Romatoid artrit tedavisine yönelik protein A- takılı poli(HEMA) kriyojellerin hazırlanması
Preparation of protein A-attached poly(HEMA) cryogels for rheumatoid arthritis treatment
Yazar: MEHMET HÜSEYİN ALKAN
Danışman: DOÇ. DR. ZÜBEYDE BAYSAL
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Romatoid artrit (RA) vücudun kendi bağışıklık sisteminin sağlıklı hücrelere saldırdığı bir otoimmün bozukluktur. Dünya nüfusunun %1-3' ünde RA görülmektedir. Son yıllarda RA hastaları için tedavi yöntemlerinde oldukça yol katedilmiştir. Bu yöntemlerden biri olan immünoadsorpsiyon yöntemi ile, plazmadan sadece patojen antikorlar uzaklaştırılmaktadır. Ligand olarak Staphylococcal Protein A ile afinite kromatografi uygulamaları, antikor saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Protein A, antikorların Fc kısımlarına spesifik olarak bağlanan bir proteindir.Sunulan çalışmada, RA tedavisine yönelik protein A takılı-Poli(2-hidroksietil metakrilat) kriyojel hazırlanmıştır. İlk basamakta yığın polimerizasyon tekniği ile plastik şırıngada monomerin sulu çözeltide donmasıyla (donmuş-polimerizasyon) Poli(HEMA) kriyojel hazırlanmıştır. Buz eridikten sonra Poli(HEMA) kriyojelinde 10-200 µm gözenek boyutunda birbiriyle bağlantılı makrogözenekler oluşturulmuştur. Daha sonra CNBr ile aktive edilip spesifik ligand olarak protein A bağlanmıştır. Hazırlanan protein A takılı-Poli(HEMA) kriyojel yüzey alan ölçümleri, şişme testleri, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve FTIR ile karakterize edilmiştir. Protein A takılı-poli (HEMA) kriyojelinde maksimum immünoglobülin G (IgG) adsorpsiyonu pH 7.4' te 83.2 mg/g olarak bulunmuştur. İnsan plazmasından adsorpsiyon incelendiğinde ise daha da yüksek adsorpsiyon kapasitesi elde edilmiştir (98.7 mg/g). Poli(HEMA) kriyojelin spesifik olmayan IgG adsorpsiyonu ise 0.38 mg/g olarak belirlenmiştir. Adsorbe olan IgG 0.1 M Glisin-HCl (pH 3.5) tamponuyla % 85 saflıkta elüe edilmiştir. Sıcaklık deneylerinde 37°C' de maksimum IgG adsorpsiyon kapasitesi (98.8 mg/g) gözlenmiştir.İmmobilize edilen protein A miktarı artıkça adsorplanan romatoid faktörün de artığı gözlenmiştir. İnsan Serum Albumin (HSA) ve IgG protein karışımı ile insan plazması için hesaplanan RS değerleri sırasıyla 2.28 ve 2.63 olarak bulunmuştur.Kan uyuşabilirlik çalışmalarında pıhtılaşma zamanı (CT), aktive kısmi tromboplastin zamanı (APTT), protrombin zamanı (PT) ve fibrinojen zamanı (FT) tayin edilmiş, protein A takılı-Poli (HEMA) kriyojellere ait bütün pıhtılaşma zamanlarının poli (HEMA) kriyojele göre arttığı gözlenmiştir.Protein A takılı- Poli(HEMA) kriyojel ile 10 kez adsorpsiyon/desorpsiyon yapıldığında IgG adsorpsiyon kapasitesinde belirli bir azalma olmadan tekrar kullanılabilir olduğu görülmüştür.

Abstract:
Rheumatoid arthritis is an autoimmune disorder in which the immune system of the body attacks healthy cells. RA prevails among 1-3 % of the world population. In recent years, the RA treatment methods have advanced greatly. One of the methods involving the removal of only pathogenic antibodies out of the plasma is immunoadsorption. Affinity chromatography applications utilizing Staphyloccal Protein A as the ligand have been widely used in antibody purification. Protein A is a protein which binds specifically to Fc domain of the antibodies.In the present study, protein A immobilized poly(2-hydroxyethyl methacrylate) cryogel was prepared. Firstly, poly(HEMA) cryogel was prepared by bulk polymerization which involves freezing of the monomer in aqueous solution in a plastic syringe. After thawing, adjacent pores of 10-200 µm in size formed in the matrix of poly(HEMA) cryogel. The cryogel was then activated by cyanogen bromide (CNBr) followed by immobilization of protein A. The protein A immobilized poly(HEMA) cryogel was characterized by surface area measurements, swelling tests, scanning electron microscopy (SEM) and FTIR. The maximum IgG adsorption by the immobilized cryogel was found to be 83.2 mg/g at pH 7.4. Higher adsorption capacity of IgG (as high as 98.7 mg/g) was reached by the cryogel when human plasma was used. The non-specific IgG adsorption onto the poly(HEMA) cryogel was about 0.38 mg/g. The IgG adsorbed was eluted using 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 3.5) with a purity of 85 %. Maximum IgG adsorption capacity was determined to be 98.8 mg/g at 37 oC in temperature experiments.It was observed that the rheumatoid factor increased as the immobilized protein A in the cryogel was increased. The computed Rs values for a mixture of Human Serum Albumin (HSA) and Immunoglobulin G (IgG) proteins and human plasma were 2.28 and 2.63, respectively.It was observed that the factors of Clotting Time (CT), Active Partial Tromboplastine Time (APTT), Protrombine Time (PT) and Fibrinogen Time (FT) increased with protein A immobilized poly(HEMA) cryogel as compared to poly(HEMA) cryogel.Protein A immobilized poly(HEMA) cryogel used for repetitive adsorption/desorption of IgG without noticeable decrease in IgG adsorption capacity after ten cycles.