Kültür ortamında farklılaşan sıçan ve köpek kemik iliği stroma hücrelerinin, kemik dokusunda yara tamiri üzerine etkileri, stroma hücrelerinin implant materyalleri ile etkileşimi ve yönlendiren faktörler
The effect of in vitro differentiated rat and dog bone marrow stromal cells on the healing of bone defect, interactions between stromal cells and implant materials and influencing factors
Yazar: FEYZAN KURT
Danışman: PROF.DR. İSMET DELİLOĞLU GÜRHAN
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
ÖZETKÜLTÜR ORTAMINDA FARKLILA AN SIÇAN VE KÖPEKKEM K L STROMA HÜCRELER N N, KEM K DOKUSUNDAYARA TAM R ÜZER NE ETK LER , STROMA HÜCRELER N NMPLANT MATERYALLER LE ETK LE M VE YÖNLEND REN FAKTÖRLERAra tırma Görevlisi Feyzan KURTKök hücreler ve uygulamaları son zamanlarda, tedavideki yararları nedeniyle önemli oldu ukabul edilen yeni bir konudur. Kemik dokusu iskelet sistemindeki rolü nedeniyle insan ve hayvansa lı ında, özellikle yara onarımı ve iyile mesinde yer aldı ı patolojik olaylarda önemlidir. Buçalı mada, kültür ortamında kemik ili i stromal kök hücrelerin (K SKH) kemik hücrelerine farklıla mamekanizması ve bu süreçte hücre davranı ına etkileyen faktörler incelenecektir. Aynı zamanda, kemikkırı ı tedavisinde kullanılan çe itli implant materyalleri ile farklıla an kemik hücreleri arasındaki ili kilerde incelenecektir. Bu proje bulgularının daha sonra insan ve veteriner hekimli indeki uygulamalaradestek olaca ı dü ünülmektedir. Kemik ili i hematopoetik ve stromal küök hücre içeren kompleks birdoku olup stromal kök hücreleri ya , fibroblast, retikülar, osteojenik ve kondrojenik serilere farklıla mapotansiyeline sahiptir. Stromal kök hücrelerin odteoblasta dönü ümleri sırasında farklıla mamarkırlarının belirlenmesi zaman ba ımlı bir süreç olup hücre tabanlı doku mühendisli i için önemlibilgiler verebilir. K SKH'leri kemik dokusunun yara tamirinde ba arılı hücre tabakaları olu turmayetene inde gözükmektedir. Ev hayvanları için kemik defektlerinin önemli oldu u bilinmesine ra menliteratürde bunlar için K SKH'ler ile ilgili çok az çalı ma bulunmaktadır. Bu neden ile bu çalı mada hemsıçan hem köpek K SKH'leri için osteojenik besi ortamının (OM) ço alma ve farklıla ma üzerineetkilerini ve farklı materyaller üzerinde tutunma ve farklıla ma ile ilgili biyolojik davranı ları ara tırıldıve kemikte yara tamirindeki rolleri incelendi. K SKH'leri eri kin erkek sıçan tibia ve femurlarındanalınarak -MEM + %15 FCS + %0,4 penisilin + %0,4 streptomisin + %0,1 amfoterisin B ve %1gentamisin içeren kontrol besi ortamına (KM) kondu ve 3 gün sonra tutunan hücreler KM ve OM ( -MEM + %15 FCS + % 0,4 penisilin + %0,4 streptomisin + % 0,1 amfoterisin B + %1 gentamisin + 50-8Âµg/ml askorbik asit, 10 mM - gliserofosfat + 10 M deksametazon) ile de i tirildi. Ço alma kapasitesive ya am yetene i MTT testi ile ölçüldü. Farklıla mı osteoblast benzeri hücreler 7 ve 21. günlerde %4'lük paraformaldehid ile fiske edildi ve osteoblast markırları osteonektin (ON) ve osteokalsin (OK) içinindirekt immünoperoksidaz yöntemi ile i aretlendi. Sıçanın tibiası ve köpe in femurundan alınanK SKH'ler OM içerisinde kültüre edilip de i ik por çaplarındaki hidroksiapatitler (HA 1, HA - jel),kalsiyum fosfat ba lı skaffoldlar (KFS), titanyum mesh (T M) ve matriks molekülleri kollajen tip I, IV(KOL I, IV) ve laminin (LMN) gibi substrat ve biyomateryallerüzerinde farklıla maları incelendi.Hücrelerin tutunma oranı ve morfolojileri taramalı elektron mikroskobu ile incelendi. Hücreli ve hücresizolmak üzere materyaller deneysel tibia yarasına implnte edildi ve iyile me etkisi için incelendi. ON;OK, alkalen fosfataz (ALP) aktivitesi ve mineralizasyon kapasitesiiçin immünohistokimyasal vehistokimyasal yöntem ile incelendi. Von Kossa boyamaları ile kemik olu umu gösterildi. ON ve OKimmuno i aretlemesinin kültürün 7. gününde ba ladı ı ve 21. güne kadar giderek arttı ı görüldü.aretlemenin OM etkisinde çok daha belirgin oldu u saptandı. K SKH'lerin kemik yara iyile mesinde otologimplant olarak kullanılabilece i dü ünüldü. Tüm materyaller üzerinde OM etkisi ile fibroblastik fenotiptenosteoblastik fenotipe dönü üm izlendi. Hücrelerin uzun sitoplazmik uzantıları ve birbirleri ile etkile imleriSEM ile gösterildi. Tutunma özellikleri ile markırlar ile gösterilen osteoblastik kapasiteleri her materyal içinfarklı bulundu. LMN ve KFS'nin hem tutunma hem adezyon hem de osteoblastik morfoloji için en etkinoldu u bulundu . Hücrelerin bu davranı ının hem köpek hem de sıçan için aynı oldu u saptandı. HA jelinhücrenin yayılma ve tutunmasını etkinle tirerek adeziv özelli ini arttırdı ı görüldü. K SKH'erin osteoblastafarklıla maları anlamında heterojen oldukları ve bir alt tür içerdikleri gözlendi. Materyallerin K SKH'lerininosteoblast farklıla masına sinerjistik etki göstererek kemik doku mühendisli inde kullanılabilir bir uygulamaolabilece ini dü ündürdü. deal kemik için olu turulabilecek bu kombinasyon büyük kemik defektlerindetedavi de büyük yarar sa layacaktır. Bu projenin gerçek önemi, ülkemizin ekonomik ko ullarındaoldukça pahalı olan kemik yara ve kırıklarının sa altım masraflarını azaltmak ve süreyi kısaltmaktır.Aynı zamanda, insan ve veteriner hekimli inde kök hücresi uygulamalarının kemoterapi veoperasyona önemli bir alternatif tedavi yöntemi oldu u da göz önüne alınmalıdır. Bu konu farklıyönleriyle ulusal ve uluslar arası ara tırmacılar tarafından halen çalı ılmaktadır. Bu açıdanbakıldı ında, bu çalı ma sonuçlarının uluslar arası literatüre de katkısı olacaktır.Anahtar Sözcükler: Kök hücre, kemik ili i stromal kök hücre, kemik, yara iyile mesi, histoloji, sıçan,köpek.

Abstract:
ABSTRACTTHE EFFECT OF IN VITRO DIFFERENTIATED RAT AND DOG BONE MARROW STROMAL CELLSON THE HEALING OF BONE DEFECT, INTERACTIONS BETWEEN STROMAL CELLS ANDIMPLANT MATERIALS AND INFLUENCING FACTORSResearch Assistant Feyzan KURTStem cells and their applications are recently discovered as an important new subject for the benefitof their role in treatment. Bone tissue plays a role in human and animal health because of its function inskeletal system and especially in pathological conditions where it takes place during wound repair andhealing process. In this study, the mechanism of differentiation of bone marrow stromal cells (BMSC) tobone cells in culture and the effecting factors in this process on the cell behavior will be investigated. In themean time, the interaction between different implant materials be used in the bone fracture therapy anddifferentiated bone cells will also be studied. It is being thought that the results of this project will support thefuture treatment applications on the human and veterinary medicine. Bone marrow is a complex tissuecomposed of hematopoietic and stromal stem cells with the potential to differentiate into adipogenic,fibroblastic, reticular, osteogenic and chondrogenic lineages. Identification of differentiation markers duringtransformation of stromal cells into osteoblasts in a time-dependent manner may be informative for cell-based tissue engineering. BMSCs promise to provide successful cell scaffolds for tissue-engineered repairof bone tissue. Although bone defects are important problem for pets, there are very few studies done withpet BMSCs in literature. Therefore, we investigated the effects of osteogenic medium (OM) on theproliferation and differentiation of rat and dog BMSCs and the biological behavior of BMSCs cultured on thedifferent materials for their attachment and differentiation to osteoblasts and also examined their role inbone repair. BMSCs from adult male rat tibia and femur were collected and cultured in alpha-MEMmedium with 15% fetal bovine serum, penicillin-- streptomycin and gentamycin. After three days of culture,the medium covering the adherent cells in culture was changed to OM containing dexamethasone, Na-bglycerophosphate and ascorbic acid. As a control, cell culture was also continued in the original mediumfor the same time period. Their proliferation capacity and viability were spectrophotometrically measuredwith MTT assay. Differentiated osteoblast like cells were fixed with 4% paraformaldehyde at 7 and 21 daysof culture, and their immunolabelling for osteoblast markers osteonectin (ON) and osteocalcin (OC) wereassessed using an indirect immunoperoxidase technique. BMSCs obtained from rat tibia and dog femurwere cultured in OM. Different pore size of Hydroxyapatite (HA-gel, HA-1), calcium phosphate basedscaffolds (CPS), titanium mesh (TiM) and matrix molecules collagen type I (COLI), COLIV and Laminin(LMN) were used as substrate and biomaterial for the differentiation of BMSCs. The BMSCs? attachmentratio and the morphology on the scaffolds were observed with scanning electron microscope (SEM).Materials with or without cells implanted to the experimental tibial fracture and examined for effect onhealing. Osteocalcin (ON)-osteonectin (ON) expression and alkaline phosphatase (ALP) activity -mineralization capacity were determined by immunohistochemistry and histochemistry respectively.Vonkossa (VK) staining technique was used to demonstrate the bone formation. Immunolabelling of ONand OC was detectable from day 7 of culture and increased steadily through to day 21. Labelling was moreintense in cells cultured with OM. BMSCs may be useful in autologous bone implant for the treatment ofbone wound healing. Similar morphological appearances were seen for all materials with the effect of OMwhere the cells change their phenotype from fibroblastic to osteoblastic. Cells with long thin processes andadhesive behavior including pattern of interconnecting cells were observed with all substrate by SEM. Theadhesive properties and osteoblastic capacity of cells determined by markers were different in eachmaterial. It seems that LMN and CPS provided more attached and adhesive cells with osteoblasticmorphology. Observation of these effects was similar for both species rat and canine. Different sizes of HAparticles did not effect the adhesive properties of these cells except HA gel. The spreading and attachmentratio of the cells on HA gel were more than the others. We found that there was heterogeneity in BMSCwith respect to differentiation capacity to the osteoblast, which was a sign of a subpopulation.Osteoinductive potential of these materials may synergistically enhance the osteodifferentiation of BMSCswith profound implications on bone-tissue-engineering applications. This combination for ideal bone couldbe used clinically in the treatment of bone defects. The main importance of this project is to reduce thetreatment expenses on the poor economical conditions of our country due to bone repair in human health,which is still expensive and has a long lasting process. It should also be recognized that stem cellapplications in human and veterinary medicine become a very important subject as an alternative forchemotherapies and operations in recent years. This subject is still being studied in different ways by bothinternational and native investigators. In this respect, the results of this project will contribute to theinternational literature.Keywords: Stem cell, bone marrow stromal cell, bone, wound healing, histology, rat, dog.