Lizil oksidaz enzimi saflaştırılması ve biyoteknolojik uygulamaları
Lysyl oxidase enzyme purification and biotechnological applications
Yazar: ALI RUSTAMBAYOV
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖZLEM ÜNLÜER
Eskişehir Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Kolon = Colon ; Lizil oksidaz = Lysyl oxidase

Özet:
Bu çalışmada, sığır aortundan lizil oksidaz (LOX) enzimi yeni bir kriyojel kolon geliştirilerek saflaştırılmıştır. Bu tez kapsamında ilk olarak metakriloil benzatriazol (Ma-Bt) temelli kompleksler sentezlenmiştir. Ardından, sentezlenen kompleksler 2-hidroksietil metakrilat (HEMA) tabanlı kriyojel kolona tutturularak LOX enzimi saflaştırılması için yeni bir kromatografik ayırım kolonu geliştirimiştir. Sentezlenen komplekslerin karakterizasyonu Fourier Taramalı Infrared (FTIR) Spektroskopisi, Nükleer Manyetik Rezonas (NMR) Spektroskopisi, kriyojel kolonun karakterizasyonu ise FTIR, Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) analizi ve şişme testleriyle yapılmıştır.
Sığır aortundan elde edilen ham ekstrakttan LOX enzimi, sentezlenen kriyojel kolonun Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC)'nde ayırım kolonu olarak kullanılmasıyla saflaştırılmıştır. Saflaştırılan enzimin protein içeriği Bradford yöntemiyle tayin edildikten sonra, saflaştırılan enzimin aktivitesi ve optimum aktivite koşulları belirlenmiştir. Dairesel dikroizm (CD) spektroskopisiyle, saflaştırılan enzimin ikincil ve tersiyer yapısındaki değişim izlenmiş ve enzimin saflığı SDS-PAGE analiziyle belirlenmiştir. Yapılan çalışmada, LOX enziminin kromatografik olarak saflaştırılması için etkili ve kolay uygulanabilir bir kolon dolgu materyali geliştirilmiştir. Geliştirilen yöntemle saflaştırılan LOX enziminin, laboratuvar koşullarında elastinin çapraz bağlanmasında etkili olduğu görülmüştür. Bu açıdan değerlendirildiğinde, LOX enziminin farklı biyoteknolojik uygulamalarda da kullanılabileceği öngörülmektedir.

Abstract:
In this study, lysyl oxidase (LOX) enzyme has purified from bovine aorta by developing a new cryogel column. In the thesis, firstly methacryloyl benzotriazole (Ma-Bt) based complexes have synthesized. Then, a new chromatographic separation column has developed for LOX enzyme purification by embedding the synthesized complexes to 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) based cryogel column. The synthesized complexes have characterized by Fourier Scanning Infrared (FTIR) Spectroscopy and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. The cryogel column has characterized by FTIR, Scanning Electron Microscope (SEM) analysis and swelling tests.
LOX enzyme has purified from the crude extract obtained from bovine aorta by using the synthesized cryogel as the separation column in Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). Then, determination of the protein content of the purified enzyme by Bradford method, activity of the purified enzyme and the optimum enzyme activity conditions have investigated. Change in the secondary and tertiary structure and the purity of the purified enzyme have investigated by Circular Dichroism (CD) spectroscopy and SDS-PAGE analysis, respectively. In this study, an effective and easily applied column material has developed for the chromatographic purification of the LOX enzyme. It has been observed that the LOX enzyme purified by the developed method is effective in cross-linking of elastin under laboratory conditions. From this point of view, it is predicted that the LOX enzyme can be used in different biotechnological applications.