İnsan yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücreleri ile yüklenmiş hyaluronik asit/jelatin plazma jellerin yumuşak doku mühendisliği uygulamalarında kullanımı
Soft tissue engineering applications of human lipoaspirate-derived stem cells on hyaluronic acid/gelatin plasma gels
Yazar: ESRA KORURER
Danışman: PROF. DR. ERDAL KARAÖZ
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı / Kök Hücre ve Doku Yenilenmesi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Plastik ve rekonsruktif cerrahide ve kalp yetmezliği ile ilgili hastalıkların
tedavisinde sayısız yumuşak doku mühendisliği temelli uygulamalar bulunmaktadır.
Sadece hücre enjeksiyonu ile yapılan hücre transplantasyonlarında hücre-hücre dışı matriks
(HDM) etkileşiminin yetersiz olmasından kaynaklanan fonksiyonel bozukluklar ve
transplantasyonda yeterli sayıda canlı hücre olmamasından kaynaklanan sorunlar meydana
gelmektedir. Laboratuvar ortamında büyüme faktörlerinin yanı sıra kök hücrelere çeşitli
mikroçevre özelliklerinin sağlanması ile hedef hücre farklılaşması daha verimli bir şekilde
gerçekleştirilebilmektedir. Bu çalışmanın amacı insan kanı plazmasından yoğunlaştırılmış
fibrinojen, jelatin ve göbek bağı türevli hyaluronik asit (HA) ile üç boyutlu iskelenin in
vitro testler ile yumuşak doku mühendisliği uygulamalarındaki uygunluğunun test edilmesi
ve jel üzerine ekilen adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (AD-MKH) yağ ve
kalp kası hücrelerine farklılaşma potansiyelinin incelenmesidir. Öncelikle, jelatin, HA ve
insan kanı plazmasından fibrinojenin çöktürülmesi ile hyaluronik asit/ jelatin plazma jeller
(HA/J plazma jel) üretildi. Gluteraldehit ile çapraz bağlanmış jellerin sıkıştırma testi ile
mekanik özellikleri incelendi ve kriyokesitleri alınan jeller komasi mavisi ile boyanarak
jellerin gözenekliliği ve gözenek çapı belirlendi. HA/J plazma jellerin elastik modüllerinin
yumuşak dokuların elastik modüllerine yakın, 3.53±0.23 kPa, olduğu belirlendi. HA/J
plazma jellerin sade plazma jellere göre daha yüksek gözenekliliğe sahip olduğu belirlendi
(% 72.5 ±5.85, % 63.86±4.27).
İnsan lipoaspirat materyalinden AD-MKH'ler izole edildi ve üçüncü pasajda akım
sitometri ile ve osteojenik ve adipojenik farklılaşma yapılarak karakterize edildi. Jel ve
cam slayt üzerine ekilen hücrelere WST-1 testi yapıldı. HA/J plazma jel üzerindeki ADMKH'lerin cam slayt üzerindeki hücrelere göre zamanla daha fazla çoğaldığı ve jelin
toksik etkisinin olmadığı belirlendi. Sonrasında, jel üzerindeki AD-MKH'lerin adipojenik
ve kardiyomiyojenik farklılaşma potansiyeli incelendi. Jel üzerindeki AD-MKH'lerin yağ
hücrelerine farklılaştığı görüldü. Kardiyomiyojenik farklılaşmaya alınan hücrelerin 2 ve 3
hafta sonra gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonları (PZR, Real-Time PCR) testi ile
özel kalp kası genleri olan GATA4, TBX5 ve cTn I genleri HA/J plazma jellerin ve
aktivin-a, BMP-4, insulin, valproik asit ve 5-azasitidin gibi çeşitli kimyasal maddelerin
etkileri karşılaştırmalı olarak incelendi. Gerçek zamanlı PZR sonuçlarına göre jel ve cam
slayt üzerindeki hücrelerin farklı kimyasal maddeler ile her bir gen için ekspresyon oranları
farklı bulundu. 
vi
Sonuç olarak, HA/J plazma jellerin yumuşak doku mühendisliği uygulamaları için
uygun gözenek büyüklüğüne, mekanik özelliklere sahip olduğu ve hücre büyümesini
desteklediği belirlenmiştir. Ayrıca bu çalışmada, aktivin-a, BMP-4 ve insulin, valproik
asitin 5-azasitidine göre jel üzerindeki AD-MKH'leri daha fazla kardiyomiyojenik
farklılaşmaya yönlendirdiği belirlenmiştir.

Abstract:
Soft tissue engineering-based approaches have numerous potential applications in
plastic and reconstructive surgery and treatments of diseases related to heart failure. Cell
transplantation through direct cell injection are not optimal for cell survival and function
due to the lack of cell-ECM interactions. More efficient differentiation to target cells is
achieved in the laboratory with the provision of various microenvironmental features
besides the growth factors to stem cells. The purpose of this study was to evaluate
cardiomyogenic and adipogenic differantiation potantial of Adipose derived stem cells
(AD-MSCs) on gels and the suitability of 3D scaffolds, composed concantrated fibrinogen
from human plasma, gelatin and human umbilical cord derived hyaluronic acid, for soft
tissue engineering applications through in vitro tests. Fibrinogen was precipitated from
human plasma and its composite gels with gelatin and hyaluronic acid (HA/G plasma gels)
were produced afterwards. Mechanical properties of the glutaraldehyde crosslinked gels
were determined with compression tests and their porosity and pore size determined from
their cryosections stained with commassie brilliant blue. The Young Modulus of the HA/G
plasma gels was determined as 3.53±0.23 kPa, close to that of soft tissues. The HA/G
plasma gels had higher porosity than plain plasma gels (72.5%±5.85vs 63,86%±4.27). ADMSCs were isolated from human lipoaspirates and characterised with flow cytometry at the
third passage, and also were differentiated into osteogenic and adipogenic lineages. ADMSCs were seeded on the gels and coverslips for comparative cell proliferation tests. The
cell proliferation assay (WST-1) of AD-MSCs on the HA/G plasma gels revealed the
nontoxic nature of the gels and that the number of cells on the gels increase more rapidly
than on the coverslips in time. After, adipogenic and cardiomyogenic differentiation
capability of AD-MSCs on the gels is being investigated. Adipogenic differentiation of
ASCs on gels were better than AD-MSCs of cover slips. After two and three weeks of
incubation for cardiomyogenic differentiation, the specific cardiac genes expressions of
GATA4, TBX5 and cTn I were examined by real-time quantitative polymerase chain
reaction (real-time PCR) analysis to investigate the effects of HA/Gelatin blood plasma
gels and the chemical modifiers like activin-a, BMP-4, insulin, valproic acid and 5-
azacytidine on cardiomyogenic differentiation of AD-MSCs. Real time RT-PCR results
showed that different ratios cardiac markers' expression of cells seeded on gels and
coverslips (GAT 4, TBX5 and cTn I) caused every chemical modifiers. The results showed
that a composite HA/Gelatin plasma gel with suitable pore size, mechanical properties and 
viii
excellent cell growth supporting property can serve as a useful scaffold for soft tissue
engineering applications . Also cardiac gene expressions of the activin-a, BMP-4 and
insulin, valproic acid induced cells compared with 5- azacytidine induceed cells on HA/G
plasma gels were the most pronounced in promoting cardiomyogenic differentiations in
this investigation.