Böbrek epitel hücrelerinde endoplazmik retikulum stresinin lipid düzeyleri, inflamatuar ve apoptotik yolaklar üzerindeki etkileri
Effects of endoplasmic reticulum stress on lipid levels, inflammatory and apoptotic pathways in renal epitel cells
Yazar: HANİFE TUĞÇE ÇEKER
Danışman: PROF. DR. MUTAY AYDIN ASLAN
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Böbrek = Kidney ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Seramidler = Ceramides ; Sfingolipidler = Sphingolipids ; Tunikamisin = Tunicamycin ; Yağ asitleri-doymamış = Fatty acids-unsaturated

Özet:
Amaç: Bu çalışma, insan böbrek epitel hücrelerinde (HEK-293), tunikamisin (TM) ile ilişkili sfingolipid ve poliansatüre yağ asidi (PUFA) değişimlerini ve bunların inflamatuar ve apoptotik yolaklar üzerine ektilerini belirlemeyi amaçlamıştır. HEK-293 hücrelerine endoplazmik retikulum (ER) stresini indüklemek için tunikamisin ve sitotoksisiteyi azaltmak için bir ER stres inhibitörü olan tauroursodeoksikolik asit (TUDCA) uygulanmıştır.
Yöntem: Hücre canlılığı 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolyum bromit (MTT) analizi ile belirlendi. Sfingomiyelin (SM), seramid (CER) ve PUFA seviyeleri sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile ölçüldü. Glukozla düzenlenen protein 78-kd (GRP78), kesilmiş kaspaz-3 ve siklooksijenaz-1 (COX-1) protein seviyeleri immünofloresan yöntem ile değerlendirildi. Enzim aktivitelerindeki değişiklikler sitozolik fosfolipaz A2 (cPLA2), total COX ve prostaglandin E2 (PGE2) ölçümleri ile belirlendi.
Bulgular: Tunikamisin ile muamele edilmiş hücrelerde azalan hücre canlılığı gözlendi. Tunikamisin uygulamasını takiben TUDCA'nın muamelesi, tek başına TM uygulamasına kıyasla hücre canlılığını anlamlı olarak arttırdı. Tunikamisin ile indüklenen ER stresi, GRP78'in anlamlı olarak artmış protein seviyeleri ile doğrulandı. Kontrole kıyasla 5 μg/ml TM ile muamele edilen hücrelerde sfingosin-1-fosfat (S1P) seviyeleri ve cPLA2 aktivitesinde anlamlı bir azalma meydana gelirken, C18-C24 CER'lerde ve kaspaz-3 aktivitesinde anlamlı bir artış gözlendi. Tunikamisin uygulanan hücrelerde cPLA2 aktivitesindeki azalmaya, anlamlı olarak artmış PUFA seviyeleri eşlik etti. Tunikamisin ile TUDCA'nın birlikte uygulaması, ER stresini, C18-C24 CER seviyelerini ve kaspas-3 aktivitesini anlamlı olarak azalttı ve S1P seviyelerini arttırdı.
Sonuç: Bu çalışma ile ER stresine maruz kalan HEK-293 hücrelerinde artan apoptotik aktivitenin yanı sıra, hücrelerde uzun zincirli CER'lerin ve PUFA'ların birikimi gösterilmiştir. Tauroursodeoksikolik asit uygulaması, TM muamelesi sonucu biriken CER seviyelerini ve TM ile indüklenen apoptotik aktiviteyi azaltmıştır.

Abstract:
Objective: This study aimed to determine tunicamycin (TM)-related sphingolipid and polyunsaturated fatty acid (PUFA) changes in human kidney cells (HEK-293) and their effects on inflammatory and apoptotic pathways. Tunicamycin was employed to induce endoplasmic reticulum (ER) stress in HEK-293 cells and an ER stress inhibitor, tauroursodeoxycholic acid (TUDCA), was given to minimize cytotoxicity.
Method: Cell viability was determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Sphingomyelin (SM), ceramide (CER) and PUFA levels were measured by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Glucose-regulated protein 78-kd (GRP78), cleaved caspase-3 and cyclooxygenase-1 (COX-1) protein levels were assessed by immunofluorescence. Cytosolic phospholipase A2 (cPLA2), total COX and prostaglandin E2 (PGE2) were measured to evaluate changes in enzyme activity.
Results: Decreased cell viability was observed in TM treated cells. Administration of TUDCA following TM treatment significantly increased cell viability compared to TM treatment alone. Tunicamycin-induced ER stress was confirmed by significantly increased protein levels of GRP78. A significant increase was observed in C18-C24 CERs and caspase-3 activity, while a significant decrease occurred in sphingosine-1-phosphate (S1P) and cPLA2 activity in cells treated with μg/ml versus controls. The decrease in cPLA2 activity was accompanied by significantly increased PUFA levels in TM-treated cells. Tauroursodeoxycholic acid treatment in conjunction with TM significantly decreased ER stress, C18-C24 CERs, caspase 3 activity, and increased S1P levels.
Conclusion: Results show the build-up of long-chain CERs and PUFAs in HEK-293 cells undergoing ER stress alongside increased apoptotic activity. Tauroursodeoxycholic acid administration, along with TM treatment alleviated the build-up of CERs and TM-induced apoptotic activity in kidney epithelial cells.