Polifenolik bileşiklerin pro-oksidan aktivitelerinin ölçümü için yeni bir spektrofotometrik yöntem geliştirilmesi
Development of a new spectrophotometric method to determine pro-oxidant activities of polyphenolic compounds
Yazar: ESİN KONDAKÇI
Danışman: PROF. DR. REŞAT APAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Organizmadaki antioksidan ve pro-oksidan dengenin bozulması olarak tanımlanan oksidatif stres koşulları altında oluşan reaktif türlerin birikimi canlı hücrelerde biyolojik makromoleküllerde onarılamayan hasarlara sebep olurlar. Polifenoller, C ve E vitaminleri meyve ve sebzelerde bulunan doğal antioksidanlardır. Ancak göreceli yüksek derişimde bulunmaları halinde veya bazı özel koşullar altında pro-oksidan aktivite gösterebilmektedirler. Bu nedenle antioksidan aktiviteye sahip bileşiklerin pro-oksidan aktivitelerini tayin edebilecek basit, kullanışlı, hızlı, değişik ortamlara uygulanabilen, duyarlı yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Mevcut pro-oksidan aktivite tayin yöntemleri değerlendirildiğinde bu aktivitenin nesnel bir tanımına dayalı somut bir yöntem bulunmadığı gibi aynı zamanda hem protein hem de polifenolik bileşik içeren sistemlerde pro-oksidan aktivite tayin edilmemiştir. Bu eksiklikten yola çıkılarak tiyol grubu içeren protein ortamında polifenolik bileşiklerin, C ve E vitaminlerinin ve antioksidan karakterli bileşikleri içerebilen bitki örneklerinin geçiş metal iyonu (Cu(II))?katalizli pro-oksidan aktivitelerinin tayin edilebilmesi için Modifiye CUPRAC (Bakır(II) İyonu İndirgeyici Antioksidan Kapasite) yöntemi geliştirilmiştir. Pro-oksidan aktivite, antioksidan bileşiklerin geçiş metal iyonlarını, Fenton-tipi reaksiyonlarla reaktif türler oluşumuna yol açabilen alçak oksidasyon basamaklarına indirgeme aktivitesi olarak tanımlanmıştır. Bu tez çalışması kapsamında, Modifiye CUPRAC yönteminin yumurta akı proteinleri ortamında polifenolik bileşiklere uygulanarak bu bileşiklerin pro-oksidan aktivitelerinin belirlenmesi ve bulunan bu değerlerin referans yöntemlerle elde edilen değerlerle karşılaştırılarak doğruluğunun ispatlanması amaçlanmaktadır.Geliştirilen yöntemin prensibi; polifenolik bileşikler tarafından ortamdaki serbest bakır(II) iyonlarının bakır(I)'e indirgenerek proteine bağlanması ve inkübasyon ürününe neokuproin (Nc)-amonyum asetat (NH4Ac) karışımı ilave edilerek Cu(I)-Nc kelatının oluşturulmasıdır. Oluşan Cu(I)-Nc kelatının 450 nm'de maksimum absorpsiyon yapmasından faydalanılarak polifenolik bileşiklerin pro-oksidan aktiviteleri tayin edilmiştir. Bu çalışmada karşılaştırma için referans yöntemler olarak atomik absorpsiyon spektrometrisi (AAS) ve literatürde mevcut olan protein karbonili tayin yöntemi kullanılmıştır. AAS yöntemi, inkübasyon ürününe CUPRAC reaktifi yerine protein çözücü tamponu ilave edilerek oluşturulan çözeltide AAS ile bakır tayini yapılması esasına dayanır. Karbonil tayini ise protein oksidasyonu sonucunda açığa çıkan karbonil gruplarının 2,4-dinitrofenilhidrazin (DNPH) ile oluşturdukları dinitrofenilhidrazonların (DNP) absorbans değerlerinin 370 nm'de ölçülmesi esasına dayanır.Bu bağlamda Modifiye CUPRAC yöntemi ve referans yöntemler uygulanarak her bir polifenolik bileşiğin pro-oksidan aktiviteleri belirlenmiş ve QREPA (Kuersetin Eşdeğeri Pro-oksidan Aktivite) katsayıları bulunmuştur. Antioksidan bileşiklerin QREPAModifiye-CUPRAC katsayılarına göre pro-oksidan aktivite sırası: gallik asid ? epikateşin ? kateşin ? ?-tokoferol ? rozmarinik asid ? troloks ? kafeik asid ? askorbik asid şeklindedir. İkili sentetik karışım çözeltileri hazırlanarak bu sentetik karışımların beklenen ve ölçülen pro-oksidan aktiviteleri mM kuersetin (QR) eşdeğeri cinsinden hesaplanıp birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Bu değerler incelendiğinde, genel olarak 5x10-4-10-4 M'lık karışım çözeltilerinin ölçülen ve beklenen pro-oksidan aktivitelerinin daha uyumlu olduğu tespit edilmiştir. Modifiye CUPRAC yöntemiyle elde edilen sonuçlar her aşamada AAS ve karbonil tayini yöntemlerininkilerle karşılaştırılmıştır.

Abstract:
Oxidative stress is defined as an imbalance of pro-oxidants and antioxidants in the organism, and cause accumulation of reactive species which induce irreversible damage on biological macromolecules. Polyphenols, vitamin C and E are natural antioxidants existing in fruits and vegetables. However, at relatively high concentrations or under specific conditions, they may show pro-oxidant activities. For this reason, simple, practical, rapid, versatile and sensitive methods are required to to determine the pro-oxidant activity of compounds having antioxidant activity. When existing methods of pro-oxidant activity determination are evaluated, there is no substantial method based on an objective definition of such activity, and at the same time, pro-oxidant activity has not been determined in systems including both protein and polyphenolic compounds. To fill in this literature gap, Modified CUPRAC (Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity) method was developed to determine transition metal ion (Cu(II))?catalyzed pro-oxidant activity of the polyphenolic compounds, C and E vitamins and herbal samples inculuding antioxidant compounds in the presence of proteins containing thiol groups. Pro-oxidant activity is defined as the transition metal ion reducing ability of antioxidant compounds to their lower oxidation states which may produce reactive species via Fenton-type reactions. Within the scope of this thesis work, it was aimed to determine the pro-oxidant activities of polyphenolic compounds through application of the Modified CUPRAC method to these compounds in the presence of egg white proteins, and to validate the proposed methodology by comparison of the results obtained with those of reference methods.The basic principle of the developed method involves the reduction of copper (II) ions to copper(I) by polyphenolic compounds, binding of Cu(I) to protein thiol groups, and formation of copper(I)-neocuproine (Cu(I)-Nc) chelate by treating the incubation product with a neocuproine (Nc)-ammonium acetate (NH4Ac) mixture. The pro-oxidant activities of polyphenolic compounds were determined by measuring the 450-nm absorbance of the Cu(I)-Nc chelate formed. In this study, atomic absorption spectrometry (AAS) and protein carbonyl assay (existing in literature) were used as reference methods of comparison. AAS method is based on adding protein dissolution buffer to incubation product instead of CUPRAC reagents and determining copper in solution by AAS. Carbonyl assay is based on the measurement of the absorbance values at 370 nm of dinitrophenylhydrazones (DNP) formed from 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) and the carbonyl groups emerging from protein oxidation.By applying Modified CUPRAC and reference methods, the pro-oxidant activities were determined for each polyphenolic compound and their QREPA (Quercetin Equivalent Pro-oxidant Activity) coefficients were found. The order of pro-oxidant activities of antioxidant compounds in terms of QREPAModified-CUPRAC coefficients was: gallic acid ? epicatechin ? catechin ? ?-tocopherol ? rosmarinic acid ? trolox ? caffeic acid ? ascorbic acid. Synthetic mixtures were prepared, and their pro-oxidant activities experimentally measured as mM quercetin (QR) equivalents and compared with those theoretically found. When these values are investigated, generally, it was noted that the experimental and theoretical values of mixtures at 5.10-4-10-4 M concentrations were more compatible. The Modified CUPRAC values were compared at every stage with those of AAS and carbonyl assay.