Karsinoembriyonik antijen tayini için aptamer esaslı yöntemlerin geliştirilmesi
Development of aptamer-based methods for determination of carcinoembrionic antigen
Yazar: ASLI ERKAL AYTEMUR
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM ENDER MÜLAZIMOĞLU ; PROF. DR. ZAFER ÜSTÜNDAĞ
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Aptasensörler = Aptasensors ; Elektrokimyasal sensörler = Electrochemical sensors

Özet:
Bu tez çalışmasında, kanser teşhis tekniklerinden birisi olan karsinoembriyonik antijen (CEA) proteininin tayini için iki farklı analitik kullanılarak aptasensör geliştirilmiştir. Her bir analitik teknik için CEA'e spesifik iki farklı aptamer kullanılmıştır. Analitik tekniklerden ilki, elektrokimyasal yöntem ile modifiye edilmiş piezokristal üzerine bağlanan aptamerler kullanılarak kuartz kristal mikrobalans (QCM) tekniği ile CEA tespitidir. Diğer analitik teknik ise yüzey plazmon rezonans ile güçlendirilmiş içten tam yansımalı elipsometri (SPRe-TIRE) ile CEA tespitidir. Bu çalışmada, CEA spesifik aptamerler, sırasıyla, 5′- GGGG CGAC GTTG AGAT TCCG CTTG TGTA TTAG TAGT CCCC-3′ (antiCEA1, KD= 37,8 nM) ve 5′-ATAC CAGC TTAT TCAA TTGG GGTA GGGG GCGA AGCG ATAC CCTA ATCA GC-3′ (antiCEA2, KD= 3,9 nM) dizilimindedir. 
Her iki analitik teknik için kullanılan aptamer platformları çeşitli yöntemlerle karakterize edildikten sonra iki farklı aptamer için CEA aptasensörleri geliştirilmiştir. QCM tekniği kullanılarak antiCEA1 ve antiCEA2 aptamerleriyle geliştirilen CEA tayin yönteminde 0,1-25 ng/mL CEA derişimi aralığında çalışan sensör geliştirilmiştir. Bu QCM sensör, sırasıyla y=0.25452x+0,31227 ve y=0,15113x+0,2659 eşitlikleri ile doğrusal kalibrasyon eğrisi vermiştir. QCM aptasensörlerin tespit sınırları (LOD, sinyal/gürültü oranı 3 olacak şekilde) antiCEA1 platformu için 0,102 ng/mL ve antiCEA2 platformu için 1,416 ng/mL olmuştur. SPRe-TIRE tekniğiyle geliştirilen yöntemlerde ise 0,01-500 ng/mL CEA derişimi aralığında aralığında antiCEA ve antiCEA2 aptasensörleri için, y=0,9764x+4.7766 ve y=0,6571x+1.9496 doğrusal denklemleri ifade edilen kalibrasyon eğrileri elde edilmiştir. SPRe-TIRE yönteminden elde edilen LOD değerleri sırasıyla 0,1 ve 2,9 pg/mL olmuştur. Her iki teknikle geliştirilen aptasensörlerin kalibrasyon eğrilerinin belirleme katsayısı (R2 cinsinden) 0,9870 ile 0,9955 arasında bulunmuştur. 
Daha yüksek analiz performansına sahip antiCEA1 aptasensör platformları için girişim yapması muhtemel α-fetoprotein (AFP), kanser antijen -125 (CEA-125) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü -165 (VEGF-165) türlerinin girişim etkilerine incelenmiştir. Girişim yapma ihtimali olan türler CEA varlığında 500 ng/mL derişimde eklenerek QCM ve SPRe-TIRE için girişim nedeniyle sinyal değişim miktarları %1,0 ile %4,1 aralığında elde edilmiştir.
Geliştirilen antiCEA1 aptasensörlerinin validasyon testlerinde,  gerçek numuneleri temsil etmek üzere insan kan serumu içerisine standart ekleme yöntemi kullanılmıştır. QCM tekniğinde 0,1 ve 10 ng/mL CEA ve SPRe-TIRE tekniğinde ise 1,00 ve 50 ng/mL CEA standardı eklenerek gerçekleştirilen testlerde yöntemlerin geri kazanım değerleri %95,5 ile %103,5 arasında bulunmuştur.

Abstract:
In this study, aptamer-based methods were developed with two different techniques for the determination of carcinoembryonic antigen (CEA) protein, which is one of the cancer diagnostic techniques. Two different CEA-specific aptamers were used for each analytical technique. The first method is based on the determination of CEA by quartz crystal microbalance (QCM) technique after two separate selective aptamers are bonded to the piezocrystal with electrochemical nanofilm. The other method is CEA determination with the help of selective aptamers using the surface plasmon resonance enhanced total internal reflection ellipsometry (SPRe-TIRE) method. In this study, the CEA-specific aptamers were 5′- GGGG CGAC GTTG AGAT TCCG CTTG TGTA TTAG TAGT CCCC-3′ (antiCEA1, KD= 37.8 nM) and 5′-ATAC CAGC TTAT TCAA TTGG GGTA GGGG GCGA AGCG ATAC CCTA ATCA GC-3′ (antiCEA2, KD= 3.9 nM), respectively.
After both aptamer platforms were characterized by various techniques, CEA analysis methods were developed for two different aptamers. In the CEA determination method developed with antiCEA1 and antiCEA2 aptamers using the QCM technique, the equations y=0.25452x+0.31227 and y=0.15113x+0.2659 were obtained, respectively, in the concentration range of 0.1-25 ng/mL. The detection limits of the methods (LOD, S/N=3) were determined as 0.102 ng/mL for the antiCEA1 platform and 1.416 ng/mL for the antiCEA2 platform. In the methods developed with the SPRe-TIRE technique, linear equations y=0.9764x+4.7766 and y=0.6571x+1.9496 were obtained, respectively, for antiCEA1 and antiCEA2 aptamer platforms in the concentration range of 0.01-500 ng/mL. The LOD values of the methods were determined as 0.1 and 2.9 pg/mL, respectively. In the regression analyzes performed in all methods were developed with both techniques, the R2 values ranged between 0.9870 and 0.9955.
For antiCEA1 aptasensor platforms with higher analysis performance, the interference effects of α-fetoprotein (AFP), cancer antigen-125 (CEA-125) and vascular endothelial growth factor-165 (VEGF-165) species were investigated. Potentially interfering species were added at a concentration of 500 ng/mL in the presence of CEA, and the signal change due to interference was obtained for QCM and SPRe-TIRE in the range of 1.0% to 4.1%.
In the validation tests of the developed antiCEA1 aptasensors, the standard addition method to human blood serum was used to represent real samples. The recovery values of the methods were found between 95.5% and 103.5% by spiked 0.1 and 10 ng/mL CEA for QCM technique and 1.00 and 50 ng/mL CEA for SPRe-TIRE technique.