Kastisin'in lipopolisakarit ile aktive edilen mikroglial hücrelerde tümör nekroz faktör-α uyarımlı protein-8 benzeri 2 ekspresyonu üzerine etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of casticin on the tumor necrosis factor‑α‑induced protein-8 like 2 expression in the lipopolysaccharide-activated microglial cells
Yazar: KEYVAN HEMMATVAND
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MEHTAP YÜKSEL EĞRİLMEZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı / Moleküler Tıp Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Kastisin = Casticin ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Mikroglial hücreler = Microglial cells ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases ; Tümör nekroz faktörü-alfa = Tumor necrosis factor-alpha

Özet:
Mikroglialar, pek çok nörodejeneratif hastalığın patogenezinde rol oynayan
yerel makrofaj hücreleridir. MSS'deki nöroinflamasyonun ilk belirtisi mikroglial
aktivasyondur. Bu aktivasyon, proinflamatuvar sitokinlerin salınmasına ve oksidatif
strese yol açarak nöronal hasarın başlamasına neden olur. TIPE2, aşırı immün yanıtı
önlemede ve immün homeostazı korumada rol oynayan yakın zamanda tanımlanan TNFAIP8 ailesine ait bir proteindir. Yapılan çalışmalar, TIPE2'nin inflamatuvar yanıtlarda ve tümör oluşumunda önemli bir rol oynadığını ortaya koymuştur. TIPE2'nin AH, PH ve MG gibi nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde de rolü olduğu belirlenmiştir. Kastisin, Vitex rotundifolia'dan elde edilen bir polimetoksiflavondur. Yapılan çalışmalar, kastisin'in anti-inflamatuvar ve antikanser etkileri olduğunu göstermiştir. Araştırmamızda, kastisin'in LPS ile aktive edilen N9 mikroglial hücrelerde TIPE2 ekspresyonu üzerine etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışmamızda N9 fare mikroglial hücreler kullanılmıştır. Kastisin'in mikroglial hücrelerde canlılığa etkisi WST-1 analizi ile incelenmiştir. Kastisin'in LPS ile aktive edilmiş N9 mikroglial hücrelerde TIPE2 mRNA ekspresyonuna etkisi qPCR, protein ekspresyonuna etkisi Western blot ile incelenmiştir. Kastisin'in LPS ile aktive edilmiş N9 mikroglial hücrelerde TNF-α sitokin salınımı üzerine etkisi ELISA ile belirlenmiştir. Çalışmamızda kastisin'in hücre canlılığına sitotoksik etki göstermeyen iki dozu (100 ve 500 nM) belirlenmiştir. LPS uygulaması N9 fare mikroglial hücrelerde TIPE2 mRNA düzeyini 3., 6. ve 24. saatlerde azaltmıştır. Kastisin 500 nM dozda 24. saatte LPS ile azalan TIPE2 mRNA ekspresyon düzeyini sadece LPS uygulanan gruba göre anlamlı olarak artırmıştır. LPS uygulaması N9 fare mikroglial hücrelerde TIPE2 protein ekspresyon düzeyini 2., 4., 8. ve 24. saatlerde azaltmıştır. Kastisin 500 nM dozda 24. saatte LPS ile azalan TIPE2 protein ekspresyon düzeyini sadece LPS uygulanan gruba göre anlamlı olarak artırmıştır. Kastisin 500 nM dozda LPS ile aktive olan N9 fare mikroglial hücrelerde 48. saatte artmış TNF-α sitokin düzeyini azaltıcı yönde etki göstermiştir ancak etki istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Elde ettiğimiz bulgular kastisin'in mikroglial hücrelerde LPS ile oluşturulan inflamatuvar modelde azalan TIPE2 mRNA ve protein ekspresyonlarını artırarak inflamasyonu azaltıcı etkisini gösteren ilk çalışmadır.

Abstract:
Microglia are local macrophage cells that play a role in the pathogenesis of
many neurodegenerative diseases. The first manifestation of neuroinflammation in the
CNS is microglial activation. This activation causes the release of proinflammatory
cytokines and initiation of neuronal damage by causing oxidative stress. TIPE2 is a
recently identified TNFAIP8 family protein that plays a role in preventing excessive
immune response and maintaining immune homeostasis. Studies have revealed that
TIPE2 plays an important role in inflammatory responses and tumorgenesis. It has
been determined that TIPE2 has a role in the pathogenesis of neurodegenerative
diseases such as AD, PD and MG. Castisin is a polymethoxyflavone derived from
Vitex rotundifolia. Studies have shown that casticin has anti-inflammatory and anticancer effects. In our study, it was aimed to investigate the effect of castisin on TIPE2
expression in LPS-activated N9 microglial cells. The effect of castisin on cell viability was investigated by WST-1 in N9 mouse microglial cells. The effect of casticin on TIPE2 mRNA expression in LPS-activated N9 microglial cells was investigated by qPCR and its effect on protein expression by Western blot. The effect of castisin on TNF-α cytokine release in LPS-activated N9  microglial cells was determined by ELISA. In our study, two doses (100 and 500 nM) of casticin, which act without affecting cell viability, were determined. LPS application decreased TIPE2 mRNA level in N9 microglial cells at 3rd, 6th and 24th hours. Castisin at 500 nM dose significantly increased the TIPE2 mRNA expression level at 24 hours compared to the group that only treated with LPS. LPS application decreased TIPE2 protein level in N9 microglial cells at 2nd, 4th, 8th and 24th hours. Castisin at 500 nM dose significantly increased TIPE2 protein expression level in the 24th hour compared to the LPS treated group. Castisin did not affect the increased TNF-α cytokine release in LPS-activated N9 microglial cells.