Antifosfolipid sendromunda trombosit membran glikoprotein polimorfizmlerinin sıklığı ve klinik etkileri
Clinical outcomes and frequencies of platelet membrane glycoprotein polymorphisms in antiphosphospholipid syndrome
Yazar: İPEK YÖNAL
Danışman: PROF. MELİHA NALÇACI
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2010
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Antifosfolipid sendromu = Antiphospholipid syndrome ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; Tromboembolizm = Thromboembolism ; Trombosit membran glikoproteinleri = Platelet membrane glycoproteins ; Tromboz = Thrombosis

Özet:
Antifosfolipid sendrom (AFS), serumda uzun süre antifosfolipid antikorların (AFA) varlığı, venöz ya da arteriyel trombozlar, tekrarlayıcı gebelik kayıpları ve trombositopeniyle karakterize, sık görülen, sistemik ve otoimmün bir hastalıktır. Klasik özellikleri derin ven trombozu (DVT), pulmoner emboli (PE), serebral ve retinal ven trombozu gibi venöz trombotik olaylar; geçici iskemik atak (TİA) ya da miyokard infarktüsü gibi arteriyel trombotik olaylar, tekrarlayıcı spontan düşükler ve trombositopenidir. AFS'da trombozun nasıl geliştiği halen aydınlatılamamıştır. AFS'da hangi hasta grubunda, ne zaman tromboz gelişeceğini kestirmek güçtür.Trombositler, trombüs oluşumunda önemli rol oynar. Damar hasar bölgelerinde trombosit glikoprotein (GP) Ib reseptörünün von Willebrand faktöre (vWF), GP Ia/IIa'nın kollajene bağlanması ile trombositler damar duvarına yapışır. Bu bağlanma trombosit içine sinyaller gönderir ve trombositler aktive olur. Aktivasyon sonrasında trombosit yüzeyinde GP IIb/IIIa reseptörü ortaya çıkar. Trombosit agregasyonu GP IIb/IIIa kompleksinin fibrinojene bağlanması ile gerçekleşir. Sonuçta hasarlı damar bölgesinde primer tıkaç oluşturulmuş olur. Trombosit membran GP reseptörleri akut tromboz ve kronik aterosklerozun etyopatogenezinde önemli rol oynar. Bu nedenle akut ve kronik arter trombozlarında trombosit fonksiyonlarını bozan antiagregan ilaçlar tedavinin esasını oluşturur. Trombosit GP'lerini kodlayan genlerde bazı polimorfizmler bildirilmiştir. Bu polimorfizmlerin trombosit adezyonu ve agregasyonunu arttırarak arter ve/veya ven trombozu riskini arttırdığına dair yayınlar mevcuttur.Bu çalışmada AFS'lu hastalarda trombosit GP'lerindeki genetik polimorfizmleri araştırdık. Bu amaçla GPIb alfa ile ilgili polimorfizmleri (VNTR ve Kozak) ve GPIa/IIa (C807T) polimorfizmini incelemeyi ve tromboz ile ilişkisini belirlemeyi hedefledik. Çalışmamıza 2006 yılında revize edilmiş AFS sınıflandırma kriterleri esas alınarak AFS tanısı konmuş 60 olgu (30'u trombozlu, 30'u trombozsuz) ve 63 sağlıklı kontrol dahil edilmiştir.Hastaların 50'si kadın, 10'u erkekdir, yaş ortalaması 39,1±10 bulunmuştur. Sağlıklı gönüllülerin 44'ü kadın, 19'u erkekdir. Hastaların ve sağlıklı gönüllülerin venöz kan örneğinden genomik DNA elde edilip, Gp Ia geninde 807 C/T'yi tespit etmek için `Light-Cycler' cihazı ile real-time polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yapılmış, erime eğrisi analizi ile genotiplendirilmiştir. Gp Ib alfa VNTR polimorfizmi ve Kozak (C/T) polimorfizmi polimorfizmini tespit etmek için `Thermal Cycler' kullanılarak klasik PCR yapılmıştır. Hastalarda tromboz öyküsü araştırılmış ve veriler SPSS istatistik programı (Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, 2008)'na yüklenmiştir. Oranlar ki-kare testi ile karşılaştırılmıştır. %95 Güven aralığı (Confidence Interval-CI), Odds oranı (Odds Ratio-OR) ve p değeri belirlenmiştir.Çalışmamızda trombosit membran polimorfizmleri ile tromboz arasındaki ilişki araştırılmıştır. Bu nedenle AFS'lu hasta grubu 30 kişiden oluşan trombozlu bireylerden (9'unda hem arter hem de ven trombozu, 10'unda sadece arter trombozu, 11'inde sadece ven trombozu) ile hiç tromboz geçirmemiş 30 AFA(+) bireylerden seçilmiştir.Araştırma sonucunda AFS'da tromboz varlığı ile soygeçmişinde (ailede) tromboz varlığı arasında zayıf ilişki saptanmıştır (r:0,26). Bununla beraber MPV değeri ile AFS'da tromboz arasında zayıf ters ilişki bulunmuştur (r:0,29). Trombozsuz AFS'da MPV değeri anlamlı olarak daha yüksek bulunmuştur.Çalışmamızda GPIa C807T polimorfizmi mutant TT genotipi sıklığı trombozlu AFS grubunda trombozsuz gruba kıyasla anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (p:0,023, OR:16,184, CI: 0,8677- 301,84). Ayrıca çoklu (birden fazla) trombozu olan grup ile hiç trombozu olmayan grup karşılaştırıldığı zaman, çoklu trombozu olanlarda GPIa C807T polimorfizmi TT homozigot mutasyonu anlamlı olarak yüksek saptanmıştır (p:0,023; OR:20,333; CI:0,967-427,54). Bulgularımız AFS'da GPIa C807T polimorfizmi TT genotipinin tromboza eğilimi arttırdığını göstermektedir.AFS hastalarında ilk kez bizim çalışmamızda GPIb alfa Kozak polimorfizmi ile tromboz ilişkisi araştırılmıştır. GPIb alfa Kozak polimorfizmi genotip dağılımında tüm AFS ile kontrol grubu ve trombozsuz grup ile trombozlu grup karşılaştırıldığı zaman bir farklılık saptanmamıştır. Arteriyel trombozlu AFS'da venöz trombozlu gruba göre TC genotip sıklığı anlamlı olarak yüksek saptanmıştır (p:0,03; OR:10,667; CI: 1,386-82,074). Ayrıca AFS arteriyel trombozlu alt grubunda TC genotip sıklığı, kontrol grubuna ve trombozsuz AFS'lu gruba göre anlamlı olarak yüksek saptanmıştır (sırasıyla p:0,0007; OR:14; CI:2,662-73,618 ve p:0,0024; OR:13,143; CI:2,248-76,841). Bulgularımız AFS'da GPIb Kozak polimorfizmi TC genotipinin arter trombozuna eğilimi arttırdığını göstermektedir.Çalışmamızda GPIb alfa VNTR polimorfizmi D allel sıklığı ve D allel taşıyıcılığı AFS'da kontrol grubuna göre anlamlı olarak düşük saptanmıştır (sırasıyla p:0,0018; OR:7,973 ; CI: 1,782-35,674 ve p:0,0046;OR:7,540; CI:1,622-35,044).Sonuç olarak çalışmamızda, AFS'lu olgularda GPIa C807T polimorfizmi mutant TT genotipinin tromboz riski ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca birden çok bölgede tromboz olanlarda TT genotipinin risk oluşturduğu gösterilmiştir. Bir diğer polimorfizm olan GPIb Kozak polimorfizmi TC genotip sıklığı arteriyel trombozlu grupta, kontrol grubuna ve trombozsuz gruba göre anlamlı olarak yüksek saptanmıştır. Ayrıca arteriyel ve venöz trombozlu AFS karşılalaştırıldığı zaman GPIb alfa Kozak polimorfizmi TC genotipinin arteriyel trombozlu bireylerde venöz trombozlulara göre anlamlı olarak yüksek sıklıkta olduğu gösterilmiştir. AFS'da GPIb alfa VNTR polimorfizmi D allel sıklığının ve D allel taşıyıcılığının (BD, CD, DD genotiplerinin toplamı) kontrol grubuna göre anlamlı olarak düşük saptanmasından yola çıkarak D alleli taşımanın hastalıktan koruyucu etkisi olabileceği söylenebilir.Bu polimorfizmlerin tanınması tromboz açısından riskli hasta gruplarının belirlenmesinde yardımcı olabilir. Özellikle yeni tanı konmuş AFS hastalarında bu polimorfizmler antikoagülan/antiagregan tedavi kararının verilmesinde etkili olabilir.

Abstract:
Antiphospholipid syndrome (APS) is a common systemic autoimmune disease characterised by the presence of antiphospholipid antibodies (aPL) in serum, venous or arterial thromboses, recurrent fetal losses and thrombocytopenia. Venous thrombotic states such as deep vein thrombosis (DVT), pulmonary embolism (PE), cerebral and retinal vein thrombosis and arterial thrombotic states such as transient ischemic attacks (TIA) or myocardial infarction are the main clinical manifestations along with recurrent spontaneous abortus and thrombocytopenia. The pathogenesis of thrombus formation in APS has yet not been elucidated. Moreover, it is both difficult to estimate the predisposing conditions leading to thrombus formation and the time of actual development of thrombus in APS.Platelets play an integral part in thrombogenesis. Upon endothelial injury, glycoprotein (GP) Ib and GP Ia/IIa bind von Willebrand factor (vWF) and collagen respectively which mediates the adhesion of plalets to the vascular wall. This adhesion causes the activation of plaletets and subsequent expression of GP IIb/IIIa on thrombocyte membrane. The aggregation of thrombocytes ensue as fibrinogen binds the GP IIb/IIIa receptors. As a result, the thrombocytes are sewn together; primary clot forms in the injured site. Since platelet membran GP receptors are important actors in the pathophysiology of acute thrombosis and chronic atherosclerosis, antiaggregant drugs are the essential drugs fort the treatment of acute and chronic arterial trombi. Previous data report the presence of various polymorphisms on genes coding platelet glycoproteins. It has been suggested that these polymorphisms cause an increase in platelet adhesion and aggregation eventually increasing the predisposition to the developmenet of arterial and/or venous thrombosis.Our study investigated the genetic polymorphisms of platelet membrane GPs. We aimed understand the relationship between thrombosis and polymorphisms of GPIb alpha (VNTR and Kozak) and GPIa/IIa (C807T). Our study group consisted of 60 patients (30 with proven thrombosis and 30 without thrombosis) diagnosed as APS according to the revised APS criteria in 2006 and 63 healthy controls.The APS group consisted of 50 females and 10 males with mean age 39,1±10. The healthy controls consisted of 44 females and 19 males. Genomik DNA was obtained from peripheral blood samples of both groups. The DNA extracts were analyzed by real time polymerase chain reaction (PCR) on the Light-Cycler device for the presence of 807 C/T on Gp Ia gene. Genotyping was performed by melting curve analysis. The presence of Kozak (C/T) and VNTR polymorphisms on Gp Ib alpha was determined by classic PCR using Thermal Cycler. The patients were questioned for history of thrombosis. Statistical analysis were performed using SPSS (Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, 2008). Comparison of ratios were made by chi-square test. 95% confidence interval (CI), odd?s ratio (OR) and p values were determined.Our study objective was to detect the relationship between platelet membrane polymorphisms and thrombosis. For that purpose, our APS group consisted of 30 patients with thrombosis (9 with arterial and venous thrombosis, 10 with only arterial thrombosis and 11 with only venous thrombosis) and 30 patients without thrombosis.Our results determined a poor positive correlation between the actual presence of thrombosis in APS patients and family history of thrombosis (r:0,26). Moreover, a poor inverse correlation was present between the presence of thrombosis in APS and MPV (r:0,29). MPV was significantly higher for APS without thrombosis.Our results show that the frequency of mutant TT genotype of GPIa C807T polymorphism is significantly higher in APS with trombosis than APS without thrombosis (p:0,023, OR:16,184, CI: 0,8677- 301,84). The frequency of TT homozygote mutation for GPIa C807T polymorphism was significantly higher in patients with multiple thrombi than those without thrombus (p:0,023; OR:20,333; CI:0,967-427,54). Our findings reveal that mutant TT genotype of GPIa C807T polymorphism predisposes to thrombosis in APS.Our study is the first investigating the relationship between thrombosis and GPIb alpha Kozak polymorphism. Neither the comparison of APS versus healthy controls nor the comparison of APS with thrombosis and APS without thrombosis exhibited any difference in the distribution of GPIb alpha Kozak polymorphism genotype. TC genotype was more frequent in APS with arterial thrombosis than in APS with venous thrombosis (p:0,03; OR:10,667; CI: 1,386-82,074). Subgroup analysis revealed that TC genotype frequency was significantly higher in APS with arterial thrombosis with respect to healthy controls and APS without thrombosis (p:0,0007; OR:14; CI:2,662-73,618 and p:0,0024; OR:13,143; CI:2,248-76,841 respectively). In APS, carriers of TC genotype of GPIb alpha Kozak polymorphism are more prone to develop arterial thrombosis.Finally, D allele frequency and carrier state for GPIb alpha VNTR polimorphism was significantly less in APS with respect to healthy controls (p:0,0018; OR:7,973 ; CI: 1,782-35,674 ve p:0,0046;OR:7,540; CI:1,622-35,044 respectively).In conclusion our results demonstrate the relationship between the risk of thrombosis and the presence of mutant TT genotype of GPIa C807T polymorphism as well as the increased risk the presence of TT genotype poses for development of multiple thrombi. The frequency of TC genotype of GPIb alpha Kozak polymorphism was significantly higher in patients with thrombosis with respect to patients without thrombosis and healthy controls. TC genotype of GPIb alpha Kozak polymorphism frequency was higher in venous thrombosis than in arterial thrombosis. The lower rate of carrier state (summation of BD, CD and DD genotypes) and lesser frequency of D allele GPIb alpha VNTR polymorphism in APS in comparison to healthy controls suggest for a protective role of D allele from APS.Detection of these polymorphisms may aid in better risk assessment for development of thrombosis. Detection of polymorphisms in newly diagnosed APS patients may shapen the decision to inaugurate anticoagulant or antiaggregant treatment.