Transient reseptör potansiyel vanilloid-1 (TRPV1) reseptör antagonisti kapsazepinin sıçan nöron hücrelerinde mitokondriyal hasar, apoptozis ve morfin toleransına etkileri
Effects of transient receptor potential vanilloid-1 (TRPV1) receptor antagonist capsazepine on mitochondrial damage, apoptosis and morphine tolerance in rat neuron cells
Yazar: AYŞEGÜL ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. ERCAN ÖZDEMİR
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Ortak Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Ağrı = Ağrı ; Morfin =

Özet:
Opioidler ağrı kesici olarak kullanılan güçlü ilaçlardır. Ancak, uzun süreli kullanımları analjezik etkilerine karşı tolerans gelişimine yol açtığı için terapötik potansiyelleri sınırlıdır. Opioid toleransı karmaşık bir süreçtir ve altta yatan mekanizmalar tam olarak açıklanmamıştır. Toleransın nasıl azaltılabileceğinin anlaşılması, bu ajanların terapötik kullanımında önemli bir avantaj sağlayacaktır. Bu çalışma, morfin toleransı oluşturulmuş sıçanlarda TRPV1 reseptör antagonisti kapsazepinin (KPZ) morfine bağlı gelişen mitokondriyal hasar, apoptozis ve antinosiseptif tolerans üzerine etkilerini analjezi testleri, biyokimyasal ve immünohistokimyasal yöntemler kullanarak araştırmak amacıyla tasarlanmıştır. 
Çalışmada 36 adet (230-250 gr) Wistar Albino sıçan kullanıldı. Morfine karşı tolerans geliştirmek amacıyla sıçanlara 7 gün boyunca morfin (10 mg/kg, s.c) verildi ve ardından 8. gün tedavi dozunda morfin (5 mg/kg, s.c ) uygulanarak analjezi testleri ile tolerans değerlendirmesi yapıldı. TRPV1 reseptör antagonisti KPZ'nin morfin analjezisi ve toleransına etkileri tail-flick ve hot-plate analjezi testlerinde belirli dakika aralıklarında (0, 15, 30, 60, 90 ve 120. dk) ölçüldü (n=6). Tüm gruplara ait sıçanlar, analjezi ölçümlerinden sonra biyokimyasal ve immünohistokimyasal analizler için servikal dislokasyon ile sakrifiye edilerek dorsal kök gangliyonları (DKG) izole edildi. 
Elde edilen bulgularda, KPZ'nin morfinle birlikte uygulaması morfinin analjezik etkisini istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artırırken (p˂0.05) tek başına uygulanması analjezik etkide anlamlı bir değişiklik göstermedi (p>0.05). Morfin toleransı geliştirilen sıçanlarda analjezik etkinlik morfin grubuna göre azaldı (p˂0.001). Buna karşın morfin tolerant grubuna KPZ uygulanması morfinin analjezik etkisinde anlamlı bir artışa neden oldu (p˂0.001). 
DKG nöronlarında yapılan biyokimyasal ve immünohistokimyasal analizler sonucunda morfin tolerant grubunda, kontrol grubuna göre mitokondriyal hasar belirteçlerinden sitokrom-c ve AIF ekspresyonlarının anlamlı düzeyde arttığı tespit edildi (p<0.001). Buna karşın tolerant grubu sıçanlara KPZ uygulanması sitokrom-c ve AIF seviyelerinde azalmaya neden oldu (p˂0.001). ELISA test sonucunda tolerant grubunda proapoptotik protein olan Bax seviyesi kontrol grubuna göre artarken, antiapoptotik faktör Bcl-2 seviyesinin azaldığı saptandı (p<0.001). KPZ uygulanması ile Bax seviyesi morfin tolerant grubuna göre azalırken, Bcl-2 seviyesi anlamlı oranda arttığı tespit edildi (p<0.001). Aynı zamanda kaspaz-9 ve kaspaz-3 seviyesinin morfin tolerant grubunda arttığı, KPZ uygulaması ile azaldığı her iki yöntemle de belirlendi (p<0.001).
Sonuç olarak, elde edilen bulgular TRPV1 kanal aktivasyonunun morfinin analjezik etkisine karşı tolerans gelişiminde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Buna karşın, TRPV1 kanal reseptörünün KPZ ile bloke edilmesinin DKG nöronlarında mitokondriyal hasar ve apoptozu önleyerek morfine karşı tolerans gelişimini azalttığını ortaya çıkarmıştır.

Abstract:
Opioids are potent medications commonly used for pain relief. However, their therapeutic efficacy is often compromised due to the development of tolerance with long-term use, which diminishes their analgesic effects. Opioid tolerance is a multifaceted phenomenon, and the underlying mechanisms remain incompletely understood. Understanding how tolerance can be reduced will significantly enhance the therapeutic use of these agents. This study aims to investigate the effects of the TRPV1 receptor antagonist capsazepine (KPZ) on morphine-induced mitochondrial damage, apoptosis, and antinociceptive tolerance in morphine-tolerant rats, utilizing analgesia tests, biochemical and immunohistochemical methods.
In this study, 36 Wistar Albino rats (weighing between 230 and 250 g) were utilized. To develop tolerance to morphine, the rats were administered morphine (10 mg/kg, s.c) for 7 consecutive days. On the 8th day, a treatment dose of morphine (5 mg/kg, s.c) was given, followed by analgesia tests and tolerance evaluations. The effects of the TRPV1 receptor antagonist KPZ on morphine analgesia and tolerance were assessed using tail-flick and hot-plate analgesia tests at specific time intervals (0, 15, 30, 60, 90, and 120 minutes) with a sample size of six rats per group (n=6). After the analgesia measurements, all rats were sacrificed by cervical dislocation, and the dorsal root ganglia (DKG) were isolated for biochemical and immunohistochemical analyses.
In the findings obtained, the administration of KPZ in conjunction with morphine significantly enhanced the analgesic effect of morphine (p<0.05). However, the administration of KPZ alone did not result in a significant change in analgesic effect (p>0.05). In rats that developed morphine tolerance, the analgesic efficacy was reduced compared to the morphine-only group (p<0.001). Conversely, the administration of KPZ to the morphine tolerant group resulted in a significant increase in the analgesic effect of morphine (p<0.001).
As a result of biochemical and immunohistochemical analyses conducted on dorsal root ganglion (DRG) neurons, the expressions of cytochrome c and apoptosis-inducing factor (AIF), which are markers of mitochondrial damage, were found to be significantly elevated in the morphine-tolerant group compared to the control group (p<0.001). Conversely, the administration of KPZ to the morphine tolerant rats resulted in a reduction of cytochrome c and AIF levels (p<0.001). The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) revealed that the level of the pro-apoptotic protein Bax increased in the morphine-tolerant group compared to the control group, while the level of the anti-apoptotic factor Bcl-2 decreased (p<0.001). Following KPZ treatment, the Bax level decreased in comparison to the morphine tolerant group, while the Bcl-2 level increased significantly (p<0.001). Additionally, levels of caspase-9 and caspase-3 were elevated in the morphine-tolerant group and decreased following KPZ treatment in both assays (p<0.001). 
In conclusion, the findings indicate that the activation of the TRPV1 channel plays a significant role in the development of tolerance to the analgesic effects of morphine. Conversely, the blockade of the TRPV1 receptor by KPZ prevented mitochondrial damage and apoptosis in DKG neurons, thereby reducing the development of tolerance to morphine.