Otolog trombin ve kalsiyum glukonat ile aktive edilen plateletten zengin plazmanın çoklu ilaç direncine (ÇİD) sahip acinetobacter baumannii mikroorganizmasına karşı antibakteriyel etkinliğinin in vitro araştırılması
In vitro antibacterial activity of platelet rich plasma (PRP) activated by autologous thrombin and calcium gluconate on multi-drug resistant (MDR) acinetobacter baumannii
Yazar: RIZA AYTAÇ ÇETİNKAYA
Danışman: PROF. DR. İSMAİL YAŞAR AVCI
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kan Bankacılığı ve Transfüzyon Tıbbı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases
Dizin: Acinetobacter baumannii = Acinetobacter baumannii ; Antibiyotikler = Antibiotics ; Ayak = Foot ; Ayak hastalıkları = Foot diseases ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Kan trombositleri = Blood platelets ; Trombositten zengin plazma = Platelet rich plasma ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Diyabetik ayak enfeksiyonu (DAE) olan hastalarda damar kan akımının azalması nedeniyle azalmış doku beslenmesine ilaveten konak hücre savunmasında önemli rol alan lökosit, lenfosit, nötrofil ve trombositlerin bu bölgelere yeterli oranda ulaşamaması nedeniyle gelişen enfeksiyonların iyileşme süreci uzamakta ya da enfeksiyonlar baskı altına alınamamaktadır. Bu enfeksiyonların tedavisinde antibiyotik kullanımı çok önemlidir. Antibiyotik tedavisine ilaveten yara debridmanı, hiperbarik oksijen tedavisi, vakum aspirasyon uygulamaları ve bunlara ilaveten trombositten zengin plazma (TZP) uygulanılması son yıllarda önem arz etmektedir.
Acinetobacter baumannii DAE'ye yol açabilen en önemli mikroorganizmalardan birisi olup beraberinde uzun süre canlılığını koruyabilen, kolaylıkla çapraz bulaşa yol açıp fırsatçı enfeksiyonlara sebep olabilen önemli bir patojendir. Geniş spektrumlu bir β-laktam antibiyotik grubu olan karbapenemlerin de dâhil olduğu çok sayıda ilaca direnç göstermesi, bu patojenle olan enfeksiyonların tedavisinde ciddi problemlerin yaşanmasına neden olmaktadır. 
Bu çalışmada, Gülhane Askeri Tıp Akademisi Haydarpaşa Eğitim Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Servisi Bakteriyoloji Laboratuvarı'nda diyabetik ayak enfeksiyonu olan bir hastadan izole edilen Çoklu İlaç Direcine (ÇİD)'e sahip A. baumannii izolatı üzerinde, Gülhane Askeri Tıp Akademisi Haydarpaşa Eğitim Hastanesi Kan Bankası Müdürlüğü'ne kan bağışında bulunan bağışçılardan elde edilen TZP'nin in-vitro etkinliğinin ortaya konulması amaçlanmıştır.
Çalışmamızda, Ulusal Kan ve Kan Ürünleri Rehberindeki kan bağışçısı seçim kriterlerlerine uygun 8 gönüllünün her birinden TZP elde edilmesi amacıyla Magellan PRP™ kiti kullanılmıştır. Toplamda 6 ml ACD-A, 54 ml tam kan otomatize kapalı sistemli MagellanPRP™ cihazı ile 3 ml TZP ve 20 ml Trombositten Fakir Plazma (TFP) elde edildi. 
Otolog trombin elde edilmesi amacıyla bağışçılardan Vacuette® serum pıhtı aktivasyon tüpüne alınan 9 ml tam kanın üzerine 1 ml %10 kalsiyum glukonat ilave edilerek çeşitli santrifüj aşamaları sonrası trombin içeren serum elde edildi.
Elde edilen TZP ve TFP'nin ÇİD'e sahip A. baumannii izolatı üzerindeki antimikrobisidal etkinliklerinin, var ise etkinlik sürelerinin araştırılması için otolog trombin ile aktivasyon yapıldı. planlandı. Bu amaçla diyabetik ayak enfeksiyonu olan bir hastadan izole edilen, versiyon 6,0 EUCAST kriterlerine göre; Tobramisin, Kolistin ve Tigesiklin antibiyotiklerine hassas diğer antibiyotiklere dirençli (ÇİD) A. baumannii izolatı kullanıldı. 
TZP grubu için; koloni sayıları ayarlanmış (1X105) 100 µl A. baumannii çalışma tüplerine eklendi. Bunun üzerine 700 µl buyyon, 160 µl TZP son olarak 40 µl trombin eklendi. Çalışma tüplerinde son bakteri konsantrasyonu 1x104 kob/ml haline getirildi. Tüpler 37°C' de etüvde 200 rpm'de çalışan ajitatör üzerinde inkübasyonda bekletilirken 1., 2., 5., 10. saattlerde %5'lik Koyun Kanlı Agarın yüzeyine ekim yapıldı. 18-24 saatlik 37°C de inkübasyon sonrası koloniler sayım için değerlendirildi. 
TZP 'deki Beyaz Küre sayısı; 60,35 x 103 µl, Trombosit sayısı 1998,875 x 103 µl olarak saptandı. TZP'deki trombosit ve WBC verimliliğinde yaklaşık 10 kat artış saptandı.
TZP grubunun saatlere göre koloni ortalamaları sırasıyla 1.saat için 16,8; 2. saat için 20; 5. saat için 50,8; ve son olarak 10. saat için 933,8 olarak bulundu. TFP grubunun koloni ortalamaları ise 1.saat için 54,7; 2. saat için 81,4; 5. saat için 343; ve son olarak 10. saat için 977,5 olarak bulundu. Kontrol (PBS) grubunun koloni ortalamaları sırasıyla 1.saat için 47,5; 2. saat için 247,1; 5. saat için 944; ve son olarak 10. saat için 1000 olarak bulundu. 
TZP grubunda 1, 2. ve 5. saatlerdeki üreyen kolonilerin kontrol grubuna göre kıyaslandığında yüzdesel olarak 5. saatte tepe noktasına ulaştığı, 10. saaatte trombositlerin antimikrobisidal etkinliğini kaybettiği görüldü. İki grup arasındaki bu fark istatiksel olarak da önemliydi (p<0.05).
TFP grubunda 1, 2. ve 5. saatlerdeki üreyen kolonilerin kontrol grubuna göre kıyaslandığında yüzdesel olarak 2. saatte tepe noktasına ulaştığı, 5. saatte trombositlerin antimikrobisidal etkinliğinin 2. saatteki etkinliğe yakın olduğu, 10. saaatte trombositlerin bu etkinliği kaybettiği görüldü. Bununla birlikte iki grup arasındaki bu 2. ve 5. saatlerdeki üremede istatiksel olarak önemliydi (p<0.05).
TZP ve TFP grupları bir biri ile kıyaslandığında; TZP grubunun antimikrobisidal etkinlik yüzdelerinin 1., 2. ve 5. saatte daha yüksek olduğu, bakteri üremesi üzerine baskının daha etkili olduğu görüldü. Bu farklılığın TZP içerisindeki trombosit ve lökosit sayısının daha yüksek olmasından kaynaklanabileceği düşünüldü. İki grup arasındaki bu fark 1. ve 5. saatlerdeki üremede istatiksel olarak da önemliydi (p<0.05).
TZP'nin rejeneratif tıp veya DAE kullanımında etkili olabilmesi için, tam otomatize kapalı sisitemlerin kullanılması ile en yüksek trombosit ve lökosit değerlerinin elde edilebileceği, bu değerlerin başarıyı etkileyen en önemli faktörlerden biri olduğu düşünüldü.
TZP'nin çeşitli mikroorganizmalar üzerine etkisini incelemeye yönelik yapılan çalışmalarda bir takım farklılıklar gözlendiği; TZP'deki trombosit sayısı ve aktivasyona bağlı olarak ortaya çıkan kemokin, kinosidin miktarlarındaki değişikliklerden bu farklılıkların ortaya çıkarabileceği düşünüldü. Ayrıca TZP içindeki, trombosit başta olmak üzere lökosit ve lenfosit sayısının artmasının antimikrobisidal etkinliği arttırdığını ve lökosit hücrelerinin ortamda bulunup bulunmadığına göre etki süresinin değiştiği anlaşıldı.

Abstract:
It takes long time and it's hard to recover from diabetic foot infections because there is a lack of tissue nutrition due to decreased blood supply, so that leucocytes, lymphocytes, neutrophils which has an important role on host cell defence and platelets have difficulties to reach the infected sites. Antibiotics have the primary role on the treatment of infected wounds. Wound debridement, hyperbaric oxygen treatment, vacuum aspiration practices and platelet rich plasma (PRP) implementation are the other important treatment modalities of these infections in recent years.
Acinetobacter baumannii is one of the most important causes of diabetic foot infections. It can stay alive for a long time in environment and cause opportunistic infections easily.  Owing to the fact that it has resistance to most β-lactam antibiotics including carbapenems, it's hard to treat these infections.
In this study, we aimed to reveal the in-vitro effectivity of PRP obtained from blood donors in Gulhane Medical Academy Haydarpasa Training Hospital Blood Banking Center on a MDR A. baumannii strain obtained from a patient with diabetic foot infection in Gulhane Medical Academy Haydarpasa Training Hospital Medical Microbiology Laboratory.
To obtain PRP, we got 54 ml of blood from brachial vene of each of eight volunteers that meet the selection criteria of National Blood and Blood Products Guide with a 60–ml-syringe in Magellan PRP™ kit which contained 6 ml ACD-A. We obtained 3 ml of PRP and 20 ml of PPP at the end of the procedure.
We put 9 ml of whole blood and 1 ml of calcium gluconate into Vacuette® serum clot activation tube and then after various centrifugation processes we got the serum including autologous trombin. 
PRP and PPP were activated by autologous trombin to search for antimicrobial activity and duration of activity on MDR A. baumannii. A MDR A. baumannii, isolated from infected wound of a patient with a diabetic foot infection and resistant to tobramycin, colistin and tigecycline according to EUCAST criteria version 6,0 were used for this purpose.
For the PRP group, having regulated colony counts (1X105)  of 100 µl of A. baumannii were put into the sample tubes. 700 µl of liquid medium, 160 µl of PRP and then 40 µl of trombin were added into these tubes. Finally, we had 1x104 CFU/ml of bacteria concentration. These tubes were incubated in an incubator on an agitator which runs on 200 rpm at 37°C, and these bacteria concentrates were inoculated on 5% sheep blood agar at the 1st, 2nd, 5th and 10th hours of incubation. The colonies were counted after 18-24 hours of incubation at 37°C.
The number of white blood cells (WBC) and platelets in PRP were detected as 60,35 x 103 µl and 1998,875 x 103 µl, respectively. We had 10 times increase on productivity of WBC and platelet.
Mean values of colony counts of PRP group were 16.8, 20, 50.8, and 933.8 for 1st, 2nd, 5th. and 10th hours, respectively. Mean values of colony counts of PPP group were 54.7, 81.4, 343, and 933.8 for for 1st, 2nd, 5th. and 10th hours, respectively. Mean values of colony counts of PBS group were 47.5, 247.1, 944, and 1000 for 1st, 2nd, 5th and 10th hours, respectively.  
When 1st, 2nd and 5th hour colony counts are compared with control group, we observed that antimicrobial effect of platelets reached its peak point at 5th hour in terms of growth percentage, and it disappeared at 10th hour in PRP group.  This difference between two groups were also statistically significant (p<0.05).
When 1st, 2nd and 5th hour colony counts are compared with control group, we observed that antimicrobial effect of platelets reached its peak point at 2nd Hour in terms of growth percentage, it was nearly the same at 5th hour and it disappeared at 10th hour. But again, there was a statistically significant difference at 2nd and 5th hours between colony counts of these groups (p<0.05).
When we compared the PRP and the PPP groups, antimicrobial effect of PRP was higher at 1st, 2nd and 5th hours, so PRP was more effective on supressing bacterial growth. The reason for this diffrence may be due to the platelet and leukocyte counts in PRP. There was also a statistically significant difference at 2nd and 5th hours between colony counts of these groups (p<0.05).
We concluded that the one of the most important factors that effects the success of PRP in regenerative medicine and diabetic foot inections are the platelet and the leukocyte counts, thus it's important to use full automatized closed systems to obtain PRP.
The results of PRP studies on different microorganisms vary. Differences in chemokin and kinocidin amounts that are released after platelet activation and platelet amounts in PRP may be the cause for this variety.  Furhermore, we concluded that first platelet, then leukocyte and lymphocyte counts increases the antimicrobial effect, and the duration of this effect changes according to leukocyte amount in the medium.