Doğal derin ötektik çözücü ile Pinaceae familyasına ait bazı kozalaklardan elde edilen ligninin fizikokimyasal karakterizasyonun ve bazı biyolojik etkinliklerinin belirlenmesi
Determination of physicochemical properties and some biological activities of lignin, obtained from cones of the Pinaceae family using natural deep eutectic solvent
Yazar: ÖZGE ÖZGÜRLÜK
Danışman: PROF. DR. AYBEN KILIÇ PEKGÖZLÜ
Bartın Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Orman Endüstri Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Ormancılık ve Orman Mühendisliği = Forestry and Forest Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında çevreye dost ve yenilikçi bir çözücü olan doğal derin ötektik çözücü (DDÖÇ) kullanılarak Abies nordmanniana (Stev.) Spach. subsp. nordmanniana (Doğu Karadeniz Göknarı), Cedrus libani A.Rich. (Toros Sediri), Picea orientalis (L.) Link. (Doğu Ladini) ve Pinus pinea L. (Fıstık Çamı) kozalaklarından lignin edilmesi ve elde edilen ligninlerin fizikokimyasal analizleri gerçekleştirerek kimyasal bileşimini ve yapısal özelliklerinin ortaya konulması, antioksidan, antibakteriyel ve antikolinesteraz aktivitelerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. DDÖÇ hazırlanmasında kolin klorür (ChCl) ve laktik asit (LA) kullanılmıştır. Muamele mol oranı 1:10, katı:sıvı oranı 1:20, sıcaklık 150 °C,  süre 1 saat  olacak şekilde mikrodalga reaktöründe gerçekleştirilmiştir. Muamele sonrası örneklerin katı (selülozca zengin kısım-SZK) ve sıvı kısımları birbirinden ayrılmıştır. DDÖÇ ile elde edilen lignince zengin kısım (LZK) örnekleri ile karşılaştırma yapmak amacıyla Doğu Ladini kraft lignin üretilmiş ve ticari kraft lignin temin edilmiştir. Herhangi bir kimyasal muamele yapılmayan kontrol ve SZK örneklerinin kimyasal yapılarının belirlenmesi için Termogravimetrik Analiz (TGA), X-Işını Difraktometresi (XRD) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizleri gerçekleştirilmiştir. LZK, Doğu Ladini kraft lignin ve ticari kraft lignin örneklerinin fizikokimyasal karakterizasyonu için jel geçirgenlik kromotografisi (GPC), SEM, Fourier transfrom infrared (FTIR), 31P Nükleer Magnetik Rezonans (31P NMR) Spektroskopisi analizleri yapılmıştır. Ayrıca, LZK örneklerinin saflıklarını belirlemek için klason lignin tayini yapılmıştır. Elde edilen LZK, Doğu Ladini kraft lignin ve ticari kraft lignin örneklerinin antioksidan aktivitesi 2,2-Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) serbest radikal giderim yöntemi, antibakteriyel aktivitelerinin tespiti gram (-) (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli) ve gram (+) (Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis) suşları ile sıvı besiyeri mikrodilüsyon yöntemi ve asetilkolinesteraz (AChE) enzim inhibisyonu tayini Ellman yöntemi ile biyoaktivite özellikleri belirlenmiştir.
Kontrol örneklerine etil alkol ekstraksiyonu ve ardından klason lignin tayini yapılmıştır. Sırasıyla etil alkol ekstraksiyonu ve klason miktarları Doğu Karadeniz Göknarı %21,1; %46,2, Toros Sediri %24,7; %34,7, Doğu Ladini %13,3; %46,32 ve Fıstık Çamı %2,9; %36,1 olarak tespit edilmiştir. DDÖÇ muamelesi sonrası elde edilen SZK verimleri %42,1-63,5 aralığında bulunmuştur. SZK örneklerinin kristallik indeksleri kontrol örneklerinden yüksek çıkmıştır. LZK örneklerinin saflık değerleri birbirine yakın bulunmuştur (%78,6-%82,8). Lignin verimleri ise Doğu Karadeniz Göknarı LZK %59,2, Toros Sediri LZK %89,3, Doğu Ladini LZK %55,2 ve Fıstık Çamı LZK %41,4 olarak tespit edilmiştir. Mw değerleri 4900 g/mol ile 2400 g/mol aralığında değişmektedir. LZK ve Doğu Ladini kraft ligninin PDI değeri, ticari ligninden düşük olduğu tespit edilmiştir. En yüksek PDI değeri ticari kraft ligninin (4,00) en düşük ise Doğu Ladini kraft ligninin (2,35) olduğu görülmüştür. 31P NMR analiz sonuçlarına göre tüm lignin örnekleriyle karşılaştırıldığında en yüksek toplam fenolik OH (1,57 mmol/g) ve alifatik OH (1,92 mmol/g), en düşük karboksilik OH (0,26 mmol/g) ticari kraft ligninde tespit edilmiştir. LZK ve kraft ligninlerin IC50 değeri sentetik antioksidan BHT'ye göre daha düşük bulunmuş olup, antioksidan etkiliğinin daha yüksek olduğu sonucuna varılmıştır. Tüm lignin örneklerinin çalışılan konsatrasyonlarda hem antibakteriyel hem de antiasetilkolinesteraz enzim aktivitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak doğal derin ötektik çözücü ile ligninlerin yüksek saflık ve verimde elde edilebildiği ve elde edilen ligninlerin yüksek biyoaktivite etkinliğinin olduğu, gıda, eczacılık ve biyomühendislik gibi birçok alanda kullanım potansiyelinin yüksek olduğu sonucuna ulaşılmıştır.

Anahtar Kelimeler: Biyoaktivite, doğal derin ötektik çözücü, kozalak, lignin, mikrodalga

Abstract:
In this thesis, it was aimed to obtain lignin from Abies nordmanniana (Stev.) Spach. subsp. nordmanniana (Nordmann Fir), Cedrus libani A.Rich. (Taurus Cedar), Picea orientalis (L.) Link. (Oriental Spruce) and Pinus pinea L. (Stone Pine) cones by using natural deep eutectic solvent (NADES), which is an environmentally friendly and innovative solvent, and to reveal the chemical composition and structural properties of the obtained lignins by performing physicochemical analyzes and to determine their antioxidant, antibacterial and anticholinesterase activities. Choline chloride (ChCl) and lactic acid (LA) were used in the preparation of NADES. The treatment was carried out in a microwave reactor with ChCl:LA for 1 hour with molar ratio of 1:10, solid:liquid ratio of 1:20 and temperature of 150 °C. After the treatment, the solid (cellulose rich fraction-CRM) and liquid fractions of the samples were separated from each other. In order to make comparison with the lignin-rich fraction (LRM) samples obtained by NADES, Oriental spruce kraft lignin was produced and commercial kraft lignin was supplied. Thermogravimetric Analysis (TGA), X-Ray Diffractometry (XRD) and scanning electron microscope (SEM) analyses were carried out to determine the chemical structures of the control sample without any chemical treatment and CRM samples. Gel permeation chromatography (GPC), SEM, Fourier transform infrared (FTIR), 31P Nuclear Magnetic Resonance (31P NMR) Spectroscopy analyses were carried out for the physicochemical characterization of LRM, Oriental spruce kraft lignin and commercial kraft lignin samples. Also, the purity of LRM samples we determined with klason lignin treatment. The antioxidant activities of the obtained LRM, Oriental Spruce kraft lignin and commercial kraft lignin samples were determined by 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging method. For antibacterial activities gram (-) (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli) and gram (+) (Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis) strains by broth microdilution and for acetylcholinesterase (AChE) enzyme inhibition Ellman's method was used.
Control samples were subjected to ethyl alcohol extraction and then klason lignin determination. Ethyl alcohol extraction and klason amounts were determined as 21.1%; 46.2% for Nordmann Fir, 24.7%; 34.7% for Taurus Cedar, 13.3%; 46.32% for Oriental Spruce and 2.9%; 36.1% for Stone Pine, respectively. CRM yields obtained after NADES treatment were found to be in the range of 42.1-63.5%. Crystallinity indices of CRM samples were higher than control samples. The purity values of LRM samples were found to be close to each other (%78.6-82.8). Lignin yields were determined as 59.2% for Nordmann Fir LRM, 89.3% for Taurus Cedar, 55.2% for Oriental Spruce and 41.4% for Stone Pine. Mw values range from 4900 g/mol to 2400 g/mol. PDI values of LRM and Oriental Spruce kraft lignin were found to be lower than commercial lignin. The highest PDI value was found in commercial kraft lignin (4.00) and the lowest in Oriental Spruce kraft lignin (2.35). According to 31P NMR analysis results, when compared with all lignin samples, the highest total phenolic OH (1.57 mmol/g) and aliphatic OH (1.92 mmol/g) and the lowest carboxylic OH (0.26 mmol/g) were detected in commercial kraft lignin. IC50 values of LRM and kraft lignins were found to be lower than synthetic antioxidant BHT, and it was concluded that their antioxidant activity was higher. It was determined that all lignin samples had both antibacterial and antiacetylcholinesterase enzyme activity at the studied concentrations. As a result, it was concluded that lignin can be obtained with high purity and yield with natural deep eutectic solvent from the cones and it has a bioactivity properties. Lignin can be use in many areas such as food, pharmacy and bioengineering.

Keywords: Bioactivity, cone, lignin, microwave, natural deep eutectic solvent