Antifosfolipid sendromunda ADAMTS-13 geninin anlatımında ve proteininin plazmadaki miktari ile aktivitesindeki farklılıkların araştırılması
The investigations on the differences of ADAMTS-13 gene expression and its protein plasma level and the activity in antiphospholipid syndrome
Yazar: VEYSEL SABRİ HANÇER
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL TOPAL SARIKAYA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
ADAMTS-13 geni insanda 37 kb uzunluğundadır. 9. kromozomun q34 bölgesinde yerleşik olup, 1427 amino asitten oluşan proteini kodlamaktadır. von Willebrand Faktör (vWF)'ün Tyr842-Met843 amino asitleri arasındaki peptit bağı, dolaşımda ADAMTS-13 tarafından kesilir. Çok miktarda ve beklenmeyen büyüklükte vWF varlığı gibi patofizyolojik durumlarda bu multimerler ile platelet etkileşimleri sonucunda pıhtı oluşumununun meydana geldiği düşünülmektedir. Ailesel trombotik trombositopenik purpura (TTP) hastalarının genomik DNA örneklerinin incelenmesi ile ADAMTS-13 genindeki bazı mutasyonların enzimde işlev bozukluğuna yol açtığı saptanmıştır. TTP'deki trombozların şekilleri ve yerleri benzer bir hastalık olan antifosfolipid sendromu (AFS)'nda görülenlere benzemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada ADAMTS-13 enziminin TTP patogenezindeki rolünden yola çıkarak AFS gelişiminde ADAMTS-13 genindeki mutasyonların katkısının olup olmadığının araştırılması, gen anlatım düzeyinin ve enziminin miktar ve aktivitesindeki değişikliklerin mutasyonlar varlığında değerlendirilmesi amaçlandı.Bu kapsamda, 70 Primer Antifosfolipid Sendromu (PAFS) hastası ve 70 sağlıklı kontrol bireyinde ADAMTS-13 geninin, C365del, Q449stop kodonu, P475S mutasyonları restriksiyon enzim kesimi analizi (REKA) ile, C508Y mutasyonu ise DNA dizileme yöntemi ile analiz edildi. Hedef gen ADAMTS-13 ve referans gen HPRT-1'e ait mRNA'lar cDNA'ya çevirilip Q RT-PZR ile çoğaltılarak transkripsiyon aşaması, enzimin plazmadaki aktivite ve miktarı ise ELISA temelli bir yöntem kullanılarak analiz edildi.Hasta ve kontrol grubundaki bireylerin hiçbirinde çalışılan mutasyonlar saptanmadı. ADAMTS-13 mRNA miktarının hasta grubunda, kontrol grubundakinin yarısı kadar olduğu saptandı. ADAMTS-13 enzim aktivitesi açısından kontrol ve hasta grubu arasında anlamlı bir bağlantı bulunmazken, enzim miktarı açısından oldukça anlamlı bir fark saptandı (p<0.0001). Hasta ve kontrol grubu bireylerinde enzim aktivitesi ile yaş arasında anlamlı bir fark olmadığı, fakat kontrol grubunda aktivite ile cinsiyet arasında anlamlı bir fark olduğu tespit edildi (p=0.0038). Enzim miktarı ile aktivitesi arasında korelasyon olmadığı, aynı miktar enzime sahip bireylerde aktivitenin değişkenlik gösterdiği belirlendi.Sonuç olarak, PAFS ile ADAMTS-13 mutasyonları arasında bağlantı bulunmadı. ADAMTS-13 mRNA miktarının hasta grubunda kontrol grubuna göre yarısı kadar olması ve plazmadaki miktarının % 40 az oluşu, ADAMTS-13 geninin transkripsiyon aşamasında negatif düzenlendiği ya da promotör bölgede mutasyon/lar olduğunu veya epigenetik bir etki varlığını düşündürmektedir. Bundan başka, cinsiyetin enzim aktivitesi için önemli bir kriter olduğu da öngörülmektedir.

Abstract:
ADAMTS 13 gene encodes an enzyme consisting of 1427 amino acids in human. It is 37 kb long and locates on the q34 site of the 9th chromosome. The peptide bond between Tyr842-Met843 of von Willebrand factor (vWF) is physiologically cleaved by ADAMT-13 in the circulation. Under pathophysiological conditions, such as in the presence of excess amounts of unusually large vWF molecules, interaction between these multimers and platelets is thought to be caused microthrombi formation in the circulation. Analysis of the genomic DNA of patients with familial Thrombotic Thrombocytopenic Purpura (TTP) showed that some mutations on ADAMTS-13 gene are to lead to functional defects for the enzyme. The form of thrombus and their localizations in TTP patients are similar with those in antiphospholipid syndrome (APS) as a disease like TTP. For this reason, in this study was aimed to investigate whether mutations on ADAMTS-13 gene are related or not with APS and to evaluate gene expression levels and amount and activity of ADAMTS-13 in the presence of mutations.In this context, C365del, Q449stop codon, P475S mutations of ADAMTS-13 gene were analyzed by resrtriction enzyme digestion technique and C508Y mutation was analyzed by DNA sequencing in 70 PAPS patients and 70 healthy control subjects. mRNA transcripts of ADAMTS-13 and reference gene HPRT-1 were directed to cDNA and amplified. Transcription step was analyzed by Q RT-PCR. The activity and the amount of enzyme were analyzed by an ELISA base technique.Mutations tested in this study were not found in both patient and healthy control group. In the patient group, amount of ADAMTS-13 mRNA was found to be half of the amount of the healthy control group. In terms of ADAMTS-13 enzyme activity, although a significant association was not detected between the patient and the control group, a very significant association was detected for the amount of enzyme (p<0.0001). In the control group, activity of ADAMTS-13 enzyme was found related with gender (p=0.0038) but not related with age. There was no correlation between the amount of enzyme and activity which was detected variable in subjects that had the same amount of enzyme .As a result, no association was detected between PAPS and ADAMTS-13 mutations. Existence of half mRNA amount of ADAMTS-13 resulted in to 40 % less amount of ADAMTS-13 in the patients. This data is thought to be that ADAMTS-13 gene is negative regulated on transcription step or mutation/s may present in the promotor region or there may be an epigenetic effect. Furthermore, gender was found to be an important criteria for the enzyme activity.