Farklı hidroliz yöntemleriyle bazı sebzelerden elde edilen sebzelerin fitoöstrojenlerin HPLCve GC-MS ile belirlenmesi
HPLC and GC-MS identification of some vegetables?s phytoestrogens obtained by using different hydrolization methods
Yazar: NEVZAT KONAR
Danışman: PROF. DR. NEVZAT ARTIK
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Sebzeler = Vegetables

Özet:
Bu çalışmada 6 farklı sebzenin yenilebilir kısımlarının içermekte oldukları serbest isoflavon (biochanin A, formononetin, genistein, daidzein ve glycitein), konjuge isoflavon (sissotrin, ononin, genistin, daidzin ve glycitin), lignan (secoisolariciresinol ve matairesinol), coumestan (coumestrol) ve diğer flavonoidler (apigenin, quercetine ve rutin) gibi fitoöstrojenik aktiviteye sahip bileşik konsantrasyonları farklı örnek hazırlama yöntemleri uygulanması sonrasında çeşitli kromatografik teknikler kullanılarak belirlenmiştir. Çalışma kapsamında uygulanan örnek hazırlama yöntemleri metanol ve seyreltik HCl ile direkt ekstraksiyon, derişik HCl ve inkübasyon ile asit hidrolizi, selülaz, ß-glucosidase ve ß-glucuronidase enzimleri ve inkübasyon ile enzimatik hidroliz ve enzimatik ve asit hidrolizlerinin birlikte uygulandığı çoklu hidroliz olmuştur. Kromatografik tekniklerden ise HPLC (HPLC-DAD ve LC-MS/MS) ile GC-MS kullanılmıştır. Tekrarlanabilirlik ve hassasiyet gibi faktörler (tayin limiti aralığı 0.9-3.0 ppb) nedeni ile en etkin yöntem LC-MS/MS olarak belirlenmiştir. Tüm sebze örneklerinde majör fitoöstrojenik bileşik secoisolariciresinol olarak saptanmış olup, bunlar arasında yeşil fasulye ise 9140.4 ppb ile en yüksek konsantrasyona sahip olan olarak belirlenmiştir. Bu sebze diğer flavonoidler açısından da 101.7 ppb'lik düzeyde konsantrasyon ile yine ön plana çıkmıştır. İsoflavon konsantrasyonu en yüksek olan sebze ise 113.7 ppb ile enginardır. Tüm örneklerde tespit edilen en yüksek konsantrasyona sahip isoflavon ise 109.9 ppb ile enginar bileşiminde bulunan glycitein olmuştur. Yeşil fasulye örneklerinde yer alan rutin ise 101.7 ppb ile teayin edilen en yüksek diğer flavonoiddir. Sebze örneklerinin toplam fitoöstrojenik madde düzeyleri 2.3-9.3 ppm aralığında değişiklik göstermekte olup, taze fasulye 9.3 ppm ile en yüksek, karnabahar 2.3 ppm ile en düşük konsantrasyona sahip olanlardır. Örneklerin hiç birinde coumestrol, daidzin, glycitin, ononin ve sissotrin tespit edilememiştir. Araştırma verileri, toplam isoflavon ve diğer flavonoid tayinleri için sebzelerde enzimatik hidroliz, toplam lignan tayini için ise çoklu hidroliz yöntemlerinin etkili olduğunu ortaya koymuş olmakla birlikte bileşikler bazında bu küçük değişiklikler gösterebilmektedir. DPPH yöntemi kullanılarak kapsam dahilindeki sebzelerin EC50 değerleri de belirlenmiş, bu değerlerin 10.4-750.7 µL aralığında olduğu, en düşük değere 10.4 µL ile enginarın, en yüksek değere ise 750.7 µL ile havucun sahip olduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
This study identified concentrations of phytoestrogenic compounds such as free isoflavones (biochanin A, formononetin, genistein, daidzein and glycitein), conjugated isoflavones (sissotrin, ononin, genistin, daidzin and glycitin), lignans (secoisolariciresinol and matairesinol), coumestan (coumestrol) and other flavonoids (apigenin, quercetine and rutin) contained by the edible parts of six different vegetables. using different chromatographic methods after different sample preparation methods. Sample preparation methods used in the study included basic extraction with methanol and diluted HCl, acid hydrolysis with concentrated HCl and incubation, enzymatic hydrolysis with cellulose, ß-glucosidase and ß-glucuronidase enzymes and incubation and multiple hydrolysis with collective use of enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis. Among chromatographic methods, HPLC (HPLC-DAD and LC-MS/MS) and GC-MS were used in the study. The most effective method was found to be LC-MS/MS due to factors of repeatability and sensitivity (range of quantification limit 0.9-3.0 ppb). Major phytoestrogenic compound was found to be secoisolariciresinol in all vegetable samples with the highest concentration in green bean (9140.4 ppb). This vegetable was also significant for other flavonoids with a concentration of 101.7 ppb. Artichoke had the highest isoflavone concentration with 113.7 ppb. The highest level of isoflavone identified in all samples was glycitein in artichoke (109.9 ppb). On the other hand, rutin contained by green bean samples was the other flavonoid with the highest concentration (101.7 ppb). Total phytoestrogenic substance amounts of vegetable samples varied between 2.3-9.3 ppm. Green bean had the highest concentration (9.3 ppm) while cauliflower had the lowest concentration (2.3 ppm). Coumestrol, daidzin, glycitin, ononin and sissotrin could not be identified in any of the samples. Although study data revealed that enzymatic hydrolysis was effective for flavonoid identification and multiple hydrolysis method was effective for identification of total lignan, compounds can show small variations. EC50 values of the vegetables in the study were identified using DPPH method. It was found that these values varied between 10.4-750.7 µL and artichoke had the lowest value (10.4 µL) while carrot had the highest value (750.7 µL).