Rumen funguslarının izolasyonu ve bu funguslara ait enzim genleri üzerine moleküler çalışmalar
Isolation of rumen fungi and molecular studies on their enzyme coding genes
Yazar: UĞUR ÇÖMLEKCİOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. EMİN ÖZKÖSE
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Bölümü / Zootekni Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Anaerobik = Anaerobic ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Gen klonlama = Gene cloning ; Ksilanaz = Xylanese ; Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria ; Mantarlar = Fungi ; Rumen = Rumen ; Selülaz = Cellulase

Özet:
Biyoteknolojik uygulamalar açısından önemli olan rumen fungusları ruminantlara ait dışkı örneklerinden izole edilmiş, morfolojik olarak cins düzeyinde Neocallimastix spp., Caecomyces spp. ve Orpinomyces spp. olarak tanımlanmıştır. Bu izolatların genomik DNA'larından ksilanaz, likenaz (1,3-1,4- ? -glukanaz) ve selülaz (karboksimetilselülaz, endoglukanaz) genleri spesifik primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonuyla taranmış, Neocallimastix sp. GMLF1'in ksilanaz ve selülaz kodlayan genleriyle Orpinomyces sp. GMLF18'in likenaz kodlayan geni çoğaltılmıştır. Genler pCT vektörüyle Escherichia coli'ye aktarılarak ekspresyonu sağlanmış ve genlerin moleküler karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Ksilanaz kodlayan gen (xyn1B) 992 bç uzunluğundadır ve glikozil hidrolaz 11 ailesine ait tek katalitik domain içermektedir. xyn1B, Lactococcus vektörü pIL253 yardımıyla Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363, Streptococcus thermophilus 8894 ve Streptococcus bovis ES1 suşlarında ifadesi sağlanmıştır. Likenaz kodlayan gen (lic18A) 707 bç uzunluğundadır ve glikozil hidrolaz 16 ailesine ait tek katalitik domain içermektedir. lic18A, pIL253 vektörüyle L. lactis ssp. cremoris ve S. thermophilus'e aktarılarak ifadesi sağlanmıştır. Selülaz kodlayan gen (cel1A), 1367 bç uzunluğundadır ve glikozil hidrolaz 5 ailesine ait tek katalitik domain ile iki dockerin domain içermektedir. cel1A'da pIL253 vektörüyle laktik asit bakterilerine aktarılmış ancak bu gen laktik asit bakterilerinde çalışmamıştır. Xyn1B, Lic18A ve Cel1A enzimlerinin çalıştığı optimum pH, sıcaklık, inkübasyon süreleriyle enzimlerin termal stabilitesi belirlenmiştir. E. coli'de hücresel aktivite yüksek bulunurken laktik asit bakterilerinde enzimler hücre dışına salgılanmıştır. Neocallimastix sp. GMLF1'in ksilanaz ve selülaz üretimi, Orpinomyces sp. GMLF18'in ise likenaz üretimleri araştırılmış, bu enzimlerin çalıştığı optimum pH ve sıcaklıkları belirlenerek klonlanan genlerle karşılaştırılmıştır. Son olarak Neocallimastix sp. GMLF1, GMLF11 ve Caecomyces sp. GMLF12'nin linoleik asite toleransları incelenmiş ve Caecomyces sp. GMLF12'nin linoleat izomeraz enzim aktivitesi araştırılmıştır.

Abstract:
Rumen fungi, which are important for biotechnological applications, were isolated from feces of ruminants and consequently identified as Neocallimastix spp., Caecomyces spp. and Orpinomyces spp. using morphological data at genus level. Genomic DNA of these isolates were extracted and the gene encoding fibrolytic enzymes such as xylanase, lichenase (1,3-1,4- ? -glucanase) and cellulase (carboxymethylcellulase, endoglucanase) were screened using specific primers with the aid of polymerase chain reaction (PCR). Xylanase and cellulase encoding genes of Neocallimastix sp. GMLF1 and lichenase encoding gene of Orpinomyces sp. GMLF18 were amplified by PCR. These genes were cloned into pCT vector and expressed in Escherichia coli. Molecular characterization of these genes were performed and it has been found that xylanase encoding gene (xyn1B) has 992 bp with a catalytic domain belongs to glycosyl hydrolase family 11. Furthermore xyn1B was expressed in Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363, Streptococcus thermophilus 8894 and Streptococcus bovis ES1 using lactococcus vector pIL253. Lichenase encoding gene (lic18A) has 707 bp with a catalytic domain belongs to glycosyl hydrolase family 16. lic18A was expressed in L. lactis ssp. cremoris MG1363 and S. thermophilus 8894 using pIL253 vector. Amplification of cellulase encoding gene (cel1A) generated a 1367 bp PCR fragment with a catalytic domain belongs to glycosyl hydrolase family 5 and two dockerin domains. cel1A was transferred to lactic acid bacteria by pIL253 however no enzyme activity could be observed. Optimum pH, temperature and incubation time and thermal stability of Xyn1B, Lic18A and Cel1A enzymes were also studied. These enzymes were found mainly as cell associated in transformant E. coli cells, whilst they were secreted into the culture supernatant when transformed in lactic acid bacteria. In addition, xylanase (Xyn1B) and cellulase (Cel1A) production of Neocallimastix sp. GMLF1 and lichenase (Lic18A) production of Orpinomyces sp. GMLF18 were investigated and the optimum pH and temperature conditions of these enzymes were determined and compared with the cloned genes. Finally, tolerance to linoleic acid of Neocallimastix sp. GMLF1, GMLF11 and Caecomyces sp. GMLF12 was examined and linoleate isomerase enzyme activity of Caecomyces sp. GMLF12 was determined.