Renal ve osteoblast hücre hatlarında naf uygulaması bazı minerallerin apoptozis ve DNA hasarı üzerine etkileri
Naf application in renal and osteoblast cell lines the effects of certain minerals on apoptosis and dna damage
Yazar: SEDAT ÇETİN
Danışman: PROF. DR. FATMAGÜL YUR ; DOÇ. DR. MEHMET TAŞPINAR
Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; DNA = DNA ; DNA hasarı = DNA damage ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre kültürü = Cell culture ; Osteoblastlar = Osteoblasts ; Sodyum florür = Sodium fluoride

Özet:
Bu çalışma,  minerallerin (MgCl2, Na2SeO3, AlCl3,CaCl2) IC50 oranında NaF uygulanan NRK-52E ve hFOB 1.19 hücre hattlarında, bazı apoptotik markerların ekpresyonu ve translasyonu üzerine etkilerinin araştırılması amacıyla planlandı. Hücreler in vitrokoşullarda haftada iki-üç kez düzenli pasajları yapılarak çoğaltıldı. MTT ile NaF'ın IC50 değeri ve minerallerin yararlı dozları belirlendi. Hücreler 96'lık kültür pleytlerine 105, flasklara ise 106 olacak şekilde hücre ekimi yapıldı. Hücre hatlarında gruplar ELISA ve real time-PCR için kontrol, NaF ve NaF+mineral olarak belirlendi. MTT % proliferasyon için ise dozlar kontrol, NaF ve NaF+ mineraller olarak belirlendi. Biyokimyasal analizler için hücreler, 24 saat inkubasyonu takiben tripsin işlemi ile hücreler toplandı ve dondur/çöz yöntemiyle parçalanarak analize hazırlandı. mRNA izolasyonu için 12 saat takiben hücreler tripsin yöntemiyle toplandı ve manuel yöntemiyle mRNA izole edildi. M30, kaspaz-3, kaspaz-8, kaspaz-9, 8-OHdG, translasyonları ELISA yöntemiyle belirlendi. Kaspaz-3, Kaspaz-8 ve Kaspaz-9 real time-PCR yöntemiyle cDNA elde edildi. Real time-PCR yöntemiyle hedef gen DNA'ları çoğaltıldı. MTT çalışmalarında NRK-52E hücrelerinde NaF+mineral verilen gruplardaki hücre proliferasyonun NaF verilen tüm gruplardan daha fazla olduğu tespit edildi. hFOB 1.19 hücrelerinde ise hücre proliferasyonu MgCl2 hariç NaF verilen tüm gruplardan daha fazla olduğu tespit edilmiştir. NRK-52E hücrelerinde NaF uygulamasının kaspaz-3 ekspresyonu kontrole göre ortalama 2 kat azalmasının nedeni,NaF'ın olası apoptotik etkisinin, bizim RNA elde ettiğimiz saate göre kaynaklanabilir. Ancak bu saate göre sonuç NaF ve diğer mineral grublarına göre değerlendirildiğinde NaF'dan kaynaklanan sitotoksi ölümün apoptotikyolak dışında yolağı kullandığını gösterebilir. Ayrıca minerallerle NaF kombinasyonlarında elde edilen real time-PCR sonuçları apoptotoik genlerin ekspresyonlarının analiz edildiğinde yalnız NaF uygulanan gruplara göre kontrol grubundaki hücrelere yaklaştığı, bununda, NaF'tan kaynaklandığı düşünülen toksik ve apoptotik olabilecek yolağın inhibe edildiğini göstermektedir. Sonuç olarak; Minerallerin iyonik özeliğinden NaF ile genelde sinerjitik olarak apoptozisi önleyebildiği düşünülmektedir. NaF'ın hücre tipine bağlı olarak NRK-52E hücrelerinde NaF+ mineral kullanımı hücreyi apoptozu korur. Osteoblastta ise artan apoptozisi inhibe ettiği için yararlı olabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
The present study was planned to investigate the effects of minerals (MgCl2, Na2SeO3, AlCl3,CaCl2) on the expression and translocation of certain apoptotic markers in NRK-52E and hFOB 1.19 cell lines, on which NaF was applied at a ratio of IC50. Cells were replicated in vitro with 2-3 weekly regular passages. IC50 values forMTT and NaF and beneficial doses for minerals were determined. Cells were seeded in 96-well culture plates at 105 and in flasks at 106.Controls for the ELISA and real time-PCR groups in cell lines were determined forNaF and NaF+ minerals in the cell lines. Controls for the MTT% proliferation, doses were determined as NaF and NaF + minerals. For biochemical analysis, the cells were collected by trypsin treatment following 24-hour incubation, and the cells were broken up by freeze / thaw method and analyzed. After 12 hours, cells were harvested by trypsin method and mRNA was isolated manually. M30, caspase-3, caspase-8, caspase-9, 8-OHdG, translations were determined with ELISA method caspase-3, caspase-8 and caspase-9 cDNA was obtained by real time-PCR method. Target gene DNAs were reproduced by the real time-PCR method. In MTT studies, it was determined that the cell proliferation in NRK-52E cellNaF + mineral groups was higher than that of all the NaF-treated groups and in hFOB 1.19 cells, cell proliferation was higher than all the NaF-treated groups except MgCl2. The reason why NaF administration in NRK-52E cells resulted in an average of 2-fold decrease in caspase 3 expression compared to the control, could be attributed to the apoptotic effect of NaF based on time that we obtained the RNA. However, based on this time, when the results are assessed with respect totoNaF and other mineral groups, it could be indicated that the NaF induced cytotoxic apoptosiscould have used a pathway other than the apoptotic pathway. Furthermore, the real time-PCR results obtained in mineral-NaFcombinationsdemonstrated that when expressions of apoptotic genes are analyzed, it was found that they were closer to the cells in the control group when compared to NaF-treated groups, indicating that the toxic and apoptotic pathway was inhibited, probably by NaF. As a result it is considered that minerals could prevent apoptosis, usually synergistically, with NaF due to its ionic character. The use of NaF + minerals in NRK-52E cells, based on theNaF cell type, protects the cell from apoptosis. In osteoblast, on the other hand, it was concluded that it may be useful since it inhibits increased apoptosis.