Antalya'nın bazı ilçelerinden toplanan Tuta absoluta Meyrick (Lepidoptera: Gelechiidae) popülasyonlarında Wolbachia sp.'nın real-time PCR ile tespiti
Detection of Wolbachia sp. in Tuta absoluta Meyrick (Lepidoptera: Gelechiidae) populations collected from some districts of Antalya using real-time PCR
Yazar: DİLŞAN BOYLU
Danışman: DOÇ. DR. CENGİZ İKTEN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Domates güvesi, Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae) domatesin ekonomik açıdan önemli bir zararlısıdır. Bu zararlı, çok çeşitli eklembacaklılarda bulunan sitoplazmik olarak aktarılan Wolbachia bakterisini barındırmaktadır. Bu çalışmada, domates güvesinin farklı gelişim aşamalarındaki Wolbachia enfeksiyon dinamiklerini incelemek amacıyla kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) testleri gerçekleştirilmiştir. qRT-PCR için Wolbachia ftsZ genini hedefleyen FAM etiketli TaqMan probu kullanılırken, konukçu gen miktarı normalizasyonu için Tuta absoluta Aktin genini hedefleyen HEX etiketli TaqMan probu kullanılmıştır. Larva örnekleri, 2021 yaz sezonunda Antalya'da yetiştirilen domates seralarından toplanmıştır. Bazı larva örnekleri laboratuvar koşullarında belirli bir yaşa kadar büyütülmüştür. Her yaşa özgü örneklerden total nükleik asit izolasyonu yapılmıştır, ardından optimizasyonu gerçekleştirilerek qRT-PCR testine tabi tutulmuştur. Her yaş evresine özgü en az 20 örnek test edilmiştir. Kantitatif olarak değişkenlik göstermekle birlikte, test edilen tüm domates güvesi örnekleri %100 Wolbachia enfeksiyonu göstermiştir. TaqMan probu yöntemi kullanılarak, zararlının gelişim aşamaları arasında Wolbachia yoğunluklarında önemli farklılıklar tespit edilmiştir. Genel olarak, ilk larva aşaması en düşük Wolbachia sinyal seviyesini gösterirken, dördüncü larva gelişim aşamasına doğru sinyal seviyesi giderek artmıştır. Wolbachia miktarı, pupa evresinde larva evresine göre daha yüksek bulunmuş, ancak ergin evresinden biraz daha düşük seviyede tespit edilmiştir. Pupa evresinde 1, 3, 6 ve 9 günlük pupalar arasında herhangi bir fark bulunmamıştır. Benzer şekilde, Wolbachia miktarının 1, 3, 6 ve 9 günlük erginler arasında farklılık göstermediği gözlemlenmiştir. Antalya'nın farklı ilçelerinden toplanan dördüncü dönem larva örneklerinin Wolbachia yoğunlukları qRT-PCR ile analiz edilmiştir. Sonuç olarak en fazla Wolbachia yoğunluğu Kepez ilçesinde, en düşük ise Finike'de tespit edilmiştir. Larvaların farklı vücut bölgeleri incelendiğinde, Wolbachia yoğunluğunun en fazla abdomenin 3-6. segmentlerinde olduğu, bunu toraks segmentleri, baş ve abdomenin son segmentinin izlediği görülmüştür. Ergin döneminde ise en fazla Wolbachia yoğunluğu baş kısmında bulunmuş, bunu toraks segmentleri ve abdomen takip etmiştir. Kanatlar ve bacaklarda ise en düşük yoğunluk gözlemlenmiştir. Sonuçlar, zararlının gelişim evreleri ve vücut bölümleri arasında Wolbachia yoğunluğunda anlamlı farklılıklar olduğunu göstermiştir. qRT-PCR analizi, konukçu-endosimbiyont dinamiği etkileşimi açısından etkinliği ve uygulanabilirliği bakımından değerlendirilmiştir.

Abstract:
The tomato pinworm, Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae), commonly known as the tomato leafminer, is an economically important pest of tomato. This pest harbors cytoplasmically transmitted Wolbachia bacteria, which is found in the arthropods. In this study, we developed a quantitative real-time PCR (qRT-PCR) assay to screen the dynamics of Wolbachia infections across different developmental stages of tomato pinworm. A FAM-labeled TaqMan probe targeting the Wolbachia ftsZ gene was used for qRT-PCR, while a HEX-labeled TaqMan probe targeting the Tuta absoluta, Aktin gene was used for the host gene quantity. Larval samples were collected from tomato grown greenhouses in Antalya, during the 2021 summer season. Some larval samples were reared to specific age under the laboratory condition. Total nucleic acid was extracted from age-specific whole specimens and subjected to optimized qRT-PCR assay. Each age-specific stage was represented with at least 20 biological samples. Though quantitatively variable, all tested Tuta absoluta samples showed 100% infected with Wolbachia. Using TaqMan Prob assay, a significant difference in Wolbachia densities was detected among the developmental stages of the pest. Overall, the first larval stage showed the lowest Wolbachia signal level, with an increasing amount towards the fourth larval developmental stage. The amount of Wolbachia was found to be higher in the pupal stage compared to the larval stage, but slightly lower than in the adult stage. No differences were observed among the 1-, 3-, 6- and 9-day old pupae. Similarly, the Wolbachia amount seemed not to differ in 1-, 3-, 6- and 9-day old moths. 
The Wolbachia densities in fourth-instar larvae collected from different districts of Antalya were analyzed using qRT-PCR. As a result, the highest Wolbachia density was detected in the Kepez district, while the lowest was observed in Finike district. Upon examining different body regions of the larvae, it was found that Wolbachia density was highest in abdominal segments 3-6, followed by the thoracic segments, the head, and the last segment of the abdomen. In the adult stage, the highest Wolbachia density was found in the head, followed by the thoracic segments and abdomen. The lowest density was observed in the wings and legs. The results indicated significant differences in Wolbachia density between developmental stages and body regions of the pest. The qRT-PCR analysis was evaluated for its efficiency and applicability in studying the host-endosymbiont interaction dynamics.