Laccase enzimini temel alan amperometrik fenol biyosensörünün geliştirilmesi
Development of an amperometric phenol biosensor based on laccase enzyme
Yazar: MERAL TOPCU SULAK
Danışman: PROF. DR. BÜLENT KESKİNLER
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering

Özet:
Bu çalışma kapsamında poli (GMA-co-MTM) kopolimerleri, AIBN başlatıcısı varlığında farklı kimyasal kompozisyonlarda, beslemedeki farklı GMA/MTM monomer oranlarının değiştirilmesiyle radikal polimerizasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. Poli(GMA-co-MTM) kopolimerleri FT-IR, 1H-NMR ve 13C-NMR spektroskopik teknikleri ile karakterize edilmiştir. Hazırlanan (MTM-co-GMA) kopolimeri kullanılarak glassy karbon elektrot modifiye edilmiştir. Lakkaz (TvLac) enzimi kopolimer ile modifiye edilen elektrot üzerine fiziksel yöntemle tutuklanmıştır.Çalışmanın ilk aşamasında üç farklı (MTM-co-GMA) kopolimeri hazırlanmıştır ve elektrodun kaplanmasında bu kopolimerlerin metilen klorürdeki çözeltisi kullanılmıştır. Çalışma elektrodunun kopolimerle kaplanmasında kopolimer çözeltisinin elektrot yüzeyine damlatılıp çözücüsünün açık havada buharlaştırılması ile yapılmıştır. Daha sonra (MTM-co-GMA) kopolimeri ile modifiye edilmiş elektrot elektrokimyasal hücreye alınarak belli bir potansiyelde aktive edilmiştir. Aktive edilmiş elektrot belirli konsantrasyona sahip enzim (TvLac) çözeltisinde bekletilerek enzimin fiziksel olarak tutuklanması sağlanmıştır. (MTM70-co-GMA30) kopolimeri kullanılarak hazırlanan enzim elektrodu ile potansiyel, ph, enzim miktarı gibi optimum çalışma şartları tespit edilmiştir. Optimum çalışma şartları tespit edildikten sonra elektrot 10 farklı fenolik türün (fenol, katekol, hidrokinon, 2-kloro fenol, 3- kloro fenol, 4- kloro fenol, 2-4 diklorofenol, 4 metoksi fenol, 2-6 dimetoksi fenol) tayini için kullanılmıştır. Her bir fenolik tür için akım zaman eğrileri, kalibrasyon eğrisi çıkarılmıştır.Yine aynı optimum koşullar kullanılarak diğer iki kopolimer [(MTM56-co-GMA44) ve (MTM85-co-GMA15)] ile yeni enzim elektrotları hazırlanmış ve bu elektrotlarda da 10 farklı fenolik tür için substrat olarak kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre enzim elektrodu hazırlamak için en uygun kopolimer %56 MTM- % 44 GMA kopolimeridir.Çalışmanın ikinci aşamasında (MTM56-co-GMA44) kopolimeri kullanılarak hazırlanan elektrodun akım cevabı üzerine karbon nanotüp parçacıklarının (CNT) etkisi araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlardan elektrot yapısında bulunan CNT parçacıklarının akım cevabını ve hassasiyeti oldukça fazla artırdığı gözlenmiştir.Fenolik türlerin tayini için GC/(MTM-co-GMA)2/TvLac ve GC/(MTM-co-GMA)2/CNT/TvLac enzim elektrodu ilk kez bu çalışmada geliştirilmiştir. Geliştirilen biyosensör ile gerçek atıksu, arıtma çamuru ve deniz suyunda ölçüm yapılmıştır. Biyosensörle elde edilen fenol tayini sonuçları standart metotla elde edilen sonuçlarla kıyaslanmıştır. Geliştirdiğimiz biyosensörlerle elde edilen fenol tayin sonuçlarının fotometrik (STM 5530-D yöntemi) yöntemle elde edilen fenol sonuçları ile uyum içerinde olduğu görülmüştür. Hazırladığımız kopolimer ile modifiye edildikten sonra laccase enzimi tutuklanmış elektrotla, fenol ve fenol türevlerinin tayininin basit bir şekilde yapmak mümkündür.

Abstract:
In this thesis, poly (GMA-co-MTM) copolymers were prepared by free radical polymerization in dimethyl formaldehyde (DMF) solution at 60 0C using ? , ??? ?-Azobisisobutyronitrile (AIBN) as an initiatior. The copolymers, poly(GMA-co-MTM), were characterized by FT-IR, 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopic techniques. Glassy carbon electrode was modified using the prepared poly (GMA-co-MTM) copolymers. Laccase enzyme (TvLac) was immobilized on the copolymer modified GC electrode with the physical techniques.Firstly, three different (MTM-co-GMA) copolymers were prepared and electrodes were coated by using these copolymers solution in methylene chloride. The coating process of working electrode with copolymers was performed by ?casting method?. And then, the modified working electrode with the (MTM-co-GMA) copolymer was activated in the electrochemical cell under the preselected potential. Activated working electrode was treated in various enzyme concentrations (TvLac) for an hour and the enzyme was immobilized on the electrode surface. The optimum working conditions such as potential, pH, enzyme concentration were optimized the modified electrode. After that, the working electrodes were used to detect the ten different phenol derivatives (3-chlorophenol, 2-chlorophenol, 2-6 dimethoxyphenol, catechol, 4 methoxyphenol, 4-chlorophenol, phenol, hydroquinone, 2-4 dichlorophenol, p-benzoquinone). Current-time response, calibration curve and were obtained for ten different phenolic derivatives. Using the same working conditions, the new enzyme electrodes were prepared with the other two copolymers [(MTM56-co-GMA44) and (MTM85-co-GMA15)] and used for ten different phenolic derivatives as a substrate.In the second step of this study, the effect of carbon nano tube (CNT) on the current response of enzyme electrode with prepared (MTM56-co-GMA44) copolymer was investigated. As results of this study, CNT was enhanced highly the current response and sensitivity of the electrode very much.Two novel enzyme electrode [GC/(MTM-co-GMA)2/TvLac and GC/(MTM-co-GMA)2/CNT/TvLac] were developed in this study. It is possible to detect the phenol and phenol derivatives with the development biosensor easily. The phenol detection in the real sample (waste water, sludge and sea water) were obtained with the development biosensor.Phenol concentrations obtained by biosensor were compared with concentrations obtained by using standard method (STN 5530-D). The results show that the development biosensor well matched the standard method results.