Hiperoksik fare akciğerinde retinoik asidin alveolar epitel yenilenmesindeki etkisi: Moleküler yaklaşım
The effect of retinoic acid on alveolar epithelial regeneration in hyperoxic mice lung: A molecular approach
Yazar: ÖZGECAN KAYALAR
Danışman: DOÇ. DR. FÜSUN ÖZTAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Göğüs Hastalıkları = Chest Diseases

Özet:
Alveolar epitel, akut ve kronik akciğer yaralanmalarında hasarın ilk olarak görüldüğü primer hedef dokudur. Transforme edici büyüme faktörü-beta 1 (TGF-ß1), alveolar epiteli doğru ya da yanlış onarıma yönlendirebilen bir moleküldür. Bu çalışma prenetal, neonatal ve erken postnatal dönemde alveologenezde etkili olan retinoik asit (RA)'in erişkin akciğerde oluşturulan deneysel alveolar epitel hasarı sonrası alveolar epitel yenilenmesinde etkili olup olmadığını saptamak ve bu süreçte TGF-ß1 sinyal yolu ve RA arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak amacıyla yapılmıştır.Çalışmada erişkin C57BL/6J fareler 4 deney grubuna ayrıldı. (1) intraperitoneal (ip) olarak 1:1 fıstık yağı/dimetilsülfoksid (DMSO) enjeksiyonu yapılan kontrol fareler, (2) 10 gün süresince günlük tek doz RA (1:1 fıstık yağı/DMSO karışımında çözündürülen, 50 mg/kg, ip) uygulaması yapılan fareler, (3) 3 gün süresince %98-100 oksijene maruz bırakıldıktan sonra 10 gün boyunca günlük tek doz 1:1 fıstık yağı/DMSO karışımı uygulanan (ip) fareler, (4) 3 gün süresince %98-100 oksijene maruz bırakıldıktan sonra 10 gün boyunca günlük tek doz RA uygulanan (ip) fareler. Alveolar alandaki hasar, çoğalma indeksi ve tip 2 pnömosit sayısı genel histolojik ve immunohistokimyasal yöntemlerle ışık mikroskobu altında araştırıldı. Akciğer homojenatlarında ELIZA ile TGF-ß1 miktarları, western analizleri ile Smad proteinlerinin ekspresyonları, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonları (QRT-PCR) ile Smad ve RAGE (tip 1 pnömosit markırı) genlerinin ekspresyonları ölçüldü.RA, sağlıklı fare akciğerlerinde tip 2 pnömosit çoğalmasını uyardı ve tip 1/tip 2 pnömosit oranını dengeledi. Eksojen RA sağlıklı ve hiperoksik fare akciğerinde Smad 4 mRNA ekspresyonunu azaltarak Smad 3 bağımlı TGF-ß1 sinyal yolunun kullanımını sınırladı. Hiperoksik fare akciğerinde aşırı uyarılmış Smad 3 bağımlı TGF-ß1 sinyal yolu alveolar epitel/duvar incelmesi ve kopmasına, alveol ve septa sayısında azalmaya ve RAGE mRNA ekspresyonunda düşüşe neden oldu. Ayrıca hiperoksik fare akciğeri alveol çapında, septa kalınlığında, çoğalma indeksinde ve tip 2 pnömosit sayısında artışla karakterize edildi. Hiperoksik farelere eksojen RA uygulamaları hiperoksik akciğerde dejeneratif değişiklikleri iyileştirdi, kısmi alveolarizasyonu uyardı ve RAGE mRNA ekspresyonunu düşürdü. Hiperoksik fare akciğerinde RA'in terapötik etkisi Smad 4 mRNA ekspresyonlarının azaltılması ve Smad 7 mRNA ve protein ekspresyonlarının arttırılması yolları ile Smad 3 bağımlı TGF-ß1 sinyal yolunun aktivasyonunun ve kullanımının sınırlandırılması nedeniyledir.Sonuç olarak RA, Smad 3 bağımlı TGF-ß1 sinyal yolunu Smad 4 ve Smad 7 molekülleri üzerinden translasyonel ve transkripsiyonel seviyede düzenler. Üstelik RA erişkin fare akciğerinde alveologenezle birlikte alveolar epitelin yenilenmesinde, onarımında ve bütünlüğünde etkilidir. RA, erişkin hiperoksik farelerde tip 2-tip 1 farklılaşması hariç akciğer hasarının iyileştirilmesinde terapötik ajan olarak önerilebilir.

Abstract:
Alveolar epithelium is the primary site of tissue damage in both acute and chronic lung injuries. Transforming growth factor- ß1 (TGF-ß1) is known to play a role in directing the repair of alveolar epithelium. Retinoic acid (RA) is another molecule with an important role in alveologenesis in prenatal, neonatal and early postnatal stages. This study aimed to determine whether RA has an effect on an alveolar epithelial regeneration following experimentally induced damage to the alveolar epithelium in adult mice. A possible relationship between RA and TGF-ß1 signalling pathway during alveolar repair was also investigated.In this study, adult C57BL/6J mice were divided into 4 groups and administered (intraperitoneally): 1:1 peanut oil/dimethylesulfoxide (PoDMSO, control group), RA dissolved in PoDMSO (RA-PoDMSO) daily for ten days; PoDMSO daily for ten days following a 72-hr hyperoxia (98-100% oxygen); and RA-PoDMSO following a 72-hr hyperoxia. The damage in alveolar areas, proliferative index and number of type 2 pneumocytes were investigated by general histological and immunohistochemical methods under light microscopy. Levels of TGF-ß1, Smads and RAGE (type 1 pneumocyte marker) expressions, were measured in lung homogenates by ELISA, western-blotting and real-time PCR (QRT-PCR).RA appeared to have induced the proliferation of type 2 pneumocytes and normalized type 1 ? type 2 pneumocyte ratio in healthy mice. Exogenous RA also limited Smad 3-dependent TGF-ß1 signaling pathway by decreasing Smad 4 mRNA expression in both healthy and hyperoxic mice. Excessive induction of Smad 3-dependent TGF-ß1 signaling in hyperoxic mice resulted in the thinning and disruption of alveolar wall integrity, decrease in alveolar septation and alveoli numbers, and reduction in the RAGE mRNA expression. Additionally, thickening of alveolar septa and increases in alveolar diameter, proliferative index and the number of type 2 pneumocytes were observed in hyperoxic mice. Exogenous RA treatments in hyperoxic mice improved degenerative alterations, induced partial alveolarization and depressed RAGE mRNA expression.RA seems to be regulating Smad 3-dependent TGF-ß1 signaling pathway at transcriptional and translational levels via Smad 4 and Smad 7. The therapeutic effects of RA on the hyperoxic lung appeared to be mediated by the inhibition of Smad 3-dependent TGF-ß1 signaling pathway via the reduced Smad 4 and increased Smad 7 expression. RA also seems to play a role in alveologenesis, involved in the regeneration and repair of alveolar epithelium in adult mice. These results suggest that RA could be used as a therapeutic agent to help repair lung damage in adult hyperoxic mice, except for type I pneumocytes differentiation.