Biyofilm enfeksiyonlarının patogenezinin kinetik değerlendirmesi
Kinetic evaluation of pathogenesis of biofilm infections
Yazar: ALI ALVANDIAN
Danışman: DOÇ. DR. MERAL KARAMAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Enfeksiyon = Infection ; Enterobacteriaceae = Enterobacteriaceae ; Enterobacteriaceae enfeksiyonları = Enterobacteriaceae infections ; Fareler = Mice ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae ; Pnömoni = Pneumonia ; Virülans = Virulence

Özet:
Klebsiella pneumoniae özellikle hastane kökenli akciğer enfeksiyonlarında sıklıkla karşılaştığımız Gram negatif fırsatçı bir patojendir. Enfeksiyonun gelişmesinde konakçı savunma sistemlerinin yanısıra bakteriye özgü çeşitli virülans faktörleri önemli rol oynamaktadır. Son yıllarda özellikle intravasküler katater, üriner katater ve kalıcı tıbbi cihazlar gibi invazif girişim uygulanan hastalarda enfeksiyonun gelişmesinden biyofilm yapı sorumlu tutulmaktadır. Biyofilm formasyonu çeşitli kronik ve tekrarlayıcı enfeksiyonlar ile ilişkili olup insan vücudundaki tüm mikrobiyal enfeksiyonların %80'inden sorumlu tutulmaktadır. Planktonik (serbest formda) hücrelerle karşılaştırıldığında biyofilmin temel özelliği antimikrobiyallere, immunolojik ve kimyasal savunma mekanizmalarına karşı artmış dirençtir Mikroorganizmanın biyofilm oluşum süreci içinde konakçıdaki davranışlarının açıklanması, immünolojik ve doku düzeyindeki değişikliklerin belirlenmesi klinik açıdan hastaya yaklaşım ve sağaltım alternatifleri konusunda katkıda bulunabileceği gibi, dirençli suşlarla kolonizasyonu ve bu suşların toplumda yayılmasını azaltabilir, 
K. pneumoniae B5055 (serotip O1:K2) kökeni planktonik (serbest formda) ve biyofilm hücreleri farelere intranazal yol ile verilerek akut pnömoni modeli oluşturuldu. Biyofilm formdaki hücrelerin eldesi için endotrakeal tüp (ETT) yöntemi kullanıldı. Bakteri MHA besiyerine pasajlanarak 37°C da 18 saat inkübe edildi. Ertesi gün üreyen koloniler tüp içindeki MHB besiyerine alındı. Steril ETT 20 mm' lik parçalara ayrılarak bu besiyerine aktarıldı. ETT parçası, 18 saat sonra steril PBS ile yıkandı, taze MHB besiyeri içeren tüpe alındı. Bu işlem üç gün süresince tekrarlandı. ETT parçaları Taramalı Elektron Mikroskobu (Scanning Electron Microscope; SEM) yardımıyla incelendi. Daha sonra ETT steril PBS ile yıkandı ve hücreler 104 CFU/ mL olacak şekilde dilüe edildi. 
Konvensiyonel olarak yetiştirilen BALB/c soyu fareler; Grup 1; planktonik (n=30), grup 2;  biyofilm (n=30) hücreleri ve grup 3; fosfat tampon (PBS) verilen grup olmak üzere (n=6) bireysel havalandırmalı kafeslere ayrıldı. Grup 1 ve 2 de yer alan farelerden 6 tanesi 6-24-48-72 ve 96. saatlerde sakrifiye edildi. Daha sonra  kan örneği, bronkoalveolar lavaj (BAL) sıvısı ve akciğer dokusu alındı. BAL örneğinde IL-10 ve TNF alfa düzeyleri ölçülürken, akciğer dokusundan bakteriyel yük ve histopatolojik değişiklikler değerlendirildi.
Bulgular:

Grupların hayatta kalma oranlarına bakıldığında 96. saat sonunda her üç grupta da ölüm gözlenmedi. Akciğer doku homojenatlarından yapılan kantitatif kültür ekimleri sonucunda PBS verilen grupta 96 saat sonunda herhangi bir bakteri üremesi saptanmazken, planktonik ve biyofilm gruplarında K. penumoniae üremesi saptandı. Her iki grupta da 24. saate kadar logaritmik üreme gözlendi. Bu saatten itibaren yapılan 48, 72 ve 96. saat değerlendirmelerinde biyofilm grubunda bakteriyel yük aynı düzeyde devam ederken planktonik hücreler ile enfekte grupta düşüş belirlendi. (p<0.000) Etken inokule edildikten 24 saat sonra her iki grupta TNF alfa ve IL-10 düzeylerinin en yüksek noktaya ulaştığı görüldü. Biyofilm grubunda TNF alfa düzeylerinde artış, planktonik gruba göre istatistiksel olarak anlamlı bulundu. ( p<0.003) Her iki grupta da akciğer doku kesitlerinde 6.saatte PMNL infiltrasyonu gözlendi. Akciğer hasarının ve PMNL infitrasyonunun 24.saatten itibaren arttığı saptanmakla birlikte gruplar arasında anlamlı bir farklılık gözlenmedi. 







Sonuç:  

Bu çalışmada, farede, K. pneumoniae ile oluşturulan akut akciğer enfeksiyonu modelinde bakteriyel yük, proenflamatuvar sitokin yanıtları ve akciğerde doku düzeyinde değişiklikler zamana bağlı olarak değerlendirildiğinde; biyofilm formunun enfeksiyonun başlangıç döneminde bakteriye bir üstünlük sağlamadığı saptanmıştır. Ancak biyofilm ile enfekte grupta bakterinin solunum yollarından temizlenemediği ve enfeksiyonun kronikleşmeye eğilimli olduğu gözlenmiştir. Olasılıkla biyofilm yapı, etrafındaki ekzopolisakkarit matriks yapı aracılığı ile patojen bakterilerin bağışıklık sistemi hücrelerinden gizlenmesine yardımcı olmaktadır. Bu nedenle mortalite ve morbidite artışlara ve ciddi ekonomik kayıplara neden  olan biyofilm enfeksiyonları ile mücadelede, biyofilm matriksin hedef alınması ve antimikrobiyal sağaltımla kombinasyonu daha uygun bir yaklaşım olabilir.

Abstract:
Klebsiella pneumoniae is a Gram negative opportunistic pathogen, which we frequently encounter in hospital-acquired pulmonary infections. In addition to host defense systems, various bacterial virulence factors play an important role in the development of infection.
In recent years, biofilm structure has been implicated in the development of infection especially in patients who are invasive intervention such as intravascular catheter, urinary catheter and permanent medical devices. Biofilm formation is associated with a variety of chronic and recurrent infections and accounts for 80% of all microbial infections in the human body.When compared to planktonic (free-form) cells, the basic feature of biofilm is increased resistance to antimicrobials, immunological and chemical defense mechanisms. Identification of the behavior of microorganisms in the host during the biofilm formation process, determination of changes in immunological and tissue levels may contribute to clinic approach to the patient and treatment alternatives, as well as colonization with resistant strains and reduction of spread of these strains in the community,	





Material and Method: 

Acute pneumonia model was established by intranasal administration of K. pneumoniae B5055 (serotype O1: K2) root planktonic (in free form) and biofilm cells to mice. The endotracheal tube (ETT) method was used for the removal of cells in biofilm form.
Bacteria were passaged in MHA medium and incubated for 18 hours at 37 ° C. The following day, breeding colonies were taken into MHB medium in the tube. Sterile ETT was transferred to this medium by dividing 20 mm pieces. The ETT piece was washed with sterile PBS after 18 hours, and fresh tuft containing MHB medium was removed. This process was repeated for three days. Conventionally grown BALB/c strain mice; Group 1; Planktonic (n = 30), group 2; Biofilm (n = 30) cells and group 3; Were divided into individual ventilated cages (n = 6) in phosphate buffered saline (PBS).  Six of the mice in Groups 1 and 2 were 6-24-48-72 and 96.
The hours were sacrificed.Then blood sample, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid and lung tissue were taken. IL-10 and TNF alpha levels were measured in BAL samples, and bacterial load and histopathologic changes were evaluated in lung tissue.

Results: 

When the survival rates of the groups were examined, deaths were not observed in all three groups at the end of the 96th hour. As a result of quantitative culturing from lung tissue homogenates, K. penumoniae remission was detected in planktonic and biofilm groups while no bacterial spillage was detected after 96 hours in the PBS group.Logarithmic growth was observed up to 24 hours in both groups. At 48, 72 and 96 hours after this time, the bacterial load in the biofilm group remained at the same level, while the decrease in the planktonic cells and the infected group was determined. (p <0.000) TNF alpha and IL-10 levels reached the highest point in both groups 24 hours after the agent was inoculated. The increase in TNF alpha levels in the biofilm group was statistically significant compared to the planktonic group. (p <0.003) PMNL infiltration was observed in lung tissue sections at 6 hours in both groups. Although lung injury and PMNL infusion increased after 24 hours, there was no significant difference between the groups.




Conclusion

In this study, when the changes in bacterial load, proinflammatory cytokine responses, and tissue levels in the lung were evaluated in the rat in the model of acute lung infection induced by K. pneumoniae, It has been found that the biofilm form does not provide a bacterial superiority during the initial period of infection. However, in the biofilm-infected group, it was observed that the bacterium could not be cleared from the respiratory tract and that the infection was prone to becoming chronic. The biofilm structure, possibly through the exopolysaccharide matrix structure around it, helps the pathogenic bacteria to hide from the cells of the immune system. Therefore, combining biofilm matrix targeting with antimicrobial treatment and combating biofilm infections leading to increased mortality and morbidity and severe economic loss may be a more appropriate approach.