MAPK inhibitörü bazı bileşiklerin kanser hücrelerindeki stres proteinleri üzerine etkileri
Effects of some MAPK inhibitor compounds on stress proteins in cancer cells
Yazar: SEVDE NUR BİLTEKİN
Danışman: DOÇ. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Kanser hücrelerinde çeşitli proteinlerin anlatımları değişmektedir. Isı şoku proteinleri (Hsp, "Heat shock protein") veya stres proteinleri olarak adlandırılan proteinler, kanser hücrelerinde anlatımlarında artış görülen proteinler arasında yer almaktadır. Ekspresyonları artan bu stres proteinlerinin anlatımının baskılanması kanser tedavi sürecine olumlu katkı sağladığından, tedaviye yönelik çalışmalarda hedef haline gelmiştir.
Özellikle anlatımı artan Hsp27 ve Mitojen Aktiviteli Protein Kinaz (MAPK)'lar tarafından fosforillenen pHsp27'nin kanserli hücrelere direnç kazandırdığı yapılan çalışmalarda tespit edilmiştir. Hsp27 anlatım seviyesindeki artışın tümör gelişimini arttırdığı ve tümör ilerlemesini aktive ettiği bilinmektedir. pHsp27'nin de kanserleşme süreciyle ilişkili olduğu, kanserli hücreleri ısı şoku, apoptoz efektörleri, oksidatif stres ve iskemiye karşı koruyup apoptozu engelleyerek hücre sağkalımını sağladığı tespit edilmiştir. Aynı zamanda MAPK'ların proliferasyon, apoptoz ve immün kaçış dahil olmak üzere kanser ilerlemesindeki çeşitli hücresel aktiviteleri düzenlediği gösterilmiştir.
Bu çalışmanın ana hedefi, BIRB796 ajanı aracılığıyla MAPK inhibisyonunu sağlayarak Hsp27'nin fosforillenmesini engellemek ve bu şekilde kanserli hücrelerde direnç geliştirip apoptoz mekanizmasının çalışmasını engelleyen pHsp27 miktarını azaltmaktır. Bu çalışma kapsamında ayrıca BIRB796'nın Hsp27 proteininin anlatımı üzerine etkileri de incelenmiştir.
Çalışmanın ilk aşamasında, Hsp27 ekspresyonunu arttıran bortezomib ve MAPK inhibitörü BIRB796'nın hücre canlılığı üzerindeki etkileri incelenmiştir. Ajanlar sitotoksisite analizlerinin sonuçlarına göre, hücreler üzerinde istatistiksel açıdan herhangi bir toksik etki göstermeyen konsantrasyonlarda hücrelere uygulanmıştır. Hücrelerden proteinler izole edilmiş ve 1-boyutlu jel elektroforezi yapılmıştır. Bu jellerde ayrıştırılan proteinler "Western blot" tekniği ile membrana aktarılarak, Hsp27 ve pHsp27'ye özgü antikorlarla işleme tabi tutulmuş ve görüntüler analiz edilmiştir. 
Bu çalışmanın sonuçlarına göre, U87MG insan glioma hücrelerine uygulanan bortezomibin Hsp27 ve pHsp27 proteinlerinin anlatım seviyelerini arttırdığı görülmüştür. MAPK inhibitörü BIRB796 maddesinin Hsp27 fosforilasyonunu engelleyerek pHsp27 miktarını belirgin bir şekilde düşürdüğü ve Hsp27 üzerinde de istatistiksel açıdan anlamlı bir azalmaya neden olduğu tespit edilmiştir. 
Bu sonuçlar, hücrelere uygulanan MAPK inhibitörü BIRB796 ajanının, beyin kanserinin tedavisinde pHsp27 ekspresyonunu azaltarak hücrenin direncini kırmasında etkin bir terapötik seçenek olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
In many cancer cells it is known that expression of some proteins are elevated which called heat shock proteins (Hsp, "Heat shock protein") or stress proteins. Suppressing the levels of Hsp in the treatment of many cancer types has become a target.
In recent studies it has been shown that especially, the increase in the expression of Hsp27 and pHsp27 which is phosphorylated by Mitogen Activated Protein Kinases (MAPKs) make the cancer cells more resistant to the treatment. It is known that the increase in expression of Hsp27 enhances tumor development and activates tumor progression. It has been found that pHsp27 is associated with the carcinogenesis process and effective in cell survival. pHsp27 inhibits apoptosis by protecting cancer cells from heat shock, apoptosis effectors, oxidative stress and ischemia. Also MAPK is effective in proliferation of tumor cells and protecting these cells from apoptosis and increase in the amounts of these kinases make the cancer cells more resistant to the treatment.
The main purpose of this study is to inhibit the phosphorylation of Hsp27 by MAPK inhibitor, BIRB796. Thereby reducing the amount of pHsp27 that inhibits the mechanism of apoptosis in cancer cells. The effects of BIRB796 on Hsp27 were also examined.
In the first stage of the study, the effect of bortezomib which is Hsp inducer and BIRB796 on the cancer cell survival was examined. According to the results of cytotoxicity analysis, the concentration that show neither a cytotoxic nor a proliferative effect on the cells was found. The effect of the bortezomib, BIRB796 and combined applications on the soluble protein profile was exhibited by using 1-dimensional electrophoresis technique. The proteins separated on this gels were transferred to membrane using Western blotting technique and were reacted with the antibody that is specific to the pHsp27 and Hsp27.
According to the results of this study, it was seen that bortezomib treatment applied to the glioma cells significantly induced pHsp27 and Hsp27 expression levels. It was found that BIRB796, which is used as an inhibitor of MAPK, reduced Hsp27 phosphorylation and significantly decreased the level of pHsp27. BIRB796 also statistically suppressed the levels of Hsp27 but not as much as pHsp27.
These results demonstrate that the cellular MAPK inhibitor BIRB796 agent may be an effective therapeutic option in cancer cells reducing resistance by decreasing pHsp27 expression in the treatment of brain cancer.