Fibrozisli fare akciğerlerinde ekstrasellular matriks düzenlenmesinde lizil oksidaz inhibisyonun rolü
A role of lysyl oxidase inhibition on extracellular matrix remodeling in the mice lung with fibrosis
Yazar: HALE ÖVET
Danışman: DOÇ. DR. FÜSÜN ÖZTAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Zooloji = Zoology

Özet:
Pulmoner fibrozis, fibroblast ve miyofibroblast sayısında artış, hücreler arası alanda kollajen, fibronektin gibi ekstrasellular matriks (ECM) elemanlarının aşırı birikimi ile karakterize edilir. Lizil oksidaz (LOX) enzim ailesinin üyeleri, kollajen fibrillerin çapraz bağlanmasını katalizleyerek bu fibrillerin ECM içinde yerleşimini ve birikimini düzenler.  Bu enzimlerin aktivitesinin artışı pulmoner fibrozise neden olabilir. Tetratiyomolibdat (TM)  bakır bağlayıcı özelliği ile LOX aktivitesini azaltır. Çalışmamızda, pulmoner fibrozisde, TM aracılı LOX inhibisyonunun, LOX ve LOX benzeri proteinleri (LOXL-1 ve 2) ile jelatinaz/kollajenaz (MMP-2/MMP-8) gibi matriks sindirim enzimlerinin ve kollajenaz inhibitör proteininin  (TIMP-1) ekspresyonları üzerinde etkisi belirlendi ve TM'in anti-fibrotik etkisi test edildi.
Çalışmada, farelerde pulmoner fibrozis, bleomisinin intratrakeal enjeksiyonu ile uyarıldı. Ergin farelerden 4 deney grubu oluşturuldu: Deneyin ilk beş günü bleomisin (0,8 mg/kg) uygulaması ile fibrozis oluşturulan ve deneyin 21. gününde kesilen fareler (I) ve kontrolleri (II), fibrozis oluşturulduktan sonra deneyin 14. gününden itibaren gavaj yolu ile bir hafta boyunca TM (ilk 4 gün 1,2 mg/gün/fare ve son 3 gün 0,9 mg/gün/fare) verilen ve deneyin 21. gününde kesilen fareler (III) ve kontrolleri (IV). Grup III ve IV'deki fareler son 7 gün boyunca düşük bakır diyeti (2 mg/kg) ile beslendi. Fare akciğerlerinde mikroskobik yöntemlerle fibrozis derecesi tespit edildi, Ayrıca akciğer homojenatlarında Western emdirimi yöntemleri ile de kollajen-I, LOX, LOXL-1, LOXL-2, TIMP-1, MMP-2 ve MMP-8 proteinlerinin analizleri yapıldı. 
Bleomisin uygulamaları, fare akciğer genelinde yaygın orta-ileri şiddette pulmoner fibrozise neden oldu. Fibrozisli fare akciğerleri  kollajen fibrillerin interstisiyel alanda birikimi yanı sıra kollajen-I protein, aktif  LOX, LOXL-1 ve LOXL-2, MMP-2, MMP-8 enzim ve TIMP-1 protein seviyelerindeki artış ile karakterize edildi. TM ve düşük bakır diyeti uygulamaları, kollajen–I protein miktarının ve interstisiyel alanda kollajen fibril birikiminin azalmasını sağlayarak, fibrotik fare akciğerinde gözlenen yapısal ve biyokimyasal değişikliklerin gerilemesine neden oldu. TM ve düşük bakır diyeti uygulamaları pulmoner fibrozisi geriletme amacıyla güvenli bir şekilde kullanılabilir.

Anahtar kelimeler: Pulmoner fibrozis, tetratiyomolibdat, lizil oksidaz, matriks 
metalloproteinazlar, TIMP-1

Abstract:
Pulmonary fibrosis is characterized by an increase in the number of fibroblasts/myofibroblasts and an excessive accumulation of extracellular matrix (ECM) components such as collagen and fibronectin. The members of lysyl oxidase (LOX) enzyme family regulate the accumulation of collagen fibers in ECM, by catalyzing cross-links bounds among these fibers. An increase in the activity of these enzymes results in pulmonary fibrosis. Tetrathiomolybdate (TM) reduces the LOX activity via its copper-binding characteristic.  The current study showed the effects of TM-induced LOX inhibition on the expression of LOX, LOX-like proteins (LOXL-1 and 2), matrix digestion enzymes such as a gelatinase/collagenase (MMP-2/MMP-8) and TIMP-1, a collaganase inhibitory protein, and also evaluated the TM-depended anti-fibrotic effect on pulmonary fibrosis. 
In the current study, pulmonary fibrosis was induced by bleomycine instillation via trachea in mice. Adult mice were divided into 4 groups: mice dissected after 21st days of the first bleomycine (0,8 mg/kg) treatment (I) and their controls (II), mice treated with TM for one week (1.2 mg/day/mice for the first 4 days and 0.9 mg/day/mice for the following 3 days) after 14 days of the first bleomycine instillation and dissected in the 21st days of experiment (III) and their controls (IV). Mice in groups III and IV fed lower copper diet (2 mg/kg) during the last 7 days of the experiment. Fibrosis score in lung was determined under microscope. Also, the expression of collagen-I, LOX, LOXL-1, LOXL-2, TIMP-1, MMP-2 and MMP-8 proteins were analyzed by Western blotting in lung homogenates. 
Bleomycin treatments resulted in expanded pulmonary fibrosis with moderate-severe degree in the mice lung. Mice lung with fibrosis were characterized by an increase in protein levels of collagen-I, activated LOX, LOXL-1, LOXL-2, MMP-2, MMP-8 and TIMP-1, in addition to an excessive accumulation of collagen fibers.  In fibrotic mice lung, TM and lower copper diet treatments significantly regressed structural and biochemical alterations, and reduced collagen-I protein expression and collagen accumulation in ECM.  In conclusion, TM and lower copper diet treatments may safely be used for regression of pulmonary fibrosis.

Keywords: Pulmonary fibrosis, tetrathiomolybdate, lysyl oxidase, matrix 
metalloproteinases, TIMP-1