Karbendazimin DNA metilasyonu üzerindeki etkisinin Fusarium'da araştırılması
Investigation of the effect of carbendazim on DNA methylation in Fusarium
Yazar: ŞULE İNAN KENAR
Danışman: PROF. DR. GÜLRUH ALBAYRAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Yüksek lisans tezi kapsamında, fungusit aktif bileşeni karbendazimin bitki patojeni Fusarium culmorum'un DNA metilasyonuna etkisi bisülfit dizileme ve enzime bağlı immunosorbent analiz (ELISA) yöntemi ile araştırıldı.
Karbendazimin bu türün referans suşunda (FcUK99) hücre canlılığına etkisi, fungal büyüme oranının belirlenmesi ve akridin turuncusu/etidyum bromür ikili boyama yaklaşımının kullanıldığı floresan mikroskobu görüntülemesi ile ortaya kondu. İlk olarak, aktif ajanın FcUK99'un büyümesini tamamen durduran minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) 2.8 µg/mL olarak belirlendi. Karbendazimin MİK25 (0.7 µg/mL) ve MİK50 (1.4 µg/mL) değerleri fungal üremeyi sırasıyla % 38.4 ve % 71.1 inhibe etti. Doz artışına bağlı olarak doğrusal büyüme oranlarındaki azalma istatistiksel olarak anlamlı (p<0.0001) bulundu. Karbendazim ile muamele edilmiş örneklerde hücrelerin yeşilden sarıya ve sarıdan turuncuya lüminesansının floresans mikroskobu altında gözlemlenmesi, bileşiğin artan dozlarının hücre canlılığını azalttığını gösterdi. Karbendazimin apoptotik sürece benzer ölüm mekanizmasını tetikleyebildiği hücresel düzeyde gösterildi.
Karbendazim uygulanmış (MİK25 ve MİK50) ve uygulanmamış örneklerin gDNA'ları izole edildikten sonra hepsi sodyum bisülfit ile muamele edildi. Elde edilen tek iplikli kodlanan ve kalıp DNA'lardan β2-tubulin geninin 311 ve 307 bp uzunluğundaki bölgelerinin çoğaltımı, sırasıyla Tub2-bs-1 ve Tub2-bs-2 primer çiftleri kullanılarak PZR ile gerçekleştirildi. Sodyum bisülfit uygulanmamış gDNA'ların çoğaltımı Tub2 ileri ve geri primerleri ile gerçekleştirildi ve 1312 bç'lik DNA fragmentleri elde edildi. Kodlanan ve kalıp DNA ipliklerden elde edilen PZR ürünleri Sanger yöntemiyle çift yönlü olarak dizilenirken, bisülfit uygulanmamış örneklerin DNA'larından çoğaltılan ürünler tek yönlü olarak dizilendi. Bisülfit uygulanmış ve uygulanmamış deney gruplarına ait amplikonların NCBI veri tabanındaki β2-tubulin gen dizisi ile hizalama analizleri karbendazimin β2-tubulin'de yer alan CpG adacıklarında metilasyona neden olmadığını gösterdi. 
FcUK99 suşunun tüm genom 5-metilsitozin içeriği ELISA yöntemi kullanılarak % 0.49 olarak belirlendi. MİK25 ve MİK50 karbendazim maruziyeti kontrole kıyasla tüm genom metilasyonunu sırasıyla %79,6 ve %232,7 oranında artırdı. Aktif bileşiğin artan konsantrasyonlarının neden olduğu hipermetilasyon istatistiksel olarak anlamlı bulundu (kontrol vice versa MİK25, p<0.001; kontrol vice versa MİK50, p<0.0001).
Sonuç olarak bu çalışmadan elde edilen bulgular, karbendazimin F. culmorum'un β2-tubulin hedef geninin CpG adacıklarında DNA metilasyonuna neden olmadığını, ancak bu türde tüm genom düzeyinde DNA metilasyonunu aşırı düzeyde artırdığını ortaya koydu. Karbendazimin epigenomik etkilerine ilişkin bulgular, bu antifungal aktif bileşiğin DNA metilasyonu ile fungisit direncine katkıda bulunabilme potansiyelinin olduğunu, bu durumda da genomik damgalama yoluyla gelecek nesillere lateral olarak aktarılabileceğini düşündürdü. Yüksek lisans tezinin çıktıları, Fusarium kontrolünde en sık karşılaşılan sorunlardan biri olan fungisit direncinin önlenmesinde epigenetik mekanizmaların önemini ortaya koymuştur.

Abstract:
Within the scope of the master's thesis, the effect of carbendazim fungicide active compound on DNA methylation of the plant pathogen Fusarium culmorum was investigated by bisulfite sequencing and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method.
The effect of carbendazim on cell viability in the reference strain (FcUK99) of this species was revealed by the determination of fungal growth rate and fluorescence microscopy imaging using the acridine orange/ethidium bromide dual staining approach. At first, the minimum inhibitory concentration (MIC) of the active agent, that completely suppresses the growth of FcUK99, was determined as 2.8 µg/mL. MIC25 (0.7 µg/mL) and MIC50 (1.4 µg/mL) values of carbendazim inhibited fungal growth by 38.4% and 71.1%, respectively. The decrease in linear growth rates due to dose increase was statistically significant (p<0.0001). The observation of the luminescence of cells from green to yellow and from yellow to orange in carbendazim-treated samples under the fluorescence microscope indicated that increasing doses of the compound reduced cell viability. It was displayed that carbendazim could trigger a death mechanism similar to the apoptotic process at the cellular level.
After genomic DNA isolation of carbendazim-treated (MIC25 and MIC50) and non-treated samples, all gDNAs were exposed to sodium bisulfite. Amplification of 311 and 307 bp length regions of the β2-tubulin gene from generated single-stranded coding DNA and template DNA was performed by PCR using Tub2-bs-1 and Tub2-bs-2 primer pairs, respectively. The amplification of non-sodium bisulfite treated gDNAs was carried out using Tub2 forward and reverse primers and produced the 1312 bp length DNA fragment. PCR products obtained from coding and template DNA strands were sequenced bi-directionally while products amplified from non-bisulfite-treated samples were unidirectional by the Sanger method. Alignment analyses of amplicons belonging to bisulfite treated and non-treated experimental groups with the β2-tubulin gene sequence in the NCBI database demonstrated that carbendazim did not cause the methylation on CpG islands located in β2-tubulin. 
Whole genome 5-methylcytosine content was determined as 0.49 % by using ELISA method. MIC25 and MIC50 carbendazim exposure increased whole genome methylation at 79.6% and 232.7%, respectively, compared to the control. Hypermethylation caused by increasing concentrations of the active compound was found statistically significant (control vice versa MIC25, p<0.001; control vice versa MIC50, p<0.0001).
In conclusion, findings obtained from this study revealed that carbendazim did not cause DNA methylation in the CpG islands of the β2-tubulin target gene, but excessively increased DNA methylation at the whole genome level in F. culmorum. Findings related to the epigenomic effects of carbendazim made us think that this antifungal active compound has the potential to contribute to fungicide resistance through DNA methylation, in which case it can be laterally transmitted to future generations through genomic imprinting. The outputs of the master thesis showed the importance of epigenetic mechanisms in preventing fungicide resistance, one of the most common problems in the control of Fusarium.