Dondurulmuş sazan sperma hücrelerinde dna hasarının tek hücre jel elektroforezi (COMET) yöntemi ile belirlenmesi
Detecti̇on of dna damage of frozed carp sperm cells wi̇th si̇ngle cell gel electrophoresi̇s (COMET)
Yazar: NAZLI YILDIRIM
Danışman: DOÇ. DR. FATİH ÖĞRETMEN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Spermanın dondurularak uzun süreli muhafazasında ve çözüm sonrası düşük fertilizasyon oranlarının sebeplerinin araştırılması açısından bu çalışma önem taşımaktadır. Araştırmada İzmir DSİ Ürkmez Su Ürünleri Üretim Tesisinden temin edilen balıklar (Cyprinus carpio) kullanılmıştır. Yapılan çalışmada; dondurulmuş sazan balığı spermasının çözüm sonrasında tek hücre jel elektroforezi yöntemi ile DNA hasarı araştırılmıştır. Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi Biyoloji Bölümü Hidrobiyoloji Laboratuvarı'nda, 2-3 yaş arasındaki 3 erkek sazan balığından alınan sperm örnekleri havuzlanarak dondurulmuştur. Numunelerin çözüm sonrası tek hücre jel elektroforezi yöntemi ile DNA hasarı analiz edilmiştir. Comet metodunda hücreler floresan mikroskobunda incelenerek DNA hasarının düzeyi belirlenmiştir. Yapılan analizlerde dondurulmuş sperm DNA'sının ortalama % 31,8±2,8a oranında hasara uğradığı gözlemlenmiştir.
Bu çalışmada üç farklı comet tekniği uygulanmıştır. Bu tekniklerden pratik olarak en uygun olanı (Singh vd., 1998) balık spermasına göre optimize edilmiştir. Böylece çalışma prensibi açısından kolay bir yöntem geliştirilmiş olmakla birlikte zamandan ve kullanılan kimyasallardan da tasarruf edilmiştir.
Çalışmada kullanılan 3 ayrı metod arasındaki farklar istatiksel olarak incelenerek, varyans analizi (ANOVA) yapılmıştır. Metodlara göre DNA hasarsız ve hasarlı hücre dağılımları incelenmiştir.  Gruplar arasında istatiksel olarak farklılık olmadığı belirlenmiştir (P <0,05).

Anahtar Kelimeler: DNA, DNA Hasarı, COMET Analizi, Tek Hücre Jel Elektroforezi, Kryoprezervasyon, Sperm Muhafazası

Abstract:
This study is important in the terms of long term cryopreservation of sperm and evaluating the reasons of low fertility rates after thawing. In this study, the fishes (Cyprinus carpio) which obtained from İzmir DSİ (the general directorate of state hydraulic works) Ürkmez aquaculture production facility were used. In this study, the DNA damage of frozen and thawed carp sperm cell has been investigated with single cell gel electrophoresis method. Sperm samples obtained from 3 common carp males between 2-3 ages were frozen in Muğla University Biology Department Hydrobiology Laboratory. Samples were analyzed with single cell gel electrophoresis after thawing. In this method, cell samples were observed by fluorescent microscopy and DNA damage level were determined. Analysis showed that the frozen sperm DNA damaged about %31±2,8a.
Three different comet techniques were applied in this study. Between these techniques, practically the most convenient one was optimized for fish sperm cells. In this way, in terms of the operation principle, a basic method improved, time and chemical usage were reduced. Statistical differences were evaluated between used 3 different method with variance analysis (ANOVA). Distributions of damaged and undamaged cells were examined according to methods. It was determined that there is no statistical difference between groups  (P <0,05).
Keywords: DNA, DNA Damage, Comet Analysis, Single Cell Gel Electrophoresis, Cryopreservation, Sperm Storage.