JAK2V617F mutasyonunun endotel hücre fonksiyonları üzerindeki etkisinin epigenetik açıdan değerlendirilmesi
The epigenetic evaluation of the effect of JAK2V617F  mutation on endothelial cell functions
Yazar: AHMET GÖKSU
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SELÇUK SÖZER TOKDEMİR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Endotelyum = Endothelium ; Genetik = Genetics ; JAK 2 = JAK 2 ; Janus kinaz 2 =   ; Lentivirüs enfeksiyonları = Lentivirus infections ; Miyeloproliferatif hastalıklar = Myeloproliferative disorders ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Amaç. Miyeloproliferatif Neoplaziler (MPN) oldukça sık görülen ve ölümle sonuçlanan hastalıklardır. JAK2V617F mutasyonu MPN' leri anlamamızı kolaylaştırsa da hastalığın patolojik gelişiminde hala birçok soru işareti vardır. Trombotik vakaların birçoğunda JAK2V617F mutasyonunun saptanması endotel hücreleri ile olan ilişkisini sorgulatmaktadır. Ayrıca epigenetik faktörlerin MPN' deki etkisi de bilinmemektedir. Bu çalışma ile JAK2V617F mutasyonunun endotel hücrelerinde (EH) yapmış olduğu etkileri ve mutasyonun EH' deki, epigenetik açıdan önemli olan, SOCS metilasyonları incelenmiştir.
Yöntem. JAK2V617F mutasyonuna sahip ve normal JAK2 geni içeren, GFP taşıyan lentiviral vektörler HUVEC hücre hattına enfekte edilmiştir. Akış sitometrisi cihazı ile GFP tespit edilmiş ve analizleri yapılmıştır. Belli bir GFP yüzdesine sahip hücre populasyonunun genomik DNA sı izole edilmiştir. Bisülfit modifikasyona maruz bırakılan DNA kullanılarak metilasyon sipesifik PZR (MSP) yapılmıştır.
Bulgular. Farklı transfeksiyon ajanları arasında en verimli ürünün Lipofectamine olduğu tespit edildi. Lentiviral vektörlerin birbiri ile ve enfekte olmayan EH' leri ile kıyaslanması sonucu morfolojik bir farklılık saptanmadı. Enfekte ve enfekte olmayan EH' lerin canlılık oranlarında bariz bir farklılık gözlenmedi. Enfekte edilen ve enfekte edilmeyen EH' ler arasında, SOCS-1 hariç, bir farklılık gözlenmeksizin hepsinin unmetile bir görüntü sergilediği tespit edilmiştir.
Sonuç. Lentiviral vektörlerle enfekte olan ve olmayan EH' lerin morfolojilerinde ve canlılık oranlarında bir farklılık saptanamamıştır. SOCS4 metilasyonu literatürde EH' de ilk defa bakılmıştır. Enfekte EH' lerdeki SOCS1,2,3 genlerin metilasyon görünümü ile MPN hastalarının kan hücrelerindekine paralel bir benzerlik yakalanmamıştır. Bu çalışma ile EH' lere enfekte edilen JAK2V617F mutasyonunun, EH' ler üzerindeki morfolojik etkilerini ve metilasyon görünümlerindeki farklılığın trombotik olaylarla bağlantılı olabileceği konusunda bir sonuca varılamamıştır. Bu konuda gelecekte yapılacak daha detaylı çalışmalar bu bağlantıyı açıklamamıza yardımcı olacaktır.


Anahtar Kelimeler: Miyeloproliferatif Neoplazi (MPN), Janus Kinaz 2(JAK2), Endotel, Epigenetik, Lentivirüs

Abstract:
Objective: Myeloproliferative Neoplasms (MPN) is frequently seen as a fatal disease. Although the JAK2V617F mutation helps to understand MPN, there are still questions to be answered in the pathological development of the disease. JAK2V617F mutation is diagnosed in the most of the thrombotic cases, and its relation to endothelial cells is controversial. The effects of epigenetic factors on MPN are unknown. In this study, the effects of JAK2V617F mutation on endothelial cells (EC) and the SOCS methylations of this mutation which are epigenetically important are examined.
Method: Lentiviral vectors that include JAK2V617F mutation and normal JAK2 genes and carry GFP were infected to HUVEC (Human umbilical vein endothelial cell) cell line. GFP was detected with flow cytometry and its analysis was conducted. The genomic DNA of cell population containing a certain percent of GFP was isolated. PCR was applied for methylation analysis by using a DNA which is exposed to bisulphite modification.
Findings: Lipofectamine was determined to be the most productive  among the different transfection agents. No morphological difference was observed upon the comparison of lentiviral vectors within JAKV617F, JAK2 and GFP vectors and uninfected ECs. No obvious difference is observed between the vitality rates of infected and uninfected ECs. It was found that among the infected and uninfected ECs, all, except from SOCS-1, without any observed difference, demonstrated an unmethyle profile.  
Result: No difference was detected in the morphologies and vitality rates of ECs which were either infected with lentiviral vectors or uninfected. SOCS4 methylation was tested in EC for the first time in literature.  No similarity was observed between the methylation profiles of SOCS 1, 2, 3 genes and blood cells of MPN patients. In this study, it could not be concluded that the morphological effects of JAK2V617 mutation on ECs and differences in methylation profiles might be connected to thrombotic events. More detailed future studies on this field will help us in explaining this relation.

Key Words: Myeloroliferative Neoplasm (MPN), Janus Kinase 2(JAK2), Endothelial, Epigenetics, Lentivirus.