Leishmania parazitlerinden lipofosfoglikan (lpg) saflaştırılması ve aşı modeli olarak lpg-polimer konjugatının antileishmanial etkinliğinin ın vıtro ve ın vıvo incelenmesi
Purification of lypophosphoglican (lpg) from leishmania parasites and investigation of antileishmanial efficiency of lpg-polymer conjugate as vaccine model in vitro and in vivo
Yazar: RABİA ÇAKIR KOÇ
Danışman: PROF. DR. ADİL M. ALLAHVERDİYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Aşılama = Vaccination ; Konjugat = Conjugate ; Leishmania = Leishmania ; Polimerler = Polymers

Özet:
Leishmaniasis, enfekte Flebotomus cinsi sineklerin kan emme sırasında Leishmania protozoan parazitlerini memeli konaklara bulaştırması ile ortaya çıkan bir hastalık grubudur. Leishmaniasis, Dünya Sağlık Örgütü'nün (DSO) belirlediği en önemli tropikal hastalıklar listesindeki 6 hastalıktan biridir. Dünyada 350 milyon kişi leishmaniasise yakalanma riski altındadır. Bu hastalık 98 ülkede endemik olup, enfekte kişilerin sayısı ise 12 milyondur. Leishmaniasis aynı zamanda Türkiye'nin de ciddi halk sağlığı problemlerinden biri olup 20 milyondan fazla kişi bu hastalığın tehdidi altındadır. Ülkemizde hastalığın visseral ve özellikle de kutanöz formları görülmektedir. Sağlık Bakanlığı'nın son yıllardaki bilgilerine göre, Türkiye genelinde her yıl yalnızca KL için yaklaşık 5.000 yeni olgu bildirilmektedir. Leishmaniasisin endemik olduğu komşu ülkelerden son yıllarda ortaya çıkan savaş nedeniyle insanların göç etmesi hastalığın giderek artmasına sebep olabilir. Hastalığın dünyada ve ülkemizde bu kadar yaygın olmasının en önemli sebepleri; hastalık etkenlerinde kullanılan ilaçlara, vektörlerinde ise insektisitlere karşı dirençliliğin gelişmesi, birçok memeli hayvanın hastalık etkenlerinin rezervuarı olması, tanıda yaşanan problemler, küresel iklim değişiklikleri gibi nedenlerdir. Tüm bunların yanı sıra günümüzde leishmaniasise karşı etkin bir aşı bulunmamakta ve hastalığı engelleyici etkin bir aşının geliştirilmesinin zorunlu hale geldiği son yıllarda DSÖ tarafından da özellikle vurgulanmaktadır.1940'lı yıllardan günümüze kadar hastalığa karşı etkin bir aşı geliştirilmesi için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlara uygun olarak aşı çalışmaları birinci, ikinci ve üçüncü nesil aşılar olarak gruplandırılmaktadır. Birinci nesil aşıların temelini öldürülmüş ya da canlılığı azaltılmış parazitler; ikinci nesil aşıların temelini tıp ve teknolojinin gelişmesiyle saflaştırılmış antijen aşıları, rekombinant protein aşıları; üçüncü nesil aşıların temelini ise DNA aşıları ve dendritik hücre aşıları oluşturmaktadır. Bütün bu yaklaşımlara rağmen etkin bir aşı geliştirilmesi halen mümkün olmamıştır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda özellikle saflaştırılmış doğal antijenlere dayalı aşılara önem verilmektedir. Bu gruptan özellikle Leishmania' nın yüzeyindeki baskın bir molekül olup, parazitin makrofajlarda hayatta kalmasını sağlayan ayrıca Flebotomus'lardaki yaşam döngüsü için de oldukça önemli olan LPG molekülünün aşı adayı olarak ümit verici olduğu belirtilmiştir.LPG ile yapılan önceki çalışmalarda L. mexicana ve L. major'dan elde edilen LPG'nin tek başına veya farklı adjuvanlar ile farelerde kısmi koruma sağladığı gösterilmiştir. Böylece yapılan bu çalışmalar, leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde LPG'nin önemli bir immünojen molekül olduğunu gösterse de; tek başına veya kullanılmış mevcut adjuvanlarla korumanın yetersiz olduğu ortaya çıkmıştır. Yapılan son yayınlarda Leishmania parazitlerinin glikokonjugatlarının aşı olarak kullanılabileceği ancak daha etkin bir taşıyıcı ve adjuvana gereksinim olduğu ortaya konulmuştur.Son yıllarda polielektrolit polimerlerin; protein, doğal mikrobiyal polisakkaritler ve onların sentetik analogları gibi antijenik yapılar ile karıştırılması sonucunda immün uyarıcı olarak görev yaptığı ve bağışıklık yanıtını birkaç kat güçlendirdiği bilinmektedir. Ayrıca Leishmania parazitlerinin LPG'sinin NH2 grupları ile poliakrilik asitin COOH grupları arasında konjugat oluşturmanın teorik olarak mümkün olması bu moleküllerden elde edilen konjugatın aşı olarak kullanılabileceğini göstermektedir.Buna göre de; bu çalışmada ilk kez olarak Leishmania parazitlerinden LPG'nin izolasyonu, saflaştırılması ve aşı modeli olarak LPG-PAA konjugatının antileishmanial etkinliğinin in vitro ve in vivo incelenmesi amaçlanmıştır.Hedefe ulaşmak için Leishmania parazitlerinin kültürü elde edilip büyük ölçekli kültür metotları geliştirildi. Daha sonra çoğaltılan kültürden biyomas elde edilip LPG izolasyonunda kullanıldı. Saflaştırılan LPG polimer ile konjugasyonu ve karakterizasyonları gerçekleştirip çeşitli hücre kültürlerinde MTT yöntemi ve flow sitometrik olarak toksisiteleri incelendi. Toksik olmadığı belirlenen farklı aşı formülasyonlarının BALB/c farelere enjeksiyonu yapıldı ve immün yanıtlar, ELISA, IFAT, sitokin ölçülmesi, Mikrokültür yöntemi, peritonel makrofajların in vitro enfektifliğinin ölçülmesi, dalak ve karaciğer ağırlıklarının ölçülmesi, Leishman-Donovan Units (LDU) ile parazit yükünün belirlenmesi yöntemleri ile incelendi.Elde edilen sonuçlar incelenen tüm parametrelere göre en yüksek aşı aracılı immün koruma yanıtının LPG-PAA konjugatı ile sağlandığını göstermiştir. Özellikle Leishman-Donovan ünite göre parazit yükündeki en yüksek düşüş %81,17 ile 35 ?g LPG içeren LPG-PAA konjugat içeren grupta olmuştur. Sadece LPG ile immünize edilen kontrol grubunda ise bu değer %44,93'tür. Diğer gruplarda 10 ?g LPG içeren LPG-PAA konjugatında %53,37, 35 ?g LPG içeren LPG + PAA fiziksel karışımında % 55,2, sadece LPG ile immünize edilen grupta %44,93, LPG + Freund's adjuvanı içeren grupta ise %65,8 olarak saptanmıştır. Böylece bu çalışmada Leishmania parazitlerinden LPG'nin izolasyonu, saflaştırılması ve aşı modeli olarak LPG-PAA konjugatının antileishmanial etkinliğinin in vitro ve in vivo incelenmesi sonucunda, hem fiziksel karışımın hem de konjugatın aşı olarak etkinliğinin yüksek olduğu ortaya çıkmıştır. Elde edilen bu sonuçların leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde bundan sonraki çalışmalara ışık tutacak yeni bir yaklaşımın öncüsü olacağını düşünmekteyiz.

Abstract:
Leishmaniasis is a group disease transmitted by the bite of the infected Phlebotomus while obtaining blood from mammalian host. According to the World Health Organization, leishmaniasis is one of the six major tropical diseases. 350 million people in the world are under the risk of the disease. It is endemic in 98 country and 21 million people is infected. Leishmaniasis is also important public health problem in Turkey and 20 million people is under the risk of disease. In our country, visceral and especially cutaneous form is endemic. According to Ministry of Health statistics, 5000 new cases are occurring every year. It is expected that this number will be on increase due to migration from endemic neighboring countries. The important reasons for spread of the disease are resistance to the drugs, global climate changes, difficulty of diagnosis. Also there is still no effective vaccine against to leishmaniasis.Different studies for vaccine development have been conducted since 1940 as first, second and third generation vaccine studies. These studies are based on killed parasites, live-attenuated parasites, purified and recombinant antigen based vaccines, DNA vaccines and dendritic cell based vaccines. Although there have been studies on vaccine development for long years, there is still no effective vaccine against to leishmaniasis. Recent studies give much more importance to LPG, one of the most important surface antigens. LPG, with glycolipid structure, is dominant molecule in the surface of parasites. LPG is responsible for pathogenesis and survival of parasites in mammalian host and vector.LPG is being investigated as a vaccine candidate thanks to its important properties. In a study, purified LPG from L. major and L. mexicana alone or with adjuvant injected to the mice and this application provided a partial protection against the disease. These studies showed that LPG is important immunogenic molecule, however, LPG, alone or with the present adjuvant does not have enough efficiency. Recently, it was revealed that synthetic polyelectrolytes, when introduced in mixtures with typical antigens (proteins, natural microbial polysaccharides, and their synthetic analogs), serve as immunostimulants by enhancing immune response as several times. Also it is theoretically possible to conjugate LPG to PAA by using NH2 groups of LPG and COOH groups of PAA.Therefore, for the first time in this study, the aim is to prepare the conjugate of LPG with poliacrylic acid (PAA) which has adjuvant property, and to investigate the efficiency of the conjugate as a vaccine on mice models against to leishmaniasis.To reach the goal of this study, firstly large-scale culture methods were developed. Then obtained cultures are used in isolation of LPG. Purified LPG was conjugated to polymer and MTT assay and flow cytometry were performed in order to determine the toxicity of the conjugates on various cell cultures. Different vaccine formulations were determined as non-toxic and injected to the BALB/c mice and immune responses were studied with ELISA, IFAT, cytokine measurement, microcultures method, in vitro infectivity of peritoneal macrophages, measurement of the spleen and liver weights, Leishman-Donovan Units (LDU) for determininig the parasite burden.Efficiency of the conjugate has been researched by ELISA, IFAT, micro culture method, additionally in vitro infectivity of peritonal macrophages, spleen and liver mass and parasite burden calculation by Leishman-Donovan Units (LDU) had been investigated by several methods. According to the obtained results, LPG-PAA conjugate possessed the most effective vaccine-Induced protective immune response comparing to the control group bound to all of studied parameters. Especially according to LDU, 35 ?g LPG including LPG-PAA conjugate has a decrease of 81,17% for parasite burden but 53,37% decrease for 10 ?g LPG including group. Especially, the highest decrease of parasite burden exists for 35 ?g LPG including LPG-PAA conjugate with a rate of 81,17%. This rate is 44,93% for immunized of LPG control group. Other groups, 10 ?g LPG including LPG-PAA conjugate has a decrease of 53,37%, 35 ?g LPG including LPG-PAA physical mixture has a decrease of 55,2% , the immunization by just LPG group has a decrease of 44,93% and LPG-Freund?s adjuvant group has a decrease of %65,8. Thereby, for the first time in the world and in our country, a new vaccine oriented to LPG-polymer has been developed against leishmaniasis.