Primer hücre kültüründe, TGF-β ile oluşturulan deneysel akciğer fibrozıs modeli üzerinde yeni potansiyel antifibrotik moleküllerin etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of new potential antifibrotic molecules on experimental lung fibrosis model induced with TGF-β in primary cell culture
Yazar: HÜLYA GÜVEN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SİBEL DOĞRU ; DOÇ. DR. SERDAR ÖZTUZCU
Gaziantep Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Solunum Biyolojisi Ana Bilim Dalı / Temel Solunum Biyolojisi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Göğüs Hastalıkları = Chest Diseases ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
İdiyopatik pulmoner fibrozis (İPF), patogenezi bilinmeyen, kötü prognozlu, ilerleyici, hayatı tehdit eden ve genellikle tanıdan itibaren medyan sağkalımı iki-beş yıl olan bir interstisyel akciğer hastalığıdır. İPF nadir görülen bir hastalık olmakla birlikte günümüzde tedavi seçenekleri oldukça kısıtlıdır. Bu amaçla primer fibroblast hücrelerini TGF- β ile indükleyerek oluşturduğumuz deneysel fibrozis modelinde yeni potansiyel antifibrotik kimyasallarının fibrozis üzerine etkisini araştırmaktır. Transforme edici büyüme faktörü-beta (TGF-β, 10ng/ml) ile sağlıklı fibroblast hücrelerinin uyarımını takip eden 72. saatinde hücrelerden RNA izolasyonu yapıldı. Fibrozis ile ilişkili olabilecek α-SMA geninin ekspresyonu qRT-PCR ile belirlendi. PCR sonucuna göre fibrozis modelinde kontrol grubuna kıyasla 4,5 kat α-SMA eksprese edildiği gözlemlendi. TGF-β 10ng/ml ile uyarılan sağlıklı fibroblast hücrelerinin 72. saatlerinde, kontrol gruplarında α-SMA ve col antikorlarının immünositokimyasal boyama sonucu reaksiyon izlenmezken fibrozis oluşturulan hücrelerde her iki belirtecin de güçlü bir şekilde boyandığı sonucuna varıldı. Çalışmamızda TGF- β varlığında ve yokluğunda, iki molekül (3, 3a) ve bunun dışında mevcut tedavide kullanılan antifibrotik ajan olarak potansiyel etkinliği bilinen Nintedanib ve Pirfenidon ise pozitif kontrol olarak kullanıldı. 3, 3a'nın MTT (3-(4,5- Dimethylthiazol-2- yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) yöntemi ile fibrozis üzerindeki IC50 (inhibitör konsantrasyonu) değerleri araştırılmıştır. Sonuçlarımız; 3 ve 3a kimyasallarının TGF-β varlığında ve yokluğunda istatiksel olarak anlamlı bir hücre sitotoksisitesi oluşturduğu tespit ettik.

Abstract:
Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a progressive, life-threatening interstitial lung disease of unknown pathogenesis, with a poor prognosis, and a median survival from diagnosis of usually two to five years. Although IPF is a rare disease, treatment options are currently very limited. For this purpose, we investigated the effects of new potential antifibrotic chemicals on fibrosis in an experimental fibrosis model that we created by inducing primary fibroblast cells with TGF-β. RNA was isolated from the cells at the 72th hour of following stimulation of healthy fibroblast cells with Transforming Growth Factor-Beta (TGF-β, 10 ng/ml). Expression of the α-SMA gene, which may be associated with fibrosis, was determined by qRT-PCR. According to PCR results, it was observed that α-SMA was expressed 4.5 times more in the fibrosis model compared to the control group. It was concluded that while no reaction was observed as a result of immunocytochemical staining of α-SMA and col antibodies in control groups at th 72th hour of healthy fibroblast cells stimulated with TGF-β 10ng/ml, both markers were strongly stained in fibrosis-induced cells. In our study, two molecules (3, 3a) and Nintedanib and Pirfenidone, which are known to have potential activity as antifibrotic agents used in the current treatment, were used as positive controls in the presence and absence of TGF-β. Cells cultured in 96-well plates were incubated with compounds and positive drugs at different concentrations (100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM) dissolved with dimethyl sulfoxide for 24 hours at 37ºC in a 5% CO2 environment. The IC50 (inhibitory concentration) values of 3, 3a on fibrosis were investigated by the MTT (3-(4,5- Dimethylthiazol-2- yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) method. In our results, we found that chemicals 3 and 3a caused statistically significant cell cytotoxicity in the presence and absence of TGF-β.