Di-N Bütil Fitalat' ın (DBP) testis üzerine etkisi ve Resveratrol' ün olası koruyucu özelliğinin çeşitli mikroskobik yöntemlerle incelenmesi
The effects of Di-N-Buthyl phthalate (DBP) on testis and various microscopic investigation of Resveratrol's possible protective features
Yazar: SEYHAN GÜLLEN ÜNAL
Danışman: DOÇ. DR. GÜLNUR TAKE KAPLANOĞLU
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Di-n-bütil fitalat = Di-n-butyl phthalate ; Fitalik asitler = Phtalic acids ; Mikroskopi = Microscopy ; Prepubertal dönem = Prepubertal period ; Resveratrol = Resveratrol ; Testis = Testis

Özet:
Bu çalışmada, bir endokrin bozucu olan Di-n-bütil fitalat'ın (DBP) testiste oluşturabileceği hasarda antioksidan olarak yeğlenen Resveratrol'ün olası koruyucu etkilerinin immünohistokimyasal yöntemlerle incelenmesi amaçlandı.Çalışmada 20 günlük 36 adet Wistar albino cinsi erkek sıçan kullanıldı. Her grupta 6 denek olacak şekilde 6 grup oluşturuldu. I. Grup: Kontrol, II. Grup: Çözücü (Karboksimetilselüloz,CMC 10 ml/kg), III.Grup : 500 mg/kg/gün DBP , IV.Grup : 500 mg/kg/gün DBP+20 mg/kg/gün Resveratrol, V. Grup: 1000 mg/kg/gün DBP, VI. Grup: 1000 mg/kg/gün DBP+20 mg/kg/gün Resveratrol. Süre sonunda alınan testis dokuları alışılmış ışık mikroskop izlem yöntemlerinden geçirilerek parafin bloklar hazırlandı. Bloklardan alınan kesitlere proliferasyon belirlemek amacıyla c-kit, seminifer epitel ve özellikle Leydig hücrelerinin stres derecesini gözlemleyebilmek ereğiyle AT1, etkileşimin hormonal düzeyle olup olmadığını belirlemek ereğiyle östrojen reseptör ? antikorları ile indirekt immünohistokimyasal boyamalar yapıldı. Apopitozisi simgelemek için ise TUNEL yöntemi kullanıldı. Her gruptan 6 denekte, 6 alanda spermatogenik epitel boyu ölçülerek Shapiro Wilk testi, Bonferroni Düzeltmeli Kruskal Wallis testi ve Bonferroni Düzeltmeli Mann Whitney U testi ile istatistiksel değerlendirme yapıldı.C-kit immun boyamasında 500mg/kg ve 1000 mg/kg DBP uygulanan gruplarda, artan DBP dozuna koşut, tutulumun kontrol ve CMC uygulanan sham kontrol gruplarına karşın azaldığı, 500mg/kg DBP+Resveratrol uygulanan grupta reaktivitenin kontrol grubuna benzer olduğu izlenmiştir.1000 mg/kg DBP+Resveratrol verilen grupta da Resveratrol'ün tam yeterli olamadığı saptandı.AT1 tutulumunun 500 mg/kg ve 1000 mg/kg DBP uygulanan gruplarda arttığı, Resveratrol uygulanan gruplarda da bu olumsuz etkinin kısmen geri döndüğü ancak Leydig hücre tutulumunun yüksek doz DBP ve Resveratrol uygulanan grupta halen korunduğu belirlendi.DBP' nin testis östrojen reseptör düzeyine etkisini incelendiğinde, gruplar arasında çok anlamlı farklılıklar olmamakla birlikte, yüksek doz DBP' nin östrojen reseptör düzeyini azalttığı, Resveratrol'ün ise endokrin koruyuculuk yönünden yeterli olamadığı izlendi.TUNEL yöntemi ile yapılan incelemelerde, özellikle yüksek doz DBP' nin tüm hücre tiplerinde apoptozisi arttırdığı belirlenmiştir. Resveratrol uygulamasının ise düşük doz DBP uygulamasında apoptotik süreçte koruyucu etki gösterdiği, ancak yüksek doz uygulamada apoptozisi tam olarak engelleyemediği saptandı.Yapılan istatistiksel değerlendirmede de DBP verilen gruplarda epitel boyunun ve seminifer tübül çapının diğer gruplara karşın azaldığı, Resveratrol uygulanan gruplarda ise bu azalmanın geri döndürüldüğü görüldü.Sonuç olarak DBP uygulamasının artan doza koşut testiste olaylandırdığı döngüsel ve hormonal değişikliklere, Resveratrol'ün döngüsel yönden koruyucu etki gösterebildiği, ancak tam yeterli olamadığı, hormonal olarak ise belirgin etkinliğinin bulunmadığı kanısına varıldı.

Abstract:
In this study it was aimed to observe the possible protective effects of Resveratrol which is preferable as a antioxidant against the damage of an endocrine disruptor di n butyl phthalate on testicles with the help of immunohistochemical methods.36 male albino Wistar rats,which are 20 days old are used.They divided into 6 seperate groups.Each group has 6 experimental subjects. I. Group: Control, II. Group:Solvent (Carboxymethyl cellulose,CMC 10 ml/kg), III.Group : 500 mg/kg/day DBP , IV.Group : 500 mg/kg/day DBP+20 mg/kg/day Resveratrol ,V. Group: 1000 mg/kg/day DBP, VI. Group : 1000 mg/kg/day +20 mg/kg/day Resveratrol. At the end of this time,after gathered testicle tissues were observed with ligth microscope paraffin blocks were prepared.C-kit was used on sections that are taken blocks to observe proliferation, AT1 used in order to observe the stress rate of seminiferous epithel especially Leydig cells and immunohistochemical stainig with estrogen receptor ? anticors used to observe whether interaction was at hormonal level or not.TUNEL method to sembolize apoptosis,was used.Spermatogenetic epithel length are measured at 6 area for 6 experimental subjects per group. Shapiro Wilk Test, Kruskal Wallis Test with Bonferroni correction and Mann Whitney U Test with Bonferroni correction are used.In c-kit immune staining,at groups that are treated with 500mg/kg and 1000 mg/kg DBP,depending on increasing DBP dose, the involvements decrease extremely in contrast to control and CMC applied sham control groups.On the other hand,at 500mg/kg DBP+Resveratrol applied groups conversely to other groups,involvements are similar to control group. At 1000 mg/kg DBP+Resveratrol applied group,it was observed that Resvaratrol was not enough.The rise of the involvement of AT1 at 500 mg/kg and 1000 mg/kg DBP treated groups;at Resveratrol applied groups partially return of the negative effect was observed;but involvement of Leydig cells at high dose of DBP and Resveratrol treated groups was still preserved.When effect of DBP on testicles and estrogen receptor level are examined,although significant differences between groups are not seen,It is observed that high doses of DBP decreases estrogen level and It is also observed that Resveratrol is not enough in endocrin protection ability.Observation made with the TUNEL method,it was determined that especially high-dose of DBP increased apoptosis in all cell types.Resveratrol application in the apoptotic process,it showed that the protective effect with low-dose DBP but not prevention apoptosis with high-dose application.Also the statistical evaluation indicated that, in contrast to other groups, at DBP treated groups ,epithelium height and diameter of seminiferous tubules decreased but this reduction were returned back at Resveratrol applied group.As a result,these lead us to conclusion that the increasing application of DBP dose negatively affects the cell cycle of the testical structure parallelly, and Resveratrol can show cyclic protective effect against hormonal and cyclic changes but this is not fully adequate and there is no hormonal effects.