Buğdayda (Tiriticum aestivum L.) protoplast izolasyonu, kültürü ve bitki regenerasyonu
Protoplast isolation, culture and plant regeneration on wheat (Triticum aestium L.)
Yazar: AKİF ESKALEN
Danışman: PROF. DR. N. KEMAL KOÇ
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü
Derece: Doktora, 1996
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Bitki koruma = Plant protection ; Bitki rejenerasyonu = Plant regeneration ; Buğday = Wheat ; Protoplast = Protoplast ; Triticum aestivum = Triticum aestivum

Özet:
Yeni buğday çeşitlerinin geliştirilmesinde biyoteknolojik yöntemlerin uygulanabilmesindeki basan öncelikle en uygun kallus, hücre süspansiyon kültürü, protoplast ve bitki regenerasyonunun gerçekleştirilmesine bağlıdır. Bu çalışmada, beş hexaploid buğday (Triticum aestivum L.) çeşidinin (Seri 82, Panda, Shafır, Gemini, Çukurova 86) olgunlaşmamış ve olgun embriyolarının embriyogenik kallus, hücre süspansiyon kültürü, protoplast ve bitki regenerasyonu kapasiteleri belirlenmeye çalışılmıştır. Öncelikle, döllenmenin gerçekleşmesinden yaklaşık 15 gün sonra alman olgunlaşmamış buğday embriyoları değişik 2,4-D (lmg/1, 2mg/l, 3mg/l, 5mg/l) konsantrasyonları içeren MS (MÜRASHIGE ve SKOOG, 1962); LS (LINSMAIER ve SKOOG, 1965), B5 (GAMBORG B5, 1975), N6 (MOROCZ ve ark., 1990) ortamları üzerinde, olgun embriyolar ise yine değişik 2,4-D (lmg/1, 3mg/l, 5mg/l, 8mg/l) konsan rrasyonl arı içeren MS, LS, B5, N6 oramlan üzerinde kültüre alınmışlardır. Olgunlaşmamış ve olgun buğday embriyoları kültüre alındıkları bütün ortamlarda farklı oranlarda kallus oluşturmuşlardır. Döllenmenin gerçekleşmesinden yaklaşık 15 gün sonra alınan olgunlaşmamış embriyolar yüksek oranda embriyogenik kallus oluştururlarken, olgun embriyolarda bu oran oldukça düşük olmuştur. Bununla birlikte kallus oluşumu yönünden olgunlaşmamış embriyolar 2mg/l 2,4-D, olgun embriyolar ise 5mg/l 2,4-D içeren MS ve B5 ortamlarında diğer ortamlara göre daha iyi sonuç vermişlerdir. Olgunlaşmamış ve olgun embriyolardan kallus oluşumuna ortama ilave edilen organik maddelerin etkilerini belirleyebilmek için patates ekstraktı, buğday nişastası, kazein hidrolizat ve glutamin içeren MS ortamlarında kültüre alınmışlardır. Kültüre alındıkları ortamlara ilave edilen organik maddeler bütün çeşitlerde kallus oluşumunu önemli ölçüde artırmıştır. Bu nedenle elde edilen119 kalkışların altkültürleri 2mg/l 2,4-D, 100mg/l kazein hidrolizat, 500mg/l glutamin içeren MS ortamları üzerinde yapılmıştır. Embriyogenik hücre süspansiyon kültürleri, Seri 82 buğday çeşidinin olgunlaşmamış embriyolarından elde edilen beyaza yakın renkteki, kolay dağılabilen, hızlı gelişen embriyogenik kalluslarından oluşturulmuştur. Hücre hacimi artışlarını (%HHA) belirleyebilmek için Seri 82 çeşidinin embriyogenik hücre süspansiyon kültürleri kazein hidrolizat, glutamin ve asparagin içeren sıvı MS ortamlarında kültüre alınmışlardır. Bu hücreler 100mg/l kazein hidrolizat, 500mg/l glutamin ve 150mg/l asparagin içeren ortamlarda yüksek oranda hücre hacimi artışı (%HHA) göstermişlerdir. Protoplast izolasyonunda Seri 82 buğday çeşidinin hızlı gelişen hücre süspansiyon kültürleri kullanılmıştır. VASIL ve ark., (1990) tarafından kullanılan enzim solüsyonunda, 6 saatlik inkübasyon sonunda, 1 gram hücre kültüründen 2x10 protoplast izole edilmiştir. Hücre bölünmesi ve kaplama etkinliği üzerine hücre kültürünün farklı altkültür sürelerinin, farklı protoplast yoğunluğunun, sıvı ve farklı agaroz konsantrasyonlarının etkileri karşılaştırılmış ve hücre altkültürünün 3. ve 5. günlerinde alınan, 1x1 06 prtoplast/ml yoğunlukta, 0.5 mg/1 2,4-D içeren MS ortamında kültüre alman protopl astların yüksek oranda bölünme ve kaplama etkinliğine sahip oldukları görülmüştür. Kültüre alındıktan 4-5 hafta sonra oluşan mikrokalluslar somatik embriyo ve bitki regenerasyonu için değişik konsantrasyonlarda oksin (0.1-0.5mg/l 2,4-D; 0.1mg/l IAA; 0.1mg/l NAA) ve sitokinin (lmg/1 BAP; lmg/1 kinetin) içeren MS ortamlarında kültüre alınmışlardır. Kültüre alındıktan yaklaşık 1 6-20 hafta sonra, mikrokalluslardan 0. lmg/1 IAA, lmg/1 BAP, lmg/1 kinetin içeren MS ortamında %38.7 oranında bitki regenere edilmiştir. Hücre süspansiyon kültürlerinde ve regenere edilen bitkilerde yapılan sitolojik çalışmalarda, hücre süspansiyon kültürlerinde %52 oranında kromozom120 kayıpları, %2 oranında kromozom fazlalıkları, %46 oranında 2n=42 normal kromozom sayısı gözlenmiştir. Protoplastlardan regenere edilen bitkilerde ise 2n=42 normal kromozom sayısı gözlenmiş, fakat bazı bitkilerde geniş yaprak ayası, aşın kardeşlenme, albino bitki ve erken dönemde içi boş başakçık oluşumu gibi anormalliklere rastlanmıştır. Mezofil protoplastlannm izolasyonunda Seri 82 buğday çeşidi in vitro bitkilerinin yapraklan kullanılmıştır. Fide elde etmek için buğday tohumlan yüzelsel sterilizasyona tabi tutulduktan soma in vitro 'da kültüre alınmıştır. 7-8 günlük buğday fidelerinin yaprakları 1-2 mm kalınlığında kesilerek WATANABE ve ark., (1988) tarafından kullanılan enzim solüsyonuna konulmuş ve 3 dakika süre ile vakum altında tutulmuştur. Daha sonra 25°C'de, 1500 lux işık altında enzim solüsyonu içerisinde inkübe edilmiştir. 7 saatlik inkübasyon sonunda 1 gram yapraktan 6x1 05 protopalst izole edilmiştir. İzole edilen mezofil protoplastlart farklı ortamlarda kültüre alınmışlardır. Dört haftalık inkübasyon sonunda, hücre bölünmesi ve dolayısıyla da bitki regenerasyonunun ilk aşamalarından olan mikrokallus oluşumu gözlenmemiştir.

Abstract:
Successful application of biotechnology in new wheat cultivars improvement is depend on most suitable cultured callus, cell suspension, protoplast and plant regeneration capacity. In this investigation we have assessed the capacity of immature and mature embryos of five wheat cultivars (Seri 82, Panda, Shafir, Gemini, Çukurova 86) to form embryogenic callus, cell suspension, protoplast isolation and plant regeneration on a range of media. Initially, immature embryos (15 days after pollination) were cultured on MS (MURASHIGE and SKOOG, 1962); LS (LINSMAIER and SKOOG, 1965), B5 (GAMBORG B5, 1975), N6 (MOROCZ et al., 1990) with different concentration 2,4-D (lmgA, 2mgA, 3mg/l, 5mg/l) and mature embryos were cultured on MS, LS, B5, N6 with different concentration of 2,4-D (lmg/1, 3mg/I, 5mg/l, 8mg/l). Immature and mature embryos formed callus on all media but immature embryos of various cultivars showed significant differences in callus formation in response to all media tested. However, callus formation from immature embryos with 2mg/l 2,4-D and mature embryos on MS and B5 media with 5mg/l 2,4-D concentrations were higher than on other media and concentrations. Callus was initiated from immature and mature embryos on MS medium with potato extract, wheat starch, casein hidrolisate and asparagine. Most cultivars formed calli on media augmented with organic substrates. Consequently, MS medium containing 2mg/l 2,4-D, 100mg/l casein hydrolisate, 500mgfl glutamine was used as the maintenance medium for callus subcultures. The embryogenic cell suspension cultures were established from immature embryos derived embryogenic callus of Seri 82 wheat cultivars which well dispersed, off-white, rapid growing. Embryogenic cell suspension of Seri 82122 were cultured in liquid MS media with casein hidrolisate, glutamine and asparagine. Increases in PCV% were highest in MS media supplemented with 100mg/l casein hidrolisate, 500mg/l glutamine, 150mg/l asparagine. Fast growing cell suspension of Seri 82 cultivar were used for the protoplast isolation. 2xl07 purified protoplast per one gram initial fresh weight could be obtained in average at the and of a 6 h incubation period, using the enzyme solution of VASIL et. al., (1990). A comparison of the division and plating efficiency on different days following subculture, and different density, and in in different liquid or agarose media. Indeed, protoplasts from isolated on the third of fifth days of subculture, and lxlO6 protoplast/ml density, and 1.2% agarose concentrations in MS media supplemented with 0.5mg/l 2,4-D highest division and plating efficiency. For further somatic embiyo and plant regeneration containing 4-5 week old microcalli transferred on MS regeneration media supplemented with various auxins (0.1-0.5mg/l 2,4-D; O.lmg/1 IAA; 0.1mg/l NAA) and cytokinins (lmg/1 BAP; lmg/1 kinetin). Plant regeneration was obtained from microcallus after 16- 20 weeks at the rate of 38.7 percent on MS media supplemented with O.lmg/1 IAA, lmg/1 BAP, lmg/1 kinetin. In cytological studies with cell suspension cultures and regenerated plants from protoplasts. To observe the chromosomes lost at the rate of 52 percent, extra chromosomes at the rate of 2 percent in cell suspension cultures, normal chromosomes number (2n=42) at the rate of 46 percent. Regenerated plants from protoplasts observed normal chromosomes number (2n=42), but some plants coincided abnormal seems such as large leaf lamina, extreme tillering, and albino plants.123 Seedling leaves were used for mesophyll protoplast isolation. To obtain seedlings, seeds of Sen 82 wheat cultivar were surface sterilized and cultured in vitro. The leaves were cut with razor blades at 1-2 mm from the base of the leaf blade from 7-8 days old seedlings. The leaf segments were transferred to enzyme solution using of WATANABE et.al.,(1988). The leaf pieces were immersed for 3 min under partial vacuum. They were incubated at 25 °C and a protoplast were isolated per one gram leaf tissue. Mesophyll protoplasts were cultured at the different culture medium, but it wasn't coincide with the cell division in four weeks.