Oksidatif DNA hasarı sonucu aktifleşen onarım mekanizmalarının araştırılması
Investigating the repair mechanism activation by oxidative DNA damage
Yazar: SELDA KARAMİL
Danışman: PROF. DR. KEMAL SAMİ KORKMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology

Özet:
NKX3.1, prostat epitelinin gelişiminde ve farklılaşmasında anahtar rollere sahip, prostat bezinin gelişimi ve kanserleşmesi arasında önemli bir bağ kuran bir transkripsiyon faktörüdür. NKX3.1, transkripsiyonel regülasyonda, antioksidan mekanizmalarda ve hücre döngüsü kontrolünde görev alan proteinlerin ekspresyonunu bir transkripsiyon faktörü olarak kontrol etmektedir. NKX3.1, pro-oksidan enzim seviyelerinin transripsiyonel regülasyonu aracılığıyla, hücreleri oksidatif strese ve DNA hasarına karşı koruyarak kanserin başlamasını baskılamaktadır. NKX3.1 inaktivasyonu ise oksidatif hasara duyarlılığı artırmakta ve dolayısıyla prostatik inflamasyon NKX3.1'in hücre içi seviyesinin azalmasına yol açarak hücreleri onkogenik transformasyona yatkın hale getirmektedir.
Organizmada serbest radikallerin oluşum hızı ile bunların ortadan kaldırılma hızı bir denge içindedir ve bu durum oksidatif denge olarak adlandırılır. Ancak, çeşitli nedenlerle reaktif oksijen türlerinin artması ve antioksidan mekanizmaların yetersiz kalması sonucu oksidatif stres adı verilen bir dizi patolojik olay meydana gelmektedir. Oksidatif stresin, farklı mekanizmalar ile DNA üzerinde baz ve şeker modifikasyonları, abazik bölgeler  ile tek ve çift zincir kırıkları gibi bir takım lezyonlara neden olarak hasara yol açtığı bilinmektedir. Bunlarla birlikte DNA polimeraz ve DNA onarımı için gerekli olan enzimlere hasar vererek replikasyonun doğruluğunu azaltmakta ve kanser oluşumuna yol açmaktadır.
Bu tez çalışmasında, prostat kanseri hücre hatlarında oksidatif hasarın doğrudan göstergesi olarak 8-OHdG, AP bölgeleri ve çift zincir kırıkları incelenmiş ve bu hasarların NKX3.1 ve AR varlığı ve yokluğunda miktarları ve birbirleri ile olan ilişkileri araştırılmıştır.
LNCaP ve LNCaP 104R2 hücre hatlarında H202 uygulaması ile yaratılan DNA hasarına yanıt olarak azalan AP bölgelerinin, çekirdeğe lokalizasyonu artan 8-OHdG seviyesinin ve artan çift zincir kırıklarına bağlı olarak gelişen γH2AX(S139) odak sayılarının arttığı belirlenmiştir. Sentetik androjen varlığı ile uyarılan ve yüksek seviyede AR ve NKX3.1 ekspresyon seviyesine sahip olan hücrelerde hasar miktarının daha fazla olduğu ancak bununla birlikte onarım oranının da artmış olduğu saptanmıştır. Bunun yanında siRNA aracılığıyla NKX3.1 ekspresyonu susturulan hücrelerde kontrole göre örneklerin AP bölgelerinin ve γH2AX(S139) odak sayılarının daha düşük olduğu belirlenmiştir. Ayrıca CM uygulanarak inflamasyon ortamı oluşturulmuş hücrelerde NKX3.1 aşırı ekspresyonu ile birlikte  AP bölgeleri ve 8-OHdG seviyesi temelinde hasar miktarının azaldığı ancak γH2AX(S139) odak sayılarının arttığı saptanmıştır. Elde edilen verilere göre H202 ile oluşturulan AP bölgelerinin çift zincir kırıklarına dönüşerek γH2AX(S139) odak sayılarının yükselmesine yol açtığı ve NKX3.1 varlığında hasarı tanımlamanın ve hasar onarımın daha yüksek olduğu sonucuna varılmıştır. Tüm bu verilerden yola çıkarak, androjen veya NKX3.1'in varlığında hücrede hasar algısının arttığı ve onarımın daha hızlı bir şekilde gerçekleştiği,  NKX3.1 yokluğunda ise onarım komplekslerinin yeterince aktif olamadığı ve hasarın biriktiği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
NKX3.1 has key roles in the development and differentiation of the prostate epithelium and therefore it is a transcription factor that forms an an important link between development and tumorigenesis of prostate gland. It is determined that NKX3.1 transcriptionally regulates the genes which function in transcriptional regulation, antioxidant mechanisms and cell cycle regulation. Additionally, NKX3.1 suppresses tumor initiation by protecting the cell against oxidative stress and DNA damage through transcriptional regulation of pro-oxidant enzyme levels. Prostatic inflammation leads to a decrease in intracellular levels of NKX3.1 therefore it makes cells susceptible to oncogenic transformation because of NKX3.1 inactivation increases the sensitivity to oxidative damage.
The rate of formation of free radicals and their rate of elimination are in equilibrium in the organism, and this is referred to as oxidative stability. However, for various reasons, the increase of reactive oxygen species and insufficient antioxidant mechanisms caused a number of pathological events that is called oxidative stress. Oxidative stress is known to cause damage with different mechanisms such as DNA base and sugar modifications, abasic regions and a number of single and double strand breaks. Additionally, oxidative stress reduces the accuracy of replication and leads to malignancy through damaging the enzymes such as DNA repair enzymes and DNA polymerase.
In this thesis, in 8-OHdG, AP sites and double strand breaks were examined as a direct indication of oxidative damage in the prostate cancer cell line and the amount of these damages and their relationship with each other was investigated in the absence and presence of NKX3.1 and AR.
Following H202 treatment we have demonstrated that level of AP sites were  decreased while localization to nucleus of 8-OHdG and γH2AX(S139) foci numbers breaks were increased in LNCaP and LNCap 104R2 cell lines. We observed that the amount of damage is more but however the rate of repair is increased in the cells that have high expression levels of AR and NKX3.1 with the administration of synthetic androgen R1881. By using siRNA, NKX3.1 silenced cells, the AP sites were found at high levels compared to control, however, γH2AX(S139) foci numbers has been determined that a lower number. AP sites and 8-OHdG level were determined on the basis of the amount of damage is reduced with overexpression of NKX3.1 in the cells which inflamation model was generated by CM administration. Hence, it is concluded that AP sites created with H2O2 treatment leads to an increase in the number of γH2AX(S139) foci by transformed into the double-strand breaks and the amount of damage and repair is higher in the presence of NKX3.1. Taken together, we suggest that damage recognition and repair are constitutively active in the presence of androgens or NKX3.1, but repair complexes may not be activated adequately due to inefficient damage recognition where the damage accumulates in the absence of NKX3.1.