Şap virüsü üretiminde kullanılan BHK 21 An30 hücrelerinin kesikli üretim prosesinde biyokinetik parametrelerinin incelenmesi
Investigation of biokinetic parameters for batch production process of BHK 21 An30 cells for FMD virus production
Yazar: MUSTAFA ÖZYİĞİT
Danışman: PROF. DR. ABDURRAHMAN TANYOLAÇ ; PROF. DR. DENİZ TANYOLAÇ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, glikoz, glutamin, laktat ve amonyum derişimlerinin şap virüsü üretiminde kullanılan BHK 21 An30 hücreleri biyokinetik parametreleri üzerine olan etkileri araştırılmıştır.Çalışmalar kesikli işletim sistemiyle çalıştırılan biyoreaktörlerde hücre kültürü ve şap virüsü kültürleri şeklinde iki bölüm halinde gerçekleştirilmiştir.Hücre kültürleri için başlangıç glikoz, laktat, glutamin ve amonyum derişimleri sırasıyla 12-44 mM, 0-30 mM, 2-12 mM ve 1,4-7,3 mM aralıklarında ve eşzamanlı olarak değişecek şekilde Design Expert® 7.0.0 yazılımı kullanılarak deney tasarımı gerçekleştirilmiştir. Tasarım ile sağlanan farklı başlangıç koşullarında gerçekleştirilen hücre kültürü deneylerinde hücre üremesi, canlılığı, glikoz, glutamin ve enerji metabolizması, oksijen tüketimi metabolizması incelenmiştir. Yüksek başlangıç amonyum derişimlerinin hücre üremesini inhibe ettiği tespit edilmiştir. Glikoz karbonlarının %72'si laktata dönüştürülmüştür. Düşük amonyum yüksek glikoz ve glutamin derişimlerinde oksidafif fosforilasyonun ATP üretimine olan katkısı %82'ye kadar çıkmış, tüm deneylerin ortalamasında ise bu katkı %68 olmuştur. Özgül ATP üretim hızı 0,81±0,12 µmol/106 hücre.sa olarak bulunmuştur. Yüksek metabolit derişimleri ATP üretim hızını arttırmıştır. Glutamin metabolizmasında oksidatif fosforilasyonun ATP üretimine katkısı %40 olmuştur. Yüksek amonyum ve laktat derişimleriyle, düşük glutamin derişiminde OP'nin katkısı %93'e kadar çıkmıştır. Oksijen tüketim hızı dinamik yöntem ile belirlenmiş ve hücre özgül oksijen tüketimi 0,092±0,017 µmol/106 hücre.sa olarak tespit edilmiştir. Özgül glikoz tüketim ve görünür laktat oluşum hızları sırasıyla 0,181±0,047 µmol/106 hücre.sa, 0,262±0,083 µmol/106 hücre.sa olarak belirlenmiştir. Görünür özgül glutamin tüketim ve görünür amonyum oluşum hızları ise sırasıyla 0,0555±0,0178 µmol/106 hücre.sa, 0,0526±0,0229 µmol/106 hücre.sa olarak bulunmuştur.Hücre kültüründe üretilen hücrelerle O tipi şap virüsü kültürleri yapılmıştır. Virüs kültürlerinde 146S, enfektif titre, antijenik titre ve toplam protein miktarı tayinleri yapılmıştır.Seçilen dört bağımsız değişken için Design Expert® 7.0.0 programı kullanılarak hücre özgül üreme hızı, son hücre derişimi, 146S, enfektif titre, antijenik titre ve toplam protein miktarı cevap parametreleri olarak seçilmiş ve modellenmiştir. Önerilen modellere ait sonuçlar ANOVA testi yapılarak istatistiksel açıdan değerlendirilmiştir. Yazılım tarafından bağımlı değişkenler için kuadratik modeller önerilmiştir. Önerilen bütün modeller düşük p değerine (<0,0001) sahip olup istatistiksel olarak önemli bulunmuşlardır.Özgül üreme hızı (?) için oluşturulan modelin regresyon katsayısı (R2) 0,82 olarak bulunmuştur. ? üzerine bağımsız değişkenlerden glikoz, laktat ve amonyum derişimlerinin etkileri istatistiksel olarak önemli bulunmuştur.146S partikül miktarı (146S) için oluşturulan modelin regresyon katsayısı (R2) 0,72 olarak bulunmuştur. 146S üzerine bağımsız değişkenlerden glikoz, glutamin ve amonyum derişimlerinin etkileri istatistiksel olarak önemli bulunmuştur.Kurulan modellerle bağımsız değişkenlerin bağımlı değişkenler üzerine etkileri incelenmiş ve optimum proses koşullarının tespit edilebilmesi için model optimizasyonu yapılmıştır. Optimizasyonda µ ve 146S proses verimliliği için maksimize edilmiştir. Amonyum, µ üzerine en olumsuz etkide bulunan bağımsız değişken olarak tespit edildiğinden optimizasyonda bu kriter minimize edilmiştir. Aynı şekilde glutaminin 7 mM'a kadar olan derişimleri olumlu etki gösterdiğinden optimizasyonda bu değer glutamin üst sınırı olarak belirlenmiştir. Yüksek tercih edilebilirlik oranı ile µ ve 146S için proses optimizasyonunda glikoz, laktat, glutamin ve amonyum konsantrasyonları sırasıyla 40.09, 2.75, 6.16 ve 1.40 mM olarak önerilmiştir.Önerilen model sonuçlarından hücre kültüründeki dört bağımsız değişkenin sadece hücre kültürü biyokinetiklerinde değil aynı zamanda bu hücrelerle üretilen şap virüslerinin üzerinde de etkisi olduğu görülmüştür. Hücre ve virüs kültürleri gibi içerisinde canlı organizmanın yer aldığı karmaşık prosesler üzerine toplam bileşke etkilerinin görülmesi açısından bu tür yaklaşımların yararlı sonuçlar verdiği tespit edilmiştir.Literatürde ilk defa glikoz, glutamin, laktat ve amonyum derişimleri eşzamanlı olarak değiştirilerek hücre kültürü (µ ve Xson) ve virüs kültürü (146S, ET, AT, TP) cevapları modellenmiştir. Modelleme ve optimizasyon sonuçları literatürde bir ilktir. Elde edilen sonuçların proses kontrol, simülasyon ve optimizasyon amaçlarına yönelik olarak kullanışlı olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
In this study, the influence of glucose, glutamine, lactate and ammonium on biokinetic parameters of BHK 21 An30 cells used in the production of foot and mouth virus were investigated.Experiments were carried out in two main sections, cell and virus cultures, with in batch operating mode bioreactors.In the cell culture studies, simultaneously change intervals in initial concentrations of glucose, lactate, glutamine and ammonium are selected as 12-44 mM, 0-30 mM, 2-12 mM, and 1.4 to 7.3 mM, respectively. The design of experiment sets was carried out using Design Expert ® 7.0.0 and these runs were accomplished in accord with the design.In designed experiments, cell growth, and viability, glucose, glutamine and energy metabolism and oxygen consumption metabolism were investigated. Cell growth was inhibited by high ammonium concentrations. 72% of the carbons of glucose converted to lactate. Lower ammonia and higher concentrations of glucose and glutamine has been attributed to increased contribution of OP to ATP production as 82% and this contribution was found as 68% in the average of all experiments. Specific ATP production rate was 0.81 ± 0.12 ?mol 10-6 cells-1 h-1. High metabolite concentrations increased ATP production rate. In the metabolism of glutamine, contribution of the OP to the ATP production was 40%. Higher concentrations of ammonium and lactate and lower concentration of glutamine has been attributed to increased contribution of OP to the ATP production as 93%. Oxygen consumption rate was determined by a dynamic method and cell-specific oxygen consumption rate was found as 0.092 ± 0.017 ?mol 10-6 cells-1 h-1. Cell specific glucose uptake rate and apparent lactate production rate were estimated as 0.181 ± 0.047 ?mol 10-6 cells-1 h-1 and ?mol 10-6 cells-1 h-1 0.262 ± 0.083, respectively. Apparent specific glutamine uptake and ammonium production rate were found as 0,0555±0,0178 µmol 10-6 cells-1 h-1 and 0,0526±0,0229 µmol 10-6 cells-1 h-1, respectively.Cells produced in cell cultures used in cultivation of O type FMDV. In virus cultures 146S, infectious titer, antigenic titer, and the total amount of protein were determined.Independent variables of the system were determined as initial concentrations of glucose, lactate, glutamine, and ammonium. In response to these, specific growth rate, the final cell concentration, 146S, infectious titer, antigenic titer, and the total amount of protein were determined. After the independent variables were introduced into Design Expert ® 7.0.0 software with surface response method, experimental planning was created and then responses for proposed experiments were modelled. ANOVA test of the proposed models were described by the statistical results. Proposed quadratic models for dependent variables with a low p value (<0.0001) were found statistically significant.The regression coefficient (R2) of the model for specific growth rate (µ) was found to be 0.82. Effects of glucose, lactate and ammonium concentrations on the specific growth rate were found statistically significant.The regression coefficient (R2) of the model for 146S was found to be 0.72. Effects of glucose, glutamine and ammonium concentrations on 146S were found statistically significant.Effects of the independent variables on the dependent variables were investigated by the proposed models, and model optimization was done to determine the optimum process conditions. µ and 146S were maximized in the optimization for the process efficiency. Since ammonium was detected as the independent variable which had the most negative effect on µ, this criteria was minimized in the optimization. Likely, since glutamine concentration which was up to 7 mM had positive effect, this value was determined as the upper limit for the glutamine in the optimization. For µ and 146S, glucose, lactate, glutamine and ammonium concentrations in the process optimizations were proposed as 40.09, 2.75, 6.16 and 1.40 mM, respectively.In according to the consequences of the proposed models four independent variables showed not only the effect on the biokinetic parameters of cell culture, but also the effect on the viruses produced from these cells. Such approaches give useful results about the total resultant effects on the complex processes which include living organism such as cell and virus cultures.In the literature, responses of cell culture (µ and Xfinal) and virus culture (146S, ET, AT, TP) were modeled by changing glucose, glutamine, lactate and ammonium concentration simultaneously for the first time. Modeling and optimization results are the first in the literature. It is thought that the achieved results are useful for process control, simulation and optimization purposes.