Serum/Plazma CNP düzeyindeki artışın büyüme, iskelet sistemi gelişimi ve iskelet displazileri üzerindeki olası etkilerinin sıçan modelinde incelenmesi
Evaluation of the effects of serum/plasma CNP level elevation on growth, skeletal system development, and skeletal dysplasias in a rat model system
Yazar: MURAT SERKANT ÜNAL
Danışman: PROF. DR. AHMET ÇEVİK TUFAN
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Temel Tıp Bilimleri Bölümü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Büyüme plağı = Growth plate ; Epifiz bezi = Epiphyses ; Kas-iskelet sistemi = Musculoskelatal system ; Kök hücreler = Stem cells ; Natriüretik ajanlar = Natriuretic agents ; Osteokondrodisplaziler = Osteochondrodysplasias ; Sıçanlar = Rats ; İskelet = Skeleton

Özet:
Axial ve appendiküler iskelet kemiklerinin epifiz büyüme plaklarında boyuna uzamayı sağlayan endokondral kemikleşme gözlenir. Bu olgu sürecinde kondrositler prolifere olurlar, değişime uğrarlar, matriks sentezlerler ve boyutlarında artış ile karakterize matürasyon ve hipertrofi evrelerinden geçerek kalsifiye olurlar ve son aşamada da kalsifiye kıkırdak matrixinin osteoblastlar ile yer değiştirmelerini ve kemikleşmeyi sağlayan apopitotik bir süreç geçirirler. Endokondral büyüme endokrin, parakrin ve otokrin pek çok faktör tarafından kontrol edilir ve bu faktörlerin çoğu fiziksel olarak normal dışı büyüme paternine sahip hastaların bulgularından yola çıkılarak yapılan araştırmalar sonucunda bulunmuştur.

	Maroteaux tipi akromezomelik displazi (AMDM, OMIM 602875) otozomal çekinik geçiş gösteren bir dwarfizm türü olup, uzun kemiklerde ve vertebralarda şekil bozuklukları, özellikle ekstremite orta ve distal uzun ve tubüler kemiklerinde kısalık ve epifiz büyüme plaklarında abnormaliteler ile karakterize bir patolojik durumdur. AMDM'e yol açan patolojinin natriüretik peptit reseptör-B (NPR-B) proteininin fonksiyon kaybına yol açan mutasyonları olduğu tespit edilmiştir. NPR-B proteini fonksiyonel haployetersizliği, ki bu durum AMDM gözlenen hastaların taşıyıcı anne ya da babalarında görülmektedir, normale göre dwarfizm düzeyinde olmayan boy kısalığı ile karakterizedir. NPR-B bir transmembran reseptör proteini olup, kıkırdak, kemik, beyin, adrenal gland, uterus gibi birbirinden farklı pek çok dokuda varlığı gösterilmiştir. Ancak mevcut literatür bilgileri bu proteinin ana görevinin iskelet sistemi gelişimi ile ilgili olduğunu düşündürmektedir. AMDM'li hastalarda da iskelet sistemi bulgularına eşlik eden nörolojik patolojiler veya anormal kan basıncı düzeyleri gibi problemlerin görülmemiş olması bu düşünceyi desteklemektedir. NPR-B'nin ligandı olan C-tipi natriüretik peptid (CNP)'i ve bu reseptörün ikincil habercilerinden birisi olarak işlev gördüğü düşünülen cGMP-bağımlı protein kinaz II (cGKII) sinyal yolunu hedef alan çalışmalar bu sinyal yolunun iskelet sistemi gelişimi üzerine olan etkileri konusunda araştırmalara ışık tutmaktadır.

	Fare modelinde yapılmış çalışmalar CNP'den yoksun farelerde dwarfizm görüldüğünü kanıtlamıştır. Fare ve sıçan tibiaları kullanılarak yapılmış organ kültürlerinde CNP'nin kondrosit proliferasyonunu ve hipertrofisini arttırdığı gösterilmiştir. Grubumuz tarafından tamamlanan iki ayrı TÜBİTAK projesinde (SBAG-104S261 ve SBAG-108S189) ise; 1) tavuk embriyosu primer mezenkimal hücrelerinin kondrojenik değişimleri sürecinde CNP/NPR-B sinyal yolunun prekondrojenik mezenkimal yoğunlaşma, glikozaminoglikan sentezi, ve kondrositlerin matürasyon ve hipertrofilerini kapsayan geç dönem değişim süreçlerinde etkin rol oynadığı, 2) insan MKH'lerinin TGF-β1 uyarısı altında kondrojenik değişimleri sürecinde CNP/NPR-B sinyal yolunun uyarıldığı, 3) bu uyarının özellikle erken kondrojenik değişim sürecinde glikozaminoglikan sentezi ve geç dönemde kondrojenik matürasyon ve hipertrofi üzerine etkileri olduğu, 4) etkilerin doza bağımlı olduğu ve 10-7 M CNP konsantrasyonunun en etkin doz olduğu gösterilmiştir.

	Mevcut literatür bilgisinden hareketle CNP'nin canlıya uygun bir formatta sistemik olarak uygulanabilirliği söz konusu olur ise büyüme ve iskelet sistemi gelişimi üzerine etkilerinin daha detaylı incelenebilmesi, dolayısı ile nedeni bilinen veya bilinmeyen iskelet sistemi displazilerinde olası bir tedavi yöntemi olarak test edilebilmesi önemli bir aşamayı oluşturmaktadır. Bugüne kadar gerçekleştirilen deneysel hayvan modelleri üzerindeki araştırmalarda ya CNP'nin transkripsiyonunu sağlayan genin ilgili hayvanın genomuna yüksek kopya sayısında aktarımı yöntemi, ya da deney hayvanına bağlanan bir infüzyon pompası ile sabit hız ve dozda sürekli sistemik CNP infüzyonu yöntemi denenmiştir. Sonuçlar CNP'nin sistemik dolaşımdaki düzeyinin artışı sonucu başarıya ulaşılabileceği doğrultusunda heyecan verici olsa da, her iki yaklaşımın da pratikte kliniğe uygulanabilmesi oldukça zordur. Buna karşılık osteokondrogenez literatüründeki yeni bilgi ve gelişmelerin doku mühendisliği ve biyoteknoloji alanlarına taşınması aşamasında yeni bir yaklaşım olarak kök hücrelerin kullanılabilirliği her geçen gün artan sayıda araştırmaya konu olmaktadır.

	Grubumuz tarafından son dönemde tamamlanan çalışmada insan trabeküler kemik kökenli MKH'lerinin gerek CNP'yi gerekse bu ligantın reseptörü olan NPR-B'yi endojen olarak eksprese ettiği gösterilmiştir. Bu çalışmada, MKH'lerin sitoplazmik sekresyon granüllerinde CNP, hücre membranında ise NPR-B'yi ifade ettikleri gösterilmiştir. Dolayısı ile MKH'lerin bu CNP sekresyon yetilerinde gerçekleştirilebilecek bir artış, bu hücreleri yukarıda bahsi geçen iskelet sistemi displazilerinde olası bir tedavi yöntemi olarak kullanabilme şansımızı gündeme getirecektir.

	Bu projede özetle, deneysel sıçan modeli kullanılarak öncelikle sıçanların büyüme parametreleri ile serum NT-proCNP düzeyleri arasındaki ilişki değerlendirilmiştir. Ardından kemik iliği kökenli MKH'ler izole edilmiş, karekterizasyon ve çoğaltılmaları sağlanmıştır. Son aşamada ise bu hücrelerin CNP ve NPR-B ifadeleri ile salgıladıkları CNP'nin kemik gelişimi üzerine olan etkileri tibia organ kültürlerinde analiz edilmiştir.

Anahtar Kelimeler: endokondral kemikleşme, C-tipi natriüretik peptid, mezenkimal kök hücreler, osteokondrodisplaziler, iskelet sistemi gelişimi.

Abstract:
Bones of the axial and appendicular skeleton form and elongate through endochondral ossification, a process by which mesenchymal cells differentiate into chondrocytes, which proliferate, mature, and undergo hypertrophy and matrix calcification; the calcified cartilage is eventually replaced by bone. This process is under the regulation of endocrine, paracrin and otocrin factors identified through the study of individuals having abnormal growth patterns.
The condition known as Acromesomelic dysplasia, Maroteaux type (AMDM; OMIM no. 602875) is an autosomal recessive skeletal dysplasia caused by loss-of-function mutations in the NPR-B gene. It is characterized with severe dwarfism, i.e., disproportionate short stature with shortening of the middle and distal segments of the limbs. Functional haploinsufficiency of NPR-B protein, generally seen in carrier parents of patients, is characterized with a short stature phenotype, which is less severe than dwarfism. NPR-B is a transmembrane receptor detected in a variety of tissues including cartilage, bone, brain, adrenal gland, and uterus etc. However, based on the literature it is believed that NPR-B is mainly involved in development of skeletal system. Exclusion of neurological pathologies and/or abnormal blood pressure levels from the symptoms of AMDM patients supports this hypothesis. Studies analyzing the functional involvement of C-type natriuretic peptide (CNP), the ligand of NPR-B, or cGMP-dependent protein kinase II, one of the main intracellular effecters of CNP/NPR-B signaling pathway in skeletal development play essential role in this field.

	Studies on natriuretic peptides utilizing genetically altered mice revealed that CNP knock-out mice were severely dwarfed in comparison to controls. Organ culture studies of mice and/or rat origin demonstrated involvement of CNP signaling in chondrocyte proliferation and hypertrophy. Two individual granted projects from TUBITAK (SBAG-104S261 and SBAG-108S189) completed by our group also implicated that; 1) CNP/NPR-B signaling is involved in prechondrogenic mesenchymal condensation, glycosaminoglycan synthesis, and late differentiation, i.e., maturation and hypertrophy, of chondrocytes differentiated from primary mesenchymal cells of embryonic chick limb buds, 2) this pathway is activated during the process of TGF-beta1 induced chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (MSCs), 3)  CNP/NPR-B signaling pathway may strongly be involved in GAG synthesis in TGF-beta1 induced chondrogenic differentiation of MSCs, 4) this effect is likely to be dose dependant, and reached its peak level at the dose of 10-7 M CNP.

	Based on the literature it is important to test systemic administration of CNP and its effects on growth, skeletal development, and finally on skeletal dysplasias as a promising treatment strategy. In limited studies worked on this strategy in the literature investigators either over-expressed CNP in the genome of the mice or given CNP i.v. via an infusion pump using the mouse model. Results were promising in terms of systemic elevation of CNP levels will induce development; however, the strategy they used are not practically possible to use in clinical applications in humans. Relevant to musculoskeletal tissue engineering, investigations concerning the use of MSCs gained importance during the last decade. Functional analysis of signaling pathways involved in these cells may help improve our knowledge in this field.

	Recent studies completed by our group showed that trabecular bone derived MSCs endogenously express both CNP and its receptor NPR-B. CNP expression in these MSCs was in agreement with CNP being a secreted protein produced in these cells. On the other hand, NPR-B expression in these MSCs was localized to the plasma membrane of these cells. Thus, a strategy that is going to increase the secretion of CNP from these MSCs may introduce these cells as a treatment option in skeletal displasias in the clinic.

	In this project,  the relationship between rat growth parameters and serum NT-proCNP levels was demonstrated by experimental rat model system.  Subsequently isolation, progressive subculturing and characterization of bone marrow derived MSCs protocoles were performed. At the last stage, MSCs' CNP, NPR-B expression and the effects of CNP secreting on bone development were analyzed in tibia organ cultures.

Keywords:  endochondral bone formation, C-type natriuretic peptide, mesenchymal stem cells, osteochondrodisplasias, skeletal system development