Mikroorganizmalarda insan proinsülin proteininin üretilmesi ve analizi
Production and analysis of human proinsulin protein in microorganisms
Yazar: ESMAGÜL HAKKIOĞLU
Danışman: PROF. DR. KADİR TURAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Elektroforez = Electrophoresis ; Pichia pastoris = Pichia pastoris ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic ; İnsülin = Insulin

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında insan prekürsör insülin proteinlerinin Pichia pastoris ve Escherichia coli hücrelerinde rekombinant olarak üretilmesi ve bu hücrelerin insülin sentez etme kapasitelerinin karşılaştırılması amaçlandı. 
Gereç ve Yöntem: İnsan insülin proteinini kodlayan gen, insan orijinli HeLa hücrelerinden elde edilen genomik DNA üzerinden polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile hazırlandı. Elde edilen insülin geni pPink-HC, pET-14b ve pGFP plazmit vektörlerine klonlandı. Oluşturulan plazmit vektörlerin ön kontrolleri uygun restriksiyon enzdonükleaz enzimleri ile kesildikten sonra agaroz jel elektroforezi teknikleri ile yapıldı. Plazmitlerin nihai kontrolleri DNA dizi analizleri ile gerçekleştirildi. Plazmitler kimyasal yöntemle ve/veya elektroporasyon yöntemiyle konak hücrelere transforme edildi. Farklı ortam koşullarında üretilen hücrelerde sentez edilen insülin prekürsör proteinleri poliakrilamid jel elektroforezi ve Western melezleme teknikleri ile incelendi.
Bulgular ve Sonuç: HeLa hücrelerine ait genomik DNA üzeriden PZR ile çoğaltılan insan insülin geni DNA fragmentindeki intron bölgesi invers (ters) PZR tekniği ile çıkartılarak, maya ve bakteri ekspresyon vektörlerine başarılı bir şekilde klonlandı. Pichia pastoris maya hücrelerine plazmit aktarımında elektroporasyon yönteminin kimyasal yönteme göre çok daha etkili olduğu saptandı. Plazmit aktarılan P. pastoris hücrelerinin genomlarında insülin genini taşıdıkları PZR ile belirlendi. Elde edilen maya ve bakteri transformantlarından hazırlanan total protein örneklerinde prekürsör insülin proteinleri Western melezleme tekniği ile belirlendi. Transformant maya kültürleri salgı formunda proteinler için de analiz edildi, fakat salgı formunda insülin belirlenemedi. Pichia pastoris hücrelerinde, E. coli hücrelerine göre çok düşük düzeylerde insülin proteini sentez edildiği görüldü. Bunun, çalışmada P. pastoris için kullandığımız plazmitler vektörlerden, hücreleri üretme koşullarından ve/veya konak proteaz aktivitesinden kaynaklanabileceği sonucuna varıldı.

Abstract:
Aim: In this thesis, it was aimed to produce recombinant human precursor insulin proteins in Pichia pastoris and Escherichia coli cells and to compare insulin synthesis capacities of these cells.
Material and Methods: The gene encoding human insulin was amplified with polymerase chain reaction (PCR) by using the genomic DNA of HeLa cells. The resulting insulin gene fragments were cloned into pPink-HC, pET-14b and pGFP plasmids. Preliminary controls of the recombinant plasmids were carried out with restriction enzyme digestions followed by agarose gel electrophoresis. Final control of plasmids was carried out by DNA sequencing. Plasmids were transformed into the host cells by chemical method and / or electroporation. The insulin proteins synthesized in the cells grown in different culture conditions were examined by polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting.
Results and Discussion: After removing of the intron region of insulin gene amplified from genomic DNA of HeLa cells with PCR by using inverse PCR technique, the resulting DNA fragmentswere successfully cloned into the expression vectors.The electroporation method for plasmid transformation to P. pastoris was found more effective compering to chemical methodes. Integrated insulin genes into the genom of P. pastoris were identified by PCR. The insulin proteins in total protein samples extracted from transformant yeast and bacteria were analysed with Western blotting.Transformant yeast cultures were also analyzed for secreted proteins, but it could not be identified secreted insulin. Comparing to E. coli, very low level of insulin protein was synthesized in P. pastoris cells. It was concluded that the low level insulin synthesis may depend on the expression plazmits, culture conditions and / or protease activity of P. pastoris.