Tolfenamik asitin karaciğer kanser hücreleri üzerine etkisi /
Yazar: SÜHA AKIN
Danışman: PROF. DR. SELDA KABADERE
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Antiinflamatuar ajanlar-nonsteroid = Anti inflammatory agents-nonsteroidal ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Apoptozis = Apoptosis ; Hücre dizisi = Cell line ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer neoplazmları = Liver neoplasms ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Tolfenamik asit = Tolfenamic acid ; Tümör nekroz faktörü-alfa = Tumor necrosis factor-alpha

Özet:
Karaciğer kanseri ülkemizde ve dünyada sık görülen, tedavisi zor kanser türlerindendir. Kanserli hücreleri yok etmeyi amaçlayan kemoterapi ve radyoterapi uygulamaları yeterli ve verimli olmadığı için yeni kimyasal ilaçlar arama çalışmaları devam etmektedir. Tolfenamik asit (TA) non-steroid antienflamatuvar ilaç sınıfının bir üyesidir ve siklooksijenaz enzimini inhibe etmektedir. Yapılan çalışmalarda prostattan akciğer kanserine kadar pek çok kanser tipinde apoptozu tetikleyerek kanserli hücreleri öldürdüğü saptanmıştır. Çalışmamızda karaciğer kanseri olarak yüksek insidansı nedeniyle kastedilen hepatosellüler karsinomadır (HSK). Bu çalışmada insan HSK (HepG2) ve sıçan HSK (H4IIE) hücre dizilerinde TA'nın 5, 10, 25, 50 ve 100 µM'lık dozları 24, 48 ve 72 saat uygulanmış ve 3-4,5-dimetil-tiazolil-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) ile canlılıkları belirlenmiştir. Etkili bulunan 50 ve 100 µM dozları H4IIE hücrelerine 24 saat süreyle uygulandıktan sonra tümör nekroz faktör (TNF-α), NF-ĸB, interlökin 1-β ve kaspaz-3 gen ifadelenmesi Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile değerlendirilmiştir. HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle 5, 10, 25, 50 ve 100 µM TA uygulaması sonucu elde edilen yaşayan hücre oranları %100, %106, %95, %89, %59 olarak hesaplanmıştır. 48 saat süreyle aynı dozlarda elde edilen yaşam oranları %120, %116, %110, %89, %50 olarak belirlenmiştir. 72 saat süreyle aynı dozlarda elde edilen yaşam oranları ise %108, %110, %103, %95, %51 olarak belirlenmiştir. H4IIE hücrelerine 24 saat süreyle 5, 10, 25, 50 ve 100 µM TA uygulaması sonucu elde edilen yaşayan hücre oranları %94, %92, %92, %90, %74 olarak belirlenmiştir. 48 saat süreyle aynı dozlarda elde edilen yaşam oranı %90, %92, %91, %77, %53 olarak belirlenmiştir. 72 saat süreyle aynı dozlarda elde edilen yaşam oranları ise %88, %82, %81, %75, %46 olarak belirlenmiştir. PCR sonuçlarına göre TNF-α gen ifade düzeyinde 50 ve 100 µM TA uygulanan gruplarda kontrol grubuna göre katlı artış gözlenmiştir. Ancak NF-ĸB, interlökin 1-ß ve kaspaz-3 gen ifadesinde gruplar arasında istatistiksel bir fark görülmemiştir. Bu sonuçlara göre artan TA dozuna zamana bağlı olarak hücre ölümünün arttığı ve TA'nın TNF-α gen ekspresyonunu arttırarak apoptoza neden olduğu gösterilmiştir. Ayrıca düşük dozdaki 5 ve 10 µM TA'nın sadece HepG2 hücre sayısında bir artışa neden olduğu gözlendi. TA'nın HepG2 ve H4IIE hücrelerinde çoğalmayı baskılayıcı ve apoptozu uyarıcı etkilerinin tespit edilmesi açısından önemlidir.

Abstract:
Liver cancer is a common type of cancer that is common in our country and in the World and treatment of this disease is very difficult. Since chemotherapy and radiotherapy applications aiming at destroying cancerous cells are not sufficient and productive, studies for finding new chemicals go on. Tolfenamic acid (TA) is a member of the non-steroidal antiinflammatory drug class and inhibits the cyclooxygenase enzyme. Studies have shown that many cancer types, from lung cancer to prostate cancer, have been shown to kill cancer cells by stimulate appoptosis. Because of the high incidence in liver cancers, hepatocellular carcinoma is referred, in our study. In the present study, at the doses of 5, 10, 25, 50 and 100 μM TA were administered on human HSK (HepG2) and rat HSK (H4IIE) cell lines for 24, 48 and 72 hours and subsequent cell viabilities were tested by  3-4,5-dimetil-tiazolil-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) analyse. Tumor necrosis factor (TNF-α), NF-κB, interleukin 1-β and caspase-3 gene expressions were assessed by Polymerase Chain Reaction (PCR) after effective concentrations (50 and 100 μM) of TA were applied to H4IIE cells for 24 hours. When HepG2 cells were exposed to 5, 10, 25, 50 and 100 µM doses of TA for 24 hours, the rates of living cells were determined as 100%, 106%, 95%, 89% and 59%, respectively. When, the same doses were applied for 48 hours, the living cell rates were %120, %116, %110, %89, %50, respectively. When, the same doses were applied for 72 hours, the living cell rates were %108, %110, %103, %95, %51 respectively. When H4IIE cells were exposed to 5, 10, 25, 50 and 100 µM doses of TA for 24 hours, the rates of living cells were determined as 94%, 92%, 92%, 90% and 74%, respectively. When, the same doses were applied for 48 hours, the living cell rates were %90, %92, %91, %77, %53, respectively. When, the same doses were applied for 72 hours, the living cell rates were %88, %82, %81, %75 and %46, respectively. According to PCR results, TNF-α gen expression level was observed to increase when compared to the control group in 50 and 100 μM TA groups. However, NF-ĸB, interleukin 1 ß and caspase-3 gen expressions were not statistically significant between the groups. 
These results show that TA increases dose and time dependent cell death and leads to apoptosis by increasing gene expression of TNF-α. It was also observed that 5 and 10 μM TA caused an increase in HepG2 cell count only. It is important that TA inhibits proliferation and stimulates apoptosis on HepG2 and H4IIE cells.