Temsirolimusun NCI-H1975 akciğer kanser hücrelerinde mTOR protein aktivitesi üzerine etkileri
Effects of temsirolimus on mTOR protein activity in NCI-H1975 lung cancer cells
Yazar: BİRCAN ÖNEL
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ESRA AYDEMİR
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kanser, hücre döngüsü kontrolünde meydana gelen aksaklıklar yüzünden ortaya çıkan ölümcül bir hastalıktır. Normalde ölmesi gereken mutant ya da hasarlı hücreler, çok sayıda mutasyonu biriktirerek hücre döngüsü boyunca ilerleyebilir ve bu sayede kanserleşmeye başlayabilir.    Son yıllarda, hücre döngüsü kontrol noktalarını hedef alan etkili anti-kanser ajanların geliştirilmesi dikkat çekmeye başlamıştır.
mTOR, ökaryotik hücrelerin hayatta kalmasını, büyümesini ve çoğalmasını kontrol eden biyosentez süreçlerinin önemli bir bileşenidir. mTOR proteini yapısal olarak mTOR kompleks 1 (mTORC1) ve kompleks 2 (mTORC2) olmak üzere iki farklı protein kompleksinden oluşmaktadır. mTORC1 hücre döngüsü kontrol noktalarının düzenlenmesinde etkin olduğu için hücre büyümesini rapamisin'e-duyarlı bir şekilde kontrol eder ve Akt ile hücresel enerjinin düzenlenmesi sayesinde aktive olur. Aksine mTORC2, hücre döngüsü kontrolünde rapamisin'e duyarsız bir rol üstlenmektedir. Bu kompleslerin inhibisyonu hücre büyümesinde, çoğalmasında, metabolizmasında, anjiyogenezinde baskılanmaya ve bu nedenle hücre döngüsünün G1 fazında beklemesine yol açmaktadır. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) de dâhil olmak üzere bir çok kanser tipinde mTOR aktivitesinde önemli bir artışın olduğu bilinmektedir. Bu bağlamda, klinikte kullanılmak üzere, mTOR aktivitesini seçici olarak baskılayabilen farklı bileşikler geliştirilmektedir. 
Rapamisinin bir analoğu olarak sentezlenen Temsirolimus (CCI-779) mTOR aktivitesini mTORC1 üzerine etki ederek seçici bir biçimde baskılamaktadır. Temsirolimus'un renal hücre ve nöroendokrin karsinomlarında, meme kanserinde, glioblastomada ve mantle hücreli lenfomada antitümoral etkileri olduğu bilinmektedir. 
mTOR proteininin inhibisyonunun hücreyi otofajik ölüme yönlendirdiği bilinmektedir. Otofaji, protein ve organeller gibi hücresel bileşenlerin otofagazomlar içinde hapsedilerek parçalanmak üzere lizozomlara iletildiği bir süreçtir. Hücresel stresin ve besin kıtlığının bulunduğu durumlarda otofaji, hücresel enerjinin, homeostasinin ve makromolekül sentezinin korunmasını sağlayarak hücrenin hayatta kalma şansını arttırmaktadır. Yapılan birçok çalışma; ılımlı ve/veya yavaş gerçekleşen otofajinin hücrenin sağkalım şansını arttırdığını, şiddetli ve/veya hızlı bir biçimde gerçekleşen otofajinin ise hücreyi ölüme yönlendirdiğini işaret etmektedir. Otofajiyi indüklemek suretiyle hücrelerin ilaca karşı olan hasasiyetini arttırmayı başaran pek çok antikanser ajan bulunmaktadır. Son yıllarda otofaji, antitümöral ilaçlara karşı dirençli hale gelen tümör hücreleri için yeni bir alternatif terapötik hedef olarak değerlendirilmektedir. 
Literatürden elde ettiğimiz tüm bu verilere dayanarak biz de temsirolimus'un küçük hücreli dışı akciğer kanseri için potansiyel bir terapötik yaklaşım olup olmayacağını sorguladık. Çalışmamızda, temsirolimus'un NCI-H1975 hücrelerinde (KHDAK hücresi) sergilediği in vitro sitotoksik etkiyi değerlendirdik. Temsirolimus, NCI-H1975 hücrelerinde doza ve zamana bağlı sitotoksik etki sergiledi. İlaç, 72 saat sonunda 0.9 µg/ml'lik dozda kaspaz -3, -8 ve  -9 enzimlerinin aktivitelerinde önemli bir artış sağlamak koşulu ile hücrelerin canlılığında %31.4'lük bir azalmaya yol açtı. Temsirolimus NCI-H1975 hücrelerinde mTOR aktivitesinde sadece 24 saatlik inkübasyon süresi sonunda bir inhibisyona sebep oldu.

Abstract:
Cancer is a lethal disease which occurs due to the malfunctions within the cell cycle regulation. The mutated or injured cells which are normally have to die are allowed to progress through the cell cycle with a number of accumulated mutations and thus become cancerous. Recently, the development of effective anti-cancer agents that target the cell cycle checkpoints have received much attention.
mTOR is an important component of biosynthetic process that regulates eukaryotic cell survival, growth and proliferation. mTOR exists as structurally two distinct protein complexes;  mTOR complex 1 (mTORC1) and complex 2 (mTORC2). mTORC1 is involved in rapamycin-sensitive control of cell growth by regulating the cell cycle checkpoints and is activated by Akt and regulation of cellular energy. Conversely, mTORC2 acts in rapamycin-insensitive control of cell growth. Inhibition of these protein complexes results in diminished cell growth and proliferation, metabolism and angiogenesis and therefore leads cell cycle block at the G1 phase. Upregulation of mTOR activity is evident in many types of cancers including NSCLC. In this respect,  several compounds that selectively inhibit mTOR activity have been developed for clinical use.
As an analogue of rapamycin, Temsirolimus (CCI-779), was synthesized to specifically inhibit mTOR by directly acting on mTORC1. It was reported that temsirolimus exerts antitumoral effects on renal cell carcinoma, breast cancer, glioblastoma, neuroendocrine carcinomas and mantle cell lymphoma.
It is known that inhibition of mTOR protein leads to autophagic cell death. Autophagy is a process in which cellular components such as proteins and organelles are engulfed by autophagosomes, and are transmitted to the lysosomes for degradation. Autophagy can facilitate cell survival by maintaining cellular energy, homeostasis and macromolecular synthesis during cellular stress and nutrient deprivation. Many reports indicated that mild and/or slow autophagy may enhance cell survival while more severe and/or rapid autophagy would induce cell death. There are several anticancer agents which induce autophagy and thereby sensitize cells to drug treatment. Recently autophagy is considered to be an innovative therapeutic target for tumor cells which are resistant to anti-tumor drugs. 
Based on these literatural results, we questioned whether temsirolimus treatment could be a potential therapeutic option for NSCLC. In this study, we evaluated the cytotoxic effects of temsirolimus in NCI-H1975, a type of NSCLC, in vitro. Temsirolimus exerted a time and dose dependent cytotoxic activity against NCI-H1975 cells. Temsirolimus at 0.9 µg/ml concentration, yielded % 31.4 inhibition in cell viability at the end of 72 hours by activating caspase -3, -8 and -9 enzymes. Temsirolimus inhibited mTOR activity only at the end of 24 hours in NCI-H1975 cells.