Mezenkimal kök hücrelerinin ve kompozit iskelelerin kullanımıyla kemik doku mühendisliği
Bone tissue engineering using mesenchymal stem cells and composite scaffolds
Yazar: AYSEL KOÇ
Danışman: PROF. DR. Y. MURAT ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu tez çalışmasında, poli (D,L-laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) ve kitosan/hidroksiapatit (K/HA) kompozit iskeleler sırasıyla partikül uzaklaştırma ve dondurarak kurutma yöntemleriyle hazırlandı. PLGA iskeleler malzeme yüzeyinde apatit oluşumu sağlamak için yapay vücut sıvısında inkübe edildi. K/HA iskelelerin bir bölümü insan vasküler endotelyal büyüme faktörü (hVEGF) ve yeşil floresan protein (GFP) sentezleyen adenoviral vektörle transfekte edildi. Mezenkimal kök hücreler Wistar sıçanların kemik iliğinden izole edilerek kültüre alınıp çoğaltıldıktan sonra mineralize PLGA iskelelere statik ve dinamik kültür şartlarında tohumlandı. Çalışmada, fare MC3T3-E1 hücre dizisi ve insan osteoblast hücreleri de hücre kaynağı olarak kullanıldı. MC3T3-E1 hücreleri saf K/HA iskelelere tohumlanırken, hOB hücreleri saf ve transfekte edilmiş K/HA iskelelere tohumlandı. Hücre tohumlanmış iskelelerin 4 hafta boyunca kültürü sürdürüldü. Hücre canlılığı MTT testiyle, osteoblastik fenotip ise alkalen fosfataz aktivitesi, immünhistokimyasal boyamalar ve taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ile belirlendi. hOB hücrelerinin K/HA iskele içerisindeki dağılımını ve GFP salımını belirlemek için konfokal lazer mikroskopisi (KLM) kullanıldı. Transfekte edilen K/HA yüzeyindeki hOB hücreleri tarafından üretilen hVEGF, ELISA yöntemiyle belirlendi. SEM bulguları iskelelerin (PLGA ve K/HA) yüksek porözitede ve birbirleriyle bağlantılı gözeneklere sahip olduğunu gösterdi. Histolojik ve SEM bulguları hücrelerin (MKH'lerin, MC3T3-E1 ve hOB hücrelerinin) iskelelerin gözeneklerine yayıldığını ve çoğaldığını gösterdi. İmmünhistokimya çalışmaları hücre tohumlanmış iskelelerin yüksek seviyede osteojenik markör proteinlerini sentezlediğini ortaya koydu. KLM hOB hücrelerinin iskele içerisine homojen dağıldığını ve hücre proliferasyonun inkübasyon süresiyle orantılı arttığını gösterdi. İskele yüzeyindeki hücreler tarafından üretilen hVEGF'un, uygulanan viral dozla paralellik gösterdiği belirlendi. Elde edilen sonuçlar, PLGA ve K/HA (saf ve genle aktive edilmiş) iskelelerin kemik doku mühendisliği için potansiyel taşıdıklarını gösterdi.

Abstract:
In this study, poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and chitosan/hydroxyapatite (C/HA) composite scaffolds were prepared by the particulate leaching and freeze-drying methods, respectively. PLGA scaffolds were incubated in simulated body fluid for apatite growth on the material. Some of the C/HA scaffolds were transfected with adenoviral vector encoding human vascular endothelial growth factor (hVEGF) and green fluorescent protein (GFP). Mesenchymal stem cells isolated from bone marrow of Wistar rats were cultured, expanded and seeded on mineralized PLGA scaffolds under static and dynamic culture conditions. In the study, mouse MC3T3-E1 cells and human osteoblasts (hOBs) were also used as cell source. While MC3T3-E1 cells were seeded on pure C/HA scaffolds, hOBs were seeded on pure and transfected C/HA scaffolds. The cell seeded scaffolds were cultured for upto 4 weeks. Cell viability was investigated by the MTT assay, differentiation of cells into osteoblastic phenotype were determined by alkaline phosphatase activity, immunohistochemical staining, and scanning electonic microscopy (SEM). Confocal laser microscopy (CLM) was used to investigate the distribution of hOBs inside the C/HA scaffolds and to visualize the GFP expression inside the cells. The hVEGF produced by hOBs on transfected C/HA scaffolds was measured using the ELISA method. SEM observations revealed that the scaffolds (PLGA and C/HA) had a highly porous structure, and were well-interconnected. Histological and SEM observations showed that cells (MSCs, MC3T3-E1 cells and hOBs) were widespread and had proliferated extensively within the pores of the scaffolds. Immunohistochemistry studies revealed that the cells-seeded scaffolds expressed higher levels of osteogenic marker proteins. CLM results confirmed that the distribution of hOBs inside sponges was quite uniform and the proliferation of the cells had gradually increased by incubation time. The hVEGF produced by the cells on the scaffolds increased with the increase in viral dose. Based on the results, it can be concluded that mineralized PLGA and C/HA (pure and gene-activated) scaffolds have potential in bone tissue engineering.