Memeli atriyal hücrelerinde ATP-duyarlı katyon kanallarının yaşlanmaya bağlı kalp fonksiyon değişikliklerindeki rolünün incelenmesi
The investigation of the role of ATP-sensitive cation channels on aging associated heart function alterations on mammalian atrial cells
Yazar: SİNAN DEĞİRMENCİ
Danışman: PROF. DR. MEHMET UĞUR ; PROF. DR. BELMA TURAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Adenozin trifosfat = Adenosine triphosphate ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kalp fonksiyon testleri = Heart function tests ; Katyonlar = Cations ; Sıçanlar = Rats ; Yaşlanma = Aging

Özet:
ATP'nin kalp üzerindeki etkileri uzun zamandır bilinmektedir. Bu etkilere birçok farklı P2 reseptörünün aracılık ettiği düşünülmektedir. Ancak P2X7 reseptörlerinin memeli kardiyak hücrelerinde fonksiyonel olarak var olup olmadığı netleşmemiş bir konudur. Bu nedenle biz çalışmamızda western blot ve immünohistokimya yöntemleri ile kardiyak hücrelerde gösterilen proteinin fonksiyonel bir P2X7 reseptörüne işaret edip etmediğini araştırdık. Fare atriyum kökenli ve pek çok açıdan kardiyak hücre özelliklerini iyi korumuş bir hücre serisi olan HL-1 hücrelerinde ve daha sonra sıçan ve fare ventrikül ve atriyumlarından enzimatik olarak izole edilen kardiyak hücrelerde daha önceden antikor temelli yöntemlerle tespit edilen proteinin fonksiyonel bir P2X7 reseptörü olup olmadığını inceledik.
Bu çalışmada sıçan ventrikül hücrelerinde divalan katyon konsantrasyonundan etkilenen ve ATP uygulamasıyla deaktivasyon özelliği yavaşlayan bir akım ölçülmüştür. Bu akımın literatürde belirtilen düşük divalan konsantrasyonunda L-tipi Ca2+ kanallarından geçen ve büyük oranda sodyum iyonlarından oluşan ve P2Y reseptörü aracılığıyla modüle olabilen bir akım olabileceğini düşünüyoruz. 
Fare atriyal hücre hattı olan HL-1 hücrelerinde ATP uygulamasıyla P2X7 reseptörünü işaret eden; büyük bir molekül olan YO-PRO-1 boya girişi, bleblenme, 40-50 saniyelik uygulamalarda neredeyse hiç desensitize olmayan katyon akımı ve tekrarlanan 400 μM ATP uygulamasıyla maximize edilmiş akım yanıtlarının spesifik P2X7 antagonistleri olan A-740003 ve A-804598 ile yaklaşık %90 oranında inhibe edildiği bulunmuştur. 
Bu çalışmada genç ve yaşlı fare kalplerinden izole edilmiş atriyum hücrelerinde HL-1 hücrelerinde yanıt alınan koşullarda yapılan deneylerde ATP uygulaması ile oluşan her hangi bir akım yanıtı gözleyemedik. Benzer şekilde farklı günlerde ve hayvanlardan izole edilmiş 10'u genç 7'si yaşlı olmak üzere 17 hücreden alınmış kayıtlar vardır.
Fare kalbinden atriyal miyositleri izole ederken, dokunun küçük olması ve canlı hücre sayısındaki azlık nedeniyle bölge ayrımı yapılmadan tüm atriyum dokusu kullanılmıştır. Literatürde görüldüğü üzere P2X7 reseptörünün miktarı bölgelere göre değişkenlik göstermektedir ve daha çok sinoatriyal düğüm gibi çok özel bir bölgede bulunduğu iddia edilmektedir. Yapılan denemelerde bu özel bölgeden hücre elde edilememiş olabilir ve bu nedenle de yanıt alınamamış olabilir. Daha lokalize bir izolasyon yöntemiyle elde edilecek hücrelerde deneyler tekrarlanabilir.
Bu çalışma ile memeli atriyal hücrelerinde fonksiyonel P2X7 reseptörlerinin varlığının gösterilmesi, bu reseptörün insan kardiyomiyositlerinde de var olduğu iddialari da göz önüne alındığında, hem kardiyak fizyolojide rol alan yeni bir tip reseptörün, hem de potansiyel bir ilaç hedefinin tanımlanmasında rol oynayabilecektir.

Abstract:
The effects of ATP on the heart have been known for a long time. These effects are thought to be mediated by many different P2 receptors. However, it is unclear whether functional P2X7 receptors exist in mammalian cardiac cells and what they function. Therefore, in this study, we investigated whether the protein expressed in cardiac cells indicates a functional P2X7 receptor. We examined whether the protein, which was previously detected by antibody-based methods, is a functional P2X7 receptor in HL-1 cells, a cell line of mouse atrial origin with well preserved cardiac cell properties in many respects, and then in cardiac cells enzymatically isolated from rat and mouse ventricles and atria.
In this study, a current, which is affected by the divalent cation concentration in rat ventricular cells and whose deactivation is slowed by ATP application, was measured. We think that this current is a current that passes through L-type Ca2+ channels at low divalent concentration and consists mostly of Na+ and can be modulated through the P2Y receptor.
This study revealed several findings pointing to the existence of the P2X7 receptor in HL-1 cells:  YO-PRO-1 dye uptake, membrane blebbing and almost no desensitizing cation current by 40-50 second agonist applications was observed. Furthermore, two of specific P2X7 antagonists, A-740003 and A-804598, approximately inhibited 90% of the cationic current which was maximized by repeated application of 400 µM ATP.
In this study, several experiments were performed in atrial cells isolated from the hearts of young and aged mice, but we could not observe any response to ATP at a constant holding potential of -80 mV. Similarly, there are recordings taken from 17 cells, 10 young and 7 old, isolated from mice hearts on different days. When isolating atrial myocytes from mouse hearts, the whole atrial tissue was used without region separation due to the small tissue size and low cell viability. As seen in the literature, the amount of P2X7 receptor varies according to regions and it is claimed that it is located in a very specific region such as the sinoatrial node. Cells may not have been obtained from this particular region in the trials, and therefore no response may have been obtained. Experiments can be repeated with cells obtained with a more localized isolation method.
With this study, the existence of functional P2X7 receptors in mammalian atrial cells may lead to the identification of both a new type of receptor involved in cardiac physiology and a potential drug target. It is crucial considering the claims that this receptor is also present in human cardiomyocytes.