Memeli hücre kültüründe ATP uygulaması ile oluşan kuantal kalsiyum salınımında SERCA'nın rolü
The investigation of the role of SERCA in ATP-induced Quantal calcium release in mammalian culture cells
Yazar: FİGEN AMBER
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET UĞUR
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2004
Konu: Biyofizik = Biophysics

Özet:
Memeli Hücre Kültüründe ATP Uygulaması ile Oluşan Kuantal Kalsiyum Salınımında SERCA'nın Rolünün Araştırılması Dinlenim durumunda sitoplazmadaki Ca2' konsantrasyonunu (|Ca"'],). hücre membranımda ve endoplasmik retikulumda (ER) bulunan Ca2+ pompaları düşük seviyelerde tutar. Ancak, agonist uyarımı ile açılan inositol 1,4,5-trilbsfat (IPî) kapılı Ca2" kanallarından sitoplazmaya salınan Ca"" kendi salınımını indükler (Calcium-induced calcium release) ve sitoplazmadaki [Ca2t]'nun birkaç misli artmasına neden olur. Bu artış, agonist uyarımı devam ederken dahi bir müddet sonra durur ve sitoplazmadaki Ca' konsantrasyonu dinlenim durumuna yakın bir değere döner. "Kuantal" ya da '"kademeli" kalsiyum salınımı olarak adlandırılan bu olguyu açıklamak için çeşitli hipotezler öne sürülmüştür. Bu çalışmamızın amacı agonist uyarımı sonucunda oluşan "kuantal" ya da "kademeli" kalsiyum salınımının oluşmasında ve Ca2*'un sitoplazmadan uzaklaştırılmasında Ca ATPazların rolünü incelemektir. LTK-8 ve RAT 1 kültür hücreleri, Fura-2 asetoksimetil ester (fura-2 AM) ile yüklenip [Ca2*]ı,'nu bir mikrospektroflorimetre ve bir CCD1 kamera ile ölçüldü. Deneyler sırasında agonist (ATP ve Fenilefrin) uyarıları ile oluşan Ca"" yanıtları F340/38O sinyal oranı olarak bilgisayara aktarıldı. LTK-8 hücrelerinde. ATP uyarısı ile kuantal kalsiyum salınımı gerçekleştirdiğini gördük Bu hücrelerde, submaksimal doz agonist yanıtının ardından verilen SERCA blokörü CPA, ani ve geçici bir Ca" yanıtı oluşturdu. CPA ve La'* kullanılarak SERCA ve PMCA ayrı ayrı bloke edildiği zaman hem RAT-1 hem de LTK-8 hücrelerinde Ca ~ yanıtlarındaki azalmanın hızına belirgin bir etki gözlemedik. Ancak iki blokörün birlikte verilmesi belirgin bir etki yaratabildi. Yaptığımız gözlemler hem SERCA'nın hem de PMCA'nın Ca+ salınınım dereceli özellik göstermesinde rolleri olduğunu ve dereceli şahmında Ca çıkışının azalmasında daha çok bunun rolü olduğunu ve bu iki Ca~+ pompasının ortaklaşa bir ilişki içinde çalıştıklarını düşündürmektedir. Elde ettiğimiz bir önemli bulgu da La un IP3 kenetli Ca4" yanıtlarını bloke etmesidir. Bu beklenmedik etkinin nedenlerinin araştırılması için daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır.Anahtar Sözcükler: Kuantal kalsiyum salınımı. İP,, SERCA. PMCA

Abstract:
The Investigation of the Role of SERCA in ATP-Induced Quantal Calcium Release In Mammalian Culture Cells In the steady state conditions, leakage and plasma membrane and endoplasmic reticulum Ca ' pumps hold cytoplasmic Ca~' concentration at low levels. However, after the agonist stimulation, released Ca2+ via IPrgated Ca24 release channels induce its own release which causes a few fold increase in the cytoplasmic [Ca *]. Despite the continuation of agonist stimulation, this increase stops after a while and cytoplasmic calcium concentration returns to its basal levels. To explain this phenomenon, which is called as "Quantal" or "Graded Calcium Release", some hypothesis have been proposed. The purpose of this study is to investigate the role of of Ca"+ ATPases in the quantal calcium release seen after agonist stimulation and also in the Ca2 ' removal from the cytoplasm. LTK-8 and RATI culture cells were loaded with Fura-2 acetoxymethyl ester (fura-2 AM) and Ca2+ responses to the agonist stimulation (ATP and phenylephrine) were measured by a microfluorimetric system and a CCDI camera and transferred to the computer programme as F340/380 signal ratio. LTK-8 cells, showed quantal calcium release. We have observed a sudden but transient release due to SERCA blockage by CPA when applied after the submaximal dose ATP (10~6 M) response. Blokage of PMCA by La or SERCA by CPA itself did not effect the decrease rate of cytoplasmic [Ca2+]. Only simultaneous application of both blockers had an effect on this decrase rate. Our results indicate that SERCA and PMCA may have a prominent role in quantal calcium release and that these two Ca"+ pumps may be functioning in close cooperation with each other. Another interesting finding in this study is the unexpected inhibitory effect of La3+ on agonist induced Ca" responses. Further experiments are needed to clarify the mechanism of this effect. Key Words: Quantal calcium release, IP,, SERCA, PMCA,