Adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin in vitro folikülogenez sürecine olan katkılarının araştırılması
Investigation of the contributions of adipose-derived mesenchymal stem cells on the in vitro folliculogenesis process
Yazar: BÜŞRA DEMİRKAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ERKAN GÜMÜŞ
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Kriyoprezervasyon = Cryoprezervation

Özet:
Amaç: Önerilen bu çalışma ile, adipoz dokudan izole edilen mezenkimal kök hücrelerin dondurulup-çözülmüş ovaryum dokuları ile ko-kültürlerinin in vitro folikülogenez sürecinin verimi ve kalitesi üzerine olan etkilerini incelemeyi amaçlamaktayız.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışma kapsamında, 8-10 haftalık dişi farelerden AK-MKH'ler izole edilmiştir ve karekterizasyonu yapılmıştır. Ovaryum dokuları 3 haftalık dişi farelerden elde edilmiştir, vitrifikasyon yöntemi ile dondurulup-çözülmüş ve agar pedleri yardımıyla AK-MKH'ler ile beraber yada ayrı ayrı 14 gün 3D ovaryum kültürü yapılmıştır. Kültürün başlangıcından itibaren kültüre alınan foliküller invert mikroskop altında görüntülenerek fotoğraflanmıştır ve folikül çapları ölçülmüştür. Deney sonunda, kontrol ve çalışma gruplarına ait ovaryum doku parçaları histopatolojik açıdan değerlendirilmiştir ayrıca QPCR yöntemi ile Gdf9, Bmp15,Bcl-xl, Bax ve Bcl-2'nin mRNA ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Deneyler sonucunda elde edilen veriler tek yönlü varyans analizi olan  (ANOVA) ile GraphPad Prism 8.0.2 kullanılarak değerlendirilmiştir. 
Bulgular: Deney sonunda vitrifikasyon işlemi uygulanan grupta canlı folikül sayısının azaldığını ancak histolojik olarak değerlendirildiğinde primordiyal ve primer folikül yapısı korunmuştur. Virtifikasyon+ msc(+) grubunda in vitro folikülogenez sürecinin sağlandığı ve sekonder, antral folikül oluşumu mikroskobik olarak izlenmiştir. Kültür sürecinde 6.güne kadar folikül çapı istatistiksel olarak anlamlı derecede artmıştır (P<00.5). Vitrifikasyon+ msc(-) grubunda ise sekonder ve antral folikül gözlemlenmemiştir. Folikül çapı 10.günde anlamlı olarak azalmıştır (P<00.1). Vitrifikasyon+ msc(+)'nin Gdf9, Bmp15'un ekspresyonu vitrifikasyon ve vitrifikasyon+ msc(-)'den yüksektir. Apoptoz belirteçlerine bakıldığında kök hücreden salgılanan sitokinler sayesinde granüloza hücresi ve stromal hücre apoptozunu inhibe etmiştir. Kontrol, virtifikasyon, vitrifikasyon+ msc(-) gruplarının AMH seviyesi vitrifikasyon+ msc(+) grubuna göre daha azdır.
Sonuç: Bu çalışmada kültüre alındığında düşük hayatta kalma oranına sahip olan dondurulup-çözülmüş ovaryum dokusunundan elde edilen foliküllerin AK-MKH'lerin ko-külütürünün ovaryum kriyoprezervasyonu sürecinde foliküller üzerinde oluşan etkileri tedavi edeceğini ve hayatta kalma oranlarını arttırabilmektedir.

Abstract:
Objective: This proposed study, we aimed to investigate the effects of co-cultures of frozen-thawed ovarian tissue and mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue on the efficiency and quality of the in vitro folliculogenesis process.
Material and Methods: In this study, AK-MSCs were isolated and characterized from 8-10 weeks old female mice. Ovarian tissues were obtained from 3-week-old female mice, freeze-thawed by vitrification method and agar pads were used. 3D ovary culture was apply for 14 days with or without AK-MSCs. Follicles cultured from the beginning of the culture were photographed under an inverted microscope and their follicle diameters were measured. At the end of the experiment, ovarian tissue pieces belonging to the control and study groups were evaluated histopathologically and mRNA expression levels of Gdf9, Bmp15, Bcl-xl, Bax and Bcl-2 were analyzed by QPCR method. The data obtained as a result of the experiments were evaluated using GraphPad Prism 8.0.2 with one-way analysis of variance (ANOVA).
Results: At the end of the experiment, the number of viable follicles decreased in the vitrified group, but when evaluated histologically, the primordial and primary follicle structure was protect. In the virtification+ msc(+) group, in vitro folliculogenesis process was provide and secondary, antral follicle formation was microscopically observed. Follicle diameter increased statistically significantly (P<00.5) until day 6 of the culture process. Secondary and antral follicles were not observed in the vitrification+ msc(-) group. Follicle diameter decreased significantly at day 10 (P<00.1). Expression of vitrification+ msc(+) Gdf9, Bmp15 is higher than vitrification and vitrification+ msc(-). Considering apoptosis markers, it inhibited granulosa cell and stromal cell apoptosis thanks to cytokines secreted from stem cells. The AMH level of the control, virtification, vitrification+ msc(-) groups is less than that of the vitrification+ msc(+) group.
Conclusion: In this study, co-culture of AK-MSCs of follicles obtained from frozen-thawed ovarian tissue, which has a low survival rate when cultured, can treat the effects on follicles during the ovarian cryopreservation process and increase survival rates.