Çift fazlı iskele üretimi ve kök hücre ile uyumu
Biphasic scaffold production and compliance with stem cells
Yazar: CANAN TÜRKOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. FEYZAN ÖZDAL KURT
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kök hücre için kaynak olarak kemik iliği stromal hücreleri ve yağ dokusu sıklıkla kullanılmakta ve farklılaşma süreçleri belirteçler eşliğinde incelenmektedir. Mezenşimal kök hücre kendini yenileme kapasitesi olan, birçok yöne farklılaşabilen, etik problemleri olmayan, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp için bir kaynak olarak her geçen gün daha önemli hale gelen hücresel tedavi için bir seçenektir. Kemik ve kıkırdak dokusu iskelet sistemindeki rolü nedeniyle insan ve hayvan sağlığında, özellikle yara onarımı ve iyileşmesinde yer aldığı patolojik olaylarda önemlidir. Bu amaçla hücre-biyomalzeme kullanımı ve kıkırdak-kemik dokular gibi farklı yapılardaki dokuların bulunduğu organlarda tek fazlı iskelelerin kullanımı başarıyı azaltmaktadır. Bu nedenle çalışmada, çift fazlı hem kemik hem de kıkırdak doku uyumu olan iskele geliştirilmesi amaçlanmıştır.

Çalışmada mezenşimal kök hücreler kemik iliği ve yağ dokusundan elde edilmiştir. Her bir kök hücre eldesi ve kültürü için ayrı protokoller uygulandıktan sonra immunositokimyasal analiz ile mezenşimal kök hücre karakterizasyonu yapılmıştır. Daha sonra osteojenik ve kondrojenik farklılaştırma ortamları ile her bir kök hücre kaynağından kemik ve kıkırdak öncü hücrelerine farklılaştırılma sağlanmıştır. Farklılaştırma süreci tamamlandıktan sonra kemik öncü hücrelerinde osteonektin ve osteokalsin, kıkırdak öncü hücrelerinde kollajen-II ve Sox-9 dağılımları immunositokimyasal analiz ile incelenmiştir. Kültür çalışmaları ile eş zamanlı olarak kemikle entegrasyonun olacağı bölge için 45S5 biyocam ve sodyum aljinat kullanılarak, üç boyutlu bir yazıcı ile üretimine başlanan iskele, kıkırdak entegrasyonu için, her bir katmanda biyocam oranı azaltılıp hidrojel oranı arttırılarak en üst katmanda mineralsiz hidrojel yapısına geçecek şekilde üretilmiştir. Farklılaştırılan hücreler üretilen çift fazlı 45S5 biyocam iskeleler üzerine damla damla ekilerek hücrelerin iskele içine homojen dağılımı sağlanmıştır.

Çalışmanın sonucunda kemik iliğinden elde edilen kök hücrelerin yağ dokusundan elde edilen kök hücrelere göre çoğalma ve farklılaşma potansiyellerinin daha yüksek olduğu görülmüştür. Farklılaşmanın 7. günde başladığı 14. günden sonra artış gösterdiği belirlenmiştir. Çift fazlı doku iskelesi ile yapılan testlerde herhangi bir delaminasyona rastlanmamıştır. Doku iskelesinin kemik ve kıkırdak yönünde farklılaştırılan kök hücreler ile başarılı bir uyum sağladığı görülmüştür. 3 boyutlu basılmış iskelelerden mevcut klinik problemlerin çözümü için işlevsel ve uygulanabilir çözümler sunma potansiyeli beklenmektedir. Geliştirilen iskeleler ile hücre etkileşme mekanizmalarının anlaşılması, klinik rutin tedavide etkin kemik ve kıkırdak oluşumu yönünden büyük önem taşımaktadır. Aynı zamanda, insan ve veteriner hekimliğinde kök hücresi uygulamalarının diğer tedavi yöntemlerine alternatif olduğu da göz önüne alınmalıdır.

Abstract:
Bone marrow stromal cells and fat tissue are often used as a source of stem cells and differentiation processes are examined with markers. Mesenchymal stem cell is an option for cellular therapy that has self-renewal capacity, is distinguishable in many respects, carries no ethical problems, and is becoming increasingly important as a source for tissue engineering and regenerative medicine. Bone and cartilage tissue is important for pathological events in wound healing and healing due to its role in human and animal health, especially in the skeletal system. For this purpose, it has been found that the use of single-phase skeletons in the organs where cell-biomaterials are used and that the tissues of different structures such as cartilage-bone tissues reduce the success. For this reason, it aims to develop a dual-phase scaffold with both bone and cartilage tissue adaptation.

In the study, mesenchymal stem cells were obtained from bone marrow and fat tissue. After applying separate protocols for each stem cell culture and culture, mesenchymal stem cell characterization was performed by immunocytochemical analysis. Later, osteogenic and chondrogenic differentiation media were provided to distinguish bone and cartilage precursor cells from each stem cell source. After the differentiation process, osteonectin and osteocalcin in bone precursor cells and collagen-II and Sox-9 distributions in cartilage precursor cells were examined by immunocytochemical analysis. Simultaneously with the cell culture studies, scaffold production was optimized. The scaffolds were started to be produced with a three-dimensional printer using 45S5 bioglass and sodium alginate for the layer to be integrated with the bone and continued layer by layer with reduced bioglass and increased hydrogel amount until pure alginate layer that is intended to integrate with cartilage. The differentiated cells were seeded on the biphasic 45S5 biocompatible scaffold produced, and the cells were distributed homogeneously on the scaffold. 

As a result of the study, the bone marrow stem cells were found to have higher proliferation and differentiation potentials than the stem cells obtained from fat tissue. It was determined that the differentiation increased exponentially after the 14th day, which started on the 7th day. No delamination was found in the tests made with biphasic tissue scaffolds. Tissue scaffolds allow for the assembly of differentiated stem cells in the direction of bone and cartilage. It has been shown that they provide the expected performance in tissue skeleton production and determination of their compatibility with stem cells. It is expected that 3D printed scaffolds can be used to solve existing clinical problems and have potential to provide feasible solutions. Understanding of cell interactions with the enhanced scaffold is of great importance for effective bone and cartilage formation in clinical routine treatment. It should also be noted that stem cell applications are an alternative to other methods of treatment in human and veterinary applications.