Laboratuvar hattı Lucilia sericata'nın lucimycin, chymotrypsin, lucifensin genlerinin moleküler karakterizasyonu ve rekombinant füzyon proteinin ekspresyon denemeleri
Molecular characterization of lucimycin, chymotrypsin, lucifensin genes of Lucilia sericata lab line and expression trials of recombinant fusion protein
Yazar: EMRAH ERDOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Füzyon = Fusion ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Kimotripsin = Chymotrypsin ; Lucilia sericata = Lucilia sericata ; Moleküler yapı = Molecular structure

Özet:
Lucilia sericata, Calliphoridae ailesinin bir üyesidir. Parazitin tıbbi önemi, larvalarının Maggot Debridman Tedavisi'nde kullanılmasıdır. Maggot Debridman Tedavisi'nde etki mekanizması üç şekilde olmaktadır. Bunlardan biri larvaların salgıladığı sekresyonların çeşitli antimikrobiyal ajanlar içermesidir. Larvalar salgıladıkları bu moleküller ile kendilerini polimikrobiyal floradan korumaktadır. Aynı zamanda salgılanan bu moleküller ile yara tedavisine ilginç bir şekilde katkı sunmaktadırlar. Bu çalışma ile,  L. sericata lucifensin geninin MT495795 numaralı izolatının ve chymotrypsin geninin MT495794 numaralı izolatının kaydı Genbank'a yapıldı. Türkiye Cumhuriyeti'nden ilk kez bildirilen bu veriler ile literatüre katkı sağlanacaktır.
Bu çalışmada; Maggot Debridman Tedavisi'nde kullanılan L. sericata larvalarının salgıladığı önemli defensin moleküllerinden olan; lucimycin, chymotrypsin ve lucifensin genlerinin klonlanmaları, moleküler karakterizasyonları, protein ekspresyonları, antijenik yapılarının analizi amaçlanmıştır. Öncelikle moleküler çalışmalarda kullanılacak L. sericata kolonileri yetiştirilmiştir. Daha sonra larvalardan RNA izolasyonu ve cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Lucimycin, chymotrypsin ve lucifensin genleri ayrı ayrı pJet1.2 plazmidine klonlama reaksiyonları ile yerleştirilmiştir. Rekombinant plazmid varlıkları tüm basamaklarda PCR tarama, DNA dizi analizi yöntemleri ile doğrulanmıştır. Bu üç gen ekspresyon vektörüne subklonlanarak elde edilen plazmitler kompetan E. coli BL21 hücrelerine transforme edilerek protein ekspresyon çalışmaları yapılmıştır. Çalışmalar sonucunda lucimycin, chymotrypsin ve lucifensin proteinlerinin ekspresyonu gerçekleştirilememiştir. Ayrıca bu genlerin restriksiyon enzimleri ile yapışkan uç protokolüne göre birleştirilmeleri ve bu şekilde füzyon proteinin ekspresyon çalışmaları da yapılmış ve başarılı olunamamıştır. Yara tedavisinde önemli larval bileşenlerden olan bu üç ayrı genin nükleotid ve aminoasit tabanlı moleküler karakterizasyonları yapılmıştır. Proteinlerin antijenik bölgeleri ve üç boyutlu yapıları elde edilmiştir.
Son yıllarda karşılaşılan antibiyotiklere direnç sonrasında yara bakımı ve tedavilerinde alternatif olabilecek veya beraber uygulanabileceği bileşiklerin keşfedilmesine ve moleküler karakterizasyonlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu amaçla farklı alanlardan bilim insanlarının, bu moleküllerin keşfi ve uygulanabilirliği noktasında multidisipliner çalışmalarına kaynak oluşturacak veriler elde edilmiştir.

Anahtar Kelimeler:Lucilia sericata, Luciymcin, Chymotrypsin, Lucifensin, Moleküler karakterizasyon, Füzyon protein

Abstract:
Lucilia sericata is a member of the Calliphoridae family. The medical importance of the parasite is that its larvae are used in Maggot Debridman Treatment. The mechanism of action in Maggot Debridement Treatment is in three ways. One of them is that the secretions secreted by the larvae contain various antimicrobial agents. The larvae protect themselves from polymicrobial flora with these molecules they secrete. In this study, the registration of the isolate numbered MT495795 of the L. sericata lucifensin gene and the isolate numbered MT495794 of the chymotrypsin gene was made to Genbank. The Republic of Turkey for the first time reported data will contribute to the literature with this.
In this study, one of the important defensin molecules secreted by L. sericata larvae used in Maggot Debridman Treatment, cloning of lucimycin, chymotrypsin and lucifensin genes, molecular characterizations, protein expressions, analysis of their antigenic structures are aimed. Firstly, L. sericata colonies were grown to be used in molecular studies. Then, RNA isolation and cDNA synthesis were performed from the larvae. Lucimycin, chymotrypsin and lucifensin genes were individually inserted into the pJet1.2 plasmid by cloning reactions. Recombinant plasmid assets were verified by PCR scanning and DNA sequence analysis methods in all steps. Plasmids obtained by subcloning these three gene expression vectors were transformed into competent E. coli BL21 cells and protein expression studies were performed. As a result of the studies, expression of lucimycin, chymotrypsin and lucifensin proteins could not be achieved. In addition, these genes were combined with restriction enzymes according to the adhesive tip protocol, and expression studies of the fusion protein were also performed and were not successful. Nucleotide and amino acid based molecular characterizations of these three separate genes, which are important larval components in wound treatment, have been performed. Antigenic regions and three-dimensional structures of proteins were obtained.
After resistance to antibiotics encountered in recent years, there is a need for the discovery and molecular characterization of the compounds that may be alternative or can be applied together in wound care and treatments. For this purpose, data that will be used as a source for multidisciplinary studies of scientists from different fields on the discovery and applicability of these molecules have been obtained.

Key Words:Lucilia sericata, Luciymcin, Chymotrypsin, Lucifensin, Molecular characterization, Fusion protein