Kriyojel ve transwell sisteminde üç boyutlu (3B) plasenta modelinin oluşturulması ve etkinliğinin araştırılması
Construction of a three dimention (3D) placenta model on cryogel and transwell systems and investigation of its efficiency
Yazar: ÜMMÜGÜL GÖZLEK
Danışman: PROF. DR. AYSUN KILIÇ SÜLOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Zooloji = Zoology

Özet:
Son yıllarda gebelik boyunca kimyasal madde ve ilaç kullanımında yaşanan artışa yönelik olarak güncel plasenta bariyer modelleri ve plasental sistemler oluşturularak yapılacak olan çalışmalara ihtiyaç oldukça artmış olup bugüne kadar yapılan in vitro çalışmalar ile standart olarak kabul edilen bir plasenta bariyer modeli henüz bulunmamaktadır. 
Bu tezde, insan plasental sitotrofoblast hücresi (BeWo) ve insan göbek kordunu veni makrovasküler endotel hücrelerinin (HUVEC) birarada kullanıldığı kriyojel ve transwell sistem kullanılmıştır. Bu iki hücreye ilave olarak ortama gerekli hormon desteğini sağlamak amacıyla adrenal bez adenokarsinom hücre hattı (H295R) eklenerek in vivo ortamı taklit eden daha etkin bir 3B sistem oluşturulmuştur. Gebelikteki kullanımı ile ilgili literatürde yeterli bir bilgiye rastlanmamış bir antidepresan etken maddesi olan vortioksetinin, 3B kriyojel ve transwell ortak-kültür sistemine uygulaması yapılarak etkinliğinin araştırılması sağlanmıştır. Daha önceki çalışmalarla optimize edilmiş kriyojeller hücrelerle birlikte kullanılarak transwell insert sistemine eklenerek, etkinlikleri karşılaştırılmış, vortioksetinin toksisitesi değerlendirilmiştir. Kriyojellere folik asit, tip IV kolajen bağlanarak hücrelerin tutunabileceği hücre dışı maddeyi (HDM) taklit eden ortamlar hazırlanmış ve daha sonra BeWo ve HUVEC hücreleri ile ortak kültürü yapılmıştır. Tez çalışması kapsamında, optimize edilmiş bu sistem üzerine transwell insert üzerinde kültüre edilmiş H295R hücreleri kullanılarak literatürde ilk defa üçlü ortak kültür sistemi oluşturulmuştur. Oluşturulan sistemin vortioksetin etken maddesine verdiği yanıt hücre canlılık analizi ile değerlendirilmiştir. Ayrıca grupların taramalı elektron mikroskobunda (SEM) morfolojik görüntüleri incelenmiştir.
HDM bileşenlerini taşıyan kriyojeller üzerinde maternal kısmı temsil eden BeWo ve HUVEC hücreleri ile fetal kısmı temsil eden H295R hücreleri transwell sisteminde bir araya getirilmiş ve hormon metabolizmasındaki değişiklikler insan koryonik gonadotropin (β-hCG), progesteron, dehidroepiandrosteron (DHEA), östriol ve östradiol hormon seviyeleri ölçülerek tespit edilmiştir. Uygun istatistiksel analizler yapılarak plasental hücrelerle oluşturulan kriyojel ve transwell insert içeren 3B ortak-kültür sistemi üzerindeki etkileri incelenmiştir.
3B kriyojel ortak kültür sistemine 30 µM vortioksetin dozu uygulaması sonucunda ortak kültürün hücre canlılığında anlamlı bir azalma görülmemiştir. İkili ve Üçlü ortak kültür grubunda β-hCG, östriol, östradiol, progesteron, DHEA hormon miktarı ölçülmüştür. PHEMA+Tip IV Kol+FA kriyojel grubunda PHEMA kriyojel grubuna kıyasla BeWo hücrelerinden sentezlendiği bilinen β-hCG hormonu miktarında artış gözlenmiştir. Çoğu grupta MTT analizi ve hormon sonuçlarına göre vortioksetin doz uygulamasına bağlı olarak anlamlı azalma görülmüştür. SEM görüntülemesi sonuçlarına göre, PHEMA Tip IV Kol+FA grubunda PHEMA grubuna kıyasla hücrelerin proliferasyonu, yayılımı ve yerleşimi bakımında daha iyi uyum sağladığı gösterilmiştir.
Bu tez çalışmasında, PHEMA ve PHEMA kriyojele Tip IV Kolajen ve Folik Asit bağlanarak kriyojel grupları oluşturulmuştur. Plasental trofoblast hücre hattı BeWo, endoteliyal hücre hattı HUVEC ve adrenokortikal hücre hattı H295R hücreleri, ortak kültür ortamında ilk kez PHEMA ve Tip IV Kolajen ve Folik Asit ile kaplanmış kriyojel ve transwell bulunan sistemde üretilmiştir. Oluşturulan 3B kriyojel ve transwell içeren sistem ile gebelikte kullanılan vortioksetin antidepresan etken maddesinin toksisitesi değerlendirilmiştir. Sonuçlar kriyojel ve transwell sisteminin ortak kültürler için biyolojik olarak uyumlu olduğunu göstermiştir. Bu 3B kriyojel sistemi yeni ilaç, doku mühendisliği, kozmetik madde, gıda toksisitesi gibi alanlarda in vivoyu yansıtan ve in vivoya oldukça benzer cevaplar veren bir sistem olarak kullanılabileceğini göstermiştir.

Abstract:
In recent years, the need for studies to be carried out by creating current placental barrier models and placental systems for the increase in the use of chemicals and drugs during pregnancy has increased considerably, and there is not yet a placental barrier model accepted as a standard with in vitro studies.
In this thesis, a cryogel and transwell system in which human placental cytotrophoblast cell (BeWo) and human umbilical vein macrovascular endothelial cells (HUVEC) are used together were used. In addition to these two cells, an adrenal gland adenocarcinoma cell line (H295R) was added to provide the necessary hormone support to the environment, creating a more effective 3D system that mimics the in vivo environment. The effectiveness of vortioxetine, which is an antidepressant active ingredient for which there is no sufficient information in the literature regarding its use in pregnancy, was applied to the 3D cryogel and transwell co-culture system to investigate its effectiveness. Cryogels optimized with previous studies were used together with cells and added to the transwell insert system, their effectiveness was compared, and the toxicity of vortioxetine was evaluated. By attaching folic acid and type IV collagen to the cryogels, media mimicking the extracellular substance (HDM) that cells can attach to were prepared and then co-cultured with BeWo and HUVEC cells. Within the scope of the thesis, a triple co-culture system was created for the first time in the literature by using H295R cells cultured on a transwell insert on this optimized system. The response of the created system to the active substance of vortioxetine was evaluated by cell viability analysis. In addition, the morphological images of the groups were examined under scanning electron microscopy (SEM).
BeWo and HUVEC cells representing the maternal part and H295R cells representing the fetal part were assembled on the cryogels carrying HDM components, and the changes in hormone metabolism were measured by measuring the hormone levels of human chorionic gonadotropin (β hCG), progesterone, dehydroepiandrosterone (DHEA), estriol and estradiol. The effects on the 3D co-culture system containing the cryogel formed with placental cells and the transwell insert were investigated by performing appropriate statistical analyzes.
As a result of the application of 30 µM dose of vortioxetine to the 3D cryogel co-culture system, no significant decrease in cell viability of the co-culture was observed. The amount of β-hCG, estriol, estradiol, progesterone, DHEA hormones were measured in the double and triple co-culture groups. An increase in the amount of β-hCG hormone known to be synthesized from BeWo cells was observed in the PHEMA+Type IV Kol+FA cryogel group compared to the PHEMA cryogel group. According to MTT analysis and hormone results in most groups, a significant decrease was observed depending on vortioxetine dosing. According to the results of SEM imaging, it has been shown that the PHEMA Type IV Arm+FA group has better compliance in terms of proliferation, spread and localization of cells compared to the PHEMA group.
In this thesis, cryogel groups were formed by binding Type IV Collagen and Folic Acid to PHEMA and PHEMA cryogels. Placental trophoblast cell line BeWo, endothelial cell line HUVEC and adrenocortical cell line H295R cells were grown in co-culture medium for the first time in a system with cryogel and transwell coated with PHEMA and Type IV Collagen and Folic Acid. The toxicity of the antidepressant active substance vortioxetine used during pregnancy was evaluated with the created 3D system. The results showed that the cryogel system is biocompatible for co-cultures, in terms of cytotoxicity, the co-culture groups showed resistance as a result of dose application, and the doses should be higher to reduce viability in dual co-culture groups compared to mono cultures. This 3D cryogel system has shown that it can be used as a system that reflects in vivo and gives similar responses in areas such as new drugs, cosmetics, and food toxicity.