Pichia pastoris kullanılarak rekombinant anti troponin I antikor parçasının üretimi ve kısmi karakterizasyonu
Recombinant expression and partial charachterication of anti cardiac troponin ScFv in Pichia pastoris
Yazar: CENGİZ AKKALE
Danışman: PROF. DR. GAYE ÖNGEN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Katlanmış proteinler = Folded proteins ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Kalp ve damar hastalıkları %30 ile tüm ölüm sebepleri arasında ilk sırada yer almaktadır. Kalp krizinin teşhis edilmesi, müdahale imkânını ve hastanın hayatta kalma şansını çok büyük oranda artırmaktadır. İmmünoloji temelli hızlı teşhis test kitleri bu noktada önemli bir role sahiptir. Bu test kitleri akut miyokardiyal enfarktüsün tanısı için kardiyak biyomarkörlerin antikorlarından faydalanır. Kardiyak troponin I molekülünün kandaki varlığının tespit edilmesi için yararlanılan anti-cTnI antikoru ağırlıkla Çin Hemstır Yumurtası (Chinese Hamster Ovary – CHO) hücrelerinde rekombinant olarak ve/veya kısmen fare ve tavşan gibi konukçu hayvanlarda in vivo üretilmektedir. Ancak bu yöntemle üretilen antikorlar arasında görülen heterojenite, tanı testi kitlerinin oluşturulmasında sorunlar çıkarmaktadır. İyi tanımlanmış bir genetik yapıya sahip olması, güçlü ve teşvik edilebilir bir promotor ile rekombinant protein ifadesi üzerinde yüksek seviyede kontrol sağlaması, ökaryötik sistem olarak posttranslasyonel modifikasyonları yapabilmesi gibi önemli avantajlara sahip Pichia pastoris ekspresyon sistemini ekonomik ve etkin bir rekombinant protein üretim aracı kılmaktadır.
Bu tez kapsamında anti-cTnI antikorunun hafif zincir değişken bölgesi Pichia pastoris ekspresyon sisteminde bir fragment olarak 12,3 mg/l konsantrasyonda biyoreaktörde üretilmiş ve immobilize metal afinitesi kromatografisi yöntemi ile saflaştırılmıştır. Troponin I proteini kullanılarak yapılan tespit çalışmasında pozitif sonuç alınmıştır. Altın nanopartikül ile konjuge ve konjuge olmayan rekombinant antikor fragmentlerinin troponin I proteinini tespit etme yetenekleri arasında belirgin bir fark gözlenmemiştir. 
Yapılan bu çalışma ile hızlı tanı kitlerinde kullanılmaya aday bir anti-cTnI antikor fragmentinin üretimi gerçekleştirilmiştir. Ulaşılan literatüre göre Pichia pastoris konukçu organizması kullanılarak rekombinant anti-kardiyak troponin I antikor fragmentinin ScFv formunda üretimi ve saflaştırılması ilk defa gerçekleştirilmiştir. Elde edilen veriler bu üretim sisteminin diğer tanı kitlerinde kullanılan antikorların da bu yöntemle üretilip kullanılabilmesine ilişkin bilgi kaynağı oluşturmuştur.

Abstract:
Heart and vascular diseases are one of the major cause of all deaths around the world with 30% incidence. Therefore, detection of myocardial infarction has a great importance in responding to emergence cases for increasing the survival rate. Immune dependent quick diagnostic kits have a key role in this point. Anti-cTnI antibody is mostly produced in recombinant Chinese Hamster Ovary (CHO) cell lines and partly in host animals such as mouse and rabbit. However, heterogeneity of antibodies produced with these seras exhibit some disadvantageous difficulties for development of diagnostic test kits.

In this study anti-cardiac troponin I (anti-cTnI) antibody, which is one of the best diagnostic antibodies used in myocardial infract diagnosis overall the world, was recombinantly expressed as an antibody fragment (hypervariable region) in Pichia pastoris at a concentration of 12.3 mg/l. Recombinant ScFv was purified using immobilized metal ion affinity chromatography. Its aplicability in these diagnostic kits before and after conjugation to gold nanoparticles was evaluated by enzyme linked immunosorbent assay. By utilization of Pichia expression system, it is intended to reduce variations (antibody heterogeneity) among whole antibodies.

According to the literature, this is the first study where a recombinant anti-troponin I antibody fragment has been expressed to use in diagnostic kit development. The data obtained serve a guideway for a technology aiming to produce similar antibody fragments for diagnostic purposes.