Kolorektal kanser tanısı almış hastalarda DNA hasarının incelenmesi ve DNA hasarı üzerine beta glukanın onarıcı rolünün araştırılması
Investigation of DNA damage in patients with colorectal cancer and investigation of the repairing role of beta-glucan on dna damage
Yazar: NİLAY UÇAR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ NECLA BENLİER
Sanko Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Comet tekniği = Comet assay ; DNA hasarı = DNA damage ; Glukanlar = Glucans ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
DNA (Deoksiribo Nükleik Asit), organizmaların genetik bilgilerini gelecek jenerasyonlara taşıyarak devamlılığı sağlayan ve birçok reaktif molekülün etkilemesiyle kolay hasar alabilen bir biyomoleküldür. Hasar, DNA molekülünün fiziksel ve kimyasal yapısındaki değişiklikle ya da çevresel etkenlerle oluşur. DNA hasarı kromozom anomalilerine ve mutasyona neden olur. DNA hasarının doğru ve hassas bir şekilde ölçülebilmesi için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Bu yöntemlerden bir tanesi Tek hücre jel elektroforezi (SCGE), diğer adıyla "Comet Assay Yöntemi"'dir. Bu teknik; birçok canlı çeşidinde DNA hasarını belirlemek için kullanılan non-invaziv, hızlı, hassas ve basit floresan mikroskobik yöntemdir. Comet Assay yöntemi; apoptozis, yaşlanma, klinik ve genetik toksikoloji, oksidatif stres- antioksidan çalışmalarında tercih edilmektedir. Beta glukan, ekmek mayası (Saccharomyces cerevisiae) hücre duvarından ekstrakte edilen, bağışıklık sistemini güçlendiren, uyarıcı etkisi olan, antioksidan etki yaratan basit bir polisakkarittir. Bu çalışmamızda, kolorektal kanser tanısı almış hastalardan alınan tam kan örnekleri Comet Assay yöntemi kullanılarak DNA hasarının tespit edilmesi ve hasarın ex vivo ortamda beta glukanın onarıcı etkisinin ispat edilmesi amaçlanmıştır. Gaziantep Medical Park Hastanesi Medikal Onkoloji bölümüne ve Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Onkoloji bölümüne gelen ve evre 3-4 kolorektal kanser tanısı almış, tedaviye başlanmamış gönüllü (40- 80) yaş arası toplam 19 yetişkin kadın ve erkek hasta üzerinde ex vivo çalışma yapılmıştır. Araştırmaya katılacak her hastaya çalışmamızın amacı açıklanmış ve gönüllü bilgilendirme formu verilmiştir. Gönüllü hastalardan steril koşullarda aynı gün içerisinde EDTA'lı tüplere 10 cc alınacak olan venöz kan uygun koşullarda laboratuvara getirilip çalışmaya başlanmıştır. Alınan tam kanlardan Comet Assay testi uygulanarak DNA hasarı tespit edilmiştir. Her bir lam örneği 50 μl/ml EtBr (Etidyum bromür) ile boyandıktan sonra floresan mikroskoptaki görüntüleri alınıp fotoğrafları çekilmiştir. Open Comet Assay programı ile her sahada 100 hücre dikkate alarak analiz edilerek sonuçlar alınmıştır. Ayrıca 20 kişiden oluşan sağlıklı gönüllü kontrol grubu oluşturulmuştur. Bu gruba beta glukan uygulaması yapılmamışıtır. Hasta grubun glukan kan örneklerine 50 μl/ml beta glukan ve antibiyotik olarak 100 U/ml penisilin (Noss, 2012) uygulanıp 12 saat süreyle 37ºC'de %5 CO2 te inkübasyona bırakılmıştır. Beta glukanın etki etme süresini takip etmek için minimum ilk 40. dakikadan itibaren kontroller yapılmıştır. Beta glukan uygulanmış örnekler Comet Assay yöntemi ile test edilmiştir. Boyanarak floresan mikroskopta lam örnekleri incelenmiş ve görüntüler fotoğrafları çekilerek kaydedilmiştir. Open Comet görüntülü analizle her sahada 100 hücre dikkate alınarak analizleri yapılmıştır. Beta glukanın DNA hasarını tamir etme yeteneği izlenmiştir. Hastaların kan örneklerine negatif kontrol olarak uygun doz (50μmol/L) (Angelie ve diğ., 2006) ve sürede (10 dk.) H2O2 uygulanmıştır. Aynı şekilde Comet Assay yöntemi uygulanarak boyanıp mikroskopta görüntüleri alınıp analizi yapılmıştır.
Kolorektal kanser tanısı almış hastaların (tedaviye başlamadan önce) Comet Assay yöntemi ile DNA hasarları (kuyruk DNA yüzdesi, kuyruk momenti ve kuyruk uzunluğu parametreleri bakımından), kontrol grubundaki (sağlıklı birey) bireylerin DNA hasarları ile kıyaslanmış olup daha sonra Beta glukanın 50 μl/ml'lik konsantrasyonu ile, kolorektal kanser tanısı almış hastalarda DNA hasarı onarıcı etkisi incelenmiştir. Hasta grubun ortalamaları ile kontrol grubunun ortalamaları arasındaki farkın önemli olup olmadığı t-testi ile kontrol edilmiştir Kolorektal kanser tanısı almış hastaların DNA'larındaki meydana gelen hasar, Comet yöntemi ile incelendiğinde kontrol grubuna göre; kuyruk momenti, kuyruk yüzdesi ve kuyruk uzunluğu değerlerinde istatistiksel olarak önemli ölçüde arttığı tespit edilmiştir. Kolorektal kanser tanısı almış hastalara Beta Glukan ex vivo koşullarda 12 saat uyguladıktan sonra Comet Assay yöntemi ile incelendiğinde oluşan DNA hasarlarının önemli ölçüde azaldığı istatistiksel olarak tespit edilmiştir. Kolorektal kanserli hasta grubuna beta glukan uygulandıktan sonra elde ettiğimiz veriler kontrol grubu değerleriyle kıyaslandığında, beta glukan sonuçları kontrol grubu değerlerine göre daha düşük çıkmıştır. Beta glukanın tedavi sonuçları, kontrol grubunda var olabilecek olası hasarları göz önünde tutarsak kontrol grubuna göre daha düşük çıkması mümkün olabilir. Sonuç olarak; beta glukanın kolorektal kanser hastaları üzerinde antisitotosik ve antigenotoksik etkilerinden dolayı DNA hasarını onarıcı etkisi olduğu söylenebilir.

Abstract:
DNA (Deoksiribo Nucleic Acid) is a biomolecule that provides continuity by transferring the genetic information of organisms to future generations and can be easily damaged by the effects of many reactive molecules. The damage is caused by changes in the physical and chemical structure of the DNA molecule or by environmental factors. DNA damage causes chromosomal abnormalities and mutations. Various techniques are used to accurately measure DNA damage. One of these methods is Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE), also known as "Comet Assay Method". This technique; It is a non-invasive, fast, sensitive and simple fluorescent microscopic method used to detect DNA damage in many species. Comet Assay method; apoptosis, aging, clinical and genetic toxicology, oxidative stress-antioxidant studies. Beta glucan is a simple polysaccharide extracted from the cell wall of yeast (Saccharomyces cerevisiae), which strengthens the immune system, has a stimulating effect and creates an antioxidant effect. In this study, it was aimed to detect DNA damage by using Comet Assay method in whole blood samples taken from patients diagnosed with colorectal cancer and to prove the restorative effect of beta-glucan in ex vivo environment. A total of 19 adult male and female volunteers (40-80 years) who were diagnosed as stage 3-4 colorectal cancer who came to Gaziantep Medical Park Hospital Medical Oncology Department and Gaziantep University Medical Faculty Medical Oncology Department were studied ex vivo. The purpose of our study was explained to each patient who participated in the study and voluntary information form was given. Venous blood, which will be taken into sterile EDTA tubes in 10 ccs from volunteer patients, was brought to the laboratory under appropriate conditions and started to work. The DNA damage was determined by using Comet Assay test from whole blood. After each slide sample was stained with 50 μl/ml EtBr, images were taken on a fluorescence microscope and photographed. The Open Comet analysis program was used to analyze 100 cells in each field. In addition, a healthy volunteer control group consisting of 20 people was formed. Beta-glucan was not applied to this group. Glucan blood samples of the patient group were given 50 μl/ml beta glucan and 100 U / ml penicillin as antibiotics (Noss, 2012) and incubated for 12 hours at 37ºC in 5% CO2. To monitor the duration of action of beta-glucan, controls were performed from a minimum of the first 40 minutes. Beta glucan-treated samples were tested by the Comet Assay method. Samples were examined by staining on a fluorescent microscope and images were recorded by taking photographs. With Open Comet image analysis, 100 cells were analyzed in each field. The ability of beta-glucan to repair DNA damage was monitored. As a negative control, H2O2 (50 μmol / L) (Angelie et al., 2006) and duration (10 min) were administered to the blood samples of the patients. In the same way, the Comet Assay method was applied and the images were taken and analyzed under a microscope.
DNA damage (in terms of tail DNA percentage, tail moment and tail length parameters) of patients with colorectal cancer (before starting treatment) was compared with DNA damage of control group (healthy individual) and then 50 μl/ml of Beta glucan DNA concentration repairing effect was investigated in patients diagnosed with colorectal cancer. The difference between the mean of the patient group and the control group was checked by t-test. The damage occurred in the DNAs of patients with colorectal cancer was examined by Comet method. It was determined that the tail torque, tail percentage, and tail length values increased significantly. After 12 hours of application of beta-glucan ex vivo in patients diagnosed with colorectal cancer, it was found statistically significant that DNA damage was significantly reduced by Comet Assay. When beta-glucan was administered to the patients with colorectal cancer, the results obtained were lower than the control group when compared with the control group values. The treatment results of beta-glucan may be lower than the control group, considering the possible damages in the control group. As a result; It can be said that beta-glucan has a restorative effect on DNA damage due to its anticytotoxic and antigenotoxic effects on colorectal cancer patients.