Semen örneklerinde miR-891a ve miR-10a belirteçlerinin çeşitli koşullarda dayanıklılığının değerlendirilmesi
Evaluating stability of miR-891a and miR10a markers in semen samples to various conditions
Yazar: AHMET CAN KURT
Danışman: PROF. DR. EMEL HÜLYA YÜKSELOĞLU
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine

Özet:
Adli soruşturmalarda biyolojik deliller, faillerin tespiti ve suç faaliyetlerinin ardındaki gerçeğin ortaya çıkarılması açısından büyük önem taşımaktadır. Sağlık alanındaki teknolojik gelişmeler ile birlikte biyolojik örneklerden DNA analizinin yapılması mümkün olmuş ve hukuki açıdan daha kesin ve güvenilir sonuçlar elde edilmesini sağlamıştır. Günümüzde olay yerinden toplanan örneklerden DNA analizi yapılmadan önce insan kaynaklı bir biyolojik örnek olduğunun kesinleşmesi gerekmektedir. Bunun için geliştirilmiş çeşitli fiziksel, immünolojik, histo-kimyasal, mikroskobik testler bulunmaktadır. Ancak bu testler, eser miktardaki örneklerle çalışıldığında, örnek içerisindeki DNA yapısının bozulmasına ve örnek miktarında azalmaya sebep olabilmektedir. Ayrıca yeterince spesifik olmayan testlerde yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlar elde etmek mümkündür. Tüm bu dezavantajlar göz önüne alındığında adli bilimlerde yeni nesil moleküler uygulamalara başvurulmuştur. Doku spesifik ekspresyon özellikleri nedeniyle RNA molekülleri, bu testlere alternatif olarak öne sürülmüştür. Tıpkı mRNA gibi miRNA'lar da doku spesifik ekspresyon özellikleri nedeniyle vücut sıvısı tayininde kullanılmaya uygun moleküllerdir. miRNA'lar daha küçük boyutları ve enzim kompleksiyle korunmasından dolayı mRNA'lara göre daha dayanıklı ve stabil moleküllerdir. Bu nedenle degrade koşullarda daha iyi sonuç vermektedir. Olay yerindeki degrade edici koşulların özellikleri göz önüne alındığında, bu tür belirteçlerin bu ortamlarda stabilitelerinin değerlendirilmesi adli bilimler için oldukça önemlidir. Bu sebeple çalışmamızda en sık karşılaşılan olay yeri senaryoları belirlenerek, bu koşullar üzerinde denemeler yapılmıştır.
Çalışmamızda, özellikle cinsel suçlarda önemli bir yer tutan bir biyolojik sıvı olan semen üzerinde, diğer vücut sıvılardan ayırt edici bir şekilde yüksek konsantrasyonlarda bulunan miR-10a ve miR-891a belirteçlerinin, degrade edici koşullarda stabiliteleri değerlendirilmiştir. Semen örnekleri gönüllülük esası ile çalışmaya katılan beş sağlıklı (normospermi) bireyden toplanmıştır. Her bir bireyden alınan semen örneği, %100 pamuklu beyaz kumaşlara damlatılmış ve bu kumaşlar olay yerleri taklit edilerek oluşturulan koşullarda bekletilmiştir. Kontrol grubu olarak kullanılan O grubu örnekleri oda sıcaklığında, S grubu örnekleri Büyükçekmece gölünden alınan su içerisinde, T grubu örnekleri standart bahçe toprağında gömülü olacak şekilde 20 gün bekletilmiştir. Y grubu örnekleri, ev tipi çamaşır makinesi içerisinde 90 °C yıkama programında 1 saat toz deterjanla birlikte yıkanmıştır. Kumaş örneklerinden, hedeflenen süre sonunda total RNA izolasyonu yapılmıştır. RNA izolasyonunun ardından cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Kantitatif analiz için RT-PCR cihazında miR-10a ve miR-891a bölgelerinin amplifikasyonu gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş ve Ct değeri elde edilmiştir. Karşılaştırma için referans olarak RNU6b kullanılmıştır. miRNA konstantrasyon karşılaştırmaları için ΔCt [Ct(miRNA) – Ct (RNU6b)] ve ΔΔCt değerleri hesaplanmış ve miR-10a ile miR-891a stabiliteleri, 2-ΔΔCt formülüyle hesaplanan kat değişimi (fold change) prensibiyle yorumlanmıştır. Ct değeri 35 ve üstü çıkan örnekler için kat değişimi ve istatistiksel analizler uygulanmamıştır. Kat değişimi verilerine göre miR-891a ekspresyonunun, miR-10a'ya göre daha fazla olduğu ve daha stabil bir belirteç olduğu yorumlanmıştır. Çamaşır makinesinde yıkanan örneklerde ise ortam sıcaklığının fazla olması ve çamaşır deterjanı gibi nükleik asit yapısına zarar veren kimyasalların bulunmasından dolayı miRNA degradasyonu daha fazla gerçekleşmiştir ve bu grupta miRNA eldesi yapılamadığı için karşılaştırmalı analizlere dahil edilmemiştir. İstatistiksel analizler için IBM SPSS Statistics 22 programı ile farklı çevresel koşulların, miRNA konsantrasyonunda anlamlı bir fark yaratıp yaratmadığının belirlenmesi için normallik testi (Shapiro–Wilk) ve One-way ANOVA ve Post-hoc Tukey ile test edilmiştir. One-way ANOVA testi sonuçlarına göre test edilen çevresel koşullar, miRNA stabilitesi üzerinde anlamlı bir etkiye sahip değildir (p>0,05).

Abstract:
Forensic investigations rely heavily on biological evidence to identify perpetrators and uncover the truth behind criminal activities. Advances in healthcare technologies have made it possible to analyze DNA from biological samples, enabling more definitive and reliable results in legal contexts. Today, before DNA analysis is performed on evidence collected from a crime scene, it is necessary to confirm that the sample originates from a human biological source. Various physical, immunological, histochemical, and microscopic tests have been developed for this purpose. However, when working with trace amounts of samples, these tests can damage the DNA structure and reduce the sample quantity. Furthermore, tests that are not sufficiently specific may yield false-positive or false-negative results. Considering these disadvantages, forensic sciences have turned to next-generation molecular applications. RNA molecules have emerged as alternatives due to their tissue-specific expression characteristics. Like mRNA, miRNAs are also suitable for the identification of bodily fluids due to their tissue-specific expression features. miRNAs are more resilient and stable than mRNAs because of their smaller size and protection by enzyme complexes. Therefore, they produce better results under degraded conditions. Given the degrading environmental conditions at crime scenes, evaluating the stability of such markers in these environments is crucial for forensic sciences. For this reason, the most common crime scene scenarios were determined in our study, and experiments were conducted under these conditions.
In our study, the stability of miR-10a and miR-891a, which are markers found in significantly higher concentrations in semen compared to other bodily fluids, was evaluated under degrading conditions. Semen samples were collected from five healthy (normospermic) volunteers. The samples were deposited on 100% cotton white fabrics, which were then exposed to simulated crime scene conditions. As the control group, O-group samples were stored at room temperature. S-group samples were submerged in water obtained from Büyükçekmece Lake, T-group samples were buried in standard garden soil, and Y-group samples were washed in a domestic washing machine at 90 °C with powdered detergent for 1 hour. After the target duration, total RNA was isolated from the fabric samples. Subsequently, cDNA synthesis was performed. Quantitative analysis was carried out using an RT-PCR instrument, where the amplification of miR-10a and miR-891a regions was monitored in real-time, and Ct values were obtained. RNU6b was used as a reference for comparison. For miRNA concentration comparisons, ΔCt [Ct(miRNA) – Ct(RNU6b)] and ΔΔCt values were calculated, and the stabilities of miR-10a and miR-891a were interpreted using the fold-change principle calculated by the 2^-ΔΔCt formula. Samples with Ct values of 35 or higher were excluded from fold-change and statistical analyses. Based on fold-change data, it was observed that miR-891a expression was higher and more stable than miR-10a. In the samples washed in the washing machine, the high temperature and the presence of chemicals such as laundry detergent, which damage the nucleic acid structure, led to greater miRNA degradation. Therefore, miRNA could not be recovered from this group, and comparative analyses were not performed. Statistical analyses were conducted using IBM SPSS Statistics 22 to determine whether different environmental conditions significantly affected miRNA concentrations. Normality was assessed with the Shapiro–Wilk test, while One-way ANOVA and Post-hoc Tukey tests were used for group comparisons. According to the results of the One-way ANOVA test, the tested environmental conditions did not have a significant impact on miRNA stability (p>0.05).