Narda bulunan antosiyaninlerin biyoyararlılığına gıda matrisi ve bileşenlerinin etkisi
Effects of food matrix and food components on bioavailability of anthocyanins in pomegranate
Yazar: HAFİZENUR ŞENGÜL
Danışman: YRD. DOÇ. DR. DİLARA  NİLÜFER  ERDİL
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Son yıllarda yaşam koşullarına, teknolojiye ve beslenme şekillerine bağlı olarak oluşan stres faktörleri; serbest radikallerin artmasına, özellikle kanser olmak üzere birçok hastalığın hızlı bir şekilde ortaya çıkmasına neden olmuştur. Bu nedenle doku ve hücrelerde serbest radikaller ve antioksidan maddeler arasındaki dengenin sağlanabilmesi amacıyla gıdalara dışarıdan selenyum, E vitamini, alfa tokoferol, karnitin, arı sütü, elajik asit, nar çekirdeği ve nar suyunun da içinde olduğu birçokantioksidan özellikte maddelerin katılması yoluna gidilmektedir. Nar (Punica granatum), zengin antioksidan potansiyeli ve fenolik içeriği nedeniyle sağlık açısından önemli bir meyvedir. Narın içerdiği önemli fenolik bileşenler;antosiyaninler, flavonol glikozitleri, prosiyanidinler, ellajik asit ve türevleridir. Yüksek antioksidan kapasitesi tanenler, flavonoidler ve antosiyaninler gibi değerli fenolik bileşenleri içermesi nedeniyledir. Fenolik bileşenler ve polifenoller antioksidan aktiviteleri nedeniyle önemli antimutajenik ve antikanserojenik özelliklere sahip olup kalp ve damar hastalıklarına karşı da koruyucu etkilere sahiptir. Fenolik madde miktarı yüksek gıdaların hangi formülasyonlarla ve nasıl tüketilmesi gerektiği konusunda çalışmalar giderek artmaktadır. Besinlerin biyolojik etkileri, biyoyararlılıklarıyla yakından ilişkilidir. Biyoyararlılık; alınan besinin normal fizyolojik fonksiyonlarda kullanmak ve depolamak için erişebilir durumdaki kısmıdır. Sonuç olarak, bir gıda veya besin desteğinin içerisinde incelenen besin ögesinin ne kadar bulunduğundan çok ne kadar biyoyararlılığı olduğu daha önemlidir. Fenolik bileşenler yapılarındaki farklılıklara, etkileşimlere ve çözünürlüklerine bağlı olarak farklı biyoyararlılık davranışları gösterirler. Gıda kaynaklı flavonoidlerin emilimi ile ilgili olarak üzerinde durulması gereken önemli bir konu bu maddelerin birlikte tüketildikleri gıda matrisinden nasıl etkilendiğidir.Literatürde narın yüksek fenolik madde içeriğiyle ilgili bir çok çalışmaya rastlanmaktadır, bunun yanı sıra diğer fenolik gıdalarla yapılan in vitro çalışmalar da yer almaktadır. In vivo çalşmaların daha karışık, yüksek maliyetli, ahlaki ve etik sorunları gündeme getirmeleri, insan veya hayvan vücudundaki değişimlerden etkilenmeleri sebebiyle in vitro çalışmalar tercih edilmektedir. In vitro çalışmalararaştırıcıya basitlik, kolay uygulanabilirlik ve düşük maliyet gibi avantajlarsunmaktadır. Bu çalışmanın temel amacı, narda bulunan fenolik bileşenlerin ve antosiyaninlerin gıda bileşenleri ve diğer gıda maddeleriyle birlikte sindirimi sonrasında biyoyararlılıklarındaki değişimleri in vitro sindirim metodu yardımıyla belirlemek amaçlanmıştır. Narda bulunan fenolik maddelerin ve antosiyaninlerin potansiyel biyoyararlılığı üzerine günlük tüketilen gıdaların etkisini araştırmak amacıyla gıda bileşenleri ve gıda matrislerinden oluşan bir model sistem geliştirilmiştir. Gıda matrisinde, bitkisel yağ, (%0.1) yağsız süt, yağsız pişmiş et, ekmek, yağsız yoğurt (%0.15), probiyotik xviiiyoğurt, elma, limon suyu, bal, soya sütü, krema ve soya fasulyesi ile nar taneleri model sistem olarak kullanılmıştır. Gıda bileşenleri olarak da; buğday proteini, süt proteini, et proteini, laktoz, fruktoz, galaktoz, glukoz, tuz, C vitamini, nişasta, pişmiş nişasta, E vitamini, linoleik asit, selüloz, sitrik asit ve pektin kullanılmıştır. Nar ile gıda maddeleri ve bileşenlerine in vitro sindirim metodu uygulanarak, toplam fenolik madde analizi, toplam antosiyanin madde analizi yapılmış, fenolik madde profili ve antosiyanin madde profili HPLC-PDA ile belirlenmiştir. Toplam fenolik madde miktarı Folin Ciocalteu yöntemi ile spektrofotometrik olarak olçülmüştür. Sonuçlar gallik asit eşdeğeri olarak ifade edilmiştir. Toplam antosiyanin miktarı ise pH diferansiyel metodu olarak bilinen toplam antosiyanin metodu ile ölçülmüştür ve mg syn-3-glu/100 g yenilebilir meyve cinsinden verilmiştir. Narlar tanelerine ayrılarak öğütülmüştür. Diğer gıdalarla ve bileşenlerle belirli oranlarda karıştırılarak model sistemler oluşturulmuş ve biyoyararlılığın tespiti için in vitro sindirim metodu uygulanmıştır. Bu kapsamda; enzimler kullanılarak sindirim benzetimi yapılmış, absorplama ise diyaliz poşeti kullanılarak taklit edilmiştir. Mide ve pankreatik sindirim sırasında oluşan antosiyanin ve fenolik madde dönüşümleri araştırılmıştır. Böylelikle antosiyanin içeren gıdaların tüketimleri sırasında ve diğer gıdalarla birlikte tüketimleri durumunda antosiyanin miktarlarındaki değişimler belirlenmiştir. Narın tek başına in vitro sindirim metodu uygulanmış hali ise kontrol olarak analizlenmiştir. Bu yöntem McDougall ve diğ. (2005) kullandığı metottan uyarlanmıştır. Bu yöntem, iki basamaktan oluşmaktadır. Mide sindirimini taklit etmek amacıyla pepsin/HCI sindirimi 37 °C'de 2 saat, bunu takiben ince bağırsaktaki sindirimi taklit etmek amacıyla, 37 °C'de 2 saat, safra tuzu/pankreatin ilavesi ile taklit edilmiştir. Örnekler, IN ve OUT fraksiyonlarını içeren in vitro sindirim metodundan alınmıştır. IN örnekleri, kana geçen kısımdakini temsil etmektedir. OUT örnekleri ise, midebağırsak sindirimi sonrasında, kalan maddeyi temsil etmektedir. Her iki fraksiyon, antosiyanin ve fenolik madde profillerinin, yanısıra, toplam fenolik ve toplam antosiyanin belirlemek için analizlenmiştir. Analiz sonuçlarının tümü istatistiksel olarak Sosyal Bilimler için İstatistik Paketi(SPSS) 16.0 versiyonu yazışımı yardımı ile tek yönlü varyans analizi (ANOVA),uygulanması sonrasında Duncan Yeni Çoklu Aralık Testi ile 0.05 önem derecesinde değerlendirilmiştir. Sonuçlar, mg eş değerleri/100 g yenilebilir meyve olarakbelirtilmiştir. Her bir analiz her örnek için üç kez tekrarlanmış ve sonuçlar ortalamadeğer ± standart sapma olarak verilmiştir.Bu çalışma sonucunda, nar tanelerinde bulunan fenolik bileşiklerin mide sindirimi sırasında stabil bir yapıda olduğu görülmüştür. Ekstraksiyon sonuçlarıyla kıyaslandığında, gastrik durumda biyoyararlılığın arttığı görülmektedir. Fenolik bileşiklerin çoğunluğu (%75) kolonda (OUT) ve daha az miktarı (%14) kana geçen kısımda (IN) bulunmaktadır. Antosiyaninlerin fenolik bileşikliklerle kıyaslandığında daha düşük biyoyararlılıklarının olduğu bulunmuştur. Nardaki fenolik bileşenler (gallik asit, kateşin, kuersetin-3-β-D-glukozit, kuersetin-3-galaktozit, ferulik asit, neoklorojenik asit, kafeik asit ve p-koumarik asit) ve antosiyaninler (siyanidin 3-O-glukozit, siyanidin 3,5-di-O-glukozit, delfinidin 3-Oglukozit, delfinidin 3,5-di-O-glukozit, pelargonidin 3-O-glukozit ve pelargonidin 3,5-di-O-glukozit) olarak bulunmuştur. Bu fenolik bileşenlerden gallik asit, kateşin, ferulik asit, kafeik asit yüksek miktarda bulunmaktadır ve kıyaslamalar bu fenolik bileşenler arasında yapılmıştır. Önemli antosiyaninler ise, delfinidin 3-5-0 diglikozit,xixsiyanidin 3,5-di-O-glukozit, pelargonidin 3,5-di-O-glukozit, pelargonidin 3,5-di-Oglukozit olarak belirlenmiştir. Diğer gıdalarda tüketildiği durumlarda; nardaki fenolik bileşenleri biyoyararlılığınınproteinli gıdaların (et, süt, ekmek, yoğurt, probiyotik yoğurt, soya sütü) ve kremanın varlığı ile azaldığı görülmektedir. Soya fasulyesi kana geçen (IN) fraksiyonda artışa neden olurken ve elma kolona geçen (OUT) kısmında artışa neden olmuştur. Bitkiselyağ ve limon varlığı ise fenolik madde biyoyararlılığını değiştirmemiştir. Diğer gıdalarla birlikte sindirimleri sırasında nardaki antosiyanin biyoyararlılığı incelendiğinde; diğer gıdalarla tüketimde mide sindirimi sırasında (PG) ve OUT fraksiyonunda (kolona geçen kısım) kontrole göre önemli bir farklılık görülmemiştir. Ancak kana geçen fraksiyonda (IN); et, soya sütü ve kremanın antosiyanin biyoyararlılığına azaltıcı etkileri olduğu görülmüştür.Gıda bileşenleri ile etkileşimler incelendiğinde; tuz, sitrik asit, selüloz, C vitamini, laktoz, nişasta ve pişmiş nişastanın tüm fraksiyonlarda fenolik bileşenleri azaltıcı etkileri olmuştur. Galaktozun biyoyararlılığa belirgin bir etkisi yoktur. Kana geçen kısımda (IN) soya proteini ve süt proteininin olumlu etkisi olmuştur. Buğday protein ise kolona geçen kısımda (OUT) olumlu etki sağlamıştır. Soya, et ve süt proteinleri PG ve OUT fraksiyonlarında olumsuz etki yapmışlardır. Stearik asit, linoleik asit, glukoz ve pektin PG ve OUT fraksiyonlarında etkisiz olurken IN fraksiyonunda azalmaya neden olmuşlardır. Fruktoz ve E vitamini OUT fraksiyonunda etkisiz olurken PG ve IN fraksiyonlarında azalmaya sebep olmuştur. Antosiyaninlerinin gıda bileşenleri ile etkileşimleri incelendiğinde; fenolik bileşenlere kıyasla farklılaşmaların daha belirgin olduğu görülmüştür. Soya, süt, buğday ve et proteinlerinin antosiyanin biyoyararlılığını tüm fraksiyonlarda önemli miktarlarda azaltıcı etkileri görülmüştür. Galaktoz, fruktoz, glukoz, pektin, E vitamini, sitrik asit ve tuzun PG fraksiyonunda etkileri olumlu olmuştur. IN fraksiyonunda ise stearik asit, galaktoz, laktoz ve fruktoz kontrole gore önemli bir etki yaratmazken, diğer tüm bileşenler azalmaya neden olmuştur. OUT fraksiyonunda tuz en yüksek değeri verirken, glukoz, pektin, C vitamini ve sitrik asit kontrol ile aynı etkiyi sağlamış ancak diğer bileşenler azaltıcı etki sağlamışlardır.Antosiyanince zengin nar içeren bir ürün geliştirilirken veya tüketilirken protein içeriğinin ve C vitamininin yüksek olmamasına dikkat edilmeli, biyoyararlılık üzerine şeker ve yağ içeriklerinin olumsuz bir etkisi olmadığı bilinmelidir.

Abstract:
In recent years, stress factors, that are caused by technology, living conditions and nutritional habits, tend to increase free radicals which rapidly result in various diseases, especially cancer. For that reason, selenium, vitamin E, alpha tocopherol, carnitine, royal jelly, ellagic acid, and many others including pomegranate seed and pomegranate juice are added to foods in order to balance free radicals and antioxidants in tissues. Pomegranate (Punica granatum) is an important fruit due to its high antioxidant potential and phenolic content. The important phenolic compounds in pomegranate are anthocyanins, flavonol glycosides, procyanidins, phenolic acids such as ellagic acid and its derivatives. The reason for its high antioxidant capacity is existence of significant phenolic compounds such as tannins, flavonoids and anthocyanins. Phenolic compounds and polyphenols have important antimutagenic and anticarcinogenic properties due to their antioxidant activity. Moreover, they have protective effects against cardiovascular diseases. Studies about formulating and the way of consuming high in phenolics food products gradually increase.Biologic effect of food are closely related with its bioavailability. Bioavailability is reachable fraction of food taken, for storing or using in physiological functions. Therefore, bioavailability of compound in food is more important rather than the quantity of that compound. Phenolic compounds show different bioavailabilities depending on their difference in structure, interactions and solubility. For the absorption of food based flavonoids the way they are affected from the consumed matrix is an important fact.In the literature there are a lot of studies regarding high phenolic compounds found in pomegranate. Also there are in vitro bioavailability studies which are applied toother foods rich in phenolics. In vivo studies are much more complicated. They are affected by shifts in human or animal body. They cost higher and bring up the moral and ethical issues. That's why in vitro studies are preferred to in vivo studies. In vitro studies offer advantages as simplicity, ease of application and low cost to the investigator. The main purpose of this study is to determine the changes after the digestion of phenolic compounds and anthocyanins found in pomegranate along with other food components.Model systems consisting of other food matrices and food components weredeveloped to investigate the matrix effect of the daily consumed food on pomegranate phenolic and anthocyanin bioavailability. Sunflower oil, UHT milk(skim milk), cooked lean meat, bread, skim yoghurt, probiotic yoghurt, apple, lemon, honey, soymilk, cream, soybean and pomegranate arils (control) were the materials used for model systems. As food components, wheat protein, milk protein, meat xxiprotein, lactose, fructose, galactose, glucose, salt, vitamin C, starch, cooked starch, vitamin E, linoleic acid, cellulose, citric acid and pectin were used. Total phenolic content, total anthocyanin content, phenolic profile and anthocyanin profiles by HPLC-PAD were analyzed to evaluate the bioavailability in pomegranate,pomegranate plus foods and pomegranate plus their components after the application of in vitro digestion method.The amount of total phenolic content was measured spectrophometrically by Folin Ciocalteu method. Results are expressed as gallic acid equivalents. The amount of total anthocyanins was measured by the pH differential method and it is expressed in mg cyn-3-gly/100 g edible fruit.Every pomegranate aril is milled. For investigating bioavailabaility in vitro digestion method was applied by mixing pomegranate with other foods and ingredients atspecific proportions. In this context, digestion simulation was performed by enzymes and absorption was simulated using dialysis tubing. The conversion of anthocyanins and phenolic compounds were investigated during the stomach and pancreatic digestion. Bioavailabaility for consumption of foods containing anthocyanins and changes in the amount during the consumption of them with other foods were measured. Single pomegranate was used as the control for in vitro digestion method.The procedure was adapted from the method of McDougall et al. (2005). The method consists of two sequential steps: an initial pepsin/HCI digestion for 2 h at 37 °C to simulate gastric conditions, followed by a bile salt/pancreatin for 2h at 37°C to stimulate small intestine conditions. Samples taken from codigestion consist of IN and OUT fractions. IN sample representing the material that enters into serum. OUTsample representing material that remains in the gastrointestinal tract. Both fraction is analyzed for anthocyanin and phenolic profiles, besides total phenolics, total anthocyanins, and antioxidant activities.All of the data were evaluated statistically using Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) program version 16.0. To determine the significant differencesbetween samples one way Analysis of Variance (ANOVA) was applied at at 0.05 significant level followed by Duncan's New Multiple Range Test as post hoc tests. The results were reported as mg equivalents/100 g edible fruit. Each analysis was repeated in triplicate for each sample and the results were reported as mean value ± standard deviation.As the result of this study; phenolic compounds of pomegranate arils are found to be stable during gastric conditions. Gastric conditions even improved bioavailability when compared with the extract. Phenolic compounds are also available in colon (75%) and to a lesser extent in serum (%14). Anthocyanins are found to have lowerbioavailability during digestion when compared to phenolic compounds.Phenolic compounds in pomegranate were identified as gallic acid, catechin, quercetin-3-β-D-glucoside, quercetin-3-galactoside, ferulic acid, neochlorogenic acid, kafeic acid and p-coumaric acid and major anthocyanins as cyanidin 3-Oglucoside, cyanidin 3,5-di-O-glucoside, delphinidin 3-O-glucoside, delphinidin 3,5-di-O-glucoside, pelargonidin 3-O-glucoside and pelargonidin 3,5-di-O-glucoside. Major phenolic compounds were found to be gallic acid, catechin, ferulic acid andcafeic acid. Major anthocyanins were selected as delphinidin 3-5-O diglucoside,cyanidin 3,5-di-O-glucoside, pelargonidin 3,5-di-O-glucoside, pelargonidin 3,5-di-Oglucoside.xxiiWhen pomegaranate is consumed with other foods; bioavailability of phenolic compounds is reduced by the presence of protein containing foods (meat, milk, bread, yoghurt, probiotic yoghurt, soy milk) and cream. Positive effects in IN fraction for soy bean and in OUT fraction for apple is observed. Availability of vegetable oil and lemon made no effect on bioavailability.When bioavailability of anthocyanins in pomegranate during consumption with other foods is investigated, there is no difference with respect to control during gastric digestion (PG) and in OUT fraction. However, in IN fraction, meat, soy milk and cream have reduced effect on biavailability of anthocyanin.When interactions with food ingredients are investigated, salt, citric acid, cellulose, vitamin C, lactose, starch and cooked starch are found to have reduced effect on phenolic compounds in all fractions. Galactose has no important effect on bioavailability. While soy protein and milk protein has positive effect on IN fraction, wheat protein has positive effect on OUT fraction. Soy, meat and milk proteins have negative effects on PG and OUT fractions. While stearic acid, linoleic acid, glucose and pectin were found to have no effect on PG and OUT fractions, they have reducing effect on IN fraction. Fructose and vitamin E have no effect on OUT fraction, but they have reduced effect on PG and IN fractions.When interactions of anthocyanins with food ingredients is evaluated; it was seen that change in anthocyanins are more obvious when compared to phenolic compounds. Soy, milk, wheat and meat proteins have significant reducing effects on bioavailability of anthocyanin in all fractions. Galactose, fructose, glucose, pectin vitamin E, citric acid and salt have positive effect on PG fraction. While, stearic acid, galactose, lactose and fructose have no important effect on IN fraction, whereas all other compounds have negative effect when compared to control. Salt has given the maximum level in OUT fraction, glucose, pectin, vitamin C and citric acid have similar effect with control, whereas the rest of the compounds have reduced effect on anthocyanins.In conclusion, protein and vitamin C content should not be high while consuming or developing a product with pomegranate, which is rich in anthocyanins. Furthermore, one should be aware that sugar and fat content have no negative effect on anthocyanin bioavailability