Over kanserinde kullanılmak üzere polimer ilaç nanokonjugatı geliştirilmesi ve kanser tedavi potansiyelinin araştırılması
Development of polymer DRUG nanoconjugate for USE in ovarian cancer and investigation of cancer treatment potential
Yazar: BUKET ÖZEL
Danışman: DOÇ. DR. NUR SELVİ GÜNEL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Kabozantinib = Cabozantinib ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Over hastalıkları = Ovarian diseases ; Over neoplazmları = Ovarian neoplasms ; İlaç formülleri = Formularies ; İlaç üretimi = Drug production

Özet:
Over kanseri, tüm kadın kanserlerinin % 2,5'ini ve kadın kanseri ilişkili ölümlerin % 5'ini oluşturan en ölümcül jinekolojik malignitedir. Over kanseri hastalarında ileri evrede (III veya IV) tanı konması nedeniyle yüksek mortalite oranları görülür. Tedavide pek çok strateji denense de hastalığın nüks oranı yüksek, sağkalım oranı düşüktür. Bu nedenle over kanseri terapisinde hedefli terapiler dikkat çekmektedir. 
Kabozantinib (CBZ), MET, VEGFR-1,2,3, FLT3, c-KIT ve RET'e karşı aktiviteye sahip çoklu reseptör tirozin kinaz inhibitörüdür. Çeşitli pre-klinik çalışmalarda CBZ'nin geniş bir tümör modeline karşı aktivitesi saptanmıştır. 
Lizofosfatidik asit (LPA) ve reseptörlerinin (LPAR), over kanserinde değişime uğradığı, jinekolojik maligniteler arasında en yüksek mortalite oranına sahip over kanseri patolojisinde rol oynadığı bilinmektedir. LPA, hücre zarında bulunan endotelyal farklılaşma geni (Edg) ailesinden G proteini bağlı reseptörler (GPCR) yoluyla etki eden bir lizofosfolipittir. En iyi incelenen LPA1 (Edg-2), LPA2 (Edg-4) ve LPA3 (Edg-7) reseptörleridir. LPAR1, LPAR2 ve LPAR3 reseptörlerinin ekspresyonu, iyi huylu tümörler ve / veya normal over dokusu ile karşılaştırıldığında over kanseri hücre hatlarında önemli ölçüde daha yüksektir. Kanser hücrelerinde sinyal yolaklarını aktifleyerek sağkalımı, tutunmayı, migrasyonu, invazyonu uyarır. LPA/LPAR sinyali, over kanserinde vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) protein ekspresyonunu artırarak tümör büyümesini ve anjiyogenezi kolaylaştırır. Bu nedenle, LPA reseptörlerini hedeflemek ve VEGFR inhibitörü ile kombine etmek over kanseri tedavisi için stratejik bir yaklaşımdır. 
Çalışmada, dual terapi yaklaşımıyla, VEGFR ve LPAR inhibisyonu ve ilaçların daha etkili olması için polimer ilaç nanokonjugatı hazırlanması amaçlanmıştır. Bunun için kanser çalışmalarında avantajları bilinen Polietilen Glikol (PEG) taşıyıcı sistem olarak seçilip, LPA1/LPA3 ve LPA2 antagonisti olan Ki16425 ve CBZ içeren nanokonjugat sentezlenip (Ki-PEG-CBZ), tedavi potansiyeli değerlendirildi. CBZ ve Ki16425 polimere, tümör asidik mikroçevresinde parçalanabilir olması nedeniyle pH-duyarlı bağlar olan hidrazon ve ester bağları ile bağlandı. Elde edilen konjugatın karakterizasyonu, HPLC, LC-MS/MS, NMR FT-IR, TGA, boyut ve zeta potansiyel analizi  ve Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) gibi yöntemler ile gerçekleştirildi. Elde edilen nanokonjugat karakterize edildikten sonra over kanseri tedavi etkinliği değerlendirildi. Sitotoksisite analizi MTT, apoptoz analizi Annexin V-FITC/PI ile yapıldı. Ki-PEG-CBZ nanokonjugatının, hücrelerin migrasyon ve invazyonu üzerine etkisi sırasıyla yara iyileşme ve invazyon analizleri, gen ekspresyonu üzerine etkisi ise qRT-PCR yöntemi ile değerlendirildi.
Ki-PEG-CBZ nanokonjugatının karakterizasyonu sonucu PEG5000'e CBZ ve Ki16425'in oldukça yüksek verimde bağlandığı belirlendi. Ki-PEG-CBZ nanokonjugatının pH-duyarlı bir şekilde sentezlenebildiği, fizyolojik ve asidik pH'daki ilaç salım denemeleriyle tespit edildi. Yapıdaki hidrazon ve ester bağlarının kırılmasına bağlı olarak CBZ ve Ki16425 salımının asidik pH'da daha yüksek olduğu belirlendi.  In vitro biyouyumluluk testleri sonucu hemolize neden olmadığı ve inflamatuar yanıtı baskıladığı gösterildi. Sitotoksisite çalışmaları sonucu A2780 ve OVCAR3 hücre hatlarında serbest ilaçlara göre daha düşük dozda daha etkili olduğu ayrıca WI-38 sağlıklı hücre hattına serbest ilaçlara kıyasla daha az etki gösterdiği belirlendi. Ki-PEG-CBZ nanokonjugatının over kanseri hücre hatları A2780, OVCAR3 ve  SKOV3'te apoptozu tekli ve kombine serbest ilaçlara göre daha fazla indüklediği tespit edildi. İnvazyon ve migrasyon sonuçları ile nanokonjugatın invaziv özellikteki ve migrasyon yapma yeteneğindeki kanser hücrelerini baskıladığı saptandı. Çalışmada hedeflenen VEGF sinyal yolağı ilişkili genlerde anlamlı ekspresyon değişimlerine neden olduğu belirlendi. 
Geliştirilen polimer ilaç nanokonjugatının, over kanseri tedavisinde etkili ve güvenli bir nanokonjugat olduğunu düşünmekteyiz.

Abstract:
Ovarian cancer is the deadliest gynecological malignancy, accounting for 2.5% of all female cancers and 5% of female cancer related deaths. Although many strategies have been tried in the treatment, the recurrence rate of the disease is high and the survival rate is low. For this reason, targeted therapies are attracting attention in ovarian cancer therapy.
Cabozantinib (CBZ) is a multi-receptor tyrosine kinase inhibitor with activity against MET, VEGFR-1, 2 ,3, FLT3, c-KIT, and RET and its activity against a wide range of tumor models has been determined in several pre-clinical studies.
It is known that lysophosphatidic acid (LPA) and its receptors (LPAR) are altered in ovarian cancer and play a role in the pathology of ovarian cancer. LPA acts via G protein-coupled receptors (GPCR) from the endothelial differentiation gene (Edg). Expression of LPAR 1, 2, 3 receptors are significantly higher in ovarian cancer cell lines compared to normal ovarian tissue. LPA/LPAR axis stimulates survival, adhesion, migration, invasion, tumor growth and angiogenesis by increasing VEGF protein expression in ovarian cancer. Therefore, targeting LPA receptors and combining with VEGFR inhibitor is a strategic approach for ovarian cancer treatment.
In this study, it was aimed to prepare polymer drug nanoconjugate for VEGFR and LPAR inhibition. For this, Polyethylene Glycol (PEG), which advantages are known in cancer studies, was chosen as the carrier system, and a nanoconjugate containing Ki16425 and CBZ (Ki-PEG-CBZ) was synthesized and its potential was evaluated. First, CBZ and Ki16425 were attached to the polymer by pH-sensitive hydrazone and ester bonds due to their degradability in the tumor acidic microenvironment. The characterization of the conjugate was performed by methods such as HPLC, LC-MS/MS, NMR FT-IR, TGA, size and zeta potential analysis and SEM. After nanoconjugate characterization, its ovarian cancer treatment potential was evaluated. MTT and Annexin V-FITC/PI analyzes were performed for cytotoxicity and apoptosis. The effect of Ki-PEG-CBZ on migration and invasion of cells was evaluated by wound healing and invasion assays, respectively, and its effect on gene expression was assessed by qRT-PCR method.
As a result of the characterization of Ki-PEG-CBZ nanoconjugate, it was determined that CBZ and Ki16425 bound to PEG5000 with high efficiency. According to drug release experiments at physiological and acidic pH, CBZ and Ki16425 had released higher at acidic pH due to the breaking of hydrazone and ester bonds. In vitro biocompatibility tests showed that Ki-PEG-CBZ did not cause hemolysis and suppressed the inflammatory response. It was found more effective in A2780 and OVCAR3 cell lines at lower doses than free drugs, and had less effect on WI-38 healthy cell line. It was determined that Ki-PEG-CBZ nanoconjugate induced apoptosis more than single and combined free drugs in A2780, OVCAR3 and SKOV3 cell lines. It was revealed that the Ki-PEG-CBZ suppressed cancer cells that were invasive and had the ability to migrate. VEGF signaling pathway related genes were significantly changes after treatment with Ki-PEG-CBZ.
We suggest that the developed polymer drug nanoconjugate is an effective and safe nanoconjugate for the treatment of ovarian cancer.