Normal oksijen ve hipoksik koşullarda VEGF sitokininin ADAMTS-2 ve ADAMTS-3 genlerinin ifadeleri üzerinde etkisi
Effect of VEGF cytokinine on ADAMTS-2 and ADAMTS-3 genes expression in normal oxygen and hypoxic conditions
Yazar: CANDAN AKDIR
Danışman: PROF. DR. FERAY KÖÇKAR ; DR. ÖĞR. ÜYESİ MELTEM ALPER
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Anjiyogenez süreci, hem normal şartlarda hem de hipoksik koşullarda VEGF gibi hücre proliferasyonunu sağlayan büyüme faktörleriyle beraber gerçekleşen bir süreçtir. Bu tez çalışmasının amacı, endotel hücre modeli olan HUVEC hücrelerinde normal ve düşük oksijen koşullarında VEGF sitokininin pro-kollajen N-propeptidaz üyeleri olan ADAMTS-2 ve ADAMTS-3 genlerinin regülasyonuna etkilerinin belirlenmesidir. ADAMTS-2 ve ADAMTS-3 genlerinin Saos-2, MG63, HUVEC hücre hatlarında mRNA seviyeleri belirlenmiştir. Buna göre HUVEC hücre hattında en fazla ifade olan üyenin ADAMTS-3 olduğu belirlenmiştir. Hipoksik ve normoksik koşullar karşılaştırıldığında mRNA seviyeleri ve farklı promotor parçalarıyla yapılan geçici transfeksiyon deneyleriyle elde edilen transkripsiyonel aktivite çalışmalarından, hipoksik koşullarda bu genlerin ekspresyonlarının arttığı belirlenmiştir. VEGF uygulanan HUVEC hücrelerinde ADAMTS-2 ve ADAMTS-3 promotor parçalarının transkripsiyonel aktivitelerinin normal oksijen koşullarında daha az hipoksik koşullarda daha fazla olduğu belirlenmiştir. VEGF artışının hangi hücre içi yolaktan gerçekleştirildiğinin belirlenmesi için yapılan çalışmalarda normal oksijen ve hipoksik koşulların farklı hücre içi yolakları kullandığı tespit edilmiştir. Bu doğrultuda ADAMTS-2 ve ADAMTS-3 genlerinin normoksik koşullarda PI3K ve p38 yolaklarını kullandığını anlamlı sonuçlarla belirlenmiştir. Hipoksik koşullarda ise ise VEGF regülasyonunun ADAMTS-2 geninde MAP kinaz, ADAMTS-3 geninde ise MAP kinaz, jnk ve p38 yolaklarıyla gerçekleştiği belirlendi. Hipoksik koşullarda ki ifadelerin normoksik koşullara göre fazla olması göz önüne alınarak EMSA deneyleri yapıldı. ADAMTS-2 promotorunun  [-379/-348] bölgesinde ADAMTS-3 promotorunun ise  [-969/-1000] bölgesinde Saos-2 hücrelerinde, [-644/628] bölgesinde hem Saos-2 ve HUVEC hücre hattında hem normoksik hemde hipoksik koşullara HIF-1α transkripsiyon faktörünün bağlanma bölgesinin olduğu belirlendi.

Abstract:
The angiogenesis is a process which occurs together with growth factors that provide cell proliferation, such as VEGF, under both normal conditions and hypoxic conditions. The aim of this thesis is to determine the effects of VEGF cytokine on the regulation of ADAMTS-2 and ADAMTS-3 genes, which are pro-collagen N-propeptidase members, in normal and low oxygen conditions in HUVEC cells, the endothelial cell model. The mRNA levels of the ADAMTS-2 and ADAMTS-3 genes were determined in the Saos-2, MG63, HUVEC cell lines. Compared with hypoxic and normoxic conditions, the transcriptional activity studies obtained by transient transfection experiments with different promoter fragments and mRNA levels showed that expression of these genes increased under hypoxic conditions. It has been determined that the transcriptional activity of the ADAMTS-2 and ADAMTS-3 promoter fragments in HUVEC cells treated with VEGF is more in hypoxic conditions, which is less pronounced in normal oxygen conditions. It was determined that the transcriptional activities of the ADAMTS-2 and ADAMTS-3 promoter fragments in HUVEC cells treated with VEGF were higher in hypoxic conditions than in normal oxygen conditions. In studies to determine which intracellular pathway of VEGF uptake was carry out, it was determined that normal oxygen and hypoxic conditions use different intracellular pathways. In this respect, ADAMTS-2 and ADAMTS-3 genes were identified with meaningful results using the PI3K and p38 pathways under normoxic conditions. In hypoxic conditions, it was determined that VEGF regulation is via MAP kinase pathway in ADAMTS-2 gene and MAP kinase, jnk and p38 pathway in ADAMTS-3 gene. EMSA experiments were carried out considering that the expressions in hypoxic conditions were more than normoxic conditions. In the region of the ADAMTS-2 promoter [-379 / -348] in the Saos-2 cells, in the region of the ADAMTS-3 promoter [-969 / -1000] in the Saos-2 cells and in the region of ADAMTS-3 promoter[-644/628] in the Saos-2 and HUVEC cell lines was found to be the binding site of the HIF-1α transcription factor in normoxic and hypoxic conditions.