Kanser kökenli hücre hatlarında gözlenen sessiz tümör süpresör gen mutasyonlarının mrna işlemlenmesi üzerine olası etkilerinin saptanması
Probable effects of silent mutations observed in tumor suppressors genes on mrna spli̇ci̇ng in cancer originated cell lines
Yazar: ALİ YÜKSEL
Danışman: PROF. DR. OĞUZ ALTUNGÖZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Memeli genlerinin transkript ürünleri öncü bir mRNA (pre-mRNA) olarak sentezlenir ve
genelde alternatif kesip ekleme mekanizması ile tek pre-mRNA biriminden çok sayıda mRNA
oluşturulur. Doğru mRNA işlemlenmesi klasik kesip ekleme sinyal motiflerine ilave olarak;
kesip eklemeyi güçlendiren, 'exonic-intronic splicing enhancers' (ESEs-ISEs) ve engelleyen
'exonic-intronic splicing silencers' (ESSs-ISSs) düzenleyici elementlere ihtiyaç duyar. ESE ve
ESS dizilerini bozan mutasyonlar hatalı mRNA ürünlerinin oluşumuna yol açabilirler. mRNA
işlemlenmesini bozan mutasyonlar genelde güdük ve işlevsel olmayan ürünler oluştururlar ve
tümör süpresör genlerde (TSG) işlev kaybına yol açan bu tarz mutasyonlar kanser gelişimine
katkı sunan sürücü mutasyonlar olarak işlev görebilir. TSG'lerde gözlenen mutasyonların
sürücü veya yolcu mutasyonlar olduklarını belirlemek bu genlerin karsinogenez'e etkisini
anlamak bakımından önem taşımaktadır. Bu çalışmada TSG'lerde ESE ve ESS dizilerinde
gözlenen sessiz mutasyonların hatalı mRNA ürünlerinin oluşmasına yol açarak kanser
gelişiminde rol oynayabilecekleri öngördük. COSMIC veri tabanında kayıtlı kültürü yapılmış
kanser hücrelerinde belirlenmiş sessiz TSG mutasyonlarını taradık ve pre-mRNA
işlemlenmesi üzerine olası etkilerini test etmek amacı ile HSF biyoinformatik analiz sistemini
kullandık. Analiz sonucu beş faklı TSG ve bu genlerde gözlenen sekiz farklı sessiz ekzonik
mutasyon seçtik. Beş gene ait normal DNA dizileri kontrol gurubunu oluşturmak üzere
pET01 plazmid'i içerisine paketlendi. Elde edilen kontrol örnekleri kalıp olarak kullanıldı ve
SDM protkolü ile mutasyon oluşturuldu. Kontrol ve mutant plazmid örnekleri HeLa hücreleri
içerisine transfekte edildi. Transfekte hücrelerden total-RNA izole edildi ve cDNA
sentezlendi. Mutasyon içeren cDNA bölgeleri PCR ile çoğaltıldı ve ürünlerinin dizi analizleri
yapıldı.
Yapılan DNA dizi analizleri sonucunda CDKN2A (2. Ekzon), TP53 (8. Ekzon), BAI3 (8.
Ekzon), CABLES2 (8. Ekzon) ve PTCH2 (2. Ekzon) genlerine ait kontrol örneklerinde
mRNA'nın doğru şekilde işlendiği görüldü. Çalışmada, CDKN2A (2. Ekzon; c.273G>A,
c.339G>T, c.342C>G), TP53 (8. Ekzon; c.793C>T ve c.801G>T), BAI3 (8. Ekzon;
c.1419C>T), CABLES2 (8. Ekzon; c.1002C>T) ve PTCH2 (2. Ekzon; c.249A>G) genlerine
ait sessiz mutasyonların DNA analiz sonuçları hiçbir örneğin hatalı mRNA ürünü oluşumuna
neden olmadığını göstermiştir. Bu çalışmada, mutasyonların mRNA işlemlenmesi üzerine
olan etkisinin araştırılmasında minigene splicing assay sistemi kullanımının primer olarak
temini zor olan dokular için faydalı bir model olabileceği görülmektedir. Seçtiğimiz sekiz
TSG mutasyonun minigene splicing assay sonuçları, hiçbir mutasyonun mRNA
işlemlenmesini bozmadığını göstermektedir. Dolayısıyla seçilen sekiz mutasyonunda kanser
gelişiminde etkisi olmayan yolcu (passenger) mutasyon gibi davranabileceği yönünde
sonuçlar elde edilmiştir.

Abstract:
Transcription of mammalian genes is synthesized as a pre-mRNA unit and generally forms
several isoform from the same transcription unit by alternative splicing mechanisms. In
adition to clasical splicing signal patterns, the acurracy of mRNA splicing is depended on
such aditional splicing regulatory elements as exonic-intronic splicing enhancers (ESEs-ISEs)
and exonic-intronic splicing silencers (ESSs-ISSs). The mutations disrupting the ESE and
ESS motifs may result in aberrant splicing products. The mutations that alter mRNA splicing
generally generate short and unfunctional products, and such mutations leading to the loss of
function in tumor suppressor genes (TSG) may act as driver mutations contributing to the
cancer development. Identification of whether the mutations observed in TSGs is driver or
passenger mutation is important to understand their effects on carcinogenesis. We suggest that
mutations in ESE and ESS motifs result in defective pre-mRNA splicing corresponding to
inactivation in TSG model and contribute the cancer progression. We searched for the silence
mutations in TSG adopted from COSMIC database which are identified in cultered cancer
cells and HSF analysis was used to test for the determination of probable effects of mutations
on mRNA splicing. We chosed the eight different silence exonic mutations in the five
different TSGs after bioinformatic analysis. Normal DNA sequences of the five different gene
were independently packed in the plasmid, pET01 in order to create control groups. Control
samples we obtained were used as molds and mutations were obtained via side directed
mutagenesis (SDM) protocol. Plasmids, for both control and mutated, were transfected to
HeLa cells. Total RNA was isolated from transfected cells and converted to cDNA. The
regions harbouring mutations in cDNA were amplified via PCR and PCR products were
sequenced. The DNA sequence analysis revealed that mRNA splicing was correctly processed
for CDKN2A (2nd exon), TP53 (8th exon), BAI3 (8th exon), CABLES2 (8th exon) ve PTCH2
(2nd exon) in control samples. In the current study, the results of DNA analysis showed that
silence mutations of CDKN2A (2nd exon; c.273G>A, c.339G>T, c.342C>G ), TP53 (8th exon;
c.793C>T, c.801G>T), BAI3(8th exon; c.1419C>T), CABLES2 (8th exon; c.1002C>T) and
PTCH2 (2nd exon; c.249A>G) did not cause to abberant mRNA products. In this study, it is
shown that minigene splicing assay may be useful model to test effects of mutations on the
mRNA processing for primer tissues that are difficult to obtain. The results of minigene
splicing assay showed that the eight different mutations did not disrupt mRNA processing.
Therefore, these result were obtained from selected eight mutations may act as a passenger
mutation that had no effect on the development of cancer.