Tip 2 diyabet gelişiminde pankreatik beta-hücre fonksiyon kaybının araştırılması
The investigation of pancreatic beta-cell dysfunction in type 2 diabetes development
Yazar: MERVE ERÇİN
Danışman: PROF. DR. SELDA OKTAYOĞLU
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases

Özet:
Tip 2 diyabet (T2D)'in erken evresi olarak bilinen pre-diyabet (PD), esas olarak hiperinsülinemiye neden olan pankreatik β-hücre kitlesindeki artışla ilişkili olarak insülin direncinin ortaya çıkması ile karakterize edilen metabolik bir bozukluktur. Genel yaklaşıma göre, hastalık sürecinin ilerleyen aşamalarında pankreatik β-hücreleri apoptoz ile ölürler ve β-hücre kitlesindeki bu kayıp hipoinsülinemi gelişmesine neden olur. Son yıllarda birikmekte olan kanıtlar T2D gelişimi esnasında β-hücre kitlesinin azalmasında β-hücrelerinin geri farklılaşarak, diğer bir ifadeyle dediferensiye olarak, fonksiyonlarını kaybetmesinin önemli bir etken olduğu görüşünü ortaya çıkarmıştır. Ancak, dediferensiyasyonun gerçekleşmesinden sorumlu olan moleküler mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır. Mevcut doktora tez çalışmamızda β-hücre karakterinin ve fonksiyonunun kaybında rol alan dediferensiyasyon mekanizmalarının endoplazmik retikulum (ER) stresi, mitokondri stresi ve mitokondri dinamikleri ile ilgili moleküllere odaklanarak aydınlatılmasına katkı verilmesi amaçlanmıştır. 
Çalışmamızda, sıçan INS1E β-hücrelerine sağlıklı, PD ve T2D hastalarından elde edilen serum örnekleri ve geri farklılaşmanın pozitif kontrolü olarak IL1β uygulandı. Bu uygulamaları takiben hücreler üzerinde toksik etki yapmayan serum konsantrasyonları ve uygulama süresi MTT canlılık testi ile belirlendi. Hücrelere uygulanan serum örneklerinin dediferensiyasyona sebep olup olmadığı β-hücre fonksiyonu ve tanımlanmasında önemli olan transkripsiyon faktörleri ile kök hücre ve progenitör hücre belirteci olan transkripsiyon faktörlerinin gen ekspresyon seviyelerinin qRT-PCR yöntemi ile ölçülmesi yoluyla araştırıldı. Ayrıca, β-hücre belirteci olgun insülin üreten hücre popülasyonu ve insülin üretmeyen progenitör hücre popülasyonu akım sitometri yöntemi ile belirlendikten sonra bu iki popülasyon akım sitometrik hücre ayrımı yöntemi ile izole edildi. β-hücre dediferensiyasyonun moleküler mekanizmasında ER-mitokondriyal eksenin rolünün araştırılabilmesi için insülin pozitif ve insülin negatif hücre popülasyonlarında CHOP, GRP78, HSP60, OPA1, DRP1, Fis1, PINK1 ve PARKIN proteinlerinin seviyelerindeki değişimler Simple Western tekniği ile gösterildi. Mitokondriyal membran potansiyeli JC1 boyası kullanılarak akım sitometri ile ölçüldü. Ayrıca, hücrelerde apoptotik ölümün belirlenebilmesi için aktif kaspaz-3 seviyelerindeki değişimler Simple Western tekniği ile belirlendikten sora AnnexinV/PI işaretlemesini takiben akım sitometri ile apoptotik ve nekrotik hücre popülasyonları belirlendi. Son olarak, PD ve T2D hastalarının serum örneklerinde bulunan β-hücre geri farklılaşmasını veya fonksiyon kaybını veya ölümünü uyarabilecek proteinlerin belirlenebilmesi için LC-MS/MS analizi yapıldı.
Sonuç olarak, PD hastalarından elde edilen serum örneklerinde yüksek seviyede bulunan α1-asit glikoprotein ve komplement C3 proteini aracılığıyla uyarıldığını düşündüğümüz geri farklılaşma mekanizmasında etkin olmayan ER katlanmamış protein cevabı (UPRER)'nın rol oynayabileceğini, geri farklılaşan hücrelerde UPRER'nin etkin olduğunu ve mitokondrilerdeki OPA1 aracılı iç zar füzyonunun kök hücre karakterinin kazanılması ve devam ettirilmesinde önemli olduğunu düşünüyoruz. Aynı gruptaki geri farklılaşmayan β-hücrelerinde ise OPA1 kaybına bağlı olarak mitokondriyal zar geçirgenliğinin artması ve apoptotik moleküllerin sitoplazmaya geçerek kaspaz-3'ü aktive etmesi yoluyla düşük oranda da olsa apoptozun gerçekleştiğini düşünüyoruz. T2D hastalarından elde edilen serum örneklerinde yüksek seviyede bulunan Vitronektin proteini aracılığıyla uyarıldığını düşündüğümüz β-hücre fonksiyon kaybının en önemli göstergesi olan insülin üretememenin yüksek UPRER ile ilişkili olabileceğini, insülin üretemeyen hücrelerde GRP78 aracılığıyla ER-mitokondri bağlantısının kurulması yoluyla iki organel arasında sinyal moleküllerinin geçişi sonucunda mitokondriyal füzyonun artması ve kaspaz-3 aracılığıyla apoptozun gerçekleştiğini düşünüyoruz. Aynı gruptaki insülin+ β-hücrelerinde ise hem OPA1 aracılı iç zar füzyonunun artması hem de mitofajinin gerçekleşmesi yoluyla mitokondrilerin fonksiyonunu yitirdiği ve bu yolla hücrelerin nekroptoz benzeri bir yol ile ölüme gidebileceğini düşünüyoruz. IL1β uygulanan β-hücrelerinde dikkat çeken nokta insülin proteini üretemeyen bir popülasyonun mevcut olmasına karşın bu grupta INS2 gen ekspresyonunun artmış olması dolayısıyla ne tam bir geri farklılaşma ne de tam bir fonksiyon kaybının gerçekleşmemiş olduğunun belirlenmesidir. İnsulin+ β-hücrelerinde yüksek UPRER ile ilişkili olabileceğini düşündüğümüz mitokondriyal hasarın ön planda olduğu görülmektedir. ER-mitokondri bağlantısının kurulması yoluyla iki organel arasında sinyal moleküllerinin geçişi sonucunda gelişebilecek olan mitokondriyal strese bağlı mitokondriyal fisyon ve OPA1 kaybına bağlı olarak mitokondriyal zar geçirgenliğinin artması ve apoptotik moleküllerin sitoplazmaya geçerek kaspaz-3'ü aktive etmesi yoluyla apoptozun gerçekleştiğini düşünüyoruz. IL1β uygulanan hücreler arasında yer alan insülin üretemeyen hücrelerde ER stresinin ön planda olduğu, OPA1 kaybından dolayı mitokondriyal zar geçirgenliğinin artması ve apoptotik moleküllerin sitoplazmaya geçerek kaspaz-3'ü aktive etmesi yoluyla apoptozun meydana geldiğini düşünüyoruz.
T2D gelişimi birbirini izleyen çok sayıda basamakta meydana gelmektedir. Bu basamaklar arasında klinik olarak tanımlanabilen iki basamağın PD ve T2D olduğu söylenebilir. Dediferensiyasyonun hangi basamakta ve nasıl meydana geldiği bilinmemektedir. Mevcut çalışmada ilk defa sıçan β-hücre hattı INS1E hücrelerine sağlıklı, PD ve T2D hastalarından elde edilen serum örnekleri uygulanarak hastalığın bu iki evresinde seruma salınan sinyal moleküllerinin yönlendirici etkisiyle dediferensiyasyonun meydana gelip gelmediği ve ilişkili moleküler mekanizmalar araştırılmıştır. Ayrıca, mitokondriyal homeostazı sağlayan fisyon, füzyon ve mitofaji mekanizmalarının β-hücre dediferensiyasyonu sürecindeki rolü ilk kez gösterilmiştir. Mevcut çalışma bu süreçte rol alan anahtar moleküllerin hedeflenmesi yoluyla yeni T2D tedavi stratejilerinin geliştirilebilmesi için yapılmış olan öncül bir araştırma niteliğindedir.

Abstract:
Pre-diabetes (PD), which is known as the early stage of type 2 diabetes (T2D), is a metabolic disorder characterized by the onset of insulin resistance, primarily resulting in hyperinsulinemia due to an increase in pancreatic β-cell mass. According to the general approach, as the disease progresses, pancreatic β-cells undergo apoptosis, leading to a loss of β-cell mass and the development of hypoinsulinemia. Recent evidence suggests that dedifferentiation of β-cells, or in other words, the loss of their function, plays a significant role in the reduction of β-cell mass during the development of T2D. However, the molecular mechanisms responsible for dedifferentiation have not been fully elucidated. The aim of our current doctoral thesis is to contribute to the understanding of the dedifferentiation mechanisms involved in the loss of β-cell characteristics and function by focusing on molecules related to ER stress, mitochondrial stress, and mitochondrial dynamics.
In our study, serum samples obtained from healthy individuals, PD patients, and T2D patients and IL1β as a positive control of dedifferentiation were applied to rat INS1E β-cells. The serum concentrations and application durations that did not exert toxic effects on the cells were determined by MTT viability assay. The potential of the applied serum samples to induce dedifferentiation in β-cells and their impact on the gene expression levels of transcription factors important for β-cell function and characterization, as well as transcription factors indicative of stem cells and progenitor cells, were demonstrated through qRT-PCR. Additionally, after the β cell marker mature insulin-producing cell population and the non-insulin-producing progenitor cell population were determined by flow cytometry, these two populations were isolated by flow cytometric cell sorting method. Changes in the levels of proteins such as CHOP, GRP78, HSP60, OPA1, DRP1, Fis1, PINK1, and PARKIN, which may play a role in the molecular mechanism of β-cell dedifferentiation in the ER-mitochondrial axis, were shown using the Simple Western technique. Mitochondrial membrane potential was measured by flow cytometry using JC1. Additionally, in order to determine apoptotic death in cells, changes in active caspase-3 levels were determined by Simple Western technique, and apoptotic and necrotic cell populations were measured by flow cytometry following AnnexinV/PI labeling. Lastly, LC-MS/MS analysis was performed to identify proteins present in serum samples from PD and T2D patients that could stimulate β-cell dedifferentiation, functional loss, or death.
As a result, we believe that the ineffective unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER) may play a role in the dedifferentiation mechanism induced through α1-acid glycoprotein and complement C3 proteins, found at high levels in serum samples from pre-diabetic patients. We also suggest that UPRER is active in dedifferentiated cells, and OPA1-mediated inner mitochondrial membrane fusion is essential for acquiring and maintaining stem cell characteristics. In the same group of dedifferentiated β-cells, we believe that there is a low level of apoptosis due to increased mitochondrial permeability caused by OPA1 loss, leading to some extent of apoptosis through the activation of caspase-3. Regarding serum samples from type 2 diabetic patients with high levels of Vitronektin protein, we propose that the most crucial indicator of β-cell function loss, the inability to produce insulin, may be associated with high UPRER. In insulin-non-producing cells, we suggest that the ER-mitochondrial interaction is established through GRP78, leading to increased mitochondrial fusion and apoptosis via the transfer of signaling molecules between the two organelles and activation of caspase-3. In insulin-producing β-cells from the same group, we propose that both increased OPA1-mediated inner mitochondrial fusion and mitophagy occur, resulting in the loss of mitochondrial function and potentially leading the cells towards a form of cell death similar to necroptosis. A noteworthy observation in IL1β-treated β-cells is the existence of a population of cells that cannot produce insulin, yet INS2 gene expression is increased in this group, indicating that neither complete dedifferentiation nor complete loss of function has occurred. In insulin-producing β-cells, which are believed to be associated with high UPRER, mitochondrial damage appears to be prominent. We propose that ER-mitochondrial interaction leads to mitochondrial stress, causing mitochondrial fission due to a transfer of signaling molecules and OPA1 loss, resulting in increased mitochondrial permeability and activation of caspase-3-induced apoptosis. Among the IL1β-treated cells, insulin-non-producing cells show a predominance of ER stress, OPA1 loss, and apoptosis through the activation of caspase-3 as the main mechanism of cell death.
It should be noted that the development of T2D occurs through a series of consecutive steps, with PD and T2D being the two clinically identifiable stages. The occurrence and mechanisms of dedifferentiation in these stages are not fully understood. The current study focuses on investigating the effect of signaling molecules released into the serum during these two stages on dedifferentiation and the associated molecular mechanisms using rat β-cell line INS1E. Additionally, the role of mitochondrial dynamics, including fission, fusion, and mitophagy mechanisms responsible for maintaining mitochondrial homeostasis, in the process of β-cell dedifferentiation has been demonstrated for the first time. This research serves as a preliminary study aimed at developing new treatment strategies for T2D by targeting key molecules involved in this process.