Horseradish peroksidaz enziminin saflaştırılması için yeni bir afinite komotografi yönteminin geliştirilmesi
Development of a new afinity chromatography method for the purification of horseradish peroxidase enzyme
Yazar: SERPİL GERNİ
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; Amino benzohidrazid türevleri = Amino benzohydrazide derivatives ; Horseradish peroxidase = Horseradish peroxidase ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında 4-Amino benzohidroksamik asit türev molekülleri kullanılarak Horseradish Peroksidaz (HRP) enziminin tek basamakta ve yüksek verimde saflaştırılması için en etkili ve yeni afinite ligantlarının belirlenmesi hedeflendi. 
Yöntem: İlk defa 4-Amino 2-metoksi benzohidroksamik asit, 4-Amino 3-nitro benzohidroksamik asit, 4-Amino 3-metil benzohidroksamik asit ve 4-Amino 3-kloro benzohidroksamik asit molekülleri sentezlenerek HRP enziminin saflaştırılmasında kullanıldı. Moleküllerin metilbenzoat formlarından hidroksamik sentezleri yapılarak HRP enzimleri üzerine inhibisyon etkileri incelendi ve dönüşümlü inhibisyon gösteren moleküller Sepharose-4B-L-Tirozin jel materyaline bağlanarak elde edilen afinite jelleri ile tek kademede HRP enziminin saflaştırılması gerçekleştirildi. FT-IR ile afinite jeli kontrol edildi.
Bulgular: 4-Amino 2-metoksi benzohidroksamik asit molekülü ligand olarak kullanılarak  sentezlenen afinite jeli ile Horseradish POD enzimi %35,97 verimle 601,13 kat, 4-Amino 3-nitro benzohidroksamik asit molekülü %14,00 verimle 404,11 kat, 4-Amino 3-metil benzohidroksamik asit molekülü %8,70 verimle 394,88 kat, 4-Amino 3-kloro benzohidroksamik asit molekülü %4,48 verimle 284,85 kat saflaştırıldı. Tüm kolonlardan saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı ve enzim saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildikten sonra sonucun doğruluğunu teyit etmek amacıyla western blot analizi yapıldı. HRP enzimi için 40-50 kDa'da tek bant gözlendi. 4-Amino 3-nitro benzohidroksamik asit ve 4-Amino 3-metil benzohidroksamik kolonları için kolon tutma kapasitesi, HRP enzimi için değişik pH, sıcaklık, iyonik şiddetlerde çalışıldı. 4-Amino 3-nitro benzohidroksamik asit kolonu için HRP enzimi pH 8,0 sıcaklık 15°C, I 0,4 M, 4-Amino 3-metil benzohidroksamik asit kolonu için ise pH 7,5 sıcaklık 20 °C, I 0,4 M olarak hesaplandı.
Sonuç: Tez kapsamında Sepharose-4B-L-tirozin-4-amino-2-metoksi benzohidroksamik asit ligandının, bilinen diğer ligandlara oranla HRP enzimini daha yüksek verimle saflaştırdığı bulundu.

Anahtar Kelimeler: horseradish peroksidaz (HRP), afinite kromatografisi, saflaştırma, 4-amino benzohidroksamik asit türevleri

Abstract:
Aim: In this thesis, it was aimed to determine the most effective and new affinity ligands for the purification of Horseradish Peroxidase (HRP) enzyme in one step and with high efficiency by using 4-Amino benzohydroxamic acid derivative molecules.
Method: For the first time, 4-Amino 2-methoxy benzohydroxamic acid, 4-Amino 3-nitro benzohydroxamic acid, 4-Amino 3-methyl benzohydroxamic acid and 4-Amino 3-chloro benzohydroxamic acid molecules were synthesized and used in the purification of HRP enzyme. Inhibition effects on HRP enzymes were investigated by hydroxamic synthesis of molecules from methylbenzoate forms, and HRP enzyme purification was carried out in one step with affinity gels obtained by binding reversible inhibiting molecules to Sepharose-4B-L-Tyrosine gel material. The affinity gel was checked with FT-IR.
Results: When 4-Amino 2-methoxy benzohydroxamic acid was used as ligand, Horseradish POD enzyme was purified 601.13 fold with a yield of 35.97%, 404.11 fold with a yield of 14.00% with 4-Amino 3-nitro benzohydroxamic acid, 394,88 fold with a yield of %8,70 with 4-Amino 3-methyl benzohydroxamic acid, 284,85 fold with a yield of %4,48 with 4-Amino 3-chloro benzohydroxamic acid. After checking the purity and molecular weight of the enzyme purified from all columns by SDS-PAGE, western blot analysis was performed to confirm the accuracy of the result. For the HRP enzyme, a single band was observed at 40-50 kDa. Column holding capacity of 4-Amino 3-nitro benzohydroxamic acid and 4-Amino 3-methyl benzohydroxamic columns were studied for HRP enzyme at different pH, temperature, and ionic strengths (I). The optimum conditions for 4-Amino 3-nitro benzohydroxamic acid column against HRP enzyme were calculated as pH 8.0, temperature 15°C, I 0,4 M and for 4-Amino 3-methyl benzohydroxamic acid column as pH 7.5 temperature 20 °C,  I 0,4 M. 
Conclusion: Within the scope of the thesis, it was found that Sepharose-4B-L-tyrosine-4-amino-2-methoxy benzohydroxamic acid ligand purified the HRP enzyme with higher efficiency compared to other known ligands.

Keywords: horseradish peroxidase (HRP), affinity chromatography, purification, 4-amino benzohydroxamic acid derivatives