Ephestia kuehniella'da transferin geninin moleküler karakterizasyonu ve savunma reaksiyonlarındaki rolü üzerinde araştırmalar
Studies on the molecular characterization of transferrin gene and the role of transferrin in defense reactions in Ephestia kuehniella
Yazar: NURPER GÜZ
Danışman: PROF. DR. NEŞET KILINÇER
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Transferin böceklerde demir metabolizmasında rol alan önemli bir proteindir. Transferin proteininin demir taşıma fonksiyonunun yanı sıra böceklerde savunma reaksiyonlarında antibiyotik bir ajan olarak, üreme sisteminde jüvenil hormon tarafından regüle edilerek vitellojenik bir protein olarak görev aldığı bilinmektedir. Bu çalışmada model olarak seçilen Ephestia kuehniella ve endoparazitoidi Venturia canescens ilişkisinde incelenmek üzere transferin geninin moleküler karakterizasyonu ve parazitlenmiş bireylerin farklı dönemlerinde transferin geninin ekspresyonundaki değişimin belirlenmesi amaçlanmıştır. Moleküler yöntemlerin kullanımıyla gerek parazitoid yumurtasına ve gerekse larvasına karşı olası bir savunma reaksiyonunun ip uçlarının ortaya konması hedeflenmiştir. Ayrıca Ephestia transferin geninin transkripsiyonel profili ve yaralanmanın transferin ekspresyonuna etkisi ortaya konmaya çalışılmıştır. Son olarak Ephestia larvalarının bakteri ile enfeksiyonu sonucunda ortaya çıkabilecek transferin ekspresyon değişikliği saptanmıştır. Ephestia kuehniella transferin cDNA'sı revers transkripsiyon polymeraz zincir reaksiyonu (RT PCR) ve cDNA uçlarının hızlı çoğaltılması (RACE) yöntemleriyle klonlanmıştır. 2458 bç uzunluğundaki cDNA'nın 683'lik bir aminoasiti kodladığı saptanmıştır. Ortaya çıkan aminoasit sekansının incelenmesiyle Ephestia transferin geninin Chilo suppressalis'e %76, Galleria mellonella'a %75, Plutella xylostella'ya %74, Manduca sexta'ya %74, Bombyx mori'ye %73, Spodoptera litura'ya %72, Choristoneura fumiferana'ya %71 oranında benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca elde edilen sekansta olası demir bağlama bölgelerinin N terminal lobda olduğu tahmin edilmektedir. Ephestia'nın baş, toraks, barsak, yağ dokusu ve ovarylerinin dissekte edilmesiyle yapılan RT PCR analizi sonucunda transferin transkriptlerinin en fazla yağ dokusunda ve ovarylerde olduğu saptanmıştır. Ephestia'nın farklı gelişme dönemlerinde transferin mRNA'sının ekspresyon profilini incelemek için yapılan Northern blot analizi sonucunda transferin ekspresyonunun en fazla görüldüğü dönemler sırasıyla otuz üç günlük larva, otuz üç günlük erkek larva ve pupadır. En düşük transferin ekspresyonu ise yumurta ve erginlerde saptanmıştır. Ephestia larvalarının steril iğne ile yaralanması sonucunda transferin ekspresyon düzeyi RT PCR ile belirlenmiş bunun sonucunda kontrol gurubuna göre artış göstermesi transferinin yara tamirinde ve bu aşamada olabilecek melanin reaksiyonlarında rolü olabileceği saptanmıştır. Önceki çalışmalarda belirtildiği gibi Ephestia larvalarının E. coli bakterisiyle enfekte edilmesiyle transferin mRNA seviyesi artış göstermiş ve bu artışın en fazla altıncı saatte olduğu ve 24 saat sonra bile kontrol grubuna göre yüksek kaldığı gözlenmiştir. Son olarak Ephestia'nın endoparazitidi olan Venturia canescens ile parazitlenmesi sonucu parazitlenmiş larvalarda transferin ekspresyon düzeyinin kademeli olarak arttığı bulunmuştur. Elde edilen sonuçlarla konukçu parazitoid ilişkisinde olası savunma reaksiyonlarında transferinin rolüne açıklık getirilmeye çalışılmıştır.

Abstract:
Tranferrin is an iron transport protein playing an important role in iron metabolism in insects. It is also a vitellogenic protein and an antibiotic agent regulated by juvenile hormone. In this study, a full length cDNA encoding a putative iron binding transferrin in the Mediterranean flour moth (EkTrf) is characterized. The clone (2458 bp) encodes a protein of 683 amino acids with a molecular weight of approximately 76 kDa. The deduced amino acid sequence showed significant homology with known insect transferrins from Chilo suppressalis (76%), Galleria mellonella (75%), Plutella xylostella (74%), Manduca sexta (74%), Bombyx mori (73%), Spodoptera litura (72%), and Choristoneura fumiferana (71%). The EkTrf appears to have residues comprising iron binding sites only in N terminal lobe. RT PCR analysis indicated that EkTrf transcripts were predominantly abundant in the fat body and ovary. EkTrf was expressed exclusively at the final larval instars of both male and female and also in pupae. Analysis of parasitized larva of Ephestia by its endoparasitoid Venturia canescens showed that transferrin expression is induced following parasitoid challenge suggesting EkTrf may play an additional role in immunity. In similar to other reports, EkTrf increased upon bacterial infection at 6 h post treatment and remained high until 24 h. Additionally, RT-PCR analysis revealed that EkTrf was upregulated by wounding.