Bazı probiyotik mikroorganizmaların farklı kanser hücre hatlarına sitotoksik etkisinin belirlenmesi
Determination of the cytotoxic effects of some probiotic microorganisms on different cancer cell lines
Yazar: SEDA YALÇINKAYA
Danışman: PROF. DR. AYNUR GÜL KARAHAN ÇAKMAKÇI ; PROF. DR. SERAP YALÇIN AZARKAN
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Docking = Docking ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Probiyotikler = Probiotics

Özet:
Bu çalışmada, potansiyel probiyotikler Lactiplantibacillus plantarum AB6-25, L. plantarum MK55 ve Saccharomyces boulardii T8-3C'nin HCT-116 kolon kanseri, HeLa rahimağzı kanseri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarına sitotoksik etkisi belirlenmiştir. Mikroorganizma hücre içeriklerinin sitotoksik etkisi öncelikle 2B ve 3B olarak geliştirilmiş kanser hücre hatlarında değerlendirilmiştir. Bunun yanı sıra potansiyel probiyotiklerin kanser hücre hatlarındaki metastaza etkisinin değerlendirilmesi için migrasyon (yara iyileştirme) ve invazyon deneyleri yapılmıştır. Daha sonra bu etkinin gen düzeyindeki yansımalarını gözlemlemek üzere her üç kanser hücre hattında apoptotik yolaklarda rol oynayan 20 genin ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Çalışmanın son aşamasında QTOF-LC/MS ile mikroorganizmaların hücre içeriklerinin bileşimi saptanmıştır. Belirlenen bileşiklerin antikanser etken madde olma potansiyeli in siliko yöntemlerden olan moleküler kenetlenme (docking) ve moleküler dinamik simülasyon çalışmaları ile değerlendirilmiştir. 
Potansiyel probiyotik suşların 2B geliştirilen kanser hücre hatlarına sitotoksik etkisi XTT deneyi ile incelenmiştir. Elde edilen bulgulara göre L. plantarum AB6-25 HeLa rahimağzı kanseri (%91 inhibisyon) ve MDA-MB-231 meme kanseri (%80 inhibisyon) hücre hatlarında en çok etkili olan suştur. L. plantarum MK55 %69 inhibisyon oranıyla en yüksek sitotoksik etkiyi HCT-116 kolon kanseri hücre hattına göstermiştir. S. boulardii T8-3C suşu ise iki bakteriye kıyasla kanser hücre hatları üzerinde daha zayıf antikanserojenik etkiye sahip bulunmuştur. 3B geliştirilen hücre hatlarında ise her üç mikroorganizma için en yüksek sitotoksik etki %10 konsantrasyonda hazırlanan hücre içeriğinde belirlenmiştir.
3B olarak geliştirilmiş HCT-116 kolon kanseri ve HeLa rahimağzı kanseri hücre hatlarına uygulanan mikroorganizma hücre içerikleri 24 saat içinde 3B yapının dağılmasına neden olmuştur. Ancak MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında mikroorganizma hücre içerikleri uygulandıktan 48 saat sonra yapıda dağılma meydana gelmeye başlamıştır. Bunun yanı sıra MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında yapı bütünlüğünün diğer iki kanser hücre hattına kıyasla daha iyi korunduğu görülmüştür. Sağlıklı meme epiteli MCF10A hücre hattında ise mikroorganizmaların herhangi bir olumsuz etkisi görülmemiştir. 
Migrasyon ve invazyon deneyleri sonucunda mikroorganizma hücre içeriklerinin kanser hücre hatlarında metastazı değişen düzeylerde engellediği belirlenmiştir. HCT-116 kolon kanseri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında L. plantarum MK55 hücre içeriği, HeLa rahimağzı kanseri hücre hattında ise S. boulardii T8-3C hücre içeriği metastazı engellemede en etkili suşlar olmuştur. 
Gen ekspresyon çalışması sonucunda ise mikroorganizma hücre içerikleri apoptotik genler üzerindeki en fazla etkiyi HeLa rahimağzı kanseri hücre hattında göstermiştir. HCT-116 kolon kanseri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında apoptotik genlerin ekspresyon düzeyleri daha az oranda değişmiştir. Western blot analizinde ise mikroorganizma hücre içerikleri CASP3 proteinini 2B olarak geliştirilmiş HeLa rahimağzı kanseri hücre hattında 3B hücre hattına kıyasla daha yüksek düzeyde eksprese etmiştir. 
Çalışmada QTOF-LC/MS analizi sonucunda üç potansiyel probiyotik mikroorganizma hücre içeriğinde toplam 248 bileşik tespit edilmiştir. Bu bileşiklerden 74 adedi yalnızca L. plantarum AB6-25, 16 adedi yalnızca L. plantarum MK55 ve 88 adedi yalnızca S. boulardii T83C suşunda tespit edilmiştir. 38 adet bileşik AB6-25 ve MK55'de, 25 adet bileşik MK55 ve T8-3C'de, 27 adet bileşik ise AB6-25 ve T8-3C'de ortak olarak belirlenmiştir. 10 adet bileşik ise her üç mikroorganizma da ortak bulunmuştur. En yüksek oranda tespit edilen bileşikler ise L. plantarum AB6-25'e ait hidrokarbonlar, L. plantarum MK55'e ait fosfolipidler ve S. boulardii T83C'ye ait yağ asitleri olmuştur.
Moleküler kenetlenme çalışmasına göre BRAF proteini ve istamycin C1 ligandı arasında -9.24 kcal/mol, BRAF proteini ve PAC1 ligandı arasında ise -9.58 kcal/mol ile en yüksek kenetlenme gerçekleşmiştir. Buna karşın BAX proteini beş adet hidrojen bağı kurarak -8.23 kcal/mol bağlanma enerjisi oluşturan istamycin C1 ligandı en iyi antikanser etkiyi gösteren molekül olarak belirlenmiştir. Moleküler dinamik simülasyon çalışması sonucunda da BAX proteini stabilitesini korumuştur.
In vitro çalışmaların sonuçları genetik ekspresyon analizi ve moleküler kenetlenme çalışmalarıyla desteklenmiş olup, mikroorganizma hücre içeriklerinin antikanser etken madde olabilme potansiyelini göstermiştir. 

Anahtar Kelimeler: Probiyotikler, Kanser, Apoptoz, Moleküler Kenetlenme

Abstract:
In this study the cytotoxic effects of potential probiotics L. plantarum AB6-25, L. plantarum MK55 and S. boulardii T8-3C probiotic strains on HCT-116, HeLa and MDA-MB-231 cancer cell lines were determined. The cytotoxic effect of microorganisms' cell contents was primarily evaluated in 2D and 3D developed cancer cell lines. In addition, migration (wound healing) and invasion experiments were performed to evaluate the effect of potential probiotics on metastasis in cancer cell lines. Then, the expression levels of 20 genes that play a role in apoptotic pathways in all three cancer cell lines were examined in order to observe the gene-level reflections of this effect. At the last stage of the study, the composition of the cell contents of the microorganisms was determined by QTOF-LC/MS. The potential of these metabolites to be anticancer agents was evaluated by molecular docking and molecular dynamics simulation studies, which are in silico methods.
The cytotoxic effect of potential probiotic strains on cancer cell lines developed in 2D was investigated by XTT assay. According to XTT results, L. plantarum AB6-25 was the most effective strain in HeLa cells (91% inhibition) and MDA-MB-231 cells (80% inhibition). L. plantarum MK55 showed the highest cytotoxic effect to HCT-116 cells with inhibition rate of 69%. S. boulardii T8-3C showed weaker anticarcinogenic effect on cancer cell lines compared to the two bacteria. In 3D cell lines, the highest cytotoxic effect for all three microorganisms was determined in the cell content at 10% concentration.
Microorganism cell contents applied to 3D HCT-116 and HeLa cervical cells caused the structure to disperse within 24 hours. On the other hand, in the MDA-MB-231 cells dispersion began to occur in the structure 48 hours after the microorganism cell contents were applied. In addition, it was observed that the structural integrity of the MDA-MB-231 cells remained more uniform compared to the other two cancer cell lines. No adverse effects of microorganisms were observed in the healthy breast epithelium MCF10A cells.
As a result of migration and invasion experiments, it was determined that microorganism cell contents prevented metastasis in cancer cell lines at varying levels. L. plantarum MK55 cell content in HCT-116 and MDA-MB-231 cells, and S. boulardii T8-3C cell content in HeLa cervical cells were the most effective strains in preventing metastasis.
As a result of gene expression study, microorganism cell contents showed the greatest effect on apoptotic genes in HeLa cells. The expression levels of apoptotic genes were less altered in the HCT-116 and MDA-MB-231 cells. In the western blot analysis, microorganism cell contents expressed CASP3 protein at a higher level in the 2D HeLa cells compared to the 3D cells.
As a result of the QTOF-LC/MS analysis in the study,248 metabolites were detected from the cell contents of three potential probiotic microorganisms. Of these compounds, 74 were detected only in L. plantarum AB6-25, 16 in only L. plantarum MK55 and 88 in S. boulardii T83C only. 38 compounds were determined in AB6-25 and MK55, 25 compounds in MK55 and T8-3C, and 27 compounds in AB6-25 and T8-3C. 10 compounds were found in all three microorganisms. The metabolites detected at the highest rate were hydrocarbons belonging to L. plantarum AB6-25, phospholipids belonging to L. plantarum MK55 and fatty acids belonging to S. boulardii T83C.
According to the molecular docking study, the highest binding energy was observed between BRAF protein and istamycin C1 ligand with -9.24 kcal/mol, and between BRAF protein and PAC1 ligand with -9.58 kcal/mol. However, istamycin C1 ligand has been determined molecule which the best anticancer effect since it creates -8.23 kcal/mol binding energy by forming five hydrogen bonds with BAX protein. As a result of the molecular dynamics simulation study, the BAX protein preserved its stability.
The results of in vitro studies have been supported by genetic expression analysis and molecular docking studies, demonstrating the potential of microorganism cell contents to be an anticancer agent.

Keywords: Probiotics, Cancer, Apoptosis, Molecular Docking