2D ve 3D ishikawa endometrial karsinom hücre kültüründe lityum, metformin ve everolimus maddelerinin hücre büyümesi üzerine etkileri
The effects of lithium, metformin and everolimus substances on cell growth in 2D and 3D ishikawa endometrial carcinoma cell culture
Yazar: EMİNE TURAL
Danışman: PROF. DR. GÜLÇİN METE
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Endometrial neoplazmlar = Endometrial neoplasms ; Endometriyum = Endometrium ; Everolimus = Everolimus ; Hücre kültür teknikleri = Cell culture techniques ; Lityum = Lithium ; Metformin = Metformin

Özet:
Gelişmiş ülkelerde en sık görülen jinekolojik kanser endometrial kanserdir.
Biyolojik, moleküler ve klinikopatolojik özelliklerine göre iki tipe ayrılır. Vakaların
%80 i Tip I (endometrioid histoloji) tümörlerden oluşmaktadır. Tip I tümörler düşük
dereceli (FIGO grade 1 ve grade 2) tümörlerdir, genellikle endometrial hiperplazi ile
ortaya çıkarlar ve iyi prognozludurlar.
Tip II tümörler yüksek dereceli (FIGO garde 3 ve üstü) ve endometrioid olmayan
histolojik alt tipleri içerirler. Genellikle atrofik endometrium zemininde ortaya
çıkarlar, östrojen bağımlı değillerdir ve yüksek gradeli kötü prognozlu neoplazmlardır.
Her yıl binlerce hasta bu nedenle ölmektedir.
Günümüzde kanser çalışmalarında ve kişiye özel kemoterapi planlamalarında iki
boyutlu hücre kültürü çalışmalarından vazgeçilmektedir. 3 boyutlu (3D) hücre
kültürlerinin in vivo ortamı 2 boyutlu (2D) kültürlerden daha iyi taklit ettiği
düşünülmektedir
Endometrial kanserlerde erken evre ve metastatik olmayan rezektabl tümörlerde
cerrahi uygulanmaktadır. Nihai tedavi patolojik tanıyla kesinleşen histolojik alt tipe
göredir. Orta riskli endometrial kanser hastalarında ameliyat sorası radyoterapi (RT)
ve kemoterapi (KT) uygulanmaktadır. Yüksek riskli hastalarda ameliyat sonrası KT
mutlaka uygulanmaktadır. Karboplatin, sisplatin ve doksorubisin sık kullanılan ilaçlar
arasındadır.
Çalışmamızın amacı endometrial kanser hücresi olan Ishikawa hücre hattında
everolimus, metformin ve lityumun hücre canlılığına olan etkilerini araştırmak, IC50
(the half maximal inhibitory concentration; bir ilacın hücrelerin yarısını öldürdüğü
doz) dozlarını saptamak, hücre proliferasyonuna, invazyonuna, koloni oluşumuna,
hücre döngüsü ve apoptoz mekanizmalarına etkilerini ve terapötik etkinliklerini in 
XIV
vitro koşullarda belirlemektir. Ayrıca Midkine, PI3K, AKT, AMPK protein
seviyelerine ELİSA testiyle, CASP3, CASP8, CASP9, FADD, TRADD, MAP1LC3A,
MAP1LCA3B, MTOR, BECLİN1, PIK3CA, PIK3CB, AKT, TNF, FASL' ı RT-PCR
ile apoptozu ise Flow sitometride Annexin V ile değerlendirmektir.
Everolimus, metformin ve lityumun IC50 değerleri 48. Saate sırasıyla 37,46 nM,
48,59 mM, 100 µM olarak bulunmuştur. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(RT-PCR) sonuçlarına göre maddelerin ve kombinasyon şekillerinin hücre döngüsü ve
apoptoz ile ilişkili genler üzerine etkileri olduğu tespit edilmiştir. ELİSA deneyi ile
bakılan protein düzeylerinde anlamlı değişiklikler saptanmıştır. Matrigel invazyon
testi ile kontrol gruplarına göre doz gruplarında Ishikawa hücrelerinin invazyon
kapasitelerinin azaldığı belirlenmiştir. Koloni formasyon testi ile de kontrol gruplarına
oranla doz gruplarında koloni oluşumunun belirgin oranda baskıladığı tespit edilmiştir.
Wound healing deneyi sonuçları ile doz gruplarında hücre göçü ve hücre-hücre
etkileşiminin belirgin oranda azaldığı gösterilmiştir. Flow sitometri ile kullandığımız
tekli ve kombine dozların apoptozu ve hücre ölümünü belirgin olarak artırdığı
gösterilmiştir. Çalışma sonuçları Everolimus, Lityum ve Metformin
kombinasyonlarının endometrial kanser tedavisinde anti kanserojen ajan olarak daha
düşük dozlar şeklinde kullanılabileceğini göstermiş ve daha detaylı çalışmalar için
veriler ortaya koymuştur.
Anahtar kelimeler: 3D hücre kültürü, everolimus, metformin, lityum,
endometrial kanser

Abstract:
Endometrial cancer is the most common gynaecological cancer in developed
countries. It is divided into 2 groups on the basis of biological, moleculer and
clinicopathological features. 80% of the cases consist of Type I (endometrioid
histology) tumors. Type I tumors are low grade (FIGO grade 1 and grade 2) and usually
occur with endometrial hyperplasia and have a good prognosis.
Type II tumors include high grade (FIGO grade 3 and above) and nonendometrioid histological subtypes. They usually occur on the atrophic endometrium
background and they are estrogen independent, high grade neoplasms with poor
prognosis. Thousands of patients have died for this reason.
Currently, two-dimensional cell culture studies are abandoned in cancer studies
and personal chemotherapy planning. 3-dimensional (3D) cell cultures are thought to
mimic the in vivo environment better than 2-dimensional (2D) cultures.
Surgery is an option at an early stage and non-metastatic resectable tumors in
endometrial cancers. The final treatment is based on the histological subtype which is
confirmed by the pathological diagnosis. Patients with intermediate risk endometrial
cancer get post-operative radiotherapy (RT) and chemotherapy (CT). Post-operative
chemotherapy should be given to high risk patients. Carboplatin, cisplatin and
doxorubicin are among commonly used drugs.
The aim of our study is to investigate the effects of Everolimus, Metformin and
lithium on cell viability in the Ishikawa cell line, to determine the IC50 (the half
maximal inhibitory concentration; the dose at which a drug kills half of the
cells)dosage effects on cell proliferation, invasion, colony formation, cell cycle,
apoptosis mechanisms and therapeutic activities in in vitro conditions. Additionally,
Midkine, PI3K, AKT, AMPK protein levels Eveluated with ELİSA test, CASP3,
CASP8, CASP9, FADD, TRADD, MAP1LC3A, MAP1LCA3B, MTOR, BECLİN1, 
XVI
PIK3CA, PIK3CB, AKT, TNF, FASL Eveluated with RT-PCR and Annexin V is
Eveluated with PCR.
IC50 levels of Everolimus, Metformin and lithium were found as 37.46 nM, 48.59
mM and 100 µM at 48th hour, respectively. According to the results of Real Time PCR
(RT-PCR), it has been determined that the substances and their combination types have
effects on cell cycle and genes associated with apoptosis. Significant changes were
detected in protein levels measured by ELİSA test. With the Matrigel invasion test, it
was determined that the invasion capacity of Ishikawa cells decreased in the dose
groups compared to the control groups.The colony formation test has been shown that
colony formation was significantly suppressed shown in the dose groups compared to
the control groups. With the results of Wound healing experiment, it has been shown
that cell migration and cell-cell interaction are significantly reduced in dose groups.
Flow cytometri has been revealed that the single and combined doses significantly
increase apoptosis and cell death. The results of the study has been presented that the
combinations of Everolimus, lithium and Metformin could be used in lower doses as
an anticarcinogenic agent in the treatment of endometrial cancer and has provided data
for more detailed studies.
Keywords: 3D cell culture, everolimus, metformin, lithium, endometrial cancer