Anne sütünde bulunan probiyotiklerin belirlenmesi, kolon kanseri hücre hattında (HT-29) antiproliferatif etkilerinin ve apoptoz yolağındaki bazı gen ekspresyonlarının değerlendirilmesi
Determination of probiotics in breast milk, evaluation of antiproliferative effects in colon cancer cell line (HT-29) and some gene expressions in apoptosis pathway
Yazar: PINAR AĞYAR YOLDAŞ
Danışman: DOÇ. DR. SERPİL UĞRAŞ
Düzce Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğal ve Bitkisel Ürünler / Kozmetik Ürünler Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Günümüzde terapötik açıdan büyük önem taşıyan yeni probiyotik adayların keşfini sağlamak üzere tasarlanmış bu çalışmanın amacı, sağlıklı annelerden alınan süt örneklerinden bakteri izolasyonu, izole edilen bakterilerin probiyotik özelliklerinin aydınlatılması ve 16s rRNA dizilemesi ile moleküler karakterizasyonunun yapılması, karakterizasyonu yapılan izolatların insan kolon adenokarsinoma hücrelerinin (HT-29) proliferasyonuna olan etkisinin belirlenmesi ve apoptoz yolaklarını etkileyen Bax, Bcl-2, kaspaz-3 ve kaspaz-9 genlerin ekspresyon seviyelerinin tespit edilmesidir. Bu amaç doğrultusunda, anne sütünden izole edilen ve moleküler karakterizasyon çalışmaları ile Enterecoccus faecalis PA-1 (OQ642313) olarak tanımlanan laktik asit bakterisinin probiyotik doğası aydınlatılmıştır. Probiyotik özellikleri açısından PA-1 suşunun asit toleransı, safra toleransı test edilmiş ve simüle edilen GIS şartlarına dayanıklı olduğu, güvenirlilik testleri kapsamında gerçekleştirilen hemolitik aktivite tayini açısından gama hemolitik olduğu antibiyotik hassasiyeti açısından ise test edilen antibiyotiklere karşı duyarlı olduğu bu bağlamda güvenli olarak kabul edilebileceği, Klebsiella pneumoniae patojenine karşı inhibitör aktivite gösterdiği, DPPH serbest radikal süpürme yeteneği % 48 ve kolon hücrelerine adezyon yeteneği ''iyi adezyon'' olarak tespit edilmiştir. Bu çalışmaların sonucunda Enterecoccus faecalis PA-1 güçlü probiyotik potansiyeli taşıdığı tespit edilmiştir. Antikanser aktivite çalışmaları kapsamında E. faecalis PA-1'in McF 0.5, 5 ve 10 konsantrasyonlarının 18 saat sonunda hücre canlılığını %50'nin altına indirdiği kaydedilmiştir. Bu oran süre uzadıkça (24 ve 48 saat) daha da azalmıştır. Gen ekspresyon çalışmalarında, HT-29 hücre ortamına verilen canlı E. faecalis PA-1 suşunun 18 saatlik inkübasyonu sonucu tüm konsantrasyonlar kaspaz-3 ve kaspaz-9 gen ekspresyonunu anlamlı olarak artırırken Bcl-2 ifadesini baskılamıştır. Hücre ortamına verilen bakterilerin 24 ve 48 saatlik inkübasyonu sonucunda da 18 saate paralel sonuçlar elde edilmiştir. Özellikle McF 5 konsantrasyonu 48 saat sonrası gen ekspresyon seviyelerini kaspaz-3'te 9 kattan fazla ve kaspaz-9'da 13 kattan fazla indüklemiştir. Sonuç olarak E. faecalis PA-1'in HT-29 hücreleri üzerinde antikanser etkinliğinin olduğu söylenebilir. E. faecalis PA-1'in antikanser etkisi daha ayrıntılı moleküler testler ve farklı hücre hatlarında gerçekleştirilecek çalışmalar ile aydınlatılmalıdır.

Abstract:
The aim of this study, which was designed to allow the discovery of new probiotic candidates of great therapeutic importance today, was to isolate bacteria from milk samples collected from healthy mothers, to elucidate the probiotic properties of the isolated bacteria and to perform molecular characterisation by 16s rRNA sequencing, to determine the effect of the characterised isolates on the proliferation of human colon adenocarcinoma cells (HT-29) and to determine the expression levels of Bax, Bcl-2, caspase-3 and caspase-9 genes, which affect apoptosis pathways. To this end, the probiotic nature of lactic acid bacteria isolated from breast milk and identified by molecular characterisation studies as Enterococcus faecalis PA-1 (OQ642313) was clarified. In terms of probiotic properties, the acid tolerance and bile tolerance of the PA-1 strain were tested and it was found to be resistant to simulated GIS conditions, it was gamma haemolytic in terms of haemolytic activity determination carried out as part of reliability testing, it was sensitive to the antibiotics tested in terms of antibiotic sensitivity and can be considered safe in this context, it showed inhibitory activity against the pathogen Klebsiella pneumoniae, the DPPH free radical scavenging ability was 48% and the adhesion ability to colon cells was rated as "good adhesion". As a result of these studies, it was found that E. faecalis PA-1 has a strong potential as a probiotic. Within the framework of studies on the anti-cancer activity, it was found that the McF 0.5, 5 and 10 concentrations of E. faecalis PA-1 reduced the viability of the cells to below 50% after 18 hours. This rate decreased even more with increasing time (24 and 48 hours). In gene expression studies, all concentrations significantly increased caspase-3 and caspase-9 gene expression and suppressed Bcl-2 expression after 18 hours of incubation of live E. faecalis PA-1 strain in HT-29 cell media. The results of 24 and 48 hours of incubation of the bacteria in the cell medium were parallel to those of 18 hours. In particular, the McF 5 concentration induced gene expression levels more than 9-fold for caspase-3 and more than 13-fold for caspase-9 after 48 hours. As a result, it can be concluded that E. faecalis PA-1 has anticancer activity on HT-29 cells. The anticancer effect of E. faecalis PA-1 should be investigated with more detailed molecular tests and studies in different cell lines.