Androjen duyarlı ve kastrasyona dirençli prostat kanseri hücre serilerinde androjen reseptörünü hedef alan miRNA' nın belirlenmesi ile hedef aldığı diğer genlerle gelişen direnç mekanizmasının incelenmesi
Defining mirna targeting androgen receptor and this miRNA's target genes with investigation of developed resistance mechanism in androgen sensitive and castration resistant prostate cancer cell lines
Yazar: ÇAĞDAŞ AKTAN
Danışman: DOÇ. DR. BUKET KOSOVA
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Androjenler = Androgens ; Mikro RNA = Micro RNA ; Mikrodizilim analizi = Microarray analysis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prostat neoplazmları = Prostatic neoplasms ; Prostat spesifik antijeni = Prostate specific antigen ; RNA = RNA ; Reseptörler-androjen = Receptors-androgens

Özet:
Prostat kanserli olgularda androjen reseptör (AR) sinyalleşmesi; hücre yaşamı, canlılığı, proliferasyonu, apoptoz ve anjiyogenezin uyarılması gibi temel biyolojik olaylar üzerinde etkili olmaktadır. Androjen ablasyon tedavilerine dirençli prostat kanseri hücre serilerinde, AR ekspresyonunun aşağı regülasyonu, hücre proliferasyonunu inhibe ettiğinin anlaşılması; kastrasyona dirençli prostat kanseri (KDPK) hücrelerinin çoğalmasında AR' nin büyük bir etkisi olduğunun kanıtı olmuştur. Günümüzde AR düzenleme mekanizmasına odaklanıp, AR' yi baskılamak için daha etkin stratejiler belirlemeye çalışılmakta ve prostat kanseri hastaları için yeni tedavi seçenekleri araştırılmaktadır. Ancak, KDPK için henüz etkin bir tedavi şekli bulunamamıştır. Bu sebeple, prostat kanseri hücrelerindeki direnç gelişimi mekanizması altında yatan moleküler değişikliklerin kapsamlı bir şekilde araştırılması gerekmektedir. Bugüne kadar AR mRNA ekspresyonunu hedef alan çok sayıda ve çeşitli küçük sentetik moleküler inhibitörler geliştirilmiştir. Bunlardan biri de miRNA' lardır.
Çalışmamızda AR' yi hedef alan olası miRNA' lar in silico analiz ile belirlenmiştir. Bu miRNA' ların LNCaP, LNCaP-Abl ve LNCaP-104R2 prostat kanseri hücre serilerindeki ekspresyon profilleri, AR ve PSA genlerinin mRNA seviyesindeki ekspresyon değişimleri qPCR ile; miRNA transfeksiyonu ve DHT uygulaması sonrasında 5 günlük süreçte gerçekleşen hücre proliferasyonu da WST-1 yöntemiyle analiz edilmiştir. 
In silico analiz sonucunda, AR genini hedef aldığı düşünülen 86 adet miRNA tespit edilmiştir. Array analizi sonrasında miR-625 ve miR-874' ün KDPK hücre serilerinde androjene duyarlı hücre serisine göre anlamlı bir şekilde daha fazla eksprese edildiği saptanmış; sonraki analizlerde bu miRNA' ların ekspresyon seviyelerini düşürmek için "anti-miR" oligonukleotidleri kullanılmıştır. Anti-miRNA-874 veya anti-miRNA-625 transfeksiyonu ile belli günlerde hücre proliferasyonunda inhibisyon saptanmıştır. Ayrıca, anti-miR-874 veya anti-miR-625 transfeksiyonu sonrasında, kontrol hücre grubuyla kıyaslandığında AR gen ekspresyon seviyesinin tüm hücre serilerinde arttığı, PSA gen ekspresyonunun ise LNCaP-104R2 dışındaki diğer tüm hücre serilerinde arttığı saptanmıştır. 
Sonuç olarak, ileride miRNA uygulamalarının KDPK gelişimini önlemede yeni ve alternatif bir tedavi yöntemi olabileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
AR signaling in patients suffering from prostate cancer plays role on essential biological processes like cell survival, viability, proliferation, apoptosis and stimulation of anjiogenesis. After it has been understood that downregulation of AR expression leads to inhibition of cell proliferation in cell lines that are resistant to androgen ablation therapies; it has been a proof that AR has an important effect on the cell proliferation of castration resistant- prostate cancer (CRPC) cells. Nowadays focusing on AR regulation mechanism, more effective strategies for suppressing AR are being studied and new treatment alternatives are investigated for prostate cancer patients. However, a curative form of treatment has not been found yet for CRPC. Therefore, the underlying molecular changes in the development of resistance to prostate cancer cells are required to be investigated comprehensively. To date, several and variety of small synthetic molecular inhibitors targeting AR mRNA expression have been developed. One of them is miRNAs.
In the current study, miRNAs which possibly target AR were identified by in silico analyses. Expression profilling of these miRNAs, expression changes of AR and PSA genes at mRNA level for LNCaP, LNCaP-Abl and LNCaP-104R2 prostate cancer cell lines were analysed by qPCR; cell proliferation for 5 days after miRNA transfection and DHT treatment was analysed by WST-1 methods.
86 miRNAs which potentially target AR gene were identified predictively after using in silico analyses. After array analyses, it has been determined that, miR-625 and miR-874 expression levels were significantly increased in CRPC cell lines compared to LNCaP cell line; so, further analyses as "anti-miR" oligonucleotides were used to decrease expression levels of these miRNAs. After transfection of either anti-miR?874 or anti-miR-625, inhibition of cell proliferation for specific days has been determined. Furthermore, after transfections of anti-miR-874 or anti-miR-625, it has been determined that, AR gene expression levels were increased in both of the prostate cancer cell lines when compared to their control cell lines; and also PSA gene expression level was increased in all prostate cancer cell lines compared to their control cell lines, except LNCaP-104R2. 
In conclusion, we think that miRNA applications could constitute a new and alternative method to prevent development of CRPC in the future.