Yeni doğan streptozotocin diabetik sıçanlarda somatostatin analogu ve kalsiyum kanal blokerinin apoptoz üzerine etkileri
The Effect of a somatostatin analogue and calcium channel blocker on opoptosis in neonatal streptozotocin diabetic rats
Yazar: FATMA KAYA
Danışman: PROF. DR. MELEK ÖZTÜRK
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 1998
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Diabetes mellitus-deneysel = Diabetes mellitus-experimental ; Kalsiyum kanal blokerleri = Calcium channel blockers ; Somatostatin = Somatostatin ; Sıçanlar = Rats

Özet:
ÖZET Diabetes Mellitusun ortaya çıkmasındaki ana neden, B hücrelerinin hasarına dayanmaktadır. Hem Tip I hem de Tip II diabetinde B hücre kütlesindeki önemli miktardaki azalmanın nedenleri, B hücrelerinin nekroz veya apoptozuna bağlı olduğunu gösteren çeşitli çalışmalar vardır. Streptozotocin (STZ) uygulanan deneysel diabetilderde hiperglisemi nedeni ile intraselluler kalsiyum miktari artmakta bu artış kalsiyuma bağımlı endonukleazları aktifleştirip apoptozun en belirgin özelliği olan DNA fragmantasyonuna neden olmaktadır. STZ'nin yapısında nitroz ucu bulunmaktadır ve STZ hücre içine girdiğinde NO'mm açığa çıkması ile apoptozu indüklediği ileri sürülmektedir. Bu çalışmadaki amacımız, tip II diabeti için uygun model olan "yenidoğan STZ diabet modelini" oluşturmak, bu model üzerinde timus ve pankreas dokularında olası apoptozu göstermek için in situ DNA uç işaretleme ve DNA gel elektroforez tekniklerini labaratuvar koşullarımıza en uygun hale getirmek, diabet tedavisinde kullanılan bir kalsiyum kanal bloken "Isradipine" ve somatostatin analogu olan "Octreotide" i yenidoğan STZ diabetik sıçanlara uygulayarak apoptoz üzerindeki olası koruyucu yada indükleyici etkilerini karşılaştırmak olarak incelemekti. Bu çalışmada yenidoğan Wistar sıçanlar kullanıldı ve 9 grup oluşturuldu, ilk 5 gruba doğumun ikinci günü; 100mg/kg dozunda STZ i.p. olarak uygulandı. Birinci grup doğumun 5.günü, ikinci grup ise doğumun lO.günü sakrifiye edildi ve pankreas dokuları alındı. Diğer gruplarda sırası ile 3. grup: STZ, 4.grup:STZ+Octreotide, 5. grup: STZ+isradipİne, 6.grup:isradipine+STZ, 7.grup:octreotide, 8.grup: isradipine, 9.grup: sağlıklı kontrol grupları oluşturuldu. 4 ve 7.gruplara octreotide 200mg/kg ve 5 ve 8. gruplara 5mg/kg isradipine 12.haftadan itibaren her guruba 6 hafta süre ile uygulandı. Apoptoz için pozitif kontrol amacıyla deksametazon 5mg/kg uygulanan erişkin sıçanlar 3 saat sonra sakrifiye edilip timuslari alındı. Deney süresince tüm grupların kan glukoz ve vücut ağırlık ölçümleri yapıldı. Deney sonunda alınan timus ve pankreas dokuların bir kısmı %10 nötral tamponlu formalin ile tespit edilip parafine gömülürken diğer kısmıda DNA izolasyonu yapılmak üzere saklandı. Dokulardan elde edilen DNAlara agaroz gel elektroforezi, parafin bloklardan elde edilen kesitlere ise in situ DNA uç işaretleme yöntemi uygulandı. Streptavidin-Biotin-Peroksidaz yöntemi ile monoklonal insulinantikoru kullanılarak pankreas doku kesitlerine immunhistokimyasal boyama uygulandı. Kan glukoz, vücut ağırlıkları, adacık çap ölçümleri ve apoptotik hücre sayımlan istatiksel açıdandan değerlendirildi. Yapılan in situ DNA uç işaretleme yöntemi sonuçlarına göre, deksametazonlu grup pozitif kontrol kabul edilerek kıyaslandığında timus da isradipine, STZ ve STZ+isradipine uygulanan gruplarda diğer gruplara göre daha fazla işaretlenmiş apoptotik hücre gözlendi. DNA gel elektroforezinde de yine sadece bu gruplar da apoptotik bantlanma görüldü. Pankreas dokusunda ise; sadece STZ uygulanmış 5 ve 1 Öğünlük sıçanlara ait grupların adacıklarında işaretli apoptotik hücre gözlenirken, elektroforetik incelemede her bir grupta tipik DNA bantları gözlenmedi. İmmunohistokimya sonuçlarına göre STZ uygulamasından sonra kısa dönem B hücre rejenerasyonu olduğunu fakat 18 haftalik diabetiklere ait adacıklarda hala az sayıda ve daha zayıf immun reaktif B hücresinin gözlenmesinden dolayı bunun ileri dönemde ortaya çıkan diabeti önlemede yeterli olmadığı sonucuna varıldı. Sonuç olarak; uyguladığımız octreotidine'nin isradipine göre apoptozu önlemede daha etkin olduğu sonucuna varıldı. Ayrıca, apoptotik hücrelerin tayininde DNA uç işaretleme yönteminin, DNA gel elektroforezine göre daha hassas ve uygun bir metod olduğunu saptadık.

Abstract:
7.S1 The main reason for the development of the diabetes mellitus depends upon the destruction of B cells. There are studies indicating that the significant amount of decrease in J3 cell mas both in type I and type II diabetes are due to necrosis or apoptosis of 6 cells. The amount of intracellular calcium ion increases due to hypergycemia in streptozotocin (STZ) treated experimental diabetics and this increase causes DNA fragmentation which is the most significant property of apoptosis by activating calcium depedent endonucleases. There is a nitrogen residue in the structure of STZ and it is suggested that STZ induces apoptosis by entering the cell and causing NO release. Our aim in this study is to form the most relevant model for type II diabetes called " neonatal STZ diabetic model ", to adapt in situ DNA labelling and gel electrophoresis techniques to our laboratory for showing apoptosis in tymus and pancreatic tissue, to compare the possible protective and inductive effects of calcium channel blocker " isradipine " used in diabetes treatment and a somatostatin analoue " octreotide " on apoptosis by administering to STZ diabetic rats. In tis study we used newborn wistar rats and formed 9 groups. To the first 5 groups STZ with a dose of 100ug/kg was administered i.p.on the second day of birth. The first and second groups were sacrificed on 5th and 10th days of birth respectively and pancreatic tissues were removed. The other groups were as follows: 3rd group; STZ, 4th group: STZ + Octreotide, 5th group; STZ + Isradipine, 6th group;Isradipine + STZ, 7th group; Isradipine, 8th group; Octreotide, 9* group; Healty control group. To the 4th and 8tt groups 200mg/kg Octreotide and to the 501 and 7th groups 5mg/kg Isradipine were administered daily for 6 weeks beginning from 12th week. Adults rats administered 5mg/kg dexametazone for positive control of apoptosis were sacrificed after 2 days and tyhic tissues were removed. Blood glucose and body weight measurements were performed for the whole experimental period. At the end of the experimental period some of thymic and pancreatic tissues were fixed in %10 neutral buffered formalin and embedded in paraffin and the rest were seperated for DNA isolation. Gel electrophoresis 65were performed to DNA obtained from the tissues and in situ DNA end labelling were to the sections from paraffine blocks. Immunohistochemical staining was performed to sections by using monoclonal antibody and streptavidin-biotin-peroxidase method. Blood glucose, body weight, islet diameter measurements and apoptotic cell counts were evaluated statistically. According to the results of DNA end labelling and the dexametasone treated group as positive control more labeEed apoptotic cells were observed in tymus of Isradipine, STZ and STZ + Isradipine treated groups compared to other groups. In DNA gel electrophoresis of these groups there were apoptotic bands. In the pancreatic tissues sections, while there were labelled apoptotic cells only in 5* and 10ft days STZ groups, no typic DNA bands were observed in the electrophoretic analysis. According to immunohistochemical results it was concluded that there was 6 cell degeneration in the period after STZ administration however that was not enough for preventing diabetes of late onset diabetes due to the observation that there were less and weakly immune reactive B cells in the islets of 1 8th week diabetic rats. As a result it was concluded that Octreotide was more effective in preventing apoptosis than Isradipine. On the other hand, we concluded that the in situ DNA end labelling tehcnique is a more sensitive and suitable method to detect apoptotic cells than the DNA gel electrophoresis method. 66