Siklin bağımlı kinaz inhibitörü olomoucine'in AuFe nanoparçacıklara konjugasyonu ve 131I ile işaretlenerek terapötik etkinliğinin in vitro olarak kanser hücreleri üzerinde incelenmesi
Radiolabelling of AuFe nanoparticle conjugated cyclin dependent kinase inhibitor olomoucine with 131I and evaluation of therapeutic efficacy on cancerous cells
Yazar: GÖKHAN TAKAN
Danışman: DOÇ. DR. EMİN İLKER MEDİNE
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nükleer Bilimler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry ; Radyoloji ve Nükleer Tıp = Radiology and Nuclear Medicine

Özet:
Siklin bağımlı kinazlar (CDK), hücre döngüsünün ve RNA transkripsiyonun önemli bir düzenleyicisidir. İnsan kanser hücrelerinde farklı şekillerde de olsa bu enzim grubunun aktivitesinin değiştiği bilinmektedir. Bu yüzden kanser tedavisinde bu enzim grubunun hedeflenmesi son 10 yılda üzerinde çalışılan bir konudur.
Bu çalışmada, hücre döngüsünde düzenleyici göreve sahip Siklin Bağımlı Kinaz (Cyclin-dependent Kinase, CDK) enzim ailesinin inhibitörü olan Olomoucine'in manyetik özelliğe sahip AuFe nanoparçacıklara konjugasyonu gerçekleştirilmiştir. AuFe nanoparçacıklar mikroemülsiyon yöntemi ile sentezlenmiştir. Nanoparçacıkların karakterizasyonu SEM, TEM, DLS, EDX, XRD ve VSM analizleri ile yapılmıştır. XRD analizi sonucunda nanoparçacıkların karakteristik demir-altın motifine sahip olduğu gösterilirken TEM analizi ile nanoparçacıkların ortalama 6 nm boyutunda oldukları tespit edilmiştir. Olomoucine'in AuFe nanoparçacıklara konjugasyonunda sisteamin hidroklorür ve CDI (1,1'-karbonildiimidazol) ara molekül olarak kullanılmıştır. Konjugasyon verimi ise HPLC analizi ile %67,60 olarak bulunmuştur.
Olomoucine ve AuFe nanoparçacıklara konjuge Olomoucine'in 131I ile iyodinasyonunda iodojen yöntemi kullanılmıştır. Olomoucine ve AuFe nanoparçacıklara konjuge Olomoucine'in 131I ile işaretlenme verimleri sırasıyla %93,27 ± 5,08 ve %85,5 ± 7,08'dir. 
Yapılan in vitro çalışmalarda A549 ve MCF7 hücre hatları kullanılmıştır. Olomoucine ve AuFe nanoparçacıklara konjuge Olomoucine için IC50 değerleri A549 hücrelerinde sırasıyla 17,96 ve 18,49 µg/mL iken MCF7 hücre hattında ise sırasıyla 21,31 ve 21,29 µg/mL bulunmuştur. Örneklerin A549 hücreleri üzerindeki bağlanma düzeyinin MCF7 hücrelerine kıyasla daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Bunun yanında, manyetik alan uygulanan örneklerde inkorporasyonun arttığı görülmüştür. Proliferasyon ve hücre migrasyonu çalışmaları ile Olomoucine'in proliferasyon hızını düşürücü etkisi görülmektedir. A549 hücre hattında Olomoucine'in apoptotik etkisi görülürken MCF7 hücrelerinde 24 saat sonunda apoptoza uğrayan hücreye rastlanmamıştır.
CDK inhibitörü Olomoucine'in AuFe nanoparçacıklara konjugasyonu sonrasında Olomoucine'in proliferasyon hızını düşürücü etkisinde kayıp olmadan, AuFe nanoparçacıkların sahip olduğu manyetik özelliği sayesinde Olomoucine'in istenilen bölgeye hedeflenmesi sağlanmıştır.
Elde edilen tüm sonuçlar değerlendirildiğinde, AuFe nanoparçacıklara konjuge Olomoucine'in, kanser tedavisinde terapötik ajan olarak kullanılmasına yönelik umut verici bir çalışma ortaya konulmuştur.

Abstract:
Cyclin-dependent kinases (CDKs) are critical regulators of cell cycle regulation and RNA transcription. Activity of these enzyme family is breakdown in human cancer cells broadly. Hence, CDK inhibition in cancer treatment is popular subject in last decade.
In this study, Cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor Olomoucine was conjugated to magnetic AuFe nanoparticles. AuFe nanoparticles were synthesized by microemulsion (water in oil) method. SEM, TEM, DLS, EDX, XRD and VSM techniques were utilized to characterize of AuFe nanoparticles. Analysis results show that nanoparticles give iron-gold pattern and average size of particles are about 6 nm. Cysteamine hydrochloride and CDI (1,1'-carbonyldiimidazole) were used as a linker molecule for conjugating Olomoucine to AuFe nanoparticles. The conjugation yield was 67.6% as determined by HPLC.
Iodination of Olomoucine and Olomoucine conjugated AuFe nanoparticles with 131I were performed by the iodogen method. Radiolabelling yield of Olomoucine and Olomoucine conjugated AuFe nanoparticles are 93.27% ± 5.08 and 85.5% ± 7.08 respectively.
A549 and MCF7 cell lines were used for in vitro studies. IC50 value of Olomoucine and Olomoucine conjugated AuFe nanoparticles for A549 cell line is 17.96 and 18.49 µg/mL respectively, whereas 21.31 µg/mL and 21.29 µg/mL for MCF7 cell line. Incorporation ratio of Olomoucine and Olomoucine conjugated AuFe nanoparticles are vary by cell lines but incorporation on A549 cell line is slightly greater than MCF7. Applying external magnetic field enhancing incorporation rate on both cell lines for Olomoucine conjugated AuFe nanoparticles. By the proliferation and cell migration assays antiproliferative effect of Olomoucine was shown. Olomoucine inducing apoptosis in A549 cells after 24h incubation but there is not any significant apoptotic effect in MCF7 cells. Conjugation of CDK inhibitor Olomoucine to AuFe nanoparticles is not reducing the toxicity of Olomoucine. Also magnetic nanoparticles lead to target Olomoucine effectually to tumor cells on external magnetic field. 
All these results obtained shows that Olomoucine conjugated AuFe nanoparticles are promising therapeutic agent for cancer treatment.