Hepatokarsinogenez sürecinde Cullin 2 gen ekspresyonu ve aktivasyonunun rolünün hepatoselüler karsinom hücre dizilerinde incelenmesi
Regulation of Cullin 2 ubiquitin ligase expression by HGF/C-Met signaling pathway
Yazar: BURÇİN BARAN
Danışman: PROF. DR. SAFİYE NEŞE ATABEY
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; HIF = HIF ; Heparin = Heparin ; Hipoksi ile indüklenebilen faktör 1 alfa =   ; Karaciğer neoplazmları = Liver neoplasms ; Karaciğer sirozu = Liver cirrhosis ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Kobalt = Cobalt ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Hepatosellüler karsinoma (HCC) sirotik zeminde gelişir. Sirozun tetiklediği fibrogenez süreci hipoksik bir çevrenin oluşmasına neden olur. Bu hipoksik ortamda Hipoksice İndüklenen Faktör (HIF1) birikir. HIF1 glukoz metabolizması, sağ kalım, invazyon, anjiyogenez, metastaz ile ilişkili pek çok genin ekspresyonunu başlatır. HCC'lerde HIF1 birikimi kötü prognozla ilişkilidir.
HIF1 iki altbirimden oluşur: alfa ve ß. Hücrede ß alt birimi devamlı stabil durumdayken, alfa altbiriminin stabilitesi hücredeki oksijen konsantrasyonuna bağlıdır. Cullin 2 (CUL2) E3 ligazlar bu alfa alt birimini parçalanmasında görev yaparlar. Bu sayede hücrede HIF1 birikimini önlerler.
Çalışmamızda önce HCC hücre dizilerinde CUL2 ekspresyon düzeyleri incelendi ve  incelettiğimiz 12 hücre dizisinin tamamında farklı düzeylerde bazal ve aktif (neddile) CUL2 ekspresyonu olduğu saptandı.  Daha sonra HIF1 birikimini artırdığı bilinen bir kimyasal olan Kobalt klorid (CoCl2) uygulamasının HCC hücre dizilerinde CUL2 ekspresyonuna etkisi araştırıldı. RT-PCR ve Western blot (WB) tekniği kullanarak yaptığımız çalışmamızda    SK-Hep 1 ve HuH7 HCC hücre hatlarında CoCl2?nin zamana ve doza bağlı olarak CUL2 ekspresyonunu arttırdığını belirlendi. CoCl2,?ün hücre sağkalımını nasıl etkilediğini belirlemek için MTT yöntemini kullanıldı. 
CUL2 ekspresyonu artışının hangi mekanizma ile gerçekleştiğini belirlemek için HIF1 düzeyinin regülayonunda ve hepatokarsinogenez sürecinde rol oynadığı  bilinen Hepatosit Büyüme Faktörü (HGF) /c-Met yolağının rolünü araştırdık.  Bu yolağı seçmemizde daha önceki mikroarray çalışmalarımızda HGF reseptörü olarak bilinen c-Met aktive edildiğinde  ekspresyonu değişen aday genlerden birinin CUL2 olması da rol  oynadı. HGF veya Heparin aracılıklı c-Met aktivasyonunun CUL2 ekspresyonunu üzerindeki etkisini RT-PCR ve WB yöntemleri ile incelendi. RT-PCR ile Heparin ve HGF'nin tek başına CUL2 transkripsiyonunu arttırırken, birlikte CUL2 transkripsiyonunu baskıladığı belirlendi. WB tekniği kullanılan çalışmada Heparinin doz ve zamana bağlı olarak CUL2, HGF?nin de zamana bağlı olarak CUL2 ekspresyonunu arttırdığı saptandı. 
Sonuç olarak literatürde ilk kez HIF1 artışının, HGF, heparinin CUL2 ekspresyonunu düzenlediği belirlenmiştir. Bu da CUL2'nin hepatokarisnogenez sürecinde önemli rol oynayan bir protein olduğu düşündürmektedir. 

Anahtar kelimeler: CUL2, HIF1, CoCl2, heparin, HGF, HCC

Abstract:
Hepatocellular carcinoma is developing in cirrhotic ground. Cirhosis induces fibrogenesis which leads to formation of a hypoxic environment. In these hypoxic environment HIF1 accumulates. HIF1 activates the expression of many genes related with glucose metabolism, cell survival,  invasion, metastasis and angiogenesis. In HCC HIF1 accumulation is related with poor prognosis. 
HIF1 is composed of  two subunits: alpha and ß.  While ß subunit is constantly stable in cell,alpha subunit stability is dependent on oxygen concentration. CUL2 E3 ligases participates in degradation of HIF1-alpha subunit so prevents HIF1 accumulation in cell.
In our study we showed that Cobalt chloride (CoCl2) is used to mimic hypoxic environment. CoCl2 is known to induce HIF1 in HCC cells. In our study we used RT-PCR and western blot techniques. In our study we showed that CoCl2 induces CUL2 expression in dose and time dependent manner. 
In addition we used CoCl2 to induce cell death in HCC cell lines. We used MTT technique to study CoCl2 effect on SK-Hep1 and HuH7 cell viability on time and dose dependent manner. We showed that CoCl2 induces apoptosis at high doses in HCC cell lines. 
In hepatocarcinogenesis HGF/c-Met pathway is highly activated. HGF/c-Met pathway contirbutes cell survival, motility, invasion and angiogenesis. We studied HGF or Heparin effect on CUL2 expression in HCC cell lines with RT-PCR and western blot techniques. In our study we showed that while Heparin or HGF induces CUL2 transcription separately, they suppress CUL2 transcription together. Furthermore we showed that HGF or Heparin induces CUL2 protein expression in dose and time dependent manner 
To sum up HIF1, Heparin and HGF contrbutes hepatocarciogenesis. In our study we showed that HIF1, Heparin, and HGF increase CUL2 expression. It can be concluded that CUL2 can have an essential role in hepatocarcinogenesis.  

Key words: CUL2, HIF1, hypoxia, Heparin, HGF, HCC