Yeşil biyonanoteknolojik yöntemlerle antioksidan özelliğe sahip bileşiklerden elde edilen nanopartiküllerin bazı patojenik mikroorganizmalara karşı antı-quorum sensıng, antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesi
Detection of anti-quorum sensing, anti-microbial activities of plant based antioxidants nanoparticles against some pathogene microorganisms using green bionanotechnological methods
Yazar: SEDEF İLK
Danışman: PROF. DR. NECDET SAĞLAM
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Nanoteknoloji tarımda yeni ve alternatif biyoteknolojik, biyonanoteknolojik ürünler geliştirmek için gelecek vaat eden yaklaşımlar sunmaktadır. Nanoteknoloji ile üretilen biyosid; pestisit, herbisit ve gübreler yoluyla yüksek verim için kontrollü kullanım sağlanabilmektedir. Ülkemizin ekonomisinde rol oynaya temel etkenler tarım ve hayvancılıktır. Bu nedenle nanobiyoteknolojik her gelişme bizi çok yakından ilgilendirmektedir. Özellikle tarım alanında biyolojik mücadelede etkili birçok yollar mevcuttur. Biyolojik mücadelede geniş yüzey alanı/hacim oranı ve hedefe göre fonksiyonelleştirilmiş yüzey özelliğine sahip nanoboyuttaki ajanların kullanılması tarım zararlıları ile mücadelede hedef canlıya karşı yüksek verim ile kontrol sağlanmasına imkân vermektedir. Özellikle flavonoid bileşikler mikroorganizmalara karşı yüksek oranda antimikrobiyal özellik göstermesine rağmen, sıvı ortamda düşük çözünürlük ve kararsız yapıda olmasından dolayı sınırlı kullanıma sahiptir ve bu yüzden istenilen verimde uygulanamamaktadır. Bu nedenle yapılan tez çalışmasının ilk aşamasında meyvelerde bolca bulunan antioksidan özellikteki flavonoid kuersetin ve kaempferol bileşikleri lesitin/kitosan ve kitosan/sodyumtripolifosfat (TPP) nanopartiküllerine hapsedilmiştir. Sentezlenen nanopartikül formulasyonları için uygun koşullar ve optimizasyon çalışmaları ile nanopartiküllerin karakterizasyonu; boy-boy dağılımı, yüzey yükü değerleri, morfolojik özellikleri (SEM), kimyasal özellikleri (FTIR ve 1H NMR), fiziksel özellikleri (DSC ve XRD) yapılmıştır. Ayrıca etken madde yükleme verimi, in vitro salınım profili, antioksidan aktivitesi ve farklı depolama şartlarındaki kararlılıkları serbest kuersetin ve kaempferol ile karşılaştırılmalı olarak da belirlenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında optimum şartlarda sentezlenen nanopartiküllerin in vitro anti-quorum sensing aktivitesi için; Chromobacterium violaceum 026 biyosensör suşu yardımıyla antifungal aktivitesi, bitki patojeni mantarlardan Fusarium oxysporium, Botrytis cinerea, Phythophtora infestans, Macrophomina phaseolina, ve Cylindrocarpon radicicola'da, Antibakteriyel aktivitesi ise, bitki patojeni bakterilerden Pseudomonas syringae pv. syringae, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola ve Pseudomonas syringae pv. Lachrymans kullanılarak belirlenmiştir. Tez çalışmasının son kısmında ise patojen mantar inokulasyonlu biberlere (Capsicum annuum L.) karşı in vivo antifungal aktivite araştırılmış ve optimum koşullarda sentezlenen kaempferol ve kuersetin yüklü lesitin/kitosan nanopartiküllerin 232.21- 268.56 nm arasında ve kitosan/TPP nanopartiküllerin 167.27-198.12 nm arasında olduğu tespit edilmiştir. Nanopartiküllerin fizikokimyasal karakterizasyonu sonucunda kaempferol ve kuersetin içerisine % 80.8-93.6 verim ile hapsedildiği belirlenmiştir. Nanopartiküllerden etken maddenin 37C'de yavaş salınım (8 saat) ile %87 ile 72 arasında değişen oranlarda salındığı belirlendi. Nanopartiküllerin 4 C'deki depolamada şartlarında boy-boy dağılımlarında, yüzey yükü değerlerinde ve antioksidan aktivitelerinde değişme olmadan 30 gün boyunca kararlılıklarını korudukları belirlendi. In vitro anti-quorum sensing, antifungal ve antimikrobiyal çalışmaları sonucunda sentezlenen nanopartiküllerin depolama sürecindeki 30 gün boyunca yüksek oranda antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu gözlemlenmiştir. Denemesi yapılan tüm mikroorganizmalar üzerinde en yüksek oranda biyolojik aktiviteye sahip olan kaempferol yüklü lesitin/kitosan nanopartiküllerin Fusarium oxysporium mantarı bulaşmış biberlere karşı in vivo aktivite çalışmalarında ise nanopartiküllerin bitki kökünde patojenlere karşı savunma hattı oluşturarak bitki kök gelişimini desteklediği belirlenmiştir.
Bu çalışma TÜBİTAK 2211-C Öncelikli Alanlara Yönelik Yurtiçi Doktora Burs Programı tarafından desteklenmiştir.

Abstract:
promises to develop biotechnologically and nanobiotechnologically new products in agriculture. Pesticides, herbicides and fertilizers produced by nanotechnology can be provided high efficiency within controlled usage. The drug residual after the application of chemical pesticides in agriculture stay for a long time in the protective applications against harmful microorganisms in the soil. Therefore, day by day, environment-friendly new biotechnological products have been developing. Agriculture is the main economic income in our country so nanobiotechnologically development in agriculture is reasonably important for devolopping country. Nanoscale agents with the large surface area to volume ratio and the functionalized with surface features to target against pathogen microorganisms allow to ensure control with high efficiency in biological control. Although flavonoids are effective antimicrobial against microorganisms, their use are limited in aqueous medium due to the their low solubility, permeability, biocompatibility and unstable behavior. Therefore their applications are not in the desired yield. In this study,in the first step, the antioxidant flavonoids quercetin and kaempferol compounds found in abundance in fruits were confined to the nanoparticles feature lecithin/chitosan and chitosan/sodiumtripolyphosphate (TPP). Suitable conditions were determined with optimization studies for synthesized nanoparticle formulations. Size-frequency distribution, surface load values, morphological (SEM), chemical properties (FTIR and 1H NMR), physical properties (DSC and XRD), the active ingredient loading efficiency, in vitro release profiles, antioxidant activity and stability of synthesized nanoparticles free quercetin and kaempferol at different storage conditions were determined with comparison. In the second step, in vitro anti-quorum sensing activity of nanoparticles synthesized in optimum conditions against Chromobacterium violaceum 026 biosensor strain, antifungal activity of plant pathogenic fungi against Fusarium oxysporium, Botrytis cinerea, Phythophtora infestans, Macrophomina phaseolina, Cylindrocarpon radicicola, and antibacterial activity of plant pathogenic bacteria, against Pseudomonas syringae pv. syringae, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola and Pseudomonas syringae pv. lachrymans were determined. In the last part of the thesis, in vivo antifungal activity study was performed against pathogenic fungi inoculated pepper (Capsicum annuum L.) plants. As result, size of kaempferol and quercetin loaded lecithin/chitosan nanoparticles synthesized in optimum conditions were displayed between 232.21- 268.56 nm and chitosan/TPP nanoparticles 167.27-198.12 nm. Nanoparticles were confined into kaempferol and quercetin with 80.8-93.6% yield as results of physico-chemical characterization. Active material from nanoparticles was released (8 hours) between 87 and 72% in varying amounts. Nanoparticles were maintained their stability for 30 days in 4 C storage conditions in terms of size-frequency distribution, surface charge value and antioxidant activity. It was observed that synthesized nanoparticles had in vitro anti-quorum sensing, antifungal and antimicrobial activities during the 30 days storage period. Also, in vivo conditions, kaempferol loaded lecithin / chitosan nanoparticles was displayed defense line against Fusarium oxysporium fungus infected pepper plant adventitious roots.
This study was funded by TÜBİTAK 2211-C National Scholarship Programme for PhD Students.