Albumin uzaklaştırılması için selüloz nanofiberler
Affinity depletion of albumin with cellulose nanofibers
Yazar: EMEL TAMAHKAR
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ ; PROF. DR. TÜLİN KUTSAL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Proteom, bir organizma ya da dokunun genomu tarafından ifade edilen proteinlere verilen addır. Proteomik olarak tanımlanan protein analizi, proteinlerin yapısal özelliklerinin belirlenmesini ve işlevlerinin aydınlatılmasını kapsar. Proteom çalışmalarında en çok çalışılan biyolojik sıvı, kan plazması ve serumdur. Kan plazması, insan vücudunda yer alan ana protein kategorilerinin büyük çoğunluğunu içermesi nedeniyle hastalıklara özgü proteinlerin belirlenmesi için ideal bir kaynaktır. Albumin ve immunoglobulinler plazma proteinlerinin % 80'ini oluştururlar ve az miktardaki diğer proteinleri maskelerler. Dolayısıyla bu proteinlerin ortamdan uzaklaştırılması sayıca daha az olan hastalık işaretçi proteinlerinin belirlenmesini kolaylaştıracaktır.Boya-ligand afinite kromatografisi, ucuz, kararlı ve grup spesifik boyaların ligand olarak kullanıldığı, protein ve enzimlerin ayrılması, saflaştırılması ve uzaklaştırılmasında kullanılan etkin ve yaygın bir yöntemdir. Özellikle albuminin uzaklaştırılması için boya-ligand Cibacron Blue F3GA ve türevleri, sıklıkla kullanılmaktadır. Bakteriyel selüloz, yüksek su tutma kapasitesi, yüksek mekaniksel dayanımı ve nanofiberlerden oluşan ağsı yapısıyla dikkat çeken biyouyumlu biyopolimerdir.Sunulan çalışmanın amacı; ucuz ve üstün özelliklere sahip bakteriyel selüloz nanofiber membranlara boya-ligand Cibacron Blue F3GA takılarak, insan plazmasındaki albumini yüksek seçicilik ve yüksek kapasiteyle uzaklaştırmak için adsorbent hazırlanmasıdır. İlk basamakta, A. xylinum bakterisi ile zamanla hücre çoğalma ve selüloz oluşumu kinetik parametreleri saptanmıştır. Daha sonra, uygun besi yeri ve koşullarında bakteriyel selüloz membranlar sentezlenmiştir. Membranların bakteriyel kültürden uzaklaştırılmalarının ardından Cibacron Blue F3GA uygun koşullarda yapıya immobilize edilmiştir. Hazırlanan Cibacron Blue F3GA takılı bakteriyel selüloz nanofiber membranlar, şişme deneyleri, elementel analiz, Fourier transform infrared spektroskopisi (FTIR) ve taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ile karakterize edilmiştir. Cibacron Blue F3GA takılı bakteriyel selüloz nanofiber membranlar, HSA sulu çözeltisi ve insan plazmasından HSA adsorpsiyonu için kullanılmıştır. Adsorpsiyon deneyleri, farklı ortam koşullarında sürekli ve kesikli sisteminde incelenmiştir (pH, akış hızı, protein konsantrasyonu, sıcaklık, tuz etkisi). Cibacron Blue F3GA takılı bakteriyel selüloz nanofiber membranların sulu çözeltiden maksimum HSA adsorpsiyon kapasitesi, HSA derişiminin platoya ulaştığı değer olan 7 mg/mL'de, 1800 mg/g olarak bulunmuştur. Sulu çözelti ve insan plazmasından maksimum adsorpsiyon oranları sırasıyla %5 ve %40'tır. HSA' nın saflığı elektroforez ile belirlenmiştir. 10 kez tekrarlanan adsorpsiyon-desorpsiyon döngüsü sonucunda adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir değişim olmadığı gözlemlenmiştir.

Abstract:
Proteome is the set of expressed proteins by the genome of organism or tissue. Proteomics is the analysis of proteins, particularly their structures and functions. Human blood plasma is possibly the most important proteome from a clinical/medical point of view. A broad inventory of plasma proteins (both qualitative and quantitative) provides diagnosis and development of new therapeutic products. It might be expected that if plasma or serum is selectively depleted of albumin, this would facilitate the analysis of proteins present at low concentration.Dye-ligand chromatography has played an important role in the separation, purification and recovery of proteins and enzymes. Dye-ligands are inexpensive, stable and group specific. Especially for the depletion of albumin, Cibacron Blue and derivatives are frequently used. Bacterial cellulose is a natural biopolymer with its high hyrophilicity, high mechanical strength and ultrafine network structure.The submitted study is dedicated to develop specific adsorbents for the removal of albumin from human plasma with high selectivity and high capacity with bacterial cellulose via coupling Cibacron Blue F3GA. In the first step, kinetic parameters of A. xylinum of bacterial growth and cellulose formation was determined. Bacterial cellulose was synthesized in static conditions in the appropriate culture medium. After the purification of the membranes, dye-ligand Cibacron Blue F3GA was immobilized to the membranes. Cibacron Blue F3GA immobilized bacterial cellulose membranes were characterized by means of swelling studies, elemental analysis, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Scanning Electron Microscope (SEM). These polymers were used for the adsorption of albumin from the aqueous solution of HSA and human plasma. Adsorption experiments were investigated under different conditions in a batch and continuous system (i.e., medium pH, flow rate, protein concentration, temperature, ionic strength). The maximum adsorption capacity of Cibacron Blue F3GA immobilized bacterial cellulose membranes from aqueous HSA solution was 1800 mg/g when plateau value of HSA concentration is 7 mg/mL. Percentage of albumin removal from aqueous solution and human plasma is respectively 5% and 40%. Purity of HSA was estimated by using SDS-PAGE.It was observed that after 10 adsorption-desorption cycle, Cibacron Blue F3GA immobilized bacterial cellulose membranes can be used without significant loss in HSA adsorption capacity.