Terapötik proteinler salgılamak üzere genetiği değiştirilmiş kök hücrelerin beyin tümörlerinin tedavisinde kullanılması
Brain tumor therapy by using genetically engineered stem cells secreting therapeutic proteins
Yazar: NİHAL KARAKAŞ
Danışman: PROF. DR. SELMA YILMAZER
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Beyin neoplazmları = Brain neoplasms ; Genetiği değiştirilmiş organizmalar = Genetically modified organisms ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Kök hücreler = Stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Pseudomonas = Pseudomonas

Özet:
Glioblastoma multiforme (GBM) yetişkinlerde en sık görülen,  agresif ve malign bir beyin tümörüdür. GBM tedavisindeki bugünkü uygulamalar cerrahi tedavi ve bunu takip eden radyoterapi ile kemoterapidir. Ancak tümörün yeniden oluşması, tedavinin sağlıklı beyin dokusu üzerindeki sitotoksik etkileri ve kan beyin bariyerinin yapısı nedeniyle bu tedavi yöntemleri yetersiz kalmaktadır. Beyin tümörlü fare modellerinde yapılan çalışmalar, kök hücrelerin primer tümör alanlarına ve mikro seviyedeki invaziv tümör odaklarına göç ettiğini göstermiştir. Böylece kök hücreler aracılığıyla terapötik proteinlerin tümör odaklarına gönderimi esasına dayanan bir GBM tedavi yaklaşımı gelişmiştir. GBM'i de içine alan kanser tedavilerinde öne çıkan terapötik proteinlerden biri hedefli toksinlerdir. Ancak, hedefli toksinlerle yapılan Faz-III klinik denemeleri, sistemik toksisite, molekülün kısa yarı ömrü ve yetersiz doku penetrasyonu nedeniyle başarısızlıkla sonuçlanmıştır. Dolayısıyla, sağlıklı dokuya hasar vermeden devamlı olarak hedefli toksinlerin salınımını sağlayacak ve yan etkilerden koruyup terapötik etkinliği artıracak bir GBM tedavi şekline ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada, mevcut terapötik ajanlara direnç gösteren GBM tümörlerini kök hücrelerden salınan hedefli toksinler ile tedavi etmek üzere, lentiviral vektörler kullanılarak Pseudomonas ekzotoksinini (PE) içeren ve epidermal büyüme faktörü yönelimli ENb-PE ile interlökin-13 yönelimli IL13-PE hedefli toksinleri geliştirildi. Bu hedefli toksinleri salmak üzere oluşturulan insan nöral kök hücrelerinin, toksin etkinliği sonucu GBM hücrelerinde protein sentezini inhibe ederek anlamlı derecede terapötik etki oluşturduğu gösterildi. Terapötik kök hücrelerin, GBM tümörlü farelerde rezeksiyon sonrası tümör nüksünü yavaşlatarak farelerde sağkalım süresini artırdığı biyolüminesan görüntüleme yöntemi ile gösterildi. Ayrıca kanser hücrelerinde apoptoz sinyallerini tetikleyen tümör nekroz faktörüne bağımlı apoptoz indükleyici ligand (TRAIL)'a dirençli GBM hücrelerinin, hedefli toksinler ile muamele edildiğinde TRAIL'a duyarlı hale geldiği gösterildi. Bu direncin kırılmasına, TRAIL'ın bağlandığı ölüm reseptörlerinden DR4/5'in ifade düzeylerindeki artışın ve apoptoz inhibe edici proteinlerin ifade düzeylerindeki azalışın öncülük ettiği belirlendi. TRAIL ve hedefli toksinlerin hem ekstrinsik hem de intrinsik apoptotik yolağın aktivasyonu ile GBM hücre ölümünü gerçekleştirdiği saptandı. Sonuç olarak, hedefli toksin üreten terapötik kök hücreler ile elde ettiğimiz bulgular, daha sonra GBM tedavisinde kullanılmak üzere klinik çalışmalara temel oluşturacak niteliktedir.

Abstract:
Glioblastoma multiform (GBM), is the most common, agressive and malignant form of brain tumors in adults. Current treatment implementations for GBM include surgical debulking with adjuvant chemotherapy and radiotherapy. Nevertheless, these treatment methods remain insufficient due to the recurrence of tumor, cytotoxicity on healthy brain tissue and blood-brain barrier characteristics. Stem cells have been shown as they have the ability to migrate primary tumor sites and microinvasive tumor deposits in mice bearing brain tumors. Therefore, a new GBM treatment approach has been developed including stem cells as delivery vehicles of therapeutic proteins migrating towards tumor foci. Among therapeutic proteins, targeted toxins are one of the most promising candidates for the treatment of many cancers including GBM. On the other hand, Phase-III clinical trials with targeted toxins were failed due to short half life, systemic toxicity and insufficient tissue penetration. There is therefore an urgent need to safely and continuously deliver targeted toxins to overcome side effects and maximize therapeutic efficacy. In this study, two cytotoxins involving Pseudomonas Exotoxin (PE) and targeting either epidermal growth factor receptor (ENb-PE) or interleukin-13 receptor alpha-2 (IL13-PE) were engineered using lentiviral vectors to treat recurrent GBMs which develop resistance to current therapeutics by stem cell delivery of targeted toxins. Our results showed that human neural stem cells (hNSCs) secreting targeted toxins have significant therapeutic effect on both GBM cell lines and patient derived GBM cells via inhibition of protein synthesis as a result of toxin action. Regression of GBM recurrence upon therapeutic stem cell delivery was monitored by bioluminescence imaging and thus, therapeutic stem cells increased long-term survival of mice. Moreover, when GBM cells treated with targeted toxins, they developed sensitivity to tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) via upregulation of death receptors DR4/5 and down regulation of anti-apoptotic proteins. Cell death in GBMs treated with a combination of targeted toxins and TRAIL were shown by the involvement of both extrinsic and intrinsic apoptosis pathways in a synergestic fashion. In conclusion, our findings serve a basis for the use of stem cells secreting targeted toxins to further adopt them into clinical applications of GBM treatment.