Nauphoeta cinera (Olivier, 1789) (Blattodea, blaberıdae) türündegerçek zamanlı RT-qPCR ile kantitatif ekspresyon analiziiçin referans genlerin tanımlanması ve doğrulanması
Identification and verification of reference genes for quantitative expression analysis by real-time RT-qPCR in nauphoeta cinera (Olivi̇er, 1789) (Blattodea, blaberidae)
Yazar: KÜBRA ÖZCAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞEYDA BERK
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) = Reverse transcription polimerase chain reaction ; Kantitatif = Quantitative ; Referans gen = Reference gene ; Validasyon = Validation

Özet:
Gen ekspresyon çalışmalarında farklı deneysel veya klinik koşullar altında genlerin
ekspresyon seviyelerinin karşılaştırılması için kullanılan en yaygın teknik Kantitatif
Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-qPCR)'dur. RT-qPCR'da güvenilir
sonuçlar elde etmek için verilerin housekeeping genler (HKG) (referans genler) ile
normalizasyonunun yapılması gerekmektedir. Delta-delta Ct yöntemi gibi gen
ekspresyonunun hesaplanması için, PCR primer verimliliğinin ilgili gen ve housekeeping
geni için karşılaştırılabilir olduğu varsayılmaktadır. Farklı PCR primer verimlilikleri (E)
sonucu etkileyebilir. Bu nedenle, veri normalizasyonu için uygun bir referans genin
tanımlanması, qPCR deneylerinin geliştirilmesinde önemli bir adımdır. Bununla birlikte;
çalışma tasarımına uygun en stabil HKG'in kullanılması, çalışma sonuçlarının
güvenilirliğini artırmaktadır. Güvenilir veri elde etmek için çalışma tasarımına uygun
stabil HKG'in seçimi ve validasyonu önemli bir adımdır ki bu ekspresyon bazlı
çalışmalarda bütünleyici bir adım olmuştur. HKG seçimi için farklı yazılım programları
geliştirilmiştir. Normalizasyon için seçilecek en stabil HKG'in seçilmeden önce deneysel
çalışmalar ile dikkatli bir şekilde değerlendirmesinin yapılması gerekmektedir. N.
cinerea lobster hamam böceği cinsel seçilim, bakteriyel enfeksiyonlar, toksiloji
çalışmaları ve metabolik hız ile uyum çalışmaları arasındaki korelasyonlar için model
olarak kullanılan türdür. Bu çalışmada altı aday referans gen ACTB (Beta-aktin), RPS18
(40S Ribozomal protein S18), EF1α (Uzama faktörü 1-alfa), α-Tub (α-Tubulin), ArgK
ix
(Arginine kinaz) ve GADPH (Gliseraldehit-3-fosfat) RT-qPCR analizi için aday olarak
seçilmiştir. Bu adayların ifade profillerinin kararlılığı geNorm, NormFinder, BestKeeper,
ΔCt ve RefFinder yöntemi ile analiz edilmiştir. Sonuçlarımız, α-Tub geninin N. cinerea
erişkinlerinde gen ekspresyon seviyelerinin doğru normalizasyonu için en satabil gen
olduğunu göstermiştir. Ayrıca, GADPH'ın ikinci en stabil referans gen olduğu
saptanmıştır. Nauphoeta cinera türünde RT-qPCR analizi için referans gen
tanımlanması, doğrulanması ve ekpresyon gen stabilitesinin saptanması ile ilgili herhangi
bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle, sonuçlar hamamböceklerinde q-RT-PCR
çalışmalarında biyotik ve abiyotik koşullar altında referans genlerin doğrulanması
ihtiyacını vurgulamaktadır.

Abstract:
The most common technique used in gene expression studies to compare the expression
levels of genes under different experimental or clinical conditions is Quantitative RealTime Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR). In order to obtain reliable results in RTqPCR, the data should be normalized with housekeeping genes (HKG). For the
calculation of gene expression, such as the delta-delta Ct method, different PCR primer
efficiencies (E) may affect the result, as PCR primer yields are assumed to be comparable
for the gene of interest and housekeeping gene. However, Using the most stable HKG
suitable for the study design increases the reliability of the study results. Selection and
validation of stable HKG suitable for study design is an important step to obtain reliable
data, which has been an integral step in expression-based studies. Different software
programs have been developed for HKG selection. Before choosing the most stable HKG
to be selected for normalization, it should be carefully evaluated with experimental
studies. N. cinerea lobster cockroach is the species used as a model for sexual selection,
bacterial infections, toxicology studies, and correlations between metabolic rate and
compliance studies. In this study, six candidate reference genes ACTB (Beta-actin),
RPS18 (40S Ribosomal protein S18), EF1α (Elongation factor 1-alpha), α-Tub (αTubulin), ArgK (Arginine kinase), and GADPH (Glyceraldehyde-3 -phosphate) was
selected as a candidate for RT-qPCR analysis. The stability of the expression profiles of
these candidates was analyzed by the geNorm, NormFinder, BestKeeper, ΔCt and
RefFinder methods. Our results showed that the α-Tub gene is the most stable gene for
accurate normalization of gene expression levels in N. cinerea adults. In addition,
GADPH was found to be the second most stable reference gene. There are no studies on
xi
reference gene identification, validation and determination of expression gene stability
for RT-qPCR analysis in Nauphoeta cinera. Therefore, the results highlight the need for
validation of reference genes under biotic and abiotic conditions in q-RT-PCR studies in
cockroaches.