Ketonların biyokatalitik indirgenmesi ile enantiyomerik saflıkta kiral madde üretimi
Production of enantiomerically pure chiral molecules via biocatalytic reduction of ketones
Yazar: ÖZLEM AYDOĞAN
Danışman: PROF. DR. ÜLKÜ MEHMETOĞLU
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Kalsiyum aljinat = Calcium alginate ; Karragenan = Carrageenan

Özet:
Bu çalışmada, bir prokiral keton olan asetofenonun asimetrik biyoindirgenmesiyle enantiyomerik saflıkta (R)-1-feniletanol üretimi gerçekleştirilmiştir. Çalışma, ?-karragenana tutuklanmış hücrelerle, dolgulu kolon biyoreaktörde gerçekleştirilmiştir. Mikroorganizmaların, saf enzimlere göre daha ekonomik olması nedeniyle alkol dehidrojenaz (ADH) aktivitesine sahip, Lactobacillus kefir NRRL B-1839 kullanılmıştır. Lactobacillus kefir mikroorganizmasının R-enantiyomer için yüksek enantiyomerik aşırılık verdiği (> % 99) belirlenmiş ve bunun üzerine dönüşümü artırma çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Asetofenon, dimetilsülfoksit çözücüsünde çözülerek tepkimelerde kullanılmıştır. Asimetrik indirgeme tepkimelerini oksidoredüktaz sınıfından, ADH enzimi katalizlemekte ve bu enzim aktivite gösterebilmek için kofaktöre ihtiyaç duymaktadır. Kofaktörler pahalı olduklarından ve tepkime sonucu tükendiklerinden, kofaktör rejenerasyonunun yapılması gereklidir. Bu çalışmada, kofaktör rejenerasyonu için üç farklı yol izlenmiştir. Bunlar, glikoz, 2-propanol ve çift enzim yöntemleriyle gerçekleştirilen kofaktör rejenerasyonudur. Kesikli sistemde serbest hücrelerle, 20 mM başlangıç substrat derişiminde; 2-propanol ile rejenerasyon geçekleştirildiğinde, enantiyomerik aşırılık (% 97) ve dönüşüm (% 95) açısından, glikoz ile rejenerasyona göre (enantiyomerik aşırılık >% 99 ve dönüşüm % 100) daha düşük değerler elde edilmiştir. Çift enzim yöntemi (alkol dehidrojenaz ve laktat dehidrojenaz, LDH) ile rejenerasyonda, bu enzimlerin genleri Escherichia coli'ye aktarılmıştır. Rekombinant Escherichia coli'de, LDH enzimi aktivite gösterirken, ADH enzimi aktivite göstermemiştir. Bu nedenle çalışmanın ilerleyen kısımlarında, glikoz ile kofaktör rejenerasyonu sağlanmıştır. Serbest hücrelerle biyoindirgemede, ürün derişimini maksimum yapmak için glikoz derişimi, hücre derişimi, biyoindirgeme süresi, cevap yüzey yöntemi ile optimize edilmiştir. Optimum değerler; glikoz derişimi 79 mM, yaş hücre derişimi 24 g/L ve tepkime süresi 4 h olarak belirlenmiştir.Daha sonra, alginat jeline tutuklanmış hücrelerle kesikli sistemde çalışılmıştır. En uygun koşullar, sıcaklık, 35 oC, pH 8 tris tamponu ve tepkime süresi, 4 h olarak belirlenmiştir. Tutuklanmış hücrelerle çalışıldığında; difüzyon kısıtlamalarından dolayı, kofaktör rejenerasyonu için 111 mM glikoz kullanılması gerektiği belirlenmiştir. Kalsiyum alginata tutuklanmış hücrelerle sürekli sistemde ön denemeler gerçekleştirilmiştir. Ancak hücrelerin mekanik dayanıklılığının az olmasından dolayı tutuklama materyali olarak ?-karragenan ile çalışmalara devam edilmiştir. Sürekli sistemde, asetofenon derişimi 15 mM, 25 mM ve 40 mM aralığında incelenmiştir. 40 mM başlangıç girdi derişiminde, 12.8 mM (R)-1-feniletanol (% 32 dönüşüm), 15 mM başlangıç girdi derişiminde ise 11.5 mM (R)-1-feniletanol (% 79 dönüşüm) elde edilmiştir. 40 mM başlangıç girdi derişiminde, verimlilik 2.82 mmolL-1h-1, 15 mM başlangıç girdi derişiminde ise 2.50 mmolL-1h-1'dir. Dolgulu kolon reaktörün ne kadar süre işletilebileceği incelenmiş ve 5 gün işletim süresinde aktivitesinin % 90'nını, 12 gün işletim süresinde aktivitesinin % 50'sini koruduğu gözlenmiştir.Dolgulu kolon biyoreaktörün modellenmesi ve çözümü gerçekleştirilmiştir. Çözüm için gerekli olan, kinetik model ve eksenel dağılma katsayısı belirlenmiştir. Modelin çözümü, Matlab (10.0) paket programı ile yapılmıştır. Kolon boyunca alınan örnekler ile model sonuçları karşılaştırılmış ve iyi bir uyum sağladığı gözlenmiştir.

Abstract:
In this study, enantiomerically pure (R)-1-phenylethanol was produced via asymmetric bioreduction of acetophenone. Cells were immobilized by ?-carrageenan and used for continuous production of (R)-1-phenylethanol in a packed bed bioreactor. Whole cells (microorganisms) are easier to obtain and more cheaper than isolated enzymes. Therefore, Lactobacillus kefir NRRL B-1839 was used as an alcohol dehydrogenase (ADH) source. Lactobacillus kefir showed high enantioselectivity for (R)-1-phenylethanol (ee > 99 % ) and then further studies focused on increasing the conversion. Acetophenone was dissolved in dimethyl sulfoxide. ADHs catalyze the enantioselective reduction of ketones with the help of nicotinamide cofactors (NADH or NADPH). However cofactors are expensive and their regeneration must be done. For solving cofactor regeneration problem, three different cofactor regeneration systems were used in this study. These were: regeneration using glucose, regeneration using 2-propanol and regeneration using two enzyme method. When 2-propanol was used, conversion and enantiomeric excess were obtained as 95 % and 97 % at 20 mM initial substrate concentration, whereas using glucose, conversion and enantiomeric excess were obtained as 100 % and > 99 %, respectively. When two enzyme method (alcohol dehydrogenases, lactate dehydrogenase, LDH) was used, lactate dehydrogenase showed activity, however alcohol dehydrogenase did not show any activity in recombinant Escherichia coli. The regeneration using glucose gave the best results. For this reason, cofactor regeneration was accomplished using glucose for further experiments. Using free cells, glucose concentration, amount of cell and bioreduction time were optimized to maximize the produced (R)-1-phenylethanol via Responce Surface Methodology. Optimum values were 79 mM glucose concentration, 24 g/L wet cells and 4 h bioreduction time.Before studying in a continuous bioreactor, cells were immobilized by alginate. Experiments were performed in a batch system and optimum conditions were determined as: temperature, 35 oC, pH 8 tris buffer and reaction time, 4 h. Due to mass transfer limitations for immobilized cells, 111 mM glucose was needed for cofactor regeneration. Pre-experiments were performed using alginate immobilized cells in a continuous reactor. However, the mechanical strenght of alginate immobilized cells were not enough. Therefore ?-carrageenan immobilized cells were used for further studies. In continuous system, several levels of substrate concentrations, 15 mM, 25 mM and 40 mM, were studied. At 4.5 h residence time, 12.8 mM (R)-1-phenylethanol was obtained at 40 mM initial substrate concentration (conversion 32 %), whereas 11.2 mM (R)-1-phenylethanol was produced at 15 mM initial substrate concentration (conversion 79 %). The productivity was 2.82 mmolL-1h-1 at 40 mM acetophenone concentration whereas it was 2.50 mmolL-1h-1 at 15 mM acetophenone concentration. Also, bioreactor operation time was investigated. The immobilized cells were retained its 90 % activity during 5 days and 50 % activity during 12 days.A mathematical model of the bioreactor was developed and solved. For solving the model, the kinetic model and axial dispersion coefficient were determined. Matlab (10.0) programme was used for solving the model. Samples were taken at different locations of bioreactor and results were compared with model predictions. It can be concluded that the model closely represents experimental conditions.