Streptomisetlerde lipaz aktivitesinin belirlenmesi, kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu
Determination of lipase activity in Streptomycetes, partial purification and characterization
Yazar: BERK AYAZ
Danışman: PROF. DR. AYSEL UĞUR
Muğla Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Streptomyces = Streptomyces

Özet:
Bu çalışmada streptomiset cinsi bakterilerin lipolitik aktivitelerinin araştırılması ve en yüksek aktivite gösteren izolattan elde edilen lipazın kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. Bu amaçla, Muğla Üniversitesi Kültür Koleksiyonuna dahil olan 300 adet Streptomyces cinsine dahil izolat kullanılmıştır.İzolatlar ISP2 (International Streptomyces Project 2) agar besiyerinde geliştirilmiştir. Kalitatif lipolitik aktivite tayini Tribütirin Agar (TA) ve Rhodamine-B Agar kullanılarak belirlenmiştir. TA'da 300 adet izolatın tamamında, Rhodamine- B Agarda ise 300 adet izolatın 270'unda (89.6%) lipolitik aktivite belirlenmiştir. Kantitatif lipolitik aktivite p-nitrofenil palmitat'ın (p-NPP) substrat olarak kullanıldığı spektrofotometrik yöntem ile belirlenmiştir. 270 adet izolatın tamamında lipaz aktivitesi belirlenmiştir ve en yüksek enzim aktivitesi ÖC 119-7 (9420 U/ml) izolatında tespit edilmiştir.Streptomyces sp. ÖC 119-7'nin proteolitik aktivitesinin olmadığı Skim Milk Agar (SMA)'a kullanılarak belirlenmiştir. Ayrıca izolatın maksimum enzim aktivitesine ulaştığı inkübasyon süresi, 120 saat ve optimum inokülasyon yoğunluğu da 0.5 OD olarak belirlenmiştir.Streptomyces sp. ÖC 119-7'den elde edilen lipaz (LipSA119-7), amonyum sülfat çöktürme, diyaliz ve jel filtrasyon kromatografisi ile kısmi olarak saflaştırılmıştır. Kısmi saflaştırma sonucu elde edilen veriler ile LipSA119-7'nin spesifik aktivitesi 68055.56 (U/mg), saflaştırma verimi 3.43% ve saflaştırma katsayısı 5.52 olarak hesaplanmıştır.LipSA119-7'nin karakterizasyonu aşamasında LipSA119-7'nin optimum pH'sı 8.0 ve optimum sıcaklığı 50 °C olarak belirlenmiştir. pH 7.0-9.0 ve 40-60 °C aralığında stabil olduğu tespit edilmiştir. Metal iyonlarının, organik solventlerin, sürfaktanların ve enzim inhibitörlerinin enzim aktivitesine ve stabilitesine etkisi araştırılmıştır. Enzimin Ca2+ ve Mg2+ metal iyonlarının varlığında aktive olduğu, Mn2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, K+, Na+ varlığında ise inhibe olduğu belirlenmiştir. Organik solventlerde ise hekzanın enzimi aktive ettiği, kullanılan diğer organik solventlerin enzimi inhibe ettiği tespit edilmiştir. Enzimin SDS varlığında aktive olduğu ve diğer sürfaktanlarda stabil kaldığı belirlenmiştir. LipSA119-7 EDTA varlığında stabil iken, ß-merkaptoethanol varlığında aktive olduğu ve PMSF'in ise enzimi inhibe ettiği belirlenmiştir. Ayrıca +4 °C'de 30 gün depolanabilir bir enzim olduğu tespit edilmiştir.Elde edilen sonuçlar, LipSA119-7'nin biyodizel üretiminde biyokatalist olarak kullanışlı bir enzim olabileceği fikrini doğurmuştur. LipSA119-7'nin geniş pH ve sıcaklık aralıklarında yüksek stabilite göstermesi ve çeşitli metal iyonlarının, sürfaktanların, enzim inhibitörlerinin ve özellikle organik solventlerin varlığında aktivitesini koruması, enzimin etkileyici olarak biyodizel üretiminde kullanılabileceğini ortaya koymuştur.

Abstract:
In this study, it was aimed to determine lipolytic activity of bacteria from Streptomyces and partial purification and characterization of lipase obtained from Streptomyces genus which shows the highest activity of lipase. For this purpose, 300 Streptomyces isolates obtained from Mugla University Culture Collection (MUKK) were used.Isolates were cultured in ISP2 (International Streptomyces Project 2) agar medium. Qualitative lipolytic activity assignment determined in Tributyrin Agar (TA) and Rhodamine-B Agar. Lipolytic activity was determined all of the isolates in TA and 270 of 300 (89.6%) in Rhodamine-B Agar. Quantitative lipolytic activity was determined by spectrophotometric method using p-NPP as a substrate. Lipase activity was determined in all of 270 of isolate and the highest enzyme activity was identified at OC 119-7 (9420 U/ml).Proteolytic activity of OC 119-7 was not observed using Skim Milk Agar (SMA). In addition, the incubation time that isolate reached to the maximum enzyme activity was determined as 120 hours and the optimum inoculation density of it was determined as 0.5 OD.The lipase (LipSA119-7), obtained from the isolate OC 119-7, which shows the highest activity, was partially purified by ammonium sulphate precipitation, dialysis and gel filtration chromatography. By the data obtained after the partial purification, specific activity of LipSA119-7, purification yield and purification factor were measured as 68055.56 (U/mg), 3.43% and 5.52, respectively.The optimal temperature and pH for LipSA119-7 determined as 50 ºC and 8.0, respectively. The lipase exhibited good stability between pH 7.0 and 9.0 and was stable between temperatures 40 and 60 ºC. To determine the LipSA119-7?s characteristics, effects of metal ions, surfactants, enzyme inhibitors and organic solvents, on enzyme activity and stability was examined. It was observed that the enzyme is being activated in the presence of Ca2+ (118.8%) and Mg2+ (140.2%) and is being inhibated in the presence of Mn2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, K+, Na+ metal ions. In the experiments those carried out with organic solvents, it was seen that except hexan (108%) all other organic solvents inhibated the enzyme activity. LipSA119-7 was activated and remained stabile in the presence of SDS (286%) and other surfactants, respectively. While LipSA119-7 was stabile in the presence of EDTA (114%), it was activated by ß-merkaptoethanol (158%) and inhibated by PMSF (55%). When LipSA119-7?s storage stability was examined, it was determined that the enzyme can be stored at +4°C for 30 days.LipSA119-7 is shown to be usable for biodiesel production as biocatalyst. Since LipSA119-7 displays high stability in a wide pH and temperature ranges, and maintains its activity in the presence of various metal ions, surfactants, enzyme inhibitors and especially organic solvents, it can be effectively used in biodiesel production.