Çilekte (Fragaria × ananassa) yüksek sıcaklık stresine toleransın fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler mekanizmalarının belirlenmesi
Determination of physiological, biochemical, and molecular mechanisms of high temperature stress tolerance in strawberry (Fragaria × ananassa)
Yazar: IZHAR ULLAH
Danışman: PROF. DR. LEYLA DEMİRSOY ; DOÇ. DR. MUSA KAVAS
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı / Meyve Yetiştirme ve Islahı Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Çilek dünyanın pek çok yerinde yetiştiriciliği yapılan önemli bir türdür. Artan küresel scaklıklar çilek yetiştiriciliği için tehdit oluşturmaktadır. Çilek çeşitlerinin yüksek sıcaklık stresine karşı fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler tepkileri ve tolerans mekanizmaları hakkındaki bilgiler sınırlıdır. Bu çalışma, farklı kısa gün ve nötr gün çilek çeşitlerinin yüksek sıcaklık stresi altında gösterdiği fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler cevapları belirlemek amacıyla yürütülmüştür. Denemede kullanılan çilek çeşitlerinin frigo bitkileri 15 cm çapındaki plastik saksılarda açık koşullarda 3-4 yapraklı oluncaya kadar 5 hafta süreyle yetiştirilmiştir. Daha sonra uyum sağlaması amacıyla bitkilerin iki hafta süreyle iklim odalarında 25/15°C'de  büyütülmesine devam edilmiştir. Kontrol bitkilerinde deneme süresince 25/15°C   sıcaklar korunurken; yüksek sıcaklık stresi uygulamalarında sıcaklığın her 48 saatte bir 5°C artırılmasıyla bitkiler 30/25, 35/25, 40/25 ve 45/25°C şeklinde artan sıcaklıklara maruz bırakılmıştır.
Denemede bitkilerin oransal su içeriği ve toplam klorofil içerikleri ve membran stabilite indeksi sıcaklığın artışıyla birlikte önemli ölçüde azalmıştır. Bitkilerin yaprak yüzey sıcaklığı, malondialdehid (MDA) ve prolin içerikleri ise sıcaklığın yükselmesiyle artmıştır. Çeşitler arasında en yüksek yaprak yüzey sıcaklığı 'Tillamook'; en yüksek yaprak oransal su içeriği, membran stabilite indeksi ve prolin içeriği 'Portola'; en yüksek toplam klorofil içeriği 'Redlands Hope'; en yüksek MDA içeriği 'Fronteras' çeşitlerinde kaydedilmiştir. İncelenen çilek çeşitleri, "Tartılı Derecelendirme" yöntemi ile yüksek sıcaklığa tolerant ('Albion', 'Portola', 'Osmanlı', 'Monterey', 'Calinda', 'Splendor', 'Sweet Ann'), orta derecede tolerant/hassas ('Alba', 'Asia', 'Favette', 'Fortuna', 'Petaluma', 'Roxana', 'Redlands Hope', 'San Andreas') ve hassas ('Festival', 'Sabrina', 'Jive', 'Tillamook', 'Amiga', 'Fronteras') olarak gruplandırılmıştır.
Yüksek sıcaklık stresinin (40°C) gen ifadesi üzerindeki etkilerini belirlemek amacıyla yüksek sıcaklığa hassas ('Fronteras') ve tolerant ('Portola') olarak seçilen iki çilek çeşidinde RNA-seq transkriptomik analizi yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, P40×F40 (Portola-40°C×Fronteras-40°C) örneğinde önemli ölçüde  ifadesi artan 11 785 ve ifadesi azalan 12 016 mRNA geni tespit edilmiştir. P40×F40'ta  önemli ölçüde ifadesi artan 1698 ve ifadesi azalan 905 lncRNA geni tespit edilmiştir. Biyolojik süreçlerde karbonhidrat metabolik süreçleri ve fotosenteze bağlı yolaklarla ilişkilendirilmiş genlerin anlamlı bir şekilde zenginleştiği gözlemlenirken, hücresel konumda tilakoid, tilakoid bölümü, fotosentetik membran ve fotosistemle ilişkilendirilmiş genlerin zenginleştiği gözlemlenmiştir. P40×F40'ta izomeraz aktivitesi ve ATPaz aktivitesi gibi moleküler fonksiyonlarda zenginleşme gözlenmiş, bu da yüksek sıcaklığa karşı dokunun moleküler, biyolojik ve hücresel düzeyde termotolerans hazırlığı olarak ifade edilmiştir. KEGG zenginleşme analizi, P40×F40'ta ribozom biyosentezi, ökaryotlarda peroksizom ve fotosentezle ilgili olarak anlamlı bir zenginleşme göstermiştir. 
qRTPCR analizi sonuçları, P40×F40'ta P25×F25'e göre glikolitik yol, hidralaz aktivitesi, oksogli, thaumatin/osmotin ubikuitin, homeobox-leucine zip kodlu protein ve floem gelişimi ile ilişkilendirilmiş genlerin ifadelerinin arttığı; syntaxin, Myb/SANT, ubikuitin protein ligaz aktivitesi, E3 ligaz, CCCH-tipi çinko parmak, floem, C-terminal ve RING/FYVE/PHD-çinko parmak tipi genlerin ifadelerinin azaldığı bulunmuştur. P40×F40'ta P25×F25'e göre ısı şoku proteinleri  LOC101290755'in ifadesi artarken, LOC101313245, LOC101304168 ve LOC101291264'ün  azaldığı gözlenmiştir. Yüksek sıcaklık stresine hassas ve tolerant çeşitlerdeki değerlendirmeler, yüksek sıcaklığa tolerans mekanizmalarına dair fizyolojik, biyokimyasal ve transkriptomik önemli veriler sunmuştur.

Abstract:
Rising global temperatures are causing irreversible damage to optimal growth, and sustainable yields of fruit crops. Currently, there is little information on the physiological, biochemical, and molecular responses of strawberry cultivars to high-temperature stress and their tolerance mechanisms. The study was conducted to determine the effects of high-temperature stress (25-45oC) on physiological, biochemical, and molecular responses of different day-neutral and short-day varieties. Frigo plants of the strawberry cultivars were grown for 5 weeks in 15 cm diameter plastic pots (3:1:1; garden soil, peat, perlite) under open conditions until they had 3-4 leaves and then transferred to climate chambers. In climate chambers, they were exposed to a temperature of 25/15°C for two weeks before being placed under high-temperature stress. The temperature of 25/15°C day/night was maintained in the control group, while in the temperature stress group, the temperature was gradually increased by 5°C every 48 hours up to 45/25°C. 
The relative water content, total chlorophyll content, and membrane stability index of the plants decreased significantly with increasing temperature. The leaf surface temperature, malondialdehyde (MDA) and proline content of the plants increased with increasing temperature. Among the varieties, the highest leaf surface temperature was recorded in 'Tillamook'; the highest leaf relative water content, membrane stability index, and proline content in 'Portola'; the highest total chlorophyll content in 'Redlands Hope', and the highest MDA content in 'Fronteras'. Strawberry cultivars studied were grouped as high temperature tolerant ('Albion', 'Portola', 'Osmanlı', 'Monterey', 'Calinda', 'Splendor', 'Sweet Ann'), moderately tolerant/sensitive ('Alba','Asia', 'Favette', 'Fortuna', 'Petaluma', 'Roxana', 'Redlands Hope', 'San Andreas') and sensitive ('Festival', 'Sabrina', 'Jive', 'Tillamook', 'Amiga', 'Fronteras') by the "Modified weighted ranked" method.
To determine the effects of high-temperature stress (40°C) on gene expression, RNA-seq transcriptomic analysis was performed in two strawberry cultivars selected as high temperature sensitive ('Fronteras') and tolerant ('Portola'). According to the obtained results, 11,785 upregulated differentially expressed genes (DEGs) and 12,016 downregulated DEGs of mRNAs were detected in P40×F40 (Portola-40oC×Fronteras-40oC). Similarly, 1698 upregulated and 905 downregulated differentially expressed genes of lnRNAs were detected in P40×F40. Gene ontology of functional analysis term showed significant enrichment of differentially expressed genes related to carbohydrate metabolic process and photosynthetic pathways in biological processes. While in cellular location, genes associated with thylakoid, thylakoid compartment, photosynthetic membrane, and photosystem were significantly enriched in P40×F40. Genes belonging to isomerase and ATPase activity were significantly enriched in molecular functions of P40×F40, which was expressed as thermotolerance preparation of the tissue at molecular, biological and cellular levels against high temperature. KEGG enrichment analysis showed a significant enrichment in P40×F40 related to ribosome biosynthesis, peroxisome in eukaryotes, and photosynthesis.
The results of qRTPCR analysis showed that expression of genes associated with the glycolytic pathway, hydrolase activity, oxogly, thaumatin/osmotin ubiquitin, homeobox-leucine zipper protein, and phloem development increased in P40×F40 compared to P25×F25, while the expression of genes belonging to syntaxin, Myb/SANT, ubiquitin-protein ligase activity, E3 ligase, CCCH-type zinc finger, sieve element occlusion, C-terminal, and RING/FYVE/PHD-zinc finger type were decreased in P40×F40 over P25×F25. The expression of heat shock protein LOC101290755 increased in P40×F40 compared to P25×F25, while the expression of LOC101313245, LOC101304168, and LOC101291264 decreased. These evaluations in high-temperature stress-sensitive and tolerant cultivars provided important physiological, biochemical, and transcriptomic data on high-temperature tolerance mechanisms.