Glifosat toksisitesine karşı rosmarinik ve vanilik asitlerin in vitro ortamda biyokimyasal ve antioksidan etkilerinin incelenmesi
Investigation of biochemical and antioxidant effects of rosmarinic and vanilic acids against glyosate toxicity in vitro medium
Yazar: GÖZDE ÖZCAN
Danışman: PROF. DR. ÖKKEŞ YILMAZ
Fırat Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
Glifosat [N-fosfonometil glisin], dünya çapında yaygın olarak kullanılan geniş spektrumlu bir herbisittir.Glifosat; tirozin, triptofan ve fenilalanin gibi aromatik amino asitlerin oluşumu için gerekli olan enzim 5¬-enolpiruvil-şikimat-3-fosfat sentaz enziminin (EPSPS) aktivitesini inhibe ederek bitkilerin gelişimini önler. Rosmarinik asit ve vanilik asit ise pek çok bitkide doğal olarak bulunan fenolik asitlerdir.Bu çalışmada, moleküler biyoloji ve biyokimya alanlarındaki çalışmalarda model organizma olarak kullanılan SaccharomycescerevisiaeL. kullanılmıştır ve glifosatın toksik etkisine karşı kültür ortamına farklı dozlarda eklenen rosmarinik ve vanilik asitin antioksidan ve biyokimyasal etkileri araştırılmıştır.Kültür ortamlarına hem glifosat hem de rosmarinik ve vanilikasit konsantrasyonları litrede 200, 400 ve 800 mg olarak eklendi. Kültür sıvıları otoklavda 121°C'de 15 dakika sterilizasyon yapıldı. Oda sıcaklığında soğutulduktan sonra, steril ortamda maya hücrelerinin aşılaması yapıldı. Bu işlemden sonra 30 oC'lik etüvde 72 saat inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda kültür sıvılarının yoğunlukları spektrofotometrede 600 nm'de ölçüldü.Daha sonra hücre pelleti +4 oC'de 6000 rpm'de santrifüjedilerek izole edildi. Hücre peleti % 0.9'luk NaCl solüsyonu ile yıkandı ve daha sonra Tris-EDTA tamponu (pH=7.4) ile homojenize edilerek üst süpernatant kısım +4 oC'de 6000 rpm'de pelet kısımdan ayrıldı. Süpernatant kısımdan total protein, GSH, GSSG, MDA ve Glutatyon S-Transferaz enzimaktivitesi ölçüldü. Geriye kalan pelet kısmı 3/2 (v/v) n-hekzan/izopropil alkol karışımı ile homojenize edildi. Santrifüj yapılarak süpernatant kısmı alındı ve esterleştirme işlemi yapılarak gaz kromatografisinde yağ asitlerinin analizi yapıldı. Gaz kromatografisi ile yapılan analiz sonucunda, maya hücresi peleti ekstraktı içinde oktanoik asit (8:0), laurik asit (12:0), miristik asit (14:0), palmitik asit (16:0), palmitoleik asit (16:1 n-7), stearik asit (18:0), oleik asit (18:1 n-9) ve linoleik asit (18:2n-6) asitlerin bulunduğu gözlendi. D, E ve K vitamin miktarlarının analizi ise HPLC Cihazı ile yapıldı.Bu analiz sonucunda, K2, -tokoferol, D2, D3, -tokoferol, ergosterol, K1, stigmasterol, -sitosterol gibi moleküller tanımlandı. Biyokimyasal analizler sonucunda 800 mg glifosat içeren kültür ortamındaki hücre yoğunluğunun azaldığı belirlendi. Protein miktarı, GST, lipid peroksidasyon ile yağ asidi düzeylerinde farklılıklar gözlendi. Saccharomyces cerevisiaeL. kültür ortamında, glifosat toksisitesine karşı vanilik ve rosmarinik asitin biyokimyasal değerler üzerinde etkili olduğu belirlendi.

Anahtar Kelimeler: Glifosat, Vanilik asit, Rosmarinik asit, Antioksidan etki, Total protein, GSH, GSSG, Lipid peroksidasyon, Yağ asidi, DPPH, GST, Saccharomyces cerevisiaeL.

Abstract:
Investigation of Biochemical and Antioxidant Effects of Rosmarinic and Vanilic Acids Against Glyphosate ToxicityIn Vitro Medium

Glyphosate inhibits the growth of plants by inhibiting the activity of enzyme 5-enolpyruvyl-shikimic-3-phosphate synthase (EPSPS), which is required for the formation of aromatic amino acids such as tyrosine, tryptophan and phenylalanine. Rosmarinic acid and vanillic acid are naturally occurring phenolic acids in many plants. In this study, Saccharomyces cerevisiaeL. was used as a model organism in studies in molecular biology and biochemistry and antioxidant and biochemical effects of rosmarinic and vanillic acid added at different doses to the culture medium against the toxic effect of glyphosate were investigated. Both glyphosate and rosmarinic and vanillic acid concentrations in culture media were added as 200, 400 and 800 mg per liter. The culture broth was autoclaved at 121 ° C for 15 minutes. After cooling at room temperature, yeast cells were inoculated in sterile medium. After this procedure, the 30 ºC sample was allowed to incubate for 72 hours. At the end of the period, the concentrations of the culture fluids were measured at 600 nm in the spectrophotometer. The cell pellet was then isolated by centrifugation at 6000 rpm at +4 ° C.The cell pellet was washed with 0.9% NaCl solution and then homogenized with Tris-EDTA buffer (pH = 7.4) and the upper supernatant was separated from the pellet at 6000 rpm at +4 º C. Total protein, GSH, GSSG, MDA and Glutathione S transferase activities were measured from the supernatant.The remaining pellet portion was homogenized with a mixture of 3/2 (v / v) n-Hexane / isopropyl alcohol. The supernatant fraction was removed by centrifugation and esterification was performed to analyze fatty acids in gas chromatography. Analysis by gas chromatography revealed that the yeast cell pellet extract contained octanoic (8: 0), lauric (12: 0), myristic (14: 0), palmitic (16: 0), palmitoleic (16:1 n-7), stearic (18: 0), oleic (18:1  n-9) and linoleic (18:2 n-6) acids were observed. Analyzes of vitamin A, D, E, and K vitamins were performed with an HPLC instrument. As a result of this analysis, molecules such as K2, δ-tocopherol, D2, D3, -tocopherol, ergosterol, K1, stigmasterol, -sitosterol were identified. Biochemical analyzes indicated that cell density decreased in culture medium containing 800 mg glyphosate. Protein amount, GST activity, lipid peroxidation and fatty acid levels were observed. . It was determined that vanillic and rosmarinic acid against glyphosate toxicity were effective on biochemical values in Saccharomyces cerevisiaeL. culture medium.

Key words: Glyphosate, Vanilic acid, Rosmarinic acid, Antioxidant effect, Total protein, GSH, GSSG, Lipid peroxidation, Fatty acid, DPPH, GST, Saccharomyces cerevisiaeL.