Prokalsitonine karşı selex yöntemiyle aptamer geliştirilmesi
Development of aptamers against prokalsitonin by selex method
Yazar: ÖMER EMECEN
Danışman: PROF. DR. SEZGİN GÜNEŞ
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Aptamerler = Aptamers

Özet:
Aptamerler, tıpkı antikorlar gibi moleküllere spesifik olarak yüksek afinite ile bağlanabilen kısa (20-100 nt) tek zincirli DNA/RNA yapılarıdır. Aptamerler hedef moleküllere bağlanması baz eşleşmesiyle değil üç boyutlu yapıları ile gerçekleşmektedir. Aptamerlerin seçilimi Ligandların Üstel zenginleştirme ile Sistematik Evrimi (SELEX) yöntemiyle gerçekleştirilmektedir. 
Klinik laboratuvarlarda sepsis tanısı ve izleminde kullanılan prokalsitoninin ölçümü immünölçüm yöntemleri ile spesifik antikor çiftleri kullanılarak sandiviç (iki bölgeli) yöntem temelinde yapılmaktadır. Prokalsitonin ölçüm yöntemlerinin, prokalsitonine spesifik aptamerler kullanılarak geliştirilmesi de mümkündür. 
Tez çalışmamız ile prokalsitonin proteininin birden fazla epitop bölgesine spesifik olarak bağlanabilen birden fazla aptamer molekülünün SELEX yöntemiyle seçilimini amaçladık. 
SELEX yönteminin her bir turunda prokalsitonin oligonükleotit havuzu ile inkübe edildikten sonra bağlanan kısımın ayrıştırıldı, ayrılan kısım polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltıldı. On iki  SELEX turu sonunda tıpkı başlangıç oligonükleotit havuzu gibi 3 boyutlu yapısına katlananarak hedef proteine bağlanabilen  diziler elde edildi.  Elde ettiğimiz ssDNA havuzunun prokalsitonine bağlanabilme afinitesinin artışını inkübasyon sonrası geri kazanılan ssDNA miktarının inkübasyona katılan ssDNA miktarına oranını izleyerek takip ettik. SELEX turları ilerledikçe geri kazanılan ssDNA oranında artış gösterdiğini gözlemledik. İnkübasyon sonrası geri kazanılan ssDNA miktarının inkübasyona katılan ssDNA miktarına oranları SELEX 1-12. turları için sırasıyla (%) 1,67,  23,28, 57,8, 15,53, 17,48, 52,05, 28,75, 64,53, 26,94,113, 22,96, 23,94 idi. Aynı epitop bölgelerine daha güçlü afiniteye sahip dizilerin bağlanma olasılığını artırmak için SELEX süreci boyunca ssDNA/prokalsitonin (mol/mol) oranı artırılarak  seçilim baskısı artırıldı.
ssDNA/prokalsitonin oranının artışına rağmen geri kazanılan ssDNA miktarlarında artışın gözlenmesi oligonükleotit havuzunun afinitesinin arttığını işaret etmektedir. 
Prokalsitonin alt birimlerine bağlanabilen bu ssDNA havuzlarının dizileme aşaması ile belirlenecek aptamer adaylarının prokalsitonin ve onun alt birimleri ile bağlanma deneyleri sonucunda aptamerler ortaya çıkacaktır.
Antikorlara alternatif olarak kullanılabilme potansiyeli, üretiminin nispeten ucuz ve sürekliliğinin sağlanmasının kolaylığı nedeniyle bu çalışmadan elde edilen sonuçlar ile geliştirilecek aptamerler, prokalsitonin proteininin iki bölgeli hassas ölçüm yöntemi geliştirilmesinde kullanılarak yeni tanı kitlerinin tasarımlarına yol gösterici olacaktır.

Abstract:
Aptamers, akin to antibodies, are short single-stranded DNA/RNA structures (20-100 nt) capable of binding molecules with high affinity. Aptamers bind to target molecules not through base pairing but via their 3D structures. The selection of aptamers is carried out using the Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) method.
The measurement of proKalsitonin, used in diagnosing and monitoring sepsis in clinical laboratories, is based on the sandwich (two-site) method using specific antibody pairs with immunoassay methods. Furthermore, it is also possible to develop proKalsitonin measurement methods utilizing proKalsitonin-specific aptamers.
In this thesis, we aimed to select multiple aptamer molecules capable of specifically binding to multiple epitope sites by targeting different sub-peptide sequences of the proKalsitonin protein using the SELEX method.
In each round of the SELEX method, proKalsitonin was incubated with the oligonucleotide pool, followed by separation of the bound portion and amplification of the separated portion using polymerase chain reaction. At the end of the 12 SELEX rounds, sequences capable of binding to the target protein by adopting a 3D structure were obtained. We monitored the increase in the affinity of the ssDNA pool for proKalsitonin by comparing the amount of ssDNA recovered after incubation to the amount of ssDNA initially participating in the incubation. We observed an increased ratio of recovered ssDNA as the SELEX rounds progressed. The ratios of recovered ssDNA after incubation to the amount of ssDNA included in the incubation were 1.67%, 23.28%, 57.8%, 15.53%, 17.48%, 52.05%, 28.75%, 64.53%, 26.94%, 113%, 22.96%, and 23.94% for SELEX rounds 1 through 12, respectively. To increase the likelihood of sequences with stronger affinity binding to the same epitope sites, selection pressure was intensified by progressively increasing the ssDNA/proKalsitonin (mol/mol) ratio throughout the SELEX process.
The increase in the amount of recovered ssDNA despite the increment of the ssDNA/proKalsitonin ratio indicates an improvement in the affinity of the oligonucleotide pool. 
After the sequencing phase of these ssDNA capable of binding to proKalsitonin, aptamers will be identified through binding experiments conductedwith proKalsitonin and its subunit peptides.
Given their potential as alternatives to antibodies, relatively inexpensive production, and sustainable nature, the aptamers developed from this study's findings will contribute to developing a sensitive two-site measurement method for proKalsitonin protein and guide the design of new diagnostic kits.