İmmunolojik analiz (CEDIA) pozitif sonuçlarının LC/MS/MSs yöntemi ile teyidi ve yöntemin validasyonu
Confirmation of the immunological analysis (CEDIA) results, using LC/MS/MS method and its validation
Yazar: SİNAN ZAZOĞLU
Danışman: PROF. DR. SALİH CENGİZ
İstanbul Üniversitesi / Adli Tıp Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Kimya = Chemistry
Dizin: Kanabis = Cannabis ; Kromatografi-gaz = Chromatography-gas ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Metabolitler = Metabolites ; Narkotik bağımlılığı = Narcotic dependence ; İdrar = Urine ; İmmünolojik testler = Immunologic tests

Özet:
Dünyaya paralel olarak ülkemizde de hızla artış gösteren yasadışı madde kullanımı ve bunun suç artış oranı ile reddedilemez paralellik göstermesi, bu maddelerin biyolojik örneklerde hızlı, güvenilir ve ucuz yöntemlerle tespiti için çalışmaların hızlanmasını doğurmuştur.Birçok analiz laboratuarı biyolojik sıvı örneklerini immünolojik yöntemlerle tarayıp pozitif çıkan neticeleri kimyasal yöntemlerle doğrulama yolunu izlemektedir. Bunun için GC/MS (gaz kromatografisi / kütle spektrometresi) en yaygın kullanılan analitik yöntem iken son zamanlarda geliştirilen yeni kromatografik yöntemler olan LC/MS (sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi) ve LC/MS/MS yöntemlerinin kullanımı hızla artmaktadır. LC/MS ve LC/MS/MS, özellikle yüksek ısıda bozunan, uçucu olmadığı ve uçucu hale getirilemediği için GC/MS te analiz edilemeyen maddelerin nitel ve nicel analizlerinde avantaj sağlamaktadır. Özellikle LC/MS/MS te çift MS detektörü kullanılması, istenmeyen iyonların, ana iyon ve ikincil iyon tayinlerinde iki defa filtrelenmesi nedeniyle gürültünün son derece düşük olmasını, bu sebeple de tayin limitinin de GC/MS ve diğer yöntemlerin oldukça altına düşmesini sağlamaktadır.Çalışmamızda da LC/MS/MS için esrar metaboliti olan THC-COOH tayini amacıyla idrarda hızlı, düşük tayin limitli, güvenilir, ucuz, yüksek geri kazanımlı ve pratik bir yöntem geliştirilmiş ve valide edilmiştir. THC-COOH için GC/MS ile tayinde gerekli olan türevlendirme aşamasında çeşitli madde kayıpları oluşabilmektedir. Bununla birlikte LC/MS/MS' te maddelerin uçucu hale getirilmesi gerekmediği ve türevlendirmeye ihtiyaç duyulmadığından, türevlendirmeye bağlı muhtemel bir madde kaybı söz konusu değildir.Toxi-tüpler kullanılarak gerçekleştirilen özütleme öncesinde hidroliz 1,0 N NaOH (sodyum hidroksit) ile 60 C ? de 30 dakikada gerçekleştirilmiştir. Her bir örnek için 4 dakika süren LC/MS/MS analizinde eksternal standart kullanılmıştır. Yöntem geçerli kılmada, seçicilik, doğrusallık, gözlem limiti (LOD), tayin limiti (LOQ), doğruluk, tekrarlanabilirlik ve günler arası ara-üretilebilirlik (intermediate precision) parametreleri belirlenmiştir. Özütleme yönteminin geri kazanımı 88,67(±5,91) olup, yönteme ilişkin gözlem limitinin 2,24 ngmL-1, tayin limitinin 5,00 ngmL-1 olduğu, yöntemin 5,00-500,00 ngmL-1 değerleri arasında doğrusallık gösterdiği bulunmuştur. Yöntemin tekrarlanabilirliği %9,64 (%RSD) iken, günler arası ara-üretilebilirlik çalışmalarında 4 gün ardı ardına yapılan analizler arasında % 95 güvenilirlik düzeyinde, istatistiksel olarak önemli bir fark ortaya çıkmadığı görülmüştür. Yöntemin günler arası ara-üretilebilirliği (%RSDR) 10,00, 100,00 ve 200,00 ngmL-1 için sırasıyla %10,73, %13,74 ve %8,11 olarak bulunmuştur. Bu derişimlerde Horwitz ve Horrat katsayıları da hesaplanmış, Horrat katsayılarının 2 den küçük olması sebebiyle, yöntemin günler arası tekrarlanabilirliğinin kabul edilebilir aralıkta (0,5-2) olduğu sonucuna varılmıştır.Çalışmamızın temeli immünolojik (CEDIA) analiz pozitif sonuçlarına dayanmakta olup, gerçek örnekler, Adli Tıp Kurumu Trabzon Grup Başkanlığı'ndan elde edilmiştir.

Abstract:
Illegal drug use in our country, paralel to the world and its parrallelity with the increase of crime in the world, caused acceleration of the studies for determination of these drugs in biological materals, using fast, reliable and economical methodsMany analysis laboratories follow the way of confirmation of the positif results of immunological screning of biological materials, using chemical methods. For this, while GC/MS (gas chromatography/mass spectrometry) was the most widespread analytical confirmation method, the use of LC/MS (liquid chromatography / mass spectrometry) ve LC/MS/MS methods which are recently developed new chromatographic methods, increase recently. LC/MS and LC/MS/MS, provide advantage for the qualitative and quantitative analysis of some drugs that cannot be analysed in GC/MS since they are non-volatile or cannot be transformed into volatile form.Especially using double MS detectors in LC / MS / MS, due to the double filtration of unwanted ions during parent ion and secondary ion determinations, will decrease the noise to extremely low levels, therefore, the limit of determination falls well below the determination limits of GC / MS and other methods. In our study, a fast, reliable, inexpensive and practical method with a low determination limit and high recovery has been developed for the determination of the marijuana metabolite, THC-COOH in urine using LC / MS / MS and validated. Concentration losses for THC-COOH may occur during derivatization procedure in GC / MS assays. However, since that there is no need for the analytes to be transformed into volatile form in LC / MS / MS analysis, analyte loss due to derivatization is not in question.Before the extraction with Toxi-tubes, basic hydrolysis was performed using 1,0 N NaOH at 60 C ? for 30 minutes. External standart was used for each 4 minutes LC/MS/MS analysis.Specificity, linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), accuracy, repeatability and intermediate precision (inter-day) system suitability parameters were determined in the validation study. The recovery of the extraction method was 88,67(±5,91). It was found that the detection and quantification limits for the method were 2,24 and 5,00 ngmL-1, in order. The method showed linear response between the values 5,00-500,00 ngmL-1. The repeatability of the method was 9,64% (RSD%). There was no istatistically significant difference between the analysis done in 3 consecutive days in intermediate precision study, for 95% confidence level. Intermediate precision of the method (RSDR%) was 10,73%, 13,74% and 8,11 % at 10,00, 100,00 and 200,00 ngmL-1concentration levels, respectively. Horwitz and Horrat ratios were also calculated at these concentration levels. Since the Horrat ratios were between 0,5-2 for each concentration level, these ratios showed that the intermediate precision of the method was between acceptable limits.This study is based on positive results of immunological the analysis (CEDIA), the real samples were obtained from the Trabzon Group Presidency of Turkish Council of Forensic Medicine.