Süt işletmelerinde biyofilm oluşturan mikroorganizmalar ve biyofilm oluşumunun karakterizasyonu
Biofilm forming microorganisms at dairy plants and characterization of biofilm formation
Yazar: DİLAY KÜTÜK AYHAN
Danışman: PROF. DR. AYHAN TEMİZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Gıda mikrobiyolojisi = Food microbiology

Özet:
Biyofilm oluşumu günümüzde pek çok gıda endüstrisinde özellikle de süt endüstrisinde önemli bir sorundur. Süt işletmelerinde yüzeylerde biyofilm oluşumuna katılan mikroorganizmalar ve yüzey özellikleri, biyofilm oluşum mekanizması, biyofilm oluşumunun süreklilik kazanması, biyofilm oluşumunun engellenmesi ve giderilmesi hususlarında çok sınırlı sayıda çalışma vardır.  Bu proje kapsamında Ankara'daki bir süt işletmesinden biyofilm oluşum riski taşıyan yüzeylerden mikrobiyolojik örnekler alınarak bu yüzeylerdeki mikroorganizmalar izole edilmiş ve tanımlanmaları yoluna gidilmiştir. Araştırma kapsamında çeşitli yüzeylerden bakteri ve mayalardan oluşan toplam 495 adet mikroorganizma izole edilmiştir. İzolatlar morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri ile 16S rRNA dizi analizleri dikkate alınarak tanımlanmıştır. Bu izolatlar arasından biyofilm oluşturma potansiyeline sahip olduğuna karar verilen 10 adet izolat seçilmiştir. Bu izolatlar Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus feacalis, Staphylococcus epidermidis, Lactococcus garvieae, Bacillus toyonensis, Escherichia coli, Klebsiella varriicola, Candida parapsilosis ve Proteus mirabilis olarak tanımlanan izolatlardır. Bu seçilmiş mikroorganizmaların yüzey özellikleri ve ekzopolisakkaritleri üretme yetenekleri araştırılmıştır.  Yüzey özellikleri ve ekzopolisakkarit üretme yetenekleri yüksek olan izolatlar arasından Gram pozitif izolatları temsil etmek üzere Bacillus toyonensis, Gram negatif izolatları temsil etmek üzere ise Pseudomonas aeruginosa test mikroorganizması olarak seçilmiştir. P. aeruginosa'nın yüzey özellikleri ve ekzopolisakkaritleri üretme yeteneğinin Bacillus toyonensis'e göre genel olarak daha üstün olduğu ortaya çıkmıştır. Bu iki mikroorganizma suşu ileriki aşamalarda paslanmaz çelik model yüzeyler varlığında "durgun" ve "akışlı" gelişme ortamlarında oluşturulan model sistemler üzerinde biyofilm oluşturma potansiyelleri yönünden denenmiştir. Pseudomonas aeruginosa'nın durgun ve akışlı gelişme ortamlarının her ikisinde de Bacillus toyonensis'e göre test yüzeyine daha yüksek düzeyde tutunma ve biyofilm oluşturma yeteneğine sahip olduğu ortaya çıkmıştır. Pseudomonas aeruginosa'nın Gram negatif bir bakteri olduğu dikkate alındığında, yukarıdaki sonuçlar Gram negatif bakterilerin hücre duvarı karakteristiklerinin paslanmaz çelik test yüzeyine tutunmasında belli bir etkinliğinin olabileceğini düşündürmektedir. Bekletme sıcaklığının mikroorganizmaların süt içeren durgun ve akışlı gelişme ortamlarında test yüzeyine tutunma ve biyofilm oluşturma yeteneği üzerinde etkili olabileceği bulunmuştur. Özellikle bekletme sıcaklıklarının 5 oC gibi düşük sıcaklıklarda tutulması mikroorganizmaların yüzeye tutunması ve biyofilm oluşturmasında engel teşkil edebileceği görülmüştür. Ancak bu etki mikroorganizma çeşidine ve sahip olduğu karakteristiklerine bağlı olarak değişebilmektedir. Bu sonuçlar mikroorganizmaların test yüzeyinde tutunma ve biyofilm oluşturma yeteneğinin gelişme ortamının durgun veya akışlı olmasına bağlı olarak değişebileceğine de işaret etmektedir. Paslanmaz çelik test yüzeyleri araştırmanın daha ileriki aşamasında durgun ve akışlı gelişme ortamlarında sırasıyla beş kez ve üç kez olacak şekilde ardışık temizlik/dezenfeksiyon işlemlerine maruz bırakılmıştır. Kültürel sayım sonuçları dikkate alınarak yapılan değerlendirmelerde; temizlik/dezenfeksiyon işlemi tekrarlarında test yüzeyinde sadece bakteri hücre tutunmasının gerçekleştiği, biyofilm oluşumunun gerçekleşmediği sonucuna varılmıştır. Durgun ve akışlı gelişme ortamlarındaki test yüzeylerinde temizlik/dezenfeksiyon işlemleri öncesinde bakterilerin belli düzeylerde yüzeye tutunduğu, yüzeye tutunmuş olan hücrelerin gerçekleştirilen temizlik/dezenfeksiyon işlemleri ile test yüzeyinden tümüyle uzaklaştırıldığı görülmüştür. SEM ve floresan mikroskobu görüntüleri ile profilometre ölçüm sonuçları da genel olarak bu bulguları destekler nitelikte bulunmuştur. Bakteri hücrelerinin süt içeren durgun ve akışlı gelişme ortamlarındaki paslanmaz çelik test yüzeyine tutunmasına "biyofilm oluşumunun başlangıç aşaması" şeklinde bir açıklama getirilebilir. Yüzeye tutunmuş bakteri hücrelerinin yüzeyden tümüyle uzaklaştırılmasında temizlik/dezenfeksiyon işlemleri aşamasında kullanılan yüzey etken madde çözeltisinin (P3-Topax) ve nitrik asit uygulamasının büyük bir etkisi olduğu düşünülmektedir. Yüzeylerde biyofilm oluşumunun gerçekleşmesi için test yüzeylerinin süt içeren durgun gelişme ortamlarında çok sayıda tekrarlarla bekletilmesi veya sütün akışlı gelişme ortamından çok sayıda tekrarlarla akıtılması gerekmektedir. Yüzeydeki hücre tutunmasının ardından süt işletmelerinde durgun ve akışlı gelişme ortamlarında biyofilm oluşumunun görülebilmesi için yıllar alan uzun bir sürecin geçmesi gerekmektedir. Süt işletmelerinde biyofilm oluşumunun engellenmesi ön planda tutulmalıdır. İşletmenin faaliyete geçmesiyle birlikte işletmeye her zaman için iyi ve kaliteli hammadde girdisi sağlamak, işletmedeki yüzeylerde biyofilm oluşumunu sürekli olarak takip etmek, biyofilm oluşturma yeteneği yüksek olan mikroorganizmalar üzerinde etkili olan hijyen ve sanitasyon önlemlerini almak, duruma göre bu programlarda değişikliklere gitmek biyofilm oluşumu engellemek için başvurulabilecek temel uygulamalardır.

Abstract:
Biofilm formation is a common problem in various food industries especially in dairy industry. There are very limited studies about the biofilm forming microorganisms on the surfaces of dairy plants, surface properties of biofilm forming microorganisms, biofilm formation mechanism in dairy industry, gaining permanency of biofilm formation and prevent or eliminate of biofilm formation. In this study, microbiological samples were taken from different sampling surfaces in a dairy plant in Ankara. Totally 495 microorganism isolates including bacteria and yeasts were isolated from these surfaces and then these isolates were identified. Isolates were identified according to the morphological, physiological and biochemical properties, and 16S rRNA gene sequence analysis. Among the isolates, totally 10 isolates were chosen, which have biofilm forming potential on the surfaces. The selected microorganisms were Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus feacalis, Staphylococcus epidermidis, Lactococcus garvieae, Bacillus toyonensis, Escherichia coli, Klebsiella varriicola, Candida parapsilosis and Proteus mirabilis. Surface properties and exopolysaccharide production ability of these selected microorganisms were investigated. Among the isolates with high surface properties and high exopolysaccharide production ability, Bacillus toyonensis and Pseudomonas aeruginosa were selected for representing of Gram positive and Gram negative bacterial isolates, respectively. Surface properties and exopolysaccharide production ability of P. aeruginosa were generally higher than those of B. toyonensis. Biofilm forming potential of these test microorganisms was investigated by using stainless steel plates in the model systems of "batch" and "flow" growth media. Pseudomonas aeruginosa had higher adhesion and biofilm forming ability in both batch and flow growth media than those of Bacillus toyonensis. These results indicated that the cell wall characteristics of Gram negative bacteria may have a certain efficacy on the adhesion of these bacteria to the stainless steel plates in the model systems. It was determined that waiting temperatures may be effective on the adhesion and biofilm forming ability of the test microorganisms in both batch and flow growth media. Especially waiting at low temperatures such as at 5 oC may prevent adhesion and biofilm formation of microorganisms. However, this effect may change according to the kind of microorganism and its individual characteristics. These results pointed out that adhesion and biofilm forming ability of microorganisms may change depending on whether the growth medium is batch or flow.  Stainless steel test plates were subjected to cleaning/disinfection treatments in batch and flow growth media with 3 and 5 times, respectively. Cultural counting methods indicated that bacterial cell adhesion was carried out on the test surfaces during the successive cleaning/disinfection treatments but there was no biofilm formation. It was determined that certain numbers of bacterial cells were adhered to the test surfaces in batch and flow growth media but these adhered bacterial cells were wholly removed from the test surfaces by cleaning/disinfection treatments. SEM and fluorescence microscopes appearances and profilometer measuring results confirmed above results.  Adhesion of bacterial cells on surfaces of stainless steel test plates in batch and flow growth media could be explained as "initial phase of biofilm formation".  It was thought that there was big effect of the surface active agent (P3-Topax) and nitric acid used in the dairy plant in the wholly removing of bacterial cells from the test surface.  It is necessary to keep the test surfaces in the batch or flow growth media with many successive repetitious. Many years are necessary to observe the biofilm formation in the batch or flow growth media in dairy plants after the bacterial cell adhesions. Prevention of biofilm formation on the surfaces of dairy plants should be taken into consideration preferably. Supplying good and high qualified raw materials to the dairy plants, following and controlling of biofilm formation on the surfaces continuously, taking effective hygiene and sanitation preventing measures on the microorganisms having high biofilm formation ability, making suitable and effective changes on these hygiene and sanitation preventing measures are the basic applications for prevent the biofilm formations.