Polikistik böbrek hastalığında PKD1 gen varyasyonlarının RNA düzeyinde analizi
Analysis of PKD1 gene variations at RNA level in polycystic kidney disease
Yazar: MUHAMEDSEMI MEMEDI
Danışman: DOÇ. DR. SELMA DEMİR
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Polikistik böbrek hastalığı, en sık karşılaşılan kalıtsal böbrek hastalığıdır. Böbrek
kistlerinin ilerleyerek büyümesi, böbrek yetmezliği ve hipertansiyon ile seyreden 500 ila
1000 doğumda bir görülen genetik bir hastalıktır. Polikistik böbrek hastalığı yenidoğanlardan
yaşlılığa kadar uzanır ve bu hastalıkta böbrekte çok sayıda kist oluşur. Oluşan kistler, giderek
büyüyerek sonunda böbreğin tamamen kistlerden oluşmasına ve işlevini yerine
getirmemesine neden olur. Polikistik böbrek hastalığının takribi %85'i PKD1 (Polisistin1)
gen bölgesiyle ilişkilidir. PKD1 geninin mutasyonlar açısından değerlendirilmesi bazı yöntemsel zorluklar
barındırmaktadır. Genin 1 ile 32. ekzonları arasında kalan bölgesi, asıl gene 13-16 mb
mesafede altı defa tekrarlandığı bir segmental duplike bölgenin içinde yer almaktadır. Bu
bölgenin analizinde PKD1'e özgü olan geniş alanı kapsayan Uzun-Menzilli Polimeraz Zincir
Reaksiyonu (long-range PCR, LR-PCR) kullanılarak yanlış pozitiflikten kaçınılmaya
çalışılmaktadır. Tez çalışmamız kapsamında, PKD1 geninin DNA düzeyinde analizinde segmental
duplikasyonlar nedeniyle yaşanan zorlukların aşılmasında, RNA'dan elde edilen cDNA'nın
dizilenmesi ile PKD1 mutasyonlarının belirlenebilirliğini değerlendirmek amaçlanmıştır. Bu
amaçla, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı Genetik Hastalıklar Değerlendirme Merkezi polikliniğine polikistik böbrek hastalığı ön tanısı ile gelen hastalardan aralarında akrabalık bağı olmayan 24 olgudan, PKD1 geninde patojenik/olası patojenik varyasyon bulunan 9 olgu belirlenmiş ve bu dokuz olgudan altısında, DNA
düzeyinde belirlenen varyasyonlar RNA düzeyinde incelenmiştir. Çalışmamızda ayrıca PKD1 geni tarafından kodlanan RNA'nın iki farklı bölgesinin periferik kandaki gen ifade düzeyleri 6 olgu ve 10 kontrolde Gerçek Zamanlı Kantitatif Ters Tranksriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile incelenmiştir. Tez çalışmamız kapsamında beş olguda, daha önce DNA düzeyinde belirlenen varyasyonlar RNA düzeyinde doğrulanmıştır. Çalışmaya dahil edilen olgularda belirlenen
altı varyasyondan üçü (%50) çalışmamızın yapıldığı tarihte literatürde ve veritabanlarında
yer almayan novel varyasyonlardı. Olgu serimizde yer alan novel NM_001009944(PKD1):
c.2853+2_2853+10del kırpılma bölgesi varyasyonunun PKD1 geninde kanonik kırpılma
bölgesinin kaybı sonrasında, ilgili patojenik varyasyonun yukarı akış kısmında yer alan
ekzonik bir AG dizisinin yeni kırpılma bölgesi olarak algılanmasına yol açtığı görülmüştür. PKD1 geninin periferik kandaki gen ifade düzeyi analizlerinde ise, genel olarak olgularda daha düşük ekspresyon görülme eğilimine karşın olgu ve kontroller arasında istatistiksel anlamlı bir ekspresyon farklılığı saptanmamıştır. Çalışmamızda RNA'dan Sanger dizi analizlerinde, düşük düzeyde olmakla birlikte, segmental duplike bölgeler içerisinde kalan PKD1 bölgelerinin gen dizilerini de kısmi olarak barındırdığı görülmüştür. Gerçek Zamanlı Kantitatif Ters Tranksriptaz Polimeraz Zincir
Reaksiyonu sonuçlarımıza göre olgu ve kontroller arasında anlamlı ekspresyon farklılığı
gözlenmemiştir. Çalışmamıza dahil edilen olgu ve kontrol sayılarının az olması kısıtlılık
oluşturmakla birlikte, bulgularımız, RNA ile yapılacak fonksiyonel analizlerin yeni kırpılma
bölgesi varyasyonlarının gen ekspresyonu düzeyindeki etkilerinin belirlenmesindeki
önemine işaret etmektedir. Buna karşın, PKD1 gen ekspresyonunun kanda düşük düzeyde
olması ve segmental duplike bölgelere ait piklerin de izlenmesi, polikistik böbrek hastalığı
olgularında periferik kandan izole edilen RNA'ya dayalı analizin, tek başına, tanısal olarak,
uzun menzilli DNA dizi analizi yaklaşımına alternatif oluşturamayacağını göstermektedir.

Abstract:
Polycystic kidney disease (PKD) is the most common hereditary kidney disease. It is
a genetic disorder characterized by the progressive growth of kidney cysts, leading to kidney
failure and hypertension, occurring in 1 in 500 to 1,000 births. PKD can manifest from
newborns to the elderly, resulting in numerous cysts in the kidneys. These cysts progressively
grow, eventually leading to the kidney being entirely composed of cysts and losing its
function. Approximately 85% of PKD cases are associated with the PKD1 gene
(Polycystin1). Assessing mutations in the PKD1 gene presents certain methodological challenges.
The region between exons 1 and 32 of the gene is located within a segmental duplication
region that has repeated six times at a distance of 13-16 Mb from the main gene. The Long-
Range PCR (LR-PCR) method, which covers a wide area specific to PKD1, is used to avoid
false positives in the analysis of this region.
In our study, we aimed to evaluate the detectability of PKD1 mutations by sequencing
cDNA obtained from RNA to overcome the challenges posed by segmental duplications in
the analysis of the PKD1 gene at the DNA level. For this purpose, among 24 cases referred
to the Genetic Diseases Assessment Center at Trakya University Medical Faculty with a
preliminary diagnosis of PKD, 9 cases with pathogenic/likely pathogenic variants in the PKD1 gene were identified, and variations determined at the DNA level were examined at the RNA level in six of these cases. Additionally, the gene expression levels of RNA encoded by the PKD1 gene were investigated in six cases and ten controls using Real-Time
Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR).
In our study, variations previously identified at the DNA level were confirmed at the
RNA level in five cases. Among the six variations identified in the included cases, three
(50%) were novel variations not present in the literature and databases at the time of the
study. The novel NM_001009944(PKD1).2853+2_2853+10del splice region variation
observed in our case series led to the recognition of a new splice site by losing the canonical
splice region in the PKD1 gene. In the analyses of gene expression levels of the PKD1 gene
in peripheral blood, although there was a general tendency for lower expression in cases, no
statistically significant expression difference was found between cases and controls. In our
study, low-level Sanger sequencing analysis of RNA revealed that the PKD1 regions within
segmental duplication areas partially contained gene sequences. According to our Real-Time
Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction results, no significant
expression difference was observed between cases and controls. While the limited number
of cases and controls included in our study presents a limitation, our findings highlight the
importance of functional analyses with RNA in determining the effects of new splice region
variations on gene expression levels. However, the low level of PKD1 gene expression in
blood and the presence of peaks related to segmental duplications indicate that RNA-based
analysis isolated from peripheral blood in cases of polycystic kidney disease cannot
independently serve as an alternative to diagnostic long-range DNA sequencing approaches.