Termofilik bakterilerden lipaz üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of lipase by thermophilic bacteria
Yazar: ALİ KOÇYİĞİT
Danışman: PROF. DR. İSMAİL KARABOZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada değişik kaynaklardan elde edilen 104 termofilik bakteri izolatının ekstraselüler termostabil lipaz üretim kapasiteleri kalitatif olarak taranmıştır. Bunlardan sadece 26'si Rhodamin B Agar'lı modifiye Thermoactinomyces besiyerinde pozitif sonuç vermiştir ve potansiyel lipaz üreticisi olarak izolat EFTL17 bundan sonraki çalışmalar için seçilmiştir. Pozitif sonuç veren izolatlardan en yüksek miktarda ışıma yapanı daha sonraki lipaz üretim çalışmaları için seçilmiştir. İzolatın tanılaması 16S rRNA gen bölgesine göre yapılmış ve Gen Bankası'ndaki baz dizisi çakışmasına göre Themobifida fusca EFTL17 olarak adlandırılmıştır. Kantitatif ekstraselüler lipaz aktivitesi spektrofotometrik yöntemle ölçüldü 5. günde lipaz aktivitesi 558,7 U/L bulunmuştur. Ekstraselüler lipaz üretimi üzerine çeşitli karbon, organik, inorganik azot kaynakları, ticari yağlar, aşılama oranları, sıcaklık, indükleyici madde oranlarını ve üretim ortam pH'sının etkisi incelenmiştir.Themobifida fusca EFTL17 suşuna ait ekstraselüler termostabil lipaz 10 kDa NMWC ultrafiltrasyon membran ile kısmi saflaştırılmıştır.T. fusca'dan üretilen ve kısmi saflaştırılması yapılan lipaz enziminin aktivitesi üzerine sıcaklık, pH, metal iyonları, inhibitörler, deterjanlar ve organik çözgenlerin etkisi araştırılmıştır. Elde edilen enzimin 25 ? C'de inaktif oldukları, 55-85 ? C arasında aktif oldğu, optimum aktiviteyi 65 ? C ve 7,2 pH'da gösterdiği; ayrıca pH 5,0 ? 9,0 aralığında aktif olduğu bulunmuştur. Hg2+, Zn2+, Ni2+, Fe3+, Mn2+, Li2+ gibi ağır metaller lipaz aktivitesini % 55 ? 68 oranında azaltmışlardır. Cu2+ % 26 oranında, Co2+ ise ancak % 10 oranında azaltmıştır. % 0,1 (ağırlık/hacim) konsantrasyonlarında Tween 80, Tween 20, SDS ve Brij 35'in % 45 ? 68 oranında inhibe ettiği saptanmıştır. Ayrıca metanol, dimetilsülfoksit, etanol, izopropanol, aseton gibi organik çözgenlerde lipaz aktivitesinde artışa neden olmuşlardır. Kloroform % 86, hekzan % 60, toluen ise % 36 oranında lipaz aktivitesinde bir azalmaya neden olduğu belirlenmiştir.Kısmi saflaştırılan Thermobifida fusca EFTL17 lipazının aktivitesi üzerine etkili koşullar dikkate alındığında bu enzimin termostabil olduğu ve organik çözgenlerde aktivitesinin iyi olması onun biyoteknolojik uygulamalar için bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.Anahtar Kelimeler: Termofilik aktinomisetler, Termostabil lipaz, Lipaz üretimi ve karakterizasyonu

Abstract:
In this study, extracellular thermostable lipase production capacity of 104 thermophilic bacteria, isolated from various sources, were tested. Only 26 of these thermophilic bacteria gave positive result in modified Thermoactinomyces medium with Rhodamine B and isolate EFTL17 was selected as a lipase producer for further studies. Identification of the microorganism has done by its 16S rRNA gene sequencing and it was named Themobifida fusca EFTL17 according to the GeneBank sequence comparison studies. Quantitative extracellular lipase activity was estimated spectrophotomertrically and the maximum lipase activity was observed with 558,7 U/L at fifth day. The effects of various carbon and nitrogen sources, different commercial oils, different inoculation rates, different temperatures, percentages of added inducer and different production media for extracellular lipase activity was observed.Extracellular thermostable lipase from Thermobifida fusca EFTL17 was partially purified with ultrafiltration by using 10 kDa ultrafiltration membrane system.Partially purified lipase from T. fusca EFTL17 was most active at 65 ? C and pH 7.2 Enzyme was found to be stable at 55-85 ? C and at pH 7,2. Heavy metals such as Hg2+, Zn2+, Ni2+, Fe3+, Mn2+, Li2+ were reduced lipase activity at the range of 55-68 %. Lipae acivity was inhibited with Tween 80, Tween 20, SDS and Brij 35 (45-68 %). The effect of organic solvents on lipase activity was also invastigated. Methanol, DMSO, ethanol, isopropyl alcohol and acetone were increased lipase activity between 100 and 120 %. However it was determined that hexan, chloroform and toluen were decreased lipase activity 60 %, 86 % and 36 %, respectively.According to the lipase characteristics of T. fusca EFTL17 it is possible to conclude that it is a thermostable enzyme and has good activity in organic sovents, which show its potential for biotechnological applications.Key words: Thermophilic actinomycetes, Thermostable lipase, Lipase produciton and characterization