Klinik apse örneklerinde anaerob mikroorganizmaların araştırılması
Investigation of anaerobic microorganisms in clinical abscess samples
Yazar: MEHTAP OSKAY
Danışman: DOÇ. DR. FATMA MUTLU SARIGÜZEL
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Temel Tıp Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Abseler = Abscess ; Bakteriler-anaerobik = Bacteria-anaerobic

Özet:
Amaç: Apseler sıklıkla endojen floranın steril bir vücut bölgesine transportuyla oluşan lokalize ve sıklıkla polimikrobiyal enfeksiyonlardır. Preanalitik ve analitik süreçlerde optimizasyonun sağlanamaması özellikle apse gibi polimikrobiyal örneklerde mikrobiyal çeşitliliğinin eksik tanımlanmasına neden olabilmektedir. Çalışmamızda, klinik apse örneklerinden konvansiyonel ve yeni nesil dizileme (YND) yöntemleri kullanılarak anaerob mikroorganizmaların tanımlanması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Laboratuvarımıza çeşitli kliniklerden gönderilen 60 apse örneği çalışmaya dahil edildi. Örneklerin Gram boyaması, aerob ve anaerob bakteri kültürü yapılarak üremesi olan bakteri kolonileri MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Almanya) ile tanımlandı. Mikoloji kültürü sonucu üremesi olan kolonilerinin tanımlanmasında germ tüp testi, üre testi ve karbonhidrat asimilasyon testleri yapıldı. Örnek miktarı yeterli olan 21 örnek Mycobacterium spp. için asido rezistan boyama (ARB) ve uygun besiyerlerine ekimleri yapıldı. Moleküler çalışmalar için örnekten DNA izolasyonunu takiben hedef gen bölgesi olan 16S rRNA geni V3-V4 bölgesi amplifiye edilerek Miseq (İllumina, ABD) platformunda YND işlemi yapıldı. Dizilerin analizleri için QIIME boru hattı (pipe-line) kullanıldı. Bulgular: Klinik örnekler baş boyun (17), beyin (9), batın içi (9), psoas (6), perirenal (3), akciğer (3), aksiller (3), anal (3), mediastinal (1), cilt (1), pelvik (1), skrotum (2), protez çevresi (1), spinal-torakolomber (1) bölgelerden alınan apselere aitti. Tüm örneklerin 18'inde Gram boyamada mikroorganizma görülürken 30'unda kültür yöntemleri ile üreme görülmüştür. Polimikrobiyal üreme olan 10 örnekte, 20 aerob bakteri ve 3 mantar suşu izole edilirken; monomikrobiyal üreme olan 20 örnekte ise 6 anaerob, 14 aerob bakteri izole edilmiştir. Kültür yöntemi ile üremesi olan örneklerden toplamda 43 suş (15 cins, 22 türde bakteri, 3 farklı türde mantar, 5 Mycobacterium tuberculosis complex) izole edilmiştir.
Örnekler kültürde üreme durumlarına göre iki gruba ayrılmıştır (grup A: üreme olan; grup B: üreme olmayan). Örneklerin laboratuvara ulaşma süreleri açısından A ve B grupları arasında istatistiksel anlamlı fark bulunmuştur (p<0.001). Anaerob kültür istemi olan 22 örneğin 7'sinde anaerob bakteri izole edilirken, üreme olan ve olmayan grupların laboratuvara ulaşma süreleri açısından istatistiksel anlamlı fark bulunmuştur (p:0.035).
Yeni Nesil Dizileme sonucunda 60 örnekten toplamda 110 Operasyonel Taksonomik Ünite (OTU) tanımlanmıştır. Bağıl bollukları en yüksek olan iki cins Fusobacterium sp. ve Prevotella sp olarak tanımlanmıştır. Gruplar için oluşturulan OTU tablosunda A grubunda Bacteroidetes,
viii
Firmicutes ve Fusobacteria bağıl bollukları B grubundan belirgin olarak yüksek bulunmuştur. B grubunda ise standart kültür yöntemiyle izolasyonu yapılamayan Chlamydia sp. ve Mycoplasma sp. gibi bakterilerin bulunduğu Chlamydiae ve Tenericutes bağıl bollukları yüksek oranda tespit edilmiştir. Gruplar arası beta çeşitlilik bray-curtis metriğine göre hesaplanarak anlamlı fark bulunmuştur (p<0.05).
Örneklerin 55'inde birden fazla kültürlenebilir bakterilere ait genetik materyal tespit edilmiştir. Yeni nesil dizileme ile örneklerin 55'inde en az bir anaerob bakterinin genetik materyali gösterilmiştir. Kültür yönteminde izole edilen suşlar ile YND de belirlenen genetik materyal uyumu %80 (24/30) bulunmuştur. Bu 24 örneğin 14'ünde (%58) kültür sonuçlarının baskın OTU'lara karşılık geldiği belirlenmiştir. Kültür yöntemi ile Mycobacterium tuberculosis complex (4), Escherichia coli (1), Streptococcus sp. (1) izole edilen 6 örneğin YND sonucunda bu bakteriler tespit edilememiştir.
Sonuç: Çalışmamız sonucunda konvansiyonel ve YND yöntemleri birlikte kullanılarak klinik apse örneklerinin 55'inde en az bir anaerob mikroorganizma ve örneklerin tamamında en az bir patojen mikroorganizma varlığı tespit edilmiştir. Apse etiyolojisinin araştırılmasında konvansiyonel ve YND yöntemlerinin birlikte kullanılmasının başarıyı artırdığı görülmüştür ancak daha büyük örnek gruplarının olduğu daha kapsamlı çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir.
Anahtar kelimeler: Anaerob, Apse Etiyolojisi, PZR, Yeni Nesil Dizileme

Abstract:
Aim: Abscesses are localized and often polymicrobial infections that occur by the transport of endogenous flora to a sterile body area. Failure to optimize preanalytical and analytical processes may lead to incomplate identification of microbial diversity, especially in polymicrobial samples such as abscesses. In our study, we aimed to identify anaerobic microorganisms from clinical abscess samples using conventional and next generation sequencing (NGS) methods.
Materials and Methods: Sixty abscess samples sent to our laboratory from various clinics were included in the study. The samples were Gram staining, aerobic and anaerobic bacterial cultures were performed and the colonies of the bacteria were identified by MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Germany). Germ tube test, urea test and carbohydrate assimilation tests were performed for identification of colonies grown in mycological culture. The 21 samples with enough sample volume were stained with acid-resistant staining (ARB) and cultured in appropriate media for Mycobacterium sp. For molecular studies, following DNA isolation from the sample, 16S rRNA gene V3-V4 that is the target gene region was amplified and NGS was performed with the Miseq (Illumina, USA) platform. QIIME pipe-line was used for sequence analyses.
Results: Clinical specimens belonged to abscesses from the head and neck (17), brain (9), intra-abdominal (9), psoas (6), perirenal (3), lung (3), axillary (3), anal (3), mediastinal (1), skin (1), pelvic (1), scrotum (2), prosthetic joint (1), spinal-thoracolumbar (1). Microorganisms were detected by Gram staining in 18 of the samples and 30 of them grew in culture. While 20 aerobic bacteria and 3 fungal strains were isolated in 10 samples with polymicrobial growth, 6 anaerobic and 14 aerobic bacteria were isolated in 20 samples with monomicrobial growth. A total of 43 strains (15 genera, 22 species of bacteria, 3 different species of fungi, 5 Mycobacterium tuberculosis complex) were isolated from the samples with culture methods.
The samples were divided into two groups according to their growth in culture methods (group A: with growth; group B: without growth). There was found a statistically significant difference between groups A and B in arrival times of the samples to the laboratory (p<0.001). Anaerobic bacteria were isolated in 7 of 22 samples for which anaerobic culture was requested, and a statistically significant difference was found between the groups with and without growth in arrival times of the samples to the laboratory (p:0.035).
x
From 60 samples, 110 Operational Taxonomic Units (OTUs) were identified by Next Generation Sequencing. Fusobacterium sp. and Prevotella sp. were the two genera with the highest relative abundances. In the OTU table created for the groups, the relative abundances of Bacteroidetes, Firmicutes and Fusobacteria in group A were significantly higher than group B. In group B, the relative abundances of Chlamydiae and Tenericutes, including bacteria such as Chlamydia sp. and Mycoplasma sp., which could not be isolated by standard culture method, were high in group A. Beta diversity between the groups was calculated using the Bray-Curtis metric and there was found a significant difference (p<0.05).
Multiple culturable bacteria was detected in 55 of the samples. Sequence analysis identified at least one anaerobic bacteria in 55 of the samples. The concordance between the strains isolated in the culture method and the NGS results was 80% (24/30). In 14 (58%) of these 24 samples, culture results correlated with dominant OTUs. Mycobacterium tuberculosis complex (4), Escherichia coli (1), Streptococcus sp. (1) were isolated by culture method and these bacteria could not be detected by NGS.
Conclusion: As a result of our study, we were identified at least one anaerobic microorganism in 55 of the clinical abscess samples and at least one pathogenic microorganism in all of the samples by using conventional and NGS methods together. It has been observed that the use of conventional and NGS methods together in the detection of abscess aetiology increases the success, but it is necessary to be supported by more comprehensive studies with larger sample groups.
Key words: Anaerobes, Abscess Etiology, PCR, Next Generation Sequencing