İshalli buzağı dışkılarında sığır coronavirusu ve sığır rotavirusunun hızlı tanı kiti ve TR-PCR ile araştırılması
Investigation of bovine coronavirus and bovine rotavirus by rapid diagnosis kit and RT-PCR in diarrheic calf feces
Yazar: GÜLŞAH UYUNMAZ SAKLI
Danışman: PROF. DR. OYA BULUT ; PROF. DR. MUSTAFA HASÖKSÜZ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Buzağılar = Calves ; Diyare = Diarrhea ; Hayvan hastalıkları = Animal diseases ; Korona virüs enfeksiyonları = Coronavirus enfections ; Korona virüsler = Coronaviridae ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Rotavirüs enfeksiyonları = Rotavirus infections ; Rotavirüsler = Rotaviruses ; Teşhis testleri = Diagnostic tests ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Dünyada ve ülkemizde ekonomik kayıplara neden olan buzağı ishallerinin en önemli etkenlerinden sığır coronavirusu (BCoV) ve sığır rotavirusu (BRV), en güvenilir tanı yöntemlerinden olan Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ile varlığı tespit edilerek, bu yöntem ile sahada klinisyen veteriner hekimlerimizin kullandığı ticari Rota-Corona Hızlı Tanı kitlerinin duyarlılıkları karşılaştırılmıştır.
Bu çalışmada; Konya ve Afyon çevresindeki sığır çiftliklerindeki ishalli buzağılardan toplanmış 96 adet dışkı örneği, BRV ve BCoV bakımından, önce Bovid-5 Ag hızlı tanı kiti ile incelenmiş sonra RT-PCR testi uygulanmıştır. Her bir dışkı örneğinden viral Ribo Nükleik Asit (RNA) izole edilmiştir, elde edilen RNA'dan Reverse Transcription System kiti kullanılarak Complementer Deoksiribo Nükleik Asit (cDNA) sentez edilmiştir. Daha sonra cDNA ürünü, PCR protokollerine uygun şekilde termocyle cihazında amplifikasyona tabi tutulmuş, elde edilen PCR ürünleri de elektroforezde incelenerek sonuçlar değerlendirmeye alınmıştır.
Çalışma sonucunda; hızlı tanı kitiyle 96 dışkı örneğinin 15'inde BRV, 1'inde BCoV pozitifliği, RT-PCR tekniği ile 18 örnekte BRV, 13 örnekte BCoV pozitifliği saptanmıştır. Ayrıca RT-PCR ile incelemede 4 örnekte hem BRV hem de BCoV pozitifliği bulunmuştur.
Hızlı tanı kitinin RT-PCR ile sensitivite ve spesifitesi bakımından karşılaştırılmasında; BRV'un sensitivitesi %83 - spesifitesi %100, BCoV'nin ise sensitivitesi %7,6 - spesifitesi %100 olarak tespit edilmiş olup sensitivite bakımından düşük sonuçlar elde edilmiştir. Enterik enfeksiyonlarda hastalığın seyri boyunca saçılan virus miktarındaki değişikliklere bağlı olarak hızlı tanı kitinin düşük düzeydeki virus partiküllerini saptayamaması, sensitivitenin düşük çıkmasına neden olmuştur.
Bu çalışmada; çiftliklerdeki buzağı ishal vakalarında BRV ve BCoV'nin tanısında klinisyen veteriner hekimler tarafından kullanılan hızlı tanı kitlerinin duyarlığının tespiti ve Konya-Afyon çevresindeki çiftliklerde buzağı ishallerindeki BRV ve BCoV dağılımının araştırılması yapılmıştır. Bu araştırma sonucunda; veteriner hekimler tarafından, sahada hastalığın pratik ve hızlı teşhisinde hızlı tanı kitinin kullanılmasının faydalı olabileceği, fakat enfeksiyonun ileriki dönemlerinde virus sayısının azalmasıyla testin duyarlılığının düşmesinden dolayı sonuçların dikkatli yorumlanması gerektiği ortaya çıkmıştır. Enfeksiyonların tanısında kullanılan hızlı tanı kitlerinin sonuçlarının teyit edilmesi ve değerlendirilmesinde, RT-PCR gibi daha duyarlı ve teknik testlerin kullanılması koruma ve kontrole yönelik doğru çözümler üretilmesini mümkün kılacaktır.
Anahtar Sözcükler: BCoV, BRV, Buzağı ishali, Hızlı Tanı Kiti, RT-PCR.

Abstract:
BRV and BcoV, which are the most important causes of calf diarrhea that causing economic loss in the world and in our country, were identified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction RT-PCR which is one of the most reliable diagnostic methods and then the sensitivity of this method was compared with the sensitivity of commercial Rota-Corona Rapid Diagnostic Kit used by our clinician veterinarians.
In this study; 96 feces samples which were collected from calves with diarrhea around Konya and Afyon, were firstly examined with Bovid-5 Rapid Diagnosis Kit in terms of BRV and BCoV, and then RT-PCR test was applied. Viral Ribo Nücleic Acid (RNA) was isolated from each feces samples, Complementer Deoxyribose Nucleic Acid (cDNA) was synthesized from the obtained RNA by using the Reverse Transcription System Kit. The cDNA product was amplified in thermocycler according to PCR protocols, the obtained PCR products were examined by electrophoresis and the results were evaluated.
As a result of study; by using Rapid Diagnosis kit, BRV positivity in 15 samples, BCoV positivity in 1 sample, and by using RT-PCR, BRV positivity in 18 samples, BCoV positivity in 13 samples of 96 feces sampleswere determined. Also, by using RT-PCT test, in 4 samples both BRV positivity and BCoV positivity was found.
As a result of comparing the Rapid Diagnosis kit with RT-PCR in terms of sensitivity and specificity; the sensitivity and specificity of BRV were detected as 83% and 100%, respectively, and the sensitivity and specificity of BcoV were detected as 7.6% and 100%, respectively, low results were obtained in terms of sensitivity. Because of the Rapid Diagnosis kit couldn't detect low level virus particles depending on the changes in amount of scattered virus during the disease course in enteric infections, sensitivity was found low.
In this study; determination of the sensitivity of Rapid Diagnosis kit used by clinician veterinarians and the distrubition of BRV and BCoV in calve diarrhea events in farms around Konya-Afyon was investigated. As a result of this research; in the practical and rapid diagnosis of the disease the using of the Rapid Diagnosis kit by clinician veterinarians may be useful, but the results must be interpreted with caution because of the sensitivity decreases due to the reduction in the number of viruses in the later stages of the infection. In confirming and evaluating of the results of Rapid Diagnosis kit using for the diagnosis of infections, the using of more sensitive and technical tests such as RT-PCR make it possible to produce correct solutions for safe and control.
Anahtar Sözcükler: BCoV, BRV, Calf diarrrhea, Rapid Diagnosis Kit, RT-PCRT-