Koyun çiçek hastalığına karşı aşı modellerinin geliştirilmesi amacıyla antijenik peptid epitopunun sentezlenmesi ve karakterizasyonu
Synthesi̇s and structure analysi̇s of anti̇geni̇c pepti̇de epi̇tope to the development of vaccines against sheeppox disease
Yazar: ELİF FATMA YILMAZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ZEYNEP AKDESTE
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Koyun Çiçek (Sheeppox) Hastalığı, koyunlarda derideki lezyonlarla karakterize edilen genç hayvanlarda ölüm oranı yüksek bulaşıcı viral bir hastalıktır. Hastalığın spesifik bir tedavi şekli yoktur, hasta sürü ve hayvanların izolasyonu, karantina tedbirleri ve dezenfeksiyon uygulanarak hastalığın yayılması önlenebilir. Koyun çiçeği hastalığı Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE) kriterlerine göre mücadele edilmesi gereken öncelikli hastalıklardan birisidir. OIE, hastalığın görüldüğü ülkelere canlı hayvan, et ve et ürünleri ile diğer hayvansal ürünlerin ihracatı noktasında önemli kısıtlamalar getirmektedir. Bu nedenle, hastalığın ekonomik kayıpları sadece hasta hayvanlarda yaptıkları kayıplarla sınırlı olmayıp, hastalığın görüldüğü ülkenin ihracatına da etki etmektedir. Günümüzde koyun çiçeğine karşı geliştirilen zayıflatılmış virülentlerden izolasyon yoluyla üretilen aşılar mevcuttur, fakat geçmiş verilerde kullanılan koyun çiçeği aşılarının enjeksiyon yerlerinde reaksiyonlara hatta aşılanan hayvanlarda hastalığa yol açtığı rapor edilmiştir ve Avrupa Birliği üye ülkelerinde canlı aşıların kullanımlarına dair kısıtlamalar getirilmişti
Bu çalışmada, günümüze kadar mevcut olmayan koyun çiçek hastalığına karşı sentetik peptid bazlı yeni nesil aşı sistemlerinin oluşturulması için antijenik özellik gösteren "W-FHNSNSRILFNQENNNFMYS(156-175)" peptid epitopu mikrodalga enerjisi kullanılarak katı fazda peptid sentez yöntemiyle sentezlenmiştir. Sentezlenen peptid dizisinin karakterizasyonu için Triptofan amino asidi eklenerek bu peptidlere floresans özellik kazandırılmıştır. Sentezlenen peptidin karakterizasyonu LC-MS cihazı ile gerçekleştirilmiştir ve preparatif HPLC ile saflaştırılarak peptidin saf olarak elde edilmesi sağlanmıştır
Yeni nesil aşı sistemlerinin oluşturulmasında iki temel nokta yer almaktadır. Bunlardan ilki hastalığı oluşturulan virüslerin yüzey proteinlerindeki antijenik bölgelerin tespit edilmesi ve sentetik yolla üretilmesi, ikincisi ise uygun polimerik taşıyıcı molekül ile canlı vücudunda en etkili şekilde kullanılmasıdır. Bu çalışmada peptidlerin kontrollü salınımlarını, biyolojik sistemde daha kararlı olmalarını, toksik etkilerinin azaltılmasını, antijen sunan hücrelere ve mukozal hücrelere yönlendirilerek daha güçlü immün cevap oluşturmasını sağlamak amacıyla peptidlerin BSA nanopartiküllerine enkapsülasyonu gerçekleştirilmiştir. Desolvasyon yöntemiyle üretilen BSA nanopartiküllerinin BSA miktarı, pH, iyonik kuvvet, desolvasyon ajanı, enkapsüle edilen peptid miktarı gibi parametrelerin optimizasyonları gerçekleştirilerek biyolojik sisteminde en etkili adjuvan etki gösterecek olan 100-300 nm aralığında nanopartiküller üretilmiştir. Elde edilen nanopartiküllerin karakterizasyonları SEM, Zetasizer, FT-IR cihazlarıyla gerçekleştirilmiştir. Elde edilen nanopartiküllerin peptid yükleme verimleri UV-spektrofotometre cihazıyla incelenmiştir.
İlerleyen toksisite ve immün çalışmalar sonucunda ilk kez hastalığa karşı yerli yeni nesil aşı prototipinin oluşturulması hedeflenmektedir. Oluşturulan aşı prototipleri sadece koyun çiçek hastalığına karşı değil aynı zamanda toplum sağlığı açısından önemli diğer viral ve bakteriyel hastalıklara karşı koruyucu yeni nesil aşıların gelişmesine olanak sağlayacaktır.

Abstract:
Sheeppox disease is a highly contagious viral disease which characterized by skin lesions in sheep and has a high mortality rate among young animals. Disease does not have a specific treatment, spread of the disease can be prevented by applying isolation of herds and animals, quarantine measures and disinfection. Sheeppox is one of the priority disease which need to be struggled according to World Animal Health Organization (OIE) criteria. OIE restricts live animals, meat and meat products for the export  to countries where are seen the disease. Therefore, economic losses of the disease is not only limited to loss of sick animal, but also effect of the disease is the country's exports. At the present time, there has been produced vaccine produced by isolation from attenuated virulents against sheeppox. But it has been reported that this attenuated vaccines cause reaction at the injection sites or even cause disease in vaccinated animals and for this reason, member states of the European Union introduced restriction to use of live vaccines. 
İn this study, "W-FHNSNSRILFNQENNNFMYS(156-175)"  peptide epitope of sheeppox virus, which showing antigenic properties was synthesizerd by solid phase peptide synthesis using microwave energy to produce new generation vaccine system based synthetic peptide that is not exsist to date against sheeppox disease. Tryptophan amino acid were added to these peptides to give fluorescence properties for characterization of synthesizerd peptide sequence. Characterization of the synthesizerd peptide was carried out by LC-MS and purified by preparative HPLC to obtain pure peptide. 
There are two main points in the creation of a new generation vaccine. The first of this is identification of antigenic sites in surface proteins of viruses and produced by synthetic pathways. The second is the use most effective way with appropriate polymeric carrier molecule in the living body. For this purpose, peptides were encapsulated in BSA nanoparticles to provide controlled release of peptides, be more stability in the biological system, reduce toxic effects and present directly to antigen-presenting cells and mucosal cells for obtaining higher immune response. BSA nanoparticles produced by the desolvation method and optimized for parameters such as BSA amount, pH, ionic strength, desolvation agent, and amount of encapsulated peptide to produce nanoparticles in the range of 100-300 nm which will have the most effective adjuvant effect in the biological system. The characterization of the obtained nanoparticles was carried out by SEM, Zetasizer, FT-IR devices. Peptide loading efficiencies of the obtained nanoparticles were examined by UV-spectrophotometer. 
As a result of progressive toxicity and immunological studies, it is aimed that to establish a national new generation vaccine prototype against the disease for the first time. This created vaccine prototypes will allow development of new generation vaccines not only against sheeppox disease but also against other viral and bacterial diseases that is important for community health.