Boğalarda musk ksilen ve musk ketonun reproduktif toksisitesinin ın vitro araştırılması
In vitro reproductive toxicity of musk xylene and musk ketone in bulls
Yazar: BARIŞ ÖTÜN
Danışman: DOÇ. DR. BEGÜM YURDAKÖK DİKMEN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Farmasötik Toksikoloji = Pharmaceutical Toxicology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Kısırlık = Infertility ; Musk keton = Musk ketone ; Musk ksilen = Musk xylene ; Sperm = Spermatozoa ; Sığırlar = Cattles ; Toksisite = Toxicity ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques

Özet:
Antik çağlardan beri doğal musk parfümlerin hazırlanmasında koku olarak kullanılmıştır. Doğal musk her zaman çok kıymetli olmuştur, erkek musk geyiklerinin (Moschus moschiferus) ekzokrin bezlerinde bulunur. Doğal musk özlerinin kokulu bileşenleri makrosiklik ketonlar, makrosiklik laktonlar, makrosiklik alkoller ve piridin türevleridir. Düşük üretim maliyetleri ve kolay hazırlanma nedeniyle muskların sentetik türevleri olan nitro musklar; sabun, kozmetik, çamaşır deterjanı ve yumuşatıcı gibi sayısız ürünün endüstriyel üretiminde yapay koku olarak büyük miktarlarda kullanılmıştır. Musk keton şüpheli bir ko mutajen iken, musk ksilen şüpheli bir ko mutagen ve kanserojendir. Musk ksilen, Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC) tarafından grup 3'te (insanlarda kanserojen olarak sınıflandırılamaz) sınıflandırılmıştır. İn vitro çalışmalarda ise nitro musk (musk ksilen ve musk ketonun) muhtemelen östrojenik aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Bu bileşiklere canlılar özellikle inhalasyon ve dermal yol ile maruz kalmaktadır. Bu kirleticiler, çevresel yolla su kaynaklarına bulaşabilmekte ve su canlılarına, çevreye ve organizmalarda sağlığa yönelik istenmeyen etkiler oluşturabilmektedir. Bu bileşiklerin insan sütüne geçişine ilişkin çalışmalar bulunmakla birlikte, inek ya da diğer hayvanların süt ya da dokusuna geçişine ilişkin çalışmalar sınırlı veya bulunmamaktadır. Özellikle insan ve çevresel kaynaklı maruziyet yolları göz önünde bulundurulduğunda boğalarda, endokrin bozucu etkinliği gösterilen bu kimyasallar için reproduktif toksisitenin yapılmamış olması, ileride damızlık potansiyeline sahip olan hayvanlar için önem taşımaktadır. Bu değerlendirmelerden yola çıkılarak, yapılan çalışmada, parfüm bazlarında bulunabilen nitro musk bileşiklerinden musk ksilen ve musk ketonun boğalarda erkek reproduktif toksisitesinin in vitro olarak araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla öncelikle musk keton ve musk ksilen bileşikleri primer parenşimal testiküler hücre kültüründe, sperm örneklerinde toksisitesi belirlenmiştir. IC50 değeri hücre kültüründe MK için 0,34 µg/ml, MX için 0,32 µg/ml bulunmuş olup, epididimal sperm hücrelerinde MK için 0,48 µg/ml, MX için 0,58 µg/ml bulunmuştur. Daha sonra sperm hücreleri IC50 ve daha düşük konsantrasyonlarda nitro musklara maruz bırakılmış ve Bilgisayar Aracılı Sperm Analiz Sistemi (CASA) kullanılarak 0, 4 ve 24 saat içerisinde motilite parametreleri (progresyon, motilite, VCL, VSL, VAP ve LIN değerleri, ALH, hiperaktivite vb.) yönüyle değerlendirilmiştir. Flow Sitometre kullanılarak akrozom uyarılmış/uyarılmamış, canlı/ölü oranlar yönüyle nitro muskın sperm üzerine etkileri gösterilmiştir. Kirleticilerin membran transport proteinleri üzerine etkileri değerlendirildiğinde, bazılarının bu proteinlerin ifadelerini arttırdığı, bazılarının ise azalttığı ve buna bağlı olarak toksik etki gösterdikleri görülmektedir. Kan testis bariyeri organizmada en kompleks bariyerler arasındadır ve özellikle gelecek nesillerin korunması için bu transport proteinlerin ekspresyonu önem taşımaktadır. Yapılan çalışma kapsamında nitro musk bileşiklerinin membran transport proteinleri arasında en önemlileri arasında yer alan P-gp üzerine etkileri, Western blot ile araştırılmıştır. P-gp protein ifadesi, her iki nitro musk bileşiği uygulaması sonrası azalmıştır, bu azalma MK için MX'den daha yüksektir. Hayvan modelleri ve epidemiyolojik kanıtlar, sperm sayısının azalması, infertilitenin artması, testiküler disgenezis sendromu ve testiküler ve prostat kanserleri ile endokrin bozucu kimyasallara maruz kalmayı ilişkilendirmektedir. Kimyasal maddelerin sperm kalitesi üzerine etkilerinin CASA ile ölçülmesi hem üreme toksikolojisi hem de risk değerlendirmesi bakımından önemli olup, henüz veteriner hekimlikte yaygın uygulama alanı bulamamıştır. Kimyasalların insan erkek reproduktif toksisitesine yönelik etkilerinin araştırılmasında in vitro testler içerisinde boğa spermi ile yapılan MTT ve CASA testleri batarya test olarak kabul edilmektedir. Ancak türler arası farklılık göz önünde bulundurulduğunda, bu testlerin farklı hayvan türleri arasında değerlendirilmesi ve maruziyete bağlı risk analizlerinin yapılmasında türlere özgü sistemlerin geliştirilmesi öne çıkmaktadır. Dolayısıyla boğalarda sperm kalitesinin değerlendirilmesi, genellikle klinik ortamda doğurganlığın öngörülmesi ile veya maksimum sayıda yavruya ulaşma isteğiyle bağlantılıdır; ancak kirleticiler gibi çevresel faktörlerden etkilenebilmektedir. Bu tür değerlendirmeler milyarlarca dolarlık endüstrileri (ör. süt, hayvancılık, kümes hayvanları) etkileyen risk değerlendirmelerinin temelini oluşturmaktadır. Bu çalışmada; nitro musk bileşiklerinden musk ksilen ve musk ketonun boğalarda erkek reproduktif toksisitesi ve testiküler P-gp ile ilişkisi değerlendirilmiştir. Sonuç olarak; boğalarda musk ksilen ve musk ketonun reproduktif toksisitesinin in vitro araştırılmasının yapıldığı çalışmamızda hem musk ketonun hem de musk ksilenin boğa spermleri için toksik olduğu, ilaçların bazı sperm fonksiyonlarını bozduğu, birçok parametrede musk ketonun musk ksilene göre toksikolojik etkisinin daha fazla olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Bu çalışma MTT, CASA ve flow sitometre testlerinin boğa reproduktif toksisite denemelerinde batarya testi olarak kullanılabilmesi için önemli bir alt yapı oluşturmuştur.

Abstract:
Since ancient times, natural musk has been used as a fragrance in the preparation of perfumes. Natural musk has always been very valuable, found in the exocrine glands of male musk deer (Moschus moschiferus). Fragrant components of natural musk extracts are macrocyclic ketones, macrocyclic lactones, macrocyclic alcohols and pyridine derivatives. nitro musks, which are synthetic derivatives of musks due to their low production costs and easy preparation; are used in large quantities as an artificial fragrance in the industrial production of numerous products such as soap, cosmetics, laundry detergent and fabric softener. Musk ketone is a suspected commutagen, while musk Xylene is a suspected comutagen and carcinogen. musk Xylene has been classified in group 3 (not classifiable as a human carcinogen) by the International Agency for Research on Cancer (IARC). In vitro studies have shown that nitro musk (musk xylene and musk ketone) probably has estrogenic activity. Living things are exposed to these compounds, especially by inhalation and dermal route. These pollutants can contaminate water resources by environmental means and cause undesirable effects on aquatic organisms, the environment and health of organisms. Although there are studies on the excretion of these compounds into human milk, studies on the transfer into the milk or tissue of cows or other animals are limited or absent. Considering the human and environmental exposure routes, it is important for animals with breeding potential that no reproductive toxicity has been made for these chemicals, which have endocrine disrupting activity in bulls. Based on these evaluations, in this study, it was aimed to investigate the male reproductive toxicity of musk xylene and musk ketone, which are nitro musk compounds that can be found in perfume bases, in bulls in vitro. For this purpose, firstly, the toxicity of musk ketone and musk xylene compounds in primary parenchymal testicular cell culture and sperm samples were determined. The IC50 value was found to be 0,34 µg/ml for musk ketone, 0,32 µg/ml for musk xylene in cell culture, and 0,48 µg/ml for musk ketone and 0,58 µg/ml for musk xylene in epididymal sperm cells. Afterwards, sperm cells were exposed to nitro musks at IC50 and lower concentrations and using Computer-Aided Sperm Analysis System (CASA) in 0, 4 and 24 hours for motility parameters (progression, motility, VCL, VSL, VAP and LIN values, ALH, hyperactivity etc.). The effects of nitro musk on sperm in terms of acrosome stimulated/unstimulated live/dead ratios were demonstrated using flow cytometry. When the effects of contaminants on membrane transport proteins are evaluated, it is seen that some of them increase the expression of these proteins, while others decrease them and accordingly have toxic effects. The blood testis barrier is among the most complex barriers in the organism, and the expression of these transport proteins is especially important for the protection of future generations. In this study, the effects of nitro musk compounds on P-gp, which is among the most important membrane transport proteins, were investigated by Western blot. P-gp protein expression decreased after administration of both nitro musk compounds, the reduction being higher for musk ketone than for musk xylene. Animal models and epidemiological evidence link exposure to endocrine disrupting chemicals with decreased sperm count, increased infertility, testicular dysgenesis syndrome, and testicular and prostate cancers. Measuring the effects of chemical substances on sperm quality with CASA is important in terms of both reproductive toxicology and risk assessment, and has not yet found widespread application in veterinary medicine. In the investigation of the effects of chemicals on human male reproductive toxicity, MTT and CASA tests performed with bull sperm among in vitro tests are considered battery tests. However, considering the differences between species, the development of species-specific systems comes to the fore in the evaluation of these tests among different animal species and in conducting risk analysis related to exposure. Thus, evaluation of sperm quality in bulls is often linked to the prediction of fertility in the clinical setting or the desire to achieve the maximum number of offspring; however, it can be affected by environmental factors such as pollutants. Such assessments form the basis of risk assessments affecting multibillion-dollar industries (eg dairy, livestock, poultry). In this study; musk xylene and musk ketone, which are nitro musk compounds, were evaluated for male reproductive toxicity and testicular P-gp in bulls. As a result; in our study, in which the reproductive toxicity of musk xylene and musk ketone was investigated in bulls, it was concluded that both musk ketone and musk xylene are toxic for bull sperm, drugs affect some sperm functions, and musk ketone has more toxicological effects than musk xylene in many parameters. This study has formed an important infrastructure for the use of MTT, CASA and flow cytometry tests as battery tests in bull reproductive toxicity trials.