Nitrik oksit sentaz enziminin sığır böbrek ve trombositlerinden saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı ilaçların enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification and characterization of nitric oxide synthase from bovine kidney and platelets and investigation of some drugs on the enzyme activities
Yazar: MEHMET MUSTAFA İŞGÖR
Danışman: PROF. DR. ŞÜKRÜ BEYDEMİR ; DOÇ. DR. DENİZ EKİNCİ
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method ; Karakterizasyon = Characterization

Özet:
Çalışma kapsamında sığır böbrek dokusu ve trombositlerinden nitrik oksit sentaz (NOS) enzimi, 2'5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi kullanılarak sırasıyla; %3,58 verimle 1217 kat ve %7,21 verimle 919 kat saflaştırıldı. Böbrek NOS enzimi için alt birim ve aktif form molekül kütleleri 104,9 kDa, 215 kDa ve trombosit NOS enzimi için 85,9 kDa, 165,4 kDa olarak hesaplandı. Saflaştırılan böbrek NOS enzimi için optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık ve stabil pH değerleri sırasıyla; 7,0, 50 mM (KH2PO4 tampon çözeltisi), 10°C ve 5,5-6,5 aralığı olarak belirlendi. Trombosit NOS enzimi için ise aynı değerler sırasıyla; 7,5, 50 mM, 40°C ve 6,5-7,0 aralığı olarak bulundu. Saflaştırılan NOS enzimlerinin NADPH ve sitokrom-c için Km ve Vmax değerleri hesaplandı. Saflaştırılan her iki NOS enzim aktivitesinin NADPH ve Ca+2 iyonuna ihtiyaç duydukları görüldü. İn vitro inhibisyon etkileri incelenen antibiyotiklerden Enrofloksasin, Kanamisin, Kloramfenikol, Gentamisin, Vankomisin, Sefazolin, Streptomisin ve Ampisilin ilaçlarının böbrek NOS enzimini ve Oksitetrasiklin, Ornidazol, Amikasin ve Linkomisin ilaçlarının ise trombosit NOS enzimini inhibe ettiği gözlemlendi.Anahtar Kelimeler: Nitrik oksit sentaz, karakterizasyon, sığır böbrek ve trombosit, antibiyotik, inhibisyon

Abstract:
In this study, nitric oxide synthase (NOS) enzymes were purified by using 2'5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography from bovine kidney tissue and platelets with 3,58% yield, 1217-fold and 7,21% yield, 919-fold respectively. Subunit and the active form molecular masses of kidney NOS enzyme were calculated as 104,9 kDa, 215 kDa and they were 85,9 kDa, 165,4 kDa for platelet NOS enzyme. Optimum pH, optimum ionic strength, optimum temperature and stable pH values for purified kidney NOS enzyme were determined as 7,0, 50 mM (KH2PO4 buffer solution), 10°C and a range of 5,5-6,5 respectively. For platelet NOS enzyme, these values were 7,5, 50 mM, 40°C and a range of 6,5-7,0 respectively. Km ve Vmax values of purified NOS enzymes for NADPH and cytochrome-c were calculated. It was found that NADPH and Ca2+ ion were needed in both purified NOS enzyme activities. It was observed that Enrofloxacin, Kanamycin, Chloramphenicol, Gentamicin, Vancomycin, Cefazolin, Streptomycin and Ampicillin inhibited renal NOS enzyme activity and Oxytetracycline, Ornidazole, Amikacin and Lincomycin inhibited platelet NOS activity in vitro.Key Words: Nitric oxide synthase, characterization, bovine kidney and platelets, antibiotics, inhibition