Farklı büyüme faktörleri içeren hedeflenmiş nanopartiküllerin nöral kök hücre farklılaşması üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of targeted nanoparticles containing different growth factors on neural stem cell differentiation
Yazar: AYŞEGÜL AÇIKSARI
Danışman: PROF. DR. YUSUFHAN YAZIR
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı / Kök Hücre ve Doku Yenilenmesi Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Amaç: Sunulan bu tez çalışmasında büyüme faktörü taşıyan nanopartiküller (Np) aracılığıyla dopaminerjik nöron kaybı sonucu ortaya çıkan Parkinson hastalığının tedavisi için sıçan beyninden elde edilen nöral kök hücrelerin (NKH) dopaminerjik nöronlara farklılaştırılması amaçlanmıştır.
Yöntem: Çalışmada öncelikle BDNF, GDNF ve TGF-ß3 yüklü, salım yaparak hücrelere ve mikroçevresine içeriğini aktaran, hücrelerin farklılaşmaya yönlenmesini sağlayan polimerik PLGA Np'ler çift emülsiyon yöntemi ile üretilmiştir. Farklı büyüme faktörü taşıyan Np'ler çeşitli kombinasyonlar halinde kullanılmış, bu partiküllerin in vitro ortamda NKH'lerin dopaminerjik nörona farklılaşması üzerine etkileri karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Farklılaşan hücrelerin gen düzeyinde analizleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile nöral belirteçlerin ekspresyonları incelenerek yapılmıştır. Hücrelerin protein düzeyindeki değişimleri immünfloresan ve ELISA çalışmaları ile belirlenmiştir. Elde edilen Np'lerin, transferrin (TRF) antikoru ile konjuge edildiğinde hedeflenebilir olduğu in vitro kan beyin bariyeri (KBB) modelinde gösterilmiştir.
Bulgular: Sonuç olarak büyüme faktörü yüklü Np'lerin kullanıldığı in vitro farklılaştırma sonrasında nöron benzeri morfolojiye sahip hücreler elde edilmiştir. Bu hücrelerde NKH belirteci olan Nestin geninin ekspresyonu değişmezken tirozin hidroksilaz (Th) geni ekspresyonunun yaklaşık 300 kat artış gösterdiği belirlenmiştir. Aynı zamanda bu hücrelerin dopaminerjik nöron belirteci olarak kabul edilen mikrotübül bağlantılı proteini (Map2) ürettiği floresan mikroskopta gösterilmiştir. Oluşturulan in vitro KBB modelinde TRF antikoru ile konjuge edilen Np'lerin hedefe spesifik olarak yönlendiği ve NKH içlerine alındığı coumarin-6 boyası aracılığı ile gösterilmiştir.
Sonuç: Sonuç olarak büyüme faktörü yüklü Np'ler ile yapılan in vitro farklılaştırma sonrası gruplarda belirgin farklar olduğu ve üç büyüme faktörünü de içeren Np'lerin kullanıldığı grupta daha etkin farklılaşma gerçekleştiği gözlenmiştir. Ayrıca antikor konjuge edilen Np'lerin NKH'lere daha hızlı ulaşabildiği gösterilmiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilen veriler ile Np'ler ve NKH'lerin Parkinson hastalığı tedavisinde ortak kullanımları ile ilgili yeni bir yaklaşım olabileceği ortaya konmuştur.
Anahtar Kelimeler: Nöral kök hücreler, nanopartiküller, kan-beyin bariyeri, Parkinson hastalığı

Abstract:
Objective: In this thesis, it is aimed to differentiate rat brain derived neural stem cells (NSC) into dopaminergic neurons for the treatment of Parkinson's disease caused by loss of dopaminergic neurons by means of growth factor loaded nanoparticles (Np). 
Method: In this study, BDNF, GDNF and TGF-ß3 loaded polymeric PLGA Np's which transfer their contents to the cells and their microenvironment via releases have been produced by double emulsion method. Np's carrying different growth factors were used in various combinations, and the effects of these particles on the differentiation of NSC's into dopaminergic neuron in in vitro environment were examined comparatively. Gene-level analyzes of differentiated cells were performed by examining the expressions of neural markers by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Changes in the protein level of the cells were determined by immunofluorescence and ELISA studies. It has been shown that the Np's can be targeted when conjugated with transferrin (TRF) antibody in the in vitro blood brain barrier model (BBB).
Results: It was determined that cells with neuron-like morphology were obtained after in vitro differentiation with growth factor loaded Np's. It was determined that the Nestin gene, which is a NSC marker, did not increase in these cells, but the expression of the tyrosine hydroxylase (Th) gene increased approximately 300 times. At the same time, it was demonstrated under fluorescence microscope that these cells produce microtubule-associated protein (Map2), which is considered a dopaminergic neuron marker. In the in vitro BBB model, it has been shown by the coumarin-6 dye that Np's conjugated with TRF antibody is directed specifically to the target and taken into the NSC.
Conclusion: As a result, it was observed that there were significant differences in the groups after in vitro differentiation with growth factor-loaded Np's, and more effective differentiation was observed in the group in which Np's containing all three growth factors was used. In addition, it has been shown that antibody conjugated Np's can reach NSC's faster. As a result of this study, a new approach has been developed for a possible use of Np's and NSC's in the treatment of Parkinson's disease.
Keywords: Neural stem cells, nanoparticles, blood-brain barrier, Parkinson's disease