Nörodejeneratif mekanizmaların mitokondriyal disfonksiyon hücre modellerinde proteomik yöntemlerle araştırılması
Differential protein expression analysis of mitochondrial dysfunction cell models to understand neurodegenerative mechanisms
Yazar: BETÜL BAYKAL
Danışman: DOÇ. DR. MURAT KASAP ; DR. AHMET TARIK BAYKAL
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Elektroforez-jel-iki boyutlu = Electrophoresis-gel-two dimensional ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Mitokondriler = Mitochondria ; Nöroloji = Neurology

Özet:
Nörodejeneratif Mekanizmaların Mitokondriyal Disfonksiyon Hücre Modellerinde Proteomik Yöntemlerle AraştırılmasıAmaç: Sıvı kromatografisi ve ardışık kütle spektrometresi ile peptit temelli diferansiyel proteomik yöntem kullanılarak nörodejeneratif hastalıklara ait mekanizmaları aydınlatmaya çalışmak.Yöntem: SH-SY5Y nöroblastoma hücreleri, elektron taşıma zincirlerindeki 5 adet kompleksin her birine özgü nörotoksinler (MPTP, 3-NP, Soydum azit, Antimisin A ve Oligomisin) ile etkileştirilip, LC-MSE temelli bottom-up etiketsiz diferansiyel proteomik yöntemi ile protein ifade farklılıkları analiz edildi. Protein ekstraksiyonu sonrasında elde edilen triptik peptitler, ters fazda nano akış sıvı kromatografisi ile ayrıştırıldı. Kütle spektrometresinde gerçekleştirilen MS deneyi ile peptitler kantitatif olarak ölçüldü ve ardından gerçekleştirilen MS/MS deneyleriyle peptitler parçalanarak amino asit dizileri tanımlandı.Bulgular: 380 adet protein yüksek güvenirlilikte tanımlandı ve mutlak miktarları ölçüldü. Tanımlanan proteinler, biyolojik süreç, moleküler fonksiyon ve hücresel yerleşimlerine göre sınıflandırılarak, her hücre modeline özgü, enerji metabolizmasında, stres cevabında ve regülasyonlarda değişim olduğu gözlendi.Sonuç: Nörotoksine maruz bırakılan SH-SY5Y nöroblastoma hücreleri, in-vitro mitokondriyal disfonksiyon modeli olarak uygundur. LC-MS/MS, protein ekspresyon değişimlerini göstermek ve nörodejeneratif mekanizmaların anlaşılabilmesi için başvurulacak güçlü bir yöntemdir. Mitokondriyal disfonksiyon, ETS'nin bloke edilmesiyle başlamış olsa da farklı kompleks inhibisyonları sonucunda gruplar arasında farklılık gözlemlenmiştir. Miktar bakımından değişimlerini gördüğümüz; alfa-enolaz, gama-enolaz, gliseraldehit-3fosfat dehidrogenaz, 14-3-3 proteinleri, profilin-1, açil-CoA dehidrogenaz, DJ-1, malat dehidrogenaz, laktat dehidrogenaz, uzama faktörü proteinleri ve hücre iskeleti proteinleri nörodejenerasyonla bağlantılı olabilir ve biyobelirteç olarak değerlendirilebilir.Anahtar Kelimeler: nanoUPLC-ESI-qTOF, Shotgun proteomik, Nörodejenerasyon

Abstract:
Differential Protein Expression Analysis of Mitochondrial Dysfunction Cell Models to Understand Neurodegenerative MechanismsAim: Understand neurodegenerative mechanisms with a method based on liquid chromatography and mass spectrometry, a bottom-up label free diferential proteomics.Method: LC-MSE based bottom-up, label-free differential proteomics expression analysis was applied to electron transport complex specific neurotoxin (MPTP, 3-NP, Azide, Antimycin A and Oligomycin) induced neuroblastoma cells to determine protein expression differences. The generated tryptic peptides were fractionated by nano chromatography and amino acid sequences for the identification and absolute quantification was achieved by the MS and MS/MS experiments.Results: 380 protein identifications were achieved and absolute amounts were quantified. Automated classification of identified proteins based on biological processes, molecular function and cellular compartmentation showed that there were cell model specific alterations in pathways related to energy metabolism, stress response, regulation, and some others.Conclusions: Neurotoxin treated SH-SY5Y neuroblastoma cells are viable in-vitro mitochondrial dysfunction models to study neurodegeneration. LC-MS/MS is a powerfull method to quantify protein expression changes and can help understand pathways involved in neurodegenerative mechanisms. Although mitochondiral dysfunction generated by inhibiting ETC, different ETC complex inhibitions cause a differentiation between groups. Alpha-enolase, gama enolase, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 14-3-3 proteins, acyl-CoA dehydrogenase, DJ-1, malate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, elongation factors and cytockeletal proteins showed alterations that we think that may be involved in neurodegeneration. These proteins also can be considered as biomarkers.Key Words: nanoUPLC-ESI-qTOF, Shotgun proteomics, Neurodegeneration