İn vitro üretilen sığır embriyolarının kültür medyumuna L-karnitin eklenmesinin embriyo dondurulması üzerine etkisi
Effect of addition of L-carnitine to the culture media on cryopreservation of bovine embryos produced in vitro
Yazar: MEHMET YILDIZ
Danışman: PROF. DR. YUNUS ÇETİN
Burdur Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Donma-çözülme = Freezing-thawing ; Embriyo = Embryo ; Karnitin = Carnitine ; Sığırlar = Cattles ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Vitrifikasyon yöntemi = Vitrification method ; İn vitro = In vitro

Özet:
Sığır embriyolarının in vitro üretimi (IVP) dünya genelinde giderek artmaktadır. Ancak IVP embriyoların özellikle yavaş dondurmaya karşı oldukça hassas olduğu bilinmektedir. Bunun nedenleri arasında; anormal oositlerden oluşan embriyolar, yüksek sitoplazma lipit içeriği, farklı lipit damlacık düzeni, reaktif oksijen türleri (ROT) seviyelerinin yüksek olması ve iç hücre kütlesinin az olması gibi nedenler bulunmaktadır. L-karnitinin ROT ve lipit miktarını düşürerek, hücreleri DNA hasarından koruyan antioksidan olduğu bildirilmektedir. L-karnitinin hücresel lipit içeriğini düşürücü ve antioksidan etkisi ile, IVP embriyolarında kriyotolerans ve gelişimsel yeteneğini iyileştirebileceği düşünülmektedir. Bu tezin amacı; kültür medyumuna L-karnitin eklenmesinin kültür sırasında ve kriyoprezervasyon sonrasında embriyoların hayatta kalma ve gelişim oranları üzerine etkisi araştırmaktı. Çalışma materyalini, mezbahada kesilen hayvanlardan toplanan 508 ovaryum oluşturdu. Toplanan A ve B kaliteli oositlerden IVP embriyolar üretildi. Kültürün 3. günü klivaj oranları ve 6. günü embriyo gelişimleri değerlendirildi. Erken blastosist ve blastosist aşamasına ulaşan embriyolardan 6 farklı grup oluşturuldu. L-karnitin içeren gruplarda 0-75 mM L-karnitin içermekteydi. Kontrol ve IVK-LK grubunda bulunan emriyolara herhangi bir işlem yapılmadan kültür işlemine devam edildi. Grup YD ve Grup LKYD'de bulunan embriyolar yavaş dondurma, Grup VİT ve Grup LK-VİT'de bulunan embriyolara vitrifikasyon yapıldı. Dondurulan embriyolar en az bir gün sıvı azot içerisinde bekletilip çözdürüldü. Embriyolar çözdürüldükten sonra 3 gün boyunca gelişimleri gözlendi. Kültürün 3. gün ve 6. gün değerlendirilmesinde kültür medyumuna L-karnitin eklenmesinin klivaj ve embriyo gelişimi üzerine etkisi bulunmadı (p>0,05). Kontrol ve Grup LK-IVK incelendiğinde, kültür medyumuna Lkarnitin eklenmesinin 24. saat ve 72. saat sonunda expanded blastosist ve hatching blastosist oranları üzerine etkisinin olmadığı tespit edildi (p>0,05). Ancak 48. saat incelemesinde Grup LK'nın hatching oranlarının Grup Kontrol'e göre daha düşük olduğu belirlendi (p<0,05). L-karnitin, yavaş dondurulan ve vitrifiye edilen embriyolarda çözdürme sonrasında 24, 48 ve 72 saat sonrasında expanded blastosist ve hatching blastosist oranları üzerine etkisinin olmadığı görüldü (p>0,05). Sonuç olarak; IVP embriyoların kültür medyumuna L-karnitin eklenmesi kültürün 3 ve 6. gününde klivaj ve embriyo gelişim oranlarına, vitrifikasyon ve yavaş dondurulan embriyolarda hayatta kalma ve gelişim oranları üzerine etkisinin olmadığı tespit edildi. İlerleyen araştırmalarda materyal sayısını arttırarak çalışmanın tekrarlanması önerilmektedir. Çalışmalarda ticari medyum kullanılacaksa kullanılan medyumun antioksidan içeriğinin ve yoğunluğunun bilinmesi gerekir. Embriyolarda L-karnitin etkinliğinin değerlendirilmesinde lipit içeriklerinin ve ROT seviyelerinin ölçülmesi önerilmektedir.

Abstract:
The in vitro production (IVP) of bovine embryos is increasing worldwide. However, it is known that IVP embryos are very particularly sensitive to slow freezing. Among the reasons for this; There are reasons such as embryos formed from abnormal oocytes, high cytoplasm lipid content, different lipid droplet arrangement, high reactive oxygen species (ROS) levels and low inner cell mass. It is reported that Lcarnitine is an antioxidant by reducing the amount of ROS and lipids and protecting cells from DNA damage. L-carnitine is thought to improve cryotolerance and developmental ability in IVP embryos, with its cellular lipid content lowering and antioxidant effect. The aim of this thesis was to investigate the effect of adding Lcarnitine to a culture medium on the survival and development rates of embryos during culture and after cryopreservation. The study material consisted of 508 ovaries collected from slaughtered animals. IVP embryos were produced from the collected A and B quality oocytes. The cleavage rates on the 3rd day of culture and the embryo development on the 6th day were evaluated. Six different groups were formed from embryos reaching the early blastocyst and blastocyst stage. L-carnitine-containing groups contained 0.75 mM L-carnitine. The culture process was continued without any treatment on the embryos in the control and LK-IVK groups. Embryos in Group YD and Group LK-YD were slow frozen, and embryos in Group VIT and Group LK-VIT were vitrified. Frozen embryos were kept in liquid nitrogen for at least one day and thawed. After the embryos were thawed, their development was observed for 3 days. In the evaluation of the culture on the 3rd and 6th days, the addition of L-carnitine to the culture medium did not effect cleavage and embryo development (p>0.05). When the control and Group LK-IVK were examined, it was determined that the addition of L-carnitine to the culture medium did effect the expanded blastocyst and hatching blastocyst rates at the end of the 24th and 72nd hours (p>0.05). However, at the 48th hour examination, the hatching rates of Group LK were found to be lower than those of Group Control (p<0.05). L-carnitine did not effect expanded blastocyst and hatching blastocyst rates at 24, 48 and 72 hours after thawing in slowly frozen and vitrified embryos (p>0.05). As a result; It was determined that the addition of L-carnitine to the culture medium of IVP embryos did not affect the cleavage and embryo development rates at the 3rd and 6th days of culture, and the survival and development rates of vitrification and slow-frozen embryos. It is recommended to repeat the study with more numbers in future studies. If commercial medium is to be used in studies, the antioxidant content and density of the medium used must be known. It is recommended to measure lipid contents and ROS levels in evaluating the efficacy of L-carnitine in embryos.