Kalsitonin testi için yöntem değerlendirme çalışması
Method evaluation study for calcitonin test
Yazar: SELİN YILDIZ SALATAN
Danışman: DOÇ. DR. ASUMAN ORÇUN
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Dr. Lütfi Kırdar Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Doğrulama = Verification ; Kalsitonin = Calcitonin ; Luminesan ölçümler = Luminescent measurements ; Tiroid hastalıkları = Thyroid diseases ; Tiroid neoplazmları = Thyroid neoplasms

Özet:
Amaç: Tiroid bezi parafoliküler C hücreleri tarafından salgılanan  kalsitonin, aynı hücrelerden köken alan medüller tiroid karsinomunun (MTC) en hassas biyokimyasal belirtecidir, ayrıca tedavi sonrası izlemde de önemli bir yeri vardır. Laboratuvarlar kullandıkları yöntemlerin geçerliliğini ve belirlenen amaçlar doğrultusunda çalıştığını objektif kanıtlarla doğrulamakla yükümlüdür.  Bu çalışmada  laboratuvarımızda rutin kullanıma yeni başlanan kalsitonin ölçümü için kullanılan kitin performansını kendi laboratuvar koşullarımızda test etmeyi amaçladık.
    Gereç ve Yöntem: Bu bir analitik metod değerlendirme çalışmasıdır. Çalışmamızda Roche HITACHI Cobas e601 (Tokyo,Japonya) cihazında elektrokemilüminesan immunoassay (ECLIA) yöntemi ile çalışılan  kalsitonin kitinin yöntem değerlendirme kapsamında kesinlik,  doğrulık, linearite, dedeksiyon limitleri  ve referans aralık parametreleri değerlendirildi. Çalışmalar için laboratuvarımıza kalsitonin ve farklı test istemleri için gelen hasta örneklerinden kalan serumlar ve firma tarafından sağlanan kontrol ve standart çözeltiler kullanıldı. Presizyon çalışması için düşük     (3.5  ng/L ) ve yüksek (175  ng/L) düzeyde analit içeren iki serum havuzunun her seviye için beş gün boyunca günde üç kez çalışılması ile elde edilen ortalama (x), standart sapma (SD)  varyasyon katsayıları (CV) hesaplandı.Varyasyon katsayısı için %CV = (SD / x)*100 formülü kullanıldı. Sonuçlar  firma tarafından önerilen  %CV değerleri ile karşılaştırıldı. Metod karşılaştırma için Cobas e 601  ve Siemens Immulite 2000 XPi (Llanberis Gwynedd, Birleşik Krallık)  cihazı ile  ölçüm aralığı içinde 40 hasta örneğinde 5 gün boyunca (günde 8 hasta) kalsitonin ölçümü yapıldı. Veriler Bland - Altman grafiği , Passing-Bablok regresyon analizi ve korelasyon katsayısı ile değerlendirildi.  Doğrusallık çalışması kalsitonin yüksek serum havuzunun (996  ng/L)  dilüsyonuyla elde edilen 11 farklı konsantrasyon ile yapıldı. Sonuçlar lineer regresyon analizi ile değerlendirildi. Dedeksiyon limitleri için ardarda 20 kez çalışılan körden (distile su) elde edilen sinyal değerleri ile kör sınırı  LOB =x (kör) + 1.645* SD(kör) formülü ile, en düşük kalibratörün dilüsyonuyla elde edilen örnek (0.9 ng/L) kullanılarak LOD =  LOB  + 1.645* SD (düşük seviye örnek) formülü ile hesaplandı. Tayin Sınırı (limit of quantitation, LOQ) için, firma tarafından belirlenen LOQ değerine (1 ng/L) yakın konsantrasyonda  oluşturulan 7 seviye örnek 10 gün çalışıldı. %95 güven aralığı içinde CV'si  %20'nin altındaki en düşük konsantrasyon LOQ olarak belirlendi. Referans aralık çalışması için 20 kadın, 20 erkek sağlıklı 40 gönüllüde kalsitonin ölçümü yapıldı, cinsiyete göre önerilen (kadın için <6.4 ng/L , erkek için < 9.2 ng/L) referans aralık değerleri içinde olup olmadıkları değerlendirildi. Çalışmadaki her bir parametre ilgili Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) değerlendirme dökümanında (EP)  önerildiği şekilde planlandı. 
    Bulgular: Presizyon çalışmasında firma tarafından bulunan total CV; düşük seviye için %2.0 yüksek seviye için %2.3 iken ; çalışmamızda elde edilen CV'ler ise sırasıyla %2.2  ve %2.7 ile firma değerleriyle uyumlu bulundu.  Metod karşılaştırma çalışmasında 40 hasta örneğinde de Cobas e 601 ile İmmulite 2000XPi'ye göre daha yüksek sonuçlar elde edildi. Bland-Altman analizinde pozitif bias (%19,6) saptandı. Passing-Bablok regresyon analizinde  lineariteden sapma gözlenmedi (p>0,10) ve    y  = 0.5780  + 1.1533 x denklemi  elde edildi. Mann Whitney U testinde değerler arasında anlamlı fark saptanmadı (p>0,05). Linearite çalışmasında kit 0.97- 996  ng/L  aralığında doğrusal bulundu. Elde edilen %uygunluk değerleri   %85 - 103 aralığında idi. Regresyon denklemi y =-2.7516 + 0.9757x elde  edildi. LOB 0.131 ng/L , LOD 0.216 ng/L, LOQ 0.73 ng/L bulundu. Çalışmamızda hem kadın hem erkek sağlıklı gönüllü grubunda cinsiyete göre belirlenmiş referans aralıkları dışında kalsitonin değeri olmadığı için referans aralık geçerli sayılmıştır.      
    Sonuç: Laboratuvarımızda Roche HITACHI Cobas e 601 cihazında elektrokemiluminesan yöntemiyle çalışılmaya başlanan kalsitonin kitinin  performans parametrelerini CLSI tarafından önerilen şekilde değerlendirdiğimiz çalışmamızda üreticinin bildirdiği kriterler sağlanmıştır ve yöntem rutin kullanım için uygun bulunmuştur. 

Anahtar kelimeler: kalsitonin, elektrokemiluminesan ,  medüller tiroid karsinomu , metod validasyonu, verifikasyon

Abstract:
Purpose:  Calcitonin secreted by parafollicular C cells of the thyroid gland is the most sensitive biochemical marker of medullary thyroid carcinoma (MTC) originating from the same cells and and has an important role in post-treatment follow-up. Laboratories are obliged to verify the validity of the methods they use and whether they work for the specified purposes with objective evidence. In this study, we aimed to test the performance of the kit used for calcitonin test in our laboratory under routine conditions.
     Materıals and Methods: This is an analytical method evaluation study. In this study, precision, accuracy, linearity, detection limits and reference range parameters of calcitonin kit which was studied by electrochemiluminescent immunoassay (ECLIA) method in Roche HITACHI Cobas e 601 (Tokyo, Japan) were evaluated. For the studies, serum samples of patients who came to our laboratory for calcitonin and some other test requests, as well as various levels of control and standard solutions provided by the company were used. Blood samples were also taken from 40 healthy volunteers for reference interval study. Two serum pools containing low (3.5 ng / L) and high (175 ng / L) analytes for the precision study were run three times a day for five days for each level. The mean (x), standard deviation (SD) coefficients of variation (CV) were calculated. % CV = (SD / x) * 100 formula was used for the CV. The results were compared with the CV values recommended by the company. Calcitonin was measured for 5 days in 40 patient  (8 patients per day) samples within the measuring range with Cobas e 601  and Siemens Immulite 2000 XPi (Llanberis Gwynedd, UK) for method comparison. Data were evaluated with Bland - Altman graph, Passing Bablok regression analysis and correlation coefficient. The linearity study was performed with a high serum pool of calcitonin  (996 ng /L) and 11 different concentrations obtained by dilutions. The results were evaluated by linear regression analysis. For detection limits, the signal values obtained from the blind (distilled water), which were run 20 times in succession, were the limit of blank                                       LOB = x(blind)+ 1.645 *SD (blank). The LOD was calculated using LOD = LOB + 1.645 * SD (low level sample) using the sample obtained by dilution of the lowest calibrator (0.9 ng / L). For the limit of quantitation (LOQ), 7 levels of sample formed at a concentration close to the LOQ value (1 ng/L) determined by the company were studied for 10 days and %CV values were calculated. Within the 95% confidence interval the lowest concentration was determined as LOQ with a CV of less than 20%. For the reference interval study, calcitonin was measured in 40 healthy volunteers (20 females and 20 males) and evaluated for gender (<6.4 ng / L for females, <9.2 ng / L for males). Each parameter in the study was planned as recommended in the relevant Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) evaluation document (EP).
     Results: The total CV suggested by the firm in the precision study; 2.0% for the low level and 2.3% for the high level; the CVs obtained in our study were found to be consistent with the firm values with 2.2% and 2.7%, respectively.  In the method comparison study, 40 patients had higher results with Cobas e 601 compared with  Immulite 2000XPi. Bland-Altman analysis revealed positive bias (19.6%) with Cobas e601. Passing-Bablok regression analysis showed no deviation from linearity               (p> 0,10) and the equation y = 0.5780 + 1.1533 x was obtained. There was no significant difference between the values in Mann Whitney U test (p > 0,05).  In the linearity study, the kit was found to be linear in the range of 0.97- 996 ng / L. The recovery values obtained were between %85 - 103. The regression equation y = -2.7516 + 0.9757x was obtained. LOB was 0.131 ng / L, LOD was 0.216 ng / L, and LOQ was 0.73 ng / L. In our study, since there were no patients other than the reference ranges determined by gender, the reference range was considered valid in both healthy male and female volunteers.
     Conclusıon : In our study, we evaluated the performance parameters of calcitonin test which was started to work with electrochemiluminescent immunoassay method in Roche HITACHI Cobas e 601 device in our laboratory , as recommended by CLSI.  And the desired criteria were met and the device was found suitable for routine use.
   
    Key words: calcitonin, electrochemiluminescence , medullary thyroid carcinoma, method validation, verification