Formalinle fikse edilmiş parafine gömülü dokularda iki farklı hızlı doku şeffaflandırma yönteminin etkinliğinin karşılaştırılması
Comparison of the efficacy of two different rapid tissue clearing methods in formalin-fixed paraffin-embedded tissues
Yazar: GÜLŞAH GÜRBÜZ ALVER
Danışman: PROF. DR. SAVAŞ AKTAŞ ; ÖĞR. GÖR. AYLA BATU ÖZTÜRK
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Standart histolojik yöntemlerle hazırlanan ve sıklıkla parafine gömülü olan dokulardan elde edilen kesitler ile doku veya hücre yapıları hakkında iki boyutlu görüntüler elde edilebilmektedir. Yeni nesil histolojik yöntemler olarak isimlendirilen doku şeffaflandırma yöntemleri dokuların üç boyutlu incelenebilmesine ve rutin histolojik yöntemlere eklendiğinde dokuların detaylı ve daha geniş düzlemde değerlendirilebilmesine önemli katkılar sağlamaktadır. Literatürde, formalinle fikse parafine gömülü (FFPG) dokularda doku şeffaflandırma yöntemlerinin kullanılabilirliğini ve etkinliğini gösteren çok az sayıda çalışma bulunduğu görülürken, bu dokularda "Basitleştirilmiş Çok Hızlı Optik Şeffaflandırma Yöntemi" (FOCMS) ve "M-Ksilendiamin bazlı Sulu Şeffaflandırma Yöntemi" (MACS) gibi hızlı doku şeffaflandırma yöntemlerinin kullanılabilirliğini gösteren çalışmalara rastlanmamıştır. Bu nedenle çalışmamızda, FFPG dokularda FOCMS ve MACS hızlı doku şeffaflandırma yöntemlerinin etkinliğinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Çalışmada erişkin Wistar Albino dişi sıçanlar (n=12) kullanılarak paraformaldehit perfüze taze doku (PPTD) (n=6) ve FFPG (n=6) dokular olmak üzere iki ana grup oluşturulmuştur. Deneklerden beyin, böbrek ve karaciğer dokuları alınarak bu organlardan doku dilimleri (1 mm kalınlığında) elde edilmiştir. Alınan dilimlere FOCMS ve MACS yöntemleri uygulanmıştır. Tüm dokularda şeffaflanma öncesi ve sonrası şeffaflanma düzeyi, süresi, doğrusal genişleme, absorbans ve transmittans % değerleri ve görüntüleme derinliği (µm) karşılaştırılmıştır. Ayrıca beyin dilimleri 5hmC antikoru ile immünohistokimyasal olarak işaretlendikten sonra FOCMS ve MACS yöntemleri uygulanarak konfokal mikroskop altında değerlendirilmiştir. Her iki yöntemde de PPTD ve FFPG gruplarında şeffaflandırmadan sonra dokulardaki doğrusal genişlemenin, transmittans % değerlerinin ve görüntülenebilir derinliğin şeffaflandırma öncesine göre arttığı gözlenmiştir. Şeffaflığın PPTD'lerde FFPG dokularına göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. FFPG dokularında şeffaflandırmadan sonra transmittans % değerinin ve görüntülenebilen doku derinliğinin şeffaflandırma öncesine göre arttığı gözlenmiştir. Yöntemler karşılaştırıldığında ise MACS yönteminin FOCMS'ye göre tüm dokularda daha fazla şeffaflık sağladığı görülmüştür. Sonuç olarak FOCMS ve MACS hızlı doku şeffaflandırma yöntemleri parafine gömülmüş arşiv dokularının ayrıntılı üç boyutlu incelenmesine önemli katkı sağlayabilmektedir, ancak bu yöntemlerin FFPG dokularında etkin kullanımını desteklemek ve geliştirmek için yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.
Anahtar Kelimeler: Hızlı doku şeffaflandırma, FOCMS, MACS, Formalin fikse dokular, Parafin blok

Abstract:
Two-dimensional images of tissue or cell structures can be obtained from sections prepared using standard histological methods and mostly from paraffin-embedded tissues. Tissue clearing methods, called new generation histological methods, contribute significantly to the three-dimensional examination of tissues and detailed evaluation of tissues when added to routine histological techniques. Although a few studies show the usability and effectiveness of tissue clearing methods in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues in the literature, no studies showing the usability of fast tissue clearing methods such as "Ultrafast Optical Clearing Method with Simple" (FOCMS) and "M-Xylylenediamine (MXDA)-based Aqueous Clearing System" (MACS) in these tissues. Thus, our study aimed to demonstrate the effectiveness of FOCMS and MACS rapid tissue clearing methods in FFPG tissues. In the study, two main groups were created using adult Wistar Albino female rats (n=12), namely paraformaldehyde perfused fresh tissue (PPFT) (n=6) and FFPE (n=6) tissues. The brain, kidney, and liver tissues were taken from the animals, and tissue slices (1mm thickness) were obtained from these organs. FOCMS and MACS methods were applied to sections that were obtained. Before and after clearing in all tissues, the level of tissue clearing, clearing time, linear expansion, absorbance and transmittance (%) values, and imaging depth (µm) were compared. In addition, after brain slices were immunohistochemically labeled with 5hmC and FOCMS and MACS methods were performed and the results were evaluated under the confocal microscope. In both methods, it was observed that linear expansion, transmittance (%) values, and the depth in the tissues increased after clearing compared to before clearing in PPTD and FFPG groups. It was determined that transparency was higher in PPTDs than in FFPG textures. It was observed that the transmittance (%) value and the tissue depth that could be examined increased after the clearing of FFPG tissues compared to before the clearing. When the methods were compared, it was observed that the MACS method provided more transparency in all tissues compared to FOCMS. In conclusion, the rapid tissue clearing methods, FOCMS and MACS, can contribute significantly to the detailed three-dimensional examination of paraffin-embedded archival tissues, however, further studies are needed to support and develop the effective use of these methods in FFPG tissues.
Keywords: Rapid tissue clearing, FOCMS, MACS, Formalin fixed tissues, Paraffin block