Kontrollü bor salan biyobozunur yara örtülerinin geliştirilmesi ve dermal/mukozal rejenerasyonda kullanımlarının araştırılması
Development of controlled boron releasing biodegradable wound dressings and investigation of their usages in dermal/mucosal regeneration
Yazar: ÖZGE EKİN AKDERE
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, oral mukoza yaralarının en yaygını olan oral mukozitlerin ve deri yaralarının en yaygını olan ayak ülserlerinin tedavisinde kullanılmak üzere, yara iyileşmesinde terapötik etkilere sahip bor (B) ve nanokil olarak montmorillonit (MMT) içeren fiber matrikslerin geliştirilmesi ve yara iyileşme basamaklarında görev alan keratinosit ve fibroblast hücreleriyle etkileşiminin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Tez çalışmasının ilk aşamasında, terapötik iyonlar arasında yer alan borun farklı derişimlerinin, hücre kültür kaplarında kültüre edilen insan endotel, keratinosit ve fibroblast hücrelerinin davranışları üzerindeki etkileri, yara iyileşmesi açısından değerlendirilmiştir. Sonuçlar, 10 ve 20 μg/mL B derişimlerinde endotel hücrelerinin damar oluşturma kapasitelerinin arttığını, keratinosit ve fibroblast hücre göçünün bir miktar hızlandığını göstermiştir. Aynı zamanda bu bor miktarı, fibroblast hücrelerinin proliferasyonunu da desteklemiştir. Hücre kültür ortamlarına 20 μg/mL'ye kadar eklenen borun, keratinosit ve fibroblast hücrelerinin morfolojisi ve canlılığı üzerine belirgin bir etkisi bulunmamıştır.
Çalışmanın 2. aşamasında montmorillonitlere bor adsorpsiyonu gerçekleştirilmiştir. Adsorplanan ortalama B miktarı 2847 μg/g MMT olarak hesaplanmış ve ilk 24 saatte borun yaklaşık %87'sinin salındığı tespit edilmiştir.
Üçüncü aşamada, MMT ve B taşıyan MMT (B-MMT) içeren PLGA (poli(laktik-ko-glikolik asit)) fiber matrikslerin elektroeğirme ile üretimi gerçekleştirilmiş ve keratinosit hücrelerinin kültürasyonu yapılmıştır. Fiber matrikslere MMT katkısının gerçekleştirildiği XRD analizi ile gösterilmiştir. Yüzde 20 oranında B-MMT ile katkılanmış PLGA fiber matrikslerin 9 gün boyunca bor salımına devam ettikleri belirlenmiştir. Bununla birlikte, PLGA bazlı fiber matrikslerde ortaya çıkan büzüşme problemi gözenekliliğin azalmasına ve yapının rijit bir hale dönüşmesine yol açarak hücre kültürünün başarısını olumsuz yönde etkilemiştir. 
Çalışmanın son aşamasında, MMT ve B-MMT katkılı PLA (poli(laktik asit)) bazlı fiber matriksler üretilmiş, karakterizasyon ve hücre kültür çalışmaları yapılmıştır. Farklı miktarlarda B-MMT katkısının fiber matrikslerin morfolojisi, bozunma davranışı ve kimyasal/fiziksel özelliklerine olan etkisi değerlendirilmiştir. Antibakteriyel testler, %10 oranında B-MMT katkılı PLA matrikslerin, gram pozitif bakteri S.aureus suşunda bakterisidal etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Mukoadezyon testi ile, %10 oranında      B-MMT içeren PLA fiber matriksin diğer gruplara göre daha mukoadeziv olduğu belirlenmiştir. Keratinosit ve fibroblast hücreleri ile yapılan hücre kültür çalışmalarında, keratinositlerin proliferasyonunun PLA grubunda en yüksek olduğu bulunmuştur. Fibroblast hücrelerinde ise %10 oranında MMT ve B-MMT içeren PLA bazlı fiber matrikslerde en yüksek proliferasyon değerlerine ulaşılmıştır. Canlı/ölü boyama analizleri, her iki hücre tipi için de PLA grubunda ölü hücrelerin daha yoğun olduğunu ortaya koymuştur. Yara iyileşmesi için önemli genlerin ifadeleri RT-PCR ile incelenmiştir. B-MMT katkılı PLA fiber matrikslerde keratinositlerin damarlanma ile ilişkili büyüme faktörlerine ait gen ifadelerinin arttığı, aynı zamanda hücrelerin proliferasyon kapasitelerinin korunduğu belirlenmiştir. B-MMT katkılı PLA fiber matrikslerin fibroblastlar üzerindeki en belirgin etkisi ise, hücre dışı matriks üretimi ile ilişkili genlerin ifadesindeki artış ile ortaya konmuştur. Tüm bu sonuçlardan yola çıkılarak, B-MMT katkılı PLA fiber matrikslerin yara iyileşme yanıtını olumlu yönde etkilediği, böylelikle hem deri hem de oral mukoza rejenerasyonu için terapötik işleve sahip biyoaktif bir yara örtüsü olabileceği değerlendirilmiştir.

Abstract:
The following thesis presents the development of fiber matrices containing boron (B), which has therapeutic effects in wound healing, and montmorillonite (MMT) as nanoclay. These are specifically used in the treatment of oral mucositis and foot ulcers, which are the most common of oral mucosal and skin wounds, respectively. This study aimed to evaluate the interaction of fiber matrices containing B and MMT with keratinocyte and fibroblast cells which are involved in wound healing process. 
In the first phase of the thesis study, the effects of different concentrations of boron               (a therapeutic ion) were evaluated in human endothelial, keratinocyte and fibroblast cells on cell culture dishes for their wound healing potential. The results showed that the vascular-forming capacity of endothelial cells increased at 10 and 20 μg/mL B concentrations, and keratinocyte and fibroblast cell migration was somewhat accelerated. At the same time, this amount of boron supported the proliferation of fibroblast cells. An addition of up to 20 μg/mL of boron to cell culture media had no significant effect on the morphology and viability of keratinocytes and fibroblasts.
In the second stage of the study, boron adsorption was carried out on montmorillonites. On average, 2847 μg/g MMT of B was adsorbed and it was determined that approximately 87% of the boron was released in the first 24 hours.
In the third step, PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid)) fiber matrices containing MMT and B-doped MMT (B-MMT) were produced by electrospinning and cultured keratinocyte cells. XRD analysis ensured MMT contribution to the fiber matrices. It was determined that PLGA fiber matrices doped with 20 percent B-MMT continued to release boron for 9 days. However, the shrinkage behaviour of PLGA-based fiber matrices caused a decrease in porosity and a rigid structure, negatively affecting the success of cell cultures.
In the last stage of the study, PLA (poly(lactic acid)) based fiber matrices with doped MMT and B-MMT were produced, characterized and cell culture studies were conducted. The effects of different amounts of B-MMT additives on the morphology, degradation behavior and chemical/physical properties of fiber matrices were evaluated. Antibacterial tests have shown that 10% B-MMT added PLA matrices have a bactericidal effect on gram-positive bacteria S.aureus strains. It was determined by a mucoadhesion test that PLA fiber matrices containing 10% B-MMT were more mucoadhesive than the other groups. In cell culture studies with keratinocytes and fibroblast cells, the proliferation of keratinocytes was highest in the PLA group. In fibroblast cells, the highest proliferation values were achieved in PLA-based fiber matrices containing 10% MMT and B-MMT. Live/dead staining analyses revealed that dead cells were more intense in the PLA group for both cell types. Expressions of genes important for wound healing were examined by RT-PCR. It was determined that gene expressions of vascularization-related growth factors of keratinocytes increased in B-MMT doped PLA fiber matrices, and simultaneously, the proliferation capacity of the cells was preserved. The increase in the expression of genes associated with extracellular matrix production particularly demonstrated the most significant effect of B-MMT doped PLA fiber matrices on fibroblasts. In light of the findings, the study suggests that B-MMT doped PLA fiber matrices positively affected the wound healing response. Thus, B-MMT doped PLA fiber matrices might has potential as a bioactive wound dressing with potential therapeutic function for both skin and oral mucosa regeneration.