Titanyum implantlarına antibiyotik yüklenmesi ve biyoaktivitelerinin değerlendirilmesi
Antibiotic loading on titanium implants and evaluation of their bioactivities
Yazar: HALE MELİS SOYLU GÜRER
Danışman: PROF. DR. FATMA YURT ONARAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomedikal Teknolojiler Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Ortopedik implantlar = Orthopedic implants

Özet:
Bazı omurga hastalıklarının tedavisi için cerrahi müdahale gerekir. Omurga implantları kullanılarak omurganın stabilitesi, iki omurun füzyonu ile sağlanabilir. Böylece omurilik güçlendirilir ve deformasyonlar düzeltilir. Titanyum ve alaşımları, uygun biyouyumluluk özellikleri, hafif ve dayanıklı olmaları ve osseointegrasyonu destekleyici kapasiteleri nedeniyle omurga implantları için en sık kullanılan malzemelerdir. Bununla birlikte, omurga implantlarının başarılı bir performansa sahip olması, implant bölgesinin çevresinde enfeksiyon bulunmamasına da bağlıdır. Bu durumun önlenmesi için, gentamisin sülfat, hem gram pozitif hem de gram negatif bakterilerdeki etkinliği sayesinde lokal tedavi için yaygın olarak kullanılan bir antibiyotiktir. Bu çalışmada, hücre büyümesini ve çoğalmasını arttırdığı bilinen biyouyumlu bir doğal polisakarit olan agaroz (Agr)  ve agaroz ile çapraz bağ oluşturabilen doğal bir katekol olan tannik asit (TA) içeren bir hidrojel hazırlanarak titanyum disklerin üzerine kaplanmıştır. Agr'nin gentamisin sülfat (GS) ile yüklenmesiyle, Ti6Al4V yüzeylerinde antibakteriyel aktivite sağlanırken aynı zamanda osseointegrasyon hızını arttırıcı etki oluşturması hedeflenmiştir.
14 mm çapındaki kumlamalı Ti6Al4V diskler, temizlendikten sonra 2,5 M sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi ile yüzeylerinde hidroksil grupları oluşturulmuştur. Daha sonra, pH 8,7'de 10 mM Tris tamponu (2 mg/mL) içinde çözülmüş dopamin (DOPA) çözeltisinde 24 saat bekletilerek yüzeylere DOPA aşılaması yapılmıştır. GS yüklemesi için % 1 Agr'den oluşan sulu çözeltisine, saf suda çözülmüş % 0,1 TA, % 0,1 kalsiyum klorür (CaCl2) ve 1 mg/mL GS ilave edilmiştir. Bu karışım daha sonra Ti6Al4V-DOPA yüzeyi üzerine kaplanmış ve 2 saat boyunca UV ışık altında bekletilmiştir. Yüzey modifikasyonlarının etkinliği XPS analizleri, su temas açısı ölçümleri, profilometre analizleri ve hidrojel karakterizasyonu ise FTIR analizleri ile değerlendirilmiştir.
Yüzeyin atomik konsantrasyonunu belirlemek için yapılan X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS) analizleri, DOPA'nın yüzeye başarılı bir şekilde aşılandığını ve Agr'nin yüzeye kaplanmasının da başarılı olduğunu açıkça göstermektedir. Nitekim, Ti6Al4V disklere kıyasla karbon yüzdesi önemli ölçüde yükselmiştir. Aynı zamanda kaplanmış olan disklerde Ti elementine rastlanmamıştır. Ayrıca, GS yüklü Agr'nin Ti6Al4V-DOPA yüzeyine kaplanması, DOPA'dan kaynaklanan azot elementinin XPS analizi sonucunda yüzeyde görülmemesi ile kanıtlanmaktadır. Su temas açısı değerleri ve profilometre analizleri ile Ti6Al4V-DOPA ve Ti6Al4V-Agr'nin homojen olarak aşılanmış olduğunu ve FTIR analizleri ile GS'nin Ti6Al4V yüzeylerinde kaplanan Agr hidrojeline etkin bir şekilde yüklendiği kanıtlanmıştır.
GS salımı fizyolojik koşullar altında 28 gün bekletilerek salınan miktar ELISA testi ile belirlenmiştir. 6. saatte ani salım ile gentamisinin büyük bir miktarı salınmıştır. Fakat TA içeren kaplamalarda 21. güne kadar S. aureus bakterileri üzerinde gentamisinin minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) değerinden daha yüksek miktarda salım devam etmiştir. Antibakteriyel testlerde kaplamaların antibakteriyel etkinliği 7. güne kadar test edilmiş ve GS yüklü kaplamaların S. aureus bakterileri üzerinde antibakteriyel etkisi kanıtlanmıştır. Hücre kültürü çalışmalarında farklı içeriklerde Agr ile kaplanmış disklerin biyoaktiviteleri değerlendirilmiştir. Saos-2 hücre hattı üzerinde yapılan indirekt testler sonucunda disklerin hücre canlılığını arttırıcı etki gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca aynı hücreler üzerinde direkt test yapılmış ve en yüksek miktarda canlı hücre sayısı, içeriğinde GS, TA, CaCl2 bulunan Agr kaplamalı disk yüzeyinde tespit edilmiştir.

Abstract:
Surgical intervention is needed for the treatment of some spinal diseases. Using spinal implants, the fusion of two vertebrae can be facilitated, the stability of the spine is by this way ensured, thus the spinal cord strengthened and deformities corrected. Titanium and its alloys are the most widely used materials for spinal implants, due to their suitable properties of biocompatibility, strength-to-weight ratio, and their capacity to prone osseointegration. However, the successful performances of spinal implants also depend on the absence of infections near the implant site. To treat them, gentamicin sulphate (GS), is commonly used for local treatment thanks to its efficiency on both gram positive and gram negative bacteria. For that purpose, Ti6Al4V implant will be coated with a hydrogel based on agarose (Agr), a biocompatible natural polysaccharide, known to improve cell growth and tannic acid (TA), a natural catechol, able to induce crosslink. By loading this hydrogel with gentamicin, the Ti6Al4V surfaces are expected to promote osseointegration whilst presenting antibacterial activity.
Sand blasted Ti6Al4V discs, 14 mm diameter, were cleaned before surface activation with 2.5 M NaOH solution. Then, they were let react overnight with dopamine solution (DOPA), dissolved in 10 mM Tris buffer (2 mg/mL) at pH 8.7. Thereafter, gentamicin loading was done as follow: 1 % Agr in water was added to an aqueous solution made of 0.1 % TA, 0.1 % CaCl2 and 1 mg/mL GS. This mixture was then coated on the Ti6Al4V-DOPA surface and let react under UV irradiation for 2h. The efficiency of surface modifications was assessed by X-ray photoelectron spectroscopy XPS analyses, contact angle (CA) measurements, profilometry analyses, and hydrogel characterization was done by FTIR. 
XPS analyses, allowing to determine the surface atomic concentration clearly exhibit the successful surface grafting of DOPA and Agr. Indeed, carbon percentage is significantly higher when compared to clean Ti6Al4V sample, whereas Ti is no more detected on coated ones. Further, the grafting of GS loaded Agr on Ti6Al4V-DOPA surface is evidenced by the lack of nitrogen from DOPA. Contact angle values also demonstrate the coating presence on surfaces. Profilometry analyses have shown that Ti6Al4V-DOPA and Ti6Al4V-Agr were homogeneously grafted and FTIR analyses have evidenced that GS was efficiency entrapped in the Agr hydrogel coated on Ti6Al4V surfaces. 
GS release was performed under pseudo-physiological conditions for 28 days and the amount quantified by using ELISA tests. At 6th h, a large amount of gentamicin was released by burst release. But the amount of GS that more than the MIC value of GS on S. aureus bacteria continued to release from TA-containing coatings until day 21. The antibacterial activity of the coatings in antibacterial tests was tested up to day 7 and the GS loaded coatings proved an antibacterial effect on S. aureus bacteria. Bioactivities of discs with Agr coated in different contents were evaluated in cell culture studies. As a result of indirect tests that were performed on Saos-2 cell line, it was determined that the discs showed proliferation effect on cells. In addition, direct testing was performed on the same cell line and the highest number of viable cells was detected on the surface of Agr coated discs containing GS, TA, CaCl2.