Lactococcus lactis subsp. lactis'te nisin üretim yeteneğinin geliştirilmesi
Enhancing of nisin production ability of Lactococcus lactis subsp. lactis
Yazar: ÖMER ŞİMŞEK
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA AKÇELİK
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Lactococcus = Lactococcus

Özet:
Lactococcus lactis subsp. lactis LL27 suşunda nisin üretimi; dirençlilik (nisFEG), regülasyon (nisRK) ve dirençlilik/regülasyon (nisRKFEG) genlerinin çoklu kopyalarının ilavesi sonucu geliştirildi. İlave nisFEG (LAC338), nisRK (LAC339) ve nisRKFEG (LAC340) genlerini ifade eden rekombinant suşlar, kontrol suşun (LL27) mg biyokütle başına 520 IU mL-1 olan nisin üretimi düzeyi ile kıyaslandığında, sırasıyla 650 IU mL-1, 750 IU mL-1, ve 745 IU mL-1 düzeylerinde olduğu belirlendi. Kesikli fermentasyonda en yüksek nisin üretim düzeyleri (LL27'de 2200 IU mL-1, LAC338'de 2330 IU mL-1, LAC339'da 2730 IU mL-1 ve LAC340'da 2780 IU mL-1) % 1 fruktoz, % 3 maya özütü, % 2.5 Na2HPO4, pH 6.0 ve 30 °C inkübasyon koşulunda elde edildi. Ayrıca en yüksek nisin aktivitesinin sağlandığı zamandan sonra, LAC338 (nisFEG) ve LAC340 (nisRKFEG) rekombinantlarının kullanıldığı kesikli fermentasyon süreçlerinde nisin aktivitesi stabil iken, LL27 (doğal suş) ve LAC339 (nisRK) için nisin aktivitelerinde kayıplar belirlendi. Sürekli fermentasyon ortamında optimum nisin aktiviteleri; 0.2 h-1 dilüsyon oranında, 12.5 g L-1 fruktoz konsantrasyonunda, pH 6.0 ve 30 °C inkübasyon sıcaklığında tanımlandı. Sürekli fermentasyonda elde edilen, doğal tip ve rekombinant suşların nisin üretim verimleri yanıt yüzey yönteminde değerlendirildi. Son aşamada dilüsyon oranı ve fruktoz konsantrasyonunun optimizasyonu için merkezi kompozit dizaynı kullanıldı ve LL27, LAC338, LAC339 ve LAC340 suşlarında sırasıyla 0.29 h-1, 0.26 h-1, 0.27 h-1 ve 0.27 h-1 dilüsyon oranları ile 11.95 g L-1, 12.01 g L-1, 11.63 g L-1 ve 12.50 g L-1 fruktoz konsantrasyonlarının en iyi koşullar olduğu tespit edildi.

Abstract:
Nisin production in Lactococcus lactis subsp. lactis LL27 was improved by introducing multicopies of immunity (nisFEG), regulation (nisRK) and immunity/regulation (nisRKFEG) genes. Recombinant strains expressing additional nisFEG (LAC338), nisRK (LAC339) and nisRKFEG (LAC340) genes produced 650 IU mL-1, 750 IU mL-1 and 745 IU mL-1 nisin per mg biomass respectively, when compared to 520 IU mL-1 nisin per mg biomass of the control strain (LL27). The highest nisin production level of the wild type strain LL27 (2200 IU mL-1) and its recombinants LAC338 (2330 IU mL-1), LAC339 (2730 IU mL-1) and LAC340 (2780 IU mL-1) batch fermentations were obtained in the presence of 1 % fructose, 3 % yeast extract and 2.5 % Na2HPO4 at pH 6.0 and 30 °C incubation temperature. It was also determined that the highest nisin activities were maintained as stable during the late phase of the batch fermentation processes for the recombinants LAC338 (nisFEG) and LAC340 (nisRKFEG) but not at LL27 (wild type) and LAC339 (nisRK). Optimum nisin activities were observed at pH 6.0, 30 °C, 0.2 h-1 dilution rate and 12.5 g L-1 fructose concentration in the continuous fermentation. The nisin productivity levels of wild type and the recombinant strains obtained during continuous fermentation were evaluated by response surface methodology. Dilution rates and fructose concentration variables were subsequently optimized by using central composite design and the optimal conditions for nisin production were determined to be at 0.29 h-1, 0.26 h-1, 0.27 h-1 and 0.27 h-1 dilution rates and at 11.95 g L-1, 12.01 g L-1, 11.63 g L-1 and 12.50 g L-1 fructose concentrations in LL27, LAC338, LAC339 and LAC340 respectively.