Porodaedalea pini ve Fuscoporia torulosa mantarlarının biyoaktif bileşiklerinin izolasyonu ve yapılarının aydınlatılması
Isolation and structure elucidation of bioactive compounds from Porodaedalea pini ve Fuscoporia torulosa mushrooms
Yazar: EBRU DEVECİ
Danışman: PROF. DR. MEHMET EMİN DURU
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu doktora tez çalışması kapsamında, Anadolu'da yaygın olarak yetişen Porodaedalea pini ve Fuscoporia torulosa ağaç mantarlarının biyoaktif bileşiklerinin izole edilmesi amaçlanmıştır. Her iki mantar türünden oda koşullarında ekstraksiyon ile elde edilen hekzan, kloroform, aseton, metanol ve su ekstrelerinin toplam fenolik ve toplam flavonoid miktarları tayin edildikten sonra her ekstrenin MTT testi ile sitotoksik; -karoten renk açılımı, DPPH serbest radikali giderim, ABTS katyon radikali giderim, CUPRAC ve metal kelat etki yöntemleri ile antioksidan ve Ellman metodu ile antikolinesteraz aktiviteleri belirlenmiştir. İlaveten her iki mantar türünün fenolik bileşikleri HPLC-DAD kullanılarak tayin edilmiştir.
Elde edilen ekstreler silika jel kolon kullanılarak fraksiyonlandırıldıktan sonra elde edilen fraksiyonların da sitotoksik, antioksidan ve antikolinesteraz aktiviteleri incelenmiştir. Fraksiyonlardan kolon kromatografisi, preparatif ince tabaka veya recycle-HPLC gibi kromotagrafik yöntemler kullanılarak P. pini mantarından altı, F. torulosa mantarından on bir bileşik saflaştırılmıştır. Bu bileşiklerden kampesterol (1) P. pini kloroform ekstresinden; ergosta-7,24(28)-dien-3β-ol (2), dioktil ftalat (3), ergosterol peroksit (4), pinoresinol (5), 4-(3,4-dihidroksifenil)-3-büten-2-on (6) bileşikleri P. pini metanol ekstresinden; oleanolik asit (7), 28-norolean-12-en-3β-ol (8), javeroik asit (9) F. torulosa kloroform ekstresinden; 4-(3,4-dihidroksifenil)-3-büten-2-on (6), β-sitosterol (10), oleanonik asit (11), 2,3-dihidroksi sinnamik asit (12), 3,4-dihdiroksi benzaldehit (13) bileşikleri F. torulosa aseton ekstresinden; ergosterol peroksit (4), ergosta-4,6,8(14)-22-tetraen-3-on (14) ve yeni 5α,8α-epidioksiergosta-6,22-dien-3β-il-palmitat (15) bileşikleri F. torulosa metanol ekstresinden elde edilmiştir. Saf bileşiklerin yapıları IR, 1D, 2D NMR teknikleri, EI-MS ve ESI-MS gibi spektroskopik yöntemler kullanılarak aydınlatılmıştır. İzole edilen bütün bileşiklerin sitotoksik, antioksidan, antikolinesteraz ve anti-tirozinaz aktiviteleri belirlenmiştir. Prostat kanseri (PC-3) hücresi üzerine yapılan sitotoksik aktivite testinde, P. pini (IC50: 33,84±0,01 µg/mL) ve F. torulosa (IC50: 49,49±0,59 µg/mL) mantarlarının hekzan ekstrelerinin en yüksek aktiviteyi gösterdiği belirlenmiştir. Meme kanseri (MCF-7) hücresine karşı yapılan sitotoksik aktivite testinde, F. torulosa metanol ekstresi (IC50: 22,58±1,13 µg/mL) ile oleanonik asit (11) bileşiği (IC50: 8,90±0,27 µg/mL) önemli derece yüksek sitotoksisite göstermiştir. Çalışılan ekstreler arasında F. torulosa metanol ekstresi DPPH serbest radikali giderim (IC50: 15,03±0,25 µg/mL) yönteminde en yüksek antioksidan aktiviteyi, P. pini mantarının metanol ekstresi -karoten renk açılımı (IC50: 1,30±0,14 µg/mL), ABTS katyon radikali giderim (IC50: 3,30±0,19 µg/mL), CUPRAC (A0,50: 11,62±0,10 µg/mL) ve metal kelat etki (% 60,50±0,81) yöntemlerinde en yüksek aktiviteyi göstermiştir. Bu iki ekstre çalışılan bütün aktivite testlerinde standart olarak kullanılan BHA ve α-tokoferolden daha yüksek aktivite göstermiştir. 4-(3,4-dihidroksifenil)-3-büten-2-on (6) ve 3,4-dihidroksi benzaldehit (13) bileşikleri metal kelat yöntemi dışında bütün aktivite testlerinde en yüksek antioksidan aktiviteyi göstermiş olup, ilaveten BHA ve α-tokoferolden daha yüksek aktivite göstermiştir. P. pini hekzan ekstresi (% 60,66±0,21) ve oleanolik asit (7) bileşiği (% 29,19±0,17) AChE enzimine karşı en aktif olarak bulunurken, F. torulosa metanol ekstresi (% 59,41±1,05) ile pinoresinol (5) bileşiği (% 80,02±0,73) BChE enzimine karşı en aktif olarak bulunmuştur. İzole edilen bileşikler arasında, pinoresinol (5) bileşiği (% 30,01±0,28) en yüksek anti-tirozinaz aktiviteyi göstermiştir. 
Bu tez çalışması ile P. pini ve F. torulosa mantar türlerinin biyoaktivite kontrollü saf bileşiklerin izolasyonu ilk kez gerçekleştirilmştir. Bu türlerden elde edilen ekstre ve saf bileşiklerin biyoaktif özellikleri detaylı olarak ilk defa bu çalışmada araştırılmıştır

Abstract:
In this doctoral thesis, it was aimed to isolate bioactive compounds of Porodaedalea pini and Fuscoporia torulosa tree mushrooms which are widely grown in Anatolia. The aerial parts of the mushrooms were extracted separately with different solvents according to their increasing polarity: hexane, chloroform, acetone, methanol, water at room temperature. Total phenolic and total flavonoid contents of obtained extracts were determined as pyrocatechol and quercetin equivalents, respectively. Cytotoxic activity of mushroom species was tested using MTT assay. Antioxidant activity was tested by β-carotene bleaching, DPPH free radical scavenging, ABTS cation radical scavenging, CUPRAC and metal chelating assays, while anticholinesterase activity of mushroom extracts was determined by Ellman method. Also, phenolic compounds of the mushrooms were determined by HPLC-DAD.
The extracts were subjected to silica gel column chromatography and obtained fractions were investigated for cytotoxic, antioxidant and anticholinesterase activities. Six compounds from P. pini and eleven compounds from F. torulosa were isolated by using column, recycle-HPLC and preparative TLC chromatography. Campesterol (1) from chloroform extract of P. pini; ergosta-7,24(28)-dien-3β-ol (2), dioctyl phthalate (3), ergosterol peroxide (4), pinoresinol (5), 4-(3,4-dihydroxyphenyl)-but-3-en-2-one (6) from methanol extract of P. pini; oleanolic acid (7), 28-norolean-12-en-3β-ol (8), javeroic acid (9) from chloroform extract of F. torulosa; 4-(3,4-dihydroxyphenyl)-but-3-en-2-one (6), β-sitosterol (10), oleanonic acid (11), 2,3-dihydroxy cinnamic acid (12), 3,4-dihydroxy benzaldehyde (13) from acetone extract of F. torulosa; ergosterol peroxide (4), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (14) and a new compound 5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-il-palmitate (15) from methanol extract of F. torulosa were isolated. The chemical structures of isolated compounds were elucidated by IR, 1D, 2D NMR, EI-MS and ESI-MS techniques. The cytotoxic, antioxidant, anticholinesterase and anti-tyrosinase activities of the isolated compounds were tested by same methods as described above. The highest cytotoxic acitivity against prostat cancer line (PC-3) were found in P. pini hexane (IC50: 33.84±0.01 µg/mL and F. torulosa hexane (IC50: 49.49±0.59 µg/mL) extracts. F. torulosa methanol extract (IC50: 22.58±1.13 µg/mL) and oleanonic acid (11) (IC50: 8.90±0.27 µg/mL) showed significiant cytotoxic activity against breast cancer line (MCF-7). Among all extracts, the highest antioxidant activity was found in F. torulosa methanol extract in DPPH• assay (IC50: 15.03±0.25 µg/mL); P. pini methanol extract in β-carotene-linoleic acid (IC50: 1.30±0.01 µg/mL), ABTS• (IC50: 3.30±0.19 µg/mL), CUPRAC (A0.50: 11.62±0.10 µg/mL) and metal chelating (60.50±0.81 %) assays. These two extracts displayed higher antioxidant activity than BHA and α-tocopherol used as standards. In addition, 4-(3,4-dihydroxyphenyl)-but-3-en-2-one (6) and 3,4-dihydroxy benzaldehyde (13) showed the highest antioxidant activity in all studied tests except metal chelating assay and exhibited higher antioxidant activity than BHA and α-tocopherol. When the hexane extract of P. pini (60.66±0.21 %) and oleanolic acid (7) (29.19±0.17 %) showed the highest activity against AChE, the methanol extract of F. torulosa (59.41±1.05 %) and pinoresinol (5) (80.02±0.73 %) exhibited the highest activity against BChE. Among all isolated compounds, pinoresinol (5) (30.01±0.28 %) indicated the best anti-tyrosinase activity. 
In this thesis, bioassay guided isolation of P. pini and F. torulosa tree mushroom species were studied for the first time. Bioactive properties of the extracts and pure compounds obtained from these muhroom species were investigated in details for the first time with this study.