Farklı periodontal hastalıklara sahip bireylerden alınan mikrobiyal dental plak örneklerinden elde edilen patojen mikroorganizmaların real-time pcr ile kalitatif ve kantitatif analizi
Qualitative and quantitative analysis of the pathogen microorganisms with using real-time pcr from dental plaque samples which are taken from patients who had different periodontal diseases
Yazar: CANER VURAL
Danışman: DOÇ. DR. GÜVEN ÖZDEMİR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Periodontal hastalıklara mikrobiyoloji penceresinden bakıldığında, ağız florasına dahil mikroorganizmaların birbirleriyle ve çevreleriyle olan etkileşimlerden söz edilebilir. Bu etkileşimler oldukça geniş, kapsamlı ve dinamiktir. Hastalığa sebep olan mikroorganizmaların ise belirli bazı dental patojen bakterilerin olduğu bilinmektedir. Birçok çevresel faktörlerle birlikte bu bakterilerin davranışları da değişebilmektedir. Beslenme, sigara kullanımı, genetik yatkınlık gibi faktörler bakterilerin hastalıktaki şiddetini etkilemektedir Periodontal hastalıklara sebep olan bakterilerin nitel ve nicel olarak belirlenmesi, hastalığın seyrinin gözlenmesi ve periodontal tedavinin şekillenmesi açısından oldukça faydalı olacağı düşünülmektedir. Bu tez çalışmasında periodontal açıdan öneme sahip Porpyhromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum ve Prevotella intermedia bakterilerinin Real-time PCR ile SYBR Green 1 boyası kullanılarak nitel ve nicel analizleri gerçekleştirilmiş, kronik ve agresif periodontitis durumlarındaki toplam bakteri miktarına göre oranları saptanmıştır. Bu amaçla kağıt filtreye (paperpoint) emdirilmiş olan 28 subgingival dental plak örneklerinden genomik DNA izolasyonu yapıldı. Daha önceden miktarları ve saflık derecesi bilinen, analiz edilecek olan her bir bakteri DNA'sı belirli oranlarda seyreltilerek uygun primerler ile birlikte standart eğri oluşturulmak üzere Real-time PCR'da reaksiyona tabi tutulmuştur. Reaksiyon sonunda oluşan ürünlerin verileri kullanılarak standart eğriler çıkarılmıştır. Her bir bakteriye özgü oluşturulan bu standart eğriler vasıtasıyla analiz sonuçları yorumlanmış ve sayısal veriler elde edilmiştir. Bunda sonra erime eğrisi analizleri yapılarak reaksiyon sonuçları doğrulanmıştır. Yapılan analizler sonucunda, tedavi başlangıcında kronik periodontitisli cepteki P. gingivalis oranı %72 iken bunu sırasıyla %21 ile T. forsythia, %6 ile F. nucleatum ve %1 ile P. intermedia olduğu görülmüştür. Her iki durumda da A. actinomycetemcomitans saptanamamıştır. Agresif periodontitis de ise P. gingivalis %39, F. nucleatum %24, A. actinomycetemcomitans %15, T. forsythia %14 ve P. intermedia %8 oranında görülmüştür. Tedavi sonrasında ise yine kronik periodontitisli cepte P. gingivalis %50, T. forsythia %28, F. nucleatum %20 ve P. intermedia %2 oranları görülürken, agresif periodontitisli ceplerde ise F. nucleatum %57, P. gingivalis %36 ve T. forsythia %7 olarak bulunmuştur. Kronik periodontitiste başlangıç toplam bakteri miktarı 5,53x10^6, agresifte ise 1,04x10^7, tedavi sonundaki miktarları ise sırasıyla 3,05x10^6 ve 1,14x10^6'dır. Tedavi öncesi ve sonrasında periodontal ceplerdeki toplam bakteri miktarının ortalama 10^6 civarında olduğu saptanmıştır. Agresif periodontitiste toplam bakteri yükü açısından ciddi bir düşüş gözlenmiştir. Her iki hastalık durumunda da F.nucleatum miktarlarında ciddi bir artış gözlenmektedir. Ayrıca tedavi sonunda A. actinomycetemcomitans saptanamamıştır. Kronik periodontitis tedavi sonunda P.gingivalis miktarında önemli bir azalma göstermiştir. Her iki bakteri sayısındaki bu azalmalar tedavinin olumlu sonuç verdiğini göstermektedir.

Abstract:
If take a view from microbiological window for periodontal diseases, it could be mentioned about microorganisms including oral flora and their interactions with each other and their environments. These interactions are wide range, extensive and dinamics. It is known that some certain dental pathogen bacteria which are the microorganisms caused disease. Behaviors of these bacteria can be changed by many environmental factors. The factors such as diet, smoking, genetic tendency have affect the bacterial strenght in disease. In terms of the observation of the disease progress and taking a shape of the periodontal treatment, it is thought that the qualitative and quantitative determination of the bacteria, which are caused periodontal disease, would be quite useful.In this thesis assay, some bacteria which have periodontal significance such as Porpyhromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum and Prevotella intermedia were qualitative and quantitative analyzed with using Real-time PCR and SYBR Green 1 dye, and in case of chronic or aggressive periodontitis, their rates were calculated as to total bacterial load.For this aim, genomic DNA izolations were carried out from the 28 subgingival dental plaque samples that were impregnated to paper filter (paperpoint). DNA of each bacterium which is known quantity and purity levels were diluted to determined grades and run in Real-time PCR with using specific primer sets for constructing species specific standart curves. Using the data obtained from PCR products, standart curves were plotted. Analyses results were explicated and quantitative data were obtained by constructed standart curves that are specific for each bacterium. After that, reaction results were confirmed by using melting curve analyses.According to the result of the analyses, it was shown that the rate of the P. gingivalis 72%, T. forsythia 21%, F. nucleatum 6% and P. intermedia 1% and, in aggressive periodontitis, P. gingivalis 39%, F. nucleatum 24%, A. actinomycetemcomitans 15%, T. forsythia 14% and P. intermedia 8% in pocket with chronic or aggressive periodontitis at the begining of treatment. After the periodontal treatment, in pocket with chronic periodontitis, the rate of the bacteria was shown as P. gingivalis 50%, T. forsythia 28%, F. nucleatum 20% and P. intermedia 2%, and in pocket with aggressive periodontitis, F. nucleatum 57%, P. gingivalis 36% ve T. forsythia 7% . The inital total bacterial counts were 5,53x10^6 for chronic periodontitis and 1,04x10^7 for agressive. After treatment the total counts of chronic periodontitis and agressive were determined as 3,05x10^6 and 1,14x10^6 respectively. The total bacterial counts of periodontal pocket were approximetly 10^6 before and after treatment. A significant decline was detected in total bacterial counts of agressive periodontitis patients. A significant rise was seen in F.nucleatum in both of the diseases. Additionally A. actinomycetemcomitans was not detected after treatment. In chronic periodontitis patients an important decline was seen in P. gingivalis after treatment. The declines seen in both of the bacteria shows that the treatment has turn out at advantage.