İnsan umbilikal ven endotel hücrelerinde uvabain ile indüklenen aponekrotik ölümlerde Rho Kinazın olası rolünün incelenmesi /
Yazar: AYSUN ÖZDEMİR
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA ARK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Uvabainin indüklediği hücre ölümleri ve apoptoziste Rho kinazın olası rölü insan umbilikal ven endotel hücrelerinde (HUVEC) araştırılmıştır.HUVEC doğumdan sonra alınan umbilikal kordlardan izole edilmiş ve yalnızca primer hücreler deneylerde kullanılmıştır. Endotel hücreleri yapıştıkları yüzeyi tamamen kaplayınca, hücrelere uvabainin (0.1-10µM, 16 saat) farklı konsantrasyonları ile ROCK inhibitörü olan Y27632 (10µM) uygulanmıştır. Hücre morfolojisi ve yapıştıkları yüzeyden kalkmaları faz kontrast ve floresan mikroskobi ile, ROCK I ve kaspaz 3 ekspresyonları immünoblotlama ile ölçülmüştür.Uvabainin, hücre kopmasına ve membran tomurcuk oluşumuna neden olduğu bulunmuştur. Ayrıca 10µM uvabain uygulaması endotel hücrelerin tomurcuklu hücre sayısını anlamlı olarak artırmıştır. Y27632 ön uygulaması ise uvabainin indüklediği membran tomurcuk oluşumunu anlamlı olarak inhibe etmiştir. Uvabain yüzen ölü hücre sayısını da anlamlı olarak artırmıştır. Fakat Y27632 ön uygulaması yüzen hücre sayısında anlamlı bir değişikliğe neden olmamıştır. HUVEC'te uvabainin hücre kopmasına etkisi doz bağımlıdır. Bu etki Y27632 ön uygulaması ile geri çevrilmiştir. ROCK I ve kaspaz 3'ün aktif fragmantasyonu da 10µM uvabain uygulanmış hücrelerde anlamlı olarak artmıştır.Sonuçlarımız uvabainin indüklediği hücre kopması ve membran tomurcuk oluşumunda Rho kinazın önemli bir rolü olduğunu göstermiştir. Bu bulgular endojen uvabain düzeylerinin yükseldiği esansiyel hipertansiyon olgularında önemli olabilir. Ayrıca bulgularımız kanser hastalarında, uvabain ve ROCK inhibitörleri ile kombine tedavi olasılığını ima etmektedir.Anahtar Kelimeler : uvabain, Rho kinaz, apoptozis, HUVEC

Abstract:
Possible involvement of the Rho kinase in ouabain-induced cell deaths and apoptosis was investigated in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).HUVEC were isolated from the umbilical cords after delivery and only primary cells were used for the experiments. When endothelial cells became confluent, cells were treated with different concentrations of ouabain (0.1-10µM, 16 hours) and Y27632 (10 µM) , a Rho kinase inhibitor. Cell morphology, detachment and ROCK I and caspase 3 expressions were evaluated by phase contrast and fluorescence microscopy and immunoblotting respectively.It was found that ouabain induced cell detachment and membrane blebbing. Moreover, ouabain (10µM) treatment significantly increased in cell numbers with blebs of endothelial cells. Preincubation with Y27632 significantly inhibited the ouabain-induced membrane blebbing. Ouabain also increased the floating death cell numbers significantly. However preincubation with Y27632 did not make a significant change in floating cell numbers. In addition, ouabain caused cell detachment in a dose-dependent manner in HUVEC. This effect was also prevented by the pretreatment with Y27632. Active fragmentation of both ROCK I and caspase 3 were significantly higher in 10µM ouabain treated cells.Our results indicate that Rho kinase plays an essential role for ouabain-induced cell detachment and blebbing. These observations may be important for essential hypertension with elevated endogenous ouabain levels. Additionally, resent findings also imply the possibility of combination therapy with ouabain and ROCK inhibitors in cancer patients.Keywords: ouabain, Rho kinase, apoptosis, HUVEC