Prediyabet ve tip 2 diyabet hastalarında oksidatif makromolekül hasarının ve transkripsiyon faktör 7 benzeri 2 gen polimorfizminin incelenmesi
Evaluation of oxidatively induced macromolecule damage and  
transcription factor 7-like 2 gene polymorphism in patients with prediabetes and TYPE2 diabetes mellitus
Yazar: MELİS KANT
Danışman: PROF. DR. GÜL HÜRAY İŞLEKEL
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: DNA hasarı = DNA damage ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Diabetes mellitus-tip 2 = Diabetes mellitus-type 2 ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Lipid peroksidasyonu = Lipid peroxidation ; Oksidatif hasar = Oxidative damage ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; Transkripsiyon-genetik = Transcription-genetic

Özet:
Giriş ve amaç: Tip 2 diyabet (T2DM), dünyada yaygın olarak görülen hiperglisemi ile karakterize kronik metabolik bir hastalıktır. Prediyabet, T2DM'in orta derecede hiperglisemi ve kan glukoz dalgalanmalarının gözlendiği subklinik dönemidir. Hiperglisemi nedeniyle ortaya çıkan oksidatif stres ve reaktif oksijen türleri, insülin direnci gelişimi, β-hücre disfonksiyonunun ortaya çıkışı ve diyabetin uzun dönem komplikasyonlarının yanı sıra, DNA, lipid ve protein gibi makromolekül hasarında etkin bir rol oynamaktadır. Diğer yandan, insülin direnci gelişimi ve β-hücre disfonksiyonunda genetik faktörler de etkili olmaktadır. Transkripsiyon faktörü 7 benzeri 2 (TCF7L2) polimorfizmleri T2DM gelişim riski ile ilişkilendirilmiş en önemli tek nükleotid polimorfizmleridir (SNP). TCF7L2'nin T2DM hastalarında ortaya çıkan oksidatif makromolekül hasarına bir etkisi olup olmadığı henüz bilinmemektedir. Tip 2 diyabetin klinik olarak ortaya çıkmasından önce vücutta oluşan hasarların ve metabolizmaya yansıyan etkilerinin erken tanımlanması ve oksidatif hasarın tam anlamıyla belirlenmesi için prediyabet döneminin daha ayrıntılı olarak araştırılması gerekmektedir. Bu bilgiler ışığında projemizin amacı prediyabet ve T2DM hastalarında sistemik oksidatif hasarın güvenilir biyobelirteçleri olarak; DNA nükleozid hasarının başlıca göstergeleri, 8-hidroksi-deoksiguanozin (8-OH-dG) ve 8,5'-siklo-2'-deoksiadenozinler (R-cdA, S-cdA) ve lipid peroksidasyon ürünü 8-izoprostan (8-iso-PGF2α) düzeylerinin araştırılması ve sağlıklı kontrollerle karşılaştırılması; olgu ve sağlıklı kontrol grubunda TCF7L2 rs7903146 polimorfizmi olan ve olmayan bireylerin oksidatif hasar yönünden incelenmesidir.
Yöntem: Çalışmamız kapsamında prediyabet (n=47) ve T2DM (n=43) hastalarından ve sağlıklı kontrol grubundan (n=37) kan ve idrar örnekleri toplandı. İdrar örneklerinde 8-OH-dG, R-cdA, S-cdA ve 8-iso-PGF2α'ın mutlak kantitasyonu sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi stabil izotop dilüsyon-çoklu reaksiyon izleme yöntemi ile gerçekleştirildi. TCF7L2 geninde rs7903146 polimorfizmi otomatize DNA dizi analizi yöntemiyle belirlendi. Elde edilen bulgular, hastaların rutin laboratuvar verileri, klinik bulguları ve demografik parametreleri ile birlikte değerlendirildi. Prediyabet ve T2DM hastalarında 8-OH-dG, R-cdA, S-cdA ve 8-iso-PGF2α'nın hiperglisemi için eşik değerleri belirlendi. İstatistiksel analizler SPSS 22.0 ve GraphPad Prism 5 programlarında gerçekleştirildi ve p<0.05 değerleri anlamlı kabul edildi. 
Bulgular: Prediyabet hastalarının idrar örneklerinde 8-OH-dG, S-cdA ve 8-iso-PGF2α düzeyleri kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulundu (Sırasıyla p˂0.0001, p=0.011 ve p=0.006).T2DM hastalarında 8-OH-dG düzeylerinin kontrol grubuna göre anlamlı yüksek olduğu gözlendi (p=0.031). Prediyabet ve T2DM hastalarında incelenen hasarlı DNA nukleozidleri, 8-OH-dG ile R-cdA ve S-cdA arasında pozitif yönde anlamlı korelasyon bulundu (Sırasıyla r=0.549, p<0.001 ve r=0.599, p<0.001, r=0.662, p<0.001 ve r=0.388, p=0.011). Prediyabet grubunda HbA1c'nin S-cdA ve 8-iso-PGF2α düzeyleri ile negatif yönde anlamlı korelasyonu olduğu belirlendi (Sırasıyla r=-0.424, p=0.007 ve r=-0.373, p=0.018). Bulgularımız prediyabet, T2DM ve kontrol gruplarında TCF7L2 polimorfizmi açısından incelendiğinde,  homozigot TT alelleli taşıma oranı sırasıyla % 7, % 22 ve % 9; heterozigot CT alelleli taşıma oranı ise sırasıyla % 50, % 50 ve % 52 olarak bulundu. Gruplar arasında homozigot allel görülme oranları karşılaştırıldığında T2DM grubundaki oranın diğer gruplara göre en az iki kat daha yüksek olduğu gözlendi. Sağlıklı kontrol grubunda TCF7L2 gen polimorfizminin hasarlı DNA nükleozidleri ile negatif yönde anlamlı korelasyonu belirlendi (Sırasıyla r=-0.468, p=0.024, r=-0.724, p<0.001 ve r=-0.663, p=0.001). Ayrıca T2DM hastalarında TCF7L2 gen polimorfizmi ile bel çevresi arasında pozitif korelasyon bulunmaktadır (r=0.479, p=0.007). 
Sonuç: Çalışmamız prediyabet ve yeni tanı almış T2DM hastalarında oksidatif makromolekül hasarının güvenilir biyobelirteçlerle kapsamlı olarak incelendiği ve oksidatif DNA hasarının TCF7L2 polmorfizmi ile ilişkilendirildiği ilk çalışmadır. Prediyabet olgularında kontrol grubuna göre yüksek bulunan hasarlı DNA nükleozidleri ve izoprostan düzeyleri, T2DM'un subklinik evresi olarak tanımlanan prediyabet döneminde ortaya çıkan sistemik oksidatif makromolekül hasarını yansıtmaktadır. 
Anahtar sözcükler: Oksidatif DNA hasarı, Lipid peroksidasyonu, Prediyabet, T2DM, Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi stabil izotop dilüsyon-çoklu reaksiyon izleme, Tek nükleotid polimorfizmleri, TCF7L2

Abstract:
Objective: Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is an endemic chronic metabolic disease characterized by hyperglycemia. Prediabetes is the subclinical stage of T2DM with moderate hyperglycemia and blood glucose fluctuations. Oxidative stress and reactive oxygen species resulting from hyperglycemia play an important part in oxidatively induced damage to macromolecules such as DNA, lipids and protein and in development of insulin resistance, β-cell dysfunction and long-term complications of diabetes. Genetic factors are also involved in the development of insulin resistance and β-cell dysfunction. Transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) polymorphisms are the most important single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with T2DM. However, the effect of TCF7L2 polymorphism on oxidative macromolecule damage remains to be clarified. Prediabetes stage must be thoroughly investigated for early identification of oxidative macromolecule damage in the human body and for determination of its effects on metabolism. New biomarkers which can be used in risk stratification and therapy control as supplementary to current parameters are needed. Therefore, the aims of this study were to investigate the levels of DNA damage products 8-hydroxy-deoxyguanosine (8-OH-dG), 8,5'-cyclo-2'-deoxyadenosines (R-cdA and S-cdA) and lipid peroxidation product isoprostane (8-iso-PGF2α) as reliable oxidative stress markers in patients with prediabetes and T2DM in comparison with healthy volunteers, to detect TCF7L2 rs7903146 polymorphisms and compare these polymorphisms in terms of oxidative damage levels. 
Method: Urine and blood samples were collected from prediabetes (n=47) and T2DM (n=43) patients, and control subjects (n=37). Absolute quantification of 8-OH-dG, R-cdA, S-cdA and 8-iso-PGF2α was made with stable isotope dilution-multiple reaction monitoring liquid chromatography-tandem mass spectrometry methods. TCF7L2 rs7903146 SNPs were analyzed with DNA sequencing method. Obtained results were evaluated together with clinical and laboratory findings and demographic features. Cut off values of 8-OH-dG, R-cdA, S-cdA and 8-iso-PGF2α were determined for hyperglycemia in prediabetes and T2DM patients. Statistical analyses were performed by using SPSS 22.0 and GraphPad Prism 5, and p<0.05 was considered significant.
Results: 8-OH-dG, S-cdA and 8-iso-PGF2α levels were significantly higher in the prediabetes patients than those in the healthy control group (p˂0.0001, p=0.011 and p=0.006, respectively). T2DM patients had significantly higher levels of 8-OH-dG compared to the healthy control group (p=0.031). 8-OH-dG were significantly positively correlated with R-cdA and S-cdA for prediabetes and T2DM (r=0.549, p<0.001 and r=0.599, p<0.001, r=0.662, p<0.001 and r=0.388, p=0.011, respectively). HbA1c was found significantly negatively correlated with S-cdA and 8-iso-PGF2α in prediabetes group (r=-0.424, p=0.007 and r=-0.373, p=0.018, respectively). Concerning TCF7L2 rs7903146 SNPs, 7% of the prediabetes patients, 22% of the T2DM patients and 9% of the healthy control group had homozygote TT allele and 50% of the prediabetes patients, 50% of the T2DM patients and 52% of the control group had heterozygote CT allele. The T2DM patients had homozygote TT allele minimum two times as frequently as the prediabetes and healthy control groups. A significant negative correlation was found between TCF7L2 SNP and the damaged DNA nucleotides of 8-OH-dG, R-cdA and S-cdA in the healthy control group (r=-0.468, p=0.024, r=-0.724, p<0.001 and r=-0.663, p=0.001 respectively). There was a significant positive correlation between TCF7L2 SNPs and waist circumference in the T2DM patients (r=0.479, p=0.007). 
Conclusion: This is the first study which examined oxidative macromolecule damage thoroughly by using reliable markers of oxidative stress in patients with prediabetes and newly diagnosed T2DM in comparison with healthy volunteers, which compared these polymorphisms in terms of oxidative damage levels and which showed a relation between DNA damage and TCF7L2 polymorphism. These results indicate that oxidatively induced macromolecule damage in cells appears during prediabetes, the subclinical stage of T2DM. 
Key Words: Oxidatively induced DNA damage, Lipid peroxidation, Prediabetes, T2DM, Stable isotope dilution-multiple reaction monitoring liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Single nucleotide polymorphism, TCF7L2