Farklı hücre tiplerinin fotobiyomodülasyon ve askorbik asit varlığında hücre tabakası oluşturma potansiyellerinin incelenmesi
Examination of the potential of different cell types to form cell sheet in the presence of ascorbic acid and photobiomodulation
Yazar: HATİCE DEMİR
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışma "Farklı hücre tiplerinin fotobiyomodülasyon ve askorbik asit varlığında hücre
tabakası oluşturma potansiyellerinin incelenmesi" başlıklı Lisansüstü Tez Projesi (FYL-
2020-18707) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir.
Gerçekleştirilen tez çalışması kapsamında farklı morfolojik yapılara sahip hücrelerle
polikromatik ışık kaynağı (600-1200 nm dalga boyunda) ve askorbik asit (vitamin C, VC)
varlığında hücre tabakası elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla üç tür hücre seçilmiştir.
Bu hücreler; insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücreleri (GK-MKH), insan
dermal fibroblast hücreleri (BJ) ve insan keratinosit epitel hücreleri (HS2) dir. Çalışmanın
ilk kısmında GK-MKH'lerin karakterizasyon çalışmaları tamamlanmış ve bu hücrelerden
hücre tabakası elde edebilmek için kültür ortamına 20 µg/mL VC eklemesi yapılmıştır.
Daha sonra bu hücreler için uygun olan fotobiyomodülasyon (PBMT) parametreleri
belirlenerek (20 cm mesafe, 2 dk ve gün aşırı uygulama) hücre tabakaları üretilmiştir.
Sonuçta VC grubunda 5-7. günler arası, PBMT ve PBMT+VC gruplarında 6-7. günler arasında hücre tabakaları elde edilmiştir. Daha sonra elde edilen bu hücre tabakalarına ait
karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmalarında hücre
tabakalarının hücre dışı matriks (ECM) yapısı, hücre morfolojisi, çekirdek yapısı ve farklı
gen ifade düzeyleri incelenmiştir. Bu kapsamda yapılan immünofloresan ve Hematoksilen-
Eozin (H&E) boyama sonuçları en yoğun çekirdek yapısının PBMT+VC grubuna ait
olduğunu göstermektedir. Makroskobik ve mikroskobik gözlemler de en kalın ve opak
hücre tabaka yapısının, PBMT+VC grubuna ait olduğunu göstermiştir. Gerçek zamanlı
polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) analiz sonuçlarına göre VC ve PBMT varlığı ECM
yapısını arttırmış, kök hücre gen ifadelerini anlamlı düzeyde etkilememiş, fakat PBMT
osteojenik gen ifade düzeylerini (OCN, RUNX2) arttırmıştır. BJ fibroblast ve HS2 hücre
hattı için de karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. BJ fibroblast hücre hattı ile hücre
tabakası elde edebilmek için kültür ortamına 60 µg/mL vitamin C eklemesi yapılmış ve bu
hücreler için uygun olan PBMT parametreleri belirlenerek (20 cm mesafe, 5 dk ve gün
aşırı uygulama) hücre tabakaları üretilmiştir. Bu hücre hattı için PBMT grubunda hücre
tabakası elde edilemezken, VC ve PBMT+VC grubunda 6-7. günlerde elde edilen hücre
tabakaları arasında özellikler açısından anlamlı farklılıklar gözlemlenmemiştir. HS2 hücre
hattı ile hücre tabakası elde edebilmek için kültür ortamına 20 µg/mL vitamin C eklemesi
yapılmış ve bu hücreler için uygun olan PBMT parametreleri belirlenerek (20 cm mesafe, 5
dk ve gün aşırı uygulama) hücre tabakaları üretilmiştir. Bu hücre hattı için VC grubunda
8.gün ve PBMT+VC grubunda 8-9.gün günlerde hücre tabakası elde edilmiştir. Elde edilen
hücre tabakaları arasında makroskobik ve mikroskobik incelemeler sonucu anlamlı
farklılar gözlemlenmemiştir.
Sonuç olarak çalışılan 3 farklı hücre tipinde de vitamin C varlığında etkin bir şekilde hücre
tabakaları elde edilebilmiştir. Polikromatik ışıkla yapılan fotobiyomodülasyon
uygulamasının çalışılan koşullarda hücre proliferasyonunu arttırıcı etkiye sahip olduğu,
GK-MKH'ler ile HS2 hücrelerinde ise tek başına tabaka oluşumunu sağlayabildiği, ayrıca
GK-MKH'lerde osteojenik farklılaşmada etkili olduğu görülmüştür. Elde edilen veriler
klinik uygulamalar için umut vaat etmektedir.

Abstract:
This study was funded by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination
Unit (BAP) graduate project entitled "Examination of the potential of different cell types to
form cell sheet in the presence of ascorbic acid and photobiomodulation" (FYL-2020
18707).
In this study, it is aimed to investigate the formation of cell sheets in the presence of
ascorbic acid and polychromatic light (600-1200 nm) with cells in different morphologies.
For this purpose, three types of cells have been selected, human umbilical cord-derived
mesenchymal stem cells (HUC-MSCs), human dermal fibroblast cells (BJ) and human
keratinocyte epithelial cells (HS2). In the first part of the study, characterization studies of
HUC-MSCs were performed. Then, in order to obtain a cell sheets from these cells, 20
µg/mL vitamin C (VC) was added to the culture medium, the appropriate
photobiomodulation (PBMT) parameters were determined and cell sheets were obtained at 5-7 days in VC group and 6-7 days in PBMT and PBMT+VC groups. In characterization
studies, the extracellular matrix (ECM) structure, cell morphology, nucleus structure and
different gene expression levels of cell sheets were examined. In this context,
immunofluorescence and Hematoxylin-Eosin (H&E) staining results and
macroscopic/microscopic observations showed that the thickest and opaque cell sheet was
obtained in the PBMT+VC group. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) results
showed that while VC and PBMT are causing to increase of ECM, they did not
significantly affect stem cell gene expressions. However, PBMT upregulates osteogenic
genes (OCN, RUNX2) expression levels. Hydroxyproline assays results were also
regulated upwards in the presence of VC and PBMT. The similar studies were also carried
out for BJ fibroblasts and HS2 cells. While no cell sheets were obtained in the PBMT
group for the BJ fibroblast cell line, no significant differences were observed between the
cell sheets obtained in the VC and PBMT+VC group on the 6th-7th days. RT-PCR and
hydroxyproline assay results also supported that ECM increased in the presence of VC and
PBMT. In the VC and PBMT+VC group for the HS2 cell line, the cell sheets were
obtained in the 8th-9th days.
In conclusion, cell sheets could be obtained effectively in the presence of vitamin C for
different cell types. Photobiomodulation with polychromatic light was found to have an
increasing effect on cell proliferation at the studied conditions. Photobiomodulation
provided sheet formation in HUC-MSCs and HS2 cells, and it was also effective in
osteogenic differentiation in HUC-MSCs. The results are promising for clinical
applications.