SARS-CoV-2 (Covıd-19) spike reseptör bağlanma domain (S-RBD) antijenine yönelik lipid nanopartikül kaplı özgün dizayn edilmiş mRNA aşısının geliştirilmesi
Development of lipid nanoparticle coated uniquely designed mRNA vaccine for SARS-CoV-2 (Covid-19) spike receptor binding domain (S-RBD) antigen
Yazar: TUĞÇE DURAN
Danışman: DOÇ. DR. NACİ ÇİNE ; DOÇ. DR. NADİR KOÇAK
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Antijenler = Antigens ; Aşılama = Vaccination ; Aşılar = Vaccines ; COVID 19 = COVID 19 ; Korona virüs enfeksiyonları = Coronavirus enfections ; Korona virüsler = Coronaviridae ; Lipidler = Lipids ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; SARS virüsü = SARS virus ; mRNA = mRNA

Özet:
Amaç: Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) dünya çapında önemli morbidite ve mortaliteye neden olmuştur. Hızla yayılan koronavirüs enfeksiyonuna karşı en etkili bağışıklama yöntemlerinden biri aşılamadır. Son yıllarda, geliştirilen mRNA aşıları güçlü bağışıklık sağlaması ve uzun süreli koruma sağlaması yönüyle diğer aşılama yöntemlerinden ayrılmaktadır. Bu çalışmada, COVID-19'a karşı yüksek koruyuculuk ve bağışıklık göstermesi beklenen SARS-CoV-2 S-RBD hedef antijenine yönelik lipid nanopartikül (LNP) kaplı özgün dizayn edilmiş mRNA aşısının geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Yöntem: mRNA aşı konstrüksiyonunun oluşturulması için, öncelikle S-RBD içeren plazmid DNA'sı, kalsiyum kompotent bakteri hücrelerinde klonlandıktan sonra kit ve alkalen lizis yöntemi ile izole edilmiştir. ORF bölgesine 5'UTR ve 3'UTR dizileri dizayn edilen köprü dizilerle ligaze edilmiştir. Ligasyon ürünü, TOPO TA vektörüne klonlandıktan sonra, 3' bölgeye Poli (T) uzantısı konstrüksiyona dahil edilmiştir. 5'kapak analoğu olan ARCA'nın da 5' bölgeye eklenmesinden sonra, modifiye nükleotitler (5-Me-CTP, Ψ-UTP) ve GTP, ATP kullanılarak IVT ile mRNA aşı molekülü oluşturulmuştur.  mRNA aşı molekülü katyonik lipid karışımı ile formülize  edildikten sonra, LNP'ye dönüştürülerek enkapsüle edilmiştir. Diyaliz ile saflaştırılan aşı molekülü, elektron mikroskobu ile görüntülenerek parçacık boyut analizi yapılmıştır. 
Bulgular: Alkalen lizis metoduyla kite göre yüksek konsantrasyonda elde edilen (p<0.01) plazmid DNA'sı şablon olarak kullanılarak, istenen tüm yapıların konstrüksiyona dahil edilmesi sonucunda mRNA molekülü elde edilmiştir. Saflaştırma adımlarından sonra, mRNA molekülü LNP ile kaplanmıştır. Elektron mikroskobik incelemeler sonucunda, mRNA aşı parçacık boyut analizi ile boyutun ≤100 nm olduğu saptanmıştır. 
Sonuç: Sonuç olarak, SARS-CoV-2'nin S-RBD hedef antijenine yönelik katyonik LNP kaplı özgün dizayn edilmiş mRNA aşısı geliştirilmiştir.

Abstract:
Objective: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has caused significant morbidity and mortality worldwide. One of the most effective immunization methods against the rapidly spreading coronavirus infection is vaccination. In recent years, mRNA vaccines developed differ from other vaccination methods in that they provide strong immunity and long-term protection. In this study, it was aimed to develop a specially designed mRNA vaccine coated with lipid nanoparticle (LNP) for SARS-CoV-2 S-RBD target antigen, which is expected to show high protection and immunity against COVID-19.
Method: In order to create the mRNA vaccine construction, first of all, plasmid DNA containing S-RBD was cloned in calcium competent bacterial cells and then isolated by kit and alkaline lysis method. The 5'UTR and 3'UTR sequences were ligated into the ORF region with the designed bridge sequences. After the ligation product was cloned into the TOPO TA vector, the Poly (T) extension was incorporated into the 3' region. After adding ARCA, which is a 5' cap analog, to the 5' region, mRNA vaccine molecule was formed by IVT using modified nucleotides (5-Me-CTP, Ψ-UTP) and GTP, ATP. After the mRNA vaccine molecule was formulated with a cationic lipid mixture, it was converted to LNP and encapsulated. The vaccine molecule purified by dialysis was visualized by electron microscopy and particle size analysis was performed.
Results: By using the plasmid DNA obtained in high concentration (p<0.01) compared to the kit by alkaline lysis method as a template, mRNA molecule was obtained as a result of including all desired structures in the construction. After purification steps, the mRNA molecule was coated with LNP. As a result of electron microscopic examinations, the size was determined to be ≤100 nm by mRNA vaccine particle size analysis.
Conclusion: As a result, a uniquely designed mRNA vaccine with cationic LNP coating for S-RBD target antigen of SARS-CoV-2 has been developed.