Hücre ölüm yolaklarının tespiti için kağıt tabanlı biyosensör tasarımı
Paper-based biosensor design for detection of cell death paths
Yazar: RUMEYSA AKÇAPINAR
Danışman: PROF. DR. LOKMAN UZUN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells

Özet:
Sunulan tez kapsamında, apoptozun erken (ekstrinsik yolak) ve geç (instrinsik yolak) safhasının tespitinde kullanılmak üzere kağıt tabanlı biyosensör tasarımı gerçekleştirilmiştir. Çalışmada geleneksel apoptoz tayin yöntemlerinin yüksek maliyet, büyük hacimlerdeki örneklem gereksinimi, uygun laboratuvar ve ekipman koşulları gibi dezavantajları bertaraf etmek için daha ucuz, kolay, düşük hacimlerde örneklem kullanımı sağlayan ve daha hassas kantitatif sonuçlar veren kağıt tabanlı bir sistem geliştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında; ilk olarak örneklem ile etkileştirilecek manyetik nanopartiküllerin sentezi ve primer kaspaz antikorlarının bu nanopartiküllerin yüzeyine immobilize edilmesi gerçekleştirilmiş ve taramalı elektron mikroskobu (SEM), Zeta potansiyel ve boyut ölçümü, Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR), Termogravimetrik Analiz (TGA), Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) ile karakterize edilmiştir. Primer antikor immobilize manyetik nanopartiküllerin standart kaspaz proteinleriyle oluşturduğu kompleksin optimizasyonu ve seçicilik çalışmaları HPLC sistemi ile incelenmiştir. Optimizasyon çalışmaları kapsamında pH: 7.4'te protein konsantrasyonları (11,2-0,7 mg/mL), optimal süre (5-90 dk), sıcaklık (4-42°C) parametreleri incelenmiştir. Optimal koşullar pH: 7.4, konsantrasyon; 5,6 μg/mL, süre: 45 dk ve sıcaklık: oda sıcaklığı olarak belirlenmiştir. Seçicilik çalışmaları kapsamında ise yarışmacı proteinlerin ( Kaspaz-3, Kaspaz-8, Kaspaz-9 ve lizozim) adsorbsiyonu araştırımıştır. Aynı yarışmacı proteinler kontrol grubu olarak antikor immobilize edilmeyen manyetik nanopartiküllerle de etkileştirilmiştir. Daha sonra toplama bölgesine immobilize edilecek upconversion silika nanopartiküllerin sentezi ve bu partiküllere sekonder antikorun immobilizasyonu gerçekleştirilmiş ve taramalı elektron mikroskobu (SEM), Zeta potansiyel ve boyut ölçümü, Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR), Termogravimetrik Analiz (TGA), Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) ile karakterize edilmiştir. Ardından primer antikor immobilize edilmiş manyetik nanopartiküllerle optimal koşullarda muamele edilmiş standart kaspaz proteinlerinin, sekonder antikor immobilize edilmiş upconversion silika nanopartiküllerle dispersiyon ortamında oluşturduğu suprakompleksin zeta potansiyel ve boyut ölçümü ve florasan emisyon spektrometresi analizi gerçekleştirilmiştir. Bu analizlerin sonucunda dispersiyon ortamında oluşan sandviç ELISA modelinin upconversion özelliğini koruduğu ve yapıya katılan protein miktarının artmasıyla bu özellikten kaynaklı emisyon yoğunluklarında düşüş olduğu gözlenmiştir. Bu da kantitatif bir sonuç elde edilebilmesini sağlamıştır. Çalışmanın ikinci aşamasında hücre deneyleri gerçekleştirilmiştir. Bu kapsamda 100 μM Cisplatin ile muamele edilen ve edilmeyen MCF-7 meme kanseri hücre hattı kullanılmış ve bu hücrelerin lizatından elde edilen proteinler tasarlanan sistem ile dispersiyon ortamında analiz edilerek kaspaz protein miktarları saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar geleneksel apoptoz tayin yöntemleri ile (İkili boyama, Annexin-v, MTT) karşılaştırılmıştır. Çalışmanın üçüncü aşamasında ise kağıt tabanlı sistem tasarlanmıştır. Bu amaçla, kullanılacak olan kağıt boyutu, üzerinde toplama bölgesine immobilize edilecek sekonder antikor immobilize upconversion slika nanopartikül hacmi (2,5-12,5 μL) ve örnek bölgesinden uzaklığı, örnek bölgesine damlatılacak primer antikor immobilize manyerik nanopartiküllerin hacmi (10-100μL) belirlenmiştir. Ardından dispersiyon ortamında standart kaspaz proteinlerle ve hücre lizatlarıyla gerçekleştirilen çalışmalar kağıt üzerinde incelenmiştir. Dispersiyon ortamından elde edilen sonuçlar ile kağıt üzerinde gerçekleştirilerek elde edilen sonuçlar karşılaştırılarak validasyon yapılmıştır. Tüm bu çalışmaların sonucunda tasarlanan kağıt tabanlı sistem ile geleneksel yöntemlerden daha hassas ve güvenilir sonuçlar elde edilebileceği gösterilmiştir.

Abstract:
The aim of the presented thesis, a paper-based biosensor design has been designed to be used in the detection of early (extrinsic pathway) and late (instrinsic pathway) stages of apoptosis. In the study, in order to eliminate the disadvantages of traditional apoptosis determination methods such as high cost, large sampling requirement, appropriate laboratory and equipment conditions, a paper-based system was developed that is cheaper, easier, and provides more precise quantitative results. In the first phase of the study, firstly, the synthesis of magnetic nanoparticles to be interacted with the sample and immobilization of primary caspase antibodies on the surface of these nanoparticles were performed and characterized with the scanning electron microscopy (SEM), Zeta potential and size measurement, Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR), Thermogravimetric Analysis (TGA), Differential Scanning Calorimeter (DSC). Optimization and selectivity studies of the complex formed by primary antibody immobilized magnetic nanoparticles with standard caspase proteins were examined by HPLC system. Within the scope of optimization studies, protein concentrations (11.2-0.7 mg / mL), optimal duration (5-90 min), temperature (4-42 ° C) parameters were examined at pH: 7.4 environment. Optimal conditions was determined as pH: 7.4, concentration; 5.6 μg / mL, time: 45 min and temperature: room temperature. Within the scope of selectivity studies, the adsorption of competitive proteins (Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 and lysozyme) was investigated. The same competing proteins were also interacted with bare magnetic nanoparticles as a control group. Synthesis of upconversion silica nanoparticles and immobilization of the secondary antibody to these particles was performed and characterized with scanning electron microscopy (SEM), Zeta potential and size measurement, Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR), Thermogravimetric Analysis (TGA), Differential Scanning Calorimetry (DSC). Subsequently, zeta potential and size measurement and fluorescence emission spectrometry analysis of the supracomplex formed in dispersion medium by standard caspase proteins treated with primary antibody immobilized magnetic nanoparticles under optimal conditions, secondary antibody immobilized upconversion silica nanoparticles were performed. As a result of these analyzes, it was observed that the sandwich ELISA model formed in the dispersion medium maintained its upconversion feature and that the amount of protein added to the structure decreased due to this feature. This enabled a quantitative result to be obtained. In the second stage of the study, cell culture experiments were carried out. In this context, MCF-7 breast cancer cell line treated with 100 μM Cisplatin and not treated was used and the proteins obtained from the lysate of these cells were analyzed in dispersion medium with the designed system and the caspase protein amounts were determined. The results obtained were compared with traditional apoptosis determination methods (Double staining, Annexin-V, MTT). In the third stage of the study, a paper-based system was designed. For this purpose, the size of the paper to be used, the secondary antibody immobilized upconversion silica nanoparticle volume to be immobilized on the collection area (2.5-12.5 μL) and its distance from the sample area, the volume of primary antibody immobilized magnetic nanoparticles (10-100 μL) to be dropped into the sample area were determined. Subsequently, studies performed with standard caspase proteins and cell lysates in dispersion medium were examined on paper. Validation has been made by comparing the results obtained from the dispersion medium with the results obtained on paper. As a result of all these studies, it has been shown that more precise and reliable results can be obtained than traditional methods with the paper-based system.