L-glutaminaz üreticisi bakterilerin topraktan taranması, izolasyonu, identifikasyonu ve L-teaninin enzimatik üretiminin geliştirilmesi
Screening, isolation and identification of L-glutaminase producing bacteria from soil and development of enzymatic production of L-theanine
Yazar: ESRA AYGÜN
Danışman: PROF. DR. MELDA ŞİŞECİOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Amaç: L-theanine (teanin), çaydaki umami tadını sağlayan ve birçok farmakolojik etkiye sahip olan bir aminoasittir. Enzimatik sentez yöntemi, L-teanin üretiminde yüksek verim, yüksek saflık ve düşük enerji tüketimi gibi avantajlar sunar ve endüstriyel üretim için uygundur. Ancak, L-teanin biyosentezi için gerekli enzimlerin mikrobiyal kaynakları sınırlıdır, bu yüzden daha fazla mikrobiyal kaynağın taranması ve enzimatik özelliklerinin incelenmesi gerekmektedir. Bu tez çalışmasında amaç, yüksek verimli L-teanin üretimi için literatürde belirtilen bakteri türleri dışında yeni bir bakteriyel tür veya suş taranması, bu izolatlardan L-glutaminaz enzimi üretimi ve bu enzim kullanılarak yüksek verimli L-teanin üretiminin sağlanmasıdır.
Yöntem: İlk olarak, Türkiyenin farklı bölgelerinden temin edilen topraklardan L-glutaminaz ve L-teanin üretim potansiyeline sahip bakteri izolasyonu gerçekleştirildi. İzole edilen suşlar kullanılarak L-glutaminaz enzimi üretildi. Enzim aktivitesini artırmak amacıyla, enzim üretim ortam koşulları istatistiksel optimizasyon programı (Plackett-Burman) kullanılarak optimize edildi. Daha sonra seçilen bakteri ve uygun besiyerinde üretilen L-glutaminaz kültür üst sıvısı kullanılarak L-teaninin enzimatik sentezi gerçekleştirildi. Son olarak L-teaninin biyotransformasyon veriminin artırılması amacıyla üretim koşulları, Yanıt Yüzeyi Metodolojisi (RSM) kullanılarak optimize edildi ve sonuçlar LC-MC analiziyle kantitatif olarak belirlendi.
Bulgular: Temin edilen toprak numunelerinden toplamda 132 adet bakteri izole edildi. Bu izolatlar bir dizi taramaya tabi tutuldu ve sonrasında en yüksek aktivitede L-glutaminaz ve en yüksek konsantrasyonda L-teanin üreten bakteriler seçilerek bu sayı 4'e düşürüldü. Daha sonra yapılan konvensiyonel ve moleküler analizler sonucunda seçilen bu 4 izolat (E-5: Lysinibacillus parviboronicapiens (Genbank No:PP819541), E-11: Aeromonas media (Genbank No:PP819513), E-12: Bacillus arachidis (Genbank No:PP819540), ve E-9: Pseudomonas iridis (Genbank No:PP828586),  ) tür düzeyinde tanılandı. Yapılan taramalar sonucunda en yüksek verimde üretimi sağlayan E-9 kodlu bakteri seçilerek çalışmaya bu suşla devam edildi. Enzim üretim verimini arttırmak amacıyla besi yeri optimizasyonu yapıldı. Plackett-Burman tasarımında elde edilen verilere göre glutaminaz aktivitesi en iyi ortam şartları (İnkübasyon süresi: 40 saat, pH  7,0, sıcaklık 30°C, C kayanağı glukoz ( 2 g/L),  N kaynağı amonyum sülfat (1 g/L), çalkalama hızı 130 rpm/dak) belirlendi. Belirlenen en iyi koşullarda üretilen enzim kullanılarak L-teaninin enzimatik sentezi gerçekleştirildi ve üretim parametreleri optimize edilerek (1:5 molar oran L-glutamin(donör):etilamin(aseptör, pH 11, sıcaklık 40 ºC, enzim miktarı 3mL) LC-MC analiziyle %76,204 verimle (0,025g/L) L-teanin üretimi sağlandığı kaydedildi.
Sonuç: Bu tez kapsamında; mikrobiyal L-glutaminaz enzim üretimi ve L-teanin biyosentezi için en uygun bakteriyal suş araştırılmış ve daha önce literatürde bu amaçla kullanılmamış olan Pseudomonas iridis E-9 suşu izole edilerek L-glutaminaz ve L-teanin üretimi sağlanmıştır. Üretilen L-teaninin mikrobiyal kayanağının yeni olması ve üretim miktarının yüksek olması çalışmada geliştirilmiş olan bu ürünün patentlenme potansiyeli olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Purpose: L-theanine is an amino acid that provides the umami flavor in tea and has many pharmacological effects. The enzymatic synthesis method offers advantages such as high yield, high purity and low energy consumption in the production of L-theanine and is suitable for industrial production. However, microbial sources of enzymes required for L-theanine biosynthesis are limited, so more microbial sources need to be screened and their enzymatic properties need to be studied. The aim of this thesis is to screen a new bacterial species or strain other than the bacterial species mentioned in the literature for high efficient L-theanine production, to produce L-glutaminase enzyme from these isolates and to ensure high efficient L-theanine production using this enzyme.
Method: Firstly, bacteria with L-glutaminase and L-theanine production potential were isolated from soils obtained from different regions of Turkey. L-glutaminase enzyme was produced using the isolated strains. In order to increase enzyme activity, enzyme production environmental conditions were optimized using statistical optimization program (Plackett-Burman). Then, enzymatic synthesis of L-theanine was performed using the selected bacteria and L-glutaminase culture supernatant produced in the appropriate medium. Finally, the production conditions were optimized using Response Surface Methodology (RSM) to increase the biotransformation efficiency of L-theanine and the results were quantitatively determined by LC-MC analysis.
Findings: A total of 132 bacteria were isolated from the soil samples. These isolates were subjected to a series of screenings and then the number was reduced to 4 by selecting the bacteria producing L-glutaminase with the highest activity and L-theanine with the highest concentration. These 4 isolates (E-55: Lysinibacillus parviboronicapiens (Genbank No: PP819541), E-11: Aeromonas media (Genbank No: PP819513), E-12: Bacillus arachidis (Genbank No: PP819540), and E-9: Pseudomonas iridis (Genbank No: PP828586)) were then identified to species level by conventional and molecular analysis. As a result of the screening, the E9 coded bacterium, which provided the highest production efficiency, was selected and the study was continued with this strain. Media optimization was performed to increase enzyme production efficiency. According to the data obtained in Plackett-Burman design, glutaminase activity was optimized with the best medium conditions (Incubation time: 40 h, pH 7.0, temperature 30°C, C source glucose (2 g/L), N source ammonium sulfate (1 g/L), shaking speed 130 rpm/min) were determined. Enzymatic synthesis of L-theanine was carried out using the enzyme produced under the best conditions determined and the production parameters were optimized (1:5 molar ratio L-glutamine (donor):ethylamine (acceptor, pH 11, temperature 40 ºC, enzyme amount 3mL) and LC-MC analysis showed that L-theanine production was achieved with 76.204% yield (0.025g/L).
Results: In this thesis, the most suitable bacterial strain for microbial L-glutaminase enzyme production and L-theanine biosynthesis was investigated and Pseudomonas iridis E9 strain, which has not been used for this purpose in the literature before, was isolated and L-glutaminase and L-theanine production was achieved. The fact that the microbial source of L-theanine produced is new and the production amount is high shows that this product developed in this study has the potential to be patented.