Crispr/Cas9 sistemi kullanılarak tütün (Nicotiana tabacum) bitkisinde DEK1 geninin susturulması
Silencing the DEK1 gene ın tobacco (Nicotiana tabacum) plant using the Crispr/Cas9 system
Yazar: AYŞEGÜL ŞENYER
Danışman: DOÇ. DR. MUSA KAVAS
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Hücre içerisine yabancı DNA girişi olmaksızın bitki genom düzenlenmesi, genetiği değiştirilmiş bitkiler ile düzenlemenin oluşturduğu endişeleri en aza indirebilir. Genom düzenleme teknolojileri ile oluşturulan mutasyonların doğal olarak oluşan genetik mutasyon ve varyasyonlardan ayırt edilemediğinden dolayı bu teknolojinin kullanımı farklı alanlarda giderek artmaktadır. Bölgeye ya da bir gene özgü mutasyon ile tarım ürünlerinin hastalık ve zararlılara karşı direncinin geliştirilmesinde bu teknolojilerden yararlanılmaktadır. Ayrıca genlerin fonksiyonlarının tespit edilmesinde kullanılabilmektedir. Bu nedenlerle günümüzde yeni nesil genom düzenleme teknolojilerinden olan ZFN, TALEN ve CRISPR/Cas9 güçlü birer genom düzenleme araçları olarak karşımıza çıkmaktadır. Özellikle CRISPR/Cas9 yeniliği, maliyeti ve uygulanabilirliği nedeniyle son 5 yılda yoğun bir şekilde kullanılan bir genom düzenleme aracı olmuştur. Bitkiler için önemli olan genlerden bir tanesi DEK1 genidir. Uygun hücre adezyonu için gerekli olan DEK1, epidermal farklılaşmanın ve onarımının düzenleyicisidir. Yapılan bu çalışmada CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak DEK1 geninin susturulması amaçlanmıştır. DEK1'in 20. ve 25. ekzonlarına gRNA dizayn edilmiştir. Bu gRNA'lar bitki ifade vektörü olan PKI1.1R vektörüne klonlanmıştır. Elde edilen vektörün Agrobacterium aracılığıyla tütün bitkisine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen genomu düzenlenmiş bitkilerin moleküler ve morfolojik analizleri yapılmıştır. Yapılan çalışmada hedef modifikasyonu gerçekleştirilmiş tütün bitkisinin normal tütün bitkisine göre stoma yapılarında değişiklikler olduğu ve tohum tutumunun olmadığı gözlemlenmiştir. Çalışmalarımız DEK1 aktivitesinin hücre duvarı kalınlığını ve bileşimini ve sonuç olarak epidermisteki hücre şeklini kontrol ettiğini göstermektedir. Böylelikle, bu teknik kullanılarak temel bilimlere yapılacak katkının yanı sıra moleküler ıslah çalışmalarına katkıda bulunacaktır.

Abstract:
Plant genome editing without foreign DNA input into the cell can minimize the concerns posed by editing with genetically modified plants. Because mutations created by genome editing technologies cannot be distinguished from naturally occurring genetic mutations and variations, the use of these technologies is increasing in different areas. These technologies are utilized to improve the resistance of agricultural products against diseases and pests by mutation specific to the region or a gene. In addition, these technologies can be used to determine the function of genes. For these reasons, ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9, a new generation of genome editing technologies, are powerful genome editing tools. Especially CRISPR / Cas9 has been a genome editing tool used extensively over the last 5 years due to its innovation, cost and applicability. One of the genes that are important for plants is the DEK1 gene. Required for proper cell adhesion, DEK1 is the regulator of epidermal differentiation and repair. The aim of this study is to silence the Dek1 gene using the CRISPR/Cas9 system. 20th and 25th exons of DEK1 were gRNA-designed. These gRNAs were cloned into the PKI1.1R vector, which is the plant expression vector. Transformation of the resulting vector to the tobacco plant via Agrobacterium was carried out. In the study, it was observed that the target modified tobacco plant had changes in stomata structures compared to normal tobacco plant and had no seed attitude. Our studies have shown that DEK1 activity controls cell wall thickness and composition and, as a result, cell shape in the epidermis. Thus, it will contribute to molecular reclamation studies as well as to the contribution to the basic sciences using this technique.