LNCRNA'ların pankreas kanserinin tanı ve prognozundaki önemi
Significance of LNCRNA's in diagnosis and prognosis of pancreatic cancer
Yazar: NEVİN ORUÇ
Danışman: DOÇ. DR. FATMA ZUHAL EROĞLU
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Gastroenteroloji = Gastroenterology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Hepatopankreas = Hepatopancreas ; Hücre dizisi = Cell line ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Pankreas hastalıkları = Pancreatic diseases ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms ; Prognoz = Prognosis ; RNA = RNA ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Pankreas kanseri malignitelere bağlı ölümler arasında dördüncü sırada yer alan bir kanser türüdür. Pankreas kanserli hastaların serumlarında belirli antijenler tanımlanmıştır. Bu antijenlerden en önemlisi müsinle ilişkili karbonhidrat antijeni CA 19-9'dur. Son yıllarda yeni belirteçlerin saptanması amacıyla moleküler çalışmalarda siRNA, miRNA ve lncRNA (uzun kodlanmayan RNA) gibi küçük kodlanmayan RNA'lar kullanılmaya başlanmıştır. Bu kodlanmayan RNA'lardan lncRNA'lar, insan genomunun intergenik ve intronik bölgelerinden transkribe edilen ve karsinogenez sürecinde etkili oldukları bilinen grubu oluşturmaktadırlar.
Bu çalışmanın birincil amacı pankreas kanserinde belirli lncRNA'ların rollerinin araştırılmasıdır. İkincil amacı pankreas kanserli hastaların demografik, laboratuar ve klinik özelliklerinin gözden geçirilerek lncRNA' larla olan ilişkilerinin belirlenmesi ve yeni bir dolaşım belirteci olarak kullanılıp kullanılamayacaklarının irdelenmesidir. 
Çalışmamızda kontrol grubu olarak normal pankreas (HPDE) hücre serisi ve hasta grubu olarak da pankreas duktal adeno kanser (PANC-1) hücre serisi kültür şartları ortamında çoğaltılarak WST-1 testi ile hücre proliferasyon ve sitotoksisite analizleri yapılmıştır. Bu hücre serilerine ilaveten pankreas kanseri tanısı konulan 18 yaş ve üzeri 40 olgudan alınan plazma örnekleri hasta grubu olarak, 10 sağlıklı bireyden alınan plazma örnekleri ise kontrol grubu olarak değerlendirilmiştir. Olgular çalışmaya dahil edilmeden önce çalışma hakkında bilgilendirilerek "Bilgilendirilmiş onam formu" imzalatılmıştır. Literatür incelemesi yapılarak onkogenezle ilişkili olabilecek lncRNA' lar belirlenmiştir. Kültür hücrelerinden ve hasta ve sağlıklı olgulardan toplanan plazma örneklerinden standart yöntem ve literatüre uygun kitlerle elde edilen kalıp cDNA'lar kullanılarak literatür bilgilerine dayanarak seçilen belirli lncRNA'ların ekspresyon seviyeleri "All-in-OneTM qPCR Mix" (Genecopoeia) ile qPCR Array analizleri ile belirlenmiştir. Çalışmada hedef lncRNA'lara (ANRIL, H19, HOTAIR, MALAT1, PCA3, PTCSC3) ve housekeeeping genlerine (ACTB, B2M, GAPDH) özgül olarak dizayn edilen primer / problar kullanılmıştır. Çalışmamızda öncelikle pankreas kanserli hasta kanlarından ayrıştırılan plazma örneklerinden qPCR yöntemi ile ölçülen lncRNA'ların ekspresyon değerleri, kültür ortamında çoğaltılan hücre serisi örneklerinin ekspresyon değerleri ile kıyaslanarak elde edilen bulgulara göre bunların bir tanı testi ve prognoz göstergesi olup olamayacağı irdelenmiştir.
Pankreas kanser hücre hattında yapılan analizlerde sağlıklı hücre hattına göre kıyaslandığında ANRIL, H19, HOTAIR, MALAT1, PCA3 ve PTCSC3 ekspresyon seviyelerinin sırasıyla 0.58 kat,  4.60 kat, 4.19 kat,  0.66 kat, 1.25 kat ve 0.38 kat arttığı saptanmıştır. Aynı lncRNA ların hasta plazma örneklerinde sağlıklı kontrollere göre değişimi incelendiğinde sırasıyla 5.85 kat, 3.91 kat, 4.22 kat, 1.70 kat, 1.81 kat ve 3,93 kat azaldığı görülmüştür. Pankreas kanser tanılı hastaların plazma lncRNA değişimlerinin alkol ve sigara kullanımı, diyabet varlığı gibi faktörlerden etkilendiği bulunmuştur. Ayrıca hastalık evresi arttıkça plazma lncRNA değişimleri artmaktadır.
Sonuç olarak in vitro analizlerde PANC1 hücre hattında H19 ve HOTAIR lncRNA ekspresyonu artmaktadır. Ancak pankreas kanseri tanısı alan hastaların plazma örneklerinde ANRIL, H19, HOTAIR ve PTCSC3 lncRNA seviyeleri azalmaktadır. Bu değişim ileri evre hastalıkta, sigara, alkol kullanımında ve diyabet varlığında daha belirgin olduğu için pankreas kanserinin erken tanısında şu an için birer tanı yöntemi olarak kullanılması mümkün gözükmemektedir.

Abstract:
Pancreatic cancer is the fourth most common cancer related to mortality. Serum analysis of patients with pancreatic cancer have revealed several detectable antigens. Best clinically usefull serum antigene in those patients is mucin-associated carbohydrate antigen, CA 19-9. Various molecular studies including small noncoding RNA such as siRNA, miRNA ve lncRNA (long noncoding RNA) have been investigated as a new biomarker of pancreatic cancer. LncRNA are RNAs transcribed from the intergenic and intronic regions of the human genome and are known to be effective in the carcinogenesis process. 
The aim of this study was to investigate the roles of lncRNAs in pancreatic cancer. The second aim was to demonstrate the relation between lncRNA levels and clinical, demographic and labaratory findings of pancreatic cancer patients and to evaluate the potencial of lncRNA's as a new circulating markır of pancreatic cancer. 
In vitro studies were carried out in two different pancreatic cell lines. One of them was pancreatic ductal adenocarcinoma cell line (PANC-1) and other was normal pancreatic cell line (HPDE). Cell lines were grown in culture conditions and used in the study. Cell proliferation index and cytotoxicity studies were performed by using WST-1 assay. Beside invitro studies, plasma of pancreatic cancer patients were included to study. Fourty patients, 18 years old or older diagnosed with pancreatic cancer and 10 healthy control were evaluated. Patients were informed about the study and informed consents were optained. The literature related to the lncRNA and oncogenesis were reviewed. The lncRNA's associated with pancreatic cancer were selected.  The expression levels of lncRNA's were determined by using template cDNA samples and qPCR Array study "All-in-OneTM qPCR Mix" (Genecopoeia). Primers / probes specifically designed for our target lncRNA's (ANRIL, H19, HOTAIR, MALAT1, PCA3, PTCSC3) and housekeeping genes  (ACTB, B2M, GAPDH) were used for the study. The initial step in our study was to measure the expression level of lncRNA by qPCR in serum of pancreatic cancer patients. Expression levels of same lncRNA's in pancreatic cell lines in vitro were investigated to proof the efficiacy of lncRNA measurements as diagnostic and prognostic markers in pancreatic cancer.
In PANC1 pancreatic cancer cell line the expression levels of ANRIL, H19, HOTAIR, MALAT1, PCA3 and PTCSC3 lncRNA were respectivelly 0.58,  4.60, 4.19,  0.66, 1.25 and 0.38 times higher compared to HPDE cell line.  When patients plasma  lncRNA levels were compared to healthy controls the lncRNA changes were 5.85, 3.91, 4.22, 1.70, 1.81 and 3,93 times lower respectivelly. Plasma lncRNA levels in pancreatic cancer patients were affected by diabetes, alcohol and smoking habbits. Advanced disease stage increased the changes in selected plasma lncRNA expressions.
In conclusion, in vitro analysis of lncRNA expresssion showed that H19 and HOTAIR lncRNA expression increase in PANC1 cell line. However the plasma expression levels of ANRIL, H19, HOTAIR, and PTCSC3 lncRNA's in  pancreatic cancer patients were lower. Those changes were also affected by diabetes, alcohol and smoking status and the early diagnosis of pancreatic cancer by plasma lncRNA analysis appears to be not effective.