Biyomoleküllerde oksidatif hasarı engelleyici antioksidan aktivite tayini  için elektrokimyasal yöntem geliştirilmesi
Electrochemical method development for determining antioxidant activity preventing oxidative hazard in biomolecules
Yazar: AYŞE NUR ÖNEM
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA REŞAT APAK ; PROF. DR. KEVSER SÖZGEN BAŞKAN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidan aktivite = Antioxidant activity ; DNA = DNA ; Elektrokimya = Electrochemistry ; Reaktif oksijen türleri = Reactive oxygen species

Özet:
Reaktif oksijen türleri (ROS), normal aerobik metabolizmanın bir sonucu olarak üretilir ve deoksiribonükleik asit (DNA) oksidatif hasarını indükleyebilir. Oksidatif DNA hasarının belirlenmesi, önemli bir genomik kararsızlık kaynağı oluşturduğu iyi bilindiği için büyük önem taşımaktadır. Elektrokimyasal teknikler kullanılarak antioksidanların koruyucu etkisinin değerlendirilmesi, DNA nükleobazlarındaki değişikliklerin incelenmesiyle gerçekleştirilebilir. Tez çalışmasında, oksidatif DNA hasarını engelleyici antioksidan aktivitenin değerlendirilmesi için altın nanopartiküller (AuNP) ve çok duvarlı karbon nanotüp (MWCNT)-nafyon modifiye camsı karbon elektrot (GCE/AuNP/MWCNT-Nafyon) geliştirildi ve hazırlanan modifiye çalışma elektrodu döngüsel voltametri (CV), elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) ve taramalı elektron mikroskopisi (SEM) teknikleri ile karakterize edildi. Geliştirilen elektrokimyasal yöntem, bakır(II) varlığında çözünmüş oksijen tarafından üretilen radikallerin elektrot yüzeyine immobilize edilen DNA'yı kısmi olarak hasara uğratmasına ve antioksidan bileşiklerin oluşan radikalleri süpürerek hasarın oluşumunu engellemesine dayanmaktadır. DNA hasarı sonucu oluşan guanin, adenin ve sitozin oksidasyon sinyallerindeki değişiklikler, antioksidanların yokluğunda/varlığında, bakır(II) ile dsDNA etkileşimi öncesinde/sonrasında diferansiyel puls sıyırma voltametrisi (DPSV) kullanılarak ölçüldü. Oluşan radikallerin guanin ve adenin bazlarına yüksek oranda (% 90,9 ve 91,2), sitozine ise tamamen hasar verdiği görüldü. Belirli antioksidan bileşiklerin (askorbik asit, gallik asit, epikateşin, kateşin, epikateşin gallat, glutatyon, klorojenik asit, N-asetil sistein, rozmarinik asit, kuersetin ve rutin) aynı konsantrasyon değerine (0,05 mM) denk gelen adenin pik akım değerleri kullanılarak, tüm bileşiklerin % antioksidan etkileri hesaplandı ve % 30,46-75,56 aralığında bir koruyucu etki olduğu gözlendi. Kuersetinin (QR) 0,005-0,05 mM lineer çalışma aralığında en yüksek antioksidan etkiyi gösterdiği bulundu (I (μA)=421,43[QR(mM)] + 11,14; r= 0,995, n=6) ve belirtme sınırı (LOD) 1 μM olarak tespit edildi. Geliştirilen biyosensör, bitki çaylarının antioksidan aktivitelerinin (AOA) belirlenmesi için uygulandı. Yeşil çay, ıhlamur, ekinezya ve elma çayı için AOA değerleri kateşin (CT) eşdeğeri cinsinden sırasıyla, 80,29, 75,79, 70,92 ve 62,04  µmol CT/g olarak bulundu. Antioksidan etkileri (%) ise sırasıyla, 66,16, 62,50, 58,44 ve 51,12 olarak bulundu. Geliştirilen yöntemin doğrulaması ve validasyonu yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemiyle yapıldı. HPLC yöntemi ile yeşil çay ve CT için antioksidan etkiler (%) sırasıyla; 61,99 ve 62,22 olarak hesaplandı. Son olarak, insan serumunda bulunan bazı bileşiklerin (dopamin, ürik asit, proteinler (temsili olarak sığır serum albümini, BSA), glukoz) ve fetal sığır serum (FBS) matriksinin (proteince zengin, hormon ve enzimler içeren sentetik serum örneği) hazırlanan elektrot ile DNA tespiti üzerine bozucu etkileri incelendi.

Abstract:
Reactive oxygen species (ROS) are produced as a result of normal aerobic metabolism and can induce deoxyribonucleic acid (DNA) oxidative damage. The study of oxidative DNA damage is of great importance as it is well known to constitute an important source of genomic instability. Evaluation of the protective effect of antioxidants using electrochemical techniques can be performed by examining changes in DNA nucleobases. In the thesis study, gold nanoparticles (AuNP) and multi-walled carbon nanotube (MWCNT)-Nafion modified glassy carbon electrode (GCE/AuNP/MWCNT-Nafion) was developed to evaluate the antioxidant activity preventing oxidative DNA damage, and the prepared modified working electrode was characterized by cyclic voltametry (CV), electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and scanning electron microscopy (SEM) techniques. The developed electrochemical method is based on the fact that the radicals produced by dissolved oxygen in the presence of copper(II) partially damage the DNA immobilized on the electrode surface and the antioxidant compounds prevent damage by scavenging the formed radicals. Changes in guanine, adenine and cytosine oxidation signals resulting from DNA damage were measured using differential pulse stripping voltametry (DPSV) before/after interaction of dsDNA with copper(II) in the absence/presence of antioxidants. It was observed that the formed radicals damaged guanine and adenine bases at a high rate (90.9% and 91.2%) and completely damaged cytosine. Using adenine peak current values corresponding to the same concentration value (0.05 mM) of certain antioxidant compounds (ascorbic acid, gallic acid, epicatechin, catechin, epicatechin gallate, glutathione, chlorogenic acid, N-acetyl cysteine, rosmarinic acid, quercetin, and rutin), the % antioxidant effects of all compounds were calculated and a protective effect in the range of 30.46-75.56% was observed. Quercetin (QR) was found to show the highest antioxidant effect in the linear working range of 0.005-0.05 mM (I (μA)=421.43[QR(mM)] + 11.14; r= 0.995, n=6) and limit of detection (LOD) was determined as 1 µM. The developed biosensor was applied to determine the antioxidant activities (AOA) of herbal teas. AOA values for green tea, linden, echinacea and apple tea were found to be 80.29, 75.79, 70.92 and 62.04 µmol CT/g in terms of catechin (CT) equivalents, respectively. The antioxidant effects (%) were found to be 66.16, 62.50, 58.44 and 51.12, respectively. The developed method was verified and validated by high performance liquid chromatography (HPLC) method. Antioxidant effects (%) for green tea and CT by HPLC method were calculated as 61.99 and 62.22, respectively. Finally, the effects of some compounds in human serum (dopamine, uric acid, proteins (representatively bovine serum albümin, BSA), glucose) and fetal bovine serum (FBS) matrix (protein-rich synthetic serum sample containing hormones and enzymes) on DNA detection with the prepared electrode were examined.