WNT--reseptör kompleksinin hücre membranı alanlarındaki aktivasyonunun moleküler mekanizmalarının anlaşılması
Understanding the molecular mechanisms of the  WNT-receptor complex activation on cell membrane region
Yazar: AYŞE YAĞMUR AZBAZDAR
Danışman: DOÇ. DR. HATİCE GÜNEŞ ÖZHAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Beta katenin = Beta catenin ; Genler = Genes ; Hücre zarı = Cell membrane ; Katenin = Catenin ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Wnt sinyal iletimi omurgalı gelişimi süresince ve yetişkin dokularda homeostazın düzenlenmesinde ve doku/organ rejenerasyonunda hayati rollere sahip bir sinyal yolağıdır. Bu nedenle yolak bileşenlerinin mutasyonları ve yolaktaki bazı hatalı işleyişler kalıtsal hastalıklar, kanser ve dejeneratif hastalıklar ile ilişkilendirilmektedir.
Wnt sinyal yolakları arasında üzerinde en çok çalışılmış ve en iyi karakterize edilmiş olanı β-katenin üzerinden işleyen kanonikal yolaktır. Wnt/β-katenin sinyal yolağında salgılanan Wnt proteini hücre yüzeyinde bulunan Frizzled reseptörüne ve koreseptör Lrp5/6'ya bağlanır. Kanonikal yolakta gerçekleşen sitoplazmik olaylar büyük oranda aydınlatılmış olmasına rağmen Wnt-reseptör kompleksinin oluştuğu nano çevre ve bu çevrenin sinyal iletiminin aktivasyonundaki rolü hakkında yeterli çalışma ve bilgi bulunmamaktadır. Bu bağlamda projede Wnt ligandının reseptör kompleksine bağlandığı membran lipid çevresine ilişkin çalışmalar yürütülmüştür. 
Çalışmamızda Wnt-reseptör kompleksinin oluştuğu nano çevrenin membrandaki düzenli bölgeler olduğu hipotezinden yola çıkılarak  bu bölgelerin yapısı çeşitli enzimler ve kimyasal ajanlar ile değiştirilmiş ve Wnt/β-katenin sinyal aktivitesi lusiferaz aktivite ölçümü yöntemi ile değerlendirilmiştir. Membranın düzenli bölgelerindeki yapının bozulmasının  sinyal iletiminde düşüşe sebep olduğu ancak düzensiz bölgelerdeki yapının değiştirilmesinin önemli bir farklılığa yol açmadığı görülmektedir. Ayrıca, düzenli membran lipidlerinin plazma zarına taşınamadığı Niemann-Pick Tip C hastalığına neden olan mutasyonları taşıyan CHO (Chinese Ovary Hamster) hücre hatlarında WT olan hücre hattına kıyasla Wnt/β-katenin aktivitesinin düştüğü  görülmektedir. Wnt ligandının membran yerleşimine ise deterjana dirençli membran (DRM) flotasyonu yönteminin ardından western blotlama yöntemi kullanılarak bakılmıştır. Ligandın, membran düzenli bölgelerinde olduğu sonucuna varılmıştır. Son olarak palmitolasyonun hem Wnt ligandı hem de Lrp reseptörü üzerindeki etkisine yine Lusiferaz aktivite ölçümü ve membrandaki yerleşimine de DRM flotasyonu ve western blotlama yöntemleri kullanılarak bakılmış olup palmitolasyonun gerek Wnt ve Lrp'nin membran bölgelerindeki lokalizasyonu gerekse Wnt/β-katenin sinyal aktivitesi için gerekli olduğu sonucuna varılmıştır. 
Sonuç olarak, bu çalışma Wnt proteininin reseptör kompleksine, spesifik olarak, membranın bazı lipidler, steroller ve lipid-bağlı proteinlerce zengin olduğu bilinen özelleşmiş bölgeleri olan düzenli membran bölgelerinde (geleneksel adıyla lipid raftlarda) bağlandığı hipotezini desteklemektedir. 
İlaç geliştirme çalışmalarında, ilacın hedef aldığı bölgeye yüksek bir özgüllük ile bağlanabilmesi, yalnızca hasta dokunun hedef alınması açısından çok önemlidir. Çalışmamız düzenli membran bölgelerinin Wnt/β-katenin sinyal iletimindeki önemini ortaya koyarak bu bölgeleri, hedeflenen tedavilerin geliştirilmesinde potansiyel öneme sahip bir konuma getirmektedir. Bu çalışmanın sonuçları, Wnt-reseptör kompleksini hedef alan ilaçların özgüllüğünü arttırmayı sağlayacak yeni stratejilerin geliştirilmesine katkı koyma potansiyeline sahiptir.

Abstract:
ABSTRACT
Wnt signaling has vital roles during vertebrate development and in regulation of adult tissue homeostasis as well as and tissue/organ regeneration. Mutations of pathway components and pathway malfunctioning are thus associated with hereditary diseases, cancer and degenerative diseases.
Wnt/β-catenin signaling (canonical Wnt signaling) is the most studied and well-characterized Wnt signaling pathway. Here, the secreted Wnt protein binds to the Frizzled receptor and Lrp5/6 coreceptor at the cell surface. While the cytoplasmic events in the canonical Wnt pathway have been widely studied, little is known about the role of the nanoenvironment where Wnt-receptor complex formation and signaling activation occur. In this context, the membrane lipid environment in which the Wnt ligand binds to the receptor complex have been carried out in the project.
Here, based on the hypothesis that the Wnt-receptor complex forms in the ordered domains of the plasma membrane, we destructured these domains by using various enzymes and chemical agents and measured Wnt/β-catenin signaling activity with luciferase assay. Disruption of the ordered membrane domains leads to reduction in the signaling activity whereas alteration of disordered domains causes no significant change. In addition, Wnt/β-catenin activity is reduced in CHO cell lines carrying mutations that cause Niemann-Pick Type C disease cells where trafficking of ordered membrane lipid components to the plasma membrane is genetically impaired. The membrane localization of the Wnt ligand was examined using detergent-resistant membrane (DRM) flotation method following by western blotting method. The result is that the ligand binds to the membrane ordered regions. Finally, the effect of palmitoylation on both the Wnt ligand and the Lrp receptor was also examined by activity using Luciferase activity measurement and membrane localization using DRM flotation and western blotting methods. As a result palmitoylation is necessary for activity and correct localization on membrane of both Wnt and Lrp.
The result is that the ligand is in the membrane regular regions. Finally, the effect of palmitolysis on both the Wnt ligand and the Lrp receptor was also examined by using Luciferase activity measurement and membrane localization using DRM flotation and western blotting, and the localization of Wnt and Lrp in the membrane region was necessary for Wnt / β-catenin signaling it has arrived at the end.
Finally, it appears that palmitoylation is necessary for both localization of Wnt and Lrp in the membrane domains and Wnt/β-catenin signaling activity. In conclusion, this study supports the hypothesis that the Wnt protein binds to the receptor complex, specifically in ordered membrane domains (often referred to as lipid rafts), which are specialized membrane regions characterized by certain lipids, sterols and lipid-anchored proteins.
In drug development studies, the ability of the drug to bind its target region with a high specificity is very important. Our study manifests the importance of ordered membrane regions in activation of Wnt/β-catenin signaling, revealing their potential for development of targeted therapies. The results of this study have the potential to contribute to the development of new strategies to increase the specificity of drugs targeting the Wnt-receptor complex.