Proteaz üreticisi mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması ve proteaz enzimlerinin biyoteknolojik uygulanabilirliği
Protease producer microorganisms isolation and identification from Kırıkkale and biotechnological applicability of protease
Yazar: FATMA ŞEYMA DUMAN
Danışman: PROF. DR. AYSUN ERGENE
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Bacillus = Bacillus ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Proteaz =

Özet:
Bu tezin amacı, proteaz üreten mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması ve proteaz enzimlerinin karakterizasyonunun yapılmasıdır. Proteaz üreticisi mikroorganizmaların izolasyonu amacıyla; Kırıkkale Üniversitesi'nin atık depolama alanından toprak örneği alındı. Toprak örnekleri skimmilk agar besiyerine yayma ekim yapıldı. Örnekler 37°C'de 24 saat inkübe edildi. Skimmilk hidrolizi sonucu koloni etrafında şeffaf zon oluşturan izolatlar proteaz üreticisi olarak kabul edildi. Çalışmada toplam 6 bakteri izole edildi. İzolatların tanımlanması amacıyla; makroskobik (koloni morfolojileri), mikroskobik (gram ve spor boyama), fizyolojik (gelişim gösterdikleri sıcaklık ve pH koşulları) ve biyokimyasal (IMVIC, katalaz, nişasta hidrolizasyon ve jelatin hidrolizasyon testi) özellikleri incelendi. Üreme eğrileri saptandı. Daha ileri tanımlama için DNA izolasyonu, PZR ile 16S rRNA analizi, PZR optimizasyonu ve ARDRA analizleri yapıldı. Sonuçlar agaroz jel elektroforezinde görüntülendi. İzolatlar Bacillus mojavensis (RFLK01), Bacillus thuringiensis (RFLK03), Bacillus mojavensis (RFLK06), Aeromonas salmonicida (RFLK07), Bacillus anthracis (RFLK08) ve Bacillus stratosphericus (RFLK12) olarak tanımlandı. Tanımlanmış izolatlar enzim üretim besiyerine ekildi ve 72 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonunda +4°C'de 5.000 rpm'de, 20 dakika santrifüj edilerek süpernatan ham homojenat olarak kullanıldı. Ham homojenatın proteaz aktivitesi (U/mL) hesaplandı. Çalışmalara Bacillus thuringiensis (RFLK03) izolatından devam edildi. RFLK03'ün optimum enzim üretimi için üretim koşulları belirlendi. Optimum enzim üretiminin 27 °C, pH 7.0'da, 72. saat ve %1 inokulum ile gerçekleştiği saptandı. Enzimin biyoteknolojik uygulanabilirliğinin belirlenmesi amacıyla; enzimin çeşitli parametrelerdeki (sıcaklık, pH, metal iyonları, kimyasallar, organik çözücüler, inhibitörler, substrat özgüllüğü) proteaz aktivitesi hesaplandı. Enzimin 17-80°C ve pH 7.0-11.0 arasında aktivitesini koruduğu, optimum enzim aktivitesinin 70 °C ve pH 7.0 olduğu saptandı. Manganın proteaz aktivitesini arttıdığı bulundu. Ayrıca oksitleyici ajan olan H2O2'ninaktiviteyi büyük ölçüde arttırdığı saptandı. Ham homojenatın PMSF VE EDTA ile inhibe olduğu belirlendi. Enzim amonyum sülfat çöktürmesi ve DEAE Sefaroz iyon değişimi kromatografisi ile saflaştırıldı. Spesifik aktivite(U/mg) ve saflaştırma katsayısı sırası ile 576.7, 1155.4 ve 1.3, 2.6 bulundu. 2 farklı proteaz enzimin moleküler ağırlığı SDS-PAGE analizinde yaklaşık 75 kDa ve 47 kDa olarak belirlendi.

Abstract:
Purpose of this thesis is on isolation and identification microorganisms which are able to produce protease and characterization of protease. In order to isolate the microorganisms in this study, soil samples were collected from the waste storage area of Kırıkkale University. Samples were plated onto skim milk agar plates. Plates were incubated at 37 °C for 24 h. A clear zone of skim milk hydrolysis was accepted as an indication of protease producing the organisms. A total of 6 bacteria were isolated. To identify the isolates, macroscopic (colony morphology), microscopic (gram and spor staining), physiological (optimum growth temperature and pH conditions) and biochemical (IMVIC, catalase, starch hydrolysis and gelatin hydrolysis test) properties of isolates were examined. Growth curves were detected. For further identification, DNA isolation, 16S rRNA analysis with PZR, PZR optimization and ARDRA analyzes were evaluated. The results were displayed on agarose gel electrophoresis. Isolates were identified as Bacillus mojavensis (RFLK01), Bacillus thuringiensis (RFLK03), Bacillus mojavensis (RFLK06), Aeromonas salmonicida (RFLK07), Bacillus anthracis (RFLK08) and Bacillus stratosphericus (RFLK12). The identified microorganisms were inoculum on the enzyme production medium and incubated for 72 hours. At the incubation, the supernatant was used as crude homogenate by centrifugation at 5,000 rpm at +4 ° C for 20 minutes. The protease activity of the crude homogenate was calculated as (U/mL). Studies continued with Bacillus thuringiensis (RFLK03). The production conditions for the optimum enzyme of the RFLK03 were determined. Optimum enzyme production was determined in 27 °C, pH 7.0, 72 hours as incubation time and %1 as inoculum ratio. The protease activity was calculated to determine the biotechnological applicability with various parameters (temperature, pH, metal ions, chemicals, organic solvents, inhibitors, substrate specificity). It has been observed that, protease enzyme maintains activity between 17-70 °C and pH 7-11, optimum enzyme activity was 70 °C and pH 7.0. Manganese was found to increase protease activity. Also, H2O2, an oxidizing agent, has greatlyincreased protease activity. Crude homogenate was inhibited by PMSF and EDTA. The enzyme was purified by ammonium sulphate precipitation and DEAE Sepharose ion exchange chromatography. Specific activity (U / mg) and purification coefficient were found as 576.7, 1155.4 and 1.3, 2.6, respectively. The molecular weight of the two protease enzymes was determined to be approximately 75 kDa and 47 kDa by SDS-PAGE analysis.