Kandidalarda SAP (1-10) genlerinin ve biyofilm oluşumunun saptanması: Sağlık bakımı ile ilişkili enfeksiyonlarda kandan ve diğer örneklerden izole edilenlerin karşılaştırılması
Expression of SAP genes (1-10) and biofilm formation in candida spp: Comparison of health care associated infection isolates from bloodstream with isolates from other sources
Yazar: AHMED MOUSTAPHA NSANGOU
Danışman: PROF. DR. DUYGU FINDIK
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Antifungal duyarlılık testleri = Antifungal sensitivity tests ; Biyofilmler = Biofilms ; Enfeksiyonlar = Infections ; Genler = Genes ; Kandida = Candida ; Sağlık = Health ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Candida türleri, mantar enfeksiyonlarından sorumlu önemli bir patojendir ve çoğu invazif mantar enfeksiyonlarında etken olarak tespit edilir. Candida'lara morfogenez, adezyon, biyofilm oluşumu, fenotipik değişim, hidrolitik enzimlerin üretimi gibi birçok önemli virülans faktörü birçok anatomik bölgeyi işgal etmede etkilidir. Bunlardan aspartik proteazların üretimi ve salınımı artı biyofilm oluşumunun, kandida türleri için virülansın anahtar belirleyicisi olduğuna inanılmaktadır. Bu çalışmada, Çeşitli sağlık bakımı ilişkili enfeksiyonu olan hasta örneklerinden izole edilen ve Vitek 2 Compact sistemi ile tiplendirilmiş ve antifungal duyarlılıkları belirlenmiş olan Candida türlerinin moleküler yöntemlerle doğrulanması, Kandan ve diğer örneklerden izole edilen C.albicans suşlarının biyofilm oluşturma yeteneklerinin ve SAP1-10 genlerini taşıma özelliklerinin araştırılması ve bu virulans faktörleri arasındaki bağlantı, kandan ve diğer örneklerden izole edilenler arasında virulans faktörleri açısından farkların incelenmesi amaçlanmıştır.  
Şubat 2019 - Şubat 2020 tarihleri arasında Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi mikrobiyoloji laboratuvarının çeşitli klinik örneklerinden Candida türleri  izole edilmiştir. Sağlık bakımı ilişkili enfeksiyon etkeni olarak tanımlanmış 87 Candida spp  suşu bu çalışmaya dahil edilmiştir. Başlangıçta kandida suşları Vitek 2 Compact yöntemiyle ve ardından moleküler yöntem olan multipleks PCR ile tanımlanmıştır. VITEK ve Multipleks PZR sonuçları uyumsuz olan örneklere tür tanımının doğrulanması amacıyla DNA dizi analizi yapıldı. ITS 1 ve ITS 2 gen bölgesinin amplifikasyonu için UNI 1 ve UNI 2 evrensel primerler kullanılmıştır. C.albicans olarak tanımlanan 31 adet suşta biyofilm oluşturma yeteneği düz tabanlı mikroplaklarda ve SAP1-10 genlerinin varlığı PCR ile araştırılmıştır. Antifungal duyarlılıkları Vitek 2 Compact sisteminde çalışılmıştır. 
Vitek 2 Compact yöntemiyle ve mültipleks PCR ie çelişkişi çıkan 14 suş sekansa yollanmş ve Vitek 2 Compact yönteminin hepsini yanlış tanımladığı görülmüştür (%16.1).  
Sekans sonuçlarına göre değerlendirmeye alınan 31 C.albicans suşu değerlendirildiğinde 18 hastanın kan örneğinden izole edilen C.albicans suşlarının hepsi biyofilm yapmıştı, 2'sinde Sap 1-10 genlerinden hiçbiri saptanmadı ve sadece 6 no'lu örnekte Sap 5 negatifti, 2 örnek CFP, 2 örnek 5-FC,  2 örnek FCZ dirençli olarak saptandı. Kan dışı örneklerin ise hepsi biyofilm yapmıştı 1 plevra örneğinde sadece Sap 4 negatifken yine diğerlerinde Sap-10 genleri saptandı, 1 örnek AMB, 2 örnek VCZ, 1 örnek CPF, 1 örnek 5-FC, 4 örnek FCZ dirençli bulundu bir örnek hem 5-FC hem de FCZ dirençli iken 1 örnek de VCZ ve FCZ birlikte dirençliydi. Sonuç olarak araştırmalarda tiplendirmede seçilecek yöntemim mutlaka moleküler yöntemler olması gerektiği, hasta bakımı ilişkili enfeksiyonlardan izole edilen C. albicans önemli bir virulans faktörü olan tüm SAP genlerini taşıdığı, biyofilm oluşturduğu ve önemli ölçüde antifungallere direnç geliştirdikleri saptanmıştır. Sınırlı sayıda antifungal bulunması Sap genlerinin baskılanmasına yönelik çalışmaların gelecekte önem kaznacağını düşündürmüştür. 
Anahtar Kelimeler: antifungal direnç; biyofilm; Candida türler; SAP

Abstract:
Candida spp. are an important pathogen responsible for fungal infections and are detected as causative agents in most invasive fungal infections. Many important virulence factors such as morphogenesis, adhesion, biofilm formation, phenotypic change, production of hydrolytic enzymes are effective in occupying many anatomical regions. The production and release of aspartic proteases, plus biofilm formation, are believed to be the key determinants of virulence for candida species. In this study, the verification of Candida species isolated from patient samples with various healthcare-associated infections and typed with the Vitek 2 Compact system and determined antifungal sensitivities by molecular methods, it was aimed to investigate the properties and the link between these virulence factors, and to examine the differences in virulence factors between those isolated from blood and other samples. Candida spp were isolated from various clinical samples of Selcuk University Faculty of Medicine microbiology laboratory between February 2019 and February 2020. 87 Candida spp strains identified as healthcare-associated infectious agents were included in this study. Initially, candida strains were identified by the Vitek 2 Compact method and then by the molecular method, multiplex PCR. DNA sequence analysis was performed to verify the species identification of the samples whose VITEK and Multiplex PCR results were incompatible. UNI 1 and UNI 2 universal primers were used for the amplification of ITS 1 and ITS 2 gene regions. The ability to create biofilms in 31 strains identified as C.albicans in flat bottom microplates and presence of SAP (1-10) genes were investigated by PCR. Antifungal sensitivities were studied in the Vitek 2 Compact system. 14 strains giving different results with the Vitek 2 Compact method and the multiplex PCR were sent for sequencing and it was observed that the Vitek 2 Compact method incorrectly identified all these strains (16.1%). When the 31 C. albicans strains evaluated according to the sequence results were evaluated, all of the C. albicans strains isolated from the blood samples of 18 patients had biofilm, none of the Sap (1-10) genes were detected in 2, and Sap (1-10) genes were not detected in only 6 and Sap 5 was negative, 2 samples CFP, 2 samples 5-FC, 2 samples FCZ resistant. All non-blood samples made biofilms. Only Sap 4 was negative in 1 pleural sample and Sap (1-10) genes were detected in the others, 1 sample AMB, 2 samples VCZ, 1 sample CPF, 1 sample 5-FC, 4 samples FCZ resistant one sample While both 5-FC and FCZ were resistant, 1 sample was both VCZ and FCZ resistant. As a recommendation, the method to be chosen in the further studies should be molecular methods, C. albicans isolated from patient care-associated infections carried all. It has been determined that they carry the SAP genes, form biofilms and significantly develop resistance to antifungals. The limited number of antifungals suggested that studies for suppression of Sap genes will gain importance in the future.
Keywords: antifungal resistance; biofilm; Candida species; SAP