Farklı dejeneratif demans hastalarında oksidatif hasar: Alzheimer hastalığında oksidatif makromolekül hasarının ve onarımının incelenmesi
Oxidative damage in different degenerative dementia patients: Evaluation of the oxidative macromolecular damage and repair in Alzheimer's disease
Yazar: GAMZE TUNA
Danışman: PROF. DR. G. HÜRAY İŞLEKEL ; PROF. DR. F. GÜLDAL KIRKALI
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; DNA = DNA ; DNA hasarı = DNA damage ; DNA onarımı = DNA repair ; Demans = Dementia ; Makromoleküller = Macromolecules ; Matriks metalloproteinazlar = Matrix metalloproteinases

Özet:
Giriş ve amaç: Alzheimer hastalığı yaşlılarda en sık görülen nörodejeneratif bozukluktur. Klinik olarak ilerleyici, geri dönüşümsüz hafıza kaybı ve bilişsel bozukluklarla karakterizedir. Serbest oksijen radikalleri aracılı oksidatif makromolekül hasarı, Alzheimer hastalığında temel nörodejeneratif mekanizmalarda rol almaktadır. Bu tez çalışmasında Alzheimer hastalarında ve sağlıklı gönüllü kişilerde, oksidatif hasarın makromoleküler (DNA, lipid, protein, karbohidrat) düzeyde incelenmesi ve DNA hasarının onarımında rol oynayan bazı enzimlerin araştırılması amaçlandı. Bunun yanısıra radikal hasar ve Alzheimer hastalığı üzerine etkilerini araştırmak amacıyla, matriks metalloproteinazlar(MMP2, MMP9) ve metalloproteinazların spesifik doku inhibitörleri (TIMP1, TIMP2) düzeylerinin de incelenmesi amaçlandı.
Gereç ve yöntem: Çalışma, 44 Alzheimer hastası ve 45 sağlıklı gönüllü bireylerden alınan periferal kan örneklerinde gerçekleştirildi. DNA baz hasarı çalışmaları izotop dilüsyonlu GC-MS/MS tekniği ile gerçekleştirildi. DNA baz hasarı onarım enzimlerinden NEIL1 ve OGG1 glikozilaz enzimlerinin mRNA ekspresyon düzeyleri RT-PCR tekniği ile belirlendi. Protein oksidasyonu belirteci 3-Nitrotirozin düzeyi ve MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 düzeyleri ELISA yöntemi ile ölçüldü. Lipid peroksidasyon ürünlerinden malondialdehit ve ileri glikasyon son ürünü olan N?-karboksimetillizin düzeyleri ise HPLC yöntemi ile incelendi.
Bulgular: Alzheimer hastaları DNA örneklerinde incelenen DNA baz hasarı lezyonlarından, FapyAde /106 DNA baz hasarı kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p=0,00). 8-OHGua/106 DNA bazı, FapyGua/106 DNA bazı, 5-OH-5-MeHyd/106 DNA bazı ve 5-OHCyt/106 DNA bazı düzeylerinde ise anlamlı farklılık gözlenmedi. ThyGly, 5-OH-MeUra, 5-OH-Ura, 5,6-diOH-Ura hasarları ise hasta ve kontrol örneklerinde saptanmadı. DNA onarım enzimlerinden NEIL1 ekspresyonu Alzheimer hastalarında kontrol grubuna göre 0,21 kat artmış olarak bulundu. OGG1 ekspresyonu ise hasta grubunda kontrol grubuna göre 0,02 kat azalmış olarak bulundu. Ancak her iki enzimdeki değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı değildi.  Alzheimer hastaları ile kontrol grubu arasında nitrotirozin ve N?-karboksimetillizin düzeyleri açısından anlamlı fark bulunmazken, Alzheimer hastalarına ait MDA düzeyleri kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p=0,000).  Alzheimer hastalarında MMP2, TIMP1 düzeyleri kontrol grubuna göre istatistiksel anlamlılıkta düşük iken (sırasıyla p=0,000, 0,003)  TIMP2 ve MMP9 düzeyleri açısından kontrol grubu ile arasında istatistiksel anlamlı bir farklılık bulunmadı. 
Sonuç: Bu çalışma Alzheimer hastalarında oksidatif makromolekül hasarı belirteçlerinin ve DNA onarım enzim ekspresyonlarının ilk kez bu kadar geniş bir biçimde araştırılmış olması açısından önem taşımaktadır. Oksidatif maromolekül hasarı, Alzheimer hastalığının patogenezinde önemli rol oynamaktadır. Bu sürece hangi moleküllerin ne derece dahil olduğunun bilinmesi hastalığın etiyolojisinde ve tedavisinde uygulanacak metodların seçiminde önem taşımaktadır. Aynı zamanda matriks metalloproteinazların ve inhibitörlerin Alzheimer hastalığının patogenezinden sorumlu Aß peptidlerin katabolizmasında rol aldıklarını destekleyici bulguların da elde edilmesinin literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Anahtar kelimeler: Alzheimer hastalığı, oksidatif makromolekül hasarı, DNA onarımı, matriks metalloproteinazlar ve metalloproteinazların doku inhibitörleri

Abstract:
Objective: Alzheimer?s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder of the elderly. It is characterized by its progressive clinical course, irreversable memory loss and cognitive disorders. Free radical-mediated oxidatively induced macromolecular damage plays a role in basic neurodegenerative mechanisms in Alzheimer?s disease. In this thesis, enyzmes which play a role in DNA repair mechanism and oxidative damage in macromolecular level (DNA, lipid, protein, carbohydrate) was studied in Alzheimer?s disease patients and healthy volunteers. In addition, matrix metalloproteinases (MMP2, MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP1, TIMP2) levels were investigated to see their effects on the radical damage and Alzheimer?s disease. 
Method: The study was carried out with periferal blood samples taken from 44 Alzheimer?s disease patients and 45 controls. DNA base damage was determined by isotope dilution GC-MS/MS. The mRNA expression levels of the two major DNA base excision repair enzymes, (NEIL1 and OGG1 glycosylases) were determined by RT-PCR. The levels of protein oxidation marker 3-Nitrotyrosine and MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 were measured with ELISA. Malondialdehyde, one of the lipid peroxidation products and N?-carboxymethyllysine, an advanced glycation end product,  levels were investigated with HPLC methods.
Results: The level of FapyAde/106 bases, a lesion of base damage, were significantly higher in AD patients compared to those in control subjects (p=0,00). There were no statistically significant difference between AD patients and the control group in 8-OHGua/106 DNA bases, FapyGua/106 DNA bases, 5-OH-5-MeHyd/106 DNA bases and 5-OHCyt/106 DNA bases. The ThyGly, 5-OH-MeUra, 5-OH-Ura, 5,6-diOH-Ura damages were not detected neither in AD patients nor in the control group. The level of NEIL1 expression, one of the DNA repair enzymes was found to be 0,21 times more in AD patients compared with the control group. However; this increase was not statistically significant. OGG1 expression level was found to be 0,02 times less in patients than in control group.  This decrease also was not significant. Where there were no statistically significant difference between AD patients and control group in 3-Nitrotyrosine and N?-carboxymethyllysine levels, the levels of malondialdehyde were significantly higher in AD patients compared to those in control subjects (p=0,000). The MMP2 and TIMP1 levels were significantly lower in the AD group than the control group (p= 0,000 and 0,003 respectively). On the other hand, there were no statistically significant difference between AD patients and control group in TIMP2 and MMP9 levels.
Conclusion: This study is noteworthy since markers of oxidative macromolecular damage and expressions of DNA base excision repair enzymes has been studied extensively in AD patients. Oxidative macromolecular damage plays an important role in pathogenesis of Alzheimer?s disease. It is vey important to be able to detect which molecule is involved at which level of this process, in understanding the etiology and selection of treatment strategies for this disease. Furthermore, it is postulated that, gathering supporting evidence about the role of matrix metalloproteinases and their inhibitors in Aß peptids catabolism which is responsible for the Alzheimer?s disease pathogenesis will contribute to the literature.	

Key Words: Alzheimer?s disease, oxidative macromolecular damage, DNA repair, matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases