Anti-SAG1 antikorlarına floresans  boya konjuge edilerek  Toxoplasma gondii parazitlerine yönelik immunofloresans yöntem geliştirilmesi
Development of immunofluorescence assay method for Toxoplasma gondii by conjugation of anti-SAG1 antibody and fluorescence dye
Yazar: MEHTAP SERT
Danışman: YRD. DOÇ. DR. RABİA ÇAKIR KOÇ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Dünyada çapında  yaygın olarak  görülen  parazit enfeksiyonlarından biri olan toksoplazmoza,  Toxoplasma gondii adı verilen  zorunlu hücre içi bir parazit neden olmaktadır.  T.gondii'nin bulaş yolları arasında doku kistleri ile enfekte etlerin çiğ ya da az pişmiş olarak tüketilmesi, enfekte kedi dışkısı ile kontamine olmuş gıda ve yiyeceklerin tüketilmesi, kan transfüzyonu, organ transplantasyonu ya da transplasental yol  yer almaktadır.
İmmun sistemi sağlıklı insanlarda toksoplazmoz genellikle asemptomatik olmakla birlikte, immun sistemi baskılanmış hastalarda ölüme bile neden olabilmektedir. Bunun yanısıra hamilelerde enfeksiyonun fetusa geçiş durumunda düşüğe neden olabilmekte veya doğan bebekte mikrosefali, zeka geriliği, körlük gibi çok ciddi hastalıklara neden olabilmektedir, ayrıca toksoplazmoz enfeksiyonu hayvanlar arasında da yaygın olarak görülmekte ve sağlık problemlerine neden olabilmektedir.
Toksoplazmoz enfeksiyonunun insanlarda ve hayvanlarda oluşturduğu sağlık açısından yarattığı problemler ve ekonomik açıdan yarattığı kayıplar,  T.gondii tanısının önemini açıkça ortaya koymaktadır. Toksoplazmozun tanısı için günümüzde kullanılan histolojik, moleküler tanı gibi  yöntemlerinin  birbirlerine göre avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. Bu durum daha etkin bir tanı için farklı  test sistemlerinin geliştirilmesi ihtiyacını doğurmaktadır. 
SAG1, T. gondii'nin bir formu olan takizoitlerin ana yüzey antijenidir. Toksoplazmoz olan  konaklarda enfeksiyona karşı oluşan bağışıklık yanıtının ana hedefini  immunodominant spesifik  bir antijen olan  SAG1 oluşturmaktadır. Toksoplazmoz enfeksiyonunda bağışıklık yanıtı sonucu oluşan antikorların büyük bir kısmının SAG1'e karşı olması nedeniyle, toksoplasmoz tanısında SAG1 yüzey antijeni parazitin oldukça stratejik bir bileşenidir. 
Memelilerden elde edilen antikorlar; toksoplazmozun serolojik yöntemlerle tanısında kullanıldığı gibi birçok hastalığın tanısında da kullanılmaktadır. Fakat memeli antikorlarının  sahip oldukları birçok dezavantaj vardır. Buna karşılık tavuk yumurtasından elde edilen IgY antikorları; kolay üretim, düşük  maliyet ve  yüksek miktarda antikor  üretimi gibi açılardan üstünlük göstermektedir. Tüm bu üstünlükler, tanı ve tedavi ile ilgili çalışmalarda IgY'yi ön plana çıkartmaktadır.
Bu tez çalışmasında, T.gondii SAG1 proteinine  spesifik IgY antikorunun üretilmesi ve elde edilen bu spesifik antikorun floresein izotiyosiyanat (FITC) ile işaretlenerek toksoplazmoz tanısında kullanılmak üzere yeni bir boya  analiz yöntemi  geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Bu doğrultuda,  tavuklar rekombinant SAG1 ile aşılanıp, T.gondii'ye karşı spesifik olan IgY elde edilmiştir. Üretilen IgY'ler PEG 6000 ile çöktürme yöntemi kullanılarak saflaştırılmış ve ELISA yöntemi ile  elde edilen antikorların spesifikliği belirlenmiştir. Protein konsantrasyonları nanospektrofotometre aracılığıyla hesaplanmıştır.  Ardından FITC bağlı SAG1'e spesifik IgY'nin elde edilmesi için optimizasyon koşulları (optimum konsantrasyon ve inkübasyon süresi) floresans spektrofotometre cihazı ile belirlenmiştir. Böylece elde edilen FITC ile işaretlenmiş SAG1'e spesifik IgY antikorları, toksoplazmoz tanısında kullanılmak üzere yeni bir  boya analiz yöntemi olarak geliştirilmiştir. Elde edilen FITC işaretli SAG1'e spesifik IgY antikorları T.gondii parazitlerinin üzerinde eklenerek direkt floresans antikor testinde (DFA testi) kullanılmıştır. Floresans mikroskobunda antikor antijen etkileşimi gözlenmiştir. 
Böylece bu tez çalışmasında, dünyada ve ülkemizde ilk  kez  T.gondii parazitinin yüzey antijeni olan SAG1'e spesifik  IgY antikorları üretilip floresans boya ile konjuge edilerek T.gondii'nin direkt belirlenmesine imkan verecek spesifik bir boya analiz yöntemi geliştirilmiştir.

Abstract:
Toxoplasmosis is one of the parasitic infections that common throughout the world and is caused by Toxoplasma gondii which is an obligatory intracellular parasite. The ingestion of the tissue cysts in raw and undercooked meat, infected cat feces contaminated food, transplantation, blood fusion and laboratory accidents are the  sources of T. gondii infections for humans.  
Sypmtoms of toxoplasmosis in immunocompetent individuals are generally asymptomatic, but toxoplasmosis can cause death in immunodeficient patients. In additon to this; toxoplasmosis can cause very serious diseases such as miscarriage in the cases of transmission of infection to fetus, fetal abnomalities, blindness, microcephalia and mental deficiency in newborns. Besides, toxoplasmosis infection is observed among animals prevalently and can cause health problems.
Problems in health and economic loses on humans and animals occured by toxoplasmosis infection show the importance of the diagnosis of T. gondii. Tests which are presently used for diagnosis such as histologic and molecular diagnosis have advantages and disadvantages compared to each other. Therefore, this situation raises the need for the development of test systems for a more accurate diagnosis. 
SAG1 is the main surface antigen in tachyzoite that is a form of T. gondii. SAG1, an immunodominant specific antigen, is the main target of immune response against infection in hosts with toxoplasmosis. SAG1 occupies an important place in Toxoplasmosis diagnosis due to a major part of antibodies that forms as a result of immune response in Toxoplasmosis infection is against SAG1.  
Mammal antibodies also are used in the diagnosis of T. gondii like in most disease like toxoplasmosis diagnosis by serological methods, but mammal antibodies have many disadvantages. On the other hand, IgY antibodies otaines from chicken egg is shown superiority in many ways like ease of production, low cost and antibody production in high quantity. This situation reveals the importance of IgY in diagnosis and treatment studies.
In this thesis; T.gondii SAG1 protein-specific IgY antibody production and development of a novel dye assay method by marking the obtained specific antibodies with FITC (fluorescein isothiocyanate) for use in T. gondii diagnosis. 
Therefore, poultry are immunized with recombinant SAG1 and T. gondii-specific IgYs are produced. After the purification of produced IgYs by precipitation method with PEG 6000, specificity of produced antibodies was determined ELISA method. Protein concentrations were calculated by nanospectrophotometer. After these steps, optimization conditions (optimum concentration and incubation time) were determined by fluorecence spectrophotometer in order to obtain IgYs specific to FITC-marked SAG1. Thus, improving a dye assay method is provided for diagnosis of T. gondii by using FITC marked specific IgY. The obtained FITC-marked SAG1-specific IgY antibodies were added in T. gondii parasites and  used in direct fluorescent antibody test (DFA test). 
Thus; in this thesis, for the first time in the world and our country, IgY antibodies which are specific to SAG1, a surface antigen of T. gondii parasite, are conjugated with fluorescence dye and a specific diagnosis tool enables the direct determination of T. gondii.