Klinik açıdan önemli bazı Trichophyton türlerinin hızlı tespiti için Multiplex Real-Time PCR temelli bir yöntem geliştirilmesi
Developing a method based on Multiplex Real-Time PCR for rapid detection of some Trichophyton species are clinically important
Yazar: ARAS FAHRETTİN KORKMAZ
Danışman: DOÇ. DR. BURHAN ŞEN
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışma çerçevesinde, insanların deri, saç ve tırnakları gibi vücut bölgelerinde dermatolojik anlamda patojen olan Trichophyton genusuna mensup olan 6 dermatofitin geleneksel kültürasyon yöntemlerine nazaran moleküler kapsamda çok daha hızlı ve doğru tanılaması amaçlanmıştır. Trichophyton genusuna ait olan; Trichophyton interdigitale, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum ve Trichophyton violaceum türlerinin daha önce hiçbir bilimsel çalışmada olmayan, spesifik primer ve prob oligonükleotid genetik sekanslarının in silico formatta tasarlanması amaçlanmıştır. Dermatofit küflerinin her biri için ayrı ayrı; Aktin, ATP6, Beta-Tubulin, IGS-1, ITS-1, ITS-2, ITS-3, ITS-4, Kalmodulin, NTS, RPB-1, RPB-2 ve TEF-1α gibi barkod genleri ile varsa özgün başka bir gen bölgesine yönelik çalışmalar yapılması planlanmıştır. Trichophyton interdigitale için NTS, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum ve Trichophyton violaceum türleri için ITS-1 ve Trichophyton rubrum için ITS-2 gen bölgelerini hedefleyen, maksimum seviyede özgünlüğe sahip ve hedef türlere spesifik olan primer ve prob dizileri, çeşitli veri tabanları kullanılarak in silico kapsamda tasarlanmış ve Multiplex Real-Time PCR reaksiyonları ile de tasarım sonuçlarının tam bir başarı ile çalıştığı tespit edilmiştir. Multiplex Real-Time PCR reaksiyonları ile hedef türlerin her biri için tespit limitleri ve analitik duyarlılıkları belirlenmiş, bilgileri bulunan referans bakteriyel ve fungal suşlar ile hedef türlerin her birinin çapraz reaksiyonlar vermediği tespit edilmiş ve filogenetik analizler hedef türlerin tamamı için gerçekleştirilmiştir. Geleneksel kültür ve biyokimyasal tanılama yöntemlerine nazaran çok daha doğru ve hızlı tanılama imkanı veren moleküler genetik yöntemler kapsamına giren bu çalışma ile dermatofitoz enfeksiyonu geçiren hastalardan alınan klinik materyallerde ilgili hedef dermatofitlerin bulunması durumunda, bu tez kapsamında türe özgü tasarlanan primer ve prob setleri kullanılarak klinisyenlere çok hızlı bir tanı koyma ve çok daha erken bir zaman diliminde tedaviye başlama imkanı sunulabileceği öngörülmektedir.

Abstract:
This study aims to diagnose the 6 dermatophytes belonging to the Trichophyton genus, which is dermatologically pathogen, in human body parts such as skin, hair and nails, much faster and more accurately compared to traditional culture methods in a molecular scope. It is aimed to design ever first specific primary and probe oligonucleotide genetic sequences of Trichophyton interdigitale, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum and Trichophyton violaceum species belonging to the Trichophyton genus, in silico format. It is planned to carry out separate studies for each dermatophyte mold on barcode genes as Actin, ATP6, Beta-Tubulin, IGS-1, ITS-1, ITS-2, ITS-3, ITS-4, Calmodulin, NTS, RPB-1, RPB-2 and TEF-1α together with, if any, another unique gene region. Primer and probe sequences which are specific to target species with maximum specificity level and target NTS gene regions for Trichophyton interdigitale, ITS-1 gene regions for Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum and Trichophyton violaceum species and ITS-2 gene regions for Trichophyton rubrum are designed in silico by using various databases and with Multiplex Real-Time PCR reactions, it was determined that the design results work with full success. With Multiplex Real-Time PCR reactions, detection limits and analytical sensitivities were determined for each of the target species, it was determined that each of the reference bacterial and fungal strains and target species did not show cross reactions, and phylogenetic analyses were performed for all of the target species. Being one of the genetic methods providing much faster and more accurate diagnosis compared to traditional culture and biochemical diagnostic methods, this study will enable the clinicians to diagnose the patients with dermatophytosis infection much faster and start treatment at a much earlier time by using our species-specific designed primer and probe sets, if any target dermatophytes are available in the clinical materials taken from the concerned patients.