Mukopolisakkaridoz tarama - tanı testlerinin kurulması ve referans aralıklarının belirlenmesi
Establishment of screening and diagnostic laboratory tests for mucopolysaccharidoses and determination of reference intervals
Yazar: KHALED EL MOUSTAFA
Danışman: DOÇ. DR. İNCİLAY LAY
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Glikozaminoglikanlar = Glycosaminoglycans ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Mukopolisakkaridoz = Mucopolysaccharidosis ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis-ayırıcı = Diagnosis-differential

Özet:
Mukopolisakkaridozlar (MPS), lizozomlarda glikozaminoglikanların (GAG) yıkımında görev alan enzimlerin kalıtsal bozukluğu sonucu oluşan bir grup lizozomal depo hastalıklarıdır (LSD). Mutasyonlar sonucu enzim bozuklukları ile yıkılamayan GAG'lar hücre, doku, organlarda birikir ve biriken GAG tipine göre farklı klinik tablolarda, kronik, ilerleyici, çoklu sistem tutulumunun görüldüğü MPS'lar ortaya çıkar. Başlıca GAG'lar; kondroitin-4-sülfat, kondroitin-6-sülfat, heparan sülfat, dermatan sülfat, keratan sülfat ve hyaluronik asittir. MPS'ların günümüze kadar 7 tipi ve birçok alt tipleri tanımlanmıştır. MPS II hariç hepsi otozomal resesif kalıtım gösterirler. MPS'ların farklı tiplerinde bozuk olan enzime göre 4 farklı GAG (dermatan sülfat, keratan sülfat, heparan sülfat ve kondroitin 4- ve 6-sülfatlar) birikir ve idrarla çok fazla miktarda GAG atılımı görülür. Nadir görülen hastalıklar olarak bilinirler fakat tüm MPS'lar için toplu insidans 1/25000'dir. Klinik tanı güç olduğu için insidansın daha yüksek olduğu tahmin edilmektedir. Akraba evlilikleri oranının %21 olduğu Türk toplumunda MPS'ların diğer toplumlara göre daha sık görüldüğü düşünülmektedir. Klinik tanının güç olduğu MPS'larda tanı, laboratuvar tarama ve tanı testleri ile konulur. MPS tiplerinin tanısı tedavi için önemlidir. Son yıllarda MPS I, MPS II, MPS IVA ve MPS VI için rekombinant enzim yerine koyma tedavisi (ERT) uygulanmakta ve diğer tipler için çalışmalar devam etmektedir. MPS'lar için idrarda artmış total GAG atılımını ve GAG tipini tespit etmek ilk basamak laboratuvar tarama testleridir. İdrarda atılan GAG tipi belirlenerek olası MPS tipleri tespit edilir ve kesin tanı  lökosit veya fibroblast hücrelerinde spesifik enzim aktivite ölçümleri ile konulur. Bu çalışmada Hacettepe Merkez Laboratuvarına MPS laboratuvar tarama ve tanı testlerinin kurulması, analitik ve klinik performanslarının validasyon çalışmaları ile belirlenmesi, Türk toplumuna özgü referans aralıklarının tanımlanması amaçlanmıştır. Validasyon ve referans aralığı çalışmaları CLSI kılavuzu protokollerine göre yapılmıştır. İdrar total GAG analizi dimetilen mavisi metodu (DMB) kullanılarak spektrofotometre ile gerçekleştirilmiştir. Uygun dalga boyu, stabilite (EP25), kesinlik (EP05), doğrusallık, rapor aralığı, geri kazanım (EP06), gerçeklik (EP09), interferans (EP7), limitler (EP17), ROC analizi (GP10) ve referans aralık (C28) çalışmaları yapılmıştır. GAG tipi belirlenmesi selüloz asetat elektroforezi, lökosit spesifik enzim aktivite ölçümleri fluorojenik substratlar kullanılarak fluorometre ve kuru kan enzim aktivite ölçümleri LC-MS/MS ile gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel analiz SPSS programı v.21.0 ile yapılmıştır. İdrar total GAG analizinde MPS hastalarını belirlemede en uygun dalga boyu 530 nm olarak bulundu. Farklı GAG konsantrasyonlarında idrar stabilitesinin oda sıcaklığı, +4°C, -20°C ve -80°C'de en az 21 gün süreyle korunabildiği ve idrar örneklerinin laboratuvara oda sıcaklığında ulaştırılabileceği tespit edildi. Kesinlik çalışmalarında, gün içi ve günler arası % ICC değerleri % 99 üzeri ve % CV değerleri % 10'un altında bulundu. Total GAG analizinin tekrarlı ölçümlerde tutarlı, güvenilir, kesin ve rastgele hatanın düşük olduğu belirlendi. Doğrusallığın 240 mg/L kondroitin sülfat A değerinden sonra bozulduğu tespit edildi. Bu değere kadar doğrusal denklem y=0,022+0,010x ve R2= 0,975 olarak belirlendi. Ölçülen ve hedeflenen değer arasında pozitif güçlü bir ilişki gösterildi (R2=0,9972). Eğim, kesme noktası ve standart sapma değerlerinin CLSI'ya göre kabul edilebilir olduğu tespit edildi. Geri kazanım çalışmasında geri kazanım ortalama yüzdesi % 100,83 olarak elde edildi. Örnek hazırlama sırasında GAG'lar korunmaktadır ve yöntem orantısal sistematik bir hataya sahip değildir. Gerçeklik çalışmasında kesinlik çalışmasında elde edilen rastlantısal hata (2,97) ve doğrusallık çalışmasında elde edilen orantısal sistematik hata (8,67) kullanılarak total hata (14,61) hesaplandı. Westgard'a göre metodun total hatası kabul edilir bulundu ve gerçek değeri ölçtüğü tespit edildi. İnterferans çalışmasında, total GAG analizinde proteinüri, hematüri, lökositüri ve pH değişikliği interferansı incelendi. MPS hastalarında gözlenen yüksek total GAG konsantrasyonlarında proteinüri ve hematüri interferansı gözlenmezken, sağlıklı bireylerde gözlenen total GAG konsantrasyonlarında proteinüri ve hematüri interferansı tespit edildi. Farklı GAG konsantrasyonlarda, total GAG analizinin lökositüri ve pH değişikliklerinden etkilenmediği gözlendi. Belli bir kesinlik ve doğruluk değerinde kantitatif olarak ölçülebilen en düşük analit miktarı 23,3 mg/L  (LoQ) olarak tespit edildi. Toplam 836 sağlıklı bireyden gerçekleştirilen idrar total GAG analizi ile yaşa bağımlı (0-3 ay, 4-6 ay, 7-12 ay, 1-2 yaş, 2-13 yaş ve >13 yaş) referans aralıkları elde edildi. Toplam 150 sağlıklı bireyden tüm MPS tipleri ve referans enzim için lökosit spesifik enzim aktiviteleri referans aralıkları belirlendi. Toplam 45 MPS hastası tanı aldı. ROC analizinde 2-3 yaş grubu için kesim noktası = 89,858 mg/g kreatinin, ROC eğrisi altındaki alan (AUC) = % 95,7 (p<0,001), duyarlılık %93,33, özgüllük %98,07, PPV ve NPV değerler yüksek bulundu. Toplam 237 sağlıklı birey kuru kan örneklerinde tandem-kütle spektrometresi yöntemi ile multipleks enzim aktiviteleri ölçülerek MPS I, Pompe, Krabbe, Niemann-Pick A/B, Gaucher ve Fabry için referans aralıkları belirlendi. Sonuç olarak çalışmamız ile Hacettepe Merkez Laboratuvarında MPS laboratuvar tarama ve tanı testleri kurulmuştur. Türk toplumuna özgü referans aralıkları belirlenmiştir. MPS'lara özgü tarama ve tanı testleri ile MPS'ların toplumumuzdaki gerçek insidansı belirlenebilecek ve tanı konulan MPS hastalarına erken tedavi seçeneği sağlanabilecektir.

Abstract:
Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of  lysosomal storage diseases (LSD), resulting from hereditary defects of the lysosomal enzymes which are involved in the catabolism of glycosaminoglycans (GAG). Undegraded GAGs due to mutated enzymes accumulate in cells, tissues, organs and chronic, progressive different clinical presentations of MPSs with multisystem involvement are observed according to accumulated GAG types. The principle GAGs are chondroitin-4-sulfate, chondroitin-6-sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate and hyaluronic acid. To date, 7 main types with subtypes of MPSs have been identified. Except MPS II, all MPSs show autosomal recessive inheritance. Due to the enzyme deficiency, 4 different GAG types (dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan sulfate and chondroitin 4- and 6-sulphates) are accumulated in different types of MPSs and excess urinary excretion of GAGs is observed. They are known as rare diseases but cumulative incidence for all MPSs is 1/25000. Since the clinical diagnosis is diffucult, the incidence is expected to be higher. Rate of consanguineous marriages in Turkish population is 21% and MPSs are suggested to occur more frequently in Turkish population than other populations. Diagnoses of MPSs are mainly based on laboratory screening and diagnostic tests, since the clinical daignoses of MPSs are diffucult. Diagnoses of MPS types are important for early treatment options. In recent years, recombinant enzyme replacement therapies (ERT) are available for MPS I, MPS II, MPS IVA and MPS VI, and studies continue for other types. First-line screening laboratory tests are based on the determination of excessive excretion of urinary total GAG and identification of GAG types in MPSs. The type of GAG detected in the urine determines the possible types of MPSs. Definitive diagnoses are made by specific enzyme activity measurements in leukocytes or fibroblast cells. In this study, we aimed to establish laboratory screening and diagnostic tests for MPSs in Hacettepe Clinical Pathology Laboratories, determine the analytical and clinical performance characteristics of the tests by validation studies, identify reference intervals for Turkish population. Validation and reference interval studies were performed according to CLSI guideline. The total GAG analysis was carried out with dimethylene blue method (DMB) by using spectrophotometer. Appropriate wavelength, stability (EP25), precision (EP05), linearity, reportable range and recovery (EP06), trueness (EP09), interference (EP7), limits (EP17), ROC analysis (GP10) and reference intervals (C28) were determined. Determination of GAG types were performed with cellulose acetate electrophoresis, measurement of leukocyte specific enzyme activities were carried out with fluorometer by using fluorogenic substrates and enzyme activity measurements on dry blood spots were performed by LC-MS/MS. Statistical analyses were carried out with SPSS v.21.0 program. Optimum wavelength for urinary total GAG analysis for determination of MPS patients was 530 nm. Urine samples with different levels of total GAG were found to be stabile for at least 21 days at room temperature, +4°C, -20°C and -80°C. Urine samples can be delivered to the laboratory at room temperature. In precision studies, intra-day and inter-day ICC% and %CV were above 99% and below 10%, respectively. Total GAG analysis was found to be consistent, reliable, accurate and random error was determined to be low in the repeated measurements. Deterioration in linearity was observed above 240 mg/L chondroitin sulfate A levels. Until this level, linearity equation was y=0.022+0.010x and R2= 0.975. Strong positive correlation between the measured and targeted values was shown (R2=0.9972). Slope, intercept and standard deviation values were found to be acceptable according to CLSI. Mean recovery percentage was obtained as 100.83 % from recovery analyses. GAGs are not degraded in sample preparation period and method does not have a proportional systematic error. In trueness study, total error (14,61) was calculated by using random error (2,97) obtained from precision studies and proportional systematic error (8,67) obtained from linearity studies. Total error of the method is acceptable according to Westgard and method can measure the true value. The effects of proteinuria, hematuria, leukocyturia, and pH changes to total GAG analysis were examined in interference studies. While no interference of proteinuria and hematuria were observed in urine samples with high total GAG concentrations as in MPS patients, interferences were observed at GAG levels of healthy individuals. Urine samples having different GAG levels were not effected with leukocyturia and pH changes. The lowest amount of analyte that could be measured quantitatively in a certain precion and accuracy was 23.3 mg/L (LOQ). Age-dependent (0-3 month, 4-6 month, 7-12 month, 1-2 age, 2-13 age ve >13 age) reference intervals for total GAG analysis were determined in urine samples of a total number of 836 healthy individuals. From a total number of 150 healthy individuals, reference intervals for leukocyte specific enzyme activities were also determined for types of MPSs and reference enzyme. Forty five MPS patients were diagnosed. ROC analysis for 2-3 years of age showed a cut-off of 89.858 mg/g creatinine, area under the curve (AUC) of 95.7% (p<0.001), 93.33% sensitivity, 98.07% specificity, high PPV ve NPV. Measurement of multiplex enzyme activities of MPS I, Pompe, Crabbe, Niemann-Pick A/B, Gaucher and Fabry on dry blood spots were performed from a total 237 healthy individuals for the determination of reference intervals by using tandem-mass spectrometer. In conclusion, with this study, laboratory screening and diagnostic tests for MPSs were established in Hacettepe Clinical Pathology Laboratories. Specific reference intervals for Turkish population were determined. By these specific screening and diagnostic tests of MPSs, the real incidence of MPSs in Turkish population could be determined. Early treatment options could be applied to MPS patients.