Hidroksil radikal süpürülmesine dayalı antioksidan aktivite ölçümünde yeni bir yöntem geliştirilmesi
Development of a novel method for antioxidant activity measurement based on hydroxyl radical scavenging
Yazar: BURCU BEKTAŞOĞLU
Danışman: PROF.DR. REŞAT APAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Oksijen yaşam için gereklidir, ancak vücut üzerinde zararlı etkileri de vardır. Oksijen,insan vücudunda solunum zinciri içersinde süperoksit, singlet oksijen, hidroksil radikalivb. reaktif oksijen türlerini (ROS) oluşturmaktadır. Hidroksil radikali bilinen en reaktifserbest radikaldir ve vücutta serbest radikal hasarının en önemli sorumlusudur. Reaktifoksijen birikimi organizmada mevcut olan veya gıdayla alınan antioksidanlarladengelenmediği taktirde; oluşan oksidatif stres koşulları altında biyolojik yapılarınhasarına neden olabilen radikalik zincir reaksiyonları meydana gelmektedir. Canlıorganizmalarda hidroksil radikalinin süpürülmesi için özel bir molekül veya enzimbulunmamaktadır. Hidroksil radikalleri sentetik antioksidanlar veya gıdalarla alınanantioksidanlar tarafından süpürülmektedir. Bu nedenden ötürü, antioksidanlarınhidroksil radikal süpürme aktivitelerinin ölçümü büyük önem taşımaktadır. Çeşitliantioksidanların hidroksil radikali süpürme yeteneklerinin ve bu maddelerin hidroksilradikali ile reaksiyon hız sabitlerinin bilinmesi gerekmektedir. Bu nedenle bilimdünyasında kabul gören, basit, kullanışlı, hızlı, ucuz ve duyarlı antioksidan aktiviteölçme yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu kapsamda bu tez çalışmasının amaçları;insan sağlığı üzerinde doğrudan etkisi bulunan hidroksil radikallerini süpürmeyeteneğine sahip antioksidanların aktivitelerinin yeni bir yöntem ile belirlenmesi vebulunan ikinci mertebeden hız sabitlerinin referans yönteminkiler ile karşılaştırılarakdoğruluğunun ispatlanmasıdır.Bu çalışmada; literatürde CUPRAC yöntemi olarak bilinen toplam antioksidan kapasiteyöntemi temel alınmıştır. Spektrofotometrik bir yöntem olan CUPRAC yöntemimodifiye edilerek hidroksil radikal süpürülmesine dayalı antioksidan aktiviteölçülmesinde kullanılabilir duruma getirilmiştir.Kromojenik yükseltgeme aracı olarak kullanılan bakır(II)-neokuproin (Cu(II)-Nc)reaktifi varlığında prob madde ile hidroksil radikallerinin reaksiyonu sonucunda oluşanhidroksillenmiş ürünlerin, Cu(II)-Nc kompleksini 450 nm'de maksimum ışık soğurmasıgösteren Cu(I)-Nc kompleksine indirgemesi ve kendilerinin uygun kinonlarayükseltgenmesinden yararlanılarak çeşitli hidroksil radikal süpürücülerin antioksidanaktiviteleri bulunmuştur.Hidroksil radikalleri Fe(II) + EDTA + H2O2'den oluşan Fenton reaksiyonuyla üretilmişve radikal oluşumu yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ilesalisilat probu kullanılarak gösterilmiştir. Bu şekilde oluşan hidroksil radikallerininsüpürücü varlığında veya yokluğunda prob madde (p-amino benzoat veya 2,4-dimetoksibenzoat veya 3,5-dimetoksi benzoat) ile reaksiyonu sonucunda oluşan hidroksi benzoikasitler etil asetat ile ekstrakte edilerek reaksiyon ortamından organik faza çekilmiştir.Süpürücü varlığında ve yokluğunda organik fazda toplanan hidroksi benzoik asitlerinmiktar tayini, bu faza CuCl2, Nc ve amonyum asetat tamponu (pH 7 tamponu) ilavesisonunda 30 dakika beklemekle, reaktif körüne karşı 450 nm absorbansının ölçümüyoluyla yapılmıştır. Reaksiyon ortamında süpürücü bileşiğin bulunması kullanılan probmadde ile süpürücünün hidroksil radikalleri için yarışmasına neden olmaktadır.Süpürücü bileşiğin hidroksil radikalleriyle vermiş olduğu reaksiyonun hızı yüksekseoluşan hidroksi benzoik asit ürün miktarı ve dolayısıyla Cu(I)-Nc kompleks oluşumuazalmaktadır. CUPRAC absorbansındaki bu azalıştan faydalanarak yarışmalı kinetikyöntemine göre süpürücü bileşiklerin hidroksil radikalleriyle ikinci mertebeden hızsabitleri hesaplanmıştır.Bu kapsamda hidroksil radikal süpürücülerin Modifiye CUPRAC yöntemi ile bulunanikinci dereceden reaksiyon hız sabitleri, antioksidan aktivite tayini için kullanılanTBARS (Tiyobarbitürik Asitle Reaksiyon Veren Maddeler) referans yöntemininbulgularıyla karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırma sonucunda hem TBARS hem deCUPRAC yöntemiyle elde edilen verilere göre sodyum metabisülfit (k3,5-DMB =5.62x109 M-1s-1), DMSO (k3,5-DMB = 4.24x109 M-1s-1), sodyum tiyosülfat (k3,5-DMB =3.92x109 M-1s-1), sodyum format (k3,5-DMB = 1.89x109 M-1s-1) gibi süpürücülerinaskorbik asit (k3,5-DMB = 7.4x108 M-1s-1), mannitol (k3,5-DMB = 6x108 M-1s-1) ve glikozdan(k3,5-DMB = 5.1x108 M-1s-1) daha hızlı süpürücüler olduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıcageliştirilen Modifiye CUPRAC yöntemi salisilat probu kullanılarak HPLC (yüksekperformanslı sıvı kromatografisi) yöntemiyle doğrulanmıştır. HPLC yöntemiyle salisilatprobu için 2,3-dihidroksibenzoik asit, 2,4-dihidroksibenzoik asit ve 2,5-dihidroksibenzoik asit olmak üzere üç adet hidroksillenme ürünü bulunmuştur.

Abstract:
Oxygen is essential for life, but it may also have harmful effects on the organism.Oxygen may form various reactive oxygen species (ROS) in the respiratory chain,namely superoxide, singlet oxygen, hydroxyl radical, etc. Hydroxyl radical is the mostreactive free radical known, and is the most important agent responsiple for free radicaldamage to the organism. If the ROS accumulation is not balanced by existing or foodinjestedantioxidants in the organism, radicalic chain reactions may ocur under oxidativestres conditions that may cause tissue damage. There is no special molecule or enzymeresponsible for hydroxyl radical scavenging in the organism. Hydroxyl radicals arescavenged by either synthetic or food-injested antioxidants. Therefore measurement ofthe radical scavenging activity of these antioxidants bears great importance. It isrequired to know the hydroxyl radical scavenging ability and rate constants of hydroxylradical quenching of various antioxidants. For this purpose, simple, readily available,rapid, inexpensive and sensitive techniques of antioxidant activity assay are requiredthat may find wide approval in the scientific community. In this regard, the aims of thisthesis study are; measurement of antioxidant activity of antioxidant capable ofscavenging hydroxyl radicals having a direct influence on human health with the use ofa novel technique, and comperison of the second-order rate constants of radicalquenching with those found by the reference assay for method validation.This study is based on the total antioxidant capacity determination known as the?CUPRAC method? in the literature. The original spectrophotometric CUPRAC(cupric ion reducing antioxidant capacity) method was modified and adapted toantioxidant activity measurement based on hydroxyl radical scavenging.The hydroxyl radical scavenging antioxidant activity of the tested compounds wasfound by measuring their inhibitive effect on the hydroxylation of the probe byhydroxyl radicals. The hydroxylated reaction products were quantified by theirreduction ability of Cu(II)-Nc complex reagent to Cu(I)-Nc chelate showing maximumabsorbance at 450 nm, the hydroxylated probes themselves being oxidized to thecorresponding quinones.The hydroxyl radicals were generated by a Fenton reaction consisting of a (Fe(II) +EDTA + H2O2) mixture, and the radical production was demonstrated using highperformance liquid chromatography (HPLC) with salicylate probe. The hydroxylradicals thus produced reacted with the probe materials (i.e., p-aminobenzoate, 2,4-dimethoxybenzoate, and 3,5- dimethoxybenzoate) in the presence and absence ofscavengers, and the hydroxybenzoic acids resulting from the reaction were isolated bysolvent extraction with ethylacetate. The quantitative determination of hydroxybenzoicacids extracted in the organic phase was made by adding cupric chloride, neocuproine,and pH 7 buffer ( ammonium acetate) to the ethylacetate phase, and measuring the 450nm-absorbance after 30 min against a reagent blank not containing the hydroxylatedproducts. If the rate constant of scavenger for hydroxyl radicals was high, then theamount of formed hydroxybenzoic acids was low, and therefore the Cu(I)-Nc chelateyield was low. By making use of this decrease in CUPRAC absorbance, the secondorder rate constants of scavenger compounds for hydroxyl radicals were calculated withthe aid of competition kinetics measurement technique.In this regard, the second order rate constants found with the modified CUPRACmethod were compared with those found with the reference method of antioxidantactivity assay, TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances). Sodium metabisulfite(k3,5-DMB = 5.62x109 M-1s-1), DMSO (k3,5-DMB = 4.24x109 M-1s-1), sodium thiosulfate(k3,5-DMB = 3.92x109 M-1s-1), sodium formate (k3,5-DMB = 1.89x109 M-1s-1) were foundfaster than ascorbic acid (k3,5-DMB = 7.4x108 M-1s-1), mannitol (k3,5-DMB = 6x108 M-1s-1),glucose (k3,5-DMB = 5.1x108 M-1s-1). In addition, the developed CUPRAC method wasvalidated with HPLC using salicylate probe. Salicylate prob has three hydroxylationproducts which are 2,3- ; 2,4- and 2,5-dihydroxy benzoic acid were verified by HPLCmethod.