Kekik (Thymus vulgaris L.) bitkisinin in vitro doku kültürü yöntemleriyle mikroçoğaltımı ve tek aşamalı dondurma yöntemleriyle kriyoprezervasyonu
Micropropagation of thyme (Thymus vulgaris L.) and its cryopreservation by one-step freezing techniques
Yazar: ERGUN KAYA
Danışman: PROF. DR. TAMER YAĞCI
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Büyüme düzenleyici maddeler = Growth regulator matters ; Doku kültürü = Tissue culture ; Kekik = Thyme ; Mikroçoğaltma = Micropropagation ; Moleküler markerler = Molecular markers

Özet:
Üç farklı Thymus türüne ait (T. vulgaris, T. longicaulis, T. cariensis) bitkilerinden alınan eksplantların mikroçoğaltımı için etkin bir protokol geliştirildi. İn vitro sürgün gelişimi için farklı derişimlerde çeşitli sitokininler (6-benziladenin, kinetin, thidiazuron) denendi, en elverişli bulunan sitokinin çeşidi ve derişimi daha sonra oksinler ve/veya gibberelik asit ve gümüş nitrat ile kombine edilerek kullanıldı. En iyi sonuç 1 mg l-1 kinetin ve 0,3 mg l-1 gibberellik asit içeren yarı-katı MS besiyerinde elde edildi. Gövdelerin köklendirilmesi, yeterli uzunluğa ulaşan gövdelerin bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen veya çeşitli derişimlerde oksinleri içeren (2,4-diklorofenoksiasetik asit, indol asetik asit, indol butirik asit, naftalen asetik asit) yarı-katı MS besiyerlerine transfer edilmesi yoluyla gerçekleştiridi. Köklenmenin en uygun olduğu besiyeri kompozisyonu 0.05 mg l?1 2,4-diklorofenoksiasetik asit içeren yarı-katı MS besiyeri olarak belirlendi. Köklenmenin ardından bitkicikler 250 ml plastik saksılara aktarılıp periyodik olarak havalandırılarak başarılı bir şekilde iklimlendirildi. Ayrıca, optimize edilen in vitro çoğaltım yönteminin, bitkilerin genetik kararlılığı üzerine etkilerinin araştırılması amacıyla, tek bir tohumun çimlendirilmesiyle elde edilen fideden alınan yaprak örnekleri ile bu fideden alınan gövde uçlarının çoğaltılması yoluyla elde edilen bitkiciklerden 2., 4., 6., 8. ve 10. alt kültür periyotlarını takiben alınan yaprak örneklerinden genomik DNA' lar izole edildi ve RAPD-PCR (Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA) tekniği ile olası genetik değişiklikler incelendi.Orta dereceli saklama yönteminin geliştirilmesi amacıyla, optimize edilen yöntemle in vitro olarak çoğaltılan T. vulgaris gövde kültürleri 4°C' ta, karanlıkta tutuldu ve bu şekilde kültürlerin periyodik transferlere gerek duyulmadan 12 ay boyunca saklanması başarıldı. Germplazm'ın kriyoprezervasyon yoluyla uzun süreli saklanması amacıyla ise, vitrifikasyon temelli, üç farklı tek aşamalı dondurma tekniği (PVS2 vitrifikasyon, enkapsülasyon vitrifikasyon ve damlacık dondurma), T. vulgaris gövde uçları üzerinde denendi. Ayrıca, genellikle sıvı azota aktarımdan önce, örneklerin soğuk toleranslarının arttırılması amacıyla uygulanan soğuğa alıştırma ve sukroz ön kültür aşamaları da optimize edildi. Buna göre, sıvı azotta saklama sonrası en yüksek bitki rejenerasyon oranı (%80), 2 hafta boyunca soğuğa alıştırılan ve 48 saat boyunca 0.25M sukroz içeren yarı-katı MS besiyerinde ön kültürlenen gövde uçlarının damlacık dondurma tekniği ile 90 dakika boyunca PVS2 ile muamelesi sonucu elde edildi.Kriyoprezervasyon yönteminin optimizasyonunu takiben, T. cariensis gövde uçları da damlacık dondurma tekniği kullanılarak başarılı bir şekilde kriyoprezerve edildi. Buna göre, soğuğa alıştırma (4ºC' ta 2 hafta) ve sukroz ön kültürünün (0,25M sukroz içeren yarı-katı MS besiyeri) ardından, gövde ucu eksplantları PVS2 ile 0ºC ta 15-120 dakika muamele edilip sıvı azota daldırıldı. T. vulgaris' e benzer şekilde, T. cariensis' te de en yüksek bitki rejenerasyonu (%20 canlılık ve %18 rejenerasyon) 90 dakika PVS2 uygulaması ile kriyoprezerve edilen gövde ucu eksplantlarından elde edildi.

Abstract:
An effective protocol was develped for in vitro propagation of young and mature explants of three botanically distant Thymus species, i.e., T. vulgaris, T. longicaulis, and T. cariensis. Optimizations for in vitro shoot proliferation included use of different concentrations of cytokinins (6-benzyladenine, kinetin and thidiazuron), followed by the use of selected cytokinin type and concentration in combination with auxins and/or gibberellic acid and silver nitrate. Best shoot proliferation was obtained when semi-solid MS medium was supplemented with 1 mg l-1 kinetin and 0,3 mg l-1 gibberellic acid. Rooting of the shoots was obtained on semi-solid MS medium that was either hormone-free or supplemented with auxins. However, the best root apparatus developed on MS medium supplemented with 0.05 mg L?1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Following rooting, the plantlets were transferred to 250-mL plastic pots and successfully acclimatized by gradually reducing the relative humidity. In addition to in vitro propagation, the effect of optimized protocol on genetic fidelity of the obtained plantlets was also investigated by isolating genomic DNAs of both the mother plant (seedling developed by germination of a seed), as well as the shoots (developed by culturing in vitro the shoot tips of the mother plant) that underwent two, four, six, eight, or ten cycles of in vitro subculturing were isolated and genetic stability was confirmed by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis.Slow growth storage was achieved by keeping the in vitro shoot cultures of T. vulgaris, obtained according to the optimized protocol of in vitro propagation, at 4°C and in darkness up to 12 months. As for the long-term storage of the germplasm, three different vitrification-based one-step freezing techniques (PVS2 vitrification, encapsulation-vitrification and droplet-freezing) were tested by using T. vulgaris shoot tips. However initially all the preliminary steps of cryoprotection (i.e.,cold- hardening, sucrose preculture) were also optimized. The best cryopreservation procedure for T. vulgaris was achieved with the droplet-vitrification method, based on a 2-week cold hardening of shoot cultures, followed by 48-h preculture of shoot tips on MS medium supplemented with 0.25 M sucrose, and a 90-min PVS2 treatment in droplets. This way, after direct immersion in LN, thawing and plating, 80% shoot-tip recovery rate was obtained.Following optimizations of the protocols, T. cariensis was also successfully cryopreserved using the droplet vitrification method. After cold adaptation (two weeks at +4ºC) and sucrose preculture (MS medium with 0.25M sucrose, 48 hours), shoot tips were dehydrated with PVS2 at 0ºC for 15-120 minute and immersed liquid nitrogen. Best vitality (%20) and regeneration (%18.3) result were obtained when PVS2 was applied at 0ºC for 90 minute.