Mesane kanserinde üriner eksozomların mikroRNA ve proteom profilinin araştırılması
Investigation of microRNA and proteome profile of urinary exosomes in bladder cancer
Yazar: TUNAY DOĞAN
Danışman: PROF. DR. NECAT VAKUR OLGAÇ ; PROF. DR. HÜLYA YAZICI
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı / Kanser Genetiği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Mesane kanseri (MK) sadece dünya genelindeki en yaygın 10. kanser türü değil aynı zamanda en fazla rekürrensin görüldüğü malignitedir ve tanı/takip için invaziv bir yöntem olan sistoskopiye alternatif biyobelirtec(ler)e ihtiyaç vardır. Çalışmamızda MK için biyobelirteç olma potansiyeli taşıyan idrar eksozomlarının miRNA ve proteom profili araştırıldı. İdrar örneklerinden eksozom izolasyonu için ultrasantrifüj ve PEG temelli kit kullanıldı. Eksozomlar NTA ve TEM ile karakterize edildi. Seksen yedi eksozomal miRNA'nın değişimi qRT-PCR ile araştırıldı ve bunlar içerisinden MK'da 2 kat veya üzeri artış/azalış gösteren istatistiksel olarak anlamlı (p<0.05) 7 miRNA'nın ROC analizine göre MK'yı sağlıklı kontrollerden ayırabilecek yüksek performansa sahip olduğu görüldü (p<0.0001; AUC: 0,7641; %95 CI: 0,6850-0,8432). Mesane kanserli vakaların idrar eksozomlarında 1,49 kat azalış gösteren (p=0.016) hsa-miRNA-200a-3p'nin mesane dokularındaki değişimi qRT-PCR ile valide edildi. LC-MS/MS analizi neticesinde tanımlanan 645 proteinden 57 tanesi anlamlı düzeyde (p<0.05) değişim gösteriyordu. Bunlardan PAPPA2, TMCC1 ve MGAM2 daha önce ExoCarta veritabanında kayıtlı olmayan yeni (novel) proteinlerdi. STRING ve Signor biyoinformatik araçlarıyla yapılan analiz RHOA ve YWHAZ proteinlerinin MK için önemli birer terapötik hedef olabileceğine işaret etti. LFQ sinyal intensitelerine göre Suprabasin'in (SBSN) en yüksek performansta artış gösteren protein olduğu anlaşıldı (Fold Change: 31,79; p=0.001). TCGA ve GTEx verileri ile yaptığımız veri madenciliği (n=404 MK; n=28 kontrol), SBSN anlatımının mesane tümör dokularında arttığını ve artmış SBSN anlatımının anlamlı düzeyde (p=0.032) azalmış genel sürvi ile ilişkili olduğunu ortaya koydu. Western blot analizi mesane tümöründeki rölatif SBSN artışını destekledi. İmmünohistokimya analizi T2-High Grade evre mesane tümörlerindeki SBSN immün ifadesinin lenfovasküler invazyon pozitifliği gösteren vakalarda anlamlı düzeyde (p=0.030) daha yüksek olduğuna işaret etti. MALDI-TOF MS ile analizi intakt eksozomlardan elde edilen mass spektral fingerprint'lerin sağlıklı kontrollerle MK'lı vakalar arasında özellikle m/z 2000-5000 aralığında farklılık gösterdiğine işaret etti. Bulgular birlikte değerlendirildiğinde üriner eksozom kökenli miRNA ve proteinlerin MK için prognostik ve prediktif belirteç olarak olarak ya da terapötik hedef olarak umut vaat ettiği söylenebilir.

Abstract:
Bladder cancer (BC) is not only the 10th most common type of cancer worldwide but also the malignancy with the highest recurrence rate. There is a pressing need for alternative biomarkers to cystoscopy, which is an invasive method for diagnosis and monitoring. In our study, we investigated the miRNA and proteome profiles of urinary exosomes, which have the potential to serve as biomarkers for BC. We isolated exosomes from urine samples using ultracentrifugation and a PEG-based kit. Exosomes were characterized using NTA and TEM. Eighty-seven exosomal miRNAs were examined using qRT-PCR. According to ROC analysis, 7 miRNAs exhibited a statistically significant increase or decrease of at least 2-fold in BC compared to healthy controls (p<0.05). These 7 miRNAs demonstrated high performance in distinguishing BC from healthy controls, with a p-value of less than 0.0001, an AUC of 0.7641, and a 95% confidence interval of 0.6850-0.8432. The reduction of hsa-miRNA-200a-3p, which showed a 1.49-fold decrease (p=0.016) in the urinary exosomes of BC cases, was validated by qRT-PCR. Of the 645 proteins identified through LC-MS/MS analysis, 57 showed significant changes (p<0.05). Among these, PAPPA2, TMCC1, and MGAM2 were novel proteins not previously registered in the ExoCarta database. Analysis with the STRING and Signor bioinformatics tools suggested that RHOA and YWHAZ proteins might each be important therapeutic targets for BC. Based on LFQ signal intensities, Suprabasin (SBSN) exhibited the highest increase in performance (Fold Change: 31.79; p=0.001). Data mining with TCGA and GTEx data (n=404 MK; n=28 controls) revealed that SBSN expression increased in bladder tumor tissues and that elevated SBSN expression was associated with significantly reduced overall survival (p=0.032). Western blot analysis supported the relative increase of SBSN in bladder tumors. Immunohistochemistry analysis indicated that SBSN immune expression was significantly higher (p=0.030) in T2-High Grade bladder tumors with lymphovascular invasion positivity. Analysis by MALDI-TOF MS indicated that mass spectral fingerprints obtained from intact exosomes differed between healthy controls and BC cases, particularly in the m/z range of 2000-5000. In conclusion, urinary exosome-derived miRNAs and proteins hold promise as prognostic and predictive markers for BC, or as therapeutic targets.