Hıv pozitif hastalarda proteaz, revers transkriptaz ve 
integraz inhibitörlerine karşı gelişen ilaç dirençlerinin yeni nesil dizileme (ynd-ngs) ile araştırılması /
Yazar: DUYGU TEKİN
Danışman: PROF. DR. ŞAZİYE RÜÇHAN SERTÖZ
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
AMAÇ: Human Immunodeficiency Virus (HIV) infeksiyonu, antiretroviral ilaçların uygun kombinasyonlarda (highly active antiretroviral therapy-HAART) kullanılmasıyla ölümcül bir hastalıktan kontrol altına alınabilen kronik bir hastalığa dönüşmüştür. Uzun ve etkili HIV enfeksiyonu tedavisinin önündeki en büyük engellerden biri antiretroviral ilaç direncidir. En uygun tedavi rejiminin belirlenmesi için tanıdan sonra mümkün olan en kısa zamanda ilaç duyarlılık testinin yapılması önerilir. Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu HIV ilaç direnç mutasyonlarının saptanmasında altın standarttır. Ama %20'nın altında bulunan direnç mutasyonlarını saptayamaması dezavantajıdır. Ayrıca Sanger temelli ticari kitler esas
olarak proteaz ve revers transkriptaz gen bölge mutasyonlarını tespit etmektedir. Yeni nesil dizileme (YND) ile >%1 mutasyonların saptanması mümkün hale gelmiştir. İntegraz
inhibitörlerinin ilk tedavi seçeneği olarak artan kullanımı ile bu ilaçlara karşı gelişen direnç mutasyonlarının da izlenmesi gerekliliği gündeme gelmiştir. Çalışmamızda YND ile proteaz,revers transkriptaz ile birlikte integraz bölge direnç mutasyonlarını tek bir amplikon kullanılarak saptanması amaçlanmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM: Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbı Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Moleküler Viroloji Laboratuvarı'nda HIV pozitif hasta örneklerinden 2008 yılı itibariyle
Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu temelli Viroseq (Abbott, ABD) ile proteaz, revers
transkriptaz inhibitörlerine karşı gelişen ilaç dirençleri rutin olarak çalışılmaktadır.
Çalışmamıza arşivlenmiş olan örneklerden farklı direnç profiline sahip 40 HIV pozitif hasta
örneği dahil edilmiştir. HIV pol gen bölgesinin dizilenmesi ve subtiplerin belirlenmesi için hasta örneklerinden viral RNA ekstraksiyonu, tek basamak RT (Reverse-Transcription)
polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve nested PCR sonrası elde edilen ürünler YND teknolojisi
ile dizilendi. Sekans verileri, HXB2 referans sekansı (GenBank accession # NC_001802) CLC
Genomics Workbench versiyon 8.1 ile %1 ve %5 cut off kullanılarak analiz edildi. Mutasyon
belirlenmesi ve subtiplendirme Stanford Üniversitesi HIV-1 ilaç Direnci Veri Bankası versiyon 8.4 (http://hivdb.stanford.edu) kullanılarak yapıldı.

BULGULAR: 40 hastanın 27'si alttip B (%67,5), altısı B+CRF 02_AG (%15), üçü alttip A
(%7,5), ikisi G+J (%5), biri CRF07_BC (%2,5) ve biri B+F (%2,5) şeklinde saptanmıştır.
Örneklerin yedisinde (%17,5) en az bir antiretroviral ilaca olası düşük seviyeden yüksek
seviyeye kadar değişen direnç tespit edilmiştir; nükleotid revers transkriptaz inhibitörleri(NRTI) ve non-nükleozid revers transkriptaz inhibitörleri (NNRTI) direnç mutasyonları oranı sırasıyla %5, %12,5 olarak bulunmuştur. Proteaz inhibitörü (PI) ve integraz inhibitörü (INSTI)direnç mutasyonu ise saptanmamıştır.Bir örnekte K103N majör NNRTI mutasyonu, iki örnekte M41L ve T215D/S mutasyonu, iki örnekte E138A mutasyonu, iki örnekte E138G mutasyonu tespitedilmiştir.Proteaz ve revers transkriptaz inhibitörlerine karşı gelişen direnç ve genotip açıdan 40 örneğin sonuçları Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu ile uyumlu (%100) bulunmuştur.%1 ve %5 cut off arasında fark saptanmamıştır.

SONUÇ:Çalışmamızda 40 hasta örneğinin YND ile PI, NRTI, NNRTI İle birlikte INSTI'ne karşı
gelişen ilaç dirençleri tek bir amplikon kullanılarak tespit edilmiştir. Bu yöntemle hem
integraz gen bölgesi dizi analizi yapılmış hem de örneklerin havuzlanması ve"multiplekslenmesi" (tek seferde birçok testin birlikte çalışılması) ile ̴%90 oranında maliyet düşmüştür. Ayrıca >%1 ilaç dirençli mutasyonların tespit edilmesi hastaların tedavisininin yönlendirilmesinde yol gösterici olacaktır

Abstract:
OBJECTIVE: HIV (Human Immunodeficiency Virus) infection has transformed, by
using antiretroviral drugs in appropriate combinations (highly active antiretroviral therapy HAART);from a fatal disease to a chronic disease that can be controlled. One of the biggest patient management problem is antiretroviral drug resistance. To determine the most
appropriate treatment regimen, it is recommended that the drug susceptibility test be
performed as soon as possible after diagnosis. The Sanger chain termination reaction is the
gold standard for HIV drug resistance mutation detection. But the disadvantage is that it
can not detect resistance mutations below 20%. In addition, Sanger-based commercial kits
mainly detect protease and reverse transcriptase gene region mutations. It has become
possible to detect >1% mutations with the new generation sequencing (NGS). Increasing
use of integrase inhibitors as an initial treatment option has necessitated the monitoring of resistance mutations against these drugs. In our study, it was aimed to detect the protease,reverse transcriptase and integrase resistance mutations with NGS using a single amplicon.

MATERIALS AND METHODS: In the Department of Medical Microbiology Laboratory of Ege University; drug resistance to protease, reverse transcriptase inhibitors
has been routinely studied in HIV positive patient samples with Viroseq (Abbott, USA)
based on the Sanger chain termination reaction since 2008. Forty samples of HIV positive
patients with different resistance profiles were included from the archived samples. After
viral RNA extraction, one step reverse transcription and nested PCR were performed. HIV
pol gene region were sequenced by NGS technology. Sequence data were analyzed using
1% and 5% cut off with the CLC Genomics Workbench version 8.1 with the HXB2 reference
sequence (GenBank accession # NC_001802). Mutation detection and subtyping was
performed using Stanford University HIV-1 Drug Resistance Data Bank version 8.4
(http://hivdb.stanford.edu).

RESULTS: Of the 40 patients, 27 were subtype B (67.5%), six were B + CRF 02_AG
(15%), three were subtype A (7.5%), two were G + J (5%), one was CRF07_BC (%2,5) and
one was B + F (2.5%). Seven of the samples (17.5%) had a resistance to at least one
antiretroviral drug, ranging from a possible low to high level of resistance; the rate of
resistance mutations of nucleotide reverse transcriptase inhibitors (NRTI) and nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTI) were found to be 5%, 12.5%
respectively. Protease inhibitor (PI) and integrase inhibitor (INSTI) resistance mutations
were not detected. In one sample major K103N NNRTI mutation, in two samples M41L and
T215D / S NRTI mutations, in two samples E138A NNRTI mutation, in two samples E138G
NNRTI mutation were detected. Forty sample results in terms of genotype and resistance to 
protease and reverse transcriptase inhibitors were found to be concordant with the Sanger
chain termination reaction (100%). There was no difference between 1% and 5% cut off.

CONCLUSION: In our study, drug resistances to INSTI in addition to PI, NRTI, and
NNRTI were detected using a single amplicon in 40 patients with NGS. In this method,
integrase gene region sequence analysis has been made and 90% cost reduction was
achieved by pooling and "multiplexing" of samples. Furthermore, detection of >1% drug
resistant mutations will guide the treatment of patients.