Domateste doku kültürü, genetik transformasyon ve CRISPR/CAS9 sistemi ile genom işleme optimizasyonu
Optimization of tissue culture, genetic transformation and CRISPR/CAS9 system with genome processes in tomato
Yazar: ZAFER SEÇGİN
Danışman: DOÇ. DR. MUSA KAVAS ; DOÇ. DR. KUBİLAY YILDIRIM
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Solanaceae familyası içerisinde yer alan domates (Solanum lycopersicum), dünya çapında ikinci en önemli bahçe bitkisidir. Sağlık, ekonomik ve besleyici öneminin yanı sıra domates, etli meyve gelişimi çalışmaları ve genom manüpülasyon çalışmalarında model bitki olarak kullanılır. Genom düzenleme sistemleri kullanılarak elde edilen bitkilerin, tarla koşullarına doğrudan uygulanabilmesi için ticari domates çeşitlerinde de optimize edilmelidir. Rejenerasyon sistemi ve Agrobacterium kullanılarak yapılan gen aktarımı bitkilerde genom düzenlemenin temelini oluşturmaktadır. CRISPR/Cas9 sistemi, domates çeşitlerinde genom düzenleme amacıyla çeşitli çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır. Genom düzenleme çalışmalarında farklı fenotipik markör genleri kullanılarak yapılan genom düzenleme çalışmalarının etkinliği tespit edilmeye çalışılmaktadır. Bu genlerden biri olan phytoen desaturaz (PDS) geni bitkilerde albino fenotipler oluşturmaktadır Akonitaz hidrataz (ACO) geni ise TCA (Tricarboxylic Acid) döngüsü içerisinde yer alan, sitratı geri dönüşümlü olarak izositrata parçalamakta ve Acly-Coa üretimi ile ilişkili olduğundan polen oluşumu ile ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmanın amaçları, Crocker domates çeşitinde doku kültürü parametrelerini optimize ederek, etkili bir Agrobacterium gen aktarım protokolü oluşturmak ve CRISPR/cas9 genom düzenleme sistemi ile PDS geni hedeflemesine yönelik optimizasyon çalışmalarını gerçekleştirmektir. Çalışmanın diğer bir amacı ise CRISPR/cas9 genom düzenleme sistemi ile SlACO4 geninin düzenlemesini yapmak ve bu düzenlemenin polen oluşumu üzerine olan etkilerini belirlemektir.
 	Crocker ticari domates çeşitinde doku kültürü optimize çalışmalarında kotiledon ve yaprak eksplantları farklı konsantrasyonlardaki benzyl adenin (BA) (0, 0.5, 1, 2, 3 ve 4 mg//L) ve indole 3-asetik asit (IAA) (0, 0.1, 0.5 ve1 mg/L) içeren MS besi ortamında test edilmişlerdir. Çalışmada Agrobacterium aracılı gen aktarımının etkinliği eksplant kaynağı, bakteri suşu ve konsantrasyonu ile inokülasyon süresi, ko-kültüvasyon süresi, ön-kültürleme süresi, antibiyotiklerin etkisi ve higromisin konsatrasyonu gibi farklı parametreler kullanılarak test edilmiştir. PDS ve SlACO4 genlerini CRISPR/Cas9 sistemi ile hedeflemek için ikişer adet klavuz RNA (gRNA) tasarlanmış ve Agrobacterium aracılı gen aktarımı yapılarak genom düzenlenmiş domates bitkileri başarılı bir şekilde elde edilmiştir. 
Çalışma sonuçları Crocker domates çeşitinde en yüksek bitki rejenerasyonunun kotiledon eksplantının kullanıldığı 3 mg/L BA ve 0.1 mg/L IAA içeren MS besi ortamından elde edildiğini göstermiştir. Agrobacterium aracılı gen aktarım sonuçları en etkin gen aktarım parametlerinin: kotiledon ekplantlarında, ön-kültür süresinin 2 gün, Agrobacterium OD600: 0.6'da 10 dakika, ko-kültüvasyon süresinin 48 saat olduğu uygulamalarda maksimum transformasyon etkinliğinin (%44) olduğu belirlenmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi ile PDS ve SlACO4 genini hedefleyen iki gRNA'nın test edildiği çalışma sonuçları, PDS geni hedeflenen bitkilerde tam albino, kimerik bitkiler ve yeşil fenotipler elde edilmiş ve mutant bitki oranı %71 olarak belirlenmiştir. SlACO4 geninin hedeflenmesi sonucunda elde edilen mutant bitkilerin meyve başına tohum sayıları %85 oranında azalmıştır. Bu çalışma sonucunda ilk kez ticari domates çeşidinde CRISPR/Cas9 genom düzenleme çalışmaları için Agrobacterium aracılı gen transferi ve doku kültürü parametreleri optimize edilerek, SlACO4 geninin polen oluşumu ile ilişkili olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Tomato (Solanum lycopersicum), a member of Solanaceae family is the second most important horticultural crop worldwide.  In addition to the health, economic and nutritional importance, tomato is used as a model plant in fleshy fruits improvement studies and in genome manipulation studies. Genome editing systems must be optimized before applying directly to field conditions and for commercial tomato varieties. The regeneration system and Agrobacterium mediated gene transfer forms the basis of genome editing in plants. CRISPR/Cas9 system has been successfully used in various genome editing studies in tomato varieties. In genome editing studies, different phenotypic marker genes are used in the genome editing efficacy studies.  These genes include, phytoen desaturaz (PDS) gene which creates albino phenotype in plants, Akonitaz hidrataz (ACO) gene which is present in the Tricarboxylic Acid (TCA) cycle, breaks the citrate reversibly into isocitrate and is associated with the production of Acyl-Coa, hence considered associated with pollen formation. The objectives of this study are to create an effective Agrobacterium mediated gene transfer protocol by optimizing tissue culture parameters of tomato cv. Crocker and to carry out optimization studies for CRISPR/Cas9 gene editing system by targeting the PDS gene. Other aim of this study is to edit the SIACO4 gene using the CRISPR/Cas9 gene editing system and study the effect of this editing on the pollen formation.
 	In the tissue culture optimization studies, leaf and cotyledon explants of commercial tomato cultivar Crocker were tested on MS medium containing different concentrations of 6-benzyladenine (BA) (0, 0.5, 1, 2, 3 and 4 mg//L) and Indole-3-acetic acid (IAA) (0, 0.1, 0.5 and 1 mg/L). Efficiency of Agrobacterium mediated gene transfer was tested using different parameters including, source of explant, bacterial strain and concentration, inoculation period, co-cultivation period, pre-cultivation timing, effect of antibiotics and concentration of hygromycin. Two each guide RNA (gRNA) were designed to target PDS and SlACO4 genes using CRISPR/Cas9 system and genome edited plants were produced using Agrobacterium mediated gene transfer.
Study results showed that highest plant regeneration of tomato cv Crocker was obtained from cotyledon explants grown in MS medium supplemented with 3 mg/L BA and 0.1 mg/L IAA. Results of  the most effective Agrobacterium mediated gene transfer parameters were found in cotyledon explant with 2 days pre-culture time, 10 minutes with Agrobacterium at OD600: 0.6 and co-cultivation period of 48 hours. These parameters resulted in maximum transformation effect (44%). Results of CRISPR/Cas9 system by testing two gRNA targeting each of PDS and SIACO4. A fully albino, chimeric and green phenotypes with mutant plant ratio of 71% were shown in PDS gene targeted plants. Targeting SIACO4 gene resulted in 85% decrease in number of seeds per fruit in mutant plants. As a result, by optimizing the optimizing Agrobacterium mediated gene transfer and tissue culture parameters for CRISPR/Cas9 genome editing studies, this study for the first time in commercial tomato cultivar determined that SIACO4 gene is associated with the pollen formation.