Inonotus dryadeus ve Bjerkandera adusta'nın antioksidan ve antikanser aktivite gösteren bileşiklerin izolasyonu ve yapılarının aydınlatılması
Isolation and structure elucidation of antioxidant and anticancer compounds from Inonotus dryadeus and Bjerkandera adusta
Yazar: SELÇUK KÜÇÜKAYDIN
Danışman: PROF. DR. MEHMET EMİN DURU
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Makromantarlar = Macrofungi ; Organik kimya = Organic chemistry

Özet:
Bu tez çalışmasında Anadolu'da doğal olarak yayılış gösteren ve ticari potansiyeli olan, Inonotus dryadeus ve Bjerkandera adusta ağaç mantarlarının kimyasal bileşenleri, antioksidan ve antikanser aktiviteleri araştırıldı. Bu amaçla, her iki mantarın sırasıyla, hekzan, metanol ve sıcak su ile ekstraksiyonları yapılarak farklı polaritede olan 3 ekstre elde edildi. Elde edilen ekstrelerin antioksidan aktiviteleri, β-karoten renk açılımı yöntemi, DPPH serbest radikali giderim aktivitesi, ABTS katyon radikali giderimi aktivitesi, CUPRAC yöntemi ve metal şelatlama kapasitesi olmak üzere 5 farklı metotla araştırıldı. Ekstrelerin Meme Kanseri (MCF-7), Prostat Kanseri (PC-3), Rahim Ağzı kanser (HeLa) ve Fare Fibroblast hücrelerine (3T3) karşı toksisiteleri in vitro testlerle belirlendi. Aktivite testlerine göre, her iki mantarın antioksidan aktivitesi ve/veya sitotoksisitesi yüksek olan ekstrelerin kimyasal bileşenleri aktivite yönlendirmeli olarak izole edildi.  İzole edilen bileşiklerin yapılarını aydınlatmak için FTIR, MS ve NMR teknikleri kullanıldı. Yapılan çalışmalarda; I. dryadeus'den ergosterol D (1), ergosterol peroksit (2), betulinik asit (3), ursolik asit (4), N-[3-hidroksi, 9-metil-1-glukopiranozil, tetradeka-4,9-dienil]-2-hidroksi oktadesenamit (5), N-[2,3-dihidroksi-1-(hidroksi metil) heptadesil]-2-hidroksi tetracosanamit (6), walsurenol (7), ergosta-5,22-dien-3β-ol (8), ergosta-5,22-dien-3-on (9), mannitol (10) elde edildi. B. adusta'dan da ergosterol D (11), ergosterol peroksit (12), N-[3-hidroksi, 9-metil-1-glukopiranozil, tetradeka-4,9-dienil]-2-hidroksi nonadesenamit (13), ergosta-7,9,22-trien-3β-ol-β-D-glukozit (14), stallestanol (15), α-D-glukopiranozit, α-D-glukopiranozil (16), fumarik asit (17), betulinan A (18), betulinan B (19) bileşikleri izole edilerek yapıları aydınlatıldı.  Bu bileşiklerden B. adusta'dan elde edilen N-[3-hidroksi, 9-metil-1-glukopiranozil, tetradeka-4,9-dienil]-2-hidroksi nonadesenamit (13)  ve I. dryadeus'den elde edilen N-[3-hidroksi, 9-metil-1-glukopiranozil, tetradeka-4,9-dienil]-2-hidroksi oktadesenamit (5) bileşiği bu tez çalışmasıyla ilk defa literatüre kazandırıldı. Elde edilen 19 bileşiğin DPPH serbest radikal giderimi, ABTS katyon radikali giderimi ve Meme Kanseri (MCF-7) ve fare Fibroblast hücrelerine (3T3) karşı toksisiteleri in vitro testlerle belirlendi.  Yapısı aydınlatılan bileşikler arasında, seramit yapısında olan ve yeni bir bileşik olarak tanımladığımız N-[3-hidroksi, 9-metil-1-glukopiranozil, tetradeka-4,9-dienil]-2-hidroksi oktadesenamit (5), Meme Kanseri (MCF-7) hücresine karşı en yüksek aktiviteye (IC50: 6,5±0,21 µg/mL) sahiptir.  I. dryadeus'dan elde edilen bir başka seramit yapısındaki bileşiğimiz olan N-[2,3-dihidroksi-1-(hidroksi metil) heptadesil]-2-hidroksi tetracosanamit (6) da MCF-7'ye karşı ikinci düzeyde toksisite (IC50:14,63±0,75)  göstermektedir. Bu çalışmalara ilaveten, her iki mantarın lipit fraksiyonunun kimyasal içerikleri, GC-FID ve GC-MS sistemleri kullanılarak belirlenirken, fenolik bileşenleri de HPLC-DAD sisteminde ayrı ayrı incelendi.

Anahtar Kelimeler: Inonotus dryadeus, Bjerkandera adusta, Ağaç Mantarı, Antioksidan Aktivite, Meme Kanseri (MCF-7), Prostat Kanseri (PC-3), Rahim Ağzı Kanseri (HeLa), Sitotoksisite

Abstract:
In this thesis, the chemical components, antioxidant and anticancer activities of Inonotus dryadeus and Bjerkandera adusta, which are naturally growing in Anatolia and have commercial potential, were investigated. For this purpose, three extracts which have different polarities were obtained from the two mushroom by extraction with hexane, methanol and hot water, respectively. Antioxidant activities of extracts were investigated with five different methods: β-Carotene linoleic acid bleaching assay, DPPH radical scavenging activity, ABTS radical scavenging activity, CUPRAC (Cupric ion reducing antioxidant capacity) and Metal chelating capacity. The toxicity of extracts determined against Breast Cancer (MCF-7), Prostate Cancer (PC-3), Cervical Cancer (HeLa) and Mouse Fibroblast cells (3T3) by in vitro tests. According to the results, bioactivity-guided isolation of the chemical components of the extracts was performed. FTIR, MS and NMR techniques were used to elucidate the structures of the isolated compounds. Ergosterol D (1), ergosterol peroxide (2), betulinic acid (3), ursolic acid (4), N-[3-hidroxy, 9-methyl-1-glycopyranosyl, tetradeca-4,9-dienyl]-2-hidroxy oktadecenamide (5), N-[2,3-dihidroxy-1-(hidroxy methyl) heptadecyl]-2-hidroxy tetracosanamide (6), walsurenol (7), ergosta-5,22-dien-3β-ol (8), ergosta-5,22-dien-3-one (9), mannitol (10) were obtained from I. dryadeus. The compounds obtained from B. adusta can be listed as follows: ergosterol D (11), ergosterol peroxide (12), 9-methyl-1-glucopyranosyl, tetradeca-4,9-dienyl]-2-hidroxy nonadecenamide (13), ergosta-7,9,22-triene-3β-ol-β-D-glycoside (14), stallestanol (15), α-D-glycopyranoside, α-D-glycopyranosyl (16), fumaric acid (17), betulinan A (18), betulinan B (19). Best of our knowledge, the compound, N-[3-hidroxy, 9-methyl-1-glycopyranosyl, tetradeca-4,9-dienyl]-2-hidroxy oktadecenamide (5) and N-[3-hidroxy, 9-methyl-1-glycopyrosyl, tetradeca-4,9-dienyl]-2-hidroxy nonadecenamide (13)  were isolated and elucidated first time by this thesis. The toxicity and antioxidant activity of the 19 compounds were determined against Breast Cancer (MCF-7), Mouse Fibroblast cells (3T3) and DPPH radical scavenging and ABTS radical scavenging methods. N-[3-hidroxy, 9-methyl-1-glycopyranosyl, tetradeca-4,9-dienyl]-2-hidroxy oktadecenamide (5), which we describe as a novel compound, has the highest toxicity against the Breast Cancer (MCF-7) cell line (IC50: 6.5 ± 0.21 μg / mL) among the elucidated compounds. N- (2,3-dihydroxy-1-(hydroxymethyl) heptadecyl] -2-hydroxy tetracosanamide (6), another ceramide structure obtained from I. dryadeus, has a second level of toxicity (IC50:14,63±0,75 μg / mL). In addition to these studies, the chemical content of the lipid fraction of both mushroom was determined using by GC and GC-MS systems, while the phenolic components were also determined separately in the HPLC-DAD systems.

Keywords: Inonotus dryadeus, Bjerkandera adusta, Tree Mushroom, Antioksidant Activity, Breast Cancer (MCF-7), Prostate Cancer (PC-3), Cervical Cancer (HeLa), Cytotoxicity