Lakrimal bez doku mühendisliğine yönelik uygun ksenojenik hücre kaynağı araştırılması
The research of suitable csenogenic cell source for lacrimal gland tissue engineering
Yazar: KIVANÇ KASAL
Danışman: DOÇ. DR. CANAN ASLI YILDIRIM
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Kuru göz sendromu = Dry eye syndromer ; Kök hücreler = Stem cells ; Lakrimal sistem = Lacrimal apparatus ; Lakrimal sistem hastalıkları = Lacrimal apparatus diseases

Özet:
Amaç: Aköz yetmezlik tipi kuru göz hastalığının tedavisinde kullanılması öngörülen, doku mühendisliği yöntemi ile in vitro ortamda kök hücrelerden lakrimal bez üretilebilmesi çalışmaları için uygun ksenojenik hücre kaynağı araştırılması

Klinik ilişki: Kuru göz hastalığı, otoimmün hastalıkların ön planda olduğu aköz yetmezlik tipinde ciddi oküler yüzey rahatsızlıklarına ve muhtemel görme kaybına yol açmaktadır. Topikal suni gözyaşı, immünsupresif ajanlar, punktum tıkaçları vb. mevcut seçenekler tedavide yetersiz kalmaktadır. Hasta bireyin lakrimal bezindeki kök/progenitör hücreler veya cilt fibroblast hücrelerinin yeniden programlanmasıyla oluşan pluripotent kök hücreler kullanılarak yapay lakrimal bez elde edilmesi kuru göz tedavisine yeni bir bakış açısı kazandırmaktadır.

Yöntem: Bu çalışma, hayvan deneyleri ve kök hücre deneyleri olmak üzere iki alanda yürütüldü. İlk olarak yetişkin ve embriyonik farelerden lakrimal bez dokusu disseke edilerek izole edildi. Histolojik, immünohistokimyasal ve akış sitometri incelemeleri yapıldı. Elde edilen hücreler, lakrimal bez morfogenezinin taklit edilmesini amaçlayan, epitel ile mezenşim bölmeleri olan ve dinamik kültür ortamı sağlayan 'lakrimal çip' sistemi içinde 14 gün boyunca kültüre edildi. Sonuçlar immünohistokimya ve qPCR yöntemi ile incelendi. İkinci yöntem olarak ise uyarılmış pluripotent kök hücreler, iki farklı protokol doğrultusunda lakrimal bezin ana komponenti olan konjunktiva epitel hücreleri ve perioküler mezenşim hücrelerine farklılaştırıldı. Sonuçlar immünhistokimya yöntemi ile incelendi.

Bulgular: Yetişkin farelerden elde edilen lakrimal bez hücrelerinin proliferasyon kapasitesinin düşük olduğu gözlendi. Embriyonik farelerden izole edilen dokuların ışık mikroskobu altında epitel ve mezenşim dokularına ayrılabildiği histolojik kesitlerde görüldü. Hücreler, doku iskelesi sağlayan jelatin metakriloil (GelMA) ile karışım haline geldikten sonra fotomaske yardımı ile iç kısımda epitel ve dış kısımda epitel dokusunu çevreleyen mezenşim bölmeleri olacak şekilde 'lakrimal çip sistemi' içine yerleştirildi. Jel ile uyum sağladığı görülen hücrelerin 14 gün boyunca canlılıklarını korudukları ve organoid yapısını oluşturdukları görüldü. İmmunhistokimya incelemede lakrimal beze özgü Aquaporin-5 (AQP-5) ve Zonula okludens-1 (ZO-1) proteini saptandı. qPCR ile yapılan incelemede gözyaşına özgü lizozim mRNA düzeyinde kontrol grubuna göre oldukça yüksek saptandı.
Uyarılmış pluripotent kök hücre deneyinde, 42 günlük kültür sonucunda önce oküler yüzey ektodermi, ardından konjonktiva epiteli belirteci olan K13 ile boyanan hücreler elde edildi. Kültürün 14. gününde immünhistokimya incelemede FOXC1; qPCR incelemede PITX2 ve LMX1B mezenşim belirteçleri saptandı.

Sonuç: Doku mühendisliği yöntemi ile embriyonik fare hücreleri kullanılarak gözyaşı üretimi yapan lakrimal bez dokusu in vitro ortamda oluşturuldu. Uyarılmış pluripotent kök hücreler kullanılarak, biyomühendislik çalışmalarında lakrimal bezi dokusu meydana getirmek üzere kullanılacak epitel ve mezenşim hücreleri elde edildi. Bu bilgiler ışığında yapılacak ileri çalışmalarda, kuru göz hastalığının başlangıç aşamasında hastanın lakrimal bez biyopsisinden izole edilecek kök/progenitör hücreler veya cilt biyopsisinden elde edilen fibroblastlardan türetilen uyarılmış pluripotent kök hücreler kullanılarak in vitro ortamda lakrimal bez eldesi ve hasta bireye otolog transplantasyonu, hastalığın ileri aşamalarında ciddi oküler yüzey bozukluklarının oluşmasını ve muhtemel görme kaybı riskini azaltabilecek bir yaklaşım olabilir. Kullanılacak her iki yöntemin de, etik sorunları ve immün yanıt riskini ortadan kaldıracağı düşünülmektedir. Ayrıca in vitro ortamda kök hücrelerden üretilen lakrimal bezden, kişiye özel üretilecek ve kompleks içeriğe sahip aköz gözyaşının, topikal olarak kuru göz hastalığı tedavisinde kullanılması mümkün olabilecektir.

Abstract:
Purpose: Investigation of appropriate xenogenic cell source for in vitro lacrimal gland development by using tissue engineering methods, for use in the treatment of dry eye disease.

Clinical relevance: Aqueous deficiency type dry eye disease, which is mostly seen in the setting of autoimmune diseases, leads to serious ocular surface disorders and possible loss of vision. Available options like topical artificial tears, immunosuppressive agents, punctal plugs etc. are insufficient in treatment. Development of an artificial lacrimal gland using stem/progenitor cells localized in patients' lacrimal gland or pluripotent stem cells formed by reprogramming skin fibroblast cells, brings a new perspective to the treatment of dry eye.

Method: This study was conducted in two areas: animal experiments and stem cell experiments. Initially, lacrimal gland tissue was dissected and isolated from adult and embryonic mice. Histological, immunohistochemical and flow cytometry analyses were performed. Harvested cells were cultured in a 'lacrimal chip' system that mimics the morphogenesis of the lacrimal gland with its epithelial and mesenchymal compartments as well as a dynamic culture medium, for 14 days. Results were analyzed by immunohistochemistry and qPCR methods. Secondly, induced pluripotent stem cells (IPSCs) were differentiated into the main components of the lacrimal gland, namely conjunctival epithelial cells and periocular mesenchymal cells, by using two different protocols. Results were analyzed by immunohistochemistry.

Results: Lacrimal gland cells obtained from adult mice showed low proliferation capacity. Tissues isolated from embryonic mice could be separated into epithelial and mesenchymal tissues under light microscope, verified by the histologic analysis. Cells were mixed with gelatin methacryloyl (GelMA) which acts as tissue scaffold, and then photomasked into the 'lacrimal chip' system that has inner epithelium and outer mesenchymal tissue compartments. Cells were found to be bio-compatible with the gel and were able to maintain their viability for 14 days. They formed appropriate organoid structure. Immunohistochemical analysis revealed lacrimal gland specific Aquaporin-5 (AQP-5) and Zonula occludens-1 (ZO-1) proteins. Tear-specific lysozyme mRNA levels were found to be significantly higher in qPCR analysis than in the control group. 
IPSCs experiment revealed ocular surface ectodermal cells initially, followed by cells that stained by K13, which is an indicator of conjunctival epithelium, at the end of 42 days. On the 14th day of culture, immunohistochemistry analysis revealed FOXC1; qPCR analysis revealed PITX2 and LMX1B, all of which are mesenchymal markers.

Conclusion: Lacrimal gland tissue was produced in in vitro conditions, by tissue engineering methods using embryonic mouse cells. IPSCs were used to obtain epithelial and mesenchymal cells to be used in bio-engineering studies to develop lacrimal gland tissue. In the light of these data, obtaining in vitro lacrimal gland tissue using stem/progenitor cells isolated from either the lacrimal gland or IPSCs derived from skin fibroblasts at the initial stages of dry eye disease and autologous transplantation to the patient might be a sound approach to reduce the risk of serious ocular surface disorders and possible loss of vision in later stages of the disease. Both methods might eliminate ethical problems and risk of immune responses. Furthermore, it is possible that aqueous tear, which has complex ingredients, to be custom-produced individually for topical use in the treatment of dry eye disease, from the lacrimal gland developed in in vitro conditions by using stem cells.