Holothuria tubulosa'dan elde edilen özütlerin sitotoksik ve apoptotik etkilerinin araştırılması
Investigation of the cytotoxic and apoptotic effects of the essentials obtained from Holothuria tubulosa
Yazar: MELEK GÜNEŞ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MEHLİKA ALPER
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Çağımızın yaygın hastalıklardan biri olan kanserin tedavisinde kullanılan kemoterapi ve radyoterapinin cşddş yan etkileri gözlendiğinden son yıllarda klinik uygulamada kullanılmak üzere seçici özelliklere sahip yeni antikanser ajanların geliştrilmesi ile ilgili araştırmalar hız kazanmıştır. Günümüzde doğal ürünlerden elde edilen etken maddeler kanser tedavisinde kullanılacak ilaç keşfine büyük katkıda bulunmaktadır. Bu tez çalışmasında ülkemizin deniz canlılarında Holothuria tubulosa' dan elde edilen su ve metanol öztülerinin farklı insan kanser hücre hattı üzerindeki sitotoksik ve apoptotik etkileri ilk kez araştırılmıştır. Ayrıca özütlerin fenolik bileşik içerikleri belirlenmiştir. Holothuria tubulosa türü deniz hıyarı Muğla/Gökova Körfezi' nden toplanmıştır. H. tubulosa' dan elde edilen su (HTS) ve metanol (HTM) özütlerinin 1000-7,8 µg/ml konsantrasyonlarının hücreler üzerindeki zamana bağlı sitotoksik etkileri MTT deneyi ile belirlenmiştir. Bu çalışmada A549 (akciğer), HeLa (serviks), PC-3 (prostat) ve MCF-7 (meme) insan kanser hücre hatları ile HEK293 (embriyonik böbrek hücre) ve BEAS2B (bronşiyal epitel hücre) insan sağlıklı hücre hatları kullanılmıştır. Özütlerin ilgili hücreler için yaklaşık IC50 değerleri hesaplanmıştır. Flow sitometri analizi ile özütlerin apoptotik etkileri araştırılmıştır. Ayrıca DNA degredasyonu ve kaspaz-3 aktivitesi deneyleri yapılmıştır. Özütlerin fenolik bileşikleri HPLC analizi ile tespit edilmiştir. Her iki özütün A549 ve HeLa kanser hücre hatlarında diğer kanser hücre hatlarına göre nispeten daha etkili olduğu belirlenmiştir. HTs ve HTM özütlerinin A549 hücreleri için yaklaşık IC50 değeri 72 saat için sırasıyla 53,95 µg/ml ve 63,12 µg/ml olarak hesaplanmıştır. En düşük IC50 değeri (21,01 µg/ml) ise HeLa hücrelerinde 72 saat HTS özütü için hesaplanmıştır.HTM özütünün HeLa hücreleri için yaklaşık IC50 değeri 72 saatte 82,32 µg/ml olarak belirlenmiştir. Flow sitometri analizleri özütlerin A549 ve HeLa hücrelerinde apoptozu indükleyebildiği göstermiştir. Özütlerin A549 ve HeLa hücrelerinde DNA fragmantasyonuna neden olabildiği görülmüştür. Özellikle 500 µg/ml konsantrasyonda her iki özütün kaspaz-3 aktivitesini A549 ve HeLa hücrelerinde önemli oranda arttırabilidği belirlenmiştir. HPLC analizine göre HTS özütünde en fazla miktarda bulunan epikateşının (790,091 µg/g özüt) HTM özütünde de çok az miktarda olduğu saptanmıştır. HTM özütünde ise en fazla miktarda 2,5 hidroksi benzoik asit (153,890 µg/g özüt) olduğu belirlenmiştir. Bu tez çalışmasında elde edilen verilere göre H. tubulosa doğal antikanser ajanların geliştirilmesi için güçlü bir potansiyel kaynak olarak ele alınabilir.

Anahtar Kelimeler: Kanser, Holothuria tubulosa, Hücre Ölüm Deneyleri, HPLC Analizi

Abstract:
Because of the serious side effects of chemotherapy and radiotherapy used in the treatment of cancer, which is one of the common diseases of our time, the researches about the developement of new anticancer agents with selective properties to be used in clinical application have gained speed in recent years. Today, the active substances obtained from natural products contribute greatl to the discovery of drugs to be used in cancer treatment. In this thesis, teh cytotoxic and apoptotic effects of aqueous and methanol extracts obtained from Holothuria tubulosa which is a sea organism on different human cancer cell lines were investigated for the first time. In addition, the phenolic compounds in the extracts were determined. The approximate IC50 values (50% inhibitory concentration) of the extracts for the respective cells were calculated. Holothuria tubulosa was collected from Mugla/Gokova Gulf. The cytotoxic effects of the aqueonus (HTS) and methanol (HTM) extracts obtained from H. tubulosa at 1000-7,8 µg/ml concentrations on the cells were determined by MTT assay. In this study, A549 (lung), HeLa (cervix), PC-3 (prostate) and MCF-7 (breast) human cancer cell lines and HEK293 (normal human embriyonic kidney) and BEAS2B (normal bronchial epithelium) human healthy cell lines were used. Apoptotic effects of the extracts were investigated by flow cytometry analysis. DNA degradation and caspase-3 activity experiments were also performed. Phenolic compounds of the extracts were determined by HPLC analysis. Both extracts were found to be more effective in A549 and HeLa cancer cell lines than other cancer cell lines. The approximate IC50 values of HTS and HTM extracts for cell at 72 h were calculated is as 53,95 µg/ml and 63,12 µg/ml respectively. The lowest IC50 value (21,01 µg/ml) was calculated from HTS extracts in HeLa cells at 72 h. The approximate IC50 values of the HTM extracts for HeLa cells was determined to be 82,32 µg/ml at 72 h. Flow cytometry analyses were shown that the extracts can incude apoptosis in A549 and HeLa cells. It was seen that both extracts could cause DNA fragmentation. IT was determined that both extracts could significantl increase caspase-3 activity in A549 and HeLa cells, especially at 500µg/ml concentration. According to the HPLC analysis, epicatechin which was the most abundant component in HTS extract (790,091 µg/g extract) was found to be very less in HTM extract. It was also determined that the most abundant component in HTM extract was 2,5 dihydroxybenzoic acid (153,890 µg/g extract). According to the results obtained in this thesis study, H. tubulosa can be considered as a strong potential source for the development of natural anticancer agents.

Keywords: Cancer, Holothuria tubulosa, Cell Death, HPLC Assay