Polikatyonik amfifilik siklodekstrin nanopartiküllerin antikanser ilaç taşıyıcı sistem olarak etkinlik ve güvenlik açısından değerlendirilmesi
Evaluation of efficacy and safety of polycationic amphiphilic cyclodextrin nanoparticles as anticancer drug delivery systems
Yazar: GAMZE VARAN
Danışman: PROF. DR. EREM BİLENSOY
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemler, sahip oldukları fizikokimyasal özellikleri sayesinde kanser tedavisinde üstünlüklere sahiptir. Nanopartikül hazırlamada farklı polimerler ve makromoleküller kullanılmaktadır. Bu polimerlerden biri olan siklodekstrinler, doğal oligosakkaritlerdir. Eşsiz yapıları sayesinde, hidrofobik ilaçları kavitelerinde hapsederek kontrollü taşınmalarını sağlarlar. Ayrıca biyouyumlu olmaları nedeniyle ilaç formülasyonlarında sıklıkla tercih edilmektedirler. İlaç taşıyıcı sistem olarak kullanılmalarının yanısıra hücre membranında yer alan kolesterolü uzaklaştırma amacıyla da çeşitli çalışmalarda kullanılmaktadır.
Son yıllarda nanopartiküler sistemlerle yapılan sayısız çalışmalara rağmen piyasada bulunan ürünlerin sayısı kısıtlıdır. Bu durumun temel nedeni, laboratuvar koşullarında hücre kültürü ile yakalanan başarının canlı sistemlerde elde edilememesidir. Biyolojik sistemde, diğer hücrelerle etkileşim halinde bulunan tümör dokusunun, in vitro hücre kültüründe tek tip hücre ile tek katmanlı olarak yetiştirilmesi biyolojik sistemi tam anlamıyla taklit edememektedir. Bu amaçla, ilaç taşıyıcı sistemlerin etkinlikleri 3-boyutlu hücre kültürü çalışmalarında biyolojik ortama daha yakın olarak belirlenmektedir.
Bu tez kapsamında, boş amfifilik siklodekstrinlerin apoptotik ve sitotoksik etkileri kaspaz-8 aktivitesi, lipit peroksidasyon tayini, TUNEL yöntemi, Tali™ görüntü tabanlı sitometre, kolesterol analizi, gen ekspresyonu çalışmaları ve survivin analizi gibi çeşitli hücresel çalışmalarla gösterilmiştir. Boş nanopartiküller, çeşitli kanser hücrelerine (MCF-7, HeLa, HepG2 ve MB49) karşı antikanser etkinlik gösterirken sağlıklı hücrelerde (L929, G / G) sitotoksiye neden olmamıştır. İlginç olarak, boş 6OCaproβCD ve boş PC βCDC6 nanopartiküllerin, apoptoz çalışmalarında MCF-7 hücrelerinin hücre sayısı ve membran bütünlüğü üzerinde etkili olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak, boş amfifilik siklodekstrin nanopartiküllerinin, kanser hücre membranında kolesterol mikro alanlarını hedef alarak mitokondriyal yolak üzerinden apoptozu indüklediği bulunmuştur.
Tez çalışmasının ikinci aşamasında paklitaksel:siklodekstrin inklüzyon kompleksleri hazırlanarak diferansiyel taramalı kalorimetri, taramalı elektron mikroskobu ve fourier dönüşümlü kızılötesi spektrofotometre ile karakterizasyonları yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmaları sonucu, paklitakselin 1:2 molar oranında amfifilik siklodekstrin türevleri ile başarılı kompleks oluşturduğu gözlenmiştir. İnklüzyon komplekslerinden yüksek yükleme ve doğrudan siklodekstrin türevlerinden konvensiyonel yükleme yöntemiyle hazırlanan paklitaksel yüklü nanopartiküllerin, uygun partikül büyüklüğüne ve düşük polidispersite indeksine sahip olduğu belirlenmiştir. İnklüzyon kompleksinden hazırlanan nanopartiküllerin konvansiyonel hazırlanan nanopartiküllerden daha fazla ilaç yükleme etkinliğine ve uzun salım profiline sahip olduğu gözlenmiştir.
Hazırlanan ilaç yüklü nanopartiküllerin antikanser etkinlikleri, farklı oranlarda kanser hücresi ve sağlıklı fibroblast hücresinden hazırlanan ko-kültür çalışmalarında ve 3-boyutlu çok hücreli küresel tümör modelinde belirlenmiştir. Hücre kültürü çalışmaları sonucu konvansiyonel hücre kültürü ile 3-boyutlu hücre kültürü sonuçlarının anlamlı derecede farklı olduğu gözlenmiştir. 3-boyutlu hücre çalışmalarında özellikle sağlıklı fibroblast hücre oranı arttıkça ilaç direnci artmıştır. Paklitaksel yüklü siklodekstrin nanopartiküllerin, 2-boyutlu hücre kültürü ve ko-kültürden hazırlanmış 3-boyutlu küresel tümörlerde ilaç çözeltisiyle karşılaştırıldığında daha yüksek antikanser etkisi olduğu bulunmuştur. Ayrıca siklodekstrin nanopartiküllerin sitotoksik etkisinin, kanser hücre oranı ile doğru orantılı olarak arttığı görülmüştür. Nil kırmızısı yüklü nanopartiküller ile yapılan hücresel alım çalışmalarında, amfiflik siklodekstrinlerin özellikle katyonik yüklü olan türevin çok katmanlı 3-boyutlu küresel tümöre penetre olduğu mikroskobik olarak gözlemlenmiştir.
Sonuç olarak bu tez kapsamında yapılan çalışmalarda farklı yüzey yüklerine sahip amfifilik siklodekstrinlerin, kendilerinin sahip olduğu apoptotik etki mekanizması aydınlatılmıştır. Bu sayede, daha az etkin madde ile etkili kanser tedavisi sağlanabilir. Ayrıca 3-boyutlu tümör modelinde ilaca verilen yanıt ve hücre morfolojisinin, 2-boyutlu hücre kültürü çalışmalarından farklı olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Nanoparticulate drug delivery systems possess advantages in cancer treatment due to their physicochemical properties. Several polymers have been used to prepare nanoparticles. Cyclodextrins, are natural oligosaccharides. Thanks to their unique structure, they encapsulate hydrophobic drugs in their cavities and provide controlled delivery. They are also frequently preferred in drug formulations due to their biocompatibility. In addition to their use in drug delivery systems, cyclodextrins are used to remove cholesterol from the cell membrane in various studies.
In spite of the numerous studies carried out with nanoparticles, the number of products in the market is limited. The main reason is that, the success achieved by cell culture in laboratory conditions can not be achieved in living systems. Tumor tissue, which is normally interacting with other cells in the biological systems, can not exactly be mimicked by using in vitro cell culture with single cell-type and monolayer. For this purpose, the activities of drug delivery systems are determined in 3-dimensional cell culture studies.
In this thesis, the apoptotic effects of blank amphiphilic cyclodextrins were demonstrated by various mechanistic studies including Caspase-8 activity, lipid peroxidation assay, TUNEL assay, Tali™-based image analysis, cholesterol assay, gene expression studies and survivin assay. Blank nanoparticles exerted cytotoxicity against a variety of cancer cells (MCF-7, HeLa, HepG2, and MB49) but none to healthy cells (L929, G/G). Interestingly, blank 6OCaproβCD and blank PC βCDC6 derivatives were also found to be intrinsically effective on cell number and membrane integrity of MCF-7 cells. In conclusion, blank nanoparticles induced apoptosis through mitochondrial pathway targeted to cholesterol microdomains in cancer cell membrane.
In the second step of the thesis study, paclitaxel:cyclodextrin inclusion complexes were prepared and characterized by differential scanning calorimetry, scanning electron microscopy and fourier transform infrared spectroscopy. As a result of the characterization studies, it was observed that amphiphilic cyclodextrins were successfully complexed with 1:2 molar ratio of paclitaxel. Paclitaxel loaded nanoparticles, prepared from the inclusion complexes and directly from cyclodextrin derivatives, have appropriate particle size distribution and low polydispersity index. The nanoparticles prepared from the inclusion complex have higher drug loading efficiency and prolonged release than the conventionally prepared nanoparticles.
The anticancer activities of drug loaded nanoparticles were evaluated in 2-dimensional cell cultures, co-colture prepared from cancer and healthy cells at different ratios and 3-dimensional multicelluler tumor spheroids. The results of the studies show that, conventional and 3-dimensional cell culture findings are significantly different. In 3-dimensional tumor studies, the drug resistance increased as the proportion of healthy fibroblast cells increased. Paclitaxel-loaded cyclodextrin nanoparticles have been found to have a higher anticancer effect when compared to drug solutions in 2-dimensional and 3-dimensional cell culture. In cellular uptake studies with nile-red loaded nanoparticles, it was observed that amphiphilic cyclodextrins, especially the cationically charged derivative, penetrates into multilayer 3-dimensional tumor.
In conclusion, the mechanism of apoptotic action of blank amphiphilic cyclodextrins is elucidated in this thesis. In this view, effective cancer treatment can be provided with lower dose of active substance. It has been determined that the response and cell morphology of the 3-dimensional tumor are different from those of the 2-dimensional cell culture studies.