Kırka bor madeninden izole edilen Bacillus aquimaris'e benzer bir izolatın bor'a bağlı proteomik analizi
Proteomic analysis of highly boron tolerant bacterium isolated from Kirka boron mine and is similar to Bacillus aquimaris
Yazar: BİLGE UÇAR
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bor, birçok sektör açısından ve biyolojik olarak önemli bir yarı metaldir. Ülkemiz Bor mineralleri bakımından oldukça zengindir. Yapılan çalışmalar doğrultusunda, Bor canlılar tarafından, belirli miktarlarda kullanılmaktadır. Ancak canlı sistemde Bor'un detaylı biyolojik fonksiyonları yeterince belirlenememiştir. Bu tez çalışmasında, Eskişehir-Kırka Bor Madeninden, daha önce yapılan çalışmalarda izole edilmiş olan ekstremofil bir bakteri izolatı, model organizma olarak kullanılmıştır. Bu izolat farklı Bor konsantrasyonlarına maruz bırakılmış ve Bor stresi sonucu ekspresyon seviyesi değişen bazı proteinler, 2D jel elektroforezi ve kütle spektrofotometresi ile analiz edilerek belirlenmiştir.
Kullanılan bakteri izolatı 16SrRNA gen analizine göre Bacillus aquimaris'e %98 oranında benzerlik göstermektedir ve triptik soy broth besi yerinde 300 mM borik asite direnç göstermektedir. Bor stresine cevap olarak, daha fazla ifade edilen proteinlerin belirlenmesi için, bor içermeyen (0 mM), 100 mM ve 200 mM borik asit içeren ortamlarda yetiştirilen bakterilerden sitoplazmik proteinler ekstrakte edilmiştir. 2D jel elektroforez sonunda boyanıp analiz edilen jellerde, regülasyon farklılığı gösteren spotlar kesilerek, tripsinizasyon işlemine tabi tutulmuştur. Peptidler ABI SCIEX 5800 MALDI-TOF-TOF kütle spektrofotometresi ile analiz edilmiştir. Mascot programı kullanılarak aday proteinler tanımlanmıştır. Bu çalışmada 20 adet protein spotı MALDI-TOF-TOF ile analiz edilmiştir. Yirmi protein spotından altısının, Mascot sonuçları ve skorlarına göre güvenilir olduğu değerlendirilmiştir. Skorları yüksek olan aday proteinler, Elongasyon Faktörü Tu (TufA), Elongasyon Faktörü G (FusA), DNA tarafından yönlendirilen RNA polimeraz altbirim beta (RpoB), pütativ metiltiyotransferaz (YqeV) inozin 5'monofosfat dehidrogenaz (GuaB) ve Lizil tRNA sentazdır (LysS). Bu proteinlerin Bor'lu ortamda, inozin 5' monofosfat hariç, ifadelerinin arttığı (up-regülasyon) gözlenmiştir. Tanımlanan proteinlerden Elongasyon Faktörü Tu, lizil tRNA sentetaz ve Elongasyon Faktörü G protein sentezinde görevli olan proteinlerdendir ve diğer proteinlerin Bor ile olası ilişkileri mevcut literatür bilgisi ışında yorumlanmıştır. 
Ayrıca, proteomik ile elde edilen verilerin onaylanması için, bazı genler seçilerek, Real Time PCR yöntemi ile gen ekspresyon seviyeleri analiz edilmiş ve benzer ifade farklılıkları görülmüştür

Abstract:
Boron is an important semi-metal in many sectors and also biologically important. Our country is very wealthy in terms of boron minerals. Boron is used in certain amounts by the living organisms shown by earlier studies in the literature. However, the detailed biological functions of Boron for life remain relatively unclear. In this thesis study, an extremophile bacterium isolated from Kırka Boron mine during the previous studies of our laboratory was used as a model organism. This isolate was treated with varying concentrations of boron and the protein spots that were differentially regulated in response to boron stress were analyzed and determined using 2D gel electrophoresis and Mass spectrometry. 
The isolate is highly similar to Bacillus aquimaris based on 16SrRNA gene sequence homology (98%) and can tolerate to 300 mM boric acid in tryptic soy broth medium. In order to find the proteins that are up-regulated in response to boron stress, the cytoplasmic proteins were extracted from the cells grown with no boric acid (0 mM), 100 mM and 200 mM boric acid. Following 2D gel electrophoresis and staining, the protein spots that were differentially regulated were determined and excised from the gels and subject to digestion with trypsin. The peptides were then analyzed with ABI SCIEX 5800 MALDI-TOF-TOF Mass Spectrometry. Candidate proteins were identified using the Mascot program. In this study, 20 different protein spots were analyzed and six of them were found to be valid based on the Mascot results and corresponding scores. The protein identification results with high scores are Elongation factor Tu (TufA), Elongation factor G (FusA), DNA directed RNA polymerase subunit beta (RpoB), putative methyltransferase (YqeV) inosine 5' monophosphate dehydrogenase IMPDH (GuaB) and lysyl tRNA synthetase (LysS). All of the proteins with the exception of IMPDH were found to be up-regulated in the presence of increasing levels of boron. Among the identified proteins, TufA, FusA and lysyl tRNA synthetase are known to be involved in protein synthesis. The potential relationship of the other proteins to boron stress was also discussed in the light of current literature. 
Furthermore, in order to validate the proteomics results, gene expression analyzes for tufA, fusA and rpoB were conducted using Real Time PCR with appropriate primers and similar regulation patterns were observed.