Kolorektal kanser kök hücre davranışı üzerine jnk inhibisyonunun incelenmesi
Invegestion of jnk inhibition on colorectal cancer stem cell behaviior
Yazar: YEŞİM KURKUTÇU
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN AKTUĞ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Onkoloji = Oncology

Özet:
Kolorektal kanser (KKH), dünya çapında morbidite ve mortalite oranı en yüksek olan gastrointestinal neoplazmlardan biridir. Kolorektal kanser kök hücresi (KKKH) diğer kanser kök hücrelerinde olduğu gibi tümör gelişimde, büyümesinde, metastazında ve nüksünde önemli roller üstlenir. JNK sinyal yolağı kendini yenileme, ilaç direnci ve tümör başlatma yeteneği gibi kanser kök hücresi özelliklerini koruyarak çeşitli kanser türleri için agresifliğinin desteklenmesine katkıda bulunduğunu göstermektedir. JNK sinyali kanser kök hücreleri nişinde ve kanser kök hücrelerinin kendini yenilemesinde de önemli rollere sahiptir. Bu çalışmada KKH'nin JNK inhibisyonu ile KKH'ne,  kolorektal hücresine ve/veya başka hücresel yapıya olası dönüşüm/yöneliminin TGF-β, ERK1/2 ve CyclinD2 belirteçlerinde incelenmesi amaçlanmıştır. HT-29 KKH (CD133+/CD44+), HT-29 ve JNK inhibisyonu uygulanmış HT-29 KKH'lerine deneyler birbirinden bağımsız üç farklı günde üç farklı deney olarak gerçekleştirilmiştir. Hücre kültürü, immünohistokimyasal boyama ve hücre döngüsü analizleri materyal methot teknikleri ile gerçekleştirilmiştir. Deneysel olarak ele alınan üç hücre grubunda belirteçlerin ekspresyon seviyeleri H-score yöntemiyle en az yüz hücre ele alınarak karşılaştırılmıştır. Düşük TGF-β ekspresyon seviyelerinde bulunduğunda KKH JNK inhibitörü KKH'lerine göre artmıştır ve KH'leri en yüksek ekspresyonda bulunmuştur. Yüksek TGF-β ekspresyon seviyelerinde karşılaştırıldıklarında ise yüksek ekspresyon seviyeleri sırasıyla KKH, KKH JNK inhibitörü ve HT-29 olarak sıralanmaktadır. TGF-β protein ekspresyonlarında grup içerisindeki heterojen dağılım nedeniyle istatistiksel fark belirlenmemiştir. Düşük ERK1/2 ekspresyon seviyelerinde bulunduğunda en yüksek KKH'inde ekspresyon saptanmıştır. Bu ekspresyon düzeyindinde JNK inhibitörü uygulandığında ERK1/2 ekspresyon seviyeleri düşmüştür. Yüksek ERK1/2 ekspresyon düzeylerindeki hücrelerde anlamlı bir fark bulunmamıştır. Protein ekspresyonlarında grup içerisindeki heterojen dağılım nedeniyle istatistiksel fark sadece düşük ekspresyon yoğunluğunda KKH ve KKH JNK inhibitöründe belirlenmiştir (p < 0.05). Düşük Cyclin D2 ekspresyon düzeyindeki hücrelerde anlamlı bir fark bulunmamıştır. Yüksek düzeyde ekspresyon gösteren hücre sayısı oldukça az olarak bulunmuştur. Cyclin D2 protein ekspresyonlarında grup içerisindeki heterojen dağılım nedeniyle istatistiksel fark belirlenmemiştir, Hücre döngüsü analizlerinde JNK inhibisyonu uygulanmış, HT-29 KKH'leri G0/G1 ve G2/M fazlarında yüksek hücre proliferasyonu göstermiştir. HT-29 KKH ve HT-29 KH hücre döngüsü aşamalarında aynı hücre proliferasyonuna sahipken JNK inhibisyonu uygulanmış HT-29 KKH'leri S fazında hücre yoğunluğu anlamlı bir şekilde azalmış ve G2/M fazında ise arrest olmuştur. 
 JNK inhibitörünün KKH'nde rolleri göz önüne alındığında JNK sinyalinin hedeflenmesi KKH köklülüğünü ve nişini baskılayarak teröpatik yaklaşımlar sunma potansiyeline sahiptir. Spesifik seçici inhibitörlerin tanımlanması, kanserde hedefe yönelik tedavinin geliştirilmesi için önemli bir adımdır.

Abstract:
Colorectal cancer (CRC) is one of the gastrointestinal neoplasms with the highest morbidity and mortality rates worldwide. Colorectal cancer stem cells (CRSCs), as in other cancer stem cells, play important roles in tumor development, growth, metastasis and recurrence. The JNK signaling pathway maintains cancer stem cell properties such as self-renewal, drug resistance and tumor initiation ability, suggesting that it contributes to the promotion of aggressiveness for various cancer types. The JNK signaling pathway also has important roles in the niche of cancer stem cells and their self-renewal. The aim of this study was to investigate the possible transformation/differentiation of colorectal cancer stem cells(CRSCs) into colorectal cancer(CRC) cells, colorectal cells and/or other cellular structures by JNK inhibition using TGF-β, ERK1/2 and CyclinD2 markers. Experiments were performed on HT-29 CSCs (CD133+/CD44+), HT-29 and JNK inhibited HT-29 CSCs as three independent repeats on three different days. Cell culture, immunohistochemical staining and cell cycle analysis were performed by the techniques described in the material method. The expression levels of the markers in the three experimental cell lines were compared using the H-score method using at least one hundred cells. When compared at low TGF-β expression levels, CSC JNK inhibitor was increased compared to CSCs and CRC cells had the highest expression. When compared at high TGF-β expression levels, the high expression levels were ranked as CSC, CSC JNK inhibitor and HT-29, respectively. No statistical difference was determined in TGF-β protein expressions due to heterogeneous distribution within the group. When compared at low ERK1/2 expression levels, the highest expression was detected in CSCs. At this expression level, ERK1/2 expression levels decreased when JNK inhibitor was applied. No significant difference was found in cells with high ERK1/2 expression levels. Due to the heterogeneous distribution of protein expressions within the group, statistical difference was determined only in CSCs and CSC JNK inhibitor at low expression intensity (p < 0.05). No significant difference was found in cells with low Cyclin D2 expression levels. The number of cells showing high level expression was found to be quite low. There was no statistical difference in Cyclin D2 protein expressions due to heterogeneous distribution within the group. In cell cycle analysis, JNK inhibition was applied and HT-29 CSCs showed high cell proliferation in G0/G1 and G2/M phases. While HT-29 CSCs and HT-29 CRC cells had the same cell proliferation in cell cycle phases, JNK-inhibited HT-29 CSCs showed significantly decreased cell density in S phase and arrest in G2/M phase. Considering the roles of JNK inhibitor in CSC, targeting JNK signaling has the potential to offer therapeutic approaches by suppressing CSC stemness and niche. The identification of specific selective inhibitors is an important step towards the development of targeted therapy in cancer.