Vazospazmın ötesine bir bakış: Deneysel subaraknoid kanama modelinde nimodipin ile CYP3A4 indükleyici deksametazon kullanımının erken beyin hasarı ve gecikmiş serebral iskemi üzerine etkileri
A look beyond vasospasm: the effects of combination of nimodipine and a CYP3A4 inducing drug dexamethasone on early brain injury and delayed cerebral ischemia in an experimental subarachnoid hemorrhage model
Yazar: SELİN BOZDAĞ
Danışman: DOÇ. DR. HASAN KAMİL SUCU
İzmir Katip Çelebi Üniversitesi / İzmir Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Beyin-Sinir ve Omurilik Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Beyin hasarı-kronik = Brain damage-chronic ; Beyin iskemisi = Brain ischemia ; Deksametazon = Dexamethasone ; Nimodipin = Nimodipine ; Subaraknoid kanama = Subarachnoid hemorrhage ; Subaraknoid kanama = Subarachnoid hemorrhage ; Vazospazm-intrakraniyal = Vasospasm-intracranial

Özet:
Tanı ve tedavi yöntemlerinde önemli gelişmeler kaydedilmesine rağmen; subaraknoid kanama (SAK) halen yüksek mortalite oranına sahip bir patolojidir ve tedavi sonrası sağ kalan hastaların yaklaşık %50'sinden fazlasında da yaşam boyu bakım ihtiyacı oluşturan ve işe geri dönmelerini engelleyen bozukluklar gelişmekte ve yaşam kaliteleri düşmektedir. Sebebi ise araştırmamızın odak noktası olan, SAK sonrası gelişen 'erken beyin hasarı' ve 'gecikmiş serebral iskemi' adı verilen bir takım patofizyolojik olaylar dizisidir ve en önemli tedavi gelişmesini önlemektir. Günümüzde SAK sonrası nörolojik kötü sonuç riskini azalttığı gösterilen elimizdeki tek ilaç 'nimodipin'dir. Nimodipini metabolize eden CYP3A4 enzimini indüklediği bilinen deksametazon; klinik pratikte SAK hastalarında anti-ödem tedavi amacıyla kullanılabilmektedir. Bu araştırmada daha önce literatürde hiç çalışılmamış olan, nimodipin ile deksametazonun birlikte kullanımının, ratlarda oluşturulan SAK modelinde nimodipinin 'erken beyin hasarı' ve 'gecikmiş serebral iskemi' üzerindeki etkisini değiştirip değiştirmediğini anlamak amaçlanmıştır. 

Çalışmamız Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Laboratuvarı'nda gerçekleştirilmiştir. Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Laboratuvarı'nda yetiştirilen, daha önce herhangi bir deneyde kullanılmamış, sağlıklı, erişkin, dişi ve ağırlıkları 250-400 gr arasında olan 35 adet Wistar Albino türü ratlar çalışmaya alınmıştır. Deney; sham(salin) grubunda 8, diğer (SAK; SAK+nimodipin; SAK+nimodipin+deksametazon) gruplarda 9'ar hayvan olacak şekilde bloklu randomizasyon yapılarak oluşturulan toplam 4 grupta gerçekleştirilmiştir. Ad libitum beslenme, 25oC ortam sıcaklığı ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü sağlanmıştır. Deneyde, standardizasyonu olan ve literatürde en çok kullanıldığı tespit edilen 'otolog kanın sisterna magnaya çift enjeksiyonu' modeli kullanılmıştır. İntraperitoneal 50-60mg/kg ketamin ve 5-10mg/kg ksilazin uygulanarak anestezi sağlanmış ve mikroskop altında sisterna magnadan 0,15ml BOS çekilip, aynı miktarda kuyruk arterinden alınmış taze otolog arteryel kan enjekte edilerek subaraknoid araknonid kanama modeli oluşturulmuştur. İlk enjeksiyondan 48 saat sonra aynı işlem ikinci enjeksiyon için tekrarlanmıştır. Ancak ikinci enjeksiyonda hayvanların kafa içi basınçlarının SAK'a sekonder artmış olabileceği göz önüne alınarak; işlem 0,1 ml BOS ve kan ile uygulanmıştır. Sham grubunda ise aynı prosedürler kan yerine salin ile gerçekleştirilmiştir.
Sham 'salin' grubunda ve 'tedavisiz SAK' grubunda ameliyatlardan sonra herhangi bir terapötik müdahale yapılmamıştır. 'SAK + nimodipin' grubunda sadece oral gavaj ile (12mg/kg, BID) nimodipin uygulanmıştır. 'SAK + nimodipin + deksametazon' grubunda ise nimodipine ek olarak, intraperitoneal yolla (1mg/kg, BID) deksametazon uygulanmıştır. Nörolojik testler ameliyat öncesinde ve ameliyat sonrası günlük olarak uygulanmıştır. Yapılan muayenelerde en kötü skoru tedavisiz SAK grubu alırken, en iyi skoru sadece nimodipin uygulanan grup almıştır (p<0,05). Hayvanlar, ilk enjeksiyondan 5 gün sonra sakrifiye edilmiştir. 

Toplam mortalite oranı ise %14,3 olarak hesaplanmış olup bir hayvanda status epileptikus ve bir hayvanda belirgin hidrosefali gelişmiştir. Çıkarılan beyin numunelerinde ilk önce SAK derecelendirmesi yapılmış olup, gruplar arasında oluşturulan SAK şiddeti arasında fark saptanmamıştır. H&E ve Verhoeff-van Gieson boyama ile baziler arterin çapı ve duvar kalınlığı, internal elastik laminada büzülme değerlendirilmiştir. Histolojik değerlendirmelerde vazospazm bulguları en fazla olan grup tedavisiz SAK grubu iken, sonuçları kontrol grubuna en yakın olan grup ise sadece nimodipin tedavisi alan grup olarak bulunmuştur (p<0,05). Taramalı elektron mikroskobu ile mikrodamarlar incelenmiş ve SAK'a sekonder bulgular kaydedilmiştir. Kan numunelerinde inflamatuar yanıt ile ilişkili IL-1, IL-6, TNF-α ve vazospazm ile ilişkili elektrolitler olan Na, K ve Ca; BOS numunelerinde nöronal hasar ile ilişkili glutamat düzeyi çalışılmıştır. Nörolojik muayenelerde, histolojik ve biyokimyasal değerlendirmelerde körleme sağlanmıştır. Tüm istatistiksel analizlerde SPSS 22 ve histopatolojik ölçümlerde Image J kullanılmıştır. Verilerin normal dağılıma uyumu Shapiro-Wilk testi ile analiz edilmiş olup; veriler normal dağılıma uyuyorsa, ANOVA ve Post Hoc testi ile ve eğer normal dağılıma uymuyorsa, Kruskall-Wallis testi ile değerlendirilmiştir.

Araştırmamız; nimodipinin etkileri, tedaviye deksametazon eklenmesi ile değiştiği yönünde sonuçlanmıştır. SAK hastalarında gecikmiş serebral iskemiyi önlemek amaçlı nimodipin kullanırken, anti-ödem tedavi gerektiği durumlarda öncelikli olarak deksametazonun tercih edilmemesi, eğer deksametazon tedavisi eklenmesi gerekiyor ise; bu çalışma bulgularıyla önerimiz bu hastaların etkinlik açısından daha yakın izlenmeleri ve gerekirse nimodipin dozunun arttırılması stratejisi olmuştur.

Anahtar Kelimeler: Vazospazm, Erken Beyin Hasarı, Gecikmiş Serebral İskemi, Nimodipin, Deksametazon

Abstract:
Although significant progress has been made in diagnosis and treatment methods; subarachnoid hemorrhage (SAH) is still a pathology with a high mortality rate, and more than 50% of the patients who survive after treatment develop disorders that require lifelong care and keep them from returning to work and their quality of life decreases. It is caused by the series of pathophysiological events called "early brain injury" and "delayed cerebral ischemia" that our research focused on. The most important treatment is prevention. Today, the only drug that shows a reduction in the risk of adverse neurological outcomes after SAH is nimodipine. Dexamethasone, which is known to induce the CYP3A4 enzyme that metabolizes nimodipine, is used for anti-edema treatment in SAH patients in clinical practice. This study aimed to understand whether the use of nimodipine and dexamethasone together, which has never been studied in the literature before, changes the effect of nimodipine on "early brain damage" and "delayed cerebral ischemia" in the SAH model created in rats.

Our study was carried out in Dokuz Eylul University Faculty of Medicine Experimental Animals Laboratory. Thirty-five healthy, female, adult Wistar Albino rats that were not used in any experiment before and were raised in Dokuz Eylul University Faculty of Medicine Experimental Animal Laboratory were included in the study. Blocked randomization was performed, and the sham group with eight animals and the other groups with nine animals were formed. Experiments were carried out with a total of 4 groups (Sham; SAH; SAH + nimodipine; SAH + nimodipine + dexamethasone).  Ad libitum feeding, 25oC ambient temperature, and 12 hours light / dark cycle were provided.  The 'double injection of autologous blood into cisterna magna' model, which has standardization and is the most used in the literature, was used in the experiment. Anesthesia was achieved by intraperitoneal administration of 50-60 mg/kg ketamine and 5-10 mg/kg xylazine. The subarachnoid arachnoid hemorrhage model was created by withdrawing 0.15 ml of CSF from the cisterna magna under the microscope and injecting fresh autologous arterial blood from the tail artery. 48 hours after the first injection, the same procedure was repeated for the second injection.  However, considering that the intracranial pressures of the animals may have increased secondary to SAH in the second injection, the procedure was applied with 0.1 ml CSF and blood. The same techniques were used in the sham group; however, saline was injected into the cisterna magna instead of blood. No therapeutic intervention was performed in the sham (saline) and "non-treatment SAH" groups after the operations. In the 'SAH + nimodipine' group, nimodipine was administered only by oral gavage (12 mg/kg, BID). In the 'SAH + nimodipine + dexamethasone' group, in addition to nimodipine, dexamethasone was administered intraperitoneally (1 mg/kg, BID).  Neurological tests were applied preoperatively and postoperatively daily. While the SAH group without the treatment received the worst score in examinations that performed, the group which received only nimodipine achieved the best score (p <0.05). Animals were sacrificed five days after the first injection. 

The total mortality rate was 14.3%, with status epilepticus in one animal and significant hydrocephalus in one animal. SAH grading was first made in the brain samples that were removed, and there was no difference between the SAH intensity generated between the groups.  The diameter and wall thickness of the basilar artery and corrugation of the internal elastic lamina were evaluated with H&E and Verhoeff-van Gieson staining. In histological evaluations, the group with the most vasospasm findings was the group without treatment. In contrast, the group with the closest results to the control group was the group that received only nimodipine treatment (p <0.05). Microvessels were examined with scanning electron microscopy, and findings secondary to SAH were recorded. In blood samples, IL-1, IL-6, TNF-α associated with the inflammatory response, and the electrolytes Na, K, and Ca associated with vasospasm were studied. In CSF samples, the glutamate level related to neuronal damage was studied. Blinding was achieved in neurological examinations, histological and biochemical evaluations. SPSS 22 was used for all statistical analyzes and Image J for histopathological measurements. The compliance of the data to the normal distribution was analyzed with the Shapiro-Wilk test; If the data conformed to the normal distribution, they were evaluated by ANOVA and Post Hoc tests, and if they did not comply with normal distribution, by Kruskall-Wallis test.

Our research resulted that the effects of nimodipine changed with the addition of dexamethasone to the treatment. While using nimodipine to prevent delayed cerebral ischemia in patients with SAH, dexamethasone should not be preferred primarily when anti-edema treatment is required, and if dexamethasone treatment should be added; with the findings of this study, our recommendation has been the strategy of monitoring these patients more closely in terms of efficacy and increasing the nimodipine dose if necessary.

Keywords: Vasospasm, Early Brain Injury, Delayed Cerebral Ischemia, Nimodipine, Dexamethasone