Glioma hücrelerinde stres proteinlerinin anlatımında HSF1'in rolü
The role of HSF1 on stress proteins expressions in glioma cells
Yazar: ELÇİN GÜNGÖR
Danışman: DOÇ. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Primer malignant beyin tümörlerinin insidansı, değişen yaşam şartları ile birlikte son 30 yılda hızla yükselmiştir. Bu tümörler arasında gliomalar, en yaygın görülen ve en kötü huylu tümör tipi olarak kabul edilmektedir. Glial tümörlerin en yüksek prevelansa sahip biçimi olan yüksek-dereceli glioblastoma multiforme (GBM) için prognoz oldukça zayıftır. Cerrahi tekniklerin gelişmesi ve standart olarak radyoterapiyle birlikte uygulanan temozolomid tedavisine rağmen, sağkalım ortalama 15-16 ayla sınırlı kalmaktadır. Merkezi sinir sisteminde gerçekleşen normal gelişim yolaklarının ve gliomagenezin anlaşılması, bu tümörlerin biyolojisinin daha iyi kavranılmasına ve gliomalı hastalar için daha etkili tedavi yöntemlerinin ortaya konulmasına yardımcı olacaktır. Isı Şoku Proteinleri ("Heat Shock Proteins", HSPs) veya stres proteinleri olarak bilinen büyük bir moleküler şaperon ailesinin, gliomalarda yüksek oranda eksprese edildiği bilinmektedir. HSP'lerin artmış ekspresyonu ile glial tümörlerin invaziv kapasitesi arasında pozitif bir korelasyon bulunmaktadır. HSP'lerin aşırı ekspresyonu, gliomada mutasyonal değişikliklere yol açmakta ve sonuçta hücreleri malignite ve invazyona yönlendirmektedir. Glioma hücrelerine sitoproteksiyon sağlayan HSP'lerin aşırı ekspresyonu, aynı zamanda radyo- ve kemo-dirence de katkıda bulunmaktadır. HSP'lerin hem normal hem de stresli hücrelerdeki rolü, doğru ekspresyon paterninin üretilmesini sağlayan kompleks regülatör süreçlerin varlığını gerektirmektedir. HSP'lerin indüksiyonu, transkripsiyon faktörleri ailesinin belirli üyelerinin aktivasyonuna bağlıdır. Memeli hücrelerinde bu regülasyonun temel mekanizması Isı Şoku Faktörü 1 ("Heat Shock Factor 1", HSF1) olarak adlandırılan bir protein ve bu proteinin gerçekleştirdiği interaksiyonlara bağlıdır. Birçok çalışmada post-translasyonel modifikasyonlarla gerçekleştirilen değişimler, proteazomal degradasyon, küçük moleküllü inhibitörlerin kullanımı ve gen düzenleme mekanizmaları gibi çeşitli etmenlerle HSF1'in "down-regülasyonu" amaçlanmaktadır. Çeşitli meyve ve sebzelerde bulunan doğal bir flavonoid olan kersetin (3,3′,4′,5,7-pentahidroksiflavon), bir HSF1 inhibitörüdür ve tümör hücrelerinin apoptozunu kolaylaştırdığı bilinmektedir. Bununla birlikte HSF1'in gen düzeyinde susturumunun ("knock-out") etkili bir mekanizma olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.Bu çalışmada glioma hücrelerinde CRISPR/Cas9 yöntemi ile HSF1 genini en yüksek verimde susturmak ana hedef olarak belirlenmiştir. Çalışmanın amacına bağlı olarak U87-MG insan glioma hücrelerinde hem kersetin uygulaması hem de CRISPR/Cas9 aracılı HSF1 susturumu gerçekleştirilmiş ve çeşitli stres proteinlerinin anlatımları Western Blot tekniğiyle incelenmiştir. HSF1 inhibisyonu amacıyla uygulanan 2, 10 ve 30 μM kersetin konsantrasyonlarından 10 ve 30 μM kersetin dozları için HSF1 anlatımında anlamlı bir azalma saptanmıştır. Yine aynı amaçla gerçekleştirilen CRISPR/Cas9 uygulamasında kullanılan iki farklı sgRNA için de HSF1 anlatımının %50'nin üzerinde azaldığı belirlenmiştir. Gerçekleştirilen her iki uygulama karşılaştırıldığında, anlamlı değişime sebep olan dozlarda kersetin uygulamasının hücre canlılığı üzerinde gösterdiği yüksek toksisite sebebiyle, CRISPR/Cas9 uygulamasına göre dezavantaja sahip olduğu belirlenmiştir. Bunun yanısıra CRISPR/Cas9'un hem düşük sitotoksisitesi hem de sergilediği yüksek verimle HSF1 susturumunda etkili bir yol olabileceği ortaya konulmuştur. Kersetin uygulaması yapılmış gruplarda ve CRISPR/Cas9 ile HSF1 susturumu gerçekleştirilmiş gruplarda Hsp27, Hsp70, Hsp90 ve pHsp27 proteinlerinin anlatım seviyelerindeki değişimleri belirlemek üzere yapılan analizlerde alınan sonuçlar her iki uygulamanın da bu proteinlerin anlatım seviyeleri üzerinde farklı etkileri olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak HSF1 glioma hücrelerinde stres proteinlerinin anlatımını tek başına regüle eden bir faktör değildir. Yapılacak ileri çalışmalarla HSP'lerin kanser hücrelerindeki yüksek anlatımına sebep olan yolaklar tam olarak aydınlatıldıktan sonra, bu proteinlerin hücrelere sağladığı avantajların tamamen ortadan kaldırılması mümkün olabilecektir.

Abstract:
The incidence of primary malignant brain tumors has increased rapidly over the last 30 years, with changing living conditions. Among these tumors, gliomas are considered the most common and most malignant tumor type. The prognosis for high-grade glioblastoma multiforme (GBM), the most common form of glial tumors, is very poor. Despite the development of surgical techniques and temozolomide treatment along with radiotherapy as a standard therapy, survival is limited to an average of 15-16 months. Comprehension the normal developmental pathways and gliomagenesis in the central nervous system will help to better understanding the biology of these tumors and to provide more effective treatment methods for patients with glioma. A large molecular chaperone family, known as Heat Shock Proteins (HSPs) or stress proteins, is highly expressed in gliomas. There is a positive correlation between the increased expression of HSPs and the invasive capacity of glial tumors. Overexpression of HSPs leads to mutational changes in glioma and ultimately drives the cells to malignancy and invasion. Overexpression of HSPs that provide cytoprotection to glioma cells also contributes to radio- and chemo-resistance. The role of HSPs in both normal and stressed cells requires the existence of complex regulator processes that allow the production of the correct expression pattern. The induction of HSPs depends on the activation of certain members of the transcription factors family. The main mechanism of this regulation in mammalian cells depends on a protein called Heat Shock Factor 1 (HSF1) and its interactions. In several studies, down-regulation of HSF1 is aimed by various factors such as changes in post-translational modifications, proteasomal degradation, use of small molecule inhibitors and mechanisms of gene regulation. Quercetin (3,3′,4′,5,7-pentahydroxyflavone), a natural flavonoid found in various fruits and vegetables, is an HSF1 inhibitor and has been reported to facilitate apoptosis of tumor cells. In addition, it is thought that knock-out of HSF1 at gene level may use as an effective mechanism. In this study, knock-out of the HSF1 gene with the highest yield by the CRISPR/Cas9 method in glioma cells was determined as the main target. Depending on the purpose of the study, both quercetin application and CRISPR / Cas9 mediated HSF1 knock-out were performed in U87-MG human glioma cells and expression of various stress proteins was examined by Western Blot technique. As a result of 2, 10 and 30 μM quercetin applications performed for the purpose of HSF1 knock-out, a significant reduction in HSF1 expression was detected for 10 and 30 μM concentrations. For two different sgRNAs used in CRISPR / Cas9 application for the same purpose, HSF1 expression was found to be decreased by more than 50%. When both applications were compared, it was determined that the application of quercetin in doses causing significant changes had a disadvantage over CRISPR / Cas9 application due to the high toxicity on cell viability. In addition, CRISPR / Cas9 has been shown to be an effective pathway in HSF1 knock-out with low cytotoxicity and high efficiency. The results of the analyzes performed to determine the changes in the expression levels of Hsp27, Hsp70, Hsp90, pHsp27 proteins in the groups with applied quercetin and CRISPR / Cas9, showed that both applications have different effects on the expression levels of these proteins. In conclusion, HSF1 is not an unattended factor that regulates the expression of stress proteins in glioma cells. It will be possible to prevent the advantages of HSPs to cancer cells after fully understanding of the pathways that cause high expressions of these proteins in cancer cells with further studies.