Farklılaşmış PANC-1 hücrelerinde INSIG1 geninin incelenmesi
Investigation of INSIG1 gene in differentiated panc-1 cells
Yazar: MERYEM SEMA AYAZ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ FEYZA NUR TUNCER
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Genler = Genes ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücreler = Cells ; Metabolik hastalıklar = Metabolic diseases ; Metabolizma = Metabolism ; Mikrodizilim analizi = Microarray analysis ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
PANC-1 hücre hattı, literatürde çoğunlukla pankreas kanserinin araştırılması ile ilişkili çalışmalarda kullanılmaktadır. İnsüline proliferatif yanıt verdiği bilinen bu hücre hattının metabolik hastalıkların açıklanmasında bir araç olarak kullanılabileceği öngörülmüş ve diyabet araştırmalarında deneysel bir model oluşturmak amacıyla kullanılmıştır. Bu kapsamda grubumuzda gerçekleştirilen bir önceki çalışmada PANC-1 hücreleri 14 günlük özel bir protokol ile farklılaştırılarak mikroarray analizine tabi tutulmuş ve hücre farklılaşmasının kolesterol metabolizması, lipogenez ve glikoz homeostazisi regülasyonunda rol alan INSIG1 gen anlatımında 4 kat anlamlı değişime neden olduğu tespit edilmiştir.
Bu tez çalışmasında ise, PANC-1 hücre hattında, uygulanan bu farklılaşma protokolünün INSIG1 gen dizisinde herhangi bir değişikliğe neden olup olmadığı araştırılmıştır. Ayrıca bir önceki çalışmanın mikroarray çıktılarını doğrulamak amacıyla kantitatif RT-PZR de gerçekleştirilmiştir. Bu hedefler doğrultusunda öncelikle INSIG1 geninin farklı transkriptlerini de kapsayacak şekilde primerler tasarlanarak bazal ve farklılaşmanın 14. gününe ait örneklerde INSIG1 geni dizilenmiştir. Diğer bir hedef olan mikroarray çıktılarının validasyonu için ise farklışma protokolünün 0 ve 14. günlerinde toplanan PANC-1 hücrelerinden RNA izolasyonu yapılarak SYBR Green ve UPL Prob yöntemleri ile kantitatif RT-PZR gerçekleştirilmiştir.
Dizi analizi sonucunda, farklı intronik bölgelerde beş tane tek nükleotit değişimi olmakla birlikte bir tane tek nükleotit delesyonu tespit edilmiştir. Ayrıca, kantitatif RT-PZR sonuçlarına göre mikroarray çıktıları, INSIG1 gen anlatımının 14. güne gelindiğinde yaklaşık 4 kat az anlatım sergilediğinin tespiti ile valide edilmiştir. 
Sonuç olarak, INSIG1 geni ilk defa PANC-1 hücre hattında karakterize edilmiştir. Dizi analizi sonucuna göre, bu hücre hattında oluşan farklılaşmanın INSIG1 gen dizisini mutasyona uğratmadığı görülmüştür. Ayrıca yapılan INSIG1 mRNA ekspresyon analizi sonuçları ile mikroarray çıktıları valide edilmiştir.

Anahtar Kelimeler : PANC-1, INSIG1, Farklılaşma, Sanger Dizilemesi, Metabolik
Yolak

Abstract:
PANC-1 cell line is mainly used in studies explaining pancreatic cancer. Since this cell line was shown to have proliferative response to insulin, its use as a tool to explain metabolic diseases was planned. In this respect, our previous study involved creation of an experimental model utilizing PANC-1 cells. In this study, PANC-1 cells were differentiated by a special 14 day protocol and microarray analyses were carried out that revealed 4-fold significant change in expression of INSIG1 gene, which is involved in cholesterol metabolism, lipogenesis and regulation of glucose homeostasis.
In this thesis, INSIG1 gene was sequenced in the PANC-1 cell line to understand if this differentiation protocol had any effect at the DNA level. In addition, INSIG1 mRNA expression levels were determined via quantitative RT-PCR to confirm the microarray results of the previous study. In line with these aims, INSIG1 gene was amplified utilizing primer pairs that encompass different transcripts of the gene and that sequencing was perfomed on PANC-1 cells at basal level and day 14 of the differentation protocol. For the expression analysis, cells were collected on day 0 and 14 of the differentation protocol, followed by RNA isolation and cDNA synthesis. SYBR Green and UPL prob techniques were utilized in quantitative RT-PCR to detect relative expression of INSIG1 in these cells.  
As a result of the sequence analysis, we have detected 1 single nucleotide deletion and 5 single nucleotide changes in different intronic regions. Moreoever, quantitative RT-PCR showed 4 fold decrease of INSIG1 expression on day 14 samples, validating microarray results.  
As a result, INSIG1 was characterized first time in PANC-1 cell line. It was observed that the differentiation of the cells did not cause a change in INSIG1 gene sequence. Moreover, INSIG1 mRNA expression analysis confirmed microarray results.

Key Words: PANC-1, INSIG1, Differentitation, Sanger Sequencing, Metabolic
Pathway