Escherıchıa colı hücre yüzey proteinlerinin biyotinilasyonu ve NLC-MS/MS analizi
Biotinylation and NLC-MS/MS analysis of cell surface proteins of escherichia coli
Yazar: ELİFCAN KOÇYİĞİT
Danışman: PROF. DR. MURAT KASAP
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Amaç: Bakteriyel Membran proteinleri hücrelerin içine ve dışına madde taşınımını, hücrelerin diğer hücrelerle veya çevresindeki moleküllerle etkileşime girmesini, hücre duvarının ve zarının yapısını ve bütünlüğünün korunmasını, hücre içi ve hücre dışı sinyal moleküllerinin algılanmasını ve hücrelerin çevresel faktörlere karşı cevap oluşturmasını sağlarlar. Membran proteinlerini tanımlama çalışmaları bu proteinlerin üstlendiği görevleri ve yer aldıkları mekanizmaları aydınlatmak açısından oldukça önemlidir. Biyotinilasyon son dönemde kullanım alanı giderek artan ve proteinleri tanımlamak için de kullanılan bir yöntemdir. Bu çalışmada, enzimatik ve kimyasal biyotinilasyon yöntemlerinin bakteri membran proteinlerini işaretleyerek yüksek sayıda protein tanımlamak için kullanılabileceğini göstermeyi, aynı zamanda da iki yöntemi birbiriyle karşılaştırmayı amaçladık.
Yöntem: Bakterilerin membran proteinlerini biyotinlemek için enzimatik (TurboID-enzim tabanlı)  ve kimyasal (Sulfo-NHS-LC-Biotin tabanlı) biyotinilasyon yöntemleri kullanılmıştır. Öncelikle rekombinant yolla TurboID enzimi histidin etiketli olarak üretilmiş ve aktif halde saflaştırılmıştır. Saflaştırılan enzimle ve kimyasal biyotin reaktifi kullanılarak E. coli K12 hücrelerinin membran proteinleri biyotin ile işaretlenmiştir. Bakteriler lizize uğratılarak protein özütleri hazırlanmış ve streptavidin kaplı manyetik boncuklar aracılığıyla biyotinile proteinler zenginleştirilmiştir. Biyotinilasyon ve zenginleştirme aşamaları Western Blot analizleriyle doğrulanmıştır. Zenginleştirilen biyotinile proteinler ve biyotinile edilmeyen bakteri protein özütleri triptik kesime tabi tutulmuş, elde edilen peptitlerle nLC-MS/MS analizleri gerçekleştirilmiştir. 
Bulgular: Yapılan nLC-MS/MS analizlerine göre biyotinile edilen gruplarda biyotinile edilmeyen gruba göre daha fazla sayıda membran proteini tanımlanmıştır. Biyotinile olmayan grupta 419 adet membran proteini tanımlanırken, enzimatik yolla biyotinile edilen grupta 463, kimyasal yolla biyotinile edilen grupta 582 adet protein tanımlanmıştır. 
Sonuç: Enzimatik ve kimyasal biyotinilasyon yöntemlerinin karşılaştırmalı analizleri her iki yönteminde etkin bir biçimde membran proteinlerini tanımlama kullanılabileceğini göstermektedir. Her ne kadar biyolojik biyotinilasyon yöntemi fiyat avantajı sunsa da, kimyasal biyotinilasyon yöntemi ile daha fazla membran proteininin tanımlanmış olması bu yöntemin biyolojik biyotinilasyona göre tercih edilmesi gerektiğini göstermektedir.  Ayrıca, yapılan tekrarlı deneylerde her iki yönteminde tekrar edilebilir olduğu gösterilmiştir. Bu bulgu, her iki yöntemle de karşılaştırmalı proteom çalışmalarının yapılabileceğine işaret etmektedir. Çalışmamız kapsamında optimize edilmiş olan protokoller kullanılarak gerçekleştirilecek çalışmalar ile antibiyotik dirençli bakteri suşları ile dirençsiz bakteri suşları arasında membran protein farklılıklarını ortaya çıkarmak ve mekanistik bilgi üretmek mümkün olacaktır.

Abstract:
Objective: Bacterial membrane proteins facilitate (1) transport of substances into and out of cells, (2) interactions between cells and other molecules in their environment, (3) mainten the structure and integrity of the cell wall and membrane, (4) detect intra- and extracellular signaling molecules, and (5) generate responses to various environmental factors. Studies identifying membrane proteins are crucial for elucidating the roles and mechanisms of these proteins. Biotinylation has emerged as a widely used method for protein identification. In this study, we aimed to demonstrate the use of enzymatic and chemical biotinylation methods for labeling bacterial membrane proteins for high-throughput protein identification and to compare these two methods.
Methods: Enzymatic (TurboID enzyme-based) and chemical (Sulfo-NHS-LC-Biotin-based) biotinylation methods were used to biotinylate bacterial membrane proteins. The recombinant TurboID enzyme was produced and purified in its native state with a histidine tag. Bacterial cell membrane proteins of E. coli K12 were then labeled with biotin both using the purified enzyme or a chemical biotin method. The bacteria were then lysed to prepare protein extracts, and biotinylated proteins were enriched using streptavidin-coated magnetic beads. Biotinylation and enrichment steps were verified via Western Blot analysis. The enriched biotinylated proteins and non-biotinylated bacterial protein extracts were subjected to trypsin digestion, followed by nLC-MS/MS analysis of the resulting peptides.
Results: A greater number of membrane proteins were identified in the biotinylated and enriched groups compared to the non-biotinylated group. While 419 membrane proteins were identified in the non-biotinylated group, 463 proteins were identified in the enzymatically biotinylated group, and 582 proteins were identified in the chemically biotinylated group.
Conclusion: Comparative analyses of enzymatic and chemical biotinylation methods demonstrated that both methods could effectively allow identification of membrane proteins. Although the biological biotinylation method offers cost advantages, the chemical biotinylation method identified more membrane proteins, indicating its preference over biological biotinylation. In addition, repeated experiments showed the reproducibility of both methods, suggesting that comparative proteomic studies can be performed using either method. With the optimized protocols generated in this study, future research may reveal differences in membrane protein compositions and levels among antibiotic-resistant and antibiotic-sensitive bacterial strains, providing mechanistic insights.