Kırım kongo kanamalı ateş virüsü kelkit suşu gc glikoproteininin ökaryotik ekspresyon sisteminde üretilmesi
Production of crimean congo hemorrhagic fever virus glycoprotein gc in eukaryotic expression system
Yazar: FİLİZ GÜNEY
Danışman: PROF. DR. MEHMET ZİYA DOYMAZ
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Glikoproteinler = Glycoproteins ; Hemorajik ateş-Kırım = Hemorrhagic fever-Crimean ; Mayalar = Yeasts ; Pichia pastoris = Pichia pastoris ; Virüs hastalıkları = Virus diseases ; Virüsler = Viruses

Özet:
Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsü (KKKAV) keneler aracılığı ile taşınan bir virüs olup Afrika, Asya, Doğu Avrupa ve Orta Doğu'da etkili olan mortalite oranı %30'lara ulaşabilen bir kanamalı ateş etkenidir. KKKAV, Bunyaviridae ailesinin Nairovirüs cinsine ait olan zarflı, tek sarmallı, negatif polariteli bir RNA virüsüdür. Kene ile taşınan virüsler arasında en geniş coğrafi yayılıma sahip olması ve Dengue virüsten sonra medikal anlamda en önemli ikinci arbovirüs olması sebebi ile dikkat çekmektedir. Bunyaviridae ailesinin diğer üyelerinde olduğu gibi KKKAV'de üç adet yapısal protein barındırmaktadır. Üç segmentli bu virüsün small (S) segmentinden nükleoprotein, large (L) segmentinden RNA-bağımlı-RNA polimeraz, medium (M) segmentinden ise Gn ve Gc olmak üzere iki adet yapısal glikoprotein kodlanmaktadır. M segment open reading frame (ORF)' inden 1684 aminoasit uzunluğunda bir poliprotein üretilir. Ardından SKI-1 ve SKI-1 like proteaz ile Pre-Gn ve Pre-Gc ve posttranslasyonel kesimler sonucunda 37 kDa boyutunda Gn ve 75 kDA boyutunda Gc glikoproteinleri oluşmaktadır. Hücre yüzey reseptörleri ile etkileşime geçmeleri, virüsün konak hücreye girişini sağlamaları ve nötralizan antikorlar için hedef olmaları sebebi ile viral glikoproteinler virüslerin yaşam döngüsünde önemlidir. KKKAV'de nükleokapsit proteininin immunolojik özellikleriyle ilgili çalışmalar literatürde nispeten bulunmasına rağmen,  bu virüsün glikoproteinleri Gn ve Gc'ye yönelik çalışmalar yeni yeni ortaya konmaya başlanmıştır.
Bu çalışmada KKKAV glikopretini Gc'ye karşı humoral immün yanıtın araştırılması için fonksiyonel bir rekombinant protein üretmek hedeflenmiştir. Bu amaçla Pichia pastoris'te üretilip saflaştırılan Kelkit suşuna özgü Gc'nin otantik antijeniteye sahip olduğu, KKKAV infeksiyonu geçirmiş insan serumlarıyla yapılan Western blot ve EIA testleriyle gösterilmiştir. Gc'nin antijenitesi tavşan ile yapılan deneylerle de gösterilmiştir. Çalışmamızın sonuçları P. pastoris'in KKKAV glikoproteini Gc'yi üretmek için uygun bir model organizma olduğunu göstermiştir.
Ayrıca KKKAV glikoproteini Gc'ye özgü antikorların KKKAV infeksiyonu geçirmiş hasta serumlarında ve inaktif virüs ile infekte tavşan serumu içerisinde bulunduğu tespit edilmiştir. P. pastoris'te rekombinant olarak üretilen Gc ile diyagnostik ve bağışıklama alanlarında daha ileri düzey işlevsel çalışmalar gerekmektedir. 
Anahtar Kelimeler:  Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsü; glikoprotein; maya;  Pichia pastoris

Abstract:
Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus is an important tick borne pathogen causing haemorrhagic fever with case fatality rate of up to 30%. The disease is gaining a wider dissemination throughout  Africa, Eastern Europe and the Middle East, Eurasia and Asia. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus is a negative-sense RNA virus of the genus Nairovirus of the Bunyaviridae family. The geographic range within CCHF virus is the most extensive among the tickborne viruses affecting human health and the second most widespread of all medically important arboviruses after dengue viruses. The three genome segments encode four structural proteins—the RNA-dependent RNA polymerase (L protein) is encoded by the large (L) segment, the glycoproteins (Gn and Gc; previously referred to as G1 and G2) are encoded by the medium (M) segment, and the nucleocapsid protein (N) is encoded by the small (S) segment. Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus genome M segment encodes an unusually large (in comparison to members of other genera) polyprotein (1,684 amino acids in length) containing the two major structural glycoproteins, Gn and Gc, that are posttranslationally processed from precursors PreGn and PreGc by SKI-1 and SKI-1-like proteases, respectively. As the only virally encoded membrane proteins, Gn and Gc must interact with cell surface receptors, mediate the entry of virus into cells, and serve as targets for neutralizing antibodies. Although studies on the immunological properties of nucleocapsid protein in CCHFV have been found in the literature, studies on the glycoproteins Gc and Gn of this virus have yet to be scrutinized. In this study, we aimed to produce functional recombinant protein to be investigated humoral immune response against CCHFV Gc. For this purpose, GC from Kelkit strain produced and purified in Pichia pastoris and was tested  in EIA and Western blot assays with CCHFV-infected human sera. In the studies, the authentic antigenicity of Gc was demonstrated in 
 humans and rabbits. Studies have shown that P. pastoris is a suitable model organism to produce CCHFV glycoprotein Gc.
Further studies conducted on the diagnoctics and immunology of CCHFV with Gc produced in P. pastoris warrented.
Keywords: Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus; glycoprotein; yeast; Pichia pastoris