Şanlıurfa yöresindeki anofel larvalarınının morfolojik ve moleküler yöntemlerle tanımlanması ve üreme alanlarının fiziksel ve ekolojik özellikleri
Identification of anopheles larvae by morphological and molecular methods and physical and ecological features of their breeding places in Şanliurfa territory
Yazar: SEHER TOPLUOĞLU
Danışman: PROF. DR. KADRİ ZAFER KARAER
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Anopheles = Anopheles ; Ekolojik özellikler = Ecological properties ; Fiziksel özellikler = Physical properties ; Hastalık vektörleri = Disease vectors ; Larva = Larva ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Morfolojik özellikler = Morphological properties ; Sıtma = Malaria ; Üreme = Reproduction ; Şanlıurfa = Şanlıurfa

Özet:
Sivrisinek kontrol çalışmalarının bilimsel temelli olarak yapılabilmesi için vektör türlerinin tanımlanması ve üreme alanlarının fiziksel ve ekolojik özelliklerinin belirlenmesi son derece önemlidir. Bu çalışmada Şanlıurfa yöresinde Anopheles türlerinin morfolojik ve moleküler yöntemlerle tanımlanması, üreme alanlarının fiziksel ve ekolojik özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 
Bu amaçla 29 Eylül 2009 ile 03 Ekim 2009 tarihleri arasında sıtma vakalarının görüldüğü Şanlıurfa ilinin Birecik, Eyyübiye, Haliliye, Harran, Siverek ve Viranşehir ilçelerinde belirlenen 9 üreme alanından toplam 274 sivrisinek larvası toplanmıştır. Dördüncü evre larvaların morfolojik karakterlerine göre yapılan tanımlama sonucunda 231 (%84,3)'i An. sacharovi,41 (%14,96)'i An. superpictus olarak tespit edilmiştir. İki (%0,73) örnek Anopheles cinsi olarak tanımlanmakla beraber tür ayrımı yapılamamıştır.
Morfolojik bulgulara göre dokuz üreme alanının %88,89 (n=8)'unda An. sacharovi, %11,11 (n=1)'nde ise An. superpictus'un baskın tür olduğu saptanmıştır. Araştırma alanında sıtma vektörü An. sacharovi farklı pH değerleri, çözünmüş oksijen oranları, elektriksel iletkenliği olan, su sıcaklıkları ve tuzluluk oranları olan yatay vejetasyonlu üreme alanlarının hepsinde tespit edilmiştir. Türün larva yaşam alanlarının temel ekolojik parametrelerinin tolerans limitleri: pH – 7,77-9,18 (ortalama 8,52); elektriksel iletkenlik – 310-1100 (µS/cm) (ortalama 496,91); çözünmüş oksijen (mg/l) – 1,64-13,06 (ortalama 9,67); su sıcaklığı – 20,3-25,8 °C (ortalama 23,46); tuzluluk –0,15-0,55 ppt (ortalama 0,24) olarak bulunmuştur.  Araştırma alanında An. superpictus türünün tespit edildiği üreme alanının temel ekolojik parametreleri: pH 8,48; elektriksel iletkenlik 710 µS/cm; çözünmüş oksijen 8,91 mg/l; su sıcaklığı 25,8 °C; tuzluluk 0.35 ppt olarak ölçülmüştür. Sivrisinek üreme alanlarının fiziksel ve ekolojik özelliklerinin istatistiksel analizlerinde; An. sacharovi ile An. superpictus üreme alanlarının pH değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı farklılık (p=0,189) göstermediği ancak su sıcaklığı (p= 0,0000001), elektriksel iletkenlik (p= 0,0000001), tuzluluk (p= 0,0000001) ve çözünmüş oksijen (p= 0,001) değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdiği bulunmuştur.
Moleküler analizler sonucunda toplanan örneklerin %85 (n=233)'inin An. sacharovi, %15 (n=41)'inin An. superpictus türüne ait olduğu saptanmıştır. An. sacharovi'nin tüm PCR ürünlerinde moleküler ağırlığı yaklaşık 444- bp olarak bulunmuştur. 4 ve 6 numaralı üreme alanlarından toplanan An. sacharovi larva örneklerinden rastgele seçilen altı örneğin ITS2 rDNA'sı sekanslanmıştır. Sekansların birbirleriyle tamamen aynı olduğu bulunmuştur. 
İlave olarak An. sacharovi'nin ITS2 bölgesi sekansları GenBank'ta kayıtlı ülkemiz, Azerbaycan, Gürcistan, İran, Irak ve Yunanistan'da saptanan sekanslar ile tam homoloji göstermiştir. Çalışmada elde edilen An. sacharovi'nin altı nükleotid sekansı FN565570-FN565575 erişim numaraları ile GenBank'a kaydedilmiştir. Çalışma kapsamında elde edilen An. superpictus'un ITS2 bölgesi sekanslarının, GenBank'ta yer alan İran ve Azerbaycan'da saptanan An. superpictus sekansları ile karşılaştırılmasında tam homoloji gösterdiği belirlenmiştir. 
An. sacharovi Şanlıurfa İlinde de birincil sıtma vektörü olup ekolojik esnekliliği nedeniyle gerek sıtma endemik gerekse bulaşın tekrar başladığı alanlarda hakim tür haline gelebildiği düşünülmektedir. Moleküler yöntemler morfolojik tanımlamaya göre daha kesin veriler sağlamaktadır. Ancak maliyeti ve pahalı ekipmanlara gereksinim duyulması nedeniyle imkanları kısıtlı laboratuvarlarca tercih edilemeyebilir. Diğer yandan morfolojik tanımlama da tecrübe gerektirmektedir. Saptanan türlerin sekans analiziyle gerek An. sacharovi gerekse An. superpictus'un hem kendi içinde hem de komşu ülkelerdekilerle homoloji gösterdiği kanıtlanmıştır. 

Şanlıurfa'da An. sacharovi türü ile mücadelede tespit edildiği tüm alanlarda larva mücadelesinin yanısıra, ergin sivrisinek mortalitesini arttırmak için Kalıcı Kapalı Alan İnsektisit uygulamasına ağırlık verilmesi gerekmektedir. An. superpictus türünün tespit edildiği alanda ise larva kontrolü ile beraber sivrisinek erginlerine yönelik Kalıcı Kapalı Alan İnsektisit uygulaması ve Açık Alan İnsektisit uygulaması da yapılmalıdır. 

Anahtar Sözcükler: Anopheles, sıtma, Şanlıurfa, üreme alanı, vektör

Abstract:
Identification of vector species and determination of physical and ecological features of their breeding places is essential in implementation of scientific based mosquito control. In this study, it is aimed to identify Anopheles species by morphological and molecular methods and determination of physical and ecological characteristics of their breeding places in Sanliurfa territory. 
A total of 274 mosquito larvae were collected from September 29 to October 03, 2009 from determined 9 breeding place in Birecik, Eyyübiye, Haliliye, Harran, Siverek and Viransehir districts of Sanliurfa province where malaria cases had been reported. As a result of identification of four instar larvae based on their morphological characteristics; 231 (84,3%) An. sacharovi and 41 (14,.96%)  An. superpictus were identified. Although two (0,73%) samples identified as Anopheles genus, species discrimination could not be done. 
In %88,89 (n=8) of nine breeding places An. sacharovi and in %11,11 (n=1) of total breeding places An. superpictus found to be dominant species according to the morphological results. Malaria vector An. sacharovi detected in all breeding places which have different pH values, dissolved oxygen proportions, electrical conductivity, water temperature and salinity proportions with horizontal vegetation. The limits of tolerance for essential ecological parameters of species found to be as: pH – 7,77-9,18 (mean 8,53); electrical conductivity – 310-1100 (µS/cm) (mean 496,91); dissolved oxygen (mg/l) – 1,64-13,06 (mean 9,67); temperature of water – 20,3-25,8 °C (mean 23,46); salinity 0,15-0,55 ppt (mean 0,24). The limits of tolerance for essential ecological parameters of An. superpictus species measured as: pH 8,48; electrical conductivity 710 µS/cm;  dissolved oxygen 8,91 mg/l; temperature of water 25,8 °C; salinity 0,35. In statistical analysis of physical and ecological characteristics of mosquito breeding places'; no significant dif-ference between pH values (p=0,189) was found between An. sacharovi and An. superpictus breeding places but significant dif¬ference have been found in water temperature (p= 0,0000001), electrical conductivity (p= 0,0000001), salinity (p= 0,0000001) and dissolved oxygen (p= 0,001) values.

As a result of molecular analysis; 85% (n=233) of collected samples were identified as An. sacharovi and 15% (n=41) were identified as An. superpictus species. 

It was found that all PCR products of An. sacharovi had molecular weight of about 444- bp. Six specimens of ITS2 rDNA of An. sacharovi from samples Number4 and Number6 were sequenced. It was found that sequences were totally identical to each other.
Additionally sequences of An. sacharovi ITS2 region showed complete homology to those identified in our country and Azerbaijan, Georgia, Iran, Iraq and Greece which are recorded in GenBank. Six nucleotide sequences of An. sacharovi obtained in our study were deposited in the GeneBank under the accession numbers FN565570-FN565575. 
In the comparison of An. superpictus ITS2 region sequences obtained in the study to those identified An. superpictus sequences in Iran and Azerbaijan, which are recorded in GenBank; complete homology was obtained.
Being the principal malaria vector also in Sanliurfa province, because of its ecological flexibility, An. sacharovi have become the predominant species in all malaria endemic areas or where serious resurgences of malaria have occurred after the interruption of transmission. Molecular methods provide more precise data according to morphological identification. However because of its cost and need of expensive equipment, it may not be preferred by the laboratories with limited resources. On the other hand morphological identification requires experience. By sequencing analysis it has been proved both An. sacharovi and An. superpictus have complete homology with their each sequences and the ones in neighboring countries.
For An sacharovi species control, Indoor Residual Spraying in order to increase adult mosquito mortality should be applied besides larval control in all breeding places where the species is identified in Sanliurfa. Space Spraying besides Indoor Residual Spraying should be applied for An. superpictus control additional to larval control measures in the breeding place where the species is identified in Sanliurfa.
 
Key Words: Anopheles, breeding place, malaria, Sanliurfa, vector.