Doku mühendisliğinde malzemeye ve hücresel özelliklere ait imgelerin görüntü işleme teknikleri ile değerlendirilmesi
Assessement of images related to materials and cellular features in tissue engineering by image processing techniques
Yazar: TANSEL UYAR
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU ; DR. ÖĞR. ÜYESİ AYKUT ERDAMAR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences
Dizin: Görüntü analizi = Image analysis ; Görüntü bölütleme = Image segmentation ; Görüntü işleme = Image processing ; Görüntü işleme algoritmaları = Image processing algorithms ; Görüntü işleme yöntemleri = Image processing methods

Özet:
Görüntü işleme teknikleri, çeşitli görüntüleme tekniklerine ait imgelerden kantitatif bilgilerin elde edilmesinde sıklıkla kullanılmaktadır. Doku mühendisliği ve hücre biyolojisi alanındaki imge analizleri, uzmanlık gerektiren ve zaman alan bir süreçtir. Aynı zamanda analizlerin subjektif sonuçları içerme olasılığı da yüksektir. Bu nedenle, bilgisayarlı öğrenme/görme tabanlı uygulamalar son yıllarda hızla gelişmektedir. Gelişen uygulamalar sayesinde, kullanıcı bağımlı yazılımlar (ImageJ, DiameterJ vb.) yerine yarı-otomatik ya da tam-otomatik yazılımlar tercih edilmektedir. Kullanıcı etkisinin azaltılması amacıyla tercih edilen otomatikleştirilmiş yazılımlar ile tekrarlanabilir sonuçlar elde edilerek, çalışma sonuçlarının doğru yorumlanması sağlanmaktadır. Otomatikleştirilmiş yazılım kullanımı, araştırmanın gelecek çalışmalarında yanlış yönlendirmeyi de önlemektedir. Hücre ve doku mühendisliği çalışmalarında otomatikleştirilmiş yazılımlar kullanılarak, hücre ve malzemeye ait özelliklerin belirlenmesinde çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Bu çalışmalarda, hücre tipi, hücre canlılığı ve hücre sayısı gibi hücreye ait özelliklerle birlikte fiber çapı, fiber yönelimi ve gözenek büyüklükleri gibi malzemeye ait özellikler de incelenmiştir.
Sunulan tez çalışması iki bölümden oluşmaktadır. Birinci bölümde kemik doku rejenerasyonunun hedeflendiği bir araştırmada kullanılmak üzere hücre canlılığı analizi gerçekleştirebilen bir yazılım tasarlanmıştır. Bu yazılımla, hücrelerin doku iskelesindeki canlılıklarının, iskele derinliğine bağlı incelenmesine olanak sağlanmaktadır. Geliştirilen yazılım ile ölü ve canlı hücrelere ait alan yüzdeleri hesaplanabilmektedir. Bu yazılımın test edilebilmesi için 35 imgelik bir veri seti oluşturulmuştur. Oluşturulan veri seti, aljinat ve aljinat-hidroksiapatit (HAp) doku iskelelerine ait lazer taramalı konfokal mikroskobu (LTKM) ile görüntülenmiş hücre kültür imgelerini içermektedir. Tasarlanan algoritma ile iki ayrı analiz gerçekleştirilmiştir. İlk analizde, algoritma ölçüm sonuçları, dört farklı analistin ImageJ ölçüm sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Analist ölçümlerinin ortalaması ile algoritma ölçümlerinin benzeştiği tespit edilmiştir. Ayrıca, analistlerin kendi aralarındaki ölçüm farklılıkları varyasyon katsayısı (ölçüm sapması) hesaplanarak incelenmiştir. Varyasyon katsayısı değerlerinin, canlı hücre imgelerinde %13,18 ile %98,34 arasında, ölü hücre imgelerinde ise %9,75 ile %126,02 arasında değiştiği belirlenmiştir. İkinci analizde ise, üç ayrı doku iskelesine (aljinat-HAp, geleneksel jelatin-metakrilat (Jel-MA) ve mikrodalga destekli Jel-MA) ait hücre canlılığının derinliğe bağlı değişimi incelenmiştir. Bu inceleme sonucunda, maksimum hücre canlılıkları mikrodalga destekli Jel-MA, aljinat-HAp ve geleneksel Jel-MA iskeleleri için sırasıyla 63 μm, 72 μm ve 90 μm derinliklerinde tespit edilmiştir.
Tez çalışmasının ikinci bölümünde, nanofiber ya da mikro metal çubuk yapılardan oluşan doku iskelelerinin fiziksel özelliklerinin incelenebildiği bir yazılım geliştirilmiştir. Bu yazılımın test edilebilmesi için 46 imgelik bir veri seti oluşturulmuştur. Oluşturulan veri seti, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görüntülenmiş nanofiber ve mikro metal çubuk imgelerini içermektedir. Farklı parlaklık ve karşıtlık özelliklerine sahip 46 adet imgenin bölütlenebilmesi için üç farklı bölütleme yöntemini içeren uyarlamalı bir yaklaşım tasarlanmıştır. Tasarlanan algoritmada kümeleme, yerel eşikleme ve histograma bağlı eşikleme gibi yöntemleri içeren üç farklı bölütleme yöntemi bulunmaktadır. Tasarlanan yazılımın bölütleme sonuçları, DiameterJ yazılımına ait bölütleme sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Sonuçlar yapısal benzerlik ölçüm (YBÖ) indeksi olarak adlandırılan bir fonksiyon ile karşılaştırılmıştır. Kırkaltı (46) adet imgeye ait bölütleme sonuçları içinde, tasarlanan algoritma 27 adet imgede ve DiameterJ yazılımı ise 19 imgede en iyi sonuçları elde etmiştir. Karşılaştırma süreci sonrasında, doku iskelelerinin bölütlenmiş imgelerinde fiziksel özellikler analiz edilmiştir. Her bir doku iskelesine ait fiber yapı özellikleri (çap aralığı ile çap dağılımı, minimum ve maksimum çap değeri) ile gözenek yapı özellikleri (minimum, maksimum gözenek alanı ve toplam gözenek yüzdesi) tespit edilmiştir.

Abstract:
Image processing techniques are frequently used to obtain quantitative information from images of various imaging techniques. Image analysis in tissue engineering and cell biology is a time-consuming and specialized process. In addition, evaluation of the results may be subjective. Therefore, computer-based learning/vision-based applications have been developed rapidly in recent years. Instead of user-dependent software (ImageJ, DiameterJ etc.), semi-automatic or full-automatic software is preferred depending on these applications. Repeatable results are obtained with the preferred automated softwares to reduce the user effect, and the correct interpretation of the results is ensured. The use of automated software also prevents the researcher from misleading in future work. There are various studies in cell and tissue engineering using automated software to determine cell and material properties. In these studies, characteristics of cells such as cell type, cell viability, cell number and properties of fiber such as fiber diameter, fiber orientation, pore size were investigated.
This study consists of two parts. In the first part, a software is designed that can perform cell viability analysis for use in an investigation targeting bone tissue regeneration. It is possible to examine the viabilities of the cells in the tissue scaffold depending on the depth of the scaffold using this software. The percentage of dead and live cell area can be calculated with the developed software. In order to test this software, a data set of 35 images was created. The generated data set includes cell culture images of alginate and alginate-hydroxyapatite tissue scaffolds visualized with laser scanning confocal microscopy (LSCM). Two different analyzes were performed with the designed algorithm. In the first analysis, the algorithm measurement results were compared with the ImageJ measurement results of four different analysts. It has been determined that the average of the analyst measurements is similar to the algorithm measurements. In addition, inter-analyst variabilities of measurements were examined by calculating the coefficient of variation (measurement deviation). The variation of coefficient values was determined from 13.18% to 98.34% for living cell images and from 9.75% to 126.02% for dead cell images. In the second analysis, the depth-dependent variation of cell viability of three different tissue scaffolds (alginate-HAp, conventional gel-MA and microwave-assisted gel-MA) was examined. As a result of this investigation, the maximum cell viability was determined at 63 μm, 72 μm and 90 μm depths for microwave-assisted gel-MA, alginate-HAp and conventional gel-MA scaffolds, respectively.
In the second part of the study, a software was developed to examine the physical properties of tissue scaffolds composed of nanofiber or micro metal rod structures. In order to test this software, a data set of 46 images was created. The generated data set includes images of nanofibers and micro metal rod visualized by scanning electron microscopy (SEM). An adaptive approach was designed that includes three different segmentation methods for segmenting 46 images with different brightness and contrast properties. The designed algorithm has three different segmentation methods including clustering, local thresholding and histogram-dependent thresholding. The segmentation results of the designed software are compared with the segmentation results of open source code DiameterJ software. The results were compared with a function called structural similarity index measurement (SSIM). In the results of segmentation of 46 images, the designed algorithm obtained the best results for 27 images and DiameterJ software obtained the best results for 19 images. After the comparison process, the physical properties were analyzed in the segmented images of the tissue scaffolds. The pore structure properties (minimum, maximum pore size and total pore percentage) and the fiber structure properties (diameter range, diameter distribution, minimum and maximum diameter value) of each tissue scaffold were determined.