Kırım Kongo Kanamalı Ateş virüsü kelkit suşu proteinlerinin ökaryotik hücrelerde stabil ifadesi
Stably expression of proteins of Crimean-Congo Hemorrhagic Aever virus kelkit strain in eukaryotic cells
Yazar: ÖZLEM BAKANGİL
Danışman: PROF. DR. MEHMET ZİYA DOYMAZ
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA), insanlarda ciddi hastalığa neden olan zoonotik bir bulaşıcı hastalıktır. Bu hastalık özellikle vektör kenelerin endemik olduğu ülkelerde yüksek ölüm oranı ile karakterizedir. KKKAV'nün biyolojisi ve immunolojisine yönelik çalışmalarda viral proteinler  diğer viral sistemde olduğu gibi büyük öneme sahiptir. KKKAV proteinlerinin çeşitli süreçlerdeki önemi birçok araştırmalarda ele alınmış ve bu çalışmalarda KKKAV proteinleri genellikle geçici ifade sistemleri kullanılarak üretimi sağlanmıştır. Bununla birlikte, proteinlerin stabil ifadesi tüm çalışmalar için zaman içerisinde tutarlı ve güvenilir bir model olmaktadır.
Bu yüksek lisans tez çalışmasında, insan hücrelerindeki glikozilasyon süreçlerini taklit edebilen ökaryotik hücre hatları kullanarak KKKAV glikoproteinlerinin ve nükleoproteinlerinin stabil ekspresyon ile sürekli bir şekilde üretilmesini amaçlanmıştır. Bunun için insan hepatoselüler hücre hatları (Huh-7), KKKAV proteinlerinin stabil ifadesinde kullanılmıştır. Hücrelerde seleksiyon için seçici antibiyotiklere olan  dirençleri, MTT analizi ile değerlendirilmiştir. KKKAV NP, PreGn ve PreGc kodlayan plazmitler Lipofectamine® 3000 ve polietilenimine (PEI) gibi transfeksiyon ajanlarının yardımıyla hücrelere aktarılmıştır. KKKAV nükleoproteinlerini ve glikoproteinlerini kararlı bir şekilde ifade eden hücreler, antibiyotiklere dirençli olan kolonilerin seleksiyonu ile üretilmiştir. Hücrelerde transfekte edilen genin stabil ekspresyon için genoma entegrasyonunun tespiti, transfekte edilen KKKAV genlerine özgü primerler tasarlanarak polimeraz zincir reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. Genomik düzeydeki doğrulamaların yanı sıra hücrelerdeki hedef proteinlerin ifadesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, Western blot, enzim immünoanalizleri ve immunfloresan analizleri  ile de test edilmiştir. Yapılan deneyler, KKKAV proteinlerinin stabil hücrelerde başarılı bir şekilde ifade edildiğini göstermiştir. Western blot analizi, stabil hücre hatlarında üretilen proteinlerin beklenen boyutta olduğunu ve antijenitelerini doğrularken, EIA analizi bunların antijenik özellikleri tekrar test edilmiştir. Ayrıca, immunofloresan yöntemle mikroskobik görüntüleme üretilen proteinlerin hücreler içindeki lokalizasyonunu ortaya koymuştur. Özetle, bu tez çalışmasında, stabil hücrelerde KKKAV'nün nükleoprotein ve glikoproteinleri başarılı bir şekilde üretilmiştir. Bu stabil hücre hatlarının, KKKAV 'nün biyolojisi, immunolojisi ve patojenezi üzerine daha detaylı araştırmalarda önemli araçlar olarak hizmet etmesi beklenmektedir; çünkü bu virüs, araştırılması gereken öncelikli patojenlerden biri olarak kabul edilmektedir.

Abstract:
Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) is a zoonotic infectious disease that causes severe illness in humans. This disease is particularly characterized by a high mortality rate in countries where vector ticks are endemic. Viral proteins play a crucial role in the biology and immunology of CCHFV, similar to other viral systems. The significance of CCHFV proteins in various processes has been addressed in numerous studies, and in these investigations, CCHFV proteins are typically produced using transient expression systems. However, stable protein expression proves to be a consistent and reliable model for such studies over time. In this study, the aim was to continuously produce CCHFV glycoproteins and nucleoproteins by using eukaryotic cell lines that mimic glycosylation processes in human cells. Human hepatocellular cell lines (Huh-7) were employed for the stable expression of CCHFV proteins. The resistance of cells to selective antibiotics was evaluated through MTT analysis, followed by transfection using transfection agents such as Lipofectamine® 3000 and polyethyleneimine (PEI). Cells expressing CCHFV nucleoproteins and glycoproteins in a stable manner were generated through the selection of antibiotic-resistant colonies. The detection of the transfected gene in the cells was performed using real-time PCR specific to the transfected CCHFV genes. Additionally, the expression of proteins was tested through immunofluorescence microscopy, Western blot, and enzyme immunoassays. The experiments demonstrated the successful expression of CCHFV proteins in stable cells. Western blot analysis confirmed that the produced proteins in the stable cell lines were of the expected sizes, while enzyme immunoassay (EIA) analysis confirmed their antigenic properties. Furthermore, immunofluorescence microscopic analysis revealed the localization of the produced proteins within the cells. The successful expression of CCHFV proteins in stable cells was demonstrated. These stable cell lines are expected to serve as important tools in further detailed investigations on CCHFV, contributing to the understanding of the virus's biology, immunology, and pathogenesis, as it is considered one of the priority pathogens for research.