Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) chitwood, 1949'nın avirülent ve Mi-1 virülent popülasyonları arasındaki DNA dizilim farklılıklarının yeni nesil dizileme yöntemiyle belirlenmesi
Determination of differences of DNA sequencing between avirulent and Mi-1 virulent populations of Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) chitwood, 1949 by next generation sequencing methods
Yazar: İBRAHİM MISTANOĞLU
Danışman: PROF. DR. ZÜBEYİR DEVRAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Domates = Tomato ; Meloidogyne incognita = Meloidogyne incognita

Özet:
Domates, yetiştiriciliği yapılan en önemli sebzelerdendir. Kök-ur nematodları domates bitkilerine saldırarak verim kaybına neden olurlar. Meloidogyne spp.'ye dayanıklı domates bitkileri, kök-ur nematodlarının mücadelesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Domatesdeki Mi-1 geni, Meloidogyne incognita, M. arenaria, M. javanica ve M. luci'ye dayanıklılık sağlamaktadır. Fakat, virülent kök-ur nematod popülasyonları Mi-1 genini aşabilmektedir. Mi-1 virülent kök-ur nematodları domates yetiştirilen alanlarda büyük bir sorundur ve giderek yaygınlaşmaktadır. Bu nedenle, kök-ur nematodlarıyla bulaşık alanlarda virülent popülasyonların hızlı ve doğru bir şekilde tanımlanması gerekir. Laboratuvarda virülent nematod popülasyonlarını tanımlamak için yapılan geleneksel testler 3-6 ay kadar sürebilmektedir. Böylece bu testler çok zaman alır ve yoğun emek gerektirir. Buna karşın virülenslikle ilgili moleküler markörler analiz süresini kısaltabilmektedir. Bu nedenle, kök-ur nematodlarının mücadelesi için virülenslikle ilgili moleküler markörlerin geliştirilmesi gereklidir.
Bu çalışmada, üç avirülent M. incognita ve üç Mi-1 virülent M. incognita popülasyonunun genom analizleri HiSeq X10 Illumina cihazında 150 bp çift yönlü okuma teknikleri kullanılarak yapılmıştır. Biyoinformatik analizler için ham verilerden adaptör dizilimleri ile kısa ve düşük kaliteli okumalar çıkarılmıştır. Daha sonra biyoinformatik analizler için beş yaklaşım kullanılmıştır. İlk olarak, sekanslar M. incognita referans genomuna (GCA_900182535.1) eşleştirilmiş ve SNP'ler ile INDEL'ler tanımlanmıştır. Sadece Mi-1 virülent izolatlarında toplam 17512 polimorfizm tespit edilmiştir. İkinci olarak, tüm izolatlarda ortak bulunan 229696 polimorfizm verilerden çıkarılmıştır. Üçüncü olarak kalan farklılıklar okuma derinliklerine (DP≥20) göre filtrelenmiş ve Mi-1 virülensliği ile ilgili olabilecek 12122 farklılık tanımlanmıştır. İzolatlarda tespit edilen bu farklılıkların 207 genle ilişkili olabileceği gösterilmiştir. Dördüncü olarak, N1 izolatında "de novo" analizi yapılmıştır. Bu izolat referans genom olarak seçilmiş ve Mi-1 virülent ile avirülent izolatlar arasındaki polimorfizmler araştırılmıştır. Bu son yaklaşımda elde edilen sonuçlar, M. incognita referans genomu kullanılarak elde edilen verilere göre ilave bir bilgi sağlamadığı görülmüştür. Beşinci yaklaşım olarak, avirülent ve virülent izolatlardan elde edilen DNA dizileri, farklı biyoinformatik araçlar kullanılarak analiz edilmiş ve virüleslikle ilişkili olabilecek 161 adet SNP belirlenmiştir.
Bu çalışma, Türkiye'de yeni nesil sekanslama kullanılarak virülent ve avirülent kök-ur nematodlarını tanımlayan ilk çalışmadır. Tanımlanan SNP'ler ve INDEL'ler gelecekteki çalışmalarda virülensliğe bağlı moleküler markörlerin geliştirilmesi için kullanılabilecektir.

Abstract:
Tomato is one of the most important vegetables cultivated. Root-knot nematodes (RKNs) attack tomato plants and cause yield losses. The tomato plants which are resistant to Meloidogyne spp. are commonly used for controlling root-knot nematodes in the tomato growing areas. The Mi-1 gene in tomato controls resistance to Meloidogyne incognita, M. arenaria, M. javanica and M. luci. However, virulent root-knot nematode populations can overcome the Mi-1 gene. Mi-1 virulent RKNs are a major problem in tomato growing areas and are becoming increasingly common. Therefore, rapid and accurate identification of virulent RKN populations is needed in fields infested with RKNs. Traditional tests to identify virulent nematode populations in laboratory take up to 3-6 months. Therefore, it takes time and requires much labor. Whereas molecular markers linked virulence, it will be able to shorten the analysis time. For this reason, the development of molecular markers linked virulence is necessary for management of RKNs.
In this study, the whole genome analyses of three avirulent M. incognita and three Mi-1 virulent M. incognita populations from Turkey were sequenced using Illumina HiSeq X10 150 bp paired-end sequencing techniques. The adapter sequences and the short and low quality readings were removed from raw data for bioinformatical analysis. Five approaches were then used in bioinformatics analysis. First, the sequences were mapped to M. incognita reference genome (GCA_900182535.1) and SNPs or INDELs were identified. A total of 17512 polimorphisms were detected only in Mi-1 virulent isolates. Second, common 229696 variants identified in all isolates were removed from data. Third, the remaining differences were then filtered according to the reading depths (DP≥20). As a result, 12122 variants that could be related to Mi-1 virulence were identified in the virulent populations. Results also showed that these differences obtained from isolates can correlate with 207 genes. Fourth, "de novo" analyse was performed on N1 isolate. This isolate was chosen as the reference genome and variants were investigated. Results showed that this last approach did not provide additional information according to data obtained using M. incognita reference genome. The fifth approach, DNA sequencings from avirulent and virulent isolates were analysed using different bioinformatic tools and 161 SNP that will be associated with virulence were identified.
This is the first study to identify virulent and avirulent RKNs using next generation sequencing in Turkey. The identified SNPs and INDELs can be used for development of molecular markers linked virulence in the future studies.