Sentromerik histone 3 ((CENH3) proteininin evrimsel değişimi, türleşmeye olan etkisi ve haploid tetikleme potansiyelinin S. lycopersicum türünde belirlenmesi
Evolutionary change of the centromeric histone 3 ((CENH3) protein and determination of its effect on speciation and haploid-inducing potential in S. lycopersicum species
Yazar: İNANÇ SOYLU
Danışman: PROF. DR. NEDİM MUTLU
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Literatürde, bir histon 3 varyantı olan sentromerik histon 3'ün (CenH3) yapısında gerçekleştirilen mutasyonlar sonucu farklı türlerde (mısır ve fare kulağı teresi) haploid tetikleyici hatların geliştirilebildiğine yönelik raporlar yer almaktadır. Bu çalışmalarda, hali hazırda var olan CenH3 "null-mutant" hattı veya RNA-interferans tekniği ile susturulmuş CenH3 proteinine sahip bitkiler, N-terminal kuyruğu değiştirilmiş veya tek nokta mutasyonları taşıyan CenH3 proteini ile kurtarılmıştır. Elde edilen T1 jenerasyonundaki bitkiler yabani türler ile melezlendiğinde ise haploid bitkilerin oluştuğu tespit edilmiştir. 
Bu tez çalışmasında üst paragrafta bahsedilen yöntem ekonomik değeri yüksek bir ürün olan domates için uygulanmıştır. Domates sahip olduğu ekonomik ve fonksiyonel önem nedeniyle haploid çalışmalarından üst düzeyde fayda sağlayabilecek bir ürün olmasına rağmen literatürde bu ürüne yönelik, yüksek başarıya sahip bir haploid bitki elde etme yöntemi henüz gösterilememiştir. 
Yöntemin başarısı domatesin sahip olduğu doğal CenH3 geninin susturulmasına bağlıdır. Bu tez çalışmasında literatürde kullanılan susturma yöntemlerin aksine, özgün olarak CRISPR-Cas9 gen düzenleme teknolojisi kullanılarak domatese ait doğal CenH3 geni devre dışı bırakılması planlanmış, oluşacak CenH3 "null-mutant" bitkilerin literatürde yer alan raporlardan ve tez kapsamında gerçekleştirilen biyoinformatik çalışmalardan elde edilen bilgilerin yorumlanması sonucu tasarlanmış sentetik genler ile kurtarılması amaçlanmıştır. Tasarlanan sentetik genler, kılavuz RNA'lar ve Cas9 Agrobacterium tumefaciens EHA105 ve AGL1 suşları kullanılarak domatese aktarılmıştır. Moleküler, biyoteknolojik ve doku kültürü çalışmaları sonucu elde edilen transgenik bitkiler, aktarılan genleri taşımaları bakımından test edilmiştir. Test sonucu pozitif bitkiler, gen düzenlenmesinin karakterizasyonu için sekanslanmıştır.
Gerçekleştirilen kapsamlı çalışmalar sonucu çok sayıda transgenik bitki elde edilmiş; ancak sadece bir bitki de (B39), hem sentetik gen hem de Cas9 sistemi tespit edilmiştir. Bu bitkiye yönelik yapılan karakterizasyon sonucu bir allelde çerçeve kayması mutasyonu, diğer allelde ise -3 delesyona bağlı tek bir amino asit kaybı tespit edilmiştir. Bu koşullarda mutant bitkiden elde edilmiş T1 jenerasyonunda haploid tetikleyici etki gözlenmemiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçların, gelecekte bu alanda yapılacak çalışmalara ışık olması ümit edilmektedir.

Abstract:
Various reports regarding to the development of haploid-inducing lines in corn and Arabidopsis thaliana, as a result of mutations in the structure of centromere-specific histone 3, a histone 3 variant are available in the literature. These studies showed that when null-mutant CenH3 plant lines or plants carrying CenH3 silenced with RNA interference techniques were rescued by CenH3 protein carrying certain mutations, the resulting progeny was able to produce haploid plants when crossed with the wild-type.
In the context of this thesis, the described method was applied to the tomato, a product with high economic and functional value. Tomato is a product that can benefit exceedingly from haploid studies due to its importance but notwithstanding this, an effective method for achieving haploid plants has not been reported in the literature yet. 
The silencing of native CenH3 protein is vital for the success of the described method. Thus, contrary to leaky silencing methods used in the literature, the natural CenH3 gene of the tomato was deleted or modified using CRISPR-Cas9 gene-editing technology and resulting CenH3 "null-mutants" were rescued by synthetic genes designed as a result of the interpretation of the information obtained from the reports in the literature and bioinformatics studies carried out within the scope of the thesis. The designed guide RNAs, Cas9 protein, and the synthetic genes were delivered to tomato plant using Agrobacterium tumefaciens strains EHA105 and AGL1. Transgenic plants obtained as a result of extensive molecular, biotechnological, and tissue culture studies were tested for carrying the transferred genes, and the target regions of T0 and T1 plants were sequenced for characterization of gene editing.
Numerous transgenic plants were obtained from the studies. However, only in one plant (B39), both the synthetic gene and the Cas9 system were found to be integrated into the tomato genome so far. Following the characterization of this bi-allelic mutant plant, a frameshift mutation was detected in one allele, and a single amino acid loss was detected due to a -3 deletion in the other. The T0 and T1 plants have been reciprocally crossed with commercial heterozygote hybrids to test haploid/double haploid induction potential of this approach in tomato.