Lignoselülozik içerikli biyokütle ile beslenen anaerobik çürütücülerde Clostridium thermocellum'un biyogaz üretimine etkisi
Bioaugmentation with Clostridium thermocellum in the anaerobic digestion of lignocellulosic biomass
Yazar: BÜŞRA ECEM ÖNER
Danışman: PROF. DR. ORHAN İNCE
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering

Özet:
Türkiye, tarım ve hayvancılık aktivitelerinin yoğun olarak yürütüldüğü bir ülkedir. Bu aktiviteler sonucunda oluşan atıklar anaerobik çürütme işlemine tabi tutularak, işlem sonucunda oluşacak biyogaz üretimi ile yenilenebilir enerji eldesi sağlayabilirler. Tarımsal atıkların içeriğinde bulunan lignoselülozik maddelerin parçalanması oldukça zordur ve bu durum çürütme işleminin hidroliz aşaması için kısıtlayıcı bir faktördür. Lignoselüloz içerikli atıkların hidroliz aşamasını hızlandırmak amacıyla anaerobik çürütücülere fiziksel, kimyasal ve biyolojik prosesler uygulanabilmektedir. Biyolojik prosesler çevreyle uyumlu, son ürünleri zararsız olduğu için anaerobik çürütücüler için daha sürdürülebilir bir çözüm sunmaktadır.
Bu tez çalışmasıyla lignoselüloz içerikli atıkların parçalanmasında hız kısıtlayıcı hidroliz adımını Clostridium thermocellum bakterisi ekleyerek iyileştirmek ve böylece biyogaz/metan üretim verimini arttırmak amaçlanmıştır. Bu kapsamda, substrat olarak büyükbaş hayvan dışkısı ve buğday sapının kullanıldığı toplam çürütücü hacminin %0, %5, %10, %15 ve %20'si olmak üzere lignoselülozik, anaerobik, termofilik bakteri olan C.thermocellum eklenen çürütücüler kesikli olarak 50 gün boyunca işletilmiştir. Bunun yanı sıra, biyoaugmentasyon kültürünün eklenmediği içerisinde yalnızca aşı çamuru, yalnızca dışkı, aşı ve dışkı, aşı ve buğday sapı ve dışkı ve buğday sapının olduğu kontrol çürütücüleri de işletilmiştir. En düşük bakteri yüzdesine ait (%5) daha büyük hacme sahip çürütücü, ilk 20 gün kesikli, sonraki 40 gün ise 4 günde bir olacak şekilde beslenerek yarı kesikli olarak işletilmiştir. Yarı kesikli işletim süresince biyogaz ve metan üretimi gözlemlenmiştir.Başlangıçta biyoaugmentasyon için kullanılacak olan C.thermocellum kültüre alınarak, hazırlanan besiyerinde anaerobik ve termofilik koşullarda büyütülmüştür. Çürütücüler kurulana kadar bakteri her 15 günde yeni besiyerine ekilerek büyütülmüştür. Bakteri büyümesi kontrol besiyerine kıyasla ekim yapılan besiyerindeki bulanıklığının gözlemlenmesiyle anlaşılmış, NanoPhotometer® cihazında büyüme yoğunluğu tespit edilmiştir. Bakteri literatürde belirtilen optimum optik yoğunluk değeri olan 600'e ulaştığında çürütücüler kurulmuştur.
Çürütücüler kurulmadan önce kullanılacak aşı çamuru, buğday sapı ve büyükbaş hayvan dışkısı karakterizasyon deneyleri (TKM, UKM, karbon/azot, alkalinite, pH, TKN, çKOİ) yürütülmüştür. Karakterizasyon deneylerine göre; katı madde yüzdeleri; aşı: %7,8, dışkı: %14,3, buğday sapı: %92,7, uçucu katı madde yüzdeleri; aşı: %5,2, dışkı: %11,1, buğday sapı: %82,3, karbon: azot oranı; aşı: 11: 1, dışkı: 25: 1, buğday sapı: 86: 1, alkalinite; aşı: 25 000±125 mg CaCO3/L, dışkı: 2 550±520 mg CaCO3/L, buğday sapı: 250±78 mg CaCO3/L olarak bulunmuştur. Bu verilere göre çürütücüye konulacak miktarlar uçucu katı madde cinsinden hesaplanıp, substrat: aşı oranı 1: 1 olacak şekilde eklenmiştir. Aşı çamurunun yüksek alkalinite değerinden dolayı karışımın alkalinitesi çürütücü koşullarını sağlamış, ekstra alkalinite eklenmemiştir.
Çürütücüler 55±1°C'de termofilik koşullarda işletilmiştir. %5, %10, %15 ve %20'lik bakteri yüzdelerine sahip kesikli çürütücülerin, %5'lik yarı kesikli çürütücünün ve diğer kontrol çürütücülerinin biyogaz üretimleri günlük olarak ölçülerek not edilmiştir. Kesikli çürütücüler için metan verimleri, metan yüzdeleri, uçucu yağ asidi konsantrasyonları, giriş çıkış TKM, UKM değerleri, çKOİ değişimleri, selüloz azaltım oranları (%) ve diğer parametre değerleri (pH, alkalinite) kontrol çürütücüleri ile kıyaslanmıştır ve sonuçlar grafikler halinde verilmiştir.
Çalışma sonucunda, en yüksek metan ve biyogaz üretimi, metan verimi ve selüloz giderim oranı %20'lik bakteri eklenen çürütücüde olduğu gözlemlenmiştir. Metan verimi değerleri; %0 (288 ml/gUKM), %5 (311 ml /gUKM), %10 (339 ml/gUKM), %15 (413 ml/gUKM), %20 (478 ml/gUKM) olarak bulunmuştur. Biyogaz verimi ise %0 (496 ml/gUKM), %5 (526 ml /gUKM), %10 (575 ml/gUKM), %15 (666 ml/gUKM), %20 (759 ml/gUKM) olarak bulunmuştur. Yarı kesikli çürütücüde biyogaz verimi 751 ml/ g UKMeklenen metan verimi ise 439ml/ g UKMeklenen şeklinde bulunmuştur. Selüloz giderimi başlangıç ve çıkış numunelerine bakılarak %0 (%20 selüloz/TKM), %5 (%24 selüloz/TKM ), %10 (%25 selüloz/TKM), %15 (%31 selüloz/TKM), %20 (%40 selüloz/TKM), aşı çamuru (%17 selüloz/TKM), dışkı (%12 selüloz/TKM), dışkı+aşı çamuru (%13 selüloz/TKM), dışkı+buğday sapı (%10 selüloz/TKM) ve aşı çamuru+ buğday sapında (%10 selüloz/TKM) olarak bulunmuştur. %20 lik bakteri yüzdesine sahip çürütücüyle %0'lık kontrol çürütücüsüne kıyasla biyogaz verimliliğinde %34 artışı sağlanmıştır. Metan verimliliğinde ise %39'luk artış sağlanmıştır. C.thermocellum bakterisinin çürütücülere eklenmesi selülozun hidrolizini kolaylaştırarak biyogaz ve metan üretimini arttırmıştır.
Kesikli çürütücülerin 30.gününde %0 ve %20'lik çürütücülerden alınan örneklerin DNA izolasyonu sonucunda elde edilen DNA numuneleri Yeni Nesil Gen Dizileme (NGS) yöntemiyle incelenmiştir. Her iki çürütücüde de en baskın bakteri şubesi Firmicutes sonrasında Thermotogae ve Bacteroidetes'e aittir. En baskın bakteri türü Clostiridium sp. olarak belirlenmiştir. Bakteri türlerine bakıldığında 30. günde çürütücülerde bakteri açısından büyük değişiklikler gözlemlenmemiştir yaklaşık olarak sonuçlar benzer çıkmıştır. Her iki çürütücüde de en baskın arke türü methanoculleus thermophilus'dur sonrasında sırasıyla Methanoculleus sp., Methanosarcina spp., Methanobrevibacter sp., Methanothermobacter thermautotrophicus ve Methanomassiliicoccus sp.'dir. En baskın arke takımı Methanomicrobiales, Methanosarcinales ve Methanobacteriales'tir. En baskın cins Methanoculleus ve Methanosarcina'dır. Metan arkeleri %20'lik çürütücüde daha baskın haldedir.

Abstract:
As of late, energy demand of the world is increased rapidly because of rising world population and welfare. World energy demand covered by fossil fuels, but nowadays clean technologies such as biogas production from agro-industrial biomass become more popular. Also this energy source, based on lignocellulosic waste is an inexpensive, renewable, abundant and gives a unique natural resource for large-scale. The trial confirmations proposed that maize, wheat, sunflower and other assortment of lignocellulosic biomass could be used effectively to create biomethane. Agriculture and livestock activities are carried out intensively in Turkey. Waste from these activites may provide energy by processing them with anaerobic digestion. At the end of anaerobic digestion process biogas is obtained to be used as energy source. It is hard to degrade the lignocellulosic material from agricultural waste and this situation is a limiting factor for hydrolysis phase of digestion. Physical, chemical and biological processes can be applied to accelerate hydrolysis phase of waste with lignocellulosic content. Biological processes are providing a more sustainable solution for anaerobic digesters because the final product of these processes are harmless and environmentally friendly. Anaerobic degradation process is performed by facultative and anaerobic microorganisms. Bioaugmentation with thermophilic, rod shaped, anaerobic, cellulolytic, ethanologenic and hydrogenogenic bacterium, C.thermocellum, which is also available from cellulose-fed anaerobic digester, as a possible method to improve the degradation of lignocellulosic biomass to enhance the efficiency of methane production.
With this study it is intended for uplifting hydrolysis phase, the rate limiting step of degredation of waste with lignocellulosic content, with addition of C.thermocellum bacteria and so to increase the efficiency of methane/biogas production. In this scope C.thermocellum which is a lignocellulosic, anaerobic, rod shape, gram positive and thermophilic bacteria is added with the 0%, 5%, 10%, 15% and 20% of volume of digesters in which waste from wheat straw and cattle manure as substrate and these digesters are operated for 50 days. In addition to this, control digesters which are not containing bioagumentation culture and contatining only seed sludge, only manure, seed sludge and manure, seed sludge and wheat straw and manure and wheat straw are also operated. The digester which has a bigger volume and with lowest percent of bacteria (5%) is operated as batch for the first 20 days and as semi-batch for next 40 days with feeding every 4 days. Biogas and methane production are observed during semi-batch operation.
At first, C.thermocellum which is going to be used for bioagumentation is cultivated and grown in prepared medium in anaerobic and thermophilic conditions. Until the digesters set up, the bacteria grown by cultivating in new medium every 15 days. It is understood that the bacterial growth by observing the turbidity of control medium and the density of the growth determined in NanoPhotometer® device. Digesters are set up, after optimum optic density which found in literature research reached to the value of 600.
Before the digesters set up, experiments for characterization (TS, VS, carbon/nitrogen, alkalinity, pH, TKN, sCOD) are carried out on seed sludge, wheat straw and cattle manure which are going to be used. According to results of characterization experiments; percentage of total solid; seed: 7,8%, manure: 14,3%, wheat straw: 92,7%, percentage of VS: seed: 5,2%, manure: 11,1%, wheat straw: 82,3%, carbon/nitrogen ratio: seed: 11:1, manure: 25:1 , wheat straw: 86:1 alkalinity; seed: 25 000±125 mg CaCO3/L, manure: 2 550±520 mg CaCO3/L, wheat straw : 250±78 mg CaCO3/L. Amounts of ingridients of digesters calculated in terms of volatile solid by using the values given above and also by taking the ratio of substrate:inoculum as 1:1. Because of the high alkalinity values of seed sludge, alkalinity of the mixture met the requirements of digester conditions and there was no need to extra alkalinity.
Digesters are operated at 55±1°C'with thermophilic conditions. Biogas production of batch digesters which have bacteria volume of 5%, 10%, 15% and 20% of total digester volume, semi-batch digester with 5% and other control digesters are measured daily. Methane efficiencies, methane percentages, volatile fatty acid concentrations, influent and effluent TS and VS values, changes in sCOD, cellulose reduction rates (%) and values for other parameters (pH, alkalinity) of batch digesters are compared with control digesters and the results are given as graphics.
As a result of this study, it is observed that the highest methane and biogas production, methane efficiency and cellulose reduction rate can be reached with 20% bacteria added digester. Methane efficiencies are observed as 288 ml/gVSadded for 0%, 311 ml /gVSadded for 5%, 339 ml/gVSadded for 10%, 413 ml/gVSadded for 15%, 478 ml/gVSadded for 20%. Biogas efficiencies are observed as 496 ml/gVSadded for 0%, 526 ml /gVSadded for 5%, 575 ml/gVSadded for 10%, 666 ml/gVSadded for 15%, 759 ml/gVSadded for 20%. Biogas efficiency of semi-batch digester obtained as 751 ml/g VSadded and methane efficiency of semi-batch digester obtained as 439 ml/g VSadded. Cellulose reduction rates are observed by taking into consideration the values of influnet and effluent samples and the rates are; for 0% (20% cellulose/TS), for 5% (24% cellulose/TS), for 10% (25% cellulose/TS), for 15% (31% cellulose/TS), for 20% (40% cellulose/TS), for seed sludge (17% cellulose/TS), for manure (12% cellulose/TS), for manure+seed sludge (13% cellulose/TS), for manure+wheat straw (10% cellulose/TS), and seed sludge+wheat straw (10% cellulose/TS). 34% of increase in biogas efficiency for 20% bacteria added digester when it is compared with 0% control digester. 39% of increase is provided in methane efficiency. Addition of C.thermocellum bacteria into the digesters catalyzed the hydrolysis of cellulose and increased the production of methane and biogas.
DNA samples which taken from the DNA isolated samples of 0% and 20% bacteria added digester in the 30th day of batch digesters, are investigated with Next Generation Gene Sequencing (NGS) method. For both of the digesters the most dominant archaea species are Methanoculleus thermophilus and Methanoculleus sp., Methanosarcina spp., Methanobrevibacter sp., Methanothermobacter thermautotrophicus and Methanomassiliicoccus sp. are following species respectively. Most dominant archaea order are Methanomicrobiales, Methanosarcinales and Methanobacteriales. Most dominant genus are Methanoculleus are Methanosarcina. Methane archaea are more dominant in 20% bacteria added digester. Most dominant bacteria phylum is Firmicutes and Thermotogae and Bacteroidetes are following phylum respectivley. Most dominant bacteria species are obtained as Clostiridium sp.. With taking into consideration bacteria species, it is observed that there were not extreme changes in terms of bacteria for digesters at 30th day and results were similar against each other. As a result, bioaugmentation with C. thermocellum increases cellulose removal, methane and biogas production in anaerobic digesters fed with wheat straw and manure. So, C.thermocellum bacteria can be used for the full-scale anaerobic digester as a bioaugmentation culture. But optimum bacteria volume is very high for maintain, so some new technologies must be try for the achive minimum bacteria volume, maximum biogas/methane yield. Economical and environmental assessment must be done before full-scale. And some other fungus or bacteria type used together with C. thermocellum for more effective results.