MLM tipte yapılandırılmış yağlar ile D vitamini enkapsülasyonu ve biyoerişilebilirliğinin araştırılması
Encapsulation of vitamin D with using MLM-type structured lipid and investigation of bioaccessibility
Yazar: SİBEL ARAZ
Danışman: PROF. DR. NEŞE ŞAHİN YEŞİLÇUBUK
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Günümüzde, yapılandırılmış yağlar sağlıklı gıdalara karşı giderek artan ihtiyacı karşılamak ve obezite, kanser, kardiyovasküler vb. hastalıkları önlemek için tasarlanabilmektedir. Yapılandırılmış yağlar, gliserole bağlı yağ asitleri bileşiminin veya konumunun kimyasal veya enzimatik olarak değiştirilmesiyle elde edilmektedir. Kistik fibrozis, kolit ve crohn gibi yağ emiliminde yetersizlik olan hastaların diyetlerinde orta zincirli yağ asitleri (OZYA) beslenme ihtiyaçlarını karşılamak için dahil edilmektedir ancak bu yağ asitleri vücudun temel yağ asidi ihtiyacını tek başlarına karşılayamadıklarından son dönemlerde hem OZYA hem de uzun zinciri yağ asitleri (UZYA) içeren MLM tipte yapılandırılmış yağlar üretilmekte ve bu hastaların diyetlerine dahil edilmektedir. 
Yapılandırılmış yağların sn-1 ve sn-3 konumlarında orta zincirli doymuş yağ asitleri (OZYA) (M) ile sn-2 pozisyonunda uzun zincirli doymuş veya doymamış yağ asitlerinin (UZYA) (L) enzimatik sentez ile konumlandırılmasıyla elde edilen MLM tipteki yağlar düşük kalori değerine sahip olması, insan vücudunun ihtiyacı olan temel yağ asitlerini içermesi ve bu nedenle obezite, yağ emilim bozukluğu ve/veya diğer metabolik bozuklukları kontrol etmek amacıyla kullanılmaktadır. 
Akdeniz diyetinin önemli bir bileşeni olan zeytinyağının (ZY) diyabet, hipertansiyon, kalp damar hastalıkları ve kanser gibi hastalıklar için yararlı etkilere sahip olduğu çalışmalarla kanıtlanmıştır. Zeytinyağındaki yağ asitlerinin yaklaşık olarak %80'ini oleik asit oluşturmaktadır. Uzun zincirli bir yağ asidi olan oleik asit, oksidasyona daha az yatkındır ve bu sebeple zeytinyağının antioksidan etkisine ve stabilitesine katkı sağlamaktadır. Laurik asit (LA) ise antibakteriyel ve antiviral özellik gösteren orta zincirli bir yağ asididir.
Bu çalışmada enzimatik asidoliz ile laurik asidin zeytinyağına katılımıyla MLM tipte yapılandırılmış yağ üretilip D2 ve D3 vitaminlerinin mikroenkapsülasyonu amaçlanmıştır. YY üretiminde laurik asit ve zeytinyağı substrat olarak kullanılmıştır.  Enzimatik sentez reaksiyonları, Thermomyces lanuginosus kaynaklı sn-1.3 spesifik Lipozyme® TL IM enzimi kullanılarak,  5 mol/mol (LA:ZY) mol oranında 60°C'de 4 saat boyunca gerçekleştirilmiştir. Elde edilen yapılandırılmış yağ ile D2 ve D3 vitaminleri emülsiyonları oluşturulmuş, emülsiyonlar dondurarak kurutma yöntemiyle kurutularak mikrokapsül haline getirilmişlerdir.
Hazırlanan emülsiyonların ve toza karakterizasyon analizleri yapıldığında, D3 vitamini içeren numunelerin kremalaşma indeksi %26.53 ± 1.33; YY içeren numunelerin kremalaşma indeksi %24.33 ± 1.15 olarak hesaplanmış ve aralarındaki fark anlamlı bulunmamıştır. En stabil emülsiyonların D2 vitamini ile hazırlanan emülsiyonlar olduğu görülmüştür. Emülsiyonların liyofilizasyonu sonucu elde edilen mikrokapsüllerin renk ölçümleri sonucunda aydınlık özelliği ölçümü olan L değeri YY ile elde edilen kapsüllerde en yüksek elde edilmiştir. Renk ölçümü sonucunda a değeri D3 vitamini içeren kapsüllerde daha düşük bulunurken, b değeri daha yüksek bulunmuştur. Toplam renk farkını temsil eden ΔE değeri, D2 ve D3 vitaminleri için sırasıyla 6,43±0,31 ve 5,50±0,40 olarak hesaplanmıştır. Elde edilen D2 ve D3 vitamini mikrokapsüllerinin renk farkı değerleri 3'ten büyük bulunmuştur. Bu örnekler ile kontrol örneği arasındaki fark insan gözüyle ayırt edilebilir olarak tespit edilmiştir.
Enkapsülasyon verimleri %32.42 ± 2.39 ile %43.39 ± 0.65 aralığında bulunmuştur. Toplam verim ise %64.91 ± 2.95 ve %88.60 ± 4.98 aralığında hesaplanmış, nem değeri en yüksek olan (10.40±1.38) D2 vitamini içeren mikrokapsüllerin en düşük toplam verime sahip olduğu görülmüştür. Düşük kapsülleme verimliliğinin nedenleri, kullanılan duvar malzemesinin türü, emülsiyonlarda kullanılan düşük katı madde miktarı veya yüksek yağ miktarı olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca çekirdek materyalini korumak amacı ile kurutma yöntemi, dondurarak kurutma yerine püskürterek kurutma ile değiştirilebilir.
Simüle edilmiş gastrointestinal sistem (GIT) modeli kullanılarak, kapsüllenmiş D2 ve D3 vitaminleri biyoerişilebilirliği incelenmiş, yağ sindirimi sırasında serbest yağ asidi salınım hızı kontrol edilmiştir. Buna göre 180 dakikanın sonunda kontrol numunelerinde ve D3 vitamini içeren numunelerde yağ salım değerleri sırasıyla %60.14 ± 2.83 ve %59.64 ± 1.54 olarak hesaplanmış, aralarındaki fark istatistik olarak anlamsız bulunmuştur (p>0.05). Bağırsak aşamasında, en fazla yağ salınımı %79.30 ± 1.95 olarak D2 vitamini içeren mikrokapsüllerde görülmüş olup, bu durum emülsiyonların daha küçük parçacıklı ve daha stabil olmalarıyla ilişkilendirilmiştir.
D2 ve D3 vitaminlerin biyoerişilebilirliği ayrıca analiz edilmiş, değerler D2 vitamini için 0.23 ± 0.04 mg/ml olarak bulunurken; D3 vitamini için ise 0.44 ± 0.16 mg/ml olarak bulunmuştur. Değerler arasındaki fark anlamlı bulunmamıştır (p>0.05).
Çalışma sonucunda zeytinyağı ve laurik asitten yağ emiliminde yetersizlik olan hastaların diyetlerinde kullanabileceği fonksiyonel bir yağ elde edilmiştir. Elde edilen yağ duvar malzemesi olarak kullanılmış, D2 ve D3 vitaminlerinin enkapsülasyonu gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
Nowadays, structured lipids (SL) have many uses in medical and functional food applications. Structured lipid applications include their use in baby foods, enteral and parenteral nutrition, human milk fat substitutes, reduced-calorie oils, trans-fat-free plastic oils and cocoa butter substitutes. As the need for healthy foods continues to increase, structured lipids can be designed to prevent diseases such as obesity, cancer, cardiovascular diseases, and others. Structured lipids are obtained by chemically or enzymatically changing the composition or location of glycerol-bound fatty acids. Medium-chain fatty acids (MCFAs) are included in the diets of people with insufficient lipid absorption like cystic fibrosis, crohn disease and colitis to meet their nutritional needs. However, since these fatty acids alone cannot meet the body's essential fatty acid needs, recently MLM (Medium-Long-Medium) type structured lipids involving both MCFAs and long chain fatty acids (LCFAs) have been produced and added in the diets of these patients. 
Compared to other structured lipid types, MLM-type lipids with a fatty acid sequence of Medium-Long-Medium are thought to be the desired structure of structured lipids because they can serve as an effective transporter of long-chain fatty acids and are well absorbed by the gut wall.
Structured lipids can be produced through enzymatic or chemical synthesis. Lipases and phospholipases are preferred as biocatalysts in enzymatic synthesis and enzymatic synthesis has the advantage of allowing better control of the positional distribution of fatty acids in the final product due to the selectivity of lipases. Chemical interestification lacks the specificity of the reaction and does not provide control over the positional distribution of fatty acids in the final product. Chemical synthesis is carried out at high temperatures, but the use of high temperatures such as 80 or 90°C can result in the formation of by-products that are difficult to eliminate. In recent years, structured lipids have been produced through genetic engineering. However, this method is relatively more difficult than others and requires expertise in various fields such as plant physiology, enzymology, molecular biology and plant breeding.
MLM type lipids, obtained by positioning structured lipids with medium-chain saturated fatty acids (MCFAs) (M) in sn-1 and sn-3 positions and long-chain saturated or unsaturated fatty acids (LCFAs) (L) in sn-2 position, have low caloric feature and are therefore used to control overweight and obesity. These functional lipids are also used for fat malabsorption and other metabolic diseases. 
Studies have proven that olive oil, an important part of the Mediterranean diet, has beneficial effects on illness such as diabetes, hypertension, cardiovascular diseases and cancer. Approximately 80% of the fatty acids in olive oil consist of oleic acid. Oleic acid, a long-chain fatty acid, is less sensitive to oxidation and therefore contributes to the antioxidant effect and stability of olive oil. Lauric acid is a medium-chain fatty acid that support to inhibits bacterial and viral growth.
In this study, it was aimed to produce MLM type structured lipids by adding lauric acid to olive oil through enzymatic acidolysis. Lauric acid and olive oil were used as substrates. The free fatty acid of the studied extra virgin olive oil (% oleic acid), was found to be 0.77, which complied with the limit value of  "Turkish Food Codex Regulation on olive oil".
Acidolysis reactions were carried out with Lipozyme® TL IM (equivalent to 10% of the total substrate weight), sn-1.3 specific lipase enzyme obtained from Thermomyces lanuginosus. Enzymatic acidolysis with various molar ratios of lauric acid and olive oil were carried out in screw-capped glass tubes. Lauric acid and olive oil were subjected to enzymatic acidolysis with a substrate molar ratio of 5:1 (lauric acid:olive oil); the acidolysis reaction was carried out at 60°C for 4 hours. 
After the oil production, vitamin D2 and D3 emulsions were prepared using MLM type oils. Structured lipids and vitamins were used in the oil phase. Gum arabic and modified starch were added as solid ingredients in microcapsules.
The characterization of the prepared emulsions and capsules was examined. After 24 hours, no phase separation was observed in emulsions containing vitamin D2. It was found that the most stable emulsions were those prepared with vitamin D2; among the other emulsions, the creaming index of the samples containing vitamin D3 was recorded as 26.53 ± 1.33%, and the creaming index of the samples containing SL was recorded as 24.33 ± 1.15%, with no significant difference between them. The color measurements of the microcapsules obtained from the lyophilization of the emulsions were performed; the L value was found to be the highest in the capsules obtained with SL. As a result of the color measurement,  a value was lower in the capsules containing vitamin D3, while the b value, which takes positive values for yellowish colors, was found to be higher. The ΔE value, which represents the total color difference, was calculated as 6.43±0.31 and 5.50±0.40 for vitamins D2 and D3, respectively. The color difference values of the obtained vitamin D2 and D3 microcapsules were higher than 3. The difference between these and the control sample could be distinguished by the human eye.
Encapsulation efficiencies were found to be in the range of %32.42 ± 2.39 to %43.39 ± 0.65, while the total yield was found to be in the range of 64.91 ± 2.95% to 88.60 ± 4.98%. The microcapsules containing vitamin D2, which had the highest moisture content (10.40 ± 1.38), had the lowest total yield (64.91 ± 2.95%). The reasons for the low encapsulation efficiency have been evaluated as the type of wall material used, the low solid content in the emulsions, or the high amount of oil used. Additionally, it has been suggested that the drying method could be changed from freeze-drying to spray-drying in order to protect the core materials.
Using a simulated gastrointestinal system (GIT) model, the amount of released free fatty acid in samples was controlled and the bioavailability of encapsulated vitamins D2 and D3 was examined. Accordingly, at the end of 180 minutes, the amount of released free fatty acid values in the control samples and samples containing vitamin D3 were calculated as 60.14 ± 2.83% and 59.64 ± 1.54%, respectively, and there was not a significant difference for their fat release values (p > 0.05).
In the intestinal phase, the highest fat release, at 79.30 ± 1.95%, was observed in microcapsules containing vitamin D2. This result was associated with the vitamin D2 emulsions being smaller in particle size and more stable.
The bioavailability of vitamins D2 and D3 was also analyzed, and the values were found to be 0.23 ± 0.04 mg/ml for vitamin D2 and 0.44 ± 0.16 mg/ml for vitamin D3. The difference between these values was not found to be significant (p>0.05).
As a result of the study, a functional lipid was obtained from olive oil and lauric acid that can be used in the diets of patients with insufficient fat absorption. The oil obtained was used as wall material and vitamin D2 and D3 encapsulation was carried out. The characterization of the prepared emulsion and powder was investigated. It has been observed that structured lipids obtained from olive oil and lauric acid can be used in the encapsulation of vitamin D2 and vitamin D3.