Nepeta italica Subsp. cadmea ekstraktının dondurulmuş-çözdürülmüş teke spermleri üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of Nepeta italica Subsp. cadmea extract on frozen-thawed buck spermatozoa
Yazar: SIDDIKA BOZTAŞ
Danışman: DOÇ. DR. NAZAN KESKİN
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Kriyoprotektif ajanlar = Cryoprotective agents ; Nepeta italica = Nepeta italica ; Sperm = Spermatozoa ; Tekeler = Billygoats

Özet:
Sperm kriyoprezervasyonu, reaktif oksijen türevlerinin (ROS) aşırı üretimine bağlı olarak sperm kalitesini ve ardından fertilizasyon yeteneğini olumsuz etkiler. Kriyoprotektanların sulandırıcıya eklenmesi, spermi oksidatif stresin (OS) zararlı etkilerinden koruyabilir. Flavonoidler ve fenolik bileşikler açısından zengin bitki ekstraktları gibi doğal kaynaklı antioksidanların, kriyoprotektif ajanlar olarak kullanılmasına yönelik çalışmalar yapılmaktadır. 
Bu çalışmada, Ankara teke spermasının, motilite, akrozom membran bütünlüğü ve DNA fragmentasyonu üzerine, antioksidan ve flavonoid içeriği bakımından zengin olan Nepeta italica subsp. cadmea esansiyel yağının üç farklı dozunun (0.75 µl/10 ml, 1.5 µl/10 ml ve 6 µl/10 ml) dondurma-çözdürme sonrası etkileri araştırılmıştır. Bitkiler, çiçeklenme döneminde Honaz dağından (Denizli, Türkiye) toplanmış ve oda sıcaklığında, gölgede kurutulmuştur. Toz haline getirilen bitkinin, esansiyel yağı Clevenger aparatı sistemi kullanılarak hidrodistilasyonla ekstrakte edildikten sonra, amber renkli şişe içinde 4ºC'de saklanmıştır. Tekelerden, üreme sezonunda elektroejakülatör ile alınan ejakülatlar birleştirilmiş, tris ana stok solüsyonu ile bitki yağının üç farklı dozu sulandırıldıktan sonra dondurulmuştur. Çözdürme sonrası motilitede, kontrol grubu ile diğer gruplara göre, yağın 0.75 µl/10 ml'lik dozunun iyileştirme yaptığı belirlenmiştir (p<0.05). Akrozomal membran bütünlüğü ve DNA fragmentasyonu analizlerinden de benzer sonuçlar elde edilmiştir. Dondurma-çözdürme sonu akrozomal membran bütünlüğünde esansiyel yağın 0.75 µl/10 ml dozu, kontrol ve 1.5 µl/10 ml ile 6 µl/10 ml dozlarına göre daha yüksek değerde bulunmuştur (p<0.05). DNA fragmentasyon analizinde ise, esansiyel yağın 0.75 µl/10 ml dozu, kontrol ve 1.5 µl/10 ml ile 6 µl/10 ml dozlarına göre daha düşük değerde bulunmuştur (p<0.05).
Sonuç olarak, esansiyel yağın 0.75 µl/10 ml'lik dozunun, Ankara tekesi spermlerinde dondurma-çözdürme sonrası, motilite, akrozomal membran bütünlüğü ve DNA fragmentasyonu parametreleri üzerinde kriyoprotektif etkisi belirlenmiştir. Sperm kriyoprezervasyonunda, antioksidan etkilere sahip ve flavonoid içeren Nepeta italica subsp. cadmea esansiyel yağının en uygun dozunun kriyoprotektan olarak kullanılabileceği gösterilmiştir. Bununla birlikte, sperm kriyoprezervasyonunda bitki esansiyel yağının belirlenen dozlarının olası kriyoprotektif etkilerini, farklı parametrelerle de çalışarak ortaya çıkarılmasına ihtiyaç vardır.

Abstract:
Sperm cryopreservation adversely affects semen quality and subsequent fertilization ability due to the overproduction of reactive oxygen species (ROS). The addition of cryoprotectants to the extender can protect sperm against the harmful effects of oxidative stress (OS). Studies are carried out to use natural antioxidants such as plant extracts rich in flavonoids and phenolic compounds as cryoprotectants. 
In this study, the effects of three different doses of antioxidant and flavonoids rich Nepeta italica subsp. cadmea oil (0.75 µl/10 ml, 1.5 µl/10 ml and 6 µl/10 ml) on motility, acrosomal integrity and DNA fragmentation on frozen-thawed Ankara buck spermatozoa were investigated. The plants were harvested during the flowering stage on Honaz Mountain (Denizli, Turkey) and air dried in the shade at room temperature. Essential oil of the powdered plant was extracted by hydrodistillation using a Clevenger apparatus system, then stored at 4⁰C in an amber colored glass bottle. The ejaculates taken from the Ankara bucks during the breeding season with an electroejaculator were combined and diluted with tris diluent and three different doses of plant oil, and then frozen. It was determined that the plant oil at the dose of 0.75 µl/10 ml was improved the post-thawed sperm motility compared to control group and other groups (p<0.05). Similar results were obtained from the analysis of acrosomal integrity and DNA fragmentation. In the acrosomal membrane integrity after freeze–thawing, 0.75 µl/10 ml dose of essential oil was found to be higher than the doses of control and 1.5 µl/10 ml, 6 µl/10 ml (p<0.05). In DNA fragmentation analysis, 0.75 µl/10 ml dose of essential oil was found to be lower than the doses of control and 1.5 µl/10 ml, 6 µl/10 ml (p<0.05).
As a result, the cryoprotective effect of 0.75 µl/10 ml dose of essential oil on motility, acrosomal integrity and DNA fragmentation parameters in Ankara bucks sperma after freeze-thawing was determined.  It has been shown that the most appropriate dose of Nepeta italica subsp. cadmea essential oil having antioxidant effects and containing flavonoids can be used as a cryoprotectant in sperma cryopreservation. However, there is a need to reveal the possible cryoprotective effects of determined doses of plant essential oil in sperm cryopreservation by studying with different parameters.