Kurkumin ve yeni nesil ultrasol kurkuminin nöroblastoma hücre hattı (N1E-115) üzerine etkilerinin karşılaştırmalı olarak incelenmesi
Comparative investigation of the effects of curcumin and new generation ultrasol curcumin on a neuroblastoma cell line (N1E-115)
Yazar: SONGÜL YENİ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MEHMET YABAŞ
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Kurkumin = Curcumin ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nöroblastom = Neuroblastoma

Özet:
Çocukluk çağı kanseri nöroblastoma, sempatik sinir sistemi hücrelerinde ortaya çıkan solid bir tümördür ve çocuklarda görülen kanser türlerinin yaklaşık %6-7'sini oluşturmaktadır. Nöroblastoma gelişiminde hücre içi ve hücre dışı birçok protein ve sinyal yolağı rol oynamaktadır. Nöroblastoma tedavisinde kullanılan konvansiyonel kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi müdahalelere ek olarak son yıllarda immünoterapi ve protein hedefli tedavi yöntemleri de uygulanmaktadır. Bu yöntemlere ilave olarak özellikle tedavi sonrasında ortaya çıkabilecek yan etkileri azaltmak için bitkisel kaynaklı uygulamalar da önemli bir çalışma alanı olmuştur. Kurkumin zerdeçaldan elde edilen ve anti-inflamatuar, antibiyotik, anti-diyabetik ve anti-kanser özellikleri tanımlanmış bitkisel bir bileşiktir. Yapılan çalışmalar kurkuminin transkripsiyon faktörleri, büyüme faktörleri, inflamatuar mediyatörleri ve sitokinleri, hücre döngüsü proteinleri, enzimleri, protein kinazları ve apoptotik proteinleri dahil birçok biyolojik hedefleri ve hücresel yolakları etkileyebilme potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir. Fakat düşük çözünürlük ve emilim gibi dezavantajlara sahip olmak ile birlikte, bu eksikliklerin giderilmesi için çeşitli formülasyonlar geliştirilmektedir. Yakın zamanda geliştirilen bu bileşiklerden olan yeni nesil ultrasol kurkuminin (next generation ultrasol curcumin, NGUC), rat plazmasında kurkumine göre yaklaşık olarak 65 kat daha fazla bulunduğu raporlanmış ve bundan dolayı daha etkili olabileceği düşünülmüştür. 
Bu çalışmada sahip olduğu avantajlarından dolayı NGUC'un N1E-115 nöroblastoma hücreleri üzerine etkileri kurkumin ile karşılaştırmalı olarak in vitro araştırılmıştır. N1E-115 hücrelerine farklı konsantrasyonlarda kurkumin ve NGUC uygulanmış ve hücrelerin proliferasyonu MTT testi ile belirlenmiştir. 48 saatlik madde uygulamasından sonra elde edilen sonuçlar kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 200, 100 ve 50 µM kurkumin uygulamalarının N1E-115 hücrelerinin canlılığını yaklaşık olarak %50 oranında azalttığı gözlemlenmiştir. 25 µM konsantrasyondaki kurkumin uygulamasının N1E-115 hücrelerinin canlılığını %40 oranında azalttığı bulunmuştur. Benzer şekilde, 200 µM NGUC uygulaması hücre canlılığını yaklaşık olarak %45 oranında azaltırken, 100 µM NGUC uygulaması hücre canlılığını %33'lük bir oranda azaltmıştır. Flow sitometrik analizler, düşük konsantrasyonlardaki kurkuminin N1E-115 hücrelerinde apoptozu tetiklediğini gösterirken, daha yüksek konsantrasyonlardaki NGUC apoptozu tetiklemiştir. Kurkumin uygulanan gruptaki saf kurkumin oranı %95 ve NGUC içerisinde %20 oranında kurkumin bulunduğundan, saf kurkuminoid oranı (95/20) açısından 4,75 kat fark bulunmaktadır. Dolayısıyla elde edilen sonuçlar bu bağlamda değerlendirildiğinde NGUC'un kurkumine oranla daha iyi bir etkiye sahip olduğu düşünülmektedir. Yapılan mekanistik analizler kurkumin ve NGUC'un N1E-115 hücrelerinde hücre döngüsünde, NFB ve apoptoz sinyal yolaklarında rol oynayan proteinleri kodlayan bazı genlerin mRNA ekspresyonları üzerine istatistiksel olarak anlamlı etkilerinin olmadığını ortaya koymuştur.
Sonuç olarak bu tez çalışmasında, kurkumin ve NGUC'un N1E-115 nöroblastoma hücrelerinin üzerine etkisi karşılaştırmalı olarak incelenmiş, her iki maddenin de hücreler üzerinde farklı konsantrasyonlarda sitotoksik bir etkiye sahip olduğu literatürde ilk kez gösterilmiştir. Her ne kadar yapılan mekanistik analizler tam olarak bir sinyal yolağı üzerine etkisini net olarak ortaya koyamasa da sonuçlar her iki maddenin hücrelerde apoptozu tetikleyerek hücre ölümüne neden olduğunu göstermiştir. Gelecekte yapılacak hem in vitro hem de in vivo çalışmalar, kurkumin ve NGUC'un nöroblastoma hastalarında konvansiyonel tedavi yöntemlerine ilave olarak yan etkileri azaltabilecek doğal bir bileşik olarak kullanılabilirliğini ortaya koyacaktır.

Abstract:
Neuroblastoma is a type of solid tumors in childhood arising from the cells of the sympathetic nervous system and constitutes approximately 6-7% of the cancer types observed in children. Many intracellular and extracellular proteins and signaling pathways play a critical role in the development of neuroblastoma. In addition to conventional chemotherapy, radiotherapy and surgery used for the treatment of neuroblastoma, immunotherapy and protein-targeted treatment approach have been applied in recent years. Besides these methods, natural substances have also been subject to many studies specially to reduce the side effects that may occur after conventional treatments. Curcumin is a natural compound derived from turmeric and has anti-inflammatory, antibiotic, anti-diabetic and anti-cancer properties. Studies have shown that curcumin has the potential to affect many biological targets and cellular pathways, including transcription factors, growth factors, inflammatory mediators and cytokines, cell cycle proteins, enzymes, protein kinases and apoptotic proteins. However, curcumin has some disadvantages such as low solubility, bioavailability and absorption, thus different formulations are being developed to overcome these problems. A study has recently reported that the new generation ultrasol curcumin (NGUC), which is one of these recently developed compounds, is found to be approximately 65 times more bioavailable in rat plasma than curcumin, suggesting that NGUC may be more effective than curcumin.
In this study, therefore, the effects of NGUC and curcumin on N1E-115 neuroblastoma cells were comparatively investigated in vitro. N1E-115 cells were treated with different concentrations of curcumin and NGUC and the proliferation of cells was determined by MTT assay. Our findings revealed that after 48h incubation period the treatment of N1E-115 cells with 200, 100 and 50 µM curcumin reduced cell viability by approximately %50 compared to control cells. Moreover, curcumin administration at a concentration of 25 µM caused 40% reduction in the viability of N1E-115 cells. Similarly, while 200 µM NGUC administration caused approximately %45 reduction in the cell viability, 100 µM NGUC treatment caused %33 reduction. Flow cytometric analysis of cells treated with curcumin and NGUC showed that while low concentrations of curcumin induced apoptosis in N1E-115 cells, higher concentrations of NGUC were required to induce apoptosis. Given that the rate of pure curcumin is 95% in the curcumin-administered group and 20% in NGUC, there is a 4.75-fold difference in pure curcumin ratio (95/20) between NGUC and curcumin. When the results of this study are evaluated in this context, NGUC can be suggested to have a better effect than curcumin. The further analysis by qPCR revealed that curcumin and NGUC did not have statistically significant effects on mRNA expression of genes encoding proteins involved in cell cycle, NFB pathway and apoptosis in N1E-115 cells.
In conclusion, in this thesis, the effects of curcumin and NGUC on N1E-115 neuroblastoma cells were examined comparatively, and our results demonstrate for the first time that both substances have a cytotoxic effect on cells at different concentrations. Although the mechanistic analysis could not clearly reveal any effects on a specific signaling pathway, the results showed that both substances triggered apoptosis, leading to cell death. Further research is needed to reveal the use of curcumin and NGUC as a natural compound that can reduce side effects of conventional treatment methods in neuroblastoma patients.