Çeşitli doğal substratların yerel bir Aureobasidium pullulans suşunun pullulan üretimine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of various natural substrates on the pullulan production by a domestic Aureobasidium pullulans strain
Yazar: BÜŞRA AKDENİZ
Danışman: PROF. DR. ZEKİYE YEŞİM ÖZBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında, çeşitli doğal substratların fermantasyon ortamları olarak kullanılmalarının, yerel bir suş olan; A. pullulans AZ-6'nın pullulan üretimi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla kullanılan doğal substratlar; çeşitli turunçgil kabukları (portakal, limon, greyfurt, turunç), üzüm posaları, fındık ve kestane kabuğundan hazırlanmış olan hidrolizatlar, şeker kamışından pekmez üretimi sırasında ortaya çıkan artık (ŞKPA), kuru ve taze fındık zürufları ve balkabağı kabuğudur. Fermantasyon deneyleri, çeşitli ön işlemler uygulanarak hazırlanan ve başlangıç pH'ları 6.48'e ayarlanmış ortamlarda, kesikli sistemde, çalkalamalı su banyolarında, 100 vuru/dak sabit çalkalama hızında, 24.2°C'de, karanlık ortamda gerçekleştirilmiştir. Belirli zaman aralıklarında fermantasyon ortamlarından alınan örneklerde; biyokütle, ekzopolisakkarit (EPS), pullulan ve substrat derişimleri tayin edilmiştir. Deneyler sırasında, mikroorganizmanın özgül üreme hızı ve özgül ürün oluşum hızı değerleri de hesaplanmıştır. Doğal substrat kaynaklarından, pullulan üretimini en iyi destekleyen substratlardan; kuru fındık zürufu ile çalışılmasına karar verilmiştir. Kuru fındık zürufu ile hazırlanan fermantasyon ortamında elde edilen en yüksek EPS ve pullulan derişimleri, sırasıyla; 30.36 ve 30.02 g/L'dir. Bu ortamda en yüksek biyokütle derişimi ise; 3.54 g/L olarak belirlenmiştir. Mikroorganizmanın üssel üreme bölgesinde hesaplanan özgül üreme hızı; 0.016 sa-1, belirlenen maksimum özgül ürün oluşum hızı değeri ise; 1.56 g pullulan/(g mo.sa)'dir. Kuru fındık zürufu ile hazırlanan fermantasyon ortamında, başlangıç derişimleri sırasıyla; 2.71 ve 8.46 g/L olarak belirlenen ksiloz ve glukoz, fermantasyonun sonunda, çalışılan suş tarafından tamamen tüketilmişlerdir. 
Bu araştırmanın ikinci aşamasında ise, kuru fındık zürufundan hazırlanan fermantasyon ortamının, optimizasyonu amacıyla; yanıt yüzey yöntemi kullanılarak bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan program yardımıyla, merkezi karma tasarım yönteminden yararlanılarak, merkez noktada 6 tekrarlı, 20 deneyden oluşan bir deney tasarım planı oluşturulmuştur. Deney tasarımındaki optimizasyon için seçilen bağımsız değişkenler; amonyum sülfat derişimi, derişik sülfürik asit hacmi ve öğütülmüş fındık zürufu miktarı, bağımlı değişkenler ise; maksimum pullulan derişimi, maksimum EPS derişimi ve mikroorganizma özgül üreme hızıdır. Bağımsız değişkenlerin bağımlı değişkenler üzerindeki etkileri, program yardımıyla türetilen model eşitlikler yardımıyla, çoklu regresyon analizi ile değerlendirilmiştir. Oluşturulan modellerin uygunluğu varyans analizi (ANOVA) ile analiz edilmiştir.  Optimizasyon deneyleri sonucunda çalışılan fermantasyon ortamı için optimum olarak belirlenen amonyum sülfat derişimi, derişik sülfürik asit hacmi ve öğütülmüş fındık zürufu miktarı sırasıyla; 7.2 g /L, 2.5 mL ve 20 g olarak bulunmuştur. Bu koşullarda elde edilen en yüksek pullulan ve EPS derişimleri ise sırasıyla; 74.39 ve 75.95 g/L olup, optimum koşullarda, A. pullulans AZ6'nın özgül üreme hızı; 0.097 sa-1olarak hesaplanmıştır. Optimum deney koşullarında istenen hedefe ulaşma fonksiyonunun değeri ise; 0.915 olarak bulunmuştur. Bu tez çalışmasında son olarak, üretilen bazı EPS örneklerinin, FT-IR spektrometresi kullanılarak, moleküler yapı analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler sonucunda elde edilen spektrumda görülen, pullulan için önemli bazı fonksiyonel gruplara ait piklerin, saf pullulan ile elde edilenlerinkine oldukça benzer oldukları da saptanmıştır. 
 
Anahtar kelimeler: Pullulan, ekzopolisakkarit, Aureobasidium pullulans, fermantasyon, doğal substrat, optimizasyon

Abstract:
In this thesis, effects of the usage of various natural substrates as  fermentation media on production of pullulan by domestic A. pullulans AZ-6 strain were investigated.  For this purpose various citrus peels (orange, lemon, grapefruit, bitter orange), grape pomaces, the hydrolysates of hazelnut and chestnut shells, sugarcane molasses residue, dried and fresh hazelnut husks and pumpkin peel were used. The batch fermentations were performed in a dark place at shaking water bath having temperature of 24.2°C and 100 rpm constant agitation speed. The fermentation media prepared from natural substrates were preprocessed and pH of the media were adjusted to 6.48.  At specific time intervals, cultures were taken from the fermentation media and the concentrations of biomass, exopolysaccharide (EPS), pullulan and substrates were determined. During the experiments, the values of the specific growth rate of microorganism and maximum specific product formation rate were calculated. Among the natural substrates, the dried hazelnut husk promoting the best pullulan production were chosen. In the fermentation medium prepared from dried hazelnut husk, the maximum EPS and pullulan concentrations were found as 30.36 and 30.02 g/L, respectively. In this medium, the maximum biomass concentration was 3.54 g/L. Furthermore, in logarithmic phase of the growth curve, the specific growth rate of microorganism was calculated as 0.016  h-1, and the maximum specific product formation rate  was found as 1.56 g pullulan/(g mo.h). In the hazelnut husk medium, the initial concentrations of the xylose and glucose were 2.71 ve 8.46 g/L. These substrates in the medium were totally consumed by A. pullulans AZ-6 at the end of the fermentation. 
At the second part of this research, a study was performed by response surface methodology for the optimization of the fermentation medium prepared from dried hazenut husk. By the help of central composite design method in optimization software, an experimental design consisting of 20 experiments with 6 runs at the center point, was created. In the experimental design, while the independent variables were (NH4)2SO4  concentration, the volume of concentrated H2SO4 and the amount of ground hazelnut husk; the dependent variables were maximum pullulan concentration, maximum EPS concentration and specific growth rate of microorganism. The effects of independent variables on the dependent ones were evaluated by multi-response regression analysis by using the model equations derived from software. The convenience of the models was analysed by variance analysis (ANOVA). As a result of the optimization experiment, the optimal conditions for (NH4)2SO4 concentration, the volume of H2SO4 and the amount of ground hazelnut husk were determined as 7.2 g /L, 2.5 mL and 20 g, respectively. In optimal conditions, the maximum pullulan concentration, maximum EPS concentration and specific growth rate of A. pullulans AZ-6 were found as in order of 74.39 g/L, 75.95 g/L and 0.097 h-1. In addition, the desirability function was 0.915. Lastly, molecular structure of produced EPS samples were analysed by FT-IR spectrometer. At the spectrum obtained for the EPS samples, the representative peaks for the functional groups of pullulan molecule were similar with those of pure pullulan sample.  

Keywords: Pullulan, exoploysaccaharides, Aureobasidium  pullulans, fermentation, natural substrate, optimization