Hepatit delta virüsü (HDV) tanısında 'real time' PZR temelinde yeni bir yöntem geliştirilmesi
Development of a new method based on real time PCR in the diagnosis of hepatitis delta virus (HDV)
Yazar: YASEMİN ÇELİK
Danışman: PROF. DR. A. İRFAN SOYKAN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Hepatit delta virüsü (HDV), delta hepatitine sebep olan bir viral hepatit ajanıdır. HDV defektif bir RNA virüsüdür ve tek başına patojen değildir, bu bakımdan yalnızca Hepatit B (HBV) enfeksiyonu olan bireylerde hastalık yapabilmektedir. HDV enfeksiyon tanısı ya da uygulanan tedavinin etkinliği ise genellikle spesifik anti-HDV IgM veya HDV-RNA gibi biyokimyasal, histolojik ve virolojik parametrelerle değerlendirilmektedir. Fakat akut enfeksiyon vakaları ya da immün sistemi baskılanmış bireylerdeki kronik enfeksiyonlar dışında HDV antijeninin serumda saptanması çok nadirdir. HDV RNA'nın serumda belirlenmesiyle HDV replikasyonu en iyi şekilde değerlendirilebilir. Real time PZR sistemi amplifikasyon ürünlerinin miktarlarının belirlenmesinde hızlı bir sistemdir, yüksek duyarlılık ve kesinlikte sonuçlar alınabilmektedir. Biz de çalışmamızda farklı `real time' PZR cihazları, farklı primer-prob sistemleri ve farklı ticari kitler deneyerek HDV-RNA'yı kantitatif olarak saptamaya yönelik en uygun, yüksek kesinlik ve duyarlılıkta `real time' PZR koşullarını belirlemeyi amaçladık.Çalışmamıza laboratuvarımızda daha önce yapılan konvansiyonel PZR testleri ile HDV RNA'sının pozitif olduğu belirlenen 40 hasta ve bir yıl süreyle interferon ya da PEG-interferon tedavisi almış 22 HDV hastası alındı. Farklı HDV izolatları karşılaştırılarak HDV genomunun korunmuş bölgeleri belirlendi ve bu bölgelere özgü primer-prob tasarımı yapıldı. Ayrıca HDV RNA'nın kantitasyonu için HDV genomunun bir bölümünü içeren standart plazmid oluşturuldu ve kopya sayısı hesaplandı. Yapılan denemeler sonucunda delta antijeni bölgesini hedef alan iki farklı primer-prob sistemi ve farklı `real time' PZR kitleri ile HDV RNA'nın, Light cycler `real time' PZR sisteminde 1000 kopya/µl'ye kadar, ABI 7300 `real time' PZR sisteminde ise 100 kopya/µl'ye kadar saptanabildiği gözlendi. Standart plazmidin bilinen miktarda oluşturulan örneklerinin döngü eşik değerlerine karşılık (CT:cycle threshold) başlangıçtaki genom kopyalarının logaritmik konsantrasyonlarının olduğu standart doğrular oluşturuldu, HDV RNA'sının pozitif olduğu belirlenen 40 hasta serumunun HDV RNA viral yükü Light cycler `real time' PZR sisteminde iki aşamalı olarak, bir yıl süreyle interferon ya da PEG-interferon tedavisi alan 22 HDV hastasının serum HDV RNA viral yükü ise ABI 7300 `real time' PZR sisteminde tek aşamada (ters transkripsiyon ve polimerizasyon aynı tüp içerisinde) kantitatif olarak belirlendi. Bu bakımdan HDV RNA'nın `real time' PZR sisteminde saptanmasına yönelik sınırlı sayıdaki çalışmalar arasında çalışmamız ilktir ve bu şekilde kontaminasyon riski ve zaman kaybı da azaltılmış olmaktadır. Sonuç olarak HDV RNA'nın serumda kantitatif ölçümü, HDV enfeksiyonlarının patofizyolojisinin analizinde ve HDV biyolojisini anlamaya yönelik çalışmalarda kullanışlı olabilir. Ayrıca HDV RNA düzeyleri ile hastalık seyri arasındaki ilişki analiz edilerek hastalığın tedavisinde izlenecek yolların belirlenmesinde ve yeni ilaçların etkilerinin değerlendirilmesinde de HDV RNA'nın kantitatif analizi yararlı olacaktır.Anahtar kelimeler: Hepatit Delta Virüsü, HDV RNA, `real time' PZR, Hepatit B Virüsü.

Abstract:
Hepatitis delta virus is an agent responsible for delta hepatitis. HDV is a defective RNA virus that can only infect people who have hepatitis B virus. HDV diagnosis or treatment of HDV infection efficiency is monitored by biochemical, histological and virological parameters such as spesific anti-HDV IgM or HDV RNA. The HDV antigen can be detected rarely in serum except in cases of acute infection or chronic infections in immunsupressed patients. HDV replication can be evaluated by detecting HDV RNA in serum specimens. Real time PCR is a rapid and sensitive method to quantity amplification products. The aim of this study was to quantity HDV RNA in serum by real time PCR using different real time PCR machines, different primer probe systems and different commercially available kits.In this study there were 40 patients who have HDV RNA in their serum detected by conventional PCR in our laboratory. Also chronically infected 22 HDV patiens receiving IFN or PEG-IFN therapy were enrolled to the study. Different HDV isolates were compared, conserved HDV regions were detected and primers and probes were designed based on these regions . Also we constructed a standard plasmid including HDV genome to quantitate HDV RNA and copy number of plasmid was calculated. Using two different primers and probes targeting hepatitis delta antigen region and using different PCR kits, HDV RNA could be detected in Light cycler real time PCR system and ABI 7300 real time PCR system. The sensitivity of the assay to detect HDV RNA was 1000 copies/µl in Light cycler real time PCR system and 100 copies/µl in ABI 7300 real time PCR system. Serial dilutions of standard plasmid with known copy number were tested with the cycle threshold (CT) values plotted against the copy number to establish a standard curve. Then HDV RNA viral load of 40 patients were evaluated by Light cycler `real time? PCR system in two steps and HDV RNA viral load of 22 patients receiving IFN or PEG-IFN therapy were evaluated by ABI 7300 real time PCR system in one step (reverse transcription and polymerization were in the same tube). As the result our study was unique among studies of determining HDV RNA in serum by real time PCR and then contamination risk and time consuming was prevented using one tube. HDV RNA quantitation in serum could be helpful understanding of HDV biology and analysing of pathophysiology of HDV infection. Also this study should help with the management of chronically infected patients and it could be used to define treatment guidelines and to evaluate the efficacy of new drugs.Key words: Hepatitis delta virus, HDV RNA, real time PCR, Hepatitis B virus.