Design of biodegradable hydrogels for the development of in vitro models for glioblastoma multiforme
Biyobozunur hidrojellerin glioblastoma multiform için in vitro modellerin geliştirilmesi için tasarlanması
Yazar: PELİN ERKOÇ
Danışman: DOÇ. DR. SEDA KIZILEL ; YRD. DOÇ. TUĞBA BAĞCI ÖNDER
Koç Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomedikal Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
Glioblastoma multiforme (GBM) beyin tümörünün en sık görülen ve kötü huylu türüdür. GBM yetişkin kanserlerinin sadece %1'ini oluştursa da, kötü huylu yapısı nedeniyle kanser sebepli ölümlerde dördüncü sırayı GBM teşkil eder.
Bir çok etken nedeniyle GBM'in klinik tedavisi zorludur. Bu etkenler arasında ameliyat, radyoterapi ve kemoterapi gibi geleneksel tedavilere karşı direncin yanı sıra beyin kan bariyerinin (BBB) seçici geçirgen yapısından dolayı yan etkiler olmaksızın istenilen seviyede kemoterapötik etkiye ulaşılamaması gösterilebilir. Bu nedenle GBM hastaları için yeni tedavi seçenekleri gereklidir.
GBM hücrelerinin sonradan edindiği, bağışıklık sisteminden ve apoptozdan kaçmak gibi özellikler, tedavilerin başarısızlıkla sonuçlanmasına neden olmaktadır. Dolayısı ile dış güdümlü apoptoz yolağının reseptörlerine bağlanan ligantların kullanılmasıyla apoptozu yeniden aktif hale getirebilen yöntemler klinik tedaviler için gelecek vaadedebilir. Bu kapsamda, sağlıklı hücrelere zarar vermeden kanserli hücrelerde apoptozu tetiklemesi bakımından Tümör-nekroz-faktör ilişkili apoptoz indükleyici ligand (TRAIL) mükemmel bir aday olarak karşımıza çıkmaktadır. Buna ragmen, TRAIL'ın verimi tümör populasyonlarında var olan ve/veya sonradan kazanılan terapötik maddelere direnç nedeniyle kısıtlanmaktadır. Biz son çalışmalarımızda in vitro TRAIL direncini yenmek amacıyla sinerjistik etki yaratabilecek bilinen başka anti-kanser ilaçlarını TRAIL ile birlikte kullandık.
Terapötik moleküllerin anti-kanser etkisini arttırmak için bir başka yöntem de biyomalzeme temelli araçların ilaçların tümörün olduğu bölgeye doğru iletimini sağlamak için kullanılmasıdır. Bu araçlar terapötik moleküller vücutta istenilen bölgede, dışarıdan bir uyarıcı sinyal varlığında salınacak şekilde geliştirilebilmektedirler.
Biyomalzemeler GBM çalışmaları için beyin ortamını taklit eden 3D platformlar tasarlamak için de kullanılmıştır. Bu in vitro modellerin geliştirilmesi, in vitro 2D ilaç denemeleri ile in vivo hayvan çalışmaları arasındaki boşluğu doldurmaktadır. Başarılı tedaviler için etkili stratejiler geliştirmek için GBM mikro-ortamının doğasını anlama konusunda da umut vaat ediyor.
Bu tezde, biyolojik olarak parçalanabilir malzemelerden hidrojel sentezlemeyi ve bu hidrojellerin GBM terapisi için biyolojik olarak uygunluğunu in vitro olarak araştırmayı amaçladık. Öncelikle, iki molekülün eşzamanlı olarak verilmesi için PEG hidrojel taşıyıcıları geliştirdik. Bu amaçla TRAIL ile birlikte son keşfedilen TRAIL sensitizörlerinden biri olan Kinakrin'i (QC) kullandık. Kısaca, Matriks metalloproteinaz (MMP) enzimi ile parçalanabilir PEG hidrojel taşıyıcılar, görünür ışık ile indüklenen su-içinde-su emülsiyon polimerizasyonu yoluyla sentezlenmiştir. Şişme, bozunma, boyut ve morfoloji gibi hidrojellerin kritik biyofiziksel özellikleri karakterize edildi. QC, hidrojel taşıyıcılarına yüklendi ve bu ilacın GBM'nin apoptozu üzerindeki etkisi, hücre canlılığı testi ve kantitatif gerçek zamanlı polimer zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanılarak apoptozla ilişkili gen ekspresyon profili aracılığıyla araştırıldı. Sonuç olarak, bu MMP'ye duyarlı parçacıkların sitokompatible olduğu ve QC ile yüklendiklerinde GBM hücrelerinde TRAIL'in indüklediği apoptozu teşvik etmekten daha üstün olduğunu bulundu. QC ve TRAIL'in tek başına uygulamaları ile karşılaştırıldığında, QC yüklü PEG hidrojel ile TRAIL kombinasyonu sinerjik olarak apoptozu indükleyici davranış sergiledi. Buna ek olarak, apoptoz ile ilişkili genlerin ekspresyonlarının analizi ile QC yüklü PEG hidrojellerinin, sadece QC veya sadece PEG-hidrojelleri kullanımına göre, apoptozu daha fazla arttırdığı bulundu.
Çalışmalarımızın ikinci bölümünde, 3D GBM mikro-çevresini taklit edebilmek için görünür ışık ile indüklenen jelatin-metakrilat (GelMA) hidrojelleri tasarladık. Literatürde ilk defa, reaksiyonun ilave bir çapraz bağlayıcı yokluğunda gerçekleştirildiği, görünür ışık ile indüklenen jelatin çapraz bağlamayı kullanan bir strateji ortaya koyduk. Görünür ışık ile indüklenen çapraz bağlanma, sentez süreci boyunca hücresel DNA hasarından ödün vermeksizin basit ve ucuz bir şekilde kanser mikro çevresi-taklidi sisteminin tasarımına izin verir. Bu yaklaşımı kullanarak, bu 3D hidrojel ağındaki hücresel davranış ve gen ekspresyon profillerini araştırmak için GBM hücrelerinden süspansiyon ve kürecik şeklinde modellerin geliştirilmesini başarmış olduk. Ayrıca malignite ve apoptoz ile ilişkili genlerin mRNA ekspresyonları ve Dijitoxigenin ilacının anti-GBM özellikleri detaylı olarak araştırılmıştır.
Genel olarak bu tez çalışması kapsamında, QC ve TRAIL'in MMP'ye duyarlı PEG nanotaşıyıcılarına dahil edilmesiyle kemoterapötiklerin etkinliğini artırmak için umut verici bir yaklaşım geliştirdik ve GBM için bir tedavi önerdik. Ayrıca, ışıkla indüklenen jelatinin, suni bir 3D tümör mikro-ortamı oluşturularak habis kanser hücresi davranışının analiz edilmesine olanak tanımasıyla kanser araştırmalarının klinik çevirisi için umut verici bir aday olduğu ön görülmüştür.

Abstract:
Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and malignant type of primary brain tumor. Even though GBM constitute only 1% of adult cancer, its malignant nature makes GBM the fourth highest reason of cancer-related deaths.
Numerous factors make the clinical treatment of GBM challenging. These factors include the resistance of tumors to conventional therapies such as surgery, radiation therapy and chemotherapy and difficulties in achieving the desired chemotherapeutic effect without side effects due to the selective permeability of blood–brain barrier (BBB). Therefore, new treatment options are needed for GBM patients.  
Evading from the immune system of the patient and apoptosis are some of the acquired features of GBM cells that results in inefficient treatments. Hence, strategies that can reactivate apoptosis through the use of ligands interacting with receptors of extrinsic apoptosis pathway can be promising for clinical treatments.  In this context, TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a perfect candidate for GBM treatment since TRAIL can induce apoptosis particularly in cancer cells without damaging healthy cells. However, the efficacy of TRAIL is limited by the intrinsic and/or acquired resistance of tumor cell populations to the therapeutic substance. In our recent studies, we have combined the other anti-tumor therapeutics along with TRAIL to achieve a synergistic effect and successfully have overcome TRAIL resistance in vitro.
Another strategy to reach increased anti-cancer effect from therapeutics involves the design of biomaterial-based vehicles to deliver drug through the tumor. These vehicles can be modified to enhance their ability to deliver therapeutics to specific regions of the body in response to an external stimulus. Biomaterials have also been used for designing brain-mimetic 3D platforms for GBM studies. The development of these in vitro models bridges the gap between in vitro 2D drug trials and in vivo animal studies. It is also promising for understanding the nature of GBM microenvironment to build efficient strategies for successful treatments. 
In this thesis, we aimed to synthesize hydrogels from biodegradable materials and investigate their biocompatibility for GBM therapy, in vitro. First, we developed PEG hydrogel carriers for simultaneous delivery of the two molecules, Quinacrine (QC), a recently discovered TRAIL sensitizer drug, and TRAIL. Briefly, Matrix-metalloproteinase (MMP) degradable PEG hydrogel carriers were synthesized via visible-light-induced water-in-water emulsion polymerization. Critical biophysical properties of the hydrogels such as swelling, degradation, size and morphology were characterized. QC was loaded into the hydrogel carriers, and the effect of this drug on apoptosis of GBM was investigated through cell viability assay and apoptosis-related gene expression profile using quantitative real-time polymer chain reaction (qRT-PCR). The results suggested that these MMP-sensitive particles were cytocompatible and they are superior to promote TRAIL induced apoptosis in GBM cells when loaded with QC. Compared to the applications of QC and TRAIL alone, combination of QC-loaded PEG hydrogel and TRAIL demonstrated synergistic apoptosis inducing behavior. Furthermore, QC-loaded PEG hydrogels, but not QC or PEG-hydrogels alone, enhanced apoptosis as measured through expression of apoptosis-related genes. 
In the second part of our work, we designed visible light-induced GelMA hydrogels to mimic 3D GBM microenvironment. For the first time in the literature we demonstrated a strategy that exploits visible-light-induced crosslinking of gelatin where reaction was carried out in the absence of an additional crosslinker. Visible light-induced crosslinking permits the design of cancer microenvironment-mimetic system in a simple and inexpensive way without compromising the cellular DNA damage during the process. By using this approach, we accomplished the development of suspension and spheroid-based models for GBM to investigate cellular behavior and gene expression profiles within this 3D hydrogel network. Furthermore, mRNA expressions of malignancy and apoptosis-related genes, and sensitivity to an anti-cancer drug Digitoxigenin treatment were investigated in detail.  
Within the scope of this thesis study, we developed a promising approach to improve the efficacy of chemotherapeutics and suggested a treatment for GBM via incorporation of QC and TRAIL into MMP-sensitive PEG nanocarriers. The photocurable gelatin is a promising candidate for clinical translation of cancer research through the analysis of malignant cancer cell behavior within an artificial 3D tumor microenvironment.
In summary, this thesis truly includes interdisciplinary aspects of material science,  engineering and medicine such as the design of tumor microenvironment with biochemical and biophysical cues within scaffolds to address the clinical limitations of existing strategies, in particular for the treatment of GBM.