Frajil-X sendromu hasta ve taşıyıcılarının tanısında non-radyoaktif southern blot yönteminin uygulanması
Diagnosis Fragile-X patients and carriers by non-radioactive southern blot technic
Yazar: DURAN ÜSTEK
Danışman: PROF. DR. SEHER BAŞARAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 1999
Konu: Hemşirelik = Nursing
Dizin: Blotting-southern = Blotting-southern ; Frajil x sendromu = Fragile x syndrome

Özet:
VI. ÖZET Frajil-X sendromu, Down sendromundan sonra ailevi geçişli mental retardasyonlann en sık nedenidir. Görülme sıklığı erkeklerde 1:4000, kadınlarda 1 :6000 olarak bildirilmektedir. Frajil-X sendromundan sorumlu gen, Frajil-X Mental Retardasyon 1 (FMRİ) genidir. Gen, Xq27.3'e lokalize edilmiştir. 5' ucunda CpG metilasyon bölgesi ve CGG üçlü tekrarlarını içermektedir. CGG dizilerindeki artma ve bu tekrar dizilerinin, 250 bp proksimalinde bulunan CpG adasındaki anormal metilasyondur. Tekrar bölgesi, normal bireylerde 2 ile 55 arasında değişen üçlü tekrar dizilerini içerir. Mutasyona hassas olan bu bölgenin üçlü tekrarlan, 55-200 arasında artış gösterirse "premutasyon", 200 ve üzerinde artış gösterirse "full mutasyon" adını alır. Full mutasyon varlığında, Frajil-X sendromu ortaya çıkar. Dengesizleşen tekrar bölgesi mayozda artarak kalıtılır. Bu durum dinamik mutasyon olarak adlandırılır. Frajil X sendromunun tanısı, uzun yıllardır sitogenetik analizlerle verilmekte ancak, hastaların tanımlanmasında bazı problemler olmakta; etkilenmiş olgunun bütün hücrelerinde frajil bölge eksprese olamamakta, taşıyıcı erkekler normal gözükmekte, taşıyıcı kadınların önemli bir oranı (%50) sitogenetik olarak normaldir ve X kromozomunun uzun kolunda üç adet folata duyarlı frajil bölge vardır (FRAXD, FRAXE, FRAXF). Ancak, yeni tanımlanan bir indeks olguda sitogenetik analiz, klinik tanıyı onaylamak ve diğer kromozomal anomalileri göstermek için gereklidir. Son yıllarda bu sorunları aşmak için yeni metodlar geliştirilmiştir. FMRP antikor testi, hastaların periferik kan yaymalarında hızlı tanıya olanak sağlayan yeni bir testtir. Şimdilik, iki moleküler metod Frajil X sendromu taşıyıcı ve hastaların tanısında kullanılmaktadır. Bu yöntemlerden biri olan PCR, 86tekrar sayısını çalışmada oldukça hızlı bir yöntemdir. Oldukça iyi tanımlanmış olunan Southern blot ile karşılaştırıldığında PCR, artmış premutasyon ve full mutasyonlann ikincil yapısından dolayı teknik zorluklar taşımaktadır. Yaygın bir şekilde kullanılan yöntem, biri metilasyon duyarlı olan bir çift enzimle kesilen genomik DNA'mn probla hibridize edildiği Southern blottır. Non radyoaktif problarla Southern blot analizlerinin laboratuarımız koşullarında denenmesi ve tekniğin rutin kullanımda duyarlılığının, güvenirliliğinin ve ekonomik yükünün araştırılması amacıyla, Frajil X klinik tanısı alan ve sitogenetik olarak pozitif saptanan 6 aileye ait 8 indeks olgu ile bunların taşıyıcılık riski olan toplam 32 aile bireyi ve ailesinde mental retardasyon hikayesi olmayan kontrol grubu olarak alınan 7 olgu bu çalışma kapsamında incelendi. FRAX 1 ailesinde, Eco Rl enzim kesim sonucu uygulanan Southern blot tekniği incelemesinde zorunlu taşıyıcı olması gereken indeks olgunun annesinde 5.2 kb'lik tek bant gözlendi. Ancak zorunlu taşıyıcı olan indeks olgunun annesi ile teyzesinde 5.2 kbiik birer bant gözlendi. Bu sonuç bizi bu olgular için Eco RI, Nru I enzim kesimleri ile metilasyon çalışmasına yönlendirdi. Metilasyon çalışmasında indeks olgunun annesi ve teyzesinde 2.8 + 3.5 + 4.1 + 5.2 kb'lik dört bant gözlendi ve metilasyon mozaisizmi gösteren premutasyon taşıyıcıları olarak değerlendirildiler Full mutasyon taşıyıcılarında gözlenen metilasyon mozaisizminin premutasyon taşıyıcılarında görülmesi son derece nadirdir. Bu kadınların çocuklarında bu bulguya rastlanmadı. Metilasyon mozaisizminde tekrar sayısı full mutasyon gibi olabilmektedir. Ancak, bütün hücrelerde metilasyon yoktur. Bu olgularda az miktarda olsa da FMRP1 proteininin bulunması, klinik olarak etkilenmemiş/hafif etkilenmiş 87olmalarını açıklamaktadır. Premutasyon taşıyıcısı bu iki olguda metilasyon mozaisizminin, metilasyona duyarlı diğer enzimlerle de araştırılması ve bu bölgenin metilasyon haritasının çıkarılması gerekmektedir. Bu aileden elde edilen sonuçlar, sadece Eco RI enzimi ile yapılacak çalışmaların düşük CGG tekrar sayılı olgularda yanlış negatif sonuçlar verebileceğini göstermiştir. Rousseau ve arkadaşlarının (1991) ileri sürdükleri, genin metilasyon durumunu gösteren metilasyona hassas bir enzim ile birlikte çalışmasının, yanlış negatif bulgu olasılığını azaltacağı görüşünü bu ailedeki sonuçlar desteklemektedir. FRAX 2 ailesinde, 3 indeks olgunun annesinde gözlediğimiz metile full mutasyon genotipi (9.4 kb), her üç olguya metile full mutasyon olarak geçmiştir. FRAX 3 ailesinde, indeks olgunun dedesinde tek bir bant (2.8 kb) gözlendi ve normal olarak değerlendirildi. Premutasyon taşıyıcısı olma olasılığı yüksek olan dedenin CGG tekrar sayışım kesin olarak göstermek olanaklı olamamıştır. Southern blot tekniği normal ve düşük CGG tekrarlı olgularda ayırt edici rezolusyonda olmadığından, bu olguların PCR ile çalışılması yanlış negatif bulgu olasılığını azaltacaktır. Çalışma grubumuz içinde iki indeks annede, en büyük tekrar sayısı (9.4 kb) gözlenmiş ve bu mutasyon indeks olgulara aynı büyüklükte aktarılmıştır. FRAX 4 ailesinde, premutasyon (5.8 kb) taşıyıcısı olan anne her iki erkek çocuğuna CGG tekrar bölgesini ekspanse ederek aktarmış, ancak her iki çocuk, mozaik full mutasyon genotipine sahiptir. Pozitif kontrol olarak alınan FRAX 5 ailesi, Lueven'de (Belçika) Radyoaktif Southern blot yöntemiyle incelendi, indeks olgu 6.6 kb (Full mutasyon) ve annesi 5.8 kb (premutasyon) olarak bulunmuştu. Non radyoaktif Southern blot yöntemiyle incelediğimiz pozitif kontrol ailesindeki indeks olgunun annesinde iki farklı bant (2.8 + 5.8 kb) 88ve indeks olguda tek bant (6.6 kb) gözlendi. Premutasyon taşıyıcısı olan indeks olgunun annesinde normale göre A=0.6 kb'lik CGG artışı indeks olguya, A=0.8 kb'lik artışla A=1.4 kb olarak kalıtılmıştır. Bu ailede elde ettiğimiz sonuçlar Leuven'in bulguları ile örtüşmektedir. Ailesinde mental retardasyon hikayesi olmayan kontrol grubunda yatığımız çalışmada, 7 olguda elde ettiğimiz bant büyüklükleri (5.2 kb ve 2.8 kb ) normal olarak değerlendirildi. Full mutasyon taşıyıcısı 9 olgunun 5' i (% 55.5) metile full mutasyon ve 4'ü (% 45.5 ) mozaik full mutasyon genotipi göstermekteydi. Rousseau ve arkadaşlarının (1991) 63 aileden 511 frajil X'li full mutasyon taşıyıcılarının % 15' inde mozaisizm göstermişlerdi. Full mutasyon taşıyıcılarının yaklaşık %15'inde mozaisizmin bulunduğu diğer çalışma grupları tarafından da bildirilmiştir. Nolin ve arkadaşları da (1994) serimizde olduğu gibi, %41'lik yüksek oranda mozaik bulgularına dikkat çekmişler ve bu durumu laboratuarlarında uyguladıkları tekniğin, hafif derecedeki mozaiklerin dahi yakalanmasına imkan sağlaması ile açıklamışlardır. Etkilenmiş erkek çocukları nedeniyle kesin taşıyıcı oldukları bilinen 6 anneden 3 'ünde full mutasyon, 2 'sinde premutasyon ve Finde premutasyon metilasyon mozaisizmi saptandı. Taşıyıcılık riski olan 14 kadın olgudan 3 'ünde full mutasyon, birinde premutasyon metilasyon mozaisizmi ve 10'unda normal genotip saptandı. Full mutasyon taşıyıcısı toplam 6 kadmda klinik bulgu bildirilmemesi, klinik değerlendirmenin eksikliği,, non random X inaktivasyonu ve olgu sayısının azlığı ile açıklanabilir. Büyük anne yaşamadığı ve NTM olasılığı taşıyan bir büyük babada uygulama tekniğinin duyarlılığı küçük artışları göstermeye yetmediğinden 89"normal" olarak değerlendirildi. Ancak bu olguların değerlendirilmesinde, PCR tekniğinin daha duyarlı olduğu bilinmektedir. PCR tekniğinde yaklaşık 3 günlük bir süre ve olgu başına sarf malzeme maliyeti olarak 178 $ gerektiği göz önünde bulundurulursa, Southern blot tekniği daha zaman alıcı ve pahalı (Olgu basma 246 $) bir teknik olarak görünmektedir. Tekniğin optimizasyonu ile test süresi 6 güne indirilirken, sarf malzemelerinin ülkemizde üretilmiyor olması test giderlerini yakın bir gelecekte dahi etkilemeyecek gibi görünmektedir. Bu çalışma sonuçlarına göre; Tekniğin tanısal amaçla uygulanmadan önce, laboratuar koşullarında optimizasyonu süre ve maliyeti azaltması, başarıyı arttırması açısından önemlidir. Bu teknik, yüksek tekrar CGG sayılarının yam sıra genin metilasyon durumunu da aynı çalışmayla gösterebilmektedir. Frajil X tanısında, bu teknikte tek enzim ile çalışılmasının yeterli güvenirlikle sonuç veremeyeceği göz önünde bulundurulmalıdır. Sadece Eco RI enzim kesimi ile elde edilen sonuçlarda "Mozaik olgular" görülemeyebilir. Full mutasyonlu CGG tekrar sayılan tekniğin uygulanmasında sorun oluşturmamaktacür, yaklaşık bir artış sayısı verilebilmektedir. Bu teknikle, düşük sayıda CGG artışlarda tekrar sayılarının kesin olarak belirlenmesi olanaklı değildir. PCR tekniği ile kombine çalışılması, başarıyı arttırması açısından önemlidir. 90

Abstract:
VII. SUMMARY Fragile-X syndrome is the second most frequent form of mental retardation after the Down Syndrome. Its prevalance is approximately one in 4000 males and one in 6000 females. The fragile site at Xq27.3 is the cytogenetic criteria in this syndrome. Apperance of this fragile site was shown to be dependent on folate deficiendcy in the culture medium which leads to the deficiency of thymidine monophosphate and cause the breakage of the fragile site. FMR1 gene contains unstable repeat sequences of CGGn at the 5 'untranslated region in exon 1. the number of repeats varies from 5 to 55 in normal individuals, from 55 to 200 in premutation carriers, and over 200 to more than 200 in full mutations as present in affected individuals. Additionaly, an upstream promoter region ot the gene (referred to as CpG island) is abnormally methylated in most affected individuals. Amplification of the CGG repeat and the abnormal methylation site show a correlation with affected status. This finding led to the hypothesis that expansion to full mutation size causes the hypermethylation of this promoter region and thereby inactivates the FMR1 gene. When unstable, the copy number changes during transmission from parent to child. This process is termed dynamic mutation. Diagnosis of Fragile X syndrome has been available by means of cytogenetic analysis for many years, however, there have been some problems for cytogenetic diagnosis of the patients; not all cells in affected males show the fragile site, transmitting males have no cytogeneticly abnormality, a significant percentage (%50) of carrier females are cytogenetically normal and the distal long arm of the X chromosome contains three folat sensitive.fragile sites (FRAXD, FRAXE, FRAXF). But cytogenetic analysis is still be needed to confirm the clinical diagnosis and 91detect other chromosome abnormalities in the index case in a newly diagnosed fragile X family. For these reasons, alternative methods were pursued in many molecular laboratories during the past decade. Recently developed FMRP antibody test allows rapid detection of male patients using blood smears. Presently, two molecular methods are refered for the detection of patients and carriers of fragile X syndrome: PCR is used to rapidly detect the size of the repeat expansion. Compared to the well-established Southern blot method, the PCR protocol contains major technical difficulties in amplifying higher premutated and full mutated alleles due to strong secondary structures of this region. The most widely used protocol is direct Southern blot hybridization of genomic DNA digested with a pair of restriction enzyme one of whic is methylation sensitive. In order to determine the effectiveness of non radioacive Southern blot technique for the molecular analysis of Fragile X Syndrome in our laboratory, we analyzed 8 Fragile X (+) patients (cytogeneticaly we assessed) in 5 families and 32 of their first degree relativies and 7 healhty individuals as a control group (2 male and 5 female) by using non radioactive Southern Blot technique. In FRAX 1 family, the mother of the index, who is obligated carrier, and aunt (sister of the mother) both showed a single band at 5.2 kb in Southern blot analysis following EcoRl restriction enzyme digestion. Therefore, we performed a second Southern blot analysis following Eco Rl with methylation sensitive enzyme Nru 1 digestions and observed four different bands at 2.8 kb, 3.5 kb, 4.1 kb and 5.2 kb. According to these results, mother and aunt evaluated to be premutation carriers with methylation mosaics. Normally, methylation mosaizm is seen in full 92mutations and it is a rare incidence among premutation carriers. The children of this mother did not show similar results. The repeat length in methylation mosaizm can be similar to full mutation. However methylation does not occur in every cell. Even little quantity of FMRP 1 protein synthesized by these cells are sufficient to decrease the clinical symptoms of the syndrome. For correct diagnosis of methylation mosaics, it is necessary to use one methylation sensitive enzyme in addition to Eco Rl before Southern blot analysis. In adition, these experiments supported the view of Rousseau et. al. that Eco Rl is not sufficient to present correct repeat length in small premutations. In FRAX 2 family, mother and her three children showed methylated full mutation compleyt methylatiion (9.4 kb). In FRAX 3 family, maternal grand father of the index had a single normal band at 2.8 kb. Although there was a high risk of this male being Normal Transmitting Male, it was not possible to show the real CGG repeat length. Since it is known that Southern blot analysis does not provide fine resolution for small premutations, therefore it is recommended to apply PCR techniques for these type of samples. In FRAX 4 family, the mother with premutation (5.8 kb) transferred her expanded allele with further expansion her two male children and boys were observed to become mosaic full mutations. Family FRAX 5 was used as positive control and DNA samples were analyzed in Leuven-Belgium by radioactive Southern blot analysis. Index had 6.6 kb (full mutation) and mother had 2.8 + 5.8 kb (premutation) expansions. With our method of Southern blot analysis with non radioactive probe hybridization, we identified the similar 2.8 + 5.8 kb in the mother and a single band (6.6 kb) in the index case. Expanded allele ( A= 930.6 kb) of the mother further expanded to 1.4 kb in her child. Our results were found in conformity with Belgium results. 7 analyses performed on the DNA from control subject with no family history of mental retardation, showed normal bands at 2.8 kb and 5.2 kb. Results of the analysis of 9 full mutations, 5 (55.5 %) showed complete methlation pattern while 4 (45.5 %) diagnosed to be methlation mosaics. In one study by Rousseau et. al. (1991), 63 subjects out of screened 511 fragile-X full mutations were found to have mosaic pattern (15 %). This result was also supported by some other international publications. On the other hand, Nolin et. al. (1994), has pointed out the mosaicizm at 41 %, in his studies. Our results were in conformity with Nolin' s presentations. The differences of these findings could be due to the higher sensitivity of our established method for slight mosaics. 6 mothers, of whom whom had affected male children, were tested and 3 had full mutations, 2 had premutations and 1 had methylation mosaizm. 14 women, with a high risk of bearing carriers, were analyzed and 3 were tend to over the fact that, 1 had premutation with methylation mosaics and 10 had normal genotypes. 6 women with full mutations with no clinical abnormalities could be explained due to only 30 % of female with full mutation show clinical symptoms, however incomplete clinical evaluation or non random X inactivation could also be considered. Technically it is known that fragile-X diagnosis with PCR is more sensitive for identifying the repeat size lengths. However methylation analysis can only be made, by Southern blotting. The results of PCR techniques are availably in 3 days with a cost of $ 180.00, while Southern 94blot is compleyt in 6 days with a cost of $ 246.00s. The cost of these tests are unlikely to drop down in with Turkey in the near future since most of the raw materials are imported. According to present study, I can summarize the pinpoints as follows: Before the application of the Southern blot analysis for diagnostic purposes, it is important to optimize the conditions for the laboratory in order to decrease the cost and increase the success of the test. Southern blot analysis is not only successful to show the large amplifications but also eligible to identify the methylation status of the gene. It should always be kept in mind that working with single enzyme is not sufficient for diagnosis. Otherwise mosaizms may be missed. Southern blot technique does not have enough resolution to identify the small expansions. 95