Kekik ve kakule esansiyel yağlarının antifungal etkisinin araştırılması
Investigation of antifungal effect of thyme and cardamom essential oils
Yazar: HİLAL NUR YAVUZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. HATİCE FUNDA KARBANCIOĞLU GÜLER
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Kakule = Cardamom ; Kekik = Thyme ; Uçucu yağlar = Essential oils

Özet:
Mikotoksinler, bazı küfler tarafından üretilen gıdalarda yaygın olarak bulunan düşük molekül ağırlıklı ikincil metabolitlerdir. İnsan ve hayvan sağlığını tehdit etmeleri ve ekonomik kayıp meydana getirmeleri bakımından önemlidirler. 
Okratoksin A (OTA) Aspergillus ve Penicillium türleri tarafından üretilen önemli bir mikotoksindir. A. carbonarius, Aspergillus section Nigri üyelerinden olup okratoksin A üreticisi küflerden biridir. Son yıllarda dünya genelinde insan ve hayvan sağlığı için tehlike arz ettiğinden OTA'ya yönelen dikkat artmıştır.
Mikrobiyal kontaminasyonun gıda kaynaklı hastalıklara yol açması ve gıdaların raf ömrünü düşürmesinden dolayı gıda güvenliği açısından önemli bir meseledir. Tüketiciler doğal, fazla işlem görmemiş, en az seviyede kimyasal koruyucu içeren gıda istemektedirler. Esansiyel yağlar doğal olmaları ve toksik olmamalarından dolayı doğal antimikrobiyal maddeler olarak kullanılmaktadırlar. Genel olarak, esansiyel yağlar küflerde misel büyümesini geciktirerek mikotoksin üretimini azaltmaktadırlar.
Yapılan çalışmada Ege Bölgesi'nden toplanan kuru incirlerden izole edilen üç adet Aspergillus carbonarius (35-03X1, 39-04X4, 57-03D1) izolatının kekik (0,01; 0,03; 0,06; 0,09; 0,12; 0,15 µg/mL) ve kakule (0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5; 1,8; 2,1; 2,4; 3 µg/mL) esansiyel yağları ilave edilmiş ortamlarda gelişme ve 7, 10, 14 günlük inkübasyon sürelerinde OTA oluşturma özellikleri 0,97 su aktivitesinde ve 30°C'de araştırılmıştır. Çalışmada kullanılan kekik ve kakule esansiyel yağları yapılan ön deneme çalışmasında Aspergillus carbonarius'a karşı etkileri göz önünde bulundurularak seçilmiştir. İzolatların gelişme hızları Baranyi modeli ile hesaplanmıştır. A. carbonarius izolatlarının okratoksin A üretimleri mikotoksin ekstraksiyonu yapıldıktan sonra yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile belirlenmiştir. 
A. carbonarius 3904-X4 izolatının gelişimine karşı en yüksek inhibisyon zonlarını kekik ve mercanköşk esansiyel yağları, en düşük inhibisyon zonunu zencefil esansiyel yağı göstermiştir. 2,5 µL kekik ve mercanköşk esansiyel yağı kullanımda A. carbonarius 3904-X4 izolatı tamamen inhibe olmuştur.
35-03X1 ve 57-03D1 izolatları 0,09 µg/mL kekik esansiyel yağı konsatrasyonunda tamamen inaktive olurken, 3904-X4 izolatının tamamen inaktivasyonu 0,12 µg/mL konsantrasyonda kekik esansiyel yağı kullanımında gerçekleşmiştir. 35-03X1 ve 57-03D1 izolatları 0,6 µg/mL konsantrasyonda kakule esansiyel yağında tamamen inhibe olurken, 3904-X4 izolatı 0,9 µg/mL kakule esansiyel yağında konsantrasyonda tamamen inhibe olmuştur.
Kekik esansiyel yağı kakuleye göre daha yüksek antifungal etki göstermiştir. En düşük minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) 0,09 µg/mL kekik ve 0,6 µg/mL kakule esansiyel yağı ilavesinde elde edilmiştir. Her iki esansiyel yağ için en yüksek MİK değeri 3904-X4 izolatına karşı belirlenmiştir. Kekik için en yüksek MİK değeri 0,12 µg/mL ve kakule esansiyel yağı için 3,0 µg/mL olarak bulunmuştur.  Minimum fungisidal konsantrasyon (MFK), yapılan çalışmada tüm yağlar ve izolatlar için MİK değerlerine eşit olarak belirlenmiştir. 
Kontrole göre izolatlar karşılaştırıldığında 0,01 µg/mL kekik esansiyel yağının kullanımında en hızlı gelişmeyi 3904-X4 izolatı göstermiştir. Bu izolatı sırasıyla 57-03D1 ve 35-03X1 izolatları takip etmiştir. İstatistiksel analiz sonuclarına göre de 3904-X4 ve 57-03D1  izolatlarına karşı 0,01 µg/mL konsantrasonunda yağ ilavesinin etkisi kontrolle aynı iken 35-03X1  izolatı için kontrolden farklıdır . 3904-X4 ve 57-03D1  kodlu izolatlar için yağın etkisi 0,03 ve daha yüksek konsantrasyonlarda  kontrolden farklıdır. 
Kakule esansiyel yağının Aspergillus carbonarius izolatlarına karşı inhibisyon etkisi kekik esansiyel yağına karşı daha düşüktür. Kakule esansiyel yağı için en düşük gelişme hızı 1,05 mm/gün ile 57-03D1 izolatına karşı 1,2 µg/mL konsatrasyonda yağ kullanımında belirlenmiştir.
57-03D1 izolatı OTA üretimi bakımından kekik ve kakule esansiyel  yağına karşı diğer izolatlardan daha dirençlidir. Kekik esansiyel yağı 3904-X4 izolatının OTA üretimi, çalışılan konsantrasyonlarda tamamen engellemiştir. Toksin varlığının belirlendiği durumlarda okratoksin A varlığı kontrole göre % 26,5- 99,83 arasında azalma göstermiştir.
Çalışmada literatür bulgularına benzer olarak 3904-X4 izolatının kekik ve kakule esansiyel yağları bulunan ortamlarda diğer izolatları göre daha iyi gelişme gösterdiği belirlenmiştir.

Abstract:
Countless pests and diseases threat foods around the world. Most of them are related to pathogenic fungal diseases. Worldwide, post harvest losses have been estimated at 50% because of fungal and bacterial infections. Fungal growth on fresh fruits and vegetables is responsible for food spoilage. 
Moulds are immanent biological agents that are able to colonize foods because of their potential to synthesize a wide variety of hydrolytic enzymes. They cause pathologic disorders in plants bringing serious economic losses for food producers. Mould growth depends on factors such as pH, water activity (aw), solute concentration, temperature, atmosphere, time, etc. Rhizopus, Aspergillus and Penicillium species cause reduction of shelf life, decrease of quality and rapid deterioration of fruits and vegetables especially after harvesting.  Aspergillus species have long been known to be common contaminants of human foods and animal feeds. The occurrence of Aspergillus in foods and feeds is dependent on the substrate and environmental factors.
Mycotoxins, low molecular weight secondary metabolites, are produced by various fungi especially genus of Aspergillus, Penicillium, Fusarium. The primary mycotoxins are aflatoxins, ochratoxins, zearalenone, fumonisin, and patulin. Mycotoxins are hazardous to human and animal health due to the carcinogenic, mutagenic, teratogenic, lethal effect. Their activity depends on the type of toxin and their concentration in the food. Poor storage and tropical climate are the suitable environmental conditions that support mould growth and mycotoxin production.
Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin commonly present in grapes, cereals, species, coffee, cocoa. It is a toxic metabolite produced by several fungi of the genera Aspergillus and Penicillium, mainly produced by Penicillium verrucosum, P. nordicum, Aspergillus niger, A. ochraceus and A. carbonarius under different environmental conditions. Some of the factors that influence growth and production of Aspergillus toxins are temperature, pH, moisture, antifungal agents and type of substrate. OTA in cereals is mainly produced by Penicillium verrucosum while OTA on grapes, coffee and cocoa is formed by Aspergillus carbonarius. Ochratoxin A has been classified as possible human carcinogen by International Agency for Research on Cancer (IARC). 
In recent years, consumers' choices are moving towards foods that contain lower levels of chemical preservatives and exhibit more fresh-like and natural characteristics. Traditional medicine, particularly herbal medicines, has increased considerably in both developed and developing countries. Global and national markets for medicinal herbs have been growing rapidly and significant economic incomes are being realized.
Investigations have turned to the study of natural antifungals such as essential oils. Essential oils are aromatic, volatile, natural oily liquids obtained by hydrodistillation from plant material and are usually mixtures of several components. They are easily decomposed, environmentally friendly and non toxic. Their natural antimicrobial activity is commonly related to the chemical structure of their components, the concentration in which they are present, and their interactions, which can affect their bioactive properties. The mechanisms of action essential oils can be explained by changes in permeability of cell membranes, granulation of the cytoplasm and cytoplasmic membrane rupture. Temperature, pH, water activity (aw), medium conditions and the microorganism involved may influence the stability of the antifungal activities of essential oils. 
The aim of this study was to determine the effect of thyme essential oil (0.01; 0.03; 0.06; 0.09; 0.12; 0.15 µg / mL) and cardamom essential oil (0.3; 0.6; 0.9; 1.2; 1.5; 1.8; 2.1; 2.4; 3 µg / mL) on growth and ochratoxin A production by three isolates (35-03X1, 3904-X4, 57-03D1)  of Aspergillus carbonarius isolated from dried figs collected from the Aegean region. Thyme and cardamom essential oils were selected aganist to the effects of Aspergillus carbonarius The plates incubated at 30°C and 0.97 water activity. OTA production was determined after 7, 10 and 14 day of incubation at each value of essential oils and concentrations. The growth of fungi evaluated by daily measurement of the colony diameter (mm). Growth rates were calculated with primary model of Baranyi. OTA detection and quantification carried out by high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection after extraction with methanol.
Thyme and origanum essential oils demonstrated the highest inhibition zones and ginger essential oil showed lowest inhibition zones of against development of A. carbonarius 3904-X4 isolate.  A. carbonarius 3904-X4 isolate has been completely inhibited by using 2.5 µL thyme and origanum essential oils.
A. carbonarius 35-03X1 and 57-03D1 isolates completely inactivated 0.09 µg/mL while 3904-X4 isolate inactivated 0.12 µg/mL of thyme essential oil. Complete inactivation for A. carbonarius 35-03X1 and 57-03D1 isolates was provided as 0.6 µg/mL concentration of cardamom essential oil. A. carbonarius 3904-X4 isolate inactivated at 0.9 µg/mL concentration of cardamom essential oil.
Thyme essential oil demonstrated higher antifungal effect than cardamom essential oil. The lowest minimum inhibitory concentration (MIC) was obtained from 0.09 µg/mL thyme ve 0.6 µg/mL cardamom essential oils. The highest MIC values were determined for bothof them against the A. carbonarius 3904-X4 isolates. The highest MIC values for thyme and cardamom essential oils were 0.12 µg/mL and 3.0 µg/mL, respectively. In this study, the minimum fungicidal concentration (MFC) values were determined as equal to MIC values for all oils and isolates.
According to control, A. carbonarius 3904-X4 isolate showed rapid development by using 0.01 µg/mL thyme essential oil. This isolate was followed by A. carbonarius 35-03X1 and 57-03D1 isolates respectively. The results of statistical analysis, 0.01 µg/mL concentration thyme essential oil had same effect with control, different effect with 35-03X1 isolate. The effect of thyme essential oil is different from the control at 0.03 µg/mL and higher concentrations for the A. carbonarius 3904-X4 and 57-03D1 isolates. 
Inhibitory effect of cardamom essential oil against isolates of Aspergillus carbonarius is lower than thyme essential oil. The lowest growth rate for cardamom essential oil was determined 1.05 mm/day 1.2 µg/mL concentration oil against 57-03D1 isolate.
A. carbonarius 57-03D1 isolate was resistant than other isolates against the thyme and cardamom essential oils of the OTA production. Thyme essential oil was completely prevented OTA production in the studied concentrations. In cases where the presence of toxin, OTA production decreased between 26.5- 99.83 %  compared to the control.
In this study 3904-X4 isolate was showed better development than other isolates in the thyme and cardamom essential oils analogously to literature findings.