Burkholderia türlerinin moleküler yöntemlerle tiplendirilmesi, türler arasında biyofilm oluşumu ve antibiyotik direnç farklılığının belirlenmesi
Multilocus sequence analysis, biofilm production, antibiotic susceptibility and synergy tests of burkholderia species in patients with and without cystic fibrosis
Yazar: HAVVA ÖZLEM ALTAY AKIŞOĞLU
Danışman: PROF. DR. AYŞE GÜLŞEN HASÇELİK
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bakteriler = Bacteria ; Biyofilmler = Biofilms ; Burkholderia = Burkholderia ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Kistik fibroz = Cystic fibrosis ; Mikrobiyal duyarlılık testleri = Microbial sensitivity tests ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Burkholderia türleri bağışıklığı baskılanmış insanların, özellikle kistik fibrozisli (KF) hastaların solunum yollarında enfeksiyona neden olan önemli patojenlerdir. Bu bakterilerin tedavisinde; konvansiyonel yöntemlerle tanımlanmada sorunların bulunması, çoğunun antibiyotiğe karşı içsel direnç göstermeleri ve biyofilm oluşturmaları nedeniyle güçlüklerle karşılaşılmaktadır. Bu çalışmanın amacı; KF ve KF olmayan hastalardan izole edilen Burkholderia türlerinin rutin mikrobiyolojik yöntemler ve multi-lokus sekans analizi (MLSA) ile tanımlanması, biyofilm oluşumunun değerlendirilmesi, antibiyotik dirençleri ve sinerjilerinin belirlenmesidir. Çalışmada 26 hastadan (13 KF, 13 KF olmayan) izole edilen 38 adet Burkholderia spp. biyokimyasal ve fenotipik testler, matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) ve MLSA ile tanımlanmıştır. PubMLST veritabani kullanilarak izolatların sekans tipleri belirlenmiştir. Klinik izolatların biyofilm oluşturma özellikleri mikroplak yöntemi ile çalışılmış, seftazidim, meropenem, trimetoprim / sülfametoksazol (TMP-SXT) ve levofloksasinin duyarlılıkları, CLSI kılavuzuna (2017) göre mikrodilüsyon yöntemi ile değerlendirilmiştir. Sinerji testleri dama tahtası yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Multilokus sekans analizinde çalışılan klinik izolatlar B. cenocepacia (n:16), B. contaminans (n:11), B. gladioli (n: 4), B. dolosa (n:4), B. multivorans (n:2) ve B. seminalis (n:1) olarak belirlenmiştir. Bu izolatların sekans tipleri ST-19, ST-72, ST-102, ST-180, ST-270, ST-482, ST-602, ST-629, ST-740, ST-839 ve ST-1392 olarak saptanmıştır. MALDI-TOF MS ile tür düzeyinde doğru tanımlama yüzdesi B. contaminans haricindeki tüm izolatlar için % 94-100 arasında bulunmuştur. Bu türlerde biyofilm oluşumu % 53 (n = 20) olarak belirlenmiştir. Biyofilm oluşumu Burkholderia türleri ve KF (%56, n:14/25) ve KF olmayan (%46, n:6/13) hastalardan izole edilen Burkholderia izolatları arasında ayrı ayrı incelendiğinde istatistiksel bir fark bulunamamıştır(p>0.05). İzolatların seftazidim, meropenem, TMP-SXT ve levofloksasine karşı direnç yüzdeleri sırasıyla % 34, % 66, % 50 ve % 40 olarak bulunmuştur. Burkholderia türlerine karşı antibiyotik direncinde, KF hastalarından elde edilen izolatlar seftazidime daha duyarlı bulunmuş, diğer antibiyotikler için anlamlı fark saptanmamıştır. İki izolatta meropenem ve TMP-SXT arasında sinerji gözlenmiştir. Onbeş izolatta antagonizma tespit edilmiş, bunun 12'si meropenem ile seftazidim, 3'ü seftazidim ile TMP-SXT arasında bulunmuştur. Bu bakteri grubunda görülen yüksek antibiyotik direncine birçok direnç mekanizması neden olmakla birlikte, bu çalışmada saptanan meropenem ve seftazidim arasındaki antagonizma beta-laktamazların ekspresyonuna bağlanabilir. Bu çalışma KF ve KF olmayan hastalarda izole edilen Burkholderia spp. sekans sonuçlarının farkını, biyofilm oluşumunun bu bakteri ile oluşan enfeksiyonlarda önemli olduğunu ve tedavinin in vitro antibiyotik duyarlılık test sonuçlarına göre değerlendirilmesi gerektiğini göstermiştir.

Abstract:
Burkholderia spp. emerged as important pathogens in the airways of immunocompromised humans, especially those with cystic fibrosis (CF). Failure of identification with conventional techniques, high intrinsic resistance to most antibiotics and biofilm formation can cause treatment of these infections very difficult. The aim of this study was to identify Burkholderia spp. strains isolated from CF and non-CF patients with with routine microbiological methods and multilocus sequence analysis (MLSA), to determine of the antibiotic resistance and synergies, and to evaluate biofilm formation of these isolates. A total of 38 Burkholderia spp. (25 CF, 13 non-CF) isolates identified and sequence types revealed by multilocus sequence analysis (MLSA). Sequence types of isolates were identified using the PubMLST database. Characteristics of biofilm formation of clinical isolates were evaluated by microplate method. Antibiotic susceptibilities of ceftazidime, meropenem, trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP-SXT) and levofloxacin were determined by broth microdilution method according to CLSI (2017) guidelines. Synergy tests are performed by checkerboard method. Clinical isolates identified as B. cenocepacia (n=16), B. contaminans (n=11), B. gladioli (n=4), B. dolosa (n=4), B. multivorans (n=2) and B. seminalis (n=1). Sequence types of these isolates were determined as ST-19, ST-72, ST-102, ST-180, ST-270, ST-482, ST-602, ST-629, ST-740, ST-839 and ST-1392.  Correct species-level identification of MALDI-TOF MS was %94-100 for all isolates when B. contaminans (%0) was excluded. Biofilm formation in these species was determined as 53% (n=20). There was no statistical difference in biofilm production among Burkholderia species and biofilm production rates between CF (56%, 14/25) and non-CF (46%, 6/13) Burkholderia isolates when examined separately. (Chi-square test, p > 0.05). Overall rates of resistance to ceftazidime, meropenem, TMP-SXT, and levofloxacin of the isolates was 35%, 66%, 50% and 40%, respectively. In antibiotic resistance against Burkholderia spp., isolates obtained from CF patients were more susceptible to ceftazidime, but no significant difference was found for other antibiotics. Synergy has shown between meropenem and TMP-SXT at two isolates. Antagonism has detected at 15 isolates, 12 of them were between meropenem and ceftazidime, three of them were between ceftazidime and TMP-SXT. A variety of molecular approaches have been developed for the identification of closely related species and MLSA was found to be the most reliable method for Burkholderia isolates. Numerous resistance mechanisms may lead to higher resistance in this bacteria, whereas the antagonism between meropenem and ceftazidime in this study might be attributed to the expression of beta-lactamases. This study identifies the distinctness of sequence types between Burkholderia spp. isolated from CF and non-CF patient, provides a better understanding about the importance of biofilm formation for the infections with these bacteria and emphasizes the management of therapy should be driven by the antibiotic test results.