Terapötik bir enzim olan L-asparajinazın deniz kaynaklı filamentöz fungus suşlarından üretimi ve kısmi karakterizasyonu
Production and partial characterization of a therapeutic enzyme, L-asparaginase, from marine filamentous fungal strains
Yazar: ZEYCAN NURÇE
Danışman: PROF. DR. ELİF ESİN TUNA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Aspergillus flavus = Aspergillus flavus ; Glutaminaz = Glutaminase ; Hücre dışı enzimler = Extracellular ezymes ; Küf mantarları = Mould fungus ; Mikrobiyal enzimler = Microbial enzymes ; Üreaz = Urease

Özet:
Çeşitli kanser hastalıklarında yüksek terapötik etkiye sahip olan L-asparajinaz, L-asparajini aspartat ve amonyağa hidroliz ederek anti-tümör etki gösterir ve özellikle lösemi tedavisinde kullanılmaktadır. Sağlıklı hücreler ortamda asparajin olmadığında L-asparajini sentezleyebilirken tümör hücreleri bu işlemi gerçekleştiremez dolayısıyla besin yetersizliği ve protein sentezinin inhibisyonu nedeniyle ölürler. Günümüzde klinik uygulamalarda kullanılan bakteriyal kökenli L-asparajinaz başta anaflaksi olmak üzere çeşitli yan etkilere sahiptir. Aynı zamanda enzimin, glutaminaz ve üreaz aktivitelerinin olması da başka yan etkilere neden olmaktadır. Glutaminaz, sağlıklı hücreler için gerekli olan glutamini parçalarken, üreaz ise kanda bulunan ürenin hidrolizine dolayısıyla amonyak artışına neden olmaktadır. Günümüzde yan etkileri daha az, glutaminaz ve üreaz negatif bir L-asparajinaza ihtiyaç duyulmaktadır.
Bu tez çalışmasında, deniz kaynaklı filamentöz fungusların glutaminaz ve üreaz negatif özellikte L-asparajinaz üretme potansiyellerinin değerlendirilmesi, aday üreticiye ait enzimin kısmi saflaştırma ve karakterizasyonu amaçlanmaktadır. Bu kapsamda, 94 adet deniz kaynaklı filamentöz fungus L-asparajinaz aktivitesinin belirlenmesi için hızlı plaka tarama yöntemiyle taranmıştır. Ardından L-asparajinaz üreticisi olduğu belirlenen 89 adet fungus glutaminaz ve üreaz aktivitesi için taranmış ve 4 aday üretici (Penicillum crustosum MF5, Aspergillus flavus MF10, Penicillum canescens MF20, Cladosporium cladosporioides MF75) seçilmiştir. Küçük ölçek fermantasyon çalışması ile asparajinaz aktivitesi 2,82 U/mL ile en yüksek A. flavus MF10 ile elde edilmiştir. L-asparajinazı hücre dışı ürettiği de belirlenen A. flavus MF10'un fermantasyon sıvısı ultrafiltrasyon ile konsantre edilmiş ardından aseton çöktürmesi gerçekleştirilmiştir. Kısmi saflaştırma ile 4,8 kat saflaştırılan enzimin spesifik aktivitesinin 259 U/mg, molekül ağırlığının yaklaşık 100 kDa olduğu belirlenmiştir. Fermantasyon sıvısında üreaz ve glutaminaz aktiviteleri belirlenmezken konsantre edilen preparatta düşük glutaminaz aktivitesi (1,27 U/mL) belirlenmiş ancak üreaz aktivitesi tespit edilmemiştir. Kısmi karakterizasyon çalışmaları ile enzimin optimum sıcaklığı 40°C, optimum pH'ı ise 8,0 olarak belirlenmiştir. Enzimin bir saat sonunda 40°C'de aktivitesini %70 koruyabildiği ve sıcaklık arttıkça kademeli olarak aktivitesini kaybettiği belirlenmiştir. Enzimin pH stabilitesi çalışması ile pH 7 ve 8'de aktivitesini koruduğu belirlenmiştir. Kısmi olarak saflaştırılan L-asparajinazın (100 µg protein/mL) sağlıklı ve kanser hücre hatlarında sitotoksisitesi değerlendirilmiş ve 24 saat sonunda SH-SY5Y (insan nöroblastom hücre hattı) hücrelerinin canlılığını %43'e, LNCap (insan prostat kanser hücre hattı) hücrelerinin canlılığını ise %61'e düşürürken sağlıklı hücre hattı olan L929 (fibroblast hücre hattı) hücrelerinde sitotoksik etki göstermemiş ve HaCaT (keratinosit hücre hattı) hücrelerinde ise düşük sitotoksisite gösterdiği belirlenmiştir.

Abstract:
L-asparaginase, which has a high therapeutic effect in various cancer diseases, hydrolyzes L-asparagine to aspartate and ammonia, has an anti-tumor effect and is especially used in the treatment of leukemia. While healthy cells can synthesize asparagine when there is no asparagine in the environment, tumor cells cannot perform this process, so they die due to nutrient deficiency and inhibition of protein synthesis. Bacterial L-asparaginase, which is used in clinical applications today, has various side effects, especially anaphylaxis. In addition, the presence of glutaminase and urease activities of the enzyme also causes other side effects. Glutaminase breaks down glutamine, which is necessary for healthy cells, while urease causes hydrolysis of urea in the blood, thus increasing ammonia. Today, there is a need for a glutaminase and urease negative L-asparaginase with less side effects.
In this thesis, it is aimed to evaluate the glutaminase and urease negative L-asparaginase production potential of marine filamentous fungi and to partial purification and characterization of the enzyme of the selected strain. In this context, 94 marine filamentous fungi were screened by rapid plate screening method to determine L-asparaginase activity.  Then, 89 fungi determined to be L-asparaginase producers were screened for glutaminase and urease activity and 4 candidate producers (Penicillum crustosum MF5, Aspergillus flavus MF10, Penicillum canescens MF20, Cladosporium cladosporioides MF7) were selected. In a small scale fermentation study, the highest asparaginase activity was obtained with A. flavus MF10 with 2.82 U/mL. Extracellular L-asparaginase produced by A. flavus MF10 was concentrated by ultrafiltration followed by acetone precipitation. It was determined that the specific activity of the enzyme, which was purified 4,8 times by partial purification, was 259 U/mg and its molecular weight was approximately 100 kDa. While urease and glutaminase activities were not determined in the fermentation broth, low glutaminase activity (1.27 U/mL) was determined in the concentrated preparation, but urease activity was not detected. With partial characterization studies, the optimum temperature of the enzyme was determined as 40°C and the optimum pH was determined as 8.0. It was determined that the enzyme could maintain its activity 70% at 40°C after one hour and gradually lost its activity as the temperature increased.  It has been determined that the enzyme maintains its activity at pH 7 and 8 by pH stability study. The cytotoxicity of partially purified L-asparaginase in healthy and cancer cell lines was evaluated and their viability was determined after 24 hours compared to the control. While the enzyme preparation decreased the viability of SH-SY5Y (human neuroblastoma) cells to 43% and the viability of LNCap (human prostate cancer) cells to 61%, it did not show cytotoxic effects in healthy cell line L929 (fibroblast) cells. It was determined that it showed low cytotoxicity in HaCaT (keratinocyte) cells.