Bazı Alkanna türlerinin biyoaktivite rehberli izolasyon yöntemi kullanarak çeşitli kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerinin in vitro ortamlarda taranarak, hücresel mekanizmalara ve apoptoz yolaklarına olan etkilerinin araştırılması
Research on cytotoxic effects of some alkanna species on various tumor cell lines by using boiassay guided isolation method and in vitro screening: Effects of these species on cellular mechanisms and apoptotic pathways
Yazar: CANAN SEVİMLİ GÜR
Danışman: DOÇ. DR. KEMAL SAMİ KORKMAZ ; PROF. DR. İSMET DELİLOĞLU GÜRHAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Yeni antikanser ajanlar keşfetmek amacıyla özellikle Alkanna cinsinden Alkanna pseudotinctoria Hausskn. ex Hub.-Mor. ve Alkanna cappadocica' nın Boiss.&Bal naftakinonları araştırılmıştır. Bitkinin köklerinin hekzan, diklorometan ve diklorometan: metanol (1:1) ekstrelerinin biyoaktivite rehberli olarak fraksiyonlanması, 4 bilinen, 4 yeni naftakinon tipi bileşiğin izolasyonu ile sonuçlanmıştır. Deoksialkanin (1), ß, ß-dimetilakrilalkanin (2), asetilalkanin (3) ve alkanin (4) isimli bilinen ve 5-metoksi deoksialkanin (5), 8-metoksi deoksialkanin (6), 5-metoksi asetilalkanin (7), 5-metoksi ß,ß-dimetilakrilalkanin (8) isimli yeni bileşikler spektroskobik yöntemler (LC-ESI-MS, 1D- ve 2D-NMR) kullanılarak tanımlanmıştır.İzole edilen bileşiklerin sitotoksik aktivitesi konsantrasyona ve zamana bağlı olarak, 12 insan kanser hücre hattı (MDA-MB-231, SK-BR-3, DU145, LNCaP, MCF7, PC-3, HeLa, HT-29, AU565, Saos-2, HepG2, Hep 3B) ve 1 adet normal hücre hattında (3T3) MTT testi kullanılarak aydınlatılmıştır. 2, 7 ve 8 numaralı bileşikler, diğer bileşiklere ve pozitif kontrollere [CPT-11 (CAMPTOSTAR®, irinotekan), doksorubisin, etoposit] göre, özellikle HT-29, MDA-MB-231 ve PC-3 hücre hatları üzerinde 0.09 ve 1.10 µM arasındaki IC50 değerleri ile belirgin biçimde yüksek ve geniş spektrumlu sitotoksik aktivite sergilediği saptanmıştır. 7 numaralı bileşiğin, diğer bileşiklere göre genellikle 4 ile 16. saatler arasında hücre canlılığının % 50' nin altına düşmesiyle hücre içine geçişi en hızlı olan ve en hızlı sitotoksik aktivite gösteren bileşik olduğu belirlenmiştir.Bileşiklerin DNA topoizomeraz I enzimini inhibe etme aktivitesi plazmit DNA'sı gevşeme testi kullanılarak analiz edilmiş ve 2, 3, 4 ve 7 numaralı bileşiklerin, sırasıyla 2-3, 2-3, 3-6, 3-6 µM potent inhibisyon değeri ile diğer bileşiklere göre oldukça yüksek inhibisyon aktivitesine sahip oldukları açığa çıkarılmıştır.Bileşiklerin hücre DNA hasarı oluşturma yetenekleri, tümör hücreleri DNA' sındaki ?-H2AX düzeyinin immüno flüoresans ve Western Blotlama yöntemleri kullanarak, nitel ve nicel olarak analiz edilmiştir. Bu çalışmaların sonunda, 2, 7 ve 8 numaralı bileşiklerin diğer bileşiklere göre daha yüksek düzeyde tümör hücre DNA'sında çift zincir kırığı oluşturdukları saptanmıştır.Bileşiklerin kanıtlanan sitotoksik aktiviteleri ve DNA hasarı oluşturma yetenekleri sonunda meydana gelen hücre ölümünün apoptoz ve/veya nekroz olduğu anneksin V-FITC/PI boyamasından yararlanarak akış sitometri tekniği kullanarak belirlenmiştir. Akış sitometri analiz sonuçları incelendiğinde, yapısı bilinen bileşiklerden 2 numaralı bileşiğin ve ilk kez tanımlanan 7 ve 8 numaralı bileşiklerin K-562 (insan kronik miyeloit lösemi) hücre hattında 500 nM dozluk uygulamalarında meydana getirdikleri sırasıyla % 49.0, 44.7, 40.7 apoptoz oranları ile apoptotik etkileri, diğer bileşiklerden anlamlı biçimde daha yüksek olduğu bulunmuştur.Saf bileşiklerin sergiledikleri sitotoksite, DNA topoizomeraz I inhibisyon aktiviteleri, DNA hasarı oluşturma yetenekleri ve apoptotik etkilerinin tamamı dikkate alınarak değerlendirildiğinde, 2, 7, 8 numaralı bileşiklerinin izole edilen diğer bileşiklerden daha yüksek anti kanser aktiviteye sahip oldukları saptanmıştır. 7 ve 8 numaralı bileşikler, kanser tedavisinde kullanılmak üzere, terapötik indeks ve yeni kimyasal birimlerin geliştirilmesi bakımından iyi yeni adaylardır. Böylece klinik için kullanışlı antikanser ajanların ortaya çıkacağı düşünülmektedir. Ek olarak endemik Alkanna pseudotinctoria, Alkanna cappadocica türlerinin antikanser ajan üretim endüstrisi açısından önemli alternatif kaynaklar olduğu açığa çıkarılmıştır.Bu çalışmanın bulguları ışığında, bazı kanser türlerinin sağaltımında kullanılabilecek biyolojik kaynaklı ucuz kemoterapötiklerin hazırlanması yönünde önemli bir adım atılmıştır. Bu çalışmanın sonuçlarının yaşam kalitesi ve hastalık tablosuna olan olumlu katkıları ile kanser hastalarına uygulanılan ithal terapötik ilaç tüketimini azaltarak, ülke ekonomisine katkı sağlayacağı ve kemoterapi, radyoterapi tedavisi gören hastaların tedavi etkinliklerini destekleyeceği umut edilmektedir.Anahtar Kelimeler: Boraginaceae, Alkanna, naftakinon, alkanin türevleri, sitotoksik aktivite, DNA topoizomeraz I inhibisyonu, ?-H2AX, DNA hasarı, anneksin V, apoptoz.

Abstract:
In order to discover new anticancer agents, particularly naphthoquinones from two species of Alkanna genus, Alkanna pseudotinctoria Hausskn. ex Hub.-Mor. and Alkanna cappadocica Boiss.&Bal were studied. Bioassay-guided fractionation of hexane, dichloromethane and dichloromethane:methanol (1:1) extracts obtained from roots of the plants resulted in isolation of four already known and four completely new naphthoquinone type compounds. The known compounds namely deoxyalkannin (1), ß,ß-dimethylacrylalkannin (2), acetylalkannin (3) and alkannin (4), and the new compounds namely 5-methoxydeoxyalkannin (5), 8-methoxydeoxyalkannin (6), 5-methoxyacetylalkannin (7), 5-methoxy-ß,ß-dimethylacrylalkannin (8) were fully characterized by using spectroscopic methods (LC-ESI-MS, 1D- and 2D-NMR).Cytotoxicity of the isolated compounds was evaluated by using MTT assay in twelve human cancer cell lines namely MDA-MB-231, SK-BR-3, DU145, LNCaP, MCF7, PC-3, HeLa, HT-29, AU565, Saos-2, HepG2, Hep3B, and in one normal cell line 3T3. Compounds 2, 7 and 8 compared to others and positive controls [CPT-11 (Camptostar®, irinotecan), doxorubicine, etoposide] exhibited distinctively high and wide-spectrum cytotoxic activity particularly on HT-29, MDA-MB-231 and PC-3 cell lines with IC50 values ranging from 0.09 and 1.10 µM. Compound 7 was generally found to be the fastest one in terms of both penetrating into the cell and showing cytotoxic activity, decreasing the cell viability below 50% by 4 to 16 hours.DNA topoisomerase I enzyme inhibition activities of the compounds were analysed by plasmid DNA relaxation assay and it was revealed that compounds 2, 3, 4 and 7 had much higher DNA topoisomerase I inhibition activity with potent inhibition values of 2-3, 2-3, 3-6, 3-6 µM, respectively. Cell DNA damaging abilities of the compounds were analysed both qualitatively and quantitatively by observing the ?-H2AX level in DNA of tumor cells and with immunofluorescence and Western Blotting. It was found that compounds 2, 7 and 8 lead to a higher level of double chain break in DNA of tumor cells PC-3, HT-29 and particulary K-562.As a result of flow cytometric analysis, it was found that compounds 2, 7 and 8 caused apoptotic cell deaths distinctively in higher rates or in lower concentrations compared to other compounds with 49.0, 44.7, 40.7 percentages, respectively, in K562 (human chronic myeloid leukemia) cell line with an application dose of 500 nM.Taking into consideration all four effects exhibited by pure compounds, namely cytotoxic, DNA topoisomerase I inhibition, apoptotic activities and DNA damaging ability; it has been found that compounds 2, 7 and 8 have higher levels of anticancer activities than the others. Compounds 7 and 8 are good, new candidates to be used in cancer treatment as far as improvement of the therapeutic index and development of new chemical units are concerned. Additionally, endemic Alkanna pseudotinctoria and Alkanna cappadocica species have been revealed to be important alternative sources in terms of anticancer agent production industry.In light of the findings of this study, an important step has been taken as far as preparation of biologically obtained, cheap chemotherapeutics to be used in treatment of some cancer types. It is hoped that results of this study will contribute not only to improve the life quality and navigation of the disease but also to the economy of the country by decreasing consumption of imported therapeutic medicine that is applied to cancer patients and will support chemotherapeutic and radiotherapic treatment effectiveness.Key Words: Boraginaceae, Alkanna, naphthoquinone, alkannin derivative, cytotoxic activity, DNA topoisomerase I inhibition, ?-H2AX, DNA damage, annexin V FITC staining, apoptosis.