Mycobacterium tuberculosis klinik izolatlarında ilaç direncinin multipleks "Real-Time PCR" yöntemiyle saptanması
Detection of drug resistance in mycobacterium tuberculosis clinical isolates by multiplex Real-Time PCR
Yazar: FATMA NUR AKDOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. ZEYNEP SARIBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: DNA = DNA ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; Pirazinamid = Pyrazinamide ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Rifampin = Rifampin ; İlaç alerjisi = Drug hypersensitivity ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Tüberküloz (TB), tüm dünyada hala insan sağlığına en ciddi tehditlerden biridir. İlaç direncinin günden güne artması da bu durumun başlıca nedenlerindendir. İlaca dirençli TB olgularının hızlı saptanması, dirençli suşların bulaşını önlemek ve etkili tedavi rejimine başlanması açısından önemlidir. Bu çalışmanın amacı, M. tuberculosis kompleks (MTBK) izolatlarında, rifampisin (RİF), izoniazid (INH) ve etambutol (EMB) direncine neden olan mutasyonların multipleks gerçek-zamanlı PCR ve erime eğrisi analizi ile saptanmasıdır. Bu yöntem kullanılarak, RİF, INH ve EMB direncini saptamak üç PCR uygulamasıyla yaklaşık iki saatte mümkün olabilmektedir. Bu çalışmaya 50 MTBK suşu dahil edilmiştir. Çalışmada bir tüpte RİF direncini saptamak amacıyla, rpoB 81bç'lik rifampisin direncini belirleyen bölge için, iki prob kullandık (RpoP1 ve RpoP2). Diğer bir tüpte ise katG315 ve inhA promotor bölgesi için çift işaretli iki prob kullandık. EMB direncini saptamak için ise ayrı bir tüpte bir prob kullandık. Mutasyon çeşitlerini belirlemek amacıyla 16 suşa DNA dizi analizi yapılmıştır. MGIT ve dizi analizi sonucuyla karşılaştırıldığında, real-time PCR'da kullanılan dört probla rpoB, katG ve inhA bölgelerindeki mutasyonların hepsi %100 özgüllük ve %100 duyarlılıkla saptanmıştır. EMB duyarlılığını saptamada ise metodumuz %92 duyarlılık ve %97 özgüllük göstermiştir. Bu yöntem, MTBK suşlarında ilaç direncinin hızlı bir şekilde saptanmasını sağlayan yeni bir yöntemdir. Çalışmamızın diğer bir kısmında, 50 MTBK klinik izolatında pirazinamid (PZA) duyarlılığı MGIT 960 sisteminde çalışılmıştır. Aynı suşların PZA duyarlılığı, 0,5 ml yerine 0,25 ml yarı hacimde inokulum konulmasıyla tekrar edilmiştir. İlk yapılan testin sonuçlarına göre 41 suş PZA dirençli çıkmıştır. Yarı hacimle çalışılan testin sonucunda ise, dirençli olan örneklerden 2 tanesi duyarlı bulunup, kalan 39 tanesi yine dirençli bulunmuştur. MGIT 960 PZA testi %5 farklı pozitif sonuç vermektedir. Sonuçlarımızın desteklenmesi için ileri çalışmalara gereksinim vardır.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is stil one of the most serious threats to human health around the world. Increasing of the drug resistance is one of the main cause of this state. Early diagnosis of drug-resistant TB cases is urgently needed to prevent the transmission of resistant strains and to optimize treatment regimens. The purpose of this study is to detect the mutations causing resistance to rifampicin (RIF), isoniazide (INH) and ethambutol (EMB) in M. tuberculosis complex (MTBC) isolates by using multiplex real-time PCR and melting curve analysis. By using this method, resistance to RIF, INH and EMB can be detected by three PCR assays in just two hours. In this study 50 MTBC strains were included. For detection of RIF resistance we used two probes (rpoP1 and rpoP2) for rpoB 81-bp RIF resistance determining region in a tube. For detection of INH resistance, we used two dually labeled probes for katG315 and inhA promoter sides in a tube. For detection of EMB resistance, we used one probe in another tube. For detecting the mutation types, DNA sequencing procedure was performed for 16 isolates. Comparision of the results with MGIT and sequencing data showed that all mutations in rpoB, katG and inhA covered by this four probes were detected with 100% sensitivity and 100% specifity. For detecting EMB resistance, our method showed 92% sensitivity and 97% specificity. This method provided a new way to rapidly detect drug-resistant mutations in MTBC. On the other hand, the susceptibility of 50 clinical isolates of MTBC to pyrazinamide (PZA) was assessed by the MGIT 960 system. Detection of PZA resistance was followed by a repeat testing using a reduced inoculum of 0.25 ml instead of 0.5 ml. According to the first MGIT 960 analysis, resistance was observed in 41 samples. In the reduced inoculum assay, 2 samples turned out to be susceptible and 39 proved to be resistant (5% different results). Further studies are required to confirm our findings.