Tat-tar etkileşmesini inhibe edebilecek bileşiklerin araştırılması
Investigation of compounds that may inhibit tat-tar interaction
Yazar: CANAN ASLAN
Danışman: PROF. DR. İLHAN DEMİRHAN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) bir retrovirüs olup, kazanılmış bağışıklık yetmezlik sendromu (AIDS) hastalığının temel etkenidir. 1980'lerde ortaya çıkan AIDS, günümüzde 33 milyondan fazla insanı etkisi altına alarak hızla yayılmasına karşın HIV virüsünün sürekli mutasyona uğraması tedavi yaklaşımlarını zorlaştırmaktadır. Bu nedenle bu çalışmada HIV virüsünün regülatör proteinlerinden birisi olan Tat'ın (Transkripsiyonu aktive edici protein), TAR (Transaktivasyon duyalı bölge) ile etkileştiği bazik aminoasit dizisini taklit eden çeşitli inhibitörlerin HIV virüsüne karşı etkileri araştırılmıştır.Bazik peptid dizilerinin Tat-proteinin aktivitesi üzerine etkileri Jurkat hücre kültüründe araştırılmıştır. Jurkat hücreleri iki farklı plazmit ile transfekte edilmiştir. Bu plazmitlerden biri Tat geni (pCV1), ikincisi ise HIV-1-LTR ile Kloramfenikol asetiltransferaz (Chloramphenicol Acetyl Transferase,CAT) geni (pC15CAT) içermektedir. Plazmitlerin kaliteleri agaroz jel elektroforezi ile test edilip görüntülenmiş ve literatürlerden faydalanılarak doğruluğundan emin olunmuştur. Transfeksiyon yapılan hücrelere inhibitörler ilk olarak tek dozda (50?g/ml) denenmiş ve hücrelerde CAT ELISA (Roche) kiti ile CAT ekspresyonu tespit edilmiştir. Tat-proteinin aktivitesinin CAT ekspresyonu ile doğru orantılı olduğu prensibine dayanarak bazı peptit dizilerinin inhibisyon yaptığı kararına varılmıştır. Bu dozda inhibisyon oluşturduğuna karar verilen inhibitörlerin dozları artırılarak (50?g/ml, 75?g/ml, 100?g/ml) gözleme devam edilmiştir.Kullanılan ilk dozda inihibisyon gözlenen bazik aminoasit dizi ve bileşikleri ?L-Histidin methil ester dihidroklorür? ve ?Lys-Lys-Lys-Lys? dizilerinde inhibisyon olduğu ancak bu inhibisyonun doza bağımlı olmadığı, ?L-Histidin methil ester dihidroklorür?'in CAT aktivasyonunu en iyi inhibe ettiği dozun 75?g /ml, ?Lys-Lys-Lys-Lys? dizisinin CAT aktivasyonunu en iyi inhibe ettiği dozun ise 50?g/ml olduğu saptanmıştır.Sonuç olarak ?L-Histidin metil ester dihidroklorür? ve ?Lys-Lys-Lys-Lys? moleküllerinin HIV virüsünün replikasyonunu aktive edici Tat-TAR etkileşimi üzerine inhibe edici etkilerinin olduğu ilk kez bu çalışma ile gösterilmiştir. Bu nedenle çalışmanın HIV enfeksiyonuna karşı geliştirilecek ilaçlar açısından oldukça önemli olduğu düşünülmektedir.Anahtar kelimeler: HIV, TAT, CAT

Abstract:
Human Immunodeficiency Virus? (HIV) is a retrovirus which is the main factor of ?Acuqired Immunodeficiency Syndrome? (AIDS). AIDS was firstly seen in 1980s and although it has rapidly spreaded up to 33 million people all around the world the rapid and variable mutations of the HIV virus limits the new treatment approaches. In this study, the effects of various inhibitors that mimic the basic aminoacid sequence of the interactions between Tat (trans activation of transcription) protein (one of the regulator proteins of the HIV virus) and TAR (trans activation response) is investigated.The effects of basic peptide sequences were investigated on Jurkat cell line cultures. The Jurkat cells are transfected by two different plasmids. One of these plasmids has Tat gene (pCV1), and the second has HIV-1-LTR and CAT (chloramphenycol-acetyl-transferase) gene (pC15CAT). The qualities of the plasmids are then monitorized and tested on agarose gel and confirmed by the literature. In the transfected cells, the inhibtors are tried in one dose (50?g/ml) and the CAT expressions were analyzed by the help of CAT ELISA (Roche) kit. Depending on the principles of the direct proportion between the Tat ?protein activity and the CAT expressions, some of the inhibitor are decided to be effective on basic aminoacid sequences. The inhibitors that are decided to be effective are then prepared in 3 different doses (50?g/ml, 75?g/ml, 100 ?g/ml) and the evaluations are performed.The aminoacid sequences that has inhibitor effects in the first dose trial were ?L-Histidine methyl ester dihydrochloride? and ?Lys-Lys-Lys-Lys? sequences however their inhibition was not dose-dependent. The best inhibitor dose of the ?L-Histidine methyl ester dihydrochloride? on CAT expression was 75?g /ml, where as it was 50?g/ml for the ?Lys-Lys-Lys-Lys?.In conclusion, the inhibitor effects of basic amino acid sequences and coumpounds ?L-Histidine methyl ester dihydrochloride? and ?Lys-Lys-Lys-Lys? molecules on the Tat-TAR interactions which activate the HIV virus replication were firstly shown by this study. Therefore, it is thought to be a very important study that may contribute to the new treatment approaches for the HIV infection.Key words: HIV, TAT, CAT