Tofasitinib ve bozunma ürünlerinin karakterizasyonu ve belirlenmesi için LC ve LC-MS/MS çalışmaları
LC and LC-MS/MS studies for the identification and characterization of tofacitinib and its degradation products
Yazar: HÜLYA ORTAK
Danışman: DOÇ. DR. EBRU ÇUBUK DEMİRALAY
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry

Özet:
Romatoid artrit (RA) eklem iltihabı ve kıkırdak, kemik ve eklem yıkımı ile karakterize edilen kronik ve sistemik otoimmün bir hastalıktır. Tofasitinib romatoid artiritin şiddetini azaltmak için uygun görülmüş yeni bir ilaçtır. Tofasitinib Janus Kinaz inhibitör sınıfının bir ilacıdır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Pfizer tarafından geliştirilmiştir. Bu ilaç Janus Kinaz 1 veJanus Kinaz 3 enziminin inhibitörüdür. Bu ilacın kalitatif ve kantitatif tayinleri, klinik öncesi, biyofarmasötik ve klinik çalışmaların başarılı gerçekleştirilmeleri için önemlidir.

Bazik ilaçlar için protonasyon sabiti değeri (pKa) bir ilacın fizikokimyasal karakterizasyonunda temel parametredir ve in vivo koşullar altında ilacın davranışını tahmin etmede faydalıdır. Ayrıca bu sabit biyolojik membran boyunca geçirgenliği, bileşiklerin çözünürlüğü, reseptör bağlanma prosesini ve ilaç analizlerinde optimum koşulun seçimini etkilemektedir. Bu tezde, ters faz sıvı kromatografide (RPLC) alıkonmanın üzerine pH etkisinin tanımlandığı bir model belirlenmiş ve Kinetex Core-Shell EVO C18 (Phenomenex, 5 µm, 150x4.6 mm) kolon ve mobil faz olarak asetonitril yüzdesi 25, 30, 35 ve 40% (v/v) olan asetonitril-su ikili karışımlarında tofasitinib analizlenmiştir. Önerilen modelde su ortamındaki pH yerine hidroorganik karışımda ölçülen pH değeri kullanılmış ve aktivite katsayılarının etkisi dikkate alınmıştır. Tofasitinibin sudaki pKa değeri farklı ekstrapolasyon yöntemleriyle çalışılan asetonitril-su karışımlarında tayin edilen pKa değerlerinden hesaplanmıştır. Alıkonma üzerine sıcaklık etkisi (25-45°C) incelenmiştir. Mobil ve sabit faz arasında çözünen transferi için standart entalpi (∆H°)  ve entropi (∆S°)  değişiklikleri de belirlenmiştir.

Bu tezde, geliştirilen RPLC metot doğruluk, kesinlik, özgünlük, doğrusallık, hassasiyet ve sistem uygunluğu açısından uluslararası uyumlaştırma konferansı (ICH) kılavuzuna göre valide edilmiştir. Zorlanmış bozunma çalışması da ICH' a göre gerçekleştirilmiştir. Bunun için 25 oC sıcaklık, akış hızı 1 mL/dakika, pH'sı 6 olan (30:70, %v/v) asetonitril-su karışımını içeren mobil fazda izokratik koşul seçilmiştir. Bileşik, oda sıcaklığında asit (0,1 M HCl) ve alkali (0,1 M NaOH) hidrolitik koşulların yanı sıra oksidatif bozunmaya (%3 (v/v) H2O2) tabi tutulmuştur. Buna ek olarak, fotolitik koşulda tofasitinib 254 nm UV ışığında, benzer şekilde termal çalışmalarda ise üç farklı sıcaklığa (30°C, 40°C ve 50°C) maruz bırakılmıştır. Tofasitinib ve bileşiğin bozunma ürünlerinin tayini Kinetex EVO C18 kolonda başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Analitler 287 nm' de DAD dedektörle tayin edilmiştir. Bütün stres koşulları altında tofasitinibte meydana gelen maksimum bozunmanın oksidatif koşulda meydana geldiği bozunma yüzdelerinin hesaplanması ile belirlenmiştir. LC-MS/MS yöntemi stress bozunma ürünlerinin karakterizasyonu ve belirlenmesi için geliştirilmiştir. Bu şekilde elde edilen bilgi, ilaç geliştirme ürününün kalitesini artırmak için kimyasal davranış bilgisinin kullanılabileceği formülasyon geliştirme, üretim ve ambalajlama gibi alanlarda farmasötik geliştirmeyi kolaylaştıracaktır.

Abstract:
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic and systemic autoimmune disease characterizedby synovial inflammation and cartilage, bone and joint destruction. Tofacitinib was a new drug recently approved for the treatment of moderate to severe RA. Tofacitinib is a drug of the Janus kinase (JAK) inhibitor class and developed by the National Institutes of Health and Pfizer. It is an inhibitor of the enzyme janus kinase 1 (JAK1) and 3 (JAK3). Determination of qualitative and quantity of this drug is critical for the successful conduct of preclinical, biopharmaceutical and clinical studies.

The protonation constant value (pKa) for basicdrug isan essential parameter in the biophysical characterization of a drug and may be helpful in predicting the behavior of a drug under in vivo conditions. Moreover, this constant affects compound's solubility, permeability through biological membranes, receptor binding process and a choice of optimal conditions in drug analysis. In this thesis a model describing the effect of pH on retention in reversed phase liquid chromatography (RPLC) is established and tested for tofacitinib using Kinetex Core-Shell EVO C18 (Phenomenex, 5 µm, 150x4.6 mm) column and acetonitrile-water binary mixtures of 25, 30, 35 ve 40% (v/v) acetonitrile as mobile phases. The suggested model uses the pH value measured in the hydro-organic mixture used as mobile phase instead of the pH value in water and takes into account the effect of the activity coefficients. The aqueous pKa value of tofacitinib has been calculated from pKa values determined in studied acetonitrile- water mixtures by means of different extrapolation methods. The effect of temperature (in the narrow range 25-45°C) on retention was investigated.  The standard enthalpy (∆H°) and entropy (∆S°) changes for solute transfer between the mobile and stationary phases were also estimated.

In the present thesis, the development RPLC method was validated according to the international Conference on Harmonization (ICH) guidelines with respect to accuracy, precision, specificity, linearity, sensitivity and system suitability. Forced degradation study was also validated according to ICH. For this, an isocratic condition of mobile phase comprising acetonitrile-water binary mixture (30:70, % v/v) at pH 6 at a flow rate of 1 mL/minute at 25oC temperature was maintained. Tofacitinib was subjected to acid (0.1 M HCl) and alkaline (0.1 M NaOH) hydrolytic conditions as well as to oxidative decomposition (3% (v/v) H2O2) at room temperature. In addition, in photolytic studies, the compound was exposed to 254 nm UV light, similarly, in thermal studies, the compound was exposed to three different temperatures (30oC, 40oC,and 50oC). Determination of tofacitinib and its degradation products were successfully carried out by Kinetex EVO C18 column. The analytes were detected with a DAD detector set at 287 nm. In all the stress conditions applied to the compound, the maximum degradation was determined by the calculated percentage of degradation values that occur in the oxidative condition. LC-MS/MS method was also developed for the identification and characterization of stress degradation products. The information, thus, obtained will facilitate pharmaceutical development in areas such as formulation development, manufacturing, and packaging, where knowledge of chemical behavior can be used to improve the quality of drug product.