Theılerıa annulata'nın laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin analizi
Analysis of gene from theileria annulata coding lactate dehydrogenase enzyme
Yazar: BELMA NURAL
Danışman: PROF. DR. DİLEK BALIK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; L-laktat dehidrogenaz = L-lactate dehydrogenase ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production

Özet:
Yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı multidispliner yaklaşımlardan oluşan bir tekniktir. Bu teknik kullanılarak enfeksiyonların ve hastalıkların moleküler seviyede kontrolü sağlanmaktadır. Enzimler biyokimyasal reaksiyonlarda sahip oldukları önemli roller ve aktif ceplerine bağlanan küçük moleküller dolayısıyla yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı için mükemmel ilaç hedeflerinden biridir.  Theileria annulata sığırlarda theileriosis hastalığına neden olan bir parazittir. Parazitin kullanılan ilaçlara karşı gösterdiği direncin rapor edilmesiyle yeni ilaçların tasarlanması için yeni yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. 
Bu tez çalışmasında parazitin biyokimyasal yolağında önemli bir enzim olan laktat dehidrogenaz enzimi yapıya dayandırılmış ilaç tasarım çalışmalarında hedef biyomolekül olarak seçilmiştir. Açık okuma çerçevesinde iki intron içeren Theileria annulata 'nın laktat dehidrogenaz enzimi daha önceki çalışmamızda klonlanmıştır.
Bu çalışmada iki intron PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez yöntemi ile uzaklaştırılarak pLATE31 vektörüne klonlaması yapılmış ve E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Yapılan kinetik analiz, SDS-PAGE ve Western Blot teknikleri ile proteinin inaktif formda olduğu gösterilmiştir.  Dizilemesi yapılan gende bir tanesi yüksek derecede korunmuş nükleotid bağlanma bölgesinde bulunan iki mutasyon gözlenmiştir. Yabanıl hale dönüştürülmesi için yönlendirilmiş mutagenez yöntemi kullanılarak gen dizisinde değişiklikler yapılarak mutasyonlar uzaklaştırılmıştır. Düzeltilen gen aynı ifade vektörüne klonlanmıştır. Çözülebilir formda elde edilen protein afinite kromatografisi ile saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ile yüksek konsantrasyonda saf protein elde edildiği gösterilmiştir (≥95). Kinetik deneylerde kullanılması için optimum pH değeri belirlenmiş ve stabil olduğu sıcakların gösterildiği termostabilite deneyi yapılmıştır. Kinetik analiz farklı pirüvat konsantrasyonları kullanılarak pH değeri 7,5 olan tamponda 25oC'de UV visible Spektrofotometre 'de ölçüm alınarak gerçekleştirilmiştir. Pirüvat için KM değeri 0,1324 mM; Vmax değeri 0,2304 ve substrat inhibisyonu dolayısıyla Ki değeri 4,295 mM olarak belirlenmiştir. Parametreler Graphpad Prism 6.0 programında substrat inhibisyon modülü seçilerek elde edilmiştir. Substratın ürüne dönüşümünü veren kcat ve katalitik etkinlik değerini veren kcat/KM değerleri sırasıyla 44,55 s-1 ve 3,3693 x 105 M-1s-1 olarak hesaplanmştır. Tezin son bölümünde yapıya dayandırılmış ilaç tasarımının son aşaması olan homoloji modelleme elde edilen protein için de oluşturularak, proteinin muhtemel ilaç bağlanma bölgeleri gösterilmiştir. Yüksek saflıkta aktif protein üretilmesi ileriki inhibitör çalışmalarının uygulanmasını sağlayacaktır.

Anahtar Kelimeler: Theileria annulata, laktat dehidrogenaz, mutasyon, yönlendirilmiş mutagenez, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı, homoloji modelleme

Abstract:
Structure based drug design is a technique that consists of multidisciplinary approaches. This technique enables controlling of diseases and infections at molecular level. Enzymes are one of magnificent drug targets for structure based drug design because they have crucial role in biochemical pathways and small molecules bind to their active site to inhibit them. Theileria annulata is a parasite that causes theileriosis in cattle. Report of articles about resistance to currently available anti-theilerials requires development of new approaches to design new drugs.
 In this thesis, LDH has been chosen as a target molecule for applying structure based drug design studies as this enzyme is crucial for the anaerobic life style of parasite. LDH gene from T. annulata was cloned in our previous studies, with having two introns in open reading frame. 
In this study, these two introns were removed by site-directed mutagenesis, the gene was then inserted into vector pLATE31 and expressed in E. coli BL21 (DE3) cells.  Analysis of protein by kinetic assay, SDS-PAGE and Western blotting showed that protein was produced in inactive form. As this was not an expected result; the subcloned gene was resequenced and two mutations were observed, one of them being in highly conserved nucleotide binding domain of the protein. These mutations were removed by making exchange on the gene sequence to obtain wild type enzyme using the site-directed mutagenesis technique. The corrected gene was than subcloned into the same expression vector. After confirmation of availability of soluble active enzyme, protein was purified by affinity chromatography. Purity of protein in high concentration was evaluated by SDS-PAGE (≥95). Optimum pH of enzyme was determined prior to kinetic analysis and its thermostability was defined. Kinetic analysis was performed using different pyruvate concentrations, at pH 7,5 at 25 oC by using UV visible spectrophotometer. KM (0.1324 mM) for pyruvate, Vmax (0,2304) and Ki (4,295mM) were calculated by choosing substrate inhibition module in Graphpad Prism 6.0. kcat and  kcat/KM was found as 44,55 s-1 and 3,3693X105 M-1s-1 respectively. All kinetic results were confirmed by using a microplate spectrophotometer. In the final section of thesis homology modelling of protein was built up and possible drug binding domains were determined. Production of highly pure active protein will enable application of further inhibitor studies.  

Key words: Theileria annulata, lactate dehydrogenase, mutation, site-directed mutagenesis, structure based drug design, homology modelling