Adenosin deaminaz 2 eksikliği hastalığında ADA2 mutant allelin ekspresyon düzeylerinin hastalığın şiddeti üzerindeki etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of ADA2 mutant allele expression levels on disease severity in adenosine deaminase 2 deficiency disease
Yazar: DUYGU BAĞÇİÇEK
Danışman: PROF. DR. SEMA SIRMA EKMEKCİ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Adenozin deaminaz = Adenosine deaminase ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Mutasyon = Mutation ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA

Özet:
DADA2, ADA2 geninde fonksiyon kaybına neden olan mutasyonlardan kaynaklanan otozomal resesif bir hastalıktır. DADA2'de aynı kurucu mutasyon için hastalığın başlangıç yaşı, sıklığı ve semptomların şiddeti değişkenlik göstermektedir. Daha önce yaptığımız bir çalışmada ADA2 geninde ekzon 7'nin atlanmasına neden olan splice site mutasyonunu (c.973-2A>G) homozigot olarak taşıyan bireylerde kısa ADA2 ifade seviyelerinde farklılık saptandı. Bu tez çalışmasında hastaların farklı hücre tiplerinde mutant allelin ifade seviyeleri ve hastalığın şiddetinin değişkenliğinin nedenini araştırmak amaçlandı. Hastalardan elde edilen hücrelere Lipopolisakkarit (LPS) uygulanarak inflamasyon tetiklendi. qRT-PZR yöntemi ile mutant ve normal mRNA ifade seviyeleri analiz edildi ve ADA2 enzim aktivitesi ölçüldü. Hastaların plazmasında ADA2 enzim aktivitesinin azaldığı bulundu. Hücre kültüründe ise ADA2 enzim aktivitesi saptanamadı. Hücrelere LPS uygulanmasının ADA2 ifadesinde belirgin bir farka neden olmadığı tespit edildi. Hastalara ait lenfosit ve nötrofil hücrelerinde ekzon 7 atlanan mutant ADA2, monosit hücrelerinde ise yabanıl tip ADA2 espresyonu görüldü. Heterozigot sağlıklı bireyin PBMC ve nötrofil hücrelerinde yabanıl tip ADA2 ekspresyonu gözlemlendi. Bu sonuçlar, hastalığın şiddeti ve klinik fenotipin mutant ADA2'nin eksprese olduğu hücre tipine bağlı olarak değişkenlik gösterebileceğini düşündürmektedir. Bu çalışma farklı hücrelerin kullanılarak ADA2 gen ifadesi ve ADA2 enzim aktivitesinin araştırıldığı ilk çalışma olma özelliğine sahiptir.
Anahtar Kelimeler: DADA2, CECR1, ADA2, LPS, mRNA

Abstract:
DADA2 is autosomal recessive disease caused by loss-of-function mutations in the ADA2 gene. For the same constitutive mutation in DADA2, the age of onset, frequency and severity of symptoms of the disease vary. In a previous study, we found differences in short ADA2 expression levels in individuals homozygous carrying the splice site mutation (c.973-2A>G), which causes exon 7 skipping in the ADA2 gene. In this study, it was aimed to investigate the reason for variability of the mutant allele expression levels and severity of disease in different cell types of the patients. Inflammation was triggered by applying Lipopolysaccharide (LPS) to the cells obtained from patients. Mutant and normal mRNA expression levels were analyzed by qRT-PCR and ADA2 enzyme activity was measured. It was found that ADA2 enzyme activity was decreased in plasma of the patients. However, ADA2 enzyme activity was not detected in cell culture.  It was determined that the LPS application to the cells did not cause significant difference in ADA2 expression. Exon 7 skipped mutant ADA2 expression was observed in lymphocytes and neutrophils of the patients, and wild type ADA2 expression was observed in monocyte. Expression of wild type ADA2 was observed in PBMC and neutrophils of heterozygous healthy person. These results suggest that the severity of the disease and the clinical phenotype may vary depending on the cell type in which mutant ADA2 is expressed. This study is the first functional study that ADA2 gene expression and ADA2 enzyme activity were investigated using different cells.
Key Words: DADA2, CECR1, ADA2, LPS, mRNA