PANC-1 ve BXPC-3 hücre hatlarında CRISPR/Cas9 yöntemi ile NUSAP1 geninin susturulmasının pankreas kanserinde Epitelyal-Mezenkimal Transizyon (EMT) ve tümör progresyonu üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of NUSAP1 gene silencing by CRISPR/Cas9 method in PANC-1 and BXPC-3 cell lines on Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) and tumor progression in pancreatic cancer
Yazar: MERVE GÖKBAYRAK
Danışman: DOÇ. DR. NACİ ÇİNE
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı / Tıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Gen susması = Gene silencing ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Pankreas kanseri hücre hattı =

Özet:
Pankreas kanseri (PK), erken metastaz ve yüksek mortalite ile karakterize edilen en ölümcül kanser türlerinden biridir. 
Metastaz ve tümör ilerlemesi, pankreas duktal adenokarsinomundan hastalarda başlıca ölüm nedenidir. Tümör büyümesi ve özellikle yayılma, tipik olarak epitelden mezenkime transizyon (EMT) programının aktivasyonu ile ilişkilidir EMT, epitel hücrelerinin mezenkimal özellikleri benimsemesini sağlayan ve göç etme yeteneklerini artıran hücresel bir süreçtir.  
Erken evre Pankreas kanserinde prognostik bir biyolojik belirteç olarak nükleolar ve iğ ile ilişkili protein 1'in (NUSAP1) çeşitli veri tabanlarında yüksek ekspresyon seviyesi tanımlanmıştır. NUSAP1 geninin düzensiz ekspresyonu, G2 / M kontrol noktasında mikrotübül demetlenmesini ve hücre döngüsü tutuklanmasını indükler. Hücre döngüsünün düzensizliği ise PK hücrelerinin proliferasyonu, invazyonu ve metastazı ile ilişkili biyolojik davranışlarda anahtar faktördür. NUSAP1'in, çeşitli solid kanser türlerinde gelişme, ilerleme, metastazda ve EMT sürecinde  rol oynadığı bilimsel çalışmalarla ortaya konmuştur. Yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde NUSAP1 geni yeni farmakolojik hedeflerden biri olabilir. 
Bu projede pankreas kanseri hücre hatlarında NUSAP1 geninin CRİSPR/Cas9 genom düzenleme tekniği ile susturulup EMT üzerine etkisine bakılacaktır. Elde edilen verilerle NUSAP1 geninin pankreas kanserinin progresyonundaki rolünü açıklamak hedeflenmiştir. 
Yöntem: Çalışmanın ilk basamağında PANC-1 ve BXPC-3 hücre hatlarından hücre kültürü çalışması yapılmıştır. NUSAP1 geninde belirlenen hedef bölgenin CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak en doğru şekilde düzenlenmesi amacıyla 3 farklı sgRNA dizayn edilerek  in vitro transkripsiyon ve tarama çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Hedef bölgede meydana gelen düzenlemeler  mutasyon saptama analizi ve erime eğrisi  çalışmaları ile analiz edilmiştir.
Pankreas kanserinde CRISPR/Cas9 uygulanan  hücrelerin tümör progresyonu üzerine etkisi; gen ifade analizleri, hücre invazyon ve proliferasyon çalışmaları ile analiz edilerek ortaya konmuştur.
Bulgular: BXPC-3 hücre hattında iki farklı deney grubu monoklonal ve poliklonal gruplar ekspresyon farklılığı gen ifade analizi ile ortaya konmuştur. PANC-1 hücre hattnda deney grubu oluşturulmak üzere CRISPR/Cas9 uygulanan  hücrelerin hücre kültürü çalışması yapılmıştır ama kültür ortamında çoğalması sağlanamamıştır. Hedef bölgede çift zincir kırığına bağlı çerçeve kayması mutasyona sebep olan indellerin gösterilmiştir. Buna bağlı olarak; BXPC-3 hücrelerinin invazyon oranının azaldığı (p<0.05), NUSAP1 geni ve EMT ile ilgili CDH2, SNAI2 Vimentin TWİST ve MMP ifadelerinin azaldığı (p<0.05), hücrelerin proliferasyon yeteneklerinin inhibe edildiği gözlenmiştir. 
Sonuç: Pankreas kanserinde NUSAP1' in CRISPR/Cas9 ile susturulmasının EMT ilerlemesini inhibe edebileceğini hücre göçü, invazyonu ve proliferasyonunda rol aldığı gösterilmiştir. Tümör progresyonu rolü nedeniyle CRISPR/Cas9 teknolojisi ile NUSAP1'in hedeflenmesinin klinik sonuçları iyileştirmek için yeni tedavi stratejileri geliştirmeye ve PK patogenezine yeni bakış açıları sağlamaya yardımcı olacağını düşünmekteyiz.

Anahtar Kelimeler: Pankreas Kanseri, CRISPR/Cas9, NUSAP1 ,EMT

Abstract:
Pancreatic cancer (PC) is one of the most lethal types of cancer, characterized by early metastasis and high mortality. 
Metastasis and tumor progression is the leading cause of death in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma. Tumor growth, and especially invasion, is typically associated with activation of the epithelial-to-mesenchyme transition (EMT) program. EMT is a cellular process that enables epithelial cells to adopt mesenchymal properties and increases their ability to migrate.  High expression level of nucleolar and spindle-associated protein 1 (NUSAP1) has been identified in several databases as a prognostic biomarker in early stage pancreatic cancer. Dysregulated expression of the NUSAP1 gene induces microtubule bundling and cell cycle arrest at the G2/M checkpoint. Cell cycle dysregulation is a key factor in biological behaviors associated with proliferation, invasion and metastasis of PC cells. Scientific studies have demonstrated that NUSAP1 plays a role in the development, progression, metastasis and EMT process in various solid cancer types. NUSAP1 gene may be one of the new pharmacological targets in the development of new treatment strategies. 
In this project, we will silence the NUSAP1 gene in pancreatic cancer cell lines by CRISPR/CAS9 genome editing technique and examine its effect on EMT. With the data obtained, it is aimed to explain the role of NUSAP1 gene in pancreatic cancer progression.
Methods: In the first step of the study, cell culture studies were performed from PANC-1 and BXPC-3 cell lines. In vitro transcription and screening studies were carried out by designing 3 different sgRNAs in order to edit the target region determined in the NUSAP1 gene in the most accurate way using CRISPR/Cas9 technology. Mutation analysis of the editing in the target region was analyzed by mutation detection kit and melting curve studies.
The effect of CRISPR/Cas9 on tumor progression in pancreatic cancer cells was analyzed by gene expression analysis, cell invasion and proliferation studies.the target region were analyzed by gene expression assays, cell invasion and proliferation studies.
Results: Differences in expression between monoclonal and polyclonal groups of two different experimental groups in the BXPC-3 cell line were revealed by gene expression analysis. Frame shift due to double chain breakage in the target region was shown to be the indels causing mutation. Accordingly, it was observed that the invasion rate of BXPC-3 cells decreased (p<0.05), the expression of NUSAP1 gene and EMT-related CDH2, Vimentin decreased (p<0.05), and the proliferation ability of the cells was inhibited.
Conclusion: CRISPR/Cas9 silencing of NUSAP1 in pancreatic cancer can inhibit EMT progression and has been shown to be involved in cell migration, invasion and proliferation. Due to its role in tumor progression, we believe that targeting NUSAP1 with CRISPR/Cas9 technology will help to develop new therapeutic strategies to improve clinical outcomes and provide new insights into PC pathogenesis.

Keywords: Pancreatic Cancer, CRISPR/Cas9, NUSAP1 , EMT