Helicobacter pylori izolatlarında klaritromisin direncini ve cagA geni varlığını birlikte belirleyecek bir ?eş-zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu? (real-time PCR) yönteminin geliştirilmesi
Development of a simultaneous detection of the clarithromycin resistance and the cagA gene status by "real-time polymerase chain reaction" in helicobacter pylori isolates
Yazar: PEREN HATİCE BAĞLAN
Danışman: PROF. DR. CUMHUR ÇÖKMÜŞ
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
H. pylori, aktif kronik gastrit, peptik ülser ve gastrik kanser gelişmesinde önemli etiyolojik rolü olan Gram negatif, 1. sınıf karsinojen bir patojendir. H. pylori aynı zamanda MALT'a da (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) neden olur. H. pylori'nin eradikasyonunun, peptik ülser nüks oranını düşürdüğü bilinmektedir. Bu nedenle H. pylori'nin antimikrobiyal ajanlarla tedavisi ve tedavide meydana gelen antimikrobiyal ajanlara direnç önem taşır. H. pylori'nin bazı suşlarıyla uzun süreli enfeksiyon, gastritin ve peptik ülserin temel nedenini ve gastrik kanserin risk faktörünü oluştururken, bazı H. pylori enfeksiyonlarında semptom görülmemektedir. Bu farklılığın nedenlerinden biri, bakterinin patojenite fakötürü olan cagA genidir. Çalışmamızın amacı, H. pylori'de klaritromisin direnci mutasyonlarını (A2142G, A2143G, A2142C) ve patojeniteyle ilgili olan cagA genini, birlikte gösterebileceğimiz bir ?Eş-zamanlı PZR? yöntemi geliştirmektir. Bu çalışmaya gastrik yakınmalar nedeniyle Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Cebeci ve İbn-i Sina Hastanelerine başvuran ve endoskopi ünitesinde endoskopik incelemeleri yapılan 119 hastadan alınan, mide biyopsi örnekleri dahil edildi. Mide biyopsi örneklerinden DNA izolasyonu yapıldıktan sonra cagA geni varlığını ve direnç mutasyonlarını birlikte gösteren bir eş-zamanlı PZR yöntemi geliştirildi. CagA geni varlığını saptamak için SYBR Green 1 boyası ve erime eğrisi analizi kullanırken, direnç mutasyonlarını saptamak için hibridizasyon probları kullanıldı ve erime eğrisi analizi yapıldı. Multipleks Eş-zamanlı PZR 23S rRNA sonuçları, üreaz, sitoloji, kültür, DNA dizi analizi ile, cagA sonuçları ise manuel cagA PZR ile karşılaştırıldı. Üreaz sitoloji ve eş-zamanlı PZR yöntemleri arasında % 91,9 oranında uyumluluk gözlendi. Ayrıca Kappa istatistiği ile bu 2 yöntemin uyumluluğu analiz edildi. Buna göre kappa değeri 0,825 (p< 0,001) ve 2 yöntem arasındaki uyumluluk ?mükemmele yakın? çıktı. Eş-zamanlı PZR sonuçları ile manuel PZR sonuçları karşılaştırıldığında, yöntemler arasında % 94,1 oranında uyumluluk gözlendi. Yine, Kappa istatistiği sonucuna göre yöntem arasındaki uyumluluk ?mükemmele yakın? çıktı (kappa değeri 0,858, p< 0,001). Geliştirdiğimiz bu yöntem ile hasta, endoskopiye girdiği gün içinde kültüre gerek kalmadan, H. pylori'ye sahip olduğunu, klaritromisine dirençli olup olmadığını ve hastalığın patojenitesi ile ilgili bilgiyi tek bir PZR sonucu ile görebilecektir. Hasta, biyopsi örneği laboratuara ulaştıktan 2,5 saat sonra bu sonuçları öğrenebilecektir. Rutin laboratuarları için hızlı sonuç alabilmek önem taşımaktadır. Klinisyen, bu sonuçları değerlendirerek, aynı gün içinde ilaç reçete edebilecek ve gastrik kansere kadar ilerleme olasılığı olan dispeptik yakınmaların, ilerideki patojenitesi hakkında bilgi sahibi olacaktır.

Abstract:
H. pylori is a gram negative and first class carcinogenic pathogen, which has an important etiologic role in developing active chronic gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. H. pylori, also causes MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue). It is recognized that, H. pylori eradication, decreases the ratio of peptic ulcer relapse. For this reason H. pylori eradication with antimicrobial agents, and resistance to antimicrobial agents are important. While long term colonization with some H. pylori strains causes peptic ulcer and gastric cancer, some H. pylori strains show no symptom. This difference is because of the patogenity factor of bacterial cagA gene. The aim of this study is, to develop a simultaneous detection of the clarithromycin resistance mutations (A2142G, A2143G, A2142C) and the caga gene status by "Real-time Polymerase Chain Reaction" in H. pylori isolates. In this study, there were 119 patients, who have gastric problems and have been applied to Ankara University Faculty of Medicine Gastroenterology Department. After the DNA isolation from gastric biopsy samples, we developed a Real-time PCR method, which can detect cagA gene status and resistance mutations simultaneously. We used SYBR Green 1 dye, hybridization probes and melting curve analysis to determine the cagA gene status and resistance mutations respectively. While Multiplex Real-time PCR 23S rRNA results have been compared with urease, cytology and DNA sequence analysis, cagA gene results have been compared with manual PCR method. There were %91.9 compatibility between, urease, cytology and real-time PCR methods. The compatibility between these two methods have been analysed by Kappa statistics. Kappa value was 0.825 (p< 0,001) and the compatibility was ?almost perfect?. When Real-time PCR cagA results have been compared with manual PCR cagA results, similar results have been achieved (kappa value was 0.858 (p< 0,001) and the compatibility was ?almost perfect?). Patients will learn resistance to clarithromycin, and pathogenesis of their disease in one day (in 2.5 hours) by this new technique. Thus the physician can prescribe the drug and learn the pathogenesis of the disease.