Mikrofluidik sistemlerde hematopoetik kök hücre izolasyonu ve karakterizasyonu
Separation and characterization of hematopoietic stem cells by microfluidic systems
Yazar: NİLGÜN OKŞAK
Danışman: PROF. DR. DÜRDANE SERAP KURUCA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Fizyoloji = Physiology ; Hematoloji = Hematology
Dizin: Hematopoetik kök hücreler = Hematopoietic stem cells ; Kök hücreler = Stem cells ; Mikro akışkanlar = Microfluidics ; Mononükleer hücreler = Mononuclear cells

Özet:
Mononükleer hücreler (MNH); lenfosit ve monositler gibi farklılaşmış hücreler ile hematopoetik kök ve VSEL kök hücre gibi ilkel hücrelerden oluşan bir tür beyaz kan hücresidir. MNH'ler tüm kan hücrelerinin %0,06'sından daha azını oluşturur. Bu nedenle oldukça düşük olmalarından dolayı araştırma ve klinik uygulamalar için zenginleştirilmeleri gerekir. Günümüze kadar bu hücrelerin saflaştırılmasında çeşitli teknikler geliştirilmesine rağmen halen etkili bir yöntem bulunmamaktadır. Son on yılda, mikroakışkan sistemler hücre saflaştırmada etkili bir araştırma alanı olmuştur. Bundan dolayı birçok hastalık ve kanser türlerinin tanı ve tedavisinde etkili olduğu ispatlanmış MNH ve VSEL kök hücrelerin ataletsel mikroakışkan sistem ile yüksek verim ve saflıkla izolasyonunu amaçladık.
Sağlıklı kişilerin aferez ve kemik iliği donörlerin kullanılmayan materyalinden fikol tabakalandırma ile MNH zenginleştirildi. Ardından bu hücreler mikroakışkan sistemden geçirilerek ataletsel kuvvetler yöntemi ile, büyüklüklerine ve deformabilite özelliklerine göre ayrıştırıldı ve saflaştırıldı. Son aşamada hücre süspansiyonu mikroçipten geçirildikten sonra, MNH alt grubu hücreleri karakterize etmek için çeşitli pluripotent ve multipotent kök hücre markırları incelendi.
Önerdiğimiz mikroakışkan sistem ile, yüksek verim ve saflıkta MNH ve VSEL kök hücre elde edildi. MNH'ler %97,52'lik bir verimle ve %84 bir saflıkla toplanırken, VSEL kök hücreler %15,76'lık bir saflık ile toplandı. Hücre canlılığının etkilenmediği bu sistemde hücre kaybı oldukça düşüktü. Ataletsel mikrokanal ayırma tekniğimiz; sürekli işleme, yüksek akış hızı (0,7 ml/dk), otomasyon için işlem prosedürlerini basitleştirme ve kanalda tıkanmanın olmaması gibi avantajlara sahiptir. Ek olarak, bu teknik, bir akış sitometride hücrelerin doğrudan analizini kolaylaştırabilir ve manipülasyon işlem sayısını azaltabilir. MNH kök hücre alt gruplarının güvenilir bir şekilde ayrıştırılması rejeneratif tıp alanında önemli sorunları çözecektir.
Anahtar Kelimeler: Kök hücre izolasyonu, mononükleer hücre karakterizasyonu, mikroakışkan sistem

Abstract:
Mononuclear cells are a kind of leukocyte that includes differentiated cells such as lymphocytes and monocytes and primitive cells such as hematopoietic and VSEL stem cells. Although various techniques have been developed for the purification of these cells, there is still no sufficiently good method. In the last decade, microfluidic systems have been an influential area of research in cell purification. Therefore, we aimed to investigate the separation of MNCs and VSEL stem cells using Sunflower-shaped microfluidic system.
After MNCs were enriched by ficoll stratification, these cells were separated according to their size and deformability properties by passing through the microfluidic system. In the final step, in these cells collected at outlets, various pluripotent and multipotent stem cell markers were examined for characterization.
With our proposed microfluidic system, MNCs and VSEL stem cells were obtained with high yields and purity. MNCs could be sorted with a recovery of 97.52% and a purity of 84%, while VSEL stem cells could be collected a purity of 15.76 %. In this microfluidic system, where cell viability was not affected, the cell loss was quite low. Our inertial microchannel separation technique has advantages such as continuous processing, a high operation flow rate (e.g., 0.7 ml/min), simplifying the operative procedures for automation, and creating no clogging problems. Furthermore, this technique can facilitate direct cell analysis in a flow cytometer, reducing the need for man-hand manipulation processes. Reliable separation of subsets of stem cells from MNCs will solve important problems in the field of regenerative medicine.
Key Words: Separation of stem cell, mononuclear cell characterization, microfluidic system