Klinik Escherichia coli izolatlarında antibiyotik direnç genlerinin araştırılması ve bazı bitki özütlerinin kinolon dirençli izolatlar üzerine etkisinin belirlenmesi
Investigation of antibiotic resistance genes in clinical Escherichia coli isolates and determination of the effect of some plant extracts on quinolon resistant isolates
Yazar: FUNDA OKUMUŞ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AZER ÖZAD DÜZGÜN
Gümüşhane Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) her yıl dünya çapında 150 milyon insanı etkileyen yaygın bakteriyel enfeksiyonlardan biridir ve en yaygın etken, üropatojenik Escherichia coli'dir. 
Bu çalışmada; Kasım 2015-Ağustos 2016 yılları arasında Türkiye'de Rize Eğitim ve Araştırma Hastanesi'nden izole edilen 90 E. coli izolatında β-laktamaz kodlayan genler, virülans faktör genleri, sınıf 1 integronları ve plazmid aracılı kinolon direnç genlerinin varlığı PZR yöntemiyle araştırıldı. PZR sonucu, integron pozitif örnekler pGEM-T vektörüne klonlanarak baz dizin analizine gönderildi. Sonuçlar biyoinformatik programlar kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca kinolon dirençli bakterilere karşı Mentha piperita L. (nane), Rosmarinus officinalis L. (biberiye), Curcuma longa (zerdeçal) , Hypericum perforatum (sarı kantaron), Camellia sinensis (yeşil çay), Alkanna tinctoria (havacıva), Urtica dioica L. (ısırgan otu), Aloe vera L. (sarısabır) , Tilia tomentosa'nın (ıhlamur) bitki özütlerinin, minimum inhibisyon konsantrasyonları (MİK) belirlendi.
Çalışmada kullanılan 90 E. coli izolatı VITEK 2 Kompakt sistem ile tanımlanmıştır. Antibiyotik duyarlılık testi sonuçları, bu izolatların fosfomisin (% 2.7), imipenem (% 3.2) ve meropeneme (%3.2) karşı düşük direnç oranlarına sahip olduğu ortaya koymuştur.  Ancak, siprofloksasin (% 62.2), trimetoprim sülfometaksozol (% 75.6) ve ampisiline (% 61.1) direnç oranlarının yüksek olduğu belirlenmiştir.  
PZR sonuçları, suşların % 63'ünün (57/90) sınıf 1 integron gen kasetlerini taşıdığını ortaya koymuştur ve  baz dizin analize göre sınıf 1 integronun dhfr gen kaseti taşıdığı belirlendi.  CTX-M-2 grubu β-laktamaz taşıyan 52 izolat (% 57) ve CTX-M-1 grubu β-laktamaz taşıyan 52 izolat (% 57) tespit edildi.  Ayrıca plazmit aracılı kinolon direç genleri PZR ile belirlendi ve sonuçta suşların, % 26'sının (24/90) qnrA, % 6.6'sının (6/90) qnrB ve % 3.3'ünün (3/90) qnrS geni taşıdığı tespit edildi. 90 E. coli izolatı arasında 11 farklı virülans faktör paterni tespit edildi. En yaygın virülans gen faktörü olarak fim (35 izolatta) belirlenirken, hly-fim, afa-aer-cnf-fim, aer-cnf, afa-aer ve afa-cnf-fim paternleri daha az sayıda suşta  görüldü. İzolatların 14'ünde virülans gen faktörü saptanmadı. 
Çalışmada kullanılan bitki özütlerinin, MİK değerlerinin belirlenmesi sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile yapıldı. Deneyler 96 well-plate kullanılarak üç tekrarlı halinde gerçekleştirildi. Yapılan çalışmalar sonucunda; en yüksek antibakteriyel aktiviteyi Alkanna tinctoria özütü göstermiş olup MİK değerleri EC58 ve EC85 için 1.25 mg/ml, EC50 ve EC90 için ise MİK değeri 2.5 mg/ml olarak tespit edildi.

Abstract:
Urinary tract infections (UTIs) are one of the most common bacterial infections affecting 150 million people worldwide each year, and the most common cause is uropathogenic Escherichia coli.
In this study; the presence of β-lactamase encoding genes, virulence factor genes, class 1 integrons and plasmid-mediated quinolone resistance genes in 90 E. coli strains isolated from Turkey Rize Training and Research Hospital, Between November 2015-August 2016, were investigated by PCR. PCR result, integron positive samples were cloned into pGEM-T vector and sent to base sequence analysis. Results were evaluated using bioinformatics programs. The minimum inhibition concentrations (MIC) of the plant extracts of Mentha piperita L. (mint), Rosmarinus officinalis L. (rosemary), Curcuma longa (turmeric), Hypericum perforatum (yellow centaury), Camellia sinensis (green tea), Alkanna tinctoria (alkanet), Urtica dioica L. (nettle), Aloe vera L. (aloe vera), Tilia tomentosa (linden) were determined.
The 90 E. coli isolates used in the study were identified by VITEK 2 Compact system. Antibiotic susceptibility test results showed that these isolates had low resistance rates for phosphomycin (2.7%), imipenem (3.2%) and meropenem (3.2%). However, resistance rates of ciprofloxacin (62.2%), trimethoprim sulfomethoxosol (75.6%) and ampicillin (61.1%) were found to be high.
PCR results showed that 63% (57/90) of the strains carried class 1 integron gene cassettes and it was determined that class 1 integron carried dhfr gene cassette according to base sequence analysis. 52 strains (57%) carrying β-lactamase in CTX-M-2 group and 52 isolates carrying β-lactamase in CTX-M-1 group were detected. Plasmid-mediated quinolone resistance genes were also detected by PCR and the strains were found to carry 26% (24/90) qnrA, 6.6% (6/90) qnrB and 3.3% (3/90) qnrS genes. Eleven different virulence factor patterns were detected among 90 E. coli isolates. Fim (35 isolates) was identified as the most common virulence gene factor, while hly-fim, afa-aer-cnf-fim, aer-cnf, afa-aer and afa-cnf-fim patterns were observed in fewer strains. No virulence gene factor was detected in 14 of the isolates.
The determination of MIC values of the plant extracts used in the study was performed by liquid microdilution method. The experiments were performed in three replications using 96 well-plates. As a result of the studies, Alkanna tinctoria extract showed the highest antibacterial activity and MIC values were found to be 1.25 mg / ml for EC58 and EC85 and MIC value of 2.5 mg / ml for EC50 and EC90.