Ekzopolifosfataz (ppx) ve polifosfatkinaz (ppk) genlerinden yoksun bacıllus thurıngıensıs subsp. ısraelensıs suşunda endotoksin biyosentezi.
Endotoxin biosynthesis in bacillus thuringiensis subsp. israelensis strain deficient in exopolyphosphatase (ppx) and polyphosphate kinase (ppk) genes .
Yazar: AYBİKE YEDEKÇİ
Danışman: DOÇ. DR. SEDEF TUNCA GEDİK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Bacillus thuringiensis = Bacillus thuringiensis ; Endotoksinler = Endotoxins ; Polifosfatlar = Polyphosphates ; Suşlar = Strains

Özet:
Bütün canlılarda bulunan Polifosfat (poliP), yüzlerce fosfat molekülünün yüksek enerjili anhidrid bağlarıyla birleşmesinden meydana gelen bir polimerdir. PoliP kinaz enzimi (PPK) tarafından sentezlenen ve ekzopolifosfataz? enzimi (PPX) tarafından yıkılan PoliP, önemli bir enerji deposu olup bazı kinazlar tarafından ATP yerine kullanılabilmekte ve adenilat kinazlar yardımıyla da NTP'lerin yapımında kullanılmaktadır. Aynı zamanda bu polimer, hücrelerin fiziksel ve kimyasal streslere karşı direnç göstermesinde de rol oynamaktadır.Endüstriyel öneme sahip önemli bir biyolojik böcek kontrol ajanı olan B. thuringiensis, tarımda, ormancılıkta ve sivrisinek kontrolünde sentetik kimyasal pestisidlere alternatif olarak kullanılan biyolojik pestisittir. B. thuringiensis'in toksin protein üretiminde, çevresel faktörlerin kritik rol oynadığı bilinmektedir. Bazı mineral elementlerin özellikle inorganik fosfatın B. thuringiensis toksin biyosentezinde çok önemli bir etkiye sahip olduğu daha önceki çalışmalarla gösterilmiştir (Banerjee-Bhatnagar, 1999; Ozkan et al., 2003; Kurt ve ark., 2005). Bu çalışmaların hepsinde, inorganik fosfat, besiyeri ortamına değişik konsantrasyonlarda eklenmiş ve fosfatın endotoksin üretimi üzerindeki tetikleyici etkisi gözlenmiştir.Çalışılan mikroorganizmalarda çok önemli fonksiyonları olmasına rağmen, literatürde polifosfat polimerinin Bacillus'daki rolüyle ilgili mevcut bilgimize göre tek bir çalışma bulunmaktadır. 2004 yılında yayımlanan bu çalışmada Shi ve ark., poliP'nin, B. cereus'un hareketliliği, biyofilm oluşturması ve sporulasyonu için vazgeçilmez olduğunu göstermişlerdir. Laboratuvarımızda yürüttüğümüz araştırmalar, poliP metabolizmasında oluşan herhangi bir değişikliğin biyoinsektisit biyosentezini etkilediğini göstermiştir. Ancak Poli P'nin endotoksin üretimine etkisini netleştirmek, Poli P üretemeyen kalıcı mutant suşların oluşturularak karakterize edilmesiyle mümkündür. PoliP metabolizması ve biyoinsektisit üretimi arasındaki ilişkiyi aydınlatmak amacıyla, bu çalışmada, Bacillus thuringiensis israelensis ppk ve ppx genlerinin büyük bir bölümü klasik kaset mutasyonu yöntemiyle kromozomdan silinmiş ve bu mutasyonun üretici suşta endotoksin üretimini arttırdığı gözlenmiştir.

Abstract:
Polyphosphate (polyP), which is found in every living cell, is a linear polymer consisting of tens to hundreds of phosphate molecules joined together by high-energy anhydride bonds. Polyphosphate, which is synthesized by the enzyme ?polyP kinase? and degraded by the enzyme ?exopolyphosphatase?, is not only an important energy store but also used as ATP substitutes and it serves as phosphate donor to regenerate NTP in association with the adenylate kinases. Moreover, this polymer has been shown to have a crucial role in the regulation of adaptive responses of cells to physical and chemical stresses.Bacillus thuringiensis, which is an important industrial agent used for biological control of insects, is a useful biological pesticide alternative to synthetic chemical pesticide in commercial agriculture, forest management and mosquito control. Environmental factors play a critical role in toxin protein synthesis by B. thuringiensis. Some mineral elements especially phosphate has been shown to play very important role in toxin production by B. thuringiensis (Banerjee-Bhatnagar, 1999; Ozkan et al., 2003; Kurt et.al., 2005). In all of these studies inorganic phosphate has been added into the culture media in different concentrations and the stimulatory effect of phosphate on endotoksin production has been evaluated.Although polyphosphate polymer has very important functions in the microorganisms studied, to our knowledge there is only one study about the role of this polymer in Bacillus. In 2004 Shi et.al. deleted the genes (ppk; polyphosphate kinase, ppx; exopolyphosphatase, pap; phosphotransferase) responsible for the polyP metabolism and show that polyP is necessary for the motility, biofilm formation and sporulation in Bacillus cereus.The research ongoing in our laboratory showed that any change in PolyP metabolism affect bioinsecticide biosynthesis in the producer strain. But the effect of PolyP on endotoxin production can be clarified by obtaining and characterizing mutant strains which can not produce PolyP. In order to find the relation between PolyP metabolism and bioinsecticide production, classic cassette mutagenesis method was used to delete nearly entire ppk and ppx gene of Bacillus thuringiensis israelensis and it was shown that this mutation caused an increase in endotoxin biosynthesis by the producer strain.