Theileria annulata ile doğal enfekte sığırların dolaşımındaki Eksozomal Mikrorna'ların karakterizasyonu, ekspresyon profilleri ve fonksiyonel önemleri
Characterization, expression profiles and functional importance of Exosomal Micrornas in the circulation of naturally infected cattle with Theileria annulata
Yazar: SADULLAH USLU
Danışman: PROF. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Theileria annulata'nın (T. annulata) neden olduğu tropikal theileriosis, vektör kenelerle bulaşan ve tüm dünyada sığırlarda yüksek morbidite ve mortalite ile seyreden ekonomik öneme sahip bir protozoon hastalığıdır. T. annulata, sığır B lenfositleri ve miyeloid hücrelerde immortalizasyon, hiper proliferasyon ve yayılma ile karakterize kanser benzeri lökomlara transformasyona yol açma yeteneği ile öne çıkan yegâne bir protozoon parazittir. T. annulata'nın bu yeteneğini açıklamak üzere önce yapılmış çalışmaların çoğu parazit ile çeşitli transkripsiyon faktörlerinin yapısal aktivasyonu arasındaki ilişkiye odaklanmıştır. Diğer yandan eksozomlar ve içerdikleri microRNA'ların (miRNA) T. annulata'nın hücresel ve biyopatolojik gelişimi üzerindeki regülatör fonksiyonlarıyla ilgili olarak hücre kültürü temelinde sınırlı araştırmalar yapılmış ve bazı miRNA'ların önemli fonksiyona sahip olduğu gösterilmiştir. Diğer yandan T. annulata ile doğal enfekte sığırların dolaşımındaki eksozomal miRNA'lar üzerine günümüze kadar herhangi bir çalışma bulunmadığı dikkati çekmiştir. Bu araştırma açığına veri sağlamak amacıyla çalışmada T. annulata ile doğal akut ve subklinik enfekte sığırların dolaşımındaki eksozomal miRNA'ların araştırılması hedeflenmiş olup enfekte sığırlarda T. annulata enfeksiyonu ile ilgili olarak farklı ifade düzeyi sergileyen miRNA'ların bulunabileceği ve bunların da parazitin hücreleri invaze etmesi ve biyopatogenezindeki süreçlerle ilgili yolaklarda görev alan genlerin regülasyonunda önemli fonksiyonlara sahip olabileceği hipotez edilmiştir.
Bu kapsamda Kayseri'nin Develi ilçesine bağlı tropikal theileriosis'in endemik seyrettiği bölgelerden non-enfekte, akut ve subklinik enfekte gruplarının teşekkülü için sığırlardan örneklem gerçekleştirilmiş ve T. annulata yönünden teşhis paneli kullanılarak değerlendirmeleri yapılmıştır. Akut ve subklinik enfekte gruplara dahil edilen örneklerde T. annulata sporozoit yüzey proteini (TASP) genini içeren rekombinant plazmitler kullanılarak standartlar oluşturulmuş ve qPCR analizi ile örneklerdeki gen kopya sayısı belirlenerek parazit yükleri hesaplanmıştır.  Akut, subklinik ve non-enfekte gruplar için belirlenen 15 sığıra ait serum örneklerinin beşerli olarak birleştirilmesiyle (parazit yükleri temelinde) her grup için üç replikasyon oluşturulmuş ve serum örneklerinden eksozom izolasyonu gerçekleştirilmiştir.  İzole edilen eksozomların taramalı elektron mikroskobu (SEM), nanopartikül izleme analizi (NTA) ve Western blot analizleriyle karakterizasyonları sağlanmıştır.  Eksozomal miRNA'ların karakterizasyonu amacıyla yapılan yeni nesil dizileme (NGS) analizleri sonucunda çalışma gruplarında toplam 288 bilinen 164'te potansiyel yeni miRNA tespit edilmiştir. Biyoinformatik analizlerle non-enfekte ve enfekte gruplar arasında farklı ifade sergileyen toplam 15 miRNA belirlenmiştir. NGS analizlerinde artan ifade düzeyi önemli bulunan dört miRNA'nın (bta-miR-29d, bta-miR-122, bta-miR-124a ve bta-miR-136) sığırların dolaşımındaki ekspresyonel farklılıkları ayrıca qPCR analizleriyle teyit edilmiştir. Gen ontoloji ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) analiz sonuçları ilgili miRNA'ların T. annulata'nın hücreleri enfekte etmesi ve transformasyonunda önemli olduğu bilinen tümör büyüme faktörü-beta (TGF-beta) ve tümör nekroz faktör (TNF) sinyal yolakları başta olmak üzere serin/treonin kinaz ve mitojen aktivasyon protein kinaz (MAPK) yolaklarındaki genlerin regülasyonunda önemli görev aldığını göstermiştir. Çalışma ile ayrıca özellikle bta-miR-29d olmak üzere T. annulata ile enfekte sığırlarda ifade düzeyi önemli olan miRNA'ların hastalığın tanısında potansiyel yeni biyobelirteçler olabileceği de gösterilmiştir.

Anahtar kelimeler: Theileria annulata, Eksozom, miRNA, Biyobelirteç, Validasyon

Abstract:
Tropical theileriosis caused by Theileria annulate (T. annulata) is a protozoan disease transmitted by vector ticks, exhibiting high morbidity and mortality in cattle worldwide, thus holding economic significance. T. annulata is an important protozoan parasite characterized by the ability to transform into cancer-like leukocytes, leading to immortalization, hyper-proliferation, and dissemination in bovine B lymphocytes and myeloid cells. Previous studies explaining this capability have primarily focused on the relationship between the structural activation of various transcription factors and the parasite. On the other hand, limited research has been conducted on the basis of cell culture regarding the regulatory functions of exosomes and the miRNAs they contain on the cellular and biopathological development of T. annulata, and some miRNAs have been shown to have important functions. On the other hand, it is noteworthy that there is no study to date on exosomal miRNAs in the circulation of cattle naturally infected with T. annulata. To address this research gap, this study aims to investigate exosomal miRNAs in the circulation of naturally acute and subclinically infected cattle with T. annulata. The hypothesis is that there may be miRNAs with varying expression levels related to T. annulata infection, and these miRNAs could play important roles in regulating genes involved in the invasion of parasite cells and the biopathogenesis processes.
In this context, cattle samples were taken from the regions where tropical theileriosis is endemic in Kayseri's Develi district, to establish non-infected, acute, and subclinically infected groups, and they were evaluated using a diagnostic panel for T. annulata. Standards were created using recombinant plasmids containing the T. annulata sporozoite surface protein (TASP) gene in the samples included in the acute and subclinically infected groups, and parasite loads were calculated by determining the gene copy number in the samples with qPCR analysis. Three replications were created for each group by combining the serum samples of 15 cattle determined for the acute, subclinical, and non-infected groups (based on parasite loads) and exosome isolation was performed from the serum samples. The isolated exosomes were characterized using scanning electron microscopy (SEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and Western blot analysis.
Next-generation sequencing (NGS) analysis was conducted for the characterization of exosomal miRNAs. A total of 288 known and 164 potentially new miRNAs were identified across the study groups. Bioinformatic analyses revealed 15 miRNAs with differential expression between non-infected and infected groups. The increased expression levels of four miRNAs (bta-miR-29d, bta-miR-122, bta-miR-124a, and bta-miR-136) identified in NGS analyses were further confirmed by qPCR. The results of gene ontology and KEGG pathway analyses indicated that these miRNAs, particularly bta-miR-29d, are involved in the regulation of genes in signaling pathways such as TGF-beta and TNF, as well as serine/threonine kinases and MAPK pathways, which are known to be crucial in the infection and transformation of the infected cells with T. annulata.
The study also showed that miRNAs, whose expression levels are important in T. annulata-infected cattle, especially bta-miR-29d, may be potential new biomarkers in the diagnosis of the disease.

Key words: Theileria annulata, miRNA, Biomarker, Validation, Next Generation Sequencing.