Rozmarinik asitin Satureja hortensis L. kallus kültürlerinde üretimi ve optimizasyonu
Production and optimization of the Rosmarinic acid by Satureja hortensis L. callus cultures
Yazar: BEKTAŞ TEPE
Danışman: PROF.DR. ATALAY SÖKMEN
Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, olgun Satureja hortensis L. (sater, anık) tohumlarındanbaşlatılan kallus kültürlerinde, ekonomik önem taşıyan ve bir fenolik asit olanrozmarinik asit'in üretimi ve optimizasyonu araştırıldı. Kallus kültürlerininbaşlatılması ve sürdürülmesinde indol bütirik asit (IBA) (1.00 ppm), 6-benzilaminopürin (6-BA) (1.00 ppm) ve sukroz (% 2.5 w/v) ile desteklenenGamborg'un B5 temel besi ortamı kullanıldı. Kültürlerle yapılan ön çalışmalarda,yukarıda bahsedilen ortam dışında, diğer bitki büyüme düzenleyicisi birleşimleriile farklı karbon kaynakları gerek büyüme ve gerekse toplam fenolik birikimiaçısından beklenen verimi sağlamadı. Bu nedenle farklı IBA/6-BA birleşimleri ilefarklı sukroz derişimlerini içeren uygulamalara geçildi. Tüm uygulamalar süreklikaranlık ortamda yapıldı. IBA/6-BA birleşimlerinin büyüme ve rozmarinik asitbirikimi üzerine etkilerinin araştırıldığı uygulamalarda (1-15. uygulamalar), enyüksek yaş biyokütle verimi 1.00 ppm IBA ve 5.00 ppm 6-BA'nın kullanıldığıuygulamadan elde edildi. En düşük verim ise 10.00 ppm IBA ve 1.00 ppm 6-BA'nın kullanıldığı uygulamadan elde edildi.Bu uygulamalardan elde edilen yaş ve kuru kütle verimlerideğerlendirildiğinde, kültür ortamında büyümede asıl belirleyici etkenin 6-BAderişimlerindeki artışın olduğu anlaşıldı. Ancak bu artışın belirli bir noktaya kadarbiyokütle artışını desteklediği ve bu noktadan sonra verimin tekrar düşüşe geçtiğibelirlendi.Rozmarinik asit birikimi esas alındığında ise, büyüme ve rozmarinik asitüretimi arasında zıt bir ilişki olduğu belirlendi. En yüksek biyokütle verimi 1.00ppm IBA ve 5.00 ppm 6-BA'nın yer aldığı uygulamadan elde edilmesine rağmen,en yüksek rozmarinik asit birikimi 1.00 ppm IBA ve 1.00 ppm 6-BA'nın iledesteklenen uygulamadan sağlandı. Bu uygulama aynı zamanda standart ya dakaynak kültürdür.Sukroz derişimlerinin büyüme ve rozmarinik asit birikimi üzerine etkilerininaraştırıldığı uygulamalarda en yüksek yaş biyokütle kütle verimi % 4.0 (w/v)sukroz bulunan uygulamadan elde edildi. En düşük verim ise % 1.0 (w/v) sukrozbulunan uygulamadan elde edildi. Bu kısımda büyüme üzerindeki belirleyicietkenin sukroz derişimindeki artış olduğu, ancak % 4.0 (w/v)'den daha yüksekderişimlerin büyümeyi olumsuz etkilediği belirlendi.Bu kısımda en yüksek rozmarinik asit birikimi % 3.0 (w/v) sukroz bulunanuygulamadan elde edildi. Yabani S. hortensis bitkisi ile yapılan çalışmalarsonucunda 25.02 Â± 1.21 mg/g rozmarinik asit tespit edildi. HPLC analizlerisonucunda elde edilen veriler, spektrofotometrik veriler ile yüksek orandatutarlılık gösterdi.Tüm uygulamalarda su içeriğinin (hiperhidrisite) yüksek olduğu belirlendi.Ancak, yalnızca yüksek sukroz derişimleri kullanılan uygulamalarda su içeriğindebir azalma gözlendi.Çalışma süresince, kallusların hiçbirisinde farklılaşma gözlenmedi.Sonuç olarak, S. hortensis kallus kültürleri ile hem yeterli biyokütle verimihem de yüksek rozmarinik asit üretimi için en ideal ortamın 1.00 ppm IBA, 1.00ppm 6-BA ve karbon kaynağı olarak % 3.0 sukroz bulunan Gamborg'un B5 besiortamı olduğu belirlendi.Anahtar Kelimeler: Satureja hortensis L., Rozmarinik asit, Kallus, HPLC,İndol bütirik asit, 6-Benzil adenin, Sukroz.

Abstract:
In this study, production and optimization of rosmarinic acid, a phenolicacid and an economically important metabolite, was investigated in the calluscultures established from the mature seeds of Satureja hortensis L. (summersavory) plant. Gamborg?s B5 basal medium, supplemented with indol butyric acid(IBA) (1.00 ppm), N6 benzyl aminopurine (6-BA) (1.00 ppm) and sucrose (% 2.5w/v), was employed for the establishment and maintenance of the callus cultures.In the preliminary experiments carried out with proformed calli, neither biomassyield nor total phenolics accumulation was much lower than expected, except forthe aforesaid culture medium. Therefore, applications were individually preparedby preferring the media containing different IBA/6-BA combinations and sucroseconcentrations. All applications were carried out in the continuous dark room. Inthe applications, where the effects of IBA/6-BA combinations on the growth androsmarinic acid accumulation were assayed (1-15. applications), the highestbiomass yield was obtained from the medium supplemented with 1.00 ppm IBAand 5.00 ppm 6-BA. The lowest yield was, on the other hand, determined in theapplication containing 10.00 ppm IBA and 1.00 ppm 6-BA.When the fresh and dry biomass yields obtained from these applicationswere evaluated it was understood that the major determinative factor on thegrowth is the increased 6-BA concentration. However, this increase was supportedat a precise point where the 6-BA concentration was 5.00 ppm and then the yieldhas become gradually decreased.In the case of the rosmarinic acid accumulation, an opposite relationship wasdetermined between the growth and rosmarinic acid production. While the highestbiomass yield was obtained from the medium containing 1.00 ppm IBA and 5.00ppm 6-BA, the highest rosmarinic acid accumulation was obtained from themedium with 1.00 ppm IBA and 1.00 ppm 6-BA. At the same time, thisapplication was employed as standart (seed) culture.In the applications where the effects of sucrose concentrations on the growthand rosmarinic acid accumulation were examined, the highest biomass yield wasobtained from the medium which was supplemented with 4.0% (w/v) sucrose. Thelowest yield, however, was obtained from the medium containing 1.0% (w/v)sucrose. For this category, it can be concluded that the determinative factor on thegrowth was the increased concentration of sucrose, but higher concentrations (i.e.4.0% and onwards) were also found to have negative effect on the growth.In this category, the highest rosmarinic acid accumulation was obtainedfrom the medium which was supplemented with 3.0% (w/v) sucrose. According tothe experiments carried out with the wild S. hortensis, it is found to have 25.02 Â±1.21 mg/g rosmarinic acid. Results obtained from the HPLC analysis showed astrong correlation with the data revealed from spectrophotometric assays.In the all applications calli were found to be hyperhydric and, therefore, itcan be said that none of applications employed in this study was capable ofreducing the hyperhydricity in the cultures.No differentiation was observed in any callus during the course of this study.In conclusion, Gamborg?s basal medium (B5) supplemented with 1.00 ppmIBA, 1.00 ppm 6-BA and sucrose as carbon source 3.0% (w/v) can be suggestedas the most appropriate medium for both sufficient biomass and higher rosmarinicacid production.Key Words: Satureja hortensis L., Rosmarinic acid, Callus, HPLC, Indolbutyric acid, N6 benzyl amino purine, Sucrose.