Nar bahçelerinden Bacillus thuringiensis izolasyonu, CRY/VIP gen profillerinin belirlenmesi ve biyoaktivitelerinin araştırılması
Isolation of Bacillus thuringiensis from pomegranate gardens, determination of CRY/VIP gene profiles and investigation of bioactivity
Yazar: BURCU ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bacillus thuringiensis (Bt), biyolojik kontrolde yaygın olarak kullanılan ve birçok başarılı biyoinsektisitin aktif bileşenini oluşturan entomopatojenik bir bakteridir. Bt, sporulasyonu sırasında ürettiği delta endotoksinler (Cry ve Cyt proteinleri) ve vejetatif evresinde salgıladığı Vip proteinleri (vejetatif insektisidal protein) ile insektisidal özellik göstermektedir. Bu tez çalışmasında, Muğla ilinde narlı alanlardan Bt izolasyonu ve karakterizasyonu yapılarak, izolatların 6 farklı Lepidopter zararlısına karşı toksik aktivitesi araştırılmıştır. Muğla ilindeki Menteşe, Ula, Dalaman, Ortaca, Köyceğiz ve Marmaris ilçelerindeki nar bahçelerinden toplanan 91 toprak ve 18 yaprak örneğinden toplamda 135 Bt izolatı elde edilmiştir. Spor-kristal yapısı taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenen iki izolatın bipiramidal, küboidal ve küresel şekilli kristaller ürettiği gözlenmiştir. Elde edilen Bt izolatlarının cry ve vip gen içerikleri PCR yöntemi ile belirlenmiştir. Taramalarda Bt izolatlarının %28'i cry1, %27'si cry2, %0.6'sı vip1, vip2 ve vip3 genleri açısından pozitif bulunmuştur. vip3 geni içeren izolat sayısını arttırmak için daha önceki Bt koleksiyonlarından cry1 ve/veya cry2 genlerini içerdiği bilinen 80 Bt izolatı vip3 geni için taranmış ve pozitif bulunan 17 izolat tez çalışmasına dahil edilmiştir. vip3-pozitif 18 Bt izolatının spor-kristal karışımlarının ve kültür süpernatanlarının insektisidal aktivitesi, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis ve Ostrinia nubilalis birinci dönem larvaları üzerinde test edilmiştir. Buna göre, bazı Bt izolatlarının spor kristal karışımlarının, Spodoptera türlerine karşı, HD1 referans suşundan daha toksik olduğu bulunmuştur. Aynı şekilde, bazı izolatların süpernatantları, Spodoptera türlerine karşı yüksek mortalite (%90-97) göstermiştir. Buna ilaveten, otoklavlanan süpernatantlarda mortaliteye rastlanmaması, HPLC analizi ile elde edilen negatif β-ekzotoksin sonuçlarını desteklemiştir. Toksik izolatların protein profilleri SDS-PAGE jel elektroforezi ile analiz edildiğinde 130 kDa ağırlığında Cry1 ve 60 kDa ağırlığında Cry2 proteinlerine denk gelen bantlar gözlenmiştir. Bu izolatlar arasından toksik olan beş izolatın Cry protein içeriği LC-MS/MS analizi ile belirlenmiştir. Sonuçlara göre, tüm izolatlarda Cry1Ac proteini ve bir Cry2A tipi proteini; üçünde Cry1Ea ve birinde CrylAa proteini tanımlanmıştır. Vip3 proteinini ifade eden izolatları belirlemek için yapılan dot blot analizinde, izolatlardan dördünün, HD1 referans suşu ile benzer ekspresyon seviyesine sahip olduğu bulunmuştur. Toksik izolatların yeni cry/vip geni içerip içermedikleri PCR-RFLP veya PCR sekanslama teknikleri ile tespit edilmiştir. RFLP sonuçlarına göre izolatların cry1Ac, cry2Ad, vip1Ab1, vip2Ac1, vip3Aa ve vip3Af genlerinin alt gruplarından olabilecekleri gösterilmiştir. vip3 genlerinin sekans analizi, Bt izolatlarının vip3Aa, vip3Af veya vip3Ag genlerinden biri ile yüksek benzerliğe (%94-100) sahip olduğunu göstermiştir. İzolatlar içerisinden hem Vip3 proteinini ifade eden hem de süpernatantı yüksek mortalite gösteren Bt 6A izolatının vip3Aa geni ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Bu izolattan elde edilen yeni Vip3Aa proteini, Bacillus thuringiensis İsimlendirme Komitesi tarafından Vip3Aa65 olarak adlandırılmıştır. Eksprese edilen ve saflaştırılan Vip3Aa65 proteini beş lepidopter türüne karşı test edilmiş ve toksisitesi bir referans protein ile (Vip3Aa16) karşılaştırılmıştır. Vip3Aa65 proteini Grapholita molesta 'ya karşı oldukça yüksek (LC50 = 49 ng/cm2) ve geri kalan türler için orta düzeyde (LC50 = 496–2660 ng/cm2) toksisite göstermiştir. Her iki protein de G. molesta ve Helicoverpa armigera'ya karşı benzer toksisiteye sahipken, Vip3Aa65 Spodoptera cinsinden üç türe karşı Vip3Aa16'dan daha az aktif bulunmuştur. Son olarak, jel filtrasyon kromatografisi ile Vip3Aa65 proteininin tetramerik bir yapıda olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada yüksek insektisidal aktiviteleri ile lepidopter zararlıların kontrolünde potansiyel kullanıma sahip bazı Bt izolatları karakterize edilip tanımlanmıştır. Ayrıca, bu izolatlardan birisi klonlanarak yeni vip3Aa65 geni literatüre kazandırılmıştır.

Anahtar Kelimeler: Bacillus thuringiensis, cry Genleri, Cry Proteinleri, vip3                 Geni, Vip3 Proteini, İnsektisidal Aktivite

Abstract:
Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium that is widely used in biological control and constitutes the active component of many successful bioinsecticides. Bt shows insecticidal properties with delta endotoxins (Cry and Cyt proteins) produced during sporulation and Vip proteins (vegetative insecticidal protein) secreted by vegetative stage. In this thesis, isolation and characterization of Bt from pomegranate areas in Muğla province and toxic activity of isolates against 6 different Lepidopter pests were investigated. A total of 135 Bt isolates were obtained from 91 soil and 18 leaf samples collected from pomegranate gardens in Menteşe, Ula, Dalaman, Ortaca, Köyceğiz and Marmaris districts of Muğla province. It was observed that the two isolates, which were examined by scanning electron microscope (SEM), produced bipyramidal, cuboidal and spherical shaped crystals. cry and vip gene contents of Bt isolates were determined by PCR method. 28% of Bt isolates were found to be positive for cry1, 27% for cry2 and 0.6% for vip1, vip2 and vip3 genes. 80 Bt isolates, known to contain the cry1 and/or cry2 genes from previous Bt collections were screened for vip3 gene and 17 isolates were found positive and included in the thesis study to increase the number of isolates containing the vip3 gene. The insecticidal activity of the spore-crystal mixtures and culture supernatants of vip3-positive 18 Bt isolates was tested against the neonate larvae of Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis and Ostrinia nubilalis. Accordingly, the spore-crystal mixtures of some Bt isolates were found to be more toxic than reference strain HD1 to Spodoptera species. Similarly, the supernatants of some isolates showed high mortality (90-97%) against Spodoptera spp. In addition, the lack of mortality in autoclaved supernatants supported negative β-exotoxin results obtained by HPLC analysis. When the protein profiles of the toxic isolates were analyzed by SDS-PAGE gel electrophoresis, bands corresponding to Cry1 (130 kDa) and Cry2 (60 kDa) proteins were observed. The Cry protein content of five toxic isolates among these isolates was determined by LC-MS/MS analysis. According to the results, Cry1Ac protein and a Cry2A type protein were identified in all isolates, Cry1Ea in 3 of them and CrylAa in one. In dot blot analysis to determine isolates expressing Vip3 protein, four of the isolates were found to have similar expression levels as the HD1 reference strain. Whether the toxic isolates contained the new cry/vip gene were determined by PCR-RFLP or PCR sequencing techniques. According to the results of RFLP, the isolates were shown to be subgroups of cry1Ac, cry2Ad, vip1Ab1, vip2Ac1, vip3Aa and vip3Af genes. Sequence analysis of vip3 genes showed that Bt isolates had a high similarity (94-100%) with one of the vip3Aa, vip3Af, or vip3Ag genes. Among the 18 vip3-positive isolates, the Bt isolate 6A was selected for vip3Aa cloning and sequencing because of being one of the isolates expressing high Vip3 protein and showing high toxicity in supernatant. The new Vip3Aa protein obtained from this isolate was named Vip3Aa65 by the Bacillus thuringiensis Nomenclature Committee. The expressed and purified Vip3Aa65 protein was tested against five lepidopteran species and its toxicity was compared with a reference protein (Vip3Aa16). Vip3Aa65 protein showed quite high (LC50 = 49 ng/cm2) toxicity against Grapholita molesta and moderate (LC50 = 496-2660 ng/cm2) toxicity for the remaining species. Both proteins had similar toxicity to G. molesta and Helicoverpa armigera, while Vip3Aa65 was found to be less active than Vip3Aa16 against three species of Spodoptera. Finally, it was shown by gel filtration chromatography that Vip3Aa65 protein has a tetrameric structure. In conclusion, in this study, some Bt isolates with high insecticidal activity and potential use in pest control have been characterized and defined. Furthermore, one of these isolates was cloned and the new vip3Aa65 gene was obtained.

Keywords: Bacillus thuringiensis, cry Genes, Cry Proteins, vip3 Gene, Vip3 Protein, Insecticidal Activity