Uyuşturucu madde analizinde tükürük, idrar, kan örneklerinde kullanılan tarama ve doğrulama yöntemlerinin laboratuvar ve klinik bakış açısından değerlendirilmesi
The evaluation of screening and verification methods used in saliva, urine, blood samples in the drugs analysis in terms of laboratory and clinical view
Yazar: GAMZE AVCIOĞLU
Danışman: PROF. DR. FATMA MERİÇ YILMAZ
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Biyokimya = Biochemistry ; Uyuşturucu Alışkanlığı ve Alkolizm = Drug Addiction and Alcoholism
Dizin: Kan = Blood ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Madde kullanım bozuklukları = Substance-related sdisorders ; Narkotik bağımlılığı = Narcotic dependence ; Narkotikler = Narcotics ; Tükürük = Saliva ; Yöntemler = Methods ; İdrar = Urine

Özet:
Madde kullanım bozukluğu bireyde ve toplumda oldukça önemli psikolojik, ekonomik ve sosyolojik problemlere yol açmaktadır. Türk Ceza Kanunu'nun 191. maddesinde uyuşturucu/uyarıcı madde kullanmanın yasak olduğu ve tedavi veya Denetimli Serbestlik tedbirine uyulmaması durumunda iki yıldan beş yıla kadar hapis cezası ile cezalandırılmasının söz konusu olacağı hükmü yer almaktadır. Dolayısıyla uyuşturucu/uyarıcı maddelerin doğru ve kesin bir şekilde tespit edilmesi çok önemlidir. 
Uyuşturucu/uyarıcı maddelerin taranmasında immün yöntemler, doğrulanmasında kromatografi ve kütle spektrometri yöntemi kullanılmaktadır. Madde kullanım bozukluğu olan ya da Denetimli Serbestlik tedbirine tabi tutulan bireylerin tedavileri AMATEM kliniklerinde yapılmakta olup bireylerin idrar örneklerinde immün yöntem ile uyuşturucu/uyarıcı madde taraması yapılmaktadır. Trafikte ise bireyin uyuşturucu/uyarıcı madde etkisi altında olup olmadığının değerlendirilmesinde tükürükte POCT cihazı ile esrar, eroin, kokain, amfetamin ve benzodiazepinlerin taraması yapılmaktadır. Bu immün yöntemlerden elde edilen pozitif tarama sonuçları gerek görülmesi durumunda Adli Tıp kurumlarında LC-MS/MS yöntemi ile doğrulanmaktadır.
Trafikte uyuşturucu madde taramasında kullanılan POCT yönteminin ve AMATEM kliniğinde kullanılan immün yöntemin güvenilirliği ilk kez bu çalışma ile test edilmiştir. Ülkemizde kullanılan bu iki tarama yönteminin sonuçları ticari kit ve laboratuvarda geliştirilen yöntem kullanılarak LC-MS/MS cihazı ile plazma ve idrar örneklerinde doğrulanmıştır. Çalışmamızda trafik uygulamasında deneme aşamasında olan ve Denetimli Serbestlik kurumlarında da kullanımına ihtiyaç duyulan POCT cihazı açısından anlamlı veriler elde edilmiştir. Kullandığımız POCT cihazının spesifitesi yüksek olarak saptanmış, ancak sensitivitesi eroin, kokain ve amfetamin maddeleri için iyi, MDMA/metamfetamin için yetersiz olarak saptanmış olup benzodiazepinler ve esrar için tükürük testinde pozitif sonuç saptanamadığından sensitivite hesaplanamamıştır. 
AMATEM kliniğinde kullanılan immün yöntemin ise amacına uygun olarak yeterli sensitivitede olduğu gözlenmiş olup çapraz reaksiyona bağlı spesifite problemlerinin olabildiği göz önünde bulundurulmalıdır. AMATEM'de kullanılan immün yöntemin cut-off limitinin opiyatlar için 300 ng/mL yerine SAMHSA'nın da önerdiği şekilde 2000 ng/mL olarak kullanılması durumunda yöntemin spesifitesinin %83'ten %95'e yükseldiği saptanmıştır. Bu nedenle yalancı pozitif sonuçların ve doğrulamaya giden örnek sayısının azaltılması adına opiyatlar için 2000 ng/mL cut-off limitinin kullanılması önerilir.
Çalışmamızda idrar ve kan örneklerinde ticari kit ve laboratuvarda geliştirilen LC-MS/MS doğrulama yöntemleri iki farklı cihazda karşılaştırılmış ve validasyon parametreleri hesaplanmıştır. Çalışmamız ayrıca LC-MS/MS yöntemlerine ait iyonizasyon modu, ekstraksiyon yöntemi, kullanılan standartlar gibi farklılığa neden olabilecek birçok parametre açısından anlamlı veriler içermektedir.
Sonuç olarak uyuşturucu/uyarıcı madde analizinde verilen pozitif ya da negatif sonucun kişinin tutuklanmasına kadar gidecek adli sürecin bir parçası olduğunun akıldan çıkarılmaması önemlidir. Yapılan analizlerin analitik aşamada validasyonu ve verifikasyonu kadar madde özelinde kullanım zamanının ve analizin yapıldığı örnek tipinin sonuca etkisini de iyi bilerek değerlendirmeyi buna göre yapmak elzemdir. Ayrıca kullanım amacına özel POCT cihazlarının geliştirilmesi ve mutlaka geliştirilen her cihazın performans değerlendirmesinin de yapılması gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: madde ile ilişkili bozukluklar, yöntem karşılaştırma, hasta başı test cihazı, immün yöntem, LC-MS/MS yöntemi

Abstract:
Substance abuse causes significant psychological, economic and sociological problems in the individual and society. Article 191 of the Turkish Penal Code states that the use of drugs/stimulants is prohibited and that if the treatment or probation measure is not followed, it will be punishable by imprisonment from two to five years. Therefore, it is very important that the drugs/stimulants are identified correctly and precisely.
Immunological methods are used for screening drugs/stimulants, chromatography and mass spectrometry are used for verification. The treatment of individuals with substance use disorder or who have been subjected to Probation measure is carried out in AMATEM clinics and the individuals' urine samples are screened by immunoassays. On the other hand,  cannabis, heroin, cocaine, amphetamine and benzodiazepines are screened in saliva with the help of POCT device to assess whether the individual is driving under the influence of drugs/stimulants in the saliva. Positive screening results obtained from these immune methods are confirmed by LC-MS/MS method in Forensic Medicine institutions if necessary.
The safety of the POCT method used in traffic drug screening and the immune method used in AMATEM clinic was tested for the first time in this study. The results of these two screening methods used in our country were confirmed by LC-MS/MS device in plasma and urine samples by using commercial kit and laboratory developed method. In our study, significant data were obtained in terms of POCT device which is in trial phase in traffic application and needed to be used in probation institutions. The specificity of our POCT device was found to be high, but the sensitivity was good for heroin, cocaine and amphetamines, insufficient for MDMA/methamphetamine, and because of the positive results in the saliva test for benzodiazepines and cannabis, the sensitivity could not be calculated.
It is observed that the immune method used in AMATEM clinic has sufficient sensitivity in accordance with its purpose and it should be considered that there may be specificity problems due to cross reaction. When the cut-off limit of the immunostaining method used in AMATEM was used as 2000 ng/mL, as suggested by SAMHSA instead of 300 ng/mL for opiates, the specificity of the method increased from 83% to 95%. It is therefore recommended to use a cut-off limit of 2000 ng/mL for opiates to reduce false positive results and the number of samples leading to validation.
In our study, validation methods of urine and blood samples LC-MS/MS validation parameters developed in the commercial kit and laboratory were compared and calculated. Our study also contains meaningful data in terms of many parameters that may cause differences such as ionization mode, extraction method and standards used in LC-MS/MS methods.
As a result, it is important to keep in mind that the positive or negative result given in the drugs/stimulant analysis is part of the judicial process leading to the arrest of the person. As well as validation and verification of the analyzes performed at the analytical stage, it is essential to evaluate the effect of the usage time and the type of the sample on the result by knowing the results accordingly. In addition, it is necessary to develop specific POCT devices and to evaluate the performance of each device developed.
 Key words: substance-related disorders, method comparison, POCT testing, immune method, LC-MS/MS method