Koyun atıklarından izole edilen brucella melitensis suşlarının random amplifiye polimorfik DNA-PCR (RAPD) yöntemi ile genetik analizi
Genetic analysis of brucella melitensis strains isolated from aborted sheep by random amplified polymorphic DNA-PCR (RAPD) method
Yazar: ZEKİ ARAS
Danışman: PROF. DR. MEHMET ATEŞ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Brusella aşısı = Brucella vaccine ; Bruselloz = Brucellosis ; RAPD-PCR = RAPD-PCR

Özet:
Bu çalısmada, Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi ve Konya Veteriner Kontrol veArastırma Enstitüsü'ne, 2007-2008 kuzulama döneminde, Konya il ve ilçe merkezleri ile köylerindebulunan 79 ayrı koyun sürüsünden yavru atma sikayeti ile getirilen 86 adet atık koyun fetusundanizole edilen 24 adet B. melitensis susu ile Konya Veteriner Kontrol ve Arastırma Enstitüsü'nce, 2006-2007 kuzulama döneminde Konya bölgesine ait atık koyun fetuslarından izole edilmis 12 adet B.melitensis susunun konvansiyonel testleri ve biyotiplendirmesi yapıldı. Sahadan izole edilen B.melitensis suslarının RAPD yöntemi ile DNA parmak izleri belirlenerek genotiplendirmeleri vebirbirlerine olan genetik yakınlıkları tespit edilerek yaygın olarak bulunan genotip belirlendi. B.melitensis Rev-1 ası susu da RAPD yöntemi ile değerlendirilip saha suslarının bant modelleri ilekarsılastırıldı. Ayrıca, atık materyallerinden izole edilen B. melitensis saha suslarının, B. melitensisRev-1 ası susundan köken alıp almadığı PZR-RFLP yöntemi ile arastırıldı. Atık görülen koyunsürülerinden kan serumları toplanarak RBPT, mSAT ve iELISA testleri ile değerlendirilerekenfeksiyonun yaygınlığı tespit edildi.Biyotiplendirme sonucunda, 36 tane B. melitensis izolatının 3 tanesinin biyotip 1, 32tanesinin biyotip 3 ve bir tanesinin B. melitensis Rev-1 ası susu olduğu belirlendi. Saha izolatı B.melitensis Rev-1 ası susu moleküler olarakda PZR-RFLP yöntemiyle teyit edildi. 9, 24, 25, 27, 28, 30,31, 32 ve 34 numaralı izolatların, penisilin veya tiyonin ve bazik fuksine duyarlılık göstermelerinedeniyle atipik oldukları saptandı. Otuz altı adet izolatın B. melitensis olduğu, tür spesifik AMOSPZRmetodu ile de doğrulandı.RAPD-PZR metodu kullanılarak, saha susları ile B. melitensis Rev-1 ası susunun DNAparmakizleri çıkarıldı ve UPGMA ile NJ dendogramları olusturuldu. Her iki dendogramda da susların14 alt gruba ayrıldığı ve aynı dağılımları sergiledikleri görüldü. Konya Bölgesi'nde atığa sebep olan36 adet B. melitensis izolatının aynı kaynaktan köken almadığı saptandı. Aynı alt grupta yer alan 10adet izolatın en yaygın görülen genotip olduğu gözlendi. Farklı alt gruplarda yer alan atipik suslarınfarklı klonlardan köken aldığı belirlendi. Referans suslar ile 36 adet B. melitensis saha izolatları109arasında ki genetik benzerlik değerleri, % 50.0'den % 99.9'a kadar genis bir aralıkta dağılım gösterdi.B. melitensis Rev-1 ası susunun, RAPD-PZR ile identifiye edilemeyeceği belirlendi.B. melitensis izole edilen 24 koyun sürüsünden elde edilen toplam 588 adet koyun kanserumu örneği, RBPT, mSAT ve iELISA testleri ile değerlendirildi ve sırasıyla % 41.1, % 37.2 ve %43.2 pozitiflik belirlendi.Sonuç olarak, Konya Bölgesi'nde atıklara sebep olan B. melitensis suslarının RAPD-PZRyöntemi ile farklılık gösterdiği, en çok izole edilen ve tiplendirilen biyotipin biotip 3 olduğu ve asısusu B. melitensis Rev-1'in ilk kez bir atık fetüsten izole edildiği ortaya konuldu. RAPD-PZRyöntemin uygulama ve yorumlamasının basit olduğu, Brusellozis'in epidemiyolojisindekullanılmasının fayda sağlayacağı kanaatine varıldı.Anahtar Sözcükler: Brucellozis; B. melitensis; B. melitensis Rev-1; Genotiplendirme;RAPD-PZR; PZR-RFLP.

Abstract:
In this study, by a total of 86 aborted sheep fetuses brought from different sheep herds (n=79)in lambing season 2007-2008 from Konya and its rural areas to Selcuk University Veterinary Facultyand Konya Veterinary Control and Research Institute numbers of 12 and of 24 Brucella melitensis(B.melitensis) were isolated and identified by the Faculty and the Research Institute, respectively. Thestrains isolated isolated from aborted sheep fetuses by Konya Veterinary Contol and ResearchInstitute in lambing season 2006-2007 were identified by conventional tests and biotyping procedures.DNA fingerprints, genetic relationships and common genotypes of field isolated of B. melitensisstrains were determined by RAPD method. B. melitensis Rev-1 vaccine strain was checked by RAPDmethod and fingerprint obtained was compared with those of field isolates. In addition, B. melitensisstrains isolated from field were evaluated by RFLP-PZR to determine origins of them for belonging tothe vaccine strain Rev-1. Serum samples were collected from infected sheep herds (n=24) andevaluated by RBPT, mSAT and iELISA tests in order to determine nature of spread of infection.Of the 36 B. melitensis isolates, 3, 32 and 1 were identified as biotype 1, biotype 3 and B.melitensis Rev-1 vaccine strain, respectively. Field isolated B. melitensis Rev-1 vaccine strain wasconfirmed by RFLP-PZR. Isolates of 9, 24, 25, 27, 28, 30, 31, 32 and 34 were detected for beingatypical since they were susceptible of penicillin or thionin and basic fuschin. A total of 36 B.melitensis isolates were confirmed by species specific AMOS-PZR.DNA fingerprints of field isolates and B. melitensis Rev-1 vaccine strain were obtained byRAPD-PZR method and UPGMA and NJ dendograms were created. Strains were separated similarly14 subgroups in both dendograms. 36 B. melitensis isolates from Konya region were detected that theyhad not from the same source. A number of 10 isolates located in the same subgroup were observedthe most common genotypes. Atypical strains that located in different subgroups have different clonalorigin. Levels of genetic similarity between reference strains and field isolates were 50,0-99,9%. Thatbetween reference vaccine strain B. melitensis Rev-1 and field isolated B. melitensis Rev-1 was11188,9%. It was also detected that B. melitensis Rev-1 vaccine strain cannot be identified by RAPD-PZRalone, while isolates located the same main group with B. melitensis Rev-1 can be suspected for beingthe vaccine strain.A total of 588 serum samples collected from B. melitensis isolation positive herds (n 24) wereexamined by RBPT, mSAT and iELISA tests. Of the 588 serum samples, 41,1%, 37,2% and 43,2%were found to be positive by RBPT, mSAT and iELISA, respectively.Consequently, B. melitensis strains were isolated in Konya region were found to be differentby RAPD-PZR. B. melitensis biotype 3 was found the most common biotype. B. melitensis Rev-1vaccine strain were isolated from aborted fetus in Türkiye for the first time. RAPD-PZR method wasfound for being an ease to use and interpretation. This can be used for studies on epidemiology ofBrucellosis.Key Words: Brucellosis; B. melitensis; B. melitensis Rev-1; Genotyping; RAPD-PZR; PZRRFLP.