Plateletten zengin plazma ve kondroitinaz abckombinasyonunun sıçan omurilik yaralanmalarındaterapötik etkisi
Therapeutic effect of platelet-rich plasma and chondroitinase abc combination on rat spinal cord injuries
Yazar: EMAD ADDEN ABDALLAH
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MUHAMMED FATİH SARI
Balıkesir Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery

Özet:
Travmatik omurilik yaralanması yüksek mortalite-morbidite oranları olan, sosyal, fizyolojik,
psikolojik yıkıcı etkileri dünya çapında belirgin önemli bir sağlık sorunudur.
Tedavi yöntemlerindeki tüm gelişmelere rağmen, spinal kord yaralanmalı hastalarda sağ kalım ve
iyilik hâli oranı çok azdır.
Tüm deneysel ve klinik araştırmalara rağmen insan omurilik yaralanmalarında nöroproteksiyon ve
yaralanmış omuriliğin rejenerasyonu gerçekleştirilememiştir.
Birincil omurilik hasarını takiben dakikalar içinde başlayan ve günle hatta haftalarca devam edebilen
moleküler ve hücresel değişimi içeren ikincil omurilik hasarı kaskatını durdurmak için
nöroproteksiyon çalışmaları uzun zamandır yapılmaktadır.
Omurilik yaralanmasında ikincil hasarın önlenmesi için hedefler: glutamaterjik, kolinerjik ve
katokolinerjik nörotransmisyon sistemleri, serbest radikal üretimi, lipid peroksidasyon, kalsiyum ve
diğer iyon kanalları, büyüme faktörleri, nörotrofik faktörler, inflamasyon prosesi, endojen opioid
reseptörleri, enzimler, apopitotik hücre ölümü ve rejenerasyon mekanizmalarıdır.15
Plateletten zengin plazma (PRP), taze kanın bir antikoagülan ile santrifüje edildikten sonra .
Plateletten zengin kısmı veya yoğunlaşan trombositlerin toplanmasıyla hazırlanır ,intratekal (i.t.) PRP
uygulamasının mikroglia ve astrosit aktivasyonu ve PDGF-B , ICAM-1, GAP43 ekspresyonu
indüklediği rapor edilmiştir.
Çözünür bir enzim kondroitinaz ABC (ChABC), CSPG moleküllerinin karbonhidrat dalını oluşturur.
CSPG'ler, merkezi sinirde hasar bölgeleri etrafında upregüle edilen ekstraselüler hücre molekülleridir
, in vitro ve in vivo nöral büyüme sürecini inhibe ederler. ChABC daha fazla büyümeye izin verir ve
santral akson rejenerasyonunu artırır.
Literatür taradığımızda , intratekal (i.t.) PRP ve intratekal (i.t.) ChABC kombine uygulamasının
spinal kord yaralanma tedavisi olarak etkilerini içeren bir yayına rastlamadık.
Bu araştırma projemizde intratekal (i.t.) PRP ve i.t ChABC kombine olarak uygulaması GAP43
ekspresyonu indüklemesinin yanında aksonal rejenerasyonda belirgin artış olabileceğini ve omurilik
iyileşmesini ciddi oranda destekleyeceğini göstermeyi planladık.
Materyal Metod:
Çalışmamız Balıkesir Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu'nun 24/03/2022
tarihli 2022/2-5 sayılı onay kararı ile gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın deneysel kısmı Balıkesir
Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Laboratuarı'nda , histopatolojik çalışmaları Balıkesir
Üniversitesi Patoloji Laboratuarı'nda gerçekleştirilmiştir.
Deney gruplarımızda 250-300 gr ağırlığında 2.5 aylık 31 adet dişi sıçan kullanıldı. Bir adet sıçan prp
hazırlamak için ayrıldı . Rastgele seçilen sıçanlar her grupta 6 rat olacak şekilde 5 gruba ayrıldı:
Grup1 (Kontrol Grubu): Sadece T9-T10 laminektomi yapıldı
Grup 2 (Serum Fizyolojik Grubu): T9-T10 laminektomi yapılıp spinal kord hasarı verildi.16
Kord hasarından sonraki 1. Saat, 1.,3.,5. ve 6. Günde toplam 5 kez İt. sf uygulandı.
Grup 3 (PRP Grubu): T9-T10 laminektomi yapılıp spinal kord hasarı verildi. Kord hasarından
sonraki 1. Saat, 1.,3.,5. ve 6. Günde toplam 5 kez İt. PRP uygulandı.
Grup 4 (Kondroitinaz ABCGrubu): Bu gruptaki sıçanlara T9-T10 laminektomi yapılıp spinal
kord hasarı verildi. Kord hasarından sonraki 1. Saat, 1.,3.,5. ve 6. Günde toplam 5 kez İt.
Kondroitinaz ABC uygulandı.
Grup 5 (Kondroitinaz ABC +PRP Grubu): Bu gruptaki sıçanlara T9-T10 laminektomi yapılıp
spinal kord hasarı verildi. Kord hasarından sonraki 1. Saat, 1.,3.,5. ve 6. Günde toplam 5 kez İt.
Kondroitinaz ABC ve PRP uygulandı.
2. Haftada deney hayvanları sakrifiye edilerek alınan spinal kord örnekleri formaldehit içeren
tüplerle Balıkesir Üniversitesi Patoloji Anabilim Dalı Laboratuvarına teslim edildi. kesitler
histopatolojik inceleme için hematoksilen eozin ile boyandı . Gruplar arasındaki histomorfolojik
değişiklikler değerlendirildi . Ayrıca immünhistokimyasal boyama için GAP43 birincil antikor
olarak kullanıldı.
İstatistiksel Analizler
Çalışmada elde edilen sonuçlar için veriler IBM SPSS V23 analiz edildi.Kategorik verilerin
karşılaştırılmasında Fisher Freeman Halton testi kullanıldı ve çoklu karşılaştırmalarda Bonferroni
Düzeltmeli Z testi ile incelendi.17
Bulgular:
Gruplar ile aksonal rejenerasyon arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağlantı vardır (p<0,001).
Aksonal rejenerasyon olmayan kontrol ve serum fizyolojik grupları ile diğer gruplar farklılık
göstermiştir.1+ rejenerasyonda ChABC ile Kontrol, PRP+ChABC ve SF grupları farklılık
göstermiştir.2+ rejenerasyonda PRP+ChABC ile ChABC, kontrolve SF grupları farklılık
göstermiştir.ChABC grubunun %20'sinde +1 boyanma, %80'inde +2 boyanma, %0'ında +3
boyanma, kontrol grubunun %100'ünde +1 boyanma, %0'ında +2 boyanma, %0'ında +3 boyanma,
PRP grubunun %20'sinde +1 boyanma, %80'inde +2 boyanma, %0'ında +3 boyanma, PRP+ChABC
grubunun %0'ında +1 boyanma, %0'ında +2 boyanma, %100'ünde +3 boyanma, SF grubunun
%100'ünde +1 boyanma, %0'ında +2 boyanma, %0'ında +3 boyanma vardır.
Gruplar ile GAP43 boyanma oranıarasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağlantı vardır
(p<0,001).+1 boyanmada Kontrol ve SF ile PRP+ChABC grupları farklılık göstermiştir.+3
boyanmada PRP+ChABC ile diğer gruplar farklılık göstermiştir.
Sonuç:
Çalışmamızda PRP+ ChABC kombine kullanımının ayrı ayrı uygulanmış PRP ve ChABC
uygulamalarına göre histopatoloik açıdan belirgin faydası gösterilmiştir ve bu sonuçlar istatisitiksel
olarak anlamlıdır.
Çalışmamız bu alanda yeni araştırmalar için ufuk açıcı sonuçlar vermiştir.
Bu konuda daha ileri hücresel bazlı ve klinik çalışmalar gelecekte hastalar ve yakınları için umut
verici olabilir.

Abstract:
Traumatic spinal cord injury is an important health problem with high mortality-morbidity rates
and devastating social, physiological and psychological effects worldwide.
Despite all the advances in treatment methods, the survival and well-being rate in patients with
spinal cord injuries is very low.
Despite all experimental and clinical research, neuroprotection and regeneration of the injured
spinal cord have not been achieved in human spinal cord injuries.
Neuroprotection studies have been carried out for a long time to stop the secondary spinal cord
injury cascade, which includes molecular and cellular changes that begin within minutes following
primary spinal cord injury and can continue for days or even weeks.
Targets for the prevention of secondary damage in spinal cord injury are: glutamatergic,
cholinergic and catholinergic neurotransmission systems, free radical production, lipid
peroxidation, calcium and other ion channels, growth factors, neurotrophic factors, inflammation19
process, endogenous opioid receptors, enzymes, apoptotic cell death and regeneration mechanisms.
Platelet-rich plasma (PRP) is used after centrifugation of fresh blood with an anticoagulant. It is
prepared by collecting the platelet-rich part. It has been reported that intrathecal (i.t.) PRP
application induces microglia and astrocyte activation and PDGF-B, ICAM-1, GAP43 expression.
A soluble enzyme chondroitinase ABC (ChABC) forms the carbohydrate branch of CSPG
molecules. CSPGs are extracellular cell molecules that are upregulated around sites of damage in
the central nerve, inhibiting the neural growth process in vitro and in vivo. ChABC allows further
growth and increases central axon regeneration.
When we scanned the literature, we did not find any publications containing the effects of
intrathecal (i.t.) PRP and intrathecal (i.t.) ChABC combined application as spinal cord injury
treatment.
In this research project, we planned to show that the combined application of intrathecal (i.t.) PRP
and i.t. ChABC will induce GAP43 expression, and also significantly increase axonal regeneration
and significantly support spinal cord recovery.
Method:
Our study was carried out with the approval decision of Balıkesir University Faculty of Medicine
Animal Experiments Ethics Committee dated 24/03/2022 and numbered 2022/2-5. The
experimental part of the study was carried out in the Experimental Animals Laboratory of
Balıkesir University Faculty of Medicine, and the histopathological studies were carried out in the
Pathology Laboratory of Balıkesir University.
31 female rats, 2.5 months old and weighing 250-300 g, were used in our experimental groups.20
One rat was separated to prepare PRP. Randomly selected rats were divided into 5 groups, with 6
rats in each group:
Group1 (Control Group): Only T9-T10 laminectomy was performed.
Group 2 (Physiological Saline Group): T9-T10 laminectomy was performed and spinal cord
damage was done. 1st hour after cord injury, 1st,3rd, 5th. and 6. A total of 5 times per day.
Physiological Saline was applied.
Group 3 (PRP Group): T9-T10 laminectomy was performed and spinal cord damage was done. 1st
hour after cord injury, 1st,3rd, 5th. and 6. A total of 5 times per day. PRP was applied.
Group 4 (Chondroitinase ABC Group): The rats in this group underwent T9-T10 laminectomy and
spinal cord damage. 1st hour after cord injury, 1st,3rd, 5th. and 6. A total of 5 times per day.
Chondroitinase ABC was applied.
Group 5 (Chondroitinase ABC +PRP Group): The rats in this group underwent T9-T10
laminectomy and spinal cord damage. 1st hour after cord injury, 1st,3rd, 5th. and 6. A total of 5
times per day. Chondroitinase ABC and PRP were applied.
In the 2nd week, the experimental animals were sacrificed and the spinal cord samples were taken
and delivered in tubes containing formaldehyde to Pathology Department Laboratory of Balıkesir
University. Sections were stained with hematoxylin and eosin for histopathological examination.
Histomorphological changes between groups were evaluated. Additionally, GAP43 was used as
the primary antibody for immunohistochemical staining.21
Statistical Analysis
IBM SPSS V23 was used for all statistical comparisons. Fisher Freeman Halton test was used to
compare categorical data, and multiple comparisons were examined with the Bonferroni
Corrected Z test.
Results:
There is a statistically significant connection between groups and axonal regeneration (p<0.001).
There were differences between the control and saline groups without axonal regeneration and
other groups. There were differences between ChABC and Control, PRP+ChABC and SF groups
in 1+ regeneration. In 2+ regeneration, PRP+ChABC and ChABC, control and SF groups showed
differences. In the ChABC group, 20% had +1 staining, 80% had +2 staining, 0% had +3 staining
,100% of the control group had +1 staining, 0% had +2 staining, 0% had +3 staining.+3 staining
20% of the PRP group had +1 staining, 80% had +2 staining, 0% had +3 staining,In the
PRP+ChABC group, 0% had +1 staining, 0% had +2 staining, 100% had +3 staining, 100% of the
SF group had +1 staining, 0% had +2 staining, and 0% had +3 staining.
There is a statistically significant connection between the groups and GAP43 staining rate
(p<0.001). Control and SF and PRP+ChABC groups showed differences in +1 staining. Other
groups showed differences in +3 staining with PRP+ChABC.
Conclusion: In our study, the combined İt administration of PRP + ChABC has been shown to
have a significant histopathological benefit compared to separate PRP and ChABC applications,
and these results are statistically significant.22
The results of our study is stimulating a new researches in this field.
Further cellular-based and clinical studies on this subject may be promising for patients and their
relatives in the future.