Β-glukozi̇daz enzi̇mi̇ni̇n farkli taşiyicilar üzeri̇ne i̇mmobi̇li̇zasyonu ve farkli çay örnekleri̇ üzeri̇ne aroma artirici özelli̇kleri̇ni̇n i̇ncelenmesi̇
Immobilization of β-glucosidase on different carriers and investigation of aroma-increasing effect on different tea simples
Yazar: AKİLE ÇELİK
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE DİNÇER
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Sistematik adı β-D-glukozid glukohidrolaz (EC 3.2.1.21) olan β- glukozidazlar oligosakkaritlerdeki veya diğer glukoz bileşiklerindeki β-glukozid bağlarını hidrolizleyen enzimlerdir. β-Glukozidazların mikroorganizmalar, hayvanlar ve bitkilerde yaygın olarak bulundukları bildirilmektedir. β-glukozidaz uygun in vitro koşulların sağlandığı durumlarda gıda detoksifikasyonu, biyokütle dönüşümü, şarap ve içeceklerde lezzet geliştirmek için kullanılmaktadır. Bunlara ek olarak gıda, kozmetik, ilaç ve deterjan endüstrisinde kullanılan ticari öneme sahip çeşitli glikozitlerin sentezinde kullanılabilmektedir. Pek çok β-glukozidazın antioksidan olma, kan glukoz düzeyini düşürme, zarları donma-çözülme hasarlarından koruma, tirozinazı inhibe etme gibi çeşitli ve önemli biyolojik aktiviteleri bulunmaktadır. β-glukozidazlar ile ilgili birçok farklı kaynaklardan yola çıkılarak yapılan saflaştırma çalışması olmasına rağmen, bu enzimle sınırlı sayıda immobilizasyon çalışması bulunmaktadır. Enzim immobilizasyonu, enzimin katalitik aktivitesi devam ederken, hareketinin önemli ölçüde kısıtlandığı bir prosestir. Kitosan, enzim immobilizasyonu için ucuz, toksik ve zararlı olmayan bir destektir. Kitosan, mükemmel hidrofilikliğe, yüksek gözeneklilik ve geniş yüzey alanı gibi birçok avantaja sahiptir. Hidroksil ve amino grupları üzerinden enzim immobilizasyonu gerçekleşebilir. Kitosan boncuklarının yoğunlukları suya çok yakındır ve dokusu çok yumuşaktır. Kitosanın mekanik kararlılığını artırmak üzere bu çalışmada kitosan, çok duvarlı karbon nanotüp (MWCNTs) ve Fe3O4 gibi materyaller ile karıştırıldı. Hazırlanan kompozit taşıyıcıların kararkterizasyonu Fourier transform infrared (FTIR) spektroskopisi, taramalı elektron mikroskopu (SEM) ve termal gravimetrik analiz (TGA) ile yapıldı. 

 β-Glukozidaz enzimi hazırlanan kitosan kompozit taşıyıcılar üzerine kovalent olarak immobilize edildi. İlk kısmında immobilizasyon koşulları optimize edildi. Bunun için optimum çapraz bağlama süresinin ve optimum çapraz bağlayıcı konsantrasyonunun belirlenmesi ile enzim immobilizasyon süresinin ve enzim konsantrasyonunun etkisi incelendi. Bununla birlikte hem serbest enzim hem de immobilize β-glukozidaz aktivitesi üzerine pH'ın etkisi ve sıcaklığın etkisi incelendi. Serbest ve immobilize enzimin termal, pH, ve depolama stabiliteleri karşılaştırılarak, immobilize β-glukozidaz enziminin tekrar kullanılabilirliği ve operasyonel kararlılığı incelendi. İmmobilize β-glukozidaz enziminin siyah, yeşil, mate, adaçayı ve melisa çay örneklerinde aroma artıcı etkisi de araştırıldı. Bu çalışmada gaz kromatografisinde yapılan analizler ile linalool, nerol, geraniol, terpineol, benzil alkol ve 2-fenil etanol aromatik öncüllerinin miktarındaki artış izlendi.

Abstract:
Systematic name β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)  are the β- glucosidase enzyme can hydrolyze β-glucoside bonds in oligosaccharides of glucose or other compounds. β-glucosidases are mostly found in microorganisms, animals and plants. Under appropriate in vitro conditions, β-glucosidase is used for food detoxification, biomass conversion and to enhance the flavor of wine and beverages. In addition, it is used for synthesing of various commercial importance glycosides which can be used in food, cosmetics, pharmaceutical and detergent industry. Many β-glucosidases have a variety of important biological activity such as antioxidant, lowering blood glucose levels, membrane protection from freeze-thaw damage, and inhibiting the activity of tyrosinase.  Although there are many studies about purification of β- glucosidase from different sources, only a few immobilization studies with this enzyme was reported. Enzyme immobilization, while continuing the catalytic activity of the enzyme, is a process wherein substantially restricted movement. Chitosan is cheap, non-toxic and non-hazardous support for enzyme immobilization. Chitosan has excellent hydrophilicity and has many advantages such as high porosity and large surface area. Enzyme immobilization can be occured via hydroxyl and amino groups. Chitosan beads' density is very close to the water and its texture is very soft. In this study, in order to increase the chitosan beads' mechanical strength, chitosan is mixed with carbon nanotube (Multiwalled carbon nanotube, MWCNTs) and Fe3O4. Characterization of composite carriers were done by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, scanning electron microscopy (SEM) and the thermal gravimetric analysis (TGA). 

In this thesis study, β- glucosidase was immobilized on chitosan composite beads covalently. In the first part of the study, immobilization conditions were optimized. To optimize the immobilization conditions, optimum cross-linking time and cross-linker concentration,  effect of β-glucosidase immobilization time and enzyme concentration was examined. In addition, effect of pH and temperature on the activity of free and immobilized β-glucoside was examined. Also, thermal and storge stability of free and immobilized enzyme was compared. The operational stability and reusability of immobilized β-glucoside was examined. Aroma-increasing effect of immobilized β-glucosidase on black, green, sage, balm and yerba mate tea samples was investigated. In this study, the increasing ratio of linalool, nerol, geraniol, terpineol, benzyl alcohol and 2-phenylethanol aromatic precursors were monitored by GC analysis.