SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinde oluşturulan parkinson hastalığı modelinde  mitokondri hedefli tedavinin hücre koruyucu etkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of the cytoprotective effect of mitochondria targeted therapy in the parkinson disease model in SH-SY5Y neuroblastoma cells
Yazar: KÜBRA ÇELİK
Danışman: PROF. DR. DİLEK TAŞKIRAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı / Sinirbilim Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Fizyoloji = Physiology ; Nöroloji = Neurology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Mitokondriler = Mitochondria ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; Parkinson hastalığı = Parkinson disease ; Reaktif oksijen türleri = Reactive oxygen species ; Rotenon = Rotenone ; Tedavi = Treatment

Özet:
Amaç: Hücrelerin enerji metabolizmasında yer alan ana organel olan mitokondri sinyal iletiminden hücre ölümüne kadar birçok hücresel süreci kontrol eder. Bunun yanısıra nörodejeneratif hastalıkların ve daha birçok hastalığın patogenezine de katkıda bulunur. Son yıllarda doğrudan mitokondriyi hedefleyen ve mitokondride biriken çeşitli farmakolojik ajanlar geliştirilmiş olup birçok nörodejeneratif hastalık modelinde iyileştirici etkileri gözlemlenmiştir. Bu çalışmanın amacı mitokondri hedefli bir ajan olan Mitotempo'nun SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinde rotenon kaynaklı nörotoksisite üzerine koruyucu etkisinin olup olmadığının araştırılmasıdır.
Yöntemler: İnsan nöroblastoma SH-SY5Y hücreleri 5x103 hücre/kuyuda olacak şekilde 96'lık plakalara ekildikten sonra 24 ve 48 saat boyunca farklı dozlarda rotenon ile inkübe edildi. Daha sonra, nöroprotektif etkisini değerlendirmek üzere rotenon tedavisinden 2 saat önce kültürlere çeşitli dozlarda MitoTempo (10, 100 ve 1000 µm) ilave edildi. Hücre canlılığı MTT testi ile değerlendirildi. Apoptotik hücre ölümü, Hoechst 33258 nükleer boyama ve western blot (bax, bcl2 ve kaspaz 3) analizi ile tayin edildi. Reaktif oksijen türlerinin (ROT) oluşumu 2',7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA) oksidasyon yöntemi ile değerlendirildi. Ayrıca hücrelerdeki mitokondri yoğunluğu ve dağılımı MitoTracker yeşil boyaması ile floresan mikroskobunda incelendi.
Sonuçlar: Çalışmanın sonuçları rotenon hücrelerde önemli ölçüde ve doza bağlı olarak sitotoksik etkiler gösterdiğini ortaya koydu (IC50=250 nM). MitoTempo ile hücrelerin ön muamelesi, rotenonun toksik etkilerine karşı hücre canlılığını korudu (p<0.001). Rotenon uygulanan hücreler, nükleer fragmantasyon ve kondansasyon, bax/bcl2 seviyeleri ve kaspaz-3 ekspresyonunda artış gibi önemli apopitotik değişiklikler gösterirken, MitoTempo bu değişiklikleri önemli ölçüde azalttı. Ayrıca MitoTempo, rotenon uygulamasına bağlı aşırı ROT oluşumunu engelledi. MitoTracker yeşil boyaması, rotenon uygulanan grupta mitokondri yoğunluğu ve lokalizasyonunda önemli değişiklikleri ortaya koydu. Öte yandan, yüksek doz MitoTempo uygulanan hücrelerde mitokondriyal yoğunluğun daha iyi durumda olduğu gözlendi.
Sonuç: Bu sonuçlar, MitoTempo'nun rotenon kaynaklı nörotoksisiteye karşı faydalı etkileri olabileceğini düşündürmektedir. Gelecekte yapılacak in vivo ve klinik çalışmalar Parkinson hastalığında yeni bir yaklaşım olan mitokondri hedefli tedavinin etkilerini daha iyi ortaya koyacaktır.

Abstract:
Aim: Mitochondria are the main organelles involved in the energy metabolism and control several cellular processes from signaling to cell death. They also contribute to the pathogenesis of many diseases as well as neurodegenerative diseases. In recent years, various pharmacological agents that directly target and accumulate in the mitochondria have been developed, and their healing effects have been observed in many neurodegenerative disease models. In this study, we aimed to investigate the effects of MitoTempo, a mitochondria-targeted agent, on rotenone-induced neurotoxicity in SH-SY5Y neuroblastoma cells.
Methods: SH-SY5Y cells were seeded into 96-well plates at 5x103 cells/well and incubated with different doses of rotenone for 24 and 48 hours. Then, various doses of MitoTempo (10, 100 and 1000 µm) were added into the cultures 2 hours prior to rotenone treatment to assess its neuroprotective effect. Cell viability was evaluated by MMT assay. Apoptotic cell death was determined by using Hoechst 33258 nuclear staining and western blot (bax, bcl2 and caspase 3). Formation of reactive oxygen species (ROS) was evaluated by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) oxidation method. Also, the activation of mitochondria was explored by using MitoTracker Green dye under fluorescence microscope.
Results: Rotenone exhibited significantly and dose-dependently cytotoxic effects (IC 50=250 nM). Pretreatment of cells with MitoTempo significantly protected cell viability against rotenone (p<0,001). Cells treated with rotenone showed significant apoptotic alterations such as nuclear fragmentation and condensation, increased levels of bax/bcl2 and cleaved caspase-3, while MitoTempo significantly reduced these changes. Also, MitoTempo decreased the excessive ROS formation due to rotenone treatment. MitoTracker Green staining showed significant changes in mitochondria density and localization in rotenone-treated group. On the other hand, it was observed that mitochondrial density was not affected much in high dose MitoTempo pretreated cells.
Conclusion: These results suggested that Mitotempo may have beneficial effects against rotenone-induced neurotoxicity Future in vivo and clinical studies would demonstrate the effects of mitochondria-targeted therapy, a new approach in the treatment of Parkinson's disease.