Resveratrol ve türevleri: Antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi ve bazı metabolik enzimler üzerinde inhibisyon etkilerinin araştırılması
Resveratrol and its derivaties: Determination of antioxidant capacities and investigation of inhibition effects on some metabolic enzymes
Yazar: ZEYNEBE BİNGÖL
Danışman: PROF. DR. İLHAMİ GÜLÇİN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Amilazlar = Amylases ; Antioksidan aktivite = Antioxidant activity ; Enzim inhibitörleri = Enzyme inhibitors ; Karbonik anhidraz = Carbonic anhydrases ; Kolinesterazlar = Cholinesterases ; Resveratrol = Resveratrol

Özet:
Amaç: Bu doktora tez çalışmasında polifenolik yapıya sahip resveratrol ve üç farklı türevinin antioksidan kapasitelerinin yanısıra insan eritrositlerinden saflaştırılan karbonik anhidraz (hCA) I, II izoenzimleri, glutatyon S-transferaz (GST) enzimi, asetilkolinesteraz (AChE), bütirilkolinesteraz (BChE), α-glikozidaz ve α-amilaz enzimleri üzerine in vitro inhibisyon etkilerinin araştırılması hedeflenmektedir.
Yöntem: Resveratrol ve türevlerinin antioksidan kapasitelerini belirlemek için indirgeme yöntemleri, radikal giderme aktiviteleri ve metal şelatlama özellikleri çalışıldı. Sonuçları mukayese için, standart antioksidan olarak troloks, α-tokoferol, bütillenmiş hidroksitolüen (BHT) ve bütillenmiş hidroksianisol (BHA) kullanıldı. Ayrıca insan eritrositlerinden Sepharose-4B-L-Tirozin Sülfanilamid afinite kolon kromatografisi tekniği ile hCA I, hCA II izoenzimleri, Glutatyon-Agaroz afinite kolon kromatografisi tekniği ile GST enzimi saflaştırıldı. Enzimlerin saflıkları ve molekül kütleleri belirlemek için sodyumdodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapıldı. Bu enzimlerin yanında ticari olarak temin edilen AChE, BChE, α-glikozidaz, α-amilaz enzimleri üzerine resveratrol ve türevlerinin inhibisyon etkileri araştırıldı.
Bulgular: İnsan eritrositlerinden hCA I yaklaşık olarak %65 verimle 197 kat, hCA II %80 verimle 947 kat, hGST ise %26 verimle 550 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimlerin molekül ağırlıkları ve enzim saflıkları SDS-PAGE ile kontrol edildi. hCA izoenzimleri için molekül ağırlıkları yaklaşık 29 kDa olarak bulunurken, GST için yaklaşık 26 kDa ağırlığında tek bant gözlendi. Resveratrol ve türevlerinin inhibisyon etkileri incelendiğinde, hCA I ve II izoenzimleri için, sırasıyla 49,50 nM, 46,50 nM IC50 değerleri ile triasetilresveratrolün en iyi inhibisyon özelliklere sahip olduğu bulundu. Triasetilresveratrol IC50: 40,76 nM ile α-glikozidaz üzerinde yüksek inhibisyon etkisine sahipken, Oksiresveratrol 1330,13 nM'lık IC50 değeri ile α-amilazı etkili şekilde inhibe etti. Kolinesterazlar incelendiğinde, en etkili inhibitör AChE'a karşı 13,86 nM'lık IC50 değeri ile 3',5'-Dimetoksiresveratrol ve BChE için 46,20 nM'lık IC50 değeri ile Triasetilresveratrol oldu. hGST üzerinde resveratrol, 463,54 nM'lık IC50 değeri ile en yüksek inhibisyon etkisi gösterdi. Çalışmanın devamında Resveratrol ve türevlerinin farklı yöntemlere göre antioksidan aktiviteleri ölçüldü. Sentetik antioksidan aktivitelerine yakın ya da daha iyi etki gösterdiği belirlendi.
Sonuç: Tez kapsamında Resveratrol ve türevleri olan 3',5'-Dimetoksiresveratrol, Oksiresveratrol, Triasetilresveratrol bileşiklerinin yüksek antioksidan potansiyeline sahip olduğu ve çalışılan enzimler üzerinde de oldukça etkili bir şekilde inhibe ettiği sonucuna varıldı.

Abstract:
Purpose: In this doctoral thesis, the antioxidant capacities of polyphenolic resveratrol and its three different derivatives were investigated. In addition, it was aimed to investigate the in vitro inhibition effects of these derivatives on carbonic anhydrase (hCA) I, II isozymes, glutathione S-transferase (GST) purified from human erythrocytes and acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE), α-glycosidase, α-amylase enzymes.
Method: In order to determine their antioxidant specifities, reduction capacities, radical scavenning capacities, and metal chelating capacities were studied. To compare the results, standard antioxidants such as trolox, α-tocopherol, butylated hydroxytoluene (BHT) and butylated hydroxyanisole (BHA) were used. Besides, hCA I, hCA II isoenzymes were purified by Sepharose-4B-L-Tyrosine Sulphanylamide affinity column chromatography technique, and GST enzyme was purified by Glutathione-Agarose affinity column chromatography technique from human erythrocytes. Sodiumdodecysulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed to determine the purity and molecular weight of the enzymes. In addition to these enzymes, inhibition studies of resveratrol and its derivatives were performed on the commercially available AChE, BChE, α-glycosidase, α-amylase enzymes.
Results: From human erythrocytes, hCA I was purified approximately 197 fold in 65% yield, hCA II 947 fold in 80 % yield, and GST 550 fold purified in 26% yield. Molecular weights and purity of enzymes were checked by SDS-PAGE. For hCA isoenzymes, molecular weights were found to be about 29 kDa, while a single band with a weight of about 26 kDa was observed for GST. When the inhibitory effects of resveratrol and its derivatives are examined, it was found that triacetylresveratrol has the best inhibitory properties with IC50 values of 49.50 nM and 46.50 nM on both hCA isozymes. While triacetyl resveratrol had highest inhibitory potency on α-glucosidase with IC50 value of 40.76 nM, oxyresveratrol inhibited most effectively α-amylase with IC50 value of 1330.13 nM. As for cholinesterases, the most effective inhibitors were 3',5'-dimethoxyresveratrol with IC50 value of 13.86 nM on AchE and triacetylresveratrol with IC50 value of 46.20 nM on BChE. On hGST, resveratrol had the highest inhibition effect with IC50 value of 463.54 nM. In the continuation of the study, antioxidant activities of resveratrol and its derivatives were measured according to different methods. It was determined that it had a similar or better effect on synthetic antioxidant activities.
Conclusion: Within the scope of the thesis, it was concluded that Resveratrol and its derivatives 3',5'-Dimethoxyresveratrol, Oxyresveratrol, Triacetylresveratrol compounds have high antioxidant potential and effectively inhibit the studied enzymes.