Yara iyileştirici bir peptidin yeni analoglarının sentezi, karakterizasyonu ve biyoaktivitelerinin incelenmesi
Synthesis, characterization and examination of bioactivities of novel analogues of a wound-healing peptide
Yazar: NURCAN BİÇEN
Danışman: DOÇ. MUHARREM AKCAN
Kütahya Dumlupınar Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Yara iyileşmesi = Wound healing

Özet:
Bu tez çalışmasında, deride oluşan yaraların iyileşmesine etki edebilecek terapötik
potansiyele sahip yeni peptid biyomoleküllerinin elde edilmesi amaçlanmıştır. Yara
bölgesinde Gram negatif ve Gram pozitif bakteriler gibi zararlı mikroorganizmalar
biyofilm oluşturarak mevcut antibiyotikleri, vücudun savunma hücreleri olan antikorları
ya da fagositleri etkisiz hale getirebilmekteler. Yara bölgesindeki bu zararlı bakterilerle
savaşmak ve yaranın iyileşmesini sağlamak için yara iyileşme aktivitesine sahip
antimikrobiyal peptidler (AMP'ler) kullanılabilir.
Kurbağa derisinden elde edilen AMP'lerin yara iyileşmeyi desteklediği rapor
edilmiştir. Brevinin peptidleri kurbağa deri salgılarından elde edilen AMP'lerdir. Fakat
bu peptidlerin uzun sekansa ve C-terminallerinde bulunan Rana kutusu sebebiyle de
hemolitik aktiviteye sahip olmaları istenmeyen özelliklerindendir. Bu amaçla, bu tez
çalışmasında Pelophylax kl. Esculentus kurbağasından izole edilen yara iyileştirici
aktiviteye sahip brevinin-2Ta peptidinin daha kolay ve az maliyetle sentezlenebilen ve
hemolitik aktiviteye sahip olmayan altı adet kısa analoğu tasarlandı. Tasarlanan kısa
analoglar mikrodalga destekli peptid sentez cihazında katı faz peptid sentezi (SPPS) ile
sentezlendi ve sonra ters faz yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile

saflaştırıldı. Toplanan fraksiyonların molekül ağırlıkları sıvı kromatografisi/kuadrupol-
uçuş zamanlı kütle spektrometresi (LC-MS/Q-TOF) ile analiz edildi. Peptid içeren

fraksiyonların saflığı da analitik RP-HPLC ile analiz edildi. Sentezlenen peptidlerin
antimikrobiyal aktiviteleri ilk önce agar difüzyon testi ile test edildi. Agar difüzyon testi
sonunda Analog-5 peptidinin antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu görüldü ve minimum
inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri hesaplandı. Peptidlerin sitotoksisiteleri 3-(4,5-
dimetil-2-tiyazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromür (MTT) testi ile analiz edildi ve en
sitotoksik olmayan Analog-5 peptidi ile fibroblast hücre kültürü kullanılarak peptidin yara
iyileşme etkisi incelendi. Analog-5'in brevinin-2Ta peptidinden daha hızlı yara
kapanması sağladığı ve peptidlerin hemolitik aktiviteleri test edildiğinde de tüm

vi

analogların brevinin-2Ta peptidinden daha az hemolitik olduğu görüldü. Bu bulgular
sonucunda yara iyileşme aktivitesine sahip yeni bir peptid elde edildi ve bu peptid ilaç
araştırma ve geliştirme çalışmalarına katkı sağlayabilecektir.

Abstract:
In this thesis, it is aimed to obtain new peptide biomolecules with therapeutic
potential that can affect the healing of skin wounds. Harmful microorganisms such as
Gram negative and Gram positive bacteria in the wound area can form a biofilm and
neutralize existing antibiotics, antibodies or phagocytes, which are the body's defense
cells. Antimicrobial peptides (AMPs) with wound healing activity can be used to fight
these harmful bacteria in the wound area and allow the wound to heal.
It has been reported that AMPs obtained from frog skin support wound healing.
Brevin peptides are AMPs derived from frog skin secretions. However, it is undesirable
for these peptides to have a hemolytic activity due to their long sequences and the Rana
box located at their C-terminus. For this purpose, in this thesis, six short analogues of
brevinin-2Ta peptide with wound healing activity isolated from Pelophylax kl. Esculentus
frog, which can be synthesized more easily and cost-effectively and have no hemolytic
activity, were designed. The designed short analogues were synthesized by solid phase
peptide synthesis (SPPS) using a microwave assisted peptide synthesizer and then
purified by reverse phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC). The
molecular weights of the collected fractions were analyzed by liquid
chromatography/quadrupole-time of flight mass spectrometry (LC-MS/Q-TOF). The
purity of the peptide-containing fractions was also analyzed by analytical RP-HPLC. The
antimicrobial activities of the synthesized peptides were first tested by agar diffusion test.
At the end of the agar diffusion test, it was observed that the Analog-5 peptide had
antibacterial activity and the minimum inhibitory concentration (MIC) values were
calculated. To test the cytotoxicity of the peptides, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-
diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay was performed and the wound healing

effect of the peptide was examined using fibroblast cell culture with the most non-
cytotoxic Analog-5 peptide. Analog-5 was found to provide faster wound closure than

brevinin-2Ta peptide and when hemolytic activities of peptides were tested, all analogs

viii

were less hemolytic than brevinin-2Ta peptide. As a result of these findings, a new peptide
with wound healing effect was obtained and this peptide may contribute to drug research
and development studies.