Lizozim ve laktoferrin içeren yeni formulasyonların geliştirilmesi ve mutans streptokokları ile laktobasiller üzerindeki antibakteriyel etkilerinin in vitro koşullarda değerlendirilmesi
Development of new formulations containing lysozyme and lactoferrin and determining the antibacterial effect of these formulations on mutans streptococci and lactobacilli in vitro conditions
Yazar: KÜBRA TONGUÇ
Danışman: PROF. DR. NÜKET SANDALLI
Yeditepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Pedodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Biyofilmler = Biofilms ; Diş macunları = Toothpaste ; Laktoferrin = Lactoferrin ; Muramidases = Muramidases ; Streptococcus = Streptococcus ; Streptococcus mutans = Streptococcus mutans

Özet:
Üç yaşın altındaki çocuklarda, gelişmekte olan sürekli dişlerde fluorozis riski oluşturması nedeniyle fluoridli diş macunu ve uzun süre kullanımındaki yan etkileri ve sitotoksisitesi nedeniyle klorheksidinin kullanımı önerilmemektedir. Tükürük proteinlerinden Lizozim ve Laktoferrin içeren bir preparatın küçük çocuklarda diş çürüklerinin önlenmesi için bir çözüm getirebileceği düşünülmektedir. Antimikrobiyal ajanların, poloxamer ve lipozomal taşıyıcı sistemler ile topikal uygulamalarının ağız hastalıklarının tedavisinde etkili olduğu görülmüştür.Çalışmamızın amacı, Lizozim ile Laktoferrin içeren ve taşıyıcı sistem olarak Pluronic F-127 isimli Poloxamer ve/veya dondurularak kurutulan DOTAP içeren lipozom [Dondurularak kurutulan Lipozomal DOTAP (DLD)] kullanıldığı farklı formulasyonların, diş çürüğüne neden olduğu bilinen Streptococcus sobrinus, Streptococcus mutans, ve Lactobacillus acidophilus bakteri suşları üzerindeki antibakteriyel etkilerinin klorheksidin jel ile karşılaştırmalı olarak in vitro koşullarda değerlendirilmesidir.Çalışmamızdaki formulasyonlar; (1) Sorensen's Çözeltisi tampon olarak, (2) yalnız poloxamer 407'nin kullanıldığı jel şeklinde, (3) Lizozim ve Laktoferrinin tamponda çözdürülerek, (4) Lizozim ve Laktoferrin tamponda çözdürüldükten sonra poloxamer 407 ile birleştirilmesiyle, (5) DLD'nin tamponda çözdürülmesiyle, (6) poloxamer 407 tamponda dağıtıldıktan sonra DLD ile birleştirilmesiyle, (7) Lizozim ve Laktoferrin tamponda çözdürüldükten sonra DLD ile birleştirilerek, (8) Lizozim ve Laktoferrin çözdürüldükten ve poloxamer 407 içerisinde dağıtıldıktan sonra DLD'nin eklenmesiyle sekiz grup olarak hazırlanmıştır. Kontrol grubu olarak % 0,2'lik klorheksidin jel/gargara, pozitif kontrol grubu olarak boş hidroksiapatit diskler kullanılmıştır. Antibakteriyel etkinin değerlendirildiği birinci bölümde, çalışma gruplarının, Streptococcus sobrinus, Streptococcus mutans ve Lactobacillus acidophilus'a karşı antibakteriyel etki gösteren minimal inhibitör konsatrasyonları (MİK) belirlenmiştir. İkinci bölümde ise, 10 farklı grubun hidroksiapatit diskler üzerinde 24 saatlik Streptococcus sobrinus ve Streptococcus mutans biyofilm oluşumu üzerine etkileri değerlendirilmiştir.MİK deneyinde, poloxamer içermeyen formulasyonlar suşlara karşı etkili bulunmamıştır. Poloxamer 407 içeren formulasyonlar, Lizozim ve Laktoferrin içeriğinden bağımsız olarak suşlar üzerine inhibisyon göstermiştir. % 0,2'lik klorheksidinin diğer formulasyonlara oranla çok düşük konsantrasyonlarda etkili olduğu görülmüştür.Biyofilm deneyinde Poloxamer 407 ile hazırlanan jel formulasyonları S. sobrinus ve S. mutans biyofilmlerinin oluşumunu önlemede diğer deney gruplarına göre üstün bulunmuşlardır. Bu gruplar arasında en yüksek etkiyi her iki suş üzerinde de Lizozim, Laktoferrin içeren ve Poloxamerin kullanıldığı grup göstermiştir (p<0,05). % 0,2'lik klorheksidin diglukonat'ın biyofilm oluşumunu tam olarak önlediği görülmüştür.Çalışmamızda antibakteriyel etkinliği gösterilen formulasyonlarda bulunan maddelerin daha uzun süreli etkilerinin anlaşılabilmesi için, ileriki çalışmalarda bu maddelerin etkinliğinin kinetik olarak değerlendirilmesi ve sitotoksisitelerinin belirlenmesi gerektiği düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler: Lizozim, Laktoferrin, taşıyıcı sistemler, antibakteriyel etki

Abstract:
The children under three years old are not suggested to use fluoridated toothpaste because of the risk of fluorosis and chlorhexidine for a long period resulting adverse effects and cytotoxicity. New formulations containing lysozyme and lactoferrin might be effective on preventing tooth decay in small children. Topical application of antimicrobial agents with drug delivery systems such as poloxamer and liposome is used for the treatment of oral diseases.The aim of this study was to determine the antibacterial effect of different formulations on Streptococcus sobrinus, Streptococcus mutans ve Lactobacillus acidophilus among containing lysozyme and lactoferrin and drug delivery system as poloxamer 407 with the trade name of Pluronic F-127 or/and freeze dried liposome containing DOTAP [Freeze dried Liposomal DOTAP (FLD)] in comparison with 0,2 % chlorhexidine.The formulations were (1) Sorensen?s Buffer Solution, (2) the gel formulation containing only poloxamer 407, (3) the formulation dissolving lysozyme and lactoferrin in Sorensen?s Buffer Solution, (4) the formulation combined with poloxamer 407 after dissolving lysozyme and lactoferrin in Sorensen?s Buffer Solution, (5) the formulation dissolving FLD in Sorensen?s Buffer Solution, (6) the formulation combined with FLD after dispersed into the poloxamer 407 in Sorensen?s Buffer Solution, (7) the formulation combined with FLD after dissolving lysozyme and lactoferrin in Sorensen?s Buffer Solution, (8) the formulation dissolving lysozyme and lactoferrin into Sorensen?s Buffer, then incorporting into the poloxamer 407 and combining with FLD. The control group was 0,2% chlorhexidine gel/mouthwash and positive control group consisted of empty hydroxyapatite discs. The antibacterial effect was assessed by determining the Minimal Inhibition Concentrations (MIC) of the test groups on Streptococcus sobrinus, Streptococcus mutans ve Lactobacillus acidophilus. The effects of ten groups on biofilm formation of Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans for 24 hours on the hydroxyapatite discs were also evaluated.In MIC experiment, the formulations which do not contain poloxamer 407 showed no inhibiton effect on these bacteria. The formulations with poloxamer 407, apart from the content of lysozyme and lactoferrin, inhibited the bacteria. The 0,2 % chlorhexidine was effective on the bacteria at very low concentrations.In biofilm experiment, the formulations with poloxamer 407 were found more effective in the inhibition of biofilm formation of Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans than other groups. Among these, the formulation containing Lysozyme and Lactoferrin with poloxamer 407 exhibited the highest efficiency on these bacteria (p<0,05). In the specimens with chlorhexidine, it was observed that there was no bacterial growth.The formulations which showed antibacterial effect in the present study, should be further evaluated with regard to longer periods, using kinetic methods. Additionally cytotoxicity should be determined.Key words: Lysozyme, Lactoferrin, drug delivery system, antibacterial effect