Spinal musküler atrofi hastalığı tanısında kullanılabilecek NGS-tabanlı dizi analizi kitinin geliştirilmesi
Development of an NGS-based sequence analysis kit for the diagnosis of spinal muscular atrophy disease
Yazar: ARAZ ALPAY
Danışman: DOÇ. DR. BUKET KOSOVA
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sağlık Biyoinformatiği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Spinal mUsküler atrofi (SMA), en yaygın ve ciddi genetik hastalıklardan biridir. SMA, otozomal resesif kalıtım gösteren nörodejeneratif bir hastalıktır. Canlı doğumdaki görülme sıklığı 1/6,000-10,000 ve taşıyıcı sıklığı da 1/40-60 olan hastalık Pediatrik nöromusküler hastalıklarda; Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) den sonra 2. en sık görülen ve fatal hastalıklarda ise Cystic Fibrosis (CF) ten sonra 2. en sık görülen hastalıktır. SMA'nın hızlı ve doğru tanısı yenidoğan döneminde, özellikle hayatı tehdit eden bulgulara eşlik ettiğinde, önemlidir. Günümüzde SMA tanısı çok zahmetli ve vakit alan klasik genetik analizlerle konulur, genetik analizlerde de genellikle MLPA veya restriksiyon enzim kesim yöntemleri kullanılır. Yeni nesil DNA dizileme (NGS) tabanlı genişletilmiş taşıyıcı tarama yöntemi, SMN1 ve SMN2 genin kopya sayısını ekstra deney yapmadan ve örnek sayısı artıkça daha düşük maliyet performansıyla tespit edebilir. Amaç: Bu tez çalışmasının temel amacı; Hibridizasyona dayalı hedef zenginleştirme ile paralel dizi sekanslama veya NGS yöntemlerinin birleştirilmesiyle popülasyon bazlı SMN1 geninin kopya sayısı ve dizi varyasyonlarının araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: SMN1 genine özgün primerlerin tasarımı yapıldıktan sonra Long-range PCR yöntemi kullanılarak hedef zenginleştirme işlemi yapılmıştır. Kütüphane hazırlığının ardından, yüksek okuma kapasitesine sahip MGI(DNBSEQ-G400) cihazında örneklerin yürütülmesi sağlanmıştır. Sekans cihazından elde edilen ham veriler tarafımızdan geliştirilen özel biyoinformatik araçları ile Linux işletim sistemi bilgisayarda analiz edilmiştir.Bulgular: Testin SMN1 ve SMN2 geninin ekzonik nokta mutasyonlarının tespitinin yanı sıra SMN1 geninde; 2 kopyaya sahip sağlıklı bireyleri ve 1 kopyaya sahip SMA taşıyıcılarını ve sıfır kopya sayısına sahip hastaların ve SMN2 kopya sayısını tespit etme duyarlılığı >%99'dur.Tartışma: Geliştirilmesi amaçlanan yöntem ve kit prototipiyle SMA'ya neden olan SMN1 genindeki mutasyonlar hedeflenerek, moleküler genetik ve biyoinformatik analizlerinin yeni nesil DNA dizi analizi cihazlarında gerçekleştirilmesi planlanmıştır. Maliyeti düşük olacağı öngörülen bu test ile SMN1 genindeki fonksiyonel mutasyon ve mutasyon tipleri belirlenerek, hastalara hızlı ve doğru genetik tanıları konulacaktır. Bu çalışmada, NGS yöntemi ile yeni, kapsamlı bir SMN1 geni kopya sayısı ve dizi varyantlarının tespiti yöntemini geliştirmiştir ve çalışılan tüm DNA'larda SMA taşıyıcılık oranları gösterilmiştir.

Abstract:
Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most common and serious genetic diseases. SMA is a neurodegenerative disease with autosomal recessive inheritance. The incidence in live births is 1/6,000-10,000 and the carrier frequency is 1/40-60. In pediatric neuromuscular diseases; it is the 2nd most common disease after Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) and the 2nd most common fatal disease after Cystic Fibrosis (CF). Rapid and accurate diagnosis of SMA is important in the neonatal period, especially when accompanied by life-threatening findings. Today, SMA diagnosis is made with very laborious and time-consuming classical genetic analyses, and MLPA or restriction enzyme digestion methods are generally used in genetic analyses. Next-generation DNA sequencing (NGS)-based expanded carrier screening method can detect the copy number of SMN1 and SMN2 genes without additional experiments and with lower cost performance as the number of samples increases. Objective: The main purpose of this thesis study; It was aimed to investigate the copy number and sequence variations of the SMN1 gene based on population by combining hybridization-based target enrichment with parallel array sequencing or NGS methods. Materials and Methods: After the design of primers specific to the SMN1 gene, target enrichment was performed using the Long-range PCR method. After library preparation, samples were run on the MGI(DNBSEQ-G400) device with high reading capacity. The raw data obtained from the sequencing device were analyzed on a Linux operating system computer with special bioinformatics tools developed by us. Findings: In addition to the detection of exonic point mutations of SMN1 and SMN2 genes, the test also detected the following in the SMN1 gene; The sensitivity to detect healthy individuals with 2 copies and SMA carriers with 1 copy and patients with zero copy number and SMN2 copy number is >99%.Discussion: With the method and kit prototype intended to be developed, mutations in the SMN1 gene causing SMA are targeted and molecular genetic and bioinformatic analyses are planned to be performed on new generation DNA sequence analysis devices. With this test, which is expected to be low cost, functional mutations and mutation types in the SMN1 gene will be determined and patients will be diagnosed quickly and accurately. In this study, a new, comprehensive SMN1 gene copy number and sequence variant detection method has been developed with the NGS method and SMA carrier rates have been shown in all studied DNAs.