Schizosaccharomyces pombe ve insanda z-dna oluşumlarının biyoinformatik ve deneysel analizleri
Bioinformatic and experimental analyses of z-dna formations in schizosaccharomyces pombe and human
Yazar: NEŞE AKÇAY
Danışman: PROF. DR. ERCAN ARICAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Moleküler genetik = Molecular genetic

Özet:
Bu doktora tezi kapsamında S. pombe ve insanda (H. sapiens) Z-DNA oluşumları biyoinformatik ve deneysel olarak çalışılmıştır. Bu çalışmanın biyoinformatik kısmı Linux yazılım ortamında çalışılmıştır. S. pombe genomunda Z-DNA dizilerinin gen anlatımında ve transkripsiyonda düzenleyici bir element olup olmadığını anlayabilmek için RNA Polimeraz II ile anlatımı olan genler (ürünü protein olan genler) https://www.pombase.org/ veri tabanı üzerinden çalışıldı. https://nonb-abcc.ncifcrf.gov/apps/nBMST/default/ veri tabanında ise ilgili genlerde 406 tane olası Z-DNA dizisi belirlendi. Olası Z-DNA dizilerinden 74 tanesinin 5′UTR'lerde konumlandığı, 332 tanesinin de bu bölgelerin dışında olduğu belirlendi. PomBase https://www.pombase.org/data/orthologs/ veri tabanı üzerinden olası Z-DNA içeren S. pombe genlerinin 232 tane H. sapiens ortoloğu olduğu tespit edildi. Ayrıca Pomabse, GeneCards ve MalaCards veri tabanları kullanılarak olası Z-DNA dizilerini içeren ortolog genlerin gen ontolojileri çalışıldı ve bu genlerin rol oynadığı 349 biyolojik süreç belirlendi. Olası Z-DNA dizilerini içeren bu ortolog genlerin 14 tanesinin nörodejeneratif hastalıklarla ilişkili olduğu, 21 tanesinin kanserle ilişkili olduğu ve 21 tanesinin de diğer hastalıklarla ilişkili olduğu belirlendi. S. pombe H. sapiens ortolog genlerinde promotör ve 5′UTR bölgelerinde olası Z-DNA dizisi ile transkripsiyonel aktivite arasındaki ilişkinin ortaya çıkarılması doğrultusunda, bu çalışmanın deneysel kısmı için biyoinformatik analizlerden yola çıkarak nörodejeneratif hastalıkla ilişkili alg13 geni seçilmiştir. Olası Z-DNA bölgesi alg13 geninin 5′UTR'sinde yer almaktadır. Seçilen bu olası Z-DNA dizisinin gen anlatımında ve transkripsiyonda düzenleyici bir element olup olmadığını anlamak için β-galaktosidaz reporter gen plazmid sistemi (pREP3X-LacZ) kullanıldı. Bu olası Z-DNA dizisi ile transkripsiyonel aktivite arasındaki ilişkiyi anlamak için olası Z-DNA bölgesinde overlap PZR tekniği ile Z-DNA konformasyonunu bozacak nokta mutasyonlar ve delesyon yaratıldı. Tam Z-DNA dizisini, nokta mutasyonlu Z-DNA dizisini ve tamamı silinmiş Z-DNA dizisini içeren alg13 geninin 5′UTR'si ve promotörü reporter genin upstreamine klonlandı. Klonlama sonrası oluşan üç farklı plazmid S. pombe leu2- 120h+ mutant ırkının transformasyonları gerçekleştirildi. S. pombe transformantları, histidin biyosentezini inhibe eden ve dolayısıyla amino asit açlığını taklit eden histidin analoğu 3-amino-1,2,4- triazol (3-AT) ile alg13 promotörünün indüklenmesi için muamele edildi. β-galaktosidaz aktivitesi analizi sonucunda Z-DNA dizisi ile transkripsiyonel aktivite arasında ilişki olduğu belirlendi.
Doktora tezi kapsamında, ardışık pürin primidin tekrar bölgelerini içeren Z-DNA dizisinin patolojik olarak hastalıkla ilişkili genlerin anlatımıyla ilgili olabileceğini ortaya koyulmuştur. Bu olağandışı DNA yapısının biyolojik işlevinin ve bu biyolojik işlevlerle ilişkili metabolik hastalıkların anlaşılmasına da katkı sağlayacaktır. Ayrıca, bu alternatif DNA konformasyonunun birkaç önemli biyolojik prosesle ilişkili olduğu ve bazı hastalıkların engellenmesi ve tedavisi için bir hedef sağlayabileceği fikrini destekler.

Abstract:
Within the scope of this doctoral thesis, Z-DNA formations in S. pombe and humans (H. sapiens) were studied bioinformatically and experimentally. The bioinformatics part of this study was studied in the Linux software program. In order to understand whether Z-DNA sequences are a regulatory element in gene expression and transcription in the S. pombe genome, genes expressed by RNA Polymerase II (genes whose product is protein) were studied on the database https://www.pombase.org/. In the database https://nonb-abcc.ncifcrf.gov/apps/nBMST/default/, 406 putative Z-DNA sequences were determined in the relevant genes. It was determined that 74 of the possible Z-DNA sequences were located in 5′UTRs, and 332 of them were outside these regions. On the PomBase https://www.pombase.org/data/orthologs/ database, 232 H. sapiens orthologs of S. pombe genes containing putative Z-DNA were identified. In addition, gene ontologies of orthologous genes containing putative Z-DNA sequences were studied using Pombase, GeneCards, and MalaCards databases, and 349 biological processes in which these genes played a role were determined. It was determined that 14 of these orthologous genes containing pputative Z-DNA sequences are associated with neurodegenerative diseases, 21 are associated with cancer, and 21 are associated with other diseases. In order to reveal the relationship between the putative Z-DNA sequence and transcriptional activity in the promoter and 5′UTR regions of S. pombe H. sapiens orthologous genes, the alg13 gene associated with neurodegenerative disease was selected for the experimental part of this study, based on bioinformatics analysis. The putative Z-DNA region is located in the 5′UTR of the alg13 gene. The β-galactosidase reporter gene plasmid system (pREP3X-LacZ) was used to determine whether this selected putative Z-DNA sequence is a regulatory element in gene expression and transcription. In order to understand the relationship between this putative Z-DNA sequence and transcriptional activity, point mutations and deletions that would disrupt Z-DNA conformation were created with an overlap PCR technique in the putative Z-DNA region. The 5′UTR and promoter of the alg13 gene containing the complete Z-DNA sequence, the point mutated Z-DNA sequence and the completely deleted Z-DNA sequence were cloned upstream of the reporter gene. Transformations of three different plasmid S. pombe leu2- 120h+ mutant strains formed after cloning were performed. S. pombe transformants were treated for the induction of the alg13 promoter with the histidine analog 3-amino-1,2,4- triazol (3-AT), which inhibits histidine biosynthesis and thus mimics amino acid starvation. As a result of β-galactosidase activity analysis, it was determined that there is a relationship between Z-DNA sequence and transcriptional activity.
In his doctoral thesis, he revealed that the Z-DNA sequence containing alternative purine pyrimidine repeat regions may be pathologically related to the expression of disease-related genes. It will also contribute to the understanding of the biological function of this unusual DNA structure and the metabolic diseases associated with these biological functions. It also supports the idea that this alternative DNA conformation is associated with several important biological processes and may provide a target for the prevention and treatment of certain diseases.