İkili enzim sistemi ile önemli alkol bileşikleri sentezi
The synthesis of important alcohol compounds by coupled enzyme system
Yazar: FATİH AKTAŞ
Danışman: DOÇ. DR. AYHAN ÇELİK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Alkol dehidrogenaz = Alcohol dehydrogenase ; Bacillus thuringiensis = Bacillus thuringiensis ; Biyotransformasyon = Biotransformation ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Enzim immobilizasyonu = Enzyme immobilization ; Enzimatik sentez = Enzymatic synthesis

Özet:
Protein mühendisliği çalışmaları ilerledikçe biyokatalistlerin endüstriyel önemi artmaktadır. Bu artışın sebebi biyokatalistlerin yüksek oranda seçici ve temiz ürün eldesinde kullanılma potansiyelidir. Buna bağlı olarak endüstriye uygun özellikte enzimlere olan ihtiyaç her geçen gün artmaktadır. Son yıllardaki genom sekanslama teknolojisinin gelişmesi ve zengin veri tabanlarının oluşması sebebiyle önemli enzim dizileri taranarak tahmini enzim analogları içeren veri bankaları zenginleştirilmektedir. Bu tahmini enzimler klonlama teknikleriyle elde edilmekte ve yüksek saflıkta rekombinant olarak sentezlenebilmektedir. Sentezlenen enzimlerin karakterizasyonu ve yapı-fonksiyon çalışmaları yapılarak amaca uygun enzimlere ulaşılabilmektedir.
Bu tez çalışmasında farmösotik kimyada ve ince kimyasallar sentezinde öncü madde olarak kullanılan önemli alkol bileşiklerinin biyosentezi için ikili enzim sistemi çalışması yapılmıştır. Enzimlerden birincisi olan alkol dehidrogenaz (BtADH) Bacillus thuringiensis serovar israelensis organizmasından klonlandı. Klonlanan enzim rekombinant olarak E.coli BL21(DE3) hücresine aktarılarak laboratuar ölçeğinde üretimi sağlandı. Saf ve aktif olarak elde edilen BtADH fiziksel ve biyokimyasal karakterizasyonu çalışmaları yapıldı. Bu yeni enzim peptid uzunluğu bakımından orta ölçekte (340 amino asit), çinko içeren ve mezofilik özelliktedir. İlaveten, BtADH primer alkollerin kısa ve orta uzunluktaki üyelerini tercih etmekle birlikte sekonder alkoller, aldehid ve keton bileşiklerinin de biyodönüşümünü sağlamaktadır. BtADH?ın aktivitesi için gerekli olan kofaktör (NADH) rejenerasyonu ikinci bir enzim olan Candida methylica kaynaklı format dehidrogenaz (CmFDH) yardımıyla gerçekleştirildi. 
İkili enzim sisteminin endüstriyel kullanımı için BtADH ve CmFDH kovalent olarak Eupergit C 250 Lye immobilize edildi. İmmobilizasyon karakterizasyonu her iki enzim için yapıldı. BtADHın aktivite gösterdiği tüm substratların kararlı hal kinetik çalışmaları spektroskopik olarak ve ürün analizleri gaz kromatografi (GC)  kullanılarak yapıldı.

Anahtar Kelimeler: Alkol dehidrogenaz (ADH), kofaktör rejenerasyonu, ikili 
enzim sistemi, biyoindirgenme, biyoyükseltgenme, enzim immobilizasyonu.

Abstract:
The use of biocatalysts in industrial applications has been rising sharply. The reason for this increase is due to inherent properties of enzymes being highly selective and environmentally benign; resulting in clean reaction products. Application of enzymes for the synthesis of high-value compounds requires suitable biocatalysts for relevant industries.  Developments in genome sequencing technology have resulted in creation of rich data bases. To exploit such rich sources, many studies performed using recombinant DNA technology to access enzymes in the recombinant forms. 
In this thesis, a coupled enzyme system was developed for the synthesis of important alcohol compounds in which a novel alcohol dehydrogenase and formate dehydrogenase have been utilized. Alcohol dehydrogenase (named as BtADH) was cloned from Bacillus thuringiensis serovar israelensis, and high level of expression was achieved in the recombinant form.  BtADH was investigated for physical and biochemical properties, and found to be a zinc-containing and being a medium-chain length of dehydrogenase. This enzyme shows remarkable activities with the members of primary alcohols short to medium-length. BtADH also shows activity with secondary alcohols, aldehydes and ketones.  
Cofactor (NADH) that is required for the activity of BtADH was regenerated by the second enzyme of formate dehydrogenase from Candida methylica (CmFDH). For the purpose of industrial use, coupled enzyme system of CmFDH and BtADH were co-immobilized to Eupergit C-250L by covalent linking. Characterization of the coupled enzyme system was completed in both free and immobilized forms. Steady-state kinetics and product analysis were performed by Uv-vis spectrophotometer and gas chromatography (GC) respectively for many substrates of interest.

Keywords: Alkol dehydrogenase (ADH), cofactor recycling, coupled enzyme 
system, bioreduction, biooxidation, enzyme immobilization.