Lactarius piperatus mantarından polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve sentetik kimyada katalitik etkinliğinin incelenmesi
Purification, characterization of polyphenol oxidase from Lactarius piperatus and investigation of its catalytic efficiency on synthetic chemistry
Yazar: FULYA ÖZ
Danışman: DOÇ. DR. AHMET ÇOLAK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada, polifenol oksidaz (PFO), yabani ve yenilebilir bir mantar olan Lactarius piperatus'tan, Sepharose-4B-L-tirosin-p-aminobenzoik asit afinite jeli kullanılarak, afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve karakterize edildi. Saf enzim elüatında PFO'ın varlığı, doğal ve SDS-poliakrilamid jel elektroforezlerinde tek bir bant halinde ortaya konuldu. Optimum PFO aktivitesi, katekol substratı kullanılarak belirlendi. Enzimin optimum pH'sı 7,0, optimum sıcaklığı ise, 20 °C olarak belirlendi. 4 °C'de 24 saat inkübe edildikten sonra L. piperatus PFO'sunun pH 3,0-9,0 aralığında oldukça kararlı olduğu gözlendi. Enzim, pH 3,0-9,0 aralığında, 4 °C'de 72 saat inkübe edildikten sonra, aktivitesini %60'ın üzerinde koruduğu tespit edildi. Enzimin ısıl kararlılık profili incelendiğinde, 4 saatlik inkübasyondan sonra, 0-50 °C aralığında oldukça kararlı olduğu gözlendi. Yapılan kinetik çalışmalar sonucunda, L. piperatus PFO'su için Km ve Vmaks değerleri, katekol substratı varlığında, sırasıyla 1 mM ve 25000 U/mg protein olarak belirlendi. PFO tarafından katalizlenen katekol oksidasyonu için elde edilen I50 değerlerine göre, askorbik asit ve sodyummetabisülfit başta olmak üzere askorbik asit, sodyum metabisülfit, sodyum azid ve benzoik asitin L. piperatus PFO'sunu inhibe ettiği gözlendi. Ayrıca bazı metal iyonlarının PFO aktivitesi üzerine farklı şekillerde etkilediği tespit edildi.L. piperatus'tan saflaştırılan PFO'nun, heptan, toluen ve diklorometan gibi organik çözücülerde, kateşin substratı kullanılması durumunda, etkili bir biyokatalizör olabileceği belirlendi.Bütün elde edilen bulgular, L. piperatus'ta bulunan difenolaz aktivitesinin, bitki polifenol oksidazlarıyla benzer özelliklere sahip olduğunu desteklemektedir.

Abstract:
In this study, a polyphenol oxidase (PPO) was purified from a wild edible mushroom, Lactarius piperatus, by using a Sepharose-4-B-L-tyrosine-p-aminobenzoic acid affinity column and characterized. The purified enzyme migrated as a single band on native- and SDS- polyacrylamide gel electrophoresis. The optimum pH and optimum temperature of the enzyme were found to be 7.0 and 20 °C, respectively, in the presence of catechol as a substrate. After 24 h of incubation at 4 °C, the L. piperatus PPO was extremely stable in the range of pH 3.0-9.0. The enzyme retained over 60% of its original activity in the range of pH 3.0-9.0 after 72 h incubation at 4 °C. When the thermal stability profile of the purified enzyme was analyzed, it was determined that the enzyme was highly stable in the range of 0-50 °C after 4 h incubation. The Km and Vmax values of L. piperatus PPO were calculated as 1 mM and 25000 U/mg protein, respectively, from the Lineweaver-Burk plot. According to I50 data, in the presence of some PPO inhibitors like sodium metabisulfite, ascorbic acid, sodium azide and benzoic acid, L. piperatus PPO was all inhibited, especially by sodium metabisulfite and ascorbic acid. In the experiments done with metal ions, it is established that the enzyme activity was very sensitive to metal ions.It was investigated that L. piperatus PPO is an effectively biocatalysis using catechin as substrate in the organic solvents of heptan, toluene and dichloromethane.All the verities support the presence of an active diphenolase in L. piperatus having similar properties to plant polyphenoloxidases.