Sitomegalovirüs spesifik T hücre yanıtının flow sitometri yöntemi ile optimizasyonu
Optimization of cytomegalovirus specific T cell response via flow cytometry
Yazar: HAFİZE KILINÇKAYA DOĞAN
Danışman: PROF. DR. MERAL GÜLTEKİN
Akdeniz Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Organ nakli = Organ transplantation ; Sitomegalovirüs = Cytomegalovirus ; T lenfositleri = T lymphocytes ; İnterferonlar = Interferons

Özet:
Human Herpesvirüs 5 (HHV-5) olarak tanımlanan insan Sitomegalovirüs (Cytomegalovirüs : CMV), Herpesviridae ailesinin Betaherpesvirinae alt ailesinde Cytomegalovirus cinsi içerisinde yer alır. CMV, primer enfeksiyondan sonra endotelyal hücreler, lökositler ve çeşitli dokularda latent enfeksiyonlara neden olur. Organ  naklinde verici CMV seropozitif (D +), alıcı seronegatif (R-) ise nakil alan hastalarda primer CMV enfeksiyonu; CMV seropozitif alıcılarda ise CMV reaktivasyonu ve reenfeksiyon gelişme  riski yüksektir. Latent virüs enfeksiyonları transplantasyon alanında immün süpresif  tedavi ile sağlanan başarıyı  olumsuz yönde etkileyen en önemli faktörlerdendir. Bu nedenle nakledilen organın reddi hatta hastanın kaybı ile sonlanabilen CMV enfeksiyon hastalığının zamanında saptanması son derece önemli ve gereklidir.
CMV enfeksiyonu tanısında hücre kültürü, histopatolojik inceleme, serolojik testler, moleküler yöntemler, CMV antijenemi testi ve immünolojik testler gibi geniş bir yelpazeye yayılan testler kullanılmaktadır. Hücre kültürü, CMV tanısında altın standard kabul edilse de günümüzde yerini daha hızlı sonuç veren, daha az emek ve iş gücü gerektiren testlere bırakmıştır. Nitekim günümüzde solid organ transplant hastalarında CMV enfeksiyonunun belirlenmesinde preemptif  tedavi uygulanacak hastaların seçiminde ve tedavinin  izleminde  moleküler yöntemler ile viral yükün saptanması ve kantitasyonu  pratik uygulamada yerini almıştır.
Özellikle immün sistemi baskılanmış olgularda ve latent virüs enfeksiyonlarında konağın etkene yanıtı ya da yanıtsızlığı klinik tablonun belirlenmesinde anahtar rol oynar. Viral enfeksiyonlardan korunmada özellikle hücresel bağışıklık yanıtının önemi büyüktür ve  hafıza CD4+ ve CD8+ T lenfositler hücresel immünitenin fonksiyonel imzalarıdır. Organ nakil hastalarında, etkenin özellikleri yanı sıra konak  immün yanıtının bilinmesi, enfeksiyon hastalığının daha erken  saptanmasını, immün süpresif tedavinin ve enfeksiyon tedavisinin monitörizasyonunu sağlayacaktır. Hücresel anti-viral immünite en yaygın olarak ELISPOT, Quantiferon ve akış sitometri yöntemleri ile çalışılmaktadır. Araştırmamızda kullandığımız sitokin akış sitometri yöntemi ile hücreleri  büyüklük ve granülaritelerine göre birbirinden ayırmanın yanı sıra  fonksiyonlarını da ölçmek  mümkündür.
Akdeniz Üniversitesi Hastanesi?nin güçlü yanlarından birisi organ naklinde göstermiş olduğu başarıdır. Bu başarı biz laboratuvar bilim dallarına da organ nakil hastalarında   enfeksiyon hastalıklarının tanısı ve izleminde evrensel- bilimsel yaklaşımları takip etmek  sorumluluğunu yüklemektedir. Biz de sorumluluğumuzun bilinci ile laboratuvarımızda organ nakil hastalarında virus spesifik hücresel yanıt araştırmalarına başlamış bulunuyoruz. Araştırmamızda,  böbrek nakli yapılmış hastalarda CMV?ye spesifik  T hücre yanıtını  sitokin akış sitometri yöntemi ile  optimizasyon ve validasyonunu ve ardından klinik olguların hücresel immün yanıtlarının monitörizasyonunu planladık.
Bu amaçla Aralık 2012- Ağustos 2013 tarihleri arasında Akdeniz Üniversitesi Organ Nakli Merkezi tarafından canlı vericiden böbrek nakli planlanan, 18-66 Y (kısaltma yapma veya ilk yaptıgında ne oldugunu yaz) yirmi bir (7 K, 14 E) hastadan  böbrek nakli öncesi ( 0.ay) ve  nakil sonrası 1., 3. ve 6. aylarda toplam dörder kez örnek aldık. Prospektif araştırma sürecinde on iki hastanın planlanan tüm örnekleri alınmış ancak dokuz  hastanın transplantasyon sonrası 6.ay örneklerini almak için projemizin süresi  yeterli olamamıştır. Kontrol grubu olarak böbrek nakli planlanan hastaların sağlıklı, CMV seropozitif vericilerinden (24-66 Y, 10 E ,10 K) örnek alınmıştır. 
Çalışmamızın optimizasyon ve validasyon testlerinin tamamlanmasının ardından hastalarımızın ve kontrol grubumuzun testlerini çalıştık. Yöntemimizin ana basamakları, tam kandan periferik kan mononükleer hücre (PKMNH) izolasyonu, dondurulup saklanması, çözülmesi, ardından lenfositlerin CMV peptidleri ile ex vivo olarak uyarılması ve CMV spesifik IFN-? üreten T lenfositlerinin  yüzey antijenleri  ve hücre içi sitokin boyama sonucunda akış sitometride fonksiyonel ayırım yaparak sayılmasıdır. Elde edilen ana bulgular IFN-? üreten CMV spesifik CD4+ , CD8+ ve toplam (CD4++CD8+) T lenfosit yüzdeleridir. Hastanın periferal kanlarındaki lenfosit sayılarıyla bu değerler oranlanarak periferal kanlarında bulunan CMV spesifik IFN-? üreten T lenfosit sayısı hesaplanmıştır ve değerlendirmeler bu sayılar üzerinden yapılmıştır.
Tüm hastalar ve kontrol grubu için yapılan testler tamamlandıktan sonra elde edilen bulgular değerlendirildiğinde nakilden sonraki 3.ayda ölçülen periferal kan lenfositlerinin 1.ay değerlerinden anlamlı oranda düşük olduğu görülmüştür. CMV spesifik CD4+  1.aydan da 3.aya (p=0,003) doğru anlamlı oranda azalma gözterdiği; diğer gruplar arasında anlamlı fark olmadığı saptanmıştır. CMV spesifik CD4+ +CD8+  T lenfosit 3.ay değerinin 1.aya göre anlamlı oranda (p=0,039) azaldığı belirlenmiştir.
Hastaların nakil öncesinde test edilen CMV IgG değerlerinin, yaşlarının, cinsiyetlerinin, hastalara uygulanan immün süpresyon ve indüksiyon tedavilerinin IFN-? salınımı yapan CMV spesifik T lenfositler üzerinde anlamlı etkilerinin olmadığı görülmüştür. 6.ay örneğinde düşük düzeyde viremi saptanan olgumuzun 3.ayında CMV hücresel immün yanıtının olmadığı,  6 ayda ise yüksek düzeyde CMV spesifik IFN-? salınımının mevcut olduğu izlenmiştir.
Sonuç olarak biz bu çalışma ile hastanamizde ve Türkiye?de ilk defa uygulanan, flow sitometrik yöntem ile böbrek nakli hastalarında CMV spesifik T hücre kantitasyonu yaptık. Optimizasyon ve validasyon çalışmalarımız sonucunda gördük ki altı aylık dondurulma süresinde bile virüs spesifik T hücre yanıtı kantitasyonu olumsuz etkilenmemektedir. Bu çalışma sadece solid organ transplantasyonu değil kemik iliği transplantasyonu alanında da yapılacak olan daha geniş kapsamlı çalışmlara öncü olacaktır

Abstract:
Human Herpesvirus 5 (HHV-5) which is defined as the human Cytomegalovirus (CMV) is located in Herpesviridae family of the Betaherpesvirinae genus of the Cytomegalovirus species.  After the primary infection, CMV causes  latent infections in endothelial cells, leukocytes and various tissues. In organ transplantation,  if donor is CMV seropositive (D +) and the recipient is seronegative (R-), the risk of the primary CMV infection is high in transplant patients and the risk of CMV reactivation and re-infection  is high in CMV-seropositive recipients. Latent virus infections are the most important factors that adversely affect the success which is provided by immunosuppressive therapy in transplant. For this reason, timely detection of CMV infection disease which causes the loss of the transplanted organ rejection and even patients is extremely important and required.
The cell culture, histopathological examination, serological tests, molecular methods, CMV antigenemia test and immunological tests are used in a wide range in the diagnosis of CMV infection. Although cell culture that is considered the gold standard in the diagnosis of CMV gave  place to more rapid and less labor-intensive tests. Thus in the present day,  detection of viral load and quantity with molecular methods has taken place in determination of CMV infection in solid organ transplant patients, the selection of patients to be applied in determining the preemptive treatment and follow-up of the treatment. 
Especially in immunosuppresive patients and latent virus infections, the presence of host response or absence of host response play a key role in determining the clinical condition. The cellular immune response has especially a great function in the prevention of viral infections, and memory CD4+ and CD8+ T lymphocytes are the functional signatures of cellular immunity. In organ transplant patients, the properties of the agent as well as the characteristic of host immune response will provide early detection of infectious disease, monitoring of immunosuppressive therapy and the treatment of the infection. Cellular immunity tests are studied by ELISPOT, Quantiferon and flow cytometry methods. It ıs possible to evaluate the cells according to size and granularity as well as measure functions by cytokine flow cytometry method which is used in our study. 
One of the strengths of the Mediterranean University Hospital is the success in organ transplantation. This success also gives a responsibility to the laboratory sciences to follow  universal-scientific approach in the diagnosis and follow-up of infectious diseases in organ transplant patients. With a sense of responsibility, we have begun viral-specific cellular response research in organ transplant patients in our laboratory. In our study, we have planned the optimization and validation of CMV-specific T-cell response in renal transplant patients with cytokine flow cytometry method and then planned the monitoring of cellular immune responses of clinical cases. 
To this end, totally for four times we have taken samples before kidney transplantation (0. month), and post-transplant 1st , 3rd and 6th months from twenty-one patients between the ages of 18 and 66 years whom were planned by Mediterranean University Organ Transplantation Center for live-donor kidney transplantation between dates December 2012 - August 2013. During prospective research process all planned samples were collected from twelve patients but we were unable to collect post-transplant 6. months samples from nine patients since. As a control group, healthy CMV-seropositive kidney donors (24 to 66 years, 10 males, 10 females) were used.
After completing the optimization and validation process we have studied the tests of patient and control groups. 
The main stages of our  procedure are, isolation of peripheral blood mononuclear cells from whole blood (PBMC), freezing and storing the samples, thawing samples, ex vivo stimulation of lymphocytes with CMV peptides and counting by flow cytometry after functional seperation as a result of CMV-specific IFN-?-producing T cell surface antigens and intracellular cytokine staining staining.  Main findings obtained from the flow cytometry is IFN-?-producing CMV-specific CD4+, CD8+ and total (CD4+ + CD8+) T-lymphocyte percentages. These values and the patient's peripheral blood lymphocyte numbers were proportioned and so CMV-specific IFN-?-producing T-lymphocyte number was calculated in   peripheral blood and evaluations were made via these numbers.
According to obtained findings after completing all tests for patient and control groups, we showed that post-transplant 3rd month peripheral blood lymphocyte values were significantly lower than post-transplant 1st month peripheral blood lymphocyte values. CMV-specific CD4+ lymphocytes were significantly decreased (p=0,003) in post-transplant 3rd month compared to post-transplant 1st month, and no significant difference was observed between  other groups. Third month CMV-specific CD4++CD8+ T lymphocytes were significantly decreased (p=0,039) compared to 1st month value.
Patients? CMV IgG values before transplantation, age, gender, immunosuppressive and induction therapies administered to patients did not have any significant effect on IFN-? secreting CMV-specific T-lymphocytes. We observed that the one case whom had low level of viremia in the 6th month sample had no cellular immune response to CMV and had high level of CMV-specific IFN-? secretion in six months. 
In conclusion, with this study, the first time in our hospital and Turkey, we quantitated CMV specific T cells in kidney transplant patients through cytokine Flow cytometry. Our optimisation and validation experiments showed that freezing and storing samples up to six months does not have any quantitative effect on the virus specific T cells. The results of this study will lead to more comphrensive studies in not only solid organ but also in bone marrow transplantation patients