Deneysel diyabetik kardiyomyopati modelinde leptinin kalbin potasyum kanal tipleri üzerine etkisi
The effects of leptin on cardiac potassium channel types in an experimental diabetic cardiomyopathy model
Yazar: MURAT ŞİMŞEK
Danışman: PROF. DR. MEHMET  ÖÇ
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kalp ve Damar Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi = Thoracic and Cardiovascular Surgery
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Kalp = Heart ; Kalp hastalıkları = Heart diseases ; Kardiyomiyopatiler = Cardiomyopathies ; Leptin = Leptin ; Potasyum = Potassium

Özet:
Diyabetin en sık görülen endokrin hastalıklardan biri olduğu bilinmektedir. Diyabetin temelinde genetik yatkınlığın olduğu bilinse de görülme sıklığı obeziteprevalansındaki artışla birlikte yükselmektedir. Patofizyolojisi,  karaciğerde, yağ dokusunda ve kas dokusundaki insülin direnci ve pankreastaki beta hücrelerinden bozulmuş insülin sekresyonu ile karakterize edilmektedir. Diyabetin yaratmış olduğu ikincil gelişimleri incelemek için sıklıkla kullanılan deneysel diyabet modelleri, insanda gözlenen patolojik bulgulara benzer bulguların moleküler mekanizmasını anlamak ve olası tedavi olanaklarının kolayca çalışmasına olanak tanımaktadır. Bizim çalışmamızda da diyabetik kardiyomiyopatide gözlenen uyarılma-kasılma çiftleminin, uyarılma basamağına dair diyabet kaynaklı elektriksel yeniden modellenme üzerine farklı doz ve süreler için leptininkübasyonunun etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. 
Çalışmamız Selçuk Üniversitesi Deney Hayvanları Etik kurul izni (2015/91) alındıktan sonra Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim Dalı araştırma Laboratuvarı ve Selçuk Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarında yapıldı. Deneyler için erkek ve ağırlıkları 200-250g arasında olan yetişkin (2,5-3 aylık) sıçanlar rastgele seçildi. Sıçanlar deney süresince (beş hafta) kafes başına üç hayvandan fazla olmamak koşuluyla standart sıçan yemi ve su kısıtlaması olmaksızın beslendi. Deneysel yoldan diyabet oluşturmak için intraperitonealstreptozosin (STZ) kullanıldı. Enjeksiyondan yedi gün sonra kan şekerleri 300 mg/dl ve üstünde olan sıçanlar diyabetik (DM, N=8) olarak değerlendirildi. Bu kan şekeri değerine ulaşmamış sıçanlar deneye alınmadı. Sitrat tamponu tek doz i.p. olarak enjekte edilmesinden sonraki beşinci hafta içinde elektrofizyolojikölçümler için kullanıldı ve bu hayvanlar kontrol grubu (Kon, N=8) olarak kabul edildi. Beş haftalık deney süresi sonunda kalpleri çıkartılıp soğuk ve Ca+2'suz çözelti içerisine konuldu. Kollajenaz eklenmiş aynı içerikli çözelti ile perfüze edilerek hücre izolasyonu yapıldı. İzole edilen hücreler 37°C'de kayıt işlemlerinden önce bir saat inkübe edildi. Potasyum akımlarının kayıtları patchclamp tekniğinin tüm hücre voltaj kenetlemesi modunda gerçekleştirildi. Tüm kayıtlar detaylı analiz için bilgisayara kaydedildi. Potasyum akımları (Itof, Itos ve IKl) patch amplifikatörü her7 saniyede bir kaydedildi ve akım eğrileri 5 kHz'dedijitalize edildi. İzole edilen kardiyomiyositler her iki grup deney hayvanından elde edilen kardiyomiyositler için 1 saat ve farklı üç doz (0,1, 0,5 ve 1 nM) için 37°C'deinkübasyonu takiben akım kayıtları gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± sem olarak ifade edildi. İkili karşılaştırılmalar için Student t testi kullanıldı ve p˂0,01 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. 
Ölçüm yapılan parametreler arasında kilo kazanımı açısından her hangi bir farka rastlanmadı. Kan şekeri ölçüm değerlerinde aynı yaş kontrol grubu deney hayvanlarına göre istatistiksel anlamlı bir artış olduğu bulundu. Geçici dışarı doğru potasyum akımının hızlı bileşeni (It0f) diyabetik grupta yapılan bu akım değerlerini neredeyse yarı yarıya azalırken leptininkübasyonun doz bağımlı olarak bir geriye dönüş oluşmasına neden olduğu izlendi. Diyabet sürecinde ölçüm yapılan akımlarda azalma bulunurken leptinile 1 saatlik inkübasyonsonrası doza bağımlı olarak akımlarda artış izlendi. IK1 akımında ise diyabetle azalmış olan akım üzerinde ciddi bir düzelme görülmedi. 
Sonuç olarak; uygulanması önerilen doz ve süre (0,1, 0,5 ve 1 nM 1 saat) ile antioksidan yolağında gözlenen olumlu etkileri ile kalp kası kasılması üzerinde depresyona neden olan patolojik durumlarda olumlu etkileri gözlenen leptin yine diyabet kaynaklı uyarılma basamağına ilişkin kardiyak problemler içinbir tedavi yöntemi olarak görülmektedir.Sadece olumlu etkileri olduğuna ilişkin işaretler sunan invitroleptin uygulaması için gözlemlenen olumlu yanıtların daha detaylı araştırılması gerektiği kanısındayız.

Abstract:
It is known that diabetes is one of the most common endocrine disorders. Although genetic predisposition is known to be one of the factors in the basis of diabetes, the incidence of diabetes is growing with the increase in the prevalence of obesity. The pathophysiology of diabetes is characterized by insulin resistance in liver, fat and muscle and defective insulin secretion in the pancreatic beta cells. Experimental diabetes models commonly used to investigate the seconder progressions due to diabetes allow to understand molecular mechanisms of pathological signs similar with seen in human and simply to study the possible therapeutic options. In our study it was aimed to investigate the effects of incubation of leptin on electrical remodeling related diabetes in extraction-contraction coupling seen with diabetic cardiomyopathy regarding extraction step for different dosages and timing. 
Our study was performed in Selcuk University Research Laboratories of Biophysics Department and Experimental Medicine Application And Research Center after ethical committee approval (2015/91). Adult male Vistar rats weighing 200-250 gr were chosen randomly and put into cages with no more than three rats in one cageduring the study (5 weeks). Intraperitonealstreptozotocine was used to induce diabetes. The rats were considered diabetic in whom blood sugars were ≥300 mg/dL 7 days after the injection (Group DM, n=8). The rats that blood sugar <300 mg/dL were excluded from the study. Citrate buffer was used for electro-physiologic measurements after single dose intraperitoneal injection at the 5th week and these rats were considered as control group (Group Kon, n=8). End of the 5 weeks the hearts were executed and put into cold calcium free solutions. Cells were isolated after perfusion with the same solution consists collagenase. The isolated cells were incubated for one hour at 37°C before taking records. The potassium channel recordings (It0f, It0s, and IKI) were performed with whole-cell patch clamp technique. Flow of potassium ions was recorded at every 7 seconds with patch amplifier and flow curves were digitalized at 5 kHz. After incubation for 1 hour and 3 different dosages (0.1, 0.5, 1 nM) at 37°C, flow recordings were performed for cardiomyocytes isolated from both groups. Data were expressed as mean± standard deviation. Student t test was used for two means and p< 0.05 was considered statistically significant.
Beyond measured parameters there was no statistically difference regarding weight gain. There was statistically significant increase at blood glucose level in DM group when compared with control group. While in diabetic group flow of It0fwere reducing half, after leptin incubation a dose-dependent increase in flow was seen. While during diabetic course all flows were decreased, after leptin incubation a dose-dependent increase was seen. In IKI flow, no significant recovery was seen on the decreased flow rate due to diabetes. 
As conclusion, leptin that has positive effects with proposed dosage and usage time (0.1, 0.5, and 1 nM for 1 hour) with the favorable effects in anti-oxidant pathway on pathologic conditions that have depressant effects on myocard contraction, can be seen as a therapeutic agent in diabetes based excitation stepcardiac problems. We think that there is need for further investigations regarding in vitro leptin application that shows only positive effects.