Yapay niş mikroçevrede doku gelişim modeli oluşturulması
Generation of a tissue development model inside artificial niche microenvironment
Yazar: NURAY EMİN
Danışman: PROF. DR. Y. MURAT ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Genel olarak hücresel rejeneratif tedaviler, hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının in vitro olarak kontrol edilebilmesi için in vivo niş şartlarının in vitro olarak uygulanabilmesi üzerine kurulmaktadır. Hücresel tedavilerde son yıllarda sıkça kullanılan kök hücreler, çevresindeki hücresel bileşenlerden ve desteklenen hücre tipi kaynaklı sinyallerden oluşmaktadır. Kök hücre nişi, kök hücreler ile bulundukları dokudaki mikroçevrede yer alan yardımcı hücreleri veya hücrelerarası ortamdaki bileşenlerin birbirleriyle olan ilişkilerini tanımlamaktadır. Yürütülen bu tez çalışmasında model sistem olarak kıkırdak doku oluşumu (kondrogenez) seçilmiş olup, doku mühendisliği yaklaşımıyla kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (MKH) ve doğal yapılı hiyaluronik asit ve kollajenden hazırlanmış polimerik iskelelerin kullanımıyla yapay niş mikroçevrenin oluşturulmasına çalışılmıştır. Sıçan femur kemik iliğinden aseptik koşullarda izole edilen mezankimal kök hücreler, öncelikle iki boyutlu kültürlerde çoğaltılmıştır. Daha sonra MKH'ler üç boyutlu Hiyaluronik Asit-Kollajen iskele üzerine, 2%'lik hiyaluronik asit çözeltisi içerisinde süspanse edilerek ekilmiştir. TGF- ? içeren kondrojenik kültür ortamında hiyaluronik asitin kontrollü yıkımını sağlamak için ortama hiyaluronidaz enzimi ilave edilmiştir. Kültür işlemi düzenli olarak faz kontrast mikroskobu ile takip edilmiş ve belirli zaman noktalarında yapılacak testler için örnekler alınmıştır. Hiyaluronik Asit-Kollajen iskele üzerinde kültüre edilen MKH'lerin farklılaşarak lakün içerisinde izogen hücre grupları oluşturmaktadır. Farklılaşarak kendi hücre dışı matrikslerini sentezlemeye başlayan hücreler, kondrositler gibi, tip-2 kollajen ve agrekan sentezlemektedir. Kültür işleminin farklı aşamalarında yapılan immünhistokimyasal testlerde, sentezlenen kollajen tip-2, tip-1 ve agrekan moleküllerinin oranı tespit edilerek, kondrogenezin bulunduğu aşama ve yönlendirilmiş kıkırdak tipi belirlenebilmektir. Bu bulgulardan da yola çıkarak yürütülen kültür sistemleri arasında kıyaslama ve yorum yapılabilmektedir.

Abstract:
The regenerative cellular therapies generally depend on implementation of the in vivo niche conditions at in vitro for controlling the cell proliferation and differentiation at in vitro conditions. The stem cells that were mostly used at cellular therapies had become cellular components around them and signals that were originated from supported cell type. The stem cell niche defines the stem cells with co-cells that were localized their microenvironment of the tissue or relationship of the components from intracellular environment. At this thesis, cartilage tissue formation (chondrogenesis) were selected as a model system and approach of tissue engineering, artificial niche microenvironment was attempted to create by using bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) and polymeric scaffold that was made of natural structure of hyaluronic acid and collagen. Firstly, the mesenchymal stem cells were aseptically isolated from patellar bone marrow of rat, had proliferated from monolayer culture. Then, MSCs that were suspended in 2% hyaluronic acid solution, were seeded on Hyaluronic acid-collagen scaffold. The chondrogenic medium consisted of TGF-ß, Hyaluronidase was added into the culture medium for providing the controlled digestion of hyaluronic acid. At certain time points (1-4 weeks), cell/HA-collagen samples were removed from the culture plates for evaluating by some test.The mesenchymal stem cells that were cultured on hyaluronic acid-collagen scaffold formed isogen cell groups in lacuna by differentiating. The differentiated cells which were starting the production of their own extra cellular matrix, synthesize type 2 collagen and aggrecan like chondrocytes. The cultures stages and directed cartilages type were determined by using immunohistochemistry studies revaluated that level of collagen type-I, collagen type-II and aggrecan. By using the test results, comparison and discussion can be made between culture systems.