Tomato brown rugose fruit virus kılıf protein geninin Agrobacterıum aracılığıyla domatese aktarılması
Agrobacterium-mediated transformation of tomato with the coat protein gene of tomato brown rugose fruit virus
Yazar: İLKEM TUTKU TÜRKMEN
Danışman: PROF. DR. BAYRAM ÇEVİK
Isparta Uygulamalı Bilimler Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Domates kahverengi buruşukluk meyve virüsü (ToBRFV) son yıllarda dünyada ve Türkiye'de domates üretim alanlarında yaygınlaşmıştır. ToBRFV mekanik olarak kolayca bulaşmaktadır ve diğer Tobamovirüslere karşı direnç sağlayan Tm22 dayanıklılığını kırabilmektedir. Ticari çeşitlerde geleneksel ıslah yöntemleri ile ToBRFV'ye karşı bir direnç henüz geliştirilmediği için alternatif direnç yöntemlerinin geliştirilmek araştırılmalıdır. Bu çalışmada, ToBRFV'ye karşı alternatif bir direnç olarak patojen kaynaklı kılıf proteinine dayalı direnç geliştirmek için araştırmalar yapılmıştır. Bu amaçla, ToBRFV-CP geni ilk olarak RT-PCR ile çoğaltılmıştır ve gen kasetini oluşturmak için CaMV 35S promotörü ve terminatör arasında klonlanmıştır. Daha sonra, gen kaseti pCAMBIA0380 ikili vektörünün T-DNA bölgesine klonlanlanarak ve Agrobacterium tumefaciens'e aktarılmıştır. In vitro koşullarda çimlenmiş domates tohumlarından elde edilen yaklaşık 1970 hipokotil ve 1300 kotiledon parçasına Agrobacterium aracılığıyla transformasyon yapılmıştır. BAP ile desteklenmiş besi yerinde transformasyon yapılan eksplantlerden yaklaşık olarak 350 sürgün elde edilmiştir ve hayatta kalan 140 sürgün köklenme ortamına aktarılmıştır. Köklenen sürgünlerin 41 tanesinden elde edilen 22 adet bitki, toprağa adaptasyonu için sıvı MS besi yeri ile desteklenmiş steril toprak içeren cam kavanozlara aktarılmıştır. Toprağa adapte olmuş 9 bitkiden genomik DNA izole edilerek ve ToBRFV-CP genine ve gen kasetine özgü primerler kullanılarak PCR yöntemi ile test edilmiştir. PCR analizi sonucunda her iki primer ile pozitif sonuç veren dört bitkinin genomlarında ToBRFV-CP geni içerdiğini göstermiştir. Daha sonra potansiyel transgenik bitkilerden RNA izolasyonu yapılarak RT-qPCR yöntemleri ToBRFV-CP geninin transgenik bitkilerde ekspresyon analizleri yapılmıştır. Yapılan ekspresyon analizleri sonucunda test edilen dört transgenik ToBRFV-CP geninin ifade edildiği ve iki transgenik bitkide yüksek düzeyde ekspresyon gösterdiği belirlenmiştir.

Abstract:
Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) has become widespread in tomato production areas in the world and Turkey in recent years. ToBRFV is easily transmitted mechanically and able to break the Tm22 resistance providing resistance to other Tobamoviruses. Since a resistance to ToBRFV has not yet been developed in commercial cultivars by conventional breeding methods, the development of alternative resistance methods should be investigated. In this study, research was conducted to develop pathogen-derived coat protein-mediated resistance against ToBRFV as an alternative resistance. For this purpose, ToBRFV-CP gene was first amplified by RT-PCR and cloned between the CaMV35S promoter and terminator to construct the gene cassette. Then, the gene cassette was cloned into the T-DNA region of the pCAMBIA0380 binary vector and transferred to Agrobacterium tumefaciens. Approximately 1970 hypocotyl and 1300 cotyledon fragments obtained from in vitro germinated tomato seeds were transformed by Agrobacterium. Approximately 350 shoots were obtained through shoot induction the transformed explants by BAP and 140 shoots survived were transferred to the rooting medium. 22 plantlets obtained from 41 of rooted shoots were transferred to glass jars containing sterile soil supplemented with liquid MS media for adaptation to the soil. Genomic DNA was isolated from nine of soil-adapted plantlets and the samples were tested by PCR method using primers specific to ToBRFV-CP gene and the gene cassette. Then, total RNA was isolated from potential transgenic plants and the expression of ToBRFV-CP transgene was analyzed by RT-qPCR methods. As a result of the expression analyses, it was determined that all tested transgenic plant expressed ToBRFV-CP gene and two transgenic plants showed high levels of expression.