Klinik Staphylococcus aureus izolatlarının identifikasyonu, antibiyotik direnç özelliklerinin moleküler olarak belirlenmesi ve plazmit içeriklerinin tespit edilmesi
The identification of clinical isolates of Staphylococcus aureus, molecular determination of antibiotic resistance and detection of plasmid content
Yazar: ZERİFE ORHAN
Danışman: PROF. DR. MURAT ARAL
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Staphylococcus aureus, tüm dünyada hem toplum kaynaklı hem de hastane kaynaklı enfeksiyonlara yol açan tehlikeli bir patojendir. Hastane enfeksiyonları arasında Staphylococcus aureus en yüksek morbidite ve mortaliteye neden olan ajandır. Günümüzde Staphylococcus aureus'un birçok antibiyotiğe direnç gösteren izolatlarının ortaya çıkması çoğu hastane için önemli bir sorun haline gelmiştir. Bu durum tedavi seçeneklerini büyük ölçüde sınırlamaktadır. Özellikle de metisiline direncin heterojen olması nedeniyle fenotipik yöntemler ile tespitte problemler olabilmektedir.
Bu çalışmada Staphylococcus aureus izolatlarındaki antibiyotik direncinin moleküler olarak daha hızlı ve güvenilir bir şekilde tespit edilmesi amaçlanmıştır. Ocak-Ekim 2014 tarihleri arasında Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarına çeşitli kliniklerden gönderilen örneklerden, standart bakteriyolojik yöntemlerle izole edilen 100 Staphylococcus aureus izolatı kullanılmıştır. Tüm izolatların antbiyotik direnci ve plazmit içerikleri araştırılmıştır. Staphylococcus aureus  izolatlarının farklı antibiyotiklere (gentamisin, penisilin, oksasilin, trimetoprim-sulfametoksazol, vankomisin, klindamisin, eritromisin, fusidik asit, linezolid, yüksek düzey mupirosin, siprofloksasin, rifampin, tetrasiklin ve kinupristin-dalfopristin) duyarlılıkları BD phoenix otomatik mikrobiyoloji sistemi ile belirlenmiştir. Metisilin direnci sefoksitin diski kullanılarak disk difüzyon testi ile de araştırılmıştır.
Ayrıca dirençten sorumlu olan hedef genler ise gentamisin (aac(6')/aph(2'')), penisilin (blaZ), oksasilin (mecA, femA), trimetoprim- sulfametoksazol (dfrA), vankomisin (vanA, vanB), eritromisin (ermA, ermB, ermC ve msrA), fusidik asit (fusA, fusB, fusC), linezolid (cfr), yüksek düzey mupirosin (ileS-2), siprofloksasin (gyrA, gyrB), rifampin (rpoB), tetrasiklin (tetK, tetM) ve kinupristin-dalfopristin (vatA, vatB, vatC) polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle araştırılmıştır. 
Staphylococcus aureus izolatlarındaki antibiyotik direnç oranları phoenix yöntemi ile sırasıyla gentamisin %2, penisilin %100, oksasilin %19, sefoksitin %19 (disk difüzyon yöntemi), trimetoprim- sulfametoksazol %1,  klindamisin %25, eritromisin %26, yüksek düzey mupirosin %2, siprofloksasin %6, rifampin %9 ve tetrasiklin %18 olarak belirlenmiştir. Vankomisin, fusidik asit, linezolid ve kinupristin-dalfopristin dirençleri tespit edilmemiştir. 
Moleküler verilere göre ise direnç sırası ile aac(6')/aph(2'') %2, blaZ  %100, mecA %19, femA  %100,  dfrA %1, ermA %6,  ermC %27, fusA %98, fusC  %1, gyrA %100, gyrB %100, rpoB %100 ve tetK %17, tetM  %3 olarak belirlenmiştir. Fakat potansiyel antibiyotik ilişkili vanA, vanB,  ermB, msrA, fusB, cfr, ileS-2, vatA, vatB ve vatC'de direnç genleri PCR ile tespit edilmemiştir.
Plazmid içerikleri araştırıldığında, toplam 79 izolatta plazmit tespit edilirken, bunların 62'sinde bir plazmit, 13'ünde iki ve dördünde ise üç farklı büyüklükte plazmit tespit edilmiştir.

Abstract:
Staphylococcus aureus is a dangerous pathogen causing both community-based and nosocomial infections in all around the world. Staphylococcus aureus is an agent that causes the highest morbidity and mortality among the nosocomial infections. These days, the emergence of Staphylococcus aureus isolates which is resistant to many antibiotics has become a serious problem for most hospitals. This case reduces the treatment options to this pathogen significantly. Especially, heterogeneous resistances to methicillin phenotypic methods are limited capacity to identify this strain.
In the present study, antibiotic resistance of Staphylococcus aureus is aimed to detect using quick and reliable molecular method. 100 isolates of Staphylococcus aureus that isolated by standard bacteriologic methods from different clinical isolates that sent to Medical Microbiology Laboratory of Kahramanmaras Sutcu Imam University at the period of January-October 2014 were used in this study. Antibiotic resistance and plasmid content was investigated in all isolates. The antibiotics resistance and plasmid content of all isolates were performed. The sensitivity of Staphylococcus aureus isolates to different antibiotics (gentamicin, penicillin, oxacillin, trimethoprim-sulfamethoxazole, vancomycin, clindamycin, erythromycin, fusidic acid, linezolid, high-level mupirocin, ciprofloxacin, rifampin, tetracycline and quinupristin-dalfopristin) is determined by BD Phoenix automated microbiology system. Methicillin resistance test was done using cefoxitin disk.   
In addition, the target genes those responsible for the resistance gentamicin (aac (6')/aph (2')), penicillin (blaZ), oxacillin (mecA, femA), trimethoprim-sulfamethoxazole (dfrA), vancomycin (vanA, vanB), erythromycin (ermA, ermB, ermC and msrA), fusidic acid (fusA, fusB, fusC), linezolid (cfr),  high-level mupirocin (ileS-2), ciprofloxacin (gyrA, gyrB), rifampin (rpoB), tetracycline (tetK, tetM) and quinupristin-dalfopristin (vatA, vatB, vatC)) was investigated using polymerase chain reaction method. 
Antibiotic resistance ratios obtained from isolates of Staphylococcus aureus by phoenix method; Gentamicin 2%, penicillin 100%, oxacillin 19%, trimethoprim-sulfamethoxazole 1%, vancomycin 0%, clindamycin, 25%, erythromycin 26%, high level mupirocin 2%,  ciprofloxacin 6%, rifampin 9% and tetracycline 18% correspondingly.
According to molecular results, resistance based on gene existing were determined in    aac(6')/aph(2'') 2%, blaZ 100%, mecA 19%,  femA 100%, dfrA 1%, ermA 6%, ermC 27%,  fusA 98%,  fusC 1%, gyrA 100%, gyrB 100%,  rpoB 100% and tetK 17%, tetM 3% ratios but the potential antibiotic responsible genes, vanA, vanB,  erm, B msrA, fusB, cfr, ileS-2, vatA, vatB and vatC were not detected by PCR.  
When plasmid contents of isolates were analyzed, 79 isolates were carrying various numbers of plasmid. Only one plasmid was isolated in 62 isolates, two plasmids in 13 and three plasmids in four isolates.