Kolorektal kanserde NOSIP, MMP-2, MMP-9 ve TIMP-2 gen ifadelenmesinin araştırılması
Investigation of NOSIP, MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 gene expressions in colorectal cancer
Yazar: AYGÜL CEMRE ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. SELDA KABADERE
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Matriks metalloproteinaz 2 = Matrix metalloproteinase 2 ; Matriks metalloproteinaz 9 = Matrix metalloproteinase 9 ; Neoplazmlar = Neoplasms ; eNOS = eNOS

Özet:
Nitrik oksit (NO), hem fizyolojik hem de patolojik şartlarda birçok hücreden nitrik oksit sentaz ( NOS) enzimleri tarafından sentezlenen, gaz yapıda bir moleküldür. NO'nun, kanserli hücrelerin invazyon ve migrasyonuna katkı sağladığı bulunmuştur. Bu etkiyi meydana getirebilmek için NO, ekstrasellüler matriks (ECM) moleküllerinin yıkımından sorumlu olan matriks metalloproteinaz (MMP) enzimlerini uyarmaktadır. Birçok tümörün gelişiminin sebebi olarak bilinen MMP-2 ve MMP-9, NO tarafından tetiklenerek ECM moleküllerinin yıkımına yol açmaktadır. MMP-2 ve MMP-9 üzerinde baskılayıcı etki gösteren doku metalloproteinaz baskılayıcısı (TIMP)-2 ise NO tarafından uyarılan ve birçok kanser tipinde varlığı kanıtlanmış bir enzimdir. Kanser malignitesi ile doğrudan ilişkili olan bu parametrelerin, dokuda NO düzeyini azalttığı bilinen nitrik oksit sentaz ile etkileşen protein (NOSIP) ile arasındaki ilişki hala bilinmemektedir. NOSIP, endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) ve nöronal nitrik oksit sentaz (nNOS) enzimlerini inhibe eden bir proteindir. Bugüne kadar yapılan kısıtlı düzeydeki çalışmalar yüksek NO düzeyinin yıkıcı etkilerine karşı NOSIP'in eNOS ve nNOS üzerinde baskılayıcı etki meydana getirerek ve NO düzeyini düşürerek, dokuyu korumada rol oynadığını savunmaktadır. Bu çalışmada, bugüne kadar hiçbir kanserli dokuda varlığı kanıtlanmamış olan NOSIP'in kolorektal kanser (KRK) dokularındaki düzeyi ve kanserin gelişiminde önemli rol oynayan parametrelerle ilişkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmamızda KRK hastalarından ve sağlıklı bireylerden alınan kan örneklerinde NO ile NOSIP, MMP-2, MMP-9, TIMP-2 düzeylerinin karşılaştırılması, ayrıca kanserli hastalardan alınan tümör dokusu ve normal doku örneklerinde NOSIP, MMP-2, MMP-9, TIMP-2 ifadelenme düzeylerinin belirlenmesi hedeflenmiştir.
Çalışmamız için KRK hastalarının tümörlü ve normal dokularından (tümörün 10 cm uzağındaki mukozal dokudan) örnekler alınmıştır. Ayrıca KRK hastalarından ve sağlıklı bireylerden kan örnekleri toplanmıştır. Toplanan kan örneklerinden elde edilen plazmalar ELISA ve renge dayalı nitrit/nitrat tayini deneylerinde kullanılmıştır. Cerrahi operasyon sırasında alınan doku örnekleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) çalışmaları için kullanılmıştır.
Kan örnekleriyle yapılan ELISA deneylerinden elde edilen sonuçlara göre NO düzeyinin tümörlü dokuda normal dokuya göre ciddi oranda yüksek olduğu saptanmıştır. ELISA ve RT-PCR sonuçları birbirine paralel olarak tümörlü dokudaki MMP-2 ve MMP-9 düzeyleri normal dokuya kıyasla daha yüksek bulunmuştur. Ancak tümörlü doku ve normal dokuda
iv
TIMP-2 düzeyleri arasında anlamlı derecede fark gözlenmemiştir. NOSIP miktarı ELISA bulgularına göre kanserli hastaların plazmalarında normal bireylere kıyasla düşük bulunmuştur. RT-PCR sonuçlarına göre ise istatistiki açıdan anlamlı olmamakla birlikte NOSIP düzeyinin tümörlü dokuda azaldığı gözlenmiştir.
Deneylerimizden elde ettiğimiz bu sonuçlar KRK ile normal dokular arasındaki farklı NO düzeyine bağlı olarak MMP-2 ve MMP-9 düzeyinin değiştiğini, bununla birlikte NOSIP düzeyinde de bir farklılığın gözlendiğini açığa çıkarmıştır. Yapılan bu çalışma tümör malignitesi, NO ve NOSIP arasındaki ilişkinin açıklandığı ilk çalışma niteliğindedir. Ancak bu mekanizmaların anlaşılabilmesi için daha ileri araştırmaların yapılması gerekmektedir.

Abstract:
Nitric oxide (NO) is a gaseous molecule synthesized by nitric oxide synthase (NOS) enzymes from many cell types in both physiological and pathological conditions. It is found that NO is involved invasion and migration of tumour cells. NO stimulates the matrix metalloproteinase (MMP) enzymes, responsible for the degradation of extracellular matrix (ECM) molecules. MMP-2 and MMP-9, known as responsible for many tumour progression, are triggered by NO, lead to the degredation of ECM molecules. Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2), which has inhibiting effects on MMP-2 and MMP-9, is an enzyme proved to be present in many types of cancer and TIMP-2 is stimulated by NO. The relationship between these parameters, which are directly related to cancer malignancy, and nitric oxide synthase interacting protein (NOSIP), known to reduce NO levels in the tissue, is still unknown. NOSIP is a protein that inhibits endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and neuronal nitric oxide synthase (nNOS). To date, limited studies have suggested that NOSIP plays a role in tissue preservation by exerting a suppresive effect on eNOS and nNOS and by reducing the level of NO; in this way NOSIP inhibits the destructive effects. In this study, it was aimed to determine the relationship between the levels of NOSIP which has not been proven to be present in any cancer tissue, and parameters that play important role in the development of cancer. We aimed to compare NO and NOSIP, MMP-2, MMP-9, TIMP-2 levels in blood samples, taken from patients with colorectal cancer (CRC) and healthy subjects. Additionally the expression levels of NOSIP, MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 in CRC tumour tissue and normal tissue samples taken from cancer patients.
In the present study, samples were obtained from the tumour and normal (mucosal tissue, 10 cm far away from the tumour) tissues in CRC patients. Blood samples were also collected from patients and healthy subjects. Collected plasma samples were used for ELISA and colorimetric nitrite/nitrate assays. Tissue samples obtained during the surgical operation were used for real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) studies.
According to the results of experiments, NO level was found to be significantly higher in tumour tissue than in normal tissue. The results of ELISA and RT-PCR experiments are found to be similar, the levels of MMP-2 and MMP-9 in tumour tissue are higher than normal tissue. However, no significant difference was observed between TIMP-2 levels in tumour tissue and normal tissue. NOSIP level was found to be low in plasma of
vi
patients with cancer compared to normal individuals according to ELISA findings. According to the results of RT-PCR experiments, although it is not significant statistically, NOSIP level decreased in the tumor tissue.
These results suggest that MMP-2 and MMP-9 levels change due to different levels of NO between CRC and normal tissues. There is a difference between patients and normal individuals in NOSIP levels. This is the first study, describing the relationship between NO, NOSIP and tumour malignancy. However, further research is needed to understand these mechanisms.