İnsan göbek kordon kanı ve periferik kan kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin in vitro kültür ortamına adaptasyonuna etki eden faktörlerin incelenmesi
Investigation of factors affecting adaptation of human umbilical cord blood and peripheral blood derived mesenchymal stem cell in vitro
Yazar: OLGA NEHİR ÖZTEL
Danışman: PROF. DR. ADİL ALLAHVERDİYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Günümüzde kordon kanı (KK) kök hücre (KH) çalışmalarına ilgi giderek artmaktadır. Bunun nedeni, KK'nın, kemik iliği, periferik kan (PK) ve yağ dokusu ile kıyaslandığında daha genç hücreleri içermesi, yaşayabilme yeteneklerinin yüksek olması gibi özelliklere sahip olmasıdır. Mezenkimal kök hücrelerin diğer bir kaynağı olan PK, kolaylıkla elde edilebilmesi ve ön çalışmalar için uygun bir kaynak olması nedeniyle tercih edilmektedir. Kordon kanından MKH'lerinin kültürü, yapılmasında mevcut olan zorluklardan dolayı dünyanın az sayıda laboratuvarında yapılmaktadır. Ülkemizde ise, bu konu ile ilgili çalışmalar sadece KK'ından hematopoetik ve MKH izolasyonu, immünofenotiplendirilmesi, kriyoprezervasyonu (Prof. Dr. Tülay İREZ) ve transplantasyonuyla sınırlıdır. Buna göre de bu çalışmanın amacı farklı donörlerin periferik ve kordon kanından elde edilen MKH'lerin izolasyonuna, in vitro kültürde adaptasyonuna ve proliferasyonuna etki eden çeşitli faktörlerin (fiziksel, kimyasal, donöre bağlı) etkisini incelemek olmuştur. Çalışmalarda 15 Kordon kanı ve 30 periferik kan örneği kullanıldı. Deneylerde farklı izolasyon yöntemleri (Ficoll, eritrosit lizis ve santrifügasyon), hücre sayımı ve canlılık tayini, hücre kültürü, mikroskobik ve Flow Sitometrik yöntemler kullanıldı. Bu çalışmada ilk kez olarak kordon kanından mononükleer hücre izolasyonunda Ficoll gradienti yönteminin (900xg hızda) incelenen yöntemler arasında en uygun yöntem olduğu, mezenkimal kök hücrelerinin izolasyon, ve adaptasyonunda +%15 HyClone serum ve düşük glikoz içeren DMEM besiyerinin kültürün yapılmasında kullanılan flasklardan ise Falcon marka flaskların en uygun olduğu tespit edildi. Flow Sitometrik analizler sonucunda, kordon kanındaki mezenkimal kök hücre miktarının, izolasyon öncesi %0,04, izolasyon sonrası %1,22 ve kültürde %10,22 olduğu belirlendi (p<0,05). Periferik kanda izolasyon öncesi, izolasyon ve kültürde mezenkimal kök hücre miktarı Flow Sitometrik olarak incelendiğinde ise sadece kültürü yapılan periferik kan MNH'lerinden %0,001 mezenkimal kök hücre olduğu belirlendi (p<0,05). Kordon kanı MKH'lerin izolasyonu ve kültür ortamında proliferasyonuna etki eden faktörler belirlenmesi sonucunda Türkiye'de ilk kez olarak kordon kanı mezenkimal kök hücrelerin adaptasyonu sağlanmıştır. Elde edilen bu sonuçlar, rejeneratif tıp ve biyomühendislikte doku mühendisliği çalışmalarında önemli olabilir. Ayrıca bu çalışmada elde edilen sonuçlar, TÜBİTAK tarafından yayınlanan 2003?2023 Teknoloji Öngörü Çalışmasında, Türkiye'de kök hücre teknolojilerinin geliştirilmesi ve kök hücrelerin özellikle rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilir hale gelmesi gerekliliği talebine de uygun olarak yapılmıştır.

Abstract:
The very promising features of cord blood stem cell studies have been attracting more and more interest nowadays. Compared to the well-known stem cell sources such as bone marrow, peripheral blood and adipose tissue, cord blood consists of younger cells with a higher survival ability. However, in the preliminary studies, peripheral blood, which also includes mesenchymal stem cells (MSC), has been preferred much more since it can be accessed easily. As likes to preripheral blood, cord blood include mesenchymal stem cells. Nevertheless, due to presence of lower amount of MSC in cord bloos and some technical difficulties in its in vitro culture, it is rarely processed by research laboratories.In our country, practiced studies of cord blood are limited with hematopoetic and mesenchymal stem cell isolation, immunophenotyping, cryopreservation (Prof. Dr. Tülay İREZ) and transplantation from cord blood. The aim of this study was following to the isolation of mesenchymal stem cells from pheripheric and cord blood, donated from different donors, to investigate the effects of a several physical, chemical and donor-related factors on cell proliferation and adaptation of these cells in vitro culture conditions. 15 cord blood and 30 peripheral blood samples were processed in this study. Cells were isolated via ficoll, erytrocyte lysis and centrifugation based different methods. In order to the assess the efficiency of these isolation methods cell count and survival assessment, cell cultuvation, microscopic and flow cytometric methods were efficiently performed.This present study proposed for the first time that the use of Ficoll gradient method (900xg speed) in mononuclear cell isolation from cord blood is more suitable than the other examined methods. Additionally, cullture medium consisiting of %15 HyClone serum and DMEM (with low glucose) yielded higher amount of MSC and provided cells better cultural environment. Finally, culture flask (Falcon BD, U. S.A) was the most appropriate in culture of MSC. Flow cytometric analysis of MSCs revealed that the percentage of MSC in cord blood was qradually increased with a significant amount; 0,04% at pre-isolation, 1,22% during isolation and 10,22% after culture (p<0,05). In case of peripheral blood, flow cytometric analysis of MSC at pre-isolation, during isolation and in culture has pointed out that only 0,001% MSCs were blood mononuclear cells in cultured peripheral (p<0,05).This present study, for the first time in Turkey, revealed out the factors that have effects on the adaptation and isolation of MSC from cord blood. Those obtained data could be beneficial for regenerative medicine and tissue engineering in bioengineering field. Furthermore, this study was performed adequately to the 2003?2023 Technology Vision Study that was published by TUBITAK with the demand of development of stem cell technologies in Turkey and making stem cells especially employable in regenerative medicine applications.