İnsan safen ven greftlerinde ex vivo olarak oluşturulan diyabet modelinde nebivololün etkileri
The effects of nebivolol in an ex vivo model of diabetes established in human saphenous vein grafts
Yazar: ÇAĞLAR BİNTEPE
Danışman: PROF. DR. BUKET REEL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı / Farmakoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Glükoz = Glucose ; Metalloproteinazlar = Metalloproteinases ; Moleküller = Molecules ; Nebivolol = Nebivolol ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Safen ven = Saphenous vein ; Transplantlar = Transplants ; Venler = Veins

Özet:
Amaç: Diyabet hastalarında gelişen uzun süreli hiperglisemi oksidatif stresi, inflamasyonu, vasküler disfonksiyonu indükleyerek kardiyovasküler komorbiditelerin gelişimini tetikler ve koroner arter bypass greft (KABG) cerrahisi sonrası yeni yerleştirilen greftte restenoz gelişimini  hızlandırarak morbidite ve mortalite riskinin artmasına yol açar. 
Çalışmamızda üçüncü nesil bir beta blokör olan nebivololün ex vivo standart diyabetik insan safen ven (İSV) greft modelinde oksidatif stres, inflamatuvar MMP'ler (MMP-2, MMP-9, MMP-14) ve inhibitörleri (Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2; TIMP-2), inflamasyona aracılık eden kılavuz moleküller (netrin-1, efrin-A2, sema-3A, slit-2), integrinler (CD41/CD61), vasküler proliferasyon ve disfonksiyon üzerindeki etkilerinin araştırılması hedeflenmiştir.
Gereç ve Yöntemler: KABG operasyonu uygulanan hastalardan alınan İSV segmentlerinin (n=10) çevre dokuları temizlenip endotel tabakaları nazikçe uzaklaştırıldıktan sonra 3 mm'lik halkalar halinde 5 gruba ayrılmışlardır. Ardından halkalar 24 saat boyunca 30 mM glukoz ve/veya 10 µM nebivolol veya % 0.1 DMSO içeren ortamda inkübe edilmiştir. İSV grefterinde reaktif oksijen türlerinin (ROT) düzeyleri lusigenin/luminol kemilüminesans yöntemiyle; MMP-2 ve MMP-9 ekspresyon/aktiviteleri jelatin zimografi ile; MMP-14, TIMP-2, α-düz kas aktini (α-SMA), netrin-1, efrin-A2, sema-3A, slit-2 ve CD41/CD61 ekspresyonları ise immün boyama/skorlama yöntemiyle incelenmiştir. Ayrıca izole organ banyosu sisteminde İSV greftlerinin potasyum klorür (KCl), noradrenalin (NA) ve serotoninine (5-HT) karşı kasılma yanıtları ile asetilkolin (ACh) ve papaverine karşı gevşeme yanıtları değerlendirilmiştir.
Bulgular: Yüksek glukoz ROT düzeylerini artırarak oksidatif stresi indüklemiştir. Ayrıca MMP-2 ekspresyon/aktivitesi ile MMP-14, α-SMA, netrin-1, efrin-A2 ve CD41/CD61 ekspresyonlarını up-regüle ederken; TIMP-2, sema-3A ve slit-2  ekspresyonlarını ise down-regüle etmiştir. Bunun aksine nebivolol, oksidatif stresi, MMP'ler, CD41/CD61 ve kılavuz moleküllerin aracılık ettiği inflamasyonu ve vasküler düz kas hücre (VDKH) proliferasyonunu inhibe etmiştir.  İSV halkalarında yüksek glukoz hasarı KCl, NA ve 5-HT'ye karşı kontraktil yanıtları anlamlı şekilde azaltmıştır. Nebivolol ise tüm kontraktil ajanlara karşı azalan yanıtları düzeltmiş, ayrıca kontrole kıyasla vazodilatasyon oluşturmuştur. Ancak papaverine karşı gevşeme yanıtları glukoz ve/veya nebivololden etkilenmemiştir. Diğer yandan glukoz ve/veya nebivolol İSV halkalarının kontraktil ajanlara karşı duyarlılığını değiştirmemiştir
Sonuç: Nebivolol İSV grefti uygulanan diyabet hastalarında oksidatif hasarı ve inflamasyonu inhibe ederek ve vazospazmı önleyerek restenoz ve erken greft yetmezliğinin önlenmesine ve greftin fonksiyonel performansının korunmasına katkıda bulunabilir.

Anahtar kelimeler: nebivolol; yüksek glukoz; matriks metalloproteinazlar; oksidatif stres; kılavuz moleküller; insan safen veni.

Abstract:
Objective: Long-term hyperglycemia in diabetic patients triggers the development of cardiovascular comorbidities by inducing oxidative stress, inflammation, and vascular dysfunction, and accelerates the development of restenosis in the newly placed graft after coronary artery bypass grafting (CABG) surgery, leading to an increased risk of morbidity and mortality. In our study, it was aimed to investigate the effects of nebivolol, a third generation beta blocker, on oxidative stress, inflammatory MMPs (MMP-2, MMP-9, MMP-14) and endogenous MMP inhibitors (Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2; TIMP-2), guidance molecules that mediate inflammation (netrin-1, ephrin-A2, sema-3A, slit-2), integrins (CD41/CD61), vascular proliferation and dysfunction in an ex vivo standard diabetic human saphenous vein graft model.
Material and Methods: Human saphenous vein (HSV) segments (n=10) taken from patients who underwent CABG operation were divided into 5 groups as 3 mm rings after the surrounding tissues were cleaned and the endothelial layers were gently removed. The rings were then incubated for 24 hours in medium containing 30 mM glucose and/or 10 µM nebivolol or 0.1 % DMSO . Reactive oxygen species (ROS) levels in HSV graft were determined by lucigenin/luminol chemiluminescence method; MMP-2 and MMP-9 expression/activities by gelatin zymography; Expressions of MMP-14, TIMP-2, α-smooth muscle actin (α-SMA), netrin-1, ephrin-A2, sema-3A, slit-2 and CD41/CD61 were examined by immunostaining/scoring method. In addition, the contractile responses of HSV grafts to potassium chloride (KCl), noradrenaline (NA) and serotonin (5-HT) and relaxation responses to acetylcholine (ACh) and papaverine were evaluated in the isolated organ bath system.
Results: High glucose induced oxidative stress by increasing ROS levels. In addition, glucose up-regulates MMP-2 expression/activity, MMP-14, α-SMA, netrin-1, ephrin-A2 and CD41/CD61 expressions, while it is down-regulating TIMP-2, sema-3A and slit-2 expressions. In contrast, nebivolol inhibited oxidative stress, inflammation mediated by MMPs, CD41/CD61, and guidance molecules, and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. High glucose damage in HSV rings significantly reduced the contractile responses to KCl, NA and 5-HT. Nebivolol, on the other hand, ameliorated the decreased responses to all contractile agents and induced vasodilation compared to control. However, relaxation responses to papaverine were not affected by glucose and/or nebivolol. Furthermore, glucose and/or nebivolol did not alter the susceptibility of HSV rings to contractile agents.
Conclusion: Nebivolol may contribute to the prevention of restenosis and early graft failure and to preserve the functional performance of the graft by inhibiting oxidative damage, inflammation and proliferation, and preventing vasospasm in diabetic patients undergoing HSV grafting.

Key words: nebivolol; high glucose; matrix metalloproteinases; oxidative stress; guidance molecules; human saphenous vein.