Köpeklerde canine distemper virus enfeksiyonunun araştırılması virusa karşı monoklonal antikor üretimi ve antijen ELISA geliştirilmesi
Investigation of canine distemper virus infection in dogs production of monoclonal antibody against virus and development of antigen ELISA
Yazar: SERKAN KÖKKAYA
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE GENÇAY GÖKSU
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Viroloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Distemper virüsü-köpek = Distemper virus-canine ; ELISA =   ; Hibridoma teknolojisi = Hybridoma technology

Özet:
Köpek gençlik hastalığı Canidae ailesi (köpek, çakal, kurt) olmak üzere Ursidae (dev panda), Ailuirdae (kırmızı panda), Mustelidae (ferret, mink), Felidae (aslan, leopar) gibi birçok aileyi etkileyen tüm dünyada oldukça yaygın viral bir hastalıktır. Yavru köpekler baĢta olmak üzere tüm yaĢ gruplarında görülebilmektedir. Solunum baĢta olmak üzer karıĢık bir klinik belirti gösterir. Hastalık etkeni Canine distempervirus (CDV) olup Paramyxoviridae ailesinden Morbillivirus genusu içerisindedir.
Bu çalıĢmada CDV Ģüpheli köpeklerden örnekler alınarak virusun varlığının araĢtırılması, hücre kültüründe virusun izolasyonu, virusa karĢı monoklonal-poliklonal antikor üreterek antijen-ELISA geliĢtirilmesi amaçlanılmıĢtır. Bu amaç doğrultusunda Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Eğitim ve AraĢtırma ve Uygulama Hastanesi'ne getirilen CDV Ģüpheli 40 farklı köpekten kan ve swab örneği alınmıĢtır. RT-PCR ile doğrulanan örnekler MDCK hücre kültüründe ekim yapılarak virus izole edilmiĢtir. Daha sonra BALB/c diĢi fareler inaktif viruslar ile immunize edilerek hibridoma teknolojisi ile monoklonal antikorlar üretilmiĢtir. Aynı zamanda Yeni Zelanda ırkı tavĢanlar yine inaktif virus ile immunize edilerek poliklonal antikorlar üretilmiĢtir. Üretilen monoklonal antikor HRP enzimi ile iĢaretlenerek geliĢtiren ELISA testinde konjugat olarak kullanılmıĢtır.
Bu tez çalıĢmasında köpek gençlik hastalığı Ģüpheli köpeklerden örnekler toplanılarak RT-PCR yöntemi ile doğrulama yapılmıĢtır. 40 farklı köpekten örnek toplanılarak 29 (%72.5) adedi pozitif olarak doğrulanmıĢtır. Örneklerin klinik bulgusuna göre genel tablosuna bakıldığında; hayvanların 25'i (%62.5) solunum yolu belirtili, 6'sı (%15) sinirsel belirtili, 9'u (%22.5) ise karıĢık (solunum+sinirsel) belirtili olarak bulunmuĢtur. RT-PCR sonucuna göre ise; solunum problemi olan 20 (%68.96), sinirsel problemi olan 3 (%10.34), karıĢık klinik tablo gösteren 6 (%20.68) olarak elde edilmiĢtir. Yine RT-PCR ile, yüksek ateĢ belirtileri (>38.5℃) gösteren 7 köpeğin 6'sı pozitif çıkarken, ateĢi normal olan 33 köpeğin 23'ü pozitif olarak değerlendirilmiĢtir. Örneklerin alındığı 40 köpeğin yaĢı 15'i (%37.5) 0-6 aylık, 11'i (%27.5), 8'i (%20) 12-24 aylık ve 6'sı (%15) >24 ay olarak kaydedilmiĢtir. RT-PCR testine göre bu yaĢ aralıklarında pozitif köpek sayısı sırasıyla; 14 (%48.27), 7 (%24.13), 5 (%17.24) ve 3 (%10.34) olarak bulunmuĢtur.
Pozitif örnekler MDCK hücresine adsorpsiyonlu yöntemle ekim yapılarak CPE (sitopatik etki, cytopathic effect) yönünden günlük olarak ters mikroskop altında incelenilmiĢ ve 8. günden itibaren yuvarlaklaĢma ve vakuol Ģeklinde CPE'ler görülmüĢtür. RT-PCR ile doğrulanan örnek tekrarlı ekimlerle MDCK34388 izolatı olarak çoğaltılmıĢtır ve monoklonal-poliklonal antikor üretimi için kullanılmıĢtır. Fare izolasyonu sonrası füzyona girilmiĢ ve alt dilüsyon ve pasajlamalar sonucunda 1G10-
vi
1A monoklonal antikoru elde edilerek Protein A ile saflaĢtırılmıĢtır ve Western blot yöntemi ile CDV F proteinine karĢı monoklonal antikor olduğu tespit edilmiĢtir. Daha sonra HRP enzimi ile iĢaretlenerek geliĢtirilen Antijen ELISA testinde konjugat olarak kullanılmıĢtır. Antijen ELISA testi sandviç ELISA test yöntemi Ģeklinde tasarlanarak poliklonal ve monoklonal antikorların ayrı ayrı optimizasyonları yapılmıĢtır. Antijen ELISA optimizasyon sonucunda 1/200 ve 1/400 oranında konjugat; 1/1000, 1/2000 ve 1/3000 oranlarında poliklonal antikor pozitiflik görülmüĢtür.
Sahadan toplanan örnekler ve farklı zamanlarda izole edilen 11 farklı izolat pozitif olarak, ayrıca 40 farklı örnekte negatif olarak geliĢtirilen antijen ELISA testi ile araĢtırılmıĢ ve geliĢtirilen ELISA testinin spesifite ve sensitivitesi hesaplanılmıĢtır. Bu sonuca göre; 36 gerçek pozitif, 5 yanlıĢ negatif, 4 yanlıĢ pozitif, 35 gerçek negatif tespit edilmiĢtir ve sensitivitesi %90, spesifitesi %87.5 belirlenilmiĢtir. Ayrıca yapılan istatistiksel analiz sonucu pozitif tahmin değeri %87.8, negatif tahmin değeri ise %89.74 olarak belirlenilmiĢtir. Fisher's Exact test yöntemine göre ise p değeri anlamlı (p<0.05) çıkmıĢtır.
Bu sonuçlar bölgemizde yaygın olan köpek gençlik hastalığının hazır test kitleri ve RT-PCR yöntemleri ile birlikte geliĢtirilen antijen ELISA testinin CDV' nin tespitinde kullanılabileceğini göstermiĢtir.

Abstract:
Canine Distemper is a widespread viral disease affecting various animal families, including Canidae (dogs, jackals, wolves), Ursidae (giant pandas), Ailuridae (red pandas), Mustelidae (ferrets, minks), and Felidae (lions, leopards). While it can affect animals of all ages, puppies are particularly susceptible. The disease primarily manifests with respiratory symptoms, though it can present a mix of clinical signs. The disease agent is Canine distempervirus (CDV) and is in the Morbillivirus genus of the Paramyxoviridae family.
This study aimed to investigate the presence of CDV in suspected dogs, isolate the virus in cell culture, and develop an antigen-ELISA using monoclonal and polyclonal antibodies. Blood and swab samples were collected from 40 dogs with suspected CDV at Erciyes University's Veterinary Medicine Faculty Hospital. RT-PCR-confirmed samples were cultured in MDCK cells for virus isolation. BALB/c female mice and New Zealand rabbits were immunized with inactivated viruses to produce monoclonal and polyclonal antibodies, respectively. The monoclonal antibody was labelled with HRP enzyme for use in the ELISA test.
Of the 40 sampled dogs, 29 (72.5%) tested positive for CDV. Clinical findings showed 62.5% with respiratory symptoms, 15% with nervous symptoms, and 22.5% with mixed symptoms. RT-PCR results revealed that 68.96% had respiratory issues, 10.34% had neurological problems, and 20.68% presented mixed clinical pictures. Most positive cases were found in dogs aged 0-6 months (48.27%).
Positive samples were cultured on MDCK cells with the adsorption method and examined daily under an inverted microscope for CPE. CPEs in the form of rounding and vacuoles were observed starting from the 8th day. The MDCK34388 isolate was used for monoclonal-polyclonal antibody production. The 1G10-1A monoclonal antibody was developed and confirmed with Western blot to target the CDV F protein. An antigen ELISA test was optimized using both monoclonal and polyclonal antibodies.
Samples collected from the field and 11 isolates isolated at different times were screened as positive, and 40 different samples as negative with the antigen ELISA test developed. According to this result, 36 true positives, four false negatives, five false positives, and 35 true negatives were detected. The sensitivity of the developed antigen ELISA test was determined as 90% and the specificity as 87.5%. In addition, the positive predictive value was determined as 87.8% and the negative predictive value as 89.74% as a result of the statistical analysis. According to Fisher's Exact test method, the p-value was found to be significant.
viii
These findings suggest that the developed antigen ELISA test, alongside existing test kits and RT-PCR methods, can be effectively used for CDV detection in our region.