Farklı bitki ekspresyon vektörleri tarafından üretilen deglikosile edilmiş PA83 antijeninin ekspresyon seviyelerinin karşılaştırılması
Comparison of expression levels of deglycosylated PA83 antigen produced by different plant expression vectors.
Yazar: ESMIRA MIRZALIYEVA
Danışman: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; Glikoproteinler = Glycoproteins ; Katlanmış proteinler = Folded proteins ; Vakum infiltrasyon yöntemi = Vacuum infiltration technique ; Yaprak proteinleri = Leaf proteins

Özet:
Son yıllarda, rekombinant proteinler için üretim konakçıları olarak bitkiler seçilmektedir. Sebepler açıktır - bitkiler hayvan ve insan patojenleri içermez, N-bağlı glikosilasyon dahil olmak üzere ökaryotik tip posttranslasyonel modifikasyonlar sağlar ve protein üretimi için neredeyse sınırsız ölçeklenebilirlik sunar.  Bu teknoloji, bitki bazlı üretimin ölçeklendirilebilirliği, saflaştırma maliyetleri, verim, istenen glikosilasyon modelinin mühendisliği ve diğer konular dahil olmak üzere, üretim konağı olarak bitkilerin ekonomik, teknik ve güvenlik yönlerini ele almaktadır. Bacillus anthracis'in ölümcül bir biyolojik silah olarak başarılı bir şekilde kullanılması şarbona karşı daha etkili aşıların geliştirilmesinde araştırma ilgisini yeniden başlatmıştır. Bitki bazlı aşılar aşı üretimi için güvenli bir alternatif sunar.  B. anthracis'in koruyucu antijeni (PA) şarbon toksininin önemli bir bileşenidir, ancak bir glikoprotein değildir.Bununla birlikte, dizisinin dokuz potansiyel glikosilasyon sahası vardır ve Nicotiana benthamiana bitkilerinde eksprese edildiğinde anormal şekilde glikosile olduğu gösterilmiştir.  Son zamanlarda PA83 antijeninin glikozillenmemiş versiyonları, ya in vivo deglikolizasyon stratejisi (PNGase F veya Endo H temelli), (Mamedov vd. 2012; Mamedov vd. 2016; Mamedov vd. 2017) ya da mutasyon (6 tane N-glikolizasyon bölgesine yönlendirilmiş mutagenez), (Mamedov vd. 2016) yaklaşımı vasıtasıyla üretilebilmiştir.   Bu çalışmada, farklı bitki ekspresyon vektörleri tarafından üretilen deglikosile edilmiş PA83 antijeninin ekspresyon seviyeleri karşılaştırılarak yeni Şarbon aşısı adayları belirlenmiştir. Yedi N-glikosilasyon sahasının (Asn-39 dahil) koruyucu antijeninin mutasyonu ile tasarlanmış ve kodon optimizasyonu yapılmış olan mutant formu,( Mamedov vd. 2017) farklı bitki ekspresyon vektörleri tarafından eksprese edildi ve N. benthamiana bitkisinde üretildi.Üretilen PA83'ün deglikosile edilmiş antijenleri, IMAC afinite kolonu kromatografi yöntemi kullanılarak saflaştırıldı ve saflaştırılmış protein stabilite analizleri için değerlendirildi.

Abstract:
In recent years, many groups are selecting plants as the production hosts for recombinant proteins. The reasons are obvious—plants are free of animal and human pathogens, provide eukaryotic type of posttranslational modifications, including N-linked glycosylation and offer virtually unlimited scalability for protein production. . These technology technical and safety aspects of plants as production hosts including scalability of plant-based production,purification costs, yield, engineering of desired glycosylation pattern, and other topics.  The successful use of Bacillus anthracis as a lethal biological weapon has prompted renewed research interest in the development of more effective vaccines against anthrax. Plant based vaccines offer safe alternative for vaccine production.   Protective antigen (PA) of B. anthracis is an important component of anthrax toxin but its not a glycoprotein.However, its sequence has nine potential glycosylation sites and it has been shown to be aberrantly glycosylated when expressed in Nicotiana benthamiana plants.   Recently,  a non-glycosylated versions of PA83 antigen was produced  by in vivo deglycosylation strategy (PNGase F or Endo H based) (Mamedov et al. 2012; Mamedov et al. 2016; Mamedov et al. 2017)  or by site-directed mutagenesis-based approach, by mutation of six N-Glycosylations sites (Mamedov et al. 2016)    In this study, new Anthrax vaccine candidates were identified by comparing the expression levels of the deglycosylated PA83 antigen produced by different plant expression vectors.a new mutant form by mutation of seven N-glycosylation sites  (including Asn-39) of protective antigen was engineered, codon optimized, (Mamedov et al. 2017)expressed and produced by different plant expression vectors in  N.benthamiana  plant. Deglycosylated antigens of PA83 were purified using the IMAC affinity column chromatography method and evaluated for purified protein stability analysis.