Gossypium hirsutum format dehidrogenaz enzimi üzerine bölge doygunluk mutasyonu uygulamaları
Site saturation mutagenesis applications on Gossypium hirsutum formate dehydrogenase enzyme
Yazar: KÜBRA ATİK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
NAD+-bağımlı format dehidrogenazlar (FDH, EC 1.2.1.2) metilotrofik mikroorganizmalar ve yüksek bitkilerde yaygın olarak bulunan enzimlerdir. FDH enzimi NAD(P)+ varlığında formatın CO2'e oksidasyonunu katalizlerken NAD+'ın NADH'a indirgenmesini ve uygun şartlarda NADH varlığında ise ters yönde, CO2'in indirgenmesini katalizleyebilmektedir. Dolayısıyla hem CO2 indirgeme reaksiyonlarının geliştirilmesinde hem de kiral moleküllerin optikçe saf olarak sentezlenmesi sırasında kullanılan NAD(P)H koenziminin yeniden elde edilmesinde önemli enzimlerdir. Literatür incelendiğinde, NAD+-bağımlı FDH enzimleri ile ilgili çalışmaların mikroorganizmalar üzerinde yoğunlaştığı, bitki FDH'leri ile ilgili protein mühendisliği çalışmalarının oldukça az olduğu görülmektedir.  Bu nedenle pamuk (Gossypium hirsutum  L.) bitkisinden izole edilerek E.coli konakçı hücresinde rekombinant olarak üretilebilen Gossypium hirsutum NAD+-bağımlı FDH (GhFDH) enziminin NAD(P)H rejenerasyonunda kullanılma potansiyelinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. FDH enzimleri genellikle NAD+ koenzimine karşı kesin bir spesifite göstermekle birlikte GhFDH'in NADP+'ye karşı da bir afinite gösterdiği tespit edilmiştir. Belirlenen bu NADP+ afinitesi  GhFDH enziminin NAD(P)H rejenerasyonu için geliştirilmeye değer olduğunu göstermektedir. NADP+ afinitesi gösteren bir FDH enziminin elde edilmesi endüstriyel olarak en az NADH kadar sıklıkla kullanılan NAD(P)H koenziminin rejenerasyonu için önemlidir. Bugüne kadar FDH enziminin koenzim spesifisitesinin değiştirilmesine yönelik çalışmalar sonucunda NADP+ molekülüne kısmi aktivite gösteren birkaç mutant enzim elde edilmiştir. 
Bu çalışmada Bölge Doygunluk Mutasyonu yöntemi kullanılarak GhFDH enziminin koenzim spesifitesinin genişletilmesi hedeflenmiştir. Elde edilen mutasyonların koenzim spesifitesinin yanı sıra, substrat spesifitesi, enzim aktivitesi ve termal kararlılığı üzerine olan etkileri de incelenmiştir. GhFDH'de koenzim spesifitesi açısından önemli bir bölge olduğu bilinen N184 amino asidine uygulanan Bölge Doygunluk Mutasyonu ile hedef bölgede mutasyonlar içeren bir akıllı kütüphane elde edilerek mutant GhFDH'ler karakterize edilmiştir. Kütüphanenin aktiviteye bağlı olarak taranması sonucunda hedef bölgedeki N184R ve N184H hedef mutasyonlarına ek olarak farklı iki mutant (D123A ve E198G) daha tespit edilmiştir. Taramalar sonucu seçilen bir başka mutantta ise sadece nükleotid değişimi gerçekleştiği, amino asidin aynı kaldığı görülmüştür (N184N, AACAAT). 
N184R mutantının katalitik aktivitesi (kcat/Km) koenzim olarak NAD+ kullanıldığında yabanıl tip GhFDH'e göre 0.39 s-1mM-1'dan 0.0048 s-1mM-1'a düşmüştür. NADP+ koenzimi kullanılarak yapılan aktivite ölçümlerinde N184R'nin katalitik aktivitesi yabanıl tip GhFDH'e göre 0.0042 s-1mM-1'dan 0.00049'a düşüş göstermiştir. Yabanıl tip GhFDH'in termal kararlılığı (T0.5) 53.8oC iken, N184R için 50.37oC olarak hesaplanmıştır. N184H mutantının katalitik aktivitesi NAD+ kullanıldığında 0.017 s-1mM-1 olarak ölçülürken, NADP+ kullanıldığında katalitik aktivite 0.00049 s-1mM-1 olarak belirlenmiştir. Termal kararlılık ise N184H için yabanıl tip GhFDH'e göre yaklaşık 1oC düşüş göstermiştir. Bununla birlikte hedef dışı rastlanan iki mutasyon noktası olan D123A ve E198G'de herhangi bir aktivite elde edilmemiştir. İleriki çalışmalarda ikinci tur bölge doygunluk mutasyonu ve koenzim spesifitesi için önemli olduğu bilinen farklı residulara bölge doygunluk mutasyonu uygulanarak, NADP+ spesifitesi için önemli bir potansiyele sahip olan GhFDH enziminin koenzim tanıma aralığının genişletilebileceği düşünülmektedir.

Abstract:
NAD+-dependent formate dehydrogenases (FDH, EC 1.2.1.2) are enzymes commonly found in methylotrophic microorganisms and higher plants. While the FDH enzyme catalyzes the oxidation of formate to CO2 in the presence of NAD(P)+, it can catalyze the reduction of NAD+ to NADH and if it is reverse in the presence of NADH under appropriate conditions, the reductive catalyzes of CO2. Therefore, they are important enzymes in the development of CO2 reduction reactions as well as in the recovery of the NAD(P)H coenzyme used during the optically pure synthesis of chiral molecules. When the literature is examined, it is seen that studies on NAD+-dependent FDH enzymes focus on microorganisms, and protein engineering studies on plant FDHs are very few. Therefore, the potential of using Gossypium hirsutum NAD+-dependent FDH (GhFDH) enzyme, which can be isolated from cotton (Gossypium hirsutum L.) and produced recombinantly in E.coli host cell, in NAD(P)H regeneration has been predicted. 
Although FDH enzymes generally show a definite specification for NAD+ coenzyme, it has been determined that GhFDH also shows an affinity for NADP+. This determined NADP+ affinity makes it worth developing for the NAD(P)H regeneration of the GhFDH enzyme. It is important for the regeneration of the coenzyme NAD(P)H, which is used at least as much as NADH, as an FDH enzyme with NADP+ affinity needs to be obtained. Until today, several mutant enzymes that show activity to the NADP+ molecule have been obtained in studies aimed at changing the coenzyme specific activity of the FDH enzyme. This site is aimed at the coenzyme-specific expansion of the GhFDH enzyme under the Site Saturation Mutagenesis. In addition to the coenzyme specification, the effects of the obtained mutations on substrate specificity, enzyme activity and thermal application were also investigated. A smart library containing targeted mutations with the Site Saturation Mutagenesis of N184 amino acid, which is known to be an important region of coenzyme specificity in GhFDH, was obtained and mutant GhFDHs were noted. 
Depending on the activity of the library, in addition to the N184R and N184H target mutations in the target region, two different mutants (D123A and E198G) were detected. The screening path was observed to occur only in the nucleotide in another mutant, and the amino acid remained the same (N184N, AACAAT). The catalytic activity (kcat/Km) of the N184R mutant decreased from 0.39 s-1mM-1 to 0.0048 s-1mM-1 compared to wild-type GhFDH when NAD+ was used as coenzyme. In the activity measurements using NADP+ coenzyme, the catalytic activity of N184R decreased from 0.0042 s-1mM-1  to 0.00049 compared to wild type GhFDH. While the thermal stability (T0.5) of wild type GhFDH was 53.8oC, it was calculated as 50.37oC for N184R. The catalytic activity of the N184H mutant was measured as 0.017 s-1mM-1 when NAD+ was used, while the catalytic activity was determined as 0.00049 s-1mM-1 when NADP+ was used. Thermal stability decreased by about 1oC for N184H compared to wild type GhFDH. 
However, no activity was obtained in D123A and E198G, two non-target mutation points. In future studies, it is thought that the coenzyme recognition range of the GhFDH enzyme, which has an important potential for NADP+ specificity, can be expanded by applying site saturation mutagenesis to different residues known to be important for second round site saturation mutagenesis and coenzyme specificity.