Nitrik oksit sentaz aktivitesinin non-radyoaktif ölçümü: Biyosensör geliştirilmesi
Non-radioactive measurement of nitric oxide synthase activity : Development of a biosensor
Yazar: ZEYNEP YILMAZ
Danışman: DOÇ. DR. GÜNAY YETİK ANACAK ; DOÇ. DR. PINAR KARA KADAYIFCILAR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Biyosensörler = Biosensors ; eNOS = eNOS ; iNOS = iNOS

Özet:
Nitrik oksit (NO) vazodilatasyon, trombozis, anjiyogenez ve inflamasyonda rol alan ve daha pek çok fonksiyonu düzenleyen, santral ve periferik sinir sisteminde rol alan endojen gaz yapısında bir nöromediyatördür. NO, nitrik oksit sentaz adını alan bir enzim ailesi tarafından üretilir. NOS enzimi; L-arjinini, L-sitrülline dönüştürmek üzere substrat olarak kullanır ve bu reaksiyon sırasında yan ürün olarak nitrik oksit oluşur.  
Endotelyal disfonksiyonun görüldüğü pek çok patolojik duruma, serbest radikaller de eşlik ettiği için, bu durumlarda, hastalığının ve uygulanan tedavilerin NOS enzimi üzerindeki etkilerini araştırmak için en uygun yol NOS aktivitesini ölçmektir. 
Nitrit ve nitrat üzerinden yapılan ölçümler, proteinlerin nitrozilasyonu ve bazı besin takviyelerinden gelen nitratların girişimi nedeniyle her durumda kullanılamazlar.
NOS aktivitesini ölçülmesi için kullanılan en yaygın yöntem radyoaktif işaretli L-arjininin   L-sitrülline dönüşümünün ölçülmesine dayalıdır. Ancak bu tekniğin kullanıcı ve çevre dostu olmaması, ekipmanların pahalı olması, özel eğitimli personele ve özel izinli laboratuvarlara ihtiyaç duyulması, kullanımını kısıtlamaktadır. 
Tasarladığımız biyosensörle NOS aktivitesinin ölçüm yöntemi; L-arjinin ve L-sitrüllinin elektrokimyasal yanıtlarının değerlendirilmesine dayalıdır. Çalışmada elektrokimyasal yöntem olarak Diferansiyel Puls Voltametresi (DPV) kullanılmıştır. 
Tasarlanan biyosensör ile sıçan aortası ve fare penil doku homojenatlarına, substrat ve kofaktörler eklendikten sonra bazal eNOS aktivitesi L-arjinin sinyallerindeki azalma ve L-sitrüllin sinyalindeki artışla istatistiksel olarak anlamlı olarak gösterilebilmiştir. 
Geliştirdiğimiz biyosensörün eNOS aktivitesini ölçtüğü negatif ve pozitif kontrollerle de test edilmiştir. eNOS inhibitörü (L-NNA) uygulaması veya endoteli sıyırılmış dokular kullanılması, kofaktörler ve substratın eklenmesinin neden olduğu L-sitrüllin sinyallerindeki artışı, istatistiksel olarak anlamlı olarak geri çevirirken, asetilkolin (ACh) gibi agoniste bağlı eNOS aktivitesini artırıcı uygulamalar, bu değişimi daha da artırmıştır.
Tasarlanan biyosensörün eNOS aktivitesi dışında, iNOS aktivitesini ölçmede de kullanılıp kullanılamayacağı araştırılmıştır. Kalsiyumsuz ortamda, LPS uygulanmış sıçanların doku homojenatlarıyla yapılan çalışmalar, L-sitrüllin sinyallerinin kontrol dokulara kıyasla anlamlı düzeyde artması ve bu artışın iNOS inhibitörü 1400 W uygulamasıyla istatistiksel olarak anlamlı biçimde geriye çevrilmesi, bu biyosensörle iNOS enzim aktivitesindeki artışı ölçtüğümüzü doğrulamıştır.

Abstract:
Nitric oxide (NO) is a gaseous neurotransmitter in central and periferic neuronal system regulating vasodilation, thrombosis, angiogenesis, and inflammation. NO is produced by an enzyme family called as nitric oxide synthases. NOS enzyme uses L-arginine to convert into L-citrulline and NO is produced as by product. 
Since endotelial dysfunction is accompanied by superoxide species in many pathological conditions, the most appropriate way to investigate the effects of disease and therapies on NOS enzyme is measuring the activity of NOS. 
Measurements over nitrite and nitrate can not be used in all conditions, since there can be interferences arising from protein nitrosylation and some nutritions.
The most common method to measure the activity of this enzyme is measuring the radioactive labelled citrullin formation. But this method is not user- and environmental-friendly, instruments are expensive and needs well-trained personel and special laboratory conditions. Thus, developing a new non-radioactive method is indispensable. 
In our study, a biosensor which is based on non-radioactive measurement of NOS is designed. Biosensor is based on evaluation of electrochemical signals of L-arginine and L-citrulline. Differential Pulse Voltammetry (DPV) is used as electrochemical method.
Addition of cofactors and substrate to the penile and aortic tissue homogenate caused a significant decrease in L-arginine and an increase in L-citrulline signal compared to homogenate alone, showing basal eNOS activity. 
To confirm that we measure the eNOS activity by biosensor, we tested if eNOS inhibitor      L-NNA or with endothelial denuded tissue homogenates reversed it back. As a result, we found out that increase in L-citrulline compared to the signals of control group was inhibited by L-NNA or endothelial denudation significantly. Further Acetylcholine (ACh) -induced agonist dependent eNOS activity could be demonstrated by the developed biosensor as well.
We investigated if we could use the designed sensor not only for eNOS activity also for iNOS activity. We used tissue homogenates of LPS-induced rat. It was found that addition of cofactors without Ca++  in LPS induced rat tissues leads to a statistically significant increase in L-citrullin signal compared to the untreated rat tissues. Beside, this augmentation is reversed by iNOS inhibitor 1400 W, confirming the measurement of iNOS activity.