Scytalidium thermophilum katalazının merkezi kanalının katalitik aktivitedeki rolünün araştırılması
Investigation of the role of central channel on catalytic activity of scytalidium thermophilum catalase
Yazar: BEDİRHAN ÖZTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. YONCA YÜZÜGÜLLÜ KARAKUŞ
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Katalaz = Catalase ; Mutasyon = Mutation ; Scytalidium thermophilum = Scytalidium thermophilum ; Termofilik mantarlar = Thermophilic fungus

Özet:
Katalaz enzimi antioksidan metalloenzimler grubuna dâhil olup başlıca işlevi hidrojen peroksitin su ve moleküler oksijene parçalanmasıdır. Katalazlar ile 100 yılı aşkın bir süredir çalışılmaktadır. Bu süreç içinde bu enzimler birçok farklı organizmadan izole edilmiş, saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Bunlardan biri termofilik bir mantar olan Scytalidium thermophilum tarafından büyümeye paralel olarak üretilen katalaz enzimidir. Bu enzim önceleri birçok difenolik bileşiği okside edebilme yeteneğinden dolayı fenol oksidaz olarak isimlendirilmiş ancak sonrasında yapılan ayrıntılı saflaştırma ve dizi analizleri sonucunda aslında fenol oksidaz aktivitesi gösteren bir katalaz olduğu bulunmuş ve CATPO (katalaz/fenol oksidaz) olarak isimlendirilmiştir. Bu çalışmada, CATPO'nun aktif merkezine uzanan kanallardan biri olan merkezi kanalın enzimin katalitik mekanizmadaki olası rolünün araştırılması amaçlandı. Bu amaç doğrultusunda, merkezi kanalda bulunan amino asitler (A80, T372, N375, N377 ve G378) hedef olarak seçilerek nokta mutasyonlar gerçekleştirildi. Rekombinant DNA sistemi kullanarak üretilen ve saflaştırılan CATPO varyantlarının katalitik etkinliklerinde meydana gelen değişiklikler, spektrofotometrik analizler ile değerlendirildi. N375H, N375E ve N375S hariç diğer amino asit dönüşümlerini içeren proteinler başarılı bir şekilde üretildi. Saf haldeki tüm varyantların ölçülebir miktarda hem-d içerdikleri tespit edildi. T372A ve T372S varyantlarının katalaz aktivitelerinde CATPO'ya göre sırasıyla %10 ve %14 oranında bir düşüş gözlenirken N377L ve A80I'da sırasıyla %263 ve %148'lik bir artış gözlendi. Fenol oksidaz aktivitelerinde T372A hariç diğer varyantlarda önemli bir değişiklik kaydedilmedi. T372A'nın fenol oksidaz aktivitesinde CATPO'ya göre %38 oranında bir kayıp gözlendi. Bulgular, merkezi kanalın katalitik aktiviteyi etkilediğini göstermekte olup endüstriyel uygulamalara yönelik daha etkin bir katalaz enziminin üretilme potansiyelinin olduğuna işaret etmektedir.

Abstract:
Catalase enzyme belonging to antioxidant metalloenzyme group catalyze the decomposition of hydrogen peroxide to water and molecular oxygen. Catalases have been studied for over 100 years, with the result that examples of the enzyme have been isolated, purified and characterized from many different organisms. Among them, the catalase enzyme produced by thermophilic fungus, Scytalidium thermophilum, is of our interest. This enzyme was previously named phenol oxidase because of its ability to oxidize many diphenolic compounds, but as a result of detailed purification and sequencing analyzes, it was found to be actually a catalase with phenol oxidase activity and was named CATPO (catalase/phenol oxidase). In this study, it was aimed to investigate the possible role of the central channel, which is one of the channels extending to the active center of CATPO, in the catalytic mechanism of the enzyme. For this purpose, the amino acids (A80, T372, N375, N377 and G378) residing in the central channel were selected and mutated. The changes in the catalytic activities of the CATPO variants, produced and purified using the recombinant DNA system, were evaluated by spectrophotometric analyses. Almost all recombinant proteins except N375H, N375E and N375S were successfully produced. All CATPO variants were found to contain a measurable amount of hem-d. The T372A and T372S variants exhibited a 10% and 14% decrease in catalase activity with respect to CATPO enzyme, whereas the N377L and A80I variants presented a 263% and 148% increase in catalase activity, respectively. In terms of phenol oxidase activity, no significant change was detected among variants but T372A presenting 38% loss in activity. The results have shown that the central channel affects the catalytic activity and by mutations on this channel more efficient variants than wild type enzyme can be produced and tested for their potential use in industrial applications.