Küçük hücreli dışı akciğer kanserlerindeimmünhistokimyasal ve moleküler yöntem ile ntrk füzyonu
Research of ntrk fusion by immunhistochemical andmolecular methods in non-small cell lung cancers
Yazar: UBEYDULLAH ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. FERDA BİR
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Patoloji = Pathology

Özet:
KÜÇÜK HÜCRELİ DIŞI AKCİĞER KANSERLERİNDE İMMÜNHİSTOKİMYASAL VE MOLEKÜLER YÖNTEM İLE NTRK FÜZYONU ARAŞTIRILMASI


Küçük hücreli dışı akciğer karsinomları akciğer kanserlerinin en sık rastlanan tipidir. Küçük
hücreli dışı akciğer karsinomlarının büyük bir kısmını skuamöz hücreli karsinom, adenokarsinom
ve büyük hücreli karsinom oluşturmaktadır. Daha seyrek olarak diğer tipler görülmektedir. Küçük
hücreli dışı akciğer karsinomlarında prognoz ve tedavideki en önemli parametre hastalığın
evresidir. Erken evre tümörlerde cerrahi rezeksiyon önerilirken, ileri evre tümörlerde ise
kemoradyoterapi tedavisine ek olarak özellikle son yıllarda immünoterapi ve sürücü onkogenin
hedeflendiği tedaviler öne çıkmaktadır.
Küçük hücreli dışı akciğer karsinomlarında terapötik ajanlara uygun hedeflenebilir spesifik
genetik değişikliklerin keşfedilmesi, rutin uygulamada bu genetik değişiklikleri saptayan
moleküler tanı testlerinin önemini artırmıştır. EGFR, ALK, ROS1, RET, BRAF V600E, MET
Ekson 14 ve NTRK genetik değişikliklerini hedefleyen tirozin kinaz inhibitörleri küçük hücreli
dışı akciğer karsinomlarının bazı alt tipleri için onay almıştır.
NTRK genleri sırasıyla TrkA, TrkB ve TrkC proteinlerini kodlayan NTRK1, NTRK2 ve
NTRK3'den oluşan bir gen ailesidir. Trk proteinleri fizyolojik olarak nöronal gelişim ve bazı
bilişsel fonksiyonların düzenlenmesinde görev alır. Ayrıca bazı tümörlerde temel genetik
değişiklik olarak NTRK gen füzyonları tespit edilmiştir. Memenin sekretuar karsinomu, tükürük
bezinin meme analoğu sekretuar karsinomu, infantil fibrosarkom ve konjenital mezoblastik
nefroma gibi nadir görülen tümörlerde NTRK füzyonuna sık rastlanır. Küçük hücreli dışı akciğer
karsinomları, kolorektal karsinomlar, papiller tiroid karsinomları gibi daha sık karşılaşılan
tümörlerde de nadiren NTRK füzyonları bildirilmiştir.
Yakın zamanda onay alan entrectinib ve larotectinib gibi tirozin kinaz inhibitörlerinin
NTRK füzyon pozitif tümörlerde belirgin yanıt sağlaması NTRK füzyonunun saptanmasının
önemini arttırmıştır. NTRK füzyon tespiti için immünhistokimyasal yöntemler yanı sıra moleküler
olarak floresan in situ hibridizasyon, reverse transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu ve yeni nesil
sekanslama testleri kullanılmaktadır.
Bu çalışmaya kurumumuzda tanı almış 295 küçük hücreli dışı akciğer karsinom olgusu
alındı. Olguların 148 (%50,2)'inin biyopsi, 147 (%49,8)'sinin ise rezeksiyon materyali mevcuttu.

Tüm olguların 188 (%63,7)'i skuamöz hücreli karsinom, 85 (%28,8)'i adenokarsinom, 9 (%3,1)'u
küçük hücreli dışı karsinom, 10 (%3,4)'u sarkomatoid karsinom, 3 (%1,0)'ü ise büyük hücreli
karsinom tanılıydı. Olguların tümü Pan-TRK immünhistokimyasal ekspresyonu, klinikopatolojik
parametreler ve prognoz açısından incelendi. İmmünhistokimyasal Pan-TRK pozitifliği reverse
transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile doğrulandı. Reverse transkriptaz polimeraz
zincir reaksiyonu ile NTRK füzyonu saptanan olgularda NTRK füzyonu floresan in situ
hibridizasyon yöntemi ile tekrar doğrulandı.
Klinikopatolojik verilerden tümör çapı, tümör evresi, lenf nodu metastazı evresi ve uzak
metastaz evresi ile olguların total sağkalım süresi arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı
(p<0,05). Tümör çapı arttıkça, tümör evresi artmakta, lenf nodu metastazı evresi ve uzak metastaz
evresi ilerledikçe total sağkalım süresi azalmaktaydı.
İmmünhistokimyasal olarak Pan-TRK (EPR17341 klonu) ekspresyonu 24 (%8,1) olguda
izlendi. Dört (%1,4) olguda sitoplazmik, 10 (%3,4) olguda fokal sitoplazmik, 10 (%3,4) olguda
fokal nükleer ekspresyon saptandı. Skuamöz hücreli karsinom tanılı 18 (%9,6), adenokarsinom
tanılı 3 (%3,5), küçük hücreli dışı akciğer karsinomu, NOS tanılı 2 (%22,2), sarkomatoid
karsinom tanılı 1 (%10,0) olguda Pan-TRK ekspresyonu saptanırken, büyük hücreli karsinom
olgularının 3 (%100)'ünde de Pan-TRK ile herhangi bir ekspresyon görülmedi.
Pan-TRK ekspresyonu açısından cinsiyet, yaş, tümör odak sayısı, tümör çapı, tümör tipleri,
tümör alt tipleri, anjiolenfatik invazyon durumu, perinöral invazyon durumu, tümör stroması,
tümör evresi, lenf nodu metastazı, uzak metastaz ve nüks durumuna göre gruplar arasında
istatistiksel olarak anlamlı bir fark izlenmedi (p>0,05). Pan-TRK pozitif ve negatif olgular
arasında hastalıksız yaşam süresi ve total yaşam süresi açısından istatistiksel olarak anlamlı fark
bulunmadı (p>0,05).
İmmünhistokimyasal olarak pozitif saptanan 24 olguya reverse transkriptaz polimeraz zincir
reaksiyonu testi uygulandı. Yirmi dört olgudan 3 (%12,5)'ünde NTRK3 füzyonu tespit edildi.
NTRK füzyon pozitif 2 (%67) olgu skuamöz hücreli karsinom, bir (%33) olgu ise
adenokarsinomdu. İki olguda ise numune yetersiz olduğu için test uygulanamadı.
Sonuç olarak biz bu çalışmada küçük hücreli dışı akciğer karsinomlarının %8,1'inde
literatüre benzer şekilde immünhistokimyasal olarak Pan-TRK ekspresyonu saptadık.
İmmünhistokimyasal olarak pozitif olgularımızın %12,5'unda ise revers transkriptaz polimeraz
zincir reaksiyonu ile NTRK3 füzyonu saptadık ve floresan in situ hibridizasyon ile bulgularımızı
konfirme ettik. Bulgularımız deneyimli patologlar tarafından titiz bir inceleme yapılırsa,
moleküler testlerin bulunmadığı ortamlarda immünhistokimyanın tarama testi olarak
kullanılabileceğini ancak mutlaka moleküler doğrulama gerektirdiğini göstermektedir.

Olgularımızın çoğunluğunu oluşturan kısıtlı tedavi seçeneklerine sahip skuamöz hücreli
karsinomlarda NTRK3 füzyonu bulgumuz, bu genin sürücü fonksiyonun bu grupta daha etkili
olabileceğini düşündürmüştür. Daha geniş seriler ile bulgumuzun desteklenebileceğini
düşünmekteyiz.

Abstract:
RESEARCH OF NTRK FUSION BY IMMUNHISTOCHEMICAL AND MOLECULAR METHODS IN NON-SMALL CELL LUNG CANCERS


Non-small cell lung carcinomas are the most common type of lung cancer. Squamous cell
carcinoma, adenocarcinoma and large cell carcinoma constitute the majority of non-small cell lung
carcinomas. Other types are seen less frequently. The most important parameter in prognosis and
treatment in nonsmall cell lung carcinomas is the stage of the disease. While surgical resection is
recommended for early-stage tumors, immunotherapy and treatments targeting the driver
oncogene have come to the fore in recent years in addition to chemoradiotherapy for advanced-
stage tumors.
The discovery of specific targetable genetic changes suitable for therapeutic agents in non-
small cell lung carcinomas has increased the importance of molecular diagnostic tests that detect
these genetic changes by routine practice. Tyrosine kinase inhibitors targeting genetic changes in
EGFR, ALK, ROS1, RET, BRAF V600E, MET Exon 14, and NTRK genes have been approved
for certain subtypes of non-small cell carcinomas.
The NTRK genes are a family of genes consisting of NTRK1, NTRK2, and NTRK3, which
encode the TrkA, TrkB, and TrkC proteins, respectively. Trk proteins are physiologically involved
in the regulation of neuronal development and some cognitive functions. Moreover, NTRK gene
fusions have been identified as the main genetic change in some tumors. NTRK fusion is
frequently encountered in rare tumors such as secretory carcinoma of the breast, breast analogue
secretory carcinoma of the salivary gland, infantile fibrosarcoma, and congenital mesoblastic
nephroma. Furthermore, NTRK fusions have been reported rarely in more common tumors such
as non-small cell lung carcinomas, colorectal carcinomas, and papillary thyroid carcinomas.
The distinct response of recently approved tyrosine kinase inhibitors such as entrectinib and
larotectinib in NTRK fusion-positive tumors has increased the importance of detecting NTRK
fusion. In addition to immunohistochemical methods, molecular fluorescence in situ hybridization,
reverse transcriptase polymerase chain reaction and new generation sequencing tests are used for
NTRK fusion detection.
In this study, 295 non-small cell lung carcinoma cases diagnosed in our institution were
included. Out of the cases, 148 (50,2%) had biopsy samples available, while 147 (49,8%) had

resection material. Of all cases, 188 (63,7%) were diagnosed with squamous cell carcinoma, 85
(28,8%) with adenocarcinom, 9 (3,1%) with non-small cell lung carcinoma, 10 (3,4%) with
sarcomatoid carcinoma, 3 (1,0%) large cell carcinoma. All cases were examined in terms of Pan-
TRK immunohistochemical expression, clinicopathological parameters and prognosis.
Immunohistochemical examination was applied to all cases for NTRK fusion detection.
Immunohistochemical Pan-TRK positivity was confirmed by RT-PCR. NTRK fusion was
reconfirmed by fluorescence in situ hybridization method in cases with positive NTRK fusion
detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction.
A statistically significant difference was found between clinicopathological data in terms of
tumor diameter, tumor stage, lymph node metastasis stage and distant metastasis stage, and total
survival time of the cases (p<0,05). As the tumor size increased, tumor stage, lymph node
metastasis stage and distant metastasis stage progressed, total survival time decreased.
Immunohistochemically, Pan-TRK (clone EPR17341) expression was observed in 24 (8,1%)
cases. Cytoplasmic expression was found in four (1,4%) cases, focal cytoplasmic expression in 10
(3,4%) cases, focal nuclear expression in 10 (3,4%) cases. Pan-TRK expression was detected in 18
(9,6%) cases with squamous cell carcinoma, 3 (3,5%) with adenocarcinoma, 2 (22,2%) cases with
non-small cell lung carcinoma, NOS, 1 (10,0%) with sarcomatoid carcinoma, although/however
no expression was observed with Pan-TRK in 3 (100%) cases of large cell carcinoma.
In terms of Pan-TRK expression statistically significant difference was not observed
between the groups according to gender, age, number of tumor foci, tumor diameter, tumor types,
tumor subtypes, angiolymphatic invasion status, perineural invasion status, tumor stroma, tumor
stage, lymph node metastasis, distant metastasis and recurrence status (p>0,05). There was no
statistically significant difference between Pan-TRK positive and negative cases in terms of
disease-free survival and total life expectancy (p>0,05).
Reverse transcriptase polymerase chain reaction test was applied to the cases who was found
to be positive immunohistochemically. NTRK3 fusion was detected in 3 (12,5%) of 24 cases.
Among the fusion positive cases 2 (67%) were squamous cell carcinoma, one (33%) was
adenocarcinoma. In two cases, the test could not be performed because the sample was
insufficient.
In conclusion, in this study, we identified Pan-TRK expression through
immunohistochemistry in 8,1% of non-small cell lung carcinomas, consistent with the literature.
Among the immunohistochemically positive cases, we detected NTRK3 fusion by reverse
transcriptase polymerase chain reaction in 12,5% of the cases, and we confirmed our findings
using FISH. Our results indicate that immunohistochemistry can be used as a screening test in

settings where molecular testing is not available, but it always requires molecular validation, as
demonstrated by meticulous examination by experienced pathologists. Our finding of NTRK3
fusion in squamous cell carcinomas with limited treatment options, which constitutes the majority
of our cases, suggested that the driver function of this gene may be more effective in this group.
We believe that our findings can be supported by larger series, which would enhance the
generalizability and reliability of our results.