Balık patojeni Vibrio anguillarum'un karakterizasyonu ve biofilm oluşumu
Biofilm formation and characterization of fish pathogen Vibrio anguillarum
Yazar: MEHMET DURNA
Danışman: DOÇ. DR. TÜLAY AKAYLI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: Gram negatif bakteriler = Gram negative bacteria ; Vibrio anguillarum = Vibrio anguillarum

Özet:
Bu çalışmada Ege Bölgesi'nde deniz balığı üretimi yapan balık çiftliklerindeki levrek balıklarında (Dicentrarchus labrax) hastalığa neden olan Vibrio anguillarum'un karakterizasyonu ve biyofilm oluşturma özelliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla iki adet işletmeden 150-200 gr ağırlığında, çeşitli hastalık belirtileri gösteren 8 adet balıktan örnekleme yapılmıştır. Hasta balık örneklerinin dış bakısında vücut üzerinde ve özellikle anal bölgede yaygın hemorajiler ile lezyonlar, pul kaybı, gözlerde ekzoftalmus, solungaçlarda hemoraji ile abdomende şişkinlik gibi klinik bulgular tespit edilmiştir. Hasta balıkların iç bakısında ise karın içerisinde ascites, karaciğerde yaygın hemoraji ve hiperemi, hiperemik bağırsak duvarında incelme ve şeffaflaşma, dalakta büyüme tespit edilmiştir. Hasta balık örneklerinin karaciğer, böbrek ve dalak gibi iç organlarından %1,5 NaCl içeren TSA yanı sıra TCBS ve VAM gibi seçici besiyerlerine yapılan bakteriyolojik ekimler sonucunda A işletmesinden temin edilen hasta balık örneklerinden V. anguillarum yanı sıra V. splendidus I, V. harveyi, V. orientalis, V. mediterranei, V. alginolyticus ve Aeromonas schubertii; B işletmesinden temin edilen hasta balık örneklerinden ise V. anguillarum yanı sıra sekonder etken olarak A. schubertii izole ve identifiye edilmiştir. Bakteri izolatlarından TSA besiyeri üzerinde krem renkli, TCBS ve VAM besiyerlerinde sarı renkli koloni oluşturan, Gram-negatif, hareketli, fermentatif, sitokrom oksidaz ve katalaz testlerinde pozitif sonuç veren, O/129'a hassas olan, kanlı agarda β-hemoliz yapan, arjinin ve ONPG testlerinde pozitif sonuç veren izolatlar, diğer biyokimyasal özelliklerine göre V. anguillarum olarak izole ve identifiye edilmiştir. Biyokimyasal metotlarla V. anguillarum olarak identifiye edilen izolatlar, rpoN-ang5' ve rpoN-ang3' primerleri ile gerçekleştirilen ve bu türe özel olan rpoN PCR analizi sonucunda 519 bazlık tek bant oluşturmuştur. 

V. anguillarum O1, O2 ve O3 serotiplerine karşı geliştirilmiş antikorlar kullanılarak gerçekleştirilen lam aglütinasyon testi sonucunda çalışmada hasta kültür levrek balığı örneklerinden izole edilen V. anguillarum suşlarından elde edilen O-antijen ekstraktları yalnızca türün O1 serotipine karşı geliştirilen antikorla reaksiyona girerek çökelme oluşturmuştur. Dot-Blot testinde; referans V. anguillarum suşları ve izole edilen V. anguillarum izolatlarının poliklonal antikorla reaksiyona girmesi sonucu nitroselüloz membranda mor renk oluşumu gözlenmiştir. Referans V. anguillarum suşları ile bu çalışmada izole edilen 2 adet V. anguillarum izolatının ELISA plağında biyofilm oluşturma yetenekleri incelenmiştir. Ayrıca saha izolatlarından yalnızca bir tanesinin sıvı-hava ara yüzeyinde pelikül oluşturduğu tespit edilmiştir.Sonuç olarak; bu çalışma ile Ege Bölgesindeki çiftliklerde yetiştirilen kültür levrek balıklarından izole edilen ve bakteriyolojik metodlarla V. anguillarum olarak identifiye edilen bakterinin aglütinasyon testi ile O1 serotipi olduğu ortaya çıkartılarak, Dot-Blot testi ile konfirme edilmiştir. Referans V. anguillarum  suşları ile bu çalışmadan izole edilen 2 adet V. anguillarum izolatının ELISA plağında biyofilm oluşturma yeteneği incelenmiş ve bir izolatın sıvı-hava ara yüzeyinde pelikül oluşturduğu tespit edilmiştir.
Anahtar kelimeler: Vibrio anguillarum, Levrek, biofilm, Dot-blot, rpoN PCR

Abstract:
The aim of this study is the characterization and determination of the biofilm formation of Vibrio anguillarum isolates that induced vibriosis in cultured European sea bass reared in marine farms operating in Aegean Sea region. For this purpose, sampling studies were made on 8 fish samples weighing between 150-200 g, showing some disease signs supplied from two farms. Diffuse hemorrhages and the body surface and especially in the anal region, loss of scales, exofthalmia, and hemorrhages in the gills and ascites in the abdomen were observed in the external examination of the diseased fish samples. Accumulation of a fluid in the abdominal cavity, diffuse hemorrhages and hyperemia over the liver, thinning and transparency on the hyperemic intestine wall and enlarged spleen were observed in the internal examination of the diseased fish samples.As a result of the bacteriological inoculations were made from the internal organs of the diseased fish samples such as liver, kidney and spleen onto TSA containing 1,5% NaCl, selective media such as TCBS and VAM. V. splendidus I, V. harveyi, V. orientalis, V. mediterranei, V. alginolyticus and Aeromonas schubertii were isolated besides V. anguillarum isolates from farm (A) and A. schubertii was isolated  beside V. anguillarum isolates from farm (B) as secondary bacterial agents. 

After comparing with the previous reports and the reference isolates, bacterial isolates that formed creamy colonies on TSA and yellow colonies on TCBS and VAM, Gram-negatif, motile, fermentative, positive in cytochromoxidase and catalase tests, sensitive to O/129, β-haemolytic on blood agar and positive in arginine and ONPG tests were identified as V. anguillarum according to their other biochemical properties and API 20E profiles. Isolates that were identified as V. anguillarum formed a single band of 519 bp in the rpoN PCR analysis which is a species-specific method and performed by using rpoN-ang5' ve rpoN-ang3' primers and subsequently molecular confirmation of the biochemical identification was made. 

As a result of the slide agglutination test in which the antibodies raised against V. anguillarum serotypes O1, O2 and O3 were used, O-antigens extracted from V. anguillarum recovered from diseased cultured sea bass in this study, only reacted with the antibody raised against V. anguillarum serotype O1 and produced agglutination. As the reference V. anguillarum isolates and field isolates has reacted with the polyclonal antibody, a purple color formation on the nitrocellulose membrane was detected in the dot-blot test. Biofilm formation abilities of reference V. anguillarum isolates and two field V. anguillarum isolates on ELISA plate were examined. Also, it was detected that only one field isolate has formed pellicle in the liquid-air interface. As a result, with this study V. anguillarum was recovered from European sea bass cultured in the fish farms located in the Aegean Sea region and identified by using bacteriological methods. Their serotype was detected as O1 and this result was confirmed with Dot-blot test. Biofilm formation abilities of reference V. anguillarum isolates and two field V. anguillarum isolates on ELISA plate were examined and it was detected that one field isolate has formed pellicle in the liquid-air interface.
Keywords: Vibrio anguillarum, European sea bass, biofilm, Dot-blot, rpoN PCR