Antimikrobiyal katkılı soğutma kulesi yapı malzemesinde biyofilm oluşumunun izlenmesi
Monitoring of biofilm formation on antimicrobial treated cooling tower construction materials
Yazar: SEVAL BAL
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ NAZMİYE ÖZLEM ŞANLI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Legionella pneumophila = Legionella pneumophila ; Soğutma kuleleri = Cooling towers

Özet:
Soğutma kuleleri endüstride merkezi klimalar, telekomünikasyon ünitesi gibi cihaz ya da sistemlerin sıcaklığının düşürülmesi, enerji ve suyun verimliliğinin arttırılması amacıyla kullanılan ünitelerdir. Soğutma kulelerinin hava ile teması, tamamlama suyundan sisteme gelen organik/inorganik materyaller ve ıslak yüzeyleri, Legionella pneumophila ve diğer bakterilerin üremesi için uygun ortam sağlamaktadır.
Soğutma kulesi gibi kısıtlı besininin olduğu ortamlarda bulunan mikroorganizmalar, biyofilm adı verilen bir tabaka oluşturmaktadırlar. Potansiyel patojenik organizmaları kontrol etmek ve biyofaulingi en aza indirgemek için fiziksel ve kimyasal dezenfeksiyon metotları uygulanmaktadır. Ancak bu yöntemler tek başlarına tam anlamıyla etkili olamazken yanlış kullanımda antimikrobiyal direnç, korozyon, patojen bulaşması, suyun deşarj edildiği ortamda sekonder kirlilik oluşturma gibi riskleri doğurmaktadır.
Bu yöntemlere alternatif olarak, ilk andan itibaren biyofauling oluşmasını ve biyofilmin tutunmasını önlemek üzere yüzeyler modifiye edilebilmektedir. 
Çalışmamızda soğutma kulesi yapı malzemesi olarak da kullanılan cam elyaf takviyeli polyester (CTP) levhalara kuaternar amonyum bileşiği olan SilQUAT (3-(trimethoxysilyl)-propyl, cocodimethylammonium chloride) bileşiği uygulanarak antibakteriyel özellik kazandırılmıştır. 
Biyofilmde, erken kolonizasyondan olgun biyofilme geçerken meydana gelen fizyolojik ve metabolik değişiklikler, mikroorganizmaların antimikrobiyallere hassasiyetini etkileyebileceği için biyofilm 6 ay süresince aylık olarak incelenmiştir.
Model sisteme, Legionella pneumophila ATCC 33152 standart suşu aşılanmış, her ay kuponların yüzeyindeki biyofilm ve sistemdeki su örnekleri alınıp heterotrofik bakteri sayısı ve Legionella varlığı, (i) klasik plak yöntemi, (ii) kültürde üremeyen ancak metabolik aktiviteleri devam eden bakterileri tespit edebilmek için canlı/ölü floresan boyama yöntemi ve (iii) suda ve biyofilmde bulunan toplam-serbest ATP miktarı ölçümü yöntemi ile değerlendirme yapılmıştır. CTP levhalara uygulanmış SilQUAT bileşiğinin kalıcılığını test etmek için, modifiye edilmiş EPA#01-1A protokolüne göre levhalara aşındırma yapılmıştır. Aşındırma işlemi sonrasında da kültür, özel floresan yöntemi ve ATP ölçümü yapılmış, aşındırma yapılmış ve yapılmamış örneklerdeki bakteri sayısı kıyaslanmıştır.
Antibakteriyel etkinlik testlerinin sonucunda SilQUAT kaplı CTP levhaların heterotrofik bakteriler ve Legionella bakterisine karşı güçlü antibakteriyel etki gösterdiği belirlenmiştir. 6 ay sonunda bileşiğin açık uçları biyofilm tabakası ile kaplandığı için etkide azalma olmuş (% 95), ancak aşındırma yapılmış örneklerde, antibakteriyel uçların reaktive olduğu ve antibakteriyel etkinin 6 ay boyunca korunduğu (% 99,90 ) belirlenmiştir. Canlı/ölü floresan boyama yöntemi ve ATP miktar ölçümü sonuçları klasik plak yöntemi sonuçlarına paralellik göstermiştir.
Kolmogorov-Smirnov analizine göre, deneysel veri normal dağılım göstermiştir. Antibakteriyel ve kontrol CTP levhaları arasında bakteri sayısı açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu belirlenmiştir (p < 0,05). Aşındırma yapılmış ve yapılmamış örnekler arasındaki farkı değerlendirmek için t testi uygulanmış, heterotrofik bakteri ve % canlı oranları için p değeri < 0,05; ATP ve Legionella için p değeri > 0,05 olarak hesaplanmıştır. Test metotları arasında da  güçlü pozitif korelasyon olduğu belirlenmiştir (r > 0).
Biyofilm tabakasının kaynağında engellenmesi ile sistemde oluşturacağı hasarlar, enerji kayıpları ve patojen bulaşma riski minimuma indirgenebilecektir. Yanı sıra, fazla biyosit kullanımının neden olduğu korozyon ve sekonder çevre kirliliğinde azalma, dolayısıyla ekonomik maliyetin düşmesi ve kamuya/çevreye olan zararın en aza indirgenmesi gibi indirekt avantajlar da söz konusu olacaktır. Bu bakımdan, antibakteriyel aktivitesi ve kalıcılığı doğrulanmış SilQUAT kaplı CTP levhaların, biyofaulingin ilk andan itibaren engellenmesinde saha uygulamalarında kullanımı önerilebilir.

Abstract:
Cooling towers are used for reducing temperature and increasing water and energy efficiency of devices or systems such as central air-conditioning systems or telecommunication unites in industry. The cooling towers provide suitable environments for the growth of Legionella pneumophila and other bacteria, since contacting with the air, containing wet surfaces, organic/inorganic materials originating from the makeup water.
Microorganisms form a layer called biofilm in environments with limited nutrients such as cooling towers. Physical and chemical disinfection methods are applied to control potential pathogenic organisms and to reduce biofouling. However, while these methods can not be effective on their own, in the misuse, they may cause risks such as antimicrobial resistance, corrosion, pathogen transmission and secondary pollution in the environment where water is discharged.
As an alternative to these methods, the surfaces can be modified to prevent biofouling and biofilm adhesion from the first instance.
In our study, glass fiber reinforced polyester (GFRP) panels which are also used as cooling tower building material, have been gained antibacterial activity by applying SilQUAT (3-(trimethoxysilyl)-propyl, cocodimethylammonium chloride) which is a quaternary ammonium compound.
Since the physiological and metabolic changes that occur as the biofilm matures may affect the susceptibility of microorganisms to antimicrobials, therefore biofilm has been examined monthly for 6 months.
Legionella pneumophila ATCC 33152 standard strain was inoculated to the model cooling tower system, and the biofilm on the surface of the coupons and the water samples were taken monthly. Samples were evaluated in view of heterotrophic plate counts and the presence of Legionella bacteria by (i) conventional culture method, (ii) live-dead fluorescent staining and (iii) total/free ATP level. In order to test the residual antibacterial activity of SilQUAT compound applied GFRP panels were abraded according to modified the EPA # 01-1A protocol. After the abrading process, conventional culture method, live-dead fluorescence staining method and ATP measurement were carried out and bacteria counts of the abraded and non-abraded samples were compared.
According to antibacterial efficacy tests, SilOUAT coated GFRP panels showed strong antibacterial effect against heterotrophic and Legionella bacteria. At the end of 6 months period, antibacterial efficacy was reduced (95%) as the open ends of the compound were covered with the biofilm layer. However, it has been determined that, antibacterial activity was preserved for 6 months (99.9%), in abraded samples, due to reactivation of the antibacterial ends of the compound. The results of live/dead fluorescent staining and ATP quantification were in line with the results of the conventional culture method.
According to the Kolmogorov-Smirnov analysis, the experimental data showed a normal distribution. Antibacterial and control GFRP panels showed significant difference statistically (p <0.05). The t test was used to evaluate the difference between the abraded and non-abraded samples, p value was calculated as <0.05 and > 0.05, for heterotrophic bacteria/% live ratios and ATP/Legionella, respectively. It was also determined that there was a strong positive correlation between the test methods (r > 0).
By preventing the biofilm layer at its source, damage to the system, energy losses and pathogen contamination risks can be minimized. In addition, indirect benefits such as reduced corrosion and secondary environmental pollution caused by the use of excess biocides, thus reducing economic costs and minimizing damage to the public / environment will also be of interest. In this respect, the use of SilQUAT coated GFRP panels that have verified antibacterial activity and durability, can be recommended for field trials   from the first moment for the prevention of biofouling.