KML vakalarının sitogenetik, moleküler sitogenetik ve moleküler genetik yöntemleri ile incelenmesi
Analysis of CML cases with cytogeneties and molecular genetics methods
Yazar: RAHİYE DİLHAN KURU
Danışman: PROF.DR. SENİHA HACIHANEFİOĞLU
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2002
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
VI ÖZET Kronik Myeloid Lösemi (KML) olguların % 90 dan fazlasında bcr-abl füzyon genine sahip olan Philadelphia kromozomu (Ph1 görülmektedir. Ph1 kromozomu t(9;22) sonucu oluşur ve prognostik indikatör olarak rol oynar. Philadelphia kromozomu görülmeyen %5'lik KML olgularının üçte birinde, moleküler olarak bcr- abl rekombinasyonu saptanmıştır. FISH yöntemi, ile bcr-abl translokasyon probları kullanılarak interfaz ve metafaz hücrelerinde Ph1 kromozomunu gösterilir. RT/PZR tekniği ise bcr-abl füzyon gen mRNA'sından reverse transkriptaz enzimi ile elde edilen cDNA nın, PZR tekniği ile amplifikasyonu sonucu bcr-abl füzyon geninin varlığının gösterilmesi prensibine dayanır. Her iki yöntem de CML tanı yöntemi olarak hassas ve güvenilirdir. Hematoloji servisinden merkezimize refere edilen 52 CML hastasında konvansiyonel sitogenetik, FISH ve RT/PZR teknikleri ile çalıştık. 48 KML hastasından sitogenetik analiz yapmak amacı ile kemik iliği aspirasyon ve RT/PZR yöntemi ile bcr-abl füzyonunun saptanması için perifer kan materyali alınırken, 4'ünden ise her iki yöntemi uygulamak için sadece perifer kan materyali alınarak çalışıldı. Kemik iliği aspirasyonu yapılan olguların ancak 26'sından aynı zamanda, sitogenetik analiz yapmak amacı ile perifer kanı da alınabildi. Kemik iliği aspirasyonu yapılan olguların tamamı, merkezimize geliş zamanına göre direkt çalışıldı yada over night kültür (ONC)uygulandı. 39 olguda sitogenetik analizlerin sonucu alınabildi. 26 olguda kemik iliği aspirasyon ve perifer kanı materyali, 4 olguda da perifer kanında olmak üzere, toplam 30 olguda, hücre kültürü yapılarak, sitogenetik olarak çalışıldı ve sadece 22 sinden sonuç alınabildi. Biz ayrıca olgularımızda mitoz hatalarına bağlı düzensizlikleri, i(17q), +8.+21 düzensizlikleri de sitogenetik olarak inceledik. i(17q) (17p13 te Tp53 tümör baskılayıcı geni bulunduğu için),+8 (8q34 te lokalize olan c-myc protoonkogeninin artışı) ve +21 KML klinik gelişimi ile ilgili olduğu bilinmektedir. Kemik iliği aspirasyonu yapılan 21 olguda sitogenetik inceleme sonucu t(9;22), Ph1(+) bulundu. Bu olguların perifer kanı lenfosit kültürlerinden sadece 1 olguda Ph1(+) tesbit edildi. Ph (+) bulunan bu 21 olgudan16'sında RT/PZR yöntemi 98ile bcr-abl füzyon genini tesbit ettik. RT/PZR sonuçları ile kemik iliği aspirasyon materyalinde yapılan sitogenetik inceleme sonuçlan uyumlu çıktı. RT/PZR yöntemi ile bcr-abl füzyonu tesbit edilemeyen 4 olguda hastanın kliniğine bağlı olabileceğini düşündük. 1 olguda ise teknik nedenlerle sonuç veremedik. Kemik iliği aspirasyonu yapılan toplam 16 olguda, GTL bantlama ile Ph1(-) bulundu. Bu olguların 7'sinde perifer kanı lenfosit kültüründe de Ph1(-) bulundu. Bu olgularda RT/PZR yöntemi ile bcr-abl füzyon genini araştırdığımızda, 10 olguda sitogenetik inceleme ile uyumlu sonuç alındı. 4 olguda ise RT/PZR yöntemi ile bcr- abl füzyon geninin varlığı tesbit edildi. Aynı olgulara Dual color FISH uygulandığında 2 Olguda RT/PZR ile uyumlu sonuç alınırken, 1 olguda Ph1(+)/Ph1(-) bulundu. Sitogenetik sonuçlan RT/PZR sonuçları ile Kappa testi kullanılarak karşılaştırıldığında RT/PZR yönteminin özellikle Ph1(-) olgularda Sitogenetik incelemeden daha uygun olduğu(Kappa:0,505 p<0,01) gösterildi. Ph1(+)/Ph1(-) bulunan olgularda FISH tekniğinin RT/PZR tekniğinden daha uygun olduğunu gördük. Sitogenetik inceleme için kemik iliği aspirasyon materyalinin daha uygun olduğu gözlenirken, FISH ve RT/PZR yöntemleri için sonuç açısından herhangi bir fark olmadığı tesbit edildi. Bu tez çalışması bize, KML olgularında tanı, uygun tedavinin saptanması, takip ve remisyon dönemindeki MRD'nin tesbit edilmesi için GTL bantlama, FISH ve RT/PZR tekniğinin bir arada kullanılması gerektiğini gösterdi. Elde edilen bu sonuçlar literatürlerle de desteklenerek, üç yöntemin önemi vurgulandı. 99

Abstract:
VII SUMMARY In more than 90% of chronic myeloid leukemia (CML) cases, Philadelphia chromosome (Ph 1) which posseses the bcr-abl fusion gene is observed. The Ph1 chromosome is formed as a result of t(9;22) and serves as a prognostic indicator. In one third of 5% of CML cases in which Ph1 chomosome is not seen, bcr-abl recombination is detected by molecular methods. By the use of the FISH method, Ph1 chromosome is shown in interphase and metaphase cells using bcr-abl translocation probes. RT/PCR tecnique is based on the principle that shows the presence bcr-abl fusion gene as a result of the amplification of the cDNA that is acquired by reverse transcriptase enzyme from the mRNA of the bcr-abl fusion gene by PCR amplification. Both methods are sensitive and reliable as methods of CML diagnosis. We performed conventional cytogenetic, FISH and RT/PCR techniques in the 52 CML patients referred to our center from the Hematology Service. While bone marrow aspiration material to perform cytogenetic analysis and peripheral blood to perform RT/PCR in order to detect bcr-abl fusion was obtained from 48 CML patients, only peripheral blood was obtained from 4 patients to perform both of the above methods. From 26 of the cases in which bone marrow aspiration was performed, peripheral blood was also obtained for cytogenetic analysis. To all of the cases in which bone marrow aspiration was done direct and overnight (ONC) culturing was done. The results of cytogenetic analysis could be obtained in 39 cases. With bone marrow aspiration and peripheral blood material in 26 cases and peripheral blood in 4 cases, cell culture was performed in a total of 30 cases and studied by cytogenetic methods; results could be obtained from only 22 of them. We also analysed the aberiation depending on mitosis, i(17q), +8, +21 abnormalities by cytogenetic analysis in our cases. It is known that i(17q)(since Tp53 tumor supressor gene is on 17p13), +8 (the amplification of the c-myc protooncogene localized on 8q34) and +21 are related to the clinical development of CML. In 21 cases in which bone marrow aspiration was done t(9:22), Ph 1(+) was found by cytogenetic analysis. Among the peripheral blood lymphcyte culture of these cases, Ph1(+) was detected in only one case. In these 21 cases in which Ph1(+) was found bcr-abl fusion gene was detected by the RT/PCR method. The results of these cytogenetics analysis done in bone marrow aspiration material were 100correlated with the results of the RTVPCR. In the 4 cases in which bcr-abl fusşon could not be detected by RT/PCR, it was considered to be due to the clinical condition of the patient. In one case, results could not be given because of technical reasons. In the total of 16 cases in which bone marrow aspiration was done Ph1 chromosome was found to be negative by GTL banding. When bcr-abl fusion gene was analysed in these cases by RT/PCR results correlated with the cytogenetic analysis in 10 of the cases. In 4 cases, the presecence of bcr-abl fusion gene was shown by the RT/PCR method. When dual color FISH was pewrformed in the same cases, results were correlated with RT/PCR in 2 cases and one case was found to be Ph 1(+)/Ph1(-). When the results of the cytogenetic analysis were compared with the results of the RT/PCR by using the Kappa test, it was shown that RT/PCR method was more appropriate especially in Ph1(-) cases han cytogenetic analysis (Kappa=0.505, p<0.01) we observed that FISH technique was more suitable than the RT/PCR tecnique. While it was observed that bone marrow aspiration material was more appropriate for cytogenetic analysis, it was detected that for FISH and RT/PCR methods there was no difference in terms of result. This thesis has shown us that, in the diagnosis, determining of appropriate teratment, monitoring and detection of MRD in the remission stage of CML cases, GTL banding, FISH and RT/PCR tecnique should be applied together. The results obtained have been supported by literature and the significance of the three methodologies have been emphasized. 10!