Irak'ın Anbar kentinde Hepatit B virüsünün moleküler çalışması ve hepatit genotiplemesi ile interlökinler ve hepatit arasındaki ilişkinin tespiti
Molecular study of Hepatitis B virus and detection of hepatitis genotyping as well as the relationship between interleukins and hepatitis in Anbar, Iraq
Yazar: MOHAMMED SHAKIR MHMOOD AL-INIZI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SONGÜL ŞAHİN ; DR. ÖĞR. ÜYESİ LAİTH MUSLEH NAJEEB
Çankırı Karatekin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Hepatit B virüsü (HBV) dünya çapında bir sağlık sorunudur. HBV'nin ortadan 
kaldırılmasında sitokinler önemli bir rol oynar. İnterlökin-6, 27 ve 34 (IL-6, Il-27, IL-34) 
son zamanlarda HBV'nin etiyolojisi ve patogenezinde rol oynayan sitokinler olarak 
bilinmektedir. HBV'nin genotiplendirilmesi önemlidir çünkü tedavi kararlarını 
yönlendirmeye yardımcı olabilir. Örneğin, HBV'nin bazı genotiplerinin belirli antiviral 
tedavilere yanıt verme olasılığı diğerlerine göre daha yüksektir. Ayrıca, hepatoselüler 
karsinom ve siroz gibi ciddi karaciğer hastalığı gelişme riski HBV genotiplemesi 
kullanılarak öngörülebilir. Yapılan çalışmalarda, hepatit hastalarının genotipleri ve alt 
genotiplerinin yanı sıra genetik dizideki varyasyonlar da belirlenmiştir. Ayrıca, hastalık 
gelişimindeki duyarlılık rollerini anlamak için HBV hastalarında ve kontrollerde IL-6, 
IL27 ve IL-34 serum seviyeleri de belirlenmiştir. Bu nedenle, çalışmamızda Irak'ta 
yaşayan akut ve kronik HBV hastalarında, HBV genotipinin ve alel frekanslarının
belirlenmesi amaçlamıştır. Çalışmamız, Ocak-Ekim 2023 tarihleri arasında hepatit ile 
enfekte olmuş farklı yaşlardaki 139 hasta (erkek ve kadın) ve 40 sağlıklı (HBV ile enfekte 
olmamış) bireyi (erkek ve kadın) içermektedir. Tüm serum örneklerinde HbsAg'yi tespit 
etmek için HBs Ag ELISA kiti ve akut HBV hastalarını belirlemek için Anti-HBc IgM 
ELISA kiti kullanılmıştır. Test edilen 112 numune hepatit B virüsü DNA'sı belirlemek
için yuvalanmış PCR ile analiz edilmiştir. Birinci tur PCR ürünleri, tüm akut hepatit B 
hastalarının 45 (%100) 1003 bp bant gösterdiğini ortaya koymuş, bu da mevcut örneğin 
virüsle hepatit B enfeksiyonu olan hastalardan geldiğini doğrulamıştır. 67 kronik hepatit 
B virüsü hastasının 42'sinde (%62,7) HBV-DNA testi pozitif, 25'inde (%37,3) HBVDNA testi 
negatif çıkmıştır. Akut HBV hastalarının yaş ortalaması ± SD 39,25±2,17 yıl,
Kronik hastaların 36,35±2,56 yıl, kontrol grubunun ise daha düşük bir yaş ortalamasına 
(26,97±1,49 yıl) sahip olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, hasta ve kontrol grupları 
arasında oldukça anlamlı bir fark belirlenmiştir (p=0,0002). Akut HBV hastalarının 
%50'sini hem erkekler hem de kadınlar oluştururken, Kronik HBV hastalarının %67,5'ini 
erkekler, %32,5'ini ise kadınlar oluşturmuştur. Son olarak, nested PCR'dan elde edilen 
amplikonlar Sanger sekanslama yöntemiyle sekanslanmıştır. Buna göre, DNA'sı 
incelenen 80 HBV hastasının tümünde tek tip D genotipinin bulunduğu, 47 (%58,75) 
erkek ve 33 (%41,25) kadının bunu taşıdığı ve alt genotipin sırasıyla D1, D3 (%92,5, 
%7,5) olduğu tespit edilmiştir. İncelenen örneklerde 348 T>C, 495 C>T, 501 A>C, 520 
C>A, 522 G>A, 530 T>C ve 535 A>C olmak üzere farklı pozisyonlarda yedi nükleik asit 
varyantı gözlemlenmiştir. Gözlenen varyasyon aynı pozisyona sahip tüm örneklerde 
bulunmuştur. Diğer varyasyonlar ise incelenen farklı örneklerde farklı pozisyonlarda 
tespit edilmiş ancak tüm örneklerde tespit edilmemiştir. Bu amino asit dizilerinin HBV 
referans amino asit dizileri (GenBank acc. NC 003977.2) ile amino asit hizalaması 
yapılmış ve farklı pozisyonlarda, amplifiye edilen lokusların boyutu dahilinde S proteini 
üzerinde etki gösteren on varyant bulunmuştur. Bunlardan dördü örneklerin çoğunda 
tespit edilmiştir, bunlar p82.Pro>Leu, p84.Gln>Pro, p91.Gly>Glu ve p33.Leu>Pro'dur. 
Altı varyant ise çeşitli örneklerde ve pozisyonlarda tespit edilmiştir. Daha sonra, 
incelenen örneklerimiz arasındaki gerçek mesafeleri anlamak ve mutasyonlara ve 
genotipe dayalı akrabaların tespiti için biyoinformatik yazılım araçları yardımıyla bir 
filogenetik analiz gerçekleştirilmiştir. Dairesel bir kladogram olarak filogenetik ağacı 
oluşturmak için boot strap yöntemi/Jukes-cantor modeli/komşu birleştirme kullanılmıştır. 
Yuvalanmış PCR, dizileme ve filogenetik analiz, D genotipinin tespit edilen tek genotip 
olduğunu ortaya koymuştur. İnterlökinler ile incelenen grup örnekleri (akut, kronik ve 
kontrol) arasındaki ilişkiye dair sonuçlarımıza gelince, sonuçlar IL-6 ve IL-27'nin serum 
seviyelerinin hepatit vakalarında önemli ölçüde arttığını, ancak akut vakalarda kronik 
vakalara kıyasla daha yüksek olduğunu ve her iki durumda da seviyelerinin kontrol 
gruplarından daha yüksek olduğunu göstermiştir. IL-27 seviyeleri, IL-6 seviyelerine göre
oldukça anlamlı bir değere (p 0,0001**) sahiptir. İnterlökin 34 seviyelerinin, hastalar ve 
sağlıklı kontrol arasında yapılan karşılaştırmada anlamlı bir değere sahip olmadığı (p 
0,708 NS) ortaya çıkmıştır.

Abstract:
Hepatitis B virus (HBV) is a worldwide health problem. Cytokines play an important role 
in the elimination of HBV. Interleukins-6, 27 and 34 (IL-6, IL-27, IL-34) have recently 
been recognised as cytokines involved in the aetiology and pathogenesis of HBV. 
Genotyping of HBV is important because it can help guide treatment decisions. For 
example, some genotypes of HBV are more likely to respond to certain antiviral therapies 
than others. Furthermore, the risk of developing serious liver disease such as 
hepatocellular carcinoma and cirrhosis can be predicted using HBV genotyping. Studies 
have identified genotypes and sub-genotypes of hepatitis patients as well as variations in 
the genetic sequence. Furthermore, serum levels of IL-6, IL27 and IL-34 have also been 
determined in HBV patients and controls to understand their susceptibility role in disease 
development. Therefore, our study aimed to determine HBV genotype and allele 
frequencies in acute and chronic HBV patients living in Iraq. Our study included 139 
hepatitis-infected patients (male and female) and 40 healthy (non-HBV-infected) 
individuals (male and female) of different ages between January and October 2023. HBs 
Ag ELISA kit was used to detect HbsAg in all serum samples and Anti-HBc IgM ELISA 
kit was used to identify acute HBV patients. The 112 samples tested were analysed by 
nested PCR to detect hepatitis B virus DNA. First round PCR products revealed that 45 
(100%) of all acute hepatitis B patients showed a 1003 bp band, confirming that the 
present sample came from patients with hepatitis B infection with the virus. Of 67 chronic 
hepatitis B virus patients, 42 (62.7%) had a positive HBV-DNA test and 25 (37.3%) had 
a negative HBV-DNA test. The mean age ± SD of acute HBV patients was 39.25±2.17 
years, chronic patients were 36.35±2.56 years, and the control group had a lower mean 
age (26.97±1.49 years). However, a highly significant difference was found between the 
patient and control groups (p=0.0002). While 50% of acute HBV patients were both men 
and women, 67.5% of chronic HBV patients were men and 32.5% were women. Finally, 
amplicons obtained from nested PCR were sequenced by Sanger sequencing method. 
Accordingly, it was determined that all 80 HBV patients whose DNA was analysed had 
a single type D genotype, 47 (58.75%) males and 33 (41.25%) females carried this 
genotype and the sub-genotypes were D1, D3 (92.5%, 7.5%) respectively. Seven nucleic 
acid variants were observed at different positions in the analysed samples: 348 T>C, 495 
C>T, 501 A>C, 520 C>A, 522 G>A, 530 T>C and 535 A>C. The observed variation was 
found in all samples with the same position. Other variants were detected at different 
positions in different samples analysed but not in all samples. Amino acid alignment of 
these amino acid sequences with the HBV reference amino acid sequences (GenBank acc. 
NC 003977.2) was performed and ten variants were found at different positions, within 
the size of the amplified loci, showing an effect on the S protein. Four of these were 
detected in the majority of samples, namely p82.Pro>Leu, p84.Gln>Pro, p91.Gly>Glu 
and p33.Leu>Pro. Subsequently, a phylogenetic analysis was performed with the help of 
bioinformatics software tools to understand the actual distances between our studied 
samples and to identify relatives based on mutations and genotype. The boot strap 
method/Jukes-cantor model/neighbour-joining was used to construct the phylogenetic 
tree as a circular cladogram. Nested PCR, sequencing and phylogenetic analysis revealed 
that genotype D was the only genotype detected. As for our results on the relationship 
between interleukins and the studied group samples (acute, chronic and control), the 
results showed that serum levels of IL-6 and IL-27 were significantly increased in 
hepatitis cases, but higher in acute cases compared to chronic cases, and in both cases 
their levels were higher than in control groups. IL-27 levels had a highly significant value 
(p 0.0001**) compared to IL-6 levels. Interleukin 34 levels did not have a significant 
value (p 0.708 NS) in the comparison between patients and healthy control.