Bazı gram negatif bakterilerde bakteriyosin üretimi ve karakterizasyonu
Bacteriocin production and characterization in some gram negative bacteri̇a
Yazar: GİZEM BATTAL
Danışman: PROF. DR. AYTEN KİMİRAN ; PROF. DR. TÜLİN ÖZBEK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibakteriyel ajanlar = Anti-bacterial agents ; Antibakteriyel aktivite = Antibacterial activity ; Antibakteriyel etkiler = Antibacterial effects ; Sucul bakteriler = Aquatic bacteria

Özet:
Antibiyotiklerin yanlış ve yaygın kullanımından dolayı gelişen antibiyotik direnci, halk
sağlığı açısından büyük bir tehdit oluşturmaktadır. Bu nedenle araştırmacılar, antimikrobiyal
aktiviteye sahip yeni bileşiklerin keşfine ve tanımlanmasına odaklanmıştır.
Bakterilerden elde edilen bakteriyosinler, gıda endüstrilerinde biyokoruyucu olarak ve çeşitli
terapötik uygulamalarda kullanılabilmektedir. Bu bakımdan bakteriyosinler, antibiyotiklerin
yerini alabilecek doğal ve sürdürülebilir bir alternatifi temsil etmektedir.
Bakteriyosinler, Gram negatif ve Gram pozitif bakteriler tarafından ortam şartları uygun
olmadığı zaman üretilen, genellikle dar etki spektrumuna sahip, antimikrobiyal peptitlerdir.
Bakterilerin, ortamda rekabet edebilmek ve sınırlı kaynaklara erişim sağlamak için
bakteriyosin ürettiği varsayılmaktadır.
Bu tez çalışmasında, daha önceki çalışmalarda çevresel örneklerden izole edilen 42; gıda
örneğinden izole edilen 19 bakteri olmak üzere toplam 61 Gram negatif bakterinin patojen
bakterilere karşı antibakteriyel aktivitesi incelenmiştir. Gram negatif bakterilerin
antibakteriyel aktivitesi ilk olarak canlı hücrelerle, nokta ekim ve agar sandviç yöntemleriyle
test edilmiştir. Canlı hücre etkileşimlerinde antibakteriyel aktivite gösteren dokuz Gram
negatif bakterinin hücresiz sıvıları (süpernatant) hazırlanmış ve antibakteriyel aktivite noktaekim, agar sandviç, kuyu difüzyon ve disk difüzyon yöntemleriyle test edilmiştir.
Antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu belirlenen BK96 bakterisinden elde edilen
süpernatantın kısmi saflaştırılması %80 doygunlukta amonyum sülfat ve 1:2 oranında
kloroform/metanol ile gerçekleştirilmiştir. Kısmi saflaştırma sonucunda elde edilen proteinin
moleküler ağırlığı SDS-PAGE yöntemi ile, antibakteriyel aktivitesi nokta ekim yöntemiyle
test edilmiştir. Farklı enzimlerin (proteaz, tripsin, α-kimotripsin, α-amilaz ve lipaz),
sıcaklıkların (30˚C, 50˚C, 70˚C, 80˚C, 95˚C, 121˚C; 15 ve 30 dakika) ve pH değişimlerinin (2,
4, 6, 8, 10) BK96'dan elde edilen proteinin antibakteriyel aktivitesi üzerine etkisi
incelenmiştir. Elde edilen proteinin minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) 96
kuyucuklu U tabanlı mikropleyt içerisinde mikrodilüsyon yöntemiyle test edilmiştir. Tez
çalışması kapsamında ayrıca, BK96 bakterisinden elde edilen proteinin, patojen bakteriler
üzerindeki biyofilm inhibisyonunu değerlendirmek amacıyla 24 saatlik anti-biyofilm ve üç
günlük olgun biyofilm eradikasyon aktivitesi incelenmiştir.
Canlı hücre etkileşimleri deneyleri sonucu, çevresel kaynaklı yedi; gıda kaynaklı iki
bakterinin canlı hücrelerinin standart patojen bakterilere karşı antibakteriyel aktiviteye sahip
olduğu saptanmıştır. Canlı hücre etkileşiminde antibakteriyel aktivite gösteren dokuz Gram
negatif bakteriden sadece BK96 kodlu bakterinin süpernatantının Staphylococcus aureus
ATCC 25923 bakterisine karşı antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır. BK96
bakterisinden elde edilen proteinin moleküler ağırlığının 35-55 kDa arasında tespit edilmiştir.
Proteaz, tripsin, α-kimotripsin, α-amilaz ve lipaz enzimleriyle muamelesi sonucunda proteinin
antibakteriyel aktivitesinde azalma meydana geldiği, en çok aktivite kaybının ise tripsin
enziminde meydana geldiği belirlenmiştir. BK96'dan elde edilen proteinin anitibakteriyel
aktivitesini farklı sıcaklık değerlerinde yüksek oranda koruduğu, özellikle 70°C ve 95°C'de
(30 dk) antibakteriyel aktivitede herhangi bir kayıp olmadığı tespit edilmiştir. BK96
bakterisinden elde edilen proteinin asidik ve bazik pH değerlerinde, antibakteriyel aktivitesini
yüksek oranda koruduğu belirlenmiştir.
Elde edilen protenin MİK değerleri, S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 6538, VRE
ATCC 51299, MRSA ATCC 3591 ve S. epidermidis ATCC 1228 bakterilerine karşı 355.52
µg/ml; B. subtilis NCTC 10400 bakterisine karşı 311.08 µg/ml olarak belirlenirken MBK
değerleri, S. aureus ATCC 25923 için 422.18 µg/ml, B. subtilis için 355.52 µg/ml olarak
belirlenmiştir.
BK96 bakterisinden elde edilen proteinin, S. aureus ATCC 25923 başta olmak üzere, çeşitli
patojen mikroorganizmaların oluşturduğu biyofilmi azalttığı ve bu patojenlerin oluşturduğu
üç günlük olgun biyofilm oluşumunu elimine edebildiği saptanmıştır. BK96'dan elde edilen
protein, S. aureus ATCC 25923'ün oluşturduğu biyofilmi 422.18 µg/ml'den 44.44 µg/ml'ye
kadar belirlenen her konsantrasyonda azalttığı tespit edilmiştir. Aynı zamanda, BK96'dan
elde edilen protein, S. aureus ATCC 25923'ün oluşturduğu 3 günlük olgun biyofilmi 422.18
µg/ml'den 44.44 µg/ml'ye kadar belirlenen her konsantrasyonda azalttığı ve 422.18 µg/ml'de
%86.94 oranında olgun biyofilmi elimine ettiği saptanmıştır. BK96 bakterisinden elde
ettiğimiz proteinin termostabil özellikte olması, değişen pH değerlerinde aktivitesini
koruması, S. aureus ATCC 25923 bakterisine karşı antibakteriyel aktivite göstermesi ve S.
aureus ATCC 25923 başta olmak üzere, çeşitli patojen bakterilerin oluşturduğu biyofilmi
önleyebilmesi, terapötik ajan olarak, gıda endüstrilerinde ve tıbbi cihazlarda antibiyofilm
ajanı olarak kullanım potansiyeli taşıdığını göstermektedir.

Abstract:
Antibiotic resistance, which develops due to the misuse and widespread use of antibiotics,
poses a major threat to public health. For this reason, researchers have focused on the
discovery and identification of new compounds with antimicrobial activity.
Bacteriocins obtained from bacteria can be used as biopreservatives in food industries and in
various therapeutic applications. In this respect, bacteriocins represent a natural and
sustainable alternative that can replace antibiotics.
Bacteriocins are antimicrobial peptides, usually with a narrow spectrum of activity, produced
by Gram negative and Gram positive bacteria when environmental conditions are not suitable.
It is assumed that bacteria produce bacteriocins to compete in the environment and to access
limited resources.
In this thesis study, the antibacterial activity of a total of 61 Gram negative bacteria, 42 of
which were isolated from environmental samples and 19 of which were isolated from foodsamples, against pathogenic bacteria was investigated. The antibacterial activity of Gram
negative bacteria was first tested with live cells, using spot inoculation and agar sandwich
methods. Cell-free fluids (supernatants) of nine Gram negative bacteria showing antibacterial
activity in live cell interactions were prepared and antibacterial activity was tested by dot
cultivation, agar sandwich, well diffusion and disk diffusion methods. Partial purification of
the supernatant obtained from BK96 bacteria, which was determined to have antibacterial
activity, was carried out with ammonium sulfate at 80% saturation and chloroform/methanol
at a ratio of 1:2. The molecular weight of the protein obtained as a result of partial purified
protein was determined by SDS-PAGE method and its antibacterial activity was tested by dot
cultivation method. The effects of different enzymes (protease, trypsin, α-chymotrypsin, α-
amylase and lipase), temperatures (30˚C, 50˚C, 70˚C, 80˚C, 95˚C, 121˚C; 15 and 30 minutes)
and pH changes (2, 4, 6, 8, 10) on the antibacterial activity of the protein obtained from BK96
were investigated. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the obtained protein was
tested in 96-well U bottom microplate by microdilution method. In addition, within the scope
of the thesis study, 24-hour anti-biofilm and three-day mature biofilm eradication activities of
the protein obtained from BK96 bacteria were investigated in order to evaluate the biofilm
inhibition on pathogenic bacteria.
As a result of live cell interaction experiments, it was determined that live cells of seven
environmentally sourced and two food-sourced bacteria had antibacterial activity against
standard pathogenic bacteria. Among the nine Gram negative bacteria that showed
antibacterial activity in live cell interaction, only the supernatant of the BK96 coded bacteria
was found to have antibacterial activity against Staphylococcus aureus ATCC 25923 bacteria.
The molecular weight of the protein obtained from BK96 bacteria was determined to be
between 35-55 kDa. It was determined that the antibacterial activity of the protein decreased
as a result of treatment with protease, trypsin, α-chemotrypsin, amylase and lipase enzymes,
and the greatest loss of activity occurred in the trypsin enzyme. It was determined that the
antibacterial activity of the protein decreased as a result of treatment with protease, trypsin, α-
chymotrypsin, α-amylase and lipase enzymes, and the greatest loss of activity occurred in the
trypsin enzyme. It was determined that the protein obtained from BK96 maintained its
antibacterial activity at different temperature values ​​at a high rate, and that there was no loss
in antibacterial activity, especially at 70°C and 95°C (30 min). It was determined that the
protein obtained from BK96 bacteria maintained its antibacterial activity at a high rate at
acidic and basic pH values.
The MIC values ​​of the obtained protein were determined as 355.52 µg/ml against S. aureus
ATCC 25923, S. aureus ATCC 6538, VRE ATCC 51299, MRSA ATCC 3591 and S.
epidermidis ATCC 1228 bacteria; 311.08 µg/ml against B. subtilis NCTC 10400 bacteria,
while MBK values ​​were determined as 422.18 µg/ml for S. aureus ATCC 25923 and 355.52
µg/ml for B. subtilis.
It was found that the protein obtained from BK96 bacteria reduced the biofilm formed by
various pathogenic microorganisms, especially S. aureus ATCC 25923, and could eliminate
the three-day mature biofilm formation formed by these pathogens. It was found that the
protein obtained from BK96 reduced the biofilm formed by S. aureus ATCC 25923 at every
concentration determined from 422.18 µg/ml to 44.44 µg/ml. At the same time, it was found
that the protein obtained from BK96 reduced the 3-day mature biofilm formed by S. aureus
ATCC 25923 at every concentration determined from 422.18 µg/ml to 44.44 µg/ml and
eliminated the mature biofilm by 86.94% at 422.18 µg/ml. The thermostable properties of the
protein we obtained from BK96 bacteria, its ability to maintain its activity at changing pH values, its antibacterial activity against S. aureus ATCC 25923 bacteria, and its ability to
prevent biofilm formed by various pathogenic bacteria, especially S. aureus ATCC 25923,
indicate that it has the potential to be used as a therapeutic agent, as an antibiofilm agent in
the food industry and medical devices.