Toxoplasma gondii ile enfekte insan trophoblastik hücrelerinin (BEWO) toll-like reseptör yolağına nitrofurantoinin etkisi
Influence of nitrofurantoin on toll-like receptor pathway of human trophoblastic cells (BEWO) infected with toxoplasma gondii
Yazar: EDA SİVCAN
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH İNCİ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Hücre dizisi = Cell line ; Nitrofurantoin = Nitrofurantoin ; Reseptörler-toll like = Receptors-toll like ; Toxoplasma gondii = Toxoplasma gondii

Özet:
Toksoplasmosis, zorunlu hücre içi protozoon parazit Toxoplasma gondii'nin neden olduğu yaygın bir paraziter hastalıktır. Hastalık fetustan erişkinliğe kadar süregelen ciddi kliniklere neden olmaktadır. Bu çalışmada, T. gondii ile enfekte insan trofoblastik koriokarsinom hücresi olan BeWo hücre hattında, TLR (Toll-Like Reseptör) ait sinyal yolağına, nitrofurantoinin (NF) etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. BeWo hücreleri takizoitler ile 1:1 oranında enfekte edilmiştir. Kullanılacak konsantrasyonu belirlenmek üzere NF, deney grublarını oluşturan hücrelere eklenmiştir. Giemsa boyama yöntemi, tripan blue boyama yöntemi ve MTS (3-(4,5-dimetiltiyazol-2-yl)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sülfofenil)-2H-tetrazolyum) testi uygulanmıştır. MTS ölçüm sonrasında GraphPad Prism 8.0 istatistik programı kullanılarak IC50 (maksimum inhibisyon konsantrasyonu) ve EC50 (maksimum cevabın yarısını vermek için gerekli ilaç konsantrasyonu) değerleri hesaplanmıştır. Uygun ilaç konsantrasyonunun 1,25 µM (mikromolar) olduğu bulunmuştur. NF'nin TLR yolağına etkisini tespit için 24. saatte, 48. saatte ve 72. saatte olmak üzere üç ayrı zamanda örnekler toplanmıştır. Deney sonrası deney gruplarından 24, 48 ve 72. saatlerde alınan örneklerin RNA izolasyonu yapılarak cDNA (complementer DNA)'ları sentezlenmiş ve Real-Time PCR (RT-qPCR) analizleri yapılmıştır. GAPD (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ve B2M (Beta-2-microglobulin) referans genleri kullanılarak gen ekspresyonlarındaki orantısal değişim hesaplanmıştır. Buna göre; MAPK1 (Mitogen-activated protein kinase 1), SPP1 (Secreted phosphoprotein 1), TLR6 (Toll-like receptor 6) ve TLR8 (Toll-like receptor 8) genlerinde görülen ekspresyon seviyesindeki azalmaya bağlı olarak ilacın en etkili saat diliminin 48. saat olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, üç deney grubundaki parazit yükünün 24 saat sonraki değişim düzeylerinde anlamlı farklılık görülmezken (p=0.086), 48 (p=0.015) ve 72 (p=0.049) saat sonra parazit yükündeki değişim düzeylerinde anlamlı farklılık olduğu görülmüştür. Sonuç olarak, NF'nin T. gondii enfeksiyonunu, TLR yolağındaki hangi genler üzerinden inhibe ettiği gösterilmiştir. Ayrıca, NF'nin toksoplamozisle mücadelede kullanılan etkin dozajının uyardığı bu moleküllerin bilinmesi, hastalığın tedavisinde alternatif bir yöntem olarak bu moleküller üzerinden etki eden daha az yan etkili geniş kullanım alanlı yeni preparatların geliştirilebileceğini de göstermiştir.

Anahtar Kelimeler: BeWo hücre hattı, Nitrofurantoin, Toll-like reseptör, Toxoplasma gondii.

Abstract:
Toxoplasmosis is a common parasitic disease caused by the obligatory intracellular protozoan parasite Toxoplasma gondii. The disease causes serious clinics from fetus to adulthood. The aim of this study was to investigate the effect of nitrofurantoin (NF) on the signaling pathway of TLR (Toll-Like Receptor) in the BeWo cell line, a human trophoblastic choriocarcinoma cell infected with T. gondii. BeWo cells were infected with tachyzoites in a 1: 1 ratio. NF was added to the cells forming the experimental groups to determine the concentration to be used. Giemsa staining method, trypan blue staining method and MTS (3-(4,5-dimetiltiyazol-2-yl)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sülfofenil)-2H-tetrazolyum) test were applied. After MTS measurement, IC50 (maximal inhibitory concentration) and EC50 (Half maximal effective concentration refers to the concentration of a drug) values were calculated using GraphPad Prism 8.0 statistical program. The appropriate drug concentration was found to be 1.25 µM (micromolar). To determine the effect of NF on the TLR pathway, samples were collected at three different times; 24 h, 48 h and 72 h. After the experiment, cDNAs were synthesized using RNA isolated from the samples taken at 24, 48 and 72 hours and Real-Time PCR (RT-qPCR) analyses were performed. Proportional change in gene expression was calculated using GAPD (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) and B2M (Beta-2-microglobulin) reference genes. According to this; due to the decrease in expression level in MAPK1 (Mitogen-activated protein kinase 1), SPP1 (Secreted phosphoprotein 1), TLR6 (Toll-like receptor 6) and TLR8 (Toll-like receptor 8) genes, the most effective time zone of the drug was found to be 48th hour. In addition, no significant difference was observed in the change levels of the parasitic load in the three experimental groups after 24 hours (p = 0.086), but after 48 (p = 0.015) and 72 (p = 0.049) hours, there was a significant difference in the parasitic load changes in the three experimental groups. As a result, it was shown that NF inhibited T. gondii infection by which genes in the TLR pathway. Furthermore, the knowledge of these molecules, which are stimulated by the effective dosage of NF used in the fight against toxoplasmosis, have shown that new preparations with fewer side effects and a wide range can be developed as an alternative method of treatment of the disease.
Keywords: BeWo cell line, Nitrofurantoin, Toll-like receptor, Toxoplasma gondii.