Lokal Pseudomonas suşundan antikanser proteini kodlayan azurin genini (AZU) moleküler tarama ve klonlama
Molecular screening and cloning the azurin gene (AZU) encoding anticancer protein from local Pseudomonas strain
Yazar: SHAYMAA FADHIL ABBAS AL-ANBAGI
Danışman: DOÇ. DR. MURAT ÇANLI ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ABDULAMEER M. GHAREEB
Kırşehir Ahi Evran Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Azulen = Azulen ; Pseudomonas = Pseudomonas ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production

Özet:
Kanser dünyada önde gelen ölüm nedenidir. Yaygın tedavi protokollerinin çoğunun sınırlamaları ve sakıncaları vardır. Bu nedenle, etkili kanser tedavileri bulmak birçok araştırmacının hedefidir. Terapötik peptitler, proteinler, antikorlar dahil olmak üzere geleneksel farmasötiklere göre sayısız fayda sağlayan umut verici bir ilaç sınıfıdır. Özellikle Pseudomonas aeruginosa'dan üretilen Azurinin, çeşitli kanser hücrelerinde antikanser etkisine sahip olduğu gösterilmiştir. Klinik örnekleri, Nisan 2021'in başından Temmuz 2021'in sonuna kadar Bağdat'taki ana hastanelerden toplandı. Hem cinsiyet hem de farklı yaş gruplarını içeren 150 hastadan yanık, kulak, yara sürüntüsü, balgam ve idrar örnekleri alındı, hastaların yaşları 10-68 arasındaydı. Daha önce konvansiyonel biyokimyasal testler ile tanımlanmış olan P.aeruginosa izolatlarının tanımlanmasını doğrulamak için VITEK 2 kompakt sistem ve PCR kullanılmıştır. Bu çalışma için bakteriyel izolatların konvansiyonel teşhisinin sonuçları, numunelerden 30'unun (%20) P.aeruginosa enfeksiyonları için pozitif sonuç verdiğini göstermiştir. Bu çalışmanın antibiyotik duyarlılık testi sonuçları, 16'sının (%44,44) 12 farklı antibiyotiğe dirençli olduğunu gösterdi. Bu çalışmada, bir Irak yerli suşu Pseudomonas aeruginosa'dan (Shiraq2) spesifik primerler ile PCR kullanarak azu genini bir ekspresyon vektörüne (pET28a) klonlayabildik ve IPTG ile indüksiyon olduktan sonra onu E. coli (BL-21/DE3) Rosetta'da eksprese edebildik. Azu dizisini sağlamak için amplikon azu geni (~500 bp) dizilendi ve Genscript Co., ABD tarafından sentezlenmeye gönderildi. Azu gen dizisinin, P. aeruginosa türü PA01 ile yüzde 99 özdeş olduğu bulundu. Protein saflaştırması, İyonik değişim kromatografisi (DEAE-selüloz) kullanılarak yapıldı. Proteinin aşırı eksprese edildiğini göstermek ve moleküler ağırlığını ölçmek için SDS-PAGE analizi kullanıldı. 14 kDa'ya tekabül eden kalın bir bandın görünümü, azurin proteininin etkili aşırı ekspresyonunu doğruladı. Saflaştırılmış azurin, sırasıyla 1637.35 cm-1 ve 1641.5 cm-1 civarında bir zirveye sahiptir. Sonuç olarak, azurin geni başarıyla klonlandı ve eksprese edildi. Yerel Pseudomonas aeruginosa'dan türetilen Azurin, gelecekte antikanser ve antibakteriyel araştırmalarda kullanılacaktır

Abstract:
Cancer is the leading cause of death in the world.  Most of the common treatments' protocols have limitations and drawbacks. Thus, finding effective cancer treatments is the goal of many researchers. Therapeutic peptides are a promising class of medicines that offer numerous benefits over traditional pharmaceuticals including proteins, antibodies. Azurin, in particular produced from Pseudomonas aeruginosa has been shown to have anticancer action in a variety of cancer cells.  The clinical specimens were collected from main hospitals in Baghdad from beginning of April 2021 to end of July 2021. burn, ear, wound swabs, sputum and urine samples were obtained from 150 patients include both gender and different age groups, the patient's age was between 10-68 years. VITEK2 compact system and PCR was employed for confirming the identification of P. aeruginosa isolates that were previously identified by conventional biochemical tests. The results of conventional diagnosis of bacterial isolates for the present study showed that 30 (20%) out of specimens were given a positive result for P. aeruginosa infections. The results of antibiotic susceptibility test of this study showed that 16 (44.44%) were resistant for 12 different types of antibiotics. In this study, we were able to clone the azu gene using PCR with specific primers from an Iraqi indigenous strain Pseudomonas aeruginosa (Shiraq2) into an expression vector (pET28a) and express it in E. coli (BL-21/DE3) Rosetta after induction with IPTG.  The amplicon azu gene (~500 bp) was sequenced to provide the azu sequence and submitted to synthesized by Genscript Co., USA. The azu gene sequence was found to be 99 percent identical to that of P. aeruginosa strain PA01. Protein purification was done using Ionic exchange chromatography (DEAE-cellulose). SDS-PAGE analysis was used to show that the protein was overexpressed and to quantify its molecular weight. The appearance of a thick band corresponding to 14 kDa confirmed the effective overexpression of azurin protein. Purified azurin has a peak near 1637.35 cm-1 and 1641.5 cm-1, respectively. As a result, the azurin gene was successfully cloned and expressed. Azurin derived from local Pseudomonas aeruginosa will be employed in anticancer and antibacterial investigations in the future.