Chlamydomonas reinhardtii arilsülfataz genlerinin ekspresyon düzeylerinin semi-kantitatif PCR ve QPCR yöntemleri ile belirlenmesi
Determination of expression levels of chlamydomonas reinhardtii arylsulfatase genes by semi-quantitative PCR and QPCR methods
Yazar: FATMA SALARVAN
Danışman: ÖĞR. GÖR. MÜNEVVER AKSOY
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Arilsülfatazlar, sülfatı diğer moleküllerden hidrolize eden enzimlerdir. Bu enzimler mikroorganizmalar ve hayvanlarda bulunmaktadır, fakat literatürde bitkilerde arilsülfataz enziminin bulunmadığı ve bitkilerde sülfataz aktivitesinin olmadığı savunulmaktadır. İnsanda arilsülfataz genlerindeki mutasyonlar farklı hastalıklara sebep olmaktadır. Bu veriler arilsülfatazların biyoteknoloji, tıp ve ziraat alanlarında önemli enzimler olduğunu göstermektedir. Çalışmada model organizma Chlamydomonas reinhardtii genomunda bulunan 19 adet arilsülfataz (ARS) geni Phytozome veri tabanında belirlenmiş, gen ve protein sekansları alınmıştır. Literatürde bunlardan ARS1 ve ARS2 genleri üzerine yapılmış çalışmalar bulunmaktadır; bu tez çalışması diğer 17 gen modeli üzerine yapılan ilk fonksiyonel çalışmadır. Biyoinformatik araçlarla olası protein sekanslarının domain, motif ve moleküler filogeni analizleri yapılmıştır. Biyoinformatik çalışmalar gen modellerinin arilsülfataz proteinleri olduğunu desteklemiştir. Bu genlerin sülfat eksikliğinde transkripsiyon seviyelerinde değişiklik olup olmadığını belirlemek için RT-PCR analizleri yapılmıştır. RT-PCR analizleri için C. reinhardtii hücreleri, ilk olarak normal besi yerinde (TAP) çoğaltılıp ardından sülfatsız besi yerine (TAP -S) geçirilmiş ve belirli zaman aralıklarında kültürlerden örnekler alınmıştır. Alınan örneklerden RNA izolasyonu yapılmış, ardından RNA'lar cDNA'ya çevrilmiş ve cDNA'lar ile PCR reaksiyonları kurulmuştur. Sonuçlar, 17 ARS geninden ARS6, ARS7, ARS11, ARS12, ARS13, ARS17 ve ARS19'da sülfatsız ortamda transkripsiyonda artış olduğunu göstermiştir; fakat bu artış pozitif kontrol genindeki (ARS2) artış kadar yüksek değildir. İlginç olarak, diğer genlerdeki artış 5. saat sülfat açlığında görülürken, ARS17 genindeki artış 24. saatte görülmüştür. C. reinhardtii ve diğer organizmalardaki ARS protein dizileri kullanılarak filogenetik ağaç çizilmiştir. Ağaçta C. reinhardtii proteinlerinin, Volvox carteri proteinleri ile yakın dallarda olduğu; Homo sapiens ve bakteri türleri ile ayrı grupta kümelendiği görülmüştür. Sonuç olarak C. reinhardtii genomunda 19 ARS geni bulunduğu saptanmıştır. Bu sonuçlar ilerideki uygulamalara ışık tutacaktır.

Abstract:
Arylsulfatases are enzymes that hydrolyze sulfate from other molecules. These enzymes are found in microorganisms and animals, but it is argued in the literature that there is no arylsulfatase enzyme in plants and that there is no sulfatase activity in plants. Mutations in the arylsulfatase genes in humans cause different diseases. These data show that arylsulfatases are important enzymes in the fields of biotechnology, medicine and agriculture. In the study, 19 arylsulfatase (ARS) genes in the genome of the model organism Chlamydomonas reinhardtii were determined in the Phytozome database, and their gene and protein sequences were obtained. In the literature, although there are studies on ARS1 and ARS2 genes; this thesis is the first functional study on 17 other gene models. Domain, motif and molecular phylogeny analyzes of possible protein sequences were performed with bioinformatics tools. Bioinformatics studies have supported that the gene models are arylsulfatase proteins. RT-PCR analyzes were performed to determine whether there were changes in the transcription levels of these genes in sulfate deficiency. For RT-PCR analyses, C. reinhardtii cells were first grown in normal medium (TAP) and then transferred to sulfate-free medium (TAP-S) and samples were taken from cultures at certain time intervals. RNA was isolated from the samples taken, then RNAs were converted into cDNA and PCR reactions were established with cDNAs. Results showed increased transcription in sulfate-free media in ARS6, ARS7, ARS11, ARS12, ARS13, ARS17 and ARS19; however, this increase is not as high as the increase in the positive control gene (ARS2). Interestingly, the increase in other genes was seen at the 5th hour of sulfate starvation, while the increase in the ARS17 gene was seen at the 24th hour. Phylogenetic tree was drawn using ARS protein sequences from C. reinhardtii and other organisms. In the tree, C. reinhardtii proteins are in close branches with Volvox carteri proteins while they were clustered in a separate group with Homo sapiens and bacterial species. As a result, 19 ARS genes were found in the C. reinhardtii genome. These results will shed light on future applications.