Klasik ve pulse radyofrekans termokoagülasyonun nöroablatif etkilerinin nöronal dizin hücreleri üzerinde incelenmesi
The comparıson of neuroablatıve effects of conventıonal and pulse radıofrequency tecnıques
Yazar: BERNA KİPİCİ
Danışman: PROF. DR. İDİL TEKİN
Celal Bayar Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Anesteziyoloji ve Reanimasyon Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Anestezi ve Reanimasyon = Anesthesiology and Reanimation
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; Nörotoksinler = Neurotoxins ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Radyofrekans = Radiofrequency

Özet:
Konvansiyonel RF (KRF)'de yüksek ısı ile oluşturulan bu nöroablasyon; nörit benzeri reaksiyonlara, motor defisitlere ve deafferantasyon sekelinine neden olabilmektedir. Yan etkilerin azaltılması amacıyla devam eden yeni arayışlar, 1996 yılında Sluijter'ın pulse RF (PRF)'i bulmasıyla sonuçlanmıştır. Sinir dokularında termokoagülasyona neden olan ısı oluşumunun, klinikte görülen sonuçlardan sorumlu olduğu düşünülmesine rağmen, PRF, destrüktif düzeyde ısı üretiminin olmadığı RF akımı oluşturmaktadır. PRF klinik olarak kanıtlanan etkinliği ve herhangi bir kalıcı nörolojik defisit yapmaması nedeniyle hızlı bir şekilde kabul edilmiş ve benimsenmiştir. Elde edilen klinik sonuçlar PRF'nin kullanımını desteklese de, etki mekanizması hala belirsizdir.Bu çalışmada amaç, nöroblastoma hücre dizininde, nörotoksisite tarama testi, apoptosis ve oksidatif stres immünohistokimyası kullanarak, RF tedavisinin nöron hücre davranışı üzerine olan etkilerini araştırmaktır. RF uygulaması ile nöron üzerinde oluşacak oksidatif stres ve neden olacağı nörit inhibisyonu ile apoptosis düzeyi arasındaki ilişki, bu uygulamaların gelecekteki kullanımlarının yönlendirilmesi anlamında önemli bilgiler edinmemizi sağlayacaktır.RF uygulamalarının nöron üzerindeki etkilerinin anlaşılmasında üç boyutlu in vivo ortam, ancak, belirgin toksik etkinin gösterilmesinde uygun olmakta ve kullanılan mekanizmaların anlaşılmasında zorluklar oluşturmaktadır. Bu nedenle iki boyutlu, in vivo ortamın kompleksliğinden arındırılarak, basit ve mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına imkan veren, in vitro kültür ortamlarının kullanılması gerekli olmaktadır. Bu ortamlar, RF uygulamalarının özellikle PRF'in nöron davranışına olan etkilerini araştırmak, uygulamanın olası zararlarını ortaya koymak ve bunların mekanizmalarını irdelemek açısından önem taşımaktadır.Çalışmada NaB2 fare nöroblastoma dizin hücreleri kullanıldı. 24 adet hücre kültür kabı kullanılan çalışmada, uygulanan RF süresine göre 4 ayrı grup oluşturuldu. Birinci gruba 180 saniye, ikinci gruba 360 saniye, üçüncü gruba 540 saniye sürelerle RF uygulandı. Dördüncü gruba ise RF uygulanmadı ve kontrol grubu olarak değerlendirildi. Bu 4 grup 40ºC KRF, 40 ºC PRF, 60ºC KRF ve 60ºC PRF olarak 4'er tane alt gruba ayırıldı. Kontrol grubu ve 180 sn'lik I. Grup'un birer hücre dizinine steroid eklenerek, steroidin lezyon üzerine etkileri araştırıldı. RF uygulamalarının sonrasında iNOS, eNOS ve TUNEL boyamaları yapıldı. Faz kontrast mikroskop görüntüleri bilgisayar ortamına alınarak morfometrik analizleri yapıldı.540 sn ve 40 ºC kullanımı sonucunda belirgin hücre kaybının oluştuğu gözlendi. Sürenin azaltıldığı 360 sn ve 40ºC uygulamalarında yine belirgin hücre ölümünün gerçekleştiği ve bunun KRF ile daha belirgin olduğu anlaşıldı. Sürenin daha da azaltıldığı 180 sn ve 40 ºC uygulamalarında hücrelerin yaklaşık kültür kabının üçte biri şeklinde daha az öldüğü, genellikle sağlıklı ve iyi görünümde oldukları görüldü. Bu görünümün PRF uygulamalarında KRF uygulamalarına göre daha belirgin olduğu saptandı. 180 sn ve 60 ºC uygulamalarında hücrelerin 360 sn sürelerindekine benzer düzeyde etkilendikleri ve bu etkilenmenin KRF uygulamasında daha belirgin olduğu bulundu.Hücre ölümünün uygulamalar arasında fark oluşturmadığı 180 sn ve 40 ºC uygulamalarının büyük büyütmelerinde RF etkisinin nörit inhibisyonu şeklinde görüldüğü saptandı. Nörit uzatma her alanda farklı düzeylerde gerçekleşirken RF uygulamalarının sonrasında oluşan toksik etkinin heterojen olduğu görüldü.RF uygulamalarının yaptığı nörit inhibisyonu oksidatif stres ile ilişkisi ve bu ilişkinin getirdiği apopitoz mekanizmasının varlığı araştırıldığında, kontrol örneklerinde bazal düzeyde bir iNOS ve eNOS ortamının bulunduğu ayrıca az miktarda apopitotik hücrenin oluştuğu anlaşıldı. RF süresi ile belirgin bir biçimde NOS varlığının arttığı ve beraberinde apopitotik hücrelerinde çoğaldığı gözlendi. Bu etkinin KRF uygulamasında, PRF uygulaması ile karşılaştırıldığında daha belirgin olduğu anlaşıldı.Morfometrik analizlerde, RF süresi uzadıkça oldukça anlamlı (p<0,001) bir şekilde hücre ölümü oluştuğu, ancak apopitotik hücredeki artışın aynı anlamlılıkta olmadığı bulundu. 180 sn, 40ºC'de hücre ölümünün en az gerçekleştiği, 60ºC uygulamasının anlamlı (p<0,05) bir toksik etki oluşturduğu ancak apopitotik hücre sayısında bir değişiklik oluşturmadığı bulundu. 180 sn ve 40ºC PRF uygulamalarında daha az oranda nörit inhibisyonu ortaya çıkarken (p<0,05), KRF uygulamasında oldukça anlamlı (p<0,001) nörit inhibisyonu gerçekleştiği görüldü. Benzer sonuçlar iNOS ve eNOS için bulunurken, TUNEL boyamalarında en az apopitotik etkinin KRF uygulamasında olduğu saptandı.PRF ile karşılaştırıldığında KRF için toksik etkinin hem hücrelerin sayısal azalması şeklinde nekroz ile görülen makro bulgulara, hem de nörit inhibisyonu ile ılımlı toksik etkiye daha çok neden olduğu ayrıca bu etkinin NOS ve apopitozla ilişkili olarak gerçekleştiği görüldü.Sonuç olarak RF uygulamalarında artan süre ve ısı ile toksik etkinin de arttığı, KRF uygulamalarında belirgin hasar oluştuğu ve PRF uygulaması ile bu hasarın engellenemediği ancak azaltılabildiği kanısına varıldı. Steroid uygulamasının in vitro ortamda koruyucu etki oluşturmadığı görüldü.

Abstract:
Neuroablation generated by the high-temperature in conventional RF (CRF) can lead to neuritis-like reactions, motor deficits and deafferentation sequels. The ongoing new searches in order to reduce the side effects resulted in the discovery of pulsed RF (PRF) by Sluijter in 1996. Although formation of heat causing ``thermocoagulation?? of the nervous tissues is thought to be responsible of the clinical outcome, pulsed radiofrequency (PRF) delivers the RF current without producing destructive levels of heat. Pulsed radiofrequency (PRF) has been rapidly accepted for its clinically demonstrated effectiveness and the lack of any permanent neurological deficits. Although the clinical results support the use of PRF, the mechanism of action is still unclear.In this study, the aim is to investigate the effects of RF treatment on the behavior of neuronal cells by using neurotoxicity screening test and apoptosis and oxidative stress immunohistochemistry in neuroblastoma cell line. The relationship between the oxidative stress on the neurons caused by PRF application and subsequent inhibition of neuritis and the level of apoptosis will provide important information in terms of guidance of future uses of these applications.In understanding the effects of RF applications on neurons, three-dimensional in vivo environment becomes available to demonstrate only the significant toxic effects and poses difficulties in understanding the mechanisms used. Therefore, the two-dimensional in-vitro culture environments which are simple and allowing a better understanding of the mechanisms are required by eliminating the complexity of in-vivo environments. These environments are important in terms of investigating the effects of RF applications, especially RF applications, on the neuronal behavior, demonstrating the potential hazards of the application, and examining their mechanisms of actions.In this study, rat neuroblastoma NaB2 cell line was used. 24 cell culture containers were used, and 4 different groups were created based on the duration of the RF. The durations of RF application were 180 seconds, 360 seconds and 540 seconds in the first, second and third groups, respectively. The fourth group was not underwent RF application and considered as a control group. Each of these 4 groups were divided into four sub-groups as CRF at 40°C, PRF at 40°C, CRF at 60°C and PRF at 60ºC. Steroid was applied in one of each cell line of the control group and the first group (180 sec), and the effects of steroids on the lesion were investigated. After RF applications, iNOS, eNOS, and TUNEL staining were performed. Phase contrast microscope images were transferred to a computer, and morphometric analysis was performed.A significant cell loss was observed as a result of the use of RF application for 540 sec at 40°C It was proven that significant cell death occurred with the applications for 360 sec at 40°C, and this was more pronounced with the use of CRF. It was demonstrated that the rate of cellular death was lower by approximately one-third of the culture container, and they generally had a healthy appearance with the applications for 180 sec at 40°C This appearance was found to be more evident in the PRF applications than the CRF applications. It was found that the cells in the 180 sec at 60°C group were affected by a similar level that of 360 sec groups and that this influence was more pronounced in CRF application.The cell death was determined to not constitute a difference between applications; the effect of RF applications for 180 sec at 40°C was seen as the inhibition of neuritis at high magnification. Different levels of neuritis extension occurred in every field, and the toxic effect that occurred after the RF applications was seen to be heterogeneous.When the relationship between the inhibition of neuritis caused by RF applications and oxidative stress, and the presence of apoptosis mechanism brought by this relationship were investigated, the basal level of iNOS and eNOS media were detected and a small amount of apoptotic cell were found in the control samples. There is a marked increase in the presence of the NOS with the increase in RF duration, accompanied by an increase in apoptotic cells. This effect was found to be more pronounced with the CRF application when compared with the PRF application.In morphometric analysis, it was found there is a significant increase in cell death with increasing RF durations (p <0.001), but not in the apoptotic cells. The amount of cell death was lowest with the application for 180 sec at 40°C, and the application at 60°C caused a significant increase in toxic effect (p <0.05), but not in the number of apoptotic cells. While a lesser extent of inhibition of neuritis occurred in PRF applications for 180 sec and 40°C (p <0.05), quite significant level of inhibition of neuritis occurred in CRF application (p <0.001). While similar results were available for iNOS and eNOS, the least apoptotic effect was found to be with the CRF application in TUNEL staining.When compared to the PRF, the toxic effect of CRF was found to cause macro-findings associated with the necrosis characterized by the numerical decline in the cells, and mostly moderate toxic effects with the inhibition of neuritis. The latter effect was also found to be associated with NOS and apoptosis.In conclusion, we concluded that the toxic effect was increased with the increasing duration and temperature in RF applications, a significant damage occurred in CRF applications, and this damage can be lessened but not eliminated with PRF application. Steroid application was found to have no in vitro protective effect.