Lipopolisakkarit ile sıçanlarda oluşturulan sistemik inflamatuvar yanıt ve ilişkili nöroinflamasyonda MTOR'un rolünün araştırılması
Investigation of the role of MTOR in systemic inflammatory response and associated neuroinflammation in rats with Lipopolysaccharide
Yazar: DEMET SİNEM GÜDEN
Danışman: PROF. DR. SEYHAN ŞAHAN FIRAT
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Eczacılık Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: HIF-1a = HIF-1a ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Mammalian target of rapamycin = Mammalian target of rapamycin ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases ; Sıçanlar = Rats ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Çalışmamızda, sıçanlarda lipopolisakkarit (lipopolysaccharide; LPS) ile oluşturulan sistemik inflamatuvar yanıt ve ilişkili nöroinflamasyonda rapamisinin memelilerdeki hedefinin (mammalian target of rapamycin; mTOR) katkısının olup olmadığı ve mTOR/κB inhibitörü (inhibitor of κB; IκB)-α/nükleer faktör-κB (nuclear factor-κB; NF-κB)/hipoksi ile indüklenen faktör-1 alfa (hypoxia inducible factor-1alpha; HIF-1α) yolu etkinliğinde ortaya çıkabilecek değişiklikler sonucunda oluşan sistemik inflamasyon ve nöroinflamasyonun gelişme sürecinde önemli rol oynayan oksidatif stres ve apopitoza neden olan mediyatörlerin ne yönde değiştiği selektif mTOR inhibitörü rapamisin kullanılarak araştırıldı. Sıçanlar 4 gruba ayrıldı: (1) Serum fizyolojik, (2) LPS (3) Serum fizyolojik+rapamisin ve (4) LPS+rapamisin. Rapamisin (1 mg/kg, i.p.) hayvanlara serum fizyolojik (4 ml/kg, i.p.) veya LPS (10 mg/kg, i.p.) ile birlikte uygulandı. LPS enjeksiyonundan 4 saat sonra gruplardaki hayvanlar sakrifiye edilerek kan, böbrek, kalp, akciğer ve beyin dokuları izole edildi. Dokulardan hazırlanan homojenatlarda ribozomal protein S6 (ribosomal protein S6; rpS6), IκB-α, NF-κB p65 protein ekspresyonları ve/veya fosforilasyonları ile HIF-1α, tümör nekrozlaştırıcı faktör (tumor necrosis factor; TNF)-α, interlökin (interleukin; IL)-1β, indüklenebilir nitrik oksit sentaz (inducible nitric oxide synthase; iNOS), gp91phox, p47phox, iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekül (ionized calcium binding adaptor molecule; Iba)-1, kaspaz-3, B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) ve Bcl-2-associated X (Bax) protein ekspresyonu immunoblotting, serumda nitrit düzeyleri Griess tepkimesi ve beyin dokusu kesitlerinde mikrogliyal etkinlik immünofloresan işaretleme yöntemleri ile ölçüldü. LPS uygulaması ile rpS6 protein ekspresyonu değişmezken fosforilasyonunda artma, IκB-α ve Bcl-2 protein ekspresyonlarında azalma, NF-κB p65 protein ekspresyonu ve fosforilasyonunun yanısıra HIF-1α, TNF-α, IL-1β, iNOS, gp91phox, p47phox, Iba-1, kaspaz-3, ve Bax protein ekspresyonlarında da artma gözlendi. Ek olarak, LPS uygulaması serum nitrit düzeyleri ve mikrogliyal etkinliği arttırdı. LPS'nin neden olduğu tüm bu değişiklikler rapamisin ile önlendi. Bulgularımız, sıçanlarda LPS'nin tetiklediği sistemik inflamasyon ve ilişkili nöroinflamasyonda mTOR enzim etkinliğindeki artışın IκB-α/NF-κB/HIF-1α yolu etkinliğini artırarak proinflamatuvar mediyatörler ve nöroinflamasyonun gelişmesinde önemli rol oynayan oksidatif stres faktörleri ile apopitoza neden olan mediyatörlerin üretimine katkıda bulunduğunu göstermektedir.

Abstract:
In this project, it was aimed to investigate the contribution of mammalian target of rapamycin (mTOR) to lipopolysaccharide (LPS)-induced systemic inflammatory response associated with neuroinflammation as well as systemic inflammation due to the activation of mTOR/inhibitory kappa B alpha (IκB-α)/nuclear factor-κB (NF-κB)/hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1α) pathway as well as the changes in the production of mediators that cause oxidative stress and apoptosis which all play an important role in the development of neuroinflammation by using a selective mTOR inhibitor, rapamycin. In the context of this project, the rats will be divided into 4 groups: (1) saline, (2) LPS, (3) saline+rapamycin, and (4) LPS+ rapamycin. Rapamycin (1 mg/kg, i.p.) was administrated simultaneously with saline (4 ml/kg, i.p.) or LPS (10 mg/kg, i.p.) injection to rats and mortality was observed during studies. After 4 hours of LPS injection, animals were sacrificed and blood, kidney, heart, lung, and brain samples were collected. Protein expression and/or phosphorylation of ribosomal protein S6 (rpS6), IB-, NF-B p65, HIF-1α, tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, inducible nitric oxide synthase (iNOS), gp91phox, p47phox, ionized calcium binding adaptor molecule (Iba-1), caspase-3, B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) ve Bcl-2-associated X (Bax), and β-actin were measured in the tissue homogenates by immunoblotting as well as nitrite levels in sera by Griess reaction and microglial activity from brain cross sections by immunofluorescence were determined for further analysis. LPS caused an increase in phosphorylated form of rpS6 but it did not effect on its protein expression in addition to enhanced phosphorylation and/or expression of IκB-α, NF-κB p65, HIF-1α, TNF-α, IL-1β, iNOS, gp91phox, p47phox, Iba-1, caspase-3, and Bax proteins while it decreased IκB-α and Bcl-2 protein expressions. Additionally, high nitrite levels and microglial activity were created by LPS. Rapamycin reversed all these effects caused by LPS. In conclusion, results from this study suggest that mTOR could have a role in LPS induced systemic inflammatory response associated with the IκB-α/NF-κB/HIF-1α signalling pathway activation that resulted with several processes like oxidative stress, apoptosis and neuroinflammation in rats.