Aspergillus niger a-amilaz enziminin pichia pastoris'te rekombinant üretimi
Recombinant production of aspergillus niger a-amylase enyzme in pichia pastoris
Yazar: FATMANUR MAVİ
Danışman: DOÇ. DR. AYSUN ÖZÇELİK
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Amilaz enzimi nişastanın parçalanmasını kataliz eder. a-amilaz enzimleri α-1,4 glikozidik bağı üzerine etki ederler. Gıda endüstrisinde fırıncılık ve meyve suyu üretimi başta olmak üzere, deterjan, tekstil ve kağıt endüstrisi gibi alanlarda amilazların kullanımı oldukça yaygındır. Endüstriyel alanda bu kadar çok kullanımı olan enzimlerin rekombinant üretimi son yıllarda çok çalışılan bir konu olmuştur. Pichia pastoris (P. pastoris) metilotrofik bir maya olup, rekombinant protein üretiminde başarılı bir şekilde kullanılan bir ekspresyon sistemidir. İndüklenebilen promotorlarının olması, ökaryotik proteinler için gerekli olan post-translasyonel modifikasyonları yapabilmesi, çok ucuz üreme ortamlarında gelişebilmesi ve çok yüksek hücre yoğunluklarına çıkabilmesi P. pastoris'in avantajları olarak sayılabilir. 
Bu çalışmada, Aspergillus niger (A. niger) a-amilaz enziminin üretimi ilk kez P. pastoris'te etanol ile indüklenebilen SNT5 promotoru kontrolü altında yapılmıştır. Bu amaçla kodon optimize şekilde temin edilen A. niger a-amilaz geni P. pastoris MK115-PDI suşuna transforme edilmiştir. Zeosin antibiyotiği içeren plakalardan seçilen tranformant Pichia hücreleriyle engelli erlenlerde 28 ˚C sıcaklık, pH 6.0 ve 225 rpm karıştırma hızında protein ekspresyonu yapılmıştır. Yapılan SDS-PAGE analizi sonucunda 58kDa büyüklüğünde a-amilaz enzimini ürettiği tespit edilen klon ile optimum protein üretim koşulları belirlenmiştir. Bu amaçla engelli erlenlerde farklı sıcaklık (20, 24 ve 28 ˚C) ve farklı pH (3, 4, 5, 6 ve 7) koşullarında protein üretimi yapılmış ve alınan örnekler analiz edilmiştir. 24 ˚C sıcaklık pH 6 ve pH 7'de yapılan üretimlerde sırasıyla 3349 U/mL ve 4519 U/mL enzim aktivitesi elde edilmiştir.   
a-amilaz enzimi üretimi 5L biyoreaktörde iki aşamalı fermantasyon stratejisi ile gerçekleştirilmiştir. Fermantasyon 24 ˚C sıcaklık, pH 6 ve çözünmüş oksijen seviyesi %20'de sabit tutularak 107 saat sürdürülmüştür. Fermantasyon sonunda en yüksek 65. saatte 2223 mg/L protein üretilmiş ve 44062 U/mL enzim aktivitesi hesaplanmıştır. Üretilen enzim karakterize edilmiş ve optimum çalışma sıcaklığı 60 ˚C ve pH'sı 7 olarak belirlenmiştir.
Bu tez çalışması sonucunda, A. niger a-amilaz enziminin P. pastoris MK115-PDI suşunda etanol ile indüklenebilen SNT5 promotoru kontrolünde üretimi yapılmış ve endüstriyel boyutta üretimi için veriler elde edilmiştir.

Abstract:
Amylase enzyme catalyzes the breakdown of starch. a-amylase enzymes act on the α-1,4 glycosidic bond. The use of amylases is quite common in areas such as baking and fruit juice production in the food industry, detergent, textile and paper industries. Recombinant production of enzymes, which have so many uses in the industrial field, has been a subject of much study in recent years. Pichia pastoris (P. pastoris) is a methylotrophic yeast and has been successfully used in recombinant protein production as an expression system. The advantages of P. pastoris include having inducible promoters, to make post-translational modifications required for eukaryotic proteins, to grow in very cheap growth media, and to reach very high cell densities.
In this study, the production of Aspergillus niger (A. niger) a-amylase enzyme was carried out for the first time in P. pastoris under the control of the ethanol-inducible SNT5 promoter. For this purpose, the A. niger a-amylase gene, which was provided in a codon-optimized form, was transformed into the P. pastoris MK115-PDI strain. Protein expression was performed with transformant Pichia cells selected from plates containing the antibiotic zeocin in shake flasks at 28 ˚C temperature, pH 6.0 and 225 rpm. As a result of the SDS-PAGE analysis, optimum protein production conditions were determined with the clone that was found to produce the 58kDa a-amylase enzyme. For this purpose, protein was produced in shake flasks under different temperature (20, 24 and 28 ˚C) and different pH (3, 4, 5, 6 and 7) conditions and the samples taken were analyzed. In the productions carried out at 24 ˚C temperature, pH 6 and pH 7, enzyme activity of 3349 U/mL and 4519 U/mL was obtained, respectively.
a-amylase enzyme production was carried out with a two-stage fermentation strategy in a 5L bioreactor. Fermentation was continued for 107 hours by keeping the temperature at 24 ˚C, pH 6 and dissolved oxygen level at 20%. At the end of fermentation, 2223 mg/L protein was produced and 44062 U/mL enzyme activity was calculated. The produced enzyme was characterized and the optimum working temperature was determined as 60 ˚C and pH 7.
As a result of this thesis study, A. niger a-amylase enzyme was produced in P. pastoris MK115-PDI strain under the control of the ethanol-inducible SNT5 promoter and data was obtained for its industrial production.