Anadolu dağ kurbağalarının kriyobiyolojisi üzerine araştırmalar
Investigations on cryobiology of Anatolian mountain frogs
Yazar: TANER YOLDAŞ
Danışman: PROF. DR. UĞUR CENGİZ ERİŞMİŞ
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Fizyoloji = Physiology ; Zooloji = Zoology

Özet:
Bu araştırmada, Anadolu dağ kurbağalarından R. macrocnemis ve R. holtzi'nin donma sıcaklıklarına maruz kaldıkları kış dönemini hayatta kalarak atlatmalarını sağlayan stratejiler araştırıldı. Bu kapsamda kurbağaların donma, anoksi ve dehidrasyon koşullarına maruz kaldıklarında; önemli bir kriyoprotektan olan glikozun kan, iskelet kası ve karaciğer dokularındaki seviyeleri, kas ve karaciğer dokularındaki su miktarı, vücut ağırlıklarındaki değişiklikler ve amfibilere özgü antifriz proteinlerin (AFP'ler; FR10, Li16 ve Fr47) transkript ekspresyon seviyeleri incelendi. 
Donma sırasında R. macrocnemis kan glikoz seviyesinde 3,3 kat (1,35 ± 0,25'ten 4,45 ± 0,51 μmol mL-1'ye), R. holtzi kan glikozunda da 4,5 kat (1,90 ± 0,25'ten 8,67 ± 2,22 μmol mL-1'ye) olarak artış kaydedilmiştir. Karaciğer dokusu glikoz miktarı; R. macrocnemis'de 6,7 kat (5,66 ± 0,15'ten 38,27 ± 8,53 μmol g-1'ye) ve R. holtzi'de de yaklaşık 6 kat (2,25 ± 0,46'dan 13,36 ± 1,32 μmol g-1'ye) artış göstermiştir. Karaciğer dokusu glikoz seviyesi anoksi ve dehidrasyon streslerine cevap olarak her iki türde de artış gösterdi. Dehidrasyon koşulları, kas dokusundaki glikoz seviyesini her iki tür için de donma ve anoksi koşullarına göre daha fazla arttırmıştır. Stres ve normalleşme koşullarında bazı AFP'lerin gen ekspresyon seviyelerinde önemli değişiklikler kaydedilmiştir.  R. macrocnemis karaciğer dokusunda donma stresi li16 geni transkript seviyesini yaklaşık 3,5 kat, anoksi stresi ise fr47 ifadesini 2,7 kat artırmıştır. R. holtzi karaciğer dokusunda donma, anoksi ve dehidrasyon koşullarının tamamında fr10 geni yukarı yönlü regülasyon göstermiştir.
Sonuç olarak, bu tez çalışmasının sonuçları Anadolu dağ kurbağalarının dondurucu sıcaklıklarda hayatta kalabildiklerini ve donma toleransına sahip olduklarını göstermiştir. Bunun yanında bu süreçteki stratejilerinde önemli kriyoprotektanlardan biri olan glikozu kullandıkları ve kurbağalara özgü AFP'lerin donma ve ilişkili streslerde rol aldığı kaydedilmiştir. AFP'lerin genomik, transkriptomik ve proteomik araştırmalarının biyoinformatiği üzerine yoğunlaşılmalısı, AFP'lerin buz kristallerine bağlanma ve kontrol etme mekanizmalarının aydınlatılmasını sağlayacaktır. Kriyoprotektanlar üzerine daha fazla araştırma yapılması Anadolu dağ kurbağalarının kriyobiyolojisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Abstract:
This study investigated strategies that enable Anatolian mountain frogs (R. macrocnemis and R. holtzi) to survive the winter period when they are exposed to freezing temperatures. In this context, frogs were subjected to conditions of freezing, anoxia, and dehydration and examined in terms of the levels of glucose, as an important cryoprotectant, in the blood, skeletal muscle, and liver tissues, the amount of water in muscle and liver tissues, the changes in body weight, and the transcript expression levels of the amphibian-specific antifreeze proteins (AFPs) FR10, Li16, and FR47.
During freezing, the blood glucose level of R. macrocnemis increased 3.3-fold (1.35 ± 0.25 - 4.45 ± 0.51 μmol mL-1) and that of R. holtzi 4.5-fold (1.90 ± 0.25 - 8.67 ± 2.22 μmol mL-1). The liver tissue glucose level increased 6.7-fold (5.66 ± 0.15 - 38.27 ± 8.53 μmol g-1) in R. macrocnemis and about 6-fold (2.25 ± 0.46 - 13.36 ± 1.32 μmol g-1) in R. holtzi. The liver tissue glucose level increased in both species in response to anoxia and dehydration stresses. For both species, the glucose levels in muscle tissue increased more with the dehydration treatment than with the freezing and anoxia treatments. Significant changes were noted in the gene expression levels of some AFPs under stress and normalization conditions. In the liver tissue of R. macrocnemis, freezing stress increased the transcript level of the li16 gene approximately 3.5-fold, and anoxia increased the fr47 expression by 2.7-fold. The fr10 gene was upregulated under all conditions (freezing, anoxia, and dehydration) in the liver tissue of R. holtzi.
Consequently, the results of this thesis study showed that Anatolian mountain frogs have the ability to survive in freezing temperatures and are freeze tolerant. Moreover, it was noted that in their strategies for this process, they use glucose, one of the important cryoprotectants, and that the frog-specific AFPs play a role in freezing and its associated stresses. Focusing on the bioinformatics of genomic, transcriptomic, and proteomic research on AFPs could provide clarification of the mechanisms by which AFPs bind to and control ice crystals. In addition, further research on cryoprotectants would provide a better understanding of the cryobiology of Anatolian mountain frogs.