Tüberkülozlu hastalarda yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) yöntemi ile plazma melatonin düzeylerinin ölçülmesi
Plasma melatonin level detection with a high performance liquid chromatography (HPLC) method in tuberculosis patients
Yazar: ESİN ÖZKAN
Danışman: PROF. DR. NEVİN İLHAN
Fırat Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Son yıllarda yaygınlığı artmakta olan tüberküloz büyük bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Tanı ve tedavisinde önemli mesafeler alınmış olsa da, immuno-endokrin mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır. Melatoninin immunmodülatör etkileri yaklaşık 30 yıldır bilinmekle birlikte tüberkülozdaki etkisi ortaya konulmamıştır. Bu çalışmada, tüberküloz ile melatonin arasındaki ilişkiyi ortaya koymak ve plazma melatonin düzeylerini yeni bir HPLC metodu ile ölçmek amaçlanmıştır.Çalışmaya ARB (+), kültür (+) olan ilk kez tüberküloz tanısı almış 31 hasta ile enfeksiyonu ve sistemik hastalığı olmayan 31 sağlıklı kişi kontrol olarak dahil edilmiştir. Çalışmaya katılanların hepsi erkek ve yaş ortalamaları hasta grubunda 22,9±3,8 ve kontrol grubunda 23,6±3,4 yıl idi.Numunelerden melatonin ekstraksiyonu için Waters Oasis HLB SPE kolonları kullanıldı. Plazma melatonin düzeyleri, floresans dedektörlü AGILENT 1100 ile 75 mM sodyum asetat/asetonitril (72/28, v/v) (pH: 5) mobil fazı kullanılarak, eksitasyon ve emisyon dalga boyları 275 ve 345 nm'de ölçüldü. 40 ? L'lik enjeksiyon ile 10 dk'lık bir çalışma süresinde analiz yapıldı. Çalışma sonuçları eksternal standarda göre hesaplandı. Saptanabilir en düşük konsantrasyon 0,25 pg/mL olup çalışma 1000 pg/mL'ye kadar lineerdi. Gün içi ve günler arası tekrarlanabilirlikleri sırasıyla % 4.02 ve 5.41 olarak bulundu. İdrar melatonin sülfat düzeyleri ise ELISA metodu ile ölçüldü.Plazma melatonin düzeyleri (pg/mL) hasta grubunda 33,17 (7,52-163,41) iken, kontrol grubunda 45,20 (19,27-288,99) tespit edildi (p=0,037). İdrar melatonin sülfat seviyeleri ( ? g/24 saat) ise hasta grubunda 6,5 (0,2-34,.8) iken, kontrol grubunda 21,7 (3,9-99,8) olarak bulundu (p<0,001).Bu sonuçlar tüberküloz ile düşük melatonin seviyesi arasında ilişki olduğunu göstermektedir. Ancak bu konuda yapılacak yeni çalışmalar ile melatoninin etki mekanizması, enfeksiyondan koruyuculuğu ve tedavideki etkinliğinin ortaya konulması, tüberküloz tedavisinde yeni ufuklar açılmasını sağlayacaktır.

Abstract:
Tuberculosis continues to constitute an important health problem in recent years along with the increase in its spread. Though important improvements were gained in diagnosis and treatment, immuno-endocrine mechanism could not have been enlightened yet. Immunomodulator effect of melatonin is known for nearly 30 years, still, its possible effects on TB was not introduced. This study aims to expose the relationship between TB and melatonin, along with development of HPLC method for melatonin in human plasma.31 patients diagnosed for the first time for TB, and positive for both ARB and culture; and 31 healthy controls with no systemic disease were involved in the study. All participants were males, and mean ages were 22,9 ± 3,8 years in patients group and 23,6 ± 3,4 in control.For SPE method, a Waters Oasis HLB extraction column was used in a fluorescent detector equipped Agilent 1100 HPLC system with isocratic 75 mM sodium acetate/acetonitrile (72/28, v/v) (pH: 5) mobile phase setup. Melatonin displays excitation and emission spectra with wavelength maxima at 275 nm and 345 nm, repectively. 40 ? L injection volume was followed by 10 min run. Limit of detection (LOD), with external standard calibration method, was 0,25 pg/mL within a linearity up to 1000 pg/mL. Inter and intraassay coefficients of variation (CV) were 4,02% and 5,41%, respectively. Urine melatonin sulphate levels were analyzed with a commercial kit using ELISA method.Mean plasma melatonin levels (pg/mL) in patient group were detected as 33,17 (7,52-163,41), and 45,20 (19,27-288,99) in control (p=0,037). Mean urine melatonin sulphate levels ( ? g/24 h) were 6,5 (0,2-34,8) in patient groups, and 21,7 (3,9-99,8) in control (p<0,001).These results suggest a relation between TB and low level melatonin in serum. Anyway, further studies may elucidate melatonin?s mechanism for effect, protection against infection and its activity in treatment, laying new frontiers in treatment of TB.