EdU molekülünün şaperon aracılı otofajideki rolü
The role of the EdU molecule in chaperone-mediated autophagy
Yazar: CEREN GENCEL GÜLER
Danışman: PROF. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Glioblastoma (GM), primer malign beyin tümörlerinin en agresif türü olarak bilinmektedir. Şu
anda mevcut olan en uygun tedavi, radyasyon ve kemoterapiye dayalı kombine tedavilerdir.
Ancak uygulanan tüm tedavi yöntemlerine rağmen hastaların sağ kalım oranları maalesef çok
düşüktür. Tedavi yetersizliğinin en önemli sebeplerinden biri kan beyin bariyerinin varlığıdır.
Farklı kanser türlerinin tedavisinde kullanılan birçok kemoterapötik ilaç kan beyin bariyerinden
geçemediği için bu hastalara uygulanamamaktadır. Bu nedenle glioblastoma için hedeflenen
alternatif terapötikler araştırılmalıdır. Hücre canlılığı, proliferasyonu, tümör göçü ve
anjiyogenezinde rol oynayan çeşitli mutasyonlarla karmaşık bir patogeneze sahip olması nedeni
ile gliomaların anlaşılmasına yönelik çalışmaların yapılması önem kazanmaktadır. 5- Etinil-2-deoksiüridin (EdU), kan beyin bariyerinden geçebilmektedir. Hücre onarım mekanizmasını sürekli olarak aktive etmekte ve kanser hücrelerinin apoptoza yönelmesine yol açmaktadır. Şaperon aracılı otofaji ve EdU ilişkisini inceleyen herhangi bir çalışma literatürde bulunmamaktadır.  Bu tez çalışmasında, U-87MG (PTEN mutant, p53 wild) glioma hücre hattında EdU molekülünün şaperon aracılı otofaji mekanizması üzerindeki etkisi 2B ve 3B-sferoid kültürlerinde araştırılmıştır. 2B kültürde farklı konsantrasyonlardaki EdU'nun etkileri proliferasyon, migrasyon, anjiyogenez, koloni oluşturma yeteneği, apoptoz, makrootofaji, şaperon aracılı otofaji ve stres yanıtı üzerinde değerlendirilmiştir. 2B hücre kültürü için 2 μM ve 10 μM dozları seçilmiştir. Glioblastoma hücrelerinin gelişiminde önemli rolleri olan migrasyon, anjiyogenez, koloni oluşturma (CFA ve SA-CFA testi) testleri EdU uygulamaları sonucunda önemli ölçüde azalmıştır. Epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) belirteçleri olan N-kaderin seviyesinde azalma E-kaderin anlatımında artış ve β-katenin seviyesinde azalma raporlanmıştır. Apoptoz ve üzerindeki etkiler immunoblot yöntemi ile kaspaz-3 ve PARP1 kesilmiş fragment analizi, Bax/Bcl2 oranı, sitokrom-c salınımı, p53ser46, Hsp60, Hsp70, HO/PI ikili boyaması (apoptotik ve ölü hücre değerlendirmesi) ile değerlendirilmiştir. Hücre döngüsü üzerindeki etkileri western blot yöntemi ile p21, CDK1, CDK2, siklin D1, MDM2, p53 analizleri ile raporlanmıştır. Makrootofaji için akridin oranj boyaması ve LC3AII/I oranı ve şaperon aracılı otofaji için LAMP-2A, HSC70, Hsp90 seviyeleri ile ortaya konmuştur. İmmünofloresan işaretleme ile Hsp70'in nükleer translokasyonunda azalma belirlenmiştir. Elde edilen veriler EdU'nun hücre döngüsü tutuklanmasını, apoptoz ve şaperon aracılı otofaji mekanizmalarını düzenlediğini göstermiştir. EdU uygulamaları, sağlıklı hücre hattı olan HEK-293 hücrelerini canlı tutarken, glioma hücrelerinin canlılığını doza ve zamana bağlı olarak azaltmıştır. 3B-SF hücre kültürü için 10 μM, 50 μM, 500 μM dozları seçilmiştir. Apoptoz artışı, hücre döngüsü tutuklanması ve otofajide en etkin anlamlı veriler 50 μM EdU dozu için belgelenmiştir. Bunlara ek olarak, 3B sferoid U-87MG kültüründe 48 saat EdU uygulaması sferoid büyümesini ve migrasyonu yavaşlatmıştır. Bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde EdU'nun GB'de ve potansiyel olarak diğer agresif tümörlerde mevcut terapötik stratejilere katkıda bulunabileceği dair önemli kanıtlar sağlamaktadır.

Abstract:
Glioblastoma (GM) is known as the most aggressive type of primary malignant brain tumors.
Currently, the optimal treatment available is combined therapies based on radiation and
chemotherapy. However, despite all the treatment methods applied, the survival rates of patients
are unfortunately very low. One of the most important reasons for the inadequacy of treatment
is the presence of the blood brain barrier. Many chemotherapeutic drugs used to treat different
types of cancer cannot be administered to these patients because they cannot pass through the
blood-brain barrier. Therefore, targeted alternative therapeutics for glioblastoma should be
investigated. Due to the fact that it has a complex pathogenesis with various mutations that play
a role in cell viability, proliferation, tumor migration, and angiogenesis, it is important to
conduct studies aimed at understanding gliomas. 5-Ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) molecule is
able to pass through the blood brain barrier. It constantly activates the cell repair mechanism
and leads to the fact that cancer cells tend to apoptosis. There are no studies conducted with the
EdU molecule in chaperone-mediated autophagy. In this thesis, the effect of EdU molecule on
chaperone-mediated autophagy mechanism in U-87MG (PTEN mutant, p53 wild) glioma cell
line was investigated in 2D and 3D spheroid cultures. The effects of different concentrations of
EdU in 2D culture were evaluated on proliferation, migration, angiogenesis, colony-formation
assay, apoptosis, macro-autophagy, chaperone-mediated autophagy and stress response. Doses of 2 μM and 10 μM were selected for the 2D cell culture. Migration, angiogenesis, colony-formation assays (CFA and SA-CFA test), which have important roles in the development of glioblastoma cells, have decreased significantly as a result of EdU applications. A decrease in the ratio of N-cadherine/ E-cadherine and β-catenin level, which are markers of epithelial-mesenchymal transition (EMT), have been reported. Apoptosis and the effects on it were evaluated by immunoblot method with caspase-3 and PARP1 fragment analysis, Bax/Bcl2 ratio, cytochrome-c release, Hsp70, HO/PI binary staining (apoptotic and dead cell evaluation).The effects on the cell cycle were reported by p21, CDK1, CDK2, cyclin D1, p53, MDM2 analyses by western blot method. It was revealed by acridine orange staining and LC3AII/I ratio for macro-autophagy and LAMP-2A HSC70, Hsp90 levels for chaperone-mediated autophagy. As a result of the application of immunofluorescent marking, a decrease in the nuclear
translocation of Hsp70 was determined. The obtained data have shown that EdU regulates cell
cycle arrest, apoptosis and chaperone-mediated autophagy mechanisms. EdU applications have
reduced the viability of glioma cells depending on dose and time, while keeping HEK-293 cells,
which are healthy cell lines, alive. Doses of 10 μM, 50 μM, and 500 μM were selected for the
3D-SF cell culture. The most effective significant data in apoptosis increase, cell cycle arrest
and autophagy have been documented for the 50 μM EdU dose. In addition, 48 hours EdU
application in 3D-spheroid U-87MG culture slowed spheroid growth and migration. These
results, taken together, provide important evidence that EdU can contribute to current
therapeutic strategies in GB and potentially other aggressive tumors.