Beauveria bassiana izolatlarından kitinaz enzimi eldesi ve bazı zararlı böceklere etkisinin araştırılması
Obtaining chitinase enzyme from Beauveria bassiana isolates and the investigation of its effects on some pests
Yazar: ÖZNUR İREM YAYALAR
Danışman: PROF. DR. NEVİN KESKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Beauveria bassiana = Beauveria bassiana ; Galleria mellonella = Galleria mellonella ; Kitinaz = Chitinase

Özet:
Günümüzde biyolojik mücadele ajanlarının tarımsal zararlılarla mücadelede kullanımı ciddi bir önem kazanmıştır. Biyolojik mücadele ajanı olarak mikroorganizma preparatları, fungus sporları ve predatör böcekler kullanılmaktadır. Entomopatojen canlıların tarım zararlıları için kullanılması maliyetlidir ve stabil tutulmaları zordur. Günümüzde kitinolitik enzimler, entomopatojen mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Kitinaz enzimi, canlı organizmanın metaboliti olduğundan, teknik açıdan saklama ve kullanma yönünden elverişlidir. Entomopatojen fungus olan Beauveria bassiana daha önce biyolojik mücadele ajanı olarak kullanılmış ve biyolojik ajan olarak başarısı kanıtlanmış bir organizmadır.
Bu çalışmada, Türkiye'den çeşitli lokalitelerden izole edilmiş çeşitli Beauveria bassiana suşlarındaki kitinolitik enzimlerinin kısmi ve ileri saflaştırma işlemi yapılmıştır. Deneylere 50 farklı izolat ile başlanmış, katı besiyerlerinde karides kabuklarıyla kitinolitik enzimlerin güçlü bulunduğu 10 izolat ile çalışmalara devam edilmiştir. Enzim saflaştırılması için, çeşitli sıvı besi ortamları denenmiş ve en yüksek aktiviteyi ortaya çıkaran Kobalt Besiyeri tarafımızca oluşturulmuştur. Kobalt besiyerinde en yüksek aktiviteyi Lüleburgaz-1(Lül-1) suşu göstermiş ve çalışmalara Lüleburgaz-1(Lül-1) suşu ile devam edilmiştir. Kaba enzim ekstraktı için en iyi üretim koşulları 28°C'de, 72 saat, pH 3,5 olarak belirlenmiştir. En uygun inokülüm miktarı 1000 µl ve maksimum enzim aktivitesi için en uygun bekletme sıcaklığı 50ᵒC olarak belirlenmiştir. Saflaştırılan enzimin geniş bir sıcaklık ve pH aralığında dayanıklı olduğu çalışmalarla görülmüştür. Enzimin ileri saflaştırılması için amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve kolon kromatografisi yöntemleri kullanılmıştır. Saflaştırma işlemleri sonrasında enzim aktivitesinde düşüş gözlenmiştir. Kısmi ve ileri saflaştırılan enzim ekstraktlarının moleküler ağırlıkları SDS-PAGE yöntemiyle belirlenmiş ve ~44 kDA bulunmuştur. Kısmi ve ileri saflaştırılan enzim ekstraktları, depo zararlısı model organizmalar olan Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) ve Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebriodeae) larvaları üzerinde daldırma ve püskürtme yöntemleri kullanılarak denenmiştir. Daldırma yöntemi, püskürtme yöntemine göre daha etkili bulunmuştur.
İstatistiksel analizler sonucunda, enzimin uygulandığı her yöntem istatistiksel olarak kontrol grubundan farklı bulunmuştur. Çalışma sonucunda, daldırma yöntemiyle uygulanan enzim ekstraktlarının, ortalama ölüm sürelerine bakılarak daha etkili olduğu sonucuna varılmıştır. Çalışmanın daha ileri saflaştırma aşamalarına öncü olması ve kitinolitik enzimlerin kullanımının biyolojik mücadeleye kazandırılması beklenmektedir.

Abstract:
Today, the use of biological control agents in combating agricultural pests has gained serious importance. Microorganism preparations, fungus spores and predator insects are used as biological control agents. The use of entomopathogenic organisms for agricultural pests is costly and difficult to maintain. Today, chitinolytic enzymes are obtained from entomopathogenic microorganisms. Since the enzyme kitinase is the metabolite of living organisms, it is technically useful for storage and use. Beauveria bassiana, the entomopathogenic fungus, has previously been used as a biological control agent and is a proven organism as a biological agent.
In this study, partial and advanced purification of chitinolytic enzymes in the various Beauveria bassina strains which has been isolated in the Turkey soil was performed. The experiments were started with 50 different isolates and studies were continued with 10 isolates which were found to be strong in chitinolytic enzymes with shrimp shells on solid medium. Various liquid media have been tested for enzyme purification and Cobalt Medium has been produced by the highest activity. Lüleburgaz-1 (Lül-1) strain showed the highest activity in cobalt medium and the studies were continued with Lüleburgaz-1 (Lül-1) strain. The best production conditions for the partially purified enzyme were 28°C, 72 hours, pH 3.5. The optimum inoculum amount of 1000 μl and the optimum waiting temperature for maximum enzyme activity was determined as 50°C. The purified enzyme was found to be resistant to a wide range of temperature and pH. Ammonium sulfate precipitation, dialysis and column chromatography methods were used for further purification of the enzyme. Decrease in enzyme activity was observed after purification. The molecular weights of partial and advanced purified enzyme extracts were determined by SDS-PAGE method and found to be ~ 44 kDA. Partial and advanced purified enzyme extracts were tested by using dipping and spraying methods on the Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) and Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebriodeae) larvaes, which are warehouse pest model organisms. The dipping method was found to be more effective than the spraying method.
As a result of statistical analysis, each method in which the enzyme was applied was statistically different from the control group. As a result of the study, it was concluded that the enzyme extracts applied by dipping method were more effective by looking at the average death time. It is expected that the study will lead to further purification stages and the use of chitinolitic enzymes will be introduced into biological control.