Klinik örneklerden izole edilen karbapenem dirençli Pseudomonas aeruginosa izolatlarındaki antibiyotik direncinin moleküler analizi
Molecular analysis of antibiotic resistance in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates isolated from clinical samples
Yazar: GÜLŞAH ALTAN
Danışman: PROF. DR. OSMAN BİROL ÖZGÜMÜŞ
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Riskli hasta gruplarında morbitide ve mortaliteye neden olan Pseudomonas aeruginosa fırsatçı bir patojendir. Busuşlarının arasında karbapenemazların yayılması neden olduğu enfeksiyon hastalıklarının tedavisini zorlaştırmaktadır. Bu tez çalışmasında, Ekim 2021 ile Mart 2023 tarihleri arasında Kocaeli Üniversitesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi Merkez Laboratuvarı Bakteriyoloji Birimi'nde çeşitli klinik örneklerden izole edilen 47 adet karbapeneme dirençli P. aeruginosa (KDPA) izolatının moleküler epidemiyolojisinin araştırılması amaçlanmıştır. İzolatlarının identifikasyonu VITEK® MS otomatize sistemle yapılmıştır. İzolatların bazı antibiyotiklere (imipenem, meropenem, aztreonam, amikasin, netilmisin, tobramisin, piperasilin, piperasilin/tazobaktam, seftazidim, sefepim, siprofloksasin ve levofloksasin) karşı duyarlılık testleri VITEK® 2 Compact otomatize sistemle yapılmıştır. İmipenem/meropenem-EDTAkombine disk yöntemi ile izolatların metallo-beta-laktamaz (MBL) üretimi araştırılmıştır. Sıvıda çiftleştirme yöntemi ile konjugasyon deneyleri yapılmıştır. Alkali lizis yöntemi ile plazmit DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Disk difüzyon yöntemi ile transkonjugantlardaki ko-transfer edilen antibiyotik dirençler belirlenmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile karbapenemaz genleri (blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaKPC ve blaOXA-48), integron gen kasetleri (sınıf 1 ve sınıf 2) ve virülans genleri (lasR ve rhlR) araştırılmıştır. İzolatların klonal ilişkileri ERIC (Enterobacterial Intergenic Repetitive Consensus)-PZR'dan elde edilen DNA parmak izi analizlerinin değerlendirilmesiyle araştırılmıştır. İzolatlarda en yüksek direnç oranı levofloksasine karşı belirlenmiştir. En düşük direnç oranı tobramisin, gentamisin ve amikasine karşı gözlenmiştir. Yirmi beş (%53,2) izolatta MBL üretimi tespit edilmiştir. Konjugasyon deneylerinde 12 (%25,5) izolatta konjugatif direnç plazmiti belirlenmiştir. İzolatların %90'ında PZR ile lasR ve rhlR biyofilm genleri tespit edilmiştir. Altı (%12,8) izolatta blaVIM geni, beş (%10,6) izolatta blaNDM geni, üç (%6,4) izolatta blaOXA-48 geni saptanmıştır. blaKPC ve blaIMP genleri tespit edilmemiştir. İntegron-spesifik PZR'larda 39 (%82,9) izolatta intI1 geni pozitifken, 24 (%51)' ünün sınıf 1 integron gen kaseti taşıdığı belirlenmiştir. Konjugatif plazmit içeren izolatların altısının sınıf 1 integron gen kaseti taşıdığı saptanmıştır. KDPA izolatlarında sınıf 2 integronlara rastlanmamıştır. ERIC-PZR paternlerinin dendogram analizinde KDPA izolatları arasında klonal benzerlik olmadığı ve izolatların çapraz bulaş ile yayılmadığı belirlenmiştir. Sonuç olarak, KDPA izolatlarının çoğunun karbapenemler haricinde diğer antibiyotik gruplarına da yüksek oranda direnç gösterdiği ve bazı dirençleri (seftazidim, sefepim, siprofloksasin, levofloksasin, piperasilin-tazobaktam) konjugatif direnç plazmitleriyle ko-transfer edebildiği görülmüştür. Klinik arenada salgına neden olabilecek potansiyeldeki bu suşların direnç gen rezervuarlarında moleküler epidemiyolojik olarak takip edilmesinin yararlı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that causes morbidity and mortality in risky patient groups. The spread of carbapenemases among these strains causes difficulties to treat infectious diseases. In this thesis study, it was aimed to investigate the molecular epidemiology of 47 carbapenem-resistant P. aeruginosa (CRPA) isolates isolated from various clinical samples at Kocaeli University Research and Application Hospital Central Laboratory Bacteriology Unit between October 2021 and March 2023. Identification of the isolates performed with the VITEK® MS automated system. Sensitivity tests of the isolates against some antibiotics (imipenem, meropenem, aztreonam, amikacin, netilmicin, tobramycin, piperacillin, piperacillin/tazobactam, ceftazidime, cefepime, ciprofloxacin and levofloxacin) were performed with the VITEK® 2 Compact automated system. Metallo-beta-lactamase (MBL) production of isolates was investigated by the imipenem/meropenem-EDTA combined disk method. Conjugation experiments were carried out using the 'broth mating' method. Plasmid DNA isolation was performed by alkaline lysis method. Co-transferred antibiotic resistances in transconjugants were determined by the disk diffusion method. Carbapenemase genes (blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaKPC and blaOXA-48), integron gene cassettes (class 1 and class 2) and virulence genes (lasR and rhlR) were investigated by polymerase chain reaction (PCR). Clonal relationships of the isolates were investigated by evaluating DNA fingerprint analyzes obtained from ERIC (Enterobacterial Intergenic Repetitive Consensus)-PCR. The most resistance rate to the isolates was determined to be levofloxacin. The lowest resistance rate was observed against tobramycin, gentamicin and amikacin. MBL production was detected in twenty-five (53.2%) isolates. In conjugation experiments, conjugative resistance plasmids were detected in 12 (25.5%) isolates. Biofilm genes lasR and rhlR were detected by PCR in 90% of the isolates. The blaVIM gene was detected in six (12.8%) isolates, the blaNDM gene was detected in five (10.6%) isolates, and the blaOXA-48 gene was detected in three (6.4%) isolates. blaKPC and blaIMP genes were not detected. In integron-specific PCR, 39 (82.9%) isolates were positive for the intI1 gene, while 24 (51%) were determined to carry a class 1 integron gene cassette. Six of the isolates containing conjugative plasmids were found to carry the class 1 integron gene cassette. Class 2 integrons were not found in CRPA isolates. Dendrogram analysis of ERIC-PCR patterns determined that there was no clonal similarity between CRPA isolates and that the isolates did not spread by cross-contamination. As a result, it was observed that most of the CRPA isolates showed high resistance to other antibiotic groups other than carbapenems and could co-transfer some resistances (ceftazidime, cefepime, ciprofloxacin, levofloxacin, piperacillin-tazobactam) with conjugative resistance plasmids. It is thought that it would be useful to follow molecular epidemiology in the resistance gene reservoirs of these strains, which have the potential to cause epidemics in the clinical arena.