Entamoeba histolytica tanısında real-time PCR yönteminin kullanılması
Identification of Entamoeba histolytica by real-time PCR method
Yazar: HANİFİ AKTAŞ
Danışman: PROF. DR. İSMAİL SONER KOLTAŞ
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Entamoeba histolytica = Entamoeba histolytica ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Protozoon parazit Entamoeba histolytica dünyanın geniş bir kısmında endemiktir ve her yıl milyonlarca dizanteri ve karaciğer absesinin sorumlusu olarak kabul edilir. İnvaziv hastalık öncesinde Entamoeba histolytica belirtisiz enfeksiyon gibi aylarca hatta yıllarca insan bağırsağında bulunabilir. Dünya Sağlık Örgütü Entamoeba histolytica için mutlaka spesifik tanısının konulmasını ve eğer bulunursa mutlaka tedavi edilmesi gerektiğini önermektedir. Klasik mikroskobik incelemeyle patojen Entamoeba histolytica ile patojen olmayan Entamoeba dispar ve Entamoeba moshkovskii'nin ayrımı mümkün olmamaktadır.Son yıllarda Entamoeba histolytica'nın Entamoeba dispar'dan ayrımı için protein ve DNA tanı sistemleri gibi bir dizi tanı yöntemleri geliştirilmiştir. PCR ile amip DNA parçalarının amplifikasyonu insan dışkısında Entamoeba histolytica veya Entamoeba dispar'ın ayrımında duyarlı ve özgül bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Son zamanlarda geliştirilen kapalı tüp ile RT-PCR metodu ile bazı sorunları aşmak mümkündür. Bu yöntem PCR esnasında bir ya da iki floresan işaretli probların bağlandığı amplikon spesifik algılamaya izin verir. Bu nedenle sonuçları almak için analizin sonuçlanması beklenmemektedir. Buna ek olarak kapalı reaksiyon tüpü çapraz kontaminasyon riskini en aza indirir ve kalitatif rakamsal sonuç ile uygun bir tanı istatistiği uygulanabilir.Bu çalışmada, Entamoeba histolytica ve Entamoeba dispar'ın ayrımı için dışkı örnekleri mikroskobi, antijen tanı testi, konvansiyonel PCR ve RT-PCR yöntemleri karşılaştırıldı. 74 dışkı örneğinin 13 tanesi E. histolytica spesifik antijen tanı testi ile pozitif bulunurken 61 tanesi negatif bulundu. Dışkıdan QIAGEN metoduyla DNA elde edildi ve PCR ile RT-PCR'da rRNA'nın küçük alt birimi amplifiye edildi. Toplam 74 dışkı örneğinin 19 tanesi RT-PCR ile E. histolytica pozitif bulunurken 16 örnek konvansiyonel PCR ile pozitif bulundu. RT-PCR ile karşılaştırıldığında antijen tanı testi %79 duyarlı ve %96 özgül bulundu. Konvansiyonel PCR ile RT-PCR karşılaştırıldığında konvansiyonel PCR'ın duyarlılığı %84,2 ve özgüllüğü %100 bulundu. Sonuç olarak, RT-PCR diğer yöntemlerden daha duyarlı ve özgül bulundu.Anahtar Kelimeler: Entamoeba histolytica, koproantijen ELISA, PCR, Real-Time PCR

Abstract:
The intestinal protozoan parasite Entamoeba histolytica is endemic in large parts of the world and is considered responsible for millions of cases of dysentery and liver abscess each year. Prior to invasive disease, E. histolytica may reside in the human gut for months or even years as symptomatic infection. The World Health Organization has recommended that Entamoeba histolytica `should be specifically identified and if present should be treated??. Classic microscopic examination of the parasite E. histolytica in stool can not differentiate it from the nonpathogenic but identically appearing parasites Entamoeba dispar and Entamoeba moshkovskii.A number of assays have been developed during recent years, such as protein and DNA detection systems, which are able to distinguish E. histolytica from E. dispar. Amplification of ameba DNA fragments by PCR has been proven to constitute a sensitivite and specific method to detect E. histolytica or E. dispar from feces. Recently developed closed-tube, real-time PCR methods can circumvent these problems. These methods allow specific detection of the amplicon by binding to one or two fluorescence-labeled the time needed to obtain results. In addition, the closed reaction tube minimizes the potential for cross-contamination, and the assay output is numerical rather than qualitative, allowing appropriate diagnostic statistics to be applied.In this study, stool samples were tested by microscopy, antigen detection assay, traditional PCR and RT-PCR methods for identification of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar. A total of 74 stool 13 (17,6%) of which were positive by the E. Histolytica-specific antigen detection test, while the other 61 (82,4%) stool were negative by the antigen detection test. DNA was extracted from the stool by the QIAGEN method and the small-subunit rRNA gene of E. histolytica and then amplified by traditional and real-time PCR. A total of 74 stool, 19 were positive by real-time PCR assay and 16 were positive by the traditional PCR test. Compared to the real time PCR assay, the antigen detection test was found 79% sensitive and 96% specific. When the traditional PCR test results were compared to the real-time PCR assay, the sensitivity of traditional PCR was 84,2% and the specificity was 100%. In conclusion, real-time PCR being the more sensitive and specific the other methods.KEW WORDS: Entamoeba histolytica, Coproantigen ELISA, PCR, Real-Time PCR