Tricholama focale (Fr.) Ricken türünün antioksidan ve antikanser aktivite kotrollü sekonder metabolitlerinin izolasyonu ve yapılarının tayini
Anticancer and antioxidant activity controlled isolation and structure elucidation of secondery metabolites of Tricholama focale (Fr.) Ricken
Yazar: MEHMET HÜSEYİN SİNGEÇ
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Analitik kimya = Analytical chemistry ; Makromantarlar = Macrofungi

Özet:
Eski zamanlardan günümüze kadar tıbbi mantarlar, özellikle bağışıklık sisteminin güçlendirici (immunomodülatör) ve kanseri önleyici olarak kullanılmaktadırlar. Bu özellikleri taşıdıkları steroid, triterpen ve özellikle sıcak suya geçen polisakkaritler gibi maddeleden kaynaklanmaktadır. Modern tıp için önemli ilaç kaynakları potansiyellerine sahip olup olmadıklarını belirlemek adına bilim insanları, mantar türlerinden izole ettikleri bileşiklerin antikanser, antioksidan, antiviral, antibakteriyal, antifungal, antiinflamatuar, immunomodulatör ve kolesterol düşürücü aktivitelerini araştırmaktadırlar. Mantarlar çok çeşitli tıbbi aktivitelere sahip olduğundan dolayı, yeni aktif madde izole edilebileceği beklentisi yüksektir. 
Bu tez kapsamında daha önce üzerinde hiçbir araştırma yapılmamış ve Anadolu'da doğal olarak yayılış gösteren ve Matsutake'nin bir başka türü olan Tricholoma focale (Fr.) Ricken, çalışıldı. Bu amaçla, kurutulmuş mantar oda şartlarında sırasıyla petrol eteri, aseton ve metanol ile ekstre edildi. Devamında geri kalan mantar örneği 80 ºC'de sıcak suyla ekstre edildi. Elde edilen ekstre filtre edildikten sonra üzerine hacminin 3 katı kadar etanol eklenerek etanol:su karışımında çözünmeyen büyük molekül ağırlıklı maddeler çöktürüldü. Çöken kısma HWEP kodu verilirken çözünen kısmın çözücüsü döner buharlaştırıcıda alınıp ekstreye HWES kodu verildi. Geri kalan mantar örneği 0,1 N NaOH içeren sui le ektre edildi. Elde edilen ektrenin üzerine hacminin üç katı etanol eklenerek büyük moleküller çöztürüldü. Çöken kısma HWEP (NaOH) ve çözünen kısma HWES (NaOH) kodları verildi. Elde edilen 7 adet ekstrenin antioksidan ve sitotoksik aktiviteleri araştırıldı. Antioksidan aktivite, β-karoten renk açılımı, DPPH, ABTS, CUPRAC ve metal bağlama aktivitelerine göre belirlenirken sitotoksik aktivite WST1 metoduna göre fibroblast (L929), akciğer kanseri (H1299) ve meme kanseri (MCF-7) hücre hatlarına karşı yapıldı. Buna ilaveten, ektrelerin aynı hücrelere karşı gerçek zamanlı hücre proliferasyonları da araştırıldı. Elde edilen veriler ışığında antikanser ve antioksidan aktivitesi yüksek olan mantar ekstreleri fraksiyonlandırıldı. Fraksiyonların antioksidan aktiviteleri DPPH ve ABTS radikal giderim metodlarıyla takip edildi. Maddeleri saflaştırmak amacıyla kolon kromatgrafisi, ince tabaka kromatografisi ve preparatif recycle HPLC-UV-RI sistemleri kullanıldı. Antioksidan aktiviteleri yüksek çıkan fraksiyonlardan aktivite kontrollü olarak 12 adet madde izole edilip, yapıları aydınlatıldı. Saf maddelerin yapılarının tayininde 1D-, 2D-NMR, EI-MS, FABMS ve HRMS teknikleri kullanıldı. Yapıları aydınlatılan maddeler 5α, 8α-epoksiergosta-6,9,22-trien, 3β-ol (1 ve 2), adenozin (3), α-D-glukopronosil (1→1)-α-D-glukopronozit (4), mannitol (5, 7-9), α-D-glucopyranoside(1→1)α-L-glucopyranosyl (6), trehaloz (10), N-(8-amino-9,10-dihidroksi-11-hekzanonil)-2,4,5,6-tertahidroksi-3-amino hekzanamid (11) ve Polyfocaline (12) (polisakkarit) olarak isimlendirildiler. Bu 12 madde arasında 1 ve 2 ile 11 ve 12 yeni maddeler olup ilk defa bu tez ile yapıları aydınlatıldı. Ayrıca, saflaştırılan ve yapıları tayin edilen bileşiklerin sitotoksik ve antioksidan aktiviteleri aynı metotlar ile incelendi.

Anahtar Kelimeler: Tricholoma focale (Fr.) Ricken, İzolasyon ve Yapı Tayini, Spektroskopi, Antioksidan aktivite, Sitotoksik aktivite

Abstract:
Medicinal mushrooms have been used particularly to prevent the cancer and used as immunomodulators since ancient times. Using against cancer and as immunomodulators are due to comprising of steroids, triterpenes and the polysaccharides gathered by hot water infusion. The scientists have been searching mushrooms for their anticancer, antioxidant, antitumor, antiviral, antibacterial, antifungal, anti-inflammatory and immunomodulatory effects and ingredients if they could be a source of modern medicine. The isolation of new compounds from mushrooms are expected since they have very diverse type of compounds.
In this thesis, Tricholoma focale (Fr.) Ricken from Matsutake family which has been uninvestigated phytochemically and naturally growing in Anatolia was studied. For this purpose, the dried mushroom material was extracted with petroleum ether, acetone and methanol, succesively. Then the remaining mushroom material was extracted with hot water at 80 ºC. After filtration, the hot water infusion was added three times volume of ethanol. The precipitated extract was coded HWEP while the soluble part was HWES. Lastly the remaining part from infusion was extracted with 0.1 N NaOH solution. After filtration, the alcaline water infusion was added three times volume of ethanol. The precipitated extract was coded HWEP (NaOH) while the soluble part was HWES (NaOH). Antioxidant and cytotoxic activities of these obtained seven extracts were investigated. β-carotene-linoleic acid, DPPH radical scavenging, ABTS cation radical scavenging, CUPRAC, and metal chelating methods were used to determine the antioxidant activity. The cytotoxic activity of the extracts was performed against fibroblast (L929) breast cancer (MCF-7) and lung cancer (H1299) cell lines using WST1 method. The extracts having high antioxidant and cytotoxic activity were fractionated using column chromatography, thin layer chromatography and recycle HPLC-UV-RI. The antioxidant activity of the fractions was done by using DPPH and ABTS assays. Twelve compounds were isolated and ulucidated from the antioxidant active fractions using 1D-, 2D-NMR techniques, and EI-MS, FAB-MS and HRMS spectroscopic methods. The compounds were elucidated as 5α, 8α-epoxyergosta-6,9,22-triene, 3β-ol (1 and 2), adenosine (3), α-D-glucopronosyl (1→1)α-D-glucopronoside (4), mannitol (5, 7-9), α-D-glucopyranoside(1→1)α-L-glucopyranosyl (6), trehalose (10), N-(8-amino-9,10-dihydroxy-11-hexanonyl)-2,4,5,6-tertahydroxy-3-aminohexanamide (11), and polyfocaline (12) (a polysaccharide). Among these 12 compounds 1 and 2, and 11 and 12 are the new compounds which are isolated and elucidate in this thesis for the first time. In addition, the cytotoxic and antioxidant activities of the isolated compounds were also investigated using the same methods.

Keywords: Tricholoma focale (Fr.) Ricken, Isolation and structure elucidation, Spectroscopy, Antioxidant activity, Cytotoxic activity.