Kolistin dirençli acınetobacter baumannıı suşlarına karşı çeşitli sinnamik asit türevleri ile kolistin kombinasyonlarının antimikrobiyal ve antibiyofilm aktivitelerinin değerlendirilmesi
Evaluation of the antimicrobial and antibiofilm activity of various cinnamic acid derivatives and colistin combinations against colistin-resistant acinetobacter baumannii strains
Yazar: ALAADDİN KORKUT
Danışman: DOÇ. DR. ELİF ODABAŞ KÖSE
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Enfeksiyon hastalıkları geçmişten günümüze halk sağlığını tehdit eden en önemli sorunlardan biridir. Antibiyotiklerin keşfiyle birlikte bu sorunun kontrol altına alındığı düşünülse de gereksiz ve aşırı antibiyotik kullanımı antimikrobiyal direnç kavramını gündeme getirmiştir. Özellikle Acinetobacter baumannii gibi klinik açıdan ciddi öneme sahip patojenler arasında antibiyotik direncinin giderek yayılması, araştırmacıları, bu patojenlerin neden olduğu enfeksiyon hastalıklarının tedavisi için yeni antimikrobiyal ajanlar ve/veya yaklaşımlar geliştirmeye yönlendirmiştir. 
Antibiyotiklere karşı direnç gelişimi ve kazanımı açısından muazzam özelliklere sahip olan A. baumannii, klinik açıdan yüksek öneme sahip nozokomiyal patojenlerinden biridir. Klinikte karbapenem dirençli A. baumannii suşlarının artmasıyla birlikte, nefrotoksik ve nörotoksik etkileri nedeniyle kullanımı sınırlandırılan kolistin yeniden kullanılmaya başlanmıştır. Fakat son yıllarda rapor edilen kolistin dirençli suşların artması nedeniyle, A. baumannii için yeni antimikrobiyallerin ve tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesi oldukça önemlidir.
Antibiyotiklerin, mevcut diğer antibiyotiklerle veya diğer antimikrobiyal ajanlarla kombine edilmesi, dirençli patojenlere karşı en çok tercih edilen stratejilerden biridir. Sekonder metabolitler yüksek antimikrobiyal aktiviteleri ve düşük toksik etkileri sayesinde, tek başlarında veya antibiyotiklerle kombinasyon halinde kullanılabilecek önemli kaynaklardır. Sinnamik asitler, bitkiler aleminde doğal olarak bulunan bir grup aromatik karboksilik asittir. Düşük toksisitelerinin yanı sıra antimikrobiyal, antioksidan ve antikanser aktivite gibi çok çeşitli biyolojik aktivitelere sahiplerdir. 
Bu bilgilere dayanarak, çalışmamızda sinnamik asit türevlerinden p-kumarik asit (p-KA), ferulik asit (FA) ve p-metoksisinnamik asidin (p-MSA) kolitsin dirençli A. baumannii'lere (KOLR-Ab) karşı antimikrobiyal, antibiyofilm ve kolistin ile sinerjistik aktiviteleri araştırılmıştır. Ayrıca bu bileşiklerin bakteriyel membran hasar potansiyelleri de değerlendirilmiştir. 
Çalıştığımız tüm izolatların kolistin minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri 32-128 µg/mL aralığında tespit edilmiştir. Bu değerler izole edilen tüm A. baumannii izolatlarının kolistin direncine sahip olduğunu göstermiştir. KOLR-Ab izolatlarına karşı p-KA (128-256 μg/mL), FA (512-1024 μg/mL) ve p-MSA'nın (128-512 μg/mL) güçlü antimikrobiyal etkiler gösterdiği tespit edilmiştir. Kolistin ile bileşiklerin, KOLR-Ab4 izolatına karşı kolistin ve FA (FİKİ = 0.51) dışındaki tüm kombinasyonları sinerjistik etki göstermiştir. Kolistinin bileşiklerle kombinasyonu sonucunda, kolistin MİK değerleri 1 µg/mL ila 4 µg/mL seviyesine düştüğü tespit edilmiştir. Bu dramatik düşüş çalışmada elde ettiğimiz en önemli sonuçlardan biridir. Nefrotoksik ve nörotoksik etkileri nedeniyle kullanımı sınırlandırılan bu antibiyotiğin düşük dozlarda güvenli kullanımı için umut vadedici bir sonuçtur.
A. baumannii'nin biyofilm oluşturma becerisi, bu bakterilerin hastane ortamlarındaki zorlu koşullar altında hayatta kalmalarına ve antibiyotik direncinin yayılımına katkı sağlamaktadır. Çalışmamızda, KOLR-Ab izolatlarının biyofilm üretim kapasiteleri mikrotitrasyon plaka bazlı CV tekniğiyle belirlenmiş ve sonuçlara göre izolatlardan biri güçlü, üçü orta derecede ve diğer biri de zayıf biyofilm üretimi göstermiştir. Ardından güçlü ve orta derece biyofilm üretim kapasitesine sahip izolatlara karşı kolistin, p-KA, FA ve p-MSA'nın antibiyofilm aktivitesi araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre tüm klinik izolatlara karşı maddelerin biyofilm oluşumunu yaklaşık %20 ila %70 oranında inhibe ettiği ortaya konmuştur. 
Tüm bileşiklerin bakteri hücre membranında oluşturduğu hasarın tespiti amacıyla, bileşikler ile bakterinin muamele edilmesi sonucu elde edilen süpernatantın 260 nm'de absorbansı (sitoplazmadan salınan nükleik asit miktarı) ölçülmüştür. p-MSA'nın MİK/4 konsantrasyonu dışındaki diğer tüm ajanların membran hasarına katkı sağladığı belirlenmiştir. Dolayısıyla bileşiklerin antimikrobiyal etkilerinin; bakteriyal membranın hasarı ve hücresel içeriğin hücre dışına sızıntısıyla ilişkili olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmanın sonuçlarının, kolistine dirençli A. baumannii'nin neden olduğu enfeksiyon hastalıklarının tedavisine yönelik daha ileri araştırmalara temel oluşturacağı öngörülmektedir.

Abstract:
Infectious diseases are one of the most important problems that threaten public health from past to present. Although it is thought that this problem has been taken under control with the discovery of antibiotics, unnecessary and excessive use of antibiotics has brought the concept of antimicrobial resistance to the agenda. The increasing spread of antibiotic resistance, especially among clinically serious pathogens such as Acinetobacter baumannii, has led to the development of new antimicrobial agents and/or approaches for the treatment of infectious diseases caused by these pathogens. 
A. baumannii is one of the nosocomial pathogens of high clinical importance, which has tremendous characteristics in terms of development and acquisition of resistance to antibiotics. With the increase in carbapenem-resistant A. baumannii strains in the clinic, colistin, which was restricted due to its nephrotoxic and neurotoxic effects, has started to be used again. However, due to the increase in colistin resistant strains reported in recent years, it is very important to develop new antimicrobials and treatment approaches for A. baumannii.
Combining antibiotics with other available antibiotics or other antimicrobial agents is one of the most preferred strategies against resistant pathogens. Secondary metabolites are an important resource that can be used alone or in combination with antibiotics due to their high antimicrobial activity and low toxic effects. Cinnamic acids are a group of aromatic carboxylic acids found naturally in the plant kingdom. In addition to their low toxicity, they have a wide range of biological activities such as antimicrobial, antioxidant and anticancer activity. 
Based on this information, we investigated the antimicrobial, antibiofilm and colistin synergistic activities of cinnamic acid derivatives p-coumaric acid (p-KA), ferulic acid (FA) and p-methoxycinnamic acid (p-MSA) against colistin-resistant A. baumannii (KOLR-Ab). The bacterial membrane damage potential of these compounds was also evaluated. 
The colistin minimum inhibitory concentration (MIC) values of all the isolates we studied were determined in the range of 32-128 µg/mL. These values showed that all A. baumannii isolates had colistin resistance. It was determined that p-KA (128-256 μg/mL), FA (512-1024 μg/mL) and p-MSA (128-512 μg/mL) showed strong antimicrobial effects against KOLR-Ab isolates. All combinations of colistin and compounds showed synergistic effect against KOLR-Ab4 isolate except colistin and FA (FICI = 0.51). As a result of the combination of colistin with compounds, colistin MIC values decreased from 1 µg/mL to 4 µg/mL. This dramatic decrease is one of the most important results of the study. This is a promising result for the safety of this antibiotic whose use is restricted due to its nephrotoxic and neurotoxic effects.
The ability of A. baumannii to form biofilms contributes to the survival of these bacteria under extreme conditions in hospital environments and the spread of antibiotic resistance. In our study, the biofilm production capacities of KOLR-Ab isolates were determined by microtiter plate-based CV technique and according to the results, one isolate showed strong, three showed moderate and one showed weak biofilm production. Then, the antibiofilm activity of colistin, p-KA, FA and p-MSA against the isolates with strong and moderate biofilm production capacity was analysed. According to the results obtained, the compounds inhibited biofilm formation by approximately 20% to 70% against all clinical isolates.
In order to determine the damage caused by the compounds on the cell membrane, the absorbance of the supernatant at 260 nm (the amount of nucleic acid released from the cytoplasm) was measured. It was determined that all agents except the MIC/4 concentration of p-MSA contributed to membrane damage. Therefore, the antimicrobial effects of the compounds are thought to be related to the damage of the bacterial membrane and leakage of cellular contents out of the cell. The results of this study are expected to form the basis for further research on the treatment of infectious diseases caused by colistin-resistant A. baumannii.