İn vivo ve in vitro koşullarda embriyonik alkaloz defans mekanizmasının karşılaştırılması
Comparison of alkalosis defense mechanism during embryonic stages at conditions of in vivo and in vitro
Yazar: HALİL ŞENER
Danışman: PROF. DR. ŞEREF ERDOĞAN
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Anyon değiştirici membranlar = Anion exchange membranes ; Anyonlar = Anions ; Embriyo = Embryo ; Embriyoloji = Embryology ; Hidrojen iyon konsantrasyonu = Hydrogen-ion concentration ; İn vitro = In vitro ; İn vivo = In vivo

Özet:
Her tür hücrede olduğu gibi, gelişen embriyolarda da hücre içi pH (pHi) regülasyonu hücrenin yaşamını devam ettirebilmesi için önemli bir faktördür. pHi düzenleyicilerinden biri olan HCO3-/Cl- değiştiricisi (anyon değiştiricisi, AE) alkalozdan savunmayı sağlarken, Na+/H+ ile Na+,HCO3-/Cl- değiştiricileri asidoza karşı embriyoları korumaktadır. Bu değiştiricilerin görevi, embriyoların daha iyi gelişim göstermeleri için pHi değerini belirli bir düzeyde tutmaktır. Alkali ortam olan oviduktta (tuba uterina) bulunan embriyoların AE aktivitesi yüksek olmasına karşılık embriyonik gelişim süreci boyunca ovidukttan uterusa doğru ilerlemesi ile AE aktivitesinde azalma görülmektedir. Bu çalışmada, in vivo gelişen ve in vitro koşullarda kültüre edilerek elde edilen embriyoların gelişim süreçlerinde (embriyogenez) AE aktivitesinin karşılaştırılması ve alkaloz savunma mekanizmasının etkinliği açısından farklılık olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. 
Çalışmada Balb/c soyuna ait beş – sekiz haftalık erişkin farelere süperovülasyon protokolü uygulandı. Dişi farelerin matür erkek fareler ile kopülasyonları sağlanarak uygun zamanlarda, in vivo koşullarda gelişen iki (2-h), dört (4-h) ve sekiz hücreli (8-h) embriyolar ile morula ve blastokist aşamasındaki embriyolar elde edildi. In vitro koşullarda ise pronüklear (PN) zigot kültürü ile 2-h, 4-h, 8-h, morula ve blastokist aşamasındaki embriyolar elde edildi. Her iki koşulda elde edilen embriyoların kayıtlarında KSOM esaslı solüsyonlar kullanıldı. İn vivo ve in vitro olarak elde edilen embriyolar, pH-sensitif florofor 2,7 bis karboksi etil 5-6 karboksi florosin (BCECF) ile yüklendi ve mikrospektrofluorometrik yöntem ile ratiometrik olarak pHi kayıtları alındı. Cl- uzaklaştırma metodu ile AE aktivitesi fonksiyonel olarak saptandı. Embriyoların amonyum puls tekniği ile indüklenen alkalozdan iyileşmeleri ve bu iyileşmelerin AE inhibitörü DIDS ile etkilenmesi incelendi. 
Hücreleri alkali şoklardan koruyan AE aktivitesi, in vivo koşullarda gelişen ve in vitro kültüre edilerek elde edilen 2-h embriyonik aşamalarda yüksek iken (0,052±0,01 vs 0,060±0,01 pHU/dk) 4-h, 8-h, morula ve blastokist aşamalarına kadar olan gelişimsel süreçte her iki koşulda da giderek azaldı (pHU/dk olarak sırasıyla; 0,040±0,00 vs 0,047±0,00; 0,031±0,00 vs 0,039±0,01; 0,024±0,01 vs 0,021±0,00; 0,017±0,01 vs 0,019±0,00). İki hücreli embriyonun AE aktivitesine göre 8-h, morula ve blastokist aşamalarındaki azalış her iki koşulda da istatistiksel olarak anlamlı idi (p<0,05). Ancak in vivo ve in vitro olarak gelişen aynı aşama embriyoların AE aktiviteleri karşılaştırıldığında anlamlı farklılık saptanmadı. İn vivo ve in vitro koşullarda elde edilen tüm embriyonik aşamalarda indüklenmiş alkalozdan iyileşme gerçekleşmiş olup dinlenim değerlerine dönmüştür. İndüklenmiş alkalozdan iyileşmeye, erken embriyonik aşamalarda ortama eklenen DIDS, in vivo ve  in vitro  embriyolarda anlamlı olarak etki gösterdi. Ancak DIDS, her iki koşulda da gelişen geç embriyonik aşamalarda etkisizdi.  İndüklenmiş alkaloza in vivo ve in vitro gelişen embriyoların verdikleri yanıtlar arasında anlamlı fark saptanmadı. 
Embriyonik gelişim sürecinde AE aktivitesindeki azalma ve indüklenmiş alkalozdan iyileşme in vivo ve in vitro şartlarda benzer şekilde gerçekleşmiştir. Embriyo kültüründe en azından pHi homeostasinde bir farklılık olmaması, daha uzun süreli kültürlerle elde edilen embriyoların transferinin değerlendirilebileceğini işaret etmektedir. Bu bilgi ışığında, ileri aşamalardaki embriyolar daha yüksek oranda implante olabildiğinden, in vitro fertilizasyonda sıklıkla kullanılan 8-h embriyo transferi yerine gelişimin daha ileri aşamalarındaki embriyoların transferi değerlendirilebilir.

Abstract:
The regulation of intracellular pH (pHi) is an important factor in order to maintain life of cell in developing embryos. There are three type of pH regulatory-mechanisms: HCO3-/Cl-, which provides defense of alkalosis, Na+/H+ and Na+,HCO3-/Cl-, which protects embryos from the acidosis. The function of these regulatory-mechanisms is to keep the pH value within a certain range for healthy developing embryos. AE activity of embryos in oviduct (tuba uterina)  is high but this activity gradually decreases during the embryonic development process. In this study, it is aimed to compare AE activity of preimplantation stage embryos, which were develop in "in vivo" condition and were obtained from "in vitro" condition. It is also aimed to investigate whether there is a difference in terms of the effectiveness of alkalosis defense mechanism of preimplantation stage in vivo and in vitro embryos or not.
Superovulation protocol was performed to 5-8 week old mature Balb/c strain mouse. In "in vivo" conditions, two-cell (2-c), four-cell (4-c) and eight-cell (8-c) embryos were obtained as well as morula and blastocyst stage embryos certain time after copulation. On the other hand, PN zygotes were cultured to obtain preimplantation stage embryos in "in vitro" conditions. . KSOM based media were used as culture and recording solutions. pH-sensitive fluorophore 2,7 bis carboxyethyl 5-6 carboxyfluorescein (BCECF) was used to record pHi values by using microspectrofluorometric method. AE activity was determined with Cl- removal method. Recovery of embryos from ammonium induced- alkalosis and effect of DIDS on this recovery has been evaluated to confirm AE function.
While AE activity  was high at in vivo and in vitro 2-c embryos (0,052±0,01 vs 0,060±0,01 pHU/min), it was gradually decrease as embryos developing 4-c, 8-c, morula and blastocyst stages in both conditions (in pHU/min; 0,040±0,00 vs 0,047±0,00; 0,031±0,00 vs 0,039±0,01; 0,024±0,01 vs 0,021±0,00; 0,017±0,01 vs 0,019±0,00, respectively). The decrease in AE activity was statistically significant at 8-c, morula and blastocyst stages (p<0,05). However, significant difference was not determined between the values of the same stage "in vivo" and "in vitro" embryos. The recovery from induced-alkalosis occurred in all embryonic stages and pHi returned to their initial values. Recovery were suppressed by adding DIDS at early preimplantation stages developed in both conditions . Whereas DIDS did not effect to recovery of embryos at the stages of morula and blastocyst. There was no significantly difference between the responses of in vivo and in vitro developing embryos.
AE activity changes and recovery from induced-alkalosis were similar in "in vivo" and "in vitro" developing embryos. Because of there is no difference at embryonic pHi regulation between in vivo and in vitro conditions, long-continued  embryo culture seems like no effect on culture success. In the light of this findings, since implantation success is high at proceed stage embryos such as morula or blastocyst, it has been considered that these proceed stage embryos can be used as uterine transfer stage embryos rather than commonly used 8-c stage in "in vitro" fertilization process.