Proteinlerin yüzeyde zenginleştirilmiş Raman saçılmasıyla tayini için yeni yöntemlerin geliştirilmesi
Development of a novel protein detection method based on surface-enhanced Raman scattering
Yazar: MEHMET KAHRAMAN
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ÇULHA ; PROF. SÜLEYMAN AKMAN
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya = Chemistry
Dizin: Nanopartiküller = Nanoparticles ; Protein analizleri = Protein analysis ; Raman spektroskopisi = Raman spectroscopy

Özet:
Yüzeyde zenginleştirilmiş Raman saçılması (YZRS) biyolojik ve biyolojik olmayan moleküllerin ve yapıların tayini için kullanılan güçlü bir tekniktir. Özellikle su molekülünün zayıf Raman saçıcısı olmasından dolayı biyolojik moleküllerin ve yapıların karakterizasyonu için daha uygundur. Proteinlerin hızlı, hassas ve doğru tayini sadece klinik uygulamarda değil aynı zamanda endüstriyel uygulamalarda da önemlidir. Bu çalışmada, YZRS'ye dayalı proteinlerin tayini için yeni yöntemlerin geliştirilmesi araştırıldı. Öncelikle proteinlerin ve gümüş nanoparçacıkların (AgNPler) basit karıştırılması, örnek hazırlama yöntemi olarak değerlendirildi. Basit karıştırma yöntemi ile sadece pozitif yüklü proteinler 5 µg/mL derişimine kadar tayin edilebilmesine rağmen elde edilen YZRS spektrumların tekrarlanabilirliği tanı ve tayin için kabul edilebilir değildir. İkinci yaklaşım olarak, doğru tanı ve tayini sağlamak ve tekrarlanabilir YZRS spektrumları elde etmek için iletim derleme yöntemi, proteinlerin ve AgNPlerin toplanmaları kontol etmek için kullanıldı. İletim derleme yöntemi ile AgNP-protein karışımları cam yüzey üzerine biriktirildi ve oluşan yüzeylerden YZRS spektrumları alındı. Spektrumlar incelendiginde bu amaç için tekrarlanabilirliğin oldukça yüksek olduğu saptandı. Proteinlerin büyüklüğüne ve yüküne bağlı olmaksızın tayin sınırı 0,5 µg/mL'ye kadar kolaylıkla başarıldı. Bu değer literatürde rapor edilen tayin sınırından en az on kat daha düşüktür. Ayrıca, iletim derleme yöntemi ile protein karışımlarının ayrılması ve YZRS ile tayini araştırıldı. Bu amaç için aynı yüklü, farklı büyüklükte ve zıt yüklü, aynı büyüklükte proteinler AgNPler ile karıştırıldı. Protein-AgNPler karışımı iletim derleme yöntemi kullanarak cam yüzey üzerine biriktirildi. Hazırlanan yüzey beş eşit bölgeye ayrıldı ve ayrılan herbir bölgeden YZRS spektrumları alındı. Deney sonuçları aynı yüke sahip protein karışımının iletim derleme yöntemi ile kısmen ayrılabileceğini ve YZRS ile işaretleyici kullanmadan tayin edilebileceğini göstermektedir. Sıcaklığın spektrum kalitesine ve sinyal zenginliği üzerini etksi de araştırıldı. Proteinler tek tek ve karışımlar halinde AgNPler ile cam yüzeye depozit edildi ve hazırlanan yüzeylerden farklı sıcaklıklarda YZRS spektrumları alındı. Sonuçlar zıt yüklü protein karışımlarının YZRS ile ayrılması için sıcaklığın kullanılabileceğini göstermektedir. Son olarak, iletim derleme yöntemi sırasında biyolojik moleküllerin zıt yüklü protein karışımlarını ayırma etkinliği araştırıldı. Biyolojik molekülün varlığının ayırmaya yardımının olmadığı saptandı.

Abstract:
Surface-enhanced Raman scattering (SERS) is a powerful technique for the detection of non-biological molecules, and biological molecules and structures. Since water is a weak Raman scatterer, it is even more suitable for the characterization of biological molecules and structure. The fast, sensitive and accurate detection of proteins have significance in not only clinical but also industrial applications. In this study, the development of a novel detection method for protein detection based on the surface-enhanced Raman scattering is investigated. First, a simple mixing of proteins and colloidal silver nanoparticles (AgNPs) is evaluated as a sample preparation method. Although the only positively charged proteins could be detected with a detection limit of 5 µg/mL with the simple mixing, the reproducibility of the SERS spectra is not acceptable for detection and identification. As a second approach, convective assembly method is used to control aggregation of proteins and AgNPs to obtain reproducible SERS spectra and achieve a healthy detection and identification. The mixture of AgNPs and proteins is deposited on the glass slide with the method and SERS spectra are obtained from the prepared surfaces. When the obtained SERS spectra are examined, the reproducibility of the SERS spectra is satisfactory for comparision. A detection limit down to 0.5 ?g/mL regardless of the proteins? charge status and size is easily achieved. The minimum improvement in detection limit is more than 1 order of magnitude compared to the previously reported detection limits using the technique. Next, separation of protein mixtures with the convective assembly method and detection with the SERS have been investigated. For this purpose, different size of proteins with same charge and same size with different charge of protein are mixed with the AgNPs. The mixture of Protein-AgNPs is deposited on the glass slide using convective assembly process. The prepared surface is divided into five equal regions and SERS spectra are obtained from the each divided region. The experimental results demonstrate that the protein mixture having same charge can differencially be separated with the convective assembly method and detected with SERS without a label. The influence of temperature is also investigated on the spectral quality and signal enhancement. Each protein and protein mixtures are deposited on a glass slide with AgNPs and SERS spectra are obtained from the prepared surfaces at different temperatures. The results show that, the temperature could be used for the separation of oppositely charge proteins mixture with SERS. Finally, the influence of other biological molecules on the separation efficiency of oppositely charged proteins during convective assembly process is investigated. It is found that the presence of a biological molecule during the process does not help.