Termofilik Bacillus licheniformis KG9'da ekstrasellüler ß-galaktozidaz enzimi üzerine çalışmalar
Studies on the extracellular ß-galactosidase enzyme in the thermophilic Bacillus licheniformis KG9
Yazar: ALEVCAN KAPLAN
Danışman: PROF. DR. KEMAL GÜVEN
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Enzim biyosentezi = Enzyme biosynthesis ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim testleri = Enzyme tests ; Enzim üretimi = Enzyme production ; Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method

Özet:
Bu çalışmada Batman Taşlıdere sıcak su kaplıcasından izole edilen termofilik Bacillus licheniformis KG9'un biyoteknolojik öneme sahip ekstrasellüler ß-galaktozidaz enziminin bazı özelliklerinin araştırılması amaçlanmıştır.Bacillus licheniformis KG9 NB besi yerinde laktozlu(%1) ve laktozsuz ortamlarda 6-96 saatler arasında kültüre alınarak zamana bağlı enzim üretimi araştırıldı. Laktozlu ortamda enzim aktivitesi 48.saatten(1.39 U/mg) başlayarak 96. saate ( 3.25 U/mg) kadar artarak devam ettiği görüldü. Laktozsuz ortamda ise enzim aktivitesinin 36.saatten(1.38 U/mg) başlayarak 96.saate(2.45 U/mg) kadar artarak devam ettiği ancak bu artışın laktozlu ortamdakine nazaran düşük olduğu görüldü.pH ve sıcaklığın ß-galaktozidaz enzimi üzerine etkisi pH 4-10 ve 30°C ile 90 °C aralığında ham enzimde hem de kısmi olarak saflaştırılan enzim solüsyonunda yapıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 8.0 ve 55 oC olarak bulundu.Enzim aktivitesi üzerine faklı substrat konsantrasyonlarının etkisi 0,25 -6 mM aralığında araştırıldı. En uygun substrat konsantrasyonu 3 mM olarak tespit edildi.Enzim üretimi üzerine değişik besi yerlerinin etkisi içerikleri farklı olan NB, BM1, BM2, BM3 besi yerlerinde araştırıldı. En iyi enzim aktivitesi NB besiyerinde elde edildi.Enzim üretimi üzerine %1 oranındaki farklı azot ve karbon kaynaklarının etkisi araştırıldı. Karbon kaynaklarının enzim üretimi arttırmadığı tespit edildi. Laktoz araştırılan diğer karbon kaynaklarına göre daha yüksek bir aktivite tespit edildi. Galaktoz, glukoz ve çözünebilir nişastanın ekstrasellüler enzim üretimini büyük oranda inhibe ettiği tespit edildi. Azot kaynaklarından glisin ve amonyum sülfat enzim üretimini az miktarda arttırdığı tespit edildi. Yeast ekstrakt, beef ekstrakt , pepton ve tripton'un enzim üretimini arttırmadığı tespit edildi.Enzim amonyumsülfat çöktürmesi ve diyaliz aşamasından geçirilerek kısmi olarak saflaştırıldı. Ham ekstraktta enzimin spesifik aktivite değeri 1631 U/mg, verim %100, saflaştırma katsayısı 1 iken diyaliz sonrasında sırasıyla spesifik aktivite değerinin 19030.45 U/mg , verimin %15,7 ve saflaştırma katsayısının 11,66 olarak değiştiği tespit edildi.Kısmi olarak saflaştırılan enzimin aktivitesi üzerine bazı kimyasalların, metallerin, metal şelatörlerin etkisi araştırıldı. MgCl2 8 mM'da %16 oranında ß-galaktozidaz aktivitesini arttırdığı, ZnCl2 ve CuCl2'ün 1mM'da sırasıyla%99.5 ve %93.5 oranında enzim aktivitesini inhibe ettiği, CaCI2'ün 20 mM'da enzim aktivitesini %62 oranında inhibe ettiği, metal şelatörleri olan EDTA ve 1,10-phenanthroline monohydrat'ın enzimde inhibisyona neden olmadığı tespit edildi. DTT ve ß-mercaptoethanol'un 10 mM'da sırasıyla %37 ve %24 oranında enzim aktivitesini arttırdığı, PCMB'nin 4 mM'da enzim aktivitesini %52 oranında inhibe ettiği, Iodoacetamide'in 20 mM'da enzim aktivitesini %53 oranında inhibe ettiği, PMSF ve N-ethylenemaleimide enzimde inhibisyona neden olmadığı tespit edildi.Kısmi olarak saflaştırılan enzimde gliserol ve sorbitolün dondurma-çözdürme işleminde koruyucu etkisi %1-5 konsantrasyonlarında araştırıldı. Sorbitol için en iyi koruyucu etki %5 konsantrasyonunda olduğu tespit edildi. Gliserol de ise %1'de %83, %2- %5 konsantrasyonlarında yaklaşık %90 oranında dondurma ve çözme işleminde koruduğu tespit edildi.Enzimin termal stabilitesi 50 -65 ºC sıcaklık aralıklarında araştırıldı. Enzimin aktivitesini 50 ºC 120dk. sonunda %90 oranında koruduğu, 55 ºC'de 120 dk. sonunda aktivitesini tamamı ile koruduğu, 60 ºC'de 120dk. sonunda %90 oranında koruduğu tespit edildi. 65 ºC'de ise 20 dk.'da enzimin aktivitesini tamamen kaybettiği tespit edildi.Glukoz ve galaktozun, enzim üzerinde yaptığı inhibisyon etkisi belirlendi. Glukoz ve galaktozun 2 -128 mM konsantrasyonları test edildi. Glukozun enzim üzerine ihibisyon etkisi gözlenmedi. Galaktoz'un ise 128 mM'da %97 oranında inhibisyona neden olduğu tespit edildi. Galaktoz'un inhibisyon çeşidini belirlemek amacı ile 4 mM , 16 mM , 32 mM konsantrasyonlarında ve belirli enzim konsantrasyonlarında, 1-6 mM aralığındaki ONPG konsantrasyonları kullanıldı. Galaktoz'un enzim üzerinde yarışmalı bir inhibisyona neden olduğu tespit edildi. ONPG için Km ve Vmax değerleri Lineweaver?Burk plot'a göre sırası ile 3.52 mM ve 1.602µmol/dk. olarak hesaplandı.12- 96. saatler arasında kültüre alınan bakterilerde zamana bağlı enzim üretim oranları non-denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile teyit edilmiştir.

Abstract:
In this study it is aimed to investigate some features of biotechnologically important ß-galactosidase enzyme produced by thermophilic Bacillus licheniformis KG9 isolated from hot spring in Batman Taşlıdere.Time related enzyme production was investigated by culturing Bacillus licheniformis KG9 in lactose-containing and lactose free NB medium between 6-9 hours. It was observed that enzyme activity in lactose-containing medium continuously increased, strating at 48 h (1.39 U/mg) up to 96 h ( 3.25 U/mg). It was seen that enzyme activity in lactose-free medium continuously increased, strating at 36. h (1.38 U/mg) up to 96. h ( 2.45 U/mg), but the increasing in this medium was less than the increasing in lactose containing medium.The effect of pH and temperature on ß-galactosidase enzyme and partially purified enzyme solution was investigated between the pH values 4-10 and temperatures between 30°C and 90 °C. The optimum pH and temperature were found 8.0 and 55°C respectively.The effect of different substrat concentrations on enzyme activity was investigated between 0,25 -6 mM. The most convenient substrat concentration was determined as 3 mM.The impact of different mediums on enzyme production was invetigated in NB, BM1, BM2, BM3 mediums which had different content. The best enzyme activity was gained from NB medium.The effect of %1 different nitrogen and carbon sources were investigated. It was determined that carbon sources didn?t increase the enzyme production. It was determined that lactose showed higher activity than the other investigated carbon sources. It was determined that galactose, glucose and soluble starch substantially inhibited extracellular enzyme production. It was observed tahat the nitrogen sources glycine and ammonium sulphate slightly increased enzyme production. Yeast extract, beef extract, pepton and tripton didn?t increase enzyme production.Enzyme was partially purified by using ammonium sulphate precipitation and dialysis. In crude extract specific activity value was 1631 U/mg, efficiency %100, purification coefficient was 1, after dialysis the specific activity value was 19030.45 U/mg , efficiency %15,7 and purification coefficient was change 11,66 respectively.The effects of some chemicals, metals and metal chelating agent on partially purified enzyme. It was determined that MgCl2 increased ß-galactosidase activity at the rate of %16 at 8 mM, ZnCl2 and CuCl2 at 1 mM inhibited enzyne activity at the percentage of %99,5 and % 93,5 respectively, CaCI2 at 20 mM inhibited enzyme activity at the percentage of %62, metal chelating agent EDTA and 1,10-phenanthroline monohydrate didn?t inhibit enzyme. DTT and ß-mercaptoethanol at 10 mM increased enzyme activity at the rate of %37 and %24 respectively, PCMB at 4 mM inhibited at the rate of %52, Iodoacetamide at 20 mM inhibited at the percentage of %53, PMSF ve N-ethylenemaleimide didn?t inhibit enzyme.Glycerol and sobitol?s protective effect to freeze-solve process on partially purified enzyme was investigated in %1-5 concentrations. The best protective effect for sorbitol was %5 concentration. And it has been determined that in gliserol it has protected at %1, %83 percent, and %2- %5 %90 percent in concentrations.Thermal stability of the enzyme was investigated in 50 ºC -65 ºC temperature intervals. Enzyme had %90 activity at 50 ºC for 120 min. Enzyme protected its activity at 55 ºC for 120 min. Enzyme had %90 activity at 60 ºC for 120 min Enzyme lost all activity at 65 ºC in 20 min.The effect of glucose and galactose on enzyme activity was determined. 2-128mM concentratinos were invetigated. No inhibition effect of glucose on enzyme activity was observed. Galactose at 128 mM caused inhibition at the rate of %97. In order to detect the type of inhibition, 4mM, 16 mM and 32 mM at concentrations and determined enzyme concetration were used with 1-6mM ONPG concentrations. It has been determined that the Galactose had a racial inhibition effect on enzyme. For ONPG Km ve Vmax values of ONPG acording to Lineweaver?Burk plot was estimated as 3.52 mM and 1.602nµmol/dk.The rate of time related enzyme production in bacteria cultured between 12-96 hours was confirmed with non-denature polyacrylamid gel electrophorese.