Baldaki aminoglikozitlerin tek tüp içerisinde in-situ sulu faz   türevlendirme sonrasında kütle spektrometresi ile tayin edilmesi
One pot in-situ aqueous derivatization and subsequent determination of aminoglycosides in honey by means of mass spectrometry
Yazar: SEZER ACAR
Danışman: PROF. DR. ECE KÖK YETİMOĞLU
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Günümüzde arıcılıkta birçok zararlı böcek ve hastalıklarla mücadele söz konusudur. Bu hastalıklardan en yaygın olanları Amerikan yavru çürüklüğü (AFB), Avrupa yavru çürüklüğü (EFB) ve Nosemosis'tir. Arıcıların kovanlarını bu hastalıklardan korumak için yaygın olarak kullandığı tekniklerden biri de antibiyotik ilaçların kullanılmasıdır. Arı hastalıklarını azaltmak veya önelemek için kullanılan antibiyotikler, baldaki kalıntı sorununun ana nedenlerindendir. Arıcılıkta yaygın olarak kullanılan antibiyotiklerden biri de aminoglikozit grubu olanlardır. Aminoglikozitler gram-negatif bakteriler üzerinde protein sentezini inhibe ederek bakterisid etki gösteren, geniş spektrumlu farmasötik moleküllerdir. Gıda ve ilaç endüstrisinde kalite kontrol ve Ar-Ge amaçlı analizleri gerçekleştirilen birçok alt grubu bulunmaktadır. Streptomisin ve dihidrostreptomisin, arıları çeşitli hastalıklara karşı korumak için yaygın olarak kullanılan aminoglikozidlerin en bilinen alt tipleridir. Bunlar yanlış uygulamalar nedeniyle arı ürünlerinde kalıntıya sebep olabilmektedirler. Aminoglikozit analizleri için piyasada özel sentezlenmiş antikorlar ile üretilen katı faz ekstraksiyon kartuşları veya ELISA kitleri bulunmaktadır. Bunlar tekrarlanabilirlikten uzak, total aminoglikozit sonucu veren, hassasiyetleri ve geri kazanım seviyeleri düşük analiz kitleridir. Buna karşın literatürde hassasiyet seviyeleri nispeten daha yüksek fakat tekrarlanabilirlik açısından problemli olan kromatografik teknikler de mevcuttur. Bu yöntemler genel olarak Katı-Faz Mikroekstraksiyon, Kolon sonrası eş zamanlı türevlendirme, UV, FL Dedektörler, Kütle spektrometresi ile kombine edilebilen İyon Çifti Kromatografisi ve Kapiler Elektroforez teknikleridir. Ancak bu tekniklerin de ön hazırlık süreçleri uzun ve yorucudur. Bu tez çalışmasında baldaki aminoglikozit grubu antibiyotiklerden streptomisin ve dihidrostreptomisin kalıntılarının belirlenmesi için numune hazırlama yaklaşımı in-situ sulu faz türevlendirme tekniği ile seyrelt ve enjekte et şeklinde geliştirilmiştir. UHPLC-MS / MS sistemi kullanılarak pratik, düşük maliyetli, 5 dakika gibi kısa süreli ve düşük limitlerde dedeksiyon sağlayan bir analiz yöntemi ile numune hazırlama işlemleri minimuma indirilmiştir. Kullanıcı dostu olan yeni yöntemle yurtdışı tedarikli kit bağımlılığını ortadan kaldırmış olarak, daha hassas, tekrarlanabilir ve her aminoglikozit grubu antibiyotiğe ayrı ayrı cevap verebilme imkanı sağlanacaktır. Ayrıca referans nitelik sağlayacak olan bu yöntem, et, süt gibi diğer gıda numuneleri ve ilaç etken madde kalite kontrol testlerinde analiz edilen diğer aminoglikozit grubu antibiyotiklerin tespitinde de yurtiçi ve yurt dışı, kalite-kontrol, Ar-Ge ve akademik laboratuvarlara büyük katkı sağlayacaktır.
Seçicilik, doğrusallık, doğruluk, kesinlik, sağlamlık ve CCα & CCβ parametreleri üzerinden validasyon çalışmaları yapılmış olup, 5,10, 15, 20, 50, 100 μg/kg konsantrasyonlarında doğrusallık çalışmaları yapılmıştır. Geri kazanım değerleri, streptomisin için %102,65 iken, dihidrostreptomisin bu değer %101,26 olarak tespit eddilmiştir. Kesinlik çalışmalarında, tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik için her iki parametrede de ortalama % RSD değerleri %0,7 ile %13,2 arasında gözlenmiştir. CCα ve CCβ değerleri, streptomisin için 5,69 ve 6,18 iken, dihidrostreptomisin bu değerler 5,82 ve 6,40 olarak tespit edilmiştir. Toplam 110 adet bal numunesi analiz edilmiş olup, 5 adet numunede streptomisin tespit edilmiş olup, 27 adet numunede de dihidrostreptomisin kantitasyon limiti üzerinde tespit edilmiştir.

Abstract:
In beekeeping, there is a struggle against many pests and diseases. The most common bee diseases are American foulbrood (AFB), European foulbrood (EFB) and Nosemosis. One of the techniques commonly used by beekeepers to protect their hives from these diseases is the use of antibiotics. Antibiotics used to reduce or prevent bee diseases are one of the main causes of the residue problem in honey. One of the antibiotics commonly used in beekeeping is the aminoglycoside group. Aminoglycosides are broad-spectrum pharmaceutical molecules that show bactericidal action by inhibiting protein synthesis on gram-negative bacteria. There are many subtypes that are analyzed for quality control and R&D purposes in the food and pharmaceutical industry. Streptomycin and dihydrostreptomycin are the most well-known subtypes of aminoglycosides widely used to protect bees against various diseases. However, due to misapplication, they can cause drug residue in bee products. In the literature, for aminoglycoside analysis, there are many applications that use immunoaffinity solid phase extraction (SPE) cartridges or ELISA kits produced with specially synthesized antibodies. However, these techniques are far from repeatability, giving a total aminoglycoside result, low sensitivity, and low recovery levels. On the contrary, there are also chromatographic techniques in the literature with relatively high sensitivity levels but problematic in terms of reproducibility. These techniques include solid-phase microextraction, post-column simultaneous derivatization, UV, FL detectors, ion-pair chromatography combined with mass spectrometry and capillary electrophoresis.However, the preliminary preparation processes are tedious and time-consuming at these techniques. In this thesis, the sample preparation approach for the determination of aminoglycoside group antibiotics streptomycin and dihydrostreptomycin residues in honey was developed as dilute and shoot using in-situ aqueous derivatization technique. Using a UHPLC-MS/MS system, sample preparation was minimized with a practical, low-cost, short-time (5 minutes) and low-limit detection method. The new user-friendly method will eliminate the dependency on foreign-supplied kits and will provide a more sensitive, reproducible and individual response to each aminoglycoside group of antibiotics. Furthermore, this method will make a great contribution by serving as a reference method for many R&D, quality control, and university laboratories in the determination of other aminoglycoside-type active substances in meat, milk, and pharmaceuticals matrices.
We have performed validation studies on selectivity, linearity, accuracy, precision, robustness and CCα & CCβ parameters, and linearity studies were performed at concentrations of 5, 10, 15, 20, 50, 100 μg/kg. The recovery value is 102,65% for streptomycin and  101,26% is for dihydrostreptomycin. For accuracy studies, % RSD values were observed on average between 0,7% and 13,2% in both parameters for reproducibility and reproducibility. CCα & CCβ values are 5,69 and 6,18 for streptomycin and for dihydrostreptomycin CCα & CCβ values are 5,82 and  6,40. Streptomycin was screened in 5 samples above 5ug/kg level on a total of 110 honey samples analyzed and dihydrostreptmycin was screened in 27 samples above 5ug/kg level on a total 110 honey samples.