Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 suşundan DNA polimeraz I'in klonlanması ve karakterizasyonu
Cloning and characterization of the dna polymerase I from thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4
Yazar: CEMAL SANDALLI
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Karakterizasyon = Characterization ; Mutasyon = Mutation ; Termal kararlılık = Thermal stabilization

Özet:
Bu çalısmada, Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 (Gca TK4) susundan DNApolimeraz I geni (DNA pol I) klonlandı ve Escherichia coli'de (E. coli) ekspres edilerek bazıbiyokimyasal ve fiziksel özellikleri incelendi. Gca TK4 DNA polimeraz I genine ait tümnükleotit sırası dejenerat primerler ve ters PZR reaksiyonu ile tamamlandı ve genin stopkodonu ile birlikte 2637 bç oldugu belirlendi. Amino asit sırası bakımından diger Bacillus veGeobacillus DNA polimeraz I enzimlerine %89 benzer oldugu bulundu. 5'3' nükleaz vepolimeraz aktivitesi için korunmus amino asitlere sahip oldugu, 3'5' ekzonükleaz aktivitesiiçin gerekli korunmus amino asitlere ise sahip olmadıgı belirlendi. Gen pET15b vektörüneklonlanarak, E. coli BL21(DE3)pLysS susunda ekspres edildi ve protein sıcaklık uygulamasıDEAE-selüloz ve BioRex 70 katyonik kromatografi ile saflastırıldı. Rekombinant enziminoptimum aktivite gösterdigi sıcaklıgının 55?60 ºC, optimum pH'sının ise 7,5 ile 9,0 arasındaoldugu tespit edildi. Enzimin 70 ºC üzerindeki sıcaklıklarda 5 dakika bekletilme sonucuaktivitesini kaybettigi belirlendi. DIG-dUTP'yi normal dNTP gibi kullanarak DNA sentezaktivitesi gösterebildigi ve kalıp/primer kompleksinde, kalıp zincir üzerindeki son nükleotitiekleyerek 3' ucuna ait boslukları doldurabildigi belirlendi. DNA-bagımlı DNA polimerazaktivitesi için Mg+2 metal iyonuna (7 mM), RNA-bagımlı DNA polimeraz aktivitesi için Mn+2metal iyonuna (6 mM) ihtiyaç duymaktadır. Mg+2 ile özgül aktivitesi 495,000 ünite/mg olarakhesaplandı. KDDNA degeri 0,192 nM, KDdNTP degeri ise 21,64 ?M olarak belirlendi. Kpoldegeri ise 24,99 s?1 olarak belirlendi. Hem çift zincir DNA hemde tek iplik DNA ile herhangibir 3'5' ekzonükleaz aktivitesinin olmadıgı, sarkık tek iplik 5' uç tasıyan DNA örnekleri ile5' nükleaz aktivitesinin KD degerinin 2,35 nM oldugu, enzimin çogunlukla 5' sarkık ucu vesarkık ucun basladıgı noktada eslesme yapmıs iki nükleotit arasından kesim yaptıgı belirlendi.Gca TK4 DNA pol I yaban tip enzimin ddNTP'ye duyarlı olmadıgı ancak 712 numaralıFenilalanin amino asiti Tirozin amino asitine dönüstürüldügünde elde edilen mutant enzimindNTP'ye olan ilgisinin nerede ise tamamen ddNTP'ye dönüstügü belirlendi. Enzimin zinciruzaklastırma aktivitesine sahip oldugu ve 721 numaralı Tirozin amino asiti Fenilalanin aminoasitine dönüstürüldügünde ise aktivitenin arttıgı belirlendi.Anahtar Kelimeler: Gca TK4, DNA polimeraz, Mutasyon, Karakterizasyon

Abstract:
In this study, DNA polymerase I gene (DNAPOL) of a thermophilic Geobacilluscaldoxylosilyticus TK4 (Gca TK4) strain, was cloned and overexpressed in Escherichia coli(E. coli), and then some biochemical and physical properties of the protein were investigated.The whole sequences of DNA pol I gene was determined by degenerate primers and inversePCR. The gene with stop codon are 2637 bp (878 amino acids). In amino acid level, it has 80?90% homology to DNA pol gene of Bacillus and Geobacillus. While the enzyme hasconserved amino acids for 5? nuclease and polymerase activity, it doesn?t have conservedaminoacids for 3?5? nuclease activity. The gene was cloned into pET15b vector andoverexpressed in E. coli BL21(DE3)pLysS strain. The enzyme was purified with heattreatment and chromatography for biochemical characterization. It was found that enzymeshows optimal activity at 55?60°C and pH between 7.5?9.0 (Tris-HCl, 50 mM). Incubation atabove 70°C for 5 minutes, it loses its activity above 70°C. Enzeyme can use DIG-dUTP as aregular dNTP and synthetize the DNA. It can also add the last nucleotite on DNA. Enzymeneeds Mg+2 (7 mM) ions and Mn+2 (6 mM) ions for DNA-dependent and RNA-dependentDNA polymerase activity respectively. Spesific activity of the enzyme is 495,000 unites/mgwith Mg+2 ions. KDDNA and KDdNTP are 0.192 nM and 21.64 ?M respectively. Kpol is 24.99 s-1. It doesn?t have any 3?5? exonuclease activity with mismatch and single strand DNA. Ithas 5?3? nuclease activity on 5? overhang DNA with spesific activity of 2,35 nM. It can cutthe overhang part of the DNA or between the two match nucleotide at the overhang part. It isnot sensitive to ddNTP but when we changed the phenilalanine?712 to tyrosine enzymemostly recognizes ddNTP instead of dNTP. Enzeyme has strand displacement activity,especially by mutant enzyme with fenilalanine?721 instead of tyrosine721.Key Words: Gca TK4, DNA polymerase, Mutant, Characterization