Lipopolisakkartit ile farelerde oluşturulan enflamatuvar hiperaljezinin RİPK1/RİPK3/MLKL nekrozomunun katkısının araştırılması
Investigation of the contribution of RİPK1/RİPK3/MLKL necrosome to inflammatory hyperalgesia induced by lipopolysaccharide in mice
Yazar: SEDA KURT
Danışman: PROF. DR. BAHAR TUNÇTAN
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Fareler = Mice ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hiperestezi = Hyperesthesia ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Nekrostatin 1 = Necrostatin 1 ; Nekroz = Necrosis ; RIPK1 = RIPK1 ; RIPK3 = RIPK3 ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Bu tezde, lipopolisakkarit (LPS) ile farelerde oluşturulan enflamatuvar hiperaljeziye reseptör ile etkileşen serin/treonin protein kinaz (receptor-interacting serine/threonine-protein kinase; RIPK) 1/RIPK3/karışık kökenli kinaz benzeri psöodokinaz (mixed lineage kinase domain like pseudokinase; MLKL) nekrozomunun katkısı seçici RIPK1 inhibitörü nekrostatin (necrostatin; Nec)-1s kullanılarak araştırılmıştır. Deneyler 8 gruba ayrılan fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir: (1) Serum fizyolojik (SF), (2) LPS, (3) SF ve dimetil sülfoksit, (4) SF ve Nec- 1s (0.01 mg/kg), (5) LPS ve Nec-1s (0.001 mg/kg), (6) LPS ve Nec-1s (0.01 mg/kg), (7) LPS ve Nec-1s (0.1 mg/kg) ile (8) LPS ve Nec-1s (1 mg/kg). Nec-1s (10 ml/kg) SF (10 ml/kg) veya LPS (10 mg/kg; 10 ml/kg) ile aynı anda intraperitoneal yoldan uygulanmıştır. Farelerin 60 saniye içinde termal uyarıya tepki verme süreleri SF veya LPS enjeksiyonundan 6 saat sonra değerlendirilmiştir. Deneyler sonunda öldürülen farelerin beyinleri ve omurilikleri alınmıştır. Beyinler ve omuriliklerden hazırlanan doku homojenatı süpernatantlarında β-tübülin, toll benzeri reseptör (toll-like receptor; TLR) 4, RIPK1, fosforile RIPK1, RIPK3, fosforile RIPK3, MLKL, fosforile MLKL, high-mobility-group-box (HMGB) 1, kaspaz-11 p20, p30-gasdermin D (GSDMD), interlökin (interleukin; IL)-1β, semaforin (SEMA) 3A ve miyelin proteolipit protein (PLP) ekspresyonu immunoblotting yöntemiyle ölçülmüştür. Farelerin termal uyarıya yanıt verme sürelerinde LPS'nin neden olduğu azalma yalnızca 0.01 mg/kg dozda Nec-1s ile önlenmiştir. Nec-1s etkili olan en düşük dozunda (0.01 mg/kg) uygulandığında, LPS'nin neden olduğu TLR4, fosforile RIPK1, fosforile RIPK3, fosforile MLKL, HMGB1, kaspaz-11 p20, p30- GSDMD, IL-1β ve SEMA3A ekspresyonundaki artmanın yanı sıra, miyelin PLP ekspresyonundaki azalma önlenmiştir. Bu bulgular, Nec-1s'nin LPS/TLR4 yolu aracılığıyla gelişen enflamatuvar hiperaljeziyi önleyici etkisine santral sinir sisteminde RIPK1/RIPK3/MLKL nekrozomu aracılıklı nekropitoz ve kaspaz-11/GSDMD aracılıklı piropitoz ile SEMA3A ekspresyonundaki azalmanın yanı sıra, miyelin PLP ekspresyonundaki artmanın katkıda bulunabileceğini düşündürmüştür.

Abstract:
In this thesis, by using the selective receptor-interacting serine/threonine-protein kinase (RIPK) 1 inhibitor necrostatin (Nec)-1s, the contribution of RIPK1/RIPK3/mixed lineage kinase domain like pseudokinase; MLKL) necrosome to inflammatory hyperalgesia induced by lipopolysaccharide (LPS) was investigated. Mice were divided into 8 groups: (1) saline, (2) LPS, (3) saline and dimethyl sulfoxide, (4) saline and Nec-1s (0.01 mg/kg), (5) LPS and Nec-1s (0.001 mg/kg), (6) LPS and Nec-1s (0.01 mg/kg), (7) LPS and Nec-1s (0.1 mg/kg), and (8) LPS and Nec- 1s (1 mg/kg). Nec-1s (10 ml/kg) was administered simultaneously with saline (10 ml/kg) or LPS (10 mg/kg) intraperitoneally. Reaction time to thermal stimuli within 60 seconds was evaluated in mice that received either saline or LPS after 6 hours. At the end of the experiments, the brains and spinal cords of the mice were removed after they were killed. In tissue homogenate supernatants prepared from brains and spinal cords, expression of β-tubulin, toll- like receptor (TLR4), RIPK1, phosphorylated RIPK1, RIPK3, phosphorylated RIPK3, MLKL, phosphorylated MLKL, high-mobility-group-box (HMGB1), caspase-11 p20, p30-gasdermin D (GSDMD), interleukin (IL)-1β, semaphorin (SEMA) 3A, and myelin proteolipid protein (PLP) proteins was measured by using the immunoblotting method. It was observed that LPS-induce decrease in the response time of mice to thermal stimulation was prevented with Nec-1s only at a dose of 0.01 mg/kg. When Nec-1s was injected at the lowest effective dose (0.01 mg/kg), it prevented the increase induced by LPS in expression of TLR4, phosphorylated RIPK1, phosphorylated RIPK3, phosphorylated MLKL, HMGB1, caspase-11 p20, p30-GSDMD, IL-1β, and SEMA3A as well as decreased expression of myelin PLP. These results suggested that suppression of the RIPK1/RIPK3/MLKL necrosome-mediated necroptosis, caspase-11/GSDMD- mediated pyroptosis, and SEMA3A expression, in addition to increased expression of myelin PLP in the central nervous system contributes to the preventive effect of Nec-1s on inflammatory hyperalgesia mediated by the LPS/TLR4 pathway.