Farklı klinik örneklerden izole edilen Candida parapsilosis kompleks türlerinin genotipik olarak tanımlanması
Genotypic identification of the Candida parapsilosis complex species isolated from different clinical samples
Yazar: ÖZLEM KARATAŞ
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM ABACI GÜNYAR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyoloji = Biology ; Candida parapsilosis = Candida parapsilosis ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; PCR =

Özet:
Candida parapsilosis tür kompleksi (C. parapsilosis sensu lato), özellikle COVID-19 pandemisi ardından İspanya başta olmak üzere dünyanın çeşitli bölgelerinde, kan dolaşımıyla ilişkili klinik örneklerden en yaygın olarak izole edilen ikinci fungal patojen olarak karşımıza çıkmaktadır. Fenotipik yöntemler ile Candida parapsilosis tür kompleksinin tanımlanmasındaki yetersizlikler, bu mayaların izolasyon oranları, coğrafi dağılımları ve klinik öneminin net olarak bilinememesine yol açmaktadır. Ayrıca bu tür kompleksi, coğrafi dağılımlarında antifungal ajanlara karşı in vitro duyarlılıkları, proteinaz, fosfolipaz aktivitesi ve biyofilm oluşturma yetenekleri gibi hastalık oluşturmada önemli patojenite belirleyicileri olan bazı virülans faktörleri açısından da farklılıklar göstermektedir. Bu nedenle çalışmamızda, öncelikle bu türlerin (C. parapsilosis sensu stricto (C. parapsilosis), C. orthopsilosis ve C. metapsilosis) genotipik yöntemlerle tanımlanması ve hastalık oluşturmada önemli bazı virulans faktörlerinin değerlendirilmesi gerçekleştirilmiştir.
Bu tez çalışmasına, İzmir İli Sağlık Bilimleri Üniversitesi Tepecik Eğitim ve Araştırma Hastanesi'nde Ocak 2015-Ocak 2019 tarihleri arasında farklı kliniklerden fenotipik olarak C. parapsilosis olarak tanılanmış ve stoklanmış 84 adet C. parapsilosis kompleks türü dahil edilmiştir.
Öncelikle fenotipik tanının doğruluğunu onaylamak için Species-Specific polimeraz zincir reaksiyonu yapılmıştır. Ardından Candida parapsilosis tür kompleksini oluşturan türlerin doğru bir şekilde ayrımını yapmak amacı ile sekonder alkol dehidrogenaz (SADH) gen bölgesi PCR ile çoğaltılmış elde edilen PCR amplikonları (716 baz çifti), BanI restriksiyon enzimi ile kesilerek PCR-RFLP analizleri yapılmıştır. Bu deneyler sonucunda, 84 adet izolatın tamamının, iki bant (196bp ve 521bp) oluşturduğu ve bu türlerin C. parapsilosis sensu stricto (C. parapsilosis) olduğu saptanmıştır.
Çalışmamızda ayrıca suşların virulans faktörleri; proteinaz ve fosfolipaz enzim aktiviteleri ve biyofilm oluşumunun yetenekleri açısından değerlendirilmiştir. Proteinaz aktivitesi incelenmiş ve 84 adet suşun, 51'inin (% 61) pozitif, 33'ünün (%39) ise negatif proteinaz enzim aktivitesi gösterdiği görülmüştür. Yine çalışmamızda, fosfolipaz aktivitesi incelenmiş, sadece iki adet (43-104 ve 90-245 kodlu) C. parapsilosis sensu stricto suşunda fosfolipaz enzim aktivitesi saptanmıştır. Ayrıca çalışmamızda 84 adet suşun 68'inin (% 81) biyofilm oluşturduğu, 16 (%19) suşun ise biyofilm oluşturmadığı saptanmıştır. Biyofilm oluşturmayan suşların sadece  (%12) katater kan kültüründen alınan suşlara ait iken, 14'ü (87) venöz kan kültüründen alınan izolatlara aittir. Katater kültüründen izole edilen 26 (%93) suşun biyofilm oluşumu pozitif bulunmuştur.
Bu sonuçlara göre, kan kültürleri ve katater kan kültürlerinden izole edilen C. parapsilosis suşlarının biyofilm oluşturma yetenekleri kıyaslandığında katater kan kültüründen izole edilen suşların biyofilm oluşturma yeteneği anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (p ≪0.05). Hem kan kültürü hem de katater kültüründen izole edilen suşlar için en fazla direnç gösterilen antifungalin flukonazol olduğu görülmüştür (p ≪0.05). Bunu ise ardından vorikonazol takip etmektedir. 
Kliniklere göre antifungal dirençlilik oranlarına bakıldığında ise organ nakli ve yoğun bakım hastalarından izole edilen C. parapsilosis suşlarının flukonazol ve vorikonazol dirençleri diğer bölümlerden gelen hastalardan izole edilen suşlara göre anlamlı şekilde yüksek bulunduğu görülmüştür.
 Tüm bu çalışma bulguları göz önünde bulundurulduğunda, sonuç olarak çalışmada tanımlanması öngörülen C. parapsilosis türlerinden C. orthopsilosis ve C. metapsilosi'in saptanmamış olması bu türlerin kan kültürü örneklerinde nadir bulunan türler olabileceğini göstermektedir. Çalışmamız, C. parapsilosis sensu sitricto türünün virulansında etkili olduğu düşünülen üç faktörün incelenmesi açısından da değer taşımaktadır.

Abstract:
In recent years, the Candida parapsilosis species complex (C. parapsilosis sensu lato) has emerged as the second most frequently isolated fungal pathogen from clinical specimens worldwide. Challenges in identifying species within the Candida parapsilosis complex through phenotypic methods have led to unclear isolation rates, geographical distribution, and clinical significance of these yeasts. Moreover, this species complex exhibits variations in some virulence factors, including in vitro susceptibility to antifungal agents, proteinase and phospholipase activity, and biofilm-forming ability, which are crucial pathogenicity determinants in disease development. Therefore, this study aimed to initially identify these complex species (C. parapsilosis sensu stricto (C. parapsilosis), C. orthopsilosis, and C. metapsilosis) using genotypic methods and subsequently evaluate important virulence factors.
	A total of 84 strains of the C. parapsilosis complex, phenotypically diagnosed as C. parapsilosis and collected from various clinics at SBU Tepecik Training and Research Hospital in Izmir province between January 2015 and January 2019, were included in this study. 
	Firstly, species-specific PCR was conducted to confirm the phenotypic diagnosis. Subsequently, to accurately distinguish the species forming the Candida parapsilosis species complex, the SADH gene region was amplified by PCR, and the resulting PCR amplicons (716 base pairs) were subjected to digestion with the restriction enzyme BanI followed by PCR-RFLP analysis. The findings indicated that all 84 isolates formed two bands (196bp and 521bp), confirming their classification as C. parapsilosis sensu stricto (C. parapsilosis).

	Our study also investigated the virulence factors, including proteinase and phospholipase activities, and the biofilm-forming ability of the strains. Proteinase activity examination revealed that 51 (61%) of the 84 strains exhibited positive proteinase enzyme activity, while 33 (39%) had negative proteinase enzyme activity. Phospholipase activity analysis showed that only two (43-104 and 90-245) C. parapsilosis strains exhibited phospholipase enzyme activity. Additionally, 68 (81%) of the 84 strains were found to form biofilms, with 16 (19%) strains not forming biofilms. Among the non-biofilm-forming strains, only 2 (12%) were isolated from catheter blood cultures, while 14 (87%) were obtained from venous blood cultures. Notably, biofilm formation was positive in 26 (93%) of the strains isolated from catheter blood cultures.
	According to these results, comparing the biofilm-forming ability of C. parapsilosis strains isolated from blood cultures and catheter blood cultures, it was observed that strains from catheter blood cultures exhibited significantly higher biofilm-forming ability (p < 0.05). Fluconazole emerged as the most resistant antifungal agent for strains isolated from both blood and catheter cultures (p < 0.05), followed by voriconazole.
	When analyzing antifungal resistance rates by hospital, it was found that the fluconazole and voriconazole resistance rates of C. parapsilosis strains isolated from organ transplant and ICU patients were significantly higher than those from patients in other departments.
	Considering these results, the absence of C. orthopsilosis and C. metapsilosis in the study suggests that these species are rare in blood culture samples. Our study is valuable for examining three factors believed to play a role in the virulence of C. parapsilosis sensu stricto.