Kütanöz leishmaniasis etmeni l.tropica'dan izole edilen lpg molekülüne karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların büyük ölçek üretilmesi ve saflaştırılması
Large scale production and purification of monoclonal antibodies based on hybridoma technology against lpg molecular from l.tropica, causative agent of cutaneous leishmaniasis
Yazar: HİLAL ŞENTÜRK
Danışman: PROF. DR. ADIL ALLAHVERDIYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Leishmaniasis, Phlebotomus'un (enfekte kum sineklerinin) kan emme esnasında memeli konaklara bulaştırdıkları hücre içi Leishmania protozoonlarının oluşturduğu bir hastalıktır. Leishmaniasis'in; visseral, kütanöz ve mükokütanöz olmak üzere 3 klinik formu bulunmaktadır. Visseral leishmaniasis (VL), kronik bir hastalık olup, iç organ tahribatı ile ağır enfeksiyonlara hatta ölüme neden olabilmektedir. Kütanöz leishmaniasis (KL); L. tropica ve L. major'un neden olduğu ve genelde tropikal ve subtropik bölgelerde görülen, bir deri hastalığıdır.  Kütanöz leishmaniasis, ülkemiz de dahil olmak üzere dünyanın yaklaşık 83 ülkesinde endemik olarak görülmektedir. Dünya genelinde olduğu gibi Türkiye'de de kütanöz leishmaniasis vakalarına daha sık rastlanmaktadır. 1988 ve 2010 yılları arasında Türkiye'de 50 bine yakın Kütanöz leishmaniasis vakasının Güneydoğu Anadolu Bölgesi civarında olduğu bildirilmiştir. Hastalığın tanısında; mikroskobik, kültür ve moleküler yöntemler kullanılır. Ancak, klasik kültür yöntemi ile mikroskobik yöntemin duyarlılığı örnekteki parazit sayısına bağlı olarak değişir. Özellikle Kütanöz leishmaniasis'in kronik ve iyileşmeyen formlarında duyarlılığı yaklaşık olarak %40 civarındadır. Klasik kültür yönteminden farklı olan mikro kültürü yöntemi (MKY); parazit sayısına bağlı olmaksızın en kısa sürede (1-3 gün) tayin etmesinin yanında, yüksek duyarlılık göstermesi ve ekonomik olmasına rağmen görüntülenebilmesi için inverted mikroskoba ihtiyaç duyulur. Leishmaniasis'in tanısında kullanılan serolojik yöntemlerin özellikle visseral leishmaniasis'e karşı yüksek duyarlılık (%80-90) gösterdiği bilinmektedir. Fakat kütanöz leishmaniasis'de oluşan hümoral yanıtın visseral leishmaniasis'e göre düşük olmasından dolayı antikor temelli serolojik yöntemler yetersiz kalmaktadır. Buna göre de, kütanöz leishmaniasis'in tanısında antijen temelli serolojik testlerin değeri daha çok önem kazanmaktadır.  Ancak antijen temelli serolojik yöntemler, antijene karşı üretilmiş yoğun bir antikorun bulunduğu koşullarda gerçekleşebilir. Bu sebeple, kütanöz leishmaniasis tanısında veya tanı kitlerinin geliştirilmesi, ancak hibridoma teknolojisine dayalı üretilen poliklonal ve monoklonal antikorlar ile mümkün olabilir.  Leishmaniasis'de hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların geliştirilmesi ile ilgili literatürde az sayıda çalışma bulunmakta olup bunların çoğu visseral leishmaniasis üzerine yoğunlaşmaktadır. Kütanöz leishmaniasis ile yapılan tek çalışmada;  L.tropica lizatına karşı poliklonal antikorlar üretilmiştir. Son yıllarda konu ile ilgili laboratuvarımızda hem VL hemde KL etmeni parazitlere karşı hibridoma teknolojisine dayalı poliklonal ve monoklonal antikorların üretimine yönelik çalışmalar tamamlanmış ve hala yürütülmektedir. Yapılan bu çalışmalar sonucunda, visseral leishmaniasis etmeni L. infantum' un 15kDa antijenine karşı spesifik olan monoklonal antikor ve kütanöz leishmaniasis etmeni L.tropica'ya karşı poliklonal antikorlar üretilmiştir. Ancak, şimdiye kadar kütanöz leishmaniasisin tanısında, L.tropica'nın yüksek immünojen özelliğine sahip yüzey antijenine karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikor üretilmesine yönelik herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Laboratuvarımızda TÜBİTAK kapsamında gerçekleştirilen "Leishmaniasis'e karşı aşı geliştirilmesinde polimerlere dayalı yeni bir yaklaşım: LPG-polimer konjugatları" projede; lipofosfoglikan (LPG) molekülü izole edilmiş ve bu molekülün Leishmaniasis'e karşı %83 oranında koruyuculuk gösterdiği saptanmıştır. LPG molekülünün böyle yüksek düzeyde antikor üretebilmesine rağmen, Leishmania'nın herhangi bir türünden izole edilmiş LPG molekülüne karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikor üretilmesine yönelik bir çalışma bulunmamaktadır. Bu açıdan, kütanöz leishmaniasis'de kullanılmak üzere geliştirilecek tanı kitinde, LPG molekülüne karşı üretilen monoklonal antikorların önemli rol oynayacağı düşünülmektedir.  Bu bilgiler ışığında tezin amacı, Dünya'da ve ülkemizde L.tropica'nın en immünojen molekülü olan lipofosfoglikana (LPG) karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların üretilmesi, saflaştırılması ve kütanöz leishmaniasis tanısında kullanılmak üzere spesifikliğinin belirlenmesi üzerine kurulmuştur. 
Bu hedefe ulaşabilmek için; dişi BALB/c farelerine (6-8 haftalık), L.tropica'dan izole edilmiş immonejen lipofosfoglikan (LPG) molekülü ile birlikte Freund ve daha önceki çalışmalarımızda etkinliği belirlenmiş FDA onaylı Freund adjuvantına göre daha az toksik olan POX adjuvantının farklı kombinasyonları ile immünize edildi. Füzyon öncesi hibridoma kültürünün gelişimini desteklemek için fare periton makrofajları besleyici hücre hattı olarak kullanıldı. İmmünizasyon sonucu LPG'ye karşı kontrol grubu farelere göre yaklaşık 8,5 kat daha yüksek antikor yanıtının görüldüğü fare B- lenfosit kaynağı olarak füzyon çalışması için kullanıldı. Füzyon aşamasında yüksek immün yanıt gösteren fareden elde edilen dalak hücreleri ile fare myeloma hücreleri (P3-X63-Ag8.653) polietilen glikol (PEG-4000) varlığında füzyona uğratıldı. Füzyon çalışmasının yürütüldüğü 660 kuyunun 128 kuyusunda hibridoma hücresi görüldü. Fakat yapılan indrekt ELISA sonuçlarına göre sadece 16 kuyunun LPG'ye karşı antikor ürettiği tespit edildi. Antikor üretiminin en yüksek olduğu 8/E7 kuyusu alt klonlanarak monoklonal antikor üretiminin tek klon hibrid hücre tarafından üretilmesi sağlandı. 8/E7 klonundan çoğalan hibridoma hücreleri kademeli olarak büyük ölçek kültürü yapılarak elde edilen monoklonal antikorların HPLC ile saflaştırılma işlemi gerçekleştirildi. Saf olarak elde edilen monoklonal antikorların LPG molekülene olan spesifikliği Dot Blot analizi ile doğrulandı. Ayrıca yapılan çapraz reaksiyonla saf monoklonal antikorların herhangi bir çapraz reaksiyon göstermediği, sadece LPG molekülüne karşı cevap oluşturduğu ortaya çıkarıldı. 
Sonuç olarak; Bilim, Sanayi ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenen 0254.STZ.2013-2 numaralı proje kapsamında, Dünya'da ve ülkemizde ilk kez olarak Kütanöz Leishmaniasis etmeni L.tropica'nın immünojenik yüzey molekülü olan lipofosfoglikana (LPG) karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorlar elde edilmiştir. Elde edilen bu sonuçlar, L.tropica'dan izole edilen LPG molekülüne karşı hibridoma teknolojisine dayalı olarak geliştirilen monoklonal antikorların, bu moleküle karşı yüksek düzeyde spesifiklik gösterdiğini ve bu nedenle elde edilen monoklonal antikorların gelecekte kütanöz leishmaniasis tanısında kullanılmasının uygun olabileceğini ortaya çıkarmıştır.

Abstract:
Leishmaniasis is a disease which is caused by infected sand nets Phlebotomus while sucking the host mammalian blood ean intercellular Leishmania protozoons. Leishmaniasis has 3 clinical formes including visceral, cutaneous and mucocutaneous. Visseral leishmaniasis (VL) is a chronical disease which result with severe infections even if death by infection of internal organs. Cutaneous leishmaniasis (CL) is caused by L. trpica and L. major and it is a skin disease which is usually seen in tropical and subtropic regions. Cutaneous leishmaniasis is seen as endemic  in 83 countries including our country. Between 1988 and 2010, 50.000 cases of cutaneous leishmaniasis in Turkey were reported to be located in the Southeastern Anatolia Region. In the diagnosis of the disease; Microscopic, culture and molecular methods are used. However, the sensitivity of the classical culture method and the microscopic method varies depending on the number of parasites in the sample.The sensitivity of chronic and non-curable forms of cutaneous leishmaniasis is approximately 40%. Micro culture method (MKY), which is different from classical culture method; detects the disease in the shortest time (1-3 days) regardless of the number of parasites,  eventhough it is economic and high sensitive an inverted microscope is required. It is known that the serological methods used in the diagnosis of Leishmaniasis show high sensitivity (80-90%) especially to visceral leishmaniasis. However, antibody-based serologic methods are inadequate because humoral response in cutaneous leishmaniasis is lower than visceral leishmaniasis. Accordingly, the value of antigen-based serological tests becomes more important in the diagnosis of cutaneous leishmaniasis. However, serologic methods based on antigens can be performed under conditions in which an intense antibody against the antigen is present. For this reason, the development of cutaneous leishmaniasis diognosis or diagnostic kits can only be possible with polyclonal and monoclonal antibodies produced based on hybridoma technology. There are few studies in the literature on the development of monoclonal antibodies based on hybridoma technology in Leishmaniasis, most of which focus on visceral leishmaniasis.In one study with cutaneous leishmaniasis, polyclonal antibody against L. tropica lysate is produced. In recent years, studies on the production of polyclonal and monoclonal antibodies based on hybridoma technology against both VL and CL mutant parasites have been completed and are still being carried out in our laboratory. As a result of these studies, monoclonal antibodies against to the 15 kDa antigen of  L. infantum as visceral leishmaniasis factor and polyclonal antibodies against to  L.tropica as cutaneous leishmaniasis factor were produced. However, as far as cutaneous leishmaniasis is concerned, there is no study based on hybridoma technology against surface antigen with high immunogenicity of disease-causing parasite. In our laboratory, a new approach based on polymers in the vaccine development against Leishmaniasis: LPG-polymer conjugates has been realized within the scope of TUBITAK. As a result of this project, a lipophosphoglycan (LPG) molecule has been isolated and it has been determined that this molecule is 83% protective against Leishmaniasis. Although there is such a high level of antibody production by LPG molecules, there is no study to produce monoclonal antibodies based on hybridoma technology against LPG molecules isolated from any species of Leishmania. Therefore, monoclonal antibodies against the LPG molecule are thought to play an important role in the diagnosis of cutaneous leishmaniasis. The aim of this thesis is to produce monoclonal antibodies based on hybridoma technology against lipophosphoglucan (LPG), the most immunogenic molecule of L. tropica in the world and in our country, to determine its specificity for use in the diagnosis of cutaneous leishmaniasis.
For the purpose of this thesis study, POX and Freund adjuvants with LPG molecule isolated from L.tropica were injected with 3-5 week old female BALB / c mice, for immunization. To support the development of pre-fusion hybridoma cultures, mouse peritoneal macrophages were used as feeder cell lines. Mice in which a high-antibody response to immunization was observed were used for fusion studies as a B-lymphocyte source.  In the fusion phase, the spleen cells which are the source of B lymphocyte spleen cells and mouse myeloma cells (P3-X63-Ag8.653) were fused in the presence of polyethylene glycol (PEG-4000). Hybridoma cells were seen in 128 wells of 660 wells where fusion work was carried out. However, according to the indirect ELISA results, it was determined that only 16 wells produced antibodies against LPG. The 8 / E7 well, the highest antibody production, was subcloned. Thus, monoclonal antibody production was provided by monoclonal hybrid cells. The hybridoma cells grown from the 8 / E7 clone were gradually cultured on a large scale. The purification of the obtained monoclonal antibodies by HPLC was carried out. The specificity of pure monoclonal antibodies against LPG molecule was confirmed by Dot Blot analysis. In addition, no cross-reaction of the pure monoclonal antibodies with the cross-reaction made. It proved that it only responds to the LPG molecule. As a result, in this thesis study, for the first time in the world, a high amount of monoclonal antibody was obtained by forming hybridoma cell line producing monoclonal antibody against LPG molecule.
As a result; Monoclonal antibodies based on hybridoma technology against lipophosphoglucan (LPG), the most immunogenic surface molecule of L.tropica, have been obtained for the first time in the world and in our country, as a result of the project 0254.STZ.2013-2 supported by the Ministry of Science, Industry and Technology. These results show that monoclonal antibodies developed based on hybridoma technology against LPG molecule isolated from L. tropica have high specificity against this molecule and that the obtained monoclonal antibodies may be suitable for use in the diagnosis of cutaneous leishmaniasis in the future.