Scytalidium thermophilum katalaz-fenol oksidaz enzimi ana kanal yapısının katalitik aktivitedeki rolünün araştırılması
The role of Scytalidium thermophilum catalase-phenol oxidase enzyme to investigate catalytic activity of the main channel structure
Yazar: MELİS ZENGİN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SEVGİ TÜRKER KAYA
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
Scytalidium thermophilum hidrojen peroksit (H2O2)'in su ve oksijene parçalanmasını gerçekleştiren ve H2O2'nin  yokluğunda ise çeşitli fenolik bileşiklerin oksidasyonunu sağlayan fenol oksidaz etkinliği olan bir katalaz üretir (CATPO). Bu çalışma ile Scytalidium atalazının aktif bölgeye uzanan ana kanal girişinde yer alan amino asit kalıntılarının katalitik mekanizmadaki rollerinin araştırılması hedeflendi. Ana kanal, ürünlerin serbest bırakılması ve substrat akışının katalitik bölgeye ulaşmasında başlıca role sahiptir. Ana kanalın katalaz aktivitesi üzerindeki rolünü araştırmak üzere Glu484 ve Thr188 amino asitleri üzerinde mutasyonlar gerçekleştirilerek CATPO varyantları üretildi. Toplamda CATPO'ya ait 7 mutant varyantı oluşturuldu. Bu amino asitlerdeki mutasyonlar sonucunda kanalın daraltılması ve/veya genişletilmesi hedef alınarak, kanalın boyutunun değiştirilmesi ve ayrıca ana kanalın üst kısmında hidrofobik bölgede solvent akışının değiştirilmesi hedeflendi. Spektrokopik çalışmalar E484D ve T188A varyantlarının d tipi hem grubu içerdiğini E484A, E484I, T188D, T188F ve T188I varyantlarının ise b tipi hem grubu içerdiğini gösterdi. Ayrıca, E484A, E484I, T188D, T188F ve T188I varyantlarının katalitik aktivitelerinde düşüş gözlenmiştir (sırasıyla % 64, % 99, % 80, %79 ve % 99 olmak üzere). Diğer taraftan E484D varyantında katalaz aktivitesinin yabanıl tipe göre, % 90 oranında korunduğu tespit edildi. T188I hariç diğer varyantların oksidaz aktivitelerinde düşüş gözlendi. En ilginç sonuç ise T188I varyantından elde edilmiştir. Katalaz aktivitesi tamamen inhibe olurken fenol oksidaz aktivitesi yabanıl tip enzime oranla önemli ölçüde bir değişiklik göstermediği tespit edildi.

Abstract:
Scytalidium thermophilum produces a catalase with phenol oxidase activity (CATPO) that catalyses the dismutation of hydrogen peroxide (H2O2) to dioxygen and water and also oxidizes several phenolic compounds in the absence of hydrogen peroxide. The goal of this study is to investigate the main channel which connects the deeply buried active site to the exterior of the enzyme. The main channel has been identified as potential routes for substrate flow and product release. To investigate the catalytic role of upper side of structure on catalase activity, CATPO variants with mutations on Glu484 and Thr188 were produced. Totally, 7 mutant variants of CATPO have been generated. Mutations in these residues changed the dimensions of the channel, both enlarging and constricting it and also changed the solvent occupancy in the hydrophobic, upper section of the main channel. Spectroscopic studies have revealed that E484D and T188A have haem d and E484A, E484I, T188D, T188F and T188I have haem b. Dramatical decrease in catalytic activity was observed in CATPO variants including E484A, E484I, T188D, T188F and T188I (64%, 99%, 80%, 73% and 99%, respectively). On the other hand, E484D variant exhibited 90% of wild type catalase activity. The most suprising result was obtained from T188I mutant where catalase activity was totally inhibited whereas phenol oxidase activity was not significantly changed in compared to the wild type enzyme.