Kolorektal karsinomlarda DNA hatalı eşleşme (mismatch) tamir genleri MLH-1 ve MSH-2'nin karsinogenezdeki yeri ve tümör biyolojisi ile ilişkisi
The importance of mismatch repair genes (MLH-1 and MSH-2) in carcinogenesis and tumor biology of colorectal carcinomas
Yazar: ESRA UÇARYILMAZ
Danışman: DOÇ.DR. SİBEL ERDAMAR ÇETİN
İstanbul Üniversitesi / Cerrahpaşa Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2006
Konu: Patoloji = Pathology

Özet:
ÖZET VE SONUÇLARKolorektal karsinom, endüstriyel toplumlarda en sık görülen malignitelerdenbiridir. Kolorektal karsinomların çoğunun, onların prekürsör lezyonu olanadenomlardan geliştiği kabul edilmektedir. Bunun patolojik temeli adenom-karsinom sekansıdır. Adenomdan karsinoma geçişin, progresif olduğunainanılmaktadır.Kolorektal karsinom gelişiminde, çok sayıda genetik ve moleküler değişikliklerinyer aldığı başlıca iki yol bildirilmektedir. Bunlardan biri, tümör baskılayıcı yol olarakbilinir ve birçok odakta heterozigositenin kaybı ( Loss of heterozygosity = LOH ) ilekarakterizedir. Diğeri, belirgin mikrosatellit instabilite ile karakterize mutator yol olupmikrosatellit mutator fenotip (MMP) olarak da adlandırılır.Bu çalışmada,1997-2002 yılları arasında Cerrahpaşa Tıp Fakültesi PatolojiAnabilim Dalı'nda tanı almış, takip ve tedavi protokolleri bilinen, karsinom nedeniylekalın barsak rezeksiyonu yapılan 77 olgu ve 2003-2004 yıllarında yine Cerrahpaşa TıpFakültesi Patoloji Anabilim Dalı'nda tanı almış 17 adenom olgusu ele alındı. Her olguiçin; yaş, cinsiyet ve tümörle ilgili bilgiler patoloji raporlarından elde edildi. Klinikbilgiler, takip ve tedavi sonuçlarına ise Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Medikal OnkolojiBilim Dalı arşivindeki hasta dosyalarından ulaşıldı.Olguların lamları ışık mikroskobunda yeniden değerlendirildi. Her bir olgu için,karsinom alanlarını ve normal kalın barsak mukozasını birlikte içeren lamlar veayrıca metastatik lenf düğümlerinin bulunduğu lamlar; karsinom, normal mukoza vemetastatik lenf düğümleri işaretlenerek bunlardan doku mikroarray (tissuemikroarray=TMA)'i oluşturuldu. Tüm TMA blokları immunhistokimyasal olarak MLH-1ve MSH-2 için ticari olarak hazırlanan antikor ile boyandı.Çalışmanın K-ras mutasyonunun belirlenmesinde kullanılan polimeraz zincirreaksiyonu ( PCR) yöntemiyle yapılan bölümünde, doku mikrroarray için belirlenen77 karsinom olgusundan 42'si DNA izolasyonu ve PCR çalışmasına dahil edildi.K-ras genindeki mutasyonun Türkiye'deki sıklığı Polimeraz Zincir Reaksiyonu(PCR) yöntemiyle belirlendi, sonuçları diğer ülkelerde saptanan K-ras mutasyon1sıklıklarıyla karşılaştırıldı ve K-ras mutasyon varlığının klinikopatolojikparametreler ile sağkalım açısından ilişkili olup olmadığı değerlendirildi. Ayrıcaolgularda, mutator yolda yer alan DNA tamir genlerinden MLH-1 ve MSH-2'ninimmunhistokimyasal olarak ekspresyonunun klinikopatolojik parametreler ilesağkalım arasındaki ilişkisi belirlendi.Sonuç olarak;â¢ Kolorektal karsinom olgularının % 39,2' sinde MLH-1 ile boyanma kaybı, %6,8'inde MSH-2 ile boyanma kaybı izlenmiştir. Bu oran, literatürlerdebildirilenlerle benzerlik göstermektedir.Olguların 2 (% 3,1)'sinde hem MLH-1 hem MSH-2 ile boyanma kaybı mevcuttur.â¢Karsinom olgularının 40 (% 57,9)'ı hem MLH-1 hem MSH-2; 3 (% 4,3)'si sadeceâ¢MLH-1; 24 (% 34,7)'ü sadece MSH-2 ile boyanma göstermektedir.Olguların normal kalın barsak mukozalarında, karsinom dokularında ve lenfâ¢düğümlerindeki metastatik karsinom dokularında MLH-1 ile boyanma açısındanistatistiksel olarak anlamlı fark vardır (p<0,001). Ancak bu fark adenom vekarsinom dokuları arasında görülmemiştir (p=0,452).Elde edilen ortalama yoğunluk ve yaygınlık değerlerine göre; MSH-2 ileâ¢karsinom alanlarında normal kalın barsak mukozasına ve adenomlara göre dahaaz boyanma mevcuttur (p<0,005). Adenom ve normal kalın barsak mukozasıarasında ise boyanma açısından belirgin fark görülmemiştir.MLH-1 (-) / MSH-2 (-) olguların her ikisinde de peritümöral Crohn benzeriâ¢inflamasyon izlenmiştir.MSH-2 (-) olgularda literatürde belirtilen bulgulara ek olarak, peritümöralâ¢yoğun nötrofil infiltrasyonu görülmüştür.MSH-2 (-) olguların 3 (% 60 )'ünde sağ kolon lokalizasyonu saptanmıştır. Ancakâ¢bu bulgu istatistiksel olarak anlamlı değildir.mmunhistokimyasal olarak MLH-1 ve MSH-2 ile boyanmanın belirlenmesi,â¢sporadik kolorektal karsinom olgularında güvenilir bir yöntem olup farklımorfolojik özelliklerle birliktedir. Ancak immunhistokimyasal boyanmadeğerlerinin moleküler yöntemle birleştirilmesi hatalı eşleşme tamir genlerinindeğerlendirilmesini daha güvenilir hale getirmektedir.2Karsinom dokularında (% 32) ve lenf düğümlerindeki metastatik karsinomâ¢dokularında (% 21) p53 ekspresyonu, normal kalın barsak mukozasına (% 7)göre daha yüksektir (p<0,01). Lenf düğümlerindeki metastatik karsinomdokularındaki boyanma oranı, primer karsinom alanlarına göre daha düşüktür.PCR-RFLP uygulanan 42 olgudan 19 (% 57,6)'unda sadece Kodon 12 Mutasyonu,â¢16 (% 44,4)'sında sadece Kodon 13 Mutasyonu, 9 (% 25)'unda hem Kodon 12hem Kodon 13 Mutasyonu, 26 (% 74,3)' sında Kodon 12 veya Kodon 13Mutasyonu mevcuttur.Kodon 12'de mutasyon saptanan olguların mutasyon tipi 14 (% 33,3)'ündeâ¢heterozigot, 5 (% 11,9)'inde homozigottur. Kodon 13'te mutasyon saptananolguların mutasyon tipi ise 14 (% 33,3)'ünde heterozigot, 2 (% 4,8)'sindehomozigot olarak bulunmuştur. Mutasyon tipindeki farklılık, çalışmadaistatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.Ülkemizdeki Kodon 12 (% 57,6) ve Kodon 13 (% 42,4)'teki K-ras mutasyonâ¢sıklığı Tayvan'a ( Kodon 12 â % 22,7 ve Kodon 13 â % 4,4 ) ve Norveç'e( Kodon 12 â % 31 ve Kodon 13 â % 9 ) göre yüksek olup talya ile benzerorandadır. Ürdün (% 33,3 ) ve Mısır (% 18,4) ile karşılaştırıldığında ise çalışmagrubundaki K-ras mutasyon sıklığı daha yüksek olarak bulunmuştur.Farklı ülkelere göre mutasyon sıklıklarındaki farklılıklar diyet ve etnikâ¢faktörlerle açıklanabilir. Ancak bu farklılık çalışmalarda kullanılan değişikmoleküler tekniklere veya farklı vaka sayılarına da bağlı olabilir.COX Regresyon analizinde; MLH-1 / MSH-2 varlığı, K-ras Kodon 12 mutasyonu,â¢K-ras Kodon 13 mutasyonu varlığı yanısıra tüm klinikopatolojik parametrelerdeğerlendirmeye alındığında metastatik lenf düğümü sayısı ve evre, bağımsızprognostik faktör olarak bulunmuştur.Hastanın TNM evresi arttıkça, hastalıksız sağkalım süresi azalmaktadırâ¢(p=0,000). Buradaki en dramatik farklılık Evre 2 (75,87 Â± 6,32 ay) ile Evre 3(32,45 Â± 6,56 ay) olgular arasında gözlenmektedir. Bunun en önemli nedeni,Evre 3 tümörlerde lenf düğümü metastazının bulunmasıdır.â¢ Buna göre çalışma grubumuzda, evreyi ve yaşam süresini belirleyen önemligösterge, lenf düğümü metastazı varlığıdır.3Diğer önemli bulgu, metastatik lenf düğümü sayısıdır. Metastatik lenf düğümüâ¢sayısı 7'nin altında olan olgularda ortalama yaşam süresi 50,14 Â± 4,47 ay iken,metastatik lenf düğümü sayısı 7 ve üzerinde olanlarda 11,00 Â± 0,00 aydır(p=0,000 ).MLH-1 / MSH-2 ile boyanma kaybı hastalıksız sağkalımı etkilememektedir.â¢Bununla birlikte çalışma grubumuzda MSH-2 ile boyanma gösteren olgulardaortalama yaşam süresi (47,08 ay), göstermeyenlere göre (12,5 ay) belirginolarak daha fazladır. Bu, istatistiksel olarak anlamlı olmamakla birliktep=0,065 olması, daha büyük vaka grubu ile çalışıldığında p değerinin anlamlıolabileceğini düşündürmektedir.â¢ Kodon 12 mutasyonunun varlığı iyi prognostik faktör olarak bulunmuştur. Bubulgu literatürlerdeki bazı çalışma grupları ile benzerlik göstermektedir.Bununla birlikte çalışma daha büyük olgu serisi ile tekrar edilmelidir.Kodon 13 mutasyonunun varlığı Kaplan- Meier analizinde hastalıksız sağkalımıâ¢ve genel sağkalımı etkilememektedir. Bununla birlikte Kodon 13 mutasyonugösteren olguların ortalama yaşam süresi (50,91 Â± 7,86 ay), göstermeyenleregöre (67,38 Â± 9,47 ay) daha azdır.statistiksel olarak anlamlı bulunmamakla birlikte Kodon 12 veya Kodon 13â¢mutasyonlarından herhangi birini gösteren olguların ortalama yaşam süreleri(57,63 Â± 6,33 ay), göstermeyenlere göre (65,47 Â± 14,5 ay) daha kısabulunmuştur.Stroma yoğunluğu ( desmoplazi ) arttıkça yaşam süresi azalmaktadır. Ancak buâ¢durum, istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0,297).Doku mikroarray literatürlerde birçok avantaja sahip bir teknik olarakâ¢tanımlanmıştır. Avantajı, çok sayıda vakayı az sayıda blokladeğerlendirebilmektir. Bu durum çalışmamızda hem değerlendirmemizikolaylaştırmış, hem de zaman, kullanılan malzeme ve immunhistokimyasalantikor açısından ekonomi sağlamıştır.Çalışmamız; kolorektal karsinomlarda hem PCR kullanılarak K-ras mutasyonâ¢sıklığına bakılması, hem de doku mikroarray yönteminin ve MLH-1/MSH-2'ninimmunhistokimyasal olarak uygulanmasının Türkiye'de ilk olması açısındanönemlidir.4

Abstract:
SUMMARY AND RESULTSColorectal carcinoma is one of the most common malignancies of Westerncountries. Most of the colorectal carcinomas are assumed to be originated fromadenomas which are precursor lesions of them. The pathologic basis for this modelis the adenoma-carcinoma sequence. It is believed that development of carcinomafrom adenoma is progressive.There are 2 major pathogenetic pathways in colorectal carcinogenesis andeach pathway contains lots of steps covering mutations. One of these is known astumor supressor pathway that is characterized as loss of heterozygosity (LOH) inmultiple genes. Another one is mutator pathway characterized by explicitmicrosatellite instability and also known as microsatellite mutator phenotype(MMP) or Mutator Pathway.Our study group consist of 77 large bowel resection material belonged tocolorectal carcinoma cases with known follow-up that were diagnosed inCerrahpaşa Medical Faculty Pathology Department during 1997-2000 and 17adenomas that were also diagnosed in Cerrahpaşa Medical Faculty PathologyDepartment in 2003-2004 were investigated. For each case; age, sex and tumorinformation were taken from pathology reports. Clinical follow-up and therapyinformation were obtained from archives of Cerrahpaşa Medical Faculty OncologyDepartment.All slides of cases were analysed again with light microscopes. For each case,slides containing carcinomas and normal large bowel mucosa together and alsometastatic lymph nodes were marked. Then tissue microarray (TMA) was builtedusing core biopsies taken from carcinomas, normal mucosa and metastatic lymphnodes. All TMA blocks were immunostained with antibodies for MLH-1 and MSH-2that were obtained commercially. 42 of 77 cases had been selected for tissuemicroarray were available for DNA isolation and PCR-RFLP analysis to detect K-rasmutation in our study.1In this study, the frequency of K-ras gene mutation of our colorectal carcinomacases was detected by polymerase chain reaction (PCR) and the results werecompared with the results of other countries. Correlations were analysed between theK-ras mutations and clinicopathologic parameters and survival. Also it?s investigatedimmunohistochemically, the relation of DNA mismatch repair gene (MLH-1 / MSH-2)expressions in colorectal carcinomas with clinicopathologic parameters and survival.As a result;It was found that loss of MLH-1 expression in % 39,2 and loss of MSH-2â¢expression in % 6,8 of our study group. This finding was shown similaritywith the literature.There was loss of expression both MLH-1 and MSH-2 in 2 (% 3,1) of cases.â¢40 (% 57,9) of cases were expressed both MLH-1 and MSH-2; 3 (% 4,3) ofâ¢them were expressed only MLH-1; 24 (% 34,7) of them were expressed onlyMSH-2 and otherwise 2 (% 2,9) of them are neither expressed MLH-1 norMSH-2.It?s found that there was significant difference between normal large bowelâ¢mucosa, carcinoma tissue and metastatic carcinoma tissues in lymph nodesfor MLH-1 expression (p<0,001). But; no statistically significant differencewas seen between adenomas and carcinoma tissues with MLH-1 expressions(p=0,452).According to mean intensity and percentage values, carcinoma tissues wereâ¢stained with MSH-2 less than normal large bowel mucosa and adenoma cases(p<0,005). There was no significant difference between adenoma andnormal large bowel mucosa for MSH-2 expression.In cases with MLH-1 (-) / MSH-2 (-), there was prominent peritumoral crohn-â¢like inflamatory reaction.MSH-2 (-) cases had prominent peritumoral neutrophylic infiltration inâ¢addition to the findings reported in the literatures.In 3 (% 60) of MSH-2 (-) cases, right colon localization was observed. But;â¢this finding was not statistically significant.2Analysis of MLH-1 and MSH-2 expressions using immunohistochemical method isâ¢a reliable method in sporadic colorectal carcinoma cases. However,immunohistochemical analysis should be combined with molecular methods formore reliable evaluation of mismatch repair genes.Expression of p53 was more extensively observed in carcinoma tissues (% 32)â¢and metastatic carcinoma tissues in lymph nodes (%21) with compare tonormal large bowel mucosa (%7) (p<0,01). Additionally, carcinoma tissueswere stained more than metastatic carcinoma tissues in lymph nodes.Using PCR-RFLP analysis, it?s found that 19 (% 57,6) case had only Codon 12â¢mutation, 16 (% 44,4) case had only Codon 13 mutation, 9 (% 25) case had bothCodon 12 and Codon 13 mutations, 26 (%74,3) case had Codon 12 or Codon 13mutations.Mutation types of Codon 12 in the cases were 14 (% 33,3) heterozygote and 5â¢(%11,9) homozygote. Codon 13 mutation types were 14 (%33,3) heterozygoteand 2 (%4,8) homozygote. Differences between mutation types were notstatistically significant.In Turkey, K-ras mutation frequency at Codon 12 (% 57,6) and Codon 13â¢(% 42,4) was higher than Taiwan (Codon 12 â % 22,7 and Codon 13 â % 4,4 )and Norway (Codon 12 â % 31 and Codon 13 â % 9 ) and almost in same levelof Italy. And in our study K-ras mutation freguencies were found higher thanJordan (% 33,3) and Egypt (% 18,4).Differences in mutation frequencies in different countries can be explained byâ¢diet and ethnical factors. However, the reason of this difference may berelated to different molecular techniques had been used in differentlaboratories or number of cases.In COX regression analysis, in addition to MLH-1/MSH-2 expressions, K-rasâ¢Codon 12 mutation, K-ras Codon 13 mutation; all of the clinicopathologicalparameters were taken into account. Number of metastatic lymph nodes andstage were found to be independent prognostic factor in our study group.As patients? TNM stage increases, disease free survival decreases (p=0.000).â¢Most dramatical decreasing was observed between stage 2 (75,87 Â± 6,32months) and stage 3 (32,45 Â± 6,56 months) cases. Most important reason forthis decreasing is lymph node metastasis in stage 3 carcinomas.3In our study it was stated that existence of lymph node metastasis was theâ¢most important parameter predicting stage and survival.The other important finding was number of metastatic lymph nodes. It wasâ¢found that; whenever number of metastatic lymph nodes was less than 7 meansurvival was 50.14Â±4,47 months and when it was 7 or higher, time wasobserved as 11.00Â±0.00 (p=0.000).Loss of MLH-1/MSH-2 expression was not affect disease free survival. Also, itâ¢was observed that in MSH-2 expression cases, mean survival (47,08 months)was considerably less (12,5 months) than MSH-2 (-) cases. However this results(p=0.065) were not statistically siginificant, it was thought that wheneverlarger number of cases were considered p value could become significant.Existence of Codon 12 mutation was found as good prognostic factor. Thisâ¢finding was similar with the results in some literatures. But this finding shouldbe repeated with larger study group.Existence of Codon 13 mutation was not affect overall survival or disease freeâ¢survival in Kaplan-Meier analysis.However, mean survival of Codon 13mutation cases (50,91Â±7,86 months) were less than non-mutant cases(67,38Â±9,47 months).Even it was not statistically significant, it was found that mean survival ofâ¢cases who has either Codon 12 or Codon 13 mutations (57,63 Â± 6,33 months)was less than non-mutant one (65,47 Â± 14,5 months).As long as, carcinoma tissue had more desmoplasia, their survival wasâ¢decreased. But this finding was not statistically significant (p=0.297).Tissue microarray tecnique was defined with lots of advantages in literatures.â¢Main advantage is to maintain for analysis of many cases in minimum numberof blocks. So, this cost-effective technique allows us to study in large groups inshort time especially in immunohistochemical staining.We proudly report here our first results in frequency and genotypes of K-rasâ¢mutations and mismatch repair gene analysis of colorectal carcinoma cases inTurkish population which was done in first time in Turkey.4