Non-alkolik steatohepatit'li ratlarda metformin, rosiglitazon, N-asetilsistein ve etodolakın tedavi edici etkilerinin değerlendirilmesi
Evaluation biochemical therapeutic effect of metformin, roziglitazon, N-Acetyl cysteine and etodalac in a model of nonalcoholic steatohepatitis in the rat
Yazar: SEDAT YILMAZ
Danışman: PROF. DR. NAİME CANORUÇ
Dicle Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Biyokimya ve Klinik Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Etodolak = Etodolac ; Hipoglisemik ajanlar = Hypoglycemic agents ; Karaciğer fonksiyon testleri = Liver function tests ; Karaciğer hastalıkları = Liver diseases ; Karaciğer yağlanması = Fatty liver ; Metformin = Metformin ; N-asetilsistein = N-acetylcysteine ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Non alcoholic fatty liver disease (NAFLD),son yıllarda, en sık görülen karaciğer hastalığı olması nedeniyle büyük önem kazanmıştır. Batı ülkelerinde, otopsi serilerindeki görülme sıklığı %70'e varmaktadır. (1) Non alcoholic fatty liver disease (NAFLD) başlığı altında basit bir karaciğer yağlanmasından, steatohepatit, fibröz ve sonunda karaciğer sirozuna kadar ilerleyebilen geniş bir hastalık grubu incelenmektedir. Son yıllarda, NAFLD ve onun daha ciddi formu olan non-alkolik steatohepatit'in(NASH) obezite, insulin rezistansı ve dislipidemilerle olan yakın ilişkisi, hastalığın mekanizması ve tedavisini aydınlatmaya yönelik en önemli araştırma odağı olmuştur. (1) Bugün için ideal tedavisi olmayan Non-alkolik steatohepatit'de(NASH) en sık kullanılan tavsiye kilo verme ve eksersizle sınırlı kalmakta, ilaçların olumlu etkilerine ait veriler yeterli kanıta dayanmamakta ve farmakolojik tedavilere yönelik çalışmalar devam etmektedir.(1)Karaciğer yağlanması hastalığı karaciğer hücrelerinde büyük trigliserit vakuollerinin geri dönüşebilir şekilde birikmesidir ki buna tıp dilinde hepatosteatosis denir. Non-alkolik steatohepatit (NASH) macroveziküler steatozis,hepatosit nekrozu, inflamasyon, mallory cismi ve fibrozisle karakterize bir karaciğer hastalığıdır. Karaciğerde oluşan inflamasyon ve hücre nekrozu stellat hücreleri uyararak fibrosiz gelişmesine neden olur. Non-alkolik steatohepatit (NASH) hastalarının %20 `sinde zamanla siroz gelişebilir.(2) Basit steatozun benign klinik gidişi olmasına karşılık, non-alkolik steatohepatit daha çok ilerleyici fibrozis ve siroz riski ile spesifik tanısal özellikleri olan bir alt gruptur. Çift vurus teorisi basit steatozdan non-alkolikSteatohepatit, fibrozis ve siroza ilerleyişi en iyi tanımlar. Bu çift vuruşlar insülin direnci nedeniyle karaciğerde aşırı yağ birikmesi ve reaktif oksijen türleri nedeniyle oksidatif stresin birleşiminden oluşur.(2)Obezite, insüline rezistans tip 2 DM gibi predispozan faktörler non-alkolik steatohepatit (NASH) patogenezi ile ilgili olmalarına rağmen ilerleyici fibrozis ve kronik karaciğer hastalığının kesin mekanizması hala bilinmemektedir.(3)Bundan dolayı biz Non-alkolik steatohepatitli (NASH) ratlarda metformin, rosiglitazon, N-asetilsistein ve etodolakın tedavi edici etkilerini ve oluşturduğu biyokimyasal değişiklikleri değerlendirmeyi amaçladık.Araştırmamıza Dicle Üniversitesi Sağlık Bilimleri Uygulama ve Araştırma Merkezinden (DUSAM) temin edilen, vücut ağırlıkları 300 ±50 gram olan 48 adet Sprague-Dawley cinsi erkek rat çalışmaya dahil edildi. Sıçanlar, standart kafeslerde barındırılıp, yem ve su alımı serbest bırakıldı. Hayvanların bulunduğu oda 22 ± 2 C°'de, 12 saat karanlık-12 saat ışık ortamında tutuldu. Sprague-Dawley cinsi erkek ratlar rastgele 6 gruba ayrıldı.1.Grup:(Kontrol grubu) Deneyin başından sonuna kadar standart bazal diyetle beslendi. (n=12) 2.Grup:(Yüksek yağlı diyet grubu) Deneyin başından sonuna kadar yüksek yağlı diyetle beslendi. (n=12) 3.Grup: (Metformin grubu) Deneyin ilk onaltı haftası yüksek yağlı diyetle beslendiler.Takip eden 4 haftada metformin ile tedavi edildiler. (n=6) Metformin 250 mg/kg/gün dozda gastrik sondayla verildi.4.Grup:(Rosiglitazon grubu) Deneyin ilk onaltı haftası yüksek yağlı diyetle beslendiler.Takip eden 4 haftada rosiglitazon ile tedavi edildiler. (n=6) Rosiglitazon 4 mg/kg/gün dozda gastrik sondayla verildi. 5.Grup: (N-asetilsistein grubu). Deneyin ilk onaltı haftası yüksek yağlı diyetle beslendiler. Takip eden 4 haftada N-asetilsistein ile tedavi edildiler. (n=6) N-asetilsistein 100 mg/kg/gün dozda intraperitoneal (ip) olarak verildi.6.Grup: (Etodolak grubu) Deneyin ilk onaltı haftası yüksek yağlı diyetle beslendiler.Takip eden 4 haftada etodolak ile tedavi edildiler. (n=6)Etodolak 10 mg/kg/gün dozda gastrik sondayla verildi. Standart diyet Elazığ Yem Sanayii A.Ş'den (Elazığ, Türkiye) temin edildi. Diyet içeriğinde,% 15 protein, % 2,5 yağ, % 15 selüloz, % 14 kil, % 13 su bulunuyordu Yüksek yağlı diyet hazırlanması:100 gram standart diyete 25 gram hayvansal bir yağ türü olan tereyağı eklenerek oluşturuldu. Böylece toplam enerjinin % 65'i yağdan kaynaklanan bir diyet sağlandı (4). Uygun oranda tereyağı eritilerek standart pelletlere eklendi. Karıştırıcı yardımıyla iyice karıştırılarak pelletlerin yağı çekmesi sağlandı. Pelletler oldukça kuru olduğundan yağı kolayca çektiği gözlendi. Sonrasında bu haliyle soğumaya bırakıldı. Yüksek yağlı diyet her gün taze olarak hazırlandı. Deney başlangıcından sonuna kadar sıçanların yağlı diyete uyum sağladığı gözlendi. Onaltı hafta sonunda standart diyetle beslenen kontrol grubundan altı rat ve yüksek yağlı diyetle beslenen gruptan altı rat75 mg/ kg ketamin HCl ve 15 mg/kg ksilazin intramuskuler verilerek anestezi edilip kardiak ponsiyonla kan örnekleri ve insizyonla karaciğer dokuları toplanan fareler sakrifiye oldular..Kan örneklerinde ALT,AST, değerleri ölçülerek ve karaciğer dokularını ışık mikroskobunda histopatolojik olarak değerlendirilerek Yüksek yağlı diyet grubunda karaciğer yağlanması oluştuğu anlaşıldığında ilaç tedavisine başlandık. Dört haftalık ilaç tedavisi sonunda bütün deney grupları 75 mg/ kg ketamin HCl ve 15 mg/kg ksilazin intramuskuler verilerek anestezi edilip kardiak ponsiyonla kan örnekleri ve insizyonla karaciğer dokuları toplanan fareler sakrifiye oldular.Kan örnekleri 4 °C `3500 devirde 5 dakika santrifuj ettikten sonra serumları analiz yapılıncaya kadar -80°C `de saklandı.Ratların karaciğerleri çıkarıldıktan sonra işaretli saklama poşetlerine konularak - 80°C'de analiz yapılıncaya kadar saklandı.Dicle Üniversitesi merkez Laboratuarında Abbott firmasının Architect c16000 cihazında spektrofotometrik metotla ALT,AST,TG,TK,HDL-C, LDL-C analizlerini yapıldı.. Karaciğer dokusu MDA analizi Ohkawa ve arkadaşlarının metoduyla Shimadzu UV-160 A spektrofotometre cihazında yapıldı. Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji Anabilim dalında bütün grupların karaciğer dokuları Hematoksilen-Eozin ve Masson Trikromla da boyanarak ışık mikroskobunda histopatolojik olarak değerlendirildi. Aynı dokulardan İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsünde (DETAE) Western blot analizi ile COX-2, PPAR-?, PPAR-?, reseptör ekspresyonları ölçüldü. Çalışmamız yüksek yağlı diyet ile karaciğer yağlanmasının oluşabileceğini, NASH tedavisinde metformin ve roziglitazonun en iyi farmakolojik ajanlar olduklarını gözlemledik. Yine N-asetilsisteinin de NASH tedavisinde etkili bir ilaç olduğunu gözlemledik. NASH tedavisinde ilk defa araştırdığımız etodolak karaciğer enzimlerinden ALT değerlerini istatistiksel olarak anlamlı derecede düzelme sağladığını ancak AST değerlerinde bir değişiklik yapmadığını gözlemledik.Etodolak yüksek dansiteli lipoprotein (HDL-C) değerlerini istatistiksel olarak anlamlı derecede düzeltiğini, ancak trigliserit, kolesterol ve düşük dansiteli lipoprotein (LDL-C) değerlerinde herhangi bir iyileştirme yapmadığını gözlemledik. Etodolak; TNF-? değerlerinde tüm gruplar içinde kontrol grubuna en yakın düzeltmeyi sağladı ancak MDA değerlerinde ise azaltmakla beraber kısmi düzelme sağladığını gözlemledik. Etodolak'ın PPAR-? reseptör ekspresyonunu artırarak kısmi düzelme ,PPAR- ? reseptör ekspresyonunu azaltarak çok az düzelme, COX-2 reseptör ekspresyonunu azaltarak tam bir düzelme sağladığını, ancak karaciğer histolojisinde steatozis ve fibrozisi önlemediği gözlemledik.Anahtar kelimeler:NAFLD, Metformin,Roziglitazon,N-Asetil sistein,Etodolak

Abstract:
Non alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) has recently gained increasing importance as the most common of all liver disorders.In Western countries it is recognized in up to 70% of autopsy series. (1) Non alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) comprises a spectrum of chronic liver diseases,starting from a simple fatty liver which may progress to steatohepatitis,fibrosis and ultimately expand to liver cirrhosis.The link between obesity,insulin rezistance and Non alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and its more severe form called.Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) remain as the major focus of investigation to enlighten the pathogenesis and the tretment of the disease . (1) Until other evidence based pharmocological therapies gain wide acceptance,diet and exercise remain the mainstay of therapeutic approach to Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) . (1) Liver disease , is a reversible condition where large vacuoles of triglyceride fat accumulate in liver cells via the process of hepatosteatosis. Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is a liver disease characterized by macrovesicular steatosis, hepatocyte necrosis, inflammation, Mallory bodies, and fibrosis. (2) Whereas simple steatosis has a benign clinical course, non-alcoholic steatohepatitis is a subgroup with specific diagnostic features and a greater risk of progressive fibrosis, cirrhosis and end-stage liver disease. The two-hit theory best describes the progression from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis, fibrosis and cirrhosis. These two hits consist of the accumulation of excessive hepatic fat due to insulin resistance and oxidative stress attributed to reactive oxygen species. (2)Although several predisposing factors, such as obesity, insulin resistance and type 2 diabetes, are related to the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis, the exact mechanism of its progression to fibrosis and chronic liver disease is still unclear.(3) Male Sprague-Dawley rats weighing 300 ±50 gram from the Experimental Laboratory Animal Center,Dicle University, Diyarbakır were used.They were kept at a controlled temperature of 25 ± 1C° under Standard conditions (12 h dark: 12 h light cycle), fed with regular dry rat chow ad libitum, and had freely access to drinking water. Sprague-Dawley rats randomly divided into six groups (n=7 animals for each group) as following:Group 1: The control group (n=12) were fed with standard basal rat chow, until the end of the beginning of the studyGroup 2: High fat diet group (n=12)were fed with high fat diet until the end of the beginning of the study .Group 3: Metformin group (n=6) were fed with high fat diet the first four weeks. After sixteen weeks the animals treated by gavage with metformin (250 mg/kg/daily) end of the study.Group 4: Rosiglitazone group (n=6) were fed with high fat diet the first four weeks. After sixteen weeks the animals treated by gavage with rosiglitazon( 4 mg/kg/daily) end of the study. Group 5: N-acetylcysteine group (n=6) were fed with high fat diet the first four weeks. After sixteen weeks the animals treated by intraperitoneally with N-acetylcysteine (100 mg/kg/daily) end of the study. Group 6: Etodolac group (n=6) were fed with high fat diet the first four weeks. After sixteen weeks the animals treated by gavage with intraperitoneally etodolac (10 mg/kg/daily) end of the study.Standard diet was purchased from Elazığ Yem Sanayii A.Ş. (Elazığ, Türkiye) Non-alkolik steatohepatit (NASH) was brought with high fat diet (100 gram standart diet, 25 gram bütirik acid ) (4). These rats both a rat fed with standard diet and a rat fed with high fat diet examinated liver Histopathology end sixteen weeks,At the end of study, the rats were anaesthetized by ketamine (75 mg/kg) and xylazin HCl (15 mg/kg), the chest was opened and blood samples collected by cardiac puncture. Blood samples were centrifuged for 10 minutes at 1500 x g at 4 °C and the plasma was stored at ?80 °C until the analysis time.Liver cell death and inflammatory responses lead to the activation of stellat cellswhich play a pivotal role in hepatic fibrosis. Over time up to 20 percent of patients with NASH may develop cirrhosis .The livers were excised weighed and immediately frozen in liquid nitrogen , stored at ?80 °C .Serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), triglycerides (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein (HDL) and low-density lipoprotein (LDL) levels were determined by use of Abbott Architec 16000 autoanalyser in Dicle University medical school center laboratory. MDA levels were measured with spectrofotometer(Shimadzu UV-160 A) according to the method of Ohkawa et al.The results were expressed as nmol/mg protein in tissue samples.Liver tissues of all group rats were histologically determined by using Masson?s trichrome and Hematoksilen-Eozin by light microscop in department of histology, Dicle University.COX-2, PPAR-? and PPAR-? receptors expression were detected by Western blotting in Department of Experimental Medicine Research İnstitute, İstanbul University. We obseved the study with high-fat diet may occur fatty liver and metformin and roziglitazonun are the best pharmacological agent for NASH treatment.We obseved N-acetylcysteine is a drug effective in the treatment of NASH. we investigated etodolac first the treatment of NASH. Etodolac were corrected values of statistically significant. Only ALT values did not improved. Etodolac were corrected high-density lipoprotein (HDL-C) values of statistically significant. Only triglycerides, cholesterol and low density lipoprotein (LDL-C) values did not improved.Etodolac; TNF-? levels in all groups with the control group was closest to fix only the MDA level was partial recovery.High fat diet induced a significant decrease of PPAR-? in liver lysates and only etodalac treatment partial prevented the high fat diet-induced PPAR-? degradation. On the contrary, PPAR-? expression was upregulated in liver from high fat diet fed animals, and etodalac treatment very little prevented its increase. High fat diet induced a significant increase receptör ekspretion of COX-2 and only etodalac treatment total prevented the high fat diet-induced induced a significant increase receptör ekspretion of COX-2.But etodolac in liver histology did not prevent steatosis and fibrosis.Key words: NAFLD, Metformin,Roziglitazone,N-acetylcysteine,Etodolac