EIF2 alfa fosforilasyonu üzerinden gerçekleşen ökaryotik translasyonel kontrol mekanizmasına yeni ilaç etken maddelerinin etkisinin proteom ebadında araştırılması
Investigation of new pharmaceutical active molecules on eukaryotic translational control mechanisms through EIF2 alpha phosphorylation by proteomic tools
Yazar: SELEN PEKER
Danışman: DOÇ. DR. FATMA DUYGU ÖZEL DEMİRALP
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Endoplazmik retikulum (ER), ӧkaryotik hücrelerde salgı ve transmembran proteinler gibi kompleks proteinlerin sentez, katlanma ve translasyon sonrası modifikasyonlarında anahtar rol oynayan ӧnemli bir organeldir. Proteinlerin katlanamaması veya hatalı katlanması ile ER'de birikmesi sonucunda ER stres oluşur. ER stres ise, evrimsel olarak korunmuş olan ve "katlanmamış protein cevabı (Unfolded Protein Response, UPR)" adı verilen bir cevabı tetikler. UPR'de PERK, ATF6 ve IRE1 olmak üzere üç sinyal yolu, hücrede translasyonu azaltarak ER'de protein birikimini önleme, protein katlama kapasitesini artırmak amacıyla şaperon kodlayan genlerin translasyonunu artırma ve katlanmamış proteinleri ER aracılı yıkım ile ortadan kaldırma yolları ile stresin giderilmesinde rol oynar. ER stresin ve UPR'nin obezite, diyabet, nörodejeneratif hastalıklar ve kanserde önemli rol oynadığı bilinmektedir. Bu hastalıklar protein sentezinin anormal düzenlenmesi sonucu geliştiğinden, translasyonel kontrolün moleküler temellerinin ve mekanizmasının anlaşılması son derece önemlidir. Yapılacak daha ileri çalışmalar bu fizyolojik mekanizmaların tam rolünü açıklamak için gereklidir ve potansiyel terapiler için yeni yollar sağlayacaktır.
ER strese ilk yanıt olarak PERK, ER'deki yükü ve protein katlama talebini azaltmak üzere translasyon başlangıç üçlü kompleksi eIF2–GTP–tRNAiMet'nin bileşeni olan eIF2α'yı Serin 51 bölgesinden fosforile eder ve genel protein sentezini durdurur. N,Nꞌ-diarilürelerin protein sentezinin başlangıcını kontrol eden PERK/eIF2α fosforilasyon kolunu HRI (heme regulated kinase)'ı aktive etmek sureti ile değiştirdiği ve böylece translasyon başlangıç üçlü kompleks bolluğunu azalttığı direkt fonksiyonel genetik ve biyokimyasal çalışmalarla gösterilmiş, ancak global olarak hangi proteinlerin ifadesinde değişiklik meydana getirdiği henüz araştırılmamıştır.
Bu çalışmada insan prostat kanser hücre hattı (PC-3) model olarak kullanılmış, bu hücrelerin Serin 51 mutant (S51A) ve yaban tiplerinin (WT) anti-kanser aktif (1781) veya inaktif (1527) N,Nꞌ-diarilüre bileşiklerle muamele edilmesiyle dört grup oluşturulmuştur. Anti-kanser aktif bileşiğin PC-3 insan prostat kanseri üzerindeki etkisi altında yatan moleküler mekanizmayı proteomik açıdan inceleyebilmek amacıyla iki boyutlu jel elektroforezi (2DE) ile oluşturulan protein profil haritalarının karşılaştırmalı analizleri gerçekleştirilmiş ve analizler sonucunda protein ifadesinde en az iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunan protein spotlarından Matriks Eşliğinde Lazer İyonlaştırıcılı ve Uçuş Zamanıyla Ölçüm Yapan (MALDI-TOF) kütle spektrometresi ile metabolizma, transkripsiyon, sinyal iletimi, proteoliz ve protein katlanması gibi çeşitli biyolojik süreçler ile bağlantılı 17 protein tanımlanmıştır.

Abstract:
Endoplasmic reticulum (ER) is an organelle in eukaryotic cells that plays key role in the synthesis, folding and post-translational modifications of complex proteins such as secretory and transmembrane proteins. Accumulation of unfolded or misfolded proteins in the ER cause the ER stress, which triggers an evolutionarily conserved response, termed the "unfolded protein response (UPR)". Three response pathways: IRE1, ATF6 and PERK, relieves ER stress by inducing genes such as ER chaperones to increase the protein-folding capacity of the ER, up-regulating components of ER-associated degradation (ERAD) pathway to enhance the clearance of unfolded proteins, and by inhibiting general protein translation to reduce the demand on the ER.  It is known that ER stress and UPR are important features of a number of human diseases such as metabolic and neurological diseases, diabetes and cancer. These diseases states result from aberrant regulation of protein synthesis, so understanding the molecular basis and mechanisms of translational control is critical and further studies are needed to elucidate the exact role of this physiological mechanism and to provide new ways for potential therapies.
As first response to ER stress, PERK inhibits general protein translation through phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 alpha (eIF2α), which is the the component of translation initiation ternary complex (eIF2–GTP–tRNAiMet), on Serine 51 residue to prevent a further increase in protein-folding demand in the ER. Direct functional-genetic and biochemical evidence demonstrated that N,N'-diarylureas activate heme-regulated inhibitor kinase, thereby phosphorylating eIF2a and reduc¬ing the abundance of the ternary complex, though  global changes in protein expressions remain unknown.
In this study,  four groups were used obtained by treating wild type (WT) or Serine 51 mutated (S51A) human prostate cancer (PC-3) cell lines either with active (1781) or inactive (1527) diarylurea compounds. Differences in protein expression levels among four groups were investigated by comparative two-dimensional gel electrophoresis (2DE) analysis. After comparative analysis, 17 proteins were identified by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometer from protein spots showing statistically significant differences in expression whose functions are connected with diverse biological processes such as metabolism, transcription, signal transduction, proteolysis and protein folding.