Buğdayda (Triticum aestivum L.) absisik asitle ilişkili gen anlatımı
Abscisic acid related gene expression in wheat (Triticum aestivum L.)
Yazar: BİRSEN CEVHER KESKİN
Danışman: PROF. DR. ABDÜLREZZAK MEMON ; PROF. DR. AYŞEGÜL TOPAL SARIKAYA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Absisik asit (ABA), bitkilerde büyüme ve gelişme süresince önemli rolü olan birfitohormondur. Bitkilerde yaşam döngüsü süresince birkaç fizyolojik stres ve gelişimselyanıtları kontrol eder. Tohumlarda protein ve lipid stoklarının arttırılması, kurumadirencinin iyileştirilmesi, erken çimlenmenin baskılanması ve dormansininuyarılmasıyla ilişkilidir. Vejetatif büyüme süresince kuraklık, tuz ve soğuk stresi gibiuygun olmayan çevresel koşullara uyumda iç sinyal olarak görev alır. Bitkiye farklıyollarla ABA'nın uygulanması, özellikle kuraklık olmak üzere stres koşullarınınoluşmasına yol açar. Kuraklık, soğuk, yüksek tuz stresi veya ABA'nın dışarıdanuygulanması sonrası stres genlerinin anlatım modelinde çok fazla çakışmaların olduğu,ortak genlerin rol aldığı belirlenmiştir. Bu durum stres sinyalleri ve ABA'nın sinyaliletim yolunda ortak elementleri paylaştığını göstermektedir.Bu araştırmada ?mRNA Farklılık Gösterim? tekniği kullanılarak buğdayda (Triticumaestivum L.) ABA ile anlatımları etkilenen (fazla veya az anlatım yapan) genlerinbelirlenmesi çalışması gerçekleştirildi. Kuraklığa hassas Triticum aestivum cv. Atay 85ve kuraklığa toleranslı Triticum aestivum cv. Sivas 111/33 buğday genotiplerikullanıldı. Otuz gün büyütülmüş buğday bitkilerine 50 ?M ve 100 ?M ABA uygulamasıyapıldı. 50 ?M ABA uygulanmış ve uygulanmamış buğday yapraklarından total RNAizolasyonu yapıldı ve RT-PCR sonrası 3 farklı ?anchor? oligo-dT primer ve 13 bazçiftlik ?arbitrary? (rastgele seçilmiş) primerler kullanılarak yapılan PCR sonrası ürünlermRNA Farklılık Gösterim jeline farklı anlatım yapan cDNA'lar poliakrilamid jeldengeri kazanılarak klonlandı ve dizi analizleri gerçekleştirildi. Dizi analizi gerçekleştirilen30 klondan 12'sinde Zea mays Mitojenle Aktive Edilmiş Protein Kinaz-4 (MAPK-4)'ebenzer dizi elde edildi. MAPK'lar abiyotik stres (kuraklık, sıcaklık ve ozon stresi) vepatojenlere yanıtta anahtar role sahiptirler. Southern emdirim analiziyle bu geninhekzaploid buğday genomunda tek kopya olduğu belirlendi. Buğday bitkisinde Zeamays MAPK-4'e benzer olarak saptanan cDNA'nın dışarıdan uygulanan ABA'ya karşıRNA düzeyindeki anlatım modeli Northern blot analiziyle yapıldı ve 4 saat ABAetkisinde bırakılmış Atay 85 buğğday bitkisi yapraklarında, RNA anlatımının en üstdüzeye ulaştığı belirlendi. MAPK kaskatlarının hücre içi sinyal iletimi cevabında enönemli yolaklar oldukları düşünülmektedir.50 ?M ABA'nın etkisiyle Triticum aestivum cv. Atay 85'e ait 1, Triticum aestivum cv.Sivas 111/33'e ait 4 yeni (Gen Bankası taramalarında homologları bulunmamış) geninanlatımında artış olduğu belirlendi. Yapılan Gen Bankası taramalarında Saccharomycescerevisiae ?indirgenmiş folat taşıyıcı protein?, Triticum aestivum ??-ekspansin?(EXPA2), Hordeum vulgare L. ?germin-like protein-1?, Hordeum vulgare L.?Tonoplast Intrinsic Protein 1?, (TIP1), Triticum monococcum ?olası direnç proteini?,Aegilops tauschii ?olası savunma cevabı proteini?, Aegilops tauschii ?lösince zenginprotein? kodlayan diziler elde edildi. ?Real time? RT-PCR çalışmalarıyla EXPA-2'nin2.saatte artış gösterdiği ve 8. saatte bu artışın devam ettiği görüldü. Sıcaklık stresiyleartış yaptığı belirlenmiş olan HSP101 geninin 2. saatte maksimum anlatım düzeyineulaştığı 8. ve 24.saatlerde anlatımın giderek azaldığı saptandı.Bu sonuçlar buğdayda 50 ?M ABA'nın RNA düzeyindeki gen anlatımını etkilediğinigösteren ilk çalışmadır. Bu genlere ilişkin ayrıntılı çalışmalar ve işlevsel genomikanalizler sinyal iletiminde bilinmeyen bazı noktalara ışık tutacak; bu genlerin abiyotikstresteki rollerinin anlaşılması ticari amaçlı strese dayanıklı buğday çeşitleriningeliştirilmesinde katkıları olacaktır.

Abstract:
The phytohormone abscisic acid (ABA) plays an important role during plant growth anddevelopment. ABA controls several physiological stress and developmental responsesthroughout the life cycle of plants. In seeds, ABA is implicated in the accumulation ofthe protein and lipid reserves, the acquisition of desiccation tolerance, the inhibition ofprecocious germination on the mother-plant and the induction of primary dormancy.During vegetative growth, ABA is the internal signal that enables plant adaptiveresponses to adverse environmental conditions such as drought, salt and cold stress.Because many stress signals increase the level of ABA, it has been shown to play acritical role in plant stress responses. The exogenously applied ABA to plants indifferent ways mimics the effect of stress conditions especially water stress. After cold,drought, high salt stress or ABA application, there is much overlap in the expressionpattern of stress genes. This suggests that these stress signals and ABA share commonelements in the signalling pathways.In this research, we investigated ABA-induced gene expression in wheat (Triticumaestivum L.) by mRNA Differential Display (DD) analysis. Two wheat genotypes Atay85 (droght sensitive) and Sivas 111/33 (drought tolerant) were used. 50 ?M and 100 ?MABA was applied to 30 day old wheat plants. Total RNA was isolated from 50 ?MABA treated and untreaed plants. After RT-PCR 3 different one-base anchored oligo dTprimers were used in combination with series of arbitrary 13 mers for DD reactions.Amplified products were loaded on polyacrylamide gel and differentially expressedtranscripts were isolated and amplified by PCR. Cloned PCR products were sequenced.GenBank search showed that 12 clones out of 30 were similar to Zea mays Mitogen-Activated Protein Kinase-4 (MAPK-4). MAPKs play a key role in plant responses tostress (drought, temperature and ozone stress) and pathogens. Southern analysisindicated that this cDNA fragment is a single copy in the hexaploid wheat genome.Northern Blot analysis was used to investigate the effect of exogeneous application ofABA on the expression of Zea mays MAPK-4 like in Atay-85 wheat genotype.Maximum expression of this gene was observed at 4 h ABA treated seedlings. MAPKcascades have been proposed as major pathways for signal transduction in intracellularresponse.Other cDNA clones gave homology to Saccharomyces cerevisiae reduced folat carrierprotein, Triticum aestivum ?-expansin (EXPA2), Hordeum vulgare L. germin-likeprotein-1, Hordeum vulgare L. Tonoplast Intrinsic Protein 1, (TIP1), Triticummonococcum putative resistant protein, Aegilops tauschii putative defence responseprotein, Aegilops tauschii leucine-rich protein coding sequences. Additionally we foundunknown novel genes one of them is over expressed in Atay 85 and 4 of them are overexpressed in Sivas by 50 ?M ABA treatment.We have showed the first time that the expression of EXPA-2 mRNAs in wheat leaveswas induced by 2 h 50 ?M ABA treated seedlings and this expression level increased at8 h 50 uM ABA treated seedlings. HSP101 which has known heat stress related geneexpression level also demonstrated in different 50 ?M ABA treated seedlings by realtime RT-PCR. HSP101 mRNA was strongly induced by ABA treatment and maximumexpression level was shown at 2h 50 ?M ABA treated seedlings and dramaticallydecreased 8h and 24 h.This is the first study in which we have shown the induction of some genes in wheat by50 ?M ABA. Characterization and functional genomic analysis of these genes will helpto identify signal transduction pathway and will promote further understanding the roleof these genes in abiotic stress and this knowledge will facilitate us to produce stressresistant wheat variaties for commercial purposes.