Metronomik kemoterapinin endotel hücre fonksiyonları üzerindeki etkisi
Effects of metronomic chemotherapy on endothelial cell function
Yazar: FATMA GİZEM SONUGÜR
Danışman: PROF. DR. HAKAN AKBULUT
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Anjiyogenez = Angiogenesis ; Endotelyal hücreler = Endothelial cells ; Endotelyum = Endothelium ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Hücreler = Cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İlaç tedavisi = Drug therapy

Özet:
Konvansiyonel kemoterapi ilaçları genellikle sitotoksik etkileri nedeniyle tümör dokusunda küçülmeye neden olmaktadır. Ancak hastaların çoğunda bu ilaçların tümör hücrelerindeki sitotoksik etkilerine karşı direnç gelişmektedir. Klasik kemoterapi ilaçlarının metronomik kemoterapi adı verilen ve düşük dozlarda ve uzun süreli olarak uygulamasıyla tümör hücrelerinde apoptozla birlikte anti-anjiyojenik etkilerin de ortaya çıkması bu hastalarda tedavi direncini yenmede bir seçenek gibi görünmektedir. Kanserde anjiyogenez, hastalığın ilerlemesinde son derece önemli bir süreçtir. Anjiyogenezi baskılayarak tümörlerin gerilemesini sağlamaya yönelik tedavi yaklaşımları son yıllarda popülarite kazanmıştır. Yeni geliştirilen anti-anjiyojenik tedavi ajanlarının ciddi yan etkilerinin yanısıra çok pahalı olması alternatif arayışları da gündeme getirmiştir. Metronomik kemoterapinin anti-anjiyojenik tedavi modalitesi olarak kullanılabilmesi ve rasyonel tedavi seçenekleri oluşturabilmek için bu uygulamanın endotel hücreleri üzerindeki etkilerinin ayrıntılı olarak bilinmesi gerekmektedir. Metronomik tedavinin endotel hücre öncüllerinin azalttığına ilişkin çalışmalar bulunmakla birlikte bu ilaçların endotel hücre fonksiyonları ve anjiyogenezde rol oynayan genlerin ifadesi üzerindeki etkilerini araştıran ayrıntılı çalışmalar gerekmektedir. Yine metronomik olarak kullanılacak dozların seçiminde bu dozlardaki anti-anjiyojenik etki potansiyelinin de bilinmesi önem taşımaktadır. Bu tez öncelikle metronomik kemoterapinin endotel hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerinin yanısıra bu hücrelerin fonksiyonları ve anjiyojenik-antianjiyojenik gen ifadeleri üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. 
 
 Çalışmamızda, HUVEC endotel hücre hattı kullanıldı. Kanser tedavisinde sıklıkla kullanılan 5-florourasil, irinotekan ve okzaliplatinin HUVEC hücrelerinde sitotoksik etkileri MTT testi ile tayin edilerek IC50 dozları bulundu. Daha sonra bu ilaçların IC50, -1logIC50,  -2logIC50 ve -3logIC50 dozlarının endotel hücrelerinin migrasyon ve tüp oluşturma fonksiyonlarına etkisinin yanısıra bu hücrelerde VEGF-A, VEGFR2, PDGF-BB, angiopoietin-2, endotelin-1, trombospondin-1, iNOS, eNOS gen ifadelerine etkileri mRNA düzeyinde gerçek zamanlı PZR yöntemi ile ve hücreler tarafından besi ortamına salgılanan VEGF-A, PDGF-BB, ANG-2, END-1 ve TBS-1 sitokin düzeylerine etkileri sandviç ELIZA, nitrat/nitrit düzeylerine olan etkileri ise ticari kit ile tayin edildi.   
 
 HUVEC hücrelerine uygulanan 5-florourasil, irinotekan ve okzaliplatinin bu hücrelerin migrasyon yeteneğini hemen bütün dozlarda anlamlı olarak azalttığını bulduk. Ancak mikro damar oluşumu açısından ilaçların kullandığımız dozlarında bir farklılık izlenmedi. 5-Florourasil, irinotekan ve okzaliplatin IC50, -1logIC50, -2logIC50, -3logIC50 dozlarında bazı farklılıklar olmakla birlikte genel olarak anjiyojenik genlerin (angiopoietin 2, nitrik oksit sentetaz-2 ve 3, PDGF-B ve VEGF-A) mRNA düzeyinde ifadesini baskılarken anti-anjiyojenik Trombospondin-1 sitokin düzeyini arttırdığını bulduk. Yine NO düzeylerini azaltma yönünden 5-florourasilin -1logIC50, irinotekanın -2logIC50 ve okzaliplatinin -3logIC50 dozlarının en etkili olduğu bulundu. 

 Tez çalışmasından elde ettiğimiz sonuçlar düşük dozlarda uygulanan 5-florourasil, irinotekan ve okzaliplatinin endotel hücrelerinde anjiyojenik faktörleri azaltırken, anti-anjyojenik faktör yapımını da uyarabildiğini göstermektedir. Ayrıca bu sonuçlar söz konusu ilaçların bu dozlarda daha ileri hayvan modelleri ve klinik çalışmalarda anti-anjiyojenik tedavi seçeneği olarak denenebileceğini göstermektedir.

Abstract:
Conventional chemotherapeutic drugs usually decrease tumor volume by killing tumor cells. However, the majority of patients develop resistance against cytotoxic effects of those drugs. The lowered doses and prolonged administration of lowered doses of chemotherapeutic drugs, called metronomic chemotherapy, seems to overcome the treatment resistance in solid tumors by increasing tumor cell apoptosis and anti-angiogenic activity. Angiogenesis is one of the basic processes in the progression of tumors.  Recently, anti-angiogenic agents have gained popularity in the treatment of advanced staged cancers. However, new alternative modalities are being investigated because of the serious side effects and the cost of the newly developed anti-angiogenic drugs. In order to use metronomic chemotherapy as an alternative anti-angiogenic treatment modality, the detailed effects of those drugs on endothelial cell functions need to be elucidated. Although there are few reports show that metronomic chemotherapy could decrease endothelial precursor cell numbers, no detailed studies regarding the effects of different doses of those drugs on the expression of angiogenic and anti-angiogenic genes, cytokine secretion and cellular functions of endothelial cells are available in the literature. In the current study we especially aimed to investigate the effects of various metronomic doses of 5-florouracil, irinotecan and oxaliplatin on the cellular functions,  angiogenic and anti-angiogenic gene expression and cytokine secretion levels in endothelial cells. 

 We used endothelial cell line in the experiments. First, we determined the cytotoxic effects of 5-florouracil, irinotecan and oxaliplatin on HUVEC cells by using MTT test and calculated IC50 doses. Then, we tested the IC50, -1logIC50, -2logIC50 and -3logIC50 doses of those drugs on cell migration and micro vessel formation functions of HUVEC cells. We've also tested the effects of the drugs on the expression levels of VEGF-A, VEGFR2, PDGF-BB, angiopoietin-2, endotelin-1, trombospondin-1, iNOS, eNOS genes by qPCR and VEGF-A, PDGF-BB, ANG-2, END-1 and TBS-1 cytokine levels by sandwich ELISA and nitrate/nitrite levels by a commercially available NO testing kit.

 5-Florouracil, irinotecan and oxaliplatin significantly decreased the migration capacity of HUVEC cells at all testing doses. However, no significant efficacy of the drugs are observed on micro vessel formation function of the HUVEC cells. The chemotherapeutic drugs tested in the current study yielded a decrease in the expression levels of angiopoietin 2, nitric oxide synthetase -2 and 3, PDGF-B and VEGF-A genes and an increase in the cytokine secretion levels of thrombospondin-1 at the doses of -1logIC50, -2logIC50 and -3logIC50. The 5-florouracil at the dose of -1logIC50, irinotecan of -2logIC50 and oxaliplatin of            -3logIC50 efficiently decreased the nitric oxide levels of HUVEC cells.

 Our results suggest that the lowered doses of 5-florouracil, irinotecan and oxaliplatin decrease angiogenic factor and increase anti-angiogenic factor production in endothelial cells and deserve to be used as an anti-angiogenic treatment modality in animal models and clinical studies.