Deneysel olarak enfekte edilen gökkuşağı alabalığı (Oncorchynchus mykiss)'nda Flavobacterium psychrophilum'un floresan antikor teknikleri ile saptanması üzerine bir araştırma
A study on using of fluorescent antibody techniques for detecting of Flavobacterium psychrophilum in experimentally infected rainbow trout (Oncorhynchus mykiss
Yazar: DERYA DELEN
Danışman: PROF.DR. GÜLŞEN TİMUR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Bu çalışma, Flavobacterium psychrophilum ile deneysel olarak enfekte edilen yavrugökkuşağı alabalığı (Oncorchynchus mykiss) dokularındaki patojen bakteri veserumlarındaki spesifisik antikor varlığının İndirekt Floresan Antikor Tekniği (İFAT)kullanılarak kısa sürede tespit edilmesi amacı ile yürütülmüştür.Çalışmada İstanbul Üniversitesi, Sapanca İçsu Ürünleri Üretimi Araştırma ve UygulamaBiriminden alınan 100 adet 3-5 gr ağırlığındaki yavru gökkuşağı alabalığı 2 fiberglastanka 50 şer adet olacak şekilde yerleştirilmiştir. Tanklardan biri deneme, diğeri isekontrol grubu olarak kullanılmıştır. Deneme grubu 30 adet balığa PBS içerisinde 106cfu/ml F. psychrophilum bakterisi intraperitonal olarak enjekte edilmiştir. Kontrolgrubu 30 adet balığa ise steril PBS ile enjeksiyon yapılmıştır. Deneme boyunca susıcaklığı 10 ± 2 ºC olarak ayarlanmıştır. Enjeksiyondan 12 gün sonra deneme grububalıklarda hastalık belirtisi görülmeye başlamış ve deneysel enfeksiyon çalışması 21gün sonunda bitirilmiştir.Deneysel olarak enfekte balıklarda iştahsızlık, vücutlarının yan yüzlerinde ülseratiflezyonlar, solgun solungaçlar, vücut renginde koyulaşma, dalakta büyüme ve boşbağırsaklar tespit edilmiştir.Etken bakteri deneysel olarak enfekte edilen balıkların iç organlarından re-izoleedilerek, klasik bakteriyolojik yöntemlerle identifiye edilmiştir.Deneysel olarak enfekte balıkların dokularındaki F. psychrophilum' u tespit etmek içinhasta balık dokularından lamda hazırlanan ezme preperatlar üzerine sırasıyla anti-F.psychrophilum poliklonal tavşan antikoru ve anti-tavşan IgG FITC konjugatı konularakinkübe edilmiştir. Enfekte balıkların serum örnekleri için ise lam üzerine çizilenhalkalar F. psychrophilum antijeni ile kaplanarak hasta balık serumları bu halkalarakonmuş ve üzerlerine sırasıyla anti-salmon immunoglobulun poliklonal tavşan antikoruve anti-tavşan IgG FITC konjugatı konularak inkübe edilmiştir. Böylece dokudakipatojen bakteri ve serumdaki spesifik antikorlar FITC ile işaretlenmiş ve preperatlarınfloresan mikroskopta incelenmesiyle antijen-antikor komplekslerinin varlığını ortayakoyan yeşil floresan görünümler tespit edilmiştir.Bu çalışmada, hastalığın klasik bakteriyolojik yöntemlerle teşhisi yaklaşık 3 haftasürerken, indirekt floresan antikor tekniği ile yaklaşık 1 gün içinde yapılmıştır.Sonuçlar, Flavobacterium psychrophilum enfeksiyonlarının teşhisinde floresan antikortekniğinin hızlı ve duyarlı bir yöntem olarak kullanılabileceğini göstermiştir.

Abstract:
The present work was carried out to rapidly detect the pathogen bacteria in the tissuesand specific antibody in the antiserum both those obtained from experimentally infectedyoung rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) with Flavobacterium psychrophilum, usingby Indirect Fluorescent Antibody Technique (IFAT).In this study, 100 young rainbow trout weighing 3-5 gr were obtained from IstanbulUniversity Sapanca Freshwater Fish Production Research and Applied Unit and placedin two fiberglas tanks, each containing 50 fish. One of the tanks was used asexperimental group and other control group. 30 fish from experimental group wereinjected intraperitoneally with 106 cfu/ml of F. psychrophilum in PBS. 30 fish fromcontrol group were injected with steril PBS. The temperature of water was 10 ± 2 ºCduring experiment. The signs of the disease occurred among the experimental fish after12 days from injection and experiment was ended after 21 days.Experimentally infected fish showed poor appetite, ulcerations of skin, pale gills, darkpigmentation of skin, enlarged spleen and empty intestinal tract.Pathogen bacteria was isolated from visceral organs of experimentally infected fish andidentified by using conventional bacteriological methods.For detecting F. psychrophilum in the tissues of experimentally infected fish, anti-F.psychrophilum polyclonal rabbit antibody and anti-rabbit IgG FITC conjugated wereoverlaid on squashed preparations prepared from infected fish tissues on the slides andthe slides were incubated. The serum samples of experimentally infected fish wereoverlaid on the wells of the slides coated with the antigen of F. psychrophilum and theslides were incubated, then anti-salmon immunoglobulin polyclonal rabbit antibody andanti-rabbit IgG FITC conjugated were overlaid on these complexes and incubated. Inthis way, pathogen bacteria in tissues and specific antibody in antiserum wereconjugated with FITC and green fluorescence, demonstrating presence of antigenantibodycomplexes, were determined by using fluorescence microscope.In this study, diagnosis of the disease by using conventional bacteriological methodstook time of three weeks, while just taking time of about a day with indirect fluorescentantibody technique. These results showed that fluorescent antibody technique can beuse in diagnosis of Flavobacterium psychrophilum infections as fast and sensitivetechnique.