Alfa amilaz-dekstran konjugatlarının sentezi ve karakterizasyonu
Synthesis and characterization of alpha amylase-dextran conjugates
Yazar: ÖZLEM ÖZTOLAN
Danışman: PROF. DR. HURİYE KUZU
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Alfa amilaz = Alpha amylase ; Dekstranlar = Dextrans ; Konjugat = Conjugate ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid

Özet:
Amilazlar endüstride nişastadaki glikozid bağlarının hidrolizinde yaygın olarak kullanılan enzimlerdir. Alfa amilazlar (1,4-?-D-glukan glukanohidrolaz; EC 3.2.1.1) nişastadaki amiloz ve amilopektinin ?-1,4 bağlarının hidrolizinden sorumlu endohidrolazlardır. ß-Amilaz nişastanın sadece indirgenmeyen uçlarındaki ?-1,4 bağlarına saldırabilir. Alfa amilazlar yapılarında 5 alt ünite bulundururlar ve 478 amino asit artığı içermektedirler. Molekül ağırlıkları 50 000 dolayındadır.Özellikle Aspergillus oryzae'den elde edilen alfa amilaz (TAKA-amilaz), başlıca gıda, tekstil, deterjan endüstrilerinde kullanılmaktadır. Bu gibi endüstriyel uygulamalarda çalışma ortamlarının sıcaklık, pH v.b. değerleri ya da mevcut kimyasallar enzimin aktivitesini olumsuz etkileyebilir. Endüstriyel proseslerde enzimlerin çalışma ortamının olumsuzluklarına karşı dirençli kılınması önemli araştırma alanlarını oluşturmaktadır. Bu maksatla uygulanan genetik çalışmalar ve kimyasal modifikasyonlar enzimlerin stabilitelerini arttırmaktadır.Bu çalışmada, Aspergillus oryzae alfa amilaz (TAKA) ?Sephadex G 50? kolon dolgu maddesi kullanılarak jel filtrasyon yöntemi ile saflaştırıldı. 75 000 ve 188 000 mol ağırlıklı dekstranlar sodyum periyodat ile aldehit türevlerine yükseltgendikten sonra saf enzime kovalent olarak bağlandı. Sentezlenen konjugatlar ultrafiltrasyon sisteminde konsantre edildi ve yıkandı. Elde edilen konjugatlar HPLC ve GPC cihazlarında incelendi. Enzim ve konjugatların pH 7 ve farklı sıcaklıklarda aktiviteleri tayin edildi ve alınan sonuçlar kıyaslandı.Sonuç olarak, pH 7'de konjugatlar saf enzime kıyasla daha geniş bir sıcaklık aralığı ve yüksek termal stabilite gösterdiler.Anahtar kelimeler: Aspergillus oryzae ?-Amilaz, Dekstran, ?-Amilaz-Dekstran konjugatları, aktivite, enzim stabilitesi, GPC, HPLC.

Abstract:
Amylases are extensively applied enzymes in industry which can hydrolyze the glycosidic bonds in starch. Alpha amylases (1,4-?-D-glucan glucanohydrolases; EC 3.2.1.1) are endo-enzymes responsible for the hydrolysis of internal ?-1,4 linkages of amylose and amylopectin in starch. ß-amylase can attack starch ?-1,4 bonds only on nonreducing ends of polymer. Alpha amylases are composed of about 478 amino acid residues and contained five subunits. Their molecular weights are about 50 000.Especially alpha amylase from Aspergillus oryzae (TAKA-amylase), is widely used in food, textile and detergent industries. It is known that many factors in industrial processes can influence the catalytic activity of enzymes negatively by affecting the enzyme?s structural state. Thus, chemical and genetic modification of enzymes has been used to improve their stability.In this study, ?-Amylase from Aspergillus oryzae (TAKA) is purified by gel filtration chromatography using ?Sephadex G?50?. Dextrans which molecular weights are 75 000 and 188 000, are oxidated to their aldehyde derivatives with NaIO4. and attached to the purified enzyme covalently. Conjugates are concentrated and washed by ultrafiltration system. The obtained conjugates were examined using GPC and HPLC. Activities of enzyme and conjugates are determined at different temperatures, at pH 7 and results are compared.It was observed that conjugates showed larger temperature range and higher thermal stability than purified enzyme at pH 7.Key words: Aspergillus Oryzae ?-Amylase, Dextran, ?-Amylase-Dextran conjugates, activity, enzyme stability, GPC, HPLC.