Kolza (brassica napus L. ssp. oleifera) bitkisinde adventif sürgün rejenerasyonu ve agrobacterium tumefaciens aracılığıyla gen aktarımı
Adventitious shoot regeneration and agrobacterium tumefaciens metiated gene transfer in rapeseed (brassicanapus L. ssp. oleifera)
Yazar: SEMRA MİRİCİ
Danışman: DOÇ. SEBAHATTİN ÖZCAN ; PROF. ORHAN ARSLAN
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Eğitimi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2000
Konu: Biyoloji = Biology ; Eğitim ve Öğretim = Education and Training
Dizin: Agrobacterium tumefaciens = Agrobacterium tumefaciens ; Gen aktarımı = Gene transfer ; Kolza = Rape ; Sürgün = Shoots

Özet:
KOLZA (Brassica napus L. ssp. oleifera) BİTKİSİNDE ADVENTİF SÜRGÜN REJENERASYONU ve Agrobacterium tumefaciens ARACILIĞIYLA GEN AKTARIMI (Doktora Tezi) Semra Mirici GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Nisan 2000 ÖZET Bu araştırmada bazı önemli kolza {Brassica napus L. ssp. oleifera) çeşitlerinde adventif sürgün rejenerasyonu ve Agrobacterium tumefaciens ile gen aktarımına yönelik çalışmalar yürütülmüştür. Adventif sürgün rejenerasyonunda eksplant olarak hipokotil, 2/3 kotiledon ve petiollü tam kotiledonlar kullanılmıştır. Değişik bitki büyümesini düzenleyiciler (BAP, kinetin, 2,4-D, TDZ, NAA) ve onların farklı konsantrasyonlarında yapılan denemelerde petiollü tam kotiledonun en yüksek sıklıkta adventif sürgün rejenerasyonu oluşturan eksplant olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, en yüksek sıklıkta adventif sürgün rejenerasyonu oluşturan çeşidin % 43,33 ile Spok ve en uygun ortamın da tek başına 2,00 mg/1 veya 4,00 mg/1 BAP içeren MSO olduğu tespit edilmiştir. Bununla beraber, Spok ve Hansen çeşidinde adventif sürgün rejenerasyonu için olgunlaşmamış embriyo eksplantları BAP ve NAA'in değişik kombinasyonlarında denemeye alınmıştır. Bu denemelerde sürgün oluşturan eksplant yüzdesi bakımından en yüksek sonuç, hem Hansen (% 55,00) hem de Spok (% 66,67) çeşidinde 0,50 mg/1 BAP ve 2,00 mg/1 NAA içeren MSO ortamından elde edilmiştir. Her iki çeşitte de olgunlaşmamış embriyo eksenleri (% 57,47) olgunlaşmamış kotiledon eksplantlarmdan (% 25,77) daha fazla adventif sürgün rejenerasyonu vermiştir. Tütün Samsun çeşidinin yaprak diski eksplantlannda değişik antibiyotik (higromisin ve kanamisin) ve herbisitlerin (metotreksat ve fosfınotrisin) seleksiyon ortamında kullanılabilecek en uygun dozlarının belirlenmesi için denemeler yürütülmüştür. Denemelerde transgenik sürgünlerin seçimi için11 gerekli olan en uygun kanamisin dozunun 50 mg/1, higromisinin 40,00 mg/1, metotreksatın 0,05 mg/1 ve fosfmotrisinin 5,00 mg/1 olduğu belirlenmiştir. Farklı non-onkogenik A. tumefaciens ve A. rhizogenesis hatları ile Samsun çeşidinin yaprak diski eksplantlanna gen aktarımı yapılmıştır. Kanamisin ve higromisin antibiyotiklerine dayanıklı sürgün oluşturan eksplant oram bakımından, % 100 ile 2260 35S GUS-INT, 15834 pRGG hpt, EHA 101 pRGG hpt ve % 95,00 ile 2260 AoPRİ NEOl en başarılı hatlar olarak belirlenmiştir. Kolza çeşitlerinin hipokotil ve petiollü tam kotiledon eksplantlarmm A. tumefaciens A281 ve C58 yabani hatlarına olan hassiyetlerinin araştırıldığı denemelerde, bakterinin tümör oluşturma yeteneği çeşit ve eksplanta göre farklılık göstermiştir. C58 bakteri hattı ile inoküle edilen hipokotil eksplantlarmda tümör oluşturan eksplant yüzdesi test edilen çeşitlere göre % 20,00 ile % 60,00 arasında, petiollü tam kotiledon eksplantmda da % 20,00 ile % 73,33 arasmda değişmiştir. A281 bakteri hattı ile inoküle edilen hipokotil eksplantlarmda ise tümör oluşturan eksplant yüzdesi test edilen çeşitlere göre % 16,67 ile % 63,33, petiollü tam kotiledon eksplantmda da % 20,00 ile % 73,33 arasmda değişmiştir. Adventif sürgün rejenerasyonu çalışmalarında test edilen diğer çeşitlere göre daha başarılı olan Spok, Helios, Darmor, Quinta ve Tarok çeşitleri ile Westar çeşidinin petiollü tam kotiledon eksplantlanna pGV 2260 35S GUS-INT hattı ile gen aktaran çalışmaları yapılmıştır. Kanamisine dayanıklı sürgün oluşturan eksplant yüzdesi çeşitlere göre % 3,59 ile % 19,20 arasında değişmiştir. Kanamisine dayanıklı sürgünler daha sonra kesilerek kanamisin içeren köklenme ortamında köklendirilmiştir. Köklenen sürgünler son olarak saksılara aktarılarak serada büyütülmüştür. Bu şekilde 174 aday transgenik bitki elde edilmiş olup, bunlardan Westar çeşidine ait sadece 2 bitki GUS pozitif bulunmuştur. Transformasyon sıklığı % 1,15 olarak tespit edilmiştir. Bilim Kodu : 5001018 Anahtar Kelimeler : Brassica napus L., kolza, Agrobacterium tumefaciens, adventif sürgün rejenerasyonu, gen transferi. Sayfa Adedi : 153 Tez Yönetişi : Prof. Dr. Orhan ARSLAN Doç. Dr. Sebahattin ÖZCAN

Abstract:
m ADVENTITIOUS SHOOT REGENERATION and Agrobacterium tumefaciens-MEDIATED GENE TRANSFER in RAPESEED (Brassica napus L. ssp.oleifera) (Ph.D. Thesis) Semra MİRİCİ GAZI UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY April 2000 ABSTRACT In this thesis, the studies related to adventitious shoot regeneration in some important Brassica napus L. cultivars and gene transfer via Agrobacterium tumefaciens have been carried out. In adventitious shoot regeneration studies hypocotyl, 2/3 cotyledons and whole cotyledons with petiol were used as explants. As a result of the experiments with various growth regulators (BAP, kinetin, 2/4 -D, TDZ, NAA) and their concentrations, it was observed that whole cotyledons with petiol was the explant to have the highest frequency in forming adventitious shoot regeneration. Besides, it was realized that Spok cultivar had the highest frequency in shoot regeneration with 43,33 % and MSO containing 2,00 mg/1 or 4,00 mg/1 BAP was the most suitable medium. In addition, for adventitious shoot regeneration in Spok and Hansen cultivars, immature embryo explants were treated with different combinations of BAP and NAA. In these treatmens, the highest percentage of explant producing adventitious shoots was obtained from MSO medium, supplemented with 0,50 mg/1 BAP and 2 mg/1 NAA in both Hansen (55,00 %) and Spok (66,67 %) cultivars. In both cultivars, immature embryo axes (55,47 %) developed more adventitious shoot regeneration than immature cotyledon explants (25,77 %). Some experiments were carried out in leaf disk explants of Samsun tobacco cultivar in order to define the most suitable doses of various antibiotics (hygromycin and kanamycin) and herbisites (methotrexate and phosphinothricin) to use in selection medium. As a result of the experiments, to select the transgenic shoots, the most suitable kanamycin dose was found asIV 50 mg/1, hygromycin was 40,00 mg/1, methotrexate was 0.05 mg/1 and phosphinothricin was 5,00 mg/1. Gene transfer to leaf disk explants of Samsun cultivar was carried out via various non-onkogenic AJumefaciens and A.rhizogenesis strains. In terms of kanamycin and hygromycin resistant shoot developing explant percentages, 2260355 GUS-INT, 15834 pRGGhpt, EHA 101 pRGGhpt were defined as the most successful strains with 100 %, and so were 2260 AoPRlNEOl with 95 %. The tumor production ability of the bacteria differed according to cultivars and explants as a result of the experiments in which the sensibility of whole cotyledon with petiol and hypokotil explants of Rapeseed cultivar to AJumefaciens A281 and C58 wild types. According to the tested cultivars, in the hypokotil explants that were inoculated with C58 strains, the tumor developing explant percentage varied between 20,00 % and 60,00 %, and so did the whole cotyledon with petiol explants 20,00 % and 73,00 %. In the hypokotil explants that were inoculated with A281 strain, the tumor developing explant percentage varied between 16,67 % and 63,33 % and so did the whole cotyledon with petiol explants 20,00% and 73,33 %. Gene transfer studies were conducted with pGV2260 35S GUS-INT strain to whole cotyledon with petiol explants of Westar as well as to Spok, Helios, Darmor, Quinta and Tarok cultivars, which were more successful than the other cultivars tested in the adventitious shoot regeneration studies. The percentage of explants producing kanamycin resistant shoots varied between 3,59% and 19,20% according to cultivars. Later on, canamycin resistant shoots were cut and planted in root medium containing kanamycin. Finally, the rooted shoots were grown in pots in the green house. In this way, 174 putative transgenic plants were obtained and among them only two plants that belong to Westar were found GUS positive. Transformation frequency was observed as 1,15 %. Science Code : 5001018 Key Words : Brassica napus L., rapeseed, Agrobacterium tumefaciens, adventitious shoot regeneration, gene transfer. Page Number : 153 Supervisor : Prof. Dr. Orhan ARSLAN Doç. Dr. Sebahattin ÖZCAN IC YÜKSEKÖ?RETİM KTOWi