Tricholoma imbricatum (Fr.) p.kumm.  ve tricholoma anatolicum H.H. Doğan & İntini türlerinin antioksidan ve sitotoksik aktivite gösteren bileşiklerinin hplc ile izolasyonu ve yapılarının aydınlatılması
Isolation and  structure eluciadtion of antioxidant and anticancer compounds of tricholoma imbricatum (Fr.) p.kumm. and tricholoma anatolicum H.H. Doğan & Intini  via hplc
Yazar: ERHAN KAPLANER
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Kimya teknikleri-analitik = Chemistry techniques-analytical ; Makromantarlar = Macrofungi

Özet:
Bu tez kapsamında kimyası çalışılan Tricholoma türleri tıbbi özellikleri olan Matsutake mantarının ailesinden gelmektedir. Tricholoma matsutake dünyada hem gıda hem de tıbbi olarak kullanılmaktadır. Tıbbi olarak özellikle kanser hastalıklarının tedavisinde ve bağışıklık sisteminin güçlendirilmesinde tercih edilen türlerden bir tanesidir. Tricholoma anatolicum türü T. matsutake'ye en çok benzeyen türdür ve Japon'ların kutsal mantarı olarak bilinir. Anadoluda doğal olarak yayılış gösteren ve yenilebilen Tricholoma anatolicum H.H. Doğan & Intini ve Tricholoma imbricatum (Fr.) P. Kumm. mantar türlerinin sekonder metabolitleri antioksidan aktivite kontrollü çalışıldı. Öncelikle, kurutulmuş örnekler oda sıcaklığında sırasıyla petrol eteri, aseton ve metanol ile ekstre edildiler. Geri kalan kalıntının 80 C'de infüzyonu alındı ve üzerine hacminin üç katı kadar etanol eklenerek yüksek molekül ağırlığına sahip maddeler çöktürüldü. Çöktürülen kısım HWEP ekstresi; çökmeden kalan diğer kısım ise HWES ekstresi olarak kodlandı. Geri kalan mantar kalıntıları 0,1 N NaOH ile aynı sıcaklıkta ekstre edillerek tekrar üzerine hacminin üç katı kadar etanol eklendi. Çöktürülen alkali kısım HWEP (NaOH) ekstresi; çökmeden kalan diğer alkali kısım ise HWES (NaOH) ekstresi olarak kodlandı. Elde edilen 7 adet ekstrenin β-karoten-linoleik asit, DPPH serbest radikali giderimi, ABTS katyon radikali giderimi, CUPRAC ve metal bağlama yöntemlerine göre antioksidant aktivitesi test edildi. Aynı ekstrelerin sitoksik aktiviteleri fibroblast (L929), akciğer kanser hücresi (H1299) ve meme kanser hücresi (MCF-7) hatlarına karşı WST-1 metoduyla test edildi. Ayrıca, ikili boyama ve kaspaz-3 immunositokimyasal yöntemleriyle apoptozun ve nekrozun belirlenmesi çalışmaları yapıldı. Bunlara ilaveten, gerçek zamanlı hücre proliferasyonları aynı hücre hatlarına karşı belirlendi. Biyoaktif bileşenlerin izolasyonu DPPH• ve ABTS•+ giderimi kontrollü olarak yapıldı. Biyoaktif ekstre ve fraksiyonlardan izolasyon çalışmaları sonucunda 2 si yeni olan 8 adet steroid ile birlikte 1 adet organik asit, 6 adet mono-, di-, ve tetra- şeker olmak üzere toplamda 15 madde saflaştırıldı ve yapıları NMR, MS, IR, GC-MS gibi spektroskopik tekniklerle belirlendi. Kristal halde saflaştırılan maddenin tanımlanmasında spektroskopik tekniklerin yanında ayrıca X-RAY de kullanıldı. Tricholoma türlerinden ergesterol peroksit (1), 5α,9α-epoksiergosta-7,22-dien 3β,6α-diol (2), 5α,9α-epoksiergosta-7,22-dien 3β,6β –diol (3),  5α,6α-epoksi ergosta-7,22-dien, 3β-ol (4), 5α,6α-epoksiergosta-7,22-dien, 3β-ol (5), ergosta-5,7,22-trien, 3β-ol (6), 5α,6α-epoksiergosta-7,22-dien, 3β-ol (7), 3,5-dihidroksi, (5β-H) 2-furanone (8), mannitol (9), α-D-Glucopyranoside, α-D-glucopyranosyl (10), maleik asit (11), tetra-mannitol (12), dimannitol (13), mannitol (14) ve ergosta-5,7,22-trien, 3β-ol (15) elde edilen maddelerdir. Yapı tayini çalışmalarıda 2 yeni madde (2 ve 3) ilk defa bu çalışma elde edilmiş ve yapısı aydınlatılmış oldu. Yapısı aydınlatılan maddelerin antioksidan ve sitotoksik aktiviteleri aynı metodlar ile belirlendi.
Anahtar Kelimeler: Tricholoma anatolicum H.H. Doğan & Intini, Tricholoma imbricatum (Fr.) P. Kumm., İzolasyon, Spektroskopi, Yapı tayini, Antioksidan aktivite, Sitotoksik aktivite, MCF-7, H1299, L929.

Abstract:
The Tricholoma species studied in this thesis belongs to Matsutake family having medicinal properties. Tricholoma matsutake is particularly used for food and medicine in all over the world. It is particularly used in the treatment of cancer diseases and strengthening of the immune system. Tricholoma anatolicum species is the most similar species to T. matsutake and is known as holy mushroom of the Japanese. Tricholoma imbricatum (Fr.) P. Kumm and Tricholoma anatolicum H.H. Doğan & Intini, which are naturally distributed in Anatolia and consumed as foods, were studied to isolate secondary metabolites by antioxidant activity guided fractionation. Dried mushroom samples were extracted with petroleum ether, acetone and methanol, successively, at room temperature. Then the remaining mushroom material was extracted with hot water at 80 ºC. After filtration, the hot water infusion was added three times volume of ethanol. The precipitated extract was coded HWEP while the soluble part was HWES. Lastly, the remaining part from infusion was extracted with 0.1 N NaOH at 80 ºC. After filtration, the alkaline water infusion was added three times volume of ethanol. The precipitated extract was coded HWEP (NaOH) while the soluble part was HWES (NaOH). The obtained 7 extracts were tested for their antioxidant activity according to β-carotene-linoleic acid, DPPH free radical scavenging, ABTS cation radical scavenging, CUPRAC and metal chelating methods. The cytotoxic activity of the same extracts was tested against fibroblast (L929), lung cancer (H1299) and breast cancer (MCF-7) cell lines by the WST-1 method. In addition, double staining and caspase-3 immunocytochemical methods were used to determine the apoptosis and necrosis index. Moreover, real-time cell proliferations were determined against the same cell lines. The antioxidant activity of the fractions was performed using DPPH• and ABTS•+ scavenging activity methods to isolate bioactive compounds. The isolation studies afforded totally 15 compound which 8 of them were steroid including 2 new steroids, 1 of them was organic acid, and remaining were mono-, di-, and tetra- sugar. The structures were elucidated using NMR, MS, IR, GC-MS etc spectroscopic techniques. The X-RAY was also used for the crystallized compound. Ergosterol peroxide (1), 5α,9α-epoxyergosta-7,22-dien 3β,6α-diol (2), 5α,9α-epoxyergosta-7,22-dien 3β,6β –diol (3),  5α,6α-epoxyergosta-7,22-dien, 3β-ol (4), 5α,6α-epoxyergosta-7,22-dien, 3β-ol (5), ergosta-5,7,22-trien, 3β-ol (6), 5α,6α-epoxyergosta-7,22-dien, 3β-ol (7), 3,5-di hydroxy, (5β-H) 2-furanone (8), mannitol (9), α-D-Glucopyranoside, α-D-glucopyranosyl (10), maleic acid (11), tetra-mannitol (12), di-mannitol (13), mannitol (14) and ergosta-5,7,22-trien, 3β-ol (15) were isolated from the Tricholoma species. The compounds 2 and 3 were isolated and elucidated for the first time in this thesis study. The antioxidant and cytotoxic activities of the isolated compounds (1-15) were determined using the same methods.
Keywords: Tricholoma anatolicum H.H. Doğan & Intini, Tricholoma imbricatum (Fr.) P. Kumm., Isolation, Spectroscopy, Structure elucidation, Antioxidant activity, Cytotoxic activity, MCF-7, H1299, L929.