Poli(2-hidroksietil metakrilat) bazlı süpergözenekli doku iskeleleri ile kemik rejenerasyonu
Bone regeneration with poly(2-hydroxyethyl methacrylate) based superporous scaffolds
Yazar: DAMLA ÇETİN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, kemik doku rejenerasyonunu destekleyecek özelliklere sahip poli(2-hidroksietil metakrilat) (pHEMA)-bazlı süpergözenekli hidrojellerin üretiminin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak, üretilen doku iskelelerinin karakterizasyon çalışmaları yapılmış ve uygun özelliklere sahip doku iskeleleri seçilmiştir. Seçilen doku iskeleleri ile yürütülen hücre kültür çalışmaları önce durgun ortamda ve ardından karıştırmalı biyoreaktörde gerçekleştirilmiştir.Tez kapsamında yapılan çalışmaların ilk aşamasında, 2-hidroksietil metakrilatın (HEMA) gaz köpükleştirme ajanı olan sodyum bikarbonat varlığında serbest radikal polimerizasyonu ile pHEMA-bazlı süpergözenekli hidrojeller sentezlenmiştir. Bu hidrojeller: pHEMA, pHEMA-jelatin, gliserol fosfat (GP) çapraz bağlı pHEMA-jelatin, gluteraldehit (GA) çapraz bağlı pHEMA-jelatin süpergözenekli hidrojelleri (SPH) ve pHEMA-hidroksiapatit (HA) süpergözenekli hidrojel kompozitleridir (SPHC). Tüm bu yapılar, boyutları yaklaşık 500 µm olan ve birbirine içsel olarak bağlantılı gözeneklere sahiptirler.Jelatin ve HA'nın pHEMA yapısına katılması, şişme oranını düşürmesine rağmen hidrojellerin denge şişme değerine ulaşması için gerekli olan süreyi (~20s) çok fazla etkilememiştir. Hidrolitik biyobozunurluk deneyleri sonucunda, jelatinin yapıya katılmasının hidrojellerin biyobozunurluğunu arttırdığı belirlenmiştir. Jelatin ve çapraz bağlayıcılarının varlığında, hidrojellerin mekanik dayanımı pHEMA SPH'lerine göre önemli derecede artmıştır. Sentezlenen tüm hidrojeller arasında en yüksek mekanik dayanıma sahip olan yapı pHEMA-HA SPHC'leridir ve elastik modül değeri 0.027 ± 0.002 N/mm2 olarak belirlenmiştir.Çalışmanın bir sonraki aşamasında, pHEMA-bazlı doku iskelelerinin osteojenik aktiviteleri preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri kullanılarak, durgun koşullarda yürütülen hücre kültür çalışmaları ile incelenmiştir. Hücre canlılığı ve üremesi MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analizi ile takip edilmiş, hücre morfolojileri SEM (taramalı elektron mikroskobu) ile görüntülenmiştir. Hücre farklılaşması, Von Kossa boyaması ve alkalen fosfataz (ALP) aktivitesinin ölçümü ile belirlenmiştir. Sonuçlar, jelatin içeren doku iskelelerinin, hücrelerin üremesini ve farklılaşmasını arttırırken, pHEMA SPH'leri ve pHEMA-HA SPHC'lerinin hücre üremesini, dolayısıyla farklılaşmasını desteklemediğini göstermiştir.Tez çalışmasının son aşamasında, pHEMA-jelatin SPH'lerinin MC3T3-E1 hücreleri üzerindeki etkisi karıştırmalı biyoreaktör kullanılarak incelenmiştir. Hücre üremesi yine MTT analizi ile belirlenmiş, hücrelerin doku iskelesi içerisindeki morfolojileri ise SEM ve CLSM (konfokal lazer taramalı mikroskobu) ile incelenmiştir. Erken dönem farklılaşma, ALP aktivitesinin ölçümü ile belirlenmiştir. RT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) ile MC3T3-E1 hücrelerinin kollajen I ve osteopontin ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir. Sonuç olarak, dinamik koşulların hücre farklılaşmasını, durgun koşullara göre daha fazla arttırdığı anlaşılmıştır.Çalışmalardan elde edilen sonuçlar, pHEMA-jelatin ve GP çapraz bağlı pHEMA-jelatin SPH'lerinin kemik doku mühendisliği uygulamaları için uygun malzemeler olabileceğini, ayrıca karıştırmalı biyoreaktörün hücre farklılaşması üzerinde olumlu etkisi olduğunu ortaya koymuştur.

Abstract:
The aim of the present study was to fabricate poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)-based scaffolds for bone tissue regeneration. For this purpose, characterization studies were done and the scaffolds with suitable properties were selected. The cell culture studies were performed under static conditions and then in spinner flask.In the first part of the study, poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)-based superporous hydrogels were synthesized by radical polymerization of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) in the presence of gas blowing agent, sodium bicarbonate. These hydrogels are: pHEMA, pHEMA-gelatin, glycerol phosphate (GP) cross-linked pHEMA-gelatin, glutaraldehyde (GA) cross-linked pHEMA-gelatin superporous hydrogels (SPHs) and pHEMA-hydroxyapatite (HA) superporous hydrogel composites (SPHCs). All these structures have interconnected pores with pore sizes approximately 500 µm.Although the extent of swelling decreased when gelatin and HA were incorporated to the pHEMA structure, the time to reach the equilibrium swelling (~20s) was not affected so much. As a result of hydrolytic biodegradation experiments, it was determined that, the incorporation of gelatin to the structure increased the degradation of hydrogels. In the presence of gelatin and its cross-linkers, mechanical properties significantly improved when compared with pHEMA SPH. Among all the synthesized hydrogels, pHEMA-HA SPHC showed great improvement in mechanical strength and its elastic modulus value was 0.027 ± 0.002 N/mm2.In the next part of the study, osteogenic activities of pHEMA-based scaffolds were examined with cell-culture studies performed under static conditions by using preosteoblastic MC3T3-E1 cell line. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT (3-[4,5-dimethylthiazoyl-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide) assay and morphological examination was done with SEM (scanning electron microscope). Cell differentiation was quantified by Von Kossa staining and determination of alkaline phosphatase (ALP) activities. Results showed that, gelatin containing scaffolds improved cell proliferation and differentiation, however, pHEMA SPH and pHEMA-HA SPHC did not support cell proliferation and also differentiation.In the last part of the study, the effect of pHEMA-gelatin SPHs on MC3T3-E1 cells were investigated using spinner flask. Cell proliferation was again analysed by MTT assay and the morphologies of cells in the scaffold were examined by SEM and CLSM (confocal laser scanning microscope). Early cell differentiation was quantified by the determination of ALP activity. Collagen I and osteopontin expression levels were determined using RT-PCR (real time polymerase chain reaction). As a result, it was understood that, dynamic conditions improved cell differentiation more than static conditions.The results of these studies indicated that pHEMA-gelatin and GP cross-linked pHEMA-gelatin SPHs could be considered as potential scaffolds for bone tissue engineering applications, and also spinner flask bioreactor has a positive effect on cell differentiation.