Vitamin D3 (1,25 (OH)2 D3) İle İşlenmiş HL-60 hücrelerindeki gen anlatımının zamana karşı değişiminin analizi
Analysis of the changes of time dependent gene expression in HL60 cells treated with vitamin D3 (1,25 (OH)2 D3)
Yazar: AYLİN KANLI
Danışman: PROF.DR. M. DOĞAN GÜLKAÇ ; Y.DOÇ.DR. HAKAN SAVLI
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
ÖZETVitamin D3 (1,25 (OH)2 D3) İle İşlenmiş HL-60 hücrelerindeki gen anlatımınınzamana karşı değişiminin analiziAkut myeloid löseminin, 1,25(OH)2D3'ün farklılaştırma etkisiyle tedavisi sonyılların ön plana çıkan araştırma konularındandır. D vitamini tedavisiyle ilişkili genanlatımındaki değişikliklerin tayini için en etkin yol, miyeloid hücrelerin fark-lılaşmasında rol oynayan mekanizmalar ve hedef genlerin anlaşılmasıdır.Bu tezin amacı HL-60 hücrelerinde lösemi hücre farklılaşması veapopitozunda 1,25(OH)2D3'ün rolünü araştırmaktır. Dört farklı zamanda (18, 36, 48,72. saatler) vitamin D ile indüklenmiş ve indüklenmemiş HL-60 hücrelerindeTNFR1, Bcl-w, Bax, Bak, Kaspaz-6, Kaspaz-8, AIF, Survivin, Cdk1 (Cdc2), Cdk2,Cdk4, Siklin D1 ve Siklin E genlerinin gen anlatımları gerçek zamanlı kantitatif PZR(polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemi kullanılarak incelenmiştir.Deneylerimiz boyunca incelenen genlerde dramatik düşüş ve yükselişler göz-lenmemiştir. Elde edilen değerler, incelenen genlerin, vitamin D bağımlı etkiye yük-sek düzeyde duyarlı olmadığını düşündürmektedir. Gerçek zamanlı PZR analizlerininsonucu, 72. saat sonunda TNFR1, Cdk-4, Siklin D1, Siklin E, Survivin genlerinin an-latımında azalma, Kaspaz-8 ve Bak genlerinin anlatımında artma olduğu gözlenmiş-tir. Hücre siklusu ile ilişkili genlerin anlatımında 18. saatten 72. saate doğru azalmaeğiliminin olması, hücrelerin proliferasyon sürecinden çıkıp farklılaşma sürecinegirdiğini düşündürmektedir. Antiapoptotik genler Bcl-w ve Survivin gen anlatımla-rının genelde azalan bir çizgi izlemesi ve pro-apoptotik bir gen olan Bak ve Kaspaz-8'in anlatımlarında artış eğilimi apoptotik sürecin 72. saat civarında başladığınıdüşündürmektedir. AIF gen anlatımında 72. saate doğru azalmanın olması da, bugenin HL-60 hücrelerinde apoptotik süreçte yer almadığının bir göstergesi olabilir.Sonuç olarak, bu genlerin yanı sıra hücre döngüsü ve apoptozis ile ilişkilidiğer genlerin çeşitli zamanlarda incelenmesi ve in vitro çalışmalara ilaveten hastaörneklerinde de çalışmaların yapılması, löseminin tedavisinde yeni yaklaşımlarıngeliştirilmesi için aydınlatıcı olacaktır.Anahtar kelimeler: HL-60, 1,25 (OH)2 D3, Hücre Döngüsü, Farklılaşma,Apoptozis, Gerçek Zamanlı Kantitatif PZR

Abstract:
ABSTRACTAnalysis of The Changes of Time Dependent Gene Expression in HL-60 CellsTreated with vitamin D3 (1,25 (OH)2 D3)The treatment of acute myeloid leukemia (AML) with differentiation effect of1,25(OH)2D3 has been one of the popular research topics recently. The most effectiveway to determine changes of gene expression related to vitamin D treatment is todetermine mechanisms and target genes which play a role in differentiation of myeloidcells.The aim of this thesis was to investigate the role of 1,25 (OH)2D3 in leukemiacell differentiation and apoptosis in HL-60 cells. At different time periods (18, 36, 48,72. hours), TNFR1, Bcl-w, Bax, Bak, Caspase-6, Caspase-8, AIF, Survivin, Cdk1(Cdc2), Cdk2, Cdk4, Cyclin D1 and Cyclin E genes expression were analyzed in HL-60cells which were treated and un-treated vitamin D using a real time quantitativepolymerase chain reaction (RQ-PCR) method.We observed that expression of the genes which was investigated during ourexperiments were not dramatically decreased and increased. What we have seen was thatthe investigated genes were not markedly effected by the supplementation of vitamin D.RT-PCR analysis revealed that 72 hour time period was a critical time for theinvestigated genes. The expression of TNFR1, Cdk4, Cyclin D1, Cyclin E and Survivingenes was reduced whereas the expression of Caspase-8 and Bak genes were increasedat the end of 72 hour period. Time dependent reduction of cell cycle related geneexpression from 18 hrs to 72 hrs implied that the cells go through proliferation processand pass into the differentiation process. The decrease in antiapoptotic Bcl-w andSurvivin genes expression and the increase in Bak (pro-apoptotic) and Caspase-8 genesexpression illustrate that apoptosis process was initiated around 72 hours. Moreover,reduction of AIF gene expression towards to 72. hours could indicate that this gene didnot participate in the apoptosis of HL 60 cells.In conclusion, investigation of other cell cycle and apoptosis related genes indifferent times should be carried out. Furthermore, aside from in vitro studies, in vivostudies should be carried out. These studies may shed light on the development of newapproaches for the treatment of leukemia.Key words: HL-60, 1,25 (OH)2 D3, Cell Cycle, Differentiation, Apoptosis, Real TimeQuantitative Polymerase Chain Reaction (RQ-PCR)