Termofilik Streptomyces sp. NT508 suşundan izole edilen peroksidaz ve endoksilanaz enzimlerinin karakterizasyonu
Characterization of peroxidase and endoxylanase enzymes isolated from thermophilic Streptomyces sp. NT508
Yazar: ALİ KURU
Danışman: DOÇ. DR. MÜNİR TUNCER
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Ksilanaz = Xylanese ; Lignin = Lignin ; Lignoselüloz = Lignocellulose ; Peroksidaz = Peroxidase ; Streptomyces = Streptomyces ; Xylan = Xylan

Özet:
Bu çalışmada, Venezuella kökenli kurak topraktan izole edilerek tanımlanmış Streptomyces sp. NT508 suşunun ekstraselüler ksilanaz ve peroksidaz aktiviteleri araştırılmıştır. Streptomyces sp. NT508'in ekstraselüler ksilanazları ve peroksidazları ile gerçekleştirilen destekleyici optimizasyon çalışmaları optimal substrat konsantrasyonunun, mısır sapı söz konusu olduğunda, ksilanazlar için %1,0 (w/v) ve peroksidazlar için %1,2 (w/v) olduğunu göstermiştir. Mikroorganizma en yüksek peroksidaz ve ksilanaz aktivitelerini sırasıyla inkübasyonun 1. ve 2. günlerinde sergilemiştir. Ham enzim örnekleri ile gerçekleştirilen karakterizasyon çalışmaları Streptomyces sp. NT508'in peroksidazları ve ksilanazlarının her ikisi için de optimal pH'ın 8,0 ve optimal sıcaklığın 45 °C olduğunu ortaya koymuştur. Bu enzimlerin aynı zamanda, 30 dakikalık ön inkübasyonun ardından, kararlılıklarını sırasıyla 60 °C (%85) ve 70 °C'ye (%89) kadar korudukları da tespit edilmiştir. Yıkım ürünlerinin TLC analizi Streptomyces sp. NT508'in ekstraselüler ksilanazlarının yulaf ksilanından, endo-tipi aktivite sergilediklerini ortaya koyar biçimde, ksilo-oligosakkaritleri, ksilobiyozu ve ksilozu serbest bırakabildiğini göstermiştir.Kullanılan suş tarafından üretilen ekstrasellüler peroksidazlar, substrat olarak kullanılan ve fenolik bileşiklerden L-DOPA, 2,4-DCP, 2,6-DCP, 2,4,6-triklorofenol, Dye azure-B ve guaiakol'e karşı pozitif aktivite gösterirken, veratril alkole karşı aktivite göstermemiştir. Streptomyces sp. NT508'in ekstraselüler endoksilanazları ise kullanılan yulaf ksilanı, huş ağacı ksilanı ve ksilobiyoz üzerinde aktivite göstermişlerdir. Streptomyces sp. NT508'in ekstraselüler endoksilanazları için Km ve Vmax değerleri, substrat olarak yulaf ksilanı kullanıldığında, sırasıyla 1,687 mg mL-1 ve 21,74 µmol dk-1 mg-1 olarak hesaplanmıştır. Streptomyces sp. NT508'in ekstraselüler peroksidazları için Km ve Vmax değerleri ise, substrat olarak 2,4-DCP kullanıldığında, sırasıyla, 1,02 mmol L-1 ve 1,637 U mg-1 olarak hesaplanmıştır.EDTA'nın (5 mM) ortamdaki varlığı ile endoksilanaz aktivitesi kısmen inhibe olurken (%88), peroksidaz aktivitesi büyük ölçüde düşüş göstermiştir (%17). 2-Merkaptoetanolün [%1 (v/v)] endoksilanaz aktivitesi için indükleyici olarak (%112), peroksidaz aktivitesi için ise inhibitör olarak (%78) rol oynadığı tespit edilmiştir. SDS [%1 (w/v)] ve ürenin (8 M) ortamdaki varlığı her iki enzimin de aktivitesini olumsuz olarak etkilemiştir ve aktivite düzeyleri endoksilanazlar için sırasıyla %34 ve %37'ye, peroksidazlar için de sırasıyla %21 ve %21'e düşmüştür. Streptomyces sp. NT508'in peroksidazları aynı zamanda KCN (1 mM) ve NaN3 (60 mM) ile de inhibisyona uğramış ve aktivite düzeyleri sırasıyla %23 ve %32,9'a düşmüştür. Ortamda CaCl2 (5 mM), NaCl (5 mM), ZnCl2 (5 mM) ve Na2SO3 (5 mM) varlığı ile her iki enzimin kararlığında da dikkate değer bir değişim gözlemlenmemiştir.Streptomyces sp. NT508 tarafından üretilen ekstraselüler peroksidazlar ve endoksilanazlar kültür süpernanatından ultra-filtrasyon, jel filtrasyon kromatografisi ve iyon değiş-tokuş kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Streptomyces sp. NT508 tarafından üretilen tek peroksidaz izoformunun moleküler kütle büyüklüğü jel filtrasyon kromatografisi ile 10,45 kDa (GF-P2), üç endoksilanaz izoformunun moleküler kütle büyüklükleri ise 42,35 kDa (GF-X1), 25,69 kDa (GF-X2) ve 7,74 kDa (GF-X3) olarak tanımlanmıştır. Streptomyces sp. NT508'in ekstraselüler peroksidazı doğal PAGE çalışmasında tek bir aktivite bandı oluşturmuş ve bu bant bölgesine ait proteinler SDS-PAGE çalışmasında moleküler kütle büyüklüğü 56,41 kDa olan yine tek bir protein bandı oluşturmuştur. Streptomyces sp. NT508'in ekstraselüler endoksilanazları doğal PAGE çalışması üzerinde yaklaşık moleküler kütleleri 84,92 kDa, 17,03 kDa ve 11,37 kDa olan üç aktivite bölgesi meydana getirmiştir.Streptomyces sp. NT508'in ekstraselüler peroksidaz ve endoksilanazlarının substratlarından yoksunken sıcaklığa karşı gösterdikleri kararlılık düzeyleri ve aktivitelerini geniş pH aralığında sergileyebilmeleri bu enzimlerin kağıt ve kağıt hamuru üretimi ya da miyokardiyal enfarktüs riskinin ortaya çıkarılması için serum kolesterolünün tespit edilmesi gibi potansiyel endüstriyel ve diagnostik uygulamalar için uygun olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
In this study, extracellular xylanase and peroxidase activities of Streptomyces sp. NT508 strain, which was isolated from arid soil in Venezuella and identified, was investigated. Supplementary optimization studies with Streptomyces sp. NT508?s extracellular xlyanases and peroxidases showed that optimal substrate concentration in terms of corn weed is %1.0 (w/v) for xylanases and %1.2 (w/v) for peroxidases. Microorganism exhibited the greatest xlyanase and peroxidase enzyme activities at the 2nd and 1st day of the incubation period, respectively. Characterization studies carried out with crude enzymes showed that peroxidases and xylanases of Streptomyces sp. NT508 both have a pH optima at 8.0 and temperature optima at 45 °C. They were also found to be stable up to 60 °C (85%) and 70 °C (89%), respectively, after 30 minutes of pre-incubation. TLC analysis of the degradation products showed that the extracellular xylanases of Streptomyces sp. NT508 are capable of releasing xylo-oligosaccharides, xylobiose and xylose from oat spelt xylan, thus suggesting an endo-type activity.Extracellular peroxidases produced by the strain used, were demonstrated positive activities against phenolic compounds such as L-DOPA, 2,4-DCP, 2,6-DCP, 2,4,6-trichlorophenol, Dye azure-B and guaiacol, but no activity was observed with veratryl alcohol. Extracellular endoxlyanases of Streptomyces sp. NT508 demonstrated positive activites against oat spelt xylan, birch wood xylan and xylobiose. Km and Vmax values calculated for endoxylanases of Streptomyces sp. NT508 are 1.687 mg mL-1 and 21.74 µmol dk-1 mg-1, respectively, using oat spelt xylan as a substrate. Km and Vmax values calculated for peroxidases of Streptomyces sp. NT508 are 1.02 mmol L-1 and 1.637 U mg-1, respectively, using 2,4-DCP as a substrate.While endoxylanase activity slightly inhibited (88%) with the presence of 5 mM EDTA, peroxidase activity was significantly decreased (17%). 2-Mercaptoethanol [1% (v/v)] was found to act as an inducer for endoxylanase activity (112%) and an inhibitor for peroxidase activity (78%). Presence of SDS [1% (w/v)] and urea (8 M) affected both enzymes activities negatively and activities dropped to 34% and 37% for endoxylanases and to 21% and 21% for peroxidases, respectively. Peroxidases from Streptomyces sp. NT508 were also inhibited with the presence of KCN (1 mM) and NaN3 (60 mM), and activity levels dropped to 23% and 32.9%, respectively. No significant change observed in the stability of both enzymes with the presence of CaCl2 (5 mM), NaCl (5 mM), ZnCl2 (5 mM) and Na2SO3 (5 mM).Extracellular peroxidases and endoxylanases produced by Streptomyces sp. NT508 was purified from the culture supernatant by ultra-filtration, gel filtration chromatography and ion exchange chromatography. Only one peroxidase isoform produced by Streptomyces sp. NT508 identified by gel filtration chromatography with apparent molecular mass was 10.45 kDa (GF-P2) and three endoxylanase isoforms were 42.35 kDa (GF-X1), 25.69 kDa (GF-X2) and 7.74 kDa (GF-X3). Extracellular peroxidase of Streptomyces sp. NT508 appeared as a single activity band on native PAGE and proteins belong to this activity band again appeared as a single protein band on SDS-PAGE, with a molecular mass of 56.41 kDa. Extracellular endoxylanases of Streptomyces sp. NT508 created three activity zones on native PAGE analysis, with estimated molecular masses of 84.92 kDa, 17.03 kDa and 11.37 kDa.The temperature-stability of the extracellular peroxidase and endoxylanases of Streptomyces sp. NT508 in the absence of substrate and their activities over a broad pH range signify the suitability of these enzymes for potential industrial and diagnostic applications, such as pulp and paper production or serum cholesterol determination as a means of assessing myocardial infarction.