Akut lenfoblastik lösemide wip1 fosfatazın kemoterapi üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of wip1 phosphatase on chemoteraphy induced cellular response on acute lymphoblastic leukemia cells
Yazar: NUR BETÜL KARTAL
Danışman: DOÇ. DR. MEHTAP KILIÇ EREN
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: DNA hasarı = DNA damage ; Fosforik monoester hidrolazlar = Phosphoric monoester hydrolases ; Lösemi = Leukemia ; Prekürsör hücreli lenfoblastik lösemi-lenfoma = Precursor cell lymphoblastic leukemia-lymphoma ; RNA = RNA ; İlaç tedavisi = Drug therapy ; İlaç tedavisi-kombine = Drug therapy-combination

Özet:
PPM1/DWip1 (Protein phosphatase 1D magnesium dependent/wild type p53 induced phosphatase) genotoksik stres üzerine DNA hasarıyla p53'e bağlı olarak indüklenen bir serin/treonin fosfatazdır. Ancak Wip1 fosfataz stres ve doku tipine bağlı olarak E2F, CREB, c-Jun ve NF-κB gibi diğer transkripsiyon faktörleriyle de indüklenebilir. Wip1 fosfataz indüklendiğinde p53, Chk1, Chk2, H2AX, ATM/ATR dahil çok sayıda proteini defosforilasyon yoluyla inaktive ederek stres cevaplarını azaltmakta ve sonuç olarak hücre döngüsü kontrol noktaları, senesens ve apoptoziside engellemektedir. Wip1'in özellikle wt-p53' e sahip insan solid tümörlerinde aşırı ifade edildiği, amplifiye olduğu ve mutasyona uğradığı ve böylece bir onkogen gibi davrandığı bilinmektedir. Wip1'in deregülasyonu solid tümörlerde kötü prognozla da ilişkililendirilmiştir. Ancak hematolojk kanserlerde ve özellikle mt-p53'e sahip olan akut lösemilerde Wip1'in aşırı ifade edildiğinde rolünü ve sonuçlarını gösteren kapsamlı bir çalışma henüz bulunmamaktadır. Bu nedenle bu çalışma da Wip1'i aşırı ifade eden ve mt-p53' e sahip olan akut T lenfoblastik lösemi hücre dizisi (Jurkat)  kullanılarak Wip1'ın kemoterapi indüklü hücresel stres cevapları üzerine rolü araştırılmıştır. 
Öncelikle Jurkat hücrelerinde Wip1 fosfatazın aşırı ekspresse olduğu qRT-PCR ve Western blot analizleriyle konfirm edilmiştir. Wst-1 testi ile etoposid ve doxorubicinin metabolik aktivite üzerinde etkilerinin zamana ve doza bağlı olduğu tespit edilmiştir. Jurkat hücrelerinin etoposid ve doxorubicinle 24 saatlik muamelesi sonucunda apoptozise direnç gösterirken 72 saatlik muamele sonucunda apoptozis oranının arttığı Annexin V ve Caspase3/7 aktivasyon testleri ile belirlenmiştir. Benzer şekilde Jurkat hücrelerinin etoposid ve doxorubicinle 72 saatlik inkübasyon sonucunda senesens oranının da oldukça düşük olduğu tesbit edilmiştir. Sonrasında Jurkat hücrelerinde etoposid ve doxorubicine cevaben DNA hasarı cevabının önemli elemanlarının ATM, ATR, Chk1, Chk2 ve H2AX dahil fosforilasyon düzeyleri WB analiziyle test edildiğinde özellikle ATM ve ATR'nin fosforilasyon düzeylerinin çok düşük olduğu tesbit edilmiştir. Takiben Jurkat hücrelerinde RNA interferansı yöntemiyle Wip1 hedeflendiğinde ise etoposid ve doxorubicine cevaben  DDR elemanlarının hepsinin ATM, ATR, Chk1, Chk2 ve H2AX dahil fosforilasyon düzeylerinin arttığı görülmüştür. Wip1'in Jurkat hücrelerinde RNA interferansı ile hedeflenmesi sürpriz bir şekilde AnnexinV ve Caspase 3/7 testi ile gösterildiği gibi apoptozis oranını azaltırken SA-β-gal testiyle gösteridiği gibi senesens oranını artırmıştır. Ayrıca Jurkat hücrelerinde Wip1'in knock-down edilmesinin hücre döngüsü tutuklanması üzerinde etkili olmadığı görülmüştür.

Abstract:
Wild-type p53-induced phosphatase 1 (Wip1/PPM1D), is a serin/threonine phosphatase induced upon genotoxic stress by DNA damage in a p53-dependent manner. However depending on the type of stress or tissue Wip1 phosphatase can be also induced by other transcription factors such as E2F, CREB, c-Jun and NF-κB. Upon induction, Wip1 dampens the stress responses by inactivating multiple proteins via dephosphorylation  including p53, Chk1, CHK2, H2AX, ATM/ATR consequently abrogates cell cycle checkpoints and inhibits senescence and apoptosis. Wip1/PPM1D is known to be overexpressed, amplified and mutated in human solid tumors hence displaying typical oncogenic properties. Deregulation of Wip-1 is also associated with poor prognosis in various types of human solid tumors. However, in hematological cancers, especially in acute leukemia containing mt p53, so far no data has shown the role of overexpression of Wip1 phosphatase and it's consequences. Hence, in this study Wip1 overexpressing acute T lymphoblastic leukemia cell line (Jurkat) containing mt p53 was used to investigate the role of Wip1 phosphatase on chemotherapy induced cellular stress responses. 
Firstly, overexpression of Wip1 was confirmed with q-RT-PCR and Western blot analyses in Jurkat cells. Metabolik activity of Jurkat cells in response to etoposid and doxorubicin was determined by Wst-1 test in a time and dose dependent manner. When analysed for apoptosis in response to doxorubicin and etoposide treatment by Annexin V and Caspase3/7 tests for 24 h Jurkat cells showed resistance to apoptosis whereas they were responsive after 72 h treatment. Similarly when Jurkat cells were tested for induction of senescence in response to etoposide and doxorubicin treatment the amount of senescencent cells were also little. As next, when Jurkat cells were analysed for phosphorylation status of the key lements of DNA damage response (DDR) ATM, ATR, Chk1 and Chk2 as well as H2AX, in response to etoposide and doxorubicin treatment by WB analysis, the results showed that phosphorylation levels of the DDR elements especially ATM and ATR were significantly low. Accordingly targeting Wip1 levels by RNA interference were increased the phosphorylation status of all DDR elements including ATM, ATR, Chk1, Chk2 and H2AX levels in Jurkat cells. Surprisingly, targeting Wip1 by RNA interference decreased the levels of apopotosis in Jurkat cells whereas it was increased the senescence levels as determined by AnnexinV and Caspase 3/7 and SA-β-gal tests, respectively. In addition knock down of Wip1 was not effective on cell cycle arrest in Jurkat cells.