Subkronik 1800 MHz elektromanyetik alan uygulanmış sıçanların testis dokusunda GRP78 ekspresyonunun incelenmesi
The investigation of GRP78 expression in testicular tissue of rat exposed to subchronic 1800 MHz electromagnetic field
Yazar: DİLEK ÖZULUS TÜZÜN
Danışman: PROF. DR. SAVAŞ AKTAŞ
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Elektromanyetik alanlar = Electromagnetic fields ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sıçanlar = Rats ; Testis = Testis ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Farklı dozlarda ve sürelerde elektromanyetik alan (EMA)'nın testis dokusunda yapısal ve fonksiyonel değişikliklere neden olduğu bildirilmiştir. Literatürde ER stresi ile ilgili çok sayıda araştırma bulunmasına rağmen spermatojenik hücrelerde 1800 MHz EMA ve ER stresi ilişkisini raporlayan çalışmaya rastlanmamıştır. Bu nedenle yapılan bu çalışmada, subkronik olarak 1800 MHz EMA'a maruz bırakılan sıçanların testis dokusunda, ER stresi ile ilişkili GRP78 mRNA ve protein ekspresyonlarındaki olası değişikliklerin ortaya konulması hedeflenmiştir. Çalışmamızda 21 adet 8-10 haftalık Wistar erkek sıçan kullanıldı. Denekler eşit sayıda ve rastgele olarak, kontrol, sham ve EMA grubu olmak üzere 3 gruba ayrıldı. Kontrol grubuna (n=7) hiçbir işlem uygulanmadı. Sham grubu (n=7) (günde 2 saat/60 gün) EMA uygulanmaksızın EMA cihazı içinde bekletildi. EMA grubuna (n=7) (günde 2 saat/60 gün) 1800 MHz EMA uygulandı. Deney sonunda sakrifiye edilen deneklerin sol testisleri ışık mikroskobik incelemeler için %10'luk nötral tamponlanmış formaline (NTF) alındı. Işık mikroskobik doku takibi sonrası parafine gömülen dokulardan 5 μm'lik kesitler alındı. Hematoksilen-eozin (H-E) ile boyanan kesitlerde seminifer tübül çapları ve germinal epitel kalınlığı ölçülürken, Johnsen skorlaması ile spermatogenezis değerlendirildi. İmmunohistokimyasal incelemeler için indirekt immunoperoksidaz tekniği kullanılarak spermatik hücrelerde GRP78 immun işaretlemesi yapıldı. Deneklerin sağ testisleri Real-Time (gerçek zamanlı) PCR yöntemi için RNAlater solüsyonuna alındı ve dokuların GRP78 mRNA ekspresyon düzeyleri incelendi. Kontrol, sham ve EMA gruplarında seminifer tübül çapları ve germinal epitel kalınlıklarının benzer olduğu ve istatistiksel olarak aralarında anlamlı fark olmadığı gözlendi (sırasıyla p=0,386, p=0,131). EMA grubunda modifiye Johnsen skorlamasının kontrol ve sham gruplarına göre anlamlı azaldığı (p<0.001) saptandı. Spermatogonyum, spermatosit, spermatid ve spermatozoonların GRP78 immünoreaktivite skorlarının (IRS) tüm gruplarda birbirine benzer olduğu görüldü (sırasıyla; p=0,963, p=0,311, p=0,790, p=0,943). Kontrol, sham ve EMA gruplarının GRP78 mRNA ekspresyonları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı (p=0.348). Sonuç olarak; 1800 MHz EMA'nın spermatogenez sürecini bozduğu, ancak spermatojenik hücrelerde ER stres belirteçlerinden biri olan GRP78 ekspresyonunda değişikliğe yol açmadığı saptandı. Uygulanan EMA frekans ve süresinin ER stresine neden olmadığı düşünülürken daha yüksek frekans ve sürelerde EMA'nın uygulanacağı yeni çalışmalarda olası ER stresinin ortaya konması gerektiği düşünüldü. 

Anahtar Kelimeler: Elektromanyetik alan, Testis, ER stresi, GRP78, İmmunohistokimya, Real-Time PCR

Abstract:
It has been reported that the different dose and duration electromagnetic field (EMF) cause changes in the testicular morphology and function. Although there are many studies about ER stress in the literature, no studies have reported the relationship between 1800 MHz EMA and ER stress in spermatogenic cells. Therefore, in this study, it was aimed to reveal possible changes in GRP78 mRNA and protein expression related to ER stress in testicular tissue of rats exposed to 1800 MHz EMA subchronic. In our study, we used twenty-one male Wistar rats (8 to 10 weeks of age). The experimental animals were divided into three groups; control, sham, and EMA. No treatment was applied to the control group (n=7). Sham group (n=7) was not exposed to the electromagnetic field but, were left in the EMF device with two hours, daily for sixty days. EMF group (n=7) was exposed to the electromagnetic field of 1800 MHz two hours daily for sixty days. At the end of the experiment, the left testes of sacrificed experimental animals were taken to %10 neutral buffered formalin (NTF) for light microscopic examination. After light microscopic tissue processing, 5 μm sections were taken from the paraffin embedded tissues. Sections stained with hematoxylin-eosin (H-E) seminiferous tubule diameters and germinal epithelial thickness were measured and spermatogenesis was evaluated by Johnsen scoring. For immunohistochemical examinations, GRP 78 immunostaining was performed in spermatic cells by using indirect immunoperoxidase technique. The right testes of the subjects were taken to RNAlater solution for Real-Time PCR chain reaction method and GRP78 mRNA expression levels of the tissues were examined. In control, sham and EMA groups, seminiferous tubule diameters and germinal epithelial thickness were similar and there was no statistically significant difference between them (p=0.386, p=0.131, respectively). Modified Johnsen scores were significantly decreased in the EMA group compared to the control and sham groups (p <0.001). GRP78 immunoreactivity scores (IRS) of spermatogonium, spermatocytes, spermatids and spermatozoa were similar in all groups (p=0.963, p=0.311, p=0.790, p=0.943, respectively). There was no statistically significant difference between GRP 78 mRNA expressions of control, sham and EMA groups (p = 0.348). As a result; It was found that 1800 MHz EMA disrupted the spermatogenesis process, but did not change the expression of GRP 78, one of the ER stress markers in spermatogenic cells. While it was thought that the frequency and duration of the EMA did not cause ER stress, it was thought that in the new studies where higher frequency and duration of EMA would be applied, possible ER stress should be revealed.

Keywords: Electromagnetic field, Testes, ER Stress, GRP78, Immunohistochemistry, Real-Time PCR