Efervesan tabletlerde L-Askorbik asit tayini için mikroakışkan düzeyde kolorimetrik yöntem geliştirilmesi
For the determination of  L-Ascorbic acid in efervescent tablets development of colorimetric method at microfluidic level
Yazar: MERVE SÜMEYYE KÜRELİ DEMİR
Danışman: PROF. DR. BİRSEN DEMİRATA ÖZTÜRK ; DR. KADRİYE IŞIL BERKER ÇETİN
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
L-Askorbik asit, yaygın adıyla bildiğimiz C vitamini, başlıca doğal antioksidanlardan biridir. Günlük olarak tüketimi insanlar için hayati önem taşımaktadır. A, D, E ve K vitaminleri vücutta depolanırken, B ve C vitaminleri vücutta depolanamamaktadır ve günlük olarak tüketilmelidir. L-Askorbik asit kristal formda oda koşullarında uzun süre bozulmadan saklanabilirken, sulu çözelti formunda ısı ve ışık etkileşimi dolayısıyla degredasyona uğrayarak kimyasal yapısı bozulmaktadır. Dolayısıyla, L-Askorbik asit tayin edilirken hızlı çalışmak önem taşımaktadır. Antioksidan tayini için kullanılan birçok yöntem bulunmaktadır. Hidrojen atomu transferine (HAT) dayalı ORAC, TRAP yöntemleri ve elektron transferine (ET) dayalı TEAC, FRAP, CUPRAC, CERAC, DPPH ve FCR yöntemleri başlıca antioksidan tayin yöntemlerindendir. L-askorbik asit ve farklı antioksidan türleri, öncelikle bilinen yöntemlerle tayin edildi. Bu çalışmada, L-Askorbik asit, trolox ve kuersetinin antioksidan kapasitelerini belirlemek için FRAP ve ferrosiyanür yöntemleri kullanıldı. Çalışmanın devamında, L-askorbik asit tayini için yeni bir kolorimetrik metod geliştirildi. Çözelti formunda bozulabilir bir yapıya sahip olan L-askorbik asit örnekleri, katı bir destek malzemesi kullanılarak uzun süre saklanabilecek numune formuna dönüştürüldü. Literatürde mevcut çalışmalara göre Cr(IV), Fe(II), Cd(II), Pb(II) gibi ağır metal iyonlarının destek malzemesine bağlanarak fiber optik reflektans spektrofotometre ile tayin edildiği bilinmektedir. Literatürdeki mevcut çalışmalar göz önünde bulundurularak, fiber optik yansıma spektrofotometresi ile antioksidan tayini için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Fiber optik reflektans spektrofotometrenin çalışma prensibine göre; yüzeye gönderilen ve geri yansıyan ışığın yansıma yüzdesi ölçülür. Bu nedenle, FORS ile tayin yapılabilmesi için bir destek malzemesine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada antioksidan tayini, AMI-7001 markasına ait anyon değişim membranı kullanılarak fiber optik yansıma spektrofotometresi ile gerçekleştirildi. L-Askorbik asit örnekleri tayin edilirken oluşturulan kompleks destek maddesine tutturularak, bozulmadan uzun süre dayanması sağlandı. Destek maddesi yüzeyine tutturulan demirli kompleks yapı, L-Askorbik asit tarafından indirgendi ve indirgenen mor renkli komplekse ait % reflektans değerlerine bakıldı. Çalışmanın özünde, ilk olarak ferrozin kompleksi destek malzemesine tutturuldu ve destek malzemesinin yüzeyine tutturulan ferrozine, Fe(III) eklenerek FZ-Fe(III) kompleksi oluşturuldu. Oluşan FZ-Fe(III) kompleksi L-askorbik asit örnekleri ile etkileşime girdiğinde FZ-Fe(II) yapısına indirgendi. 20 dakika boyunca L-askorbik asit örnekleri içerisinde tutulan renklenmiş membranlar 20. dakikanın sonunda çıkarıldı yani reaksiyon 20. dakikada durduruldu. Mor renkli FZ-Fe (II) kompleksinin kromatikliği kullanılarak yansıma ölçümü yapıldı. Artık dayanıklı formda bulunan örneklerin renkli olmasından faydalanılarak L-Askorbik asit tayini sağlandı. Sonuç olarak, fiber optik sensörler kullanılarak mikroakışkan seviyesinde L-askorbik asit tayini için kolorimetrik bir yöntem geliştirildi. Işığı yansıtma yüzdesi ve antioksidan konsantrasyonu arasında bir ilişki olduğu tespit edildi. Fiber optik reflektans spektrofotometresi tarafından membran yüzeyine ışık gönderildi ve geri yansıyan ışık % reflektans olarak saptandı. Tam yansıma prensibi ile herhangi bir kayba uğramadan ışık ilerledi ve yüzeye düşürüldü. Bu prensibe dayanarak yüksek konsantrasyona sahip antioksidan örnekleri ile etkileşen membranın daha koyu renge büründüğü görüldü ve daha az ışık yansıttığı belirlendi. Konsantrasyona karşı reflektans değerleri alınarak kalibrasyon doğrusu oluşturuldu. Elde edilen reflektans ve konsantrasyon arasında lineer ilişki olduğu, reflektans değerinden yola çıkarak konsantrasyon tayin edilebildiği tespit edildi. Efervesan tablet örneklerine uygulanan bu method bilinen derişime sahip askorbik asit örneklerinin geri kazanımıyla doğrulandı. Antioksidan tayini için uygulama kolaylığı sunan, hızlı yanıt veren, çevre dostu, tekrar edilebilir ve hesaplı olan bu kolorimetrik yöntem geliştirildi. Farklı metotlar kullanarak yapılan antioksidan tayinlerinde ulaşılan veriler ile geliştirilen yöntem sonucunun örtüştüğü belirlendi. Geliştirilen yöntem vasıtası ile L-askorbik asit geri kazanımında elde edilen sonuçların istatistiksel olarak mukayese edilerek, tutarlı sonuçlar elde edildi.

Abstract:
L-Ascorbic acid, commonly known as vitamin C, is one of the main natural antioxidants. Its daily consumption is vital for humans. While vitamins A, D, E and K are stored in the body, vitamins B and C cannot be stored in the body and must be consumed daily. While L-Ascorbic acid can be stored in crystal form without deterioration for a long time at room conditions, its chemical structure deteriorates in aqueous solution form due to heat and light interaction. L-Ascorbic acid solution begins to lose its properties within 2 hours after preparation. Therefore, it is important to work quickly when determining L-Ascorbic acid. The most stable condition of L-ascorbic acid solution is in the pH 5-6 range. 
Vitamin C, which must be consumed daily since it is not stored in the body, prevents the excess of free radicals in the body and provides protection against immune-reducing diseases. L-ascorbic acid supplementation is very important to strengthen the immune system, delay aging and protect against diseases. It acts as a shield against damage that may be caused by oxidative stress by neutralizing free radicals released as by-products during metabolic activities. Vegetables and fruits such as oranges, lemons, parsley, rose hips and green peppers are foods that should be included in the nutritional routine because they have rich vitamin C content. It is possible to meet the need for vitamin C not only from fruits and vegetables but also with nutritional supplements with L-ascorbic acid content, which are commercially available in tablet form. The presence of L-ascorbic acid is of great importance not only for human life but also for the maintenance of enzymatic activities of plants.
There are many methods used for antioxidant determination. ORAC, TRAP methods based on hydrogen atom transfer (HAT) and TEAC, FRAP, CUPRAC, CERAC, DPPH and FCR methods based on electron transfer (ET) are the main antioxidant determination methods. While developing the new method, L-ascorbic acid and different antioxidant species were determined by known methods. At this study, FRAP and ferrocyanide methods were used to determine the antioxidant capacities of L-Ascorbic acid, trolox and quercetin. 

L-ascorbic acid samples, which have a perishable structure in solution form, were determined in a form that can be stored for a long time by using a solid support material. According to the studies available in the literature, it is known that heavy metal ions such as Cr(IV), Fe(II), Cd(II), Pb(II) were determined by the fiber optic reflectance spectrophotometer by attaching to the support material. Considering the existing studies in the literature, a new method for antioxidant determination by fiber optic reflectance spectrophotometer, was developed. According to the working principle of fiber optic reflectance spectrophotometer; the percentage of reflection of light sent on the surface and reflected back is measured. For this reason, a support material is needed for determination with FORS. In this study, antioxidant determination was performed by fiber optic reflectance spectrophotometer using AMI-7001 anion exchange membrane. In this study, L-Ascorbic acid samples were attached to the complex support material while determining them, ensuring that they last for a long time without deterioration. The ferrous complex structure attached to the support surface was reduced by L-Ascorbic acid and the % reflectance values of the reduced  purple complex were examined. The colored membranes, which were kept in the L-ascorbic acid samples for 20 minutes, were removed at the end of the 20th minute, that is, the reaction was stopped at the 20th minute. L-Ascorbic acid determination was achieved by taking advantage of the color of the samples, which were now in durable form. In the core of the study, the ferrozine complex was first attached to the support material and the FZ-Fe (III) complex was formed by adding Fe (III) to the ferrozine attached to the surface of the support material. The formed FZ-Fe (III) complex was reduced to FZ-Fe (II) form when it interacted with L-ascorbic acid samples. Reflectance measurement was performed using the chromaticity of the purple colored FZ-Fe (II) complex. As a result, a colorimetric method for the determination of L-ascorbic acid at the microfluidic level using optical fiber sensors was developed.
It was determined that there was a relationship between the percentage of light reflection and antioxidant concentration. Light was sent to the membrane surface by the fiber optic reflectance spectrophotometer and the reflected light was determined as % reflectance. With the principle of full reflection, the light traveled and fell on the surface without any loss. Based on this principle, it was determined that the membrane interacting with high concentration antioxidant samples became darker and reflected less light. The light traveling in the fiber optic cable according to the principle of total reflection is sent to the sample without loss of energy, and after the reflected beam reaches the detector, the signal is processed in the signal processor to obtain the reflectance (%) spectrum against wavelength (nm). Maximum reflectance values are found at 562 nm wavelength. There should be a linear relationship between the sample concentration and the analytical signal. A calibration line was constructed to determine the concentration (mol/L)-reflectance (%) relationship. Reflectance values at 562 nm wavelength are taken while creating the calibration curve. The calibration curve consisting of reflectance values versus concentration is plotted. 
The linear working range was determined by considering deviations from linearity in the calibration curve. It was determined that there was a linear relationship between the reflectance and concentration obtained and  the concentration could be determined based on the reflectance value. This method applied to effervescent tablet samples was validated by the recovery of ascorbic acid samples of known concentration. L-ascorbic acid contained in effervescent tablet samples was determined by the developed method and the accuracy of the method was determined by recovering L-ascorbic acid samples of known concentration. The limit of detectability (LOD) and limit of observability (LOQ) were determined and evaluated with this method developed for the determination of L-ascorbic acid by fiber optic reflectance spectrophotometry.
This colorimetric method, which is easy to apply, responsive, environmentally friendly, reproducible and affordable, was developed for antioxidant determination. It is aimed to match the data obtained in antioxidant determinations using different methods with the results of the developed method. It was concluded that the results obtained in L-ascorbic acid recovery with the developed method were compared statistically and confirmed each other.