Klinik örneklerde high resolution melting analysis (HRMA) yöntemiyle leishmania tanısı ve etken tiplerinin belirlenmesi
Diagnosis of leishmania and determination of types on clinical samples by using high resolution melting analysis (HRMA) method
Yazar: SERHAT SİREKBASAN
Danışman: DOÇ. DR. ERDAL POLAT
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Genotip = Genotype ; Leishmania = Leishmania ; Leishmaniasis = Leishmaniasis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhir = Showing ; Teşhis teknikleri ve prosedürleri = Diagnostic techniques and procedures ; Teşhis testleri = Diagnostic tests

Özet:
Leishmaniosis, Leishmania ile infekte Phlebotomus ve Lutzomyia cinsi kum sinekleri ile bulaşan bir hastalık grubu olup kırsal alanlarda daha fazla görülmektedir. Yeni Dünya'da 22, eski Dünya'da ise 66 ülkede olmak üzere 4 kıtada toplam 88 ülkede endemik olarak görülen leishmaniosis 6 önemli tropikal hastalıklar listesinde ikinci sırada yer almaktadır.
Uygun tedavinin planlanması ve hastalığın önlenmesi için hastalık etkeni parazit türünün hızlı ve doğru bir şekilde tanımlanması oldukça önemlidir. Çünkü aynı klinik tabloyu oluşturan farklı türlerde hastalığın seyri ile şiddeti aynı olmamakta ve tedavi rejimleri değişmektedir. Bununla birlikte kitap bilgisi olarak ülkemizde leishmaniosise neden olan türlerin çoğunlukla L. tropica ve L. infantum olduğu yazılmaktadır. Ancak Aralık 2011 yılında Suriye'de yaşanan iç savaştan kaçarak ülkemize sığınan ve sayıları 3 milyona yaklaşan göçmenlerle birlikte bunlara yeni türler ve beş değerli antimon türevlerine dirençli kökenler eklenmiştir. Bu nedenle hastalığın tedavisi ve gerekli önlemlerin alınması bakımından leishmaniosisde etken türünün ve varsa ilaç direncinin belirlenmesi önemlidir.
Leishmaniosis tanısında rutin olarak kullanılan direkt mikroskobi ve kültür yöntemleri ile ancak Leishmania'nın görüldüğünü ve ürediğini söyleyebiliriz. Leishmania'nın türünü ve ilaçlara karşı direncin olup olmadığını belirlemek için moleküler yöntemlerin kullanılması gerekmektedir. Bundan dolayı çalışmamızda moleküler yönden basit, hızlı ve uygun maliyetli olan HRMA yöntemi kullanılmıştır. Çalışmada 6 VL ve 79 KL şüpheli olmak üzere toplam 85 hastaya ait örnek incelenmiştir. Örneklerden hazırlanan preparatlar Giemsa ile boyanarak ışık mikroskobunda bakılmış ve Real Time PCR'da saptanan sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Real Time PCR'da pozitif bulunan Leishmania'ların HRMA yöntemi ile tür tayini yapılmıştır.
Mikroskobik incelemede; KL şüphesi ile alınan 79 adet örneğin 27 (% 34,2)'sinde Leishmania amastigotları görülmüş ve pozitif olarak kabul edilmiştir. VL şüphesi ile alınan 6 örneğin incelemesinde ise 1 (% 16,7) adet pozitif olgu saptanmıştır. Real Time PCR yönteminde; KL şüphesi ile alınan 79 adet örneğin 25 (% 31,6)'inde pozitiflik saptanmıştır. VL şüphesi ile alınan 6 örneğin hiç birinde pozitiflik saptanmamıştır. Real Time PCR'da pozitif bulunan 25 adet Leishmania'nın HRMA yöntemi ile yapılan incelemesinde 21 (% 84)'inin L. tropica, 3 (% 12)'ünün L. major ve 1 (% 4)'inin L. infantum olduğu belirlenmiştir.
Çalışmanın sonucunda leishmaniosis tanısında direkt mikroskobik incelemenin ve NNN kültürünün yeterli olacağı, ancak etken türünün ve ilaçlara karşı olası direncin belirlenmesinde Real Time PCR ve HRMA yöntemlerinin kullanılmasının yararlı olacağı kanaatine varılmıştır.

Abstract:
Leishmaniosis, Leishmania, infected Phlebotomus and Lutzomyia are a group of disease transmitted by sand flies and are more common in rural areas. Leishmaniosis, which is endemic in 88 countries on 4 continents, 22 in the New World and 66 in the Old World, ranks second on the list of 6 important tropical diseases.
It is important that the disease-affecting parasite pathway be identified quickly and accurately for proper treatment planning and disease prevention. Because the severity of the disease is not the same in different types of the same clinical picture, and the treatment regimes are changing. However, most of the species that cause leishmaniosis in our country as a book are written as L. tropica and L. infantum. However, with the immigrants who escaped from the civil war in Syria in December 2011, who took refuge in my country and had close to 3 million in number, they added new species and resistant origins to their five valuable antimony derivatives. For this reason, it is important to identify the causative agent of leishmaniosis and the drug resistance, if any, in terms of treating the disease and taking the necessary precautions.
With direct microscopy and culture methods routinely used in the case of Leishmaniosis, we can only say that Leishmania is seen and procured. Molecular methods are needed to determine whether Leishmania is resistant and resistant to drugs. Therefore, our study used a simple, fast and cost effective HRMA method in the molecular direction. A total of 85 patients, 6 VL and 79 KL, were studied in the study. Preparations prepared from samples were stained with Giemsa and examined with light microscope and compared with the results determined in Real Time PCR. Leishmania, positive in Real Time PCR, were identified by HRMA method.
Microscopic examination; Of the 79 suspected cases of KL, 27 (34.2%) had Leishmania amastigotes and were considered positive. In the case of 6 samples taken by VL, 1 (16,7%) positive cases were detected. Real Time PCR method; KL was found positive in 79 cases (25.6%). VL was found to have no positivity in any of the 6 samples taken. Twenty-five (84%) L. tropica, 3 (12%) L. major and 1 (4%) L. infantum were detected by Leishmania's HRMA method, which was found to be positive in Real Time PCR It has been identified.
As a result of this study, direct microscopic examination and NNN culturing of leishmaniosis would suffice, but Real Time PCR and HRMA methods would be useful in determining possible resistance to the causative agent and drugs.