Periodontal rejenerasyon için Kitosan/nano-Hidroksiapatit/PCL bariyer membranların geliştirilmesi
Development of Chitosan/nano-Hydroxyapatite/PCL barrier membranes for periodontal regeneration
Yazar: ELİF SUNAL
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Bariyer membranları = Barrier membranes

Özet:
Bu çalışma 114M132 numaralı TÜBİTAK Projesi ve TÜBİTAK 2210-C Öncelikli Alanlara Yönelik Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı desteği ile hazırlanmıştır. Sunulan tez çalışmasının amacı mevcutlarından daha etkin özelliklere sahip yeni bir bariyer membranın geliştirilmesi ve geliştirilen membranın periodontal rejenerasyon amaçlı kullanım potansiyelinin incelenmesidir. 
Tez çalışmasının ilk aşamasında çözücü döküm-partikül uzaklaştırma yöntemi ile gözenekli kitosan membranlar üretilmiştir. Bu amaçla, 150-250 µm boyut aralığındaki silika partikülleri kitosan çözeltisine farklı oranlarda eklenmiş ve yeterli gözenekliliğe sahip bir membran elde edebilmek için çözeltiye eklenen silika miktarı optimize edilmiştir. NaOH ortamında farklı uygulama süreleri ile denemeler yapılarak silika partiküllerini membran yapısından tamamen uzaklaştırmak için gerekli süre belirlenmiştir. Sonuç olarak homojen ve içsel bağlantılı gözenekleri olan, ortalama 169.7±78.7 µm gözenek çapına sahip, gliserin muamelesi öncesindeki ve sonrasındaki kalınlığı sırasıyla; 408.6±42.2 µm ve 519.3±23.4 µm olan kitosan membranlar üretilmiştir. 
Çalışmanın sonraki aşamasında, hazırlanan kitosan membranın mekanik ve biyoaktiflik özelliklerini iyileştirmek için membranın gözenekli yüzeyi mikrodalga ışımasının etkisiyle sentetik vücut sıvısı (10xSBF) kullanılarak hidroksiapatit (HA) ile kaplanmıştır. Yüzeydeki ve gözeneklerin içerisindeki HA varlığı taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizi ile gösterilmiş ve membran yüzeyindeki kemik benzeri HA kaplamaya ait ortalama Ca/P (w/w) oranı EDX analizi ile 2.54±0.59 olarak hesaplanmıştır. HA kaplı membran yüzeyi kemik morfojenik proteini-6 (BMP-6) ile zenginleştirilerek, BMP-6'nın periodontal rejenerasyondaki etkinliği incelenmiştir. Membranın gözeneksiz yüzeyi epitel hücre göçünü engellemek ve yumuşak dokudaki inflamasyonu ortadan kaldırmak amacıyla elektroeğirme yönteminden faydalanarak optimize edilen koşullarda ağırlıkça %5, 10 ve 15 metronidazol (Mz) içeren poli-ɛ-kaprolakton (PCL) fiberler ile kaplanmıştır. Ortalama çapları 1 µm olan fiberlerin membran yüzeyinden kalkmadıkları ve Mz salımını gerçekleştirdikleri belirlenmiştir. Sonuç olarak 750.1±21.9 µm kalınlığında, şişme oranı 3.43±0.13, kuru ve ıslak haldeki çekme dayanımları sırasıyla; 0.948±0.123 MPa ve 0.418±0.053 MPa olan, lizozim ortamında 28 gün boyunca ağırlığında herhangi bir değişim gözlenmeyen bir bariyer membran (HA/Ch/PCL) üretilmiştir. 
Tez çalışmasının son aşamasında geliştirilen membranın sert doku ile temas edecek olan gözenekli yüzeyinin biyoaktivitesi MC3T3-E1 preosteoblastik hücre hattı ile in vitro koşullarda incelenmiştir. Hücre canlılığı ve üremesi PrestoBlue analizi, hücrelerin morfolojik özellikleri ise SEM ile değerlendirilmiştir. Hücre farklılaşması alkalen fosfataz (ALP) boyama ile belirlenmiştir. Hücrelerin osteojenik farklılaşma belirteçleri olan kollajen I, RunX2, osteokalsin ve osteopontin gen ifadeleri RT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) ile tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlar membran yüzeyinin hücre yapışmasını, çoğalmasını ve farklılaşmasını desteklediği yönündedir. Membranın yumuşak doku ile temas edecek olan yüzeyi ise in vitro koşullarda Madine Darby Bovine Kidney (MDBK) hücre hattı ile kültüre edilmiştir. Hücre canlılığı ve üremesi PrestoBlue analizi, hücrelerin morfolojik özellikleri ise SEM ile değerlendirilmiştir. Elde edilen sonuçlar membran yüzeyinin epitel hücre göçünü engellediği yönündedir. 
Sonuç olarak sunulan tez çalışmasında; biyobozunur, kolay bir şekilde manipüle edilebilen, kemik rejenerasyonunu destekleyen, epitel hücre göçünü engelleyen ve inflamasyonu ortadan kaldırabilecek bir bariyer membran geliştirilmiştir.

Anahtar kelimeler: Yönlendirilmiş doku rejenerasyonu, kitosan, hidroksiapatit, BMP-6, elektroeğirme, metronidazol.

Abstract:
This thesis was prepared with the supports of 114M132 TÜBİTAK project and TÜBİTAK 2210-C Primary Subject Scholarship for National Master Program. The aim of the present study is to develop a new barrier membrane that is more effective than currently used membranes and investigate its potential for periodontal regeneration.
In the first stage of the study, porous chitosan membranes were produced by solvent casting-particle leaching method. For this purpose; silica particles having the size of 150-250 µm were added into the chitosan solution with different ratios. In order to obtain a membrane having sufficient porosity, the amount of silica added to chitosan solution and also silica leaching period were optimized. Consequently, the chitosan membranes were found to have homogenous and interconnected porous structure with the average pore size of 169.7±78.7 µm. The thickness of the produced membranes increased from 408.6±42.2 µm to 519.3±23.4 µm as due to the glycerine treatment.
In order to enhance the mechanical and bioactive properties of the membranes, the porous surface of membrane was coated with hydroxyapatite (HA) through the application of microwawe radiation by using concentrated simulated body fluid (10xSBF). The presence of HA on the surface and within the pores was designated through scanning electron microscopy (SEM) and the average Ca/P (w/w) ratio referring to HA coating was calculated by means of EDX analysis as 2.54±0.59. The HA coated membrane was also enriched with bone morphogenetic protein-6 (BMP-6). In order to inhibit epithelium cell migration and to eliminate inflammation in soft tissue nonporous surface of the membrane was coated in optimised conditions with poly-ɛ-caprolactone (PCL) electrospun fibers having, 5, 10, 15 % (w/w) antibacterial agent, metronidazole (Mz). The fibers having the diameters of approx. 1 µm were strongly attached to the membrane surface and performed Mz release. The result membrane including HA coating and PCL fiber coating (HA/Ch/PCL) was detected to have the thickness of 750.1±21.9 µm, swelling ratio of 3.43±0.13, dry and wet tensile strength of 0.948±0.123 MPa and 0.418±0.053 MPa, respectively.
In the last stage of this study, the bioactivity of HA coated surface of membrane having contact with hard tissue, was investigated by MC3T3-E1 preosteoblastic cell line in vitro conditions. The cell viability and proliferation were evaluated by PrestoBlue analysis and the morphological examination was evaluated with SEM. Differentiation of cells was determined with alkaline phosphatase (ALP) staining. The osteogenic differentiation indicators like collagen I, RunX2, osteocalcin and osteopontin gene expressions were determined through RT-PCR (real time polymerase chain reaction). The results indicates that the membrane surface supports adhesion, proliferation and differentiation of the cells. The other surface of the membrane having contact with soft tissue was cultured with Madine Darby Bovine Kidney (MDBK) cell line in vitro conditions. The results of Presto Blue analysis and SEM demonstrate that, the membrane surface inhibits ephitelial cell migration.
In conclusion, in this thesis a novel barrier membrane having periodontal regeneration potential was developed with the following properties: biodegradable, easily manipulated, supporting bone regeneration, inhibiting ephitelial cell migration and enabling to eliminate inflammation.

Keywords: Guided tissue regeneration, chitosan, hydroxyapatite, BMP-6, electrospinnig, metronidazole.