Etil piruvat'ın mikroglial hücrelerde NLRP3 inflamazom aktivasyonuna etkisi
The effects of ethyl pyruvate on NLRP3 inflammasome activation in microglial cells
Yazar: İREM NUR GÖKBAYRAK
Danışman: PROF. DR. ŞERMİN GENÇ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı / Temel Sinirbilimler Bilim dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Nöroloji = Neurology
Dizin: Adenozin trifosfat = Adenosine triphosphate ; Etil piruvat = Ethyl pyruvate ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Nöroglia = Neuroglia ; Pirin = Pyrin ; Piropitoz = Pyroptosis ; Piruvatlar = Pyruvates ; İnflamazom = Inflammasome

Özet:
İnflamazom aktivasyonu klasik inflamatuar yanıtlardan farklı olarak başlayan ve gelişen bir süreçtir. İnflamazom aktivasyonun oluşabilmesi için makrofaj veya mikroglia hücresinin algılayacağı bir tehlike sinyalinin olması gerekir. Bu sinyal; patojenle ilişkili moleküler yapılar (PAMP) ya da hasarlanma ile ilişkili moleküler yapılar (DAMP) olarak adlandırılırlar. İnflamazom aktive olduğunda kaspaz-1 aracılığıyla interlökin-1β (IL-1β) ve interlökin-18 (IL-18) gibi sitokinlerin salınımı gerçekleşmektedir. İnflamazom aktivasyonu olduğunda hücre ölümü de gerçekleştiğinden, inflamazom aktivasyonunun regülasyonu ve baskılanması önem arz etmektedir. Etil Piruvat (EP) anti inflamatuar ve pro metabolik etkileri olan bir moleküldür. EP'nin Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıkların klinik tablolarında iyileşme sağladığı gösterilmiştir. Ayrıca BV2 mikroglial hücre hattında inflamatuar aktivasyonu baskıladığı saptanmıştır. Çalışmamızda EP'nin N9 mikroglial hücre hattında inflamazom aktivasyonuna etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır.
Çalışmamızda, N9 mikroglial hücrelerine Lipopolisakkarit (LPS) ve ATP uygulaması ile NOD benzeri reseptör ailesi pirin domain içeren protein 3 (NLRP3) inflamazom aktivasyonu oluşturuldu. Öncelikle EP'nin inflamazom aktivasyonunu baskılayacak ve en önemlisi hücrelere toksik olmayacak dozu belirlenerek başlandı. Daha sonra inflamazom aktivasyonunun belirteçleri mRNA düzeyinde real-time PCR, protein düzeyinde ELISA ve immunblot yöntemleri ile incelendi. Bunun yanında mitokondriyal reaktif oksijen türleri (ROS) ve mitokondriyal membran potansiyeli florometrik yöntemlerle tespit edildi. Sonuçlarımıza göre EP, LPS+ATP modeli ile NLRP3 inflamazom aktivasyonu gerçekleştirilen N9 mikroglial hücrelerinde, IL-1β ve IL-18 inflamatuar sitokinlerinin mRNA düzeyinde miktarını istatistiksel olarak anlamlı azaltmıştır. Ayrıca, inflamazom ile ilişkili proteinlerin ekspresyonunu ve inflamazom aktivasyonu sonucunda görülen piroptotik hücre ölümünü azalttı. Bunların yanı sıra, mitokondriyal ROS miktarını baskılayıp ve mitokondriyal membran potansiyelinin bozulmasını önledi.

Anahtar Kelimeler: Etil Piruvat, Mikroglia, NLRP3 inflamazom, piropitoz, LPS,
ATP

Abstract:
Inflammasome activation is a process that begins and develops differently from classical inflammatory responses. For inflammasome activation, a danger signal must first reach the macrophage or microglia cell. In order to induce inflammasome activation, there must be a danger signal detected by the macrophage or microglia cell. This signal either can be named damage-associated molecular pattern (DAMP) or pathogen-associated molecular pattern (PAMP). When inflammasome mediators are active, cytokines such as interleukin-1β and interleukin-18 (IL-18) are released via caspase-1. Regulation and suppression of inflammasome activation is important because cell death can occur when inflammatory activity is present. Ethyl pyruvate (EP) is a molecule with anti-inflammatory and pro metabolic effects. EP has been shown to improve clinical presentation of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's. It was also found that BV2 inhibits inflammasome activation in the microglial cell line. In our study, it was aimed to investigate the effect of EP on N9 microglial cell line for inflammasome activation.
In our study, inflammasome  activation of protein 3 (NLRP3) containing NAD-like receptor family pyrine domain by Lipopolysaccharide (LPS) and ATP administration to N9 microglial cells was established. First, it will play an active role in the inflammasome activation of EP and most importantly it has been started by determining the dose not toxic to the cells. Subsequently, outputs of inflammasome activation were examined by real-time PCR, protein level ELISA and immunoblot methods at mRNA level. In addition, mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential were determined by fluorometric methods. According to our results, EP significantly reduced the amount of IL-1β and IL-18 inflammatory cytokines in mRNA level with LPS+ATP model which activates NLPR3 inflammasome in N9 microglial cells. In addition, it suppressed the amount of mitochondrial ROS and prevented the mitochondrial membrane potential from deteriorating. This study is the first to demonstrate that EP is effective to suppress the NLRP3 inflammasome activation in microglial cells.


Keywords: Ethyl Pyruvate, Microglia, NLRP3 Inflammasome, Pyroptosis, LPS,
ATP