Yeni nesil dizileme teknolojisi ile Türkiye'den izole edilen kutanöz leishmaniosis etkeni leishmania infantum'un genom dizisinin çıkarılması
The genome sequencing with next generation sequencing technology of leishmania infantum causing cutaneous leishmaniosis from Turkish isolate
Yazar: DİLEK GÜLDEMİR
Danışman: PROF. DR. AYŞE SERPİL NALBANTOĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Dizi analizi = Sequence analysis ; Genom = Genome ; Leishmania = Leishmania ; Leishmania infantum = Leishmania infantum ; Leishmania infantum = Leishmania infantum

Özet:
Leishmania subgenus Leishmania, insan ve hayvanlarda deri ve iç organları tutabilen sistemik kronik bir hastalık olan "leishmaniosis" in etkenidir. Hastalık insanlarda genel olarak üç farklı klinik tablo [(visseral, Kala-Azar, VL) kutanöz (CL) ve mukokutanöz leishmaniosis (MCL)] ortaya çıkmaktadır. Leishmaniosis, Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ)'ne göre hala dünyanın en çok ihmal edilen hastalıklardan biridir. Leishmania tüm genomu dizisinin ilk kez çıkarılmasından bu yana ise sadece 
10 yıllık bir zaman geçmiştir. Bununla beraber, doku tropizmindeki farklılıkların nedenleri gibi bilim insanları için hala aydınlatılması gereken birçok şey bulunmaktadır. Bu çalışmada "Yeni Nesil Dizileme Teknolojisi" ile Türkiye'de kutanöz leishmaniosis olgusundan izole edilen Leishmania infantum'un tüm genom dizisinin çıkarılması amaçlanmıştır.
Genom sekanslama işlemi "Illumina HiSeq 2500" platformunda gerçekleştirilmiştir. Dizileme kütüphanelerini oluşturmak için, "Illumina HiSeq 2500" platformuyla uyumlu "TruSeq Nano DNA Low Throughput Library Prep Kit" kullanılmıştır. Sentez ile dizileme (SBS), HiSeq Rapid SBS Kit v2 ile iki fragmanın uç uca birleştirilmesi ile edilen tek fragman okumaları (2 x 150 bp; PE) şeklinde gerçekleştirilmiştir. Biyoinformatik analizler Geneious 11.0.5. (www.genius.com) platformu ile yapılmıştır.
Çalışmamızda L. infantum'un yüksek kalitede tüm genom dizisi (WGS) başarı ile sekanslanmış ve 36 kromozoma ait toplam 32.009.138 baz çifti büyüklüğünde genomik DNA elde edilmiştir. Ardından elde edilen genomik DNA, National Center for Biotechnology Information, USA, (NCBI) GenBank'a (www.ncbi.nlm.nih.gov) yüklenerek Leishmania infantum_TR01 (Lin_TR01) ismi ile tescillenmiştir. Bu konuda yapılan WGS çalışmaları incelendiğinde, Lin_TR01 suşu kutanöz leishmaniosis olgusundan izole edilmiş olması açısından bir ilktir. Zira referans genom olan L. infantum JPCM5 (Peacock ve ark., 2007) suşu türün klasik doku ve organ tropizmine uygun olarak visseral leishmaniosis olgusundan elde edilmiştir. Diğer yandan Lin_TR01, JPCM5 suşundan bu yana dünya genelinde tüm genomu dizilenen ikinci suş olma niteliğindedir. Lin_TR01 genomu elde edilen diğer genomlar ile karşılaştırıldığında seviye olarak comlete durumda olan tek Leishmania infantum tüm genom dizisidir. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/249).
Lin_TR01 genomunun 36 kromozomuna ait NCBI tarafından verilen accession (erişim) numaraları "CP027807, CP027810, CP027808, CP027811, CP027809, CP027812, CP027813, CP027814, CP027817, CP027818, CP027819, CP027815, CP027821, CP027816, CP027823, CP027820, CP027822, CP027824, CP027825, CP027826, CP027827, CP027828, CP027829, CP027830, CP027831, CP027832, CP027833, CP027834, CP027835, CP027836, CP027837, CP027838, CP027839, CP027840, CP027841, CP027842" şeklindedir. Lin_TR01 genomunun anotasyonu sonucunda 3153 polimorfizm, 8324 Gen, 8199 CDS, 8109 mRNA, 67 tRNA, 11 rRNA ve 58 ncRNA bulunmuştur. Elde edilen 8199 CDS'nin 5278 tanesi hipotetik protein niteliğindedir. Bulunan 3153 polimorfik bölgenin 799'u deletion, 528 insertion, 511 substitution ve 1315'i ise SNP şeklindedir. Bu polimorfizmlerin 466'sının proteinler üzerine etkisi tespit edilmiş olup, bunların 3'ü delesyon (deletion), 5'i uzama (extention), 44'ü çerçeve kayması (frame shift), 2'si insersiyon (insertion), 299'ü substitüsyon (substitution), 11'i kesilme (truncation) ve 102'si ise etkisiz (none) olarak sınıflandırılmıştır. 3153 polimorfizm incelenmiş ve 166 tanesinin "fonksiyonu bilinen bir protein üretimini kodlayan bölge" üzerinde meydana geldiği tespit edilmiştir. Ardından 166 adet polimorfizmin etkilediği 63 farklı protein (-bunların 20'si n>1, 43'ü ise n=1 şeklinde olup; n, aynı protein üzerinde meydana gelen toplam polimorfizm sayısını ifade etmektedir-) hakkında PubMed veritabanı kullanılarak literatür taraması yapılmış ve aynı protein üzerinde meydana gelen mutasyon sayısı, yeri, boyutu ve tipi, konu ile ilgili daha önce çalışma yapılıp yapılmadığı, yapılmış ise çalışma ile ilgili kısa açıklama detaylı bir şekilde özetlenmiştir. Literatür taramasında 63 proteinin 14'ü ile ilgili çalışma yapıldığı saptanırken geriye kalan 49'u ile ilgili herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Burada bahsi geçen 14 proteinin 5'i virülansla ilişkili, 2'si aşı adayı, 4'ü tanı/tiplendirme ile ilişkili, 2'si ilaç direnci, 3'ü ilaç hedefi ve 1'i yaşamsal fonksiyon ile ilişkilidir. 
Bu çalışmada elde edilen veriler esasen Leishmania genomu konusunda önümüzde katedilecek daha çok yol olduğunu gösterse de, çalışmamızın bilime katkı sağlayacağı, ülkemizde yapılacak Leishmania genom çalışmaları için bir temel oluşturacağı ve global düzlemdeki çalışmalara katkı sağlayacağı kanaatindeyiz.

Abstract:
Leishmania subgenus Leishmania is causing Leishmaniosis which is a chronic systemic disease in humans and animals can keep the skin and visceral organs. The disease generally constitute three different clinical table in humans [(visceral, Kala-Azar, VL) cutaneous (CL) ve mucocutaneous leishmaniosis (MCL)]. According to World Health Organitization (WHO), Leishmaniosis is still one of the world's most neglected diseases. It has been nearly 10 years since the completion of the first entire genome sequence of a Leishmania parasite. However, there are still many things in the dark for scientists such as the causes of differences in tissue tropism. The aim of this study is to generate that the whole genome sequencing with next generation sequencing technology of Leishmania infantum causing cutaneous leishmaniosis from Turkish isolate.
Genomic sequencing was performed on the Illumina HiSeq 2500 platform. The "TruSeq Nano DNA Low Throughput Library Prep Kit" compatible with the "Illumina HiSeq 2500" platform was used to create the library. Synthesis sequencing (SBS) was performed with HiSeq Rapid SBS Kit v2 in the form of single fragment readings (2 x 150 bp; PE) with two fragment end-to-end assemblies. Bioinformatics analyzes were performed Geneious 11.0.5. (www.genius.com) platform.
In our study, a high quality whole genome sequence (WGS) of L. infantum was successfully sequenced and a total of 32,009,137 base pairs of genomic DNA of 36 chromosomes were obtained. The resulting genomic DNA submitted to the National Center for Biotechnology Information, USA, (NCBI) GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) and registered under the name Leishmania infantum_TR01 (Lin_TR01). When the WGS studies on this subject are examined, Lin_TR01 strain is the first one to be isolated from cutaneous leishmaniosis. Because the reference genome, L. infantum JPCM5 (Peacock et al., 2007) was obtained from the visceral leishmaniosis case in accordance with the classical tissue and organ tropism of the species. On the other hand, Lin_TR01 is the second whole genome sequenced strain in the world since the JPCM5 strain. The Lin_TR01 genome is the only Leishmania infantum whole genome sequence that is comlete level compared to the other genomes obtained. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/249).
Accession numbers assigned by the NCBI of the 36 chromosomes of the Lin_TR01 genome are described in CP027807, CP027810, CP027808, CP027811, CP027809, CP027812, CP027813, CP027814, CP027817, CP027818, CP027819, CP027815, CP027821, CP027816, CP027823, CP027820, CP027822, CP027824, CP027825, CP027826, CP027827, CP027828, CP027829, CP027830, CP027831, CP027832, CP027833, CP027834, CP027835, CP027836, CP027837, CP027838, CP027839, CP027840, CP027841, CP027842. As the result of annotation with the Lin_TR01 genome were found 3153 polymorphisms, 8324 Gene, 8199 CDS, 8109 mRNA, 67 tRNA, 11 rRNA and 58 ncRNA. 5278 of 8199 CDS obtained are hypothetical proteins. Founded the 3153 polymorphism is included 799 deletion, 528 insertion, 511 substitution, and 1315 SNPs. The effect of 466 of the polymorphisms on proteins were determined; these are classified as 3 deletion, 5 extention, 44 frame shift, 2 insertion, 299 substitution, 11 truncation and 102 none. 3153 polymorphism examined, and it has been found that 166 of them occur on the "region of a known protein production coding". Following this, a literature review was conducted using the PubMed database, using 63 different proteins affected by 166 polymorphisms (20 of which were n> 1, 43 of them were n=1; n expressed the total number of polymorphisms on the same protein). The number of mutations, location, size and type of mutations on the same protein, whether or not the study was performed previously, and the short description of the study were summarized in detail. In the literature search, it was determined that 14 of 63 proteins were studied and no study was found regarding the remaining 49. Of the 14 proteins mentioned here, 5 are related to virulence, 2 are vaccine candidate, 4 are related to diagnosis / typing, 2 are drug resistance, 3 are drug target and 1 are vital function.
Although the data obtained in this study show that there are more ways to be covered in the Leishmania genome, we believe that our study will contribute to science and will provide a basis for Leishmania genome studies in our country and contribute to the studies in the global platform.