Hepatosellüler karsinoma hücre proliferasyonunda lösince zengin tekrarlar içeren g-protein aracılıklı reseptör 5 (LGR5)'in önemi
The importance of leucine-rich repeat containing g-protein coupled receptor 5 (LGRS5) in proliferation of hepatocellular carcinoma cell
Yazar: SOHEİL AKBARİ
Danışman: DOÇ. DR. ŞERİFE ESRA ERDAL
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: G proteinleri = G proteins ; Hücreler = Cells ; Karaciğer neoplazmları = Liver neoplasms ; Karsinoma = Carcinoma ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Katenin = Catenin ; Kök hücreler = Stem cells ; Leucine = Leucine ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Her yıl yaklaşık 700 bin yeni karaciğer kanseri olgusu tanımlanmaktadır ve bu vakaların yaklaşık %85-90'ı Hepatosellüler karsinoma (HCC)'dır. İkinci ölümcül kanser türü olan HCC için, hepatit virüsleri, kronik alkol kullanım, obesite ve aflatoksin gibi kimyasallar en iyi bilinen risk faktörleridir. Tüm HCC'lerin üçte birinde, mutasyonel ya da mutasyonel olmayan şekilde oluşan Wnt/beta-katenin sinyalizasyon bozuklukları, bu yolağın hepatokarsinogenez sürecindeki önemini göstermektedir. Örneğin bir Wnt reseptörü olan FZD-7 HCC'lerin %90'ında aşırı eksprese edilmektedir. Yine HCC'lerin %20 ile %40 aralığında, anormal sitoplazma ve çekirdekte lokalize beta-katenin birikimi bulunmaktadır. Fakat, artan nükleer beta-katenin ve onun transkripsiyonel hedeflerinin ekspresyonu arasında bir korelasyon olmaması bize HCC için bilinen hedef genlerinin ekspresyonunu kontrol eden başka sinyal yolaklarının olabileceğini ve/veya böylesine aktivasyona bağlı HCC'de bilinenlerin dışında başka hedef genlerin bulunabileceğini düşündürdü. Grubumuzca yapılan önceki çalışmalarda Lityum-aracılıklı Wnt/beta-katenin sinyalizasyonu uyarımı ile HCC hücre hatlarından HuH7'da LÖSİNCE ZENGİN TEKRARLAR İÇEREN G-PROTEİN ARACILIKLI RESEPTÖR 5 (LGR5) gen ekspresyonunun en az 10 kat arttığı gösterilmiştir. Barsak dokusunda Wnt/beta-katenin hedef genlerinden biri olarak tanımlanan LGR5'ın, son yıllarda kolon ve saç folikül hücrelerinde kök hücre belirteci olduğu ve özellikle kolon kanser kök hücrelerin tanımlanmasında kullanıldığı bildirilmiştir. Bu tez kapsamında ise LGR5'ın HCC hücre hatlarında ekspresyonları ve hücre proliferasyonundaki rolü araştırılmıştır. Buna göre, ilk olarak LGR5, 9 HCC hücre hattından (SNU398, SNU-475, SK-Hep1, HepG2, PLC, Mahlavu, Hep3B, SNU449, HuH7), yalnızca literatürde hepatik kanser kök hücre (HpCSC) içerdikleri bildirilen, daha az motil ve invaziv olan, epitelyal-benzeri HCC hücre hatlarında (HepG2, PLC, Hep3B, HuH7) yüksek düzeyde eksprese olurken, diğerlerinde yok/düşük şeklinde bulunduğu tespit edilmiştir. İkinci olarak ise, HuH7 hücrelerinde, Wnt/beta-katenin sinyal yolağını tetikleyen her hangi bir indüksiyon olmadan, pCMV6-AC-GFP-LGR5 plazmiti ile geçici transfeksiyon aracılığı ile overeksprese edilen LGR5'in boş plazmit (mock) kontrolüne karşı hücre proliferasyonunda anlamlı değişiklikler yapmadığı bulunmuştur. Çalışmalarımızda ek olarak LGR5 sinyalizasyonunu ve bu sinyalizasyonun etkilerini aydınlatmak için LGR5 overeksprese eden hücrelerde LGR5/Wnt3a/R-Spondin1 üçlü kompleksin hücre biyolojisini ve Wnt/beta-katenin sinyal yolağını nasıl etkilediği araştırılmıştır. R-Spondin1 tek başına Tcf/Lef transkripsiyonel aktivitesini artırmazken, Wnt3a tek başına Tcf/Lef transkripsiyonel aktivitesinin artışına sebep olmuştur. Ayrıca Wnt3a ve R-spondin1 ikisi bir arada oldukları durumda Tcf/Lef transkripsiyonel aktivitesi daha da artmıştır. HuH7 hücrelerinde, pCMV6-AC-GFP-LGR5 plazmiti ile geçici transfeksiyon aracılığı ile overeksprese edilen LGR5 ekspresyonunun ise bu değişimler üzerine etkisinin olmadığı yani, Wnt3a veya Wnt3a/R-Spondin1 sinyalizasyonunun LGR5'ten bağımsız olduğu sonucu cıkmaktadır. LGR5 overeksprese hücrelerde boş vektör kontrole göre, Wnt3a ve/veya R-Spondin1'in tek başlarına, bir arada ya da hiç olmadıkları durumlar arasında hücre proliferasyonunda bir değişimin olmadığı gözlenmiştir. Sonuç olarak, LGR5'in , Wnt/ß-katenin sinyal yolağını indüklemeden HCC hücre proliferasyonda anlamlı bir rolü bulunmasa da, HpCSC içeren daha az invaziv ve motil olan grupta daha fazla bulunması bize, henüz bilmediğimiz başka biyolojik davranışlarda rolü olabileceğini ve bunun ileride araştırılması gerektiğini düşündürmektedir.

Abstract:
Every year, approximately 700 thousands of newly diagnosed liver cancer cases are reported and approximately 85% to 90 of all these cases are hepatocellular carcinoma (HCC). HCC is the third most common cause of cancer related death and the most well-known risk factors for HCC are chronic viral hepatitis, chronic alcohol consumption, obesity, and chemicals such as aflatoxin. Presence of non-mutational or mutational Wnt/beta-catenin signaling deregulation in the one-third of all HCC indicates the importance of this pathway in hepatocarcinogenesis. For example, FZD-7, which is a Wnt receptor, is overexpressed in 90% of all HCC cases. Furthermore abnormal cytoplasmic and nuclear beta-catenin accumulation was found in 20 to 40% of HCC cases. However the lack of correlation between increased nuclear ß- catenin level and expression of its target proteins give us the idea that signaling pathways other than Wnt/beta-catenin might regulate expression of the target genes and/or activation of Wnt/beta-catenin signaling network might control other target genes which have not been described yet. In our previous studies we observed that Lithium mediated Wnt/beta-catenin signalization caused a 10-fold increased in the expression of LGR5 in HuH-7 cells (HCC cell line). LGR5, which is defined as one of the target genes of Wnt/beta-catenin pathway in the intestine, is reported to be a stem cell marker in hair follicle and especially it is used for describing colon cancer stem cells. In this thesis, expression of LGR5 in HCC cell lines and role of its expression in proliferation were investigated. Firstly, we showed that, among 9 HCC cell lines (SNU398, SNU-475, SK-Hep1, HepG2, PLC, Mahlavu, Hep3B, SNU449, HuH7), while LGR5 expressed significantly in poorly invasive and motile epithelial like HCC cell lines cell lines, comprising hepatic cancer stem cell population, it has no or low expression level in the others. Secondly, when without any induction that triggers Wnt / beta-catenin signaling pathway, LGR5 was overexpressed in HuH-7 cell lines by transient transfection with pCMV6-AC-GFP-LGR5 plasmid in the presence of mock cell controls, no significant effect was observed on proliferation. Since results obtained from mock controls comprising empty plasmid vector, and parental controls were considerably different from each other, it is worth repeating the experiments. In addition to LGR5 signalization and effects of this signalization on cell biology, we also investigated role of the triple complex of LGR5/Wnt3a/R-Spondin1 on cell biology and on Wnt/beta-catenin signaling pathway in the LGR5-overexpressed cells. While R-Spondin1 had no influence on transcriptional activity of Tcf/Lef, Wnt3a had little effect on Tcf/Lef activity when used alone. However, R-Spondin1 strongly synergized with Tcf/Lef activity induced by Wnt3a. In HuH7 cells, which were transiently transfected with the pCMV6-AC-GFP-LGR5 plasmid, overexpression of LGR5 did not affect either Wnt3a or Wnt3a/R-Spondin1 mediated signalization. This result implicated that Wnt3a and Wnt3a/R-Spondin1 mediated signalization was independent from LGR5-induced signalization. Wnt3a and/or R-Spondin treatment did not alter cell proliferation of LGR5-transiently transfected HuH7 cells compared to mock-transfected control cells. Overall, although LGR5 has no significant role in proliferation, its expression in HpCSC including poorly motile and invasive cell lines let us to think that it may involve in other biological behaviors of cells and this should be investigated in the future.