Eupatilin'in in vitro proliferatif vitreoretinopati modelinde epitelyal-mezenkimal geçiş mekanizmaları üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of eupatilin's effect on epithelial mesenchymal transition mechanisms in the in vitro proliferative vitreoretinopathy model
Yazar: AYÇA KÜPELİ ÇINAR
Danışman: DOÇ. DR. SADIK ALTAN ÖZAL
Trakya Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Cerrahi-göz = Surgery-eye ; Eupatilin = Eupatilin ; Göz = Eye ; Göz hastalıkları = Eye diseases ; Hücre çoğalması = Cell proliferation ; Retina = Retina ; Retinal pigment epiteli = Retinal pigment epithelium

Özet:
Proliferatif vitreoretinopati, sıklıkla retina dekolmanı cerrahisinden sonra gelişen ve görmeye önemli bir tehdit oluşturan bir hastalıktır. Proliferatif vitreoretinopatinin temel özelliği; retina pigment epitel göçü, adezyonu ve gerçekleşen migrasyonun sonucu olan epitelyal-mezenkimal transformasyondur. Şu anda proliferatif vitreoretinopatinin tek tedavisi cerrahidir ve gelişmesini önlemede veya hastalığın tedavisinde etkili bir farmakolojik ajan bulunmamaktadır. Eupatilin, farklı hücrelerin hücre proliferasyonunu ve epitelyal-mezenkimal transformasyonunu inhibe etme potansiyeline sahip, doğal olarak oluşan bir flavonoiddir. Bununla birlikte, Transforming growth faktör-β2'nin neden olduğu hücre proliferasyonu ve göçü üzerindeki etkinliği bilinmemektedir. Bu çalışmada, eupatilinin retina pigment epitel hücre çoğalması ve epitelyal-mezenkimal transformasyon üzerindeki potansiyel etkisi araştırılmıştır.
	Bu amaçla hücrelerin canlılık analizi MTT testi ile yapıldı. Kullanılacak uygun dozlar belirlendikten sonra serumdan aç bırakılmış ARPE-19 hücreleri, tek başına 10 ng / ml Transforming growth faktör-β2 ile muamele edildi, daha sonra 48 saat boyunca 25 uM eupatilin ile birlikte muamele edildi. mRNA ve protein ekspresyonları, sırasıyla qt-PCR ve Western blot ile değerlendirildi. Apoptoz ve hücre döngüsü ilerlemesi, görüntü tabanlı sitometri ile tespit edildi. Tedavinin hücre göçü üzerindeki etkisi, yara iyileştirme deneyi ile değerlendirildi. Çalışmanın istatiksel analizinde gruplar arasındaki farklılıklar için varyans analizi (ANOVA) ve ardından çoklu karşılaştırmalar için de Duncan'ın çoklu karşılaştırma testi kullanıldı.
	Çalışmamızda, eupatilinin hücre döngüsünü düzenleyerek ve apoptozu indükleyerek Transforming growth faktör-β2 ile indüklenen retina pigment epitel hücre proliferasyonunu inhibe ettiği gösterilmiştir. Mezenkimal belirteçlerden fibronektin ve vimentinin mRNA ekspresyonlarının Transforming growth faktör-β2 ile up regüle olduğu, eupatilin tedavisiyle ise önemli ölçüde down regüle edildiği ortaya konmuştur. Epitelyal belirteçlerden E-kadherin ve okludin ekspresyonları ise Transforming growth faktör-β2 ile down regüle edilirken, eupatilin ile muamele edildikten sonra ekspresyonlarının up regüle edildiği gösterilmiştir. Eupatilin uygulaması, Transforming growth faktör-β2 tarafından indüklenen transkripsiyon faktörleri Twist, Snail ve ZEB1'in ekspresyonunu down regüle ederek Transforming growth faktör-β2'nin yarattığı etkileri önemli ölçüde baskılamıştır. Ayrıca, eupatilinin Matriks metalloproteinaz-1,7,9'un ekspresyonunu önemli ölçüde inhibe ettiği sonucuna varılmıştır. Western blot ile gösterildiği üzere eupatilin tedavisi NF-κB sinyalini de baskılamıştır.
	Bu sonuçlar, eupatilinin, proliferasyonu ve retina pigment epitel hücrelerinin fibroblast benzeri hücrelerine dönüşmesini inhibe edebileceğini göstermektedir. Bu nedenle eupatilin, proliferatif vitreoretinopatinin tedavisinde potansiyel bir terapötik değeri olabileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Proliferative vitreoretinopathy is a disease that often develops after retinal detachment surgery and poses a significant threat to vision. The main feature of proliferative vitreoretinopathy; retinal pigment epithelium migration is epithelial–mesenchymal transition, which is the result of adhesion and migration. Currently, the only treatment for proliferative vitreoretinopathy is surgery and there is no effective pharmacological agent in preventing its progression or treating the disease. Eupatilin is a naturally occurring flavonoid that has the potential to inhibit cell proliferation and epithelial–mesenchymal transition of different cells. However, its effectiveness on Transforming growth factor-β2-induced cell proliferation and migration is unknown. In this study, the potential effect of eupatilin on retinal pigment epithelium cell proliferation and epithelial–mesenchymal transition was investigated.
	For this purpose, the cell viability analysis was performed with the MTT test. After determining the appropriate doses to use, serum-starved ARPE-19 cells were treated with 10 ng / ml Transforming growth factor-β2 alone, then co-treated with 25 µM eupatilin for 48 hours. mRNA and protein expressions were evaluated by qt-PCR and Western blot, respectively. Apoptosis and cell cycle progression were determined by image-based cytometry. The effect of treatment on cell migration was evaluated by the wound healing experiment. In the statistical analysis of the study, analysis of variance (ANOVA) was used for the differences between the groups, followed by Duncan's multiple comparison test for multiple comparisons.
	In our study, it has been shown that eupatilin inhibits Transforming growth factorβ2-induced retinal pigment epithelium cell proliferation by regulating the cell cycle and inducing apoptosis. It has been demonstrated that mRNA expressions of mesenchymal markers fibronectin and vimentin are up-regulated by Transforming growth factor-β2 and significantly down-regulated with eupatilin treatment. E-cadherin and occludin expressions of epithelial markers were down-regulated with Transforming growth factor-β2, while their expression was upregulated after treatment with eupatilin. The administration of eupatilin significantly suppressed the effects of Transforming growth factor-β2 by down-regulating the expression of the Transforming growth factor-β2-induced transcription factors Twist, Snail and ZEB1. It has also been concluded that eupatilin significantly inhibits the expression of matrix metalloproteinas-1,7,9. Eupatilin, treatment also suppressed the NF-κB signal, as shown by Western blot.
	These results show that eupatilin can inhibit proliferation and transformation of retinal pigment epithelium cells into fibroblast-like cells. Therefore, we think that eupatilin may have a potential therapeutic value in the treatment of proliferative vitreoretinopathy.