Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin izolasyonu, klonlanması ve analizi
Isolation, cloning and analysis of the gene encoding lactate dehydrogenase enzyme from Fusobacterium nucleatum
Yazar: EMRAH SARIYER
Danışman: PROF. DR. DİLEK BALIK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics

Özet:
Birçok iltihaplı hastalıklara sebep olan Fusobacterium nucleatum fusobakteri ailesinden, gram negatif ve obligatif anaerob bakteridir. İnvaziv ve pro-inflamatuar etkiye sahip bu anaerobik bakteri kolorektal karsionama, periodontal hastalıklar ve perikardit gibi birçok yumuşak doku hastalığına sebep olmaktadır. Dünya sağlık örgütünün raporlarında göre, Fusobacterium nucleatum kaynaklı kolorektal kanser vakalarında 610.000'e yakın ölüme neden olmaktadır. Bu sebeple bakteriyel infeksiyonu baskılamak amacıyla F. nucleatum'un metabolizmasının bilinmesi gerekmektedir. Laktat dehidrogenaz enzimi anaerobik glikolizis ve hücre içi biyomoleküllerin üretiminde önemli rol oynamaktadır. Bu enzim yeni ilaç tasarım çalışmalarında muhtemel hedef molekül seçilmiştir. Bu tez çalışmasında laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan gen Fusobacterium nucleatum genomik DNA'sından izole edilmiş, PCR ile amplifiye edilmiştir ve literatürde ilk defa standart protokol uygulanarak pGEM-T easy vector sistemine klonlanmıştır. Klonlanan Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz (FnLDH) enzimini kodlayan gen nükleotit ve aminoasit düzeyinde analiz edilmiştir. FnLDH aminoasit dizisinin insandaki eşdeğeri olan LDH ile çakıştırılması ile 98-109 residüleri arasındaki enzimin aktif bölgesi önemli farklılıklar göstermiştir. 
Gen ifadesi için FnLDH geni ekspresyon vektörü olan pKK223-3 vektörüne alt-klonlama yapılmış ve E. coli JM109 hücresinde ifadesi yapılmıştır. Hücrelerin sonikasyonu sonrası supernatant kısmında az miktarda protein gözlemlenmiş ve enzimin çoğu pellet kısmında bulunmuştur. Uygun sistemlerde gen ifadesi sonrası aktif ve çözünebilir fazda protein üretimi, yapıya dayandırılmış ilaç tasarım çalışmalarında oldukça önemlidir. Yapılan SDS-PAGE analizi sonucu 34.697 Da moleküler ağırlıktaki protein gözlemlenmiştir fakat yeterli miktarda üretim ve aktif enzim olmadığından, aLICator LIC ekspresyon sisteminin avantajlarından yararlanmak amacıyla FnLDH geni pLATE31 vektörüne klonlanmıştır. Çözünebilir fraksiyonda başarılı bir şekilde ifade edilmiş ve Ni-NTA agaroz kolonu kullanılarak  % 95 oranında saflaştırılabilmiştir.  Saflaştırılan 34.697 Da molekül ağırlığındaki FnLDH SDS-PAGE'de analiz edilmiştir. Saflaştırılan FnLDH enziminin spesifik aktivitesi, NADH ve piruvat kullanılarak ölçülmüştür ve daha sonraki kinetik analizler için yeterli aktivite görülmüştür. 
Çalışmamızda üç boyutlu kristal yapısı bilinen Lactobacillus casei L-laktat dehidrogenaz kalıp alınarak Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz enzimi için bir model oluşturulmuştur. Bu iki enzim arasındaki benzerlik %41'dir.  Proteinlerin üç boyutlu yapısını modellemek için karşılaştırmalı modelleme prensibine dayanan homoloji modelleme yöntemi kullanılmıştır. Oluşturulan 3D yapısı MODELLER programı kullanılarak yapılandırılmıştır. Bu program yapısı belirlenmek istenen yapı ile bilinen yapıları karşılaştırarak model oluşturur. 3D boyutlu yapı ile ilgili değerlendirmeler ve düzeltmeler web tabanlı ERRAT, PROSA, HYPERCHEM ve RAMPAGE kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Proteindeki muhtemel ligand bağlanma bölgeleri web tabanlı SiteFinder, Pocket-Finder ve DoGSiteScorer programları kullanılarak belirlenmiştir. 98-109 arası residüler ligandın bağlanması için en uygun bölge olduğu ve bu bölgenin insan kas LDH'ında eşdeğer bölgesinden farklılık gösterdiği tespit edilmiştir. 
Mevcut çalışma Fusobacterium nucleatum'un enerji metabolizmasında laktat dehidrogenaz enziminin rolünün ve yapıya dayandırılmış ilaç tasarım çalışmalarında kullanılabilir uygulamaların anlaşılmasına yardımcı olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Fusobacterium nucleatum is a gram-negative and obligative anaerobic bacteria species of fusobacteria phylum. This bacterium is invasive, proinflammatory and related with bowel disease, periodontitis and pericarditis. It is also known that F. nucleatum could be associated with colorectal cancer that is responsible for 610,000 deaths per year worldwide, according to the World Health Organisation. F. nucleatum metabolism needs to be further studied with the ultimate aim of blocking bacterial infection. Lactate dehydrogenase enzyme has a key role in anaerobic glycolysis and producing intracellular biomolecules in the bacterium. The enzyme has been chosen as a possible target for new drug design studies. In this thesis study, the gene encoding lactate dehydrogenase from F. nucleatum (FnLDH) has been successfully isolated from the genomic DNA by PCR and then cloned into the pGEM-T easy vector system using the standard protocols for the first time in the literature.  FnLDH was analyzed at the nucleotide and amino acid levels. It was determined that the gene was consisted of 957 base pairs. Alignment of amino acid sequence of FnLDH to its counterpart in human showed a distinct sequence difference in the active site of the enzyme that is located between residues 98-109.  
FnLDH gene was then subcloned into expression vector pKK223-3 and expressed in E. coli JM109 cells. A decent amount of protein was observed in the supernatant fraction, but most of the protein was found to be present in the pellet fraction following the sonication. Production of the active and soluble protein following expression of the enzyme in an appropriate system is essential for the structure based drug design studies. Therefore, in this present study, 34.697 Da protein was observed on SDS PAGE following the protein purification. Because satisfying production of FnLDH protein was not observed by using this system, FnLDH was then cloned into the pLATE 31 vector in order to use advantages of aLICator LIC expression system. Protein was successfully expressed in soluble fraction and purified with over 95% purity using Ni-NTA agarose by affinity chromatography. The purified 34.697 Da protein was analyzed by SDS-PAGE. Specific LDH activity of purified enzyme was measured using NADH and substrate pyruvate at 340 nm.  The enzyme was made available for further kinetic characterizations.
Homology modeling based on comparative modeling of protein three dimensional structures was used to generate a model of FnLDH using crystal structure of L-lactate dehydrogenase from Lactobacillus casei Identity between two sequences were 41%. Constructed 3D structure was built by MODELLER that models 3D dimensional structures with known structures. ERRAT, ProSA, RAMPAGE and HYPERCHEM softwares were used for the purpose of evaluation and refinement of 3-dimensional structure. Probable ligand binding sites on the protein were determined using web based software, Q-SiteFinder, Pocket-Finder and DoGSiteScorer.  The region located between residues 98 and 109 was determined as most favoured ligand binding site. Modelling study further showed the same region being distinct from the same region present in human muscle LDH.
Present study may help to understand role of lactate dehydrogenase enzyme in Fusobacterium nucleatum energy metabolism and enables application of further studies on structure based drug design.