Galleria mellonella (Lepidoptera)'da beyin nörosekresyon hücrelerinde mikroskobik (Floresan ve elektron) ve analitik (Cap LC-ESI-MS/MS) yöntemlerle sialik asit belirlenmesi
Determination of sialic acid in Galleria mellonella brain neurosecretory cells with microscopic (Florescence and elektron) and analytical (Cap LC-ESI-MS/MS) methods
Yazar: SANAZ NAGHAVİ
Danışman: PROF. DR. SABİRE KARAÇALI
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışma da Galleria mellonella'nın Pars İnterserebralis (PIC) bölgesi ve nörosekresyon hücrelerinde (NSC) sialik asidin varlığı aranmıştır. Bu amaçla mikroskobik (Floresan ve elektron mikroskoplar, sırasıyla FM ve TEM) ve analitik (cap ESİ-LC-MS/MS) yöntemler kullanılmıştır.Mikroskobik yöntemler lektinlerin şekerleri seçici tanımasına dayanır. FM'de, frozen kesitlere ve lowicryl'e gömülmüş örneklerden alınan yarı ince kesitlere tüm sialik asit (Sia) tiplerini tanıyan Limulus polyphemus agglutinin (LPA) lektini uygulanmıştır. 3., son ve ergin evre beyinlerinden alınan frozen kesitlerde floresan ışıma PIC bölgesinde geniş bir alanda ve beyni dıştan saran nöral lamella veya stromada görülmüştür. Lowicryl'e gömülmüş beyinlerden alınan yarı ince kesitlere Sia'ların glikozidik bağ tipini de tanıyan altın bağlı lektinler Sambucus nigra agglutinin (SNA) Maackia amurensis agglutinin (MAA) uygulanmıştır.Elde edilen floresan ışımalar ?-2,3 ve ?-2,6 glikozidik bağla bağlanan Sia'ların PIC bölgesinde bulunduğunu işaret etmektedir.3.evre, son evre larva ve 6.gün pupa'nın lowicryl'e gömülmüş örneklerinden alınan ince kesitlere TEM de incelemek amacıyla glikozidik bağ tipini tanıyan altın bağlı lektinler uygulanmıştır. MAA-bağlı altın partikülleri 3. ve son evre larva NSC hücrelerinin nukleuslarında kromatine bağlı, sitoplazmalarında ise sitosolde, nörosekresyon granüllerinde mitokondrilerde ve lipit vakuollerde yer almaktadır. NSC'leri incelenen iki evrede de, MAA-bağlı altın partikülleri SNA-bağlı altın partiküllerinden daha fazla bulunmuştur. Genç (3.evre larva) ve yaşlı (son evre larva) evreler karşılaştırıldığında hem MAA ve hem de SNA-bağlı altın partikülleri genç hücrelerde daha boldur. TEM incelemeleri sonucunda son evre larva NSC'lerinde; ?-2,6 bağlı Sia'ların yok denecek kadar azaldığı, ?-2,3 bağlı Sia'ların ise yine azaldığı fakat bulunmaya devam ettiği gözlemlenmiştir.Analitik yöntemle elde edilen sonuçlar mikroskobik yöntemlerle elde edilen sonuçları desteklemektedir. Belirlenen Sia tipi Neu5Ac ve Neu5Gc9Ac dir. Neu5Ac 7.6 ng/mg ile en fazla 3. evre PIC bölgesinde saptanmıştır. Son evre larva'da PIC bölgesi için bu değer 1.1 ng/mg ve 6.gün pupa'da 1.5 ng/mg ölçülmüştür. Ergin yapılanmanın devam ettiği pupal evrenin ikinci yarısındaki böceklerde, 3. evrede bulunanlardan önemli ölçüde az olmakla birlikte, son evre larvaya göre hafif bir artış görülmüştür. Sonuç olarak; NSC'de sialik asit bulunmaktadır. İlerleyen yaşla hücrelerde ? 2,6 bağlı Sia yok denecek kadar azalırken ? 2,3 bağlı Sia azalarak bulunmaya devam eder. PIC bölgesinde ise yaşlanan dokuda Sia tipleri ve konsantrasyonları azalmaktadır.Anahtar sözcükler: Sialik asit, Nörosekresyon hücreler, Lektin, Transmisyon elektron mikroskobu, LC-MS/MS, Floresan mikroskobu, Altın işaretleme, Galleria mellonella, Böcek

Abstract:
In this study, presence of sialic acid in Galleria mellonella?s Pars Intercerebralis (PIC) zone and neurosecretory cells (NSC) has been investigated. For this purpose, microscopy (Fluorescence and Transmission Electron microscope; FM and TEM respectively) and analytical (Cap ESI-LC-MS/MS) methods were used.Microscopic methods is based on selective recognition of sugars with lectins. For FM, frozen sections and semi-thin sections from lowicryl-embedded specimens, were applied with Limulus Polyphemus agglutinin (LPA) lectin which identifies the all types of sialic acid (Sia). Frozen sections from 3th, last and adult instar brains shows a large area fluorescence radiation in the PIC zone and surrounding outside the brain, neural lamella or stroma. Semi-thin sections from Lowicryl-embedded brains were labeled to recognize Sia's depending on the type of glycosidic bond with gold conjugated Sambucus nigra agglutinin (SNA) and Maackia amurensis agglutinin (MAA) lectins.Obtained fluorescent radiations, indicate the presence of ?-2,3 and ?-2,6 glycosidic-linked Sia's in PIC zone.For TEM investigation, thin sections from lowicryl-embedded specimens of 3th, last larval instar and 6th day pupa were applied with gold conjugated lectins which recognize the type glycosidic of bond. MAA-bound gold particles in NSC?s of 3th and last instar nucleus: connected to chromatin, and cytoplasm: mitochondria, lipid vacuoles and neurosecretion granules, are located. MAA-bound gold particles were found more than SNA-gold particles in both instar of examined NSC?s. Young (3.evre larvae) and old (last larval) instars when compare, in both MAA and SNA-bound gold particles shows more abundant in young cells. As a result of the TEM investigations, in NSC?s of last larval stage; ?-2,6 linked Sia's decreased almost non-existent, ?-2,3 linked Sia's decreased but continue to observe.Results of analytical method supports obtained results from microscopic methods. Neu5Ac and Neu5Gc9Ac Sia types determined. Neu5Ac was found at most in the PIC?s zone of 3th stage with amount 7.6 ng/mg. This amount for PIC zone of last stage larvae is 1.1 ng/mg and 1.5 ng/mg for 6th day pupa. In second half of pupal stage insects that continue to make adult structure, Sia is significantly less than those found in 3th stage and according to last stage larvae this amount shows slight increase. In conclusion, in NSC there are sialic acid. Advancing age of cells ? 2.6 linked Sia decreases by almost non-existent while ? 2.3 linked Sia decreases but continue to be observe. In aging tissue of PIC zone Sia types and concentrations decreases.Key words: Sialic acid, Neurosecretory cells, Lectin, Transmission electron microscope, LC-MS/MS, Fluorescence microscope, Gold labeling Galleria mellonella, Insect