Gebelik olaylanan deneysel hipoksi sonrasında gingko biloba'nın postnatal beyin gelişimi üzerine olası etkisi: Western bloting elektron mikroskobik ve immuno histokimyasal değerlendirme /
Yazar: FATMA HELVACIOĞLU
Danışman: PROF. DR. DENİZ ERDOĞAN
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Beyin = Brain ; Gebelik = Pregnancy ; Ginkgo biloba = Ginkgo biloba ; Hipoksi = Hypoxia ; Mikroskopi-elektron = Microscopy-electron ; Postnatal bakım = Postnatal care ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Erken geliĢim sürecinde oksijen ve enerji dağılımına en duyarlı
organ beyindir. Bu nedenle fötus ve yenidoğanda ortaya çıkan beyin
anomalilerinin bilinen en belirgin nedeni gebelikte olaylanan hipoksidir.
Diyabetli, kronik hipertansiyonlu, orak hücre anemili, astımlı ya da
uyuĢturucu madde bağımlısı olan annelerin bebekleri kronik hipoksi tehdidi
altındadır. Böyle hastalıkları olan annelerin bebeklerinde intrauterin
büyüme geriliği, doğum sonrası yaĢamda epilepsi, beyin felçleri, öğrenme
güçlüğü ve zeka geriliği ile motor iĢlevlerde yetersizlik dikkati çekmektedir.
Hipoksi sonucu olaylanan iĢlevsel bozukluklar fötal ya da yeni doğan
beyinlerinde önemli yapısal hasarların sonucudur.
ÇalıĢmamızda embriyonel dönemde oluĢturulan hipobarik hipoksi
modelinde beynin geliĢiminde olaylanan dejeneratif değiĢiklerde postnatal
Gingko biloba uygulamasının Western blotting, elektron mikroskobik ve
immünohistokimyasal düzeyde etkilerinin incelenmesi amaçlanmıĢtır.
ÇalıĢmamızda hipobarik hipoksi, % 10 ‗luk O2, % 90 N gaz karıĢımı
kullanılarak hipoksik kamarada oluĢturuldu. Vajinal plak oluĢumu görülen
sıçanlar gebeliğinin 0. gününde kabul edildi. Gebeliğin 5. gününde (E5)
% 10'luk O2 gaz karıĢımı verilen hipoksik kamaralara konuldu ve hipoksi
uygulaması gebeliğin 15. güne (E15) dek aralıksız sürdürüldü. Elde edilen
erkek yavrulardan bir grubu yalnızca hipoksi uygulanan gruplar olarak 233
belirlendi ve doğum sonrası 7., 14., 21. ve 28. günlerde beyin dokuları
alındı. Bir grubuna ise doğumun gerçekleĢmesi ile birlikte yavrulara her
gün belirlenen saatte 100mg/kg Gingko Biloba ekstresi oral yolla
uygulandı ve 7,14,21 ve 28 günlerde beyin dokuları alındı. Normal
atmosfer basında yaĢayan gebe sıçanlardan elde edilen erkek yavrulardan
ise eĢ zamanlı kontrol grupları belirlendi ve toplam 12 deney grubu
oluĢturuldu.
Elde edilen beyin dokuları, Western blotting, elektron mikroskop ve
immünohistokimya için alıĢılagelen yöntemler uygulanarak incelemeye
alındı.
Değerlendirmelerimiz sonucunda, embriyonel dönemde uygulanan
hipobarik hipoksinin frontal alanda ve hipokampüs'deki nöronlarda stres
proteinlerinden olan HSP ve Hif1α'yı artırdığı belirlendi. MBP ile yaptığımız
değerlendirmede ise, ak maddede immünreaktivitenin azalması hipokside
azalan kas aktivitelerinin bir göstergesi olarak kabul edildi. Hipoksi ve
Gingko biloba etkinliğinin birlikte değerlendirildiği deney gruplarında
verilerimiz, HSP ve Hif1α protein ekspresyonunda belirli bir süre
uygulamaya koĢut olumlu etkilerin görülebileceğini düĢündürdü. Ġnce yapı
düzeyinde hipoksi gruplarında eĢ zamanlı kontrol gruplarına karĢın nöron
hücre gövdelerinde izlenen yapısal değiĢimlerde, Gingko biloba'nın geri
dönüĢtürücü etkisi baskın olarak izlenmedi. Bunun yanı sıra 234
hipokampüsde nörogenezde düzenleyici rolü olduğu düĢünülen Chordin
ve noogin proteinlerinin Western blott analizlerinde; Chordin proteininin
ekspresyonu hipoksi gruplarında eĢ zamanlı kontrol gruplarına göre
azalırken, Gingko biloba uygulanan gruplarda yalnızca hipoksi uygulanan
gruplara göre artıĢ gösterdiği saptandı. Noggin proteinlerinin ekpressyonu
hem hipoksi uygulanan gruplarda hem de hipoksi+ Gingko biloba
uygulanan gruplarda kontrol grubuna göre azaldığı belirlendi. Antioksidan
uygulamanın noggin ekspresyonunu belirgin olarak etkilemediği izlendi.
Yapılan değerlendirmeler sonucunda süreye koĢut stres proteinlerinin
ekspresyonunun artması Gingko biloba'nın uzun süreli kullanımında daha
etkin olabileceği yargısını uyandırdı.

Abstract:
Brain is the most sensitive organ for distribution of oxygen
and energy in the early development. Hence, the most significant cause
of the brain abnormality seen in fetus and new-born is hypoxia occurred
during pregnancy. Babies whose mothers have diabetes, chronic
hypertension, sickle-cell anemia, asthma or are drug addict are subjected
to chronic hypoxia. It is pointed out that these babies have intrauterin
growth retardation, epilepsia after born, cerebral palys, learning difficulties,
mental retardation, and disabilities in motor functions. Functional
disabilities caused by hypoxia are the consequences of major structural
damages occurred in fetus or new-borns' brains.
In our experiment, hypobaric hypoxia was generated in
hypoxic camara by using gas mixture of 10% O2 an 90% N. Rats having
vaginal plaque were excepted as they are on their 0. (zeroth) day of their
pregnancy. On the 5th day (E5) of the pregnancy, they were put into
hypoxic camara filled with the mixture of gas containing 10% O2 and were
continuously held in there until the 15th day (E15) of the pregnancy. A
group of male offsprings were assigned to be the group having only
hypoxia and their brain tissues were taken out on 7., 14., 21. and 28. days
after birth. For another group of male offsprings, 100 mg/kg Gingko Biloba
were given by oral path at the same hour of everyday after birth and their
brain tissues were taken out on 7., 14., 21. and 28. days after birth. 236
Simultaneous control groups containing male offsprings born from
pregnant rats lived in normal atmospheric pressure were assigned and 12
control groups were generated totally.
Acquired brain tissues were investigated by using usual techniques
such as Western blot analysis, immunohistochemical analysis and
electron microscopy.
In conclusion of our study, it is revealed that hypobaric hypoxia
applied in embryological process increases HSP and Hif1α, stress proteins
in neurons, at frontal area and hypocampus. In an evaluation performed
with MBP, decreasing in immunoreactivity of white matter was accepted to
be a indicator of decreased muscle activity in hypoxia. Experiment groups
in which hypoxia and Gingko biloba activity were evaluated together, our
data revealed that with a definite period of application, both hypoxia and
Gingko biloba have parallel positive effects on HSP and Hif1α protein
expression. In ultrastructural level, the reverse conversion effect of Gingko
biloba on the structural changes observed in neuron cell bodies was not
dominantly observed at hypoxia groups despite in simultaneous control
groups. In addition Chordin and Noggin, protein which thought to be
regulatory role in neurogenesis, in Western blot analysises of
hypocampus; Chordin protein is decreased at hypoxia groups compared
to simultaneous control groups, it is determined that expression of Chordin 237
proteins increased at Ginkgo biloba apply group when only compared to
hypoxia groups. It is also determined that expression of Noggin proteins
decreased both at hypoxia groups and hypoxia+Gingko biloba apply
groups compared to control groups. It is observed that antioxidant apply
didnot affect significantly the expression of Noggin protein. Increased
expression of stress proteins as time progresses, has shown that Gingko
biloba can be more effective in the long-term use