Deniz ortamlarından izole edilen Actinomycetes'lerin antibakteriyel karakterizasyonu
Antibacterial characterization of Actinomycetes isolated from sea enviroments
Yazar: GÜLNİHAN SELİM
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ELİF ÖZLEM ARSLAN AYDOĞDU
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Aktinomisetler = Actinomycetes ; Antibakteriyel aktivite = Antibacterial activity

Özet:
Actinomycete bakterileri Gram pozitif, filamentli, sporlu, aerobik bakterilerdir. Toprak, sediment, tatlı ve tuzlu su kaynakları, bitkiler, sünger, böcek ya da balık gibi çeşitli hayvanların dokularında bulunan bu bakteriler ürettikleri biyoaktif bileşiklerle bilinmektedirler. 
Actinomycete'ler farklı özellikteki yüksek sekonder metabolit üretme kapasitesine sahip bakterilerdir. Bulundukları ortamda sağladıkları adaptasyonlar bu bakterilerin yeni antibakteriyel madde sentezlemelerini sağlar. Bu sebeple farklı ortamlardan izole edilen Actinomycete'ler sahip oldukları sekonder metabolitler açısından mutlaka incelenmelidir. Tez çalışmamızda Marmara Denizi'nin farklı bölge ve derinliklerden su ve sediment örnekleri toplanmış ve bu örnekler soğuk zincirle laboratuvar ortamına taşınmıştır. Laboratuvara getirilen su ve sediment örnekleri Actinomycete bakterilerinin izole edilebilmesi amacıyla antibiyotik ve antifungal ile desteklenen ISP2, GM2 ve M6 besiyerlerine farklı izolasyon teknikleri kullanılarak ekilmiştir. Su örnekleri süzme ve direkt ekim yöntemleri ile çalışılırken, çeşitli ön işlemler ugulanan sediment örnekleri seri sulandırma yöntemi ile ekilmiştir. Yapılan makroskobik ve mikroskobik incelemeler sonucunda 35 tane Actinomycetes şüpheli bakteri kolonisi belirlenmiştir. 
Actinomycete bakterilerine ait antibakteriyel etkinlikler birincil ve ikincil tarama olarak adlandırılan yöntemlerle taranmıştır. Tez çalışmamızda Actinomycetes izolatlarının antibakteriyel etkinliğini belirlemek için Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ve Bacillus subtilis patojenleri seçilmiştir. Birincil taramada çizgi ekim ve agar kaplama yöntemleri denenmiştir.  Çizgi ekim yönteminde 13 adet izolat en az bir patojen bakteri üzerine antibakteriyel özellik gösterirken, agar kaplama yönteminde 7 adet izolat en az bir patojen bakteri üzerine antibakteriyel özellik göstermiştir. Birincil tarama yöntemlerinde çeşitli izolatlarımızın günümüzde de kullanılan azitromisin ve tetrasiklin gibi enfeksiyonların tedavisinde kullanılan antibiyotiklere kıyasla S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, K. pneumoniae ve S. enterica bakterilerine karşı çok daha yüksek antibakteriyel etki gösterdiği tespit edilmiştir. 
İkincil tarama yöntemleri için Actinomycete'lerden süpernatant elde edilmiştir. Elde edilen süpernatant disk difüzyon ve MİK/MBK deneylerinde kullanılmıştır. Disk difüzyon yönteminde sonuç elde edilemezken, MİK/MBK yöntemi ile incelendiğinde 10 adet Actinomycetes izolatının süpernatantının denenen en az bir patojen üzerinde antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. MİK/MBK sonuçlarına göre bazı izolatlarımıza ait sekonder metabolitlerin düşük dozlarda bile antibakteriyel bir etki gösterdiği tespit edilmiştir.
Actinomycetes izolatlarının adlandırılması için ilk olarak bakterilere ait genomik DNA'larının 9F ve 1509R primerleri ile PZR yöntemi uygulanarak çoğaltılan 16S rRNA gen bölgelerinin sekans analizi yapılmıştır. Sekans analizi sonucunda elde edilen diziler kullanılarak NCBI GenBank'ta izolatlarımıza en yakın Actinomycetes türleri belirlenmiştir. Sekans analizi sonuçlarına göre tez çalışmamız kapsamında Streptomyces cinsi başta olmak üzere Nocardiopsis, Micromonospora ve Nonomuraea cinslerine ait Actinomycete'lerin izolasyonu yapılmıştır.

Abstract:
Actinomycete bacteria are Gram-positive, filamentous, spore-forming, aerobic bacteria. These bacteria, which are found in the tissues of various animals such as soil, sediment, fresh and salt water sources, plants, sponges, insects or fish, are known for the bioactive compounds they produce. 
Actinomycetes are bacteria with a high capacity to produce secondary metabolites with different characteristics. The adaptations they provide to their environment enable these bacteria to synthesize new antibacterial substances depending on their living environment. For this reason, Actinomycetes isolated from different environments should be examined in terms of their secondary metabolites In our thesis study, water and sediment samples were collected from different depths and parts of the Marmara Sea from and these samples were transported to the laboratory environment by cold chain. Water and sediment samples brought to the laboratory were inoculated on ISP2, GM2 and M6 media supplemented with antibiotics and antifungals using different isolation techniques in order to isolate Actinomycete bacteria. While water samples were studied by filtration and direct inoculation methods, sediment samples with various pre-treatments were inoculation with serial dilution method. As a result of the macroscopic and microscopic examinations, 35 Actinomycetes suspicious bacterial colonies were determined.
Antibacterial activities of Actinomycete bacteria were screened by methods called primary and secondary screening. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Bacillus subtilis pathogens were selected to determine the antibacterial activity of Actinomycetes isolates in our thesis study. Cross streak and agar overlay methods were tried in primary screening. While 13 isolates showed antibacterial properties on at least one pathogenic bacteria in the cross streak method, 7 isolates showed antibacterial properties on at least one pathogenic bacteria in the agar overlay method. In primary screening methods, it was determined that various isolates showed much higher antibacterial activity against S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, K. pneumoniae and S. enterica bacteria compared to antibiotics used in the treatment of infections such as azithromycin and tetracycline, which are still used today.
Supernatant was obtained from Actinomycetes for secondary screening methods.This supernatant was used in secondary screening methods. The obtained supernatant was used in disk diffusion and MIC/MBK experiments. While no results were obtained in the disk diffusion method, it was determined that the supernatant of 10 Actinomycetes isolates had antibacterial activity on at least one of the pathogens tested when examined by the MIC/MBK method. According to the MIC/MBK results, it was determined that the secondary metabolites of some of our isolates showed an antibacterial effect even at low doses.
In order to identify the Actinomycetes isolates, firstly, the sequence analysis of the 16S rRNA gene regions of the bacterial genomic DNAs amplified by the PCR method with 9F and 1509R primers was performed. Using the sequences obtained as a result of the sequence analysis, the closest Actinomycetes species to our isolates were determined in the NCBI GenBank. According to the results of the sequence analysis, within the scope of our thesis study, Actinomycetes belonging to the genus Nocardiopsis, Micromonospora and Nonomuraea, especially the genus Streptomyces, were isolated