Moleküler hastalık kontrolü için fitoplazma efektör proteinlerinin belirlenmesi
Determination of phytoplasma effector proteins for molecular disease control
Yazar: KAYHAN DERECİK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ IŞIL TULUM
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Botanik = Botany
Dizin: Bitki patojeni bakteriler = Plant pathogenic bacteria ; Bitki proteinleri = Plant proteins

Özet:
Fitoplazmalar, bitki özsuyuyla beslenen ve aynı zamanda konakçı olarak görev yapan böcekler
tarafından iletilen bitkilerin zorunlu parazitleri olan en saldırgan floem sınırlı patojenlerden
biridir. Birçok önemli ürün de dahil olmak üzere 1000'den fazla bitki türünü enfekte ederler ve
dünya çapında yıkıcı verim kayıplarıyla ilişkilendirilirler. Bu benzersiz bakteriler, bakteriyel
atalarından evrimleşmeleri sırasında genomlarındaki birçok metabolik yolak kaybolmuş ve
boyutlarında büyük azalmalar geçirerek en küçük genomlardan birine ulaşmışlardır.
Fitoplazmalar, N-terminal sinyal peptitlerinin (SP), sinyal peptidaz I (SPaz I) taradından kesimi
ile ekstraselüller alana salgıladıkları "efektör proteinler" aracılığıyla konak hücre
fonksiyonlarını manipüle edebilir ve bitkilerde çeşitli anomalilere neden olabilirler. Efektörler
virülans için önemlidir ve bu nedenle fitoplazma ile ilişkili hastalıkların kontrolü için hassas
hedeflerdir. Fitoplazmaların in vitro kültüre alınamayan durumları nedeniyle fitoplazma
efektörleri üzerine sınırlı çalışmalar vardır. Günümüzde efektör adaylarının SP'leri ve kesim
noktaları (KN); amino asit sekansları üzerinden in silico uygulamalar yardımı ile tahmin
edimektedir fakat sonuçlar yüksek oranda yanlış pozitif yanlış negatif değerler göstermektedir.
Bu çalışmada, fitoplazmalarda in silico SP tahmin yöntemlerini ikinci boyuttan üçüncü boyuta
(3D) çıkartarak, sekansa dayalı SP tahmin programlarının sonuçlarını, 3D protein yapılarını
kullanarak SP-SPaz I etkilişimleri üzerinden valide edebileceğimiz bir gidişat yolu geliştirmeyi
hedefledik. Literatürde kesilebilir SP barındırdığı gösterilmiş olan virülans proteilerinden oluşturduğumuz
datasetinin ve bu referans virülans proteinlerin (RVP) belirlemiş olduğumuz homologlarının
olası SP KN'larını tekrar valide ettik. Daha önce üzerinde her hangi bir çalışma bulunmayan
Fitoplazma SPaz I'lerini yapısal analizler ile karakterize ettik ve bakteriler arasında ender
görülen ökaryotik ER-tipi SPaz I olduklarını belirledik. ColabFold uygulamasını kullanarak
oluşturduğumuz 3D SP-SPaz I hetero-oligomer yapıları üzerinden SP karakterizasyonu ve
bağlanma profili oluşturduk. Elde ettiğimiz verileri kulanılarak güvenilir bir Fitoplazma SP
belirleme, hali ile Fitoplazma efektör proteinlerini belirleme gidişat yolunu tasarlamış olduk.
Geliştirmiş olduğumuz gidişat yolunu, Fitoplazma taksonlarının salgıladığı olası efektör protein
adaylarını belirlemek için kullandık. Fitoplazma olası efektör adaylarının çoğunun, SAP54'te
de görüldüğü gibi; transkripsiyon faktörleri ile etkileşime girerek destabilize edici coiled coil
katlanma motifi gösterdiğini gördük. Bunların yanında M41 ailesine ait metalopeptidaz ve
C3H1-tipi çinko parmak motifi taşıyan efektör adayları ve diğer proteinler ile homolojik
benzerlik taşımayan birçok yeni efektör adayı belirledik. Fitoplazmaların ER-tipi SPaz I'e sahip
olduğu ilk bu çalışma ile gösterilmiş olmakla birlikte, tasarladığımız gidişat yolu ile,
laboratuvar ortamında test edilebilecek birçok olası efektör proteini belirlemiş bulunduk.
Keşfettiğimiz bu efektörler üzerine yapılan çalışmalar ile, fitoplazma salgınına karşı direnç ve
savunma yöntemlerinin geliştirilebileğini umut ediyoruz.

Abstract:
Phytoplasmas are one of the most aggressive phloem-limited pathogens, obligate parasites of
plants transmitted by insects that feed on plant sap and also act as hosts. They infect over 1000
plant species, including many important crops, and are associated with devastating yield losses
worldwide. During their evolution from their bacterial ancestors, these unique bacteria lost
many metabolic pathways in their genome and have undergone massive reductions in size,
resulting in one of the smallest genomes. Phytoplasmas can manipulate host cell functions and
cause various anomalies in plants through "effector proteins" secreted into the extracellular
space by cleavage of N-terminal signal peptides (SP) by signal peptidase I (SPaz I). Effectors
are important for virulence and are therefore sensitive targets for the control of phytoplasma associated diseases. Due to the inability of phytoplasmas to be cultivated in vitro, there are limited studies on phytoplasma effectors. Currently, the SPs and cleavage sites (CSs) of effector
candidates are predicted from amino acid sequences using in silico applications, but the results
show a high rate of false positive and false negative values. In this study, we aimed to develop
a pipeline by extending in silico SP prediction methods in phytoplasmas from the second to the
third dimension and validate the results of sequence-based SP prediction programs on SP-SPaz
I interactions using 3D protein structures. We re-validated the possible SP CSs of a dataset of virulence proteins that have been shown to
harbor truncable SP in the literature and homologs of these reference virulence proteins (RVPs).
We characterized the previously unstudied Phytoplasma SPaz I by structural analysis and found
that they are eukaryotic ER-type SPaz I, which is rare among bacteria. We used ColabFold to
characterize and binding profile SP on 3D SP-SPaz I hetero-oligomer structures. Using our
data, we have designed a reliable pipeline for the identification of Phytoplasma SP and,
consequently, Phytoplasma effector proteins.
Using the pipeline we developed, we sought to identify possible effector protein candidates
secreted by Phytoplasma taxa. We found that most of the possible phytoplasma effector
candidates show a destabilizing coiled coil folding motif by interacting with transcription
factors, as seen in SAP54. In addition, we have identified a number of new effector candidates
from the M41 family, including metallopeptidase and C3H1-type zinc finger motif-bearing
effector candidates, as well as many new effector candidates that do not share homologous
similarities with other proteins. In addition to being the first to show that phytoplasmas possess
ER-type SPaz I, our designed pathway has identified many possible effector proteins that can
be tested in the laboratory. We hope that by studying these effectors, resistance and defense
methods against phytoplasma outbreaks can be developed.