İnsan spermlerinde kriyoprezervasyon sonrası papaverin uygulamasının motilite parametreleri ve apoptoz üzerine etkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of the effect of papaverine application after cryopreservation on sperm parameters and apoptosis in human sperm
Yazar: EBRU İBİŞ
Danışman: PROF. DR. NURSEL GÜL ; DOÇ. DR. İSKENDER SİNAN ÖZKAVUKCU
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonu (KP), fertilite koruma ve Üremeye Yardımcı Tedaviler sırasında sıklıkla başvurulan yöntemlerden biridir. Ancak KP ve çözme işlemleri sonrasında sıcaklık değişimleri, ozmotik şok, Reaktif Oksijen Türlerinin (ROT) oluşumu, Lipit Peroksidasyonu gibi etkenler spermlerde geriye dönüşümsüz hasarlar oluşturmaktadır. Mitokondriyal membran potansiyelindeki azalmaya ve membran hasarına bağlı olarak hücredeki Na+, K+, H+, HCO3- ve Ca2+ iletimini sağlayan CNG, voltaj bağımlı kanallar, CATSPER gibi kanalların ve membran reseptörlerinin işlevinde değişimler olmaktadır. KP'nin en yaygın olumsuz etkisi sperm canlılığı ve hareketliliğindeki azalmadır. Çalışmamızda Fosfodiesteraz10A (FDE10A) spesifik inhibitörü olan Papaverin (PAP) kullanılarak hücre içindeki cAMP ve cGMP yıkımının inhibisyonuyla sperm hareketliliğinde artış sağlanmıştır. Normozoospermik 20 kişinin sperminin hareketlilik, Akrozom Bütünlüğü (AB), Fosfatidil Serin Translokasyonu (FST), canlılık ve DNA hasar oranı belirlenerek hücreler dondurulmuştur. KP sonrası çözdürülen spermlere PAP uygulanmış, 30. ve 60. dakikalarda motilite aktivasyonu, canlılık oranı, Akrozom Reaksiyonu (AR), apoptoz, ve DNA hasarı oluşumu incelenmiştir. PAP etkinliğinin tespitinde immünfloresan boyamayla Floresan Mikroskopta görüntüleme sonrası Flow Sitometri yöntemi kullanılmıştır. Bulgularımız KP işleminin sperm hücrelerinin canlılık ve hareketliliğinde azalmaya ve DNA hasarında artışa yol açtığını göstermektedir. KP sonrası AB ve erken apoptoz oluşumu belirteçlerinden FST oranlarında değişim gözlenmemiştir. PAP uygulanan spermler kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, total sperm motilitesi 30. (%32,14±6,90 ve %25±6,15; p<0,001) ve 60. dakikada (31,84±7,32 ve 25,72±6,23; p=0,001) artmıştır. PAP varlığında 30-60 dakika arasında AB, FST ve DNA hasarı oranlarında değişim olmamıştır. Ancak PAP varlığında 30. dakika ile karşılaştırıldığında 60. dakikada AnneksinV(-)/ Propidium Iodide(-) hücrelerde azalma (%32,64±12,88 ve %29,29±11,78; p=0,019) ve PI(+) hücre sayısında istatistiksel olarak anlamlı olmasa da hafif artış olduğu belirlenmiştir (p=0,066).

Abstract:
Sperm cell cryopreservation (KP) is one of the methods frequently used during fertility preservation and reproductive aids. However, factors such as temperature changes, osmotic shock, formation of Reactive Oxygen Species (ROT), and Lipid Peroxidation cause irreversible damage to spermatozoa. Due to the decrease in mitochondrial membrane potential and membrane damage, there are changes in the function of channels and membrane receptors such as CNG, voltage dependent channels, CATSPER, which provide the transmission of Na +, K +, H +, HCO3- and Ca2 + in the cell. The most common negative effect of KP is the decrease in sperm viability and motility. In our study, an increase in sperm motility was achieved by inhibition of the destruction of cAMP and cGMP in the cell using Papaverine (PAP), a specific inhibitor of Phosphodiesterase10A (FDE10A). Cells were frozen by determining the motility, Acrosome Integrity (AB), Phosphatidyl Serine Translocation (FST), viability and DNA damage rate of 20 normozoospermic sperm. PAP was applied to the thawed sperm after KP, and motility activation, Acrosome Reaction (AR), viability rate, apoptosis and DNA damage formation were examined at 30 and 60 minutes. For determining PAP effectiveness, Flow Cytometry method was used after imaging under fluorescent microscopy by immunofluorescence. Our findings show that KP treatment leads to a decrease in viability and motility of sperm and an increase in DNA damage. There was no change in FST rates, which are among the markers of AB and early apoptosis formation after KP. Compared with the control group of sperm administered with PAP, total sperm motility was 30 (32.14 ± 6.90% and 25 ± 6.15%; p <0.001) and 60 minutes (31.84 ± 7.32 and 25.72 ± 6.23; p = 0.001). In the presence of PAP, there was no change in the rates of AB, FST and DNA damage between 30-60 minutes. However, in the presence of PAP, compared to the 30th minute, in the 60th minute, AnneksinV (-) / Propidium Iodide (-) cells decreased (32.64 ± 12.88% and 29.29 ± 11.78; p = 0.019) and although it is not statistically significant (p = 0.066) the number of PI (+) cells slightly increased.