Şap aşısı üretiminde kullanılan 146 S testine alternatif kromatografik yöntem geliştirilmesi
Development of a chromatographic method as an alternative to the 146 S test used in fmd vaccine production
Yazar: ALİ DEMİRTAŞ
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Şap hastalığı, çift tırnaklı hayvanlarda görülen, ekonomik açıdan büyük bir öneme sahip olan viral ve çok bulaşıcı bir hastalıktır. Hastalığın Türkiye gibi endemik olarak seyrettiği ülkelerde, coğrafi ve ekonomik koşullardan dolayı hastalıkla mücadelede koruyucu aşı uygulamalarının büyük önemi bulunmaktadır. Kullanılan aşılar 146 S partikülü olarak adlandırılan tam virüs partikülü konsantrasyonuna göre formüle edilmektedir. Etkin koruma sağlayan ve kazançlı bir aşı üretimi için uygun dozda formülasyon çok önemlidir. Yeterli miktarda antijen içermeyen aşılar hayvanlarda istenilen düzeyde koruma oluşturamamakta; ya da aşı içerisine daha fazla antijen konularak aşı maliyeti gereksiz yere artırılmaktadır. Standart sapması ve hata olasılığı düşük, güvenilirliği yüksek bir test yöntemi ile en uygun aşı formülasyonu gerçekleştirilebilir. 
Bu çalışma ile Şap Enstitüsünde viral antijen miktarının tespiti amacıyla rutin olarak kullanılmakta olan 146 S testine alternatif olarak veya onunla birlikte kullanılabilecek kromatografik bir yöntem geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu amaçla yapılan çalışmada iyon değişim kromatografisinin kullanımına yer verilmiş ve şap virüsünün  izoelektrik pH değerine uygun olan ticari kolonlar kullanılmıştır. Kolon matriksi güçlü katyonik yapıya sahip, anyon değiştirici Q Sepharose XL  matriksidir. Aynı matrikse sahip HiPrep Q XL 16/10 ve HiTrap Q XL 5 mL kolonları ile FPLC (Fast protein liquid chromatography) cihazında metot belirleme çalışmaları yapılmış olup, sonraki deneylerde daha hızlı ve uygun sonuç veren HiTrap Q XL 5 mL kolonu kullanılmıştır. Elüent olarak 20 mM Tris-HCL + 1 M NaCl (pH 7,5) tamponu kullanılmıştır. UV dedektör dalga boyu  254 nm değerinde daha düzgün kromatogramlar elde edilmiştir. Deneylerde akış hızı 5 mL/dk seviyelerine kadar çıkartılmıştır. Başarılı bir şekilde ayrımı yapılan piklerden fraksiyonlar toplanmış ve RT-PCR, ELISA, CFT testleri yardımı ile kromatogramdaki 146 S antijenini içeren pik belirlenmiştir. Devam eden çalışmalarda nükleaz enzimi ile muamele edilmiş numuneler ile de çalışılmış olup konakçı hücre DNA'sının 146 S pikine bir etkisi olmadığı görülmüştür. Kromatogramdaki pikler Unicorn Manager 5.11 programı ile analiz edilmiş ve pik alanları hesaplanmıştır. Daha sonra hesaplanan 146 S piki alan değeri ile numunelerin 146 S değerleri grafiğe geçirilmiş ve regresyon analizi Microsoft Excel yardımı ile yapılmış olup, yüksek R2 değerleri (0,97- 0,98) elde edilmiştir. Farklı derişimlerde numuneler ile deneyler yapılarak test yönteminin doğrusallığı değerlendirilmiş ve yapılan regresyon analizi sonucuna göre 0,97-0,99 R2 değerleri elde edilmiştir.
Gerçekleştirilen çalışmanın neticesinde; iyon değişim kromatografisi yöntemi kullanılarak, FPLC cihazında, Q Sepharose XL kolonları ile şap virüsünün başarılı bir şekilde ayırımı yapılmıştır. Bu kapsamda geliştirilen test yönteminin Şap Enstitüsü'nde kullanılan 146 S testine alternatif olabilecek, tekrarlanabilir analiz sonuçlarının elde edilebileceği,  kolay ve kısa sürede uygulanabilen geçerli bir test yöntemi olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

Anahtar kelimeler: Şap Hastalığı, 146 S testi, İyon değişim kromatografisi, FPLC,  Şap virüsü.

Abstract:
Foot and mouth disease (FMD), which is common among double-hoofed animals, is a viral and very contagious disease having a major importance in economic terms. Seen in countries as Turkey, where the disease is endemic, preventive vaccination is of great importance in the fight against the disease due to the geographical and economic conditions. Vaccinations used are formulated according to the whole virus particle concentration called 146 S. The formulation of vaccine production in proper dosage providing effective protection is very important as well as being lucrative. Vaccines which do not contain enough antigens are either unable to generate a sufficient amount of the desired level of protection on animals; or increase the cost unnecessarily by enabling the producer to put more antigen into vaccine. The optimal vaccine formulation whose standard deviation and the error probability is low, can be performed via high reliability testing method.
With the help of this study, it is tried to develop a chromatographic method for the purpose of being used as an alternative to or together with the 146 S test, which is used to determine the amount of viral antigen in the Foot and Mouth Disease Institute as a routine. For this purpose, the uses of ion exchange chromatography studies were included. Commercial columns which are suitable for isoelectric pH of Foot and Mouth virus were used. A strong cationic matrix structure of the anion exchanger Q Sepharose XL was selected as column matrix. The same matrix with HiPrep Q XL 16/10 and HiTrap Q XL 5 mL column in FPLC (fast protein liquid chromatography) was used to determine the method which will be followed. By taking into account the results, the subsequent experiments were done with HiTrap Q XL 5 mL column which gives more fast and relevant results 20 mM Tris-HCl + 1 M NaCl (pH 7.5) buffer was selected as the eluent. More smooth chromatograms were obtained in the case of 254 nm UV detector wavelength. In the experiments, a flow rate was increased until the level 5 mL/min. Successfully-separated fractions of the peak were pooled and by means of RT-PCR, ELISA, and CFT tests the peak containing 146 S antigen was determined. Following studies  were carried out in samples treated with nuclease enzyme with host cell DNA and it was shown to have no effect on the 146 S peak. Unicorn peaks in the chromatogram were analyzed by Manager 5.11 software, the areas of 146 S peaks were calculated. Then, the calculated peak areas was plotted versus 146 S values obtained from 146 S test and regression analysis was performed by using Microsoft Excel, subsequently high R2 values (0,97-0,98) were obtained. Verification of the testing method was evaluated via the experiments with different concentrations of the samples and 0.97 to 0.99 R2 values were obtained by regression analysis.
As a result of study performed; the successful separation of Foot and Mouth virus was realized in the FPLC device with Q Sepharose XL column by using ion exchange chromatography. In this context, it was concluded that the developed test method may be considered as an alternative to the 146 S test used at FMD Institute. It can be used as a valid test method which can be applied easily and quickly by giving reproducible results.
Keywords: Foot and mouth disease (FMD), 146 S test, Ion exchange chromatography, FPLC,  Foot and Mouth virus (FMDV).