Farelerin dorsumuna yerleştirilen insan dişi kök dentinlerinin değişik asitlerle dağlanmasi sonrasi insan dental pulpa kök hücre ekimi yoluyla yapilan rejeneratif endodontik tedavilerde oluşan yeni dokularin histolojik ve immunohistokimyasal yöntemlerle karşılaştırmali olarak incelenmesi
Comparative histological and immunohistochemical analysis of new tissues after conditioning root canal dentin with different acids in regenarative endodontic treatment using dpsc seeding implanted in mice dorsum
Yazar: ALP ABİDİN ATEŞÇİ
Danışman: PROF. DR. AHMET CEMAL ERONAT
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Pedodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Dental pulpa = Dental pulp ; Dentin = Dentin ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Endodonti = Endodontics ; Fareler = Mice ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kemik rejenerasyonu = Bone regeneration ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Rejeneratif endodontik tedavilerin amacı, travmatik yaralanmalar veya bakteriyal kontaminasyon sonrası gelişen enflamasyon sonucu canlılığını kaybetmiş ve bundan dolayı kök gelişimi duraksamış dişlerin pulpa-dentin kompleksinin gelişiminin ve fonksiyonunun tekrar kazandırılmasıdır. Klinik rejeneratif endodontik tedavilerde son irrigasyon ajanı olarak EDTA kullanımı altın standart olarak kabul edilmektedir. Bu çalışmanın amacı rejeneratif endodontik tedavilerde kullanılan EDTA'ya alternatif olabilecek dentin pürüzlendirme ajanlarının dentinden büyüme faktörlerinin (TGF-β1, FGF, VEGF ve BMP-2) salınımına ve kullanımları sonrasında oluşan yeni dokulara olan etkilerinin histolojik ve immünohistokimyasal yöntemler ile incelenmesidir.
Çalışmamızın in vitro bölümünde çekilmiş gömülü yirmi yaş dişlerinin koronal bölümleri kullanılmıştır. Çekilen dişlerin önce kök kısımları, daha sonra da mineleri su soğutması altında aeratör yardımıyla uzaklaştırılmıştır. Kök kısımlarından ayrılmış kronlar önce kron-kök istikametinde ortadan ikiye bölünmüş ve her parçadan enlemesine izomet cihazı yardımıyla steril salin irrigasyonu altında 1mm kalınlığında dentin diskleri elde edilmiştir. Dentin disklerinin ilk yarısındaki örnekler kontrol (distile su) ve test edilecek asit gruplarına (EDTA, sitrik asit, fitik asit, fosforik asit) belirlenen sürelerde batırılmış ve öğütülerek toz haline getirilmiştir. Dentin disklerinin ikinci yarısındaki örnekler kontrol ve test edilecek asit gruplarına batırıldıktan sonra 3 gün süre ile mezenkimal kök hücre ortamında inkübasyona bırakılmıştır. 3 günlük inkübasyon periyodundan sonra örnekler toplanmış ve öğütülerek dentin tozu haline getirilmiştir. Elde edilen dentin tozları TGF-β1, FGF-2, VEGF ve BMP-2 salınımları açısından ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) kitleri yardımıyla incelenmiştir. Kök hücre ekimi yapılmayan gruplar içerisinde en yüksek TGF-β1 salınımı sitrik asit grubunda, en yüksek VEGF salınımı fosforik asit grubunda, en yüksek BMP-2 ve FGF-2 salınımı fitik asit grubunda gözlenmiştir. Kök hücre ekimi yapılan gruplar içerisinde en yüksek TGF-β1, VEGF ve BMP-2 salınımı fosforik asit grubunda gözlenirken en yüksek FGF-2 salınımı EDTA grubunda gözlenmiştir. MKH uygulaması sonucunda tüm büyüme faktörlerinde dramatik bir artış olduğu gözlenmiştir.
Çalışmamızın in vivo bölümünde çekilmiş tek köklü insan keser dişlerinin kök bölümleri kullanılmıştır. Çekilen dişlerin kron kısımları su soğutması altında aeratör yardımıyla uzaklaştırılmıştır. Kök kanalları kanal eğeleri yardımıyla genişletildikten sonra 3-4 mm uzunluğunda kök fragmanı örnekleri elde edilmiştir. Kök fragmanları, kontrol (Distile su) ve asit grupları (EDTA, sitrik asit, fitik asit, fosforik asit) ile irrige edilmiştir. İrrigasyon tamamlandıktan sonra kök kanallarının dar çapa sahip uç kısımları 1-2 mm kalınlığında mineral trioksit agregat (MTA) ile örtülmüştür. Örneklerin ilk yarısındaki kök fragmanlarının içine sadece polilaktid-koglikolik asit (PLG) doku iskelesi implantasyonu yapılmıştır. Grupların ikinci yarısındaki kök fragmanlarının içine, hücre kültüründe üzerine insan MKH ekimi yapılan sentetik PLG doku iskeleleri yerleştirilmiştir. Kök fragmanları immünsupresif deney farelerinin dorsumlarına (fare başına 2 adet kök fragmanı) subkutan olarak yerleştirilmiştir. 2 ay sonra fareler sakrifiye edilerek dişler histolojik ve immünohistokimyasal boyalar yardımıyla incelenmiştir. MKH ve asit uygulaması yapılan örneklerde çok daha organize ve pulpa benzeri bir doku oluşumu gözlenmiştir. Odontoblastlar tarafından eksprese edilen belirteçlerin en yoğun olarak fosforik asit + MKH grubunda boyandığı saptanmıştır. Fosforik asitin rejeneratif endodontik tedavilerde altın standart olarak kabul edilen EDTA yerine kullanılabileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
The primary goal of the regenerative endodontic treatment is to regain vitality and function of pulp-dentin complex which lost due to trauma or microbial contamination. By this way, root development will continue and teeth will function as an organ in its lifespan. EDTA has been considered the gold standard in regenerative endodontic treatments. The aim of this study was to evaluate the effects of different dentin conditioning agents alternative to EDTA on released growth factors (TGF-β1, FGF , VEGF ve BMP-2) and investigate their effects on the newly formed tissues in vivo by histochemical and immunohistochemical methods.
In the in vitro part of the study coronal sections of extracted human impacted third molar teeth were used. Crowns were seperated from roots and splitted from its half by cutting corono-apical direction and cut into a disc shape (approximately 1-mm thick) horizontally with isomet saw under sterile saline irrigation. First half of the dentin discs prepared from half of the crowns were immersed in the acids and grinded into dentin powder. Other half of the dentin discs prepared from other half of the crowns were conditioned with the same acids and medium containing human mesenchymal stem cells (MSCs) were seeded onto dentin discs for three days. After three days of incubation period, dentin discs were removed and grinded into dentin powder. Dentin powders were tested by ELISA kits for TGF-β1, FGF-2, VEGF and BMP-2 quantification. In the first half of the groups, highest TGF-β1 release was seen in citric acid group, highest VEGF release was seen in phoshoric acid group, highest BMP-2 and FGF-2 release was seen in the phytic acid group. In the second half of the groups highest TGF-β1, FGF-2 and BMP-2 release was seen in the phoshoric acid group while highest FGF-2 release was seen in the EDTA group. Three days of MSC seeding after dentin conditioning has made a dramatic increase in all of the growth factors.

In the in vivo part of our study, root sections of extracted human incisor teeth were used. Crowns sections of extracted teeth were removed from roots under water cooling. Root canals were enlarged by endodontic files and approximately 3-4 mm length of root fragements were cut under water cooling. Root fragments were irrigated with the groups including control and acid solutions (distilled water, EDTA, citric acid, phytic acid, phosphoric acid). After irrigation narrow end of the canals were sealed with 1-2 mm thickness of MTA. In the first half of the groups only PLG scaffolds were inserted into the root fragments. In the second half of the groups, MSCs were seeded onto PLG scaffolds and then inserted into root fragments. Root fragments were implanted into the subcutaneous space of immunodeficient mice dorsum (2 teeth for each mice). Two months after implantation, mice were sacrificed and root fragments were evaluated by histochemical and immunohistochemical stainings. Pulp-like tissues were observed in the groups which include acid application and MSC seeding. The highest density stainings with odontoblast markers were observed in the phosphoric acid + MSC application group. We conclude that phosphoric acid could be an alternative conditioning agent to EDTA, which is considered as golden standard, in regenerative endodontic treatments.