Mikrosatellit instabil karsinomlarda DNA mismatch onarım sistemi gen değişimlerinin araştırılması
Analysis of DNA mismatch repair system gene alterations in mikrosatellit instabil carcinomas
Yazar: HİLAL ÖZAKINCI
Danışman: DOÇ. DR. DUYGU ENNELİ
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Patoloji = Pathology
Dizin: Mikrosatelitler = Microsatellites ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Kanserlerin önemli bir kısmında "Mismatch repair" (MMR) sistem bozukluğu (dMMR)/mikrosatellit instabilite (MSI-H) bulunmakta; dMMR/MSI-H bulunan ileri evre tümörlerde, tümör tipinden bağımsız olarak immünoterapi tedavi alternatifini oluşturmaktadır. Ayrıca dMMR/MSI-H saptanması; tedavi seçenekleri yanısıra, tümörün prognozu ve herediter sendromlarla ilişkili vakaların belirlenmesi noktasında da bilgi vermektedir.
Tüm bu gerekçelerle, pek çok kanser tipinde, giderek artan sıklıkta dMMR/MSI-H analizi yapılmakta, ancak mevcut yöntemlerin kısıtlılıkları nedeni ile hastaların %5-10 kadarında yanlış negatiflik görülmektedir. dMMR/MSI-H analizi için en sık ve ilk basamak olarak başvurulan yöntem; tümör dokusunda 4 majör MMR proteininin (MSH2, MSH6, PMS2, MLH1) ekspresyonunun İHK ile araştırılmasıdır. Ancak MMR sisteminde görevli 38 protein bulunmaktadır ve bunlardan MSH2, MSH6, PMS2, MLH1 dışı diğer 34 proteinin dMMR/MSI-H etyolojisindeki rolünü araştıran çalışma bulunmamaktadır. 
Çalışmamızda; rutinde MMR proteinlerinden sadece 4'ünün ekspresyon kaybının immünohistokimyasal olarak araştırılmasının yanlış negatifliğe sebep olabileceği hipotezinden yola çıkılmıştır. Bu hipotez cBioPortal bilgi bankası üzerinden "in-silico" olarak test edilmiştir. MSI-H saptanmış ancak MSH2, MSH6, PMS2, MLH1 genlerinde değişim olmayan hastalarda, MMR sisteminde rol alan diğer 34 genin moleküler değişimleri araştırılmış; hastaların yarısında MSH3 geninde K383Rfs*32 mutasyonu bulunduğu görülmüştür. Hipotezimizi destekleyen ve "in-silico" olarak elde edilen bu verinin,  "in-vitro" araştırılması çalışmamızın ikinci basamağında gerçekleştirilmiştir. Bölümümüzde MSH3 p.Lys383Argfs*32 mutasyonu saptanan hastalarda PCR ile MSI araştırılmış ancak hiçbir hastada MSI-H saptanmamıştır. Bu durum; hastalarımızda MSH3 mutasyon allel frekansının düşük olmasına (%4-%8) ve tümör miktarı düşük olduğunda MSI-PCR'ın sensitivitesinin düşmesine bağlanmıştır. Gelecek çalışmalarda yüksek allel frekanslı MSH3 mutasyonu taşıyan hastalarda MSI analizi yapılır ve MSH2, MSH6, PMS2, MLH1 proteinlerine ek olarak MSH3 proteini de rutin olarak İHK ile değerlendirilebilir ise hastalar tanısal, terapötik ve diagnostik açıdan daha doğru yönlendirilebilir.

Abstract:
Majority of cancers show Mismatch repair system deficiency (dMMR)/microsatellite instability (MSI-H). Regardless of tumor type and tumor origin, immunotherapy constitutes the treatment alternative in advanced stage solid tumors which show dMMR/MSI-H. In addition to treatment options, dMMR/MSI-H detection also provides information about prognosis of the tumor and the identification of cases associated with hereditary syndromes.
Therefore, dMMR/MSI-H analysis is being performed with increasing frequency in many cancer types, but false negative results are seen in 5-10% of patients due to the limitations of current analyses methods. The most frequently used and first step method for dMMR/MSI-H analysis; is to investigate the expression of 4 major MMR proteins (MSH2, MSH6, PMS2, MLH1) in tumor tissue by immunohistochemistry (IHC). However, there are 38 proteins have role in MMR system, and there are no studies investigating the role of non-major MMR proteins in the etiology of dMMR/MSI-H.
In the present study, it was hypothesized that immunohistochemical investigation of the loss of nuclear expression of only 4 major MMR proteins routinely, could cause false negativity about dMMR/MSI-H status. This hypothesis was tested in-silico on the cBioPortal database. The molecular changes of other 34 genes involved in the MMR system were investigated in patients whom have MSI-H and don't have any mutation or gene expression alteration in major MMR genes (MSH2, MSH6, PMS2, MLH1). Half of these patients had a K383Rfs*32 mutation in the MSH3 gene. Second step of our study was in-vitro confirmation of the in-silico result. MSI status was analyzed by PCR in tumors which evaluated in our department before and had p.Lys383Argfs*32 mutation in MSH3 gene. However, MSI-H was not detected by PCR in these patients so in-silico results could not be verified by in-vitro analyses. MSI-PCR sensitivity decreases when tumor cell percentage is low, so the reason of this inconsistency can be due to low allele frequency (4-8%) of MSH3 mutation in our patients. In the future, MSI-PCR analysis can be performed in patients whom had MSH3 mutation with high allelic frequency and if in addition to MSH2, MSH6, PMS2, MLH1 proteins, MSH3 protein can be routinely evaluated by IHC, so patients can be guided more accurately in terms of diagnosis, prognosis and therapy.