Legionella pneumophila üzerine biyofilm araştırmaları ve çeşitli doğal ürünlerin antibakteriyel ve antibiyofilm etkilerinin denenmesi
Biofilm experiments on Legionella pneumophila and investigation of antibacterial and antibiofilm activities of natural products
Yazar: BÜLENT TURASAY
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ÖZGÜR CEYLAN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Çalışmada Muğla ilindeki çeşitli binalara ait su şebeke sistemlerinden alınan numunelerden izole edilmiş 11 adet L. pneumophila suşu kullanılmıştır. Bu suşların Buffered Yeast Extract (BYE) besiyeri ve steril musluk suyu ortamlarındaki biyofilm oluşturma kapasiteleri incelenmiş ve BYE'de oluşan biyofilmlere ait optik dansite değerlerinin steril musluk suyundaki değerlerin yaklaşık 2 katı olduğu tespit edilmiştir. 
L. pneumophila'nın biyofilm özellikleri bakımından, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas flourescens, Pseudomonas putida, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes ve Enterococcus faecalis gibi sularda bulunabilen bakterilerle ilişkisi araştırılmıştır. L. pneumophila bakterisinin P.fluorescens, E.faecalis, P.putida ile birlikte anlamlı derecede fazla biyofilm oluşturduğu, P.aerugionosa ile birlikte ise biyofilm miktarında azalma olduğu görülmüştür. Bahsedilen bakterilere ait 24 saatlik biyofilmlerin olduğu ortama L. pneumophila eklendiğinde ise P.aerugionosa'ya ait biyofilm üzerinde tutunma oranı negatif kontrollere göre daha yüksek bulunmuştur. Tüm L. pneumophila suşları en fazla K.pneumoniae  biyofilmleri üzerinde biyofilm oluşumu göstermiştir. Bu sonuçlar L.pneumophila'nın tutunma özelliklerinin farklı tür bakterilere ait planktonik hücreler veya biyofilm varlığında değişiklik gösterdiğini ortaya koymuştur.
Çalışmada L. pneumophila suşlarının ölü bakteri hücreleri içeren steril musluk suyu ortamında biyofilm oluşturma kapasiteleri araştırılmış ve bu suşların ölü bakteri hücrelerini kullanarak oluşturdukları biyofilm oranlarının, steril musluk suyundakilerden ve negatif kontrollerden anlamlı derecede fazla olduğu görülmüştür. L. pneumophila hücrelerinin biyofilm oluşumu esnasında ölü bakteri hücrelerinden yararlanma miktarının BYE besiyeri seviyesine ulaşamadığı görülmüştür. 
Çalışmada ticari preparat olarak satın alınan Adaçayı, Defne, Kekik, Limon ve Nane yağlarının L. pneumophila suşları üzerinde antibakteriyel ve antibiyofilm etkileri araştırılmıştır. Antibakteriyel aktivite sonuçları çalışmada kullanılan tüm yağların antibakteriyel etki gösterdiğini ortaya koymuştur. Özellikle defne yağı ve limon yağı yüksek antibakteriyel etki göstermiştir. Minimum inhibisyon (MİK) ve minimum bakterisidal (MBK) konsantrasyonlar sırasıyla, defne yağı için 0.044-0.100 ve 0.16-0.31 µl/ml, limon yağı için 0.83-1.25 ve 1.25-3.75 µl/ml olarak tespit edilmiştir. 
Yağların antibiyofilm etkileri biyofilm oluşumunun inhibisyonu ve önceden oluşmuş biyofilmin giderimi şeklinde, MİK, MİK/2, MİK/4, MİK/8 ve MİK/16 konsantrasyonlarında denenmiştir. Tespit edilen en yüksek biyofilm inhibisyonu ve giderimi değerleri: Defne yağı için %78 - %49.1, limon yağı için %63.3 - %34.2, nane yağı için %45.5 – 16.7, adaçayı yağı için %35.6 – 39.4 ve kekik yağı için %23   31.9 oranındadır. Defne yağı antibakteriyel etki yanısıra en yüksek antibiyofilm etkiye sahip yağ olarak da tespit edilmiştir. En düşük antibiyofilm etki oranları kekik yağında tespit edilmiştir. Tüm yağların biyofilm oluşumunu inhibe edici aktiviteleri, biyofilm giderici aktivitelerine göre daha fazla bulunmuştur. 
Çalışma sonuçları L. pneumophila'nın nekrotrofik ortamlarda biyofilm oluşturabildiğini ve farklı bakteri türleri ile biyofilm oluşumu yönünden etkileşim içinde olduğunu ortaya çıkarmıştır. Ayrıca çalışmada kullanılan yağların yüksek antibakteriyel ve antibiyofilm etkileri nedeniyle L. pneumophila'nın dezenfeksiyonu amacıyla kullanılabileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
Eleven L. pneumophila strains were used in the study, which have been isolated from water samples of supply systems of various buildings in Muğla. Biofilm production capabilities of the strains in Buffered Yeast Extract (BYE) medium and sterile tap water (STW) were investigated, and it was founded that optical density values of BYE biofilms was approximately two-fold higher than of STW biofilms.  
Relationship of L. pneumophila was investigated with other bacteria that can be found in water such as Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis and Klebsiella pneumonia, in terms of biofilm features. It was observed that L. pneumophila formed significantly greater biofilms with P.fluorescens, E.faecalis and P.putida, but biofilms formed with P. aeruginosa were significantly lower. Contrarily, when L.pneumophila added to preformed 24h biofilms of other bacteria, attachment of L. pneumophila to P. aeruginosa biofilms was significantly higher than negative controls. L. pneumophila strains produced highest biofilms on K. pneumoniae biofilms. Results showed that biofilm production features of L. pneumophila might change in the presence of planktonic or attached cells of other bacterial species.
In the study, biofilm formation of L. pneumophila in STW containing dead bacteria cells was investigated, and it was shown that necrotrophic biofilms of L. pneumophila has significantly higher values than negative controls and medium contain only STW. It was observed that the amount of the benefits of L.pneumophila from dead cells for the biofilm production did not reach the level of BYE medium.
Antibacterial and antibiofilm activities of sage, laurel, thyme, lemon and peppermint essential oils supplied as commercially were investigated against L. pneumophila. Antibacterial activity results showed that all studied oils have antibacterial activities. Above all laurel oil and lemon oil was shown greatest antibacterial activities. Minimum inhibition and minimum bactericidal concentrations was determinated as 0.044-0.100 and 0.16-0.31 µl/ml for laurel oil, 0.83-1.25 and 1.25-3.75 for lemon oil, respectively. 
Antibiofilm activities of essential oils were studied as inhibition of biofilm formation and as eradication of preformed biofilms, at the concentrations of MIC, MIC/2, MIC/4, MIC/8 and MIC/16. Highest biofilm inhibition and eradication rates detected as: 78% - 49.1% for laurel oil, 63.3% - 34.2% for lemon oil, 45.5% - 16.7% for peppermint oil, 35.6% - 39.4% for sage oil and 23% - 31.9% for thyme oil. Laurel oil was detected to have most antibiofilm effects, as in antibacterial activity. Thyme oil was detected to have lowest antibiofilm activitiy. It was observed that the rates for inhibition of biofilm production activity were much higher than the rates for eradication of preformed biofilms, for all studied essential oils.  
Results of the study reveal the ability of L. pneumophila to form biofilm in necrotrophic media, and its interactions with different bacteria in terms of biofilm production. Furthermore, it was shown that the oils employed in the study could be used in disinfection of L. pneumophila, because of their high antibacterial and antibiofilm activities.