Sirkadyen ritmin farede uterus üzerindeki etkisinin hippo sinyal yolağı üzerinden gösterilmesi
Demonstrating the effect of circadian RHYTHM on the uterus of the mouse via the hippo signaling pathway
Yazar: ELAZA ALIYEVA
Danışman: PROF. DR. AYLİN YABA UÇAR
Yeditepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Sirkadiyen ritim, insanlar da dahil olmak üzere tüm memelilerde birçok fizyolojik fonksiyonu koordine etmektedir. Dişi üreme sistemi, merkezi sirkadyen sistem tarafından düzenlenir. Yapılan araştırmalar ile sirkadiyen ritim genlerinin senkronizasyonunun üreme başarısı için kritik olduğu, ışık ve karanlık döngüsünde meydana gelen herhangi bir bozulmanın annenin uyku düzenini, embriyo gelişiminin erken aşamalarını, fetüsün gelişimini olumsuz olarak etkileyebileceği gösterilmiştir. Biz tez çalışmamızda, sirkadiyen ritim ile uterus arasındaki ilişkinin Hippo sinyal yolağı ve telomeraz aktivitesi ile bağlantılı olabileceğini hipotez ettik. Buradan yola çıkarak, sirkadiyen ritmin bozulduğu hayvanların uteruslarında Hippo sinyal yolağı bileşenleri ve mTERT ekspresyonunu göstermeyi amaçladık. Çalışmamızda, toplam 20 adet BalbC türü 6-8 haftalık dişi fare kullanarak iki grup oluşturduk (n=10). Kontrol grubu fareler bir hafta boyunca 12:12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde, deney grubu fareler bir hafta boyunca 12:12 saat aydınlık/aydınlık döngüsünde tutularak sirkadyen ritmin bozulması sağlanmıştır. Bir haftalık deney süresinin sonunda fareler diseke edilerek uterus dokuları izole edildi. Deneklerin sağ uterus boynuzu morfolojik analiz ve immünofloresan boyama yapmak üzere doku takibi için fiksatif içerisine alınırken, sol uterus dokusu kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PZR) yönteminde kullanılmak üzere izole edildi. İmmünofloresan yöntemi ile PER2, YAP1, TEAD4 ve mTERT lokalizasyonu belirlenirken, qRT-PCR yöntemi ile YAP1, TEAD4 ve mTERT ekspresyonları ile sirkadiyen ritim genleri BMAL1, CLOCK, PER2 ve CRY'in ekspresyonları mRNA düzeyinde gösterildi. Gruplar arasındaki tüm değerlendirmeler, ImageJ ve GraphPad programları kullanılarak yapıldı. Elde edilen veriler, student's t testi ile istatistiksel olarak değerlendirildi (p<0.05). Elde ettiğimiz bulgular ile, bir hafta boyunca 12:12 saat aydınlık/aydınlık döngüsünde tutulan sirkadyen ritmin bozulduğu uteruslarda; endometriyumun lümen epiteli kalınlığının deney grubunda kontrol grubuna kıyasla azaldığını, bez sayısı ve lümen çapının arttığını, miyometriyum kalınlığının azaldığını, endometriyum kalınlığı ve damar lümeni çapında ise anlamlı bir farklılık olmadığını belirledik. Hippo sinyal yolağı proteinleri YAP1 ve TEAD4'ün ekspresyonlarının deney grubunda arttığını ve mTERT ekspresyonunun azaldığını gösterdik. YAP1, TEAD4, mTERT, BMAL1, CLOCK, PER2 ve CRY'in ekspresyonları mRNA düzeyinde değerlendirildiğinde, YAP1, TEAD4, BMAL1, CLOCK ve PER2 ekspresyonlarının değişmediği, CRY ekspresyonunun arttığı ve mTERT ekspresyonunun azaldığı belirlendi. Sonuç olarak, sirkadiyen ritim bozulmasının farede uterus üzerindeki etkisinin, Hippo sinyal yolağı üzerinden gerçekleşebileceğini gösterdik. Tez çalışmamız sonucu elde ettiğimiz verilerin, gece vardiyasında çalışan kadınlarda, tekrarlayan ışık/karanlık değişimi veya jetlag benzeri durumlarda uterusun kendi sirkadiyen ritminin düzenlenmesinde Hippo sinyal yolağının önemli olabileceğini düşünmekteyiz. Sirkadiyen ritim bozulması neticesinde karşılaşılan açıklanamayan infertilitede, Hippo sinyal yolağı bileşenlerinin terapötik hedef olarak değerlendirilebileceğini önermekteyiz.
Anahtar kelimeler: Sirkadiyen ritm, Hippo sinyal yolağı, mTERT, Uterus.

Abstract:
The circadian rhythm coordinates many physiological functions in all mammals, including humans. The female reproductive system is regulated by the central circadian system. Studies have shown that the synchronization of circadian rhythm genes is critical for reproductive functions, and that any disruption in the light and dark cycle may adversely affect the mother's sleep pattern, early embryonic development, and the development of the fetus. In our thesis, we hypothesized that the relationship between the circadian rhythm and the uterus may be related to the Hippo signaling pathway and telomerase activity. Therefore, we aimed to show the Hippo signaling pathway components and mTERT expression in the uterus of animals with impaired circadian rhythm. In our study, we created two groups (n=10) using a total of 20 BalbC 6-8 weeks old female mice. In the control group, mouse caged on a 12:12 hour light/dark cycle for one week. In the experimental group mice, the circadian rhythm was disrupted by keeping the mice on a 12:12 hour light/light cycle for one week. At the end of the one-week experimental period, mice were dissected and uterine tissues were isolated. While the right uterine horn of the uterus was placed in fixative for tissue processing for morphological analysis and immunofluorescence staining, the left uterus tissue was isolated for use in quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). While PER2, YAP1, TEAD4 and mTERT localization were determined by immunofluorescence method, YAP1, TEAD4 and mTERT expressions and circadian rhythm genes BMAL1, CLOCK, PER2 and CRY were detected at mRNA level by qRT-PCR. All the comparisions between groups were performed using ImageJ and GraphPad programs. The obtained data were statistically evaluated with Student's t test (p<0.05). We determined that the thickness of the lumen epithelium of the endometrium decreased in the experimental group compared to the control group, the number of glands and lumen diameter increased, the thickness of the myometrium decreased, and there was no significant difference in endometrial thickness and diameter of vessel lumen. We showed that the expression of the Hippo signaling pathway proteins YAP1 and TEAD4 were increased in the experimental group and the expression of mTERT was decreased. When the expressions of YAP1, TEAD4, mTERT, BMAL1, CLOCK, PER2 and CRY were evaluated at the mRNA level, it was determined that YAP1, TEAD4, BMAL1, CLOCK and PER2 expressions did not change between groups, CRY expression increased and mTERT expression decreased in experimental group. In conclusion, we showed that the effect of circadian rhythm disruption on the mouse uterus may be mediated through the Hippo signaling pathway. We though that the Hippo signaling pathway may be important in regulating the circadian rhythm of the uterus in cases such as night shifts workers, repetitive light/dark changes or jetlag-like conditions in women. We suggested that Hippo signaling pathway components may be considered as therapeutic targets in unexplained infertility as a result of circadian rhythm disruption.


Keywords: Circadian rhythm, Hippo signaling pathway, mTERT, Uterus.