Farklı pamuk çeşitlerinde ın vıtro sürgün rejenerasyonu ve Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla gen aktarımı
In vitro shoot regeneration and Agrobacterium tumefaciens-mediated gen transfer in different cotton cultivars
Yazar: EMİNE ANAYOL
Danışman: PROF. DR. SEBAHATTİN ÖZCAN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Ziraat Bölümü / Tarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Agrobacterium tumefaciens = Agrobacterium tumefaciens ; Gossypium hirsutum = Gossypium hirsutum ; Transformasyon-genetik = Transformation-genetic

Özet:
Diğer birçok bitki türüyle karşılaştırıldığında pamuk bitkisinde adventif sürgün rejenerasyonu ve gen aktarımı oldukça zordur. Bu çalışmada ülkemizde yaygın olarak üretilen pamuk çeşitlerinin farklı eksplantları farklı besin ortamlarında kültüre alınarak gen aktarımına uygun adventif sürgün rejenerasyonu ve Agrobacterium tumefaciens ile gen aktarım yöntemi geliştirilmesi hedeflenmiştir. En yüksek sürgün rejenerasyonu BAP içeren besin ortamlarından elde edilmiştir. Çeşitler arasında önemli farklılıklar kaydedilirken, en yüksek rejenerasyon oranı Coker 312 ve GSN-12 çeşitlerinin sürgün ucu ve kotiledon boğum eksplantlarından elde edilmiştir. İlave olarak, A. tumefaciens ile gen aktarımı için sürgün uçları en iyi eksplant olarak belirlenmiştir. Yine bu çalışmada cry1Ac ve bar genlerinin pamuk çeşitlerine A. tumefaciens ile aktarılarak böceklere dayanıklı ve herbisite toleranslı bitkilerin elde edilmesi amaçlanmıştır. Bunun için öncelikle pJIT61 klonlama plazmidinde AoPR1-Cry1Ac ve CaMV 35S-Cry1Ac ekspresyon kasetleri oluşturulmuştur. Daha sonra bu kasetler restriksiyon enzimleriyle kesilerek pTF101.1 binari transformasyon vektörlerinin bar genini de içeren T-DNA bölgesine klonlanmıştır. Klonlamadan sonra bu plazmidler elektroporasyon ile farklı Agrobacterium tumefaciens hatlarına aktarılarak pamuk çeşitlerine gen aktarımında kullanılmıştır. pTF101.1 AoPR1-Cry1Ac, pTF101.1 35S-Cry1Ac, pk2Ac 35S-Cry1Ac ve pRD400 AoPR1-Cry1Ac vektörlerini taşıyan GV2260 ve LBA4404 A. tumefaciens hatlarıyla STN 468, Özbek 100, Ayhan 107 ve GSN 12 çeşitlerinin sürgün ucu eksplantlarının inokülasyonu sonucunda toplam 133 adet transgenik adayı bitki elde edilmiş ve bunlarında 48 adedinin kesin transgenik olduğu PCR analizleriyle teyit edilmiştir. Biyotest çalışmalarında elde edilen bitkilerin bir kısmının Spodoptera exigua ve S. littoralis larvalarına karşı %100 oranında dayanıklılık gösterdiği belirlenmiştir.

Abstract:
Adventitious shoot regeneration and gene transfer in cotton is difficult compared to many other plant species. The aim of this study was to develop adventitious shoot regeneration system suitable for gene transfer using different explants and nutrient media and gene transfer methods by Agrobacterium tumefeciens in cotton cultivars commonly produced in Turkey. The highest shoot regeneration was achieved from shoot apex and cotyledonary node explants of cooker and GSN-12 cultivars on BAP containing medium and shoot apex was also found to be the best explants for gene transfer by A. tumefaciens. After optimization of regeneration and gene transfer, cy1Ac and bar genes were aimed to transfer to different cotton cultivars by A. tumefaciens. Therefore, AoPR1-Cry1Ac and CaMV 35S-cry1Ac expression cassettes were created in pJIT61 cloned plasmid. Thereafter, these cassettes were cut off with restriction enzymes and cloned into the T-DNA region of pTF101.1 binary plant expression vector containing bar gene. After cloning, these plasmids were transferred to Agrobacterium tumefaciens strains by electroporation and used for gene transfer to different cotton cultivars. After inoculation of shoot apex explants of STN 468, Özbek 100, Ayhan 107 and GSN 12 cultivars with A. tumefaciens GV2260 and LBA4404 strains carrying pTF101.1 AoPR1-Cry1Ac, pTF101.1 35S-Cry1Ac, pk2Ac 35S-Cry1Ac and pRD400 AoPR1-Cry1Ac vectors, 133 putative transgenic plants were produced and 48 of them were confirmed as transgenic plants by PCR. Bioassay studies indicated that some transgenic plants showed 100% resistance against Spodoptera exigua and S. littoralis larvae.