Türkiye'deki bazı denizel sedimentlerin prokaryotik çeşitliliğinin metagenomik analizle belirlenmesi ve denizel aktinomisetlerden antimikrobiyal bileşiklerin izolasyonu
Determination of prokaryotic diversity of some marine sediments from turkey by metagenomic analysis and isolation of antimicrobial compounds from marine derived actinomycetes
Yazar: KADRİYE ÖZCAN
Danışman: PROF. DR. ATAÇ UZEL ; PROF. DR. ERDAL BEDİR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu araştırmanın amacı Türkiye'deki bazı kıyısal sedimentlerin prokaryotik çeşitliliğini araştırmak ve denizel Aktinomisetlerden antimikrobiyal bileşiklerin izolasyonudur. Bu çalışmada toplam 12 kıyısal sediment örneği metagenomik metotlar kullanılarak analiz edilmiştir. 12 sediment örneğinden 10'u ise kültürel metotlar kullanılarak araştırılmıştır. Metagenomik analizlerde sediment örneklerinden eDNA izolasyonu yapılmış ve PCR ile 16S rDNA V3 ve V4 gen bölgeleri çoğaltılmıştır. Amplikonlar pirosekanslama ile dizi analizine tabi tutulmuştur. Toplam bakteriyel ve arkeal çeşitlilik pirosekanslama ile elde edilen ham verilerden QIIME programı kullanılarak belirlenmiştir. Ham dizinlerden toplam 32.826 operasyonel taksonomik ünite (OTU) açığa çıkarılmıştır. Bunun yanı sıra sedimentlerde 10 bakteriyel ve 2 arkeal filum tespit edilmiştir. Sedimentlerdeki aktinomiset çeşitliliğinin 5 ordodan (Solirubrobacteriales, Rubrobacteriales, Coriobacteriales, Actinomycetales, Acidimicrobiales) ve sınıflandırılamayan aktinomisetlerden oluştuğu belirlenmiştir.Örneklerin eDNA'ları, antibiyotik üretimiyle ilişkili PKS1, PKS2, NRPS ve halojenaz genleri mevcudiyeti bakımından taranmıştır. PCR taramalarında 8 örnekte PKS1, 2 örnekte PKS2, 3 örnekte NRPS ve 1 örnekte halojenaz genlerinin bulunduğu belirlenmiştir.Kültürel çalışmalarda 10 farklı sediment örneğinden toplam 296 aktinomiset suşu izole edilmiştir. 71 izolatta antibiyotik dirençli test organizmalarından en az birisine karşı aktivite tespit edilmiştir. Aktif izolatlar 16S rDNA dizileri kullanılarak tanımlanmıştır. Bu izolatlardan 3 tanesi (10CM9, 9CM17 ve 2CM9) biyoaktivite rehberli izolasyon için seçilmiştir. Kromatografik teknikler kullanılarak yapılan ileri çalışmalarla izolatlardan toplam 7 molekül elde edilmiştir. 10CM9 kodlu izolattan E. coli, E. faecium, S. aureus test organizmalarına karşı aktivite gösteren bir bileşiğin NMR analizleri sonunda kloramfenikol olduğu belirlenmiştir. 9CM17 kodlu izolattan 2 bileşik saflaştırılmıştır. Bunlardan bir tanesi tüm test organizmalarına karşı aktivite göstermiş, NMR ve MS analizi sonrasında streptoklorin olarak tanımlanmıştır. 2CM9 kodlu izolattan tüm test organizmalarına karşı aktivitesi olan 4 madde saflaştırılmıştır. 2CM9-05 kodlu bileşiğin NMR analizinde dihydro-5-pentyl-4-methyl-4-hydroxy-2(3H)-furanone olduğu saptanmıştır. 2CM9'un saflaştırılan diğer 3 bileşiğinin moleküler yapıları, 14-methylpentadecanoic acid (2CM9-01), 6-heptodecenoik asit (2CM9-06), 6-Pentadecenoic acid, 14-methyl'den (2CM9-7) oluşan yağ asidi yapısında oldukları belirlenmiştir.Aktif izolatları da içeren 80 aktinomisette PKS1, PKS2, NRPS ve halojenaz gen bölgelerinin varlığı için PCR ile taranmıştır. Taramalarda 77 izolatın antibiyotik üretiminden sorumlu genleri bulundurduğu belirlenmiştir.Anahtar Kelimeler: Metagenomik, Biyoçeşitlilik, Pirosekanslama, Antibiyotikler, Kloramfenikol, Streptoklorin, Furanon.

Abstract:
The aim of this study was to investigate the prokaryotic diversity of the coastal sediments collected from Turkey by using metagenomic methods and isolation and characterization of antimicrobial compounds from marine derived Actinomycetes. A total of 12 coastal sediment samples were analyzed by using metagenomic methods, 10 of which were also investigated by using cultural methods. In metagenomic analysis, eDNA was isolated from sediment samples, and V3 and V4 regions of 16S rDNA were amplified by PCR. Amplicons were subjected to DNA sequence analysis with pyrrosequencing. Total bacterial and archaeal diversity was revealed by using QIIME software. A total of 32.826 operational taxonomic units (OTU) were distinguished from raw sequence data. Besides 10 bacterial and 2 archaeal phyla were revealed. In all sediments, Actinobacterial diversity was found containing 5 orders, Solirubrobacteriales, Rubrobacteriales, Coriobacteriales, Actinomycetales, Acidimicrobiales, as well as unclassified Actinobacteria.eDNA of the samples were also screened for the presence of PKS 1, PKS2, NRPS and halogenase genes, which are significant for antibiotic production. PKS1 genes were detected in 8 samples, whereas PKS2 genes were found in 2 samples. Halojenaz and NRPS genes were detected for 1 and 3 samples, respectively.In cultural studies, 296 actinomycetes strains were isolated from 10 different sediment samples. Seventy one strains showed antimicrobial activity against antibiotic resistant test microorganisms. These strains were identified by using 16SrDNA sequence analysis. Three strains (10CM9, 9CM17 and 2CM9) were selected for bioactivity guided isolation. Further studies by chromatographic techniques resulted in purification of 7 compounds. The isolate 10CM9 provided a compound, 10CM9-01 which was against E. coli, E. faecium and S. aureus. The structure of 10CM9-01 was determined as chloramphenicol by extensive use of NMR. Two compounds were isolated from 9CM17, one of which 9CM17-01 was found active against all test organisms. Structure of 9CM17-01 was established as streptochlorine by NMR and MS analyses. Four bioactive compounds (2CM9-01, 2CM9-05, 2CM9-06, 2CM9-07) were obtained from the strain 2CM9, active against all test organisms. The structure of 2CM9-05 was elucidated as dihydro-5-pentyl-4-methyl-4-hydroxy-2(3H)-furanone by spectral analysis. Molecular structures of other purified 3 compounds of 2CM9 were determined as fatty acids including 14-methylpentadecanoic acid (2CM9-01), 6-heptodecenoic acid (2CM9-06) and 6-Pentadecenoic acid, 14-methyl (2CM9-7).Eighty isolates including active ones were screened for presence of PKS 1, PKS2, NRPS and Halogenase genes. Seventy seven isolates were found to be positive for above mentioned genes, significant for antibiotic production.Keywords: Metagenomics, Biodiversity, Pyrrosequencing, Antibiotics, Chloramphenicol, Streptochlorine, Furanone.