Anaplastik oligodendrogliomda kromozom 1P ve 19q'daki kombine delesyonun, IDH-1 gen mutasyonu ve p53 protein ekspresyonu ile korelasyonu ve klinikopatolojik parametrelerle ilişkisi
The correlation between chromosome 1P/19q combined deletion, IHD1 gene mutation P53 protein overexpression and clinicopathologic parameters in anaplastic oligodendroglioma
Yazar: UĞURAY PAYAM AHMEDMAULID
Danışman: PROF. DR. BİLGE BİLGİÇ
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Patoloji = Pathology
Dizin: Beyin neoplazmları = Brain neoplasms ; Gen ifadesi = Gene expression ; Kromozomlar = Chromosomes ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Oligodendrogliom = Oligodendroglioma ; Protein-P53 = Protein-P53

Özet:
Oligodendrogliom, oligodendrositlerden köken aldığı düşünülen bir primer glial tümördür. Oligodendrogliom nadir görülen bir tümördür. Tüm intrakranial tümörlerin %2,5'unu, tüm gliomların ise 5-6'sını oluşturur. Dünyadaki yıllık insidansı 0,27-0,35/ 100000'dir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) gradlama sistemine göre başlıca diferansiyasyon, hücresel atipi ve tümöral damar değişiklikleri derecesine göre oligodendrogliomlar WHO grad II ve WHO grad III (anaplastik) olarak ikiye ayrılır. WHO gradlama sistemi, tedavi planlamasında rol oynamaktadır. Zaman içinde, genel olarak tüm gliomların kendi içinde genetik olarak farklılıklar taşıdığı ve bu genetik farklılıkların tedavinin belirlenmesi ve prognostik açıdan önem taşıdığı anlaşılmıştır. Böylelikle anaplastik oligodendrogliom, kendi içinde farklı genetik alt gruplara ayrılmıştır. 
Yapılan moleküler sitogenetik çalışmalarda kromozom 1p ve 19q'daki kombine delesyonun,  oligodendrogliomda diğer primer beyin tümörlerinden anlamlı olarak daha sık oranda görüldüğü ve oligodendrogliom patogenezinde erken bir genetik değişiklik olduğu belirtilmektedir. Kromozom 1p ve 19q'da gözlenen kombine delesyonun kemoterapiye yanıt, sağkalım ve nüks göz önüne alındığında daha iyi prognozla ilişkili olduğu 1994 yılından beri yapılan çok sayıda klinik çalışma ile kanıtlanmıştır. 
Kromozom 2q33.3`de lokalize izositrat dehidrogenaz-1 (IDH1), insanlarda sitozolik NADP(+) bağımlı izositrat dehidrogenaz enzimini kodlayan gendir. İzositrat dehidrogenaz sitrik asit siklusunda yer alan bir enzimdir ve sitratın ?-ketoglutarata dönüşümünü katalize eder. IDH1, hücrelerdeki temel antioksidan olarak görev alan sitozolik redükte glutatyonun rejenerasyonu icin gerekli NADPH`nin ana kaynağıdır. Yapılan çalışmalarda, gliomlara spesifik IDH1 mutasyonlarının daima izositratın bağlanma bölgesini kodlayan 132. kodondaki arginin aminoasidini etkilediği bildirilmiştir. Bu gendeki mutasyon sonucunda, IDH1 enzim aktivitesi inaktive olur ve  2 hidroksiglutarat onkometaboliti birikir. Biriken aşırı miktardaki 2 hidroksiglutarat, gliom patogenezi ve progresyonunda rol oynar. Yapılan çalışmalar IDH genindeki mutasyonun, primer glioblastom hariç astrositik ve oligodendroglial orijinli tüm difüz gliomlarda yüksek oranda görüldüğünü ve erken tümör gelişiminde etkili bir faktör olduğunu göstermektedir. Son yıllarda yapılan sitogenetik ve mutant proteine spesifik immünhistokimyasal çalışmalar, IDH1 mutasyonunun anaplastik oligodendrogliomda sağkalım göz önüne alındığında iyi prognostik belirteç olduğunu göstermektedir. Yine yapılan çalışmalar göstermektedir ki 1p/19q delesyonu bulunan oligodendrogliomlarda IDH1mutasyonu anlamlı olarak daha sık görülmektedir. 
p53, kromozom 17p13.1'de lokalize bir gendir. Bu gen, bir tümör supressör protein olan p53 isimli proteini kodlar. p53 gen mutasyonu insan gliomlarının gelişiminde ve malign transformasyonunda önemli bir rol oynar. Astrositik tümörlerle karşılaştırıldığında, oligodendroglial tümörlerde kromozom 17p kaybı ve p53 mutasyonu nadir görülmektedir. Yapılan çalışmalarda, oligodendroglial tümörlerde kromozom 1p/19q delesyonu ve p53 mutasyonu arasında negatif bir korelasyon bulunmuştur. Bazı çalışmalarda ise oligodendroglial tümörlerde bu iki genetik değişikliğin, birbirini dışlayan mekanizmalar olduğu bildirilmiştir. Çalışmalar sonucunda, kromozom 1p/19q delesyon yokluğu ve p53 protein aşırı ekspresyonu, oligodendroglial tümörlerde negatif prognostik ve prediktif faktörler olarak bulunmuştur. Anaplastik oligodendrogliomda kromozom 1p/19q delesyonu, IDH1 mutasyonu ve p53 protein aşırı ekspresyonunu bir arada inceleyen çalışma sayısı ise sınırlıdır.
Çalışmamızın amacı, adjuvan radyoterapi ve temozolomid kemoterapisi almış anaplastik oligodendrogliom vakalarında kromozom 1p/19q delesyonu ile IDH1 mutasyonu ve p53 protein ekspresyonunun korelasyonu ve klinikopatolojik parametrelerle ilişkisini incelemektir. Çalışmamızda 2004-2011 yılları arasında, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı'nda anaplastik oligodendrogliom tanısı alan 46 vaka değerlendirilmiştir. Bu vakaların 12'sinin tümör örneklerinin nüks tümör olduğu bilgisine ulaşılmıştır. Floresan İn Situ Hibridizasyon (FISH) incelemesi ile 46 hastanın 5'inin kromozom 1p ve 19q incelemesinde, parametreleri değiştirerek iki kez tekrara rağmen sinyal alınamamıştır. Altta yatan sorunun doku kaynaklı olduğu sonucuna varılmış ve bu 5 hasta çalışma dışı bırakılmıştır.
FISH incelemesi ile, çalışmamıza dahil ettiğimiz 41 hastanın 23'ünde (%56) kromozom 1p'de delesyon saptanmıştır. On sekiz hastada (%44) ise kromozom 1p'de delesyon saptanmamıştır. Hastaların 19'unda (%46) kromozom 19q'da delesyon saptanmıştır. Yirmi bir hastada (%51) ise kromozom 19q'da delesyon saptanmamıştır. Bir hastada iki kez tekrara rağmen kromozom 19q'da sinyal gözlenememiştir. On dokuz hastada (%46) kromozom 1p/19q'da kombine delesyon saptanmıştır. On sekiz hastada ise (%44), kromozom 1p/19q'da kombine delesyon yoktur.  Kırk bir hastanın 3'ünde (%7) ise kromozom 1p'de delesyon mevcuttur ancak 19q'da delesyon yoktur. Hastaların 26'sında (%63) anti-IDH1 antikoru ile pozitif reaksiyon, 15'inde (%37) negatif reaksiyon gözlenmiştir. Hastaların 6'sında (%15) p53 antikoru ile pozitif reaksiyon, 35'inde (%85) negatif reaksiyon mevcuttur. 
Çalışmamızın sonucunda kromozom 1p/19q kombine delesyonu olan 19 hastanın 17'sinde  (%90), mutant proteine spesifik anti IDH1 immünhistokimyasal antikoru ile pozitif reaksiyon saptanmıştır. Sadece kromozom 1p delesyonu olan, 19q'da delesyon olmayan 3 vakanın 2'sinde anti-IDH1 antikoru ile pozitif reaksiyon gözlenmiştir. Kromozom 1p/19q kombine delesyonu olan vakaların hiçbirinde p53 protein aşırı ekspresyonu saptanmamıştır. IDH1 mutasyonu olan 26 vakanın 3'ünde (%12) ve mutasyon olmayan 15 vakanın 3'ünde (%20) p53 protein aşırı ekspresyonu gözlenmiştir.
Çalışmamıza dahil ettiğimiz 41 hastanın 36'sının klinik verilerine ulaşabilmiş, prognozla ilişkili istatistiksel çalışmalara bu hastaların verileri dahil edilmiştir. Kromozom 1p/19q kombine delesyonu olan hastaların tahmini ortalama nükssüz sağkalım süresi 73,4 ± 13 ay iken (medyan değer: 40 ± 44 ay), delesyon olmayan vakalarda bu süre 27,3 ± 6,7 aydır (medyan değer: 12,9 ± 1,2 ay), (p=0,004, Kaplan- Meier, log rank testi). IDH1 mutasyonu olan hastaların tahmini ortalama nükssüz sağkalım süresi 73,2±12,5 ay iken (medyan değer: 49,1± 33,1), mutasyon olmayan hastalarda bu süre 27,8 ± 7,7 aydır (medyan değer: 12 ± 1,5 ay), (p=0,004, Kaplan-Meier, log rank testi). Çalışmamızda sınırlı sayıdaki hastanın tümörlerinde p53 protein ekspresyonu bulunduğu için, p53 protein ekspresyonu olan ve olmayan hastaların prognozlarıyla ilgili istatistiksel çalışmadan anlamlı bir sonuç alınamamıştır.      
Çalışmamızın sonucunda kombine kromozom 1p/19q delesyonu ve IDH1 mutasyonu, anaplastik oligodendrogliomlu hastalarda istatistiksel olarak anlamlı derecede iyi prognostik faktörler olarak bulunmuştur.

Abstract:
Oligodendroglioma is a primary brain tumor which is believed to originate from oligodendrocytes. It is a rare tumor; accounting for about 2,5% of all primary brain tumors, and 5-6% of all gliomas. Adjusted annual incidence rates have been estimated to range from 0,27 to 0,35/100000. According to the World Health Organization's (WHO) grading system, the grading of oligodendroglioma is performed primarily according to the degree of differentiation achieved as well as the presence of cellular atypia and tumoral vascular changes, into two groups: the WHO grade II and WHO grade III (anaplastic). WHO grading system plays a pivotal role in therapy management. 
Molecular cytogenetic trials have determined that the combined deletion on chromosome 1p and 19q is an early genetic change which plays a significant role in the pathogenesis of oligodendroglioma, and is present more often in oligodendroglioma than any other primary brain tumor. Numerous clinical trials performed since 1994, have proven that the presence of the combined deletion on chromosome 1p and 19q is a favorable prognostic factor clinically.
Isocytrate dehydrogenase-1 (IDH1), which is localised on chromosome 2q33.3, is a gene which encodes cytosolic NADP(+) dependent isocytrate dehydrogenase in humans. Isocytrate dehydrogenase is an enzyme in citric acid cycle, which catalyses the transformation of cytrate to ?-ketoglutarate. IDH1 is the main resource of NADPH, necessary for the regeneration of reducted cytosolic gluthation, which is the main cellular antioxidant. In studies performed, IDH1 mutations specific to gliomas have always been found to effect the arginin aminoacid on codon 132, which encodes the isocytrate binding region. As a result of a mutation on this gene, IDH1 enzyme activity is inactivated and an oncometabolite, called 2 hydroxyglutarate accumulates. Excessive 2 hydroxyglutarate accumulation plays a role in glioma pathogenesis and progression. The studies that have been performed have showed that the IDH gene mutation is present at a very high rate in all diffuse gliomas of astrocytic and oligodendroglial origin except primary glioblastomas. Cytogenetic and immunohistochemical studies performed recently have determined that the IDH1 mutation is a favourable prognostic marker for anaplastic oligodendrogliomas. The IDH1 mutation was shown to be present in significantly higher rates in oligodendrogliomas exhibiting the 1p/19q deletion. 
p53 gene is localised on chromosome 17p13.1. This gene encodes a tumor supressor protein called p53. The p53 gene mutation plays an important role in  gliogenesis and malignant transformation of human gliomas. The chromosome 17p loss and p53 mutation is rarer in oligodendroglial tumors, when compared with astrocytic tumors. Studies performed have shown a negative correlation between chromosome 1p/19q co-deletion and p53 protein expression in oligodendroglial tumors. Chromosome 1p/19q co-deletion and p53 mutation have been found mutually exclusive in some clinical trials. The absence of chromosome 1p/19q co-deletion and presence of p53 overexpression have been stated to be negative prognostic and predictive factors in oligodendroglial tumors. There are limited studies which have observed chromosome 1p/19q combined deletion, IDH1 mutation and p53 protein overexpression together.
The aim of our study is to observe the correlation between 1p/19q deletion, IDH1 mutation and p53 protein overexpression and clinicopathologic parameters in anaplastic oligodendroglioma patients who were treated with adjuvant radiotherapy and temozolomide chemotherapy. 
In our study we evaluated 46 patients who were diagnosed as anaplastic oligodendroglioma in Istanbul University, Istanbul Medical Faculty Pathology Department, between 2004 and 2011. Twelve of the cases were determined to be obtained from patients with recurrent tumors. We were unable to get any signals on tumor samples of 5 patients through the Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) technique despite repeating the test twice, and changing the parameters. We concluded that it was a tissue based problem, so we excluded those 5 patients from our study. We observed chromosome 1p deletion in 23 of 41 patients (56%) which were included in our study, by FISH technique. There was no chromosome 1p deletion in 18 patients (44%). Nineteen of 41 patients (46%) had chromosome 19q deletion. Twenty one patients (51%) did not have deletion on chromosome 19q. We could not get any signals on chromosome 19q on tumor sample of one patient by FISH technique, in spite of two times repetation. Nineteen of 41 patients (46%) had chromosome 1p/19q combined deletion. Eighteen patients (44%) did not have chromosome 1p/19q combined deletion. Three of 41 patients (7%) had chromosome 1p deletion, but did not have chromosome 19q deletion. 26 of 41 patients (63%) showed positive immune reaction with mutant protein spesific anti-IDH1 antibody, whereas 15 patients (37%) showed negative immune reaction. Six patients (15%) showed positive immune reaction with anti p53 antibody, whereas 35 patients (85%) showed negative immune reaction. 
Seventeen of 19 patients (90%), who had chromosome 1p/19q co-deletion showed positive immune reaction with anti-IDH1 antibody. Two of three patients who had chromosome 1p, but not19q deletion showed positive immune reaction with anti-IDH1 antibody. In our study, the patients who had chromosome 1p/19q co-deletion and p53 overexpression were mutually exclusive. Three of 26 patients (12%) with IDH1 mutation showed p53 protein expression, whereas 3 of 15 patients (20%)  without IDH1 mutation showed p53 protein expression.     
We accessed the clinical data of 36 of 41 patients which have been included in our study. The prognostic statistical analysis were performed on the data obtained from those patients. The mean estimated time of progression free survival of the patients with chromosome 1p/19q combined deletion was 73,4 ± 13 months (median: 40 ± 44 months), whereas the mean estimated time of progression free survival of the patients with no combined chromosome 1p/19q deletion was 27,3 ± 6,7 months (median: 12,9 ± 1.2 months), (p=0,004, Kaplan-Meier, log rank). The mean estimated time of progression free survival of the cases with IDH1 mutation was 73,2±12,5 months (median: 49,1± 33,1 moths). The mean estimated time of progression free survival of the cases which showed no IDH1 mutation was 27,8 ± 7,7 months (median: 12 ± 1,5 months), (p=0,004, Kaplan-Meier, log rank test). In our study, we did not find any statistical significance between the mean estimated progression free survival between the patients with or without p53 protein overexpression because of the limited number of the patients whose tumors showed p53 expression.
As a result of our study, chromosome 1p/19q co-deletion and IDH1 mutation were determined to be statistically significant good prognostic factors in anaplastic oligodendroglioma patients.