ETP 45658'in HT-29 kolon kanseri hücrelerine karşı antiproliferatif etkisinin altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılması
Investigation of molecular mechanisms underlying the antiproliferative effects of ETP 45658 against HT-29 colon cancer cells
Yazar: FATİH YULAK
Danışman: DOÇ. DR. AHMET KEMAL FİLİZ
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Apoptozis = Apoptosis ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Fosfoinositid 3-kinaz = Phosphoinositide 3-kinase ; Hücre döngüsü = Cell cycle ; Hücre çoğalması = Cell proliferation ; Kolon hastalıkları = Colonic diseases ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Kanser, ciddi ekonomik ve sosyal sorunlara neden olan bir halk sağlığı sorunudur. Birçok kanser türü arasında, kolon kanseri en sık teşhis edilen üçüncü kanserdir ve kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Kolon kanseri tedavisinde birçok kemoterapötik ajan kullanılmasına rağmen ideal kemoterapötik ajan arayışı devam etmektedir. Bu bağlamda pek çok yol ve mekanizma öne çıkmaktadır. Bu yollardan birisi de PI3K aracılı yoldur. PI3K aracılı yolak, bir dizi hormona ve büyüme faktörüne yanıt veren hücre içi sinyal yolağıdır. Bu yolağın aktivasyonu, hücre büyümesi, hücre proliferasyonu, hayatta kalma ve artan hücre göçü, ayrıca düzensiz apoptoz ve onkogenez gibi hücresel süreçleri modüle etmektedir. PI3K/AKT/mTOR yolağı deregülasyonu birçok insan kanserinde tümöral hücre proliferasyonu, büyüme ve apoptozisinde önemli rol oynamaktadır. Bu bilgiler ışığında çalışmamızda bir PI3K/AKT/mTOR yolağı inhibitörü olan ETP 45658'in kolon kanseri üzerine antiproliferatif etkinliğinin araştırılması hedeflenmiştir. 
Çalışmamızda 1, 10, 25, 50, 100 μM dozlarda ETP 45658, HT-29 kolon kanseri hücrelerine uygulanarak XTT hücre canlılığı testi ile sitotoksik etkisi değerlendirilmiştir. Elde edilen verilerden ETP 45658'in IC50 değeri hesaplanmıştır. Hücrelere belirlenen IC50 doz verilmiştir ve flow sitometri ile apoptoz, hücre döngüsü, mitokondri zar potansiyeli, kaspaze 3/7 çalışmaları yapılmıştır. Belirlenen IC50 değeri hücreye uygulandıktan sonra elisa ile bax, bcl, kaspaz 3, parp ve 8-oxo-dG miktarları ve TAS, TOS değerleri ölçülmüştür. Aynı doz uygulandıktan sonra hücrelere DAPİ boyası verilerek ETP 45658'in sitotoksik etkisinin altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması amaçlanmıştır.
Elde ettiğimiz XTT sonuçlarına göre ETP 45658 doz bağımlı bir şekilde HT-29 kolon kanseri hücreleri üzerine istatistiksel olarak anlamlı bir antiproliferatif etki göstermiştir. Hesaplanan IC50 dozu ile yapılan ileri çalışmalarda ETP 45658 hücre döngüsünü G0/G1 fazında durdurmuş, apoptotik proteinleri artırıp anti apoptotik proteinleri azaltmış, TAS seviyesini azaltıp TOS seviyesini artırmış ve mitokondri zar potansiyelini depolarize hale getirerek HT-29 kolon kanseri hücrelerinde apoptozisi indüklemiştir.
Sonuç olarak ETP 45658'in antiproliferatif etkisi, hücre döngüsünü durdurması ve apoptotik proteinleri artırması ile HT-29 kolon kanseri hücreleri üzerinde apoptozisi uyararak antikanser etkinliği olduğu gösterilmiştir. ETP 45658'in bu etkisi dikkate alındığında kolon kanserli hastalarda PI3K/AKT/mTOR yolağının hedeflenmesi yeni bir tedavi seçeneği olabileceği düşünülmektedir. Ancak bu konuyla ilgili daha fazla hem in vitro hem in vivo çalışmaya ve klinik faz çalışmalarına ihtiyaç vardır.

Abstract:
Cancer is a public health problem that causes serious economic and social problems. Among many types of cancer, colon cancer is the third most commonly diagnosed cancer and remains the second leading cause of cancer-related death. Although many chemotherapeutic agents are used in the treatment of colon cancer, the search for the ideal chemotherapeutic agent continues. In this context, many ways and mechanisms come to the fore. One of these pathways is the PI3K mediated pathway. The PI3K -mediated pathway is an intracellular signaling pathway that responds to a number of hormones and growth factors. Activation of this pathway modulates cellular processes such as cell growth, cell proliferation, survival and increased cell migration, as well as dysregulated apoptosis and oncogenesis. PI3K/AKT/mTOR pathway deregulation plays an important role in tumoral cell proliferation, growth and apoptosis in many human cancers. In the light of this information, our study aimed to investigate the antiproliferative activity of ETP 45658, a PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor, on colon cancer.
In our study, 1, 10, 25, 50, 100 μM doses of ETP 45658 were applied to HT-29 colon cancer cells and its cytotoxic effect was evaluated by XTT cell viability test. The IC50 value of ETP 45658 was calculated from the data obtained. The determined IC50 dose was given to the cells and apoptosis, cell cycle, mitochondrial membrane potential, kaspaz 3/7 studies were performed by flow cytometry. After the determined IC50 value was applied to the cell, bax, bcl, caspase 3, parp and 8-oxo-dG amounts and TAS, TOS values were measured by ELISA. It was aimed to elucidate the molecular mechanisms underlying the cytotoxic effect of ETP 45658 by administering DAPI dye to the cells after the same dose was applied. 
According to the XTT results we obtained, ETP 45658 showed a statistically significant antiproliferative effect on HT-29 colon cancer cells in a dose-dependent manner. In further studies with the calculated IC50 dose, ETP 45658 stopped the cell cycle in the G0/G1 phase, increased apoptotic proteins and decreased anti-apoptotic proteins, decreased the TAS level and increased the TOS level, and depolarized the mitochondrial membrane potential and induced apoptosis in HT-29 colon cancer cells.
As a result, ETP 45658 has been shown to have anticancer activity by stimulating apoptosis on HT-29 colon cancer cells, with its antiproliferative effect, cell cycle arrest and increasing apoptotic proteins. Considering this effect of ETP45658, targeting the PI3K/AKT/mTOR pathway in patients with colon cancer is thought to be a new treatment option. However, more in vitro and in vivo studies and clinical phase studies are needed on this subject.