Broiler karkaslarından izole edilen campylobacter jejunı izolatlarının makrolid, kinolon ve tetrasiklin grubu antibiyotiklere karşı direnç durumu
The resistance state of campylobacter jejuni isolated from broiler carcasses against to macrolide, quinolone and tetracycline groups of antibiotics
Yazar: HARUN HIZLISOY
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN KILIÇ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Antibiyotikler-makrolid = Antibiotics-macrolide ; Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Antienfektif ajanlar-kinolon = Anti infective agents-quinolone ; Kampilobakter jejuni = Campylobacter jejuni ; Tavuklar = Chickens ; Tavuklar = Chickens ; Tavukçuluk = Chicken farming ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Bu çalışmada broiler karkaslarından Campylobacter jejuni izolasyonu, elde edilen izolatların makrolid, kinolon ve tetrasiklin antibiyotiklerine karşı dirençlerinin ortaya konulması, Minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) düzeylerinin tespiti, genomik ve plazmid kaynaklı direnç genlerinin gösterilmesi ve direnç epidemiyolojilerindeki mevsimsel farklılıkların belirlenmesi amaçlandı.
Campylobacter jejuni izolasyonu amacıyla, Haziran 2012 ve Ocak 2013 dönemlerinde Kayseri ilindeki süpermarketlerden satın alınan but, göğüs, kanat ve bütün tavuk olmak üzere toplam 200 örnek incelendi. Örneklerden elde edilen izolatların identifikasyonu, fenotipik testler ve multipleks Polimeraz Zincir Reaksiyonu (mPZR) ile gerçekleştirildi. C. jejuni'lerin antibiyotiklere direnç durumları disk difüzyon testi ile; MİK dağılımları ise E test ile saptandı. Aynı zamanda antibiyotiklere dirençlilikleri; PZR ve sekans analizi gibi moleküler yöntemlerle test edildi. 
Fenotipik testlerle Haziran 2012 döneminde toplanan 100 örneğin 81'i, Ocak 2013 döneminde ise 100 örneğin 77'si Campylobacter spp. yönünden pozitif bulundu. mPZR testi ile Haziran 2012 döneminde Campylobacter spp. izolatlarından, 88; Ocak 2013 döneminde ise 68 C. jejuni tespit edildi. İzolasyon ve identifikasyon sonuçları bakımından dönemler arasındaki fark istatistiksel yönden (Ki kare testi) önemli bulunmadı (P>0,05). Disk difüzyon testinde en yüksek direnç oranları, Haziran 2012 ve Ocak 2013 dönemi izolatları için sırasıyla nalidiksik asit (% 78,4-% 92,6), siprofloksasin (% 67,1-% 86,7) ve tetrasikline (% 55,6-% 64,7) karşı gözlenirken, en düşük oranlar ise azitromisin (% 1,1-% 4,4), doksisiklin (% 2,2-% 1,4) ve eritromisine (% 11,3-% 4,4) karşı bulundu. E test sonuçları ile disk difüzyon testi sonuçlarının uyumlu olduğu belirlendi. İzolatların test edilen antibiyotiklere duyarlılıklarında her iki dönem arasındaki fark istatistiksel olarak önemli bulunmadı (P>0,05). Tetrasiklin direnci yönünden genomik tetO geni; Haziran 2012 ve Ocak 2013 dönemi izolatlarının sırasıyla % 88 ve % 85,7'inde gösterilirken; plazmid aracılı tetO geni izolatların % 93,7 ve % 85,7'sinde tespit edildi. Makrolid direncinde 23S rRNA'da A2074C mutasyonuna izolatların hiçbirinde rastlanmazken; A2075G mutasyonuna Haziran 2012 ve Ocak 2013 dönemlerinde izolatların % 18,4 ve % 14,8'inde rastlandı. Genomik kinolon direncinde gyrA geni üzerindeki mutasyonlar, Haziran 2012 ve Ocak 2013 dönemlerinde, izolatların % 83,5 ve % 81,8'inde tespit edilirken; plazmid aracılı kinolon direnci amacıyla incelenen qnr geni, izolatların hiçbirinde bulunamadı. PZR ile saptanan kinolon ve makrolid direnci, DNA sekans analizi ile doğrulandı. Sekans analiziyle kinolon dirençli izolatlarda Tre-86-İle mutasyonuna rastlanırken; duyarlı izolatlarda bu mutasyona rastlanmadı. Sekans analizi ile makrolid dirençli izolatlarda A2075G mutasyonu tespit edildi. Ancak, hiçbir izolatta A2074C mutasyonuna rastlanmadı. Duyarlı izolatların hiçbirinde de bu iki mutasyon görülmedi. 
Sonuç olarak; tavuk etindeki antibiyotiklere dirençli C. jejuni varlığı nedeniyle koruyucu tedbirlerin alınması, tedavi edici amaçla bilinçsiz antibiyotik kullanımının engellenmesi, dar spektrumlu antibiyotik kullanımının tercih edilmesi ve antibiyotik uygulanan hayvanlarda, kullanılan antibiyotiğin organizmadan atılma süreleri tamamlanmadan hayvanların kesilip tüketime sunulmaması gerektiği, Campylobacter spp. enfeksiyonlarının tedavisinde ilk seçenek olarak kullanılan eritromisine ilaveten azitromisinin ve doksisiklinin de alternatif olarak kullanılabileceği kanısına varıldı.

Abstract:
In this study, to isolate Campylobacter jejuni from broiler carcasses, to reveal the resistance to macrolide, quinolone and tetracycline groups of antibiotics, to determine the MIC values, to demonstrate the genomic and plasmid mediated genes played role in resistance and to evaluate the seasonal differences in the resistance epidemiology of obtained isolates were aimed.
For the isolation of C. jejuni, a total of 200 samples including chicken thigh, breast, wings and carcasses purchased from supermarkets in Kayseri province were examined as materials in June 2012 and January 2013. The identification of the isolates was performed by phenotypical tests and multiplex Polymerase Chain Reaction (mPCR) method. The antibiotic resistance and MIC values of C. jejuni isolates were detected with disk diffusion and Etest method, respectively. In addition, the antibiotic resistances were examined by using PCR and sequencing.
Eighty one of 100 samples collected in June and 77 of 100 samples in January were found to be positive in terms of Campylobacter spp. with phenotypical tests. By using of mPCR, 88 and 68 C. jejuni isolates were detected from Campylobacter spp. isolates during June 2012 and January 2013 terms, respectively. According to isolation and identification results, the differences between June and January periods were not statistically (Qhi-squared test) significant (P>0,05). In disk diffusion test, while, the highest resistance rates were observed as nalidixic acid (78,4% - 92,6%), ciprofloxacin (67,1% - 86,7%) and tetracycline (55,6% - 64,7%), the lowest resistance rates as azithromycin (1,1% - 4,4%), doxycycline (2,2% - 1,4%) and erythromycin (11,3% - 4,4% ), for the period June and January, respectively were determined. It was determined that Etest results were compatible with disk diffusion test. The differences between June and January periods in terms of the tested antibiotics were not statistically important (P>0,05). Whilst, chromosomal tetO gene was shown in June and January isolates at 88 % and 85,7 % rates, plasmid mediated tetO gene was found at 93,7% and 85,7% rates, respectively. In macrolide resistance, while A2075G mutation was detected in 23SrRNA at rates 18,4 % and 14,8 % of June 2012 and January 2013 isolates, A2074C mutation was not observed at any of June 2012 and January 2013 isolates, respectively. When, in chromosomal quinolone resistance, the mutations in gyrA gene were detected at rates of 83,5% and 81,8% in June 2012 and January 2013 isolates, respectively, qnr gene examined for plasmid mediated quinolone resistance was found in none of C. jejuni isolates. Quinolone and macrolide resistances detected by PCR were confirmed by DNA sequencing. While, Tre-86-Ile mutation was found in quinolone resistant isolates with sequencing, but these mutations were not detected in susceptible isolates. Additionally, A2075G mutation was detected in macrolide resistant isolates. However, A2074C mutation was not observed in any isolates by using sequencing. It was not observed that none of the macrolide susceptible isolates had any of these two mutations. 
In conclusion, due to the presence of antibiotic resistant C. jejuni detected in chicken meat, protective measures should be taken, for therapeutic purposes, the misusing of antibiotics may be prohibited and the using of narrow-spectrum antibiotics may be preferred, in animals treated with antibiotics, before the completion of withdrawal period of antibiotics from organisms, animals may not be cut and presented for consumption. Besides, it is considered that in the treatment of Campylobacter infections, azythromycin and doxycycline may be used as alternative to erythromycin is the drug of choice.