Mpp+ (1-metil-4-fenilpridinyum) ile muamele sonucu fare nöroblastoma (n2A) hücresinde oluşacak eksitotoksisite  durumunun ve GLT-1 seviyelerinin araştırılması
Examination of excitotoxicity status and GLT-1 levels in MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium)-treated mouse neuroblastoma (N2A) cells
Yazar: CEYLAN AK
Danışman: DOÇ. DR. GİZEM DÖNMEZ YALÇIN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Eksitotoksisite = Excitotoxicity ; Fareler = Mice ; Glutamat = Glutamates ; Glutamat taşıyıcısı 1 = Glutamate transporter 1 ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Lewy cisimleri = Lewy bodies ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; Parkinson hastalığı = Parkinson disease ; Piridinyum bileşikleri = Pyridinum compounds

Özet:
Parkinson hastalığı, lewy nöritleri ve lewy cisimleri olarak ifade edilen α-sinükleinin intranöronal agregatlarının birikimleri ile substansiya nigra'daki dopamin üreten hücrelerin kaybından ve böylece dopaminerjik nöronların dejenerasyonundan kaynaklanan bir fonksiyon bozukluğu olarak tanımlanır. 
Eksitotoksisite nörodejenerasyonun ortak moleküler mekanizmalarından biridir. Glutamat eksitotoksisitesi, presinaptik sinir terminallerinden ve astrositlerden intraselüler alana aşırı glutamat salınımının tetiklenmesiyle ve glutamat reseptörlerinin aşırı uyarılmasıyla oluşur. Glutamat taşıyıcıları biriken fazla glutamatı toplayarak glutamat reseptörlerinin aşırı aktivasyonunu önler. Özellikle GLT-1 (Glutamate Transporter-1) ya da EAAT2 (Excitatory Amino Acid Transporter2) beyindeki toplam glutamate emiliminin %95'inden sorumludur.
MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine), Parkinson hastalığı  için önemli bir kimyasal model ve sık kullanılan etkili bir toksindir. Elektron transport zincirindeki Komplex 1'i inhibe ederek mitokondriyal fonksiyona zarar verir. Bu çalışmada MPTP'nin aktif metaboliti MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium) kullanılarak, nöron ve glia hücrelerinde eksitotoksisite modeli oluşturuldu ve MPP+'nin GLT-1 ekspresyonu üzerine etkisi araştırıldı. N2A (fare nöroblastoma hücreleri) ve glia (IHA-immortalized human astrocytes-immortalize olmuş insan astrositleri) MPP+ ile muamele edildikten sonra, hücrelerin canlılık oranları, glutamat salınım oranları ve GLT-1'in mRNA ve protein düzeylerindeki değişiklikleri araştırıldı.
 MPP+  muamelesinden sonra IHA hücrelerinden total protein izole edildi, GLT-1 ekspresyonu western blot yöntemi ile incelendi ve MPP+ verilen hücrede kontrole oranla anlamlı artış görüldü. MPP+ muamelesi yapılan ve yapılmayan (kontrol) N2A hücre hattından total RNA izole edilerek cDNA üretildi ve Real Time PCR (Gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile GLT-1 mRNA düzeyi ölçüldü. IHA hücrelerinde alınan sonuç ile uyumlu olarak, MPP+ muamelesi yapılan N2A hücrelerinde GLT-1 mRNA seviyesinin kontrol hücrelerine göre anlamlı artışı görüldü. Glutamat salınımı glutamat assay ile ölçüldü.
Sonuç olarak, MPP+ ile oluşturulan eksitotoksik durum karşısında, GLT-1 ekspresyonunun bir kurtarıcı mekanizma olarak arttığı gözlendi. Bu nedenle, ilk 12 saatlik dönemde glutamat salınımının azaldığı ancak nörotoksisitenin etkisi devam ettikçe glutamat salınımının artmaya devam ettiği görüldü. Glutamat salınımının azalmasının nedeni aynı zamanda hücre ölümü gerçekleştiği için olabileceği düşünüldü. GLT-1 ekspresyonunun düzenli arttırılması hedef alınarak ilgili moleküler yolakların araştırılması, eksitotoksisiteyi azaltarak Parkinson hastalığına karşı tedavi geliştirilmesi yolunda önemli olacaktır.
Anahtar Kelimeler: Eksitotoksisite, GLT-1, glutamat, lewy cisimciği, MPP+, Parkinson

Abstract:
Parkinson's disease is defined as a dysfunction resulting from the accumulation of intraneuronal aggregates of α-synuclein, expressed as lewy neurites and lewy bodies, with loss of dopamine-producing cells in the substantia nigra and thus degeneration of dopaminergic neurons.
Excitotoxicity is one of the common molecular mechanisms of neurodegeneration. Glutamate excitotoxicity occurs by triggering excessive release of glutamate from presynaptic nerve terminals and astrocytes into the intracellular domain and by overexcitation of glutamate receptors. Glutamate carriers prevent excess activation of glutamate receptors by accumulating excess glutamate. In particular, GLT-1 (Glutamate Transporter-1) or EAAT2 (Excitatory Amino Acid Transporter2) is responsible for 95% of total glutamate absorption in the brain.
MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) is an important chemical model for Parkinson's disease and a commonly used effective toxin. It interferes with mitochondrial function by inhibiting Complex 1 in the electron transport chain. In this study, MPT+ (1-methyl-4-phenylpyridinium), the active metabolite of MPTP, was used to model excitotoxicity in neuron and glia cells and the effect of MPP+ on GLT-1 expression was investigated. After N2A (mouse neuroblastoma cells) and glia (IHA-immortalized human astrocytes-immortalized human astrocytes) cells were treated with MPP+, the viability of cells, glutamate release and changes in GLT-1's mRNA and protein levels were investigated.
After MPP+ treatment, total protein was isolated from IHA cells and GLT-1 protein expression was examined by western blot. It was observed that MPP+ treated IHA cells showed a significant increase in GLT-1 expression when compared to control. Total RNA was isolated from MPP+ treated and untreated (control) N2A cells, total RNA was isolated and cDNA was produced. GLT-1 mRNA level was measured by Real Time PCR (Real-time Polymerase Chain Reaction). Consistent with the results of IHA cells, a significant increase in GLT-1 mRNA level was observed in MPP+ treated N2A cells compared to control cells. In the end, glutamate release was measured by glutamate assay.
	As a result, it was observed that GLT-1 expression increased as a rescue mechanism in response to the excitotoxicity induced by MPP+. Therefore, it was observed that glutamate release decreased in the first 12 hours. However, glutamate release continued to increase as the effect of neurotoxicity continued. It was thought that the decrease in glutamate secretion may be due to cell death. It will be important to investigate the relevant molecular pathways with the aim of increasing GLT-1 expression regularly, and to develop treatment against Parkinson's disease by reducing excitotoxicity.
Keywords: Excitotoxicity, GLT-1, glutamate, lewy body, MPP+, Parkinson