Klinik örneklerden izole edilen difteri dışı korineform bakterilerin identifikasyonu, antibiyotik direnç paterninin ve biyofilm oluşumunun araştırılması
Identification, research of antibiotic resistance pattern and biofilm formation of non-diphtheria coryneform bacteria isolated from clinical specimens
Yazar: HATİCE ER
Danışman: PROF. DR. İLKNUR KALELİ
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Corynebacterium cinsine ait bakteriler; Corynebacterium diphtheriae ve non-difterik korineform bakteriler (NDC) olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. Önceki yıllarda laboratuvar kontaminantları olarak değerlendirilen non-difterik korineform bakterilerin (NDC) yapılan son çalışmalarda önemli hastane enfeksiyon etkeni olabilecekleri ve bu bakterilerin birçok antimikrobiyal ajana dirençli oldukları gösterilmiştir. Ciddi enfeksiyonlarda artan oranda NDC'lerin görülmesi bunların potansiyel patojenler olarak tanınmasını gerekli kılmaktadır.Bu çalışmada Pamukkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarına Aralık 2020-Ocak 2023 tarihleri arasında, klinik birimlerden gönderilen çeşitli klinik örneklerden izole edilen NDC'lerin tür düzeyinde identifikasyonları ve antibiyotik duyarlılık testlerinin yapılması, antibiyotik direnç paternlerinin incelenmesi, suşların moleküler epidemiyolojisinin ve biyofilm oluşumlarının araştırılması amaçlanmıştır.Tüm izolatlar MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry) ile tür düzeyinde tanımlanmıştır. İzolatların %94,3'ü C. striatum ve %5,7'si C. afermentans olarak tanımlanmıştır. İzolatların %15'i kan, %5'i kateter içi kan, %34,3'ü yara, %32,9'u trakeal aspirat (TA), %7,9'u balgam, %2,9'u abse materyali ve %2,1'i plevral sıvı örneklerinden izole edilmiştir. En sık izole edilen klinik örnek yara (%34,3), ikinci en sık klinik örnek trakeal aspirat (%32,9) iken; en az izole edilen klinik örnek ise %2,1 ile plevral sıvı örneği olmuştur. EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) rehberi doğrultusunda Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile yapılan antimikrobiyal duyarlılık testi sonuçlarına göre izolatların tamamı linezolid ve vankomisine duyarlı iken tamamı siprofloksasine dirençli bulunmuştur. İzolatların %98,6'sı penisiline, %96,4'ü klindamisine, %99,3'ü rifampisin ve tetrasikline, %88,6'sı gentamisine ve %75,7'si eritromisine dirençli bulunmuştur. İzolatlarda direnç genlerinin varlığı PCR (Polymerase Chain Reaction) ile araştırılmıştır. İzolatların %94,3'ünde bla geni,
%95'inde ampC geni, %95,7'sinde ermX geni, %90'nında aac(3)-XI geni, %92,1'inde aphA1 geni, %97,9'unda gyrA geni ve %32,9'unda tetA geni tespit edilmiştir. ermB ve tetB genleri izolatların hiçbirinde tespit edilmemiştir. aac(3)-XI ve aphA1 geni pozitif olan izolatlarda anlamlı bir şekilde gentamisin direnç oranı yüksek bulunmuştur (p<0,05). ermX geni pozitif olan izolatlarda anlamlı bir şekilde eritromisin ve klindamisin direnç oranı yüksek bulunmuştur (p<0,05). İzolatlarda tetA geni pozitifliği ile tetrasiklin direnç oranı arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır (p>0,05). bla/ampC geni pozitifliği ile penisilin direnç oranı arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır (p>0,05). İzolatların biyofilm oluşturmaları mikrotitrasyon plak yöntemi ile semikantitatif olarak değerlendirilmiştir. İzolatların %26,4'ünde biyofilm oluşumu tespit edilmiştir. Corynebacterium türleri ile biyofilm oluşumu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır (p>0,05). Çalışmadaki 140 suşun klonal ilişkisi PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) yöntemi ile araştırılmıştır. 140 suş 46 farklı PFGE paterni göstermiştir. Bu paternlerden 13 tanesi yalnızca birer suş içermektedir. Kalan 33 patern ise küme oluşturan suşları içermekte olup küme genişliği 2-12 arasında değişmektedir. Kümeleşme oranı %90,7 olarak saptanmıştır. En büyük küme; 12 izolatın yer aldığı A ile kodlanan kümedir. Çalışmamızdaki izolatların çoklu ilaç direncine sahip olmaları ve antimikrobiyal    direnç oranlarının yüksek olması nedeniyle bu mikroorganizmalara bağlı gelişen hastane enfeksiyonlarının tedavi stratejisinin zor olacağı düşünülmektedir. Bu nedenle bu mikroorganizmaların hastane enfeksiyon etkeni olabileceği göz önünde bulundurularak aktif sürveyans çalışmalarının yapılması önem arz etmektedir.

Abstract:
Bacteria belonging to the genus Corynebacterium are divided into two as Corynebacterium diphtheriae and non-diphtheric coryneform bacteria (NDC). Non- diphtheric coryneform bacteria (NDC), which were considered laboratory contaminants in previous years, have been shown in recent studies to be important causative agents of nosocomial infections and that these bacteria are resistant to many antimicrobial agents. The increasing incidence of NDCs in serious infections makes it necessary to recognize them as potential pathogens. In this study, it was aimed to determine the species level identification and antibiotic susceptibility tests, antibiotic resistance patterns, molecular epidemiology and biofilm formation of NDCs isolated from various clinical samples sent from clinical units to Pamukkale University Medical Faculty Research and Application Hospital Medical Microbiology Laboratory between December 2020 and January 2023. All isolates were identified to species level by MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry). 94,3% of the isolates were identified as C. striatum and 5,7% as C. afermentans. 15% of the isolates were isolated from blood, 5% from intra-catheter blood, 34,3% from wound, 32,9% from tracheal aspirate (TA), 7,9% from sputum, 2,9% from abscess material and 2,1% from pleural fluid samples. The most frequently isolated clinical sample was wound (34,3%), the second most frequently isolated clinical sample was tracheal aspirate (32,9%), while the least frequently isolated clinical sample was pleural fluid sample with 2,1%. Antimicrobial susceptibilities were determined by the Kirby-Bauer disk diffusion method and evaluated according to the criteria of EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) guidelines. All of the isolates were susceptible to vancomycin and linezolid, while all of them were resistant to ciprofloxacin. The isolates were resistant to penicillin (98,6%), clindamycin (96,4%), rifampicin and tetracycline (99,3%), gentamicin (88,6%) and erythromycin (75,7%), respectively. Drug-resistant genes were investigated by PCR (Polymerase Chain Reaction). The presence of bla gene was detected in 94,3% of the isolates, ampC gene in 95%, ermX gene in 95,7%, aac(3)-XI gene in 90%, aphA1 gene in 92,1%, gyrA gene in 97,9% and tetA gene in 32,9%. The ermB and tetB genes were not detected in any of the isolates. Gentamicin resistance rate was significantly higher in isolates with positive aac(3)-XI and aphA1 genes (p<0.05). Erythromycin and clindamycin resistance rates were significantly higher in ermX gene positive isolates (p<0.05). No significant difference was found between tetA gene positivity and tetracycline resistance rate in isolates (p>0.05). No significant difference was found between bla/ampC gene positivity and penicillin resistance rate (p>0.05). Biofilm formation of the isolates were detected semi-quantitatively by microtiter plate method. Biofilm formation was detected in 26,4% of the isolates. No statistically significant difference was found between Corynebacterium species and biofilm formation (p>0.05). The clonal relationship of 140 strains in the study were investigated by PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) method. XbaI digestion of the 140 Corynebacterium isolates revealed 46 distinct PFGE patterns. 13 of these patterns include only one strain. The remaining 33 patterns include cluster-forming strains, with cluster width ranging from 2-12. The clustering rate was found to be 90,7. The largest cluster is the cluster coded A, which includes 12 isolates.It is thought that the treatment strategy of nosocomial infections due to these microorganisms will be difficult because the isolates in our study have multidrug resistance and have high antimicrobial resistance rates. Therefore, it is important to carry out active surveillance studies considering that these microorganisms may be nosocomial infection agents.