Bazı entomopatojenik bakterilerin vejetatif insektisidal protein (vip) gen içeriklerinin ve insektisidal etkilerinin belirlenmesi
Determination of vegetative insecticidal protein (vip) gene contains and insecticidal activities of some entomopathogenic bacteria
Yazar: AYSUN ADIGÜZEL
Danışman: PROF. DR. KAZIM SEZEN
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bacillus thuringiensis = Bacillus thuringiensis ; Biyolojik mücadele = Biological control

Özet:
Bu çalışma ile daha önceki çalışmalarda izole ve karakterize edilmiş lokal Bacillus thuringiensis kurstaki (BnBt, MnD) ve Bacillus thuringiensis tenebrionis (Xd3, Mm2) izolatlarında vip (vip1, vip2 ve vip3) genlerinin PCR ile taranması, izolatlara ait bazı vip genlerinin klonlanması, karakterizasyonu gerçekleştirildi. BnBt ve MnD izolatlarından kısmi olarak saflaştırılan Vip3 proteinlerinin Spodoptera littoralis larvalarına karşı insektisidal aktivitesi belirlendi. Yapılan PCR taraması ve klonlama sonucunda MnD ve BnBt suşlarında vip3 geninin, Xd3 ve Mm2 suşlarında ise vip1 ve vip2 geninin varlığı tespit edildi. BnBt ve MnD izolatlarına ait Vip3 proteinleri, kültür süpernatantlarından iyon değişim kromagrafisiyle elde edilerek SDS-PAGE analizi yapıldı ve proteinlere ait 90 kDa'luk bant belirlendi. Elde edilen proteinler S. littoralis larvalarına karşı kullanıldı ve biyotest sonucunda BnBt'ye ait Vip3 proteininin % 40, MnD'ye ait Vip3 proteininin % 31 oranında öldürücü etkiye sahip olduğu gözlendi. Tezin ikinci kısmında BnBt ve MnD izolatlarına ait tam uzunluktaki vip3A genleri klonlandı ve baz dizilimleri belirlendi. vip3A geninin, 2.370 bp uzunluğunda olup 790 aminoaside sahip olduğu belirlendi. Daha sonra pGEX-2T ekspresyon vektörüne klonlanarak E. coli BL21(DE3)'de ifade edildi ve kısmi olarak saflaştırıldı. SDS-PAGE analizi sonucunda ~90 kDa'luk Vip3A proteinine eklenmiş 26 kDa'luk GST kuyruğu ile ~116 kDa'luk bir bant gözlendi.

Abstract:
In this study, the screening by PCR, the cloning and the characterization of vip genes of local Bacillus thuringiensis kurstaki (BnBt, MnD) and Bacillus thuringiensis tenebrionis (Xd3, Mm2) isolates which isolated and characterized in previous studies were performed. The insecticidal activity of partly purificated Vip3 proteins of BnBt and MnD isolates against the Spodoptera littoralis larvae was determined. As a result of the PCR analysis and the cloning, vip3 gene in MnD and BnBt isolates, vip1 and vip2 genes in Xd3 and Mm2 isolates were determined. Vip3 proteins of BnBt and MnD isolates by obtained from culture supernatants by ion exchange chromatography were subjected to SDS-PAGE analysis and a 90 kDa band of proteins were determined. The obtained proteins were used against the larvae of S. littoralis and according to results, the insecticidal effects of the Vip3 proteins of BnBt and MnD were observed as 40% and 31%, respectively. In the second part of the thesis, the full-length vip3A genes of BnBt and MnD isolates were cloned and the base sequences were determined. vip3A gene was 2,370 bp in length and had 790 amino acids. Then Vip3A proteins were expressed in E. coli BL21(DE3) by cloning into pGEX-2T expression vector and purified. SDS-PAGE analysis showed a band of totally 116 kDa for the Vip3A protein (~90 kDa) with the 26 kDa GST tag attached.