Hepatoselüler karsinoma hücrelerinin epitelyal-mezenkimal dönüşüm sürecinde mikro-RNA'ların rolünün belirlenmesi
The role of micro-RNAs in epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells
Yazar: PEYDA KORHAN
Danışman: PROF. DR. SAFİYE NEŞE ATABEY
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Tıp Bilimleri Bölümü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Epitel = Epithelium ; Karsinoma = Carcinoma ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Mikro RNA = Micro RNA ; Mortalite = Mortality ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Hepatoselüler karsinoma (HCC) metastatik ve rekürren doğası nedeniyle dünyada en sık rastlanan, agresif ve kötü prognozlu kanser türlerindendir. Epitelyal-Mezenkimal Dönüşüm (EMT)  diğer epitel kökenli kanserlerde olduğu gibi HCC'de de tümör invazyonu ve metastazı için en önemli aşamalardan biridir. Bu süreçte mikro-RNA'ların (miRNAs) rol oynadığı bildirilmiştir. HCC'de mortalitinin bu kadar yüksek olmasının nedenlerinden en önemlileri invazyon ve metastaz olduğundan, projemiz kapsamında EMT'nin rol oynadığı hücre migrasyon ve invazyonunda miRNA'ların rolünü incelemeyi amaçladık. 
EMT sürecinde değişen miRNA'ları belirlemek için EMT fenotipinin uyarıldığı HCC hücreleri ile atasal HCC hücreleri ile miRNA mikrodizin çalışması gerçekleştirdik. Biyoinformatik analizlerle  ekspresyonu değişen miRNA'ları ve onların hedeflerini belirledik. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) ile seçilen miRNA'lardaki değişimi doğruladık. Bu miRNA'larden biri olan miR-181a-5'nin  overekspresyonu ve baskılanmasının adezyon, proliferasyon, motilite, invazyon, ve tübülogenez rolünü inceledik. İlişkili hedef moleküllerinin ekspresyon düzeylerini Western Blotlama (WB) yöntemiyle araştırdık. "Luciferase Reporter Assay" yöntemi ile  miRNA'nın bağlandığı hedef molekülü belirledik. Normal karaciğer, siroz, HCC ardışık doku kesitlerinde miR-181a-5p ekspresyonunu in situ hibridizasyon (ISH), hedef molekül ekspresyonunu da İmmünfloresan (IF) yöntemiyle inceledik.  
miR-181a-5p baskılanmasının motilite, invazyon ve tübülogenezi uyardığını, overekspresyonunun ise motilite, invazyon ve tübül oluşumunu azaltığını belirledik. Buna karşın, miR-181a-5p ekspresyonunun hücre adezyon ve proliferasyonu üzerinde belirgin bir etkisinin olmadığını gözlemledik. miR-181a-5'nin motilite, invazyon ve tübülogenezi  c-Met sinyal yolağı aracılıklı düzenlediğini ve bunu c-Met reseptörünü direk olarak hedef alarak gerçekleştiridiğini gösterdik. Doku mikrodizin analizlerinde miR-181a-5p ekspresyonunun hepatokarsinogenez sürecinde azalırken, c-Met ekspresyonunun arttığını ortaya koyduk.  
Bu çalışma ile literatürde ilk kez hepatokarsinogenezde miR-181a-5p ekspreyonunun azaldığı, buna karşın c-Met ekspresyonunun arttığı gösterilip, miR-181a-5p'nin c-Met sinyal yolağını hedefleyerek, HCC hücre migrasyon, invazyon ve tübulo-morfogenezinin düzenlenmesinde rol oynadığı ortaya konmuştur. Elde ettiğimiz bulgular, c-Met ve miR-181a-5p'nin birlikte hedef alınarak HCC'de yeni birleştirilmiş-hedefli tedavi yaklaşımları için iyi hedefler olabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
HCC is one of the most common and aggressive cancers worldwide. EMT, known as a phenotypical conversion of cells,  is a key event in tumor invasion of carcinomas including HCC. There are lots of molecular mechanisms responsible for EMT and still underlying mechanism is unknown.  Emerging evidence indicates that MicroRNAs are often deregulated during  EMT. Since main mortality reason of HCC is due to recurrence of disease and metastasis, we aimed to analyze role of miRNAs in HCC migration and invasion in this project.   
We performed miRNA microarray assay with EMT-induced clones and wild type cells to determined miRNA affected by EMT.  We performed some bioinformatics works to cluster miRNAs and to find out predicted target of these miRNAs. Microarray results were validated by RT-PCR. We analyzed expression of target molecules by WB after transfecting cells either with miRNA mimic or miRNA inhibitor. miRNA-181a-5p target molecule was determined by Luciferase Assay. Biological behaviors including, adhesion, proliferation, motility, invasion, and tubulomorphogenesis were evaluated after miRNA mimic or inhibitor transfections. Analysis of miR-181a-5p expression by ISH and c-Met expression by IF, respectively were carried out in liver tissue microarrays sectioned sequentially, including normal, cirrhotic and HCC tissues. 
We determined that while overexpression of miR-181a-5p reduced migration invasion, and branching tubulogenesis, its inhibition increased cellular motility, invasion and branching tubulogenesis. However, we observed that miR-181a-5p expression had no significant effect on cell adhesion and proliferation. We showed that miR-181a-5p regulated cellular motility, invasion and tubulogenesis through a direct inhibition of c-Met expression and indirectly regulated c-Met signaling pathyway. ISH of miR-181a-5p and c-Met staining  in normal liver, cirrhosis and HCC tissues revealed that miR-181a-5p expression showed a significant decreased during transformation of normal liver to HCC, whereas c-Met expression increased in hepatocarcinogenesis.
This project demonstrated for the first time that miR-181a-5p decreseased during hepatocarcinogenesis and miR-181a-5p plays a central role in cellular motility invasion, and tubulogenesis through directly targeting c-Met and regulating c-Met signaling pathyway. Taken together, our results define a regulatory link between miR-181a-5p and c-Met signaling pathway in hepatocarcinogenesis, which imply that combined modality targeting both  miR-181a-5p and c-Met  may become a therapy alternative in HCC.