İnfluenza virusunun tanısında hücre kültürü hızlı test,real time PCR yöntemlerinin karşılaştırılması ve izole edilen virusların tiplendirilmesi
Comparison of cell culture, rapid test real time PCR for diagnosis of influenza virus and typing of isolated viruses
Yazar: SEYHAN SELVİ ASLAN
Danışman: PROF.DR. EMEL BOZKAYA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Çalışmamızda, günümüzde başlıca önemli viral patojenlerden biri olanİnfluenza virusunun tanısında kullanılan tekniklerin duyarlılık ve özgüllüklerininincelenmesi ve birbirleri ile karşılaştırılması hedeflenmiş, ayrıca izole edilen İnfluenza Aviruslarının altip ve antijenik tip tayini yapılmıştır. Bu amaçla İ.T.F Viroloji ve İmmunolojiB.D laboratuvarına gönderilen 100'ü 2004-2005 , 50'si ise 2005-2006 sezonuna ait 150solunum örneği farklı yöntemler ile İnfluenza virus açısından incelenmiştir. Örneklerinincelenmesinde birinci sezonda hücre kültürü+IC-ELISA, real time RT-PCR ve InfluenzaA/B Rapid ile FLU OIA hızlı testleri; ikinci sezonda ise hücre kültürü ve real time RT-PCRile Influenza A/B Rapid testi uygulanmış ve ek olarak, In-House PCR uygulanmıştır.Birinci sezonda hücre kültürü gold standart yöntem olarak kabul edilmiş ve buna görereal time-PCR, İnfluenza A/B Rapid test ve FLU OIA hızlı testlerin duyarlılıkları sıraylayüzde 80, 14,5 ve 14,5 olarak; özgüllükleri ise yüzde 91,5, 100 ve 100 olaraksaptanmıştır. İkinci sezonda ise gerçek pozitif örnekleri saptamak için en az iki test'depozitiflik saptanması kriteri uygulanmış ve hücre kültürü, real time RT-PCR, İn-HousePCR ve İnfluenza A/B Rapid testlerin duyarlılıkları sırayla yüzde 86,6, 100, 76,6, 10,özgüllükleri ise yüzde 100, 85,100 ve 100 olarak tespit edilmiştir. İki sezonda uygulananreal time RT-PCR tekniği ile farklı duyarlılık oranları elde edilmesi ayrı kit ve primer-probsistemlerinin kullanılması ile ilgili bulunmuştur.Ayrıca her iki sezonda izole edilen İnfluenza viruslarının tip tayini yapılmıştır.Bunun için 2004-2005 sezonunda HAI deneyi uygulanmış, 24 suşun antijeniktiplendirmesi yapılarak 22 H1N1 (A/New Caledonia/20/99-benzeri) ve iki H3N2(A/Shantou/1219/2004-benzeri) suşu identifiye edilmiştir. 2005-2006 sezonunda isealttiplendirme için In-House PCR kullanılmış ve tiplendirmesi yapılan 10 suşun tümününH3N2 olduğu tespit edilmiştir.Çalışmamızda laboratuvar bulgularının yanısıra klinik bulgular da değerlendirilmiş,yüksek ateş+ öksürük klinik kombinasyonun görüldüğü vakalar ile laboratuvarda pozitifbulunan vakalar yaş gruplarına göre karşılaştırılmıştır. Birinci ve ikinci sezondaateş+öksürük kombinasyonunun duyarlılığı yüzde 47 ile 100, özgüllüğü ise yüzde 23,5 ile70 oranları arasında saptanmıştır. Her iki sezonda da en düşük özgüllüğe 0-4 yaşarasında rastlanmıştır (yüzde 23.5 ve 33.5).Sonuç olarak bu çalışmada elde edilen bulgular değerlendirildiğinde İnfluenzavirusunun tanısında kullanılan PCR ve hücre kültür tekniklerinden optimal sonucunalınabilmesi için bazı parametrelere uyulması gerektiği ortaya çıkmıştır. Zira iyi birİnfluenza virus tanısı ve sürveyansı, suşların duyarlı yöntemler ile tespiti ve izolasyonunabağlıdır.

Abstract:
In this study it is aimed to show the comparison and examination of specifityand sensitivity of the techniques which is today mainly used to diagnose the influenzavirus that is an important viral pathogen, furthermore the insulated influenza A virussubtype and antigenic type has been determined. For this purpose, 150 respiratorysamples which has been sent to İTF Virology and İmmunology Department, 100 wassent in 2004-2005 and 50 in 2005-2006, were investigated with different techniquesin terms of influenza virus. In the examination of the samples in the first season cellculture+IC-ELISA, real time RT-PCR and influenza A/B rapid and FLU OIA rapidtests; and in the second season cell culture and real time RT-PCR, and influenzaA/B rapid test was applied and additionally In-House PCR was applied. In the firstseason the cell culture has been admitted as gold standart method and according tothis the sensitivity of real time-PCR, influenza A/B rapid test and FLU OIA rapid testsdetermined in turn percent 80, 14,5, and 14,5 and their specifity are percent 91,5,100, and 100. In the second season to determine the real positive samples thepositive determination criteria has been applied at least in two tests and cellculture, real time RT-PCR, In-House PCR and Influenza A/B rapid test?s sensitivitywas determined in turn percent 86,6, 100, 76,6, 10 and their specifity wasdetermined 100, 85, 100 and 100. Obtaining different sensitivity rates with the realtime RT-PCR technique in the second season is connected with the using of differentkit and primer-prob system.Besides the type of insulated influenza virus has been determined in bothseasons. For this in 2004-2005 season HAI experiment has been applied, 24 strain?santigenic typing has been done, 22 H1N1 (A/New Caledonia/20/99-like) and twoH3N2(A/Shantou/1219/2004-like) strains identified. In 2005-2006 season to subtype,in-house PCR has been used and 10 strain which was typed determined all H3N2. Inour study besides laboratory discoveries also clinic inventions are evaluated, thecase of high temperature +cough clinic combination and positive found cases in labsare compared according to age groups. In the first and second season the sensitivityof temperature+cough combination was determined %47 and percent 100 andspecifity rate was percent 23,5 and 70. In both seasons minimum specifity is found in0-4 age group ( percent 23,5 and 33,5)Consequently when the cases obtained in this study evaluated PCR and cell culturetechniques in the diagnosis of influenza virus showed that some parameters should be obeyedto take the optimal results. Because a good diognosis and survey of an influenza virusdepends on the determination and insulation of strain with the sensitive methods