Batı Anadolu'da yayılış gösteren centaurea athoa dc. ve endemik centaurea polyclada dc. taksonları üzerinde araştırmalar
Investigations on centaurea athoa dc. and endemic centaurea polyclada dc. taxa naturally distributed in West Anatolia
Yazar: SERDAR DEMİR
Danışman: PROF. DR. CANAN KARAALP ; PROF. DR. ERDAL BEDİR
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Botanik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Centaurea = Centaurea ; Doğal bileşikler = Natural compaunds

Özet:
Centaurea L. (Asteraceae) cinsi, Türkiye florasında 110 tanesi endemik olmak üzere 200 takson ile temsil edilmektedir. Centaurea türleri halk arasında çeşitli hastalıkların tedavisinde dahilen ve haricen kullanılmaktadır. Yapılan biyoaktivite araştırmaları ile Centaurea türlerinin antienflamatuvar, antimalaryal, antiprotozoal, antimikrobiyal, antiülserojenik ve sitotoksik aktivitelerinin bulunduğu belirlenmiştir.
Biyoaktif sekonder metabolitler açısından zengin olan Centaurea taksonları ile gerçekleştirilen fitokimyasal çalışmalar, genellikle seskiterpen laktonların, flavonoitlerin, lignanların ve bunların glikozitlerinin izolasyonuyla sonuçlanmıştır.
Centaurea athoa DC. ve endemik Centaurea polyclada DC. türlerinden hazırlanan metanol ekstrelerinde antioksidan; kloroform ekstrelerinde ise sitotoksik ve antienflamatuvar aktivite gözlenmesi, çalışmamızın çıkış noktasını oluşturmuştur.
Bu çalışmada C. athoa ve C. polyclada türlerinin toprak üstü kısımlarından hazırlanan kloroform, metanol ve n-butanol ekstreleri, sekonder metabolit içerikleri açısından incelenmiştir. Çeşitli kromatografik yöntemler [Açık kolon kromatografisi (AKK), vakum sıvı kromatografisi (VSK), katı faz ekstraksiyonu (KFE)] ile izolasyonu gerçekleştirilen moleküllerin yapıları spektroskopik metotlar [1 ve 2 Dimensiyonlu (1D ve 2D) Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR), kütle ve İnfrared (IR) spektroskopileri] kullanılarak aydınlatılmıştır.
Yapılan izolasyon çalışmaları sonucunda, C. athoa kloroform ekstresinden 3 eleman tip [athoin (CA-1), 14-O-asetil athoin (CA-2) ve 14-O-asetilathoin-12 metil esteri (CA-3)] ve 1 germakranolit tip [4'-hidroksipekterolit-14-O-asetat (CA-4)] olmak üzere 4 seskiterpen; n-butanol ekstresinden ise 2 basit fenolik ve 2 fenolik glukozit [p-hidroksibenzoik asit (CA-5), protokateşik asit (CA-6), vanilik asit-4-O-b-D-glukopiranozit metil esteri (CA-7) ve picein (CA-8)], 2 fenil propanoit türevi [9-O-metil koniferin (CA-9) ve siringin (CA-10)] ve 1 fitosterol [b-sitositerol-3-O-b-D-glukopiranozit (CA-11)] elde edilmiştir.

C. polyclada kloroform ve n-butanol ekstrelerinden ise 5 eleman tip [6a,8b,15-trihidroksielema-1,3,11(13)-trien-12-oik asit (CP-2) ve metil esteri (CP-1), 8a-O-[2'-(hidroksimetil)-but-2'-enoil]-6a,15-dihidroksielema-1,3,11(13)-trien-12-oik asit (CP-3), 13-N-prolin melitensin (CP-4), 13-N-prolin-6a,8a,15-trihidroksielema-1,3-dien-12-oik asit (CP-5)] ve 1 ödesman tip [1b,6a,8a-trihidroksi-15-okso-ödesm-11(13)-en-12-oik asit metil esteri (CP-6)] olmak üzere 6 seskiterpen, 3 flavon [salvigenin (CP-7), öpatorin (CP-8) ve 3'-O-metil öpatorin (CP-9)], 1 lignan [arktiin (CP-10)], 1 fenolik glukozit [taçiozit (CP-11)] ve 1 fenilpropanoit glukoziti [siringin (CP12)] izole edilmiştir.
C. athoa ve C. polyclada'nın toprak üstü kısımlarından 6 eleman türevi (CA-1, CA-2, CA-3 ve CP-3, CP-4, CP-5) ve 1 ödesman türevi olmak üzere (CP-6) 7 yeni seskiterpen bileşiği elde edilmiştir. Germakranolit türevi CA-4 ve eleman türevi CP-2 kodlu seskiterpenler ise Centaurea türlerinden ilk defa rapor edilmektedir.
Bitkilerden izole edilen seskiterpen yapıdaki moleküller, farklı hücre hatlarında sitotoksik ve antienflamatuvar aktiviteleri yönünden incelenmiştir.
3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) canlılık metodu ile gerçekleştirilen sitotoksik aktivite çalışmasında; C. athoa'dan elde edilen germakranolit türevi 4'-hidroksipekterolit-14-O-asetat (CA-4) tüm hücre hatlarında (A549, CaCO-2, HeLa, MCF-7,  MDAMB231, mPanc-96, PC3, U87MG ve HEK293) sitotoksik aktivite göstermiştir.
RAW 264.7 fare makrofaj hücreleri üzerinde iNOS (indüklenebilir nitrik oksit sentaz) inhibisyonuna ve NF-kB (Nükleer Faktör kappa B) lusiferaz raportör stabil HeLa hücre hattında da NF-kB inhibisyonuna dayalı antienflamatuvar aktivite testleri gerçekleştirilmiştir. 4'-hidroksipekterolit-14-O-asetat (CA-4) ve 13-N-prolin melitensin (CP-4) moleküllerinde her iki yöntemle de inhibitör aktivite gözlenmiştir. iNOS aktiviteleri sonrası gerçekleştirilen MTT testi ile moleküllerin RAW 264.7 fare makrofaj hücrelerine karşı sitotoksik etki göstermedikleri belirlenmiştir.

Abstract:
The genus Centaurea L. (Asteraceae) is represented by 200 taxa in the flora of Turkey, 110 of which are endemic. Centaurea species are used orally or externally as traditional medicines for various purposes. Bioactivity studies on several Centaurea species have reported antiinflammatory, antimalarial, antiprotozoal, antimicrobial, antiulserogenic and cytotoxic properties.
Phytochemical investigations on Centaurea species that are rich in bioactive secondary metabolites are generally resulted in isolation of sesquiterpene lactones, flavonoids and lignan glucosides.
In our preliminary studies, the methanol and chloroform extracts from C. athoa and C. polyclada exhibited in vitro antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities, which prompted us to start a detailed investigation on these species.
In this thesis, the chloroform, methanol and n-butanol extracts obtained from the aerial parts of C. athoa and C. polyclada were studied for their secondary metabolite content. Structures of the compounds purified by chromatographic methods [Open column chromatography (OCC), vacuum liquid chromatography (VLC), solid phase extraction (SPE)] were established using spectral methods [1 and 2 dimensional (1D and 2D) Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR), mass spectroscopy and infrared (IR) spectroscopy].
Fractionation of the chloroform extract from the aerial parts of C. athoa led to the isolation of three elemane-type sesquiterpenes; [athoin (CA-1), 14-O-acetylathoin (CA-2) and methyl 14-O-acetylathoin-12-oate (CA-3)] with a germacrane type sesquiterpene [4'-hydroxypecterolide-14-O-acetate (CA-4)], whereas the n-butanol extract afforded two simple phenolic compounds and two phenolic glucosides [p-hydroxybenzoic acid (CA-5), protocatechuic acid (CA-6), vanillic acid-4-O-b-D-glucopyranoside methyl ester (CA-7) and picein (CA-8)], two phenylpropanoid derivatives [9-O-methyl coniferin (CA-9) and syringin (CA-10)] and a phytosterol [b-sitosterol-3-O-b-D-glucopyranoside (CA-11)].
 
Fractionation of the chloroform and n-butanol extracts of the C. polyclada aerial parts provided five elemane-type sesquiterpenes [6a,8a,15-trihydroxyelema-1,3,11(13)-trien-12-oic acid (CP-2) and its methyl ester (CP-1), 8a-O-[2'-(hydroxymethyl)-but-2'-enoyl]-6a,15-dihydroxyelema-1,3,11(13)-trien-12-oic acid (CP-3), 13-N-proline melitensin (CP-4) and 13-N-proline-6a,8a,15-trihydroxyelema-1,3-dien-12-oic acid (CP-5)], an eudesmane-type sesquiterpene [1b,6a,8a-trihydroxy-15-oxo-eudesm-11(13)-en-12-oic acid methyl ester (CP-6)], three flavonoids [salvigenin (CP-7), eupatorin (CP-8) and 3'-methoxy eupatorin (CP-9)], a lignan [arctiin (CP-10)], a phenolic glucoside [tachioside (CP-10)] and a phenylpropanoid glucoside [syringine (CP-12)].
The investigation of the aerial parts of C. athoa and C. polyclada afforded six new elemanolide derivatives (CA-1, CA-2, CA-3 and CP-3, CP-4, CP-5) and one new eudesmane (CP-6). Also the germacranolide CA-4 and the eleman derivative CP-1 have been reported from the genus Centaurea for the first time. 
Antiinflammatory and cytotoxic activities of the isolated sesquiterpenes were investigated on different cell lines.
The highest cytotoxic activity against all cell lines (A549, CaCO-2, HeLa, MCF-7, MDAMB231, mPanc-96, PC3, U87MG and HEK293) was observed with the germacranolide 4'-hydroxypecterolide-14-O-acetate (CA-4) isolated from C. athoa by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) cell viability assay.
Antiinflammatory activities were studied by iNOS (Inducible nitric oxide synthase) inhibition assay on RAW 264.7 murine macrophage cell line and NF-kB (Nuclear Factor kappa B) inhibition assay on NF-kB luciferase reporter stable HeLa cell line. 4'-hydroxypecterolide-14-O-acetate (CA-4) and 13-N-proline melitensin (CP-4) showed significant inhibitory activities while they had no cytotoxicity on RAW 264.7 cell line.