Probiyotik Bifidobacterium breve 'nin bağışıklık düzenleyici tır proteinin tanımlanması, klonlanması ve rekombinant üretimi
Identification, cloning and recombinant expression of immune modulatory tir protein from probiotic Bifidobacterium breve
Yazar: DİCLE DİLARA AKPINAR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ BURCU KAPLAN TÜRKÖZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bağışıklık düzenleyici özelliğe sahip probiyotikler üzerine yapılan çalışmalar, probiyotiklerin ürettikleri moleküllerle bağışıklık sistemini etkileyebildiklerini göstermiştir. Bu etkileşimde hücre yüzeyinde bulunan Toll benzeri reseptörlerin (TLR) de rol aldığı düşünülmektedir. Çeşitli bakteriyel TIR domain proteinleri, yapısal olarak insan TIR domain proteinlerini taklit ederler ve sinyal iletimini değiştirerek bağışıklık cevabını yönlendirirler. 
Probiyotiklerin TIR domain yapısında proteinlere sahip olabileceği düşünülerek yapılan biyoinformatik taramalarda Bifidobacterium breve 'nin genomunda olası TIR domaini dizisine ulaşılmıştır. Bu tezde, probiyotik Bifidobacterium breve 'nin olası TIR domain proteinin (BbTIR) klonlanması, rekombinant üretimi ve saflaştırılması amaçlanmıştır. 
Biyoinformatik yöntemlerle, çoklu dizi hizalamalarla BbTIR 'ın korunan TIR domain desenleri içerdiği doğrulanmıştır. PZR ile çoğaltılan bbtir, pETM11-SUMO3GFP ve pET151/D-Topo plazmidlerine klonlanmıştır. Farklı ekspresyon hücrelerinden ve farklı sıcaklıklarda rekombinant protein üretimi için optimum koşullar belirlenmiştir. 6his-BbTIRV1 ve 6his-BbTIRV2 proteinlerinin üretimi için optimum üretim koşulları 1 mM IPTG ile Rossetta 2 hücrelerinden sırasıyla 20 ̊C geceboyu ve 25 ̊C 6 saat indüksiyon olarak belirlenmiştir.
Rekombinant proteinler, kırılma ürünü olduğu düşünülen ve TIR domain moleküler ağırlığına denk gelen bir proteinle beraber nikel afinite kromotograsisi ile saflaştırılmıştır. Jel filtrasyon kromotografisi ile oligomerik yapısı incelenmiş ve 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, %10 gliserol, 10 mM DTT tamponuyla yapılan jel filtrasyon kromotografisi ile protein monomerik formda elde edilmiştir. 
Elde edilen deneysel sonuçlar, biyoinformatik analizler; çoklu dizi hizalamaları ve protein yapısı modelleri ile desteklenmiş ve probiyotik bakteri TIR domain proteinlerinin yapısal olarak TIR domain protein özelliklerine sahip oldukları bu tez çalışması ile gösterilmiştir.

Abstract:
Studies on probiotics which have immunomodulatory properties, show that probiotics produce molecules which can affect the immune system. In this interaction, Toll like receptors (TLR) on cell surface are also thought to play a role. Several bacterial TIR domain proteins structurally mimic the human adaptor TIR domain proteins and they manipulate the immune response by altering the signal transduction.
Following these, the presence of probiotic TIR domain proteins was searched using bioinformatics tools. A putative TIR domain sequence in the genome of Bifidobacterium breve was found. In this thesis, cloning, recombinant production and purification of putative TIR domain protein from B. breve (BbTIR) was investigated.
It has been confirmed by bioinformatics methods that BbTIR contains conserved TIR domain patterns by multiple sequence alignments.  bbtir gene was cloned into pETM11-SUMO3GFP and pET151/D-TOPO vectors. Protein expression from different cells and induction conditions were tested for optimum recombinant protein production. 6his-BbTIRV1 and 6his-BbTIRV2 protein was achieved from Rosetta 2 cells at 20 ̊C with overnight and 25 ̊C for 6 hours with 1 mM IPTG induction respectively.
The recombinant proteins were purified by nickel affinity chromatography together with a protein which is thought to be a cleavage product and is equal to the moleculer weight of the TIR domain. The oligomeric structure was examined by gel filtration chromatography and protein was obtained in monomeric form in 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 10 mM DTT buffer.
Experimental results were supported by alignments and protein structure models from bioinformatics analyzes verifying the presence of probiotic TIR domain proteins with TIR domain structures.