Badem (Amygdalus communis L.) proteinlerinden lipaz izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi
Purification and characterization of lipase from almond (Amygdalus communis L.) seed
Yazar: LALECAN BAŞKURT
Danışman: YRD. DOÇ. DR. YEŞİM YEŞİLOĞLU
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2005
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Badem = Almond tree ; Lipaz = Lipase ; Prunus dulcis = Prunus dulcis

Özet:
Lipazlar (triaçilgliserol açilhidrolazlar, EC 3.1.1.3), gliserol ve uzun zincirli yağ asitlerinden ester fonnlannın hidrolizini ve sentezini katalizleyen enzimlerdir. Gelişen kullanım alanları ve yüksek değerde bileşiklerin sentezlerindeki pek çok uygulamaları nedeniyle, biyolojik proseslerdeki yeri ve önemi gittikçe artmaktadır. Bu çalışmada, 'yaltinski' türü olarak bilinen badem tohumundan lipaz enziminin izole edilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu amaçlandı. Badem proteinlerinin yağsızlaştırılmasından sonra, amonyum sülfat çöktürmesi (0-90) ve diyaliz metodlan uygulanarak badem tohumu lipaza 5.34 kat saflaştınldı. Her saflaştırma basamağında Lowry metoduna göre protein tayini ile her fraksiyon için lipaz aktivitesi tayini titrimetrik metod kullanılarak yapıldı. Saflaşürılan enzimin molekül ağırlığı, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ~21 kDa olarak belirlendi. Saflaştınlan badem tohumu lipazı pH: 8.5 ve 65°C'de maksimum aktivite, alkali şartlarda (pH: 7.0-10.0) ve 40-70°C arahğmda ki sıcaklıklarda kararlılık gösterdi. Badem tohumu lipazımn, substrat olarak tribütirin ve doğal kaynaklı substratlardan soya yağma karşı daha spesifik olduğu belirlendi. Badem tohumundan elde edilen lipazın depo kararlılığını belirlemek amacıyla, bir yıl süreyle enzim denemeleri gerçekleştirildi. -20°C'de 11. ayın sonunda enzim aktivitesinin yaklaşık % 80' inin korunduğu gözlendi. Erızimin izoelektrik noktası 6.0 olarak belirlendi. 1.0 mM CaCİ2 varlığında, lipaz aktivitesi önemli ölçüde (% 37) arttı. Substrat olarak Mbütirine karşı saflaştınlan badem tohumu lipazmm Km ve Vnm değerleri sırasıyla 25 mM ve 1 13.63 U/dk.mg.enzirn olarak hesaplandı. Badem tohumu lipazımn aktivasyon enerjisi Ea= -5473.6 cal/mol olarak hesaplandı. Metal iyonu etkisi incelendiğinde, Fe2*, Co2+, Mn2+, Ba2* ve Ca2+ iyonlan hidrolitik aktiviteyi arttuırken, Mg^'nin aktiviteyi azalttığı, Cu2+ ve Ni2+'in inbibe ettiği ve EDTA'nın değiştirmediği belirlendi. Enzim aktivitesi üzerine farklı iyonik ve non-iyonik deterjanlarınIV etkileri de araştırıldı. İyonik deterjanlardan CTAB ve SDS lipaz aktivitesini inhibe etti. Sodyum deoksikolat ve Triton X-100 lipaz aktivitesini arttırırken, Triton X-405 ve DTAB etki etmedi. Son olarak, aktivite üzerine inhibitor etkisi araştırıldığında ise inhibitor olarak kullanılan maddeler içinden sadece sistein, potasyum ferrisiyanür, tİyoasetamid ve ûre'nin inhibisyona neden olduğu gözlendi. Anahtar Kelimeler: Badem (Amygdalus communis L.) tohumu, lipaz, saflaştırma ve karakterizsyon.

Abstract:
Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are enzymes that catalyze the hydrolysis and the synthesis of esters formed from glycerol and long-chain fatty acids. In view of the increasing understanding of lipases and their many applications in high-value compounds synthesis and as bulk enzymes, these enzymes are having an increasing impact on bioprocessing. In this study, it was aimed that lipase enzyme from almond seed identified as 'yaltinski' species was isolated, purified and characterized. Lipase from almond seed was purified 5.34 fold to homogeneous state by ammonium sulfate precipitation (0-90) and dialyse after by defatting from almond proteins. At each purification step, it was defined by using titrimetric assay lipase activity determination for each fraction with protein assay according to Lowry Method. The molecular weight of purified enzyme was determined as ~21 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Purified lipase from almond seed exhibited the maximum activity at pH: 8.5 and 65°C, stable under alkaline conditions (pH: 7.0-10.0) and at temperatures 40-70°C. Lipase from almond seed was determined to be more specific versus soybean oil among the natural oils and Iributirin as substrate. To determine the storage stability of lipase from almond seed, the activity assays carried out for a period of one year. It was observed that about 80 % of its activity was retained at the end of 1 1th months at -20°C. The isoelectric point (pi) of enzyme was defined as 6.0. In the presence of 1.0 mM CaCİ2, the lipase activity was considerably increased by 37%. Km and V^ax values of purified lipase from almond seed versus tributirin as substrate was calculated as 25 mM and 113.63 U/dk.mg.enzyme., respectively. Activation energy (Ea) of lipase from almond seed was calculated as -5473.6 cal/mol. When the effect of different ions were examined, the hydrolytic activity was enhanced by Fe2+, Co2+, Mn2+, Ba2+ and Ca2+, but was reduced by Mg2+, was inhibited by Cu2+ and Ni2+,VI while EDTA had no effect. The effect of different ionic and non-ionic detergents on enzyme activity was investigated too. From the ionic detergents CTAB and SDS inhibited lipase activity. Activity was enhanced by sodium deoxicholat and Triton X-100 while Triton X-405 and DTAB had no effect. Finally, when the effect of inhibitors was investigated, it was seen that only cysteine, potassium ferri-cyanide, tioacedamid and urea caused an inhibition on enzyme activity among the other inhibitors. Keywords: Almond (Amygdalus communis L.) seed, lipase, purification and characterization.