Peynir altı suyunda ß-kazomorfin-7 ölçümü için ELİSA'ya dayalı kantitatif metot tasarımı
ELISA-based quantitative method design for the detection of ß-casomorphin-7 in cheese wheys
Yazar: ÖMER ERGİN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. EBRU SAATÇİ
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Genel Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid

Özet:
Bu çalışmada Türkiye?de imal edilmiş peynirlerin, peynir altı sularında bulunan beta-kazomorfin-7 (ß-kazomorfin-7, BKM-7) peptiti indirek ELİSA ve ters-faz HPLC de analiz edilmiştir. Öncelikle ELİSA standart grafiğini elde etmek üzere, standart inek BKM-7 peptidi BSA ile gluteraldehit konjugasyon metoduyla konjuge edilmiştir. Optimize ELİSA metodu sonlandırılması 25. dk da, 405 nm dalga boyunda plaka okuyucu ile yapılmıştır. Elde edilen absorbans değerleri, 1:30 molar oranda BSA-BKM-7 peptit konjugatının 6.25-100 ng/ml aralığında 1/150 primer antikor ve 1/250 enzimatik işaret dilüsyonlarında bir seri standart BKM-7 eğrisine karşı hesaplanmıştır. ELİSA testinin hassasiyeti 23±5.3 ng/ml olarak bulunmuştur. 0.05-0.5 dilüsyon aralığındaki 9 çeşit peynir altı suyu BKM-7 miktarı optimizasyon sonrası indirek ELİSA metodu ile ölçülmüştür. C marka peynir örneği için bulunan BKM-7 miktarı absorbans BKM-7 standart eğrisi kullanılarak, 403.1 ng/ml olarak bulunmuştur. Diğer peynir sularında BKM-7 miktar hesaplaması için immün aktivite alınamamıştır.
Ters-faz HPLC çalışmalarında, BKM-7?nin 220 nm dalga boyunda, 36-38. dk arasında maksimum absorbans verdiği gözlenmiştir. Elde edilen BKM-7 piklerinin konsantrasyonu, 0.0312-1.25 mM derişim aralığında standart eğrisine karşı hesaplanmıştır. Kullanılan filtrelerin geri kazanım katsayılarına göre (30000 MWCO için 0.9) yapılan iyileştirme ile A marka peynir altı suyundaki ortalama BKM-7 miktarı 12.5 ±2.35 µM ve karşılığı 10 ng/ml, B marka peynir altı suyundaki ortalama BKM-7 miktarı 35.1±3.93 µM ve karşılığı 28.1 ng/ml ve C marka peynir altı suyundaki ortalama BKM-7 miktarı 422.68 ± 4.16 µM ve karşılığı 338.15 ng/ml bulunmuştur.
Çalışılan metotları karşılaştırdığımızda, ELİSA metodunun deteksiyon alt limiti 6.25 ng/ml olmakla beraber HPLC metodunun düşük konsantrasyonlarda, ELİSA?nın ise yüksek konsantrasyonlarda HPLC?ye göre daha iyi sonuç verdiği görülmüştür. C marka peynir altı suyu BKM-7 peptit miktarının HPLC ile tespit edilen miktarı ile ELİSA da tayin edilen miktarı yüksek tutarlılık göstermektedir. Çalışılan metotlar peptit tespiti ve ölçümü açısından birbirlerini desteklemektedirler.
Pek çok hastalığın etmeni olan ve sağlık açısından her yönden önem ihtiva eden biyoaktif peptit BKM-7, şimdiye kadar geliştirilen diğer yöntemlerinin aksine, sindirim metabolizması çalışmaları ve ekstraksiyon yöntemleri dâhil edilmeden, çalışmamızda geliştirilen metotlarla peynirde direk olarak tespit edilmektedir. Buna bağlı olarak çalışmamız, marketlerde, A1 tip inek sütü ürünlerinin tespitine olanak sağlayan özel bir araştırma niteliği taşımaktadır. İnek sütünde A1 tip süt biyobelirteci niteliğindeki BKM-7? nin miktar tayini yapılabilinmesi yönünden geliştirilen analitik metot, günlük hayata uygulanabilirliği kuvvetle muhtemel inovatif bir çalışmadır.

Abstract:
In recent study, beta-casomorphin-7 (ß-casomorphin-7, BCM-7) content of Turkish white cheese rennet was quantitatively detected by indirect ELISA and RP-HPLC methods. Bovine standard BCM-7 was conjugated with BSA by using glutaraldehyde conjugation method for the drawing of standard graph of ELISA method. Developed ELISA plates had read at 405 nm at 25. min by using plate reader. The concentration of BCM-7 peptides in the samples were calculated towards standard graphics. The graphics were constructed by using 1:30 (w/w) molar ratio of BSA-BCM-7 peptide conjugation in the range of 6.25-100 ng/ml with 0.991 r2 linearity where the optimum antibody dilutions were 1/150 and 1/250 for the primer antibody and enzymatic labels, respectively. The presicion of the indirect ELISA test was as 23±5.3 ng/ml. BCM-7 quantity of 9 different brands of cheese wheys were detected in the dilution limits of 0.05-0.5 by using optimized indirect ELISA method. As a result of detection, the amount of BCM-7 in white cheese C brand was found as 403.1 ng/ml. For the other brands, the immunoreactive did not detected for the calculation of the amount of the peptide.
In RP-HPLC chromatograms, the maximum absorbance peaks of standard bovine BCM-7 peptides were detected at 220 nm between 36-38. minutes. The amount of the petide in the cheese rennets were calculated towards standard graphic in the range of 0.0312-1.25 mM concentration with 0.9999 r2 linearity. After the calculation of the recovery coefficient (0.9 for MWCO 30,000) of the used filters in the filtration, the concentration of BCM-7 were found as 12.5 ±2.35 µM and 10 ng/ml, 35.1±3.93 µM and 28.1 ng/ml, 422.68 ± 4.16 µM and 338.15 ng/ml for brands A, B and C, respectively. 
When we compare the methods, even the detection limit of ELISA test was 6.25 ng/ml. It was seen that indirect ELISA method was good in the high concentrations of the peptide and RP-HPLC was good in the low concentrations. A good correlation was found between the methods for the concentration of brand C cheese peptide. Developed methods are supported each other in the determination and the detection of the peptide.
The bioactive peptide BCM-7, factor and reason of many diseases in terms of the importance of health, can be directly detected from the cheese rennet by using the designed method in the thesis without the need for digestion, extraction processes and metabolism studies, unlike the other methods so far developed. Therefore, our study is a unique and an innovative research which allows to determine A1-type cow milk and milk products in the markets. In terms of the amount to determination of BCM-7 as A1 type cow milk biomarker in the milk products, the applicability ofthe analytical developed method in daily life is more likely.