Sünger mikrobiyomunun metagenomik yöntemlerle belirlenmesi
Determination of sponge microbiome by metagenomic approaches
Yazar: EBRU EMİRİYE KAVRUK
Danışman: PROF. DR. ELİF ESİN HAMEŞ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Çeşitlilik = Diversity

Özet:
Denizel çevrelerdeki mikrobiyal çeşitliliği oluşturan mikroorganizmaların çoğunluğunun süngerlerle simbiyotik yaşam sürdürdükleri uzun süredir bilinmektedir. Bu çeşitliliğin aydınlatılmasında geleneksel kültivasyon tekniklerinin yetersizliği nedeniyle mikroorganizmanın genetik materyalinin kullanıldığı metagenomik yaklaşımlar son yıllarda önemli bir yere sahiptir.
Bu tez çalışmasında Akdeniz'den toplanan Agelas oroides, Ciocalypta carballoi, Petrosia ficiformis ve Sarcotragus foetidus sünger türlerinin mikrobiyal çeşitliliği metagenomik yöntemlerle araştırılmıştır. Örneklerden metagenomik DNA izolasyonu yapılarak, 16S rDNA-V3 ve ITS1 primerleriyle PCR'da çoğaltılmış, 16S rDNA-V3 amplikonları %0-50 ve %40-70; ITS1 amplikonları ise %0-50 denatürant konsantrasyonunda Denatüre Gradient Jel Elektroforezi'nde (DGGE) yürütülmüştür. %40-70 gradientinde yürütülen 16S rDNA-V3 fragmentleri daha etkili şekilde ayrılmış, sırasıyla 20 ve 14 adet bant izole edilmiştir. %0-50 denatürasyon gradientinde yürütme sonucunda ise 10 adet fungal bant izole edilmiştir. Toplamda 44 adet bant izole edilmiş ve dizi analizleri yapılmıştır. Bu dizilerin BLAST analizleri yapılarak yakın oldukları mikroorganizmalar belirlenerek MEGA6 programıyla filogenetik ağaçları çizilmiştir. 16S rDNA-V3 dizileri için KY379824-KY379849,  ITS1 dizileri için KY363543-KY363552 erişim numaralarıyla GenBank'a kaydedilmiştir. 
Agelas oroides, Ciocalypta carballoi, Petrosia ficiformis ve Sarcotragus foetidus süngerlerindeki bakteriyel çeşitliliğin fungal çeşitliliğe göre fazla olduğu belirlenmiştir. Süngerlerde en sık rastlanan Proteobacteria filumu üyeleri çalışmada kullanılan tüm örneklerde belirlenmiştir. P. ficiformis'ten elde edilen bantların, BLAST sonucunda benzerlik gösterdiği dizilerin denizel çevrelerden elde edilen 16S rDNA dizileri olduğu tespit edilmiştir. A. oroides süngerinde saptanan karasal kaynaklı kültive edilmemiş Roseospirillum sp. bu süngerde ilk defa belirlenmiştir. Literatürde kaydı çok yeni ve henüz hakkında az çalışma olan C. carballoi süngerindeki BLAST sonucunda kültive edilmemiş karasal kaynaklı Cellulomonas sp. ve Actinobacterium olduğu tespit edilmiştir. Fungal çeşitlilik ise yalnızca A. oroides ve P. ficiformis süngerinde belirlenmiştir. A. oroides'den elde edilen 4 adet fungal bandın ise denizel sedimentlerden elde edilen kültive edilmemiş fungus dizileriyle benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. P. ficiformis süngerinden elde edilen fungal bandın BLAST sonucunda ise kaynaklı kültive edilmemiş liken oluşturan karasal Trichopezizella relicina ilk kez bu çalışma ile belirlenmiştir.

Abstract:
It has been known that most of the microorganisms that constitutes microbial diversity in marine environments has symbiotic relationship with sponges. The metagenomic approaches in which the genetic material of the microorganism is used due to the inadequacy of conventional cultivation techniques exposing this diversity took an important place in the recent years.
In this thesis, microbial diversity of Agelas oroides, Ciocalypta carballoi, Petrosia ficiformis and Sarcotragus foetidus sponges collected from Mediterranean sea has been analyzed by metagenomic methods. Metagenomic DNA was isolated and amplified by PCR with 16S rDNA-V3 and ITS1 primers. 0-50% and 40-70% denaturant concentrations were used for Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of 16S rDNA-V3 amplicons and 20 and 14 bacterial bands were isolated respectively. 0-50% denaturant concentration was used for Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of ITS1 amplicons and 10 fungal bands were isolated. Totally 44 bands were isolated and sequenced. BLAST analysis were performed to define the nearest sequence match and phylogenetic trees were constructed by using MEGA6 software. Sequences have been registered to GenBank with accession numbers; KY379824-KY379849 for the 16S rDNA-V3 sequences, KY363543-KY363552 for the ITS1 sequences.
It was determined that bacterial diversity of A. oroides, C. carballoi, P. ficiformis and S. foetidus was higher than their fungal diversity. Most common Proteobacteria phylum members were identified in all sponges. In this thesis, uncultured Roseospirillum sp. was determined in A. oroides for the first time. Uncultured terrestrial Cellulomonas sp. and Actinobacterium was also determined in C. carballoi. Fungal diversity was determined only in A. oroides and P. ficiformis. Fungal sequences obtained from A. oroides, was found highly similar to uncultured fungal sequences obtained from marine sediments. Uncultured lichen forming terrestrial Trichopezizella relicina from P. ficiformis was identified in this study for the first time.