BMSM (BrothMixing Sterile Mucosal Content) ortamında gelişen Crohn hastalığı ile ilişkili adherent- invasive Escherichiacoli(AIEC) ırkının adeziv ve invaziv özelliklerinin karşılaştırılması
Comparison adhesive and invasive features of Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichiacoli(AIEC) strain growing in BMSM (BrothMixing sterile mucosal content) medium
Yazar: HÜSAMETTİN AYGÜN
Danışman: PROF. DR. FİKRET UYAR
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Crohn hastalığı = Crohn disease ; Escherichia coli enfeksiyonları = Escherichia coli infections

Özet:
Şu ana kadar Crohn hastalığının gelişiminde rol alan faktörlerden biri olan
bağırsak florası içinde hastalığın birçok karakteristiğiyle uyumlu patojen özellikleriyle Crohn
hastalığına genetik olarak yatkın bireylerde spesifik hasara neden olan en olası ırk Adherent-
Invasive Escherichia coli ırkıdır. Bununla birlikte bu ırk sağlıklı bireylerde de bulunduğundan
genellikle bir patobiyont olarak kabul edilir. Ayrıca ırka özgü moleküler hedefler henüz mevcut
olmadığından bu ırkın sağlıklı mukozadaki yerleşim yerini belirlemek mümkün değildir.
Şüphesiz ırkın sağlıklı intestinal mukozadaki yerleşim yerinin belirlenmesi ırkın hastalığın
gelişimindeki rolüyle ilgili önemli veriler sunacaktır.

Çalışmamızda farklı zamanlarda kullandığımız FVB/N ve Balb/c farelerine ait kolon
(CR) ve ileum (IR) bölgelerinden elde ettiğimiz mukozal içerikleri ve hücre kültür ortamını
veya Luria-Bertani (LB) ortamını belli oranlarda içeren, Broth Mixing Sterile Mucosal Content
(BMSM) ortamlarını oluşturduk. Böylelikle hem bu BMSM ortamlarını içeren hücre enfeksiyon
deneyleri yoluyla LF82'nin adeziv/invaziv özelliklerini karşılaştırarak hem de LF82'nin BMSM
ortamlarındaki bakteriyel kültürünü yaparak AIEC ırkı, LF82'nin sağlıklı intestinal mukozadaki
yerleşim yeri ile ilgili ipuçları elde etmeyi amaçladık. I-407 hücre hattının kullanıldığı invazyon
ve adezyon deneylerine ait sonuçlar her iki fare ırkında da genellikle benzerdi ve birbirini
doğruladı. Sonuçlar bağırsak sisteminin farklı kısımlarından hazırlanmış her bir BMSM
ortamında, LF82'nin üreme ve adeziv/invaziv özellikler bakımından oldukça farklı davranışlar
sergilediğini gösterdi. Üstelik bu farklılıklar genellikle IR bölgesinden hazırlanan BMSM
ortamında CR bölgesinden hazırlanan BMSM ortamına göre daha güçlü ve anlamlıydı. 3 saatlik
hücre enfeksiyon periyodundan sonra, IR bölgesinden hazırlanan BMSM ortamını içeren hücre
kültür ortamı, LF82'nin adezyonunu inhibe etti ve gentamisin uygulamasını takiben 1 saatlik ek
hücre inkübasyon periyodundan sonra bu ortam LF82'nin invazyonunu da güçlü bir şekilde
inhibe etmişti. Bu BMSM ortamında hücre yüzeyine yapışan LF82 oranı kontrole göre
neredeyse yarı oranlardayken, intraselüler LF82 oranı, kontroldeki intraselüler LF82 oranı %100
kabul edildiğinde %5'ten daha azdı. Bakteriyel kültür sonuçlarına göre ise her iki bölgeye ait
BMSM ortamında da LB ortamına göre daha yüksek bir bakteri üremesi görüldü. Üstelik IR
bölgesinden hazırlanan BMSM ortamının, LF82'nin üreme kabiliyeti bakımından en iyi ortam
olduğunun gözlenmesi ilginçti. Keza bir gecelik inkübasyondan sonra LB ortamıyla
karşılaştırıldığında, bakteri bu ortamda ortalama iki katı sayıda üredi.

Sonuç olarak özgün bir yaklaşımla gerçekleştirdiğimiz bu çalışma, sağlıklı intestinal
mukozada kolon yerine ileumun, AIEC ırkı, LF82 için daha olası bir yerleşim yeri olduğuna
dair önemli ipuçları sundu.

Anahtar Kelimeler: AIEC, LF82, Crohn Hastalığı, Broth Mixing Sterlie Mucosal Content
(BMSM), Adezyon, İnvazyon.

Abstract:
To date Adherent-Invasive Escherichia coli (AIEC) with pathogenic traits that is
compatible with many characteristic of this disease is the most likely strain to case specific
damage to the people who are genetically susceptible to Crohn's disease (CD) in the gut flora
that is one of factors playing a role in development CD. However AIEC usually is being
accepted as pathobiont because of this strain is also isolated from healthy individuals. Besides,
the exact localization of these strains in healthy intestinal mucosa is not possible to be detected
due to the fact that specific molecular targets belonging these strains have not been determined
yet. Undoubtedly, determining exact localization of this strains in the healthy intestinal mucosa
will be provide significant data related to role of AIEC in development CD.

In our study, we designed Broth Mixing Sterile Mucosal Content (BMSM) mediums
composed of certain rates of cell culture medium or Luria-Bertani (LB) medium and mucosal
contents obtained from colonic region (CR) and ileal region (IR) belonging to FVB/N and
Balb/c mice that we used different times. Thus, We aimed to obtain some clues about the exact
localization of AIEC strain, LF82 in healthy intestinal mucosa via both using bacterial culture of
LF82 in BMSM mediums and comparing adhesive and invasive abilities of LF82 with cell
infections experiments including BMSM mediums. Results of adhesion and invasion
experiments that using I-407 cell line, usually were similar and agree each other in both mice
type. The results showed that LF82 exhibit rather different behaviors in terms of proliferation
and adhesive/invasive features in each BMSM mediums prepared from different part of
intestine. Moreover, these differences were stronger and significant in BMSM medium prepared
from IR than in BMSM medium prepared from CR. After 3 hours cell infection period, cell
culture medium including BMSM medium prepared from IR, inhibited adhesion of LF82 and
after gentamicin treatment following additional one hour incubation period, ıt also had inhibited
strongly invasion of LF82. In this BMSM medium, while rate of LF82 associated to the cell
surface were almost half rates according control, rate of intracellular LF82 was more less than 5
% when rate of intracellular LF82 in control defined as 100 %. According bacterial culture
results however, more bacterial proliferation was seen in both BMSM medium prepared from
IR and CR than LB medium. Moreover, it was interesting to observe that BMSM medium
prepared from IR was the best medium in term of the proliferation capability of LF82. Likewise
after overnight incubation period, LF82 number growing in BMSM medium prepared from IR,
was about twice in compared with LF82 number growing in LB medium.

In conclusion, this study which we performed with an original approach offered
significant clues regarding to ileum being more likely localization site for AIEC strain, LF82
rather than colon in the healthy intestinal mucosa.

Key Words: AIEC, LF82, Crohn's Disease (CD), Broth Mixing Sterile Mucosal Content
(BMSM), Adhesion, Invasion.