Rumen bakteri ve funguslarının bazı enzimlerinin moleküler düzeyde karakterisazyonu
Molecular characterization of some enzymes in rumen bacteria and fungi
Yazar: HALİT YÜCEL
Danışman: PROF. DR. MEHMET SAİT EKİNCİ
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ksilanaz = Xylanese ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Rumen mikroorganizmaları = Rumen microorganisms ; Selülaz = Cellulase ; İnülinaz = Inulinase

Özet:
Rumen mikroorganizmalarının sahip olduğu glikozit hidrolaz (GH) enzimleri gıda, kağıt, yem ve tekstil gibi farklı endüstriyel alanlarda aktif olarak kullanılmaktadır. Özellikle ksilanaz, selülaz ve inülinaz enzimleri biyoteknolojik özelliği olan enzimler olarak bilinmektedir. Bu çalışmada rumen içerisinde yayılış gösteren anaerobik gut fungus (AGF) ve rumen bakterisinin sahip olduğu biyoteknolojik potansiyeli olan enzimlerin tespiti ve moleküler düzeyde incelenmesi gerçekleştirilmiştir. Bunun için Biyoteknoloji ve Genetik Mühendisliği (BİGEM) kültür koleksiyonunda bulunan Neocallimastix sp.  (GMLF1) izolatının sahip olduğu ksilanaz enzim aktivitesi, Orpinomyces sp.  (GMLF 19) izolatı için selülaz enzim aktivitesi ve  Selenomonas ruminantium suşuna ait inülinaz enziminin aktivitesi incelenmiştir. Ayrıca GMLF 1 izolatına ait ksilanaz enzimini kodlayan ve GMLF 19 izolatına ait selülaz enzimini kodlayan gen bölgeleri uygun primerler aracılığıyla PZR yardımıyla çoğaltılmış ve ilgili genler pUC18 plazmit vektör kullanılarak Escherchia coli DH5α suşuna klonlanmıştır. Daha sonra klonlanan gen bölgelerinin oligonükleotid analizleri gerçekleştirilmiştir. Doğal ve elde edilen rekombinant suşlardan sentezlenen enzimler ile  Selenomonas ruminantium  suşuna ait rekombinant olmayan  inülinaz enziminin optimum sıcaklık, optimum pH, termal stabilite, pH stabiliteleri, çeşitli iyonların (Mn+2, Co+2, Ca+2, Mg+2 ve Zn+2) enzim üzerine etkisi belirlenmiştir. Ksilanaz enzimini kodlayan gen bölgesi için yapılan dizilim analizi sonrası ilgili genin 900 bç uzunluğunda, bir açık okuma çerçevesi (ORF) ile bir katalitik domaini olan bir bölge olarak tespit edilmiştir. Elde edilen ksilanaz enzimi GH 11 ailesine ait olup, izoelektrik noktası (pI) 7.78'dir. İlgili gen bölgesinden sentezlenen enzimin hücresel aktivitesi 4986,24 µmol/dk/mg protein, optimum sıcaklığı 50℃ ve pH'ı ise 6.5 olarak belirlenmiştir. Rekombinant enzime ait ince tabaka kromatografi analizi sonrası Rf (Retention factor) değeri Neocallimastix sp. izolatından sentezlenen ksilanaz enzimi ile kıyaslanmış ve son ürün Rf değerlerinin aynı olduğu gözlemlenmiştir. Orpinomyces sp. izolatından izole edilen selülaz enzimini kodlayan gen bölgesine ait oligonükleotid dizi analizine göre bu bölge 1.4 kb uzunluğundadır, bir ORF bölgesi ile bir karbonhidrat bağlama modülüne (KBM) ait domain bölgesine sahiptir. Enzimin GH 6 ailesine üye olduğu ve pI değerinin 8.72 olduğu tespit edilmiştir. İlgili gen bölgesinden sentezlenen enzimin hücresel aktivitesinin 589,64 µmol/dk/mg protein, optimum sıcaklık değerinin 50oC ve optimum pH değerinin ise 6.0 olduğu tespit edilmiştir. Rekombinant suş tarafından salgılanan selülaz enzimin 40oC'de termal stabilitesini koruduğu ve 4.0-8.5 pH değerleri arasında  % 50.7 oranında pH stabilitesine sahip olduğu tespit edilmiştir. Rekombinant enzimin TLC analizi sonrası Rf değeri Orpinomyces sp. GMLF 19 izolatı için tespit edilen Rf değerine benzer çıkmıştır. Selenomonas ruminantium suşuna ait süpernatant inülinaz enzim aktivitesi 8.82 µmol/dk/mg protein, optimum sıcaklığın 40oC ve pH'ın 5.5 olduğu belirlenmiştir. Ayrıca inülinaz enzimin pH 3.0-9.0 değerleri arasındaki pH stabilitesi %50.90 oranında ve 40oC'de termal stabiliteye sahip olduğu gözlemlenmiştir. Selenomonas ruminantium suşuna ait olan inülinaz enziminin inülin substratının hidrolizini gerçekleştirdiği yapılan TLC analizi ile belirlenmiştir. Ayrıca çalışılan bütün enzimler üzerinde Mn+2, Co+2, Ca+2ve Mg+2  iyonlarının 1mM'lık konsantrasyon uygulamalarının indükleyici olduğu, Zn+2  iyonunun ise aynı konsantrasyonda inhibitör etki gösterdiği gözlemlenmiştir.

Abstract:
The glycoside hydrolase (GH) enzymes possessed by rumen microorganisms are actively used in different industrial areas such as food, paper/pulp, feed and textile. Especially xylanase, cellulase and inulinase hold a great potential as to be used in biotechnological application. In this study, the determination of the biotechnological potential enzymes of some anaerobic gut fungi (AGF) and rumen bacterium inhabiting in the rumen and their analysis at the molecular level were carried out. For this purpose, xylanase enzyme activity of Neocallimastix sp. (GMLF1), cellulase enzyme activity for Orpinomyces sp. (GMLF 19),  and inulinase enzyme activity of Selenomonas ruminantium were investigated. In addition, the xylanase and cellulase enzyme encoding gene region of the isolate GMLF 1 and isolation GMLF 19 were amplified respectively by PCR using appropriate primer pairs. The relevant genes were cloned into E.coli DH5α by strain using the pUC18 plasmid as vector. Then, the cloned gene regions were sequence. Optimum temperature, optimum pH, thermal stability, pH stability, and the effect of various ions (Mn+2, Co+2, Ca+2, Mg+2 and Zn+2)  on the native and recombinant enzymes of GMLF1 and GMLF 19 and native inulinase enzyme of Selenomonas ruminantium were determined. The sequence analysis showed that the gene region encoding the xylanase enzyme activity was identified as a 900 bp long region with an open reading frame (ORF) and a catalytic domain. The obtained  xylanase enzyme thought to be belongs to the GH 11 enzyme family and has an isoelectric point (pI) of 7.78. The cellular activity of the xylanase enzyme was determined as 4986.24 µmol/min/mg protein, the optimum temperature was 50℃ and the pH was 6.5. After thin layer chromatography (TLC) analysis of the recombinant enzyme, the Rf (Retention factor) value was compared with the xylanase enzyme synthesized from Neocallimastix sp. GMLF1  and it was observed that the final product Rf values were the same. According to sequence analysis of the gene region encoding the cellulase enzyme of Orpinomyces sp. GMLF19 the coding region is about 1.4 kb long, and has an ORF region and a carbohydrate binding module (CBM) domain region.The obtained cellulase enzyme thought a member of the family GH 6, its pI value was found to be 8.72. It was determined that the cellular activity of the enzyme was 589.64 µmol/min/mg protein, the optimum temperature was 50℃ and the optimum pH was 6.0. It was determined that the cellulase enzyme secreted by the recombinant strain maintained its thermal stability at 40℃ and and pH stability of 50.7 % between 4.0-8.5 pH values. According to TLC analysis the Rf value of the recombinant enzyme, was similar to the Rf value of the Orpinomyces sp. GMLF19. It was determined that the inulinase supernatant of Selenomonas ruminantium was 8.82 µmol/min/mg protein, the optimum temperature was 40℃ and the pH was 5.5. In addition, the pH stability of inulinase enzyme between pH 3.0-9.0 values is 50.90 % and has thermal stability at 40℃. The TLC analysis also proved that the inulinase enzyme of the Selenomonas ruminantium hydrolyse of the inulin substrate. In addition, it has been observed that 1mM concentrations of Mn+2, Co+2, Ca+2 and Mg+2 ions have an inducing effect on all the enzymes studied, while Zn+2 ions have an inhibitory effect at the same concentration.