Gen tedavisi amacıyla DNA yüklü katı lipid nanopartikül formülasyonlarının hazırlanması
Preparation of DNA loaded solid lipid nanoparticle formulations for gene therapy
Yazar: HASAN AKBABA
Danışman: DOÇ. DR. GÜLTEN KANTARCI ; YRD. DOÇ. DR. DEVRİM DEMİR DORA
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Genetik = Genetics
Dizin: DNA = DNA ; Eczacılık = Pharmacy ; Gen tedavisi = Gene therapy ; Lipidler = Lipids ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; İlaç formülleri = Formularies ; İlaçlar = Drugs

Özet:
Çıplak DNA, nükleazlar tarafından sindirilme ve hepatik alım klirensi nedeniyle intravenöz uygulamadan sonra sirkülasyondan hızla elimine olur. Bundan dolayı, optimize DNA taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi, başarılı ve konvansiyonel klinik kullanım için önemlidir. Gen taşıma sistemleri viral ve viral olmayan vektörleri içermektedir. Viral vektörler, en etkin olanlardır ancak immünojenite ve onkojenite nedeniyle uygulamaları kısıtlıdır. Viral olmayan vektörler, bununla birlikte, daha güvenli, maliyetleri düşük ve daha tekrarlanabilirdir. Viral olmayan sistemlerin esas kısıtlayıcı faktörü düşük transfeksiyon etkinliğidir. Viral olmayan transfeksiyon sistemleri genelde katyonik peptidler, katyonik polimerler, katyonik lipidler veya bunların kombinasyonundan oluşur.Katyonik lipidler, pozitif yüklü lipidlerin fizyolojik pH'da negatif yüklü DNA ile doğrudan karıştırılmasıyla DNA-lipid komplekslerin oluşturulması için kullanılabilirler. Ancak bunların in vivo kullanımı toksisiteleri nedeniyle kısıtlıdır. Bununla birlikte, gen terapisi amacıyla ilaç geliştirmek için, in vivo transfeksiyonda kullanışlı, daha etkilili ve güvenli sistemlerin geliştirilmesi gerekmektedir. KLN'ler genelde fizyolojik olarak iyi tolere edilebilen bileşenlerden oluşur, büyük ölçekte kolayca üretilebilirler, dondurarak-kurutma gibi iyi saklama kapasiteleri vardır, sterilize edilebilirler ve intravenöz olarak enjekte edildiklerinde düşük sitotoksisite gösterirler. Bunlara ek olarak, KLN'lerin avantajı partikül yükünün, içeriği ile modüle edilebilmesi ve bunun zıt yüklü moleküllerin elektrostatik etkileşimlerle bağlanmasına imkan vermesidir. KLNler, partiküllerin mikrovasküler sisteme geçebilecek ve makrofaj alımını engelleyecek kadar küçük olduğu, bu nedenle sistemik taşıma için uygun olarak, nano-ölçekte (10-300 nm) üretilebilirler.Bu avantajlarına rağmen henüz KLN'ler gen terapisinde lipozomlar kadar yaygın olarak çalışılmamıştır. Bu nedenle, bu tezde, gen terapisi için yeni bir KLN formülasyon geliştirerek, DNA ile kompleks oluşturulmuş ve KLN-DNA komplekslerinin bileşiminin transfeksiyon kapasitesine etkisini değerlendirilmiştir. KLN'ler literatürde bulunan mikroemülsiyon dilüsyon yöntemi metodu modifiye edilerek hazırlanmıştır. Ayrıca, yük taşıyıcı olarak katyonik lipidlerde formülasyona ilave edilmiştir. Hazırlanan KLN sistemlere yeşil floresans protein ekspresyon plazmiti yüklenmiş ve daha sonra, KLN ve KLN-DNA komplekslerinin karakterizasyonu yapılmıştır. Uygun partikül büyüklüğü ve zeta potansiyel değerine sahip kompleksler ile hücre kültürlerinde transfeksiyon yeteneginin saptanması için çalışmalar yapılmıştır.

Abstract:
Naked DNA is rapidly eliminated from the circulation after intravenous administration, due to the digestion by nucleases and to the hepatic uptake clearance. Therefore, the development of optimized DNA delivery systems is necessary for its successful and conventional clinical use. Gene delivery systems include viral and non-viral vectors. Viral vectors are the most effective, but their application is limited by their immunogenicity and oncogenicity. Non-viral vectors, however, are safer, of low cost and more reproducible. The main limitation factor of non-viral systems is their low transfection ef ? ciency. Non-viral transfection systems are usually composed of cationic peptides, cationic polymers or cationic lipids, although the combination of some of them is also possible.Cationic lipids can be used to form DNA?lipid complexes by direct mixing the positively charged lipids at the physiological pH with the negatively charged DNA. However, their use in vivo is limited by the toxicity. Therefore, the development of more effective and safer systems useful for in vivo transfection is needed in order to develop medicines for gene therapy. SLN usually consists of physiologically well-tolerated ingredients already approved for pharmaceutical application in humans, can readily be produced in large scale, have good storage capabilities including freeze-drying, can be sterilised and show low cytotoxicity, when injected intravenously. In addition, the advantage of SLN is that the charge of the particles can be modulated via the composition, thus allowing binding of oppositely charged molecules via electrostatic interactions. SLN can be produced in nano-scale size (10?300 nm), wherefore the particles are suf ? ciently small to traverse the microvascular system and prevent macrophage uptake and are therefore particularly suitable for systemic delivery.SLN have not been studied as extensively as liposomes for gene therapy yet. Because of this reason, in this thesis we developed a novel SLN system, to complex it with DNA and evaluated the in ? uence of the formulation factors and the composition of DNA-SLN on transfection capacity for gene therapy. SLNs were prepared with modified microemulsion dilution method available in literature. In addition, cationic lipids were added to the formulation as charge carrier. Green Fluorescent protein expression plasmid was complexed with the prepared SLN systems. Then, SLN and DNA-SLN complexes were caracterized. Transfection study was carried out with complexes which have appropriate particle size and zeta potential value for determining transfection ability.