Parkinson hastalığı hücresel modelinde inflamasyonun ve inflamasyon sonrası uygulanan N-asetilsisteinin H4 hücrelerindeki LAG3 ve TLR2 reseptörleri üzerine etkisi
The effect of inflammation and post-inflamatory administration of n-acetylcysteine on LAG3 and TLR2 receptors of H4 cells in the cellular (in vitro) model of parkinson's disease
Yazar: ZEYNEP BENGİSU KAYA
Danışman: PROF. DR. PERGİN ATİLLA
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Alfa sinüklein = Alpha synuclein ; Apoptozis = Apoptosis ; N-asetilsistein = N-acetylcysteine ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases ; Parkinson hastalığı = Parkinson disease ; Reseptörler-toll like = Receptors-toll like ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Parkinson hastalığı, bir çok sistemin etkilendiği nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın prevalansı genel popülasyonda binde 2-3, 55 yaş üzerinde ise %1 oranındadır. Parkinson hastalığındaki patolojik değişiklikler substantia nigra pars compacta'daki dopaminerjik nöronların kaybı ve hücrelerin içinde Lewy cisimciği olarak adlandırılan, ağırlıklı olarak alfa-sinüklein (α-syn) ve ubikutinlenmiş proteinler içeren küresel inklüzyon cisimciklerinin saptanması şeklindedir. α-syn proteinin nöronlarda hatalı katlanmalar sonucu hücre içinde çeşitli yerlerde birikebildiği gibi hücre dışı alana da geçebildiği bilinmektedir. Hücre dışı alana geçen α-syn proteini özellikle nöronlar ve glia hücreleri tarafından hücre içine endositoz yolu ile alınır. Endositozda TLR2 ve LAG3 reseptörlerinin rolünün açıklanabilmesi için çeşitli  çalışmalar yapılmaktadır. α-syn proteininin endositozu, TNF-α, IL-1β, IL-2 ve IL-6 başta olmak üzere çeşitli inflamatuar sitokinlerin üretimine ve salınmasına sebep olmanın yanı sıra; hücre içinde mitokondriyal yolak üzerinden apoptoz ve mitofajiyi tetikleyerek hücre ölümünü yol açmaktadır. N-Asetilsistein (NAC), anti-oksidan, anti-inflamatuar ve anti-kanserojen etkilere sahip bir ilaçtır. Bu tez çalışmasında, inflamasyonun tetiklenmesi sonrası, LAG3 ve TLR2 reseptörlerinin ekspresyonunda artış görülebileceği ve inflamasyon NAC ile kontrol altına alındığında, inflamasyonun sebep olduğu hasarın azalması ve hücre canlılığında artış görülebileceği hipotezlerinde bulunuldu. Bu varsayımları test etmek amacı ile; in vitro koşullarda deney ve kontrol grupları içeren bir çalışma planlandı. α-syn proteinini aşırı eksprese eden insan nöroglioma (H4) hücre hattı kullanılarak inflamatuar bir Parkinson hastalığı modeli oluşturuldu. İnflamasyon, TNF-α ile tetiklendi ve NAC uygulanarak inflamasyon kontrol altına alındı. Çalışmada α-syn protein ekspresyonu ve transkripsiyonu, Western Blot ve q-PCR metotları ile ölçüldü. Hücre canlılığı Toxilight testi ile, apoptoz Western Blot tekniği ile apoptoz belirteçlerinin ölçülmesi ve TUNEL immunofloresan işaretleme metodu ile değerlendirildi. TLR2 ve LAG3 reseptörlerinin transkripsiyonları q-PCR metodu ile ölçüldü. Reseptörlerin protein düzeyleri immunofloresan işaretleme ve Western Blot tekniği ile saptandı. Elde edilen veriler ışığında, NAC tedavisinin, TLR2 ve LAG3 reseptörlerinin transkripsiyonunu ve ekspresyonunu değiştirerek inflamasyon aracılı toksisiteyi ve hücre ölümünü azalttığı belirlendi. Bu çalışma ile, NAC'nin Parkinson Hastalığında ortaya çıkan nöroinflamasyon süreci için umut vaat eden bir aday olduğu düşünüldü.

Anahtar kelimeler: Parkinson Hastalığı, İnflamasyon, Alfa-sinüklein (α-syn), N-Asetilsistein (NAC), Apoptoz

Abstract:
. Parkinson's disease is a complex, multifactorial neurodegenerative disease that has prevalence of 1% over the age of 55. Pathological hallmarks of Parkinson's disease include the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta and the accumulation of inclusion bodies that contain predominantly alpha-synuclein (α-syn) and ubiquitinated proteins, called Lewy bodies. Although the formation of α-syn occurs intracellular, it can also be translocalized to extracellular space and then taken into the other cells via receptor mediated endocytosis. TLR2 is a well known receptor which detects extracellular α-syn and modulates the uptake of the protein by other cells.  Uptaken α-syn is known to trigger expression and secretion of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, IL-2 and IL-6 and induce neuroinflammation, apoptosis and mitophagy that results in cellular death. N-Acetylcysteine ​​(NAC), an anti-inflammatory and anti-carcinogenic drug, has gained some focus to circumvent the detrimental effects of neuroinflammatory response. In this thesis, we hypothesized that, NAC treatment will result in anti-inflammatory response that restrict in vitro apoptotic and neuroinflammatory response by modulating transcription and expression of TLR2 and LAG3 receptors.  In order to test this hypothesis, WT α-syn overexpressing human neuroglioma (H4) cell line was treated with TNF-α to induce inflammation and NAC, as anti-inflammatory drug to recover from deleterious effects of TNF-α induced inflammation and apoptosis.  α-syn protein transcription and expression were validated by q-PCR and Western Blot, respectively. Cell viability was measured by Toxilight assay, and apoptosis was evaluated by Western Blot and TUNEL methods. We observed that NAC treatment diminishes inflammation mediated toxicity and cell death by altering transcription and expression of TLR2 and LAG3 receptors. Thereby, this study demonstrates NAC to be a promising candidate to recover from neuroinflammation that occurs in Parkinson's Disease.

Key Words: Parkinson's Disease, Inflammation, Alpha-synuclein (α-syn), N-Acetylcysteine (NAC), Apoptosis

Supported by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit     (Project ID: THD-2019-18110)