Beta-galaktosidaz enzim üretiminin optimizasyonu ve saflaştırılması
Optimization of beta-galactosidase enzyme production and its purification
Yazar: SEVAL DAĞBAĞLI
Danışman: DOÇ. DR. YEKTA GÖKSUNGUR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Beta galaktosidaz = Beta galactosidase ; Biyoreaktörler = Bioreactors ; Cevap yüzey yöntemi = Response surface methodology

Özet:
Bu tezde Kluyveromyces türü mayalar ile ß-galaktosidaz enzim üretiminde bazı proses değişkenleri incelenmiş, çalkalamalı kültürde ve karıştırmalı tank tipi biyoreaktörde Cevap Yüzey Yöntemi kullanılarak ß-galaktosidaz enzim üretimi optimize edilmiştir.Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 ile sentetik ortam kullanılarak çalkalamalı kültürde ß-galaktosidaz enzim üretimine etki eden faktörler araştırılmıştır. ß-galaktosidaz enzim üretiminde önemli fermentasyon parametreleri olan ortam pH'sı (6-8), karıştırma hızı (150-250 rpm), başlangıç substrat konsantrasyonu (20-40 g/l) ve fermentasyon süresi (36-60 saat) optimize edilmiştir. Maksimum spesifik enzim aktivitesi, proses değişkenlerinin optimum seviyelerinde (başlangıç ortam pH 7.35, karıştırma hızı 179.2 rpm, başlangıç substrat konsantrasyonu 24.9 g/l, fermentasyon zamanı 50.9 saat) 4218.4 U/g olarak tespit edilmiştir. Karıştırmalı tank tipi biyoreaktörde ß-galaktosidaz enzim üretiminin optimizasyonu Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 ile sentetik ortam kullanılarak gerçekleştirilmiştir. ß-galaktosidaz enzim üretimi üzerine başlangıç substrat konsantrasyonu (15-35 g/l), karıştırma hızı (100-300 rpm), havalandırma hızı (1-3 vvm) ve fermentasyon süresinin (12-32 s) etkileri incelenmiş ve optimum seviyeleri belirlenmiştir. Maksimum spesifik enzim aktivitesi olan 4622.7 U/g, proses değişkenlerinin optimum seviyeleri olan 33.8 g/l başlangıç substrat konsantrasyonu, 2.21 vvm havalandırma hızı, 24 saat fermentasyon süresi ve 173.4 rpm karıştırma hızında elde edilmiştir. CYY'nin, çalkalamalı kültürde ve karıştırmalı tank tipi biyoreaktörde ß-galaktosidaz enzim üretiminin optimizasyonunda ve proses parametreleri arasındaki interaksiyon etkilerinin belirlenmesinde başarı ile kullanılabileceği bulunmuştur.ß-galaktosidaz enziminin saflaştırılması, Sephadex A50 iyon değiştirici jel kullanılarak gerçekleştirilmiş ve enzim yaklaşık 3 kat saflaştırılmış, saflaştırma verimi %74.41 olarak bulunmuştur. Kluyveromyces lactis NRRL 8279'dan elde edilen saflaştırılmış ß-galaktosidaz enzimine ait SDS PAGE görüntülerinde enzime ait dört adet alt birim (133.77, 58.07, 49.81, 24.71 kDa) tespit edilmiştir Üretilen ß-galaktosidaz enziminin optimum sıcaklık ve pH değerleri 37°C ve pH 7.0 olarak bulunmuştur. Enzimin pH 6.0-7.5 ve 25-37°C sıcaklık aralığında stabil olduğu belirlenmiştir. Enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 1.10 mM ve 1000 µmol/min mg protein olarak belirlenmiştir.

Abstract:
In this thesis, process variables in ß-galactosidase production by Kluyveromyces were investigated and ß-galactosidase production was optimized by using Response Surface Methodology. In the first part of the thesis, production and optimization of ß-galactosidase enzyme using synthetic medium by Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 in shake flask cultures were investigated. Among the different cell disintegration methods used, the highest specific activity was obtained when the cells were permeabilized using isoamyl alcohol. Response surface methodology was used to investigate the effects of four fermentation parameters (agitation speed, pH, initial substrate concentration and incubation time) on ß-galactosidase enzyme production. Results of the statistical analysis showed that the fit of the model was good in all cases. Maximum specific enzyme activity of 4218.4 U/g was obtained at the optimum levels of process variables (pH 7.35, agitation speed 179.2 rpm, initial sugar concentration 24.9 g/l and incubation time 50.9 h). In the second part of the thesis, production and optimization of ß-galactosidase enzyme using synthetic medium by Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 in stirred tank bioreactor were investigated. Response surface methodology was used to investigate the effects of four fermentation parameters (aeration rate, agitation speed, initial sugar concentration and incubation time) on ß-galactosidase enzyme production. The fermentation parameters mentioned above had strong linear and negative quadratic effects on specific enzyme activity. Maximum specific enzyme activity of 4622.7 U/g was obtained at the optimum levels of process variables (aeration rate 2.21 vvm, agitation speed 173.4 rpm, initial sugar concentration 33.8 g/l, incubation time 24.0 h). The purification of the enzyme from a crude protein extract of K. lactis by ion exchange chromatography resulted in a purification factor of 3-fold over the crude extract having an overall yield based on total enzyme units of 74.41%. Enzyme is consist of four subnits (133.77, 58.07, 49.81, 24.71 kDa) The optimum temperature and pH of the ß-galactosidase enzyme produced under optimized conditions were 37°C and pH 7.0, respectively. The enzyme was stable over a pH range of 6.0-7.5 and a temperature range of 25-37°C. The Km and Vmax values for ?-nitrophenol-ß-D-galactopyranoside (ONPG) were 1.10 mM and 1000 µmol/min mg protein, respectively. The response surface methodology was found to be useful in optimizing and determining the interactions among process variables in ß-galactosidase enzyme production. Hence, this study fulfills the lack of using mathematical and statistical techniques in optimizing the ß-galactosidase enzyme production in stirred tank bioreactor.