Orman kesim artıklarından Mikrodalga Ekstraksiyonu Yöntemi (MEY) ile Derin Ötektik Çözücüler (DÖÇ) kullanılarak elde edilen biyoaktif bileşenlerin karakterizasyonu
Characterisation of bioactive compounds obtained from forest trimmings by microwave assisted extraction (MAE) using Deep Eutectic Solvents (DES)
Yazar: DİDEM VEREP
Danışman: PROF. DR. SAİM ATEŞ ; DOÇ. DR. EYYÜP KARAOĞUL
Kastamonu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Orman Endüstri Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Ormancılık ve Orman Mühendisliği = Forestry and Forest Engineering

Özet:
Günümüzde orman kesim artıkları birçok ürünün hammadde ihtiyacını karşılamakta önemli bir potansiyel olarak görülmektedir. Doğada bırakılması halinde oluşturacağı olumlu etkilerle birlikte en önemli sakınca da olarak, büyük bir potansiyelin atıl kalması yanında, kuruduklarında oluşturacakları yüksek miktarlardaki biyokütlenin yangın risklerini artırmasıdır. Orman ağaçlarının yıllık sürgün ve dallarının ekstraktif bileşenleri ve karakterizasyonu ile ilgili çalışmalar bulunmasına karşın son zamanlarda geliştirilen çevre dostu, enerji, maliyet ve zaman açısından etkili yeni çözücü ve ekstraksiyon yöntemlerinin geliştirilmesiyle biyokütle bileşiminin kalitatif ve kantitatif olarak ne şekilde bir değişim göstereceği, farklı çözücülerin bu değişime etkilerinin araştırılması ihtiyacı ortaya çıkmıştır. 
                                        
Bu çalışmada karaçam (Pinus nigra), meşe (Quercus robur), göknar (Abies nordmanniana)  ve kayın (Fagus orientalis) ağaçlarının ibre, yaprak ve sürgünlerinden oluşan orman kesim atıklarından, Mikrodalga Destekli Ekstraksiyon Yöntemi (MEY) ile farklı Derin Ötektik Çözücüler (DÖÇ) ve organik çözücüler kullanılarak elde edilen ekstrakt ve uçucu yağların karakterizasyonu ve antimikrobiyal aktiviteleri gerçekleştirilmiştir. Uçucu bileşenlerin analizi GS-MS-SPME analizi, uçucu olmayan bileşenlerin tayini ise LC-MS/MS analizleri ile yapılmıştır. Elde edilen her bir ekstraktın şeker ve organik asit içeriği HPLC analizi ile belirlenmiştir. Ekstraksiyon öncesi ve sonrası yaprak yüzeyleri, SEM (Taramalı Elektron Mikroskobu) ile görüntülenmiştir. Elde edilen ekstraktların, toplam fenolik, flavonoid ve antosiyanin madde miktarları standart metodlar ile belirlenmiştir. Ekstrakt ve uçucu yağların antioksidan aktivitelerini belirlemek için DPPH, ABTS ve CUPRAC analizleri gerçekleştirilmiş süpürme, trolox ve IC50 değerleri hesaplanmıştır. Ayrıca, ekstrakt ve uçucu yağların, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa ve Bacillus cereus suşlarına karşı disk difüzyon yöntemi ile antimikrobiyal aktiviteleri de belirlenmiştir.

Ekstraksiyon işlemi sonucunda, derin ötektik çözücülerin kullanıldığı ekstraktların verimleri %29,56-72,57 aralığında bulunmştur. Karaçam, meşe, göknar ve kayın ağaçlarının yapraklı yıllık sürgünlerinde, uçucu bileşen analizine göre sırasıyla %14,19; %14,42; %17,76 ve %25,80 ile en yüksek oranları veren 1R-α-pinene bileşenine rastlanmıştır. LC-MS/MS analizi ile ekstraktlarda tespit edilen 23 bileşen içerisinde; en yüksek sonuçları şikimik asit ve kateşi̇n bileşenleri vermiştir. Şikimik asit de 263,203 µg/L ile en yüksek değeri veren etanol+Kç; kateşi̇n için ise 11,495 µg/L ile en yüksek sonucu veren etanol+M numuneleri olmuştur. Döç-3+K numunesi 195,948 g/L turanoz; döç-3+K numunesi ise 82,393 g/L maltoz ile ekstraktlar içerisindeki en yüksek şeker içeriğini vermiştir. Toplam fenolik madde içeriği bakımından metanol ve etanol çözücülerinden elde edilen ekstraktlar sırasıyla 77,238-237,637 mg/L ve 183,316-242,436 mg/L aralığındaki değerlerle en yüksek içeriği vermiştir. Toplam flavonoid madde içeriği bakımından da benzer şekilde en yüksek sonuçları 68,072-192,517 mg/L ve 153,628-222,114 mg/L aralığında değerler veren sırasıyla metanol ve etanol çözücülerden elde edilen ekstraktlar olmuştur. Toplam antosiyanin madde içeriğinde ise aseton+M ve metanol+M sırasıyla 1,920 mg/L; 0,818 mg/L ile en yüksek içeriğin görüldüğü ekstraktlar olmuştur. IC50 değerlerine göre, DPPH analizinde sırasıyla 5,18 mg/L ve 7,72 mg/L değerlerine veren aseton+K ve etanol+M; ABTS analizinde sırasıyla 1,79 mg/L ve 8,82 mg/L sonuçlarını veren döç-1+K ile saf su+G ekstraktları en yüksek antioksidan aktiviteyi göstermiştir. CUPRAC analizinde ise etanol+K ve metanol+M ekstraktları sırasıyla 116,077 mg/L ve 111,311 mg/L ile en yüksek trolox sonucunu vererek en yüksek antioksidan aktiviteyi göstermişlerdir. Tüm numuneler içerisinde en yüksek antibakteriyel aktiviteyi, B. cereus'a karşı 15 mm'lik zon oluşturan etanol+G ekstraktı göstermiştir.

Sonuç olarak yüksek verimlerin elde edildiği derin ötektik çözücülerden elde edilen ekstraktların, odunun ana bileşeninde, degradasyonundan kaynaklı yüksek şeker içeriğine sahip olduğu belirlenmiştir. Organik çözücülerden elde edilen ekstraktların derin ötektik çözücülerden elde edilen ekstraktlara göre daha düşük verim göstermelerine rağmen yüksek polaritede olmaları sebebiyle bitkide fenolik bileşenleri çözme kabiliyetinin daha iyi olduğu düşünülmektedir. Fenolik bileşenlerce zengin olan ekstraktların yüksek antioksidan, antibakteriyel ve antifungal aktivitede oldukları tespit edilmiştir. Endüstriyel alanda kullanımı yaygın olan karaçam, meşe, göknar ve kayın ağaçların yapraklı yıllık sürgünlerinden çevre dostu, daha az enerji ve süre kullanımı ile elde edilen ekstraktların antioksidan, antibakteriyel ve antifungal aktiviteleri bakımından farmakolojide, kozmetik sanayisinde ve takviye gıda olarak kullanılabileceği önerilmektedir. Bu sayede endüstriyel orman kesim artıklarının özellikle sağlık sektöründe değerlendirilmesi ile, hem orman kesim artıklarının geri dönüşümle değerlendirilerek yangınlar için büyük risk oluşturan önemli bir etmenin ortadan kaldırılabilmesi hem de toplumun doğal ve organik esaslı ürün kullanımına yönelik talebinin karşılanmasında katma değerli ürünlerin üretiminde rahatlıkla değerlendirilebilir.

Abstract:
Today, forest cutting residues are seen as having an important potential to meet the raw material needs of many products. In addition to the positive effects of leaving them in nature, the most important drawback is that a great deal of potential remains idle, and the high amount of biomass they will form when they dry out increases the risk of fire. Although there are studies on the extractive components and characterization of annual shoots and branches of forest trees, with the recent development of new environmentally friendly, energy-, cost-, and time-effective solvents and extraction methods, the need to investigate how the composition of biomass will change qualitatively and quantitatively and the effects of different solvents on this change has emerged. 
                                       
In this study, characterization and antimicrobial activities of extracts and essential oils obtained from forest-cutting wastes consisting of needles, leaves, and shoots of larch (Pinus nigra), oak (Quercus robur), fir (Abies nordmanniana), and beech (Fagus orientalis) trees were carried out by the Microwave-Assisted Extraction Method (MAE) using Deep Eutectic Solvents (DES) and organic solvents. Volatile components were analyzed by GS-MS-SPME, and non-volatile components were analyzed by LC-MS/MS. The sugar and organic acid content of each extract were determined by HPLC analysis. The leaf surfaces of the trees used before and after extraction with each solvent were imaged by SEM (Scanning Electron Microscopy). The total phenolic, flavonoid, and anthocyanidin contents of the extracts were determined by methods. DPPH, ABTS, and CUPRAC analyses were performed to determine the antioxidant activities of the extracts and essential oils, and scavenging, trolox, and IC50 values were calculated. In addition, by disk diffusion method, the extracts and essential oils were determined to have antimicrobial activities against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, and Bacillus cereus strains.

As a result of the extraction process, the yields of the extracts using deep eutectic solvents were in the range of 29,56-72,57%. In the leafy annual shoots of larch, oak, fir, and beech trees, 1R-α pinene was found in the volatile component analysis with the highest percentages of 14,19%, 14,42%, 17,76%, and 25,80%, respectively. Among the 23 components detected in the extracts by LC-MS/MS analysis, shikimic acid and catechin components gave the highest results. Ethanol+Kç gave the highest value with 263,203 µg/L for shikimic acid, and ethanol+M samples gave the highest result with 11,495 µg/L for catechin. The döç-3+K sample had the highest sugar content among the extracts, with 195,948 g/L of turanose and 82,393 g/L of maltose. In terms of total phenolic content, the extracts obtained from methanol and ethanol solvents had the highest content, with values in the range of 77,238–237,637 mg/L and 183,316–242,436 mg/L, respectively. Similarly, the highest results in terms of total flavonoid content were obtained from the extracts obtained from methanol and ethanol solvents, which gave values in the range of 68,072–192,517 mg/L and 153,628–222,114 mg/L, respectively. Acetone+M and methanol+M had the highest total anthocyanidin content, with 1,920 mg/L and 0,818 mg/L, respectively. According to IC50 values, acetone+K and ethanol+M gave values of 5,18 mg/L and 7,72 mg/L, respectively, in DPPH analysis; döç-1+K and purified water+G extracts, which gave results of 1,79 mg/L and 8,82 mg/L, respectively, in ABTS analysis, showed the highest antioxidant activity. In CUPRAC analysis, ethanol+K and methanol+M extracts showed the highest antioxidant activity, with the highest trolox result of 116,077 mg/L and 111,311 mg/L, respectively. ethanol+G extract showed the highest antibacterial activity among all samples, forming a 15 mm zone against B. cereus.

Consequently, high yield extracts, obtained from deep eutectic solvents, were found to have a high sugar content due to the degradation of the main components of wood. Although extracts obtained from organic solvents showed lower yields than from deep eutectic solvents that they are thought to have a better ability to dissolve phenolic components in the plant due to their high polarity. The extracts rich in phenolic compounds were found to have high antioxidant, antibacterial, and antifungal activities. It is suggested that the extracts obtained from the leafy annual shoots of larch, oak, fir, and beech trees, widely used in the industrial production, can be used in pharmacology, the cosmetics industry, and as food supplements in terms of antioxidant, antibacterial, and antifungal activities. In this way, it is suggested that by utilizing industrial forest trimming residues, especially in the health sector, both an important factor that poses a great risk for fires can be eliminated by recycling forest felling residues and value-added products can be produced to meet the demand of society for the use of natural and organic-based products.