Melanom tedavisi için veziküler ilaç taşıyıcı sistemin geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterisation of vesicular drug delivery system for melanoma treatment
Yazar: NAHİDE ZEREN ARDA ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. KEVSER ÖZGEN ÖZER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı / Farmasötik Teknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Melanom; melanositlerin bir malignitesi olarak tanımlanabilir. UV maruziyet, diyet, sigara kullanımı, maruz kalınan kimyasallar melanom oluşumuna sebep olan faktörler arasında sayılabilir. Melanom, cilt kanseri kaynaklı ölümlerin büyük çoğunluğundan sorumludur ve metastatik melanomlu hastaların sağ kalım oranı oldukça düşüktür (Schadendorf et al., 2015). Melanom tedavisinde ilk seçenek cerrahi olmakla birlikte cerrahinin uygun olmadığı durumlarda (lentigo maligna melanoma gibi) medikal tedavi gerekmektedir. Melanom tedavisinde en sık kullanılan ajanlar kemoterapötiklerdir. Ancak kemoterapötikler; hastalar üzerinde ciddi yan etkilere sahip olmaları, hedeflendirmelerinin istenilen şekilde yapılamaması, hasta hücrelerin yanında sağlıklı hücrelere de zarar verebilmeleri açısından istenilen verimde kullanılamamaktadır ve yeni tedavi stratejilerine ihtiyaç vardır. Topikal tedavi, hedefe yönelik olması yönüyle bu konuda dikkat çeken bir tedavi yaklaşımıdır. Ancak FDA tarafından melanom tedavisinde onaylanmış topikal bir ürün bulunmamaktadır.
Gen terapisi; çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılan, terapötik nükleik asit materyallerinin hücrelere aktarılarak hücresel süreçlerin düzenlenmesine dayanan bir tedavi şeklidir. Yapılan çalışmalarda melanomlu hücrelerde miR-23a düzeylerinin düştüğü rapor edilmiştir. Farelerde yapılan deneylerde miR-23a replasman tedavisi ile tümör metastazının azaldığı ve sağ kalımın arttığı gösterilmiştir. Ancak günümüzde gen terapisi için kullanılan yöntemlerin güvenlik ve toksisite sorunları vardır. Bu sebeple genetik materyallerin taşınmasında etkin ve güvenli taşıyıcı sistemlere ihtiyaç vardır.
Sentetik eksozom-mimetikler; biyolojik eksozomlardan ilham alınarak geliştirilmiş laboratuvar ortamında tamamen sentetik olarak hazırlanan; genetik materyallerin, proteinlerin ve aktif maddelerin verilmesinde etkili ilaç taşıyıcı sistemlerdir. Eksozomların içerikleri, hücresel iletim mekanizmalarından sorumlu maddeler kullanılarak oluşturulur. Doğal bir fonksiyon olarak genetik materyal taşıyan eksozomların sentetik türevleri olduklarından genetik materyallerin hücrelere verilmesindeki engellerin üstesinden gelmede başarılıdırlar. Ayrıca yüklenen aktif maddelerin hücresel alımlarında da eksozomların füzyon ve adezyon özelliklerinin etkisiyle fosfatidilkolin:kolesterol lipozomlarına kıyasla daha iyi sonuçlar verirler. Bu işlevleri gerçekleştirirken toksik ve immünojenik olmamaları, gen terapisinde kullanılan diğer ilaç taşıyıcı sistemlere karşı üstünlük sağlar ve sentetik eksozom-mimetikleri dikkat çeken ilaç taşıyıcı sistemler yapar.
Kanser tedavisindeki en büyük problemler arasında, ilacın kanser hücrelerinin yanısıra sağlıklı hücrelere de zarar vermesi ve tedavi edilmek istenen kanser hücrelerinin tedaviye karşı direnç oluşturması sayılabilir. Bu tez çalışmasında; etkin maddelerin melanom hücrelerindeki akümülasyonunun artırılması, kanser hücrelerinin tedaviye karşı direnç koymalarının engellenmesi ve ilaç taşıyıcı sistemin toksisite profilinin az olması sebepleriyle ilaç taşıyıcı sistem olarak eksozom-mimetikler seçilmiştir. Formülasyonda seçici olarak antikanser olan EGCG ile antianjiyogenetik özelliğe sahip miR-23a kombine edilerek kanser tedavisi sağlanırken metastazın önlenmesi amaçlanmıştır. Bu sayede melanom tedavisinde seçici antikanser, sağlıklı hücreler üzerine toksisite profili düşük, melanom hücreleri tarafından kolay kabul edilebilen ve etkin maddeleri dış etkenlerden koruyan bir formülasyon geliştirilerek kanser tedavisindeki zorlukların üstesinden gelinmesi hedeflenmiştir. 
Bu tez çalışmasında melanom tedavisi için CD9 ve Thrombospondin-1 (TSP-1) proteinleri ile fonksiyonelleştirilmiş, miR-23a ve (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) yüklenmiş sentetik eksozom-mimetik formülasyonlarının hazırlanması, karakterizasyonu, hücre kültürü çalışmaları ve in ovo etkinlik çalışmaları gerekleştirilmiştir. 
Formülasyonun hazırlanmasına ince film hidrasyon, etanol enjeksiyon ve microfluidcs metotlarıyla membranlarında DMPC, kolesterol, DOPE, DOPS, sfingomyelin içeren eksozom-mimetiklerin hazırlanması ile başlanmıştır. Ardından optimize edilen hazırlama metotları ile eksozom-mimetiklere miR-23a ve EGCG yüklenmiştir. Hazırlanan eksozom-mimetikler, hücrelerde füzyon süreçlerinde görevli CD9 ve bir adezyon molekülü olan TSP-1 proteinleri ile ayrı ayrı işlevselleştirilmiştir. Bu yöntemle etkin, güvenli, ölçek büyütmeye uygun, tekrarlanabilir formülasyonların geliştirilmesi amaçlanmıştır. 
Yapılan hücre kültürü çalışmalarında etkin maddelerin hücresel alımının artması, melanomlu hücrelerde antikanser etkinlik sağlanması ve sağlıklı hücrelere zarar verilmemesi veya kanser hücrelerinden daha az zarar verilmesi hedeflenmiştir.
Yapılan CAM (koriyoallantoik membran modeli) çalışmasında geliştirilen eksozom-mimetiğin tümör üzerindeki antikanser ve antianjiyogenetik etkileri gözlemlenmiştir.
Bu projede geliştirilen sentetik eksozom-mimetikler ile uzun vadede daha etkin ve güvenilir kanser tedavisi sağlanabilir. Ayrıca eksozomlar vücudun neredeyse tüm hücrelerinden sentezlendiklerinden bu sistem bir model olacak olup sentetik eksozom-mimetikler kullanılarak kalp damar hastalıkları, nörodejeneratif hastalıklar gibi daha birçok hastalığa yönelik tedavi geliştirilebilir.

Abstract:
Melanoma may be defined as a malignancy of melanocytes. UV exposure, diet, cigarette smoking, exposure to chemicals can be counted among the factors that cause melanoma formation. Melanoma is responsible for the majority of deaths from skin cancer and the survival rate of patients with metastatic melanoma is quite low. (Schadendorf et al., 2015) Although surgery is the first choice in the treatment of melanoma, medical treatment is required in cases where surgery is not appropriate (such as lentigo maligna melanoma). The most commonly used agents in melanoma treatment are chemotherapeutics. However, chemotherapeutics cannot be used with the desired efficiency because they have serious side effects on patients, their targeting cannot be done in the desired way, they can damage healthy cells as well as patient cells and new treatment strategies are needed. Topical treatment is a treatment approach that attracts attention in this regard due to its target-oriented nature. However, there is no topical product approved by the FDA for melanoma treatment.
Gene therapy is a form of treatment used in the treatment of various diseases, based on the regulation of cellular processes by transferring therapeutic nucleic acid materials into cells. In studies, it was reported that miR-23a levels decreased in melanoma cells. Experiments in mice have shown that miR-23a replacement therapy reduces tumour metastasis and increases survival. However, the methods used for gene therapy today have safety and toxicity problems. For this reason, effective and safe carrier systems are needed for the transport of genetic materials.
Synthetic exosome-mimetics are drug carrier systems that are inspired by biological exosomes and prepared completely synthetically in the laboratory environment; effective in the delivery of genetic materials, proteins and active substances. The contents of exosomes are created using substances responsible for cellular transmission mechanisms. Since they are synthetic derivatives of exosomes carrying genetic material as a natural function, they are successful in overcoming the obstacles in the delivery of genetic materials to cells. In addition, they give better results in the cellular uptake of the loaded active substances compared to phosphatidylcholine:cholesterol liposomes due to the fusion and adhesion properties of exosomes. The fact that they are non-toxic and immunogenic while performing these functions provides superiority over other drug carrier systems used in gene therapy and makes synthetic exosome-mimetics remarkable drug carrier systems.
Among the biggest problems in cancer treatment are the damage of the drug to healthy cells as well as cancer cells and the resistance of the cancer cells to the treatment. In this thesis, exosome-mimetics was chosen as the drug delivery system to increase the accumulation of active substances in melanoma cells, to prevent cancer cells from resisting the treatment and to reduce the toxicity profile of the drug delivery system. In the formulation, EGCG, which is selectively anticancer, and miR-23a, which has antiangiogenetic properties, were combined to prevent metastasis while providing cancer treatment. In this way, it is aimed to overcome the difficulties in cancer treatment by developing a formulation that is selective anticancer in melanoma treatment, has a low toxicity profile on healthy cells, is easily accepted by melanoma cells and protects the active ingredients from external factors. 
In this thesis, preparation, characterisation, cell culture studies and in ovo efficacy studies of synthetic exosome-mimetic formulations functionalized with CD9 and Thrombospondin-1 (TSP-1) proteins, loaded with miR-23a and (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) for melanoma treatment were carried out. 
The preparation of the formulation started with the preparation of exosome-mimetics containing DMPC, cholesterol, DOPE, DOPS, sphingomyelin in membranes by thin film hydration, ethanol injection and microfluidcs methods. Then miR-23a and EGCG were loaded into exosome-mimetics by optimised preparation methods. The prepared exosome-mimetics were functionalised separately with CD9 and TSP-1 proteins, which are involved in fusion processes in cells. With this method, it was aimed to develop effective, safe, reproducible formulations suitable for scale-up. 
In the cell culture studies, it was aimed to increase the cellular uptake of active substances, to provide anticancer activity in melanoma cells and to prevent damage to healthy cells or to cause less damage to cancer cells.
In the CAM (chorioallantoic membrane model) study, the anticancer and antiangiogenetic effects of the developed exosome-mimetic on the tumour were observed.
With the synthetic exosome-mimetics developed in this project, more effective and reliable cancer treatment can be provided in the long term. In addition, since exosomes are synthesised from almost all cells of the body, this system will be a model and treatment for many other diseases such as cardiovascular diseases and neurodegenerative diseases can be developed using synthetic exosome-mimetics.