Ratlarda intrakameral karbakolun korneada oksidatif stres ve apoptozise etkisinin araştırılması
Investigation of the effects of intracamaral carbachol on oxidative stress and apoptosis in rats cornea
Yazar: ÖMER FARUK YILMAZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ALİ AKAL
Harran Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Göz hastalıkları = Eye diseases ; Kaspazlar = Caspases ; Kornea = Cornea ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Parasempatolitikler = Parasympatholytics ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Giriş: Katarakt cerrahisinden sonra erken dönemde göz içi basınç (GİB) artışı sık gözlenen bir bulgudur. Postoperatif GİB artışını azaltmak için intraoperatif viskoelastiklerin temizlenmesinin yanısıra intrakamaral karbakol kullanımıda önemlidir. Alınan tüm önlemlere rağmen artmış olan intraoküler basınç optik sinirde kalıcı hasara yol açabilir. Katarakt ameliyatı esnasında intrakameral karbakol verilen hastalarda postoperatif ilk gün düşük intraoküler basınç görülmektedir. İntrakameral karbakol ilaç etkisinin uzun sürmesi istendiği durumlarda asetilkoline tercih edilmektedir. 
Organizma oksidanlara sürekli maruz kalmaktadır. Oluşan oksidan moleküller hücrelere ve dokularda zarara neden olur. Oksidatif stres, ilaçlar, toksik ajanlar, kimyasalların etkisi, virüsler, serbest radikaller, sitokin ve hormonlar gibi çeşitli uyaranlar kaspazlar üzerinden apoptozisi aktive etmektedir. Apoptozis ise fizyolojik veya patolojik uyaranlara sekonder olarak gerçekleşen genetik kontrol altında olan programlanmış hücre ölümüdür.
Literatür araştırmasında, intrakameral karbakolun korneada mikroskobik ve makroskobik etkileri ile ilgili sınırlı çalışmalar mevcuttur. Fakat intrakameral karbakolun korneada oksidatif stres ve endotelyal apoptozis üzerine etkileri ile ilgili çalışmaya rastlamadık.
Amaç: Bu çalışmada, ratlarda intrakameral karbakol'ün korneada oksidatif stres ve apoptozise etkisini araştırmayı planladık. 
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda 4-8 haftalık, 180-200 gram ağırlığında toplam 28 adet Wistar albino rat kullanılmıştır. Sham, Balanced Salt Solution (BSS) ve karbakol grubu olmak üzere üç grub oluşturuldu. Sham grubu 10, BSS grubu 9 ve karbakol grubu 9 rattan oluşturuldu. Laboratuvar ortamında, anestezi altında BSS grubuna 0.01 cc BSS ve karbakol grubuna 0.01cc karbakol intrakameral uygulandı.  Sham grubuna herhangi bir ilaç verilmedi. Bir hafta sonra ratların korneaları ve kan örnekleri alındı. Apoptozisi immunohistokimyasal olarak saptamak için kornea endotelinde kaspaz 3 ve kaspaz 8 bakıldı. Oksidatif stresi değerlendirmek için korneada ve serumda Total Oksidan Seviye (TOS), Total Antioksidan Seviye (TAS), Oksidatif Stres İndeksi  (OSİ) ve Paraoksonaz (PON) ve Arilesteraz (ARE) seviyelerine bakıldı.
Bulgular: Rat serumlarında Karbakol grubunda OSİ değerleri Sham grubuna göre anlamlı olarak düşük bulunmuştur (p=0.05). Karbakol grubundaki OSİ değerleri BSS grubuna göre daha düşüktür ve anlamlılık düzeyi daha fazladır (p=0,004). Rat serumlarında Karbakol grubunun TOS değerleri, BSS grubuna göre düşük bulunmuş olup yüksek düzeyde istatiksel anlamlılık göstermiştir (p=0,001). 
Sham, BSS ve karbakol grublarındaki ratların kornealarında TAS, TOS, OSİ, PON ve ARE düzeyleri açısından istatiksel anlamlı bir fark saptanmamıştır (p>0.05).
Karbakol, Sham ve BSS grupları arasında kaspaz-3 boyanması açısından yapılan karşılaştırmada, karbakol grubunda tüm rat korneaları negatif boyanmış olup, grublar arasında yüksek düzeyde istatiksel anlamlı farklılık bulunmuştur (P=0.002).
Karbakol, Sham ve BSS grublar arasında kaspaz-8 boyanması açısından istatiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır (p=0.094).
Sonuç: Karbakol, rat serumlarında BSS ve sham grublarına göre oksidatif stresi azaltmakta ve oksidatif strese karşı koruyucu rol oynamaktadır.	 Korneada ise karbakol, sham ve BSS grublarına göre  oksidatif stresi artırmamaktadır. İmmunohistokimyasal inceleme karbakolün apoptozisi artırıcı etkisi olmadığını, aksine koruyucu etkisinin olabileceğini göstermektedir. Çalışmamız intrakameral olarak uygulanan karbakolün korneada oksidatif stres ve apopitozis üzerine arttırıcı etkisi olmadığı ve güvenli bir ilaç olduğunu desteklemektedir.
Anahtar Kelimeler: Apopitozis, Karbakol, , Kaspaz-3, Kaspaz-8, Kornea, Oksidatif stres

Abstract:
Introduction: Intraocular pressure (İOP) elevation is frequently observed in early period after cataract surgery. Use of intracamaral carbachol and cleaning intraoperative viscoelastic is important to reduce postoperative IOP. Nevertheless, increased intraocular pressure may result in permanent damage to the optic nerve. Lower intraocular pressure was observed the patients given intracameral carbachol during the cataract surgery at postoperative first day. Intracameral carbachol may be preferred to acetylcholine when desired to take long effects of drugs.
Organisms are continuously exposed to the oxidant. Oxidant molecules causes damage to cells and tissues. Oxidative stress, free radicals, drugs, toxic agents, chemicals, viruses, cytokine, or various stimuli such as hormones activates apoptosis through caspases. Apoptosis is a programmed cell death that stems from physiological or pathological secondary stimuli under genetic control.
Literature review reveals that there are limited investigations on the microscopic and macroscopic effect of intracameral carbachol on cornea. There is no study, however, about effects of intracameral carbachol on corneal endothelial oxidative stress and apoptosis. 
Purpose: The aim of this study is to investigate the effect of intracameral carbachol on oxidative stress and apoptosis in rats cornea.
Materials and Methods: In this study, 28 Wistar albino rats, weighing 180-200 grams and 4-8 weeks, were used. Sham, BSS, and carbachol groups were consisted of 10, 9, 9 rats, respectively. 0.01 cc intracameral carbachol and 0.01 cc BSS were injected to the rat groups of carbachol and BSS, respectively, in the conditions of anesthesia. No drug was injected into sham group of rats.  A week later, the cornea and blood samples of rats were taken. Caspase 3 and caspase 8 were investigated to determine apoptosis as immunohistochemical method in corneal endothelial. Oxidative stress (TOS), total antioxidant status (TAS), oxidative stress index (OSİ), paraoxonase (PON) and arylesterase (ARE) levels were measured to determine oxidative stress at corneal endothelial tissue and serum. 
Results: In the rat serum, OSI values in the carbachol group were significantly lower compared to the sham group (p=0.05). OSI values in the carbachol group were very lower compared to the BSS group (p=0,004). TOS values in the carbachol group were very lower compared to the BSS group (p=0,001). 
statistically significant difference was not observed in the TAS, TOS, OSI, PON and ARE levels of cornea in sham, BSS and carbachol groups (p>0.05).
In terms of caspase-3 staining of the cornea, all of the carbachol group of rats were negative painted and statistically significant differences were found between the Carbachol, Sham and BSS groups (P=0.002). 
In terms of caspase-8 staining of the cornea, statistically significant differences were not observed between the Carbachol, Sham and BSS groups (p=0.094).
Conclusion: Carbachol reduces oxidative stress in rat serum in comparison to the BSS and sham groups, and plays a protective role against oxidative stress. In cornea, carbachol does not increase oxidative stress in comparison to the sham and BSS groups. Immunohistochemical examination showed that carbachol had no effect to increase apoptosis. On the contrary, carbachol might have protective effect.
The results of this study also showed that intracameral carbachol have not promoting effect on oxidative stress and apoptosis in cornea. The results show that intracameral carbachol is a safe intracameral drug.


Keywords: Apoptosis, Carbachol, Caspase-3, Caspase-8, Cornea, Oxidative stress