Rosmarinus officinalis, Mentha piperita, Syzgium aromaticum bitki ekstraktları aracılığı ile gümüş nanopartiküllerinin yeşil sentezi ve Streptococcus sanguinis'e karşı antimikrobiyal antibiyofilm ve antivirülans aktivitelerinin araştırılması
Rosmarinus officinalis, Mentha piperita, Syzgium aromaticum plant extracts mediated green synthesis of silver nanoparticles and investigation of their antimicrobial, antibiofilm and antivirulence activity against Streptococcus sanguinis
Yazar: BÜŞRA MERVE SARITAŞ
Danışman: PROF. DR. FETİYE KOLAYLI
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibakteriyel etkiler = Antibacterial effects ; Diş çürükleri = Dental caries ; Gümüş nanopartiküller = Silver nanoparticles ; Streptococcus sanguinis = Streptococcus sanguinis

Özet:
Amaç: S. sanguinis, diş yüzeyine kolonize olan ilk streptokoklardan biridir. Biyofilm oluşumunda öncü kolonizer olarak görev almaktadır. S. sanguinis aynı zamanda enfektif endokardit, bakteriyemi, menenjit gibi hastalıklara neden olan fırsatçı bir patojendir. Bu araştırmada S. sanguinis'e etkili gargara ve diş macunu gibi malzemelerin içeriğinde kullanılabilecek gümüş nanopartiküllerin sentezlenmesi amaçlanmış olup; oluşturulan gümüş nanopartiküllerin antimikrobiyal, antibiyofilm, sitotoksik ve gen ekspresyonu üzerine etkileri araştırılmıştır. 
Yöntem: AgNP'ler R. officinalis, M. piperita, S. aromaticum bitki ekstraktları kullanılarak yeşil sentez yöntemiyle sentezlenmiştir. AgNP'lerin karakterizasyonu için Ultra Viyole Görünür Bölge Spektroskopisi, Geçirimli Elektron Mikroskobu, Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi, X-Işını Difraktometresi, SEM-EDS kullanılmıştır. AgNP'lerin S. sanguinis üzerine antimikrobiyal etkileri sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle, antibiyofilm etkileri kristal viyole yöntemi ve SEM ile belirlenmiştir. AgNP'lerin fare fibroblast L929 hücre hattı üzerine sitotoksik etkileri MTT hücre canlılığı testi ile değerlendirilmiştir. S. sanguinis'in farklı AgNP'ler ile 24 saat boyunca muamele edilmesinin spxB gen ekspresyonundaki değişiklikler Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonuyla tespit edilmiş, ΔΔCt yöntemiyle gen ekspresyon düzeyindeki değişiklikler göreceli olarak karşılaştırılmıştır.
Bulgular: AgNP'lerin sentezi renk değişikliği ile doğrulanmış ve diğer karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. UV-Vis karakterizasyonu sonucunda R. officinalis, M. piperita, S. aromaticum AgNP'lerin sırasıyla 440, 450 ve 460 nm dalga boyunda spektrum gösterdiği; TEM analizinde ortalama partikül boyutlarınının sırasıyla 39±13, 24±6, 26±9 nm olduğu ve küresel şekilli AgNP'lerin oluştuğu görülmüştür. SEM-EDS analizinde AgNP'lerin küresel yapıda ve başlıca elementin Ag olduğu tespit edilmiş, XRD analizinde gümüşe özgü yüzey merkezli kübik ve kristal yapıda olduğunu gösteren 4 pik gözlenmiştir. FTIR analizinde ekstraktların AgNP'lere  indirgenmesi sonucunda çeşitli gruplara ait spektrumlar gözlenmiştir. Bu özelliklerine göre yeşil sentez AgNP'lerin üçünün de nanopartikül olma özelliği taşıdığı belirlenmiştir. Karakterizasyonu tamamlanan AgNP'lerin biyolojik etkileri araştırılmıştır. R. officinalis AgNP'lerin MİK değeri 256 μg/mL olarak bulunmuş, antibiyofilm etki gösterdiği belirlenmiştir. SEM görüntülerinde pozitif kontrole kıyasla biyofilm oranında azalma görülmüştür. R. officinalis AgNP'lerin 1/4 MİK konsantrasyonunda (64 μg/mL) muamele edilen S. sanguinis'in; spxB gen ekspresyonunda artış görülmüştür. EC50 değeri 298,2 μg/mL olarak hesaplanmıştır.  M. piperita AgNP'lerin MİK değeri 128 μg/mL olarak bulunmuş, biyofilmi düşük konsantrasyonlarda dahi inhibe ettiği tespit edilmiştir. M. piperita AgNP'lerin 1/4 MİK konsantrasyonunda (32 μg/mL) muamele edilen S. sanguinis'in; spxB gen ekspresyonunda ise azalma görülmüştür. EC50 değeri 35,32 μg/mL olarak hesaplanmıştır. S. aromaticum AgNP'lerin MİK değeri 128 μg/mL olarak bulunmuş biyofilmi düşük konsantrasyonlarda dahi inhibe ettiği tespit edilmiştir. S. aromaticum AgNP'lerin 1/4 MİK konsantrasyonunda (32 μg/mL) muamele edilen S. sanguinis'in; spxB geninin ekspresyonunda azalma görülmüştür. EC50 değeri 50,51 μg/mL olarak hesaplanmıştır
Sonuç: Kulanılan bitkilerden sentezlenen AgNP'lerin boyut ve şekillerinin biyolojik özelliklerini etkilediği görülmüştür. R. officinalis AgNP'lerin boyutlarının büyük olması sitotoksik etkiyi azalttığı gibi antimikrobiyal ve antibiyofilm etkilerini de azalttığı belirlenmiştir. S. aromaticum ve M. piperita AgNP'lerin daha küçük boyutlarda sentezlendiği ve aynı MİK değerine sahip olduğu görülmüştür.  S. aromaticum AgNP'lerin ayrıca sub-MİK değerinde biyofilmi güçlü bir şekilde inhibe ettiği ve bu konsantrasyonda sitotoksik etkisinin de M. piperita AgNP'lere göre daha düşük olduğu saptanmıştır. Bu nedenle S. aromaticum AgNP'lerin diş hekimliğinde ağız gargarası, diş macunu veya dolgu materyalleri için antimikrobiyal ve antibiyofilm özellik taşıyan NP'ler olarak geliştirilebileceği düşünülmektedir.
Anahtar Sözcükler: S. sanguinis, Gümüş nanopartiküller, Antimikrobiyal aktivite, Antibiyofilm aktivite, Sitotoksisite.

Abstract:
Objective: S. sanguinis is one of the first streptococci to colonize the tooth surface. It acts as a precursor colonizer in biofilm formation. S. sanguinis is also an opportunistic pathogen that causes diseases such as infective endocarditis, bacteremia and meningitis. In this study, it was aimed to synthesise silver nanoparticles that can be used in the content of materials such as mouthwash and toothpaste effective against S. sanguinis; the effects of the formed silver nanoparticles on antimicrobial, antibiofilm, cytotoxic and gene expression were investigated. 
Methods: AgNPs were synthesised by green synthesis method using R. officinalis, M. piperita, S. aromaticum plant extracts. Ultra-Violet Visible Spectroscopy, TEM, Fourier Transform Infrared Spectroscopy, X-Ray Diffractometer, SEM-EDS were used to characterize AgNPs. Antimicrobial effects of AgNPs on S. sanguinis were determined by liquid microdilution method and antibiofilm effects were determined by crystal violet method and SEM. The cytotoxic effects of AgNPs on mouse fibroblast L929 cell line were evaluated by MTT cell viability assay. The changes in spxB gene expression of S. sanguinis treated with different AgNPs for 24 hours were determined by Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction and the relative changes in gene expression level were compared by ΔΔCT method.
Results: Synthesis of AgNPs was confirmed by colour change and further characterization was performed. UV-Vis characterization of R. officinalis, M. piperita, S. aromaticum AgNPs showed spectra at wavelengths of 440, 450 and 460 nm, respectively; TEM analysis showed the formation of spherical shaped AgNPs with average particle sizes of 39±13, 24±6, 26±9 nm, respectively. In SEM-EDS analysis, it was determined that AgNPs were spherical in structure and the main element was Ag. 4 peaks were observed in XRD analysis, indicating that AgNPs had a silver-specific surface-centred cubic and crystalline structure. In FTIR analysis, spectra belonging to various groups were observed as a result of the reduction of the extracts to AgNPs. According to these properties, it was determined that all three of the green synthesised AgNPs were characterized as nanoparticles. The biological effects of the characterized AgNPs were investigated. The MIC value of R. officinalis AgNPs was found to be 256 μg/mL and it was determined that they showed antibiofilm effect. SEM images showed a decrease in biofilm ratio compared to the positive control. S. sanguinis treated at 1/4 MIC concentration (64) showed an increase in spxB gene expression. EC50 value was calculated as 298.2 μg/mL.  The MIC value of M. piperita AgNPs was found to be 128 μg/mL, and it was found to inhibit biofilm even at low concentrations. S. sanguinis treated at 1/4 MIC concentration (32 μg/mL) showed a decrease in spxB gene expression. EC50 value was calculated as 35.32 μg/mL. The MIC value of S. aromaticum AgNPs was found to be 128 μg/mL and it was determined that it inhibited biofilm even at low concentrations. S. sanguinis treated at 1/4 MIC concentration (32 μg/mL) of S. aromaticum AgNPs showed a decrease in the expression of spxB gene. EC50 value was calculated as 50.51 μg/mL
Conclusion: It was observed that the size and shape of AgNPs synthesised from the plants used affect their biological properties. The large size of R. officinalis AgNPs decreased the cytotoxic effect and also decreased the antimicrobial and antibiofilm effects. S. aromaticum and M. piperita AgNPs were synthesised in smaller sizes and had the same MIC value.  It was also found that S. aromaticum AgNPs strongly inhibited biofilm at sub-MIC value and its cytotoxic effect at this concentration was lower than M. piperita AgNPs. Therefore, it is thought that S. aromaticum AgNPs can be developed as NPs with antimicrobial and antibiofilm properties for mouthwash, toothpaste or filling materials in dentistry.

Key words: S. sanguinis, Silver nanoparticles, Antimicrobial activity, Antibiofilm activity, Cytotoxicity.