Nohut bitkisinde (Cicer arietinum L.) Agrobacterium aracılı gen transferinin etkinleştirilmesi için vakum infiltrasyonu ve sonikasyonun birlikte kullanımının araştırılması
An investigation on the combination of sonication and vacuum infiltration to enhance Agrobacterium mediated transformation in chickpea (Cicer arietinum L.)
Yazar: SEMA SELVİ NUR TAŞYAPAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MİKAİL AKBULUT
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Agrobacterium tumefaciens = Agrobacterium tumefaciens ; Nohut = Chickpea ; Transformasyon-genetik = Transformation-genetic

Özet:
Bu çalışmanın amacı yaygın olarak yetiştirilen nohut kültivarlarımızdan biri olan Beyaz Nohut için güvenilir, tekrarlanabilir bir rejenerasyon ve transformasyon sistemi geliştirmektir. Doku kültürü çalışmalarında MS tuzları ve Gamborg vitaminlerini içeren modifiye MS ortamı (MS-Gamborg) kullanılmıştır. MS-Gamborg ortamı 0.25-0.5 g/L kazein ve 1 g/L glutamin ile desteklenmiş ve çoklu sürgün oluşturmak için çeşitli büyüme düzenleyicileri (BAP, Kn, TDZ, zeatin, IAA, giberillik asit) eklenmiştir. Çoklu sürgün oluşturmak amacıyla plumula ve radikula kısımları kesilmiş 4-5 gün çimlendirilen fidelerden elde edilen eksenler kullanılmıştır. Tüm çalışmalar boyunca en fazla sürgün sayısı 10 µM BAP kullanılan (ortalama 4.2 sürgün) MS-Gamborg ortamında elde edilmiştir. 0.5 mg/L Kn, 0.5 mg/L BAP ve 0.2 mg/L IAA uygulaması ile en düşük sürgün sayısı (ortalama 1.5 sürgün) elde edilmiştir. Agrobacterium temelli transformasyonun etkinliğini artırmak için sonikasyon, sonikasyon-vakum infiltrasyonu, agroinfiltrasyon, ve ayrıca yaralama?agroinfiltrasyon kombinasyonları gibi parametreler test edilmiştir. Sonikasyonla birlikte vakum infiltrasyonu kombinasyonunun en etkili uygulama olduğu tespit edilmiştir. En iyi stabil transformasyon bulguları banyo tipi sonikatörle 5 sn ara ile 20 ve 30 sn sonikasyon uygulaması ile elde edilmiştir. Ayrıca ara vermeden 40 sn yapılan sonikasyon uygulaması ile selektif ortamda yaşayan çok sayıda sürgün elde edilmiştir. 1 dk'dan 20 dk'ya kadar uygulanan sonikasyon süreleri içinde en etkili stabil transformasyon bulguları 1 ve 5 dk yapılan sonikasyon ile elde edilmiştir. Aday transformant bitkicikler 2-3 seleksiyon döngüsü sonucunda seçilmiştir ve PZR ile moleküler analizleri yapılmıştır.Anahtar Kelimeler: Nohut, Transformasyon, Agrobacterium, Sonikasyon

Abstract:
Main purpose of this study was to develop an efficient and reproducible regeneration and transformation system for a local chickpea cultivar. A modified tissue culture medium (MS-Gamborg) was used throughout the regeneration and transformation studies. MS-Gamborg medium was fortified with casein (0.25 g/L) and L-glutamin (1 g/L). Various plant growth regulators (BAP, TDZ, zeatin, IAA, and giberellicasit) were used for multiple shoot inductions. Plumuls and radiculs of 4 or 5 day germinated seedlings were removed and used as an explant for multiple shoot induction. Maximum shoot inductions were observed when 10 µM BAP (4.2) was used as a sole growth regulators. Multiple shoot induction was the lowest when MS-Gamborg medium was supplied with 0.5 mg/L Kn, 0.5 mg/L BAP and 0.2 mg/L IAA. The impact of several parameters, such as sonication, sonication-vacuum infiltration, agroinfiltration and Agrobacterium mediated transformation with wounding of explant tissue were tested to increase the efficiency of Agrobacterium mediated transformation. Combination of vacuum infiltration with sonication had remarkable effect on the efficiency of Agrobacterium mediated transformation of local chickpea cultivar. The best stable transformation results were obtained from bath type sonicator with the parameters of 20 and 30 s sonications with 5 s intervals. Continuous 40 second sonication resulted in many living plantlets in selective medium. Among the 1 to 20 min of sonication durations, 1 and 5 min of sonication gave the best results. Putative transformants were selected in 2-3 cycles of selection and analyzed by polymerase chain reaction (PCR).Key words: Chickpea, Transformation, Agrobacterium, Sonication