Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde dosetaksel'in WNT sinyal yolu inhibitörü FH535 ile birlikte kullanımının antiproliferatif etkilerinin araştırılması
Investigation of the antiproliferative effects of docetaxel in combination with WNT signaling pathway inhibitor FH535 in non-small cell lung cancer
Yazar: EDA NUR AVŞAR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ İDİL ÇETİN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Dosetaksel = Docetaxel ; Hücresel yolaklar = Cellular pathways ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung

Özet:
Çalışmamızda, KHDAK tedavisinde kullanılan DTX ve WNT sinyal yolağı inhibitörü olan FH535'in kombin halde kullanımının adenokarsinomik insan alveolar bazal epitelyum hücresi A549 ve sağlıklı bronşiyal epitel hücresi BEAS-2B hücre hatları üzerindeki etkileri MTT ve gerçek zamanlı hücre analizi ile değerlendirilmiştir. A549 kanser hücresinin aktivitesini azaltırken BEAS-2B sağlıklı akciğer hücresinde minimum zararı gösteren kombin doz belirlenerek KHDAK'de mitotik aktivite analizi, BrdU analizi ve kaspaz 3-7 aktivite analizi yöntemleriyle in vitro koşullarda bu kombin dozun hücresel seviyede meydana getirdiği etkilerin araştırılması amaçlanmıştır. Bu bağlamda sağlıklı akciğer hücresine minimum zararı verirken; KHDAK hücresinde antiproliferatif etkiyi gösteren dozun belirlenmesiyle birlikte mevcut tedavi protokollerine ek yeni tedavi protokollerinin oluşturulması hedeflenmiştir. 

Elde ettiğimiz sonuçlara göre; 0,005 μM DTX+0,5 μM FH535 kombinasyon dozunun KHDAK hücre hattı olan A549'da anti-mitotik etki göstererek mitotik katastrofa neden olduğu; sağlıklı akciğer hücresi BEAS-2B'ye minimum zararı vererek tek başına DTX kullanımında verilen sitotoksik etkiden daha fazla zarar vermediği tespit edilmiştir. Bu kombinasyon dozunun ayrı ayrı verilen DTX ve FH535 dozlarının verdiği etkiden daha yüksek bir etki göstererek 0,37505 kombinasyon indeksi değeriyle yüksek sinerjik etkide olduğu tespit edilmiştir. Dolayısıyla A549 hücre hattına uygulanan kombin dozun, hücre üzerindeki etkisinin tek başına her iki ajanın kullanılmasından daha etkili olduğu gösterilmiştir.

Tüm sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, kombin uygulama sonrası A549 hücre hattında çoğalma hızı anlamlı şekilde azalmıştır. Gerçek zamanlı hücre analizinde hücrenin anti-mitotik aktivitesinin artarak mitotik katastrof yoluyla ölüme gittiği görülmüştür. Mitotik aktivite analizi sonuçları da gerçek zamanlı hücre analizinden elde edilen mitotik katastrof sonucunu destekleyici şekilde sonuçlanarak kontrol grubuna kıyasla mitotik aktivitede 72 saatte azalma görülmüştür. BrdU analizi ile kombin uygulama sonrası hücre siklusunun sentez fazında, hücre proliferasyonunun nasıl etkilendiği incelenmiştir. BrdU aktivitesinin zamana bağlı olarak kontrol grubuna kıyasla 72 saatte %68'lere düştüğü görülmüştür. Bu sonuç, mitotik aktivite analizi sonuçlarına paralel olarak mitoz bölünmenin azalmasıyla prolifere olan hücre sayısının da azaldığının bir göstergesidir. Hücre canlılığında ve mitotik aktivitedeki azalmaya bağlı olarak hücrenin kombin doz uygulaması sonrası apoptotik hücre ölüm yolağını kullanarak ölüme gidip gitmediğini belirlemek amacıyla kaspaz 3,7 aktivitesine bakılmıştır. Kontrol grubuna kıyasla aktivitede anlamlı bir değişiklik olmadığı görülmüştür. Bu sonuç, gerçek zamanlı hücre analizinden elde edilen verilerle uyumlu olarak kombin doz uygulaması yapılan kanser hücresinin apoptotik hücre ölüm yolağını kullanarak ölmediğini, dolayısıyla anti-mitotik etkiyle; mitotik katastrof yolağını kullanarak ölüme gittiği fikrini desteklemektedir. Çalışmamızda, DTX ve FH535 kombinasyonunun KHDAK modeli A549 hücre hattı ve BEAS-2B sağlıklı akciğer hücre hattındaki etkileri ilk kez gösterilmiştir.

Abstract:
In our study, the effects of combined use of the WNT signaling pathway inhibitor FH535 and DTX used in the treatment of NSCLC, on adenocarcinomic human alveolar basal epithelium cell A549 and healthy bronchial epithelial cell BEAS-2B cell lines were evaluated by MTT and real-time cell analysis. While A549 reduces the activity of cancer cells, it is aimed to determine the combined dose showing the minimum damage in BEAS-2B healthy lung cell and to investigate the effects of this combined dose at the cellular level in vitro conditions with mitotic activity analysis, BrdU analysis and caspase 3-7 activity analysis methods in NSCLC. In this context, when giving minimum damage to the healthy lung cell; with the determination of the dose showing antiproliferative effect in NSCLC cell, it is aimed to establish new treatment protocols in addition to existing treatment protocols. 

According to the results we obtained; A combination dose of 0.005 μM DTX+0.5 μM FH535 showed anti-mitotic effects in the NSCLC cell line A549, causing mitotic catastrophism; it has been found to cause minimal damage to the healthy lung cell BEAS-2B and no more harm than the cytotoxic effect given in the use of DTX alone. This combination dose was found to have a high synergistic effect with a combination index value of 0.37505, showing a higher effect than the effect given by DTX and FH535 doses given separately. Therefore, the combined dose applied to the A549 cell line has been shown to be more effective than the use of both agents alone. 

When all the results are evaluated together, the proliferation rate in the A549 cell line was significantly reduced after the combined application. In real-time cell analysis, it was observed that the anti-mitotic activity of the cell increased and it died through mitotic catastrophe. Mitotic activity analysis results also supported the mitotic catastrophe result obtained from real-time cell analysis, and a decrease in mitotic activity was observed at 72 hours compared to the control group. It was investigated how the cell proliferation of the cell cycle in the synthesis phase was affected after the combined application with BrdU analysis. It was observed BrdU activity that decreased to 68% in 72 hours compared to the control group depending on time. As a result of, is an indication that the number of proliferated cells decreases with the reduction of mitotic division in parallel with the results of mitotic activity analysis. Caspase 3,7 activity was examined to show whether the cell died using the apoptotic cell death pathway after combined dose administration due to the decrease in cell viability and mitotic activity.  There was not significant change in activity compared to the control group. This result, in parallel with the data obtained from real-time cell analysis, suggest that cancer cell treated with combined dose does not die using the apoptotic cell death pathway, and thus supports the idea that it goes to death using the mitotic catastrophe pathway within anti-mitotic effect. In our study, the effects of DTX and FH535 combination on NSCLC model A549 cell line and BEAS-2B healthy cell line were shown for the first time.