Demir (II, III)-esaslı antioksidan aktivite/kapasite tayin yöntemlerinin geliştirilmesinde kinetik ve termodinamik öğeler
Kinetic and thermodynamic features in the development of iron(II,III)-based antioxidant activity/capacity determination methods
Yazar: KADRİYE IŞIL BERKER
Danışman: PROF. DR. İZZET TOR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidan vitaminler = Antioxidant vitamins ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Spektrofotometri = Spectrophotometry ; Spektrofotometrik yöntem = Spectrophotometric method ; Spektroskopik yöntemler = Spectroscopic methods

Özet:
Elektron transferine dayalı antioksidan kapasite ölçüm yöntemleri, gıda antioksidanlarını topluca belirlemek için etkin yöntemler olup ferrisiyanür (heksasiyanoferrat(III)) yöntemi bu amaçla en yaygın kullanılanlardandır. Literatürde mevcut olan ve indirgeme kapasitesi ölçümü için kullanılan ferrisiyanür yöntemi, antioksidanlara tekrarlanabilir nitelikte doğrusal ve toplamsal yanıt vermek üzere optimize edilmiştir. Yöntemin bu çeşitlemesi, daha fazla antioksidan çeşidini yükseltgeyebilecek şekilde redoks koşullarını ayarlamak üzere ferrisiyanür ve demir(III)'i birlikte kullanmayı içermektedir. Prusya mavisi kompleksinin çökmesi sodyum dodesil sülfat katkısıyla engellenmiştir; ortam pH'sı 1,7'ye ayarlanarak Fe(III)'in hidrolizi engellenirken redoks aktivitesi sürdürülmüştür. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında 30 dakika bekleterek yükseltgenme reaksiyonları orijinal ferrisiyanür yöntemine göre daha makul bir şekilde tamamlanmıştır. Troloks eşdeğeri antioksidan kapasite değerleri (TEAC) sırasıyla kuersetin > rosmarinik asit > gallik asit > ferulik asit ? kateşin > kafeik asit ? rutin ? askorbik asit ? troloks olarak belirlenmiştir. Sentetik antioksidan karışımları Beer Kanunu'na uygun biçimde kendilerinden teorik olarak beklenen toplam antioksidan kapasite değerlerini vermişlerdir. Yöntem, gerçekte antioksidan olarak nitelenmeyen basit şekerler ve sitrik asite karşı reaksiyon vermezken, diğer Fe(III) esaslı yöntemler ile reaksiyona girmeyen biyolojik öneme sahip tiyollere cevap vermektedir. Yöntem gerçek örnek çözeltileri kullanılarak yeşil çay, ısırgan otu ve adaçayı içine standart katkı çalışması yapılmak suretiyle sınanmış ve diğer bazı antioksidan ölçüm yöntemlerine karşı valide edilmiştir.Bu çalışmada ikincil olarak geliştirilen bir antioksidan belirleme yöntemi demir(III)-ferrozin yöntemidir. 562 nm de maksimum absorbans gösteren magenta renkli demir(II)-ferrozine (Fe(II)-FZ) kompleksi, demir bağlama kapasitesi belirlemek amacıyla kullanılmasına karşın antioksidan tayin yöntemi olarak kullanılmamıştır. Ferrozin, demirin alçak oksidasyon basamağını o kadar kararlı kılar ki demir(III) iyonu ferrozin varlığında antioksidanları kolaylıkla yükseltger ve kendisi yüksek molar absorptiviteye sahip olan Fe(II)-FZ'ye indirgenir. Böylece birçok antioksidanların daha duyarlı tayini mümkün olur. Karmaşık antioksidan karışımlarının kapasitesini ölçmek üzere vazgeçilmez koşullardan olan `kapasitelerin toplamsallığı ilkesi'nin, geliştirilen Fe(III)-FZ yöntemi yapay antioksidan karışımlarına uygulandığında geçerli olduğu saptanmıştır. Troloksun tek başına ve bitki çayı infüzyonları içindeki kalibrasyon doğrularının paralelliğinden hareketle, bitki çayı içindeki antioksidanlarla troloks arasında uygulanan yöntem açısından Beer Kanunu'ndan kimyasal sapmalara yol açacak nitelikte bir etkileşim olmadığı gösterilmiştir. Yöntem şifalı bitki infüzyonlarına uygulanarak troloks eşdeğeri cinsinden toplam antioksidan kapasite değeri hesaplanarak sonuçlar CUPRAC (Cu(II) İndirgenme Antioksidan Kapasitesi), FRAP (Demir(III) İndirgeme Antioksidan Kapasitesi) ve Folin yöntemleriyle karşılaştırılmıştır. Bulunan sonuçlar CUPRAC yöntemindeki sonuçlar ile uyum içerisindedir.Bu çalışmanın üçüncül katkısı ise lipofilik ve hidrofilik antioksidanların birarada tayinidir. Demir (III) esaslı antioksidan kapasite tayinlerinin, ortaya çıkan kromoforların yükünden ötürü lipofilik antioksidanlara cevap vermediği bilinmektedir. Bu çalışmada ayrıca SDS katkılı ve pH'sı belirli modifiye Fe(III)-ferrisiyanür yönteminin, hidrofilikler yanında lipofilik antioksidanlara da cevap verdiği gösterilmiştir. Fe(III)-ferrisiyanür yöntemi, çözücü olarak 1:9 (v/v) su-aseton karışımı kullanılarak metil- ? -siklodekstrin (M- ? -CD) gibi oligosakkarid yapılı bir çözünme kolaylaştırıcıya gereksinim duymadan lipofilik antioksidanlara başarıyla uygulanmıştır.

Abstract:
Electron-transfer based antioxidant capacity measurement methods are widely used for the overall assessment of food antioxidants, and the conventional ferricyanide (hexacyanoferrate(III)) method is one of the widely used methods fort his purpose. The existing Ferricyanide/Prussian blue assay of reducing capacity measurement was optimized so as to obtain a more reproducible, linear and additive response from antioxidants. The modification involved the simultaneous use of ferricyanide and iron(III) to regulate more favorable redox conditions for a greater variety of antioxidants. Prussian blue precipitation was hindered with the addition of sodium dodecyl sulfate, and the optimal pH was adjusted to 1.7 to maintain the redox activity of ferric ion while preventing its hydrolysis. Incubation of the reaction mixture at room temperature for 30 min enabled more complete oxidations than observed in the conventional ferricyanide method. The order of trolox equivalent antioxidant capacities was quercetin > rosmarinic acid > gallic acid > ferulic acid ? catechin > caffeic acid ? rutin ? ascorbic acid ? trolox. Synthetic antioxidant mixtures gave the theoretically expected total antioxidant capacities conforming to Beer?s law. The assay was nonresponsive to simple sugars and citric acid (which are not true antioxidants) but responsive to biologically important thiols which are not oxidized by other Fe(III)-based assays. The assay was used in real sample solutions by using the method of standard additions to green tea, nettle, and sage, and validated against other similar antioxidant assays.A secondary antioxidant assessment method developed in this work is the ferric-ferrozine method. The magenta-coloured iron(II)-ferrozine (Fe(II)-FZ) complex showing an absorbance maximum at 562 nm has previously been utilized for iron-binding assays, but not for antioxidant determination. Ferrozine is a highly ferrous-stabilizing ligand such that ferric ion in the presence of ferrozine easily oxidizes antioxidants and is itself reduced to Fe(II)-FZ, yielding a very high molar absorptivity and thus enhanced sensitivity for most antioxidants. The Fe(III)-FZ assay was applied to synthetic antioxidant mixtures to yield additive absorbance values, which is a prerequisite for precise determination of antioxidant capacity of complex mixtures. The calibration curves (lines) of trolox and quercetin individually and in herbal infusions ?by using the method of standard additions? were parallel, confirming that the herbal antioxidants and trolox did not chemically interact among each other so as to cause apparent deviations from Beer?s law. The proposed method was applied to medicinal plant infusions for total antioxidant capacity assay as trolox-equivalents, and the results were compared to those found with CUPRAC (cupric reducing antioxidant capacity), FRAP (ferric reducing antioxidant power) and Folin total phenols assays, the highest correlation being achieved with CUPRAC.A tertiary contribution of this study is the simultaneous determination of lipophilic and hydrophilic antioxidants. Due to the high charge of the resulting chromophores in iron(III)-based assays, such assays cannot respond to lipophilic antioxidants. In this work, it has been demonstrated that the modified SDS-added and pH-optimized ferricyanide method can effectively respond to lipophilic antioxidants as well as to hydrophilic ones. Thus, the ferric-ferricyanide method has been successfully adapted to the assessment of lipophilic antioxidants in a 1:9 (v/v) water-acetone solvent mixture without necessitating the use of a solubility enhancer such as methyl- ? -cyclodextrin (M- ? -CD) oligosaccharide.