Bacillus sp. EBTA6 ile proteaz üretiminin optimizasyonu ve  enzimin endüstriyel kullanım olanaklarının araştırılması
Optimization of protease production by Bacillus sp. EBTA6 and investigation of industrial application potentials of the enzyme
Yazar: SELİN DEMİR
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE AVCI
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmada, çeşitli toprak ve gıda örneklerinden izole edilmiş olan 32 adet Bacillus izolatının proteaz üretimi araştırılmış ve en iyi üretici izolatlardan biri olan Bacillus sp. EBTA6 seçilerek proteaz üretiminin optimizasyonu yapılmış ve enzimin özellikleri ile bazı endüstriyel uygulama olanakları belirlenmiştir. Enzim üretiminin optimizasyonu, yanıt yüzey yöntemi (RSM) tabanlı merkezi kompozit dizaynı (CCD) ile yapılmıştır. Bu amaçla, üç önemli bağımsız değişken (pH, sıcaklık, maya özütü konsantrasyonu) ve bağımlı yanıt değişkenleri (enzim aktivitesi, mikroorganizma gelişmesi) belirlenmiştir. Optimizasyon sonucunda; bağımsız değişkenlerin hepsinin enzim üretimi için; maya özütü konsantrasyonu ve sıcaklığın ise mikroorganizma gelişmesi için anlamlı faktörler olduğu belirlenmiştir. Optimum üretim 30°C, pH 9, 15 g/L maya özütü konsantrasyonunda olmuş ve bu koşullarda, proteaz aktivitesi 3207,01 U/mL olarak belirlenmiştir. CCD ile ortam bileşenlerinin ve kültür koşullarının optimizasyonunun ardından Bacillus sp. EBTA6 tarafından proteaz üretiminde 2,6 kat artış gözlemlenmiştir. Enzimin optimum sıcaklık ve pH'sının sırasıyla 50-60°C ve 8 olduğu tespit edilmiştir. Enzimin pH 7-10 gibi geniş bir pH aralığında kararlı (% 82-93) olduğu gözlenmiştir. Enzim, 50°C'de bağıl aktivitesinin %55'ini 150 dakika süreyle koruyabilmiştir. Metal iyonlarından; K+,  Cu2+, Sn2+ ve Zn2+'nin çok düşük oranda inhibe edici, Ca2+ ve Mg2+'nin ise aktiviteyi arttırıcı etkisi olmuştur. EDTA, PMSF ve SDS enzim aktivitesini düşürmüş, Tween 20 ve Tween 80 ise etkilememiştir. Ham enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 2,762 mg/mL ve 3125 U/mL olarak belirlenmiştir. CaCl2 varlığında enzim önemli oranda süt pıhtılaşma akvitesi göstermiştir. Yıkama performansı analizinde kan ve ketçap gibi çeşitli lekeleri etkili bir şekilde 50°C'de çıkarabildiği gözlemlenmiştir. Yapılan çalışmalar Bacillus sp. EBTA6'nın ürettiği proteazın serin alkalin özellikte ve endüstriyel kullanım potansiyeline sahip olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, 32 Bacillus isolates, that were previously isolated from soil and food samples, were screened for protease production and one of the best producers, Bacillus sp. EBTA6, was selected for the optimization of protease production and the determination of the properties of the enzyme as well as the industrial applications. Central Composite Design (CCD) of Response Surface Methodology was used for the optimization. For that purpose, three important independent variables (pH, temperature and yeast extract) and two dependent variables (protease activity and growth) have been determined. The results showed that all of the independent factors have significant effect on the enzyme activity and yeast extract concentration and temperature had significant effect on the growth. Optimum conditions for protease production were determined as 30°C, pH 9, and 15 g/L yeast extract concentration with the activity of 3207,01 U/mL. A 2,6 times increment in the activity have been achieved after the optimization. The optimum pH and temperature of the enzyme was determined as 8 and 50-60°C, respectively. The enzyme was stable at a broad pH range between 7 and 10 (82-93 %). It retained 55% of its activity at 50°C in 150 min. Amongst the metal ions, K+,  Cu2+, Sn2+ and Zn2+ slightly inhibited the activity while Ca2+ and Mg2+ increased it. EDTA, PMSF and SDS have decreased the the activity, on the other hand Tween 20 and Tween 80 did not effect it. Km and Vmax values of the enzyme were deterimed as 2,762 mg/mL and 3125 U/mL, respectiely. It possessed considerably high milk clotting activity in the presence of CaCl2. Washing performance of the enzyme which were tested on blood and ketchup stains showed that it was quite effective at 50°C.  The studies have revealed that the protease from Bacillus sp. EBTA6 was serin alkaline and had industrial potential.