Defne (Laurus nobilis L.) bitkisinin ince hücre tabaka kültür sistemi ile ın vitro rejenerasyon potansiyellerinin saptanması ve uçucu yağ bileşiminin belirlenmesi
Determination of in vitro regeneration potentials through thin cell layerculture system and essential oil composition of laurel (Laurus nobilis L.) plant
Yazar: HALİDE HANDE GÜNGÖR
Danışman: PROF. DR. AYNUR GÜREL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Türkiye, Laurus nobilis L. (Defne) bitkisinin üretiminde önde gelen ülkelerden biridir. Üretimi tohumla ya da vejetatif yöntemlerle yapılan defne bitkisinde artan talebin karşılanması ve homojen kalitenin sağlanabilmesi için alternatif üretim tekniklerinin kullanılması gerekmektedir. Bu tez çalışması kapsamında, defne tohumlarının sterilizasyonunun ardından tohum kabuğu ve embriyonun sebep olduğu dormansi kırılarak yüksek oranda tohum çimlenmesinin sağlanması amaçlanmıştır. In vitro koşullarda çimlendirilen tohumların yaprak ve sap eksplantları ile arazideki dişi defne ağacından alınan yaprak, sap ve petiol eksplantları enine ve boyuna şekilde İnce Hücre Tabaka (TCL) sistemi ile kesilerek rejenerasyon potansiyelinin belirlenmesine çalışılmıştır. Rejenere edilen defne sürgünleri, mikroçoğaltım denemelerine alındıktan sonra boylarının uzaması için uzama ortamlarına aktarılmışlardır. Boyları en az 3-4 cm'ye ulaşan defne sürgünleri köklendirme ortamlarında köklendirildikten sonra yapraklarındaki uçucu yağ miktarları ve bileşenleri belirlenmiştir. In vitro'da rejenere edilen defne bitkicikleri aklimatize edilerek dış ortam koşullarına alıştırılmaya çalışılmıştır.
Perikarplı ve perikarpsız tohumlara uygulanan 6 farklı sterilizasyon yöntemi sonucunda perikarplı tohumlar için en yüksek steril tohum yüzdesi (%76.6) 1 dk %70'lik etil alkolde ve 5 dk %80'lik çamaşır suyunda bekletmenin ardından 5 kere steril su ile durulama yönteminde elde edilirken;  perikarpsız tohumlar için en yüksek steril tohum yüzdesi (%100)  1 dk %70'lik etil alkol ve 5 dk %0.1'lik HgCl2 ile muamelenin ardından 5 kere steril su ile durulama yönteminde belirlenmiştir.
Tohumlar kültüre alındıktan 6 hafta sonra yapılan gözlemler sonucunda bazı tohumlar çimlenmiş olsa dahi sürgün gelişimi gözlemlenmemiştir. Perikarplı tohumların hiç birinde çimlenme meydana gelmemiştir. En yüksek çimlenme yüzdesi (%33.33) ve sürgün oluşturma yüzdesi (%26.67), perikarpsız ve tohum kabuğuna kesik atılmış defne tohumlarında elde edilmiştir. Dormansiyi kırmak ve çimlenmeyi arttırmak için tohumlara yapılan ön uygulamalar sonucunda; en yüksek çimlenme yüzdesi (%86.67), sürgün oluşturma yüzdesi (%80) ve sürgün uzunluğu (2.43 cm), 1000 mg/L GA3 solüsyonunda 24 saat boyunca bekletilmiş tohumlarda elde edilmiştir. Defne tohumlarına uygulanabilecek en iyi ön uygulama belirlendikten sonra bitki büyüme düzenleyicilerinin de çimlenmeye etkisini saptamak için 1 mg/L BAP, NAA veya GA3 içeren MS besin ortamları kullanılmıştır. En yüksek çimlenme yüzdesi (%100), sürgün oluşum yüzdesi (%100), ortalama olarak sürgün uzunluğu (5.13 cm), kök sayısı (2.07 adet), uzunluğu (7.11 cm), yaprak sayısı (3.43 adet) ve yaprak uzunluğu (0.90 cm) değerleri 1 mg/L GA3 ile desteklenmiş MS ortamında kültüre alınmış tohumlardan elde edilmiştir.
Dişi defne ağacından alınan yaprak, sap ve petiol eksplantlarına da 7 farklı sterilizasyon yöntemi uygulanmıştır. En yüksek steril eksplant yüzdesi, yaprak eksplantları için (%93.33) 5. yöntemde (1 dk %70'lik etil alkolde bekletme, 5 dk %25 çamaşır suyunda bekletme ve 5 kere steril su ile durulama); petiol eksplantları için (%100) 1. yöntemde (1 dk deterjanlı suda çalkalama, 10 dk akarsuda bekletme, 1 dk %0.1'lik HgCl2'de bekletme ve 5 kere steril su ile durulama), 3. yöntemde (1 dk deterjanlı suda çalkalama, 10 dk akarsuda bekletme, 5 dk %0.1'lik HgCl2'de bekletme ve 5 kere steril su ile durulama) ve 6. yöntemde (1 dk %70'lik etil alkolde bekletme, 3 dk %50'lik çamaşır suyunda bekletme ve 5 kere steril su ile durulama); sap eksplantları için (%96.67) 3. yöntemde (1 dk deterjanlı suda çalkalama, 10 dk akarsuda bekletme, 5 dk %0.1'lik HgCl2'de bekletme ve 5 kere steril su ile durulama) ve 5. yöntemde (1 dk %70'lik etil alkolde bekletme, 5 dk %25 çamaşır suyunda bekletme ve 5 kere steril su ile durulama) elde edilmiştir En yüksek kararmamış eksplant yüzdesi, yaprak eksplantları (%83.33) ve petiol eksplantları için (%56.67) 1. yöntemde (1 dk deterjanlı suda çalkalama, 10 dk akarsuda bekletme, 1 dk %0.1'lik HgCl2'de bekletme ve 5 kere steril su ile durulama) tespit edilmiştir. Sap eksplantlarının tamamında kararma gözlemlenemiştir.
In vitro koşullarda çimlendirilmiş tohumların yaprak ve sap kısımlarının ve arazideki dişi defne ağacından alınan yaprak, sap ve petiol kısımlarının enine ve boyuna kesilmiş TCL eksplantları 1, 2 veya 4 mg/L BAP, kinetin, NAA, TDZ, 2,4-D içeren ya da içermeyen MS ve ½ MS temelli farklı besin ortamlarında kallus ve sürgün rejenerasyonun sağlanması için kültüre alınmıştır. Yaprak ve petiol eksplantlarının hiç birinde sürgün rejenerasyonu gözlemlenmemiştir. In vitro koşullarda çimlendirilen defne tohumları için en yüksek sürgün rejenerasyon yüzdesi (%33.33),  4 mg/L BAP içeren ½MS besin ortamında boyuna kesilmiş sap TCL eksplantlarında elde edilirken; arazideki dişi defne ağacı için en yüksek sürgün rejenerasyon yüzdesi (% 26.67) ise 0.5 mg/L TDZ içeren ½MS besin ortamında enine kesilmiş sap TCL eksplantlarında gözlemlenmiştir. Daha sonra sükrozun ve karanlığın sürgün rejenerasyonuna etkisini belirleyebilmek için en yüksek sürgün rejenerasyonu elde edilen besin ortamı kompozisyonlarında farklı sükroz konsantrasyonlarında ve karanlık koşullarda denemeler kurulmuştur. In vitro koşullarda çimlendirilmiş tohumların sap TCL eksplantlarında en yüksek sürgün rejenerasyonu (%16.67), içerisinde 40 g/L sükroz bulunan besin ortamında boyuna TCL eksplantlarında elde edilmiştir. Arazideki dişi defne ağacının sap TCL eksplantlarında ise en yüksek sürgün rejenerasyonu (%16.67), içerisinde 40 g/L sükroz bulunan besin ortamında enine kesilmiş sap TCL eksplantlarında elde edilmiştir. Her iki eksplant kaynağı için de karanlık koşullarda kültüre alınan TCL eksplantlarında sürgün rejenerasyonu gözlemlenemiştir. 
TCL eksplantlarından rejenere edilen sürgünlerin sayılarının arttırılması için kurulan mikroçoğaltım denemeleri sonucunda en yüksek çoğaltım katsayısı  (2.13) 0.5 mg/L BAP ve 0.5 mg/L IBA içeren MS besin ortamında elde edilmiştir. Uzama ortamına aktarılan defne sürgünlerinde en yüksek sürgün uzunluğu (7.15 cm), yaprak sayısı (7.27 adet) ve ortalama yaprak uzunluğu (1.63 cm) 0.5 mg/L GA3 içeren MS besin ortamında sağlanmıştır. Köklendirme ortamlarına aktarılan defne sürgünlerinde en yüksek kök oluşturma yüzdesi (%70), ortalama olarak kök sayısı (1.97 adet) ve kök uzunluğu (4.12 cm) 0.25 mg/L IBA içeren ½ MS besin ortamında belirlenmiştir. 
Neo-Clevenger Uçucu Yağ Tayin cihazı kullanılarak in vitro koşullarda rejenere edilen defne bitkiciklerinin yaptaklarında %1.06 oranında uçucu yağ elde edilmiştir. Uçucu yağın içerisinde %6.71 alfa-pinen, %1.90 kamfen, %5.13 beta-pinen, %6.16 sabinen, %1.73 beta-mirsen, %5.84 beta-felandren, %1.75 limonen, %18.42 1,8-sineol, %3.98 beta-okimen, %3.95 linalol, %1.96 bornil asetat, %11.63 beta-elemen, %0.41 terpinen-4-ol, %3.41 beta-kartofilen, %1.04 beta-farnesen, %0.60 alfa-humulen, %7.77 alfa-terpinil asetat, %1.74 germasiren, %4.84 bisiklogermasiren, %0.43 delta-kadinen, %5.01 metil öjenol, %0.65 sinnamil asetat ve %4.24 tanımlanamayan bileşenler tespit edilmiştir.
TCL eksplantlarından rejenere edilen ve köklendirilen defne bitkiciklerinin aklimatizasyonu sonucunda; 20. günün sonunda 60 adet bitkinin hiç biri canlılığını sürdürememiştir. Bu sebeple aklimatizasyon için torf yerine taş yünlerinin kullanıldığı 2 farklı sistem ile aklimatizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Birinci sistemde aklimatize edilen 26 adet bitkicikten 22 tanesinde taze sürgün, yaprak ve kök gelişimleri (Başarı oranı: %84.6) elde edilirken; ikinci sistemde aklimatize edilen 28 adet bitkiden 26 tanesinde yeni sürgün, yaprak ve kök gelişimleri (Başarı oranı: %92.9) gözlemlenmiştir Daha sonra bu bitkiler torf içeren saksılara aktarılmıştır.

Abstract:
Turkey is one of the leading countries in the production of Laurus nobilis L. (Laurel) plant. Alternative production techniques must be used to meet the increasing demand of the bay plant, which is produced by seed or vegetative methods, and to ensure homogeneous quality. Leaf and stem explants of seeds germinated under in vitro conditions and leaf, stem and petiole explants taken from a female laurel tree in the field were cut transversely and longitudinally with the Thin Cell Layer (TCL) system to determine the regeneration potential. After the regenerated laurel shoots were taken into micropropagation experiments, they were transferred to growth media to increase their length. Following the laurel shoots, which reached at least 3-4 cm in length, were rooted in rooting media, the amount and components of essential oils in their leaves were determined. Laurel plantlets regenerated in vitro were acclimatized and tried to get used to outdoor conditions.
As a result of 6 different sterilization methods applied to seeds with and without pericarp, the highest percentage of sterile seeds for seeds with pericarp (%76.6) was obtained by soaking in %70 ethyl alcohol for 1 minute and % 80 bleach for 5 minutes and then rinsing with sterile water 5 times has been obtained. For seeds without pericarp, the highest percentage of sterile seeds (%100) was determined by treatment with % 70 ethyl alcohol for 1 minute and %0.1 HgCl2 for 5 minutes and rinsing with sterile water 5 times. 
As a result of the observations made 6 weeks after the seeds were cultured, although some seeds germinated, no shoot development was observed. Germination did not occur in any of the seeds with pericarp. The highest germination percentage (%33.33) and shoot formation percentage (%26.67) were obtained in laurel seeds without pericarp and with cuts on the seed coat. As a result of pre-treatments made to the seeds to break dormancy and increase germination; the highest germination percentage (%86.67), shoot formation percentage (%80) and shoot length (2.43 cm) were obtained in seeds soaked in 1000 mg/L GA3 solution for 24 hours. After determining the best pre-treatment to be applied to bay laurel seeds, nutrient media containing 1 mg/L BAP, NAA or GA3 were used to determine the effect of plant growth regulators on germination. The highest germination percentage (100%), shoot formation percentage (100%), average shoot length (5.13 cm), number of roots (2.07), length (7.11 cm), number of leaves (3.43) and leaf length (0.90). cm) values were obtained from seeds cultured in MS nutrient medium containing 1 mg/L GA3.
Seven different sterilization methods were applied to leaf, stem and petiole explants taken from female laurel trees. The highest percentage of sterile explants was observed for leaf explants (%93.33) in the 5th method (soaking in %70 ethyl alcohol for 1 minute, soaking in % 25 bleach for 5 minutes and rinsing with sterile water 5 times); for petiole explants (%100) in the 1st method (rinsing in detergent water for 1 minute, waiting in running water for 10 minutes, waiting in % 0.1 HgCl2 for 1 minute and rinsing with sterile water 5 times), in the 3rd method (rinsing in detergent water for 1 minute, soaking in running water for 10 minutes, soaking in % 0.1 HgCl2 for 5 minutes and rinsing with sterile water 5 times) and in the 6th method (soaking in %70 ethyl alcohol for 1 minute, soaking in %50 bleach for 3 minutes and rinsing with sterile water for 5 minutes); for stem explants (%96.67) in the 3rd method (rinsing in detergent water for 1 min, soaking in running water for 10 min, soaking in %0.1 HgCl2 for 5 min and rinsing with sterile water 5 times) and the 5th method (soaking in %70 ethyl alcohol for 1 min, soaking in %25 bleach for 5 minutes, and rinsing with sterile water 5 times) were obtained. The highest percentage of non-browned explants was obtained for leaf explants (%83.33) and petiole explants (%56.67) in 1th method (rinsing in detergent water for 1 minute, waiting in running water for 10 minutes, waiting in % 0.1 HgCl2 for 1 minute and rinsing with sterile water 5 times). Browning was observed in all stem explants.
. 
Transversely and longitudinally cut TCL explants of the leaf and stem parts of seeds germinated in vitro and the leaf, stem and petiole parts of the female laurel tree in the field were cultured in different MS based nutrient media containing 1, 2 or 4 mg/L BAP, kinetin, NAA, TDZ or 2,4-D to ensure callus and shoot regeneration. No shoot regeneration was observed in any of the leaf and petiole explants. For bay seeds germinated under in vitro conditions, the highest shoot regeneration percentage (33.33%) was obtained in longitudinally cut stem TCL explants on ½MS nutrient medium containing 4 mg/L BAP; the highest shoot regeneration percentage (26.67%) for the female laurel tree in the field was observed in transversely cut stem TCL explants on ½MS nutrient medium containing 0.5 mg/L TDZ. Then, in order to determine the effect of sucrose and darkness on shoot regeneration, experiments were set up at different sucrose concentrations and dark conditions in the nutrient medium compositions that achieved the highest shoot regeneration. The highest shoot regeneration (16.67%) in stem TCL explants of seeds germinated in vitro was obtained in longitudinal TCL explants on nutrient medium containing 40 g/L sucrose. In the stem TCL explants of the female laurel tree in the field, the highest shoot regeneration (16.67%) was obtained in the transversely cut stem TCL explants in the nutrient medium containing 40 g/L sucrose. For both explant sources, shoot regeneration could not be observed in TCL explants cultured in dark conditions.
As a result of micropropagation experiments established to increase the number of shoots regenerated from TCL explants, the highest multiplication coefficient (2.13) was obtained on MS nutrient medium containing 0.5 mg/L BAP and 0.5 mg/L IBA. The highest shoot length (7.15 cm), number of leaves (7.27 number) and average leaf length (1.63 cm) in laurel shoots transferred to growth medium were obtained on MS nutrient medium containing 0.5 mg/L GA3. The highest root formation percentage (%70), average number of roots (1.97 pieces) and root length (4.12 cm) in laurel shoots transferred to rooting media were achieved in ½ MS nutrient medium containing 0.25 mg/L IBA.
In essential oil, %6.71 alpha-pinene, %1.90 camphene, %5.13 beta-pinene, %6.16 sabinene, %1.73 beta-myrcene, % 5.84 beta-phlandrene, %1,75 limonene, %18.42 1,8-cineole, % 3.98 beta-ocimene, %3.95 linalool, %1.96 bornyl acetate, %11.63 beta-elemen, % 0.41terpinene-4- ol, %3.41 beta-cartophyllene, % 1.04beta-farnesene, %0.60 alpha-humulene, %7.77 alpha-terpinyl acetate, %1.74 germasiren, %4.84 bicyclogermasiren, %0.43 delta-cadinene, %5.01 methyl eugenol, %0.65 cinnamyl acetate and %4.24 unidentified components were detected.
As a result of acclimatization of laurel plantlets regenerated and rooted from TCL explants; none of the 60 plants could survive at the end of the 20th day. For this reason, the acclimatization process was carried out with two different systems in which stone wool was used instead of peat. In the first system; fresh shoot, leaf and root development was achieved in 22 of the 26 acclimatized plantlets (Success rate: %84.6). In the second system; new shoot, leaf and root development was observed in 26 of the 28 plants acclimatized (Success rate: %92.9). These plants were then transferred to pots containing peat.