Ratlarda siklofosfamid ile indüklenen hepatotoksisiteye karşı enginar (Cynara scolymus L.) yaprak ekstrelerinin koruyucu etkinliğinin araştırılması
Investigation of protective efficiacy of artichoke (Cynara scolymus L.) leaf extracts against hepatotoxicity induced by cyclophosphamide in rats
Yazar: SÜMEYRA ALBAYRAK
Danışman: PROF. DR. GÜLCAN AVCI
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veteriner Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antioksidan aktivite = Antioxidant activity ; Enginar = Artichoke ; Histopatoloji = Histopathology ; Sitokinler = Cytokines

Özet:
Karaciğer, metabolizmada detoksifikasyon merkezi toksik metabolitlerin hasarına en çok maruz kalan organdır. Geleneksel tıpta, biyoaktif maddeler içeren enginar (Cynara scolymus L.) ve yapraklarının karaciğerdeki terapötik ilaçların toksik metabolitlerinin olumsuzluklarını ortadan kaldırmak için kullanımı oldukça yaygındır. Bu bilgiler ışığında çalışmamızda C. scolymus bitkisinin yapraklarının ratlarda siklofosfamid (CP) nedenli oluşan akut hepatotoksisiteye karşı koruyucu etkinliğinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda, C. scolymus bitkisinin yaprakları toz haline getirilmiş ve sırasıyla n-hekzan, etil asetat (EtOAc) ve metanol (MeOH) ekstraktları hazırlanmıştır. Ratlarda CP ile indüklenen hepatotoksisiteye karşı hazırlanan ekstrelerin koruyucu etkinliği rutin biyokimyasal parametreler (AST, ALT, ALP, total protein (TP), total bilirubin (TB)), karaciğer histopatolojisi, oksidan-antioksidanları (MDA, GSH, GPx, SOD) ve sitokin (IL-1β, IL-10, TNF-α) ölçümleri ile belirlenmiştir. Ayrıca üç ekstrenin toplam fenolik madde miktarları, DPPH radikali süpürücü aktiviteleri, süperoksit radikali süpürücü aktiviteleri ve metal bağlama aktiviteleri dahil olmak üzere çeşitli in vitro deneylerle antioksidan aktiviteleri ölçülmüştür. Ekstraktların fenolik içeriklerini belirlemek için Sıvı Kromatografisi - Kuadrupol Uçuş Zamanlı Kütle Spektrometrisi (Liquid Chromatography - Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry (LC-QTOF-MS) yöntemi kullanılmıştır. Buna göre LC-QTOF-MS analizi sonucunda luteolin-7-O-glikozit, apigenin 7-glikozit, apigenin ve okso oktadekatrienoik asit, hidroksi oktadekatrienoik asit, hidroksi oktadekadienoik asit bileşikleri EtOAc ekstresinde MeOH ekstresinden daha yüksek bulunurken, apigenin-7-O-rutinozit ise sadece EtOAc ekstresinde bulunarak tanımlanmıştır. İn vitro antioksidan aktivite tayinlerinde MeOH, EtOAc, n-hekzan ekstrelerin toplam fenolik madde miktarı sırasıyla 5,735 mg; 0,917 mg; 0,167 mg gallik asit (GAE)/g ekstre düzeyinde bulunmuştur. DPPH radikal süpürücü aktivite MeOH ekstresinde (%87,73), süperoksit radikal süpürücü aktivitesi EtOAc ekstresinde (%49,02) ve metal bağlama aktivitesi (289,32 μM Fe) ise n-hekzan ekstresinde en yüksek olarak ölçülmüştür. 
Çalışmanın in vivo deneylerinde CP uygulanmasının plazma transaminazları, TP, MDA, TNF-α ve IL-1β seviyesini artırdığı, GSH, GPx, SOD ve IL-10'u azaltığı belirlenmiştir. CP grubuna göre tüm ekstre gruplarında AST, ALT ve ALP düzeyleri istatistiki olarak azalırken TP düzeyi sadece EtOAc grubunda azalmıştır. Total bilirubin seviyesindeki değişimler ise kontrole göre tüm deneme gruplarında önemsiz bulunmuştur. Çalışmada CP grubuna göre MeOH grubunda plazma ve KC dokusu MDA, TNF-α ve IL-1β düzeyleri azalırken; GSH (KC dokusu hariç), GPx, SOD ve IL-10 düzeyleri ise istatistiksel olarak artış göstermiştir. EtOAc grubunda ise sadece KC dokusu MDA düzeyi düşük ve plazma GSH düzeyi yüksek bulunmuş olup tüm sitokin düzeyleri önemsiz bulunmuştur. Aynı zamanda n-hekzan grubunda tüm oksidan-antioksidan parametreler ve sitokin düzeyleri önemsiz bulunmuştur.
Çalışmanın histopatolojik sonuçları temel alındığında, CP grubunda KC dokusunda sinüzoidal dilatasyon, vena sentralislerde hiperemi, vakuoler dejenerasyon ve Kupferr hücre aktivasyonunda anormal değişimler belirlenirken, EtOAc grubunda ise tam tersine KC dokusundaki bu anormal değişimlerin anlamlı olarak düştüğü ve dokuda iyileşme sağlandığı görülmektedir. Bu iyileşme MeOH grubunda vena sentralislerde hiperemi ve vakuoler dejenerasyonda azalma ile şeklinde görülürken n-hekzan grubunda ise doku iyileşmesinin çok sınırlı kaldığı belirlenmiştir.
Yüksek düzeyde fenolik madde içeren MeOH ekstraktının, CP'nin neden olduğu akut hepatotoksisiteye, artan inflamasyona ve oksidatif strese karşı daha etkili olduğu bulunmuştur. Aynı zamanda, daha geniş bir yelpazede fenolik madde içeren EtOAc ekstraktının doku iyileşmesinde daha etkili olduğu bulunmuştur. Buna karşın, n-hekzan ekstraktı antioksidanlar, sitokinler ve histopatolojik incelemeler açısından diğer ekstraktlara göre en etkisiz ekstrakt olarak bulunmuştur.
Sonuç olarak, mevcut bulgular, enginar yaprağının özellikle MeOH ekstraktının, antioksidan ve antiinflamatuar özelliklerinden dolayı sıçanlarda CP'nin neden olduğu hepatotoksisite hasarına karşı iyileştirici etkiler sunduğunu göstermiştir.

Abstract:
As the liver is the detoxification center in metabolism, it is the organ most exposed to damage by toxic metabolites. In traditional medicine, the use of artichoke (Cynara scolymus L.) and leaves, which contain bioactive substances, to eliminate the negative effects of toxic metabolites of therapeutic drugs in the liver is quite common. In the light of this information, it was aimed to evaluate the protective efficacy of C. scolymus leaves against cyclophosphamide (CP)-induced acute hepatotoxicity in rats. The protective efficacy of extracts prepared against CP-induced hepatotoxicity in rats was determined using routine biochemical parameters (AST, ALT, ALP, total protein (TP), and total bilirubin (TB)), liver histopathology, oxidant-antioxidant levels (MDA, GSH, GPx, and SOD), and levels of cytokines (IL-1β, IL-10, and TNF-α). In addition, antioxidant activities of the three extracts were measured by various in vitro experiments, including total phenolic content, DPPH radical scavenging activities, superoxide radical scavenging activities and metal binding activities. To determine the phenolic contents of the extracts, Liquid Chromatography - Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry (LC-QTOF-MS) method was utilized. The findings of the LC-QTOF-MS analysis revealed that the EtOAc extract had higher concentrations of luteolin-7-O-glycoside, apigenin 7-glycoside, apigenin, oxooctadecatrienoic acid, hydroxy octadecatrienoic acid, and hydroxy octadecadienoic acid compounds compared to the MeOH extract. On the other hand, only the EtOAc extract had higher concentrations of apigenin-7-O-rutinoic acid compounds. In the in vitro antioxidant activity assays, the total phenolic content of the MeOH, EtOAc, and n-hexane extracts were 5,735 mg, 0.917mg, and 0.167 mg gallic acid (GAE)/g extract, respectively. The MeOH extract showed the highest DPPH radical scavenging activity (87.73%), the EtOAc extract showed the highest superoxide radical scavenging activity (49.02%), and the n-hexane extract showed the highest metal binding activity (289.32 μM Fe).
In the in vivo experiments of the study, it was determined that the administration of CP increased the levels of plasma transaminases, T. protein, MDA, TNF-α and IL-1β, and decreased GSH, GPx, SOD and IL-10. While AST, ALT and ALP levels were statistically decreased in all extract groups compared to the CP group, T. protein level decreased only in the EtOAc group. Changes in T. bilirubin levels were found to be insignificant in all experimental groups compared to the control. In the study, plasma and liver tissue MDA, TNF-α and IL-1β levels decreased in MeOH group compared to CP group, while GSH (except liver tissue), GPx, SOD and IL-10 levels increased statistically. In the EtOAc group, only liver tissue MDA levels were low and plasma GSH levels were high, and all cytokine levels were found to be insignificant. At the same time, all oxidant-antioxidant parameters and cytokine levels were found to be insignificant in the n-hexane group. Based on the histopathological results of the study, sinusoidal dilatation in the liver tissue, hyperemia in the vena centralis, vacuolar degeneration and abnormal changes in Kupferr cell activation were determined in the CP group, whereas in the EtOAc group, on the contrary, these abnormal changes in the liver tissue decreased significantly and tissue healing was achieved. While this improvement was seen in the form of hyperemia in the vena centralis and a decrease in vacuolar degeneration in the MeOH group, it was determined that tissue healing was very limited in the n-hexane group.
The MeOH extract with high levels of phenolic substances has been found to be more effective against acute hepatotoxicity, increased inflammation, and oxidative stress caused by CP. In addition, the EtOAc extract, which contains a wider variety of phenolic substances, has been found to be more effective in tissue healing. On the other hand, n-hexane extract was found to be the most ineffective extract compared to other extracts in terms of antioxidants, cytokines and histopathological examinations. 
In conclusion, the present findings showed that especially MeOH extract of artichoke leaf offered curative effects against CP-induced hepatotoxicity damage in rats due to its antioxidant and anti-inflammatory properties.