Nematod caenorhabditis elegans model organizmasında insülin maruziyetine bağlı metabolomik değişimin araştırılması: C. elegans kanser modeli
Investi̇gati̇on of insulin-induced metabolomic changes in the nematode caenorhabditis elegans: A C. elegans cancer model
Yazar: ÖZGÜR ÜLKÜ ÖZDEMİR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞEYDA BERK ; PROF. DR. MUSTAFA ÇELEBİER
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antikanser = Anticancer

Özet:
Serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans (C. elegans), son yıllarda yaşlanma çalışmalarında iyi bilinen bir model organizma haline gelmiştir. Kısa ömrü, kültürlenmesinin ve deney yapılmasının kolaylığı, tam olarak dizilenmiş ve iyi açıklanmış genomu ve ileri ve geri genetik taramalar için bolluğu bunun başlıca nedenleridir. Farklı çalışmalar C. elegans'ta yaşlanma, uzun ömür ve metabolizma arasındaki ilişkiyi araştırmıştır. Yaşlanmaya özgü mekanizmaları daha iyi anlamak ve bu fizyolojik süreci karakterize eden biyobelirteçler oluşturmak elzem hale geldiğinden tüm biyomoleküller arasında metabolitler bu biyobelirteçlerin incelenmesi için iyi bir hedef olarak ön plana çıkmaktadır. İki ana besin algılama yolu olan rapamisin hedefi (TOR) ve insülin/IGF sinyalleme (IIS) yolları, en etkili doğrulanmış yaşlanma karşıtı müdahalelerle ilişkilendirilmiştir. İnsülin/İnsülin Benzeri Sinyalizasyon (IIS) ve mTOR sinyal yollarında yer alan genlerin nakavt edilmesi uzun ömürlülüğü artırma eğilimindedir. Diyabet, kanser ve embriyonik ölüm gibi ciddi olumsuz etkiler, bu sinyalleme yollarından herhangi birinde önemli değişikliklerden kaynaklanabilmektedir. Sonuç olarak, yaşlanma karşıtı IIS veya TOR manipülasyonlarının uygulanması, kanser ve diyabet dahil olmak üzere çok sayıda yaşlanmayla ilgili hastalığın ilerlemesini engelleyebilecek önemli bir etkiye sahiptir. Ön çalışmamızda, en iyi doğrulanmış yaşlanma karşıtı müdahalelerin temel besin algılama yollarıyla ilişkili IIS yolağı olan insülin ilacına maruz kalan solucanların uzun ömürlülükle ilişkilendirilmiştir. Bu tez çalışmasında ise, bu insüline bağlı ömür uzunluğu etkisinin, memelilerde tümör baskılayıcı pRb işleviyle ilişkili olan mutant suş lin-35 ve yabanıl N2 solucanlarında LC-Q-TOF-MS/MS analizi ile metabolomik profillemeleri elde edilmiştir. Ek olarak, insülin maruziyeti sonrasında kanser metabolizmasında meydana gelen değişiklikler ve etkilenen yolaklar belirlenmiştir. Retinobastona (pRB) mutasyonlu lin-35 solucanları insülin tedavi uygulaması sonrası N2 yabanıl solucanlar ile karşılaştırılarak elde edilen metabolitler arasındaki farklar belirlenmiş ve metabolit skorları değerlendirilmiştir. Böylece pRB mutasyonuna sahip lin-35 solucanları ve yabanıl N2 solucanları arasındaki farklar moleküler analizlerle ortaya konulmuştur. Böylelikle, C. elegans odaklı kanser-IIS ilişkisi moleküler ve metabolomik analizlerle aydınlatılmıştır. IIS- insülin tedavisi ön çalışmamızda elde ettiğimiz uzun ömürlülük etkisinin altında yatan fizyolojik süreci aydınlatılarak metabolit profili oluşturulmuştur ve uzun ömürlü solucanların (insüline maruz kalan solucanlar) metabolizmasının normal ömre sahip kontrollerle (insülin uygulanmayan solucanlar) karşılaştırıldığında nasıl değiştiği analiz edilmiştir. Bu amaçla, örnekler, Sıvı kromatografi-dörtlü zaman-uçuşlu tandem kütle spektrometrisi (LC-Q-TOF-MS/MS) yöntemi kullanılarak C18 kolon ile gradiyent elüsyon programı kullanılarak analiz edilmiştir. Elde edilen ham veriler MZmine 2.53 yazılımı ile analiz edilmiştir. Metabolit profilleri, MetaboAnalyst 6.0 platformunda biyolojik yolak analizleriyle değerlendirilmiş ve bulunan metabolitlerin kanser ve insülin ile ilişkisi ortaya koyulmuştur. Yapılan veri değerlendirmesi sonucunda; FC>1.5 ve p<0.05 istatistiksel olarak güvenilir pikler tespit edildiğinde, lin-35 solucanları ve N2 solucanlarında toplam 75 metabolit elde edilmiştir. Yapılan literatür taraması sonucunda bu metabolitlerden toplamda 38 tanesi kanser/diyabet modeli ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Bunlardan en önemli 3 metabolit L-arjinin, fruktoz 6- fosfat ve fumarik asit olarak rol almaktadır. Ayrıca Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yolak analizi sonucunda 21 metabolik yolak kanser/diyabet modelinde rol almıştır. Bunlardan en önemlisi fenil alenin tirozin ve triptofan biyosentez sinyal yolağı ile Riboflavin sinyal yolağı olarak belirlenmiştir. Elde edilen bulgular, yaşlanmaya özgü mekanizmaları daha iyi anlaşılır hale getirmiş ve bu fizyolojik süreci karakterize eden biyobelirteçler oluşturmuştur. Yapılan bu çalışmada tespit edilen metabolomik profillerdeki değişikliklerden kanser metabolomik gelişimi mekanizmalarının aydınlatılmasında ve yeni biyobelirteç hedeflerinin geliştirilmesine katkı sağlamıştır. Ayrıca metabolomik için genel olarak geçerli olduğu gibi, C. elegans metabolomunun kapsamlı bir analizini sağlayan analitik bir platform yoktur. Metabolomik verilerinin biyoenformatik analizi de giderek daha fazla önem kazandığından, HMDB örneğini izleyerek, metabolitler, MS-, MS/MS spektrumları dahil olmak üzere C. elegans'a özgü metabolit veritabanının oluşturulmasına katkı sağlamıştır.

Abstract:
The free-living nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has recently become a well-established model organism in aging research. Its short lifespan, ease of cultivation and experimental manipulation, fully sequenced and well-annotated genome, and suitability for both forward and reverse genetic screens are the primary reasons for its widespread use. Numerous studies have investigated the relationship between aging, longevity, and metabolism in C. elegans. As the need to better understand aging-specific mechanisms and to identify biomarkers characterizing this physiological process becomes increasingly critical, metabolites among all biomolecules have emerged as strong candidates for biomarker discovery. Two major nutrient-sensing pathways, the Target of Rapamycin (TOR) and Insulin/Insulin-like Growth Factor Signaling (IIS) pathways, have been associated with the most effective and validated anti-aging interventions. Gene knockouts within the IIS and mTOR signaling pathways tend to extend lifespan. However, significant alterations in these signaling pathways may result in severe adverse effects such as diabetes, cancer, and embryonic lethality. Therefore, anti-aging interventions targeting IIS or TOR pathways have the potential to significantly hinder the progression of numerous age-related diseases, including cancer and diabetes. In our preliminary study, lifespan extension was observed in worms exposed to insulin treatment, a validated anti-aging intervention associated with nutrient-sensing pathways, particularly the IIS pathway. In this thesis, we investigated the metabolomic profiles of both the lin-35 mutant strain—linked to the mammalian tumor suppressor pRb function—and wild-type N2 worms using LC-Q-TOF-MS/MS analysis to elucidate the insulin-dependent lifespan extension effect. Additionally, changes in cancer-related metabolism and affected metabolic pathways were identified following insulin exposure. The differences in metabolite profiles between lin-35 mutant worms and wild-type N2 worms after insulin treatment were assessed, and metabolite scores were evaluated. Thus, molecular analyses revealed the metabolic distinctions between lin-35 mutants carrying a pRB-like mutation and wild-type N2 worms. This study has illuminated the cancer-IIS relationship in C. elegans through molecular and metabolomic approaches. The physiological processes underlying the observed longevity effect in insulin-treated worms from our preliminary research were further clarified by constructing metabolite profiles. We analyzed how the metabolism of long-lived (insulin-exposed) worms differed from that of control worms (not treated with insulin). To this end, samples were analyzed using a Liquid Chromatography/Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry (LC-Q-TOF-MS/MS) system with a C18 column and a gradient elution program. The raw data obtained were processed using MZmine 2.53 software. Metabolite profiles were assessed via pathway analysis on the MetaboAnalyst 6.0 platform, and the relationships of the detected metabolites with cancer and insulin signaling were investigated. Upon evaluation, 75 statistically significant metabolites (fold change >1.5, p < 0.05) were identified in lin-35 and N2 worms. Literature review revealed that 38 of these metabolites are associated with cancer and/or diabetes models. The most significant among them were L-arginine, fructose 6-phosphate, and fumaric acid. Moreover, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis indicated that 21 metabolic pathways were involved in the cancer/diabetes model. The most prominent among them were the phenylalanine, tyrosine, and tryptophan biosynthesis pathway and the riboflavin metabolism pathway. The findings of this study contribute to a better understanding of aging-specific mechanisms and aid in the identification of biomarkers characterizing this physiological process. The alterations identified in the metabolomic profiles may facilitate the elucidation of cancer metabolism mechanisms and the development of novel biomarker targets. Furthermore, as there is currently no comprehensive analytical platform for studying the full metabolome of C. elegans, this study contributes to the creation of a species-specific metabolite database—following the model of HMDB—by incorporating metabolite data, including MS and MS/MS spectra, specific to C. elegans.