Leptospirosis tanısında LipL32, OmpL1 ve 16S rRNA gen bölgelerindeki spesifik dizileri hedef alan PCR-RFLP yöntemlerinin duyarlılıklarının tespiti
Detection of sensitivity, PCR-RFLP metods, targeted spesific sequence in LipL32, OmpL1 and 16S rRNA gene regions for diagnosis leptospirosis
Yazar: AYBEN SOYAL
Danışman: PROF. DR. FATİH KÖKSAL
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Genler = Genes ; Leptospiroz = Leptospirosis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA ; Taksonomi = Taxonomy

Özet:
Leptospiroz, tüm dünyada ılıman ve yağışlı iklim özelliği gösteren bölgelerde görülen en önemli zoonozlardadır. Oldukça geniş bir spektrumda klinik tabloya sebep olan leptospirosis'de olguların sadece %10'unda görülebilen hematürinin de spesifik bir semptom olmaması sebebi ile Leptospirosis'in klinik tanısı son derece zordur. Leptospirozlu vakaların çoğu ya tanı almadan nonspesifik olarak ampirik tedavi almakta veya hastalık spontan iyileşme ile sonlanmaktadır. Ancak son ikterik dönemdeki hastalar araştırma hastanelerine zorunlu olarak başvurmakta ve idrar ve kan örneklerinin karanlık alan mikroskopisi ile değerlendirilmesi ile non-spesifik ve düşük sensitivitede tanı almaktadır.Bu çalışmada konvensiyonel tanıdaki yetersizliklere alternatif olmak üzere, şüpheli hastaya ait klinik materyallerde; a- leptospira varlığı, b- L.interrogans ve L.bifleksa tür tayini yapabilecek, yüksek sensitivite ve spesifiteye sahip ve hızlı sonuç üretebilen PCR bazlı tanı kiti geliştirilmesi amaçlandı.Karanlık Alan Mikroskopisi ve MAT' ne göre daha sensitif, spesifik ve hızlı bir alternatif tanı testi oluşturmak üzere 16SrRNA Nested-PCR RFLP, OmpL1 PCR ve LipL32 Nested-PCR testlerinin kullanılabilirliğini belirlemek amacı ile, Çukurova bölgesinde klinik olarak leptospirosis şüphesi olup Ç.Ü Tıp Fakültesi hastanesi ile SB Adana Devlet Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları Kliniklerine başvuran 38'i yetişkin 9'u 18 yaş altı hastalardan alınan 47 kan örneği ile bölgemizde hematüri ve ikter bulguları olan 86 büyükbaş hayvana ait kan örneği 47'si insan 86'sı hasta hayvanlara ait olmak üzere toplam 133 serum/plazma örneği değerlendirildi.Karanlık alan mikroskobisinde (KAM) incelenen 22 insan ve 34 hayvan örneğinde leptospira ile uyumlu görüntü elde edilirken, 7 farklı L.interrogans suşu ve L. patoc suşunun antijen olarak kullanıldığı MAT ile değerlendirilmesi sonucunda ise insan serum örneklerinin 21'i ile hayvan serum örneklerinin 69'unda en az 1/50 titrasyonda bir antijene karşı seropozitiflik görüldü.16S rRNA Nested-PCR-RFLP ile 77'si L.interrogans 15'i de L.biflexa olmak üzere, toplam 92 örnekte hedef diziler tespit edilirken, sadece L.interrogans türlerinde bulunan LipL32 geni spesifik primerlerin kullanıldığı PCR ile örneklerin 77'sinde, serotip düzeyinde L.interrogans ayrımına imkan veren OmpL1 PCR ile ise toplam 67 örnekte pozitiflik elde edildi.Bölgede en sık karşılaşılan serotipin %2,1'i insan %25,6'sı hayvan örneklerinden olmak üzere %17 oranı ile L.hardjo olduğu, bu serotip dışında, sırası ile L.grippotyphosa, L.Bratislava ve L.ichteriohaemmorhagia gibi serotiplerin görüldüğü tespit edilmiştir.

Abstract:
Leptospirosis is one of the most important zoonozis, seen in regions with temperate and rainy climate, including our region. Causing a wide clinical spectrum, clinical diagnosis of Leptospirosis is extremely difficult because only 10 % of cases with nonspecific symptoms can be seen. Most of the cases of Leptospirosis are either non-specific empirical treatment without diagnosis, or disease terminated with spontaneous recovery. However, with patients in the last icteric period, it is necessary to admit them to research hospitals, and evaluate them via non-specific and low sensitivity methods with blood and urine samples through dark field microscopy.This study is aimed at developing alternative methods for identifying deficiencies in conventional diagnosis methods, diagnostic kit based PCR-RFLP, which belong to the suspect patient clinical materials; a- to show existence leptosipira, b- identification of L.interrogans and L.biflexa types, with high sensitivity and specificity and can produce rapid results.A total of 47 human patients, 38 adults and 9 under of 18 age, were admitted to Ç.U. Faculty of Medicine and The Depertment of Infectious Disaease of Adana State Hospital of Health Ministery, and blood samples of 86 cattle belongs to Çukurova region which showed hematuria and icter symptomps, were investigated with 16S rRNA Nested-PCR RFLP, OmpL1 PCR and LipL32 nested-PCR tests, to create more sensitive, specific and rapid alternative diagnostic tests to determine the usability of DFM and MAT.While positivity rates in all samples analyzed in DFM methods, 22 human and 34 animal, sera appearance were obtained by Leptospira compatible images, the result of the MAT samples from 7 different L.interrogans strains and L.patoc strain were used as an antigen to evaluate, 21 human and 69 animal serum samples seropositivity were detected in at least 1/50 via antigen titration. The target sequences with in 16SrRNA gene were found to be positive in 92 patients, of which 77 belonged to the L.interrogans and 15 L.biflexa by using 16S rRNA-specific nested-PCR-RFLP which allows the separation of pathogenic and non-pathogenic strains. And the result of LipL32 gene specific primers PCR in 77 samples of all samples L.interrogans was found, and by using OmpL1 PCR which allows separation of the level of serotype to L.interrogans, 67 samples were found to be positiveL.hardjo have been identified as the most common serotypes in the region with rate is 17% including 2,1% of people and 25,6% of animal samples and except for this serotype, L.grippotyphosa, L.bratislava and L.ichteriohaemmorhagia respectively have been seen as the serotypes identified.