Transferrin izoformları analizinde elektroforez ve sıvı kromatografi yöntemlerinin karşılaştırılması
Comparision of electrophoresis and liquid chromatography in analysis of transferrin isoforms
Yazar: ARZU ALYAKUT
Danışman: DOÇ. DR. ASLI PINAR
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Uyuşturucu Alışkanlığı ve Alkolizm = Drug Addiction and Alcoholism

Özet:
Alyakut A., Transferrin izoformlarının analizinde elektroforez ve sıvı
kromatografisi yöntemlerinin karşılaştırılması, Hacettepe Üniversitesi Tıp
Fakültesi, Tıbbi Biyokimya, Uzmanlık tezi, 2017, Ankara. Transferrin (Tf),
siyalik asit sayısına göre birçok izoformu bulunan bir serum glikoproteinidir. Tf
izoformlarındaki patern değişiklikleri konjenital glikozilasyon defektlerinin tanısında
kullanılmaktadır. Bu amaçla izoelektrik odaklama (İEO) elektroforezi, yüksek
performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve kapiller zon elektroforez (CE)
yöntemleri ile Tf izoformları değerlendirilmektedir. Çalışma, Hacettepe Üniversitesi
Hastaneleri Merkez Laboratuvarında Mayıs 2015-Mayıs 2016 tarihleri arasında
Konjenital glikozilasyon sendromu (CDG) taraması amacıyla kabul edilen hasta
numuneleri ile gerçekleştirildi. Çalışmamızda merkez laboratuvarda rutin analizlerde
kullanılan 1. CE sistemi (Sebia 2 Capillarys™ Sebia, France), 2. CE sistemi (Helena
Biosciences V8® E-class analizörü; Helena Biosciences Europe, UK) ve HPLC
(CDT test kiti UV/VIS-FAST EUREKA reagent / Shimadzu Europe) sistemleri
karşılaştırıldı. Her bir sistemin gün içi ve günler arası varyasyonları hesaplanarak
karşılaştırıldı. Sistemler Tf izoformları analiz performansları ve çeşitli interferanslar
(hemoliz, lipemi, bilirübin ve betada ilerleyen monoklonal pik) yönünden
karşılaştırıldı. Her üç sistemin varyasyon katsayısı (%CV) değerleri
karşılaştırıldığında gün içi ve günler arası varyasyon çalışmasında; disialo-Tf için en
düşük değerler HPLC sisteminde diğer izoformlar için 1.CE sisteminde görüldü.
Rutin Tf izoformları analiz karşılaştırmasında toplam 36 serum numunesi çalışıldı.
1.CE sistemi ile 36, 2.CE sistemi ile 29, HPLC sistemi ile de 35 numune
değerlendirildi. Üç sistemin sınıf içi korelasyon analizi sonucunda yöntemler
arasında uyum saptanmadı. Sistemler ikişerli sınıf içi korelasyon analizi ile
karşılaştırıldığında en kabul edilebilir sonucun trisiyalo-Tf ölçümünde 1.CE ve 2.CE
sistemleri arasında olduğu görüldü. Sistemler arasında her bir Tf izoformu için
yapılan Bland-Altman analizlerinde disiyalo-Tf için sonuçlar uyumlu bulundu.
Trisiyalo-Tf için sonuçların kabul edilebilir sınırlar içinde (<%10) ancak, 2. CE ve
HPLC sisteminde artan konsantrasyonlarda negatif yönde bias gösterdiği saptandı.
Tetrasiyalo-Tf'de sistemler arasında farklılığın arttığı ancak kabul edilebilir sınırlar
içinde olduğu, pentasiyalo-Tf için arasındaki uyumun bozulduğu görüldü.
Hemoglobin (Hb) interferansının özellikle disiyalo-Tf üzerinde negatif yönde etkisi
saptandı. Transferrin izoform analizlerinde Hb'nin 125 mg/dL düzeylerinden itibaren
hemolizin kabul edilmemesi gerektiği sonucuna varıldı. Hemolizli, lipemik ve
bilirübinli numunelerden en az etkilenen sistemin 1. CE sistemi olduğu belirlendi.
Beta bölgesinde ilerleyen monoklonal piklerin Tf izoformları analizine etkisi
değerlendirildiğinde HPLC sisteminin genel olarak etkilenmediği saptandı. Buna ek
olarak, HPLC sisteminde gözlenen az sayıda monoklonal pik interferansının immün
eksiltme işlemi ile giderildiği saptandı. CDG şüpheli olarak saptanan hasta
numuneleri HPLC ve 1. CE sistemlerinde uyumlu Tf izoform paternleri gösterdiği
saptandı. Tf izoformları analizinde iyi bir performans elde edilebilmesi, kullanılan
yönteme olduğu kadar hasta numunesinin bileşenlerine de bağlıdır. Bu nedenle
yöntemi interfere eden etmenler tam olarak belirlenmelidir. Kullanılan analiz
sisteminin bu değişkenlere verdiği yanıt bilinirse doğru sonuç elde etmek mümkün
olacaktır.

Anahtar kelimeler: Transferrin izoform analizi, Kapiller elektroforez,
HPLC, İnterferens, Monoklonal bant

Abstract:
Alyakut A, Comparision of electrophoresis and liquid chromatography
in analysis of transferrin isoforms, Hacettepe University Faculty of Medicine,
Thesis in Medical Biochemistry, Ankara 2017. Transferrin (Tf) , is a serum
glycoprotein with many isoforms based on number of sialic acid residues. Changes in
Tf isoform patterns are used in diagnosis of congenital glycosylation defects. For this
purpose, isoelectric focusing (IEF) electrophoresis, high performance liquid
chromotography (HPLC) and capillary zone electrophoresis (CE) methods are used
to evaluate Tf izoforms. The study was carried out in the Hacettepe University
Hospitals Centeral Laboratory between May 2015- May 2016 with patient samples
accepted for congenital disorders of glycosylation (CDG) screening. 1.CE system
(Sebia 2 Capillarys™ Sebia, France) which is used in routine analyzes in the central
laboratory was compared with 2. CE system (Helena Biosciences V8® E-class
analyzer; Helena Biosciences Europe, UK) and HPLC sysem (CDT test kit UV/VISFAST
EUREKA reagent / Shimadzu Europe). Intra-day and between-days variations
were calculated and compared for each system. Systems were compared according to
Tf isoform analysis performances and various interferences (hemolysis, lipemia,
bilirubin, and beta migrating monoclonal components). When coefficient of variation
(%CV) values of three systems were compared for each isoform, lowest value for
disialo-Tf was found in HPLC system, for the other isoforms in 1.CE system. In
comparison of routine Tf isoforms analysis, totally 36 serum samples were studied
and 36 samples with 1.CE system, 29 samples with 2.CE system, 35 samples with
HPLC system were analyzed. No accordance was detected in intra-class correlation
analysis of three systems. When the three systems were compared by double pairs
intra-class correlation analysis, the most acceptable result in measurement of
threesialo-Tf measurement was found between 1.CE and 2.CE systems. According to
Bland- Altman analysis for each Tf isoforms, results were compatible for disialo-Tf
between the systems. The results for threesialo-Tf were found to be within the
acceptable limits (<%10) but negative bias was detected for increasing
concentrations in 2.CE and HPLC systems. For tetrasialo-Tf analysis, it was
observed that the difference between the systems was within the acceptable limits,
but for pentasialo-Tf analysis compatibility was impaired. Negative effect of
hemoglobin (Hb) interference was observed in disialo-Tf analysis. It was concluded
that Hb levels greater than 125 mg/dL were not acceptable in transferrin isoforms
analysis. On the other hand it was determined that the system which is at minimally
effected by hemolysed, lipemic and icteric samples is 1. CE system. When the effect
of monoclonal peaks migrating in beta region was evaluated, it was observed that the
HPLC system was generally uneffected. In addition, it was determined that a small
number of monoclonal peak interferences observed in the HPLC system were
eliminated by immune-substraction process. CDG suspected patient samples showed
consistent Tf isoform patterns in HPLC and 1.CE systems. Achievement of a good
performance in Tf isoform analysis, is based on patient sample constituents as well
as the technique used. For this reason, all elements interfering with the method
should be detected. Results will be correct, if the responses of the analysis systems
are elucidated to these variables.

Key words: Transferrin isoform analysis, Capillary electrophoresis, HPLC,
Interference, Monoclonal Band