Polivinilasetat nanopartiküllerinin hazırlanması ve akciğer hücrelerine etkileri üzerine in vitro araştırmalar
Preparation of polyvinylacetate nanoparticles and in vitro studies on their interaction with lung cells
Yazar: MİNE ORLU GÜL
Danışman: PROF. DR. AHMET ARAMAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Çalışmamızda, nanopartiküllerin in vitro hücre kültürü sisteminde izlenebilmesi amacıyla floresans özellik gösteren 5(6)-karboksifloressein (KF) ile polivinilasetat (PVA) ın kimyasal modifikasyonu gerçekleştirilmiş ve modifiye polimer ile hazırlanan floresans işaretli nanopartiküllerin akciğer epitel hücreleriyle biyolojik etkileşimleri incelenmiştir. Stabil bir floresans işaretleme sağlamak için KF, trifenilfosfat ve dizopropilazodikarboksilat yardımıyla PVA ya kovalan yolla bağlanmıştır. Optimum floresans madde bağlanmış polimerin (KF-PVA) işaretlenme etkinliği % 0,45 ± 0,06 olarak bulunmuştur. Bu modifiye polimer kullanılarak nanopartiküller (PVA-L-F2A) nanoçöktürme yöntemi ile hazırlanmıştır. Karakterizasyon çalışmalarında, PVA nanopartiküllerinin cryo-TEM mikroskobu ile elde edilen veriler ışığında küresel bir görünüme; foton korelasyon spektoskopisiyle ölçümü sonucunda ortalama 297,33± 5,9 nm büyüklüğe, hücre kültürü çalışma besiyerinde ve tamponunda sırasıyla 0,23 ± 0,4 ve 1,92± 3,76 mV yüzey yüküne sahip oldukları ve hücre kültürü çalışma besiyerinde 48 saate kadar stabilitelerini korudukları saptanmıştır. PVA nanopartiküllerinin akciğer epitel hücreleriyle olan etkileşimleri, floresans gösteren ticari polistiren (PS) nanopartikülleri ile karşılaştırmalı olarak araştırılmıştır. İnsan bronş epitel hücre kültürü (Calu-3) ve insan alveol epitel hücre kültürü (A549) ile gerçekleştirilen hücre yaşayabilirlik testinde, PVA ve PS nanopartikülleri hücresel toksisiteye neden olmamıştır. Transepitel elektrik direnci ölçümü ve radyoaktif mannitol geçiş çalışması bulguları, floresans özellik gösteren PVA ve PS nanopartikül formülasyonlarının Calu-3 hücre bütünlüğünü olumsuz etkilemediğini göstermiştir. Calu-3 hücrelerinden nanopartikül geçiş çalışmaları, PVA nanopartiküllerin uygun bir pulmoner taşıyıcı sistem olduğunu belirtmiştir. Konfokal lazer taramalı mikroskop fotoğrafları, PVA nanopartiküllerinin akciğer hücreleri içine alımının düşük oranda gerçekleştiğini göstermiştir. PVA nın tarafımızdan literatürde ilk defa gerçekleştirilen bir uygulama ile floresans boya yardımıyla işaretlenerek modifiye hale getirilmesi, PVA nanopartiküllerinin akciğer epitel hücreleriyle etkileşiminin incelenmesini mümkün kılmıştır.

Abstract:
In the present study, polyvinylacetate (PVA) was fluorescently labelled with 5(6)-carboxyfluorescein (KF) via covalent binding and the biological interaction between nanoparticles prepared with the modified fluorescent polymer and lung epithelial cells was studied with the aim of enabling the investigation of the biological fate of nanoparticles using in vitro cell culture systems. In order to provide a stable fluorescence labelling, KF was covalently attached to PVA (1:1) in the presence of triphenylphosphine and diisopropylazodicarboxylate. The labelling efficiency of the optimum fluorescent attached polymer (KF-PVA) was found 0.45 ± 0.06%. Nanoparticle formulations (PVA-L-F2A) with this modified polymer were prepared using nanoprecipitation method. In the characterisation studies, cryo-TEM images revealed the spherical structure of PVA nanoparticles. The mean particle size of PVA nanoparticles was found as 297,33 ± 5,9 nm and the surface charge in cell culture working medium and buffer was determined as 0,23 ± 0,4 and 1,92 ± 3,76 mV, respectively. PVA nanoparticles were stable in cell culture medium up to 48 h. The interaction of PVA nanoparticles with respiratory epithelial cells was studied in vitro, with commercially available polystyrene (PS) fluorescein-labelled nanoparticles used for comparison. No overt cellular toxicity was observed in the cell viability assay (MTT) using the human bronchial epithelial cell line, Calu-3, and human alveolar epithelial cell line, A549. The transepithelial electrical resistance measurements and the radioactive mannitol permeability data did not produce any adverse effect on the Calu-3 cell integrity. Nanoparticle transport studies on Calu-3 cells indicated that PVA nanoparticles were suitable for pulmonary transport. Confocal laser scanning microscopy photos showed low PVA nanoparticle uptake from Calu-3 and A549 cells. The strategy of modifying PVA by fluorescent labelling, performed for the first time in this study, provided the evaluation of the interaction of PVA nanoparticles with lung epithelial cells.