TGFBI geninde genom düzenleme tekniği ile oluşturulan varyasyonların zebra balığı korneasındaki fenotipik etkilerinin incelenmesi
Evaluation of phenotypic effects of genome editing mediated tgfbi variation on zebrafish cornea
Yazar: FULYA YAYLACIOĞLU TUNCAY
Danışman: PROF. DR. PERVİN RUKİYE DİNÇER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Genetik varyasyon = Genetic variation ; Genler = Genes ; Genom = Genome ; Kornea = Cornea ; Zebra balığı = Zebrafish

Özet:
TGFBI-ilişkili kornea distrofileri, bu gende meydana gelen yanlış anlamlı mutasyonlar sonucu oluşan protein ürününün amiloid ya da hiyalin yapıda korneada birikmesiyle ortaya çıkan kalıtsal bir hastalık grubudur. TGFBI geni zebra balığında tek kopya olarak bulunmakta olup protein dizisi insandaki ortoloğu ile %65 homolojiye sahiptir. Bu genin protein ürünü (TGFBIp) zebra balığı korneasında gösterilmiştir. TGFBI'da 124. amino asit olan arjinini kodlayan kodon bu hastalık grubunda en sık bildirilen mutasyon bölgelerinden biridir. 124. arjinin amino asidi zebra balığında da korunmuştur. Bu verilerden yola çıkarak tez kapsamında zebra balığında tgfbi'de hedefteki arjinin rezidüsünü kodlayan bölgede TALEN ya da CRISPR/Cas9 genom düzenleme araçlarını kullanarak in frame değişiklik yapmayı amaçladık. Tgfbi'de hedef bölgedeki değişiklik homolog olmayan uç birleştirme tamir mekanizması ile oluşturulmuş olup hedef arjinin amino asidini ortadan kaldıracak şekilde p. Ser115_Arg117delinsLeu (c. 347_353delinsT) varyasyonu elde edilmiştir. Bu varyasyon hastalığı zebra balığında taklit etme potansiyeline sahiptir. Varyasyonu heterozigot olarak taşıyan 3 aylık zebra balıklarının gözlerinde ışık mikroskobu ile yapılan histolojik incelemelerde hematoksilen eosin, masson trikrom ve kongo kırmızısı ile boyamada hiyalin veya amiloid birikim saptanmamıştır. Bu tez çalışması, tgfbi geninde kornea distrofilerine neden olan 124. arjinin amino asidini zebra balığı genomunda ortadan kaldırarak in frame indel oluşturan ilk çalışmadır. Bu varyasyonu taşıyan zebra balıklarının daha ileri yaşlarda incelenmesi sonucu fenotipik değişiklikler tespit edilerek TGFBI-ilişkili kornea distrofilerinin modellenmesi ve hastalığın patogenezinin ortaya konulması mümkün olabilecektir.

Abstract:
TGFBI-related corneal dystrophies are hereditary disorders characterized by accumulation of the abnormal protein product of TGFBI gene in the hyaline or amyloid form due to missense mutations of this gene. This gene exists in the zebrafish genome without duplication and its protein product has 65% homology to its human ortholoque. Protein product of tgfbi (TGFBIp) was shown in the cornea of zebrafish. Mutations of this gene that effect the arginine residue on the 124th position of TGFBIp were reported as one of the hot spots for this group of corneal dystrophies. This argininine residue was also conserved in zebrafish. According to these data; in this study we aimed to make an in frame change in the region that codes the 124th amino acid residue of tgfbi in the zebrafish genome by using TALEN or CRISPR/Cas9. Finally, we achieved indel variation at the target sequence that resulted in p. Ser115_Arg117delinsLeu (c. 347_353delinsT) by nonhomology mediated repair. This variation could mimic the disease process in the zebrafish cornea. The 3 months old zebrafish eyes were examined histopathologically under the light microscope but no amiloid or hyaline deposits could be detected with hematoxylen-eosin, masson-trichrome and congo red staining. Thus, this study is the first in literature that succeeded to make an in frame variation effecting the hot spot arginine residue in tgfbi protein and further studies could detect phenotypical changes in older zebrafish that could mimic the TGFBI-related corneal dystrophies and help to reveal the disease pathogenesis.