Farklı prostat kanseri hücre hatlarında epibrassinolidle tetiklenen apoptotik süreçte poliaminlerin rollerinin araştırılması
Investigation of the roles of polyamines in epibrasinolide-induced apoptosis in various prostate cancer cell lines
Yazar: PINAR OBAKAN
Danışman: PROF. DR. ŞEHNAZ BOLKENT
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Dünyada prostat kanseri, erkeklerde kansere bağlı ölüm nedenleri arasında ikinci sırada yer almaktadır. Prostat bezi tüm insan vücudunda en fazla poliamin konsantrasyonunun bulunduğu dokudur. Poliaminler (PA?lar) prostat kanserinde kan dolaşımında artan miktarlarda bulunmakta ve bu nedenle prostat kanseri gelişiminde biyobelirteç olarak belirtilmektedirler. PA?lar, amin türevli organik bileşenler olup, hücre çoğalması ve büyümesindeki rolleri ile bilinmektedirler. Bu nedenle tümör hücrelerinde poliamin miktarının azaltılması son zamanlarda terapötik yaklaşımlardan biri olmuştur. Birçok kemoterapötik maddenin poliamin katabolizmasını tetiklediği ve reaktif oksijen türlerinin yan ürün olarak açığa çıkmasını sağladığı, aynı zamanda hücre içi poliamin seviyelerini düşürdüğü ve apoptoza neden olduğu çeşitli tümör modellerinde gösterilmiştir. Epibrassinolid (EBR), bitki büyüme düzenleyicileri olan brassinostreroidlerinlerin biyolojik olarak aktif bir üyesi olup, son yıllarda tümör oluşturmayan hücrelere etki etmeksizin, farklı kanser hücrelerinde apoptozu tetikleyen bir madde olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte moleküler mekanizması tam olarak bilinmemektedir.

Bu çalışma kapsamında EBR?nin apoptotik etkisi androjen reseptör (AR) pozitif LNCaP ve AR negatif DU145 prostat kanseri hücre  hatlarında, hücre canlılığının tayini, mitokondri membran potansiyeli kaybı, DNA kırıkları oluşumu parametreleri ile incelenmiş, aynı zamanda kaspaz ve Bcl-2 protein aileleri üyelerindeki ifade değişimleri immunoblotlama yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. EBR uygulaması ile hücre döngüsündeki değişimler akım sitometrisi ve immunoblotlama yöntemleri ile belirlenmiştir. Poliamin biyosentez ve katabolik enzimlerinde EBR ile tetiklenen değişimler immunblotlama ve eş zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu yöntemleri ile ortaya koyulmuştur. Bunun yanı sıra, EBR ile tetiklenen apoptotik süreçte poliaminlerin ve androjen reseptörünün rolleri ise katabolik enzimlere ve androjen reseptörüne özgü siRNA?lar ile gen sessizleştirmesi gerçekleştirildikten sonra hücre canlılığı tayini ve DNA kırıklarının ELİZA yöntemi ile incelenmesi sonucu ortaya koyulmuştur.

EBR uygulaması her iki hücre hattında da hücre canlılığında kayba, mitokondri ile ilişkili, kaspaz-bağımlı apoptozun tetiklenmesine neden olmuştur. Aynı zamanda prostat kanseri hücrelerinde, EBR hücre döngüsünü düzenleyen proteinlerin anlatımlarında değişiklikler yaratarak hücre döngüsünün durmasına neden olmuştur. Bunun yanı sıra, LNCaP hücrelerinin, DU145 hücrelerine oranla EBR?ye karşı daha duyarlı oldukları saptanmıştır. Bu farklı etkinin nedeni EBR?nin PA biyosentetik ve katabolik enzimlerinin EBR ile etkileşimi kapsamında araştırılmış ve LNCaP hücrelerinde poliamin metabolik enzimlerinin anlatımlarındaki değişimlerin EBR ile tetiklenen apoptozda önemli olduğu saptanmıştır. Poliamin katabolik enzimlerinin aktivitesini hedef alan inhibitör varlığında veya söz konusu enzimlerin anlatımlarının geçici olarak susturulması ile LNCaP hücrelerinde EBR ile tetiklenen apoptozun engellendiği saptanmıştır. EBR?nin steroid türevli bir molekül olması dolayısı ile AR ile olan ilişkisi, her iki hücre hattının AR bakımından farklı genomik özelliğinden yararlanılarak, AR susturulması yöntemi ile incelenmiş ve AR?nin EBR ile tetiklenen apoptozda fonksiyonel olduğu saptanmıştır. Tüm bu sonuçlar, EBR?nin terapötik etkinliğinin belirlenmesinde bilgi verme ve diğer moleküler yolaklarla olan ilişkinin aydınlatılmasında bir başlangıç niteliği taşımaktadır.

Abstract:
Prostate cancer is the second leading cause of cancer-related death among men, in the worldwide. Prostate gland has the highest polyamine concentrations of any tissue in human body. Their levels were found increased in blood flow during prostate cancer, therefore they have been indicated as biomarkers for prostate cancer development. Polyamines (PAs), amine-derived organic compounds, are known for their role in cell proliferation and growth. Therefore reducing polyamine contents in tumor cells is one of the recent theurapeutic approaches. Recently many chemotherapeutic agents have been demonstrated to induce polyamine catabolism with the generation of reactive oxygen species (ROS) as by-products, deplete intracellular PA levels and cause apoptosis in different tumor models.  Epibrassinolide (EBR) a biologically active member of the brassinosteroids, plant growth regulator family, has been recently indicated as an apoptotic inducer in various cancer cells without affecting non-tumor cell growth. However, the precise molecular mechanism of EBR is not entirely understood. 

In this study, the apoptotic effect of EBR was investigated in androgen receptor (AR) positive LNCaP and AR negative DU145 prostate cancer cell lines by relative cell viability, mitochondria membrane potential loss determinations and the formation of DNA fragmentation. In addition, the changes in the expression profiles of caspases and Bcl-2 family members were detected by immunoblotting method. The cell cycle profile changes in response to EBR treatment were investigated by fluorescence-activated cell sorter and immunoblotting methods. The polyamine biosynthetic catabolic enzymes alterations following EBR treatment were determined by immunoblotting quantitative real-time polymerase chain reaction methods. Additionally, the roles of polyamines and AR in EBR-induced apoptosis were shown by cell viability determination and DNA fragmentation profiles by ELİSA method after the gene silencing procedure using specific siRNAs.

We aimed to determine the potential apoptotic effect of EBR related with PA metabolism in androgen-dependent LNCaP, androgen-independent DU145 prostate cancer cells in this study. EBR treatment induced cell viability loss, mitochondria-mediated and caspase-dependent apoptosis in both prostate cancer cell lines. EBR also affected the expression levels of cell cycle regulatory proteins and caused cell cycle arrest in prostate cancer cells.  However, LNCaP cells were found more sensitive to EBR than DU145 cells. The reason of the different responses against EBR was investigated by targeting polyamine biosynthetic and catabolic enzymes. We concluded that the changes of protein expression levels of polyamine metabolic enzymes are critical in EBR-induced apoptosis in LNCaP cells. 
We determined that in the presence of polyamine catabolic enzymes inhibitor or siRNAs, the apoptotic response against EBR was prevented in LNCaP prostate cancer cells. Since EBR is a steroid-derived molecule, its ability to induce apoptosis in relation with the androgen receptor was investigated due to the different genomic characterization of two cell lines in terms of active AR status. AR silencing method showed that AR is functional in EBR-induced apoptosis in LNCaP prostate cancer cell line. All these results highlighted the therapeutic efficiency of EBR as well as constituted an introduction to enlight the relation of EBR with other molecular pathways.