"Subtractive" hibridizasyon kütüphanesinden izole edilen ve kalp gelişiminde önemli rolü olduğu düşünülen genlerin analizi
Analysis of the genes from a subtractive hybridization library that are suspected to have a role in cardiogenesis
Yazar: BİLGE ŞADAN ÖZSAİT
Danışman: DOÇ. DR. NİHAN ÜNALTUNA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2002
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
insan Genom Projesi ve yeni genlerin tespit edilmesine yönelik çalışmalar genler hakkında bilgi sağlamasının yanı sıra birçok yeni tekniğin gelişimine de yol açmıştır. Araştırılan gen bölgesinin moleküler genetik teknikler ile analizi ve sanal ortama taşınan gen bankalarındaki dizilerle karşılaştırılması sonucunda detaylı bilgiye ulaşılmaktadır. Moleküler biyoloji tekniklerindeki gelişmeler ve konjenital kalp hastalıklarının gelişim dönemindeki evrelerinin incelenmeye başlaması, bu hastalıkların genetik kökeni ve patogenezi hakkında daha çok bilgi edinilmesini sağlamıştır. Kalbin embriyolojik dönemdeki karmaşık gelişimi birçok genin bu oluşumda yer aldığım düşündürmektedir. Bu çalışmada laboratuvarımızda önceki deneylerde oluşturulan çıkartılmış hibridizasyon cDNA kütüphanesindeki transkriptlerden kalp gelişiminde önemli rolü olduğu düşünülen üçünün biyoinformatik ve moleküler genetik yöntemlerle analizi yapıldı. Bu amaçla detaylı bilgisayar analizleri yürütüldü. Ardından elde edilen diziler yetişkin kalp ve iskelet kası total RNA'ları kullanılarak elde edilen cDNA'larda semikantitatif PCR yapıldı. "Northern Blot" hibridizasyon veya "Dot Blot" hibridizasyon ile kalp dokusuna özgü olduğu doğrulanan bu homolog genler çeşitli embriyolojik dönemlerde semikantitatif PCR ile araştırıldı. Yetişkin BALB/c fare kalbine has oluşturulan çıkartılmış hibridizasyon cDNA kütüphanesinden seçilen transkriptlerin embriyonik dokularda ekspresyon düzeyi iki grup altında incelendi. Birinci grupta kalp ve iskelet kasındaki ekspresyon düzeyleri karşılaştırıldı ve ikinci grupta total embriyolardaki ekspresyon düzeyleri birbirleri ile karşılaştırıldı. Jel densitometrisi aracılığıyla bir "housekeeping" gen olan beta aktin ile kıyaslanarak ekspresyon düzeylerini belirten değerler elde edildi Tüm sonuçlar tablo altında toplandı (Tablo 10, 11) Bu çalışma sonrasında hangi transkriptin hangi embriyonik dönemden başlanarak araştırılabileceği hakkında ön bilgi elde edilmiştir. Transkriptlerin daha ileri araştırmalarının "Insitu" hibridizasyon tekniği ile yapılması planlanmaktadır. Ayrıca bu dizilerin insan hastalıklarındaki olası rolleri de araştırılması düşünülmektedir. Genom benzerlikleri sayesinde fere genomunda yapılan araştırmalar insan genomunun yorumlanması için kaynak sağlamakta ve insan hastalıklarının açıklanmasında model sistem olarak farenin kullanılmasına olanak tanımaktadır. Dolayısı ile yeni genlerin tanımlanması ve ürünlerinin analiz edilmesi çeşitli hastalıkların tam ve tedavisine yön verecektir.

Abstract:
Human Genome Project and researches for the detection of novel genes has not only provided enormous knowledge about genes also facilitated the improvement of many techniques. Analysing the gene of interest with the molecular genetic methods and detecting homologues through the cyber gene banks via internet made it easy to reach the information about the genes. Both the improvement of these techniques and screening the cardiovascular diseases through the developmental stages leaded to get more information about the genetic causes and pathogenesis of these disorders. Because of the complex statue of heart development it is suspected that many genes takes part in the procedure. A subtractive hybridisation cDNA library specific to heart tissue was previously created in our laboratory. And this research is based upon these previous experiments. We analysed the three of the transcripts that thought to has an important role in heart development by molecular genetic methods and bioinformatics. The transcripts isolated from the library analysed by semiquantitative PCR using the cDNAs synthesied from total RNAs of heart and skeletal tissue. Northern/Dot Blotting is done for these transcripts and concluded that have specific expression for heart tissue. Semiquantitative PCR is also done for the embryonic stages. Two groups is formed for the embryonic stage: First group for the comparison of expression at heart and skeletal tissue and second for the comparison among the embryonic stages. The expression value get from the gel densitometer measurement is compared to beta actin gene which is known to be housekeeping. All the values are summarised in the tables 10 and 11. The research leaded us about the expression patterns of the transcripts in different stages for the following experiments. We plan to analyse these transcripts further by insitu hybridisation techniques. In addition it is planned to analyse the roles of these transcripts in human diseases. The genome similarities of mouse and human provide a source for human genome research and a model organism to explain the human diseases. Therefore, detecting novel genes and analysing their products will lead the scientific experiment for various diseases and their medications.