Mezenkimal kök hücrelerin BMP-6 geni aktarımı ile kıkırdak dokusuna farklılaşması
Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells mediated by BMP-6 gene delivery
Yazar: GONCA KARAGÖZ
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasında amaç, BMP6 (Bone Morphogenetic Protein 6) geni ile modifiye edilmiş sıçan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler ve kitosan doku iskelelerinden oluşan yapının, in vitro ortamda kıkırdak doku oluşturma potansiyelinin araştırılmasıdır. Bu amaca yönelik olarak, BMP6 genini içeren pShuttle-rBMP6 plazmidi elde edilmiş, hücrelerin plazmidle modifikasyonu sağlanmış ve BMP6 ile modifiye olmuş hücrelerin kitosan doku iskeleleri üzerindeki davranışları, hücre kültür sistemlerinde araştırılmıştır.Çalışmanın ilk aşamasında, gen aktarımında kullanılacak plazmidin taşıdığı BMP6 cDNA'sının, plazmidteki varlığı ve nükleotid dizisi, dizi analiziyle doğrulandıktan sonra, plazmidin kompetent E.coli hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir.Transforme E.coli hücreleri sıvı besi ortamlarında kültüre edilerek plazmidin bu hücrelerde çoğaltılması sağlanmış, çoğalan hücrelerden kit aracılığıyla saf halde plazmid DNA izolasyonu yapılmıştır.Çalışma kapsamında gerçekleştirilen bir diğer aşamada, kitosan ve lipid bazlı ajandan oluşan iki farklı gen aktarım sistemiyle plazmid DNA birleştirilip DNA-lipozom ve DNA-kitosan kompleksleri elde edilmiştir. Oluşturulan DNA-lipozom kompleksleri sıçan mezenkimal kök hücrelerine aktarılıp BMP6 geni ile modifiye edilmiş mezenkimal kök hücreler elde edilmiştir. Gen ile aktifleşmiş kitosan ise dondurarak-kurutma yöntemiyle üretilmiş kitosan doku iskelelerine (çap=5 mm, kalınlık=1 mm), fosfat tampon çözeltisi içinde çözünmüş plazmid DNA emdirilerek hazırlanmıştır.Tez çalışmasının son aşamasında, kitosan doku iskeleleri ile hücre kültürü çalışmaları yapılmıştır. Çalışmalar 4 grup örnekle yürütülmüştür. Birinci gruptaki kitosan doku iskelelerine yalnızca hücre ekilmiş (kontrol grubu), ikinci gruptaki hücreler kültüre edilirlerken, farklılaşma ortamlarına iskele başına 20 ng olacak şekilde rekombinant BMP6 proteini eklenmiştir. Üçüncü gruptaki doku iskelelerine pShuttle-rBMP6 plazmidiyle modifiye edilmiş hücreler ekilmiştir. Dördüncü gruptaki örnekler ise, pShuttle-rBMP6 emdirilmiş kitosan doku iskelelerine mezenkimal kök hücreler ekilerek hazırlanmıştır. Hücre kültür çalışmaları 21 gün boyunca durgun ortamda yürütülmüştür. Plazmid emdirilmiş iskelelerden kültür ortamına salınan DNA miktarı, deneysel çalışmaların devam ettirildiği 21 gün boyunca, spektrofotometrik olarak izlenmiştir. Kitosan doku iskelelerinin, hücrelerin kondrojenik farklılaşmaları için uygun bir sürede ve kontrollü olarak plazmid DNA'nın salımını desteklediği belirlenmiştir. Hücre üremesi MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) analizi ile takip edilmiş, analiz sonucunda modifiye hücrelerin üreme eğilimlerinin daha yüksek olduğu saptanmıştır. Hücre morfolojileri SEM ile görüntülenmiş, kontrol grubundaki hücrelerin hipertrofik bir morfolojiye sahip oldukları, BMP6 ile modifiye olmuş hücrelerin ise kondrojenik fenotipte oldukları gözlemlenmiştir. Plazmid aktarılmış hücrelerde BMP6 geninin ifadesi ELISA testiyle kantitatif olarak saptanmış, böylece hücrelere gen aktarımının gerçekleştiği doğrulanmıştır. Ayrıca bu analizle, dolaylı olarak iki farklı yolla gerçekleşen transfeksiyonun birbirine yakın verimlilikte olduğu saptanmıştır. Kondrogenezin kantitatif olarak değerlendirilmesi ve farklı gruplardaki DNA içeriklerinin karşılaştırılması için biyokimyasal analiz yapılmıştır. İki haftalık ve üç haftalık periyod sonunda yapılan ölçümlerde, modifiye hücreleri içeren doku iskelelerinin, glikozaminoglikan (GAG) ve DNA içeriğinin, diğer gruplarla karşılaştırıldığında daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Gen ile aktifleşmiş kitosan doku iskelelerindeki modifiye hücrelerin, lipozomal ajanla transfekte edilenlere göre daha fazla GAG sentezledikleri belirlenmiştir.Elde edilen sonuçlar değerlendirilerek, BMP6 geni ile modifiye edilmiş sıçan mezenkimal kök hücreleri ve üç boyutlu kitosan doku iskelelerinden oluşan yapının, kondrogenezin sağlanmasında etkin bir sistem olabileceği ve klinik uygulamalarda kıkırdak onarımına yönelik olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
In the presented study, the promotion of in vitro chondrogenesis was investigated by using chitosan scaffolds and bone marrow derived mesenchymal stem cells (rBMSCs) which are modified with BMP6 (Bone Morphogenetic Protein 6). For this purpose, pShuttle-rBMP6, the expression vector consisting of the coding sequence of the BMP6 is obtained, and then chondrogenic and cellular activities of modified cells on chitosan scaffolds were determined under static culture conditions.In the first part of the study, pShuttle-rBMP6 were amplified and sequenced to ensure that the BMP6 cDNA insert and nucleotide sequence were correct. After the confirmation of cloned BMP6 gene; plasmids were transformed into competent E.coli cells, and then they were propagated in E.coli. Finally, the plasmid DNA was isolated and purified from E.coli.In the next part of the study, by combining plasmid DNA with two different gene delivery systems which are composed of chitosan and lipid based agent, DNA-lyposome and DNA-chitosan complexes were produced. By the transfection of constructed DNA-lyposome complexes into rBMSCs, cells modified with BMP6 gene were obtained. To produce gene activated matrix, plasmid DNA (in PBS) was embedded into the chitosan scaffolds (diameter=5mm, thickness=1mm) fabricated by freeze-drying technique.In the last part of the study, in vitro cultivation of cells which are seeded onto chitosan scaffolds was performed. Scaffolds were divided to four groups. Group 1 is composed of only MSCs seeded into the pure chitosan scaffolds; group 2 was the scaffolds consist of MSCs which were cultured in the presence of 20 ng recombinant protein per scaffold; group 3 was BMP6-modified MSCs that are seeded into chitosan scaffolds and group 4 consists of MSCs seeded into the scaffolds together with pShuttle-rBMP6. Cell culture studies were carried out in static conditions for 21 days. The plasmid DNA release from scaffolds were quantified by spectrophotometrically during the culture period. Results demonstrated that, chitosan scaffolds were performed the controlled-release of plasmid DNA for sustained periods of time and at an adequate level, thus they provide the modification of MSCs to induce chondrogenic differentation. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT(3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Results demonstrated that the percent of viable MSCs modified with BMP6 was significantly higher than those of nontransfected MSCs, which indicated that BMP6-transfected MSCs showed much better proliferation properties. The attachment, proliferation and chondrogenic differentiation of stem cells into the scaffolds were morphologically examined by SEM analysis.The observations suggested that, BMP6-modified MSCs differentiated to the chondrogenic phenotype, otherwise cells in the control group showed hypertrophic morphology. The expression level of BMP6 protein in the culture medium of BMP6-modified MSCs was quantified by ELISA. BMP6 protein detection demonstrated the synthesis of BMP6 protein that was secreted to the medium by successfully transfected cells via two different gene delivery systems. In addition, this analyze indirectly showed that, the transfection efficiencies of both systems were close to each other. Furthermore, biochemical analysis was performed with cell-seeded scaffolds to determine glycosaminoglycan (GAG) and DNA quantities at the 7th and 14th days of culture. As a result, higher amounts of GAG and DNA were obtained from the scaffolds containing modified cells than that of the scaffolds containing unmodified cells.After the evaluation and discussion of the results obtained from the cell culture studies, the engineered construction that composed of three dimensional chitosan scaffolds and bone marrow derived mesenchymal stem cells modified with BMP6 could be considered as efficient systems to induce cartilage regeneration for clinical applications.