Sıçanlarda siklofosfamid ile oluşturulan prematüre ovarian yetmezlik modelinde melatonin ve vitamin D'nİn ovaryum üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of melatonin and vitamin D on the ovary in a model of premature ovarian failure induced by Cyclophosphamide in rats.
Yazar: ÖZDEM KARAOĞLAN
Danışman: PROF. DR. ÖZGÜL TAP
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Kanser hastalarına uygulanan kemoterapi ovaryumda primordiyal folikül apopitozunu ya da primordiyal foliküllerin aşırı aktivasyonunu tetikleyerek prematüre ovarian yetmezlik (POY) ve infertiliteye neden olabilmektedir. Ancak prematüre ovarian yetmezliğin gelişmesinde etkili olan mekanizmalar tam olarak aydınlatılamadığı için etkin bir tedavi yöntemi henüz bulunamamıştır. Sunulan çalışmada siklofosfamid ile oluşturulan deneysel prematüre ovarian yetmezlik modelinde fertiliteyi korumaya yönelik farmakolojik bir yaklaşım olarak melatonin ve vitamin D'nin birlikte kullanımının, ovarian folikül rezervi ve yapısı üzerine olan etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
Araştırmada 49 erişkin dişi sıçan 7 gruba ayrıldı. Grup 1 intakt kontrol grubu, grup 2 melatonin kontrol grubu, grup 3 vitamin d kontrol grubu, grup 4 POY grubu, grup 5 siklofosfamid ve melatonin grubu, grup 6 siklofosfamid ve vitamin D grubu, grup 7 kombine tedavi grubu olarak değerlendirildi. Deneyin 11. gününde anestezi altındaki deneklerden intrakardiyak kan örnekleri alınarak, serum FSH, LH, E2 ve P değerleri analiz edildi. Her gruba ait deneklerin over doku örnekleri ışık mikroskobik, elektron mikroskobik ve moleküler biyolojik yöntemlerle incelenmek üzere hazırlandı. Işık mikroskobik incelemeler sırasında seri kesitlerde primordiyal, gelişen, atretik foliküller ve korpus luteum sayılarak istatistiksel analizleri yapıldı. Masson trikrom boyama yöntemi ile ovarian fibrozis, qRT-PCR tekniği ile PTEN, FOXO3a, AMH gen ekspresyon seviyeleri ve immünohistokimyasal yöntem ile PTEN, FOXO3a, AMH, kaspaz-3 ve TNF- α ekspresyonları değerlendirildi.
Siklofosfamid uygulanan deneklerde FSH ve LH düzeylerinin belirgin bir şekilde arttığı, E2 ve P düzeylerinin ise azaldığı, tedavi gruplarında ise FSH ve LH seviyelerinin azaldığı, E2 ve P seviyelerinde ise artışın gerçekleştiği görüldü. Siklofosfamidin normal yapıdaki primordiyal ve gelişen folikül sayısında azalma ile korpus luteum, atretik folikül sayısında ve fibroziste artışa sebep olduğu, tedavi gruplarında ise bu parametrelerin kontrol gruplarına yakın olduğu belirlendi. Ovaryumlardaki PTEN, FOXO3a ve AMH mRNA ekspresyonlarının siklofosfamid uygulamasıyla azaldığı, tedavi gruplarında ise artış olduğu ve immünohistokimyasal incelemelerin de benzer korelasyon gösterdiği izlendi. Siklofosfamid ile oluşturulan ovaryum hasarında kaspaz-3 ve TNF- α ekspresyonunda da artış saptanırken, primordiyal ve gelişen foliküllerde, yüzey epiteli ve ovarian stromada belirgin yapısal değişikliklerin varlığı da saptandı. Tedavi gruplarında ise kaspaz-3 ve TNF- α  ekspresyonunda belirgin bir azalma görülürken, foliküllerde ve ovarian stromada yapısal değişikliklerin daha hafif seyrettiği dikkati çekti. 
Bütün bulgular birlikte değerlendirildiğinde, siklofosfamid ile oluşturulan ovaryum hasarında folikül ileri gelişimi üzerine negatif düzenleyici etkisi bilinen PTEN, FOXO3a ve AMH gen ekspresyonlarının azalması ile primordiyal foliküllerin aşırı aktivasyonu sonucunda çok sayıda folikülün gelişme sürecine girerek büyük oranda atreziye uğradığı, melatonin ve vitamin D kombine tedavisinin PTEN, FOXO3a ve AMH gen ekspresyon seviyelerini değiştirerek ovarian rezervi koruduğu saptandı. Ayrıca melatonin ve vitamin D'nin anti fibrotik, antioksidan ve antienflamatuvar etkileri aracılığı ile ovarian fonksiyonun geri kazanılmasında etkili olduğu ve klinik açıdan terapötik ajan olarak değerlendirilebileceği sonucuna varıldı.

Anahtar kelimeler: Folikülogenez, Prematüre ovarian yetmezlik, Siklofosfamid, PTEN, FOXO3a, AMH

Abstract:
Chemotherapy can lead to premature ovarian failure (POF) and infertility by triggering primordial follicle apoptosis or excessive activation of primordial follicles in the ovary. However, an effective treatment method has not been found yet due to the mechanisms effective in the development of premature ovarian failure have not been fully elucidated. In the presented study, it was aimed to investigate the effects of the combined use of melatonin and vitamin D as a pharmacological approach to preserve fertility in an experimental premature ovarian failure model induced by cyclophosphamide, on ovarian follicle reserve and structure. 
	In the study, 49 adult female rats were randomly divided into 7 groups. Group 1 was evaluated as intact control group, group 2 as melatonin control group, group 3 as vitamin d control group, group 4 as POF group, group 5 as cyclophosphamide and melatonin group, group 6 as cyclophosphamide and vitamin D group, and group 7 as combined treatment group. Intracardiac blood samples were taken from the rats under anesthesia on the 11th day, for serum FSH, LH, E2 and P level analyzes. Ovaries were prepared for examination by light microscopic, electron microscopic and molecular biological methods. During light microscopic examinations, primordial, developing, atretic follicles and corpus luteum number were counted in serial sections and statistical analyzes were performed. Ovarian fibrosis was evaluated by Masson trichrome staining method, PTEN, FOXO3a, AMH gene expression levels were evaluated by qRT-PCR technique, and PTEN, FOXO3a, AMH, TNF- α and caspase-3 expressions were evaluated by immunohistochemical method.
It was observed that FSH and LH levels in cyclophosphamide-treated rats were increased significantly, E2 and P levels decreased significantly, and FSH and LH levels were decreased in the melatonin and vitamin D treatment groups, whereas there was a significant increase in E2 and P levels. It was determined that cyclophosphamide caused a decrease in the numbers of primordial and developing follicles and an increase in the number of the corpus luteum, atretic follicles and fibrosis, and the values in the treatment groups were close to the control groups. It was observed that PTEN, FOXO3 and AMH mRNA expression in the ovarian tissue were decreased with cyclophosphamide administration, while PTEN, FOXO3 and AMH mRNA expressions were increased in the treatment groups, and immunohistochemical examinations showed a similar correlation with these findings. While an increase in TNF- α and Caspase-3 expressions were detected in ovarian damage caused by cyclophosphamide, significant structural changes were also detected in primordial and developing follicles, surface epithelium and ovarian stroma. Significant decreases in TNF- α and caspase-3 expression were observed in the treatment groups, it was noted that structural changes in the follicles and ovarian stroma were milder.
When all the findings are evaluated together, in ovarian damage caused by cyclophosphamide, as a result of the decrease in PTEN, FOXO3a and AMH gene expressions, which are known to have a negative regulatory effect on follicular growth, and the excessive activation of primordial follicles, many follicles enter the development process and eventually suffer atresia. It was determined that combined melatonin and vitamin D therapy protected ovarian reserve by changing PTEN, FOXO3 and AMH gene expression levels. It was also concluded that melatonin and vitamin D are effective in restoring ovarian function through their antifibrotic, antioxidant and anti-inflammatory effects and can be evaluated clinically as a therapeutic agent.
Key words: Cyclophosphamide, Folliculogenesis, Premature ovarian failure, PTEN, FOXO3a, AMH