Allojenik transplantasyonlarda kullanılan immünsupresif ilaç dozlarının azaltılmasında umblikal kord mezenkimi kaynaklı kök hücrelerin rolü
The role of  stem cells derivated from mesenchym of umblical cord  in reducing immunsupressive drug doses  used in allogenic transplantations
Yazar: ŞEYDA GÜRAY
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSTAFA SÜTÇÜ
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Doz-cevap ilişkisi-ilaç = Dose-response relationship-drug ; Kök hücreler = Stem cells ; Toksisite = Toxicity ; Toksisite testleri = Toxicity tests ; Transplantasyon = Transplantation ; İmmünosupresif ajanlar = Immunosuppressive agents ; İmmünosüpresyon = Immunosuppression

Özet:
Giriş: Mezenkimal kök hücrelerin immünmodülatör özellikleri olduğu ve bu özelliğin immünsupresyon yönünde kullanılabileceği birçok deneysel ve klinik çalışmada kanıtlanmıştır. Literatürde bu etkinin immünsupresif tedavi dozlarını azaltacak kadar güçlü olup olmadığını araştıran yeterli sayıda çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada umblikal kord mezenkimal kök hücrelerinin (UK-MKH) immünsupresif dozlarını azaltmadaki rolü ve etki mekanizmasının deneysel bir model üzerinde nicel parametrelerle gösterilmesi amaçlanmıştır. Gereç-Yöntem: Çalışmada donör olarak 10 adet, 4-6 haftalık, 30-40 gram ağırlığında ''erkek inbred C57BL/6'' ve alıcı olarak 40 adet benzer özelliklerde ''inbred Balb/c'' fareler etik kurul onayı alınarak kullanıldı.
1.Grup (n:5); Cilt allogrefti transplante edildi, kök hücre ya da immünsupresif tedavi uygulanmadı. 2.Grup (n:7); Allogreft sonrası hergün 15mg/kg/gün Siklosporin-A subkütan uygulandı. 3.Grup (n:7); Allogreft sonrası 0.gün 5.7X10⁶ hücre/kg ve 3.günde 10.3X10⁶ hücre/kg UK-MKH intramusküler (İM) uygulandı. 4.Grup (n:7); Allogreft sonrası hergün 15mg/kg/gün Siklosporin-A subkütan; 0.gün 5.7X10⁶ hücre/kg ve 3.günde 10.3X10⁶ hücre/kg UK-MKH İM uygulandı. 5.Grup (n:7); Allogreft sonrası hergün 10mg/kg/gün Siklosporin-A subkütan; 0.gün 5.7X10⁶ hücre/kg ve 3.günde 10.3X10⁶ hücre/kg UK-MKH İM uygulandı. 6.Grup (n:7); Allogreft sonrası hergün 5mg/kg/gün Siklosporin-A subkütan; 0.gün 5.7X10⁶ hücre/kg ve 3.günde 10.3X10⁶ hücre/kg UK-MKH İM uygulandı. Tüm allogreft pansumanları 4.günde açıldı. Takip süreleri 30 gündü. Greft yaşayabilirliği aşağıdaki parametrelerle değerlendirildi. Makroskopik olarak; greftin rengi, doku özelliği ve konturu üzerinden rejeksiyon değerlendirildi. Sayısal termal görüntülemede (STG); kızılötesi görüntüleme cihazıyla (VarioCAM® HD head, InfraTec, Dresden, Germany) cilt allogreftinin çevre dokulara göre sıcaklık değişimleri (Δt) kantitatif olarak belirlendi. Mikroskopik olarak; rejeksiyonun en yoğun olduğu 10.gün biyopsilerinde inflamatuar hücre infiltrasyonu, epitel kalınlığı, dermo-epidermal ayrışma değerlendirildi. Çalışmanın sonunda farelerden elde edilen karaciğer ve böbrek biyopsilerinde immünsupresyonun etkileri incelendi. İmmünohistokimyasal incelemelerle; hücre proliferasyonu (Ki-67) ve anti-apoptozis (Bcl-2) dereceleri belirlendi. Biyokimyasal incelemede; serum anti-inflamatuar (IL-10) ve pro-inflamatuar (IL-2, IFN-gama, TNF-alfa) sitokin düzeyleri belirlendi. Veriler istatistiksel olarak karşılaştırıldı. Bulgular: Makroskopik olarak; tüm allogreftler 4.günde vaskülarize görünümdeydi. Renk değişikliği ve nekroz başlangıcı; 1. grupta 10. gün, 3. ve 6. gruplarda 11. günde gözlenirken; total rejeksiyon; 1. grupta 12. gün, 3 ve 6. gruplarda 13. günde gözlendi. 2, 4 ve 5. gruplarda allogreft kaybı gözlenmedi. STG'de; allotransplantasyonlarda inflamasyonun maksimum olduğu 10. günde allogreftlerin çevre dokuya göre ısı artışı; 1. grupta en fazlayken; 4. grupta en azdı ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (1.grup Δt: 2,08 °C, 2.grup Δt: 1,11 °C, 3.grup Δt: 1,75°C, 4.grup Δt: 0,88°C, 5.grup Δt: 1,05 °C, 6.grup Δt: 1,17 °C). Mikroskopik bulgular; allogreftlerin epitel kalınlığı değerlendirildiğinde 2, 4 ve 5. gruplarda
158
çok sıralı epidermal kalınlık korundu ve aralarında istatistiksel fark yoktu. İnflamatuar hücre infiltrasyonu en fazla 1. ve 3. gruptaydı ve aralarında istatistiksel fark yoktu. Dermo-epidermal ayrışma ise 1, 3 ve 6. gruplarda gözlenirken, diğer gruplarda gözlenmedi. Böbrek ve karaciğer biyopsilerinde 2. ve 4. gruplarda SK toksisitesine bağlı bulgular gözlenirken; 1, 3, 5 ve 6. gruplarda gözlenmedi ve aralarında istatistiksel fark bulunamadı. İmmünohistokimyasal bulgular; hücresel proliferasyon (Ki-67) ve anti-apoptozis (bcl-2) skorları 2, 4 ve 5. gruplarda en yüksekti ve aralarında istatistiksel fark yoktu. Biyokimyasal incelemede; 1, 3 ve 6. gruplarda pro-inflamatuar sitokinler en yüksek, anti-inflamatuar sitokinlerse en düşüktü. Grup 2, 4, 5'de ise pro-inflamatuar sitokinler düşük, anti-inflamatuar sitokinler yüksekti. Gruplar arasında istatistiksel fark yoktu.
Tartışma: İmmünsupresif tedavinin yan etkilerinden kaçınmanın en etkin yolu; terapötik etkiyi azaltmadan immünsupresif dozlarının düşürülmesi olmalıdır. Bu çalışmada allojenik transplantasyonlarda kullanılan immünsupresif ilaçlardan SK'nin dozunun azaltılmasında UK-MKH'nin rolü araştırılmış ve allotransplantasyonlarda ''UK-MKH+immünsupresif'' kombine uygulamasının nefrotoksisite ve hepatotoksisiteye neden olmadan immünsupresif ilaç dozlarının azaltılmasını sağladığı kanıtlanmıştır. Bu kombinasyonun klinik pratiğe uyarlanabilecek etkin ve güvenilir bir tedavi seçeneği olduğu gösterilmiştir.

Abstract:
Introduction
It has been proved by many clinical and experimental studies that mesenchymal stem cells have immunomodulatory properties and can be used for immunosuppression. There are not enough studies in the literature to determine whether this effect is strong enough to reduce immunosuppressive treatment doses.
The aim of this study was to prove the role and mechanism of action of umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSC) with quantitative parameters in reducing immunosuppressive doses on an experimental model.
Material and Method
10 black male inbred C57BL / 6, weighing 30-40 grams, 4-6 weeks old and 40 inbred Balb / c mice with similar properties were used with the approval of the ethics committee in this study.
Group 1 (n:5): Skin allograft was transplanted, no stem cell or immunosuppressive treatment was applied.
Group 2 (n: 7); Cyclosporine-A subcutaneous 15mg / kg / day was administered after allograft.
Group 3 (n: 7); On day 0, 5.7X10⁶ cells / kg on day 3, 10.3X10⁶ cells / kg were administered intramuscular (IM) UC-MSC.
Group 4 (n: 7); 15 mg / kg / day Cyclosporin-A subcutaneous daily after allograft; On day 0, 5.7X10⁶ cells / kg and on day 3 10.3X10⁶ cells / kg UC-MSC were administered.
Group 5 (n: 7); Cyclosporin-A subcutaneous 10mg / kg / day after allograft; On day 0, 5.7X10⁶ cells / kg and on day 3, 10.3X10⁶ cells / kg UC-MSC were administered.
Group 6 (n: 7); Cyclosporin-A subcutaneous 5mg / kg / day after allograft; On day 0, 5.7X10⁶ cells / kg and on day 3, 10.3X10⁶ cells / kg UC-MSC were administered.
All allograft tie overs were removed on the 4th day. Follow-up period was 30 days.
Macroscopically; rejection was assessed by changes in color, texture and contour of the graft. In digital thermal imaging (DTI); The temperature changes (Δt) of the skin allograft relative to surrounding tissues were quantitatively determined by infrared imaging device (VarioCAM® HD head, InfraTec, Dresden, Germany).
Microscopically; In the 10th day biopsies where rejection was most intense, inflammatory cell infiltration, epithelial thickness and dermo-epidermal separation were evaluated. At the end of the study, the effects of immunosuppression on liver and kidney were examined with biopsies obtained from mice.
Immunohistochemical examinations; cell proliferation (Ki-67) and anti-apoptosis (Bcl-2) levels were determined.
In biochemical examination; Serum anti-inflammatory (IL-10) and pro-inflammatory (IL-2, IFN-gamma, TNF-alpha) cytokine levels were determined.
The data were compared statistically.
Results
Macroscopically; all allografts were vascularized on the 4th day. Color change and onset of necrosis; on the 10th day in the 1st group, on the 11th day in the 3rd and 6th groups; total rejection was observed on day 12 in group 1, and day 13 in groups 3 and 6. Allograft loss was not observed in groups 2, 4 and 5. Digital Thermal Imaging; the highest temperature increase of allografts relative to surrounding tissue on the 10th day when inflammation was maximal in allotransplantations was in group 1, and Group 4 was the least. The difference was statistically significant (group 1 Δt: 2,08 ° C, group 2 Δt: 1,11 ° C, group 3 1,t: 1,75 ° C, group 4 Δt: 0 , 88 ° C, 5.group Δt: 1.05 ° C, 6.group Δt: 1.17 ° C).
160
Microscopic results; when the epithelial thickness of allografts was evaluated, multilevel epidermal thickness was maintained in groups 2, 4 and 5 and there was no statistical difference between them. Inflammatory cell infiltration was mostly in the first and third groups and there was no statistical difference between them. Dermo-epidermal separation was observed in groups 1, 3 and 6, but not in other groups. Kidney and liver biopsies showed signs of SC toxicity in groups 2 and 4; There was no statistical difference between groups 1, 3, 5 and 6.
Immunohistochemical results; Ki-67 and bcl-2 scores were highest in groups 2, 4 and 5 and there was no statistical difference between them.
In biochemical examination; Pro-inflammatory cytokines were the highest and anti-inflammatory cytokines were the lowest in groups 1, 3 and 6. In group 2, 4, 5 pro-inflammatory cytokines were low and anti-inflammatory cytokines were high. There was no statistical difference between the groups.
Discussion: The most effective way to avoid side effects of immunosuppressive therapy is decreasing of immunosuppressive doses without reducing the therapeutic effect. The aim of this study was to investigate the role of UC-MSC in reducing the dose of SC one of the immunosuppressive drugs used in allogeneic transplantations. It was proven that combination of the ''UC-MSC + immunosuppressive'' is of benefit to reducing of immunosuppressive drug doses without causing nephrotoxicity and hepatotoxicity. It has been shown that this combination is an effective and safe treatment option that can be adapted to clinical practice.