Dipeptidil peptidaz IV enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve inhibitörlerinin belirlenmesi
Purification and characterization of dipeptidyl peptidase IV and determination of inhibitors
Yazar: ALİ ZEYTÜNLÜOĞLU
Danışman: PROF. DR. FİGEN ZİHNİOĞLU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Karakterizasyon = Characterization ; Saflaştırma = Purification ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Dipeptidil peptidaz IV (EC 3.4.14.5); immun cevap, T hücre aktivasyonu, sinyal transdüksiyonu, T hücre proliferasyonu ve metabolik homeastazın kontrolünde kritik fonksiyona sahip birçok biyolojik aktif peptidin hidrolizinden sorumlu multifonksiyonel bir serin ekzopeptidazdır. Bu çalışmada; Dipeptidil peptidaz IV enzimi koyun akciğerinden amonyum sülfat çöktürmesi sonrası sırasıyla; DEAE-Sefaroz, Con A ve Gly-Pro- EC-HA Sepabead afinite kromatografileri kullanılarak % 6 verimle 370 kat saflaştırıldı. Non-denature PAGE ve SDS-PAGE jellerde aktivite/glikoprotein boyaması ve triptik peptidlerin LC-MS/MS analizi ile enzimin (DPPIV) varlığı teyid edildi. Enzimin karbohidrat içeriği % 18,9 olarak belirlendi.Saflaştırılan DPPIV enziminin CD26 primer antikorlarına karşı reaksiyon vermemesi CD26 ve akciğer DPPIV'ünün identik olmadığını gösterdi. Koyun akciğerinden saflaştırılan DPPIV'ün molekül kütlesi SDS-PAGE'de 90 kDa, jel filtrasyon kromatografisi sonrası yapılan değerlendirmeler ile yaklaşık 180 kDa olarak belirlendi ve enzimin dimerik yapıda olduğu düşünüldü. İzoelektrik noktası yaklaşık 4,8 ? 0,2 olarak belirlendi. Enzimin optimum sıcaklık ve pH'sı; 45 oC ve 7,4 olarak bulundu. Gly-Pro-pNA substratı kullanılarak KM ve Vmax değerleri; 0,32 mM ve 35,9 ? mol/dk/mg olarak hesaplandı.DPPIV'ün termal ve pH kararlılığı; 0-45 °C ve pH 7,0 ? 9,0 aralığında % 100 ve % 94 olarak belirlendi. Ayrıca, enzimin -80 °C'de 8 hafta depolama süresi sonrası aktivitesinin % 88'ini koruduğu gözlendi. Zn+2, Hg+2 ve Cd+2'nin koyun akciğer DPPIV enzimine inhibisyon etkisi gösterdiği buna karşın Mg+2 iyonlarının enzim aktivitesini arttırdığı belirlendi. 0,1 mM Diprotin A ile enzim aktivitesinin % 91'inin inhibe edildiği bulundu. PMSF ve 1-10 fenantrolinin 0,1-5,0 mM konsantrasyonlarında, konsantrasyon artışına paralel olarak enzim inhibisyon etkinliklerinin arttığı; aynı konsantrasyon aralıklarında ? -mercaptoethanol ve DTT'nin enzimi çok az inhibe ettiği tespit edildi. Serin proteaz inhibitörlerinden benzamidin ve pABA'nın sadece yüksek konsantrasyonlarında inhibisyon etkisi göstermesinin enzimin tripsin benzeri serin proteazlarla olan substrat afinite farklılığından kaynaklandığı düşünüldü. Enzimin; prolin içeren sentetik ve doğal substratları daha hızlı, alanin içerenleri ise daha yavaş hidrolizlediği gözlendi. İleri aşamada DPPIV enziminin inhibisyonuna yönelik yapılan tarama çalışmasında; en fazla inhibitör etkisi sulu ekstraksiyonla hazırlanan bitkilerden Dulavrat otu (Arctium tomentesum) ve Aslan pençesi (Alchemilla vulgaris)'nde gözlendi ve IC50 değerleri sırasıyla 4,6 ve 16,9 ? g/ml olarak hesaplandı. Dulavrat otunun IC50 değeri, DPPIV inhibitörü olan Diprotin A'ya göre ( 10,1 ? g/ml) daha etkin bulundu.

Abstract:
Dipeptidyl peptidase IV (EC 3.4.14.5) is a multifunctional serine exopeptidase and it is responsible for immune response, T cell activation, signal transduction, T cell proliferation and hydrolysis of many biologically active peptides, which have critical functions in control of metabolic homeostasis.In this study, Dipeptidyl peptidase IV from sheep lung was purified 370 fold with a yield of % 6 by using ammonium sulfate precipitation followed by DEAE-Sepharose, ConA-Sepharose 4B and Gly-Pro-EC-HA Sepabeads affinity chromatography. DPPIV identify was confirmed by activity glycoprotein staining of non-denaturating PAGE/SDS-PAGE gels and LC-MS/MS analysis of tryptic peptides. Carbohydrate content of the enzyme was estimated as 18.9 %.The unreactivity of purified DPPIV to CD26 antibodies indicated the CD26 and lung DPPIV is unidentical. Molecular weight of the enzyme purified from sheep lung was estimated to be about 180 kDa by gel filtration and 90 kDa by SDS-PAGE suggesting that the native enzyme is a dimeric form. Isoelectric focusing indicated a pI of approximately 4,8 ? 0,2. The optimum temperature and pH was 45 °C and 7.4, respectively. KM and Vmax values for the hydrolysis of Gly-Pro-pNA were 0.32 mM and 35,9 ? mol/min/mg, respectively.Temperature and pH stability of the DPPIV at 0-45 °C and pH 7.0 - 9.0 were defined as 100 % and 94 %, respectively. Furthermore, the enzyme maintained 88 % of its activity after storage at -80 °C for 8 weeks. Lung DPPIV was inhibited by Hg +2, Zn +2 and Cd +2 ions and activated by Mg +2 ions.DiprotinA (0.1 mM) was shown to inhibit the enzyme acitivty at a ratio of 91%. Using PMSF or 1-10 fenantroline in the concentration range of 0.1 to 5.0 mM resulted in enzyme inhibiton in a concentration dependent manner. However, ? -mercaptoethanol and DTT in the same concentration range had a slight effect on enzyme activity. Among serine protease inhibitors, benzamidine and PABA were effective only at high concentrations suggesting the substrate affinity difference of trypsin-like serin proteases. The enzyme hydrolysed natural and synthetic substrates containing proline at a faster rate, while it slowly hydrolysed natural and synthetic substrates containing alanine.In further experiments, among the plants prepared by aqueous extraction, burdock plants (Arctium tomentesum) and the lion's claw (Alchemilla vulgaris) were observed the highest inhibitory effect and its IC50 values were calculated as 4.6 and 16.9 ? g/ml, respectively. IC50 value of the burdock plant was more effective than that of DiprotinA ( 10,1 ? g/ml).