Orak hücreli anemide NETosis
NETosis in sickle cell anemia
Yazar: GÜRCAN GİZEM HATEM
Danışman: DOÇ. DR. ANIL TOMBAK
Mersin Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Hematoloji = Hematology

Özet:
AMAÇ:Orak hücreli anemide inflamasyon ve tromboz artmıştır. NETosis, birçok
inflamatuar ve malign hastalıkta artmıştır ve trombozla ilişkilidir. Bu çalışmada, orak
hücreli anemili hastalarda uyarılmamış nötrofillerde NETosis'in artıp artmadığının
araştırılması amaçlanmıştır.
MATERYAL VE METOT: Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji bölümüne
başvuran orak hücreli anemili hastaların ve sağlıklı kişilerin kan örnekleri, onamları
alındıktan sonra alınmıştır. Çalışmaya, 25 (yirmibeş) orak hücreli anemi hastası ve
kontrol grubuna da 25 (yirmibeş) sağlıklı birey dahil edilmiş, hastaların ve sağlıklı
bireylerin 2 mL'lik venöz kan örnekleri, nötrofil elastaz enzim düzeyi için EDTA'lı tüpe,
Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı polikliniğinde alınmıştır. Nötrofil
izolasyonu için EDTA'lı tüpe alınan kan örnekleri 4000 devirde 10 dakika santrifüj
edildikten sonra +4 ºC'de Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi, biyokimya laboratuarında
saklanmıştır. Tüm kan örnekleri aynı anda çalışılmıştır. MACSxpress® Neutrophil
Isolatıon Kit Human kullanılarak elde edilen nötrofiller NETs oluşumu için kullanılmıştır.
NETosis ASSAY Kit aşamasında hücreler NET assay buffer ile süspanse edilip inkübe
edildikten sonra santrifüj edilerek nötrofil elastaz enzim aktivitesi çalışılması için
toplanmıştır. Elde edilen supernatantlara NET Assay Neutrophil Elastase Substrate
eklenerek inkübe edildikten sonra plate üzerindeki film açılarak 405 nm de
okutulmuştur. Standartlardan faydalanarak konsantrasyon absorbans grafiği çizilmiş
ve hesaplamalar Tıbbi Farmakoloji Laboratuarında ve Biyokimya hesaplanmıştır.
İmmun floresan ve taramalı elektron mikroskobu görüntüleri için hasta ve kontrol
gruplarından kan örnekleri alınarak uygun protokollerle hazırlanmıştır.
BULGULAR: Çalışmada; orak hücreli anemili hastalarda sağlıklı bireylere kıyasla
NETosis oluşumunun arttığı gösterilmiştir, bununla beraber her 2 grup arasında
istatistiki bir fark saptanmamıştır (p=0,329). Ağrılı kriz sayısının artmasıyla NETosis
oluşumunun arttığı da gösterilmiştir.
SONUÇ: Bu çalışmada, orak hücreli anemili hastalarda sağlıkla bireylere kıyasla
NETosis oluşumunun arttığı gösterilmiştir. NETosis oluşumun orak hücreli anemi
hastalığının etiyopatogenezine katkısına dair daha fazla sayıda vaka ile yapılmış daha
fazla sayıda çalışmaya ihtiyaç vardır.

Abstract:
OBJECTIVE: The aim of this study was to demonstrate the increased inflammation in
sickle cell anemia by demonstrating the activity of NETosis and to regulate the
prophylaxis necessary for life-threatening thrombosis, which may occur at the end of
this process.
MATERIAL AND METHODS:Blood samples of patients with sickle cell anemia and
healthy persons who applied to Mersin University Medical Faculty Hematology
Department were taken after their consent was obtained. Twenty-five (25) and 25
(twenty-five) healthy individuals were included in the study. 2 mL venous blood
samples of the patients and healthy individuals, EDTA tube for neutrophil elastase
enzyme level, received at Mersin University Medical Faculty Hematology Department.
Blood samples taken into EDTA tube for neutrophil isolation were centrifuged at 4000
rpm for 10 minutes and stored at +4 ºC at Mersin University Medical Faculty
biochemistry laboratory. All blood samples were studied simultaneously. Neutrophils
obtained using MACSxpress® Neutrophil Isolation Kit Human were used for NETs
formation. In the NETosis ASSAY Kit stage, cells were suspended with NET assay
buffer and incubated, then centrifuged to collect neutrophil elastase enzyme
activity.The supernatants were incubated with the addition of NET Assay Neutrophil
Elastase Substrate and the film on the plate was opened at 405 nm. The concentration
absorbance graph was drawn by utilizing the standards and the calculations were
calculated in the Medical Pharmacology Laboratory and Biochemistry.
Blood samples from patient and control groups were prepared for appropriate
fluorescence and scanning electron microscope images and prepared with appropriate
protocols.
RESULTS: Although no statistically significant difference was found, we showed that
NETosis formation increases in patients with sickle cell anemia compared to healthy
subjects (p=0,329). We also showed that NETosis formation increses with the
increasing number of painfull crisis in these patients.
CONCLUSION:
In this study, it has been shown that NETosis formation increases in patients with sickle
cell anemia compared to individuals with health subjects. However, more studies with
larger number of cases are needed for understnading the NETosis in the
ethiopathogenesis of sickle cell disease.