Triturus karelinii (Urodela:Salamandridae) türünde siyatik sinir rejenerasyonunun davranışsal, elektrofizyolojik ve moleküler yöntemlerle incelenmesi
Investigation of the sciatic nerve regeneration in Triturus karelinii (Urodela:Salamandridae) by behavioral, electrophysiological and molecular methods
Yazar: SEÇİL KARAHİSAR TURAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ ONUR ; DOÇ. DR. FATMA DUYGU ÖZEL DEMİRALP
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Periferal sinir yaralanmaları sık karşılaşılan bir olgudur. Yaralanma şekli, hasarın konumu ve tedaviye başlama zamanına bağlı olarak tedavi edilebilirliği değişmekle birlikte, tedavi oranları genellikle düşüktür. Bir çok memeli dokusunda embriyonik dönemle sınırlı kalan bir özellik olan rejenerasyon yeteneği, urodele amfibilerde ergin dönemde de devam etmektedir. Bu tez çalışması kapsamında, omurgalı hayvanlar arasında rejenerasyon yeteneği en yüksek grubu oluşturan ve amfibi sınıfına ait bir takım olan semenderlerden Triturus karelinii türünde siyatik sinir hasarı sonrası iyileşme sürecinin, yürüme testleri, elektrofizyolojik ölçümler ve proteomik stratejilerle aydınlatılması amaçlanmıştır. 
Siyatik sinir dokularında kesik hasarı oluşturulan semenderlerin, iyileşme dönemleri operasyon sonrası 0-3. ve 24. saat, 7., 14., 21. ve 35. günler olmak üzere altı zaman aralığında incelenmiştir. 
Çalışmamızda yürüme testleri ve birleşik kas aksiyon potansiyeli verileri ile iyileşme süreci gözlenmiştir. Bottom-up proteomik stratejilerin kullanıldığı çalışmada, periferal sinir rejenerasyonu sürecindeki moleküler mekanizmayı en iyi yansıtan grubun kesik hasarı sonrası distal ve proksimal sinir uçların ayrı incelenmesi ile elde edildiği belirlenmiştir. İki boyutlu jel elektroforezi ile elde edilen protein profillerinden zaman aralıkları ve gruplara göre ifadesi artan azalan protein kümeleri tespit edilmiştir. Her bir zaman aralığına ait distal sinir ucu örnekleri kendi aralarında test edildiğinde 28 protein kümesi; proksimal sinir ucu örnekleri kendi aralarında test edildiğinde ise 38 protein kümesinin ifadesindeki değişim p<0.05 güven aralığında anlamlı bulunmuştur. Fosfoproteomik ve glikoproteomik incelemeler ile sinir rejenerasyonu sürecinde etkili olabilecek translasyon sonrası modifikasyonlar gösterilmiştir. 
MALDI-TOF kütle spektrometresi ile sinir rejenerasyonu sürecine katıldığı tespit edilen toplam otuz dört adet protein, peptit kütle parmak izi yöntemi kullanılarak tanımlanmıştır. Bu proteinler, hücre iskeleti proteinleri, enzim aktivitesi olan proteinler, ubikutinasyon mekanizması ile ilgili proteinler, sinyal molekülleri ve reseptörleri, taşıyıcı proteinler, hücre adezyon molekülleri ve düzenleyici proteinler şeklinde sınıflandırılmıştır. Tanımlanan proteinlerin doku ve organ morfogenezi, hücre ve doku gelişimi, büyüme, hücre farklılaşması, nöron homeostasisi, mikrotübüle bağlı hareketler, sinyal yollarının pozitif düzenlenmesi gibi fonksiyonlara sahip olduğu bulunmuştur. Taşıyıcı proteinler, büyüme faktörleri, sinyal molekülleri ve düzenleyici moleküllerin distal sinir ucunda; nörit uzaması ile ilgili moleküllerin, özellikle hücre iskeleti proteinlerinin ise proksimal sinir ucunda daha yüksek ifade edildiği görülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Siyatik sinir, Triturus karelinii, rejenerasyon, yürüme testi, elektrofizyoloji, 2D-PAGE, MALDI-TOF

Abstract:
Peripheral nerve injuries are frequently observed cases. The curability rate can change due to injury type, location of the damage and time to start treatment, although treatable cases are generally low. The regenerative capacity is limited to the embryonic period in many mammalian tissues, but in urodele amphibians it continues during adulthood. Within the scope of this thesis, it is aimed to clarify the recovery period of Triturus karelinii species after sciatic nerve damage. As a result of the study, this species which belongs to class Amphibia, order Urodela, has the highest regenerative capacity through the vertebrates, which is assessed by walking track analysis, electrophysiological recordings and proteomic strategies.      
The sciatic nerves of the newts were transected and the recovery period is examined in six time points which are 0-3rd and 24th hours, 7th, 14th, 21st and 35th days postoperatively.  
In this study, regeneration process is observed by walking track analysis and compound muscle action potential data. In the study by which bottom-up proteomic strategies are used in order to assess the underlying molecular mechanism of regeneration period, the transection damage group where distal and proximal nerve endings are analysed separately is identified as the most effective group. From the protein profiles of two dimensional gel electrophoresis, protein spots which have different expression levels between time points and groups are determined. When distal nerve stumps from different time intervals were statistically tested, 28 protein spots were found to be significant and 38 for proximal nerve stumps (p<0.05). By phosphoproteomic and glycoproteomic analysis, posttranslational modifications which can be effective in nerve regeneration period is indicated. 
Totally 34 proteins which relate to nerve regeneration process are identified with peptide mass fingerprinting analysis by using MALDI-TOF mass spectrometry. These proteins were classified as cytoskeletal proteins, enzymes, proteins involved in ubiquitination, signal molecules and receptors, transport proteins, cell adhesion molecules and regulatory proteins. These proteins function as tissue and organ morphogenesis, cell and tissue growth, development, cell differentiation, neural homeostasis, microtubule driven movements, positive regulation of signal pathways. 
Transport proteins, growth factors, signal and regulatory molecules are highly expressed in distal nerve stumps, whereas proteins related with neurit elongation process, and especially cytoskeletal proteins are highly expressed in proximal nerve stumps.

Keywords: Sciatic nerve, Triturus karelinii, regeneration, walking track analysis, electrophysiology, 2D-PAGE, MALDI-TOF