Kolorektal kanser hücrelerinde BIBR1532 ve resveratrol kombinasyonunun LncRNA ekspresyon değişimi üzerindeki etkisi
The effect of combination of resveratrol and BIBR1532 on the LncRNA expression in colorectal cancer cells
Yazar: SELİN ÇEŞMELİ
Danışman: DOÇ. DR. ÇIĞIR BİRAY AVCI
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Kolon hastalıkları = Colonic diseases ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; RNA = RNA ; Resveratrol = Resveratrol

Özet:
Kolorektal kanser en sık rastlanan üçüncü kanser tipi ve dördüncü ölüm nedeni olarak bilinmektedir ve hedefe yönelik yeni tedavi yöntemleri araştırılmaya devam etmektedir. Kanser hücrelerinde; belirli uzun kodlanmayan RNA'lar olarak bilinen lncRNA'ların ekspresyonunun yüksek olduğu; karsinomların gelişmesi ve progresyonundan sorumlu olduğu bilinmektedir. Dolayısıyla, lncRNA'ların kanser tedavisinde hedef olarak ele alınabileceği düşünülmektedir. BIBR1532 bir telomeraz inhibitörüdür ve tümörlerdeki aktif telomerazı inhibe etme amaçlı kanser araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Resveratrol ise doğal bir fitoaleksindir, proliferasyon ve apoptozda rol oynayan molekülleri hedeflediği bilinmektedir. Ayrıca spesifik olarak KRAS-aracılı sinyalleşmeyi inhibe ederek apoptozu indüklediği tespit edilmiştir.
Çalışmamızda, HT-29 kolorektal kanser hücrelerine BIBR1532 ve resveratol maddeleri uygulanmasının ardından; maddelerin sitotoksisitesi,olası apoptotik etkileri ve lncRNA ekspresyonlarındaki değişimi incelemek hedeflenmektedir. Proliferasyon deneyi ile her kuyucuk için uygun HT-29 hücre miktarı belirlenmiştir. WST-1 analizi ile BIBR1532 ve resveratrol maddelerinin sitotoksik etkisi doza ve zamana bağlı olarak değerlendirilmiştir. Ardından, belirlenen IC50 dozlarında tekli ve kombine olarak ilaç uygulanmış ve ilaç uygulanmayan hücreler kontrol olarak ele alınarak apoptoz analizi Annexin V ile gerçekleştirilmiştir. LncRNA analizi için, apoptoz deneyinde uygulandığı şekilde dozlar hücrelere uygulanmış, ilaç eklenmeyen hücreler kontrol olarak ele alınmıştır. Tüm hücre gruplarından RNA izolasyonu gerçekleştirilerek cDNA sentezlenmiş ve lncRNA ekspresyonundaki değişiklikler RT-PCR ile değerlendirilmiştir.
HT-29 hücreleri için uygun hücre konsantrasyonu 2 x 104 hücre / ml olarak belirlenmiş, ardından sitotoksisite testleri yapılmıştır. BIBR1532 ve resveratrol için IC50 dozları sırasıyla 50.81 μM (48. saat) ve 86.23 μM (72 saat) olarak belirlenmiştir. İki madde için CI 1.7 olarak belirlenmiştir. BIBR1532 ve resveratrol ajanlarının her ikisi de hücrelerin canlılık oranını düşürürken, apoptozu indükleyici bir etkileri tespit edilmemiştir.
BIBR1532 ve resveratrol kombinasyonunun kolorektal kanser hücrelerinde uygulanmasına dair literatürde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Çalışmamızda bu maddelerin uygulamasının kanser ilişkili lncRNA ekspresyonlarında yarattığı değişiklikler ekpsresyon analizleri ile araştırılmasının, daha önce incelenmemiş olan lncRNA'ların CRC ile ilişkilendirilerek tedavi stratejilerinin oluşturulmasında yeni bir bakış açısı kazandıracağını düşünmekteyiz.

Abstract:
Colorectal cancer is known as the third most common cancer type and the fourth most common cause of death and thus new targeted therapies are continuously investigated. In cancer cells; it is known that certain types of long non-coding RNAs are highly expressed, and these lncRNAs are involved in development and progression of carcinomas. Therefore, lncRNAs are thought as a target for cancer therapies. BIBR1532 is a telomerase inhibitor and in cancer research, it is used to inhibit active telomerase in tumours. Resveratrol is a natural phytoalexin and it targets the molecules that are involved in proliferation and apoptosis. In addition, resveratrol induces apoptosis by inhibiting KRAS-mediated signalling.
In this study, the aim is to apply BIBR1532 and resveratrol agents to HT-29 colorectal cancer cells and to determine cyototoxicity of these agents. Following this, possible apoptotic effects of BIBR1532 and resveratrol will be investigated. Finally, after exposure to these two agents, lncRNA expression changes will be determined in HT-29 cells. The concentration of HT-29 cells in each well of a 96-well plate was determined with the proliferation experiment. With WST-1 analysis cytotoxic effects of BIBR1532 and resveratrol were investigated depending on time and dose. After this, pre-determined IC50 doses were applied to HT-29 cells both single and in combination and the cells with no drug application, were taken as control.Then apoptosis test was performed via Annexin V assay. For lncRNA analysis, agents were applied as in the apoptosis test and again the cells with no drug application, were taken as control. RNA isolation from all cell groups was carried out and cDNA was synthesized, then RT-PCR was performed for the examination of changes in lncRNA levels.
For HT-29 cells, optimal cell concentration was determined as 2x104 cells/ ml and according to cytotoxicity assay IC50 doses were decided for BIBR1532 and resveratrol to be 50.81 μM (48. hour) and 86.23 μM (72 hour) respectively. CI was 1.7 for these two agents. Viability of cells after exposure to both BIBR1532 and resveratrol agents, decreased; however there was no apoptosis inducing effect found for both agents.
There is no study about the application of BIBR1532 and resveratrol combination on CRC cells in literature. We suggest that the investigation of the effects of these agents on cancer related lncRNAs and linking lncRNAs with CRC will give new point of view in generating new treatment strategies.