Trıklosan'ın ın vıtro embriyonik rat gelişimi üzerine etkisi
Effects of triclosan on in vitro embriyonic rat development
Yazar: DİCLE ÇAYAN
Danışman: PROF. DR. ERDOĞAN UNUR
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Anatomi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Anatomi = Anatomy

Özet:
Triklosan (2.4.4'-trichlora-2'-hydroxydiphenyl ether), doğal olmayan, laboratuvarda üretilen, noniyonik, yağda çözünen bir maddedir. Özellikle kişisel ve tıbbi bakım ürünleri (sabunlar, diş macunları, ağız bakım suları, losyonlar, deodorantlar, tıraş köpükleri, şampuanlar, deterjanlar, kozmetik ürünler, antiseptikler, dikiş ipleri, üretral stentler, kateterler) içinde bulunan, klorlanmış bisfenol halka yapısına sahip bu geniş spektrumlu madde, bakterilerin canlılığını sürdürebilmesi için gerekli olan yağ asidi sentezini bozarak antimikrobik etkisini gösterir. Yapılan araştırmalar triklosanın plazma, idrar, feçes ve anne sütünde bulunduğunu tespit etmiş ancak memeli embriyoları üzerine etkisini açığa çıkaramamıştır. 
Rat embriyo kültür tekniği (WEC), özellikle 1960'lı yıllarda dünyada talidomit faciasının ortaya çıkmasıyla önem kazanan toksikoloji ve teratoloji çalışmaları için geliştirilen bir yöntem olmuştur. Bu yöntemle çalışmamızın amacı, triklosanın in vitro koşullarda embriyonik rat gelişimi üzerine etkisini araştırıp, ardından gen ekspresyonu yöntemi ile hücreleri apopitoza sürükleyen kaspaz değerlerini belirlemektir.
Çalışmamızda 40 adet 9.5 günlük rat embriyosu kullanıldı. Kültür şişesine eklenen triklosan dozuna göre, kontrol ve 3 deney grubu (100 ng/ml, 200 ng/ml ve 300 ng/ml) oluşturuldu. Embriyolar kültür şişelerine eklendikten sonra ilk gün %5'lik O2, ikinci gün %20'lik O2 ve üçüncü gün %40'lık O2 bulunan gaz karışımı ile gazlandı. 48 saatlik kültür periyodundan sonra embriyolar gelişimsel değerlendirme amacıyla morfolojik skorlamaya tabi tutuldu. Ardından 40 embriyoya gen ekspresyonu yapılarak kaspaz 2, kaspaz-7, kaspaz-8 ve kaspaz-9 değerleri ölçüldü. Veriler SPSS yazılım programı kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi.
Toplam morfolojik skorlama kontrol grubunda 62.8, deney gruplarında ise triklosan miktarına göre sırasıyla 30.4, 14.9 ve 1.8'e geriledi. Morfolojik skorlamaya ait diğer 17 parametrede de istatistiksel olarak anlamlı bir gerileme tespit edildi (p < 0.001). Triklosanın hücrede hangi yol üzerinden apopitozise neden olduğunu belirlemek için 4 farklı kaspaz düzeyi gen ekspresyonu ile belirlendi. Kaspaz-2 değerlerinin triklosan miktarı ile ters orantılı bir şekilde, gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gösterdiği bulundu (p<0.001). Kaspaz-7 ve kaspaz-8 değerlerinin triklosan dozu ile orantılı olarak arttığı ancak bu artışın istatistiksel bir anlam ifade etmediği, kaspaz-9 değerlerinin ise triklosan miktarıyla anlamlı bir biçimde istatistiksel olarak anlamlı bir artış gösterdiği tespit edildi.
Bu verilere göre, gebelik döneminde triklosan kullanımının, hücrelerde ekstrinsik yol aracılığıyla apopitoza yol açarak, embriyonik gelişme geriliğine neden olduğu, bu durumun doza bağlı olarak arttığı belirlendi.  
Anahtar Kelimeler: Triklosan, rat embriyo kültürü, in vitro, apopitozis, gen ekspresyonu

Abstract:
Triclosan (2.4.4'-trichlora-2'-hydroxydiphenyl ether) is a non-natural, non-ionic, oil-soluble material and is produced in laboratories. This substance, which has a wide-range of chlorinated bisphenol ring structure, and which is found in especially in personal and medical care products (soaps, toothpastes, oral care water, lotions, deodorants, shaving foams, shampoos, detergents, cosmetic products, antiseptics, sewing threads, ureteral stents, and catheters), shows its antimicrobial effect by breaking down the fatty acid synthesis, which is necessary for the survival of bacteria. Studies conducted so far have detected the presence of Triclosan in the plasma, urine, feces and breast milk; however, have not revealed its effects on the mammalian embryo. 
Whole Rat Embryo Culture Technique (WEC) was developed for toxicology and teratology studies, which became important when the Thalidomide Disaster emerged in the world in 1960s. By using this method, the purpose of the present study is to investigate the effects of triclosan in in vitro conditions on embryonic rat development, and to determine the caspase values that lead the cells to apoptosis. In our study, a total of 40 rat embryos that were 9.5 days old were used. According to the triclosan dose that was added to the culture bottle, the control and the 3 study groups (100 ng/ml, 200 ng/ml and 300 ng/ml) were formed. After the embryos were added to the culture bottles, they were given gas as follows; 5% O2 on the first day; 20% O2 on the second day; and 40% O2 on the third day. After 48 hours of culture period, the embryos were subjected to morphological scoring for developmental evaluation. Then, the gene expression was performed to the 40 embryos, and the Caspase 2, Caspase-7, Caspase-8 and Caspase-9 values were measured. The data that were obtained in this way were analyzed statistically by using the SPSS Software Program. 
In terms of the amount of Triclosan, the total morphological scoring was 62.8 in the control group and regressed to 30.4, 14.9 and 1.8, respectively, in the Study Groups. Statistically significant regressions were detected in other 17 morphological scoring parameters (p<0.001). In order to determine through which way triclosan caused apoptosis in the cells, 4 different Caspase levels were determined by gene expression. It was determined that the Caspase-2 levels showed a significant decrease among the groups at a statistically significant level, which was reversely proportional to the amount of Triclosan (p<0.001). It was determined that Caspase-7 and Caspase-8 values increased at a significant level in proportion to the Triclosan dose; however, this increase was not statistically significant, and that Caspase-9 levels significantly increased at a statistically significant level with the amount of Triclosan.
In this respect, it was determined that the use of Triclosan during pregnancy caused apoptosis through extrinsic pathway in the cells, which in return, caused retardation in the embryonic development, and this increased in a dose-dependent manner.
Keywords: Triclosan, whole embryo culture, in vitro, apoptosis, gene expression