Fitokimyasalların Kanser Kök Benzeri Hücrelerdeki Metabolik Reprogramlamaya Etkisinin Transkriptomik Olarak Araştırılması
A Transcriptional Investigation of the Effect of Phytochemicals on Metabolic Reprogramming in Cancer Stem-Like Cells
Yazar: GÜLSÜM AYTEN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MEHMET ALTAY ÜNAL
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Kök Hücre ve Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı / Kök Hücre ve Doku Yenilenmesi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Beslenme ve Diyetetik = Nutrition and Dietetics ; Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
KRK karsinojenezinin heterojenik ve karmaşık doğasını en iyi açıklayan modellerden biri olan KKKH'ler KRK'in başlanması, ilerlemesi, metastazı ve tekrar ortaya çıkmasından sorumlu hücre alt popülasyonudur. KKKH'ler onları diğer hücrelerden ayıran kendini yenileme, farklılaşma; MDR hücre plastisitesi ve EMT gibi bilinen özelliklerinin yanı sıra metabolik olarak değişime uğrayabilme gibi özellikleri de bulunmaktadır. Metabolik olarak oluşan değişimde birçok metabolik enzim ve taşıyıcı protein etkilenmektedir. Etkilenen bu metabolik enzim ve hücre yüzey taşıyıcı proteinlerinin KRK dahil çeşitli kanser türlerinin KKH popülasyonlarında kök hücre özellikleri ve tümörogenez üzerine önemli etkileri bulunmaktadır. Kanser ve KKH'lerinde önemli etkileri fitokimyasallar kanser ve KKH metabolizmasını da modüle etmektedir ve hedef tedavi olarak günümüzde araştırılmaktadır. Bu bilgiler doğrultusunda bu tez çalışmasında genistein fitokimyasalının HT-29 KRK hücrelerinde CD44 olmak üzere diğer hücre yüzey belirteçleriyle hücre metabolizmasında rol oynayan enzim ve hücre taşıyıcılarının gen ekspresyonları arasındaki korelasyona bağlı olarak kolorektal kanser kök benzeri hücrelerinde metabolik hedef tedavi olarak kullanılma etkinliklerinin araştırılması amaçlanmıştır. HT-29 hücre hatlarının KKH popülasyonuna sahip olup olmadığı anlamak için karakterizasyon (flow sitometri ve tümör spheroid oluşum) deneyleri yapılmıştır. Genistein fitokimyasalının hücre hattındaki toksisitesi MTT testi ile belirlenmiştir. Belirlenen genistein konsantrasyonunun karakterizasyona etkisi için flow sitometri ve tümör spheroid oluşum deneyleriyle yapılmıştır. Genistein'in kanser benzeri popülasyondaki metabolik reprogramlamaya etkisini belirlemek için tedavi uygulanan ve uygulanmayan için hücre hatları RNA-seq analizine gönderilmiştir. Analiz sonuçlarına göre diferansiye olan KKH belirteçleri ve metabolik genlerin korelasyon analizleri yapılmıştır. HT-29 hücrelerinin yapılan karakterizasyon testleri sonucunda KKH popülasyonunu içerdiği gözlenmiştir. 24 saat 25 µM genistein tedavisinden sonra CD44 KKH belirtecinde protein düzeyinde anlamlı bir düşüş ve spheroid morfolojilerinde ise gözle görülür bir değişiklik, boyutlarında küçülme oluşmuştur. Yine 24 saat 25 µM genistein tedavisinden sonra yapılan RNA-seq analizlerine göre; CD44 KKH belirtecinin transkript düzeyinde anlamlı bir değişiklik görülmezken, CD26 ve SOX9 KKH belirteçlerinde, PFKFB-2, G6PD, GLS-2, MAT2A, ACAT-1, FASN ve ACAT-2 metabolik gemlerinde anlamlı bir azalış, gösterirken HK2, LDHA, TPI-1, SDHB, ALDH-7A1, DNMT1, GSS, GLUD1, SLC25A11 ve MAT2-B metabolik genlerinde anlamlı bir artış gözlenmiştir. Bu metabolik genlerin CD26 ve SOX9 KKH belirteçleriyle korelasyonu sonucu genistein tedavisiyle, PFKFB-2, G6PD, GLS2, MAT2A ve FASN genleri üzerinden kolorektal kanser kök benzeri hücrelerinde metabolik hedef tedavi olarak kullanılabileceği ve kanser kök benzeri hücrelerin metabolizmasını modüle edebileceği tahmin edilmektedir.

Abstract:
One of the most illustrative models for understanding the heterogeneous and complex nature of CRC carcinogenesis is the use of CCSCs. These cells represent a subpopulation that plays a pivotal role in the initiation, progression, metastasis, and reappearance of CRC. In addition to the known features that distinguish them from other cells, such as self-renewal, differentiation, multidrug resistance (MDR), cell plasticity, and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), CRCs also exhibit altered metabolic activity. A number of metabolic enzymes and transporter proteins are subject to alteration as a consequence of the metabolic changes that occur.  These metabolic enzymes and cell surface transporter proteins exert a significant influence on stem cell characteristics and tumorigenesis in CSC populations of diverse cancer types, including CRC. Phytochemicals that exert significant influence on cancer and CSCs also regulate cancer and CSC metabolism, and are currently being investigated as potential therapeutic targets. In accordance with the aforementioned information, the objective of this thesis study was to investigate the efficacy of genistein as a metabolic target therapy in colorectal cancer stem-like cells, with particular emphasis on the correlation between CD44 and other cell surface markers, as well as the gene expressions of enzymes and cell transporters involved in cell metabolism in HT-29 CRC cells. To ascertain whether the HT-29 cell line exhibits a CSC population, characterization experiments were conducted using flow cytometry and tumor spheroid formation. The toxicity of genistein, a phytochemical, in the cell line was determined by MTT assay. Flow cytometry and tumor spheroid formation experiments were performed to ascertain the effect of the determined genistein concentration on characterization. To determine the effect of genistein on metabolic reprogramming in the cancer-like population, treated and untreated cell lines were subjected to RNA-seq analysis. The results of the analysis indicated the necessity for a correlation analysis of differentiated CSC markers and metabolic genes. The characterization tests revealed the presence of the CSC population in HT-29 cells. Following a 24-hour treatment with 25 µM genistein, a notable reduction in the protein expression of the CD44 CSC marker was observed, accompanied by a discernible alteration in spheroid morphology and a decrease in their size.  Once more, according to the RNA-seq analysis, after a 24-hour treatment with 25 µM genistein, while no significant change was observed in the transcript level of the CD44 CSC marker, a significant decrease was observed in the transcript levels of the CD26 and SOX9 CSC markers, as well as those of PFKFB-2, G6PD, and GLS-2. A significant increase was observed in the expression of HK2, LDHA, TPI-1, SDHB, ALDH-7A1, DNMT1, GSS, GLUD1, SLC25A11, and MAT2-B metabolic genes, while a significant decrease was observed in the expression of MAT2A, ACAT-1, FASN, and ACAT-2 metabolic genes.  Given the correlation between these metabolic genes and CD26 and SOX9 CSC markers, it is postulated that genistein treatment may serve as a metabolic target therapy in colorectal cancer stem-like cells through PFKFB-2, G6PD, GLS2, MAT2A, and FASN genes, thereby modulating the metabolism of cancer stem-like cells.