Kiraz bahçelerinden Bacillus thuringiensis izolasyonu, Cry gen profillerinin belirlenmesi ve parasporinler üzerine çalışmalar
Isolation of native Bacillus thuringiensis strains from cherry orchards, determination of Cry gene profiles and studies on parasporins
Yazar: MÜJGAN KESİK OKTAY
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bt sporulasyonun başlangıcından itibaren ve durağan faz boyunca parasporal kristal inklüzyonları şeklinde,  δ-endotoksin'ler olarak adlandırılan Cry ve Cyt proteinlerini üretir. Son yıllarda 700'den fazla Cry gen sekansı belirlenmiştir. Bunların büyük kısmı zirai mücadelede yararlı olabilecek insektisidal aktiviteye sahipken; diğer kristal proteinler kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik aktivitelerinden dolayı parasporin olarak adlandırılmıştır. Bu proteinler de Cry proteinler ile birlikte sınıflandırılmakta olup, spesifik kanser türlerine karşı sitosidal aktivite göstermektedir. Genetik çeşitlilikleri ve potansiyel toksisitelerinin izole edildikleri bölgelere göre değişiklik göstermesinden dolayı, dünyanın farklı ülkelerinde yeni Bt suşlarının tanımlanmasına yönelik çalışmalar yapılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, yeni Bt suşlarının İzmir-Kemalpaşa kirazlık alanlardan izolasyonu ve kristal protein genlerinin tanımlanması ve ayrıca, yeni Bt suşlarında parasporin gen profilleri belirlenerek, çeşitli kanser hücre hatlarında antiproliferatif etkileri ve mekanizmalarının araştırılmasıdır. Bu çalışmada, İzmir'deki kirazlık alanlardan toplanan 41 kiraz toprağından 80 Bacillus thuringiensis izolatı elde edilmiştir. cry gen içeriklerinin belirlenmesi amacıyla cry1, cry2 ve cry3 içerikleri; ilgili primerler kullanılarak PCR çalışmaları ile yapılan taramalar sonucunda 66 izolatın cry1, cry2 ve cry3 genlerinden mutlaka birini taşıdığı, izolatlardan 14'ünün ise hiçbir cry genini içermediği saptanmıştır. cry geni içeren 66 izolatın 16'sının yalnızca cry1, 3'ünün yalnızca cry2, 7'sinin yalnızca cry3 içerdiği belirlenmiştir. İzolatların parasporin gen içerikleri de 7 primer çifti kullanılarak, PCR analizleri ile tespit edilmiş olup; toplam 22 izolatta parasporin geni bulunmuştur. Bt izolatlarına ait parasporal proteinlerin, HeLA, A549, MCF-7, PC-3 ve Burkitt kanser hücreleri üzerinde ve bir sağlıklı hücre hattı olan HEK-293 hücreleri üzerinde sitotoksik etkileri MTT deneyi ile belirlenmiş ve parasporal proteinlerin hücreler üzerinde farklı oranlarda sitotoksik aktiviteye neden olduğu belirlenmiştir. 5.4 izolatına ait parasporal proteinin A549 ve PC-3 hücreleri üzerindeki morfolojik etkisi inverted mikroskop altında izlenmiş ve bu parasporal proteinin hücreler üzerindeki sitotoksik etkisini, zamana bağlı olarak hücrelerin şişkinleşmesi, çekirdeklerinin kaybolması ve son olarak balonumsu şeklinin kaybolarak, hücre lizislerinin başlaması ile gösterdiği gözlemlenmiştir. Etki mekanizmalarının belirlenmesi amacıyla yapılan, Annexin-V ve kaspaz-3 aktivitelerinin araştırılması ile,  A549 ve PC-3 hücrelerinde 5.4 suşuna ait parasporal proteinlerin morfolojik değişimleri destekler nitelikte apoptozu indüklediği belirlenmiştir. Ayrıca propidyum iyodür ile gerçekleştirilen hücre döngüsü analizi sonucunda, apoptoza uğradığı belirlenen hücrelerin G1 evresinde hücre döngüsünü durdurduğu görülmüştür. Doğal anjiyogenez mekanizmasının bozulması sonucunda hücrelerde artan VEGF salınımının 24 saatlik inkübasyon sonrasında A549 ve PC-3 hücrelerinde kontrole göre anlamlı olarak azaldığı gözlenmiştir. Hücre göçünün belirlendiği yara iyileşme deneyi ile PC-3 hücrelerine parasporal proteinlerin uygulandığı kuyucuklarda oluşturulan yaranın kapanmadığı, yani bu boşlukları doldurmak üzere hücrelerin göç etmediği gözlenmiştir. Ayrıca, günümüzde kanser hastalıklarının tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir kemoteröpatik ajan olan cisplatin ile parasporal proteinlerin sinerjisitik etkileri araştırılmış ve kullanılan izolatlardan birinin orta dereceli sinerjistik etkiye yol açtığı tespit edilmiştir. 
Bu çalışma ile ülkemizden toplanan Bt suşlarından bazılarının kanser hücreleri üzerinde etkili parasporal protein genlerini içerdiği gösterilmiştir. Parasporal protein geni pozitif Bt suşlarından elde edilen ve Proteinaz K ile aktifleştirilen parasporal proteinlerin çeşitli kanser hücreleri üzerindeki antikanser etkileri; sitotoksik, apoptotik, anti-anjiyogenik ve yara iyileşmesi üzerindeki fonksiyonlarıyla tespit edilmiştir. Ayrıca 5.4 parasporal proteini kanser ilacı cisplatin ile kombinasyonel etkileşime girerek orta derecede sinerjistik etki göstermiştir. Bütün bu veriler, parasporal proteinlerin kanser hücrelerine karşı ilaç geliştirmede önemli bir potansiyele sahip olduklarını göstermektedir.

Abstract:
Bt produces Cry and Cyt proteins called δ-endotoxins, in the form of parasporal crystal inclusions from the onset of sporulation and throughout the stationary phase. More than 700 Cry gene sequences have been identified in recent years. Most of them have pesticidal activity which is useful in agricultural control; other crystal proteins have been termed "parasporin" due to their cytotoxic activities on cancer cells. These proteins are also classified with Cry proteins and show cytocidal activity against specific types of cancer. Due to the genetic diversity and potential toxicity of these isolates, they are being studied in different countries around the world to identify novel Bt strains. 
The aim of this study was to isolate new Bt strains from İzmir-Kemalpaşa cherry fields and to identify the crystal protein genes, and also to investigate the antiproliferative effects and mechanisms of new Bt strains by determining parasporin gene profiles in various cancer cell lines. In this study, 80 Bacillus thuringiensis strains were isolated from 41 cherry soils collected from Izmir cherry fields. In order to determine cry gene contents PCR analysis were performed and as a result of PCR studies, 66 isolates were found to carry one of the cry1, cry2 and cry3 genes and 14 of the isolates did not contain any cry gene. The parasporin gene contents of the isolates were determined by PCR analysis using 7 primer pairs and parasporin genes were found in 22 isolates. Cytotoxic effects of parasporal proteins of Bt isolates on HeLA, A549, MCF-7, PC-3 and Burkitt cancer cells and HEK-293 cells which is a healthy cell line were determined by MTT assay and it was determined that parasporal proteins cause cytotoxic activity at different rates on cells. The morphological effect of the parasporal protein of the 5.4 isolate on A549 and PC-3 cells was observed under inverted microscope and the cytotoxic effect of this parasporal protein on the cells was observed with the swelling of the cells, the loss of nuclei and finally the disappearance of the balloon shape.  In order to determine the mechanisms of action Annexin-V and caspase-3 activities were evaluated and it was found that the parasporal proteins of 5.4 isolate induced apoptosis on A549 and PC-3 cells. Besides,  it was seen that the cells determined to have apoptosis stopped cell cycle in G1 stage by cell cycle analysis with propidium iodide.  As a result of the disruption of the natural angiogenesis mechanism, increased VEGF release in the cells was observed to decrease significantly in A549 and PC-3 cells after 24 h incubation. It was observed by the wound healing experiment, the wound created in the wells where the parasporal proteins applied to the PC-3 cells were not closed, that means the cells did not migrate to fill these gaps. In addition, the synergistic effects of cisplatin, which is widely used in the treatment of cancer diseases, and parasporal proteins were investigated and it was observed that one of the isolates had moderate synergistic effect.
In this study, it has been shown that some of the Bt strains collected from our country contain parasporal protein genes acting on cancer cells. Anticancer effects of parasporal proteins derived from Parasporal protein gene positive  Bt strains on various cancer cells were determined by cytotoxic, apoptotic, antiangiogenic and wound healing activities. In addition, the combination of 5.4 parasporal proteins and the cancer drug cisplatin showed moderate synergistic effect.  All these data indicate that parasporal proteins have significant potential in developing drugs against cancer cells.