İmplant kaynaklı enfeksiyon etkeni olan staphylococcus epidermidis'e özgü aptamer geliştirilmesi ve aptamerin biyofilm oluşumuna etkisinin in vitro koşullarda incelenmesi
Development of specific aptamer for staphylococcus epidermidis which causes implant related infections and in vitro investigation of aptamer's effect on biofilm formation
Yazar: EMİNE ALTUN
Danışman: PROF. DR. HÜLYA YAVUZ ERSAN ; DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Çeşitli hastalıklar ile birlikte kazalar sonucunda hasar alan ya da kaybedilen doku veya organların yerini alan biyomalzemelerle ilgili klinikte karşılaşılan en büyük sorunlardan biri enfeksiyon oluşumudur. Enfeksiyon oluşumuna biyofilm oluşturarak sebep olan etkenlerin başında Staphylococcus epidermidis gelmekte olup, bu bakteri normal deri florasının bir elemanı olmasına rağmen implantasyon sırasında vücut içerisine girerek patojen konuma geçmektedir. Biyofilm oluşumu sonrasında rutin antibiyotik tedavileri yeterli olmamakla birlikte, birçok dezavantajı da bulunmaktadır. Bu nedenle antibiyotiklere alternatif olabilecek veya destekleyici yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. 

Tez çalışması kapsamında implant kaynaklı osteomyelit oluşumuna neden olan S. epidermidis bakterisinin biyofilm ilişkili Aap (birikimle ilişkili protein) proteininin ait iki farklı bölgesine karşı SELEX (üstel zenginleştirme ile ligandların sistematik evrimi) yöntemi ile aptamer seçilimi yapılmış ve biyofilm oluşumu üzerine etkileri hem kitosan ile kaplama yapılan hem de yapılmayan titanyum yüzeylerinde incelenmiştir. İlk aşamada A1.0, B1.0 ve B1.5 olmak üzere Aap proteininin farklı alt-kısımlarının kombinasyonları yapılarak rekombinant üretimi sağlanmıştır. A1.0 ve B1.0 adlı parçaları daha yüksek oranda ve miktarda saflaştırıldığı için, bu parçaların afinite immobilizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir.  Sonraki aşamada SELEX yönteminde kullanılacak olan aptamer kütüphanesi ve primerleri tasarlanarak sentezlettirilmiştir. Primerler ile aptamer kütüphanesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılması ve uygunluğunun belirlenmesi için optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Sekiz SELEX döngüsü sonrasında elde edilen aptamer havuzunun klonlanarak dizi analizi yapılmış ve seçilen aday aptamerlerin ayrılma sabitleri ELONA (Enzime Bağlı Oligonükleotid Analizi) yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. En son aşamada ise titanyum yüzeylerinin kitosan ile kaplanmasında farklı molekül ağırlığı ve derişimi kullanılmış olup, yüzeylerin karakterizasyonu SEM, EDX ve ATR-FTIR analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Seçilen aday aptamerlerin kitosan ile kaplama yapılan ve yapılmayan titanyum yüzeyler üzerindeki etkisi hem kristal viyole kullanılarak yapılan mikroplak testi hem de SEM analiz sonuçları ile tespit edilmiştir. Seçilen 6 aday aptamer içerisinde en yüksek bağlanma afinitesine (10,2 nM) sahip olan ve biyofilm oluşumu üzerinde en etkili olan aptamerin AC31 kodlu aptamer olduğu belirlenmiştir. AC31 aptameri varlığında, kaplama yapılmayan titanyum yüzeyler üzerinde biyofilm oluşumunu engelleme oranının en az 4-kat olduğu, kitosan ile kaplama yapılan titanyum yüzeylerde ise en az 2-kat olduğu belirlenmiştir. 

Sonuç olarak, S. epidermidis bakterisinin biyofilm ilişkili Aap proteinine ait iki farklı bölgesine karşı SELEX yöntemi ile aptamer seçilimi ilk kez bu çalışma kapsamında gerçekleştirilmiştir. AC31 aptamerinin, titanyum yüzeyler üzerinde S. epidermidis'in yapışma mekanizması üzerinde etkisini göstererek biyofilm oluşumuna engel olduğu gösterilmiş ve yapılacak in vivo çalışmaların ardından terapötik ajan olarak kullanımının önü açılmıştır.

Abstract:
One of the biggest problems encountered in the clinic regarding biomaterials that replace tissues or organs damaged or lost because of accidents along with various diseases is the occurrence of infection. Staphylococcus epidermidis is the leading cause of infection by forming a biofilm, and although this bacterium is an element of the normal skin flora, it enters the body during implantation and becomes a pathogen. While routine antibiotic treatments are not sufficient after biofilm formation, they also have many disadvantages. Therefore, alternative or supplemental methods to antibiotics are needed.

Within the scope of the thesis, aptamer selection was made against two different domains of the biofilm-associated Aap (accumulation associated protein) protein of S. epidermidis bacteria, which causes the formation of implant-associated osteomyelitis, with the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) method and its effects on biofilm formation were investigated on both chitosan-coated and uncoated titanium surfaces. In the first stage, recombinant production was provided by making different combinations of Aap protein domains, A1.0, B1.0 and B1.5. Since the A1.0 and B1.0 domains were purified at a higher rate and amount, the immobilization process was carried out with these domains. In the next step, the aptamer library and primers to be used in the SELEX method were designed and synthesized. Polymerase chain reaction (PCR) optimization studies were carried out to amplify the primers and the aptamer library, and to determine their suitability. Sequence analysis was performed following cloning the aptamer pool obtained after 8 cycles of SELEX, and the dissociation constants of the selected candidate aptamers were determined using the ELONA (enzyme-linked oligonucleotide assay) method. In the last step, different molecular weights and concentrations were used in the coating of titanium surfaces with chitosan, and SEM, EDX and ATR-FTIR analyzes were used in the characterization of the surfaces. The effect of selected candidate aptamers on chitosan coated and uncoated titanium surfaces was determined by both microplate test using crystal violet and SEM analysis results. Among the 6 selected candidate aptamers, the aptamer with the highest binding affinity (10.2 nM) and the most effective on biofilm formation was determined to be the aptamer coded as AC31. In the presence of the AC31 aptamer, it was determined that the rate of preventing biofilm formation on uncoated titanium surfaces was at least 4-fold, and at least 2-fold on titanium surfaces coated with chitosan.

As a result, aptamer selection by SELEX method against two different domains of the biofilm-induced Aap protein of S. epidermidis bacteria was performed for the first time within the scope of this study. AC31 aptamer has been shown to prevent biofilm formation by showing its effect on the adhesion mechanism of S. epidermidis on titanium surfaces, and paved the way for its use as a therapeutic agent following in vivo studies.