Karbonik anhidraz II'nin homosistein ve metilglioksal ile modifikasyonunun enzim aktivitesi ve antijenik özelliklerine etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of modification of carbonic anhydrase II with homocysteine and methylglyoxal on enzyme activity and antigenic properties
Yazar: NESLİHAN SAĞLAM
Danışman: PROF. DR. AHMET ALVER
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Karbonik anhidrazlar (CA'lar), karbondioksitin hidrasyonunu geri dönüşümlü olarak 
katalizleyen metalloenzimlerdir.  CA enzim ailesinin posttranslasyonel modifikasyonlarına 
(PTM'larına) dair çalışmalar genellikle veritabanlarına dayanarak değerlendirilmiştir. 
PTM'ler ile CA'ların fonksiyonları arasında açık bir korelasyon olduğu ifade edilse de 
birçok modifikasyon olayı için yeterince deneysel çalışmalar yapılmamıştır. Bu çalışmada, 
geniş bir doku dağılımına sahip insan karbonik anhidraz II (hCAII) izoenziminin 
homosistein (HCY) ve metilglioksal (MGO) ile in vitro modifikasyonlarının enzimin 
aktivitesi ve antijenik özellikleri üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, 
çalışmada kullandığımız saf hCAII izoenzimi, insan eritrositlerinden afinite kromotografisi 
ile saflaştırıldı. Elde edilen saf hCAII izoenzimi,  HCY ve MGO ile in vitro olarak modifiye 
edildi. Modifikasyonların varlığı western blot ile teyit edildi. Modifiye edilen hCAII 
izoenzimlerinin hidrataz ve esteraz aktiviteleri ölçüldü. Modifiye olan hCAII 
izoenzimlerinin  antijenik özeliklerini belirlemek için Balb-c fareler bu enzimlerle immünize 
edildi ve fare serumlarındaki antikor titreleri ELISA yöntemi  ile ölçüldü. Enzim aktiviteleri 
ölçüldüğünde,  
hCAII enziminin HCY ve MGO ile modifikasyonlarında, N
homosisteinilasyona bağlı olarak enzim aktivitesinde dozla ilişkili olarak inhibisyona neden 
olurken, glikasyona bağlı etkisininin ise düşük modifikasyon dozunda önemli ölçüde 
aktivasyona sebep olurken yüksek modifikasyon dozunda ise inhibisyona neden oldu. MGO 
ile modifikasyonun Balb-c farelerde yüksek antijenik cevap oluşturduğu, HCY'nin 
antijeniteyi değiştirmediği gözlendi. Sonuç olarak,  MGO ile modifikasyonun hCAII 
enziminin hem aktivite hem de  antijenik özelliklerini etkilediği, HCY ile modifikasyonun 
ise enzimin aktivitesinde önemli etkisi olduğu gözlenirken, antijenik olarak etkisi 
belirlenmemiştir.

Abstract:
Carbonic anhydrases (CAs) are metalloenzymes that reversibly catalyse the 
hydration of carbon dioxide.  Studies on posttranslational modifications (PTMs) of the CA 
enzyme family have been evaluated mainly based on databases. Although there is a clear 
correlation between PTMs and the function of CAs, many modification events have not been 
adequately studied experimentally. In this study, we aimed to investigate the effects of in 
vitro modifications of human carbonic anhydrase II (hCAII) isoenzyme with homocysteine 
(HCY) and methylglyoxal (MGO) on the activity and antigenic properties of the enzyme. 
For this purpose, pure hCAII isoenzyme was purified from human erythrocytes by affinity 
chromatography. The obtained pure hCAII isoenzyme was modified in vitro with HCY and 
MGO. The presence of modifications was confirmed by Western blotting. Hydratase and 
esterase activities of the modified hCAII isoenzymes were measured. To determine the 
antigenic properties of the modified hCAII isoenzymes, Balb-c mice were immunised with 
these enzymes and antibody titres in mouse sera were measured by ELISA. When the 
enzyme activities were measured, modifications of hCAII enzyme with HCY and MGO 
caused dose-related inhibition of the enzyme activity due to N-homocysteinylation, while 
the glycation-dependent effect caused significant activation at low modification dose and 
inhibition at high modification dose. It was observed that modification with MGO induced 
a high antigenic response in Balb-c mice, while HCY did not alter antigenicity. In 
conclusion, modification with MGO affected both the activity and antigenic properties of 
hCAII enzyme, while modification with HCY had a significant effect on the activity of the 
enzyme, but no antigenic effect was determined.