Sağlıklı kemik iliği donörlerinde granülosit koloni stimüle edici faktörün mezenkimal kök hücre kaynaklı immün modülatör sitokinlere etkisi
The effect of granulocyte colony-stimulating factor on immune modulatory cytokines by mesenchymal stem cell in the healthy bone marow donors
Yazar: İKBAL OK BOZKAYA
Danışman: PROF. DR. DUYGU UÇKAN ÇETİNKAYA ; DOÇ. DR. FATİH MEHMET AZIK
Sağlık Bakanlığı / Ankara Çocuk Sağlığı ve Has. Hematoloji Onkoloji Eğt. Arş. Hastanesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Hematolojik Onkoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Dinoproston = Dinoproston ; Granülosit koloni stimülan faktör = Granulocyte colony stimulating factor ; Hepatositler = Hepatocytes ; Kemik iliği = Bone marrow ; Kök hücreler = Stem cells ; Sitokinler = Cytokines ; Stroma = Stroma ; Transforme edici büyüme faktörleri = Transforming growth factors ; Transforme edici büyüme faktörü-beta = Transforming growth factor-beta

Özet:
Granülosit koloni uyarıcı faktör (GCSF) hematopoezi ve immün sistemi düzenleyici temel hematopoetik büyüme faktörüdür. Radyoterapi ve kemoterapi sonrası gelişen myelosupresyon sonrasında normal hematopoetik hücrelerin çoğalması ve farklılaşmasını artırması ve nötrofillerin fonksiyonlarını aktive etmesi nedeni ile klinikte yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca kemik iliği kök hücrelerinin periferik kana geçmesini sağlaması nedeniyle periferik kök hücre naklinde donörlere uygulanmaktadır. Seyrek olarak da periferik kandan kök hücre toplamaya uygun olmayan ve verici kemik iliğinden hasta için gereken sayıda kök hücre toplanamayacağı öngörülen donörlere de kemik iliği toplanmadan önce G-CSF verilmektedir. Granülosit koloni uyarıcı faktörün T hücre reaktivitesi ve antijen sunan hücrelerin fonksiyonunu modifiye ederek immün sistemi etkilediği bildirilmiştir. Devam eden çalışmalarda ise G-CSF'nin inflamatuvar cevabı uyarıcı ancak adaptif immün sistemi baskılayıcı özellikleri gösterilmiştir. Kök hücre nakli amacıyla donörlere verilen G-CSF'nin hastanın immün sistemini nasıl etkilediği konusunda literatürde yeterli bilgi bulunmamaktadır. Donöre uygulanan G-CSF'nin hastada transplant sonrası T lenfositlerin inflamatuvar fenotipten immünsupresif özelliğe geçmelerinde (Th1- Th2 shift) rol oynayarak alloimmün cevabı etkilediği ileri sürülmektedir.Mezenkimal kök hücreler (MKH) 30 yıl kadar önce in-vitro kemik iliği kültür ortamında plağa yapışan ve hematopoetik kök hücrelerden farklı iğsi bir hücre topluluğunun fark edilmesi ile tanımlanmıştır. Mezoderm kaynaklı çoğu dokudan izole edilmiş ve mezoderm kaynaklı dokulara farklılaşabildikleri gösterilmiştir. Günümüze kadar bu hücrelerin özellikleri, fonksiyonları konusunda araştırmalar yapılmıştır. Bu hücrelerin; hücresel etkileşimlerle hücrelere destek olduğu, salgıladığı faktörlerle kök ve öncül hücrelerin büyümesi ve farklılaşmasında, anjiogenezde ve immün modulasyonda rol aldığı düşünülmektedir. Literatürde immün modulatuvar etkilerin ortaya çıkmasında hücre-hücre ilişkilerinin ve MKH'lerden salınan transforme edici büyüme faktörü ß1 (TGF- ß1), hepatosit büyüme faktörü (HGF), prostaglandin E2 (PGE2), indoleamin dioksijenaz (IDO) ve insan lökosit antijeni G-5 (HLA-G5) gibi faktörlerin önemli katkısı olduğu bildirilmiştir. Son yıllarda bu hücreler rejeneratif tedavide giderek artan ilgi uyandırmış, bilhassa immünmodulatuvar özellikleri nedeniyle steroide cevapsız akut graft-versus-host hastalığı (aGVHH) başta olmak üzere çeşitli patolojik durumlarda deneme tedavisi veya deneysel araştırma kapsamında klinik uygulama alanına girmiştir.G-CSF'nin immün sistem üzerindeki etkilerinde MKH'lerin katkısı ve MKH'lerden salınan immün modulatuvar sitokinlerin etkisi olup olmadığı incelenmemiştir. Granülosit koloni uyarıcı faktör ile uyarılmış kemik iliğinden izole edilen MKH'lerin salgıladıkları immün modulatuvar sitokinlerde değişiklikler olacağı düşünülerek bu çalışma planlanmıştır.Bu amaçla, G-CSF ile uyarılmış ve uyarılmamış sağlıklı kemik iliği nakli vericilerinden toplanan kemik iliği örneklerinden izole edilerek in-vitro hücre kültür ortamında çoğaltılan MKH'lerin incelenmesi planlanmıştır. Granülosit koloni uyarıcı faktör ile uyarılmış 8 sağlıklı kemik iliği donörlerinden elde edilen MKH'ler in-vitro kültür ortamında çoğaltıldıktan sonra morfolojik, fenotipik, farklılaşma özellikleri incelenmiş ve 2. pasaja getirilen hücrelerin (P2) kültür süpernatantlarında immün modulatuvar sitokinler olan TGF- ß1, HGF ve PGE2 düzeyleri ölçülerek G-CSF ile uyarılmamış sağlıklı kemik iliği vericilerinden aynı şekilde elde edilen kemik iliği MKH'leri ile karşılaştırılmıştır. Çalışmada ayrıca kemik iliği mikroçevresini yansıtacağı düşünülen kemik iliği plazmasında da aynı solubl faktör düzeyleri ölçülmüş ve karşılaştırmalar yapılmıştır.Çalışmada G-CSF ile uyarılmış veya uyarılmamış sağlıklı donörlerin tamamından MKH kültürleri geliştirilebilmiştir. İncelemeler sonunda morfolojik, antijenik ve farklılaşma özellikleri açısından G-CSF ile uyarılmış MKH'lerin sağlıklı kontrollerden elde edilenler ile benzerlik gösterdiği görülmüştür. Granülosit koloni uyarıcı faktör ile uyarılmış 8 sağlıklı donörün MKH süpernatantında TGF- ß1, HGF ve PGE2 düzeylerinin incelenmesi sonucu ise PGE2 düzeyinde kontrol grubuna göre istatiksel anlamlı bir düşüklük saptanmıştır. Donörlerin kemik iliği plazmasında aynı sitokinler ölçülmüş ve G-CSF alanlarda HGF düzeyleri istatiksel anlamlı bir yükseklik bulunmuştur. Granülosit koloni uyarıcı faktörün kemik iliği üzerine etkisi hayvan deneylerinde incelenmiş, bilindiği kadarıyla bu konuda insanlarda yapılan bir çalışma bildirilmemiştir. Bu bulgular, G-CSF'nin kemik iliği kaynaklı immün modulatuvar sitokinlerde değişikliğe neden olarak kemik iliği mikroçevresini değiştirdiği ve MKH'nin salgıladığı sitokinleri etkilediğini göstermektedir. Özetle, G-CSF faktör ile uyarılmış kemik iliği MKH'lerinin morfolojik, fiziksel, antijenik özellikleri ve farklılaşma kapasitesi yönünden G-CSF ile uyarılmamış sağlıklı kontrollerden geliştirilen hücrelerle benzer olduğu, ancak MKH'lerin en önemli özellikleri olan sekretuvar kapasite yönünden farklılık gösterdiği, MKH'lerden TGF- ß1, HGF ve PGE2 salınımının olduğu ve bunun hastadan hastaya farklı olduğu gösterilmiştir. Bu bulgular, GCSF'nin inflamasyon ve immün modulasyon üzerine olan etkilerinde kemik iliği MKH'lerinin ve kemik iliği mikroçevresindeki değişikliklerin katkısı olduğunu göstermiştir.Anahtar kelimeler: Mezenkimal kök hücre, mezenkimal stromal hücre, granülosit koloni uyarıcı faktör, prostaglandin E2 (PGE2), Hepatosit büyüme faktörü (HGF), transforme büyüme faktörü-ß1 (TGF- ß1), kemik iliği, mikroçevre

Abstract:
Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is the basic hematopoietic growth factor that modulates hematopoiesis and immune system. It is widely used in clinical practice for radiotherapy and chemotherapy induced myelosuppression to increase the proliferation and differentiation of hematopoietic cells and activate the neutrophils functions. In addition, G-CSF is administered to donors to mobilize stem cells from the bone marrow into peripheral blood prior to collection from of peripheral blood stem cells. G-CSF is rarely administered to donors prior to bone marrow harvest. However if the established number of stem cells needed for the recipient will necessitate large volume marrow collection from the donor and if the donor is not eligible for peripheral blood collection G-CSF may be used to increase the stem/progenitor cell content of the prodıct. G-CSF has been shown to affect the immune system by modifying T-cell reactivity and antigen presenting cell function. Following studies have shown that G-CSF stimulates the inflammatory response while suppressing the adaptive immune system. However, there is paucity of information in the literature regarding the effects of G-CSF primed stem cells on recipient immune system. Data suggest G-CSF induced TH-1 to TH-2 shift may play a role in modification of the alloimmune reactions in the recipient.Mesenchymal stem cells (MSC) were first characterized more than 30 years ago, and were described as fibroblast-like cells with the property of adhering to plastic when bone marrow cultured in-vitro. It has been shown that MSCs may be isolated from most of the mesoderm derived tissues and have the differentiation capacity of mainly connective tissue and different mesoderm tissues. Up to date, several studies have been performed on biological properties and function of these cells. MSCs are believed to play a role in supporting other types of cells/stem cells by establishment of cellular interactions, by providing secretory factors for growth, differentiation, and other biological functions and by contributing to in angiogenesis and immune modulation. MSCs have been shown to effect the functions of immune cells mainly by secretion of immune modulatory factors such as transforming growth factor beta 1 (TGF-ß1), hepatocyte growth factor (HGF) and prostaglandin E2 (PGE2), indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), human leucocyte antigen G-5 (HLA G-5) and through cell-cell interactions. In the recent years, these cells have aroused increasing attention in the field of regenerative medicine, and for treatment of autoimmune and inflammatory conditions including steroid resistant graft-versus-host disease (GVHD) in which clinical trials are ongoing.To our knowledge, the effect of G-CSF on the immunomodulatory functions of MSCs and on secretion of immune modulatory cytokines has not been studied. In the present study it is hypothesized that G-CSF?primed bone marrow derived MSCs may modulate secretion of immune modulatory cytokines in the bone marrow microenvironment.For this purpose, examination of G-CSF-primed and unprimed bone marrow derived MSCs is planned. In the present study G-CSF-primed bone marrow derived MSC?s from 8 healthy donors were expanded in in-vitro cultures, and their proliferative characteristics, morphology, phenotype and differentiation capacity were examined. In addition, supernatants of the second passage of MSCs were evaluated for TGF-ß1, HGF and PGE2 levels and compared with the controls. Furthermore, in order to reflect their status in the microenvironment of the bone marrow, the levels of those soluble factors were also determined in the bone marrow plasma of the G-CSF primed and unprimed donors.Mesenchymal stem cell expansion was successful in all samples obtained from controls and G-CSF stimulated donors. Morphological, surface antigenic properties and differentiation capacity of MSC?s were similar in patient and control samples. The analyses of TGF-ß1, HGF and PGE2 levels in the G-CSF-primed and unprimed bone marrow derived MSCs supernatants revealed that PGE2 levels were signicantly lower in the G-CSF-primed samples. These cytokines were also measured in the bone marrow plasmas and a statistically significant increase was detected in the level of HGF in G-CSF-primed bone marrow plasmas. These findings suggest that G-CSF induces changes in the bone marrow microenvironment through modification of secretion of immune modulatory cytokines and affects the secretion of cytokines from MSCs. The current study is novel to show the effects of G-CSF on bone marrow microenvironment of healthy human donors. The preliminary data suggest that G-CSF-primed and unprimed bone marrow derived MSCs have similar morphologic/phenotypic properties and differentiation capacity but differ in their secretory capacity, the most important feature of MSCs. In addition significant changes in cytokine levels of bone marrow plasma of G-CSF primed donors were also demonstrated. These findings suggest that bone marrow MSCs and changes in the marrow microenvironment may contribute to the effects of G-CSF on inflammation and immune modulation.Keywords: Mesenchymal stem cell, Mesenchymal stromal cell, granulocyte colonystimulating factor, prostaglandin E2 (PGE2), hepatocyte growth factor (HGF), transforming growth factor ß1 (TGF-ß1), bone marrow, microenvironment