Nanofiber-desenli polimerik membranlar: Yüzey kimyası, topografisi ve hücresel etkileşimler
Nanofiber-patterned polymeric membranes: Surface chemistry, topography and cellular interactions
Yazar: MURAT ŞİMŞEK
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Bakteriyel enfeksiyonlar = Bacterial infections ; Desenlendirme = Patterning ; Nanoteknoloji = Nanotechnology ; Polikaprolakton = Polycaprolactone ; Polimerik membranlar = Polymeric membranes ; Titanyum = Titanium ; Topoğrafya = Topography

Özet:
Sunulan tez çalışması iki ana hedef doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. İlk kısımda, elektroeğirme yöntemiyle üretilen farklı fiziksel ve kimyasal yapıya sahip nanofiberlerle farklı kimyasal yapıdaki polimerik membranların desenlenmesi ve elde edilen sonuçların hücre-nanotopografi ilişkisi açısından değerlendirilmesi amaçlanmıştır. İkinci kısımda ise elektroeğirmeyle üretilen nanofiberlerle implant yüzeylerin kaplanması ve kaplanmış yüzeylerin hayvansal hücre/bakteri tutunabilirliğine olan etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır.
Tez çalışmasının ilk kısmı için, çözücü döküm yöntemi ile çapraz bağlı kitosan ve polikaprolakton (PCL) membranlar hazırlanmıştır. Membranların farklı fiziksel yapıdaki PCL ve PCL/kollajen nanofiberlerle desenlenmesi amacıyla elektroeğirme koşulları optimize edilmiştir. Kitosan membranlar 205±65 nm ve 550±190 nm çapa sahip PCL fiberlerle ve 480±20 nm çapa sahip PCL/kollajen fiberlerle gelişigüzel düzende desenlenmiştir. Kitosan membranların hizalanmış düzende fiberlerle desenlemesi 385±62 nm çapındaki PCL ve 276±105 nm çapındaki PCL/kollajen fiberlerle gerçekleştirilmiştir. PCL membranların gelişigüzel ve hizalanmış düzende desenlenmesi ise sırasıyla 211±70 nm ve 228±43 nm çapında PCL fiberlerle sağlanmıştır. 
Desenlenmiş membranlar üzerinde nanotopografi-hücre etkileşimlerinin araştırılmasına yönelik olarak preosteoblast MC3T3-E1 ve MDBK (Madine Darby Bovine Kidney) hücreleri ile durgun ortamda hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Hücre canlılığı ve üremesi MTT  (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür)  analizi ile takip edilmiş ve hücre morfolojileri SEM ve konfokal mikroskobu ile incelenmiştir. Analiz sonuçlarına göre, hücreler hizalanmış düzendeki fiberlerin yöneliminden etkilenerek morfolojilerini değiştirmişlerdir. Hücrelerin hizalanmış düzendeki desenler yönünde yönelerek sitoplazmalarında oldukça uzun ve düzenli organize yapıda aktin demetleri oluşturdukları görülmüştür. Ayrıca çap artışına bağlı olarak hücrelerin morfolojisi gelişigüzel desenlerden de etkilenmiştir. Matrislerde kollajenin varlığı yüzeye yayılan hücre alanında artışa neden olmuştur.
Tezin ikinci kısmı için, titanyum (Ti) implantların elektroeğirme ile üretilmiş polietilen oksit (PEO) nanofiberlerle kaplanmasına yönelik olarak optimizasyon çalışmaları yürütülmüştür. Üretilen fiberler SEM ile analiz edilerek uygun üretim koşulları belirlenmiştir. In-vitro koşullarda fiberlerin çözünmemelerini sağlamak amacıyla çeşitli çapraz bağlanma işlemleri gerçekleştirilmiştir. En uygun çapraz bağlama koşulu şişme deneyleri ve FTIR-ATR analizi ile belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda Ti yüzeyler, %10 PETA (pentaeritritol triakrilat) (w/w) içeren PEO fiberlerle kaplanmıştır. Kaplanmış yüzeyler 37ºC'de 8 günlük kuruma işlemi sonrasında ultraviyole ışık kaynağı ile muamele edilerek fiberlerin çapraz bağlanması sağlanmıştır. Ti yüzeyler olarak pürüzlendirilmiş (Ti-p) ve pürüzlendirilmemiş (Ti-y) implantlar kullanılmıştır. Kaplama öncesi ve sonrası Ti yüzeylerin karakterizasyonu SEM, AFM, pertometre ve su temas açısı ölçümü ile gerçekleştirilmiştir. Analiz sonrası Ti-y yüzeylerdeki fiberlerin çapı 184±48 nm, Ti-p yüzeyindekilerin çapı ise 175±50 nm olarak hesaplanmıştır. Kaplama sonrası yüzeyler daha hidrofilik hale gelmiştir.  Fiberler Ti-p yüzeylere daha kararlı bir şekilde tutunmuşlardır. 
PEO kaplı Ti yüzeylerin hücresel tutunmaya olan etkisinin incelenmesi için MC3T3-E1 hücreleri ve S. epidermidis bakterileri ile durgun ortamda kültür çalışmaları yapılmıştır. Hücre canlılığı ve üremesi MTT ile takip edilmiş, hücre/bakteri tutunabilirliği SEM ile incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar neticesinde, PEO fiber kaplı Ti yüzeylerde yapışma önemli ölçüde azalmışken, kaplanmamış yüzeylerin hücre/bakteri üremesini desteklediği belirlenmiştir.
Tüm bu sonuçlar ışığında, elektroeğirme yönteminin polimerik biyomalzemelerde nanotopografik desen oluşturulması ve metal implant kaynaklı enfeksiyon riskinin minimize edilmesi için ''etkin bir kaplama yöntemi'' olarak kullanılabileceği yorumu yapılmıştır.

Abstract:
In the presented study, two main aims were purposed. The first aim was to pattern polymeric membranes which have different chemistry by chemically and physically different nanofibers produced via electrospining technique and to investigate cellular behaviour on patterned membranes for cell-nanotopography interactions. The second aim was to investigate animal cell/bacterial attachment on implant surfaces coated by electrospun nanofibers. 
For the first part, chitosan and polycaprolactone (PCL) membranes were prepared by solvent casting method. Electrospinning conditions were optimized for patterning of membranes by PCL and PCL/collagen nanofibers in different physically form. Chitosan membranes were patterned by random PCL fibers with diameters of 205±65 nm or 550±190 nm and random PCL/collagen fibers with diameter of 480±20 nm. They were also patterned by aligned PCL and PCL/collagen fibers with diameter of 385±62 and 276±105 nm, respectively. Patterning of PCL membranes was realised by random and aligned PCL fibers with diameters of 211±70 nm and 228±43 nm, respectively.
Cell-culture studies were performed under static conditions by using preosteoblastic MC3T3-E1 and epithelial MDBK (Madine Darby Bovine Kidney) cell lines to investigate nanotopography-cell interactions on patterned surfaces. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT assay and morphological examination was done with SEM and confocal microscope. Results showed both cells were affected significantly by aligned fiber orientation. The fibers of the actin filament tend to align along the fiber direction forming long and highly organized actin bundles in the cytoplasm. Randomly oriented patterns also affected the cell morphology owing to an increase in fiber diameter. In the presence of PCL/collagen patterns, the spreading area of cells was increased.
In the second part, polyethlene oxide (PEO) nanofibers were prepared by electrospinning for coating titanium (Ti) implants with nanofibers. Characterization of fibers was done by SEM. Crosslinking procedures were carried out to obtain insoluble PEO fibers under in-vitro conditions. Optimum crosslinking condition were determined by swelling experiments and ATR-FTIR analysis. As a result, Ti surfaces were coated by fibers including 10% (w/w) crosslinker PETA (pentaerythritol triacrylate). After drying for 8 days in 37ºC, coated surfaces were placed under UV light to crosslink fibers. Roughned (Ti-p) and smooth (Ti-y) Ti surfaces were used for coating. 
Characterization of Ti surfaces before/after coating was done by SEM, atomic force microscopy, perthometer and water contact angle measurements. Hydrophilicity of both surfaces was improved after coating.  SEM results revealed that fiber diameters on coated Ti-y and Ti-p were 184±48 nm and 175±50 nm, respectively. Fibers on Ti-p exibited more stable attachment than the ones on Ti-y. 
To investigate the effect of PEO coated surfaces on adhesion of MC3T3-E1 cells and S. epidermidis bacteria, cell-culture studies were performed under static conditions.  Cell viability and proliferation were analyzed by MTT assay and examination of attachment of the cells/bacteria was done by SEM.  In conclusion, coated surfaces inhibited cellular attachment significantly, whereas proliferation of cells/bacteria was supported by uncoated surfaces. 
In conclusion, electrospinning technique can be used as ''an effective coating method'' for creating patterns on polymeric biomaterials and minimizing infection risk of metalic implant.