Kemik doku mühendisliği için elektro-eğrilmiş poli(e-kaprolakton) membran esaslı doku iskeleleri
Electrospun poly(e-caprolactone) membrane based scaffolds for bone tissue engineering
Yazar: İSMAİL ALPER İŞOĞLU
Danışman: PROF. DR. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Tez çalışmasının ilk aşamasında, kalay oktoat katalizörlüğünde (e-kaprolakton) monomerinden düşük ve yüksek molekül ağırlıklı poli(e-kaprolakton) sentezlenmiştir. Sentezlenen PCL'ler, ağırlıkça % 80 düşük - % 20 yüksek molekül ağırlıklı polimer içerecek şekilde karıştırılmış ve blendler hazırlanmıştır. Hazırlanan blendlerden elektro-eğirme yöntemi kullanılarak örgüsüz nanofiber yapıda mikro gözenekli membranlar üretilmiştir. Membranların kimyasal ve fiziksel özellikleri çeşitli yöntemler ile incelenmiş, mekanik özellikleri test edilmiş ve in vitro bozunma davranışları araştırılmıştır. Karakterizasyon çalışmaları tamamlandıktan sonra elektro-eğirilmiş mikro gözenekli membranlardan dairesel olarak katlama yöntemi ile makro kanallara sahip üç boyutlu doku iskeleleri hazırlanmıştır. Hazırlanan membranlara ve doku iskelelerine iki farklı yaklaşımla, osteoblastik aktiviteyi arttırdığı ve yenik kemik oluşumuna katkıda bulunduğu literatürde rapor edilmiş olan simvastatin yüklenmiştir. Doku iskeleleri ve bunların simvastatin yüklü formları, hücre tutunması ve çoğalması açısından değerlendirilmek üzere in vitro hücre kültür çalışmasında incelenmiştir.Çalışmanın son kısmında doku iskeleleri, kritik büyüklükteki kraniyal kemik defekti için onarım malzemesi olarak, iki aşamada tamamlanan hayvan çalışmalarında denenmiştir. İlk aşama hayvan çalışmasında, doku iskeleleri ve simvastatin yüklü formları denek hayvanı olarak seçilen sıçanların kraniyal bölgesinde oluşturulan kritik büyüklükteki defektlere yerleştirilmiş, doku cevabı ve defekt iyileşmesi açısından karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Çalışmada her gruptan 1, 3 ve 6. aylarda hayvanlar sakrifiye edilmiş, alınan örnekler fikse edilip, ? CT analizleri ve histolojik değerlendirmeleri gerçekleştirilmiştir.İkinci aşama hayvan çalışmasında doku iskeleleri ve bunların mezenkimal kök hücrelerle birleştirilmiş formları defekt iyileşmesi, yeni kemik oluşumu ve doku cevabı açısından değerlendirilmiştir. Seçilen zaman noktalarında (1, 3 ve 6. ay) kemik örnekleri çıkartılmış, fikse edildikten sonra kalınlığı 5 ? metre olan histolojik kesitler alınmıştır. Kesitler, hematoksilin eozin ve masson trikrom ile boyanmış, 20 kesitten rasgele bir kesit alınarak her bir numune için hesaplama yapılmıştır. Defektteki yeşile boyanmış yeni kemik alanı Masson trikrom boyalı kesitler üzerinden hesaplanmıştır. Yeni kemik miktarının istatistiksel açıdan anlamlı olup olmadığını değerlendirmek için parametrik varyans analiz testi (sırasıyla çoklu karşılaştırmalar için one way ANOVA ve post-hoc test olarak Tukey testi) yapılmıştır. Kemik iyileşmesi ve doku cevabı parametrik-olmayan testlerle (çoklu karşılaştırmalar için Kruskal-Wallis ve Beonferoni düzeltmesi ile post-hoc test olarak Mann Whithey U) analiz edilmiştir. Kortikal kemik yapılanması ve kemik iliği elemanlarının iyileşmesi her bir grup için ayrı ayrı semikantitatif olarak incelenmiştir.

Abstract:
In this study, poly(e-caprolactone) in low and high molecular weights were synthesized by using stannous (II) octoate as catalyst. Blends of different molecular weight polymers were prepared by mixing in a percentage of 80:20 (low MW: high MW). Microporous membranes in nonwoven nanofiber structure were produced by electrospinning method. Structural and mechanical properties and also in vitro degradation behaviour were investigated.Following characterization, three dimensional scaffolds having macrochannels were obtained by electrospun microporous membranes using spiral wounding method. Simvastatin, which has ability to enhance osteoblastic activity and lead new bone formation as shown in literature, was loaded to the membranes and scaffolds by two different approaches. Scaffolds and their drug-loaded forms were investigated in vitro for their cell attachment and proliferation properties.In the final part of the study, scaffolds were applied to animals as regeneration materials for critical size cranial defects. At first stage, scaffolds and their simvastatin-loaded forms were placed into the critical size defects formed in calvaria of the rats. They were investigated in terms of tissue response and healing of the defect. Rats from each group were sacrificed at the end of the 1st, 3rd and 6th months. Samples were fixed and MicroCT analyses and histological studies were performed.At the second stage, scaffolds and their mesenchymal stem combined forms were evaluated as their ability in defect regeneration, new bone tissue formation and tissue response. Bone tissue samples were removed in different time points (1st, 3rd and 6th months) and histological 5 ? m sections were prepared following fixation. These sections were stained by hematoxylin eosin and Masson?s trichrome and new bone quantity was calculated for each sample by random selection of one in twenty samples. Green-stained new bone area was calculated based on Masson?s trichrome sections. Statistical analysis of new bone formation was evaluated by parametric variant analysis test (one way ANOVA and Tukey multiple comparison test as post-hoc). Bone regeneration and tissue response were analyzed by non-parametric tests (Kruskal-Wallis and Bonferroni correction for multiple comparisons and Mann Whithey U as post-hoc test). Cortical bone construction and healing of bone marrow components were investigated by semi-quantitatively for each group.