EF-24 ve sisplatinin apoptotik etkilerinin fare malign plevral mezotelyoma hücrelerinde in vitro ve in vivo olarak belirlenmesi
Determination of apoptotic effects of EF24 and cisplatin on murine malign pleural mesothelioma cells in vitro and in vivo
Yazar: İLKNUR PORSUK DORU
Danışman: DOÇ. DR. HACER İLKE ÖNEN
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Difenil difloroketon = Diphenyl difluoroketone ; Fareler = Mice ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Mezotelyoma = Mesothelioma ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sisplatin = Cisplatin

Özet:
Malign plevral mezotelyoma (MPM), plevranın mezotel hücrelerinden köken alan, prognozu kötü,
günümüzde uygulanan tedavilere yanıtı sınırlı bir kanser türüdür. Nadir görülen bir kanser olarak
tanımlanan MPM'nin insidansı son yıllarda artış göstermiştir. Bu nedenle, terapötik potansiyeli
olabilecek yeni aday molekül veya ajanların belirlenebilmesine yönelik çalışmalar hız kazanmıştır.
Difenil difloroketon (EF24) kurkumin analoğu sentetik bir bileşiktir. Farklı insan kanserlerinde tek
başına ya da klasik kemoterapötiklerle birlikte uygulandığı çalışmalarda, EF24'ün kanser
hücrelerinde programlı hücre ölümünü uyardığı belirlenmiştir. Bu tez çalışmasının amacı, EF24 ve
sisplatin tek başlarına ve birlikte kullanılmasıyla apoptotik yolak üzerindeki etkilerinin
değerlendirilerek terapötik potansiyelinin belirlenmesidir. Bu tez çalışmasında, EF24 ve sisplatinin
farklı konsantrasyonlarda tek başlarına ve birlikte 24 ve 48 saat boyunca AB12 fare MPM
hücrelerine uygulanması ile elde edilen hücre canlılık oranları MTT yöntemiyle belirlendi. 6-8
haftalık dişi BALB/c farelere, (1X105) AB12 hücresi subkütanöz uygulandı. Tümör gelişimi
gözlenen fareler her grupta eşit sayıda olacak şekilde (n=4) kontrol grubu, sham I (PBS kontrol),
sham II (DMSO kontrol), sisplatin, EF24 ve sisplatin+EF24 (kombine) tedavi grupları olmak üzere
6 gruba ayrıldı. Tümör dokularındaki antiapoptotik ve apoptotik yolakta görevli bazı genlerin (Bcl-
2, Bcl2l1, Casp3, Casp8 ve Casp9) mRNA düzeyindeki ifade değişimleri nicel gerçek zamanlı
PCR yöntemi ile belirlendi. Bcl-2, Bcl2l1 ve Casp3 protein miktarları ise ELISA yöntemi ile
saptandı. MTT sonuçlarına göre EF24 uygulanan hücrelerde hücre canlılığının konsantrasyona
bağlı bir şekilde, sisplatin uygulanan hücrelerde ise konsantrasyona ve zamana bağlı bir şekilde
azaldığı görülmüştür. Sisplatin ve EF24'ün birlikte kullanımının hücrelerde sisplatinin etkisini
arttırdığı belirlendi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, kombine ve sisplatinin tek başına
uygulandığı grupta, Bcl-2 mRNA ifadesindeki artış istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.05).
Bcl2l1, Casp3 ve Casp8 genlerinin mRNA ifade düzeyinde gruplar arasında ve kontrole göre bir
fark belirlenmedi (p>0.05). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, kombine ve sisplatinin tek başına uygulandığı grupta belirlenen Casp9 mRNA ifade düzeyindeki azalış anlamlıydı (p<0.05). Bcl-2
protein miktarının, kontrol ve sisplatin uygulanan gruba göre kombine grupta anlamlı olarak arttığı
saptandı (p<0.05). Bcl2l1 ve Casp3 protein miktarlarında ise, gruplar arasında bir fark
belirlenmedi (p>0.05). Çalışmamız sonucunda EF24'ün ve sisplatinin tek başına birlikte kullanımın
apoptotik yolak üzerindeki etkisinin olup olmadığı gösterildi. EF24'ün in vivo olarak farklı
konsantrasyonlarının araştırılmasının apoptotik yolak üzerindeki etkisinin ortaya çıkarılmasında
yararlı olacağı düşünülebilir. Bu ajanın diğer hücre ölüm yolakları üzerindeki etkisinin araştırılması bu ajanın terapötik potansiyelinin belirlenmesine katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Malign pleural mesothelioma (MPM) is a type of cancer that is rooted in the mesothelial cells of
the pleura, having bad prognosis, and recalcitrant to the therapies administered nowadays. Even if
it is described as a rarely seen cancer, its incidence has increased in the recent years. Hence, there is an increasing number of studies aimed at determining new candidate molecule and agents with
therapeutic potential. Diphenyl difluoroketone (EF24) is a curcumin-like synthetic compound. In
some studies, in which EF24 was administered either alone or in combination with the standard
chemotherapeutics at various human cancers, it was seen that EF24 stimulate apoptosis. The aim of
this study is the determination of therapeutic potential of EF24 and cisplatin by evaluating their
effects on apoptotic pathway either alone or in combination with each other. In this thesis study,
the cell viability rates that are obtained by administering EF24 and cisplatin alone and in
combination for 24 and 48 hours to AB12 murine MPM cells were determined by the MTT method. AB12 cells (1X105) were subcutaneously administered to 6-8 week-old female mice. Tumor progression being monitored, the mice were divided into 6 groups in equal numbers (n=4), a control group and the treatment groups sham I (PBS control), sham II (DMSO control), cisplatin, EF24, and cisplatin+EF24 (combined). The expression variations in mRNA levels of some genes (Bcl-2, Bcl2l1, Casp3, Casp8, and Casp9), operating in the anti-apoptotic and apoptotic pathways in the tumor tissues, were determined by the quantitative real time PCR method. The amounts of proteins Bcl-2, Bcl2l1, and Casp3 were determined by ELISA method. According to the MTT outcomes, the cell viability of the EF24-administered cells decreased in a concentration-dependent manner and the cell viability of the cisplatin-administered cells decreased in a concentration- and time-dependent manner. It was also observed that combined use of cisplatin and EF24 increases the effect of cisplatin. Compared to the control group, the increases in Bcl-2 mRNA expression levels of both the combined and cisplatin-alone groups were found statistically significant (p<0.05). No difference was detected across groups in mRNA expression levels of the genes Bcl2l1, Casp3, and Casp8 compared to the control (p>0.05). Compared to the control group, the decreases in Casp9 mRNA expression levels of the combined and cisplatin-alone groups were statistically significant (p<0.05). It was detected that the amount of protein Bcl-2 in the combined group significantly increased compared to the control and the cisplatin-alone groups. No difference was detected in the amounts of proteins Bcl2l1 and Casp3 across groups (p>0.05). As a result of this study, it was shown whether or not combined and individual use of EF24 and cisplatin have any effect on the apoptotic pathway. In vivo investigation of different concentrations of EF24 is considered to be useful in revealing its effect on the apoptotic pathway. Investigation of the effects of this agent on the other cell death pathways will also contribute to the determination of its therapeutic potential.