Colchıcıne measurement method with LC-MS/MS
LC MS/MS i̇le kolşi̇si̇n ölçüm yöntemi̇ni̇n vali̇dasyonu
Yazar: TEVFİK HONCA
Danışman: PROF. DR. HALİL YAMAN
GATA / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Kolşisin, Lily familyasından bitkilerinin bir alkaloid derivesidir. Bitkideki alkaloidlerin çoğu amid yapılı ve çok zayıf bazik karakterli ve nötraldir. Kolşisin azotu halka dışındadır ve bir asetamid teşkil etmiştir. Bu asetamid grubu 4 tane metoksil taşıyan benzosikloheptana tropolon halka sisteminde sikloheptana bağlı olarak bulunur. Tropolon bir keton grubu taşıyan 7 üyeli ve doymamış bir halkadır. 4 metoksil grubunun 3'ü benzen, 1'i tropolon halkasına bağlanmıştır. Kolşisinin erime noktası 142- 158 ˚C'dir. Işığa dayanıksızdır. Bu eğim molekülün tübülinle bağ oluşturabilmesi için gereklidir. Bu bağ mikrotübülinlerin oluşmasını engeller ve alkoloidin anti-mitotik aktivitesinden sorumludur.
Kolşisin yıllar boyunca gut, psödogut ve ailevi Akdeniz ateşi (AAA) tedavisinde kullanılmıştır. 2009 yılında US Food and Drug Administration (FDA) tarafından ilacın onaylanmasıyla dozlarının uygulamasında düzenlemeler yapılarak daha güvenilir şekilde uygulanmaya başlamıştır. Kolşisin etkileri plazmadan ziyade lökositlerdeki konsantrasyonuyla ilişkili olmasına rağmen kolşisin terapisi altındaki hastalarda plazma ölçüm yöntemleri, düşük intestinal absorbsiyon, yüksek riskli toksisite ve tedaviye zayıf yanıt durumlarında yararlı olmaktadır. Terapötik indeksi dardır. Çeşitli ölçüm yöntemleri ile bu zararlı durumların izole edilmesi gerekmektedir. 
Terapötik etkinliği değerlendirmek için, ölçüm yöntemleri arasında gold standart olan, Sıvı Kromatogtafisi-Tandem Kütle Spektrometrisi kullanılmaktadır. Ölçümlerin, doğru yapılması için analitik safhada olduğu gibi preanalitik faz'a da önem verildi. Kan örnekleri EDTA içeren mor kapaklı tam kan tüplerine alındı sonra 4 °C'de 4000 rpm'de 10 dakika santrifüj edildi. Daha sonra plazma örnekleri ayrılıp eppendorf tüplerine alınarak çalışma gününe kadar -80 °C'de saklandı ve gün ışığına maruziyetten korundu. Plazmayı deproteinize etmek için 150 µL örnek üzerine 900 µL üçlü karışım (diklormetan, izopropilalkol, etilasetat), (1/1/3), (v/v/v) ilave edilirek vortekslendi. Soğutmalı santrifüj kullanılarak +4 oC'de 4,000 rpm'de 5 dk santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatant ölçüm için alındı ve azot gazıyla çeker ocakta uçuruldu. Mobil faz olarak amonyum asetat, formik asit ve distile su içeren çözelti kullanıldı. Akış hızı 0.55 mL/dk idi. 4.6 x 150 mm, ACE, C18 5 µm ters faz analitik kolon ve Phemomenex ODS-3, C18 5 µm koruyucu kolon kullanıldı. Kütle spektrometrisi parameterini optimize etmek için, analit ve internal standartın bir karışımla cihaza verilmesi sağlandı. Kalibrasyon eğrisinde görüldüğü üzere kolşisin metodu ile yapılmış olan kolşisin standardı ve IS tegafur pik alanlarının oranı ile kolşisin ve tegafurun konsantrasyonları oranları arasında yüksek derecede korelasyon saptandı (r2=0,997).  
Elde ettiğimiz sonuçlarla, kolşisin ölçümü için sensitivitesi ve spesifitesi daha yüksek, uygulaması daha kolay bir LC-MS/MS yöntemi oluşturmaya çalıştık. Laboratuvarımızda kurduğumuz LC-MS/MS yöntemi ile kolşisin ölçümü, Türkiye'deki ilk kolşisin ölçümü olma özelliği de taşımaktadır. Yapılacak daha ileri çalışmalar ile daha standardize LC-MS/MS yöntemleri için bir ön çalışma niteliği de taşımaktadır.

Abstract:
Colchicine is an alkaloid derived from the plant of Lily family. Most of the  alkaloids of the plant is amide, poor basic and neutral. Colchicine is outside the ring nitrogen and this was an acetamide. This group is found to be bound acetamide cyclohept 4 with one methoxyl benzosiklohepto until the tropolone ring system. Bearing a keto group and the 7-membered unsaturated ring tropolone. This is necessary in order to create a bond with tubulin molecules tilt. This bond prevents formation of microtubules and alkaloid is responsible for the anti-mitotic activity. 4 on 3 benzene of methoxyl group is linked to one of the tropolone ring. Colchicine is a melting point of 142- 158 °C. It is vulnerable to light.
For many decades colchicine has been used to treat gout, pseudogut and familial mediterranean fever (FMF). After the approval of the drug by US Food and Drug Administration (FDA), changes in dosing regimens  brought safety  in the use of the drug. Although effects of colchicine is associated in leukocytes rather than  plasma, measurement of  plasma is useful in the patients under colchicine treatment during low intestinal absorption, high risk of toxicity and poor reply to the treatment. The therapeutic margin of colchicine is narrow. Various laboratory mesurement techniques have to be used to provide toxic effects of colchicine. 
To determine the therapeutic range, gold standart liquid chromatography-Tandem mass spectrometry has been used. Similar to analytical phase, preanalytical phase was considered important to obtain true results. Blood samples EDTA-containing whole blood were centrifuged to purple tubes were then capped at 4 °C at 4000 rpm for 10 minutes. Then plasma samples were separated according to the study day to eppendorf tubes and stored at -80 °C and protected from exposure to light. Plasma, 150 µL to 900 µL of sample deproteinized ternary mixture (dichloromethane, isopropylalcohol, ethylacetate), (1/1/3), (v / v / v) was added and vortexed edilirek. +4 °C using a refrigerated centrifuge was centrifuged at 4,000 rpm for 5 minutes. After centrifugation the supernatants were collected for measurement and evaporated in a fume hood under nitrogen gas. Ammonium acetate as mobile phase, the solution containing formic acid and distilled water were used. The flow rate was 0.55 mL / min. 4.6 x 150 mm, ACE, 5 mm C18 reverse phase analytical column and Phemomenex ODS-3, 5 µm C18 guard column was used. To optimize the mass spectrometry parameter, the analyte and the internal standard were given to the device with a mixture. The calibration curve colchicine as seen colchicine made by the method of standard and colchicine with the proportion of IS tegafur peak areas and a high correlation was observed between tegafur the concentration ratios (r2 = 0.997).
With the results we have achieved, more sensitivite and specific  colchicine measurement  with an easier application LC-MS/MS method. we have tried to create. In our laboratory we have established LC-MS/MS method for colchicine measurement, this method also carries the distinction of being the first measurement with LC-MS/MS in Turkey. Things to further studies with more standardized LC-MS/MS method for the preliminary study also transports.