Telomeraz inhibitörü GRN163L''nin (Imetelstat) hücre iskeleti ve hücre döngüsü üzerine etkileri.
The effects of telomerase inhibitor GRN163L (Imetelstat) on cell cytoskeleton and cell cycle
Yazar: İLGEN MENDER
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ZELİHA GÜNNUR DİKMEN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Hücre döngüsü = Cell cycle

Özet:
Telomeraz aktivitesi, normal somatik hücrelerde bulunmadığı halde, insan tümörlerinin % 85-90'nında pozitiftir. Bu da telomerazı, kanser tedavisi için yeni bir hedef haline getirmiştir. GRN163L, telomeraz RNA'sının (hTR) kalıp bölgesine komplementer olan N3' ? P5'-tiyo-fosforamidat yapıda bir oligonükleotittir. A549 akciğer kanseri hücreleri, GRN163L (1mM) varlığında ekildiklerinde ilk 24 saat içinde yuvarlaklaşma şeklinde morfolojik değişiklikler ve adezyon kaybı göstermektedirler. Bu çalışmada, A549 akciğer kanseri hücrelerine uygulanan GRN163L tedavisinin hücre iskeleti, hücre adezyon molekülleri ve hücre siklusu üzerindeki etkilerinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, A549 hücreleri ekilirken kültür ortamına GRN163L (1mM) eklendi. İlaç uygulanmış ve uygulanmamış A549 hücrelerinde hücre iskeleti elemenlarından aktin, tübülin, sitokeratin, ?-aktinin ve hücre adezyon moleküllerinden E-kaderin ekspresyonlarına hem Western-blot hem de immünohistokimya ile bakıldı. GRN163L ile inkübe edilen hücrelerde ilk 24 st içerisinde aktin, tübülin ve E-kaderin ekspresyonlarında belirgin azalma izlendi. Tedaviye devam edilmediği takdirde 72 st sonra etkinin geriye döndüğü saptandı. Hücre siklusunun G1 evresini kontrol altında tutan cdk 6, cdk 4 ve siklin D1 mRNA'larına Real-time PCR ile bakıldı ve 1 haftalık GRN163L uygulamasının cdk 4, cdk 6 ve siklin D1 ekspresyonlarında belirgin azalmaya neden olduğu tespit edildi. GRN163L, 800C'de ısıtılarak inaktive edildiğinde ise aktin, tübülin ve kaderinde bir değişiklik gözlenmedi. Hücre iskeleti elemanlarında ilk 24 saatte saptanan değişiklikler ve adezyon kaybı, telomeraz inhibisyonundan ve telomerik kısalmadan bağımsız akut etkilerdir. Telomeraz inbisyonuna ek olarak görülen bu hedef dışı etkiler, kanser hücrelerinin adezyonunu, proliferasyonunu ve metastaz yapma potansiyellerini azaltmaktadır. Bu nedenle cerrahi tedavi sonrasında residüel kalan kanser hücrelerinin metastaz yapmalarını önlemek amacıyla GRN163L'nin diğer kemoterapotik ilaçlarla kombine edilmesiyle kanser tedavisinde daha başarılı sonuçlar elde edilebilir.

Abstract:
Although telomerase activity can not determined in somatic tissues, it can determined as positive in 85-90% of human tumors. This makes telomerase as a new target for cancer therapy. GRN163L which complements to template cite of telomerase RNA (hTR) is oligonucleotite in structure of N3' ? P5'-thio-phosphoramidate. When A549 lung cancer cells were plated in the presence of GRN163L (1mM), the cells were rounded up and loss of adhesion was observed within 24 hrs. In this study, we aimed to investigate the in vitro effects of GRN163L treatment on cell cytoskeleton, cell-cell adhesion and cell cycle of A549 cells. With this purpose, A549 cells were plated in the presence of GRN163L (1 mM) and incubated for 24 hrs. The untreated control cells and treated cells were collected following 24 hr of GRN163L incubation, then actin, tubulin, cytokeratin, ?-actinin and E-cadherin expressions were analysed by both Western Blot and immunohistochemistry. We observed that actin, tubulin and E-cadherin expressions of GRN163L treated cells were significantly decreased within 24 hrs. The effects were reversible after 72 hrs due to the the cessation of treatment. Then, cdk 6, cdk 4 and cyclin D1 which regulate the G1 phase of the cell cycle were investigated by Real-time PCR and it was obvious that Cdk 6, cdk 4 and cyclin D1 mRNA levels decreased following 1 week of GRN163L treatment compared with the controls. When GRN163L was heated and inactivated at 800C, the expressions of actin, tubulin and E-cadherin were not altered. As the morphological changes in cell cytoskeleton and loss of adhesion occur within 24 hr, we can conclude that these acute effects are independent from telomere shortening or telomerase inhibition. These target-off effects besides telomerase inhibition decrease the adhesion, proliferation and metastatic potential of A549 cancer cells. For this reason, it may be possible to inhibit metastasis of residuel cancer cells by combining GRN163L with other chemotherapeutics following surgery.