Nötrofil hücre dışı tuzaklarının oluşumunda (NETosis) DEK proteininin rolünün araştırılması
Investigation of the relationship between DEK protein and NETosis formation
Yazar: İRFAN BAKİ KILIÇ
Danışman: PROF. DR. AYTEN KANDİLCİ
Gebze Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
DEK proteini ilk olarak kromozomal translokasyon sonucu DEK-NUP214 kimerik
geni ile keşfedilmiştir. Yoğunlukla kromatine bağlı halde çekirdekte bulunmasına
rağmen post translasyonel modifikasyonlar sonucu DNA'ya olan afinitesini
kaybederek hücre dışınan aktif ve pasif olarak serbest ya da eksozomlar aracılığı ile
salınır. Salgılanan DEK proteini nötrofiller ve T hücreleri için kemo-çekici fonksiyon
gösterir. Aynı zamanda CXCR1/2 reseptörlerine bağlanabilen IL-8 (CXCL8) gibi
kemokinlere benzer ELR motifi taşıyan DEK, hematopoietik kök hücrelerin
proliferasyonunu CXCR2 aracılığı ile düzenler. Juvenil idiyopatik artirit hastalarının
eklemlerinde bulunan DEK ve DEK oto-antikorları ile yapılan çalışmalarda Dek geni
silinen farelerin nötrofillerinin özgün bir savunma mekanizması olan nötrofil hücre
dışı tuzaklar (NET) oluşturamadığı fakat rekombinant fare DEK (rDEK)
muamelesinin bu özelliği geri kazandırdığı görülmüştür. Otoimmün hastalıklar dışında
COVID-19'da da görev aldığı bilinen NET oluşumunda salgılanan DEK ve IL-8'in
rolü bilinmemektedir. DEK proteininin sağlıklı insan nötrofillerinde NET oluşturma
kapasitesi, rDEK ile uyarılan nötrofillerde immünofloresan boyama, morfolojik
analizler ve NET ilişkili miyeloperoksidaz analizi yapılarak ilk kez bu tez çalışmasında
gösterildi. rDEK ile uyarılan NET oluşumunun anti-DEK antikorları ve CXCR1/2
reseptörlerinin inhibitörü olan reparixin ile baskılandığı ve rDEK ile uyarılan NET
oluşumunda CXCR1/2 reseptörlerinin rol oynadığı belirlendi. Ardından sağlıklı
bireylerde (kontrol; n=60) ve hem akut (n=23) hem de konvalesan (n=45) evredeki
COVID-19 hastalarının serumlarında DEK, inflamatuvar sitokinler ve NET
belirteçlerinin konsantrasyonu ELISA yöntemiyle tespit edildi; incelenen sitokin ve
NET belirteçleri arasında korelasyon olduğu (DEK proteini ile sağlıklı bireylerdeki
IL-8, akut evre bireylerdeki IL-1β ve MPO, ve tüm COVID-19 hastaları beraber
incelendiğinde MPO ile negatif; konvalesan evre bireylerdeki IL-1β, tüm COVID-19
hastaları beraber incelendiğindeki IL-6 ve IL-1β ile pozitif korelasyon) tespit edildi.
Ayrıca, gerek sağlıklı insan nötrofillerinde gerekse COVID-19 hastalarının serumları
veya rIL8 ile uyarılan nötrofillerde oluşan NETosis'te, DEK proteininin beklenin
aksine çekirdekte değil, nötrofil elastaza benzer şekilde şekilde sitoplazmik
granüllerde lokalize olduğu ve NET yapılarında ancak eser miktarda yer aldığı
gösterildi. Son olarak COVID-19 hasta serumlarının sağlıklı nötrofillerde NETosisi
uyarmasında DEK ve IL-8 konsantrasyonlarının belirleyici rol oynadığı ve NET
oluşumunun anti-DEK ve anti-IL-8 antikorlarına ek olarak reparixin ile de
baskılanabildiği gösterildi.
Bu tez çalışması TÜBİTAK 120S979 projesi ile desteklenmiştir.

Abstract:
DEK protein was first discovered through the DEK-NUP214 chimeric gene as a result
of chromosomal translocation. Although it is mostly found in the nucleus bound to
chromatin, DEK loses its affinity for DNA as a result of post-translational
modifications and is released from outside the cell, actively or passively, and free or
through exosomes. Secreted DEK protein functions as a chemoattractant for
neutrophils and T cells. DEK, which carries an ELR motif similar to chemokines such
as IL-8 (CXCL8), which can also bind to CXCR1/2 receptors, regulates the
proliferation of hematopoietic stem cells through CXCR2. Interestingly, in studies
conducted with DEK and DEK auto-antibodies found in the joints of Juvenile
Idiopathic Arthritis patients, it was observed that neutrophils of mice with DEK gene
deletion are unable to form neutrophil extracellular traps (NET), a neutrophil-specific
defense mechanism, but mouse recombinant DEK (rDEK) treatment restored this
feature. The role of secreted DEK and IL-8 in NET formation, which plays a role in
COVID-19 as well as autoimmune diseases, is still unknown. In this thesis study, the
NET-forming capacity of the DEK protein was demonstrated, first time, by stimulating
NETosis with rDEK in healthy neutrophils evaluated morphologically by
immunofluorescence staining, and enzymatically by NET-associated myeloperoxidase
analysis. This effect was confirmed by suppressing rDEK-induced NET formation
with anti-DEK antibodies and Reparixin which shows CXCR1/2 receptors play a role
in rDEK-induced NET formation. Then, the concentration of DEK, cytokine, and NET
markers in the serum of healthy individuals and COVID-19 patients in both acute and
convalescent stages were determined by the ELISA method, and correlations were
found between DEK and the examined cytokine and NET markers that could be
associated with NET formation and prognosis of the disease. In addition, in COVID-
19 serum and rIL8-stimulated neutrophils, DEK protein, contrary to expectations, was
found not in the nucleus but in the granules, showing a similar localization with
neutrophil elastase, but it was observed that it did not participate in NET structures or
was included in trace amounts. Finally, it has been shown that DEK and IL-8
concentrations play a decisive role in the stimulation of NETosis in healthy neutrophils
of COVID-19 patient sera and that NET formation can be suppressed by reparixin in
addition to anti-DEK and anti-IL-8 antibodies.
This thesis work was supported by TUBITAK 120S979 grants.