Mikro toplam analiz sisteminde (µ-TAS) katekolaminlerın saflaştırılması ve ön-deriştirilmesı için kullanılacak katyon-değişim temelli monolitik kolonların hazırlanması
Preparation of cation-exchange based monolithic columns for purification and pre-concentration of catecholamines in micro total analysis system (µ-TAS)
Yazar: MÜSLÜM ALTUN
Danışman: PROF. DR. PERİHAN ÇAĞLAR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada, birçok biyolojik proseste yeralan ve parkinson, şizofreni,
nöroblastoma, hipertansiyon gibi hastalıkların patalojik incelenmesinde önemli rol
oynayan ve vücutta nörotransmiter veya hormon olarak görev yapan
katekolaminlerin [norepinefrin (NE), epinefrin (E), ve dopamin (DA)] mikro toplam
analiz sistemlerinde saflaştırılması ve ön-deriştirilmesi amacı ile katyon-değişim
temelli monolitik kolonlar hazırlanmıştır. Çalışma dört aşamada yürütülmüştür.

Çalışmanın ilk bölümünde, katyon-değişim temelli Poli(metakrilik asit-etilenglikol dimetakrilat)(PMAA) gözenekli monolitik kolonlar, mikroçip üzerinde sentezlenmeden önce farklı başlatıcılar kullanılarak cam kapiler tüplerde fotopolimerizasyonla hazırlanmıştır. Bu amaçla, hazırlanacak monolitlerin polimerizasyon koşulları belirlenmiş ve polimerleşmeden sonra monolitlerin
karakterizasyonu için civalı porozimetre, yüzey karakterizasyonu (BET), taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve Fourier transform infrared (FTIR) spektroskopisi analizleri yapılmıştır.

Çalışmanın ikinci bölümünde, hazırlanan PMAA monolitik kolonların katekolamin tutma kapasitelerinin ve desorpsiyon koşullarının optimize edilmesi için çalışmalar yapılmıştır. Bunun için, cam kapiler tüplerde hazırlanan monolitik kolonlar, farklı tamponlarda ve farklı derişim ile farklı pH larda hazırlanmış olan çeşitli katekolamin çözeltilerinde belirli sürelerde bekletilmiş ve 279 nm de UV absorbans ölçümleri alınmıştır. Elde edilen verilerden katekolamin tutma kapasitesi değerleri (mg Katekolamin / g polimer) ve "% desorpsiyon" değerleri hesaplanmıştır.

Çalışmanın üçüncü bölümünde, PMAA monolitik diskleri T-şeklindeki elektroforez mikroçiplerinde oluşturulmadan önce, üzerinde çoklu yuvacıkların bulunduğu cam mikro yapılarda hazırlanmıştır. Bu işlemin yapılmasının sebebi, pahalı ve üretimi zahmetli olan elektroforez mikroçipine geçmeden önce monolitin istenilen yerde oluşturulmasının sağlanması ve sıvı geçişinin incelenmesidir. Monolitik disklerin mikro cam yapıların istenilen bölgesinde hazırlanabilmesinden ve rahat sıvı geçişinin sağlanmasından sonra kolonlar, T-şeklindeki elektroforez mikroçipi üzerindeki yuvada oluşturulmuştur.

Çalışmanın son aşamasında ise, T-şeklindeki elektroforez mikroçipinde oluşturulan PMAA monolitik diskler, katı faz özütleme amacı ile kullanılmıştır. [(4-(2-Hidroksietil) piperazin–1–etansülfonik asit] (HEPES) tamponunda (pH 7, 20mM) hazırlanan çeşitli derişimlerdeki standart katekolamin çözeltileri, T-şeklindeki mikroçipin örnek enjeksiyon kanalı üzerinden elektrokinetik olarak sıra ile geçirilerek, katekolaminlerin monolitik diske adsorpsiyonu sağlanmıştır. Adsorpsiyon koşullarında yapılan yıkama işleminden sonra, Fosfat tamponu ile (pH 3, 100 mM) monolitik diskten desorbe edilen katekolaminler kanal üzerinde elektroforetik olarak göç ettirilerek, lazerle indüklenmiş doğal floresans ölçümleri alınmıştır.

Abstract:
Catecholamines [norepinephrine (NE), epinephrine (E), and dopamine (DA)] take
place in various biological processes and have functions as neurotransmitter or
hormone and play important roles in the pathologic investigation of parkinson,
schizophrenia, neuroblastoma, hypertension and such diseases. In this study,
cation-exchange based monolithic columns were prepared with the aim of
purification and preconcentration of catecholamines in micro total analysis
systems. The study was carried out in four parts.

In the first part of the study; cation-exchange based porous monolithic columns
were prepared by photopolymerization in glass capillary tubes by using different
initiators, before being synthesized in microchips. For this aim, polymerization
conditions of monoliths were determined and mercury porosimetry, BET, SEM,
FTIR analyses of monoliths were performed for characterization after the
polymerization.

In the second part, ideal catecholamine adsorption capacity and elution conditions
of prepared PMAA monolithic columns were optimized. For this aim, monolithic
columns prepared in glass capillary tubes were kept in various catecholamine
solutions which were prepared in different buffer solutions at different
concentrations and pH values, and UV absorption of the solutions was measured
at 279 nm. The adsorption capacity of catecholamines (mg Catecholamine / g
polymer) and "% elution values" were calculated from provided data.

In the third part of the study, PMAA monolithic disks were prepared in reservoirs of
multiple glass micro structures prior to T-shaped electrophoresis microchips. The reason for this process is to generate the monolith in desired place and to
investigate the moving of liquid before applying in expensive and labor intensive
electrophoresis microchips. Having prepared monolithic disks on targeted place of
the micro glass structure and satisfied of easy moving of liquid, columns were
generated on the reservoir of the T-shaped electrophoresis microchip.

At the last part of the study, PMAA monolithic disks generated on T-shaped
electrophoresis microchip with the aim of solid phase extraction. The standard
catecholamine solutions prepared in HEPES buffer (pH 7, 20mM) were electro
kinetically injected through the sample injection channel of T-shaped microchip
and the adsorption of catecholamines on disk was accomplished. After washing
process at adsorption conditions, catecholamines desorbed from the disk with
phosphate buffer (pH 3, 100 mM) and migrated within the seperation channel and
detected with laser induced natural florescence.