Gıda kaynaklı patojen tespitinde amplifikasyon ürünlerinin kolorimetrik belirlenmesi
Colorimetric determination of amplification products in foodborne pathogen detection
Yazar: NAZLI AYYILDIZ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ BESTE ÇAĞDAŞ
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu tez çalışmasında hedef gıda kaynaklı patojene ait asimetrik polimeraz zincir reaksiyonu ile elde edilen amplifikasyon ürününün jel elektroforez ile belirlenmesi aşamasına ihtiyaç duyulmadan altın nanoparçacık temelli hızlı teşhisi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla öncelikle pozitif ve negatif kontrol olarak seçilen gıda kaynaklı hastalıklara neden olan, seçilmiş bakteri suşlarının uygun koşullarda kültürü yapılmış (37°C, nutrient broth) ve kültürlerden genomik DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Ardından asimetrik polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile, etkileştiğinde, altın kolloidal süspansiyonu renginde değişikliğe neden olan ve çok düşük konsantrasyonlarda dahi çıplak gözle tespit edilebilen tek zincirli bölgeleri olan PCR ürünleri elde edilmiştir. Çalışmanın son aşamasını gerçekleştirmek amacıyla ise Turkevich yöntemi kullanılarak AuNP'ler sentezlenmiş ve karakterizasyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. Buna göre sentezlenen AuNP'lerin hidrodinamik boyutu 28 nm ve zeta potansiyeli ise -26,4 mV olarak bulunmuştur. SEM ile yapılan analize göre ise parçacıkların yuvarlak morfolojide oldukları ve agregasyona eğilimli olmadıkları tespit edilmiştir. Çalışmanın son aşamasında ise AuNP/NaCI etkileşiminin, ortama PCR ürünü ilavesi sonrasında çökelmeye karşı stabilliği çözelti renginin kırmızı veya mavi renk yoğunluklarına göre akıllı telefon uygulaması yardımı ile (RGB analizine göre) değerlendirilmiştir. Sonuç olarak, patojen hedef dizisinin, günümüzde yaygın kullanılan diğer yöntemlere göre daha hızlı ve ekonomik bir şekilde kolorimetrik olarak tespiti gerçekleştirilebilmiştir.

Abstract:
In this study, gold nanoparticle-based rapid diagnosis of the target foodborne pathogen was achieved without the need for gel electrophoresis determination of the amplification product obtained by asymmetric polymerase chain reaction. For this purpose, selected bacterial strains that cause foodborne diseases, selected as positive and negative controls, were cultured under appropriate conditions (37°C, nutrient broth) and the concentration and DNA samples were obtained sby isolating genomic DNA from the cultures. Then, by asymmetric polymerase chain reaction (PCR), PCR products with single-chain regions were obtained, which, when interacted, cause a change in the color of the gold colloidal suspension and can be detected with the naked eye even at very low concentrations. In order to carry out the last stage of the study, AuNPs were synthesized and characterization was carried out using the Turkevich method. Accordingly, the hydrodynamic size of the synthesized AuNPs was found to be 28 nm and the zeta potential was -26.4 mV. According to the analysis performed with SEM, it was determined that the particles had a round morphology and were not prone to aggregation. In the final stage of the study, the stability of the AuNP/NaCl interaction against precipitation after the addition of the PCR product to the medium was evaluated with the help of a smartphone application (according to RGB analysis) according to the red or blue color intensities of the solution color. As a result, colorimetric detection of the pathogen target sequence was possible faster and more economically than other methods commonly used today.