Farelerde 7,12-dimetilbenzantrasen/12-tetradocanoylphorbol-13-asetat uyarımlı deri kanseri modelinde kalsiyum fruktoborat'ın biyoetkinliğinin araştırılması
The assesment of calcium fructoborate bioactivity on 7,12-dimethylbenzanthracene/12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate induced skin cancer model in mice
Yazar: MEHMET ALİ KISAÇAM
Danışman: PROF. DR. PENBE SEMA TEMİZER OZAN
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Deri neoplazmları = Skin neoplasms ; Dimetilbenzantrasen = Dimethylbenzanthracene ; Fareler = Mice ; Kalsiyum = Calcium ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Protein kinazlar = Protein kinases ; Tetradekan = Tetradecane

Özet:
Kanser; hücrelerin aşırı ve zamansız çoğalmalarına yol açan, metabolik davranışsal değişiklikler geçirdikleri, çok basamaklı bir süreçtir. Kanserli hücrelerde sinyalizasyon ve apoptozis mekanizmalarında değişiklikler meydana gelmektedir. Deri kanseri ise epidermiste apoptozisin çok az olması veya çok fazla hücrenin prolifere olmasıyla karakterize bir kanser türüdür. Kanser tedavilerinde bor bileşenlerinin kullanıldığı ve bu bileşenlerin birçok biyolojik fonksiyonu olduğu bilinmektedir. Bu bileşenlerden kalsiyum fruktoborat (CaFB) yenilebilir bitkilerde bulunan Bor'un doğal formuyla aynı kimyasal yapıyı gösteren besin katkı maddesidir. Yapılan araştırmalar, CaFB'ın, yangı önleyici etkilerinin olduğunu ayrıca invitro ortamda antioksidan özellik gösterebileceğini ortaya koymuştur. Bu bağlamda çalışmanın amacı, CaFB'ın deri kanseri üzerine etkilerinin araştırılması oluşmaktadır. CaFB'ın antikanser etkinliği; 7,12-dimetilbenza[a]ntrasen (DMBA)/12-Tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) uyarımlı deri kanseri modelinin 7-9 haftalık dişi balb-c farelerde oluşturulmasıyla araştırıldı. Deney protokolü kapsamında 92 adet balb-c fare kullanıldı fareler; kontrol (n=10), CaFB (n=10), Tümör (D+T, DMBA+TPA) (n=18), T1 (CaFB+DMBA+TPA) (n=18), T2 (DMBA+CaFB+ TPA ) (n=18), T3 (DMBA+TPA+CaFB) (n=18), grubu olacak şekilde 6 gruba ayrıldı. 22 haftalık deney periyodu sonunda fareler dekapite edilerek kan, deri ve tümör örnekleri alındı. Alınan normal deri ve tümör örneklerinde PTEN, Akt, HRAS, HIF-1α gen ekspresyon düzeyleri Kantitatif Polimer Zincir Reaksiyonu (qPZR) analiziyle gerçekleştrildi. Aynı genlerin protein düzeyleri Western Blot ve immunohistokimyasal analizlerle belirlendi. Oksidatif hasar belirteçlerinin tayini spektrofotometrik analizlerle, GAPDH aktivite testi ise ticari kit kullanılarak gerçekleştirildi.  Ayrıca alınan normal deri ve tümör dokusunda histokimyasal ve TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP)-biotin nick end-labeling) analizi yapıldı. Alınan kan serumlarında ise İnterlökin-6 (IL-6), İnterlökin-1Beta (IL-1β), Tümör Nekrozis Faktör alfa (TNFα) düzeyleri ELISA analizleri ile belirlendi. Yapılan analizler sonucunda tümör grubunda tedavi gruplarına göre ortalama tümör sayısı ve boyutunun istatistiksel olarak arttığı (p<0,01) belirlenmiştir. Gliseraldehit-3-fosfat (GAPDH) aktivitesinin ve 6-fosfoglukonat dehidrogenaz (PGD) enzim düzeyinin tümör gruplarında kontrole göre istatistiki bir artış gösterdiği (p<0,001) CaFB uygulamasının ise PGD enzim düzeyini tedavi guplarında düşürdüğü tespit edilmiştir. Akt, PTEN, HRAS ve HIF-1α'nın mRNA ve protein düzeylerinin tümör grubunda kontrole göre, istatistiksel olarak arttığı saptanmıştır, CaFB uygulaması ise bu düzeyleri düşürmüştür. Yapılan histopatolojik değerlendirmelerde kontrol ve CaFB gruplarnda epidermis ve dermis tabakaları normal görünümdeydi. Tümör grubunda in-situ skuamoz hücre karsinomu izlendi. T1 grubunda displazi ve yer yer papillomlar görüldü. T2 grubunda papillomdan displaziye kadar değişen lezyonlar tespit edildi. T3 grubunda ise papillomdan in-situ skuamoz karsinoma kadar değişen lezyonlar görüldü. Apoptotik indeksin tümör grubunda arttığı CaFB uygulamasının ise bu artışı düşürdüğü tespit edilmiştir. Oksidatif hasar belirteçlerinden malondialdehit (MDA) düzeylerinin tümör grubunda kontrole göre istatistiksel olarak azaldığı, Katalaz (CAT) aktivitesi ve Glutatyon (GSH) düzeylerinin ise istatistiksel olarak arttığı tespit edilmiştir. CaFB'ın tedavi gruplarında GSH düzeyleri ve CAT aktivitesini düşürdüğü belirlenmiştir. Serum IL-6, IL-1β ve TNFα düzeylerinin ise tümör grubunda kontrole göre istatistiksel olarak arttığı tespit edilmiştir. 
Sonuç olarak bu çalışmayla CaFB uygulamasının, DMBA ve TPA ile oluşturuşmuş deri kanserinde tümör oluşumunu ve tümör oluştuktan sonra tümörün etkilerini azaltabileceği ve en etkin uygulama zamanının başlatıcı ajanla (T1 grubu) birlikte verilmesi olduğu ortaya konmuştur. 
Anahtar Kelimeler: Kanser, Warburg Etkisi, HRAS, AKT, Kalsiyum Fruktoborat

Abstract:
Cancer is a multistep disease leading normal cells to proliferate excessively in a timeless manner and to switch their metabolic activity. Boron component is known to be used in cancer treatment and several biological functions. Having the same chemical structure found in edible plants, CaFB is a dietary supplement. Experimental results indicate that CaFB has anti-inflammatory effects besides, it may exhibit antioxidant effects in-vitro. In this context, the aim of this study was to investigate the effects of CaFB on skin cancer. The anticancer efficacy of CaFB was investigated following the induction of skin cancer model with 7,12-dimethylbenzene[α]ntrasen (DMBA)/12-Tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) in 7-9 week old female balb-c mice. In the scope of the experimental protocol, 92 balb-c mice were used and divided into 6 groups as described: Control (n=10), CaFB (n=10), Tumor (D+T, DMBA+TPA) (n=18), T1 (CaFB+DMBA+TPA) (n=18), T2 (DMBA+CaFB+ TPA ) (n=18), T3 (DMBA+TPA+CaFB) (n=18) group. At the end of the 22-week experimental period, mice were decapitated and blood, skin and tumor samples were collected. PTEN, Akt, HRAS, HIF-1α gene expression levels in normal skin and tumor samples were carried out by Quantitative Polymer Chain Reaction analysis. Protein levels of the same genes were determined by Western Blotting and immunohistochemical analysis. Detection of oxidative damage markers was performed by spectrophotometric analysis and determination of GAPDH activity test was performed by using a commercial kit. Moreover, histochemical and TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) -mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) -biotin nick end-labeling) analysis were performed in normal skin and tumor tissue. In the collected blood serum,  IL-6, IL-1β, and TNFα levels were determined by ELISA analysis. The result of the analysis showed that the average tumor number and size increased statistically in the tumor group compared to the treatment groups (p<0.01). Glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH) activity and 6-phosphogluconate dehydrogenase (PGD) enzyme levels were found to be statistically increased in tumor groups compared to control (p<0.001) and CaFB application was determined to decrease PGD enzyme level in treatment groups. The mRNA and protein levels of Akt, PTEN, HRAS, and HIF-1α were found to be increased in the tumor group compared to the control group, while the CaFB administration decreased these levels. In the histopathological evaluation, epidermis and dermis layers were normal in control and CaFB groups. In-situ squamous cell carcinoma was observed in the tumor group. Dysplasia and papillomas were seen in T1 group. In the T2 group, lesions ranging from papilloma to dysplasia and in the T3 group, lesions ranging from papilloma to in-situ squamous carcinoma were detected. Apoptotic index was observed to increase in tumor group and CaFB administration decreased this increase. It was determined that malondialdehyde (MDA) level which is an oxidative damage marker was statistically decreased compared to the control group while Catalase (CAT) activity and Glutathione (GSH) levels increased statistically. Serum IL-6, IL-1β, and TNFα levels were found to be increased in the tumor group compared to the control group.
In conclusion, this study showed that CaFB administration can reduce tumor formation and it may also reduce the effect of the tumor after tumor development and it was also indicated that the most effective application time of CaFB is when it is administrated with the initiating agent (T1 group).
Key Words: Cancer, Warburg Effect, HRAS, Akt, Calcium Fructoborate