HT-29 ve Caco-2 hücrelerinde hiperisin ile fotoaktivasyona bağlı değişikliklerin moleküler, akış sitometrisi, immünfloresan ve spektrofotometrik yöntemler ile araştırılması
The investigation of alterations in Ht-29 and Caco-2 cells caused by photoactivation with hypericin using molecular, flow cytometric, immunfluorescence and spectrophotometric methods
Yazar: AYSUN KILIÇ
Danışman: PROF. DR. GÜLDENİZ SELMANOĞLU ; PROF. DR. MEHMET TURAN AKAY
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Hiperisin = Hypericin ; Hücre ölümü = Cell death

Özet:
Fotodinamik tedavi (PDT), özgül olarak kanserli hücrede biriken ışık duyarlı maddenin (IDM) belirli bir dalga boyundaki ışıkla uyarıldığı alternatif bir tedavi şeklidir. PDT sonucunda oluşan reaktif oksijen türleri (ROS) hücreiçi organellere hasar vererek kanser hücrelerini apoptotik ve/veya nekrotik hücre ölümüne götürmektedir. Hiperisin, Hypericum perforatum bitkisinde doğal olarak oluşan bir IDM'dir. Hiperisin antidepresif, antiviral, antineoplastik ve antitümör etkileri nedeniyle fototeşhiste ve fototedavide kullanılmaya aday olan önemli bir etken maddedir. Hiperisin ışık ile uyarıldığında 600 nm'de floresan ışıma yapmakta ve birçok kanser tipinde hücrede seçici olarak birikmektedir.Son yıllarda, kanser hücresinin yayılımını kolaylaştıran bir anti-adezyon molekülü olan disaderin bulunmuştur. Birçok kanser hücresinin yüzeyinde yer alan bir zar glikoproteini olan disaderin, hücre içinde hücre iskeleti elemanlarıyla bağlantı yapmaktadır. Bu nedenle disaderin tümör metastazı, hücre hareketliliği ve aktin filamentinin organizasyonu ile ilişkilidir.Bu çalışmada HT-29 (derece-1) ve Caco-2 (derece-2) insan kolon adenokarsinom hücreleri, yapılan ön çalışmalara göre belirlenen 0,04 µM, 0,08 µM ve 0,15 µM hiperisin ile inkübe edilmiştir. Uygulamadan 24 saat sonra beyaz floresan lambalarla ışıma yapılmıştır. Aktivasyondan 16 ve 24 saat sonra hiperisinin hücre canlılığına etkisi tripan mavisiyle boyanarak ve MTT testi ile; metabolik aktivite glukoz, laktat miktarlarının ve laktat dehidrogenaz (LDH) aktivitesinin ölçülmesi ile; hücredeki ölüm tipi akridin oranj/propidyum iyodür (AO/PI) ve DAPI boyaması ile; morfolojik değişiklikler Giemsa boyaması ile tespit edilmiştir. Disaderin ve filamentöz aktin (F-aktin) proteinleri immünfloresan (IF) boyama ile floresan ataşmanlı inverted mikroskopta görüntülenmiştir. Ayrıca disaderinin RNA düzeyinde ifadesi reverse transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) ile incelenmiştir. Hiperisinin hücre içine alımı ve hücre döngüsündeki değişiklikler akış sitometri analizleriyle tespit edilmiştir.Çalışmadan elde edilen sonuçlara göre, HT-29 ve Caco-2 hücreleri için hiperisin konsantrasyonundaki artışa bağlı olarak hiperisinin sitotoksik etkisi artmış, farklı oranlarda apoptotik ve nekrotik hücre ölümü gözlenmiştir. AO/PI boyamalarına göre, HT-29 hücrelerinde aktivasyondan 24 saat, Caco-2 hücrelerinde ise 16 saat sonra apoptotik hücre ölümü en fazla 0,08 µM hiperisin grubunda, nekrotik hücre ölümü ise 0,15 µM hiperisin grubunda görülmüştür. Her iki hücrede hiperisin konsantrasyonundaki artışla glukoz tüketimi ve laktat üretimi azalırken, LDH aktivitesi artmıştır. Disaderinin IF boyamasının her iki hücrede özellikle 0,15 µM hiperisin uygulamasından sonra azalması, RNA düzeyindeki azalmayla uyumlu bulunmuştur. Ayrıca F-aktin'in immünfloresan boyamalarına göre, hiperisin konsantrasyonundaki artışla hücreiçi aktin stres fibrilleri azalırken, aktin agregatları artmıştır. Akış sitometri sonuçlarına göre özellikle 0,08 µM hiperisin uygulaması, HT-29 ve Caco-2 hücrelerinde hücre döngüsünün G2/M fazında durmasına neden olmuştur.

Abstract:
Photodynamic therapy (PDT) is an alternative therapeutic modality based on administration of photosensitizer which is specifically accumulated in cancer cells when activated by local irradiation with light of an appropriate wavelength. PDT triggers with damage to intracellular organelles by producing highly cytotoxic reactive oxygen species (ROS) which cause cancer cell death either by apoptosis or necrosis. PDT is a promising therapeutic modality for cancer treatment; however, a more detailed understanding is needed to improve the clinical use of this therapy.Hypericin is a photosensitizer which is occured naturally in Hypericum perforatum plant. It is a target agent in photodiagnosis and photodynamic therapy because of its antidepressive, antiviral, antineoplastic, antitumor activities. Hypericin exhibits bright fluorescence at approximately 600 nm when stimulated with light and preferantially accumulated in various types of cancer cells. In recent years, dysadherin which is an anti adhesion molecule was discovered. It is a membrane glycoprotein which has connection with intracellular cell cytoskeletal proteins. It has important role in facility of metastasis and related with cell motility and organisation of actin filament.In this study, HT-29 (grade-1) and Caco-2 (grade-2) human colon adenocarcinoma cells treated with 0,04 µM, 0,08 µM or 0,15 µM hypericin concentrations and after 24 hours cells were irridated with fluorescent lamps. The effects of hypericin examined 16 and 24 hours after the activation. The effect of hypericin on cell viability analysed with trypan blue staining and MTT test; amounts of glucose, lactate and activity of LDH were measured for the metabolic activity; cells were stained with AO/PI and DAPI for determining the type of cell death and with Giemsa for evaluating the morphological changes. Dysadherin and F-actin were examined with immunfluoresence (IF) staining under inverted microscope. Besides, dysadherin expression was determined in RNA level with RT-PCR. Hypericin content of cells and cell cyle analysis were performed in flow cytometry.According to the results, in HT-29 and Caco-2 cells as hypericin concentration increased cytotoxicity increased, and the different percentages of apoptotic and necrotic cell death were observed. According to the AO/PI stainings, in HT-29 cells after 24 hours and in Caco-2 cells after 16 hours from the activation apoptosis induced mostly in 0,08 µM hypericin group and necrosis in 0,15 µM hypericin group. In both cells, while glucose consumption and lactate production decreased, the activity of LDH increased depending on the hypericin doses. The decrease in dysadherin IF stainings especially in 0,15 µM hypericin treatment, were parallel to the decreased expression of dysadherin in RNA level. Besides, F-actin IF results showed that according to the increase of hypericin concentration while actin stress fibers decreased, actin agregates increased. According to the cell cycle analysis in flow cytometer especially 0,08 µM hypericin treatment caused G2/M arrest in HT-29 and Caco-2 cells.