Astragalus trojanus Stev. hücre süspansiyon kültürlerinde sekonder metabolit içeriklerinin arttırılması
Enhancing secondary metabolite production in Astragalus trojanus Stev. cell suspension cultures
Yazar: PINAR NARTOP
Danışman: PROF. DR. AYNUR GÜREL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Astragalus trojanus Stev., özellikle sikloartan-tip metabolitler başta olmak üzere çok değerli sekonder metabolitlere sahip tıbbi bir bitkidir. Bu projede A. trojanus?a ait tohumlar in vitro koşullarda çimlendirilmiştir ve 27 klon arasından en yüksek rejenerasyon kapasitesine sahip 3 tanesi (klon 1, 12 ve 15) seçilerek çalışmalara devam edilmiştir. Bu üç klona ait gövde ve yaprak eksplantları farklı büyüme düzenleyicilerine, çevre koşullarına ve besin ortamı bileşimlerine maruz bırakılarak kallus oluşturma kapasiteleri belirlenmiştir. Bu eksplantlar farklı konsantrasyonlarda kinetin, naftalen asetik asit, 2,4-diklorofenoksiasetik asit, thidiazuron ve indolasetik asit içeren Murashige ve Skoog (MS) ve Woody Plant (WPM) besin ortamlarında, iki farklı ışık yoğunluğu (1000 ve 4000 lux) ve karanlık koşullar altında kültüre alınmışlardır. Hem MS hem de WPM besin ortamlarının kallus oluşumunu tetiklediği görülmüştür. Gövde ve yaprak eksplantlarında kallus rejenerasyonları görülmesine rağmen, gövde eksplantlarında yaprak eksplantlarına göre daha yüksek miktarlarda kallus rejenere olmuştur. 4 ve 8 mg/L 2,4-D içeren WPM besin ortamlarında %100 kallus oluşumu tespit edilmiştir. 100 ?g/L selenyum ve iki kat WPM vitaminlerinin eklenmesiyle karanlık koşullarda kallus biyokütlesinin (78 mg) arttığı görülmüş ve bu besin ortamı hücre süspansiyon kültürlerinin kurulması için de kullanılmıştır. 
Hücre süspansiyon kültürlerinde sekonder metabolit üretiminin teşvik edilmesi için elisitörler (metil jasmonat, jasmonik asit, salisilik asit ve pektin) ve prekürsör (ß-sitosterol) uygulaması yapılmıştır. Mikroçoğaltım yapılan dokuların, kallusların ve süspanse hücrelerin astragalozit-IV ve sikloastragenol üretim kabiliyetleri belirlenmiştir. Mikroçoğaltımı yapılan dokularda en yüksek astragalozit-IV (0.5486 µg/mg) ve sikloastragenol (0.1263 µg/mg) içeriği 1. klonun in vitro?da gelişen köklerinde belirlenmiştir. Kallus dokusunda en yüksek astragalozit-IV (3.5 µg/mg) ve sikloastragenol (4.8 µg/mg) içeriği gövdeden gelişen kalluslarda tespit edilmiştir. Süspanse hücrelerde, 50 mM metil jasmonat ile elisite edilmiş kültürlerin (3.57 g/L yaş ağırlık) 14. gününde en yüksek astragalozit-IV içeriği 0.9435 µg/mg olarak belirlenirken, en yüksek sikloastragenol içeriği 50 mM jasmonik asit eklenen kültürlerin (0.82 g/L yaş ağırlık) 28. gününde 0.3626 µg/mg olarak saptanmıştır. Süspanse hücrelerin büyük ölçekli üretimi için iki farklı kesikli kültürle (500 mL?lik erlende 200 mL ve 1000 mL?lik erlende 400 mL) çalışıldığında, en yüksek astragalozit-IV  miktarı 0.3759 µg/mg olarak 500 mL ölçeğinde elde edilmiştir.

Abstract:
Astragalus trojanus Stev. is a medicinal plant which produce valuable secondary metabolites, especially cycloartane-type glycosides. In this project, seeds of A. trojanus were germinated in vitro conditions and three out of 27 clones were selected for further experiments based on the highest regeneration capacity (clones 1, 12 and 15). Stem and leaf explants of these three clones were subjected to different plant growth regulators, environmental conditions and media compositions to identify their callus responses. The explants were cultured in Murashige and Skoog (MS) and Woody Plant (WPM) media supplemented with different concentrations of kinetin, naphthalene acetic acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, thidiazurone and indole acetic acid under two light intensities (1000 and 4000 lux) and also in dark conditions. Both MS and WPM media triggered callus regeneration. Although, callus regeneration was observed on both stem and leaf explants, stem explants regenerated higher amounts of callus than leaf explants. In WPM medium supplemented with 4 and 8 mg/L 2,4-D, callus regeneration ratio was found as 100%. Addition of 100 ?g/L selenium and doubled concentration of WPM vitamins enhanced callus biomass (78 mg) on stem explants under dark conditions, and this medium was also used for the establishment of cell suspension cultures. 
Elicitors (methyl jasmonate, jasmonic acid, salicylic acid and pectine) and precursor (ß-sitosterol) were used for stimulation of secondary metabolite production in cell suspension cultures. Astragaloside IV and cycloastragenol production efficiencies were determined in micropropagated tissues, callus and suspended cells. In micropropagated tissues, the highest astragaloside IV (0.5486 µg/mg) and cycloastragenol (0.1263 µg/mg) contents were detected in well-grown roots of Clone 1. In callus tissue, the highest astragaloside IV (3.5 µg/mg) and cycloastragenol (4.8 µg/mg) production was found in callus tissues regenerated from stem explants. In suspended cells, the highest astragaloside-IV amount was 0.9435 µg/mg in the 14th day of culture (3.57 g/L FW) which was elicitated with 50 mM methyl jasmonate, whereas the highest cycloastragenol production was 0.3626 µg/mg  in the 28th day of culture (0.82 g/L FW) which was added 50 mM jasmonic acid. When scaling up of suspended cell production were studied in two batch culture systems (200 mL working volume in 500 mL erlenmayer flask and 400 mL in 1000 mL),  the highest astragaloside-IV amonut was obtained as 0.3759 µg/mg in 500 mL scale.