Ranibizumab ve aflibercept'in In vitro oküler toksisitesinin araştırılması
Investigation of In vitro ocular toxicity of ranibizumab and aflibercept
Yazar: EREN EKİCİ
Danışman: PROF. DR. ENDER YARSAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Farmasötik Toksikoloji = Pharmaceutical Toxicology ; Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Aflibersept = Aflibercept ; Gen ifadesi = Gene expression ; Göz hastalıkları = Eye diseases ; Matriks metalloproteinaz 2 = Matrix metalloproteinase 2 ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Ranibizumab = Ranibizumab ; Toksisite = Toxicity ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; İn vitro = In vitro

Özet:
Günümüzde, anti-VEGF moleküllerinin intravitreal enjeksiyonları, neovasküler YBMD tedavisi için altın standarttır. Yanı sıra; RVT, DMÖ ve prematüre retinopatisi başta olmak üzere yeni damar büyümesi ve damar aşırı geçirgenliği olan diğer oküler patolojilerde de yaygın olarak kullanılmaktadır. Tedavinin genellikle aylık ve tekrarlanan dozlarda uygulanması gerekmektedir. Tedavinin kesilmesi neovaskülarizasyonun nüksüne sebep olabilir. Bu nedenle çoğu durumda tedavinin birkaç yıl sürdürülmesi gerekebilir. Her ne kadar VEGF antagonistlerinin güvenli olduğu gösterilmiş olsa da, hücrenin hayatta kalabilmesinde VEGF kritik bir faktör olduğu için, bir takım yan etkileri de tespit edilmiştir. Bazı çalışmalar, anti-VEGF tedavisinden sonra, RPE yırtıkları ve göz içi iltihabı bildirmiştir. Dahası, uygulanan intravitreal enjeksiyon sayısının retinal atrofinin ilerlemesi ile önemli ölçüde ilişkili olduğu bulunmuştur. Ancak bu etkilerin hastalığın doğal seyrinin bir sonucu mu yoksa anti-VEGF tedavisinden mi kaynaklandığını ayırt etmek mümkün değildir. Söz konusu çalışma kapsamında, çok sayıda randomize klinik çalışmalar neticesinde güvenilirlik profili ispatlanarak FDA onayı alan Ranibizumab ve Aflibercept'in, erişkin insan RPE hücre hattında (ARPE-19) olası toksik etkilerini in vitro olarak değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Bunun yanı sıra, söz konusu ilaçların 1) Otofaji yolağında kritik öneme sahip Beclin1 ve ATG4 ekspresyonları üzerine olan etkilerini 2) Hücreler arası yapısal ve kimyasal destekte görevli ekstraselüler matriksin düzenlenmesinde başlıca öneme sahip enzimlerden MMP2 ve TIMP1 ilişkisinin aydınlatılması amaçlanmıştır. Hücrelere sitotoksisite değerlendirilmesi için MTT testi uygulanmıştır. Ardından RNA izolasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Son olarak Kantitatif Ters Transkripsiyon PCR ile seçilen otofaji ve matriks metalloproteinaz proteinleri analiz edilmiştir. Sonuç olarak, klinik uygulamada kullanılandan çok daha yüksek dozlarda uygulanan bu iki anti-VEGF ilacın, in vitro olarak RPE'ye önemli bir toksisite oluşturmadığı gözlemlenmiştir. Kontrol grubuna kıyasla, Ranibizumab'ın Beclin1 ekspresyonu üzerinde anlamlı bir etkisi yokken Aflibercept'in Beclin1 ekspresyonunu istatistiksel olarak anlamlı derecede azalttığı tespit edilmiştir. Her iki anti-VEGF de ATG4 gen ekspresyonunu arttırmıştır. Kontrol grubuna kıyasla Ranibizumab MMP2 ve TIMP1 ekspresyonunda artışa neden olmuşken; Aflibercept MMP2 ekspresyonunu azaltıp TIMP1 ekpresyonunu arttırmıştır. TIMP1'i MMP2'ye oranladığımızda bu oran Aflibercept'te daha yüksek bulunmuştur.

Abstract:
Currently, intravitreal injections of anti-VEGF molecules are the gold standard for the treatment of neovascular AMD. Besides this, it is also widely used in other ocular pathologies with neovascular growth and vascular hyperpermeability, especially in RVT, DME, and retinopathy of prematurity. Treatment usually needs to be administered in monthly and repeated doses. Discontinuation of therapy may result in the recurrence of neovascularization. Therefore, in most cases, treatment may need to be continued for several years. Although VEGF antagonists have been shown to be safe, since VEGF is a critical factor in cell survival, several side effects have also been identified. Some studies have reported RPE tears and intraocular inflammation after anti-VEGF therapy. Moreover, the number of intravitreal injections administered was found to be significantly associated with the progression of retinal atrophy. However, it is not possible to distinguish whether these effects are a result of the natural course of the disease or are due to anti-VEGF therapy. In our study, we aimed to evaluate the possible toxic effects of Ranibizumab and Aflibercept, which have been approved by the FDA as a result of numerous randomized clinical studies, on the adult human RPE cell line (ARPE-19), in vitro. In addition, we aimed to elucidate the effects of these drugs on 1) Beclin1 and ATG4 expressions, which are critical in the autophagy pathway, 2) MMP2 and TIMP1, which are enzymes that are of critical importance in the regulation of the extracellular matrix involved in intercellular structural and chemical support. The MTT test was applied to the cells for the evaluation of cytotoxicity. Then RNA isolation was performed. Finally, selected autophagy and matrix metalloproteinase proteins were analyzed by Quantitative Reverse Transcription PCR. In conclusion, we observed that these two anti-VEGF drugs, administered at much higher doses than those used in clinical practice, did not cause significant toxicity to the RPE in vitro. Compared to the control group, it was found that Ranibizumab had no significant effect on Beclin1 expression, while Aflibercept significantly reduced Beclin1 expression. Both anti-VEGFs increased ATG4 gene expression. Compared to the control group, Ranibizumab caused an increase in MMP2 and TIMP1 expression; Aflibercept decreased MMP2 expression and increased TIMP1 expression. When comparing TIMP1 to MMP2, this ratio was higher in Aflibercept.