Granüler kornea distrofisi tip 1 hastalarının periferal kan mononükleer hücrelerinde TGFBI genindeki R555W mutasyonunun CRISPR/Cas9 teknolojisi ile düzenlenmesi
Editing of the R555W mutation in TGFBI gene in peripheral blood mononuclear cells of granular corneal dystrophy type 1 patıents using CRISPR/Cas9 technology
Yazar: BURAK DAĞDELEN
Danışman: PROF. DR. HİLAL ARIKOĞLU
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Transforme edici büyüme faktörü beta ile indüklenen gen (TGFBI) 683 aminoasit rezidüsünden oluşan bir hücre dışı matriks elemanı olan transforme edici büyüme faktörü beta ile indüklenen proteini (TGFBIp) kodlamaktadır. TGFBIp, farklı tip kolajen ve integrinlerle birlikte korneanın yapısal bütünlüğü ve şeffaflığının korunmasında görev almaktadır. TGFBI genindeki mutasyonlar, yüzeysel korneada bulanık agregatlar birikmesi sonucu görme bozukluğu oluşan bir dizi kornea distrofisi ile ilişkilendirilmiştir. Patogenezi tam olarak bilinmeyen kornea distrofilerinde, TGFBI genindeki mutasyonların protein salgılanmasını veya katlanmasını bozabileceği ve korneada artan stabiliteye sahip mutant TGFBIp agregatlarının birikimi ile sonuçlanabileceği düşünülmektedir. TGFBI geninde bugüne kadar 70'den fazla farklı mutasyon tanımlanmıştır. Bu mutasyonlardan R555W sıcak nokta mutasyonu granüler kornea distrofisi (GCD) tip 1 ile ilişkilendirilmiştir. Kornea distrofilerinin tedavisinde uygulanan mevcut yaklaşımlar agregatların oluşmasını yavaşlatmak, durdurmak ya da yok olmasını sağlamak bakımından yetersiz kalmaktadır. Bu yüzden kalıcı çözümlerin arandığı genetik temelli araştırmalar gün geçtikçe önem kazanmaktadır. Çalışmamızda GCD Tip 1 tanısı almış ve R555W mutasyonuna sahip olduğu PCR-dizi analizi ile belirlenmiş hasta bireylerden elde edilen periferal kan mononükleer hücreler (PBMC)'de, CRISPR/Cas9 genom düzenleme tekniği ile R555W mutasyonun düzenlenmesi amaçlandı. Bu amaçla, TGFBI geni R555W mutasyonun düzenlenmesine yönelik üç farklı rehber RNA (sgRNA) ve üç farklı tek zincirli oligonükleotid (ssODN) donör dizileri https://www.benchling.com/ adresi üzerinden ulaşılabilen online uygulaması kullanılarak tasarlandı ve ticari olarak temin edildi. Çalışmamızda CRISPR/Cas9 bileşenleri, pX459V2.0-eSpCas9(1.1) ve pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA plazmid vektörleri ile oluşturuldu. sgRNA oligolarının plazmid vektörlerine ligasyonu AT klonlama metodu ile gerçekleştirilerek, DH5alpha (E.coli) kimyasal kompotent bakterilerine transforme edildi. Ligasyon işlemleri PCR-dizi analiz yöntemi ile doğrulandı. Dizi analizi sonuçlarına göre, başarılı bir şekilde klonlanan plazmid vektörler ve ssODN'ler, GCD1 hastalarından elde edilen PBMC'lere elektroporasyon yoluyla transfekte edildi. pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA ve ssODN oligolarının transfekte edildiği GFP+ hücreler, GFP+ sinyal vermeyen hücrelerden FACS cihazı ile ayıklandı. GFP+ sinyal veren hücrelerden elde edilen DNA'lar ile R555W mutasyon bölgesini amplifiye edecek primerler kullanılarak erime eğrisi analizi yapıldı. Yapılan kantitatif analizler sonucunda, pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA1 plazmid ve ssODN1 şablonun birlikte transfekte edildiği hücre grubunda %5,64 oranında, pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA2 plazmid ve ssODN2 şablonun birlikte transfekte edildiği hücre grubunda %15,77 oranında, pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA3 plazmid ve ssODN3 şablonun birlikte transfekte edildiği hücre grubunda %20,78 oranında değişim saptandı. Bu tez çalışması, GCD1 hastalarından elde edilen primer hücrelerde R555W mutasyonun CRISPR/Cas9 sistemi ile düzenlenmesini içeren literatürdeki ilk çalışma olup elde edilen sonuçlar ile ileride yapılacak in vitro ve in vivo çalışmalara zemin hazırlanmıştır. Bu zeminden temel alarak yapılacak daha kapsamlı çalışmalar ile kornea distrofilerinin tedavilerinde umut vadeden bir yaklaşım olan CRISPR/Cas9 tabanlı gen tedavi stratejilerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.

Abstract:
The transforming growth factor beta-induced (TGFBI) gene encodes the transforming growth factor beta-induced protein (TGFBIp), which is an extracellular matrix element, consisting of 683 amino acid residues. TGFBIp, together with different types of collagen and integrins, is involved in maintaining the structural integrity and transparency of the cornea. Mutations in the TGFBI gene have been associated with a number of corneal dystrophies in which vision impairment occurs as a result of the accumulation of cloudy aggregates in the superficial cornea. In corneal dystrophies of fully unknown pathogenesis, it is thought that mutations in the TGFBI gene may disrupt protein secretion or folding that may result in the accumulation of mutant TGFBIp aggregates with increased stability in the cornea. To date, more than 70 different mutations have been identified in the TGFBI gene. Among these mutations, the R555W hotspot mutation has been associated with granular corneal dystrophy (GCD) type 1. Current approaches used to treat corneal dystrophies are insufficient to slow down, stop or eliminate the formation of aggregates. Therefore, genetic-based research seeking permanent solutions is gaining importance day by day. In our study, it is aimed to edit R555W mutation by using CRISPR/Cas9 technique in peripheral blood mononuclear cells obtained from patients with GCD Type 1 and having R555W mutation determined by PCR-sequence analysis. For this purpose, three different guide RNA (sgRNA) and three different single-stranded oligonucleotide (ssODN) donor sequences were designed using the online application accessible at https://www.benchling.com/ and commercially obtained for editing R555W mutation in TGFBI gene. In our study, CRISPR/Cas9 components were constructed with the plasmid vectors pX459V2.0-eSpCas9(1.1) and pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA. Ligation of sgRNA oligos to plasmid vectors was performed using the AT cloning method and transformed into DH5alpha (E. coli) chemically competent bacteria. Ligation results were confirmed by PCR-seq analysis method. According to the results of sequence analysis, successfully cloned plasmid vectors and ssODNs were transfected into PBMCs obtained from GCD1 patients by electroporation. GFP+ cells transfected with pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA and ssODN oligos were seperated from GFP+ non-signaling cells by FACS sorting. Melting curve analysis was performed using primers to amplify the R555W mutation site using DNAs obtained from GFP+ signaling cells. As a result of quantitative analyses, ~5.64% change was detected in the cell group co-transfected with pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA1 plasmid and ssODN1 template, ~15.77% change was detected in the cell group co-transfected with pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA2 plasmid and ssODN2 template, and ~20.78% change was detected in the cell group co-transfected with pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA3 plasmid and ssODN3 template. This thesis is the first study in the literature involving the editing of the R555W mutation in primary cells obtained from GCD1 patients with the CRISPR/Cas9 system and the results obtained in the study have prepared a groundwork for future in vitro and in vivo studies. More comprehensive  studies based on this groundwork are needed to develop CRISPR/Cas9 based gene therapy strategies which is a promising approach in the treatment of corneal dystrophies.