11-deoksikortizol ölçümünde immunoassay ve sıvı kromatografi-tandem   kütle spektrometre (LC-MS/MS) metodlarının karşılaştırılması
Comparison of  Immunoassay and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LCMS/MS) Methods in the Measurement of  
11-Deoxycotisol
Yazar: HATİCE BARAN
Danışman: PROF. DR. ALİ ÜNLÜ
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Adrenal korteks = Adrenal cortex ; Hidrokortizon = Hydrocortisone ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Spektrometri = Spectrometry ; İmmünoassay = Immunoassay

Özet:
11-deoksikortizol (Compound S) glukokortikoidlerin sentezinde aradaki bir steroid hormondur. 11-deoksikortizol, 17-alfa-hidroksiprogesteronun (17-OHP) 21-hidroksilasyon ile adrenal kortekste sentezlenir. CYP11B1 (P450c11) 11-beta-hidroksilaz aktivitesiyle 11-deoksikortizolü kortizole dönüşümünü katalizler. Serum veya plazma 11-deoksikortizol ölçümleri 11-beta-hidroksilaz eksikliğini tespit etmek için ya da metirapon testinin parçası olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada serum 11-deoksikortizol ölçümü için yeni bir sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometre (LC-MS/MS)  yöntem geliştirilmiş, geçerli kılınmış ve bu yöntem radyoimmünoassay (RIA) ve enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) yöntemleriyle karşılaştırılmıştır.
11-deoksikortizol rutin tesbitinde kararlı-izotop-işaretli internal standard (IS) ile beraber LC-MS/MS kullanılmıştır. Buradan elde edilen değerler RIA ve ELISA yöntemleriyle karşılaştırılmıştır. 11-deoksikortizol için 0.78, 12.5 ve 100 µg/L derişimlerinde gün içi yüzde varyasyon katsayısı (%CV) sırasıyla 6.6, 4.3 ve 5.3 olarak bulunmuştur. 11-deoksikortizol için LC-MS/MS yöntemin deteksiyon limiti <0.39 µg/L olarak tesbit edildi. Yöntemin total çalışma zamanı 7 dakikadır. Valide edilen metodumuzun matriks etkisinden etkilenmediği, diğer steroidlerle interfere olmadığı gözlenmiştir. Yöntem karşılaştırması çalışmasında LCMS/MS ile RIA yönteminin denklemi y = (0.211882) + (2.471358) x olarak hesaplandı.
Antikor sensitivite ve spesifitesinden etkilenmediği için LC-MS/MS yöntemi referans yöntem olarak değerlendirilmektedir. Çalışmamızda ELISA yönteminin rutin klinik çalışmalarda doğruluğunun yeterli olmadığı tesbit edildi. RIA yöntemi ile de elde edilen korelasyonun düşüklüğü nedeni ile özellikle klinik validasyon konusunda daha ileri çalışmalar yapılması gerekmektedir. 

Anahtar Sözcükler: 11-deoksikortizol; ELISA; RIA; LC-MS/MS.

Abstract:
The 11-desoxycortisol (compound S) is an intermediate steroid in the glucocorticoids biosynthesis. 11-desoxycortisol is synthesized in the adrenal cortex by 21-hydroxylation of 17-alpha-hydroxyprogesterone (17-OHP). CYP11B1 (P450c11) catalyzes the conversion of 11-desoxycortisol to cortisol via its 11-beta hydroxylase activity. Serum or plasma 11-desoxycortisol measurements are used to detect 11β-hydroxylase deficiency or as part of the metyrapone stimulation test. In this study,  A new liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) method was developed, validated for measuring  serum 11-desoxycortisol. The Developed method was also compared with two immunassay methods which are radioimmunoassay (RIA) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) .
We used LC-MS/MS for determination of 11-desoxycortisol with a stable-isotope-labeled internal standard. The values we obtained by LC-MS/MS compared with RIA and ELISA methods. The interassay Coefficient of Variation (CV) for 11-desoxycortisol were 6.6%, 4.3% and 5.3% at 0.78, 12.5 and 100 µg/L, respectively. The detection limit of the LC-MS/MS method was <0.39 µg/L for 11-desoxycortisol. Total run time was 7 min. This method was not affected by the matrix effect and other steroid hormones intereferences. Method comparison between LC-MS/MS and RIA showed a good correlation: y = (0.211882) + (2.471358) x.
Since LC-MS/MS methods are not prone to antibody sensitivity and specifity, the method is accepted as a gold standard for measuring especially low level steroids. Depending on the LC-MS/MS method, the accuracy of ELISA approaches can not sufficient in routine use. Method comparison with RIA needs some further investigation especially on clinical validation because of moderate correlation. 

Key Words: 11-desoxycortisol; ELISA; RIA; LC-MS/MS.