Oral kavite ve orofarinks skuamöz hücreli kanserlerde P16 ve HPV DNA varlığının araştırılması, PD-L1 ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi, bu biyobelirteçlerin birbirleri arasındaki ilişkinin ve sağkalım üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of P16 and HPV DNA existence in oral cavity and oropharinx squamous cell cancers, determination of PD-L1 expression levels, investigation of the relationship between these biomarkers and their effects on survival
Yazar: AĞAH YENİÇERİ
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET DÜZLÜ
Gazi Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kulak Burun Boğaz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Kulak Burun ve Boğaz = Otorhinolaryngology (Ear-Nose-Throat)
Dizin: Ağız = Mouth ; Ağız mukozası = Mouth mucosa ; Ağız neoplazmları = Mouth neoplasms ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; DNA = DNA ; Gen ifadesi = Gene expression ; Karsinoma-yassı hücreli = Carcinoma-squamous cell ; Neoplazmlar = Neoplasms ; PD-L1 = PD-L1 ; Papillomavirüsler = Papillomaviridae

Özet:
Başta orofarinks kanserleri olmak üzere Human Papilloma Virüs (HPV) ilişkili baş boyun skuamöz hücreli karsinomları (HNSCC) özellikle batılı ülkelerde giderek artış göstermektedir. HPV pozitif HNSCC'li hastalar farklı klinik özelliklere sahiptir ve genellikle HPV negatif HNSCC'den daha iyi bir sağkalım gösterir. HNSCC immünosupresif bir hastalık olarak kabul edilmektedir. Tümör hücrelerinin, immün sistemden kaçışı için PD1:PD-L1 immün kontrol noktası yolağı gibi çeşitli mekanizmalar önerilmiştir. Bizim çalışmamızda, oral kavite ve orofarinks skuamöz hücreli karsinom hastalarında p16, HPV DNA ve PD-L1 ekspresyon düzeylerini, bu biyobelirteçlerin birbirleri arasındaki korelasyonunu ve sağkalım üzerindeki prognostik değerlerini araştırdık.
Oral kavite ve orofarinks skuamöz hücreli karsinom tanılı 73 hasta çalışmaya dahil edildi. İmmünhistokimya (IHC) ile p16 ve PD-L1 ekspresyonu, kromojen in situ hibridizasyon (CISH) ile HPV 16 DNA ekspresyonları değerlendirildi. Formaldehit içerisinde fikse edilmiş parafine gömülmüş tümör dokularında, Mouse monoclonal antikor (clone E6H4) ile p16, Rabbit monoclonal antikor (clone SP142) ile PD-L1 ve INFORM HPV III Family 16 Probe ile HPV DNA boyaması yapıldı. P16 pozitifliği skuamöz hücrelerin ≥%10 sitoplazmik veya nükleer boyanma olması, HPV DNA pozitifliği skuamöz hücrelerin ≥%1 nükleer boyanma olması ve PD-L1 pozitifliği tümöral hücre (TH) ≥%5 membranöz boyama olması şeklinde tanımlandı. Karşılaştırma yapabilmek için PD-L1 tümöral hücre membranöz boyanması ≥%1 ve PD-L1 immün hücre (IH) ≥%5 membranöz boyanma pozitif kabul edilerek ayrıca not edildi.
Ortalama takip süremiz 37,2 aydı. Hastaların 45'inde (%61,6) p16 pozitif, 12 hastada (%16,4) HPV DNA pozitif ve 21 hastada (%28,7) PD-L1 pozitifti. p16 pozitifliğini en iyi öngören değişken cinsiyetti (p=0.026). HPV DNA ve p16 ekspresyonları arasında anlamlı bir korelasyon yoktu (R:0.3, P=0.8). Eşik değer %1 ve %5 olduğunda sırasıyla %46,5 ve %28,7 oranında TH PD-L1 pozitifliği vardı. 45 hastada (%61,6) IH PD-L1 pozitifliği vardı. P16 (-) ve p16 (+) tümörler arasında PD-L1 ekspresyonunda anlamlı bir fark gözlenmedi (%32'e karşı %26 p = 0.62). İleri evre, genel sağkalım için kötü prognozla ilişkili tek bağımsız faktördü (HR, 0.198; %95 Confidence İnterval (CI), 0.057-0.687: p=0.011). Genel sağkalım (OS) ve hastalıksız sağkalım (DFS), p16 pozitif olanlarda daha iyiydi (p=0.039). HPV DNA negatif hastalarda genel sağkalım anlamlı derecede daha iyiydi (p=0.019). Tümör ve immün hücre PD-L1 oranları ile genel ve hastalıksız sağkalım arasında anlamlı bir ilişki yoktu (Tümör hücre OS p=0.921, DFS p=0.624 ve Immün hücre OS p=0.430, DFS p=0.398).
Oral kavite ve orofarinks skuamöz hücreli karsinom hastalarında, p16 ekspresyonu, sağkalım için güçlü bir prognostik biyobelirteçtir. HPV DNA'nın prognostik değerini belirlemek için daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır. HPV DNA, p16 ve PD-L1 ekspresyonları arasında korelasyon bulunmamaktadır. Hastaların çoğunda PD-L1 ekspresyonu gözlenmesine rağmen, PD-L1'in sağkalım için prognostik bir değeri yoktur. Literatür ve çalışmamızdaki veriler incelendiğinde PD-L1 ekspresyonunun prognostik veya prediktif bir biyobelirteç olarak rolünü belirlemek için daha geniş kapsamlı ve ileriye dönük prospektif çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
Human Papilloma Virus (HPV) related head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC), especially oropharyngeal cancers, are increasing in western countries. Patients with HPV positive HNSCC have different clinical features and generally show better survival than HPV negative HNSCC. HNSCC is considered an immunosuppressive disease. Various mechanisms have been proposed, such as PD1: PD-L1 immune control point pathway, for tumor cells to escape from the immune system. In our study, we investigated p16, HPV DNA and PD-L1 expression levels, correlation between these biomarkers and prognostic values on survival in patients with oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.
73 patients with oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma were included in the study. P16 and PD-L1 expression by immunohistochemistry (IHC), HPV 16 DNA expressions by chromogen in situ hybridization (CISH) were evaluated. Paraffin-embedded tumor tissues fixed in formaldehyde were stained p16 with Mouse monoclonal antibody (clone E6H4), PD-L1 with Rabbit monoclonal antibody (clone SP142) and HPV DNA with INFORM HPV III Family 16 Probe. P16 positivity was defined as squamous cell ≥10% cytoplasmic or nuclear staining, HPV DNA positivity was squamous cell ≥1% nuclear staining and PD-L1 positivity was a tumoral cell (TH) ≥5% membranous staining. For comparison, PD-L1 tumor cell membranous staining ≥1% and PD-L1 immune cell (IH) ≥5% membranous staining were considered positive, and were also noted.
Our average follow-up was 37.2 months. P16 was positive in 45 (61.6%) patients, HPV DNA positive in 12 patients (16.4%) and PD-L1 positive in 21 patients (28.7%). The best predictor of p16 positivity was gender (p = 0.026). There was no significant correlation between HPV DNA and p16 expressions (R: 0.3, P = 0.8). When the cut-off value was 1% and 5%, there was 46.5% and 28.7% TH PD-L1 positivity, respectively. 45 patients (61.6%) had IH PD-L1 positivity. No significant difference in expression of PD-L1 was observed between p16 (-) and p16 (+) tumors (32% vs. 26% p = 0.62). Advanced stage was the only independent factor associated with poor prognosis for overall survival (HR, 0.198; 95% Confidence Interval (CI), 0.057-0.687: p = 0.011). Overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) were better in those positive for p16 (p = 0.039). Overall survival was significantly better in HPV DNA negative patients (p = 0.019). There was no significant relationship between tumor and immune cell PD-L1 ratios and overall and disease-free survival (Tumor cell OS p = 0.921, DFS p = 0.624 and Immune cell OS p = 0.430, DFS p = 0.398).
In oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma patients, p16 expression is a strong prognostic biomarker for survival. More extensive studies are needed to determine the prognostic value of HPV DNA. There is no correlation between HPV DNA, p16 and PD-L1 expressions. Although PD-L1 expression is observed in the majority of patients, PD-L1 has no prognostic value for survival. When the data in the literature and our study are examined, more comprehensive and prospective prospective studies are needed to determine the role of PD-L1 expression as a prognostic or predictive biomarker.