Protein C saflaştırılması için moleküler baskılanmış adsorbentler
Molecular imprinted adsorbents for protein C purification
Yazar: BİNNAZ DEMİRCİ
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Protein C (PC), insan pıhtılaşma sistemi için önemli bir antikoagülant ve antitrombotiktir. Protein C, pıhtılaşma önleyici etkisini protein S (PS) ile birlikte FVa ve FVIIIayı inaktive ederek gösterir. Protein C, insan kanında 4 µg/mL derişiminde bulunur. Eksikliğinde damarlarda tromboz oluşma riski yüksektir. Bu kan pıhtıları (trombositler) damar yüzeyinden kopup kan akımına karıştığında felç, kalp krizi ve pulmoner emboli?ye neden olabilmektedir. Kan pıhtılaşması erken fark edilip tedavi edilmezse hayatı tehdit edici olabilir. Protein C eksikliği olan hastaların tedavisi için yaygın olarak heparin ve coumadin kullanılmaktadır. Ancak bu ilaçlar aşırı iç kanama, felç, organ yetmezliği gibi tehlikeli yan etkilere sahiptir. Buna karşılık, Protein C'nin herhangi bilinen bir yan etkisi yoktur; bu yüzden, protein C'nin tedavi olarak yerini alması çok ümit vericidir. Moleküler baskılama, moleküler kalıp kullanılarak polimerik matriksde tanıma bölgeleri oluşturan bir teknolojidir. Moleküler baskılanmış polimerler hazırlanması kolay, dayanıklı, ucuz ve moleküler tanıma yeteneği olan polimerlerdir. MIP'ler yapay bir afinite ortamı olarak kabul edilebilir. Kriyojeller sıfırın altındaki sıcaklıklarda üretilen makrogözenekli polimerlerdir. Gözenekli kriyojeller geniş gözenekler, kısa difüzyon yolu ve düşük basınç düşmesi ve hem adsorpsiyon hem de elüsyon için çok kısa direnç zamanı gibi birçok avantajıyla geleneksel protein bağlama matrikslerine çok iyi bir alternatiftir.
Bu çalışmanın amacı, sulu çözeltiden Protein C saflaştırılması için kullanılacak Protein C baskılanmış poli(hidroksietil metakrilat) süpermakrogözenekli kriyojeller hazırlamaktır. MIP kriyojeli hazırlamak için Cu2+ iyonları varlığında kalıp Protein C ile kompleks oluşturan metal şelat monomeri [N-metakriloil-(L)-histidinmetilester (MAH)], çapraz bağlayıcı olarak metilen-bis(akrilamid) (MBAAm) ve başlatıcı/aktivatör çifti olarak amonyum persülfat (APS)/N,N,N?,N?-tetrametilen diamin (TEMED) kullanılarak hidroksietil metakrilat (HEMA) ile kopolimerize olmuştur. Polimerizasyon tamamlandıktan sonra, kalıp protein C molekülleri 1.0 M NaCl çözeltisi kullanılarak MIP kriyojelden uzaklaştırılmıştır. Protein C baskılanmış P[HEMA-MAH/Cu(II)] kriyojele sulu çözeltiden Protein C adsorpsiyonu sürekli sistemde çalışılmıştır. Hazırlanan Protein C baskılanmış [P(HEMA-MAH/Cu(II)] kriyojeller spesifik yüzey alanı 31.5 m2/g, şişme oranı ise % 88.4?dür. Maksimum Protein C adsorpsiyon kapasitesi 30.4 mg Protein C/g kriyojel?dir. Seçici bağlama çalışmaları hemoglobin ve insan serum albumini varlığında yapılmıştır. Protein C/hemoglobin ve Protein C/insan serum albumini için MIP kriyojelin bağıl seçicilik katsayısı baskılanmamış PHEMA kriyojelinkine göre sırasıyla 2.37 ve 8.89 kat daha fazla görülmüştür. Protein C için MIP kriyojelinin seçiciliği protein sıvı kromatografisi ile doğrulanmıştır. MIP kriyojel, protein C bağlama kapasitesinde azalma olmaksızın birçok kez kullanılmıştır.

Anahtar Sözcükler: Kriyojeller, Moleküler baskılama, Moleküler tanıma, Protein 
C, Protein adsorpsiyonu, Afinite bağlanma.

Abstract:
Protein C (PC) is the pivotal anticoagulant and antithrombotic in the human coagulation cascade.  Protein C is showed its anticoagulant effect with Protein S (PS) by inactivating FVa and FVIIIa. PC is at a concentration of 4 µg/mL in human blood. In the absence of Protein C (Protein C deficiency) increases risk of generation thrombosis. When these blood clots break away from the surface of the vein and enter the blood stream, they will induce strokes, heart attacks and pulmonary embolisms. Blood clotting can be life threatening if it is not recognized early and treated. Heparin and coumadin are commonly used to the treatment for protein C deficient patients. However, these therapeutics have dangerous side effects as excessive bleeding, stroke, organ failure. In contrast, protein C has no known side effects; therefore, therapeutic replacement of protein C appears very promising. Molecular imprinting is a technology to create recognition sites in a polymeric matrix using a molecular template. Molecularly imprinted polymers (MIP) are easy to prepare, stable, inexpensive and capable of molecular recognition. MIPs can be considered as affinity separation media. Cryogels are macroporous polymer materials produced at sub-zero temperatures. Porous cryogels are a very good alternative to traditional protein-binding matrices many advantages like large pores, short diffusion path and low pressure drop, and very short residence times for both adsorption and elution.
The aim of this study is to prepare Protein C-imprinted poly(hydroxy ethylmethacrylate) based supermacroporous cryogels which can be used for the purification of Protein C from aqueous solution. A metal chelate monomer [N-methacryloyl-(L)-histidinemethylester (MAH)] forming coordination complex with the template Protein C in the presence of Cu2+ ions copolymerized with hydroxyethyl methacrylate (HEMA), using N,N?-methylene-bis(acrylamide) (MBAAm) as the cross-linker and ammonium persulfate (APS)/N,N,N?,N?-tetramethylene diamine (TEMED) as initiator/activator pair to prepare the MIP cryogel. After polymerization is completed, the template Protein C molecules were removed from the MIP cryogel using 1.0 M NaCl solution. Adsorption of Protein C was performed from aqueous solution by Protein C imprinted P[HEMA-MAH/Cu(II)] cryogel in continuous system. The specific surface area of the Protein C imprinted cryogel was found to be 31.5 m2/g, swelling ratio was % 88.4. The maximum Protein C adsorption capacity was 30.4 mg Protein C/g cryogel. Selective binding studies were performed in the presence of hemoglobin and human serum albumin. The relative selectivity coefficients of MIP cryogel for Protein C/hemoglobin and Protein C/human serum albumin were 2.37 and 8.89 times greater than those of the non-imprinted PHEMA cryogel, respectively. The selectivity of MIP cryogel for Protein C was also confirmed with fast protein liquid chromatography. The MIP cryogel could be used many times with no remarkable decrease in Protein C binding capacity.


Key Words: Cryogels, Molecular imprinting, Molecular recognition, Protein C, 
Protein adsorption, Affinity binding.