Leishmania donovanı yüzey gp63 geninin klonlanması ve IL-12 ile formülasyonu
Cloning of the leishmania donovani surface gp63 gene and formulation with IL-12
Yazar: ARZUV CHARYYEVA
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN YAZAR
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Genler = Genes ; Klonlama = Cloning ; Leishmania donovani = Leishmania donovani ; Leishmaniasis = Leishmaniasis ; İnterlökin 12 = Interleukin 12

Özet:
Leishmaniasis, Leishmania cinsine ait zorunlu hücre içi protozoon parazitin sebep olduğu vektör kaynaklı bir hastalıktır. Özellikle tropikal ve subtropikal bölgeler olmak üzere dünyada 98 ülkede 35 milyondan fazla kişi risk altındadır. Hastalık tedavi edilmediği takdirde ölümcül olabilmektedir ve henüz insan kullanımı için etkili bir aşı mevcut değildir. Leishmaniasise karşı immun yanıtı uyarabilen birçok antijen bulunmakta olup Gp63 parazitin virulansında önemli fonksiyonlara sahip olmasıyla birlikte en umut verici immunojenlerden biridir. Gp63'ün tek başına ya da diğer antijenler ve adjuvanlarla kombine edildiğinde hayvanlarda leishmaniaise karşı koruyucu olduğunu gösteren birçok çalışma mevcut olmasına rağmen adjuvan olarak IL-12 ile kombine edildiği bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada hastalığın en ağır formu olan visceral leishmaniasise (VL) sebep olan L.donovani türüne ait promastigotlar kullanılmıştır. Kültürde üretilen promastigotlardan saflaştırılan total genomik DNA templeyt olarak kullanılmış ve Gp63 geni PCR yöntemi ile çoğaltılmıştır. PCR ürünü pcDNA3.1 vektörüne klonlanarak kompetan hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Antibiyotik içeren LB pleytinde üreyen hücreler PCR tarama yöntemi ile pozitif olarak tespit edildikten sonra kültürü yapılan hücrelerden rekombinant plazmit saflaştırılması yapılmıştır. Gp63 genini içeren saflaştırılmış plazmitler miniprep PCR tarama, restriksiyon enzim reaksiyonları ve DNA dizi analizi gibi çeşitli yöntemlerle doğrulanmıştır. Doğrulanmış ilgili geni kodlayan rekombinant plazmit endotoksinsiz olarak üretilmiş ve IL-12 ile aşılama işlemi uygulanana kadar -20ºC'de muhafaza edilmiştir. Çalışmada elde edilen ürün sadece IL-12 ile formüle edilmiş DNA aşısı şeklinde değil, aynı zamanda leishmaniasise karşı umut verici başka antijenlerle de kombinasyon halinde kullanılabilecektir. Ayrıca Gp63 genini kodlayan plazmit aşı çalışmalarında ve ELISA gibi tanı testlerinde yararlanılabilecek rekombinant protein sentezinde de kullanılma potansiyeli vardır.

Anahtar Kelimeler: Leishmaniasis, Leishmania donovani, Gp63, IL-12.

Abstract:
Leishmaniasis is a vector born disease caused by obligate intracellular protozoan parasite of the genus Leishmania. More than 35 million individuals are at risk in 98 countries worldwide, especially in tropical and subtropical regions. Disease can be fatal if left untreated and there is no effective vaccine available for human use. There are many antigens can induce immune response against leishmaniasis and Gp63 is one of the most promising immunogens with its important functions in parasite virulence. There are a lot of studies indicate that Gp63 alone or combined with other antigens or adjuvants can protect animals from leishmaniasis, but there is no study until today carried out on Gp63 combined with IL-12 as an adjuvant. In this study promastigotes of L.donovani species which causes visceral leishmaniasis (VL) the most severe form of the disease was used. Total genomic DNA purified from the cultured promastigotes used as template and Gp63 gene was amplified by PCR. PCR product cloned into pcDNA3.1 vector and transformed into competent cell. After detection growing cells on the LB plate containing antibiotic as positive by PCR screening, recombinant plasmid purification was performed from the cultured cells. Purified plasmids containing Gp63 gene confirmed by various methods such as miniprep PCR screening, restriction enzyme reactions and DNA sequencing. Confirmed recombinant plasmid encoding the gene of interest produced as endotoxin-free and stored at -20ºC before vaccination with IL-12. The product obtained in this study can be used for immunization not only as DNA vaccine formulated with IL-12, but also combined with another promising antigens against leishmaniasis. Furthermore plasmid encoding Gp63 gene has the potential to be used for synthesis of recombinant protein, which can be used for vaccination studies and for diagnostic tests such as ELISA.

Key Words: Leishmaniasis, Leishmania donovani, Gp63, IL-12.