Farelerde in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferinin yetişkin akciğer dokusunda toll-benzeri reseptör (TLR)-9 ekspresyonu üzerine etkisi
Effect of in vitro embryo culture and embryo transfer on the expression of toll-like receptor (TLR)-9 in adult mouse lung tissue
Yazar: MURAT ÖZTÜRK
Danışman: PROF. LEVENT KARAGENÇ
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Embriyo = Embryo ; Embriyo nakli = Embryo transfer ; Fareler = Mice ; Fertilizasyon-in vitro = Fertilization-in vitro ; Reseptörler-toll like = Receptors-toll like ; Reseptörler-toll like = Receptors-toll like ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques ; İn vitro = In vitro

Özet:
İn vitro fertilizasyon ve embriyo transferi başta olmak üzere çeşitli üremeye yardımcı tedavi (ÜYTE) uygulamaları tüm dünyada infertilite tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak yapılan çalışmalar, ÜYTE uygulama sonucu dünyaya gelen çocukların normal gebelik ile dünyaya gelmiş çocuklara oranla enfeksiyonlara ve astım gibi alerjik solunum yolları hastalıklarına karşı daha fazla duyarlı olduklarını göstermektedir. Doğal bağışıklık sistemi, patojenlere ve yabancı antijenlere karşı ilk savunma hattını oluşturmaktadır. Toll-benzeri reseptörler, doğal bağışıklık sisteminde önemli bir yer tutmaktadır. Bununla birlikte doğal bağışıklık sisteminin önemli bir unsuru olan TLR-9, bakteriyel/viral CpG-DNA'nın algılanmasında ve immun yanıtın şekillenmesinde önemli rol oynamaktadır. Sunulan tez çalışmasında, in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferi işlemlerinin yetişkin dönemde akciğer dokusunda TLR-9 ekspresyonu üzerine herhangi bir etkisinin olup olmadığının incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, bir adet Kontrol grubu ve bir adet Deneme grubuna yer verilmiştir. Kontrol grubu, PMSG+hCG uygulaması yapılmamış olan dişilerin, aynı yaştaki erkeklerle çiftleştirilmelerinden elde edilen yetişkin bireylerden; Deneme grubu ise PMSG+hCG uygulamasını takiben çiftleştirilen dişilerden elde edilen döllenmiş yumurta hücrelerinin (zigot) atmosferik oksijen konsantrasyonunda büyütülmesiyle elde edilen, dolayısıyla in vitro ortamda gelişen blastosistlerin yalancı gebelere transferiyle elde edilen yavruların büyütülmesiyle elde edilen bireylerden oluşturulmuştur. Elde edilen Kontrol ve Deneme gruplarına ait yetişkin akciğer dokusunda, dokunun genel histolojik yapısını incelemek amacıyla Crossman'ın üçlü boyama yöntemi uygulanmıştır. Dokularda, TLR-9'un hangi hücreler tarafından eksprese edildiğini belirlemeye yönelik olarak immunohistokimya ve immunofloresan analizleri gerçekleştirilmiştir. TLR-9 ekspresyonunun mRNA ve protein düzeylerinde ekspresyonunu belirlemek amacıyla real-time PCR ve western blot tekniklerinden yararlanılmıştır. İmmunohistokimya/immunofloresan analiz sonuçları, TLR-9'un hava yollarında, alveol duvarında, alveol lümeninde, damar çevresinde, damar lümeninde eksprese edildiğini ve boyanmanın her iki grupta da benzer olduğunu göstermiştir. Western blot analizlerinden elde edilen sonuçlar, Kontrol grubu ile kıyaslandığında Deneme grubunda TLR-9 proteinine ait ekspresyon düzeyinin 1,25 kat arttığını göstermiştir (p=0,015). Diğer yandan, real-time PCR analizlerinden elde edilen sonuçlar, Kontrol grubu ile kıyaslandığında Deneme grubunda TLR-9'a ait mRNA düzeyinin 1,38 kat azaldığını göstermiştir (p>0,05). Sonuç olarak elde edilen veriler, TLR-9'un yetişkin farelerde akciğer dokusunda Tip II pnömositler ve makrofajlar da dahil olmak üzere belirli hücreler tarafından eksprese edildiğini göstermekte ve in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferi işlemlerinin yetişkin akciğer dokusunda TLR-9 ekspresyonunun değiştirerek akciğer immun yanıtını etkiliyebileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Various assisted reproductive technologies (ART), mainly in vitro fertilization and embryo transfer, are widely used in infertility treatment all over the world. However, recent studies have indicated that children born following ART are more sensitive to infections and allergic respiratory diseases like asthma compared with children born through normal pregnancy. Innate immune system is the first line of defense against pathogens and foreign antigens. It is known that toll-like receptors are an important component of the innate immune system. Among these, TLR-9 plays an important role in the detection of bacterial/viral CpG-DNA and in the establishment of an immune response. The aim of the present study was to examine if there is any effect of in vitro embryo culture and embryo transfer on the expression of TLR-9 in adult lung tissue. Two groups were included in the study: The Control group consisted of adult mice obtained through mating of female mice that did not receive PMSG + hCG administration with male mice of the same age. The Experimental group consisted of adults derived from the transfer of in vitro produced blastocysts. To this end, fertilized egg cells (zygotes) were cultured under atmospheric oxygen concentration until the blastocysts stage of development, blastocysts were transferred to pseudo-pregnant mice and pups born were reared to adulthood to be included in the Experimental group. Crossman's triple staining method was used to demonstrate the general histological structure of the adult lung tissue. Immunohistochemistry and immunofluorescence methods were used to determine cell types that express TLR-9 in both Control and Experimental groups. In addition to those methods, real-time PCR and western blot techniques were used to determine expression level of TLR-9 at the mRNA and protein levels, respectively. The results of immunohistochemistry/immunofluorescence analyses demonstrated that cells within and around the air ways, epithelium lining the alveoli and blood vessels express TLR-9 and that the pattern of staining was similar between the two groups. Results obtained from western blot analysis indicated that the expression level of the TLR-9 protein in the Experimental group was 1.25 fold higher compared to the Control group (p=0,015). On the other hand, real-time PCR analyses demonstrated that the expression of TLR-9 transcripts decreased 1.38 fold in the Experimental group when compared to the Control group (p>0,05). Taken together, results obtained from the present study demonstrate that TLR-9 is expressed in certain cell types including Type II pneumocytes and macrophages in the adult lung tissue and suggest that in vitro embryo culture and embryo transfer may affect the immune response of the lung by altering expression of TLR-9.