Kantitatif floresan polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile duchenne kas distrofisi taşıyıcılarının saptanması
Detection of duchene muscular dystrophy carriers with quantitative fluorescent polymerase chain reaction
Yazar: AYSEGÜL ÇINAR KUŞKUCU
Danışman: PROF. DR. SENİHA HACIHANEFİOĞLU
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Genetik = Genetics

Özet:
Duchenne ve Becker kas distrofileri (DMD/BMD), X'e bağlı çekinik kalıtım gösteren kas hastalıklarıdır. DMD 1/3300 oranında görülen, ilerleyici ve ölümcülken, allelik formu olan BMD daha hafif seyirlidir. DMD/BMD Xp21.2 bölgesinde yer alan Distrofin geninde meydana gelen mutasyonlar sonucu oluşur. DMD'li olguların %60-65'nde gözlenen kısmi gen delesyonları, %5-10'unda duplikasyonlar genin 2 ?hot spot? bölgesinde toplanmıştır. Olguların kalan %25-30'unda nokta mutasyonları ve insersiyonlar bulunur. Olguların 2/3'ü taşıyıcı bir anneden aktarılan mutasyonla, 1/3'ü ise yeni mutasyon sonucu oluşur. Etkilenmiş erkeklerde delesyonlar çoklu PZR ile gösterilebilir. Ancak kadında taşıyıcılığın belirlenmesi zordur. Bu zorluğu çözmeye yönelik bağlantı analizi, floresan in-situ hibridizasyon, MLPA gibi çeşitli moleküler tanı yöntemleri kullanılmıştır. Tüm bu yöntemlerin teknik zorluk, yüksek maliyet, fazla zaman alımı, taze örnek ya da tüm ailelere uygulanamaması gibi dezavantajları vardır. Çalışmamızda, gen dozaj yöntemi olan kantitatif floresan PZR'yi (QF-PCR) bu problemlerin çözümüne yönelik uyarladık. QF-PCR, floresan işaretli primerler kullanılarak çoğaltılan DNA parçalarının bir genetik analiz cihazında kopya sayılarının belirlenmesine dayalı bir yöntemdir. Biz bu yöntemi daha önce çoklu PZR yöntemiyle delesyonları tespit edilmiş DMD/BMD'li hastaların ailelelerindeki kadınlarda taşıyıcılığın belirlenmesinde kullandık. Bunun için 24 ailede 23 olguda ekson delesyonları ve 28 kadında delesyon taşıyıcılığı inceledik. Olgularda 18 ekson ve promotor bölgesinin yanı sıra 3 STR belirtecini iç standart ve bağlantı analizi açısından inceledik. 19 hastada daha önce belirlenen delesyonla örtüşen sonuçlar elde edildi. 3 hastada ek bir ekson, 1 hastada önceki sonucundan eksik bir ekson delsyonu bulundu. 19 ailede annelerde delesyon taşıyıcılığını gösterirken 5 ailede annelerde delesyon gözlenmeyerek normal olarak bulundu. Sonuç olarak QF-PCR'ı DMD/BMD'li hastalarda delesyonun belirlenmesi ve taşıyıcı taramasında hızlı, güvenilir, tekrarlanabilen bir yöntem olarak tanımladık.

Abstract:
Duchenne and Becker muscular dystrophies (DMD/BMD) are most common X linked neuromuscular diseases. DMD is progressive, lethal, affecting 1/3300 live-born males. BMD is milder, allelic form of DMD. Both of them result from mutations in Dystrophin gene at Xp21.2. Partial gene deletions responsible for up to %60-65 DMD cases and %5-10 of cases result from gene duplications which are cluster in 2 ?Hot spot? regions. Point mutations and insertion of few nucleotides account for the remaining cases (%25-30). Mutations are either inherited from female carriers (2/3) or occur de novo (1/3). In affected males, deletions can be easily detected using multiplex PCR. But determining female carrier status is difficult. This difficulty reflected in the great variety of techniques that have been used for this purpose. These include methods such as linkage analysis, fluorescent in-situ hybridization (FISH), MLPA, etc. All of these methods have disadvantages; they are technically demanding, require fresh samples, are subject to error or are not applicable to all families. To overcome these problems we optimized gene dosage method quantitative fluorescent PCR (QF-PCR). QF-PCR refers to the amplification of DNA fragment using fluorescence-labeled primers, followed by quantitative analysis of the products on a genetic analyzer to determine copy number of DNA fragments. In our study, to determine deletions in DMD/BMD patients, who were previously diagnosed at the molecular level and female carrier status. We used 18 exon and promoter region STR markers as internal control and for linkage analysis. We found the same results, which previously reported, in 19 patients. In 3 patients we found an extra exon deletion and in 1 patient we found less exon deletion than previously found. In 19 families mothers were carriers, in 5 families mothers were not carriers.As a result we conclude that quantitative florescent PCR is a fast, reproducible and robust for detection of deletions of DMD/BMD patients and useful method for carrier screening.