Klinoptilolit içeren polimer nanopartiküllerin cryptosporidium parvum üzerine in vitro etkinliğinin araştırılması
Investigation of in vitro effectiveness of polymeric nanoparticles containing clinoptilolit on cryptosporidium parvum
Yazar: GAMZE KARAOĞLAN
Danışman: PROF. DR. BÜLENT ULUTAŞ
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İç Hastalıkları (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Cryptosporidium = Cryptosporidium ; Klinoptilolit = Clinoptilolite ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Polimerler = Polymers ; Protozoa = Protozoa ; Protozoa enfeksiyonları = Protozoa infections ; İn vitro = In vitro

Özet:
Cryptosporidium spp, insan ve birçok hayvan türünde ishale neden olan, enterik protozoon patojenlerdir. Cryptosporidium parvum enfeksiyonunun tedavisi için birçok ilaç kullanılmış; ancak tam bir parazitolojik iyileşme sağlanamamıştır. Günümüzde C. parvum için kesin bir korunma ve tedavi protokolü bulunmamaktadır. Bu kapsamda cryptosporidiosis için yeni tedavi protokolüne ihtiyaç duyulmaktadır. Klinoptilolit üzerine yapılan tıbbi çalışmalarda klinoptilolit'in antiviral, antitümöral ve antidiyarel olarak etkinliği araştırılmış ve bu alanlarda olumlu etkilerinin olduğu görülmüştür. Bu çalışmada, klinoptilolit içeren polimer nanopartikül C. parvum üzerine in vitro etkinliğinin ortaya konması amaçlandı. 
Bu araştırmada deneysel in vitro enfeksiyonu gerçekleştirmek için insan kolon adenocarcinoma (Caco-2) hücreleri kullanıldı. Doğal enfekte buzağı veya kuzu dışkılarından elde edilen Cryptosporidium ookistlerinin türünün ve tipinin belirlenmesi amacıyla DNA izolasyonu yapıldı. Cryptosporidium parvum'un tiplendirilmesi, nested PCR ve SspI, VspI ve MboII enzimleri kullanılarak RFLP analizi ile gerçekleştirildi. Deneysel in vitro enfeksiyon gerçekleştirmek için insan Caco-2 hücreleri  kullanıldı. Enfeksiyon denemelerinde 12 well hücre kültürü plaklarının içine 18 mm steril yuvarlak lameller yerleştirilerek üzerlerine Caco-2 hücreleri ekildi. Hücreler lamellerin yüzeyini %80 kapladıktan sonra enkiste 1x106 C. parvum ookisti ile enfekte edildi.
Cryptosporidium  parvum ile enfekte enterositlere 4 farklı konsantrasyonda (250, 500, 750, 1000 µg/ml)  klinoptilolit içeren polimer nanopartikül ve bir gruba da su ilave edilip kontrol grubu oluşturuldu. İnkubasyon sonrası fluoresans mikroskopta 400X büyütmede, aynı hat üzerinde 20 yan yana mikroskop sahasındaki hücreler ve hücrelerdeki ookistler sayılarak yüzde enfeksiyon oranı belirlendi. Verilerin istatistiksel değerlendirmesi Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 19 paket programı kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm istatistiksel değerlendirmelerde p<0.05 anlamlı kabul edildi.
Bu kapsamda kontrol grubunda %23,46 olan enfeksiyon oluşma yüzdesi klinoptilolit içeren polimer nanopartikülün farklı konsantrasyonlarında (1000µg/ml, 750µg/ml, 500µg/ml, 250µg/ml) sırasıyla %15.6, %8.13, %10.33 ile %13.46 aralığında belirlendi. Klinopitilolit içeren nanopartikülün farklı konsantrasyonlarında (1000µg/ml, 750µg/ml, 500µg/ml, 250µg/ml) sırasıyla inhibisyon yüzdesinin %33.54, %65.56, %55.99, %42.66 olduğu ortaya kondu.
	Sonuç olarak C. parvum ile Caco-2 hücrelerinde oluşturulan in vitro enfeksiyonda klinoptilolit içeren polimer nanopartiküllerin antikriptosidal aktiviteye sahip oldukları belirlendi.  Ancak bu etkinliğin dozla ilişkili olduğu ve inhibisyon yüzdesi (IC50) değerine sahip klinoptilolit içeren polimer nanopartikül konsantrasyonların 750µg/ml ve 500µg/ml olduğu saptandı.

Anahtar kelimeler: Cryptosporidium parvum, klinoptilolit, nanopartikül.

Abstract:
Cryptosporidium spp is an enteric protozoan pathogen causing diarrhea in human and multi-species species. Several drugs have been used to treat Cryptosporidium parvum infection; However, a complete parasitological recovery has not been achieved. Currently, there is no definitive protection and treatment protocol for C. parvum. In this context, a new treatment protocol for cryptosporidiosis is needed. Antiviral, antitumoral and antidiarrheal activities of clinoptilolite investigated and found to have positive effects on these fields. In this study, it was aimed to reveal the in vitro efficacy of polymer nanoparticle containing clinoptilolite on C. parvum.
In this study, human colon adenocarcinoma (Caco-2) cells were used to perform experimental in vitro infection. DNA isolation was performed to determine the strain and type of Cryptosporidium oocysts from natural infected calves or lambs. Typing of Cryptosporidium parvum was performed by RFLP analysis using nested PCR and SspI, VspI and MboII enzymes. Human colon adenocarcinoma (Caco-2) cells were used to perform experimental in vitro infection. In infectious experiments, 18 mm sterile round laminates were placed into 12 well cell culture plates and Caco-2 cells were plated on them. Cells were coated with 80% of the surface of the coverslips and then infected with 1x106 C. parvum oocysts.
Clinoptilolite-containing polymer nanoparticles and water in a group were added to the infected enterocytes at 4 different concentrations (250, 500, 750, 1000 μg / ml) and the control group was formed. Percent infection rate was determined by counting oocysts in cells and cells in 20 side-by-side microscope on the same line at 400x magnification on a fluorescence microscope after incubation. Statistical evaluation of the data was performed using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 19 package program. p <0.05 was considered significant in all statistical evaluations.
In this context, the percentage of infection occurrence in the control group was determined as 23,46%. Different concentrations of clinoptilolite-containing polymer nanoparticles (1000μg / ml, 750μg / ml, 500μg / ml, 250μg / ml) was determined as 15.6%, 8.13%, 10.33% and 13.46% respectively. It was revealed that the percent inhibition was 33.54%, 65.56%, 55.99%, 42.66% of the inhibition percentage at different concentrations of the clinopitilolite nanoparticle (1000μg / ml, 750μg / ml, 500μg / ml, 250μg / ml).
In conclusion, anticryptocidal activity of in vitro infection of C. parvum with Caco-2 cells, clinoptilolite-containing polymer nanoparticles was detected. However, it was determined that this activity was dose-related and the concentrations of clinoptilolite-containing polymer nanoparticles with inhibition percentage (IC50) values were 750μg / ml and 500μg / ml.
 
Key words: Cryptosporidium parvum, clinoptilolite, nanoparticle.