İmatinibin İndometazin, Lityum, Selisiklib ve Noskapin ile kombinasyonunun T98G insan glioblastoma hücrelerine etkisinin in vitro incelenmesi.
The evaluation of imatinibs? effects combined with indometacin, lithium, seliciclib, noscapine on T98G human glioblastoma cells in vitro. L?examination de l?effet combiné de l?imatinibine, l?indométacine, du lithium, du selisiclibe et de la noscapine sur les cellules de glioblastome humaines in vitro.
Yazar: MİNE ERGÜVEN
Danışman: PROF. DR. NURİYE AKEV
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Çalışmanın amacı imatinibin indometazin, lityum klorür, selisiklib ve noskapin ile birlikte uygulanmasının glioblastoma tedavisindeki etkilerini araştırmaktı. Hedefimiz glioblastoma ile birlikte birçok hastalık tipinin ve/veya komplikasyonun birarada bulunduğu vakalarda çoklu ancak yan etkileri yok denecek kadar az, hızlı ve ucuz tedavi protokolü oluşturmaktı.İlaçlar tek başına ve imatinib mesilat ile birlikte insan kökenli T98G glioblastoma hücre hattının iki boyutlu (tek tabakalı) ve üç boyutlu (sferoid) kültürlerinde 72 saat süresince denendi. İlaçların etkileri iki boyutlu hücre kültürlerinde hücre çoğalması (toplam hücre sayısı), hücre canlılığı ve mitokondri işlevi (MTT yöntemi), programlı hücre ölümü (Akım sitometrik Anneksin-V-FITC/PI yöntemi), hücre döngüsü (Akım sitometrik PI yöntemi), cAMP seviyeleri (RIA yöntemi), siklooksijenaz 1 ve 2 aktiviteleri (in vitro peroksidaz yöntemi), kaspaz-3 aktivitesi (ELIZA yöntemi), protein seviyeleri (western emdirimi yöntemi), üç boyutlu hücre morfolojisi (SEM), ve üç boyutlu hücre kültürlerinde ise hücre inceyapısı (TEM) kriterleri temel alınarak değerlendirildi.Lityumun (100 ?M) hücre çoğalması ve hücre canlılığını azaltan, selisiklibin (200 ?M) ise programlı hücre ölümünü artıran tüm zaman aralıklarında en etkili ilaçlar olduğu saptandı. Kaspaz-3 aktivitesini artıran en etkili grubun 24. saatte indometazin, 72. saatte ise imatinib (10 ?M) ve lityum ikili uygulaması olduğu saptandı. İmatinib ve indometazin ikili uygulamasının 24. saatte ve noskapinin (10 ?M) 72. saatte hücre döngüsü G0+G1 fazı hücre oranlarını en etkili azaltan gruplar olduğu saptandı. cAMP seviyelerini en etkili azaltan grubun 24. ve 72. saatlerde lityum olduğu saptandı. İmatinib ve indometazin ikili uyglaması ve indometazinin (100 ?M) sırasıyla siklooksijenaz 1 ve 2 aktivitelerini 10 dakika sonunda en etkili azaltan gruplar olduğu saptandıTrombosit türevi büyüme faktörü reseptörü alfa ve tubulin seviyelerini, çoklu ilaç direnci proteini, ve telomeraz katalitik alt birimi seviyelerini azaltan en etkili ilaçların tüm zaman aralıklarında sırasıyla imatinib ve noskapin ikili uygulaması, lityum klorür ve selisiklib olduğu saptandı. İmatinib ve noskapin 24. saatte, imatinib ve selisiklib ikili uygulamasının ise 72. saatte nf-?B seviyelerini azaltan en etkili ilaçlar olduğu saptandı. Glikojen sentaz kinaz beta (GSK-ß) ve fosforile GSK-ß seviyelerinde meydana gelebilecek olası değişiklikler sadece lityum için incelendi. GSK-ß seviyelerini azaltan ve fosforile GSK-ß seviyelerini artıran en etkili grupların tüm zaman aralıklarında sırasıyla imatinib ve lityum olduğu saptandı. Selisiklib ve lityumun kontrol grubuna göre hücre morfolojisi ve inceyapısını değiştiren en etkili gruplar olduğu saptandı.Bulgularımız, tek başına uygulanan ilaçların, imatinib ile yapılan ikili ilaç uygulamalarına göre daha etkili olduğunu gösterdi. Sonuç olarak, yardımcı ilaçların imatinib ile birlikte uygulanması halinde glioblastoma tedavisinde etkili olamayacağı hatta bu uygulamanın ilaç direncini artırabileceği yönündedir.

Abstract:
The purpose of this study was to investigate the effects of imatinib with indometacin, lithium chloride, seliciclib, noscapine in the treatment of glioblastoma. Our goal was to compose the multi-treatment protocol with properties as causing little or no side-effects, quick and cheap for glioblastoma cases with several illnesses and/or complications.Drugs were used singly or combined with imatinib at the two dimensional (monolayer) and three dimensional (spheroid) cultures of human derived T98G glioblastoma cell lines for 72 hours. The effects of the drugs were evaluated by cell proliferation (total cell number), cell viability and mitochondrial activity (MTT assay), programmed cell death (Flow cytometric Annexin-V-FITC/PI assay), cell cycle (Flow cytometric PI assay), cAMP levels (RIA assay), cycloxygenase 1 and 2 activities, caspase-3- activity (ELISA assay), protein levels (western blotting), three dimennsional cell morphology (SEM) at two dimensional cell cultures and cell ultrastructure (TEM) at three dimensional cell culture.Lithium (100 ?M) was the most effective drug to decrease cell proliferation and cell viability, and seliciclib was another effective drug to increase programmed cell death for all time intervals. The most effective drugs to increase caspase-3 activity were determined as indomethacin at the 24th hour, and imatinib (10 ?M) with lithium at the 72nd hour. İmatinib with indomethacin at the 24th hour, and noscapin (10 ?M) at the 72nd hour were determined as the most effective drugs increseasing the ratio of cells at the G0+G1 phase of cell cycle. The most effective drug to decrease cAMP levels was lithium for 24 and 72 hours. İmatinib with indomethacin and indomethacin (100 ?M) were determined as the most effective drugs that decrease cycloxygenase 1 and 2 at the end of 10 minutes, respectively.The effective decrease at the levels of platelet derived growth factor alpha and tubulin, multidrug resistance protein, and telomerase reverse transcriptase were determined as imatinib with noscapin, lithium and selisiclib for all time intervals, respectively. İmatinib with noscapin at 24th hour and imatinib at the 72nd hour were determined as the effective drugs in decreasing nf-?B levels. The possible alterations of glycogen synthase kinase 3 beta (GSK-3ß) ve phospho-GSK-3ß levels were only evaluated for lithium. The most effective drugs that decreased GSK-3ß levels and increased phospho-GSK-3ß levels for all time intervals were determined as imatinib and lithium, respectively. Selisiclib and lityum were evaluated as the most effective drugs to change cell morphology and ultrastructure in comparison to control group.Our results revealed that singly applied drugs were more effective than the combination with imatinib. As a result, the combination of helper drugs with imatinib were not effective in glioblastoma treatment, moreover this applications may increase drug resistance.