Bölünmüş-TurboID Biyotinilasyon Enzim Teknolojisi kullanarak çekirdek proteinlerinin seçici biyotinilasyonu için füzyon proteinlerin nükleusa yönlendirilmesi ve doğrulanması
Directing and validation of fusion proteins into the nucleus for selective biotinylation of nuclear proteins via adaptation of Split-TurboID Biotinylation Enzyme Techonology
Yazar: FATMA ZEHRA ÖZEN
Danışman: PROF. DR. MURAT KASAP
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Çekirdek hücrenin merkezinde bulunan, genetik bilgiyi saklayan, koruyan, kullanan ve bu yolla birçok hücresel olayı yöneten bir organeldir. Hücre içerisinde uç birleştirme, transkripsiyon, replikasyon ve DNA onarımı gibi birçok fizyolojik olayın gerçekleştiği oldukça önemli bir organeldir. Hücre içi organellerde bulunan proteinler, organellerin hücre içi görevlerini ve ilişkilerini dikte eden öğelerdir. Organel proteom çalışmaları ilgi duyulan organelin klasik hücre biyolojisi teknikleri kullanılarak izolasyonu ve izole edilen organelden hazırlanan zenginleştirilmiş protein özütlerinin tanımlanması prensibine dayanmaktadır.Literatürde çekirdek proteomu çalışmaları için kullanılan ticari kitler aracılığı ile basit fraksiyonlama teknikleri ya da densite gradyan santrifügasyonu yaklaşımları kullanılmaktadır. Ancak bu tür yaklaşımlarda bazı eksiklikler bulunmaktadır. Bu eksiklikler arasında (1) sitoplazmik protein kontaminasyonları (2) sitoplazmik proteaz kaynaklı protein degredasyonu gibi sorunlar söylenebilir. Yapılan bu çalışmada ise belirtilen eksikliklerin giderilmesi ve çekirdek proteomunun daha net çalışılabilmesi için farklı bir yaklaşım kullanılmıştır.
Bu yaklaşımda; çekirdek izolasyonuna gerek kalmadan çekirdek proteinlerinin enzimatik biyotinilasyon aracılığı ile biyotinile edilip zenginleştirilerek tanımlanması gerçekleştirilmiştir. Enzimatik biyotinilasyon amaçlı kullanılacak enzim modifiye edilmiş TurbolD enzimi olup, Split TurboID (Bölünmüş TurbolD) olarak bilinmektedir. Split TurboID, ayrı ayrı iken inaktif olan 8kDa'lık N-terminal domaini ve 27kDa'lık C-terminal domaininden oluşmaktadır. Biyotin ligaz enzimine ait bu iki domain bir araya geldiğinde aktif enzim hale geçerek ortamda biyotin ve ATP varlığında yakınsal etiketleme ile proteinleri lizin aminoasitlerine bağlanarak biyotinile etmektedir. Enzime ait iki domainin etkileşimi ve aktif forma geçmesi için Rapamisin varlığında etkileşim sağlayan FKBP ve FRB proteinleri kullanılarak füzyon protein tasarımı yapılmıştır. Hücre içerisinde kontrollü biyotinilasyonun sağlanması için Split TurboID-N terminalini içeren füzyon protein pcDNA4/TO plazmiti içerisine klonlanmıştır. Bu sayede kültür ortamında tetrasiklin varlığında Split TurboID-N füzyon protein ekspresyonu kontrollü bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Enzimin C terminalini içeren füzyon protein ise pcDNA3.1 plazmitine klonlanarak, hücre içerisinde sürekli protein ekspresyonunun gerçekleşmesi sağlanmıştır. Stabil HEK293T TetR+_Split TurboID –N-C hücrelerinde besi yeri ortamına, N terminalinin ekspresyonu için tetrasiklin, reaksiyon substratı olarak biyotin ve etkileşimi sağlaması için rapamisin kompotentlerinin eklenmesi ile eksprese edilen füzyon proteinler çekirdeğe yönlenerek biyotinilasyon reaksiyonunu gerçekleştirmişlerdir. Bu sayede nükleer proteinler biyotinile edilmiş ve Streptavidin kaplı boncuklar kullanılarak zenginleştirilmiştir. Zenginleştirilen proteinler triptik kesim sonrası LC/MS-MS analizleri ile tanımlanmıştır. 
Yapılan çalışmanın sonucunda 361 protein tanımlanmış, bu proteinlerden 302 adetinin çekirdek proteomu içerisinde bulunduğu yapılan GO (Gene Ontology) analizi ile tespit edilmiştir. Elde edilen sonuca göre geliştirilen bu yaklaşımın çekirdek proteom çalışmalarında yaklaşık %83.6 oranında verimlilikle çalıştığı gösterilmiştir.
Tez çalışması kapsamında geliştirilen bu yeni ve özgün yaklaşımda nükleer proteinlerin tanımlanması için biyotin ile etiketlenmesi ve streptavidin kaplı boncuklar ile zenginleştirilmesi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar yapılan bu çalışmada uygulanılan yaklaşımın çekirdek proteomu çalışmalarında yüksek verimlilikle kullanılabileceğini göstermiştir.

Anahtar kelimeler: Biyotinilasyon, çekirdek proteomu, Bölünmüş TurboID biyotin ligaz enzimi

Abstract:
The nucleus is an organelle located at the center of the cell, which stores, preserves and uses genetic information and in this way manages many cellular events. It is a very important organelle in the cell where many physiological events such as splicing, transcription, replication and DNA repair take place. The proteins found in intracellular organelles are the elements that dictate the intracellular functions and relationships of the organelles. Organelle proteome studies are based on the isolation of the organelle of interest using classical cell biology techniques and the identification of enriched protein extracts prepared from the isolated organelle. In the literature, simple fractionation techniques or density gradient centrifugation approaches are used through commercial kits used for nuclear proteome studies. However, there are some shortcomings in these approaches such as Among these shortcomings, problems such as (1) cytoplasmic protein contaminations and (2) cytoplasmic protease-induced protein degradation can be mentioned. In this study, a different approach was used to eliminate the mentioned deficiencies and to study the nuclear proteome more clearly.
In this approach; the nuclear proteins were identified by biotinylated using by enzymatic biotinylation and enriched without the need for organelle isolation.Split TurboID consists of an 8kDa N-terminal domain and a 27kDa C terminal domain, which are inactive separately. When these two domains of the biotin ligase enzyme come together, they become an active enzyme and biotinylate proteins by proximal labeling in the presence of biotin and ATP. FKBP and FRB proteins, which interact in the presence of rapamycin, have been used to design a fusion protein for the interaction of the Split TurboID N- and C- terminal domains.The fusion protein containing the Split TurboID-N terminus was cloned into pcDNA4/TO plasmid to ensure controlled biotinylation in the cell.In this way, Split TurboID-N fusion protein expression was carried out in a controlled manner in the presence of tetracycline in the culture medium. The fusion protein containing the C-terminus of the enzyme was cloned into the pcDNA3.1 plasmid, resulting in continuous protein expression in the cell. In stable HEK293T TetR+_Split TurboID –N-C cells, the fusion proteins expressed by adding tetracycline for the expression of the N-terminus, biotin as the reaction substrate and rapamycin comppotents to provide the interaction, were directed to the nucleus and carried out the biotinylation reaction.In this way, nuclear proteins were biotinylated and enriched using Streptavidin coated beads. The enriched proteins were identified by LC/MS-MS analyzes after tryptic digestion.
As a result of the study, 361 proteins were identified, and it was determined by GO (Gene Ontology) analysis that 302 of these proteins were in the nuclear proteome.This approach, which was developed according to the results obtained, has been shown to work with an efficiency of approximately 83.6% in nuclear proteome studies.
In this new and unique approach developed within the scope of the thesis study, biotin labeling and enrichment with streptavidin-coated beads were successfully performed for the identification of nuclear proteins. The results obtained showed that the approach applied in this study can be used with high efficiency in nuclear proteome studies.

Keywords: Biotinylation, nuclear proteome, Split TurboID biotin ligase enzyme