Karkamış Baraj Gölü'ndeki gökkuşağı alabalığı işletmelerinde bakteriyofajların izolasyonu, moleküler karakterizasyonu ve bakteriyofaj tedavisinin balıklara deneysel uygulaması
Isolation and molecular characterization of bacteriophages in rainbow trout farms in Karkamış Reservoir and an experimental application of bacteriophage treatment to rainbow trout
Yazar: OĞUZHAN KUZUCU
Danışman: DOÇ. DR. MİKAİL ÖZCAN
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Bu tez çalışmasında Karkamış Baraj Gölü'ndeki gökkuşağı alabalığı işletmelerinde bakteriyofajların izolasyonu, moleküler karakterizasyonu ve bakteriyofaj tedavisinin balıklara deneysel uygulaması amaçlandı. Bu amaçla 35 farklı kafes ve 2 kuluçkahane işletmesinden 10-700 gr ağırlığındaki gökkuşağı alabalıklarının karaciğer, dalak, böbrek ve bağırsaklardan örnekler alındı. Bakteriyel hastalık etkenlerinin izolasyonu için; Tryptic Soy Agar (TSA), Nutrient Broth (NB), Brain Heart (Infusion) Agar (BHIA), KF Streptococcus Agar, Yersinia Selective Agar ve Tryptone Yeast Extract Salt Agar (TYES-A) kullanıldı. Bu besiyerlerine balık örneklerinde ekim yapılarak 15-24 oC'de 24-72 saat süreyle inkübatörde inkübe edilmiştir. Üreyen saf suşlara biyokimyasal tanımlama testlerinin yanısıra Biolog Sistemi (The biolog GENIII micro plate) uygulanıp fenotipik özellikleri incelendi. Biolog Sistemi ile doğrulanan suşların genetik özeliklerine bakıldı. Elde edilen bakteri örneklerinin 16s rDNA gen sekans analizi yapıldı ve analiz sonucu NCBI'daki referans bakterilerle karşılaştırıldı. Aeromonas sobria, Lactococcus garvieae ve Pseudomonas sp. bakterilerinin biyokimyasal, fenotipik ve genotipik özelliklerine göre identifikasyonu yapıldı. İdentifikasyonu gerçekleştirilen Aeromonas sobria, Lactococcus garvieae ve Pseudomonas sp. bakterilerinin litik fajlarının izolasyonu yapıldı. Elektron mikroskobu ile litik fajların görüntülemesi sonucunda; Aeromonas sobria fajının ikosahedral baş yapısında, kuyruksuz ve 66-68 nm boyutunda, Lactococcus garvieae fajının ikosahedral baş yapısında, kısa kuyruklu, baş kuyruk toplam uzunluğunun yaklaşık 130-150 nm olduğu,  Pseudomonas sp. fajının ise ikosahedral baş yapısında kuyruksuz 70-80 nm boyutunda olduğu gözlemlendi. Pseudomonas sp. litik fajının tüm genom sekansı yapılmış ve Fast QC Sekans sayıları ve referans gen ile eşleşme yüzdesi belirlendi. Aeromonas sobria, Lactococcus garvieae ve Pseudomonas sp. bakterileri ve bunların litik fajları ile bir terapi denemesi kuruldu. Terapi denemesi sonucunda elde edilen kümülatif ölüm oranları istatiksel açıdan değerlendirilerek, su ürünleri yetiştiriciliğinde bakteriyel hastalıkların önlenmesinde profilaktik açıdan bakteriyofaj tedavisinin etkinliği belirlendi. Faj tedavisinin kullanılması, kümülatif ölümlerin azalmasına ve ölüm zamanının gecikmesine neden olmakla beraber, faj preparatları ile kontrol grubundaki ölüm oranları arasında istatistiki olarak anlamlı bir farklılık saptandı (p<0.05). Sonuç olarak Fajların terapötik potansiyeli olup olmadığını belirlemek için daha fazla çalışma gereklidir. Su ürünleri yetiştiriciliğinde bakteriyel enfeksiyonları kontrol etmek için alternatif bir yaklaşım olarak faj tedavisini kullanmak uygun görünmektedir, ancak etkinliği artırmaya odaklanmak ve ayrıca uygulama ve ticarileştirmedeki somut sınırlamaların ve engellerin üstesinden gelmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Ayrıca, su ürünleri yetiştiriciliğinde daha geniş bir faj uygulamaları yelpazesi araştırılmalıdır.

Abstract:
In this thesis study, the isolation and molecular characterization of bacteriophages in rainbow trout farms in Karkamış Reservoir were investigated and an experimental study of bacteriophage treatment to rainbow trout was applied. For this purpose, liver, spleen, kidney and intestine samples were taken from rainbow trout weighing 10-700 grams from 35 different cages and 2 hatcheries. Tryptic Soy Agar (TSA), Nutrient Broth (NB), Brain Heart (Infusion) Agar (BHIA), KF Streptococcus Agar, Yersinia Selective Agar and Tryptone Yeast Extract Salt Agar (TYES-A) were used for isolation of bacterial disease agents. These media were inoculated with fish samples and incubated in an incubator at 15-24 oC for 24-72 hours. Biochemical identification tests were also applied to the pure strains using the Biolog System (The biolog GENIII micro plate) and their phenotypic characteristics were examined. The genetic characteristics of the strains confirmed by the Biolog System were analyzed. The 16s rDNA gene sequence analysis obtained bacterial samples was performed and the results of the analysis were compared with reference bacteria in NCBI. Aeromonas sobria, Lactococcus garvieae and Pseudomonas sp. bacteria were identified according to their biochemical, phenotypic and genotypic characteristics. Lytic phages were isolated from Aeromonas sobria, Lactococcus garvieae and Pseudomonas sp. bacteria. As a result of the imaging of lytic phages by electron microscopy; it was observed that Aeromonas sobria phage has icosahedral head structure, tailless and 66-68 nm in size, Lactococcus garvieae phage has icosahedral head structure, short tail, head-tail total length is approximately 130-150 nm, Pseudomonas sp.   phage has icosahedral head structure, tailless and 70-80 nm in size. Full genome sequencing of Pseudomonas sp. lytic phages was performed. Fast QC Sequence numbers and percentage of matching with the reference gene were determined. A therapy trial was established with Aeromonas sobria, Lactococcus garvieae and Pseudomonas sp. bacteria and lytic phages. The cumulative mortality rates obtained as a result of the therapy trial were statistically evaluated and the efficacy of bacteriophage therapy as a prophylactic measure for the prevention of bacterial diseases in aquaculture was demonstrated. The use of phage therapy resulted in reduced cumulative mortality and delayed time to death, although the differences between groups were not significant and further studies are required to determine whether phages have therapeutic potential. Using phage therapy as an alternative approach to control bacterial infections in aquaculture seems feasible, but further studies are needed to focus on improving efficacy and also to overcome concrete limitations and barriers in implementation and commercialization. Furthermore, a wider range of phage applications in aquaculture should be explored.