Mi-1.2 geninin sağladığı dayanıklılıkta rol alan genlerin Meloidogyne incognita'ya karşı transkripsiyon seviyelerinin qRT-PCR ile araştırılması
qRT-PCR investigation of transcription levels of genes involved in the resistance provided by Mi-1.2 gene against Meloidogyne incognita
Yazar: TEVFİK ÖZALP
Danışman: PROF. DR. ZÜBEYİR DEVRAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Kök-ur nematodları, domateste verim ve kalite kaybına neden olan zararlılardan biridir. Domateste Mi-1.2 geni, en yaygın kök-ur nematodu türleri olan Meloidogyne incognita, M. javanica ve M. arenaria'ya karşı dayanıklılık sağlamaktadır. Ancak, Mi-1.2 virülent popülasyonların giderek yaygınlaşması bu genin etkinliğini ciddi ölçüde sınırlandırmaktadır.
Nematodun beslenmeye başladığı bölgede nematod ve bitki arasında uyumlu ve uyumsuz ilişkisinde birçok genin ifadesinde değişimler gözlenmektedir. Mi-1.2 geninin sağladığı dayanıklılıkta birçok gen etkili olmaktadır. Bu genlerin nematod enfeksiyon sürecindeki ifade düzeylerinin bilinmesi mücadele stratejilerinin geliştirilmesinde önemli olabilecektir. Bu tez kapsamında Mi-1.2 geni ile birlikte dayanıklılıkla ilgili olduğu düşünülen PR-1a, PR-2, PR-5, WRKY72a, WRKY72b, WRKY45, WRKY3, glycogenin glucosyltransferase, HsfA1a, Hsp90 ve peroksidaz genleri ile çalışılmıştır. Bu genleri taşıyan dayanıklı ve duyarlı domates bitkilerinin Meloidogyne incognita'nın Mi-1.2-virülent (V30) ve avirülent (S6) izolatlarına tepkisi sonucu gen ifadelerindeki değişim qRT-PCR ile araştırılmıştır. Mi-1.2 geninin ekspresyon miktarını belirlemek için kullanılan FjMi-1.2 primeriyle inokulasyondan sonra 2. günde, ToMi-1.2 primeriyle ise 5. günde kontrol grubu ve inokulasyon yapılmış bitkiler arasında farklılık bulunmuştur. Mi-1.2 virülent ve avirülent izolatlara karşı bitkilerin Mi-1.2 için elde edilen ΔCT değerleri arasında istatistiki önemde farklılık görülmemiştir. Dayanıklı ve hassas domates bitkilerindeki PR-1a geninin ΔCT değerleri M. incognita'nın Mi-1.2 virülent ve avirülent izolatına göre değişim göstermemiştir. PR-2 geninin hassas bitkideki ifadesi nematod inokulasyonundan sonra 3. güne kadar azalmış daha sonra artmaya başlamış buna karşın dayanıklı bitkide ise günlere ve izolata göre değişiklik göstermemiştir. PR-5 geninin ifadesi hassas bitkide nematod inokulasyondan sonra 5. güne kadar artış göstermiş, dayanıklı bitkide ise Mi-1.2 virülent izolatın inokulasyonundan 3 gün sonra artış göstermiştir. SIWRKY72a, SIWRKY72b, SIWRKY45 ve SIWRKY3 genlerinin M. incognita'nın Mi-1.2 virülent ve avirülent izolatları ile inokulasyonu yapılmış dayanıklı bitkileri ve nematod inokulasyonu yapılmamış kontrol grubu bitkilerinden aynı gün içerisinde elde edilen ΔCT değerleri arasında farklılık bulunmamıştır. Hassas domates çeşidinde nematod inokulasyonundan sonra ilk 5 gün içerisinde SIWRKY72a geninin ΔCT değerleri, kontrol bitkisiyle istatistiki önemde farklılık göstermemiştir. M. incognita'nın avirülent ve Mi-1.2 virülent izolatlarla inokulasyonu yapılan hassas bitkilerde SIWRKY72b ve SIWRKY3 genleri için inokulasyondan 2 gün sonra, SIWRKY45 için 4 gün sonra elde edilen ΔCT değerleri arasında önemli farklılık görülmüştür. Glycogenin glucosyltransferase ve HsfA1a genlerinin, hassas ve dayanıklı bitkilerde M. incognita'nın avirülent ve Mi-1.2 virülent izolatları ile inokulasyonundan sonra uyarılmadığı görülmüştür. Hsp90 geninin ifadesi M. incognita'nın Mi-1.2 virülent izolat ile inokulasyon yapılmış dayanıklı bitkide inokulasyondan sonra 4. ve 5. günlerde artış göstermiş ancak hassas bitkilerde bu durum gözlemlenmemiştir. Peroksidaz geninin hassas bitkideki ifadesi, M. incognita'nın avirülent ve Mi-1.2 virülent izolatlarının inokulasyonu yapıldıktan 2 gün sonra en yüksek düzeyde tespit edilmiştir. Dayanıklı bitkide ise avirülent izolat inokulasyonu yapılan bitkilerdeki ifade düzeyi Mi-1.2 virülent izolat inokulasyonu yapılan bitkilerden daha düşük bulunmuştur.
Elde edilen sonuçlar, PR genlerinin hassas domates bitkisindeki nematodlara karşı bazal savunmada rol alabileceğini göstermektedir. Bu tez çalışmasının Mi-1.2 geninin virülent popülasyonlara karşı daha uzun süre başarılı şekilde kullanılması için temel bilimsel bilgilerin oluşturulmasına imkan verebileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Root-knot nematodes are one of the pests that cause yield and quality loss in tomatoes. In tomato, Mi-1.2 gene confers resistance against the most common root-knot nematode species, Meloidogyne incognita, M. javanica and M. arenaria. However, the increasing prevalence of Mi-1.2 virulent populations severely limits the effectiveness of this gene.
In the site where the nematode begins to feed, changes are observed in the expression of many genes in compatible and incompatible relationship between the nematode and the plant. Many genes are effective in the resistance provided by the Mi-1.2 gene. Knowing the expression levels of these genes in the nematode infection process might be important in the development of management strategies. In this thesis, beside Mi-1.2 gene, PR-1a, PR-2, PR-5, WRKY72a, WRKY72b, WRKY45, WRKY3, glycogenin glucosyltransferase, HsfA1a, Hsp90 and peroxidase genes, which are thought to be related to resistance, were studied. Changes in gene expressions as a result of the response of resistant and susceptible tomato plants carrying these genes to Mi-1.2-virulent (V30) and avirulent (S6) isolates of Meloidogyne incognita were investigated with qRT-PCR. A difference was found between the control group and inoculated plants on the 2nd day after inoculation with the FjMi-1.2 primer sets used to determine the expression level of the Mi-1.2 gene, and on the 5th day with the ToMi-1.2 primer sets. There was no statistically significant difference between the ΔCT values obtained for Mi-1.2 of plants versus Mi-1.2 virulent and avirulent isolates. The ΔCT values of the PR-1a gene in resistant and susceptible tomato plants did not change compared to the Mi-1.2 virulent and avirulent isolate of M. incognita. The expression of the PR-2 gene in the susceptible plant decreased until the 3rd day after nematode inoculation and then started to increase, however, in the resistant plant, it did not change according to the days and the isolate. The expression of the PR-5 gene increased up to 5 days after nematode inoculation in susceptible plant, whereas it increased 3 days after inoculation of Mi-1.2 virulent isolate in resistant plant. There was no difference between the ΔCT values of SIWRKY72a, SIWRKY72b, SIWRKY45 and SIWRKY3 genes obtained in the same day from resistant plants inoculated with Mi-1.2-virulent and avirulent isolates of M. incognita and control plants without nematode inoculation. The ΔCT values of the SIWRKY72a gene in the first 5 days after nematode inoculation in susceptible tomato cultivars did not differ statistically from the control plant. In susceptible plants inoculated with avirulent and Mi-1.2 virulent isolates of M. incognita, a significant difference was observed between the ΔCT values obtained 2 days after inoculation for SIWRKY72b and SIWRKY3 genes and 4 days for SIWRKY45. It was observed that glycogenin glucosyltransferase and HsfA1a genes were not stimulated after inoculation with avirulent and Mi-1.2 virulent isolates of M. incognita in susceptible and resistant plants. Expression of the Hsp90 gene increased on days 4 and 5 after inoculation in resistant plant inoculated with Mi-1.2 virulent isolate of M. incognita, but this was not observed in susceptible plants. Expression of peroxidase gene in susceptible plant was determined at the highest level 2 days after inoculation of avirulent and Mi-1.2 virulent isolates of M. incognita. In the resistant plant, the expression level in the plants infected with avirulent isolate was lower than the plants inoculated with Mi-1.2 virulent isolate.
The results show that PR genes may be involved in basal defense against nematodes in susceptible tomato plants. It is thought that this thesis study will enable the establishment of basic scientific information for the successful use of the Mi-1.2 gene against virulent populations for a longer period.