Hipoksik ve yüksek glükozlu ortamlarda IGF-I ve MGF'in nöral kök hücrelerde ekspresyonu ve proliferasyon üstündeki etkilerinin in vitro araştırılması
In vitro investigation of the effects of İGF-i and MGF in neural stem cells and their effects on proliferation in hypoxic and high glucose environments
Yazar: TUĞBA GÜRBÜZ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SELÇUK SÖZER TOKDEMİR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Genetik = Genetics ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Büyüme maddeleri = Growth substances ; Glükoz = Glucose ; Hipoksi = Hypoxia ; Kök hücreler = Stem cells ; Nöral kök hücreleri = Neural stem cells ; İnsülin benzeri büyüme faktörü I = Insulin like growth factor I

Özet:
Amaç: İnme, dünyada en önde gelen ölüm nedenlerinden ikinci sırada olmasına rağmen hala etkili bir tedavisi yoktur. Diyabet hastalarında inmenin normal kan glükoz seviyesine sahip hastalara oranla daha ciddi hasarlara neden olduğu bilinmektedir. Bu nedenlerden dolayı inme ile ilgili çalışmalar hayati önem taşımaktadır. Bu projenin amacı in vitro iskemi modeli olarak hipoksiye ve yüksek glükoza maruz bırakılmış NKH'lerde IGF-I ve MGF ekspresyonunun olup olmadığı ve yine bu iki koşula maruz bırakılan NKH'lerde hücrelere dışarıdan IGF-I ve MGF verildiğinde proliferasyonları üzerindeki etkilerin ne olacağının gözlenmesidir.                                                  Yöntem: in vitro iskemi koşulları oluşturmak amacıyla hücre kültürü koşullarında yetiştirilen NKH'ler, CellAsic ONIX cihazı kullanılarak farklı oksijen düzeylerine(%0 ve %3 oksijen) maruz bırakılmışlardır. Kontrol olarak normoksi koşulları oluşturulmuştur (%20 oksijen). Kontrol ve hipoksi koşulları elde edildikten 24 saat sonra hücrelerden RNA izole edilip cDNA sentezi yapılmıştır. Sonrasında IGF-I - MGF ekspresyonu olup olmadığına Gerçek Zamanlı PZR tekniği ile bakılmıştır. Hipoksiye uğratılmış NKH'lere dışarıdan verilen IGF-I ve MGF'in proliferasyon üzerindeki etkileri, ImageJ programı ile analiz edilmiştir. Aynı şekilde NKH'ler hücre kültürü koşullarında farklı yüksek glükoz konsantrasyonlarına maruz bırakılmış (27.75mM, 41.75mM ve 83.75mM glükoz), bu koşullarda hücrelerde IGF-I - MGF ekspresyonu olup olmadığına Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (GZ-PZR) tekniği ile bakılmıştır. Daha sonra farklı yüksek glükoz konsantrasyonlarına maruz bırakılan NKH'lere dışarıdan verilen IGF-I ve MGF'in proliferasyon üzerindeki etkileri BrdU-Akım Sitometri yöntemi ile ölçülmüştür.                                                                  Sonuç: %3 O2'ye maruz bırakılan örneklerde IGF-I ve MGF ekspresyonu tespit edilmiştir. Hipoksiye maruz bırakılan örnekler ile kontrol arasında (%3 O2-%20 O2) istatistik olarak anlamlı bir fark tespit edilmemiştir.Yüksek glükoza maruz brakılan NKH'lerde glükoz düzeyinin artmasına bağlı olarak hücre proliferasyonunun azaldığı tespit edilmiştir. Yüksek glükoza maruz bırakılan NKH'lerde MGF ve IGF-I ekspresyonu olduğu tespit edilmiştir. Dışarıdan MGF ve IGF-I verildiğinde de bu iki büyüme faktörünün yüksek glükoz ortamında NKH'lerde proliferasyonu olumlu yönde etkilediği tespit edilmiştir.                                                                                    Bulgular: %3 O2'ye maruz bırakılan NKH'lerde hasarı azaltmak amacıyla IGF-I ve MGF ekspresyonu artmıştır. Yüksek glükoza maruz bırakılan NKH'lerde MGF ve IGF-I ekspresyonunun olduğu MGF'in IGF-I'e oranla daha fazla eksprese olduğu tespit edilmiştir. Bu bulgular bize MGF ve IGF-I'in hasar anında NKH'lerin proliferasyonunu arttırdığını yani nöroprotektif etkisi olduğunu göstermektedir. Eksojen MGF ve IGF-I'in de hasar anında NKH proliferasyonunu arttırdığı, MGF'in IGF-I'e oranla daha nöroprotektif olduğu tespit edilmiştir. Tüm sonuçlar, nöroprotektif ve proliferatif etkilerinden dolayı eksojen MGF ve IGF-I'in diyabet hastalarında inme gibi nedenlerle nöronal hasarın etkisinin hafifletilmesi adına, tedavide kullanılabileceği yolunda bir ışık yakmaktadır.

Abstract:
Objective: Stroke is second leading cause of death in the world. However there is no efficient treatment for stroke and its results. It is known that stroke causes more serious damage in patients with diabetes than in patients with normal blood glucose levels. Therefore, stroke researchs are crucial. The aim of this project is generally to determine the intrinsic and extrinsic effects of IGF-I and MGF in NSCs subjected to hypoxia and high glucose levels. Thus,we will try to learn that if IGF-I and MGF express in NSCs in above conditions (in hypoxia and high glucose level). We will also try to investigate that if both growth factors have proliferative and neuroprotective effects in the cells in such conditions when their peptides apply for extrinsically.
Method:  NSCs grown in cell culture conditions were exposed to different oxygen levels (0% and 3% oxygen) using the CellAsic ONIX device to generate in vitro ischemia conditions. Normoxy conditions were established as control (20% oxygen). After 24 h of control and hypoxia conditions, RNA was isolated from the cells and cDNA synthesis was performed. Then, IGF-I - MGF expression in cells was investigated by Real Time PCR. The effects of exogenous IGF-I and MGF on proliferation into NSCs exposed to hypoxia conditions were analyzed by ImageJ program. NSCs were also exposed to different high glucose concentrations (27.75mM, 41.75mM ve 83.75mM glucose) under cell culture conditions and under these conditions  IGF-I - MGF expression in cells was investigated by Real Time PCR. The effects of exogenous IGF-I and MGF on proliferation into NSCs exposed to high glucose conditions were measured by BrdU-Flow Cytometry.
Findings: IGF-I and MGF expression were detected in the samples exposed to 3% O2. No statistically significant difference was found between the samples exposed to hypoxia and the control (3% O2-20% O2). It has been determined that cell proliferation decreases due to increased glucose levels in NSCs exposed to high glucose. MGF and IGF-I expression were detected in NSCs exposed to high glucose. Exogenous IGF-I and MGF positively affect proliferation in NSCs grown in high glucose medium.
Results: IGF-I and MGF expression were increased for reduce the damage in NSCs exposed to 3% oxygen. It was found that MGF and IGF-I expression  in NSCs exposed to high glucose and MGF was more expressed than IGF-I. These findings suggest that MGF and IGF-I increase the proliferation of NSCs at the time of injury and thus have a neuroprotective effect. It was determined that exogenous MGF and IGF-I increased NKH proliferation at the time of injury and MGF was more neuroprotective than IGF-I. All the results show that exogenous MGF and IGF-I can be used in treatment of diabetes patients for relieving the effect of neuronal damage due to their neuroprotective and proliferative effects.