Protein kalite kontrolünde görev alan FtsH-HflKC protein kompleksinin yapısal biyolojisi
Structural biology of FtsH-HflKC protein complex involved in protein quality control
Yazar: GÜNCE GÖÇ
Danışman: DOÇ. DR. YONCA YÜZÜGÜLLÜ KARAKUŞ ; DR. BURAK VELİ KABASAKAL
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Membran proteinleri = Membrane proteins ; Rekombinant proteaz üretimi = Recombinant protease production

Özet:
Escherichia coli membran proteini FtsH, AAA+ ATPaz ve metalloproteaz özelliklerine sahip, yanlış katlanmış veya hatalı proteinleri parçalayan bir proteindir. FtsH'nin proteolitik aktivitesi, HflKC tarafından düzenlenmektedir. Bu çalışma, FtsH-HflKC kompleksinin biyokimyasal karakterizasyonunu ve yapısal analizini içermektedir. FtsH-HflKC ve HflKC'nin rekombinant üretimi, Lemo21 (DE3) konak hücrelerinde optimize edilmiş, Streptaktin ve/veya Kobalt reçineleri kullanılarak saflaştırılmıştır. FtsH ve FtsH-HflKC'nin proteolitik deneyleri, ATP varlığı ve yokluğunda %0,4 kazein kullanılarak 574 nm'de 37 ve 50ºC'de gerçekleştirilmiştir. Buna göre 37°C'de ATP yokluğunda FtsH'nin bağıl aktivitesi %100, ATP varlığında %90 olarak belirlenmiştir. FtsH, HflKC ile kompleks oluşturduğunda 37°C'deki ATP varlığında ve yokluğunda bağıl proteolitik aktivitesi sırasıyla %39 ve %40 olarak tespit edilmiştir. Sonuçlar, HflKC'nin FtsH'nin proteolitik aktivitesinde düşüşe neden olduğunu göstermiştir. ATPaz aktiviteleri, farklı ATP konsantrasyonlarında 360 nm'de incelenmiştir. 2 µM FtsH ve FtsH-HflKC'nin 10 mM ATP varlığında spesifik aktiviteleri sırasıyla 9,97 U/mg ve 3,85 U/mg olarak hesaplanmıştır. Yapısal analizde, FtsH-HflKC, TEM, Kriyo-EM ve SAXS ile incelenmiştir. RELION 4.1 ve CryoSPARC programlarında FtsH-HflKC'nin üç boyutlu haritaları elde edilmiştir. İki boyutlu sınıflandırmada FtsH-HflKC'nin dinamik yapısını koruduğu gözlemlenmiştir. Bu nedenle, RELION 4.1'de yapı, FtsH ve HflKC olarak iki ayrı harita şeklinde işlenmiş, CryoSPARC'ta kompleks yapı bir tutularak algoritması esneklik üzerine olan Uniform Olmayan İyileştirme işlemi gerçekleştirilmiştir. C6 simetrisinde olduğu SAXS deneyleriyle desteklenen ve ~27 nm büyüklüğündeki kompleksin çözünürlükleri; RELION 4.1'de FtsH için 8,8 Å, HflKC için 9,32 Å; CryoSPARC'ta tüm yapı için 9,25 Å olarak belirlenmiştir. Harita, hekzamerik FtsH yapısının altı HflKC dimeriyle kompleks oluşturduğunu göstermektedir. Bu araştırma, antibiyotik direnciyle mücadelede önemli katkılar sunarak yeni antibiyotiklerin geliştirilmesine yönelik fırsatlar sağlamaktadır.

Abstract:
Escherichia coli membrane protein FtsH is an AAA+ ATPase and metalloprotease and cleaves misfolded proteins. Proteolytic activity of FtsH is regulated by HflKC. This study encompasses biochemical and structural analysis of FtsH-HflKC complex. Recombinant production of FtsH-HflKC and HflKC was optimized in Lemo21 (DE3) cells, purified using Streptactin and/or Cobalt resins. Proteolytic experiments of FtsH and FtsH-HflKC were conducted at 574 nm, using 0.4% casein, at 37 and 50°C, with and without ATP. At 37°C without ATP, FtsH exhibited a relative activity of 100%, while in presence of ATP, relative activity was 90%. Relative proteolytic activities of FtsH-HflKC were 39-40% in presence and absence of ATP, respectively. Results indicate that HflKC has down-regulatory effect on FtsH's proteolytic activity. ATPase activities were performed at 360 nm under different ATP concentrations. Specific activities of FtsH and FtsH-HflKC are found 9.97 U/mg and 3.85 U/mg, respectively. Structural analysis employed TEM, Cryo-EM, and SAXS for FtsH-HflKC. Three-dimensional maps were obtained using RELION 4.1 and CryoSPARC. Two-dimensional classification revealed dynamic structure preservation of FtsH-HflKC. Separate maps as FtsH and HflKC were generated in RELION 4.1, while in CryoSPARC, structure was processed as FtsH-HflKC. SAXS experiments confirming C6 symmetry, ~27 nm-sized particles have resolutions of 8.8Å for FtsH and 9.32Å for HflKC in RELION 4.1, and 9.25Å for the entire structure in CryoSPARC. Maps indicate formation of complex with a hexameric FtsH structure and six HflKC dimers. This research makes a significant contribution to combating antibiotic resistance by providing opportunities for the development of novel antibiotics.