Altın nanopartikül-bilayer tiyol modifiye diamin oksidaz-peroksidaz çiftli enzim sistemine dayalı yeni bir biyosensör sistemi
A novel biosensor system based on gold nanoparticles-bilayer thiol modified diamine oxidase-peroxidase coupled enzymes system
Yazar: CANSU GÜVENÇ
Danışman: PROF. DR. EROL AKYILMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tez çalışmasında biyosensör teknolojisine yeni ve orijinal bir bakış açısı getiren serotonin tayinine yönelik, altın nanopartikül-bilayer tiyol modifiye diamin oksidaz-peroksidaz çiftli enzim sistemine dayalı biyosensör geliştirilmesi amaçlanmıştır. Geliştirilen biyosensör sisteminde öncelikle altın elektrod (Au) yüzeyine fonksiyonel tiyol grubu içeren 1,6-hekzanditiyolün bağlanması ve kendiliğinden oluşan tek tabakaların (SAM) oluşumu gerçekleştirildi. Ditiyolün elektrod yüzeyine bağlanması sonrası diğer reaktif (-SH) ucuna altın nanopartikül bağlanması sağlandı. Ardından altın nanopartikül (AuNP)  3- merkaptopropiyonik asit ile etkileşime sokuldu. Modifiye elektrot yüzeyine diamin oksidaz ve peroksidaz ilavesi sonrası üzerine glutaraldehit damlatılarak kovalent immobilizasyonu sağlandı. 
Tasarlanan biyosensör sistemiyle serotonin ölçümleri 0,2 V'ta amperometrik metod kullanılarak yapılmıştır.  Serotonin konsantrasyonuyla doğru orantılı olarak artan akım değerlerinden çıkılarak tayin yapılmıştır. 
Hazırlanan biyosensörün biyoaktif tabakasının optimizasyonu çalışmalarında öncelikle tek tabaka oluşum süresi, diamin oksidaz-peroksidaz aktiviteleri, glutaraldehit konsantrasyonu gibi parametreler çalışıldı. Çalışma koşullarının optimizasyonunda pH optimizasyonu gerçekleştirildi. Biyosensörün karakterizasyon çalışmalarında serotonin için doğrusal tayin aralığı, tekrarlanabilirlik, substrat spesifikliği, girişim etkisi, depo kararlılığı ve örnek analizi gibi parametreler araştırılmıştır.
Optimizasyon çalışmaları sonucunda serotonin biyosensörü için en uygun tek tabaka oluşum süresi, enzim aktivitesi (diamin oksidaz- peroksidaz) ve glutaraldehit konsantrasyonu sırasıyla 20 saat, 0,11 Unit/ml – 113 Unit/ml ve % 2,5 olarak bulunmuştur. Çalışma koşullarının optimizasyonu amacıyla yapılan denemelerde serotonin biyosensörü için çalışma tamponu olarak 50 mM pH 7,0 fosfat tamponu ve çalışma sıcaklığı olarak 30 °C bulunmuştur.  Geliştirilen biyosensör için yapılan karakterizasyon çalışmalarında ise serotonin için 1 – 10 µM aralığında doğrusal sonuçların alındığı belirlenmiştir. Tekrarlanabilirlik denemelerinde (n=6) 5 µM serotonin konsantrasyonunda ortalama değer ( ) , standart sapma (S.S) ve % varyasyon katsayısı (%V.K) sırasıyla 4,97 µM, ± 0,241 ve % 4,84 olarak bulunmuştur.
 
Anahtar kelimeler : 1,6-hekzanditiyol, altın nanopartikül, diamin oksidaz, peroksidaz, serotonin, biyosensör

Abstract:
In this thesis, a biosensor system based on a gold nanoparticles(AuNP)-bilayer thiol modified diamine oxidase-peroxidase coupled enzyme system was intended to be developed to determine serotonin which brings a new and original perspective to biosensor technology. Primarily, in this developed biosensor system, binding of 1,6-hexanedithiol, having functional thiol group, were performed to the gold electrode (Au) surface and self assembled monolayers  (SAM) formation was carried out. After the binding of dithiol to the electrode surface, the gold nanoparticles were allowed to bind to the other reagent (-SH) terminal. After that, the gold nanoparticles (AuNP) were reacted with 3- mercaptopropionic acid. After the addition of diamine oxidase-peroxidase on to the modified electrode surface, covalent immobilization was provided by dropping of glutaraldehyde on to the electrode surface.
The serotonin measurements were made using 0,2 V amperometric method with the designed biosensor system. The determination was made on the basis of increasing current values in direct proportion with serotonin concentration.
In the optimization studies of the biosensor firstly bioactive layer components such as SAM formation time, diamine oxidase-peroxidase activity and glutaraldehyde concentration were carried out. In the optimization of working conditions; optimum pH was also investigated. Afterwards, in the characterization studies of the biosensor some paramaters such as linearity, reproducibility, storage stability were determined.
From the result of the optimization studies  optimum 1,6-hexanedithiol amount , optimum diamine oxidase – peroxidase  activitiy and optimum  glutaraldehyde concentration  were determined to be 20 hour, 0.11 Units/ml- 113 Units/ml and 2.5 % respectively. From the experiments the phosphate buffer (50 mM, pH 7.0) and 30 °C were chosen to be optimum working conditions for the biosensor. It was determined from the characterization studies of the biosensor that linear curves were obtained serotonin concentration between the ranges of 1 µM to 10 µM. At the repeatability experiments (n=6), the average value ( ), standard deviation, (SD) and coefficent of variation (CV %) were calculated to be 4.97 µM mM, ± 0.241 and 4.84 % for 5 µM serotonin concentration, respectively.

Keywords : 1,6- hexanedithiol, gold nanoparticles, diamine oxidase, peroxidase, serotonin, biosensor