Trichomonas vaginalis sialidaz geninin escherichia coli'de klonlanıp biyolojik aktivitesinin araştırılması
Cloning and biological activity determination of sialidase gene of trichomonas vaginalis
Yazar: GAMZE BAŞBÜLBÜL
Danışman: PROF. DR. BÜLENT BOZDOĞAN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Parazitoloji = Parasitology

Özet:
Amaç: Bu araştırma bir protozoon parazit olan T.vaginalis'in siyalidaz enzimini kodlayan geni klonlamak ve rekombinant organizmadan elde edilen ham ve saflaştırılmış siyalidaz enziminin biyolojik aktivitesini araştırmak amacıyla yapılmıştır. 
Gereç ve Yöntem: Araştırmada ADÜ Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı'ndan temin edilen T. vaginalis parazitinin DNA'sı kullanılmıştır. PCR ile çoğaltılan siyalidaz geni, resktriksiyon ve ligasyon aşamalarından sonra, pET30a plazmidi üzerinde kimyasal transformasyon ile E.coli bakterisine aktarılmış ve üretilen siyalidaz proteini saflaştırılmıştır. Siyalidaz aktivitesi ham ve saflaştırılmış örneklerde, Nöraminidaz deney kiti ile araştırılmıştır. 
Bulgular: PCR ile çoğaltılan siyalidaz geninin büyüklüğü yaklaşık 1050 bp'dir. Sekans analizi sonucu amplikonun T. vaginalis G3 suşuna ait siyalidaz enzim geni ile % 99.69 oranında identiktir. pUC19 ve Pet30 plazmidleriyle yapılan transformasyon sonucu Sia32 olarak adlandırılan klon seçilmiş ve üretilen rekombinant proteinin molekül ağırlığı 44.5 kDa olarak hesaplanmıştır. Saflaştırma için yapılan optimizasyon denemelerinde en iyi metodun imidazolsüz başlangıç ve 25-200 mM lık imidazol elüsyon adımlarını içeren yöntem olduğu gösterilmiştir. Ham ve saflaştırılmış siyalidaz içeren örneklerde nöraminidaz deney kiti ile enzimin biyolojik aktivitesi doğrulanmış ve saf örneklerde enzim aktivitesinin daha düşük olduğu tespit edilmiştir.
Sonuç: Bu çalışmada T. vaginalis parazitine ait siyalidaz geni klonlanarak saflaştırılmış ve biyokimyasal aktivitesi ticari deneme kiti ile doğrulanmıştır. Böylece, laboratuvarımızda rekombinant siyalidaz üreten E.coli BL21 suşu oluşturulmuştur.  Rekombinant suş, siyalidaz enziminin diğer biyolojik özelliklerinin çalışılması ve siyalidaz inhibitörü geliştirmek için kaynak olacaktır.

Abstract:
Objective: The aims of the research were cloning of sialidase gene from T.vaginalis which  known as a parasitic protozoon and investigation of biological activity of both crude and purified enzyme preparations obtained from recombinant organism. 
Material and Methods: In this research, T. vaginalis genomik DNA sample was provided by ADÜ Medical Parasitology Department. PCR amplified sialidase gene transferred to E.coli host after restriction and ligation steps. Then, sialidase activity was tested on both crude and purified samples using Neurominidase assay kit. 
Results: PCR amplified sialidase gene was 1050 bp in length. According to sequence analysis, amplicon sequence showed highest identity to T.vaginalis G3 sialidase gene at 99.69%. The clone named Sia32 was choosen after transformation steps and molecular weight of recombinant sialidase protein was determined as 44.5 kDa. According to optimization results,  most effective way for protein purification was the one which started without imidazole and elution at 25-200 mM imidasole. To determine the biological activity of enzyme in crude and pure samples, neurominidase assay kit was used. It was found that enzyme activity was lower in purified samples than the crude ones.
Conclusion: In this study, T.vaginalis sialidase gene was cloned and the biochemical activity of enzyme was verified with commercial assay kit. Thus, a recombinant sialidase producing E.coli BL21 strain was constructed in our laboratory. Recombinant strain will be a source for further studies regarding other biological properties of enzyme and inhibitory substance development for sialidase.