Schizosaccharomyces pombe'de demir stresi altında ght5 heksoz taşıyıcısının işlevsel analizi
Functional analysis of ght5 hexose transporter under iron stress in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: SEVİM NUR AKYÜZ
Danışman: PROF. DR. BEDİA PALABIYIK ; DR. ÖĞR. ÜYESİ AHMED SAYED IBRAHIM ALY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Metabolik işlevler için tüm ökaryotlar demir elementine ihtiyaç duyar. Demir, elektron transportu ve birçok enzimatik aktivite için gerekliyken, bazı koşullarda sitotoksik bir etki gösterir. Diğer taraftan, glukoz çoğu organizma tarafından tercih edilen enerji ve karbon kaynağıdır ve biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde önemli bir sinyal molekülüdür. Glukozun hücre içine alınması heksoz taşıyıcı proteinler ile sağlanır. Schizosaccharomyces pombe'de sekiz farklı heksoz taşıyıcı protein (Ght1-8) vardır. Bunlar arasında Ght5, düşük glukoz koşullarında hücre proliferasyonu için gereklidir. Bu çalışmada, S. pombe´de demir stresinin algılanması ve sinyalizasyonunda ght5 geninin işlevi araştırılmıştır. Bu amaçla ght5 geni pSLF172 ve pSLF173 vektörlerine klonlanarak, elde edilen rekombinant plazmidler (SA01, SA02, SA03) S. pombe EDD666 ırkına transforme edildi. Elde edilen SA01 ve SA02 rekombinant plazmidleri ile HA epitopunun, Ght5 proteinin karboksi ya da amino ucunda  herhangi bir fark oluşturup oluşturmadığının araştırılması için kullanıldı. Öte yandan SA03 transformant S. pombe ırkı, yüksek (%2) ve düşük (%0,5) glukoz koşullarında ve farklı derişimlerde (0, 0.5, 1 ve 2 mM) demir uygulanarak üretildi. Demir stresinin ght5 geninin anlatım profiline olan etkisi protein düzeyinde western blot yöntemi ile analiz edildi.
Western blot sonuçları ile HA epitopunun Ght5 proteininin karboksi ya da amino ucuna bağlanmasının herhangi bir fark oluşturmadığı, her iki durumda da çalıştığı gözlemlendi. SA03 ırkı için; %0,5 glukoz içeren ortamda, %2 glukoz içeren ortamda üretilene göre daha koyu ve kalın bir bant gözlemlenmesi yüksek glukoz affiniteli olduğu bilinen ght5 geninin anlatım profilini doğrulamaktadır. %0,5 glukoz içeren ortamda 1 mM demir içeren koşulda oldukça koyu ve kalın bir bant gözlenirken, 0.5 mM ve 2 mM demir stresinde daha açık bantların gözlemlenmesi, demirin ght5 geninin anlatımı üzerinde etken olabileceğine işaret etmektedir. Buna ek olarak, %2 glukoz içeren ortamda üretilen SA03 ırkından elde edilen bantlar, %0,5 glukoz ortamındakilere kıyasla daha açık olmakla beraber, artan demir stresine bağlı belirginleşen Ght5-HA protein bantlarının görülmesi, bu tezimizi daha da kuvvetlendirmektedir. Sonuç olarak, SA03 ırkında represe ve dereprese koşullarda değişen demir stresine karşı gözlenen Ght5-HA protein bantlarındaki faklılık, demir stresinin algılanması ve sinyalizasyonunda ght5 geninin, önemli rol oynadığını düşündürmektedir.

Abstract:
All eukaryotes need the element iron for metabolic functions. While iron is essential for electron transport and many enzymatic activities, it exerts a cytotoxic effect under certain conditions. On the other hand, glucose is the preferred energy and carbon source by most organisms and is an important signaling molecule in the regulation of biological processes. The uptake of glucose into the cell is provided by hexose carrier proteins. Schizosaccharomyces pombe has eight different hexose transporter proteins (Ght1-8). Among them, Ght5 is essential and sufficient for cell proliferation under low-glucose conditions. In this study, the function of the ght5 gene in S. pombe in sensing and signaling iron stress was investigated. For this purpose, the ght5 gene was cloned into pSLF172 and pSLF173 vectors and the resulting recombinant plasmids (SA01, SA02, SA03) were transformed into S. pombe EDD666 strain. The resulting SA01 and SA02 recombinant plasmids were used to investigate whether the HA epitope made any difference at the carboxy or amino terminus of the Ght5 protein. On the other hand, SA03 transformant S. pombe strain was produced under high (2%) and low (0.5%) glucose conditions and by applying iron at different concentrations (0, 0.5, 1 and 2 mM). The effect of iron stress on the expression profile of the ght5 gene was analyzed at the protein level by western blot method.It was observed that binding the HA epitope to the amino or carboxy terminus of the Ght5 protein did not make any difference, and the epitope worked in both cases. For SA03 strain; The observation of a darker and thicker band in the medium containing 0.5% glucose than that produced in the medium containing 2% glucose confirms the expression profile of the ght5 gene, which is known to have high glucose affinity. While a very dark and thick band was observed in the presence of 1 mM iron in the medium containing 0.5% glucose, the observation of lighter bands at 0.5 mM and 2 mM iron stress indicates that iron may be a factor on ght5 expression. In addition, the bands obtained from SA03 strain grown in 2% glucose media were lighter than those in 0.5% glucose media, but the presence of Ght5-HA protein bands that became evident due to increased iron stress ,further strengthens our thesis. In conclusion, the difference in the Ght5-HA protein bands observed in the SA03 strain against changing iron stress in repressed and depressed conditions suggests that the ght5 gene plays an important role in the detection and signaling of iron stress.