Primer ve metastatik baş boyun kanseri hücre hatlarında ESM1 geninin siRNA ile baskılanarak fonksiyonel analizi
Functional analysis of ESM1 gene function by siRNA knockdown in primary and metastatic head and neck cancer cell lines
Yazar: ONUR BENDER
Danışman: PROF. DR. MEHMET GÜNDÜZ
Turgut Özal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Genetik = Genetics ; Genetik mühendisliği = Genetic engineering ; Kafa ve boyun neoplazmları = Head and neck neoplasms ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; RNA = RNA

Özet:
Baş boyun kanserleri dünya çapında sık rastlanılan kanser tiplerindendir. Bu durumun sebepleri arasında; hastalık tanısının erken yapılamaması, kanserin metastaz kabiliyetinin ve nüks oranlarının yüksek olması yer almaktadır. Baş boyun kanserlerinde esas tedaviyi cerrahi ve kemoradyoterapi oluştursa da bu yöntemler hastalar üzerinde yaşam standartlarını olumsuz etkileyen deformasyonlara sebep olmaktadır. Tıp ve temel bilimlerdeki teknolojik gelişmeler ile birlikte baş boyun kanserlerinde alternatif tanı ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi gerekli hale gelmiştir. Bu çalışmada da çeşitli kanser türlerinde aktif rolü olduğu kanıtlanan, tümör büyümesinde, metastazında ve anjiyogenezinde etkileri ortaya konulmuş, kritik bir gen olan ESM1'in baş boyun kanseri üzerine etkileri araştırılmıştır.
Çalışmamız kapsamında, baş boyun kanserine ait UT-SCC-74A ve metastazı UT-SCC-74B hücre hatları kullanılmıştır. Hücreler üzerinde ESM1 geninin ekspresyonu immunofloresan boyama ile gösterilmiştir. Kültüre edilen hücrelerin transfeksiyon etkinliği GAPDH-siRNA ile belirlenmiş ve ardından hücrelere ESM1-siRNA transfekte edilerek ESM1 geni baskılanmıştır. Baskılanma düzeyleri kantitatif real time PCR ve western blot analizleriyle gösterilmiştir. ESM1 geninin baş boyun kanseri hücre hatları üzerinde proliferasyon ve migrasyona olan etkileri xCELLigence gerçek zamanlı hücre analiz sistemi ile araştırılmıştır. Aynı zamanda proliferasyon analizlerinin validasyonu için XTT testi, migrasyon analizlerinin validasyonu için ise in vitro scratch assay testi yapılmıştır. Hücrelerin proliferasyon ve migrasyon kinetiklerinin değişimi sırasındaki apoptoz durumu ise kaspaz 3 aktivite analizi ile araştırılmıştır.
Çalışmamız sonucunda UT-SCC-74A ve UT-SCC-74B hücre hatlarında ESM1 geni ekspresyonu gösterilmiştir. Hücrelerde ESM1 ekspresyonu ESM1-siRNA kullanılarak anlamlı şekilde baskılanmıştır. Optimal baskılama şartlarında gerçekleştirilen proliferasyon ve migrasyon analiz sonuçlarına göre hem UT-SCC-74A hem de UT-SCC-74B hücrelerinde ESM1 ekspresyonunun baskılanması kanser hücrelerinin büyümesini ve göç kabiliyetini de anlamlı şekilde azaltmıştır. ESM1 ekpsresyonu baskılandığında hücrelerde kaspaz 3 aktivite ölçüm sonuçlarına göre de her iki hücre grubunda da ESM1-siRNA ve kontrol grupları arasında anlamlı bir fark oluşmamıştır.
Sonuç olarak; çalışmamız kapsamında ESM1 geninin baş boyun kanser ve metastazlı hücreleri üzerindeki etkileri ortaya konulmuştur. Bu fonksiyonel çalışma ile ESM1 geninin baş boyun kanserlerindeki temel moleküler rolleri belirlenmiş ve bundan sonraki aşamada mevcut agresif tedavilere alternatif olarak ESM1 geni ile yeni moleküler tedavi yöntemlerine temel oluşturulmuştur.

Abstract:
Head and neck cancer is a commonly seen cancer worldwide. Among the reasons for this are the difficulty in diagnosing the disease at an early stage, its metastatic capacity and high recurrence rate. The main treatment modalities are surgery and chemoradiotherapy which have a negative impact on patient quality of life due to deformations resulting from treatment. In combination with medical and basic science developments, there is a need for the development of alternative diagnosis and treatment methods. ESM1 has been shown to play an active role in many types of cancer in terms of tumor growth, metastasis and angiogenesis. In this study we investigated the effects of ESM1 in head and neck cancer.  
Our study was conducted using the head and neck cancer cell lines UT-SCC 74A and its metastasis UT-SCC-74B. ESM1 gene expression in these cell lines is shown using immunofluorescence staining. Transfection efficiency of the cultured cells was determined via GAPDH-siRNA. Cells were then transfected with ESM1-siRNA. Knock-down is shown by q-RT-PCR and Western blot analysis. The effect on proliferation and migration capacity of ESM1 gene knock-down in the cell lines was studied using xCELLigence real-time cell analysis system. To confirm the proliferation and migration analysis, XTT and in vitro scratch assay, respectively, were also used. The apoptotic status of cells was investigated using caspase 3 activity analysis.
We show ESM1 gene expression in UT-SCC 74A and UT-SCC 74B cell lines. Efficient ESM1 gene knock-down was achieved using ESM1-specific siRNA. Using optimized knock-down conditions, proliferation and migration analysis showed significant reduction in the growth and migration capacity of both UT-SCC 74A and UT-SCC 74B. There was, however, no significant difference in caspase 3 activity between control and cells treated with ESM1-siRNA.
In conclusion, our results show a role for ESM1 in both primary and metastatic head and neck cancer cells. In this functional study, the basic molecular role of ESM1 in head and neck cancer is shown and the results suggest that new molecular treatment methods using ESM1 may be an alternative to currently available aggressive treatments.