Mikroalbumin tayini için SPR temelli nanosensörlerin hazırlanması
Preparation of SPR based nanosensors for microalbumin assays
Yazar: MELTEM KOCA ESENTÜRK
Danışman: PROF. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
İnsan Serum albümini (HSA) kanda en çok bulunan proteindir. Böbreklerde oluşan hasarlar, glomerüllerdeki gözeneklerin genişlemesine ve fazla miktarda plazma proteinin idrara sızmasına neden olmaktadır. İdrara sızan HSA'nın belli bir miktarı (spot idrarda 0-20 mg/L) mikroalbümin olarak tanımlanmaktadır. Mikroalbümin miktarının artması önemli bazı hastalıkların habercisi olduğundan erken tayini oldukça önemlidir. 
Biyolojik cevabı elektriksel sinyallere dönüştüren cihazlara "Biyosensör" denir. Biyosensörler bünyesinde biyolojik tanıma elemanı bulunduran ve fizikokimyasal dönüştürücü içeren analitik cihazlardır. Biyosensör alanındaki büyük gelişmelerle birlikte moleküler baskılanmış polimerler (MIP) dönüştürücülerle birleştirilmiş ve tayin edilecek analitle MIP arasındaki etkileşim işlenilebilir bir sinyale dönüştürülmüştür. Bu anlamda yüzey plazmon rezonans (SPR) temelli optik cihazlar büyük bir potansiyele sahiptirler. 
Bu çalışmada, idrarda mikroalbümin tayinine yönelik moleküler baskılama tekniği kullanarak, SPR temelli nanosensör hazırlanması amaçlanmıştır. İlk aşamada HSA ile etkileşerek boşluklar oluşturabilecek fonksiyonel N-Metakriloil-(L)-Lösin Metil Ester (MALM) monomeri, L-Lösin metil esterin metakroil klorür ile reaksiyonu sonucu elde edilmiştir. Optimum kalıp molekül HSA ve MALM monomeri oranı, HSA'nin farklı oranlarda MALM monomeri ile etkileştirilmesiyle UV-görünür bölge spektrofotometre cihazıyla tespit edildi ve optimize edilen bu orana göre nanosensör hazırlama çalışmaları gerçekleştirildi. Nanosensör hazırlama çalışmaları sırasıyla Mikro-temas yöntemi ile HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanosensörlerin hazırlanması ve HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin sentezlenmesiyle iki farklı şeklinde gerçekleştirildi.
Belirlenen amaç doğrultusunda mikro-temas yöntemiyle alil merkaptan ile modifiye edilmiş SPR sensör yüzeyinde, HSA baskılanmış poli(N-Metakriloil-(L)-Lösin Metil Ester-insan serum albümin) [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm sentezlenmiştir. Belirli oranlarda hazırlanan MALM monomeri, çapraz bağlayıcı etilen dimetakrilat (EDMA) ve başlatıcı 2,2'-azobis(izobütironitril) (AIBN)'den oluşan karışımından 20 µl alınarak damlatılan SPR sensör çip yüzeyine, lam üzerinde hazırlanan kalıp protein HSA baskılanmıştır. Bu preparatın UV ışık altında 4 saat bekletilmesiyle hedef protein HSA'ya ait özel boşluklar oluşturulmuştur. Kontrol deneyleri için hedef protein HSA eklemeden aynı koşullarda baskılanmamış nanofilm hazırlanmıştır.
HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilmler ile hazırlanan SPR nanosensörlerin karakterizasyon çalışmaları FTIR-ATR, Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), Temas açısı (CA) ve Elipsometre ölçümleri ile gerçekleştirilmiştir. AFM ölçümlerinden elde edilen pürüzlülük değerleri HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanoflimler için sırasıyla 3,64 ve 2,47 nm olarak bulunmuştur. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilmlerin pürüzlülük değerleri arasındaki farklılık HSA moleküllerinin başarılı bir şekilde baskılandığını göstermektedir.  HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilmlerin film kalınlığı elipsometri ile ölçülmüş ve sırasıyla 89,9±6,3 ve 95,0±4,9 olarak bulunmuştur. Islanabilirlik çalışmaları temas açısı ölçümü ile gerçekleştirilmiştir. Modifiye edilmemiş altın yüzey için (80°±0,73), HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm yüzey için (55,2°±2,24) ve HSA baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilm yüzey için (61,5°±4,63) elde edilen artan temas açısı değerleri baskılama işleminin hidrofilikliği arttırdığını göstermektedir. 
Hedeflenen derişim aralığına inmek amacıyla çalışmanın ikinci kısmında HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanopartiküller iki fazlı miniemülsiyon polimerizasyon yöntemiyle sentezlenmiştir. Faz I; PVA (95 mg), SDS (15 mg) ve NaHCO3'ın (12 mg) 5,0 mL deiyonize su içinde çözülmesiyle hazırlanmıştır. Faz II; PVA (50 mg) ve SDS'in (50 mg) 100 mL deiyonize suda çözülmesiyle hazırlanmıştır. Hazırlanan MALM:HSA ön-kompleksi (0.15:0,015 mmol), çapraz bağlayıcı monomer EDMA ile (4,8 mmol) karıştırılarak yağ fazı elde edilmiştir. Yağ fazı faz I'e yavaşça eklenmiştir. Karışım, 25.000 rpm de homojenizatörde homojenize edildikten sonra Faz II ile karıştırılmıştır. Sodyum bisülfit (50 mg) ve amonyum persülfat (100 mg) başlatıcısının eklenmesinden sonra polimerizasyon işlemi 40°C de 24 saat süreyle gerçekleştirilmiştir. Kontrol deneyleri için HSA baskılanmadan hazırlanan nanopartiküller aynı koşullarda sentezlenmiştir. 
Sentezlenen nanopartiküller, zeta boyut analizi ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterize edilmiştir. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin ortalama boyut dağılımı zeta boyut analizörü ile ölçülerek sırasıyla 63 ve 55 nm şeklinde bulunmuştur. Baskılanmış ve baskılanmamış nanopartiküller için düşük polidispersite indeks değerleri (PDI:0,138; PDI:0,113) nanopartiküllerin ortalama boyut dağılımının homojen olduğunu göstermektedir. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanopartiküllerin büyüklüğü ise taramalı elektron mikroskobu ile ölçülmüş ve ortalama boyutları 60-65 nm aralığında bulunmuştur. 
Etil alkol ile temizlenerek vakumlu etüvde kurutulan altın çip yüzeyine sentezlenen HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin 100 kat seyreltilmiş çözeltisinden 5 µl damlatılarak UV ışık altında 2 saat bekletilmesiyle nanopartiküllerin çip yüzeyine tutturulması sağlanmıştır.
HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin tutturulmasıyla hazırlanan SPR nanosensörler FTIR-ATR, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), temas açısı (CA) elipsometre ölçümleri ile karakterize edilmiştir. AFM ölçümlerinden elde edilen pürüzlülük değerleri HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküller için sırasıyla 1,61 ve 1,28 nm olarak bulunmuştur. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin pürüzlülük değerleri arasındaki farklılık HSA moleküllerinin başarılı bir şekilde baskılandığını göstermektedir. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin film kalınlığı elipsometri ile ölçülmüş ve sırasıyla 118,4±0,3 ve 116,7±0,3 nm olarak bulunmuştur. Islanabilirlik çalışmaları temas açısı ölçümü ile gerçekleştirilmiştir. Modifiye edilmemiş altın yüzey için (80°±0,73), HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm yüzey için (67,3°±2,24) ve HSA baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilm yüzey için (84,5°±4,63) elde edilen artan temas açısı değerleri baskılama işleminin hidrofilikliği arttırdığını göstermektedir.
HSA tayini için mikro-temas yönteminde 1,5-300 nM derişim aralığında çalışılırken, nanopartiküller ile HSA tayininde 0,15-500 nM gibi daha geniş derişim aralığında 50 mM pH 7,4 fosfat tamponunda hazırlanan HSA çözeltileri ile çalışılmıştır. Desorpsiyon ajanı olarak 0,05 M NaCl çözeltisi kullanılmıştır. Farklı derişimlerde yapay plazma ve yapay idrar örneklerin de HSA analizleri fosfat tamponu ortamında (pH 7,4) gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) sensörlerin seçiciliğini göstermek için yarışmacı ajan olarak seçilen farklı proteinler ile (hemoglobin-transferrin) çalışmalar yapılmıştır. Mikro-temas yöntemiyle hazırlanan HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensörün tespit edilen seçicilik faktörünün, nanopartikül tutturularak hazırlanan [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensörün seçicilik faktöründen büyük olduğu tespit edilmiş ve Hb ve HTR için değerleri sırasıyla k'= 5,02, k'= 4,25 olarak hesaplanmıştır. Mikro-temas ve nanopartiküllerle hazırlanan nanosensörlerin tayin limitleri (LOD) sırasıyla 8,8 ve 0,7 pM olarak hesaplanmıştır. Mikro-temas ve nanopartiküllerle hazırlanan nanosensörlerin tekrar kullanılabilirlik çalışmaları sırasıyla 300 ve 500 nM çözeltiler için arka arkaya 5 kez yapılarak reflektans değerleri ölçülmüştür. Kararlılık çalışması için aynı nanosensör çip 3 aylık periyotlarla 3 kez 4 tekrarlı HSA analizi için kullanılmış ve SPR nanosensörlerin kararlılığı gösterilmiştir. 
HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm tutturulmuş SPR nanosensör ile HSA arasındaki etkileşimlerin kinetik ve adsorpsiyon modelini belirlemek amacıyla dört farklı izoterm modeli uygulanmıştır: Scatchard Langmuir; Freundlich ve Langmuir-Freundlich (LF) modelleri. Langmuir adsorpsiyon izoterm modelinin bu afinite sistemine en uygun model olduğu görülmüş ve sonuçlar HSA baskılanmış  [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensördeki HSA'e afinite gösteren bağlanma bölgelerinin homojen olarak dağıldığını ve tek tabakalı yapı oluşturduğunu göstermektedir.
HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP)  nanopartikül tutturulmuş SPR nanosensör ile HSA arasındaki etkileşimlerin kinetik ve adsorpsiyon modelini belirlemek amacıyla dört farklı izoterm modeli uygulanmıştır: Scatchard,  Langmuir; Freundlich ve Langmuir-Freundlich (LF) modelleri. SPR sensörün düşük derişimlerde Langmuir adsorpsiyon izoterm modeline, yüksek derişimler de ise Freundlich adsorpsiyon izoterm modeline uygun olduğu görülmüştür. Sonuçlar HSA baskılanmış  [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensördeki HSA'e afinite gösteren bağlanma bölgelerinin homojen olarak dağıldığını ve düşük derişimler için tek tabakalı yapı oluşturduğunu göstermektedir.
Sonuç olarak 0-20 mg/L (0-303 nM) aralığındaki HSA derişimi mikroalbümin işaretçisi olarak kabul edilmektedir. Mikro-temas yöntemiyle hazırlanan nanosensörün HSA tayininde nanopartiküllerle hazırlanan nanosensöre göre daha seçici olduğu tespit edildi. Mikro-temas yöntemiyle hazırlanan nanosensör 1,5-300 nM konsantrasyon aralığındaki HSA tayininde başarılı bir şekilde kullanılabilmesine rağmen 0-300 nM konsantrasyon aralığındaki HSA yı tam olarak tayin edemediği için daha düşük tayin limitlerine inilmesine gerek duyulmuştur. Böylece nanopartiküler kullanılarak hazırlanan nanosensör ile daha düşük tayin limitine inilmiştir. Mikro-temas yöntemiyle hazırlanan nanosensör HSA tayinini, seçici, duyarlı, herhangi bir işaretlemeye ihtiyaç duymadan, diğer yöntemlere göre, düşük maliyet, hızlı ve gerçek zamanlı yapabilmektedir ve nanopartiküllerde düşük HSA derişimlerinin tayininde kullanılabilmektedir. Bu çalışmanın HSA tayinine yönelik, mikro-temas yöntemiyle nanofilm tututurularak hazırlanan nanosensörün ve nanopartikül tutturularak hazırlanan nanosensörün avantajlarının karşılaştırılması bakımından, literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Human serum albumin (HSA) is the most abundant protein in the blood. Enlargement of the pores in the glomeruli and remarkable amount of plasma proteins' leakage into urine is caused by the kidney damages. A certain amount of leaked HSA (in spot urine 0-20 mg/L) is defined as microalbumin. Since the increase in the amount of microalbumin is a sign of some important diseases, early identification is very important for the diagnosis.
Devices which convert biological response to electrical signals are defined as ''Biosensors''. Biosensors are analytical devices that contain biological recognition elements and physicochemical transducers in their bodies. Molecular imprinted polymers was unified with the transducers through major developments in the field of biosensors and interactions between analyte and MIP can be converted into a processable signals. In this sense, surface plasmon resonance (SPR) based optical devices have a great potential.
In this study, it was aimed to prepare SPR based nanosensor using molecular imprinting technique for microalbumin detection in urine. In the first step, N-Methacryloyl-(L)-Leucine Methyl Ester (MALM) monomer having capability of interaction with HSA to create cavities was synthesized by reacting of L-Leucine methyl ester with methacrloyl Chloride. To define optimum ratio between template HSA molecule and MALM monomer, HSA was mixed with different ratios of MALM monomer and optimum ratio was determined by using UV-visible spectrophotometer instrument.
Nanosensor preparation studies were realized according to the optimized ratio conditions. Nanosensors are prepared in two ways by micro-contact method with HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM] (NIP) nanosensor preparation and by attaching HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM] (NIP) nanoparticles to the chip gold surface respectively. 
For this specified purpose, HSA imprinted poly(N-Methacryloyl-(L)-Leucine Methyl Ester-Human Serum Albumin) [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm was synthesized onto the allyl mercaptan modified gold chip surface by micro-contact method. Mixture prepared from specific proportions of MALM monomer, crosslinker ethylene dimethacrylate (EDMA) and initiator 2,2'-azobis (isobutyronitrile) (AIBN) was poured (20 μL) onto the SPR gold sensor surface and after then HSA immobilized glass slides was inserted onto the poured mixture by pressing to form stamped structure. Special cavities for the target HSA protein was formed when the mixture put under the UV light for 4 hours. For control experiments non-imprinted nanofilm preparation was performed in the same conditions without adding target HSA protein.
SPR biosensors prepared by HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM-HSA] (NIP) nanofilms were characterized by FTIR-ATR, Atomic force microscope (AFM), Contact angle (CA), Ellipsometer measurements. Surface rougness measurements were obtained by Atomic force microscopy  (AFM) method and images showed that roughness of HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM] (NIP) nanofilms was estimated as 3.64  and 2.47 nm respectively. Rougness difference between HSA imprinted [PEDMALM-HSA] and non imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilms show that imprinting process of HSA molecules was performed successfully. Film thickness of HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM] (NIP) nanofilms was estimated by ellipsometry measurements and recorded as 95±4.9 and 89.9±4.9 nm for imprinted and non imprinted nanofilms respectively. Wettability studies was performed by contact angle measurements. Increasing contact angle values for unmodified gold chip surface (80°±0.73), HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) (55.2°±2.24) and HSA non imprinted [PEDMALM] (NIP) (61.5±4.63°) nanofilms show that imprinting process enabled hydrophilicity increment.
In the second part of the study to work in a a targeted concentration range [PEDMALM-HSA] (MIP) nanoparticles were synthesized by a two-phase mini-emulsion polymerization method. The first aqueous phase PHASE I was prepared by dissolving of PVA (95 mg), SDS (15 mg) and NaHCO3 (12 mg) in 5.0 mL deionized water. The second phase PHASE II was prepared by dissolving of PVA (50 mg) and SDS (50 mg) in 100 mL of deionized water. Prepared  MALM:HSA pre-complex (0.15; 0.015 mmol) was dissolved in a crosslinker, ethylene glycol dimethacrylate (EDMA; 4.8 mmol) to form oil phase. The oil phase was slowly added to the first aqueous phase. In order to obtain mini-emulsion, the mixture was homogenized at 25 000 rpm by a homogenizer. After homogenization, mixture was added to the PHASE II. Then, initiators, sodium bisulfite (125 mg) and ammonium persulfate (125 mg), were added into the solution. Polymerization was continued for 24 h at 40°C. Besides this, for control experiment, the non-imprinted [PEDMALM] (NIP) nanoparticles were synthesized by applying same procedure with imprinted nanoparticles except addition of template HSA molecules.
Size distrubution of the prepared nanoparticles was characterized by zeta size and scanning electron microscopy measurements. Averaged size distrubution value of the HSA imprinted  [PEDMALM-HSA] (MIP) and nonimprinted [PEDMALM] (NIP) nanoparticles was estimated as 63 and 55 nm respectively. Because of low polydispersity index values for imprinted and nonimprinted nanoparticles (PDI:0.138; PDI:0.113) homogeneous average nanoparticle size distrubition was attained. Average size of HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) nanoparticles was determined as 60-65 nm by Scanning electron microscopy measurements.
Target protein HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM] (NIP) nanoparticles were attached to the chip surface by dropping 5 µl of the prepared particles diluted 100 times with distilled water onto the chip surface which was already cleaned with ethyl alcohol and dried in a vacuum oven and put under the UV light for 2 hours.
Prepared HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM] (NIP) nanoparticles attached SPR nanosensors were characterized by FTIR-ATR, atomic force microscope (AFM) method, contact angle (CA), ellipsometer measurements. Surface rougness measurements were obtained by Atomic force microscopy (AFM) and images showed that roughness values of HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM] (NIP) nanoparticles were estimated as 1.61 and 1.28 nm respectively. Rougness difference between HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM] (NIP) nanoparticles attached nanoparticles show that imprinting process of HSA molecules was performed successfully. Thickness of HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) and non imprinted [PEDMALM] (NIP) nanoparticles attached biosensor chips was estimated by ellipsometry measurements and recorded as 118.4 ±0.3  and 116 ± 0.3 nm for imprinted and non imprinted nanofilms respectively. Wettability studies was performed by contact angle measurements. Increasing contact angle values for unmodified gold chip surface (80°±0,73), HSA imprinted [PEDMALM-HSA] (MIP) (67.3°±2.24) and HSA non imprinted [PEDMALM] (NIP) (84.5°±4.63) biosensors show that imprinting process enabled hydrophilicity increment.
Detection of HSA by micro-contact method was performed in the 1,5-300 nM concentration range and by nanoparticles in the 0,15-500 nM concentration range for HSA solutions prepared with 50 mM pH= 7.4 phosphate buffer solution. Desorption studies were carried out by using 0.05 M NaCI solution. Adsorption analyses for the HSA spiked artificial urine and plasma samples which was prepared in pH=7.4 phosphate buffer were examined. Selectivity studies of [PEDMALM-HSA] (MIP)  and [PEDMALM] (NIP) SPR biosensors for HSA determination were investigated by using different protein samples such as hemoglobine and transferrine. Higher selectivity factor was estimated for the [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensor which was prepared by micro-contact method than nanoparticles attached [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensor as k'=5.02, k'=4.25 for Hb and HTR respectively. Limit of detection value for the nanoparticles was estimated lower (LOD: 0.7 pM) than the nanofilms prepared by micro-contact method (LOD: 8.8 pM). As a result nanoparticles attached biosensors more sensitive than the nanofilm attached ones. Repeatability experiments of [PEDMALM-HSA] nanosensor prepared by microcontact method and nanoparticles attached nanosensor was performed five times (5 times) by using HSA solutions (300 nM and 500 nM respectively) and reflectance values were measured. Stability studies were performed for the 3 times in the three months periods with four repeatibity.
To determine the kinetic and adsorption models of interactions between [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm attached SPR nanosensor and HSA solution, four different adsorption models named Scatchard, Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich (LF) were employed. Langmuir adsorption model was found most applicable model for this affinity system and results showed that affinity regions on the surface of [PEDMALM-HSA] (MIP) SPR nanosensor for the HSA template were homogeneously distributed and have monolayer structure.
To determine the kinetic and adsorption models of interactions between [PEDMALM-HSA] (MIP) nanoparticles attached SPR nanosensor and HSA solution, four different adsorption models named Scatchard, Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich (LF) were employed. Langmuir adsorption model was found most applicable model for the low concentratins of HSA while Freundlich adsorption model fits for the high HSA concentrations in this affinity system and results showed that affinity regions on the surface of [PEDMALM-HSA] (MIP) SPR nanoensor for the HSA template were homogeneously distributed and have monolayer structure for the low concentrations.
As a result, albumin level are used as a Biomarker for the 0-20 mg/L (0-300 nM) concentration range. Nanosensor prepared by the micro-contact method was estimated more selective for the HSA determination than the nanosensor prepared by the  nanoparticle attached method. Although the nanosensor prepared by the micro-contact method can be used successfully for the estimation of HSA in the 1.5-300 nM concentration level, it can not detect precisely 0-300 nM HSA concentration level. So it has been required to use nanoparticles to detect HSA with lower concentration limits.  
Selective and sensitive nanosensor prepared by micro-contact method can be used for HSA detection by real time measurement, no need labeling, low cost and ease of miniaturization when compared with the other methods and nanoparticles can be used for the detection of lower HSA concentrations. This study will contribute to the literatüre by comparing the advantages of the nanofilm attached nanosensor prepared by micro-contact method and nanoparticles attached nanosensor.