Nigella sativa'nın meme kanseri, metastaz ve NK (Natural killer) hücrelerinin sitotoksik aktivitesi üzerinde etkisinin araştırılması
The effects of nigella sativa on breast cancer, metastasis and cytotoxicity of natural killer (Nk) cells
Yazar: TUĞCAN KORAK
Danışman: DOÇ. DR. EMEL ERGÜL
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Katil hücreler-doğal = Killer cells-natural ; Meme = Breast ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nigella sativa L. = Nigella sativa L. ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Çörekotu = Nigella

Özet:
Amaç: Bu çalışma ile in vitro olarak TQ, N. sativa su ve alkol özütlerinin meme kanseri hücrelerinde CDK4, MYC, NF-KB1, VEGFA, FGF1, N-kaderin, ULBP1, ULBP2 ve CD155 genlerinin ekspresyonları üzerindeki etkisini ortaya koymak hedeflenmiştir. Genel bir ifadeyle ULBP1, ULBP2 ve CD155 genleri NK hücrelerinin sitotoksik aktivitelerinde rol oynarken diğer genler tümörigenez ve metastaz sürecinde görevlidirler.
Yöntem: N. sativa tohumlarının öğütülmesinin ardından steril de-iyonize H2O ve %95 etanol içerisinde 36 saat +4oC'de bekletilmesiyle su (SE) ve etanol özütü (AE) elde edildi. Toz halinde olan timokinon (TQ) DMSO içerisinde çözülerek 10.000 µg/ml stok solüsyon hazırlandı. Çalışmada meme kanseri hücre hattı olan MCF-7 hücreleri kullanılmıştır. xCELLigence sistemi kullanılarak optimum hücre sayısı, IC50 değerleri ve doz uygulama süresine karar verildi. Hücre canlılığı, belirlenen parametler ile MTT testi kullanılarak teyit edildi. Ardından belirlenen SE, AE ve TQ dozlarının uygulandığı hücrelerden total RNA izolasyonu ve cDNA sentezi gerçekleştirildi. Her bir genin transkripsiyonel düzeyde ekspresyonunu anlamak adına genlere özgü tasarlanan primerler kullanılarak RT-PCR gerçekleştirildi ve istatistik analiz  SPSS 20.0 programı ile gerçekleştirildi.
Bulgular: Özüt oluşturma aşamalarında N. sativa tohumlarının su ve etanol içerisinde 36 saat bekletilmesi gerektiği gösterildi. xCELLigence sistemi ile çalışmamız için optimum hücre sayısı (17.500), dozların IC50 değerleri (SE: 600 µg/ml, AE: 197 µg/ml, TQ: 2.5 µg/ml) ve doz uygulanma saati (48 saat) belirlendi. RT-PCR sonucunda CDK4 geni için;  hücrelere AE (p=0,012) ve TQ (p=0,027) uygulandığında kontrole göre istatistiksel olarak daha düşük düzeyde ekspresyon (AE için 1,25 kat, TQ için 1.20 kat) elde edilmiştir. SE ve kontrol arasında anlamlı fark olmadığı bulunmuştur (p=1.000). MYC geni için;  hücrelere AE (p=0,001) ve TQ (p=0,001) uygulandığında kontrole göre istatistiksel olarak daha düşük düzeyde ekspresyon (AE için 2,65 kat, TQ için 2.54 kat)  elde edilmiştir. SE ve kontrol arasında anlamlı fark olmadığı bulunmuştur (p=0,450). NF-κB1 geni için;  hücrelere uygulanan AE (p=0,238) ve TQ (p=0,830) için kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı etkisi olmadığı ortaya çıkmıştır. Hücrelere SE uygulandığında kontrole göre 1,59 kat daha yüksek düzeyde ekspresyon görülmüştür (p=0,019). VEGFA geni için;  hücrelere uygulanan SE (p=0,179) ve AE (p=0,089) için kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı bulunmuştur. Hücrelere TQ uygulandığında ise kontrole göre 2,13 kat daha yüksek düzeyde ekspresyon görülmüştür (p=0,005). FGF1 geni için;  hücrelere AE (p=0,022) ve TQ (p=0,043) uygulandığında kontrole göre istatistiksel olarak daha yüksek düzeyde ekspresyon (AE için 156,5 kat, TQ için 135,5 kat) elde edilmiştir. SE ve kontrol arasında anlamlı fark olmadığı görülmüştür (p=1,000). ULBP1 geni için;  hücrelere AE (p=0,045) ve TQ (p=0,040) uygulandığında kontrole göre istatistiksel olarak daha yüksek düzeyde (AE için 23,9 kat, TQ için 24,6 kat) ekspresyon elde edilmiştir. SE ve kontrol arasında anlamlı fark olmadığı bulunmuştur (p=1,000). MCF-7 hücre hattına uygulanan AE, SE ve TQ'nun N-kadherin (p=1,84), ULBP2 (p=0,131) ve CD155 (p=0,071) gen ekspresyonları üzerine anlamlı etkisi olmadığı görüldü.
Sonuç: Çalışmamız bilimsel temelde birçok alanda terapötik etkisi gösterilmiş olan N. Sativa'nın meme kanserinde hedeflediğimiz genlerde transkripsiyonel düzeyde etkisini ortaya koymuştur. Bu çalışma her bir hedef gen için özüt tipi, hücre hattı veya her ikisini kapsayacak şekilde N. sativa etkilerinin ilk kez gösterilmesi bakımından önem taşımaktadır. İleriki çalışmalarda özüt bileşenlerinin analizi, proteomiks, metabolomiks gibi farklı boyutlarda in vitro/in vivo ve klinik çalışmaların arttırılması N. Sativa'nın taşıdığı farmakolojik potansiyeli görmek adına değer taşıyacaktır.

Abstract:
Objective: The aim of this in vitro study is to reveal the effects of TQ, water and alcohol extracts of N. sativa on the following genes CDK4, MYC, NF-KB, VEGF, FGF, N-cadherin, ULBP1, ULBP2 and CD155. In general terms, ULBP1, ULBP2 and CD155 genes play a role in the cytotoxic activities of NK cells, while other genes are involved in the process of tumorigenesis and metastasis.
Method: After grinding N. sativa seeds, water (SE) and ethanol extract (AE) were obtained by soaking them in sterile de-ionized H2O and 95% ethanol for 36 hours at +4oC. Thymoquinone (TQ) stock solution (10,000 µg/ml) was prepared by dissolving TQ in DMSO. MCF-7 cells, a breast cancer cell line, were used in the study. Optimum cell number, IC50 values, and duration of dose administration were determined using the xCELLigence system. Cell viability was confirmed by MTT assay. Then, total RNA isolation and cDNA synthesis were performed from the cells where the determined SE, AE and TQ doses were administered. In order to understand the expression of each gene at the transcriptional level, RT-PCR was performed using primers designed specifically for the genes, and statistical analysis was carried out with the SPSS 20.0 program.
Results: During the extraction process, it was shown that N. sativa seeds should be soaked in water and ethanol for 36 hours. The optimum number of cells (17,500), IC50 values of doses (SE: 600 µg/ml, AE: 197 µg/ml, TQ: 2.5 µg/ml) and dose administration time (48 hours) were determined with the xCELLigence system. As a results of RT-PCR for the CDK4 gene, when AE (p=0.012) and TQ (p=0.027) were applied to cells, statistically lower levels of expression were obtained (1.25-fold for AE, 1.20-fold for TQ) compared to the control. There was no significant difference between SE and control (p=1.000). For the MYC gene; when AE (p=0.001) and TQ (p=0.001) were applied to cells, statistically lower levels of expression (2.65-fold for AE, 2.54-fold for TQ) were obtained compared to the control. There was no significant difference between SE and control (p=0.450). For the NF-kB1 gene, no statistically significant effect was obtained compared to the control for AE (p=0.238) and TQ (p=0.830). When SE was applied to the cells, a 1.59-fold higher level of expression was observed than in the control (p=0.019). For the VEGFA gene,  no statistically significant difference was found for SE (p=0.179) and AE (p=0.089) compared to the control. When TQ was applied to the cells, a 2.13-fold higher level of expression was observed than in the control (p=0.005). For the FGF1 gene, when AE (p=0.022) and TQ (p=0.043) were applied to cells, statistically higher expression levels were obtained (156.5-fold for AE, 135.5-fold for TQ) compared to the control. There was no significant difference between SE and control (p=1,000). For the ULBP1 gene, when AE (p=0.045) and TQ (p=0.040) were applied to cells, a statistically higher level of expression was obtained (23.9-fold for AE, 24.6-fold for TQ) compared to the control. There was no significant difference between SE and control (p=1,000). It was observed that AE, SE and TQ applied to the MCF-7 cell line did not have a significant effect on N-Cadherin (p=1.84), ULBP2 (p=0.131) and CD155 (p=0.071) gene expressions.
Conclusions: This study revealed the effects of N. sativa, which has been shown to have evidence-based therapeutic effects in many fields, on the targeted genes at the transcriptional level in breast cancer. Our study is essential to show the effects of N. sativa for each target gene in terms of extract type, cell line, or both. In future studies, analysis of extract components, increasing in vitro/in vivo and clinical studies in different perspective such as proteomics and metabolomics will be valuable to discover the pharmacological potential of N. sativa.