Perifosin ve D Vitamini kombinasyonunun endometriyum kanseri hücre hattı (HEC1A) üzerine etkisi
The effect of perifosine and Vitamin D combination on endometrial cancer cell line (HEC1A)
Yazar: MERYEM İLKAY KARAGÜL
Danışman: PROF. DR. SAVAŞ AKTAŞ
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Endometrial neoplazmlar = Endometrial neoplasms ; Endometriyum = Endometrium ; Genler-Bax = Genes-Bax ; Genler-Bcl-2 = Genes-Bcl-2 ; Genler-P53 = Genes-P53 ; Hücre dizisi = Cell line ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Perifosin = Perifosine ; Vitamin D = Vitamin D

Özet:
Endometriyum kanseri kadın üreme sisteminde en sık görülen kanserdir. Perifosin protein kinaz B (AKT) fosforilasyonunu inhibe ederek çeşitli kanserlerde bir anti-kanser aktivitesi göstermektedir. D vitamininin aktif metaboliti olan kalsitriolün anti-proliferatif ve pro-apoptotik ilaç olarak kanser tedavisinde etkili olduğu ileri sürülmektedir. Spesifik ilaçlarla yapılan kombinasyon tedavileri kanser için hedefe yönelik tedavi olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bu çalışmada, perifosin, D vitamini ve perifosin+D vitamini kombinasyonlarının endometriyum kanseri hücre hattı (HEC1A) üzerindeki anti-proliferatif ve apoptotik etkilerini araştırmayı amaçladık. HEC1A hücrelerine 48 ve 72 saat boyunca perifosin (10 μM, 30 μM, 50 μM), D vitamini (50 nM, 200 nM) ve perifosin+D vitamini kombinasyonları (10 μM+50 nM, 10 μM+200 nM, 30 μM+50 nM, 30 μM+200 nM, 50 μM+50 nM ve 50 μM+200 nM) uygulandı. xCELLigence ile hücre proliferasyonunun zamana bağlı değerlendirilmesi yapıldı. RT-qPCR kullanılarak hücrelerde BCL2, BAX ve P53 mRNA ekspresyon seviyeleri saptandı. Apoptotik hücre oranları APC Anneksin V kiti kullanılarak akım sitometri ile belirlendi. HEC1A hücreleri transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile incelendi. Perifosin+D vitamini kombinasyonunun (48. saatte 30 μM+200 nM ve 72. saatte 10 μM+200 nM) HEC1A hücrelerindeki anti-proliferatif ve apoptotik etkilerinin sadece perifosin ve sadece D vitamini uygulamalarına göre daha fazla olduğu görüldü. Perifosinin doza bağlı olarak HEC1A hücrelerinde BCL2, BAX mRNA ekspresyonunu arttırdığı saptandı. D vitamini ve perifosin+D vitamini kombinasyonlarının ise HEC1A hücrelerinde P53 mRNA ekspresyonunu arttırırken BCL2, BAX mRNA ekspresyonlarında herhangi bir değişikliğe neden olmadığı gözlendi. HEC1A hücrelerinin TEM incelemelerinde, perifosinin otofajik hücre ölümüne, D vitamininin paraptozis benzeri hücre ölümüne, perifosin+D vitamini kombinasyonlarının ise apoptotik ve apoptotik olmayan (paraptotik, otofajik ve nekrotik) hücre ölümüne neden olduğu saptandı. Bu nedenle, endometriyum kanseri tedavisinde her iki ilacın kombine edilerek kullanılmasının, kanser hücrelerinde apoptotik ve apoptotik olmayan hücre ölüm mekanizmalarını aktive ederek alternatif ve etkili bir tedavi seçeneği olabileceği düşünülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Endometriyum kanseri, perifosin, D vitamini, xCELLigence, apoptoz, BCL2, BAX, P53.

Abstract:
Endometrial cancer is the most common cancer of the female reproductive system. Perifosine shows an anti-cancer activity in a variety of cancers by inhibiting of protein kinase B (AKT) phosphorylation. It has been suggested that calcitriol, an active metabolite of vitamin D, is effective as an anti-proliferative and pro-apoptotic drug in cancer treatment. Combination treatment with specific drugs has been widely used as targeted therapy for cancer. In this study, we aimed to investigate anti-proliferative and apoptotic effects of differential concentrations of perifosin and vitamin D on endometrial cancer cell line (HEC1A). HEC1A cells were exposed to perifosine (10 μM, 30 μM, 50 μM), vitamin D (50 nM, 200 nM) and perifosine+vitamin D combinations (10 μM+50 nM, 10 μM+200 nM, 30 μM+50 nM, 30 μM+200 nM, 50 μM+50 nM ve 50 μM+200 nM) for 48 h and 72 h. Evaluation of cell proliferation in a time-dependent manner was performed with the xCELLigence. Levels of BCL2, BAX and P53 mRNA expression were examined by RT-qPCR. Apoptotic cell rates were determined by flow cytometry using APC Annexin V kit. HEC1A cells were analyzed by transmission electron microscopy (TEM). The anti-proliferative and apoptotic effects of the perifosine+vitamin D combination (30 μM+200 nM at 48 h and 10 μM+200 nM at 72 h) on HEC1A cells were higher than in perifosine and vitamin D alone. It is observed that perifosine has increased the expression of BCL2, BAX mRNA in HEC1A cells in a dose-dependent manner. While vitamin D and perifosine+vitamin D combinations increased P53 mRNA expression in HEC1A cells, BCL2, BAX mRNA expression did not show any significant change. In TEM examinations of HEC1A cells, perifosine appeared to lead autophagic cell death, whereas vitamin D caused paraptosis-like cell death and combination of perifosine+vitamin D caused apoptotic and non-apoptotic (paraptotic, autophagic and necrotic) cell death. Therefore, it is considered that the combination of both drugs in the treatment of endometrial cancer might be an alternative and effective treatment option through activating the apoptotic and non-apoptotic cell death mechanisms in cancer cells.

Keywords: Endometrial cancer, perifosine, vitamin D, xCELLigence, apoptosis, BCL2, BAX, P53.