Pankreatik kanser in-vitro modelinde wj460 molekülünün etkilerinin ve gemsitabin ile potansiyel sinerjistik etkileşimlerinin araştırılması
Investigation of the effects of wj460 molecule and its potential synergistic interactions with gemcitabine in an in-vitro model of pancreatic cancer
Yazar: CEREN KARSLIOĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SEVCAN ATAY
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Gemsitabin = Gemcitabine ; Miyoferlin = Myoferlin ; Moleküller = Molecules ; Neoplazmlar = Neoplasms ; PANC-1 = PANC-1 ; Pankreas hastalıkları = Pancreatic diseases ; Pankreas kanseri hücre hattı =   ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms ; Sinerji = Synergy

Özet:
Pankreatik duktal adenokarsinom, henüz etkili bir tedavisi olmayan kötü prognozlu bir kanser türü olup, tanı, izlem ve tedavisinde yeni biyobelirteçlerin ve moleküler hedeflerin keşfine ihtiyaç bulunmaktadır. Çalışmamızda TCGA PAAD kohortunda gerçekleştirdiğimiz analizler neticesinde MYOF gen ekspresyonunun pankreatik kanser tümör dokularında normal pankreatik dokulara göre daha yüksek oranda eksprese olduğunu (ntumor=179, nnormal=171, p<0,01), yüksek MYOF ekspresyonunun hastalarda düşük genel sağkalım (Logrank p=0,0045; HR=2,2) ve hastalıksız sağkalım (Logrank p=0,032; HR=1,8) ile ilişkili olduğunu ve MYOF mRNA ekspresyonunun hastalarda TNM evreleme ile ilişkili olduğunu (Pr(>F)= 0,00351) gösterdik. Genel sağkalım üzerine olan verilerin valide edilmesi ve farklı TNM evrelerinde bulunan hastalarda MYOF ekpresyonunun genel sağkalım ilişkisinin değerlendirilmesi için daha geniş bir hasta kohortu oluşturduk (n=783; TCGA PAAD, ICGC_Array, GSE28735, ICGC_Seq, GSE62452, GSE71729, EMTAB6134). Yüksek MYOF mRNA ekspresyonunun hastalarda düşük genel sağkalım ile korele olduğunu valide ettik (yüksek %30 (n=392) vs. düşük %30 (n=391); p=0, HR=1,69). MYOF gen ekspresyon yüksekliğinin evre I, II ve III hastalarda düşük genel sağkalım ile korele olduğunu (sırasıyla p=0,0097 (HR=4,62), p=0,0005 (HR=1,7), p=0,0004 (HR=2,04)), fakat evre IV seviyesinde anlamlı bir korelasyon olmadığını ortaya çıkardık (p=0,9, HR=0,96). Daha sonra, bir in vitro pankreas kanseri modelinde, WJ460 MYOF inhibitörünün hücre canlılığı, apoptoz, hücre döngüsü ve hücre göçü üzerindeki etkilerini sırasıyla kristal viyole hücre canlılığı tahlili, akış sitometrisi ve yara iyileşmesi tahlili ile değerlendirdik. Sonuçlar, tek ajanlı Gemsitabin tedavisinin etkinliği ile karşılaştırıldı ve iki ilaç arasındaki etkileşimler, kombinasyon indeksi (CI) analizi ile değerlendirildi. Çalışma sonucunda elde edilen veriler, tek ajanlı WJ460 tedavisinin hücre canlılığını inhibe ettiğini, apoptozu tetiklediğini, G2 fazı tutulumunu indüklediğini ve PANC-1 hücrelerinde göçü baskıladığını göstermektedir.
Tüm analizlerde tek ajanlı WJ460 tedavisinin tek ajanlı gemsitabin tedavisine göre daha etkili olduğu bulundu. Kombinasyon tedavisinin hücre canlılığı üzerindeki etkileri değerlendirildiğinde, düşük dozlarda sinerjistik etkileşimler gözlenmesine rağmen, yüksek dozlarda ilaçlar arasında antagonizm gözlenmiştir. Kombinasyon tedavisinden sonra hücrelerde hücre döngüsü durması gözlenmedi ve apoptotik hücre oranının, tek ajan WJ460 ile tedavi edilen hücrelere kıyasla daha az olduğu bulundu. Göçün inhibisyonunda, tek ajanlı WJ460 tedavisi, kombinasyon tedavisinden daha yüksek bir inhibisyon oranı gösterdi. Çalışma sonucunda elde edilen veriler, MYOF mRNA ekspresyonunun pankreas kanserinde hem tanısal hem de prognostik bir biyobelirteç olma potansiyelinin yüksek olduğunu ve miyoferlin inhibisyonunun pankreas kanseri için umut verici bir tedavi stratejisi olabileceğini göstermektedir. Bu çalışmada elde edilen verilerin daha ileri in vivo çalışmalarda doğrulanması gerekmektedir.

Abstract:
Pancreatic ductal adenocarcinoma is a cancer type with a poor prognosis for which there is no effective treatment yet, and the discovery of new biomarkers and molecular targets is needed in the diagnosis, follow-up and treatment. As a result of the analyzes we performed in the TCGA PAAD cohort in our study, we showed that MYOF gene expression was higher in pancreatic cancer tumor tissues than in normal pancreatic tissues (ntumor=179, nnormal=171, p<0,01), that high MYOF expression was associated with lower overall survival (Logrank p=0,0045; HR=2,2) and disease-free survival in patients (Logrank p=0,032; HR=1,8), and that MYOF mRNA expression was correlated with TNM staging (Pr(>F)= 0,00351). To validate data on overall survival and evaluate the association of MYOF expression with overall survival in patients at different TNM stages, we established a larger patient cohort (n=783; TCGA PAAD, ICGC_Array, GSE28735, ICGC_Seq, GSE62452, GSE71729, EMTAB6134). We validated that high MYOF mRNA expression was correlated with lower overall survival in patients (high 30% (n=392) vs. low 30% (n=391); p=0, HR=1.69). High MYOF gene expression was correlated with lower overall survival in stage I, II, and III patients (p=0.0097 (HR=4.62), p=0.0005 (HR=1.7), p=0.0004, respectively (HR=2.04)), but we found no significant correlation in stage IV patients (p=0.9, HR=0.96). Next, in an in vitro pancreatic cancer model, we evaluated the effects of WJ460 MYOF inhibitor on cell viability, apoptosis, cell cycle, and cell migration by crystal violet cell viability assay, flow cytometry, and wound healing assay, respectively. The results were compared with the efficacy of single Gemcitabine therapy and interactions between the two drugs were evaluated by combination-index (CI) analysis. The data obtained as a result of the study show that WJ460 treatment inhibits cell viability, triggers apoptosis, induces G2 phase arrest, and suppresses migration in PANC-1 cells. WJ460 single-agent treatment was found to be more effective than single-agent gemcitabine treatment in all analyzes. When the effects of combination therapy on cell viability were evaluated, although synergistic interactions were observed at low doses, antagonism was observed between drugs at high doses. Cell cycle arrest was not observed in cells after combination treatment, and the proportion of apoptotic cells was found to be less compared to cells treated with single-agent WJ460. In inhibition of migration, the single-agent WJ460 treatment showed a higher inhibition rate than the combination treatment. The data obtained as a result of the study show that MYOF mRNA expression has a high potential to be both a diagnostic and prognostic biomarker in pancreatic cancer, and myoferlin inhibition may be a promising treatment strategy for pancreatic cancer. The data obtained in this study need to be validated in further in vivo studies.