Mitokondri hasarı ile ilişkili mir-382-5P ve mir-409-3P'nin hedef genlerinin araştırılması
Investigation of the target genes of mir-382-5P and mir-409-3P which are associated with mitochondrial damage
Yazar: ERAY TAHA KUMTEPE
Danışman: PROF. DR. BURCU BALCI
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen ifadesi regülasyonu = Gene expression regulation ; Mikro RNA = Micro RNA ; Nöromusküler hastalıklar = Neuromuscular diseases

Özet:
Mitokondriyal sitopatiler dışında kalan ve birbirinden farklı klinik, genetik ve patolojik temelleri olan birçok nöromüsküler hastalıkta ortak ve sekonder bir bulgu olarak, iskelet kasında mitokondri hasarı gözlenmektedir. Tamamlamış olduğumuz bir çalışmada (HUBAP Proje no: TSA-2017-14413); literatürde ilk defa farklı nükleer genlerin sorumlu olduğu müsküler distrofilerin etiyopatogenezinde gözlenen sekonder mitokondri hasarı ile ilişkili ortak miRNA'lar tanımlanmıştır. Yapılan hücre temelli işlevsel analizlerle; bu miRNA'lar arasından miR-382-5p ve miR-409-3p'nin iskelet kas hücrelerinde arttırılmış ifadesinin hem ATP sentezini azalttığı hem de organel morfolojisini bozduğu saptanmış ve bu miRNA'lar öncelikli aday olarak belirlenmiştir. Tez çalışması kapsamında; iskelet kasında gözlenen sekonder mitokondri hasarı ile ilişkilendirdiğimiz miR-382-5p ve miR-409-3p'nin aday mitokondriyal hedef genlerinin tanımlanması amaçlanmıştır. İlk aşamada, miRNA'ların bağlanma olasılığı olan genler biyoinformatik analizler yardımıyla belirlenmiş ve bu genler MitoCarta3.0 listesindeki genler ile çakıştırılarak miRNA'lar için mitokondriyal hedef gen listesi oluşturulmuştur. Gene Ontology veri tabanı ile yapılan gen zenginleştirme analizleri ile her iki miRNA için hücresel ATP üretimi ve/veya mitokondri morfolojisi ile ilişkili yolaklarda görevli öncelikli aday genler belirlenmiştir. C2C12 fare miyoblast hücrelerine ayrı ayrı yapılan miR-382-5p ve miR-409-3p miRNA mimik transfeksiyonları sonrasında 48, 72 ve 96. saatlerde; miR-382-5p için aday mitokondriyal hedef genler olarak seçilen Opa1, Uqcc1 ve Mief1'in, miR-409-3p için ise Mfn1 ve Uqcc1'in mRNA ifade seviyeleri RT-qPCR ile analiz edilmiştir. Artan miR-382-5p ifadesinin 48. saatte Mief1 ifadesini, artan miR-409-3p ifadesinin de 96. saatte Mfn1 gen ifadesini mimik negatif kontrol transfekte hücrelere kıyasla istatistiksel olarak anlamlı seviyede azalttığı (Mief1: 2,29 kat, p=0,0286; Mfn1: 2,11 kat, p=0,007937) sonucuna ulaşılmıştır. Devamında yapılan Western Blot analizlerinde miR-382-5p transfekte hücrelerde kontrol hücrelere kıyasla Mief1 protein seviyesinde anlamlı bir azalma tespit edilemezken, miR-409-3p transfekte edilen hücrelerde, RT-qPCR sonucu ile uyumlu olarak transfeksiyon sonrası 96. saatte Mfn1 protein miktarının kontrol hücrelere kıyasla istatistiksel olarak anlamlı şekilde azaldığı (1,67 kat, p=0,0317) sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
Mitochondrial dysfunction and dysmorphology in skeletal muscle are observed as a common and secondary finding in most neuromuscular diseases that have different clinic, genetic and pathologic background, other than mitochondrial cytopathies. In our previous study (HUBAP Project no: TSA-2017-14413), common miRNAs associated with secondary mitochondrial damage observed in the ethiopathogenesis of neuromuscular diseases, in which different nuclear genes are responsible, were identified for the first time in the literature. Cell based functional analyses revealed that increased expression of miR-382-5p and miR-409-3p in skeletal muscle cells both reduce ATP synthesis and disrupt organelle morphology, thus these miRNAs were identified as priority candidates. In this thesis study, it was aimed to identify candidate mitochondrial target genes of miR-382-5p and miR-409-3p, which we associated with secondary mitochondrial damage observed in skeletal muscle. For this purpose, in the first step, potential target genes were identified by bioinformatics analysis and overlapped with MitoCarta3.0 gene list to create a potential mitochondrial target gene list for each miRNA. Gene enrichment analyses using the Gene Ontology database identified priority candidate genes for both miRNAs involved in pathways related to cellular ATP production and/or mitochondrial morphology. After transfection of miR-382-5p and miR-409-3p miRNA mimics into C2C12 mouse myoblast cells, mRNA expression levels of Opa1, Uqcc1 and Mief1 for miR-382-5p and, Mfn1 and Uqcc1 for miR-409-3p, were analyzed by RT-qPCR at 48, 72 and 96 hours. It was concluded that increased miR-382-5p expression decreased the Mief1 mRNA level (2,29-fold, p=0,0286) 48 hours after transfection, and increased miR-409-3p expression decreased the Mfn1 level (2,11-fold, p=0,007937) 96 hours after transfection, at a statistically significant level compared to mimic negative control transfected cells. In the subsequent Western Blot analyses, no significant decrease in the Mief1 protein level could be detected in miR-382-5p transfected cells, whereas the amount of Mfn1 protein was found to be statistically significantly reduced compared to control cells at 96 hours after transfection (1,67-fold, p=0,0317), consistent with the RT-qPCR results.