Farklı biyoreaktör tiplerinde hepg2 hücrelerinin sferoid oluşturma potansiyellerinin incelenmesi
Examination of the hepg2 cell spheroids generation potentials on different bioreactor types
Yazar: BAŞAK TUĞCU
Danışman: DOÇ. DR. SUPHİ ŞURİŞVAN ÖNCEL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu tezde biyoproseslerde en çok kullanılan biyoreaktör tipi olan 
CSTR (karıştırmalı tank reaktör) ve yerçekimi kuvvetini minimize ederek
hücrelerin askıda kalmasını sağlayan RCCS (Rotary Cell Culture System)
biyoreaktör kullanılarak insan karaciğer karsinoma hücresi olan HepG2 
hücrelerinin sferoid oluşturma potansiyelleri incelenmiştir.
Tez sürecinde Ege Üniversitesi, Biyomühendislik Bölümü, 
EgeBiyoTheraNostics (Ege Biyoterapötikler ve Biyodiagnostikler 
Laboratuvarı) Hücre Kültürü Koleksiyonunda bulunan HepG2 hücreleri 
(insan karaciğer karsinoma hücreleri), RPMI besin ortamı, RCCS-1 (500 
ml) reaktör (Synthecon) ve karıştırmalı tank biyoreaktör (500 ml) 
kullanılmıştır. Stokta bulunan HepG2 hücreleri T-flasklara alınarak RPMI 
besin ortamında çoğaltılmıştır. Ölçek büyütme işlemi ve iki boyutlu 
sistemden üç boyutlu sisteme geçişin sağlanabilmesi için çoğaltılan hücreler 
reaktörlere alınarak üretime başlanmıştır. Reaktörlerde üretim denemeleri 
yapılarak hücrelerin sferoid oluşturabilmeleri için gerekli optimum 
karıştırma hızları belirlenmiştir. Belirlenen karıştırma hızlarında üretilen 
hücreler ve hücrelerin oluşturduğu sferoid yapılar için: Hücre canlılığı testi, 
hücre sayımı, karaciğer hücrelerine spesifik belirleyici olan albümin 
sekresyonu analizi ve sferoid yapıların görüntülenmesi için taramalı 
elektron mikroskopi (SEM) analizi yapılmıştır.
viii
Yapılan tez çalışması sonucunda hem CSTR hem de RCCS 
biyoreaktörde sferoid üretimi başarıyla sonuçlanmıştır. Mikroskop altında 
yapılan incelemelerde (ışık mikroskobu, floresan mikroskop ve SEM) 
RCCS'te üretilen sferoidler eşit büyüklükte, ideal sferoid boyut ve 
yapısındayken CSTR'da üretilen sferoidlerin hızlı bir şekilde diğer 
sferoidlerle birleşerek rastgele doku parçaları oluşturduğu gözlemlenmiştir. 
Sferoid üretimi sürecinde CSTR'deki hücre canlılığı ve konsantrasyonunun 
RCCS'ten yüksek olduğu gözlemlense de CSTR'deki rastgele birleşmelerin 
sferoid kalitesini düşürdüğü sonucuna ulaşılmıştır. Her iki 
biyoreaktörlerdeki sferoidlerin de canlılığı 10. güne kadar %80'in üzerinde 
kaydedilmiştir. Yapılan MTT denemesi sonucunda inkübe edilmiş olan 
monolayer hücrelerin EtOH'ü katabolize etme kapasitesinin sferoidlere 
kıyasla daha düşük olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Karaciğer hücrelerine 
spesifik olan albümin sentezinin RCCS biyoreaktörden alınan 2, 4 ve 6. gün 
örneklerinde sentezlenen albümin miktarının CSTR'deki sferoidlerin 
sentezlediği albümin miktarından daha fazla olduğu; 8., 10., 12. ve 14.
günlerde CSTR'deki sferoidlerin RCCS'teki sferoidlerden daha fazla 
albumin sentezlediği gözlemlenmiştir.

Abstract:
In this thesis, spheroid forming potential of HepG2 cells, a human 
liver carcinoma cell was investigated using CSTR (stirred tank reactor), 
which is the most widely used bioreactor type in bioprocesses and RCCS
(Rotary Cell Culture System) which minimizes the gravitational force and 
allows the cells to remain suspended.
During the thesis process, RPMI nutrient medium, RCCS-1 (500 ml)
reactor (Synthecon), stirred tank bioreactor (500 ml) and HepG2 cells 
(human liver carcinoma cells) in Ege University, Department of 
Bioengineering, EgeBiyoTheraNostics (Ege Biotherapeutics and 
Biodiagnostics Laboratory) Cell Culture Collection was used. HepG2 cells 
in the stock were transferred to T-flasks and grown in RPMI nutrient 
medium. In order to scale up and transition from a two-dimensional 
system to a three-dimensional system, the proliferated cells were taken 
into the reactors and production started. Production trials were carried out 
in the reactors and optimum mixing speeds required for cells to form 
spheroids were determined. Cell viability test, cell count, analysis of 
albumin secretion, which is a specific marker for liver cells and scanning
electron microscopy (SEM) analysis for imaging spheroid structures were 
performed for the cells and spheroid structures formed by the cells 
produced at the determined mixing speeds.
x
As a result of the thesis study, spheroid production in both CSTR 
and RCCS bioreactor was successfully completed. In the examinations 
made under the microscope (light microscope, fluorescent microscope and 
SEM), it was observed that spheroids produced in RCCS were of equal 
size, ideal spheroid size and structure, while spheroids produced in CSTR 
quickly combined with other spheroids to form random tissue fragments. 
Although cell viability and concentration in CSTR were observed to be 
higher than RCCS during the spheroid production process, it was 
concluded that random associations in CSTR reduced spheroid quality. 
The viability of spheroids in both bioreactors was over 80% up to day 10. 
As a result of the MTT experiment, it was concluded that the capacity of 
incubated monolayer cells to catabolize EtOH was lower compared to 
spheroids. The amount of albumin synthesized in the 2nd, 4th and 6th day 
samples taken from the RCCS bioreactor for albumin synthesis specific to 
liver cells was higher than the amount of albumin synthesized by the 
spheroids in the CSTR; It was observed that on the 8th, 10th, 12th and 
14th days, spheroids in the CSTR synthesized more albumin than 
spheroids in the RCCS.