Streptozotosin ile diyabet oluşturulmuş sıçanların hipokampüsünde otofajinin araştırılması
Investigation of autophagy in the hippocampus of streptozotocin-induced diabetes rats
Yazar: ŞAZİMET TAŞ
Danışman: PROF. DR. FEYZULLAH BEYAZ
Erciyes Üniversitesi / Gevher Nesibe Genom ve Kök Hücre Enstitüsü  / Nörobilim Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Otofaji hasarlı hücresel proteinleri ve organelleri ortadan kaldıran evrimsel bir sürecin bir parçasıdır. Post-mitotik olan nöronlar, proteotoksinlerin birikmesine karşı özellikle savunmasızdır ve bu nedenle homeostazı sürdürmek için büyük ölçüde otofajiye bağımlıdırlar. Bu çalışmanın amacı, deneysel olarak streptozotosin (STZ) ile diyabet oluşturulmuş sıçanların hipokampüslerinde otofajinin araştırılmasıdır.
Bu çalışmada 24 adet Wistar albino suşu erkek sıçan (180-200 gr, 1 aylık) kullanıldı. Sıçanlar rastgele ve eşit olarak; diyabet grubu (45 mg/kg streptozotosin i.p. n: 8), sham grubu (sitrat tamponu ph; 4,5 i.p n: 8) ve kontrol grubu (n: 8) olmak üzere 3 gruba ayrıldı. Hayvanların her gün kuyruk venalarından kan alınarak kan glükoz seviyeleri ölçüldü. Sıçanlar deney bitimine kadar 3'er gün aralıklarla tartıldı ve ağırlıkları kaydedildi. Deney 40 gün süreyle devam ettirildikten sonra hayvanlara Bouin tespit solüsyonu ile perfüzyon yapılarak beyinleri çıkarıldı. Beyin dokularından 4 µm kesitler alındıktan sonra bu dokulara genel yapının incelenmesi amacıyla Nisll boyama yapıldı. Ardından diğer kesitlere AMPK, mTOR, LC3 ve Beclin-1 için Strept-avidin peroksidaz immunboyanma yöntemi uygulandı. Image J yöntemiyle değerlendirme yapıldı.
Yapılan boyamalar sonucunda hem kontrol grupları hem de diabetik gruptaki hayvanların hipokampüslerinin dentat girus ve kornu ammonis bölümlerindeki nöronların sitoplazmalarında beclin-1 pozitif immunreaksiyon gözlendi. Beclin-1 immunreaktivitesinin diyabetik gruptaki nöronlarda kontrol gruplarındakine göre daha belirgin olduğu dikkati çekti (P<0,05). Kalitatif incelemelerde herhangi bir fark gözlenmemesine karşın araştırma mikroskobu ile elde edilen görüntülerin Image J proğramı ile de değerlendirilmesi sonucunda diabetik gruptaki sıçanların sıçan hipokampüslerinin girus dentatus ve kornu ammonis yapılarının incelenmesinde kontrol gruplarına göre alan boyanma yoğunluğu açısında anlamlı bir değişiklik belirlendi (P<0,05). Hem kontrol gruplarında hem de diabetik gruptaki hayvanların hipokampüs bölümlerindeki bazı nöronların nörolemma ve aksolemmaları ile nöropilde AMPK pozitif reaksiyon gözlendi. Araştırma mikroskobu ile elde edilen görüntülerin Image J programı ile de değerlendirlmesi sonucunda diabetik gruptaki sıçanların hipokampüslerinin dentat girus ve kornu ammonis gibi yapılarının incelenmesinde kontrol gruplarına göre alan boyanma yoğunluğu açısında anlamlı bir değişiklik belirlenmedi (P˃0,05). Kontrol gruplarında ve diabetik gruptaki hayvanların hipokampüslerindeki nöronların sitoplazmalarında yoğun mTOR pozitif immunreaksiyon gözlendi. Araştırma mikroskobu ile elde edilen görüntülerin J-image programı ile de değerlendirlmesi sonucunda diabetik gruptaki sıçanların beyinlerinin hipokampüslerinin dentat girus ve kornu ammonis gibi yapılarının incelenmesinde kontrol gruplarına göre alan boyanma yoğunluğu açısında anlamlı bir değişiklik belirlendi (P<0,05). Diyabet grubunda mTOR boyanma alan yoğunluğunda azalma vardı.
Çalışmamızda tüm elde ettiğimiz veriler ışığında deneysel STZ ile diyabet oluşturulan sıçanların hipokampüsündeki nöronlarda beclin-1 aracılı bir otofaji gözlendi.

Anahtar Kelimeler:  Diyabet, Hipokampüs, Otofaji, Sıçan, Streptozotosin.

Abstract:
Autophagy is part of an evolutionary process that removes damaged cellular proteins and organelles. Neurons that are post-mitotic are particularly vulnerable to the accumulation of proteotoxins and are therefore highly dependent on autophagy to maintain homeostasis. The aim of this study was to investigate autophagy in the hippocampus of rats with experimental streptozotocin (STZ) diabetes.
In this study, 24 male Wistar albino strains (180-200 g, 1 month old) were used. Rats randomly and equally; They were divided into 3 groups as diabetes group (45 mg/kg streptozotocin i.p. n: 8), sham group (citrate buffer pH; 4.5 i.p n: 8), and control group (n: 8). Blood glucose levels were measured by drawing blood from the tail veins of the animals every day. The rats were weighed at 3-day intervals until the end of the experiment and their weights were recorded. After the experiment was continued for 40 days, the animals were perfused with Bouin fixation solution and their brains were removed. After 4 µm sections were taken from the brain tissues, Nisll staining was applied to these tissues to examine the general structure. Then, Strept-avidin peroxidase immunostaining method was applied to other sections for AMPK, mTOR, LC3 and Beclin-1. Evaluation was made using the Image J method.
As a result of staining, beclin-1 positive immunoreaction was observed in the cytoplasm of neurons in the dentate gyrus and cornu ammonis parts of the hippocampus of both control groups and animals in the diabetic group. It was noted that Beclin-1 immunoreactivity was more prominent in neurons in the diabetic group than in the control groups (P<0.05). Although no difference was observed in the qualitative examinations, as a result of the evaluation of the images obtained with the research microscope with the Image J program, a significant change was determined in the area staining intensity in the examination of the gyrus dentatus and cornu ammonis structures of the rat hippocampus of the rats in the diabetic group compared to the control groups (P<0.05). AMPK positive reaction was observed in the neurolemma and axolemma of some neurons and neuropil in hippocampus parts of both control groups and animals in the diabetic group. As a result of the evaluation of the images obtained with the research microscope with the Image J program, there was no significant change in the intensity of field staining compared to the control groups in the examination of the structures such as the dentate gyrus and cornu ammonis of the hippocampus of the rats in the diabetic group (P˃0.05). Intense mTOR positive immunoreaction was observed in the cytoplasm of neurons in the hippocampus of the control groups and animals in the diabetic group. As a result of the evaluation of the images obtained with the research microscope with the J-image program, a significant change in the intensity of field staining was determined in the examination of the structures such as the dentate gyrus and cornu ammonis of the brains of the rats in the diabetic group compared to the control groups (P<0.05). There was a decrease in mTOR staining area density in the diabetes group.
In the light of all the data we obtained in our study, a beclin-1-mediated autophagy was observed in neurons in the hippocampus of rats with experimental STZ-induced diabetes.

Key words: Autophagy, Hippocampus, Diabetes, Rat, Streptozotocin.