İmmobı̇lı̇ze metal affı̇nı̇te kromatografı̇sı̇ ı̇le fosfoproteı̇n ı̇zolasyonu ı̇çı̇n sı̇lı̇ka bazlı sabı̇t fazların sentezı̇ ve karakterı̇zasyonu
Synthesis and characterization of silica-based stationary phases for phosphoprotein isolation via immobilized metal affinity chromatography
Yazar: DUYGU YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN ALİ TUNCEL ; DR. ÖĞR. ÜYESİ FATOŞ ÇİĞDEM KİP
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Silika bazlı, fosfonat grubu içeren immobilize metal afinite kromatografisi (İMAK) sorbenti geliştirilmiş ve sorbentin karakterizasyonu yapılmıştır. Geliştirilen sorbent, büyük fosforlu biyomoleküllerin saflaştırılması için uygun gözeneklilik yapısına sahiptir. Yüksek yüzey alanına sahip monodispers-mezogözenekli formdaki silika mikroküreler çok basamaklı hidroliz-kondenzasyon yöntemi ile sentezlenmiştir. Destek malzemesi olarak kullanılan silika mikrokürelerin sentezinde poli(metakrilik asit-co-etilen glikol dimetakrilat) (poli(MAA-co- EGDMA)) mikroküreler kalıp olarak kullanılmıştır. Hidroksil gruplarınca zenginleştirildikten sonra silika mikrokürelere fosfonat içeren ligand olan 3- tri(hidroksisilil)propil metilfosfonat (THSPMP) kovalent olarak bağlanmıştır.
Fosfonat grubu üzerinden Ti(IV) katyonları, destek malzemesine immobilize edilmiştir. Geliştirilen sorbent, metal(IV)-fosfat grubu arasındaki afinite kullanılarak fosfoproteinlerin izolasyonu için kullanılmıştır. Fosfoprotein örneği olarak seçilen a-casein veya b-casein ve referans proteini olarak seçilen sığır serumu albümini (BSA) ile kesikli sistemde Ti(IV) bağlı silika mikrokürelerin (Ti(IV)@THSPMP@SiO2) denge adsorpsiyon kapasitesi ve desorpsiyon verimleri belirlenmiştir. Kesikli sistemde elde edilen en yüksek denge adsorpsiyon kapasiteleri a-casein, b-casein ve BSA için sırasıyla 597 mg fosfoprotein/ g sorbent, 194 mg fosfoprotein/g sorbent ve 116 mg protein/g sorbenttir. Fosfoproteinler sütten ve insan serumundan yüksek desorpsiyon verimiyle (50 kat seyteltilmiş süt ve insan serumu için kantitatif değerde) ve yüksek saflıkta (50 kat seyreltilmiş süt için birinci desorpsiyonda %95 ve ikinci desorpsiyonda %85, insan serumu için a-casein için %90 ve b-casein için %93) izole edilmiştir. Mikroakışkan sistemde gerçekleştirilen deneylerde mikrokolon geçirgenliği 3.66 x 10-14 m2 olarak hesaplanmıştır. Uygun kolon geçirgenliğine, uygun ortalama çapa (5.3 μm), yüksek gözeneklilik hacmine (0.948 cm3/g) ve yüksek yüzey alanına (163 m2/g) sahip olması Ti(IV)@THSPMP@SiO2 mikrokürelerin dinamik kromatografide de sabit faz olarak kullanılabilirliğini göstermiştir.

Abstract:
A silica-based immobilized metal affinity chromatography (IMAC) sorbent functionalized with phosphonate group was synthesized and characterized. The designed sorbent was suitable for the purification of large phosphorylated biomolecules due to its porosity. Monodisperse-mesoporous silica microspheres were synthesized according to a staged shape-templated hydrolysis and condensation protocol. Poly(methacrylic acid-co-ethylene glycol dimethacrylate) (poly(MAA-co-EGDMA) microspheres was used as a template for synthesizing the support material, silica microspheres. After enrichment of hydroxyl groups, the support was functionalized with covalently bound ligand 3-
tri(hydroxysilyl)propyl methylphosphonate (THSPMP) containing phosphonate groups. Ti(IV) cations were immobilized on the support via phosphonate moieties. The developed sorbent was used for the isolation of phosphoproteins using the affinity between metal (IV) cations and phosphate groups. The equilibrium adsorption capacity and desorption yield of Ti(IV) immobilized phosphonate- functionalized silica microspheres (Ti(IV)@THSPMP@SiO2) were determined using a-casein and b-casein as phosphoproteins target proteins, and bovine serum albumin as a reference protein in a batch system. The highest equilibrium adsorption capacity for a-casein, b-casein, and BSA were 597 mg phosphoprotein/g sorbent, 194 mg phosphoprotein/g sorbent, and 116 mg protein/g sorbent, respectively. Phosphoproteins were isolated from milk and human serum with high desorption yields (quantitative for 50-fold diluted milk and human serum) and high purity (95% in first desorption and 85% in second desorption for 50-fold diluted milk and 90% with a-casein and 93% with b-casein for human serum experiments). Microcolumn permeability was calculated as 3.66 x 10-14 m2 for the microfluidic system. Ti(IV)@THSPMP@SiO2 microspheres were evaluated as a stationary phase for dynamic chromatography based on their appropriate column permeability, appropriate average diameter (5.3 μm), high pore volume (0.948 cm3/g) and high surface area (163 m2/g.)