Karaciğer kanser hücre hattında r-547 isimli siklin bağımlı kinaz inhibitörünün hücre ölümü üzerindeki etkisi /
Yazar: BETÜL HACIOĞLU
Danışman: PROF. DR. SELDA KABADERE
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Apoptozis = Apoptosis ; Hepatositler = Hepatocytes ; Hücre canlılığı = Cell survival ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre ölümü = Cell death ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Sisplatin = Cisplatin ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
ÖZET
	 
 Kanser, Türkiye ve dünyada ölüm oranı yüksek olan bir hastalıktır. Hepatoselüler karsinoma (HSK), hepatositlerden köken alır, kanser bağlantılı ölümlerde 3. sıradadır. Son yıllarda yeni tedavi yöntemleri ve anti kanser ilaçlar geliştirmek amacıyla birçok çalışma yapılmaktadır. Hücre bölünmesini ve kontrol noktalarında düzenleyici görevi olan siklin bağımlı kinaz (CDK) inhibitörleri de bu yönüyle kanser araştırmalarında yol gösterici fikirler vermektedir.
Çalışmamızda, apoptoz mekanizmaları ve hücre canlılığı üzerine etkileri bulunan CDK inhibitör sınıfına ait R-547 isimli ilacın, HSK'lı hücre soylarında hücre canlılığı ve hücre ölümüne olan etkisini detaylı olarak ortaya koymak amaçlandı. Bu sebeple insan karaciğer dokusu kaynaklı hepatosellüler karsinomalı HepG2 hücre soyu ve sıçan karaciğer dokusu kaynaklı hepatosellüler karsinomalı hücre soyu olan H-4-IIE kullanıldı. Her iki hücre soyu da (Hep G2 ve H-4-IIE) 24 ve 48 saat boyunca 0,1, 1, 10, 50, 100 µM'lık dozlarda R-547 ilacı ile muamele edildi ve hücre canlılıkları MTT testi ile belirlendi. Sonuçlar pozitif kontrol olarak alınan antikanser ilaç olan Cisplatin'in etkileri ile karşılaştırıldı. Hep G2 hücre soyunda R-547 ilacı uygulanan doz ve zaman aralıklarında beklenen etki görülemediği için deneylere H-4-IIE hücreleri ile devam edildi. Etkili olduğu düşünülen dozlar ile akım sitometri,  hücrelerde meydana gelen morfolojik değişimlerin tespiti için konfokal mikroskobi ve geçirimli elektron mikroskobi yöntemleri uygulandı. Hep G2 hücrelerinde 24 saat boyunca uygulanan 0,1, 1, 10, 50, 100 µM R-547 ilaç dozlarında hücrelerin yaşam oranı sırası ile %101, %94, %93, %89, %79 (p<0,001) iken 48 saat boyunca %92, %101, %53,6 (p<0,01), %47,4 (p<0,001), %41 (p<0,001) oldu. H-4-IIE hücrelerinde 24 saat boyunca uygulanan 0,1, 1, 10, 50, 100 µM R-547 ilaç dozlarında hücrelerin yaşam oranı sırası ile %90, %80 (p<0,01), %63 (p<0,001), %47 (p<0,001), %43 (p<0,001) iken 48 saat boyunca aynı ilaç dozları ile muamele edilen hücre yaşam oranları sırasıyla %96, %85 (p<0,01), %46 (p<0,001), %44 (p<0,001), %45 (p<0,01) oldu. H-4-IIE hücrelerinde 24 saatlik ilaç muamelesi sonuçlarına göre 10 ve 50 µM dozlar ile yapılan akım sitometri analizi ile apoptotik değerler (kontrol %4,1) %38, %45 (her ikisi için p<0,05) olarak tespit edildi. 

Sonuçlara göre, R-547 isimli CDK inhibitörünün hücre bölünmesini durdurucu etkisinin Cisplatin'den daha etkili olduğu gözlendi. 10 ve 50  µM akım sitometri sonuçlarına göre de apoptozu uyarmaktadır. R-547 ilacını 24 saatte, 10 ve 50 µM dozlarda uygulayarak yapılan konfokal ve Transmission Electron Microscopy (TEM) yöntemlerinin sonuçlarına göre de hücrelerde morfolojik olarak şekil değişikliği, hücre içeriğinde değişiklikler ve hücre ölümü gözlemlendi. 
Anahtar Kelimeler: R-547, hepatosellüler karsinoma, H-4-IIE, HepG2,  MTT, apoptoz, akım sitometri, konfokal mikroskobi, geçirimli elektron mikroskobi (TEM).

Abstract:
SUMMARY

Cancer is a disease that has high mortality rate in Turkey and in the world. Hepatocellular carcinoma (HCC) is derived from hepatocytes and it is the 3rd cancer related death type. Recently, there are many studies about developing new drugs and new therapy methods. Cyclin dependent kinase inhibitors, regulate the cell cycle and check points, give some guiding ideas for cancer studies. 
In this study, we aimed to determine the possible effect of R-547 which is a member of cyclin kinase inhibitor family on on growth and apoptotic mechanisms of Hep G2, derived from human and H4IIE derived from rat HCC. Both cell lines were exposed to 0,1, 1, 10, 50, 100 µM of R-547 for 24 and 48 hours. Also compared the results with the effects of Cisplatin as a positive control. We determined in vitro survival rate with MTT assay, apoptosis with flow cytometry, morphological changes with confocal microscopy and transmission elektron microscopy (TEM). After 24 h culturing at 0,1, 1, 10, 50, 100 µM doses of R-547, the corresponding percentages of live Hep G2 cells were 101, 94, 93, 89 and %79 (p<0,001), respectively. The corresponding percentages of alive Hep G2 cells were 92, 101, 53,6 (p<0,01), 47,4 (p<0,001), and 41 (p<0,001) %, respectively, for 48 hours. After 24 h culturing at the same doses of R-547, the corresponding percentages of live H-4-IIE cells were 90, 80 (p<0,01), 63 (p<0,001), 47 (p<0,001) and 43 (p<0,001) % respectively. The corresponding percentages of alive H4IIE cells were 96, 85 (p<0,01), 46 (p<0,001), 44 (p<0,001) and 45 (p<0,01) %, respectively, for 48 hours. Because R-547 was not affect the cell survival of Hep G2 cells for 24 hours, experiments for flow cytometry, confocal and transmission elektron microscopies were continued with H4IIE cells. The rates of early apoptotic H-4-IIE cells were about 38 and 45 (p<0,05 for both) % after applications of 10 and 25 μM R-547 after 24 h (control: 4,1%), respectively.
 
According to our results, it is clear that R-547 has a growth inhibitory action than cisplatin. Also, R-547 had apoptotic effect on H-4-IIE cells for 24 hours. According to the confocal and Transmission Electron Microscopy (TEM) results, morphological changes has seen inside and outside the H-4-IIE cells. 

 Key words: R-547, hepatocellular carcinoma, H-4-IIE, MTT, apoptosis, flow cytometry, confocal microscopy, TEM.