Akciğer adenokarsinomlu olgularda birinci basamak tedavi sonrası onkogen değişimlerinin periferik kan serbest DNA (cfDNA) örneklerinden araştırılması
Investigation of oncogene changes in periferic blood cfDNA specimens after first line therapy of lung adenocarcinoma patients.
Yazar: METİN ÇALIŞKAN
Danışman: DOÇ. DR. NUR SELVİ GÜNEL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; DNA = DNA ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Onkogenler = Oncogenes ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Akciğer kanseri günümüzde en yüksek mortaliteye sahip kanser tipidir. Küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK) ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) olmak üzere iki tipi vardır. KHDAK'nin yaklaşık yarısını adenokarsinom alt tipi oluşturmaktadır. Klasik tedavide cerrahi müdahele, kemoterapi ve radyoterapi uygulanırken immünoterapi ve hedefe yönelik tedavi önemini her geçen gün artırmaktadır. Adenokarsinomların yaklaşık yarısında gözlemlenen onkogen mutasyonlarının varlığı hedefe yönelik tedavi ve prognoz tayini açısından önemlidir. Onkogen mutasyonlarının tespiti tümör biyopsisi ile gerçekleştirilmektedir. Tümör biyopsisinin hastaların tümünde uygulanamaması, uzmanlık gerektiren, zaman alıcı ve invaziv bir işlem olması önemli dezavantajlardır. Ayrıca tümör biyopsisi sadece biyopsi alınan bölgeyi yansıtmakta intra ve inter tümör heterojenitesini yansıtamamaktadır. Tedavi sürecinde tümörün takibi açısından tekrarlanma şansı yok denecek kadar azdır. Son yıllarda likit biyopsi olarak tanımlanan, vücut sıvılarına yayılmış tümör serbest DNA'sının (cfDNA) toplanmasıyla tümöre ait onkogenlerin tespit edilebilmesi mümkün olmuştur. Likit biyopsi örneğinin tümör yükünü ve heterojenitesini yansıtması, minimal invaziv olması tüm hastalarda istenilen zaman ve sıklıkta tekrarlanabilmesi önemli avantajlar sağlamaktadır. Gelecekte likit biyopsi ile tümör monitörizasyonunun mümkün olabileceğini, tespiti muhtemel çok sayıdaki moleküler değişikliğin ortaya çıkış sırasının ve interaksiyonlarının tümörün moleküler evrimine ışık tutacağını böylece tedavi başarısının artacağını düşünmekteyiz. Bu projede, birinci basamak tedavi öncesi ve sonrası tespit edilebilen onkogen değişimleri, mutasyon değişimleri, mutasyon yükü değişimleri ve mutasyon birlikteliklerinin tümörün akciğer içi pozisyonu ve yerleşimi, yeni oluşumlarla olan ilişkisi, metastaz ilişkileri, tedavi yanıtıyla karşılaştırarak tedavi ve prognoza katkı sağlayabilecek bilgiler elde etmeyi amaçladık.
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Uygulama ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Onkoloji Bilimdalı'na başvurmuş ve akciğer adenokarsinomu tanısı almış 52 olgu araştırmaya dahil edilmiştir. Tedavi öncesi ve sonrası örnekleri temin edilen olgulardan EGFR, KRAS, BRAF, NRAS ve PIK3CA onkogenlerinde sık gözlemlenen 123 mutasyon Allel Spesifik PCR (AS-PCR) yöntemiyle araştırılmıştır. Olguların 29'unda tedavi öncesi ve sonrası hiçbir mutasyona rastlanmazken 23'ünde en az bir mutasyon olmak üzere toplam 39 mutasyon tespit edilmiştir. Bir olguda 3 ayrı mutasyon, 4 olguda 2 ayrı mutasyon ve 18 olguda tek mutasyon saptanmıştır. Tedavi öncesi mutasyon tespit edilmeyen 3 olguda tedavi sonrası mutasyon tespit edilirken tedavi öncesi mutasyonu mevcut 5 olguda tedavi sonrası mutasyon tespit edilememiştir. Mutasyon tespit edilen 15 olguda tedavi öncesi ve sonrası mutasyon yükü değişimleri tespit edilmiştir. NRAS mutasyonu bulunan bir olguda tedavi sonrası KRAS mutasyonları tespit edilmiştir.
EGFR mutasyonu mevcut olan olgular tedaviye iyi yanıt vermiş tedavi sonrası tümörün gerilemesiyle EGFR mutasyonları tespit edilemeyecek seviyeye düşmüştür. Literatürde nadir gözlemlenen KRAS kodon 59, 117, 146 mutasyonları çalışmamızda %7,5 gibi yüksek bir oranda tespit edilmiştir. Bu mutasyonların çoklu mutasyon birliktelikleri göstermesi tümör merkezlerinin nekroze olması ve özellikle sağ akciğer üst lobda konumlandıkları gözlenmiştir. KRAS kodon 12 mutasyonu içeren olguların KRAS kodon 13 mutasyonu içeren olgulara göre daha iyi tedavi yanıtı sergiledikleri, mutasyon birliktelikleri göstermedikleri ve sağ akciğer üst lob dışında konumlandıkları gözlenmiştir. Primer tümörü merkezi yerleşimli olguların uzak metastaz göstermeyip akciğer içi yayılımla kötü prognoza sebep oldukları tespit edilmiştir. Kemik metastazı gösteren olguların sağ akciğerde yoğunlaştıkları, primer tümörü sağ akciğerde olan olguların sağ sürrenal beze, solda olanların sol sürrenal beze metastaz eğiliminde oldukları gözlemlenmiştir. Bulguların daha fazla olgu içeren çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: Akciğer adenokarsinomu; Onkogen; cfDNA; EGFR; KRAS

Abstract:
Nowaday, lung cancer has the highest mortality rate among cancer types. There are two types of lung cancer that small cell lung cancer (SCLC), and non-small cell lung cancer (NSCLC). Approximately half of NSCLC is composed of adenocarcinoma subtype. Surgery, chemotherapy and radiotherapy are applied in classical treatment, while the importance of immunotherapy and targeted therapy are increasing day by day. The presence of oncogene mutations observed in about half of adenocarcinomas is important in terms of targeted treatment and prognosis. Oncogenic mutation detection is based on samples of tumor tissue taken by biopsy. Tumor biopsy cannot be performed in all patients and it is a time consuming and invasive procedure that requires expertise. In addition, tumor biopsy reflects only the biopsy site and does not reflect intra and inter tumor heterogeneity. There is little chance of repeat the follow-up of the tumor during the treatment process. In recent years, it has been possible to detect oncogene mutations by collecting cell-free DNA (cfDNA) called liquid biopsy. Liquid biopsy specimen reflects tumor burden and heterogeneity, is minimally invasive and can be repeated at any time and frequency in all patients. We think that tumor monitoring by liquid biopsy may be possible in the future, and that the sequence and interactions of many possible molecular changes will shed light into the molecular evolution of the tumor, thus improving treatment success. In this thesis, we aimed to obtain information that can contribute to treatment and prognosis by comparing oncogene changes, mutation changes, mutation burden changes, the mutation associated with tumor before and after first-line therapy, relation of tumor with new formations, metastasis relationships, and treatment response. 
Fifty-two cases with adenocarcinoma of lung admitted to Aydın Adnan Menderes University Practice and Research Hospital Medical Oncology Department were included in the study. 123 mutations observed in EGFR, KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA oncogenes were investigated by Allel Specific PCR (AS-PCR) method. In 29 of the cases, no mutations were detected before and after the treatment, while 39 mutations were detected, of which 23 had at least one mutation. There were 3 different mutations in one case, 2 mutations in 4 cases and one mutation in 18 cases. In 3 cases where no mutation was detected before treatment, post-treatment mutation was detected in 5 cases, whereas in 5 cases there was no post-treatment mutation. In 15 cases with mutation, mutation burden changes were detected before and after treatment. One patient with NRAS mutation had KRAS mutations after treatment.
The cases with EGFR mutation responded well to the treatment and the EGFR mutations decreased to an undetectable level after tumor regression. KRAS codon 59, 117, 146 mutations, which are rarely observed in the literature, were detected as high as 7.5% in our study. It was observed that these mutations showed multiple mutation associations, tumor centers were necrosis and they were located especially in the upper lobe of the right lung. It was observed that patients with KRAS codon 12 mutation having better treatment response than patients with KRAS codon 13 mutation, did not show mutation associations, and were located outside the upper lobe of the right lung. It was found that the primary tumor of the central location did not show distant metastasis, and caused a poor prognosis with intra-pulmonary spread. It was observed that the cases with bone metastasis were concentrated in the right lung, the cases with primary tumor in the right lung were tend to metastasize to the right adrenal gland, and the left ones to the left adrenal gland. The findings were supported by studies involving more cases.
Keywords; Lung adenocarcinoma; cfDNA; Oncogene; EGFR; KRAS