Cinsiyet gelişim bozukluğu olan hastalarda sry ve sf1 gen çalışmaları
Sry and sf1 genes studies in patient with disorders of sexual development
Yazar: AHMET YEŞİLYURT
Danışman: PROF.DR. SITKI ÖZTAŞ
Atatürk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2007
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
IV2.ÖZETCİNSİYET GELİŞİM BOZUKLUĞU OLAN HASTALARDA SRY ve SF1 GENÇALIŞMALARIBu çalışmanın amacı cinsiyet gelişim bozukluğu (CGB) olan hastalarda, SeksDetermining Region of Y (SRY) ve Steroidogenik Faktör1 (SF1=NR5A1=Ad4BP)genlerinin kodlayan ekzonlarında herhangi bir mutasyon taşıyıp taşımadıklarınıaraştırmaktır.Bu çalışmaya 37 CGB'li hasta ve yirmi sağlıklı gönüllü alınmıştır. Ayrıca, tekzincir konformasyon polimorfizmi (SSCP) analizinde şüpheli bant paterni olanhastaların ebeveynleri de çalışmaya dahil edilmiştir. Çalışmamızda herhangi bir yaşaralığı tespit edilmemiştir. Hastaların yaşları 1ay ile 40 yaş arasında değişmekteydi.Tüm hastalar bu çalışmaya ?Çocukluk dönemi cinsiyet gelişim bozukluklarının yönetimiiçin klinik kılavuz?a (Intersex Society of North America2006) göre dahil edilmiştir.Araştırma protokolü tüm katılımcılara ve onsekiz yaş altı hastaların ebeveynlerineaçıklanmış ve onayları alınmıştır.Tüm hastalar muayene edilerek, bilgileri hasta dosyalarına kayıt edilmiştir.Hastalardan alınan 2 ml (mililitre) periferik kan örneğinin 1 ml'si kromozom analizi için,geriye kalanıda DNA ekstraksiyonu için kullanılmıştır. Her bir hastadan, yeterli kalitedeen az 20 metafaz plağı, 500-550 bant seviyesinde analiz edilmiştir. Virilize hastalarda Ykromozom kökenli materyal araştırmak üzere, SRY geni için lokus spesifik prob vekontrol olarak da X kromozomu için alfa-satelit (sentromerik) prob kullanılarak Floresanİn Situ Hibridizasyon (FISH) analizi yapılmıştır. Her bir bireyden en az 200 metafazve/veya interfaz hücresi değerlendirilmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), SRY veSF1 genlerinin tüm kodlayan ekzonlarını amplifiye etmek için spesifik primerler ilegerçekleştirilmiştir. Amplikonlar %2'lik agaroz jelde doğru amplifikasyonungerçekleştiğini teyit etmek için yürütülmüştür. Daha sonra, her bir amplikon %8'likpoliakrilamid jel elektroforezinde (PAGE), SSCP tekniği ile yürütülerek şüpheli bantpaternine sahip hastalar kaydedilmiştir. Şüpheli bant paterni gösteren hastalara aitörnekler, sağlıklı kontroller ve hasta ebeveynlerine ait örnekler ile ikinci kezyürütülmüştür.Kuşkulu genitalyalı bir hastada marker kromozom üzerinde [45,X/46,X,+mar (%45/55)] SRY geni tespit edilmiştir. Bu hastanın DNA analizinde SRY ve SF1 genlerindemutasyon tespit edilememiştir. Bu durum, kuşkulu genitalyalı hastalarda SRY genVdozajının SRY mutasyonlarından daha önemli olduğunu düşündürmektedir. Başka birvirilize hastanın sitogenetik analizinde 45,X/46,Xi(Xq) kromozom yapısı tespit edilmiştir.Hastanın FISH ve PCR analizlerinde, SRY genine ait bir sinyal yada amplifikasyontespit edilememiştir. Bundan dolayı, bu olgudaki virilizasyonun gonadal dokulardakigizli kalmış bir Y kromozom kökenli materyale yada bu karyotipe eşlik eden tespitedilememiş bir hormonal bozukluğa bağlı olabileceği düşünülmüştür.Hastalarımızın hiçbirinde, SRY ve SF1 genlerinin kodlayan ekzonlarındamutasyon tespit edilememiş olmakla birlikte, çalışmaya dahil ettiğimiz hastaların SRYve SF1 genlerinin regülatör (promoter) bölgelerinde mutasyona sahip olupolmadıklarını ekarte etmek için ilave araştırmaların yapılmasının gerekli olduğudüşünülmektedir. Ayrıca cinsiyet belirlenmesi ve farklılaşmasında rol oynayan diğergenlerin de bu tip hastalarda araştırılmasının etyopatogenezi aydınlatmaya daha çokyardımcı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
VI3.SUMMARYSRY AND SF1 GENES STUDIES IN PATIENT WITH DISORDERS OFSEXUAL DEVELOPMENTThe aim of this study is to investigate the patients with Disorder of SexualDevelopment (DSD) whether they harbor any mutations in all coding exons of SRY orSF1 genes.Thirty seven patients with DSD and twenty healthy volunteers are included inthe study. Moreover, the parents of the patients who had suspicious band pattern inSSCP analysis are also included in this study. Ages of the patients ranged 1 month to40 years. All patients included in the study are accepted according to ?Clinicalguidelines for the management of disorders of sex development in childhood? (IntersexSociety of North America2006). The approvals of each individuals or the parents of thepatients who are under the eighteen year old are received by explaning the protocol ofinvestigation.All patients are examined carefully and their informations are recorded in thepatient?s files. Periferic blood samples of 2 ml (mililiter) are collected from patients and1 ml of total blood volum was used for kromosome analysis and remaining volum areused to extract DNA. At least 20 metaphyse spreads at proper quality from eachpatients are analysed at 500-550 band levels. In order to investigate Y chromosomederived material in virilized patients, locus specific probe for SRY gene and alpha-satellit (centromeric) probe for X chromosome are used in FISH (Flouresan In SituHybridisation) analysis. At least 200 metaphyse and/or interphase are evaluated fromeach individiuals. Polymerase chain reaction (PCR) is performed to amplify all codingexons of SRY and SF1 genes with specific primers. The amplicons are ran in2% agarose gel to confirm the exact amplification were carry out. Then, eachamplicons are ran on 8% polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) by using singlestrand confirmed polymorphism (SSCP) technique and each patients with suspiciousband pattern are recorded. The samples, which show suspicious band pattern,belonging to the patients are ran two times with both of healthy control group and theirparents?s samples.A marker chromosome [45,X/46,X,+mar (45/55 %)] harboring SRY gene isdetected in a patient with ambiguous genitalia.No mutation is detected both of SRYand SF1 genes of the patient in DNA analysis. So, it is suggested that SRY geneVIIdosage may be more important than SRY mutations in patients with ambiguousgenitalia. In another virilized case, 45,X/46,Xi(Xq) chromosome structure is detected incytogenetic analysis. FISH and PCR analysis of the patient are failed to detect SRYgene signal or amplification, respectively. So, it is suggested that virilisation in this casemay depends on a cryptic Y chromosome derived material in gonadal tissues orundetected hormonal disorders cohort the karyotype. No mutations was detected inother patients in coding exons both of SRY and SF1 genes.In conclusion, we could not detected any mutations in coding exons of SRY andSF1 genes. However, we thought that further investigations are needed to excludewhether the patients with DSD have mutations in regulator (promoter) sequences ofSRY and SF1 gene or another genes involving sex determination and differentiationcascades.