Arabidopsis thaliana epigenetik mutantlarında tuz stresinin DAN metilasyonu üzerindeki etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of salt stress on DNA methylation in Arabidopsis thaliana epigenetic mutants
Yazar: YAĞMUR VECİDE YEŞİLDİREK
Danışman: DOÇ. DR. NESLİHAN TURGUT KARA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: DNA metilasyon = DNA methylation

Özet:
Dünya nüfusunun giderek artması gıda ihtiyacını da arttırmaktadır. Ancak tarım alanlarının tahrip edilmesi ve iklimsel dalgalanmalar gibi nedenler bitkileri çeşitli biyotik ve abiyotik stres koşullarına maruz bırakır. Bu durum mahsul verimliliğini düşürmekte ve açlık tehdidinin artmasına sebep olmaktadır. Bitkilerin değişen çevre koşullarını tolere etmek için epigenetik düzenlemeler de dahil olmak üzere çeşitli moleküler mekanizmalar geliştirdiği bilinmektedir. Bitkilerin strese karşı dayanıklı hale getirilmesi ve bu dayanıklılığı nesiller boyu sürdürebilmelerini sağlamak için öncelikle moleküler mekanizmaların iyi anlaşılması gerekmektedir.
Mahsul verimliliğini düşüren en büyük tehditlerden biri tuzluluk stresidir. NaCl uygulamasının Arabidopsis thaliana Col-0 bitkilerinde hipometilasyona neden olduğu ve DNA metilasyonu açısından tüm bitki ve kallus dokuları arasında dikkate değer farklılıklar olduğu bilinmektedir. Bu tez çalışmasında, A. thaliana bitkisinin MET1 enziminin sentezlenmediği null mutantları olan met1-7 ve met1-3 in vitro koşullarda tuz stresine maruz bırakılmış ardından morfolojik değişimleri gözlenmiş ve genom düzeyinde metilasyon seviyeleri karşılaştırılmıştır. Aynı zamanda mutantlara uygulanan tuz stresinin etkileri, bitkilerde DNA metilasyonunda görev aldıkları bilinen DRM2, Pol IV ve Pol V genlerinin anlatımlarının analizi ile test edilmiştir. Gen anlatım analizleri gerçek zamanlı PZR yöntemi ile yapılmış, bu yolla NaCl uygulamasının sebep olduğu hipometilasyonun MET1 geni ile ilişkisi anlaşılmaya çalışılmıştır. MET1 geninin homozigot mutantları ile elde edilen sonuçlar önceki veriler ile karşılaştırılarak bitkinin tuzluluk stresine verdiği cevapta metilasyonun rolü hakkında bilgi elde edilebilecektir. 
NaCl uygulamasının Col-0 bitkisine göre met1-7 ve met1-3 mutantlarını morfolojik olarak daha çok etkilediği görülmüştür. Bitkilerin yaprak sayısına, yaprak yüzey alanına ve kök uzunluklarına bakılarak tüm parametrelerde artan NaCl konsantrasyonunun negatif etkili olduğu belirlenmiştir. Bitkilerdeki morfolojik değişimlerin DNA metilasyonu, histon modifikasyonları, histon varyantları ve siRNA'lar aracılığı ile düzenleme gibi pek çok epigenetik düzenlemelere de bağlı olduğu bilinmektedir. Bu sebeple, bu çalışmada tuz stresine maruz bırakılan Col-0, met1-7 ve met1-3 bitkilerinin genom düzeyindeki metilasyon seviyeleri ELISA tabanlı bir kit ile ölçülmüştür ve tuz stresinin mutantlarda daha yüksek oranda olmak üzere tüm gruplarda hipometilasyona sebep olduğu görülmüştür. NaCl uygulamasının epigenetik düzenlemelerde görev aldığı bilinen DRM2, Pol IV ve Pol V genlerinde yarattığı etki de gerçek zamanlı PZR yapılarak analiz edilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda, incelenen genlerin anlatımlarının mutant bitkilerde farklı oranlarda arttığı belirlenmiştir. 
Sonuç olarak, bu tez çalışması ile NaCl uygulamasının MET1 enziminin sentezlenmediği mutantlar üzerindeki etkileri hakkında elde edilen morfolojik ve moleküler verilerin stres mekanizmalarının epigenetik temelini anlamamıza yardımcı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
The gradual increase in the world population increases the need for food. However, reasons such as the destruction of agricultural lands and climatic fluctuations expose crops to various biotic and abiotic stress conditions. This situation reduces crop productivity and causes an increase in the hunger threat. It is known that plants develop various molecular mechanisms, including epigenetic arrangements, to tolerate changing environmental conditions. In order to make plants resistant to stress and sustain this resistance for generations, firstly molecular mechanisms must be understood well.
One of the biggest threats to crop yields is salinity stress. It is known that NaCl application causes hypomethylation in Arabidopsis thaliana Col-0 plants and there are considerable differences between plants and callus tissues in terms of DNA methylation. In this thesis study, the null mutants met1-7 and met1-3, in which the MET1 enzyme of A. thaliana plant was not synthesized, were exposed to salt stress in vitro, morphological changes were observed and methylation levels at the genome level were compared. At the same time, the effects of salt stress applied to mutants were tested by analysis of the expressions of DRM2, Pol IV and Pol V genes known to be involved play in DNA methylation in plants. Gene expression analyzes were made by real-time PCR method, and the relationship between the hypomethylation caused by NaCl application and the MET1 gene was tried to be understood. By comparing the results obtained with homozygous mutants of the MET1 gene with previous data, information about the role of methylation in the plant's response to salinity stress can be obtained.
It was observed that NaCl application affected the met1-7 and met1-3 mutants morphologically more than the Col-0 plant. By looking at the number of leaves, leaf surface area and root length of the plants, it was determined that the increasing NaCl concentration has negative effect in all parameters. It is known that morphological changes in plants are also connected to many epigenetic regulations such as DNA methylation, histone modifications, histone variants, and regulation via siRNAs. Therefore, in this study, genome-level methylation levels of Col-0, met1-7 and met1-3 plants exposed to salt stress were measured with an ELISA-based kit, and salt stress was found to cause hypomethylation in all groups, with a higher rate in mutants. The effect of NaCl application on DRM2, Pol IV and Pol V genes, which are known to be involved in epigenetic regulations, was also analyzed by real-time PCR. As a result of the studies, it was determined that the expressions of the examined genes increased at different rates in mutant plants. 
In conclusion, with this thesis, it is thought that the morphological and molecular data obtained about the effects of NaCl application on mutants where MET1 enzyme is not synthesized will help us to understand the epigenetic basis of stress mechanisms.