Fare embriyolarının in vitro kültüründe farklı BSA oranlarının gelişime etkisi
Effect of various BSA levels on development of mouse embryos in vitro culture
Yazar: MİTHAT EVECEN
Danışman: PROF. DR. İ. KAMURAN İLERİ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 1999
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Albüminler = Albumins ; Embriyo = Embryo ; Fareler = Mice ; Fetal gelişim = Fetal development ; İn vitro = In vitro

Özet:
8.0ZET. Çalışma iki aşamada gerçekleştirildi. Birinci aşama farelerde süperovulasyon, embriyoların kazanılması ve kazanılan embriyoların değişik miktarlarda BSA içeren farklı kültür medyumlarında 96 saat süreyle kültürlerini ve bu süreç içerisinde direkt mikroskobik bakı (natif muayene) ile embriyonik gelişimsel kontrollerini kapsamaktadır. İkinci aşama ise, aynı şekilde kazanılan embriyoların yine aynı şartlar altında 96 saat süreyle kültürü ve in vitro kültürün her 24 saatinde bir olmak üzere hücre çekirdeklerinin boyanarak, embriyonik hücre sayılarının tespiti yöntemiyle embriyonik gelişim kontrollerinin yapılışını içermektedir. Çalışmanın birinci aşamasında, embriyo eldesi amacıyla 94 dişi farenin plak gösteren 72 tanesi ve bunların tohumlanması içinde 20 adet erkek fare kullanıldı. Süperovulasyon, 5 I.U PMSG enjeksiyonunu müteakip 48 saat sonra yine 5 I.U. hCG enjeksiyonu ile gerçekleştirildi. Yapılan ovidukt yıkamalarında fare başına ortalama 18.16 ± 8.65 adet iki blastomerli embriyo, 1.26 ± 0.96 adet döllenmemiş oosit ve 0.39 ± 0.70 adet dejenere embriyo düştüğü tespit edildi. Çalışmanın ikinci aşamasında ise, embriyo eldesi amacıyla 75 farenin plak gösteren 50 tanesi kullanıldı. Senkronizasyon aynı yöntemle yapılırken bu gruptaki farelerden elde edilen iki blastomerli embriyoların fare başına ortalaması, 20.20 ± 4.06, döllenmemiş oosit ortalaması 2.54 ± 1.61 ve dejenere embriyo ortalaması da 1.57 ± 1.09 olarak bulundu. Birinci aşamada elde edilen iki blastomerli embriyolar, M 16 ve Whitten's medyumlarının sırasıyla 0 (kontrol), 0.3, 1, 3 9, 18 ve 36 mg/ml BSA İçeren gruplarında ve aynı koşullar altında (% 5 C02, % 5 02, % 90 N2'li gaz ortamı ve % 100'e yakın rutubetin sağlandığı 37°C'lik inkübatör ortamı) 96 saat süreyle kültüre edildiler. Embriyoların gelişimsel kontrolleri in vitro kültür periyodunun her 24 saatinde bir kere olmak üzere natif yöntemle yapıldı. M 16 medyumunun 0 (Kontrol), 0.3, 1, 3, 9, 18 ve 36 mg/ml miktarlarında BSA içeren gruplarında kültüre edilen embriyoların gelişim oranları arasında, in vitro kültürün ilk 24 saati itibarıyla istatistiksel açıdan herhangi bir fark bulunmadı (p>0.05). Kültür periyodunun 48 saatlik döneminde ise en yüksek gelişim düzeyi % 100.00 ± 0.00 ile 3 mg/ml BSA içeren grupta meydana geldi. Bu değer ile 0.3,1 ve 9 mg/ml BSA içeren gruplardaki değerler arasında istatistiksel anlamda herhangi bir fark saptanmadı (p>0.05). Buna karşın, bu değer ile BSA' nın bulunmadığı (0 mg/ml) ve yoğun olarak bulunduğu (18 ve.36 mg/ml) gruplardaki değerler arasındaki farkların istatistiksel açıdan önem taşıdığı saptandı (p<0.05). In vitro kültür periyodunun 72 ve 96. saatlerinde ise en yüksek gelişim 73oranları % 88.01 ± 16.06 ve % 84.74 ± 17.61 ile yine 3 mg/ml BSA grubunda saptanırken bu değer ile 1 ve 9 mg/ml gruplarındaki değerlerle arasındaki farkların istatistiki açıdan önemsiz (P>0.05), buna karşın diğer gruplarla ise arasındaki farkların önem taşıdığı saptandı (P<0.05). Whitten's medyumunun farklı miktarlarda BSA içeren gruplarında kültüre edilen embriyoların yapılan gelişimsel kontrollerinde kültür periyodunun 24. saati itibari ile en yüksek gelişim oranı % 100.00 ± 0.00 ile 3 mg/ml BSA grubunda gözlenirken hiçbir grup arasında istatistiksel açıdan herhangi bir gelişimsel farklılık gözlenmedi (p>0.05). In vitro kültürün 48 saatlik döneminde ise en yüksek gelişim oranı % 96.52 ± 6.70 ile yine 3 mg/ml BSA grubunda saptandı. Yapılan istatistiksel değerlendirmede bu değer ile 0,0.3 ve 1 mg/ml BSA gruplarında bulunan değerler arasındaki farkların önem taşımadığı gözlenirken (p>0.05), bu değer ile BSA'nın yoğunlaştığı (9, 18 ve 36 mg/ml) gruplarındaki değerler arasındaki farkların 3 mg/ml BSA grubu lehine olmak üzere önem taşıdığı saptandı (p<0.05). In vitro kültürün 72 ve 96. saatlerinde ise en yüksek embriyonal gelişim oranı % 94.57± 7.43 ile yine 3 mg/ml BSA grubunda gerçekleşti. Yapılan istatistiksel değerlendirmede bu değer ile 0.3 ve 1 mg/ml BSA gruplarındaki değerler arasındaki farkların önem taşımadığı belirlendi (p>0.05). Buna karşın bu değer ile BSA'nın bulunmadığı (0 mg/ml) ve yoğun olarak bulunduğu (9, 18 ve 36 mg/ml) gruplarda bulunan değerlerle arasındaki farkların, 3 mg/ml BSA grubu lehine olmak üzere önem taşıdığı belirlendi (p<0.05). M16 ve Whitten's medyumlarının aynı miktarlarda BSA içeren gruplarında kültüre alınan embriyoların in vitro kültür periyodunun sonunda ulaştıkları hatching + hatched blastosist toplam oranları açısından birbirleriyle yapılan karşılaştırmalarında, BSA'nın sıfıra yaklaşan miktarlarında (0, 0.3 ve 1 mg/ml) Whitten's medyum grupları lehine olmak üzere istatistiksel açıdan önemli oranlarda farklılıklar saptandı (p<0.05). Buna karşın, BSA'nın yoğun olarak bulunduğu (9, 18 ve 36 mg/ml) gruplar arasında yapılan istatistiksel değerlendirmelerde herhangi bk fark -gözlenmedi - (p>0t?6^ M4? - ve - Whrtten^ medyumlarının her ikisinde de en yüksek hatching + hatched blastosist toplam oranlarının sırasıyla % 44.34 ± 25.94 ve % 67.70 ± 25.22 ile 3 mg/ml BSA içeren gruplarında gerçekleştiği görüldü. Yapılan istatistiksel değerlendirmede bu iki değer arasında, Whitten's medyum grubu lehine bulunan 23.36'lık farkın önem taşımadığı belirlendi (p>0.05). ikinci aşamada ise; iki blastomerli fare embriyoları yine aynı medyumların aynı miktarlarda BSA içeren gruplarında 96 saat süreyle kültüre alındılar. Bu aşamada, embriyoların gelişimsel kontrollerinin daha sağlıklı bir şekilde yapılmasına yönelik olarak, in vitro kültür periyodunun her 24 saatlik döneminde bir olmak üzere (ilk 24 saat hariç) embriyolar hücre çekirdek boyası ile boyanarak embriyonik hücre sayıları tespit edildi. 74M 16 medyumunun24 ve 48 saatlik kültür periyotlarında en yüksek embriyonik hücre sayısı ortalamaları sırasıyla 9.6 ± 3.2 ve 43.65 ± 9.65 ile 1 mg/ml grubunda gözlenirken, bu değer ile diğer tüm gruplarda bulunan değerler arasında istatistiksel açıdan önemli oranlarda farklılıklar gözlendi (p<0.05). in vitro kültür periyodunun 72. ve 96. saatlerinde de benzer veriler alındı ve sonuçta en yüksek embriyonik hücre sayısı ortalamasına sahip embriyoların 1 mg/ml BSA içeren grupta gelişenler olduğu belirlenirken (95.45 ± 9.61), bu değerin diğer tüm gruplardaki değerlere oranla istatistiki açıdan üstün olduğu saptandı (p<0.05). Oysa; embriyonal gelişim oranlarının natif muayene yöntemiyle belirlendiği çalışmanın ilk aşamasında, en yüksek gelişim oranına sahip olarak bulunan 3 mg/ml BSA grubundaki embriyoların hücre çekirdek sayılarının ancak 81.37 ± 18.31 de kaldığı ve 1 mg/ml'deki değer olan 95.45 ± 9.61 'lik hücre sayısı ortalaması ile arasındaki 14.08'lik farkın istatistiksel açıdan önem taşıdığı saptandı (p<0.05). Aynı miktarlarda BSA içeren Whitten's medyum gruplarında kültüre edilen embriyolara ait hücre çekirdek sayılarının, in vitro kültür periyodunun ilk 24 saatlik döneminde en yüksek olarak 9.6 ± 5.09 ortalama ile 3 mg/ml BSA grubunda meydana geldiği saptandı. Yapılan istatistiksel değerlendirmede bu değer ile diğer tüm BSA gruplarında bulunan ortalama değerler arasındaki farkların bu grup lehine olmak üzere önemli olduğu belirlendi (p<0.05). Kültür periyodunun 48 saatlik döneminde ise en yüksek ortalama değer 67.72 ± 22.90 ile 1 mg/ml BSA-grubunda gözlenirken, bu değer ile diğer tüm gruplardaki ortalama değerler arasındaki farkların istatistiksel anlamda önemli oldukları tespit edildi (p<0.05). Devam eden kültür periyodunun 72 ve 96. saatlerinde ise. en yüksek embriyonik hücre sayısı ortalaması yine 3 mg/ml BSA gruplarında ve sırasıyla 86.3 ± 6.73 ve 107.65 ± 10.27 olarak saptandı. Her iki saatte gözlenen bu değerler ile 1 mg/ml grubunda bulunan 92.75 ±7.18 ve 105.60 ± 11.52'lik ortalama değerlerle aralarında istatistiksel açıdan herhangi bir fark gözlenmedi (p>0.05). Buna karşın diğer tüm BSA gruplarında saptanan ortalama değerler, 3 mg/ml BSA grubundaki bu değerlerin oldukça altında gerçekleşti (p>0.05). Gerek M16 ve gerekse Whitten's medyumlarında, BSA miktarlarının sıfıra doğru azalması ve 36 mg/ml'ye doğru artması durumlarında embriyonik hücre sayısı ortalamalarında önemli oranlarda düşüşler gözlendi. Farklı medyumların aynı miktarlarda BSA içeren gruplarının birbirleriyle yapılan karşılaştırmalarında hiçbir BSA miktarı ve hiçbir saat açısından gruplar arasında istatistiksel anlamda önemli farklara rastlanmadı (p>0.05). Sonuç olarak, iki hücreli fare embriyolarının in vitro kültüründe protein kaynağı olarak BSA'nın olumlu katkılar yapabildiği ve kültür medyumu olarak gerek M16 ve gerekse de Whitten's medyumlarının rahatlıkla kullanılabileceği görüldü. Ancak in vitro kültür periyodu sonunda optimal sonucu elde etmek için; M16 medyumu kullanılacaksa 1 75mg/ml, Whitten's medyumu kullanılacaksa 3 mg/ml BSA yoğunluklarının tercih edilmesi gerektiği ortaya çıktı. Ayrıca embriyoların in vitro kültür ortamındaki gelişimlerinin sadece natif yolla yapılmasının yanıltıcı sonuçlar verebileceği, bunun yanında araştırmada kullandığımız hücre çekirdeklerinin boyanmasına dayalı yöntemin daha sağlıklı sonuçlar verebileceği kanısına varıldı. 76

Abstract:
9.SUMMARY EFFECT OF VARIOUS BSA LEVELS ON DEVELOPMENT OF MOUSE EMBRYOS IN IN VITRO CULTURE The study was performed in two stages. In the first stage, mice were superovulated, embryos were recovered, cultured in different culture media containing various levels of BSA for 96 hours and the control of embryonic developments by direct microscopic observation were done. In the second stage the culture of the embryos under same conditions for 96 hours and control of embryonic development at every 24 hour during the in vitro culture period by nuclear staining were performed. Out of 94 female mice. 72 with vaginal plug and 20 male mice for matings were used. Superovulation was achieved by 5 i.u. PMSG injection and 5 i.u. hCG injection 48 hours after that. 18.16 ± 8.65 two blastomere embryos, 1.26 ± 0.96 non fertilized oocyte and 0.39 ± 0.70 degenerated embryo per female were recovered by oviduct flushings. In the second stage of the study 50 plug bearing female out of 75 were used for embryo collection. By the same superovulation method 20.20 ± 4.06 two blastomere embryos, 2.54 ± 1.61 non fertilized oocytes and 1.57 ± 1.09 degenerated embryos Per female were recovered in this group. The two blastomer embryos collected in the first group were cultured for 96 hours in M 16 and Whitten's media containing 0 (control), 0.3, 1, 3, 9, 18 and 36 mg/ml BSA respectively under same conditions (at 37 ° C incubator under air containing 5% C02, 5% 02, 90% N2 and rearly 100% humidity). Developmental stages of embryos were observed at every 24 hour during in vitro culture period by neat observation technique. No statistical differences was observed among the M 16 medium groups containing 0 (control), 0.3, 1, 3, 9, 18 and 36 mg/ml BSA at the first 24 hours (p> 0.05). Highest development (100 ± 0.00 %) was observed in 3 mg/ml BSA containing group at 48. hour. No statistical difference was observed between these results and the groups (p> 0.05). Although there were important statistical differences (p< 0.05) between these results and the results of the groups containing lowest (0 mg/ml) and highest (18 and 36 mg/ml) BSA levels. Highest development rates at 72. and 96. hours of the in vitro culture period were 88.01 ± 16.06 % and 84.74 ± 17.61 % in 3 mg/ml BSA containing group. The difference between these values and the values of 1 and 9 mg/ml BSA containing groups was insignificant (p> 0.05), and between the values of other groups was significant (p<0.05). When the developments of the embryos cultured in Whitten's medium containing various levels of BSA were evaluated, highest development rate for the first 24 hour (100 77± 0.00 %) was observed in 3 mg/ml BSA containing group. No statistical difference was observed among the groups (p> 0.05). Highest development rate at the 48 hour of in vitro culture was 96.52 ± 6.70 % in 3 mg/ml BSA group. No important statistical difference was observed between this value and the values of 0. 0.3 and 1 mg/ml BSA containing groups (p> 0.05). Whilst the difference between this value and the values of the groups containing higher levels of BSA (9, 18 and 36 mg/ml) was important (p<0.05) in favor of 3 mg/ml BSA group. At 72 and 96 hours of in vitro culture highest embryonic development rate was, 94.57 ±7.43 % in the 3 mg/ml BSA group. There were no important statistical difference between this result and the result of 0.3 and 1 mg/ml BSA containing groups (p>0.05). The difference between this result and and the results of the group without BSA (0 mg/ml) arid the groups with higher BSA (9, 18 and 36 mg/ml) were statistically important in favor of 3 mg/ml BSA group (p<0.05). When the groups of M 16 and Whiten's media containing same amounts of BSA were compared at the end of in vitro period relating to their total hatching + hatched blastocyst rates, important statistical differences were observed in favor of 0, 0.3 and 1 mg/ml BSA containing groups of Whitten's medium (p<0.05). Contrary to this, no statistical importance were found among the high BSA (9, 18 and 36 mg/ml)containing groups (p>0.05). Highest total hatching + hatched blastocyst rates in both M 16 and Whitten's media were 44.34 ± 25.94 % and 67.70 ± 25.22 % respectively in 3 mg/ml BSA containing groups. Statistical evaluations showed that 23.36 difference in favor of Whitten's medium was not significant (p>0.05). In the second stage of the study, two blastomere mouse embryos were cultured for 96 hours in groups containing same amounts of BSA.At this stage, in order to control the developments embryos were stained with nucleus stains and nuclei were counted every 24 hours during in the in vitro culture period (except the first 24 hour). The highest embryonic cell numbers of M 16 medium at 24 and 48 hours culture period were 9.6 ±3.2 and 43.65 ± 9.65 respectively in 1 mg/ml BSA containing group, and these values were superior statistically to the values of all other groups (p<0.05). At 72. and 96. Hours of in vitro culture period similar results were achieved. Highest embryonic cell containing embryos were 69.60 ± 17.29 and 95.45 ± 9.61 in 1 mg/ml BSA containing group and these values were seen to be superior statistically to all the other groups (p<0.05). However, in the first stage of the study where the embryonic development rates were evaluated by neat observations, highest development rate was observed in 3 mg/ml BSA group but the cell numbers of the embryos in this group remained at 81.37 ± 18.31. The 14.08 difference between this value and the value of 1 mg/ml group (95.45 ± 9.61) was important statistically (p<0.05). In embryos cultured in similar BSA the highest embryonic cell number was mean 9.6 ± 5.09 in 3 mg/ml BSA group at 24 hours of the culture period. 78containing Whitten's medium groups. The statistical evaluations of the results revealed that the difference between this value and the values of all BSA groups was important (p<0.05) in favor of this group. At 48 hour of culture period, highest value was 67.72 ± 22.90 in 1 mg/ml BSA group and the differences between this group and other groups were important statistically (p<0.05). At 72 and 96 hours of culture period, highest embryonic counts were 86.30 ± 6.73 and 107.65 ± 10.27 respectively in 3 mg/ml BSA containing groups. No statistical difference was observed between these values and the values 92.75 ± 7.18 and 105.60 ± 11.52 of 1 mg/ml BSA group (p>0.05). However mean values of all BSA groups, were lower than this value of 3 mg/ml BSA group (p>0.05). Important decreases were observed in embryonic cell counts with the decrease of BSA amount in both M 16 and Whitten's media towards 0 and also with increase to 36 mg/ml. In comparison of the different media containing similar BSA amount no important statistical difference was seen among all BSA groups and all time periods (p>0.05). In conclusion, it was observed that BSA is a good protein resource and could be added to M16 and Whitten's media in in vitro culture of two cell mouse embryos. It is suggested to add 1 mg/ml BSA to M 16 and 3 mg/ml BSA to Whitten's media in order to get optimal results from in vitro culture also the observation of developmental stages of the embryos in in vitro culture can be achieved more accurately by nuclei staining procedures instead of using neat observation method only. 79