Arabidopsis Thaliana bitkisinde sitokinin sinyal yollarında görev alan AHP1 proteinine karşı monoklonal antikorların üretimi, seçimi ve karakterizasyonu
Production, selection and characterization of monoclonal antibodies against AHP1 protein that has function in Arabidopsis Thaliana signaling pathway
Yazar: ŞEYHMUS ERSEN KOLDEMİR
Danışman: PROF. DR. S. SEYHAN TÜKEL
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Arabidopsis thaliana = Arabidopsis thaliana ; Sitokinin = Cytokinine

Özet:
Bu çalışmada Arabidopsis thaliana bitkisinde sitokinin sinyal yollarında görev alan AHP1 proteinine karşı monoklonal antikorlarının üretimi, seçimi ve immünoanalizi yapılmıştır. Monoklonal antikorlar Ni Sepharose yüksek performanslı kromatografi kolonu kullanılarak monoklonal antikorlar saflaştırılmıştır. Saflaştırma sonucu elde edilen monoklonal antikorların karakterizasyonu ELISA ve Western Blot teknikleri kullanılarak incelenmiştir. Yapılan deneyler sonucunda üç monoklonal antikorun monospesifik, diğer iki monoklonal antikorun ise polispesifik karakterde olduğu tespit edilmiştir. İzotipleme yöntemi ile monoklonal antikorların IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgGM ve IgGA ikincil antikorları ile etkileşimi incelenerek; monoklonal antikorların ikincil antikorlardan hangisi ile daha iyi reaksiyon verdiği absorbans değerlerinin kıyaslanmasıyla belirlenmiştir. Monoklonal antikorlar kaba özütler üzerinde denenerek monospesifik karakterli antikorlardan ikisinin sadece AHP1 proteiniyle reaksiyon verdiği, diğer monospesifik karakterli monoklonal antikorun AHP1 proteininin yanı sıra AHP6 proteiniyle çapraz reaksiyon verdiği, polispesifik karakterli antikorların ise AHP1,2,3,4,5,6 proteinleriyle reaksiyon verdiği belirlenmiştir. Monoklonal antikorlara hassasiyet testi yapılarak monoklonal antikorların seyreltme oranları hesaplanmıştır. Monoklonal antikorlardan birisinin epitop haritalandırılması gerçekleştirilmiştir. AHP1 antijeninin bu monoklonal antikora KVDPHVHQLK epitopu üzerinden bağlandığı MS/MS spektrofotometrisi ile belirlenmiştir.

Abstract:
In the present study; production, selection and characterization of monoclonal antibodies against AHP1 protein that has function in Arabidopsis thaliana signaling pathway are completed. Monoclonal antibodies are purified by using Ni Sepharose high performance chromatography column. Monoclonal antibodies were characterized by using ELISA and Western Blot techniques and three of them are classified as monospecific and two of them classified as polyspecific. Using by isotyping method; monoclonal antibodies are tested on IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgGM and IgGA (secondary antibodies) to find out which secondary antibody gives best reaction with antibodies. Antibodies are tested on crude extracts and as a result; two of the monospecific antibodies are only specific to AHP1 protein, other monospecific antibody is specific to AHP1 and has cross reaction with AHP6 and polyspecific antibodies are specific to AHP1,2,3,4,5,6 proteins. Sensitivity test is used for each antibodies and best dilutions are calculated. Besides these epitope mapping is completed. According to MS/MS analysis; AHP1 protein is bounded to one of the antibody on KVDPHVHQLK epitope.