Koyunlarda haemonchus contortus'un moleküler karakterizasyonu ve benzimidazol dirençliliğinin moleküler olarak araştırılması
Molecular characterization of haemonchus contortus in sheep and molecular investigation of benzimidazole resistance
Yazar: ZUHAL ÖNDER
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Benzimidazoller = Benzimidazoles ; Haemonchus contortus = Haemonchus contortus ; Koyunlar = Sheep ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu çalışma, Kayseri yöresinde koyunlarda Haemonchus contortus'un moleküler prevalansı ve karakterizasyonu ile benzimidazol dirençliliğinin moleküler olarak araştırılması amacıyla planlanmıştır. Bu amaçla 2012-2013 yılları arasında Kayseri'nin İncesu, Erkilet ve Bünyan ilçelerinde çeşitli koyunculuk işletmelerinde toplam 300 baş akkaraman ırkı koyundan tekniğine uygun olarak dışkı örneği toplanmıştır. Toplanan dışkılar çinko sülfat flotasyon yöntemi ile mikroskobik olarak parazit yumurta/ookistleri yönünden incelenmiştir. Konvansiyonel dışkı muayenesi sonucunda, incelemesi yapılan koyunların 244'ü (%73,2) çeşitli parazit yumurta ve/veya ookistleri yönünden pozitif bulunmuştur. En yaygın türler %48,3 ile Trichostrongylid tip etkenler belirlenmiş bunu sırasıyla %36,7 ile Marshallagia sp., % 28,3 ile Eimeria sp., %14,3 ile Nematodirus sp., %4,3 ile Moniezia sp. ve %1.7 ile Trichuris ovis izlemiştir. Trichostrongylid türlerle enfekte koyunlarda gram dışkıdaki yumurta sayısı (EPG) ortalama 120,3±53,5 olarak belirlenmiştir. EPG düzeylerinin 2 yaş üzeri koyunlarda iki yaş altına göre yaklaşık 2 kat yüksek olduğu saptanmıştır (p<0,05). Trcihostrongylid yumurtalar yönünden pozitif belirlenen 145 örneğin dışkılarından genomik DNA ekstraksiyonunu takiben elde edilen DNA'lar H. contortus tür spesifik ribosomal complete internal transcript spacer 2 (ITS-2 ) gen bölgesini amplifiye eden primerler ve TaqMan probu ile Real Time PCR analizine tabii tutulmuştur. İncelenen örneklerin 36'sı (%24,8) H. contortus yönünden pozitif belirlenmiş olup ortalama Ct (dR) değeri 30,9±3,38 bulunmuştur. Belirlenen Ct (dR) değerlerine göre >2 yaş grubunda paraziteminin ≤ 2 yaş grubuna oranla daha yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0,05).  Real Time PCR analizleri sonucu H. contortus pozitif belirlenen örneklerin filogenetik analizleri için ITS-2 rDNA ve mitokondriyal cytochrome oxidase subunit 1 (mt-COI) gen bölgelerini amplifiye eden spesifik primerler ile PCR analizleri gerçekleştirilmiştir. İzolatlara ait amplikonların PCR primerleri ile ve/veya klonlanlanıp plasmid pürifikasyonundan sonra sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen izolatların GenBank kayıtları yapılmış ve dünyadaki benzer izolatlar ile çoklu hizalamaları yapılarak filogenetik analizleri gerçekleştirilmiştir. ITS-2 nükleotid sekansları ortaya konan 4 H. contortus izolatının (TrERUHcon04, TrERUHcon05, TrERUHcon06, TrERUHcon07) pairwise analizleri sonucu %100,0 identik oldukları, Dünyanın farklı bölgelerinden GenBank'a kayıtlı benzer izolatlarla ise ortalama %0,1 genetik farklılık gösterdikleri tespit edilmiştir. Mt-COI gen bölgesine göre incelenen izolatların (TrERUHcon01, TrERUHcon02, TrERUHcon03) pairwise analizleri sonucu %96,3-%100,0 identik oldukları, dünyada GenBank'a kayıtlı az sayıdaki izolatlarla ise %5,3±0,6 genetik farklılık gösterdikleri belirlenmiştir. Çalışmada H. contortus pozitifliği belirlenen 36 örnekte benzimidazol dirençliliğini araştırmak amacıyla β tubulin izotip-1 gen bölgesindeki duyarlı ve dirençli allellere spesifik TaqMan probları ve primerler ile Real time PCR analizleri gerçekleştirilmiştir. Real time PCR analizleri sonucu H. contortus popülasyonlarında benzimidazol dirençliliği açısından duyarlı allel sıklığı %87,12±16,19, dirençli allel sıklığı ise %12,88±16,19 olarak belirlenmiş ve bu farklılık istatistiksel açıdan önemli (p<0,05) bulunmuştur. Çalışmada ayrıca duyarlı ve dirençli allel sıklıklarına göre belirlenen bazı izolatlarda β tubulin izotip-1 gen bölgesinin sekansları belirlenmiş ve benzimidazol dirençliliği açısından tek nükleotid polimorfizmleri araştırılmıştır. Duyarlı allele ait izolatların hiçbirinde polimorfizm görülmezken dirençli allele ait iki izolatın β tubulin izotip-1 gen bölgesinin 200. kodonunda tek nükleotid polimorfizmi gösterdiği ve fenilalanin (TTC) amino asidinin tirozin amino asitine (TAC) dönüştüğü saptanmıştır. Duyarlı ve dirençli allellere ait izolatların GenBank kayıtları gerçekleştirilmiştir.
Sonuç olarak bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez koyunlarda H. contortus'un moleküler prevalansı belirlenmiş ve genetik karakterizasyonu yapılmıştır. Çalışma ile araştırma yöresinde H. contortus popülasyonlarında benzimidazol dirençliliği moleküler olarak ortaya konmuş, duyarlı ve dirençli allel sıklıkları belirlenerek risk faktörleri saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar, dirençli H. contortus popülasyonu dinamikleri açısından tedavi ve ilaçlama yöntemlerinin gözden geçirilmesi ve alternatif stratejilerin oluşturulmasının zorunlu olduğunu ortaya çıkarmıştır.

Anahtar kelimeler: Benzimidazol dirençliliği, Haemonchus contortus,  Koyun, Moleküler karakterizasyon, Real time PCR

Abstract:
This study was conducted to investigate the molecular prevalence and characterization of Haemonchus contortus and as well as benzimidazole resistance in H. contortus populations in sheep from Kayseri and vicinity. For this aim between 2012 and 2013 feces samples were techniqually collected from totally 300 Akkaraman sheep raised in several sheep farms in İncesu, Erkilet and Bünyan districts of Kayseri. Collected feces samples were analyzed by zinc sulfate flotation technique in order to investigate the parasite eggs/oocysts under light microscope. 244 (73.2%) out of examined sheep were found to be positive with several parasite eggs and/or oocysts. Trichostrongylids were found to be the most prevalent species with the raito of 48.3% and this ratio was followed by Marshallagia sp., Eimeria sp., Nematodirus sp., Moniezia sp. and Trichuris ovis with the ratios 36.7%, 28.3%, 14.3%, 4.3% and 1.7%, respectively. The mean egg per gram of feces (EPG) value in sheep infected with trichostrongylids was determined as 120.3±53.5. The EPG levels in sheep >2 years age group was determined twice higher than ≤2 years age group (p<0.05). Genomic DNA extractions were performed on 145 samples which were found positive for trichostrongylid eggs and TaqMan Probe based Real Time PCR analyses were done on the obtained DNAs with the specific primers and probe that amplified ribosomal complete internal transcript spacer 2 (ITS's-2) gen region. 36 (24.8%) out of 145 samples were determined positive for H. contortus with a mean Ct (dR) value of 30.9±3.38. Parasitemia was determined higher in >2 years age group than ≤2 years age group based on the obtained Ct (dR) values (p<0.05). In order to phylogenetic analyses of H. contortus in positive samples, PCR analyses were performed with the primer pairs specific to ITS-2 rDNA and mitokondriyal cytochrome oxidase subunit 1 gene regions (mt-COI). Sequence analyses of the isolates were done directly with PCR primers and/or after cloning and plasmid purifications. The obtained isolates were deposited to the GenBank and phylogenetic analyses were carried out by multiple alignments of the isolates with the similar ones available in GenBank in the world. The 4 H. contortus isolates (TrERUHcon04, TrERUHcon05, TrERUHcon06, TrERUHcon07) which the ITS-2 nucleotide sequences determined, showed 100.0% identity to each other and 0.1% genetic difference with the isolates from different parts of the world in the GenBank. The pairwise analyses of the isolates (TrERUHcon01, TrERUHcon02, TrERUHcon03) characterized by Mt-COI sequences showed 96.3%-100.0% identity to each other and also they exhibited 5.3±0.6% genetic difference with the few isolates from the World in GenBank. TaqMan based Real Time PCR analyses were performed on totally 36 H. contortus positive samples with the primers and probes specific to β tubulin isotipe-1 gene region of sensitive and resistant alleles in order to investigate benzimidazole resistance. Sensitive and resistant allele frequencies by means of benzimidazole resistance in H. contortus populations were determined as 87.12%±16.19 and 12.88%±16.19, respectively in Real Time PCR assays and the difference between sensitive and resistant allele frequencies was found statistically significant (p<0.05). β tubulin isotipe-1 gene sequences of some isolates which were selected by means of sensitive and resistant allele frequencies were also determined and single nucleotide polymorphisms (SNPs) were investigated according to the benzimidazole resistance. No polymorphism was seen in all the isolates belong to sensitive allele whereas SNPs were detected in the codon 200 of the two isolates belong to resistant allele and transformation of phenylalanine (TTC) to tyrosine (TAC) at this codon was determined in both isolates. The isolates belong to sensitive and resistant alleles were also deposited to the GenBank.
In conclusion, molecular prevalence and genetic characterization of H. contortus in sheep in Turkey were determined for the first time with this study. Benzimidazole resistance was molecularly detected in H. contortus populations in the research area and also risk factors were determined by revealing the sensitive and resistant allele frequencies. The obtained results from this study revealed that revising the treatment and disinfection methods in terms of resistant H. contortus population dynamics and also producing new alternative strategies are essential. 
Key words: Benzimidazole resistance, Haemonchus contortus, Sheep, Molecular characterization, Real time PCR