Fotolitografi ve mikrospotlama ile array platformlarının hazırlanmasi ve uygulamaları
Preparation and applications of array platforms by photolithography and microspotting
Yazar: NİHAN GÜVENER
Danışman: PROF. DR. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Elipsometri = Ellipsometry ; Fotolitografi = Photolithography ; Yüzey plazmon rezonans teorisi = Surface plasmon resonance theory

Özet:
Sunulan çalışmanın amacı, proteinlerin ve oligonükleotidlerin tanısında kullanılmak üzere istenilen desendeki dizi analiz (?array?) platformlarının `litografi' tekniklerinden biri olan fotolitografi yöntemi ile desenlendirilmesi, mikrospotlama yöntemi ile moleküler etkileşimlerin oluşturulması ve oluşturulan bu platformlarının performanslarının ölçülmesidir. Tez çalışması üç ana grupta toplanmıştır. İlk bölümde, platformları oluşturmak için kullanılacak cam slaytlar öngörülen süreçler uygulanarak temizlenmiş ve altın kaplanmıştır. Platformlarının desenlendirilmesi için farklı spot boylarına sahip maskeler kullanılmıştır. En iyi desenlenmenin belirlenmesi için kendiliğinden düzenlenen moleküller ile spot boyutu optimizasyonu yapılmıştır. İkinci bölümde, dizi analizi için spesifik prob moleküllerin immobilizasyonu gerçekleştirilmiş olup, üçüncü bölümde validasyon çalışmaları yapılmıştır. Protein dizi analiz platformları için prob molekül olarak sırasıyla İnsan Serum Albümini (HSA) ve Protein A; DNA dizi analiz platformları için prob molekül olarak sırasıyla M. Gordonea (GOR), M. Tuberculosis (MTB) ve M. Avium (MAC-01) kullanılmıştır.Protein esaslı dizi analiz platformlarını oluşturmak için önce altın kaplı cam slaytlara Merkaptoundekanoikasit (MUA) mikrospotlama yöntemi ile immobilize edilmiş ve MUA'nın yüzeyde kendiliğinden düzenlenen tek tabakaları oluşturması, 200 ?m çaplı spotlara desenlendirilmiş yüzeyin 1 saatlik etkileşimi sonucunda elde edilmiştir. Daha sonra karbodiimid reaksiyonu ile MUA immobilize edilmiş bölgelere (`spot') kimyasal olarak protein bağlanmıştır. Yüzey Plazmon Rezonans destekli elipsometre cihazı ile farklı derişimlerde (5-500 nM) prob etkileşiminde elde edilen bağlanma kinetikleri ve kalınlık ölçümleri göz önünde bulundurularak HSA ve Protein A immobilizasyonu için optimum derişim sırayla 5 nM ve 10 nM olarak belirlenmiştir. Bu işlemi takiben, HSA ve Protein A spotlarına sırasıyla farklı derişimlerde İnsan Serum Albümin Antikoru (anti-HSA) ve İmmünogloblin G (IgG) gönderilerek etkileşimleri incelenmiş, oluşturulan dizi analiz platformlarının performansları belirlenmiştir. Elde edilen bağlanma kinetikleri ve yapılan kalınlık ölçümleri doğrultusunda anti-HSA ve IgG hedefleri ile etkileşim derişimleri sırasıyla 10 nM ve 50 nM olarak optimize edilmiştir. Mikro-desenlenmiş yüzeylerde çoklu protein dizi analiz performansının değerlendirilmesi amacıyla farklı prob molekülleri taşıyan sıvıların bağımsız mikroskobik damlacıklar şeklinde yüzeye spotlanmıştır. Karşılaştırma amaçlı daha önce optimum prob immobilizasyon derişimlerindeki çözeltiler kullanılarak oluşturulan yüzeylere hedef olarak sırasıyla 10 nM anti-HSA, 10 nM IgG ve karışım hedefler gönderilerek etkileşimler izlenmiştir. Spesifik prob immobilize edilmiş bölgeden spesifik hedef ile etkileşimi sonucunda alınan delta değişimi, tekli analiz plafromunda alınan cevap ile yakın değerler göstermektedir.Oligonükleotid esaslı dizi analiz platformlarını oluşturmak için önce altın kaplı cam slaytlara M. gordonea (GOR) mikrospotlama yöntemi ile immobilize edilmiş ve GOR'un yüzeyde dizilimin kontol edilmesi amacıyla, 1mM Merkaptohekzanol (MCH) ile bloklanmıştır. Optimum immobilizasyon koşulları, 200 ?m çaplı spotlara desenlendirilmiş yüzeyin 1 saatlik etkileşimi sonucunda elde edilmiştir. Altın kaplanan cam slaytlara, pH 3.8 tampon çözelti ile değişik derişimlere seyreltilmiş spesifik prob oligonükleotidler mikrospotlama yöntemi ile yüzeye immobilize edilmiş ve özgün prob oligonükleotid dizi analiz platformları oluşturulmuştur. Yüzey Plazmon Rezonans destekli elipsometre cihazı ile farklı derişimlerde (0.05-4 ?M) prob etkileşiminde elde edilen bağlanma kinetikleri ve kalınlık ölçümleri göz önünde bulundurularak oligonükleotid immobilizasyonu adımında optimum derişim GOR için 1 ?M, MTB için 0.5 µM ve MAC01 için 0.5 µM olarak belirlenmiştir. Bu işlemi takiben, GOR, MTB ve MAC01 spotlarına pH 7.4 tampon çözelti ile değişik derişimlere seyreltilmiş spesifik hedef oligonükleotidler gönderilerek etkileşimleri incelenmiş, oluşturulan dizi analiz platformlarının performansları belirlenmiştir. Elde edilen bağlanma kinetikleri doğrultusunda hedefler ile etkileşim derişimleri GOR için 0.25 ?M, MTB için 0.1 µM ve MAC01 için 0.25 µM olarak optimize edilmiştir. Mikro-desenlenmiş yüzeylerde çoklu oligonükleotid dizi analiz performansının değerlendirilmesi amacıyla farklı prob molekülleri taşıyan sıvıların bağımsız mikroskobik damlacıklar şeklinde yüzeye spotlanmıştır. Karşılaştırma amaçlı daha önce optimum prob immobilizasyon derişimlerindeki çözeltiler olan 1?M GOR ve 0.5 ?M MTB kullanılarak oluşturulan yüzeylere hedef olarak sırasıyla 1?M GOR hedef, 1?M MTB hedef ve karışım hedefler gönderilerek etkileşimler izlenmiştir. Spesifik prob immobilize edilmiş bölgeden spesifik hedef ile etkileşimi sonucunda alınan delta değişimi, tekli analiz plafromunda alınan cevap ile yakın değerler göstermektedir.

Abstract:
The aim of the presented thesis is preparation of array platforms with desired to detect proteins and oligonucleotides, and developing the array platform by using microspotting to support the molecular interaction to the surface, additionally preparing the array platform with one of lithographic techniques: ?photolithography?, finally validation of the platforms. Thesis consists of three main parts. In the first part, the slides were cleaned and coated by gold layer. Masks of different patterns were used in advance. For the optimization of pattern on the array surface, optimum spot size was selected due to the self-assembled monolayer formation. In the second part, probe molecules were immobilized for specific detections and in the last part validation and performance analysis of the platforms were observed. The probe molecues used for protein array systems were Human Serum Albumin (HSA) and Protein A. The probe molecues used for oligonucleotide array systems were M. gordonea (GOR), M. tuberculosis (MTB) and M. avium (MAC-01).In order to obtain protein array platforms first Mercaptoundecanoicacid (MUA) was immobilized on gold coated glass slides by microspotting method, then optimizing of printing pattern and duration of interaction were determined as 200 ?m spotted pattern and 1 hour respectively in order to obtain self-assembled monolayer formation of MUA. Later, protein probes were chemically bonded to MUA immobilized regions (`spot?) by carbodiimide reaction. According to the binding kinetics that were observed by Surface Plasmon Resonance enhanced Ellipsometer and measured thickness values of proteins at different concentrations (5-500 nM), the optimum immobilization concentrations of HSA and Protein A were determined as 5nM and 10nM, respectively. Then, examining the interaction of Human Serum Albumin antibody (anti-HSA) and Immunoglobulin G (IgG) with HSA and Protein A spots respectively at different concentrations by SPR, array platform performances were determined. According to obtained binding kinetics and ellipsometric thickness values, interaction concentration of anti-HSA and IgG target molecules were optimized as 10 nM ve 50 nM respectively. Multi-detection on the micro-patterned array platform has observed by different probe molecules that were spotted on the same platform as separate microscopic drops. The optimized immobilization concentrations of probe molecules were spotted and the target solutions were 10 nM anti-HSA, 10 nM IgG and mixed solution to observe the interaction. Specific responses, as change in delta, are similar to the single detection of the target molecules.In order to obtain oligonucleotide array platforms first M. gordonea (GOR) was immobilized on gold coated glass slides by microspotting method, and blocking with 1mM Mercaptohexanol (MCH) for surface orientation, then optimizing of the duration of interaction were determined as 1 hour on 200 ?m spotted pattern. Oligonucleotide array platforms were developed as microspotting of specific probes of different concentrations, prepared in pH 3.8 buffer solution. According to the binding kinetics that were observed by Surface Plasmon Resonance enhanced Ellipsometer and measured thickness values of proteins at different concentrations (0.05-4 ?M), the optimum immobilization concentrations of GOR, MTB and MAC01 were determined as 1 ?M, 0.5 µM and 0.5 µM, respectively. Then, examining the hybridization of target oligonucleotides at different concentrations, that prepared in pH 7.4 buffer solution, array platform performances were determined by SPR. According to obtained binding kinetics and ellipsometric thickness values, hybridization concentration of target oligonucleotides of GOR, MTB and MAC01 were optimized as 0.25 ?M, 0.1 µM and 0.25 µM respectively. Multi-detection on the micro-patterned array platform has observed by different probe molecules that were spotted on the same platform as separate microscopic drops. The optimized immobilization concentrations of probe molecules, as 1?M for GOR and 0.5 ?M for MTB, were spotted and the target solutions were 1?M GOR target, 1?M MTB target and mixed solution to observe the interaction. Specific responses, as change in delta, are similar to the single detection of the target molecules.