İdrar ve serum kortizol ve kortizon seviyelerinin ölçümünde 
ımmunoassay ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometre (LCMS/MS) metodlarının 
karsılaştırılması.
Comparison of immunoassay and liquid chromatography-tandem mass 
spectrometry (LCMS/MS) methods in the measurement of serum and urine cortisol and cortisone levels.
Yazar: FATMAGÜL GÜN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. HÜSAMETTİN VATANSEV
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Hidrokortizon = Hydrocortisone ; Kortizon = Cortisone ; Kromatografi = Chromatography ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Serum = Serum ; Spektrofotometri = Spectrophotometry ; İdrar = Urine ; İmmünoassay = Immunoassay

Özet:
Kortizol adrenal korteksten salınan ana glukokortikoid hormondur. Vücudun strese karşı gösterdiği yanıtın yanında, karbonhidrat, protein ve lipit metabolizmasında da önemli rol oynar. Temel olarak kortikosteroid bağlayıcı globüline, az miktarda albümine bağlanarak plazmada taşınır. Yaklaşık %5'lik kısmı plazmada serbest olarak bulunur. Serbest kortisol fraksiyon aktif olan formdur ve glomerüler filtrasyona uğrar. Karaciğerde metabolize edilir ve glukronid ve sülfat konjugatı şeklinde atılır. Kortizol metabolizmasının değişimi pek çok patolojik durumla ilişkilidir. Hem hipokortizolizm hem de hiperkortizolizm hastalığa neden olur. Plazma kortizol ve ACTH düzeyi ile birlikte idrar kortizol analizi Cushing sendromunun tanısında önemlidir. İdrardaki kortizol/kortizon oranı ve minerelokortikoid fazlalığı sendromu, konjenital adrenal hiperplazi ve adrenal yetmezliğin tespiti için de önemlidir.
Biyolojik sıvılardaki kortizol düzeyinin ölçümü, rutin biyokimya laboratuvarlarında immunoassaylerle gerçekleştirilmektedir. Kullanım kolaylığı, otomasyon uyumu ve yüksek verim bu yöntemin önemli avantajlarındandır. Ancak immunoassay yöntemlerde sıvı-sıvı ektraksiyon ile interfere edici bileşikler elemine edilmesine rağmen, bu yöntemlerde kortizon ve diğer endojen steroid metabolitlerin ve prednizolon gibi sentetik glukokortikoidlerin interferansı bulunmaktadır. Yöntemin diğer bir kısıtlaması da ektraksiyon sürecinde kortizol kaybını dengeleyen bir internal standartın bulunmamasıdır. İmmunoassay yöntemlerin tüm bu sınırlamaları kortizol ölçümünde spesifik kromatografik yöntemlerin geliştirilmesine ışık tutmuştur. Kromatografik metotlar kortizol ölçümünde sadece interferansı azaltmaz, aynı zamanda kortizolün endojen metaboliti olan kortizon ölçümüne de olanak sağlar. Son çalışmalar, kortizol/kortizon oranının ölçülmesinin, 11BHSD aktivitesinin gösterilmesinde, kortizol ve kortizonun endojen metabolitlerinin oranından daha iyi bir gösterge olduğunu vurgulamıştır. Karşılaştırma çalışmaları kromatografik yöntemlerin kortizol miktarını daha doğru ölçtüğünü göstermiştir. Kromatografik yöntemler immunoassay yöntemlere göre Cushing sendromu ve minerelokortikoid fazlalığı sendromunun tanısında daha iyi bir diagnostik değer sağlamaktadır.
Bu çalışmada, kortizol/kortizon analizinde altın standart metot olarak değerlendirilen LC-MS/MS yönteminin metot validasyonu CLSI kurallarına uygun bir şekilde gerçekleştirildi. Yöntem karşılaştırma amacıyla idrar ve serum kortizol düzeyleri LC-MS/MS, ELISA ve kemilüminesans immunassay yöntemler ile çalışıldı.
Metot validasyon parametreleri kapsamında linearite, tekrarlanabilirlik, geri kazanım, interferans, referans aralık doğrulama, analitik ölçüm limitleri, taşıma, numune satabilitesi, matriks etkisi, dondurma-çözmenin etkisi ve yöntem karşılaştırma çalışmaları yapıldı. Linearite çalışmasında yöntemimiz kortizol için 10000 ve 1.9 μg/L aralığında, kortizon için 200 ve 0.78 μg/L aralığında lineer olarak bulundu. Tekrarlanabilirlik çalışmasından elde edilen en düşük ve en yüksek %CV değerleri kortizol için sırasıyla 0.9 ile 7.6, kortizon için sırasıyla 1 ile 7.1 bulundu. Kortizol ve kortizon için yapılan interferans çalışmasında elde edilen % bias, izin verilen % Bias'ın altındadır. Kortizol için %103 lük, kortizon için 98.8'lik bir geri elde sağlanırken, kantitasyon limiti kortizolde 3.125 μg/L, kortizonda 3.125, dedeksiyon limiti kortizolde 1.56 μg/L, kortizonda 0.78 μg/L olarak belirlendi. Numune aktarım miktarı kortizolde –0.0256, kortizonda ise 0.1458 olarak tespit edildi. Metot karşılaştırma sonucunda kortizol ölçümlerinin LC-MS/MS ile kemilüminesans immunoassayler ve ELISA arasındaki değerlendirmeler literatür ile uyumlu bulundu. CLSI tarafından belirlenen yöntemin kabul edilebilirlik kuralları göz önüne alınarak yapılan performans değerlendirmesinde LC-MS/MS yöntemi kabul edilebilir bulundu.
ANAHTAR KELİMELER: kortizol, kortizon, LC-MS/MS, immunoassay, metot validasyonu

Abstract:
Cortisol is a glucocorticoid hormone that is released from adrenal cortex. It plays an important role in carbohydrate, lipid and protein metabolism besides stress response of body. Cortisol is carried in plasma by binding to corticosteroid-binding globulin basically, and binding to albumin in small amounts. Almost 5% percent of cortisol is free form in plasma. Free cortisol fraction is active form and it is exposed glomerular filtration. It metabolized in liver and excreted as the glucuronide and sulfate conjugates. Alteration of cortisol metabolism is related of various pathological cases. Hypocorticolism and also hypercorticolism cause diseases. Cortisol analysis with level of plasma cortisol and ACTH is important for diagnosis of Cushing syndrome. Cortisol-cortisone ratio in urine and apparent mineralocorticoid excess syndrome are important for determination of congenital adrenal hyperplasia and adrenal deficiency.
Cortisol quantification in biological fluids is done by using immunoassays in routine biochemistry laboratories. Ease of use, automation and high throughput are important advantages of this method. Although, interfering substances are eliminated by liquid-liquid extraction in immunoassay methods, interference of endogen steroid metabolites such as cortison and synthetic glucocorticoid such as prednisolan are present in these methods. Another limitation of method is lack of internal standard that compensates of loss of cortisol during extraction process. These disadvantages of immunoassay methods set light to improvement of specific chromatographic methods. Chromatographic methods do not only reduce interference in cortisol quantification, also they facilitate quantification of cortisone that is an endogen metabolite of cortisol. Recent studies emphasize that quantification of cortisol-cortisone ratio is a better indicator than endogen metabolites ratio of cortisol and cortisone to show 11BHSD activity. Comparative studies show that chromatographic methods measure amount of cortisol more correctly. Chromatographic methods provide better diagnostic value for diagnosis of Cushing syndrome and apparent mineralocorticoid excess syndrome compared to immunoassay methods.
In this study, method validation of LC-MS/MS which is a gold standard method for cortisol/cortisone analysis, was done according to CLSI rules. Cortisol levels in urine and serum were studied with LC-MS/MS, ELISA and immunoassay methods for method comparison.
Linearity, repeatability, recovery, interference, reference internal verification, determination limit of detection and limit of quantification, carry over, sensitivity, specificity, stability of samples, effect of matrix, freezing-thawing studies were done within a context of method validation. Our method was found linear in 1.9-10000 μg/Lrange for cortisol and cortisone lineer in 0.78-200 μg/Lrange. Highest and lowest CV% values obtained in repeatiblity study were 0.9 and 7.6 for cortisol and 1and 7.1 for cortisone respectively. According to results of interference study cortisol and cortisone bias % did not exceed the limit of allowable bias % . While 103 % recovery was acquired for cortisol and 98.8 % for cortisone, quantification limit was determined as 3.125 μg/Lfor cortisol, 3.125 μg/Lfor cortisone, detection limit was determined as 1.56 μg/Lfor cortisol and 0.78 μg/Lfor cortisone. Amount of carry over of samples was found as -0.0256 for cortisol and 0.1458 for cortisone. Method comparison of cortisol results in LC-MS/MS with ratings between chemiluminescence immunoassay and ELISA were found to be consistent with the literature. LC-MS/MS was found acceptable in evaluation of performance according to acceptable rules of method determined by CLSI.
KEYWORDS: Cortisol, cortisone, LC-MS/MS, immunoassay, method validation