Tiyol-metakrilat polimerizasyonu ile affinite monolitlerinin sentezi ve histidin işaretli protein izolasyonunda kullanımı
The synthesis of affinity monolitshs by thiol-methacrylate polymerization and their usage in histidine tagged protein separation
Yazar: FATMA ÇAMBAY
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN ALİ TUNCEL ; DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; IMAK = IMAC

Özet:
Proteinlerin saflaştırılması için günümüzde birçok yöntem kullanılmaktadır. Saflaştırma işleminin mümkün olduğu kadar az kademede, yüksek verimlilikle ve kısa sürede gerçekleştirilmesi önemlidir. Bu yüzden izolasyon işlemi ile saflaştırılacak olan proteinin özellikleri (amino asit kalıntısı - histidin, triptofan veya sistein gibi) göz önünde bulundurularak en verimli ve etkili ayırma yöntemini seçmek gerekmektedir.
Tez kapsamında immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) kullanılarak, histidin-işaretli proteinlerin seçici ve güvenilir bir şekilde ayrılması için histidin ve geçiş metali iyonları arasındaki metal koordinasyon etkileşimi kullanılmıştır. Histidin grupları iki değerlikli metal iyonu olan Ni2+ ile koordinasyon kompleksi oluşturmaktadır. İç çapı 300 μm olan kapiler kolonda hidrofilik ligand olarak MSA, ana monomer ve çapraz bağlayıcı olarak POSS-MA ve termal başlatıcı olarak AIBN kullanılarak tek basamakta tiyol-metakrilat polimerizasyonu ile monolitik dolgu materyali sentezlenmiştir. NiCl2 çözeltisi kolon içerisinden geçirilerek Ni2+ iyonlarının monolit yüzeyine immobilize olması sağlanmıştır. Ni2+ iyonu immobilize edilmiş MSA-(POSS-MA) kapiler monolitik kolon (IMAC sorbenti) histidin işaretli protein olan yeşil floresan proteinin (green fluorescent protein, GFP),  E. coli bakteri lizatından seçici bir şekilde ayrımı için kullanılmıştır.
SEM görüntüleri, monolit yüzeyinin kolon iç çeperine başarılı bir şekilde tutunduğunu ve gözenekli yapıda olduğunu göstermiştir. Mikro ve makro gözenek yapıcı ajanların (n-bütanol ve etilen glikol) kullanılması nedeniyle monolit dolgu materyali önemli bir yüzey alanına sahiptir. BET analizi sonucuna göre MSA-(POSS-MA) monolitinin yüzey alanı 143 m2/g, Ni2+-MSA-(POSS-MA) monolitinin yüzey alanı ise 116 m2/g olarak bulunmuştur. Sentezlenen Ni2+-MSA-(POSS-MA) kapiler monolitik kolonda 4 µL/dk akış hızında, 3.5 mg/mL başlangıç protein konsantrasyonunda farklı desorpsiyon koşullarında çalışılarak imidazol konsantrasyondaki değişimin protein izolasyonu üzerinde etkisi incelenmiştir. SDS-PAGE analiz sonuçlarına, göre uygun çalışma koşullarında monolitik kolona 25.55 µg GFP adsorplanmış ve 18.74 µg GFP desorplanmıştır. Monolitik sistemde aynı protein konsantrasyonuna (2.1 mg/mL) sahip lizat ile akış hızı taraması yapılarak akış hızının protein izolasyonuna etkisi incelenmiştir. Akış hızı 2 µL/dk iken adsorpsiyon verimi % 61.9, desorpsiyon verimi % 100 olarak tayin edilmiştir. Başlangıç protein konsantrasyonu değişiminin protein izolasyonuna etkisini belirleyebilmek için sentezlenen standart monolitik kapiler kolonlarda 0.4 µL/dk akış hızında, farklı protein konsantrasyonu içeren lizatlar ile çalışılmıştır. Başlangıç protein konsantrasyonu 1.2 mg/mL iken adsorpsiyon verimi %87.6, desorpsiyon verimi %100, izolasyon verimi ise %89.3'tür. Başlangıç protein konsantrasyonu 2.1 mg/mL iken adsorpsiyon verimi %77.6, desorpsiyon verimi %73.9, izolasyon verimi ise %57.3 olarak tayin edilmiştir. Ni2+ iyonunun protein izolasyonuna etkisini belirleyebilmek için Ni2+ içermeyen ve Ni2+ ve MSA içermeyen kolonlar sentezlenmiştir. Adsorpsiyon verimleri Ni2+ iyonu ve MSA içermeyen kolon için  % 9,  Ni2+ içermeyen kolon için %45.8 ve Ni2+-MSA-(POSS-MA) kolon için ise %77.6 olarak bulunmuştur. Ni2+ iyonu içermeyen kolonun desorpsiyon verimi %19.8, izolasyon verimi ise %9'dur. Ni2+-MSA-(POSS-MA) kolonun da desorpsiyon verimi %73.9, izolasyon verimi ise %57.3 olarak tayin edilmiştir.

Abstract:
There are many methods currently available for the purification of proteins. It is important that the purification process is carried out in as little steps as possible, with high purity and in a short time. Therefore, it is necessary to choose the most efficient and effective separation method by taking into consideration the properties of the protein to be purified by isolations (such as amino acid residue - histidine, tryptophan or cysteine). 
Within the scope of this thesis, metal coordination interaction between histidine and transition metal ions is used to selectively and reliably separate histidine-labeled proteins using immobilized metal affinity chromatography (IMAC). Histidine groups form coordination complex with divalent metal ion Ni2+. Column packing material was synthesized in a capillary column with internal diameter of 300 μm with thiol-methacrylate polymerization using MSA as hydrophilic ligand, POSS-MA as main monomer and crosslinker and AIBN as thermal initiator. NiCl2 solution was passed through the column so that Ni2+ ions were immobilized on the monolith surface. Ni2+ ion-immobilized MSA-(POSS-MA) capillary monolithic column (IMAC sorbent) was used for the selective separation of green fluorescent protein (GFP), a histidine-labeled protein, from E. coli bacteria lysate.
SEM images showed that the monolithic surface was porous and it successfully adhered to the inner wall of the column. Due to the use of micro and macro porosity agent (n-butanol and ethylene glycol), the monolith packing material has a very large surface area. According to the results of BET analysis, the surface area of MSA-(POSS-MA) monolith was 143 m2/g and the surface area of Ni2+-MSA-(POSS-MA) monolith was 116 m2/g. Effect of change in imidazole concentration on protein isolation was investigated in the synthesized Ni2+-MSA-(POSS-MA) cappilary column at 4 µL/min flow rate and 3.52 mg/mL initial protein concentration at different desorption conditions. According to SDS-PAGE analysis, 25.55 µg GFP was adsorbed and 18.74 µg GFP was desorbed under suitable experiment conditions.
Adsorption efficiency was determined as 61.9% and desorption efficiency as 100%, while the flow rate was 2 µL/min. In order to determine the effect of the initial protein concentration change on protein isolation, lysates containing different protein concentrations were studied in synthesized standard monolithic capillary columns at 0.4 µL/min flow rate. When the initial protein concentration was 1.2 mg/mL; adsorption efficiency was found 87.6%, desorption efficiency was found 100% and isolation efficiency was found 89.3%. When the initial protein concentration was 2.1 mg/mL; adsorption efficiency was found 77.6%, desorption efficiency was found 73.9% and isolation efficiency was found 57.3%. In order to determine the effect of Ni2+ ion on protein isolation, both nickel-free and nickel-MSA-free columns were synthesized. Adsorpsion efficiency was found 9% for nickel-MSA-free column, 45.8% for nickel-free column and 77.6% for Ni2+-MSA-(POSS-MA) column. For nickel- free column, desorption efficiency was found 19.8% and the isolation efficiency was found 9%. For standard Ni2+-MSA-(POSS-MA) column, desorption efficiency was found 73.9% and the isolation efficiency was found 57.3%.