Lipoksijenazın çapraz bağlı enzim agregatlarının oluşturulması ve çeşitli kinon sentezleinde kullanılması
Preparation of crosslinked enzyme aggregates of lipoxygenase and its use in the synthesis of various quinones
Yazar: ALİ TOPRAK
Danışman: PROF. DR. SEYDE SEYHAN TÜKEL
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Bölümü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada soya fasülyesi tohumlarından (Glycine max (L.) Merr. Cv. Atakişi) kısmi olarak saflaştırılan  lipoksijenaz (LOX) çapraz bağlı lipoksijenaz agregatları (LOX-CLEA) oluşturularak immobilize edilmiştir. İmmobilizasyon için en uygun glutaraldehit ve amonyum sülfat derişimleri ve immobilizasyon süresi yanıt yüzey metodu (RSM) kullanılarak sırasıyla %20 (w/v), %55 (w/v) ve 10 saat olarak belirlenmiştir.
Serbest LOX ve LOX-CLEA örneklerinin maksimum aktivite gösterdiği pH ve sıcaklık değerleri serbest LOX sırasıyla 8,5 ve 25 ºC,  LOX-CLEA için ise sırasıyla 8,5 ve 60 ºC olarak belirlenmiştir. Serbest LOX?un belirlenen optimum pH ve sıcaklık değerlerinde linoleik asit substratı için Km ve Vmax değerleri sırasıyla 28 mM ve 1593 nmol/dk mg potein olarak,  LOX-CLEA için ise bu değerler 4,4 mM ve 1046 nmol/dk g CLEA olarak belirlenmiştir. Serbest LOX 35 ve 60 °C?de 24 saat inkübasyon süresi sonunda başlangıç aktivitesinin sırasıyla %85 ve 47?sini korurken aynı koşullarda LOX-CLEA başlangıç aktivitesinin sırasıyla %90 ve 73?ünü korumuştur.
Serbest LOX ve LOX-CLEA örneklerinin hidroperoksidaz aktivitesi 1,4-benzokinon ve timokinon sentezleri için incelenmiştir. En yüksek 1,4-benzokinon verimi 15 dakika reaksiyon süresi sonrasında serbest LOX ve LOX-CLEA için sırasıyla %24 ve 33 olarak, buna karşın en yüksek timokinon verimleri serbest LOX ve LOX-CLEA için sırasıyla % 12 ve 15 olarak  elde edilmiştir.  LOX-CLEA kesikli reaktörde 1,4-benzokinon sentezi için 15 kullanım sonunda başlangıç aktivitesinin % 39?unu korumuştur.

Abstract:
In this study, lipoxygenase (LOX) partially purified from soybean seeds (Glycine max (L.) Merr. Cv. Atakişi) was immobilized as crosslinked enzyme aggregates (LOX-CLEA). The optimal glutaraldehyde and ammonium sulfate concentrations and immobilization time for the immobilization were determined as 20% (w/v), 55% (w/v) and 10 h, respectively by using response surface methodology (RSM). 
The optimum pH and temperature of free LOX and LOX-CLEA were determined as 8.5 and 25 ºC, respectively for the free LOX and 8.5 and 60 ºC, respectively for LOX-CLEA. Under the predetermined optimal pH and temperature values, Km and Vmax values of the free LOX were 28 mM and 1593 nmol/min mg protein, respectively towards linoleic acid. The corresponding Km and Vmax values of the LOX-CLEA were 4.4 mM ve 1046 nmol/min g CLEA. After 24 h preincubation time, the free LOX protected 85 and 47% of its initial activity at 35 and 60 °C, respectively whereas LOX-CLEA protected 90 and 73% of its initial activity, respectively under the same conditions.
	   The hydroperoxidase activities of free lipoxygenase and LOX-CLEA were investigated for the synthesis of 1,4-benzoquinone and thymoquinone. After 15 min reaction time the highest 1,4-benzoquinone yield was obtained as 24 and 33%, respectively for the free LOX and LOX-CLEA whereas the highest thymoquinone yields were obtained as 12 and 15%, respectively for the free LOX and LOX-CLEA. After 15 reuses, LOX-CLEA protected 39% of its initial activity for the synthesis of 1,4-benzoquinone in a batch type reactor.