G6PD aktivitesinin belirlenmesine yeni bakış: Seçici enzim biyosensörü
New insight at determining G6PD activity: Selective enzyme biosensor
Yazar: BAŞAK GÜNAŞTI
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH TULİ
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Tıp) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biyosensörler = Biosensors ; Enzim aktivasyonu = Enzyme activation ; Enzimler = Enzymes ; Glükozfosfat dehidrogenaz = Glucosephosphate dehydrogenases ; Sensörler = Sensors

Özet:
Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzimi pentoz fosfat yolunun (PFY) ilk basamağını katalizleyen kilit bir enzimdir. Eritrositlerde NADPH oluşumu için tek kaynak PFY olup, G6PD eksikliğinde NADPH üretimi önemli ölçüde azalmaktadır. Günümüz mevcut G6PD enzim aktivite ölçüm yöntemleri enzim düzeyini sıfır olarak belirleyebilmektedir. Fakat "housekeeping" enzim olan G6PD enziminin aktivitesinin mutlak sıfır olması yaşamla bağdaşmamaktadır. Biz de bu durumu açıklığa kavuşturmak amacıyla tez çalışması kapsamında enzim düzeyini hassas olarak belirleyebilen seçici enzim biyosensörü sistemini tasarladık.
	Çalışma grubu G6PD enzim aktivitesi sıfır olarak ölçülen veya düşük olan olgulardan oluşmaktadır. Çalışmamızda 3'lü elektrot sistemi kullanıldı. Çalışma elektrodu olarak altın, karşıt elektrot olarak platin tel, referans elektrot olarak Ag/AgCl kullanıldı. Biyoaktif tabaka hem BSA/Jelatin hem de HEMA-MAC polimerleri ile oluşturuldu. Biyoaktif tabakanın SEM görüntüsü alındı ve FTIR analizi yapıldı. Glutatyon redüktaz enzimi G6PD enzim aktivitesi sonucu oluşan NADPH'leri substrat olarak kullanmak üzere altın elektroda immobilize edildi. Glutaraldehit ile çapraz bağlama gerçekleştirildi. Biyosensörde; biyoaktif tabakanın, immobilizasyon koşullarının ve enzimin çalışma koşullarının optimizasyonu yapıldı. NADPH'nin yükseltgenerek NADP oluştururken ortaya çıkan potansiyel fark biyosensörde Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) ile ölçüldü. Standart grafik kullanılarak G6PD enzim düzeyinin hassas ölçümü yapıldı.
	Tasarladığımız seçici enzim biyosensörü sistemi ile geleneksel yöntemlerle sıfır olarak ölçülen olguların G6PD enzim aktivite düzeylerinin gerçek değerlerine ulaşıldı. G6PD enzim aktivitesinin mutlak sıfır olmadığı elde edilen DPV ölçümleri sonucu ortaya kondu. Böylelikle dünyada en sık rastlanan enzimopati olan G6PD'nin enzim aktivitesi biyosensör sistemi kullanarak daha duyarlı bir biçimde ölçüldü. Tasarlanan bu seçici enzim biyosensörünün eritrosit G6PD enzim eksikliği olan olguların teşhis ve izlemlerine önemli katkıda bulunacağı öngörülmektedir.

Abstract:
Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) is a key enzyme that catalyzes the first step of the pentose phosphate pathway (PPP). The only source for NADPH formation in erythrocytes is the PPP, and NADPH production is significantly reduced in G6PD deficiency. Current G6PD activity measurement methods can determine the enzyme level as zero. However, the absolute zero activity of the "housekeeping" enzyme, G6PD, is incompatible with life. In order to clarify this situation, we designed a selective enzyme biosensor system that can precisely determine the enzyme level.
The experiment group consisted of cases whose G6PD activity was measured as zero or low. In our study, a triple electrode system was used. Gold was used as the working electrode, the platinum wire was used as the counter electrode, and Ag/AgCl was used as the reference electrode. The bioactive layer was formed with both BSA/Gelatin and HEMA-MAC polymers. SEM image of the bioactive layer was taken, and FTIR analysis was performed. The glutathione reductase enzyme was immobilized on the gold electrode to use the NADPHs, formed after the G6PD enzyme activity, as a substrate. Crosslinking was performed with glutaraldehyde. In biosensor, the optimization of the bioactive layer, the immobilization conditions and the working conditions of the enzyme were done. The potential difference that emerged when NADPH was oxidized to form NADP was measured with a Differential Pulse Voltammetry (DPV). Precise measurement of G6PD level was made using the standard chart.
In our study, by using the selective enzyme biosensor system, the actual values of the G6PD activity levels of the cases, which were measured as zero by traditional methods, were determined. It was revealed that the G6PD activity was not absolute zero due to the DPV measurements obtained. Thus, the activity of G6PD, the most common enzymopathy in the world, was measured more sensitively using a biosensor system. Predictably, this selective enzyme biosensor design will contribute significantly to the diagnosis and follow-up of patients with erythrocyte G6PD enzyme deficiency.