İzmir yöresinde culicoides türlerinin moleküler karakterizasyonu ve haemosporidia enfeksiyonları yönünden vektörlük potansiyellerinin araştırılması
Molecular characterization of culicoides species in İzmir vicinity and investigation of their vector potential for haemosporidia infections
Yazar: HAKAN YEŞİLÖZ
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Culicoides = Culicoides ; DNA analizi = DNA analysis ; Gen ifadesi = Gene expression ; Haemoproteus = Haemoproteus ; Hastalık vektörleri = Disease vectors ; Kümes hayvanları = Poultry ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Parazit hastalıkları-hayvan = Parasitic diseases-animal ; Parazitler = Parasites ; İzmir = Izmir

Özet:
Bu çalışmada İzmir ilinin farklı ilçelerine bağlı bazı odaklarda yaygınlık gösteren Culicoides türlerinin konvansiyonel morfolojik ve moleküler yöntemlerle belirlenmesi, izolatların moleküler karakterizasyonlarının yapılması ve kanatlı Haemosporidian parazitlerin nakli açısından vektör potansiyellerinin moleküler olarak ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. Çalışmada, 2016 yılının Mayıs-Ağustos ayları arasında Bergama, Ödemiş, Kemalpaşa ve Foça ilçelerinde belirlenen istasyonlardan ışık tuzakları ile Culicoides örneklemesi yapılmıştır. Toplanan Culicoides örneklerinin kanat morfolojilerine göre identifikasyonları yapıldıktan sonra her türden belirlenen örneklerden genomik DNA (gDNA) izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen gDNA izolatlarının barkod mt-COI gen bölgesi amplifiye edilmiş ve sonraki basamakta amplifikasyon ürünlerinin klonlama, plazmid pürifikasyonu ve sekans analizleri gerçekleştirilerek moleküler karakterizasyonları sağlanmıştır.  GenBank aksesyonları sağlanan izolatların Türkiye ve Dünyadaki homolog izolatlarla filogenetik yapılanmaları belirlenmiştir. Toplanan örneklerde Haemosporidian parazitlerin araştırılması amacıyla her türe ait dişi Culicoides örneklerinin baş/toraks (BTH) ve abdomen (AH) kısımları diseke edilerek tür ve toplama merkezi bazında ayrı ayrı havuzlar oluşturulmuştur. Havuzlardan gDNA ekstraksiyonundan sonra elde edilen izolatların Haemosporidian mt-cytb gen bölgesini amplifiye eden spesifik primerlerle nested PCR analizleri gerçekleştirilmiştir. BTH'da belirlenen pozitiflikler muhtemel potansiyel vektörlük göstergesi olarak kabul edilmiş ve minimum enfeksiyon oranları (MIRs) hesaplanmıştır. BTH ve AH'de belirlenen Haemosporidian nesillerinin sekans analizleri ile karakterizasyonları yapılmıştır. Araştırmada toplanan 800 dişi Culicoides örneğinin morfolojik identifikasyon sonuçlarına göre C. circumscriptus, C. nubeculosus kompleks, C. newsteadi, C. imicola, C. gejgelensis, C. obsoletus, C. punctatus ve Culicoides sp. (C. truncorum'a yakın) türlerine ait oldukları belirlenmiştir. En yaygın türler %39,4 ile C. circumscriptus ve %33,8 ile C. imicola belirlenirken en düşük yayılışı gösteren türler ise %1,9 ile C. punctatus ve %1,8 ile C. newsteadi bulunmuştur. Araştırma yöresinde belirlenen türlere ait mt-COI sekansları arasında 18 farklı haplotipi ortaya koyan 175 polimorfik bölge saptanmıştır. Filogenetik analizler C. newsteadi dışında tüm türlere ait nesillerin monofiletik karakterde olduğunu göstermiştir. Karakterize edilen türlere ait haplotipler arasında ortalama genetik heterojenite %25,3±2,4 saptanmıştır. Çalışmada belirlenen haplotiplerin Türkiye ve Dünya'dan bildirilmiş homolog izolatlarla filogenetik yapılanmaları ortaya çıkarılmıştır. Çalışmada incelenen AH'dan C. circumscriptus, C. imicola, C. obsoletus ve C. gejgelensis'de Haemosporidian mt-cytb DNA'sı belirlenirken (%10,22), BTH pozitiflikleri (%7,95) yalnızca C. circumscriptus'ta tespit edilmiştir. C. circumscriptus için Haemoproteus nesilleriyle MIRs %22,2 olarak hesaplanmıştır. İlgili Culicoides türlerinde belirlenen Haemosporidian parazitlerin sekans analizleri sonucunda C. circumscriptus BTH izolatlarında Haemoproteus sp. GAGLA05 ve H. minutus TURDUS2 nesilleri karakterize edilmiş ve bu türün araştırma yöresinde ilgili nesillere muhtemelen potansiyel vektörlük yaptığı ortaya çıkarılmıştır. Çalışmada ayrıca C. circumscriptus AH'da Plasmodium sp. CXPIP10, C. obsoletus AH'da Plasmodium sp. CXPIP23 ve SYCON02, C. imicola, C. obsoletus ve C. gejgelensis AH'da P. relictum SGS1 ve C. imicola ve C. gejgelensis AH'da da Plasmodium sp. YWT4 nesilleri identifiye edilmiştir.
Sonuç olarak bu çalışma ile İzmir yöresinde yaygınlık gösteren Culicoides türleri morfolojik ve moleküler identifikasyonlarla belirlenerek moleküler epidemiyoloji açısından Türkiye için özgün veriler sağlanmıştır. Ayrıca çalışma sonuçları kanatlı Haemosporidian parazitlerin İzmir yöresinde yaygın olduğunu ortaya çıkarmış ve C. circumscriptus'un Haemoproteus nesillerinin nakli açısından potansiyel bir öneme sahip olduğuna dair kanıtlar sağlamıştır.
Anahtar kelimeler: Culicoides, Moleküler karakterizasyon, Kanatlı Haemosporidianları, Vektör potansiyeli, İzmir

Abstract:
In this study it was aimed to determine the Culicoides species widespread in the centers belonging to different districts of İzmir by conventional morphologic and molecular techniques, to perform molecular characterization of the isolates and to reveal their vector potential by molecular tools regarding to transmission of avian Haemosporidian parasites. Between May-August 2016 Culicoides samplings were performed via light traps from previously determined stations in Bergama, Ödemiş, Kemalpaşa and Foça districts in the study. After the identification of Culicoides species by wing morphology genomic DNA (gDNA) isolations were performed on the determined specimens from each species. The barcode mt-COI gene region of the obtained gDNA isolates were amplified and molecular characterization of isolates were provided after cloning, plasmid purification and sequence analyzes of the amplification products. GenBank accessions were provided for the obtained isolates and phylogenetic constructions of the isolates with the homolog isolates from Turkey and World were determined. The pools were constituted on the base of species and collection region by dissection of head/thorax (HTP) and abdomen (AP) parts of the each female Culicoides species in order to investigate Haemosporidian parasites in the collected specimens. Nested PCR analyses of the isolates with the specific primers amplifying Haemosporidian mt-cytb gene region were utilized after the gDNA extractions from the pools. The positives determined in the HTP were accepted as an indicator of the possible vector potential and minimum infection rates (MIRs) were calculated. The characterizations of the Haemosporidian linages in HTP and AP were performed via sequence analyses. Morphological identification results revealed that, 800 female Culicoides specimens collected in the study were belonged to C. circumscriptus, C. nubeculosus komp., C. newsteadi, C. imicola, C. gejgelensis, C. obsoletus, C. punctatus and Culicoides sp. (near C. truncorum) species. C. circumscriptus with 39.4% and C. imicola with 33.8% prevalence rates were determined as the most prevalent species. While C. punctatus with 1.9% and C. newsteadi with 1.8% prevalence rates were the lowest prevalent species.  One hundred seventy five polymorphic sites were distributed among the COI sequences of the obtained isolates from the research area leading to the detection of 18 different haplotypes. Phylogenetic analyses revealed that lineages of all species except C. newsteadi had monophyletic character. The overall genetic heterogeneity among the haplotypes belonging to characterized species was determined as 25.3±2.4%. The phylogenetic constructions of the determined isolates in the study with the other homolog isolates from both Turkey and World were revealed.  While the Haemosporidian mt-cytb DNAs were determined in the AP of C. circumscriptus, C. imicola, C. obsoletus and C. gejgelensis (10.22%), HTP positivities (7.95%) were detected only in C. circumscriptus. Therefore, MIRs of Haemoproteus lineages for C. circumscriptus was calculated as 22.2%. According to the sequence analyses of the Haemosporidian parasites determined in the related Culicoides species, Haemoproteus sp. GAGLA05 and H. minutus TURDUS2 linages were characterized in C. circumscriptus HTP isolates thus, the possible potential vector role of this species in the transmission of the related lineages was revealed. Furthermore Plasmodium sp. CXPIP10 in C. circumscriptus AP, Plasmodium sp. CXPIP23 and SYCON02 in C. obsoletus AP, P. relictum SGS1 in C. imicola, C. obsoletus and C. gejgelensis AP and Plasmodium sp. YWT4 in C. imicola and C. gejgelensis AP were identified in the study. 
In conclusion, the Culicoides species widespread in İzmir region were determined with morphologic and molecular identifications with this study and original data were provided for Turkey regarding to molecular epidemiology. Furthermore results of the study revealed the prevalence of avian haemosporidian parasites in İzmir region and also provides evidence for the potential importance of C. circumscriptus in the transmission dynamics of Haemoproteus linages. 
Key words: Culicoides, Molecular characterization, Avian Haemosporidians, Vector potential, İzmir