Yabani kuş dışkılarından izole edilen escherichia coli izolatlarında beta laktam direnç varlığının araştırılması
Investigation of beta lactam resistance in E. coli isolated from wild bird feces
Yazar: BARIŞ HALAÇ
Danışman: PROF. DR. SEYYAL AK
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Dışkı = Feces ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Kuşlar = Birds ; Yabani hayvanlar = Wild animals ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Bu çalışmada, Marmara bölgesinde yaşayan yabani ya da göç sırasında bu bölgeye uğrayan ve belli bir dönemi bu bölgede geçiren yabani göçmen kuşların dışkılarında, beta laktam dirençli Escherichia coli'nin fenotipik ve genotipik olarak belirlenmesi amaçlandı. Yabani kuşlardan noninvaziv yöntemlerle alınan 272 taze dışkı kullanıldı. Dışkı alınacak kuşlar dört grup ve her bir grup 68 adet örnek içerecek şekilde sınıflandırıldı. Grup 1; Marmara Bölgesinde yerleşik yabani su kuşlarını, Grup 2; yerleşik (şehirlerde yaşayan) yabani karakuşlarını (Kumru, güvercin, karga, serçe vb.), Grup 3; kışı ülkemizde geçiren göçmenleri, Grup 4; ilkbahar ve yazı ülkemizde geçiren Göçmenleri kapsadı.
Dışkı örneklerine Triptic Soy Broth'da ön zenginleştirme uygulandı. Kültürler sefotaksimli(1g/L) ve sefotaksimsiz MacConkey agar besiyerine pasajlandı. Sefotaksimsiz MacConkey agarda üreyen E.coli izolatlarının tamamına uygulanan Modifiye Hodge Testi sonucunda E.coli izolatlarının (n=212) hiçbirisinde karbapenem direnci saptanmadı. Sefotaksimli MacConkey agarda üreyen E.coli izolatlarının Genişlemiş spektrumlu Beta Laktamaz (GSBL) ve AmpC beta laktamaz pozitifliği tarama ve doğrulama testleri ile fenotipik olarak tespit edildi. Gruplara dağılım bakılmaksızın sefotaksim katkılı MacConkey Agar'dan izole edilen 84 E. coli suşunun GSBLve/veya AmpC pozitif izolat sayısı 62 (62/272; %22,8)olarak bulundu. Dağılımda 55'inin GSBL, 12'sinin AmpC aktivitesine sahip olduğu belirlendi. Bu E. coli suşlarının 50'sinin yalnız GSBL, 7'sinin AmpC ve 5'inin GSBL ve AmpC aktivitelerinin her ikisine de sahip olduğu saptandı. Bu ayrımlar dikkate alınmadan hayvan sayısına göre saptanan E. coli izolatlarının fenotipik direnç aktiviteleri değerlendirildiğinde 272 kuşun 59(%21,7)'unda antimikrobiyal direnç olduğu belirlendi. Bu 59 kuşun 47'si sadece GSBL, 6'sı sadece AmpC ve 6'sı GSBL + AmpC fenotipik dirence sahipti. Bulgular gruplara göre değerlendirildiğinde grup 1'in ve hayvan türlerine göre değerlendirildiğinde, grup 1'de yer alan martıların yüksek oranlada GSBL ve/veya AmpC direncine sahip sahip E. coli suşlarını barındırdığı görüldü.
Sefotaksimli MacConkey agarda üremiş 84 E.coli izolatının fenotipik sonuçlarına bakılmaksızın GSBL ve AmpC kodlayan genleri belirlemek amacıyla yapılan PCR sonucunda 48'inin yalnız GSBL, 3'ünün yalnız AmpC, 5'inin GSBL ve AmpC aktivitesini kodlayan genler yönünden pozitif olduğu saptandı. Genlerin dağılımı GSBL için blaCTX-M (n=50), blaSHV (n=2), blaOXA10  (n=10), AmpC yönünden blaMOX (n=6), blaCIT (n=2) olarak belirlendi. Hayvan türlerine göre değerlendirildiğinde grup 1 de yer alan martıların en yüksek oranda enzim genleri içeren E. coli suşlarını içerdiği belirlendi.
 	Tüm sonuçlar incelendiğinde, gerek fenotipik, gerekse genotipik bulgular ışığında GSBL ve/veya AmpC β-laktamaz üreten E.coli prevalansının grup 1 ve 2'de en yüksek oranda olduğu saptandı. Bu gruplardaki pozitiflik ve gruplar arasındaki önem istatistiki açıdan anlamlı bulundu (P<0,001).  Bu çalışmanın yapıldığı İstanbul'da geniş yaşam dağılımlarına sahip olan ve grup 1'de yer alan martı türlerinin, özellikle çöplüklerden ve çeşitli ortamlarda direkt olarak insan, hayvan ve tarımsal atıklar ile beslendiği göz önüne alındığında, saptanan direnç profilinin insan ve/veya hayvan kaynaklı olduğunu düşündürdü.

Abstract:
In this study, it was aimed to determine phenotypic and genotypic beta lactam resistant Escherichia coli in the faeces of wild migratory birds living in the Marmara region or visiting this region during migration and spending a certain period in this region. 272 fresh feces taken from wild birds by noninvasive methods. Birds to be defecated were classified into four groups and each group included 68 samples. Group 1; resident wild waterfowl, Group 2; resident (city-dwelling) wild birds (Dove, pigeon, crow, sparrow, etc.), Group 3; immigrants who spend the winter in our country, Group 4; covered the Immigrants who spent the spring and summer in our country.
Stool samples were pre-enriched in Triptic Soy Broth. Cultures were passaged on MacConkey agar with and without cefotaxime (1 g/L). Carbapenem resistance was not detected in any of the E.coli isolates (n=212) as a result of the Modified Hodge Test applied to all E.coli isolates grown on MacConkey agar without cefotaxime. Extended-spectrum Beta-Lactamase (ESBL) and AmpC beta-lactamase positivity of E.coli isolates grown on MacConkey agar with cefotaxime were detected phenotypically by screening and confirmatory tests. Regardless of group distribution, the number of ESBL and/or AmpC positive isolates of 84 E. coli strains isolated from MacConkey Agar supplemented with cefotaxime was 62 (62/272; 22.8%). It was determined that 55 of them had ESBL activity and 12 of them had AmpC activity in the distribution. It was determined that 50 of these E. coli strains had only ESBL, 7 had AmpC and 5 had both ESBL and AmpC activities. When the phenotypic resistance activities of E. coli isolates, which were determined according to the number of animals without considering these distinctions, were evaluated, it was determined that 59 (21.7%) of 272 birds had antimicrobial resistance. Of these 59 birds, 47 had ESBL only, 6 AmpC only, and 6 ESBL + AmpC phenotypic resistance. When the findings were evaluated according to the groups, when group 1 was evaluated according to animal species, it was seen that the gulls in this group harbored E. coli strains with high ESBL and/or AmpC resistance. 
Regardless of the phenotypic results of 84 E.coli isolates grown on MacConkey agar with cefotaxime, PCR was performed to determine the genes encoding ESBL and AmpC, and 48 of them were positive for ESBL only, 3 for AmpC only, and 5 for ESBL and for genes encoding AmpC activity. The distribution of genes was determined as blaCTX-M (n=50), blaSHV (n=2), blaOXA10 (n=10) for ESBL, blaMOX (n=6), blaCIT (n=2) for AmpC. When evaluated according to animal species, it was determined that the seagulls in group 1 contained the E. coli strains containing the highest enzyme genes. 
When all the results were examined, it was determined that the prevalence of E.coli producing ESBL and/or AmpC β-lactamase was highest in groups 1 and 2 in the light of both phenotypic and genotypic findings. The positivity in these groups and the significance between the groups were found to be statistically significant (P<0.001). Considering that the gull species in group 1, which have a wide habitat distribution in Istanbul, where this study was conducted, are fed directly with human, animal and agricultural wastes, especially from garbage dumps and in various environments, the resistance profile determined is of human and/or animal origin.