Helicobacter pylori ve klaritromisin direncinin parafin bloklarda floresan ın situ hibridizasyon (fısh) yöntemi ile belirlenmesi
Detection of helicobacter pylori and clarithromycin resistance from formalin-fixed, paraffin-embedded gastric biopsy specimens by fluorescence in situ hybridization
Yazar: EBRU DEMİRAY
Danışman: DOÇ.DR. ÖZLEM YILMAZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
1. ÖZETHelicobacter pylori ve Klaritromisin Direncinin Parafin Bloklarda Floresan In SituHibridizasyon (FISH) Yöntemi ile BelirlenmesiHelicobacter pylori enfeksiyonunda klaritromisin direnci artış göstermekte veeradikasyon tedavisinde başarısızlık oranı artmaktadır. 23S rRNA geninin 2142, 2143 ve 2144pozisyonundaki nokta mutasyonları ile oluşan klaritromisin direncinin belirlenmesindefenotipik duyarlılık testlerinin yanısıra moleküler yöntemler de kullanılmaktadır.Çalışmamızda parafin bloklu mide biyopsi örneklerinde deparafinizasyon sonrası H. pylorienfeksiyonu tanısı ve klaritromisin direncinin saptanması için floresan in situ hibridizasyonmetodu (FISH) uygulandı.Mayıs-Kasım 2003 tarihleri arasında Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp FakültesiGastroenteroloji Polikliniği'ne dispeptik yakınmaları ile başvuran ve endoskopi endikasyonukonulan toplam 54 hasta (17 erkek, 37 kadın, yaş ortalaması 46.48Â±13.12; yaş aralığı 21-78)çalışmaya alındı. Herbir hastadan 2 antrum ve 2 korpus biyopsi örneği alındı ve H. pylorienfeksiyonu tanısı için hızlı üreaz testi ve histopatolojik inceleme altın standart yöntemlerolarak uygulandı. H. pylori enfeksiyonu varlığı hızlı üreaz testi ve histopatoloji olumluluğuile, H. pylori enfeksiyonu yokluğu ise her iki testin olumsuzluğu ile belirlendi. Toplam 108formalin ile tespit edilmiş ve parafine gömülmüş antrum ve korpus biyopsilerinden hazırlananhistolojik kesitler deparafinize edildi ve FISH (seaFAST H. pylori Combi-Kit; SeaProTheranostics International bv, Lelystad, The Netherlands) metodu ile incelendi. Bu teknikteH. pylori'nin spesifik identifikasyonu için Hpy1 ve H. pylori'nin klaritromisin direncineneden olan nokta mutasyonlarını hedefleyen ClaR1 (A2143G), ClaR2 (A2144G) ve ClaR3(A2143C) floresan işaretli oligonükleotid problar kullanıldı. Toplam 54 hastanın 45'i (%83.3)altın standart yöntemler ve FISH metoduna göre H. pylori enfeksiyonu olumlu, 9'u (%16.7)olumsuz bulundu. 45 hastanın 14'ünde (%31.1) klaritromisin duyarlı H. pylori suşu, 4'ünde(%8.9) klaritromisin dirençli H. pylori suşu ve 27'sinde (%57.5) ise klaritromisin dirençli veklaritromisin duyarlı H. pylori suşu saptandı. Klaritromisin dirençli suşlar yüksek orandasaptandı, bu da bu hasta grubundaki olası tedavi başarısızlığını gösterecektir. Duyarlılık%95.6, seçicilik %77.8, olumlu öngörü değeri %95.6, olumsuz öngörü değeri ise %77.8 olup,altın standart yöntemler ile istatistiksel anlamlı fark gözlenmedi (p=1.00,kappa=0.73). Sonuçolarak, parafin bloklu dokularda FISH metodu H. pylori'nin saptanması ve eş zamanlı olarakklaritromisin direncinin belirlenmesi için altın standartlara göre oldukça hızlı, 3 saat içerisindeuygulanabilen, kültürden bağımsız, fiyat açısından uygun ve güvenilir bir tekniktir. H.pylori'nin basiller formu ve kokoid formunu saptayabilen FISH metodu, parafin blokludokulara uygulanmasının yanı sıra taze biyopsi örneklerine ve H. pylori kültüründen izoleedilen kolonilere de uygulanabilmektedir. Bu teknik klinik açıdan önemi nedeniyle, bakteriyaldansiteyi saptayabilme, tedavinin takibinde ve tedaviye başlanmadan önce tedavidekibaşarısızlığın önlenmesine olanak sağlayacağı için rutin uygulamalarda kullanılabileceğikanısına varıldı.Anahtar kelimeler: Helicobacter pylori, FISH metodu, klaritromisin direnci

Abstract:
2. SUMMARYDetection of Helicobacter pylori and Clarithromycin Resistance from Formalin-fixed, Paraffin-embedded Gastric Biopsy Specimens by Fluorescence In SituHybridizationHelicobacter pylori is etiologically associated with gastritis, gastric and duodenalulcers, gastric adenocarcinoma and mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma.H. pylori can be detected by noninvasive and invasive methods, the latter requiringendoscopy. Recently, clarithromycin resistance in H. pylori strains is increasing anderadication therapy of this bacterium is becoming more difficult. Molecular methods havefrequently been applied besides phenotypic methods for susceptibility testing to detectclarithromycin resistance due to mutations in the 2143 and 2144 positions of 23S rRNA gene.Fluorescence in situ hybridization (FISH) method can be used to detect H. pylori anddetermine clarithromycin resistance simultaneously as a non culture method.In this study, fifty four patients (17 males, 37 females; mean age, 46.48Â±13.12 years; agerange, 21 to 78 years) were studied for the detection of H. pylori and determineclarithromycin resistance in paraffin embedded tissue sections retrospectively by FISHmethod between May and November 2003. All patients had dyspeptic symptoms and werereferred to a diagnostic upper endoscopy. Two antrum and corpus biopsies were taken fromeach patient. Rapid urease test and histopathology were applied to all patients as gold standardmethods for the diagnosis of H.pylori infection. A total of 108 paraffin embedded biopsyspecimens were deparaffinized and examined by FISH (seaFAST H. pylori Combi-Kit;SeaPro Theranostics International bv, Lelystad, The Netherlands) method. This technique wasperformed using the fluorescence-labeled oligonucleotide probes: Hpy1 for the specificidentification of H. pylori and ClaR1 (A2143G), ClaR2 (A2144G) and ClaR3 (A2143C)targeting to the point mutations for clarithromycin resistance. Forty five of 54 patients(83.33%) were diagnosed as positive and 9 (16.67%) were negative for H. pylori infection bygold standard methods and FISH method. Among the specimens from 45 patients infectedwith H. pylori, FISH identified H. pylori infection in 43 (95.5%) deparaffinized biopsyspecimens. Among the 9 negative H. pylori infection, 7 (77.7%) were negative for H. pyloriinfection by FISH with 2 false positive results. H. pylori negativity was confirmed byhistopathology showing no H. pylori on 2 consecutive tissue sections.Fourteen (31.11%) positive biopsy samples exhibited clarithromycin-sensitive H.pylori strains, 4 (8.89 %) were clarithromycin-resistant H. pylori strains and 27 (57.45%)were both wild-type and clarithromycin resistant H. pylori strains. The sensitivity, specificity,positive and negative predictive values for FISH method were 95.56%, 77.78%, 95.56% and77.78%, respectively. The statistical difference was not found when compared to the goldstandard methods (p=1.00, kappa=0.73). In conclusion, FISH method in paraffin embeddedtissues is a rapid, accurate and cost-effective method for the detection of H. pylori infectionand to determine clarithromycin resistance within three hours according to the gold standardsas a non-culture method. This method can also be applied to fresh biopsy samples and to theisolated colonies from a culture of H. pylori, also detecting both the culturable bacillary formsas well as the coccoid forms of H. pylori besides the paraffin embedded tissue sections. Thistechnique will be helpful determining the bacterial density and the success of treatment whereclarithromycin has been widely used in populations to increase the efficacy of the treatmentand to clarify the treatment failure in vitro.Key words: Helicobacter pylori, FISH method, clarithromycin resistance