İnsan serum paraoksonaz enziminin saflaştırılarak kinetik özellikleri, endojen substratları ve antioksidan özelliklerinin araştırılması
Purification, determination of kinetic properties, physiological substrates and mechanism of antioxidant actions of human serum paraoxonase
Yazar: AHMET BAYRAK
Danışman: PROF. DR. KAMER KILINÇ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
İnsan serum paraoksonaz enziminin saflaştırılarak kinetik özellikleri, endojen substratları ve antioksidan özelliklerinin araştırılması. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyokimya programı, Doktora Tezi, Ankara, 2008. İnsan serum paraoksonaz enzimi (PON1), amonyum sülfat çöktürmesi, Sephacryl S-300 HR jel eleme kromatografisi, birinci DEAE iyon değiştirici kromatografi, Cibacron Blue 3GA spesifik olmayan afinite kromatografisi ve ikinci DEAE iyon değiştirici kromatografi aşamalarıyla saflaştırılmıştır. Bu yöntem ile paraokson substratı kullanılarak insan serum PON1'i 590 kat saflaştırılmış ve spesifik aktivite 1168 U/mg protein olarak bulunmuştur. Substrat olarak fenilasetat kullanıldığında ise insan serum PON1'i 795 kat saflaştırılmış ve spesifik aktivite 970 U/mg protein bulunmuştur. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile saflık kontrolü yapılmıştır ve Western blot ile protein bandının PON1'e spesifik olduğu gösterilmiştir. Saflaştırılmış enzimin Michaelis-Menten ve Lineweaver-Burk grafikleri çizilerek 37ºC'de, 2 mM Ca+2 içeren 0,1 M Tris/HCl tamponunda (pH 8,5) paraokson substratı için Km değeri 0,8±0,06 mM, 25 ºC'de, 1,0 mM Ca+2 içeren 50 mM Tris/HCl tamponunda (pH 8) fenilasetat substratı için Km değeri 1,025±0,078 mM olarak saptanmıştır.PON1'in paraoksonaz aktivitesi üzerine fenilasetat ve Hg+2'nın inhibisyon etkileri araştırılmıştır. Buna göre; insan serum PON1'i için; hem fenilasetatın (Ki 1,2 ± 0,112 mM ve alfa katsayısı 2,3 ± 0,122), hem de Hg+2'nin `lineer karışık tip inhibitör' (Ki 2,9±0,23 ?M ve alfa katsayısı 2,9 ± 0,23) olduğu bulunmuştur. EDTA ile yapılan inhibisyon çalışmaları sonucunda, PON1'in paraoksonaz aktivitesi 1 mM EDTA ile tamamen inhibe olmuştur. Paraoksonaz aktivitesi 1 mM EDTA ile inhibe edildikten hemen sonra, tepkime ortamına aktivatör olarak eklenen Ca+2'nin etkisi incelenmiş ve inhibisyon, 1,2 mM Ca+2 konsantrasyonunda %98 oranında geri döndürülmüştür. Saf PON1 ve HDL bağlı PON1'in bakırla indüklenen LDL oksidasyonuna etkileri araştırılmıştır. Hem saflaştırılmış PON1, hem de HDL bağlı PON1'in bakırla indüklenen LDL oksidasyonunu sırasıyla %48 ve %57 oranında inhibe ettiği saptanmıştır.Anahtar kelimeler: insan serumu, arilesteraz/paraoksonaz, saflaştırma, substrat ve inhibitör kinetiği.

Abstract:
Purification, determination of kinetic properties, physiological substrates and mechanism of antioxidant actions of human serum paraoxonase. Hacettepe University Institute of Health Sciences Ph.D. Thesis in Biochemistry, Ankara, 2008. Human serum paraoxonase (PON1) has been purified by ammonium sulfate precipitation, Sephacryl S300HR gel filtration chromatography, DEAE ion-exchange chromatography, Cibacron Blue 3GA non-specific affinity chromatography and DEAE ion-exchange chromatography, consecutively. In our study, human serum paraoxonase had a specific activity of 1168 units per milligram protein when paraoxon was used as a substrate with a purification fold of 590. Furthermore, human serum paraoxonase had a specific activity of 970 units per milligram protein when phenylacetate was used as a substrate with a purification fold of 795. The purity was controlled by using SDS-PAGE and the specificity of the PON1 protein band was shown by Western Blotting. The purified enzyme had a Km value of 0,8±0,06 mM, which was calculated from Michaelis-Menten and Lineweaver-Burk plots, by using paraoxon as a substrate at the assay conditions of 37ºC in 0.1 M Tris/HCl buffer (pH 8) containing 2 mM Ca+2. When phenylacetate was used as a substrate, the Km value was 1,025±0,078 mM, which was evaluated from Michaelis-Menten and Lineweaver-Burk plots, at the assay conditions of 25ºC in 50 mM Tris/HCl buffer (pH 8) containing 1 mM Ca+2. Inhibitory effects of phenylacetate and the Hg+2 on the paraoxonase activity of PON1 has been assessed. Both phenylacetate and Hg+2 were lineer mixed type inhibitors of human serum PON1 with the kinetic parameters of Ki 1.2±0,112 mM and alpha coefficient 2.3±0,122 for phenylacetate, and Ki 2,9±0,23 ?M and alpha coefficient of 2,9±0,23 for Hg+2, respectively. EDTA inhibition study showed total inhibition of the paraoxonase activity of PON1 at the concentration of 1 mM EDTA. Following 1 mM EDTA inhibition on the enzyme activity, the effect of Ca+2, as an activator, was also examined by adding 1.2 mM Ca+2 to the reaction medium immediately, which was resulted in 98% recovery of activity. Also the effects of both pure PON1 and HDL associated PON1 on copper induced LDL oxidation has been studied. The inhibition of copper induced LDL oxidation by both pure PON1 and HDL associated PON1 was found as 48% and 57%, respectively.Key words: Human serum, arylesterase/paraoxonase, purification, substrat, inhibitor kinetics.