Multipl skleroz hastalığında miRNA'ların biyobelirteç olarak araştırılması
Investigation of miRNA's as potential biomarkers in multiple sclerosis
Yazar: FATMA SAĞIR
Danışman: PROF. DR. ERDEM TÜZÜN ; DOÇ. DR. NAGEHAN ERSOY TUNALI
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı / İleri Nörolojik Bilimler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Nöroloji = Neurology

Özet:
Multipl Skleroz (MS) merkezi sinir sisteminin otoimmün inflamatuvar bir hastalığıdır. MS'de periferik kan mononükleer hücreleri (PKMH) hastalığın patogenezinde rol alırlar ve aktif demiyelinizasyonu tetiklerler. mikroRNA'lar (miRNA'lar) gen ekspresyonunu post transkripsiyonel olarak regüle eden yaklaşık 21 nükleotit uzunluğunda, kodlama yapmayan küçük RNA molekülleridir.
Çalışmanın ilk kısmında inflamasyon ve sitokin regülasyonunda rolleri olduğu düşünülen miR-132-3p, miR-19b-3p ve miR-106b-5p'nin MS hastalığının tanısında ve hastalığın seyrinin belirlenmesinde biyobelirteç olarak kullanılma potansiyelleri, ikinci kısmında ise miRNA stabilitesi araştırılmıştır.
Çalışmanın ilk kısmında 46 MS hastasından alınan kanlardan PKMH izolasyonu yapılmıştır. MS alt grupları (3 KIS, 1 PPMS, 14 SPMS, 28 RRMS) ile sağlıklı gönüllülerin (n=13) PKMH 'nde miR-132-3p, miR-106b-5p ve miR-19b-3p'nin ekspresyon farklılıklarına qRT-PCR yöntemi ile bakılmıştır. İstatiksel analizler GraphPad Prism 9.1 aracılığı ile Mann-Whitney ve Kruskal-Wallis testi uygulanarak yapılmıştır.
Çalışmada miR-132-3p, miR-19b-3p ve miR-106b-5p ekspresyonlarında kontrollere kıyasla hasta gruplarında istatiksel olarak anlamlı artış gözlemlenmiştir. Her üç miRNA için yapılan ROC eğrisi analizleri bu miRNA'ların hastalarla kontrolleri ayırt edebileceğini göstermektedir. 
Çalışmanın ikinci aşamasında ise farklı ortam şartlarına maruz bırakılan beyin omurilik sıvısı ve plazma örneklerinin miRNA stabilitesi small-seq isimli güncel bir yöntem ile analiz edilmiştir. Bu çalışma bazı miRNA'ların farklı ortam şartlarında stabilitesini koruduğunu fakat varyasyon gösteren miRNA'ların olması sebebiyle olası diğer etmenlerin incelenmesinin önemini göstermektedir. 
Bu araştırmadan alınan sonuçlar miR-132-3p, miR-106b-5p ve miR-19b-3p'nin MS'in erken tanısının konması ve hastalığın seyri hakkında bilgi verebileceğini göstermektedir. Ayrıca miRNA'ların stabilitelerinin maruz bırakılan ortam koşulları dışında bazı özel baz tekrarlarının varlığı, biyosıvı örneklerindeki hücre kontaminasyonu, RNaz enziminin varlığı gibi olası etmenlerden etkilenebileceğini göstermektedir.

Abstract:
Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune inflammatory disease. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are involved in the pathogenesis of MS. MicroRNAs are small non-coding molecules of about 21 nucleotides in length, regulate gene expression at post-transcriptional level. 
The first part of the study investigates the potential of miR-132-3p, miR-19b-3p and miR-106b-5p to be used as biomarkers in the diagnosis and progression of MS and second part investigates miRNA stability.
In the first part, PBMCs were obtained from the blood taken from 3 CIS, 1 PPMS, 14 SPMS, 28 RRMS, 13 controls and miRNA's expression profile analysis was performed with qRT-PCR. Data were analyzed using Mann-Whitney and Kruskal-Wallis test.
Results show significant overexpression of investigated miRNAs in MS patients compared to controls. ROC analyses implicate that these miRNAs have the ability to distinguish MS patients from controls.
The second part aimed to show that miRNAs are stable and would not be affected by freeze/thaw cycles and room temperatures using small-seq method.  Results showed that some miRNAs are stable after being exposed to different enviromental conditions. Yet, there are some variability in some of the miRNAs that indicates other possible factors affecting the miRNA stability to be considered.  
qRT-PCR results of miRNAs show that these miRNAs have potential to be biomarkers for the diagnosis of MS. It also shows that the stability of miRNAs may be affected by other factors: presence of some specific base repeats and RNase enzyme; and having cell contamination in biofluid samples other than the exposed environmental conditions.