Buğday kahverengi pası (Puccinia triticina Eriks) efektör adayı PTTG-01827'nin hıgs yöntemiyle fonksiyonel analizi
Functional analysis of candidate effector PTTG-01827 of wheat brown rust (Puccinia triticina Eriks) by higs method
Yazar: İLAYDA KÜÇÜK
Danışman: PROF. DR. SEMRA HASANÇEBİ
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Buğday kahverengi/yaprak pası bir mantar hastalığıdır. Etken olan Puccinia triticina Eriks (Pt), bitkinin fotosentez yapma yeteneğini azaltarak verim kaybına neden olur. Efektörler, patojenler tarafından konakçı savunmalarını bastırmak ve virülans başarılarını arttırmak için konakçı fizyolojisini modüle etmek üzere salgılanan proteinler/peptit molekülleridir. Bu nedenle, efektörlerin tespiti, hastalığı kontrol altına almanın en umut verici yollarından biri olarak görülmektedir.
Bu çalışmada aday efektör genin fonksiyonel olarak analiz edilerek gerçek efektör olup olmadığının saptanması amaçlanmıştır. Bunun için daha önce proteomik çalışmada tanımlanan aday efektör PTTG-01827 susturuldu ve fonksiyonel olarak analiz edildi. Fungal gen susturma için HIGS yöntemi kullanıldı. HIGS, bitkilerin doğal savunma mekanizmalarından biri olan RNAi mekanizmasını kullanarak fitopatojenik fungal genlerin susturulmasında başarı ile kullanılan bir yöntemdir.
Çalışmada PTTG-01827 efektör adayına özgü 350 bp uzunluğundaki DNA fragmenti tasarlanarak BSMV vektörüne klonlandı. HIGS yöntemi,  PTTG-01827 geninin susturulması için optimize edildi. Hassas buğday çeşidi Morocco fideleri, PTTG-01827 fragmenti içeren rekombinant BSMV ile inokule edildi ve virüs aracılığı ile efektör adayına özgü dsRNA molekülleri, bitki hücrelerinde çoğaltılıp dağıtıldı. BSMV semptomlarının görüldüğü 10. Günde aynı bitkiler Pt ırk-1 ile inokule edildi. Böylece Pt ırk-1'in enfeksiyon gelişimi sırasında eksprese olan efektör mRNA'ları hedeflendi. qRT-PCR ve mikroskobik inceleme ile RNAi mekanizmasının etkinliği ve aday genin susuturulma düzeyi belirlendi. Pt enfeksiyon şiddetindeki değişiklikler ile genin susturulma düzeyi arasındaki koorelasyon değerlendirildi. HIGS uygulaması sonucunda, PTTG_01827'nin ekspresyonunda yaklaşık %50'lik azalma olduğu tespit edildi. Pt sporulasyonunda azalma ve hif gelişiminde yavaşlamanın eşlik ettiği ve enfeksiyon şiddetinin %50 oranında azaldığı gözlemlendi. Elde edilen bulgular, PTTG_01827'nin gerçek bir efektör olduğu yönündeki beklentileri desteklemektedir.

Abstract:
Wheat brown/leaf rust is a fungal disease. The causative agent, Puccinia triticina Eriks (Pt), causes yield loss by reducing the plant's ability to photosynthesize. Effectors are proteins/peptide molecules secreted by pathogens to suppress host defenses and modulate host physiology to increase their virulence success. Therefore, detection of effectors is seen as one of the most promising ways to control the disease.
This study aimed to functionally analyze the candidate effector gene and determine whether it is a real effector. For this, the candidate effector PTTG_01827, previously identified in the proteomic study, was silenced and functionally analyzed by HIGS method. HIGS is a method used successfully to silence phytopathogenic fungal genes using the RNAi mechanism, one of the natural defense mechanisms of plants.
In the study, a 350 bp long DNA fragment specific to the PTTG_01827 effector candidate was designed and cloned into the BSMV vector. The HIGS method was optimized for silencing the PTTG_01827 gene. Seedlings of the sensitive wheat variety Morocco were inoculated with recombinant BSMV containing the PTTG_01827 fragment, and effector candidate-specific dsRNA molecules were amplified and distributed in plant cells via the virus. When BSMV symptoms were observed at 10 dpi, the same plants were inoculated with Pt race-1. Thus, expressed effector mRNAs during the infection development of Pt race-1 were targeted. The effectiveness of the HIGS mechanism and the silencing level of  the candidate gene were determined by qRT-PCR. Changes of the infection type were detected by microscobic and fenotypic observations. At the end, the coorelation between changes in Pt infection severity and the gene silencing level was evaluated. As a result of HIGS application, it was determined that there was an approximately 50% decrease in the expression of PTTG_01827. It was observed that a decrease in Pt sporulation was accompanied by a slowdown in hyphae development, and the severity of infection decreased by 50%. The findings support the expectations that PTTG_01827 is a true effector.

Changes in the type of infection, the effectiveness of the RNAi mechanism and the effect of silencing the candidate gene on the development of infection were analyzed and confirmed by qRT-PCR and microscopic examination. As a result of HIGS application, the expression of PTTG-01827  was an approximately 50% decrease. Pt infection on the same leaves was also decrease accompanied by a decrease in Pt sporulation and a slowdown in hyphal development. The our  findings support the predictions that PTTG_01827 may be a real effector.