Schizosaccharomyces pombe'de oksidatif stres yanıtı ile glukoz baskılaması ilişkisinin genom boyutunda araştırılması
Investigation of the relationship between glucose repression and oxidative stress response on genome-wide in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: KADİR GÖKHAN SÜSLÜ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BEDİA GEMİCİ PALABIYIK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Genetik = Genetics ; Glükoz = Glucose ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Schizosaccharomyces pombe = Schizosaccharomyces pombe

Özet:
Basit yapılı bir şeker olan glukoz, birçok organizma tarafından tercih edilen karbon ve enerji kaynağı ve aynı zamanda bir sinyal molekülüdür. Ökaryotik organizmalar, glukoz algılanması ve sinyal iletiminde rol oynayan çok sayıda karmaşık yollara ve düzenleme mekanizmalarına sahiptirler. Hücresel ve çevresel bir takım stres faktörlerine karşı verilen yanıtta metabolik adaptasyon, glukoz algılanması ve sinyal iletimi gibi süreçler önemli rol oynamaktadır. Bu bağlamda, hücrede oluşan oksidatif stres yanıtı ve glukoz metabolizması arasındaki ilişkinin aydınlatılmasını hedefleyen çalışmalar hız kazanmıştır.Bu çalışmada, S. pombe'de glukoz baskılaması ile oksidatif stres yanıtı arasındaki ilişkide rol oynayan gen veya genlerin tespit edilmesine yönelik, farklılık gösterim tekniği kullanıldı. Bu amaçla, glukoz baskılamasına dirençli konstitütif invertaz mutantı (ird11h-), yabani ırkla (972h-) karşılaştırılarak kullanıldı. Yabani ve mutant hücrelerden total RNA izolasyonu yapıldı ve oligo-dT primerler kullanılarak total RNA'lardan cDNA'lar sentez edildi. Bu cDNA'lardan rastgele/oligo-dT primer kombinasyonu kullanarak PZR ürünleri elde edildi. Bu ürünler poliakrilamid jelde yürütülerek anlatımları farklı olan genler saptandı. Ardından ikinci PZR yapılıp, kontrol edildi ve dizi analizleri yaptırıldı. Nükleotid dizilemeleri yapılan cDNA'ların, S. pombe genom veritabanında gerçekleştirilen BLAST analizleri ile mannoz-1-fosfat guanil transferaz enzimini kodlayan mpg1 geni ve 60S ribozomal proteini olan L3'ü kodlayan rpl302 geni elde edildi. Son olarak, farklılık gösterimi ile elde edilen genlerin anlatım profilleri Gerçek Zamanlı PZR (GZ PZR) yöntemi kullanılarak kontrol edildi.Genel gen anlatımında görevli rpl302 geninin anlatım seviyesinin stres altındaki hücrelerde (ird11 ve yabani tip) belirgin bir şekilde düştüğü (sırasıyla, 0,6 ve 0,5 kat), oysa mpg1 geninin anlatımının önemli bir değişime yol açmadığı belirlendi. Stres uygulanmayan koşulda, ird11'de rpl302 geninin anlatımının yabani tipinkiyle karşılaştırıldığında 1,8 kat artmış bulundu. Benzer şekilde, ird11'deki mpg1 geninin anlatımının yabani tipinkinden istatistiki olarak yüksek (1,3 kat) olduğu bulundu. Bu bulgular, bu iki genin ird11'deki oksidatif stres toleransında rol oynayabileceğini düşündürdü. Dahası, glukoz baskılamasına dirençli konstitütif invertaz mutantının (ird11), glukoz algılama/sinyal ve oksidatif stres yanıt yolaklarındaki çalışmalar için uygun bir model olabileceğini desteklemektedir.

Abstract:
Glucose, as a simple sugar, is preferred as a carbon and energy source by many organisms, and is also a signalling molecule. Eukaryotic organisms have a large number of complex ways and various regulatory mechanisms which play a role in glucose sensing and signalling. Processes like metabolic adaptation, glucose sensing and signalling, play important roles responding to a number of cellular and environmental stress. In this regard, studies which aim to elucidate the relationship between oxidative stress and glucose repression are increasing.In this study, differential display technique was used to determine the gene or genes which play roles in the relationship between oxidative stress and glucose repression in S. pombe. For that purpose, constitutive invertase mutant ird11h- which is resistant to glucose repression is used in comparison to wild type (972h-). Total RNA was isolated from wild type and mutant cells and cDNAs were synthesized from total RNAs by using oligo-dTs. PCR products were obtained from these cDNAs by using a combination of random/oligo-dT primers. By running these products on a polyacrylamide gel, differentially expressed genes were detected. Subsequently, a second PCR was performed, checked and sequenced. The mpg1 gene encoding mannose-1-phosphate guanyltransferase enzyme and rpl302 gene encoding 60S ribosomal subunit protein L3 were obtained by BLAST analysis of the sequenced cDNAs in S. pombe genome database. In conclusion, the gene profiles obtained by differential display method were checked by Real-Time PCR.It was indicated that the expression level of rpl302 gene, involved in general gene expression, were sharply reduced (0,6 and 0,5, respectively) in both cells (ird11 and wild type) under stressed conditions, whereas expression of mpg1 gene did not appear to cause significant change. Under non-stressed condition, rpl302 expression in ird11 was found to be increased 1,8 fold compared to that of wild type. Similarly, the expression level of mpg1 gene in ird11 was found to be statistically higher (1,3 times) than that of wild type. These findings are thought that both of two genes might be played a role in the oxidative stress tolerance in ird11. Moreover, they are supported that glucose repression to constitutive invertase mutant, ird11 would be a convenient model cell for the studies on the glucose sensing/signalling and the oxidative stress response pathways.