V. vinifera ve C. spinosa ekstraktlarının hepatosellüler karsinom üzerindeki in vitro etkileri
in vitro effects of V. vinifera and C. spinosa extracts on hepatocellular carcinoma
Yazar: FATMA SENA DUMLU
Danışman: DOÇ. DR. ERAY METİN GÜLER
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Hamidiye Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Beslenme ve Diyetetik = Nutrition and Dietetics ; Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
Amaç: Hepatoselüler karsinom (HSK), en yaygın primer karaciğer malignitesidir ve dünya çapında kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Bitkisel ilaçlarda bulunan bileşiklerin çeşitli doku hücreleri üzerinde antioksidan ve prooksidan etkileri olduğu gösterilmiştir. Çalışmamızın amacı Vitis vinifera (V. vinifera) ve Capparis spinosa (C. spinosa)'nın hepatoselüler karsinom ve sağlıklı hepatositler üzerindeki etkilerini in vitro olarak değerlendirmektir.
Gereç ve Yöntem: C. spinosa bitkisinin kuru ve yaş tomurcukları ve V. vinifera'nın çekirdeği farklı çözücülerle ekstrakte edilmiştir. Ekstraktların total fenol, total flavonoid, total antioksidan içerik analizleri gerçekleştirilmiştir. Ekstraktlar insan hepatoselüler karsinomu (HepG2) ve sağlıklı hepatosit (THLE-2) üzerinde in vitro olarak çalışılmıştır. Hücreler, farklı konsantrasyon değerlerindeki C. spinosa ve V. vinifera ekstraktları (62,25-3000 μg/mL) ile 24 saat inkübe edilip hücre canlılığı ATP testi ile lüminometrik olarak ölçülmüştür. Sitotoksik etkisi en iyi olan ekstraktlarla deneylere devam edilmiştir. Hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyeleri 2',7'-dikhloro-dihidrofluoresin-diasetat (H2DCF-DA) floresan probuyla florometrik olarak, mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) 3,3' diheksiloksakarbosiyanin iyodür (DiOC6(3)) boyasıyla florometrik olarak, hücre içi kalsiyum seviyeleri Fura-2AM boyasıyla, hücre içi glutatyon düzeyleri lüminometrik olarak, apoptoz akridin turuncusu/ etidyum bromür (AT/EB) çift boyası ile floresans mikroskopta ve DNA hasarı alkalen tek hücre jel elektroforezi yöntemi ile analiz edilmiştir.
Bulgular: Deney sonuçlarında C. spinosa ve V. vinifera ekstraktlarının hepatoselüler karsinom hücrelerinde ve sağlıklı hepatositlerde artan konsantrasyonlarına bağlı olarak sitotoksisiteyi arttırdığı bulunmuştur. HepG2 ve THLE-2 hücrelerinde hücre içi ROS ve hücre içi kalsiyum seviyeleri artmış, MMP ve hücre içi glutatyon düzeyleri ise azalmıştır. Bunların sonucunda apoptoz ve DNA hasarı indüklenmiştir. HepG2 hücreleri THLE-2'ye kıyasla hücre içi ROS ve hücre içi kalsiyum seviyelerinde istatistiksel anlamlı olarak daha fazla artış göstermiştir. MMP ve hücre içi glutatyon düzeylerinde ise istatistiksel anlamlı olarak daha fazla azalma göstermiştir. 


Sonuç: Çalışmamızla C. spinosa ve V. vinifera ekstraktlarının HepG2 ve THLE-2 üzerinde sitotoksik ve apoptotik etkileri olduğu ortaya koyulmuştur. Ancak bitkilerin detaylı olarak araştırıldığı daha fazla in vitro çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Aim: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common primary liver malignancy and the leading cause of cancer-related death worldwide. Compounds found in herbal medicines have been shown to have antioxidant and prooxidant effects on various tissue cells. The aim of our study was to evaluate the in vitro effects of Vitis Vinifera (V. vinifera) and Capparis spinosa (C. spinosa) on hepatocellular carcinoma and healthy hepatocytes.
Materials and Methods: Dry and fresh buds of C. spinosa and seeds of V. vinifera were extracted with different solvents. The extracts were analyzed for total phenol, total flavonoid and total antioxidant status contents. The extracts were studied in vitro on human hepatocellular carcinoma (HepG2) and hepatocytes (THLE-2). Cells were incubated with different concentrations of C. spinosa and V. vinifera extracts (62.25-3000 μg/mL) for 24 hours and cell viability was measured by ATP assay. Experiments were continued with the extracts with the best cytotoxic effect. Intracellular reactive oxygen species (ROS) levels were measured fluorometrically with 2',7'-dichloro-dihydrofluorescein-diacetate (H2DCF-DA) fluorescent probe and mitochondrial membrane potential (MMP) was measured fluorometrically with 3,3' dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6(3)) dye, Intracellular calcium levels were analyzed by Fura-2AM stain, intracellular glutathione levels were analyzed luminometrically, apoptosis by acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) double stain with flourescence microscopy, and DNA damage by comet assay.
Results: Experimental results shows that C. spinosa and V. vinifera extracts increased cytotoxicity in hepatocellular carcinoma cells and healthy hepatocytes by increasing concentrations. Intracellular ROS and intracellular calcium levels increased, while MMP and intracellular glutathione levels decreased in HepG2 and THLE-2 cells. As a result, apoptosis and DNA damage were induced. HepG2 cells showed a statistically significant higher increase in intracellular ROS and intracellular calcium levels compared to THLE-2. MMP and intracellular glutathione levels decreased significantly. 
Conclusion: Our study revealed that C. spinosa and V. vinifera extracts have cytotoxic and apoptotic effects on HepG2 and THLE-2. However, more in vitro studies in which plants are investigated in detail are needed.