Hepatit B virusu (HBV) ile kronik enfekte hastalarda HBV bazal kor promoter/prekor gen mutasyonları ve genotip değerlendirilmesi
Basal core promoter/precore gene mutations in chronically infected patients with hepatitis B virus and genotype evaluation
Yazar: SEDA TEZCAN
Danışman: PROF. DR. GÜROL EMEKDAŞ
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Hepatit B virüsü = Hepatitis B virus

Özet:
Hepatit B Virusu (HBV) genotipleri oldukça farklı coğrafik dağılıma sahiptir. Ayrıca HBV genomunun bazal kor promoter ve prekor gen bölgelerinde oldukça fazla genetik değişkenlik tanımlanmıştır. Bazal kor promoter ve prekor gen bölgeleri viral repikasyon ve ?e? antijen sentezinde öneme sahip olduğu için, yaptığımız tez çalışmasında bu bölgeler doğal olarak meydana gelen mutasyonlar yönünden ve bu mutasyonların genotip ve ?e? antijen durumu ile olan ilişkisi incelenmiştir. Ayrıca çalışmada, oldukça sınırlı bir coğrafi bölge olan Mersin ilinde daha önce çalışılmamış olan HBV genotiplerinin lokal olarak tanımlanması, bazal kor ve prekor gen bölgelerindeki genetik heterojenitenin araştırılması ve sonrasında da predominant olarak görülen mutasyon paternlerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.Çalışmada, polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase chain reaction, PCR) ile tespit edilebilir DNA'ya sahip 54 adet kronik hepatit B hastası toplanmıştır. Kronik HBV infeksiyonlu bütün hastaların, serum HBV DNA düzeyi, serolojik markırlar (HBsAg, Anti-HBs, HBeAg, Anti-HBe, Anti HBc) ve biyokimyasal profili analiz edildi. HBV genotipi, pre-S geninin PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analizi ile belirlendi. Bazal kor promoter ve prekor gen bölgeleri PCR ile belirlendi ve bu bölgelerdeki mutasyon, PCR ürünlerinin direkt dizi analizi belirlenmesinden sonra bilinen wild-tip HBV genotipleri ile hizalanarak karşılaştırılması ile tespit edildi.Çalışmadaki 54 hastanın 35 (%64.8)'i HBeAg negatif ve 19 (%35.2)'u ise HBeAg pozitiftir. HBV DNA ortanca değeri, HBeAg pozitif hastalarda, HBeAg negatifler ile karşılaştırıldığında belirgin olarak yüksek bulunmuştur (P=0.001). HBeAg pozitif ve HBeAg negatif hastalar arasında ALT (P=0.356) ve AST (P=0.800) düzeyleri arasında anlamlı bir ilişki bulunmamıştır. Hastaların hepsinde (%100) D genotipi bulunmuştur. Bazal kor promoter (1753-1762/1764) ve/veya prekor (1896) mutasyonları serumunda tespit edilir düzeyde DNA bulunan hastaların %87.75 (43/49)'inde bulunmuştur. HBeAg negatif hasta grubunda mutasyon oranı %97.1 (33/34) ve HBeAg pozitif hasta grununda ise %66.7 (10/15) olarak tespit edilmiştir (P=0.008). Prekor G1896A mutasyonu HBeAg negatif hastalarda, HBeAg pozitf olanlardan oldukça yaygın olarak bulunmuştur (%73.5 - %20, P=0.001). İki grup arasında meydana gelen bazal kor promoter mutasyonları arasında anlamlı bir farklılık bulunamamıştır (P=0.331), buna karşın bazal kor promoter ve prekor birlikte mutasyon oranı HBeAg negatif hastalarda oldukça yüksek olarak bulunmuştur (P=0.008). Bazal kor ve/veya prekor stop kodon mutasyonuna sahip hastaların serum HBV DNA seviyeleri ile mutasyona uğramamış virus taşıyan hastalar arasında anlamlı bir farklılığa rastlanmıştır.Yaptığımız bu çalışma, Mersin'de görülen başlıca genotipin, genotip D olduğunu göstermiştir. Hastaların önemli bir kısmı basal kor ve prekor varyanları ile infektedir. Birden fazla gen bölgesinde görülen mutasyonlar ise oldukça yaygındır. Prekor gen bölgesinde görülen G1896A stop kodon mutasyonu ise Mersin ilindeki HBV ile kronik olarak infekte hastalardaki HBeAg kaybında önemli bir role sahip olarak görünmektedir.Anahtar kelimeler: Hepatit B virus, hepatit B ?e? antijeni (HBeAg), nükleotidmutasyonu, bazal kor promoter, prekor, genotip

Abstract:
Hepatititis B virus (HBV) genotypes have distinct geographic distribution. Moreover much genetic variability has been described in basal core promoter and precore gene regions of HBV genome. Since basal core promoter and precore regions important to viral replication and ?e? antigen synthesis, these regions were examined for naturally occurring mutations and theirs correlations with the genotype and ?e? antigen status. Furthermore the aim of present study, local definition of HBV genotypes, investigation to genetic heterogeneity and then determination predominant mutation patterns of basal core and precore region, because of has not been studied previously, in our restricted region, Mersin-Turkey.A total of 54 chronic hepatitis B patients with detectable HBV DNA by a polymerase chain reaction (PCR) were enrolled in the study. Serum HBV DNA level, serological markers (HBsAg, Aanti-HBs, HBeAg, anti-HBe, Anti HBc) and biochemical profile (ALT and AST) were analyzed in all patients with chronic HBV infections. Genotype of HBV was determined by PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) base on pre-S gene. Basal core promoter and precore gene regions were determined by PCR and mutations of these regions were determined direct sequencing of PCR products then aligned with known wild-type HBV sequences.Of the 54 patients, 35 (64.8%) were HBeAg negative and 19 (35.2%) were HBeAg positive. HBV DNA median values were found significantly higher than HBeAg positive patients compared with HBeAg negative patients (P= 0.001). There were not found significant relation to ALT (P= 0.356) and AST (P= 0.800) levels in between HBeAg positive and negative patients. HBV genotype D was found in 100% of the patients. Basal core promoter (1753-1762/1764) and/or precore (1896) mutations were detected in 87.75% (43/49) out of patients with detectable DNA levels in serum. In HBeAg negative patient group, mutation rate were detected in 33/34 (97.1%) and in 10/15 (66.7%) of the HBeAg positive patient group (P= 0.008). Precore G1896A mutation was more common found in HBeAg negative samples than in HBeAg positive samples (73.5% vs. 20%, P= 0.001). There was no significant differences in the occurrence basal core promoter mutations between the two groups (P= 0.331), while the rate of basal core plus precore mutants was higher in HBeAg negative patients (P= 0.008).Our study shows that type D is the main HBV genotype in Mersin, Turkey. Significant numbers of patients have basal core and precore variants. Mutations at more than one site are common. G1896A stop codon mutation in precore region seems to have a significant role in the loss of HBeAg in our patients from restricted region, Mersin. Serum HBV DNA levels of having basal core mutation and/or precore stop codon mutation were not significant different from the other non-mutated virus carrying patients.Key words: Hepatitis B virus, hepatitis B ?e? antigen (HBeAg); nucleotidemutation; basal core promoter, precore, genotype