Pazı kökü (Beta vulgaris L. var. cicla) peroksidaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve substrat spesifikliğinin belirlenmesi
Purification, characterization and determination of substrate specificity of the chard (Beta vulgaris L. var. cicla) peroxidase enzyme
Yazar: BETÜL BOLDAZ
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada, 4-Amino-3floro benzohidrazid ligandı sentezlenerek afinite jelinin hazırlanması ve pazı bitkisinden peroksidaz enziminin tek kademede saflaştırılması, saflaştırılacak peroksidaz enzimi için kinetik çalışmalar ve substrat spesifikliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 4-Amino-3floro benzoat molekülü ticari olarak temin edildi ve bu molekülden 4-Amino-3-floro benzohidrazid sentezi yapıldı. Sentezlen molekül Sepharose-4B-L tirozine kenetlendirildi ve pazı peroksidaz enzimi tek basamakta saflaştırıldı. Saflaştırılan POD enzimi üzerine KM, Vmax, Ki, optimum pH, optimum sıcaklık ve inhibisyon etkileri incelendi. 4-Amino-3-floro benzohidrazid molekülü ligand olarak kullanılarak sentezlenen afinite jeli ile pazı POD enzimi %8,83 verimle 50,3 kat saflaştırıldı. Saflaştırma sonucunda elde edilen enzim için sodyum dodesil sülfat–poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) yapıldı ve yaklaşık 37 kDa'da tek bant gözlendi. Saflaştırılan enzim üzerine kinetik çalışmalar guaiakol substratı varlığında yapılarak kullanılan ligandın dönüşümlü inhibisyon gösterdiği belirlendi ve IC50 değeri 577 µM ve Ki değeri 523,11±145,11 µM bulundu. Enzimin substrat spesikliği çalışmaları kapsamında 5 farklı substrat kullanılarak her bir substrat için sırasıyla, hidrojen peroksit için KM 0,05 mM, Vmax 5,91 EU/mL, ABTS için KM 0,074 mM, Vmax 37,04 EU/mL, pirokatekol için KM 1,295 mM, Vmax 58,82 EU/mL, o-Dianisidin için KM 1,724 mM, Vmax 55,55 EU/mL, guaiakol için KM 15,15 mM, Vmax 20,66 EU/mL değerleri hesaplandı. Guaiakol substratı ile yapılan çalışma sonucunda optimum pH ve optimum sıcaklık değerleri sırasıyla 5,5 ve 30 °C olarak bulundu. Yapılan çalışmada pazı peroksidaz enzimi, sentezlenen 4-Amino-3-floro benzohidrazid ligandı ile yüksek verim ve saflıkta elde edildi. Optimum pH 5,5 olarak hesaplanan ve substrat spesifite çalışmalarından en iyi substratının Lineweaver – Burk grafikleri kullanılarak guaiakol olduğu bulunmuştur.

Abstract:
In this study, it was aimed to prepare affinity gel with synthesed 4-Amino-3-fluoro benzohydrazide molecule for one-step purification of peroxidase enzyme from chard plant. Then, kinetic studies and determination of substrate specificity of the purified peroxidase were carried out.
The 4-Amino-3-fluoro benzoate molecule was commercially available and hydrazide was synthesized from this molecule. The synthesized molecule was bound to the Sepharose-4B column as a ligand and by purifying the chard peroxidase enzyme, Km, Vmax, Ki, optimum pH, optimum temperature and inhibition effects on the purifield POD enzyme were investigated.
POD enzyme with 4-Amino-3-fluoro benzohydrazide ligand was bound to Sepharose-4B-L-Tyrosine gel meterial and purified 50,3 times by affinity chromatography in 8,83 % yield. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) were made and a single band a 37 kDa were observed fort he enzymes obtained in purification. Kinetic studies on the purified enzyme were performed with the guaiacol substrate. It was determined that the used ligand showed alternating inhibition and the IC50 value was 0,577 mM and the Ki value was 0,5231±0,1451 mM. For substrate specificity of the enzyme, try 5 different substrates, primary for one substrate, KM 0,05 mM for hydrogen peroxide, Vmax 5,91 EU/mL, KM 0,074 mM for ABTS, Vmax 37,04 EU/mL, KM 1,295 mM for pyrocatecol, Vmax 58,82 EU/mL, KM 1,724 mM for o-Dianicidine, Vmax 55,55 EU/mL, KM 15,15 mM for guaiacol, Vmax 20,66 EU/mL were calculated. In the case of working with guaiacol substrate, optimum pH and optimum temperatures were found between 5,5 and 30 °C.
In the study carried out, chard peroxidase enzyme was obtained in high efficiency and purity with the synthesized 4-Amino-3-fluoro benzohydrazide ligand. Using Lineweaver- Burk plots, it was found that the best substrate from substrate specificity studies, which was calculated as the optimum pH of 5,5 was guaiacol.