Bazı sitokinlerin insan kolon kanseri hücrelerinde CAIX ifade düzeylerine etkilerinin belirlenmesi
Determination of the effects of some cytokines on CAIX expression levels in human column cancer cells
Yazar: RAHŞAN ILIKÇI SAĞKAN
Danışman: DOÇ. DR. FERAY KÖÇKAR ; PROF. DR. ALİ ŞENGÜL
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Karbonik anhidrazlar (CA), karbon dioksitin hidratasyonunu geri dönüşümlü olarak katalize ederler. Transmembran protein CAIX, CA ailesinin tümörle ilişkili bir üyesidir. CAIX ekspresyonu, bazı tümör hücreleri oldukça yüksek ekspresyon düzeyinde iken, normal dokularda oldukça sınırlıdır. CAIX, hipoksi, malin hücre invazyonu ve hücre proliferasyonunun regülasyonunda önemli rol oynarlar.Bu çalışmada, farklı konsantrasyonlarda TNF?, TGFß, IL1? ve bu sitokinlerin ikili kombinasyonları uygulanmış HT-29 kolon karsinoma hücrelerinde CAIX protein ve mRNA ekspresyon seviyeleri araştırılmıştır. CAIX protein ekspresyonu, CAIX-FITC monoklonal antikor kullanılarak akış sitometrisinde saptanmıştır ve ?gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu?, mRNA ekspresyon seviyeleri için kullanılmıştır. Buna ilaveten, bu sitokinlerin etkisi, HT?29 hücrelerinde akış sitometri kullanılarak, propidyum iyodid ile hücre döngüsü, ?AnnexinV-FITC apoptozis saptama kiti? ile hücre canlılığı, nekroz ve apoptozis, araştırılmıştır.TNF? uygulanmış HT?29 hücreleri, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, mRNA ve protein seviyesinde CAIX ekspresyonunda, zamana bağlı olarak istatistiksel olarak önemli bir azalışa neden olmuştur. TNF?,-IL1?, TNF?-TGFß ikili kombinasyonları, HT?29 hücrelerinde sinerjistik etkiyle CAIX ekspresyon seviyesinde daha fazla bir düşüşe sebep olmuştur. Buna ilaveten, tek başına TNF? ve kombinasyonlarının hücre döngüsü analizi, hücrelerin G0/G1 tutuklandıklarını ve hücre canlılığında azalış, hücre nekrozunda artışı göstermiştir. Diğer taraftan, TGFß uygulaması, CAIX protein ve mRNA seviyesinde artışla sonuçlanmıştır. Fakat hücre döngüsü, hücre canlılığı ve nekroz/apoptozis üzerinde bir değişim gözlenmemiştir. Benzer şekilde, IL1? ve IL1?-TGFß kombinasyonu uygulanmış HT?29 hücrelerinde CAIX ekspresyonu ve hücre döngüsü analizinde anlamlı bir etki bulunmamıştır.ANAHTAR SÖZCÜKLER: CAIX, ekspresyon, sitokin, TNF?, IL1?,TGFß, hücre döngüsü, hücre canlılığı, akış sitometrisi, Gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Abstract:
The carbonic anhydrases (CAs) catalyze the reversible hydration of carbon dioxide. CAIX, transmembrane protein is a tumor associated member of the CA family. CAIX expression is very limited in normal tissue whereas some tumor cells exhibit very high expression. CAIX play important roles in hypoxia, malignant cell invasion and the regulation of cell proliferation.In this study the CAIX protein and mRNA expression levels in HT?29 colon carcinoma cells treated with different concentrations of TNF?, TGFß, IL1? and double combinations of these cytokines were investigated. CA IX protein expression was detected by CAIX-FITC monoclonal antibody by flow cytometry and Real time Polymerase Chain Reation was used for mRNA expression levels. In addition, the effect of these cytokines was investigated in cell cycle by propidium iodide, cell viability, necrosis and apoptosis by ?AnnexinV-FITC apoptosis detection kit? in using flow cytometry in HT?29 cells.TNF? led to statistically significant decrease in CAIX expresion protein and mRNA level in time-dependent manner in HT?29 cells compared to control cells. Double combinations of TNF?/IL1? and TNF?/TGFß caused more decrease in CAIX expression level suggesting their synergistic effect in HT?29 cells. In addition, cell cycle analysis of TNF? in single and combinations showed G0/G1 arrest and decrease of cell viability, the increase cell necrosis. On the otherhand, TGFß result in increase in CAIX mRNA level and protein level but no change in cell cycle, cell viability and necrosis/apoptozis. .Similarly, no significant effect in CAIX expression and cell cycle analysis was observed in IL1? and combinations of IL1?/TGFß treated HT?29 cell.KEY WORDS: CAIX, expresssion, cytokines, TNF?, IL1?,TGFß, cell cycle, cell viability, flow cytometry, Real time Polymerase Chain Reaction