Schizosaccharomyces pombe'de gen anlatımındaki nitrik okside bağımlı değişimlerin araştırılması
Investigation of nitric oxide dependent changes in gene expression in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: CENK KIĞ
Danışman: PROF. DR. GÜLER TEMİZKAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Memeli hücrelerinde önemli fizyolojik olayların düzenlenmesinde rol oynadığı bilinen nitrik oksidin (NO) memeliler dışında, prokaryotlardan gelişmiş yapılı ökaryotlara kadar çok çeşitli canlı türünde de bazı fizyolojik işlevleri üstlenebildiği ve bu organizmalarda nitrik oksit sentazınkine (NOS) benzer aktivite göstererek NO oluşumunu katalizleyen enzimlerin varlığı gösterilmiştir. Moleküler düzeydeki özellikleri bakımından memeli hücrelerine benzerlik gösterdiği için uygun bir model organizma olarak kabul edilen Schizosaccharomyces pombe maya türünde ise NOS aktivitesinin varlığı bilinmemekte ve NO'nun fizyolojik işlevleri hakkında çok sınırlı bilgi bulunmaktadır.Bu çalışmada, S. pombe'de NOS aktivitesinin var olup olmadığının belirlenmesi, eğer aktivite varsa anlatımları hücre içi NO konsantrasyonundaki artma ve azalma şeklindeki değişimlere duyarlı olan genlerin saptanması ve bu genlerin işlevlerinden yola çıkılarak NO'nun bazı fizyolojik olayların düzenlenmesinde sinyal molekülü olarak etki gösterip gösteremeyeceğinin araştırılması amaçlandı.Çalışmada, spektrofluorometrik bir yöntemle S. pombe ham hücre özütlerinde NOS'unkine benzer aktivitenin varlığı ilk kez gösterildi. Anlatımları hücre içi NO düzeyindeki değişimlere duyarlı olabilen genlerin saptamasına yönelik olarak, farklılık gösterimi tekniği ile NOS engelleyicisi olan NG-nitro-L-arjinin metil ester (L-NAME) etkisinde bırakılan hücrelerde anlatımları azalan veya duran, NO vericisi olan sodyum nitropurissid (SNP) uygulamasıyla da anlatımları artan cDNA'lar belirlendi. Nükleotid dizilemeleri yapılan cDNA'ların, S. pombe genom veri tabanında gerçekleştirilen BLAST analizleriyle PBC17A3.09c, SPCC553.12c, byr1, pek1, sid1, wis1, ppk14 ve ubp12 genlerine benzerlik gösterdikleri saptandı. Bu genlerden pek1, sid1 ve ubp12'nin NO düzeyindeki değişimlere yanıt olarak anlatımlarında gözlenen değişimler gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle kantitatif olarak doğrulandı.pek1, sid1 ve ubp12 genlerinin bilinen işlevleriyle ilişkili olarak yapılan morfolojik ve fizyolojik düzeydeki bazı denemeler, NO'nun S. pombe'de mitoz bölünme, mayoz bölünme, spor oluşumu, programlı hücre ölümü ve hücre bütünlüğünün korunması gibi işlevlerin düzenlenmesinde rol oynayabileceğini işaret etti. Ayrıca, elde edilen bulgular NO'nun genel olarak hücre bölünmeleri ve stres yanıtı ile ilişkili etkilerinin MAPK sinyal yolundaki bazı bileşenlerin uyarılması aracılığıyla meydana gelebileceğini düşündürdü. Ek olarak, S. pombe'de NO'ya duyarlı olduğu belirlenen bu genlerin memelilerdeki homologlarının da benzer işlevlere sahip olmaları, bu mayanın NO'nun hücrelerdeki moleküler düzeydeki etkilerinin araştırılmasında uygun bir model sistem olarak kullanılabileceğini ortaya koydu.

Abstract:
Nitric oxide (NO) which is known to play important regulatory roles in various physiological processes in mammals is also shown to have some phsysiological functions in broad range of species other than the mammals, and nitric oxide synthase (NOS) like enzymes catalyzing NO production were found in these organisms. Presence of NOS activity has not been reported to date in Schizosaccharomyces pombe which is believed to be a convenient model organism since it shares a number of characteristic similarities with the mammalian cells at the molecular level, and very little is known about the phsysiological roles of NO in this yeast species.In this study, we firstly aimed to find out whether S. pombe cell extracts had NOS activity, then in order to detect the genes which are sensitive to both decreased and elevated intracellular NO levels. We also aimed to investigate if NO could function in regulation of some phsyiological processes as a signaling molecule in relation with the cellular functions of NO sensitive genes to be detected in S. pombe cells.NOS like activity was detected in the S. pombe crude cell extracts for the first time using a spectrofluorometric NOS assay. In order to detect the NO responsive genes, the cDNAs whose expression ratios decreased or repressed upon exposure to a NOS inhibitor NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), and elevated in response to a NO donor sodium nitroprusside (SNP) treatment were determined by employing differential display technique. BLAST analysis of the differentially expressed cDNAs sequences, performed in S. pombe genome database, produced significant similarities to PBC17A3.09c, SPCC553.12c, byr1, pek1, sid1, wis1, ppk14 and ubp12 genes of S. pombe. pek1, sid1 and ubp12 genes were quantitatively confirmed to be sensitive to the changes in the intracellular NO levels by employing real time polymerase chain reaction.The data obtained from the experiments regarding the functions of pek1, sid1 and ubp12 genes addressed to the possibility that NO could have some regulatory roles in mitosis, meiosis, sporulation and apoptosis in S. pombe. Moreover, it may also be possible to suggest that the effects of NO on cell divisions and stress response pathways in this yeast are exerted through activation of some MAPK signaling pathway components. In addition, these findings may also imply that S. pombe can be used as a convenient model system for investigating the cellular effects of NO at the molecular level, as the NO responsive genes detected in S. pombe share similar functions with those of the mammalian homologs.