Otizmde kalıtsal mirna'ların hedef gen profillerinin ve ilişkili yolaklarının araştırılması
Investigation of the target gene profiles and their related pathways of inherited mirnas in autism
Yazar: NESLİHAN BAŞGÖZ
Danışman: PROF. DR. YUSUF ÖZKUL
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Otizm spektrum bozukluğu (OSB), çocuklarda yaygın olarak görülen nörogelişimsel bir bozukluktur. Hem sosyal iletişim ve etkileşimdeki bozukluklar hem de stereotipik davranışlarla karakterizedir. Otizm, yaygın bir gelişimsel bozukluk olmasına rağmen etiyolojisi tam olarak bilinmemektedir. Genetik, epigenetik ve çevresel faktörler arasındaki karmaşık bir etkileşimden kaynaklandığı varsayılmaktadır. 
Çalışmadaki amacımız, fare modelleri üzerinden otizm spektrum bozukluğuna neden olan genetik mekanizmaları daha iyi anlamak için, OSB'ye yol açan aday gen olduğu tartışılan Coiled-Coil and C2 Domain Containing 1A (Cc2d1a), Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (Fmr1), Forkhead Box P2 (Foxp2) ve Phosphatase and Tensin Homolog (Pten) genlerinin ifade düzeylerini hem transkript hem de protein düzeyinde ölçmek ve bu genleri hedef aldığı düşünülen miRNA'lardan miR-19a-3p, miR-126-3p, miR-150-5p, miR-361-5p ve miR-499a-5p'nin OSB üzerine olan etkileri araştırılmasıdır.
Bu amaçla çalışma grubu olarak postnatal dönemde valproik asit (VPA) enjekte edilmiş fareler, Cc2d1a+/- nakavt fareler ve bu grupların kontrolleri olmak üzere toplam 35 erkek fare çalışmaya dahil edilmiştir ve farelere davranış deneyleri yapılmıştır. Sonrasında moleküler deneyler için farelerden kan, sperm ve hipokampus örnekleri alınmıştır. Örneklerin qRT-PZR yöntemiyle 4 genin ve 5 miRNA'nın ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir. Ayrıca hipokampus örneklerinde western blot yöntemiyle 4 proteinin ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir.
Çalışma sonucunda, OSB model farelerde, tırmalama veya kazma gibi basmakalıp kemirgen davranışlarının önceden yapılmış olan çalışmalardan elde edilen sonuçlar ile birçok noktada birbirini destekler olduğu görülmüştür.
Cc2d1a+/- farelerinin Cc2d1a, Fmr1, Foxp2 ve Pten genlerinde kan ve sperm örneklerinin ekspresyon seviyesinin yüksek olduğu gözlemlenirken, Cc2d1a ve Foxp2 genlerinin hipokampus örneklerinin ekspresyon seviyesinin düşük olduğu tespit edilmiştir. VPA enjekte edilmiş farelerde Cc2d1a, Fmr1 ve Pten genlerinde kan ve hipokampus örneklerinin ekspresyon seviyesinin düşük olduğu gözlenmiştir. Cc2d1a+/- ve VPA enjekte edilmiş farelerde 5 miRNA'nın kan, hipokampus ve sperm örneklerinin ekspresyon seviyesinin yüksek olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca Cc2d1a+/- ve VPA enjekte edilmiş fare gruplarının sperm örneklerinde hem gen hem de miRNA ekspresyon seviyesinin yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuç otizmin kalıtsal olarak aktarıldığı düşüncesine büyük katkı sağlamaktadır.
Bu çalışmadan elde edilen bulgular ile miRNA'ların hedef genlerinin OSB ile ilişkili çeşitli yolaklarda yer aldığı ve daha fazla deneysel/klinik verilerle doğrulanmasıyla yeni biyobelirteçler ve terapötik ajanların geliştirilip, teşhis ve tedavi stratejilerine katkı sağlayabileceği ileri sürülmekte olup, otizmin kalıtsal olarak aktarılabileceği düşüncesine de katkı sağlamaktadır.
Anahtar Kelimeler: fare modeli; gen ekspresyonu; miRNA ekspresyonu; protein ekspresyonu; Otizm spektrum bozukluğu.

Abstract:
Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder commonly seen in children. It is characterized by both impairments in social communication and interaction and stereotypical behavior. Although autism is a common developmental disorder, its etiology is not completely known. It is thought to result from a complex interaction between genetic, epigenetic and environmental factors.
The aim of this study was to measure the expression levels of Coiled-Coil and C2 Domain Containing 1A (CC2D1A), Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (FMR1), Forkhead Box P2 (FOXP2), Phosphatase and Tensin Homolog (PTEN) genes, which are argued to be candidate genes causing ASD, at both transcript and protein levels in order to better understand the genetic mechanisms causing autism spectrum disorder through mouse models. And to research the effects of miR-19a-3p, miR-126-3p, miR-150-5p, miR-361-5p and miR-499a-5p, which are miRNAs thought to target these genes, on ASD.
For this purpose, a total of 35 male mice, including mice injected with valproic acid (VPA) in the postnatal period, Cc2d1a+/- knockout mice and controls of these groups, were included in the study and behavioural experiments were performed on the mice. Then, blood, semen and hippocampus samples were taken from the mice for molecular experiments. Expression levels of 4 genes and 5 miRNAs were determined by qRT-PZR method. In addition, expression levels of 4 proteins were determined by western blot method in hippocampus samples.
It was observed that the expression levels of Cc2d1a, Fmr1, Foxp2 and Pten genes in blood and sperm samples of Cc2d1a+/- mice were high. The expression levels of Cc2d1a and Foxp2 genes in hippocampus samples were found to be low. In VPA injected mice, it was observed that the expression levels of Cc2d1a, Fmr1 and Pten genes in blood and hippocampus samples were low. In Cc2d1a+/- and VPA injected mice, the expression levels of 5 miRNAs in blood, hippocampus and sperm samples were found to be high. In addition, both gene and miRNA expression levels were found to be high in sperm samples of Cc2d1a+/- and VPA injected mice. This result contributes greatly to the idea that autism is inherited.
With the findings obtained from this study, it is suggested that the target genes of miRNAs are involved in various pathways associated with ASD and that new biomarkers and therapeutic agents can be developed and contribute to diagnosis and treatment strategies by confirming with more experimental/clinical data, and it also contributes to the idea that autism can be inherited.
Keywords: Autism spectrum disorder; mouse model; gene expression; miRNA expression; protein expression.