Lateral Flow Immunoassay (LFI) tabanlı alternatif Crossmatch tanı kiti geliştirilmesi
Development of Lateral Flow Immunoassay (LFI) based alternative Crossmatch diagnostic kit
Yazar: MUHAMMET ALİ GÜRBÜZ
Danışman: DOÇ. DR. HASAN DOĞAN ; PROF. DR. MESUT TAŞKIN
Atatürk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Amaç: Transplantasyon immünolojisi alanında kullanılan geleneksel CM testleri uzun çalışma süresi, yüksek maliyet, deneyimli personel ihtiyacı vb. dezavantajlara sahiptir. Bu olumsuzlukların giderilmesi amacıyla, son yıllarda sağlık alanında çokça kullanılan LFI alt yapısına sahip yeni bir CM testinin geliştirilmesi hedeflenmiştir.
Materyal ve Metot: Potansiyel verici kan örneklerinden immünomanyetik izolasyon yöntemiyle CD45(+) lökositler ile yoğunluk farkına bağlı izolasyon yöntemiyle PBMC elde edildi. Hücreler, %10'luk lizis tamponu ile karıştırılıp 3000 rpm'de 3 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatant kısmı verici hücre lizatı olarak ayrıldı. CM reaksiyonu için 24 µl alıcı serumu ve 24 µl verici hücre lizatı ile oluşan analitleri etiketlemek için 15 µl konjugat solüsyonu, 15 dakika 200 rpm çalkalayıcıda inkübe edildi. Süre bitiminde, son hacmi 100 µl'ye tamamlamak amacıyla 37 µl yürütme tamponu eklendi. Daha önce hazırlanan LFI şeritleri, süspansiyonun içine daldırılarak beş dakika boyunca nitroselüloz membrandaki renk değişimleri gözlendi. 
Bulgular: T1 ve T2 test çizgileri ile K çizgisindeki renk oluşumları tam pozitif CM, T1 veya T2 test çizgisi ile K çizgisindeki renk değişimi kısmi pozitif CM, yalnız K çizgisindeki renk değişimi ise negatif CM olarak değerlendirildi. Oluşan renk değişimleri hafif, orta ve yoğun olarak kategorize edilerek LFI şeritlerinin yarı kantitatif analizi yapıldı.  
Sonuç: Geliştirilen yöntem HLA sınıf I ilişkili pozitifleri tespit edebilirken, HLA sınıf II ilişkili pozitif reaksiyonları tespit edememektedir. HLA sınıf II 'ye spesifik yeni yakalama antikorları ile test geliştirme süreci devam ettirilecektir. Başarılı olunduğu takdirde, muadillerine kıyasla zaman ve maliyet bakımından daha avantajlı olan, deneyimli personel gereksinimi olmayan potansiyel bir CM testi ortaya çıkabilecektir.

Abstract:
Aim: Conventional CM tests used in the field of transplantation immunology have disadvantages such as long working time, high cost, need for experienced lab staff, etc. In order to eliminate these negativities, it is aimed to develop a new crossmatch test with LFI platform.
Material and Method: CD45(+) leukocytes were obtained from potential donor blood samples by immunomagnetic isolation method and PBMC were obtained by density gradient centrifugation method. After the cells were mixed with 10% lysis buffer and centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes, the supernatant part was separated as donor cell lysate. For the CM reaction, 24 µl of recipient serum and 24 µl of donor cell lysate and 15 µl of conjugate solution to label the formed analytes were incubated for 15 minutes in a 200 rpm shaker. At the end of the time, 37 µl of running buffer was added to make up the final volume of the suspension to 100 µl. The previously prepared LFI strips were dipped into the suspension to observe the color changes on the nitrocellulose membrane for five minutes.
Results: The color changes in the T1 and T2 test lines and the K line were considered as fully positive CM, the color changes in the T1 or T2 test lines and the K line were considered as partially positive CM, and the color change in the K line alone was considered as negative CM. Semi-quantitative analysis of LFI strips was performed by categorizing the color changes as mild, moderate and intense.
Conclusion: The developed method can detect HLA class I-associated positives, but not HLA class II-associated positive reactions. Test development process will continue with new capture antibodies specific to HLA class II. If successful, a potential CM test may arise that is more advantageous in terms of time and cost than its counterparts and does not require experienced lab staff.