Galaktozemi tanısı ve tedavisinin izlenmesine yönelik biyosensör temelli yöntemler geliştirilmesi
Development of biosensor-based methods for monitoring galactosemia diagnosis and treatment
Yazar: ERHAN CANBAY
Danışman: DOÇ. DR. EBRU SEZER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biyosensörler = Biosensors ; Galaktosemi = Galactosemia ; Galaktoz = Galactose ; Sensörler = Sensors ; Tedavi = Treatment ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Galaktozemi galaktoz metabolizmasındaki bazı enzimlerin (GALT, GALK, GALE) az veya hiç sentezlenememesi sonucu ortaya çıkan kalıtımsal bir hastalıktır. Özellikle yenidoğanlarda erken tanı konulamaması ağır klinik, hatta ölümcül sonuçlar doğurabilir. Bu projenin amacını biri plazmada serbest galaktoz düzeyini ölçen diğeri de eritrosit hemolizatında total galaktoz (galaktoz+Galaktoz-1-fosfat) düzeyini ölçen iki biyosensör geliştirilmesi oluşturmaktadır. Geliştirilen serbest galaktoz biyosensörünün immobilizasyon bileşenlerini screen printed karbon elektrot, prusyan blue, kitosan, nafyon, altın nanopartikül ve galaktoz oksidaz oluştururken total galaktoz biyosensöründe yapıya alkalen fosfataz dahil olmaktadır. Biyosensörün yüzey karakterizasyonu döngüsel voltametri ve taramalı elektron mikroskobu ile yapılırken, optimizasyon ve performans karakterizasyonları amperometri tekniği uygulanarak yapılmıştır. Serbest galaktoz biyosensörü için amperometrik çalışma potansiyeli olarak -0,05 V belirlenirken total galaktoz biyosensörü için -0,1 V belirlenmiştir. İmmobilizasyon bileşenleri ve çalışma koşullarının optimizasyonu yapılmıştır. Serbest galaktoz biyosensörü için doğrusal tayin aralığı 0,025-10 mM arasındadır. Bu aralık hem sağlıklı bireylerin hem de hastaların plazmasındaki galaktoz seviyelerini içermektedir. Total galaktoz biyosensörünün Galaktoz-1-fosfat (Gal-1-P) için doğrusal tayin aralığı ise 0,1-10 mM arasında bulunmuştur. Bu aralık klasik tip galaktozemili hastaların eritrosit Gal-1-P düzeylerini içerirken sağlıklıların eser miktardaki Gal-1-P düzeylerini kapsamamaktadır. Her iki biyosensörün de gün içi ve günler arası üç seviye tekrarlanabilirliği için hesaplanan %Varyasyon Katsayısı (VK)  değerleri kabul edilebilir limit olan %15'in altındadır. Serbest galaktoz biyosensörünün tekrar üretilebilirliği için hesaplanan %VK %7,78; total galaktoz biyosensörü için hesaplanan %VK değeri ise 8,75'tir. Sağlıklı ve hasta galaktoz düzeylerini içeren plazma örneklerinde galaktoz tayini yapılırken hasta düzeylerini içeren eritosit hemolizatlarında ise Gal-1-P tayini yapılmıştır. Geliştirilen biyosensörlerin plazma ve hemolizat matrikslerinde doğru ölçüm yaptıkları hem % geri elde deneyleriyle hem de yöntem karşılaştırılmasıyla gösterilmiştir. Bu tez çalışmasında geliştirilen yeni galaktoz biyosensörlerinin benzersiz analitik özellikleri ve zahmetsiz hazırlanması, onları hasta başı tanı testi uygulaması için ciddi birer aday haline getirmektedir.

Abstract:
Galactosemia is an inherited disease that occurs as a result of insufficient or no synthesis of spesific enzymes (GALT, GALK, GALE) in galactose metabolism. Failure to make an early diagnosis, especially in newborns, can lead to severe clinical and even fatal consequences. The aim of this project is to develop two biosensors, one measuring free galactose levels in plasma and the other measuring total galactose (galactose+Gal-1-P) levels in erythrocyte hemolysate. While screen printed carbon electrode, prussian blue, chitosan, nafion, gold nanoparticle and galactose oxidase are the immobilization components of the developed free galactose biosensor, alkaline phosphatase is included in the structure of the total galactose biosensor. While the surface characterization of the biosensor was performed with cyclic voltammetry and scanning electron microscopy, the optimization and performance characterizations were made by applying the amperometry technique. For the free galactose biosensor, -0.05 V was determined as the amperometric operating potential, while -0.1 V was determined for the total galactose biosensor. The linear detection range for the free galactose biosensor is between 0.025-10 mM. This range involves galactose levels in plasma of both healthy subjects and galactosemia patients. The linear detection range for Gal-1-P of the total galactose biosensor was found to be between 0.1 and 10 mM. This range involves erythrocyte Gal-1-P levels of patients with classical type galactosemia, but not Gal-1-P levels of healthy subjects. The %CV values calculated for the intra-day and inter-day three-level reproducibility of both biosensors are below the acceptable limit of 15%. The % CV calculated for the reproducibility of the free galactose biosensor was 7.78%, the %CV value calculated for the total galactose biosensor is 8.75. While galactose was determined in plasma samples containing healthy and patient galactose levels, Gal-1-P was determined in erythrocyte hemolysates containing patient levels.. It has been shown that the developed biosensors make accurate measurements in plasma and hemolysate matrices, both by % recovery trials and by method comparisons. The unique analytical properties and effortless preparation of the new galactose biosensors developed in this thesis make them notable candidates for point-of-care diagnostic testing.