Normozoospermik infertil hastalardan farklı seçim yöntemleri ile elde edilen spermlerin immünohistokimyasal ve elektron mikroskobik incelenmesi
Immunohistochemical and Electron Microscopic Analysis of The Normozoospermic İnfertile Patients' Sperms Obtained By Different Selection Methods
Yazar: SEVİLAY ERİMŞAH
Danışman: PROF. DR. SÜHEYLA GONCA ; PROF. DR. AYSEL KÜKNER
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: DNA = DNA ; Kısırlık = Infertility ; Kısırlık-erkek = Infertility-male ; Mikroskopi-elektron = Microscopy-electron ; Serbest radikaller = Free radicals ; Sperm = Spermatozoa ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Amaç: Normozoospermik infertil hastalardan, swim up, density gradient ve mikro akışkan
çip yıkama yöntemleri ile elde edilen spermlerin immünohistokimyasal ve elektron
mikroskobik olarak incelemesi ve uygun yıkama yöntemin belirlenmesi amaçlandı.
Yöntem: 20 normozoospermik infertil hastaya ait semen parametreleri değerlendirildi.
Semen örnekleri, density gradient, swim up ve mikro akışkan çip yöntemleri için 4 eşit
hacime ayrılarak gruplandı. Gruplara ait spermlere kromatin kondensasyon defektlerinin
belirlenmesi için anilin ve toluidin mavisi boyamaları, sperm DNA fragmantasyonunun
(SDF) belirlenmesi için TUNEL boyaması uygulandı. Hücre içi ROS seviyeleri flow
sitometri ile ince yapı değerlendirmesi ise elektron mikroskobik olarak yapıldı.
Bulgular: Konsantrasyon değerlendirmelerinde, swim up (45,65M/ml) ve mikro akışkan
çip (46,90M/ml) yöntemleri ile benzer sayıda sperm elde edilirken, density gradient
(55,55M/ml) yöntemi ile anlamlı olarak yüksek sayıda sperm elde edildi (P<0.0001).
Mikro akışkan çip ile normal morfolojili (%19,45) ve ileri hareketli sperm oranı (%83,55)
diğer yöntemlere göre anlamlı olarak yüksek bulundu (P<0.0001). Bununla beraber a sınıfı
hareketteki artış da diğer yöntemlere göre mikro akışkan çip ile anlamlı olarak daha yüksek
belirlendi (P<0.0001). Sperm kromatin kondensasyon defekti ve SDF yüzde oranı mikro
akışkan çip yönteminde anlamlı olarak düşük bulundu (P<0.0001). Hücre içi ROS
analizlerinde DCFH ile boyanan sperm sayısı mikro akışkan çip yönteminde anlamlı olarak
en düşük (%7,45) hesaplandı (P<0.0001). Elektron mikroskobik olarak tüm yıkama
yöntemlerinde, granüler kromatinin ve apopitozun azaldığı ayrıca density gradient
yönteminde akrozomal düzensizliklerin daha sık olduğu görüldü.
Sonuç: Bu çalışmanın sonuçları; aşılama tedavisinde mikro akışkan çip yönteminin,
density gradient ve swim up yıkama yöntemlerine göre daha etkili bir yöntem olduğunu
göstermektedir.

Abstract:
Objective: In normozoospermic infertile patients, we aimed to investigate
immunohistochemical and electron microscopic examination of sperm obtained by swim
up, density gradient and microfluidic chip methods as well as to determine the ideal
method.
Method: Semen parameters of 20 normozoospermic infertile patients were evaluated.
Each patient's semen was grouped into four equal volume, for density gradient, swim up
and microfluidic chip method. Aniline and toluidine blue staining were used to identify
chromatin condensation defects and TUNEL staining was used for sperm DNA
fragmentation (SDF). ROS levels were determined by flow cytometry and fine structure
evaluation by electron microscopy.
Results: Evaluation of concentration, swim up (45.65M/ml) and micro fluid chip (46,90
M/mL) was achieved with a small number of similar and sperm density gradient
(55,55M/mL) significantly higher number of sperm was obtained (P<0.0001). Microfluidic
chip method was found to be significantly higher in normal morphology and motion
evaluations (P<0.0001). However, the rate of increase of class a movement was
significantly higher after microfluidic chip method (P<0.0001). Sperm chromatin
condensation defect and SDF were found to be significantly lower in the microfluidic chip
method (P<0.0001). In ROS analysis, the number of sperm stained with DCFH was
calculated to be the lowest (7.45%) in the microfluidic chip method (P <0.0001). When the
methods were examined by electron microscopy, it was seen that granular chromatin and
apoptosis decreased and acrosomal irregularities were more frequent in the density
gradient method.
Conclusions: The results of this study show that sperm obtained by microfluidic chip
method may be more effective at insemination treatment than density gradient and swim
up methods.