Konvulsif  ve nonkonvulsif  epilepsi  modellerinde leptin, ghrelin ve npy'nin serum tnf-a, Il-1ß, Il-6, fgf-2, galanin     düzeyleri ve oksidatif stres üzerine etkileri
Epileptic seizure models of convulsive and nonconvulsive, leptin ghrelin and npy effects on serum tnf-a, Il-1ß, Il-6, fgf-2, galanin levels and oxidative stress
Yazar: BERRİN ÖZTAŞ
Danışman: PROF. DR. SEVİNÇ KUŞKAY
Kocaeli Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Amaç: Epilepsi tekrarlayan nöbetlerle karakterize dünya nüfusunun %0.8?ni etkileyen kronik beyin hastalığıdır. Halen epilepside altta yatan patofizyolojik mekanizmalar bilinmemekte dolayısıyla da tedavi yaklaşımları var olan antikonvulsan ilaçlarla sadece nöbet aktivitesini baskılamak şeklinde olmaktadır. İnsanlarda antiepileptik tedavi için hedefleri saptamak oldukça güçtür. Epileptogenez kavramını anlamak, moleküler hedefleri saptayabilmek tedavide esas olacaktır. İnsanlarda epileptogenez çalışmaları çok güç ve etik kısıtlılıkları olduğundan epileptogenezin hayvan modelleri bilimsel ilerleme için çok gereklidir. Birçok endojen peptid beyinde hücreler arası iletişimde ve nöroendokrin sistemde haberci molekül olarak işlev görür. Endojen peptidler, üreme, gıda alımı, sirkadien ritm, ağrı, bellek fonksiyonları, ödül mekanizması gibi birçok fizyolojik durumların yanında epileptik nöbetlerin patogenezinde de önemli bir role sahiptirler. Diğer taraftan epileptik nöbetlerin beyinde yayılımında ve bir sonraki nöbetin oluşmasında kritik bir role sahip olduğu ileri sürülen bazı proinflamatuar sitokinler ve oksidatif stres ile bu endojen peptitler arasında önemli etkileşimler olduğu ileri sürülmektedir.
Bu amaçla çalışmamızda, endojen ligandlardan olan ghrelin, leptin ve nöropeptid Y?nin konvulsif ve nonkonvulsif nöbet modellerinde; nöbetlerin oluşumuna etkileri, periferal antioksidan etkinlikleri ve oksidatif stresle mücadeledeki rolünün yanısıra sistemik bağışıklık yanıtının bir sonucu olan sitokinler üzerindeki rolünü araştırdık.  
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda; konvulsif nöbet modeli; Wistar sıçanlara tek doz (65 mg/kg) Pentylenetetrazole (PTZ) enjeksiyonu ile oluşturuldu. Nonkonvulsif nöbet modeli olarak; genetik absans epilepsili WAG/Rij ırkı sıçanlar kullanıldı. Nöbet aktivitesini EEG ile değerlendirebilmek için tüm gruplara, çalışmadan iki hafta önce steriotaksik alet ile kayıt elektrotları yerleştirildi. Farklı farmakolojik profillere sahip deneysel epilepsi modellerini içeren deney gruplarına,  leptin (4 mg/kg i.p.), ghrelin (80 µg/kg i.p.) ve NPY(60 µg/kg i.p.) intraperitoneal olarak ayrı ayrı uygulandı. Tüm gruplarda deneylerle eş zamanlı monitörize EEG kayıtları alındı. Bu endojen ligandların konvulsif nöbetler üzerine etkileri hem nöbet gözlemi hem de EEG kayıtlarına göre değerlendirildi, nonkonvulsif nöbetler üzerine etkileri ise EEG kayıtlarında diken dalga deşarjların (SWDs) sayı ve süresinin değerlendirilmesi ile belirlendi. Ayrıca bu endojen peptidlerin, epileptogenezde önemli rolleri olduğu düşünülen bazı biyokimyasal parametreler üzerine etkilerini incelenmek üzere, hem konvulsif hemde nonkonvulsif deney gruplarında serum TNF-?, IL-1ß, IL-6, FGF-2, galanin, NO?, MDA, GSH seviyeleri ölçüldü. 
Bulgular: Çalışmamızda hem konvulsif hem de nonkonvulsif nöbetler üzerine bu endojen ligandların etkilerinin olduğu bulunmuştur. Konvulsif nöbet modelinde hem leptin, hem ghrelin hem de NPY nöbet başlangıcını, minimal nöbet başlangıcını ve jeneralize major nöbet başlangıcını geciktirmiş ve nöbet şiddetinde anlamlı azalma oluşturarak konvulsif nöbet aktivitesini kontrol grubuna göre anlamlı olarak baskıladığı bulunmuştur (p<0.05). 
Konvulsif nöbet modelinde; PTZ uygulanan kontrol grubu?nda jeneralize tonik-klonik nöbet aktivitesi sonrasında serum TNF-?, IL-1ß ve IL-6 seviyeleri, serum fizyolojik yapılan gruba göre artmış bulundu (p<0.01). Leptin, ghrelin ve NPY uygulanan gruplarda; TNF-?, IL-1ß ve IL-6 seviyelerinde Kontrol Grubu?na göre azalma olduğu, özellikle ghrelin uygulanan grupta, TNF-? ve IL-6 da istatistiksel anlamlı azalma olduğu bulundu (sırasıyla p<0.001, p<0.01). Ayrıca leptin uygulanan grupta, serum galanin seviyelerinde istatistiksel anlamlı artış olduğu bulundu (p<0.05). Konvulsif nöbet modelinde leptin, ghrelin ve NPY uygulanan gruplarda, SF+PTZ uygulanan gruba göre MDA seviyelerinde azalma olduğu tesbit edildi (sırasıyla p<0.05, p<0.01, p>0.05).
Nonkonvulsif nöbet modeli olan genetik absans epilepsili WAG/Rij sıçanlarda leptin, ghrelin ve NPY uygulanmasını takiben elektroensafogramda (EEG), 1.saat SWD sayı ve süresinde hem kendi bazal değerlerine hem de kontrol grubunun 1. saatine göre istatistiksel anlamlı artış olduğu tesbit edildi. Nonkonvulsif nöbet modelinde leptin uygulanan grubun kontrol grubuna göre; serum IL-1ß ve FGF-2 seviyelerinde anlamlı artış (p<0.05, p<0.01 ), serum NO? seviyelerinde anlamlı azalma olduğu bulundu (p<0,05). Nonkonvulsif nöbet modelinde ghrelin uygulanan grubun kontrol grubuna göre; MDA seviyelerinde anlamlı azalma olduğu bulundu (p<0,002). Nonkonvulsif nöbet modelinde NPY uygulanan grubun kontrol grubuna göre; serum FGF-2 seviyelerinde anlamlı artış (p<0,01), serum MDA seviyelerinde anlamlı azalma tesbit edildi (p<0.003). 
Sonuç: Sonuçlarımıza göre; endojen peptidlerden olan leptin, ghrelin ve NPY; tek doz Pentylenetetrazole ile oluşturduğumuz jeneralize tonik klonik konvulsif nöbet modelinde antikonvulsif etkili, jeneralize nonkonvulsif epilepsi modeli olan genetik absans epilepsili WAG/Rij sıçanlarda SWD leri arttırarak proepileptik etkili özellikler gösterdiği bulunmuştur. Konvulsif nöbet modelinde, leptin, ghrelin ve NPY?nin proinflamatuar sitokinlerden TNF-?, IL-1ß ve IL-6 seviyelerinde oluşturdukları azalma,  bu peptidlerin epileptik nöbet durumlarında antiinflamatuar etkili olabileceğini göstermektedir. Ayrıca leptinin, endojen bir antikonvulsif ajan olduğu bilinen serum galanin seviyelerini artırması, leptinin antikonvulsif etkisine aracılık eden mekanizmalarda galaninin etkili rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Bu endojen peptidlerin herbirinin, hem jeneralize tonik klonik konvulsif nöbetlerde hem de jeneralize nonkonvulsif epilepsilerde lipid peroksidasyonunu göstergesi olan MDA seviyelerinde oluşturdukları azalma, bu peptidlerin epilepsi patogenezinde yer aldığı düşünülen oksidatif hasara karşı koruyucu olabileceğini düşündürmektedir.
Bu çalışma, epileptik nöbetlerin çok yönlü doğasını göstermektedir. Sitokin ağları, bağışıklık sistemi ve epilepsi arasındaki karmaşık ilişkinin incelenmesi, endojen ligandların bu ilişkilerin modülasyonunudaki rolünün ortaya konulmasına katkı sağlayarak ileride yapılacak çalışmalara ışık tutacaktır. Bu çalışmada hem konvulsif hemde nonkonvulsif nöbetler üzerine etkileri gösterilen endojen ligandların doz bağımlı ve uzun süreli etkilerinin incelenmesi epileptojenezdeki rollerinin açıklığa kavuşturulmasına ayrıca daha etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine katkı sağlayacaktır. 
Anahtar Kelimeler: Epilepsy, konvulsif nöbet, nonkonvulsif nöbet, leptin, ghrelin, Nöropeptid Y, TNF-?, IL-1ß, IL- 6, FGF-2, galanin, nitrik oksit, malondialdehit, glutatyon

Abstract:
Purpose: Epilepsy is a chronic brain disorder characterized by recurrent seizures and affects 0.8% of the population in the world. The underlying mechanisms of epilepsy are still unknown; therefore, treatment approaches are only based on the suppression of seizure activity by existing anticonvulsant medications. In humans, it is difficult to detect the targets for antiepileptic therapy. The treatment will be based on understanding the term epileptogenesis and detection of the molecular targets. Since epileptogenesis studies are very difficult and have ethical limitations, animal models of epileptogenesis are needed for scientific progression. Many endogenous peptides function as messenger molecules in neuroendocrine system and intercellular communication in the brain. Endogenous peptides have an important role in many physiological conditions such as reproduction, food intake, circadian rhythm, pain, memory functions, reward mechanism as well as the pathogenesis of epileptic seizures. On the other hand, it is proposed that there are important interactions between these endogenous peptides and some proinflammatory cytokines and oxidative stress, which are alleged to have a critical role in the propagation of epileptic seizures in the brain and the formation of the next seizure.
For this purpose, we investigated the role of endogenous ligands such as ghrelin, leptin and neuropeptide Y in the fight against oxidative stress, their effects on the formation of seizures and their peripheral antioxidant activities as well as their role on the cytokines, which are the results of systemic immune response, in convulsive and nonconvulsive seizure models in our study. 
Materials and Methods: Convulsive seizure model was constituted by the injection of a single dose (65 mg/kg) of Pentylenetetrazole (PTZ) to Wistar rats in our study. Genetic absence epilepsy WAG/Rij rats were used as the nonconvulsive seizure model. Recording electrodes were placed into all groups by a steriotaxic instrument two weeks before the study in order to assess the seizure activity by EEG. Leptin (4 mg/kg i.p.), ghrelin (80 µg/kg i.p.) and NPY(60 µg/kg i.p.) were applied separately to the experimental groups involving experimental epilepsy models with different pharmacological profiles via intraperitoneal route. EEG recordings that were monitorized simultaneously with the experiments were taken in all groups. The effects of these endogenous ligands on convulsive seizures were evaluated based on both seizure observations and EEG recordings; their effects on noncolvulsive seizures were determined by the evaluation of the number and duration of spike wave discharges (SWD) in EEG recordings.  In addition, serum TNF-?, IL-1ß, IL-6, FGF-2, galanin, NO?, MDA and GSH levels were measured in both convulsive and nonconvulsive experimental groups in order to evaluate the effects of these endogenous peptides on some parameters that are thought to have important roles in epileptogenesis. 
Results: In our study, it was found that these endogenous ligands have effects on both convulsive and nonconvulsive seizures. In convulsive seizure model, leptin, ghrelin and also NPY have delayed the onset of the seizure, onset of the minimal seizure and onset of the generalized major seizure; and it was observed that they have significantly suppressed the convulsive seizure activity compared to control group by causing a significant reduction in the severity of the seizure (p<0.05). 
In convulsive seizure model, serum TNF-?, IL-1ß ve IL-6 levels in control group, which was given PTZ, were found to be elevated compared to the group, which was given saline solution, following generalized tonic-clonic seizure activity (p<0.01). In leptin, ghrelin and NPY-administered groups, it was observed that there were reductions in TNF-?, IL-1ß and IL-6 levels compared to control group, with a statistically significant decrease in TNF-? and IL-6 especially in ghrelin-administered group (p<0.001 and p<0.01, respectively). Moreover, it was found that there was a statistically significant increase in serum galanin levels in leptin-administered group (p<0.05). In convulsive seizure model, decreases were detected in MDA levels in leptin, ghrelin and NPY-administered groups compared to SF+PTZ administered group (p<0.05, p<0.01 and p>0.05, respectively). 
Following leptin, ghrelin and NPY administration in genetic absence epilepsy WAG/Rij rats, which was the nonconvulsive seizure model, a statistically significant increase was observed in the number and duration of SWDs at the first hour in electroencephalogram (EEG) compared to its own basal values as well as the first hour in the control group. It was seen that there was a significant increase in serum IL-1ß and FGF-2 levels (p<0.05, p<0.01 ), and there was a significant decrease in serum NO level in leptin administered group (p<0,05) compared to control group in nonconvulsive seizure model. In nonconvulsive seizure model, a significant reduction was found in MDA levels of ghrelin-administered group compared to control group (p<0,002). In addition, a significant increase in serum FGF-2 levels (p<0,01), and a significant decrease in serum MDA levels (p<0.003) were found in NPY-administered group compared to control group in nonconvulsive seizure model.
Conclusion: Based on our results, it was found that endogenous peptides such as leptin, ghrelin and NPY have shown an anticonvulsive effect in the generalized tonic clonic convulsive seizure model, which was constituted by a single dose of Pentylenetetrazole, and a proepileptic effect on genetic absence epilepsy WAG/Rij rats, which was the generalized nonconvulsive epilepsy model, by increasing SWDs. In convulsive seizure model, the decreases in the levels of proinflammatory cytokines as TNF-?, IL-1ß ve IL-6 by leptin, ghrelin and NPY have showed that these peptides might have an antiinflammatory effect in case of epileptic seizure. Moreover, the elevation in serum levels of galanin, which is known to be an endogenous anticonvulsive agent, by leptin makes us think that galanin may play an effective role in the mechanisms mediating the anticonvulsive effect of leptin. The reduction by each of these endogenous peptides in the levels of MDA, which is an indicator of lipid peroxidation, in both generalized tonic clonic convulsive seizures and generalized nonconvulsive epilepsies,  makes us think that these peptides may provide protection against the oxidative damage which is thought to be involved in epilepsy pathogenesis.
This study shows the versatile nature of epileptic seizures. The evaluation of the complicated relationship between cytokine networks, immune system and epilepsy will shed a light on the future studies by contributing to understand the role of endogenous ligands in the modulation of these relationships. The assessment of dose-dependent and long-lasting effects of the endogenous ligands, whose effects on both convulsive and nonconvulsive seizures were shown in this study, will contribute to clarify their roles in epileptogenesis as well as to develop more effective treatment methods.
Key words: Epilepsy, convulsive seizures, nonconvulsive seizures, leptin, ghrelin, neuropeptide Y, TNF-?, IL-1ß, IL-6, FGF-2, galanin, nitric oxide, malondialdehyde, glutathione