Tek hücrede real time PCR ile beta talasemi mutasyonlarının tanımlanması
Detection of beta-thalassemia mutations in single cells by using real time PCR
Yazar: BURAK DURMAZ
Danışman: PROF. DR. FERDA ÖZKINAY
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Mutasyon = Mutation

Özet:
Ülkemizde beta talasemi mutasyonu taşıyan yaklaşık 1,5 milyon kişi bulunmaktadır. Taşıyıcı ve hasta bireylerin hasta çocuğa sahip olmamaları için bir seçenek preimplantasyon genetik tanı (PGT) dır. PGT, embriyoların anne rahmine yerleştirilmeden önce genetik tanısı yapılarak sağlıklı embriyoların seçilmesi işlemidir. Blastomer ile çalışmadan önce diğer tek hücre kaynakları ile protokol test edilmelidir. Bu çalışmada, beta talasemi mutasyonu heterozigot olarak belirlenmiş 9 bireyden ve bileşik heterozigot olarak belirlenmiş 1 bireyden elde edilen periferik kandan, mikromanipülasyonla tek lenfositler elde edilmiş ve bu kişilerin anne, babaları ve 2 ailede 2 homozigot hasta bireyle beraber genotiplendirilmiştir. Beta globin gen bölgesi ile 3 adet gen içi ve 2 adet gen dışı polimorfik markırların multipleks PCR'ı uygulanmıştır. Bu markırlar, öncesinde 100 kişiden oluşan Türk populasyonu üzerinde incelenerek heterozigotluk oranları hesaplanmıştır. İkinci PCR, nested PCR olarak dizayn edilmiş olup, her mutasyona özgün farklı sentez ettirilmiş olan Light Cycler probları kullanılmıştır. Ayrıca ilk PCR'dan elde edilen ürünler sekans cihazında incelenerek kontaminasyon ve allel dropout incelenmiştir. D11S4891, D13S314, GABRB ve D11S2362 markırları için heterozigotluk oranları %74'ün üzerinde bulundu. Seçilen 10 birey için uygulanan tek hücre PCR'ında tüm hibridizasyon probları denendi; %98 amplifikasyon başarısı ve %1 ADO saptandı. Kontaminasyon gözlenmedi. Çalışmaya alınan tüm bireylerin genotiplendirmesi başarıyla yapıldı. Bu çalışmayla elde edilen bilgi ve deneyimler, ileriki dönem tek hücre çalışmalarına ışık tutacaktır.

Abstract:
In our country, the number of the beta-thalassemia carriers has been estimated as 1,5 million. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) is one of the options for the carriers and beta thalassemia patients to have a healthy child. PGD is defined as the selection of the healthy embrios by genetic testing prior to implantation. The protocol has to be tested with other sources of single cells before working with blastomeres. In this study, blood obtained from heterozygotes / compound heterozygotes for beta thalassemia are used to isolate a single lymphocyte by micromanipulation. In this study, blood samples obtained from 9 patients with known heterozygote mutation and 1 with known compound heterozygote mutation were used to isolate single lymphocytes. The lympocytes, the parents of the probands and 2 children with homozygous mutation in 2 families were genotyped. Multiplex PCR including the beta globin gene region, 3 linked and 2 unlinked polymorphic markers was done. These markers were tested on 100 people from Turkish population for the calculation of heterozygosity rates. Second PCR was designed as nested PCR and seperate Light Cycler hybridization probes were used for each set of mutations. Besides, first PCR products were analyzed in the sequencer for contamination and allele dropout. The heterozygosity rates of D11S4891, D13S314, GABRB and D11S2362 markers ranged between 74% and 85%. All the hybridization probe sets were used in the selected 10 probands. An amplification efficiency rate and ADO rate were 98% and 1% respectively. No contamination was observed. The genotyping was successful for all the volunteers enrolled in the study. The knowledge and experince gathered from this study will light on further studies including PGD.