Beyin-omurilik sıvısı şantlarında bakteriyel kolonizasyonun önlenmesi
Preventation of bacterial colonization on cerebrospinal fluid shunts
Yazar: EBRU AKDOĞAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET MUTLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Plazma polimerleşmesi = Plasma polymerization

Özet:
Bu çalışmanın amacı, plazma polimerizasyonu (PP) yöntemi ile beyin-omurilik sıvısı şantlarında bakteriyel kolonizasyonun engellenmesini sağlayan amfoterik özellikte yüzeyler geliştirilmesidir. Bu amaçla, ticari olarak mevcut silikon kateterler (Si), PP yöntemi ile dietil fosfit (DP) ve dietil alil fosfat (DAP) monomerleri kullanılarak farklı PP parametrelerinde modifiye edilmiştir. Modifiye edilen kateterler, yüzey ait-az özellikleri, yüzeye protein tutunması, yüzeye tutunan proteinlerin ikincil yapılarındaki değişimlerin belirlenmesi, sterilizasyona dirençleri, sitotoksisiteleri, in-vitro ve in-vivo bakteri tutunması özellikleri açısından değerlendirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında PP yöntemi ile tek monomer kullanılarak Si yüzeylerine amforterik özellik kazandırlabileceği gösterilmiştir. Yüzeylerin asit-baz oranlarının PP parametrelerinin değiştirilmesi ile ayarlanabileceği belirlenmiştir. FTIR-ATR analizleri, her iki monomerle modifiye edilen yüzeylerde söz konusu yüzeylere asidik özellik veren fosofrik asit-OH ve Si-OH grupları ve bazik özellik veren fosfin (-PH3) gruplarının varlığını göstermiştir. Protein tutunmasının belirlenmesi amacıyla, model protein olarak sığır serum albumini (BSA) kullanılmıştır. PP ile farklı parametrelerde modifiye edilen yüzeyler ile Si yüzeyi kıyaslandığında, protein tutunmasının en yüksek oranda azaltıldığı yüzeyler, amfoterik özellikteki PP-DP (100W5dk) (%93'lük indirgenme) ve PP-DAP (100W5dk) (%92'lik indirgenme) olarak tespit edilmiştir. Bu üç yüzeye adsorplanan BSA'nın ikincil yapısı incelendiğinde, PP modifiye yüzeylere adosorplanan BSA'nın ikincil yapısını, Si yüzeyine adsorplandığı duruma göre daha iyi koruyabildiği görülmüştür. PP-DP (100W5dk) modifikasyonlu üzerine etilen oksit (EtO) ve otoklav sterilizasyonunun etkisi, FTIR-ATR ve su temas açısı (STA) analizleri ile belirlenmiştir. Buna göre her iki sterilizasyon yönteminin de modifiye yüzeylerin STA değerlerinde veya kimyasal yapılarında önemli değişikliklere yol açmadığı belirlenmiştir. Model mikroorganizma olarak Staphylococcus epidermidis' in kullanıldığı in-vitro bakteri tutunma testleri, Si, PP modifiye yüzeyler ve antibiyotik (rifampicin) yüklenmiş kateter (Si-Antb) için gerçekleştirilmiştir. Buna PP-DP (100W5dk) ve Si-Antb yüzeylerinde bakteri tutunmasının sırasıyla % 98,7 ve % 89,3 oranında azaltıldığı gözlemlenmiştir. Sitotoksisite çalışmaları, L929 hücreleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Buna göre PP-DP (100W5dk) yüzeyinin sitotoksik özellik göstermediği anlaşılmıştır. İn-vivo bakteri tutunması testleri, Spraque Dawley cinsi ratlar kullanılarak gerçekleştirlmiştir. Önden 2x108 cfu/mL Staphylococcus epidermidis içerisinde üzerlerine bakteri tutundurulan Si, PP-DP (100W5dk) ve Si-Antb malzemeleri ratların deri altına açılan ceplere yerleştilmiş ve 72 saat sonunda çıkartılarak yüzeylere tutunan bakteri sayısı belirlenmiştir. Buna göre bakteri tutunmasının azaltılmasında PP-DP (100W5dk) modifikasyonunun, kateterlere antibiyotik yüklenmesi ile aynı derecede etkili olduğunu ve Si yüzeyinden daha düşük oranda kolonizasyon meydana geldiği görülmüştür. Bu örneklerin SEM görüntüleri ise Si ve Si-Antb yüzeylerde biyofilm oluşumunu gösterirken PP-DP (100W5dk) yüzeyinde biyofilm oluşumu görülmemiştir.Sunulan çalışma ile, amfoterik özellikte yüzeyler PP yöntemi ile tek monomerli sistemde geliştirilmiş ve bu yüzeylerin beyin-omurilik sıvısı şant kateterlerinde bakteriyel kolonizasyonu engellemek amacıyla kullanılabileceğini gösterilmiştir.

Abstract:
The aim of this study is the development of amphoteric surfaces that resists bacterial colonisation via plasma polymerisation (PP) technique. For this purpose, commercial silicone catheters (Si) were modified with PP using diethyl phosphite (DP) and diethyl allyl phosphate (DAP) as precursors at different PP parameters. Modified catheters were characterised by the means of their surface acid-base properties, protein adsorption, and the conformational changes of proteins upon surface adsorption, sterilisation endurance, cytotoxicity, in- vitro and in-vivo bacterial attachment. The first part of the study showed that amphoteric surfaces can be generated using a single monomer via PP technique and that the surface acid-base ratios can be adjusted with PP parameters. FTIR-ATR studies showed that modification with both monomers produced acidic phosphorous acid-OH and Si-OH groups on the surfaces and basic phoshine (PH3) groups on the surfaces. For the protein adsorption studies, a model protein bovine serum albumin (BSA) was used. The highest reduction of BSA adsorption compared to Si surface was found to be for the PP-DP (100W5min) (93% reduction) and PP-DAP (100W5min) (92% reduction) surfaces. When the secondary structure of BSA adsorbed to these surfaces was investigated, it has been found that BSA protects its secondary structure upon adsorption on PP modified surfaces better than the Si surface. The effect of sterilisation on PP modified surfaces was investigated By FTIR-ATR and water contact angle (WCA) measurements. It has been shown that ethylene oxide (EtO) and autoclave sterilisation did not cause significant changes on the WCA or the chemical composition of the PP-DAP (100W5min) and PP-DP (100W5min) surfaces. In-vitro bacterial attachment studies were performed on Si, PP-DAP (100W5min), PP-DP (100W5min) and antibiotic (rifampicin) impregnated surfaces using Staphylococcus epidermidis as the model microorganism. It has been shown that on the Si-Antb and PP-DP (100W5min) surfaces, the bacterial adherence was reduced 89,3 % and 98,7 % respectively. Cytotoxicity of PP-DP (100W5min) surface was investigated using L929 cells. PP-DP (100W5min) surfaces showed no cytotoxic properties. In-vivo bacterial attachment test were performed using Spraque Dawley rats. Si, DP (100W5min) and Si-Antb catheters were preseeded with 2x108 cfu/ml Staphylococcus epidermidis and were inserted on subcutaneous pockets of the rats. After 72 hours catheters were removed and the bacteria attached on their surfaces were counted. It has been shown that the total reduction for PP-DP (100W5min) surface and Si-Antb surfaces were the same and less than the Si surface. SEM images showed that although the bacterial count were the same for PP-DP (100W5min) and Si-Antb surfaces, Si-Antb surfaces was covered with biofilm while no biofilm was observed for PP-DP (100W5min) surface.With this study it has been shown that surfaces with amphoteric properties can be generated using PP technique with a single monomer system and that those surfaces can be used for the preventation of bacterial colonisation on CSF shunts.