Microsporum canis ve trichophyton mentagrophytes teşhisine yönelik lamp kiti geliştirilmesi
Development of lamp technique for diagnosis M.canis and T.mentagrophytes
Yazar: GÜLTEKİN ÜNAL
Danışman: DOÇ. DR. HAMİT KAAN MÜŞTAK
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu tez çalışmasında hayvanlardan en çok izole edilen dermatofit etkenleri olan
M.canis ve T.mentagrophytes'in, klinik örneklerden hızlı teşhisine yönelik bir LAMP
yönteminin geliştirilmesi ve sonrasında geliştirilen bu yöntemin saha şartlarında
uygulanabilirliğinin gösterilmesi hedeflendi. Çalışmada, yöntemde kullanılmak üzere primer
tasarımı için CHS-1 gen bölgesi seçildi. Bu gen bölgesine yönelik tasarlanan primerler ile
süre optimizasyonu yapıldı. Süre optimizasyonundan sonra geliştirilen LAMP yöntemi
referans materyaller ile denendi. Yöntemin özgül ve duyarlı olduğu belirlendi. Tüm
deneylere, çıplak gözle objektif olarak değerlendirmeye olanak sağlayan HNB boyası
eklenerek ve reaksiyon süresi sonunda renk değişimi objektif olarak değerlendirildi. Ankara
Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı'na gönderilen konvansiyonel
mikolojik ekim yöntemi ile teşhisi yapıldıktan sonra kültürlerden izole edilmiş 108 (64
M.canis, 44 T.mentagrophytes) adet DNA ile geliştirilen yöntem denendi. Bu denemeden
sonra LAMP yönteminin saha şartlarında kullanılabilirliğini arttırmak amacıyla geliştirilen
kıl örneklerinden hızlı fungal DNA ekstraksiyonu yöntemi geliştirildi. Ankara Üniversitesi
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı stoklarında bulunan 100 adet kıl örneğiyle bu ekstraksiyon
yönteminin ardından LAMP yöntemi uygulanarak valide edildi. Yapılan validasyon
çalışmalarından elde edilen veriler yardımıyla geliştirilen yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğü
ve tekrarlanabilirliği hesaplandı.

Yapılan çalışmalar sonucunda geliştirilen yöntemin kıl örneklerinden tespit limiti
M.canis için 100 spor/ml, T.mentagrophytes için 100 spor/ml, kültür örneklerinden 10
spor/ml ve 10 spor/ml, DNA örneğinden 0,00048 ng/µl ve 0,00048 ng/µl olarak bulundu.
Geliştirilen yöntem hazır DNA'lara uygulandığında özgüllüğün her iki etken için de %100,
duyarlılığın M.canis için 96,87, T.mentagrophytes için 95,45 bulundu. Paralel olarak
geliştirilen hızlı ekstraksiyon yöntemi ile yapılan çalışmada, özgüllüğün her iki etken için de
%100, duyarlılığın M.canis için 94,73, T.mentagrophytes için 91,66 olduğu belirlendi.

LAMP yöntemi ile konvansiyonel mikolojik yönteminin sonuçları ve bu tez
kapsamında geliştirilen yöntemin sonuçları karşılaştırıldığında elde edilen sonuçlara göre
geliştirilen yöntemin saha şartlarında uygulanabilir olduğu, duyarlılık ve özgüllük
değerlerinin diğer yöntemler ile karşılaştırılabilir olduğu görüldü. Bu tez çalışmasında
dünyada ilk defa 30 dk'da M.canis ve T.mentagrophytes'in teşhis edilebildiği duyarlı ve
özgül bir LAMP yöntemi tasarlanmış oldu. Geliştirilen bu LAMP yönteminin M.canis ve
T.mentagrophytes'in düşük bütçeli laboratuvarlar ve veteriner kliniklerinde hızlı, güvenilir,
doğru bir şekilde teşhis edilebilmesini sağlayacağı ve teşhis ile tedavi arasında geçen sürenin
minimuma indirilmesi sonucunda gereksiz ilaç kullanımının engellenebileceği ve tedavi
başarısının arttırılmasını sağlayacağı sonucuna varıldı.

Abstract:
The aim of this study was to develop a LAMP assay for rapid screening of M. canis
and T. mentagrophytes which are most commonly isolated dermatophyte causative agents
from animals, and to demonstrate the applicability of this assay under field conditions.

The CHS-1 gene region was selected for primers design to be used in the study. The duration
optimization was performed by using primers designed for this gene region. Then, the
developed LAMP assay was tested by using reference materials. The assay was found to be
specific and sensitive.In all trials, the color change was evaluated by adding HNB dye which
allows objective evaluation by the naked eye at the end of the reaction. A total of 108 DNA
(64 M.canis, 44 T.mentagrophytes) were tested after being identified conventionally at the
Microbiology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Ankara University. Then, a rapid
fungal DNA extraction method from hair samples was developed in order to increase the
usability of LAMP assay under field conditions. A total of 100 hair samples were tested by
the developed LAMP assay after being extracted by using the above-mentioned extraction
method.The sensitivity, specificity, and repeatability of the developed assay were calculated
after using the data obtained from validation studies.

As a result, the detection limits of M.canis and T.mentagrophytes were 100 spores/ml and
100 spores/ml in hair samples, 10 spores/ml and 10 spores/ml in culture samples, 0.00048
ng/µl and , 0.00050 ng/µl in DNA samples respectively.When the developed assay was
applied to the previously prepared DNAs of M.canis and T.mentagrophytes, the specificity
was 100% and 100%, the sensitivity was 96.87% and 95.45, respectively.In parallel with the
rapid extraction method developed in the study, the specificity was 100% and 100%, the
sensitivity was 94.73 and 91.66 for M.canis and T.mentagrophytes respectively. The
comparison of the results obtained from the LAMP assay, conventional mycological methods
and the assay developed in this study, revealed that the developed assay was applicable
under field conditions and the sensitivity and specificity values were comparable with other
methods. In this study, a sensitive and specific LAMP assay was developed for the first time
in the world in which M.canis and T.mentagrophytes can be identified in 30 minutes.

In conclusion, the developed LAMP assay could enable M.canis and T.mentagrophytes to be
identified quickly, reliably, accurately in laboratories which lacks for fundings and
veterinary clinics, the unnecessary medication use could be prevented and the treatment
success would be increased as a result of minimizing the time between diagnosis and
treatment.