İnsan kolanjiokarsinoma hücre hattında (TFK-1) saha uygulamasının E-kaderin, N-kaderin ve vimentin genleri üzerine etkisinin araştırılması
The investigation of saha effects on E-cadherin, n-cadherin and vimentin genes in human cholangiocarcinoma cell line (TFK-1)
Yazar: ESRA HİLAL YÜKSEK
Danışman: PROF. DR. GÜLDEN BAŞKOL
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Cadherinler = Cadherins ; Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Histon deasetilaz = Histone deacetylases ; Karsinoma = Carcinoma ; Kolanjiokarsinoma = Cholangiocarcinoma ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Suberoylanilid hidroksamik asit = Suberoylanilide hydroxamic acid ; Vimentin = Vimentin

Özet:
Kolanjiokarsinoma (KK), safra epitelinden kaynaklanan malign bir neoplazidir. KK'nin insidans ve mortalite oranı her geçen gün artmaktadır ve ikinci en sık rastlanan primer hepatobiliyer kanser türüdür. Suberoilanilid Hidroksamik Asit (SAHA); hidroksamik asit yapısında bir Histon deasetilaz inhibitörü (HDACI)'dür. Terapötik açıdan, geri dönüşümlü epigenetik değişimleri hedeflemenin, daha stabil haldeki genetik mutasyonları hedeflemekten daha cazip bir yöntem olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle biz çalışmamızda epigenetik değişikliklerle ilişkili bir faktör olan HDACI (SAHA) kullandık. İn vitro ve in vivo yöntemlerle yapılan pek çok çalışma ile SAHA'nın antikanser etkisi araştırılmıştır. Epitelyal-Mezenkimal Geçiş (EMT); epitel hücrelerinin bir takım değişiklikler geçirmesi sonucunda epitel özelliklerini kaybederek mezenkimal özellikler kazandıkları önemli bir değişim sürecidir. EMT sonucunda kanser hastalığının hayati tehlike oluşturan belirteçleri ortaya çıkmaktadır.
Bu çalışmada, in vitro ortamda TFK-1 hücrelerine 1 μM, 2,5 μM, 5 μM ve 10 μM konsantrasyonlarında SAHA uygulandı ve IC50 değeri 2 μM olarak bulundu. Migrasyon deneyi (yara iyileşmesi deneyi) yapılarak kontrol ve 2 μM konsantrasyonunda SAHA verilen gruplardaki yara genişlikleri, belirlenen zamanlarda ölçüldü ve zamana göre yara genişliğindeki anlamlı değişim gösterildi. Deney sonucunda, 2 μM SAHA verilen grupta kontrole göre migrasyonun inhibe edildiği tespit edildi. Ayrıca SAHA'nın E-Kaderin, N-Kaderin ve Vimentin genleri üzerine etkisi araştırıldı. TFK-1 hücreleri 2 μM SAHA ile 48 saat inkübe edildi ve Kantitatif PZR (LightCycler®480Real-TimePCR-Roche) yöntemiyle gen ekspresyon seviyeleri incelendi.2 μM SAHA konsantrasyonuyla muamele edilen TFK-1 hücrelerinde, kontrole göre N-Kaderin ve Vimentin genleri pozitif regüle olurken, E-Kaderin'in negatif regüle olduğu gözlemlendi. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,05).
Sonuç olarak SAHA'nın, TFK-1 hücrelerinin  migrasyonunu engellediğini gözlemledik. Ancak bunun yanında olumsuz bir sonuç olan, EMT'nin indüklendiğini de gördük. Bu durum, SAHA'nın kullanımı sırasında çok dikkat edilmesi gerektiğini düşündürmektedir. Ayrıca bu konuda daha ayrıntılı çalışmalar yapılmasının faydalı olacağını öngörmekteyiz.

Abstract:
Cholangiocarcinoma (CC) is a malignant neoplasm  being composed of the biliary epithelium. The incidence and mortality rate of CC is increasing day by day and the second most common primer is hepatobiliary cancer. Suberoylanilide Hydroxamic Acid (SAHA) is; Hydroxamic acid of a histone deacetylase inhibitor (HDACI). Therapeutically, targeting reversible epigenetic changes is thought to be more attractive method than target more stable genetic mutations. For this reason, we used HDACI which is a factor associated with epigenetic changes in our study. Several in vitro and in vivo studies have been examined the anticancer effect of SAHA. Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT); is an important change process in which epithelial cells lose mesenchymal properties by losing epithelial properties as a result of a number of changes. As a result of EMT, life-threatening markers of cancer are seen. 
In this study, TFK-1 cells were in vitro treated with 1 μM, 2.5 μM, 5 μM and 10 μM SAHA and the IC50 value was found to be 2 μM. Migration experiment (Wound Healing) in the control and SAHA groups at 2 μM concentration were measured at specified times by and significant change in wound width was shown according to time. As a result, migration was inhibited in the 2 μM SAHA group compared to the control. In addition, the effect of SAHA on E-Kaderin, N-Kaderin and Vimentin genes was investigated. TFK-1 cells were incubated with 2 μM SAHA for 48 hours and their gene expression levels were examined by Real Time PCR (LightCycler®480Real-TimePCR-Roche) method. It was observed that N-cadherin and Vimentin genes were positively regulated in TFK-1 cells treated with 2 μM SAHA concentration, whereas E-Kaderin was negatively regulated. The results were statistically significant (p<0.05).
As a result, we observed that SAHA inhibits the migration of TFK-1 cells. However, we have seen EMT that induced a negative result. This suggests that careful attention should be paid to the use of SAHA. We also anticipate that further studies in this regard will be useful.