Zehirden ilaca: Mesobuthus eupeus zehirinin insan kolorektal karsinomunun proliferasyonuna karşı terapötik etkisinin moleküler düzeyde incelenmesi
From venom to medicine: Molecular investigation of the therapeutic effect of mesobuthus eupeus venom against the proliferation of human colorectal carcinoma
Yazar: HAVVA NUR ÇANAK
Danışman: PROF. DR. SERDAR KARAKURT
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Kanser değişik organlarda hücrelerin kontrolsüz çoğalmasından oluşan, klinik görünümü, tedavisi ve yaklaşımı birbirinden farklı olan hastalık grubudur. Tüm kanserler içinde üçüncü sıklıkta görülen ve kanserden ölüm nedenleri arasında ikinci sırada yer alan kolorektal kanser (KRK) tedavisinde genellikle geleneksel kemoterapi, radyoterapi, immünoterapi ve gen terapisi yöntemleri kullanılmaktadır. Bu tedavi yöntemlerinin ciddi yan etkileri ve tedavide ki yetersizliği nedeniyle alternatif veya tamamlayıcı yeni tedavi yöntemleri araştırılmaktadır. Bu etkileri yok etmek ve tedavide ilerleme sağlamak için araştırmacılar birçok hastalığın tedavisinde kullanabilme potansiyelleri olan akrep zehirleri üzerine odaklanmışlardır.  Akrep zehirleri, kanser hücreleri üzerinde hücre döngüsünü bozma, büyümeyi engelleme ve apoptozu tetikleme yetenekleri göz önüne alındığında, kanser tedavisi için eşsiz bir yol sunuyor. Bu çalışma da Mesobuthus eupeus akrep zehirinin kolorektal kanserin çoğalması ve ilerlemesi üzerindeki etkisini moleküler düzeyde araştırmaktadır. Iğdır ilinden toplanan akrep türünün zehri elektrostimülasyon tekniği ile elde edilmiştir. Elde edilen zehrin karakterizasyonu, total akrep zehrinin insan kolon hücre hatları DLD-1, HT-29 ve sağlıklı kolon epitel hücre hattı CCD-18Co hücrelerinin canlılığı, proliferasyonu, metastazı ve koloni oluşturma potansiyelleri üzerine etkileri in vitro koşullarda incelenmiştir. Ayrıca zehrin apoptoz etkisi flow sitometrik yöntem ile belirlenmiştir. Hücre ölüm mekanizması üzerindeki etkisinin moleküler mekanizmasını aydınlatabilmek amacıyla apoptoz yolağında ve kolon kanseri gelişiminde rol alan 96 genin mRNA ekspresyonu qRT-PCR yöntemi ile belirlenmiştir. Ayrıca apoptoz ve kolon kanseri gelişiminde rol alan proteinlerin ekspresyonları ise western blot yöntemi ile belirlenmiştir.


 Akrep zehrinin karakterizasyon çalışmaları, Mesobuthus eupeus akrep zehrinin 280 nm'de spesifik bir maksimum absorbans verdiği tespit edildi. Bu absorbans değeri venom içerisinde peptit içeriğinin olduğuna işaret etmektedir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analizi, zehirdeki peptitlerin ve proteinlerin çeşitliliğini daha da ortaya çıkardı. Zehirdeki toplam protein konsantrasyonunun 607.5 µg/mL olarak belirlenmesi, zengin bileşimini ve terapötik uygulama potansiyelini vurgulamaktadır.
In vitro çalışmalar sonucunda ise Mesobuthus eupeus akrep zehirinin sırasıyla 4.32 µg/mL ve 7.61 µg/mL IC50 değerleriyle DLD-1 ve HT-29 kolorektal kanser hücrelerinin çoğalmasını doza bağlı bir şekilde etkili bir şekilde azalttığını ortaya koymuştur. Ayrıca sağlıklı kolon epitel hücre hattı CCD-18Co'de >250 µg/mL ile 
toksisite göstermediği bulunmuştur. Akabinde ise Mesobuthus eupeus akrep zehrinin zehrinin DLD-1 hücre hattında %89.24;  HT-29 hücre hattında ise %62.28 oranında metastazı inhibe ettiği bulunmuştur. Akrep zehrinin koloni oluşturma potansiyelini ise DLD-1 hücre hattında %52.80; HT-29 hücre hattında ise %63.78 oranında inhibe ettiği bulunmuştur. Akış sitometrisi ile gerçekleştirilen apoptoz deneyi sonucunda akrep zehrinin her iki kanser hücre hattında dA erken ve geç apoptozu indüklediği bulunmuştur. Apoptoz yolağında ve kolon kanseri gelişiminde rol alan genlerin ekspresyon seviyeleri ise qRT-PCR ile analiz edilmiştir. Kolorektal kanserle ilgili 16 genin ekspresyon seviyesinin arttığı, 23 genin ise ekspresyon seviyesinin azaldığı bulunmuştur. HT-29 hücre hattında zehir tedavisinin ardından 57 genin ekspresyon seviyesi arttı ve 1 genin ekspresyon seviyesi azaldı. Aynı zamanda apoptoz yolağında ve kolon kanseri gelişiminde rol alan proteinlerin ekspresyon seviyeleri de incelenmiştir. Mesobuthus eupeus akrep zehri, özellikle Kaspaz-3 ve BcL-2 aileleri dahil olmak üzere apoptozla ilişkili proteinlerin ekspresyonunda değişikliklere yol açarken, NF-κB ve Bax seviyelerinde de artışa neden olmuştur. Yapılan bu tez kapsamında elde edilen verilerin kanser tedavilerinde Mesobuthus eupeus akrep zehirinin doğal bir terapötik yaklaşım olarak potansiyelinin altını çizmektedir.  Kesin mekanizmaları aydınlatmak ve klinik uygulamaları kolaylaştırmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu sayede Mesobuthus eupeus türü akrep zehri, dünyada hem görülme sıklığı hem de ölüm oranından dolayı ciddi bir hastalık olan KRK'nin tedavi protokollerinde umut verici terapötik ajan olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.
Kanser değişik organlarda hücrelerin kontrolsüz çoğalmasından oluşan, klinik görünümü, tedavisi ve yaklaşımı birbirinden farklı olan hastalık grubudur. Tüm kanserler içinde üçüncü sıklıkta görülen ve kanserden ölüm nedenleri arasında ikinci sırada yer alan kolorektal kanser (KRK) tedavisinde genellikle geleneksel kemoterapi, radyoterapi, immünoterapi ve gen terapisi yöntemleri kullanılmaktadır. Bu tedavi yöntemlerinin ciddi yan etkileri ve tedavide ki yetersizliği nedeniyle alternatif veya tamamlayıcı yeni tedavi yöntemleri araştırılmaktadır. Bu etkileri yok etmek ve tedavide ilerleme sağlamak için araştırmacılar birçok hastalığın tedavisinde kullanabilme potansiyelleri olan akrep zehirleri üzerine odaklanmışlardır.  Akrep zehirleri, kanser hücreleri üzerinde hücre döngüsünü bozma, büyümeyi engelleme ve apoptozu tetikleme yetenekleri göz önüne alındığında, kanser tedavisi için eşsiz bir yol sunuyor. Bu çalışma da Mesobuthus eupeus akrep zehirinin kolorektal kanserin çoğalması ve ilerlemesi üzerindeki etkisini moleküler düzeyde araştırmaktadır. Iğdır ilinden toplanan akrep türünün zehri elektrostimülasyon tekniği ile elde edilmiştir. Elde edilen zehrin karakterizasyonu, total akrep zehrinin insan kolon hücre hatları DLD-1, HT-29 ve sağlıklı kolon epitel hücre hattı CCD-18Co hücrelerinin canlılığı, proliferasyonu, metastazı ve koloni oluşturma potansiyelleri üzerine etkileri in vitro koşullarda incelenmiştir. Ayrıca zehrin apoptoz etkisi flow sitometrik yöntem ile belirlenmiştir. Hücre ölüm mekanizması üzerindeki etkisinin moleküler mekanizmasını aydınlatabilmek amacıyla apoptoz yolağında ve kolon kanseri gelişiminde rol alan 96 genin mRNA ekspresyonu qRT-PCR yöntemi ile belirlenmiştir. Ayrıca apoptoz ve kolon kanseri gelişiminde rol alan proteinlerin ekspresyonları ise western blot yöntemi ile belirlenmiştir.


 Akrep zehrinin karakterizasyon çalışmaları, Mesobuthus eupeus akrep zehrinin 280 nm'de spesifik bir maksimum absorbans verdiği tespit edildi. Bu absorbans değeri venom içerisinde peptit içeriğinin olduğuna işaret etmektedir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analizi, zehirdeki peptitlerin ve proteinlerin çeşitliliğini daha da ortaya çıkardı. Zehirdeki toplam protein konsantrasyonunun 607.5 µg/mL olarak belirlenmesi, zengin bileşimini ve terapötik uygulama potansiyelini vurgulamaktadır.
In vitro çalışmalar sonucunda ise Mesobuthus eupeus akrep zehirinin sırasıyla 4.32 µg/mL ve 7.61 µg/mL IC50 değerleriyle DLD-1 ve HT-29 kolorektal kanser hücrelerinin çoğalmasını doza bağlı bir şekilde etkili bir şekilde azalttığını ortaya koymuştur. Ayrıca sağlıklı kolon epitel hücre hattı CCD-18Co'de >250 µg/mL ile 
toksisite göstermediği bulunmuştur. Akabinde ise Mesobuthus eupeus akrep zehrinin zehrinin DLD-1 hücre hattında %89.24;  HT-29 hücre hattında ise %62.28 oranında metastazı inhibe ettiği bulunmuştur. Akrep zehrinin koloni oluşturma potansiyelini ise DLD-1 hücre hattında %52.80; HT-29 hücre hattında ise %63.78 oranında inhibe ettiği bulunmuştur. Akış sitometrisi ile gerçekleştirilen apoptoz deneyi sonucunda akrep zehrinin her iki kanser hücre hattında dA erken ve geç apoptozu indüklediği bulunmuştur. Apoptoz yolağında ve kolon kanseri gelişiminde rol alan genlerin ekspresyon seviyeleri ise qRT-PCR ile analiz edilmiştir. Kolorektal kanserle ilgili 16 genin ekspresyon seviyesinin arttığı, 23 genin ise ekspresyon seviyesinin azaldığı bulunmuştur. HT-29 hücre hattında zehir tedavisinin ardından 57 genin ekspresyon seviyesi arttı ve 1 genin ekspresyon seviyesi azaldı. Aynı zamanda apoptoz yolağında ve kolon kanseri gelişiminde rol alan proteinlerin ekspresyon seviyeleri de incelenmiştir. Mesobuthus eupeus akrep zehri, özellikle Kaspaz-3 ve BcL-2 aileleri dahil olmak üzere apoptozla ilişkili proteinlerin ekspresyonunda değişikliklere yol açarken, NF-κB ve Bax seviyelerinde de artışa neden olmuştur. Yapılan bu tez kapsamında elde edilen verilerin kanser tedavilerinde Mesobuthus eupeus akrep zehirinin doğal bir terapötik yaklaşım olarak potansiyelinin altını çizmektedir.  Kesin mekanizmaları aydınlatmak ve klinik uygulamaları kolaylaştırmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu sayede Mesobuthus eupeus türü akrep zehri, dünyada hem görülme sıklığı hem de ölüm oranından dolayı ciddi bir hastalık olan KRK'nin tedavi protokollerinde umut verici terapötik ajan olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.
Kanser değişik organlarda hücrelerin kontrolsüz çoğalmasından oluşan, klinik görünümü, tedavisi ve yaklaşımı birbirinden farklı olan hastalık grubudur. Tüm kanserler içinde üçüncü sıklıkta görülen ve kanserden ölüm nedenleri arasında ikinci sırada yer alan kolorektal kanser (KRK) tedavisinde genellikle geleneksel kemoterapi, radyoterapi, immünoterapi ve gen terapisi yöntemleri kullanılmaktadır. Bu tedavi yöntemlerinin ciddi yan etkileri ve tedavide ki yetersizliği nedeniyle alternatif veya tamamlayıcı yeni tedavi yöntemleri araştırılmaktadır. Bu etkileri yok etmek ve tedavide ilerleme sağlamak için araştırmacılar birçok hastalığın tedavisinde kullanabilme potansiyelleri olan akrep zehirleri üzerine odaklanmışlardır.  Akrep zehirleri, kanser hücreleri üzerinde hücre döngüsünü bozma, büyümeyi engelleme ve apoptozu tetikleme yetenekleri göz önüne alındığında, kanser tedavisi için eşsiz bir yol sunuyor. Bu çalışma da Mesobuthus eupeus akrep zehirinin kolorektal kanserin çoğalması ve ilerlemesi üzerindeki etkisini moleküler düzeyde araştırmaktadır. Iğdır ilinden toplanan akrep türünün zehri elektrostimülasyon tekniği ile elde edilmiştir. Elde edilen zehrin karakterizasyonu, total akrep zehrinin insan kolon hücre hatları DLD-1, HT-29 ve sağlıklı kolon epitel hücre hattı CCD-18Co hücrelerinin canlılığı, proliferasyonu, metastazı ve koloni oluşturma potansiyelleri üzerine etkileri in vitro koşullarda incelenmiştir. Ayrıca zehrin apoptoz etkisi flow sitometrik yöntem ile belirlenmiştir. Hücre ölüm mekanizması üzerindeki etkisinin moleküler mekanizmasını aydınlatabilmek amacıyla apoptoz yolağında ve kolon kanseri gelişiminde rol alan 96 genin mRNA ekspresyonu qRT-PCR yöntemi ile belirlenmiştir. Ayrıca apoptoz ve kolon kanseri gelişiminde rol alan proteinlerin ekspresyonları ise western blot yöntemi ile belirlenmiştir.

 Akrep zehrinin karakterizasyon çalışmaları, Mesobuthus eupeus akrep zehrinin 280 nm'de spesifik bir maksimum absorbans verdiği tespit edildi. Bu absorbans değeri venom içerisinde peptit içeriğinin olduğuna işaret etmektedir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analizi, zehirdeki peptitlerin ve proteinlerin çeşitliliğini daha da ortaya çıkardı. Zehirdeki toplam protein konsantrasyonunun 607.5 µg/mL olarak belirlenmesi, zengin bileşimini ve terapötik uygulama potansiyelini vurgulamaktadır.
In vitro çalışmalar sonucunda ise Mesobuthus eupeus akrep zehirinin sırasıyla 4.32 µg/mL ve 7.61 µg/mL IC50 değerleriyle DLD-1 ve HT-29 kolorektal kanser hücrelerinin çoğalmasını doza bağlı bir şekilde etkili bir şekilde azalttığını ortaya koymuştur. Ayrıca sağlıklı kolon epitel hücre hattı CCD-18Co'de >250 µg/mL ile 
toksisite göstermediği bulunmuştur. Akabinde ise Mesobuthus eupeus akrep zehrinin zehrinin DLD-1 hücre hattında %89.24;  HT-29 hücre hattında ise %62.28 oranında metastazı inhibe ettiği bulunmuştur. Akrep zehrinin koloni oluşturma potansiyelini ise DLD-1 hücre hattında %52.80; HT-29 hücre hattında ise %63.78 oranında inhibe ettiği bulunmuştur. Akış sitometrisi ile gerçekleştirilen apoptoz deneyi sonucunda akrep zehrinin her iki kanser hücre hattında dA erken ve geç apoptozu indüklediği bulunmuştur. Apoptoz yolağında ve kolon kanseri gelişiminde rol alan genlerin ekspresyon seviyeleri ise qRT-PCR ile analiz edilmiştir. Kolorektal kanserle ilgili 16 genin ekspresyon seviyesinin arttığı, 23 genin ise ekspresyon seviyesinin azaldığı bulunmuştur. HT-29 hücre hattında zehir tedavisinin ardından 57 genin ekspresyon seviyesi arttı ve 1 genin ekspresyon seviyesi azaldı. Aynı zamanda apoptoz yolağında ve kolon kanseri gelişiminde rol alan proteinlerin ekspresyon seviyeleri de incelenmiştir. Mesobuthus eupeus akrep zehri, özellikle Kaspaz-3 ve BcL-2 aileleri dahil olmak üzere apoptozla ilişkili proteinlerin ekspresyonunda değişikliklere yol açarken, NF-κB ve Bax seviyelerinde de artışa neden olmuştur. Yapılan bu tez kapsamında elde edilen verilerin kanser tedavilerinde Mesobuthus eupeus akrep zehirinin doğal bir terapötik yaklaşım olarak potansiyelinin altını çizmektedir.  Kesin mekanizmaları aydınlatmak ve klinik uygulamaları kolaylaştırmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu sayede Mesobuthus eupeus türü akrep zehri, dünyada hem görülme sıklığı hem de ölüm oranından dolayı ciddi bir hastalık olan KRK'nin tedavi protokollerinde umut verici terapötik ajan olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Cancer is a group of diseases consisting of the uncontrolled proliferation of cells in different organs, whose clinical presentation, treatment and approach differ from each other. Colorectal cancer (CRC), which is the third most common of all cancers and the second leading cause of cancer death, is usually treated with conventional chemotherapy, radiotherapy, immunotherapy and gene therapy. Due to the serious side effects and inadequacy of these treatment methods, new alternative or complementary treatment methods are being investigated. To counteract these effects and advance treatment, researchers have focused on scorpion venoms, which have the potential to treat many diseases. Given their ability to disrupt the cell cycle, inhibit growth and trigger apoptosis in cancer cells, scorpion venoms offer a unique way to treat cancer. This study investigates the effect of Mesobuthus eupeus scorpion venom on the proliferation and progression of colorectal cancer at the molecular level. The venom of the scorpion species collected from Iğdır province was obtained by electrostimulation technique. Characterization of the venom obtained, the effects of total scorpion venom on the viability, proliferation, metastasis and colony forming potential of human colon cell lines DLD-1, HT-29 and healthy colon epithelial cell line CCD-18Co cells were investigated under in vitro conditions. In addition, the apoptosis effect of the poison was determined by flow cytometric method. In order to elucidate the molecular mechanism of its effect on cell death mechanism, mRNA expression of 96 genes involved in apoptosis pathway and colon cancer development were determined by qRT-PCR method. In addition, the expression of proteins involved in apoptosis and colon cancer development was determined by western blotting. 

	Characterization studies of scorpion venom found that Mesobuthus eupeus scorpion venom gave a specific maximum absorbance at 280 nm. This absorbance value indicates that there is peptide content in the venom. High-performance liquid chromatography (HPLC) analysis further revealed the diversity of peptides and proteins in the venom. The total protein concentration in the venom was determined to be 607.5 µg/mL, highlighting its rich composition and potential for therapeutic application.
In vitro studies revealed that Mesobuthus eupeus scorpion venom effectively reduced the proliferation of DLD-1 and HT-29 colorectal cancer cells in a dose-dependent manner with IC50 values of 4.32 µg/mL and 7.61 µg/mL, respectively. In addition, in the healthy colon epithelial cell line CCD-18Co with >250 µg/mL 
did not show toxicity. Subsequently, Mesobuthus eupeus scorpion venom was found to inhibit metastasis by 89.24% in DLD-1 cell line and 62.28% in HT-29 cell line. Scorpion venom inhibited colony formation potential by 52.80% in DLD-1 cell line and 63.78% in HT-29 cell line. As a result of apoptosis assay performed by flow cytometry, it was found that scorpion venom induced ds early and late apoptosis in both cancer cell lines. Expression levels of genes involved in apoptosis pathway and colon cancer development were analyzed by qRT-PCR. It was found that the expression levels of 16 genes related to colorectal cancer increased and the expression levels of 23 genes decreased. In the HT-29 cell line, the expression level of 57 genes increased and the expression level of 1 gene decreased after the poison treatment. The expression levels of proteins involved in the apoptosis pathway and colon cancer development were also examined. Mesobuthus eupeus scorpion venom caused changes in the expression of apoptosis-related proteins, especially Caspase-3 and BcL-2 families, and increased NF-κB and Bax levels. The data obtained in this thesis underline the potential of Mesobuthus eupeus venom as a natural therapeutic approach in cancer treatments.  Further research is needed to elucidate the exact mechanisms and facilitate clinical applications. In this way, it is thought that Mesobuthus eupeus scorpion venom can be used as a promising therapeutic agent in the treatment protocols of CRC, which is a serious disease due to its incidence and mortality rate in the world.