Muşmuladan (Mespilus germanica) izole edilen polifenol oksidaz enziminin aktivitesi üzerine amino asitlerin inhibisyon etkileri
Inhibition effects of amino acids on the activity of polyphenol oxidase enzyme isolated from medlar (Mespilus germanica)
Yazar: EREN ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. EMİNE KARAKUŞ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ÇİĞDEM BİLEN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Amino asitler = Amino acids ; Enzimatik esmerleşme = Enzymatic browning ; Mespilus germanica = Mespilus germanica ; Polifenol oksidaz = Polyphenol oxidase ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Polifenol oksidaz enzimleri, bakır içeren, oksidoredüktaz sınıfından bir enzim grubudur ve bitkilerde meydana gelen esmerleşme olayından sorumludurlar. Esmerleşme olayı, meyve ve sebzelerin besin değerlerinin düşmesine ve kalite kaybına uğramalarına sebep olmaktadır. Bu durum, ürünlerin raf ömrünün kısalmasına ve ekonomik kayıplara neden olduğu için enzimin inaktivasyonu istenen bir durumdur. Bu çalışmada, farklı amino asitlerin enzim üzerindeki inhibisyon etkileri ile enzim için doğal enzim inhibitörü olma potansiyelleri araştırılmıştır. Çalışmada enzim kaynağı olarak muşmula meyvesi kullanılmıştır. Polifenol oksidaz enzimi, amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz işlemleri ile kısmi olarak saflaştırılmış ve kinetik sabitleri (Km = 2.5 mM ve Vmax = 12542,46 U) belirlenmiştir. Her amino asit için inhibisyon türleri ve Ki değerleri çizilen Lineweaver-Burk grafikleriyle tespit edilmiştir. IC50 değerleri çizilen doğrusal grafiklerle belirlenmiştir.  Substrat olarak katekol kullanılmıştır. İnhibitör olarak kullanılan glisin, L-fenilalanin, L-tirozin, L-sistein, L-serin, L-aspartik asit, L-histidin, L-lizin, L-prolin ve L-metiyonin amino asitleri için IC50 değerlerinin sırasıyla 11.15, 12.43, 5.16, 0.071, 18.13, 12.00, 7.40, 9.71, 3.20 ve 15.00 mM ve Ki değerlerinin de sırasıyla 16.52, 11.20, (2.06 ve 3.48), 0.004, 16.86, (4.48 ve 6.60), 4.37, 7.69, 2.18 ve (5.75 ve 11.86) mM olduğu saptanmıştır. En zayıf ve en güçlü inhibitör etkiye sahip amino asitler sırasıyla L-serin ve L-sisteindir. Amino asitler inhibisyon türlerine göre sınıflandığında glisin, L-fenilalanin, L-prolin, L-serin, L-histidin ve L-lizinin yarışmasız inhibisyon, L-sisteinin yarışmalı inhibisyon ve L-tirozin, L-metiyonin ve L-aspartik asidin ise karışık inhibisyon türlerini gösterdikleri belirlenmiştir.  Enzimin, SDS-PAGE tekniği ile molekül ağırlığı için yaklaşık olarak 40 kDa ve 35 kDa olmak üzere iki bant gözlenmiştir. Native-PAGE sonucu 40 kDa ve 70 kDa'da iki bant elde edilmiş ve molekül ağırlıkları 40 ve 70 kDa olan iki izoenzim olabileceği şeklinde yorumlanmıştır.

Abstract:
Plant browning is caused by a set of enzymes called polyphenol oxidases, which belong to the copper-containing oxidoreductase class. Fruits and vegetables lose quality and their nutritional value when they are browned. Since this reduces the items' shelf life and results in financial losses, inactivating the enzyme is preferred. In this work, the potential for different amino acids to act as natural enzyme inhibitors for the enzyme and their effects on enzyme inhibition were examined. Medlar fruit was used as enzyme source in the study. By ammonium sulfate precipitation and dialysis, the polyphenol oxidase enzyme was largely purified, and its kinetic constants (Km = 2.5 mM and Vmax = 12542.46 U) were established. The inhibition types and K$_i$ values for each amino acid were determined by plotted Lineweaver-Burk plots. Plotted linear graphs are used to determine the values of the IC50. The substrate used was catechol. The IC$_{50}$ values for the amino acids glycine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-cysteine, L-serine, L-aspartic acid, L-histidine, L-lysine, L-proline and L-methionine used as inhibitors were 11.15, 12.43, 5.16, 0.071, 18.13, 12.00, 7.40, 9.71, 3.20 and 15.00 mM  respectively. The Ki values were also found to be 16.52, 11.20, (2.06 and 3.48), 0.004, 16.86, (4.48 and 6.60), 4.37, 7.69, 2.18 and (5.75 and 11.86) mM, respectively. L-serine and L-cysteine are the amino acids that have the weakest and most potent inhibitory effects, respectively. When the amino acids were classified according to inhibition types, glycine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-histidine and L-lysine showed uncompetitive inhibition, L-cysteine showed competitive inhibition and L-tyrosine, L-aspartic acid and L-methionine showed mixed inhibition types. The molecular weight of the enzyme was determined by the SDS-PAGE method as two bands, roughly 40 kDa and 35 kDa. Native-PAGE resulted in two bands at 40 kDa and 70 kDa and this result was interpreted as two isoenzymes with molecular weights of 40 and 70 kDa.