Trabectedin'in (YONDELİS; ET-743)  CD133+/ CD44+ insan prostat kanser kök hücresi üzerindeki etkilerinin iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) sistemde incelenmesi
The examination effect of trabectedin (YONDELIS, ET-743) ON CD133 + / CD44 + human prostate cancer stem cells in two-dimensional (2D) and three dimensional (3D) system
Yazar: EDA AÇIKGÖZ
Danışman: PROF. DR. GÜLPERİ ÖKTEM
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Kanser çalışmaları, tümörlerin içinde yer alan küçük bir populasyonun tümörün başlaması, büyümesi ve klasik tedavilere dirençten sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Bu hücreler "kanser kök hücreleri" (KKH) olarak ifade edilmektedir. Bu nedenle, dikkatler KKH'lerini ortadan kaldırarak kanserin önlenmesi ve tedavisi için yeni bir anti-kanser ilacının tanımlanmasına odaklanmıştır. Kanserin önlenmesi ve tedavisi için KKH'lerinin belirlenmasi ve karakterize edilmesi gerekmektedir. CD44, CD133 gibi kanser kök hücrelerinin yüzeyinde yer alan değişik yüzey belirteçleri farklı tümörlerdeki KKH'lerinin izolasyonunda kullanılmaktadır. Prostat kanser kök hücreleri CD133+/CD44+ yüzey özelliklerine göre izole edilmektedir.
         Trabectedin (Yondelis; ET-743) tunikat Ecteinascidia turbinata'dan izole edilmiş bir tetrahidroizokinolin alkaloiddir. Bileşik, çok düşük dozlarda in vitro ve in vivo modellerde farklı kökenlerden gelen çeşitli tümör hücre hatlarına karşı kuvvetli bir sitotoksik aktivite sergiler. Ancak, Trabectedin'in kanser kök hücrelerindeki etkisi hala keşfedilmeyi beklemektedir. 
         Bu çalışmada, prostat kanser kök hücrelerinde Trabectedin'in hücre proliferasyonu, hücre döngüsü ve apoptoz üzerindeki etkileri üzerinde duruldu. Bunun için prostat kanser hücre hatlarından (DU-145-PC-3) CD133+/CD44+ hücreler izole edildi. Trabcetedin'in inhibitör etkisinin belirlenmesi için hücreler doza ve zaman bağlı olarak Trabectedin ile muamele edildi. Hücre canlılığı ve proliferasyon hücre canlılık deney kiti kullanılarak değerlendirildi. Apoptotik yolağın değerlendirilmesi için Annexin V ve immunfloresan analizleri yapıldı. Trabectedin'in hücre döngüsü üzerindeki etkisi hücre döngü analiz kiti ile belirlendi. Üç boyutlu (3D) kültür sisteminde Trabectedin'in sitotoksik etkisi multiselüler tümör sferoid modeli kullanılarak gerçekleştirildi.
         Trabectedin'in prostat kanser hücre kültürleri, prostat kanser kök hücreleri ve non-kanser kök hücreleri üzerinde artan doza (0.1-100nM) ve zamana (24., 48., 72.,) bağlı olarak sitotoksik etki gösterdiği belirlendi. Trabectedin'in insan RWPE-1 normal prostat epitel hücreleri üzerindeki doza ve zamana bağlı sitotoksik etkisinin prostat kanser hücre kültürlerine oranla daha az olduğu belirlendi.
         Çalışmada elde edilen veriler, Trabectedin'in hücre ölümü ve apoptozu artırarak kanser kök hücrelerinde sferoid oluşumunu önlediğini göstermektedir. Trabectedin tüm deney gruplarında spesifik olarak erken apoptozisi indüklemektedir. Trabectedin kaynaklı büyümenin engellenmesi ve apoptozda doza bağlı olarak kaspaz-3, kaspaz-8, kaspaz-9 ve p53 ifadesinin artığı ve bcl-2 ifadesinin ise azaldığı tespit edildi. Trabcetedin'in DU-145 hücrelerinde intrinsik ve ekstrinsik yolakları aracılığı ile apoptoza neden olmuştur; fakat PC-3 hücrelerinde ise sadece ektrinsik yolak üzerinden apoptozu indüklediği bulundu. Hücre döngü analizi Trabectedin'in G2/M arrestine neden olduğunu gösterdi. Üç boyutlu kültür çalışmaları, Trabectedin'in doza ve zamana bağlı olarak DU-145 KKH ve PC-3 KKH'lerinde sferoid sayısının ve çapını azalttığını gösterdi. Ayrıca, Trabectedin'in DU-145 ve PC-3 KKH'lerinin multiselüler sferoidlerindeki E-kaderin aracılı hücre-hücre etkileşimini bozduğu da bulundu.
         Bu tez, Trabectedin'in prostat kanser kök hücrelerinde sitotoksik ve apoptotik etkileri olduğunu gösteren ilk in vitro çalışmadır. Bu veriler, in vivo ve faz çalışmaları tamamlandıktan sonra Trabectedin'in prostat kanser tedavisi için etkili bir kemoterapötik molekül olabileceğini ortaya koymaktadır.

Abstract:
Cancer studies have revealed that tumors contain a minority popula¬tion of cells within tumors is responsible for tumor initiation, growth, resistance to the conventional treatments. These are called "cancer stem cells" (CSCs). Therefore, attention has been focused on defining new anticancer drug for cancer prevention and therapy by eliminating CSCs. For cancer prevention and treatment, we need to identify and characterize CSCs. A number of cell surface markers such as CD44, CD133 exist on the surface of cancer stem cells are often used to isolate and enrich CSCs from different tumors. Prostat cancer stem cells can isolate by CD133+ / CD44+ surface features.  
         Trabectedin (Yondelis; ET-743) is a tetrahydroisoquinoline alkaloid that was isolated from the tunicate Ecteinascidia turbinata. The compound exhibits a potent cytotoxic activity against a variety of tumor cell lines of different origins in vitro and in vivo models at very low doses. However, it is still waiting to discover that the effect of Trabectedin in cancer stem cells.  
         The present study focused on the effect of Trabectedin in cell proliferation, cell cycle progression and apoptosis in prostate cancer stem cells. We therefore, isolated CD133 +/CD44 + from human prostate cancer cell lines (DU-145 and PC-3). Cells were treated with Trabectedin in a dose and time dependent manner to determine the inhibitor effect of Trabectedin. Cell viability and proliferation were analyzed and efficiency of Trabectedin was assessed using cell viability assay kit. Annexin-V and immunofluorescence analysis were performed for evaluation of apoptotic pathways. The effect of Trabectedin on cell cycle was determined by cell cycle assay kit. The cytotoxicity of Trabectedin in three dimensional (3D) culture system was determined using the Multicellular Tumor Spheroid (MTS) model.
         Trabectedin was cytotoxic to prostate cancer cell cultures, prostate cancer stem cells, and prostate non-cancer stem cells in a dose (0.1-100 nM) and time (24., 48. and 72. h) dependent manner. It was determined that dose and time dependent cytotoxic effect of Trabectedin was less in human RWPE-1 normal prostate epithelial cells. 
         Our data demonstrate that Trabectedin inhibits cancer stem cell spheroid formation by increasing the cell death and apoptosis. Trabectedin specifically induced early apoptosis in all treated groups.  Trabectedin-induced growth inhibition and apoptosis was associated with increased expression of caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53 and decreased expression of bcl-2 in a dose-dependent manner. It was found that Trabectedin induced apoptosis through extrinsic and intrinsic pathways in DU-145 cells but only extrinsic pathway in PC-3 cells. The cell cycle analysis showed that Trabectedin induced G2/M phase arrest. The three-dimensional culture studies showed that Trabectedin reduced the number and diameter of spheroids of DU145 CSCs and PC3 CSCs in a dose and time dependent manner. Furthermore, we have found that Trabectedin disrupted E-cadherin-mediated cell-cell interactions in multicellular spheroids of DU-145 and PC-3 CSCs.
         This thesis is the first in vitro study indicating that Trabectedin has cytotoxic and apoptotic effects in prostate cancer stem cells. These data reveal that after completing in vivo and phase studies Trabectedin may be effective chemotherapeutic molecule for prostate cancer treatment.