Petrolden elde edilen bakteri kültürlerinin petrol taşımacılığında kullanılan çeliklerin mikrobiyolojik korozyonuna etkisi
The effect of bacterial cultures obtained from petroleum on the microbiological corrosion of steels used in oil transportation
Yazar: TUĞÇE TÜCCAR
Danışman: PROF. DR. ESRA SUNGUR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Anaerobik bakteriler = Anaerobic bacteria ; Mikrobiyolojik korozyon = Microbiological corrosion ; Petrol = Petroleum ; Sülfat = Sulfate

Özet:
Mikroorganizmaların metabolik aktiviteleri sonucu meydana gelen mikrobiyolojik korozyon, petrol üretim, depolama ve taşıma sistemlerinde hasarlara yol açarak, ürün kayıpları ve giderlerin artması gibi ciddi sorunlara neden olmaktadır. Bu nedenle petrol endüstrisinde korozyona neden olan mikroorganizmaların tespit edilmesi ve aktivitelerinin izlenmesi önem arz etmektedir. Sülfat indirgeyen bakteriler (SRB'ler), petrol endüstrisindeki mikrobiyolojik korozyondan sorumlu olan başlıca mikroorganizma grubudur. Petrol borusunun iç yüzeyinde meydana gelen biyofilm tabakası içinde yer alan anaerobik SRB'ler, boru hattı çeliğini korozyona uğratmaktadır. 

SRB'ler hem biyofilmlerde hem de diğer doğal ortamlarda çeşitli mikrobiyal gruplarla birlikte bulunmaktadır. Petrolden izole edilen SRB'lerin özellikle halofilik anaerobik bakteriler (AB'ler) ile bir arada bulunduğu bildirilmiştir. Bu noktada, SRB'lerin bu halofilik AB'ler ile sintrofik ilişkiler kurabileceği ve bu ilişkinin SRB'nin varlığını ve aktivitesini olumlu veya olumsuz etkileme potansiyeline sahip olabileceği ve dolayısıyla SRB'nin mikrobiyolojik korozyon üzerine etkisini değiştirebileceği esas olarak göz ardı edilmektedir. Nitekim, literatürde petrol endüstrisinde kullanılan çeliğin mikrobiyolojik korozyon sürecinin değerlendirilmesinde, petrol ortamından izole edilen SRB'ler ile sıkı ilişki kuran AB grupları arasındaki etkileşimin etkisini inceleyen herhangi bir çalışmaya rastlanılmamıştır.

Bu tez çalışmasında, SRB ve bu SRB türleri ile sıkı sintrofik birliktelik içerisinde olan AB'leri içeren  karışık halofilik/halotolerant bakteri kültürünün elde edilmesi ve elde edilen bu kültürün,  petrol taşımacılığında kullanılan API 5L X65 çeliğin korozyonuna olan etkisinin incelenmesi hedeflenmiştir. Tez çalışması kapsamında, Adıyaman Petrol Bölgesi'nde bulunan Çaylarbaşı 1 petrol kuyusundan üretim suyu numunesi alındıktan sonra mikrobiyolojik, moleküler ve mikrobiyolojik korozyon analizlerini içeren sistematik bir araştırma yapılmıştır.

Mikrobiyolojik analizler kapsamında, ilk olarak, üretim suyu örneğinden SRB içeren karışık halofilik/halotolerant bakteri kültürleri (ana kültürler) elde edilmiştir. Sonrasında, pasajlama işlemleri ile SRB içeren karışık bakteri alt kültürleri ve akabinde seri dilüsyon yapılarak kültür dilüsyonları elde edilmiştir. Kültür dilüsyonları arasından aday kültür seçilerek bu aday kültüre seri dilüsyon yapılmış ve böylece aday kültürün kültür dilüsyonları elde edilmiştir. Moleküler  analizler kapsamında ise, seçilen alt kültürlerin ve kültür dilüsyonlarının içerdikleri bakteri komünite profili, iki aşamalı nested Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)-Denatüran Gradyan Jel Elektroforezi (DGGE) yöntemi ile belirlenmiştir. 

Moleküler analizi yapılmış bakteri kültürleri içerdikleri komünite komposizyonları açısından karşılaştırılmıştır. Alt kültürleme ve seyreltme işlemlerinin sonuçlarına göre, bakteri topluluğu üyeleri arasındaki sintrofik ilişkinin ortaya konabilmesi için, kültürlerin topluluk dinamiklerinde bir dengenin sağlanması gerektiği belirlenmiştir. Bu denge de esas olarak alt kültürleme sonrası yapılan ilk dilüsyon işlemleri ile sağlanmıştır. Öte yandan, bakteriler arasındaki sintrofik ilişkiyi doğrulamak için ikinci bir seyreltmenin gerekli bir işlem olduğu bulunmuştur. Böylece, alt kültürleme  ve akabinde seri dilüsyon yaklaşımı ile, SRB (Oleidesulfovibrio  alaskensis) ve bu SRB türü ile sıkı sintrofik birliktelik gösteren heterotrofik AB'leri (Geotoga sp. ve Sphaerochaeta halotolerans) içerdiği belirlenen karışık bakteri kültürü elde edilmiştir. 

Mikrobiyolojik korozyon analizleri, laboratuvar ölçekli deney düzeneği ve laboratuvar ölçekli kontrol düzeneği olmak üzere iki farklı düzenekte gerçekleştirilmiştir. Deney düzeneğinde API 5L X65 çelik kuponlar, SRB (O. alaskensis) ve bu SRB türü ile sıkı birliktelik içinde olan heterotrofik AB'leri (Geotoga sp. ve S. halotolerans) içeren karışık bakteri kültürüne maruz bırakılmıştır. API 5L X65 çelik kuponlar ve bakteri içermeyen steril besiyeri ile kurulan kontrol düzeneği ise, deney düzeneği ile eş zamanlı olarak çalıştırılmıştır. 50 gün süresince işletilen düzeneklerden 1, 4, 7, 10, 15, 23, 34, 43 ve 50. günlerde örnekleme yapılmıştır. Deney düzeneğinden çıkarılan kuponların yüzeyinde oluşan biyofilm tabakasından SRB ve heterotrofik AB sayımı yapılmış ve hücre dışı polimerik maddeler (EPS) elde edilerek karbonhidrat analizi gerçekleştirilmiştir. Kuponların korozyon hızları ağırlık kaybı ölçümü ile tespit edilmiştir. Ayrıca planktonik SRB ve heterotrofik AB sayımı ve kimyasal ölçümler için kültür örneği de alınmıştır. Kontrol düzeneği için, kuponların ağırlık kaybı ve ortamın kimyasal parametreleri deney düzeneği ile eş zamanlı olarak belirlenmiştir.

Deney düzeneğindeki kuponların yüzeyinde oluşan biyofilmde SRB'ler 1. günden itibaren yer alırken, heterotrofik AB'ler ancak 4. günden sonra tespit edilmiştir. Heterotrofik AB'nin biyofilm tabakasına SRB'den sonra yerleşmiş olması, heterotrofik AB'lerin metabolik aktivite açısından SRB'nin varlığına ve dolayısıyla da ürettiği metabolitlere bağlı olduğunun bir göstergesidir. Ayrıca O. alaskensis'in kesikli kültür ortamında 15 gün süresince hem biyofilm hem de kültür ortamında logaritmik fazda büyümesi, bu SRB türünün büyümesinin de ortamdaki Geotoga sp. ve S. halotolerans tarafından desteklendiğini gösterebilir. Bu durum, O. alaskensis SRB türü ile Geotoga sp. ve S. halotolerans bakterileri arasında sintrofik bir ilişkinin varlığına işaret etmektedir.

Korozyon analizi sonuçlarına göre, deney ve kontrol kuponlarının ağırlık kayıplarının zamanla arttığı (p<0.01) tespit edilmiştir. Bununla birlikte, deney kuponlarının ağırlık kayıplarının ve bu verilerden hesaplanan korozyon hızlarının kontrol kuponlarınınkinden anlamlı derecede yüksek olduğu saptanmıştır (p<0.01). Bu çalışmada tespit edilen O. alaskensis içeren karışık bakteri konsorsiyumunun ağırlık kaybı sonuçları, literatürde bildirilen saf O. alaskensis suşunun ağırlık kaybı ölçümleri ile karşılaştırıldığında, karışık bakteri konsorsiyumunda yer alan fermentatif bakterilerin (S. halotolerans ve Geotoga sp) saf O.alaskensis suşunun X65 çeliği üzerine korozif etkisini 120-140 kat arttırdığı görülmektedir. Bu durum, SRB'lerin diğer bakteriler ile sintrofik birliktelik içerisinde iken, daha agresif bir korozyon davranışı gösterdiğine işaret etmektedir. Ayrıca, biyofilmde sadece SRB'nin tespit edildiği 4. günde deney kuponunun korozyon hızının kontrol kuponunun korozyon hızından 2 kat daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu sonuç da, test kuponlarındaki korozyonu O. alaskensis'in başlattığına işaret etmektedir. 

Sonuç olarak, bu tez çalışmasında ilk kez, O. alaskensis SRB türü ile Geotoga sp. ve S. halotolerans bakterileri arasında kurulan sintrofik bir ilişkinin varlığı saptanmıştır. Ek olarak, O. alaskensis türü SRB ve fermantasyon yapan AB'leri (Geotoga cinsi ile S. halotolerans türü)  içeren halofilik/halotolerant karışık bakteri kültürünün X65 çeliğini korozyona uğrattığı ilk kez rapor edilmiştir.

Abstract:
Microbiological corrosion, which occurs as a result of the metabolic activities of microorganisms, causes damage in oil production, storage and transportation systems, causing serious problems such as product losses and increased costs. For this reason, in the petroleum industry it is important to detect corrosion associated microorganisms and monitor their activities. Sulphate-reducing bacteria (SRB) are the major group of microorganisms responsible for the microbiological corrosion in the petroleum industry. Anaerobic SRB in the biofilm layer formed on the inner surface of the oil pipe corrode the pipeline steel.

SRB coexist with various microbial groups in both biofilms and the other natural environments. It has been reported that SRB isolated from petroleum coexist especially with halophilic anaerobic bacteria (AB). At this point, it is mainly ignored that SRB may establish syntrophic relationships with these halophilic anaerobes and this relationship may have the potential to affect the presence and activity of SRB, positively or negatively, and thus change the effect of SRB on microbiological corrosion. In this context, no study has been found in the literature that examines the effect of interaction between AB groups, which are closely associated with SRB isolated from the petroleum environment, on the evaluation of the microbiological corrosion process of steel used in the petroleum industry.

In this thesis, it was aimed to obtain a mixed halophilic/halotolerant bacterial culture containing SRB and AB, which are tightly syntrophic associatied with this SRB, and to examine the effect of this culture on the corrosion of API 5L X65 steel used in oil transportation. Within the scope of the thesis study, a systematic research including microbiological, molecular and microbiological corrosion analyses was carried out after the produced water sample was taken from Çaylarbaşı 1 oil well located in Adıyaman Petroleum Region. 

Within the scope of microbiological analyses, firstly, mixed halophilic/halotolerant bacterial cultures (main cultures) containing SRB were obtained from the produced water sample. Subsequently, mixed bacterial sub-cultures and culture dilutions, both of which contain SRB, were obtained by passaging and serial dilution, respectively. Afterwards, a candidate culture, which was selected among the culture dilutions,  was serially diluted and thus culture dilutions of the candidate culture were obtained. On the other hand, within the scope of molecular analyses, the bacterial community profile of the selected sub-cultures and culture dilutions were determined by a two-step nested Polymerase Chain Reaction (PCR)-Denaturant Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) method. 

The bacterial cultures analysed by molecular techniques were compared in terms of their community compositions. According to the results of sub-culturing and dilution processes, it was determined that a stability in the community dynamics of the cultures should be ensured  in order to reveal the syntrophic relationship between the bacterial community members. This balance was mainly achieved by first dilution processes after sub-culturing. On the other hand, a second dilution has been found to be a necessary procedure to confirm the syntrophic relationship between the bacteria. Thus, by sub-culturing followed by serial dilution approach, a mixed bacterial culture containing SRB (Oleidesulfovibrio alaskensis) and heterotrophic AB (Geotoga sp. ve Sphaerochaeta halotolerans), exhibiting tightly coupled coexistence with this SRB species was obtained. 

Microbiological corrosion analyses were carried out in two different systems, such as a lab-scaled test system and a lab-scaled control system. In the test system, API 5L X65 steel coupons were exposed to the mixed bacterial culture containing both SRB (O. alaskensis) and heterotrophic AB (Geotoga sp. and S. halotolerans), which were exhibited tightly coupled coexistence with this SRB. Control system containing API 5L X65 steel coupons and sterile medium without bacteria was set to work simultaneously with the test system. Sampling was made days 1, 4, 7, 10, 15, 23, 34 and 50 of the systems during 50 days operation. SRB and heterotrophic AB counts were made from the biofilm layer formed on the surface of the coupons removed from the experimental setup, and carbohydrate analysis was performed by obtaining extracellular polymeric substances (EPS). Corrosion rates of the coupons were determined by weight loss measurement. In addition,  culture samples were taken for planktonic SRB and heterotrophic AB counts and chemical measurements. For the control system, the weight loss of the coupons and chemical parameters of the medium were determined simultaneously with the test system. 

SRB were detected in the biofilm formed on the surface of the coupons in the test system from day 1, while heterotrophic AB were detected in the biofilm only after the 4th day. The fact that heterotrophic AB settled in the biofilm layer after SRB may indicate that the metabolic activity of heterotrophic AB depends on the presence of SRB and the metabolites it produces. In addition, the growth of O. alaskensis in both biofilm and culture medium in logarithmic phase for 15 days in batch culture medium, may show that the growth of this SRB species was supported by Geotoga sp. and S. halotolerans in the medium. This situation points out that an existence of a syntrophic relationship between O. alaskensis SRB species, and Geotoga sp. and S. halotolerans bacteria.

According to the results of the corrosion analyses,  the weight losses of the test coupons increased over time (p<0.01). In addition to this, the weight losses of the test coupons and the corrosion rates calculated from these data were significantly higher than the corrosion rate of the control coupons (p<0.01).When the weight loss measurements of the mixed bacterial consortium containing O. alaskensis detected in this study were compared with the pure O. alaskensis strain reported in the literature, it was determined that in the mixed bacterial consortium fermentative bacteria (S. halotolerans and Geotoga sp.) increased the corrosive effect of pure O. alaskensis strain 120-140 fold on X65 steel. This is an indication that the effect of SRB on corrosion is more aggressive when they are in syntrophic association with the other bacteria. In addition, on the 4th day when only SRB was detected in the biofilm, the corrosion rate of the test coupon was determined as 2 times higher than the corrosion rate of the control coupon. This result may also point out that the corrosion of the test coupons were initially induced by SRB.

In conclusion, in this thesis study, it was determined for the first time that there is a syntrophic association between SRB species O. alaskensis, and bacteria, Geotoga sp. and S. halotolerans. Additionally, it was also reported for the first time that that a mixed halophilic/halotolerant bacterial culture containing SRB species O. alaskensis and fermentative AB (genus Geotoga and species S. halotolerans) corroded API 5L X65 steel.