Primer immün yetersizlik hastalarında belirlenen yeni varyantların validasyonu
Validation of new variants identified in primer immune deficiency patients
Yazar: MERVE SARITAŞ
Danışman: PROF. DR. MÜGE SAYİTOĞLU
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Alerji ve immünoloji = Allergy and immunology ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Fenotip = Phenotype ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genetik varyasyon = Genetic variation ; Genotip = Genotype ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İmmün yetmezlik = Immun deficiency

Özet:
Primer immün yetersizlikler (PİY), immün sistemin gelişimini, fonksiyonunu veya her ikisini de etkileyen 130'dan fazla farklı bozukluğu içeren hastalıklar grubudur. PİY fenotipleri her biri nadir hastalık grubuna girerler ve yaklaşık 1:10000 canlı doğum prevalansına sahiptirler. Ancak Türkiye gibi akraba evliliğinin yüksek olduğu veya genetik olarak izole popülasyonlarda daha yüksek bir oran gözlenmektedir. Klasik olarak, PİY'ler Mendel kalıtım ilkelerini izleyen hastalıklardır.
Hastalığın geniş fenotipik değişkenliğinin olması nedeniyle PİY tanısının konulması gecikmektedir. Bu sebeple Primer immün yetersizlik sendromlarının temelinde yatan moleküler bozuklukların belirlenmesinde, immünolojik ve genetik testler büyük önem taşımaktadır.
Grubumuzun önceki çalışmalarında PİY hastalarında yeni nesil dizileme temelli gen panelleri ve ekzom analizleriyle bilinen ve bilinmeyen gen varyasyonları saptanmıştır. Bu tez çalışması kapsamında, saptanan varyasyonlar indeks olguda Sanger dizilime ile doğrulanması yapılmış ve ailevi segregasyonu gösterilmiştir ve doğrulanmış varyasyonlarda in-silico tahmin araçları kullanılarak olası hasarların öngörülmesi ve saptanan varyasyonun özelliğine göre gen anlatımı (kantitatif PCR) ve protein anlatımının (Western blot, ELISA) araştırılması yapılmıştır. Çalışma sonucunda, çalışılan altı varyasyon/gen'in iki tanesi Sanger dizileme ile doğrulanamamıştır. RAG2 geninde tespit edilen varyantın ekspresyon analizlerine dayalı çalışması sonucu sağlıklı bireylere göre azalmış ekspresyonu bulunmuştur. Bu varyanta ek olarak hastadaki lenfoma bulgularını açıklayan başka bir gende tespit edilmiştir. Çalışma ileri fonksiyonel analizler ile devam ettirilecektir. PİY fenotipi için yeni bir aday gen olan TM4SF4'ün hastalıkla genotip- fenotip ilişkisinin kurulması için çalışılmıştır. Çalışmada tanısı net olarak konulamayan bir hasta da tespit edilen MASP2 genindeki varyantın hastalıkla ilişkisi belirlenmeye çalışılmıştır. Hastaya özgü genetik değişikliklerin bilinmesi klinisyen için hastalığın prognozu ve tedavi yaklaşımı bakımından yol gösterici olacaktır.
 
Anahtar Kelimeler: Primer immün yetersizlik, varyasyon, kantitatif PCR, akım sitometrisi, Sanger dizileme.

Abstract:
Primary immunodeficiencies (PID) are a group of diseases that consist over 130 different diseases which influence function, development or both of the immune system. The PID phenotypes each fall into the rare disease group and have a prevalence of approximately 1:10000 live births. However, a higher rate is observed in populations where consanguineous marriage is high or genetically isolated populations such as Turkey. In the most cases, PIDs are monogenic diseases that follow a Mendelian princibles of inheritance.
Diagnosis of PID is delayed due to the wide phenotypic variability of the disease. For this reason, immunological and genetic tests are of great importance in determining the molecular disorders underlying primary immune deficiency syndromes.
In previous studies of our group, known and unknown gene variations were detected by next generation sequencing-based gene panels and exome analyzes in PID patients. Within the scope of this thesis, the detected variations were verified with Sanger sequencing in the indeks case and familial segregation was shown, and predicting possible damage (protein, splice site, etc.) quantitative PCR and protein expression (Western blot, flow cytometry, ELISA) were investigated. In this thesis, two of the six variations/genes studied could not be confirmed by Sanger sequencing. For the remaining four variants/genes, the function of at least one method has been studied. As a result of the study based on the expression analysis of the variant detected in the RAG2 gene, its expression was found to be decreased compared to healthy individuals. In addition to this variant, another gene has been identified that explains the lymphoma findings in the patient. The study will be continued with further functional analysis. A new candidate gene for the PID phenotype, TM4SF4, was studied to establish the genotype-phenotype relationship with the disease. In the study, the relationship of the variant in the MASP2 gene, which was detected in a patient whose diagnosis could not be made clearly, with the disease was tried to be determined. Knowing the patient- specific genetic changes will guide the clinician in terms of the prognosis of the disease and the treatment approach.

Key Words: Primary immunodeficiency, variation, quantitative PCR, flow cytometry, Sanger sequencing.