Antioksidan enzimlerin aktivite ölçümü için yeni spektroskopik yöntemlerin geliştirilmesi
Development of new spectroscopic methods for measurement of antioxidant enzyme activity
Yazar: MERVE EMEK KAYALILAR
Danışman: PROF. DR. REŞAT APAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants

Özet:
Reaktif oksijen birikimi organizmada mevcut olan veya gıdayla alınan antioksidanlarla dengelenmediği takdirde; oluşan oksidatif stres koşulları altında biyolojik yapıların hasarına neden olabilen radikalik zincir reaksiyonları meydana gelmektedir. Oksidatif stresin zararlı etkilerini önlemek için canlı organizma tarafından geliştirilen antioksidan koruma sistemleri, enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanlardan oluşur. Katalaz (CAT), süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon redüktaz (GSSG-Red) ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) gibi antioksidan enzimler, hücrelere zarar veren reaktif türleri (serbest radikaller) etkin bir şekilde süpürerek düşük toksisiteli veya toksik olmayan ürünlere dönüştürürler. Süperoksit anyon radikali (O2.-), hidroksil radikali (?OH) ve hidrojen peroksit (H2O2) gibi reaktif oksijen türlerinin canlı organizmalardan uzaklaştırılması ve bu türleri süpürebilen antioksidan enzimlerin araştırılmasına olan ilgi günümüzde giderek artmaktadır. Bu nedenle bu antioksidan enzimlerin aktivitelerinin belirlenebilmesi için basit, duyarlı ve hızlı yöntemler gereklidir.Bu tez çalışması kapsamında, modifiye CUPRAC yöntemiyle antioksidan enzimlerin (katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) aktiviteleri) aktivitelerinin belirlenmesi ve bulunan bu değerlerin referans yöntemlerle elde edilen değerlerle karşılaştırılarak doğruluğunun ispatlanması amaçlanmaktadır.Biyolojik örneklerin (serum, doku homojenizatı) enzim (katalaz, glutatyon peroksidaz) aktivitelerinin ölçülmesinde bu enzimlerin substratı olan hidrojen peroksit ve glutatyon, CUPRAC reaktifi (bakır(II)-neokuproin kompleksi) ile reaksiyona girer. Bu reaksiyonda bakır(II)-neokuproin kompleksi, spektrofotometrik tayine elverişli olan renkli bir kelat kompleksi (Cu(I)-neokuproin)'ne indirgenir. Katalaz aktivite tayini için geliştirilen CUPRAC yönteminde sıçanlardan alınan karaciğer (198.11 U mL-1), kalp (15.09 U mL-1) ve böbrek (56.58 U mL-1) dokularının katalaz aktiviteleri belirlenmiş ve genellikle karaciğer katalaz aktiviteleri, diğer dokuların katalaz aktivitelerine göre daha yüksek bulunmuştur. Katalaz aktivite tayini için geliştirilen CUPRAC yöntemiyle dokularda seyrelme oranının etkisi, güniçi ve günlerarası katalaz aktivite değişimi incelenmiş ve standart katkı yöntemi uygulanarak sonuçların uyumluluğu açısından bir değerlendirme yapılmıştır. Ayrıca katalaz aktivite tayini için geliştirilen CUPRAC yöntemiyle bulunan sonuçlar, referans yöntem olarak seçilen UV yöntemle karşılaştırılmış ve her iki yöntemle uyumlu sonuçlar elde edilmiştir. Karaciğer dokusu için yöntemler arası korelasyon değeri 0.9808 olarak bulunmuştur.Glutatyon peroksidaz aktivite tayini için geliştirilen CUPRAC yönteminde ise öncelikle sıçanlardan alınan karaciğer (28.41 U mL-1), kalp (16.91 U mL-1) ve böbrek (25.26 U mL-1) dokularının glutatyon peroksidaz aktiviteleri belirlenmiştir. Daha sonra bu yöntemle dokularda güniçi ve günlerarası GSH-Px aktivite değişimi incelenmiş ve standart katkı yöntemi uygulanarak % hata oranları 0.28 ile 7.5 arasında bulunmuştur. Ayrıca glutatyon peroksidaz aktivite tayini için geliştirilen CUPRAC yöntemiyle bulunan sonuçlar, referans yöntem olarak seçilen GSH-Px-DTNB yöntemiyle karşılaştırılmış ve her iki yöntemle uyumlu sonuçlar elde edilmiştir. Karaciğer dokusu için yöntemler arası korelasyon değeri 0.9111 olarak bulunmuştur.

Abstract:
If the ROS accumulation is not balanced by existing or food-injested antioxidants in the organism, radicalic chain reactions may occur under oxidative stress conditions that may cause tissue damage. Antioxidant protection systems which are developed by living organisms to prevent the harmful effects of `oxidative stress? consist of enzymatic and nonenzymatic antioxidants. Antioxidant enzymes like catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione reductase (GSSG-Red) and glutathione peroxidase (GSH-Px) effectively scavenge reactive species (free radicals) responsible for cellular damage, and convert these species to low toxic or nontoxic products. Recently, the importance of removing excessive ROS from living organisms is becoming increasingly recognized, together with a growing interest in investigating antioxidant enzymes that can scavenge superoxide anion (O2.-), hydroxyl radical (?OH) and hydrogen peroxide (H2O2). Thus simple, sensitive and rapid methods have to be devised to measure antioxidant enzyme activity.Within the scope of this thesis work, it was aimed to determine of antioxidant enzyme (catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px)) activities with the modified CUPRAC methods, and to validate the proposed methodology by comparison of the results obtained with those of reference methods.In the measurement of enzyme (catalase and glutathione peroxidase) activities of biological samples, hydrogen peroxide and glutathione ?as the substrates of these enzymes, respectively? are reacted with the CUPRAC reagent (i.e. cupric neocuproine complex). In this reaction CUPRAC reagent is reduced to a colored complex (cuprous neocuproine chelate) suitable for spectrophotometry. In the CUPRAC method developed for catalase activity assay, catalase activities of liver (198.11 U mL-1), kidney (56.58 U mL-1) and heart (15.09 U mL-1) tissues taken from rats were determined, and it was found that catalase acitivities of liver tissues were generally higher than those of other tissues. With the developed CUPRAC method for catalase acitivity, the effect of dilution ratio and the intra-day and inter-day variability of catalase activity in tissues were examined, and the method of standart additions was applied to the tissues to observe the compatibility of expected and found results. Additionally, the ? ndings of the developed CUPRAC method for catalase activity were compared with those of reference UV method, where the ? ndings were statistically alike. The inter-assay correlation coefficient (r) for liver tissues between the developed CUPRAC method and UV spectrometry was 0.9808.In the CUPRAC method developed for glutathione peroxidase activity assay, firstly liver (28.41 U mL-1), kidney (25.26 U mL-1) and heart (16.91 U mL-1) glutathione peroxidase activities of rat tissues were determined. Then, using this method, the intra-day and inter-day variabilities of glutathione peroxidase activity in tissues were examined, and the method of standart additions applied to kidney, liver and heart tissues gave relative standard errors between 0.28 and 7.5 %. Additionally, the findings of the developed glutathione peroxidase CUPRAC method were compared with those of the reference GSH-Px-DTNB method, yielding compatible results. The inter-assay correlation coefficient (r) of glutathione peroxidase acitivities for liver tissues between the developed CUPRAC method and GSH-Px-DTNB reference method was 0.9111.