Yeni bir tedavi olarak in vitro ve farede in vivo metastatik meme kanseri modellerinde nav1.5 kanalının hedeflenmesi
Targeting of nav1.5 channel in metastatic breast cancer models in vitro and in vivo mice as A novel therapy
Yazar: MÜMİN ALPER ERDOĞAN
Danışman: PROF. DR. FERDA BELGE
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Lipozomlar = Liposomes ; Meme kanseri =   ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; RNA = RNA ; Sodyum kanalları = Sodium channels

Özet:
Kansere karşı açılan savaşta terapötik amaçla potansiyel gücü ve popülaritesi artan yeni tedavi girişimlerin geliştirilmesi ve etkinliğinin incelenmesi hem dünya hem de ülkemiz için büyük önem arz etmektedir. İyon kanalları kanser hücresinde proliferasyon, apoptozis, migrasyon, anjiyogenez ve metastaz ile ilişkilendirilmektedir. Özellikle Nav1.5 kanalının in vitro yüksek metastatik potansiyel ve in vivo olarak meme kanseri gelişimiyle ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Meme kanseri gelişiminde ve metastatik yolaklar ile ilişkili hücre içi olayları etkilemede Nav1.5 kanalının özellikle neonatal izoformundaki ekspresyon ve aktivite artışının önem taşıdığı belirtilmiştir. Ancak bu konuda kanalın meme kanserine olan etkilerine ilişkin detaylı bir mekanizma ve hücre içi protein değişimlerini değerlendiren ayrıntılı bir çalışma bulunmamaktadır.
Tez çalışmamızda meme kanseri gelişimi ve metastazı üzerinde Nav1.5 kanalının Adult ve Neonatal alt tiplerinin olası rolleri ve etkileri değerlendirildi. Bu amaçla kanala spesifik siRNA ile gen susturma yöntemi kullanıldı. İn vitro deneyler olarak hücre proliferasyonu testi, koloni oluşturma kapasitesi, invazyon ve migrasyon yeteneği ile ilişkili testler, flow sitometri ile apoptoz ve hücre siklusu analizi, kemoterapötik dirençliliğine olan etkiler, tüm bunlar ile ilişkili protein yolakların değerlendirilmesi için Western blot analizi ve kanal tiplerinin mRNA ekspresyonları için Real-Time ve RT-PCR deneyleri gerçekleştirildi. In vivo ksenograft ortotopik meme kanseri modeli ve ksenograft akciğer metastaz modeli gerçekleştirilerek nanolipozomal taşıyıcılar içindeki Nav1.5 siRNA tedavilerinin hem meme kanseri tümör büyümesi hem de metastaz kapasitesi üzerine olan etkileri değerlendirildi.
Çalışmamızda MDA-MB-231 hücre hattında MCF7'a göre Adult ve Neonatal Nav1.5 mRNA ekspresyonunun daha yüksek düzeyde olduğu ayrıca bu iki tipe spesifik siRNA'ların kanalı etkin bir şekilde downregüle ettiği PCR ve Western blot yöntemleri ile tespit edildi. MDA-MB-231, MDA-MB-468 ve MCF7 meme kanseri hücre hatlarında Spesifik Nav1.5 siRNA tedavilerinin meme kanseri hücrelerinin proliferasyon düzeyleri ve koloni oluşturabilme yeteneklerinde önemli düzeyde azalma gerçekleştirdiği belirlendi. Ancak Nav1.5 siRNA'larının normal meme epiteli hücre hattı MCF10A üzerinde hücre proliferasyonunu azaltıcı ve sitotoksik etkilere sahip olmadıkları tespit edildi. MDA-MB-231 hücre hattında spesifik Nav1.5 siRNA tedavilerinin standart bir kemoterapötik olan paklitaksel ile kombinasyonlarının ilacın etkinliğini artırdığı ve ilaç dirençliliğini azalttığına ilişkin bulgular tespit edildi. Bu sonuçların yanısıra Nav1.5 siRNA'larının metastatik meme kanseri hücre hatları MDA-MB-231 ve MDA-MB-468'de meme kanseri hücrelerinin invazyon, migrasyon ve yara iyileşmesi migrasyonu kapasitelerini önemli ölçüde azalttığı gözlendi. MDA-MB-231 hücre hattında bu siRNA'ların hücrelerde apoptoz düzeylerinde artış şekillendirdiği ve hücre siklusunda G1 arrestine neden olduğu flow sitometri yöntemi ile belirlendi. İn vitro MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 hücre hatlarında Nav1.5 siRNA'larının tüm bu etkilerine ilişkin hücre içi mekanizmalarda görev alan proteinlerin ekspresyon düzeylerinde önemli azalmalar gözlendi. In vivo olarak da MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 Ksenograft ortotopik meme kanseri modellerinde spesifik Nav1.5 siRNA tedavilerini alan gruplarda tümör büyüklüğünde ve tümör ağırlığında önemli düzeyde azalma görüldü. Bunun yanısıra MDA-MB-231 Ksenograft akciğer metastaz modelinde de aynı tedavi gruplarında akciğerlerdeki tümör metastazı büyüklüğünde ve birim alan başına düşen foton sayısında önemli düzeyde azalma tespit edildi.
Tüm bu sonuçlar ile Nav1.5 kanalının meme kanseri metastazında, gelişimi ve progresyonunda önemli bir role sahip olduğu ortaya konuldu. Çalışmamız birçok konuda ortaya koyduğu veriler ile literatürde ilk olması bakımından önem arz etmektedir. Böylece kansere karşı savaşta bu yeni tedavi yaklaşımının etkinliğinin ve ayrıntılarının ortaya çıkmasıyla meme kanserinin organizmadaki yayılımını ve iletişimini keserek onu kronik bir hastalık haline dönüştürebilmek, rutin tedavilerin etkinliğini artırabilmek, yapılacak yeni çalışmalar ile meme kanserini tamamen yenebilmek mümkün olabilecektir.

Anahtar Kelimeler: Nav1.5, Nanolipozom, Meme kanseri, Metastaz/İnvazyon, siRNA.

Abstract:
Development and examination of the effectiveness of new therapeutic interventions which the potential strength and popularity are growing for therapeutic purposes in the fight against cancer have great importance for both our country and the world. Ion channels are associated with proliferation, apoptosis, migration, angiogenesis and metastasis in cancer cell. It has been found that especially Nav1.5 is associated with high metastatic potential in vitro and the development of breast cancer in vivo. The importance of an increase in Nav1.5 channel especially the neonatal isoform expression and activity for influencing the intracellular events that are associated with breast cancer development and metastatic pathways was mentioned. Nevertheless, there is not a detailed study that evaluates intracellular protein changes and elaborative mechanism about the effects of the channel protein on breast cancer.
Possible roles and effects of neonatal and adult subtypes of the Nav1.5 channel on breast cancer development and metastasis were evaluated in our study. In this study, gene silencing method by channel-specific siRNA was used. As in vitro experiments, cell proliferation test, colony formation capacity, tests associated with invasion and migration ability, apoptosis and cell cycle analysis by flow cytometry, the effects on chemotherapeutic resistance, western blot analysis for the evaluation of protein pathways that are associated with all these effects and Real-Time/RT-PCR experiments for mRNA expression of channel types were performed. Effects of Nav1.5 siRNA treatments in nanolipozomal carriers on both tumor growth and metastasis capacity of breast cancer were evaluated by performing xenograft orthotopic breast cancer model and xenograft lung metastasis model in vivo.
In our study, expression of Adult and Neonatal Nav1.5 mRNAs are higher levels in MDA-MB-231 cell line compared to MCF7 and siRNAs that are specific to these two types downregulates the channel effectively were detected by PCR and Western blot methods. Specific Nav1.5 siRNA treatments realize a significant reduction in proliferation levels and colony formation abilities of breast cancer cells in MDA-MB-231, MDA-MB-468 ve MCF7 breast cancer cell lines were determined. However Nav1.5 siRNAs have not effects that are reducing cell proliferation and cytotoxic on normal breast epithelium cell line MCF10A were identified.   Findings in relation with combinations of specific Nav1.5 siRNA treatments with a standard chemotherapeutic drug Paclitaxel increase the efficacy of the drug and reduce the drug resistance in MDA-MB-231 cell line were found. In addition to these results, it was observed that specific Nav1.5 siRNAs reduce significantly invasion, migration and wound-healing capacities of breast cancer cells in metastatic breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-468. In MDA-MB-231 cell line, these siRNAs increase the level of apoptosis and cause G1 arrest in cell cycle on cells were determined by flow cytometry method. İn vitro in MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cell lines, significant reductions in the level of expression of the proteins that are involved in intracellular mechanisms regarding to all these effects of Nav1.5 siRNAs were observed. As in vivo experiments in MDA-MB-231 and MDA-MB-468 xenograft orthotopic breast cancer models, significant decrease in tumor size and tumor weight was seen in specific Nav1.5 treatment groups. On the other hand also in MDA-MB-231 xenograft lung metastasis model, significant decrease in size of tumor metastasis and photon counts per area in the lungs was found in same treatment groups. 
It was revealed with all these results that Nav1.5 channel has an important role in the metastasis, development and progression of breast cancer. Our study is of great importance in terms of being the first in the literature with the data that has revealed on many issues. Thus, with the appearance of effectiveness and details of this new treatment approach in the battle against cancer, it will be possible to transform it into a chronic disease by cutting off propagation and communication of breast cancer in organism, to increase the effectiveness of routine treatments and to completely defeat breast cancer by new studies to be made.

Key Words: Breast cancer, Nanoliposome, Nav1.5, Metastasis/Invasion, siRNA.