Klinik örneklerden izole edilen candida glabrata kompleksi'nin moleküler epidemiyolojisi, antifungal ajanlara duyarlılıkları ve virülans faktörlerinin belirlenmesi
Molecular epidemiology of candida glabrata complex isolated from clinical samples, sensitivity to antifungal agents and determination of virulance factors
Yazar: ÖZGE KAAN
Danışman: PROF. DR. AYŞE NEDRET KOÇ
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Antifungal duyarlılık testleri = Antifungal sensitivity tests ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Kandida = Candida ; Mantarlar = Fungi ; Virülans = Virulence ; Virülans faktörleri = Virulence factors

Özet:
Amaç: Candida glabrata DNA dizi analizi tekniklerindeki gelişmelere bağlı olarak, günümüzde bir kompleks tür olarak değerlendirilmektedir. Candida glabrata insan vücudunda çeşitli bölgeleri enfekte etmesi ve özellikle azol grubu antifungallere dirençli olabilmesi nedeniyle önemli bir fırsatçı patojendir. Bu çalışmada mantar enfeksiyonu düşünülen hastaların klinik örneklerinden izole edilen C. glabrata kompleks suşlarının tür düzeyinde tanımlanması, antifungal duyarlılıklarının, virulans faktörlerinin ve moleküler epidemiyolojisinin belirlenmesi amaçlandı.
Gereç ve Yöntem: Çalışmaya Mart 2015 ile Mayıs 2017 tarihleri arasında Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Klinikleri'nde takip edilen hastaların çeşitli klinik örneklerinden izole edilen 83 C. glabrata kompleks suşu dahil edildi. Mantar identifikasyonu konvansiyonel yöntemler ve Sanger metodu ile ITS1 ve ITS4 bölgelerinin dizilemesi ile yapıldı. Suşların proteinaz, fosfolipaz, esteraz ve biyofilm aktivitesi gibi virulans özellikleri fenotipik olarak belirlendi. Candida glabrata suşlarının antifungal duyarlılık profilleri CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) önerileri doğrultusunda amfoterisin B, flukonazol, vorikonazol, itrakonazol, ketokonazol, flusitozin için sıvı mikrodilüsyon testi ile; kaspofungin, anidulafungin ve posakonazol için gradient strip testi ile belirlendi. Suşlar arasındaki evrimsel ilişki Clustal w yazılım programı ile hizalama yapıldıktan sonra Neighbour-Joining yöntemi ile araştırılıp, benzerlik yüzdelerine göre klonlar belirlendi.
Bulgular: Çeşitli klinik örneklerden izole edilen 83 suş, fenotipik testler ile Candida glabrata kompleks olarak tanımlandı. Candida glabrata kompleks suşları çift yönlü DNA dizi analizi sonucunda Candida glabrata olarak tanımlandı, ancak diğer kompleks üyeleri olan C. nivariensis ve C. bracarensis suşları bulunamadı. Suşların tümünde fosfolipaz ve proteinaz aktivitesi negatif olarak; %7.2 (6/83)'sinde esteraz ve %75.9 (63/83)'unda biyofilm aktivitesi pozitif olarak bulundu. Suşların antifungal direnç oranları; flukonazole %9.2 ve itrakonazole %45.8 olarak; vorikonazol için suşların %43.4'ü NWT (Non-Wild Type, Vahşi olmayan tip) olarak belirlendi. Suşların evrimsel ilişkisini gösteren filogenetik ağaçta 3 (A, B, C) ana klon belirlendi. Çalışmaya dahil edilen suşların %97.6 (81)'sı A ana klonu içinde olup, A klonunun bu çalışmanın hakim klonu olduğu tespit edildi. A ana klonunda 17 alt klon (A1-A17) belirlendi; B ve C ana klonlarında ise birer suş tespit edildi. Suşları izole edildikleri klinik örneklerin laboratuvara geliş tarihlerine ve kliniklere göre değerlendirdiğimizde bir salgını belirleyecek klon dağılımına rastlanmadı.
Sonuç: C. glabrata kompleks suşlarının tür düzeyinde tanımlanması, prevalanslarının ve klonal yakınlıklarının belirlenmesi epidemiyolojik açıdan önem taşımaktadır. Bu çalışmada C. glabrata'nın virulans faktörlerinden özellikle biyofilm aktivitesinin patojenitesinde önemli bir rol oynadığı belirlenmiştir. Azoller başta olmak üzere antifungal ilaç direncinin tespit edilmesi C. glabrata enfeksiyonlarının tedavisinde klinisyene yol göstermesi açısından önemlidir.

Abstract:
Objective: Nowadays, Candida glabrata is considered as complex species due to the recent advances in DNA sequencing techniques. Candida glabrata is an important opportunistic pathogen as it infects various sites in the human body and is particularly resistant to azole group antifungals. In this study; it was aimed to identify the C. glabrata complex strains which are isolated from clinical specimens of patients that are suspected to have fungal infection at species level, determining their antifungal susceptibility, virulence factors and molecular epidemiology.
Materials and Methods: 83 C. glabrata complex strains that are isolated from various clinical specimens of patients followed-up in Erciyes University Medical Faculty Hospital Clinics between March 2015 and May 2017 were included and investigated in the study. Fungal identification has been performed by conventional methods and Sanger method as well as sequencing of ITS1 and ITS4 regions. The virulence properties of the strains such as proteinase, phospholipase, esterase and biofilm activity were determined phenotypically. Antifungal susceptibility profiles of Candida glabrata strains were determined by applying broth microdilution test for amphotericin B, fluconazole, voriconazole, itraconazole, ketoconazole, flucytosine according to the recommendations of CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute); whereas gradient strip test has been applied to determine antifungal susceptibility profiles for caspofungin, anidulafungin and posaconazole. After alignment with the Clustal w software, the evolutionary relationship between strains was investigated by Neighbour-Joining method and the clones were determined according to the resemblance percentages.
Results: 83 strains isolated from various clinical specimens were identified as Candida glabrata complex by phenotypic tests. Candida glabrata complex strains were identified as Candida glabrata by the result of bi-directional DNA sequence analysis, however other complex member being C. nivariensis and C. bracarensis strains were not found. In all strains; phospholipase and proteinase activity was negative; where esterase was found positive around 7.2% (6/83) and biofilm activity was found positive around 75.9% (63/83). Antifungal resistance rates of strains were determined as 9.2% for fluconazole and 45.8% itraconazole; whereas for voriconazole, 43.4% of the strains were determined as NWT (Non-Wild Type). Three (A, B, C) clones were identified in the phylogenetic tree which expresses the evolutionary relationship of the strains. 97.6% (81) of the strains included in the study were located in the main clone A and clone A therefore was determined as the dominant clone of this study. 17 sub-clones (A1-A17) were identified in the A main clone; whereas one strain (for each) were detected both for B and C main clones. Any clone distribution was not found to detect a potential outbreak when the strains both were evaluated according to the date of arrival of the clinical samples to which they were isolated in and based on the clinics. 
Conclusion: Determination of C. glabrata complex strains at the species level, determination of their prevalence and clonal affinity carries a significance based on epidemiological purposes. In this study; C. glabrata has been found to play an important role especially on the pathogenicity of biofilm activity, considered as one of the virulence factors. Furthermore, determination of antifungal drug resistance, notably for azoles is considered as remarkably important for guiding the clinician in the treatment of C. glabrata infections.