MTA fillapex® kanal dolgu patının antimikrobiyal etkinliğinin ve dentin tübüllerine penetrasyonunun değerlendirilmesi
The evaluation of antimicrobial activity and dentinal tubule penetration of MTA fillapex root canal sealer
Yazar: ALİ TÜRKYILMAZ
Danışman: PROF. DR. ALİ ERDEMİR
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Endodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Dental materyaller = Dental materials ; Dental restorasyon = Dental restoration ; Dentin = Dentin ; Dentin geçirgenliği = Dentin permeability ; Kök kanal dolgu materyalleri = Root canal filling materials ; Kök kanal tedavisi = Root canal therapy ; Mikroskopi-elektron taramalı = Microscopy-electron scanning

Özet:
Kök kanal tedavisinde kanal dolgu patları uzun yıllardan beri kullanılmakta ve gün geçtikçe çeşitlenmektedir. Bu çalışmamızda yakın geçmişte üretilen MTA içerikli kanal dolgu patı olan MTA Fillapex kanal dolgu patının antibakteriyel ve antifungal etkinliği ile birlikte kök kanal dentinindeki penetrasyon yeteneğinin incelenmesi amaçlandı. Bu çalışmada S. aureus (ATCC 6538), E. faecalis (ATCC 29212) ve C. albicans (ATCC 10231) mikroorganizmaları ve AH26, AH Plus (Dentsply, De Trey, Konstanz, Germany), RealSeal (SybronEndo, Orange, CA, USA), MTA Fillapex (Angelus Industria de Produtos Odontologicos S/A, Londrina, Brasil) kanal dolgu patları kullanıldı. Antimikrobiyal etkinlik agar difüzyon testi ve direkt kontakt testi ile değerlendirildi.
Agar difüzyon testte kanal dolgu patları sadece yeni karıştırılmış halde kullanıldı. Direkt kontakt testte ise hem yeni karıştırılmış hem de sertleşmiş formları ayrı ayrı test edildi. ADT için 48 adet Müller-Hinton agar pleyt kullanıldı. Pleytler üç mikroorganizma için 3 ana gruba ayrıldı. Sonra her grup 4 farklı pat için 4 alt gruba ayrıldı. Besiyeri olarak S. aureus ve E. faecalis için Müller- Hinton agar tercih edilirken C. albicans için Sabouraud agar kullanıldı. Her pleyte ilgili mikroorganizma ekimi yapıldıktan sonra agar üzerine 3 adet çukur açılarak ilgili kanal dolgu patı uygulandı. Her bir agar pleytte yalnız bir tür mikroorganizma ve yalnız bir tip pat olacak şekilde ayarlandı. Pleytler nemli ortamda 37ºC'de saklandı. Oluşan inhibisyon alanlarından periyodik olarak 24. saat, 48. saat, 7. gün ve 10. gün ölçümler alınarak çapları kaydedildi. Normallik dağılımı testinde Kolmogorov-Smirnov testi kullanıldı. Normal dağılım gösteren verilerde ANOVA ve Tukey testi uygulandı. 

Direkt kontakt testte 96 hücreli mikrotiter pleyt içerisine yeni karıştırılan kanal dolgu patları uygulandı. Öneriler doğrultusunda yaklaşık 20 dk sonra bakteriyel süspansiyon kanal dolgu patlarının üzerine eklendi. Hazırlanan pleytler nemli ortamda 37 ºC'de 1 saat bekletilerek materyalin mikroorganizma ile doğrudan teması sağlandı. Daha sonra üzerlerine taze besiyeri eklenerek dikkatlice karıştırıldı. Bu pleytteki her hücreden 15'er µm karışım alınarak ikinci 96 hücreli mikrotiter pleytte hazırlanan taze besiyerlerinin üzerine eklendi. Ölçümler bu ikinci pleyt ile yapıldı. Optik yoğunluğu değerlendirmek için Microplate spectrophotometer (BioTek, PowerWave XS2) cihazı yardımıyla 24 saat içerisinde 16 farklı zamanda ölçüm alındı. Sertleşmiş grupta kanal dolgu patları karıştırıldı ve 24 saat sertleşmesine izin verildi. Sonra diğer işlemler yeni karıştırılmış formdaki sıra ile gerçekleştirildi. Ayrı bir pleytte mikroorganizmalar kanal dolgu patları olmaksızın kültüre edildi ve pozitif kontrol grubu olarak ayrıldı. Verilerin değerlendirilmesinde tek yönlü ANOVA ve Tukey testi kullanıldı.
Çalışmada kanal dolgu patlarının penetrasyon derinliklerinin değerlendirildiği kısmında, 84 adet tek köklü gelişimini tamamlamış insan dişi kullanıldı. Bütün dişlerin kron kısımları mine sement sınırından dişin uzun aksına dik olarak kesilerek uzaklaştırıldı. Kanal boyları belirlendikten sonra ProTaper® (Dentsply, De Trey, Konstanz, Germany) egeler kullanılarak genişletildi. İki kök kanalı pozitif kontrol grubu olarak belirlendi. 82 kök kanalı smear tabakasını uzaklaştırmak için NaOCl ve EDTA kullanılarak irrige edildi. Bunlardan iki kök kanalı negatif kontrol grubu olarak ayrıldı. Ardından 80 kök kanalında dehidratasyonu sağlamak için dişler sırasıyla %80'lik %90'lık ve %100'lük alkol solüsyonları içerisinde 1'er saat bekletildi. Dişler, her grupta 20 diş olacak şekilde rastgele 4 gruba ayrıldı. Her gruptaki dişlerin yarısı (n=10) geniş açılı tek kon tekniğiyle, diğer yarısı da soğuk lateral kondensasyon tekniğiyle dolduruldu. Hazırlanan örnekler, kanal dolgu patlarının tamamen sertleşmesi için 2 hafta boyunca 37ºC'de %100 nemli ortamda bekletildi. Daha sonra örnekler SEM analizi için hazırlandı. Koronal, orta ve apikal üçtebir alanlardan penetrasyon görüntüleri tespit edilerek X500, X1000, X1500, X2500 büyütmede fotoğraflandı. Patlara ait maksimum ve minimum penetrasyon ölçümleri bilgisayar ortamında belirlenerek görüntüler üzerinde kaydedildi. İstatistik analizinde ANOVA ve post hoc Tukey ve Dunnett testleri kullanıldı.
ADT'te S. aureus'a karşı en yüksek antibakteriyel etkiyi AH 26 ve RealSeal kanal dolgu patları gösterirken en düşük etki MTA Fillapex kanal dolgu patında gözlendi. E. faecalis'e karşı en yüksek antibakteriyel etkiyi AH 26 kanal dolgu patı gösterirken en düşük etkiyi AH Plus kanal dolgu patı göstermiştir. C. albicans'a karşı en yüksek antifungal etkiyi AH 26 kanal dolgu patı gösterirken en düşük etkiyi AH Plus kanal dolgu patı göstermiştir.
DKT'te yeni karıştırılmış kanal dolgu patları tüm bakteri gruplarında 24 saat boyunca antimikrobiyal etkinliğini korurken, 24 saat bekletilmiş kanal dolgu patlarında AH Plus kanal dolgu patının tüm mikroorganizmalara karşı 8. saatten sonra antimikrobiyal etkinliği azaldı. AH 26 kanal dolgu patı da yine benzer şekilde sadece C. albicans'a karşı 10. saatten sonra antimikrobiyal etkinlik kaybı göstermiştir.
İstatistiksel olarak anlamlı fark olmamakla birlikte en yüksek penetrasyon ortalaması RealSeal kanal dolgu patında bulunurken en düşük penetrasyon ortalamasının AH Plus kanal dolgu patına ait olduğu belirlendi (p=0.416). MTA Fillapex kanal dolgu patı ADT'te diğer kanal dolgu patlarına karşı benzer antimikrobiyal etkinlik gösterdi. RealSeal ve MTA Fillapex kanal dolgu patları DKT süresince diğer kanal dolgu patlarına göre daha tutarlı antimikrobiyal etki gösterdi. SEM analizinde penetrasyon yeteneği test edilen diğer materyallerle benzerdi.
Sonuç olarak, MTA Fillapex kanal dolgu patı endodontide iyi bir alternatif olabileceği mümkün görülmektedir. Ancak fiziksel ve kimyasal özellikleri ile ilgili daha çok çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır.

Anahtar Sözcükler: Agar Difüzyon Test, Antimikrobiyal Etkinlik, Direkt Kontakt Test, Penetrasyon, Taramalı Elektron Mikroskobu

Abstract:
Root canal sealers have been used for many years in root canal treatment and have been diversified day by day. In this study it was aimed to investigate the antibacterial and antifungal activity of recently produced MTA containing MTA Fillapex root canal sealer and its penetration ability inside the root canal dentin. In the study S. aureus (ATCC 6538), E. faecalis (ATCC 29212) and C. albicans (ATCC 10231) microorganisms and AH26, AH Plus (Dentsply, De Trey, Konstanz, Germany), RealSeal (SybronEndo, Orange, CA, USA), MTA Fillapex (Angelus Industria de Produtos Odontologicos S/A, Londrina, Brasil) root canal sealers were used. Antimicrobial activity was evaluated using the agar diffusion test and direct contact test. 
Root canal sealers were used only as a fresh mixed form in agar diffusion test. Both fresh mixed form and set form of the root canal sealers were tested in direct contact test respectively. 48 Muller-Hinton plates were used for ADT. All plates were devided 3 groups for 3 microorganisms. Then each group was devided 4 subgroup for 4 different root canal sealers. Muller-Hinton agar was preferred as medium for S. aureus and E. faecalis, Sabouraud agar was used for C. albicans. After cultivation of microorganisms on every plate, 3 wells were formed on the agar surface and relevant root canal sealer was applied. Only one type of microorganism and root canal sealer were set to each agar plate. The plates were preserved at 37ºC in humid environment. The diameter of the established inhibition zones were measured and recorded at 24. hour, 48. hour, 7. day and 10. day periodically. Kolmogorov-Smirnov test was used to test the normality of distribution. ANOVA and Tukey's test was applied to the data in normal distribution.
In direct contact test, fresh mixed root canal sealers were applied on the 96 wells microtiter plates. According to recommendations bacterial suspension was added on the root canal sealer surface about 20 minutes later. The prepared plates were stored at 37ºC in humid environment during 1 hour and ensured the direct contact between test materials and microorganisms. Then fresh broth was added on each well and gently mixed. 15 µm mixture was taken from the each well of the first microtiter plate, then added to second microtiter plate that contains fresh broth in its each well respectively. The second plate was used for optical density determinations. To determine the optical density the microplate spectrophotometer was used (BioTek, PowerWave XS2) for 16 different evaluation time in 24 hours. In the set form group, the root canal sealers were mixed and waited 24 hours for completely set. Other processes were applied similarly with freshly mixed form group. In a different microplate microorganisms were cultivated without root canal sealers and served as positive control group. One way ANOVA and Tukey test were used for analysing the data.
In the study the part of the evaluation of the root canal sealers penetration, 84 recently extracted with single canal and straight mature root human teeth were used. All teeth were decoronated perpendicular to the long axis. After the canal lengths were determined, the root canals were prepared using ProTaper® Sx-F4 files (Dentsply, De Trey, Konstanz, Germany). The two root canals were served as positive control. Eighty two root canals were irrigated using NaOCl and EDTA for removing the smear layer. Again two root canals were served as negative control. Then eighty root canals were immersed in %80, %90, %100 rational alcohol solutions respectively to obtain dehydration for one hour. The teeth were randomly divided 4 group include 20 teeth in each group. In each group half of teeth (n = 10) were filled using single cone technique and the other half was filled using cold lateral condensation technique. The prepared samples were stored at 100% humidity environment at 37 °C for 2 weeks for complete setting of root canal sealers. Then the samples were prepared for SEM analysis. The penetration images were determined from coronal, middle and apical one-third areas and microphotographs were taken at X500, X1000, X1500, X2500 magnifications. The maximum and minimum penetration depths of sealers were defined and recorded on images. ANOVA and post hoc Tukey and Dunnett tests were used in statistical analysis.
AH 26 and RealSeal root canal sealers showed the highest and MTA Fillapex showed the lowest antibacterial effect against S. aureus in ADT. AH 26 root canal sealer showed the highest antibacterial effect against E. faecalis and AH Plus showed the lowest. AH 26 root canal sealer showed the highest antifungal effect against C. albicans and AH Plus root canal sealer showed the lowest effect.
In DCT, while the fresh mixed root canal sealer groups were maintained the antibacterial activity in all microorganism species, in the set form root canal sealer groups, the antimicrobial activity of AH Plus root canal sealer decreased after 8. hour against all microorganisms. Similar to AH Plus root canal sealer, antimicrobial activity of AH 26 root canal sealer decreased after 10. hour against C. albicans.
Although there were no statistical differences between the root canal sealers it was defined that RealSeal root canal sealer showed maximum, AH Plus root canal sealer showed minimum penetration average (p=0.416). MTA Fillapex root canal sealer showed the same antimicrobial activity against the other root canal sealers in ADT. RealSeal and MTA Fillapex root canal sealers showed more stable antimicrobial effect than the other root canal sealers during the DCT. In the SEM analysis it's penetration ability was similar with other test materials.
As a result, it seems to be possible that MTA Fillapex root canal sealer can be a good alternative in endodontics. However more research is needed on it's physical and chemical properties.

Keywords: Agar Diffusion Test, Antimicrobial Activity, Direct Contact Test, Penetration, Scanning Electron Microscope