Metilglioksal-aracılı nöronal hasarda oksidatif stresin rolünün araştırılması
Investigation of the role of oxidative stress in methylglyoxal-mediated neuronal injury
Yazar: MELİSA AKOL
Danışman: PROF. DR. DİLEK TAŞKIRAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı / Fizyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Kuersetin = Quercetin ; Metilglioksal = Methylglyoxal ; Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Nöroproteksiyon = Neuroprotection ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Periferik sinir hasarları = Peripheral nerve injuries ; Sinir ezilmesi = Nerve crush

Özet:
Giriş ve Amaç: Metilglioksal (MGO), bir dikarbonil bileşiği olup hücresel metabolizmanın bir ürünü olarak normal veya patolojik koşullar altında tüm hücrelerde oluşur. MGO hücrede protein ve yağ asidi metabolizması sırasında sentezlenmekle birlikte asıl endojen kaynak olan glikoliz sırasında ortaya çıkan gliseraldehit 3-fosfat (GAP) ve dihidroksi aseton fosfat (DHAP) gibi triozfosfatların fragmantasyonu sonucu oluşmaktadır. Hücrede MGO oluşumu, hücreye glukoz girişi arttığında ve hiperglisemi durumunda artmaktadır. MGO güçlü bir glikasyon ajanı olup hücrelerde, lipidlere ve proteinlerin lizin ve arginin aminoasitlerine bağlanarak ileri glikasyon son ürünlerinin oluşumuna yol açar. Son yıllarda yapılan çalışmalar özellikle hiperglisemi sonucu ortaya çıkan hücre hasarının altında MGO oluşumunun artışına işaret etmektedir. Ancak MGO-aracılı hücre hasarının altında yatan mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu tez çalışmasının amacı nöron benzeri hücreler olan SH-SY5Y hücrelerinde metilglioksal ile oluşturulan hücresel hasarda oksidatif stresin rolünün olup olmadığını araştırmaktır.

Yöntemler: Çalışmada insan nöroblastoma kaynaklı hücreler olan SH-SY5Y hücre hattı kullanıldı. MGO'nun toksik etkilerinin olup olmadığını ve etkin toksik dozunu belirlemek için farklı dozlardaki (0-1000 µM) MGO kültür medyumuna eklendi ve 24 saatlik inkübasyon sonrasında hücre canlılığı MTT testi ile belirlendi. Etkin MGO dozunun belirlenmesinden sonra antioksidan etkileri olduğu bilinen kuersetin (0.1 ve 1 µM) MGO ile birlikte kültür ortamına verilerek hücre canlılığı testi (MTT), morfolojik değerlendirme, apopitotik hücre değerlendirilmesi (Hoechst 33258 yöntemi), reaktif oksijen ürünlerinin değerlendirilmesi (DCFH-DA oksidasyon yöntemi), total antioksidan kapasite (TAK) ve total oksidan stres (TOS) ölçümleri gerçekleştirildi.  Çalışmada elde edilen veriler istatistiksel olarak değerlendirildi ve anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edildi. 

Bulgular: Çalışmanın sonuçları MGO'nun SH-SY5Y hücrelerinde konsantrasyona bağlı olarak hücre ölümüne yol açtığını ortaya koydu. Etkin dozu 40 µM olarak belirlenen MGO hücrelerin morfolojik özelliklerinde belirgin olarak bozulmalara yol açarken apopitotik hücre ölümünde artışa ve reaktif oksijen ürünlerinin (ROS) oluşumunda artışa yol açtı. Ayrıca MGO eklenen hücrelerde total oksidan stresin kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu gözlendi Antioksidan etkileri olduğu bilinen kuersetin MGO ile birlikte kültür ortamına eklendiğinde hücre ölümünde ve diğer tüm parametrelerde istatistiksel olarak anlamlı düzelme olduğu görüldü.

Sonuç: Bu çalışmanın sonuçları MGO'nun insan SH-SY5Y hücrelerinde doza bağlı olarak toksik etki gösterdiğini ve bu toksik etkiden oksidatif hasarın sorumlu olabileceğini ortaya koydu. Ayrıca elde edilen bulgular bir polifenol olan kuersetinin MGO aracılı hücre hasarında koruyucu etkilerinin olabileceğini gösterdi.

Anahtar Kelimeler: Metilglioksal, nöronal hasar, oksidatif stres, hücre ölümü, kuersetin

Abstract:
Aim: Methylglyoxal (MGO), a dicarbonyl compound, is found in all cells under normal or pathological conditions as a product of cellular metabolism. Although MGO is synthesized during protein and fatty acid metabolism in the cell, the main endogenous source is the fragmentation of triosephosphates such as glyceraldehyde 3-phosphate (GAP) and dihydroxy acetone phosphate (DHAP) that occurs during glycolysis. MGO formation in the cell increases when glucose entry into the cell increases and in case of hyperglycemia. MGO is a powerful glycation agent and binds to lipids and to lysine and arginine amino acids of proteins, leading to the formation of advanced glycation end products in the cells. Studies conducted in recent years point to an increase in MGO formation, especially under the cell damage that occurs as a result of hyperglycemia. However, the mechanisms underlying MGO-mediated cell damage have not been fully elucidated. The aim of this thesis is to investigate whether oxidative stress plays a role in methylglyoxal-induced cellular damage in neuron-like SH-SY5Y cells.

Methods: The human neuroblastoma SH-SY5Y cell line was used in the study. To determine whether MGO has toxic effects and its effective toxic dose, different doses (0-1000 µM) of MGO were added to the culture medium and cell viability was determined by MTT test after 24 hours of incubation. After determining the effective MGO dose, quercetin (0.1 and 1 µM), which is known to have antioxidant effects, was given to the culture medium together with MGO and cell viability test (MTT), morphological evaluation, apoptotic cell evaluation (Hoechst 33258 method), evaluation of reactive oxygen products (DCFH-DA oxidation method), total antioxidant capacity (TAK) and total oxidant stress (TOS) measurements were performed. The data obtained in the study were evaluated statistically and the level of significance was accepted as p<0.05.

Results: The results of the study revealed that MGO caused cell death in SH-SY5Y cells depending on the concentration. MGO, the effective dose of which was determined as 40 µM, caused significant deterioration in the morphological features of the cells, while it led to an increase in apoptotic cell death and an increase in the formation of reactive oxygen species (ROS). In addition, it was observed that the total oxidant stress was higher in the cells to which MGO was added, compared to the control group (p<0.005). When quercetin, which is known to have antioxidant effects, was added to the culture medium together with MGO, it was observed that there was a statistically significant improvement in cell death and all other parameters.

Conclusion: The results of this study demonstrated that MGO has a dose-dependent toxic effect on human SH-SY5Y cells and oxidative damage may be responsible for this toxic effect. In addition, the findings showed that quercetin, a polyphenol, may have protective effects against MGO-mediated cell damage.

Keywords: Methylglyoxal, neuronal damage, oxidative stress, cell death, quercetin