Solunum yolu örneklerinden izole edilen tüberküloz dışı mikobakterilerin PCR-RFLP yöntemi ile tanımlanması
Identification of non-tuberculous mycobacteria isolated from respiratory specimens by PR-RFLPC method
Yazar: ŞERİHAN KÜBRA EMİKOĞLU CERİT
Danışman: PROF. DR. GÜLNUR TARHAN
Adıyaman Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Genler = Genes ; Mycobacterium = Mycobacterium ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Solunum sistemi = Respiratory system

Özet:
Amaç: Mikobakterilerin tür düzeyinde hızlı ve doğru tanımlanması hastalığın etkene
özgün tedavisi için önemlidir. Tanımlamada kullanılan konvansiyonel yöntemler uzun
zaman alması, tartışmalı sonuçları ve mevcut olan 170 üzerindeki türü tanımlamadaki
sınırlılıklarıyla günümüzde yerini moleküler yöntemlere bırakmıştır. Bu çalışmada
Adıyaman Üniversitesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi ile Atatürk Göğüs Hastalıkları ve
Göğüs Cerrahisi Eğitim Araştırma Hastanesi'nden (Dr. İsmail Ceyhan) gönüllülük
esasına dayalı olarak gönderilen solunum yolu örneklerinden soyutlanan 34 adet
tüberküloz dışı mikobakteri (TDM) izolatının ve 14 adet referans suşun PCR-RFLP
yöntemi ile tür düzeyinde tanımlanması amaçlanmıştır.
Yöntem: Çalışmamızda Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght
Polymorphism (PCR-RFLP) yöntemi kullanılmıştır. Laboratuvarımıza gelen izolatların
Löwenstein-Jensen besi yerlerine ekimi yapılarak üremeleri sağlanmıştır. Üreyen
kültürlerden alınan örneklerin kaynatma yöntemiyle DNA izolasyonu yapıldıktan sonra
hsp65 gen bölgesine özgün primerler kullanılarak, PCR ile amplifiye edilmiştir.
Amplifikasyon sonrası PCR ürünleri BstEII ve HaEIII enzimleri ile bir gece
bekletildikten sonra DNA fragmanları referans algoritmalar ile karşılaştırılarak
değerlendirilmiştir.
Bulgular: Çalışmamızda kullanılan 34 izolattan TDM'lerin tür dağılımı; %23,52(8/34)
M. intracellulare, %17,64 (6/34) M. gordonae, %17,64 (6/34) M. abscessus, %17,64
(6/34) M. simiae, %5,88 (2/34) M. lentiflavum, %2,94 (1/34) M. kansasii, %2,94 (1/34)
M. scrofulaceum olarak belirlendi. Örneklerden 4 tanesi değerlendirilemedi.
Sonuç: Çalışmamızda kullanılan mikobakteri izolatlarından en yaygın olarak saptanan
türlerin M. intracellulare, M. abscessus ve M. simiae olduğu tespit edilmiştir.
Bu çalışmaya göre PCR-RFLP yöntemi mikobakterilerin tür düzeyinde tanımlanmasında
konvansiyonel yöntemlere göre daha hızlı ve kesin tanı sağlayan faydalı bir yöntemdir.
Ancak enzimle kesim işlemleri sonrasında oluşan DNA fragmanlarının değerlendirilmesi
ve referans algoritmalar ile karşılaştırılması aşamalarının kritik önem taşıdığı görüldü.
Özellikle görüntüleme işlemlerindeki standardizasyonun doğru türü belirlemede oldukça
önemli olduğu sonucuna varıldı.
Anahtar kelimeler: Tüberküloz dışı mikobakteri, PCR-RFLP, hsp65 gen

Abstract:
Background: Rapid and accurate identification of mycobacteria is important for the
treatment of the disease. Conventional methods used in identification have long been
replaced by molecular methods with their controversial results and limitations in
identifying over 170 species. In this study, it was aimed to identify 34 NTM isolates and
14 reference strains isolated from respiratory tract samples (sputum) sent from Adıyaman
University Training and Research Hospital and from Atatürk Thoracic Diseases and
Thoracic Surgery Training and Research Hospital (Doc. İsmail Ceyhan) according to the
voluntary procedure at specify level by PCR-RFLP method.
Material and methods: In our study, Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment
Lenght Polymorphism (PCR-RFLP) method was used. It was ensured that the isolates
coming to our laboratory were cultivated on LJ media. DNA isolation was performed by
boiling the samples from the cultivated cultures and then amplified by PCR using primers
specific to the hsp65 gene region. After amplification, PCR products were kept overnight
with BstEII and HaEIII enzymes, and DNA fragments were evaluated by comparison
with reference algorithms.
Results: Species distribution of NTMs out of 34 isolates used in our study; 23.52% (8/34)
M. intracellulare, 17.64% (6/34) M. gordonae, 17.64% (6/34) M. abscessus, 17.64%
(6/34) M. simiae was determined as 5.88% (2/34) M. lentiflavum, 2.94% (1/34) M.
kansasii and 2.94% (1/34) M. scrofulaceum. 4 of the samples could not be evaluated.
Conclusion: The most common mycobacterial isolates were M. intracellulare, M.
abscessus and M. simiae. According to this study, PCR-RFLP method is a useful method
that provides faster and more precise diagnosis in comparison to conventional methods
in the identification of mycobacteria at the species level. However, the steps of evaluating
DNA fragments formed after enzyme cutting and comparing them with reference
algorithms were found to be critical. It was concluded that standardization, especially in
imaging processes, is very important in determining the correct type.
Keywords: Non-tuberculosis Mycobacteria, PCR-RFLP, hsp65 gene