Benign ve malign melanositik proliferasyonlarda epigenetik değişiklik belirteçleri 5-hidroksi metil sitozin ve histon deasetilaz-6'nın tanısal değeri ve histopatolojik prognostik parametrelerle ilişkisi
Diagnostic value of epigenetic biomarkers, 5-hydroxy methyl cytosine and histone deacetylase-6 and the relationship with histopathological parameters in benign and malignant melanocytic proliferations
Yazar: ASLIHAN YAVAŞ
Danışman: PROF. DR. AYLİN HEPER
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: 5-hidroksi metil sitozin = 5-hydroxy methyl cytosine ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Histon deasetilaz = Histone deacetylases ; Histopatoloji = Histopathology ; Melanom = Melanoma ; Melanositler = Melanocytes ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nevüs = Nevus ; Prognoz = Prognosis

Özet:
Amaç: Melanositik deri tümörleri, oldukça çeşitli klinik, histopatolojik ve genetik özelliklere sahip benign ve malign neoplazileri içeren geniş bir spektrumdur. Melanositik lezyonların yorumlanması, benign-malign ayrımı dermatopatolojide sık karşılaşılan zorluklardan bir tanesidir. Çok agresif bir tümör olan malign melanom ile benign melanositik lezyonların ayırıcı tanısında ve bu lezyonların biyolojik davranışlarının tahmininde yararlı olacak güvenilir biyobelirteç eksikliği mevcuttur. Melanomun gelişimi ve ilerlemesinde genetik olayların yanında epigenetik mekanizmalar da rol almaktadır. Çeşitli patolojik ve biyolojik süreçler için önemli bir epigenetik değişiklik olan 5. pozisyondaki sitozinin metillenmesi ile oluşan anormal DNA metilasyonu son zamanlarda üzerinde oldukça durulan bir mekanizmadır. Kromatin yapısının düzenlenmesinde rol alan diğer bir epigenetik mekanizma histon modifikasyonudur. Histon deasetilazlar (HDAC) ve histon asetil-transferazlar (HAT) birçok hastalıkta gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesinde rol oynarlar. 
Bu çalışmada epigenetik belirteçler olan 5-hmC ve HDAC6 ifadesinin malign, borderline ve benign melanositik lezyonların ayrımında tanısal yararının; primer melanomda histopatolojik prognostik parametreler ile ilişkisinin araştırılması planlanmış; ayrıca primer ve metastatik melanomlarda karşılaştırarak, bu epigenetik değişikliklerin tümör progresyonundaki rolünün incelenmesi amaçlanmıştır.
Materyal Metod: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı'nda, 2005-2018 yılları arasında incelenmiş olan 110 benign (22 dermal nevus, 22 konjenital nevus, 22 displastik nevus, 22 Spitz nevus, 22 mavi nevus), 110 primer malign (24 nodüler melanom, 24 yüzeyel yayılımlı melanom, 22 akral lentijinöz melanom, 22 lentigo maligna melanom, 18 özel tip melanom [spitzoid, nevoid, desmoplastik, iğsi hücreli]), 8 borderline melanositik lezyon ve 100 melanom metastazı (30 deri, 30 yumuşak doku, 30 lenf nodu ve 10 visseral metastaz) olgusu olmak üzere toplam 328 olgu çalışmaya dahil edilmiştir. Ayrıca bu olgular arasından alt tiplerden bağımsız olarak hem primer lezyonun hem de metastatik lezyonun aynı hastaya ait olduğu 24 olguluk bir grup oluşturulmuştur. Hastaların yaşı, cinsiyeti, lezyon lokalizasyonu not edilerek olgulara ait H-E boyalı kesitler yeniden incelenmiş ve histopatolojik parametreler değerlendirilmiştir. Histopatolojik parametreler primer melanom olgularında Breslow tümör kalınlığı, Clark invazyon seviyesi, mm2' de mitoz sayısı, ülserasyon, regresyon, lenfovasküler invazyon, perinöral invazyon durumu ve tümör infiltre eden lenfositlerin (TİL) varlığı ve yoğunluğu; benign lezyonlardan dispastik nevuslarda atipi derecesi ve tüm lezyonda mitoz sayısı; Spitz nevus ve borderline grubunda ise tüm lezyonda mitoz sayısıdır. İmmünhistokimyasal analizlerde tüm olgularda anti-HDAC6 boyanmasına rağmen, teknik nedenlerden dolayı anti-5-hmC 214 olguya uygulanabilmiş; değerlendirmeler preparatlar dijital olarak taranarak dijital görüntüler üzerinden, boyanma yüzdesi ve şiddetini içeren H-skoru ile yapılmıştır. Verilerin analizi "SPSS version 20" paket programı kullanılarak yapılmış, p<0.05 için sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.	
Bulgular: Tüm olguların yaş ortalaması 49.4'tür (6-92). Olguların %52.1'i (n:171) kadın, %47.9'u (n:157) erkektir. Primer malign ve metastaz ana tanı gruplarının yaş ortalaması benign ve borderline ana tanı gruplarından yüksektir (p<0.05). En küçük yaş ortalaması Spitz nevus olgularına aittir; dermal, displastik ve mavi nevus olgularından istatistiksel olarak anlamlı düzeyde düşüktür (p<0.05). Displastik ve konjenital nevuslar gövde, mavi nevuslar ekstremite, lentigo maligna melanomalar ağırlıklı olarak baş-boyun yerleşimlidir. Lenf nodu metastazı grubunda en fazla inguinal lenf nodu metastazı, visseral metastaz grubunda ise en çok akciğer metastazı bulunmaktadır.  Histopatolojik prognostik parametreler açısından; nodüler melanom, akral lentijinöz melanom hariç, diğer tip melanomlara kıyasla daha fazla Breslow tümör kalınlığına sahiptir (p<0.05). Nodüler melanom, yüzeyel yayılımlı melanom, lentigo maligna melanoma ve özel tip melanomlara göre daha fazla mitoz içermektedir (p<0.05). Displastik nevuslarda, atipi derecesi ile mitoz arasında pozitif korelasyon vardır (p<0.05, r:0.497). Lenfovasküler invazyon daha çok nodüler (%20.8) ve akral lentijinöz melanomlarda (%13.6) gözlenirken, perinöral invazyon açısından melanom tipleri arasında farklılık saptanmamıştır. Ülserasyon en sık nodüler (%58.3) ve akral lentijinöz (%36.4) melanomda mevcuttur. Regresyon en fazla yüzeyel yayılımlı melanomdadır (%16.7). Primer melanom grupları arasında TİL açısından istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır. Epigenitik belirteçlerin analizlerinde benign lezyonlarda daha fazla ve yoğun 5- hmC ekspresyonu bulunurken, primer malign ve metastatik lezyonlarda parsiyel ya da total kayıp mevcuttur. Dermal nevus, displastik nevustan ve konjenital nevustan daha fazla 5- hmC ekspresyonu göstermiştir; konjenital nevus, displastik nevusa benzer 5- hmC ekspresyonu sergilemiştir. Dermal, displastik, konjenital nevus grupları, primer melanom olgularından daha yüksek 5- hmC H-skoruna sahiptir. Primer melanom ve melanom metastazı olguları arasında hem ana gruplarda hem de alt tanı grupları arasında 5- hmC farkı bulunmamaktadır. 5-hmC; Breslow kalınlığı, Clark invazyon seviyesi ve mitoz ile negatif korelasyon, TİL ile pozitif korelasyon göstermiştir. HDAC6 H-skoru ile prognostik parametreler arasında istatistiksel anlamlı düzeyde ilişki saptanmamıştır. Primeri ve metastazlarının aynı hastaya ait olduğu grupta metastatik lezyonlarda daha yüksek HDAC6 ekspresyonu saptanmış; 5-hmC ekspresyonu farklılık göstermemiştir. 
Sonuç: Bu çalışmada elde edilen bulgular 5- hmC'nin disregülasyonunun melanom patogenezinde erken aşamalarda meydana geldiğini ve benign ve malign melanositik lezyonlarda faydalı bir tanısal ve prognostik marker olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca konjenital nevusların 5-hmC ekspresyonu açısından displastik nevuslara benzer bir profil sergilemesi konjenital nevusların diğer benign melanositik lezyonlardan biyolojik farklılığını vurgulamaktadır. Çalışma immünhistokimyasal yöntem ile çok geniş bir melanositik lezyon serisinde parafin takipli insan dokularında HDAC6 ekpresyonunu araştıran ilk çalışmadır. Primer malign lezyonu ve metastazı aynı hastaya ait olan lezyonlardaki sonuçlar HDAC6'nın metastazı kolaylaştırıcı etkileri olabileceğini, HDAC6'yı hedef alan terapötik ajanların melanom tedavisinde faydasının olabileceğini düşündürmüştür. Ancak bu sonuçların farklı ve büyük hasta serilerinde de desteklenmesi faydalı olacaktır.
Anahtar kelimeler: melanositik lezyonlar, prognostik histopatolojik parametreler, epigenetik belirteçler, 5-hidroksi metil sitozin (5-hmC), histon deasetilaz (HDAC6)

Abstract:
Aim: Melanocytic skin tumors show a broad spectrum including benign and malignant neoplasms with a wide variety of clinical, histopathological and genetic features. Interpretation of melanocytic lesions is one of the most common difficulties in dermatopathology. Malignant melanoma is the most aggressive form of skin cancer which shows high metastatic capacity, rapid progression and high mortality. There is lack of a reliable biomarker which can be useful in the differential diagnosis of malignant melanocytic lesions which is almost the most aggressive form of skin cancer and benign ones and also can be useful in predicting the biological behavior of these lesions. In addition to genetic events, epigenetic mechanisms also play a role in the development and progress of melanoma. Abnormal DNA methylation, formed by the methylation of the cytosine in position 5, an important epigenetic change for various pathological and biological processes, is a mechanism that has been recently elaborated on. Another epigenetic mechanism involved in the regulation of chromatin structure is histone modification. Histone deacetylases (HDAC) and histone acetyltransferases (HAT) play a role in the epigenetic regulation of gene expression in many diseases.

The aim of this study is, to investigate the diagnostic utility of epigenetic markers, 5-hmC and HDAC6 in distinguishing malignant, borderline and benign melanocytic lesions; to analyze the relationship between these epigenetic markers and histopathological prognostic parameters in primary melanoma; and to compare the role of these epigenetic changes in tumor progression by comparing them between primary and metastatic melanomas.

Material and method: 110 benign (22 dermal nevus, 22 congenital nevi, 22 dysplastic nevi, 22 Spitz nevi, 22 blue nevi), 110 primary malign melanoma (24 nodular melanomas, 24 superficial spreading melanomas, 22 acral lentiginous melanomas, 22 lentiginous maligna melanomas, 18 special types of melanomas [spitzoid, nevoid, desmoplastic, spindle cell]), 8 borderline melanocytic lesions and 100 melanoma metastases (30 skin, 30 soft tissue, 30 lymph nodes and 10 visceral metastases) were included in the study, and a group of 24 patients with both primary lesions and metastatic lesions were included in the study, independently of the subtypes. Besides age and sex of the patients, localisation of the lesions were noted; H-E stained sections of the cases were reexamined and histopathological parameters were evaluated. Histopathological parameters were Breslow tumor thickness, Clark level, number of mitosis per mm2, presence or absence of ulceration, regression, lymphovascular invasion and perineural invasion, presence and density of tumor infiltrating lymphocytes (TIL) in primary malignant melanoma cases; degree of atypia in dysplastic nevi and number of mitosis for whole lesion in both dysplastic nevi, Spitz nevi and borderline lesions. In immunohistochemical analyzes, anti-HDAC6 antibody could be applied to all cases, but due to technical reasons anti-5-hMC antibody could be applied to the 214 cases; evaluations were made on digital images by digitally scanned slides with the H-score which includes the percentage and density of staining. The analysis of the data was made using the "SPSS version 20" package program and the results for p <0.05 were considered to be statistically significant.

Results: The mean age of all cases is 49.4 years (6-92). 52.1% (n: 171) of the cases were female and 47.9% (n: 157) were male. The mean age of the primary malignant and metastatic diagnosis groups was higher than the borderline and benign diagnostic groups (p <0.05). The youngest average age was found in Spitz nevus cases, which were statistically significantly lower than dermal, dysplastic and blue nevus cases (p <0.05). Dysplastic and congenital nevi were located preferentially on trunk; blue nevi were found on extremities and lentigo malignant melanomas were on head and neck region. The most common metastized lymph node region was inguinal lymph nodes in the lymph node metastasis group and lung metastasis was the most frequent among visceral metastasis group. Among histopathologic prognostic parameters; nodular melanomas were found to have higher Breslow tumor thickness than other types of melanomas except acral lentiginous melanoma (p <0.05). It was found that nodular melanomas have more mitosis than all of the superficial spreading melanomas, lentigo malignant melanomas and special type melanomas (p<0.05). There was a positive correlation between degree of atypia and mitosis in dysplastic nevi (p<0.05, r:0.497). Lymphovascular invasion was more frequent in nodular (20.8%) and acral lentiginous melanomas (13.6%), whereas there was no difference between primary melanoma subtypes according to perineural invasion. Ulceration was present more frequent in nodular (58.3%) and acral lentiginous melanomas (36.4%). Regression was found highest in superficial spreading melanoma (16.7%). There was no statistically significant difference between primary melanoma subtypes according to TILs.
In epigenetic marker analysis, benign lesions showed more and intense 5-hmC expression, while partial or total loss was found in primary malignant and metastatic melanomas. Dermal nevi showed more 5-hmC expression than dysplastic and congenital nevi; congenital nevi exhibited 5-hmC expression similar to dysplastic nevi. Dermal, dysplastic and congenital nevi had higher 5-hmC H-scores than primary melanoma and metastatic melanoma cases. There was no difference between primary malignant and metastatic cases and also between their subdiagnostic groups according to 5-hmC expression. In primary melanoma cases, H-scores of 5- hmC was correlated negatively with Breslow thickness, Clark level, mitosis and was correlated positively with TIL. In primary melanoma, benign melanocytic proliferation and borderline lesion groups, the HDAC6 H-score was not found to be related with any prognostic parameter statistically. Higher HDAC6 expression was higher in metastatic lesions in the group in which the primary and metastases were from the same patient; but 5-hmC showed no difference. 
Conclusion: The results of our study, suggesting that dysregulation of 5-hmC may be occurring early in the pathogenesis of melanoma and 5-hMC may be a diagnostic and prognostic valuable marker in melanocytic lesions. In terms of similar expression profile of 5-hmC in congenital nevi to dysplastic nevi emphasizes the biological differences of congenital nevi from other benign melanocytic lesions. This is the first study which investigates HDAC6 expression in paraffin-embedded human tissues in a wide range of melanocytic lesions by immunohistochemical method. The results of the group which includes primary and metastatic lesions of same patients suggested that HDAC6 has promoting effects on melanoma metastasis and also therapeutic agents targeting HDAC6 may be beneficial in the treatment of melanoma. However, it would be beneficial to support these results in different and large patient series.
Key words: melanocytic lesions, prognostik histopathological parameters, epigenetic markers, 5-hydroxy methyl cytosine (5-hmC), hyston deacetylase-6 (HDAC6)