Mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasının bor katkılı HAp-kaplı kitosan doku iskelelerinde incelenmesi
Investigation of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells on boron containing HAp-coated chitosan scaffolds
Yazar: INCİ ŞIKHALİYEVA
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasının amacı, osteoindüktif özelliğe sahip bor katkılı hidroksiapatit kaplı kitosan (B-HAp/kitosan) doku iskeleleri üzerinde iki farklı kaynaktan elde edilen (kemik iliği ve yağ dokusu) mezenkimal kök hücrelerin in vitro osteojenik farklılaşma potansiyellerinin incelenmesidir.
Tez çalışmasının ilk aşamasında dondurarak-kurutma yöntemiyle 100 µm gözenek çapına sahip kitosan doku iskeleleri hazırlanmıştır. Ardından hazırlanan bu iskeleler, mekanik ve biyoaktif özelliklerini arttırmak amacı ile mikrodalga enerjisi yardımı ile yapay vücut sıvısı (10xSBF) ve bor katkılı yapay vücut sıvısı (B-SBF) kullanılarak sırasıyla HAp ve B-HAp ile kaplanmıştır. Çalışmanın sonraki aşamasında, adipoz doku ve kemik iliğinden mezenkimal kök hücre izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Hücre canlılığı Presto Blue analizi ile, hücre morfolojisi 
F-aktin/DAPI ve kristal viyole boyamaları ile incelenmiştir. Hücrelerin sağlıklı oldukları ve multipotensi özelliklerini kaybetmedikleri senesens boyaması ile gösterilmiştir. Mezenkimal kök hücrelerin multipotensi özelliklerini incelemek için çalışmalar, büyüme ve farklılaşma ortamı olmak üzere iki farklı koşulda yürütülmüştür. Oil Red O boyaması ile hücrelerde yağ doku farklılaşmasını gösteren hücre içi yağ damlacıkları belirlenmiştir. Osteojenik farklılaşmanın göstergesi olan matris mineralizasyonu alkalin fosfataz-von Kossa (ALP/VK) boyaması ile gösterilmiş ve zamanla mineralize nodüllerin çoğaldığı tespit edilmiştir. Kondrojenik farklılaşma, Safranin O/Fast Green boyaması ile gösterilmiştir. Adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelere özgü yüzey belirteçleri akış sitometrisi analizi ile belirlenmiştir. Böylece, çalışmada kullanılacak kemik iliği (KiMKH) ve adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin (AKH) karakterizasyonu tamamlanmıştır.
Tez çalışmasının son aşamasında, izole edilen mezenkimal kök hücrelerin 
B-HAp/kitosan doku iskeleleri üzerindeki üreme ve osteojenik farklılaşmasının incelenmesi için durgun koşullarda in vitro hücre kültür çalışmaları yürütülmüştür. Doku iskeleleri üzerinde hücre canlılığı ve üremesi MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analizi, hücrelerin morfolojik özellikleri ise taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile değerlendirilmiştir. Hücrelerin osteojenik farklılaşma belirteçleri olan kollajen tip I, RunX2, osteonektin ve osteopontin gen ifadeleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile tespit edilmiştir. AKH'ler ile elde edilen sonuçlar bor katkılı hidroksiapatit kaplı kitosan doku iskelesinin bu hücrelerin yapışmasını, çoğalmasını ve farklılaşmasını desteklediği yönündedir. KiMKH ile yapılan çalışmaların sonuçları AKH'lerinki ile karşılaştırıldığında KiMKH'lerin iskelelere daha az sayıda tutundukları görülmüştür.
Sonuç olarak sunulan tez çalışmasında bor katkılı HAp'in özellikle AKH'lerin doku iskeleleri üzerinde üreme ve osteojenik farklılaşma potansiyelini önemli derecede etkilediği görülmüştür.

Abstract:
The aim of the present study is to investigate in-vitro osteogenic potential of mesenchymal stem cells, isolated from two different sources (bone marrow and adipose tissue), on boron doped hydroxyapatite (HAp) coated chitosan 
(B-HAp/chitosan) scaffolds with osteoinductive properties.
In the first part of the study, chitosan scaffolds, which have approximately 100 μm pore diameter, were prepared by freeze-drying technique. In order to enhance the mechanical and bioactive properties of the scaffolds, they were coated with HAp and B-HAp through the aid of microwave energy by using 10xSBF (simulated body fluid) and boron containing 10xSBF (B-SBF).  In the following part of the study, mesenchymal stem cells were isolated from adipose tissue and bone marrow. 
The cell viability was evaluated by Presto Blue analysis, cell morphology was investigated by F-actin/DAPI and crystal violet staining. The cells aging and maintenance of multipotency of the cells were visualized by senescence staining. Intracellular fat droplets which show adipogenic differentiation were demonstrated by Oil Red O staining. Matrix mineralization which shows osteogenic differentiation was visualized by alkaline phosphatase-von Kossa (ALP-VK) staining and it was detected that mineralized nodules were getting increased by time. Differentiation into the chodrogenic lineage was demonstrated by Safranin O/Fast Green staining. Specific surface markers of adipose derived mesenchymal stem cells (AdMSCs) were demonstrated by flow cytometry analysis. Thus, isolation and characterization studies of bone marrow stem cells (BMSCs) and AdMSCs used in this study were completed.
In the last part of this study, the proliferation and osteogenic differentiation of AdMSCs and BMSCs on chitosan, HAp/chitosan and B-HAp/chitosan scaffolds were investigated by in vitro cell culture studies, under static conditions. 
Cell viability and proliferation were analyzed by MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay and morphological examination was done with scanning electron microscopy (SEM). Osteogenic differentiation markers, collagen type I, RunX2, osteonectin and osteopontin expression levels of the cells were determined using real time polymerase chain reaction (RT-PCR). The results showed that boron doped HAp coated chitosan scaffolds supported adhesion, proliferation and differentiation of AdMSCs. The results of cell culture studies showed that there were fewer BMSCs attached onto the scaffolds compared with AdMSCs.