Kırmızı şarapta Okratoksin a ve Fumonisin B2 varlığının incelenmesi
Determination of Ochratoxin a and Fumonisin B2 in red wines
Yazar: CEREN DEĞİRMENCİ
Danışman: PROF. DR. ZEYNEP DİLEK HEPERKAN
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Şarap, tarihin en eski dönemlerinden günümüze uzanan üzümdeki şekerin fermentasyonu ile elde edilen alkollü bir içecektir. Tarih boyunca üzümün olduğu her yerde şarap üretilmiştir. Doğru toprak, doğru iklim, doğru üzüm ve doğru üretim basamakları kaliteli son ürünün temelini oluşturur. 	Şarap yalnızca alkollü bir içki olarak değil, aynı zamanda üzümün değerlendirilmesinde de büyük önem taşır. Büyük bağcı ülkelerin birçoğunda bağ ekonomisinin temeli üzümün şarap olarak değerlendirilmesine dayanır. Şarap üretim tekniklerine göre ve kullanılan üzüm çeşidine bağlı olarak kırmızı, beyaz ve pembe renkli olarak çeşitlilik kazanır. Şarapta kalite kavramı çok önemlidir ve kalite kriterleri duyusal, fiziksel-kimyasal ve mikrobiyolojik olmak üzere 3? e ayrılır. Küfler, mikrobiyolojik kalite kriterlerinden biridir.
Okratoksin A (OTA), başlıca Penicillium verrucosum, Aspergillus ochraceus ve Aspergillus section Nigri üyelerinin büyük bir kısmı tarafından üretilen, toksik özellikte ikincil bir küf metabolitidir. OTA üreticisi küfler, farklı özellikte ve çok sayıda substratta gelişme özelliğine sahip oldukları için meydana gelen kontaminasyonlara bir çok gıdada rastlanılmaktadır. Şarapta ve üzüm suyunda OTA kontaminasyonu ilk olarak 1996 yılında rapor edilmiştir. Daha sonra yapılan çalışmalar derlendiğinde, genel olarak OTA konsantresi beyaz şaraptan, pembe ve kırmızı şaraba doğru; soğuktan sıcak iklime doğru artmaktadır. Ayrıca tatlılık ve şeker oranı arttıkça OTA artışı olduğu görülmektedir. Ortam koşulları ve şarabın içeriği kontaminasyon için önemli faktörler olsada OTA varlığının ana sebebi toksikojenik küflerden kontamine olmuş üzümlerdir
Fumonisinler, Fusarium spp. tarafından üretilen, genellikle mısır ve mısır ürünlerinde bulunan kontaminantlardır. Genellikle Fusarium proliferatum ve F. verticillioides tarafından üretilmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalarla birlikte Aspergillus niger? in fumonisin B2 (FB2) ve B4 (FB4) üretme kapasitesinde olduğu bildirilmiştir. Üzüm, şıra ve şarapta sıklıkla rastlanan bu küfün FB2 oluşturma riski yapılan araştırmalarla incelenmektedir. 
Deney hayvanlarında gerçekleştirilen araştırmalar ve epidemiyolojik çalışma sonuçları incelendiğinde OTA ve FB2, Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC) tarafından potansiyel karsinojen (2B) olarak değerlendirilmiştir. 
Bu çalışmada, Marmara, Ege, İç Anadolu, Karadeniz ve Doğu Anadolu olmak üzere Türkiye?nin 5 farklı bölgesinden toplam 51 adet kırmızı şarap temin edilmiştir. Çalışma kapsamında kırmızı şaraplarda OTA ve FB2 varlığı incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar AB ülkelerinde ve Türk Gıda Kodeksi (TGK)?nde kabul edilen maksimum limitlere göre değerlendirilmiştir. 
Kırmızı şarap örneklerinde OTA ve FB2 varlığı yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile araştırılmıştır. OTA ve FB2 analizi, hazırlanan örneklerin ekstraksiyonu sonrasında immunoaffinite (IA) kolonla saflaştırılan ekstraktların HPLC yöntemi ile  analiziyle gerçekleştirilmiştir. Ters faz kolonda OTA ve FB2 ayrımı sonrasında fluoresans dedektörle tespit ve tayin gerçekleştirilmiştir. 
Kırmızı şarap örneklerinin 16? sında (%31,4) 0,0903-11,2639 ?g/l arasında değişen düzeylerde OTA belirlenmiştir. İç Anadolu Bölgesinden toplanan şarapların 1 tanesinde (%12,5), Ege Bölgesine ait şarapların 2?sinde (%13,3), Karadeniz Bölgesi şaraplarının 2?sinde (%25), Doğu Anadolu Bölgesi şaraplarının ise 3 tanesinde (%37,5) kontaminasyon tespit edilmiştir. Marmara Bölgesinin ise 8 örneğinde (%66,6) OTA kontaminasyonuna rastlanılmıştır. OTA kontaminasyonlarının üzüm ve şaraplarda görülme sıklığı coğrafik farklılıklardan etkilenmektedir. Bölgelere göre yapılan meterolojik araştırmalar incelendiğinde, yüksek nem miktarı ile OTA kontaminasyonu arasındaki ilişki ortaya çıkmaktadır. Bunun yanında farklı bölgelerden alınan kırmızı şaraplarda FB2 kontaminasyonuna rastlanılmamıştır. İnsan sağlığını olumsuz etkileri olan bu mikotoksinin analizlenen şaraplarda bulunmaması tüketici sağlığı açısından olumlu bir sonuçtur.
Şarap yapımı sırasında OTA ve FB2 oluşumunun önlenmesi amacıyla hammadde kontrolü, bağ alanlarında, hasat sırasında ve sonrasında İyi Tarım Uygulamaları (GAP), İyi Üretim Uygulamaları (GMP) ve İyi Hijyen Uygulamaları (GHP)  oldukça önemlidir. Üretim esnasında her bir basamağın titizlikle kontrol edilmesi, son ürünün depolama koşullarının uygun olması, mikotoksin analizlerini düzenli olarak uygun yöntemlerle yapılması kontaminasyonların önlenmesinde etkilidir. Şarapta OTA ve FB2 oluşumunun önüne geçilmesiyle hem halk sağlığı korunur hem de ekonomik kayıplar önlenmiş olur.

Abstract:
Wine is an alcholic beverage produced by fermentation of grape with a history that spans thousands of years. Celebrated for centuries, wine has extensive historical, cultural and economic significance in the world. Wine has always been produced wherever grape exists. Suitable soil, weather conditions, grape and production steps form the fundementals of quality. Wine is not only important as an alcoholic beverage but also important in terms of the marketing of grapes for profit. Economy of big wine producer countries rely on this assessment. Wine is categorized as red, white or pink as a result of production techniques or types of grape. Quality concept is very important and quality criterions are categorized as sensory, physical/chemical and microbilogical. Fungi is a criterion of microbiological type.
Ochratoxin A (OTA) is a secondary metabolite, and it is mainly produced by Penicillium verrucosum and several species of Aspergillus, including Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger and Aspergillus carbonarius. These mould species are capable of growing on several substrates under different conditions; hence contamination of OTA in food products could be seen all over the world. OTA is one of the most important mycotoxins of concern for human health. This mycotoxin is a potent nephrotoxin, which also exhibits immunosuppressive, teratogenic and carcinogenic properties. In 1993, the International Agency for Research on Cancer (IARC) classified OTA as a possible human carcinogen (group 2B). Several nephropathies affecting animals as well as humans have been attributed to OTA. In humans, OTA is frequently cited as the possible causative agent of endemic kidney disease observed in the Balkans (Balkan Endemic Nephropathy and related Urinary Tract Tumours).
OTA contamination has been reported in several food commodities, including wine. The occurrence of OTA in wine is related to fungal growth on grapes. Although Penicillium verrucosum and A. ochraceus are considered to be the main OTA producing species, the Aspergillus carbonarius presents a strong evidence of the mainly contribution in the OTA contamination in wine grapes. Several factors, such as climate, grape cultivation, and winemaking techniques affect the presence of OTA in wines. Levels are influenced by climate, which obviously depends on the latitude, but also on the particular circumstances of a given year, such as the temperature and relative humidity in the month before harvest. The geographic region of the origin of wine influences the frequency of occurrence and concentration of OTA in it. In Europe, the OTA content in wine and special wines from southern wine-growing regions is higher than the one from the northern areas.

Fumonisins produced by several Fusarium species, especially by Fusarium verticilloides and Fusarium proliferatum, and natural contaminants of corn and corn products exist all over the world. Fumonisins were first isolated from F. verticilloides in 1988 (formerly F. moniliforme Sheldon MRC 826) which is isolated from corns consumed in Transkei Region of Southern Africa. Among the fumonisin derivatives, Fumonisin B1 is the most common one and constitutes about 70?80% of the total fumonisin content of F. verticilloides cultures and naturally contaminated foods. Fumonisin B1 is a kind of fumonisin which is produced by F. verticilloides and F. proliferatum, fungi that commonly contaminate maize. Fumonisin B2 accounts for 15?25% of the total fumonisin, while fumonisin B3 accounts for 3?8%.

Fumonisins have nephrotoxic, hepatotoxic and immunosuppressive effects against various animal species. It has been detected that fumonisins cause leukoencephalomalacia in horses, Porcine Pulmonary Edema and liver cancer in rats. Fumonisins have been classified as a possible human carcinogen (Group 2B) by International Agency for Research on Cancer (IARC) according to findings obtained from test animals.

Fumonisin B1 is the most commonly found, in corn (maize) and corn-based foods, beer, milk, rice, sorghum, triticale, cowpea seeds, garlic (powder), garlic bulbs, onion powder, black radish, figs, black tea,  beans, soybeans and asparagus. Some industrially important strains of Aspergillus niger were reported to produce, in addition to ochratoxin A, the mycotoxin fumonisin B2. It has also been shown that strains of A. niger from coffee beans and raisins produced both fumonisin B2 and fumonisin B4. A. niger is produced fumonisin B2 from grape. A. niger strains isolated from raisins are capable of producing both fumonisin B2 and fumonisin B4 when cultured on either grapes or raisins.

In this work 51 types of red wine have been collected from 5 different regions of Turkey (Marmara, Central Anatolia, Aegean, Black Sea, East Anatolia). As part of the study, it was investigated whether OTA and fumonisin B2 exist in wine, and results were evaluated with respect toTurkish Food Codex and European Union limits.

An analytical method based on immunoaffinity column clean-up and high performance liquid-chromatography with fluorimetric detection was used to determine the occurrence of OTA in red wines. The limit of detection (LOD) was 0,2 µg/l and recovery value was %83,5. In order to minimize public health risk, the European Commission and Turkish Food Codex established a maximum level of 2 µg/l for OTA in wine.

In 16 of the red wine samples (31.4%), OTA was detected between 0,0903-11,2639 ?g/l. In one sample From Central Anatolia region (12.5%), 2 samples from Aegean (13.3%), 2 from Black Sea (25%), 3 fom East Anatolia (37.5%), contamination was detected. In 8 samples from Marmara (66.6%) OTA contamination were determined. Two samples were detected to have OTA accumulation over the prescribed legal limits in sixteen samples. These samples were from Marmara and the Black Sea Region. The amount of contamination in the sample taken from the Black Sea region was remarkably high. Taking precautions in this region is very significant for public health. 

In one sample from Marmara Region, OTA contamination was above the legal limit (2,9414 µg/l). In general,  the only one sample in Marmara region, the legal limit exceeded, and OTA contamination was found in many samples.

Existence of OTA contamination in  grapes and wine is related to geographic differences. OTA is more frequently detected in red wines than in rose and white wines, suggesting that the reason for the different levels lie in different winemaking techniques. Different climatic conditions, especially humidity and temperature influence the frequency of occurence and concentration of OTA in wines. Levels are influenced by climate, which obviously depends on the latitude, but also on the particular circumstances of a given year, such as the temperature and relative humidity in the month before harvest. When weather is considiered, positive correlation between high moisture and OTA contamination is observed. Grape cultivation, wine making techniques inflence the levels of OTA in wines. The higher ratio of sugar, the more contamination is seen. 

Recently, , some industrially important strains of A. niger were reported to produce, in addition to ochratoxin A, the mycotoxin fumonisin B2. Fumonisins have been widely studied as mycotoxin with cancer-promoting activity and are associated with a number of animal and human diseases. Evaluating the potential risk for wine comsumers, 51 red wine samples were investigated. Analytical methods such as high-performance liquid chromatography with fluorescence detection and immunoaffinity column cleanup were used for fumonisin B2 determination in red wine. The limit of detection (LOD) was 8 µg/l and recovery value was %70,53. Fumonisin B2 contamination was not observed during the study. Non existence of this hazardous microtoxine is a positive result considering the consumers? health.

Raw material control, good agricultural practices (GAP), good manifacturing practices (GMP), good hygene practices (GHP) are necessary in vineyards, during harvesting and post harvesting phases , in order to prevent OTA and fumonisin B2. While producing wine, it is vitally important to prevent contamination in raw material to prevent OTA and fumonisin B2. Contamination being detected indicates that good agricultural practices haven?t been used or contaminated grapes have been used. Good agricultural practices contain setting up vineyards, pruning, soil cultivation, watering, applying hormones, plant protection and harvesting process. Each of these stages should be controlled carefully. As well as controlling raw material, wine and the place where it is kept being under control is significant. Before and while fermentation, ripening and purifying processes, contamination can be kept under control. For preparatory steps for fermentation to be made properly, suitable yeasts must be used to decrease contamination. In vineyards, during harvesting and post harvesting, occurrence of OTA and fumonisin B2 can be prevented using good manufacturing practices, proper storing conditions and using high quality raw material in wine. During production, every step should be meticulously controlled and storage conditions should be suitable for regular micotoxine analysis work in order to prevent contamination. Preventing OTA and fumonisin B2 is necessary in terms of protecting health and preventing economic losses.?