Mycobacterium tuberculosis ilaç direncinde dışa atım (efflüks) pompasının etkisinin araştırılması
Investigation effect of efllux pumps in drug resistance of mycobacterium tuberculosis
Yazar: GUMRAL ALAKBAROVA
Danışman: PROF. DR. BELMA DURUPINAR
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; Reserpin = Reserpine ; Verapamil = Verapamil ; İlaçlar = Drugs ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Materyal ve metot: Çalışmada 42 tanesi Çok İlaça Dirençli (ÇİD) ve 50 tanesi primer ilaçlara duyarlı, 5 referans Mycobacterium tuberculosis izolatları temin edildi. Çalışmada test edilen bakterilerin direnç profillerinin belirlenmesi rezasurin mikrodilüsyon yöntemi ile yapıldı. Çalışmanın ilk aşamasında izoniazid (INH), rifampsin (RIF), etambutol (ETM), streptomisin (STM), nikotinamid (NIC), levofloksasin (LEVO), moksfloksasin (MOX), ofloksasin (OFX) ve siprofloksasin (CIPRO) için MİK değerleri tespit edildi. İzolatların duyarlılıkları belirlendikten sonra çalışmanın ikinci aşamasında, MİK değerleri her antibiyotik için efflüks pompa inhibitörleri olan carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), verapamil, rezerpin, tioridazin varlığında da saptandı. Çalışmanın üçüncü aşamasında, efflüks pompa inhibitörleri varlığında MİK değerlerinde düşüş saptanan 6 M. tuberculosis izolatında RT-PZR ile efflüks pompa genlerinin ekspresyonu araştırıldı.
Bulgular: Çalışmada primer ilaçlara (INH, RİF, STM, ETM) duyarlı 50 (%55) izolat saptandı. Geriye kalan ÇİD 42 (%45) izolatın tümü INH ve RİF dirençli bulundu. Toplam 11 (%11,9) izolatta florokinolonlara direnç saptandı. Çalışmamızda efflüks pompa inhibitörlerin varlığında ÇİD, florokinolonlara duyarlı 6 izolatta efflüks pompalarının aktif olduğu tespit edildi. 6 izolatın tamamında CCCP, verapamil, rezerpin gibi inhibitörler varlığında florokinolonların (CIPRO, %6,52; LEVO, %6,52; MOX, %6,52;  OFX, %6,52) MİK'lerinde düşüş saptandı. Bu 6 izolatın 3'ünde STM; 4'ünde RİF CCCP ve verapamil varlığında (RİF, %4,34 ve STM, %3,26) MİK değerlerinin düştüğü gözlendi. Efflüks pompa inhibitörleri varlığında MİK değerlerinde düşüş saptanan 6 izolatta efflüks pompa genlerine ait 15 gen bölgesinin tamamında aşırı ekspresyon görüldü.
Sonuç: Dirençli izolatlarda gen bölgelerinin aşırı ekspresiyonu efflüks pompalarının direnç gelişimi ile ilişkisini düşündürmektedir.

Anahtar Kelimeler: Efflüks pompası; efflüks pompa inhibitörleri; ilaç direnci; Mycobacterium tuberculosis

Abstract:
Aim: Active efflux is known to play a major role in the resistance of many bacteria to antibiotics.
Material Method: In this study, we included 50 pan-sensitive, 42 Multidrug Resistant (MDR) clinic al isolates and 5 Mycobacterium tuberculosis control strains. Resistance profiles of bacteria were tested by resasurinb microtitre microtitre assay (REMA). In the first phase of our study; MIC levels for isoniazid (INH), rifampin (RIF), etambutol (ETM), streptomycin (STM), nicotinamide (NIC), levofloxacin (LEVO), moxifloxacin (MOX), ofloxacin (OFX) and ciprofloxacin (CİPRO) were determined. In the second phase of the study after detection susceptibility of isolates, antibiotics MIC levels were also determined in the presence of efflux pump inhibitors such as carbonyl cyanide, m-chlorophenylhydrazone (CCCP), verapamil, reserpine thioridazine. In the third phase of the study, MIC levels werereduced in 6 M. tuberculosis isolates in thepresence of efflux pump inhibitors, in these isolates for determining the presence expression of putative efflux pump genes was examined by Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR).
Results: In this study, 50 (55%) isolates were identified susceptible to primary drugs (INH, RIF, STM, ETM), 42 (45%) isolates (MDR) were resistant to INH and RIF. 11 (11.9%) isolates were resistant to fluoroquinolones. In our study, in the presence of efflux pump inhibitors active efflux pumps were detected in 6 MDR fluoroquinolones susceptible isolates. In the study MIC levels of fluoroquinolones (CIPRO, 6,52%, LEVO, 6,52%, MOX, 6,52%, OFX, 6,52%) in these 6 isolates decreased in the presence of inhibitors such as CCCP, verapamil and reserpine. MIC of RİF in 4 (4.34%) isolates, MIC of STM in 3 (3.26%) isolates decreased in the presence of efflux pump inhibitors such as CCCP, verapamil. Overexpression of all 15 efflux pump genes was observed in 6 isolate with a reduction in MIC values in the presence of efflux pump inhibitors.
Conclusion: Overexpression of gene regions in resistant isolates suggests that efflux pumps are associated with resistance development.
Keywords: Drug resistance; efflux pumps; efflux pumps inhibitors Mycobacterium tuberculosis