Karyojenik bakterilerin dental pulpa hücresinde oluşturduğu oksidatif stresin incelenmesi
Evaluation of oxidative stress caused by cariogenic bacteria in dental pulp cell
Yazar: HATİCE DOĞAN BUZOĞLU
Danışman: PROF. DR. YASEMİN BAYAZIT
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Bakteriler = Bacteria ; Dental pulpa = Dental pulp ; Glütatyon = Glutathione ; Glütatyon transferaz = Glutathione transferase ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Çürük yapıcı patojen mikroorganizmalar (karyojenik mikroorganizmalar) pulpal inflamasyon ve enfeksiyonun majör kaynağıdır ve salgıladıkları hücre zarı komponentleri ile reaktif oksijen moleküllerinin (ROS) oluşumuna dolayısıyla da oksidatif hasarın artmasına neden olurlar. Bu çalışmada sağlıklı insan diş pulpasından hazırlanan primer hücre kültüründe karyojenik mikroorganizmaların oluşturduğu oksidatif stres parametreleri olan ROS, Glutatyon (GSH), Glutatyon S-Transferaz (GST) ve oksidatif hasarın elimine edilmesinde etkin bir antioksidan molekül olan N-asetilsistein'in (NAC) etkisi incelendi. Bu amaçla sağlıklı genç bireylerden gömülü yirmi yaş dişlerinden elde edilen sağlıklı diş pulpaları ile primer hücre kültürü hazırlandı. 4.-7. Pasaj aralığındaki dental pulpa hücreleri 40 g/ml lipopolisakkarit (LPS), 40 g/ml lipoteik asit (LTA) ve 0,3 mM hidrojen peroksit (H2O2) ile tek başına ve 10 mM NAC preinkübasyonu ile inkübe edildi. Dental pulpa hücrelerinde ROS, GSH ve GST protein düzeyleri ve immunohistokimyasal boyamaları yapıldı. Ayrıca akım sitometri ile hücre canlılığı ve nekroz-apoptoz düzeyleri incelendi. Gruplar arası istatistiksel farklılıklar Kruskal Wallis analiziyle, ikili karşılaştırmalar da Mann-Whitney-U analiziyle =0,05 güven aralığında değerlendirildi. Hücre canlılığının LPS, LTA ve H2O2 uygulamalarında istatistiksel olarak fark yaratmayacak düzeyde azaldığı, NAC preinkübasyonunun önemli bir değişiklik oluşturmadığı gözlendi (p>0.05). NAC preinkübasyonunun LPS, LTA ve H2O2 uygulanan dental pulpa hücrelerindeki ROS düzeylerini önemli derecede azalttığı hem biyokimyasal analizlerle hemde immünfloresans yöntemiyle gözlenmiştir (p<0.05). Biyokimyasal analiz sonuçları LPS, LTA ve H2O2 inkübasyonunun dental pulpa hücrelerinin hücre içi GSH değerlerini düşürürken, NAC preinkübasyonunun hücre içi GSH'u rejenere etmede yetersiz kaldığını gösterdi. Diğer taraftan immün boyama sonuçlarına göre NAC+ H2O2 kontrole göre hücre içi GSH'u önemli derecede artırmıştır (p<0.05).  Deney grupları arasında GST enzim aktivite değerleri açısından önemli bir fark gözlenmemiştir. Sonuç olarak LPS, LTA ve H2O2 dental pulpa hücrelerinde oksidatif stresi farklı düzeylerde etkilerken, NAC molekülü ROS düzeylerini azaltmasına rağmen hücre içi GSH düzeyleri üzerine belirgin bir etki gösterememiştir.
Anahtar kelimeler: Apoptoz, dental pulpa, GSH, GST, inflamasyon, oksidatif stres, ROS.

Abstract:
Caries-causing pathogenic microorganisms (cariogenic microorganisms) are the major source of pulpal inflammation and infection, and they cause the formation of reactive oxygen molecules (ROS) with the cell membrane components they secrete, thus increasing oxidative damage. In this study, the effects of ROS, Glutathione (GSH), Glutathione-S-Transferases (GST), which are the oxidative stress parameters caused by cariogenic microorganisms, and N-acetylcysteine (NAC), an effective antioxidant molecule, on the elimination of oxidative damage in primary cell culture prepared from healthy human dental pulp were investigated. For this purpose, primary cell culture was prepared with healthy dental pulps from wisdom teeth extracted from young individuals. Dental pulp cells in the passageway were incubated with 40 µg/ml lipopolysaccharide (LPS), 40 µg/ml lipoteic acid (LTA) and 0.3 mM hydrogen peroxide (H2O2) alone or with 10 mM pre-incubation. ROS, GSH and GST protein levels and immunohistochemical staining were performed in dental pulp cells. In addition, cell viability and necrosis-apoptosis levels were examined by flow cytometry. Statistical differences between groups were evaluated by Kruskal Wallis analysis followed by Mann-Whitney-U test for pairwise comparisons at =0,05. It was observed that cell viability decreased statistically insignificantly in LPS, LTA and H2O2 applications, and NAC pre-incubation did not cause a significant change (p>0.05). It was observed that NAC preincubation significantly reduced ROS levels in dental pulp cells treated with LPS, LTA and H2O2, both by biochemical analyzes and by immunofluorescence method (p<0.05). Biochemical analysis results showed that LPS, LTA and H2O2 incubation decreased intracellular GSH values of dental pulp cells, while NAC preincubation was insufficient to regenerate intracellular GSH. On the other hand, according to the immunostaining results, NAC+ H2O2 significantly increased intracellular GSH compared to the control (p<0.05). No significant difference was observed between the experimental groups in terms of GST enzyme activity values. As a result, while LPS, LTA and H2O2 affected oxidative stress in dental pulp cells at different levels, although NAC molecule reduced ROS levels, it did not show a significant effect on intracellular GSH levels. 

Key words: Apoptosis, dental pulp, inflammationon, GSH, GST, oksidative stress, ROS.