Sıtma tanılı hastaların arşivlenmiş örnekleri kullanılarak PCR yöntemi ile plasmodium falciparum genetik tür tayinin yapılması ve direnç genlerinin araştırılması
Determination of plasmodium falciparum genetic species by PCR method using archived samples of patients diagnosed with malaria and investigation of resistance genes
Yazar: KÜBRA DİLAN AVCI
Danışman: PROF. DR. KADRİYE KART YAŞAR
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Bakırköy Dr. Sadi Konuk Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Enfeksiyon ve Klinik Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji = Infectious Diseases and Clinical Microbiology ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Genler = Genes ; Plasmodium falciparum = Plasmodium falciparum ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sıtma = Malaria ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Amaç: Çalışmamızda mikroskobik incelemeyle sıtma tanısı almış hastaların arşivlenmiş örneklerinde antimalaryal ilaç direnç genlerinin araştırılması amaçlanmıştır. 
Gereç ve Yöntem: Çalışmamıza arşivlenmiş P. falciparum tanılı ve Batı, Orta ve Doğu Afrika kaynaklı olarak sınıflandırılmış, ince-kalın yayma ve EDTA'lı kan örnekleri dâhil edilmiştir. DNA izolasyonu sonrası real-time PCR ile P. falciparum tür tayini; nested-PCR/klasik PCR yöntemleriyle direnç marker bölgelerinin (Pfcrt, Pfmdr1, PfK13) amplifikasyonu amaçlanmıştır. Amplifiye örneklerin tek nükleotid polimorfizminin (SNP) araştırılması amacıyla sekans analizi Macrogen Laboratuvarında (Macrogen, Kore); referans P. falciparum clone 3D7 izolatıyla kıyaslamalı SNP analizi ise SBÜ Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarında Geneious R9 programıyla sağlanmıştır. 
Bulgular: Çalışmadaki 100 P. falciparum örneğinin 45'i yayma, 55'i EDTA'lı kan örneğiydi. Yayma örneklerinin %82,2'si, EDTA'lı örneklerin tamamı real-time PCR'la P. falciparum olarak tanımlandı. Sekans verileri incelendiğinde, en yüksek mutasyon oranı Pfmdr1 bölgesinde gözlenmiştir (%74,5). Pfmdr1 bölgesinde Y184F mutasyonu 91 örneğin 68'inde (%74,7); N86Y ve N1042D mutasyonu sırasıyla 3 ve 16 örnekte (%3,3 ve %17,4) saptanmıştır. Pfcrt mutasyonu 11(%12,2), PfK13 mutasyonu sadece iki örnekte saptanmıştır. Tüm Afrika bölgelerinde Y184F oranı, Pfcrt ve N1042D'den istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksekti (p<0,01). Pfmdr1 için değişen prevalans oranlarında olmak üzere beş farklı haplotip; NYN (Yabanıl), NFN (%56,2), NYD (%2,2), NFD (%15,7) ve YFN (%3,4) saptanmıştır. Pfcrt ve Pfmdr1 geni kombine olarak incelendiğinde yedi haplotip (MNKNFN, MNKNFD, MNKYFN, IETNYD, IETNFN, IETNYN, IETYFN) oluşturduğu gözlenmiş ve MNKNFN ve MNKNFD en sık 2 haplotip olmuştur (%51,7 ve %15,7). Hem Pfcrt ve Pfmdr1 mutasyon haplotiplerinin birlikteliği %7,9 oranındaydı.
Sonuç: Türkiye'de, antimalaryal dirençle ilgili moleküler belirteçlerin sürveyansı hakkındaki ilk çalışma olan bu çalışmada, en yüksek mutasyon olarak Pfmdr1 ve Pfmdr1 kodonları içinde de Y184F mutasyonu başta olmak üzere N86Y ve N1042D SNP'leri; 2.sıklıkta ise Pfcrt mutasyonu ile sadece 2 örnekte PfK13 geninde E602D mutasyonu saptanmıştır. Antimalaryal ilaç direnci ve genetik SNP sürveyansının düzenli olarak yapılması, küresel sıtma eliminasyon stratejilerinin belirlenmesine önemli katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Aim: In our study, we aimed to investigate antimalarial drug resistance genes in archived samples of patients diagnosed with malaria by microscopic examination.
Material and Methods: Archived P. falciparum thick/thin smear and EDTA Bloodd samples, originating from East, West, and Central Africa, were included in this study. After DNA extraction we aimed to identify P. falciparum by real-time PCR and amplify resistance marker regions (Pfcrt, Pfmdr1, PfK13) using nested-PCR/classical PCR methods. Amplified PCR products were sequenced commercially (Macrogen, Korea) in order to investigate single nucleotide polymorphism (SNP) by comparing with reference P. falciparum clone 3D7 isolate. Data analysis was done using Geneious R9 software in Department of Medical Microbiology of University of Health Sciences. 
Results: Of the studied 100 samples, 45 were preserved as thick/thin smear, while 55 of them were archived in EDTA blood tubes. While all of the EDTA samples were identified as P. falciparum by real-time PCR, only 82.2% of the Smear samples could be identified. When the sequence data were analyzed, the highest mutation rate was observed in the Pfmdr1 region (74.5%). Y184F mutation in the Pfmdr1 region in 68 of 91 samples (74.7%); N86Y and N1042D mutations were detected in 3 and 16 samples (3.3% and 17.4%), respectively. Y184F ratio was statistically significantly higher than Pfcrt and N1042D in all African regions (p<0,01). Five different haplotypes for Pfmdr1with varying prevalence rates; NYN (wild-type), NFN (56.2%), NYD (2.2%), NFD (15.7%) and YFN (3.4%) were detected. When Pfcrt and Pfmdr1gene were examined in combination, it was observed that they formed seven distinct haplotypes (MNKNFN, MNKNFD, MNKYFN, IETNYD, IETNFN, IETNYN, IETYFN) and among the detected haplotypes, MNKNFN and MNKNFD were found to be most common. The prevalence of the combination of both Pfcrt and Pfmdr1mutation was found as 7.9%.
Conclusion:
In this study, which is the first study on the surveillance of molecular markers related to antimalarial resistance in Turkey, N86Y and N1042D SNPs, especially Y184F mutation, are found in Pfmdr1 and Pfmdr1 codons as the highest mutation; E602D mutation in PfK13 gene was detected in only 2 samples with Pfcrt mutation in the second frequency. Regular surveillance of antimalarial drug resistance and genetic SNPs will contribute significantly to the determination of global malaria elimination strategies.