Çeşitli klinik örneklerden elde edilen streptococcus pyogenes izolatlarında quadripleks gerçek zamanlı PCR yöntemi ile belirlenen emm serotip dağılımının hastaların klinik durumuyla ilişkilendirilmesi
Correlation of emm serotype distribution determined by quadriplex real-time PCR method with the clinical status of patients in streptococcus pyogenes isolates from various clinical samples
Yazar: BÜŞRA SAYGIN
Danışman: PROF. DR. BEDİA DİNÇ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Ankara Bilkent Şehir Hastanesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Streptococcus pyogenes = Streptococcus pyogenes

Özet:
Amaç: Dünya çapında yaygın olarak görülen S. pyogenes enfeksiyonları, insanları etkileyen bakteriyel patojenler arasında önemini korumaktadır. Bu çalışmada; boğaz ve boğaz dışı klinik örneklerden elde edilen S. pyogenes izolatlarında emm tip dağılımının belirlenmesi ile yerel epidemiyolojik verilere güncel katkı sağlanması, emm tipleri ile klinik tablolar arasındaki ilişkinin incelenmesi ve mevsimsel aşı kapsayıcılığının araştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca, olası bir S. pyogenes kaynaklı salgın durumunda hem hızlı sonuç alma hem de maliyet etkin bir yaklaşım sağlaması nedeniyle quadripleks gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR) yöntemi ile emm tiplendirmesinin kapsayıcılığı araştırılmıştır. 
Gereç ve Yöntem: Şubat 2024-Mayıs 2024 tarihleri arasında gerçekleştirilen çalışmada; 68 boğaz ve 38 boğaz dışı klinik örnekten elde edilen toplam 106 S. pyogenes izolatında, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) protokolüne göre tasarlanan kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (quantitative polymerase chain reaction, qPCR) kiti ile emm tiplendirme yapıldı ve yaygın görülen 20 emm tipinin varlığı araştırıldı. Moleküler tiplendirmeyi temsilen qPCR ile saptanan her emm tipinden birer izolatta ve PCR yöntemi ile emm tipi belirlenemeyen 31 izolatta dizi analizi yapıldı. Çalışmaya dahil edilen izolatların penisilin, eritromisin, klindamisin, tetrasiklin, levofloksasin ve trimetoprim-sülfametoksazol (SXT) antibiyotik duyarlılıkları disk difüzyon yöntemi ile belirlendi. 
Bulgular: Hastaların %81,1'i pediatrik yaş grubundayken, İnvaziv grup A streptokok (iGAS) enfeksiyonlarının %64,8'i erişkin hastalarda saptandı. Tüm izolatlar penisiline duyarlı iken, tetrasikline %12,3; eritromisine %2,8 ve klindamisine %1,9 oranında direnç tespit edildi. qPCR yöntemi ile S. pyogenes izolatlarının %70,8'inde emm tipi belirlendi. Tiplendirmeyi temsilen yapılan dizi analizi sonuçları qPCR sonuçları ile uyumlu bulundu. Dizi analizi verileri de dahil edildiğinde; S. pyogenes izolatlarının %16'sında emm tipi belirlenemedi. Tespit edilen 12 farklı emm tipinin tamamı 30 valanlı aşıda mevcut olup emm tipi belirlenen 89 S. pyogenes izolatı için bu aşının kapsayıcılığı %100 olarak saptandı. S. pyogenes izolatlarındaki baskın emm tipi emm3 iken; emm2, emm6 ve emm89 da diğer sık tespit edilen emm türlerini oluşturdu.
Sonuç: Hızlı, maliyet etkin ve pek çok laboratuvar alt yapısına uygun bir yöntem olan qPCR ile emm tiplendirmesinin güvenilir bir şekilde gerçekleştirileceği ve bu yöntemin olası S. pyogenes salgınlarının yönetimine katkı sağlayacağı belirlenmiştir. Primer ve prob tasarımlarının ülkemizde dolaşımda olan S. pyogenes izolatlarına yönelik yapılmasıyla qPCR yönteminin tiplendirme duyarlılığının artacağı öngörülmüştür. Yerel epidemiyolojik verilerimizin sürekliliğinin sağlanması için laboratuvar temelli aktif bir sürveyans sisteminin geliştirilmesi gerektiği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
Objective: S. pyogenes infections, widely prevalent globally, remain significant among bacterial pathogens affecting humans. This study aimed to contribute updated epidemiological data by determining the emm type distribution in S. pyogenes isolates obtained from throat and non-throat clinical samples, to examine the relationship between emm types and clinical presentations, and to investigate seasonal vaccine coverage. Additionally, the coverage of emm typing through the quadriplex real-time PCR method, which provides rapid results and cost-effective approaches, was assessed for its potential use in the event of an S. pyogenes outbreak.
Materials and Methods: In our study conducted between February 2024 and May 2024, emm typing was performed on a total of 106 S. pyogenes isolates obtained from 68 throat and 38 non-throat clinical samples using a qPCR kit designed according to the CDC protocol. The presence of 20 commonly seen emm types was investigated. Sequence analysis was performed on one isolate from each emm type identified by qPCR to represent molecular typing, as well as on 31 isolates where the emm type could not be determined by PCR. The antibiotic susceptibility of the isolates included in the study to penicillin, erythromycin, clindamycin, tetracycline, levofloxacin, and SXT was assessed using the disk diffusion method. 
Results: While 81.1% of the patients were from the pediatric age group, 64.8% of invasive GAS infections were detected in adult patients. All isolates were susceptible to penicillin, with resistance observed to tetracycline (12.3%), erythromycin (2.8%), and clindamycin (1.9%). The emm type was determined in 70.8% of S. pyogenes isolates using the qPCR method. The results of sequence analysis were found to be consistent with those obtained from qPCR. When including sequence analysis data, emm typing could not be determined in 16% of S. pyogenes isolates. All 12 different emm types identified were present in the 30-valent vaccine, and the vaccine coverage for the 89 S. pyogenes isolates with identified emm types was determined to be 100%. The dominant emm type among the S. pyogenes isolates was emm3, followed by emm2, emm6, and emm89 as the other frequently detected emm types.
Conclusion: The study concluded that emm typing could be reliably performed using qPCR, a rapid, cost-effective method applicable across various laboratory infrastructures, and that this approach could contribute to the management of potential S. pyogenes outbreaks. It is further anticipated that the typing sensitivity of the qPCR assay could be improved by designing primers and probes specifically targeting the circulating S. pyogenes isolates within the country. Additionally, the study emphasized the need for establishing an active laboratory-based surveillance system to ensure the continuity and accuracy of local epidemiological data.