Meme kanseri hücreleri tarafından üretilen fibronektinin miyeloid hücre karakteri üzerine etkisi
The effect of fibronectin produced by breast cancer cells on myeloid cell character
Yazar: GÜRCAN TUNALI
Danışman: PROF. DR. GÜNEŞ ESENDAĞLI
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Elastaz = Elastase ; Fibronektinler = Fibronectins ; Makrofajlar = Macrophages ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Monositler = Monocytes ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Tümör hücreleri-kültürü yapılmış = Tumor cells-cultured ; İnterlökin 1 = Interleukin 1

Özet:
Bazal-benzeri meme kanseri (BBMK) inflamasyonu düzenleyici karaktere sahiptir ve yüksek düzeyde miyeloid hücre infiltrasyonu gösterir. Tümör dokusunu oluşturan hücre-dışı matriks bileşenleri, özellikle fibronektin (FN), miyeloid hücrelerin farklılaşmasına katkıda bulunur. Tümördeki makrofajlar STAT3 transkripsiyon faktörünün katkısı ile immün baskılayıcı karakter kazanır. Tümör-ilişkili makrofajlar (TAM), tümörde inflamatuvar mikroçevrenin oluşumuna katkı sağlar. Elastaz-2 FN'i özgül bölgelerden keserek TLR4 reseptörünü uyarabilen EDA bölgesinin ortaya çıkmasını sağlar. Bu tez çalışması, BBMK hücrelerinden üretilen faktörlerin miyeloid hücrelerdeki STAT3 aktivitesini ve tümör mikroçevresindeki inflamatuvar karakterde önemli rol oynayan interlökin-1β (İL-1β) üretimini düzenlediği ve FN/FN-EDA, elastaz ve TLR4 ekseninin meme kanserinde inflamasyonun devamlılığını sağladığı hipotezine dayanmaktadır. Analizlerde periferik kan monositleri ve immatür miyeloid hücre modeli olarak miyeloid lösemi hücre hatları kullanıldı. Bu hücrelerde fenotipik (CD11b, CD11c, CD14, CD40) ve fonksiyonel (reaktif oksijen türlerinin üretimi, kemotaksis ve fagositoz kapasitesi, CD4+ T hücre çoğalmasının uyarılması) farklılaşma parametreleri değerlendirildi. BBMK hücre süpernatanları ile inkübe edilen miyeloid hücrelerde STAT3 aktivasyonu TLR4 düzeyleri, İL-1β ve elastaz-2 üretimi araştırıldı. STAT3 aktivasyonu sonrasında miyeloid hücrelerin İL-1β, TLR4, elastaz-2 ve NF-kappa B aktivitesini uyarma düzeyi değerlendirildi. Pro-inflamatuvar sitokinler varlığında meme kanseri hücrelerinde total FN ve FN-EDA düzeyleri test edildi. FN-EDA'nın TLR4 ve NF-kappa B aktivitesine etkisi incelendi. BBMK hücrelerinden salgılanan faktörler miyeloid hücrelerde fenotipik ve fonksiyonel olgunlaşmayı uyardı. Kemotaksis kapasitesi artan miyeloid hücrelerde BBMK hücrelerinden salgılanan faktörlerin STAT3 aktivitesini uyardığı belirlendi. Yüksek STAT3 aktivitesine sahip miyeloid hücrelerde İL-1β salım kapasitesi arttı. İL-1β ile uyarılan BBMK hücrelerinde total FN ve FN-EDA izoformunun arttığı gözlemlendi. FN-EDA konsantrasyonu arttırılan BBMK hücre süpernatanlarının monositlerden İL-1β üretimini etkili bir şekilde desteklendiği görüldü. Yüksek düzeyde FN-EDA içeren ortamda BBMK hücrelerinden ve monositlerden salgılanan faktörlerin NF-kappa B aktivitesini uyardığı tespit edildi. İL-1β üretimi ve NF-kappa B aktivitesi üzerindeki etkinin STAT3 aktivasyonuna bağlı olarak gerçekleştiği belirlendi. BBMK hücrelerinden salgılanan FN-EDA'nın ve rekombinant FN-EDA varlığında yüksek düzeyde elastaz-2 içeren PMN lökosit süpernatanlarının TLR4 ve NF-kappa B aktivitesini uyarmadığı görüldü. Sonuç olarak, BBMK ve monositler arasında tümör mikroçevresindeki kronik inflamasyonu destekleyen, STAT3/İL-1β/FN molekülleri aracılığı ile pozitif bir geri-besleme mekanizmasının olabileceği yönünde bilgilere ulaşılmıştır. BBMK'de STAT3, İL-1β ve FN'in hedeflenmesi inflamatuvar mikroçevreyi kanser tedavisine elverişli hale getirebilir. BBMK için tedavi stratejileri geliştirilirken bu pozitif geri-bildirim mekanizmasının varlığı dikkate alınmalıdır.

Abstract:
Basal-like breast cancer (BLBC) possess high capacity to regulate inflammation and identified with high-level myeloid cell infiltration. Extracellular matrix components produced by tumor cells, e.g. fibronectin (FN), can support myeloid cells' maturation. Macrophages in the tumor gain immunosuppressive characters with the contribution of the STAT3 transcription factor. Tumor-associated macrophages (TAM) contribute to the formation of inflammatory microenvironment. EDA fragment released by elastase-2-mediated cleavage of FN can stimulate TLR4 receptor. This study is based on the hypothesis that the factors produced by BLBC cells regulate STAT3 activity in myeloid cells and interleukin-1β (IL-1β) production, which plays an important role in the inflammatory character of the tumor microenvironment, and FN/FN-EDA, elastase and TLR4 axis provide the contribution of inflammation in breast cancer. Peripheral blood monocytes and myeloid leukemia cell lines, as immature myeloid cell model, were used. Phenotypic (CD11b, CD11c, CD14, CD40) and functional (production of reactive oxygen species, chemotaxis and phagocytosis capacity, stimulation of CD4+ T cell proliferation) differentiation parameters were evaluated. STAT3 activation, TLR4 levels, IL-1β and elastase-2 production were investigated in myeloid cells incubated with BLBC cells' supernatants. IL-1β, TLR4, elastase-2 and NF-kappa B stimulation by myeloid cell were evaluated following STAT3 activation. In the presence of pro-inflammatory cytokines, total FN and FN-EDA levels were evaluated in breast cancer cells. The effect of FN-EDA on TLR4 and NF-kappa B activity was investigated. Factors produced by BLBC cells induced phenotypic and functional maturation in myeloid cells. In myeloid cells with increasing chemotaxis capacity, STAT3 activation was stimulated by factors produced by BLBC. IL-1β secretion increased in myeloid cells with high STAT3 activity. Total FN and FN-EDA isoform was highly produced by IL-1β-induced BLBC cells. BLBC cell supernatants and FN-EDA were synergistically promoted IL-1β production from monocytes and stimulated NF-kappa B activity. The effect on IL-1β production and NF-kappa B activity were associated with STAT3 activation. Either secreted by BLBC cells or recombinant FN-EDA, when treated with neutrophil supernatants containing high levels of elastase-2, did not stimulate TLR4 and NF-kappa B activity. In conclusion, a positive feedback mechanism between BLBC and monocytes through STAT3/IL-1β/FN molecules supports chronic inflammation in the tumor microenvironment. Targeting STAT3, IL-1β and FN in BLBC may modulate inflammatory microenvironment in favour of cancer therapy. The development of treatment strategies for BLBC should take into account the presence of this positive feedback mechanism.