Osteo-mimetik kültür ortamı tasarımı ile kemik iliği mezankimal kök hücrelerinin osteojenik farklılaşma kapasitesinin artırılması
Increasing osteogenic differentiation capacity of bone marrow mesenchymal stem cells by design of osteo-mimetic culture environment
Yazar: ELİT ÖZELÇAĞLAYAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ NURAY EMİN
Kastamonu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Malzeme Bilimi ve Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: 11111 = 12345 ; Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Hidroksiapatitler = Hydroxyapatites ; Hyalüronik asit = Hyaluronic acid ; Kemik dokusu = Bone tissue ; Kollajen = Collagen ; Kondroitin = Chondroitin ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Travma, kırıklar, bulaşıcı hastalıklar veya tümörler, iyileşmesi zor olan kemik kusurlarına neden olabilir. Çeşitli kemik hasarlarının tedavisi için doku mühendisliği çalışmalarında yüksek gözeneklilik oranına sahip, biyouyumlu yapay kemik iskelelerinin kullanımı tercih edilen bir yöntemdir. Üç boyutlu (3B) yapay kemik doku iskeleleri, hücrelerin osteojenik farklılaşması ve dokulaşması için uygun bir destek ortamı sağlayarak doğal kemik yapısının taklit edilmesine olanak tanımaktadır. %1 kollajen, %1 hiyalüronik asit ve %0,1 kondroitin sülfat polimer kompozitlerinin biyomimetik yaklaşımla yapay vücut sıvısı (SBF) çözeltisi içerisinde hidroksiapatit minerali ile kaplanması sonucunda kolajen/hiyalüronik asit/kondroitin sülfat-hidroksiapatit (KOL/HYA/KS-HA) polimer-seramik kompozit yapı iskelelerinin geliştirilmesi ve mezenkimal kök hücreler (MKH) kullanılarak kemik dokusu oluşturma yeteneklerinin belirlenmesi amaçlandı.  
Yapı iskeleleri kemik morfogenetik proteini (BMP) ile takviye edilmiş Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı  (DMEM-LG) ile osteojenik indüksiyon altında kemik dokusu oluşturma kabiliyetinin belirlenmesi için sıçan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler ile etkinleştirildi. Kemik oluşumunu değerlendirmek için haftalık aralıklarla kültürden örnekler alındı. Biyouyumluluk, MTT kit analizi ile test edildi. ALP analizi ile alkalin fosfataz aktivitesi değerlendirildi. Ayrıca kemik dokulaşması immünohistokimya, histoloji ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizleri ile takip edildi.
SEM analizinde boş yapı iskelelerinin yüzey morfolojisi ve MKH ile kültür sonrası mineralize ekstraselüler matris (ECM) yapısı net bir şekilde görüldü. MTT analizi sonuçlarına göre mitokondriyal aktivite 7. günden itibaren kısmen artmış ve 28. günde en yüksek seviyeye ulaşmıştır. Alizarin kırmızısı ile boyama, Kol/HYA/KS-HA iskelelerinde MKH kültürleri sırasında kalsiyum birikiminin arttığını kanıtladı. Alsian ve Safranin-O boyaması, kemik benzeri dokunun ECM'sinde sırasıyla proteoglikanları ve kollajen liflerini gösterdi. İmmünhistokimya boyama, kültür sonunda kemik benzeri doku oluşumunun meydana geldiğini ve MKH ile başlatılan dokulaşma sürecinin doğal osteogeneze uygun olarak ilerlediğini gösterdi.

Abstract:
Trauma, fractures, infectious diseases or tumors can cause bone defects that are difficult to heal. The use of biocompatible artificial bone scaffolds with high porosity is a preferred method in tissue engineering studies for the treatment of various bone injuries. Three dimensional (3D) artificial bone scaffolds allow mimicking natural bone structure by providing a suitable support environment for osteogenic differentiation and tissueization of cells. Development of collagen/hyaluronic acid/chondroitin sulfate-hydroxyapatite COL/HYA/CS-HA polymer-ceramic composite scaffolds as a result of coating 1% collagen, 1% hyaluronic acid and 0.1% chondroitin sulfate polymer composites with hydroxyapatite mineral in SBF solution with biomimetic approach and bone marrow using mesenchymal stem cells (MSC). It was aimed to determine the ability to create texture.
The scaffolds were activated with rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells to determine the ability to form bone tissue under osteogenic induction with Dulbecco's Modified Eagle's Medium-Low Glucose (DMEM-LG) supplemented with bone morphogenetic protein (BMP). Samples were taken from the culture at weekly intervals to assess bone formation. Biocompatibility was tested by MTT kit analysis. Alkaline phosphatase activity was evaluated by alkaline phosphatase (ALP) analysis. In addition, bone tissue was followed by immunohistochemistry, histology and SEM analysis.
The surface morphology of the hollow scaffolds and the mineralized extracellular matrix (ECM) structure after culture with MSC were clearly seen in the SEM analysis. According to the results of MTT analysis, mitochondrial activity increased partially from the 7th day and reached the highest level on the 28th day. Alizarin red staining demonstrated increased calcium deposition during MSC cultures on Col/HYA/CS-HA scaffolds. Alsian and Safranin-O staining showed proteoglycans and collagen fibers, respectively, in the ECM of bone-like tissue. Immunohistochemistry staining showed that bone-like tissue formation occurred at the end of culture and the MSC-initiated tissueization process proceeded in accordance with natural osteogenesis.