Manyetik kobalt ferrit nanoparçacıkların sentezi ve histidin etiketli rekombinant prepromelittinin saflaştırılması
Synthesis of magnetic cobalt ferrite nanoparticles and purification of histidine-tagged recombinant prepromelittin
Yazar: HACER KARABULUT
Danışman: DOÇ. DR. YAĞMUR ÜNVER ; PROF. DR. AHMET MAVİ
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında Komagataella phaffii tarafından rekombinant olarak üretilen ve potansiyel terapötik protein olan prepromelittinin (ppMEL) manyetik nanopartiküller (MNP) kullanılarak düşük maliyetli, hızlı ve etkili bir şekilde saflaştırılması amaçlandı.
Yöntem: Manyetik özelliğe sahip CoFe2O4 manyetik nanopartiküller (MNP) birlikte çöktürme yöntemi ile sentezlendi. MNP'lerin karakterizasyonu için TEM (Transmisyon elektron mikroskobu) ve XRD (X ışını kırınımı) kullanıldı. Diğer yandan, genomunda ppMEL geni taşıyan K. phaffii hücreleri ile histidin etiketli rekombinant prepromelittinin (rppMEL) ekstraselüler üretimi gerçekleştirildi. 72 saatlik inkübasyon boyunca üretim ortamına 24 saatte bir %0,5 metanol ilave edildi. Sentezlenen CoFe2O4 MNP'ler ile rppMEL'in saflaştırılması için optimizasyon çalışmaları yapıldı. Bu bağlamda, MNP konsantrasyonu, MNP'lere protein bağlama (inkübasyon) süresi, saflaştırma tamponuna eklenen EDTA ve imidazol konsantrasyonu çalışıldı. Saflaştırma sonucu elde edilen proteinler SDS-PAGE'de yürütülerek gümüş boyama ile görüntülendi.
Bulgular: Birlikte çöktürme metoduna göre sentezlenen CoFe2O4 MNP'lerin boyutlarının yaklaşık 20-25 nm arasında olduğu TEM ile belirlenirken kristal yapısı XRD ile belirlendi. Rekombinant K. phaffii hücrelerinin 72 saatlik inkübasyonu sonucu elde edilen kültür sıvısı saflaştırma çalışmalarında kullanıldı. MNP'lerle protein saflaştırma için yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda MNP konsantrasyonunun 10 mg/mL, protein bağlama (inkübasyon) süresinin 2 dakika olarak kullanılabileceği belirlendi. 
Sonuç: Bu tez çalışmasında CoFe2O4 MNP'leri başarılı bir şekilde sentezlendi. Kültür sıvısına salgılanan rppMEL'in, CoFe2O4 MNP'ler ile tek adımda ve kısa sürede kısmi olarak saflaştırılabildiği görüldü.

Anahtar Kelimeler: Rekombinant prepromelittin, histidin, manyetik nanopartikül, CoFe2O4, saflaştırma

Abstract:
Purpose: In this thesis, it was aimed to purify prepromelittin (ppMEL), a potential therapeutic protein produced recombinantly by Komagataella phaffii, in a low-cost, rapid and effective manner using magnetic nanoparticles (MNP).
Method: Magnetic CoFe2O4 magnetic nanoparticles (MNP) were synthesized by co-precipitation method. TEM (Transmission electron microscope) and XRD (X-ray diffraction) were used for the characterization of MNPs. On the other hand, extracellular production of histidine-labeled recombinant prepromelittin (rppMEL) was performed with K. phaffii cells carrying ppMEL gene in their genome. 0.5% methanol was added to the production medium every 24 hours during 72 hours of incubation. Optimization studies were performed for the purification of rppMEL with the synthesized CoFe2O4 MNPs. In this context, MNP concentration, protein binding (incubation) time to MNPs, EDTA and imidazole concentration added to the purification buffer were studied. The proteins obtained as a result of purification were run on SDS-PAGE and visualized with silver staining.
Findings: The dimensions of CoFe2O4 MNPs synthesized according to the co-precipitation method were determined to be approximately 20-25 nm by TEM, while the crystal structure was determined by XRD. The culture fluid obtained as a result of 72 hour incubation of recombinant K. phaffii cells was used in purification studies. As a result of optimization studies conducted for protein purification with MNPs, it was determined that the MNP concentration could be used as 10 mg/mL and the protein binding (incubation) time as 2 minutes.
Results: In this thesis study, CoFe2O4 MNP was synthesized successfully. It was seen that rppMEL secreted into the culture fluid could be purified in a single step and in a short time with CoFe2O4 MNP.

Keywords: Recombinant prepromelittin, histidine, magnetic nanoparticle, CoFe2O4, purification