Genetik karakterizasyonu yapılmış çeşitli laktik asit bakterilerinin bazı özeliklerinin belirlenmesi
Determination of some characteristics of various genetically characterized lactic acid bacteria
Yazar: EDİBE RABİA ÖZKAN
Danışman: PROF. DR. NİHAT AKIN
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmada geleneksel Tulum peynirinden izole edilen 11 adet Lactobacillus spp., 10 adet Enterococcus spp. ve 8 adet Streptococcus spp.'ye ait suşlar gelişme özellikleri (farklı sıcaklıklarda gelişme, farklı alkol, NaCl ve H2O2 konsantrasyonlarında gelişme, dondurma ve liyofilizasyona dayanıklılık), stres tolerans kabiliyeti (lizozim, safra, asit, mide ve pankreas özsu toleransı), adezyon yeteneği (hidrofobisite ve otoagregasyon), fonksiyonel özellikler (antibakteriyal aktivite, bakteriyosin üretimi, diasetil üretimi, β-galaktosidaz aktivitesi, kolesterol asimilasyonu, ekzopolisakkarit üretimi) ve güvenlik özellikleri (hemolitik aktivite, antibiyotik direnci, biyojen amin üretimi ve virülans gen) açısından incelenmiştir. 
Tüm izolatların lizozim varlığında 2 saat inkübasyon sonundaki canlılıkları % 50'nin üzerinde tespit edilmiş olup izolatlar % 1 oranında safra varlığında da canlılıklarını koruyabildiği tespit edilmiştir. pH 3'te tüm Lactobacillus izolatları ile birlikte 4 Enterococcus (277, 894, 702 ve 394) ve 4 Streptococcus (1046, 932, 120 ve 1214) izolatı canlı kalabilirken pH 2'de sadece 8 (665, 16, 184, 15, 449, 24, 480 ve 675) laktobasil izolatı canlı olarak tespit edilmiştir. Pepsin içeren ortamda tüm laktobasil izolatları, 99, 277, 894, 702, 1041, 394, 1078 no'lu enterokok izolatları ve 930 no'lu streptokok izolatı %50'nin üzerinde bir oranda canlılığını korumuştur. Bununla birlikte izolatların üzerinde pankreatinin önemli bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir.
15, 449, 24 no'lu laktobasil, 99, 1041, 394, 1078, 1050 no'lu enterokok, 1046, 930, 937 ve 1191 no'lu streptokok izolatlarının n-hekzadekan ve ksilene karşı hidrofobisite yetenekleri %40'ın üzerinde belirlenmiş ve tüm LAB izolatlarının 3 ve 24 saat sonundaki otoagregasyon oranları sırasıyla %7.44-43.19 ve %2.53-53.87 aralığında tespit edilmiştir.
Salmonella Typhimurium ATCC 14028'e karşı hiçbir izolat antibakteriyal etki göstermemiş olup 16, 184 ve 375 dışındaki tüm izolatların Staphylococcus aureus ATCC 25923'a karşı antibakteriyal zon oluşturduğu gözlemlenmiştir. Listeria monocytogenes ATCC 7644'e karşı 10 izolat (laktobasillerde 15 ve 449; enterokoklarda 277, 894, 702, 1041 ve 394; streptokoklarda 1046, 932 ve 375), Bacillus cereus ATCC 11778'e karşı 2 izolat (120 ve 930 no'lu streptokok) ve Escherichia coli ATCC 25922'e karşı sadece 1 izolat (675 no'lu streptokok) antibakteriyal etki oluşturmuştur. İlgili suşların antibakteriyal etkilerinin bakteriyosin kaynaklı olmadığı belirlenmiştir. LAB suşları arasında sadece 1030 (181.87 MU), 1270 (132.57 MU), 24 (120.17 MU) ve 480 (177.93 MU) no'lu laktobasil izolatlarının yüksek β-galaktosidaz aktivitesine sahip olduğu belirlenmiştir. En yüksek kolesterol asimilasyon değerleri laktobasillerde 184 (%53.67), 1030 (%49.44), 15 (%43.79), 16 (%41.90), 288 (%41.90), 665 (%41.43) no'lu izolatlarda, enterokoklarda ise 675 (%0.49), 99 (%50.85) ve 12 (%48.49) no'lu izolatlarda belirlenmiştir. İncelen bütün izolatların EPS ürettiği belirlenmiştir.
Güvenlik açısından incelenen LAB izolatlarının hepsi γ-hemolitik aktivite göstermiş olup lisin, tirozin ve ornitin içeren besiyerlerinde biyojen amin üretimi gerçekleşmezken arjinin dekarboksilasyon aktivitesi sadece 665, 1030, 1270, 15 no'lu laktobasil, 277, 1041, 394, 1050 no'lu enterokok, 120 ve 937 no'lu streptokok suşlarında belirlenmiştir. En yaygın kullanılan penisilin antibiyotiğine karşı 24, 937 ve 1214 dışında hiçbir izolat direnç göstermemektedir. 99, 394 ve 894 no'lu enterokok izolatları virülans gen varlığı açısından incelenmiş olup 99 no'lu izolat hiç virülans gen içermezken izolat 894'te 3 (gelE, cylA ve asa1) 394'te ise 5 (gelE, cylA, cylLl,S, cylM, hylefm) virülans gen belirlenmiştir.
Elde edilen sonuçlara göre Lb. plantarum izolat 15, Ent. faecium izolat 99, Ent. faecium izolat 894 ve S. infantarius 930 no'lu suşların yüksek probiotik özellik gösterdiği ve ileri in vivo çalışmalar için iyi birer probiyotik aday olabilecekleri düşünülmektedir.

Abstract:
In this study; eleven Lactobacillus (Lb.), ten Enterococcus (Ent.) and eight Streptococcus (S.) strains isolated from traditional Turkish Tulum cheeses were characterized regarding their growth properties (growth at different temperature, growth at different alcohol, NaCl and H2O2 concentrations and resistance to freezing and lyophilization), stress tolerance ability (lysozyme tolerance, bile and acid tolerance, gastric and pancreatic juices tolerance), adhesion ability (hydrophobicity and auto-aggregation), functional properties (antibacterial activity, bacteriocin and diacetyl production, β-galactosidase activity, production of exopolysaccharides, and cholesterol removal), and safety properties (hemolytic activity, antibiotic resistance, biogenic amine production, and virulence gene).
The viability of all isolates was determined above 50% after 2 hours in the presence of lysozyme and all isolated strains survived, even in the presence of 1% bile after 48 h. At pH 3, all lactobacilli isolates, 4 enterococci (277, 894, 702 and 394), and 4 streptococci (1046, 932, 120 and 1214) isolates survived, while at pH 2 only 8 lactobacilli isolates (665, 16, 184, 15, 449, 24, 480 and 675) survived. All the Lactobacillus isolates, Enterococcus isolates 99,277, 894, 702, 1041, 394, 1078 and Streptococcus isolate 930 kept their viability (over 50%) after the treatment with simulated gastric juice. All the lactic acid bacteria strains exhibited good survival at simulated pancreatic juice.
The highest cell hydrophobicity rates towards both n-hexadecane and xylene were observed for isolates 15, 449, 24, 99, 1041, 394, 1078, 1050, 1046, 930, 937 and 1191, while the auto-aggregation values of the isolates ranged from 7.44 to 43.19% and 2.53 to 53.87% at 3 and 24 h, respectively.
None of the isolate showed antibacterial effect against Salmonella Typhimurium ATCC 14028, while all the lactic acid strains except isolates 16, 184 and 375 expressed a clear inhibition zone against Staphylococcus aureus ATCC 25923. A total of 10 isolates (15, 449, 277, 894, 702, 1041, 394, 1046, 932, 375), 2 isolates (120 and 930), and 1 isolate selectively provided antibacterial effect against Listeria monocytogenes ATCC 7644, Bacillus cereus ATCC 11778, and Escherichia coli ATCC 25922, respectively, and these antibacterial effects were not found to be caused by bacteriocin action. Among the LAB strains, 1030 (181.87 MU), 1270 (132.57 MU), 24 (120.17 MU) and 480 (177.93 MU) indicated the presence of β-galactosidase activity. The highest cholesterol assimilation values were observed for isolates 184 (53.67%), 1030 (49.44%), 15 (43.79%), 16 (41.90%), 288 (41.90%), 665 (41.43%), 675 (40.49%), 99 (50.85%), and 12 (%48.49). All the isolates exhibited EPS production ability.
Whole the LAB isolates examined for safety showed γ-hemolytic activity. None of the LAB strains tested could decarboxylase lysine, tyrosine, or ornithine, and only ten strains (665, 1030, 1270, 15, 277, 1041, 394, 1050, 120 and 937) produced agmatine from arginine. All the LAB isolates except isolate 24, 937, and 1214 were found to be sensitive or intermediate sensitive to penicillin, which is a frequently used antibiotic. Isolates 99, 394 and 894 were examined based on the presence of virulence genes encoding for aggregation substance (asa1), cytolysin (CylLL, CylLs, CylM, CylB, CylA), gelatinase (gelE), and hyaluronidase (hylefm) and no virulence gene was detected for isolate 99. Isolate 894 harbored three virulence determinants including asa1, gelE and CylA, while isolate 394 harbored five virulence determinants including gelE, CylA, cylLl,S, cylM, hylefm.
According to the results obtained, Lb. plantarum isolate 15, Ent. faecium isolate 99, Ent. faecium isolate 894, and S. infantarius isolate 930 were shown to be a potential candidate for further in vivo investigations as a probiotic culture.