Oosit yaşlanmasının genetik mekanizması
Geneti̇c mechani̇sm of oocyte agi̇ng
Yazar: BAHAR KARTAL
Danışman: PROF. DR. GÜLNUR TAKE KAPLANOĞLU
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: DNA = DNA ; Genetik = Genetics ; Genetik teknikler = Genetic technics ; Mitokondriler = Mitochondria ; Mitokondriyal proteinler = Mitochondrial proteins ; Oositler = Oocytes ; Yaşlanma = Aging

Özet:
Oositler enerji ihtiyaçlarını, mitokondriyonlarda gerçekleşen oksidatif fosforilasyonla sağlarlar. Mitokondriyal DNA'nın (mtDNA), mitokondriyon iç zarının iç kısmında, reaktif oksijen türleri (ROS)'ların üretildiği yerde bulunması nedeniyle, oksidatif hasara uğrar. Mitokondriyonlarda üretilen ROS nükleer DNA (nDNA)'daki hasarı indükleyerek yaşlanmaya katkıda bulunur. Oluşan DNA hasarında okside bazların tamirinde, mitokondriyal ve nükleer DNA'nın kullandığı başlıca tamir mekanizması baz ekzisyon tamiri (BER)'dir. mtDNA'nın DNA tek zincir kırık tamir mekanizması kullandığına dair veriler vardır. Bu bilgiler ışığında çalışmamızda yaşın oosit mitokondriyonu üzerine etkisinin çeşitli moleküler genetik ve immunofloresan yöntemlerle belirlenmesi amaçlandı. Çalışmada, genç (n=5) ,(3-4 ay) ve yaşlı (n=5), (9-12 ay) FVB dişi farelere ovulasyon indüksiyonu yapılarak artan sayıda oositler toplantı. Her bir oositte, mtDNA tamir yolaklarında yer alan mitokondriyal transkripsiyon faktör A (TFAM) , Nei-like DNA glikozilaz1(NEIL1), tirozil DNA fosfodiestereaz 1 (TDP1)  ve poly ADP riboz 1 (PARP1) genlerinin ifadelenmeleri kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu  (qRT-PCR) yöntemi ile analiz edildi. Gen ekspresyon analizlerini doğrulamak amacıyla ise genç ve yaşlı fare oositlerinde PARP1 ve TDP1 protein ekspresyonları immünofloresan yöntemi kullanılarak belirlendi. mtDNA paketleme protein olan ve oksidatif hasarlı mtDNA'ya hasarsız mtDNA'ya oranla daha fazla bağlanan TFAM gen ekspresyonunun, yaşlı fare oositlerinde genç fare oositlerine oranla anlamlı derecede arttığı saptandı. BER'de yer alan ve hasarlı bazlar üzerine etkili çift fonksiyonlu bir DNA glikozilaz olan NEIL1 gen ekspresyonu, yaşlı fare oositlerinde genç farelere oranla azalmış olarak saptandı. DNA tek zincir kırıklarında sensör görevi gören bir protein olan PARP1 ve DNA tamir enzimi olan ve DNA tek zincir kırık tamirinde görev alan TDP1 gen ekspresyonları değerlendirildiğinde ise her iki gene ait ekspresyonların yaşlı fare oositlerinde genç farelere kıyasla, anlamlı derecede yüksek olduğu gözlendi. İmmünofloresan boyamalarda da yaşlı fare oositlerinde genç farelere kıyasla PARP1 ve TDP1 protein ifadelenmesinde parallel artış belirlendi. Sonuç olarak yaşlı oositlerde TFAM'in yüksek ve NEIL1'in düşük ifadelenmesi, yaşla birlikte oksidatif DNA hasarının birikmesinden dolayı DNA tamirindeki azalmanın göstergesi olarak kabul edilirken, PARP1 ve TDP1 gen ve protein expresyonlarındaki yaşa bağlı paralel artış, oositlerde yaşla birlikte DNA tek zincir hasarının arttığı ve bu kırıklara dengeleyici bir tamir yanıtının olduğu kanısını doğurdu.

Abstract:
Oocytes rely on energy produced by mitochondria via oxidative phosphorylation. Mitochondrial DNA (mtDNA) locates on the inner side of the mitochondrial inner membrane, where most reactive oxygen species (ROS) are generated, rendering it susceptible to oxidative damage. Mitochondria contributes to the aging process, ROS produced in the mitochondria induce damage on mtDNA. Base excision repair (BER) is one of the main pathways for the repair of oxidized modifications both in nuclear and mtDNA. There is some evidence that mtDNA use single strand break repair.The aim of the study is to determine the effect of aging on mitochondria of the oocytes by using several molecular genetic and immunofluorescence tecniques. We performed ovulation induction to young (n=5), (3 to 4 months)  and old (n=5), (9 to 12 months) FVB female mice and collected the oocytes. We analyzed the expression of mithocondrial transcription factor A (TFAM) , Nei-like DNA glycosylases (NEIL1), tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 (TDP1) and poly ADP-Riboe polymerase (PARP1) genes that are involved in mtDNA repair pathways, by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR in individual oocytes). To confirm the findings of gene expression studies we also analyzed the protein expression of PARP1 and TDP1, in young and old mouse oocytes by using immunofluorescence staining. We found that the expression of TFAM, a packaging protein that binds to oxidatively-damaged mtDNA with greater avidity than to undamaged mtDNA, was significantly increased in old oocytes compared to young ones. NEIL1 is invoved in BER and codes for bifunctional glycosylases that act on damaged bases. We found that the expression of NEIL1 was reduced in older oocytes. PARP1 is a nuclear protein that serves as a sensor of ssDNA breaks and TDP1 is a DNA repair enzyme, which participates in the repair of mtDNA. We found that the expressions of TDP1 and PARP1 were significantly higher in old oocytes compared to young ones. We observed a parallel increase in the protein expression of PARP1 and TDP1, in old mouse oocytes by using immunofluorescence staining. İn conclusion, the higher expression of TFAM and lower expression of NEIL1 in older oocytes, suggests that there may be an age-related decline in DNA repair in aging oocytes resulting in accumulating ROS. The parallel increase of gene and protein expression of PARP1 and TDP1 with the age, suggest that single-strand damage is also increased in oocytes with age and there may be a compensatory response to repair these breaks.