Yerel Bacillus soylarının ürettiği lipazların özelliklerinin 
yönlendirilmiş evrim ve/veya akılcı protein tasarımı yöntemleri ile iyileştirilmesi
Improvement characteristics of local Bacillus lipases by directed evolution and/or rational protein design methods
Yazar: NAGİHAN AKBULUT
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Lipazlar (EC 3.1.1.3), gliserol ve uzun zincirli yağ asidi esterlerinin sentez ve hidrolizini kataliz ederler. Mikrobiyal kaynaklı lipazlar, önemli ticari enzimler arasında yer alırlar. Bacillus pumilus lipazları, Bacillus subtilis lipazları ile % 74-77 dizi benzerliği taşırlar ve I.4 alt ailesine aittirler. Lipazların endüstriyel uygulamalarda biyokatalist olarak kullanılması için, aktivite, sıcaklık kararlılığı, substrat özgüllüğü ve enantiyo seçicilik gibi özelliklerin geliştirilmesi istenir. Yönlendirilmiş evrim, enzim özelliklerinin geliştirilmesi için kullanılan güçlü bir yöntemdir. DNA karıştırma, moleküler çeşitliliğin oluşturulması için kullanılan en iyi yöntemler arasındadır. Gen çeşitliliği, homolog rekombinasyon ile elde edilir ve aktivite, sıcaklık kararlılığı ya da enantiyo seçicilikte oluşan önemli değişikliklerle sonuçlanır. 

Bu çalışmada, Bacillus pumilus lipazlarının enzimatik aktivitelerinin artırılması amacıyla DNA karıştırma yöntemi, L5 ve L21 yerel izolatlarından elde edilen lipaz genlerine uygulandı.  İki ?crossover? pozisyonu ve üç nokta mutasyonu taşıyan L3-3 kimerik mutantı ?High-throughput? tarama yöntemi kullanılarak seçildi. L3-3 mutantı, ebeveyn enzimlere görece 6.4 ve 8.2 kat daha yüksek spesifik aktivite, farklı deterjanlara ve organik çözücülere de yüksek tolerans gösterdi ve 50 °C?taki yarı ömrünün ebeveyn enzimlere görece 9 kat daha fazla olduğu belirlendi. L3-3 mutantının homoloji modelleme çalışmaları, yüksek homoloji gösteren B. subtilis A lipazına dayandırılarak yapıldı. Mutant enzimin artan sıcaklık kararlılığının yapıdaki sağlamlık ve azalan hidrofobiklikten, artan spesifik aktivitenin ise mutasyonların aktif bölgeye yakınlığından kaynaklandığı düşünüldü.

Abstract:
Lipases (EC 3.1.1.3) catalyze the hydrolysis and synthesis of esters of glycerol and long-chain fatty acids. In particular, lipases of microbial origin are among the most important commercial enzymes. Bacillus pumilus lipases have been classified as members of subfamily I.4, sharing sequence identities of 74-77%,  also the well-characterized Bacillus subtilis lipases belong to this family. In order to use lipases as biocatalysts in industrial applications, it is often desirable to improve properties such as activity, thermostability, substrate specificity and enantioselectivity. In this respect, directed evolution is a powerful technique that has been used to improve various properties of enzymes. One of the best methods for creating molecular diversity is DNA shuffling, where gene diversity is rapidly generated by homologous recombination, resulted in remarkable improvements of activity, thermostability or enantioselectivity. 

In this work, to improve enzymatic activity of Bacillus pumilus lipases, DNA shuffling was applied to two B. pumilus lipase genes from local isolates (L5 and L21). Using a high-throughput activity assay, a chimeric mutant (L3-3) was selected, carrying two crossover positions and three point mutations, with a specific activity 6.4 and 8.2 times higher than the parent enzymes. This mutant also is more tolerant to various detergents and organic solvents, and has a 9 times longer half-life at 50°C. Homology modeling of mutant L3-3, based on the highly homologous B. subtilis A, shows that the increased thermostability is likely due to structural rigidification and decreased surface hydrophobicity. Increased specific activity may result from the location of the mutations close to the active site.