Lactococcus lactis'in oksidatif stres toleransının arttırılması ve aerobik koşullarda nisin üretimi ve optimizasyonu
Improving oxidative stress tolerance of Lactococcus lactis and optimization of nisin production in aerobic conditions
Yazar: ZEYNEP GİRGİN ERSOY
Danışman: PROF. DR. SEDEF TUNCA GEDİK
Gebze Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Nisin, laktik asit bakterilerinden Lactococcus lactis'in çeşitli suşları tarafından üretilen bir bakteriyosindir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından gıda katkı maddesi olarak onaylanmış tek bakteriyosin olan nisinin kimyasal yolla üretimi mümkün olmadığından, bu bakteriyosini üreten suşların üretim veriminin arttırılması önem taşımaktadır. Bu nedenle, tezin temel amacı, nisinin üretimini, L. lactis'in oksidatif strese olan toleransını arttırarak geliştirmektir.
Bu amaç doğrultusunda, çalışmada, Bacillus subtilis'in H2O2 gideriminde görev alan başlıca enzimini kodlayan katalaz geni (katE) ile L. lactis'in oksidatif stres ile savaşan en önemli enzimlerinden birini kodlayan süperoksit dismutaz (sodA) genini farklı seviyelerde ifade edebilen rekombinant suşların oluşturulmasına çalışılmıştır. Ancak gerçekleştirilen bütün denemelere rağmen, B. subtilis'e ait katalaz genini veya L. lactis superoksit dismutaz genini içeren plazmide sahip rekombinant L. lactis hücresi elde edilememiştir.
Tez çalışmasının devamında, L. lactis'in oksidatif stresini azaltmak için antioksidan özellikleri bilinen glutatyon (GSH) ve pirüvat, L. lactis'in büyüme ortamına eklenmiş ve bu antioksidanların hücrelerin büyümesi, nisin üretimi ve stres cevabı üzerindeki etkileri belirlenmiştir. GSH ve pirüvatın, aerobik koşullarda büyütülmüş L. lactis hücrelerinde nisin üretimini hem transkripsiyonel hem de translasyonel düzeyde tetiklediği gösterilmiştir. GSH ve pirüvatın varlığı, hem ilave edilmiş besiyerinden daha fazla nisin verimine neden olmuştur. Kesikli kültürde elde edilen bu sonuçların büyük hacimlerde de geçerli olduğu, yapılan fermentör çalışmaları ile doğrulanmıştır. Ayrıca, strese bağlı enzimleri kodlayan genlerin ifadesi, GSH ve pirüvat varlığında açıkça artmıştır. Elde edilen sonuçlar ışığında, besiyerinde hem bulunmadığında GSH ve pirüvatın L. lactis hücrelerinin savunma sistemine katkıda bulunduğu ve böylece nisin üretiminin artmasına neden olan daha yüksek biyokütleye ulaşıldığı sonucuna varılabilmektedir. Antioksidan etkileri bilinen GSH ve pirüvatın, nisin üretimi üzerindeki uyarıcı etkileri ilk kez bu çalışmada gösterilmiştir.

Abstract:
Nisin is a bacteriocin which is produced by certain strains of Lactococcus lactis (member of lactic acid bacteria). It is the only bacteriocin which is approved by World Health Organization (WHO) as a food additive. Since this bacteriocin cannot be produced by chemical methods, to increase the production efficiency of nisin producing strains is important. Therefore, the main purpose of the thesis is to improve the production of nisin by increasing the tolerance of L. lactis to oxidative stress.
For this purpose, in the study, B. subtilis catalase gene (katE), which encodes the main enzyme functioning in H2O2 removal, and L. lactis superoxide dismutase gene (sodA), which encodes one of the most important enzymes that fight against oxidative stress, were tried to be expressed at different levels in L. lactis cells. However, despite all trials, recombinant L. lactis cell with plasmid containing the B. subtilis catalase gene or L. lactis superoxide dismutase gene could not be obtained.
In the continuation of the thesis, glutathione (GSH) and pyruvate molecules, whose antioxidant properties have already known, were added to the growth media to reduce the oxidative stress of L. lactis and the effects of these antioxidants on cell growth, production of nisin and stress response have been determined. GSH and pyruvate have been shown to trigger the production of nisin at both transcriptional and translational level in L. lactis cells grown under aerobic condition. Presence of GSH and pyruvate caused more nisin yield than the haem supplemented medium. The fact that these results obtained in batch culture are valid in large volumes has been confirmed by fermenter studies. Moreover, the expression of genes that encode stress-related enzymes were apparently upregulated in the presence of GSH and pyruvate. It can be concluded that, in the absence of haem in the medium, GSH and pyruvate contributed to the defense system of L. lactis cells, thus achieving higher biomass leading to increased production of nisin. Antioxidant effect of GSH and pyruvate was known, however, their stimulating effect on nisin production was shown for the first time in this study.