Glutatyon redüktaz enziminin sıçan böbreğinden saflaştırılması, substrat ve inhibitör kinetiğinin incelenmesi
Purification of glutathione reductase from rat kidney and investigation of substrate and inhibitor kinetics
Yazar: BETÜL CAN
Danışman: PROF. DR. NAZMİ ÖZER ; ÖĞR. GÖR. GÜLNİHAL KULAKSIZ ERKMEN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Böbrek = Kidney ; Glütatyon = Glutathione ; Glütatyon redüktaz = Glutathione reductase ; Kinetik = Kinetics ; Saflaştırma = Purification ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Canlı hücrelerde reaktif oksijen bileşikleri, fosfolipid, protein, DNA ve RNA gibi hücresel bileşenlerin bütünlüğünü tehdit ederek mutajenik ve toksik etkilere yol açar. İndirgenmiş glutatyon (GSH) hücre, doku ve organ sistemlerinde bu tür bileşiklerin zararlı etkilerine karşı koruyucu bir antioksidan molekül olarak büyük önem taşır. GSH, glutamik asit, sistein ve glisinden oluşan bir tripeptittir ve hücrede okside glutatyon (GSSG) şeklinde de bulunur. GSSG, glutatyon peroksidaz enziminin katalizlediği peroksit detoksifikasyonu tepkimeleriyle GSH'nin oksidasyonuyla oluşurken, GSSG'nin GSH'ye indirgenmesini katalizleyen enzim ise bir flavoenzim olan glutatyon redüktazdır (GR; E.C.1.8.1.7). Glutatyon redüktazın katalizlediği bu tepkimelerde NADPH koenzim olarak görev alır ve tepkimelerde gereken NADPH büyük oranda pentoz fosfat metabolik yolunda üretilir. Bu çalışmanın amacı, glutatyon redüktaz enziminin sıçan böbrek dokusundan saflaştırılması, çeşitli özelliklerinin belirlenmesi, substrat ve inhibitör kinetiklerinin incelenmesidir. Sıçan böbrek glutatyon redüktazı sırasıyla homojenizasyon, santrifügasyon, ısı bozunumu, Sephadex G-25 jel filtrasyonu, 2',5'-ADP Agaroz 4B ve ?Polybuffer exchanger-94? kolon kromatografileri kullanılarak 2355.6 kez ve % 15.7 verimle saflaştırıldı. Enzimin özgül aktivitesi 250.28 U/mg protein olarak bulundu. Saflaştırılan enzim % 10 SDS poliakrilamid jel elektroforezinde tek bant halinde gözlendi ve alt birim molekül ağırlığı ~ 53 kDa olarak hesaplandı. Michaelis-Menten sabitleri pH 7.4 ve 37 °C'de; sabit 1 mM [GSSG]'de, 10-200 µM [NADPH] aralığı için Km(NADPH)=15.3 ± 1.4 µM; sabit 0.1 mM [NADPH]'de, 20-1200 µM [GSSG] aralığı için Km(GSSG)=53.1 ± 3.4 µM olarak bulundu. Enzimin optimum pH'sı, optimum sıcaklığı, aktivasyon enerjisi (Ea) ve sıcaklık katsayısı (Q10) değerleri sırasıyla 6.52, 65 ºC, 7.021 kcal/mol ve 1.42 olarak belirlendi.Enzimin NADP tarafından inhibisyonu GSSG'ye göre non-kompetitif, NADPH'ye göre ise kompetitif bulundu; [GSSG] sabit, [NADPH] değişken iken Ki(NADP), Lineweaver-Burk grafiğinden 118.5 ± 11.3 µM, Dixon grafiğinden 122.9 ± 38.9 µM; [NADPH] sabit, [GSSG] değişken iken Ki(NADP), Lineweaver-Burk grafiğinden 141.1 ± 19.6 µM, Dixon grafiğinden ise 116.1 ± 2.5 µM olarak bulundu.

Abstract:
Reactive oxygen species damage to entireness of biomolecules like phospholipids which provide the stability of membranes, proteins, DNA and RNA causing to mutagenic and toxic effects in living cells. Glutathione (GSH) has a crucial importance as a protective antioxidant molecule against the toxic effects of such compounds on cell, tissue and organ systems. Glutathione is a tripeptide consisting of glutamate, cysteine and glycine. It is found as in two forms in the cell; the reduced (GSH) and the oxidized form (GSSG). GSH is oxidized to GSSG in the reaction catalyzed by the enzyme glutathione peroxidase. The GSH needed for this reaction is achieved by the flavoenzyme glutathione reductase (GR; E.C.1.8.1.7) which reduces GSSG to GSH. In these reactions, NADPH serves as a coenzyme of GR and is produced mainly by the pentose phosphate pathway. The aim of this study is to purify glutathione reductase from rat kidney and investigate some of its molecular properties, substrate and inhibitor kinetics. In this study, GR was purified from rat kidney using homogenization, santrifugation, heat-denaturation, Sephadex G-25 gel filtration, 2',5'-ADP Agarose 4B and Polybuffer exchanger-94 columns chromatographies with a purification fold and percent yield of 2355.6 and 15.7, respectively. The purified enzyme had a specific activity of 250.28 units per mg of protein, displaying a single band on SDS/PAGE (10 %) with a subunit mass of ~ 53 kDa. The Michaelis-Menten constants were established at pH 7.4, 37 °C (at fixed 1 mM [GSSG], Km(NADPH)= 15.3 ± 1.4 µM for the concentration range of 10-200 µM NADPH; at fixed 0.1 mM [NADPH], Km(GSSG)= 53.1 ± 3.4 µM for the concentration range of 20-1200 µM GSSG). The optimum pH, optimum temperature, activation energy (Ea) and temperature coefficient (Q10) for rat kidney GR were found to be 6.52, 65 ºC, 7.021 kcal/mole and 1.42, respectively.The inhibition of enzyme by NADP was non-competitive with respect to GSSG and competitive with respect to NADPH; at fixed [GSSG], and variable [NADPH], Ki(NADP) value of 118.5 ± 11.3 µM was found, from Lineweaver-Burk and, 122.9 ± 38.9 µM from Dixon graph; and at fixed [NADPH], and variable [GSSG], Ki(NADP) value of 141.1 ± 19.6 µM and 116.1 ± 2.5µM were obtained from Lineweaver-Burk and Dixon graphes, respectively.