Marmara, Ege ve Karadeniz'den çıkartılan kara midyesi ve kum midyelerindeki vibrio parahaemolyticus izolatlarının moleküler karakterizasyonu, antibiyotik direnç profili ve biyofilm oluşturma kapasitesi
Molecular characterization, antibiotic resistance pattern and biofilm formation of vibrio parahaemolyticus isolated from mussels and clams in the Marmara, aegean and black sea
Yazar: GÖRKEM CENGİZ
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM KÜPLÜLÜ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veteriner Besin Hijyeni ve Teknolojisi Ana Bilim dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Biyofilmler = Biofilms ; Midyeler = Mussels ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Vibrio parahaemolyticus = Vibrio parahaemolyticus ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Son yıllarda Türkiye'de tüketici alışkanlıklarının değişmesi ile başta çift kabuklu deniz ürünleri olmak üzere balık dışındaki diğer deniz ürünlerinin tüketim miktarlarında büyük bir artış görülmektedir. Çift kabuklu deniz ürünleri, besleyici değerinin yanı sıra salgınlarla ilişkili gıdalar içerisinde yer alarak halk sağlığı açısından da oldukça önem taşımaktadır. Deniz ürünleri kaynaklı gastroenteritlerin dünyada en önde gelen nedeni olarak kabul edilen Vibrio parahaemolyticus için iyi bir rezervuar olan midyeler, potansiyel kontaminasyon kaynakları olarak değerlendirilerek tüketiciler için risk oluşturmaktadır.
Bu kapsamda bu tez çalışmasında Mayıs 2021 – Mayıs 2022 döneminde Ege, Marmara ve Karadeniz'in 14 farklı bölgesinden çıkartılan 135 kara midyesi (Mytilus galloprovincialis) ve farklı türlere ait 120 kum midyesi (Chamelea gallina, Ruditapes philippinarum ve Donax trunculus) olmak üzere toplam 255 örnek balıkçılardan temin edilmiştir. Bu örneklerden V. parahaemolyticus izolasyonu ve identifikasyonu ISO 21872-1:2017 standardına göre klasik kültür metoduyla yapılmış, şüpheli izolatlardaki V. parahaemolyticus varlığı toxR geni esas alınarak konvansiyonel PCR ile doğrulanmıştır. Enteropatojen suşların belirlenmesi amacıyla, konfirme edilmiş V. parahaemolyticus izolatlarının moleküler karakterizasyonu yapılarak başlıca virülens genleri olan tdh ve trh gen bölgelerinin varlığına bakılmıştır. Ardından V. parahaemolyticus olarak belirlenen izolatların, antimikrobiyal direnç profilleri Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi kullanılarak belirlenmiş, daha sonra patojen ve patojen olmayan suşlardan seçilen izolatların 3 farklı sıcaklık derecesi (10°C, 25°C ve 37°C) ve 2 farklı inkübasyon süresinde (24 ve 48 saat) biyofilm oluşturma kapasitesi araştırılmıştır.
Çalışmada elde edilen sonuçlara göre toplanan 255 örneğin %32,2'si V. parahaemolyticus olarak konfirme edilmiş olup, bunların %30,8'i kum midyesinden; %33,3'ü ise kara midyesinden izole edilmiştir. İzolatların görülme sıklığı denizlere göre sırasıyla Karadeniz (%52,5), Marmara Denizi (%34,8) ve Ege Denizi (%3,6) şeklinde olup, denizler arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Mevsimlere göre sonuçlarda en yüksek pozitiflik oranının yaz mevsiminde toplanan örneklerde (%60) olduğu, ilkbahar örneklerinin ise en düşük orana (%15,9) sahip olduğu belirlenmiştir. Toplanan 255 örnekten izole edilen izolatların %5,9'u patojen olarak tespit edilmiştir. Patojen izolatların %73,3'ü kum midyesinden; %26,7'si ise kara midyesinden izole edilmiş olup, patojen izolat açısından midyeler arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Patojen izolatların %60'ının Karadeniz, %40'ının ise Marmara Denizi'nde yer aldığı, Ege Denizi'nde ise hiçbir patojen izolat bulunmadığı dikkat çekmektedir. Ayrıca patojen izolatların çoğunun (%46,7) kış mevsiminde izole edildiği belirlenmiştir.
Midye örneklerinden izole edilen toplam 82 V. parahaemolyticus suşunun antimikrobiyal direnç profilleri araştırılarak MAR indeks değeri ortalama 0,67 olarak belirlenmiştir. Elde edilen izolatların ikisinin test edilen dokuz antibiyotiğin tamamına direnç göstermesi ve izolatların tamamında en az üç antibiyotik grubuna karşı direnç belirlenmesi ile çoklu antibiyotik direnci tespit edilmiş, bu durum Türkiye sularındaki yüksek kontaminasyon riskini göstermiştir. Ayrıca çalışmada en fazla dirençli izolatın tespit edildiği antibiyotiklerin
101
piperasilin ve tetrasiklin olduğu, 82 izolatın tamamının (%100) bu antibiyotiklere karşı direnç oluşturduğu belirlenmiştir.
Biyofilm oluşturma kapasitelerinde patojen suşlarla patojen olmayan suşlar arasında bir fark belirlenemezken, izolatların 48 saatlik inkübasyon süresinde 24 saatlik inkübasyon süresine göre, 25°C sıcaklık derecesinde ise 10°C ve 37°C sıcaklık derecelerine göre daha iyi biyofilm oluşturdukları tespit edilmiştir. Suşların hiçbirinde güçlü biyofilm oluşumu gözlenmezken, orta derecede biyofilm oluşumu sadece kum midyelerinden izole edilen suşlarda (%7,1) gözlenmiştir.
Deniz ürünleri kaynaklı gastroenterit vakalarının en önemli sebeplerinden biri olan Vibrio türlerinin yaygınlığının ve patojen suşların varlığının belirlenmesi, bu vakaların tedavi, koruma ve kontrol stratejilerinin geliştirilmesi için ilk adım niteliği taşımaktadır. Bu çalışma Türkiye'nin üç farklı denizinden (Ege, Marmara ve Karadeniz) elde edilen kara ve kum midyelerindeki Vibrio parahaemolyticus varlığının ve patojen suşlarının belirlendiği, midye örneklerinde antibiyotik direnç profillerinin ortaya konduğu ve suşların biyofilm oluşturma kapasitelerinin araştırıldığı ilk kapsamlı araştırma olması özelliğiyle önem taşımaktadır.

Abstract:
In recent years, with the change in consumer habits in Turkey, a great increase is observed in the consumption amounts of other seafood other than fish, especially bivalve seafood. In addition to its nutritional value, bivalves are also very important for public health by being included in the foods associated with epidemics. Mussels are considered as potential sources of contamination and pose a risk to consumers as a reservoir for Vibrio parahaemolyticus, which is considered to be the leading cause of seafood-borne gastroenteritis in the world.
In this study, 135 mussels (Mytilus galloprovincialis) and 120 clams from different species (Chamelea gallina, Ruditapes philippinarum and Donax trunculus) were collected from Aegean, Marmara and Black Sea between May 2021 and May 2022. The culture method according to ISO 21872-1:2017 standard was used for isolation and identification of V. parahaemolyticus, confirmation of V. parahaemolyticus in suspected isolates was conducted by PCR based on the toxR gene. Molecular characterization of confirmed V. parahaemolyticus isolates was performed by determining the presence of the main virulence genes (tdh and trh). Antimicrobial resistance profiles of the isolates were determined by the Kirby-Bauer disc diffusion method, and then the isolates selected from pathogenic and non-pathogenic strains were incubated at 3 different temperatures (10°C, 25°C and 37°C) and 2 different incubation time (24 and 48 hours) to investigate the biofilm formation capacity.
According to the results, 32.2% of the all samples were confirmed as V. parahaemolyticus, and 30.8% of them were from clams; 33.3% from mussels. The incidence of the isolates was the Black Sea (52.5%), the Marmara Sea (34.8%) and the Aegean Sea (3.6%), respectively, and the difference between the seas was statistically significant (p<0.05). It was determined that the highest positivity rate in the results according to the seasons was in the samples collected in the summer season (60%), while the spring samples had the lowest rate (15.9%). 5.9% of the 255 samples collected were identified as pathogens. 73.3% of the pathogen isolates were from clams; 26.7% were from mussel, and the difference between mussels in terms of pathogen isolate was statistically significant (p<0.05). It is noteworthy that 60% of the pathogen isolates were from the Black Sea and 40% from the Marmara Sea, and no pathogen isolates were found in the Aegean Sea. In addition, it was determined that most of the pathogen isolates (46.7%) were isolated in winter.
The antimicrobial resistance profiles of a total of 82 V. parahaemolyticus strains isolated from mussel samples were investigated, and the mean MAR index value was determined as 0.67. A high risk of contamination in Turkish waters was shown by detecting multi-antibiotic resistance. Two of the isolates were resistant to all nine antibiotics tested and all isolates were resistant to at least three antibiotic groups. In addition, all isolates (100%) were resistant to piperacillin and tetracycline.
Any difference could not be determined between pathogenic and non-pathogenic strains in their biofilm forming capacities. It was determined that the isolates formed better biofilms at a 48-hour incubation period than at a 24-hour incubation period, and at 25°C compared to 10°C and 37°C temperatures. While strong biofilm formation was not observed in any of the strains, moderate biofilm formation was observed only in strains isolated from clams (7.1%).
103
Determining the prevalence of Vibrio species, which is one of the most important causes of seafood-borne gastroenteritis cases, and the presence of pathogenic strains is the first step to develop treatment, protection and control strategies for these cases. This study is important as it is the first comprehensive study in Turkey to determine the presence of Vibrio parahaemolyticus and pathogen strains in mussels and clams obtained from three different seas of Turkey (Aegean, Marmara and Black Sea), to reveal antibiotic resistance profiles in mussels and clams samples, and to investigate the biofilm forming capacities of strains.