İşlevsel ve fonksiyonel gıdaların geliştirilmesinde kullanılabilecek geniş sıcaklık ve pH aralığında aktif mikrobiyal kaynaklı ekstrasellüler rekombinant pektat liyaz
Optaining of microbial-derived extracellular recombinant pectate lyase wich can be used in the development of operational and functional foods in wide range of temperature and pH
Yazar: SEDA BEKLİ
Danışman: PROF. DR. BELMA ASLIM
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Pektik maddeler yüksek bitkilerin hücre duvarlarından ekstrakte edilen başlıca kompleks heteropolisakkaritlerdir. Pektik maddelere etki eden ve kısaca pektik enzimler denilen grupta çok sayıda enzim yer almaktadır. Biyoteknolojik uygulamalarda kullanılabilecek, farklı koşullarda yüksek aktivite gösterebilecek yeni enzimlerin bulunmasına ihtiyaç vardır. Bu çalışmada 7 bakteri ve 5 maya türü taranmıştır. Yüksek PEL aktivitesine sahip bakteri türlerinin moleküler düzeyde tanımlanması yapılarak doğrulanmıştır. PEL enziminin optimizasyon çalışmalarına göre optimum koşulları tespit edilmiştir. En yüksek Pektat Liyaz Enzim (PEL) aktivitesine sahip olan B. amyloliquefaciens BS6 suşundan elde edilen gen bölgesi ( ̴1600 bp ) belirlenmiş olup, Pet-20b(+) vektörüne klonlaması yapılarak Escherichia coli BL 21 (D3) suşuna aktarımı yapılmıştır. Klonlama sonrası elde edilen rekombinant PEL BS6 (RPEL BS6) enziminin karakterizasyon çalışmaları sonrasında 0,5 mM CaCI2 en yüksek aktivite (49,8 Units/mg) göstermiş olup, 15-90˚C sıcaklık aralığında ve 4,0-14,0 pH aralığında aktivitesini yüksek ölçüde korumuştur (p<0,01). 18 aylık depolama stabilitesi kontrol edilmiş ve aktivitesini % 98 oranında koruduğu gözlenmiştir (p<0,01). Molekül ağırlığı ise western ile 65,75 kDa olarak tespit edilmiştir. PEL BS6 geni ile termostabil PEL genleri hizalanmış, gen kalıntılarının olduğu bölgeler ve Ca+2 bağlanma bölgeleri gösterilmiştir(Clustal W). Elde edilen RPEL BS6 enzimi ile portakal ve elma suyunda kısa sürede etkin berraklaştırma başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. B. amyloliquefaciens (BS6)'den elde edilen RPEL BS6, özellikleri bakımından literatürdekiler ile farklılık göstermiştir. Bu enzim termostabil, termotolerant ve pH tölerant özelliği bakımından ve moleküler özellikleri ile de değerlendirildiğinde yeni bir enzim bulunmuştur.  RPEL BS6 enzimi, farklı koşullarda yüksek aktivite göstermesi ve bunu koruması nedeniyle farklı endüstri alanlarında başarı ile kullanımı mümkün olabileceği gibi, bu enzimi kullanarak farklı fonksiyonel gıdalar geliştirmekte mümkün olabilecektir. PEL BS6 enziminin rekombinant olarak elde edilmiş olması ve raf ömrünün uzun olması ticari kullanım potansiyelini daha da güçlendirmiştir.

Abstract:
Pectic substances are the major complex heteropolysaccharides extracted from the cell walls of higher plants. So-called pectic enzymes, the group affecting the pectic substances, contain many enzymes. There is a need for novel enzymes which can be used in biotechnology applications and are able to exhibit high activity under various conditions. In this study, 7 bacteria and 5 yeasts were screened for their Pectate Lyase Enzyme (PEL) activity. Types of bacteria with high PEL activity identification, were made at the molecular level. According to the study of the optimization of the optimal enzyme, PEL conditions have been identified. Moreover strains selected based on the high PEL activity were verified by describing them on a molecular level based on their 16S rRNAs. The gene domain ( ̴1600 bp ) obtained from the B. amyloliquefaciens BS6 strain with the highest Pectate Lyase Enzyme (PEL) activity was identified, and cloned to the Pet-20b(+) vector and transfected into  Escherichia coli BL 21(D3) strain. The characterization studies of the recombinant PEL BS6 (RPEL BS6) enzyme obtained after cloning revealed that the highest activity was exhibited at 0.5 mM CaCI2 (49,8 Units/mg) and the activity was maintained in the temperature range of 15-90˚C and the pH range of 4.0-14.0 to a significant extent (p<0.01). Its 18-month storage stability was checked and it was found to maintain its activity by 98% (p<0.01). The molecular weight was determined by Western i-blot as 65.75 kDa. The PEL BS6 gene and the thermostabile PEL genes were aligned using the Clustal W software and the regions with gene residues and the Ca+2 binding sites were identified. Using the obtained RPEL BS6 enzyme, effective clarification in orange and apple juices was successfully performed in a short time. Regarding its properties, the RPEL BS6 obtained from the B. amyloliquefaciens BS6 differs from those in the literature. Consideringits molecular characteristics, a novel thermostabile, thermotolerant and pH-tolerant enzyme was found.  Due to its high and well-maintained activity under different conditions, the RPEL BS6 enzyme can be successfully used in various industry fields. Moreover, its use would allow for the development of diverse functional foods. The recombinant production and the long shelf-life of the PEL BS6 enzyme increase its potential for commercial use.