Rosacea hastalarında bağırsak mikrobiyomunun metagenomik DNA profili
Metagenomic DNA profile of gut microbioma in patients with rosacea
Yazar: KEREM YILMAZ
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ALTINDİŞ
Sakarya Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bağırsaklar = Intestines ; DNA = DNA ; Dizi analizi-DNA = Sequence analysis-DNA ; Gastrointestinal mikrobiyom = Gastrointestinal microbiome ; Gül hastalığı = Rosacea ; Mikrobiyota = Microbiota ; RNA = RNA

Özet:
Giriş ve Amaç: Yeni nesil sekans analiz sistemlerinin kullanıma girmesi ile bağırsak mikrobiyomunun hemen hemen tamanını tespit etme olanağı sağlandığı için, mikrobiyomun öneminin daha iyi anlaşılmasına olanak sağlanmıştır. Yapılan çalışmalarda bağırsak mikrobiyomu diyabet, hipertansiyon, depresyon gibi birçok hastalıkla ilişkilendirilmektedir. Aynı şekilde diğer vücut bölgeleri için de kullanılan bu ileri teknoloji akne vulgaris, sedef hastalığı ve atopik dermatit gibi bazı dermatolojik hastalıkların patogenezini ortaya koymak için de kullanılmıştır. Dermatolojik hastalık mekanizmaları sadece deri mikrobiyomundan değil, aynı zamanda bağırsak mikrobiyomundan da etkilenmektedir. Kronik inflamatuar bir dermatoz olan rosacea hastalığının patofizyolojisi tam olarak aydınlatılamamış olup, tanısı klinik olarak konulabilmektedir. Bu çalışmanın amacı; rosacea hastalığı ile bağırsak mikrobiyomu arasındaki ilişkileri belirleyerek rosacea patogenezine ışık tutmak, yeni tanı ve tedavi yaklaşımlarına yardımcı olmaktır.
Gereç ve Yöntem: Bilinen bir sistemik ve / veya dermatolojik hastalığı olmayan, 18-49 yaş aralığında olan, en az 4 hafta ve daha kısa süre antibiyotik, proton pompası inhibitörü ve / veya probiyotik, prebiyotik kullanmamış olan 20 rosacea tanılı gönüllü hasta ve aynı şartları taşıyan 10 sağlıklı gönüllü bu çalışmaya dahil edilmiştir. Gönllülere ilaç kullanımı dışında beslenme alışkanlıkları, sigara, alkol kullanımı sorularını kapsayan mini bir anket uygulanmıştır. Hastalardan steril olan numune kapları ile, taze gaita örneği hastane şartlarında alınmıştır. Tüm örneklerde Bristol dışkı skorlaması yapılmıştır. Toplanan gaita örneklerinden indikatör şeritleri ile (Merck, NJ, ABD) pH ölçümleri sonrası hasta ve kontrol grubundan alınan yaklaşık 1gram gaita örnekleri, stabilizasyon tamponuna (DNA/RNA Shield™ Collection Tube, Zymo Research, CA, ABD) konularak -20°C'de birkaç gün saklanmıştır. Daha sonra nükleik asit izolasyonu (ZymoBIOMICS DNA Mini kiti, Zymo Research, CA, ABD) yapılmıştır. Bakteriyel 16S ribozomal RNA (rRNA)  geni hedef dizilemesi,  universal bakteri 16S primerleri 16S rRNA geninin V3-V4 bölgesini hedefleyen 341f (CCTACGGGNGGCWGCAG) ve 805r (GACTACHVGGGTATCTAATCC) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Final kütüphane Illumina MiSeq ile oluşturulmuştur. Uygun amplikon dizi tanımları ve düzenlemeleri yapılarak takson ve numunelerin hiyerarşik kümelenmesiyle taksonomik haritalar hazırlanmıştır. Biyoinformatik işlemlerden sonra istatistiksel analizler yapılmıştır (LefSe). Varsayılan ayarlarla (p < 0.05 ve LDA etki boyutu > 2) gruplar arasında önemli farklılık gösteren taksonlar belirlenmiştir.
Bulgular: Rosacea tanılı hastaların, kontrol grubu olan sağlıklı gönüllülere göre gaita pH ortalamaları ve Bristol skorları daha yüksek bulunmuştur. 16S rRNA sekans analizleri sonuçlarına göre rosacea tanılı hastalarda sağlıklı kontrol grubuna göre düşük alfa çeşitlilik ve beta çeşitlilikte farklılık görülmüştür.
Metagenomik DNA analizleri sonuçlarına göre rosacea hastalarında; Lachnospira, Lachnoclostridium, Roseburia ve Roseburia intestinalis daha yüksek oranda, sağlıklı gönüllülerde ise Prevotellaceae, Prevotella copri, Coriobacteriaceae, Desulfovibrio, Ruminococcaceae, Ruminococcus, Clostridiales, Clostridiales Family 13, Selenomonadales, Succinivibrio, Hungatella, Mollicutes, Butyricimonas virosa, Alisitipes, Oscillospira ve Erysipelotrichaceae gibi cins, tür, aile, takım bazında etkenler istatistiki olarak daha yüksek oranda saptanmıştır.
Sonuç: Rosacea hastalığı ile bağırsak disbiyozisi arasında ilişki olduğu saptanmıştır. Bu çalışmada sağlıklı gruba göre rosacea hastalarında; Lachnospira, Lachnoclostridium, Roseburia ve Roseburia intestinalis daha yüksek oranda, Prevotellaceae, Prevotella copri, Coriobacteriaceae, Desulfovibrio, Ruminococcaceae, Ruminococcus, Clostridiales, Clostridiales Family 13, Selenomonadales, Succinivibrio, Hungatella, Mollicutes, Butyricimonas virosa, Alisitipes, Oscillospira ve Erysipelotrichaceae  daha düşük oranda içerdiği tespit edilmiştir. Ancak literatürde rosacea ve bağırsak mikrobiyomu ile yapılmış çok az çalışma (sadece bir çalışmaya ulaşılabilmiştir) olduğu için öne çıkan mikroorganizların anlamlandırılabilmesi için daha çok sayıda ve daha fazla örnekleme sahip çalışamalara ihtiyaç vardır.

Anahtar Kelimeler: Rosacea, bağırsak mikrobiyomu, 16S rRNA, Roseburia, yeni nesil sekans

Abstract:
Introduction and Aim: The introduction of the new generation of sequence analysis systems allows for better understanding of the importance of the microbiome, as it is possible to detect almost all of the intestinal microbiome. In the studies, intestinal microbiome is associated with many diseases such as diabetes, hypertension and depression. This advanced technology, which is also used for other body areas, has also been used to demonstrate the pathogenesis of some dermatological diseases such as acne vulgaris, psoriasis and atopic dermatitis. Dermatological disease mechanisms are not only affected by skin microbiome but also by intestinal microbiome. The pathophysiology of rosacea disease, a chronic inflammatory dermatosis, has not been fully elucidated and its diagnosis can be made clinically. The aim of this study is; To determine the relationship between rosacea disease and intestinal microbiome, to shed light on the pathogenesis of rosacea and to help the new diagnosis and treatment approaches.
Material and Method: 20 volunteers with rosacea with no known systemic and / or dermatological disease, aged between 18-49 years, who had not used antibiotics, proton pump inhibitors and / or probiotics, prebiotics for at least 4 weeks or less, and 10 healthy volunteers with the same conditions was included in the study. A mini questionnaire including questions not only about drug use but also about diet, smoking and alcohol use was applied to the volunteers. Fresh stool samples were taken from patients in samples vessels under sterile hospital conditions. All samples were applied Bristol stool scoring. After the pH measurements of the collected stool samples (Merck, NJ, USA), approximately 1 g stool samples taken from the patient and control groups were placed in the stabilization buffer (DNA / RNA Shield ™ Collection Tube, Zymo Research, CA, USA) at -20°C for a few days. Nucleic acid isolation (ZymoBIOMICS DNA Mini kit, Zymo Research, CA, USA) was then performed. Bacterial 16S ribosomal RNA (rRNA) gene target sequencing was performed using the 341f (CCTACGGGNGGCWGCAG) and 805r (GACTACHVGGGTATCTAATCC), targeting the V3-V4 region of the 16S rRNA gene of the universal bacteria 16S primers. The final library was created with Illumina MiSeq. 
Taxonomical maps were prepared by hierarchical clustering of taxa and samples by making appropriate amplicon array definitions and regulations. After bioinformatics, statistical analyzes were performed (LefSe). With the default settings (p <0.05 and LDA effect size> 2) taxa which are significantly different were determined between groups. 
Results: Patients with rosacea were found to have higher stool pH averages and Bristol scores than healthy volunteers in the control group. According to the results of 16S rRNA sequence analysis, in patients with rosacea, there was low alpha diversity and there was difference in beta diversity compared to healthy control group.
According to the results of metagenomic DNA analysis; in rosacea patients; Lachnospira, Lachnoclostridium, Roseburia and Roseburia intestinalis were found at a higher rate, in healthy volunteers Prevotellaceae, Prevotella copri, Coriobacteriaceae, Desulfovibrio, Ruminococcaceae, Ruminococcus, Clostridiales, Clostridiales Family 13, Selenomonadales, Succinivibrio, Hungatella, Mollicutes, Butyricimonas virosa, Alisitipes, Oscillospira and Erysipelotrichaceae, factors on the basis of genus, species, family and order, were found to be statistically higher.
Conclusion: There was a relationship between rosacea disease and intestinal dysbiosis. In this study, in rosacea patients according to healthy group; Lachnospira, Lachnoclostridium, Roseburia and Roseburia intestinalis at a higher rate. However, in the literature there is a need for more studies with more and more sampling in order to make sense of the microorganisms that stand out because there are very few studies done with rosacea and intestinal microbiome (only one study has been achieved).

Keywords: Rosacea, gut microbiome, 16S rRNA, Roseburia, next generation sequencing