Hücre tabakası mühendisliğinde kalınlık ve vaskülerizasyon problemlerine yönelik stratejilerin geliştirilmesi
Development of strategies towards thickness and vascularization problems in cell sheet engineering
Yazar: ATAKAN TEVLEK
Danışman: DOÇ. DR. HALİL MURAT AYDIN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Doku mühendisliği çalışmaları kapsamında bugüne kadar çeşitli dokuları onarmak ve yenilemek amaçlı çeşitli biyomalzemeler, hücreler ve biyosinyal molekülleri tek başlarına veya birlikte kullanılarak doku mühendisliği ürünü yapıların eldesine odaklanılmıştır. Hücresel terapilerle başlayan doku mühendisliği yolculuğu doku iskelesi temelli yaklaşımlarla büyük bir yol kat etmiş ancak hazırlanan bu üç boyutlu dokularda, hücre canlılığı için temel gereksinim olan çeşitli gaz ve besin maddelerinin taşınımı ve metabolik atıkların uzaklaştırılması sağlanamamıştır. Araştırmacılar bu bağlamda çeşitli biyoreaktörlerin tasarımı ve üç boyutlu biyofabrikasyon yöntemleri ile difüzyon sınırlamalarını ortadan kaldıracak tasarımlara yönelmiş ve elde edilen yapılarda çeşitli teknikler ile kütle aktarımını sağlayacak vasküler ağ yapısını oluşturmayı hedeflemişlerdir.

Sunulan bu tez çalışması kapsamında da çeşitli doku hasarlarında kullanılmak üzere üç boyutlu biyofabrikasyon yöntemlerinden biri olan hücre tabaka mühendisliği ile çok katmanlı doku eşleniklerinin üretilmesi ve vaskülerize edilmesi amaçlanmıştır. Öncelikle MC3T3-E1 fare osteoblast öncülü hücreler, büyüme ortamı ve osteojenik ortam varlığında sıcaklık duyarlı kültür kaplarında (Nunc Upcell) ayrı ayrı kültürlenmiş ve hücre tabakası oluşturma potansiyelleri incelenmiştir. Bu aşamada MC3T3-E1 hücrelerinden oluşan sağlam, başka bir yüzeye transfer edilebilir ve pratik olarak elde edilebilir bir hücre tabakası eldesi literatürde ilk defa önerilmiştir. Hücre tabakaları eldesi sürecinde mikroskobik ve makroskobik görüntüleme, kollajen ve sülfatlanmış glikozaminoglikan (sGAG) miktarı tayini, osteojenik genlerin ifade düzeylerinin belirlenmesi, Alizarin Kırmızısı ile mineralizasyon sürecinin incelenmesi ve kalsiyum miktarı tayini çalışmaları yürütülmüş ve elde edilen bulgularla osteojenik ortamın üstünlüğü ortaya konulmuştur.

Tez çalışmasının bir sonraki aşamasında osteojenik ortam uygulaması ile elde edilen hücre tabakaları üst üste lamine edilerek doku kalınlıkları artırılmaya çalışılmıştır. Bu aşamada, doku kalınlığını artırmaya yönelik ayrı bir yöntem olarak yine tez çalışması kapsamında üretilmiş, elektroeğirilmiş poli(L-laktik asit) (PLLA) membranlar kullanılmış ve nihai yapıların elde edilme süreci mikroskobik ve makroskobik bulgularla aydınlatılmıştır. Ardından PLLA membran kullanılarak elde edilen ve doğrudan hücre tabakalarının üst üste lamine edilmesiyle elde edilmiş çok katmanlı hücre tabakalarının in vitro etkinlikleri araştırılmıştır. Bu bağlamda, elde edilen nihai yapılarda öncelikle hücre canlılıkları ve hücre ölümü mikroskobik ve kolorimetrik yöntemlerle araştırılmıştır. Ardından, bir PLLA membranın üzerine iki hücre tabakasının lamine edilmesiyle oluşturulan ve toplam 3 PLLA membran ve 4 hücre tabakası içeren çok katmanlı yapıların kültür süresince sergilediği üstün sağ kalım ortaya konulmuştur. Böylece sunulan bu tez çalışması kapsamında doku mühendisliği ürünü, hücre-biyomalzeme kombinasyonunun sağlandığı, çok katmanlı, ıslak hali yaklaşık 1 mm olan, pratik bir şekilde transfer edilebilen, hücrece zengin ve hücrelerin kendi ECM'ini beraberinde taşıdığı üç boyutlu doku eşleniği yapılar üretilmiştir. Elde edilen bu yapılarda ayrıca kültür süresince alkalen fosfataz aktivitesi, kollajen, sGAG sentezine ilişkin karakterizasyonlar gerçekleştirilmiştir.

Tez çalışmasının son kısmında ise bir önceki aşamada elde edilen nihai yapılarda ilerleyen süreçlerde vasküler ağ oluşumunu teşvik edecek endotel hücresi kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla yine bu tez çalışması kapsamında yüzeyi kanal ile desenlenmiş poli(gliserol sebakat) PGS elastomerler geliştirilmiş, karakterize edilmiş ve endotel hücresi kültürasyonu için ideal kültür şartlarının belirlenmesine yönelik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. PGS elastomerlerinin kanallarında 14 gün süreyle endotelyal besi ortamı (EGM-2) ile kültüre edilen HUVEC hücrelerinin poligon biçiminde tübüler organizasyon sergilediği gözlemlenmiş ve anjiyogenezis sürecinin başladığı düşünülmüştür.

Tez çalışması kapsamında geliştirilen yaklaşımların kraniyofasiyal kemik doku rejenerasyonu için kullanılabilirliği önerilmiş ve ileride osteokondral, kornea veya damar gibi ikili veya daha fazla mikroçevre içeren doku mühendisliği uygulamaları için de potansiyel teşkil edebileceği düşünülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Hücre Tabaka Mühendisliği, Çok Katmanlı Doku Eşlenikleri, Doku Kalınlığı Limitasyonu, Vaskülerizasyon.

Abstract:
In the context of tissue engineering studies, various biomaterials, cells and biosignal molecules have been used to repair and replace diverse tissues either alone or in combination, namely to produce tissue-engineered constructs. Although the tissue engineering journey, which started with cellular therapies, has gone a long way with scaffold-based approaches, the transport of various gases and nutrients that is the basic requirements for cell viability and the removal of metabolic wastes have not been achieved. In this context, the researchers aimed to design the various bioreactors and the three-dimensional biofabrication methods to eliminate the diffusion constraints and to create a vascular network that will provide mass transfer with various techniques in the obtained structures.

Within the scope of this thesis studies, it was aimed to produce and vascularize multilayered tissue conjugates by cell sheet engineering which is one of the three dimensional biofabrication methods to be used in various tissue damages. Primarily, MC3T3-E1 mouse pre-osteoblast cells were cultured separately in the temperature responsive culture dishes (Nunc Upcell) in the presence of growth medium and osteogenic medium seperately, and the effect of the culture conditions on cell sheet forming potentials were examined. At this stage, an intact, easily transferable, practically obtainable cell sheets composed of MC3T3-E1 cells and their extracellular matrix were prepared for the first time in the literature. The obtained cell sheets were analysed by different techniques such as microscopic and macroscopic imaging, quantification of the amount of collagen and sulfated glycosaminoglycan (sGAG), determination of the levels of expression of osteogenic genes, investigation of the mineralization process and the calcium content. The results obtained were revealed the superiority of the osteogenic environment on obtaining cell sheets.

At the next stage of the thesis study, the thickness of the tissue was increased by laminating the cell sheets obtained by the application of osteogenic medium. At this stage, electrospun poly (L-lactic acid) (PLLA) membranes, which were produced within the scope of the thesis study, were used as a separate method to increase the thickness of the tissue constructs. The process of obtaining final structures was illuminated by various microscopic and macroscopic findings. Later, the in vitro activity of multilayered cell sheets constructed by laminating the cell sheets with PLLA membranes was investigated. In this context, the cell viability and the cell death were investigated by several microscopic and colorimetric methods. Here, the superior survival rate of multilayered structures formed by laminating two cell sheets onto one PLLA membrane and containing a total of 3 PLLA membranes and 4 cell sheets was demonstrated during culture. Thus, within the scope of this thesis study, three-dimensional tissue conjugate structures consisting of cell-biomaterial combinations, which can be transferred in a practical manner, are multi-layered and have a wet state of about 1 mm, are provided. In these structures, the characterization of alkaline phosphatase activity, collagen and sGAG synthesis was carried out during the culture period.

The approaches developed within the scope of this thesis study was suggested to be able to restore craniofacial bone tissue regeneration and it was thought to be potential for tissue engineering applications involving dual or more microenvironment such as osteochondral, cornea or vessel.

Keywords: Cell Sheet Engineering, Multi-layered Tissue Conjugates, Thickness Limitation, Vascularization.