Origanum onites L.'de mitojenler tarafından aktive edilen protein kinaz kinaz (mapkk) enzim ailesi üyelerinden birinin klonlanması ve enzimatik olarak tanımlanması
Cloning and enzymatic characterization of a mitogen-activated protein kinase kinase(mapkk) enzyme family member in Origanum onites
Yazar: İSMAİL POYRAZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. EMEL SÖZEN ; YRD. DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
Anadolu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Enzimler = Enzymes ; Origanum onites = Origanum onites ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Protein motifleri = Protein motifs

Özet:
Origanum onites ülkemizde kültüre alınmıs, ticareti en fazla yapılan bitkitürüdür. O.onites'ten elde edilen uçucu yaglar ilaç ve kozmetik basta olmak üzerebirçok endüstri alanında kullanılmakta, ayrıca yaprakları baharat olaraktüketilmektedir. Bu bitkiden elde edilen uçucu yag miktarının farklı bölge, iklimve yıllara göre farklı oranlarda oldugu bilinmektedir. MAPK (Mitojenlertarafından aktive edilen protein kinaz) enzim ailesi, MAPKKK-MAPKK-MAPKseklinde üçlü kinaz modülünden olusan bir sinyal iletim yoludur ve bitkilerdeçevresel faktörlere karsı hücresel cevabın olusmasında rol oynar. Bu çalısmada O.onites bitkisinde MAPK sinyal yolunda görev alan MAPKK enzim ailesiüyelerinden birinin klonlanması ve karakterize edilmesi amaçlanmıstır. O.onitesbitkisinden bes farklı olası MAPKK cDNA'sının orta bölgeleri klonlanaraknükleotid dizileri belirlenmis ve bunlardan Oo17-MAPKK'nin 5' ve 3' uçlarıRACE teknigi ile elde edilmistir. 5' ve 3' uçlarının dizi bilgisi kullanaraktasarlanan spesifik primerlerle yaklasık 1400bç büyüklügünde ürün eldeedilmistir. Bu ürün klonlanarak nükleotid dizisi saptanmıs, NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information) veritabanında MAPKK oldugugösterilmistir. Klonlanan cDNA OoMAPKK-1 olarak isimlendirilmistir. Geninamino asit dizisi belirlenerek MAPKK enzim ailesine özgü motifler ortayaçıkartılmıstır. Yapılan RT-PZR analizleriyle OoMAPKK1 gen ekspresyonununyaprak ve gövde dokularında var oldugu, kök de dört ayrı deneme yapılmasınaragmen var olmadıgı, ayrıca soguk ve yaralanma stres sartlarında arttıgıgörülmüstür. Rekombinant OoMAPKK1-MBP füzyon proteini üretmek amacıylastart ve stop kodonları içeren spesifik primerler tasarlanarak yapılan PZR sonucuelde edilen 1059 bç (353 A.A.)'lik ürün, pMAL-p2x ekspresyon plazmitineaktarılarak E.coli'de üretilme deneyi yapılmıstır.Anahtar Kelimeler: Origanum onites, MAPKK, RT-PZR, RACE Teknikleri,Gen Klonlama, Rekombinant Protein Üretimi

Abstract:
Origanum onites is the most commercially cultivated plant species inTurkey. The essential oils extracted from O.onites are used in drug and cosmeticindustry as well as other industrial areas. The leaves of O.onites are also used asspice. It is known that the amount of essential oils extracted from Origanumdiffers between different geographic regions, climates and year. The MAPK(mitogen activated protein kinase) enzyme family is a signal transduction pathwaycomposed of triple kinases modules namely MAPKKK-MAPKK-MAPK and playroles in production of cellular response to environmental factors in plants. Theaim of this thesis was to clone and characterize one member of MAPKK enzymefamily from O.onites. Mid-region nucleotide sequences of the five differentputative MAPKK cDNAs were cloned by using MAPKKs specific degeneracyprimers. Among them Oo17-MAPKK was chosen and its 5?, 3? ends wereproduced by using RACE technique. The sequence data of 5?, 3? ends was used todesign specific primers to obtain whole cDNA sequence. PCR reactions withthese primers gave an expected ~1400 bp product. The nucleotide sequence of theproduct was determined and confirmed as MAPKK in NCBI (National Center forBiotechnology Information) database and it was named as OoMAPKK1.OoMAPKK1 amino acid sequence was determined by bioinformatic analysis andMAPKK spesific conserved domains were shown. Expression of OoMAPKK1was shown to be present in leaf and stem but absent in root based on the fourassays, and to be induced under cold and wounding stress. Specific primerscontaining start and stop codons of OoMAPKK1 gene were designed and by usingthese primers a 1059 bp (353 aa.) PCR product was obtained. This PCR productwas transferred to a pMAL-p2x expression plasmit and an experiment to express arecombinant OoMAPKK1-MBP fusion protein was done in E. coli.Keywords: Origanum onites, MAPKK, RT-PCR, RACE Techniques, GeneCloning, Recombinant Protein Synthesis