Keratinolitik enzimlerin deri sanayinde kullanım imkanlarının geliştirilmesi üzerine araştırmalar
Investigations on the usage improvement possibilities of keratinolytic enzymes in leather industry
Yazar: ARİFE CANDAŞ ADIGÜZEL ZENGİN
Danışman: DOÇ. DR. BEHZAT ORAL BİTLİSLİ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Deri Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Deri Mühendisliği = Leather Engineering
Dizin: Bacillus cereus = Bacillus cereus ; Elastaz = Elastase ; Keratinaz = Keratinase ; Kuvvet = Force ; Kuvvet analizi = Force analysis ; Kıl = Hair

Özet:
Doktora tez çalışmasının ilk aşamasında, enzim üretimini gerçekleştirmek amacıyla koyun yününden proteolitik aktivite gösteren bakteri, fungus ve aktinomiset organizmaları izole edildi. İzole edilen mikroorganizmalarda genel proteaz aktivitesi tayinleri yanında kollagenaz, elastaz ve keratinaz enzimi aktivite tayinleri gerçekleştirildi. Bu tayin sonuçlarına göre en yüksek keratinaz aktivitesini bakteri izolatlarının gösterdiği tespit edildi. Bakteri izolatları; keratinaz, kollagenaz ve elastaz aktivite testlerine göre değerlendirilerek en iyi iki izolat seçildi. Ardından, bu iki izolata ilişkin üretim ortamı denemeleri yapıldı. Üretim ortamı denemeleri sonucunda, karbon ve azot kaynağı olarak yün ve peptonun, karbon kaynağı olarak maltoz ve glikozun kullanılmasına karar verildi. Bu denemeler sonucunda her iki izolatın, karbon ve azot kaynağı olarak sadece yün veya sadece peptonda büyüyebildiği, karbon kaynağı olarak ise glikoz, maltoz ve diğer basit şekerleri kullanabildiği tespit edildi. Ayrıca, karbon ve azot kaynağı olarak yün veya peptonun kullanılmasının aktivite sonuçlarını etkilemediği, her iki azot kaynağında da benzer kollagenolitik, elastinolitik ve keratinolitik aktivitelerin görüldüğü belirlendi. Bu üç proteolitik aktivitenin azot kısıtlaması nedeniyle indüklendiği ve aktivitelerin büyüme ortamındaki protein içerikli substratların varlığına bağlı olmadığı saptandı. Karbon kaynağı olarak maltoz kullanıldığında proteolitik aktivitelerin baskılanmadığı, glikoz kullanıldığında ise aktivitelerin baskılandığı belirlendi. Elde edilen bulgulara göre fermentör üretiminde kullanılmak üzere maltoz ve pepton substratları seçildi ve fermentör denemelerine geçildi.Fermentör ortamındaki enzim üretim çalışmaları sonucunda, kollagenolitik, elastinolitik ve keratinolitik aktivitelerin büyüme ortamına ardaşık olarak salgılandığı belirlendi. Fermentör üretimlerinin erken safhalarında azotun yeterli miktarda bulunmasına bağlı olarak proteaz aktivitesinin görülmediği fakat hali hazırda bulunan peptitler tüketildiğinde ve spesifik büyüme hızı düşmeye başladığında kollagenaz ve elastaz aktivitelerinin üretildiği tespit edildi. Bu 2 aktivitenin daha sonra yerini keratinaz üretimine bıraktığı saptandı. Dolayısıyla, bu iki izolatın giderek daha da zor bulunan protein substratlarını hedef alan ardışık proteaz salınımları gerçekleştirdiği belirlendi.Araştırma kapsamında izole edilen ve incelenen iki mikroorganizmanın tür tanımlama çalışmaları Almanya'daki DSMZ'de (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) yapıldı. Tür tanımlama çalışmaları sonucunda her iki mikroorganizmanın Bacillus cereus türünden geldikleri saptandı ve Bacillus cereus IZ-06b ve IZ-06r olarak adlandırıldı.Ardından, B. cereus IZ-06b ve IZ-06r'den ham proteaz çözeltileri üretildi ve koyun derilerinin kıl gidermesindeki etkileri incelendi. Bu amaçla ham proteaz çözeltilerinin kıl giderme etkileri bilgisayar bağlantılı bir kuvvet sensörü kullanılarak ticari enzim preparatları ile karşılaştırmalı olarak incelendi ve koyun derisindeki kılları önemli ölçüde gevşettiği belirlendi.

Abstract:
Firstly for production of the enzymes, bacteria, fungi and actinomycetes showing proteolytic activity were isolated from sheep wool. Beside the general protease activity tests, collagenolytic, elastinolytic and keratinolytic activity tests were also carried out on the isolated microorganisms. According to these findings, the highest keratinolytic activity was determined from bacteria isolates. For further experiments, the bacteria isolates were also evaluated by collagenolytic, elastinolytic and keratinolytic tests and the best two isolates were selected. Growth medium trials were also performed on the two isolates and it was concluded that both strains were able to grow on wool and peptone as sole carbon and nitrogen sources and utilize simple sugars like glucose and maltose. In addition, it was observed that the use of wool or peptone as carbon and nitrogen source did not affect the activity results and approximately the same collagenolytic, elsatinolytic and keratinolytic activities were obtained with wool or peptone as carbon and nitrogen sources. It was understood that all the three proteolytic activities were induced by nitrogen limitation but were not dependent on the presence of proteinaceous substrates in the growth medium. It was also observed that the usage of maltose as carbon source did not suppress the proteolytic activities; however, when glucose was used, the activities were found to be suppressed. According to these results, maltose and peptone substrates were chosen for the fermentation step.The results obtained from fermentor during enzyme production showed a sequential enzyme secretion of collagenolytic, elastinolytic and keratinolytic activities into the growth medium. In the early stages of fermentation which was rich in nitrogen source did not show any protease activity, whereas collagenolytic, elastinolytic activities were found to be produced when the present peptides were depleted and the specific growth rate started to decrease. Only after these activities keratinolytic production was started. Consequently, it was identified that a sequential protease secretion was occurred by these 2 isolates according to the scarcity of proteinaceous substrates in the medium.The strain identification studies of the 2 isolated microorganisms were performed in DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) in Germany. The results showed that both two microorganisms were Bacillus cereus and were named as Bacillus cereus IZ-06b and IZ-06r.Lastly, the crude protease solutions were obtained from these 2 bacteria and their affect on unhairing of sheep skins were investigated. For this purpose, a computerized force sensor was used for the evaluation of unhairing affect of protease solutions in comparison to the commercial enzyme solutions. The produced protease solutions were found to be effective at loosening the hair of sheep skins.