Çocukluk çağı medulloblastomlarında moleküler alt sınıflandırma
Molecular subclassification of pediatric medullablastomas
Yazar: NAZ KANIT
Danışman: PROF. DR. ERDENER ÖZER
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology ; Çocuk Cerrahisi = Pediatric Surgery
Dizin: Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Gen ifadesi = Gene expression ; Medulloblastom = Medulloblastoma ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Çocukluk dönemi = Childhood ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Medulloblastom özellikle çocuklarda olmakla beraber her yaşta görülebilen, santral sinir sisteminin en sık rastlanılan embriyonal tümörleri arasında yer alır. Dünya Sağlık Örgütü sınıflamasına göre Derece IV olarak kabul edilir ve genellikle prognozu oldukça kötüdür. Medulloblastomlar WNT-aktive, SHH-aktive, Grup 3 ve Grup 4 olmak üzere dört temel alt gruba ayrılmaktadır. Alt gruplar arasındaki epigenetik değişikliklerin önemi son yıllarda vurgulanmış olup özellikle anormal promotor hipermetilasyonlarının hastalığın kliniği ile ilişkisi önem kazanmıştır.
Bu çalışmanın amacı, çocukluk çağı medulloblastom hastalarında moleküler alt sınıflandırmanın yapılması ve analiz edilen metilasyonel değişikliklerin yapılan sınıflandırma ile ilişkisinin ortaya koyulmasıdır.
Bu amaçla, Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji arşivlerinden çıkarılan 47 pediatrik medulloblastom olgusuna ait formalin fikse parafine gömülü doku ve hastalara ait demografik ve klinik veriler kullanıldı. Tüm olgular için histolojik tanıların konfirmasyonu yapıldı. İmmünohistokimya yöntemi kullanılarak nükleer beta-katenin lokalizasyonu gösteren tümörler WNT-aktive; sitoplazmik beta-katenin lokalizasyonu, GAB1 ve YAP1 ekspresyonu gösteren tümörler ise SHH-aktive medulloblastomlar olarak sınıflandırıldı. SHH-aktive medulloblastomlarda, p53 ekspresyon seviyelerine göre TP53 mutant olmayan ve TP53 mutant alt grupları tanımlandı. Beta-katenin ekspresyonu görülmeyen tümörler WNT/SHH-aktive olmayan (Grup 3 ve 4) medulloblastomlar olarak adlandırıldı. 
Dokulardan izole edilen DNA'lar kullanılarak bisülfit çevrimi sonrası CDKN2A, RASSF1A, HIC1, ZIC2, SPINT2, SFRP1, KLF4, PTCH1 ve EZH2 genlerinin metilasyon durumları pirosekanslama yöntemi ile incelendi. DNA metilasyon analizleri sonucunda KLF4, PTCH1 ve ZIC2 genlerindeki hipermetilasyonların SHH-aktive medulloblastomlarla ilişkili olduğu bulundu. SPINT2 geninin hipermetilasyonu ve RASSF1A geninin yüksek dereceli hipermetilasyonlarının metastaz ile istatistiksel olarak anlamlı bir ilişkisi olduğu belirlendi. CDKN2A, HIC1 ve SFRP1 genlerindeki metilasyon çalışmaları güvenli sonuçlar vermediğinden hastalıkla ilişkilendirilemedi. Hiçbir örnekte EZH2 geninin hipermetilasyonuna rastlanılmadı.
Araştırmamız, medulloblastomlardaki epigenetik değişikliklerin klinik seyrin öngörülmesinde önemli bir araç olabileceğini ve özellikle KLF4, PTCH1, ZIC2, SPINT2 ve RASSF1A genlerinin bu hastalıktaki potansiyel onkolojik önemini ortaya koymuştur.

Abstract:
Medulloblastoma is one of the most common embryonal tumors of the central nervous system, which can be seen at any age, especially in children. It is considered Grade IV according to the World Health Organization classification and generally has a very poor prognosis. Medulloblastomas are divided into four basic subgroups: WNT-activated, SHH-activated, Group 3 and Group 4. The importance of epigenetic changes between subgroups has been emphasized in recent years, and the relationship between abnormal promoter hypermethylations and the clinic of the disease has become a significant research topic.
The aim of this study is to investigate the significance of molecular subclassification in pediatric medulloblastoma cases and to analyze the methylation status of the selected genes for their prognostic significance.
For this purpose, formalin fixed paraffin embedded tissues of 47 pediatric medulloblastoma cases were obtained from the archives of Dokuz Eylül University Hospital Patology Department, alongside demographic and clinical data of the patients. A revision of past histological diagnoses was performed for all tissues. Using immunohistochemistry, tumors showing nuclear beta-catenin localization were classified as WNT-activated; tumors showing cytoplasmic beta-catenin positivity, GAB1 and YAP1 expression were classified as SHH-activated medulloblastomas. In SHH-activated medulloblastomas, TP53 wildtype and TP53 mutant subgroups were identified according to p53 immunopositivity. Tumors without beta-catenin expression were defined as non-WNT/SHH-activated (Groups 3 and 4) medulloblastomas. 
The methylation status of CDKN2A, RASSF1A, HIC1, ZIC2, SPINT2, SFRP1, KLF4, PTCH1 and EZH2 genes were examined by pyrosequencing method after bisulfite conversion using DNA isolated from tissues. As a result of DNA methylation analysis, hypermethylations in KLF4, PTCH1 and ZIC2 genes were associated with SHH-activated medulloblastomas. Hypermethylation of the SPINT2 gene and high-grade hypermethylation of the RASSF1A gene were found to have a statistically significant relationship with the presence of metastasis. Methylation studies in CDKN2A, HIC1 and SFRP1 genes could not be associated with the disease since they did not provide optimal results. Hypermethylation of the EZH2 gene was not detected in any of the samples.
We conclude that detection of methylation status in medulloblastomas may be an important tool in predicting the clinical course and the potential importance of methylation changs of KLF4, PTCH1, ZIC2, SPINT2 and RASSF1A genes in this disease.