Termal kaynaklardan izole elde edilen çeşitli Bacillus türlerinden 1,4-β-endo ksilanaz enziminin üretilmesi, saflaştırılması ve ticari kullanılabilirliğinin araştırılması
Purification, production and investigation of commercial use of 1,4-β-endo xylanase in various Bacillus species isolated from thermal resources
Yazar: ORHAN ULUÇAY
Danışman: DOÇ. DR. ARZU GÖRMEZ
Erzurum Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bacillus subtilis = Bacillus subtilis ; Ksilanaz = Xylanese ; Termofilik bakteri izolasyonu = Thermophilic bacteria isolation

Özet:
Bu çalışmada; Doğu ve Güneydoğu Anadolu bölgesinde bulunan sıcak su kaynaklarından termofilik bakteriler izole edilmiştir. İzole edilen örneklerin morfolojik özellikleri tespit edilerek total ksilanaz aktiviteleri belirlenmiştir. İzole edilen DNA'lardan 16s rDNA bölgeleri PCR ile amplifiye edildikten sonra klonlanmış ve sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. Yüksek aktivite gösteren Bacillus subtilis türüne ait ksilanaz enzimini kodlayan gen dizileri biyoinformatik analiz yöntemleri ile belirlenmiştir. Nikel affinitesi ile 6X-His takısına sahip rekombinant proteinlerin saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılan enzim ANADOLUCA yöntemi ile kafeslenmiştir. 5 farklı izolat (Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis ve Geobacillus kaustophilus) tanılanmış olup bunlardan en yüksek aktivite gösteren B. subtilis izolatının ksilanazı saflaştırılarak rekombinant olarak üretilmiştir. Rekombinant ve rekombinant nano ksilanaz enziminin her ikisinin de optimum pH'nın 7.0, optimum sıcaklık değerinin ise rekombinant enzim için 68 °C, nano enzim için ise 75 °C olarak belirlenmiştir. Optimum enzim aktivitesi rekombinant enzim için 1803 U/mg, nano enzim için ise 1898 U/mg olduğu belirlenmiştir. İzolatların Km ve Vmax değerleri rekombinant enzim için sırasıyla 2,298 (mM) ve 5,691 (EU/mL.dk.), Nano enzim için ise 2,402 (mM) ve 6,195 (EU/mL.dk.) olarak belirlenmiştir. Metal iyonlarının rekombinant ksilanaz enzimi için MgSO4 (%80), CuSO4 (%57), CaCl2 (%74), ZnSO4 (%5) ve FeSO4 (%72), rekombinant nano ksilanaz enzimi için ise MgSO4 (%85), CuSO4 (%71), CaCl2 (%85), ZnSO4 (%50) ve FeSO4 (%94) farklı rölatif aktivite gösterdiği belirlenmiştir.

Abstract:
In this study; thermophilic bacteria have been isolated from hot water springs in Eastern and Southeastern Anatolia. The morphological characteristics of the isolated samples were identified and total xylanase activities were determined. The 16s rDNA regions from the isolated DNAs were amplified by PCR and then clonning and sequence analysis was performed. Gene sequences coding for xylanase enzyme from Bacillus subtilis strain with high activity were determined by bioinformatics analysis methods. Purification of recombinant proteins with 6X-His tag was performed through nickel affinity chromatography. The purified enzyme was caged by the ANADOLUCA method. Five different isolates (Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis and Geobacillus kaustophilus) were identified and the xylanase from B. subtilis isolate which showed highest activity was produced as recombinant enzyme. The optimal pH of both the recombinant and recombinant nano-xylanase enzyme was 7.0, the optimum temperature was 68 °C for the recombinant enzyme and 75 °C for the nano-enzyme. Optimum enzyme activity was determined to be 1803 U/mg for the recombinant enzyme and 1898 U / mg for the nano-enzyme. The Km and Vmax values of the isolates were determined to be 2,298 (mM) and 5,691 (EU/mL.dk) for the recombinant enzyme, 2,402 (mM) and 6,195 (EU/mL.dk) for the Nano enzyme, respectively. It was found that the recombinant and nano xylanase showed different relative activity when metal ions were included: recombinant xylanase; MgO4 (80%), CuSO4 (57%), CaCl2 (74%), ZnSO4 (5%) and FeSO4 (72%), nano xylanase; MgO4 (85%), CuSO4 (71%), CaCl2 (85%), ZnSO4 (50%) and FeSO4 (94%).