Diz osteokondral defektlerinin tedavisinde kullanılacak olan iki katmanlı sentetik skafoldun etkinliğinin değerlendirilmesi-deneysel çalışma-
Treatment of knee osteochondral defectstwo-layer synthetic to be usedevaluation of the effectiveness of scaffold-experimental study-
Yazar: BİLGE KAĞAN YILMAZ
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET NURİ KONYA
Afyonkarahisar Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology
Dizin: Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kondrositler = Chondrocytes ; Kıkırdak = Cartilage ; Kıkırdak-artiküler = Cartilage-articular ; Osteokondrom = Osteocondroma ; Skafoid kemik = Scaphoid bone ; Skafold oluşumu = Scaffold formation ; Yara iyileşmesi = Wound healing ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries

Özet:
Amaç: Laboratuvar ortamında üretilen çift katmanlı ve tek katmanlı skafoldları hücreli ve hücresiz olarak mikrokırık zemininde oluşturulan osteokondral defektlere uygulayarak kıkırdak doku iyileşmesini elde etmeyi ve iyileşen dokuları histolojik olarak karşılaştırmaktır.
Materyal Metod: Çalışmada ortalama yaşları 3 ay olan toplam 70 adet Wester Albino türü erkek rat kullanıldı. Deney hayvanları her grupta 14 adet rat olacak şekilde 5 gruba ayrıldı. Her grupta sağ femur trohlear bölgesiye 2 mm çapında 1 mm derinliğinde osteokondral defekt oluşturulduktan sonra 0.8 mm kirschner teli ile mikrokırık işlemi uygulandı. Daha sonra kontrol grubu hariç her gruba belirlenen özel skafold uygulaması yapıldı. Cerrahi sonrası 4. hafta erken dönem iyileşmeyi, 8. hafta orta dönem iyileşmeyi değerlendirmek amacıyla her gruptan 4. hafta 6 rat, 8. hafta 6 rat sakrifiye edildi. En az 6 denek kullanarak yapılan çalışmada güç analizi sonucu %95 olarak hesaplandı. Kullanılan Wester Albino türü denek hayvanlarının DNA benzerliği %99 olması çalışmamızın güç analizini kuvvetlendirmiştir. Gruplar, sakrifikasyon zamanlarına göre yüksek doz anestezik madde enjeksiyonu ile sakrifiye edildi. Ratların sağ femur distalleri çıkartıldıktan sonra elde edilen materyaller %10'luk tamponlanmış formalinde 1 hafta süre ile fikse edildi. Fiksasyondan sonra materyaller %50'lik formik asit ve %20'lik sodyum sitrat çözeltilerinden hazırlanan solüsyonda dekalsifiye edildi. Dekalsifikasyon sonrası kemik doku örnekleri parafin bloklara gömülerek mikrotom ile 5-7 μm kalınlığındaki kesitler lamlar üzerine alındı. Bu kesitler Hematoksilen-Eozin ve Masson's Tricrom boyama yöntemiyle boyanıp, Modified Mankin ve O'Driscol skalasına göre değerlendirmeleri yapıldı.Değişkenler; Kolmogorov Smirnov testi ve Histogram ile incelenmiş ve normal dağılım göstermeyen sürekli değişkenlerin üç ve üzeri gruplar arasında karşılaştırılmasında ise Kruskal-Wallis testi kullanılmıştır. Kruskal-Wallis testi sonucunda anlamlı bir farklılığın elde edilmesi durumunda farkın hangi gruplar arasından kaynaklandığını belirlemek amacıyla ise Bonferroni düzeltmeli MannWhitney testi yapılmıştır. Bütün analizlerde IBM SPSS.23 programı kullanılmış ve anlamlılık düzeyi olarak p< 0.05 değeri kabul edilmiştir.
Bulgular: Skafoldların hücreli kullanımının morfolojik alan değişimlerinde olumlu sonuç etkisini gösterildi. Skafold katmanları karşılaştırıldığında ise çift katmanlı skafold uygulamanın hem hücreli hem hücresiz kullanımda tek katmanlı skafolda göre morfolojik alan skorunda minimal artış etkisi görülmektedir. Yüzey düzenliliğinde çift katmanlı hücreli skafold grubunda kontrol grubundan da daha iyi sonuçlar elde edilmiştir. Komşu bağlanmanın akut iyileşme döneminde çift katmanlı hücresiz skafold ile en yüksek skorlar elde edilmiştir. Hücre popülasyonunun akut dönem sonuçları incelendiğinde; kontrol grubuna göre  hücreli çift ve tek katmanlı skafold grubunda beklenenin aksine çok düşük değerler saptanmıştır. Hücre popülasyonu değerlendirmesinde akut ve orta dönem en iyi sonuçlar kontrol grubunda görülmüştür. Kıkırdak tıkaç kalitesinin akut dönem sonuçları incelendiğinde çift katmanlı hücresiz skafold etkinliği anlamlı derecede yüksek bulunmuştur. Ancak bu etkinlik orta dönem sonuçlarına yansıyamamıştır. İyileşmede matriksin durumu incelendiğinde; tüm iyileşme döneminde kontrol grubuna en yakın skor çift katmanlı hücreli skafold grubunda saptanmış olup çift katmanlı skafoldun tek katmanlı skafolda göre daha iyi matriks oluşturduğu görülmektedir. Yapısal bütünlüğün tüm dönem sonuçlarında çift katmanlı hücreli skafoldun iyileşmiş kıkırdak dokusunda yapısal 
bütünlüğünün daha iyi olduğu görüldü. Çift katmanlı skafoldun yara dolgusunda daha etkili bir tedavi yöntemi olduğu görülmüştür. Osteokondral bağlanmada çift katmanlı skafoldun etkinliği belirgin şekilde yüksek bulunmuştur. Komşu bağlanmada çift katmanlı skafoldun akut dönemde etkinliği saptanmış olup hücre takviyesi ile bu etkinliği orta dönemde de sürdürdüğü görülmüştür. Kümeleşme dağılım incelendiğinde, akut dönem sonuçlarında çift katmanlı skafold etkinliği iyi iken, orta dönemde tek katmanlı 
skafold etkinliği belirgin şekilde artmıştır. Subkondral kemik iyileşmesi incelendiğinde, akut dönem sonuçlarında çift katmanlı skafold etkinliği iyi iken orta dönemde tek katmanlı skafold etkinliği belirgin şekilde artmıştır.
Sonuç: Mankin skorlaması toplam skoruna bakıldığında; akut dönem iyileşmede çift katmanlı skafoldun daha etkin olduğu bulunmuş iken orta dönem sonuçlarında gruplar arası anlamı bir fark elde edilememiştir. Uzun dönem sonuçlarında en 
etkin tedavinin mikrokırık uygulanan kontrol grubu olduğu görülmüştür.O'Driscol skorlaması toplam skoruna bakıldığında; akut dönem iyileşmede çift katmanlı skafoldun daha etkin olduğu bulunmuş iken bu skafoldun hücreli uygulanması ile çok daha iyi sonuçlar elde edilmiştir. Bu sonuçlar orta dönem sonuçlarına da yansımıştır. Çift katmanlı skafold, mikrokırık uygulanan tedaviye 
alternatif olarak değerlendirilebilir. Genel olarak kontrol grubu olan mikrokırık grubuna en yakın iyileşme parametreleri hücreli çift katmanlı skafold grubunda elde edilmiştir. Osteokondral kıkırdak defektlerinde mikrokırık yöntemi ile iyileşme hala güncelliğini korumaktadır. Kıkırdak doku mühendisliği ile üretilen çeşitli skafoldlar ile histolojik olarak daha iyi sonuçlar alınabilmektedir.
Anahtar Kelimeler: Osteokondral defekt, Kıkırdak, Skafold, Hayvan deneyi

Abstract:
Objective: To compare double-layer and single-layer scaffolds produced in a laboratory environment with tissues with cartilage tissue healing by applying it to osteochondral defects created by the microfracture methods, with and without cells.
Material and Method: A total of 70 Wester Albino male rats with an average age of 3 months were used in the study. Experimental animals were divided into 5 groups with 14 rats in each group. After creating an osteochondral defect with a diameter of 2 mm and a depth of 1 mm in the right femoral trochlear region in each group, microfracture was performed with a 0.8 mm Kirschner wire. 
After that, a special scaffold was applied to each group, except the control group. 6 rats from each group were sacrificed in the 4th week to evaluate the early recovery, and in the 8th week to evaluate the mid-term recovery after surgery. By using at least 6 subjects in the study, the power analysis result was 95%. The DNA similarity of the Wester Albino type experimental animals used shown as 99% strengthened the power analysis of our study. The groups were sacrificed by injection of high-dose anesthetic according to the time of sacrification. Materials obtained after removal of the right distal femur bones of the rats were fixed in 10% buffered formalin for 1 week. After fixation, the materials were decalcified in a solution prepared from 50% formic acid and 20% sodium citrate solutions. After decalcification, bone tissue samples were embedded in paraffin blocks and 5-7 μm thick sections cut with a microtome were taken on slides. These sections were stained with Hematoxylin-Eosin and Masson's Tricrom staining method and evaluated according to Modified Mankin 
and O'Driscol scales.
Variables were examined with the Kolmogorov Smirnov test and Histogram, and the Kruskal-Wallis test was used to compare the continuous variables that did not show normal distribution in 3 or more groups. When a significant difference is obtained as a result of the Kruskal-Wallis test, the Mann-Whitney test with Bonferroni correction was used to determine the groups causing the difference.IBM SPSS.23 program was used in all analyzes and p< 0.05 value was accepted as the level of significance.
Results: The cellular use of scaffolds showed a positive effect on morphological field changes. When the scaffold layers were compared, a minimal increase in the morphological area score of the double-layered scaffold application was observed compared to the single-layered scaffold, both with and without cells. In the surface regularity, better results were obtained in the doublelayered cellular scaffold group compared to the control group. The highest scores  of adjacent attachment were obtained with the double-layered cell-free scaffold during the acute recovery period. When the acute period results of the cell population are examined; Contrary to expectations, very low values were found in the cellular double and single layered scaffold groups compared to the control group. In cell population assessment, the best results in the acute and mid-term  were found in the control group. When the acute period results of cartilage plug  quality were examined, the efficiency of the double-layered cell-free scaffold was found to be significantly higher. However, this efficiency was not reflected in the mid-term results. When the state of the matrix is examined in recovery; During 
the whole recovery period, the closest score to the control group was found in the double-layered cellular scaffold group, and it was found that the double-layered scaffold forms a better matrix than the single-layered scaffold. In all-term results of structural integrity, it was observed that the structural integrity of the doublelayered cellular scaffold was better in the healed cartilage tissue. It has been observed that the double-layered scaffold is a more effective treatment method in wound filling. The efficiency of the double-layered scaffold in osteochondral attachment was 
found to be significantly higher. The efficiency of the double-layered scaffold in  adjacent attachment was detected in the acute period, and it was observed that this  efficiency continued in the mid-term with cell reinforcement. When the cluster distribution is examined, while the double-layer scaffold had a good efficacy in the acute phase results, the effectiveness of medium-term single-layered scaffold has increased significantly. When subchondral bone healing is examined, while double-layered scaffold activity was good in the acute period, single-layered scaffold activity increased significantly in the mid-term.
Conclusion: Considering the total score of Mankin scoring; While the double-layered scaffold was found to be more effective in acute recovery, no significant difference was found between the groups in the mid-term results. In the long-term results, the most effective treatment was the microfracture performed control group. Considering the total score of O'Driscol scoring; While the double-layered scaffold was found to be more effective in acute healing, much better results were obtained with the cellular application of this scaffold. These results were also found in the mid-term results. Double-layered scaffold can be considered as an alternative to microfracture treatment. Generally, the closest healing parameters to the microfracture group, which is the control group, were obtained in the cellular double-layered scaffold group. Recovering with the 
microfracture method in osteochondral cartilage defects is still up to date. Better results can be obtained histologically with various scaffolds produced by cartilage tissue engineering.