Meme kanserinde antiöstrojen ilaçların hipoksik koşullarda VEGF ekspresyonu üzerindeki etkileri
Effect of antiestrogenic drugs on VEGF expression in breast cancer cell lines under hypoxi̇c condi̇ti̇ons
Yazar: MEHTAP ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. BOLKAN ŞİMŞEK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Hipoksi = Hypoxia ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors ; Östrojen antagonistleri = Estrogen antagonists ; Östrojenler = Estrogens

Özet:
MEME KANSERİNDE ANTİÖSTROJEN İLAÇLARIN HİPOKSİK KOŞULLARDA VEGF EKSPRESYONU ÜZERİNDEKİ ETKİLERİ 
Meme kanserinin önlenmesinde ve tedavisinde hormonal tedavi yaklaşımlarının östrojen reseptör-aracılıklı kanser gelişimini ve ilerlemesini güçlü olarak inhibe ettiği gözlemlenmiştir. Bu çalışmada ERα pozitif meme kanseri için günümüzde kullanılan anti-östrojenik ilaç olan letrozol, tamoksifen fulvestran'ın normal ve hipoksik koşullarda VEGF salınımı üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. VEGF tümör anjiyogenezinde başlıca etken olup, meme kanserinin ilerlemesi ve metastazı ile ilişkilidir. Hipoksi, VEGF ekspresyonu için en önemli uyarıcı etkendir. Bu çalışmada insan meme kanseri hücre hattı MCF-7/AROM-1 ve T47D/AROM kullanıldı. Hücreler kültüre alınarak, 1 nM estrodiol (E2) ya da 1 nM testosteron (T) ile ilaçların (Letrozol,Fulvestran,Tamoksifen) varlığında ya da yokluğunda stimule edilerek hücre yaşamsallığı kristal viyole boyama tekniği ile analiz edildi. HIF1α p-AKT, p-mTOR, p-p70S6K proteinleri, elektroforez ve blot işlemleri ile tespit edildi. VEGF ELİSA kiti kullanılarak hücre kültürünün süpernatantındaki VEGF miktarı belirlendi. Gerçekten, anti-östrojenik tedavilerde ER aktivitesi azaltılması ile teorik olarak VEGF üretimi baskılanabilir ve vaskülarizasyonun gerilemesine öncülük edebilir, böylece meme kanserinin ilerlemesi engellenmiş olur. Deney sonuçlarımıza göre, normal koşullar altında uygulanan letrozol tedavisi, östradiolün uyardığı MCF-7/AROM-1 ve T47D/AROM meme kanseri hücre hattındaki hücre proliferasyonunu tamamen inhibe etti. Ayrıca letrozol tedavisi, AKT/mTOR yolağında down-regülasyon oluşturdu. Hipoksik koşullardaki hücre proliferasyonu yavaşladı, bu nedenle letrozol tedavisinin inhibisyon etkisi çok az gözlendi, bu koşullarda AKT/mTOR yolağının etkili bir şekilde inhibe edildiği sonucuna varıldı. MCF-7/AROM-1 ve T47D/AROM meme kanseri hücre hatlarında, hipoksiye yanıt olarak VEGF-A salınımının güçlü bir şekilde indüklendiği, salgılanan VEGF-A miktarlarının her iki hücre hattında da doza bağlı letrozol tedavisi ile anlamlı ölçüde azaldığı bulundu. Benzer olarak, saf anti-östrojen fulvestranın, hipoksik koşullarda VEGF-A'nın östrojen stimülasyonunu inhibe ettiği, bu etkinin kısmen ER aracılığı ile gerçekleştiği düşünüldü. Bunun aksine, tamoksifen tedavisi hipoksik koşullarda VEGF-A üretimi üzerindeki östrojenin uyarıcı etkisini inhibe etmemiş, ayrıca kültür medyasındaki VEGF-A salınımını indüklemiştir. Tamoksifen tedavisinden sonra hipoksik ve normal koşulların her ikisinde de mTOR ısrarlı bir şekilde aktivasyonunu sürdürmüştür. mTOR inhibitörü rapamisin VEGF-A miktarının artışını önlemiştir. Sonuçlarımız, aromataz inhibitörü letrozol ve saf anti-östrojen fulvestranın, hipoksik koşullarda VEGF salımını azaltabileceğini ve böylece meme tümörünün ilerlemesini ve anjiyogenezi engellediğini göstermiştir. 

Anahtar kelimeler: meme kanseri, ERα, VEGF, HIF1α, letrozol, fulvestran, tamoksifen, rapamisin

Abstract:
EFFECT OF ANTIESTROGENIC DRUGS ON VEGF EXPRESSION IN BREAST CANCER CELL LINES UNDER HYPOXIC CONDITIONS
Breast cancer hormonal therapies in the prevention and treatment of estrogen receptor mediated cancer development and progression is observed that strongly inhibited. The aim of this study was to investigate the effects of anti-estrogenic drugs currently used in the treatment of ERα (+) breast cancer (letrozole, tamoxifen and fulvestrant) on VEGF release under normoxic and hypoxic conditions. VEGF is a major inducer of tumor angiogenesis and it is involved in breast cancer progression and metastasis. Hypoxia is an important inducer of VEGF expression. İn this study we used MCF-7/AROM-1 and T47D/AROM, ERα-positive breast cancer cell lines. Cells were cultured and then treated with 1 nM estrodiol (E2) or stimulated with 1 nM testosterone (T) in the absence or presence of the drugs (Letrozole,Fulvestran, Tamoxifen) and cell viability was analyzed by crystal violet staining technique. Protein quantification of HIF1α p-AKT, p-mTOR, p-p70S6K was determined by electrophoresis and blotting analysis. VEGF ELİSA kit has been used for determination of VEGF in the supernatant of human cell cultures. The treatment with letrozole under normoxic conditions completely inhibited estradiol-driven cell proliferation in MCF-7/AROM-1 and T47D/AROM breast cancer cell lines. Moreover the exposure to letrozole treatment produced a down regulation of the AKT/mTOR pathway. Under hypoxic conditions cell proliferation was slowed down, therefore the inhibitory effect of letrozole treatment was less appreciable; in this condition the AKT/mTOR pathway was strongly inhibited.
MCF-7/AROM-1 and T47D/AROM breast cancer cell lines responded to hypoxia strongly induced VEGF-A release in the culture medium; the treatment with letrozole significantly decreased secreted VEGF-A amounts in both cell lines in a dose-dependent manner.
Similarly, the pure antiestrogen fulvestran inhibited estrogen stimulation of VEGF-A under hypoxic conditions, suggesting that this effect was in part mediated by ER.
On the contrary, tamoxifen treatment did not inhibit estrogens effect on VEGF-A production under hypoxic condition, but induced VEGF-A release in the culture medium. Additionally, the mTOR pathway was not down regulated after tamoxifen treatment both under normoxic and hypoxic conditions and mTOR activation persisted also after hypoxic treatment. The mTOR inhibitor rapamycin prevented the increase of VEGF-A levels, showing a relationship between the production of VEGF and the activation of the mTOR pathway.
Our findings show that the aromatase inhibitor letrozole and the pure antiestrogen fulvestran, but not the selective estrogen modulator tamoxifen, can reduce VEGF release under hypoxic condition and therefore prevent breast tumor progression and angiogenesis.

Keywords: breast cancer, ERα, VEGF, letrozole, fulvestrant, tamoxifen, HIF1α, rapamycin