Curcumin ve hidroksiürea' nın gen düzenleyici ve anti-anjiyogenik etkilerinin meme kanseri hücre hattında araştırılması
Investigation of anti-angiogenic and gene regulatory effects of curcumin and hydroxyurea in breast cancer cell line
Yazar: GÜLER GÜL
Danışman: YRD. DOÇ. YASEMİN SOYSAL
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Anjiyogenez inhibitörleri = Angiogenesis inhibitors ; Bevacizumab = Bevacizumab ; Eritropoietin = Erythropoietin ; Genler = Genes ; Hidroksiüre = Hydroxyurea ; Hücre dizisi = Cell line ; Kurkumin = Curcumin ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors

Özet:
Anjiyogenez, lokal tümör büyümesini etkileyerek meme kanserinin metastazı ve gelişiminde önemli rol oynar. Toksik olmayan ve kemo-direnç göstermeyen anjiyogenezi inhibe eden ajanların geliştirilmesi önem taşımaktadır.
Çalışmamızda MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatları ile MCF-10A normal meme hücre hattında curcumin, bevacizumab ve hidroksiürenin tek başlarına ve kombine kullanımlarında anti anjiyogenik etkinliklerini değerlendirmeyi amaçladık. 
Curcumin, hidroksiüre ve bevacizumab'ın hücre canlılığı üzerinde zamana ve doza bağlı etkisini araştırmak için Curcumin, 40 μM ve 50 μM; bevacizumab 250 μg/mL ve 350 μg/mL; hidroksiüre 1 mM ve 3mM konsantrasyonlarında 24, 48 ve 72 saat inkübasyon sürelerinde MDA- MB-231, MCF-7 ve MCF-10A hücre hatlarında denendi. Sitotoksik etki WST-1 testi ile ölçüldü. 72 saat inkübasyon sonunda graphpad prism programı ile curcumin, bevacizumab ve hidroksiürenin IC50 değerleri hesaplandı. İlaç kombinasyonlarındaki sinerji ve kombinasyon indeks (CI) CalcuSyn yazılımıyla hesaplandı. 
Hücrelere uygulanan ajanların hücre migrasyonu üzerindeki etkisi Scratch Assay uygulamasıyla değerlendirildi. Hem sinerjistik etki hem de <%50 migrasyon değeri gösteren kombinasyon grupları seçildi. Bu grupların HIF-1α, VEGF, EPO ve C-RAF gen ekspresyonlarını değerlendirmek için Real time PCR yöntemi, protein ekpresyonlarını değerlendirmek için western blot analizi kullanıldı. Ayrıca kaspaz-9 protein ekspresyonu ile kullanılan ajanların apoptotik etkisi gösterildi.  
Curcuminin MCF-7, MDA-MB-231 ve MCF-10A hücreleri için IC50 değerleri sırasıyla 46.96, 53,56 ve 39.4 μM; bevacizumabın IC50 değerleri sırasıyla 232.8, 335.7 ve 380.5 μg/mL; hidroksiürenin IC50 değerleri sırasıyla 0.36, 1.22 ve 1.22 mM olarak tespit edildi. Curcumin, bevacizumab ve hidroksiürenin ikişer farklı dozları MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde 48. ve 72 saatte etkin sitotoksisite gösterirken MCF-10A hücreleri canlılık oranları anlamlı düşüş gösterdi. Migrasyon deneyinde MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde madde uygulanan gruplardaki aralık kontrole göre geç kapanırken MCF-10A hücreleri 12.saatte tam kapanma gösterdi. 
HIF-1α, VEGF, EPO ve C-Raf gen ekspresyonu analizlerinde MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde en etkin down-regülasyon, MCF-10A hücresinde en etkin up regülasyonun olduğu IC50 ve kombinasyon harici gruplar curcumin 40 μM ve hidroksiüre 2 mM doz grupları olarak tespit edildi. Real time analizlerinin western blot analizleri ile paralellik gösterdiği belirlendi.

Abstract:
Angiogenesis plays an important role towards the development of and metastasis for breast cancer by affecting the local tumor growth. It is important to develop angiogenesis inhibiting agents that is non-toxic and non-chemoresistant. 
The aim of this study is to comment the anti-angiogenic effectiveness of curcumin, bevacizumab and hydroxyurea, alone or combined together, in the MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines with MCF-10A normal breast cell line.
Curcumin, concentrating at 40 μM and 50 μM, bevacizumab, concentrating at 250 μg/mL and 350 μg/mL, hydroxyurea concentrating at 1 mM and 3mM were treated in MDA- MB-231, MCF-7 and MCF-10A cell lines during24, 48 and 72 hours. Cytotoxic effect was measured by WST-1 test. IC50 values of curcumin, bevacizumab and hydroxyurea were calculated with graphpad prism programme after 72 hours incubation. Synergy and combination index (CI) in drug combinations were investigated with CalcuSyn software. 
Migration of cells were determined with scratch assay. Combination groups which have both synergistic effect and <50% migration value were selected. HIF-1α, VEGF, EPO ve C-RAF gene expressions of these groups were analyzed with Real time PCR, these protein expressions were analyzed with western blot. Apoptozis was also investigated with caspase-9 protein expression.
For MCF-7, MDA-MB-231 and MCF-10A cells respectively, IC50 values of curcumin are 46.96, 53,56 and 39.4 μM, IC50 values of bevacizumab are 232.8, 335.7 and 380.5 μg/mL, IC50 values of hydroxyurea are 0.36, 1.22 and 1.22 mM. Two each different dosages of curcumin, bevacizumab and hydroxyurea have effective cytotoxicity in MCF-7 and MDA-MB-231cells while viability ratios of MCF10A cells don't have significant decrease in 48 and 72 hours.  In migration assay, spaces in treated MCF-7 and MDA-MB-231 groups close less as against control group while MCF-10A cells close completely in 12 hours.
In HIF-1α, VEGF, EPO and C-Raf gene expression analyzes, groups except IC50 and combinations which have predominant down regulation in MCF-7 and MDA-MB-231 cells and up regulation in MCF-10A cells are curcumin 40 μM and hydroxyurea 2 mM dosage groups. Real time analyses show parallelism with western blot analyses.