Fotodinamik tedavinin leishmania tropica üzerine olan in vitro etkisi
In vitro effect of photodynamic therapy on leishmania tropica
Yazar: SERÇİN ÖZLEM ÇALIŞKAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET DİNÇER BİLGİN ; PROF. DR. HATİCE ERTABAKLAR
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Feofitin = Pheophytin ; Fototerapi = Phototherapy ; Leishmania = Leishmania ; Leishmania tropika = Leishmania tropica ; Leishmaniasis = Leishmaniasis ; Metilen mavisi = Methylene blue ; Toluidin = Toluidine

Özet:
Phelebotomus türü sineklerle bulaştırılan ve "Şark Çıbanı" olarak adlandırılan kutanöz leishmaniasisin (KL), ülkemizde etkeni sıklıkla Leishmania tropica'dır. Fotodinamik tedavi (FDT) fotosensitif ajan ve görünür dalga boylarında ışığın birlikte kullanarak, moleküler oksijen varlığında başlıca singlet oksijen oluşturmasıyla hedef hücrelerde nekroz ve/veya apoptozise yol açan bir tedavi yöntemidir. Bu çalışmada KL enfeksiyonlarının etkeni olan L.tropica promastigotlarında metilen mavisi (MB), toluidin mavisi (TB), kloralimünyum fitalosiyanin (AlClPc) ve feoforbid a (Pa) kullanarak FDT'nin etkinliğinin in vitro olarak araştırılması amaçlanmıştır. 
Parazitler bir saat boyunca artan konsantrasyonlarda MB, TB, AlClPc ve Pa ile inkübe edildi. Ajanlar besiyerinden uzaklaştırılıp PBS ile yıkandı ve PBS eklenen parazitlere 30 dakika boyunca beyaz diyot ışık uygulandı. Metilen mavisi, toludin mavisi, alüminyum ftalosiyanin ve feoforbid a konsantrasyonlarının fonksiyonlarının L.tropica promastigotları üzerine etkisi 26°C'de 18 saat inkübasyondan sonra; hücre canlılığı, morfolojik değişiklikler ve apoptotik deneyler ile değerlendirilmiştir. FDT etkinliği kontrol grubu, ışık + ajan veya yalnız ajan uygulaması ile yapılan tüm deneyler için değerlendirildi.
Metilen mavisi, toluidin mavisi ve feoforbid a + FDT uygulanan gruplarda canlı L.tropica promastigot sayısı sadece ajan uygulanan gruplar ile karşılaştırılmış ve istatistiksel olarak sadece ajan uygulanan gruplara göre anlamlı olarak farklı bulunmuştur (p<0,001 p<0,05 p<0,0001). Kloralüminyum ftalosiyonin + FDT uygulaması ise sadece AlClPc'ye maruz kalan deney grubundaki hücre canlılığının istatistiksel olarak anlamlı (p=0,07) olmadığı tespit edilmiştir Ayrıca tüm fotosensitif ajanlar + FDT uygulamasının kontrol grubuna göre canlı parazit sayısında dikkat çekici azalma gözlenmiştir. Hücresel olarak apoptozun belirlenmesinde kullanılan DAPI boyama sonuçlarına göre MB, AlClPc, PA + FDT uygulamasının L.tropica promastgotları üzerinde etkili oldukları gözlenmiştir.
Aynı zamanda MB, AlClPc, Pa + FDT'ye maruz kalan gruplarda apoptozun belirteci olan apoptotik DNA merdiveni görüntüsüne rastlanır iken kontrol, MB, AlClPc, tek başına TB ve TB+FDT ile beraber uygulandığı gruplarda bu görüntüye rastlanmamıştır.
Bu çalışmada gösterilen sonuçlar bize parazitin sadece promastigot formunu kullanarak Leishmaniasis üzerine fotodinamik tedavinin etkileri hakkında fikir vermiş ve parazite karşı alternatif bir tedavi için yeni yaklaşım olabileceğini göstermiştir. L.tropica promastigotlarına metilen mavisi, kloralümunyum falosiyanin ve feoforbid a + FDT uygulandığında meydana gelen hücre ölümünün apoptoz ile destekler bulgular olduğu düşünülmüştür.

Abstract:
Leishmaniasis is a vectorborne disease transmitted by Phlebotomus species and the cuteonus form (CL) of disease is known as "Şark Çıbanı". Leishmania tropica is the most often agent of cutaneous leishmaniasis (CL) in Turkey. Photodynamic therapy (PDT) is a treatment which uses of a light-sensitive drug (a photosensitiser) in combination with light of a visible wavelength, to destroy target cells (canserous and non-cancerous) by generating mainly singlet oxygen in the presence of molecular oxygen. In this study, we investigated the effects of PDT using different photosensitizers, namely methylene blue (MB), toluidine blue (TB), alüminum ftalosiyanin chlorid (AIClPc) and pheporbide a (Pa) in L. tropica promastigotes. 
Parasites were incubated with increasing concentrations of TB, MB, AlClPc and Pa for one hour. After the media containing phosensitizers were removed, promastigotes were washed with PBS. Fresh PBS was added and parasites were illuminated with a white light source for 30 min. Following the irradiation of the cells, fresh growth medium was added. After incubation at 26°C for 18 h, the cell viability (analyzed using a hemocytometer and XTT colorimetric assay), morphological changes (staining with giemsa) and apoptotic assay (staining with DAPI and DNA fragmentation assay) of Leishmania tropica parasites were evaluated as a function of MB, TB, AlClPc and PPa concentration. The efficiency of PDT was investigated using irradiation+ phosensitizers, phosensitizers alone and in control group in all experiments.
Parasite viability was significantly different (p<0,001 p<0,05 p<0,0001) between groups treated with MB,TB and PPA with or without irradiation. There were no statistically significant differences in cell viability between AlClPc trated L. tropica promastigotes with and without irradiation (p=0,07). Viability of L.tropica promastigotes was significantly lower than control groups in all PDT groups including all photosensitizers.
Also, DAPI staning method, which is used to determine cellular changes in apoptotic cells, showed that MB, AlClPc and PA with irradiation affected on L.tropica promastigotes.
Furthermore, DNA ladder pattern defining the apoptosis, was observed in irradiated MB,AlClPc and PA groups and not observed in TB with irradiation, AlClPc, TB, MB and PA without irradiation. 
The findings of this study promoted insight on the effects of PDT on Leishmania using the promastigote form of the parasite and has opened a new perspective for the alternative treatment of the parasites. The results also reveased that apoptosis induced cell death was observed in L.tropica promastigotes after the application of photosensitizers in combination with light irradiation