Antiapoptotik protein inhibitörü yüklü nanopartiküllerin kanser hücreleri üzerindeki etkileri
Effects of antiapoptotic protein inhibitor-loaded nanoparticles on cancer cells
Yazar: ÖZLEM KAPLAN
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA ; DOÇ. DR. MEHMET KORAY GÖK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Farmasötik nanoteknoloji = Pharmaceutical nanotechnology ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production

Özet:
Apoptozdan kaçınma, kanser hücrelerinin ayırt edici bir özelliğidir. Miyeloid lösemi hücre farklılaşma proteini (MCL-1), hücresel apoptozu düzenleyen B-hücreli lenfoma 2 (BCL-2) ailesinin anti-apoptotik bir proteinidir. MCL-1 ekspresyonu, kanser hücrelerinin hayatta kalmasında anahtar bir rol oynamaktadır ve bu nedenle kanser tedavisinde umut verici bir hedeftir. MCL-1 ve diğer antiapoptotik BCL-2 proteinlerinin korunmuş BH3 domenlerini hedef alan BH3 mimetik peptidler oldukça spesifik MCL-1 inhibitörleridir. Ancak peptidlerin, metabolik olarak kararsızlıkları, hücresel proteazlara bağlı bozunmaları, hücresel zarlardan geçişlerinin zor olması gibi nedenlerle kullanımları sınırlıdır. Bu çalışmada, antiapoptotik protein MCL-1'in seçici inhibitörü MS1 peptidinin hücresel alımının ve stabilitesinin artırılması hedeflenmiş ve bu doğrultuda, nanobiyoteknolojik yöntemler kullanılarak MS1 peptidini içeren nanoyapılar oluşturulmuş ve bu yapıların kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik ve apoptotik etkileri araştırılmıştır. Bu kapsamda, Bim BH3 mimetiği MS1 peptidi, mNeonGreen floresan proteini ve polihistidin ile füzyona uğratılmış şekilde rekombinant olarak üretilmiştir. Bu rekombinant protein kullanılarak iki nanopartiküler sistem hazırlanmıştır. Birincisi, rekombinant protein temelli kendiliğinden kurulan (self-assembly) nanopartiküler sistemlerdir. İkincisi ise bu füzyon proteinin enkapsüle edildiği polimerik nanopartiküller sistemlerdir. Nanopartiküllerin serviks kanseri (HeLa), akciğer kanseri (A549) ve meme kanseri (MDA-MB-231) hücre hatları ile sağlıklı hücre hattı (HUVEC) üzerindeki sitotoksik etkileri MTT testi ile analiz edilmiştir. Ayrıca, nanopartiküllerin apoptotik etkileri, uygulandıkları hücrelerdeki antiapoptotik ve apoptotik proteinlerin ekspresyon seviyeleri RT-PCR ve Western blotlama ile belirlenerek incelenmiştir.
Sonuç olarak, kanser hücrelerine karşı spesifik olarak sitotoksik etki gösteren ve bu hücrelerde apoptozu indüklediği ortaya koyulan hedefli ilaç adayı yeni nanopartiküller geliştirilmiştir. Elde edilen veriler gelecekte, terapotik peptidlerin klinik uygulamalarda başarısını artırabilecek biyoteknolojik ilaç formülasyonlarının geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Abstract:
Evasion of apoptosis is a hallmark of cancer cells. Myeloid leukemia cell differentiation protein (MCL-1) is an anti-apoptotic protein of the B-cell lymphoma 2 (BCL-2) family that regulates cellular apoptosis. MCL-1 expression plays a key role in the survival of cancer cells and is therefore a promising target in cancer therapy. BH3 mimetic peptides targeting the conserved BH3 domains of MCL-1 and other antiapoptotic BCL-2 proteins are highly specific MCL-1 inhibitors. However, the use of peptides is limited due to their metabolic instability, degradation by cellular proteases, and difficulty in passing through cellular membranes. In this study, it was aimed to increase the cellular uptake and stability of MS1 peptide, a selective inhibitor of the antiapoptotic protein MCL-1, and accordingly, nanostructures containing MS1 peptide were formed using nanobiotechnological methods and the cytotoxic and apoptotic effects of these structures on cancer cells were investigated. In this context, Bim BH3 mimetic MS1 peptide was produced recombinantly fused with mNeonGreen fluorescent protein and polyhistidine. Two nanoparticular systems were prepared using this recombinant protein. The first is recombinant protein-based self-assembly nanoparticular systems. The second is polymeric nanoparticle systems in which this fusion protein is encapsulated. The cytotoxic effects of nanoparticles on cervical cancer (HeLa), lung cancer (A549) and breast cancer (MDA-MB-231) cell lines and healthy cell line (HUVEC) were analyzed by MTT assay. In addition, the apoptotic effects of nanoparticles were investigated by determining the expression levels of antiapoptotic and apoptotic proteins in the cells to which they were applied, by RT-PCR and Western blotting.
As a result, new targeted drug candidate nanoparticles have been developed that have a specific cytotoxic effect against cancer cells and have been shown to induce apoptosis in these cells. In the future, the obtained data may contribute to the development of biotechnological drug formulations that can increase the success of therapeutic peptides in clinical applications.