Küçükbaş hayvan derilerindeki ılımlı halofil bakterilerin karakterizasyonu
Characterization of moderately halophilic bacteria found on the sheep and goat skins
Yazar: PINAR ÇAĞLAYAN
Danışman: PROF. DR. MERAL BİRBİR ; PROF. DR. ANTONIO VENTOSA
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Çalışmamızda Tuzla ve Çorlu Organize Deri Sanayi Bölgelerinden toplanan tuzlanmış 25 adet koyun ve 25 adet keçi derisi örnekleri kullanılmıştır. Koyun derilerinin %92'si (n=23) farklı ülkelerden [Avustralya (4), Bulgaristan (2), Yunanistan (4), İsrail (2), Güney Afrika (2), A.B.D. (3), Dubai (3), Rusya (2) ve Kuveyt (1)] ithal edilmişken, %8'i (n=2) Türkiye'ye ait koyun derisi örneklerinden toplanmıştır. Keçi derilerinin %84'ü (n=21) farklı ülkelerden [Avustralya (3), Bulgaristan (3), İsrail (2), Güney Afrika (4), Rusya (2), Çin (3) ve Fransa (4)] ithal edilmişken, %16'sı (n=4) Türkiye'deki tabakhanelerde tuzlanmıştır. Bu çalışmanın amacı, tuzlanmış küçükbaş hayvan derilerindeki mikroorganizmaların toplam sayılarını belirlemek, bu derileri pH, nem içeriği, kül içeriği ve tuz doygunluğu yönünden incelemek, tuzlanmış derilerdeki ılımlı halofil bakterileri tanımlamak ve ılımlı halofil bakteri izolatlarının gelişmelerini antimikrobiyal madde ve elektrik akımı kullanarak önlemekti. Koyun derilerinin pH değerleri, nem içerikleri, kül miktarları ve tuz doygunlukları sırasıyla 6.53-8.01, %32-%68, %12-%30 ve %58.4-%100 arasında bulunmuştur. Keçi derilerinin pH değerleri, nem içerikleri, kül miktarları ve tuz doygunlukları sırasıyla 6.65-8.06, %34-%70, %11-%32 ve %63.8-%100 arasında saptanmıştır. Test edilen derilerin çoğunun pH değerleri, tuz doygunluğu ve nem içerikleri bakteri gelişimi için uygun olarak tespit edilmiştir. Koyun ve keçi derilerinin tamamından halofil olmayan bakteriler (103-107; 103-107 kob/g), ılımlı halofil bakteriler (103-107; 103-107 kob/g) ve aşırı halofil arkeler (103-107; 104-107 kob/g) izole edilmiştir. Tuzlanmış koyun ve keçi derilerinin tamamında proteolitik halofil olmayan bakteriler (102-106; 102-106 kob/g), proteolitik ılımlı halofil bakteriler (102-106; 102-106 kob/g) ve proteolitik aşırı halofil arkeler (102-106; 102-106 kob/g) saptanmıştır. Lipolitik halofil olmayan bakteriler (102-106; 102-106 kob/g), lipolitik ılımlı halofil bakteriler (102-106; 102-106 kob/g) ve lipolitik aşırı halofil arkeler (102-106; 102-106 kob/g) hem tuzlanmış koyun hem de keçi derilerinden izole edilmiştir. Biyokimyasal ve moleküler test sonuçları tuzlanmış koyun derilerinden izole edilen 90 adet ılımlı halofil izolatın Firmicutes (n=49) ve Proteobacteria (n=41) şubelerine ait olduğunu göstermiştir. Firmicutes şubesinde Staphylococcus, Salimicrobium, Bacillus, Salinicoccus, Planococcus, Alkalibacillus, Gracilibacillus, Marinococcus ve Oceanobacillus olmak üzere toplam 9 farklı cins bulunmuştur. Proteobacteria şubesinde ise Halomonas, Salinivibrio, Chromohalobacter ve Idiomarina gibi 4 farklı cins bulunmuştur. İzolatların tamamının katalaz pozitif olduğu ve L-arjinini kullandığı, büyük çoğunluğunun D-glukoz, D-mannoz ve laktozdan asit ürettiği, yarısından fazlasının D-trehalozdan asit ürettiği, L-alanin, L-prolin ve L-hidroksiprolini kullandığı saptanmıştır. Biyokimyasal ve moleküler test sonuçları tuzlanmış keçi derilerinden izole edilen 47 adet izolatın Firmicutes (n=37) ve Proteobacteria (n=10) şubelerine ait olduğunu göstermiştir. Firmicutes şubesinde Staphylococcus, Bacillus, Salinicoccus ve Gracilibacillus gibi 4 farklı cins bulunmuştur. Proteobacteria şubesinde ise Halomonas ve Chromohalobacter olmak üzere toplam 2 farklı cins saptanmıştır. İzolatların tamamının katalaz pozitif olduğu ve L-arjinini kullandığı, çoğunluğunun D-glukoz, laktoz ve sukrozdan asit ürettiği, izolatların yarısından fazlasının fruktozdan asit ürettiği, L-prolin ve L-hidroksiprolini kullandığı gözlenmiştir. Ayrıca, proteaz ve lipaz üreten izolatların karışık kültürleri [Chromohalobacter israelensis (Y6), Chromohalobacter canadensis (TR6), Halomonas halodenitrificans (K2), Staphylococcus nepalensis (KT1) ve Halomonas halmophila (YN4)] 0.5A Doğru Akım (DA) ile 10. dakikada, 1A DA ile 5. dakikada, 1.5A DA ile 3. dakikada ve 2A DA ile 1. dakikada öldürülmüştür. Bu izolatların karışık kültürleri 0.5A Alternatif Akım (AA) ile 20. dakikada, 1A AA ile 15. dakikada, 1.5A AA ile 10. dakikada ve 2A AA ile 5. dakikada öldürülmüştür. Hem Chromohalobacter israelensis (Y6), Chromohalobacter canadensis (TR6), Halomonas halodenitrificans (K2), Staphylococcus nepalensis (KT1) ve Halomonas halmophila (YN4) hem de bu izolatların karışık kültürü üzerine antimikrobiyal maddenin (sodyum dimetilditiyokarbamat) 0.028 µg/ml'den 4000 µg/ml'ye kadar değişen 18 farklı konsantrasyonu disk difüzyon metodu ile uygulanmıştır. Ayrıca hem test izolatları hem de karışık kültür için antimikrobiyal maddenin minimal inhibitör konsantrasyonları (MİK) belirlenmiştir. Antimikrobiyal maddenin 4000 µg/ml'lik konsantrasyonunda tüm izolatlarda ve karışık kültürde 20 mm'nin üstünde inhibisyon zonu gözlenmiştir. Chromohalobacter israelensis, Chromohalobacter canadensis, Halomonas halodenitrificans, Halomonas halmophila ve bunların karışık kültürü için MİK değeri 15.6 µg/ml olarak bulunmuşken, Staphylococcus nepalensis (KT1) için MİK değeri 0.96 µg/ml olarak saptanmıştır. Koyun ve keçi derilerindeki yetersiz koruma işleminden dolayı ılımlı halofil bakteri türleri çok fazla sayıda saptanmıştır. Bu izolatların çoğu derilere zarar verme potansiyeline sahiptir. Bu nedenle tuzlanmış koyun ve keçi derilerindeki zarar verici mikroorganizmaları inhibe etmek için etkili antimikrobiyal işlemler uygulanmalıdır.

Abstract:
In the present study, 25 salt-cured sheep skin and 25 salt-cured goat skin samples were obtained from the Leather Organized Tannery Regions of Tuzla and Çorlu. While 92% of sheep skin samples (n=23) were imported from different countries [Australia (4), Bulgaria (2), Greece (4), Israel (2), South Africa (2), U.S.A. (3), Dubai (3), Russia (2) and Kuwait (1)], 8% of the samples (n=2) were obtained from the sheep skin samples belonging to Turkey. While 84% of goat skin samples (n=21) were imported from different countries [Australia (3), Bulgaria (3), Israel (2), South Africa (4), Russia (2), China (3) and France (4)], 16% of the samples (n=4) were salted in tanneries in Turkey. The goal of this study was to determine total numbers of microorganisms on salted skins, to examine pH values, moisture contents, ash contents and salt saturations of these skin samples, to identify moderately halophilic bacteria on the samples and to inhibit the growth of these microorganisms using antimicrobial agent and electric current. The pH values, moisture contents, ash contents and salt saturations of sheep skin samples were respectively found to be between 6.53-8.01, %32-%68, %12-%30 and %58.4-%100. The pH values, moisture contents, ash contents and salt saturations of goat skin samples were respectively found to be between 6.65-8.06, %34-%70, %11-%32 and %63.8-%100. The pH values, salt saturations and moisture contents of the samples were suitable for  bacterial growth. Non-halophilic bacteria (103-107; 103-107 kob/g), moderately halophilic bacteria (103-107; 103-107 kob/g) and extremely halophilic archaea (103-107; 104-107 kob/g) were isolated from all sheep and goat skins. Proteolytic non-halophilic bacteria (102-106; 102-106 kob/g), proteolytic moderately halophilic bacteria (102-106; 102-106 kob/g) and proteolytic extremely halophilic archaea (102-106; 102-106 kob/g) were detected on all salted sheep and goat skins. Lipolytic non-halophilic bacteria (102-106; 102-106 kob/g), lipolytic moderately halophilic bacteria (102-106; 102-106 kob/g) and lipolytic extremely halophilic archaea (102-106; 102-106 kob/g) were isolated from both salted sheep and goat skins. Biochemical and molecular test results showed that 90 moderately halophilic strains isolated from salted sheep skins were belonged to the phyla Firmicutes (n=49) and Proteobacteria (n=41). In the phylum Firmicutes, 9 different genera such as Staphylococcus, Salimicrobium, Bacillus, Salinicoccus, Planococcus, Alkalibacillus, Gracilibacillus, Marinococcus and Oceanobacillus were found. In the phylum Proteobacteria, 4 different genera such as Halomonas, Salinivibrio, Chromohalobacter and Idiomarina were found. It was determined that all isolates were catalase positive and used L-arginine, most of them produced acid from D-glucose, D-mannose and lactose, more than half of the isolates produced acid from D-trehalose, used L-alanine, L-proline and L-hydroxyproline. Biochemical and molecular test results showed 47 strains isolated from salted goat skins were belonged to the phyla Firmicutes (n=37) and Proteobacteria (n=10). In the phylum Firmicutes, 4 different genera such as Staphylococcus, Bacillus, Salinicoccus and Gracilibacillus were found. In the phylum Proteobacteria, 2 different genera such as Halomonas and Chromohalobacter were detected. It was observed that all isolates were catalase positive and used L-arginine, most of them produced acid from D-glucose, lactose and sucrose, more than half of the isolates produced acid from fructose, used L-proline and L-hydroxyproline. In addition, the mixed cultures of protease and lipase producing isolates [Chromohalobacter israelensis (Y6), Chromohalobacter canadensis (TR6), Halomonas halodenitrificans (K2), Staphylococcus nepalensis (KT1) and Halomonas halmophila (YN4)] were separately killed by 0.5A Direct Current  (DC) in 10min, 1A DC in 5min, 1.5A DC in 3min and 2A DC in 1min. The mixed cultures of these isolates were separately killed by 0.5A Alternating Current (AC) in 20min, 1A AC in 15min, 1.5A AC in 10min and 2A AA in 5min. Eighteen different concentrations of antimicrobial agent (sodium dimethyldithiocarbamate) ranging from 0.028 µg/ml to 4000 µg/ml, were applied to both Chromohalobacter israelensis (Y6), Chromohalobacter canadensis (TR6), Halomonas halodenitrificans (K2), Staphylococcus nepalensis (KT1) and Halomonas halmophila (YN4) and the mixed culture of these isolates by disc diffusion method. In addition, minimal inhibitory concentrations of this agent (MIC) for each test isolate and their mixed culture were determined. More than 20 mm inhibition zones were observed for all isolates and mixed culture at the 4000 µg/ml concentration of the antimicrobial agent. While the MIC values for Chromohalobacter israelensis, Chromohalobacter canadensis, Halomonas halodenitrificans, Halomonas halmophila and for the mixed culture were found as 15.6 µg/ml, it was detected as 0.96 µg/ml for Staphylococcus nepalensis. Because of the insufficient preservation method applied to sheep and goat skins, a large number of moderately halophilic bacterial species have been isolated. Most of these isolates were capable to damage the skins. Therefore, the effective antimicrobial applications should be applied to inhibit the destructive microorganisms on the salted sheep and goat skins during salting process.