Çinko eksik koşullarda yetiştirilmiş Hordeum spontaneum C. Koch gövdesinden kurulmuş baskılayıcı çıkarım hibridizasyon kütüphanesinden seçilen cDNA'ların moleküler ve biyoinformatik analizleri
Molecular and bioinformatics analysis of cDNA's selected from stem suppression subtractive hybridization library of Hordeum spontaneum C. Koch grown under zinc deficient conditions
Yazar: BAHAR IŞIK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ŞENAY VURAL KORKUT
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Arpa = Barley ; Çinko = Zinc

Özet:
Çinko bütün organizmalar için önemli bir mikrobesindir ve 1000'den fazla enzim ve proteinin temel bileşenidir. Canlı hücrelerde protein, karbohidrat ve lipid metabolizmasında, replikasyon ve transkripsiyonda, biyomembranların yapısal ve fonksiyonel bütünlüğü için kritik rolleri vardır.Çinko eksikliği tüm canlılarda bir çok bozukluğa neden olur. Düşük çinko koşullarında yetişen bir bitkide cüce gövde, genç yapraklarda kıvrılma ve yuvarlanma, yaprak uçlarının ölümü ve klorozis görülür. Memelilerde ise, çinkonun yetersiz olduğu bir beslenme şekli anemi, savunma sistemi bozuklukları ve gelişimsel problemlere neden olur. Bu nedenle, organizmalarda çinko düzeylerini iyi bir şekilde kontrol eden ve beklenmeyen eksikliklere veya fazlalıklara anında tepki oluşturan hücresel mekanizmalar gelişmiştir.Tüm dünyada yaygın bir sağlık problemi olan çinko eksikliğinin giderilmesi için çinkonun eksik olduğu bilinen tarım alanlarında bu strese dayanıklı ürünler yetiştirilmelidir. Bitki türleri arasında çinko alım etkinliği bakımından genotipik varyasyonlar görülmektedir. Bu varyasyonlar çinkonun alımı, taşınımı ve depolanmasında görev alan proteinleri kodlayan genlerin farklı anlatımından kaynaklanmaktadır. Araştırma grubumuzda çinko eksikliğinde anlatımı olan genlerin yüksek verimlilikle identifikasyonu için Türkiye topraklarına iyi adapte olmuş Hordeum spontaneum C. Koch kullanılmıştır. Önceki projelerimizde, çinko eksik koşullarda yetiştirilmiş Hordeum spontaneum C. Koch yaprak, kök ve gövdesinden elde edilmiş RNA'lar kullanılarak, toplam 5808 klon içeren, üç farklı baskılayıcı çıkarım hibridizasyon (Suppression Subtractive Hybridization=SSH) kütüphanesi kurulmuştur. Yaprağa ait 960 klon ve köke ait 384 klonun dizin ve biyoinformatik analizleri tamamlanmıştır.Bu çalışmada ise gövde SSH kütüphanesinde bulunan cDNA'ların izolasyon ve identifikasyonlarının gerçekleştirilmesi amaçlandı. Bu amaçla, 672 klon rastgele olarak seçilip dizin analizleri gerçekleştirildi. Ham dizin verileri biyoinformatik araçlar kullanılarak işlendi. Öncelikle, düşük kaliteli dizinler, vektör dizinleri ve rekombinant olmayan klonlar, Cygwin yazılımı ile kullanılabilen Phred ve Cross-Match programlarıyla uzaklaştırıldı. Daha sonra, CAP3 ve Phrap programlarıyla kontig ve singletler oluşturulup, her iki program için sonuçlar karşılaştırıldı. Kontig ve singlet dizinlerinin nükleotid ve protein BLAST analizleri gerçekleştirildi. BLAST analizlerinde dizinlerin, metabolizma, savunma ve stres cevabı, yapı ve hücresel organizasyon, transkripsiyon, translasyon, sinyal iletimi ve apoptosisde görev aldığı düşünülen çeşitli genlere benzediği bulundu. Bu genlerden bazılarının yapısal ve fonksiyonel olarak iyi karakterize edilmiş genlerdir. Bunlar içinde Ribuloz-1,5-Bifosfat karboksilaz/oksigenaz (RuBisCO), Lipid Transfer Protein (LTP), BLT4 protein, kitinaz, aktin, patojen-ilişkili protein, UDP-glukoz pirofosforilaz, papain-benzeri sistein proteinaz ve CPN60 proteinlerini kodlayan genler yer almaktadır.

Abstract:
Zinc (Zn) is an important micronutrient for all organisms and an essential component of over 1000 enzymes and proteins. Zinc plays a fundamental roles in protein, carbohydrate and lipid metabolisms, replication, transcription and translation and for structural and functional integrity of biomembranes.Zinc-deficiency causes many symptoms in all living things. In plants grown under low zinc conditions the general symptoms are stunting of shoot, curling and rolling of young leaves, death of leaf tips and chlorosis. In mammals low Zn in nutrition causes anemia, disorder of immunity and growth problems. Therefore, all organisms have evolved some mechanisms that tightly control zinc levels and respond to unexpected deficiency or excess of zinc in their cells.The crop plants that are resistant to zinc-deficiency should be cultivated to eliminate Zn-deficiency as a worldwide health problem. There are genotypic variations in zinc-uptake efficiency between plants species. These variations cause differential expression of genes encoding proteins used in uptake, transport and storage of zinc. In our research group Hordeum spontaneum C. Koch which is well adapted to Turkey?s zinc-deficient soils was used for high throughput identification of genes that are expressed upon zinc-deficiency. In our previous projects three different SSH library, including about total 5808 clones, were constructed using RNAs extracted from leaf, stem and root of Hordeum spontaneum C. Koch which was grown on zinc deficient medium. Sequence and bioinformatics analysis of 960 leaf and 384 root clones were completed.In this study we aimed isolation and identification of cDNAs that are found in stem SSH library. For this purpose 672 clones were selected randomly and sequenced. Raw sequence data was manipulated using some bioinformatics tools. Firstly low quality sequences, vector fragments and nonrecombinant clones were removed using Phred and Crossmatch programmes which are used with Cygwin software. Then contigs and singlets were generated using both CAP3 and Phrap programmes and results were compared.Sequences of contigs and singlets were subjected to nucleotid and protein BLAST. The sequences showed significant similarity to a variety of genes that were implicated to have roles in metabolism, defence and stress responses, structure and cellular organisation, transcription, translation, signal transduction, and apoptosis. Some of these genes are well characterised in terms of structure and function. These include Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO), Lipid Transfer Protein, BLT4 protein, Chitinases, Actin, Pathogen-Related Protein, UDP-Glucose Pyrophosphorylase, Papain-like Sistein proteinase and CPN60 protein encoding genes.