Kontrollü biyoreaktör ortamında üretilecek eksozomlar ile rekombinant Hepatit B aşısının geliştirilmesi ve hepatoselüler karsinoma modelinde denenmesi
Improvement of recombinant Hepatitis B vaccine by exosomes that will be produced in a controlled bioreactor environment and testing in hepatocellular carcinoma model
Yazar: ILGIN KIMIZ GEBOLOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. SUPHİ ŞURİŞVAN ÖNCEL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Nanopartiküler taşıyıcı sistemler, taşıdıkları ilacı ya da antijenik materyali serumdaki enzimlerden koruyan, ideal olarak 10-100 nm boyutlarında olan ve vücutta istenmeyen bir etki oluşturmayan materyallerden hazırlanan partiküllerdir. Lipozomlar, polimerik nanopartiküller, emülsiyonlar, virüs benzeri parçacıklar, inorganik nanopartiküller ve eksozomlar taşıyıcı olarak kullanılan bu nanopartiküler yapılar arasında yer almaktadır. Eksozomlar, doğal lipozomlar olarak da adlandırılmaktadır ve vücut hücrelerinden salınan, 20-100 nm boyutlarındaki nanokeseciklerdir. Eksozomların keşfinden bugüne kadar hem taşıyıcı sistem olarak hem de çeşitli hastalıklarda erken tanı ve tedavi aracı olarak kullanılmasına ilişkin araştırmalar devam etmektedir. Ancak, klinikte kullanımı için yeterli miktarda eksozom üretimi, izolasyonu ve çeşitli yükleme stratejileri ile ilgili sorunlar tam olarak çözüme ulaşamamıştır. Bu tez çalışmasında, insan monosit hücre hattı olan THP-1'in serum ve hayvansal protein içermeyen kimyasal olarak tanımlanmış besin ortamına (FBCD) adaptasyonu, hücrelerin büyük ölçekte üretiminin optimizasyonu, hücrelerden eksozom izolasyonu sırasında büyük ölçeğe daha uygun olan ultrafiltrasyon yönteminin optimizasyonu, elde edilen eksozomların detaylı karakterizasyonu, hepatit B antijeni ile yüklenmesi ve oluşturulan hepatoselüler karsinoma modelinde denenmesi adımları gerçekleştirilmiştir.
Kademeli adaptasyon ile FBCD ortamına THP-1 hücreleri adapte edilirken serum oranı %5'in altına düştüğünde hücrelerin zorlandığı ve daha fazla pasajlanarak adapte olabildiği belirlenmiştir. Adapte edilen hücreler, başlangıç hücre konsantrasyonun belirlenmesi amacıyla erlende ve sonra karıştırma hızının belirlenmesi amacıyla da spinnerda üretilmiştir. Spesifik güç girişi sabit tutularak 1L çalışma hacimli karıştırmalı tank biyoreaktöre ölçek büyütülmüş ve üretim parametreleri optimize edilmiştir. Hücre süpernatantının 125 rpm akış hızı ile çapraz akışlı ultrafiltrasyon sistemine beslemenin eksozom izolasyonu için optimum olduğu belirlenmiştir. İzole edilen eksozomların 92.5 ± 5.51 nm boyutta, 5.25x107 eksozom partikülü/mL konsantrasyonda olduğu ve TSG101 ve CD9 yüzey antijenlerini taşıdığı detaylı karakterizasyon yöntemleri ile belirlenmiştir. "Hanging drop" yönteminde HepG2 hücreleri kullanılarak oluşturulan hepatoselüler karsinoma modelinde HBsAg yüklü ve 50 µg/mL konsantrasyondaki boş eksozomlar denendiğinde, boş eksozomların hücre büyümesini arttırıcı özellik gösterip sferoid çapını, hacmini ve canlılığını arttırdığı belirlenmiştir. 5 µg/mL HBsAg yüklü eksozomların ise sferoid oluşumu sırasında ortama eklenmesinin, oluşan sferoidin hem çapını hem hacmini hem de canlılığını azalttığı, sferoid oluştuktan sonra ortama eklenmesinin ise boyutta yine azalmaya neden olurken, canlılığı üzerinde bir etkisi olmadığı belirlenmiştir.
En büyük problemlerinden biri düşük verim ve verimlilik olan eksozomların büyük ölçekte üretimi ve ona uygun olarak çapraz akışlı ultafiltrasyon sisteminin optimize edilmesi sayesinde kısa sürede çok miktarda eksozom elde edilmesinin prosedürü oluşturulmuştur. Buradan elde edilen eksozomlar model olarak Hepatit B antijeni ile yüklenip hesaptoselüler karsinoma modelinde denenmiştir. Ancak başka antijenik molekül, ilaç vb. yüklenmesi ile farklı bir taşınım sistemi veya biyobelirteç olarak hastalık tanısında da kullanılabilir.

Abstract:
Nanoparticular delivery systems are particles prepared from substances that do not cause any undesirable side effects in the body, ideally 10-100 nm in size, that protect the drug or antigenic materials they carry from enzymes in the serum. Liposomes, polymeric nanoparticles, emulsions, virus-like particles, inorganic nanoparticles and exosomes are belong these nanoparticular structures which used as carriers. Exosomes are also called natural liposomes and they are nanovesicles 20-100 nm in size released from body cells. Since the discovery of exosomes, research continues on their use both as a carrier system and as a tool for early diagnosis and treatment in various diseases. However, the problems related to the production and isolation of sufficient exosomes for clinical use, and various loading strategies have not been fully resolved. In this thesis, the adaptation of human monocyte cell line THP-1 to a chemically defined medium that does not contain serum and animal protein (FBCD), optimization of the production of cells in a large scale, optimization of the ultrafiltration method, which is more suitable for large scale during exosome isolation from cells, detailed characterization of exosomes, loading with hepatitis B antigen and testing in the created hepatocellular carcinoma model were performed.
While THP-1 cells were adapted to the FBCD medium with gradual adaptation, it was determined that when the serum ratio fell below 5%, the cells were forced and could adapt by passing more. Adapted cells were grown in the erlenmeyers to determine the initial cell concentration and then in the spinner flasks to determine the mixing speed. By keeping the specific power input constant, the 1L working volume stirred tank bioreactor was scaled up and the production parameters were optimized. It was determined that feeding the cell supernatant to the cross-flow ultrafiltration method with a flow rate of 125 rpm was optimal for exosome isolation. It was determined by detailed characterization methods that the isolated exosomes were 92.5 ± 5.51 nm in size, 5.25x107 exosome particles/mL concentration and carried TSG101 and CD9 surface antigens. When HBsAg-loaded and 50 µg/mL empty exosomes were tested in the hepatocellular carcinoma model using HepG2 cells in the "hanging drop" method, it was determined that empty exosomes increased cell growth-enhancing properties and increased the diameter, volume and viability of the sphere. And also, it was determined that the addition of 5 µg/mL HBsAg loaded exosomes to the medium during spheroid formation reduced both the diameter, volume and viability of the formed spheroid, while adding it to the medium after the spheroid was formed again caused a decrease in size but had no effect on its viability.
As a result, thanks to the large-scale production of exosomes and the optimization of the cross-flow ultrafiltration system accordingly, one of the biggest problems of low yield and productivity has been solved and the procedure of obtaining a large amount of exosomes in a short time has been carried out. Exosomes obtained here were loaded with Hepatitis B antigen as a model and tested in a hepatocellular carcinoma model. However, it can also be used in the different transport system with the loading of other antigenic molecules and drugs or as a biomarker for the diagnosis of disease.