Alt solunum yolu örneklerinden izole edilen acinetobacter spp. izolatlarında biyofilm oluşturma özelliğinin in vitro ortamda saptanması, kolistin ve n- asetilsistein bileşiklerinin biyofilmler üzerine tek başına ve kombine etkilerinin araştırılması
In vitro determination of biofilm-forming properties in acinetobacter spp. i̇solated from lower respiratory tract samples and investigation of alone or combined effects of colistin and n-acetylcysteine on biofilms
Yazar: ELİF ÇALIŞKAN
Danışman: DOÇ. DR. ÜMMÜ GÜL ERDEM
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Ankara Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim Ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Acinetobacter = Acinetobacter ; Biyofilmler = Biofilms ; N-asetilsistein = N-acetylcysteine ; Solunum sistemi = Respiratory system ; İn vitro = In vitro

Özet:
Amaç: Acinetobacter spp. özellikle yoğun bakım ünitelerinde yüksek mortaliteyle ilişkili nosokomiyal pnömonilere yol açmaktadır. Canlı ve cansız yüzeylerde biyofilm oluşturma kabiliyeti, patojenin çevre koşullarına ve antimikrobiyallere direncinde önemli bir virülans faktörüdür. Bu enfeksiyonların kurtarma tedavisinde son çare ilaç olarak kullanılan kolistine direnç gelişiminde artış yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesini gerektirmektedir. Bu amaçla çalışmamızda Acinetobacter türlerinde in vitro biyofilm oluşturma kapasitesinin değerlendirilmesi; kolistin, N-asetilsistein (NAC) bileşiklerinin planktonik ve biyofilm içindeki bakteri toplulukları üzerine tek başına ve kombine etkilerinin araştırılmasını amaçladık.
Gereç ve Yöntem: Haziran 2018-Aralık 2019 tarihleri arasında laboratuvarımıza gelen alt solunum yolu örneklerinden izole edilen 116 Acinetobacter spp. izolatı ve A. baumannii ATCC 19606 suşu çalışmada kullanılmıştır. Biyofilm oluşumu mikroplak yöntemiyle saptanmış ve izolatlar biyofilm oluşturma özelliklerine göre negatif, zayıf, orta, güçlü olarak kategorize edilmiştir. Biyofilm oluşturan izolatlardan 16'sı ve ATCC 19606 suşu sinerji araştırılmasında kullanılmıştır. Sinerji varlığı dama tahtası yöntemiyle kolistin ve NAC kombinasyonlarının planktonik ve biyofilm içindeki bakteri popülasyonu üzerinde uygulanması sonrası FİK indeksi hesaplanarak değerlendirilmiştir. Resazurin ile boyamayla MBİK değerleri belirlenerek metabolik etkinlik; kristal viyole ile boyamayla total biyofilm kitlesindeki inhibisyon yüzdelerinin değişimi karşılaştırılmıştır.
Bulgular: 116 izolatın kolistin MİK değerleri 0,125-128 arasında değişmekte olup, 5 izolat (%4,31) kolistine dirençli bulundu. İzolatların büyük yüzdesi XDR (95, %81,9) fenotipe sahipken %11,2'si MDR, %4,3'ü PDR ve %2,6'sı duyarlı fenotipte bulundu. İzolatlar biyofilm oluşturma özelliklerine göre değerlendirildiğinde %5,2'sinde biyofilm oluşumu saptanmazken; %61,2'si güçlü, %28,4'i orta ,%5,2'si zayıf biyofilm oluşturucu olarak değerlendirilmiştir. Kolistin-NAC kombinasyonları planktonik fazda kolistin duyarlı izolatlarda sıklıkla indiferan ve additif/parsiyel sinerjistik etki gösterirken; dirençli izolatlarda kolistin dirençli fenotipi değiştirerek sinerjistik etki göstermiştir. Biyofilm içinde popülasyonda kolistin MİK değerlerinin 4-2000 kat kadar yükselebildiği görülmüştür. Biyofilm içindeki popülasyonda kolistin-NAC kombinasyonları, izolatların büyük kısmında konsantrasyona bağlı artan sinerjistik etki göstermiştir. Toplam biyofilm kitlesindeki en yüksek inhibisyon yüzdeleri bütün biyofilm gruplarında yüksek kolistin içeren kombinasyonlarda görülmüş, ≤4 mg/L kolistin içeren kombinasyonlarda inhibitör etkinin %50'nin altında kaldığı ancak NAC konsantrasyonuna bağlı olarak artış eğilimi gösterdiği saptanmıştır.
Sonuç: Biyofilm oluşturan izolatlarda kolistinin inhibitör konsantrasyonu planktonik bakteri popülasyonundan çok daha yüksek seviyelere çıkmaktadır. Bu durum tedaviye yanıtsız enfeksiyonlar ve kötü klinik sonuçlara yol açabilmektedir. Çalışmamızın sonuçları N-asetilsistein ve kolistinin kombine kullanımının dirençli Acinetobacter türlerinin neden olduğu enfeksiyonların tedavisinde ve biyofilm ilişkili enfeksiyonların önlenmesinde alternatif bir rejim olarak değerlendirilebileceğini göstermektedir. Ancak yapılacak ileri çalışmalarla kombine tedavinin klinik kullanıma uygunluğunun araştırılması gerekmektedir.

Abstract:
Aim:Acinetobacter spp. causes nosocomial pneumonia associated with high mortality, especially in intensive care units.The ability to form biofilms on living and non-living surfaces is an important virulence factor that contributes to pathogen's resistance to antimicrobials and long time survival in enviromental conditions.The increase in resistance to colistin, which is used as a last resort drug in the salvage therapy of these infections, requires the development of new treatment strategies. The aim of current study evaluation of in vitro biofilm formation capacity of Acinetobacter species and investigate the alone and combined effects of colistin, N-acetylcysteine (NAC) compounds on planktonic and biofilm embedded bacteria.
Materials and Methods:One hundred and sixteen Acinetobacter spp. isolates recovered from lower respiratory tract samples sent to microbiology laboratory between 2018 June–2019 December and A. baumannii ATCC 19606 reference strain were included in the study.Antimicrobial susceptibility for colistin and NAC were determined by broth microdilution method.Biofilm formation was determined by microplate method and isolates were categorized as negative, weak, medium, strong biofilm producer according to their biofilm forming abilities. Sixteen of the biofilm-forming isolates and ATCC 19606 strain were used to investigate the potential synergism between two agents.Interaction between agents evaluated by calculating the FIC index after the treatment of planktonic and biofilm embedded bacterial populations with colistin and NAC combinations using the checkerboard method.While MBIC values were determined together with metabolic activity by staining with resazurin, inhibition percentages in total biofilm mass were compared by staining with crystal violet.
Results: Colistin MIC values of 116 isolates ranged from 0.125 to 128 mg/L, 5 isolates (4.31%) were found resistant to colistin. While a large percentage of the isolates had XDR (95, 81.9%) phenotype, percentages of isolates with MDR, PDR and susceptible phenotype 11.2%, 4.3% and 2.6%  respectively.When biofilm forming properties of isolates were evaluated, biofilm formation was not detected in 5.2% of the isolates; 61.2% was found to be strong, 28.4% moderate, 5.2% as weak biofilm former.While colistin-NAC combinations showed mostly indifference or additive / partial synergistic effect on colistinsusceptible isolates in planktonic phase, it showed synergistic effect on colistin resistant isolates with change in resistant phenotype.It has been observed that the MIC values of colistin in the biofilm-embedded population can increase up to 4-2000 times.In the biofilm-embedded population, colistin-NAC combinations exhibited concentration-dependent increasing synergistic effects on most isolates.The highest inhibition percentages in total biofilm mass were seen in combinations with high colistin concentrations in all biofilm groups, it was also observed that the inhibitory effect decreased below 50% in combinations containing ≤4 mg / L colistin, but it tended to increase dose depending on the NAC concentration.
Conclusion: Inhibitory concentration of colistin on biofilm-embedded population is much higher than planktonic bacteria. This situation may lead to unresponsiveness or poor clinical outcomes in the treatment of associated infections.The data obtained in our study show that the combined use of N-acetylcysteine and colistin can be considered as a alternative treatment option for infections associated resistant Acinetobacter species and prevention of biofilm-related infections.However, further studies are needed to investigate the suitability of combined therapy for clinical use.