Probiyotik mikroorganizmaların püskürterek dondurma ve kurutma teknikleriyle mikroenkapsüle edilerek probiyotik kek üretiminde kullanım imkanlarının araştırılması
Microencapsulation of probiotic microorganism by spray chilling and drying techniques and using possibilities in probitic cake production
Yazar: SULTAN ARSLAN TONTUL
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA ERBAŞ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Günümüzde probiyotik gıda geliştirme çalışmalarında probiyotik mikroorganizmalar, çoğunlukla gıdalara pişirme sonrası işlemlerle ilave edilmektedir. Ancak ısıl stabilizasyonu yüksek matriks içerisinde tutuklanan probiyotik mikrokapsüller her türlü prosesle her türlü gıdaya uygulanabilme imkânı sağlamaktadır. Probiyotik mikroorganizmaları içeren fırıncılık ürünlerinin arttırılması ancak yeni ve sıcaklık toleransı yüksek probiyotik mikrokapsüllerin üretimi ile gerçekleştirilebilecektir. Bu nedenlerle probiyotik mikroorganizmaların; ürünlerin işleme proseslerinden, depolama süreçlerinden ve sindirim sisteminin ekstrem şartlarından etkilenme oranını azaltacak püskürterek kurutma ve dondurma gibi farklı mikroenkapsülasyon tekniklerine ihtiyaç duyulmaktadır. 

Bu çalışmada püskürterek kurutma ve dondurma yöntemleri ve bunların kombinasyonları kullanılarak probiyotik mikroorganizmaların (Saccharomyces boulardii, Lactobacillus acidophilus LA-5 ve Bifidobacterium bifidum BB-12) tek ve çift katlı olarak mikroenkapsüle edilmesi ve elde edilen bu mikrokapsüllerin sade, çikolata kreması dolgulu, marmelat dolgulu ve çikolata kaplamalı kek üretiminde kullanılması araştırılmıştır. 

Üretilen mikrokapsüllerde S. boulardii, L. acidophilus ve B. bifidum sayımı ve canlılığı, in vitro mide ve bağırsak direnç testi, ısıl stabilizasyon testi, depolama stabilizasyon testi, nem ve su aktivitesi, verim ve sıkıştırılmış yığın yoğunluğu, partikül boyutu, DSC ve SEM görüntüleme analizleri yapılmıştır. Üretilen kek örnekleri 90 gün boyunca +4°C'de depolanmış ve depolamanın 0., 30., 60. ve 90. günlerinde alınan örneklerde S. boulardii, L. acidophilus ve B. bifidum sayımı ve canlılığı, pH ve titrasyon asitliği, tekstür ve duyusal analizler gerçekleştirilmiştir.

Mikrokapsülasyon işlemi sonrasında en yüksek S. boulardii, L. acidophilus ve B. bifidum sayısının püskürterek dondurma sistemi ile üretilen tek katlı mikrokapsüllerde (P) elde edildiği ve bu değerlerin sırasıyla 8.21, 8.10 ve 8.25 log kob/g olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca işlem sonunda probiyotik mikroorganizma canlılıklarının püskürterek dondurma yöntemi ile üretilen mikrokapsüllerde daha yüksek olduğu belirlenmiştir. 

Yapılan in vitro mide testi sonuçlarına göre en iyi korumanın püskürterek dondurma sistemi ile üretilen tek katlı mikrokapsüllerde (P) sağlandığı ve 180 dakikalık test süresi sonunda tüm mikrokapsül örneklerinde probiyotik mikroorganizma canlılığının %79'un üzerinde olduğu tespit edilmiştir. In vitro bağırsak testi sonuçlarına göre ise S. boulardii ve L. acidophilus hücrelerinde en yüksek koruma sırasıyla 7.44 ve 7.11 log kob/g değerleri ile püskürterek kurutma sistemi ile üretilen tek katlı mikrokapsüllerde (GS) elde edilmiştir. Buna karşın test sonunda en yüksek B. bifidum sayısı ise 6.78 log kob/g ile püskürterek dondurma sistemi ile üretilen tek katlı mikrokapsüllerde görülürken, püskürterek kurutma sistemi ile üretilen tek katlı mikrokapsüllere kıyaslandığında %89 ile daha yüksek canlılık sağladığı belirlenmiştir. Ayrıca test süresi sonunda tüm mikrokapsül örneklerinde canlılık değeri %74'ün üzerinde tespit edilmiştir. 

Isıl stabilizasyon testi sonuçlarına göre çift katlı mikrokapsülasyon işleminin S. boulardii ve B. bifidum canlılığı üzerinde etkili olmadığı ancak L. acidophilus hücrelerinin canlılığını daha fazla koruduğu belirlenmiştir. Probiyotik mikroorganizma hücre sayılarının artan inkübasyon sıcaklığı ile azaldığı ve 80°C'de bekletme sonunda S. boulardii, L. acidophilus ve B. bifidum canlılıklarının sırasıyla yaklaşık %28, %47 ve %48 olduğu tespit edilmiştir. Buna karşın mikrokapsüle edilmemiş serbest probiyotik hücrelerin ise artan test sıcaklıklarında canlı kalamadığı belirlenmiştir.

Mikrokapsüllerin +4°C'de 45 gün boyunca yapılan depolama testi sonunda en yüksek korumanın püskürterek dondurma sistemi ile üretilen tek katlı mikrokapsüllerde (P) sağlandığı belirlenmiştir. Depolama süresi sonunda bu mikrokapsüllerin S. boulardii, L. acidophilus ve B. bifidum sayısı sırasıyla 7.74, 6.86 ve 5.91 log kob/g olarak belirlenmiştir. Depolama sonunda her üç probiyotik mikroorganizmanın da canlılıklarının %60'ın üzerinde korunduğu tespit edilmiştir. 

Püskürterek dondurma yöntemi ile üretilen mikrokapsüllerin nem içeriği ve su aktivitesi değeri %4.41 ve 0.83 olarak ve püskürterek kurutma yöntemi ile üretilen mikrokapsüllerin nem içeriği ve su aktivitesi değeri ise %11.00 ve 0.53 olarak belirlenmiştir. Püskürterek kurutma yöntemi ile üretilen mikrokapsüllerin hacim ve yüzey ağırlıklı ortalama partikül boyutu değerleri 24.06 ve 4.88 µm olarak ve püskürterek dondurma yöntemi ile üretilen mikrokapsüllerin hacim ve yüzey ağırlıklı ortalama değerleri ise 612.54 ve 244.55 µm olarak belirlenmiştir. 

Probiyotik mikroorganizma içeren mikrokapsüller ile yapılan sade kek üretimleri sonucunda; en yüksek S. boulardii ve L. acidophilus sayısının iç katmanı hidrofilik kaplama materyali kullanılarak püskürterek kurutma yöntemi ve dış katmanı ise hidrofobik kaplama materyali kullanılarak püskürterek dondurma yöntemi ile üretilen çift katlı mikrokapsülde (P/GS) elde edildiği belirlenmiştir. Kek örneklerinde pişirme sonunda S. boulardii ve L. acidophilus canlılığının sırasıyla %67.4 ve %70.7 oranında korunduğu belirlenmiştir. Ancak mikrokapsül ilave edilen sade kek örneklerinde, canlı B. bifidum tespit edilememiştir.

Çikolata kreması dolgulu, marmelat dolgulu ve çikolata kaplamalı kek örneklerinde depolamanın ilk gününde probiyotik mikroorganizma içeriği istenilen seviyede (>106 kob/g) sağlanabilmiştir. Depolama süresi boyunca kek örneklerinin probiyotik mikroorganizma sayısında azalış meydana gelmiş ancak en düşük azalış, püskürterek dondurma yöntemi ile üretilen tek katlı mikrokapsüllerde (P) ve çikolata kreması dolgulu kek örneklerinde tespit edilmiştir. 

Tüm bu sunuçlar birlikte değerlendirildiğinde ise; püskürterek kurutma ve dondurma yöntemleri kullanılarak S. boulardii, L. acidophilus ve B. bifidum probiyotik mikroorganizmalarını içeren tek ve çift katlı mikrokapsüllerin üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretilen mikrokapsüllerden hidrofobik kaplama materyali kullanılarak püskürterek dondurma yöntemi ile üretilen P mikrokapsülünün diğer mikrokapsül örnekleri ile kıyaslandığında yüksek canlılık ve ekstrem şartlara karşı yüksek koruma sağladığı belirlenmiştir. Çift katlı kaplama tekniğinin ise L. acidophilus hücrelerinin in vitro mide sistemi ve ısıl direncini arttırdığı belirlenmiştir.
Bu tez çalışması ile çift katlı probiyotik mikrokapsül örneğinin (P/GS), pişirme sırasında merkez sıcaklığı 102°C olan kek örneklerinde S. boulardii ve L. acidophilus sayılarını 103 log kob/g seviyesinde koruduğu belirlenmiştir. Ayrıca püskürterek dondurma yöntemi ile üretilen P mikrokapsülü depolama sırasında çikolata kreması dolgulu ve marmelat dolgulu kek örneklerinde daha yüksek probiyotik mikroorganizma koruması sağladığı belirlenmiştir. Kek tipleri değerlendirildiğinde ise çikolata kreması dolgulu kek örneklerinin daha yüksek probiyotik mikroorganizma canlılığı sağladığı tespit edilmiştir. 

Sonuç olarak; iç katmanı Arap zamkı/siklodekstrin karışımı ile püskürterek kurutma ve dış katmanı ise hidrojenize palm yağı ile püskürterek dondurma yöntemi ile üretilen çift katlı mikrokapsülün (P/GS) kek miksine ilave edildikten ve  kek pişirme işleminden sonra 103 log kob/g canlı probiyotik mikroorganizma sağladığı, S. boulardii ve L. acidophilus mikroorganizmalarının ısıl tabilizasyonu yüksek mikrokapsüller üretmek için uygun probiyotik mikroorganizmalar olduğu ve pişirme sonucu keklere probiyotik özellik kazandırmak için ise hidrojenize palm yağı kullanılarak püskürterek dondurma yöntemi ile üretilen mikrokapsüllerin (P) çikolata dolgulu kek örneklerine uygulanmasının en uygun yöntem olduğu belirlenmiştir

Abstract:
Nowadays, product development studies involving microencapsulated probiotic microorganisms are often applied after a heat treatment. However, probiotic microcapsules, which are encapsulated in a heat stabilized matrix, can be applied to all types of process and food. The improvement of bakery products containing probiotic microorganisms can only be achieved by the production of new, high temperature tolerant probiotic microcapsules. For these reasons, there is a need for different combined microencapsulation techniques, such as spray drying and chilling, for increasing the tolerance of probiotic microorganisms to extreme conditions occurring in food process, storage and digestive system.

In this study probiotic microorganisms (Saccharomyces boulardii, Lactobacillus acidophilus LA-5 and Bifidobacterium bifidum BB-12) were encapsulated as single and double layered by spray drying and chilling technics and using possibilities of these microcapsules in chocolate cream filled, marmalade filled and chocolate coated cakes were also investigated.

S. boulardii, L. acidophilus and B. bifidum enumeration, in vitro simulated gastric and intestinal test, heat stabilization test, storage stabilization test, moisture content and water activity, yield, tapped bulk density, particle size, DSC and SEM analysis were conducted with produced microcapsules. Additionally, cake samples were stored for 90 days at +4°C and microbiological, pH, titration acidity, texture and sensorial analysis were carried out by taken cake samples at 0th, 30th, 60th and 90th days.

After the microencapsulation process, the highest S. boulardii, L. acidophilus and B. bifidum count were determined in microcapsule of P and the counts were 8.21, 8.10 and 8.25 log cfu/g, respectively. Additionally, survivability of microcapsules produced by spray chilling was higher than spray drying. 

According to in vitro gastric tests, the best protection was ensured in microcapsule of P and survivability of all probiotic microorganisms was more than 79% at the end of 180 min test period. The highest protection of S. boulardii and L. acidophilus was noted at microcapsule of GS in vitro intestinal tests and these counts were 7.44 and 7.11 log cfu/g, respectively. However, B. bifidum count was 6.78 log cfu/g in microcapsule of P and good survivability was detected at microcapsule of GS (89%). Moreover, survivability of probiotic microorganisms was detected more than 74% in all microcapsules at the end of 180 min. 

According to the results of the heat stabilization test, it was determined that the double layered microencapsulation did not affect the viability of S. boulardii and B. bifidum, but the survival of L. acidophilus was further protected. The counts of probiotics decreased with increasing incubation temperatures and S. boulardii, L. acidophilus and B. bifidum counts were determined as 28%, 47% and 48%, respectively at 80°C incubation temperature. On the other hand, non-microencapsulated free probiotic cells could not survive at increasing test temperatures.

The highest protection was detected in microcapsule of P at +4°C storage for 45 days. Throughout the storage period, S. boulardii, L. acidophilus and B. bifidum counts were determined as 7.74, 6.86 and 5.91 log cfu/g, respectively. The survivability rate of each three probiotics was more than 60% at the end of the storage.

Moisture content and water activity of microcapsules produced by spray chilling were 4.41% and 0.83, and these values were 11.00% and 0.53 for microcapsules produced by spray drying. Volume and surface mean diameter of microcapsules produced by spray drying were measured as 24.06 and 4.88 µm and these values were 612.54 and 244.55 µm for microcapsules produced by spray chilling. 

It was determined that the highest count of S. boulardii and L. acidophilus was obtained in the double layered microcapsules produced in the spray drying using the hydrophilic coating material and the outer layer using the hydrophobic coating material in the spray chilling system. After baking, S. boulardii and L. acidophilus count was 67.4% and 70.7%, respectively. Whereas B. bifidum count was not detected in each of microcapsules. 

On the first day of storage in chocolate cream filled, marmalade filled and chocolate covered cakes, the adequate probiotic microorganism number (>106 cfu/g) was achieved. However, during the storage period, the probiotic microorganisms count in the cake samples decreased, but the lowest decrease was detected in single layered microcapsules (P) produced by spraying chilling and in chocolate cream filled cake samples.

Consequently, S. boulardii, L. acidophilus and B. bifidum were microencapsulated by spray drying and spray chilling technique as single or double layered. It has been determined that the microcapsule produced in the spray chilling system by hydrophobic wall material provides high protection against extreme conditions when compared with other microcapsule samples. Additionally, the double layer microencapsulation has been increased the in vitro gastric system and heat resistance of L. acidophilus.

In this study, it was determined that double layered probiotic microcapsule sample (P/GS), ensured 103 log cfu/g survivability of S. boulardii and L. acidophilus in the cake samples with a central temperature of 102°C during baking. It was also found microcapsule of P, produced by spraying chilling method, provided higher probiotic microorganism protection in chocolate cream and marmalade filled cake samples during storage. When cake types were considered, chocolate cream filled cake samples were found to provide higher probiotic microorganism viability.

As a result; double layered microcapsule (P / GS), inner layer produced with gum Arabic/cyclodextrin by spray drying and outer layer produced with hydrogenated palm oil by spray chilling in the cake mix, ensured 103 cfu/g probiotic microorganism survivability after baking of cakes. Additionally, it was determined that S. boulardii and L. acidophilus are suitable probiotic microorganisms for producing microcapsules with high thermal stability. It was evaluated that microcapsules produced with hydorogenated palm oil by spray chilling (P) could be used in choclate cream filled cake due to producing probiotic cake.