Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde, vinorelbinin m2 makrofajları modüle etme ve tümör progresyon genlerinin ekspresyon seviyesi üzerindeki etkisi
The effect of vinorelbine on modulating M2 macrophages and expression level of tumor progression genes in non-small cell lung cancer
Yazar: AHMED FARIS SAAD AL-OMAR
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE CANER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı / Kanser Biyolojisi ve İmmünolojisi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Gen ifadesi = Gene expression ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Makrofajlar = Macrophages ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Vinorelbin = Vinorelbine

Özet:
Amaç: Akciğer kanseri, yüksek insidans ve mortalite ile dünyadaki en ölümcül kanserlerden biridir. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), akciğer kanserlerinin %80-85'ini oluşturmaktadır. KHDAK'de tedavi yöntemlerindeki gelişmelere rağmen, hala uygulanan tedaviler ile hastaların sağ kalım oranında önemli bir artış sağlanamamıştır. Akciğer kanserinin tedavi protokolü KHDAK'nin evrelerine göre farklılık göstermekle birlikte, kemoterapi ve radyoterapi kombine veya tek başına uygulanmaktadır. Bunun yanında, tümör mikro çevresi de kanserin tedavisinde ve progresyonunda önemli rol oynamaktadır. Özellikle, TAM'lar gibi M2 makrofajlar, tümör proliferasyonunu ve büyümesini, anjiyogenezi, migrasyonu, invazyonu ve immünosupresyonu indüklemektedir. Ayrıca, tümör mikro çevresindeki TAM/M2 makrofajların varlığı ilaç direncine de neden olmaktadır. Bu nedenle M2 makrofajlarını M1'e yeniden modüle edebilen farklı anti-kanser ajanların geliştirilmesi, KHDAK hastalarının tedavi yanıt oranını ve genel sağ kalımını arttırabilir. Günümüzde vinorelbin, KHDAK hastalarında tedavi için kullanılmaktadır. Ancak vinorelbinin KHDAK hücrelerinde karsinogenez genlerini nasıl regüle ettiği ve M2 makrofajlar üzerindeki etkisi bilinmemektedir. Tezimizde vinorelbinin, hem M2 makrofajlarını M1'e yeniden modüle etme yeteneği hem de A549 hücre hattında karsinogenez genler üzerine etkisi M2 makrofajların varlığında araştırılmıştır. 

Gereç ve Yöntemler: Tez çalışması in vitro ortamda gerçekleştirilmiş ve A549 KHDAK hücre hattı kullanılmıştır. Öncelikle vinorelbinin, A549 hücreleri üzerinde sitotoksisitesini değerlendirmek için XTT testi uygulanmıştır. Daha sonra, donör periferik kanından PBMC'ler elde edilmiş ve buradan monositlerin izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Monositlerden, M-CSF ile M0 makrofajlar oluşturulmuş, LPS molekülü ve IL4/IL10 sitokinleri kullanılarak sırasıyla M1 ve M2 makrofajlara polarizasyonu gerçekleştirilmiştir. Makrofajların karakterizasyonu, CD80, CD163 ve CD206 antikorları kullanılarak akış sitometrisinde yapılmıştır. Vinorelbinin, M2 makrofajlar üzerindeki sitotoksisitesini değerlendirmek için XTT testi uygulanmıştır. Ardından, M2 makrofajlar ile A549 hücrelerinde indirekt ko-kültür gerçekleştirilmiş ve vinorelbin tedavisi uygulanmıştır. Ko-kültüre edilmiş ve vinorelbin uygulanmış A549 hücrelerinde, kanser progresyon ve immünosupresyon genlerinin ekspresyon seviyeleri revers transkriptaz PCR yöntemi ile araştırılmıştır.

Bulgular: Vinorelbinin, A549 hücreleri üzerindeki IC50 değeri 50 M olarak tespit edilmiştir. Monositlerden elde edilen M0 makrofajlar ve bunlarin polarizasyonu ile elde edilen edilen M1 ve M2 makrofajların MFI değeri akış sitometrisi ile saptanmıştır. M1 makrofajlarına ait MFI değeri (CD80), M0 ve M2 makrofajlarına göre anlamlı seviyede yüksek seviyede saptanmıstır (p<0.0001, p<0.0001). M2 makrofajlarına ait MFI değerleri de (CD206), M0 ve M1 makrofajlarına göre anlamlı seviyede bir artış göstermiştir (sırasıyla p<0.001, p<0.001). M2 makrofajlarına ait bir diğer markerin MFI değerlerinde de (CD163), M0 ve M1 makrofajlarına göre anlamlı seviyede bir yükseklik saptanmıştır (sırasıyla p<0.001, p<0.0001). Daha sonra 50 nM ve 100 nM konsantrasyonlarında vinorelbin dozları M2 makrofajlar üzerine uygulanmıştır. 50 nM ve 100 nM vinorelbin dozları ile M2 makrofajlara ait CD206 ve CD163 MFI değerlerinde anlamlı seviyede bir azalma bulunmuştur (sırasıyla, CD206 için p<0.05, p<0.01; CD163 için p<0.001, p<0.01). M2 makrofajlar ile A549 hücrelerinin indirekt ko-kültürü sonrasında, M2 makrofajların, kanser progresyonunda rol oynayan bazı genlerin ekspresyonunda artışa neden olduğu ve vinorelbinin etkisini azalttığı saptanmıştır.

Sonuç: Elde ettiğimiz veriler çerçevesinde, vinorelbinin M2 makrofajları M1'e yeniden programlama etkisi olduğu gösterilmiştir. Ayrıca M2 makrofajların, vinorelbinin etkinliğini azalttığı ve bazı kanser progresyon genlerini de artırdığı gösterilmiştir. Sonuçta, vinorelbin tedavisinin tubulin polimerizasyonunu inhibe ederek kanser hücre döngüsünü G2/M fazında durdurmasının yanında M2 makrofajları M1'e yeniden modüle etme etkisi de gösterilmiştir.

Abstract:
Objective: Lung cancer is one of the deadliest cancers in the world, with a high incidence and mortality. Non-small cell lung cancer (NSCLC) constitutes 80-85% of lung cancers. Despite the improvements in treatment methods in NSCLC, the survival rate of the patients has not increased significantly. Treatment protocols of lung cancer are different, and according to the NSCLC, chemotherapy and radiotherapy in combination or alone are applied depending on the stages of the disease. In addition, the tumor microenvironment plays an important role in the treatment and progression of cancer. For instance, M2 macrophages, like TAMs, induce tumor proliferation and growth, angiogenesis, migration, invasion, and immunosuppression. Furthermore, the presence of TAM/M2 macrophages in the tumor microenvironment also causes drug resistance. Therefore, the development of different anti-cancer agents that can remodulate M2 macrophages to M1 may improve the treatment response rate and overall survival of NSCLC patients. Currently, vinorelbine is used for treatment in patients with NSCLC. However, it is unknown the effect of vinorelbine on genes that promote tumor progression in NSCLC cells and the effect of the treatment on M2 macrophages. In our thesis, the ability of vinorelbine to re-modulate M2 macrophages to M1 and the effect of the drug on pro-tumor genes in A549 cell line was investigated in the presence and absence of M2 macrophages.

Material and Methods: The thesis study was carried out in vitro using A549 cell line. First of all, XTT test was applied to evaluate the cytotoxicity of vinorelbine on A549 cells and to determine the IC50 value. Then, PBMCs were obtained and monocytes were isolated from the peripheral blood of healthy donors. M0 macrophages were polarized from monocytes by M-CSF, then the macrophages polarized to M1 and M2 macrophages using LPS and IL4/IL10 respectively. Characterization of macrophages was shown by flow cytometry using antibodies CD80, CD163, and CD206. XTT test was applied to evaluate the cytotoxicity of vinorelbine on M2 macrophages. Then different doses of vinorelbine were applied on M2 macrophages to evaluate the effect of the drug. Finally, indirect co-culture was performed on A549 cells with M2 macrophages with and without vinorelbine. Expression levels of cancer progression and immunosuppression genes were investigated by reverse transcriptase PCR method in co-cultured and vinorelbine-treated A549 cells.

Results: The IC50 value of vinorelbine on A549 cells was determined as 50 µM. MFI values of M0, M1, and M2 macrophages that were isolated from monocytes were determined by flow cytometry. MFI value of (CD80) in M1 macrophages was increased significantly compared to M0 and M2 macrophages (p<0.0001, p<0.0001). The MFI values of the first M2 marker (CD206) were augmented significantly compared to M0 and M1 macrophages (p<0.001, p<0.001 respectively). With another M2 marker (CD163), a significant increase was found in MFI values in M2 macrophages compared to M0 and M1 macrophages (p<0.001, p<0.0001 respectively). Then, two doses of vinorelbine at 50 nM and 100 nM concentrations were applied to M2 macrophages. MFI values of CD206 and CD163 were decreased significantly with 50 nM and 100 nM vinorelbine doses (p<0.05, p<0.01 for CD206, p<0.01, p<0.01 for CD163, respectively). After indirect co-culture of M2 macrophages and A549 cells, M2 macrophages were found to increase the expression of some genes involved in cancer progression and reduce the effect of vinorelbine.

Conclusion: In the framework of the data we have obtained, it has been shown that vinorelbine has a reprogramming M2 macrophages to M1. In addition, M2 macrophages have been shown to reduce the efficacy of vinorelbine and increase some cancer progression genes. In conclusion, in addition to the inhibition of tubulin polymerization and arrest of cancer cell cycle in G2/M phase, the effect of vinorelbine treatment to re-modulate M2 macrophages to M1 was also shown.