Bir gen modeli olarak nötral lipozomların bivalan metal iyonları ile birlikte kullanımının incelenmesi
Investigetion of the usage of neutral liposomes together with bivalent metal ions as a gene transfer model
Yazar: FATMA FUNDA DEMİRSOY
Danışman: PROF. DR. HİLAL ÖZDAĞ
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Gen tedavileri; kalıtsal, otoimmün, immün sistemi baskılayıcı ve kanser hastalıklarının
iyileĢtirilmesinde kullanılmak üzere geliĢtirilen yöntemlerdir. Gen tedavisi amacıyla
kullanılan viral vektörlerin aktarmak üzere taĢıdıkları DNA‟yı hücreye taĢırken hedefleri
dıĢında olan hücreleri de enfekte edebilme, taĢıdıkları DNA‟yı konakçı genomunda entegre
olmaması gereken bir bölgeye sokabilme gibi risklerinin bulunması nedeniyle gen
tedavisindeki kullanımları sınırlanmaktadır. Gen tedavisinin önündeki bu sınırlamayı
kaldırmak üzere hücreye DNA aktarımında plazma membranından geçebilme özelliğine
sahip olan lipid vesikülleri denenmektedir. Gen transferi için kullanılan ve lipid
veziküllerininin nükleik asitlerle beraber oluĢturduğu nanobileĢenler, genozom veya
lipopleks adını almaktadır. Günümüzde insan gen tedavisi ile ilgili araĢtırmalarda alınan
sonuçlar yalnızca tedavi edilmesi hedeflenen hücreye özgü gen aktarım araçları
bulunmadığından henüz istenen verimde çalıĢmamaktadır. Lipid vesiküllerinin hücrelerin
bulunduğu ortama verilmesinden gen ifadesine kadar giden yolda terapötik geni taĢıyan
DNA‟yı degradasyondan koruyacak optimize edilmiĢ gen taĢıma sistemlerine ihtiyaç
vardır. Yoğun olarak kullanılan katyonik lipitlerle yapılan lipofeksiyon deneyleri sıkça
istenmeyen sitotoksisiteye neden olabilmekte, kontrolü zor olan serum stabilitesine
olumsuz etki edebilmekte ve tüm bu olumsuzluklar nedeniyle düĢük transfeksiyon oranları
ile sonuçlanmaktadır.
Bu tez çalıĢmasında sitotoksik katyonik lipozomlar yerine, zwitteriyonik fosfolipitler, çift
değerli katyonlar (Mg+2 ve Ca+2) ile DNA bir araya getirilerek toplaĢımlar oluĢturulmuĢ ve
bu yapıların özellikleri ile kullanımları irdelenmiĢtir. Daha spesifik olarak çok katmanlı 
(MLV) ve tek katmanlı (ULV) fosfatidilkolin vezikülleri oluĢturulduktan sonra, çift
valanslı metal katyonlarca tetiklenen DNA‟nın MLV ve ULV fosfatidilkolin vezikülleri
üzerine adsorpsiyonu, agregasyonu ve adhezyonu UV/VIS spektroskopisi ile araĢtırılmıĢtır.
Zwitteriyonik lipozomların termotropik faz değiĢimleri Mg+2 varlığında polinükleotitler ve
çeĢitli DNA‟lar ile bileĢik oluĢturmaları termodinamik ölçümler ve floresan mikroskopisi
ile incelenmiĢ ve çeĢitli elektrostatik lipit-nükleik asit bileĢiklerinin oluĢumları ile ilgili
daha önce yayınlanan verilerle kıyaslanmıĢtır. Bu Ģekilde oluĢan üçlü bileĢiklerin (DNA,
lipid, Mg+2) yüzey tanınma ve sınırlararası özellikleri Langmuir-Blodgett tek katman,
titreĢim (FTIR ve Raman) spektroskopisi ile araĢtırılmıĢtır. Bu genozomların boyut ve
morfoloji analizleri z-potansiyel, Dinamik IĢın Saçılımı (DLS) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Üçlü
bileĢiklerin yapısal değiĢikleriyle ilgili termodinamik ve kinetik modellerin ortaya
konmasına yönelik olarak Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (DSC), Termogravimetrik
Analiz (TGA) ve Ġzotermal Titrasyon Kalorimetrik (ITC) ölçümleri yapılmıĢtır. Mg+2
varlığında DNA ile lipozomlar arasında meydana gelen füzyon olayları ise floresan ve
konfokal mikroskopisi ile incelenmiĢtir. Transfeksiyon için etkili dairesel ve süpersarmallı
plazmidlerin oluĢumu agaroz jel elektroforez ile gösterilmiĢtir. Spektroskopik ölçümlerle
üçlü bileĢenlerin yapılarında yer alan biyomakromoleküllerin ikincil yapılarındaki yapısal
değiĢiklikler gösterilmiĢtir. Mikroskobik ölçümler sonucunda üçlü oluĢumlar görsel olarak
tanımlanmıĢ, boyut-potansiyel ölçümleri sonucunda görsel olarak TEM ile belirlenen
sonuçlar teyit edilmiĢtir. Termal ölçümler ile biyodinamikleri ve oluĢum termodinamiği
parametreleri hesaplanmıĢtır. Ayrıca lipit/DNA/(Mg+2 ve Ca+2) üçlü kompleksinin hücresel
sisteme aktarılması için transfeksiyon deneyleri yapılmıĢ; metal katyonlarca (Me+2)
gerçekleĢtirilen transfeksiyon etkinlikleri incelenmiĢtir. Bu üçlü toplaĢımın Mg+2 ile
yapılan kısmında transfeksiyon gerçekleĢmiĢ ancak deney tekrarlanamamıĢtır.
Lipit/DNA/Ca+2 ile transfeksiyon ise başarılı olmuştur.

Abstract:
Gene therapies are developed for curing inherited, autoimmune, immune system
suppressive and cancer diseases. The use of viral vectors in gene therapy is limited because
viral vectors have the risk to infect cells other than targeted ones and the DNA they carry
can integrate into an undesirable locus in the host genome . In order to overcome these
limitations of gene therapy lipid vesicles capable to transfer DNA across cellular plasma
membrane are being tested. Lipid vesicles used in gene transfer and the nanocomplexes
they formed with nucleic acids are referred to as genosomes or lipoplexes. Nowadays, the
results obtained in the field of human gene therapy are unsatisfactory, due to the lack of
selective tools towards the targeted cells. There is a need for optimized lipid vesicle based
gene carrying systems protecting the DNA from degradation throughout their routes from
the application site to gene expression. Lipofection experiments undertaken with widely
used cationic lipids frequently lead to undesired cytotoxicity and has negative effec t on
serum stability. Thus their transfection rates are low.
In this thesis the use of zwitterionic phospholipids, forming assemblies with divalent metal
cations (Ca2+ and Mg2+) with DNA and the potential use of these structures were
investigated. More specifically, upon multilamellar (MLV) and unilamellar (ULV)
phosphatidylcholine vesicle formations, the DNA adsorption, aggregation and adhesion
onto these vesicles, triggered by divalent metal cations, were analyzed by UV/VIS
spectroscopy. 
The thermotropic phase transitions, the complex formations between polynucleotides and
various DNA in the presence of Mg2+ were studied by thermodynamic measurements and
fluorescence microscopy. The results were compared to previously reported electrostatic
lipid-nucleic acid formations. The surface recognition and interfacial properties of the
formed ternary complexes (DNA/lipid/Mg2+) were investigated by Langmuir-Blodgett
monolayers and vibrational (FTIR and Raman) spectroscopy. Size and morphology
analyses of these genosomes were undertaken by z-potential and Dynamic Light Scattering
(DLS) measurements. Thermodynamic and kinetic models concerning structural changes
of ternary complexes were built based on Differential Scanning Calorimetry (DSC),
Thermogravymetric Analysis (TGA) and Isothermal Titration Calorimetry (ITC). Fusion
events occuring between DNA and liposomes in the presence of Mg2+ were analyzed by
fluoresence and confocal microscopies. Transfection competent circular and supercoiled
plasmid formations were shown by agarose gel electrophoresis. Secondary structural
changes of biomacromolecules engaged in ternary complex formations were shown by
spectroscopic measurements. Ternary formations were depicted visually by microscopic
measurements and the obtained results on their sizes were verified by Transmission
Electron Microscopy (TEM). Their biodynamical features and formation thermodynamic
parameters were estimated by thermal measurements. Moreover, the cellular transfers of
lipid/DNA/(Mg2+ and Ca2+) ternary complexes were analyzed by transfection experiments
and the transfection efficiencies trigerred by metal cations (Me2+) were determined.
Transfection studies based on these ternary complexes and Mg2+ were accomplished but
these results cannot reproduced. Transfections based on lipid/DNA/Ca2+ system were
successful.