Kan akımı enfeksiyonu ile ilişkili candida türlerinin antifungal duyarlılıklarının belirlenmesi
Determination of antifungal susceptibility of candida species associated with bloodstream infection
Yazar: ELİF OĞUZMAN
Danışman: PROF. DR. EBRU EVREN YURTCU
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: Kandidemi, en yaygın hastane enfeksiyonları arasındadır, insidansının son yıllarda artış göstermesi, yüksek ölüm oranları ve artan antifungal direnç nedeniyle en büyük halk sağlığı sorunlarından biri haline gelmiştir. Çalışmamızda Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İbn-i Sina Hastanesi Merkez Mikrobiyoloji Laboratuvarı'na gelen kan kültürü örneklerinde üreyen Candida türlerinin dağılımı, referans sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile antifungal duyarlılıkları, yoğun bakım ünitesi (YBÜ) ve diğer servislerdeki hasta popülasyonunda, tür dağılımındaki ve ilaç direncindeki farklılıklarının araştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca antifungal duyarlılık testi (AFDT) için referans sıvı mikrodilüsyon yönteminin yanısıra yeni geliştirilmiş ticari yöntemlerden VITEK 2'nin (BioMérieux, Fransa) antifungal duyarlılıkları saptamadaki performansının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Laboratuvarımızda kan akımı enfeksiyonu (KAE) etkeni olan Candida türleri arasında en sık izole edilen tür olması ve nozokomiyal salgınlar yapabilmesi nedeniyle Candida parapsilosis'te azol direncinin moleküler mekanizmalarının da araştırılması amaçlanmıştır. 
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda, laboratuvarımızda 2021-2023 yılları arasında kan kültürlerinden izole edilen 134 izolata EUCAST sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile flukonazol, vorikonazol, itrakonazol, anidulafungin, kaspofungin, mikafungin ve amfoterisin B için ve VITEK 2 otomatize sistemi ile flukonazol, vorikonazol, kaspofungin, mikafungin, amfoterisin B ve flusitozin için AFDT çalışılmıştır. C. parapsilosis'de azol direnci gelişiminden en sık sorumlu olan erg11 genindeki A395T (Y132F) mutasyonunun taranması amacıyla literatürde yer alan iki farklı prosedürde multipleks allel spesifik polimeraz zincir reaksiyonu (MAS PZR) yöntemi çalışılmıştır. C. parapsilosis türlerinde azolleri hücre dışına taşıyan dışa atım pompası'nın (DAP) transkripsiyon faktörü olan mrr1 genindeki mutasyonlar araştırılmıştır. mrr1 gen bölgesi PZR ile çoğaltılmış ve sonrasında DNA dizi analizi yapılmıştır. Elde edilen diziler referans gen ile karşılaştırılarak mutasyonlar taranmıştır. 
Bulgular: KAE nedeni olan 182 adet tekrarlamayan Candida saptanmıştır. İzolatların %36,3'ü (n=66) Candida parapsilosis, %28,6'sı (n=52) Candida albicans, %18,1'i (n=33) Candida glabrata, %7,7'si (n=14) Candida auris, %3,8'i (n=7) Candida tropicalis, %2,2'si (n=4) Candida kefyr, %2,2'si (n=4) Candida krusei, %1,1'i (n=2) Candida dubliniensis olarak tanımlanmıştır. Duyarlılık testleri, en sık izole edilen türler olan C. parapsilosis (n=57), C. albicans (n=49) ve C. glabrata (n=28) olmak üzere toplam 134 Candida izolatına uygulanmıştır. Test edilen izolatların yaklaşık %62'si (n=84) YBÜ, %48'i (n=55) diğer servislerden gelmiştir. YBÜ'de kandidemi hastalarından en sık izole edilen tür C. parapsilosis (%50, n=42) iken diğer servislerde C. albicans (%44, n=22) olmuştur. EUCAST referans sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile izolatların %33,6'sının (n=45) flukonazole dirençli olduğu, tür düzeyinde C. parapsilosis'in flukonazole en dirençli (%68,4) tür olduğu ve diğer azollere de çapraz direnç gösterdiği saptanmıştır. C. albicans ise flukonazole en duyarlı (%93,9, n=46) tür olarak gözlenmiştir. YBÜ'de, diğer servislere göre flukonazol, vorikonazol ve itrakonazol direncinin daha yüksek olduğu saptanırken direncin yüksekliği sadece vorikonazolde istatistiksel olarak anlamlı şekilde farklılık içermiştir. Ekinokandinlere direnç %6,7 (n=9) ve en yüksek ekinokandin direnç oranı C. glabrata'da saptanmıştır (%28,6, n=8). C. parapsilosis'de ekinokandin direncine rastlanmamıştır. Amfoterisin B direnç oranı düşük olup %3 olarak saptanmıştır. VITEK 2 ile izolatların %99,3'ü flusitozine duyarlı bulunmuştur. VITEK 2 yönteminin esansiyel uyumu (EU) amfoterisin B için %91,7, flukonazol için %88,5, mikafungin için %83,3 ve vorikonazol için %75 olarak tespit edilmiştir. Kategorik uyum (KU) ise mikafunginde %95, vorikonazol ve amfoterisin B'de %92,5, flukonazolde ise %91,8 şeklinde saptanmıştır. Çok büyük hata (ÇBH) oranı  vorikonazolde %7,8 iken flukonazolde %4,35 olarak bulunmuştur. Büyük hata (BH) oranı amfoterisin B'de %7,7, mikafunginde %4,6 ve vorikonazolde %2,1 olarak belirlenmiştir. Küçük hata ise (kH) flukonazolde %6,7, vorikonazolde %3,7 oranındadır.
 C. parapsilosis izolatlarının erg11 genindeki A395T (Y132F) mutasyonunun varlığını taramak amacıyla gerçekleştirilen her iki MAS PZR protokolü ile izolatların %61,4'ünde (35/57) mutasyon saptanmıştır. Azollere duyarlı olmayan C. parapsilosis izolatlarının DNA dizi analizinde izolatların %36,6'sında (15/41) mrr1 geninde mutasyon saptanmıştır. En sık G1214A (R405K) (%22) ardından G2779T (G927C) (%14,6) mutasyonları saptanmıştır. 
Sonuç: Hastanemizde en sık kandidemi etkeninin C. parapsilosis olduğu saptanmış ve azollere direnç oranının yüksek olduğu gösterilmiştir. Değerlendirilen izolatların taşıdığı erg11 ve mrr1 genlerindeki direnç mutasyonları belirlenerek azol direncinin altında yatan moleküler mekanizmalar belirlenmiş ve bu konu hakkında epidemiyolojik verilere katkı sağlanmıştır. Çalışmamızda VITEK 2 sisteminin, Candida türlerinde kategorik uyumunun iyi olduğu ancak bazı türlerde VITEK 2 konsantrasyon aralıklarının düzenlenmesi gerektiği kanısına varılmıştır.

Abstract:
Aim: Candidaemia is one of the most common nosocomial infections and has become one of the biggest public health problems due to its increasing incidence in recent years, high mortality rates and increasing antifungal resistance. In our study, we aimed to investigate the distribution and antifungal susceptibilities of Candida species isolated from in blood cultures of patients at the Central Microbiology Laboratory of Ankara University Faculty of Medicine Ibn-i Sina Hospital. Antifungal susceptibilities were revealed by the reference broth microdilution method, and differences in distribution of Candida species and drug resistance in intensive care units (ICU) and other clinical services were evaluated. In addition to the reference broth microdilution method for antifungal susceptibility testing (AFST), we also aimed to evaluate the performance of VITEK 2 (BioMérieux, France), a newly developed commercial method, for determining the antifungal susceptibilities of Candida species. We also aimed to investigate the molecular mechanisms of azole resistance in C. parapsilosis since it is the most frequently isolated Candida species causing blood stream infections (BSI) in our hospital and is capable of causing nosocomial outbreaks.
Materials and Methods: In our study, 134 Candida strains isolated from blood cultures of patients in our laboratory between 2021 and 2023 were evaluated. AFSTs for fluconazole, voriconazole, itraconazole, anidulafungin, caspofungin, micafungin and amphotericin B were carried out by the EUCAST broth microdilution method, and fluconazole, voriconazole, caspofungin, micafungin, amphotericin B and flucytosine susceptibilities were also determined by the VITEK 2 automated system. Two different multiplex allele specific polymerase chain reaction (MAS PCR) methods in the literature were used to screen the A395T (Y132F) mutation in the erg11 gene, which is the most frequently detected mutation responsible for the development of azole resistance in C. parapsilosis species. Mutations in the mrr1 gene, which is the transcription factor of the efflux pump (DAP) that transports azoles out of the cell in C. parapsilosis species, were also investigated. Fort his purpose, mrr1 gene region was amplified by PCR and then DNA sequence analysis was performed subsequently. The sequences obtained were compared with the reference gene and mutations were screened. 
Results: 182 non-duplicate Candida CAEs were found. Of the isolates, 36.3% (n=66) was Candida parapsilosis, 28.6% (n=52) was Candida albicans, 18.1% (n=33) was Candida glabrata, 7.7% (n=14) was Candida auris, 3.8% (n=7) was Candida tropicalis, 2.2% (n=4) each were Candida kefyr and Candida krusei, and 1.1% (n=2) was Candida dubliniensis. Susceptibility tests were performed on a total of 134 Candida isolates including C. parapsilosis (n=57), C. albicans (n=49) and C. glabrata (n=28), which were the most frequently detected ones. Of the isolates tested, 62% (n=84) were isolated from the ICU patients and 48% (n=50) were from patients hospitalized at various clinical services. While C. parapsilosis (50%, n=42) was the most frequently isolated species from patients with candidemia in the ICU, C. albicans (44%, n=22) was the most frequently isolated species from other clinical services. With the EUCAST reference broth microdilution method, 33.6% (n=45) of the isolates were resistant to fluconazole, C. parapsilosis was the most resistant (68.4%) species to fluconazole and showed cross-resistance to other azoles. C. albicans was the most susceptible (93.9%, n=46) species to fluconazole. Voriconazole resistance was statistically significantly higher in the ICU than other clinical services. Resistance to echinocandins was 6.7% and the highest echinocandin resistance rate was found in C. glabrata (28.6%, n=8). Echinocandin resistance was not observed in C. parapsilosis species. Amphotericin B resistance rate was low (3%). With the VITEK 2 system, 99.3% of the isolates were found to be susceptible to flucytosine. Essential agreement (EA) of VITEK 2 was 91.7% for amphotericin B, 88.5% for fluconazole, 83.3% for micafungin and 75% for voriconazole. Categorical agreement (CA) was 95% for micafungin, 92.5% for amphotericin B and voriconazole, and 91.8% for fluconazole. Very majör error (VME) rate was 7.8% for voriconazole and 4.35% for fluconazole. Major error (ME) rate was 7.7% for amphotericin B, 4.6% for micafungin and 2.1% for voriconazole. Minor error (miE) rates were 6.7% for fluconazole and 3.7% for voriconazole. 
With both of the MAS PCR protocols used to screen the presence of A395T (Y132F) mutation in the erg11 gene of C. parapsilosis isolates, 61.4% (35/57) of the isolates were found to carry this mutation. In C. parapsilosis isolates that were not susceptible to azoles, mutations in the mrr1 gene were detected in 36.6% (15/41) of the isolates by sequence analysis. The most common mutation in the mrr1 gene was G1214A (R405K) (22%) followed by G2779T (G927C) (14.6%) mutation.
Conclusions: C. parapsilosis was found to be the most commonagent of candidaemia in our institution and was highly resistant to azoles. By determining the resistance mutations in the erg11 and mrr1 genes of the isolates, the molecular mechanisms underlying azole resistance in the study strains were determined and epidemiological data on this subject was provided. In our study, it was concluded that the CA of the VITEK 2 system was good in Candida species, but for some species the concentration ranges of the antifungals must be reviewed.