Çeşitli hücre hatlarında Silimarinin epigenetik etkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of epigenetic effect of Silymarin in various cell lines
Yazar: YEŞİM KORKMAZ KASAP
Danışman: PROF. DR. ERKAN YURTCU
Başkent Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Azasitidin = Azacitidine ; Epigenetik = Epigenetic ; Histon deasetilaz = Histone deacetylases ; Hücre dizisi = Cell line ; Neoplazmlar-kas dokusu = Neoplasms-muscle tissue ; Silimarin = Silymarin

Özet:
Epigenetik değişimler kanser gelişiminde etkilidirler. Waddington 1940'lı yıllarda epigenetiği DNA'nın baz dizilimini değiştirmeden gen ifadelenmesinin değişmesi olarak açıklamıştır. DNA metilasyonu, histon modifikasyonları, kromatin yeniden modelleme ve mikro-RNA temel epigenetik mekanizmalar olarak kabul edilmektedir.
Kanser hücrelerinde tümör gelişimi ile ilgili yolakları etkilediği için epigenetik değişiklikler, tümörün oluşumunda ve ilerlemesinde önemli rol oynamaktadır (115). Epigenetik etkili ilaçlar hücre döngü kontrolü, apoptozis, hücre sinyalizasyonu, invazyon, metastaz ve anjiyogenez ile ilgili gen ifadelerinin kontrolünde kullanılmaktadır (113). Epigenetik düzensizliklerin geri döndürülebilir olması, DNA metilasyon ve histon asetilasyon inhibitörlerinin kanser tedavisinde kullanımına olanak sağlamaktadır ve DNA modifikasyonu ve histon modifikasyonu gibi epigenetik farklılıkların hedef alınarak kanser tedavisinde etkili bir strateji izlenebileceği gösterilmiştir (100,106). DNA metilasyon ve histon modifikasyon profilini değiştirebilen ilaç adayı bileşikler geliştirilmeye başlanarak preklinik ve klinik aşamalara geçilmiştir.
5-azasitidin ve SAHA inhibitör grupları Food and Drug Administration (FDA) tarafından onaylanan tek başlarına veya kemoterapi, radyoterapi gibi sitotoksik ajanlarla birlikte uygulanmaktadır (16,98). 5-azasitidin, yapısal olarak sitozin nükleotidine benzemektedir ve DNA metiltransferazların inhibisyonunu sağlamaktadır. Epigenetik mekanizmalar kullanılarak geliştirilen bir diğer tedavi ajanı histon deasetilaz (HDAC) inhibitörü olan SAHA'dır (30,95).
Silimarin, Asteraceae familyasına ait devedikeni olarak da adlandırılan Silybum marianum L. bitkisinin tohumlarından elde edilmektedir. Silimarin kimyasal olarak bir polifenol olup, bitki kimyası olarak da bir flavonolignandır (79,80). Yapılan çalışmalarla silimarinin antioksidan, antimetastatik, antianjiyogenik ve antiinflamatuar etkileri gösterilmiştir (71). Silimarin, antikarsinojenik etkileri sebebiyle kemoterapi alan hastalar arasında tamamlayıcı ve alternatif tedavi amacıyla en sık kullanılan ajandır (54).
Bu çalışma ile silimarinin çeşitli kanser hücre dizilerinde epigenetik regülasyon üzerine olan etkisinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
İnsan nöroblastom hücre dizisi SHSY5Y hücreleri, insan hepatosellüler hücre dizisi HepG2 hücreleri veinsan meme kanseri hücre dizisi MCF-7 hücreleri %5 CO2 ve %95 nem içeren 37°C'lik inkübatörde çoğaltıldı. Silimarin, 5-azasitidin ve SAHA'nın genotoksik dozları MTT testi ile belirlendi. Belirlenen IC50 dozlarına göre hücrelere 48 saatlik uygulama yapıldı. DNMT ve HDAC enzim aktiviteleri ölçüldü. Western Blot ile p53, cMyc ve NFκB protein düzeyleri belirlendi.
Silimarinin epigenetik yolaklara olan etkisi ile ilgili sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmada ile silimarinin tek başına ve epigenetik inhibitörler ile birlikte uygulandığında çeşitli kanser hücre dizilerinde epigenetik enzimler ve protein düzeylerine olan etkileri değerlendirilmiştir. 
Sonuçlarımıza göre silimarin DNMT üzerinde inhibe edici etki göstermiştir. HDAC üzerinde inhibisyon etki görülmemiştir. Silimarin p53 K373, p53 K382, cMyc ve NFκB protein seviyelerini baskılarken, p53 S46 protein seviyesini artırmıştır.

Abstract:
Epigenetic changes are effective in cancer development. Waddington described epigenetics in the 1940s as a change in gene expression without altering the base sequence of DNA. DNA methylation, histone modifications, chromatin remodeling and micro-RNA are recognized as the basic epigenetic mechanisms.
Epigenetic changes play an important role in tumor formation and progression since it affects pathways related to tumor development in cancer cells. Epigenetically effective drugs are used in the control of gene expression related to cell cycle control, apoptosis, cell signaling, invasion, metastasis and angiogenesis. Reversibility of epigenetic irregularities allows the use of DNA methylation and histone acetylation inhibitors in the treatment of cancer, and has been shown to be an effective strategy in cancer treatment by targeting epigenetic differences such as DNA modification and histone modification. Drug candidate compounds capable of altering DNA methylation and histone modification profile have begun to develop and have been switched to preclinical and clinical stages.
5-azacitidine and SAHA inhibitor groups are administered alone or in combination with cytotoxic agents such as chemotherapy, radiotherapy approved by the Food and Drug Administration (FDA). 5-azacytidine is structurally similar to the cytosine nucleotide and provides for inhibition of DNA methyltransferases. Another therapeutic agent developed using epigenetic mechanisms is the histone deacetylase (HDAC) inhibitor SAHA.
Silymarin is obtained from the seeds of Silybum marianum L., also called milk thistle of Asteraceae family.The most important active ingredient is silymarin is a polyphenol chemically and a flavonolignant as plant chemistry. Antioxidant, antimetastatic, antiangiogenic and antiinflammatory effects of silymarin have been shown in the studies. Silymarin is the most frequently used agent for complementary and alternative therapy among chemotherapy patients due to its anticarcinogenic effects.
The aim of this study was to evaluate the effect of silymarin on epigenetic regulation in various cancer cell lines.
Human neuroblastoma cell line SHSY5Y cells, human hepatocellular cell line HepG2 cells and human breast cancer cell line MCF-7 cells were grown in a 37°C incubator containing 5%CO2 and 95% humidity. Genotoxic doses of silymarin, 5-azacytidine and SAHA were determined by MTT test. Cells were treated for 48 hours according to the determined IC50 doses. DNMT and HDAC enzyme activities were measured. p53, cMyc and NFκB protein levels were determined by Western Blot.
There are a limited number of studies on the effect of silymarin on epigenetic pathways. In this study, the effects of silymarin on epigenetic enzymes and protein levels in various cancer cell lines when used alone and in combination with epigenetic inhibitors were evaluated.
According to our results, silymarin showed an inhibitory effect on DNMT. There was no inhibition effect on HDAC. Silymarin inhibited p53 K373, p53 K382, cMyc and NFκB protein levels, while p53 increased S46 protein level.