Kemik doku mühendisliği yaklaşımında melatoninin rolü: İn vitro çalışmalar
The role of melatonin in bone tissue engineering approach: In vitro studies
Yazar: DAMLA ÇETİN ALTINDAL
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, melatoninin osteoindüktif ve antikanserojenik özelliklerinin bir arada bulunduğu doku iskelesi-temelli bir sistem geliştirilmesi amaçlanmıştır. Melatoninin osteoindüktif etkileri preosteoblastik MC3T3-E1 hücre hattı ve insan mezenkimal kök hücreleri (hMSC); antikanserojenik etkileri ise MG-63 insan osteosarkom hücre hattı kullanılarak yürütülen in vitro hücre kültür çalışmaları ile incelenmiştir.
Emülsiyon oluşturma/çözücü buharlaştırma yöntemiyle üretilen poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) nanopartiküllerin ve PLGA mikropartiküllerin sırasıyla, yaklaşık 200 nm ve 3 µm çapa sahip olduğu belirlenmiştir. İn vitro salım çalışmaları sonucunda, PLGA nano/mikropartiküllerin melatoninin kontrollü ve uzun dönemli salımı için oldukça uygun sistemler olduğu ve 40 gün sonunda partiküllerden salınan melatonin konsantrasyonunun mikromolar mertebede olduğu görülmüştür. Partiküllerden melatonin salımının Higuchi salım modeline uyduğu, dolayısıyla difüzyon mekanizmasıyla gerçekleştiği kanıtlanmıştır. PLGA nanopartiküllerin preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri ve MG-63 insan osteosarkom hücreleri üzerinde toksik etki gösterdiği belirlenmiş ve partiküllerin hücre içerisine alım yüzdeleri, sırasıyla ~%30 ve ~%60 olarak hesaplanmıştır. Dolayısıyla, PLGA nanopartiküllerin doku iskelelerine yüklenerek kullanılması gerektiği vurgulanmıştır. 
Kitosanın biyoaktivitesini arttırmak amacıyla toz ve boncuk formdaki hidroksiapatit (HAp) partiküllerin kitosan yapısına katılmasıyla dondurarak-kurutma yöntemi ile kitosan/hidroksiapatit (HAp) doku iskeleleri üretilmiştir. İskelelerin üç boyutlu gözenek yapıları taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve mikro-bilgisayarlı tomografi (µ-CT) ile incelenmiştir. MC3T3-E1 hücreleri ile gerçekleştirilen çalışmalarda kitosan/boncuk HAp doku iskelesinin hücre üremesini daha çok desteklediği belirlenmiştir. Melatonin yüklü PLGA mikropartiküllerin kitosan/HAp doku iskelelerinin yapısına üretim sırasında katılmasıyla hazırlanan kitosan/HAp+Mp doku iskelelerinde üreyen MC3T3-E1 hücrelerinin alkalen fosfataz (ALP) aktivitesinin ve runt-ilişkili transkripsiyon faktör (RunX2), kollajen tip 1 (Col1), osteokalsin (Ocn) ve osteopontin (Opn) genlerinin ekspresyon seviyelerinin diğer gruplara göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. SEM ve konfokal lazer taramalı mikroskop (CLSM) görüntüleri, hücrelerin iskelenin 600-700 µM derinliklerine kadar göç ettiklerini göstermiştir. 
Melatoninin osteosarkom hücreleri üzerindeki etkisini incelemek amacıyla, 900 W, 60 s ve 90 s mikrodalga koşullarında melatonin/hidroksipropil-β-siklodekstrin (HPβCD) inklüzyon kompleksleri üretilmiştir. Melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksleri, kitosan/HAp+Mp doku iskelelerine, iskele başına 2.267 ± 0.236 mg melatonin içerecek şekilde başarılı bir şekilde yüklenmiştir. İn vitro salım çalışmaları, doku iskelelerinden melatonin salımının 5 gün gibi oldukça kısa sürede gerçekleştiğini ve salınan melatoninin yaklaşık 8 mM konsantrasyonda olduğunu ortaya koymuştur. Hazırlanan melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksi yüklü doku iskelelerinin MG-63 insan osteosarkom hücreleri üzerindeki etkisi in vitro hücre kültür çalışmaları ile incelenmiş ve bu sistemden yüksek miktarda ve çok hızlı bir şekilde salınan melatoninin kanser hücrelerinin üremesini hücre döngüsünün G0/G1 fazında inhibe ettiği belirlenmiştir. 
Melatoninin hMSClerin osteoblastlara farklılaşmasındaki etkisini incelemek amacıyla ipek filmler kullanılmış ve bu filmlerin yüzeyi farklı konsantrasyonlarda (0-2,000 µM) melatonin ile modifiye edilmiştir. İpek filmlerden ilk 24 saatte melatoninin büyük bir kısmı ani bir şekilde salınmış ve salım 5 gün boyunca devam etmiştir. Melatoninin 250 µM, 500 µM ve 1,000 µM konsantrasyonları hücreler üzerinde herhangi bir toksik etki yaratmadığından bu konsantrasyonlar kullanlarak hMSCler ile in vitro hücre kültür çalışmaları yürütülmüştür. Hem büyüme hem de farklılaşma ortamında gerçekleştirilen çalışmalar sonucunda, melatonin varlığının hücrelerin ALP aktiviteleri ve sırasıyla, erken ve geç dönem farklılaşma belirteçleri olan RUNX2 ve OCN protein ekspresyonlarını arttırdığı görülmüştür. Von Kossa boyamaları sonucunda, melatonin içeren ipek filmler üzerinde kültüre edilen hücrelerin kültürün geç dönemlerinde mineralize nodüller sentezledikleri belirlenmiştir. 
Elde edilen veriler sonucunda, geliştirilen doku iskelesi-temelli melatonin taşıyıcı sistemden salınan mikromolar konsantrasyondaki melatoninin preosteoblast hücrelerinin proliferasyonunu arttırdığı, milimolar konsantrasyondaki melatoninin ise osteosarkom hücrelerinin üremesini inhibe ettiği belirlenmiştir. Böylece, melatoninin osteoindüktif ve antikanserojenik özelliklerinin bir arada etkili olduğu bu sistemin osteosarkom tedavisi için uygun olduğu sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
In the presented study, it was aimed to develop a tissue scaffold-based system in which the osteoinductive and anticarcinogenic properties of melatonin coexist. For this purpose, osteoinductive effects of melatonin were investigated using preosteoblatic MC3T3-E1 cell line and human mesenchymal stem cells (hMSC); anticarcinogenic effects of melatonin were investigated using MG-63 human osteosarcoma cell line by in vitro cell culture studies. 
It has been determined that, poly(lactide-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles and PLGA microparticles produced by emulsion/solvent evaporation method have diameters of about 200 nm and 3 μm, respectively. In vitro release studies showed that, PLGA nano/microparticles are highly suitable systems for controlled and long-term release of melatonin, and the concentration of melatonin released from the particles after 40 days is in micromolar level. The release behavior of melatonin from the particles was consistent with the Higuchi release model, so the diffusional mechanism proved to be the result of mathematical analysis. PLGA nanoparticles were shown to be toxic on both preosteoblastic MC3T3-E1 cells and MG-63 human osteosarcoma cells and the percentages of particles uptaken by the cells were determined to be ~ 30% and ~ 60%, respectively. Therefore, it has been emphasized that PLGA nanoparticles should be loaded onto tissue scaffolds.
In order to increase the bioactivity of chitosan, chitosan/hydroxyapatite (HAp) tissue scaffolds were produced by freeze-drying by adding HAp particles in powder and bead form to the chitosan structure. Three-dimensional pore structures of the scaffolds were investigated by scanning electron microscopy (SEM) and micro-computerized tomography (μ-CT). Studies conducted with MC3T3-E1 cells have shown that chitosan/bead HAp tissue scaffold more strongly supported cell proliferation. It was determined that cells proliferating in chitosan/HAp+Mp tissue scaffolds prepared by incorporation of melatonin loaded PLGA microparticles during the production of chitosan/HAp tissue scaffolds produce the most favorable results. The alkalene phosphatase (ALP) activity and the expression levels of runt-related transcription factor (RunX2), collagen type 1 (Col1), osteocalcin (Ocn) and osteopontin (Opn) genes of this group were found to be higher than that of the other groups. SEM and confocal laser scanning microscope (CLSM) images showed that the cells migrated into the depth of 600-700 μM of the scaffold. 
To investigate the effect of melatonin on osteosarcoma cells, melatonin/hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) inclusion complexes were produced under 900 W, 60 s and 90 s microwave conditions. Melatonin/HPβCD inclusion complexes were successfully loaded into chitosan/HAp+Mp to contain 2.267 ± 0.236 mg of melatonin per scaffold. In vitro release studies demonstrated that melatonin was released from tissue scaffolds within a very short time period such as 5 days and the released melatonin was approximately 8 mM. The effect of melatonin/HPβCD inclusion complex-loaded tissue scaffolds on MG-63 human osteosarcoma cells was examined by in vitro cell culture studies and it was determined that melatonin released from this system in a high amount and very rapidly inhibited the proliferation of cancer cells in the G0/G1 phase of the cell cycle.
Silk films were used to study the effect of melatonin on the differentiation of hMSCs into osteoblasts and the surface of these films was modified with melatonin at different concentrations (0-2,000 μM). In the first 24 hours, most of the melatonin was released suddenly and the release continued for 5 days. Since concentrations of melatonin at 250 μM, 500 μM and 1,000 μM did not cause any toxic effects on the cells, in vitro cell culture studies with hMSCs were carried out using these concentrations. Studies of both growth and differentiation medium showed that, the presence of melatonin increased ALP activities of cells and RUNX2 and OCN protein expressions that were early and late differentiation markers, respectively. As a result of Von Kossa staining, it was determined that cells cultured on silk films containing melatonin synthesized mineralized nodules in the late culture period.
As a result of the obtained data, it was determined that melatonin in the micromolar concentration released from the developed tissue scaffold-based melatonin carrier system increased the proliferation of preosteoblast cells and melatonin in milimolar concentration inhibited the proliferation of osteosarcoma cells. Thus, it was concluded that this system, in which osteoinductive and anticarcinogenic properties of melatonin are effective, is suitable for osteosarcoma treatment.