Timol yüklü kitosan nanopartiküllerinin optimizasyonu ve karakterizasyonu
Optimization and characterization of thymol loaded chitosan nanoparticles
Yazar: MUHAMMET ALİ ÇAKIR
Danışman: DOÇ. DR. FATİH TÖRNÜK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Timol, çeşitli kekik türlerinden elde edilen uçucu yağların majör bileşenlerinden birisi olan, antimikrobiyal ve antioksidan aktivite gibi önemli fonksiyonel özellikler gösteren biyoaktif bir moleküldür. Timolün suda çözünür olmaması, gıda endüstrisinde katkı maddesi olarak kullanımını kısıtlayan en önemli etkendir. Bu çalışmada, timolün kitosan (KS) kullanılarak iyonik jelasyon yöntemi ile nano ölçekte enkapsülasyon koşulları optimize edilmiş ve optimum koşullarda elde edilen timol yüklü kitosan nanopartikülleri (TKNP) karakterize edilmiştir. Çalışmanın birinci aşamasında; sıcaklık (25-45 °C) ve KS (3-6 mg/mL), timol (3-6 mg/mL), Tween 80 (T80, 3-6 mg/mL) ve tripolifosfat (TPP,0,15-0,75 mg/mL) konsantrasyonu olmak üzere iyonik jelleşme ile enkapsülasyon sırasında uygulanan 5 proses parametresi, faktöriyel dizayn (FD) yöntemi uygulanarak optimize edilmiştir. Optimizasyonda, düşük partikül çapı, sıfırdan uzak zetapotansiyel (ZP) ve yüksek enkapsülasyon etkinliği (EE) hedeflenmiştir. Yapılan optimizasyon çalışmaları sonrasında, optimum proses parametreleri 42 °C sıcaklık, 3 mg/mL KS oranı, 5,9 mg / mL timol oranı, 3 mg/mL T80 oranı ve 0,75 mg / mL TPP oranı olarak belirlenmiştir. 
Bu noktada üretilen TKNP'nin EE, ZP ve ortalama partikül çapı sırasıyla % 64,1, 35,5 mV ve 317,4 nm olarak bulunmuştur. Çalışmanın ikinci aşamasında ise optimum koşullarda üretilen TKNP ayrıntılı olarak karakterize edilmiş ve SEM, DSC, RAMAN, FTIR, antibakteriyel ve antioksidan aktiviteleri ile in vitro salım şartları belirlenmiştir. FTIR ve Raman ölçümleri ile KNP'lere timol yüklenmesi sonucu TKNP oluşumundaki moleküler etkileşimleri işaret eden yeni piklerin ortaya çıkışı ve bu piklerin alanlarında meydana gelen  artış gözlemlenmiştir. SEM analizlerinde, timol eklenmesiyle nanopartiküllerin boyutunun genişlediği görülmüş ve TKNP'ler 200-590 nm arasında küresel bir şekil göstermişlerdir. TKNP'ler (IC50=0,55 mg/mL) ve saf timolün (IC50=0,747 mg/mL) DPPH radikal yakalama aktiviteleri karşılaştırıldığında, kapsüllenme işlemiyle timolün antioksidan aktivitesinin arttığı gözlemlenmiştir. TKNP'ler en yüksek antibakteriyel etkiyi Listeria monocytogenes üzerinde gösterirken, en düşük etki Staphylococcus aureus üzerinde gözlemlenmiştir. KNP'ler için ise tam tersi sonuçlar elde edilmiştir. Sıvı besiyeri dilüsyon metodunda, TKNP ve KNP'ler 24 saatte bakteri sayılarında istatistiksel olarak önemli (P<0.05) azalmalar sağlarken, TKNP'lerin %2'lik (v/v) seviyesini içeren ortamlarda L. monocytogenes sayısı 24 saat sonunda tespit limitinin altında bulunmuştur. Asetat tamponunda (pH 3), fosfat tamponuna (pH 7,2) göre daha yavaş aktif madde salımı meydana gelmiştir. Şişme indeksi ve partikül verimi sırasıyla % 6,7±0,3, ve % 30,8±2,76 olarak bulunmuştur. Sonuç olarak, bu çalışma ile düşük partikül çapına sahip, suda çözünebilir, kontrollü salım yapan ve yüksek antioksidan ve antimikrobiyal aktivite gösteren TKNP'ler yüksek verimde üretilmiştir.

Abstract:
Insolubility of thymol in water is the most important factor limiting its use as an additive in the food industry. In this study, conditions of the nano scale encapsulation of thymol using chitosan (CS) by ionic gelation method were optimized and the thymol loaded chitosan nanoparticles (TCNPs) obtained under optimum conditions were characterized. In the first stage of the study; 5 process parameters namely temperature (25-45 °C) and concentrations of CS (3-6 mg/mL), thymol (3-6 mg/mL), Tween 80 (T80, 3-6 mg/mL) and tripolyphosphate (TPP, 0.15-0.75 mg/mL) applied during the encapsulation with ionic gelation were optimized by using the factorial design (FD) method. The lowest particle diameter, zetapotential (ZP) far from zero and the highest encapsulation efficiency (EE) were aimed during the optimization. At optimization studies, the optimum process parameters were determined as 42 °C temperature, 3 mg/mL CS ratio, 5.9 mg/mL thymol ratio, 3 mg/mL T80 ratio and 0.75 mg/mL TPP ratio. The EE, ZP and average particle diameter of the TCNP produced at this point were found to be 64.1%, 35.5 mV and 317.4 nm, respectively. In the second stage of the study, the TCNP produced under optimum conditions was characterized in detail and SEM, DSC, RAMAN, FTIR, antibacterial and antioxidant activities as well as in vitro release conditions were determined. The incidence of new peaks indicating the molecular interactions during the formation of the TCNPs and the increase in the peak densities were observed with FTIR and Raman measurements. In SEM analyzes, it was observed that the size of the nanoparticles expanded with the addition of thymol, and the TCNPs showed a spherical shape between 200-590 nm diameter. When comparing the DPPH radical scavenging activities of the TCNPs (IC50 = 0.55 mg/mL) and pure thymol (IC50 = 0.747 mg/mL), it was observed that the antioxidant activity of thymol increased with the encapsulation process. The lowest antibacterial effect of the TCNPs was observed on Staphylococcus aureus while they showed the highest effect on Listeria monocytogenes, In the case of CNPs, the opposite results were obtained. TCNP and CNPs provided statistically significant (P<0.05) decreases in bacterial numbers in 24 h during broth dilution method, L. monocytogenes numbers were below the detection limits after 24 hours in the existence of 2% (v/v) TCNPs. A slower release of the active compound at acetate buffer (pH 3) occurred as compared to the phosphate (pH 7.2). Swelling index and particle yield was found as % 6.7±0.3 and %30.8±2.76, respectively. In conclusion, water-soluble and controlled release TCNPs with low particle diameter and high antimicrobial and antioxidant activity were produced with this study.