Sorafenib dirençli Huh7 hücrelerinde sorafenib direncini geri çevirmede yeni bir tedavi hedefi: Depo kontrollü kalsiyum girişi
A novel therapeutic target for reversing sorafenib resistance in sorafenib-resistant Huh7 cells: Store-operated calcium entry
Yazar: BESTE YURDACAN YAŞAR
Danışman: PROF. DR. YASEMİN ERAÇ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı / Farmakoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Hepatoselüler karsinoma (HSK), küresel olarak kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedenidir ve genellikle kronik karaciğer hastalıkları zemininde ortaya çıkmaktadır. Erken evre HSK'da cerrahi tedaviler uygulanabilse de HSK hastalarının birçoğunun kronik karaciğer rahatsızlıklarının bulunması ve ileri evrede tanı almaları sebebiyle tedavi seçenekleri kısıtlanmaktadır.  İleri evre HSK'nın sistemik tedavisinde kullanılan Sorafenib (SOR) HSK tedavisinde onaylı birinci basamak ajandır ve Ras/Raf/MEK/ERK sinyal yolaklarını baskılayarak tümör hücresi proliferasyonunu inhibe etmektedir. SOR tedavisi alan hastaların yaklaşık %30'unun SOR'dan fayda görmesi ve bu hasta grubunun genellikle 6 ay içinde ilaca direnç geliştirmesi sebebiyle HSK'da kemorezistansın üstesinden gelinmesi ve spesifik tedavi seçeneklerinin keşfedilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. 
Depo kontrollü Ca+2 girişi (SOCE) uyarılamayan hücrelerde anjiyogenez, metastaz, hücre göçü, EMT ve ilaç yanıtları gibi birçok sürecin kritik düzenleyicisidir. HSK'da SOCE'nin ve SOCE moleküler bileşenlerinin  proliferasyon, hücre göçü, metastaz ve apoptoz üzerindeki etkilerinin yanında, HSK hücrelerinde gelişen kemorezistansta direnci geri çevirebilme potansiyelinin belirlenmesi sonucu HSK'da SOCE'nin potansiyel bir tedavi hedefi olduğu düşünülmektedir. 
Bu bilgiler ışığında tez çalışmasında SOR direnci geliştirilen Huh7 hücrelerinde (SRHuh7) SOCE'nin farmakolojik olarak inhibisyonu (SKF-96365) ve SOCE'nin moleküler komponenti TRPC1'in baskılanması ile kemorezistans üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Huh7 ve SRHuh7 hücrelerinde SOR, SKF-96365 ve SKF-96365+SOR uygulamaları ve TRPC1 baskılanması ile 1)hücrelerin proliferasyon kalıpları, 2) hücre içi Ca+2 dinamiklerindeki değişimler 3) SOCE ilişkili (TRPC1, TRPC6, STIM1 ve Orai1) MDR (MDR1) ve EMT (Vimentin, N-kaderinin ve E-kaderinin) ilişkili genlerin mRNA ve protein ekspresyon düzeyleri, 4)apoptoza bağlı hücre ölümü, 5)hücre göçü düzeyleri ile migrasyon yetenekleri belirlenmiştir. Ayrıca elde edilen bulguların kliniğe yansımasını araştırmak amacıyla çeşitli veritabanlarında (GEPIA, GEO, Kaplan-Meier) in silico analizler gerçekleştirilmiştir.
Bulgularımız parental hücrelere kıyasla SRHuh7 hücrelerinde ER Ca+2 salıverilişi, SOCE ve SOCE ile ilişkili mRNA ve protein düzeylerinde arttığı göstermiş, sonuç olarak SOR direninde SOCE'nin rolü olabileceğini göstermektedir. 
SRHuh7 hücrelerinde SOCE'nin farmakolojik inhibisyonu ve TRPC1 ekspresyonunun baskılanması sonucu proliferasyon hızında ve MDR ilişkili mRNA/ protein ekspresyon düzeylerinde azalış belirlenmiştir. Bunun yanında apoptotik düzeylerini artırmıştır. Dirençli hücrelerde artan EMT ve migrasyon düzeyleri SOCE inhibisyonu ile azalmıştır. İn siliko analiz sonuçlarımız bulgularımızla uyumlu olarak SOR tedavisi alan HSK hastalarında SOCE'yi hedefleyen terapötik yaklaşımların SOR direncini engelleyebilecek veya geciktirebilecek bir tedavi hedefi olabileceğini göstermiştir.
Tez çalışmasından elde edilen bulgular SOR dirençli hücrelerde SOCE sinyal yolağının önemli bir rolü olabileceğini ortaya koymuştur. Dirençli hücrelerdeki SOCE artışının direnç gelişiminde bir neden mi yoksa direnç gelişim sürecinin bir sonucu olarak mı ortaya çıktığının belirlenmesi için yeni çalışmaların yapılması gerekmektedir. Bulgularımız zenograf deney modellerinde, SOCE inhibisyonunun tümör oluşumu ve tümör boyutu üzerindeki etkilerinin in vivo olarak incelenmelidir.

Abstract:
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second leading cause of cancer-related deaths worldwide and often arises in the context of chronic liver diseases. While surgical treatments are applicable in early-stage HCC, most patients have limited treatment options due to the presence of chronic liver conditions and late-stage diagnosis. Sorafenib (SOR), used in the systemic treatment of advanced HCC, is the only first-line agent approved for HCC treatment and inhibits tumor cell proliferation by targeting the Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathways. However, since only about 30% of patients benefit from SOR and most develop resistance within six months, there is an urgent need to overcome chemoresistance in HCC and discover specific treatment options.
Store-operated Ca²⁺ entry (SOCE) is a critical regulator of various processes, including angiogenesis, metastasis, cell migration, EMT, and drug responses, in non-excitable cells. The effects of SOCE and its molecular components on proliferation, migration, metastasis, and apoptosis in HCC, as well as their potential to reverse resistance in chemoresistant HCC cells, suggest that SOCE could be a potential therapeutic target in HCC.
In this context, this thesis investigates the effects of pharmacological inhibition of SOCE (SKF-96365) and the inhibition of the SOCE molecular component TRPC1 on chemoresistance in Sorafenib-resistant Huh7 cells (SRHuh7). The study evaluates 1) cell proliferation patterns, 2) intracellular Ca²⁺ dynamics, 3) mRNA and protein expression levels of SOCE-related (TRPC1, TRPC6, STIM1, and Orai1), MDR-related (MDR1), and EMT-related genes (Vimentin, N-cadherin, and E-cadherin), 4) apoptosis-induced cell death, and 5) cell migration levels and migratory capabilities in Huh7 and SRHuh7 cells under SOR, SKF-96365, SKF-96365+SOR treatments, and TRPC1 suppression. Additionally, in silico analyses were performed using various databases (GEPIA, GEO, Kaplan-Meier) to investigate the clinical relevance of the findings.
Our findings demonstrate that, compared to parental cells, SRHuh7 cells exhibit increased ER Ca²⁺ release, SOCE, and elevated mRNA and protein levels associated with SOCE, suggesting a role for SOCE in resistance. Pharmacological inhibition of SOCE and suppression of TRPC1 expression in SRHuh7 cells resulted in reduced proliferation rates and decreased MDR-related mRNA and protein expression levels, while apoptotic levels increased. Furthermore, elevated EMT and migration levels in resistant cells were reduced with SOCE inhibition. In silico analysis results, consistent with our findings, indicate that targeting SOCE in HCC patients receiving SOR treatment could be a therapeutic approach to prevent or delay the development of SOR resistance.
The findings from this study suggest that the SOCE signaling pathway may play a significant role in Sorafenib-resistant cells. Further studies are needed to determine whether the increase in SOCE observed in resistant cells is a cause of resistance development or a consequence of the resistance process. Our results indicate that in vivo studies using xenograft models are necessary to investigate the effects of SOCE inhibition on tumor formation and tumor size.