Antik insan kemik ve diş örneklerinde dna izolasyon metotlarının verimlilik açısından karşılaştırılması
Comparison of dna isolation methods in terms of efficiency in ancient human bone and dental samples
Yazar: HAZAL TAHRAVİ
Danışman: PROF. DR. HATİCE MERGEN ; PROF. DR. YEŞİM DOĞAN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Antropoloji = Anthropology ; Biyoloji = Biology
Dizin: DNA = DNA ; DNA hasarı = DNA damage ; DNA-antik = DNA-ancient ; DNA-mitokondrial = DNA-mitochondrial ; Dizi analizi-DNA = Sequence analysis-DNA ; PCR =

Özet:
Antik DNA (aDNA); ileri derecede hasara uğramış, müze örneklerinden veya kazılardan elde edilen diş ve kemik gibi materyallerdeki DNA olarak tanımlanmaktadır. Antik DNA çalışmaları ile nesli tükenen canlıların genetik dizilerinin okunması, akrabalık ilişkilerinin aydınlatılması, insan popülasyonlarının evrimsel kökeninin ortaya konması ve eski zamana ait patojenlerin dizilerinin eldesi mümkün olmuştur. PZR teknolojisinin gelişmesiyle birlikte antik DNA çalışmaları ilerlemiş ancak bu teknolojinin hassaslığı ve kontaminasyona karşı açık olması alanda yaşanan sorunların da şekillenmesine yol açmıştır. Antik DNA'nın uğramış olduğu hasar, kemik ve diş gibi materyallerden DNA eldesini zorlaştırmakta ve elde edilebilir DNA'nın uzunluğunu büyük ölçüde kısıtlamaktadır. Antik DNA'ya dair yapılan çalışmalar çok çeşitli olmakla birlikte ilk çıkışından bu yana DNA'nın izolasyonu ve PZR başarısının iyileştirilmesi alan içerisinde önemli bir konu olmuştur. Antik DNA örneklerinin dizilerinin okunması ve diğer moleküler tayinler için örnekten başarılı bir şekilde DNA izolasyonunun gerçekleştirilmesi gerekmektedir. Bunun için antik DNA'da sıklıkla kullanılan iki yöntem fenol-kloroform ve silika membran izolasyon yöntemleridir. 

Yapılan tez çalışmasıyla silika membran ve fenol-kloroform izolasyon metotlarının verimlilik ve amplifiye edilebilir DNA uzunlukları açısından karşılaştırılması hedeflenmiştir. Mitokondriyal DNA'nın amplifikasyonu için 162 bç, 177 bç ve 218 bç boyutlarında ürün veren 3 farklı primer çifti kullanılmıştır. Bu bağlamda yapılan çalışmalarda 5 adet femur, 5 adet talus ve 5 adet diş örneği kullanılarak silika membran ve fenol-kloroform izolasyonları gerçekleştirilmiş olup bu metotların farklı örnek türlerindeki başarısı da karşılaştırılmıştır. Örnekler Karia Bölgesinde bulunan Stratonikeia Antik Kenti kazılarından elde edilmiştir. 

Yapılan deneyler sonucunda femur ve talus örneklerinin fenol-kloroform izolasyonlarında yalnızca en kısa amplikonda (162 bç) başarılı sonuç alınmıştır. Aynı örneklerin silika membran izolasyonları ise her üç amplikonda da başarılı sonuç vermiştir. Böylelikle femur ve talus örnekleri için silika membran izolasyon yönteminin hem verim hem de amplifiye edilebilir uzunluk açısından fenol-kloroform izolasyonundan daha başarılı olduğu gösterilmiştir. Diş örneklerinde ise fenol-kloroform yönteminde en kısa amplikon boyutunda yoğun bantlar elde edilmiş, silika membran yönteminde ise az yoğun ancak daha uzun amplikon (177bç) boyutlarında sonuç alınmıştır. Aynı zamanda silika membran izolasyonunda fenol-kloroform metodunun aksine dekalsifikasyona gerek olmadığı ve PZR'nin 2. kuşakta sonuç verdiği görülmüştür. Kullanılan yöntem örnek özelinde değişiklik gösterebilmekle birlikte silika membran izolasyonu fenol-kloroform izolasyonuna kıyasla daha başarılı bulunmuştur.

Abstract:
Ancient DNA refers to DNA in severely damaged materials such as teeth and bones that come from museum specimens or excavations. The study of ancient DNA has made it possible to read the genetic sequences of extinct organisms, clarify kinship relationships, reveal the evolutionary origins of human populations, and preserve the sequences of ancient pathogens. With the development of PCR technology, the study of ancient DNA has evolved, but the sensitivity and susceptibility of this technology to contamination has also led to problems in this area. Damage to ancient DNA makes it difficult to extract DNA from materials such as bones and teeth and severely limits the length of DNA that can be recovered. Although studies of ancient DNA are diverse, isolation of DNA and improvement of PCR success have been important topics in the field since their first appearance. Successful isolation of DNA from the sample is a prerequisite for reading the sequences of ancient samples and for other molecular determinations. For this purpose, two methods are usually used to isolate ancient DNA: phenol-chloroform and silica membrane isolation.

The aim of this work is to compare the silica membrane and phenol-chloroform isolation methods in terms of efficiency and amplifiable DNA lengths. For the amplification of mitochondrial DNA, 3 different primer pairs were used, yielding products in sizes of 162 bp, 177 bp and 218 bp. In this context, silica membrane and phenol-chloroform isolations were performed on 5 femur, 5 talus, and 5 tooth samples in the studies, and the success of these methods on different sample types was compared. The samples were obtained from the excavations of Stratonikeia Ancient City located in the Caria Region.

The experiments showed that only the shortest amplicon (162 bp) was successful in phenol-chloroform isolation of femur and talus specimens. Isolation of the same specimens with silica membranes yielded successful results for all three amplicons. Thus, the isolation method with silica membranes was shown to be more successful than the isolation method with phenol-chloroform samples for femur and talus samples, both in terms of efficiency and amplifiable length. For dental samples, the phenol-chloroform method yielded dense bands with the shortest amplicon length, whereas the silica membrane method yielded less dense but longer amplicon lengths. Although the method used may vary depending on the type of sample, silica membrane isolation was found to be more successful compared to phenol-chloroform isolation.