Farklı immünsüpresif ajanlar ile kültüre edilmiş mezenkimal kök hücre uygulamasının diskordan deri xenogreft rejeksiyonu üzerine olan etkileri
Effect of application of mesenchymal stem cells cultured with different immunosuppressive agents on rejection of discordant skin xenogreft
Yazar: SİNAN ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. SELÇUK IŞIK
GATA / Tıp Fakültesi / Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Cerrahi-plastik = Surgery-plastic ; Deri = Skin ; Deri nakli = Skin transplantation ; Kök hücreler = Stem cells ; Transplantlar = Transplants ; İmmünosupresif ajanlar = Immunosuppressive agents ; İn vitro = In vitro ; İn vivo = In vivo

Özet:
Deri immünojenitesi en fazla olan organdır. Bu organın xenogreft ola-rak transplante edildiği durumlarda hızlı bir immün rejeksiyon gözlenir. Xenojenik deri greftleri CD8+ T hücrelerinin rol aldığı hücresel immunite ile rejekte edilir. Bu çalışma ile farklı immün baskılayıcı ajanlar ile 72 saat kültüre edilmiş Mezenkimal Kök hücre(MKH) uygulamasının, T hücre aracılı hücresel tip deri xenogreft rejeksiyonu üzerine olan etkileri araştırılmıştır.İmmünsüpresif ajanlar, siklosporin A, takrolimus, everolimus ve miko-fenolat ile ayrı ayrı kültüre edilerek MKH'ler modifiye edildi. Modifiye Mezen-kimal kök hücreler(mMKH) ile fitohemaglutinin ile uyarılmış T hücreleri farklı hücre oranları ile kültüre edildi. CD8+ hücrelerde CD25 aktivasyonu akım sitometri ile değerlendirildi. Proinflamatuar sitokin (IL-2, IL-6 ve IFN gama) ve antiinflamatuar sitokin(IL-10,TGF b1) yanıtları Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) ile değerlendirildi. Farklı immünsüpresiflere MKH proliferasyon cevabı 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, tetrazole(MTT) testi kullanılarak ölçüldü. Rat dorsal cilt defektlerine 2x2 cm boyutlarında kısmi kalınlıkta insan deri xenogrefti uygulandı. Sağ kalım süreleri günlük muayene ile incelendi. Takip sırasında %90 ve üzeri nekroz izlenen durumlarda deri xenogrefti rejekte olarak kabul edildi.Mikofenolat ile modifiye edilmiş kök hücreler CD8 aktivasyonunu nor-mal kök hücrelere benzer oranda baskılarken, siklosporin, takrolimus ve eve-rolimus ile modifiye gruplarda bu baskılayıcı etki azalmış bulundu(p<0.05). Proinflamatuar sitokin yanıtı, siklosporin, takrolimus ve everolimus ile modifi-ye gruplarda, normal MKH ve mikofenolat modifiye gruplara göre daha yük-sekti(p<0.05). MKH proliferasyonu. 72. Saat sonunda çalışmada kullanılan tüm immünsüpresif ajanlar ile baskılanmış olarak bulundu(p<0.05). Deri xenogreft sağ kalımı kontrol grubunda ortalama 7,3 gün olarak bulundu. MKH grubunda ortalama 11,7 gün ile daha uzun olarak bulundu(p<0.05). Ortalama sağ kalım süreleri mMKH ve MKH grupları açısından farklılık göstermedi(p>0.05). MKH'lerin CD8 aktivasyonunu inhibe edici ve proinflamatuar sitokinleri baskılayıcı özelliklerinin; Siklosporin, Takrolimus, Everolimus ile yapılan modifikasyonda olumsuz olarak etkilendiği, Mikofenolat ile yapılan modifikasyonda değişmediği gösterilmiştir. mMKH ile xenogreft sağ kalım analizinde, mMKH'lerin temel olarak CD8+ hücreler aracılı immün rejeksiyon üzerine etkileri, MKH'ler ile kıyaslandığında in-vitro olarak farklılık gösterse de in-vivo olarak benzemektedir.Mezenkimal kök hücreler ile immünsüpresif ilaçların in-vitro ve in-vivo etkileşimlerinin daha detaylı ortaya konması ile başarılı xenotransplantasyonlarının ilk adımı atılabilir

Abstract:
Skin is the most immunogenic organ of the body. Especially in xeno-geneic transplantation it is rejected quickly. Xenogeneic skin graft rejection is primarily dependent on CD8+ T cells.in this study, we investigated the effect of Mesenchymal Stem Cells(MSCs) modified with different immunosuppressant agents on CD8+ T cell dependent cellular rejection of skin xenografts.We cocultured the rat MSCs with cyclosporine A, tacrolimus, everoli-mus and mycophenolate mofetil for 72 hours to get modified MSCs(mMSCs). mMSCs cocultured with rat T cells activated with phyto-hemagglutinin (PHA) in different cell ratios. The expressions of CD25 on CD8+ T cells were evaluated with flow cytometer. Proinflamatory cytokines (IL-2, IL-6, IFN gamma) and anti-inflammatory cytokines levels evaluated with Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).The proliferation response of MSCs to immunsuppressants was evaluated with 3- (4,5- Dimethylthiazol - 2-yl) - 2,5-diphenyltetrazolium bromide, tetrazole(MTT) test. Full thickness skin defects at 2x2cm dimensions were created on rat dorsum and defects were grafted with human skin graft. During the follow up the skin grafts with %90 or above necrosis were accepted as rejected.We found decreased inhibitor effect of MSCs' on CD8+ T cell activa-tion in the groups of cyclosporine A,tacrolimus and everolimus modified MSCs compared with naive MSCs and the mycophenolate modified MSCs(p<0.05).Proinflammatory cytokines, IL-2,IL-6 and IFN gamma, levels were high in the groups of cyclosporine A,tacrolimus and everolimus modified MSCs compared with naive MSCs and the mycophenolate modified MSCs(p<0.05).MSCs proliferation was suppressed by all immunosuppressive agents in 72 hours(p<0.05).The mean skin xenograft survival was 7.3 days in the control group. In the naive MSCs group the mean skin xenograft survival was longer than the control group with 11.7 days (p<0.05). The mean skin xenograft survival was similar in the the naive MSCs group and the modified groups (p>0.05).In conclusion, MSC modified with Cs A, tacrolimus, everolimus was found to have decreased immunosuppressive effects on CD8+ T cells and increased proinflammatory cytokines with contrast to modified with MMF. Better understanding of interaction between MSC and different immunsupp-ressive drugs is thought to allow more successful skin xenotransplantation?