Hepatosellüler karsinoma hücre hattında SB203580 ve Ginnalin A'nın antikanser etkisinin araştırılması
Investigation of Anticancer Effect SB203580 and Ginnalin A on Hepatocelluler Carcinoma (HCC) Cell Line
Yazar: PINAR ÖZDEN
Danışman: DOÇ. DR. HASİBE VURAL
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Fenolik bileşikler = Phenolic compounds ; Ginnalin A = Ginnalin A ; Hücre dizisi = Cell line ; Karaciğer hastalıkları = Liver diseases ; Karaciğer neoplazmları = Liver neoplasms ; Karsinoma = Carcinoma ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular

Özet:
Insan populasyonunda en sık görülen kanser tiplerinden biri olan hepatosellüler karsinoma (HCC) klinik olarak kullanılan kemoterapötik ve radyoterapötik ajanlara direncin gözlendiği ve tedavi seçeneklerinin kısıtlı olduğu kanser türlerinden biridir. Son yıllarda kullanılan ilaçların büyük bir kısmı bitki türevlidir. Düşük toksisiteli doğal ürünlerin antikanserojenik etkilerinin araştırılması, kansere karşı yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde oldukça önemlidir. Ginnalin A (GA), Acer cinsinin önemli fenolik bileşenlerinden biridir. Çeşitli hücre hatları ile yapılan çalışmalarda GA'nın antikanserojenik etkiye sahip olduğu gösterilmiştir.  Bir primidil imidazolü olan SB203580, p38 mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) inhibitörüdür ve çeşitli biyolojik süreçlerde p38-MAPK'ın rolünü aydınlatmak için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bazı çalışmalarda SB203580'in, p38-MAPK'den bağımsız olarak hücre proliferasyonunu inhibe edebildiği rapor edilmiştir. Bu çalışmada, Hep-3B HCC hücre hattında GA ile SB203580 kombinasyonunun sitotoksik etkisinin belirlenmesi, Kaspaz-3 aktivitesi analizinin yanı sıra apoptoz, hücre döngüsü ve nekrozda önemli genlerin ekspresyon seviyelerinin değerlendirilmesi ile antikanser etkinliğinin araştırılması hedeflenmiştir. 
GA ve SB203580'nin hücre canlılığına etkisi XTT yöntemi ile belirlenmiştir. Kombinasyon uygulamasının etkinliği CompuSyn Version 1.0 yazılımı kullanılarak değerlendirilmiştir. GA ve SB203580 uygulamaları sonrasında Kaspaz-3 aktivitesi, Kaspaz-3 analiz kit ile belirlenmiştir. Apoptoz, nekroz ve hücre döngüsü ile ilişkili genlerin ifadesindeki değişiklikler kantitatif gerçek zamanlı PZR (qPZR) ile analiz edilmiştir.
XTT sonuçlarına göre, GA ve  SB203580'in Hep-3B hücre hattında, 72 saat için IC50 değerleri sırasıyla 155 µM ve 32,5 µM olarak bulunmuştur. GA ve SB203580'in birlikte hücre canlılığının %50'sini inhibe eden konsantrasyonlarda (GA:86,22 μM, SB203580:17,24 μM) additif etki gösterdiği saptanmıştır (CI=1). SB203580 ve kombinasyon uygulaması sonrasında Kaspaz-3 aktivitesinde kontrol grubuna kıyasla sırasıyla 7,8 ve 8,2 kat artış tespit edilmiştir. qPZR sonuçlarına göre, GA uygulaması sonrasında CASP3,  CASP9 ve CYCS gen ekspresyonlarında anlamlı artış, CCND1 gen ekspresyonunda anlamlı azalış tespit edilmiştir. Hücreler SB203580 ile muamele edildiğinde ise CASP3 ve BAX gen ekspresyonlarında anlamlı artış, CCND1 ve CDK4 gen ekspresyonunda anlamlı bir azalış gözlenmiştir. GA ve SB203580 kombinasyonunun ise CASP3, CASP9, BAX ve CYCS gen ekspresyonlarında anlamlı artışa, BCL2, CCND1 ve CDK4 gen ekspresyonunda anlamlı azalışa neden olduğu saptanmıştır. 
Bu çalışmanın sonuçlarına göre, GA ve SB203580'nin hücre canlılığının %50'sini inhibe ettikleri dozlarda kombine kullanımları Hep-3B hücrelerinde additif etkiye neden olmaktadır. Ayrıca, Kaspaz-3 aktivitesinde artışa ek olarak, apoptoz ve hücre döngüsü ile ilişkili önemli genlerin ekpresyonlarını etkileyerek antikanser etki göstermektedir. 
Anahtar Kelimeler: Apoptoz, Ginnalin A, Hepatosellüler karsinoma, Hücre döngüsü, SB203580

Abstract:
Hepatocellular carcinoma (HCC), one of the most common types of cancer in human populations, is one of the cancer types in which chemotherapeutic and radiotherapeutic agents used clinically are resistant and treatment options are limited. Most of the drugs used in recent years are plant derivatives. The search for anticarcinogenic effects of low toxicity natural products is crucial in the development of new treatment strategies for cancer. Ginnalin A (GA) is one of the major phenolic components of the Acer genus. Studies with various cell lines have shown that GA has anticarcinogenic effect. SB203580, a pyridinyl imidazole, is a p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) inhibitor and is used to elucidate the role of p38-MAPK in various biological processes. However, in some studies SB203580 has been reported to be able to inhibit cell proliferation independent of p38-MAPK. In this study, it was aimed to determine the cytotoxic effect of the combination of GA and SB203580 in the Hep-3B HCC cell line, the assay of caspase-3 activity as well as the evaluation of expression levels of important genes in apoptosis, cell cycle and necrosis, and anticancer activity.
The effect of GA and SB203580 on cell viability was determined by the XTT method. The effectiveness of the combination applications was evaluated using CompuSyn Version 1.0 software. After GA and SB203580 applications, the activity of caspaz-3 was determined by the Caspaz-3 assay kit. Changes in the expression of genes associated with apoptosis, necrosis and cell cycle were analyzed by real-time PCR (qPZR).
According to the XTT results, the IC50 values for 72 hours in the Hep-3B cell line of GA and SB203580 were found to be 155 μM and 32.5 μM, respectively. GA and SB203580 showed an additive effect (CI = 1) at concentrations inhibiting 50% of cell viability (GA: 86,22 μM, SB203580: 17,24 μM). After SB203580 and combination applications, Caspase-3 activity was 7.8 and 8.2 fold increased compared to the control group, respectively. qPCR results showed a significant increase in CASP3, CASP9 and CYCS gene expressions and a significant decrease in CCND1 gene expression after GA applications. When cells were treated with SB203580, a significant decrease in CASP3 and BAX gene expression, a significant decrease in CCND1 and CDK4 gene expression was observed. GA and SB203580 resulted in a significant increase in CASP3, CASP9, BAX and CYCS gene expressions, a significant decrease in BCL2, CCND1 and CDK4 gene expression.
According to the results of this study, the combined use of GA and SB203580 at doses that inhibited 50% of cell viability caused additive effect in Hep-3B cells. Also, in addition to an increase in Caspase-3 activity, anticancer effects by affecting the expression of important genes associated with apoptosis and cell cycle.
Key words: Apoptosis, Cell cycle, Ginnalin A, Hepatocellular carcinoma, SB203580