Kokain kullanım bozukluğu olan erkek bireylerde periferik kandaki miRNA ekspresyon düzeylerinin araştırılması
Investigation of miRNA expression levels in peripheral blood of males with cocaine use disorder
Yazar: SÜHEYLA AYFER ALKAÇ
Danışman: DOÇ. DR. SELDA MERCAN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Genetik = Genetics
Dizin: Kokain = Cocaine ; Mikro RNA = Micro RNA

Özet:
Birçok hayvan ve hücre çalışması mikroRNA'ların kokain, alkol, eroin ve metamfetamin bağımlılığı dahil olmak üzere psikotrop madde bağımlılıklarının gelişmesinde ve ilerlemesinde önemli roller oynadığını göstermiştir. Uluslararası literatürde kokain kullanım bozukluğunun, insan periferik kanında mikroRNA düzeyindeki etkisini araştıran bilimsel çalışmaların sınırlı sayıda olduğu gözlenmektedir. Bununla birlikte, ülkemizde mikroRNA'ların kokain bağımlılığı üzerine periferik kanda potansiyel biyobelirteçler olarak rolü henüz keşfedilmemiştir. Bu bağlamda, bu çalışma kokain bağımlılarının periferik tam kanında yer alan bazı mikroRNA'ların (miR-9-5p, miR-26b-5p, miR-132-3p ve miR-134-5p) ifadelerindeki değişimi saptayarak, kokain bağımlılığı düzenlenmesinde rol oynayabilecek aday mikroRNA'ları tanımlamayı hedeflemiştir. Bu çalışma, uluslararası literatüre göre kokain bağımlısı insan periferik kanında ilgili mikroRNA'ların analizinin yapıldığı ilk çalışmadır. 
Bu çalışmada, kokain bağımlısı olan 12 erkek birey bağımlı grubunu, kokain bağımlılığı tedavisi gören 11 birey tedavi grubunu ve herhangi bir madde bağımlılığı olmayan 16 sağlıklı birey kontrol grubunu oluşturmaktadır. Bağımlı ve tedavi grubu bireylerine ait kan örnekleri Balıklı Rum Hastanesi Anatolia Kliniği'ne tedavi edilmek üzere başvuran ve çalışmaya katılmayı kabul eden gönüllü bireylerden toplanmıştır. Bireylerden alınan periferik kan örneklerinden total RNA izolasyonu gerçekleştirildikten sonra ters transkriptaz ile cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. MikroRNA'ların ifadelerindeki değişim kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile belirlenmiştir. 2-ΔΔCT formülüne göre mikroRNA ekspresyon düzeylerindeki ''fold change'' (kat değişimi) değeri belirlenmiştir. İstatiktiksel analizlerde mikroRNA'ların ekspresyonu için ΔCt değerleri üzerinden analizler yapılmıştır. Bağımlı, tedavi ve kontrol grupları arasında aday mikroRNA'ların ΔCt değerleri açısından fark olup olmadığı One-way ANOVA testi ile analiz edilmiştir. Post-hoc test olarak LSD testi ya da Tamhane's T2 testi kullanılmıştır. Tüm analizlerde p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Periferik kan mikroRNA'larının tanısal yeterliliğini değerlendirmek için ROC analizi yöntemi kullanılmıştır. Çalışmanın sonucunda, bağımlı grubu ile tedavi grubu arasında yalnızca miR-132-3p (p=0,003) ve miR-134-5p'nin (p=0,020) ΔCt değerleri açısından anlamlı bir fark olduğu belirlenmiştir. Bağımlı grubu ile tedavi grubu arasında sırasıyla miR-9-5p (p=0,012), miR-26b-5p (0,009), miR-132-3p (p=0,026) ve miR-134-5p'nin (p=0,023) ΔCt değerleri açısından anlamlı bir fark olduğu belirlenmiştir. Tedavi grubu ile kontrol grubu arasında, yalnızca miR-9-5p (p=0,019) ve miR-26b-5p'nin (0,024) ΔCt değerleri açısından anlamlı bir fark olduğu belirlenmiştir. Yapılan ROC eğrisi analizleri kontrol grubu ile karşılaştırıldığında bağımlı grubunda miR-132-3p için AUC değeri 0,778; miR-134-5p için AUC değeri 0,744 ile anlamlı bulunmuştur. Bu sonuçlar miR-132-3p ve miR-134-5p'nin kokain bağımlısı olan bireylerde tanıda etkili yardımcı parametreler olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlarla birlikte gelecekte benzer bulguların başka çalışmalarla ortaya konması durumunda, özellikle kokain bağımlılığı patolojisinde rol oynayabilecek mikroRNA'ların tespit edilmesi ve bu mikroRNA'ların kokain bağımlılığının tedavisinde potansiyel bir hedef olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Many animal and cell studies have shown that microRNAs play important roles in the development and progression of drug addictions, including addiction to methamphetamine, cocaine, alcohol, and heroin. In the international literature, it is observed that there are a limited number of scientific studies investigating the effect of cocaine use disorder on microRNA level in human peripheral blood. However, the role of microRNAs as potential biomarkers in peripheral blood on cocaine addiction has not yet been discovered in our country. In this context, this study detected changes in the expression of some microRNAs (miR-9-5p, miR-26b-5p, miR-132-3p, and miR-134-5p) in the peripheral whole blood of cocaine addicts, which may play a role in the regulation of cocaine addiction aimed to identify candidate microRNAs. According to the international literature, this study is the first to analyze relevant microRNAs in the peripheral blood of cocaine addicted humans. 
In this study, 12 male individuals who were addicted to cocaine constituted the addict group, 11 individuals who were being treated for cocaine addiction constituted the treatment group and 16 healthy individuals without any substance addiction constituted the control group. Blood samples of dependent and treatment group individuals were collected from volunteers who applied to the Anatolia Clinic of Balıklı Rum Hospital for treatment and agreed to participate in the study. After isolation of total RNA from peripheral blood samples obtained from individuals, cDNA synthesis was performed with reverse transcriptase. The change in the expression of microRNAs was determined by the quantitative real-time PCR method. The ''fold change'' value in microRNA expression levels was determined according to 2- ΔΔCT. In statistical analyses, analyzes were made based on ΔCt values for the expression of microRNAs. One-way ANOVA test was used to analyze whether there was a difference in ΔCt values of candidate microRNAs between dependent, treatment and control groups. LSD test or Tamhane's T2 test was used as post-hoc test. In all analyses, p<0.05 was considered statistically significant. ROC analysis was used to assess the diagnostic adequacy of peripheral blood microRNAs. 
At the end of the study, it was determined that there was a significant difference between the dependent group and the treatment group only in terms of ΔCt values of miR-132-3p (p=0.003) and miR-134-5p (p=0.020). There was a significant difference between the dependent group and the treatment group in terms of ΔCt values of miR-9-5p (p=0.012), miR-26b-5p (0.009), miR-132-3p (p=0.026) and miR-134-5p (p=0.023), respectively. There was a significant difference between the treatment group and the control group only in terms of ΔCt values of miR-9-5p (p=0.019) and miR-26b-5p (0.024). When the ROC curve analyses were compared with the control group, the AUC value for miR-132-3p was found to be 0.778 and the AUC value for miR-134-5p was found to be 0.744 in the dependent group. These results suggest that miR-132-3p and miR-134-5p can be used as effective diagnostic parameters in individuals with cocaine addiction. With the results obtained in this study, it is thought that if similar findings are demonstrated by other studies in the future, microRNAs that may play a role in the pathology of cocaine addiction may be identified and these microRNAs may be a potential target in the treatment of cocaine addiction.