PCR-DGGE tekniği ile kefir mikroflorasındaki laktik asit bakterilerinin tanımlanması
Identification of lactic acid bacteria isolated from kefir microflora by PCR-DGGE method
Yazar: NAZİFE KAÇMAZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ZÜLAL KESMEN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: DNA parmak izi = DNA fingerprinting ; Kefir = Kefir ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Kefir beslenme ve sağlık üzerindeki olumlu etkileri her geçen gün daha iyi anlaşılan fermente bir süt ürünüdür. Kefirin karakteristik özellikleri ve sağlık üzerindeki etkilerinin mikroflora kompozisyonuna bağlı olduğu anlaşılmıştır. Ancak bu floranın sabit olmayıp birçok faktöre bağlı olarak az ya da çok değişebildiği belirtilmektedir. Bu nedenle öncelikle kefir mikroflorasının detaylı olarak ortaya konulması, kefirle ilgili araştırmalarda kritik önem arz etmektedir.Fermente ürünlere özgü nitelikleri kazandıran mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla yoğun araştırmalar yapılmakta ve DNA'ya dayalı tanımlama teknikleri, özellikle Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) bu ürünlerin karmaşık mikroflorasınının tanımlanmasında yaygın olarak kullanılmaktadır.Bu araştırmada farklı üniversitelerden sağlanan kefir taneleri ve piyasadan temin edilen farklı marka kefirlerin laktik asit bakteri profili, PCR-DGGE ve 16S rRNA tam sekans analizi ile kullanılarak incelenmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında kefir ve kefir tanelerinden direkt olarak DNA izole edilerek PCR-DGGE analizine tabi tutulmuş ve sonuçta Lactobacillus kefiranofaciens, Aeromonas media, (Lb. buchneri Lb. kefiri, Lb. sunkii, Lb. otakiensis), Streptoccocus. thermophilus, Lactococcus lactis, Lc. raffinolactis, Paenibacillus apiarius, Bacillus sp, Aeromonas hydrophila, Bifidobacterium, Lb. helveticus, Lb. jensenii olmak üzere 12 farklı bakteri tespit edilmiştir. İkinci aşamada ise, MRS ve M17 agar ortamında geliştirilen saf bakterilere ait DNA'ların 16S rRNA tam sekans analizi yapılmıştır. Tam sekans analizi sonucunda Lc. lactis, Leuconostoc mesenteroides, St. epidermidis, St. thermophilus, Leu. pseudomesenteroides, Lb. casei, Lb. kefiri, Pseudomonas sp, Acetobacter ghanensis, Lb. diolivorans, Lb. acidophilus olmak üzere toplam 11 adet farklı bakteri tespit edilmiştir.Sonuç olarak kefir ve kefir tanelerinin bakteriyel florasını tanımlamada PCR-DGGE oldukça güçlü bir teknik olmakla beraber sonuçların güvenilirliği ve ortamın gerçek bakteri profilinin ortaya çıkarılması için diğer moleküler tekniklerle birlikte kullanılmasının gerekli olduğu düşünülmektedir.Anahtar kelimeler: Kefir, Laktik Asit Bakterisi, PCR-DGGE, 16S rDNA

Abstract:
Kefir is a fermented diary product whose positive effect on nutrition and health are understood better day by day. It has been realized that Kefir?s characteristic features and effects on health depend on microflora composition. But it is also pointed out that this flora is not stable and changes more or less depending on a number of factors. Therefore, it is of paramaount importance that kefir?s microflora be described in detail in studies on kefir.Several studies are carried out in order to define the microorganisms that bring in the specific features of fermented products and definition techiques based on DNA especially Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) is commonly used in definition of the complicated microflora of these products.In this study, lactic acid bactery profiles, PCR-DGGE and 16S rRNA supplied from kefir grains from different universities and different kefir brands from the market were examined using full sequence analysis. In the first step of the study, DNA was directly isolated from kefir and kefir grains afterwards it was analysed consequently 12 different bacteries namely Lactobacillus kefiranofaciens, Aeromonas media, (Lb. buchneri Lb. kefiri, Lb. sunkii, Lb. otakiensis), Streptoccocus. thermophilus, Lactococcus lactis, Lc. raffinolactis, Paenibacillus apiarius, Bacillus sp, Aeromonas hydrophila, Bifidobacterium, Lb. helveticus, Lb. jensenii have been determined. In the second step full sequence analysis was carried out for 16S rRNA of DNAs belonging to pure bacteries cultivated in MRS and M17 agar medium. At the end of the full sequence analysis 11 different bacteries namely Lc. lactis, Leuconostoc mesenteroides, St. epidermidis, St. thermophilus, Leu. pseudomesenteroides, Lb. casei, Lb. kefiri, Pseudomonas sp, Acetobacter ghanensis, Lb. diolivorans, Lb. acidophilus were determined.Consequently PCR-DGGE is a quite reliable technique in defining the bacterial flora of kefir and kefir grains but it should be used with the other molecular techiques for the reliability of the results and for determining the real bacteria profile of the medium.Key words: Kefir, Lactic Acid Bacteria, PCR-DGGE, 16S rRNA