Kemik hasarları için vaskülarize kemik doku mühendisliği: 3B biyoyazıcı ile hidrojel/hücre/biyosinyal sistemlerin hazırlanması
Vascularized  tissue engineering for bone defects: Preparation of hydrogel/cell/biosignal systems using 3D bioprinting
Yazar: TUĞRUL TOLGA DEMİRTAŞ
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Tezin sahibi Tuğrul Tolga Demirtaş, doktora tez dönemi boyunca Tübitak 2211-C Öncelikli Alanlar Tez Teşvik Bursu kapsamında ve Amerika Birleşik Devletleri Stanford Üniversitesinde gerçekleştirdiği çalışmaları için ise 2214-A Yurt Dışı Doktora Sırası Araştırma Bursu kapsamında (9 ay) desteklenmiştir.
Sunulan tez çalışması kapsamında üç boyutlu ''Bottom-up'' (aşağıdan yukarıya) biyofabrikasyon yöntemleri (biyoyazıcı ve 3B fotolitografi sistemi)  kullanılarak hücre yüklü hidrojellerin 3B baskılanması ve hidrojellerin in-vitro kemik doku mühendisliği ve vaskülarize kemik doku modeli oluşturulması alanında kullanım potansiyellerinin belirlenmesi hedeflenmiştir.
Tezin ilk aşamasında, 3B biyoyazıcı kullanılarak baskılanan MC3T3-E1 (pre- osteoblast) yüklü kitosan ve kitosan-HA hidrojellerinin karakterizasyonu aljinat ve aljinat-HA hidrojeller ile karşılaştırılarak belirlenmiştir. Kitosan çözeltisinin ve nano yapıdaki kemik benzeri hidroksiapatit (n-HA) ile kompozit çözeltisinin literatürde ilk defa hücrelerle karıştırılarak başarılı bir şekilde baskılanabilirliği gösterilmiştir. Reolojik analiz ile  tüm grupların viskoelastik karaktere sahip oldukları belirlenmiş ve fizyolojik koşullar taklit edildiğinde (37°C vücut ortamı), kitosan ve kitosan-HA hidrojellerinin kararlı ve  elastik  yapıda olduklarını gösterilmiştir. Biyoçözeltilerin viskozite değerlerinin 3B biyoyazıcıda kullanılabilir aralıkta olduğu görülmüştür. Hücre canlılığı ve proliferasyonu analizleri ile  hücrelerin biyoçözeltiler ile baskılandıktan sonra canlılıklarını bütün gruplarda devam ettirdiği, ancak kitosan ve kitosan-HA hidrojelleri içinde enkapsüle edilen MC3T3-E1 hücrelerinin aljinat hidrojeline göre hücre canlılığı ve proliferasyonunu daha fazla desteklediği gösterilmiştir. Hücre farklılaşmasının moleküler düzeyde incelenmesi amacıyla gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yapılmıştır. Gruplar arasında karşılaştırma yapıldığında, kitosan-HA kompozit hidrojeli içinde 3B baskılanan hücrelerin Kol-1, RunX2, Ocn ve Opn ekspresyonları en yüksek düzeyde bulunmuştur. Kolorimetrik olarak hidrojeller içinde yer alan hücrelerin ürettiği kalsiyum miktarı, RT-PCR analizinde yapılan Ocn ve Opn analizi sonuçları ile uyumlu olarak artış göstermiştir. Kitosan ve kitosan-HA hidrojelleri içinde yer alan hücrelerin 21 günlük kültür sürecinde mineralize olduğu ve osteojenik olarak farklılaştığı sonucuna varılmıştır. Biyoyazıcı sistemlerde en çok kullanılan aljinat çözeltisi ile karşılaştırıldığında kitosanın hücre üremesinde ve farklılaşmasında aljinata olan üstünlükleri de gösterilmiştir. Böylece bir biyoyazıcı çözeltisi olarak kitosanın baskılanabilirliği ve uygunluğu açık bir şekilde kanıtlanmıştır. Ayrıca kemik benzeri n-HA' nın varlığının aljinat ve kitosan hidrojeller içindeki hücrelerin canlılığını, proliferasyonunu ve osteojenik farklılaşmasını daha fazla arttırdığı gösterilmiştir.
Tezin ikinci aşamasında ise, fotolitografi ile 3B mikrojeller içerisinde enkapsüle edilen  yeşil floresan protein ile işaretlenmiş insan göbek veni endotel hücreleri (GFP-HUVEC) ve  insan kemik iliği kök hücreleri  (hBMSC) hücreleri, farklı desenlerde baskılanarak yapılan in-vitro ko-kültür çalışmaları ile vaskülerize kemik modeli geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, ilk olarak metakrilik anhidrid ile fonksiyonlandırılan jelatin (Jel-MA) fotobaşlatıcı varlığında UV ile fotoçapraz bağlanarak vücut sıcaklığında kararlı hidrojel formuna getirilmiştir. GFP-HUVEC hücreleri, %5 (w/v) ve %7.5'luk iki farklı jel-MA konsantrasyonunda desenlerin hem halka kısmına hem de halka kısmının dışına başarılı bir şekilde baskılanmışlardır. Yapılan floresan görüntülemeler sonucu, hidrojel matrisin yapısal bütünlüğünü 21 günlük kültür süresince koruduğu gözlenmiştir. Deneysel çalışmalar sonucunda GFP-HUVEC hücrelerinin oluşturulan desenin dış kısmında %5 Jel-MA içerisinde, hBMSC hücrelerinin ise %7.5 Jel-MA+%2.5 metakrilatlanmış aljinat (OMA) içerisinde desenin halka kısmına baskılanmasına karar verilerek vaskülerize kemik modeli oluşturulmuştur. 
Halka yapısının dışına enkapsüle edilen GFP-HUVEC hücreleri organize olarak prevasküler bir yapı oluştururken halka deseninde enkapsüle edilen GFP- HUVEC hücrelerinin herhangi bir prevasküler ağ yapısı oluşturmadığı görülmüştür. Bu durumdan, hücrelerin  tübüler yapıda organize olabilmeleri için 500 μm çapına sahip halka desenin yetersiz olduğu ve daha geniş bir yüzey alanı içerisinde enkapsüle edildiklerinde (halka dışına) prevasküler ağı  oluşturdukları sonucuna varılmıştır. İmmünositokimyasal analizlere göre oluşturulan kapiler ağın CD31 pozitif olduğu gösterilmiştir. Vasküler kısım için yapılan immünositokimya analizlerinde hücrelerin laminin ve kollajen tip IV gibi endotel hücrelere ait ECM proteinlerini salgıladıkları gösterilmiş ve SEM görüntüleri ile uyumlu olarak olgun damar ağının oluşturulduğu belirlenmiştir.
Kemik kısmı için yapılan immünositokimya analiz sonuçları; OCN, OPN ve RUNX2 antijenlerinin pozitif olduğunu ve hBMSC hücrelerinin iç ve dış kısımda konumlandırılmalarının osteojenik farklılaşmaya bir etkisi olmadığını, hücrelerin her iki koşulda da farklılaşmaya gittiklerini göstermektedir. 
Tez kapsamında kemik benzeri n-HA'in, osteojenik farklılaşmaya ve mineralizasyona etkisi osteojenik farklılaşmada oldukça sık kullanılan bir büyüme faktörü olan rhBMP-2 ile karşılaştırılmıştır. İmmünositokimya boyamaları sonucunda kemik benzeri hidroksiapatit içeren, BMP-2 içermeyen (+HA/-BMP 2) grubun kemik farklılaşma belirteçlerinin (OCN ve OPN) yalnızca BMP-2 içeren grup kadar olduğu görülmüştür. Dolayısıyla üretimi BMP-2'ye göre oldukça kolay ve ucuz olan kemik benzeri n-HA'in BMP-2 yerine osteojenik farklılaşmayı indükleyici ajan olarak kullanılabilir olduğu kanıtlanmıştır.
Yapılan in-vitro hücre kültür çalışmaları ile Jel-MA hidrojeli içerisinde 3B olgun pre-vasküler yapı başarı ile oluşturulmuştur ve aynı şekilde hBMSC hücreleri tamamen olgun osteoblast hücrelerine farklılaştırılarak vasküler bir kemik modeli başarıyla elde edilmiştir. Farklı hücrelerin 3B olarak farklı desenlere baskılanmasına imkan veren bu yöntem, ilaç çalışmaları için vaskülarize mikro organların veya insan hastalık modellerinin oluşturulması için çok uygun bir sistem olarak ifade edilebilmektedir.

Abstract:
The author of this dissertation, Tuğrul Tolga Demirtaş, had been a scholarship student of Tübitak 2211-C Primary Areas Thesis Incentive Scholarship throughout his doctoral dissertation stage and his studies at Stanford University in United States of America was supported in the scope of 2214-A Doctoral Overseas Research Scholarship (for 9 months).
In the scope of the presented dissertation study, three dimensional printing of cell laden hydrogels using 3D bottom-up biofabrication methods (bioprinters and 3D photolithography system) and determination of the potential use of said hydrogels in in-vitro bone tissue engineering and in the area of fabricating vascularized bone tissue models was aimed. 
In the first stage of the thesis, MC3T3-E1 (pre-osteoblast) laden chitosan and chitosan-HA hydrogels printed with the use of a 3D bioprinter were characterized by comparing these hydrogels to alginate and alginate-HA hydrogels. It was shown for the first time in liteature that chitosan solution and its composite solution with nanostructured bone-like hydroxyapatite (HA) can be mixed with cells and be printed successfully. It was determined with rheological analyses that all groups had viscoelastic properties and it was shown that when in simulated physiological conditions (37°C body environment) chitosan and chitosan-HA hydrogels were stable and elastic. It was determined that the viscosity values of the bio-solutions were in applicable range for use in 3D bioprinters. It was shown using cell viability and proliferation analyses that after printing with bio-solutions, cells continued to be viable in all groups, yet chitosan and chitosan-HA hydrogels showed increased support for the MC3T3-E1 cells encapsulated inside them in terms of viability and proliferation compared to alginate hydrogels. Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) was conducted to investigate cellular differentiation in molecular level. When groups were compared between each other, it was found that cells printed within chitosan-HA composite hydrogel showed peak expression levels for Kol-1, RunX2, Ocn and Opn. The increase seen in colorimetric results for calcium produced by cells inside the hydrogel were in line with the Ocn and Opn results obtained with RT-PCR analyses. It was concluded that cells within chitosan and chitosan-HA hydrogels had mineralized and differentiated osteogenically after 21 days of culture. It was also shown that chitosan is superior to alginate, which is the most widely used solution used in bioprinting systems, in terms of cell proliferation and differentiation. Thus, applicability and printability of chitosan as a bioprinting solution is clearly demonstrated. Furthermore, it was also shown that the presence of bone-like nanostructured hydroxyapatite in alginate and chitosan hydrogels improved cell viability, proliferation and osteogenic differentiation. 
In the second stage of the thesis, development of a vascularized bone model was aimed through in-vitro co-culture studies, by printing using human umbilical vein endothelial cells marked with green fluorescent protein (GFP-HUVEC) and human bone marrow stromal cells (hBMSC) encapsulated in 3D microgels through the use of photolithography in different patterns. With this purpose in mind, first, gelatin functionalized with methacrylic anhydride (gel-MA) was transformed into its stable hydrogel form in body temperature by UV cross-linking with the use of photoinitiators. GFP-HUVEC cells were successfullly printed both inside and outside of the ring patterns in two different concentrations of gel-MA; 5% (w/v) and 7.5% (w/v). It was determined through fluorescent imaging that hydrogel matrix maintained its structural integrity throughout the 21 day culture process. Through experimental studies, it was decided to print GFP-HUVEC cells in 5% gel-MA outside the pattern, and to print hBMSC cells in 7.5% gel-MA + 2.5% methacrylated alginate (OMA) inside the pattern ring, and the vascularized bone model was formed. 
While GFP-HUVEC cells encapsulated outside the ring structure organized to form a prevascularized structure, it was seen that GFP-HUVEC cells encapsulated in the ring pattern had not formed a prevascular network structure. From these results it was concluded that, the ring pattern that had a diameter of 500 μm was not enough for the cells to organize themselves into tubular structures, and that they were able to form a prevascular network when they were encapsulated in a place with a wider surface area (outside the ring). Immunocytochemical analyses showed that the generated capillary networks were CD31 positive. Immunocytochemistry analyses conducted for the vascular area showed that the cells secreted endothelial ECM proteins of laminin and collagen type IV, and the formation of mature vascular networks were determined in accordance with SEM images.
Results of the immunocytochemistry analyses conducted for the bone section showed that; OCN, OPN and RUNX2 antigens were positive and inside or outside placement of hBMSC cells did not have any effect on osteogenic differentiation, and that cells differentiated in both circumstances.  
In the scope of the thesis, the effects of bone-like nano-hydroxyapatite (n-HA) on osteogenic differentiation and mineralization was compared to that of the growth factor rhBMP-2 which is widely used in osteogenic differentiation. It was determined with immunocytochemical staining that the group that contained bone-like hydroxyapatite and that did not contain BMP-2 (+HA/-BMP 2) had the same amount of bone differentiation identifiers (OCN and OPN) compared to that of only BMP-2 including group. Thus, it was demonstrated that bone-like n-HA, which is cheap and easier to produce compared to BMP-2, can be used instead as osteogenic differentiation inducing agent. 
With the conducted in-vitro cell culture studies, 3D mature pre-vascular structures were successfully generated in Gel-MA hydrogel and likewise, a vascularized bone model was successfully obtained by differentiating hBMSC cells into fully mature osteoblast cells. This method which allows the 3D printing of different cells in different patterns can be identified as a highly favourable system for the generation of vascularized micro organs for drug studies or for the development of human disease models.