Streptozotosin (STZ) ile diyabet oluşturulmuş sıçanların prefrontal kortekslerinde otofajinin araştırılması
Investigation of autophagy in the prefrontal cortex of streptozotocin (STZ)-induced diabetes
Yazar: KEVSER YÜCEL KARASU
Danışman: PROF. DR. FEYZULLAH BEYAZ
Erciyes Üniversitesi / Gevher Nesibe Genom ve Kök Hücre Enstitüsü  / Nörobilim Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Nöroloji = Neurology

Özet:
Otofaji, hasarlı organelleri ve protein agregatlarını sitoplazmadan uzaklaştıran bir lizozomal bozunma yoludur. Post-mitotik olan nöronlar, proteotoksinlerin birikmesine karşı özellikle savunmasızdır ve bu nedenle homeostazı sürdürmek için büyük ölçüde otofajiye bağımlıdırlar. Bu çalışmanın amacı, deneysel olarak streptozotosin (STZ) ile diyabet oluşturulmuş sıçanların beyin kortekslerinde otofajinin araştırılmasıdır.
Bu çalışmada 24 adet Wistar albino suşu erkek sıçan  (180-200 gr, 1 aylık) kullanıldı. Sıçanlar rastgele ve eşit olarak; diyabet grubu (45 mg/kg streptozotosin i.p. n: 8), sham grubu (sitrat tamponu ph; 4,5 i.p n: 8) ve kontrol grubu (n: 8) 3 gruba ayrıldı. Hayvanların haftada bir kuyruk venalarından kan alınarak kan glikoz seviyeleri ölçüldü. Sıçanlar deney bitimine kadar 3'er gün aralıklarla tartıldı ve ağırlıkları kaydedildi. Deney 40 gün süreyle devam ettirildikten sonra hayvanlara Bouin tespit solüsyonu ile perfüzyon yapılarak beyinleri çıkarıldı. Beyin dokularından 4 µm kesitler alındıktan sonra bu dokulara genel yapının incelenmesi amacıyla Nisll boyama yapıldı. Ardından diğer kesitlere AMPK, mTOR, LC3 ve Beclin-1 için Strept-avidin peroksidaz immunboyanma yöntemi uygulandı. Image J yöntemiyle değerlendirme yapıldı.
Beclin-1 için yapılan boyamalardan elde edilen görüntülerin J-image proğramı ile de değerlendirlmesi sonucunda diyabetik gruptaki sıçanların beyinlerinin prefrontal korteks, singular korteks ve motor korteks gibi yapılarının incelenmesinde kontrol gruplarına göre alan boyanma yoğunluğu açısında anlamlı bir değişiklik belirlendi. Diyabetik grupta, kontrol grubuna göre Beclin 1 boyanma yoğunluğu daha fazlaydı (P< 0,05). LC3 için yapılan boyamalardan elde edilen görüntülerin J-image proğramı ile de değerlendirlmesi sonucunda diyabetik gruptaki sıçanların beyinlerinin prefrontal korteks, singular korteks ve motor korteks gibi yapılarının incelenmesinde kontrol gruplarına göre alan boyanma yoğunluğu açısında anlamlı bir değişiklik belirlendi. Diyabetik grupta, kontrol grubuna göre LC3 boyanma yoğunluğu daha fazlaydı (P< 0,05). Hem kontrol gruplarında hem de diabetik gruptaki hayvanların beyinlerinde prefrontal korteks, singular korteks ve motor korteks gibi yapıların L1-L6 katmanlarındaki bazı nöronların nörolemma ve aksolemmaları ile nöropilde AMPK pozitif reaksiyon gözlendi. AMPK için yapılan boyamalardan elde edilen görüntülerin J-image proğramı ile de değerlendirlmesi sonucunda diyabetik gruptaki sıçanların beyinlerinin prefrontal korteks, singular korteks ve motor korteks gibi yapılarının incelenmesinde kontrol gruplarına göre alan boyanma yoğunluğu açısında anlamlı bir değişiklik belirlendi. Diyabetik grupta, kontrol grubuna göre AMPK boyanma yoğunluğu daha azdı (P< 0,05). Kontrol gruplarında ve diabetik gruptaki hayvanların beyinlerinin prefrontal korteks, singular korteks ve motor korteks gibi korteks yapılarının L1-L6 katmanlarındaki nöronların sitoplazmalarında yoğun mTOR pozitif immunreaksiyon gözlendi. Araştrıma mikroskobu ile elde edilen görüntülerin J-image proğramı ile de değerlendirlmesi sonucunda diyabetik gruptaki sıçanların beyinlerinin prefrontal korteks, singular korteks ve motor korteks gibi yapılarının incelenmesinde kontrol gruplarına göre alan boyanma yoğunluğu açısında anlamlı bir değişiklik belirlendi. Diyabetik grupta, kontrol grubuna göre mTOR boyanma yoğunluğu daha azdı (P< 0,05). Sunulan çalışmada, beyinlerin prefrontal korteks, singular korteks ve motor korteks gibi korteks yapılarının L1, L2, L4, L4, L5 ve L6 katmanlarındaki nöronların incelenmesi sırasında kontrol gruplarına göre diyabetik gruptaki hayvanların bu korteks bölgelerindeki katmanlarda tüm immunohistokimyasal ve Nisll boyamalarında nörodejeneratif nöronlar ile dark nöron olarak tabir edilen normal görünümlü olmayan sinir hücrelerinin sayısının daha fazla olduğu belirlendi. Buna göre deneysel STZ ile oluşturulan sıçanların beyinlerindeki nöronlarda hiperglisemiye bağlı olarak bir nörodejenerasyonun gerçekleştiği sonucuna varabiliriz.
Çalışmamızda tüm elde ettiğimiz bulgular ışığında, deneysel STZ ile diyabet oluşturulan sıçanların beyin kortekslerinde kontrol gruplarına göre beclin-1 ve LC3'ün immunhistokimyasal ekspresyonlarındaki artışın belirlenmesi diyabetik sıçanların beyin kortekslerinde otofajinin gerçekleştiği sonucunu göstermektedir. 

Anahtar Kelimeler:  Diyabet, Beyin korteks, Otofaji, Sıçan, Streptozotosin.

Abstract:
Autophagy is a lysosomal degradation pathway that removes damaged organelles and protein aggregates from the cytoplasm. Neurons that are post-mitotic are particularly vulnerable to the accumulation of proteotoxins and are therefore highly dependent on autophagy to maintain homeostasis. The aim of this study was to investigate autophagy in the cerebral cortices of rats with experimental streptozotocin (STZ) diabetes.
In this study, 24 male Wistar albino strains (180-200 g, 1 month old) were used. Rats randomly and equally; diabetes group (45 mg/kg streptozotocin i.p. n: 8), sham group (citrate buffer pH; 4.5 i.p n: 8) and control group (n: 8) were divided into 3 groups. Blood glucose levels were measured by drawing blood from the tail veins of the animals once a week. The rats were weighed at 3-day intervals until the end of the experiment and their weights were recorded. After the experiment was continued for 40 days, the animals were perfused with Bouin fixation solution and their brains were removed. After 4 µm sections were taken from the brain tissues, Nisll staining was applied to these tissues to examine the general structure. Then, Strept-avidin peroxidase immunostaining method was applied to other sections for AMPK, mTOR, LC3 and Beclin-1. Evaluation was made with the Image J method.
As a result of the evaluation of the images obtained from the staining for Beclin-1 with the J-image program, a significant change was determined in terms of area staining intensity compared to the control groups in the examination of the structures such as prefrontal cortex, cingular cortex and motor cortex of the brains of rats in the diabetic group. Beclin 1 staining intensity was higher in the diabetic group compared to the control group (P< 0.05). As a result of the evaluation of the images obtained from the staining for LC3 with the J-image program, a significant change was determined in terms of area staining intensity compared to the control groups in the examination of the structures such as prefrontal cortex, cingular cortex and motor cortex of the brains of rats in the diabetic group. The LC3 staining intensity was higher in the diabetic group than in the control group (P< 0.05). A positive AMPK reaction was observed in the neurolemma and axolemma of some neurons in the L1-L6 layers of structures such as the prefrontal cortex, cingular cortex and motor cortex in the brains of both the control groups and the animals in the diabetic group. As a result of the evaluation of the images obtained from the staining for AMPK with the J-image program, a significant change was determined in terms of area staining intensity compared to the control groups in the examination of the structures such as prefrontal cortex, cingular cortex and motor cortex of the brains of rats in the diabetic group. The AMPK staining intensity was lower in the diabetic group compared to the control group (P< 0.05). Intense mTOR positive immunoreaction was observed in the cytoplasm of neurons in L1-L6 layers of cortical structures such as prefrontal cortex, singular cortex and motor cortex of the brains of animals in the control groups and the diabetic group. As a result of the evaluation of the images obtained with the research microscope with the J-image program, a significant change was determined in terms of area staining intensity compared to the control groups in the examination of the structures such as prefrontal cortex, cingular cortex and motor cortex of the brains of the rats in the diabetic group. The mTOR staining intensity was lower in the diabetic group compared to the control group (P< 0.05). In the present study, during the examination of neurons in the L1, L2, L4, L4, L5 and L6 layers of cortical structures of the brains such as prefrontal cortex, cingular cortex and motor cortex, neurodegenerative neurons and dark neurons were detected in all immunohistochemical and Nisll staining layers in these cortical regions of animals in the diabetic group compared to the control groups. It was determined that the number of non-normal-appearing nerve cells, referred to as Accordingly, we can conclude that neurodegeneration occurred in neurons in the brains of rats created with experimental STZ, due to hyperglycemia.
In the light of all the findings we obtained in our study, the determination of the increase in the immunohistochemical expressions of beclin-1 and LC3 in the cerebral cortices of rats with diabetes mellitus by experimental STZ, compared to the control groups, shows the result that autophagy occurs in the cerebral cortices of diabetic rats.

Key words: Autophagy, Cerebral cortex, Diabetes, Rat, Streptozotocin.