Bakteriyosin üreten Pedıococcus sp. 13 suşunun 16S rRNA ile tanımlanması ve karakterizasyonu
Identification with 16S rRNA and characterization of the bacteriocin producing strain Pediococcus sp. 13
Yazar: EVRİM GÜNEŞ ALTUNTAŞ
Danışman: PROF. DR. KAMURAN AYHAN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında, Pedioccoccus acidilactici 13 suşunun ve ürettiği bakteriyosinin tanımlanması ve karakterizasyonu araştırılmıştır. Bakteriyosin ürettiği belirlenmiş olan suş, öncelikle API test kiti ile biyokimyasal olarak, ardından 16S rRNA dizi analizi yöntemi ile moleküler olarak tanımlanmıştır. Suş ve ürettiği antimikrobiyel maddenin bazı özellikleri belirlendikten sonra, suşun ürettiği bakteriyosinin üretim koşulları optimize edilmeye çalışılmıştır. Amonyum sülfatla çöktürme ve diyaliz uygulanmış bakteriyosinin saflaştırılması aşamasında katyon değişimli kolon ve TSK jel filtrasyon kolonu ile ultrafiltrasyon santrifüj tüpleri kullanılmıştır. Tez çalışmasının son aşamasında ise saflaştırılmış bakteriyosin, iki boyutlu jel elektroforez, tripsin enzimi ile parçalama ve MALDI-TOF ile moleküler ağırlık belirleme aşamalarından oluşan bir seri işlem ile karakterize edilmeye çalışılmıştır. P. acidilactici 13 bakterisi %15 NaCl'ün altındaki konsantrasyonlarda gelişimini devam ettirebilirken, 37 oC optimum gelişme sıcaklığına sahiptir. Suşun bakteriyosin üretimi pH 6.0 ve sıcaklık 37 oC olduğunda en yüksek seviyeye ulaşmaktadır. Elektroforetik olarak yapılan çalışmada bakteriyosinin 55 ile 65 kDa arasında moleküler ağırlığa sahip olduğu gözlenmiştir. Bakteriyosin üretiminin optimizasyonu aşamasında bazı besiyeri bileşenlerinin de üretim üzerindeki etkileri araştırılmış ancak özellikle pH'nın ve sıcaklığın bu konuda etkin oldukları gözlenmiştir. Çalışmanın başlarında 9244 AU/mL antimikrobiyle aktiviteye sahip olan bakteriyosinin optimizasyon denemeleri sonucunda aktivitesi 204800 AU/mL'ye ulaşmıştır. Saflaştırma aşamasında ultrafiltrasyon santrifüj tüpü kullanıldığında bakteriyosin aktivitesinin 819200 AU/mL'ye ulaştığı ve bu yöntemle saflaştırmanın oldukça etkin olduğu gözlenmiştir. Liyofilize edilmiş örnek iki boyutlu jel elektroforezinde moleküler ağırlık ve izolektrik noktasına göre ayrıştırılarak daha ileri düzeyde saflaştırılmıştır. Jelde 50 kDa ve 8 izolektrik noktasında bulunan ve bakteriyosine ait olduğu düşünülen protein spotu tripsin enzimi ile parçalandıktan sonra MALDI-TOF cihazında incelenmiş ve elde edilen bulgulara göre P. acidilactici 13 suşunun ürettiği bakteriyosinin pediosin PA-1 ile uyumlu olabileceği sonucuna varılmıştır. Bu tez kapsamında daha önce yapılan saflaştırma çalışmalarında genellikle kromatografik yöntemlerin önerilmesinin aksine kullanımı daha pratik ve kolay olan ultrafiltrasyon santrifüj tüpünün daha üstün olduğu sonucuna varılmıştır. P. acidilactici 13 suşunun gelişebildiği sıcaklık aralığı ve tuza dirençli olması nedeniyle özellikle fermente gıdalarda koruyucu kültür olarak kullanımını olanaklı kılacağı düşünülmektedir. Ayrıca, üzerinde çalışılan bakteriyosinin aktivitesini 88.6 kat ((819200 AU/mL) / (9244 AU/mL)) artırma olanağı sunmuştur. Bu bakteriyosinin özellikle Listeria monocytogenes patojenine karşı sahip olduğu etki göz önünde bulundurulursa gıdalarda kullanımı güvenli kabul edilen bakteriyosinin diğer gıda koruyucularına karşı kuvvetli bir alternatif olarak gösterilmesi de sözkonusudur.

Abstract:
In this thesis, the identification and characterization of the strain Pediococcus acidilactici 13 and the bacteriocin produced by that strain were searched. The strain which was determined as a bacteriocin producer was identified first biochemically with API test kit then identifed by molecular technique with 16S rRNA gene sequencing method. After defining some properties of the strain and bacteriocin, the production conditions of the bacteriocin produced by the strain were tried to optimized. While purification of the bacteriocin that was applied by ammonium sulphate precipitation and dialysis, cation exchange column and TSK gel filtration column and also ultrafiltration centrifuge tubes were used. At the end of the thesis, the purified bacteriocin was tried to characterized by two dimension (2D) gel electrophoresis, trypsinization and determining the molecular weight by MALDI-TOF. Besides the P. acidilactici 13 can maintain growing under concentrations of 15% NaCl, optimal temperature of the strain is 37 oC. The bacteriocin production of the strain rises to maximum level when the pH is 6.0 and the temperature is 37 oC. It is observed that the molecular weight of the bacteriocin is between 55 and 65 kDa by electrophoresis study. At the stage of optimization of the bacteriocin, the effect of the some components of the medium was also searched but it is sighted that specially pH and temperature are effective on this subject. Activity of the bacteriocin which was 9244 AU/mL at the begining of the study reached to 204800 AU/mL as a result of the optimization experiments. At the purification stage, bacteriocin activity achieved to 819200 AU/mL when ultrafiltration centrifuge tube used and it is observed that purification is considerably effective with this method. Liyophilized sample was advanced purificated by dissociating on molecular weight and isoelectric point by two dimension gel electrophoresis. The protein spot at 50 kDa and 8 isoelectric point on the gel which is thougt as belong to bacteriocin was applied by trypsin, then analysed by MALDI-TOF and according to obtained results it is deduced that the bacteriocin produced by P. acidilactici 13 can be similar with pediocin PA-1. On the contrary to the studies examined on purification offering chromatographic methods, within this thesis, it is concluded that ultrafiltration centrifuge tube whichs usage is more practical and easy is more outstanding method. It is thought that because of growing temperature interval and salt resistance of the strain P. acidilactici, it can be used as protective culture in fermented foods. Further, the studies examined in the thesis, gave a chance to increase bacteriocin activity 88.6 time ((819200 AU/mL) / (9244 AU/mL)). If the inhibition effect especially against to Listeria monocytogenes pathogen of the bacteriocin is considered, bacteriocin whichs usage is accepted as safe in foods could be indicated as a strong alternative to other food preservatives.