Penisilin asilaz üreten rekombinant E.coli soylarında gen ekspresyonu, enzimin saflaştırılması ve nitelendirilmesi
Gene expression in penicillin acylase producing recombinant E.coli strains, purification and characterization of the enzyme
Yazar: HÜLYA AKDEMİR
Danışman: Y.DOÇ.DR. SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Penisilin G, penisilin V, ampisilin gibi Î²-laktam çekirdeğine sahip bileşiklerinhidrolizini katalize eden penisilin asilazlar (penisilin amidohidrolaz, E.C.3.5.1.11)bakteri, maya, mantar gibi birçok mikroorganizmada bulunmakta olup, substrattercihlerine göre penisilin G asilaz, penisilin V asilaz ve ampisilin asilaz olmak üzereüç gruba ayrılır. Bulundukları mikroorganizmaya bağlı olarak hücre içinde ya dahücre dışında yer alabilen penisilin asilazlar, gram negatif bir bakteri olanEscherichia coli soylarında periplazmik alanda yer alır. Sitoplazmada inaktif öncülbir molekül olarak sentezlenen E. coli penisilin asilazı karmaşık translasyon sonrasıişlenme basamakları sonucunda periplazmada aktif/olgun şekline kavuşur. laçendüstrisinde yarı sentetik penisilinlerin üretiminde başlangıç bileşiği olan 6-aminopenisillanik asit (6-APA) üretiminde yaygın olarak kullanılan penisilinasilazlar, ayrıca peptit sentezi ile amino asit, amin ve amino alkollerin ayrılmasındada katalizör olarak kullanılır. laç endüstrisinde bu enzime duyulan gereksinim;enzimin bulunduğu ya da rekombinant olarak üretileceği organizmalarda üretimininarttırılmasına ve endüstriyel süreçlerde daha verimli bir şekilde kullanılabilmesi içinçeşitli özelliklerinin geliştirilmesine yönelik çalışmalara hız kazandırmıştır.Bu tez çalışmasında; penisilin asilaz enziminin transkripsiyon vetranslasyonunu iyileştirmeye yönelik olarak, TÜB TAK GMBAE Enzim MolekülerGenetiği Laboratuvarı tarafından tasarlanarak geliştirilen, kontrol bölgesindemutasyonlar taşıyan pac genlerini içeren rekombinant E. coli soyları arasından, enyüksek enzim aktivitesine sahip rekombinant soyun seçilmesi ve bu soy ile yine aynıGrup tarafından geliştirilen ve yaban pac genini taşıyan rekombinant soy tarafındanüretilen enzimlerin paralel olarak saflaştırılması ve nitelendirilmesi hedeflenmiştir.Yapılan gen ekspresyonları sonucunda P2Spaclac- rekombinant soyu en yüksekaktivite değerini verdiğinden, tez çalışması kapsamında, yaban tipi pac genini taşıyanrekombinant E. coli JM109 (pacwt) soyu tarafından üretilen enzimin yanı sıraP2Spaclac- soyu tarafından üretilen penisilin asilazın saflaştırılarak nitelendirilmesinekarar verilmiştir.Penisilin asilaz hücre içinden, sonikasyonu izleyen kademeli amonyum sülfatçöktürmeleri ardından yapılan DEAE-selüloz FF anyon değiştirici kromatografieliyle saflaştırılmıştır. Yapılan saflaştırma çalışmaları sonucunda; pacwt rekombinantpenisilin asilaz % 1053 verimle, 1446 kez saflaştırılmış ve enzimin spesifik aktivitesi48 U/mg olarak belirlenmiş; P2Spaclac- rekombinant penisilin asilaz ise % 413verimle, 460 kez saflaştırılmış ve spesifik aktivitesi 36 U/mg olarak belirlenmiştir.Yapılan nitelendirme çalışmaları sonucunda; pH 8.0-9.0 aralığının enzim içinoptimal olduğu ve enzimin pH 3.5-9.0 aralığında, iki gün inkübasyon sonrasındaaktivitesini % 75-100 oranında koruduğu belirlenmiştir. Enzimin optimal reaksiyonsıcaklığı 60 ºC olarak saptanmış ve yapılan sıcaklık kararlılığı testlerinde enzimin,25-50 ºC'ta aktivitesini koruduğu, 55-60 ºC gibi daha yüksek sıcaklıklarda isekararsız olduğu belirlenmiştir. 1 ve 10 mM derişimdeki çeşitli metal iyonlarıvarlığında, enzim aktivitesinde önemli bir değişiklik olmamıştır. Triton-X 100,Tween 20 ve Tween 80 gibi deterjanlar enzim aktivitesini değiştirmemiştir.EDTA'nın enzim aktivitesi üzerinde belirgin bir inhibe edici etkisinin olmaması,penisilin asilazın işlevini gerçekleştirirken, herhangi bir kofaktöre (metal) gereksinimduymadığı ile ilgili çalışmaları doğrulamıştır. DTT ve Î²-ME varlığında enziminaktivitesini koruyor olması, yapısında sistein köprüsü taşımadığını ve PMSFvarlığında enzim aktivitesinin tamamen inhibe olması, aktif bölgede bulunan serinamino asitinin, katalitik rezidü olduğunu doğrular niteliktedir. Enzimin kritiksıcaklıklardaki kararlılığını arttırmak üzere reaksiyon ortamına eklenen gliserol,etilen glikol ve CaCl2, enzim aktivitesini önemli oranda korumuş, hatta arttırmıştır.Aseton, etanol, metanol, izopropanol, DMSO ve asetonitrilin özellikle % 10'lukderişiminde enzim aktivitesinde çok büyük oranda değişiklik belirlenmemiştir.Nitelendirme çalışmalarından elde edilen sonuçlar, rekombinant enzimlerin buözellikleriyle biyokataliz süreçlerinde kullanılabileceğine işaret etmiştir.

Abstract:
Penicillin acylases (penicillin amidohydrolyses, E.C.3.5.1.11) which catalyze thehydrolysis of Î²-lactam nucleus containing compounds such as penicillin G, penicillin V,ampicillin are mainly produced by many microorganisms (i.e. bacteria, yeast, fungi) andthey are divided into three groups, namely penicillin G acylase, penicillin V acylase andampicillin acylase, according to their substrate preferences. Penicillin acylases, whichcan be found extracellularly or intracellularly depending on the producer microorganism,is found within periplasmic space of Gram-negative bacterium Escherichia coli. E. colipenicillin acylase is synthesized as an inactive precursor in the cytoplasm and it isconverted to its active mature form at the end of complex post-translational modificationsteps. Penicillin acylases are widely used in the production of 6-aminopenicillinic acid(6-APA) which is used as a starting compound in the production of semi-syntheticpenicillins, and also, they are used as a catalyst in peptide synthesis and in the separationof amino acids, amine and amino alcohols. The demand of pharmaceutical industry forthis enzyme enhances the studies targeting increase of its production in wild-type orrecombinant microorganisms, and also, more effective usage of penicillin acylase inindustrial processes.In this thesis work; the selection of recombinant strain showing highest enzymeactivity among recombinant E. coli strains which are harvesting pac genes carryingmutations within their control regions, and also, the purification and characterization ofenzyme produced by the selected strain and, as well as, the enzyme produced by therecombinant E. coli strain carrying wild type gene which has not any mutations in thecontrol region were aimed. The mutations within control regions and the recombinantstrains were designed and developed formerly by Enzyme Molecular GeneticsLaboratory at the Research Institute for Genetic Engineering and Biotechnology,TUBITAK in order to improve the transcriptional and translational efficiency ofpenicillin acylase.At the end of gene expression experiments, P2Spaclac- recombinant strain showedthe highest enzyme activity. Thus, beside of the enzyme produced by the E. coli JM109strain (pacwt), the purification and characterization of penicillin acylase produced byP2Spaclac- strain were decided in the context of this thesis work.Penicillin acylase was purified from the cells firstly by sonication, then followedby stepwise amonium sulfate precipitation, and finally, by DEAE-cellulose FF anionexchange chromatography. At the end of the purification experiments; pacwt penicillinacylase was purified 1446 times with 1053 % recovery and specific activity of theenzyme was 48 U/mg; P2Spaclac- recombinant penicillin acylase was purified 460 timeswith 413 % recovery and specific activity of the enzyme was 36 U/mg.At the end of the characterization experiments, the enzyme showed its optimalactivity in the pH range of 8,0-9,0 and the enzyme retained 75-100 % of its initialactivity after incubation at pH 3,5-9,0 for two days. The optimal reaction temperature ofthe enzyme was found to be 60 ºC. While the enzyme activity was retained withintemperature range of 25-50 ºC, at higher temperatures, i.e. 55-60 ºC, the enzyme wasfound to be unstable. The enzyme activity was not affected by 1 and 10 mMconcentrations of various metal salts. The detergents such as Triton-X 100, Tween 20and Tween 80 did not affect the enzyme activity. No marked inhibitory effect of EDTAon enzyme activity agreed with the results of the studies suggesting the independence ofpenicillin acylase activity from any cofactor (metal). Retaining of the activity in thepresence of DTT and Î²-ME and the total inhibition of the activity in the presence ofPMSF confirmed the early results regarding to the enzyme have a catalytic serineresidue in the active site and does not carry any disulfide bridge within its structure.Glycerol, ethylene glycol and calcium chloride (CaCl2) which were added to the reactionmedium in order to increase enzyme stability at critical temperatures protected theenzyme activity, and even, increased the activity of the enzyme. At 10 % concentrationsof acetone, ethanol, methanol, isopropanol, DMSO and acetonitrile, no significant effecton enzyme activity was detected.The results obtained at the end of the characterization experiments showed thatthese recombinant enzymes can be used in biocatalysis processes.