Ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.)'da biyoteknolojik yöntemlerle çinko biyoyararlılığının artırılması
Increasing zinc bioavailability in bread wheat (Triticum aestivum L.) by biotechnological methods
Yazar: ESMA YİĞİDER
Danışman: PROF. DR. MAHMUT SİNAN TAŞPINAR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Amaç: Ekonomik açıdan önemli bir tür olan ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.)'da,
myo-inositol-1-fosfat sentaz (MIPS) gen bölgesinin CRISPR/Cas9 genom düzenleme aracıyla
nakavt edilmesinin amaçlandığı bu çalışmada fitik asit (PA) miktarının düşürülmesi ve çinko
(Zn) biyoyararlanımının artırılması hedeflenmiştir. Ayrıca, araştırmada MIPS geninin
susturulmasının inositol yolağında ilişkili inositol pentakisfosfat 2-kinaz (IPPK), myo-inositol
3- kinaz (MIK), inositol monofosfataz 3 (IMP) ve myo-inositol oksijenaz (MIOX) gibi diğer
genlerin ifadesine olan etkisi belirlenmeye çalışılmıştır.
Yöntem: MIPS gen bölgelerinin belirlenmesi biyoinformatik araçlar kullanılarak
gerçekleştirilmiştir. Bu bölgeler tasarlanıp plazmit içerisine aktarılmıştır. Daha sonra plazmit,
elektrokompetan Agrobacterium içerisine aktarılmış ve koloni PCR ile pozitif bakteriler
belirlenmiştir. Plazmiti taşıyan Agrobacterium hücreleri kanamisin içeren ortamda
büyütülmüş ve endosperm destekli olgun embriyo kaynaklı buğday kallusları ile inoküle
edilerek gen transformasyonu sağlanmıştır. Aday mutant bitkiler P35 S ve Cas9 primerleri ile
plazmit varlığı açısından değerlendirilmiştir. Ardından mutant bitkiler, gen bölgeleri ile
ilişkili hedef 1 ve hedef 2 primerleri ile çoğaltılarak Sanger dizileme yapılmıştır. Yine
mutasyonların belirlenmesinde, T7 Endonükleaz I analizi kullanılmıştır. MIPS, IPPK, MIK,
IMP ve MIOX genlerinin ifade analizleri qRT-PCR kullanılarak belirlenmiştir.
Bulgular: Buğdayda olgun embriyo kültüründe Agrobacterium aracılı etkili bir gen aktarımı
sağlanmıştır. Araştırmada 10 günlük kallus dokularının aktarım için uygun olduğu
görülmüştür. Yine araştırmada, en yüksek genetik transformasyon etkinliği, OD 600 = 0,8
bakteri yoğunluğunun, inokülasyon ortamında asetosiringon (AS) dozu olarak 200 µl
kullanılmasının ve inokülasyondan sonra kallusların MS ortamı + 200 µl AS içeren kağıt
ortamında 25 °C'de 48 saat süreyle karanlıkta ko-kültivasyona alınmasından elde edilmiştir.
Araştırma sonucunda PA yolağında yer alan MIPS geninde CRISPR/Cas9 sistemiyle mutasyon
oluşturulan 21 adet T0 hattı elde edilmiş, bu hatlarda, hedeflenen iki bölgede delesyon,
insersiyon ve nükleotit seviyesinde değişimler (transisyon ve transversiyon) tespit edilmiştir.
MIPS geninin dört mutant bitkinin (T0-9, T0-12, T0-13 ve T0-21) tüm genomlarında
mutasyona bağlı olarak aşağı yönde düzenlendiği görülmüştür. Ayrıca, MIPS geninin IPPK ve
MIK genleriyle pozitif yönde ilişkisinin olduğu belirlenmiştir.
Sonuç: Araştırmada, buğdayda olgun embriyo kültüründe yüksek verimli ve tekrarlanabilir
bir transformasyon sistemi geliştirilmiş ve bu sistemin, CRISPR/Cas9 tabanlı genom
düzenleme için başarıyla kullanılabileceği gösterilmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi ile MIPS
geninde meydana gelen mutasyonlara sahip T0 bitkilerinin ileri generasyonlara kadar
yetiştirilmesi ve tohumlarda bitki besin elementi ve PA içeriğinin belirlenerek Zn
biyoyararlılığı bakımından ıslaha uygun hatların elde edilmesi önerilmektedir.

Abstract:
Purpose: In this study, which aims to knockout the myo-inositol-1-phosphate synthase
(MIPS) gene region in bread wheat (Triticum aestivum L.), an economically important
species, using the CRISPR/Cas9 genome editing tool, the reduction of phytic acid (PA)
content and the enhancement of zinc (Zn) bioavailability were targeted. Additionally, the
effect of silencing the MIPS gene on the expression of other genes involved in the inositol
pathway, such as inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPPK), myo-inositol 3-kinase (MIK),
inositol monophosphatase 3 (IMP), and myo-inositol oxygenase (MIOX), was investigated in
this research.
Method: The identification of MIPS gene regions was performed using bioinformatics tools.
These regions were designed and transferred into plasmids. Subsequently, the plasmids were
transferred into electrocompetent Agrobacterium, and positive bacterial colonies were
determined using colony PCR. Agrobacterium cells carrying the plasmid were cultured in a
medium containing kanamycin and then inoculated with wheat callus derived from mature
embryos supported by endosperm to facilitate gene transformation. Candidate mutant plants
were evaluated for the presence of the plasmid using P35 S and Cas9 primers. Then, mutant
plants were amplified using target 1 and target 2 primers specific to gene regions and
subjected to Sanger sequencing. T7 Endonuclease I analysis was used to determine mutations.
The expression analyses of MIPS, IPPK, MIK, IMP, and MIOX genes were determined using
qRT-PCR.
Findings: Effective gene transfer through Agrobacterium was achieved in wheat mature
embryo culture. The study showed that 10-day-old callus tissues were suitable for transfer.
Additionally, the highest genetic transformation efficiency was obtained by using an
OD 600 =0.8 bacterial density, a dose of 200 µl acetosyringone (AS) in the inoculation medium,
and co-cultivation of the calli in MS medium + 200 µl AS on filter paper in darkness at 25 °C
for 48 hours after inoculation. As a result of the research, 21 T0 lines were obtained with
mutations in the MIPS gene involved in the PA pathway using the CRISPR/Cas9 system.
Deletions, insertions, and nucleotide-level changes (transitions and transversions) were
detected in the targeted regions in these lines. It was observed that the MIPS gene was
downregulated due to mutations in the genomes of four mutant plants (T0-9, T0-12, T0-13,
and T0-21). Additionally, a positive correlation was found between the MIPS gene with the
IPPK and MIK genes.
Results: In the study, a highly efficient and reproducible transformation system was
developed in wheat mature embryo culture, and it was demonstrated that this system can be
successfully used for CRISPR/Cas9-based genome editing. It is suggested that T0 plants
carrying mutations in the MIPS gene using the CRISPR/Cas9 system should be grown to
subsequent generations, and the plant nutrient element and PA content in the seeds should be
determined to obtain breeding lines suitable for improvement in terms of Zn bioavailability.