Tuz Gölü'nden izole edilen halofilik mikroorganizmaların serin proteaz aktivitelerinin belirlenmesi ve kısmi saflaştırılması
The determination of serine protease activities of halophilic microorganism isolated from Tuz Lake and their partial purification
Yazar: ALİ ARSLAN
Danışman: DOÇ. DR. GÜLTEN ÖKMEN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Halofilik archaea = Halophilic archaea ; Mikrobiyal enzimler = Microbial enzymes ; Protein saflaştırma = Protein purification ; Serin alkali proteaz = Serine alkaline protease

Özet:
Bu çalışmanın amacı, halofil mikroorganizmalardan serin proteaz enziminin tanımlanması, aktivitelerinin belirlenmesi ve kısmen saflaştırılmasıdır. Tuz Gölü'nden izole edilen kültürler Sehgal-Gibbons broth (SGB) ve Sehgal-Gibbons agar (SGA) ortamında yetiştirildi. Proteaz aktivitesi olan kültürler %1 skim milk içeren SGA ortamı vasıtası ile belirlenmiştir. En iyi proteaz etkinliğine sahip 3 kültür sonraki basamaklarda kullanılmıştır. En iyi proteaz aktivitesine sahip bir kültür, enzim saflaştırması için aday olarak seçilmiştir. Bu kültür, amonyum sülfat çökeltmesi ve jel geçirgenlik kromatografisi ile saflaştırma için kullanılmıştır. Enzim % 22 saflaştırma oranı ve % 6,2 verimle elde edilmiştir. Enzimin varlığı sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi ile belirlenmiş ve enzimin yaklaşık 55 kD olduğu bulunmuştur. Enzim karakterizasyonu çalışmalarında, saf enzimin aktiviteleri farklı sıcaklık, pH, tuz konsantrasyonu, metal iyonları, substratlar, inhibitörler ve yüzey aktif maddelerinde saptanmıştır. Optimum enzim aktivitesi 60 oC' de bulunmuştur. pH 7' de,  enzim optimum aktivite göstermiştir. Farklı tuz konsantrasyonlarında, enzimin optimum aktivitesi % 10 NaCl ortamında bulunmuştur. Farklı metal iyonlarının kullanıldığı çalışmalarda, optimum enzim aktivitesi 1 mM MgCl2 (% 95,9) içeren ortamda belirlenmiştir. Buna ek olarak, optimum enzim aktivitesi % 0,65 sığır serum albümin (BSA)  içeren ortamda bulunmuştur. Fenil metil sülfonil florid (PMSF) enzim aktivitesini çok fazla inhibe etmesinden dolayı serin proteaz olduğunu düşündürmektedir. Farklı yüzey aktif maddelerinin kullanıldığı çalışmalarda, enzim aktivitesi sodyum dodesil sülfat (SDS)' den en fazla inhibe (% 87,5)  olmuştur.

Abstract:
The purpose of this work was to identify, determine their activities, and perform purification of this enzyme serine protease from halophilic microorganisms. The cultures isolated from Lake Tuz were grown in Sehgal-Gibbons broth (SGB) and Sehgal-Gibbons agar (SGA)  media. The cultures with protease activity were determined by SGA media contain 1% skim milk. The 3 cultures with best protease activity were used at the following. The one culture with the best protease activity has been selected as candidate for enzyme purification. This culture was used for ammonium sulphate precipitation and purification by gel permeation chromatography. The enzyme was obtained with 22 % purification rate and 6.2 % yield. The presence of the enzyme was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) method, and the enzyme was found to be about 55 kD. In the enzyme characterization studies, activities of pure enzyme have been determined at different temperatures, pH, salt concentrations, metal ions, substrat, inhibitors and surfactants. Optimal enzyme activity was found at 60 °C. In pH 7, enzyme showed optimum activity. At different salt concentrations, the optimum activity of enzyme has been found in 10 % NaCl containing media. In studies with the different metal ions in the medium optimum enzyme activity was determined in the medium containing 1 mM MgCl2 (95.9 %). Additionally, optimum enzyme activity was found in the medium containing 0.65 bovine serum albumin (BSA). Since the inhibition of enzyme by phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF) was dramatic, it was thought that enzyme is serine protease. In studies with different surfactants in the medium the highest inhibition (% 87.5)  was due to sodium dodecyl sulfate (SDS).