Resveratrolün in vitro hidrojen peroksit ile indüklenen insan koroner arter endotel hücre hasarına olası etkisinin incelenmesi
The investigation of the possible effects of resveratrol on human coronary artery endothelial cell damage induced by in vitro hydrogen peroxide
Yazar: OYA SAYIN
Danışman: PROF. DR. GÜL GÜNER AKDOĞAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Endotelyum = Endothelium ; Hidrojen peroksit = Hydrogen peroxide ; Koroner damarlar = Coronary vessels ; Oksidatif hasar = Oxidative damage ; Resveratrol = Resveratrol ; İn vitro = In vitro

Özet:
Giriş: Oksidatif stres, reaktif oksijen ürünlerinin oluşumu ve yıkılımı arasındaki bir dengesizlik olarak tanımlanmaktadır. Vasküler ve enflamatuvar hücrelerden kaynaklanan hidrojen peroksit, oksidatif stresi indükleyerek endotelde fonksiyon kaybına neden olmaktadır. Bu da koroner arter hastalığı, kalp yetmezliği, hipertansiyon, periferal arter hastalığı ve diyabet gibi hastalıklarda önemlidir. Enzimatik antioksidan savunma kaynakları süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz ve katalazı kapsamaktadır. Enzimatik olmayan antioksidanlar askorbik asit, ?-tokoferol, glutatyon, karotenoidler, flavonoidler, stilbenler ve diğerleridir. Resveratrol; stilbenlerin alt grubu olup, üzüm ve kırmızı şarapta bulunan polifenolik bir bileşiktir. Antienflamatuvar, antioksidan, antikanser, sitoprotektif ve kardioprotektif etkilere sahiptir.Amaç: Literatürde resveratrolün hidrojen peroksit hasarı ile indüklenen endotel hücresi üzerine in vitro etkisinin araştırıldığı bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmanın amacı, resveratrolün in vitro insan koroner arter endotel hücresini hidrojen peroksit hasarına karşı koruyucu etki gösterip göstermediğini araştırmaktır. Bu amaçla hücre sitotoksisitesi, reaktif oksijen ürünleri oluşumu, ?-glutamil sistein sentetaz, glutatyon redüktaz ve glutatyon peroksidaz enzimlerinin protein ekspresyonları ve glutatyon düzeyi incelenmiştir.Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada; in vitro insan koroner endotel hücrelerinde resveratrolün değişik konsantrasyonları ve preinkübasyon sürelerinde hidrojen peroksit'in indüklediği hücre sitotoksisitesi üzerine etkileri araştırıldı. Resveratrolün hücre hasarındaki etkisi hücre sitotoksisite değerlendirme testi olan laktat dehidrogenaz ile incelendi. Hasar modelinde resveratrolün değişik konsantrasyonlarının çeşitli preinkübasyon sürelerinde ve zaman dilimlerinde reaktif oksijen ürünleri oluşumuna etkisi oksidan duyarlı bir fluoresans prob olan hidroksifenil floresin kullanılarak değerlendirildi. Resveratrolün antioksidan etkileri ?-glutamil sistein sentetaz, glutatyon redüktaz ve glutatyon peroksidaz enzimlerinin protein ekspresyonları Western blot yöntemi ile değerlendirildi. İn vitro insan koroner endotel hücrelerinde resveratrolün glutatyon düzeyine etkisi de yüksek performanslı sıvı kromatografisinde değerlendirilmiştir.Bulgular: Resveratrolün 10 ve 50 ? M konsantrasyonlarının 1, 12 ve 24 saat preinkübasyon sürelerinde 1 saat, 750 ? M hidrojen peroksit'in oluşturduğu sitotoksisiteyi istatistiksel olarak anlamlı azalttığı saptanmıştır (p<0.05). 10, 50 ve 100 ? M resveratrol ile 24 saat preinkübasyon süresinde resveratrolün 15., 60. dakika ve 6. saat zaman noktalarında reaktif oksijen ürünleri oluşumunu da anlamlı olarak azalttığı saptanmıştır (p<0.05). Resveratrol, indirgenmiş glutatyon düzeyiniı anlamlı olarak arttırmaktadır (p<0.05). Yine resveratrol oksidatif hasarda görülen, ?-glutamil sistein sentetaz, glutatyon peroksidaz-1 ve glutatyon redüktaz enzimlerinin protein ekspresyonlarını anlamlı olarak arttırmaktadır (p<0.05).Sonuç: Tüm bulgular birbirlerini destekleyici özellikte olup, araştırma koşullarında resveratrolün çeşitli yönlerden insan koroner arter endotel hücre hasarına koruyucu etki gösterdiğine işaret etmektedir. Bu araştırmanın sonuçlarının kardiyovasküler hastalıklarda oluşan oksidatif stresin geri döndürülmesinde kullanılabilecek yeni terapötik yaklaşımlara ışık tutabileceği düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler: Resveratrol, İnsan Koroner Arter Endotel Hücresi, Oksidatif Hasar

Abstract:
Introduction: Oxidative stress is defined as an imbalance between the production and destruction of reactive oxygen species. Hydrogen peroxide resulting from vascular and inflammatory cells causes endothelial dysfunction by inducing oxidative stress, which is of importance in coronary artery disease, cardiac failure, hypertension, peripheral artery disease and diabetes. Defense sources of enzymatic antioxidant include superoxide dismutase, glutathione peroxidase and glutathione catalase. Non-enzymatic antioxidants are ascorbic acid, ?-tocopherol, glutathione, carotenoids, flavonoids, stilbenes and others. Resveratrol, a subclass of stilbenes family, is a polyphenolic compound found in grapes and red wine. It has anti-inflammatory, anti-oxidant, anti-apoptotic, cytoprotective, anti-cancer and cardio-protective effects.Aim: No research conducted on in vitro effects of resveratrol on endothelial cells induced by hydrogen peroxide damage have been found in the literature. The purpose of this study is to investigate whether resveratrol can protect in vitro human endothelial cells against hydrogen peroxide damage. Therefore, cell cytotoxicity, production of reactive oxygen species, expressions of ?-glutamylcysteine synthetase, glutathione reductase and glutathione peroxidase enzymes and glutathione levels were investigated.Materials and methods: In this study, various concentrations of resveratrol found in in vitro human coronary endothelial cells and the effects of resveratrol on cell cytotoxicity induced by hydrogen peroxide during pre-incubation periods were investigated. The effect of resveratrol on cell damage was investigated with the lactate dehydrogenase test, a test used for the evaluation of cell cytotoxicity. The effects of various concentrations of resveratrol on the production of reactive oxygen species during various pre-incubation periods and time slices were evaluated by using hydroxyphenyl fluorescein, an oxidant-sensitive fluorescent probe. Anti-oxidant effects of resveratrol, protein expressions of ?-glutamylcysteine synthetase, glutathione peroxidase and glutathione reductase enzymes were evaluated with the Western blot method. The effects of resveratrol on the glutathione level in vitro human coronary endothelial cells were evaluated with high performance liquid chromatography.Results: It was determined that 10 and 50 ? M concentrations of resveratrol statistically significantly decreased the cytotoxicity induced by 750 ? M hydrogen peroxide during 1, 12 and 24-hour pre-icubation periods for one hour (p<0.05). It was also determined that 10, 50 and 100 ? M concentrations of resveratrol statistically significantly decreased the production of reactive oxygen species at 15th and 60th minutes and 6th hour during the 24-hour pre-icubation periods (p<0.05). Resveratrol statistically significantly increases the reduced glutathione levels (p<0.05). Resveratrol increases the protein expressions of ?-glutamylcysteine synthetase, glutathione peroxidase-1 and glutathione reductase enzymes (p<0.05).Conclusion: All the data support each other and suggest that resveratrol has a protective effect on the human coronary artery endothelial cell damage. It is thought that the findings obtained in this study can light the way to the new therapeutic approaches to be used for the reversal of oxidative stress which develops in cardiovascular diseases.Key words: Resveratrol, human coronary artery endothelial cell, oxidative damage