Escherichia coli W3110'da porin proteinlerinin (OmpA, OmpC, OmpF. OmpG, OmpT, LamB ve PhoE) metal stresindeki rollerinin belirlenmesi
Determination of the role of porin proteins (OmpA, OmpC, OmpF. OmpG, OmpT, LamB and PhoE) under metal stress in Escherichia coli w3110
Yazar: GÜLÇİN ÇETİN KILIÇASLAN
Danışman: PROF. DR. CİHAN DARCAN
Bilecik Şeyh Edebali Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Moleküler genetik = Molecular genetic

Özet:
Metaller, canlılar için oldukça önemlidir. Genellikle metaller, temel biyolojik süreçler için önemli olan biyomoleküllerin yapısal veya katalitik bileşeni olarak görev almaktadır. Ancak çeşitli nedenlerden dolayı doğada biriken bakır, kadmiyum, kurşun, çinko, nikel, civa ve krom gibi ağır metaller, canlıları olumsuz etkileyen en önemli çevre sorunlarından biri haline gelmiştir. Hücredeki metallerin homeostazı, öncelikle hücre içine ve hücre dışına metal taşınmasının düzenlenmesi ile ilgilidir. Bu nedenle membran geçirgenliğinde rolü olan porin proteinlerinin metal direncinin gelişmesinde önemli rolü olacağı değerlendirilmektedir. Bu çalışmada, Escherichia coli W3110'nun dış membran kanal proteinlerinden OmpA, OmpC, OmpF, OmpG, OmpT, LamB, ve PhoE porin proteinlerinin kobalt, bakır, çinko, kadmiyum ve nikel metallerine karşı rolleri belirlendi. Bununla birlikte, metal homeostazında yer alan CueR, RcnR, NikR, Zur, CpxAR ve CusSR proteinlerinin porin genleri üzerindeki rolleri araştırıldı. Çalışmada kullanılmak üzere E. coli W3110 mutantları ve komplement hücreleri elde edildi. Porin proteinlerinin kobalt, bakır, çinko, kadmiyum ve nikel metallerine karşı rolleri, yabani tip E. coli W3110 ve porin mutantlarının çoğalma ve yaşam deneyleri yapılarak belirlendi. Porin genlerinin ifadelerinin çalışılan metallerin varlığında değişimi ve bu değişimde CueR, RcnR, NikR, Zur, CpxAR ve CusSR proteinlerinin rolü gerçek zamanlı PZR ile belirlendi. Son olarak, zayıflatılmış toplam yansıtma (ATR)–Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi kullanılarak, metale maruz kalan yabani E. coli W3110 ile farklı porin mutantlarında meydana gelen moleküler profiller karşılaştırıldı. Çalışmalar sonunda elde edilen verilerin istatiksel analizleri GraphPAD Prism 8.3.0 programında 2way ANOVA testine göre yapıldı ve P≤ 0.05 sistemine göre önem dereceleri belirlendi. Çalışma sonucunda, genel olarak OmpA ve OmpC proteinlerinin yokluğu hücreyi duyarlı hale getirirken, OmpF ve LamB'nin yokluğu metale karşı direnci arttırdığı belirlendi. Bütün metal streslerinde, yabani tip E. coli W3110'da ompA, ompC, ompF genlerinin sentezinin azaldığı, ompG ve phoE genlerinin sentezinin ise önemli derecede arttığı belirlendi. ompT geninin sentezi kadmiyum metalinde önemli derecede baskılandığı, lamB'nin ise Cu ve Zn varlığında sentezinin arttığı ancak Cd ve Co varlığında ise azaldığı belirlendi. Bu sonuçlar, porin proteinlerinin metal direnci geliştirmede önemli rolü olduğunu göstermektedir. Cd stresinde önemli rolü olduğu belirlenen ompF ve lamB genlerinin baskılanmasında NikR'nin, ompT
iv
geninin baskılanmasından ve phoE geninin artışından NikR ve CueR'nin; ve ompG'nin artışından ise NikR ve Zur'un rolllerinin olduğu belirlendi. Co stresinde, ompC ve ompF'nin baskılanmasından NikR'nin, phoE ve ompG'nin artışından ise RcnR ve NikR'nin rolü olduğu görüldü. Cu stresinde, ompA'nın baskılanmasının CpxA ve CusSR'nin; ompC'nin baskılanmasının CueR ve CusS'nin; ompF ve ompT sentezlerinin baskılanmasının CusS'nin; ompG'nin artışının NikR ve CusR'nin ve phoE'nin ise artışının NikR, Zur, CpxR ve CusSR sisteminin kontrolünde olduğu tespit edildi. Ni stresinde, anlamlı olarak belirlenen ompA'nın baskılanmasında, ompG ve phoE'nin artışından CueR, RcnR, NikR ve Zur proteinlerinin rolü olmadığı farklı bir düzenleyicinin kontrolünde olduğu belirlendi. Son olarak, Zn stresinde ise ompA ve ompC'nin NikR ve Zur'un, ompT'nin ise NikR tarafından kontrol edildiği tespit edildi. Bu çalışma, metallerin detoksifikasyon etkinliğini karakterize etmeye yardımcı olabilir ve biyoremediasyonda kullanılacak aktif canlı hücrelerin elde edilmesi için rehberlik edebilir.

Abstract:
Metals are very important for microorganisms. Generally, metals act as the structural or catalytic component of biomolecules important for basic biological processes. However, heavy metals such as copper, cadmium, lead, zinc, nickel, mercury and chromium, which accumulate in nature for various reasons, have become one of the most important environmental problems that negatively affect microorganisms. Homeostasis of metals in the cell is primarily concerned with the regulation of metal transport into and out of the cell. Therefore, porin proteins, which have a role in membrane permeability, have an important role in the development of metal resistance. In this study, the roles of outer membrane channel proteins OmpA, OmpC, OmpF, OmpG, OmpT, LamB, and PhoE porin proteins of E. coli W3110 against cobalt, copper, zinc, cadmium and nickel metals were determined. In addition, the roles of CueR, RcnR, NikR, Zur, CpxAR and CusSR proteins on porin genes, which are involved in metal homeostasis, were investigated. E. coli W3110 mutants and complement cells were obtained for use in the study. The roles of porin proteins against cobalt, copper, zinc, cadmium and nickel metals were determined by growth and survival experiments of wild type E. coli W3110 and porin mutants. The change in the expression levels of porin genes in the presence of the studied metals and the role of CueR, RcnR, NikR, Zur, CpxAR and CusSR proteins in this change were determined by real-time PCR. Finally, using attenuated total reflectance (ATR)–Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, the molecular profiles occurring in wild E. coli W3110 exposed to metal and different porin mutants were compared. Statistical analyzes of the data obtained at the end of the studies were performed in the GraphPAD Prism 8.3.0 program according to the 2way ANOVA test and their significance levels were determined according to the P≤ 0.05 system. As a result of the study, it was determined that the absence of OmpA and OmpC proteins in general sensitized the cell, while the absence of OmpF and LamB increased resistance to metal. It was determined that the synthesis of ompA, ompC, ompF genes decreased, while the synthesis of ompG and phoE genes increased significantly in wild type E. coli W3110 at all metal stresses. It was determined that the synthesis of the ompT gene was significantly suppressed in cadmium metal, and the synthesis of lamB increased in the presence of Cu and Zn, but decreased in the presence of Cd and Co. These results show that porin proteins have an
vi
important role in developing metal resistance. In the suppression of ompF and lamB genes, which were determined to have an important role in Cd stress, NikR and CueR from suppression of ompT gene and increase of phoE gene; and from the increase of ompG, it was determined that NikR and Zur had roles. It was observed that NikR from the suppression of ompC and ompF, and RcnR and NikR from the increase of phoE and ompG in Co stress. In Cu stress, the suppression of ompA resulted in CpxA and CusSR; suppression of ompC CueR and CusS; CusS inhibition of ompF and ompT syntheses; It was determined that the increase of ompG was under the control of NikR and CusR and the increase of phoE was under the control of NikR, Zur, CpxR and CusSR systems. It was determined that CueR, RcnR, NikR and Zur proteins did not have a role in the suppression of ompA, which was determined significantly in Ni stress, from the increase of ompG and phoE, but under the control of a different regulator. Finally, under Zn stress, ompA and ompC were found to be controlled by NikR and Zur, and ompT by NikR. This study can help characterize metals detoxification efficiency and guide for obtaining active living cells to be used in bioremediation.