Bazı fermente ürünlerden izole edilen Pediococcus suşlarının ürettiği laktik asit ve diasetil miktarlarının belirlenmesi
Determination of lactic acid and diacetyl amounts produced by Pediococcus strains isolated from some fermented products
Yazar: ASENA ASLIHAN ÇELİK
Danışman: PROF. DR. KAMURAN AYHAN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Antimikrobiyal ajanlar = Antimicrobial agents ; Diasetil = Diacetyl ; Fermente gıdalar = Fermented foods ; Laktik asit = Lactic acid ; Pediococcus = Pediococcus ; RNA dizileme = RNA sequencing

Özet:
Bu tez çalışmasında geleneksel yöntemlerle üretilmiş çeşitli fermente ürünlerden Pedioccocus suşlarının izolasyonu, bu suşların hem biyokimyasal testlerle hem de 16S rRNA moleküler yöntemle tanımlanması yapılmış olup, ürettikleri diasetil ve laktik asit miktarları kromatografik yöntemlerle belirlenmiştir.  İzolatların antimikrobiyal özelliklerinin belirlenmesi için agar spot testi kullanılmıştır. Toplam 37 adet gıda örneğinden izole edilen 91 adet izolatın Gram pozitif olan 55 adedinden, Pediococcus mikromorfolojisine benzerlik gösteren 13 adedi 50℃'de gelişme, katalaz ve oksidaz testlerine tabi tutulmuştur. İzolatların oluşturduğu laktik asit düzeyini belirlemek için HPLC, diasetil miktarı için HS-GC/FID teknikleri kullanılmıştır. Son olarak elde edilen 13 izolat 16S rRNA yöntemiyle tanımlanmıştır. Biyokimyasal test sonuçlarına göre tüm izolatlar katalaz ve oksidaz negatif olarak bulunmuştur. Ayrıca 9 adet izolat (B1, B2, F2, 8, 14, 17, 34, 40, 50)  50℃'de gelişme gösterirken; G3, AF1, AF2, 16 numaralı izolatlarda bu sıcaklıkta gelişme görülmemiştir.  Antimikrobiyal aktivite testlerinde 6 adet patojene karşı yapılan agar spot denemelerinde en yüksek antimikrobiyal etkiyi AF2 nolu izolat L. monocytogenes ATCC 7644 (34.5 mm) patojenine karşı gösterirken en düşük antimikrobiyal etkiyi ise 16 nolu izolat E. coli ATCC 8339 (13.5 mm) patojenine karşı göstermiştir. Çalışmada 8 ve 14 numaralı izolatın dışındakilerin tamamı çalışılan tüm patojenlere karşı inhibitör etki göstermiştir. Kromotografik analiz sonuçlarına göre en yüksek miktarda laktik asit ve diasetil üreten izolatlar sırasıyla F2 (10.07 mg/mL) ve 8 (0.8 µg/mL) iken en düşük miktarda laktik asit ve diasetil üreten izolatlar sırasıyla 8 (0.42 mg/mL) ve F2 (0.05 µg/mL) olarak belirlenmiştir. Elde edilen bu veriler doğrultusunda laktik asit açısından en yüksek oranı ortaya koyan suşun en düşük miktarda diasetil ürettiği dikkat çekmiştir. Benzer şekilde en yüksek miktarda diasetil üreten suşun diğer izolatlarla kıyaslandığında düşük miktarda laktik asit ürettiği görülmüştür. En yüksek miktarda diasetil üreten 8 numaralı suşun ise en düşük antimikrobiyal etki gösteren suş olduğu görülmüştür. Elde edilen 3 adet P. acidilactici türü (B1, B2, 40) ve 1 adet P. pentosaceus türü (50) sırasıyla 2.41, 0.97, 3.34, 2.35 mg/mL laktik asit ve 0.3, 0.18, 0.07, 0.59 µg/mL diasetil üretmiştir. G3, AF1, AF2, 34 izolatları ve kontrol suş olarak kullanılan P. pentosaceus ATCC 43201 suşu ise diasetil üretmemiştir. Moleküler tanımlama sonuçlarına göre; 13 izolattan 3 adedinin Pediococcus acidilactici (B1, B2, 40), 1 adedinin Pediococcus pentosaceus (50), 1 adedinin Lactobacillus plantarum (8), 1 adedinin Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus (G3), 2 adedinin Leuconostoc mesenteroides (AF1, AF2), 1 adedinin Staphylococcus hominis (14), 1 adedinin Enterococcus italicus (16), 1 adedinin Enterococcus faecalis (17) ve 1 adedinin ise Enterococcus faecium (34) olduğu saptanmıştır. F2 numaralı izolat ise sekans sonuçlarına göre Lactobacillus pentosus (%95.83), Pediococcus parvulus (%91.69) veya Pediococcus acidilactici (%90.53) ile benzerlik göstermiştir. Sonuç olarak, çalışmada izole edilen 13 adet bakterinin gıda patojenleri üzerinde değişen oranlarda antimikrobiyal etkisinin olduğu ve antimikrobiyal etkinin başlıca kaynağının laktik asit üretimi olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, the isolation of Pedioccocus strains from various fermented products produced by traditional methods, the identification of these strains with both biochemical tests and 16S rRNA molecular method, and the diacetyl and lactic acid production of the strains were investigated by chromatographic methods. Agar spot test was used to determine the antimicrobial activity of the isolates. Out of 91 isolates obtained from 37 food samples, 55 isolate was detected as Gram positive and 13 of the Gram positive strains which were showed Pediococcus micromorphology, were subjected to catalase and oxidase tests and growing ability at 50°C test as well. HPLC was used to determine the level of lactic acid produced by the isolates, and HS-GC/FID technique was used for the quantitative analysis of diacetyl. Finally, 13 isolates were identified by 16S rRNA method. According to the biochemical test results, all isolates were found as catalase and oxidase negative. In addition, 9 isolates (B1, B2, F2, 8, 14, 17, 34, 40, 50) were able to grow at 50°C; however the isolates G3, AF1, AF2, 16 did not grow at this temperature. In agar spot tests that were performed against 6 pathogens as part of the antimicrobial activity tests, the highest antimicrobial effect against the pathogen L. monocytogenes ATCC 7644 (34.5 mm) was shown by isolate AF2, while the lowest antimicrobial effect was shown against the pathogen E. coli ATCC 8339 (13.5 mm) by isolate 16. In the study, all of the isolates except 8 and 14 showed inhibitory effects against all the pathogens studied. According to the chromatographic analysis results, the highest amount of lactic acid and diacetyl producing isolates were F2 (10.07 mg/mL) and 8 (0.8 µg/mL), respectively, while the lowest amount of lactic acid and diacetyl producing isolates were 8 (0.42 mg/mL) and F2 ( 0.05 µg/mL). In line with these data, it was noted that the strain that showed the highest rate in terms of lactic acid had also produced the lowest amount of diacetyl. Similarly, it was observed that the strain that produced the highest amount of diacetyl also produced lower amounts of lactic acid when compared to other isolates. It was observed that the strain number 8 producing the highest amount of diacetyl was the strain with the lowest antimicrobial effect. Three of the obtained P. acidilactici species (B1, B2, 40) and 1 of the obtained P. pentosaceus species (50) produced 2.41, 0.97, 3.34, 2.35 mg/mL lactic acid and 0.3, 0.18, 0.07, 0.59 µg/mL diacetyl, respectively. G3, AF1, AF2, 34 isolates and P. pentosaceus ATCC 43201 strain used as control did not produce diacetyl. According to the molecular identification results; among the 13 isolates, 3 isolates were Pediococcus acidilactici (B1, B2, 40), 1 was Pediococcus pentosaceus (50), 1 was Lactobacillus plantarum (8), 1 was Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus (G3), 2 were Leuconostoc mesenteroides (AF1, AF2), 1 was Staphylococcus hominis (14), 1 was Enterococcus italicus (16), 1 was Enterococcus faecalis (17) and 1 was Enterococcus faecium (34). F2 isolate showed similarity with Lactobacillus pentosus (95.83%), Pediococcus parvulus (91.69%) or Pediococcus acidilactici (90.53%) according to the sequencing results. As a result, it was determined that 13 bacteria isolated in the study have antimicrobial effects at varying rates on food pathogens and the main source of antimicrobial effect was originated from lactic acid production.