Pleurotus ostreatus atıklarından elde edilen lakkaz enziminin polimerik nanopartiküle immobilizasyonu ve karakterizasyonu
Immobilization and characterization of laccase from waste of Pleurotus ostreatus to polimeric nanoparticle
Yazar: MERVE DİLMAÇ AYDIN
Danışman: PROF. DR. İHSAN YAŞA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Lakkazlar (EC 1.10.3.2, p-difenol dioksijen oksidoredüktaz) potansiyel endüstriyel uygulamalarda ilgi çekici özellikleri ile oksidatif enzimlerin bir sınıfına aittir. Son zamanlarda değer katan ürün üretimi için atık mantar substratının kullanımı hakkında dikkate değer tartışmalar olmuştur. Bu ürünlerden biri lakkaz gibi lignoselülozik enzim üretimidir. Bu amaçla, bu çalışma biyoremediasyon, hayvan besleme ve enerji hammaddesi gibi ucuz ve hazır enzim kaynağı olarak atık mantar substratının pratik uygulamalarını ve bilimsel araştırma imkanı sağlamaktadır. Aynı zamanda bu çalışma immobilize enzimin depolama, stabilite ve tekrar kullanımlarının serbest lakkazdan daha iyi olduğunu göstermiştir. 
Çalışmamızda, polimetil glisidil metakrilat- konkanavalin A (p(GMA)-ConA) sürfaktansız emülsiyon polimerizasyon yöntemiyle sentezlenmiştir. p(GMA)-ConA nanopartikülünün spesifik yüzey alanı hesaplanmıştır. Taramalı elektron mikroskopu (SEM) ve FTIR ile karakterize edilmiştir. Kısmi olarak saflaştırılmış Pleurotus ostreatus atıklarından elde edilen lakkaz p(GMA) üzerine kovalent bağlanma, ConA üzerine ise fiziksel bağlanma gerçekleştirilmiştir. Bağlanma miktarları belirlenmiştir (Q değeri).  
p(GMA)-ConA nanopartikül immobilizasyon şartlarını optimize etmek için; pH, sıcaklık, konsantrasyon, zaman, iyon şiddeti deneyleri gerçekleştirilmiştir. İmmobilize edilen lakkazın optimum pH, sıcaklık değerleri belirlenmiştir. SDS-Page ile serbest ve immobilize lakkazın moleküler ağırlıkları belirlenmiştir. Serbest ve immobilize lakkaz depolama stabilite deneyleri 12 hafta boyunca yürütülmüştür. Herbir örneğin aktivitesi, başlangıç aktivitesine kıyasla kalan aktivitenin yüzdeliği olarak ifade edilmektedir.  Pleurotus ostreatus atıklarından ekstraselüler lakkaz kısmi olarak saflaştırılmış ve izole edilmiştir. Saflaştırma ultrafiltrasyon sistemi ile gerçekleştirilmiştir.  Enzim başlangıç miktarından 7.8 kat saflaştırılmıştır. Saflaştırılmış lakkazın moleküler ağırlığı 52 kDa olarak bulunmuştur. Saflaştırılmış lakkazın optimum pH ve sıcaklığı sırasıyla 4.5 ve 50°C olarak bulunmuştur. 
Nanopartikülün morfolojik yapısı incelendiğinde küresel morfolojide olduğu ve SEM analizi incelendiğinde 142 nm boyutunda olduğu ve yüzey alanı 708,3 m2/g olduğu belirlenmiştir. Optimum immobilizasyon pH  8'de, 1 mg/ml konsantrasyonda 0.5 M iyonik şiddette,  25°C'de gerçekleştirilmiştir. Bağlanma miktarı 197,6 mg/g (Q değeri) olarak belirlenmiştir. ABTS substratı kullanılarak immobilize lakkazın optimum değerleri pH 8'de  55°C olarak bulunmuştur.

Keywords: lakkaz, enzim immobilizasyonu, p(GMA)-ConA, bağlanma

Abstract:
Laccases (EC 1.10.3.2, p-diphenol dioxygen oxidoreductase) are a class of oxidative enzymes which are attracting increasing interest for their potential industrial applications. There has been considerable discussion recently about the potentials of using Spent Mushroom Substrate (SMS) for the production of value-added products. One of them is the production of lignocellulosic enzymes such as laccase. For this goal, this study provides scientific research and practical applications of SMS as a readily available and cheap source of enzymes for bioremediation, animal feed, and energy feedstock. Also, this study shows that immobilized laccase has better storage, stability and reusable than free laccase. 
In this study, polymethyl glycidyl methacrylate-concanavalin A nanoparticles p(GMA)-ConA were synthesized by surfactant-free emulsion polymerization. Specific surface area of the p(GMA)-ConA nanoparticles was calculated. p(GMA)-ConA nanoparticles were characterized by scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Partial purified from Pleurotus ostreatus wastes laccase was immobilized through covalent immobilization p(GMA), physical adsorption on ConA. The quantities of adsorption were calculated (Q value). 
To optimize p(GMA)-ConA nanoparticle immobilization conditions; pH, temperature, concentration, time, ionic strength experiments were performed. The optimum pH, temperature value of the immobilized laccase was determined. The molecular weight of purified laccase and immobilized laccase was determined by SDS-Page. The storage stability experiments were conducted to determine the stabilities of free and adsorbed laccase preparations after storage for 12 weeks. The activity of each preparation was expressed as a percentage of its residual activity compared to the initial activity. An extracellular laccase was isolated and partial purified from Pleurotus ostreatus wastes. Purification was carried out using ultrafiltration system. The enzyme was purified up to 7.8 fold from the initial protein preparation. The purified laccase was monomeric with on apparent molecular weight of 52 kDa. The optimum pH and temperature for the purified enzyme were 4.5 and 50°C, respectively. 
When the morphological structures of the nanoparticles are examined, it is seen that they are in spherical morphology and when SEM analysis is examined, they are in the size of 142 nm and the surface areas are 708,3 m2 / g. Optimum immobilization was achieved at pH 8, with a concentration of 1 mg/ml, in a 0.5 M ionic strength when the temperature was 25°C. The quantities of adsorption was 197,6 mg/g (Q value).  Using ABTS as a substrate, the optimum pH 8 and temperature value was 55°C for the immobilized laccase. 

Keywords: laccase, enzyme immobilization, p(GMA)-ConA, adsorption