Kurbağa (Pelophylax ridibundus) karaciğerinde leptin ve leptin reseptörünün saptanması: İmmünohistokimyasal bir çalışma
Detection of leptin and leptin receptor in the frog (Pelophylax ridibundus)liver: an immunohistochemical study
Yazar: TUĞBA DUZLA
Danışman: DOÇ. DR. MELİHA İNCELİ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmanın amacı bir Anura örneği olan Pelophylax ridibundus'un karaciğerinde leptin ve leptin reseptörünün varlığını ve leptin enjeksiyonu ile leptinin bu dokuda meydana getirebileceği etkileri histolojik ve immünohistokimyasal olarak belirleyerek leptinin olası fonksiyon/fonksiyonları ile ilgili temel bilgiyi oluşturmaktır.
Protein yapıda bir hormon olan leptin, besin alımını ve vücut ağırlığının dengelenmesini düzenleyen, bunun yanı sıra üreme, immün cevap, hematopoiez gibi farklı fonksiyonları da etkileyen obez (ob) geninin bir ürünüdür. Leptin esas olarak adipositler tarafından sentezlenir ve kana salınır. Fakat son yıllarda leptinin plasenta, meme bezi, beyin, hipofiz ve mide gibi farklı doku ve organlarda da üretildiği tespit edilmiştir. Leptin reseptörü ise sitokin reseptör ailesinin bir üyesi olarak tanımlanmıştır ve çeşitli izoformları vardır. Aşağı omurgalılarda ve özellikle ergin amfibilerde leptin ve leptin reseptör ekspresyonu ve fonksiyonu hakkında kısıtlı bilgi mevcuttur. 
Çalışmamızda Pelophylax ridibundus cinsi 24 adet ergin dişi kurbağa kullanıldı. Bir gün ve beş gün süren iki ayrı deney grubu oluşturuldu. Her bir grup, kontrol bireyleri ve leptin enjeksiyonlu bireylerinden oluşmaktadır. Karaciğerden alınan doku örnekleri histolojik ve immünohistokimyasal incelemeler için Bouin ile fikse edildi. Parafin bloklardan alınan kesitlere hematoksilin-eosin, bromphenol blue, Masson'un üçlü boyası ile periyodik asit Schiff reaksiyonu, immünohistokimyasal olarak ise leptin ve leptin reseptör antikoru uygulandı. Bireylerin karaciğer kesitlerindeki hepatosit sayısı, pigment hücrelerinin oluşturduğu pigmentli alan sayısı ve pigmentli yüzey alanı belirlendi. Ayrıca hepatositlerdeki leptin ve leptin reseptörü immünoreaktivitesi semikantitatif olarak hesaplandı.
Çalışmamızda Pelophylax ridibundus'un hepatositlerinde ve safra kanalı epitel hücrelerinde leptin immünoreaktivitesi; hepatositler, safra kanalı epitel hücreleri, bazı melanomakrofajlar, eritrositler ve arter duvarı düz kas hücrelerinde leptin reseptör immünoreaktivitesi saptadık. Leptin enjeksiyonunun, uygulama süresine bağlı olarak leptin reseptörü taşıyan hücreleri etkileyebildiğini gözledik. Bu etkileri karaciğerde, hepatosit ve pigmentli alan sayısı ile pigmentli yüzey alanında artış, safra kanalı epitel hücrelerinin yüksekliğinin azalması, hepatositlerde glikojen ve lipit içeriğinin azalması ile protein içeriğinin artması şeklinde gözledik. Safra kanalı epitelinin yüksekliğinin ve protein içeriğinin azalması, fibrozis ve eozinofilik hepatositlerin gözlenmesi leptin uygulamasının doz/süresine bağlı olarak meydana gelen olumsuz etkilerdir. Bir gün leptin enjeksiyonu hepatositlerdeki leptini baskılarken, leptin reseptöründe artışa neden olmuştur. Beş gün leptin enjeksiyonunun ise hepatositlerdeki leptini bir gün leptin enjeksiyonuna göre daha az baskılayabildiğini, leptin reseptöründe ise azalmaya neden olduğunu saptadık. Ayrıca leptin uygulaması, safra kanalı epitelinde leptini baskılarken, leptin reseptöründe artışa sebep olmuştur.  
Sonuç olarak, ergin Pelophylax ridibundus karaciğerinde yaygın olarak leptinin varlığını saptamamız, bu organın Anura amfibilerinde önemli bir leptin sentez yeri olabileceğini göstermektedir. Leptin, reseptörü aracılığıyla hepatositler ve melanomakrofajlar üzerinde belirgin proliferatif etkiye sahiptir. Ayrıca hepatositlerdeki karbonhidrat, lipid ve protein metabolizmasını düzenler. Leptinin kurbağa karaciğeri üzerindeki bu etkilerinin dokunun bütünlüğünü ve fonksiyonunu düzenlemeye yönelik olabileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
The purpose of this study is to constitute the basic information about the possible function/functions of leptin by determining histologically and immunohistochemically the existence of leptin and leptin receptor in the liver of Pelophylax ridibundus, which belongs to the order of Anura, and the possible effects of leptin in this tissue by leptin injection.
Leptin, originally a protein hormone, is a product of obese (ob) gene which also affects different functions such as reproduction, immune response, hematopoiesis as well as regulating food intake and body weight balance. Leptin is mainly synthesized by adipocytes and released into the bloodstream. However, it has been recently identified that leptin is also produced in different tissues and organs like placenta, mammary gland, brain, pituitary gland and stomach. Leptin receptor is identified as a member of cytokine receptor family and has several isoforms. Limited information is available about leptin and leptin receptor expression and function in lower vertebrates and especially in adult amphibians.
In our study, 24 adult female Pelophylax ridibundus frogs were used. Two different experimental groups, one for one-day and the other for five-day period, were formed. Each group consists of control individuals and leptin injected individuals. The tissue samples taken from the liver were fixed with Bouin for histological and immunohistochemical examinations. Hematoxylin eosin, bromphenol blue, Masson's trichrome stain and periodic acid Schiff reaction and also immunohistochemically leptin and leptin receptor antibody were applied to the sections obtained from paraffin-embedded blocks. The number of hepatocytes, the number of pigmented areas and pigmented surface area constituted by pigment cells in the liver section of individuals were measured. Additionally, immunoreactivity of leptin and leptin receptors in hepatocytes were calculated semiquantitatively.
In our study, we detected leptin immunoreactivity in hepatocytes of Pelophylax ridibundus, epithelial cells of bile duct; leptin receptor immunoreactivity in hepatocytes, epithelial cells of the bile duct, some melanomacrophages, erythrocytes and smooth muscle cells of artery wall. We observed that leptin injection, depending on the application time, could affect the cells that have leptin receptor. We observed these effects as an increase in the number of hepatocytes, in pigmented areas and in pigmented surface area and a decrease in height of the bile duct epithelial cells. In hepatocytes, decrease in glycogen and lipid content and increase in protein content were observed. Fibrosis and eosinophilic hepatocytes and decrease in protein and height of the bile duct epithelial cells are negative effects of leptin administration depending on  dose/duration. While one-day leptin injection suppressed the leptin in hepatocytes, it caused an increase in leptin receptor. On the other hand, five-day leptin injection suppressed the leptin in hepatocytes less than it was in one-day leptin injection, and caused a decrease in leptin receptor. Additionally, while leptin administration supressed the leptin in bile duct epithelial cell, it caused an increase in leptin receptor.
As a result, detecting the wide presence of leptin in the liver of adult Pelophylax ridibundus shows that this organ could be an important place for leptin synthesis in Anura amphibians. Leptin has significant proliferative effect through its receptor on hepatocytes and melanomacrophages. Moreover, it regulates carbohydrate, lipid and protein metabolism in hepatocytes. We think that these effects on frog liver of leptin migth be for regulating integrity and function of tissue.