Sığır böbreğinden aldoz redüktaz ve sorbitol dehidrogenaz enzimlerinin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı antibiyotiklerin enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification and characterization of aldose reductase and sorbitol dehydrogenase enzymes from bovine kidney and investigation of some antibiotics effects on the enzymes activity
Yazar: NAMIK KILINÇ
Danışman: PROF. DR. ŞÜKRÜ BEYDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Biyokimya = Biochemistry ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method

Özet:
Hiperglisemi durumunda aktifleşen ve diyabetik komplikasyonların ortaya çıkmasında önemli rol oynayan poliol yolu enzimlerinden Aldoz redüktaz (AR, Alditol: NADP+ 1- oksidoredüktaz, E.C. 1.1.1.21) ve Sorbitol dehidrogenaz (SDH, L-İditol: NAD+ oksidoredüktaz, EC 1.1.1.14) sığır böbreğinden saflaştırılarak karakterize edildi ve bazı antibiyotiklerin enzimlerin aktiviteleri üzerine inhibisyon etkileri incelendi. AR enziminin saflaştırması homojenatın hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sephadex iyon değişim kromatografisi, Sephadex G-100 jel filtrasyon kromatografisi ve 2', 5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisini içeren 5 basamakta gerçekleştirilmiştir. SDH enzimini saflaştırma işlemi ise homojenatın hazırlanması, amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sephadex iyon değişim kromatografisi, CM-Sephadex C-50 iyon değişim kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi olmak üzere 5 basamakta gerçekleştirildi. 2,53 EÜ/mg protein spesifik aktivitesine sahip olan AR enzimi %1,94 verimle, yaklaşık 31 kat saflaştırıldı. 2,50 EÜ/mg protein spesifik aktivitesine sahip olan SDH enzimi %2,34 verimle, yaklaşık 17 kat saflaştırıldı.  Enzimlerin saflığını kontrol etmek ve alt birim molekül kütlelerini tespit etmek amacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı. Her iki enzim için optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, stabil pH'lar belirlendi. Enzimlerin alt birimlerinin mol kütleleri ise SDS-PAGE ile sırasıyla 37,50 kDa ve 37,56 kDa olarak bulundu. Ayrıca iki enziminde substratları için KM ve Vmax değerleri hesaplandı. Daha sonra sığır böbrek AR enzimi ve SDH enzimi aktivitesi üzerine bazı antibiyotiklerin inhibisyon etkileri incelendi. İnhibisyon gösteren ilaçlar için Lineweaver-Burk grafikleri yardımıyla Ki sabitleri ve inhibisyon tipleri tespit edildi.

Abstract:
Aldose reductase (AR, Alditol: NADP+ 1- oxidoreductase, E.C. 1.1.1.21) and Sorbitol dehydrogenase (SDH, L-iditol: NAD+ oxidoreductase, EC 1.1.1.14) are enzymes of the polyol pathway which is activated in the event of hyperglycemia that plays an important role in the development of diabetic complications, purified from bovine kidney. These enzymes were characterized and effects of some antibiotics on the enzymes activities were investigated. The purification of AR enzyme, including preparation of homogenate, ammonium sulphate precipitation, DEAE-Sephadex ion exchange chromatography, Sephadex G-100 gel filtration chromatography and 2',5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography was purified in five steps. The purification steps of SDH enzyme are  preparation of homogenate, ammonium sulphate precipitation, DEAE-Sephadex ion exchange chromatography, CM-Sephadex C-50 ion exchange chromatography and Sephadex G-100 gel filtration chromatography. AR enzyme was obtained having a specific activity of 2,53 EU/mg proteins, with a yield 1.94% and approximately 31 fold. SDH enzyme was obtained having a specific activity of 2,50 EU/mg proteins, with a yield 2,34% and approximately 17 fold. SDS-PAGE was done to control the purity of enzymes and to determine molecular weight of subunits as 37.5 kDa and 37.56 kDa, respectivly. Optimal pH, optimal ionic intensity, optimal temperature, stable pH were determined for both enzymes. Besides, KM and Vmax values for substrates of two enzymes were calculated. Then effects of some antibiotics on bovine kidney AR and SDH activities were examined. For drugs that exhibit inhibitory effect, Ki constants were calculated and inhibition types were determined by the help Lineweaver-Burk curves.