Tavşan karotid arter anastomozunda sığır serum albümin-glutaraldehit ve polietilen glikol polimer'in neointimal hiperplazi üzerine etkisi
Effect of bovine serum albumin-gluteraldehyde and polyethylene glycol polymer on neointimal hyperplasia in rabbit carotid artery anastomosis
Yazar: ERTÜRK KARAAĞAÇ
Danışman: DOÇ. DR. YÜKSEL BEŞİR
İzmir Katip Çelebi Üniversitesi / İzmir Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Kalp ve Damar Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi = Thoracic and Cardiovascular Surgery
Dizin: Albüminler = Albumins ; Anastomoz = Anastomosis ; Arteryel oklüzif hastalıklar = Arterial occlusive diseases ; Gluteraldehit = Glutaraldehyde ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Karotis arteri hastalıkları = Carotid artery diseases ; Polietilen glikoller = Polyethylene glycols ; Polimerler = Polymers ; Sığır serum albümin = Bovine serum albumin ; Tavşanlar = Rabbits

Özet:
AMAÇ: Koroner ve periferik arter hastalıkları, günümüzde yaşam kalitesi ve ortalama yaşam süresini belirleyen en önemli kronik hastalıklardandır ve bu hastalıkların tedavisinde vasküler cerrahi girişimler oldukça sık kullanılan girişimlerden biridir. Vasküler girişimler sonrası gelişebilen restenoz üzerinde, intimal hiperplazi ve düz kas hücre proliferasyonunun büyük etkisi vardır. Neointimal hiperplazi nedeniyle gelişen restenoz, günümüzde bu tarz işlemlerin uzun dönem başarısını olumsuz etkilemektedir (1). Kalp damar cerrahisi uzmanlığı son 50 yıl içinde hızlı bir şekilde gelişim göstermiştir (7). Artan operasyon sayıları ve kompleks cerrahi girişimler sebebiyle, hemostaz sağlayarak kanamanın etkili tedavisi cerrahi operasyonlar sonrası olumlu sonuçlar alabilmek için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle cerrahi operasyonlarda hemostaz sağlamak için çok çeşitli ajanlar geliştirilmiştir. Hemostatik ajanlar arasındaki; polimerizasyon ve etki süreleri, sitouyumluluk, biyoçözünebilirlik, patlama basıncı dayanımı, elastikiyet, çözülme süreleri, ıslak veya kuru dokuya yapışmaları gibi farklar kalp ve damar cerrahisinde kullanılan hemostatik ajanları sınırlamaktadır. Günümüzde vasküler rekonstrüksiyon sonrası hemostatik ajan olarak sıkça kullanılan polietilen glikol polimer (PEGP) ve sığır serum albümin-glutaraldehit (SSA-glutaraldehit)'in neointimal hiperplazi ve endotelyal proliferasyon üzerine etkisi hakkında yeterli veri yoktur. Bu iki ajanın vasküler rekonstrüksiyonda güvenli kullanımının değerlendirilmesi ve diğer hemostatik ajanların da kullanılmadan önce neointimal hiperplazi ve endotelyal proliferasyona etkilerinin incelenmesi gerektiği kanaatindeyiz. Bu yüzden biz de, tavşan karotid arter anastomozunda PEGP ve SSA-glutaraldehit'in neointimal hiperplazi ve endotelyal proliferasyon üzerine etkisini araştırmayı hedefledik.
MATERYAL-METOD: Çalışmamızda randomize olarak seçilen, ortalama 2-3 kg ağırlığında 21 adet Yeni Zelenda tipi erkek tavşan kullanıldı ve tavşanlar 3 gruba ayrıldı. Ketamin ve ksilazin anestezisi sonrası sterilizasyon sağlanarak tavşanlara uygun pozisyon verildi ve profilaktik antibiyotik olarak sefazolin uygulandıktan sonra, tüm grup tavşanlara vertikal orta hat boyun insizyonu yapıldı ve sağ ana karotid arter eksplore edildi. Sağ ana karotid arter heparinizasyon sonrası transekte edildi. 8/0 polipropilen dikiş kullanılarak tek tek sütur tekniğiyle aynı cerrah tarafından uç uca anastomoz edildi. Anastmoz sonrası lümen açıklıkları duplex ultrasonografi ile doğrulandı. Grup 1 (7 adet) tavşanların sağ ana karotid arter anastomoz sahasına lokal olarak herhangi bir hemostatik ajan uygulanmadı. Grup 2 (7 adet) tavşanların sağ ana karotid arter anastomoz sahasına lokal olarak 0,5cc SSA-glutaraldehit anastomoz hattını tam olarak kapatacak şekilde uygulandı. Grup 3 (7 adet) tavşanların sağ ana karotid arter anastomoz sahasına lokal olarak 0,5cc PEGP anastomoz hattını tam olarak kapatacak şekilde uygulandı. Tüm gruptaki tavşanların 28 günün sonunda anastomoz yapılan sağ ana karotid arter segmenti çıkarılarak histolojik inceleme amacıyla tespit edildi, incelenmek üzere histoloji laboratuvarına gönderildi. Daha sonra yüksek doz sodyum pentotal ile hayvanların yaşamına son verildi. Uygun protokolle hazırlanan preparatlara H&E boyama ve Masson trikrom boyama yapıldı. Ayrıca alınan karotid arter segmentleri VEGF ve a-SMA tutulumu açısından immünohistokimyasal incelemeye alındı. Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobunda görüntülenerek fotoğraflandı ve fotoğraf analiz programı ile incelenerek ve lümen çapı, lümen alanı, intima kalınlığı, media kalınlığı, intima-media kalınlık oranı, intima alanı, media alanı, intima-media alanları oranı hesaplandı. Alınan örneklerdeki VEGF ve a-SMA tutulumları de incelenerek tüm sonuçlar değerlendirildi.

BULGULAR: İncelenen seri kesitler istatistiksel olarak değerlendirildiğinde; Grup 1 intima kalınlığı Grup 2 ve Grup 3'den anlamlı (p:0,003) olarak daha yüksekti. Grup 2 ve Grup 3 intima kalınlığı anlamlı (p˃0.05) farklılık göstermemiştir. Grup 1'de media kalınlığı Grup 2'den anlamlı (p:0,022) olarak daha düşüktü. Grup 1 ve Grup 3 media kalınlığı anlamlı (p˃0.05) farklılık göstermemiştir. Grup 2 ve Grup 3 media kalınlığı anlamlı (p˃0.05) farklılık göstermemiştir. Grup 1'de İ/M kalınlık oranı Grup 2 ve Grup 3'den anlamlı (p:0,000) olarak daha yüksekti. Grup 2 ve Grup 3 İ/M kalınlık oranı anlamlı (p˃0.05) farklılık göstermemiştir. Grup 1, Grup 2, Grup 3 intima alanı anlamlı (p˃0.05) farklılık göstermemiştir. Grup 1'de media alanı Grup 2'den anlamlı (p:0,008) olarak daha yüksekti. Grup 1 ve Grup 3 media alanı anlamlı (p˃0.05) farklılık göstermemiştir. Grup 3'de media alanı Grup 2'den anlamlı (p:0,001) olarak daha yüksekti. Grup 1, Grup 2, Grup 3 İ/M alan oranı anlamlı (p˃0.05) farklılık göstermemiştir. Grup 1'de lümen çapı Grup 2'den anlamlı (p:0,005) olarak daha yüksekti. Grup 1 ve Grup 3 lümen çapı anlamlı (p˃0.05) farklılık göstermemiştir. Grup 3'de lümen çapı Grup 2'den anlamlı (p:0,000) olarak daha yüksekti. Grup 1'de lümen alanı Grup 2'den anlamlı (p:0,002) olarak daha yüksekti. Grup 1 ve Grup 3 lümen alanı anlamlı (p˃0.05) farklılık göstermemiştir. Grup 3'de lümen alanı Grup 2'den anlamlı (p:0,003) olarak daha yüksekti. H&E boyama sonrası grupların kendi içinde tunika adventisya tabakaları incelendiğinde; Grup 1'e göre Grup 2 ve Grup 3'te daha fazla sayıda yağ doku gözlendi. Grup 2 ve Grup 3 arasında ise; yağ doku artışında net bir fark gözlenmedi. Her üç grupta da adventisyal vaso vasorum varlığı görüldü. Ek olarak Grup 2'deki kesitlerde lümene mekanik basıya neden olan tutkal parçalarına rastlandı.  Masson trikrom boyama sonrası yapılan incelemelerde, Grup 1'de tunika mediada mavi boyanma ile yaygın bağ doku artışı izlenirken Grup 2'de az miktarda mavi boyanma ile bağ dokuya rastlandı. Grup 3'te ise; tunika media tabakası tamamen düzgün seyirli ve kırmızı boyanırken bağ doku oluşumu izlenmedi. İmmünohistokimyasal incelemede VEGF tutulumu değerlendirildiğinde; Grup 1'de güçlü tutulum, Grup 2'de zayıf/orta tutulum, Grup 3'te ise orta tutulum mevcuttu. A-SMA tutulumu değerlendirildiğinde ise; Grup 1'de zayıf tutulum, Grup 2'de zayıf/orta tutulum, Grup 3'te ise tüm tabakalarda olmak üzere orta tutulum mevcuttu.

SONUÇ: Vasküler cerrahi girişimlerin uzun dönem başarısını etkileyen en önemli durumun, neointimal hiperplaziye bağlı gelişen restenoz olduğu bilinmektedir. Vasküler anastomozda kanama kontrolünü sağlamak amacıyla lokal olarak kullanılan ajanların neointimal hiperplaziye etkisini göstermek için yaptığımız bu çalışmanın sonucunda; biyolojik yapılı hemostatik ajan SSA-glutaraldehit ve sentetik yapılı hemostatik ajan PEGP'nin her ikisinin de neointimal hiperplazi gelişimini engelledikleri gösterilmekle birlikte, SSA-glutaraldehit'in mekanik basıya bağlı lümen alanı ve lümen çapında azalmaya neden olduğu, PEGP'nin ise lümen alanı ve lümen çapı üzerinde olumsuz etkisinin olmadığı gösterilmiştir. Lokal olarak uygulanan bu iki hemostatik ajanın, özellikle damar duvarındaki VEGF ve a-SMA salınımı, adventisyal vaso vasorum ve adipoz doku üzerindeki etkileri sebebiyle neointimal hiperplazi gelişimini azalttığını düşünmekteyiz. Tunika adventisyanın bu rolü sebebiyle, periadventisyal lokal ilaç uygulamalarının neointimal hiperplazi ve restenoz üzerinde olumlu veya olumsuz etkileri olabileceği kanaatindeyiz. Bu nedenle vasküler rekonstrüksiyon sonrası lokal olarak uygulanan periadventisyal maddelerin kullanılmadan önce; sitotoksite, neointimal hiperplazi ve restenoz üzerindeki etkilerinin araştırılması gerektiğini düşünmekteyiz. Bu çalışma neticesinde PEGP'nin;  lümen alanı, lümen çapı, intima kalınlığı, intima/media kalınlık oranı, tunika mediadaki bağ doku oluşumu, damar duvarındaki VEGF ve a-SMA tutulumu, adventisyal yağ doku miktarı gibi neointimal hiperplazi ile ilişkili belirteçlerde iyi sonuçlarının olması yanında, SSA-glutaraldehit gibi tutkal parçalarına bağlı mekanik bası oluşturmaması sebebiyle lümen alanı ve lümen çapı üzerinde olumsuz etkisi yoktur. Bu avantajları dolayısıyla PEGP'nin vasküler anastomozda güvenle kullanılabileceğini öngörmekteyiz. Çalışmamız sonucunda elde edilen standart koşullardaki karşılaştırmalı verilerin yardımı, kullanılan hemostatik ajanların ticari formu olması ve cerrahi operasyonlarda kullanılması sebebiyle klinik pratikte durum odaklı karar vermeye yardımcı olacağı düşüncesindeyiz.

Anahtar Kelimerler: tavşan, karotis, neointimal hiperplazi, polietilen glikol polimer, sığır serum albümin-glutaraldehit

Abstract:
OBJECTIVE: Coronary and peripheral arterial diseases are the most important chronic diseases that determine the quality of life and life expectancy and vascular surgery is one of the most frequently used procedures in the treatment of these diseases. Intimal hyperplasia and smooth muscle cell proliferation have a major effect on restenosis that may develop after vascular interventions. Restenosis due to neointimal hyperplasia has a negative impact on the long-term success of these procedures (1). Cardiovascular surgery expertise has developed rapidly in the last 50 years (7). Due to the increasing number of operations and complex surgical interventions, effective treatment of bleeding by providing hemostasis is critical for achieving positive results after surgical operations. Therefore, a variety of agents have been developed to provide hemostasis in surgical operations. Hemostatic agents include; differences in polymerization and effect times, cytocompatibility, biodegradability, bursting pressure resistance, elasticity, dissolution times, adhesion to wet or dry tissue limit the hemostatic agents used in cardiovascular surgery. Currently, there is insufficient data on the effect of polyethylene glycol polymer (PEGP) and bovine serum albumin-glutaraldehyde (SSA-glutaraldehyde), commonly used as hemostatic agent after vascular reconstruction, on neointimal hyperplasia and endothelial proliferation. We believe that the safe use of these two agents in vascular reconstruction should be evaluated and the effects of other hemostatic agents on neointimal hyperplasia and endothelial proliferation should be examined. Therefore, we aimed to investigate the effect of PEGP and SSA-glutaraldehyde on neointimal hyperplasia and endothelial proliferation in rabbit carotid artery anastomosis.
MATERIALS AND METHOD: In this study, 21 New Zealand male rabbits, randomly selected and weighing 2-3 kg on average, were used and were divided into 3 groups. After ketamine and xylazine anesthesia, the rabbits were placed in the appropriate position and after prophylactic antibiotic cefazolin was applied, vertical midline neck incision was made to all rabbits and right main carotid artery was explored. The right main carotid artery was transected after heparinization. It was end-to-end anastomosed by the same surgeon using a single suture technique using 8/0 polypropylene stitches. Lumen clearance after anastomosis was confirmed by duplex ultrasonography. Group 1 (7 rabbits) did not receive any local hemostatic agent at the right main carotid artery anastomosis line. Group 2 (7) rabbits were applied to the right main carotid artery anastomosis line to close the 0.5cc SSA-glutaraldehyde anastomosis line completely. Group 3 (7) rabbits were applied to the right main carotid artery anastomosis site to close the 0.5cc PEGP anastomosis line completely. At the end of 28 days, in the rabbits in the whole group, the right main carotid artery segment was removed for histological examination and sent to the histology laboratory for examination. Then, the animals were sacrificed with high dose sodium pentotal. The sampels were subjected to H&E staining and Masson trichrome staining. In addition, carotid artery segments were taken into immunohistochemical examination for VEGF and α-SMA signal. The sampels were photographed by visualization under light microscope and examined with photo analysis program and the lumen diameter, lumen area, intima thickness, media thickness, intima-media thickness ratio, intima area, media area, intima-media areas ratio were calculated. VEGF and α-SMA uptake were also examined and all results were evaluated.
FINDINGS: When the serial sections examined were evaluated statistically; Intima thickness of Group 1 was significantly higher than Group 2 and Group 3 (p: 0.003). In Group 2 and Group 3, intima thickness did not differ significantly (p˃0.05). Media thickness was significantly lower in Group 1 than Group 2 (p: 0.022).  Group 1 and 3  did not differ significantly (p˃0.05). Media thickness of Group 2 and 3 did not differ significantly (p˃0.05). The I / M thickness ratio was significantly higher in Group 1 than Group 2 and Group 3 (p: 0.000). The  I / M thickness ratio of Group 2 and Group 3 did not differ significantly (p˃0.05). The intima area of Group 1, Group 2, and Group 3 did not differ significantly (p˃0.05). Media area was significantly higher in Group 1 than Group 2 (p: 0.008). Media area of Group 1 and Group 3 did not differ significantly (p˃0.05). Media area was significantly higher in Group 3 than Group 2 (p: 0.001). I / M area ratio of Group 1, Group 2, Group 3 did not differ significantly (p˃0.05). Lumen diameter was significantly higher in Group 1 than Group 2 (p: 0.005). The lumen diameter of Group 1 and Group 3 did not differ significantly (p˃0.05). Lumen diameter was significantly higher in Group 3 than Group 2 (p: 0.000). Lumen area was significantly higher in Group 1 than Group 2 (p: 0.002). The lumen area of Group 1 and Group 3 did not differ significantly (p˃0.05). Lumen area was significantly higher in Group 3 than Group 2 (p: 0.003). After the H&E staining, when the tunica adventitia layers were examined; A greater number of adipose tissues were observed in Group 2 and Group 3 than Group 1. Between Group 2 and Group 3; there was no clear difference in adipose tissue increase. Adventitial vaso vasorum was observed in all three groups. In addition, glue fragments causing mechanical compression to the lumen were observed in the sections in Group 2. Masson trichrome staining showed widespread connective tissue increase with blue staining in the tunica media in Group 1, whereas connective tissue with small amount of blue staining was observed in Group 2. In Group 3; While the tunica media layer was completely smooth and stained red, no connective tissue formation was observed. When VEGF signal was evaluated in immunohistochemical examination; Group 1 had strong signal, Group 2 had weak / moderate signal, and Group 3 had moderate signal. When A-SMA signal was evaluated; Group 1 had weak signal, Group 2 had weak / moderate signal, and Group 3 had moderate signal in its all layers.
CONCLUSION: It is known that the most important condition affecting the long-term success of vascular surgery is restenosis due to neointimal hyperplasia. As a result of this study to show the effect of locally used agents on neointimal hyperplasia to control bleeding in vascular anastomosis; although biological hemostatic agent SSA-glutaraldehyde and synthetic hemostatic agent PEGP have been shown to inhibit the development of neointimal hyperplasia, SSA-glutaraldehyde causes a decrease in the lumen area and lumen diameter due to mechanical compression. PEGP has no negative effect on the lumen diameter and lumen diameter. We think that these two locally applied hemostatic agents reduce the development of neointimal hyperplasia due to their effects on VEGF and α-SMA secretion, adventitious vaso vasorum and adipose tissue. Because of this role of tunica adventitia, we think that periadventitial local drug administration may have positive or negative effects on neointimal hyperplasia and restenosis. Therefore, prior to the use of locally applied periadventitial agents after vascular reconstruction, we think that effect of these agents on cytotoxicity, neointimal hyperplasia and restenosis should be investigated. As a result of this study, PEGP has good results neointimal hyperplasia associated markers such as luminal area, lumen diameter, intima thickness, intima / media thickness ratio, connective tissue formation in the tunica medias, VEGF and α-SMA signal in the vessel wall and periadventitial fat tissue. It does not have a negative effect on the lumen area and lumen diameter due to no mechanical compression cause of glue fragments such as SSA-glutaraldehyde. Therefore, we think that PEGP can be used safely in vascular anastomosis. As a result of the comparative data obtained in the standard conditions obtained from our study, the commercial form of the hemostatic agents used and used in surgical operations, we think that it will help in case-oriented decision making in clinical practice.

Key Words: rabbit, carotid, neointimal hyperplasia, polyethylene glycol polymer, bovine serum albumin-glutaraldehyde