Lakkaz enzimi ile bazı toksik klorofenolik bileşiklerin detoksifikasyonu
Detoxification of some toxic chlorophenolic compounds by laccase enzyme
Yazar: ARZU ÜNAL
Danışman: PROF. DR. NAZİF KOLANKAYA
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2004
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada beyaz-çürükçül bir fungal suş olan Trametes versicolor'dan elde edilen lakkaz enzimi ile bazı klorlu fenolik bileşiklerin (2,4,6-triklorofenol, 2,4- diklorofenol, ve 4-klorofenol) deklorinasyonuna bağlı detoksifikasyonu araştırıldı. Klorlu bileşiklerden klor giderimi, özel olarak tasarlanmış laboratuvar ölçeğindeki bir bioreaktörde serbest ve tutuklanmış lakkaz enzimi muamelesi ile gerçekleştirildi. Lakkaz aktivitesine bağlı olarak reaksiyon ortamında ortaya çıkan oksijen ve klor iyonu konsantrasyonundaki değişiklikler bioreaktöre monte edilmiş klor iyonu ve çözünmüş oksijen elektrodları ile izlendi. Lakkaz immobofizasyonu lakkaz enziminin Na-aljinat boncukları üzerine adsorbsiyonu ile gerçekleştirildi. Kappa-karragenan boncuklarının bu bakımdan uygun olmadığı bulundu. Serbest ve tutuklanmış lakkaz kullanılarak gerçekleştirilen deklorinasyon deneyleri sonucunda uygun reaksiyon pH'sı 5.0 ve uygun sıcaklık 25 °C olarak optimize edildi, öte yandan 30 dakika deklorinasyon süresi ve 160 jaM substrat konsantrasyonu bütün deklorinasyon çalışmaları için uygun inkübasyon zamanı ve uygun substrat olarak belirlendi. Enzimatik reaksiyon ürünlerinin GC/MS (Gaz Kromatografisi/Kütle Spektroskopisi) analizleri, klorlu fenoliklerden klor gideriminin lakkaz tarafından bu maddelerin yıkımının bir sonucu olduğunu gösterdi. Deklorinasyon kinetiğinin değerlendirilmesinde substrat olarak 2,4,6-triklorofenol kullanıldı. Bir istatistik programı olan Systat 10 paket programı, deklorinasyonun kinetik davranışlarının açıklanması için iki substratlı çözüm ortamı olarak kullanıldı. Deneyler ve istatistiksel analizler sonucunda, Moser eşitliğinin en uygun kinetik model olduğu gözlendi. Toksisitenin ölçümünde laboratuvarımızda geliştirilen ve prensip olarak klorlu fenolik bileşikler tarafından p-Galaktosidaz enzim aktivitesinin inaktivasyonu temelinde çalışan mikrotoksisite test sistemi kullanıldı. Lakkaz enzimi ile klorlu fenolik bileşiklerin deklorinasyonunu gösteren mikrotoksisite testinden elde edilen veriler, bu kimyasallarda varolan toksik özelliğin giderildiğini gösterdi. Anahtar Kelimeler: Detoksifikasyon, deklorinasyon, lakkaz, klorofenolik bileşikler

Abstract:
In this study, detoxification of some chlorinated phenolic compounds, such as 2,4,6-trichlorophenol, 2,4-dichlorophenol and 4-chlorophenol, through the treatment with laccase enzyme produced from a white-rot fungal strain, Trametes versicolor was investigated. Enzymatic dechlorination experiments by using free and immobilized laccase, have been performed in a specially designed lab-scale bioreactor. Laccase immobilization has been carried out by adsorbing the laccase enzyme on Na-aljinate beads. Kappa-carragenan beads were not found suitable in this respect. Chlorine ion and dissolved oxygen electrodes mounted to the bioreactor were used continuously to detect the profiles of in chlorine ion and oxygen concentrations, respectively, in reaction medium. The increase in free chlorine ion concentration in contrast to decrease in dissolved oxygen concentration in the reaction medium was the common observation of laccase catalysed dechlorination studies. In the experiments directed to optimize enzymatic dechlorination using free and immobilized laccase, pH: 5.0 and 25°C were found to be appropriate reaction pH and reaction temperature, respectively. In the same respect, 160 pM was determined as optimum substrate concentration whereas 30 minutes was determined as optimum incubation time. GC/MS (Gas Chromatography & Mass Spectroscopy) analysis of enzymatic reaction products indicated that chlorine removal from chlorinated phenolics was a result of the degradation of these chlorinated substances by laccase. Kinetical evaluation of enzymatic dechlorination was carried out in the experiments where 2,4,6-trichlorophenol used as the substrate. Statistical Programme Systat 10 was used to find on appropriate mathematical model to explain the kinetic behaviour of the laccase catalysed dechlorination. According to the result of the experiments and statistical analysis, mathematical model based on double substrate Moser equation seemed to be the most suitable kinetic expression. Mikrotoxicity test system developed in our laboratory which works principally based on inactivation of p galactosidase activity by toxic chlorinated phenolics, was used for toxicity detection. Data obtained from microtoxicity tests have shown that dechlorination of chlorinated phenolics with laccase has resulted in the lost of toxic potentiality of these chemicals to a substantial extent. Keywords: Detoxification, dechlorination, laccase, chlorophenolic compounds