Sentetik ve doğal polimerik gözenekli yapılara enzim immobilizasyonu ve biyoteknolojik uygulamaları
Enzyme immobilization into synthetic and natural polymeric porous structures and their biotechnological applications
Yazar: ŞAHİN DEMİRCİ
Danışman: PROF. DR. NURETTİN ŞAHİNER
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Bu tez çalışması kapsamında, enzim immobilizasyonunda kullanılmak üzere sentetik p(HEMA), p(AAm), p(AMPS), p(APTMACl), p(Amfoter) ve PEI kriyojelleri ile doğal polimer olan CMC ve Dekstran dan kriyojeller hazırlanmıştır. Süper makro gözenekli bu kriyojellerin sentezi için kullanılan bileşenler ile birlikte α-glikosidaz (α-Glu) ve Üreaz enzim çözeltileri değişik miktarlarda eklenerek gözenekler içerisine immobilize edilmiştir. İçerisine enzim yerleştirilmiş (enzim@kriyojel) kriyojellerin karakterizasyonu SEM, FT-IR ve TGA cihazları ile yapılmıştır. Hazırlanan enzim@kriyojel sistemlerinde immobilizasyon verimleri %80'in üzerinde bulunmuştur. Serbest α-Glu enzimi için en yüksek aktivitenin gözlendiği optimum koşullar 37 oC ve pH 6,8 iken aynı sıcaklıkta α-Glu@p(HEMA) ve α-Glu@p(AAm) kriyojelleri için pH 6,8, α-Glu@p(AMPS) kriyojelleri için pH 8,0 ve α-Glu@p(APTMACl) kriyojelleri için pH 5,0'da %90'ın üzerinde aktivite gözlenmiştir. α-Glu@p(Amfoter) kriyojel sistemleri için ise pH 5,0-9,0 aralığındaki tüm değerlerde %70'ten yüksek aktivite gözlenmiştir. Üreaz@PEI kriyojel sistemlerinin, pH 5,0-9,0 ve 15-45 oC sıcaklık aralığında, serbest enzimin optimum koşulları (pH 7,0, 37 oC) dışında, serbest enzime göre daha yüksek aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, Üreaz enzimi immobilize edilmiş CMC ve Dekstran kriyojelleri %90'nın üzerinde immobilizasyon verimine sahip olmalarına rağmen serbest Üreaz enzimine göre daha düşük aktivite gösterdikleri belirlenmiştir. Buna rağmen bu kriyojeller tekrar kullanım ve depolama çalışmalarında serbest enzime göre daha yüksek kararlılık göstermiştir. Tez kapsamında hazırlanan enzim@kriyojel sistemlerinin serbest enzime kıyasla en az 10 kez yüksek aktivite ile kullanılabileceği ve kriyojel içerisinde immobilizasyonun enzimlerin saklama sürelerini oldukça arttırdığı belirlenmiştir. Michaelis-Menten kinetik parametreleri, lineer ve non-lineer Lineweaver-Burk denklemleri kullanılarak hesaplanmıştır. Hazırlanan enzim@kriyojel sistemlerinin serbest enzimlere göre daha yüksek Km değerleri hesaplanması, substratın enzim için afinitelerinin azaldığını göstermiştir. Bununla beraber, rozmarinik asit çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilen enzim deaktivasyon çalışmalarında serbest α-Glu ve α-Glu@kriyojel sistemleri benzer davranışlar göstermiştir.

Abstract:
Within the scope of this thesis, synthetic p(HEMA), p(AAm), p(AMPS), p(APTMACl), p(Amphoter) and PEI cryogels and CMC and Dextran as natural polymeric cryogels were prepared for use in enzyme immobilization. Together with the components used in synthesis of these super macroporous cryogels, different amounts of α-glucosidase (α-Glu) and Urease enzyme solutions were added into reaction and immobilized within the pores of cryogels. The characterization of the enzyme-embedded (enzyme@cryogel) cryogels was performed via SEM, FT-IR and TGA devices. Immobilization yields of the enzyme@cryogel systems were found to be over 80%. The optimum conditions of free α-Glu where the highest enzyme activity is found to be at 37 oC, and pH 6.8, and at the same temperature the optimum pHs for α-Glu@p(HEMA) and α-Glu@p(AAm) cryogels was observed at 6.8 whereas more than 90% activity was observed at pH 8.0 for α-Glu@p(AMPS) cryogels and at pH 5.0 for α-Glu@p(APTMACl) cryogels. For α-Glu@p(Amphoter) cryogel systems, higher than 70% activity was observed at all pHs in 5.0-9.0 range. Urease@PEI cryogel systems at pH 5.0-9.0 and temperature 15-45 oC ranges were shown higher activities with respect to the free enzyme except for the optimum conditions of the free enzyme (pH 7.0, 37 oC). Additionally, even though more than 90% urease immobilization efficiency was observed for CMC and Dextran cryogels, a lower activity compared to that of the free enzyme was determined. Nevertheless, these cryogels showed higher stability than the free enzyme in reuse and storage studies. It was established that the enzyme@cryogel systems in comparison to the free enzyme can be used at least 10 times sequentially with higher activities and the immobilization of enzyme within the cryogels considerably increases storage time of enzymes for extended time durations. Michaelis-Menten kinetic parameters were calculated using linear and non-linear Lineweaver-Burk equations. Accordingly, the prepared enzyme@cryogel systems exhibited decreased substrate affinities as higher Km values were calculated then free enzymes. Besides, free α-Glu and α-Glu@cryogel systems showed similar inhibition trend in the enzyme deactivation studies using rosmarinic acid solution as deactivator.