Mycobacterıum phlei hücre ekstraktlarının sitokin aktivasyon ve antifungal etkisi, etkiden sorumlu bileşenlerin araştırılması
Investigation of the cytokine stimulating and antifungal activities of Mycobacterium phlei cell extracts, the components responsible of these activities
Yazar: BAĞNU ORHAN
Danışman: PROF. DR. N. LEYLA AÇAN
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Mycobacterium = Mycobacterium

Özet:
İnsan için patojen olmayan bir mikobakteri türü olan Mycobacterium phlei hücre bileşenleri çeşitli fizikokimyasal yöntemlerle kısmen ayrıştırılmıştır. Elde edilen hücre ekstraktlarının immün stimülan aktivitelerini incelemek amacıyla, insan monosit hücre dizilerinde TNF- ? uyarma düzeyleri ölçülmüştür. Örneklerin ökaryot hücre üzerindeki olası direkt etkisini incelemek amacıyla, bu örneklerin çeşitli Candida türleri üzerindeki antifungal etkileri araştırılarak etkili örneklerin minimum inhibitör konsantrasyon değerleri saptanmıştır. Örneklerin SDS poliakrilamid jel elektroforezi ve MALDI-TOF/MS profilleri de çıkarılmıştır. TNF- ? uyarıcı aktivite çeşitli hücre ekstraktlarında gözlenmiştir. Bu aktiviteye birden fazla bileşenin yol açtığı düşünülmektedir. Aktif bileşenlerden bir kısmının, SDS ile muameleye duyarlılıkları nedeniyle protein yapısındaki bileşikler olduğu, bir kısmının ise SDS'den etkilenmeyen düşük molekül ağırlıklı (550-900 Da) yapılar oldukları gözlenmiştir. SDS'den etkilenmeyen yapıların mikobakteri duvarındaki mikolik asitler olduğu düşünülmüştür. Antifungal aktivitenin ise protein yapısında olmayan, düşük molekül ağırlıklı (600-955 Da) ve organik fazda çözünen bileşenlerin etkisiyle olduğu sonucu çıkarılmıştır. Bu bileşik(ler) TNF- ? uyarıcı etki göstermemektedir. Bu düşük molekül ağırlıklı bileşikler, ekzokelin ve mikobaktin gibi sideroforlar olabilir.Mycobacterium phlei ve Mycobacterium smegmatis hücrelerinin üretildiği sıvı besiyerindeki proteinler çöktürülüp kısmen saflaştırılarak elde edilen örneklerin de sitokin aktivasyonu ve antifungal etkiye sahip oldukları tespit edilmiştir. Her iki tür besiyeri örneğinin benzer kütle spektrumuna sahip olduğu görülmüştür.Sonuç olarak, mikobakteri hücresinde bulunan çeşitli bileşiklerin önemli terapötik etkileri olduğu görülmektedir.Anahtar Kelimeler: Mycobacterium phlei, sitokin aktivasyonu, TNF- ? , antifungal aktivite, kütle spektrometrisi, SDS-PAGE, protein, mikolik asit, siderofor.Bu tez, Hacettepe Üniversitesi Araştırma Birimi (03G31) ve Sanayi ve Ticaret Bakanlığı'nın desteklediği (SANTEZ-105S361) projelerin bir bölümüdür.

Abstract:
Several cellular components of a nonpathogenic mycobacterial strain, Mycobacterium phlei, were partially purified by physicochemical techniques. TNF- ? production by human monocytic cell lines in response to M. phlei extracts was measured in order to investigate their immunostimulating activity. To examine the possible direct effect of the extracts on eukaryotic cells, antifungal activities on several Candida strains were investigated and minimum inhibitory concentrations of the active samples were determined. SDS polyacrylamide gel electrophoresis and MALDI-TOF/MS profiles of the samples were also obtained. Various cell extracts showed TNF- ? stimulating activity. More than one cellular component might be responsible for this immune stimulating activity. Part of the active components is sensitive to SDS treatment implying protein structure, while some other might be caused by SDS insensitive, low molecular weight (550-900 Da) structures. These SDS insensitive structures are most probably mycolic acids of the cell wall. On the other hand antifungal activity is due to low molecular weight (600-955 Da) structures soluble in organic phase. These component(s) do not show TNF- ? stimulating activity. These low molecular weight substances might be siderophores such as exochelins or mycobactins.Samples prepared by precipitation and partial purification of the proteins of the culture filtrate of Mycobacterium phlei and Mycobacterium smegmatis also showed TNF- ? stimulating and antifungal activities. Both types of culture filtrate samples had similar mass spectra.In conclusion, several components of mycobacteria cell is shown to have significant therapeutic effects.Key words: Mycobacterium phlei, cytokine activation, TNF- ? , antifungal activity, mass spectrometry, SDS-PAGE, protein, mycolic acid, siderophore.This thesis is part of the research projects supported by Hacettepe University Research Unit (03G31) and Ministry of Industry and Trade (SANTEZ-105S361).