Kesikli-biyoreaktör işletim türlerinin terapatik protein üretimine etkilerinin incelenmesi
Influences of batch bioreactor operation modes in therapeutic protein production
Yazar: HANDE AFŞAR
Danışman: PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Araştırmanın amacı, rekombinant Bacillus subtilis ile rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH) üretiminde, rhGH üretimini verimliliği düşürmeden arttırmak için yarıkesikli-biyoreaktör işletim parametrelerinin belirlenmesi ve araştırılmasıdır. Rekombinant-plasmid pMK4::pre(subC)::hGH taşıyan B.subtilis ile hücre-dışı rhGH üretimi için kesikli-biyoreaktör proses bulguları değerlendirilerek, üretim ortamının belirlenen bileşiklerinin sürekli-beslenmesiyle yarıkesikli-biyoreaktör sistemi tasarımı için parametreler belirlenmiştir. Üretim ortamındaki üç girdi-bileşeninin (glukoz, NH4+, ve HPO4-2) sürekli beslenerek yarıkesikli-işletimle verimin arttırılabileceği öngörülmüştür. Kesikli-işletimden yarıkesikli-işletime geçiş-kalma-süresi tG'nin belirlenmesi için, üretim-bölgesinde uygun bir spesifik-çoğalma hızı  (μ0=0.100 st-1) belirlenerek,, farklı yarıkesikli-biyoreaktör işletimi geçiş-kalma-sürelerinde (tG) hücre- ve substrat- için  kütle-korunum denklemlerinden ön-hesaplanan QO(t) debi değişim eğrilerine uygun sürekli-besleme yapılarak, tasarlanan koşullarda, pilot-ölçek biyoreaktör deneyleri yapılmıştır. Yarıkesikli-işletime geçiş-kalma-süresi bulunduktan sonra, ürün verimini arttırmak için kullanılan μ0  değerlerinin üstündeki  (μ0> 0.100 st-1) değerler için hesaplanan QO(t) değerlerinde ikinci-grup deneyler yaparak, μ0  için proses üretim-bölgesi üst-sınırı ve rhGH üretimini maksimum yapan μ0Max değeri bulunmuştur. rhGH üretimi için yarıkesikli-biyoreaktör işletim-stratejisi tasarımında, kesikli-işletimden yarıkesikli-işletime geçiş-kalma-süresi tG = 4 st'ta  μ0Max=0.125 st-1 değerinde QO(t) üstel besleme stratejisiyle, CrhGH=127 mg dm-3'e ulaşılmıştır. Yarıkesikli-işletim stratejisiyle ulaşılan üretim verimi aynı başlangıç biyoreaktör işletim koşullarında kesikli-biyoreaktör işletimiyle ulaşılan değerden %36 daha fazladır; ve proses süresi 8 st kısalarak ürün verimliliği de arttırılmıştır. Üretim ortamında glukoz, hücre, rhGH, organik asit ve amino asit derişimlerinin kalma süresi t ile değişimleri; ve, Dinamik-Yöntemle sıvı-faz hacımsal kütle-aktarım katsayısı KLa ve hacımsal oksijen-tüketim hızı –rO'ın kalma süresi ile değişimleri, sırasıyla,  ölçülmüş ve hesaplanmıştır. Rekombinant B.subtilis hücreiçi reaksiyon akıları, araştırma grubumuzda geliştirilen genom-seviye matematik model ile, deneysel veriler  kullanılarak hesaplanmış; sonuçlar değerlendirilmiştir.

Abstract:
The aim of this thesis-research is to determine and investigate design parameters for semibatch-bioreactor operation for heterologous-recombinant protein production by Bacillus subtilis, e.g., recombinant-human-growth-hormone (rhGH) production, for increasing production without decreasing productivity. Based on findings of batch bioprocess for rhGH production by B. subtilis carrying pMK4::pre(subC)::hGH, parameters to design semibatch-bioreactor system were determined based on continuous-feeding of components of production-medium. Three components of defined medium, i.e., glucose, NH4+, and HPO4-2,  were predicted to feed continuously to increase the rhGH production together with fine-tuning bioreactor performance by keeping the productivity high. To determine the transition-residence-time tT  indicating the time to shift batch-operation to semibatch, based on  a  specific-growth rate within the production region, i.e., μ0=0.100 h-1, using pre-calculated QO(t) flow-rate profiles of inlet-feed-stream by the mass-balance equations for the components B. subtilis- and glucose,  a group of semibatch pilot-scale bioreactor experiments were conducted. After the determination of tT, using  μ0  values higher than the specific-growth rate value used in first program, next  group of semibatch experiments were conducted using pre-calculated QO(t) flow-rate profiles, the upper-limit of high production-region was found by determining μ0Max. The first-parameter semibatch-transition-residence-time was determined as tT=4 h, and the second-parameter was determined as μ0Max=0.125 h-1 by a dynamic pre-calculated QO(t) exponential volumetric-feed-rate, which enabled a rhGH concentration of CrhGH=127 mg/dm3, with a 36% higher yield than that of the batch-operation, and the productivity of the process increased, as the residence-time shortened 8h. The concentrations of glucose, cell, rhGH, amino and organic acids; and using  Dynamic Method liquid-phase mass-transfer-coefficient KLa, and oxygen-consumption-rate –rO were, respectively, measured and calculated throughout the experiments. Using the genom-scale-model intracellular flux distributions in r-Bacillus subtilis were calculated.