Endokrin bozucu bileşiklerden Tetrabromobisfenol A'nın gebe sıçanlara etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of Tetrabromobisfenol A as an endocrine disrupting compound on pregnant rats
Yazar: MEVLAHAN ÖZKAN
Danışman: PROF. DR. NURHAYAT BARLAS ; PROF. DR. EVRİM ARZU KOÇKAYA
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Alev geciktirici = Flame delayer ; Endokrin bozucu kimyasallar = Endocrine disrupting chemicals ; Plasenta = Placenta ; Sıçanlar = Rats ; Toksisite = Toxicity ; Üreme biyolojisi = Reproductive biology

Özet:
Yanma geciktiriciler arasında en çok üretimi gerçekleşen TBBP-A (tetrabromobisfenol-A) yüksek konsantrasyonlarda tekstil, plastik polimer, elektrikli ekipmanlar ve endüstriyel ürünlerde bulunmaktadır. Endokrin bozucu olduğu bilinen ve konserve iç kaplamalarda kullanılması günlük hayatta özellikle beslenme yoluyla maruz kalmayı arttırmaktadır. Gebeler için bu durumun daha riskli olduğu düşünülmektedir. Bu sebeple çalışmamızda gebelerin oral yolla TBBP-A'ya maruz kalmasından sonra plasenta dokusu üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. 
Sıçanlardaki üç haftalık gebelik süresi üç trimester (1'er hafta) şeklinde gruplandırılmakta ve insanların üç trimester (3'er ay) dönemlerine denk gelmektedirler. Çalışmamızda bu bilgiler doğrultusunda üç trimesterin inceleneceği bir deney düzeneği oluşturulmuş ve gebelikle beraber gelişen plasenta dokusunun incelenmesi esas alınmıştır. 
Çalışmamızda 72 adet gebe Rattus norvegicus tür sıçan kullanılmıştır. Damızlık olarak temin edilen erkek sıçanlarla çiftleştirilip dişi smear örneklerinde sperm tespit edilen her dişi, gebe kabul edilip deney gruplarına dahil edilmiştir. Deney grupları: GD10 (10.gebelik günü) kontrol (mısır yağı), 20mg/kg (minimum), 200mg/kg (orta), 400mg/kg (yüksek) doz; GD15 (15.gebelik günü) kontrol, 20mg/kg, 200mg/kg, 400mg/kg doz; GD20 (20.gebelik günü) kontrol, 20mg/kg, 200mg/kg, 400mg/kg doz şeklindedir. Her grup gebelik günü boyunca (10, 15 ve 20. günler) mısır yağında çözdürülen TBBP-A'ya oral gavaj yöntemiyle maruz bırakılmıştır. Her bir grupta 6 sıçan bulunmaktadır. Uygulama süresince sıçanların yem-su tüketimi, ağırlık değişimleri kaydedilmiş, son aşama diseksiyondan sonra plasenta, böbrek, karaciğer ve ovaryum dokuları alınmış, ağırlıkları kaydedilmiş, histopatolojik yönden ışık mikroskobunda incelenmek üzere doku takibi aşamalarından geçirilmiştir. Tüm dokular H&E ile plasenta dokusu buna ek olarak PAS boyama yöntemi ile boyanmıştır. Sıçanların kalplerinden alınan kandan elde edilen serumlardan Folikül Stimule Edici Hormon (FSH), progesteron, Luteinize Edici Hormon (LH), östrojen hormon analizleri yapılmıştır. GD20 grubu dişi fetüslerin ovaryum doku homojenatından östrojen, erkek fetüslerin testis doku homojenatından ise testosteron hormon değerlerine bakılmıştır.
Deney sonunda GD20 grubu sıçanların besin ve su tüketimleri ile bitiş ağırlıklarında azalma tespit edilmiştir. Doku ağırlıkları bulgularında, GD20 grubu sıçanların böbrek ve plasenta rölatif ağırlık değerlerinin azaldığı görülmüştür. GD15 grubu sıçanların plasenta ağırlık, embriyo ağırlık, plasenta X ekseni uzunluk ile GD20 grubu sıçanların embriyo uzunluk ve göbek kordon uzunluklarında azalma tespit edilmiştir. GD15 grubu sıçanların sol böbrek ağırlık ve plasental indeks değerlerinde artış saptanmıştır. 
Histopatolojik yönden incelenen dokulardan, karaciğer dokusunda konjesyon ve sinüzoidal genişleme; böbrek dokusunda konjesyon, glomerular atrofi, glomerulus pariyetal yapraklarda açılma, tübüler dejenerasyon görülmüştür. Plasenta dokusunda, GD10 200mg/kg, GD10 400mg/kg, GD15 ve GD20 gruplarının tüm doz gruplarında konjesyon; GD15 ve GD20 gruplarının tüm doz gruplarında labirent bölge dejenerasyonu, dev hücrelerde sitoplazmik erime ve piknozis ile spongiyotrofoblastlarda dejenerasyon tespit edilmiştir.
Alcian Blue ve Alizarin red ile boyanan kontrol ve TBBP-A uygulama gruplarına ait GD20 grubu fetüs iskeletlerinin kemik ölçüm değerlendirmesi yapılmıştır. İskelet ölçümlerinde x-y eksen iskelet çapı, sağ-sol skapula, sağ-sol humerus, sağ-sol radius, sağ-sol ulna, sağ ilium, sağ femur, sol tibia gerçek uzunlukları kontrol grubuna göre anlamlı azalma gözlenmiştir. 
Serum FSH değerleri GD20 grubunda istatistiksel olarak artış göstermiştir. Serum progesteron ve LH değerleri GD15 grubunda istatistiksel olarak artış göstermiştir. Serum östrojen değerlerinde artış ve azalmalar varsa da istatistiksel olarak anlamlı değillerdir. GD20 dişi fetüslerin östrojen hormon değerleri 20mg/kg uygulama grubu kontrol grubuna göre istatistiksel olarak azalma gösterirken, 200mg/kg uygulama grubu kontrol grubuna göre istatistiksel olarak artış göstermiştir. GD20 erkek fetüslerin testosteron hormon değerleri göre istatistiksel olarak artış göstermiştir.
Sonuç olarak gebelere oral yolla uygulanan TBBP-A'nın etkileri hem maternal hem fetal bazı olumsuzluklara sebep olmuştur. Plasenta dokusunun detaylı histopatolojik incelenmesi ile birlikte incelenen hormonlar üzerine etkisi dikkate alındığında endokrin bozuculuğu gösterilmiştir.

Abstract:
TBBP-A (tetrabromobisphenol-A), which is the most produced among the fire retardants, is found in high concentrations in textiles, plastic polymers, electrical equipment and industrial products. It is known to be endocrine disruptor and its use in canned interior coatings increases exposure in daily life, especially through diet. This situation is considered to be more risky for pregnant women. For this reason, in our study, it was aimed to investigate the effects of pregnant women on placental tissue after oral exposure to TBBP-A.
The three-week gestation period in rats is grouped into three trimesters (1 week each), and they correspond to three trimesters in humans. In our study, in line with this information, an experimental setup was created to examine the three trimesters, and the examination of the placental tissue that develops with pregnancy was based on.
In our study, 72 pregnant Rattus norvegicus rats were used. Each female, which was mated with male rats provided as breeding and sperm was detected in the female smear samples, was considered pregnant and included in the experimental groups. Experimental groups: GD10 (10th gestational day) control (corn oil), 20mg/kg (minimum), 200mg/kg (moderate), 400mg/kg (high) dose; GD15 (day 15 of gestation) control, 20mg/kg, 200mg/kg, 400mg/kg dose; GD20 (20th gestational day) is in the form of control, 20mg/kg, 200mg/kg, 400mg/kg. Each group was exposed to TBBP-A dissolved in corn oil by oral gavage method during the gestational day (days 10, 15 and 20). There are 6 rats in each group. During the application, the feed-water consumption and weight changes of the rats were recorded. After the last stage of sacrification, the tissues of the placenta, kidney, liver and ovary were taken, their weights were recorded, and the tissue was followed up to be examined histopathologically under the light microscope. All tissues were stained with H&E and placenta tissue was additionally stained with PAS staining method. Follicle Stimulating Hormone (FSH), progesterone, Luteinizing Hormone (LH), estrogen hormone analyzes were made from the serum obtained from the blood obtained from the hearts of rats. Estrogen from the ovarian homogenate of GD20 group fetuses and testosterone from the testicular homogenate of male fetuses were examined.
At the end of the experiment, it was determined that the food and water consumption and the ending weights of the GD20 group rats decreased. In the tissue weight findings, it was observed that the kidney and placenta relative weight values of the GD20 group rats decreased. It was determined that placental weight, embryo weight, placental X-axis length of GD15 group rats and embryo length and umbilical cord length of GD20 group rats were decreased. There was an increase in left kidney weight and placental index values of GD15 group rats.
Among the tissues examined histopathologically, congestion and sinusoidal enlargement in the liver tissue; Congestion in kidney tissue, glomerular atrophy, opening of glomerulus parietal leaves, tubular degeneration were observed. In placental tissue, congestion in all dose groups of GD10 200mg/kg, GD10 400mg/kg, GD15 and GD20 groups; In all dose groups of GD15 and GD20 groups, labyrinth region degeneration, cytoplasmic melting and pycnosis in giant cells and degeneration in spongiotrophoblasts were detected.
Bone measurement evaluation of the GD20 group fetal skeletons of the control and TBBP-A application groups, which were stained with Alcian Blue and Alizarin red, was performed. In skeletal measurements, a significant decrease was observed in x-y axis skeletal diameter, right-left scapula, right-left humerus, right-left radius, right-left ulna, right ilium, right femur, left tibia real lengths compared to the control group.
Serum FSH values increased statistically in the GD20 group. Serum progesterone and LH values increased statistically in the GD15 group. Although there are increases and decreases in serum estrogen values, they are not statistically significant. Estrogen hormone values of GD20 female fetuses decreased statistically in the 20mg/kg administration group compared to the control group, while the 200mg/kg administration group showed a statistical increase compared to the control group. GD20 male fetuses showed a statistical increase in testosterone hormone levels.
As a result, the effects of TBBP-A administered orally to pregnant women caused both maternal and fetal negativities. Considering the effect on the hormones examined together with the detailed histopathological examination of the placental tissue, endocrine disruption has been shown.