Osteokondral doku mühendisliğinde tabakalı hibrit yapıların geliştirilmesi
Development of layered hybrid structures in osteochondral tissue engineering
Yazar: SELCAN GÜLER AKSAKALOĞLU
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM VARGEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışmada kemik doku mühendisliği ve osteokondral doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere seramik ve deselülerize kemik katkılı Poli(gliserol sebakat) (PGS) elastomer bazlı doku iskeleleri tasarlanmış, üretilmiş ve karakterize edilerek kemik ve osteokondral doku mühendisliğindeki etkinlikleri in-vitro hücre kültürü çalışmalarıyla belirlenmiştir. Tez çalışmasının birinci bölümünde PGS elastomeri subkondral kemik doku iskelesi olarak kullanılmak üzere farklı miktarlarda hücresizleştirilmiş (deselülerize) kemik (deK) hücre dışı matriksi (ECM) ile fonksiyonelleştirilmiştir. Tez çalışmasının ikinci bölümünde ise subkondral kemik doku iskelesi olarak kullanılmak üzere PGS elastomeri farklı miktarlarda β-TCP katkısıyla fonsiyonelleştirilmiştir. Ayrıca, osteojenik farklılaşma bağlamında gözenek boyutu ile PGS elastomer bileşimi arasındaki karmaşık etkileşim de tez çalışmasının ilk iki bölümünde ortaya konmuştur. Tez çalışmasının son bölümünde mezenkimal kök hücreler üzerinde osteojenik etkinliği kanıtlanan seramik ve kemik katkılı subkondral doku iskeleleri kullanılarak bifazik osteokondral doku iskeleleri üretilmiş, karakterize edilmiş ve osteokondrojenik etkinlikleri in-vitro hücre kültürü çalışmalarıyla belirlenmiştir. Tez çalışmasının ilk iki bölümü TÜBİTAK, BİDEB, 2214A- doktora öğrencileri için uluslararası araştırma burs programı tarafından desteklenerek Trinity College Dublin, Trinity Biomedical Sciences İnstitute'de gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasının üçüncü bölümü ise Hacettepe Üniversitesi BAP komisyonu tarafından 19746 No'lu proje ile desteklenmiştir. 
Tez çalışmasının birinci bölümünde MSC'lerin osteojenik soy taahhüdü için dokuya özgü ipuçları içeren ve uygun bir mikro yapı ile kemik doku mühendisliği için PGS elastomeri bazlı biyouyumlu ve biyoaktif bir doku iskelesi geliştirilmiştir. Bu doğrultuda PGS elastomeri, osteoindüktif potansiyelini artırmak amacıyla ağırlıkça %14 ve %28 deselülerize kemik (deK) ECM kaynağı ile fonksiyonelleştirilmiştir. İn-vitro osteogenez için tercih edilen gözenek boyutunu belirlemek amacıyla küçük (100–150 μm) ve büyük (250–355 μm) iki farklı gözenek boyutuna sahip PGS/deK doku iskeleleri tuz uzaklaştırma yöntemiyle üretilmiştir. PGS/deK subkondral doku iskelelerinin hücresizleştirilmiş kemik ECM ile fonksiyonelleştirilmesi, ilkin hücre tutunma verimini %100'e çıkarırken ve osteojenik farklılaşmayı da iyileştirmiştir. Aynı zamanda doku iskelesinin mekanik gücünü 165 kPa'ya kadar artırmıştır. PGS yapısına kemik katkısıyla birlikte ayrıca gelişmiş bir bozunma oranı/pH değişimi ve ıslanabilirlik ile başarılı bir şekilde uyarlandığı ortaya konmuştur. %28 kemik katkılı küçük gözenekli (KG) PGS/deK doku iskelesi, 28 günlük inkübasyon sonrası %12 kütle kaybına uğramış ve ortamın pH değeri yaklaşık 7,14 olarak ölçülmüştür. PGS/deK doku iskelelerinde MSC'lerin in vitro osteojenik farklılaşması, kalsiyum ölçümü, Alkalin fosfataz (ALP) ifadesi ve alizarin kırmızısı ile kanıtlandığı gibi, küçük gözenek boyutlu ve %28 (a/a) kemik katkılı doku iskelelerinin daha iyi bir osteojenik soy taahhüdünü sağladığı ortaya konmuştur. Bu çalışma ile kemik doku iskelesi olarak uyarlanmış PGS/deK doku iskeleleri aracılığıyla MSC'lerin osteoindüksiyonu için uygun gözenek boyutu ve hücresizleştirilmiş kemik ECM miktarı gösterilmiş ve kemik doku mühendisliği uygulamaları için etkili bir aday olduğu ortaya konmuştur. 
Tez çalışmasının ikinci bölümünde dokuya özgü ipuçları içeren ve uygun bir mikro yapı ile PGS elastomeri bazlı biyouyumlu ve biyoaktif subkondral doku iskelesi geliştirilmiştir. Bu doğrultuda PGS elastomeri, osteoindüktif potansiyelini artırmak amacıyla ağırlıkça %14 ve %28 β-TCP katkısı ile fonksiyonelleştirilmiştir. Aynı şekilde in-vitro osteogenez için tercih edilen gözenek boyutunu belirlemek amacıyla küçük (100–150 μm) ve büyük (250–355 μm) iki farklı gözenek boyutuna sahip PGS/β-TCP doku iskeleleri tuz uzaklaştırma yöntemiyle üretilmiştir. PGS yapısına %14 β-TCP katkısıyla birlikte elastik basma modülü 30.56 kPa olarak ölçülmüştür. Yapıda artan β-TCP miktarıyla doku iskelesinin elastik basma modülünde ileri bir iyileşme gözlenmemiştir. Bununla birlikte doku iskelelerinin hidrofilisitesi β-TCP katkısıyla birlikte anlamlı şekilde artmıştır. PGS yapısına katılan seramik miktarındaki artış ile hücre ekim verimliliği %100 olarak ölçülmüştür. β-TCP inkülüzyonu içermeyen küçük gözenekli doku iskelesi (PGS-0TCP-KG) %40.7'lik hücre yapışması gösterirken,  PGS-5TCP-KG doku iskelesi %58.3 ve PGS-15TCP-KG doku iskelesi %100 verimle hücre yapışması sergilemiştir. Yapıdaki yüksek β-TCP inkülüzyonuna rağmen doku iskelesi gözenek boyutunun artmasına bağlı olarak PGS-15TCP-BG doku iskelesinde hücre ekim verimliliği %32.3'ye düşmüştür. PGS/β-TCP kemik doku iskelelerine ekilen domuz kökenli BMSC'lerin SEM analizinde, küçük gözenekli doku iskelesi yüzeyinde geniş yayılma alanı ve doğru kontraktil hücre fenotipi sergilemesinin osteojenik soy taahhütü için faydalı olabileceğini göstermiştir. İn-vitro osteojenik indüksiyon ortamında 21 gün kültür sonrası tüm doku iskelelerinde osteojenik farklılaşmanın geç belirteci olarak Ca miktarı artarken, ALP ifadesindeki artış 21.güne kadar uzamıştır. MSC'lerin osteojenik farklılaşmalarının bir ileri belirteci olarak doku iskelelerinde mineralizasyon Alizarin kırmızısı ile belirlenmiştir. Özellikle küçük gözenekli PGS/β-TCP doku iskelelerinde yoğun pozitif Alizarin kırmızısı gözlenmiştir. Bu çalışma ile kemik doku iskelesi olarak uyarlanmış PGS/β-TCP doku iskeleleri aracılığıyla MSC'lerin osteoindüksiyonu için uygun gözenek boyutu ve β-TCP miktarı gösterilmiş ve kemik doku mühendisliği uygulamalarında başarılı bir şekilde kullanılabileceği ortaya konmuştur. 
Tez çalışmasının üçüncü bölümünde subkondral doku iskelesi olarak ilk iki bölümde en iyi etkinliği gösteren PGS-15deK-KG ve PGS-15TCP-KG doku iskeleleri kullanılarak bifazik osteokondral doku iskeleleri üretilmiştir. Kondral tabaka yerine gözenek boyutu  0-45 μm aralığında tutularak PGS/deK ve PGS/β-TCP subkondral doku iskelesi kalıplarının üzerine kondral tabaka kalınlığı 1 mm'nin üzerinde olacak şekilde belirli miktarda tuz aktarılarak bifazik osteokondral doku iskelelerinin kalıbı oluşturulmuş ve tek seferde yerinde PGS'nin in-situ polimerizasyonu sağlanmıştır. Bifazik ostekondral doku iskeleleri OC-PGS-15deK ve OC-PGS-15TCP olarak adlandırılırken, seramik veya kemik katkısı içermeyen bifazik kontrol doku iskelesi OC-PGS-Ktrl olarak adlandırılmıştır. Yüksek hidrofilik yapıdaki bifazik osteokondral doku iskelelerinin aynı zamanda %90'ın üzerinde çapraz bağlı olduğu belirlenmiştir. Bifazik osteokondral doku iskeleleri 28 günlük inkübasyon sonrası %13 bozunma oranına sahipken tabakalar arası bütünlük korunmuştur, ortam pH değeri 7.2 olarak ölçülmüştür. Bifazik osteokondral doku iskelelerine kondral tabakaya hücre ekimi deselülerize ve nötralize kıkırdak ECM pre-jeline enkapsülasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Bifazik osteokondral doku iskelelerinin kondral tabakaya sıçan BMSC, subkondral tabakaya MC3T3-E1 preosteoblastik hücrelerin ikili kültürü ile hem osteojenik hem de kondrojenik farklılaşma ipuçlarını içeren osteokondrojenik farklılaşma ortamında 28 gün in-vitro kültürü gerçekleştirilmiştir. 28 gün kültür sonrası kondral ve subkondral kemik tabakalarında DNA ve GAG miktarı her bir tabaka için bağımsız ve aynı zamanda kümülatif olarak ölçülmüştür. Histolojik analizler ile osteokondral doku oluşumuna yönelik ipuçları ortaya konmuştur.  

Anahtar Kelimeler: Kemik doku mühendisliği, poli(gliserol-sebakat) (PGS), β-TCP, deselülerizasyon, osteokondral doku mühendisliği, kemik, kıkırdak, pBMSC, rBMSC, MC3T3-E1

Abstract:
In this study, ceramic and decellularized bone inserted Poly(glycerol sebacate) (PGS) elastomer-based scaffolds for use in bone tissue engineering and osteochondral tissue engineering applications were designed, produced and characterized, and their efficiency in bone and osteochondral tissue engineering was determined by in-vitro cell culture studies. In the first part of the thesis, the PGS elastomer was functionalized with different amounts of decellularized bone (deK) extracellular matrix (ECM) to be used as a subchondral bone scaffold. In the second part of the thesis, the PGS elastomer was functionalized with different amounts of β-TCP to be used as a subchondral bone tissue scaffold. In addition, the complex interaction between pore size and PGS elastomer composition in the context of osteogenic differentiation was revealed in the first two chapters of the thesis. In the last part of the thesis, biphasic osteochondral scaffolds were produced and characterized by using ceramic and bone-inserted subchondral scaffolds with proven osteogenic activity on mesenchymal stem cells, and their osteochondrogenic activities were determined by in-vitro cell culture studies. The first two parts of the thesis work were carried out at Trinity College Dublin, Trinity Biomedical Sciences Institute, supported by TÜBİTAK, BİDEB, 2214A- international research scholarship program for doctoral students. The third part of the thesis was supported by the Hacettepe University BAP commission with the project number 19746.
In the first part of the thesis, a biocompatible and bioactive scaffold based on PGS elastomer was developed for bone tissue engineering with a suitable microstructure and containing tissue-specific clues for osteogenic lineage commitment of MSCs. After the PGS elastomer was functionalized with 14% and 28% by weight decellularized bone (deK) ECM source to increase its osteoinductive potential. In order to determine the preferred pore size for in-vitro osteogenesis, PGS/deK scaffolds with two different pore sizes, small (100–150 μm) and large (250–355 μm), were produced by salt removal method. Functionalization of PGS/deK subchondral scaffolds with decellularized bone ECM increased the initial cell adhesion efficiency to 100% and also improved osteogenic differentiation. It also increased the mechanical strength of the scaffold up to 165 kPa. Along with the contribution of bone to the PGS structure, it has also been shown to be successfully adapted with an improved degradation rate/pH variation and wettability. The small pore (KG) PGS/deK scaffold with 28% bone doped lost 12% mass after 28 days of incubation and the pH value of the medium was measured as approximately 7.14. In vitro osteogenic differentiation of MSCs in PGS/deK scaffolds suggests a better commitment to osteogenic lineage of scaffolds with small pore size and 28% (w/w) bone doped, as evidenced by calcium quantification, Alkaline phosphatase (ALP) expression, and alizarin rejection. provided has been demonstrated. In this study, the appropriate pore size and the amount of decellularized bone ECM for osteoinduction of MSCs through PGS/deK scaffolds adapted as bone tissue scaffolds have been demonstrated and it has been demonstrated that they can be used successfully in bone tissue engineering applications.
In the second part of the thesis, a biocompatible and bioactive subchondral scaffold based on PGS elastomer with tissue-specific clues and an appropriate microstructure was developed. Accordingly, the PGS elastomer was functionalized with 14% and 28% β-TCP additives by weight in order to increase its osteoinductive potential. Likewise, to determine the preferred pore size for in-vitro osteogenesis, PGS/β-TCP scaffolds with two different pore sizes, small (100–150 μm) and large (250–355 μm), were produced by salt removal method. The elastic compressive modulus was measured as 30.56 kPa with 14% β-TCP contribution to the PGS structure. No further improvement was observed in the elastic compression modulus of the scaffold with increasing amount of β-TCP in the structure. However, the hydrophilicity of the scaffolds increased significantly with the contribution of β-TCP. With the increase in the amount of ceramic added to the PGS structure, the cell seeding efficiency was measured as 100%. Small-pore scaffold without β-TCP inclusion (PGS-0TCP-KG) showed 40.7% cell adhesion, while PGS-5TCP-KG scaffold showed 58.3% and PGS-15TCP-KG scaffolds with 100% yield. Despite the high β-TCP inclusion in the structure, the cell seeding efficiency in PGS-15TCP-BG scaffold decreased to 32.3% due to the increase in the pore size of the scaffold. SEM analysis of porcine BMSCs seeded on PGS/β-TCP bone scaffolds showed that the small-pore scaffold surface exhibited wide spreading area and the correct contractile cell phenotype could be beneficial for osteogenic lineage commitment. After 21 days of culture in in-vitro osteogenic induction medium, the amount of Ca as a late marker of osteogenic differentiation increased in all tissue scaffolds, while the increase in ALP expression was prolonged until the 21st day. Mineralization of scaffolds was determined with Alizarin red as a further marker of osteogenic differentiation of MSCs. Intense positive Alizarin red was observed especially in small-pore PGS/β-TCP scaffolds. In this study, the appropriate pore size and amount of β-TCP for osteoinduction of MSCs were demonstrated through PGS/β-TCP scaffolds adapted as bone tissue scaffolds, and it was demonstrated that they could be used successfully in bone tissue engineering applications.
In the third part of the thesis, biphasic osteochondral scaffolds were produced by using PGS-15deK-KG and PGS-15TCP-KG scaffolds, which showed the best efficiency in the first two sections as subchondral scaffolds. By keeping the pore size in the range of 0-45 μm for the chondral layer, a certain amount of salt was transferred onto the PGS/deK and PGS/β-TCP subchondral scaffold molds, with a chondral layer thickness above 1 mm, to form a mold of biphasic osteochondral scaffolds, and in-situ polymerization of PGS was created in one go. The biphasic osteochondral scaffolds were named OC-PGS-15deK and OC-PGS-15TCP, while the biphasic control scaffold without ceramic or bone insertions was named OC-PGS-Ktrl. It was also determined that the highly hydrophilic biphasic osteochondral tissue scaffolds were also cross-linked over 90%. Biphasic osteochondral scaffolds had a degradation rate of 13% after 28 days of incubation, while interlayer integrity was preserved, and the media pH value was measured as 7.2. Cell seeding into the chondral layer of biphasic osteochondral tissue scaffolds was accomplished by encapsulation of decellularized and neutralized cartilage ECM pre-gel. Biphasic osteochondral tissue scaffolds were cultured in vitro for 28 days in osteochondrogenic differentiation medium containing both osteogenic and chondrogenic differentiation cues, by co-culture of rat BMSC to the chondral layer and MC3T3-E1 preosteoblastic cells to the subchondral layer. After 28 days of culture, the amount of DNA and GAG in the chondral and subchondral bone layers was measured independently for each layer and also cumulatively for entire biphasic scaffold. Histological analyzes revealed clues to osteochondral tissue formation.

Keywords: Bone tissue engineering, poly(glycerol-sebacate) (PGS), β-TCP, decellularization, osteochondral tissue engineering, bone, cartilage, pBMSCs, rBMSCs, MC3T3-E1