N. benthamiana bitkisinde aktif insan faktör IX rekombinant proteininin varyantlarının klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Cloning, expression, purification and characterization of factor IX variants in N. benthamiana plant
Yazar: ILAHA MUSAYEVA
Danışman: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Yürütülen bu çalışmada, insan FIX geni kodon optimize edildi, klonlandı ve N.benthamiana bitkisinde yalnız veya modifiye edilmiş enzimler, VKD-GC ve Furin ile birlikte eksprese edildi. İlaveten, bitki glikolizasyonunun bitkide üretilmiş FIX'nın aktivitesi ve stabilitesi üzerindeki spesifik etkisini çalışmak için FIX, deglikolizasyon enzimleri olan PNGase F veya Endo H ile ko-eksprese edildi. Bitkide üretilmiş FIX varyantları IMAC kolon kullanılarak kısmen pürifiye edildi ve kıyaslamalı enzimatik aktiviteleri hesaplandı. Bitkide üretilmiş ve kısmen pürifiye edilmiş FIX varyantlarının aktivitesi kromogenik yöntemle belirlendi. Sonuçlar, bitkide üretilen FIX'nın insan FIX'a kıyasla %10 göreceli aktiviteye sahip olduğunu gösterdi. Buna rağmen, yalnız üretilen ve Furin veya VKD-GC ile ko-eksprese edilen FIX proteinlerinin aktiviteleri arasında küçük farklılık ya da herhangi bir farklılık gözlemleyemedik. Furin veya Furin ve VKD-GC ile birlikte ko-eksprese edilen FIX proteininin insan FIX proteinine kıyasla yaklaşık olarak %12'lik göreceli aktiviteye sahip olduğunu gözlemledik. İlaveten, biz bitkide üretilen FIX'nın farklı varyantlarının aktivite ve stabilite analizini yaptık. FIX'nın Endo H ve PNGase F deglikolize varyantlarının insan FIX'a kıyasla göreceli aktiviteleri sırasıyla 13.6 ve 12.5'dir. FIX'nın bitkide üretilmiş glikozillenmiş ve in vivo deglikozillenmiş formlarının stabilitesi 37°C'de 24 saatlik inkübasyondan sonra belirlendi. Glikozillenmiş FIX'nın (%50'nin kalma süresi), PNGase F in vivo deglikozillenmiş ve Endo H in vivo deglikozillenmiş formlarının in vitro yarı ömrü Western blot analiziyle protein bantları analiz edilerek, sırasıyla 25.80, 37.99 ve 80.57 saat olarak hesaplandı. Bu sonuçlar FIX'nın bitkide üretilmiş Endo H in vivo deglikolize formunun glikolize FIX ve PNGase F in vivo deglikolize formuna kıyasla yüksek sıcaklıkta daha stabil olduğunu gösterdi.

ANAHTAR KELİMELER: Geçici gen anlatımı, Hemofilia B hastalığı, in vivo   deglikolizasyon, Karboksilasyon, Proteolitik kesilme.

Abstract:
In this study, human FIX was codon optimized, cloned, and expressed in N. benthamiana plant alone or with modified enzymes, VKD-CG and Furin. In addition, to study the specific effect of plant glycosylation on stability and activity of plant produced FIX, FIX was also co-expressed with deglycosylating enzymes, PNGase F or Endo H. Plant produced FIX variants were then partially purified using IMAC column and their comperative enzymatic activities were performed. Activities of plant produced partially purified FIX variants were determined by chromogenic assay. The results showed that plant produced FIX possess about 10% relative activity to human FIX. However, we observed very little or no difference between FIX activities, produced alone or produced with co-expression with furin or VKD-GC. About 12% relative activity to human FIX was observed for plant produced FIX, produced with co-expression with furin or furin plus VKD-GC genes.  In addition, we also performed a stability and activity analysis of different variants of plant produced FIX. The activities of Endo H and PNGase F deglycosylated FIX variants were 13,6 and 12,5% relative to human FIX, respectively. The stability of plant produced glycosylated and in vivo deglycosylated forms of FIX were examined after incubation at 37˚C for 24 hours. In vitro half-life (time to 50% remaining) of glycosylated, PNGase F in vivo deglycosylated, and Endo H in vivo deglycosylated forms of FIX were calculated by analyzing protein bands on Western blot, which were 25.80, 37.99 and 80.57 hours respectively. These results demonstrate that the plant produced Endo H in vivo deglycosylated form of FIX appeared to be more stable compared to glycosylated FIX or PNGase F in vivo deglycosylated counterparts at elevated temperatures.

KEYWORDS: Carboxylation, Hemophilia B disease, in vivo deglycosylation, Proteolytic cleavage, Transient gene expression.