İnsan ADAMTS2 geninin transkripsiyonel regülasyonu
Transcriptional regulation of human ADAMTS2 gene
Yazar: MELTEM ALPER
Danışman: PROF. DR. FERAY KÖÇKAR
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Sitokinin = Cytokinine ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
ADAMTS'ler (A Disintegrin And Metalloprotease domain with ThromboSpondin type I motifs) embriyonik gelişim, anjiyogenez ve kıkırdak degredasyonu gibi önemli fizyolojik süreçlerde görev yapan metaloproteazlardır. Bu ailenin üyelerinden ADAMTS2 fibriler prokollajenlerin amino uçlarının kesilmesinde görev yapmaktadır. ADAMTS2 genindeki mutasyonlar insanlarda Ehler Danlos sendromu tip VIIC?ye neden olmaktadır. Organizma için daha birçok önemli fonksiyonu bulunan ADAMTS2?nin transkripsiyonel regülasyonunun aydınlatılması oldukça önemlidir.
Bu çalışmada transkripsiyon başlangıç bölgesinden 760bç'ye kadar uzanan ADAMTS2 promotor bölgesi ve transkripsiyonel olarak en aktif bölgenin belirlenmesi amacıyla üç farklı uzunlukta [-530/+112], [-324/+112], [-180/+112] promotor parçası lusiferaz vektörüne klonlandı. Saos (insan osteosarkoma) hücrelerinde yapılan geçici transfeksiyon analizleri sonucunda bütün parçaların yüksek promotor aktivitesi gösterdiği ve transkripsiyonel aktivite için en küçük promotor parçasının yeterli olduğu belirlendi. Biyoinformatik analizlerle ADAMTS2 promotorunun 110bç'lik 5'UTR bölgesine sahip olduğu, TATA kutusu içermediği, GCkutuları, GA kutuları, CpG adaları, SP1 ve USF için bağlanma motifleri içerdiği belirlendi. Yapılan ko-transfeksiyon çalışmalarıyla USF ve SP1'in ADAMTS2 promotor aktivitesini arttırdığı belirlendi. USF'nin fonksiyonel olarak promotora bağlandığı da EMSA çalışmalarıyla belirlendi. 
ADAMTS2'nin çalışılan hücre hatlarında en fazla MG-63'te ve en az HUVEC'te ifade olduğu belirlendi. Saos hücrelerinde ADAMTS2 proteini immunfloresans ile işaretlendi. Ayrıca Saos hücrelerinde IL-6 ve IL-1a stimülasyonuyla ADAMTS2 ve ADAMTS3 ekspresyonunun mRNA ve protein düzeyinde arttığı qRT-PCR ve Western blot çalışmalarıyla belirlendi. Benzer MG-63 modelinde de sonuçlar doğrulandı. IL-6?nın ADAMTS2 promotor aktivitesini arttırdığı belirlendi. Saos hücrelerinde yapılan inhibisyon çalışmalarıyla IL-6'nın STAT yolunu ve de-novo protein sentezini aktive ettiği belirlendi. IL-6 sitokininin Saos hücrelerinde hücre proliferasyonuna neden olmazken IL-1a'nın hücre proliferasyonuna neden olduğu MTT çalışmalarıyla belirlendi.
ANAHTAR KEL?MELER: ADAMTS2, transkripsiyonel regülasyon, Ehler Danlos sendromu, osteosarkoma, IL-6, IL-1?, STAT

Abstract:
ADAMTS (A Disintegrin And Metalloprotease domain with ThromboSpondin type I motifs) are metalloproteinases with demonstrated functionality in embryonic development, angiogenesis and cartilage degradation. One of the members of this family, ADAMTS2 responsible for removal of the amino terminus of the fibrillar procollagens. Mutations in the ADAMTS2 gene causes Ehler Danlos syndrome type VIIC in humans. It is quite important to elucidate the transcriptional regulation of the ADAMTS2 which has many important functions for organism.
In this study, ADAMTS2 promoter region extending up to 760bp from the transcription start site and three different portions of the promoter [-530/+112], [-324/+112], [-180/+112] fragments were cloned into luciferase vector to determine transcriptionally most active region. As a result high promoter activity was determined with all constructs in transiently transfected Saos (human osteosarcoma) cells and the smallest construct was enough to exhibit the transcriptional activity. Bioinformatic analyses revealed that TATA-less ADAMTS2 promoter has a 110bp 5'UTR region including GC, GA boxes, CpG islands, SP1 and USF binding motifs. The co-transfection studies determined increased activity of the ADAMTS2 promoter with USF and SP1. Functional binding of USF to ADAMTS2 promoter was determined by EMSA studies.
Expression of ADAMTS2 was determined at most MG-63 and at least HUVEC among the studied cell lines. ADAMTS2 protein was labelled in Saos cells by immunofluorescence. Increased ADAMTS2 and ADAMTS3 expression at mRNA and protein levels with IL-6 and IL-1' stimulation of Saos cells was also determined qRT-PCR and Western blotting studies. Results were also confirmed similar MG-63 model. IL-6 was increased activity of the ADAMTS2 promoter. Inhibition studies showed STAT pathway and de-novo protein synthesis activation after IL-6 stimulation in Saos cells. Cell proliferation wasn't determined with IL-6 stimulation in Saos cells by MTT experiments. On the contrary IL-1a caused cell proliferation.
KEYWORDS: ADAMTS2, transcriptional regulation, Ehler Danlos Syndrome, osteosarcoma. IL-6, IL-1?, STAT