Antibiyotik  direnç genleri  ve heterotrofik bakterilerin pcr ile kantitatif olarak belirlenmesi
Quantitative determination of antibiotic resistance genes and heterotrophic bacteria by pcr
Yazar: SHADMAN TARIQ SADIQ SADIQ
Danışman: PROF. DR. İHSAN YAŞA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Halk Sağlığı = Public Health ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering

Özet:
Antibiyotik dirençli bakteriler (ADB) ve antibiyotik direnç genleri (ADG) dünya çapında gittikçe büyümekte olan önemli bir konudur.
    Nisan 2018 - Mart 2019 arasında Manisa Saruhanlı Atıksu Arıtma Tesisinden giriş ve çıkış noktalarından su numuneleri alınmıştır. Bu tezde ADB ve ADG belirlemek için kültürel ve molekuler biyolojik yöntemler uygulanmıştır, ayrıca kalıntı analizleri için kromatografi tekniği kullanıldı.
   Yıl boyunca elde edilen total heterotrofik bakteri sayım sonuçları, giriş sularında minimum 4.26 × 106 kob / mL'den 7.525 × 104 kob / mL'ye, çıkış sularında ise maksimum 9.8 × 102 kob/mL'den minimum 9.4 × 102 kob/mL olarak değiştiğini göstermiştir.
     Dirençli bakteri hücrelerinin sayısı giriş ve çıkış kısımlarında Eritromisin (Er), Ampisilin (AMP), Gentamisin (Gen), Kanamisin (Kan), Tetrasiklin (TC) ve Clindamisin (Cln) gibi yaygın antibiyotiklere karşı test edilmiş.
    Giriş örnekleri için yıl boyunca toplam dirençli bakteri sayısı değişmiş olup, İlgili antibiyotiğe karşı oluşturulan direnç tüm aylarda yapılan örneklemelerde tespit edilmiş olup, sulfonamid dirençli bakteriler ile kanamisin ve klindamisine dirençli bakteriler bahar aylarında tespit edilmemiştir. 
     Yedi özgün antibiyotiğin varlığı ve mevsimsel değişimi  Atık Su Arıtma Tesisinde yüksek çözünürlüklü sıvı kromatografi spektroskopisi (LC-Q-ToF-MS) kullanılarak araştırılmıştir Antibiyotik rezidülerinin tayin sonuçları tüm ilgilenilen antibiyotiklerin dört mevsim örneklerinde bulunduğunu, sülfonamid ve kanamisin ile tespit edilmediğini göstermiştir. 
    Antibiyotik rezidülerinin değerlendirilmesinde kullanılan LC-Q-ToF-MS ile yine pestisit, herbisit ve veteriner ilaçları analiz edilmiş olup en çok bulunan pestisit ve herbisitlerin DDT, dinoterb ve denatonyum olduğunu.
    Çalışmamızda 15 farklı metalin (As, Se, Al, Ag, Sb, Ba, Hg, Cd, Pb, Mn, Cu, Zn, Cr, Fe and Ni) katı ve sıvı formları 4 mevsim boyunca incelenmiştir. Tüm metallerin giriş sularında %100 ve çıkış sularında ise yaklaşık olarak %90 oranında (toplam konsantrasyon) bulunduğu tespit edilmiş olup.
   Atık sudaki antibiyotik kalıntılarının tayini yapıldıktan sonra, konvansiyonel PCR ile antibiyotik direnç genleri tespit edilmiştir. Araştırmalarımız ile beş direnç gen bölgesinin (tetA, ermA, sul 1, ant (2")-I ve AmpC) incelenmiştir. 4 antibiyotik direnç gen elde edilen örneklerinin hepsinde %100 olarak tespit edilmiş olup, sadece (AmpC) geni tespit edilememiştir. 
    Direnç genlerinin kantitatif belirlenmesi için qPCR yapılmıştır. Bu uygulama için Gentamisin direnç geni (GDG)  ant(2") seçilmiştir. ant (2") kopya sayısı olarak belirtilmiştir. Klasik PCR sonuçlarında görüldüğü gibi GDG bütün mevsimlerde dağılım göstermiştir, sonuçlara göre giriş sularında GDG'de yüksek kopya sayısı bulunmuştur, çıkış sularında ise gen kopya sayısı arıtma işlemden dolayı daha düşük tespit edilmiştir.
Anahtar kelimeler: Antibiyotik direnç genleri,Antibiyotik dirençli bakteriler, Saruhanlı Atıksu Arıtma Tesisi.

Abstract:
Nowadays, antibiotic-resistant bacteria (ARB) and antibiotic resistance genes (ADGs) are a hot topic of concern which growing worldwide and considered new classes of water contaminants. In this project, we used cultural and molecular techniques for assessment of ARB & ADG, as well as chromatographic techniques to do antibiotics & pesticide residues analyses. 
    Sample collected from Saruhanli wastewater treatment plant system (WWTPs) in Manisa city of Aegean region between April 2018 – March 2019 meanly 2 campaigns per month.
   The obtained results of total heterotrophic bacteria (THB) during the year was showed changing from (4.26 × 106 ) CFU/mL to (7.52 × 104 )   CFU/mL as minimum for influent part and changed from (9.8 × 102) CFU/mL as maximum to( 9.4 × 102 ) CFU/mL as minimum for effluent
  The number of resistant bacterial cells also calculated in both influent and effluent against six commonly used antibiotics, the applied antibiotic solutions were Erythromycin (Er), Ampicillin (AMP), Gentamycin (Gen), Kanamycin (Kan), Tetracycline (TC) and Clindamycin (Cln) as well as susceptibility test was performed to ensure the resistance to antibiotics by disc diffusion method.
    The total number of bacteria in influent samples during the year was changed. Most resistance bacteria against interested antibiotics are detected in all months of the sampling.
   High-Resolution liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-Q-ToF-MS) used for qualification investigates the occurrence, amount and seasonal change of seven typical antibiotics resıdues sulfonamide/ Sulfamethoxazole, Ampicillin. Tetracycline, Erythromycin, Clindamycin, Gentamycin and Kanamycin, results showed that all targeted antibiotics founded in four-season except Sulphonamide and kanamycin not detect.
   LC-Q-ToF-MS also used for Pesticides, Herbicides and Veterinary drugs residue qualification. Results showed that the most pesticides and herbicides founded was DDT, Dinoterb and Denatonium.
   As well as residues analyses, 15 metal (As, Se, Al, Ag, Sb, Ba, Hg, Cd, Pb, Mn, Cu, Zn, Cr, Fe, and Ni) assessed. All these metals founded 100% in influent and about 90% for affluent parts.
    Finally, we detected ADGs in the same samples by Convenient PCR. Our investigations succeeded to assay four ADGs: tetA, ermA, sul 1 and ant (2")-I.
    The results of qualification detection showed that all of these ADG was founded 100 % in all samples during one year of sampling for both influent and effluent samples of WWTP except (AmpC) gen not detected and only (ermA) gen appeared in 20 % of effluent samples with no appear in effluent samples.
     For quantification of ADGs, qPCR method applied and Tagman probe used for determination of gene copy number, among qualified ADGs, Gentamicin resistance gene ant (2") was selected for quantification. The result showed variation in gene copy number and the gene copy number was high in all seasons.
Keywords: Antibiotics resistance genes, Antibiotics resistance bacteria, Saruhanlı wastewater treatment plants.