Mcf-7 ve mda-mb-231 meme kanseri hücre hatlarında juglon ve kurkumin uygulamasının fabp proteinleri (fatty acid binding protein) üzerine etkilerinin moleküler yöntemler ile belirlenmesi
Determination of juglone and curcumin treatment on fabps effects (fatty acid binding protein) in mcf-7 and mda-mb-231 breast cancer cell lines
Yazar: DİLEK SÖYLER
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ EMİNE NEDİME KORUCU
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
Meme kanseri, dünya çapında kadınlarda en sık rastlanan malign kanser türlerinden biridir. Sürekli artmakta olan meme kanseri vakası nedeniyle, birincil ve ikincil korunmada etkili tedaviler geliştirmek hayati önem taşımaktadır. Kanser önleme yönteminin her iki türünü de birleştiren en iyi yöntemlerden biri, kimyasal müdahale gibi görünmektedir. Bu kimyasal müdahalelerde de karsinojenez sürecini engellemek, geciktirmek veya tersine çevirmek için doğal veya yapay bileşikler kullanır. Doğal kökenli kemoprevansiyon maddeler arasında, geniş spektrumlu bir anti-kanser aktivitesi gösteren polifenol türevi olan kurkumin ve naftakinon yapılı olan juglona büyük önem verilmektedir. 
Düşük moleküler ağırlıklı (14-15 kDa) bir protein grubu olan FABP'ler, lipit bağlayıcı protein süper ailesinin üyeleridir. FABP'ler çeşitli dokularda bulunur ve yağ asidi metabolizmasında önemli bir rol oynar ayrıca hücre büyümesinin ve çoğalmasının modülasyonundan sorumlu olabilirler. FABP'lerin kanser gelişiminde yer aldığı bildirilmektedir. Birçok kanser türünde artış veya azalış göstermektedir ve bu nedenle tümör markörü olarak kullanılabileceği belirtilmiştir.  
Yapılan çalışmada kurkumin ve juglonun meme kanseri hücre hatlarında antikanser ve sitotoksik etkileri sonucu hücre canlılığına etkisini ve FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonu ve protein düzeyindeki değişiklikleri araştırmak amaçlanmaktadır.
 Çalışmamızda MCF-7 meme kanseri hücre hattına 0,1 – 40 μM kurkumin ve 1 – 40 μM juglon muamelesi yapılmış ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattınada 1 – 20 μM kurkumin ve 1 – 15 μM juglon muamelesi yapılmıştır. Bu farklı doz uygulamaları sonucu hücre canlılığına etkileri MTT analiz ile tespit edilmiştir. Hücrelere 24 saat boyunca IC50 değerlerine göre belirlenen farklı dozlarda kurkumin ve juglon muamelesi yapılmış ve Real-time PCR ve Western blot yöntemiyle FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonları ve protein düzeyleri kontrol grubu ile karşılaştırılarak hesaplanmıştır.
MCF-7 hücre hattında kurkumin uygulaması sonucunda, IC50 dozu 22,41 μM olarak tespit edilmiş ve FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonlarının arttığı, juglon uygulaması sonucu IC50 dozu 16,27 μM olarak tespit edilmiş ve FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonunun ilk dozda azaldığı yükselen dozlarda arttğı belirlenmiştir. MDA-MB-231 hücre hattında, kurkumin uygulaması sonucunda IC50 dozu 10,43 μM, juglon uygulaması sonucunda da IC50 dozu 3,38 μM olarak tespit edilmiş ve FABP5 ve FABP9 gen eksperesyonunun azaldığı belirlenmiştir. Ekspresyon analizleri yapıldıktan sonra, FABP5 ve FABP9 proteinlerine ait özgün antikorlar kullanılarak Western blot analizi yapılmıştır. MCF-7 hücre hattında kurkumin uygulamasının FABP5 ve FABP9 protein düzeylerini kontrol grubuna göre azalttığı tespit edilmiştir. Aynı şekilde MCF-7 hücre hattında juglon uygulamasının da FABP5 ve FABP9 protein düzeylerinin kontrol grubuna göre azalttığı tespit edilmiştir. MDA-MB-231 hücre hattında ise kurkumin uygulaması sonucu FABP5 ve FABP9 protein düzeylerinde kontrol grubuna göre ilk dozlarda arttığı görülürken sonraki dozlarda azaldığı tespit edilmiştir. Benzer şekilde MDA-MB-231 hücre hattında juglon uygulaması sonucu FABP5 ve FABP9 protein düzeylerinde kontrol grubuna göre ilk dozlarda arttığı görülürken sonraki dozlarda azaldığı tespit edilmiştir.
Çalışma sonucunda hem MCF-7 hem MDA-MB-231 hücre hattında kurkumin ve juglon uygulamasının hücre canlılığını ve FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonlarını ve protein düzeylerini azalttığı bulunmuştur. 

Anahtar Kelimeler: FABP5, FABP9, Juglon, Kurkumin, Meme Kanseri

Abstract:
Breast cancer is one of the most common types of malignant cancer in women worldwide. Due to the ever-increasing case of breast cancer, it is vital to develop effective treatments for primary and secondary prevention. One of the best methods that combine both types of cancer prevention method seems to be chemical intervention. In these chemical interventions, it uses natural or artificial compounds to prevent, delay or reverse the carcinogenesis process. Among the chemoprevention substances of natural origin, great importance is given to curcumin, which is a polyphenol derivative with a broad spectrum anti-cancer activity, and a juglone with naphthaquinone. 
FABPs, a low molecular weight (14-15 kDa) protein group, are members of the lipid-binding protein superfamily. FABPs are found in a variety of tissues and play an important role in fatty acid metabolism and may be responsible for modulation of cell growth and proliferation. FABPs are reported to be involved in cancer development. It increases or decreases in many types of cancer and therefore it has been stated that it can be used as a tumor marker.
The aim of this study is to investigate the effects of curcumin and juglone on cell viability as a result of anticancer and cytotoxic effects in breast cancer cell lines, and the changes in FABP5 and FABP9 gene expression and protein level.
In our study, MCF-7 breast cancer cell line was treated with 0.1 - 40 μM curcumin and 1 - 40 μM juglone, and the MDA-MB-231 breast cancer cell line was treated with 1 - 20 μM curcumin and 1 - 15 μM juglone. The effects of these different doses on cell viability were determined by MTT analysis. Cells were treated with different doses of curcumin and juglone determined according to IC50 values for 24 hours, and FABP5 and FABP9 gene expressions and protein levels were calculated by comparing with the control group by Real-time PCR and Western blot method.
As a result of curcumin application in the MCF-7 cell line, IC50 dose was determined as 22.41 μM and FABP5 and FABP9 gene expressions increased, as a result of juglone application IC50 dose was determined as 16.27 μM and FABP5 and FABP9 gene expression decreased at the initial dose and increased in increasing doses. In the MDA-MB-231 cell line, the IC50 dose was determined as 10.43 μM after curcumin application and 3.38 μM as a result of juglone application, and it was determined that FABP5 and FABP9 gene expression decreased. After the expression analysis, Western blot analysis was performed using specific antibodies of FABP5 and FABP9 proteins. It was determined that curcumin application in MCF-7 cell line decreased FABP5 and FABP9 protein levels compared to the control group. Likewise, it was found that juglone application in MCF-7 cell line decreased FABP5 and FABP9 protein levels compared to the control group. In the MDA-MB-231 cell line, it was observed that FABP5 and FABP9 protein levels increased in the initial doses compared to the control group as a result of curcumin administration, but decreased in the following doses. Similarly, as a result of the application of juglone in the MDA-MB-231 cell line, it was observed that FABP5 and FABP9 protein levels increased in the initial doses compared to the control group, but decreased in the following doses. 
As a result of the study, it was found that curcumin and juglone application decreased cell viability and FABP5 and FABP9 gene expressions and protein levels in both MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines.

Keywords: Breast Cancer, Curcumin, FABP5, FABP9, Juglone