Türk buğday çeşitlerinde kuraklık stresi altında mikrorna'ların yeni nesil dizileme teknolojileri ile dizilenmesi ve ifade analizlerinin belirlenmesi
Sequencing of microrna via next generation sequencing technology in Turkish wheat cultivars under drought stress and determination of their expression analysis
Yazar: FERHAT ULU
Danışman: PROF. DR. MEHMET CENGİZ BALOĞLU
Kastamonu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Biyoinformatik = Bioinformatics ; Buğday = Wheat ; Ekmeklik buğday = Bread wheat ; Kuraklık stresi = Drought stress ; Makarnalık buğday = Durum wheat ; Mikro RNA = Micro RNA ; Ploidiler = Ploidies ; Poliploit = Polyploidy

Özet:
Buğday, 2020 yılında yaklaşık 219 milyon ha ekilebilir alan ve 761 milyon ton hasat ile en önemli tahıllardan biri olup, ekim açısından ilk sırada ve üretim açısından mısırdan sonra ikinci sırada yer almaktadır.
Tuzluluk, yüksek sıcaklık ve kuraklık gibi abiyotik stresler, iklim değişikliklerine bağlı olarak buğday üretimine karşı önemli bir sorun oluşturmaktadır. Kuraklık, bitki büyümesini, gelişmesini ve hayatta kalmasını sınırlayan en yaygın abiyotik streslerden biridir. Bu nedenle, kök uzaması ve ozmotik stres düzenlemesi gibi çeşitli stratejiler, kendilerini kuraklığın sert etkilerinden korumak için bitkiler tarafından evrimsel süreç boyunca geliştirilmiştir. Kuraklık yanıtı; çoklu genler, proteinler, transkripsiyon faktörleri, metabolitler, hormonlar ve miRNA'ları içeren karmaşık bir mekanizmadır.
MikroRNA'lar (miRNA'lar), bitkilerde ve hayvanlarda hedef gen ekspresyonunu düzenleyen, 20-24 nt uzunluğunda, endojen, çoğunlukla korunmuş, kodlama yapmayan küçük düzenleyici RNA'lardır. miRNA'lar hormon regülasyonu, büyüme, beslenme dengesi ve stres tepkileri gibi birçok biyolojik süreçte önemli rol oynamaktadırlar.
Bu çalışmada, farklı kuraklık toleransı ve farklı ploidi seviyelerine sahip üç Türk buğday çeşidinde –Triticum aestivum cv. Yüreğir-89, hekzaploid çeşit (2n=6x=42, AABBDD), orta toleranslı; Triticum turgidum durum cv. Kızıltan-91, tetraploid çeşit (2n=4x=28, AABB), yüksek toleranslı; ve Triticum monococcum cv. monococcum (Einkorn/Siyez), diploid çeşit (2n=2x=14, AmAm), düşük toleranslı– kuraklık stresi sonucu oluşan daha önceden tanımlanmış ve tanımlanmamış miRNA'ların ve bunların hedef genlerinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. Ayrıca, miRNA'ların ve hedef genlerinin ifade profilleri, hem yeni nesil dizileme hem de qRT-PZR kullanılarak ortaya çıkarılmıştır. Hedef genlerin Gen Ontolojisi (GO), MapMan yolak analizleri yapılarak hangi metabolik yollarda rol oynadıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır.
Çalışmanın ilk aşamasında elde edilen dizileme sonuçları ve biyoinformatik araçlar ile gerçekleştirilen analizler sonucunda kuraklık cevabında rolü olduğu düşünülen  miRNA'lar ve bunların hedef genleri, qRT-PZR ile kontrol edilmiştir. Belirlenen miRNA'lrda biri tae-miR159a'dır. Bu miRNA'nın miRseq sonuçlarına göre her 3 buğday türünün yaprak dokusunda ifadesinin azaldığı görülmüş ve bu durumu qRT-PZR sonuçları da doğrulamıştır. Buna karşın, beklenildiği gibi tae-miR159a'nın belirlenen 3 hedef genin Yüreğir-89 ve Kızıltan-91'de ifadelerinin arttığı Siyez'de ise azaldığı tespit edilmiştir. Diğer yandan kök dokularında ise hem tae-miR159a ve hedef genler Yüreğir-89'da yaprak dokularına benzer bir ifade profili gösterirken Siyez ve Kızıltan-91'de miRNA'nın ifadesi artmış ve hedef genler ise azalmıştır. Sonuç olarak, farklı kromozom setlerine sahip buğday türleri arasında hangi miRNA'ların işlev gördüğü ve kuraklık stresi sonucu ifade edildiği gösterilmiştir. Bunun yanında, çalışılan ve kuraklık stresine farklı tepki verdiği bilinen buğday çeşitlerinin ploidi düzeyleri farklı olduğundan, kuraklığa duyarlı ve dayanıklı bireylerde tanımlanmış ve henüz tanımlanmayan yeni miRNA'ların durumu ve bu miRNA'ların köken aldığı buğday türleri de ilk kez bu çalışmada incelenmiştir. Ayrıca hem biyoinformatik yöntemler hem de degradom kütüphaneleri yardımıyla kuraklığa farklı tepki veren buğday türlerinde tanımlanan miRNA'ların hedef genleri tespit edilmiş ve bu hedef genlerin gen ekspresyon analizleri qRT-PZR ile doğrulanmış ve ardından GO ve MapMan yolak analizleri ile kontrol edilmiştir. 
Bugüne kadar buğdayın farklı dokularında abiyotik stres ile ilişkili birçok miRNA tanımlanmış olmasına rağmen, farklı ploidi seviyelerine sahip buğday çeşitlerinde kuraklık stresine cevap veren miRNA'ların tespiti ve analizi ile ilgili literatürde bilgi eksikliği bulunmaktadır. Bu nedenle bu çalışma, farklı kromozom setlerine ve farklı kuraklık toleransı özelliklerine sahip Türk buğday çeşitlerinde kuraklık stresi ile ilgili moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına ilişkin bilgileri ortaya çıkarmıştır.

Abstract:
Wheat is one of the most important cereal planted around 219 millions ha farmable area in 2020 with 761 millions ton, and in the second place after maize in terms of production and in the first place for cultivating area.
Abiotic stress such as salinity, high temperature, and drought is a major handicap against wheat production depending on climatic changes. Drought is one of the most common abiotics stresses that limit plant growth, development and survival. For this reason, divers strategies, such as root elongation and osmotic stress regulation, have been enhanced throughout evolution by plants to protect themselves from harsh effects of drought. Drought response is a complex mechanism including multiple genes, proteins, transcription factors, metabolites, hormones, and miRNAs. 
MicroRNAs (miRNAs) are endogenous, mostly conserved, small noncoding regulatory RNAs with 20–24 nt in length that regulate target gene expression in plants and animals. miRNAs are playing important role in many biological processes, such as hormone regulation, growth, nutritional balance, and stress responses. 
In this study, it was aimed to reveal previously defined and unidentified miRNAs and their target genes, which are formed as a result of drought stress in three Turkish wheat varieties with different drought tolerance and different ploidy levels –Triticum aestivum cv. Yuregir-89, a hexaploid cultivar (2n=6x=42, AABBDD), intermediate-tolerant; Triticum turgidum durum cv. Kiziltan-91, a tetraploid cultivar (2n=4x=28, AABB), high-tolerant; and Triticum monococcum cv. monococcum (Einkorn/Siyez), a diploid cultivar (2n=2x=14, AmAm), low tolerant–In addition, differential expression profiles of miRNAs and their target genes were declared by both by next-generation sequencing and Quantitative Real-Time PCR. Gene Ontology (GO), and MapMan pathway analyzes of the target genes were performed to determine which metabolic pathways they play a role in.
As a result of the sequencing results obtained in the first stage of the study and the analyzes performed with bioinformatic tools, miRNAs and their target genes, which are thought to have a role in the drought response, were controlled by qRT-PZR. One of the identified miRNAs is tae-miR159a. According to the miRseq results of this miRNA, it was observed that its expression level decreased in the leaf tissue of all 3 wheat species and this was confirmed by the qRT-PZR results. On the other hand, as expected, expression of tae-miR159a's 3 target genes increased in Yuregir-89 and Kızıltan-91 and decreased in Siyez. On the flip side, in root tissues of Yüreğir-89, both tae-miR159a and target genes showed a similar expression profile in leaf tissues, while expression of miRNA increased and target genes decreased in Siyez and Kızıltan-91. As a result, it was shown that among the wheat species with different chromosome sets, which miRNAs function and differentially expressed as a result of drought stress. Besides that, since the studied wheat cultivars which are known to respond differently to drought stress have different ploidy levels, the status of identified and yet unidentified new miRNAs in drought-sensitive and resistant individuals, and from which wheat strain these miRNAs originate, are also investigated for the first time in this study. In addition, the target genes of the identified miRNAs were detected in wheat species that respond differently to drought with the help of both bioinformatics methods and degradome libraries, and gene expression analyzes of these target genes were checked with Quantitative Real-Time PCR and then Gene Ontology and MapMan pathway analyzes were performed.
Althought, many miRNAs associated with abiotic stress have been identified in different tissues of the wheat until to date, there is lack of information in the literature regarding the detection and analysis of miRNAs that can respond to drought stress in wheat varieties with different ploidy levels. For this reason, this study has revealed the data about the elucidation of molecular mechanisms related to drought stress in Turkish wheat varieties with different chromosome sets and different drought tolerance characteristics.