Filamin proteinlerinin hücrelerdeki işlevlerinin araştırılması
Investigation of filamin protein functions in cells
Yazar: REZA SALIMI
Danışman: DOÇ. DR. NİLGÜN YENER
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Aktinler = Actins ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Filamin = Filamin ; Hücre iskeleti = Cytoskeleton ; Kalpain = Calpain ; Kalpeptin = Calpeptin ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Amaç: Filaminler, çok fazla miktarda eksprese edilen, aktin bağlayıcı büyük proteinlerdir ve F-aktin'in üç boyutlu yapısını sağlamca kuvvetlendirerek hücre zarına bağlanmasını sağlarlar. Filaminler içinde, filamin A (FLNA) en çok bulunan izoformdur ve yaygın olarak insan dokularında eksprese olmaktadır. Kalpain, FLNA'yı tercihen menteşe 1 ve 2 (H1, H2) bölgesinden keser ve karboksil terminal uç içeren FLNACT'yi üretir. Kalpeptin ise, FLNA'nın kesilmesinden sorumlu bir kalpain 1 ve 2 inhibitörüdür. Bu çalışmanın amacı, FLNA'nın kesilmesinin engellenmesiyle, hücrenin proliferasyon, migrasyon, invazyon ve koloni oluşturma yeteneklerini, azaltabileceğimiz yönündeki hipotezimizi test etmektir. Böylece kalpeptin'in kanser dokularının büyümesini ve yayılmasını engelleyerek tedavi edici bir rolünün olup olmadığının anlaşılması hedeflenmiştir. Ayrıca, FLNA'nın hücredeki işlevinin belirlenmesi ve kalpeptin gibi inhibitör moleküllerin tanımlanması, kanser tedavilerinde kullanılacak daha etkili ilaçların geliştirilmesine de çok büyük katkılar sağlayacaktır.

	Yöntem: Bu çalışmada A7 (İnsan Melanoma), PC3 (İnsan prostat kanser), T241 (Fare fibroblast, fibrosarkoma) ve MS1 (Fare endotel) hücre hatları kullanarak; hücre kültürü, western blot, proliferasyon, migrasyon, invazyon ve koloni oluşturma deneyleri yapıldı.  

 	Bulgular: Kalpeptin varlığında, hücrelerin proliferasyon, migrasyon, invazyon ve koloni oluşturma yeteneklerinde kontrol guruba kıyasla anlamlı olarak azalma gözlendi. Veriler ortalama ± SD değerleri olarak gösterildi ve n = 3 olarak alındı. Gruplar arası istatistik analizinde unpaired two-tailed Student t testi kullanıldı.

      	Sonuç: Bu çalışmanın sonucu, kalpeptin'in, FLNA'yı eksprese eden kanser hücrelerinde kalpain'e bağlı olarak oluşan FLNACT üretimini azalttığını gösterdi. Öte yandan, azalmış FLNACT üretimine sahip hücreler, anlamlı olarak (p<0.05) daha az migrasyon, invazyon, proliferasyon ve koloni oluşturma yeteneği gösterdiler. Bu veriler ayrıca, FLNACT fragmanının, hücrelerin proliferasyon, migrasyon, invazyon ve koloni oluşturmalarında önemli düzenleyicilerden biri olduğunu da göstermiştir. 
      Araştırma deneysel niteliktedir ve deneysel kısım Göteborg Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Anabilim Dalı Laboratuarlarında, 2014-2017 yılında yapılmıştır.

Anahtar Sözcükler: Filamin, Filamin A, Kalpain, Kalpeptin, Proliferasyon, Migrasyon, İnvazyon, Koloni oluşturma, Kanser.

Abstract:
Objective: Filamins are large actin-binding proteins that stabilize three-dimensional actin filament networks and link them to cellular membranes where they integrate cell architectural and signaling functions important for cell locomotion. Filamin A (FLNA) is the most abundant and widely expressed isoform in human tissues. Endogenous 90 kDa Carboxyl-terminal (CT) (FLNACT) is produced by cleavage in hinge 1 (H1) and hinge 2 (H2) sites by calpain. Carboxyl-terminal (CT) fragment of the cytoskeletal protein FLNA transports to the cell nucleus and stimulates cell transcription. Calpeptin is a calpain 1 and 2 inhibitor, which is responsible for FLNA cleavage. Identification of FLNACT roles in cell migration and invasion may help to develop more effective cancer therapies.

	Method: Human melanoma (A7), prostate cancer (PC3), mouse fibrosarcoma (T241) and endothelial (MS1) cells were assayed for proliferation, migration, invasion and colony formation after treatment with calpeptin.

	Results: In all cell lines, for calpeptin treated group we found less migration, invasion, proliferation and colony forming ability compared to the controls. 

	Conclusion: The result of this study showed that calpeptin reduces FLNACT production by calpain cleavage in multiple cancer cells that express FLNA. On the other hand, cells with reduced FLNACT production showed significantly (p<0.05) less migration, invasion, proliferation and colony forming ability. These data suggest that FLNACT is one of the important regulators in cell proliferation, migration, invasion and colony forming.

       This experimental study was carried out through 2014-2017 in Department of Medical Biochemistry and Cell Biology, Institute of Biomedicine, University of Gothenburg.

Key Words: Filamin, Filamin A, Calpain, Calpeptin, Prolifaration, Migration, İnvasion, Colony Forming, Cancer.