R-limonene nanoemülsiyonların kanal içi uygulamalarının kök dentini üzerindeki antibakteriyel etkilerinin in vitro olarak araştırılması
In vitro investigation of the antibacterial effects of r-limonene nanoemulsions on root dentin
Yazar: İLKE DOĞA ŞEKER
Danışman: PROF. DR. TAYFUN ALAÇAM
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Endodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Antibakteriyel ajanlar = Anti-bacterial agents ; Dental pulpa boşluğu = Dental pulp cavity ; Dentin = Dentin ; Emülsiyonlar = Emulsions ; Enterococcus faecalis = Enterococcus faecalis ; Kök kanal dolgu materyalleri = Root canal filling materials ; Kök kanal tedavisi = Root canal therapy ; Limonen = Limonene ; Mikroemülsiyon = Microemulsion ; Nanoemülsiyon = Nanoemulsion

Özet:
Bu tezin amacı R-Limonene ve farklı nanoemülsiyon formülasyonlarının Enterococcus faecalis üzerindeki antimikrobiyal etkilerinin öncelikle agar difüzyon testleri ile kalsiyum hidroksitle karşılaştırılarak araştırılması, MİK ve MBK değerlerinin bulunması ve daha sonra saptanan MİK/MBK değerleri ile saf R-Limonene ve %20 R-Limonene içeren nanoemülsiyonun, E. faecalis ile enfekte kök kanalları üzerindeki etkilerinin araştırılmasıdır. İlk aşamada, faz inversiyonu yöntemiyle farklı R-Limonene nanoemülsiyon formülasyonları hazırlandı. E. faecalis içeren agar plaklarında antimikrobiyal etkilerin değerlendirilmesi için test materyalleri uygulandı, inhibisyon zonları kaydedildi. Tüpte makrodilüsyon yöntemi ile MİK/MBK değerleri kaydedildi. Daha sonra E. faecalis bakteri süspansiyonu hazırlandı ve çekilmiş dişlerin kök kanalları enfekte edildi. Son olarak R-Limonene'nin belirlenen MİK/MBK değeri, %20 R-Limonene içeren nanoemülsiyon, kalsiyum hidroksit ve steril salin E. faecalis ile enfekte kök kanallarına uygulandı. Kök kanalındaki enfeksiyonu araştırmak için nikel-titanyum döner eğe kullanılarak her kanaldan dentin talaşları alındı. Çıkarılan dentin talaşları ve döner eğe, besiyeri içeren steril bir Eppendorf tüpüne yerleştirildi ve vortekslendi. MHA petri plakalarına ayrı ayrı ekim yapıldı. Örnekler 37 °C'de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyonun sonunda gelişen koloniler sayıldı ve CFU/mL cinsinden canlı bakteri sayısı hesaplanan her numunenin sonucu kaydedildi. Kalsiyum hidroksit hem disk difüzyon hem de kuyu difüzyon testlerinde daha geniş inhibisyon bölgeleri oluşturdu. R-Limonene de testlerde aktivite gösterdi. Ancak hem %10 hem de %20 R-Limonene içeren nanoemülsiyonun agar testlerinde etkisiz olduğu bulundu. Kök kanallarındaki canlı koloni sayılarının değerlendirilmesinde, test materyalleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. Her bir grup ile salin solüsyonu arasında anlamlı bir fark bulundu. R-Limonene içeren nanoemülsiyon, daha az aktif bileşen içermesine rağmen saf R-Limonene ile kök kanallarında karşılaştırılabilir sonuçlar vermiştir. R-Limonene'nin nano boyuta getirilmesinin antibakteriyel aktiviteyi göreceli olarak artırdığı düşünülebilir. Agar ortamında R-Limonene nanoemülsiyonunun etkinliği gözlemlenmezken, kök kanalları üzerinde kalsiyum hidroksitle karşılaştırılabilir düzeyde etkili olduğu gözlendi. Bununla beraber deney materyalleri kalsiyum hidroksitte de olduğu gibi dentin kanalcıklarındaki E. faecalis'in total eliminasyonunda yetersiz kaldı. Mevcut antibakteriyel etkisi ve hoş kokusu göz önüne alındığında, R-Limonene endodontik ilaçların içerik listesine eklenebilecek alternatif bir ajan olarak düşünülebilir.

Abstract:
The aim of this thesis was to investigate the antimicrobial effects of R-limonene and its different nanoemulsion formulations compared to calcium hydroxide in agar diffusion tests on Enterococcus faecalis and find out the MIC and MBC levels, and to evaluate the efficacy of determined MIC/MBC level of R-limonene, nanoemulsion containing 20 % R-limonene and Ca(OH)2 and sterile saline on the E. faecalis infected root canals. In the first step different formulations of R-limonene nanoemulsions were prepared by the phase inversion method. E. faecalis was cultivated and test materials used for the evaluation of antimicrobial effects in agar for E. faecalis. MIC/MBC values were determined with the macrodilution method in tube. Then, prepared bacterial suspensions of E. faecalis were used for infecting the root canals of extracted teeth. Finally, pure R-limonene at the determined MIC/MBC dose, a nanoemulsion containing 20% R-limonene, calcium hydroxide, and sterile saline were applied into E. faecalis infected root canals. To analyze the treatment outcome bacterial samples were taken from each canal using a nickel-titanium rotary file. The extracted dentin chips and the rotary file were placed in a sterile Eppendorf tube containing medium, and vortexed. Inoculations were made on MHA Petri plates separately. Samples were incubated at 37 °C for 24 hours. Colonies that grew at the end of the incubation were counted and the result of each sample calculated in terms of viable bacteria count was recorded in CFU/mL. Calcium hydroxide formed wider inhibition zones in both disc diffusion and well diffusion tests.  However, nanoemulsion containing both 10% and 20% R-limonene was found ineffective in agar tests. In the evaluation of viable bacteria counts in the root canal, there was no statistically significant difference between the test materials. A significant difference was found between each group and the saline solution. However, test materials, like calcium hydroxide, were not sufficient to completely eliminate E. faecalis in dentinal tubules. Nanoemulsion containing R-limonene yielded similar results in root canals infected with E. faecalis compared to pure R-limonene despite containing a less amount of the active ingredient. It can be thought that bringing R-limonene to nanosize relatively increases the antibacterial activity.  While the effectiveness of R-limonene nanoemulsion was not observed in the agar medium, it was comparably effective with calcium hydroxide in root canals infected with E. faecalis. Considering its existing broad spectrum antibacterial effect on endodontic pathogens and its pleasant smell, R-limonene may be regarded as a promising agent that can be added to the list of content of endodontic medicaments.