Fitaz üreticisi aspergıllus nıger izolasyonu, enzimin saflaştırılması, karakterizasyonu ve optimizasyonu
Isolation of phytase producer aspergillus niger, purification, characterization and optimization of the enzyme
Yazar: SAYIM AKTÜRK
Danışman: PROF. DR. SADIK DİNÇER
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, çürümüş bitki parçacıkları, su, toprak ve gübreden izole edilen Aspergillus niger FM-7 izolatından fitaz enzimi üretimi, karakterizasyonu ve saflaştırılması yapılmıştır. Bu fungusun fitaz enzimi üretimi sodyum fitatlı besiyerinde 30oC'de 72 saatlik inkübasyondan sonra mikroorganizmanın etrafında oluşan şeffaf zonla saptanmıştır. Aspergillus niger FM-7 suşundan izole edilen enzim en iyi aktivite gösterdiği için bu suş çalışmada kullanılmıştır.
FM-7 suşundan üretilen fitazın M1 besiyerideki SDS-PAGE analizinde  molekül ağırlıkları 93 kDa ve 70 kDa, M1+%0.1 Na-fitatlı besiyerinde ise moleküler ağırlıkları 100 kDa ve 83 kDa olan iki protein bandı elde edilmiştir. M1ve M1+%0.1 Na-fitatlı besiyerinden üretilen enzim optimum aktivitesini sırasıyla 70oC ve pH 3.8, 70oC ve pH 4.6'de gösterirken piyasada satılan Aspergillus niger kaynaklı Ticari A ve Ticari B fitazlarında optimum aktivite 70oC ve pH 3.4 olarak bulunmuştur. M1, M1+%0.1Na-fitat, Ticari A ve Ticari B enzimleri sırasıyla 90oC'de 60 dakika süreyle aktivitelerini %35, %35, %1 ve %41 oranında koruyabilmiştir. M1 besiyerinden elde edilen enzimin diyaliz ve kolon kromotografisi sonrası spesifik aktivitesi 941.17 U/mg olarak bulunmuş ve başlangıca göre 6 kat saflaştırılmıştır. Km ve Vmax kinetik parametreleri Na-fitat substratı için sırasıyla 7,7 mM ve 5137 U/mg protein bulunmuştur. Tüm enzim aktiviteleri MgCl2, NiCl2, MgSO4, CuSO4, MnSO4 ve asetik asitle ile önemli düzeyde artarken EDTA ve SDS ile inhibe olmuştur. Bu sonuçlara göre, Aspergillus niger FM-7 suşundan üretilen enziminin sahip olduğu karakteristik özelliklerden dolayı yem katkı maddesi alanında kullanımı önerilebilir.

Abstract:
In this study, the phytase enzyme from Aspergillus niger FM-7 isolated from decayed plants, water, soil and manure was produced, characterized and purified. Phytase production of this strain was determined by production of clear zone around the colonies on the sodium phytate containing medium, after 72 hours incubation at 30οC. The enzyme isolated from Aspergillus niger FM-7 strain was selected in this study, because of its superior activity.
SDS-PAGE analysis of phytase enzyme produced from Aspergillus niger FM-7 strain gave two protein bands corresponding to molecular weights of 93 kDa and 70 kDa in M1 medium and 100 kDa and 83 kDa in M1+% 0.1 Na-phytate medium, respectively. The optimum activity of the enzyme produced in M1 and M1+%0.1 Na-phytate medium was emerged at 70οC, pH 3.8 and 70οC, pH 4.6, respectively, on the otherhand, the optimum activity of commercial phytase enzymes, A and B, produced from Aspergillus niger was emerged at 70 οC, pH 3.4. For 60 minutes at 90οC, the enzymes produced in M1 and M1+%0.1 Na-phytate medium, and the commercial A and B maintained their activity at a rate of 35%, 35%, 1% and 41%, respectively. After dialysis and gel-filtration chromatography, the specific activity of the enzyme produced in M1 medium was found as 941,17 U/mg and a 6-fold purification was achieved when compared with the initial purification. The Km and Vmax values for Na-phytate substrate were 7,7 mM and 5137 U/mg proteins, respectively. Full enzyme activities were significantly stimulated with MgCl2, NiCl2, MgSO4, CuSO4, MnSO4 and acetic acid; however, significantly inhibited with EDTA and SDS. Due to its characteristic properties, we propose that the phytase enzyme, produced from Aspergillus niger FM-7 may be conveniently used in feed additive