Serum ve eritrosit membran yağ asitlerinin gaz kromatografisi-alev iyonizasyon dedektörü ile ölçümü ve klinik kullanımı
Measurement of serum and erythrocyte membrane fatty acids with gas chromatography-flame ionisation dedector and its clinical usage
Yazar: ERDİM SERTOĞLU
Danışman: PROF. İSMAİL KURT
GATA / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kromatografi-gaz = Chromatography-gas ; Lipidler = Lipids ; Renal diyaliz = Renal dialysis ; Yağ asitleri = Fatty acids

Özet:
Son yıllarda yağ asitleri ve özellikle omega-3 (?-3) yağ asitlerinin böbrek ve kardiyovasküler hastalıklar başta olmak üzere hiperlipidemi, enflamatuvar ve otoimmün hastalıklar, solunum hastalıkları, onkolojik, nörolojik hastalıklar ve endokrinolojik bozuklukların etyopatogenezindeki rolü ve bunların diyetle alımının bu hastalıkların tedavisindeki etkileri üzerine çok fazla çalışma yapılmıştır ve halen bu konudaki çalışmalar yoğun olarak sürmektedir. Yine ?-3 yağ asitlerinin nefroloji alanında IgA nefropatisi, lupus nefriti, siklosporin A toksisitesi, diyabetik nefropati ve hemodiyaliz ile olan etkileşimi üzerine birçok yayın bulunmakla birlikte bu konudaki araştırmalar halen devam etmektedir.Bu çalışmada GATA Tıbbi Biyokimya AD Metabolizma Laboratuvarına plazma ve membran yağ asidi konsantrasyonlarının Gaz kromatografisi-Alev İyonizasyon Dedektörü (GC-FID) ile ölçüm metodu kurularak ve optimize edilerek hemodiyaliz tedavisi gören son dönem böbrek yetmezliği (SDBY) hastalarında yağ asidi konsantrasyonlarının ölçülmesi amaçlanmıştır.Plazma ve membran yağ asitlerinin GC-FID ile ölçüm metodunda SPTM-2560 Kapiller Kolon (100m X 0.25mm X 0.2 µm) kullanılmış olup ve 3N metanolik HCl ile 90oC'de 4 saat türevlendirme işlemi uygulanmasını takiben 45 dk toplam analiz süresinde 34 yağ asidine ait pikler elde edilmiştir. Bu metodla , yağ asitlerinin 300 µg/ml konsantrasyona kadar lineer olduğu, LOD 0.3-4.2 µg/ml konsantrasyonlar arasında, geri kazanımın totalde % 87-107 aralığında ve tekrarlanabilirliğin % 4.2-10.4 aralığında olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuçlar kaynaklarla karşılaştırıldığında, kullandığımız metodun plazma ve membran yağ asidi konsantrasyonlarını belirlemede yeterli performansa sahip olduğu düşünülmektedir.GATA Nefroloji Kliniği Hemodiyaliz Ünitesinde hemodiyaliz tedavisi gören 38 SDBY hastası (18 tanesinde beraberinde Tip II DM mevcut) ve 28 kontrol hastası (14'ü Tip II DM, 14'ü kronik hastalık sahibi değil) çalışmaya dahil edilmiştir.Çalışmaya dahil edilen tüm hasta gruplarında serum lipid içeriği incelendiğinde SDBY+Tip II DM hastalarında serum trigliserit ve VLDL-Kol düzeyleri Tip II DM hastalarına göre istatistiksel anlamlı yüksek bulunurken (p<0.001) HDL-Kol düzeyleri düşük bulunmuştur (p<0.001). Serum trigliserit düzeyleri SDBY+Tip II DM hastalarında SDBY hastalarına kıyasla da yüksek bulunmuştur (p<0.01). Ayrıca membran Eikosapentaenoik asit/Araşidonik asit (EPA/AA) oranı Tip II DM hastalarında sağlıklı kontrollere göre anlamlı yüksek bulunmuştur (p<0.01). SDBY+Tip II DM hastalarında plazma EPA düzeyleri ile EPA/AA oranı Tip II DM hastalarında göre istatistiksel azalmış (p<0.01) bulunurken DHA ile EPA+DHA düzeyleri açısından anlamlı farklılık gözlenmemiştir. Membran yağ asidi konsantrasyonları açısından değerlendirildiğinde ise SDBY+Tip II DM hastalarında DHA ve EPA düzeyleri Tip II DM hastalarına göre istatistiksel anlamlı düşük bulunmuştur (p<0.05). Plazma ve membran EPA+DHA düzeyleri açısından hasta grupları arasında anlamlı farklılık gözlenmemiştir. Bununla birlikte SDBY+Tip II DM ve Tip II DM hasta gruplarının plazma ve membran EPA, EPA+DHA, EPA/AA ve DHA konsantrasyonları arasında anlamlı pozitif korelasyon bulunmuştur.Omega grubu yağ asitlerinin (özellikle EPA ve DHA) immünomodülatör etkileri düşünüldüğünde Tip II DM ve SDBY hasta gruplarında plazma ve membran konsantrasyonlarının düşük düzeylerde gözlenmesi, bu hastalıklara bağlı komplikasyonların gelişim ve ilerleme mekanizmalarında bu yağ asitlerinin rolü olabileceğine işaret etmektedir.Laboratuvarımıza kazandırılan bu plazma ve membran yağ asit ölçüm metodunun, bazı yağ asit oksidasyon bozukluklarının tanısında yararlı bir test olarak kullanılabileceği, yağ asitlerinin hem çeşitli hastalıkların etyopatogenezindeki rollerinin araştırılması hem de diyetle alınan yağ asitlerinin biyoyararlanımı ile ilgili yapılacak çalışmalara temel oluşturacağına inanıyoruz.

Abstract:
Recently, etiopathogenetic role of fatty acids, particularly omega-3 fatty acids, especially on renal and cardiovascular diseases and hyperlipidemia, autoimmune and inflammatory diseases, respiratory diseases, oncological, neurological diseases and endocrinological disorders and effects of dietary intake to the treatment of these diseases were studied in many researches. And researches on this subject are still ongoing intensively. While there are many publications in the field of nephrology about the interaction of ?-3 fatty acids with the IgA nephropathy, lupus nephritis, cyclosporin A toxicity, diabetic nephropathy and hemodialysis, number of studies on this subject are still increasing.In this study, it's aimed to develop and optimize the method to determine fatty acid concentrations in end-stage renal disease (ESRD) patients undergoing hemodialysis by Gas Chromatography-Flame Ionisation Detector (GC-FID) in GATA Department of Medical Biochemistry Metabolism Laboratory.SPTM-2560 capillary column (100m X 0.25 X 0.2 m) was used to determine plasma and membrane fatty acids with GC-FID. Following derivatization process with 3N methanolic HCl for 4 hours at 90oC, 34 fatty acid peaks were obtained in 45 min of total analysis time. In this method, fatty acid concentrations were linear up to 300 µg/ml, LOD was between 0.3-4.2 µg/ml concentrations, recovery have been found to be in the range of 87-107 % and reproducibility have been found to be in the range of 4.2-10.4 %. When these results are compared to the literatures, it is considered that the method we used have adequate analytical performance to determine plasma and membrane fatty acids concentration.38 ESRD patients undergoing hemodialysis treatment in the Hemodialysis Unit of GATA Nephrology Department (18 with Type II DM) and 28 control patients (14 with Type II DM, 14 with no chronic disease) have been included in the study.When the serum lipid content is analyzed in all patient groups included in the study, serum HDL-Chol levels were statistically significantly lower in ESRD+Type II DM patients compared to Type II DM patients (p<0.001), while triglyceride and VLDL-Chol levels were significantly higher (p<0.001). Serum triglyceride levels were higher in ESRD+Type II DM patients compared to patients with ESRD (p <0.01) indeed. Also membrane Eicosapentaenoic acid/Arachidonic acid (EPA/AA) ratio in Type II DM patients was statistically significantly higher than in healthy controls(p<0.01). While plasma EPA levels and EPA/AA ratio were statistically significantly higher in ESRD+Type II DM patients than Type II DM patients (p<0.01), no significant difference was observed with DHA and EPA+DHA levels. When membrane fatty acid concentrations were assessed, DHA and EPA levels in ESRD+Type II DM patients were significantly lower than in Type II DM patients (p<0.05) and there were no statistically significant difference in EPA+DHA levels between the patient groups. However, there were significant positive correlation in plasma and membrane EPA, EPA+DHA, EPA/AA and DHA concentrations between ESRD+Type II DM and Type II DM patients.While considering immunomodulatory effects of omega fatty acids (particularly EPA and DHA) and determination of low plasma and membrane concentrations in Type II DM and ESRD patient groups, it can be suggested that these fatty acids may play a role in the mechanisms of development and progress of complications associated with these diseases.We believe that the method we developed to determine plasma and fatty acid concentrations can be used as a screening test for the diagnosis of some fatty acid oxidation disorders, and provide a basis for future studies about bioavailability of dietary fatty acids as well as to evaluate the role of fatty acids in the etiopathogenesis of various diseases.