Hücre kültüründe tümör hücrelerine akıllı polimerik taşıyıcılar ile anttisens oligonükleotit aktarımı
Transfer of antisense oligonucletide into tumor cells in cell culture by using intelligent polymeric carriers
Yazar: ELA KIRSAÇ OSKAY
Danışman: PROF.DR. KEVSER PİŞKİN ÖZDEN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2005
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
HÜCRE KÜLTÜRÜNDE TÜMÖR HÜCRELER NE AKILLI POL MER KTAŞIYICILAR LE ANT SENS OL GONÜKLEOT T AKTARIMIEla Kırsaç OskayÖZBu tezin amacı, melanoma hücrelerinin c-myc gen ekspresyonunu baskılayarakhücrelerin çoğalmasını durdurmak için yüksek transfeksiyon etkinliği gösterenpolimer-anti c-myc ODN konjugatlarını oluşturmak ve karakterize etmektir.Bu amaçla ilk önce karboksil uçlu Poli ( N PA)'in sentezi gerçekleştirilmiş vesuda çözünebilen karbodiimid (EDAC) varlığında dallanmış ve 2 kDa molekülağırlıklı PE ile kopolimerleri oluşturulmuştur. Kopolimer çeşitli yöntemler ilekarakterize edilmiştir; Kopolimerizasyon verimi gravimetrik olarak % 40hesaplanmıştır. Molekül ağırlığı viskozimetreyle ölçülmüş ve 14670 olarakhesaplanmıştır. Kopolimerizasyon oluşumu FTIR ve 1H-NMR ile gösterilmiştir.Kopolimerizasyon sonucu LCST değerlerinin 320C'den 35,5-37 0C'ye yükseldiğigörülmüştür.Anti-c-myc oligonükleotitler c-myc mRNA'nın 5' başlangıç kodonunakomplementer olan 15 bazlık, baz sırası: 5' AACGTTGAGGGGCAT-3' olanoligonükleotitleri ile poli(N P)/PE kopolimerinin farklı oranlarda konjugatlarıoluşturulmuştur. Oluşturulan konjugatlar poli akrilamid jel elektroforezindeincelenmiş, karakterizasyonları ve DNA'ya bağlanma eğilimleri jelde geri kalma ilebelirlenmiştir. Konjugatların çift sarmal, A-T ve G-C baz dizilerine eşit olarakbağlanabildikleri görülmüştür. Ağırlıkça farklı oranlarda (6, 9 ve 12) oluşturulankonjugatların boyutları zeta sizer ölçülmüştür. Poli(N PA) ve dallanmış 2000molekül ağırlığında PE içeren kopolimerlerden oluşan konjugat boyutları oran 6, 9ve 12'ye göre sırasıyla, 25 0C'de 281Â±8, 350.2Â±22 37 0C'deve 619Â±105,232.9Â±12, 255Â±15 ve 520Â±44 olarak bulunmuştur. Poli(N PA) ile oluşturulankopolimerin sıcaklık davranışının konjugat oluşumuna etkisi, ölçülmüş,poli(N PA)'nın uyarı-cevap özelliğine bağlı olarak konjugatların boyutlarındaküçülme olduğu görülmüştür. Anti-c-MYC Oligonükleotitinin, PEI2Dhomopolimerinin ve poli (NiPA)/PEI2D kopolimerinin yükleri ölçüldüğündesırasıyla, - 8,2, + 4,1 ve + 3,7 olarak bulunmuştur . Ağılıkça 6, 9 ve 12oranlarında hazırlanan konjugatların yükleri ise 3,1, 3,6 ve 4,2 olarak ölçülmüştür.Kopolimerlerin konjugatlarının toksik etkileri fibroblast hücrelerinde MTTyöntemiyle araştırılmıştır. Kopolimerlerin toksik etkileri düşük çıkmış konjugatlardaise toksitite ortadan kalkmıştır.Polimer/ODN konjugatlarının melanoma hücrelerinin çoğalmaları üzerindekietkisi hücre kültür ortamında MTT yöntemiyle araştırılmıştır. Maksimum çoğalmabaskılayıcı etki uygulamanın 48' nci saatinde % 48 olarak oran 9'da görülmüştür.Antisens oligonükleotit aktarımında elde edilen sonucun poli(N PA)'insıcaklılığa duyarlılık özelliği ile moleküllerin boyutlarını vücut sıcaklığında aşağıçekmesi olduğu düşünülmektedir.Sonuç olarak sıcaklığa duyarlı, biyolojik sınırlarda kalacak miktarda toksik,polikatyonik poli(N PA)/PE taşıyıcı sistemin SK-MEL-30 melanoma hücrelerineanti-c-MYC oligonükleotitlerin etkin şekilde aktarımını sağladığı ve anti-c-MYColigonükleotitlerinin protein ekspresyonu engelleyerek kanser hücrelerininçoğalmasını baskıladığı tespit edilmiştir.Anahtar Kelimeler: Antisens Gen Terapi, c-MYC, Melanoma, Poli(N PA), PE ,SK-MEL-30.Danışman: Prof. Dr. Kevser Pişkin, Hacettepe Üniversitesi, Biyokimya Ana BilimDalı.

Abstract:
TRANSFER OF ANTISENSE OLIGONUCLETIDE INTO TUMOR CELLS INCELL CULTURE BY USING INTELLIGENT POLYMERIC CARRIERSEla Kırsaç OskayABSTRACTThe aim of this thesis is to form and characterize polymer-anti c-myc ODNconjugates in order to provide high transfection efficiency and significantsuppresive effects on c-myc expression of myeloma cells and thereby inhibitingtheir growth.Poly ( NIPA) with carboxyl ends is synthesized and in the presence of watersoluble carbodiimide (EDAC) it is copolymerized with branched PEI ( 2 kDa) .Copolymer is analysed by a series of methods. Copolymerisation efficiency iscalculated gravimetrically as 40 %. The molecular weight is measured byviscosimetry and calculated as 14670. Copolimerisation was furher shown by FTIRand 1H-NMR analyses. Following copolimerisation LCST value increased to 35,5-37 0C from 32 0C . Anti-c-myc oligonucleotides (ODN) were complementary tothe 5? start codon of c-myc mRNA having a sequence of 5?-AACGTTGAGGGGCAT-3?. ODNs were combined with poly (NIPA)/PEI copolymerat different ratios. The conjugates were then analysed with polyacrylamide gelelectrophoresis ( PAGE) and gel retardation was determined for theircharacterisation and assessment of DNA binding affinities. Congugates were ableto bind duplex, AT rich and GC rich sequences equally. Copolymer andconjugates of copolymers with ODNs at different ratios per weight (6, 9 ve 12)were measured by zeta sizer. The sizes at 6, 9 ve 12 ratios were found to be at25 0C 281Â±8, 350.2Â±22 and 619Â±105, at 37 0C 232.9Â±12, 255Â±15 and 520Â±44respectfully. The size of the conjugates decreased at 370C as a result of thecopolymers temperature response behaviour. The charges of anti c-myc ODN,PEI2D homopolymer ve poly (NIPA)/PEI2D copolymer were measured as - 8,2, +4,1 and +3,7 respectfully. A decrease in the electropositivity of PEI is noted uponcopolymerisation with poly (NIPA).Copolymers and conjugates were tested fot toxicity using fibroblast cells anddetermined by MTT test. The copolymer had low levels of toxicity and this wasimproved by conjugate formation.The effects of ODN/polymer conjugates on the growth of melanoma cells weredetermined in cell culture and by measuring their viability with MTT. Themaximum growth suppressive effect was 48% and was obtained at polymer/ODNratio of 9 after 48 hours declining gradually.The efficient transfection achieved by poly (NIPA)/PEI is thought to be due to itstemperature sensitive nature that allows it to decrease its dimentions at bodytemperature.It is concluded that, temperature sensitive policationic poly (NIPA)/PEI providesan efficient vector with very low toxicity for c-myc antisense delivery to SK-MEL-30melanoma cells which results in c-myc and cell growth suppression.Keywords: Antisens Gene Therapy, c-MYC, Melanoma, Poly(NIPA), PE , SK-MEL-30.Advisor: Prof. Dr Kevser Pişkin, Hacettepe University, Biochemistry Departmant.