Kars yöresinde insanlarda üriner sistem enfeksiyonlarından izole edilen escherichia coli ve klebsiella pneumoniae suşlarında CTX-m, tem ve SHV tipi genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz aktivitesinin otomatize ve moleküler yöntemlerle araştırılması
Investigation of CTX-M, tem and SHV TYPE extended spectrum beta-lactamase activity by automated and molecular methods in escherichia coli and klebsiella pneumoniae strains isolated from urinary track infections in humans in Kars Region, Turkey
Yazar: SİBEL DENİZ
Danışman: DOÇ. DR. FATİH BÜYÜK
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Beta laktamazlar = Beta lactamases ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Kars = Kars ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Üriner sistem enfeksiyonları = Urinary tract infections ; İdrar = Urine

Özet:
Genişlemiş Spektrumlu Beta-Laktamazlar (GSBL), penisilinler, sefalosporinler, monobaktamlar ve karbapenemler gibi beta-laktam antibiyotikleri hidrolize ederek inaktif hale getiren enzimlerdir. Bu enzimler, Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae gibi Enterobacteriaceae üyeleri arasında yaygın görülmektedir. İnsanlarda başta üriner sistem enfeksiyonları olmak üzere lokal enfeksiyonlar, bakteriyemi ve solunum sistemi enfeksiyonları oluşturarak ciddi sağlık sorunlarına yol açmaktadır. Yol açtığı enfeksiyonların yanı sıra çoklu ilaç direncine sahip bu etkenler tedavide başarısızlıkların temel nedeni olarak görülmektedir. GSBL üreten etkenlerin teşhisinde tanısal performansı değişkenlik gösteren çeşitli difüzyon yöntemleri ve otomatize identifikasyon sistemleri kullanılmaktadır. Teşhiste, ilaç direncine neden olan enzim ve hatta enzimi kodlayan gen bölgeleri düzeyinde saptayan PCR temelli moleküler tekniklerden de faydalanılmaktadır. Bu çalışmada, Kars Harakani Devlet Hastanesi'ne idrar yolları yakınması ile başvuran bireylere ait idrar örneklerinden izole edilen E. coli ve K. pneumoniae suşları arasında GSBL enzim üreten suşların moleküler yöntemlerle araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, Nisan-Ağustos 2019 tarihleri arasında örneklenen 5000 idrar örneği dahil edilmiştir. Örnekler, Mac Conkey ve %7 koyun kanlı agarda kültüre edildikten sonra elde edilen izolatların BD Phoenix™ 100 otomatize sisteminin ID paneli ile identifikasyonu yapılmıştır. İzolatların antibiyotik duyarlılıkları ve GSBL aktiviteleri BD Phoenix™ 100 sisteminin AST paneli ile gerçekleştirilmiştir. İzolatların GSBL aktivitesinden sorumlu CTX-M, TEM ve SHV genleri single-step PCR ile analiz edilmiştir. Veriler, IBM SPSS Statistic 22.0 programı ile analiz edilmiş ve yorumlanmıştır. İdrar örneklerinden %19,5 oranında aerobik bakteriyel etken kültür pozitifliği elde edilmiş ve bunların 120 (%13,33)'sinin GSBL aktivitesi olduğu saptanmıştır. GSBL pozitif izolatların 102 (%85)'si E. coli ve 14 (%11,67)'ü K. pneumoniae olarak identifiye edilmiştir. GSBL pozitifliği toplamda idrar örneklerinde %2,4, bakteri özelinde ise E. coli ve K. pneumoniae için sırasıyla %2,04 ve %0,28 olarak belirlenmiştir. İzolatların beta laktam grubu antibiyotiklere toplam direnci %57,46 olurken en yaygın dirençlilik sefalosporinlere (%92,53) ve en yaygın duyarlılık (%47,19) ise karbapenemlere karşı saptanmıştır. Bakteri özelinde, E. coli izolatlarının en (%100) dirençli olduğu antibiyotik Ampisilin ve Sefiksim, en (%99,02) duyarlı olduğu antibiyotik ise Imipenem olmuştur. K. pneumoniae izolatlarının ise en (%100) dirençli olduğu antibiyotik Ampisilin, Aztreonam, Sefiksim, Sefepim ve Seftriakson, en (%92,86) duyarlı olduğu antibiyotik türü ise Imipenem ve Meropenem olmuştur. PCR ile GSBL pozitif izolatların %90,52'inde en az bir veya birden fazla direnç geni saptanmıştır. Hem toplamda (%78,45) hem de bakteri özelinde (E. coli için %80,39 ve K. pneumoniae için %64,29) en yaygın saptanan direnç geni CTX-M olmuştur. Bunu %60,34 (E. coli için %61,76 ve K. pneumoniae için %50) ile SHV ve %49,14 (E. coli için %50 ve K. pneumoniae için %42,86) ile TEM izlemiştir. GSBL pozitif izolatların 29'unda CTX-M ve SHV, 16'sında CTX-M ve TEM, 9'unda TEM ve SHV ve 30'unda CTX-M, TEM ve SHV genleri eş zamanlı saptanmıştır. PCR ile saptanan GSBL genleri toplamda ve gen özelinde tanımlanan bakteri türleri arasında ilişkili saptanamamıştır. Fakat gerek bireysel gerekse kombine GSBL genlerini taşıyan izolatlarda (E. coli ve K. pneumoniae) penisilin ve sefalosporin dirençliliği ve karbapenem duyarlılığı daha fazla saptanmıştır. İzolatların elde edildiği hastaların %57,8'ini kadın ve %42,2'sini erkeklerden oluşmakta olup, kadınlarda GSBL pozitifliği en fazla 24 yaş ve altı, erkeklerde ise 65 ve üzeri hastalarda saptanmıştır. GSBL pozitif E. coli ile yaş arasında benzer durum söz konusu olup, K. pneumoniae ise en fazla 25 ile 44 yaş arası hastalarda, erkeklerde ise 65 ve üzeri hastalarda saptanmıştır. GSBL pozitifliği ile yaş grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanamazken, hastaların cinsiyetleri arasında %21,9 oranında pozitif yönde bir ilişki saptanmıştır. Sonuç olarak, GSBL kaynaklı enfeksiyonların insidansının azaltılmasında risk faktörlerinin ortadan kaldırılmasının yanı sıra enfeksiyöz etkenlerin identifikasyonu, ilgili GSBL profillerinin çıkarılması ve bu modellerine göre geliştirilecek doğru antibiyotik tercihi oldukça önemlidir. Sınırlı bir lokasyonda, Kars yöresinde, insanlarda üriner sistem enfeksiyonlarına yol açan GSBL üreten mikroorganizmalar üzerine gerçekleştirilen bu sistematik çalışmanın bu yönde fayda sağlayacağı umulmaktadır.

Abstract:
Extended-Spectrum Beta-Lactamases (ESBL) are enzymes that hydrolyze and inactivate beta-lactam antibiotics such as penicillins, cephalosporins, monobactams and carbapenems. These enzymes are common among Enterobacteriaceae members such as Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. ESBLs cause serious health problems by leading local infections, bacteremia and respiratory system infections, primarily urinary system infections in humans. In addition to the infections it causes, the agents with multiple drug resistance are seen as the main cause of treatment failures. Different diffusion methods and automated identification systems with varying diagnostic performance are used in the diagnosis of the agents producing ESBL. The diagnosis also utilizes PCR-based molecular techniques that detect the enzyme causing drug resistance and even at the level of gene regions encoding the enzyme. In this study, it was aimed to investigate ESBL enzyme producing strains among E. coli and K. pneumoniae strains isolated from urine samples belonging to individuals who applied to Kars Harakani State Hospital with urinary tract complaints by molecular methods. Five thousand urine samples obtained between April and August 2019 were included in the study. After the samples were cultured in Mac Conkey and 7% sheep blood agar, the isolates obtained were identified with the BD Phoenix ™ 100 automated system ID panel. Antibiotic susceptibilities and GSBL activities of the isolates were performed with the BD Phoenix ™ 100 system AST panel. CTX-M, TEM and SHV genes responsible for the ESBL activity of the isolates were analyzed by single-step PCR. The data were analyzed and interpreted with IBM SPSS Statistic 22.0 program. In the study, 19,5% aerobic bacterial agent culture positivity was obtained from urine samples and 120 (13,33%) of them were found to have ESBL activity. Out of the ESBL positive isolates, 102 (85%) were identified as Escherichia coli and 14 (11,67%) as Klebsiella pneumoniae. The ESBL positivity was 2,4% in urine samples in total, and 2,04% and 0,28% for E. coli and K. pneumoniae, respectively. While the total resistance of the isolates to beta-lactam antibiotics was 57,46%, the most common (92,53%) resistance was found against cephalosporins and the most common (47,19%) susceptibility was to carbapenems. The most (100%) resistant antibiotics against E. coli isolates were found Ampicillin and Cefixim, while the most (99,02%) sensitive antibiotic was Imipenem. The most (100%) resistant antibiotics against K. pneumoniae isolates were found Ampicillin, Aztreonam, Cefixime, Cefepime and Ceftriaxone, and the most (92,86%) sensitive antibiotics were Imipenem and Meropenem. At least one or more resistance genes were detected in 90,52% of ESBL positive isolates by PCR. CTX-M was found the most common resistance gene both in total (78,45%) and in individual bacterium (80,39% for E. coli and 64,29% for K. pneumoniae). This was followed by SHV with 60.34% (61,76% for E. coli and 50% for K. pneumoniae) and TEM with 49,14% (50% for E. coli and 42,86% for K. pneumoniae). Genes of CTX-M and SHV in 29 of ESBL positive isolates, CTX-M and TEM in 16 isolates, TEM and SHV in 9 isolates and CTX-M, TEM and SHV in 30 isolates were detected simultaneously. Neither overall nor gene-specific correlations were found between the identified bacterial species and the ESBL genes detected. However, in isolates (E. coli and K. pneumoniae) carrying both individual and combined ESBL genes, penicillin and cephalosporin resistance and carbapenem sensitivity were found to be higher. 57,8% of the isolates were obtained from female and 42,2% from male patients. ESBL positivity was found highest in female patients aged 24 and under, and male patients 65 and older. There is a similar correlation between ESBL positive E. coli and age, however, K. pneumoniae was detected in female between the ages of 25 and 44, and in men 65 and older. While there was no statistically significant relationship between ESBL positivity and age groups, however, a positive relationship was found between ESBL and gender of the patients at a rate of 21,9%. In conclusion, in addition to eliminating risk factors in reducing the incidence of ESBL-related infections, identification of infectious agents, removal of relevant ESBL profiles and the right antibiotic preference to be developed according to these emerged models are very important. It is hoped that this systematic study on ESBL-producing microorganisms that cause urinary tract infections in humans in a limited location in Kars region will benefit in this context.