Oligotrofik bakteriler yardımıyla düşük maliyetli rekombinant termostabil enzim üretimi
Low-cost recombinant thermostable enzyme production using oligotrophic bacteria
Yazar: MUSTAFA TANKUŞ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AHMET KATI
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Hamidiye Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Amaç: Endüstride üretilen enzimlerin girdi maliyetinin büyük kısmı besiyeri kaynaklıdır. Düşük konsantrasyonlarda gelişme ve üreme yeteneği olan oligotrofik bakteriler, besiyeri maliyetini düşürmek için mükemmel bir potansiyel taşımaktadır. Endüstride Taq DNA polimeraz üretimi için standartlaştırılmış suşlara alternatif olarak oligotrofik bakterilerin kullanılması besiyeri maliyetlerinin azaltılmasını sağlayacaktır. Çalışma kapsamında düşük besiyeri konsantrasyonunda büyüme yeteneğine sahip oligotrofik bakteriler aracılığıyla yapılan fermantasyon sayesinde besiyeri maliyetini azaltarak termostabil Taq DNA polimeraz üretimi yapılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Çevresel izolatlardan oligotrofik bakteri seçimi yapıldı. Seçilen organizma 16S rRNA dizilemesi ile Klebsiella oxytoca olarak tanımlandı. Kompetent hale getirildikten sonra sonra satın alınan Taq DNA polimeraz kodlayan plazmitlerin oligotrofik K.oxytoca'ya transformasyonu gerçekleştirildi. İlgili enzimlerin laboratuvar koşullarında ve büyük hacimde oligotrofik bakterideki ekspresyon, saflaştırma ve aktivite deneyleri gerçekleştirilerek oligotrofik bakterinin rekombinant DNA teknolojisindeki kullanılma potansiyeli incelendi.
Bulgular: Taq DNA polimeraz enzimi, laboratuvar ölçeğinde standart besiyerinde, endüstriyel ölçekte standart besiyeri ve 1:10 oranında seyreltilmiş LB'de ekspresyon analizi ve iki farklı tampon çözeltisinde aktivite deneyleri gerçekleştirildi. Bu çalışmalar neticesinde K.oxytoca Taq DNA'nın eksprese edildiği, ölçek büyütme çalışmaları neticesinde biyoreaktör üretimine uygun olduğu tespit edilmiştir. Çalışmada kullanılan plazmitteki Taq DNA polimeraz enzimi kontrol suşu olan E.coli'de ve K.oxytoca'da başarılı şekilde eksprese edilmiştir. Özellikle oligotrofik K.oxytoca'nın ekspresyen kabiliyeti önemli bir bulgu olarak ortaya çıkmıştır. Ancak Taq DNA polimeraz'ın PCR aktivitesi farklı tampon çözeltileri denenmesine rağmen K.oxytoca'da pozitif sonuç vermemiştir.
Sonuç: Oligotrofik bakteride eksprese edilen Taq DNA polimerazın ileride yapılacak çalışmalar sonucunda aktivite gösteren ve ticari açıdan verimli Taq DNA polimeraz üretimi sağlanabilecektir.

Abstract:
Purpose: Most of the input cost of industrially produced enzymes originates from the medium. Oligotrophic bacteria, which are capable of growing and reproducing at low concentrations, have excellent potential to reduce medium costs. Using oligotrophic bacteria as an alternative to standardized strains for Taq DNA polymerase production in industry will reduce medium costs. Within the scope of the study, it was aimed to produce thermostable Taq DNA polymerase by reducing the cost of the medium through fermentation by oligotrophic bacteria capable of growing in low medium concentration.
Materials and Methods: Oligotrophic bacteria were selected from environmental isolates. The selected organism was identified as Klebsiella oxytoca by 16S rRNA sequencing. After becoming competent, the purchased Taq DNA polymerase-encoding plasmids were transformed into oligotrophic K.oxytoca. Expression, purification and activity experiments of the relevant enzymes in laboratory conditions and in large volumes of oligotrophic bacteria were carried out to examine the potential of oligotrophic bacteria to be used in recombinant DNA technology.
Results: Expression analysis of Taq DNA polymerase enzyme was carried out in standard medium on a laboratory scale, in standard medium on an industrial scale and in LB diluted at a ratio of 1:10, and activity experiments were carried out in two different buffer solutions. As a result of these studies, it was determined that K.oxytoca Taq DNA was expressed and was suitable for bioreactor production as a result of scale-up studies. The Taq DNA polymerase enzyme in the plasmid used in the study was successfully expressed in the control strain E.coli and K.oxytoca. In particular, the expression ability of oligotrophic K.oxytoca emerged as an important finding. However, the PCR activity of Taq DNA polymerase did not give positive results in K.oxytoca despite trying different buffer solutions.
Conclusion: As a result of future studies of Taq DNA polymerase expressed in oligotrophic bacteria, active and commercially efficient Taq DNA polymerase production will be possible.