Mikroakışkan sistemlerde enzimatik tepkimeler
Enzymatic reactions in microfluidic systems
Yazar: ŞEREF AKAY
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM YEŞİL ÇELİKTAŞ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu tez çalışması kapsamında enzimatik hidrolizleri gerçekleştirebilmek için uygun bir mikrosistem ve enzimleri bu mikrosisteme immobilize etmek uygun immobilizasyon tekniği geliştirilmesi amaçlanmıştır. Geliştirilen mikrosistem ve immobilizasyon tekniğinin başarısın değerlendirmek için temsili saponin bileşiklerinin (Ginsenozit Rg1 ve Glizirizik Asit) hidrolizi hedef uygulama olarak seçilmiştir. Bu amaç doğrultusunda tek bir uzun kanaldan oluşan Silikon-cam bir mikroreaktör tasarlanıp, Fotolitografi teknikleri ile üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretilen tek kanallı mikroreaktöre beta-glukozidaz ve beta-glukuronidaz enzimlerinin immobilizasyonu için Aljinat tabanlı jelleşme metodu optimize edilmiştir. 
Serbest enzim ve immobilize enzim ile ilgili çalışmalar pNP-Glu ve pNP-Uro substratları ile gerçekleştirilmiştir. Uygun jel formülasyonunu belirlemek için GDL konsantrasyonu, Kitosan oranı gibi farklı parametreler test edilmiş ve bu parametrelere bağlı olarak elde edilen monolitleri enzimatik aktivite performansı ve yapısal karakteristikleri tespit edilmiştir. Parametrelerin enzimatik aktivite üzerine etkisinin yanı sıra jelleşme süresi ve zamana bağlı stabilite çalışmaları yapılmıştır. Aljinat monolitlerin karakterizasyonu amacıyla Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) analizi, Brunauer–Emmett–Teller (BET) yüzey alanı ve Barrette–Joyner–Halenda (BJH)  gözenek çapı ve hacmi ve Fourier Dönüşümlü Infrared Spektrofotometre (FTIR) analizleri yapılmıştır.
Yapılan çalışmalar sonunda 150 mM GDL konsantrasyonu, 16:1 Aljinat: Kitosan oranı ve β-glukozidaz için 0.8 mg Enzim/ g jel, β-glukuronidaz için 20000 U/ ml enzim konsantrasyonu en uygun formülasyon olarak seçilmiştir. Bu formülasyon için β-glukozidaz ve β-glukuronidaz enzimlerinin serbest formlarına göre rölatif enzimatik aktiviteleri sırasıyla %38.5 ve %59.4 olarak tespit edilmiştir. Mikroreaktörlerde yapılan denemelerde 20 mM pNP-Glu, 2 µl/dakika hızında mikrokanallara beslenmiş ve substratın tamamen dönüştürüldüğü belirlenmiştir. Mikrokanallara immobilize edilen enzimleri akış koşullarında 24 saat aktif kaldığı gözlenmiştir. 
Temsili seçilen Ginsenozit Rg1 ve Glizirizik Asit farklı hızlarda mikroreaktörlere beslenmiş ve elde edilen örnekler HPLC- ELSD ile analiz edilerek reaksiyon ürünleri tespit edilmiştir. Reaksiyon sonunda Rg1'in enzimatik hidroliz sonunda C-20 pozisyonunda şeker grubunu kaybederek Rh1 bileşiğine dönüştüğü tespit edilmiştir. Konvansiyonel hidroliz sistemleri ile karşılaştırıldığında yüksek verimde dönüşüm elde edilmesi hem enzimatik reaksiyon hem de mikrosistemlerin üstünlüğü olarak değerlendirilebilir.

Abstract:
Design of suitable microsystem for enzymatic reaction and development of proper immobilization method are aimed to perform enzymatic hydrolysis in the fabricated microsystems in this study. Ginsenoside Rg1 and Glycyrrhizic Acid were chosen as representative compounds for enzymatic hydrolysis to test the performance of immobilization methods and the microsystems. Silicon-glass microreactor consists of long single channel was designed and fabricated using Photolithography techniques. Alginate based gels were optimized to immobilize β- glucosidase and β-glucuronidase into the microreactor. 
pNP-Glu and pNP-Uro were used as a substrate for free and immobilized enzymes. Effects of GDL concentration and chitosan ratio were investigated to develop proper immobilization method. Enzymatic activities and structural characteristics of monoliths were determined according to these parameters. Besides, gelation time and stability of produced monolith were investigated. 
The Alginate monoliths characterized by Brunauer-Emmet-Teller (BET) Specific surface area, Barrett- Joyner-Halenda (BJH) pore diameter, scanning electron microscope (SEM) and Fourier- Transformed Infrared Spectrometer (FTIR) analyzes. 
As result 150 mM GDL concentration and 16:1 Alginate: Chitosan ratio were found as optimum for immobilization. Enzyme concentrations for β-glucosidase and β-glucuronidase were determined as 0.8 mg enzyme/ g gel and 2500 U/ g gel respectively. Relative activities were calculated %38.5 for β-glucosidase and %59.4 for β-glucuronidase. In the microreactor studies 20 mM pNP-glu was pumped into microchannel at 2 µl/min flow rate and complete conversion of substrate were observed. Moreover the immobilized enzymes retain its activity after 24h. 
Representative saponin compound were fed into microchannel at different flow rate and reaction product were analysed by HPLC-ELSD. It is shown that hydrolysis of Rg1 was achieved by cleavage of on sugar moieties from C-20 position and resulted with Rh1. High conversion yield and specific hydrolysis can be attributed to advantages of both enzymatic reaction and microsystems.