin in ethyl acetate extracts, and the most in the inner part of the pumpkin in methanol extracts.
While determining the antioxidant enzyme activities of pumpkin, activities were determined for four enzymes. These enzymes are polyphenol oxidase, peroxidase, catalase and ascorbate peroxidase. When polyphenol oxidase enzyme values were analyzed in pumpkins, the highest enzyme activity was found in the skin of the spaghetti squash, while the lowest enzyme activity was found in the skin of the pumpkin. When the peroxidase enzyme activity was examined, the highest enzyme activity was found in the peel of the pumpkin, while the lowest enzyme activity was determined in the inner part of the gum squash. When catalase enzyme activity is examined, for 100 µL; While the highest value was found in the shell part of the pumpkin, the lowest value was found in the shell part of the pumpkin. When catalase enzyme activity was also tested in a volume of 500 µL, the maximum activity value was observed in the skin of the spaghetti squash, while the lowest enzyme activity value was observed in the inner part of the gum squash. The highest enzyme activity value for ascorbate peroxidase was found in the skin of the pumpkin, while the lowest enzyme activity value was found in the inner part of the spaghetti squash. In the light of all the data obtained, when the enzymatic and non-enzymatic antioxidant activities in different parts of three different pumpkins grown in Sakarya were evaluated, it was determined that the highest antioxidant activity was in the skin part of the pumpkin.