Broylerlerde escherichia coli o157'nin prevalansı ve pulsed field gel electrophoresis (PFGE) yöntemi ile tiplendirilmesi
The prevalence of escherichia coli o157 in broilers and molecular typing by pulsed field gel electrophoresis (PFGE)
Yazar: RECEP KALIN
Danışman: DOÇ. DR. HASAN ÖNGÖR
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Escherichia coli = Escherichia coli ; Escherichia coli enfeksiyonları = Escherichia coli infections ; PFGE = Pulsed field gel electrophoresis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Tavuklar = Chickens ; Tavukçuluk = Chicken farming ; Virülans = Virulence ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İnsan = Human

Özet:
Bu çalışmada; Escherichia coli (E. coli) O157'nin broyler tavuk örneklerindeki varlığının kültür ve immunomanyetik separasyon (IMS) ile araştırılması, moleküler yöntemlerle karakterize edilerek virülens genlerinin saptanması, Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) yöntemi ile alt tiplendirmesi ve böylece izolatlar arasındaki genetik ilişkilerin ortaya konması amaçlandı.Bu amaçla, Elazığ ve Malatya illerindeki üç farklı kanatlı kesimhanesinden 1000 broylere ait karaciğer ve sekum örnekleri ile aynı işletmelerde bulunan 1000 broylere ait karkas örnekleri toplandı. Ayrıca bu çalışmada, broyler izolatları ile insan izolatları arasındaki genetik ilişkiyi ortaya koymak amacıyla, aynı bölgedeki beş hastaneye ishal şikâyeti ile başvuran hastalardan temin edilen 367 gayta numunesi incelendi. Broyler sekum ve insan gayta örneklerinden direkt ekim ve immunomanyetik seperasyon (IMS) sonrası ekim gerçekleştirilirken, karkas ve karaciğer örneklerine yalnızca direkt ekim uygulandı.Broyler tavuklarda örneklerin direkt ve IMS sonrası ekiminde saptanan sorbitol negatif izolatların Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile incelenmesinde; karaciğerde % 0,1 (1/1000) ve sekumda % 0,4 (4/1000) olmak üzere iç organlardan hayvan bazında % 0,5 oranında E. coli O157 tespit edilirken, karkas örneklerinden etken izolasyonu yapılamadı. İnsan gayta örneklerinden ise % 2,7 (10/367) oranında pozitiflik saptandı.Kümes bazında bakıldığında; kümeslerin % 12'sinde (3/25) etken identifikasyonu yapıldı. E. coli O157 pozitif bulunan bu işletmelerden bir tanesi Malatya'da ve iki tanesi Elazığ'da yer alıp, bu kümeslerdeki pozitiflik oranları sırasıyla % 2 (1/50), % 6,7 (2/30) ve % 4 (2/50) olarak bulundu. Kümes bazındaki pozitiflik oranları arasındaki farkın istatistiksel olarak önemli olduğu tespit edildi (P <0,001).Virülens genlerine spesifik PCR ile incelenen beş broyler tavuk ve on insana ait E. coli O157 izolatının hiçbirinde H7, shigatoksin 1-2 ve enterohemolizin genleri bulunamadı. Buna karşın, broyler izolatlarının tamamı ve bir adet insan izolatı intimin geni yönünden pozitif olarak tespit edildi.PFGE analizi sonucunda hem broyler hem de insan izolatlarında birbirinden farklı 4'er profil saptandı. Bu çalışmada elde edilen insan E. coli O157 izolatları ile kanatlı orijinli izolatlar arasında herhangi bir genetik ilişki saptanamaması, bulaşma kaynağının kanatlı kökenli olmadığı fikrini desteklemektedir.Sonuç olarak bu çalışmada, broyler tavukların E. coli O157 serotipini taşıdığı tespit edildi. E. coli O157'ye bağlı enfeksiyon ve salgınların epidemiyolojisinin daha iyi anlaşılabilmesi ve etkin kontrol stratejilerinin geliştirilebilmesi için ruminant türlerinin yanı sıra başta broyler olmak üzere kanatlı hayvanların da incelenmesinin faydalı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
This study was carried out to investigate the presence of Escherichia coli (E. coli) O157 in various samples collected from broiler chickens by culture and Immunomagnetic seperation (IMS). In addition, the isolates were subjected to molecular characterization in order to determine the presence of virulence genes and were then subtyped by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) method to reveal the genotypic relationships between the strains.For this purpose, liver and caecum samples collected from 1000 broilers and carcass samples obtained from another 1000 broilers which slaughtered at three different abattoirs located in Malatya and Elazig provinces were examined. Also, faecal samples provided from 367 humans with diarrhea, who applied to five different hospitals in the region, were examined in order to reveal genetic relationships between broiler and human E. coli O157 isolates. While all the samples collected from broilers and humans were subjected to direct cultivation, caecum and human fecal samples were also examined by the combination of Immunomagnetic separation (IMS) and culture.In the Polymerase Chain Reaction (PCR) analysis of sorbitol negative isolates, E. coli O157 was identified from 0.1% (1/1000) and 0.4% (4/1000) of the liver and caecum samples of broiler chickens, respectively. In overall, the agent was detected in 0.5% (5/1000) of internal organ samples of broilers. On the other hand, none of the carcass samples were determined to be positive for E. coli O157. The percentage of 2.7% (10/367) was obtained in the PCR examination of human faecal samples.When the results were assessed at flock base, the identification percentage of E. coli O157 was calculated as 12% (3/25). Of the positive flocks, one was located in Malatya and the other two were in Elazig. The positivity rates within these flocks were detected as 2% (1/50), 4% (2/50) and 6.7% (2/30), respectively. The difference between the flocks in terms of the positivity rates were determined to be statistically significant (p<0.001).The PCR analysis specific for virulence genes showed that none of the broiler (n=5) and human (n=10) E. coli O157 isolates possessed H7, shigatoxins 1-2, and enterohemolysin genes, whereas all the broiler isolates and one of the human isolates were positive for intimin gene.In the PFGE analysis, a total of eight different profiles (four from broiler and four from human isolates) were observed. However, there were no genetic relationships between broiler and human E. coli O157 isolates which suggest that broilers do not play significant role in the transmission of infection to humans.In conclusion, this study showed that E. coli O157 was isolated from broilers. It is therefore plausible to suggest that in addition to ruminants, avian species, especially chickens, should be considered for the better understanding of the epidemiology of E. coli O157 infection. This will help develop more effective control strategies against infections and outbreaks due to E. coli O157.