Sarı pas enfeksiyonuna dirençli buğday (Triticum aestivum L.)'da proteomik analizler
Proteomic analyses in yellow rust-resistant wheat (Triticum aestivum L.)
Yazar: CİHAN İNAN
Danışman: DR. SEMRA HASANÇEBİ ; PROF. DR. NAZLI ARDA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Türkiye dünyanın 9. büyük buğday (Triticum aestivum L.) üreticisidir. Besinsel, ekonomik ve ticari önemi, buğdayı ülkemizin en önemli tarım ürünlerinden biri yapmaktadır. Puccinia striiformis f. sp. tritici ekmeklik buğdayda sarı pas hastalığına yol açan biyotrofik bir mantardır. Sarı pas hastalığına karşı geleneksel ıslah çalışmaları yeterli olamamaktadır. Bu nedenle dayanıklı çeşitlerin üretilmesi daha etkili ve çevreci bir stratejidir. Araştırmacılar dayanıklı çeşitler elde etmek için yoğun bir biçimde daha etkin ve hızlı yöntemler araştırmaktadırlar. Buğdayda sarı pas dayanıklılığına ait veriler genel olarak transkriptomik ve genomik yaklaşımlara dayanmaktadır. Daha detaylı sonuçlar elde edilebilecek olmasına rağmen, günümüze kadar bu konuda sadece birkaç proteomik çalışma yapılmıştır.Bu çalışmanın amacı, patojen ile inoküle edilmiş, sarı pasa dirençli buğday (Triticum aestivum L.) çeşidi İzgi 2001'de dayanıklılıkla ilişkili proteinlerin proteomik tekniklerle belirlenmesidir.Total proteinler patojen-inoküle ve boş-inoküle (kontrol) edilmiş patojene dirençli bitkilerden 4 farklı zamanda alınan yapraklardan izole edilmiş ve PF2D (?Protein Fractionation 2 Dimensional?) sistemi ile fraksiyonlarına ayrılmıştır. Enfekte ve kontrol örneklerin protein profilleri karşılaştırılıp farklı düzeylerde anlatımı yapılan proteinleri içeren fraksiyonlar nanoLC-ESI-MS/MS sistemi ile analiz edilip tanımlanmıştır.İnokülasyondan sonra 24, 48, 72 ve 96. saatlerde; kontrole göre farklı anlatım yaptığı belirlenen sırasıyla 33, 24, 34 ve 42 protein tanımlanmıştır. Tanımlanan farklı 77 protein rol aldıkları biyolojik olaylar göz önüne alınarak 8 farklı grupta değerlendirilmiştir. Tanımlanan proteinlerin %14'ünün patojen kaynaklı, %21'inin savunma yanıtı, %21'inin fotosentez, %22'sinin metabolizma, %8'inin gen ekspresyonu, %6'sının elektron transportu ve %4'ünün protein metabolizması ile ilişkili olduğu, %4'ünü ise yapısal proteinlerin oluşturduğu belirlenmiştir.İnokülasyondan sonraki 24. saat örneklerinde, fungal proteinlerden ubikitin benzeri protein (ATG12), ubikinon biyosentez protein ve E3 ubikitin protein ligaz BRE1; savunma cevabı proteinlerinden patojenez-ilişkili protein 4 (PR-4), PR-1 ve peroksiredoksin Q; protein metabolizması ve gen ekspresyon proteinlerinin büyük çoğunluğu; metabolizma proteinlerinden sistein sentaz ve adenin fosforibozil transferaz; elektron transport proteinlerinden tiyoredoksin M ve yapısal proteinlerden histon H4 ve histon H2A indüklenirken, fotosentetik proteinlerin tamamı indirgenmiştir.İnokülasyonu takiben 48. saat örneklerinde fungal proteinlerden mitokondriyal iç membran proteaz ATP23 ve tip 1 fosfataz regülatör YPI1; savunma proteinlerinden kalmodulin, Cys peroksiredoksin BAS1, geç embriyogenez baskın protein grup 3, katalaz 1 ve sinyal yolaklarında görev alan profilin 1; tanımlanan tüm fotosentetik proteinler; gen ekspresyon proteinlerinden ökaryotik translasyon başlatıcı faktör E4-1; metabolizma proteinlerinden S adenozil metiyonin sentaz 1, sedoheptuloz 1,7-bifosfataz ve translasyonel protein; elektron transport proteinlerinin büyük çoğunluğu indüklenirken; yapısal proteinlerden histon H4 indirgenmiştir. Bu evrede protein metabolizması ile ilişkili protein tanımlanmamıştır.İnokülasyonu takiben 72. saat örneklerinde DNA replikasyon kompleksi GINS protein PSF3 ve sitokrom c; savunma proteinlerinden sinyal iletiminde görev alan profilin 1, taumatin benzeri protein (PR-5), dehidrin, katalaz 2 ve peroksidaz; fotosentetik proteinlerin büyük çoğunluğu; protein metabolizması proteinlerinden protein disülfit izomeraz; elektron transport proteinlerinden ferredoksin ve apositokrom indüklenmiş, metabolizma ile ilişkili proteinlerin büyük çoğunluğu ise indirgenmiştir.İnokülasyonu takiben 96. saat örneklerinde glukoz N-asetil transferaz 1 ve polycomb benzeri artırıcı protein 1; savunma proteinlerinden PR-5, katalaz 1, katalaz 2, peroksidaz ve glutatyon S transferaz; fotosentetik proteinlerin büyük çoğunluğu; gen ekspresyon proteinlerinden 50S ribozomal protein L9; protein metabolizması proteinlerinden ubikitin konjuge enzim E2 2; metabolizma proteinlerinden fosfogliserat kinaz ve adenozil fosforibozil transferaz; elektron transport proteinlerinden tiyoredoksin M ve ferredoksin indüklenmiş; yapısal proteinlerden HMG1 2 benzeri protein ise indirgenmiştir.Sonuç olarak; bu çalışmada daha önce buğday-sarı pas etkileşimine ilişkin proteomik düzeyde tanımlanmamış çok sayıda protein tanımlanmıştır. Özellikle bitki savunma cevabında önemli rol aldığı bilinen ve patojen-konukçu etkileşiminde etkin rol oynayan patojenez-ilişkili protein sınıfına ait PR-1, PR-4 ve PR-5 başta olmak üzere oksidatif stres ile ilişkili katalaz, peroksiredoksin ve GST ile sinyal iletiminde rol alan profilin ve kalmodulin tanımlanmıştır. Bu çalışma ile ortaya konulan sonuçların, buğdayda sarı pasa karşı verilen savunma cevabının daha iyi anlaşılmasına önemli katkılar sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Turkey is the 9th biggest producer of wheat (Triticum aestivum L.) in the world. Nutritional, economical and commercial importance of wheat, makes it one of the major crop products of our country. Puccinia striiformis f. sp. tritici is a biotrophic fungus that causes yellow rust disease in common wheat. Striving against yellow rust disease using conventional breeding methods is not sufficient. Therefore development of resistant cultivars has considered to be an effective and environmentally safe strategy. Scientists intensively investigate more efficient and faster methods to obtain resistant cultivars. Data on resistance mechanism of wheat to yellow rust is mainly based on transcriptomic and genomic approaches. Although more detailed results would be expected, only a few study has been evaluated rests upon proteomics, till today.The aim of this study is to determine the proteins related to resistance against yellow rust in pathogen inoculated local resistant wheat (Triticum aestivum L.) cultivar, Izgi 2001 using proteomic methods.Total proteins were extracted from the leaves of pathogen-inoculated and mock-inoculated (control) pathogen resistant plants in 4 different time points, and fractionated with PF2D (?Protein Fractionation 2 Dimensional?) system. Protein profiles were compared and fractions containing the proteins differed in expression level were furtherly analyzed and identified with nanoLC-ESI-MS/MS system.After inoculation at the time points 24, 48, 72 and 96th hours; 33, 24, 34 and 42 proteins differed in expression levels compared to control were identified, respectively. These unique 77 proteins were classified into 8 different groups, according to their roles in biological processes. Identified proteins were found to be related to pathogen, defense, photosynthesis, metabolism, gene expression, electron transport and protein metabolism by 14%, 21%, 21%, 22%, 8%, 6%, 4%, respectively whereas 4% of the proteins were detected as structural proteins.24th hours samples following the inoculation, fungal proteins ubiquitin-like protein (ATG12), ubiquinone biosynthesis protein and E3 ubiquitin protein ligase BRE1; proteins related to defense response pathogenes-releated protein 1 (PR-1), PR-4, peroxiredoxin Q chloroplastic and glutathione S transferase; most of proteins related to protein metabolism and gene expression; proteins related to metabolism cysteine synthase and adenine phosphoribosyl transferase; proteins related to electron transport thioredoxin M type from electron transport abd structural proteins histone H4 and histone H2A were found to be induced whereas all of the identified photosynthetic proteins were reduced.48th hours samples after the inoculation, fungal proteins mitochondrial inner membrane protease ATP23 and type 1 phosphatases regulator YPI1; proteins related to defense response calmodulin, Cys peroxiredoxin BAS1, late embryogenesis abundant protein group 3, profilin 1 and catalase 1; proteins related to metabolism eukaryotic translation initiation factor E4-1 from gene expression proteins; S adenosylmethionine synthase and sedoheptulose 1,7-bisphosphatase; and most of the electron transport proteins and all of the photosynthetic proteins were found to be induced while structural protein histon H4 protein was reduced. No protein metabolism protein was detected in this period.72nd hours samples after the inoculation fungal proteins DNA replication complex GINS protein PSF3, and cytochrome c; proteins related to defense response profilin 1, catalase 2, dehidrin, peroxidase and thaumatin like protein (PR-5); all of the photosynthetic proteins; protein disulfide isomerase (ERp72) related to protein metabolism; proteins related to electron transport ferredoxin chloroplastic and apocytochrome were found to be induced while most of the metabolic proteins and 50S ribosomal protein L9 chloroplastic related to gene expression proteins were reduced.96th hours samples after the inoculation fungal proteins glucose N-acetyltransferase 1 and enhancer of polycomb like protein 1; proteins related to defense response PR-5, catalase 1, catalase 2, peroxidase and glutathione S transferase; most of the photosynthetic proteins; 50S ribosomal protein L9 (chloroplastic) related to gene expression proteins; ubiquitin conjugating enzyme E2-2 related to protein metabolism; proteins related to metabolism phosphoglycerate kinase and adenine phosphoribosyl transferase and proteins related to electron transport thioredoxin M type and ferredoxin chloroplastic were found to be induced while HMG1-2 like protein from structural proteins were reduced.In conclusion, many proteins that have been never reported in wheat-yellow rust interactions with proteomic methods were identified in this study. Especially, PR-1, PR-4 and PR-5 from pathogenesis-related protein class and oxidative stress related catalase 1, catalase 2 and glutathione S transferase; signal transduction related profilin and calmodulin that have important roles in plant defense response were identified. The findings of this study are thought to contribute understanding of the defense response to yellow rust in wheat.