Trakeal stenozda D-valin etkisi; invitro ve invivo deneysel çalışma
D-valine effect in tracheal stenosis; invitro and invivo experimental study
Yazar: MEHMET AKİF EKİCİ
Danışman: DOÇ. DR. AHMET ULUŞAN
Gaziantep Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göğüs Cerrahisi Ana Bilim Dalı / Deneysel Cerrahi Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi = Thoracic and Cardiovascular Surgery
Dizin: D-valin = D-valin ; Fibroz = Fibrosis ; Tavşanlar = Rabbits ; Trakea = Trachea ; Trakea hastalıkları = Tracheal diseases ; Trakeal stenoz = Tracheal stenosis ; İn vitro = In vitro ; İn vivo = In vivo

Özet:
Amaç: Bu çalışmada hücre kültüründe fibroblastları seçici olarak uzaklaştırmak
için kullanılan bir molekül olan D-valinin fibroblastların çoğalmasını inhibe ederek
trakeal stenoz tedavisindeki yerini göstermek amaçlandı.
Yöntem:
İnvitro deneysel çalışma: Çeşitli nedenlerle lobektomi veya pnömonektomi
yapılan 10 hastanın ameliyat eksplantlarından, tanı için patoloji tarafından kullanılan
materyalden arta kalan doku kullanıldı. Aynı hastadan hem bronş epitel hücre kültürü
hem fibroblast kültürü elde edildi. İlk 4 hastanın kültürleri standardizasyon için
kullanıldı ve beş D-valin konsantrasyonu (10,12.5,15,17.5,20 mM) belirlendi. Sonraki 6
hastanın örnekleri her birinden bronş epitel ve bağ doku ayrı ayrı ekildi ve beş farklı Dvalin
konsantrasyonu ve serum fizyolojik uygulanan altı grup oluşturuldu. Her hastanın
epitel ve bağ dokusu kültüre edildi. Ancak teknik sebepler ve dokuların farklı üreme
hızları nedeniyle eş zamanlı kültür edilip çalışılamadı. Bu yüzden her doku kültür
edildi, ama %70 yayılım gösteren hücreler deneye alındı. Hücre kültürleri 96 kuyucuklu
(ml/2000hücre) platelerde %70-80 oranında yüzeyi kaplar hale geldiklerinde, D-valinin
farklı konsantrasyonları (10,12.5,15,17.5,20 mM) ile 24 saat süre ile inkübe edildi.
Hücrelerin canlılığı MTT (3- [4,5- dimethylthiazol- 2- yl]- 2,5- diphenyltetrazoliumbromide)
yöntemi ile değerlendirildi. Kısaca, kültür vasatı 1 mg/ml MTT
(Sigma) içeren SF vasatı ile değiştirilerek 37 C de 30 dk süre ile inkübe edildi. Daha
sonra MTT solüsyonu dökülüp, hücrelerin üzerine DMSO (Sigma) konuldu. Renkteki
değişim kolorometrik bir okuyucu ile (spektrofotometre) 550 nm'de okundu. D-valin in
en uygun inhibe edici dozları tespit edildi.
İnvivo Deneysel Çalışma: 20 (yirmi) adet yetişkin Yeni Zellanda beyaz tavşanı
(2 ila 3,4 kg) randomize 4 gruba ayrıldı. Birinci grup kontrol grubu, ikinci grup serum
fizyolojik (SF) uygulanan grup, üçüncü grup lokal steroid (Deksametazon 2 mg)
uygulanan grup, dördüncü grup D-Valin uygulanan grup olmak üzere, her grupta 5
tavşan yer aldı. Tüm hayvanlara standart cerrahi prosedür uygulanarak trakeal stenoz
indüklendi. 15. günde kontrol grubunda bulunan hayvanlar aşırı doz pentobarbital ile
sakrifiye edildi, trakeal stenoz oluştuğu histopatolojik olarak gösterildi. Takip eden
günlerde diğer gruplarda da aynı cerrahi yöntem uygulanarak cerrahi sırasında ikinci
gruba serum fizyolojik, üçüncü gruba deksametazon(2 mg/0,5 ml), dördüncü gruba Dvalin
(20 mM/0,5 ml) tek seferde uygulandı. 15. günün sonunda tüm hayvanlar sakrifiye
edilerek trakeaları histopatolojik olarak incelendi.
Bulgular:
V
İnvitro Deneysel Çalışma: Epitel ve bağ doku kültürlerinde SF ve 5 farklı Dvalin
konsantrasyonu arasında anlamlı fark bulunmadı. 20 mM konsantrasyonda epitel
ve bağ doku kültürleri arasında pozitif yönde anlamlı korelasyon bulundu.
İnvivo Deneysel Çalışma: Kontrol grubu tavşanlarda submukozal kalınlık
literatürün aksine diğer gruplardan daha az görüldü ve istatistiksel olarak anlamlı
bulundu (p=0,004, p=0,006, p=0,022). SF, deksametazon ve D-valin grupları arasında
anlamlı fark bulunmadı. Fibrozis oranlarına bakıldığında kontrol grubu ile SF
uygulanan grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulundu; ancak kontrol
grubunda fibrozis oranı daha düşüktü (p=0,001). Kontrol grubu ile diğer iki grup
arasında ve SF, deksametazon ve D-valin gruplarının kendi aralarında
karşılaştırılmasında ise anlamlı bir fark bulunmadı.
Sonuçlar: Literatür incelendiğinde trakeal stenozda D-valin etkisi üzerine bir
çalışmaya rastlanmadı. Dolayısıyla çalışmamız bu konuda ilk olma özelliği
taşımaktadır. Ayrıca trakeal stenoz üzerine hem invitro hem invivo çalışılması
nedeniyle de önem arz etmektedir. D-valin in fibrozis üzerine baskılayıcı etkisi
bilinmektedir. Ancak invitro koşullarda fibroblastları baskıladığı konsantrasyonlarda
epitel dokuyu da etkilediği görüldü. İnvivo koşullarda ise göreceli olarak fibrozisi
etkilediği izlendi, ancak istatistiksel olarak anlamlı sonuç elde edilemedi. İnvitro
koşullarda daha fazla konsantrasyon denenmesi, invivo koşullarda ise daha fazla hayvan
sayısı ve çeşitli hayvanlarla deneyin tekrarlanması yol gösterici olacaktır.

Abstract:
Objective: In this study, it was aimed to show the place of D-valine, a molecule
used to selectively remove fibroblasts in cell culture, in the treatment of tracheal
stenosis by inhibiting the proliferation of fibroblasts.
Methods: In vitro experimental study; The remaining tissue from the
material used by the pathology for diagnosis surgical explants of 10 patients who
underwent lobectomy or pneumonectomy for various reasons was used. Both bronchial
epithelial cell culture and fibroblast culture were obtained from the same patient. The
cultures of the first 4 patients were used for standardization and five D-valine
concentrations (10,12.5,15,17.5,20 mM) were determined. The bronchial epithelium and
connective tissue samples from each of the next 6 patients were seeded separately, and
six groups were formed that were treated with five different D-valine concentrations
and saline. Epithelial and connective tissue of each patient were cultured. However, due
to technical reasons and different growth rates of the tissues, they could not be cultured
and studied simultaneously. Therefore, each tissue was cultured, but cells with 70%
dispersal were included in the experiment. When cell cultures became 70-80% surface
coverage in 96-well (ml/2000 cells) plates, they were incubated with different
concentrations of D-valine (10,12.5,15,17.5,20 mM) for 24 hours. Cell viability was
evaluated by the MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl- tetrazoliumbromide)
method. The culture medium was replaced with SF medium containing 1 mg/ml MTT
(Sigma) and incubated at 37°C for 30 min. Then, MTT solution was poured and DMSO
(Sigma) was placed on the cells. The change in color was read at 550 nm with a
colorometric reader (spectrophotometer). The most appropriate inhibitory doses of Dvaline
were determined.
In vivo Experimental Study: 20 (twenty) adult New Zealand white rabbits (2
to 3.4 kg) were randomly divided into 4 groups. There were 5 rabbits in each group, as
the first group was the control group, the second group was administered saline (SF),
the third group was administered local steroid (Dexamethasone 2 mg) and the fourth
group was the group administered D-Valine. Tracheal stenosis was induced in all
animals by performing a standard surgical procedure. On the 15th day, the animals in
the control group were sacrificed with an overdose of pentobarbital, and tracheal
stenosis was demonstrated histopathologically. In the following days, the same surgical
method was applied in the other groups, and saline was administered to the second
group, dexamethasone (2 mg/0.5 ml) to the third group, and D-valine (20 mM/0.5 ml) to
the fourth group at one time during surgery. At the end of the 15th day, all animals were
sacrificed and their tracheas were examined histopathologically.
VII
Results:
Invitro Experimental Study: No significant difference was found between SF
and 5 different D-valine concentrations in epithelial and connective tissue cultures. A
significant positive correlation was found between epithelial and connective tissue
cultures at 20 mM concentration.
In vivo Experimental Study: Contrary to the literature, submucosal thickness
was observed less in the control group rabbits than in the other groups and it was found
to be statistically significant (p=0.004, p=0.006, p=0.022). There was no significant
difference between SF, dexamethasone and D-valine groups. When the fibrosis rates
were examined, a statistically significant difference was found between the control
group and the SF applied group; however, the fibrosis rate was lower in the control
group (p=0.001). No significant difference was found between the control group and the
other two groups, and when the SF, dexamethasone and D-valine groups were
compared among themselves.
Conclusions: When the literature was examined, no study was found on the
effect of D-valine in tracheal stenosis. Therefore, our study is the first in this regard. It
is also important because it is studied both in vitro and in vivo on tracheal stenosis. The
suppressive effect of D-valine on fibrosis is known. However, it was observed that it
also affected epithelial tissue at concentrations that suppressed fibroblasts under in vitro
conditions. In vivo conditions were observed to affect fibrosis relatively, but statistically
significant results could not be obtained. Trying more concentrations in in vitro
conditions, and repeating the experiment with a larger number of animals and various
animals in in vivo conditions will be guiding.