Mycobacterium tuberculosis kompleks klinik izolatlarında izoniazid direncine neden olan dışa atım pompalarının saptanması
Determination of efflux pumps that cause isoniazid resistance in mycobacterium tubeerculosis complex clinical isolates
Yazar: ÖZLEM TUNCER
Danışman: DOÇ. DR. ZEYNEP SARIBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Gen ifadesi = Gene expression ; Klorpromazin = Chlorpromazine ; Mutasyon = Mutation ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; Reserpin = Reserpine ; Verapamil = Verapamil ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial ; İsoniazid = Isoniazid

Özet:
Mycobacterium tuberculosis kompleks klinik izolatlarında izoniazid direncine neden olan dışa atım pompalarının saptanması
Mycobacterium tuberculosis'te izoniazid direnci sıklıkla katG, inhA, ahpC, kasA, ndh gibi gen bölgelerindeki spontan mutasyonlara bağlı olarak gelişmektedir. Bu genlerdeki mutasyonlar izoniazid dirençli izolatların yaklaşık %70-80'inde saptanmaktadır. Son yıllarda, dışa atım pompalarının M. tuberculosis'te izoniazid direncine neden olabileceği ve özellikle spontan mutasyon saptanmayan izolatlarda pompa ekspresyon genlerinin araştırılması gerektiği vurgulanmaktadır. Bu çalışmada, 50 adet izoniazid dirençli M. tuberculosis kompleks klinik izolatında, izoniazid minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri agar dilüsyon yöntemiyle belirlendikten sonra pompa inhibitörleri (klorpromazin, verapamil, rezerpin) varlığında izoniazid MİK değerleri tekrar çalışılmış ve MİK değerlerindeki değişim araştırılmıştır. Eş zamanlı olarak izoniazid direncine sebep olduğu bilinen katG ve inhA gen bölgeleri mutasyonları DNA dizi analizi ile araştırılmıştır. Son olarak pompa inhibitörü varlığında etidyum bromür boyasının hücre içi yoğunluğu araştırılarak dışa atım pompalarının varlığı tespit edilmeye çalışılmıştır.
Bu çalışmada, klinik izolatların %76'sında herhangi bir pompa inhibitörü varlığında izoniazid MİK değerlerinin en az bir dilüsyon ve üzerinde azalma gösterdiği saptanmıştır. Tek başına değerlendirildiğinde izolatların klorpromazin ile %68, verapamil ile %36 ve rezerpin ile %36'sının izoniazid MİK değerlerinin düştüğü gözlenmiştir. İzolatların %86'sında katG, %42'sinde ise inhA bölgesinde mutasyon tespit edilmiştir. Pompa inhibitörü varlığında en az 2 dilüsyon değişiklik saptanan 21 izolatın inhibitör varlığında ve yokluğunda hücre içindeki etidyum bromür yoğunluğu araştırılmış ve 11 izolatta pompa inhibitörü varlığında etidyum bromüre ait floresansın belirgin olarak daha fazla olduğu gözlenmiştir. Çalışmamızın sonuçları, izoniazid dirençli M. tuberculosis klinik izolatlarında özellikle pompa inhibitörleri kullanılarak izoniazid gibi temel bir ilacın tedavide tekrar kullanılabilme ihtimalini desteklemektedir. Konu ile ilgili olarak daha fazla sayıda izolat içeren çalışmaların yapılmasının dirençli M. tuberculosis izolatlarının tedavisinde yol gösterici olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis develops due to spontaneous mutations in the gene regions katG, inhA, ahpC, kasA and ndh. Mutations in these genes can be detected in approximately 70-80% isoniazid resistant isolates. In recent years, it is emphasized that efflux pumps may cause isoniazid resistance in M. tuberculosis and pump ekspression should be investigated in isolates, especially in which the spontaneous mutations are not detected. In this study, we investigated the minimum inhibitory concentration (MIC) values of isoniazid for the 50 isoniazid resistant M. tuberculosis complex clinical isolates by agar dilution method then changes in isoniazid MIC values in the presence of efflux pump inhibitors (chlorpromazine, verapamil, reserpine). katG ve inhA gene mutations which were associated INH resistance were investigated by DNA sequence analysis. Finally the presence of efflux pumps were shown by observing decrease in accumulation of ethidium bromide in the cell at the presence of efflux pump inhibitor.
In this study, isoniazid MICs decreased 1 dilution and over in %76 of clinical isolates in the presence of efflux pump inhibitors. When considered alone, isoniazid MIC values decreased at least one fold dilution with chlorpromazine, verapamil and reserpine in 68%, 36% and 36% of the isolates respectively. katG gene mutations were detected in 86% of isolates whereas inhA mutations were detected in 42% of them. Twenty one isolates with at least decrease of 2 fold dilutions in isoniazid MIC values with an efflux pump inhibitor, were chosen and ethidium bromide concentrations inside the cell were detected in the presence and absence of efflux pump inhibitor. It was clearly observed that fluorescense due to the ethidium bromide was higher at the presence of pump inhibitor in 11 isolates. Our results support the possibility of reusing of isoniazid in treatment by adding efflux pump inhibitors. It is thought that studies containing more resistant isolates should be done in order to guide treatment of resistant M. tuberculosis clinical isolates.