Anne sütü ve yenidoğan bağırsak florasının moleküler yöntemler ile tespiti
Determination of intestinal flora of newborn and breast milk using molecular methods
Yazar: GÜL GÜNER NAR
Danışman: PROF. DR. MÜNEVVER KAYNAK TÜRKMEN
Adnan Menderes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Anne sütü = Milk-human ; Bağırsaklar = Intestines ; Bebek-yenidoğmuş = Infant-newborn ; Bebek-yenidoğmuş hastalıkları = Infant-newborn diseases ; Mikroflora = Microflora ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; RNA = RNA

Özet:
Doğum öncesinde fetusun çeşitli yollardan kolonize olabileceği ve doğumdan hemen sonra mikroorganizmalar ile temas ederek florasını oluşturduğu bilinmektedir. Beslenme, doğum şekli, hospitalizasyon, prematürite, antibiyotik alımı ve gelişmişlik düzeyinin intestinal floraya etkisi birçok çalışmada araştırılmıştır.Floradaki bakterilerin %60-80'nin kültürü yapılamayan bakteriler olması nedeniyle günümüzde araştırmacılar moleküler genetik metodları tercih etmektedir. En sık kullanılan yöntemler FISH, 16S rRNA, DGGE ve TGGE'dir. 16S rRNA amplifikasyon ve klonlama sonrası sekans analizi diğer yöntemler ile kıyaslandığında sonuç verimliliği açısından daha avantajlıdır.Çalışmadaki amacımız; hasta ve sağlıklı term yenidoğanların gayta ve anne sütü bakteri dağılımının moleküler yöntemler ile tespit edilerek anne sütü ve çevresel etkenlerle yenidoğan bağırsak florasında ilk haftada oluşan kolonizasyon değişikliklerinin belirlenmesidir.Çalışmaya 10 yenidoğan- anne çifti dahil edildi ve her yenidoğandan doğumunun 1, 3, 7.günlerinde gayta, annelerinden de 7.günde anne sütü alındı. Toplam 30 gayta ve 10 anne sütü örneğine 16S rRNA amplifikasyon ve klonlama sonrasında sekans analizi uygulandı ve analiz sonrasında mikroorganizma tiplendirilmesi yapıldı.Anne sütlerinden DNA ekstraksiyonu için iki ayrı yöntem kullanılmasına rağmen ekstraksiyon gerçekleşmedi. Sütlerde bakteri olmaması ihtimali açısından nonspesifik besiyerlerine direkt kültür ekimi yapıldı ve az miktarda koloniye rastlandı.Tanımlanan mikroorganizmalar örnek alım günleri, olguların doğum şekli, beslenme durumu, antibiyotik kullanımı, yoğun bakım veya anne yanında izlemi, gelişmişlik düzeyi ve bakterilerin oksijen kullanımları açısından değerlendirildi.Yenidoğanda bakteri yoğunluğunun doğum sonrası 24. saatte başladığı ve günler ilerledikçe bakteri sayı ve çeşitliliğinin arttığı görüldü. En sık rastlanılan cins Streptococcus (%26), en sık rastlanılan bakteri türü Escherichia coli (%15,4) idi. Çalışmamızdaki hiçbir örnekte Bifidobacter cinsine ait bakteri tespit edilmedi. Asemptomatik olgularda Salmonella, Shigella ve Clostridium cinsi bakteriler özellikle 3 ve 7.günlerde tespit edildi.Vajinal yol ile doğan olgularda en sık Bacteroides; sezaryen ile doğan olgularda en sık Streptococcus tespit edildi. Sezaryen ile doğan olgularda kommensal bir bakteri olan Bacteroides'e rastlanmadı.Anne sütü alan olgularda yedinci günde oluşan heterojen mikroflorada Clostridium, E. coli, Veillonella ve Lactobacillus tespit edildi.Yenidoğan yoğun bakım ünitesinde yatışın ilk hafta florasının içeriğinde azalmaya neden olduğu tespit edildi. Bu olgularda mikroorganizma çeşitliliği de daha azdı.Erken dönemde alınan antibiyotiklerin ilk hafta kolonizasyonunu özellikle 1 ve 3.günde azalttığı saptandı.Anneleri şehir dışında yaşayan olgularda anaerobik ve kapsamlı flora erken dönemde oluştu.Sonuç olarak çalışmamızda yenidoğan bağırsak florasında ilk haftadan itibaren yoğun bakteri kolonizasyonu olduğu, bu bakterilerin çeşitliliğinin sıklıkla beslenme, hastaneye yatış ve antibiyotik kullanımından etkilendiği tespit edilmiştir. Tanımlayıcı nitelikteki bu çalışmanın ilerleyen dönemlerde yapılacak mikroflora araştırmalarında yol gösterici olacağı kanısına varılmıştır.Anahtar kelimeler: 16S rRNA, intestinal mikroflora, yenidoğan, anne sütü

Abstract:
It is well known that the fetus can be colonized in contact with the microorganisms after but also before delivery by many ways. Several studies were done that show many factors may affect intestinal flora including of feeding type, mode of delivery, hospitalization, prematurity, administration of antibiotics and the level of development of country.A total of 60-80% of intestinal bacteria consist of uncultured bacteria for which reason the investigators prefer molecular methods to analyze the intestinal flora. The most used methods by the investigators are FISH, 16S rRNA, DGGE, TGGE analysis and sequences after cloning that have advantages compared to cultural methods.The aim of this study was to analyze the fecal flora of newborn and breast milk flora of their mothers by molecular techniques and determine the dynamics of intestinal bacterial flora during the first week of life.Ten baby-mother pairs were recruited for the present study. Fecal samples were collected at 1, 3, 7. days and breast milk samples were collected at 7. days after delivery. Thirty fecal and 10 milk samples were analyzed by 16S rRNA amplification and cloning. After analysis of sequencing results the bacterial flora was determined.Although two distinct methods were used to extract DNA from breast milk. No 16S rRNA were amplified. Culture analysis of breastmilk showed very low quantity of colonies.The bacteria defined by molecular method were classified by delivery mode, feeding type, antibiotic use, place of nursery (NICU or mother), life style, and oxygen use and analysed.The results showed that the colonization started immediately after birth. The number and diversity of microorganisms increased day by day during the study. For all days that samples were taken, the most detectable genus was Streptococcus (%26), the most detectable species was Escherichia coli (%15,4).None of the samples was positive for Bifidobacteia. Pathogen bacteria like Salmonella, Shigella and Clostridium were positive in 10 % of the feces samples of asymptomatic babies, especially at third and seventh days after birth.The most common bacteria were Bacteroides among vaginally delivered babies and Streptococcus among delivered by cesarean section. None of the fecal samples from cesarean section babies was positive for Bacteroides.The breastfed babies had an heterogeneous intestinal flora at the seventh day of life which include Clostridium, E. coli, Veillonella and Lactobacillus.Our study showed that stay at newborn intensive care unit at first week of life causes decrease in intestinal flora as well as the diversity of intestinal flora.The colonisation of intestin at first week of life affected by antibiotic use especially at first and third day samples.Our study indicated differences between intestinal flora of the babies of mothers who lives in countryside and cities; babies from countryside and low income had anaerobic heterogen flora than babies from city and high income.We conclude that intestine of newborn is colonized intensively at the first week of the life. The diversity of bacterial flora is affected by alimentation type, stay at hospital, and use of antibiotics. Our study which defined establishment of intestinal flora during first week of life will be a base for further studies on intestinal flora.Key words: 16S rRNA, intestinal microflora, newborn, breast milk