Antalya ili turunçgil alanlarında psorosis virüsünün belirlenmesi, biyolojik ve moleküler karakterizasyonu
Detection, biological and molecular characterization of citrus psorosis virus from different citrus growing regions of Antalya
Yazar: BENGİ TOPKAYA KÜTÜK
Danışman: DOÇ. DR. BAYRAM ÇEVİK
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Bitki hastalıkları = Plant diseases ; Bitki koruma = Plant protection ; Bitki virüsleri = Plant viruses

Özet:
Turunçgil psorosis virüsü (Citrus psorosis virus, CPsV) tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de, turunçgil yetiştirilen alanlarda görülmektedir. CPsV, kullanılan anaç ve kaleme bağlı olarak turunçgillerin yapraklarında klorotik lekelerden ilerleyen dönemlerde bitkinin ölümüne kadar varan farklı belirtiler meydana getirmektedir. Son yıllarda dünyada CPsV'nin moleküler karakterizasyonuna yönelik çok sayıda çalışma yapılmıştır. Ancak, ülkemizde CPsV' ünün varlığı uzun yıllardır bilinmesine rağmen, etmenin sadece teşhisine yönelik yapılan serolojik çalışmalar ağırlıklı olarak Doğu Akdeniz Bölgesi'nde yürütülmüştür. Bu çalışmada, Türkiye'de turunçgil yetiştiriciliğinin yaygın olarak yapıldığı Antalya İli'ndeki turunçgil üretim alanında belirlenen 51 şüpheli ağaçtan yaprak ve sürgün örnekleri alınarak CPsV taşıyıp taşımadıklarını belirlemek amacıyla öncelikle DTBIA ve ELISA yöntemiyle test edilmiştir. Serolojik testler sonucunda 6 örnek CPsV ile enfekteli bulunmuştur. Tüm örneklerin yaprak dokularından total RNA izolasyonu yapıldıktan sonra, CPsV' nün kılıf protein (CP) geni iki aşamalı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemiyle dejenere primerler kullanılarak çoğaltılmıştır. RT-PCR ile test edilen 51 örneğin 6 tanesinde 1320 bp büyüklüğünde CPsV CP genine denk gelen bant elde edilerek serolojik testlerin sonuçları teyit edilmiştir. Ayrıca dejenere primelerle yapılan PCR ürünleri ve CP geninin 350 bp kısmını çoğaltacak bir çift primer kullanılarak nested PCR yöntemi geliştirilmiştir. Daha önce serolojik yöntemlerle ve RT-PCR ile test edilen örnekler nested PCR ile test edildiğinde 51 örnegin 45 tanesinin CPsV ile enfekteli olduğu belirlenmiştir. Altı farklı CPsV izolatından çoğaltılan tam kılıf protein genleri pGEM-T easy plazmit vektörüne klonlanıp Escherichia coli bakterisine aktarılarak koloniler elde edilmiştir. Her bir örnek için elde edilen beyaz kolonilerden en az dört tanesi seçilerek koloni PCR yöntemiyle taranmış ve her bir örneğin kılıf protein genini içeren en az iki beyaz koloni belirlenmiştir. Bu kolonilerden plazmit izolasyonu yapıldıktan sonra plazmitler EcoRI enzimiyle kesilip CPsV kılıf protein geni içerdikleri teyit edilmiştir. Daha sonra, kılıf protein genlerinin dizilimi yapılarak bunların nükleotid dizilimi ve kodladığı amino asit dizilimi belirlenmiştir. Bu diziler analiz edilerek ülkemizin farklı bölgelerinden elde edilen CPsV izolatlarının birbirleriyle ve dünyadaki diğer izolatlarla karşılaştırılarak benzerlik oranları ve filogenetik ilişkileri ortaya konmuştur.

Abstract:
Citrus psorosis virus (CPsV), which is widespread in all citrus growing areas of the world including Turkey, causes significant economical losses. CPsV induces different symptoms ranging from chlorotic flecks on the leaf to death of trees depending on the combination of the rootstock and scion used. In recent years, a significant number of studies have been conducted about molecular characterization of CPsV in the world. However, even though the existence of CPsV in Turkey has been known for a long time only serological diagnostic tests have been conducted for detection of CPsVin primarily in the Eastern Mediterranean region. In this study, 51 suspicious samples collected from different citrus growing areas of Antalya. The samples were first tested by CPsV DTBIA and ELISA fort he presence of CPsV and 6 samples were found to be infected with CPsV by serological tests Total RNA was isolated from all leaf tissues and the coat protein (CP) gene of CPsV were amplified by a two-step reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method using degenerate primers. A DNA fragment of 1320 bp corresponding to the CP gene of CPsV was amplified from nine of the 51 tested samples and confirmed the results of stereological tests. In addition, using PCR products of degenerate primers with a set of primer amplifying 350 bp portion of CPsV CP gene a nestet PCR was develop for detection of CPsV. When the samples previously tested by serological methods and RT-PCR tested with nested PCR 45 of the 51 samples found to be infected with CPsV. The CP genes amplified from six different isolates of CPsV by RT-PCR were cloned into the pGEM-T Easy plasmid vector using T-A cloning method. After the transformation of the Escherichia coli a number of colonies potentially carrying the CPsV CP genes were obtained. For each sample at least four white colonies were screened by colony PCR and at least two colonies carrying the pGEM-T Easy plasmid with the CPsV CP gene were identified. Plasmids were isolated from these colonies and of the presence of CPsV CP gene in the plasmids was confirmed by EcoRI digestion. The CP genes were sequenced and their nucleotide and deduced amino acid sequences were determined. Similarity and phylogenetic relationship of the CP gene of Turkish CPsV isolates with each other and with the CP genes of CPsV isolates from different regions of the world were determined using the nucleotide and amino acid sequences.