Sığırlarda paratüberküloz hastalığının serolojik teşhisinde laboratuvar yapımı Elisa kitinin değerlendirilmesi
Evaluation of a homemade ELISA kit for serological diagnosis of cattle paratuberculosis
Yazar: TUBA ASLAN
Danışman: PROF. DR. HAKAN KALENDER
Fırat Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Paratüberküloz, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis'in sebep olduğu, kronik gastroenteritis, ishal, zayıflama ve süt veriminde azalma ile seyreden ve bazen ölümle sonuçlanabilen bakteriyel bir enfeksiyondur. Hastalık sığırlarda uzun süre klinik belirti göstermeden subklinik olarak seyredebilir. Subklinik enfekte hayvanlar dışkı, süt ve kolostrumlarıyla etkeni saçarak hastalığın sağlam hayvanlara bulaşmasına neden olurlar. Paratüberküloz tüm dünyada görülen ve süt sığırı işletmelerinde önemli ekonomik kayıplara yol açan zoonotik karakterde bir hastalıktır.
Bu araştırmanın amacı, laboratuvar yapımı Enzyme-Linked Immonosorbent Assay (ELISA) kiti ile Elazığ ilinde 2 yaşın üzerindeki sütçü sığırlarda paratüberkülozun yaygınlığını  araştırmaktır. Bu amaçla görünürde sağlıklı 150 sütçü sığırdan kan serumu örnekleri toplandı. Mycobactin J ve ANV (amphotericin, nalidixic acid ve vancomycin) içeren Herrold's Egg Yolk Agar besiyerinde üretilen Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis suşundan (DSMZ 44133) antijen hazırlandı. Optimizasyon çalışmaları sonunda;  antijenin 0.125 µg/kuyucuk şeklinde hazırlanan dilüsyonunun, serumun 1/60 ve konjugatın 1/20000 dilüsyonunun ELISA testinde kullanılabileceği belirlendi. ELISA testinde her serum çift olarak test edildi. Serum örneklerinin optik dansitelerinin aritmatik ortalamaları alınarak herbir serumun S/P oranı hesaplandı. İncelenen toplam 150 serumun 15'i (%10) pozitif, 4'ü (%2.66) düşük pozitif,  3'ü (%2) şüpheli ve 128'i (% 85. 33) negatif olarak saptandı. Bir ticari ELISA kiti ile karşılaştırma sonucunda, hazırlanan kitin sensitivitesi % 95 ve spesifitesi % 96 olarak hesaplandı. Hayvanların yaşına göre pozitiflik oranları arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli (p˂0.05) bulunmasına karşın, hayvan ırkına göre pozitiflik oranları arasındaki farklılık önemli bulunmadı (p>0.05).  
Bu çalışmanın sonuçları, Elazığ ilinde paratüberkülozun önemli bir sorun olduğunu ve koruma ve kontrol programlarının titizlikle uygulanması gerektiğini göstermektedir.  

Anahtar Kelimeler: Paratüberküloz, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Sığır, ELISA, Teşhis

Abstract:
Paratuberculosis is a bacterial infection caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. It is characterized by chronic gastroenteritis, diarrhea, weight loss, reduced milk production and occasionally death.  A long subclinical stage can be occurred in infected cattle. Subclinically infected animals transmit the infection to  healthy animals by shedding the agent in their faeces, milk and colostrum. Paratuberculosis is a zoonotic disease which is seen all over the world and causes significant economic losses in dairy cattle farms.
The aim of this study is to investigate the prevalence of paratuberculosis in dairy cattle over 2 years of age in the Elazig province by using a homemade Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit. For this purpose, blood serum samples were collected from 150 dairy cattle without showing any clinical signs. Antigen was prepared from Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis strain (DSMZ 44133) grown on Herrold's Egg Yolk Agar medium with Mycobactin J and ANV (amphotericin, nalidixic acid and vancomycin). After optimization, the dilution of 0.125 µg/well of the antigen, 1/60 of the serum and 1/20000 of the conjugate were determined to be used in the ELISA. Each of serum samples was tested in dublicate. The arithmetic averege optical density (OD) value of each serum sample was transformed to sample-to-positive (S/P) ratio. Of the total 150 serum samples, 15 (10%) were positive, 4 (2.66%) were low positive, 3 (2%) were suspicious and 128 (85. 33%) were negative. In comparison with a commercial ELISA kit, the sensitivity and specificity of optimized ELISA kit were 95% and 96%, respectively. Although the difference between the positivity rates according to the age of the animals was statistically significant (p˂0.05), the difference between the positivity rates according to animal breed was not significant (p> 0.05).
The results of this study indicate that paratuberculosis is  an important problem in Elazığ province and that protection and control programs should be applied carefully.

Keywords: Paratuberculosis, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Cattle, ELISA, Diagnosis