İnsülin, metoprolol ve deferoksaminin sıçanlarda yağ grefti sağ kalımı üzerine etkilerinin araştırılması
Effects of insulin, metoprolol and deferoxamine on fat graft survival
Yazar: MEHMET FATİH OKYAY
Danışman: DOÇ. DR. HAKAN ARSLAN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Cerrahpaşa Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Cerrahi-plastik = Surgery-plastic ; Deferoksamin = Deferoxamine ; Gref yaşaması = Graft survival ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Karın yağı = Abdominal fat ; Metoprolol = Metoprolol ; Sıçanlar = Rats ; Transplantlar = Transplants ; İnsülin = Insulin

Özet:
Giriş ve Amaç: Yağ grefti uygulamaları estetik ve rekonstrüksiyon amacıyla plastik cerrahide en sık kullanılan ameliyatlar arasında yerini almıştır. Yaşlanan cildin formunu geriye döndürmek, ciltteki nedbe dokusunu yumuşatmak ve bunun getirdiği cilt kalitesinde artış, bir kontur defektinini gidermek, yüz, meme, kalça gibi bölgelerde estetik amaçlı projeksiyon artışı, radyoterapi görmüş ciltlerde görülen sertleşmeyi gidermek, bir bölgedeki doku azlığını gidermek yağ greftinin kullanım alanlarından sadece birkaçıdır. Ucuz, tekrarlaması kolay, komplikasyonları az bir teknik olması sebebiyle plastik cerrahinin elindeki önemli silahlardan biri haline gelmiştir; ancak implant amaçlı kullanılan yabancı materyallere kıyasla pek çok avantaj içermesine karşın rezorpsiyonuna bağlı greft hacim kayıplarının her daim miktar ve oran olarak ön görülememesi önemli bir problem teşkil etmektedir. Yağ greftlerinin sağ kalımı, güvenilir, tekrar edilebilir sonuçların elde edilebilmesi için gerekli koşullar üzerine çalışmalar yapılmış ve bu plastik cerrahide önemli sorular arasında yerini almıştır.
Deferoksamin anjiyogenezde etkili olduğu gösterilmiş HIF-1 (hipoksiyle indüklenebilir faktör) yıkımında etkin rol alan prolil hidroksilaz enziminin bir inhibitörüdür. Anjiyogeneze dolaylı yoldan katkısı nedeniyle daha önce yağ grefti sağ kalımı üzerine etkisi araştırılmış olumlu sonuçlar bildirilmiştir. Selektif β1 beta bloker olan metoprolol, cAMP üzerinden lipojenik etkisi nedeniyle yağ grefti sağ kalımı üzerine çalışılmış anlamlı sonuçlar bildirilmiştir. İnsülinin yağ grefti sağ kalımı üzerine etkisinin büyüme faktörlerinin etkileriyle anlamlı farklılık göstermediği bilinmektedir. Yağ grefti sağ kalımı üzerine daha önce metoprolol ve deferoksaminin etkilerini karşılaştıran bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmanın amacı daha önce çalışılmış ucuz, eldesi ve uygulaması kolay maddeler olarak insülin, metoprolol ve deferoksaminin yağ grefti sağ kalımı üzerine olan etkilerini araştırmak, karşılaştırmak ve ne ölçüde olduğunu ortaya koymaktır.
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda ağırlıkları ~300±10 gr arasında değişen 22 adet erkek 8-9 haftalık Sprague-Dawley cinsi sıçan kullanılmıştır. Denekler genel anestezi altında, antisepsi kurallarına azami uyum gösterilerek ve enfeksiyon profilaksisi uygulanarak cerrahi işleme tabi tutulmuştur.
Sıçanların sırt bölgeleri sağ kraniyal, sağ kaudal, sol kraniyal ve sol kaudal olmak üzere dört alana ayrılmıştır. Sol kraniyal cepteki yağ greftleri; S: Kontrol (SERUM) grubu, sağ kraniyal cepteki yağ greftleri; I: İnsülin (INS) grubu, sol kaudal cepteki yağ greftleri; D: Deferoksamin (DFO) grubu ve sağ kaudal cepteki yağ greftleri; B: Beta Bloker (Metoprolol-B/B) grubu olarak belirlenmiştir. 
İnguinal yağ yastığı greft olarak alındıktan sonra alınan yağ dokulardan göz kararı ağırlık olarak yaklaşık eşit dört adet yağ grefti elde edilmiş ve greftler hassas kantar ile ağırlık olarak ölçülerek kaydedilmiştir. Kontrol ve deferoksamin grubu ceplerine yerleştirilecek olan yağ greftleri herhangi bir işleme tabi tutulmadan ve kuruması beklenmeden kendileri için belirlenen bölgelere yerleştirilmiştir. İnsülin ve metoprolol grubu ceplerine yerleştirilecek olacak yağ greftleri uygun koşullarında inkübe edildikten sonra kendileri için belirlenen bölgelere yerleştirilmiştir.
Cerrahi işlem sonrası bir ay boyunca üç günde bir kez olmak üzere toplam on doz SERUM grubuna 0,2 mL %0,9 NaCl solüsyonu, DFO grubuna 0,2 mL 300 mg deferoksamin (Desferal 500 mg 10 flakon; Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri San. Tic. A.Ş, TR) ile hazırlanmış %0,9 NaCl solüsyonu otuz günlük periyotta enjekte edilmiştir. 
Toplamda üç aylık yağ grefti olgunlaşma sürecinden sonra sıçanlara cerrahi işlem öncesi ötenazi uygulanmıştır. Greft alanı, çevresindeki geçiş alanı ile beraber kesilip çıkartılarak hassas kantar ile ağırlık olarak ölçülerek kaydedilmiştir. 
Deneklerin sakrifikasyonu esnasında her sıçandan ayrı ayrı alınan birer adet beyaz yağ doku biyopsisi aynı sıçandan alınan yağ greftleriyle histolojik ve immunohistokimyasal olarak kıyaslanmak üzere öz yağ doku (ÖYD) grubu olarak çalışmaya dahil edilmiştir. Histopatolojik incelemede yağ grefti alanları incelenerek adiposit alanları yüzdesel olarak oranlanmıştır, immunohistokimyasal analizde ise perilipin antikorları ile canlı yağ doku, CD31 antikorları ile yeniden damarlanma ve CD34 antikorları ile kök hücre aktivasyonu gösteren öncül hücre miktarı oranlaması yapılmıştır.
Bulgular: Gruplardaki değişkenlerin dağılımı Kolmogorov Smirnov testi ile ölçülmüştür. Sayısal veriler için bağımlı gruplarda t-testi kullanılmıştır ve değişim yüzdesi için delta hesaplanmıştır. İki grup arası karşılaştırmalarda; parametrik olmayan verilerde Mann-Whitney U testi, kesikli veriler için bağımlı gruplarda McNemar testi kullanılmıştır. İkiden fazla gruplar arası karşılaştırmalarda parametrik olmayan sayısal verilerde Kruskal-Wallis testi kullanılmıştır. Post-hoc analizler için Mann-Whitney U testi kullanılıp istatistiksel anlamlılık düzeyi Bonferroni düzeltmesiyle saptanmıştır. Analizlerde SPSS 21.0 programı kullanılmıştır.
INS grubu, DFO grubu ve B/B grubu kendi aralarında ve kontrol grubuyla yağ grefti ağırlık değişimleri, yağ nekrozu oranları, perilipin boyalı hücre oranları, kök hücre oranları (CD34), yeni kan damarı gelişim oranları (CD31) açısından kıyaslanmıştır. Deney öncesi ve deney sonu yağ grefti ağırlık değişim ortalamaları benzer olarak bulunmuş ve istatistiksel olarak anlamlı farklılık görülmemiştir (p>0,05). DFO ve B/B grupları kontrol grubu karşısında sırasıyla yaklaşık %20 ve %30 perilipin ile boyalı canlı yağ hücre artış oranı göstermiştir. Ancak B/B grubunun gösterdiği %30 artış istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) bulunurken; DFO grubunun gösterdiği %20 artış anlamlı olarak değerlendirilememiştir (p>0,05). INS grubu ise kontrol grubuna yaklaşık eşit bir oran ortaya koymuştur (SERUM: %50-INS: %48,8). 
CD34 aktivasyonu tüm deneklerde ve tüm gruplarda zayıf olarak izlenmiş gruplar arasındaki yaklaşık değerler istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0,05). CD31 aktivasyonu DFO ve INS grubunda B/B grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulunmuştur (p<0,05). Yağ nekrozu oranlarında istatistiksel olarak anlamlı farklılık görülmemiştir (p>0,05).
Sonuç: Yağ grefti sağ kalımını artırmak için bugüne kadar kullanılan birçok madde ve yöntem bildirilmiştir. Daha önce yağ grefti sağ kalımını artırdığı muhtelif çalışmalarda gösterilmiş olan bu maddelerin -diğer denenmiş olan tüm madde ve yöntemler gibi- yağ grefti sağ kalımını artırma üzerine olan etkileri literatürde bildirilen tüm çalışmalarda eşit düzeyde ve süreklilik arz edecek biçimde bulunamamıştır.
Çalışma yöntem olarak her sıçanın her gruba dahil edilmesiyle aynı genetik, fizyolojik ve metabolik durumda farklı maddelerin tek bir durum üzerine etkisinin kıyas edilmesi amaçlı tasarlanmıştır. Bu sayede genetik ve epigenetik koşulların sonuç üzerine etkisi sıfıra indirilmiştir. Genetik ve çevresel faktörlerin denekler üzerinde yaratacağı etkilerin en aza indirilebilmesi için çalışmamızda kullanılan hayvan israfını en aza indiren deneysel yöntemin yaygın hale getirilmesinin uygun olacağı görüşündeyiz.
Çalışmamızda en kolay ulaşılabilir ve maliyeti düşük maddeler seçilmiş; literatür ortalamasının çok üzerinde örneklem sayısına ulaşılmış ve benzer yağ grefti ağırlık değişim oranları elde edilmiştir. Ancak immunohistokimyasal incelemelerle metoprololün yağ grefti sağ kalımını canlı yağ hücre oranı olarak artırdığı gösterilmiştir (p<0,05). Sonucun kalıcılığı hayvanın kendi yağ dokusuna yakın derecede zayıf kök hücre aktiviteleriyle desteklenmiştir. 
Çalışmamızdan yola çıkılarak gelecekte tasarlanacak olan çalışmalarda uzun ve kısa etkili, farklı etki gücü ve reseptör selektivitesine sahip beta blokerlerin yağ grefti sağ kalımı üzerine olan etkilerinin kıyaslanması amaçlanabilir.

Abstract:
Introduction and Purposes: Fat graft applications are among the most frequently used surgeries in plastic surgery for aesthetic and reconstructive procedures. Regaining form of the skin for old skins, making skin scars softer and additional increase of the skin quality, removing a contour defect, increasing the projection in areas such as face, breast and hip for aesthetic purposes, getting rid of the hardness seen on radiotherapy applied skin, getting rid of the tissue defect in a region, these are just a few usage areas of fat grafting. It has become one of the most important weapons in the hands of the plastic surgeons because it is cheap, easy to repeat, with less complication. Although it has many advantages compared to the foreign materials used for implantation, it is an important problem that graft volume losses due to resorption that almost always can not be predicted as the amount and ratio. Studies have been undertaken on the conditions necessary for the survival of fat grafts, reliable and reproducible results, and this has become an important question among plastic surgeons.
Deferoxamine has been shown to be effective in angiogenesis that an inhibitor of the prolyl hydroxylase enzyme which plays an active role in the HIF-1 (hypoxia-inducible factor) degradation. Because of on the effect of indirectly on angiogenesis, previously studied on fat graft survival and positive results have been reported. Metoprolol, a selective β1 beta blocker, has been reported to work on increasing fat graft survival due to the lipogenic effect related with cAMP. It is known that the effect of insulin on fat graft survival does not differ significantly from the effects of growth factors. There are no studies comparing the effects of metoprolol and deferoxamine on fat graft survival. The aim of this study is to investigate, comparison and how matters the effects of insulin, metoprolol, and deferoxamine on fat graft survival as cheap, elaborate and easy-to-apply substances which have previously studied.
Material and Methods: In our study, weighing ~300±10 gr 22 male 8-9 week old Sprague-Dawley type rats were used. The subjects underwent surgical operation under general anesthesia, with maximum compliance with antisepsis rules and with infection prophylaxis. 
The back regions of the rats divided into four as, right cranial, right caudal, left cranial and left caudal. They were determined as left cranial fat grafts were S: Group 1, Control (SERUM) group, right cranial fat grafts were I: Group 2, Insulin (INS) group, left caudal fat grafts were D: Group 3, Deferoxamine (DFO) group and right caudal fat grafts were B: Group 4, Beta Blocker (Metoprolol-B/B).
After the inguinal fat pad was taken as a graft, four fat grafts were obtained approximately equal in weight from the fat has taken and the grafts were weighed and recorded with precision weighing scale. The fat grafts to be placed in the control and deferoxamine group pockets were placed in the areas designated for themselves without any treatment and without any unexpected drying. The fat grafts to be placed in the insulin and metoprolol group pockets were placed in the zones designated for them after being incubated under appropriate conditions.
After surgical operation, a total of ten doses, once every three days 0,2 mL %0,9 NaCl solution to SERUM group, 0,2 mL %NaCl solution prepared with 300 mg deferoxamine (Desferal 500 mg 10 flakon; Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri San. Tic. A.Ş, TR) to DFO group were injected in a thirty-day period. 
In total, after three months of fat graft maturation period, rats were euthanized prior to surgery. The graft area, after being cut out with the passage area around it, it was recorded by weighing with precision weighing scale.
One white fat tissue biopsy taken separately from each rat during sacrification of the subjects was included in our study as an autologous self-fat tissue (SFT) group for comparison histologically and immunohistochemically with the same rat fat grafts. Adipocyte areas were scored as percentages by examining fat graft sites in the histopathological examination, in the immunohistochemical analysis, perilipin antibodies and live fat tissue, re-vascularization with CD31 antibodies and progenitor cell rate indicating stem cell activation with CD34 antibodies were performed.
Results: The distribution of the variables in the groups was measured by the Kolmogorov Smirnov test. For the numerical data, the t-test was used for the dependent groups and the delta was calculated for the percent change. In the comparison between the two groups; Mann-Whitney U test for non-parametric data, McNemar test for intermittent data was used on dependent groups. Kruskal-Wallis test was used for non-parametric numerical data in comparison between more than two groups. Mann-Whitney U test was used for post hoc analyzes and statistical significance was determined by Bonferroni correction. SPSS 21.0 program was used in the analysis.
INS group, DFO group, and B/B group were compared between themselves and control group in terms of fat graft weight changes, fat necrosis ratios, perilipin stained cell ratios, stem cell ratios (CD34), and new blood vessel development rates (CD31). Pre and post-study fat graft weight averages were similar and no statistically significant difference was observed (p>0,05). DFO and B/B groups showed 20% and 30% increase versus the control group in the percentage of stained live fat cells with perilipin, respectively. However, 30% increase in the B/B group was statistically significant (p<0,05); 20% increase in the DFO group was not (p>0,05). INS group provided an approximately equal ratio to the control group (SERUM: %50-INS: %48,8). 
CD34 activation was monitored poor stained in all subjects and in all groups and values were not found statistically significant (p>0,05). CD31 activation was statistically significantly higher in the DFO and INS groups than in the B/B group (p>0,05). There were no statistically significant differences in fat necrosis ratios (p>0,05).
Conclusion: Many substances and methods used to date have been reported to increase the survival of fat grafts. The efficacy of these substances -such as all other tried and tested substances and methods- that have been shown in various trials that previously increased fat graft survival was not found to be equally consistent in all studies reported in the literature.
The study was designed to compare the effect of different substances on a single case in the same genetic, physiological and metabolic state, with each rat being included in each group. By the way, the effect of genetic and epigenetic conditions on the outcome has been reduced. In order to minimize the effects of genetic and environmental factors on the subjects, we believe that it would be appropriate to make the experimental method that minimizes the animal wastes used in our study to be widespread.
The most easily accessible and low-cost materials were selected for the study; the number of samples exceeding the literature average was reached and similar fat graft weight change rates were obtained. Immunohistochemical studies, however, have shown that metoprolol was increased fat graft survival as the ratio of live fat cells (p<0,05). The result was supported by low stem cell activity at the equivalent of the animal's own fat tissue. 
With this study, it may be aimed to compare the effects of beta-blockers with long and short-acting, different potency and receptor selectivity on fat graft survival in studies to be designed in the future.