Sıçan böbrek dokusunda karbon tetraklorür (CCl4) toksisitesine karşı melatonin ve D vitamininin koruyucu etkisi
The protective effect of melatonin and vitamin d on carbon tetrachloride (CCl4)–induced toxicity in rat kidney
Yazar: SAFA MOHAMED ELMUSTAFA OSMAN ELMUBARAK
Danışman: PROF. DR. NESRİN ÖZSOY ERDAŞ
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, sıçanlarda CCl4 ile oluşturulan nefrotoksisiteye karşı biyokimyasal, histokimyasal ve immünohistokimyasal parametreler kullanılarak melatonin ve D vitamininin koruyucu ve iyileştirici etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada ağırlıkları 200-220 gr arasında değişen erişkin erkek Wistar albino sıçanlar kullanılmıştır. Sıçanlar yedi gruba ayrılmıştır: Mısır yağı kontrol, PBS+etanol kontrol, 10 haftalık CCl4  grubu, 10 haftalık CCl4 + melatonin grubu, 12 haftalık CCl4 + melatonin grubu, 10 haftalık CCl4 + D vitamini grubu ve 12 haftalık CCl4 + D vitamini grubu. Her deney grubu için 6 adet toplam 42 sıçan kullanılmıştır. CCl4 1.5 ml/kg dozunda haftada iki kez subkutan yolla, melatonin 10 mg/kg dozunda hergün subkutan olarak ve D vitamini 0.5 µg/kg dozunda intraperitonal olarak hergün verilmiştir. Deneyin sonunda ketamin/rompun anestezisi altında sıçanların kan örnekleri alınmış ve böbrek dokuları çıkartılmıştır. Kan serum örneklerinde üre, kreatinin ve glukoz ölçümleri yapılmıştır. Böbrek doku homojenatlarında malondialdehit, nitrik oksit, glutatyon, süperoksit dismutaz ve katalaz düzeyleri ölçülmüştür. Doku kesitleri Hematoksilen Eosin, Periyodik Asit Shiff ve Masson trikrom ile boyanmıştır. Katalaz ve kaspaz-3 enzim aktiviteleri immünohistokimyasal olarak incelenmiş ve kesitler ışık mikroskobu ile değerlendirilmiştir. Sonuç olarak CCl4 grubunda serum üre, malondialdehit (MDA) düzeylerinin arttığı glutatyon (GSH) ve süperoksit dismutaz (SOD) düzeylerinin azaldığı saptanmıştır. Histopatolojik olarak CCl4  verilen sıçanların böbrek doku kesitlerinin korteks bölgesinde belirgin glomerüler ve tübüler değişimler tespit edilmiştir. Tübüllerde dilatasyon, tübülo-interstisyel bölgelerde hemorajik alanlar, proksimal tübül hücrelerinde fırçamsı kenar kaybı, genel olarak proksimal ve distal tübül hücrelerinde şişme, vakuolizasyon ve ayrılma, glomerüler atrofi, belirgin glomerüler konjesyon, pariyetal tabakaya yapışma, Bowman kapsülü bazal membranında kalınlaşma ve kortiko-medüller bölgede interstisyel inflamatuvar hücre infiltrasyonu ve kollajen lif artışı saptanmıştır. Kesitlerde doku organizasyonunun bozulduğu ve Bowman kapsüllerinin bir araya toplandığı da dikkati çekmiştir. İmmünohistokimyasal olarak CCl4 uygulanan sıçanlarda yoğun kaspaz-3 immünreaktivitesi ve zayıf katalaz immünreaktivitesini saptanmıştır. Melatonin ve D vitamini uygulanan gruplarda dokudaki  hasarının gerilediği ve doku bütünlüğünün kontrole yakın olduğu gözlenmiştir. Biyokimyasal analizlerin sonuçlarına göre CCl4  grubunda yüksek olan serum üre düzeyinin D vitamini uygulanmış  gruplarda düştüğü, melatonin uygulanmış gruplarda ise değişmediği gözlenmiştir. Melatonin ve D vitamini tedavili her iki grupta da (10 ve 12 haftalık) böbrek dokusunda MDA düzeylerinin azaldığı ve kontrol gruplarına yakın olduğu tesbit edilmiştir. GSH düzeylerinin arttığı bulunmuştur. SOD düzeylerinin ise 10 haftalık D vitamini tedavili grupta ve 12 haftalık melatonin tedavili grupta artış gösterdiği dikkati çekmiştir. Elde edilen biyokimyasal ve histopatolojik bulgulara göre melatonin ve D vitamininin CCl4 ile oluşturulan oksidatif stres ve böbrek hasarını kısmen azaltabildiği ileri sürülebilir. İmmünohistokimyasal olarak da Kaspaz-3 immünreaktivitesi bakımından melatonin ve D vitamininin antiapoptotik etkiye sahip olduğu ifade edilebilir.

Abstract:
The aim of this study was to evaluate the protective and curative effects of melatonin and vitamin D treatment on CCl4-induced nephrotoxicity in rats using biochemical, histochemical and immunohistochemical parameters. In this study, adult male Wistar albino rats weighing 200-220 g were used. The rats were divided into 7 groups; corn oil control group, PBS+ethanol control group, 10 week CCl4 group, 10 week CCl4 + melatonin group, 12 week CCl4 + melatonin group, 10 week CCl4 + vitamin D group and 12 week CCl4 + vitamin D group. There were 6 rats in each experimental group with a total of 42 rats. CCl4 was injected subcutaneously, 1.5ml/kg, twice a week. Melatonin was administrated subcutaneously, 10 mg/kg, every day. Vitamin D was administrated intraperitoneally, 0.5 µg/kg, every day.  At the end of the experiment, blood samples were taken and kidney tissues were removed under ketamine/rompun anesthesia. The urea, creatinine and glucose levels were determined in the blood tests. The level of malondialdehyde, nitric oxide, glutathione, superoxide dismutase and catalase were measured in kidney tissue homogenates. Sections were stained by  Hematoxylin and Eosin, Periodic Acid Shiff and Masson's trichrome. Catalase and caspase-3 enzyme activities were assessed by immunohistochemical methods and sections were examined by light microscopy. There was an increase in the urea and malondialdehyde (MDA) levels and a decrease in the glutathione (GSH) and superoxide dismutase (SOD) levels in CCl4 group. Histopathological analysis of CCl4 group indicated pronounced glomerular and tubular changes in the cortex region of kidney tissue sections. There was tubular dilatation, hemorrhage in tubulo-interstitial area, loss of brush border of the proximal tubule cells, swelling of the proximal and distal tubule cells and vacuolization within the tubules. Glomerular atrophy, marked glomerular congestion and adhesion to parietal layer were observed. Bowman's capsule basement membrane thickening, interstitial inflammatory cell infiltration and increase in collagen fibers in cortico-medullary region were detected. In the sections, tissue disorganization and aggregation of Bowman's capsules were noted. The immunohistochemical analysis of caspase-3 and catalase activities indicated strong immunoreactivity of the caspase-3 and weak immunoreactivity of the catalase. In the melatonin and vitamin D treated groups, tissue damage was reduced and tissue integrity was similar to that of the control group. Biochemical results showed that the serum urine levels increased in the CCl4 group, decreased in the vitamin D groups and were unchanged in the melatonin groups. MDA levels of the kidney tissue decreased in melatonin and vitamin D (both 10 and 12 weeks) groups and were similar to that of the control group. GSH levels had increased. It was noted that SOD levels increased in 10 weeks vitamin D group and 12 weeks melatonin group. Our results suggest that melatonin and vitamin D treatment could ameliorate CCl4-induced oxidative stress and renal damage. Moreover, analysis of caspase-3 activity reveals possible antiapoptotic effects of melatonin and vitamin D.