Schmallenberg virüsünün vero hücre hattı üzerine apoptotik etkisinin belirlenmesi
Determination of apoptotic effect of schmallenberg virus on vero cell line
Yazar: EMEL AKSOY
Danışman: PROF. DR. AHMET KÜRŞAT AZKUR
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Anneksin V = Annexin V ; Apoptozis = Apoptosis ; DNA = DNA ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre dizisi = Cell line ; Schmallenberg virüsü = Schmallenberg virus ; Vero hücreleri = Vero cells

Özet:
Schmallenberg virüsü (SBV) 2011 yılında Almanya'da keşfedilen, ruminantlarda ateş, ishal, süt veriminde azalma, abort ve konjenital malformasyonlarla seyreden bir hastalık tablosuna yol açan bir virüstür. Etken Peribunyaviridae ailesinin Orthobunyavirus cinsinde yer alan, negatif polariteli segmentli bir RNA virüsüdür. İlk keşfinden bu yana SBV ile ilgili pek çok çalışma yapılmasına karşın SBV'nin in vitro apoptotik etkisi detaylıca araştırılmamıştır. Bu tez çalışmasında, SBV'nin ile ilgili pek çok çalışmada yaygın olarak kullanılan Vero hücre hattında, SBV'nin apoptozise neden olup olmadığı farklı yöntemler ile araştırıldı. 
Bu tez çalışmasında, SBV Vero hücrelerinde üretildi, plak titrasyon ile viral titre belirlendi ve Vero hücreleri 0,1 ve 0,01 MOI SBV ile enfekte edildi. SBV enfeksiyonlarından 0, 2, 6, 12, 18, 24, 36, 48 ve 72 saat sonra hücreler toplandı. Toplanan hücrelerde apoptozisin belirlenmesi için DNA fragmentasyon deneyi, akan hücre ölçerde (flow sitometri) Annexin V/PI boyama, kaspaz-3, kaspaz-8, kaspaz-9 aktivasyonları ve real-time RT-PZR ile bazı pro-apoptotik (Bak, Bax, Puma) ve anti-apoptotik (Bcl-2, Bcl-xl) genlerin ekspresyonunda meydana gelen değişimler incelendi. Tez çalışması ile ilk defa, SBV'nin Vero hücre hattında apoptozisi hem iç yolak hem de dış yolak aracılığıyla indüklediği, apoptozis indüklenmesinde zamanın ve virüs titresinin etkili olduğu belirlendi. Gen ekspresyon analizlerine göre SBV, Puma geni aracılığıyla hücrelerde apoptozisi indükleyebileceği belirlenmiştir.
Sonuç olarak, bu tez çalışması ile Vero hücrelerinde SBV enfeksiyonunun apoptozise neden olduğu, bu apoptozisin hem iç yolak hem de dış yolak aracılığıyla gerçekleştiği ve SBV kaynaklı apoptozisin moleküler patogenezinde Puma geninin etkili olduğu belirlenmiştir. Daha ayrıntılı moleküler çalışmalar ile SBV'nin neden olduğu apoptozisin moleküler patogenezi aydınlatılmaya ihtiyaç duymaktadır.

Abstract:
Schmallenberg virus (SBV), discovered in 2011 in Germany, is associated with clinical manifastations as fever, diarrhea, reduced milk yield, abortions and congenital malformations in ruminants. The agent is classified in Orthobunyavirus genus of Peribunyaviridae family and has negative-sense three-segmented RNA. Unless many studies performed with SBV to date, there is no detailed research about in vitro apoptotic effect of SBV. In this PhD dissertation, whether SBV induces apoptosis in Vero cell line, widely used in SBV studies, with using different methods. 
SBV was propagated in Vero cells, viral titer was determined by plaque titration assay, and Vero cells were infected with 0.1 and 0.01 MOI of SBV. Cells infected with SBV were collected in 0, 2, 6, 12, 18, 24, 36, 48 and 72 hours. For investigation of apoptosis, DNA fragmentation assay, flow cytometry analysis with Annexin V/PI staining, caspase-3, caspase-8, caspase-9 activation, and expression analysis of pro-apoptotic (Bak, Bax, Puma) and anti-apoptotic (Bcl-2, Bcl-xl) genes with real-time RT-PCR were performed. According to results of the thesis, SBV induces apoptosis in Vero cells via both intrinsic and extrinsic pathways and this induction is depending to infection time and viral dose. Gene expression analyses reveal that SBV induce apoptosis mainly by Puma gene.
In conclusion, for the first time with this thesis, SBV infection leads to apoptosis in Vero cells, this apoptosis induction is maintained by intrinsic and extrinsic pathways, and Puma gene is effective in molecular pathogenesis of SBV-induced apoptosis. The molecular pathogenesis of apoptosis induced by SBV is needed to be clarified with more detailed molecular studies.