İlaç direncine karşı shrna kodlayan dna taşıyıcı sistemlerin formülasyonu ve in vitro değerlendirilmesi
Formulation and in vitro evaluation of shrna-encoding dna delivery systems against drug resistance
Yazar: MUSTAFA KOTMAKÇI
Danışman: PROF. DR. GÖKHAN ERTAN ; DOÇ. DR. AYŞE GÜLTEN KANTARCI
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; DNA = DNA ; Gen tedavisi = Gene therapy ; Mikroemülsiyon = Microemulsion ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; İlaç formülleri = Formularies ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers ; İlaçlar = Drugs ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İn vitro = In vitro

Özet:
Bu çalışmada DNA taşınması için kullanılmak üzere mikroemülsiyon ve spontan emülsifikasyon yöntemiyle katyonik KLN?ler hazırlanmış ve temel olarak tanecik boyutları bakımından karakterize edilmiştir. 100 nm?nin altında tanecik boyutuna ve yüksek pozitif zeta potansiyel değerine sahip nanotaneciklerin elde edilmesi amaçlanmıştır. İstenen özelliklere sahip olan KLN?lere kanser oluşumunda ve antikanser ilaç direncinde önemli yere sahip olan STAT3 mRNA?sına karşı shRNA kodlayan plazmit DNA yüklenmesi gerçekleştirilmiştir. DNA yüklenmesi standart jel elektroforezi, SDS teşvikli DNA salımı, DNazI ve serum stabilitesi bakımından tanımlanmıştır. Optimal olarak belirlenen formülasyonların DNA ile kompleks oluşturduktan sonra bunların WI-38, Calu1 ve CD-Calu1 hücrelerinde sitotoksisitesi incelenmiştir.
Mikroemülsiyon yöntemiyle, mikroemülsiyon alanı tanımlanarak seçilen formülasyonlardan katyonik madde türüne ve miktarına bağlı olarak 7 nm?den 211nm?ye değişen ve zeta potansiyel değeri de negatiften pozitife doğru değişen, spontan emülsifikasyon yöntemiyle ise 100-130nm boyutta ve +50 mV gibi yüksek zeta potansiyele sahip KLN?ler elde edilmiştir. 100 nm?den küçük olan ve +30 mV?un üzerinde zeta potansiyele sahip olan KLN?lerle DNA?yı tutma ve salma özellikleri iyi olan, DNazI ve serum nükleazlarının etkisinden koruyabilen KLN:DNA kompleksleri elde edilmiştir. WI-38 hücrelerine uygulanan komplekslerdeki KLN miktarının optimize edilmesiyle gözlenen toksisite düşmüş ve % 80?in üzerinde canlılık gözlenmiştir. Calu1 hücrelerinde STAT3 shRNA kodlayan plazmitle elde edilen kompleksler canlılıkta hafif azalmaya neden olurken CD-Calu1 hücrelerini yüksek oranda öldürmüştür.

Abstract:
In this study cationic solid lipid nanoparticles (SLN?s) were prepared for DNA delivery using microemulsion and spontaneous emulsification methods and characterized in terms of particle size and zetapotential. It was aimed to obtain nanoparticles which have particle size below 100 nm and high positive zetapotential value. SLN?s with appropriate characteristics were complexed with plasmid DNA encoding for shRNA against STAT3 mRNA, a protein which has important role in the tumor formation and the anticancer chemoresistance. DNA loading was characterized in terms of standart gel electrophoresis, SDS-induced DNA release, DNaseI- and serum stability. Cytotoxicity of the complexes of optimal formulations with DNA was studied on WI-38, Calu1 and CD-Calu1 cell lines.
Depending on the cationic surfactant type and concentration, SLN?s with particle size between 7 and 211 nm and zetapotential values varying from negative to positive were obtained from selected microemulsions, while the spontaneous emulsification method revealed SLN?s with size between 100 and 130 nm and high positive zetapotential around +50 mV. SLN:DNA complexes having good DNA loading and release properties, as well as good protection against degradation by DNaseI and serum nucleases were obtained with SLN?s  below 100 nm in size and zetapotential higher than +30 mV. With the optimisation of the SLN amount in the complexes applied to WI-38 cells the apparent toxicity was lowered and viability above 80% was observed. Complexes obtained with STAT3 shRNA-encoding plasmid DNA caused low decrease in the viability of Calu1 cells, while in CD-Calu1 cells viability was significantly reduced.