Akciğer kanseri hücre serilerinde epidermal büyüme faktörü reseptörünün inhibisyonunun claudinler üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effects of epidermal growth factor receptor inhibition on claudins in lung cancer cell lines
Yazar: EDA DOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. VİLDAN BOZOK ÇETİNTAŞ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Claudin = Claudin ; Epidermal büyüme faktörü = Epidermal growth factor ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre dizisi = Cell line ; Mikro RNA = Micro RNA ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Sıkı bağlantılar epitelial, endotel ve mezotel hücrelerinde bulunan membrana bağlı
yapılardır. Hem epitel hem de endotel hücre tabakalarının bitişik hücreleri arasında bağlantı
sağlayan çoklu protein kompleksleridir. PIKfyve inhibitörü YM201636'nın sıkı bağlantı
proteinleri CLDN1 ve CLDN2'nin endositik geri dönüşümünü inhibe ederek sıkı bağlantı
yapılarını bozduğu bildirilmiştir.
Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), hücre zarında bulunan bir
transmembran glikoproteindir ve hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde kritik önemi
bulunmaktadır. Kanser hücrelerinde EGFR işlevini inhibe etmek için hücre içi tirozin kinaz
sinyalizasyonunu engelleyen moleküller veya EGFR'ye ve ligandlarına karşı nötrleştirici
antikorlar kullanılmaktadır. Canertinib (CI-1033), in vitro koşullarda EGFR, HER2 ve
HER4'ü inhibe eden bir tirozin kinaz inhibitörüdür.
Bu tez çalışmasında sıkı bağlantıların yapısal bir bileşeni olan claudinler ve EGFR
arasındaki ilişkinin aydınlatılması amaçlanmıştır. Bunun için EGFR mutant ve wild type
akciğer kanseri hücre serileri HCC827 ve H1299 kullanılmış, CI-1033 ve YM201636 etken
maddelerinin sitotoksik ve apoptotik etkileri ile birlikte EGFR ve claudin mRNA ve protein
düzeylerine etkileri araştırılmıştır. Sitotoksisite analizlerinde XTT, apoptoz analizlerinde
Annexin/PI boyaması, mRNA ve protein düzeylerinin belirlenmesinde kantitatif RT-PCR ve
western blot yöntemleri kullanılmıştır.
CI-1033'ün HCC827 ve H1299 hücre serilerinde IC50 dozu sırasıyla 2.17 ve 16.42 µM
bulunmuştur. YM201636, EGFR mutant HCC827 hücre serisinde 11.07 µM'da sitotoksik
etki gösterirken, EGFR wild type H1299 hücrelerinde 75 µM konsantrasyonda hücre
canlılığını etkilememiştir. YM201636 etken maddesi HCC827 hücrelerinde EGFR, CLDN1
ve CLDN3 mRNA ekspresyon düzeylerinde anlamlı artışa neden olmuştur, H1299
hücrelerinde ise YM201636 uygulandıktan sonra CLDN1 mRNA düzeyi anlamlı olarak
azalmıştır. CI-1033 ve YM201636 inhibitörleri EGFR mutant ve wild type hücre serilerinde
CLDN ekspresyonlarına farklı yönde etki etmiştir.
Anahtar kelimeler: akciğer kanseri; sıkı bağlantılar; claudin; EGFR

Abstract:
Tight junctions are membranous structures present in epithelial, endothelial and
mesothelial cells. It is a multiprotein complex that links between adjacent cells of both
epithelial and endothelial cell layers. It has been reported that tight junction proteins of the
pump inhibitor YM201636 inhibit the endocytic recycling of CLDN1 and CLDN2 and
disrupt their tight junctions.
EGFR is a transmembrane glycoprotein present in the cell membrane, and there is a
critical importance in the regulation of cell proliferation. To inhibit EGFR function in cancer
cells, molecules that inhibit intracellular tyrosine kinase signaling or neutralizing antibodies
against EGFR and its ligands are used. Canertinib (CI-1033) is a tyrosine kinase inhibitor
that inhibits EGFR, HER2 and HER4 invitro conditions.
In this thesis study, it is aimed to elucidate the relationship between EGFR and
claudins, which is a structural component of tight junctions.
For this, EGFR mutant and wild-type lung cancer cell lines HCC827 and H1299 were
used, and the cytotoxic and apoptotic effects of CI-1033 and YM201636 agents were
investigated and their effects on EGFR and claudin mRNA and protein levels were
investigated. XTT in cytotoxicity analyzes, Annexin / PI in apoptosis assays, quantitative
RT-PCR and western blot methods in determining mRNA and protein levels were used.
The IC50 for CI-1033 was determined to be 2.170 and 16.42 μM for the HCC827 and
H1299 cell lines respectively. YM201636 showed cytotoxic effect at 11.07 μM in the EGFR
mutant HCC827 cell line whereas EGFR did not affect cell viability at 75 μM concentration
in wild-type H1299 cells. The agents YM201636 caused a significant increase in EGFR,
CLDN1 and CLDN3 mRNA expression levels in HCC827 cells, and in H1299 cells, the
level of CLDN1 mRNA decreased significantly after administration of YM201636. CI-1033
and YM201636 inhibitors exerted different effects on CLDN expression in EGFR mutant
and wild-type cell lines.
Key Words: lung cancer; tight junction; claudins; EGFR