İnsan papilloma virüsünün saptanmasındalaboratuvar yapımı LAMP yönteminin etkinliğinindeğerlendirilmesi
O, evaluation of the efficacy of laboratory made lamp method indetection of human papilloma virus
Yazar: ONUR TAŞÇI
Danışman: PROF. DR. ALPASLAN ALP
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
İnsan Papilloma Virüsleri (Human papilloma virüs: HPV) insanlarda cilt ve mukoza
enfeksiyonlarına sebep olan DNA virüsleridir. HPV enfeksiyonu, en sık görülen
cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar arasında birinci sıradadır. Günümüzde 200'den
fazla HPV tipi tanımlanmıştır ve yüksek riskli (high risk: HR) tipler olarak bilinen
onkojenik HPV tiplerinin neden olduğu kalıcı enfeksiyon, kanser öncülü lezyonlara
ve kansere neden olabilmektedir. Bunlar arasında da HPV 16 ve HPV 18 tipleri en
yüksek karsinojenik potansiyele sahip olanlardır. HR HPV tiplerinin neden olduğu
kanserler arasında serviks kanseri ilk sırada gelmektedir ve serviks kanseri
olgularının çoğunluğu HPV 16 ve HPV 18 enfeksiyonlarından kaynaklanmaktadır.
Uygun aşılama ve tarama programları sayesinde serviks kanseri gelişmesine engel
olunabilmektedir. Klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında servikal sürüntülerden
HPV DNA varlığının araştırılması ve HPV genotiplemesi amacıyla PZR (Polimeraz
Zincir Reaksiyonu) temelli testler kullanılmaktadır. PZR için termal döngü cihazı
gibi özel bir ekipman, önemli miktarda zaman ve eğitimli personel gerekmektedir.
Bu gerekliliklerinden ötürü, PZR testlerine ulaşabilen birey sayısı sınırlıdır. PZR'nin
bilinen zorluklarına çözüm olması amacıyla Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon
(Loop Mediated Isothermal Amplification: LAMP) olarak bilinen yöntem
geliştirilmiştir. LAMP yöntemi ile kompleks laboratuvar cihazlarına ihtiyaç
duyulmadan, 60-65°C sabit sıcaklıkta ve kısa bir sürede DNA amplifikasyonu
gerçekleştirilebilmektedir. Bu çalışmada, serviks kanseri olgularının büyük
çoğunluğundan sorumlu olan HPV 16 ve HPV 18 genotiplerinin klinik örneklerden
saptanmasında LAMP yönteminin etkinliğini değerlendirmek amaçlanmıştır. Bir yıl
boyunca moleküler mikrobiyoloji laboratuvarında PZR testi sonuçlandırılan örnekler
içerisinde HPV 16 ve HPV 18 pozitif olanlar ileriye dönük olarak toplanmıştır.
Toplamda 288 adet servikal sürüntü örneğinden 259 adet HPV 16 ve 29 adet HPV 18
elde edilmiştir. LAMP için primer tasarlanması ve LAMP optimizasyonu yapıldıktan
sonra tüm izolatlar LAMP deneylerine dahil edilmiştir. LAMP yönteminin HPV 16

5

ve HPV 18 saptamadaki performansını değerlendirmek için PZR sonuçları referans
alınmıştır. Elde edilen sonuçlara göre LAMP yönteminin HPV 16 için duyarlılığı
%97 ve özgüllüğü %100 olarak saptanırken, HPV 18 için ise duyarlılık %86 ve
özgüllük %91 olarak saptanmıştır. LAMP yönteminin tespit edebileceği minimum
virüs miktarının HPV 16 ve HPV 18 genotiplerinin her ikisi için de 10 IU/mL olduğu
tespit edilmiştir. Çalışmada, LAMP yöntemi ile servikal sürüntülerden DNA
izolasyonu yapılmadan da HPV 16 ve HPV 18 saptamanın mümkün olduğu
görülmüştür. Bunun yanı sıra LAMP reaksiyon ürünlerinin tespitinde Sybr Green
boyası veya yanal akış şeridi kullanarak görsel sonuç almanın mümkün olduğu
görülmüştür. Sonuç olarak; LAMP yönteminin HPV 16 ve HPV 18 saptanması için
laboratuvarda veya hasta başı test uygulamasında faydalı bir yöntem olabileceği
düşünülmüştür. Örnek sayısı ve çeşitliliği arttırılarak, yöntemin performansını
geliştirici çalışmalara ihtiyaç olduğu kanısına varılmıştır.

Abstract:
Human Papillomaviruses (HPV) are DNA viruses that
cause skin and mucous membrane infections in humans. HPV infection ranks first
among the most common sexually transmitted infections. Today, more than 200 HPV
types have been identified and persistent infection caused by oncogenic HPV types
known as high risk (HR) types can cause precancerous lesions and cancer. Among
these, HPV 16 and HPV 18 types have the highest carcinogenic potential. Cervical
cancer ranks first among cancers caused by HR HPV types and the majority of
cervical cancer cases are caused by HPV 16 and HPV 18 infections. Appropriate
vaccination and screening programmes can prevent the development of cervical
cancer. In clinical microbiology laboratories, PCR (Polymerase Chain Reaction)
based tests are used to investigate the presence of HPV DNA in cervical swabs and
for HPV genotyping. PCR requires specialised equipment such as a thermal cycler, a
significant amount of time and trained personnel. Due to these requirements, the
number of individuals who can access PCR tests is limited. As a solution to the
known difficulties of PCR, a method known as Loop Mediated Isothermal
Amplification (LAMP) has been developed. With the LAMP method, DNA
amplification can be performed at a constant temperature of 60-65°C and in a short
time without the need for complex laboratory equipment. In this study, we aimed to
evaluate the efficiency of the LAMP method in the detection of HPV 16 and HPV 18
genotypes, which are responsible for the majority of cervical cancer cases, in clinical
samples. Among the samples whose PCR tests were completed in the molecular
microbiology laboratory for a year, HPV 16 and HPV 18 positive samples were
collected prospectively In total, 259 HPV 16 and 29 HPV 18 were obtained from 288
cervical swab samples. After primer design for LAMP and LAMP optimisation, all
isolates were included in LAMP experiments. PCR results were taken as reference to
evaluate the performance of LAMP method in HPV 16 and HPV 18 detection.
According to the results obtained, the sensitivity and specificity of the LAMP

7

method for HPV 16 were 97% and 100%, respectively, while the sensitivity and
specificity for HPV 18 were 86% and 91%, respectively. The minimum amount of
virus detected by the LAMP method was found to be 10 IU/mL for both HPV 16 and
HPV 18 genotypes. The study showed that it was possible to detect HPV 16 and
HPV 18 by LAMP method without DNA isolation from cervical swabs. It was
observed that it was possible to obtain visual results by using Sybr Green stain or
lateral flow strip in the detection of LAMP reaction products. As a result, it was
concluded that the LAMP method can be a useful method for the detection of HPV
16 and HPV 18 in the laboratory or in bedside testing. It was concluded that studies
are needed to improve the performance of the method by increasing the number and
variety of samples.