İn vivo kıkırdak onarımı üzerine TGF-β1 transfekte edilmiş dental pulpa kaynaklı mezenkimal kök hücrenin etkisi
Effect of TGF- β1 transfected dental pulpa derived mesenshymal stem cells on in vivo cartilage regeneration
Yazar: BETÜL TEKİN
Danışman: PROF. DR. SAİM ÖZDAMAR
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Kıkırdak rejenerasyonunun zayıf olması nedeniyle hasarlı kıkırdak dokusunun onarımında sorunlar sıklıkla yaşanmaktadır. Bu nedenle kıkırdak onarımında mezenkimal kök hücrelerin (MKH) kullanımı ile tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Ancak MKH kullanımının da yetersiz olduğu çalışmalar bulunmaktadır. Bununla birlikte MKH'lerin aktive gen eklenmesiyle rejenerasyonun daha hızlı ve etkin şekilde gelişebileceği düşünülmüş ve ilgili çalışmalara başlanılmıştır. MKH'lerin kondrogenezinde önemli rol oynayan transforme edici büyüme faktörü-beta 1 (TGF-β1) bunlardan biridir ve in vitro çalışmalarda etkinliği gösterilmiştir. Bu çalışmada, dental pulpa kaynaklı TGF-β1 ile transfekte edilmiş MKH'lerin tavşanlarda oluşturulan eklem kıkırdağı hasarının iyileşmesi üzerine etkisinin in vivo olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. 
Çalışmada 2-3 kg ağırlığında 3-4 aylık erkek Yeni Zelanda türü 32 tavşan dört gruba ayrıldı. Kontrol grubuna herhangi bir işlem yapılmadı. Diğer üç grupta eklem kıkırdağında diril ile osteokondral defektler oluşturuldu. Sonrasında hayvanların eklem boşluğuna; Grup 2'de 0.5 mL serum fizyolojik (SF), Grup 3'de 3X106 MKH içeren 0.5 mL SF, Grup 4'de 3X106 TGF-β1 transfekte edilmiş MKH içeren 0.5 mL SF enjekte edildi. Altı hafta sonra tavşanlar sakrifiye edildi. Femoral artiküler eklem kemikten dirille kesilerek %4'lük formaldehit solüsyonuna alındı. Fiksasyondan sonra %10'luk nitrik oksit solüsyonunda dekalsifiye edildi. Doku takibi basamaklarından geçirilerek parafin bloklara gömülen dokulardan 5 μm kalınlığında kesitler alındı, hematoksilen-eozin, Masson trikrom ve toludin blue ile boyanarak ışık mikroskobunda incelendi ve immünohistokimyal yöntemler ile değerlendirildi.
Kontrol grubunda eklem kıkırdağı düzgün bir görünüme sahipti ve yüzeyel zonda kondrositler kollajen katmanlar arasında disk şeklinde, geçiş zonunda daha küresel ve derin zonda ise eklem hattına dikey yerleşimli para dizileri şeklinde görüldü. Derin zon ile kalsifiye zon arasındaki sınır düzgün bir hat şeklinde izlendi. SF verilen hasar grubunda ise kendi kendine iyileşme bölgesinde, çoğunlukta düzensiz kollajen liflerden oluşan bağ dokusu ve fibröz kıkırdaktan oluşan küçük alanlar gözlendi. MKH grubunda SF verilen gruba göre bağ dokusunda azalma fibröz kıkırdak miktarında artış vardı. Belli bölgelerde düzensiz hyalin kıkırdak yapısı ve dağınık kondrositlerin oluşturduğu alanlar görüldü. TGF-β1+MKH uygulanan grupta ise MKH grubuna göre hyalin kıkırdak miktarında artış vardı. Kondrositler yoğun kümelenmiş dağınık bir yapılanma sergilese de yer yer organize düzenli alanlar gözlendi.
Sonuç olarak sadece MKH uygulan grupta kıkırdak onarımı SF uygulanan gruba göre daha iyi iken mezenkimal kök hücrelere TGF-β1 transfeksiyonunun, yapıcı-onarıcı hücreleri uyardığı ve hyalin kıkırdak oluşumunu artırarak iyileşmeyi daha da olumlu yönde etkilediği görülmektedir. Gen transfeksiyonu yapılmış MKH uygulamalarının kıkırdak rejenarasyonunu artıran bu çalışmanın sonuçlarının klinikte uygulanabilir hale gelmesi için moleküler düzeyde daha detaylı araştırılması ve geliştirilmesi gerektiğini düşünmekteyiz.
Anahtar Kelimeler: Eklem kıkırdağı, Kök Hücre, TGFβ1, Kondrojenik Farklılaştırma, Kıkırdak İyileşmesi

Abstract:
Due to the weakness of cartilage regeneration, problems are frequently experienced in the repair of damaged cartilage tissue. Therefore, it is aimed to develop treatment methods by the use of mesenchymal stem cells (MSC) in cartilage repair. However, studies on the use of MSC are insufficient and it also has been thought that regeneration can be developed more quickly and efficiently by adding active gene to MSCs and related studies have started. Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1), which plays an important role in the chondrogenesis of MSCs, is one of them and demonstrated efficacy in in vitro studies. In this study, it was aimed to evaluate the effect of dental pulp-derived TGF-β1 transfected MSCs in vivo on the improvement of joint cartilage damage caused by rabbits.
In the study, three to four-month-old, male, 2-3 kg on weigh, New Zealand varieties were divided into four groups of 32 rabbits. No action was taken on the control group. In the other three groups, osteochondral defects were formed by dirrhism in the articular cartilage. Later on the joint space of the animals; 0.5 mL of saline (SF) in Group 2, 0.5 mL SF containing 3X106 MKH in Group 3, and 3X106 TGF-β1 transfected MKH in Group 4 were injected. Six weeks later the rabbits were sacrificed. The femoral articular joint was cut from bone by dirrhism and taken 4 % formaldehyde solution. After fixation, it was decalcified in 10 % nitric oxide solution. Sections with a thickness of 5 μm were taken from the tissues embedded in the paraffin blocks after the tissue steps and examined by light microscopy with hematoxylin-eosin, Masson Tricrom and Toludin Blue and evaluated by immunohistochemical methods.
In the control group, the articular cartilage had a smooth appearance, and the superficial zone where chondrocytes were seen as disk-shaped between the collagen layers, more spherical in the transition zone, and vertically aligned to the joint line in the deep zone. The boundary between the deep zone and the calcification zone was observed as a straight line. In the damaged group with SF, connective tissue mostly composed of irregular collagen fibers and small areas of fibrous cartilage were observed in the self-healing zone. In the MSC group, there was a decrease in the amount of connective tissue and an increase in the amount of fibrous cartilage according to given the SF. In certain regions, irregular hyaline cartilaginous structures and areas of scattered chondrocytes were seen. In the group receiving TGF-β1 + MKH, there was an increase in the amount of hyaline cartilage compared to the group of MKH. Although the chondrocytes exhibit a dense, clustered and disorganized structure, some areas of organizing have been observed.
As a result, TGF-β1 transfected mesenchymal stem cells stimulates constructive-repairing cells and improves more positively hyaline cartilage formation, while cartilage repair is better in MF group than SF group. We believe that the results of this study, which increases the cartilage regeneration of MSC applications with gene transfection, need to be further explored and developed at the molecular level to be clinically feasible.
Key Words: Joint cartilage, Stem cell, TGFβ1, Chondrogenic differentiation, Cartilage healing.