Serum neopterin ölçümünde yüksek basınçlı sıvı kromatografi yöntemlerinin karşılaştırılması
Comparison of high pressure liquid chromagraphy methods for measurement of serum neopterin
Yazar: MEHMET AĞILLI
Danışman: DOÇ. DR. HALİL YAMAN
GATA / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Neopterine = Neopterine

Özet:
Neopterin düşük molekül ağırlıklı (253,22 g/mol) bir pirazinopirimidin bileşiğidir. Hücresel bağışıklık sisteminin aktivasyonu sonucu primer olarak interferon gamma stimülasyonu ile monosit, makrofaj ve dentritik hücreler tarafından salınır. Neopterin biyosentezi, monosit, makrofaj ve dentritik hücrelerde guanozin trifosfat (GTP)'ın 7,8-dihidroneopterin trifosfata dönüşümü ile başlar.Neopterin düzeyi çeşitli enfeksiyonlar, sepsis, otoimmun hastalıklar, maligniteler, allograft rejeksiyonu, sarkoidoz, tüberküloz, multiple skleroz, koroner arter hastalığı, miyokard enfarktüsü, viral enfeksiyonlar, merkezi sinir sistemi hastalıkları, böbrek, karaciğer, kalp, pankreas ve kemik iliği transplantlarının rejeksiyonu gibi birçok klinik durumda artmaktadır.Neopterin ölçümünde çeşitli analiz yöntemleri kullanılmaktadır. Günümüzde neopterin ölçüm yöntemlerinden HPLC yüksek analitik performansı nedeniyle tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır.Biz bu çalışmada viral ya da bakteriyel enfeksiyonu bulunan hastalar ile sağlıklı bireylerde serum neopterin düzeylerini üç faklı yöntemle belirledik. Bu yöntemleri birbirleriyle karşılaştırdık. Çalışmaya dahil ettiğimiz hasta grubunda neopterin düzeylerinin tanısal değerliliğini inceledik.Neopterin ölçümünde kullandığımız ELISA neopterin kiti ?metot 1?, laboratuvarımızda güncel olarak kullandığımız potasyum fosfat tampon (pH: 6.4) içeren mobil faz ve deproteinizasyon için trikloroasetik asit kullanılan metot ?metot 2? ve yeni geliştirdiğimiz su/asetonitril (99/1, v:v) içeren mobil faz ve deproteinizasyon için asetonitril kullanılan metot ise ?metot 3? olarak adlandırıldı.Neopterinin alıkonma zamanı (retention time) metot 2'de 6.4'üncü dakika civarında iken metot 3'de ise 2.4'üncü dakika civarında olduğu görüldü. Metot 2 ve metot 3'ün lineerite değerleri oldukça iyiydi (metot 2 için r2: 0.987, metot 3 için r2: 0.998). Metotların tekrarlanabilirlikleri değerlendirildiğinde, metot 3'ün metot 2'ye ve metot 1'e göre daha üstün olduğu sonucuna varıldı (gün içi ve günler arası tekrarlanabilirlik çalışma verileri tablo 3 ve 4'de verilmiştir).Ayrıca viral ya da bakteriyel enfeksiyonun tanısı amacıyla neopterin ölçümünde metot 3'ün, yapılan ROC analizi sonucunda diğer metotlara göre daha sensitif ve spesifik olduğunu bulduk. Dolayısıyla viral ya da bakteriyel enfeksiyon kesin tanısı öncesinde neopterin seviyelerinin erken tanı amacıyla kullanılabilecek yardımcı bir belirteç olabileceğini düşündük.Elde ettiğimiz sonuçlarla, neopterin ölçümü için halen kullandığımız yönteme göre sensitivitesi ve spesifitesi daha yüksek, analiz süresi daha kısa ve uygulaması daha kolay bir HPLC yöntemi geliştirdik.

Abstract:
Neopterin is a pyrazinopyrimidine compound, that has a low molecular weight (253,22 g/mol). It is secreted as a result of activation of cellular immune system, primarily by monocytes, macrophages and dendrytic cells with the stimulation of interferon gamma. Neopterin biosynthesis starts with the transformation of guanosine triphosphate to 7,8-dihydroneopterin triphosphate in monocytes, macrophages and dendrytic cells.Neopterin levels increase in many clinical states such as various infections, sepsis, autoimmune diseases, allograft rejection, sarcoidosis, tuberculosis, multiple sclerosis, coronary artery disease, myocardial infarction, viral infections, central nervous system diseases; rejections of transplants of kidney, liver, heart, pancreas and bone marrow.For the measurements of neopterin, some methods of analysis are commonly used such as high pressure liquid chromatography (HPLC), radioimmuno assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), electrophoresis, thin layer chromatography, paper chromatography. Today HPLC method has been used widely all over the world because of its high analytical performanceWe established the serum neopterin levels with three different methods in this study, in patients with viral or bacterial infection and healthy subjects. We compared these methods with each other. We surveyed the diagnostic value of neopterin levels in the patient group that we included in the study.ELISA neopterin kit that we use for the measurement of neopterin was named as ?Method 1?; the method which we have already used in our laboratory and which includes potassium phosphate buffer (pH: 6,4) as mobile phase and trichloroacetic acid for deproteinization, was named as ?Method 2?; and the method which we have recently developed and which includes water/acetonitrile (99/1, v:v) as mobile phase and acetonitrile for deproteinization, was named as ?Method 3?.It was seen that the retention time of neopterin in method 2 was nearly 6,4 min and it was 2,4 min in method 3. The linearity of method 2 and method 3 was quite good (r2: 0.987 for method 2, r2: 0.998 for method 3). When the repeatability of methods were assessed, it was concluded that method 3 was more superior with respect to method 2 and method 1 (Intrassay and interassay repeatability data was shown in Table 3).Also, in neopterin measurement for diagnosis of viral or bacterial infection, we found that method 3 was more sensitive and more spesific than the other methods as a result of ROC analyze. Thus we thought that serum neopterin levels might be an auxiliary biomarker for early diagnosis before the definitive diagnosis of viral or bacterial infection.With these results, we developed an HPLC method which has higher sensitivity and specificity values and shorter analyse time and which is easier to apply with respect to the method we have already used for neopterin measurement.