Leishmania infantum aşı adayı LACK ve KMP-11 genlerinin moleküler karakterizasyonu, füzyon proteinin ekspresyonu ve antijenik yapısı
Molecular characterization of leishmania infantum LACK and KMP-11 vaccine candidate genes, expression and antigenic structure of fusion protein
Yazar: SERKAN KARACA
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Antijenler = Antigens ; Aşılama = Vaccination ; Aşılar = Vaccines ; DNA = DNA ; Genler = Genes ; Leishmania = Leishmania ; Leishmania infantum = Leishmania infantum

Özet:
Leishmania cinsi zorunlu hücre içi protozoonların neden olduğu leishmaniasis, Dünya Sağlık Örgütü'nün önemli tropikal hastalıklar listesinde yer almaktadır. Leishmaniasis tedavisinde rutin olarak kullanılan bileşiklerin yüksek maliyetleri, toksisite ve yan etkilerinin fazla olması nedeniyle alternatif tedavi ve aşı araştırmaları devam etmektedir. Faz aşamaları devam etmekle birlikte leishmaniasise karşı insanlarda etkili bir aşı henüz geliştirilememiştir. Leishmania infantum, Türkiye'de ve dünyada leishmaniasis formlarından en tehlikelisi olan visseral leishmaniasis (VL) etkenleri arasındadır. Leishmania infantum homolog aktive edilmiş C kinaz reseptörü (LACK) ve Kinetoplastid membran proteini-11 (KMP-11) genleri üçüncü nesil aşılar olarak kabul edilen DNA aşı adayları arasındadır.
Bu çalışmada L. infantum'un neden olduğu VL'e karşı aşı geliştirme çalışmalarında umut verici adaylardan olan L. infantum LACK ve KMP-11 genlerinin klonlanması, moleküler karakterizasyonu, insanlarda DNA aşısı olarak kullanıma uygun özellikte bir plazmide multi-antijenik olarak yerleştirilmesi, LACK ve KMP-11 proteinlerinden oluşan füzyon proteininin ekspresyonu ve antijenik yapısının analizi amaçlanmıştır.
Çalışmada öncelikle L. infantum promastigot kültüründen genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. Sonra LACK geni pJET1.2 plazmidine, KMP-11 geni ise pcDNA 3.1 plazmidine klonlama reaksiyonu ile yerleştirilmiştir. Takiben LACK geni restriksiyon enzimleri ile pcDNA3.1+KMP-11 plazmidine eklenmiş ve multi-antijenik rekombinant DNA elde edilmiştir. Rekombinant plazmid varlığı tüm basamaklarda PCR tarama ile araştırılmıştır. Pozitif kolonilerden plazmid izolasyonu yapılmış ve klonlanan genlerin varlığı PCR ve DNA dizi analiz yöntemleri ile doğrulanmıştır. LACK+KMP-11 genleri ekspresyon vektörüne sub-klonlanarak elde edilen plazmidler kompetan E. coli BL21 hücrelerine transforme edilmiş ve füzyon proteininin ekspresyonu sağlanmıştır. 47 kDa büyüklüğündeki füzyon proteininin varlığı SDS-PAGE ve western blot analizleri ile doğrulanmıştır. Kültüre edilen L. infantum nesillerinin LACK ve KMP-11 gen bölgelerine göre nükleotid ve aminoasit tabanlı moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Leishmania izolatlarının LACK ve KMP-11 gen bölgesi sekans analizleri, bu gen bölgelerindeki intraspesifik nükleotid farklılıklarının interspesifik nükleotid farklılıklarla çakıştığını ve dolayısıyla filogenetik bazda tür ayrımına olanak vermediğini ortaya koymuştur. LACK proteininde 13, KMP-11 proteininde ise 3 antijenik bölgenin mevcut olduğu tespit edilmiş ve proteinlerin 3 boyutlu yapıları elde edilmiştir.
Sonuç olarak bu çalışma ile L. infantum kaynaklı VL'e karşı umut verici DNA aşı adaylarından olan LACK ve KMP-11 genlerinin moleküler karakterizasyonu ve filogenetik analizleri yapılmıştır. Bu iki geni birlikte taşıyan multi-antijenik plazmid ve LACK+KMP-11 füzyon proteini ilk kez elde edilmiş ve antijenik yapıları incelenmiştir.

Abstract:
Leishmaniasis is caused by an obligate intracellular protozoa Leishmania genus and listed in the major tropical diseases by World Health Organization. Because of the high costs, toxicity and adverse effects of the compounds which are routinely used in the treatment of leishmaniasis, alternative treatment and vaccine studies are currently underway. As well as the phase studies are ongoing an effective vaccine has not been developed yet. Visceral leishmaniasis (VL) is the most dangerous form of leishmaniasis and Leishmania infantum is one of VL agents in Turkey and in the world.
Leishmania infantum homolog activated C kinase receptor (LACK) and Kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11) genes are among the DNA vaccine candidates considered as third generation vaccines.
This study aims to clone L. infantum LACK and KMP-11 genes, analyze their molecular and phylogenetic characteristics and ligate them into plasmid can be used as multi-antigenic DNA vaccine candidate in human. Additionally, to express fusion protein and analyze its antigenic structure.
In the study, primarily genomic DNA isolated from L. infantum promastigote culture. Then, LACK and KMP-11 genes were cloned into pJET1.2 and pcDNA 3.1 plasmids respectively. Subsequently, LACK gene sub-cloned into pcDNA3.1+KMP-11 recombinant plasmid by restriction cloning and multi-antigenic recombinant DNA was obtained. The presence of the recombinant plasmid was investigated by PCR scanning at all steps. Plasmid isolation was performed from positive colonies and the presence of cloned genes was confirmed by PCR and DNA sequencing methods.
For expression of the LACK+KMP-11 fusion protein, genes were sub-cloned into pET100 expression vector and plasmids were transformed into competent E. coli BL21 cells. The presence of 47 kDa fusion protein was confirmed by SDS-PAGE and western blot analysis. Nucleotide and amino acid-based molecular characterization of L. infantum genera was performed according to LACK and KMP-11 gene regions. Sequence analysis of LACK and KMP-11 regions of Leishmania isolates revealed that intraspecific nucleotide differences in these gene regions coincided with interspecific nucleotide differences. Thus, these genes did not allow species discrimination on phylogenetic basis. 13 and 3 antigenic regions were determined in LACK and KMP-11 proteins respectively. 3-dimensional structures of the LACK and KMP-11 proteins was obtained.
As a result, molecular characterization and phylogenetic analysis L. infantum LACK and KMP-11 genes were performed and LACK + KMP-11 based multi-antigenic plasmid and fusion protein were obtained for the first time with this study.