Antik insan kemiklerinden DNA izolasyon protokollerinin geliştirilmesi
Improving method for DNA extraction from ancient human skeletal material
Yazar: ELİF ÖZDEMİR KAYNAK
Danışman: DOÇ. ÖZLEM YEŞİL ÇELİKTAŞ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Adli uygulamalarda, paleontolojik, arkeolojik ve evrimsel çalışmalarda yapılacak incelemelerde en önemli aşamalardan birisi antik dokulardan DNA'nın izolasyonu ve analiz edilmesidir. Kimliklendirme için çeşitli biyolojik kaynaklar kullanılabilmektedir. Ancak çoğu zaman erişilebilir tek kaynak kemik numuneleri olmaktadır. Bu çalışmanın amacı, adli uygulamalarda kullanılabilecek hızlı, alternatif bir DNA izolasyon protokolü geliştirmektir. Kemik tozu ya da dilimleri şeklindeki örneklere, farklı tampon çözeltiler, ön işlemler ve izolasyon prosedürleri uygulanarak antik insan kemiklerinden en iyi koşullarda yüksek verimde DNA eldesi sağlanmaktadır. Çalışma kapsamında yapılan analizlerde PZR inhibitörleri tarafından meydana gelebilecek kontaminasyonlar da değerlendirilmiştir. Ön işlemler, çalkalamalı inkübatörde karıştırma ve mikrodalga destekli ekstraksiyon uygulanarak yapılmıştır. Buna ek olarak ise izolasyon klasik fenol-kloroforom-izoamil alkol ve silika destekli spin kolonlar yardımıyla yapılmış ve birbiriyle kıyaslanmıştır. Dekalsifikasyon tamponunun toplam demineralizasyon yapması açısından lizis tamponundan daha iyi sonuç verdiği ve mikrodalga destekli ekstraksiyonun 2 dakikalık süre ile çalkalamalı inkübatörde 24 saat karıştırarak bekletme süresinden çok daha hızlı olduğu görülmüştür. Sonuç olarak DNA izolasyonunun mikrodalga destekli ekstraksiyon işlemini takiben silika destekli spin kolon uygulanarak yapılmasıyla 19.40 ng/µl konsantrasyonda DNA elde edilmiştir. Organik ekstraksiyon yöntemine göre çevre dostu, hızlı ve ucuz bir yöntem olmasıyla adli çalışmalarda kullanılabilecek alternatif teknik geliştirilmiştir.

Abstract:
One of the most important stage in forensic, paleontological, archeological and evolutionary studies is the analysis and isolation of DNA from ancient tissue residues. There are lots of biological tissues for the identification but sometimes bones are the only accessible source of DNA. The main objective of this study was to develop a rapid and alternative protocol for DNA extraction to be utilized in forensic genetics. Sample form as powder or slice, different buffer, pretreatment and extraction methodologies were compared in order to investigate the best conditions yielding the highest concentration of DNA from ancient bones. In this study, the degree of extract contamination by polymerase chain reaction (PZR) inhibitors was analysed. Pretreatment was carried out using agitation at an incubator shaker and microwave digestion. Subsequently, DNA from ancient bones was isolated by the classical organic phenol-chloroform extraction and silica based spin columns and compared as well. Decalcification buffer for total demineralization was better than the lysis buffer, whereas microwave assisted digestion proved to be very rapid with an incubation time of 2 min instead of 24 h at an incubator shaker. Consequently, DNA digestion followed by silica column application yielded a high purity DNA with a concentration of 19.40 ng/µl and proved to be a superior alternative to the organic extraction method, presenting an environmentally friendly, cheap and a rapid technique for forensic genetic analysis.