Kanatlı hayvanlarda aşı adayı escherichia coli mutant suşunun geliştirilmesi
Development of vaccine candidate escherichia coli mutant strain in poultry
Yazar: TUĞÇE ÜSTÜN
Danışman: PROF. DR. MEHMET AKAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Aşılama = Vaccination ; Aşılar = Vaccines ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Kümes hayvanları = Poultry ; Mutant = Mutant

Özet:
APEC infeksiyonu dünya çapında kanatlı hayvan endüstrisindeki önemli ekonomik kayıplardan sorumludur ve genellikle kesim sırasındaki karkas kayıplarının en sık sebebidir. Tedavi amacıyla antibiyotiklerin yaygın olarak kullanılması sonucunda antibiyotik dirençli suşların oranı giderek artmaktadır. Bu sebeplerden ötürü hastalıktan korunma oldukça önemlidir. Korunma stratejilerinden biri olan aşılama ülkemizde de giderek önem kazanmaktadır. Bu amaçla bu tez çalışmasıyla oksotrofik mutant aşı aday suşu geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Çalışmada kullanılan suşlar Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalında O78 olarak serotiplendirilmesi yapılan ve kültür koleksiyonunda saklanan 18 adet suş arasından antibiyotik dirençlilik özellikleri dikkate alınarak seçildi. E. coli 353 suşu tüm transformasyon ve mutasyon aşamalarında kullanıldı. 
Seçilen suşta hedeflenen genin (aroA) delesyonunu gerçekleştirmek için oldukça kullanışlı ve günümüzde de yaygın olarak kullanılan Lambda Red yöntemi ve Gene Bridge Quick & Easy Gene Deletion kiti kullanıldı.
Elde edilen mutant suşun fenotipik ve biyokimyasal özellikleri değerlendirildi ve saha suşu ile karşılaştırmaları yapıldı. Mutant suşun, koloni morfolojisinin ve bazı biyokimyasal özelliklerinin değiştiği görüldü. Kanlı agarda hemoliz özelliği gösteren saha suşu mutant hale getirildiğinde hemoliz özelliğini kaybetmiş oldu. E. coli için tipik olan MacConkey agarda pembe, EMB agarda yeşil parlamalar mutant bakteri laktozu kullanamadığı için kayboldu ve renksiz koloniler oluştu. Yarı katı besiyerinde yapılan hareket muayenesi sonucunda mutant bakterinin hareket özelliğini önemli derecede kaybettiği görüldü. Saha suşunda pozitif olan ornitin, glikoz, mannitol, ksiloz, ONPG ve indol testlerinin mutant suşta negatife döndüğü tespit edildi.
Oluşturulan mutant suşun saha suşu ile antibiyotik duyarlılık kıyaslaması yapıldığında ise tetrasiklin, β laktam, sülfanomid, sefolosporin grubuna ve aminoglikozidlerden gentamisin ve streptomisin antibiyotiklerine duyarlılıklarının artmış olduğu; amoksisilin/klavulonik asit ve ampisiline saha suşunda olduğu gibi dirençli olduğu, kanamisine ise direnç göstermeye başladığı görüldü.

Yürütülen bu tez çalışması ile Türkiye'de ilk kez bir APEC O78 suşunda aromatik aminoasit sentezi ve çeşitli sekonder metabolit oluşumu için önemli bir gen olan aroA geninin delesyonu yapılarak mutant aşı aday suşu geliştirildi. Oluşturulan bu aşı aday suşunun gelecekteki araştırmalara ve gelişmelere katkı sağlayacağı düşülmektedir.

Abstract:
APEC infection is responsible for major economic losses in the poultry industry worldwide and is often the most common cause of carcass losses at slaughter. As a result of the widespread use of antibiotics for treatment purposes, the rate of antibiotic-resistant strains is increasing. For these reasons, disease prevention is very important. Vaccination, which is one of the prevention strategies, is becoming increasingly important in our country. For this purpose, it was aimed to develop an auxotrophic mutant vaccine candidate strain with this thesis study.
The strains used in the study were selected among 18 strains that were serotyped as O78 in Ankara University Faculty of Veterinary Medicine Microbiology Department and kept in the culture collection, taking into account their antibiotic resistance properties. E. coli 353 strain was used at all transformation and mutation stages.
Lambda Red method and Gene Bridge Quick & Easy Gene Deletion kit were used to deletion of the targeted gene (aroA) in the selected strain.
The phenotypic and biochemical characteristics of the obtained mutant strain were evaluated and compared with the field strain. It was observed that colony morphology and some biochemical characteristics of the mutant strain changed. When the field strain that showed the hemolysis feature on blood agar was transformed into a mutant and it lost its hemolysis feature. Pink flashes on MacConkey agar and green flashes on EMB agar, typical for E. coli, disappeared because mutant bacteria could not use lactose and colorless colonies were formed. As a result of the motility examination on a semi-solid growth medium, it was observed that the mutant bacteria lost their motility significantly. It was determined that the ornithine, glucose, mannitol, xylose, ONPG, and indole tests were turned negative in the mutant strain while was positive in the field strain.

When the antibiotic susceptibility comparison of the mutant strain was made with the field strain, it was found that the susceptibility of tetracycline, β-lactam, sulfonamide, cephalosporine group and aminoglycosides gentamicin and streptomycin antibiotics increased; It was observed that it was resistant to amoxicillin/clavulanic acid and ampicillin as in the field strain and started to show resistance to kanamycin.

With this thesis, a mutant vaccine candidate strain was developed for the first time in Turkey by deleting the aroA gene, which is an important gene for aromatic amino acid synthesis and the formation of various secondary metabolites in an APEC O78 strain. It is considered that this vaccine candidate strain will contribute to future research and developments.