Bruselloza karşı koruyucu amaçlı antijenik proteinlerin ve nanoformülasyonların eldesi ve biyolojik etkinliklerinin değerlendirilmesi
Obtaining of antigenic proteins and nanoformulations for protective purposes against brucellosis and evaluation of their biological effectiveness
Yazar: İLKGÜL AKMAYAN
Danışman: PROF. DR. TÜLİN ÖZBEK ; PROF. DR. SERAP DERMAN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
SARS-CoV-2 (COVID-19) pandemisinin ardından birçok basın-yayın organında vurgulandığı şekliyle dünya genelinde yeniden salgın tehdidi olarak görülen brusellozun, yeni aşı teknolojileri ile elimine edilmesi yaklaşımı günümüzde akılcı bir çözüm olarak görülmektedir. Bu tezde; antijenik özellikteki farklı kimyasal yapılara sahip Omp25 ve EipB proteinlerinin, rekombinant DNA teknolojisi ile ülkemize endemik B. abortus biovar 3 strainin genomundan elde edilerek yüksek miktarda üretimi gerçekleştirilmiştir. Akabinde, rOmp25 ve rEipB proteinleri adjuvan özelliği bilinen PLGA nanopartiküllerine enkapsüle edilerek üretilen nanopartiküllerin biyouyumluluk ve immmünostimülan etkisi J774 makrofaj hücre hattında in vitro olarak değerlendirilmiştir. Prokaryotik ekspresyon sistemi ile (E. coli BL21 DE3 hücre hattında) rOmp25 proteinin yüksek miktarda üretimi aşamasında; Terrific Broth ortamının Lurian Bertani besiyerine göre yakla¸sık üç katlık miktar artı¸sına neden olduğu görülmüş ve benzer koşullar rEipB proteini için de uygulanmıştır. Üretilen rekombinant Omp25 ve EipB proteinlerinin biyouyumluluğunda önemli bir parametre olan endotoksin değerleri, sırasıyla; 1.125 ve 0.725 Eu/ml olarak tespit edilmiştir. Üretilen proteinlerin, biyobozunur polimer olan PLGA nanopartiküllerin içerisine enkapsülasyonu ikili emülsiyon (su/yag/su) çözücü buharlaştırma yöntemiyle hazırlandıktan sonra FE-SEM, FT-IR ve Zeta-sizer ile karakterize edildi. MTT testi ile hem protein hem de nanoformülasyonlarının sitotoksisiteleri değerlendirilerek, rOmp25'in 16µg/ml; rEipB'nin ise 64 µg/ml dozlarda sonraki deneyde kullanımı uygun görülmüştür. Tüm formülasyonların J774 makrofaj hattındaki nitrik oksit üretimi, incelenen en yüksek konsantrasyonda tek başına Omp25 proteinine maruziyette 17.13 nmol/ml iken, Omp25 yüklü nanopartiküller için 20.39 nmol/ml olarak ölçülmüştür. Benzer şekilde aynı konsantrasyonda tek başına EipB proteinine maruz bırakılan makrofajların ürettigi nitrik oksit seviyesi 18.14 nmol/ml iken, EipB yüklü nanopartiküller için 23.10 nmol/ml olarak ölçülmüştür. Rekombinant protein yüklü nanoformülasyonlarının, PLGA'dan dolayı nitrik oksit seviyelerini arttırması immünostimülan etkinin saglandığının göstergesidir. İleriki çalışmalarda üretilen bu formülasyonların birarada ve ayrı ayrı in vivo deneylerle aşı adayı potansiyellerinin değerlendirilmesi gerçekleştirilecektir.

Abstract:
Following the SARS-CoV-2 (COVID-19) pandemic, brucellosis, which is recognized worldwide as a re-emerging threat as highlighted in various media, is needed as a rational approach to eliminated using new vaccine technologies. In this thesis, the high-level production of Omp25 and EipB proteins with antigenic properties, possessing different chemical structures, was achieved via recombinant DNA technology, obtained from the genome of the endemic B. abortus biovar 3 strain in our country. Subsequently, the biocompatibility and immunostimulatory effect of nanoparticles produced by encapsulating rOmp25 and rEipB proteins into PLGA nanoparticles, known for their adjuvant properties,
were evaluated in vitro using the J774 macrophage cell line. Terrific Broth medium provided an approximately tri-fold increase in the production of high amounts of rOmp25 protein using the prokaryotic expression system (E. coli BL21 DE3 cell line) compared to other media, and similar conditions were applied for rEipB protein. The endotoxin values, an important parameter for the biocompatibility of the produced proteins, were determined to be 1.125 and 0.725 Eu/ml, respectively. After encapsulation of the recombinant Omp25 and EipB proteins into biodegradable PLGA nanoparticles using the double emulsion (water/oil/water) solvent evaporation method, they were characterized using FE-SEM, FT-IR, and Zeta-sizer. The cytotoxicities of both proteins and their nanoformulations were evaluated using the MTT assay, and the use of rOmp25 at a dose of 16 µg/ml and rEipB at a dose of 64 µg/ml was decided for the subsequent experiments. The nitric oxide production of all formulations in the J774 macrophage cell line showed an increase with exposure to Omp25 protein alone at the highest concentration, resulting in 17.13 nmol/ml, whereas it was measured at 20.39 nmol/ml for Omp25-loaded nanoparticles. Similarly, the nitric oxide level produced by macrophages exposed to EipB protein alone at the same concentration was 18.14 nmol/ml, while it was 23.10 nmol/ml for EipB-loaded nanoparticles. The increase in nitric oxide levels due to recombinant protein-loaded nanoformulations, attributed to PLGA, indicates the achievement of an immunostimulatory effect. In future studies, the evaluation of these formulations, both together and separately, as potential vaccine candidates will be conducted through in vivo experiments.