Bazı hidrolitik enzimlerin süperkritik karbondioksit ortamında kararlılığı ve yapısal bozunmalarının incelenmesi
Researches on stability and structural degradations of some hydrolytic enzymes under supercritical carbon dioxide conditions
Yazar: DENİZ ŞENYAY ÖNCEL
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM YEŞİL ÇELİKTAŞ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Alfa amilaz = Alpha amylase ; Alkali proteaz = Alkaline protease ; Katalitik aktivite = Catalytic activity

Özet:
Yüksek basıncın en güncel uygulamaları enzimlerin inaktivasyonuna yönelik olmasına rağmen, bazı enzimlerin aktivite ve kararlılıklarının yüksek basınç uygulamaları ile iyileştiğine dair bulgular bulunmaktadır. Bilindiği gibi enzim aktivite ve kararlılığını arttırmada birçok fiziksel, kimyasal ve genetik yaklaşımlar kullanılmaktadır. Son yıllarda da süperkritik akışkanların biyoteknolojik proseslere uygulanmasına yönelik çalışmalar artmıştır. 
Bu çalışmanın amacı, süperkritik karbondioksitin hidrolitik enzimlerin aktivite ve kararlılığını arttırmada alternatif bir yöntem olarak araştırılmasıdır. İşletme parametreleri olarak basınç (60-300 bar), sıcaklık (28-80 oC), CO2 akış hızı (2-10 g/dak) ve sürenin (60-180 dak), hidrolitik enzimler olan ?-amilaz, selülaz, proteaz ve ß-glukanaz'ın aktivite ve stabiliteleri üzerine etkisi değerlendirilmiştir. ?-amilaz enzimi için en yüksek aktivite 240 bar, 41°C, 4 gr/dak akış hızı ve 150 dakika sonucunda, proses edilmemiş enzime oranla %67.7'lik bir artışla 29728 ?mol/mL/dak olarak belirlenmiştir. Selülaz enziminde en yüksek aktivite değeri %48.3'lük bir artışla 9.27 ?mol/mL/dak olarak hesaplanmıştır. Proteaz enziminin aktivitesi incelendiğinde, artan basınçla birlikte aktivite artmış ve 300 bar basınçta en yüksek aktivite (417.51 ?mol/mL/dak) elde edilmiştir. Süperkritik CO2 uygulamaları ile ß-glukanaz enziminin en yüksek aktivite değeri 240 bar, 90 dakika, 67°C ve 8 g/dak akış hızıyla 18.39 µmol/mL/dak olarak tespit edilmiştir.
Basınca bağlı stabilizasyon ve aktivasyon için olası mekanizmalar NMR, SEM, FTIR ve XPS analizleri ile değerlendirilmiştir. Süperkritik CO2 ile proses edilmiş enzimlerden (?-amilaz, selülaz, proteaz ve ß-glukanaz) en yüksek ve en düşük aktivite gösteren enzim örnekleri ile süperkritik CO2'le proses edilmemiş enzim örneklerinin aktivitelerine pH'ın ve sıcaklığın etkilerinin incelenmesi amacı ile farklı pH değerlerinde (4.0-9.0) ve sıcaklık koşullarında (20-80°C) aktivite tayinleri yapılmıştır. Kinetik sabitler (Km - Vmax), Lineweaver- Burk grafikleri oluşturularak belirlenmiştir. Böylece enzimin yapısındaki muhtemel değişimlerin enzimin kinetik parametrelerinde farklılık oluşturup oluşturmadığı gözlenmiştir.
En yüksek aktiviteyi gösteren süperkritik CO2 ile proses edilmiş enzim, immobilize edilerek ardışık enzimatik reaksiyonlarda kullanılmıştır. Her reaksiyon sonunda aktivite tayini yapılarak ve proses edilmiş enzimin relatif aktivitesi proses edilmemiş enzimden düşük olana kadar ardışık reaksiyonlara devam edilmiştir. Akabinde, işlem görmüş enzim aktivitesinin ardışık reaksiyonlar sonrasında arttırılıp arttırılamayacağını araştırmak amacı ile optimum süperkritik CO2 koşullarında tekrar uygulama yapılmış ve enzimlerin tekrar kullanılabilirlikleri belirlenmiştir.

Abstract:
While most current applications of high pressure are for inactivating deleterious enzymes, there is evidence that high pressure can induce stabilization and activation of some enzymes. Various physical, chemical and genetic approaches have been applied in order to enhance enzyme stability and activity. In recent years, supercritical fluids have been of interest in the biotechnological processes.
In this project, the aim is to investigate the capability of supercritical carbon dioxide to alter the stability and activity of hydrolytic enzymes as an alternative technique. The effects of operational parameters such as pressure (60-300 bar), temperature (28-80 oC), CO2 flow (2-10 g/min) and time (60-180 min) were evaluated in regards to the activity and stability of hydrolytic enzymes such as ?-amylase, cellulase, protease and ß-glucanase. For ?-amylase, maximum activity was determined as 29728 ?mol/mL/min with 240 bar, 41°C, 4 g/min flow rate and 150 min of process duration yielding 67.7% higher activity than the untreated enzyme. The highest activity for cellulase was determined as 9.27 ?mol/mL/min with an increase rate of 48.3%. Having studied the activity of protease, the activity was increased with the raise of pressure and maximum activity (417.51 ?mol/mL/min) was determined at the pressure of 300 bar. The highest activity of ß-glucanase enzyme was measured as 18.39 µmol/mL/min at 240 bar, 90 min, 67°C and 8 g/min flow rate with supercritical CO2 applications.
Possible mechanisms for pressure induced stabilization and activation were investigated by NMR, SEM, FTIR and XPS analyses. The effect of pH and temperature on the activity of supercritical CO2 treated enzymes exhibiting the highest and the lowest activities (?-amylase, cellulase, protease and ß-glucanase) and the untreated enzyme at various pH (4.0-9.0) and temperature conditions (20-80°C) were evaluated. Kinetic constants (Km - Vmax) were determined by Lineweaver- Burk graphs. Hence, whether possible structural changes have an effect on kinetic parameters of the enzyme were observed.   
Treated enzymes exhibiting the highest activities were immobilized and used in consecutive enzymatic reactions. Activities were calculated at the end of each reaction and consecutive reactions were conducted till the residual activity of the treated enzyme becomes lower than the untreated enzyme. Subsequently, the treated enzyme was once again treated under optimized supercritical CO2 conditions in order to figure out whether the activity can be enhanced or not and the reusage of the enzymes were determined.