XBP1 susturumunun ve antioksidan terapinin meme kanseri patogenezinde etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of XBP1 silencing and antioxidant therapy on the pathogenesis of breast cancer
Yazar: SEDEF AKÇAALAN
Danışman: PROF. DR. ERCAN KURAR
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Kanser, ölümcül sonuçları olan hastalıklar arasında ilk sıralarda yer almaktadır. Kadınlarda en yaygın görülen kanser türü olan meme kanseri, aynı zamanda kanser kaynaklı ölümlerin başlıca sebebidir. Bu nedenle, meme kanseri için daha az yan etkili anti-kanser ajanlarının geliştirilmesine halen ihtiyaç duyulmaktadır. Kanser tedavisinde alternatif olarak, düşük toksisitesi ve yan etkileri nedeniyle bitkilerden elde edilen bileşikler tıbbi araştırmalarda ve kanser tedavisinde sıklıkla kombine olarak kullanılmaktadır. RNA interferans teknolojilerinden biri olan shRNA aracılı susturma, kansere karşı hedef genlerin modüle edilmesinde güçlü bir araç olarak bilinmektedir. Bu tez çalışmanın temel amacı, MCF7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarında antioksidan bir bileşik olan kuersetin ve XBP1 gen ifadesinin shRNA aracılı baskılanmasının EMT, metastaz ve apoptoz yolakları üzerine etkilerinin incelenmesidir. 
Bu amaçla; MCF7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde XBP1 gen ifadesi shRNA aracılığıyla baskılanmıştır. Kuersetinin, XBP1 susturumu ve kombine uygulamanın hücrelerin canlılığına ve proliferasyonuna etkisini değerlendirmek amacıyla XTT yöntemi ve koloni oluşturma kapasitesi testi kullanılmıştır. Kuersetin uygulanmış, XBP1 anlatımı baskılanmış ve kombine uygulanmış MCF7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde apoptoz, metastaz ve EMT yolaklarındaki bazı önemli genlerin (BAX, BCL2, CASP3, CASP7, CASP8, CASP9, CYCS, FADD, FAS, P53, CDH1, CDH2, VIM, TIMP1, TIMP2, TIMP3, MMP2 ve MMP9) ifadelerindeki değişiklikler qPZR ile belirlenmiştir. Gen ifadesinde önemli değişim görülen CASP3, CASP8, CASP9, CDH1 ve CDH2 genlerinin protein seviyeleri western blot yöntemi ile değerlendirilmiştir. 
XTT canlılık sonuçlarına göre kuersetinin IC50 dozu 48. saat için MCF7 hücre hattında 154,262 µM, MDA-MB-231 hücre hattında ise 192,103 µM olarak hesaplanmıştır. XBP1 susturumunun mRNA düzeyinde MCF7 hücre hattında 40 kat, MDA-MB-231 hücre hattında ise 20,8 kat baskılanmıştır. XTT ve koloni oluşum testleri sonucunda XBP1 inhibisyonu ve kuersetin kombine uygulamasının hücre proliferasyonunu anlamlı derecede azalttığı belirlenmiştir. İki hücre hattında da XBP1'in susturulması ve kuersetin uygulamasının birlikte kullanımı, apoptoz, metastaz ve EMT yolaklarında önemli genlerin ifadelerini anlamlı şekilde apoptotik ve anti-metastatik bir yönde değiştirmiştir. XBP1 ifadesinin baskılanması ve kuersetin uygulamasının kombinasyonu, kanser hücrelerinde stres birikimini artırarak apoptoz indüksiyonunu güçlendirmiş ve bunun sonucunda CASP3, CASP8 ve CASP9 ifadelerinin artmasına neden olduğu değerlendirilmiştir. CDH1 seviyesindeki artış, hücreler arası bağların güçlendiğini ve tümör hücrelerinin daha az yayılma eğiliminde olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, CDH2 seviyesindeki azalma, hücrelerin mezenkimal özelliklerini kaybederek invaziv özelliğini baskılamıştır.
Bu bulgular, XBP1'in susturulması ve kuersetin kombinasyonunun, kanser progresini engelleyebilecek bir etkiyi düşündürmektedir. Bu tez çalışmasının sonuçlarına göre; meme kanserinde XBP1 susturumu ve kuersetin kombine kullanımının hücrelerde proliferasyonu azalttığı, hücreleri apoptoza daha duyarlı hale getirdiği ve anti-metastatik belirteçlerin arttığı belirlenmiştir. Ayrıca, bu çalışma bulgularının meme kanseri tedavisi için doğal bileşiklerle kombinasyon halinde RNAi kullanımına bağlı tedavilerin geliştirilmesine katkı sağlaması beklenmektedir.

Abstract:
Cancer is among the most deadly diseases. Breast cancer, the most common type of cancer in women, is also the main cause of cancer-related deaths. Therefore, there is still a need to develop anti-cancer agents with fewer side effects for breast cancer. As an alternative in cancer treatment, compounds obtained from plants are often used in combination in medical research due to their low toxicity and side effects. One of the RNA interference technologies, shRNA-mediated silencing, is known as a powerful tool in modulating target genes against cancer. The main purpose of this thesis is to investigate the effects of quercetin, an antioxidant compound, and shRNA-mediated suppression of XBP1 gene expression on EMT, metastasis and apoptosis pathways in MCF7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines. 
For this purpose, XBP1 gene expression was suppressed in MCF7 and MDA-MB-231 cells using shRNA. The XTT method was used to evaluate the effects of quercetin, XBP1 silencing and combined application on the viability and proliferation of cells, and the colony assay was used to evaluate the effects on colony formation capacity. Changes in the expression of some important genes (BAX, BCL2, CASP3, CASP7, CASP8, CASP9, CYCS, FADD, FAS, P53, CDH1, CDH2, VIM, TIMP1, TIMP2, TIMP3, MMP2 and MMP9) in apoptosis, metastasis and EMT pathways in MCF7 and MDA-MB-231 cells treated with quercetin, suppressed XBP1 expression and combined application were determined by qPCR. Protein levels of CASP3, CASP8, CASP9, CDH1 and CDH2 genes, in which significant changes in gene expression were observed, were evaluated by western blot method.
According to the XTT viability results, the IC50 dose of quercetin for the 48-hour was calculated to be 154.262 µM for the MCF7 cell line and 192.103 µM for the MDA-MB-231 cell line. XBP1 silencing revealed a 40-fold decrease mRNA level expression in the MCF7 cell line and a 20.8-fold decrease in the MDA-MB-231 cell line. Based on the XTT cell viability assay and colony formation assays, it was determined that XBP1 inhibition and quercetin combination significantly reduced cell proliferation. In both cell lines, XBP1 silencing and quercetin treatment together significantly altered the expression of genes important in apoptosis, metastasis and EMT pathways in an apoptotic and anti-metastatic direction. The suppression of XBP1 expression and combination of quercetin treatment potentiated apoptosis induction by increasing stress accumulation in cancer cells, resulting in increased expression of CASP3, CASP8 and CASP9. An increase in CDH1 levels suggests that intercellular conections are strengthened and tumor cells tend to spread less. In contrast, a decrease in CDH2 levels suppressed the invasive property of the cells by losing mesenchymal properties.
These findings suggest that the combination of XBP1 silencing and quercetin may inhibit cancer progression. According to the results of this thesis study; XBP1 silencing and quercetin combined use in breast cancer decreased cell proliferation, made cells more sensitive to apoptosis and increased anti-metastatic markers. Furthermore, the findings of this study are expected to contribute to the development of therapies based on the use of RNAi in combination with natural compounds for the treatment of breast cancer.