STZ ile uyarılmış diyabetik sıçanlarda hipokampüs ve öğrenme üzerine krokinin etkileri
Effects of crocin on hippocampus and learning in STZ-induced diabetic rats
Yazar: NESLİHAN AKARSU
Danışman: PROF. DR. KADRİYE AKGÜN DAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Diyabette kronik hiperglisemi nörolojik komplikasyonlara yol açmaktadır. Diyabetik hastalarda bilişsel bozuklukların olduğu ve antihiperglisemik ilaçların hafıza sorunları üzerine olumlu etkisi olduğu bildirilmiştir. Safran ve bileşenlerinden olan krokinin antioksidan, antiinflamatuvar, hafıza ve öğrenme geliştirici, Antidiyabetiketkilerinin olduğu bildirilmektedir. STZ ile uyarılan diyabette bilişsel bozukluklar, hipokampüse bağlı davranışsal görevler, uzamsal hafızada bozulmalar oluşmaktadır. Krokinin diyabetle ilişkili hafıza bozukluklarında oksidatif stresi azaltarak bilişsel işlevleri geliştirdiği bildirilmektedir. 
Çalışmamızda STZ ile oluşturulan diyabet modelinde krokin uygulamasının olası hafıza bozuklukları üzerine olan etkilerini ve hipokampüsün ilgili kısımlarını nasıl etkilediğini araştırmayı amaçladık.
Yetişkin 44 adet erkek Wistar albino sıçanlar; Kontrol (%0.9 FTS), Diyabet (tek doz 65 mg/kg STZ), Krokin (50 mg/kg), Tedavi  (tek doz 65 mg/kg STZ, 50 mg/kg krokin) olmak üzere dört gruba ayrıldı. Düzenli olarak hayvanların kan glikoz düzeyleri ve ağırlıkları ölçüldü. STZ enjeksiyonunun 4. gününden itibaren 21 gün boyunca madde uygulamaları yapıldı. Diyabette oluşan kısa ile uzun süreli hafıza değişikliklerini belirlemek için pasif sakınma testi yapılarak sonrasında deney sonlandırıldı. Biyokimyasal çalışmalarda 7; histolojik ve immünohistokimyasal çalışmalarda 4 hayvanın hipokampüsü kullanıldı. Hipokampüs ve kan örneklerinde süper oksit dismutaz (SOD), insülin düzeyi, öğrenme ve hafıza için beyin türevli nörotrofik faktör (BDNF), nöronal nüklearantijen (NeuN), inflamatuar süreçlerde önemli olan tümör nekrozis faktör-alfa (TNF-α), apoptotik yolakla ilgili olarak sitokrom-c düzeyi biyokimyasal yöntemle ölçüldü. Histolojik olarak hipokampüs dokusu Nissl boyama yöntemiyle incelendi ve immunohistokimyasal olarak NeuN anlatımı incelenerek H-Skor yöntemiyle gruplar arası dağılımları hipokampüsün alt bölümleri olan CA1, CA3 ve dentat girus (DG) için belirlendi.
Çalışmamızda diyabetik sıçanlara yirmi bir gün süresince krokin (50 mg/kg) uygulaması sonucunda 15. gün ve 25. günde ölçülen glikoz değerlerinin, diyabetik hayvanların glikoz değerlerine göre anlamlı olarak azalmış olması krokinin hipoglisemik etkilerini desteklemektedir. Deney sonunda, hayvanların ağırlıkları kontrol ve krokin gruplarında artarken; diyabet ve tedavi gruplarında diyabete bağlı olarak azalmıştır. 21 gün süren krokin uygulamasıyla diyabetik hayvanlarda kilo kaybının diyabet grubuna göre daha az olduğu belirlenmiştir. Pasif sakınma testi sonuçlarımızda 21 gün süreyle 50 mg/kg uygulanan krokin latans sürelerinde istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir artışa yol açmıştır ancak bu durum kısa ve uzun süreli hafıza üzerine anlamlı etkisinin olmadığını düşündürmektedir. 
Diyabet ve tedavi gruplarında plazma insülin düzeylerinin kontrol grubuna göre anlamlı derecede azaldığı belirlenmiştir. Bu bulgu STZ ile tip 1 diyabet modeli oluşturduğumuzu doğrulamaktadır. Bunun yanı sıra biyokimyasal bulgularımızda BDNF ve NeuN düzeyleri plazma ve hipokampüs dokusunda bir farklılık göstermemiştir. Öğrenmede etkili olan bu moleküllerin translasyonunun etkilenmesi için daha uzun süre gerekmektedir. Çalışmamızda diyabetin 25 gün sürmesinden dolayı hipokampüs insülin, BDNF ve NeuN düzeylerinin etkilenmediğini düşündürmektedir.
Hipokampüs doku homojenatı örneklerinde sadece krokin grubunda SOD düzeyinin kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttığı belirlenmiştir. Diyabetik sıçanlara 50 mg/kg krokin uygulamasının hipokampüs homojenatı ve plazma örneklerimizde krokin grubundaki SOD düzeylerini arttırdığı gösterilmiştir. Krokin grubunun plazma ve homojenat örneklerinde SOD düzeyinin artması, krokinin antioksidan özelliğiyle gerçekleşmiş olabileceğini göstermektedir.  Çalışmamızda hipokampüs doku homojenatı örneklerinde diyabet oluşturulduktan sonra 21 gün süreyle 50 mg/kg krokin uygulanan tedavi grubunun TNF-α düzeylerinin diyabet grubuna göre azaldığı belirlenmiştir. Krokin uygulaması tedavi grubunda TNF- α'yı azaltırken plazma TNF- α düzeyini arttırmıştır. Krokinin yapmış olduğu bu etki farklı fizyolojik koşullar altında farklı etki yapabildiğini düşündürmektedir. 
Histolojik incelemelerimizde diyabet grubuna ait CA1, CA3 ve DG bölgesindeki kesitlerde nöron kaybı ve nöronal değişiklikler gözlenmiştir. Dejenere nöronlar, koyu boyananve büzülen sitoplazmaları ile ayırt edilmiştir. Diyabet grubundaki CA1, CA3 ve DG bölgelerindeki dejenere nöron yüzdesinin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı derecede arttığı tespit edilmişir. Bu histolojik bulgularımız diyabetle birlikte gelişen yapısal bozukluğu desteklemektedir. Ayrıca diyabetik sıçanlara uygulanan krokinin sadece hipokampüsün DG bölgesindeki dejenere nöron yüzdesini diyabet grubuna göre anlamlı olarak azalttığı tespit edilmiştir. İmmunohistokimyasal olarak incelediğimiz hipokampüs dokusunda diyabetik sıçanların sadece CA1 bölgesinde azalan NeuN anlatımını krokin uygulamasının arttırdığını göstermiştir. Krokinin bu etkisini sadece CA1 bölümünde gösterdiği, ilginç olarak krokin grubunun hipokampüsününCA3 bölgesinde NeuN anlatımını azalttığı gösterilmiştir.
Sonuç olarak, diyabetik sıçanlara 50 mg/kg/ip olarak krokin uygulaması antidiyabetik etkisinin olduğu ve kilo kaybını azaltıcı etkilerinin olduğu teyit edilmiş oldu. Hafıza üzerine etkisinin olmaması diyabet süresine bağlı olarak gerçekleşmiş olabilir, çünkü hipokampüs homojenatlarında insülin ve sitokrom-c seviyeleri, BDNF, NeuN bakımından anlamlı bir farklılık belirlenmedi. İlginç olarak tek başına krokin uygulanması plazma ve hipokampüs SOD düzeyleri ile plazma TNF-α düzeyini arttırıcı etki göstermiştir. Sadece krokin uygulanan grupların hipokampüslerinin CA1, CA3 ve DG bölümlerinde dejenere hücre yüzdelerinin arttığı belirlenmiştir. Ayrııca krokin, CA1 bölgesinde NeuN anlatımlarını azaltıcı etki gösterirken CA3 bölgesinde NeuN anlatımlarını azaltıcı etki göstermiştir. Hipokampüs dokusunda krokinin daha belirgin olası etkilerinin görülebilmesi için daha uzun süreli diyabet modelinde farklı dozlarda krokin uygulamaları içeren çalışmalar yapılabilir.

Abstract:
Chronic hyperglycemia in diabetes leads to neurological complications. It has been reported that there are cognitive disorders in diabetic patients and that antihyperglycemic drugs have a positive effect on memory problems. It is reported that saffron and crocin among its components have antioxidant, anti-inflammatory, memory and learning enhancing and antidiabetic effects. In STZ-induced diabetes, cognitive disorders, behavioral tasks related to the hippocampus, and spatial memory impairment occur. It has been reported that crocin improves cognitive functions by reducing oxidative stress in diabetes-related memory disorders. In our study, we aimed to investigate the effects of crocin application on possible memory disorders in the diabetes model created with STZ and how it affects the relevant parts of the hippocampus.
Adult 44 maleWistar albino rats were separated to 4 groups as Control (0.9% FTS), Diabetes (single dose 65 mg / kg STZ), Crocin (50 mg / kg), Treatment (single dose 65 mg / kg STZ, 50 mg / kg crocin). Blood glucose levels and weights of the animals were measure dregularly. Substance applications were performed for 21 days from the 4th day of the STZ injection. Passive avoidance test was performed to determine the short and long-term memory changes in diabetes, and the experiment was terminated after wards. Hippocampus of 7 animals wereused in biochemical stıdies, hippocampus of 4 animals were used in histological and immunohistochemical studies. Superoxide dismutase (SOD) in hippocampus and blood samples, insulin level, brain derived neurotrophic factor (BDNF) for learning and memory, neuronal nuclear antigen (NeuN), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) important in inflammatory processes, cytochrome-c level in relation to apoptotic pathway was measured by biochemical method. Histologically, hippocampus tissue was examined by Nissl staining method, and immunohistochemically, NeuN expression was examined and inter group distribution was determined by H-Score method for CA1, CA3 and dentate gyrus which are sub-sections of hippocampus.
The fact that glucose values measured on the 15th and 25th days as a result of crocin (50 mg / kg) application for twenty-one days in diabetic rats were significantly decreased compared to the glucose values of diabetic animals in our study supports the hypoglycemic effects of crocin. At the end of the experiment, while the weight of the animals increased in the control and crocin groups; decreased in diabetes and treatment groups due to diabetes. It was determined that with crocin application which lasted 21 days, weight loss was less in diabetic animals compared to the diabetic group. In our passive avoidance test results, 50 mg / kg administered crocin for 21 days led to a statistically in significant increase in latency times, but this suggests that it has no significant effect on short and long-term memory.
It was determined that plasma insulin levels were significantly decreased in the diabetes and treatment groups compared to the control group. This finding confirms that we have created a type 1 diabetes model with STZ. In addition, BDNF and NeuN levels did not show any difference in plasma and hippocampus tissue in our biochemical findings. Longer time is required for the translation of these molecules that are effective in learning to be affected. Our  study suggests that the hippocampus insulin, BDNF and NeuN levels are not affected because diabetes lasts for 25 days.
In the hippocampus tissue homogenate samples, it was determined that the SOD level increased significantly only in the crocin group compared to the control group. It has been shown that administration of 50 mg / kg crocin to diabetic rats increased SOD levels in crocin group in our hippocampus homogenate and plasma samples. The increase in SOD level in plasma and homogenate samples of crocin group indicates that this may have been caused by antioxidant properties of crocin. In our study, it was determined that the TNF-α levels decreased in the hippocampus tissue homogenate samples of the treatment group, in which 50 mg / kg crocin was administered for 21 days after diabetes was induced, compared to diabetes group. Crocin administration decreased TNF-α in the treatment group, while increasing the plasma TNF-α level. This effect of crocin suggests that it may have different effects under different physiological conditions.
In our histological examinations, neuronal loss and neuronal changes were observed in sections of hippocampus CA1, CA3 and DG regions of the diabetes group. Degenerated neurons are distinguished by their dark stained cell and shrunken cytoplasm. It was determined that the percentage of degenerated neurons in the CA1, CA3 and DG regions of the diabetes group increased significantly when compared to the control group. These histological findings support the structural disorder that develops with diabetes. In addition, it was determined that crocin applied to diabetic rats significantly decreased the percentage of degenerated neuron only in the DG region of the hippocampus compared to the diabetes group. It has been shown that in the hippocampus tissue examined by immunohistochemistry, the application of crocin increased the decreased NeuN expressiononly in the CA1 region of diabetic individuals. It has been shown that crocin shows this effect only in the CA1 part, and interestingly, NeuN expression decreased in the hippocampus CA3 region in the crocin group.
As a result, it was confirmed that the administration of 50 mg / kg / ip crocin to diabetic rats had an antidiabetic effect and reduced weight loss effects. The lack of effect on memory may have occurred depending on the duration of diabetes, because no significant difference was found in hippocampus homogenates in terms of insulin and cytochrome-c levels, BDNF, and NeuN. Interestingly, crocin applicational one increased the plasma and hippocampus SOD levels and plasma TNF-α levels. It was determined that the percentage of degenerated cells increased in the CA1, CA3 and DG sections of the hippocampuses of only crocin-applied groups. In addition, crocin showed a decreasing effect of NeuN expressions in CA1 region, while decreasing effect of NeuN expressions in CA3 region. In order to see more pronounced possible effects of crocin on hippocampus tissue, studies involving different doses of crocin can be performed in a longer-term diabetes model.