Trabzon hurması (Diospyros kaki L.)'ndan polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu
Purification and biochemical characterization of polyphenol oxidase enzyme from persimmon (Diospyros kaki L.)
Yazar: DİDEM ÜLGÜT SAKALLIOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. YONCA YÜZÜGÜLLÜ KARAKUŞ
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Karakterizasyon = Characterization ; Polifenol oksidaz = Polyphenol oxidase ; Trabzon hurması = Persimmon

Özet:
Ülkemiz yenilenebilir enerji kaynakları açısından büyük bir potansiyele sahip olmasına karşın, bu kaynakların endüstriyel kullanımdaki payı oldukça düşüktür. Bu çalışmada, yerel pazarlarda yaygın olarak satılan, fenolik madde (antioksidan) içeriği bakımından zengin olduğu bilinen Trabzon hurması (Diospyros kaki L.)'nın polifenol oksidaz (PPO) enzimi çalışılarak meyvenin endüstriyel,özellikle tıbbi, alanda iyi bir PPO kaynağı olarak kullanımının yaygınlaşması amaçlandı. Bu amaç doğrultusunda, önce %0,1 (v/v) Triton X-100 ve 0,1 mg/mL polivinilpolipirolidon (PVPP) varlığında hurmadan ham enzim ekstraktı elde edildi. Daha sonra üçlü faz ayırma sistemi (TPP) kullanarak ham ekstrakttan %81 verimle PPO enzimi 2,5 kat saflaştırıldı. Optimum saflaştırma, %20 (w/v) amonyum sülfatla doyurulmuş ham ekstrakta 1:1 oranında t-bütanol eklenerek pH 7,0'de hazırlanan sistemde gerçekleştirildi. TPP ile alt fazda toplanan örneğin sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) sonrası, jelde 32 kDa'ya denk gelen tek bir bant tespit edildi. Enzimin optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 60 °C ve 6,0 olarak belirlendi. Ayrıca 50-70 °C arasında 60 dk'lık inkübasyon sonrasında aktivitesinin %60-76'sının, pH 6,0-9,0 arasında ise %50'den fazlasının korunduğu gözlendi. Substrat spesifite analizine göre enziminorto-difenolik bileşikleri okside edebildiği para-difenolikler üzerinde etkili olmadığı saptandı. İnhibitörler ile yapılan denemelerde L-sistein, tiyoüre, β-mercaptoetanol, benzoik asit ve SDS'nin PPO aktivitesini 60 dk'lık inkübasyon sonunda tamamen inhibe ettiği bulundu. Tüm sonuçlar değerlendirildiğinde antioksidan özellikteki Trabzon hurmasından PPO enzimininkısa zamanda, düşük maliyette, toksik madde oluşmadan doğaya dost bir şekilde izole edilebileceği ve saf haldeki PPO'nun sahip olduğu biyokimyasal özellikleri sebebiyle orto-difenoliklerin kullanıldığı spesifik uygulamalar için iyi bir aday olarak değerlendirilebileceği öngörülmektedir.

Abstract:
Our country has abundant renewable energy sources. In contrast, the ratio of industrial usage of these sources are surprisingly quite low. In this study, it was intended to make the use of persimmon (Diospyros kakiL.) widespread in industrial applications, especially medicine, by studying its polyphenol oxidase (PPO) enzyme. Persimmonisrich in phenolic substance (antioxidant) content and can be obtained from local markets. Considering that persimmon can be a good source of PPO enzyme, the crude enzyme extract was firstly obtained from persimmon in the presence of 0.1% (v/v) Triton X-100 and 0.1 mg/mL polyvinylpolypyrrolidone (PVPP).Then, using a three-phase partitioning system (TPP), PPO enzyme was 2.5-fold purified from the crude extract with 81% yield. Optimum purification was carried out in the system prepared at pH 7.0 by adding 1:1 ratio of t-butanol to the crude extract saturated with 20% (w/v) ammonium sulfate. After sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the sample collected from the lower phase of TPP, a single band corresponding to 32 kDa was observed on the gel. The optimum temperature and pH values of the purified enzyme were determined as 60 °C and 6.0, respectively. In terms of stability, the enzyme maintained 60-76% of its original activity between 50-70 °C and more than 50% of its activityat pH 6.0-9.0after a 60-minute incubation. Substrate specificity analyses revealed that the PPO enzyme can only oxidase ortho-diphenolic compounds rather than para-diphenolics. L-cysteine, thiourea, β-mercaptoethanol, benzoic acid and SDS completely inhibited PPO activity after 60 minutes of incubation. Overall results have indicated that the PPO enzyme can be extracted from antioxidant persimmon in a short time, at low cost, in an environmentally friendly way without the formation of toxic substances and that the biochemical properties of the TPP-partitioned PPO enzyme support the use of enzyme in specific applications where ortho-diphenolics utilized.