Nöroblastoma Hücrelerinde MAPK ve AKT Sinyal Yolaklarındaki Bozulmanın ve Aralarındaki Etkileşimin Speedy/RINGO Proteini ile İlişkisinin siRNA Yöntemi ile Aydınlatılması
Revealing the role of Speedy/RINGO protein on deregulation of MAPK and AKT signaling pathways and crosstalk between these pathways using siRNA silencing method in neuroblastoma cells
Yazar: SEREN KÜÇÜKVARDAR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AYŞEGÜL YILDIZ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Nöroblastoma kanseri de dahil olmak üzere birçok kanser türünün ortaya çıkışında ve tedavi sürecinde kemoterapiye direnç oluşmasına katkı sağlayarak tedavininin etkinliğinin oldukça azalmasında MAPK ve PI3K/Akt sinyal yolaklarının tetiklenmesi ve aşırı aktivasyonu en önemli etkenlerden biridir. Bu süreçte bu iki sinyal yolağının birbirleriyle iletişim ve etkileşim halinde hareket ettiklerini ve bu etkileşimin odak noktasının bir hücre siklus regülatörü olan Speedy/RINGO proteini olma ihtimalini güçlendiren veriler mevcuttur. 
Bu noktadan yola çıkılarak çalışmanın amacı, kanserleşmenin temelindeki önemli faktörlerden olan MAPK ve PI3K/Akt sinyal yolaklarının aşırı aktivasyonunun ve aralarındaki etkileşimin, Speedy/RINGO proteininin aşırı ekspresyonu ile ilişkisi olup olmadığının nöroblastoma hücrelerinde aydınlatılmasıdır. Bu amaca yönelik olarak çalışma iki kısımda gerçekleştirilmiştir. İlk kısımda, MAPK sinyal yolağının inhibitörler ile inhibisyonu sonucu Speedy/RINGO'nun protein düzeyinde ekspresyonu incelenmiş, sonrasında ise CDK2 ekspresyonu ve buna bağlı olarak da Akt fosforlanma seviyeleri incelenmiştir. İkinci kısımda, ilk kısımdaki MAPK inhibisyonu devamında görülecek olan etkilerin MAPK inhibisyonunun diğer etkilerinden bağımsız olarak yalnızca Speedy/RINGO ekspresyonundaki azalmayla doğrudan ilişkili olduğundan emin olmak amacıyla siRNA teknolojisi ile Speedy/RINGO geni direkt susturulup, Cyclin A-CDK2 ve Akt protein seviyelerinde aynı değişimlerin gerçekleşip gerçekleşmediği gözlenmiştir. Bu tezin konusu kapsamında ise söz konusu çalışmanın siRNA tekniği ile susturma yöntemini içine alan ikinci kısmı gerçekleştirilmiştir. Tüm bu proteinlerin ekspresyon seviyelerine bakmak için western blotlama tekniği uygulanmıştır. Ayrıca bu inhibisyon uygulamalarının hücrelerin yaşamsal durumlarına etkisi de canlılık analiziyle belirlenmiştir. 
Çalışmadan elde edilen bulgularda, Speedy/RINGO genine özgü siRNA teknolojisi uygulanan nöroblastoma hücrelerinde Speedy/RINGO protein ekspresyonuna bakıldığında, susturulduğunu gösteren anlamlı bir azalma olduğu görülmüştür. Bir hücre siklus regülatörü olan Speedy/RINGO, G1/S faz geçişini kontrol ederken partnerleri olan Cyclin A-CDK2 kompleksi ile işbirliği içinde olduğundan, Speedy/RINGO'nun inhibisyonuna bağlı olarak Cyclin A ve CDK2 protein seviyelerinde de beklendiği üzere önemli ölçüde azalmalar görülmüştür. Cyclin A-CDK2 kompleksi, Akt fosforlanmasında önemli rol oynadığından, Cyclin A ve CDK2 protein seviyelerindeki azalmaya bağlı olarak Akt fosforlanma miktarlarında da beklendiği şekilde anlamlı azalmalar görülmüştür. Fosforlanma düzeylerindeki bu azalmalar, hücreyi kanserleşmeye götüren en önemli nedenlerden biri olan Akt aşırı fosforlanması olayının engellendiğini de göstermiştir. Speedy/RINGO hücre döngüsünün düzenlenmesinde etkin bir rol aldığından ve MAPK sinyal yolağı da hücre döngüsü ile ilişkili bir yolak olduğundan, Speedy/RINGO'nun inhibisyonunun MAPK sinyal yolağı üzerindeki muhtemel etkisi de araştırılmış ve MAPK sinyal yolunun da inhibe olduğu gözlenmiştir. Elde edilen tüm bulgular, PI3K/Akt ve MAPK sinyal yolakları arasındaki ilişkinin odak noktasında Speedy/RINGO'nun yer alabileceği, dahası her iki sinyal yolu üzerinde de regülatör etkisi bulunabileceğine dair hipotezimize katkıda bulunmuştur. Bu durumun hücrelerin yaşamsal faaliyetleri üzerindeki etkisine bakıldığında, siRNA teknolojisi ile Speedy/RINGO'nun susturulması, önemli bir sağkalım yolağı olan Akt'nin fosforlanmasını engelleyip kanser hücrelerinin canlılığını %15 oranında ve anlamlı şekilde azaltmıştır. 
Sonuç olarak bu çalışma, nöroblastoma kanserinin oluşum ve kemoterapiye direnç mekanizmasının altında yatan PI3K/Akt ve MAPK sinyal yolaklarının bu etkilerini birbirleriyle Speedy/RINGO proteini üzerinden iletişim kurarak, ayrıca Speedy/RINGO tarafından bağımsız olarak kontrol edilerek ortaya koydukları hipotezine önemli derecede katkıda bulunacak veriler sağlamış ve özellikle nöroblastoma hücreleri için bu noktada Speedy/RINGO'nun muhtemel fonksiyonuna dair ilk kez aydınlatıcı bilgiler sunmuştur. Bu çalışma ile başta nöroblastoma kanseri olmak üzere birçok kanserin tanı ve tedavisi için doğru terapötik hedeflerin seçilmesinin ve bu sayede uygun tedavi yöntemleri geliştirilmesinin önünü açabilme potansiyeli oluşmuştur.

Abstract:
Triggering and overactivation of MAPK and PI3K/Akt signalling pathways are one of the most important factors in the formation of many types of cancer, including neuroblastoma, by reducing the effectiveness of treatment and contributing to the development of resistance to chemotherapy during the treatment process. There is evidence reinforcing the possibility that these two signalling pathways are communicating and interacting with each other in carcinogenic process and there, in the focus of this interaction is a cell cycle regulator protein, Speedy/RINGO. 
The aim of this study is to elucidate whether crosstalk between MAPK and PI3K/Akt signaling cascades which is the major cause of MAPK and PI3K/Akt overactivity and tumorigenesis is associated with overexpression of Speedy/RINGO protein or not in SH-SY5Y neuroblastoma cells.  For this purpose, the study was carried out in two parts. In the first part, as a result of inhibition of the MAPK signalling pathway with inhibitors, the expression of Speedy/RINGO at the protein level was investigated and then the expression of CDK2 and consequently the Akt phosphorylation levels were investigated. In the second part, to confirm that the effects to be observed in the subsequent MAPK inhibition in the first part are directly related to decrease in the expression of Speedy/RINGO regardless of the other effects of MAPK inhibition, the Speedy/RINGO gene was directly silenced with the siRNA technology and it was observed that whether or not the same changes in Cyclin A-CDK2 and Akt protein levels would occur. Within the scope of this thesis, the second part of this study which includes silencing method with siRNA technique was performed. Western blotting technique was applied to analyze the expression levels of all the proteins. Also, the effect of these inhibition experiments on the vital status of cells was determined by viability analysis.
In the results obtained from the study, it was observed that the Speedy/RINGO protein expression was successfuly decreased in neuroblastoma cells with siRNA technology. Since Speedy/RINGO, a cell cycle regulator, cooperates with its partner Cyclin A-CDK2 complex when controlling G1/S phase transition, the expected significant reductions in Cyclin A and CDK2 protein levels due to inhibition of Speedy/RINGO was observed. Since the Cyclin A-CDK2 complex plays an important role in Akt phosphorylation, the expected decrease in Akt phosphorylation amounts due to the decrease in Cyclin A and CDK2 protein levels was observed. These reductions in Akt phosphorylation levels have also shown that inhibition of Speedy/RINGO prevented Akt hyperphosphorylation, which is one of the most important causes for cells to become cancerous. Since Speedy/RINGO takes an active role in the regulation of cell cycle and the MAPK signalling pathway is a cell cycle-related pathway, the effects of Speedy/RINGO inhibiton on MAPK signaling was also analyzed. It was observed that MAPK signaling was downregulated as a result of Speedy/RINGO inhibition. All data obtained from the study contributes to the hypothesis that at the focus of relationship between PI3K/Akt and MAPK signalling pathways may be Speedy/RINGO. Considering the effect of this situation on the vital activities of cells, since silencing of Speedy/RINGO with siRNA technology prevented phosphorylation of Akt, which is an important survival pathway, cell viability analysis was also conducted and it was shown that the viability of cancer cells decreased by 15%. 
In conclusion, this study provided the first evidence in the literature significantly contributing to the hypothesis that PI3K/Akt and MAPK signalling pathways communicate with each other via the Speedy/RINGO protein which underlie the mechanism of neuroblastoma cancer formation and chemotherapy resistance, and furthermore Speedy/RINGO may independently act on these pathways to regulate carcinogenesis. From all reasons above, this study has the potential to enable the selection of appropriate therapeutic targets and the development of effective diagnosis and treatment strategies for many cancers, particularly for neuroblastoma cancer.