Quercetinin KML kök hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin moleküler düzeyde incelenmesi
Investigation of the cytotoxic effects of quercetin on CML stem cells at the molecular level
Yazar: GÜNSU AYDIN
Danışman: PROF. DR. ALİ ÜNAL
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Kuersetin = Quercetin ; Kök hücreler = Stem cells ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Sitotoksisite-immünolojik = Cytotoxicity-immunologic

Özet:
Kronik miyeloid lösemi (KML), transforme olmuş hematopoietik kök hücrenin klonal genişlemesi ile sonuçlanan miyeloproliferatif bozukluktur. KML tedavisinde gelişen dirençliliğin nedenlerinden biri KML kök hücrelerinin (KML-KH) tedavilerden etkilenmemesidir. Bu proje çalışması kapsamında quercetinin KML kök hücreleri üzerine sitotoksik ve apoptotik etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 
K562 hücre popülasyonundan KML-KH'leri sorting yöntemiyle elde edildi ve akım sitometri yöntemiyle ilgili belirteçlere bakılarak bu hücrelerin kök hücre olduğu immünofenotipik karakterizasyonla belirlendi. KML-KH'leri artan dozlarda quercetine maruz bırakıldı ve quercetinin hücre çoğalması üzerine etkisi XTT yöntemiyle belirlendi. Quercetinin KML-KH'leri üzerine apoptotik etkileri, kaspaz-3 enzim aktivitesi; mitokondri zar potansiyelinde (MZP) meydana gelen değişimler ve Annexin-V yöntemleri ile belirlendi. Akım sitometri yöntemi ile seçilen hücrelerin, %93,2'inin CD38-CD34+ olduğu belirlendi. Bu sonuçlar seçilen hücrelerin KML-KH'si olduğunu göstermiştir. Artan dozlarda quercetine (1-40 nM) 48 saat boyunca maruz bırakılan KML-KH'lerinin çoğalma yüzdesinde doza bağımlı bir azalma belirlendi ve quercetinin IC50 değeri 1,5 nM olarak hesaplandı. Elde edilen XTT hücre proliferasyonu sonuçlarına göre, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, 1, 5, 10, ve 20 nM quercetinin KML-KH'lerinin proliferasyonunu %37, %72, %90 ve %99 oranında azalttığı hesaplandı. Artan dozlarda quercetin (1-20 nM) uygulanan KML KH'lerinde kontrol grubuna göre doza bağımlı olarak kaspaz-3 enzim aktivitesinde ve MZP bozulumunda önemli artışlar belirlendi. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, 10 ve 20 nM Quercetine maruz bırakılan KML-KH'lerinin kaspaz-3 enzim aktivitesinde sırasıyla %75 ve %321 artış belirlenirken aynı dozların KML-KH'lerindeki mitokondri zar potansiyeli bozulumunda %86 ve %333 artışlara neden olduğu tespit edildi. Annexin-V analiz sonuçları da quercetinin doza bağımlı olarak apoptozu tetiklediğini ve apoptotik hücre populasyonunda önemli artışlar oluşturduğunu gösterdi. 5, 10 ve 20 nM quercetine maruz bırakılan KML kök hücrelerindeki hücre ölümlerinde kontrol grubu hücrelerine kıyasla sırasıyla 2.6, 11.2 ve 39.3 kat artış belirlendi. Quercetinin KML kök hücreleri üzerine apoptotik ve antiproliferatif etkileri belirlenmiş ve kaspaz-3 enziminin ve mitokondrinin apoptotik hücre ölümlerindeki rolleri ortaya konulmuştur.

Abstract:
Chronic myelogenous leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder resulting in a clonal expansion of a transformed multipotent hematopoietic stem cell. One of the main reasons for the resistance developed in CML treatment is that CML stem cells (CML-SC) are not affected by the treatments. In this study, it is aimed to determine the cytotoxic and apoptotic effects of quercetin on chronic miyeloid leukemia stem cells that were sorted among K562 cell population. 
CML stem cells were obtained by sorting method among K562 cell population and it was confirmed that the cells were the CML-SCs by flow cytometry method with immunophenotypic characterization. CML-SCs were exposed to increasing doses of quercetin and the effects of quercetin on cell proliferation were determined by XTT assay. Apoptotic effects of quercetin on CML-SCs were determined by caspase-3 enzyme activity, changes in loss of mitochondrial membrane potential (MMP), and Annexin-V flow cytometry methods. 93,2% of the cells sorted by flow cytometry were CD34+CD38. These results showed that the selected cells were CML stem cells. There was a decrease in the percentage of cell proliferation of CML-SCs exposed to the increasing doses of quercetin (1-40nm) for 48 hours and IC50 value of quercetin was calculated as 1.5nM. According to the results of XTT cell proliferation assay, there was 37, 72, 90 and 99% decreases in cell proliferation in 1, 5, 10, ve 20 nM quercetin applied cells compared to the control group, respectively. The significant increase in caspase-3 enzyme activity and the loss of mitochondrial membrane potential has been detected in quercetin (1-20nM) exposed CML stem cells compared to control group in a dose dependent manner. There were 75 and 321% increases in caspase-3 enzyme activity; whereas 86 and 333% increase in loss of mitochondrial membrane potential in 10 and 20 nM quercetin applied CML-SCs, respectively. There were increased population of apoptosis in response to increasing doses of quercetin as determined by Annexin-V analysis. 5, 10 and 20 nM quercetin application resulted in 2.6, 11.2, and 39.2 fold increases in the number of dead cells as compared to the control cells, respectively. This study showed for the first time that apoptotic and antiproliferative effects of quercetin on CML stem cells and the roles of caspase-3 and mitochondria in apoptotic cell death.