Covid-19 tedavisi için rna-bağımlı rna polimeraz (RDRP) inhibitörlerinin sanal ligand taraması yöntemiyle tasarlanması
Design of rna-dependent rna polymerase (RDRP) inhibitors by virtual ligand screening method for the treatment of Covid-19
Yazar: BEKİR CAN UĞUR
Danışman: PROF. DR. VİLDAN GÜRSOY
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Çin'in Wuhan kentinde Aralık 2019 tarihinde başlayan ve COVID-19 (Koronavirüs Hastalığı 2019) küresel çapta pandemik bir salgına dönüşmüştür. Bundan dolayı COVID-19 hastalığına yol açan virüse SARS-CoV-2 adı verilmiştir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) verilerine göre dünya genelinde hastalığa yakalanmış kişi sayısı 775 milyonu geçerken hastalıktan kaynaklı can kaybı ise 7,7 milyonu aşmıştır. Bu durum ülkemizde ise 17 milyona aşkın vaka görülürken can kaybı ise 100 binin üzerindedir. Günümüzde COVID-19 tedavisi için Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onay alan 8 tane ilaç vardır ve Birleşik Devletler İlaç ve Gıda Yönetimi (USFDA) tarafından onay alan 3 tane ilaç vardır. Bunun yanı sıra ilaç tedavisine ek olarak güncel onay almış kullanımda 5 tane aşı vardır. 

Tüm koronavirüsler yapısında membran üzerinde bulunan S protein, Membran proteini ve zarf proteini olmak üzere toplam üç yapısal protein bulundururlar. Bu proteinlere ek olarak virüs kalıtsal malzemesi olan RNA yapısında papain benzeri proteaz (PLpro), 3-kimotripsin benzeri proteaz (3CLpro), RNA bağımlı RNA Polimeraz (RdRp) ve helikaz olmak üzere dört tane fonksiyonel olan protein bulundururlar. COVID-19 tedavisi için yeni inhibitör araştırmaları için önemli ilaç hedefleri; PLpro, 3CLpro, RdRp ve S proteinidir. Tez kapsamında seçilen ilaç hedefi RdRp enzimidir. RdRp enzimi ile etkileşen Remdesivir ve Molnupiravir olmak üzere iki tane inhibitör bulunmaktadır. 

RdRp enzimi SARS-CoV-2 virüsünün kalıtsal materyali olan RNA zincirinin transkripsiyonu ve replikasyonundan sorumludur. RdRp enzimi bu görevinden kaynaklı oldukça önem arz eden bir hedeftir. RdRp enzimi avuç içi, parmak ve başparmak bölgesinden oluşmaktadır. Aktif bölge avuç içi bölgesinde konumlanmıştır. Aktif bölge 7 bölümden oluşmaktadır. RdRp enziminin aktif bölgesine bağlanmak isteyen inhibitörler genellikle enzimin substrat yapısına kovalent bağlanırlar. Enzimin aktif bölgesi içerisinde yer alan motif B bölümü substat yapısının stabilizasyonunu sağlamaktadır. Bu bölgeye yapılacak olan ikincil etkileşimler içeren enzim inhibisyonu bu şekilde sağlanabilir. 

Bu tez çalışması, validasyon, moleküler doking (kenetlenme), sanal ligand tarama ve ADMEt olmak üzere dört hesaplama içermektedir. Birinci aşamada, nükleotit olmayan moleküller için SARS-CoV-2 RdRp enziminin motif B bölgesi ile etkileşebilecek düşük 7D4F  PDB kodlu protein-ligand kompleksi ile bu komplekse ait Suramin ligandı için Autodock Vina programı kullanılarak validasyon çalışması yapıldı. Nükleotit olan moleküller için SARS-CoV-2 RdRp enziminin motif F bölgesi ile etkileşebilecek 7BV2  PDB kodlu protein-ligand kompleksi ile bu komplekse ait Remdesivir Trifosfat ligandı için Autodock Vina programı kullanılarak validasyon çalışması yapıldı. Yeniden kenetlenme (redoking) hesaplamaları sonucu, deneysel (x-ray) ve hesapsal sonuçlarının çakıştırılması sonucu 7D4F PDB kodlu protein için RMSD değeri 1.878 Å bulundu ve değerin 2Å değerinden düşük olması seçilen yöntemin uygunluğunu göstermektedir. Ligandın hesaplanan Ki değeri 1.12 nM olarak bulunmuştur. 7BV2 PDB kodlu protein için RMSD değeri 1.914 Å bulundu ve değerin 2Å değerinden düşük olması seçilen yöntemin uygunluğunu göstermektedir. Ligandın hesaplanan Ki değeri 1.45 nM olarak bulunmuştur.  

İkinci aşama farklı hastalıklarda kullanılan 10 tane nükleotit yapıda olan antiviral ilaç, 24 tane flavonoid ve 1 tane de Zaire Ebolavirüs ve Zika virüsü tedavisinde kullanılan Suramin molekülü dahil olmak üzere nükleotit yapıda olmayan 35 molekül RdRp aktif bölgesinde bulunan ve RNA stabilizasyonu sağlayan motif B bölgesine bağlanması hedeflendi. Bunun için yapı tabanlı ilaç tasarımı yöntemlerinden olan moleküler kenetlenme Autodock Vina programı kullanılarak yapıldı.  

Üçüncü Aşamada, PubChem veri tabanında sanal ligand taraması yapılmıştır. Yapılan sanal ligand taraması sonucunda 413 molekül bulunan bir veri tabanı oluşturulup çoklu moleküler kenetlenmeye tabi tutulmuştur. Çoklu yapılan moleküler kenetlenme sonucunda en yüksek afinite değerine sahip 20 molekül tespit edilmiştir. Son aşama 20 molekül için ADME ve toksisite (emilim-dağılım-metabolizma-atılımtoksisite) hesaplamaları yapıldı. Belirlenen ADMEt testlerinden uygun sonuç alan 20 molekül belirlenerek çalışma tamamlandı. Elde edilen bu moleküller, COVID-19 pandemisi için RdRp enzim inhibitörü olarak antiviral ilaç tasarımı açısından etkili olabilir, öncü molekül bulma konusunda önemli katkıda bulunabilir.

Abstract:
The COVID-19 pandemic, which started in December 2019 in Wuhan, China, has since become a global outbreak. Consequently, the virus that causes COVID-19 has been named SARS-CoV-2. According to data from the World Health Organization (WHO), the number of people infected worldwide has exceeded 775 million, with over 7.7 million deaths. In our country, over 17 million cases have been reported, with more than 100,000 deaths. Currently, there are 8 drugs approved by the European Medicines Agency (EMA) and 3 drugs approved by the United States Food and Drug Administration (USFDA) for the treatment of COVID-19. In addition to drug treatments, there are 5 vaccines that have received approval and are in use. 

All coronaviruses contain three structural proteins on their membranes: the spike (S) protein, the membrane (M) protein, and the envelope (E) protein. In addition to these proteins, the viral genetic material RNA comprises four functional proteins: papain-like protease (PLpro), 3-chymotrypsin-like protease (3CLpro), RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), and helicase. Important drug targets for new inhibitor research in COVID-19 treatment include PLpro, 3CLpro, RdRp, and the S protein. The selected drug target for this thesis is the RdRp enzyme. There are two inhibitors interacting with the RdRp enzyme: Remdesivir and Molnupiravir. 

The RdRp enzyme is responsible for the transcription and replication of the RNA strand, the genetic material of the SARS-CoV-2 virus. Due to this role, the RdRp enzyme is a highly significant target. The RdRp enzyme consists of the palm, fingers, and thumb regions, with the active site located in the palm region. The active site comprises seven segments. Inhibitors that aim to bind to the active site of the RdRp enzyme typically covalently attach to the enzyme's substrate structure. The motif B region within the enzyme's active site stabilizes the substrate structure. Enzyme inhibition can be achieved by secondary interactions within this region. 

This thesis study includes four computational processes: validation, molecular docking, virtual ligand screening, and ADME/Tox (absorption-distribution-metabolism-excretion/toxicity). In the first phase, validation studies were performed using the Autodock Vina program for the interaction of nucleotide-free molecules with the motif B region of the SARS-CoV-2 RdRp enzyme with the 7D4F PDB coded protein-ligand complex and its Suramin ligand. For nucleotide molecules, validation was conducted for the interaction with the motif F region of the SARS-CoV-2 RdRp enzyme using the 7BV2 PDB coded protein-ligand complex and its Remdesivir Triphosphate ligand. Re-docking calculations yielded an RMSD value of 1.878 Å for the 7D4F PDB coded protein, indicating the method's suitability with a value below 2 Å. The calculated Ki value for the ligand was found to be 1.12 nM. For the 7BV2 PDB coded protein, an RMSD value of 1.914 Å was obtained, also indicating method suitability with a value below 2 Å. The calculated Ki value for the ligand was found to be 1.45 nM. 

In the second phase, molecular docking using the Autodock Vina program was performed for 10 nucleotide antiviral drugs, 24 flavonoids, and 1 non-nucleotide molecule (Suramin) used in the treatment of Zaire Ebolavirus and Zika virus. These molecules were targeted to bind to the motif B region in the active site of RdRp, responsible for RNA stabilization. 

In the third phase, a virtual ligand screening was conducted in the PubChem database, resulting in a dataset of 413 molecules subjected to multiple molecular dockings. The 20 molecules with the highest affinity values were identified. 

In the final phase, ADME and toxicity (absorption-distribution-metabolism-excretion/toxicity) calculations were performed for the top 20 molecules. The molecules that passed the ADME/Tox tests were determined, completing the study. These identified molecules could be effective as RdRp enzyme inhibitors in antiviral drug design for the COVID-19 pandemic and contribute significantly to the discovery of lead compounds.