Oligonükleotit ve dna ile yeni nesil floresans maddelerin etkileşimlerinin kütle spektrometrisi ve spektroskopik yöntemlerle incelenmesi
Investigation of the interactions of oligonucleotide and dna with new generation fluorescent substances by mass spectrometry and spectroscopic methods
Yazar: AYŞEGÜL ÖZGEN
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: DNA = DNA ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Nükleik asit = Nucleic acids ; Oligonükleotidler = Oligonucleotides ; Spektroskopi = Spectroscopy

Özet:
Tez çalışmasında yeni nesil floresans maddeler olan benzimidazol temelli platin (II) ve paladyum (II) içeren metal kompleksleri ve perilen diimit türevi yapıların tek iplik oligonükleotitler, çift iplik kısa ve uzun DNA'lar ile kovalent olmayan etkileşimleri hem DNA ile etkileşime girme mekanizmaları üzerinden hem de oluşan komplekslerin spektroskopik özelliklerinden dolayı DNA görüntüleme amacıyla kullanılabilme üzerinden tartışılmıştır. Bağlama etkileşimleri hakkında kalitatif ve/veya kantitatif bilgi sağlayan çeşitli kütle spektrometrik, spektroskopik ve jel elektroforetik yöntemler kullanılmıştır. 

Tez çalışmasında N,N-di(n-butil)-1,6,7,12-tetra(4-hidroksifenoksi)perilen-3,4,9,10-tetrakarboksilik asit diimit (FP-3), Sakkarinato-2,6-bis(N-metil-benzimidazol-2-il)piridinpaladyum(II) (PT-5), Sakkarinato-2,6-bis(N-metil-benzimidazol-2-il)piridinplatin(II) (PT-6) yapıları boyalar olarak kullanılmıştır. Tezde kullanılan boyaların, tek iplik oligonükleotitlerin, çift iplik DNA'ların ve aptamerlerin karakterizasyonu, bu boyalarla nükleik asitlerin etkileşimleri, etkileşim stokiyometrileri, kararlılıkları ve etkileşim oluşumunda etkili olan kovalent olmayan etkileşimin türünün tayini, DNA bağlanma yüzdeleri, inkübasyon süresinin ve inkübasyon derişiminin etkileşim üzerine etkisi ile ilgili çalışmalar Matriks Yardımlı Laser Desorpsiyon/İyonlaştırmalı Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ve/veya Elektrosprey İyonlaştırmalı Kütle Spektrometresi (ESI-MS) ile incelenmiştir. Aynı molekül kütlesine sahip farklı dizilimdeki oligonükleotitlerin konformasyonel olarak farklılıklarının ve bu oligonükleotitlerin eşleşmesi ile oluşan çift iplik DNA ile PT-5 ve PT-6 yapılarının etkileşimlerinin konformasyonel olarak incelenmesi amacıyla İyon Hareketliliği Kütle Spektrometresi (IM-MS) ile analizleri yapılmıştır.

Bağlanmanın uygun olduğu etkileşimlerin absorbans değişiklikleri Ultraviyole-Görünür Bölge Spektroskopisi (UV-vis) ile izlenerek bağlanma sabitleri hesaplanmış ve floresans verimleri Floresans Spektroskopisi ile izlenmiş olup küçük molekül-DNA etkileşim mekanizmaları araştırılmıştır. Ayrıca tez çalışmasında kullanılmak üzere sentezlenen yapıların Agaroz Jel Elektroforezi yönteminde sensör-boyar madde olarak kullanımı ve DNA teşhisinde kullanılıp kullanılamayacağı incelenmiştir. Böylece DNA, RNA ve bunların fraksiyonlarının gözlemlenmesine dayanan, literatürde ve uygulamalarda sıklıkla kullanılan, oldukça kanserojen olan Etidyum Bromür yerine alternatif görüntüleme ajanları tespit edilmeye çalışılmıştır.

Özgün 1:1 stokiyometrideki tüm etkileşimler için optimum inkübasyon süresi 24 saat olarak bulunmuştur.

Perilen diimit türevi FP-3 boyasının uzun zincirli çift sarmal DNA yapıları için iyi bir interkalatör olduğu ve etkin bir şekilde görüntüleme ajanı olarak EtBr'ye alternatif olabileceği sonucuna varılmıştır. Benzimidazol türevi olan platin (II) içeren PT-6 ve paladyum (II) içeren PT-5 yapılarının DNA nükleik asitlerinin tüm nükleobazlarıyla etkileşime girdiği ve platinin paladyuma kıyasla daha kuvvetli ve kararlı etkileşim oluşturduğu belirlenmiştir. Bu boyaların DNA ile bağlanmalarında, EtBr molekülüne kıyasla daha zayıf floresans etki gösterdikleri bulunmuştur ancak özellikle uzun çift sarmal DNA'larla etkileşimler için EtBr'ye alternatif görüntüleme ajanı olabilecekleri belirlenmiştir. Tez çalışmaları sonucunda DNA ile iyi etkileştikleri tespit edilen bu boyaların tıp alanında kanser teşhisi ve ileriki deneysel çalışmalarla birlikte kanser tedavisi alanında, yan etkileri ve direnci bilinen cis-platine alternatif olarak kullanılabilme olasılıklarının yüksek olduğu kanaatine varılmıştır.

Abstract:
In the thesis study, the non-covalent interactions of benzimidazole-based platinum (II) and palladium (II) containing metal complexes and perylene diimide derivative structures with single-stranded oligonucleotides, double-stranded short and long DNAs were discussed both through their mechanisms of interaction with DNA and their use for DNA imaging due to the spectroscopic properties of the complexes formed. Various mass spectrometric, spectroscopic and gel electrophoretic methods have been used that provide qualitative and/or quantitative information about binding interactions.

N,N-di(n-butyl)-1,6,7,12-tetra(4-hydroxyphenoxy)perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic acid diimide (FP-3), Saccharinato-2,6- bis(N-methyl-benzimidazol-2-yl)pyridinepalladium(II) (PT-5), Saccharinato-2,6-bis(N-methyl-benzimidazol-2-yl)pyridineplatin(II) are used in the thesis study as dye structures. Studies on the characterization of the dye structures, single-stranded oligonucleotides, double-stranded DNAs and aptamers used in the thesis, interactions of these dyes and nucleic acids, interaction stoichiometry, stability and determination of the type of non-covalent interaction that is effective in the formation of interaction, DNA binding percentages, the effect of incubation time and incubation concentration on the interaction were examined with Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) and/or Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS). Ion Mobility Mass Spectrometry (IM-MS) analyzes were performed in order to examine the conformational differences of oligonucleotides with the same molecular mass in different sequences and the conformational examination of the interactions of the double-stranded DNA (which is formed by the pairing of these oligonucleotides) with PT-5 and PT-6 structures.

The absorbance changes of the interactions where binding is appropriate were monitored by Ultraviolet-Visible Region Spectroscopy (UV-vis), and binding constants were calculated, fluorescence efficiencies were monitored by Fluorescence Spectroscopy, and small molecule-DNA interaction mechanisms were investigated. In addition, the use of the structures synthesized for use in the thesis study as a sensor-dye in the Agarose Gel Electrophoresis method and whether they can be used in DNA identification were examined. Thus, alternative imaging agents have been tried to be determined instead of Ethidium Bromide, which is highly carcinogenic, which is based on the observation of DNA, RNA and their fractions, which is frequently used in the literature and applications.

The optimum incubation time for all interactions in the specific 1:1 stoichiometry was found to be 24 hours.

It was concluded that FP-3 dye, a derivative of perylene dimide, is a good intercalator for long double-stranded DNA structures and can be an alternative to EtBr as an effective imaging agent. It has been determined that PT-6 containing platinum (II) and PT-5 containing palladium (II) dyes, derivatives of benzimidazole, interact with all nucleobases of DNA nucleic acids and platinum creates a stronger and more stable interaction compared to palladium. It has been found that these dyes show weaker fluorescence compared to the EtBr molecule in binding with DNA, but it has been determined that they can be an alternative imaging agent to EtBr, especially for interactions with long double-stranded DNAs. As a result of the thesis studies, it was concluded that these dyes, which were found to interact well with DNA, have a high probability of being used as an alternative to cis-platin, whose side effects and resistance are known, in the field of cancer diagnosis and treatments with further experimental studies.