Streptozotosin verilen sıçanların pankreas beta hücrelerinde sinir büyüme faktörünün apoptoz mekanizmasına etkileri
The effects of nerve growth factor on apoptosis mechanism in pancreas beta cells of streptozotocin administered-rats
Yazar: SELDA GEZGİNCİ OKTAYOĞLU
Danışman: PROF. DR. ŞEHNAZ BOLKENT
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Pankreatik beta hücrelerinin canlılık ve fonksiyonlarını devam ettirmeleri hücre içi ve çevresel çok sayıda faktöre bağlıdır. Hücrelerin canlılığını sürdürmesinde büyüme faktörlerinin önemli olduğuve bu faktörlerin eksikliğinde apoptotik hücre ölüm mekanizmalarının aktive olduğu bilinmektedir. Sinir büyüme faktörü (NGF)'nün nöronların canlılığını sürdürmesinde önemli bir aracı olduğu iyi bilinmekle birlikte, son yıllarda yapılan çalışmalarda NGF eksikliğinin kültüre edilmiş insan ve sıçan beta hücrelerinde apoptozu teşvik ettiği ortaya konmuştur. Bu çalışmanın amacı, Streptozotosin (STZ) enjeksiyonu ile pankreatik ß hücrelerinde meydana gelen apoptotik hücresel sinyal mekanizmasını, bu hasara karşılık oluştuğu düşünülen anti-apoptotik mekanizmanın ve sinir hücrelerinde NGF sentezini artırdığı iyi bilinen bir nonamin katekol bileşiği olan 4-Metilkatekol (4-MC)'ün bu mekanizmalar üzerine olan etkilerinin araştırılmasıdır.Çalışmada kullanılan Wistar albino erkek sıçanlar dört gruba ayrıldı. Birinci grup 10 gün süreyle günde 1 defa intraperitoneal enjeksiyon (i.p.) ile fizyolojik su (FS) uygulandıktan sonra 11. gün sitrat tamponunun i.p. enjeksiyon ile verilmesinden 4 saat sonra; ikinci grup 10 gün süreyle günde 1 defa i.p. enjeksiyon ile FS içinde çözündürülen 10 ?g/kg 4-MC uygulanmasını takiben 11. gün sitrat tamponu verilmesinden 4 saat sonra; üçüncü grup 10 gün süreyle günde 1 defa i.p. enjeksiyon ile FS enjekte edildikten sonra 11. gün sitrat tamponunda çözülen 75 mg/kg STZ uygulanmasından 4 saat sonra ve dördüncü grup ise 10 gün süreyle günde 1 defa i.p. enjeksiyon ile 10 ?g/kg 4-MC verilmesini takiben 11. gün i.p. yolla tek doz 75 mg/kg STZ enjekte edildikten 4 saat sonra öldürülen hayvanlardan oluşturuldu.Pankreas dokusunda NGF ve tümor nekroz faktör-alfa (TNF-?) seviyeleri ELISA yöntemi ile, kaspaz-3 ve -8, süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx) ve katalaz (CAT) aktiviteleri ile lipid peroksidasyonu (LPO) ve glutatyon (GSH) seviyeleri spektrofotometrik olarak ölçüldü. NGF+/insülin+, TrkA+/insülin+, p75NTR+/insülin+, RASSF1+/insülin+ ve NORE1+/insülin+ pankreatik hücreler ikili immunofloresan yöntemi ile işaretlenirken, apoptotik beta hücreleri in situ DNA uç işaretlemesi (TUNEL) yöntemini takiben uygulanan insülin immünohistokimyası ile mikroskobik olarak gösterildi. Streptozotosin uygulaması ile, pankreatik NGF ve GSH seviyelerinde; SOD, GPx, CAT aktivitelerinde ve total ß hücre sayısı ile NGF+, TrkA+ ß hücre sayısında azalma gözlenirken, kan glikozu, TNF-? ve LPO seviyelerinde; kaspaz-3 ve -8 aktiviteleri ile p75NTR+, RASSF1+, NORE1+ ß hücre sayısı ve apoptotik ß hücre sayısında belirgin bir artış gözlendi. Buna karşın 4-MC'nin STZ enjeksiyonundan önce uygulanması ile NGF ve GSH seviyelerinde; SOD, GPx, CAT aktivitelerinde ve total ß hücre sayısı, NGF+, TrkA+ ß hücre sayısında azalma ile kan glikozu, TNF-? ve LPO seviyelerinde; kaspaz-3 ve -8 aktivitelerinde ve p75NTR+, RASSF1+, NORE1+ ve apoptotik ß hücre sayısında meydana gelebilecek olan artışı engellediği belirlendi.Elde edilen bulgular, STZ'nin pankreatik ß hücrelerinde meydana getirdiği hasar sonucunda insülin ve NGF sentezinin zarar görmesi ile gelişen hipergliseminin TNF-? üretiminin artması ile sonuçlandığını göstermektedir. Azalmış olan NGF sinyaline bu apoptotik uyaranın eklenmesi p75NTR, kaspaz-3 ve -8, RASSF1 ve NORE1'i aktive ederek ß hücrelerinin apoptoz yoluyla kaybına neden olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrıca, bu yolağın oksidatif stresi de kapsadığı gösterilmiştir. 4-Metilkatekol enjeksiyonu ile artmış olan NGF seviyelerinin STZ ile ß hücrelerinde tetiklenen apoptotik yolağın aktivasyonunu engellediği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Maintaining the survival and functions of the pancreatic ß cells are dependent on many intracellular and peripheral factors. It is known that growth factors are important in maintaining the survival of the cells and absence of these factors result in activation of apoptotic cellular death mechanisms. Nerve growth factor (NGF) is a well known mediator for maintaining the survival of neurons, while recent studies report that its absence encourages apoptosis in cultured beta cells of human and rats. The aim of this study was to investigate the apoptotic cellular signaling mechanism that occurres in pancreatic beta cells of rats rendered hyperglycemic with streptozotocin (STZ), the antiapoptotic cellular mechanism that occures as a defence to apoptotic signals, and the effects of 4-Metilkatekol (4-MC), a nonamin catechol compound is a well known activator of NGF synthesis in nerve cells, on these mechanisms.The Wistar albino rats used in the study were divided into four groups. The first group was given physiologic saline (FS) daily for 10 days by intraperitoneal injection (i.p.) followed by the administration of citrate buffer (i.p.) at 11th day and was sacrificed 4h later; the second group received 10 ?g/kg 4-MC dissolved in FS by i.p. injection, daily for 10 days, and then administered with citrate buffer at 11th day, and sacrificed 4h later; the third group was administered FS by i.p. injection, daily for 10 days, and then received 75 mg/kg STZ dissolved in citrate buffer at 11th day, and sacrificed 4h later; and the fourth group was given 10 ?g/kg 4-MC by i.p. injection, daily by 10 days, and then received 75 mg/kg STZ by i.p. injection as a single dose at the 11th day and sacrificed 4h later.The levels of NGF and tumor necrosis factor-alfa (TNF-?) in pancreatic tissue were determined with ELISA method, and caspase-3 and -8, superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), catalase (CAT) activities and lipid peroxidation (LPO), glutathione (GSH) levels were measured spectrophotometrically. NGF+/insülin+, TrkA+/insülin+, p75NTR+/insülin+, RASSF1+/insülin+ and NORE1+/insülin+ pancreatic cells were labeled with double immunofluorescence method, while apoptotic beta cells were stained by using in situ DNA nick end-labeling (TUNEL) assay, followed by insulin immunohistochemistry. With STZ administration pancreatic NGF, and GSH levels and SOD, GPx, CAT activities, and in cell number of both total ß, NGF+ and TrkA+ ß cells were decreased, while there was a significant increase in blood glucose, TNF-? and LPO levels in tissue, and caspase-3 and -8 activities and, p75NTR+, RASSF1+, NORE1+ and apoptotic ß cell number. As a contrary, it was observed that the administration of 4-MC before STZ prevented the decreament of NGF and GSH levels; SOD, GPx, CAT activities and total ß cell number, NGF+ and TrkA+ ß cells and the increment of blood glucose, TNF-?, LPO levels, caspase-3 and -8 activities and, p75NTR+, RASSF1+, NORE1+ and apoptotic ß cell numbers.These findings suggest that hyperglycemia occurred due to destructed synthesis of insulin and NGF by STZ damages to pancreatic ß cells and this process results in the increment of TNF-? production. The addition of this apoptotic stimulator to decreased NGF signal activates the p75NTR, caspase-3 and -8, RASSF1 and NORE1 that caused loss of ß cells by apoptosis. Moreover, it was shown that this pathway also includes oxidative stress. It was also concluded that increased NGF levels by 4-methylcatechol administration prevented activation of apoptotic ß cell death pathway induced by STZ.