Perakende olarak satışa sunulan kırmızı etlerde GSβl, AMP-C ve karbapenemaz üreten escherichia coli suşlarının antimikrobiyal direncinin MIC, klasik PCR ve lamp PCR analizleri ile araştırılması
Research of antimicrobial resistance of escherichia coli strains producing GSβl, AMP-C and carbapenemas in retail red meats by mic, classic PCR and lamp PCR assurances
Yazar: CEREN HALICI DEMİR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SİBEL KIZIL
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Beta laktamazlar = Beta lactamases ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Et = Meat ; Et ürünleri = Meat products ; Genler = Genes ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-bakteriyel = Drug resistance-bacterial

Özet:
Antibiyotikler; insanlar ve hayvanlarda, bakteriyel hastalıklara yol açan patojenlerin bertaraf edilmesi için kullanılan ajanlardır. Antibiyotik kullanımıyla birlikte, bakteriyel enfeksiyon kaynaklı ölüm sayılarının azaldığı belirlenmiş, yıllar içinde antibiyotikler enfeksiyon kaynaklı hastalıklarda kullanılan normal bir ilaç haline gelmiştir. Antibiyotiklerin giderek artan kullanımı, antibiyotiğe dirençli mikroorganizmaların ortaya çıkmasına neden olmuştur. Bu çalışmada; perakende satışa sunulan kırmızı etlerden izole edilen GSβL, Amp-C ve karbapenemaz üreten Escherichia coli (E. coli) suşlarının, fenotipik olarak antibiyotik direnç özelliklerinin disk difüzyon ve E-Test ile; antibiyotik direnç genlerinin ise Klasik PCR ve LAMP PCR metotlarıyla belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda alınan 120 adet kırmızı etten, 12'sinde E. coli izole edilmiş ve hızlı idendifikasyon sistemi (BBL Crystal) ile doğrulanmıştır. İzolatların disk difüzyon test sonuçları European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ve Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)'a göre değerlendirilmiş ve GSβL aktivitesi 10 izolatta belirlenmiştir. Disk difüzyon test sonuçlarına göre; ampisiline ve tetrasikline %91,6, sefotaksime %83,33, kloramfenikole, siprofloksasine ve nalidiksik asite %75, sulfametoksol/trimetopirim ve azitromisine %66, gentamisine %41,6, seftazidime %41,6 ve tigesikline %33,3 oranında direnç görülmüş; meropeneme karşı direnç görülmemiştir. Ayrıca izolatların hepsi (%100) sefoksitine dirençli bulunmuştur. İzolatların E-Test sonuçları EUCAST, CLSI ve E European Union Reference Laboratory-Antimicrobial Resistance (EURL-AR)'a göre değerlendirilmiş ve 1 adet izolatta GSβL bulunmuş; Amp-C ve karbapenemaz aktivitesi izolatların hiçbirinde saptanmamıştır. Antibiyotik direnç genlerinin tespiti için, DNA'lar izole edildikten sonra Klasik PCR ve LAMP PCR testleri yapılmıştır. Klasik PCR ile izolatlar GSβL, Amp-C ve karbapenemaz genleri yönünden analiz edilmiştir. PCR sonrasında, agaroz jel elektroforezde oluşan bantlar değerlendirilmiştir. LAMP PCR metodunda ise DNA'lar, izotermal şartlarda (65°C), yaklaşık 40 dakika amplifiye edildikten sonra, agaroz jel elektroforezde yürütülerek sonuçlar değerlendirilmiştir. 
Klasik PCR sonucunda, GSβL aktivitesi yönünden incelendiğinde 4 izolatta (12B, 1D, 12A, 9D) CTX-M1 geni ve izolatların tamamında SHV geni tespit edilirken; Amp-C ve karbapenemaz geni tespit edilmemiştir. LAMP PCR ile karbapenemaz genleri incelendiğinde, 2 izolat (14D ve 24D) karbapenemaz pozitif tespit edilmiş ve incelenen karbapenamaz genlerinin hepsi (NDM, OXA-48, IMP, VIM, KPC) tespit edilmiştir. Ayrıca bu çalışmada kırmızı etlerin Tamponlanmış Peptonlu Su (TPS)'da 24 saatlik ön zenginleştirmesinden, etken izolasyonuna gerek kalmadan, direkt direnç genlerini tespit etmek amaçlanmış; Klasik PCR sonucunda, 4 numunede (12B, 1D, 12A, 9D) CTX-M1 ve SHV genleri; diğer numunelerde sadece SHV geni tespit edildiği görülmüştür. Yapılan LAMP PCR'da ise iki numunede (24D ve 14D), tüm karbapenemaz genleri (NDM, OXA-48, IMP, VIM, KPC) tespit edilmiştir. Piyasadan toplanan kırmızı etlerden izole edilen E. coli' lerin GSβL, Amp-C ve karbapenemaz genleri halk sağlığı ve hayvan sağlığı açısından riskli olabileceği ve bu konu ile ilgili olarak antibiyotik dirençliliğin ve direnç genlerinin izlenilmesi gerektiği kanaatine varılmıştır. Özellikle tüketicileri direkt etkilediği için kırmızı etlerde tespit edilen antibiyotik direnç genlerinin izlenmesi tek sağlık konsepti açısından oldukça önemlidir. Antibiyotik kullanımının veteriner sahada uygulanma sıklığının ve hem hayvanlarda hem de insanlarda oluşabilecek antibiyotik direnç yayılımının da azaltılması için gerekli önlemlerin alınması gerekmektedir. 
Bu çalışma, Kırıkkale Üniversitesi, Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje Numarası: 2020/077'dir.

Abstract:
Antibiotics are agents used to eliminate pathogens that cause bacterial diseases in humans and animals. It has been determined that the number of deaths due to bacterial infections has decreased with the use of antibiotics, and antibiotics have become a normal drug used in infectious diseases over the years. The increasing use of antibiotics has led to the emergence of antibiotic-resistant microorganisms. In this study; GSβL, Amp-C and carbapenemase-producing Escherichia coli (E. coli) strains isolated from red meats offered for retail sale were determined phenotypically by disk diffusion and E-Test for antibiotic resistance properties; Antibiotic resistance genes were determined by Classical PCR and LAMP PCR methodsIn this context, E. coli was isolated in 12 of 120 red types of meat and confirmed by a rapid identification system (BBL Crystal). The disk diffusion test results of the isolates were evaluated according to the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) and the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), and GSβL activity was determined in 10 isolates. According to disk diffusion test results; 91.6% resistance to ampicillin and tetracycline, 83.33% to cefotaxime, 75% to chloramphenicol, ciprofloxacin and nalidixic acid, 66% to sulfamethoxazole/trimethoprim and azithromycin, 41.6% to gentamicin, 41.6% to ceftazidime and 33.3% to tigecycline seen; No resistance to meropenem was observed. In addition, all (100%) isolates were resistant to cefoxitin. E-Test results of the isolates were evaluated according to EUCAST, CLSI and European Union Reference Laboratory-Antimicrobial Resistance (EURL-AR) and GSβL were found in one isolate; Amp-C and carbapenemase activity were not detected in any of the isolates. Classical PCR and LAMP PCR tests were performed after the DNAs were isolated for the detection of antibiotic resistance genes. By classical PCR, isolates were analyzed for GSβL, Amp-C and carbapenemase genes. After having PCR, bands formed in agarose gel electrophoresis were evaluated. In the LAMP PCR method, the DNAs were amplified under isothermal conditions (65°C) for approximately 40 minutes, and the results were evaluated by conducting them in agarose gel electrophoresis. As a result of classical PCR, when examined in terms of GSβL activity, the CTX-M1 gene was detected in 4 isolates (12B, 1D, 12A, 9D) and the SHV gene was detected in all isolates; Amp-C and carbapenemase gene could not be detected. When carbapenemase genes were examined by LAMP PCR, two isolates (14D and 24D) were found to be carbapenemase positive, followed by all of the carbapenemase genes examined (NDM, OXA-48, IMP, VIM, KPC). In addition, this study, it was aimed to determine the resistance genes directly from the 24-hour pre-enrichment of red meats in Buffered Peptone Water (BPW) without the need for agent isolation. As a result of classical PCR, CTX-M1 and SHV genes in four samples (12B, 1D, 12A, 9D); only the SHV gene was detected in other samples. In LAMP PCR, all carbapenemase genes (NDM, OXA-48, IMP, VIM, KPC) were detected in two samples (24D and 14D). It has been concluded that GSβL, Amp-C and carbapenemase genes of E. coli isolated from red meat collected from the market may be risky in terms of public health and animal health, and antibiotic resistance and resistance genes should be followed in this regard. Monitoring of antibiotic resistance genes detected in red meat is very important in terms of single health concept, especially since it directly affects consumers. Necessary measures should be taken to reduce the frequency of antibiotic use in the veterinary field and the spread of antibiotic resistance that may occur in both animals and humans.
This study was supported by Kırıkkale University Scientific Research Projects Coordination Unit. Project Number: 2020/077.