Mycobacterium tuberculosis man-lam antijeninin fibroblast-makrofaj kokültür modelinde makrofaj polarizasyonuna etkisinin araştırılması
Investigation the effect of mycobacterium tuberculosis man-lam antigen on fibroblast–macrophage coculture model to the macrophage
Yazar: NURHAN ALBAYRAK
Danışman: PROF. DR. EMİN ÜMİT BAĞRIAÇIK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İmmünoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases
Dizin: Antijenler = Antigens ; Fibroblastlar = Fibroblasts ; Makrofajlar = Macrophages ; Mycobacterium = Mycobacterium ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis

Özet:
Makrofajlar Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonuna karşı korunmada ana bileşendir. M. tuberculosis mannoz-kaplı lipoarabinomannanı (Man-LAM) ile makrofaj reseptörlerinin etkileşimi, makrofaj işlevini düzenlemektedir. Bu çalışmada, granülom formasyonunda enfeksiyonu sınırlama işlevi olan fibroblastların Man-LAM ile uyarımı takiben makrofaj polarizasyonuna etkisinin kokültür modelinde araştırılması amaçlanmıştır. Man-LAM M. tuberculosis H37Rv standart suşundan izole edildi. 3T3 fare fibroblast ve J774.1 fare makrofaj hücre dizinleri kokültür çalışmalarında kullanıldı. 3T3 ve J774.1 hücreleri üç farklı şekilde Man-LAM ile uyarıldı; tek başlarına, temas halinde ve 0,4 µm por çaplı naylon membran filtre ile temassız olarak. Ayrıca hücreler tüm bu üç konfigürasyonda TLR-2 antagonistleri ile bloklandı. İnkübasyonun 18'inci saatinde süpernatant sitokin analizi için toplandı. Yirmidördüncü saatte toplanan hücrelerden akım sitometri ile CD11b, CD80, CD86, MHC sınıf II, CD103, CD44, CD62L, CD107b yüzey molekül ekspresyonlarınının analizi yapıldı. Man-LAM ile uyarılan makrofajların, fibroblast varlığında M1 makrofaj fenotipi ile ilişkili İL-12 ve TNF-α sitokinlerini oluşturduğu gözlendi. Bu etkinin tümüyle hücre – hücre temasına bağlı olmadığı saptandı. Ayrıca Man-LAM ile uyarımın M2 makrofaj fenotipi ile ilişkili TGF-β ve İL-10 üretiminde azalmaya neden olduğu saptandı. Ek olarak, immün düzenleyici sitokin İL-33 üretiminin fibroblast ve makrofaj kokültür modellerinde arttığı tespit edildi. Akım sitometri analizi için makrofaj hücreleri ilk önce CD11b ile karakterize edildi. Man-LAM ile uyarımı takiben CD11b+ makrofaj hücrelerinin MHC sınıf II ve CD86 ekspresyonlarının fibroblast varlığında devam ettiği gösterildi. Bulgular, fibroblastların Man-LAM ile uyarılması sonucu makrofajların M1 fenotipine farklılaştığını ve fibroblastın makrofajı aktive ederek yanıt verdiğini gösterdi. Ayrıca bu etkinin TLR-2'nin bloklanmasından sonra arttığı saptandı. Fibroblastların granülom formasyonunda makrofajların polarizasyonunu ve aktivasyonunu etkileyerek immünolojik olarak aktif rol aldığı, TLR-2'nin Man-LAM ile uyarımı takiben immün modülatör etkiye sahip olduğu kanısına varılmıştır.

Abstract:
Macrophages play an essantial role in protection to Mycobacterium tuberculosis infection. Interactions between M. tuberculosis mannose-capped lipoarabinomannan (Man-LAM) and macrophage receptors modulate macrophage functions. In this study, we aimed to evaluate the effect of the fibroblast, the cells play restrictive function in granuloma formation, effects on the macrophage polarisation in a coculture model after stimulation with Man-LAM. Man-LAM were isolated from M. tuberculosis H37Rv standart strain. 3T3 mouse fibroblast cell line and J774.1 mouse macrophage cell line were used in the coculture studies. The cells treated with Man-LAM in three different conditions; alone, together and together with an 0.4 µm pore size nylon membrane filter. And, cells also treated with TLR-2 antagonist in all conditions with and without Man-LAM. After 18 hour incubation, supernatant collected for cytokine analysis, and after 24 hour incubation the cells measured for CD11b, CD80, CD86, MHC class II, CD103, CD44, CD62L, CD107b cell surface receptor with flow cytometry. Macrophages incubated with Man-LAM in the presence of fibroblast after a period of cell incubation produced IL-12 and TNF-α cytokines that are the markers of the M1 macrophages. This effect is not fully in a cell contact dependent manner. Also the M2 macrophage marker TGF-β decreased after stimulation of the coculters induced by Man-LAM in both coculture situation.  In addition, the immonomodulatory cytokine IL-33 increased in the coculture models after treatment with Man-LAM. After treatment with Man-LAM, CD11b+ macrophage cells MHC class II and CD86 expression were maintained in the presence of fibroblast. The results demonstrated that, the fibroblasts had an effect on the macrophage M1 polarization and macrophage activation. And also the proinflamatory effect of Man-LAM increased after blocking the TLR-2. It is suggested that, fibroblasts had a very important and immunologically active role in the granuloma formation by leading the macropage polarisation, and activation and TLR-2 had an immunomodularory function on macrophages after stimulation of fibroblast and macrophages with Man-LAM.