Biberdeki (Capsicum annuum) karotennoid genlerinin Schizosaccharomyces pombe`de anlatımı
Expression of bell pepper (Capsicum annuum) carotenoid genes in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: TUBA ŞENKAYA GÜNEL
Danışman: PROF. DR. GÜLER TEMİZKAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2004
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
xÖZETBİBERDEKİ (Capsicum annuum) KAROTENOİD GENLERİNİN Schizosaccharomycespombe'de ANLATIMIBu çalışmada, Capsicum annuum (kırmızı biber)'dan izole edilen, karotenoid biyosentezyolunda anahtar enzim olan, geranilgeranil pirofosfat sentaz (GGPPS) enzimini (2.5.1.32)şifreleyen gen, ökaryotlar için uygun model organizma kabul edilen Schizosaccharomycespombe'de klonlandı ve bu yabancı konaktaki heterolog anlatımı analiz edildi. Böylece, doğalolarak karotenoid sentezi yapamayan bu mayanın bu önemli bileşikleri üretebilmesi içinergosterol metabolik yolundan karotenoidlerin sentezine doğru yeni bir yol oluşturulmasıamaçlandı.GGPPS enzimini şifreleyen genin pBluescript II KS (+) vektöründe klonlanmış olan cDNA'sıPCR ile çoğaltılarak S. pombe'ye özgü pART1 ve pREP42 ekspresyon vektörlerinde klonlandı.pART1 ekspresyon vektöründe klonlanmış olan GGPPS geni S. pombe'nin leu1-32 mutantırkına transfer edildi. S. pombe transformantlarında gerçekleştirilen koloni PCR sonucundaGGPPS genini taşıdığı belirlenenler KTG olarak adlandırıldı. Bunlar arasında, KTG1transformantında GGPPS geninin heterolog anlatımı transkripsiyon ve translasyon düzeyindeanaliz edildi. ?Dot? ve Northern melezleme sonuçlarına göre göre GGPPS geninin RNAdüzeyinde anlatım yaptığı belirlendi. Hücrelerden izole edilen suda çözülebilir proteinlerindenatüre edici (SDS-poliakrilamid) jelde elektroforetik analizi sonucunda transformantta konakırkta bulunmayan ~37 kDa'luk ek bir bantın varlığı gözlendi. KTG1 transformantında GGPPSgeninin ürünü olan heterolog proteinin aktif olup olmadığı, aynı metabolik yolun bir başkadalının son ürünü olan ergosterol düzeyindeki değişimle araştırıldı. Transformantdan özütlenenergosterolün spektrofotometrik analizinde 282 nm dalga boyundaki maksimum absorbsiyondeğerinde konak ırka göre istatistik olarak anlamlı bir azalma belirlendi. Daha duyarlı bir teknikolan HPLC ile de KTG1 transformantının ergosterol düzeyinde konak ırka göre %50-60 azalmasaptandı.Çalışmadan elde edilen sonuçlar memeli genlerinin heterolog anlatımı için konak organizmaolarak sıklıkla kullanılan S. pombe'nin bitkisel kaynaklı genlerin anlatımı için de uygunolduğunu gösterdi. Ayrıca, endüstriyel öneme sahip olan karotenoidlerin bu mayada heterologanlatım yoluyla üretimine ilişkin olarak, ilk renksiz karotenoid olan, fitoenin elde edilebileğiyolunda umut verdi.

Abstract:
xiSUMMARYEXPRESSION OF BELL PEPPER (Capsicum annuum) CAROTENOID GENES INSchizosaccharomyces pombeIn this study, the gene encoding geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) from bellpepper (Capsicum annuum) which is a key enzyme in carotenoid biosynthetic pathway has beencloned and its? heterologous expression has been analyzed in Schizosaccharomyces pombe, asuitable model organism for eukaryotes. We aimed to partially direct the ergosterol pathway tocarotenoid biosynthesis in this yeast, which can not naturally synthesize carotenoids.cDNA of GGPPS encoding gene which was cloned in pBluescript II KS (+)vector had beenamplified by PCR and cloned in S. pombe specific pART1 and pREP42 expression vectors.GGPPS gene cloned in pART1 expression vector has been transferred to leu1-32 mutant strainof S. pombe. As a result of colony PCR performed on S. pombe transformants, the ones carryingthe GGPPS gene were named KTG. In KTG1 transformant, heterologous expression of GGPPSgene have been analyzed at the levels of transcription and translation. GGPPS gene was shownto be transcribed by ?Dot? and Northern hybridization. When water soluble proteins isolatedfrom the transformant cells have been analyzed on SDS-denaturating gels, a â¼ 37 kDa notnormally present in the host band has been detected which was not found in the host. In order tounderstand whether the heterologous protein in KTG1 transformant is active or not, changes inergosterol level which is the end product of another branch of the same pathway have beenanalyzed. When ergosterol extract has been analyzed spectrofotometrically at 282 nm aconsiderable decrease in the absorbance have been detected in the transformant when comparedto the host with HPLC, a more sensitive technique, 50-60 % decrease was found in the KTG1transformant when compared to the host.The results obtained from this study suggest that S. pombe, which is widely used as a hostorganism for heterologous expression of mammalian genes, is also a suitable host for theexpression of plant genes. Furthermore, it was shown that production of the first colorlesscarotenoid phytoen might also be achieved through heterologous production of carotenoids withindustrial importance.