Özgün DNA dizilerinin floresan in situ hibridizasyon (FISH) tekniği için işaretlenmesi
Spesific DNA fragments labelling for flouresan in situ hybridization (FISH)
Yazar: KADER YILMAZ
Danışman: PROF. DR. SEHER BAŞARAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2002
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Sitogenetik yöntemlerle hazırlanmış preparatlar üzerinde, moleküller genetik yöntemlerle hazırlanmış probların hibridizasyona sokulması ve hibrid ürünlerin mikroskopta görüntülenmesi temeline dayanan floresan in situ hibridizasyon ( FISH ) tekniği ( 103 ), gerek interfaz uygulamalarında hızlı ve güvenilir sonuçlar vermesi gerekse klasik bantlama teknikleri ile tanımlanamayan submikroskobik inversiyon, insersiyon, duplikasyon, translokasyon ve marker kromozomların kökeninin aydınlatılmasında sitogenetik laboratuvariarında vazgeçilmez bir teknik olmuştur ( 71 ). Ayrıca, gen haritalamasında da kullanılan bu yöntem hem tanıyı güçlendirmede hem de araştırmaya yönelik çalışmalarda kullanılabilmektedir ( 72 ). FISH çalışmalarında, tanısal amaçlı olarak sık kullanılan problar ticari olarak bulunmakla birlikte bu problar özgün araştırmalarda yetersiz kalabilmektedir. Bu nedenle, kendi laboratuvar koşullarımızda özgün probların işaretlenebilmesi gerek araştırma amaçlı çalışmalarda gerekse nadir görülen kromozom anomalilerin aydınlatılmasında büyük yararlar sağlayacağından yola çıkılarak laboratuvar koşullarımıza en uygun işaretleme protokollerini oluşturabilmek amaçlanmıştır. Bu amaçla Nick translasyon ve PCR işaretleme yöntemleri alternatif ve karşılaştırmalı olarak çalışılmıştır. Plazmid ve kozmid problar nick translasyon yöntemi ile, PCR ürünleri ise hem nick translasyon hem de PCR yöntemi ile işaretlenmiştir. Çalışmamızda, 16 olguya ait preparatlar kullanılmış, 7 olguda tanıya yönelik çalışmalar yapılırken, diğer 9 olguda ise araştırma amacı ile FISH çalışmaları yapılmıştır. Nick translasyon yöntemi ile işaretlenen plazmid prob uygulamalarında yaşanan yüksek oranlı non-spesifık sinyal sorunu yıkama koşullarının değiştirilmesi ile aşılmış ve başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Bu prob ile yapılan çalışmalarla, tanının kesinleştirilmesi sağlanmıştır. PCR ile işaretlenen problarda ise nick translasyon yöntemi ile yapılan teknikte olduğu gibi yüksek oranda non-spesifık sinyallerin varlığı sorunu, yıkama 86koşullarında değişiklik yapılarak çözülmeye çalışılmış ancak, non-spesifik sinyallerin yanısıra spesifik sinyallerin de bu güçlü yıkama koşullarında kaybedildiği görülmüştür. Bu nedenle, prob hazırlanması, prob denatürasyonu ve hibridizasyon ısısında değişiklikler yapılmıştır. Prob hazırlanmasında, dekstran sülfat ve Denhard's solüsyonu kullanılmış ve prob denatürasyon ısısı değiştirilmiştir. Hibridizasyon ısısının yükseltilmesi ile alınan spesifik sinyallerin zayıflaması nedeni ile hibridizasyon ısısı değiştirilmemiş ve yapılan bu değişiklikler sonucunda, PCR ile işaretlenen KCNIP2 geninin kromozomal lokalizasyonu belirlenmiştir. Çalışmamızda, sınırlı sayıda prob kullanılmış olmasına karşın önemli deneyimler kazanılmış, özellikle nick translasyon yöntemi ile ilgili protokolümüz belirlenmiştir. Ayrıca bu deneyler sırasında elde edilen bazı sonuçlar tanı ve araştırma için önemli katkılar sağlamıştır. 87

Abstract:
Fluorescence in situ hybridization (FISH) technique ( 104 ), the mechanism of nucleic acid probe hybridization onto immobilized chromosomes on microscope slides, is an essential cytogenetic method not only for that it provides quick and accurate results for the identification of chromosomal locations which are not normally feasible by classical banding techniques, but also for the identification of the origin of the marker chromosomes ( 71 ). This technique, supports the diagnosis of cytogenetic disorders, is also well established for various gene mapping experiments (72). Although the commercial probes are commonly used for FİSH, they are found inadequate for the identification of novel locations. Therefore, we aimed to establish optimized conditions for the preparation of FISH probes in our laboratory not only for to employ it in our ongoing research projects but also to support the diagnosis of rare chromosomal abnormalities. To proceed to our aim, nick translation and PCR labeling were both used relatively and comparatively. Plasmid and cosmid probes were basically labeled only by nick translation method while PCR products were labeled by both nick and PCR methods. FISH analysis were performed on sixteen distinct cases of microscobic slides, in which seven were designed to support our cytogenetic diagnosis and nine were planned for our ongoing research studies. Plasmid probes prepared by nick translation provided successful results after overcoming the initial non-specific signals by optimizing the washing conditions. One probe prepared by this method further used to support one of our cytogenetic diagnosis. Probes prepared by PCR method also initially gave non-specific signals, however despite various washing conditions tried, it was not possible to recover specific signals. Therefore, we proceeded by trying various conditions of probe preparation, as well as alternative hybridization solutions by including in and out thedextran sulfate and Denhard's solution, and further tried various denaturation and hybridization temperatures. After experimenting alternative conditions, chromosomal localization of KCNIP2 gene was identified by PCR probe without changing the hybridization temperatures since otherwise specific signals were also tended to disappear. Although the limited number of probes were used for our optimization studies, we gained prominent experiences for the preparation of FISH probes and optimized conditions for the preparation of nick translation probes. Never the less our studies provided considerable support for our diagnostic and on going research projects. 89