Salmonella typhimurium'da CsgD regülasyonunun otoindüktör-2 aktivitesine ve quorum sensing ilişkili küçük RNA'ların ekspresyon seviyelerine etkilerinin belirlenmesi
Determination of the effects CsgD regulation on autoinducer-2 activity and expression levels of quorum sensing related small RNAs in salmonella typhimurium
Yazar: MELİH AŞAN
Danışman: DOÇ. DR. NEFİSE AKÇELİK
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Quorum sensing = Quorum sensing ; RNA = RNA ; Salmonella = Salmonella

Özet:
İnsanlarda gıda kaynaklı hastalıklarda en sık karşılaşılan patojen olan Salmonella Typhimurium, bulunduğu yüzeylerde biyofilm oluşturma yeteneğine sahiptir. Bu sayede; çeşitli çevresel stres koşullarına, konak bağışıklık sistemine ve antibiyotiklere karşı büyük ölçüde direnç gösterir. S. Typhimurium biyofilmleri, hücre dışı matriks bileşenleri olan kıvrımlı fimbriya ve selülozun ekspresyonu ile karakterize edilir. Transkripsiyonel regülatör olan CsgD, bu yapıların biyosentezini aktive ederek bakteri hücrelerinin planktonik yaşamdan biyofilm formuna geçişini sağlar. Güncel bilgiler, küçük RNA'lar (sRNA'lar) ve Quorum Sensing (QS) sisteminin bu süreçte önemli roller üstlendiğini göstermektedir. Bu tez, S. Typhimurium biyofilmlerinin ana regülatörü csgD ile QS sinyalizasyonu arasındaki ilişkinin ilk ipuçlarını ortaya çıkarmayı amaçlamıştır. Öncelikle, S. Typhimurium'da csgD'nin ifadesi kontrol altına alınarak QS ilişkili olduğu bilinen MicA, CsrB, CsrC ve RyeE adlı sRNA'ların ekspresyon seviyelerine etkisi belirlenmiştir. qRT-PZR analizlerine göre, araştırılan sRNA'ların tümü, csgD ifadesine bağlı olarak yukarı doğru düzenlenmiştir. Dolayısıyla csgD geni, incelenen dört sRNA'nın pozitif regülasyonu açısından önemli bir role sahiptir. Çalışmanın diğer aşamasında, QS sinyalizasyonunu sağlayan AI-2 aktivitesinin csgD ifadesine bağlı olarak değişimi saptanmıştır. Sonuçlar, csgD'nin aşırı ifade edildiği suşun, 4 saatlik inkübasyonun ardından en yüksek (% 277) bağıl AI-2 aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Bunu takiben, csgD ifadesinin AI-2'nin hücre içine alımında görevli Lsr taşıma sisteminde yer alan lsrA, lsrK ve lsrR genlerinin ifadeleri üzerindeki etkileri araştırılmıştır. En yüksek AI-2 aktivitesine sahip olduğu belirlenen suşta, yalnızca lsrK ifadesinin artışı gözlenmiştir. Dolayısıyla csgD'nin AI-2 aktivitesi üzerindeki pozitif etkisini, Lsr taşıma sisteminde yer alan genler üzerinden gerçekleştirmediği sonucuna varılmıştır. Bu sonuç, csgD'nin LuxS tarafından gerçekleştirilen AI-2 sentezi sürecinde pozitif bir regülasyona sebep olabileceği hipotezini güçlendirmektedir. Öte yandan csgD eksikliğinin lsrA, lsrK ve lsrR ifadelerinin tamamında artışa sebep olduğu ancak AI-2 aktivitesinde önemli bir değişiklik yaratmadığı belirlenmiştir. Bu durumda, LsrR'nin, QS süreci üzerindeki bilinen negatif etkisi, lsrA ve lsrK ifadelerindeki güçlü artış sebebi ile kompanse edilmiş gibi görünmektedir. Tüm bu sonuçlar birlikte ele alındığında, CsgD'nin S. Typhimurium'da biyofilm oluşumundaki rolüne benzer olarak QS sinyal ileti yolağında da pozitif bir etkisi olduğunu bildiriyoruz. Biyofilm oluşumu ile QS sinyalizasyonu arasındaki ilişkinin tam bir resminin elde edilmesi yalnızca transkripsiyon faktörlerinin değil aynı zamanda düzenleyici sRNA'ların bu süreçteki rollerinin açıklanması ile mümkündür. Ayrıca bu tip düzenleyici mekanizmaların aydınlatılması, bakteriyel enfeksiyonların önlenmesi amacıyla yeni stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

Abstract:
Salmonella Typhimurium is the most common pathogen in foodborne diseases in humans. With its ability to form biofilms on different surfaces, this pathogen shows great resistance to various environmental stress conditions, host immune system and antibiotics. Biofilms formed by S. Typhimurium are characterized by the expression of extracellular matrix components, curli fimbriae and cellulose. CsgD, a transcriptional regulator, activates the biosynthesis of these components, allowing bacterial cells to shift from planktonic life to sessile life. Current literature shows that small RNAs (sRNAs) and Quorum Sensing (QS) system play important roles in this process. This thesis aimed to reveal the first clues of the relationship between CsgD, the master regulator of S. Typhimurium biofilms, and QS signaling. First of all, by controlling the expression of csgD in S. Typhimurium, its effect on the expression levels of MicA, CsrB, CsrC and RyeE sRNAs, which are known to be related to QS, were determined. Based on qRT-PCR analyses, the expressions of all investigated sRNAs were upregulated depending on csgD expression. Thus, the csgD gene has an important role in the positive regulation of the four sRNAs studied. In the other phase of the study, the effect of csgD expression on the activity of the QS signalling molecule was determined. Our results showed that the strain in which csgD was overexpressed had the highest (277 %) relative AI-2 activity after 4 hours of incubation. Following this, the effects of csgD expression on the expressions of lsrA, lsrK and lsrR genes, which are involved in the Lsr transport system involved in the uptake of AI-2 into the cell, were investigated. In the strain known to have the highest AI-2 activity, only increased expression of lsrK was observed. Therefore, we concluded that csgD did not exert its positive effect on AI-2 activity through the genes involved in the Lsr transport system. This result strengthens the hypothesis that csgD may cause a positive regulation of the AI-2 synthesis process by LuxS. On the other hand, csgD deficiency caused an increase in all lsrA, lsrK and lsrR expressions, but did not cause a significant change in AI-2 activity. Thus, the known negative effect of LsrR on the QS process appears to be compensated for by the significant increase in lsrA and lsrK expressions. Taken together, we report that CsgD has a positive effect on the QS signal transduction pathway, similar to its role in biofilm formation in S. Typhimurium. Obtaining a complete picture of the relationship between biofilm formation and QS signaling is possible by revealing not only the roles of transcription factors but also regulatory sRNAs in this process. In addition, elucidating such regulatory mechanisms will help develop new strategies for the prevention of biofilm related bacterial infections.