Elektrikle uyarılan izole sıçan atriyum şeritlerinde 4-aminopirid'in (4-ap) inotropik etkilerinde ca2+ ve sarkoplazmik retikulumun rolü
The role of ca2+ and sarcoplasmic reticulum in the inotropic effects of 4-aminopyridine (4-ap) in the electrically driven atrial strips of rats
Yazar: AYŞE HANDE ERDAL
Danışman: PROF. DR. CİHAT KÜÇÜKHÜSEYİN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı / Farmakoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Aminopiridinler = Aminopyridines ; Atriyal fonksiyon = Atrial function ; Atriyum = Atrium ; Elektrik = Electricity ; Kalsiyum = Calcium ; Ryanodin = Ryanodine ; Sarkoplazmik retikulum = Sarcoplasmic reticulum

Özet:
Elektrikle uyarılan izole sıçan atriyum şeritlerinde 4-Aminopiridin (4-AP)'in inotropik etkilerinde Ca2+ ve sarkoplazmik retikulumun rolü araştırıldı. Her iki cinsiyetten 250-350g sıçanlar servikal dislokasyon ile deserebre edildikten sonra kanatıldı. Hızla göğüs boşluğuna girilerek kalp çıkarıldı ve gazlandırılmış Tirod solüsyonu içinde 3x5mm sol ve sağ atriyum şeritleri hazırlandı. Şeritler iki elektrot arasına yerleştirilerek içinde 30 derecede %95 O2 + %5CO2 ile sürekli gazlandırılan Tirod bulunan organ banyosu içine alındı. Preparatlar 0.5g gerilim altında 2x eşik voltaj, 2ms uyarı süresi ve 2Hz ile uyarılarak kasılma sağlandı. 30 dakika dengeleşme süresi boyunca preparatlar 3 kez taze solüsyonla yıkandı. 4-AP 1-32mM arasında logaritmik artan konsantrasyonlarda 0.1ml sıvı içinde 2 dakika aralarla banyo ortamına ilave edildi. Verapamil, dantrolen ve ryanodinli deneylerde preparatlar 4-AP vermeden önce 5 dakika bu maddelerle inkübe edildi.Kalsiyumlu ortamda:?4-AP 1-8mM doz aralığında kasılmayı doza-bağımlı olarak artırdı. 8mM ötesinde kasılma azalırken beraberinde kontraktür gelişti.?1µg/ml verapamil ile 5 dakika ön muamele 4, 8, 16mM 4-AP'in pozitif inotrop etkisini antagonize ederken (p<0.05) 16 ve 32mM 4-AP kontraktürünü potansiyalize etti (p<0.05)?2µg/ml dantrolen ile 5 dakika ön muamele 4, 8, 16mM 4-AP'in pozitif inotrop etkisini antagonize etti (p<0.05), fakat kontraktürde anlamlı bir değişme yapmadı.?5µg/ml ryanodin ile 5 dakika ön muamele 1 ve 32mM 4-AP'in pozitif inotrop etkisini artırırken diğer dozlarda bir değişme olmadı. Buna karşılık tüm 4-AP dozlarında kontraktür yapıcı etkiyi potansiyalize etti (p<0.05).?İlaçsız ortamda uyarının 30 saniye kesilmesinden sonraki ilk kasılma kontrol değerin üzerinde bulundu (SR'dan fazla Ca2+ salıverilmesin bağlı). 4mM 4-AP bu ilk kontrol-üstü kasılmayı anlamlı bir şekilde deprese etti (p<0.05). 1µg/ml verapamil ile 5 dakika ön muameleden sonra kontrol ilk kasılma çok güçlendi ve 4-AP'in ilk kasılmayı deprese edici etkisi tersine çevirerek çok belirgin şekilde potansiyalize oldu (p<0.05). 2µg/ml dantrolen ile 5 dakika ön muamele 4-AP'in etkisini fazla değiştirmedi, fakat kontrol ilk kasılmayı anlamlı olarak azalttı (p<0.05).Kalsiyumsuz ortamda:Tirod solüsyonundan Ca2+ çıkarılarak ve 0.4mM EGTA eklenerek mutlak kalsiyumsuz bir solüsyon elde edildi. 4-AP, bu Ca2+'suz ortamda 4, 8, 16 ve 32mM dozlarında kullanıldı ve doza bağımlı kontraktür oluşturdu. 1µg/ml verapamil 4-AP'in oluşturduğu doza-bağımlı kontraktürde anlamlı bir değişme yapmadı. Buna karşılık, 2µg/ml dantrolen 8, 16, 32mM 4-AP ve 5µg/ml ryanodin ise 32mM 4-AP'in yaptığı kontraktürü anlamlı bir şekilde potansiyalize etti (p<0.05).Ca2+'lu ve Ca2+'suz ortamdaki kontraktür yanıtlarının karşılaştırılması:4 ve 8mM 4-AP'in kontraktür yapıcı etkisi kalsiyumsuz ortamda kalsiyumlu ortama göre daha güçlü (p<0.05), 32mM'de ise daha düşük bulundu (p<0.05). Buna karşılık 4-AP, Ca2+(+) +verapamil ve Ca2+(+) +ryanodin içeren kalsiyumlu ortamlarda kalsiyumsuz ortama göre istatistiksel bakımdan daha güçlü kontraktür oluşturdu (p<0.05). Dantrolen Ca2+'lu ortamda verapamil gibi 4-AP'e bağlı kasılmaları antagonize ederken kontraktür yapıcı etkiyi değiştirmedi. Fakat Ca2+(-) +dantrolenli ortamda 4, 8, 16mM'in yaptığı kontraktürü Ca2+(+) +dantrolenli ortamdakine göre anlamlı olarak potansiyalize etti (p<0.05).Sonuç:Deneysel çalışmalar kalsiyumsuz ortamda oluşan kontraktür ve kalsiyumlu ortamda görülen istirahat-sonrası potansiyalizasyonun SR kökenli olduğuna işaret etmektedir. Ryanodin içeren kalsiyumlu ve kalsiyumsuz ortamlarda 4-AP'in yaptığı kontraktürün artması, bu kontraktürün SR aracılı olduğunu destekler niteliktedir. Öte yandan Ca2+'lu ortamlarda 4-AP'in yaptığı kontraktürün Ca2+'suz ortamdakilere göre daha güçlü olması, kontraktür oluşmasına hücre-dışı Ca2+'un da karıştığını düşündürmektedir. Verapamil ve dantrolenli ortamlarda hücre içine Ca2+ girişinin azalması SR'da Ca2+ depolarını artırabilir ve 4-AP'in tersine bir etki ile bu depoları küçültebilir. Gerçekten de istirahat sonrası ilk kasılmanın 4-AP ile deprese olması ve verapamil ile potansiyalize olması bu görüşü destekler niteliktedir. 4-AP, hem Ca2+'lu ve hem de Ca2+'suz ortamlarda kontraktür oluşturduğu görülmüştür. Ca2+'suz ortamlarda kontraktür yapan Ca2+ kaynağının SR olması ve ryanodin ve dantrolenin bunu potansiyalize etmesi, 4-AP'in SR ile etkileştiğini telkin etmektedir. Bu bulgulara dayanarak, 4-AP'in SR'dan Ca2+ salgılanmasına neden olarak kontraktür yaptığı sonucuna varılmıştır.

Abstract:
The role of Ca2+ and SR on the inotropic effects of 4-AP in electrically driven strips of rat atriums were investigated. Rats of both sexes weighing 250-350g were exsanguinated after cervical dislocation induced decerebration. The heart was rapidly removed from the chest and atrial strips of 3x5mm in dimension were prepared from both left and right atria in oxygenated Tyrode solution. After strips were placed between two electrodes, they were taken into the organ bath filled with Tyrode solution being continuously bubbled with 95% O2 + 5% CO2 mixture. Contractions were induced by stimuli of 2Hz, 2x threshold voltage and 2msec pulse duration under a basal tension of 0.5g. During an initial equilibrium period of 30 minutes or so, preparations were washed with fresh solution at least for 3 times. 4-AP was applied cumulatively in 0.1ml fluid by 2 minutes interval in logarithmically increasing concentrations in the range of 1-32mM. In experiments with verapamil, dantrolene and ryanodine, the preparations incubated with these drugs for 5 minutes.In media with Ca2+:?4-AP increased contractions in a dose-dependent manner between 1-8mM dose intervals. Beyond 8mM, the declines of contractions were followed by a slowly developing contracture.?Although pretreatment of preparations with 1µg/ml verapamil for 5minutes significantly antagonized positive inotropic effects of 4, 8 and 16mM 4-AP (p<0.05), contractures induced by 16 and 32mM 4-AP were augmented (p<0.05)?Exposure to 2µg/ml dantrolene for 5 minutes depressed positive inotropic effects of 4, 8, 16mM 4-AP (p<0.05), but did not change contractures significantly.?Only the positive inotropic effects of 1 and 32mM 4-AP were significantly increased by exposure to 5µg/ml ryanodine for 5 minutes (p<0.05); but the effects of other doses were almost unaffected. However, the contracture inducing effects of 4-AP were significantly potentialized at all dose levels (p<0.05).?The amplitude of first contraction right after interruption of electrical stimulation for 30 seconds in control media which is dependent on Ca2+ release from SR was found to be over control levels. This over-control first contraction was markedly depressed by 4mM 4-AP (p<0.05). The initial first contraction was not only strongly augmented after exposure of preparations to 1µg/ml verapamil for 5 minutes but 4-AP mediated depression in it was reverted and very significantly potentialized (p<0.05). Pretreatments with 2µg/ml dantrolene for 5 minutes did not alter the effect of 4-AP on first contraction, but reduced the first contraction in controls to significant extent (p<0.05).In media without Ca2+Ca2+-free Tyrode solution was prepared by subtracting Ca2+ from Tyrode and adding 0.4mM EGTA (a Ca2+ chelator) in it. In such a media, 4-AP was used in doses in the range of 4, 8, 16 and 32mM and produced dose-dependent contractures. This dose-dependent contracture by 4-AP was not affected by 1µg/ml verapamil significantly. Whereas, contractures induced by 8, 16 and 32mM 4-AP were augmented by 2µg/ml dantrolene and 5µg/ml ryanodine to a significant extent (p<0.05).Comparison of contractures responses in media with and without Ca2+The contracture inducing effects of 4-AP in Ca2+(-) versus in Ca2+(+) media were found to be more powerful at low (4 and 8mM) but weak at high doses of 4-AP (p<0.05). However, 4-AP induced significantly more powerful contractures in Ca2+(+)+verapamil and Ca2+(+)+ryanodine containing media (p<0.05). In Ca2+(+) media 4-AP contractions were antagonized by dantrolene and verapamil (p<0.05), but contractures were almost unaffected. In contrast, contractures induced by 4, 8 and 16mM 4AP in a media containing Ca2+(-)+dantrolene were augmented to significant extent with respect to those obtained in Ca2+(+)+dantrolene (p<0.05).Conclusion:Experimental studies steadily indicate that contractures in media without Ca2+ and post-rest potentialisation of first contraction Ca2+-containing media are of SR in origin. The finding that contractures are augmented by ryanodine in media with and without Ca2+ supports the idea that they are mediated by SR. On the other hand, the findings that 4-AP induced contractures in the presence of Ca2+ are more powerful with respect to those in Ca2+ absent media implies that extracellular Ca2+ is also involved in the genesis of these contractures. It is likely that reduction of Ca2+ entry into the cell in the presence of verapamil and dantrolene may increase Ca2+ depots in the SR in contrast to 4-AP that reduce them by promoting Ca2+ release from this intracellular site. Indeed, the depression of post-rest first contraction by 4-AP and its reversal and potentialisation by verapamil strongly support this view. 4-AP induces contracture both in media with and without Ca2+. The fact that the source Ca2+ inducing contracture in Ca2+-free media is SR and that ryanodine and dantrolene augment it, suggests an interaction of 4-AP with SR. Depending on these experimental results, it was concluded that 4-AP induces contracture mainly by inducing Ca2+ release from SR.