Oksidaz enzimleri ve substratları için nanosensör geliştirilmesi
Development of nanosensor for oxidase enzymes and their substrates
Yazar: ASLI NESLİHAN AVAN
Danışman: PROF. DR. SEMA DEMİRCİ ÇEKİÇ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Enzim katalizli reaksiyonlar genellikle ılımlı çevre koşulları gerektirir ve pratik uygulamalarda serbest enzimler kolaylıkla inaktive olmaktadırlar. Ayrıca bunların tekrar kullanımı zordur. Nanopartiküller üzerine immobilize edilen enzimler genellikle doğal enzimlere göre daha geniş çalışma pH'ı, daha fazla termal stabilite ve artan yeniden kullanılabilirlik gibi avantajlara sahiptir. Manyetik nanopartiküller (MNP'ler), enerji ve zaman harcayan santrifüj adımları gerektirmeden harici bir manyetik alanın uygulanmasıyla reaksiyon ortamından kolaylıkla ayrılarak enzimlerin tekrar kullanımlarına büyük ölçüde olanak sağladıkları için, destek materyali olarak kullanılmaktadır. Tez çalışmasında oksidaz enzimlerinden olan ürikaz (UOx), glukoz oksidaz (GOx) ve kolin oksidaz (ChOx)'ın fonksiyonalize Fe3O4 manyetik nanopartikül üzerine immobilizasyonu sağlanarak ürik asit (UA), glukoz ve kolin tayini için kolorimetrik sensörler geliştirilmiştir. Birlikte çöktürme yöntemiyle hazırlanan MNPlerin yüzeyi tetraetil ortosilikatın kullanıldığı Stöber metoduyla silanol gruplarıyla kaplanmıştır. Daha sonra –NH2 fonksiyonalize MNP elde etmek için (3-Aminopropil)trietoksisilan ile muamele edilen MNPler glutaraldehit ile aktive edilip enzimlerin immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. 
UA, insanda pürin metabolizmasının nihai ürünüdür. Anormal ürik asit seviyesi çeşitli hastalıklara neden olabildiğinden kanda veya idrarda ürik asidi izlemek hastalığın takibi ve teşhisi açısından çok önemlidir. UA, önemli bir antioksidan olmasına rağmen, nörodejeneratif hastalıklar varlığında oluşan kandaki yüksek UA seviyeleri gerçek antioksidan kapasiteyi yansıtmamaktadır. Geliştirilen yöntemle hem UA tayini yapılmış hem de UA içermeyen gerçek antioksidan kapasite hesaplanabilmiştir. Bunun için, UA içeren örnek çözeltisine doğrudan CUPRAC yöntemi uygulanmıştır. Daha sonra aynı miktardaki örnek immobilize UOx ile inkübe edilip mıknatıs yardımıyla immobilize UOx uzaklaştırıldıktan sonra CUPRAC yöntemi uygulanmıştır. İki örnek arasındaki CUPRAC absorbans farkından UA miktarı belirlenmiştir. Geliştirilen yöntemle çeşitli fenolik ve tiyol grubu içeren antioksidanlar yanında UA tayini %0,18 ila %4,87 hata ile gerçekleştirilmiştir. UA için dedeksiyon limiti 0,34 μM, linner aralık 5,43 – 65,22 μM olarak bulunmuştur. Yöntem ayrıca fetal bovine serum (FBS) örneğinde UA tayini ve UA içermeyen antioksidan kapasitenin belirlenmesi için uygulanmıştır. Yöntemin doğruluğu HPLC yöntemiyle karşılaştırılmıştır. Standart katkı sonucu geliştirilen yöntemle % geri kazanım değerleri %98,07 ve %98,43 olarak bulunmuştur.
Tez çalışmasının ikinci kısmında, hazırlanan fonksiyonalize MNP'ler üzerine GOx immobilize edilerek glukoz tayini gerçekleştirilmiştir. Glukozun GOx katalizli reaksiyonu sonucu glukonik asit ve H2O2 meydana gelmektedir. Glukoz, CUPRAC reaktif bir bileşik değildir. Ancak, yöntemde enzimatik reaksiyon sonucu glukoz konsantrasyonuna eşdeğer miktarda oluşan H2O2'nin CUPRAC reaktif olmasından yararlanılmıştır. Geliştirilen yöntem ile lineer aralık 11,1 μM ila 111,1 μM, dedeksiyon limiti ise 0,59 μM olarak bulunmuştur. İmmobilize enzim ve serbest enzimin kinetiğini karşılaştırmak için enzimatik reaksiyon sonucu oluşan H2O2'in oluşum hızı takip edilmiştir. İmmobilize ve serbest enzim için KM değerleri hesaplanmış ve her iki enzim için de aynı bulunduğundan immobilizasyon sonucu substrata ilgisinde bir düşüş görülmemiştir. Hızında ise immobilizasyon sonrası %43'lük bir azalma görülmüştür. Geliştirilen yöntem ile FBS'de glukoz tayini gerçekleştirilmiş ve 141,0 ± 4,2 mg/dL olarak bulunmuştur. Sonucun firma tarafından belirtilen değer (139 mg/dL) ile uyumlu olduğu görülmüştür. FBS'ye standart katkı yapılmış ve geri kazanım değerleri %101 olarak bulunmuştur.
Kolin, fosfolipidlerin önemli bir bileşenidir, nörotransmiter asetilkolinin sentezi için gerekli olan bir amino alkoldür. Kolin eksikliği karaciğer fonksiyon bozukluğuna neden olabilir ayrıca kanser, Parkinson ve Alzheimer gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Pek çok gıda kolin ve kolin esterleri içerir. Özellikle bebek mamaları olmak üzere çeşitli gıdaların işlenmesi sırasında ilave edilir.  Bu nedenle kolin tespiti ve tayini, gıda ve klinik analizler için önemlidir. Tezin üçüncü kısmında fonksiyonalize MNP üzerine ChOx enzimi immobilize edilerek kolin tayini gerçekleştirilmiştir. Yöntemde kolinden ChOx enzimi katalizliğinde betain ve H2O2 oluşmasından yararlanılmıştır. Kolin'e eşdeğer miktarda oluşan H2O2 CUPRAC yöntemiyle tayin edilmiştir. Kolin için lineer aralık 2,78 – 44,4 μM, LOD değeri 0,20 μM olarak bulunmuştur. Geliştirilen yöntem bebek mamasında kolin tayininde kullanılmış ve elde edilen sonuçlar (16,1 ± 0,5 mg/100 mL) firmanın belirttiği kolin miktarı ile (15 mg/ 100 mL) uyumlu bulunmuştur.

Abstract:
Enzyme catalyzed reactions usually require mild environmental conditions and free enzymes are easily inactivated in practical applications. Also, reusing free enzymes are difficult. Enzymes immobilized on nanoparticles generally have advantages such as a wide range of working pH, higher thermal stability and increased reusability than natural enzymes. Magnetic nanoparticles (MNPs) are used as support materials since they allow the enzymes to be reused by easily separating (MNPs) from the reaction medium by applying an external magnetic field without requiring energy and time-consuming centrifugation steps. In this thesis, uricase (UOx) glucose oxidase (GOx) and choline oxidase (ChOx) which are the oxidase enzymes, have been immobilized on functionalised Fe3O4 magnetic nanoparticle and colorimetric sensors have been developed for the determination of uric acid (UA), glucose and choline. The surface of the MNPs prepared by co-precipitation method which was covered with silanol groups with the Stöber method using tetraethyl orthosilicate. MNPs treated with (3-Aminopropyl) triethoxysilane to obtain –NH2 functionalized MNPs, then they were activated with glutaraldehyde, and the enzymes were immobilized on them. 
UA is the end product of purine metabolism in humans. Since abnormal uric acid level can cause various diseases, monitoring uric acid in blood or urine is very important for the follow-up and the diagnosis of certain diseases. Although UA is an important antioxidant, high UA levels in the blood, which occur in the presence of neurodegenerative diseases, do not reflect the true antioxidant capacity. With the developed method, both UA determination was made and the real antioxidant capacity without UA could be calculated. For this purpose, CUPRAC method was applied directly to the sample solution containing UA. After that the same amount of the sample was incubated with immobilized UOx and the CUPRAC method was applied after the immobilized UOx was removed by using a magnet. The amount of UA was determined from the difference in CUPRAC absorbance in both samples. In the developed method, UA was determined with an error of 0.18% to 4.87% in the presense of various antioxidants containing phenolic and thiol groups. The detection limit for UA was found to be 0.34 μM, and the liner range was 5.43 – 65.22 μM. The method was also applied for the determination of UA and also to determine antioxidant capacity without UA in fetal bovine serum (FBS) sample. The accuracy of the developed method was compared with the HPLC method. In the developed method from the result of the standard additive, the % recovery values were found to be 98.07% and 98.43%. 
In the second part of this thesis, glucose determination was performed by immobilizing GOx on the prepared functionalized MNPs. Gluconic acid and H2O2 are formed as a result of the GOx catalyzed reaction of glucose. Glucose is not a CUPRAC reactive compound. However, H2O2, which is formed in an amount equivalent to the glucose concentration as a result of the enzymatic reaction, is CUPRAC reactive.  The linear range was found to be 11.1 μM to 111.1 μM, and the detection limit was 0.59 μM. The rate of formation of H2O2 that was formed as a result of the enzymatic reaction was followed in order to compare the kinetics of the immobilized and the free enzyme. KM values were calculated and found to be the same for both enzymes as there was no decrease in affinity for the substrate as a result of immobilization. On the other hand, there was a 43% decrease in velocity after immobilization. With the developed method, glucose determination in FBS was performed and it was found to be 141.0 ± 4.2 mg/dL. It has been observed that the result is compatible with the value (139 mg/dL) specified by the company. Glucose standard was added to FBS and the obtained recovery values were found to be 101%. 
Choline is an essential component of phospholipids, which is an amino alcohol that is necessary for the synthesis of the neurotransmitter acetylcholine. Choline deficiency can cause liver dysfunction and has been associated with various diseases such as cancer, Parkinson's and Alzheimer's. Many foods contain choline and choline esters. It is added during the processing of various foods, especially infant formulas. Therefore, the detection and determination of choline is important for food and clinical analysis. In the third part of the thesis, ChOx enzyme was immobilized on the functionalized MNP and choline determination was performed. In this method, betaine and H2O2 formation from choline catalyzed by using ChOx enzyme. H2O2, which was formed in an amount equivalent to choline, was determined by CUPRAC method. The linear range for choline was 2.78 – 44.4 μM, and the LOD value was found to be 0.20 μM. The developed method was used for the determination of choline in infant formula and the results obtained (16.1 ± 0.5 mg/100 mL) were found to be compatible with the choline amount declarated by the company (15 mg/ 100 mL).