Kolorektal kanserde transkriptomik meta analiz ve yeni biyobelirteçlerin keşfi
Transcriptomic meta-analysis and discovery of new biomarkers in colorectal cancer
Yazar: HAKIIMU KAWALYA
Danışman: PROF. DR. HİLAL ÖZDAĞ
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoenformatik Ana Bilim Dalı / Biyoenformatik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Kolorektal kanser (KRK) günümüzde dünyada en yaygın görülen kanser tiplerinden biridir ve gelişmiş ülkelerde mortalite sıralamalarında 3. sırada yer almaktadır. Erken teşhis, KRK'nın tedavi ve önlenmesinde önemlidir. Bugüne kadar bu tür malignitelerin taramasında kullanılan en makul tanı aracı biyobelirteçlerin kullanımı olmuştur. Ancak mevcut biyobelirteçlerin yetersizliği nedeniyle yeni biyobelirteçlerin belirlenmesine veya geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Muhtemel kolorektal kanser biyobelirteçlerinin tanımlanması için seçilebilecek olan yollardan birinde, ilk olarak gen ekspresyon profillerinin belirlenerek, kanserli ve normal dokunun ifade profillerini karşılaştırılması gerekmektedir. Bu amaçla yaptığımız çalışmada keşif seti olarak tanımladığımız araştırma ekibimizin daha önce yürütmüş olduğu projeden elde edilen gen ekspresyon profillerini doğrulamak ve kesin sonuçlara ulaşmak amacıyla, keşif seti örnekleri gen ekspresyon veri tabanlarından (GEO_Gene Expression Omnibus) alınan ve validasyon seti olarak adlandırılan örneklerle karşılaştırılmıştır. Kullanılan keşif setinde, 50 normal örnek farklı sınıflaması olan ve eşli olduğu 50 tümör örneğiyle karşılaştırılmıştır. Doğrulama seti 1260 örneklerden oluşmaktadır ve bu örnekler GEO veri tabanından belirlenmiştir. Her bir set RMA ön işleme algoritması ile normalize edilmiştir. Bu meta-analiz metodolojisinde, genlerin filtre edilmesinde p≤0.001 anlamlılık düzeyinde ve 2 kat değişim eşiğinde ortak olarak farklı ifade edilip, setler arasında örtüşen genlerinin, gen anotasyon gruplarında ≥1,3 zenginleşme skoruna sahip olma kriterleri kullanılmıştır. 
ANOVA analizi sonucunda tümör-normal kontrol karşılaştırmasında keşif ile validasyon setlerinin gen listeleri arasında %59'lık uyum tespit edilmiştir. DAVID biyoinformatik aracı ile gerçekleştirilen ontoloji ve yolak analizleri, bu genlerin bulunduğu önemli zenginleştirilmiş kümelerin arasında kanserdeki yolaklar, fokal adezyon ve aldesteron bağımlı sodyum geri emilimi gibi yolaklar olduğunu göstermiştir. 28 genin KRK hastalarında biyobelirteç potansiyeline sahip olduğu görülmüştür. Tümor derecelerine (grade) göre yapılan karşılaştırmalarda gen liste örtüşmeleri, grade 2 normal kontrol karşılaştırmasında %66 ve grade 3 normal kontrol karşılaştırmasında ise keşif seti ile %68 örtüştüğü görülmüştür. Grade 2 hastalarda hücre döngüsü ve p53 sinyal yolağı gibi pre-invasif genlere bağlantlı yolaklar belirlenirken, grade 3 hastalarında PPARD, CLCA1, CLCA4 ve NR3C1'i içeren özel gen imzası ortaya çıkmıştır. Ayrıca, keşif ve validasyon setlerinin arasında çakışan evre (stage) genlere bakıldığında, normal örnekler ile evre 2 karşılaştırması sonucunda hastalara ait genin % 61'i valide edilirken evre 3 hastalarına ait genin % 68'i doğrulanabilmiştir. Hippo sinyal yolağın yanısıra, MUC2, MUC5B ve ATP2A3 genlerin evre 3 hastalarına özgü olduğu belirlenmiştir.Bu çalışma sonucunda KRK tanısı, evrelendirme ve sınıflanmasında kullanılabilecek biyobelirteç adayı olabilecek genler belirlenmiştir.

Abstract:
Colorectal cancer (CRC) is one of the most prevalent tumors worldwide with the third highest mortality rate in developed countries. Early diagnosis is crucial to the treatment and prevention of colorectal cancer and currently, the most plausible diagnosis tool for CRC screening is the use of biomarkers. Identification of probable colorectal cancer biomarkers often commences with comparing the expression profiles of cancerous and normal tissue by performing gene expression profiling. This study compared our samples against samples from the gene expression database so as to validate our findings and reach more robust conclusions.Design:  In our discovery set 50 normal samples were matched with 50 tumor samples of different grading and staging. A validation set of 1260 samples was identified from GEO database and each set was normalized using RMA tool embedded in the Partek software. A meta-analysis methodology that derived overlaps from differentially expressed genes (p≤0.001, fold change =2) of discovery and validation sets and used an enrichment score threshold (e.s ≥1.3) for biological process and molecular functional annotation clustering of overlap gene lists was developed.
Results indicated a 59% validation of the ANOVA tumor vs normal gene-list of the discovery set. Analysis using DAVID bioinformatics tool related significant enriched clusters to pathways such as P13K-Akt pathway, pathways in cancer, focal adhesion, ECM receptor interaction, metabolic pathways and aldosterone regulated sodium reabsorption. Consquently a 28-gene signature was highlighted as possessing diagnostic potential in Turkish CRC patients.  Meanwhle, grade gene-list overlaps validated 66% of grade 2 vs normal and 68% of grade 3 vs normal of our cohort. Cell cycle and p53 signaling pathways were found to be linked to only grade 2 samples while genes such as PPARD, CLCA1,CLCA4 and NR3C1 were unique to the grade 3 gen signature. Meanwhile, stage gene-list overlaps validated 61% of stage 2 and 52% of stage 3 samples of our pateints in comparison to normal samples. MUC2, MUC5B and ATP2A3 genes were specific to stage 3 patients. Hippo pathway was also linked to only the stage 3 gen signature.Therefore this study may be useful in developing kits for CRC diagnosis and providing more insight into scantly studied genes believed to have a role in CRC grading and staging.