Bazı bitki büyüme düzenleyicileri ve pestisitlerin mutajenik rekombinojenik ve promoter (kanser ilerletici) etkilerinin araştırılması
Investigations of mutagenic recombinogenic and cancer promoter effects of some plant growth regulators and pesticides
Yazar: ASUMAN KARADENİZ
Danışman: PROF. DR. ŞABAN FATİH TOPCUOĞLU
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, canlılarda doğal olarak sentezlendiği bilinen bir bitki büyüme düzenleyicisi olan IAA'nın sentetik formu ve Antalya yöresi tarımında en çok kullanılan sentetik bitki büyüme düzenleyicilerinden biri olan BNOA ile yaygın olarak kullanılan fungisitlerden Siprodinil ile Fludioksonil ve herbisitlerden Fluazifop-p-bütil ile Fenoksaprop-p-etil'in değişik konsantrasyonlarda mutajenik ve rekombinojenik etkilerinin olup olmadığı, eğer mutajenik ve/veya rekombinojenik etkinlik gösteriyorlarsa bu etkiyi doğrudan mı yoksa biyoaktivasyonla mı gösterdikleri Drosophila melanogaster kanat somatik mutasyon ve rekombinasyon testiyle, ayrıca bunların promoter (kanser ilerletici) etkilerinin olup olmadığı tripan mavisi ve MTT testleriyle HEK293 hücrelerinin yaşayabilirliği ve çoğalabilirliği esasına göre araştırılmıştır.   
	
Drosophila kanat somatik mutasyon ve rekombinasyon testi için, genomlarında çekinik flare ve çoklu kanat kılı (mwh) genlerini taşıyan üçüncü evre transheterozigot larvalar söz konusu bitki büyüme düzenleyicileri ve pestisitlerle kronik olarak beslenmiştir. Söz konusu maddelerin genotoksik etkileri, larvaların kanat imajinal disk hücrelerinde meydana gelen genetik değişimler (nokta mutasyon, parça kopması, ayrılmama, rekombinasyon) sonucu kanatlarda oluşan küçük ve büyük tek tip, ikiz, mwh ve toplam mutant klonlar şeklinde değerlendirilmiştir. 

Tripan mavisi ve MTT testleri için, kanserleşmenin erken evresinde bulunan HEK293 hücreleri söz konusu bitki büyüme düzenleyicileri ve pestisitlerin  DMEM'li çözeltileriyle 8 günlük inkübasyona bırakılmıştır. Bu süre sonunda, tripan mavisi testinde, canlı ve ölü hücreler ışık mikroskobunda sayılarak canlı hücre yüzdeleri belirlenmiştir. MTT testinde ise, canlılık oranı, tetrazolyum boyasının canlı hücrelerdeki mitokondrial bir enzim olan süksinat dehidrogenazla verdiği tepkimeler sonucunda indirgenmesiyle oluşan formazan maddesinin spektrofotometrik olarak belirlenmesi esasına göre saptanmıştır.  

Çalışmanın sonucunda, uygulanan tüm konsantrasyonlarda IAA ve BNOA'nın ve metabolitlerinin D. melanogaster'de mutajenik ve rekombinojenik olmadığı ve hücre kültüründe hücre çoğalabilirliği (kanser ilerletici) üzerine etkilerinin olmadığı belirlenmiştir. Ancak hücre yaşayabilirliğiyle ilgili olarak tripan mavisi ve MTT testlerinde, IAA ve BNOA'nın uygulanan en yüksek konsantrasyonları olan 0,5 mg/ml'de (IAA için molar eşdeğeri=2,853 mM, BNOA için molar eşdeğeri=2,472 mM) hücre öldürücü etkisinin bulunduğu gözlenmiştir. 

Siprodinil'in, 10 mM'da kendisinin rekombinojenik, 1 mM'da ise metabolitlerinin mutajenik etki gösterdiği, uygulanan tüm konsantrasyonlarda hücre çoğalabilirliğine etki göstermediği ancak hücre yaşayabilirliği ile ilgili olarak 150 M'da hücre öldürücü etkisinin bulunduğu belirlenmiştir. 

Fludioksonil'in, 2 mM hariç uygulanan tüm konsantrasyonlarda hem kendisi hem de metabolitleri mutajenik ve rekombinojenik etki göstermezken, en yüksek konsantrasyonu olan 2 mM'da kendisinin rekombinojenik etki gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca Fludioksonil'in, hücre çoğalabilirliğine etki göstermediği  ancak hücre yaşayabilirliği ile ilgili olarak 180 M'da hücre öldürücü etkisinin bulunduğu belirlenmiştir. 

Fluazifop-p-bütil'in, 5 mM hariç uygulanan tüm konsantrasyonlarda hem kendisi hem de metabolitleri mutajenik ve rekombinojenik etki göstermezken, en yüksek konsantrasyonu olan 5 mM'da metabolitlerinin  rekombinojenik etki gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca Fluazifop-p-bütil'in, hücre çoğalabilirliğine etki göstermediği ancak hücre yaşayabilirliği ile ilgili olarak 653 M'da hücre öldürücü etkisinin bulunduğu belirlenmiştir.

Fenoksaprop-p-etil'in, 0,05, 0,5 ve 1 mM hariç uygulanan tüm konsantrasyonlarda hem kendisi hem de metabolitleri mutajenik ve rekombinojenik etki göstermezken, metabolitlerinin 0,05 mM'da mutajenik, 0,5 ve 1 mM'da  rekombinojenik etki gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca Fenoksaprop-p-etil'in, hücre çoğalabilirliğine etki göstermediği ancak hücre yaşayabilirliği ile ilgili olarak 180 M'da hücre öldürücü etkisinin bulunduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, mutagenic and recombinogenic effects of IAA, a plant growth regulator, naturally synthesized in plants but produced synthetically, and BNOA, a synthetic plant growth regulator, fungicides Cyprodinil, Fludioxonil and herbicides Fluazyfop-p-butyl and Fenoxaprop-p-ethyl, widely used in the agricultural regions of Antalya province have been investigated by wing somatic mutation and recombination test (SMART), and cancer promoter effects (viability and proliferation rates) of these substances were investigated by the tripan blue exclusion assay and MTT test.

In SMART test, 3-day-old  larvae trans-heterozygous for the third chromoseome recessive markers flare (flr3) and multiple wing hair (mwh) were reared using the medium containing different concentrations of such plant growth regulators and pesticides. The effects of these substances were evaluated according to genetic changes (point mutation, deletion, non-disjuncton, recombination) in wing imaginal disc cells that lead to the formation of mutant trichomes. Classification was based on the categories (small single spot, large single spot, twin spot, multiple wing hair and total spot) developed by Graf et al. (1984).

For the tripan blue exclusion and MTT assays, early-stage HEK293 cells were incubated with plant growth regulator and pesticide solutions prepared with DMEM, for 8 days. At the end of the incubation period, alive and dead cells were counted by using light microscope for the tripan blue exclusion assay, and viability rates were determined spectroscopically for the MTT test.

	The results demonstrated that, neither IAA nor BNOA were mutagenic or recombinogenic on the wing cells of Drosophila.   However,  both IAA and BNOA decreased cell viability at the highest concentration, 0.5 mg/ml, tested (molar equivalent for IAA =2,853 mM, molar equivalent for BNOA=2,472 mM). 

	Cyprodinil was found to be recombinogenic at 10 mM concentration and its metabolites were found mutagenic at 1 mM concentration. The pesticide was found ineffective on the proliferation rate of the HEK293 cells but decreased cell viability at the highest concentration tested (150 µM).


	Fludioxonil was found to be recombinogenic at 2 mM concentration. It was also found ineffective on the proliferation rate of the HEK293 cells but decreased cell viability at the highest concentration tested (180 µM). 

	Metabolites of Fluazifop-p-butyl were found to be recombinogenic at 5 mM concentration. It was ineffective on the proliferation rate of the HEK293 cells but decreased cell viability at the highest concentration tested (653 µM).

	Metabolites of Fenoxaprop-p-ethyl were found to be mutagen at 0,05 mM, and recombinogenic at 0,5 and 1 mM concentrations. It was also found ineffective on the proliferation rate of the HEK293 cells but decreased cell viability at the highest concentration tested (180 µM).