Bacillus anthracis sporlarının saptanmasına yönelik amperometrik ve impedimetrik temelli biyosensör geliştirilmesi
Development of amperometric and impedimetric based biosensors for the detection of Bacillus anthracis spores
Yazar: ZAHİR KILIÇ
Danışman: DOÇ. DR. MESUT ORTATATLI ; DR. ÖĞR. ÜYESİ EBRU SAATÇİ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Gülhane Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kimyasal, Biyolojik, Radyolojik ve Nükleer Savunma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Savunma ve Savunma Teknolojileri = Defense and Defense Technologies
Dizin: Amperometri = Amperometry ; Bacillus anthracis = Bacillus anthracis ; Empedans = Impedance ; İmmünosensör = Immunosensor

Özet:
Biyolojik savaş ajanları, bitkiler, hayvanlar ve mikrobiyal kökenden kaynaklanan bakteri, virüs, mantar ve toksinlerin insanlar, hayvanlar ve bitkiler üzerinde zararlı veya öldürücü etkileri olan kitle imha silahlarıdır. Bacillus anthracis en tehlikeli biyolojik savaş ajanlarından biridir. Bunun nedeni, üretilmesi ve saklanmasının kolay olması, sporlarının güneş ışığı ve sıcaklık gibi çevresel koşullara karşı oldukça dayanıklı olmasıdır. Biyolojik savaştaki önemi nedeniyle sporlarının hızlı ve hassas tespiti her yönden önemlidir. Ticari saptama yöntemleri dışında, B. anthracis sporlarını saptamak için şu anda çeşitli biyosensör yöntemleri geliştirilmektedir. Özellikle elektrokimyasal immünosensörler bu alanın en önemli kısmını almaktadır.
Çalışmamızda, yeni geliştirilen bir amperometrik immünosensör, manyetik boncuklar ve çoklu ekran baskılı elektrotların bir kombinasyonu ile B. anthracis sporları tespit edilmiştir. Bu yöntemde, çalışan elektrottaki oksidasyon ve redüksiyondan kaynaklanan akım yoğunluğundaki değişiklikler, doğrudan spor konsantrasyonlarına karşılık gelmektedir. Ek olarak, inaktif ve canlı spor konsantrasyonlarında standart grafikler çizmek için amperogram eğrilerinden gelen sinyaller kullanıldı. Bununla birlikte oldukça hassas başka bir impedimetrik immünosensör de geliştirildi. Bu biyosensörde, elektrokimyasal sistemlerde ölçülebilir değerleri belirlemek için kullanılan baskılı elektrotlar üzerinde hem biriktirme hem de arayüz elektriksel özellikleri yüksek hassasiyetle ölçüldü.
Amperometrik immünosensör için, 2x102-2x104 spor/ml konsantrasyonları arasında canlı spor sayısı test edilerek yöntemde standart bir eğri oluşturuldu. Uygulanan sabit bir potansiyel altında akım değişiklikleri alındı ve LOD ve LOQ değerleri sırasıyla 92 ve 272 spor/ml olarak bulundu. İmpedimetrik immünosensör için ölçüm aralığı 1x102-1x104 spor/ml olarak bulundu. LOD ve LOQ değerleri sırasıyla 55 ve 154 spor/ml olarak bulundu. %CV=2,59 olarak hesaplandı. Bacillus subtilis, Bacillus cereus ve  
Bacillus thuringiencis sporlarına karşı Bacillus anthracis sporu biyosensör sonuçları, şarbon sporu standart eğrisinin elde edildiği koşullar altında da incelendi. Bu Bacillus türleri için çapraz reaksiyon görülmedi.
Sonuç olarak tasarlanan KBRN ajanı şarbon tespiti immünosensörlerinin yüksek hassasiyet ve seçiciliğe sahip olduğu ve hızlı sonuçlar verdiği gösterilmiştir. Ayrıca, immünosensörler, sahadaki canlı sporları yüksek doğrulukla tespit etmek için minyatürize edilebilmektedir.

Abstract:
Biological warfare agents are weapons of mass destruction that have harmful or lethal effects on humans, animals, and plants, of bacteria, viruses, fungi, and toxins originating from plants, animals, and microbial sources. Bacillus anthracis is one of the most dangerous biological warfare agents. This is because they are easy to produce and store and are highly resistant to environmental conditions such as sunlight and temperature. Due to its biological warfare importance, the fast and sensitive detection of its spores is crucial in all ways. Several biosensor methods are currently being developed to detect B. anthracis spores, except for commercial detection methods. Especially electrochemical immunosensors take the most significant part of this area. 
In our study, a newly developed amperometric immunosensor was designed to develop B. anthracis spores with a combination of magnetic beads and multiplex screen-printed electrodes. In this method, changes in current intensity resulting from oxidation and reduction in the working electrode are measured directly to the spore concentrations. In addition, signals from amperogram curves were used to draw standard graphics in inactive and live spore concentrations. Besides, an other highly sensitive impedimetric immunosensor was developed. In this biosensor, both deposition and interface electrical properties were measured with high precision on the printed electrodes used to determine measurable values in electrochemical systems. 
For amperometric immunosensor, a standard curve was formed in the method by testing the number of live spores between 2x102-2x104 spores/ml concentrations. Current changes were taken under an applied potential and, LOD and LOQ values were found to be 92 and 272 spores/ml, respectively. For impedimetric immunosensor, the measurement range was found to be 1x102-1x104 spore/ml. LOD and LOQ values were 55 and 154 spores/ml, respectively. It was shown as %CV=2,59. Bacillus anthracis spore biosensor results against Bacillus subtilis, Bacillus cereus and Bacillus  
thuringiencis spores were also studied under conditions where Anthrax spore standard curve was obtained. No cross-reactions were seen for these Bacillus types.
As a result, it is shown that the designed CBRN agent Anthrax immunosensor has high sensitivity and selectivity with fast results. Furthermore, the immunosensor can also be minituarized to detect live spores in the field with high accuracy.