Yarı-iletken nano parçacıklar kullanılarak fotoelektrokimyasal dna biyosensörlerinin hazırlanması
Development of photoelectrochemical dna biosensors by using semiconductor nanoparticles
Yazar: DENİZ BAŞ
Danışman: PROF. DR. İSMAİL HAKKI BOYACI
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Biyosensörler = Biosensors ; DNA = DNA ; Fotoakım = Photocurrent ; Kuantum noktaları = Quantum dots ; Nükleik asit = Nucleic acids ; Yarı iletkenler = Semiconductors

Özet:
Bu çalışmanın amacı, CdSe/ZnS kuantum noktalar kullanılarak fotoelektrokimyasal DNAbiyosensöru?nu?n geliştirilmesidir. Bu amaç doğrultusunda yapılan çalışmaları u?ç grup altında incelemekmu?mku?ndu?r. İlk olarak; fotoelektrokimyasal ölçu?m sisteminin geliştirilmesi ve CdSe/ZnS kuantumnoktalar kullanılarak fotoakım eldesi u?zerine çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Ortam koşullarının,elektron transfer medyatörlerinin (trietanolamin ve metilen mavisi) ve ışık kaynaklarının fotoakımeldesi u?zerine etkileri incelenerek, uygun koşullar belirlenmiştir. Fotoakım eldesi koşullarınınbelirlenmesinin ardından, biyomoleku?l immobilizasyonu için karboksil grubuna sahip 16-fosfonohekzadekanoik asit ile elektrot yu?zeyinde kendiliğinden du?zenlenen tek tabaka (SAM)oluşturulması, SAM' in karakterizasyonu ve avidin-biyotin sistemini temel alan model bir biyoanalitikuygulama gerçekleştirilmiştir. Avidin immobilize edilen elektrotlar ile biyotin işaretli kuantum noktalaretkileştirilerek, fotoakım eldesi sonucunda kantitatif olarak biyoanalitik uygulama gerçekleştirilebileceğisaptanmıştır. Son olarak; SAM oluşturulan elektrot yu?zeylerine prob DNA immobilize edilerek, tanıyıcıtabaka oluşturulmuş ve hedef DNA ile kuantum nokta-DNA kompleksinin yarışmalı hibridizasyonunutemel alan kantitatif fotoelektrokimyasal DNA biyosensöru? uygulaması hayata geçirilmiştir.Deneysel çalışmalar sonucunda, ışık kaynağı olarak ışık yayan diyotların (LED) kullanılabildiği,metilen mavisi ile fotoakımda en az altı katlık bir artış elde edilebildiği ve fotoakım eldesinintekrarlanabilirliğinin yu?ksek olduğu saptanmıştır. Avidin-biyotin model sistemi kapsamında, fotoakımdeğerinin 18 nM biyotin kaplı kuantum nokta derişimine kadar doğrusal olarak arttığı gözlemlenmiş veelde edilen kalibrasyon eğrisinin denklemi y=0.33x + 0.10 (R2 = 0.997) olarak saptanmıştır. Ölçu?msınırı 1 nM, alt tayin sınırı ise 3 nM olarak hesaplanmıştır. Yarışmalı hibridizasyon temelindegerçekleştirilen DNA biyosensöru? uygulamasında, hedef DNA derişiminin artması sonucundafotoakımda azalma gözlemlenmiş ve 16 ?M hedef DNA derişimine kadar doğrusal bir davranışgöstermiştir. Elde edilen kalibrasyon eğrisinin denklemi y=0.824x + 0.556 (R2 = 0.991) olaraksaptanmıştır. Geliştirilen yöntemin ölçu?m sınırı 2.22 ?M, alt tayin sınırı ise 7.3 ?M olarakhesaplanmıştır. Ayrıca sistem tamamlayıcı olmayan DNA dizilimi ile test edilmiş ve tamamlayıcıolmayan dizilimin fotoakımda azalmaya neden olmadığı saptanmıştır.Avidin-biyotin model sistemi ve DNA biyosensöru? çalışmalarında kantitatif olarak sonuç eldeedilebildiği ve kuantum noktaların fotoakım eldesi amacı ile biyoanalitik uygulamalarda işaretlemeajanı olarak kullanılabileceği, ancak sistemin hassasiyetinin geliştirilmesi gerektiği göru?lmu?ştu?r.Hassasiyetin arttırılması sonucunda; du?şu?k maliyetli, taşınabilir ve minyatu?rize edilebilir sistemlergeliştirilerek eşzamanlı analizlere olanak tanıyan ışık adreslemeli fotoelektrokimyasal biyosensörleringeliştirilmesi mu?mku?n olabilecektir.

Abstract:
The aim of this thesis is to develop photoelectrochemical DNA biosensors by using CdSe/ZnSquantum dots. For this purpose, it is possible to examine the work conducted under three groups.First, studies were carried out for the development of photoelectrochemical measurement system andfor obtainment of photocurrent from the CdSe/ZnS quantum dots. Effects of environmental conditions,electron transfer mediators (Triethanolamine and methylene blue) and light sources on thephotocurrent were investigated and thus, optimum conditions were determined. And then, formation ofcarboxyl modified self-assembled monolayers (SAM) of 16-phosphonohexadecanoic acid on theelectrode surfaces, characterization of SAM and a model bioanalytical application based on avidinbiotinwere performed. By interacting the avidin-immobilized electrodes with the biotin conjugatedquantum dots, a quantitative photoelectrochemical bioanalytical application was performed. Finally, arecognition layer was prepared by the immobilization of DNA probes onto the electrode surfacethrough SAM and competitive DNA hybridization assay was performed for the quantitativephotoelectrochemical analysis of DNA.Experimental results showed that the light emitting diodes (LED) can be used as the light source, atleast six-fold increase in the photocurrent can be obtained in the presence of methylene blue and thereproducibility of photocurrent was high. In avidin-biotin model system, it was observed that thephotocurrent was linear up to the 18 nM of biotin conjugated quantum dots and the typical equation forthe calibration curve was found as y=0.33x + 0.10 with the coefficient of determination (R2) of 0.997.The limit of detection and the lower limit of quantification were calculated as 1 nM and 3 nM,respectively. In competitive DNA hybridization assay, a decrease in photocurrent was observed withthe increase in target DNA concentration and the photocurrent was linearly decreased up to 16 ?M oftarget DNA. The typical equation of the calibration curve was obtained as y=0.824x + 0.556 with thecoefficient of determination (R2) of 0.991. The limit of detection and the lower limit of quantificationwere calculated as 2.22 ?M and 7.3 ?M, respectively. Moreover, a specificity test with the noncomplementaryDNA was performed and the presence of non-complementary DNA did not cause adecrease in the photocurrent.These results demonstrate that the quantum dots can be used as photoelectrochemical labelingagents in bioanalytical applications and it is possible to perform quantitative analysis both in avidinbiotinmodel system and in DNA biosensors. On the other hand, the sensitivity of the proposedsystems should be enhanced. As a result of increased sensitivity, it will be possible to develop lowcost, portable, miniaturized and light addressable systems, which allow simultaneous analysis ofmultiple targets.