İlaç araştırmaları için 3-boyutlu mikroakışkan damar modelinin geliştirilmesi
Development of 3-dimensional microfluidic vessel model for drug testing
Yazar: BURAK İPEK
Danışman: PROF. DR. KEZBAN ULUBAYRAM
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Kan damarları = Blood vessels

Özet:
Vasküler hastalıkların araştırılması, yeni ilaç adayı moleküllerin taranması, tespiti ve vasküler toksisitelerinin araştırılmasında kullanılabilecek in vivo damar fizyolojisi, anatomisi ve kan akışı kaynaklı oluşan sıvı gerilim kuvvetinin taklit edilebildiği 3-boyutlu (3B) damar modeline ihtiyaç duyulmaktadır. Son yıllarda insan doku ve/veya organların fizyolojik tepkilerini taklit etmek amacıyla modellenen mikroakışkan organ çipleri 3B doku/organların in vitro modellemesinde ilgi odağı olmuştur.
Bu tez çalışmasında fizyolojik koşulları ve in vivo damar yapısını (tunika eksterna, tunika media ve tunika intima tabakaları) taklit eden perfüze edilebilir 3B damar çip modelinin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla 3B yazıcı ile 35 mm çapında PDMS tabanına Pluronic F-127 kopolimeri ile 1,8 mm çap, 20 mm uzunluk ve 1,1 cm2 lateral alana sahip kanal oluşturulmuştur. Kanal önce dopamin hidroklorid (poliDOPA, 2 mg/mL), sonra kollajen veya fibronektin ile kaplanmıştır. Daha sonra sığır aort damarından izole edilip karakterize edilen vasküler düz kas hücreleri (vSMC), vasküler endotel hücreleri (vEC) ile insan (hFB) veya fare (L-929) kaynaklı fibroblast hücreleri PDMS kanallar içinde statik veya dinamik koşullarda (60 μL/dak.) koşullarda kültür edilmiştir. 3B damar yapısını oluşturmak için kültür süresi, substrat, hücre sayısı (50.000 hücre/çip veya
25.000 hücre/çip) test edilerek hücre davranışları araştırılmıştır. Daha sonra farklı i
CellTracker® ile işaretlenmiş fibroblast hücreleri ve vSMC dinamik koşullarda PDMS kanalda ko-kültür edilerek perfüze edilmiş ve hücre varlığı, hücre lokalizasyon paterni ve hücre tabakalarının oluşumu incelenmiştir. Son olarak poliDOPA veya poliDOPA+kollajen ile kaplı PDMS kanallarda sırasıyla hFB, vSMC ve vEC (1:1:1) hücreleri kültüre edilerek üçlü direkt ko-kültür yapılarak dinamik koşullarda 3B damar modeli geliştirilmiş ve hücre tabakası ile endotel ve düz kas hücre spesifik proteinlerinin ifadesi açısından karakterize edilmiştir. Temas açısı ve FTIR sonuçları PDMS yüzeyin polidopamin ile kaplandığını ve hidrofilik bir yüzeyin elde edilebildiğini göstermiştir. Mikroskobik analiz, statik koşullarda test edilen farklı hücre sayısı, substrat tipi ve kültür süresinde vSMC'lerin benzer davranışlar göstererek yüzeye tutunabildiklerini, dinamik koşullarda ise test edilen tüm substrat ve hücre sayısında yüksek hücre canlılığına sahip mikro doku oluşturduklarını göstermiştir. Dinamik koşullarda, vEC ve fibroblast hücrelerinin statik koşullarda oluşturdukları hücre tabakası yapısını korudukları, sıvı gerilim kuvvetine maruz kalma süresine bağlı olarak vEC'lerin tabaka yapısını kaybetme, fibroblast hücrelerinin ise daha yoğun bir tabaka oluşturma eğilimi gösterdikleri tespit edilmiştir. vSMC-fibroblast ko-kültür çalışmaları fibroblast-vSMC direkt ko-kültürünün başarılı bir biçimde gerçekleştirildiğini, hücrelerin kültürde varlıklarını koruduklarını göstermektedir. Konfokal ve immünofloresan analizleri poliDOPA+kollajen ile kaplanmış PDMS kanallarda dinamik koşullarda üçlü ko-kültürün başarılı bir biçimde yapılarak fibroblast, düz kas ve endotel tabakalarını içeren 3B damar modelinin oluştuğunu göstermiştir.

Abstract:
There is a need for a 3-dimensional (3D) vessel model that can be used to simulate in vivo vessel physiology, anatomy, and blood flow-induced fluid tension force that can be used in the investigation of vascular diseases, screening, and detection of new drug candidate molecules and investigating their vascular toxicities. In recent years, microfluidic organ chips modeled to mimic the physiological responses of human tissues and/or organs have been the focus of attention in in vitro modeling of 3D tissues/organs.
This thesis aims to develop a perfusable 3D vessel chip model that mimics physiological conditions and in vivo vascular structure (tunica externa, tunica media, and tunica intima layers). For this purpose, channel with 1.8 mm diameter, 20 mm length and 1.1 cm2 lateral area was created with Pluronic F-127 copolymer on a 35 mm diameter PDMS base with a 3D printer. The channel was coated first with dopamine hydrochloride (polyDOPA, 2 mg/mL), then with collagen or fibronectin. After that, isolated and characterized vascular smooth muscle cells (vSMC), vascular endothelial cells (vEC), and human (hFB) or mouse (L-929) fibroblast cells were cultured in PDMS channel under static or dynamic condition (60 μL/min.). Cell behavior was investigated by testing the culture time, substrate, cell number (50,000 cells/chip or 25,000 cells/chip) to create the 3D vessel structure. Subsequently, different CellTracker® labeled fibroblast cells, and vSMC were iii
co-cultured and perfused in PDMS channels under dynamic conditions; cell presence, cell localization pattern, and formation of cell layers were examined. Finally, hFB, vSMC and vEC (1:1:1) cells were co-cultured in polyDOPA or polyDOPA+collagen coated PDMS channel, respectively, and a 3D vessel model was developed under dynamic conditions. This model was characterized for the expression of endothelial and smooth muscle cell- specific proteins. The contact angle and FTIR results showed that the PDMS surface was coated with polydopamine and obtained a hydrophilic surface. Microscopic analysis showed that vSMCs could adhere to the surface by showing similar behavior in different cell number, substrate type and culture time tested under static conditions, and formed micro tissue with high cell viability in all substrates and cell numbers tested under dynamic conditions. In dynamic conditions, it was determined that vEC and fibroblast cells preserve the cell layer structure they formed under static conditions, vECs tend to lose their layer structure, and fibroblast cells tend to develop a denser layer depending on the exposure time to shear stress. vSMC-fibroblast co-culture studies showed that fibroblast-vSMC direct co-culture was successfully performed, and the cells were preserved in culture. Confocal and immunofluorescence analyzes showed that the 3D vessel model, including fibroblast, smooth muscle, and endothelial layers was formed by successful triple co-culture in PDMS channel coated with polyDOPA+collagen under dynamic conditions.