İdiyopatik pulmoner fibrozisin mimiklenmesi için çok fonksiyonlu dinamik mikroakışkan platform geliştirilmesi
Development of a multifunctional dynamic microfluidic platform for mimicking idiopathic pulmonary fibrosis
Yazar: ECEM SAYGILI
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM YEŞİL ÇELİKTAŞ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Monositler = Monocytes ; Pulmoner fibroz = Pulmonary fibrosis ; Sferoid = Spheroid

Özet:
Bilinmeyen bir etiyolojiye sahip olan ve solunum yeteneğini sınırlayan idiyopatik pulmoner fibrozis (İPF), yüksek ölüm oranına sahip ve giderek tedaviye dirençli hale gelen önemli bir kronik akciğer rahatsızlığıdır. Heterojen akciğer rahatsızlıkları grubuna ait olan bu hastalık, akciğer epitel hücrelerinde meydana gelen ileri düzeyli hasar ve sonrasında solunum yetmezliği nedeniyle ölümlere yol açan akciğer yapısının tahribatı ile karakterize edilmektedir. İPF'ye yönelik FDA onaylı pirfenidon ve nintedanib gibi anti-fibrotik ilaçlar geliştirilmiş olsa da henüz hastalığın ilerlemesini tamamen durdurabilen veya gerilemesine yardımcı olabilen geçerli bir tedavi sistemi bulunmamaktadır. Bu hastalığın takibini sağlamak ve yeni ilaçlar geliştirebilmek için hayvan modelleri kullanılmış olsa da bu modellerin insan fizyolojisine benzetilmesi genellikle zordur. Başka bir deyişle, epitel/fibroblast çapraz etkileşimini incelemek için geliştirilmiş evrensel bir deney modeli yoktur.

Bu tez çalışması kapsamında, fibrotik doku içindeki karmaşık hücresel etkileşimleri modelleyebilmek için, insan bronşiyal epitelyal hücreleri ve insan akciğer fibroblastlarının birlikte kullanıldığı ve bleomisin (BLM) ile ilaca bağlı İPF'nin taklit edildiği bir multiselüler sferoid (MSS) modeli ve çip-üstü-küçük hava yolu platformu tasarlanmıştır. Epitelyal-interstisyel mikro-ortamı özetleyen her iki model de, BLM'ye yanıt olarak morfolojik değişikliklerle birlikte aşırı alfa düz kas aktin (α-SMA) ve kolajen tip I salgılanması açısından İPF hastalığını başarıyla yansıtmıştır. Ayrıca, MSS modelinde artış gösteren fibrotik bağlantılı kolajen tip I3A1 (COL13A1), matris metaloproteinaz-2 (MMP2), Wingless/ Int-3 (WNT3) seviyeleri ile azalış gösteren kaderin 1 (CDH1) eksp-resyon seviyesi, oluşturulan fibrosis modelinin güvenilirliğini göstermiştir. FDA onaylı nintedanib ve pirfenidone anti-fibrotik ilaçların müteakip uygulaması, modelin ilaca duyarlılığını kanıtlamak için kullanılmıştır. Çip-üstü-küçük hava yolu platformu ile elde edilen İPF modelinde ise, üzerinde epitel hücreleri ve içerisinde fibroblast hücreleri barındıran hidrojel tabanlı jelatin-metakrilat (GelMA) tabaka, interstisyel bölgenin taklidi için kullanılmıştır. Vasküler sınırın taklidi için ise literatürde sıklıkla görülen polyester membrane (PET) yerine bakteriyel selüloz tabanlı membran üretimi gerçekleştirilmiş ve sistem içerisinde endotel hücreler ile birlikte kullanılmıştır. Hava/sıvı arayüzü ve akciğerlerde-ki interstisyel bölgenin taklit edildiği modelde, epitel/fibroblast çapraz etkileşimini neden olduğu immün hücre yönelimi dolaşımdaki insan lösemi monositik (THP-1) hücreleri kullanılarak araştırılmıştır. 12 gün süren dinamik kültürün sonunda, BLM indüklemesi sonucu oluşan fibrotik yapıda gözlemlenen ileri epitel hücre hasarı sonucu profibrotik özellikteki transforme büyüme faktörü-1 (TGF-β1) ve laktat dehidrogenaz (LDH) seviyelerinde artış gözlemlenmiştir. Oluşan sitotoksiste ve profibrotik TGF-β1 etkisiyle anti-inflamatuar cevap olarak M2 tip makrofaj benzeri THP-1 monositlerinin hasarlı epitel hücrelere yönelimi gözlemlenmiştir.

Abstract:
Having an unknown etiology and limiting the ability of breathing, idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic lung disease associated with a high mortality and is increasingly resistant to treatment. Being classified in a heterogeneous group of lung disorders, IPF is characterized by progressive damage to epithelial cells, and consequently, destruction of lung structure and tissues result in death from respiratory failure. Although FDA- approved anti-fibrotic drugs such as pirfenidone and nintedanib have been developed, there is currently no efficient treatment approach that can completely stop or cure the disease. Animal models have been used to follow up on this disease and develop new drugs. However, it is often difficult to simulate these models in human physiology. In other words, there is no improved universal experimental model to research epithelial / fibroblast cross-interaction. 
In this thesis, to model the complex cellular interactions within the fibrotic tissue, a multicellular spheroid (MCS) model and a small airway-on-chip platform were designed where human bronchial epithelial cells incorporated with human lung fibroblasts and treated with bleomycin (BLM) to emulate drug-induced IPF. Recapitulating the epithelial-interstitial microenvironment, both models successfully reflected the IPF disease in the aspect of excessive alpha-smooth muscle actin (α-SMA) and collagen type I secretion along with the morphological changes in response to BLM. Moreover, with the MCS model, increased levels of fibrotic linked collagen type 13A1 (COL13A1), matrix metallopeptidase 2 (MMP2), Wingless/Int-3 (WNT3), and decreased expression level of cadherin 1 (CDH1) provide evidence for the model reliability on fibrosis modeling. Subsequent administration of the FDA-approved nintedanib and pirfenidone anti-fibrotic drugs, have been used to prove the drug-responsiveness of the model. As for the IPF model with small airway-on-chip, a hydrogel-based gelatin-methacrylate (GelMA) layer containing epithelial cells and fibroblasts was used to simulate the interstitial region. For the imitation of the vascular border, bacterial cellulose-based membrane was produced instead of the polyester (PET) membrane, which is frequently seen in the literature, and it was used together with endothelial cells within the system. In the model mimicking the air/liquid interface and the interstitial region in the lungs, immune cell recruitment caused by epithelial/fibroblast crosstalk was investigated using circulating human leukemia monocytic (THP-1) cells. At the end of 12 days of dynamic culture, an increase in the levels of transforming growth factor-1 (TGF-β1) and lactate dehydrogenase (LDH) with profibrotic properties was observed as a result of epithelial cell damage observed in the fibrotic structure formed as a result of BLM induction. The recruitment of M2-type macrophage-like THP-1 monocytes to damaged epithelial cells was observed as an anti-inflammatory response with the effect of cytotoxicity and profibrotic TGF-β1.