Van, Bitlis, Muş ve Hakkari illerinde bulunan gökkuşağı alabalığı çiftliklerinden elde edilen Lactococcus garvieae izolatlarının fenotipik, serotipik ve genotipik farklılıklarının belirlenmesi
Determination of phenotypic, serotypic and genotypic differences between L. garvieae isolates obtained from rainbow trout farms in Van, Bitlis, Mus and Hakkari provinces
Yazar: ŞÜKRÜ ÖNALAN
Danışman: PROF. DR. MUHAMMED ARABACI
Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: Alabalık üretme çiftlikleri = Trout propagation farms ; Gökkuşağı alabalığı = Rainbow trout ; Lactococcus garvieae = Lactococcus garvieae ; Oncorhynchus mykiss = Oncorhynchus mykiss

Özet:
Bu tez çalışmasında; Van, Bitlis, Muş ve Hakkâri illerinde bulunan, Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı'na kayıtlı 54 adet Gökkuşağı alabalığı çiftliğinden izole edilen izolatlar arasında fenotipik, genotipik ve serotipik farklılıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır. 
Bu amaçla izolatlar arasındaki fenotipik farklılıkları belirlemek için natif muayene, Gram boyama, oksidaz, katalaz ve hemoliz testleri, sıcaklık ve tuzluluk tolerans testleri ile API Rapid ID 32 Strep biyokimyasal testleri; genotipik farklılıkları belirlemek için, real-time PCR ile 16S rRNA gen bölgesinden tür teşhisi ve kapsül gen bölgelerinin seçimi ile bu bölgelere spesifik primer dizayn edilerek, genetik farklılıkların belirlenmesi, agaroz jel elektroforez ile allellerin belirlenmesi ve dendrogram oluşturulması; serotipik farklılıkların belirlenmesi amacıyla ise ELISA testi yapılmıştır. 
Çalışmada, Gökkuşağı alabalığı çiftliklerinden elde edilen 4 adet L. garvieae izolatı ve Türkiye'nin muhtelif bölgelerinden Prof. Dr. Haşmet ÇAĞIRGAN tarafından izole edilen 18 L. garvieae izolatı kullanılmıştır. Elde edilen L. garvieae izolatlarının tamamının triptic soy agar (TSA)'da krem renkli, parlak, yuvarlak düzgün kenarlı S tipli koloni verdikleri, natif muayenede suşların tamamının hareketsiz olduğu tespit edilmiştir. Morfolojik olarak izolatların tamamının Gram (+), hareketsiz, α-hemolitik, %0-6,5 NaCl tuzlulukta, 21, 37 ve 45 °C sıcaklıkta üreyebilen, oksidaz ve katalaz negatif olduğu görülmüştür. API Rapid ID 32 Strep testi ile yapılan biyokimyasal özelliklerin incelenmesi sonrasında; sakkaroz kullanımı açısından 2 adet L. garvieae izolatının diğer izolatlardan farklı olduğu, maltoz profili bakımından ise 1 adet L. garvieae izolatının diğer izolatlardan farklı olduğu görülmüştür. Bu fenotipik farklılıklar birlikte değerlendirildiğinde çalışmada kullanılan izolatların fenotipik özellikler açısından 3 farklı profil oluşturdukları görülmüştür.
İzolatların genotipik özellik ve farklılıklarının belirlenmesi amacıyla 16S rRNA gen bölgesine spesifik dizayn edilen primerler ile yapılan real-time PCR sonucuna göre izolatların tamamının L. garvieae oldukları doğrulanmıştır. İzolatlar arasındaki genotipik farklılıklarının belirlenmesi amacıyla patojeniteden sorumlu gen bölgesinde bulunan LCGL_0441 ve LCGL_0658 genleri kullanılmıştır. Bu genlere yönelik uygulanan real-time PCR sonrasında bir izolat negatif sonuç vererek patojen genleri taşımayışı ile diğer izolatlardan ayrılmıştır. Pozitif sonuç veren real-time PCR ürünlerine uygulanan agaroz jel elektroforezi sonrasında ise patojen genleri taşıyan izolatların farklı gen lokuslarında verdikleri farklı allel büyüklükleri ile birbirlerinden farklılık gösterdikleri gözlenmiştir. Elde edilen real-time PCR ürünlerine uygulanan agaroz jel elektroforezde LCGL_0441 geni için 8 farklı allel, LCGL_0658 geni için 7 farklı allel olmak üzere toplam 15 allel elde edilmiştir. Elde edilen allellerin baz büyüklükleri LCGL_0441 geni için 60 bp, 70 bp, 123 bp, 173 bp, 260 bp, 340 bp, 370 bp ve 471 bp, LCGL_0658 geni için ise 60 bp, 70 bp, 140 bp, 200 bp, 260 bp, 310 bp ve 540 bp'dir. Agaroz jel elektroforez sonrasında elde edilen allel profili binomial verilere dönüştürülmüştür. L. garvieae izolatlarının genotipik farklılıklarını belirlemek için bu binomial veriler kullanılarak dendrogram oluşturulmuştur. Dendrogram sonuçlarına göre izolatlar genotipik olarak 10 farklı grup altında toplanmıştır.
İzolatların serotipik farklılıklarının belirlenmesi amacıyla kullanılan ELISA testi sonuçlarına göre 2 adet L. garvieae izolatı diğer izolatlardan serotipik olarak farklı olduğu ve çalışmada kullanılan L. garvieae izolatlarının serotipik olarak 2 farklı serotipik grup oluşturdukları görülmüştür.
Çalışmada L. garvieae izolatları arasında fenotipik, genotipik ve serotipik farklılıkların bulunduğu görülmüştür. Bütün yöntemler birlikte değerlendirildiğinde; fenotipik farklılıkların bulunduğu izolatların genotipik ve serotipik farklılık gösteren izolatlar ile benzer olduğu, aynı şekilde genotipik ve serotipik farklılık gösteren izolatların da fenotipik farklılık gösteren izolatlar ile benzerliği dikkati çekmektedir. İzolatların aynı çevresel şartlarda patojenite açısından da farklılıkların tespit edilmesi gerekliliği çalışmaların verilerinin birlikte değerlendirilmesi açısından önemli olduğu görülmektedir. Çalışmada kullanılan yöntemler izolatlar arasındaki farklılıkları belirlemiş olsa da değişik yöntemler kullanılarak elde edilen sonuçların birlikte değerlendirilmesi çalışmanın özgünlüğü açısından önem arz etmektedir. 
Çalışmadan elde edilen veriler birlikte değerlendirildiğinde L. garvieae enfeksiyonunun vermiş olduğu zararların azaltılması bakımından önemli veriler taşıdığını düşünmekteyiz. Kullanılan yöntemlerin tekrarlanabilir ve geliştirilebilir olması da ileride yapılması planlanan çalışmalar açısından önemli bir basamak teşkil edebileceği kanısındayız.
Sonuç olarak; çalışmada kullanılan 22 adet L. garvieae izolatı fenotipik, genotipik ve serotipik farklılıklar yönünden birlikte değerlendirilmiş ve elde edilen farklılıklar neticesinde izolatların; 3 farklı fenotipik grup, 10 farklı genotipik grup ve 2 farklı serotipik grup oluşturduğu görülmüştür. Fenotipik ve genotipik farklılıklar birlikte değerlendirildiğinde çalışmada 12 adet L. garvieae biyotipinin olduğu; fenotipik, genotipik ve serotipik farklılıklar birlikte değerlendirildiğinde ise L. garvieae suşlarının 13 farklı tip oluşturdukları görülmüştür.

Abstract:
The objective of the present dissertation is to determine phenotypic, genotypic, and serotypic differences between the isolates collected from 54 rainbow trout farms registered to the Ministry of Food, Agriculture and Livestock in Van, Bitlis, Muş and Hakkari provinces.
To determine the phenotypic differences between the isolates, native examination, Gram staining, oxidase, catalase, and hemolysis tests, temperature and salinity tolerance tests and API Rapid ID 32 Strep biochemical tests; to determine genotypic differences, identification of genetical differences by strain diagnosis in 16S rRNA region using real-time PCR and selection of capsule gene regions and designing region specific primers for these regions, identification of alleles by agarose gel electrophoresis and dendogram formation; to determine serotypic differences, ELISA test were conducted.
In the study, 4 L. garvieae isolates obtained from rainbow trout farms and 18 L. garvieae isolates collected from different regions in Turkey by Prof. Dr. Haşmet ÇAĞIRGAN were evaluated. It was determined that all L. garvieae isolates produced crème colored, bright, round and smooth margined S-type colonies in triptic soy agar (TSA) medium, and all strains were non-motile. It was observed that all isolates were Gram (+), α-hemolytic, with 0–6.5 %NaCl salinity, reproducible under 21, 37, and 45°C temperatures, oxidase and catalase negative. Examination of biochemical properties with API Rapid ID 32 Strep test demonstrated that 2 L. garvieae isolates were different from other isolates based on sucrose utilization, and 1 L. garvieae isolate was different from others based on maltose profile. These phenotypic differences showed that the isolates tested in the study formed 3 different profiles based on phenotypical properties when these phenotypic differences were considered in conjunction.
Real-time PCR, conducted with primaries specifically designed for 16S rRNA region to determine the genotypic properties and differences of isolates, confirmed that all isolates were L. garvieae LCGL_0441 and LCGL_0658 genes in the gene region responsible for pathogenicity were used to determine the genotypic differences between the isolates. Real-time PCR showed was observed that an isolate produced negative result and separated from the other isolates. Agarose gel electrophoresis showed that isolates containing pathogen genes were different based on the different allele sizes they demonstrated in different gene loci. Agarose gel electrophoresis conducted on obtained real-time PCR products resulted in 8 different alleles for the LCGL_0441 gene, 7 different alleles for the LCGL_0658 gene, a total of 15 alleles. Base sizes of the obtained alleles were 60 bp, 70 bp, 123 bp, 173 bp, 260 bp, 340 bp, 370 bp and 471 bp for LCGL_0441 gene and 60 bp, 70 bp, 140 bp, 200 bp, 260 bp, 310 bp and 540 bp for LCGL_0658 gene. Allele profile obtained as a result of the agarose gel electrophoresis were then transformed into binomial data. A dendogram was created using these data to determine the genotypic differences between L. garvieae isolates. Isolates were divided into 10 different groups based on the dendogram results.
ELISA test used to determine serotypic differences between the isolates showed that 2 L. garvieae isolates were different than others serologically and L. garvieae isolates used in the study serologically formed 2 different groups of serotypes.
Results of the study demonstrated that there were phenotypic, genotypic and serotypic differences between L. garvieae isolates. Considering the applied methods in conjunction show that isolates with phenotypic differences were similar to isolates with genotypic and serotypic differences, and similarly, isolates with genotypic and serotypic differences were similar to isolates with phenotypic differences. It was found significant that the findings of the study should be assessed together to determine the differences between the isolates in the same environmental conditions based on pathogenicity. Although the methods utilized in the study identified the differences between the isolates, it was considered important to assess the findings obtained using various other methods for the uniqueness of the present study.
We consider that the study provided significant findings to prevent the harm caused by L. garvieae infection when we evaluated all data obtained through the current study. We also consider that the repeatability and improvability of the methods used in this study would consist a significant step for future studies.
As a result, 22 L. garvieae isolates were assessed in conjunction for phenotypic, genotypic and serotypic differences in the study and it was observed that isolates formed 3 different phenotypic, 10 different genotypic and 2 different serotypic groups based on the obtained differences. When phenotypic and genotypic differences heve been considered together, there were 12 L. garvieae biotypes, and when phenotypic, genotypic and serotypic differences are considered together, it was observed that formed 13 different types of L. garvieae strains.