Blaptica dubia (Servılle, 1838) (Blattıdae, blaberınae) türünde gerçek zamanlı RT-QPCR normalizasyonu için endojen referans genlerin tanımlanması ve ekspresyon stabilitesinin değerlendirilmesi
Identification of endogenic reference genes for real time RT-QPCR normalization in Blaptica dubia (serville, 1838) (Blattidae, blaberinae) and assessment of expression stability
Yazar: EMİN UFUK KARAKAŞ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞEYDA BERK
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) = Reverse transcription polimerase chain reaction ; Kantitatif = Quantitative ; Normalleştirme = Normalization ; İçsel büyüme = Endogeneous growth

Özet:
Blaptica dubia (Serville, 1838) blaberidae ailesine ait Blaptica cinsi bir böcek türüdür. Bu böcek türü genellikle Dubia hamamböceği, Guyana benekli hamam böceği veya turuncu benekli hamam böceği olarak bilinmektedir. Blaptica dubia (B. dubia) Kosta Rika'dan başlayarak Orta ve Güney Amerika'da bulunmaktadır. Fransız Guyanası ve Brezilya'dan Arjantin'e kadar yaygındır. Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) gen ekspresyonunu ölçmek için en güçlü ve en güvenilir tekniklerden biridir. Gen ekspresyon analizindeki duyarlılığı, doğruluğu ve tekrarlanabilirliği nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. İyi bir qPCR analizinin merkezinde doğru yapılmış normalizasyon işlemi bulunmaktadır; aynı zamanda bu analiz izolasyon, ters transkripsiyon ve amplifikasyonun verimliliğindeki mevcut değişiklikleri gözlemleme imkanı sunmaktadır. Bu sayede farklı örnekler arasındaki mRNA konsantrasyonlarının karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Doğru ve güvenilir normalizasyon sonuçları kararlı referans genlerin kullanımına bağlıdır. Bununla birlikte yaygın olarak kullanılan bazı referans genlerinin ekspresyonu farklı deneysel çalışmalarda değişiklik gösterebilmektedir. Referans genler, genel olarak tüm hücrelerde evrensel olarak ifade edilen ve ürünleri Actin, Tubulin, EF1-α (Uzama faktörü 1-alfa) ve GADPH (Gliseraldehit-3-fosfat) gibi hücre yapısı veya bazal metabolizma için gerekli temel genler olarak bilinmektedir. Bu çalışmada, B. dubia hamamböceğinin ergin bireylerinde seçilmiş housekeeping genlerinin (GADPH, RPS18, α-TUB, EF1α, ArgK ve ACTB) ekspresyon stabilitesini değerlendirmek amacıyla beş farklı algoritma (ΔCt yöntemi, geNorm, Bestkeeper, Normfinder ve RefFinder) kullanılarak  validasyon çalışması yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre çalışmada yer alan altı housekeping gen arasında GADPH en kararlı housekeping gen olarak belirlenmiştir. Aynı zamanda RPS18 GeNorm ve BestKeeeper algoritmaları tarafından en kararlı gen olarak önerilmiştir. ACTB'nin tüm algoritmalar arasında en az seviyede kararlı olduğu gösterilmiştir. Sonuçlar, beş algoritmaya göre GADPH ve RPS18 genlerinin, B. dubia ergin bireylerinde transkript seviyelerinin normalizasyonu için kullanılabileceğini, ACTB'nin ise B. dubia hamamböceğinin transkript seviyelerinin normalizasyonu için uygun olmadığını göstermiştir.

Abstract:
Blaptica dubia (Serville, 1838) is an insect species of the genus Blaptica, belonging to the family Blaberidae. This insect species is commonly known as the Dubia cockroach, the Guyana spotted cockroach, or the orange spotted cockroach. Blaptica dubia is found in Central and South America, starting with Costa Rica. It is common from French Guiana and Brazil to Argentina. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) is one of the most powerful and reliable techniques for measuring gene expression. It is widely used because of its sensitivity, accuracy and reproducibility in gene expression analysis. Correct normalization is at the heart of a good qPCR analysis; at the same time, this process offers the opportunity to observe current changes in the efficiency of isolation, reverse transcription and amplification. In this way, it allows the comparison of mRNA concentrations between different samples. Accurate and reliable normalization results depend on the use of stable reference genes. However, the expression of some commonly used reference genes may vary in different experimental studies. Reference genes are generally known as essential genes that are universally expressed in all cells and required for cell structure or basal metabolism, such as Actin, Tubulin, EF1-α (Elongation factor 1-alpha) and GADPH (Glyceraldehyde-3-phosphate). In this study, a validation study was conducted using five different algorithms (ΔCt method, geNorm, Bestkeeper, Normfinder and RefFinder) to evaluate the expression stability of selected housekeeping genes (GADPH, RPS18, α-TUB, EF1α, ArgK and ACTB) in adult individuals of B. dubia cockroaches. According to the results, GADPH was determined as the most stable housekeping gene among the six housekeping genes included in the putative study. Furthermore, RPS18 was suggested as the most stable gene by GeNorm and BestKeeeper algorithms. ACTB has been shown to be the least stable of all algorithms. The results showed that GADPH and RPS18 genes can be used for normalization of transcript levels in B. dubia adult individuals, whereas ACTB is not suitable for normalization of transcript levels in B. dubia cockroaches according to the five algorithms.