Muğla çam balında dna izolasyonu optimizasyonu ve real-time PCR ile rbcl geninin analizi
Optimization of DNA isolation methods for Mugla pine honey and real-time PCR analysis of rbcl gene
Yazar: MEHMET KARAALİ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
Bal, nektar veya bitki özütü ile beslenen böceklerden elde edilen salgıların, arılar tarafından toplanıp, işlenmesiyle üretilen, doğal ve karmaşık bir besin maddesidir. Çam balı ise, arıların Marchalina hellenica gibi çam ağaçları üzerinde yaşayan böceklerin salgılarını kullanarak oluşturdukları bir bal çeşididir. Çam balı üretiminin Akdeniz ülkelerinde özellikle Türkiye ve Yunanistan'ın bazı bölgelerinde yaygın olduğu bilinmektedir. En çok tüketilen doğal besinlerin başında gelen bal, insan sağlığı açısından birçok faydaya sahiptir. Balın içeriğinde, glikoz, fruktoz başta olmak üzere, karbonhidratlar, lipitler, flavonoidler, proteinler, enzimler, makro ve mikro besinlerin bulunduğu bilinmektedir. Balın bileşimi ve biyolojik özellikleri, botanik orijinine bağlı olarak, mevsimsel ve çevresel faktörlerin etkisiyle değişim gösterebilir. 
Hem ülkemizde, hem de dünyanın geri kalanında bal üretimi, her geçen gün önemi biraz daha artan, bir ticaret alanı halini almaktadır. Baldaki polen çeşitliliği, mikroorganizma varlığı ve GDO statüsü gibi detayların bilinmesi, hem ekonomik hem de sağlık açısından potansiyel önem taşımaktadır. Bu bilgileri ulaşmak için en etkili yollardan biri, balda bulunan DNA'nın izolasyonu sonrası, içerdiği bazı spesifik gen dizilerinin analiz edilmesidir. Ancak, doğası gereği oldukça viskoz olan ve içinde bulundurduğu inhibitörlerden dolayı, baldaki DNA'nın analizinde bir takım problem ve limitasyonlar söz konusudur. Şu ana kadar yapılan çalışmalarda, baldan DNA analizi için, güvenilir ve verimli sonuç veren, daha etkili bir DNA izolasyon tekniğine ihtiyaç duyulduğu değerlendirilmiştir. Bu çalışma ile, bazı standart yöntemler ve ticari kitlerin denenerek, çam balı için göreceli olarak en uygun DNA izolasyon yönteminin önerilmesi hedeflenmiştir. Ayrıca, gerektiğinde botanik köken belirleme çalışmalarında kullanılmak üzere, elde edilen bal DNA'sından PCR ile rbcL geninin çoğaltılması ve kısmi olarak bir plazmide klonlanması amaçlanmıştır. 
Bu çalışmada, Muğla'da bazı bölgelerden rasgele toplanan çam balı örnekleri kullanılmıştır. İlk olarak, baldaki polenler çöktürülerek, mikroskop altında incelenmiş ve görüntüleri kaydedilmiştir. Ardından, beş farklı kit ve iki standart metod olmak üzere, yedi farklı yaklaşım uygulanarak, bal örneklerinden DNA izolasyonları gerçekleştirilmiştir. Bunlar, CTAB yöntemi, manuel silika dioksit yöntemi, DNeasy Plant Mini Kiti, Magrev Kiti, MagJet Plant Kiti, Biotecon Sample Preparation Kiti ve Surefood Plant Kiti'dir. Uygulanan tekniklerin verimlilikleri, öncelikle DNA kalitesi ve saflığı açısından karşılaştırılmıştır. Bunun için nanodrop spektrofotometrede DNA'ların absorbans ölçümleri yapılmıştır. Ayrıca, genomik DNA'lar agaroz jel elektroforezi ve standart PCR ile analiz edilmiştir. Spekrofotometrik yöntem ve genomik DNA'yı görüntülemek için yapılan jel analizleri sonucunda, bal DNA'sının varlığı ya da kalitesi tespit edilememiştir. Burada elde edilen DNA miktarının çok az olmasından dolayı, jel analizi sonucunda gözlemlenebilecek eşik değerinin altında bir miktarda olabileceği düşünülmüştür. Absorbans değerlerinin göreceli olarak yüksek olmasına rağmen, DNA'nın gözlemlenemesinin nedeni ise, balın doğası gereği, izolasyon sürecinde taşınabilecek bazı şekerler gibi, DNA dışındaki kontaminasyonların varlığı olabilir. Ancak, standart PCR'da rbcL geninin çoğaltılmasıyla, izole edilen genomik DNA'nın varlığı ve göreceli olarak kalitesi tespit edilebilmiştir. Bununla birlikte, balda GDO içeriklerinin belirlenmesinde Real-Time PCR analizi rutin olarak kullanıldığı için, çam balı örneklerinden izole edilen genomik DNA'lar, TaqMan prob ve SYBR Green odaklı analizlere tabii tutulmuştur. Bunun için, bitkilerin plastid genomunda yer alan trnL bölgesi için bir TaqMan probu tasarlanmıştır. SYBR Green yöntemi için ise, bitkilerin rbcL gen bölgesine uygun primerler kullanılarak, uygulama yapılmıştır. Ayrıca, rbcL geninin çoğaltılmasıyla elde edilen PCR ürünlerinin, pACYC Duet 1 plazmidine klonlanması için çalışmalar yapılmış ve elli adet civarında pozitif klon elde edilmiştir. Bu rekombinant plazmidleri içeren suşlar, ileriki çalışmalarda botanik köken belirlemek üzere, gerektiğinde sekanslanmak için stok alınarak saklanmıştır. 
Böylece herbir DNA izolasyon yönteminden elde edilen bal DNA'larının verim ve kaliteleri, farklı moleküler yaklaşımlarla araştırılmıştır. Real-Time PCR deneyleri baldaki genlerin analizinde başarılı sonuçlar vermiştir ve her bir DNA izolasyon tekniğinden elde edilen veriler karşılaştırılarak yorumlanmıştır

Abstract:
Honey is a natural and complex sweet food made by the bees from the nectar or sugary secretions excreted by some insect species. Pine honey in particular is a type of honey produced by the honey bees from the sugary secretions made by some insect species such as Marchalina hellenica living on pine trees. Pine honey is mostly produced in the Mediterranean countries including Turkey and some parts of Greece. Honey is a highly consumed natural food associated with numerous health benefits. The nutritious content of honey consists of carbohydrates including primarily glucose and fructose, lipids, flavanoids, proteins, enzymes, macro and micro nutrients. The composition and biologic properties of honey depend on the botanical origin of honey, which may vary depending on the changes caused by the seasonal and environmental factors. 
Honey production and trade have become increasingly important in our country and worldwide. Knowing the diversity of pollens, microorganism content of honey or ensuring its GMO (genetically modified organisms) status is potentially worthwhile both in terms of health and economy. One of the most effective ways in order to obtain such information is to analyze the specific genes present in pine honey following DNA isolation. However, due to the nature of pine honey such as its viscosity and the presence of inhibitors, there are some problems and limitations in the analysis of DNA of pine honey. The studies conducted so far have been examined and led to the assessment that there is a need for a better DNA isolation method that yields reliable and efficient results. This study, thus, aims to investigate the most effective DNA isolation method among some of the standard and commercial approaches for the pine honey of Muğla. It is also intended to amplify the rbcL gene by PCR from the obtained DNA of honey and partially clone into a plasmid in order to be used in the studies to determine botanical origin, when needed.
In this study, the pine honey samples randomly collected from Muğla region were used. First, the pollens of the honey samples were precipitated, visualized under microscopy and pollen pictures were recorded. Then, seven different DNA isolation methods including five different commercial kits and two standard methods were applied to extract DNA from the honey samples. These methods include the CTAB method, manual silica dioxide method, DNeasy Plant Mini Kit, Magrev Kit, MagJet Plant Kit, Biotecon Sample Preparation Kit and Surefood Plant Kit. DNA extraction protocols were first compared in terms of DNA yield and purity. For this purpose, absorbance measurements of the isolated DNAs were conducted by a Nanodrop spectrophotometer. Furthermore, genomic DNAs were analyzed by agarose gel electrophoresis and standard PCR. Spectrophotometric measurements and gel analyses to visualize genomic DNAs were not able to produce reliable results. It is thought that the reason for such outcome could be due to the fact that the amount of DNA obtained is so little and may be below the threshold value that can be observed as a result of gel analysis. Even though the absorbance values are relatively high, DNAs could not be detected by gel analysis. High values of absorbance may be due to the presence of contaminants (i.e. some sugars) carried over other than DNA during the process of isolation as the nature of honey dictate. Nevertheless, it was possible to detect the presence and relative quality of honey DNA utilizing standard PCR through the amplification of plant rbcL gene. Moreover, since Real- Time PCR analysis was routinely used to assess GMO content of honey, genomic DNAs obtained from pine honey were also subject to Taqman probe and SYBR green –based analyses. To achieve this, the primers and a Taqman probe suitable for trnL region in the plant plastid genome were designed and used. For SYBR green based analysis, the primers to amplify rbcL gene were used in Real-Time PCR experiments. Also, the studies were conducted to clone the PCR products of rbcL gene into pACYC Duet-1 plasmid and about 50 positive clones were obtained. The strains containing these recombinant plasmids were saved as glycerol stocks in order to use in the future efforts to determine botanical origin in case needed.
In conclusion, honey DNAs obtained from each method were analyzed in terms of yield and quality using several molecular approaches. We report that Real-Time PCR experiments produced successful results in the analysis of the genes contained in the pine honey samples and the results obtained from each technique are discussed and interpreted.