Baş ve boyun kanser hücrelerinin hipoksik mikroçevresinde HIF-1a ile ilişkili mitokondriyal glukoz metabolizmasının rolünün incelenmesi
Investigation of the role of mitochondrial glucose metabolism related with HIF-1a in the hypoxic microenvironment of head and neck cancer cells
Yazar: ŞENİZ İNANÇ SÜRER
Danışman: PROF. DR. GÜLGÜN OKTAY
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Ağız mukozası = Mouth mucosa ; Ağız neoplazmları = Mouth neoplasms ; Dikloroasetat = Dicholoroacetate ; Hücre dizisi = Cell line ; Kafa ve boyun neoplazmları = Head and neck neoplasms ; Metformin = Metformin ; Mitokondriler = Mitochondria ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Giriş: Son derece agresif bir malign tümör olan oral skuamöz hücreli karsinom, baş ve boyun kanserlerinin bir alt türüdür ve dünya çapında 6.sırada yer almaktadır. Oral kanserlerin tedavisinde kullanılan temel tedavi yöntemleri cerrahi, radyoterapi ve/veya kemoterapidir. İlaçların yeniden konumlandırması FDA-onaylı mevcut ilaçların, başta kanser olmak üzere farklı hastalıkların tedavisindeki potansiyel etkilerini belirlemek amacıyla kullanılan bir ilaç tasarım yöntemidir. Bu kapsamda Tip 2 diyabet tedavisinde kullanılan Metformin ve laktik asidoz tedavisinde kullanılan Dikloroasetat, FDA onaylı metabolik ajanlardır ve tümör metabolizması üzerindeki etkileri nedeniyle kanser tedavisinde kullanılabilecek potansiyele sahiplerdir.
Amaç: Bu çalışmanın amacı; oral skuamöz hücreli karsinom hücre hattında (UPCI-SCC-131) Metformin ve Dikloroasetat'ın hücre canlılığı, HIF-1α and PDK-1 ekspresyonları ve mitokondiyal metabolizma üzerindeki etkilerinin incelenmesidir.
Yöntem: İlk olarak, UPCI-SCC-131 hücreleri normoksik (%20 O2, 37ﹾ) ve hipoksik koşullar (%1 O2, 37ﹾ) altında 72 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda Metformin ve Dikloroasetat ile muamele edildi ve IC50 değerleri belirlendi. Metformin ve DCA kombinasyonlarının sinerji gösterip göstermediği CompuSyn software ile incelendi. Belirlenen ilaç dozları 48 saat boyunca hücrelere uygulandıktan sonra HIF-1α ve PDK-1 mRNA ekspresyon düzeyleri Real-Time PCR; protein ekspresyon düzeyleri ise Western Blot yöntemi ile incelendi. Bunun yanı sıra ilaçların metabolizma üzerindeki etkileri Seahorse XF Analyzer ile değerlendirildi.
Bulgular: Metformin ve Dikloroasetatın normoksik koşullardaki IC50 değerleri sırasıyla 4mM ve 30mM iken; hipoksik koşullarda 14mM ve 40mM bulundu. Tüm kombinasyon gruplarındaki CI değerlerinin (0,46-0,80) 1'in altında olması, UPCI-SCC-131 hücrelerinde Metformin ve DCA'nın hücre canlılığı üzerinde sinerjistik bir etkiye sahip olduğunu gösterdi. Metformin uygulaması sonucunda UPCI-SCC-131 hücrelerinde HIF-1α ve PDK-1 mRNA ekspresyon düzeylerinin değişmediği, protein ekspresyon düzeylerinin ise anlamlı olarak azaldığı belirlendi. Dikloroasetat uygulanan hücrelerde ise PDK-1 mRNA ve protein ekspresyonlarının anlamlı olarak azaldığı, HIF-1α protein ekspresyon düzeylerinin ise doza bağlı olarak azaldığı belirlendi. Ek olarak, metabolik akış deneyleri uygulandığında ise UPCI-SCC-131 hücrelerinin hücresel fenotipinin Metformin kullanımı ile glikolitik yöne kaydığı, Dikloroasetat kullanımı ile enerjitik yöne kaydığı gösterildi.
Sonuç: Sonuç olarak elde ettiğimiz verilerin gelecekte oral skuamöz hücreli karsinom metabolizmasını hedef alan ve anti-tümörijenik özelliklere sahip yeni terapötik kombinasyonların geliştirilmesine katkıda bulunacağını öngörmekteyiz.

Abstract:
Introduction: Oral squamous cell carcinoma, highly aggressive malignant tumor, is sixth cancer worldwide and a subtype of head and neck cancers. The basic treatment methods of oral cavity cancer are surgery, radiotherapy and/or chemotherapy. Drug repositioning is a drug designing method in which available FDA-approved drugs are determined for their potent effects in different diseases especially cancer. In this context, Metformin, used in type 2 diabetes, and Dichloroacetate (DCA), used in lactic acidosis, are FDA approved drugs and have potential in cancer therapy for the effects on tumor metabolism.
Objective: The aim of this study is to investigate the effects of Metformin and Dichloroacetate on cell viability, HIF-1α and PDK-1 expressions, and mitochondrial metabolism in the oral squamous cell carcinoma cell line (UPCI-SCC-131).
Method: At first, UPCI-SCC-131 cells were treated with Metformin and Dichloroacetate at different concentrations for 72 hours under normoxic (20% O2, 37ﹾC) and hypoxic conditions (1% O2, 37ﹾC) and IC50 values were determined. The synergism of Metformin and DCA were analyzed with CompuSyn software. Gene and protein expression levels of HIF-1α and PDK-1 were examined by Real-Time PCR and Western Blot, respectively. In addition, the effects of drugs on metabolism were evaluated by Seahorse XF Analyzer.
Results: The IC50 values of Metformin and Dichloroacetate under normoxic conditions were 4mM and 30mM; under hypoxic conditions were 14mM and 40mM, respectively. Combination index values in all combination groups (0.46-0.80) below 1 showed that Metformin and DCA in UPCI-SCC-131 cells had a synergistic effect on cell viability. After Metformin treatment, HIF-1α and PDK-1 mRNA expression levels did not change and protein expression levels decreased significantly in UPCI-SCC-131 cells. PDK-1 mRNA and protein expressions were significantly decreased in Dichloroacetate-treated cells. In addition, metabolic flow experiments showed that Metformin shifted cellular phenotype into glycolytic pathway and Dichloroacetate into the energetic pathway.
Conclusion: We conclude that the data we have obtained will contribute to the development of new therapeutic combinations with anti-tumorigenic properties which targeted the oral squamous cell carcinoma metabolism in the future.