Kitosanın insan periferal kanı mononüklear hücreleri üzerinde in-vitro oksidatif ve sito-genotoksik etkileri
In-vitro oxidative and cyto-genotoxic effects of chitosan on human peripheral blood mononuclear cells
Yazar: SALİM ÇERİĞ
Danışman: PROF. DR. FATİME GEYİKOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Genel Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Böceklerin iskeletlerinin, mantarların hücre duvarlarının, yengeç ve karides gibi kabuklu su ürünlerinin ana bileşeni olan kitin, dünyada selülozdan sonra en bol ve yaygın bulunan ikinci biyopolimer ya da amino polisakkarittir. Kitinin karmaşık ve zor çözünen yapısı göz önüne alındığında, deasetilasyonu ile başlıca türevi olan kitosanın elde edilmesi önem arz etmektedir. Kitosan, fonksiyonel bir materyal olmasının yanısıra, farklı bilimsel çalışmalarla önemine fazlasıyla değinilen ve gelecek vadeden bir polimerdir. Literatür için ilk olacak bu çalışmada, kitosanın insan periferal kanı mononüklear hücre (iPKMH) kültürleri üzerinde in vitro oksidatif, sitotoksik ve genotoksik etkileri 24 ve 48 saat maruziyet sürelerinde ve geniş doz aralığında (0-2000 µg/mL) araştırılmıştır. Bu amaçla, kitosanın hücre kültürlerinde oluşturacağı oksidatif hasarı değerlendirebilmek için toplam antioksidan kapasite (TAK) ve toplam oksidan durum (TOD) analizleri yapılmıştır. Hücre canlılığının ve hücresel hasarın belirlenmesinde ise; 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenytetrazolium bromide (MTT), 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), nötral kırmızısı (NK) ve laktat dehidrogenaz (LDH) sitotoksisite testleri kullanılmıştır. Diğer taraftan, genotoksik etkileri değerlendirmek amacıyla da hassas ve güvenilir sonuçlar veren kromozom aberasyonları (KA) ve mikroçekirdek (MÇ) yöntemleri uygulanmıştır. Sonuç olarak, kitosanın artan dozları (6.25-150 µg/mL) kanda antioksidan kapasiteyi artırırken, oksidatif stresi azaltmıştır. 200 ve 250 µg/mL dozlarındaki kitosan herhangi bir etki göstermezken, 1000 ve 2000 µg/mL dozları oksidatif strese sebep olmuştur. Sitotoksik açıdan değerlendirildiğinde kitosanın 0- 250 µg/mL dozlarının herhangi bir hasara ve hücre canlılığında önemli bir değişikliğe sebep olmadığı ancak 500-2000 µg/mL dozlarının doz artışına paralel olarak hücre canlılığını düşürüp önemli hasarlar oluşturduğu belirlenmiştir. Genotoksik değerlendirmeler sonucunda ise kitosanın düşük dozlarda KA ve MÇ oranlarını etkilemediği ancak yüksek dozlarda önemli derecede genetik hasarlar oluşturduğu tespit edilmiştir. Bulgularımıza göre, düşük dozlarda kitosan kullanımının insan sağlığı açısından risk oluşturmadığı, ancak bu biyopolimerin yüksek doz kullanımına ve maruziyet süresine bağlı olarak oksidatif ve sito-genotoksik etkiler gösterebileceği anlaşılmıştır.

Abstract:
Chitin which is skeleton of insects, cell walls of fungi and the main component of crustaceans such as crabs and shrimps is the second most abundant and widely available biopolymer or amino polysaccharide after cellulose in the world. Given the complex and difficultly soluble nature of the chitin, it is important to obtain chitosan, the main derivation of deacetylation. In addition to being a functional material, chitosan is a promising polymer that has been greatly emphasized by various scientific studies. In this study, for the first time in the literature,  in vitro oxidative, cytotoxic and genotoxic effects of chitosan on human peripheral blood mononuclear cell (hPBMC) cultures were investigated at 24 and 48 h exposure times and at broad dose ranges (0-2000 mg / L). For this purpose, total antioxidant capacity (TAC) and total oxidant status (TOD) analyzes were carried out to evaluate the oxidative damage of chitosan in cell cultures. In determining cell viability and cellular damage; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenytetrazolium bromide (MTT), 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), neutral red (NR) and lactate dehydrogenase (LDH) cytotoxicity tests were used. On the other hand, chromosomal aberrations (CA) and micronuclei (MC) methods have been applied in order to evaluate genotoxic effects. As a result, increased doses of chitosan (6.25-150 mg / L) increase antioxidant capacity in blood while reducing oxidative stress. At doses of 200 and 250 mg / L, the chitosan did not show any effect, whereas doses of 1000 and 2000 mg / L caused oxidative stress. When assessed from a cytotoxic perspective, doses of 0-250 mg / L of chitosan did not cause any damage and any significant change in viability of the cells, but doses of 500-2000 mg / Lwere found to reduce cell viability and cause significant damage in parallel with the increase of the dose. As a result of genotoxic evaluations, it was determined that chitosan did not affect CA and MC rates at low doses but caused significant genetic damage at high doses. According to our findings, it has been understood that the use of chitosan at low doses does not pose a risk to human health, but may show oxidative and cytogenotoxic effects depending on the high dose of this biopolymer and the duration of exposure.