Isparta kiraz üretim alanlarında görülen önemli virüslerin serolojik ve moleküler yöntemlerle teşhisi ve kılıf protein gen dizilimlerinin belirlenmesi
Detection of important viruses on cherry production region of Isparta by serological, moloculer methods and determination of coat protein gene sequences
Yazar: YUSUF ÖZTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. BAYRAM ÇEVİK
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Bitki koruma = Plant protection ; Bitki virüsleri = Plant viruses

Özet:
Kiraz dünyada ve ülkemizde ekonomik önemi yıldan yıla artan bir meyve türüdür. Kirazda ekonomik kayıplara yol açan çok sayıda virüs hastalığı bulunmaktadır. Bu virüsler içerisinde Elma mozaik virüsü (Apple mosaic virus, ApMV), Prunus nekrotik halkalı leke virüsü (Prunus necrotic ring spot virus, PNRSV), Erik cüceleşme virüsü (Prune dwarf virus, PDV) Şarka virüsü ( Plum pox virus, PPV) ve Elma klorotik yaprak leke virüsü (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) ülkemizde ve dünyada sert çekirdekli meyvelerde en yaygın görülen virüslerdir. Bu çalışma da ülkemizin kiraz üretiminde önemli bir yere sahip olan Isparta ilinin 10 ilçesindeki 142 kiraz bahçesinde ApMV, PDV, PNRSV, CLRV, ACLSV ve PPV'nin varlığı double antibody sandwich ? enzyme linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) ve ters traskripsiyon polymeraz zincir reaksiyon (Polymerase chain reaction (RT-PCR) yöntemleri ile araştırılmış, belirlenen bazı izolatların biyolojik ve moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Sert çekirdekli meyve ağaçlarında görülen bu 6 virüsün varlığını belirlemek amacıyla 521 kiraz yaprak örneği öncelikle DAS-ELISA yöntemiyle test edilmiştir. ELISA testi sonucunda 269'u PDV, 23'ü ACLSV, 7'si PNRSV, 36'sı PDV+ACLSV, 8'i PDV+PNRSV, 1'i PDV+ApMV, 3'ü ACLSV+PNRSV, 2'si PDV+PNRSV+ApMV olmak üzere toplamda 349 örnek virüslerle enfekteli bulunmuştur. PDV en sık görülen virüs olurken CLRV ve PPV hiç bir örnekte tespit edilememiştir. ELISA sonuçlarında şüpheli veya pozitif çıkan örneklerin bir kısmına bölgeleri ve virüsleri temsil edecek şekilde seçilerek total RNA izolasyonu yapılmıştır. RNA izolasyonundan sonra, PDV, PNRSV, ACLSV, kılıf protein (CP) genlerini içeren bölge RT-PCR yöntemiyle çoğaltılmıştır. 22 PDV, 5 PNRSV ve 7 ACLSV izolatından sırasıyla 862 bç, 616 bç ve 677 bç büyüklüğünde hedeflenen bölgeye spesifik DNA'lar çoğaltılmıştır. Ancak test edilen PPV, CLRV ve ApMV örneklerinin hiç birinde virüslere spesifik bant çoğaltılamamıştır. RT-PCR yöntemiyle çoğaltılan PDV, PNRSV ve ACLSV'ye ait bantlar saflaştırılarak doğrudan dizileme için kullanılmıştır. Dizileme sonucunda bu virüslere ait CP genlerinin nükleotid dizileri ve kodladıkları amino asit dizilimleri belirlenmiştir. Bu diziler karşılaştırılıp analiz edilerek Isparta ili'nin farklı ilçelerinden elde edilen PDV, PNRSV ve ACLSV izolatlarının birbirleriyle ve dünyanın farklı üretim bölgelerinden izolatlarla benzerlik oranları ve filogenetik ilişkileri ortaya konulmuştur. Buna göre PDV, PNRSV ve ACLSV Isparta izolatları sırasıyla %86-98 ile %82 -%99, %86-99 ile %89-100 ve %80-98 ile %88-%100 arasında değişen oranlarda kılıf protein genlerinin nükleotid ve amino asit diziliminde benzerlik olduğu bulunmuştur. Nükleotid dizilimine göre ACLSV Isparta izolatı en fazla benzerliği Yunanistan'dan kiraz izolatı ile gösterirken, PNRSV Isparta izolatları en çok benzerliği Çek Cumhuriyeti kiraz ve vişne, Polanya, ABD ve Şili'den kiraz izolatlarıyla, Türkiye'den ise şeftali izolatlarıyla göstermiştir. PDV Isparta izolatları ise en fazla benzerliği ABD ve İsrail'den kiraz ve İtalya'dan badem izolatları ile göstermiştir. Amino asit dizilimine göre ise ACLSV Isparta izolatı en çok benzerliği Yunanistan'dan kiraz izolatı ile gösterirken, PNRSV Isparta izolatı daha çok Tunus'tan şeftali ve Polanya'dan kiraz izolatıyla benzerlik göstermiştir. PDV Isparta izolatlarına en çok benzerlik gösterenler ise İtalya ve Polanya'dan vişne ve İtalya'dan badem izolatları olmuştur. Filogenetik analizler sonucunda ACLSV izolatlarının çoğrafik bölgelere ve konukçuya göre gruplandığı ve Isparta izolatların Avrupa izolatlarıyla gruplanarak Avrupa kaynaklı olabileçeğini gösterirken PNRSV ve PDV izolatlarının filogenetik analizleri coğrafik bölge ve konukçuya göre gruplanmadığını göstermiştir. Tespit edilen izolatların bazıları biyolojik karakterizasyonu amacıyla otsu ve odunsu test bitkilerine inokülasyonları yapılmıştır. Yapılan inokülasyon çalışmalarında PDV izolatları mekanik olarak inoküle edilen otsu bitkilerden Nicotiana occidentalis'de, PNRSV ve ACLSV izolatları ise aşılanarak inokülasyon yapılan odunsu Bing kiraz çeşidinde virüslere özgü belirtiler göstermişlerdir.Anahtar Kelimeler: Kiraz, PDV, PNRSV, ACLSV, CLRV, ApMV, PPV, kılıf protein geni, filogenetik analiz

Abstract:
Sweet Cherry is an important fruit species with increasing economic value in Turkey and the world but a number of viruses cause diseases and economic losses in sweet cherry. Apple mosaic virus (ApMV), Prunus necrotic ring spot virus (PNRSV), Prune dwarf virus (PDV), Plum pox virus (PPV) and Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) are the most commonly viruses in stone fruits in Turkey and the world. In this study the presence of ApMV, PDV, PNRSV, CLRV, ACLSV, PPV was determined in 142 sweet cherry orchard of 10 district of Isparta province by double antibody sandwich ? enzyme linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) methods and biological and molecular characteristics of some of these isolates were determined. A total of 521 sweet cherry leaf samples were first tested for the presence these 6 viruses commonly found in stone fruits by DAS-ELISA method. ELISA test showed that 349 of 521 samples tested were infected with folowing virus(es); 269 with PDV, 23 with ACLSV, 7 with PNRSV, 36 with PPV+ACLSV, 8 with PDV+PNRSV, 1 with PDV+ApMV, 3 with ACLSV+PNRSV and 2 with PDV+PNRSV+ApMV. While PDV was the most wide spread virus, CLRV and PPV were not detected in any of samples tested. Some of the sample to represent different growing region and found to be infected or suspicious in ELISA were chosen selected and total RNA was isolated from these samples. After RNA isolation, the genomic region containing the coat protein (CP) regions of PDV, PNRSV, ACLSV were amplified by RT-PCR method. A spesific DNA fragment in the size of 862 bp, 616 bp and 677 bp were amplified from the targeted region containing the CP gene of 22 PDV, 5 PNRSV, 7 ACLSV isolates, respectively. However, no PPV, CLRV and ApMV specific DNA was amplified from the tested samples by RT-PCR method. PDV, PNRSV and ACLSV specific DNA fragments amplified by RT-PCR were purified and used for direct sequencing. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of the region containing the CP gene of PDV, PNRSV and ACLSV were determined. These sequences PDV, PNRSV, ACLSV isolates from different production regions were compared with each other and other isolates from different stone fruit growing regions of the world and phylo-genetic relations among these isolates were also determined. Sequence comparisons of Isparta PDV, PNRSV and ACLSV, isolates showed %86-98 to, %82-%99, %86-99 to, %89-100 and %80-98 to %88-%100. Similarity among nucleotide and amino acid sequences of the CP genes respectively. Based on the nucleotid sequences while Isparta ACLSV isolate was most similar to sweet cherry isolate Greece, PNRSV Isparta isolates were most similar to sweet chery isolate from the Czech Republic from the United States, Poland and sweet cherry from Chile and was a peach isolate fromTurkey. The amino acid sequence of PDV Isparta isolates was more similar to sweet cherry isolates from the USA and Israel and almond isolates from Italy. The amino acid sequences of ACLSV Isparta isolates were most similar to Greece sweet cherry isolates. PNRSV Isparta isolates were evaluated similar to Tunusian peach isolates and sweet cherry isolates from Poland. Sour cherry isolates from Italy and Poland and almond isolate from Italy were most similar to PDV Isparta isolates. Based on the phylogenetic analyses, while ACLSV isolates were grouped geographically and host with europaean isolates; PNRSV and PDV Isparta isolates were not group based on the geogrophic location and host. Some of the selected isolates were inoculated to annual and perennial test plants for biological characterization. Inoculation studies showed that PDV isolates induced symptoms in Nicotiana occidentalis mechanically inoculated PNRSV, ACLSV isolates grafted inoculated on Bing sweet cherry variety and showed typically symptoms.Key Words: Sweet cherry, PDV, PNRSV, ACLSV, CLRV, ApMV, PPV, Coat protein gene, phylogenetic analysis