Klinik pseudomonas aeroginosa izolatlarının antibiyotik direncinde resistance nodulation division (RND) dışa atım pompası etkinliğinin araştırılması
Nvestigation of the effectiveness of resistance nodulation division (RND) extraction PUMP on antibiotic resistance of clinical pseudomonas aeruginosa isolates
Yazar: MUHAMMED FURKAN KÜRKÇÜ
Danışman: DOÇ. DR. TUĞRUL HOŞBUL
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Gülhane Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı /  Tıbbi Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Karbapenemler = Carbapenems ; Membran proteinleri = Membrane proteins ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Pseudomonas aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Dışa atım pompaları, dış membran porin geçirgenliğinin azalması ve karbapenemaz üretimi Pseudomonas aeruginosa'da antibiyotik direnci gelişiminde önemli mekanizmalardandır. Çalışmamızda Resistance Nodulation Division (RND) dışa atım pompalarının, OprD dış membran porin proteininin ve karbapenemaz üretiminin direnç gelişimindeki etkinliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
 Çalışmamıza 50 karbapenem duyarlı ve 30 dirençli P. aeruginosa izolatı dahil edildi. İzolatların tanımlanması MALDI-TOF MS (Brucker Daltonics, Almanya) ile yapıldı ve duyarlılık sonuçları VITEK® 2 (Biomerieux, Fransa) ile EUCAST kriterlerine göre belirlendi. Dışa atım pompalarının düzenleyici genleri olan MexB, MexC, MexE ve MexX ile OprD dış membran proteininin ekspresyon düzeyleri belirlendi ve çeşitli antibiyotiklere duyarlı ve dirençli izolatlar arasındaki ekspresyon düzeyleri gerçek zamanlı kantitatif revers transkriptaz PCR (RT-qPCR) yöntemi ile saptandı ve karşılaştırıldı. Karbapenem dirençli izolatlarda bla KPC, bla NDM, bla OXA-48, bla IMP, ve bla VIM varlığı PCR ile araştırıldı. (Çalışmada kullanılan primerler tablo 1 ve 2'de sunulmuştur) İzolatlar arasındaki klonal ilişki M13 primerinin kullanıldığı Arbitrarily Primed Polimerize Zincir Reaksiyonu (AP-PCR) yöntemi araştırıldı. Çalışmamızda izolatların 50 tanesi (% 62,5) karbapenem dirençli, 30 tanesi (% 37,5) karbapenem duyarlı idi. Karbapenemlere dirençli 50 izolatın %74'ünde OprD ekspresyon düzeyinde azalma saptandı (p=0014). Karbapenem dirençli izolatların %82'sinde MexB, aşırı ekspresyonu tespit edildi ve bu artış istatistiksel olarak anlamlı düzeyde bulundu (p<0,01). (Tablo 3) Amikasin ve gentamisine dirençli izolatlar ile duyarlı izolatlar karşılaştırıldığında yalnızca MexX aşırı ekspresyonunda anlamlı fark saptanırken. MexX aşırı ekspresyonu amikasin dirençli izolatların %68'inde, gentamisin dirençlilerin ise %64,3'ünde saptandı (p=0,020, p=0,041). Çok ilaca direnç gözlenen izolatların %76,6'sında MexB, %61,7'sinde de MexX genlerinde aşırı ekspresyon saptandı. MexB ve MexX aşırı ekspresyonu çok ilaca dirençli grupta istatistiksel olarak anlamlı düzeydeydi (p=0,04; p=0,05).Karbapenem dirençli izolatlarda çalışmada araştırılan karbapenemaz direnç genleri saptanmadı. AP-PCR ile izolatlar 64 farklı genotipte gruplandırıldı. Çalışmamızda karbapenemlere direnç gelişiminde MexB aşırı ekspresyonu ve OprD geçirgenliğinde azalmanın etkili olduğu; MexX aşırı ekspresyonunun aminoglikozid direnci; MexAB-OprM ve MexXY dışa atım pompalarının aşırı aktivasyonunun ise çok ilaca direnç gelişiminde etkili olduğu gösterilmiştir.

Abstract:
Excretion pumps, decreased outer membrane porin permeability and carbapenemase production are important mechanisms in the development of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa. In our study, it was aimed to determine the effectiveness of Resistance Nodulation Division (RND) efflux pumps, OprD outer membrane porin protein and carbapenemase production in the development of resistance.
 50 carbapenem-susceptible and 30 resistant P. aeruginosa isolates were included in our study. Identification of isolates was done with MALDI-TOF MS (Brucker Daltonics, Germany) and susceptibility results were determined according to EUCAST criteria with VITEK® 2 (Biomerieux, France). Expression levels of MexB, MexC, MexE and MexX, and OprD outer membrane protein, which are regulatory genes of efflux pumps, were determined and expression levels between isolates sensitive to and resistant to various antibiotics were determined and compared by real-time quantitative reverse transcriptase PCR (RT-qPCR). The presence of bla KPC, bla NDM, bla OXA-48, bla IMP, and bla VIM in carbapenem resistant isolates was investigated by PCR. (Primers used in the study are presented in Tables 1 and 2) Clonal relationship between isolates Arbitrarily Primed Polymerized Chain Reaction (AP-PCR) method using M13 primer was investigated. In our study, 50 (62.5%) of the isolates were carbapenem resistant and 30 (37.5%) carbapenem sensitive. OprD expression level decreased in 74% of 50 isolates resistant to carbapenems (p=0014). MexB overexpression was detected in 82% of carbapenem resistant isolates, and this increase was found to be statistically significant (p<0.01). (Table 3) When amikacin and gentamicin resistant isolates were compared with susceptible isolates, only MexX overexpression showed a significant difference. MexX overexpression was detected in 68% of amikacin resistant isolates and 64.3% of gentamicin resistant isolates (p=0.020, p=0.041). Overexpression of MexB genes was detected in 76.6% and MexX genes in 61.7% of the isolates with multidrug resistance. Overexpression of MexB and MexX was statistically significant in the multidrug resistant group (p=0.04; p=0.05). Carbapenemase resistance genes investigated in the study were not detected in carbapenem resistant isolates. The isolates were grouped into 64 different genotypes by AP-PCR. In our study, it was found that MexB overexpression and decreased OprD permeability were effective in the development of resistance to carbapenems; aminoglycoside resistance of MexX overexpression; Overactivation of the MexAB-OprM and MexXY efflux pumps has been shown to be effective in the development of multidrug resistance.