In vıtro ortamda, erişkin ve çocuk kanserleri sağaltım modelinde, mikro çevrenin apoptotik yolak üzerine etkileri
Effects of microenvironment on apoptotic pathway in adult and children cancers therapy models, in in vitro environment.
Yazar: YASEMİN BASKIN
Danışman: PROF. DR. NUR OLGUN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Onkoloji = Oncology

Özet:
Amaç ve Hipotez: Yeni sağaltım stratejilerinin geliştirilmesi ve uygulanan kemoterapistratejilerinin daha etkin kılınması amacıyla yapılan çalışmalarda önemli hedeflerden biri detümör mikro çevresi ve doğal anti tümör sistemlerdir. Tümör hücresi ile mikro çevresiarasında çok sayıda etkileşmenin, tümör hücresinin yaşamında etkin rol aldığınıdüşünülmektedir. Reaktif oksijen ve nitrojen ürünlerini kapsayan mikro çevrenin, farklımetabolitler oluşturarak hücresel süreçlerde farklı yolakları etkileyebileceği bilinmektedir.Sağaltım süreçlerinde, apoptotik yolakta, RNS ve ROS temelli mikro çevre bileşenlerininetkileri, sağaltım stratejilerinin gelişmesini ve kemoterapi sağaltımının daha uygunkompozisyonda kullanılmasını amaçlayan yeni bir çalışma alanıdır. Bu çalışmanın amacı invitro bir kanser sağaltım modeli oluşturarak, reaktif oksijen ve nitrojen temelli bir mikroçevrenin apoptotik yolağı ve sağaltım süreçlerini nasıl etkilediğini göstermektir.Yöntem: SHSY5Y, Kelly HeLa ve HEp-2 hücre hatlarında in vitro sağaltım modelioluşturuldu. ROS ve RNS temelli mikro çevre modellerinin deneysel tasarımında; L-Arg,GSNO, SIN-1, H2O2, baskılayıcı olarak L-NAME, SOD, Ebselen, Aminoguanidine.Bicarbonate, viral enfeksiyon modeli olarak BHV-1 kullanıldı. Hücreler üzerine oluşansitotoksik etkiler MTT ve XTT yöntemleri ile değerlendirildi. Apoptotik hücre ölümü için,Hoechst 33342 / Propidyum iyodid çekirdek boyaması, (in situ TdT-mediated dUTP nick endlabeling technique) TUNEL tekniği, apoptozun erken dönemde saptanması için Annexin Vişaretlemesi uygulandı. Nitrik oksit yanıtları Griess Ayıracı ile total nitrit olarakdeğerlendirildi.Bulgular ve sonuç: Servikal karsinoma hücre hattında mikro çevre değişikliğine yanıtınaraştırıldığı deneylerde, L-Arg (endojen NO donörü), doza bağımlı olarak, apoptotik yolağıuyarmıştır. Ortamda süperoksit bulunduğu durumlarda, NO uyarıldığında, hücresel ölüm1sinerjik olarak artmıştır. Endojen NO uyarımı ile oluşan hücresel ölüm apoptotik ölümken,süperoksit ve NO'in birlikte bulunduğu durumlarda baskın olan ölüm şekli nekrotik ölümolmuştur. Bu sonuçlar, NO'in hücresel ölüm şeklini (ortamda baskın olan radikale bağlıolarak) yönlendirmede temel bir rol oynadığını göstermiştir.BHV-1'de ya normal hücresel mikro çevrede ya da kanser hücresinde ?E? döneminden ?L?dönemine geçiş sırasında sunulan proteinler, staurosporin ile uyarılmış apoptozu bilebaskılamaktadırlar. Tersine normal bir hücresel mikro çevrede (MDBK) BHV-1 ?E? genlerisunulurken apoptoz en fazla uyarılırken, kanser hücrelerinde (HEp-2) ?IE? genleri sunulurkenapoptoz uyarılmıştır. BHV-1 apoptozunun kaspaz-8 yolağı ile yani ?dış membran reseptör?yolağından oluştuğunu göstermiştir.SHSY5Y hücrelerinde; ekzojen NO (GSNO), peroksinitrit (SIN-1) radikalinin baskın olduğumikroçevrede, DOXO, CIS, ETOP sağaltım modellerinde, CARBO+ETOP uygulamasında,peroksinitrit ve süperoksit; CIS+ETOP uygulamasında ekzojen NO ve süperoksit hücreölümünü arttırmışlardır.Kelly hücrelerinde; ekzojen NO (GSNO), peroksinitrit (SIN-1) ve süperoksit ve hidroksilradikalleri (H2O2) radikalinin baskın olduğu mikro çevrede, DOXO, CIS, ETOP sağaltımmodellerinde CARBO peroksinitrit ve süperoksit, CIS+ETOP uygulaması, ekzojen NO ilebirlikte, CARBO+ETOP uygulamasında hem ekzojen NO hem de süperoksit hücre ölümünüarttırmıştır. Sağaltım sürecindeki nöroblastoma hücrelerinde gözlenen apoptotik hücre ölümü,ortamda peroksinitrit bulunduğunda 2. 74 kat; ekzojen NO bulunduğunda 2. 18 kat; ROSbaskın bir ortamda 3. 45 kat artmıştır.Bu sonuçlar, mikro çevrede bulunan serbest radikalin cinsine bağlı olarak sağaltımsüreçlerinin etkilendiğini desteklemektedir.TÜRKÇE ANAHTAR KEL MELERNöroblastoma, tümör mikro çevresi, in vitro sağaltım modeli, ROS, RNS, apoptotik yolak.2

Abstract:
Aim and Hypothesis: One of the main targets of the studies which aim to optimize appliedchemotherapy strategies more effectively and to develop new therapy strategies is the tumormicroenvironment and natural anti tumor systems. It is thought that many interactionsbetween tumor cell and its microenvironment play an effective role in the survival of thetumor cell. It is known that a microenvironment including reactive oxygen and nitrogenproducts, may affect distinct pathways by producing distinct metabolites in cellular processes.Effects of the RNS and ROS based microenvironment components on therapy processes;apoptotic pathways are new study areas which are aimed to develop therapy strategies andchemotherapy therapy in more appropriate compositions. The aim of this study is to showhow a reactive oxygen and nitrogen based microenvironment may affect the apoptoticpathway and therapy processes by forming an in vitro cancer therapy model.Method: An in vitro therapy model was formed in SHSY5Y, Kelly, HeLa and HEp -2 celllines. In experimental design of ROS and RNS based microenvironment L -Arg, GSNO, SIN -1, H2O2, and L -NAME, SOD, Ebselen, Aminoguanidine, Bicarbonate (as inhibitors) wereused. BHV -1 was used as a viral infection model. Cytotoxic effects on cells were determinedby MTT and XTT methods. For apoptotic cellular death; Hoechst 33342 / Propidium iodidenuclear staining, in situ TUNEL technique (TdT-mediated dUTP nick end labeling technique),and for early determination of the apoptosis; Annexin V labeling were used. Nitric oxideresponses were determined as total nitrite by Griess Reagent.Results and Conclusion: In experiments which the responses against microenvironmentchanges in cervical carcinoma cell line are searched, L -Arg (endogen NO donor) stimulatedthe apoptotic pathway in a dose-response manner. Cellular death increased synergistically1when NO was stimulated in conditions which superoxide was in the microenvironment.Endogen NO stimulated cellular death type was apoptotic, but dominant cellular death typewas necrotic when superoxide and NO were together. These results showed that NO played anessential role in mediating the cellular death according to the dominant radical in themicroenvironment.The proteins expressed during the transition from ?E? stage to ?L? stage either in normal or incancer microenvironment in BHV -1 infection; also inhibit the staurosporin stimulatedapoptosis. On the contrary, apoptosis was stimulated at most in a normal microenvironment(MDBK cells) when BHV -1 ?E? genes are expressed whereas when ?IE? genes wereexpressed in a cancer (HEp -2 cells) microenvironment. It was shown that BHV -1 stimulatedapoptosis was through caspase-8 pathway (means through ?outer membrane receptor?).In DOXO, CIS and ETOP therapy protocols in SHSY5Y cells, cell death was increased.When exogenous NO (GSNO) and peroxynitrite (SIN -1) were dominant inmicroenvironment, In CARBO + ETOP therapy protocols in SHSY5Y cells; cell death wasincreased when peroxynitrite and superoxide were dominant in microenvironment.And in CIS+ETOP therapy protocols in SHSY5Y cells, cell death was increased whenexogenous NO and superoxide were dominant.In DOXO, CIS, ETOP therapy protocols in Kelly cells, cell death was increased when ROSand RNS were dominant in microenvironment. In CARBO application, peroxynitrite andsuperoxide radicals; in CIS+ETOP application, exogenous NO; in CARBO+ETOPapplication both exogenous NO and superoxide increased the cellular death.Apoptotic cellular death in neuroblastoma cells during therapy process was increased 3,45times when ROS was dominant; 2,18 times when exogenous NO was dominant; and 2,74times when peroxynitrite was dominant in the microenvironment.These results support that therapy processes are affected by the type of free radical in themicroenvironment.KEY WORDSNeuroblastoma; tumor microenvironment; in vitro therapy model; ROS; RNS; apoptoticpathway2