Bacillus thuringiensis 37Q2 orijinli bakteriyosin benzeri inhibitör maddenin antimikrobiyal, sitotoksik ve anjiyogenik potansiyellerinin belirlenmesi
Determination of antimicrobial, cytotoxic and angiogenic potentials of bacteriocin-like inhibitory substance of 37Q2 origin of Bacillus thuringiensis
Yazar: NARIMENE BELKRAOUANE
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bacillus thuringiensis'in çeşitli suşları, sporlanma sırasında Cry ve Cyt gibi toksin proteinlerini sentezleyen ve biyopestisit olarak kullanılan en başarılı entomopatojen bakterilerdir. Enfeksiyon hastalıkları dünyadaki en genel ikinci ölüm nedenidir. Günümüzde antimikrobiyal peptidler (AMPs) yeni generasyon antibiyotikler için önemli alternatiflerdir. Küçük moleküler ağırlıklı AMP'ler bakteriyosinler olarak tanımlanmıştır. Bacillus türlerinden izole edilen AMP'ler, mevcut antibiyotik direncine karşı umut verici potansiyele sahiptirler.  Bütün bunların yanı sıra, son yıllarda bazı bakteriyosinlerin bazı kanser hücreleri üzerinde seçici olarak sitotoksik etkileri gösterilmiştir. Mevcut kanser ilaçlarının dezavantajlarına karşı yeni etken maddelerin araştırılması giderek artmaktadır. Önceki çalışmalarımızda Bt Koleksiyonumuzdaki 100 adet Bt'nin B. cereus indikator bakterisine karşı antimikrobiyal etkisi araştırılmış ve sınırlı sayıda Bt'nin etkili olduğu görülmüştür. Dolayısıyla, bu tez çalışmasında B.cereus'a karşı antimikrobiyal etkisi en yüksek olan Bt-37Q2 suşundan bakteri süpernatantının veya kısmi olarak saflaştırılan bakteriyosinin çeşitli mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal spektrumu kuyu difüzyon yöntemiyle; çeşitli kanser hücre hatları üzerinde sitotoksik etkileri MTT yöntemiyle; ve anjiyogenik özelliği ise ELISA testi ile araştırılmıştır.
Öncelikle Bt-37Q2 suşunun büyüme eğrisi ve bakteriyosin üretim kinetiği incelendiğinde, en yüksek antimikrobiyal aktivite 8'inci saat içinde gözlenmiştir. Bu suşun kültür süpernatında (CFS) gözlenen bakteriyosin aktivitesinin sıcaklığa duyarlılığı çalışıldığında: en yüksek antimikrobiyal aktivite 30-40˚C'de tespit edilirken, 50˚C'de 30 dakikada aktivite azalmış; 50-70˚C'de ise 2 saattin sonunda hiç aktiviteye rastlanmamıştır. Bununla birlikte CFS çeşitli pH'de muamele edildiğinde, bakteriyosin aktivitesi pH6'da en yüksek düzeyde bulunurken, pH3 ve pH'10'da hiç aktivite gözlenmemiştir. CFS çeşitli enzimatik işlemlere tabi tutulduğunda, Proteinaz K (PK) ve lipaz gibi enzimlerdeki aktivitenin tamamen kaybolması, BPP'nin bir lipoprotein çeşidi olarak göstermektedir. Ayrıca, Bt-37Q2 suşunun 16SrDNA ve flagellin Hag geni PCR analizlerine göre Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis olduğu saptanmıştır. Ayrıca, kısmi olarak saflaştırılan bakteriyosin benzeri protein preparasyonu (BBPP) SDS-PAGE'de görüntülenmiştir. İlave olarak, CFS'ın Bacillus genusuna ait türler üzerinde antimikrobiyal etki gösterdiği ve kanser hücre hatlarından A549, HT-29 ve PC-3 hücrelerinde % 75 üzerinde sitotoksik etkili olduğu tespit edilmiştir. BBPP'nin 3ug/ml'de dahi %70 üzerinde sitotoksik etkisi olduğu kaydedilmiştir. Son olarak, BBPP (50ug/ml) ile 6 saat muamele edilen A549 hücrelerinde anjiyogenik faktör VEGF salgılanması kontrole göre anlamlı bir şekilde azalmıştır. Elde edilen sonuçlar, Bt-37Q2 suşunun antimikrobiyal ve antikanser etkili yeni ajanların geliştirilmesinde anlamlı potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Anahtar Kelimeler: Bacillus thuringiensis, bakteriyosinler, antimikrobiyal, sitotoksisite, kanser hücre hatları, anjiyogenez

Abstract:
Various strains of Bacillus thuringiensis are the most successful entomopathogenic bacteria that synthesize toxin proteins, such as Cry and Cyt, during sporulation and are used as biopesticides. Infectious diseases are the second leading cause of death worldwide. Currently, antimicrobial peptides (AMPs) are important alternatives for the development of new generation antibiotics. AMPs with low molecular weight have been defined as bacteriocins. AMPs isolated from Bacillus species have promising potential against current antibiotic resistance. Furthermore, in recent years, select cytotoxic effects of certain bacteriocins on certain cancer cells have been demonstrated. The search for new agents to overcome the disadvantages of current cancer drugs is increasing. In previous literature studies, the antimicrobial effects of 100 Bt strains from our Bt Collection against the indicator bacterium B. cereus were investigated, and a limited number of Bt strains were found to be effective. Therefore, in this thesis study, the antimicrobial spectrum of bacterial supernatant or partially purified bacteriocin from the Bt-37Q2 strain, which exhibited the highest antimicrobial effect against B. cereus, was investigated against various microorganisms using the well diffusion method. Cytotoxic effects on various cancer cell lines were assessed using the MTT method, and angiogenic properties were evaluated using the ELISA test. 
Firstly, when the growth curve and bacteriocin production kinetics of the Bt-37Q2 strain were examined, the highest antimicrobial activity was observed at the 8th hour. The temperature sensitivity of bacteriocin activity observed in the culture supernatant (CFS) of this strain was investigated, and the highest antimicrobial activity was detected at 30-40°C, while activity decreased in 30 minutes at 50°C, and no activity was observed after 2 hours at 50-70°C. Additionally, when CFS was treated at various pH levels, bacteriocin activity was found to be highest at pH6, while no activity was observed at pH 3 and pH 10. When CFS was treated with various enzymes, the complete loss of activity in Proteinase K and lipase indicates that BPP is a kind of lipoprotein. Moreover, based on 16S rDNA and flagellin Hag gene PCR analyses, the Bt-37Q2 strain was identified as Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis. Furthermore, the partially purified bacteriocin-like protein preparation (BBPP) was visualized on SDS-PAGE. Additionally, it was determined that CFS exhibited antimicrobial effects against species belonging to the Bacillus genus and showed more than 75% cytotoxicity in cancer cell lines A549 and PC-3. BBPP exhibited cytotoxic effects of over 70% even at a concentration of 3 μg/ml. Finally, treatment of A549 cells with BBPP (50 μg/ml) for 6 hours resulted in a significant reduction in the secretion of the angiogenic factor VEGF compared to the control. The obtained results demonstrate that the Bt-37Q2 strain has significant potential for the development of novel antimicrobial and anticancer agents.

Keywords: Bacillus thuringiensis, bacteriocins, antimicrobial, cytotoxicity, cancer cell lines, angiogenesis