Reseptörle etkileşen serin treonin kinaz 4 (RIPK4) ve pleimorfik adenomagen benzeri 2 (PLAGL2) proteinlerinin etkileşimlerinin araştırılması
Investigation of receptor-interacting serine-threonine kinase 4 (RIPK4) andpleimorphic adenoma gene-like 2 (PLAGL2) proteins interaction
Yazar: ASİYE BÜŞRA BOZ ER
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ TUBA DİNÇER
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Epidermis, çoğalabilen tek kat bazal keratinositlerden ve bazal katmandan
ayrılarak farklılaşma sürecine girmiş suprabazal keratinosit katmanlarından
oluşmaktadır. Epidermiste bulunan bu tabakalaşma TGF-beta, WNT, Notch, PI3K ve
NF-κB gibi gelişim biyolojisi için önemli yolaklar tarafından düzenlenmektedir. Daha
önce Aslan Tip Multiple Pterygium sendromu ile ilişkilendirilen ve epidermal
farklılaşmada yer aldığı gösterilen RIPK4'ün moleküler mekanizması tam olarak
bilinmemektedir. RIPK4'ün epidermal farklılaşma sürecindeki rolünü aydınlatmaya
yönelik olarak, yürütücülüğünü Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Yrd. Doç.
Dr. Tuba DİNÇER'in yapmış olduğu KTÜ BAP tarafından desteklenen 9749 nolu proje
kapsamında RIPK4 ile insan keratinosit cDNA kütüphanesi büyük ölçekli maya ikili
hibrit ile taranmış ve sonucunda 16 proteinin RIPK4 ile etkileştiğine dair bilgi elde
edilmiştir. Tespit edilen proteinlerden biri PLAGL2 isimli bir trankripsiyon faktörüdür.
RIPK4 ve PLAGL2' nin WNT yolağında rol aldığının daha evvel gösterilmiş olması bu
iki proteinin hücresel olaylarda birlikte çalışabileceğine dair ipucu vermektedir.
Tezin amacı, RIPK4- PLAGL2 etkileşimini in-vivo koşullarda küçük ölçek maya
ikili hibrit ile, sonrasında ko-immünopresipitasyon ve ko-immunofloresan yöntemleri
ile doğrulamak ve bu etkileşimden sorumlu domainleri analiz etmektir.
Bu doğrultuda, küçük ölçek maya ikili hibrit ile insan RIPK4 ve PLAGL2
proteinlerinin etkileştiği doğrulandı. İki proteinin memeli hücrelerinde de etkileştiği ve
bu etkileşimin RIPK4 ün N terminal kinaz domaini ile PLAGL2' nin C terminal
domaini üzerinden olduğu ayrıca, RIPK4'ün kinaz aktivitesinin etkileşim için gerekli
olduğu gösterildi. İlaveten, RIPK4'ün hücrede PLAGL2 ile birlikte ekspresyonunun
PLAGL2'nin çekirdeğe lokalizasyonunu engelleyerek PLAGL2'yi sitoplazmada, hücre
iskelet filamanları ve nokta benzeri yapılarda sabitlediği ve bu ko-lokalizasyondan
RIPK4'ün kinaz aktivitesi ve C-terminalinin sorumlu olduğu gösterildi.

Abstract:
Epidermis is a stratified squamous epithelium, composed of a proliferating basal
and differentiated suprabasal keratinocyte layers. Epidermal layers are under the control
of different signaling pathways, such as TGF-beta, WNT, PI3K and NF-kB, that are
important for development. RIPK4, which we have previously associated with Aslan
Type Multiple Pterygium syndrome, regulates the epidermal differentiation. However,
there is not enough information about the molecular mechanisms of RIPK4 in this
process. Within the context of a BAP9749 Project that was conducted by Asst. Prof.
Tuba DİNÇER and supported by KTU Scientific Reaserch Coordination Unit, RIPK4
interacting proteins were aimed to be identified to clarify the role of RIPK4 in
epidermal differentiation. For this purpose, human keratinocyte cDNA library was
screened by large scale yeast two hybrid system using RIPK4 as bait and sixteen
proteins were identified. Among them, transcription factor PLAGL2 was chosen for
further analyses since it was previously reported to have a role in WNT signaling
pathway similar to the RIPK4.
Accordingly within the scope of this thesis; we aimed to verify the interaction of
RIPK4 and PLAGL2 and identify the domains responsible for his interaction firstly in
yeast with small scale yeast two hybrid system and secondly in mammalian cells by coimmunoprecipitation and co-immunoflourescence experiments.
In this context, initially the interaction betwwen RIPK4 and PLAGL2 was
shownwith small scale yeast two hybrid in yeast. Then interaction of RIPK4 and
PLAGL2 was verifien in mammalian cells by co-immunoprecipitation experiment.
Furthermore, N-terminal domain of RIPK4 with intact kinase activity and C-terminal
domain of PLAGL2 were found to be responsive from this interaction. In addition
immunoflourescence experiment showed that when RIPK4 and PLAGL2 co-expressed
RIPK4 prevented nuclear trasnsport of PLAGL2 by keeping PLAGL2 in the
cytoskeleton filaments and cytoplasmic dot like structures and RIPK4's kinase activity
and C-terminal domain was important for PLAGL2-RIPK4 cytoplasmic co-localization.