Eş boyutlu, katyonik, fonksiyonel grup içeren/içermeyen, manyetik yüklü nanopartiküllerin sentezi, karakterizasyonu ve nükleik asit uygulamaları
Monosize, cationic, functional/non-functional group carrying, magnetic nanoparticle synthesis, characterization and their nucleic acid applications
Yazar: GÜLDEM GÜVEN
Danışman: PROF.DR. ERHAN PİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
EŞ BOYUTLU, KATYONİK, FONKSİYONEL GRUP İÇEREN / İÇERMEYEN,MANYETİK YÜKLÜ NANOPARTİKÜLLERİN SENTEZİ, KARAKTERİZASYONU VENÜKLEİK ASİT UYGULAMALARIGüldem GüvenÖZSunulan Doktora tez çalışmasının amacı katyonik (pozitif yüklü) monodispersfonksiyonel yük taşıyan veya taşımayan polimerik nanopartiküllerin ve aynı zamandabunların manyetik yüklü formlarının plazmid DNA (pDNA) ile gen transferi veizolasyonunda kullanımı için sentezlenmesi.Birinci grup deneylerde, katyonik fonksiyonel gruplar taşımayan poli(stiren/N-[3-(dimetil amino) propil] metakrilamid/poli(etilenglikol) etil eter metakrilat) (poli(St/PEG-EEM/DMAPM)) nanopartiküller yüzey aktif madde içermeyen emülsiyonpolimerizasyonu yöntemiyle sentezlenmiştir. Kullanılan ana monomer stiren (St),katyonik monomer N-[3-(dimetil amino) propil] metakrilamid (DMAPM), emülsiyonortamı stabilizasyonu da sağlayan monomer poli(etilenglikol) etil eter metakrilat(PEG-EEM), dağıtma ortamı (Su) ve başlatıcı 2,2'-azobis(2-metil propionamidin)dihidroklorür (V-50) miktarlarının partikül boy/boy dağılımlarına ve zeta potansiyeline(yüzey yüküne) olan etkileri incelenmiştir. Polimerizasyon sıcaklık ve süresinin,ortamın iyonik gücünün ve pH'sının lateks kararlılığına ve partikül boy/boydağılımlarına olan etkileri araştırılmıştır. Ana monomer olan stiren yerine dahahidrofilik yapıda olan metil metakrilat kullanılmasının, lateks kararlılığına, partikülboy/boy dağılımına ve yüzey yüküne olan etkileri araştırılmıştır. Bu gruptakiçalışmalarda hemen hemen tüm parametrelerin partikül boy/boy dağılımında farklıölçülerde etkin oldukları bulunmuştur. En küçük boyutlu katyonik partiküller (zetapotansiyeli: 56.2 mV) (ortalama çap: 75.1 nm) ve dar boy dağılımı ile (polidispersiteindeksi, PI: 1.081) şu reçete ve koşullarda üretilmiştir: Su, St, DMAPM, PEG-EEM veV-50 miktarları sırasıyla, 120 ml, 1.25 ml, 0.1 ml, 0.1 ml, ve 0.03 g, polimerizasyonsıcaklığı: 65ºC; süresi; 24 saat, pH:2.5-3.0 dür. St yerine MMA ile üretilen latekslerdaha az kararlıdır, partiküller daha büyük ve boy dağılımları daha geniştir.İkinci grup deneyler de yine katyonik ancak bu kez fonksiyonel gruplar taşıyanpolimerik nanopartiküller, PEG-EEM yerine, stabilizör monomer olarak polietilenglikolmetakrilat (PEG-MA) kullanılarak üretilmiştir. Burada stabilizör miktarının,polimerizasyon sıcaklık ve süresinin partikül boy/boy dağılımı ve yüzey yüküneetkileri incelenmiştir. Bu nanopartiküller şu reçete ve koşullarda üretilmiştir: Su, St,DMAPM, PEG-MA ve V-50 derişimleri sırasıyla, 120 ml, 1.25 ml, 0.1 ml, 0.1 ml, ve0.03 g, polimerizasyon sıcaklığı: 65ºC; süresi; 24 saat, pH: 2.5-3.0 dür. Bupartiküllerin ortalama boyu 71.3 nm, PI: 1.110, ve a zeta potansiyeli 55.6 mV dur.Birinci ve ikinci grup deneylerde üretilen nanopartiküllerin karakterizasyonu ZetaSizer, Fourier Transform Infrared Spektrofotometresi (FTIR), Nükleer ManyetikRezonans Spektrometresi (NMR), Elementel Analiz, Diferansiyel TaramalıKalorimetre (DSC), Jel Geçirgenlik Kromotogrofisi (GPC), Atomik Kuvvet Mikroskobu(AFM), Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve viskozimetri gibi yöntemlerlegerçekleştirilmiştir.Çalışmanın üçüncü bölümünde ilerki çalışmalarda ayırma amacıylakullanılabilecekleri düşünülerek manyetik yüklü nanopartiküller üretilmiştir. Bunun içinönce nano boyutlu magnetit partiküller üretilmiştir. Bu partiküllerin boy, boy dağılımıve zeta potansiyelleri sırasıyla 77 ve 130 nm, 1.236 ve 1.317, ve -48.5 ve -42.3 mVdur. Sonraki adımda bu partiküller ilk iki grupta uygulanan reçete ve koşullarda yüzeyaktif madde içermeyen emülsiyon polimerizasyonu ile kaplanmıştır. Burada üretilenmanyetik yüklü poli(St/DMAPM/PEG-EEM)'in partikül boy/boy dağılımı ve zetapotansiyeli sırasıyla 155.7 nm ve 200.6 nm; PI: 1.355 ve PI: 1.141; 53.4 mV ve 47.6mV dur. Manyetik yüklü poli(St/DMAPM/PEG-MA) için aynı değerler sırasıyla 89.3nm ve 164.9 nm; PI: 1.617 ve PI: 1.105 ve 54.6 mV ve 50.9 mV dur. Partiküllerinkarakterizasyonu Zeta Sizer, FTIR, Elektron Spin Rezonans (ESR) gibi yöntemlerleyapılmıştır.Önceki basamaklarda üretimi gerçekleştirilen nanopartiküllerin ilk olarak genomikDNA (gDNA) ile etkileşimi incelenmiştir. Deneyler pH 3.0-10.0 aralığında değişiktamponlarda yapılmıştır. PH 3.0-8.0 aralığında oldukça yüksek etkileşim görülmüştür.Bu aralıkta nanopartiküle bağlanan DNA miktarı 204-215 mg gDNA/gnanopartiküldür. Oluşan konjugatların boyları, pH 4.0-8.0 aralığında 111.4-256.8 nmdir.Son grup deneylerde, ilk olarak partiküllerin HeLA hücrelerine olan toksisitesiincelenmiştir. Belli hücre sayısı için kullanılan partikül miktarına bağlı olarak, PEG-MA ile hazırlanan nanopartiküller (yaklaşık%16 toksisite), PEG-EEM (%19-26civarında toksisite) ile hazırlananlara göre daha az toksiktir. Gen aktarımı deneyleriyeşil florasan protein (GFP) sentezleme genini taşıyan plazmid DNA (pDNA) ileyapılmıştır. Nanopartiküllerin bu pDNA ile konjugatları pH 7.4 de 0.15 M NaCl içindeoluşturulmuştur. Konjugatların boy/boy dağılımları ve yükleri Zeta Sizer ilebelirlenmiştir. Konjugatların HeLa hücre hattı transfeksiyonu ve GFP ekspresyonu,HeLa hücre hattını kullanan hücre kültürlerinde incelenmiştir. GFP ekspresyonları,ilgili literatürde rapor edilen non-viral vektörlerin ulaştığı değerlerle kıyaslandığında,72 saatte çok yüksek değerlere (yaklaşık %85-90) ulaşmıştır.Anahtar Kelimeler: Katyonik, eşboyutlu, Stiren, polietilenglikol etil eter metakrilat,polietilenglikol metakrilat, dimetil amino propil metakrilat, V-50, emülsiyonpolimerizasyonu, yüzey aktif madde içermeyen emülsiyon polimerizasyonu,nanopartikül, manyetik, DNA, plazmid, HeLaTez Danışmanı: Prof. Dr. Erhan Bişkin, Hacettepe Üniversitesi, Kimya MühendisliğiBölümü.

Abstract:
MONOSIZE, CATIONIC, FUNCTIONAL / NON-FUNCTIONAL GROUP CARRYING,MAGNETIC NANOPARTICLE SYNTHESIS, CHARACTERIZATION AND THEIRNUCLEIC ACID APPLICATIONSGuldem GuvenABSTRACTThe aim of this Ph.D. thesis is to synthesize cationic (positively charged),monodisperse nanoparticles, with or without surface functional groups and also theirmagnetically loaded forms for possible use in gene transfer with plasmid DNA(pDNA) and its isolation.In the first goup of the experiments, cationic, non-functional, poly(styrene/N- [3-dimethylamino) propyl] methacrylamide/poly(ethyleneglycol) ethylether methacrylate)(poly(St/PEG-EEM/DMAPM)) nanoparticles were synthesized by emulsifier-freemicroemulsion polymerization. The effects of amount of the main monomer styrene(St), cationic comonomer N-[3-(dimethyl amino) propyl] methacrylamide (DMAPM),hydrophilic comonomer (which contributes also stabilization of the nanoparticlelatexes) poly(ethyleneglycol) ethyl ether methacrylate (PEG-EEM), dispersionmedium (Water) and cationic catalyst 2,2?-azobis(2-methyl propionamidine)dihydrochloride (V-50) on particle size/size distributions and zeta potential (surfacecharge) were investigated. The effect of polymerization temperature and time, ionicstrength and pH of the medium on stability of latexes and particle size/sizedistribution were also examined. Another set of nanoparticles were produced using amore hydrophilic monomer, methyl methacrylate (MMA), instead of styrene as themain monomer. It was observed that almost all of the parameters mentioned aboveaffected the particle size/size distribution and zeta potential, but with different extents.The smallest cationic particles (zeta potential: 56.2 mV) (average diameter: 75.1 nm)with a narrow size distribution (polydispersity index, PI: 1.081) were produced withthe following recipe and the conditions: amount of water, St, DMAPM, PEG-EEM andV-50 respectively, 120 ml, 1.25 ml, 0.1 ml, 0.1 ml, and 0.03 g, polymerizationtemperature: 65ºC; time; 24 hr, pH:2.5-3.0. The latexes produced with MMA insteadof St were less stable, and particle sizes were larger and size distributions werebroader.In the second group of the experiments, again cationic nanoparticles but with surfacefunctional groups were produced by using polyethyleneglycol methacrylate (PEG-MA), instead of PEG-EEM, as stabilizing monomer. Here, changes in particle size/size distribution and surface charge were examined with the changes in the amountof PEG-MA, polymerization temperature and time. In this group, the smallestnanoparticles were produced with the following recipe and conditions: Water, St,DMAPM, PEG-MA and V-50 amounts respectively, 120 ml, 1.25 ml, 0.1 ml, 0.1 ml,and 0.03 g, polymerization temperature: 65ºC; time: 24 hr, pH:2.5-3.0. Thesenanoparticles have an average diameter of 71.3 nm, with a PI of 1.110, and a zetapotential of 55.6 mV.The nanoparticles produced in the first and second group were characterized bymeans of Zeta Sizer, Fourier Transform Infrared Spectrophotometer (FTIR), NuclearMagnetic Resonance Spectrometer (NMR), Elementel Analysis, Differential ScanningCalorimeter (DSC), Gel Permeation Chromatography (GPC), Atomic ForceMicroscope (AFM), Scanning Electron Microscope (SEM) and viscosimetry.In the third part of the study, magnetically loaded nanoparticles were produced forpossible applications in pDNA separation. In the first step, nano-sized magnetiteparticles were produced by a coprecipitation procedure. The average particle size,size distribution and zeta potential of the two different particles were 77 nm and 130nm, PI:1.236 and PI:1.317, -48.5 mV and -42.3 mV. In the next step, these particleswere coated with a polymeric layer again by emulsifier free microemulsionpolymerization, in which the same recipe and conditions given in the first two groupof studies mentioned above. Particle size/size distribution and zeta potential of themagnetically loaded poly(St/DMAPM/PEG-EEM) were 155.7 nm and 200.6 nm; PI:1.355 and PI: 1.141; 53.4 mV and 47.6 mV, respectively. The same values for themagnetically loaded poly(St/DMAPM/PEG-MA) were 89.3 nm and 164.9 nm; PI:1.617 and PI: 1.105 and 54.6 mV and 50.9 mV, respectively. Characterization ofthese particles were done by Zeta Sizer, FTIR, and Electron Spin Rezonans (ESR).The interaction of the nanoparticles produced in the previous steps, with first genomicDNA (gDNA) was studied. These experiments were performed in different buffersolutions in the pH range of 3.0-10.0. The interaction was quite high in the pH rangeof 3.0-8.0. In this pH range, the amount of DNA bound to the nanoparticles wasabout 204-215 mg gDNA/g nanoparticle. The average size of the gDNA-nanoparticles conjugates was in the range of 11.4-256.8 nm in pH range of 4.0-8.0.In the last group of the experiments, firstly the toxicity of the particles on HeLA cellswere investigated. The nanoparticles prepared with PEG-MA were less toxic (around16%) then those ones prepared with PEG-EEM (about 19-26%) depending also theamount of nanoparticles used for certain number of cells. Gene transfer studies wereperformed by using a green floresence protein (GFP) expressing plasmid DNA(pDNA). Conjugates of nanoparticle with this pDNA were formed 0.15 M NaClsolution at pH 7.4. Particle size/size distribution and surface charge were determinedby Zeta Sizer. HeLa cell line transfection and GFP expression of the conjugates wereexamined in the cell cultures using the HeLa cell line. The GFP expressions reachedin 72 hr were very high (around 85-90%) comparing the gene expressions reachedwith the nonviral vectors reported in the related literature.Keywords: Cationic, monosize, Styrene, polyethyleneglycol ethyl ether methacrylate,polyethyleneglycol methacylate, dimethyl amino propyl methacrylate, V-50, emulsionpolymerization, emulsifier-free emulsion polymerization, nanoparticle, magnetic,DNA, plasmid, HeLaThesis Supervisor: Prof. Dr. Erhan Bişkin, Hacettepe University, Department ofChemical Engineering.