Resveratrol'ün peripubertal sıçan epifiz plağında hidrokortizon ile oluşturulan büyüme inhibisyonu üzerine koruyucu etkilerinin araştırılması
Evaluation of the protective effects of resveratrol on hydrocortisone-induced growth inhibition in the peripubertal rat epiphyseal plate
Yazar: SERKAN KEMER
Danışman: PROF. DR. HAKAN ERGÜN
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Adrenal korteks hormonları = Adrenal cortex hormones ; Büyüme = Growth ; Büyüme bozuklukları = Growth disorders ; Büyüme plağı = Growth plate ; Epifiz bezi = Epiphyses ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hidrokortizon = Hydrocortisone ; Resveratrol = Resveratrol ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Glukokortikoidler güçlü anti-inflamatuar özellikleri sayesinde pek çok inflamatuar hastalığın tedavisinde sıkça kullanılmaktadır. Fizyolojik ve farmakolojik etkilerini diğer steroid maddeler gibi hücre içinde yer alan nükleer reseptörü glukokortikoid reseptörüne (GR) bağlanarak göstermektedir. Bu reseptör insan vücudundaki hücrelerin neredeyse tamamında bulunduğundan terapötik dozlarda bile advers etkiler izlenebilmektedir. Kemik mineralizasyonunda bozulma ve boy uzamasının baskılanması çocukluk döneminde kronik steroid kullanımı ile görülebilen önemli advers etkilerdir. Glukokortikoidler kronik olarak kullanıldığında adrenokortikotropik horman (ACTH), büyüme hormonu (GH), tiroid stimülan hormon (TSH) ve lüteinizan hormonun (LH) hipofiz salınımını baskılamaktadır. Epifizyel kıkırdakta enkondral ossifikasyonu kontrol eden insülin benzeri büyüme faktörü-1'in (IGF-1) sentez ve salınımını azaltarak biyolojik aktivitesini azaltmaktadır. Sonuçta uzun dönem kullanımda osteoporotik değişikliklere ve boy uzamasında inhibisyona yol açmaktadır.
Resveratrol ise fitoöstrojenik özelliğe sahip önemli bir antioksidan maddedir. Kardiyovasküler hastalık insidansını azaltıcı etkisiyle gündeme gelmiş ve sonrasında klinik ve preklinik çalışmalarla osteoporoz benzeri kemik patolojilerinde kemik sağlığı üzerine olumlu etkileri bildirilmiştir. Postmenopozal kadınlarda kemik mineral dansitesini arttırabildiği gösterilmiştir. Deneysel hayvan osteoporoz modellerinde osteoblastik kemik formasyonunu arttırıp osteoklastik rezorpsiyonu azaltabildiği, tavşan çalışmalarında epifiz kapanmasını geciktirerek tibia uzunluğunu arttırdığı gösterilmiştir. 
Çalışmamızda resveratrol'ün hidrokortizon ile epifiz plağında oluşturulan büyüme inhibisyonu üzerine koruyucu etkilerinin araştırılması için peripubertal dönem Wistar Albino sıçanlar biri kontrol grubunu oluşturmak üzere 6 gruba randomize edildi. Çalışma öncesi standart AP tibia radyografisi çekildikten sonra 10 gün boyunca sırasıyla 10 mg/kg/gün subkutan hidrokortizon, 10 mg/kg/gün subkutan hidrokortizon + 50 mg/kg/gün orogastrik gavaj ile resveratrol ve resveratrol tek başına 10-50-100 mg/kg/gün dozlarında uygulanmıştır. Onuncu gün kontrol radyografisi çekildikten sonra sıçanlar sakrifiye edilerek kan örneklenmiş ve tibia kemikleri uygun koşullarda disseke edilerek histopatolojik değerlendirme için saklanmıştır. Toplanan kan örneklerinden kemik biyobelirteçleri sclerostin ve osteopontin "Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay" (ELISA) yöntemiyle ölçülmüştür.  Patolojik örneklerde epifiz plağının kıkırdak zonları (resting, proliferatif, hipertrofik ve total zon) histomorfometrik olarak ölçülmüştür. İmmünohistokimyasal boyama yöntemiyle osteojenik zonda apoptoz belirteci kaspaz-3 ve bir transkripsiyon faktörü olan NF-κB p65 semikantitatif olarak değerlendirilmiştir. 
Çalışmamızdan elde ettiğimiz bulgulara göre 10 mg/kg/gün dozunda subkutan 10 gün uygulanan hidrokortizon radyografik olarak değerlendirilen tibia uzamasını kontrole göre anlamlı ölçüde azaltmıştır (%23.4 vs %15,1, p<0,001). Resveratrolün gavaj ile 50 mg/kg/gün dozunda 10 mg/kg/gün sc hidrokortizon ile birlikte verildiği grupta ise tibia uzama inhibisyonu ortadan kalkmıştır. Yapılan histomorfometrik ölçümlerde kontrol grubu referans alınarak yapılan karşılaştırmalarda hidrokortizon ve resveratrol 50 mg/kg (RSV50) gruplarında total zon kalınlığı belirgin olarak azalmış olarak belirlendi (554,95±17,14 μm, vs 483,74±14,66 μm, 384,91±20,52 μm, p<0,05, p<0,001). Resveratrol 50 mg/kg ve hidrokortizon 10 mg/kg birlikte uygulandığı grubun total zon ölçümü kontrol grubuna benzerdi. Resveratrol'ün tek başına uygulandığı gruplarda resting zon kontrolden belirgin olarak daha ince olarak belirlendi (p<0,05). Epifiz kıkırdağının distalinde kalan osteojenik zon kaspaz-3 ve NF-κB p65 ifadesi açısından değerlendirilmek üzere immünhistokimyasal olarak boyandı ve semikantitatif olarak değerlendirildi. Hidrokortizon 10 mg/kg ve resveratrol 100 mg/kg uygulanan gruplarda osteojenik alandaki apoptoz oranı kontrol grubundan daha yüksek bulundu. (p<0,05). NF-κB p65 ifadesi ise tüm gruplarda benzer olarak belirlendi. Kemik formasyonu inhibitörü sclerostinin kan düzeyi kontrol grubu ile kıyaslandığında yüksek doz resveratrol grubunda (100 mg/kg/gün) önemli ölçüde azalmış olarak saptandı (1.342 pg/ml (897-1.617), p<0,05)). Kemik mineralizasyon göstergesi olarak kabul edilen osteopontin kan düzeyi ise yüksek doz resveratrol grubunda kontrole kıyasla anlamlı derecede artmış olarak belirlendi (24.491 pg/ml (16.345-72.408), p<0,05). 
Sonuç olarak çalışmamızda subkutan 10 mg/kg/gün hidrokortizon ile tibia kemik uzamasında ve büyüme plağı total zon kalınlığında izlenen inhibisyon 50 mg/kg/gün oral resveratrol uygulanması ile geri döndürülmüştür. Resveratrolün 10-50-100 mg/kg/gün dozları tek başına radyografik tibia lineer uzamasını etkilemezken 50 mg/kg/gün dozunda büyüme plağı kalınlığında azalma oluşturmuştur. Hidrokortizonun gonadotropin sekresyonu inhibisyonu ve hücresel yaşlanmayı yavaşlatıcı etkisine karşı resveratrolün fitoöstrojenik özelliği ve kondrositlerdeki yaşlanmayı hızlandırıcı etkisinin bu durumu açıklayabileceği düşünülmüştür.

Abstract:
Glucocorticoids are frequently used in the treatment of many inflammatory diseases according to their strong anti-inflammatory properties. They show their physiological and pharmacological effects by binding to the nuclear-type glucocorticoid receptor (GR) located inside the cell, like other steroid substances. Since this receptor is found in almost all cells in the human body, adverse effects can be observed even at therapeutic doses. Deterioration in bone mineralization and suppression of height growth are important adverse effects that can be seen with chronic steroid use in childhood. When glucocorticoids are used in chronically, they suppress the pituitary release of adrenocorticotropic hormone (ACTH), growth hormone (GH), thyroid stimulating hormone (TSH) and luteinizing hormone (LH). They reduce the biological activity of insulin-like growth factor-1 (IGF-1), which controls enchondral ossification in epiphyseal cartilage, by decreasing its synthesis and release. As a result, they lead to osteoporotic changes and inhibition of height growth in long-term use.
	Resveratrol is an important antioxidant substance with phytoestrogenic properties. It has come up with its effect on reducing the incidence of cardiovascular disease, and subsequently, its positive effects on bone health in osteoporosis-like bone pathologies have been reported in clinical and preclinical studies. It has been shown to increase bone mineral density in postmenopausal women. It has been shown that it can increase osteoblastic bone formation and decrease osteoclastic resorption in experimental animal osteoporosis models and increase tibia length by delaying epiphyseal closure in rabbit studies.
	In our study, to investigate the protective effects of resveratrol on the growth inhibition of the epiphyseal plate with hydrocortisone, peripubertal Wistar Albino rats were randomized into 6 groups, one of which was the control group. After a standard AP tibia radiograph was taken, 10 mg/kg/day subcutaneous hydrocortisone, 10mg/kg/day subcutaneous hydrocortisone + 50 mg/kg/day resveratrol with orogastric gavage, and resveratrol alone at doses of 10-50-100 mg/kg/day has been applied for 10 days respectively. After the control radiograph was taken on the tenth day, the rats were sacrificed, blood was sampled, and the tibia bones were dissected under appropriate conditions and stored for histopathological evaluation. Bone biomarkers sclerostin and osteopontin were measured from the collected blood samples with the "Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" (ELISA) method. Cartilage zones of the epiphyseal plate (resting, proliferative, hypertrophic and total zone) were measured histomorphometrically in pathological samples. Apoptosis marker caspase-3 and a transcription factor NF-kB p65 were evaluated semiquantitatively by immunohistochemical staining method. 
	According to our study findings, hydrocortisone administered subcutaneously at a dose of 10mg/kg/day for 10 days significantly decreased the tibia elongation evaluated by radiography (23.4% vs 15.1%, p<0.001). In the group in which resveratrol was given by gavage at a dose of 50 mg/kg/day with 10 mg/kg/day sc hydrocortisone, inhibition of tibia elongation disappeared. In the comparisons made with the control group in the histomorphometric measurements, the total zone thickness was found to be significantly decreased in the hydrocortisone and resveratrol 50 mg/kg (RSV50) groups (554.95±17.14 μm, vs. 483.74±14.66 μm, 384.91±20.52 μm, p<0.05, p<0.001). The total zone measurement of the resveratrol 50mg/kg and hydrocortisone 10mg/kg group was similar to the control group. The resting zones were determined to be significantly thinner than the control in the groups in which resveratrol was administered alone (p<0.001). The osteogenic zone distal to the epiphyseal cartilage was immunohistochemically stained for caspase-3 and NF-kB p65 expression and evaluated semi quantitatively. The apoptosis rates in the osteogenic area were found to be higher in the groups in which hydrocortisone was administered 10 mg/kg/day and resveratrol 100 mg/kg/day (p<0.05). NF-kB p65 expression was similar in all groups. The blood level of the bone formation inhibitor sclerostin was significantly reduced in the high-dose resveratrol group (100 mg/kg/day) compared to the control group (1,342 pg/ml (897-1,617), p<0.001)). Osteopontin blood level, which is accepted as an indicator of bone mineralization, was found to be significantly increased in the high-dose resveratrol group compared to the control (24,491 pg/ml (16,345-72,408), p<0.05). 
In conclusion, inhibition of tibia bone elongation and growth plate total zone thickness with subcutaneous 10 mg/kg/day hydrocortisone was reversed with 50 mg/kg/day oral resveratrol administration in our study. While doses of 10-50-100 mg/kg/day of resveratrol alone did not affect the radiographic linear elongation of the tibia, a dose of 50 mg/kg/day caused a decrease in growth plate thickness. It has been thought that the phytoestrogenic property of resveratrol and its accelerating effect on chondrocyte cellular senescence against the inhibitory effect of hydrocortisone on gonadotropin secretion and decelerating effect on cellular senescence may explain this condition.