Santral sinir sistemi infeksiyonu etkeni olan enterovirüslerin saptanmasında  hücre kültürü yöntemi ve rt-pcr yöntemlerinin karşılaştırılması
Comparison of cell cultural method and rt-pcr methods in determination of enteroviruses that cause active infection
Yazar: GÜNEŞ ÖZÇOLPAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET TOLGA TAN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Enterovirüsler = Enteroviruses ; Hücre kültür teknikleri = Cell culture techniques ; Merkez sinir sistemi enfeksiyonları = Central nervous system infections ; Merkez sinir sistemi hastalıkları = Central nervous system diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Santral sinir sistemi (SSS) infeksiyonları; menenjit, ensefalit ve ensefalomiyelitten beyin apselerine kadar geniş bir klinik dağılım gösterir. Hızlı ilerleme potansiyeli, kalıcı nörolojik hasar olasılığı ve ölüme yol açabilmesi nedeniyle çoğu infeksiyonda acil tanı ve tedavi yaklaşımı gerekmektedir.  
Aseptik menenjit, inflamatuvar bir beyin zarı hastalığı olup, birçok etkenle gelişebilmektedir. Aseptik menenjitin en sık saptanan etkeni viruslardir ve %80-95'inden enterovirüslar (EV) sorumludur. Viral ensefalitlerin yaklasık %10-20'si de enterovirüs kaynaklıdır.
Enterovirüs infeksiyonlarını saptamada hücre kültürü, serolojik testler ve nükleik asit amplifikasyon testleri (NAT) kullanılmaktadır. Enterovirüs infeksiyonu tanısında hücre kültürü standart yöntemdir ancak NAT tanıda daha yaygın olarak kullanılmaktadır.
Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi (ADÜTF) Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarında santral sinir sistemi infeksiyonu etkeni virusların saptanmasında mültipleks Real-Time PCR yöntemi kullanılmaktadır. İlgili örneklerin laboratuarımızda rutinde Real-Time PCR yöntemi yanısıra hücre kültürü yöntemi ile de çalışılmasının enterovirüs yakalama oranını arttırabileceği ve olası yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçların yorumlanmasına katkı sağlayabileceği düşünülmektedir. 
Bu çalışmaya, ADÜTF hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarlarına viral SSS enfeksiyonu şüphesi olan hastalardan, Real-Time PCR testi istemiyle,  01.11.2018 ile 01.11.2019 tarihleri arasında, klinik açısından viral SSS infeksiyonu şüphesi olan hastalardan, nükleik asit testi ile viral menenjit paneli çalışılması için gönderilen, 20 adet BOS örneği çalışmaya dahil edilmiştir. Ayrıca Enterovirüs üremesi olan hücre kültür hattı süpernatantından 20 adet, 2 katlı,  seri dilüsyon hazırlanmıştır. Farklı miktarlarda enterovirüs içeren dilüsyonların herbiri iki alikota ayrılmıştır ve hem hücre kültürü yöntemiyle hem de Real-Time PCR yöntemiyle, eş zamanlı çalışılmıştır.  Hücre  kültürü çalışması, "shell vial" yöntemi ile Vero (African green monkey kidney-fibroblastbenzeri hücre; Refik Saydam Hıfzıssıhha, Ankara), HEp-2 (Human laringeal carsinoma-epitelyal hücre; Japonya Hücre Bankası) ve RD (Human rabdomyosarkoma-kas hücresi;DSMZ, Almanya) hücre hatları kullanılarak yapılmıştır.
Bu çalışmada menenjit şüpheli hastalara ait 20 adet BOS örneği arasından, altı örnekte (%30) real-time PZR ile EV RNA saptanmıştır ve bir örnekte (%5) hücre kültürü ile enterovirüs üremesi saptanmıştır. Hücre kültürü yönteminde doğru sonuç için örnekte bulunan virüsün canlı olması gerekmektedir.  Bu çalışmada yöntemler arası saptama oranı farklılığının hücre kültürü çalışmasının saklanmış örneklerde yapılması ve saklama sırasında da virüsün canlılığını kaybetmesine bağlı olabileceği düşünülmüştür. Örnek miktarının az olması nedeniyle test tekrarına gidilememiştir. 
Hücre kültüründe EV üreyen BOS örneğininin süpernatantından MEM sıvısında hazırlanan 2 katlı dilüsyon örneklerinde (20 adet dilüsyon 1/2 - 1/4 - 1/8…)  ise 20 dilüsyon örneğinin 17(%85)'sinde, hücre kültüründe EV üremesi saptanmıştır  ve 15(%75)'inde ise real-time PZR testi ile EV RNA saptanmıştır. Bu çalışmada hücre kültüründe üreme olan vialin süpernatantından dilüsyonla hazırlanan, EV içeren örnekler işlemlendiğinde hücre kültüründe NAT'a göre daha yüksek oranda (%85/%75) EV pozitiflği sapanmıştır.    Dilüsyonlu örneklerin, bekletilmeden ekilmesi nedeniyle virüs canlılığını yitirmeden viallere inoküle edilebilmiştir. Bu durum hücre kültürü yönteminde örneğin transferi ve saklama koşullarının  etken izolasyon oranını büyük oranda etkilediğini göstermiştir.
Rutin tanıda kullanılan NAT'ların validasyon kriterleri ve saptayabildikleri EV tipleri yönünden özenle seçilmesinin önemi vurgulanmalıdır. Hücre kültürü yöntemi  zaman alıcı ve fazla miktarda örnek inokülasyonu gerektirmesi gibi nedenlerle rutin uygulama açısından pratik değildir ancak rutin tanı laboratuvarlarında NAT negatif çıkan BOS örneklerinde, shell vial yöntemiyle hücre kültürü yapılarak tanının desteklenmesinin, tanı duyarlılığını arttırmada önemli  olduğu düşünülmüştür.

Anahtar kelimeler: Enterovirüs, Hücre kültürü, Real-Time PCR

Abstract:
Central nervous system (CNS) infections includes many clinical forms ; meningitis, encephalitis and encephalomyelitis to brain abscesses. Most of the enteroviral infections require immediate diagnosis and treatment because of the potential for rapid progression, the possibility of permanent neurological damage and death.
Aseptic meningitis is an inflammatory brain disease and can be caused by many factors. Viruses are the most common causative agent of aseptic meningitis and enteroviruses (EV) are responsible for 80-95%. Approximately 10-20% of viral encephalitis is caused by enterovirus.
Cell culture, serological tests and nucleic acid amplification tests (NAT) are used to detect enterovirus infections. Cell culture is the standard method for the diagnosis of enterovirus infection, but NAT is more widely used in the diagnosis.
Adnan Menderes University Medical Faculty (ADÜTF) Hospital Department of Medical Microbiology Laboratory uses Real-Time PCR method for detection of central nervous system infections. It is considered that studying the related samples with routine cell culture method as well as Real-Time PCR method in our laboratory may increase the rate of enterovirus capture and contribute to the interpretation of possible false positive and false negative results
20 CSF samples; from the patients suspected of viral CNS infection sent to investigate the viral meningitis panel by the Real-Time PCR test in ADUTF Hospital Medical Microbiology Laboratories between 01.11.2018 and 01.11.2019;  were included in the study. 
 In addition, supernatant obtained from enterovirus positive cell cultures, 2  folds serially diluted with sterile SF. 20 dilution samples, each dilution containing different amounts of enterovirus, were prepared.  Each dilution specimen was divided into two aliquots and studied by both cell culture method and real-time PCR method at the same time. All samples were cultured using "shell vial" method using Vero, HEp-2 and RD cell lines.
In this study, a higher rate of enterovirus positivity was detected in CSF specimens (20 CSF specimen) with NAT compared with cell culture (%30/%5 respectively). This difference between the methods was thought to be due to the loss of viability of the virus during storage. Due to the small sample amount, the test could not be repeated. Cell culture enterovirus positivity rate is higher than  NAT (%85/75 respectively) in the dilution samples prepared from the enterovirus positive cell culture. These dilution samples were not stored and were tested quickly. This showed that transfer and storage of factors greatly affect the isolation rate of the cell culture method.
It should be emphasized that NATs used in routine diagnosis should be carefully selected in terms of validation criteria and EV types they can detect. Cell culture method; is time consuming and it requires excess sample inoculation;  is not practical for routine applications because. In routine laboratory diagnosis especially for NAT-negative CSF samples, supporting the diagnosis performed in cell culture with the shell vial method together with NAT is thought to be important in increasing diagnostic sensitivity.

Key words: Enterovirus, Cell culture, Real-Time PCR