Beta-katenin ile apoptozis arasındaki ilişkinin sitolojik ve immünositokimyasal yöntemlerle araştırılması
Examination of interaction between beta-catenin and apoptosis by cytological and immunocytochemical methods
Yazar: HANİFE GÜLER DÖNMEZ
Danışman: PROF. DR. ŞAYESTE DEMİREZEN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Çalışmamızda β-katenin proteini ile apoptozis arasındaki ilişkinin sitolojik ve immünositokimyasal olarak araştırılması amacıyla 224 hastanın servikovajinal örnekleri incelenmiştir. Bu olgular içinde hiçbir enfeksiyon ve atipik değişiklik saptanmayan 144 olgu (%64,3) kontrol grubu, 80 olgu (%35,7) ise çalışma grubu olarak kabul edilmiştir. Çalışma grubu ise atipik olgular (n=17,  %21,3) ve enfeksiyon olguları (n=63, %78,7) olmak üzere iki kategoride değerlendirilmiştir. Sitolojik olarak apoptotik hücresel değişiklikler de saptanarak, kaydedilmiştir.
İmmünositokimyasal yöntem kullanılarak β-katenin proteini ve apoptotik hücrelerin varlığı araştırılmıştır. Apoptotik hücrelerin saptanması için aktif kaspaz 3, 8, 9 antikorları kullanılmıştır. β-katenin proteininin zardaki pozitifliği ve sitoplazmadaki zayıf pozitifliği Wnt/β-katenin sinyal yolunun inaktif olduğunu gösterirken, sitoplazmadaki ve çekirdekteki pozitiflik ise sinyal yolunun aktif olduğunu göstermektedir. Bu verilere dayanarak, 224 olgunun 44'ünde (%19,6) sinyal yolunun aktif, 180'inde (%80,6) ise inaktif olduğu belirlenmiştir. Apoptotik hücrelerle β-katenin proteini arasındaki ilişki incelendiğinde, β-katenin proteininin hücre zarında, sitoplazmada ve çekirdekte negatif olduğu ve apoptotik hücrelerde Wnt/β-katenin sinyal yolunun inaktif durumda olduğu görülmüştür. Aktif kaspaz enzimlerine ait bulgular incelendiğinde; 224 olgunun 95'inde (%42,4) aktif kaspaz 3 [apoptozis (+)], 79'unda (%35,3) aktif kaspaz 3 ve 8 veya aktif kaspaz 3, 8 ve 9 [ölüm reseptörleri aracılı apoptozis(+)], 5'inde (%2,2) ise aktif kaspaz 3 ve 9 [mitokondri aracılı apoptozis (+)] enzimlerinin pozitif olduğu saptanmıştır.
Wnt/β-katenin sinyal yolu aktivitesi ile apoptozis ve ölüm reseptörleri aracılı apoptozis arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu belirlenirken (p<0,05), sinyal yolu ile mitokondri aracılı apoptozis arasında ise bir ilişkiye rastlanmamıştır (p>0,05). Aktif kaspaz 3, 8 ve 9 enzimlerine ait H-skor ortalamaları sinyal yolu aktif ve inaktif olgularda birbirleriyle karşılaştırıldığında, sinyal yolu aktif olgularda H-skoru ortalamalarının, sinyal yolu inaktif olan olgulara kıyasla daha yüksek olduğu ve H-skor ortalamaları arasında istatistiksel olarak da anlamlı bir ilişki olduğu görülmüştür (p<0,05). 
β-katenin proteininin hücre zarı H-skorları; apoptozis, ölüm reseptörleri aracılı ve mitokondri aracılı apoptozis varlığıyla karşılaştırıldığında, apoptozis, ölüm reseptörleri aracılı ve mitokondri aracılı apoptozis pozitif olan olgularda zardaki β-katenin pozitifliğinin azaldığı belirlenmiştir. Ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunamamıştır (p>0,05). Kaspaz enzimleri arasındaki ilişki incelendiğinde aktif kaspaz 3, 8 ve 9 enzimleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir pozitif korelasyon olduğu bulunmuştur. Bu üç enzimin birindeki artışın diğerlerinde de artışa neden olduğu sonucuna gidilmiştir (p<0,05).
Tüm bu sonuçlar doğrultusunda apoptotik hücrelerde Wnt/β-katenin sinyal yolunun inaktif durumda olduğu, ancak apoptotik hücrelerin apoptozis sonucu azalan epitel hücreleri telafi etmek için apoptotik olmayan hücrelerde Wnt/β-katenin sinyal yolunu aktivitesini uyardığı ve bu şekilde epitel dokunun bütünlüğünün korunduğu yorumu yapılmıştır.

Abstract:
In our study, cervicovaginal samples of 224 cases were evaluated to examine interaction between β-catenin protein and apoptosis. Of these cases, 144 cases (64.3%) without any infection and atypical changes were the control group, 80 cases (35.7%) were formed the study group. Study group was evaluated in two categories as atypical cases (n=17, 23.3%), and infectious cases (n=63, 78.7%). Apoptotic cellular changes were also observed cytologically. 
β-catenin protein and the presence of apoptotic cells were investigated by using immunocytochemical method. To detect apoptotic cells, active caspase 3, 8, and 9 antibodies were used. Positivity of membranous β-catenin staining with weak cytoplasmic staining indicated that Wnt/β-catenin signaling was inactive, while positivity in the cytoplasm and nucleus showed active signaling. Thus, in 44 of 224 cases (19.6%) signaling pathway was active, in 180 cases (80.4%) was inactive. In the examination of interaction between apoptotic cells and β-catenin, it was observed that β-catenin protein was negative in the cell membrane, cytoplasm and nucleus and Wnt/β-catenin signaling was showed inactive in apoptotic cells. In the examination of the findings related with activated caspases, active caspase 3 were positive in 95 of 224 cases (42.4%) [apoptosis (+)],  active caspase 3 and 8 or active caspase 3, 8, and 9 were positive in 79 cases (35.3%) [death receptor mediated apoptosis (+)], and active caspase 3, 9 were positive in 5 cases (2.2%) [mitochondria mediated apoptosis (+)].
Statistically significant relationship between activity of Wnt/β-catenin signaling, apoptosis and death receptor mediated apoptosis were determined (p<0.05), while there was no association between signaling activity and mitochondria mediated apoptosis (p>0.05). When the mean of H-scores belonging to active caspase 3, 8, and 9 were compared with each other in view of signaling activity, the mean of H-scores were higher in the signaling active cases than the signaling inactive cases, also statistically significant relationship were found between H-scores (p<0.05). 
When the H-scores of membranous β-catenin protein were compared with the presence of the apoptosis, death receptor mediated and mitochondria mediated apoptosis, decreasing of membranous positivity were detected in apoptosis, death receptor mediated and mitochondria mediated apoptosis. However, these decreases were not statistically significant (p>0.05). In analysing the relationship between the caspase enzymes, significant positive correlation between active caspase 3, 8 and 9 was found. Thus, increase in one of the three enzymes caused increases in others (p<0.05).  
In accordance with all these findings, Wnt/β-catenin signaling were inactive in apoptotic cells; however it was thought that apoptotic cells induce Wnt/β-catenin signaling in non-apoptotic cells to compensate decreases in epithelial cells as a result of apoptosis in order to maintain for epithelial tissue integrity.