Deneysel iskemik inme modelinde oksidatif hasarın hücresel düzeyde incelenmesi
Investigation of oxidative damage at cellular level in an experimental ischemic stroke model
Yazar: ASLIHAN TAŞKIRAN SAĞ
Danışman: PROF. DR. TURGAY DALKARA
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Nörolojik Bilimler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Nöroloji = Neurology
Dizin: Beyin iskemisi = Brain ischemia ; Nörogörüntüleme = Neuroimaging

Özet:
Bu çalışmada iskemi/reperfüzyon hasarında koruyuculuğu bilinen, kan beyin engelinden (KBE) geçiş özellikleri farklı iki antioksidan molekülün farmakolojik etkilerinin doğrudan intravital yöntemlerle vasküler ve parankimal hücreler düzeyinde izlenmesi böylece klinikteki başarısızlıklarına ilişkin ipuçlarının elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla Swiss albino ve pan-tissue-mt-cpYFP transgenik farelerde bir saatlik distal orta serebral arter iskemisi oluşturulmuştur. Rekanalizasyon evresindeki süperoksit (O2•̄) oluşumu konvansiyonel floresan (dihidroetidyum floresansı ile) ve konfokal (mt-cpYFP floresansı ile) mikroskopta in vivo takip edilmiş, vasküler ve parankimal alanlar ayrı ayrı incelenmiştir. Radikal tutucu ajanlar olan N-tert-butil alfa fenil nitron (PBN) ve S-PBN ile O2•̄ sinyalindeki sönme, serebral kan akımı, histopatoloji, nörolojik kusur ve mikrodamar akım hızları değerlendirilmiştir. PBN (100mg/kg, rekanalizasyondan 15dk önce) hem vasküler hem de parankimal O2•̄ sinyalini rekanalizasyonun başından itibaren tama yakın baskılamakta ve iskemik alanı 1557±313μm2'den 552±116μm2'ye düşürmektedir (p=0,01). KBE'den geçemeyen S-PBN'in (156mg/kg) antioksidan etkisi vasküler alanda hemen başlamakta ancak parankimdeki etkisi 30-40dk sonra ortaya çıkan %64'lük bir baskılanma şeklinde olmaktadır. PBN'ye benzer şekilde S-PBN iskemik alanı 1557±313 μm2'den 807±71 μm2'ye düşürmüş (p=0,03), post-iskemik kan akımını iyileştirmiş, beyin kesitlerinde kapiller tıkaçlarını azaltmış (158±24'ten 105±18'e p=0,05) ve kapiller eritrosit hızlarını artırmıştır (0,3±0,1mm/s'den 1±0,1'e p<0,001). S-PBN'nin parankimal etkisinin, doku kan akımını iyileştirmesi sonucu olduğu düşünülmüştür. S-PBN, NXY-059'un (S-PBN benzeri bir molekül) klinikte etkisiz bulunan dozuna karşılık gelen dozda uygulandığında ise parankimal etkisinin kaybolduğu görülmüştür. Nöroprotektif ilaç etkilerinin hücresel düzeyde intravital incelenmesi preklinik bulguların kliniğe daha başarılı aktarımına katkıda bulunabilir. Genetik olarak kodlanmış sensörler antioksidan araştırmalarında önemli katkı sağlayabilir.

Abstract:
The aim of this study is direct intravital monitorization of the pharmacological effects of two well-known neuroprotectant antioxidant molecules having different blood-brain barrier (BBB) permeability against ischemia/reperfusion at vascular and parenchymal cellular level to gain insight to their failure in clinical trails. For this purpose, 1-hr distal middle cerebral artery ischemia was induced in Swiss albino and pan-tissue-mt-cpYFP transgenic mice. Superoxide (O2•̄) formation during recanalization was monitored in vivo by conventional fluorescence (via dihydroethidium fluorescence) and confocal (via mt-cpYFP fluorescence) microscopy in vascular and parenchymal compartments separately. Radical scavengers (N-tert-butyl alpha phenyl nitrone- PBN- and S-PBN) were evaluated for suppression of O2•̄ signal, cerebral blood flow, histopathology, neurological deficit and microvascular flow velocities. PBN (100mg/kg, 15min before recanalization) suppressed both the vascular and parenchymal O2•̄ signal almost completely from the beginning of recanalization and reduced the ischemic area from 1557±313μm2 to 552±116μm2 (p=0.01). The vascular antioxidant effect of BBB impearmeable S-PBN (156mg/kg) started instantly, whereas its parenchymal effect was partial (64%) and delayed by 30-40 min. Similarly to PBN, S-PBN reduced the ischemic area from 1557±313μm2 to 807±71μm2 (p=0.03), improved post-ischemic blood flow, reduced capillary obstructions in brain sections (105±18 vs. 158±24 p=0.05) and increased capillary erythrocyte velocities (1±0.1 mm/s vs. 0.3±0.1 p<0.001). The parenchymal effect of S-PBN was thought to result from improved tissue perfusion. When S-PBN was administered at a dose corresponding to the clinically ineffective dose of NXY-059 (an S-PBN-like molecule), its parenchymal effect disappeared. In conclusion, intravital examination of neuroprotective drug effects at the cellular level may promote a more successful translation of preclinical data to the clinic. Genetically encoded biosensors can significantly advance antioxidant research.