Endometriozis oluşturulan ratlarda atmosferik basınçlı soğuk plazma uygulamasının iyileştirici etkisinin histopatolojik ve immünohistokimyasal olarak incelenmesi
Histopatological and immunohistochemical investigation of the improvemental effect of atmospheric pressure cold plasma application in rats with endometriosis
Yazar: AYŞE SARI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ FATMA ŞİMŞEK
İzmir Katip Çelebi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology
Dizin: Basınç = Pressure ; Endometrial hiperplazi = Endometrial hyperplasia ; Endometriyoz = Endometriosis ; Endometriyum = Endometrium ; Histopatoloji = Histopathology ; Matriks metalloproteinaz 2 = Matrix metalloproteinase 2 ; Soğuk plazma = Cold plasma ; Sıçanlar = Rats ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Endometriozis, endometrial bezlerin veya stromanın uterus dışında büyümesiyle ortaya çıkmaktadır. Östrojen bağımlı olan endometriozis, üreme çağındaki kadınlarda sıklıkla görülmektedir. Standart tedaviler, kombine-progestin oral kontraseptif haplar (OKH) ve cerrahi girişimlerden oluşmaktadır. OKH'lerin östrojen düzeyini düşürmesi ve yan etkileri sebebiyle uzun süreli kullanımları mümkün olmamaktadır. Cerrahi müdahaleler ise uzmanlar tarafından yapılmakta ve hastalığın tekrarlayabilme riskinden dolayı her zaman kesin çözüm olmamaktadır.
Endometriozis için mevcut tedavi yöntemlerindeki eksiklikleri gidermek ve daha az yan etkiye sahip kesin çözümler üretmek için moleküler düzeyde birçok çalışma yapılmaktadır.
Maddenin 4. hali olan plazma, soğuk atmosferik basınçta üretildiğinde atmosferik basınçlı soğuk plazma adını almakta ve gazların iyonizasyonu sonucu meydana gelmektedir. İçinde uyarılmış atom ve moleküller, çeşitli radikaller bulunmaktadır. Atmosferik basınçlı soğuk plazma, sterilizasyon, yara iyileşmesi gibi tıp alanında çok çeşitli kullanımlara sahiptir. Aynı zamanda yapılan bilimsel çalışmalarda kanser hücreleri üzerinde anti-inflamatuar, anti-invaziv ve anti-anjiyogenik etkilere sahip olduğu gösterilmiştir. Atmosferik basınçlı soğuk plazmanın kanser hücrelerindeki etkisine benzer etki göstererek endometriozis lezyonlarında da gerileme sağlayabileceğini düşünmekteyiz.
Endometriozis lezyonlarının oluşum aşamasında matriks metalloproteinazlar (MMP), gelişim aşamasında ise anjiyogenezi sağlayan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) gibi moleküller etkili olmaktadır. Hastalığın ilerlemesiyle birlikte pro-inflamatuar sitokinlerin üretiminde rol oynayan p38 MAPK düzeyi ve buna bağlı olarak pro-inflamatuar bir sitokin olan tümör nekrozis faktör-α (TNF-α) düzeyi artmaktadır. Endometriozis sürecini destekleyen bu moleküllerin inhibe edilmesinin endometriozis lezyonlarının gelişimini önlemede etkili olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Bizim çalışmamızda ise endometriozisin atmosferik basınçlı soğuk plazma ile tedavisi sonucunda bu moleküler mekanizmaların nasıl etkilendiğini araştırmak amaçlanmıştır. 
Mevcut çalışmamızda, ratlar üzerinde deneysel endometriozis modeli oluşturularak plazma ile muamele edilmiş %0.09 NaCl sıvısı intraperitoneal tedavi olarak uygulanmıştır. Deney sonunda plazma ile tedavinin endometriozis implantları üzerindeki makroskobik, histopatolojik ve immünohistokimyasal etkileri incelenmiştir.
Çalışmada 32 rat kullanılmıştır ve çalışma öncesinde ratlar rastgele 5 gruba ayrılmıştır. Vajinal sürüntü alınarak östrus döngüsünde olduğu belirlenen ratlar cerrahi operasyona alınmışlardır. Kontrol grubunun batın bölgesi açılıp hiçbir işlem yapılmadan kapatılmıştır. Diğer gruplarda deneysel endometriozis modeli oluşturulmuştur. Sham grubunda hastalık modeli oluşturulduktan sonra herhangi bir tedavi uygulanmamıştır. Önleme (profilaktik) grubunda ise cerrahi işlemden hemen sonra batın içi, plazma ile muamele edilmiş %0.09 NaCl sıvısı ile yıkanmış ve sonrasında batın kapatılmıştır. Tedavi grubunda hastalık modeli oluşturulduktan ve implantların yerleşmesi için gereken 3 haftalık süre beklendikten sonra 10 gün boyunca intraperitoneal olarak plazma ile muamele edilmiş %0.09 NaCl sıvısı uygulanmıştır. Serum fizyolojik (SF) grubunda ise tedavi grubundan farklı olarak plazma ile muamele edilmiş %0.09 NaCl sıvısı yerine 10 gün boyunca intraperitoneal serum fizyolojik uygulanmıştır. Deney sonunda endometriozis implantları ve çevre dokular makroskobik ölçüm, histopatolojik ve immünohistokimyasal incelemeler için eksize edilmiştir.
Plazma ile tedavi sonucunda makroskobik adezyonun azaldığı, önleme ve tedavi gruplarının implant boyutlarının küçüldüğü görülmüştür. Ayrıca hematoksilen eozin boyaması ile endometriozis dokusunun epitelleri skorlanmış ve önleme ve tedavi gruplarının epitel skorlarının diğer gruplara göre daha küçük olduğu görülmüştür. Masson Trikrom boyama sonuçları tedavi olarak plazma uygulanan gruplardaki fibrozisin sham ve serum fizyolojik gruplarına göre daha az olduğunu göstermektedir. İmmünohistokimyasal boyama sonuçlarında ise önleme ve tedavi gruplarında MMP-2, VEGF ve p38 MAPK moleküllerinin düzeylerinin azaldığı gözlenmiştir. TNF-α düzeyi ise yalnızca tedavi grubunda diğer gruplara göre daha düşük bulunmuştur.
Araştırmamız plazma tedavisinin, endometriozis patogenezine katkıda bulunan MMP-2, VEGF, p38 MAPK ve TNF-α moleküllerini azalttığını ve endometriozis implantlarının boyutunu küçülttüğünü göstermektedir. Çalışmamızın gelecekte yapılacak olan endometriozis tedavisinde plazma uygulaması çalışmalarına ışık tutmasını ve endometriozis tedavisinde yeni kapılar açmasını umut etmekteyiz.
 Anahtar kelimeler: Endometriozis, Atmosferik Basınçlı Soğuk Plazma, MMP-2

Abstract:
Endometriosis occurs when endometrial glands or stroma grow outside of the uterus. Estrogen-dependent endometriosis is common in women of reproductive age. Standard treatments consist of combined-progestin oral contraceptive pills (OCP) and surgical interventions. Long-term use of OCPs is not possible due to the decrease in estrogen levels and side effects. Surgical interventions are performed by specialists and are not always a definitive solution due to the risk of recurrence of the disease.
Many studies are carried out at the molecular level to eliminate the deficiencies in current treatment methods for endometriosis and to produce definitive solutions with fewer side effects.
Plasma, which is the 4th state of matter, is called atmospheric pressure cold plasma when it is produced at cold atmospheric pressure and occurs as a result of the ionization of gases. It contains excited atoms and molecules, various radicals. Atmospheric pressure cold plasma has a wide variety of uses in the medical field, such as sterilization, wound healing. It has also been shown in scientific studies to have anti-inflammatory, anti-invasive and anti-angiogenic effects on cancer cells. We think that atmospheric pressure cold plasma may also regress in endometriosis lesions by showing similar effects to cancer cells.
Molecules such as matrix metalloproteinases (MMP) are effective in the formation of endometriosis lesions, and molecules such as vascular endothelial growth factor (VEGF), which provides angiogenesis in the developmental stage. With the progression of the disease, the level of p38 MAPK, which plays a role in the production of pro-inflammatory cytokines, and accordingly, the level of tumor necrosis factor-α (TNF-α), a pro-inflammatory cytokine, increases. Studies have shown that inhibiting these molecules that support the endometriosis process is effective in preventing the development of endometriosis lesions. In our study, it was aimed to investigate how these molecular mechanisms are affected by the treatment of endometriosis with atmospheric pressure cold plasma.
In our current study, an experimental endometriosis model was created on rats and 0.09% NaCl liquid treated with plasma was administered as intraperitoneal treatment. At the end of the experiment, the macroscopic, histopathological and immunohistochemical effects of plasma treatment on endometriosis implants were investigated.
32 rats were used in the study and the rats were randomly divided into 5 groups before the study. Rats determined to be in oestrus cycle by taking vaginal swab were taken into surgical operation. The abdomen of the control group was opened and closed without any procedure. An experimental endometriosis model was created in other groups. In the Sham group, no treatment was applied after the disease model was established. In the prevention (prophylactic) group, immediately after the surgical procedure, the inside of the abdomen was washed with plasma-treated 0.09% NaCl fluid and then the abdomen was closed. In the treatment group, after establishing the disease model and waiting for 3 weeks for the implants to settle, 0.09% NaCl liquid treated with plasma was administered intraperitoneally for 10 days. In the saline group (SG), unlike the treatment group, intraperitoneal saline was administered for 10 days instead of 0.09% NaCl fluid treated with plasma. At the end of the experiment, endometriosis implants and surrounding tissues were excised for macroscopic measurement, histopathological and immunohistochemical examinations.
As a result of treatment with plasma, it was observed that macroscopic adhesion decreased, and the implant sizes of the prevention and treatment groups decreased. In addition, the epithelium of the endometriosis tissue was scored with hematoxylin-eosin staining and it was observed that the epithelial scores of the prevention and treatment groups were lower than the other groups. Masson Trichrome staining results show that fibrosis in the plasma treated groups was less than in the sham and saline groups. In the immunohistochemical staining results, it was observed that the levels of MMP-2, VEGF and p38 MAPK molecules decreased in the prevention and treatment groups. TNF-α level was found to be lower only in the treatment group compared to the other groups.
Our research shows that plasma therapy reduces MMP-2, VEGF, p38 MAPK and TNF-α molecules that contribute to the pathogenesis of endometriosis and reduces the size of endometriosis implants. We hope that our study will shed light on future studies of plasma application in the treatment of endometriosis and open new doors in the treatment of endometriosis.
Keywords: Endometriosis, Atmospheric Pressure Cold Plasma, MMP-2