Sulu ikili faz sistemi ile Agaricus bisporus atıklarından lakkaz geri kazanımı
Recovery of laccase from Agaricus bisporus waste by aqueous two-phase system
Yazar: EBRU GÜLEÇ
Danışman: PROF. DR. İHSAN YAŞA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Lakkazlar (EC 1.10.3.2, benzendiol: oksijen oksidoredüktaz) fenolik bileşikleri fenoksil radikallere dönüştürebilme yeteneğine sahip olan çoklu-bakır proteinleridir. Lakkazlar 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS) mediatörü gibi fenolik olmayan bileşikleri okside edebilme potansiyeline sahiptir. Lakkazlar, ilk defa bitkilerden izole edilmiş ancak mantarlarda ve bazı bakterilerde de bulunmuştur. Fungal lakkazlar, lignin parçalanması, sporulasyon, pigment üretimi, meyve oluşumu ve bitki patogenezi gibi süreçlere aracılık etmektedir. Lakkazların Agaricus bisporus atık mantar sapından salgılanan en önemli   ligninolitik enzimlerin ilkidir. Bu çalışmada, Agaricus bisporus'un atık sap lakkazlarının geri kazanımı için düşük maliyetli sulu ikili faz sisteminin (ATPS) kullanımı araştırılmıştır. Sulu ikili faz sistemi tuz ve poli etilen glikol (PEG) polimerinden oluşmaktadır Sulu ikili faz sisteminde, PEG konsantrasyonu ve moleküler ağırlığı, tuz türü ve sistem pH parametreleri ile birlikte en iyi lakkaz konsantrasyonu belirlenerek enzim geri kazanımı sağlanmıştır.
	Çalışmamızda, lakkaz enzim kaynağı olarak Agaricus bisporus atık mantar sapı kullanılmıştır. %12.21 kuru madde olan atık mantar sapından elde ettiğimiz ham enzim ekstraktının protein miktarı 3.9 mg/ml ve spesifik aktivitesi 13.713 U/mg olarak saptanmıştır. Sulu ikili faz sistemi ile faz hacim oranı<1.0 olan en yüksek değerlerin alındığı pH 4.60'daki kombinasyon %10 PEG-1000 / %12.5 Na2SO4 / %1 ham enzim ekstraktı karışımıyla, enzimin protein miktarı 0.46 mg/ml aktivitesi 16.144 U/mg , saflaştırma katsayısı 1.20, enzim geri kazanımı %94.06 ve %86'lık verim ile saflaştırılmıştır. Ultrafiltrasyon sonucu protein miktarı 1.1 mg/ml aktivitesi 24.171 U/mg olduğu görülmüştür. Enzim başlangıç ham enzim ekstraktına göre 1.76 kat saflaştırılmıştır.

Abstract:
The laccases (EC 1.10.3.2, benzenediol: oxygen oxidoreductase) are members of the multi-copper protein family that are capable of oxidation phenolic compounds to phenoxyl radicals. In the presence 2,2'-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS) mediator, laccases has potential of oxidation of nonphenolic compounds. First time, laccases were isolated from plants but were founded in fungi and some bacteria. Fungal laccases facilitated several processes such as lignin degradation, sporulation, pigment production, fruiting body formation and plant pathogenesis. Laccases are known as the first and main ligninolytic enzymes secreted by Agaricus bisporus in spent mushroom stipe.  In our work, to recovery of laccase from the residual mushroom stipe of Agaricus bisporus, a low cost aqueous two-phase systems (ATPS) were evaluated. ATPS was assembled from a mixture of polymers such as poly ethylene glycol (PEG) and salts. By evaluation of molecular mass, concentration of PEG, type of salt and system pH parameters, the best laccase concentrates in the aqueous two-phase systems (ATPS) were determined. 
In this study, PEG 1000 and Na2SO4 ATP System established to be appropriate for the primary recovery of laccase. An extraction of spent mushroom stipe from % 12.21  dry matter, amount of protein 3.9 mg/ml, enzyme activity 13.713 U/ml, ATPS stage comprising volume ratio <1.0, PEG 1000 10% (w/w), Sulphate 12.5% (w/w), system pH of 4.6 and loaded with 1% (w/w) of crude extract from residual mushroom stipe allowed the laccase recovery. The ATPS resulted in one-single primary recovery stage process produced an overall yield of 86%. Amount of protein 0.46 mg/ml, enzyme activity 16.144 U/ml, purification fold 1.20 and enzyme recovery %94.06 were determined. After ultra filtration, amount of protein and enzyme activity were resulted 1.1 mg/ml and 24.171 U/mg, respectively. According to these results, final enzyme extract were 1.76 fold purified more than crude enzyme extract.