Levamizolün model organizma Galleria mellonella'nın tüm gelişim evreleri ve antioksidan enzim aktiviteleri üzerine etkisi
The effect of levamisole on developmental stages and antioxidant enzyme activities of model organism Galleria mellonella
Yazar: VOLKAN KELEŞ
Danışman: PROF. DR. ENDER BÜYÜKGÜZEL
Zonguldak Bülent Ecevit Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Fizyoloji = Physiology
Dizin: Antioksidan enzimler = Antioxidant enzymes ; Büyük kovan güvesi = Greater wax moth ; Levamizol = Levamisole ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Yaşama oranı = Survival rate

Özet:
Antimikrobiyal ajanların etkinliğinin ve toksisitesinin değerlendirilmesinde fare ve sıçan gibi omurgalı model organizmalar son yıllarda bazı etik kaygılardan dolayı yerini alternatif model organizmalara bırakmıştır. Tarım zararlısı olarak da bilinen Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyraliadae) son yıllarda yapılan çalışmalarda sıklıkla tercih edilen bir model organizmadır. İmidotiyazol türevi antihelmintik bir madde olan levamizol memelilerde görülen helmintik enfeksiyonların tedavisinde kullanılan sentetik bir antibiyotiktir. Bu çalışmada, G. mellonella yapay besinine eklenen levamizolün böceğin yaşama oranı, gelişim süresi ve ergin ömür uzunluğuna etkisi araştırıldı. Ayrıca, bu antihelmintik maddenin, G. mellonella'nın 7. evre larva, pup ve ergin evrelerindeki ve 7. evre larvalardan izole elde edilen hemolenf, yağ doku ve orta bağırsağındaki oksidatif hasar biyobelirteçlerinden malondialdehit (MDA) ve protein karbonil (PCO) miktarı, antioksidan enzimlerden süperoksitdismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon-s-transferaz (GST) ve glutatyon peroksidaz (GPx) aktiviteleri üzerine etkileri araştırılmıştır.Besine eklenecek olan levamizol konsantrasyonları 100 gram besin başına düşen gram antibiyotik olarak belirlendi. Yapay besine eklenecek olan levamizol konsantrasyonları % 0,001gr, % 0,01gr ve % 0,1gr olarak belirlendi. Levamizolün % 0,001gr ve % 0,01gr'lık konsantrasyonları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 7.evreye ulaşan larva oranını istatiksel olarak önemli derecede düşürdü. Denenen en yüksek konsantrasyonda (% 0,1gr) bu oran kontrol grubuna göre (% 98,75) 3 kat azalarak % 28,75 olarak belirlendi. Levamizol içeren yapay besinlerde beslenen gruplarda kontrol grubuna göre pup olma oranı ve ergin olma oranında da benzer etkiler gözlemlendi. Levamizolün farklı konsantrasyonlarını içeren yapay besinde yetiştirilen böcekler, levamizol içermeyen kontrol grubuna göre 7.evre larva, pup ve ergin evrelere daha geç ulaştı. Denenen en yüksek levamizol konsantrasyonu (% 0,1gr) böceğin 7. evre larval döneme ulaşma süresini yaklaşık olarak 2 gün, pup evresine ulaşma süresini 10 gün ve ergin olma süresini 7 gün uzattı. Levamizolün denenen en yüksek konsantrasyonu (% 0,1gr) kontrol grubuyla karşılaştırıldığında G. mellonella'nın 7. evre larva ve erginlerindeki lipid peroksidasyon son ürünlerinden MDA miktarını önemli derecede artırırken, böceğin 7. evre larvalarındaki MDA miktarını kontrol grubuna göre (0,223 ± 0,03 nmol/mg protein) yaklaşık olarak 4 katına çıkardı (0,830 ± 0,06 nmol/mg protein). Yapay besine eklenen levamizolün denenen tüm konsantrasyonları kontrol grubuyla karşılaştırıldığında G. mellonella'nın 7. evre larva, pup ve erginlerindeki PCO miktarını gelişim evrelerine göre farklı konsantrasyonlarda artırdı. Yapay besinle alınan levamizolün % 0,01 gr'lık konsantrasyonu kontrol grubuna göre G. mellonella 7. evre larvalarındaki PCO miktarını önemli derece artırırken (371,2 ± 32,94 nmol/mg protein'den 602,46 ± 53,49 nmol/mg protein'e), böceğin pup evresinde levamizolün % 0,001 gr' lık konsantrasyonu PCO miktarını istatistiksel olarak önemli derecede artırdı (372,44 ± 52,84 nmol/mg protein'den 1074,71 ± 113,39 nmol/mg protein'e) ve böceğin ergin evresinde ise denenen en yüksek levamizol konsantrasyonu (% 0,1gr) PCO miktarını istatistiksel olarak önemli derecede artırarak yaklaşık 12 katına yükseltti (43,32 ± 0,006 nmol/mg protein'den 531,21 ± 67,2 nmol/mg protein'e). Yapılan enzim aktivitesi analizlerinde, yapay besinle alınan levamizolün tüm konsantrasyonları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında G. mellonella'nın 7. evre larva, pup ve erginlerinde antioksidan enzimlerden SOD ve CAT aktivitelerini önemli derecede artırdığı tespit edildi. Denenen en yüksek levamizol konsantrasyonu (% 0,1gr) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 7.evre larva ve erginlerindeki GST ve GPx aktivitelerini önemli derecede artırdı.Yapay besin ile birlikte alınan levamizolün % 0,001gr, % 0,01gr ve % 0,1gr olmak üzere denenen konsantrasyonları G. mellonella'nın hemolenf, yağ doku ve orta bağırsaktaki oksidatif stres belirteçlerinden MDA ve PCO miktarı ile antioksidan enzimlerden SOD, CAT, GST ve GPx aktivitelerinde önemli değişikliklere neden olduğu tespit edildi. Denenen levamizol konsantrasyonları (% 0,001, % 0,01 ve % 0,1gr) kontrol grubuyla karşılaştırıldığında G. mellonella'nın hemolenfinde MDA miktarını önemli derecede azaltırken, orta bağırsak ve yağ dokudaki MDA miktarını kontrol grubuna göre önemli derecede artırdı, fakat yağ dokudaki bu artış istatistiksel açıdan önemli çıkmadı. Yapay besine eklenen levamizolün denenen konsantrasyonları kontrol grubuyla karşılaştırıldığında G. mellonella'nın hemolenf ve orta bağırsağındaki PCO miktarını önemli derecede azaltırken, yağ dokuda sadece levamizolün denenen en yüksek konsantrasyonu (% 0,1gr) PCO miktarını kontrol grubuna göre istatistiksel olarak önemli artırdı. Yapay besine eklenen levamizolün denenen bütün konsantrasyonları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında G. mellonella'nın hemolenf ve orta bağırsağındaki SOD aktivitesini önemli derecede azalttı. Yağ dokuda ise levamizolün sadece % 0,01gr'lık konsantrasyonu kontrol grubuna göre böceğin SOD aktivitesini istatistiksel açıdan önemli derecede artırdı. Levamizolün denenen en yüksek konsantrasyonunu (% 0,1gr) içeren yapay besinlerle beslenen larvalardan alınan yağ doku örnekleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında böceğin CAT aktivitesini önemli derecede artırırken, levamizolün denenen bütün konsantrasyonlarının hemolenf ve orta bağırsaktaki CAT aktivitesini kontrol grubuna göre önemli derecede azaldığı tespit edildi. Levamizolün denenen en yüksek konsantrasyonunu (% 0,1gr) içeren yapay besinlerle beslenen larvalardan alınan yağ doku örnekleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında böceğin CAT aktivitesini önemli derecede artırırken, levamizolün denenen bütün konsantrasyonlarının hemolenf ve orta bağırsaktaki CAT aktivitesini kontrol grubuna göre önemli derecede azaldığı tespit edildi. Yapay besinle alınan levamizolün denenen konsantrsasyonları G. mellonella'nın hemolenfindeki GST aktivitesini istatistiksel olarak önemli derecede düşürürdü. Levamizolün denenen % 0,001gr ve % 0,01gr'lık konsantrasyonları böceğin orta bağırsak ve yağ dokudaki GST aktivitesini kontrol grubuna göre önemli derecede artırdı fakat bu artış orta bağırsakta istatistiksel olarak anlamlı değildi. Levamizolün denenen bütün konsantrasyonları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında G. mellonella'nın hemolenf ve orta bağırsağındaki GPx aktivitesiniistatistiksel olarak önemli derecede azaltırken, levamizolün % 0,01gr ve % 0,1gr'lık konsantrasyonlarını içeren yapay besinlerle beslenen böceğin yağ dokusundaki GPx aktivitesini kontrol grubuna göre istatistiksel olarak önemli derecede artırdı. Çalışmamızda denenen levamizol konsantrasyonlarının böceğin yaşama ve gelişim parametreleri, ömür uzunluğu ve oksidatif stres belirteçleri üzerinde olumsuz etkileri gösterilmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda denenen levamizol konsantrasyonlarının tarım alanlarında kullanılan kimyasallara alternatif bir madde olarak önerilebileceği ve ayrıca model organizma G. mellonella'nın laboratuvar şartlarında kitle üretiminde mikrobiyal kontaminasyonların önlenmesi amacıyla yapay besinlere eklenen antimikrobiyal maddelere yeni bir öneri olarak da katkıda bulunacağı düşünülmektedir.

Abstract:
In the evaluation of the efficacy and toxicity of antimicrobial agents, vertebrate model organisms such as mice and rats have been replaced by alternative model organisms due to some ethical concerns in recent years. Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyraliadae) is an important agricultural pest due to its damage to honeycombs and a frequently preferred model organism in recent studies. Levamisole, an imido-thiazole derivative anthelmintic agent, is a synthetic antibiotic used in the treatment of helminthic infections in mammals. In this study, the effect of levamisole added to the artificial diet of G. mellonella on the survival rate, development time and adult lifespan of the insect was investigated. In addition, the effects of this anthelmintic on malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl (PCO) contents, oxidative stress biomarkers in living organisms, antioxidant enzyme activities including superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione-s-transferase (GST) and glutathione peroxidase (GPx) activities of 7th stage larva, pup and adult stages and also in hemolymph, fat body and midgut of G. mellonella were investigated. Levamisole concentrations to be added to artificial diet were determined as grams of antibiotic per 100 grams of diet.Levamisole concentrations to be added to the artificial food were determined as 0,001 % g, 0,01 % g and 0,1 % g. The concentrations of 0,001 % g and 0,01 % g of levamisole significantly decreased the survival rates of larvae when compared to the control group. At the highest concentration (0,1 % g), this rate decreased 3 times compared to the control group (98,75 %) and was determined as 28,75 %. Similar effects were observed in the pupal and adult stage in the groups fed artificial diets containing levamisole compared to the control group. Insects grown on artificial diet containing different concentrations of levamisole reached the 7th stage larva, pup and adult stages later than the control group without levamisole. The highest levamisole concentration (0,1 % g) extended time to reach 7th stage larval stage by 2 days, pup stage by 10 days, and adult stage by 7 days of the insect. The highest concentration of levamisole (0,1 % g) significantly increased the MDA content, one of the lipid peroxidation end products, in the 7th stage larvae and adults of G. mellonella when compared to the control group, while the MDA content in the 7th stage larvae of the insect was increased by approximately 4-fold compared to the control group (0,223 ± 0,03 nmol /mg protein to 0,830 ± 0,06 nmol/mg protein). Artificial diet containing levamisole concentrations including 0,001 %, 0,01 % and 0,1 % g were increased PCO content in the 7th stage larvae, pupae and adults of G. mellonella at different concentrations based on the developmental stages when compared with the control group. While artificial diet with 0,01 % g and 0,001 % g concentrations of levamisole significantly increased the PCO content in the 7th stage larvae and pupal stage (from 371,2 ± 32,94 nmol/mg protein to 602,46 ± 53,49 nmol/mg protein and from 372,44 ± 52,84 nmol/mg protein to 1074,71 ± 113,39 nmol/mg protein respectively), the highest concentration of levamisole increased PCO content by approximately 12-fold in the adult stage of G. mellonella (from 43.32 ± 0.006 nmol/mg protein to 531,21 ± 67,2 nmol/mg protein). When compared the control, tested concentrations of 0,001 % g, 0,01 % g and 0,1% g of levamisole taken with artificial diet were significantly increased SOD and CAT activities of the 7th stage larvae, pupae and adults of G. mellonella. The highest levamisole concentration (0,1 % g) significantly increased GST and GPx activities in 7th stage larvae and adults of insect compared to control group. In the hemolymph, fat body and midgut of insect, experimented concentrations of 0,001 % g, 0,01 % g and 0,1 % g of levamisole taken with artificial diet caused significant changes in MDAand PCO contents, and antioxidant enzymes activities including SOD, CAT, GST and GPx. While tested levamisole concentrations (0,001 % g, 0,01 % g and 0,1 % g) significantly decreased the amount of MDA in the hemolymph of G. mellonella, there were an increased MDA content in midgut and fat body when compared to the control group. While the PCO content in hemolymph and midgut was significantly reduced, a significant increase was determined in only the highest concentration of levamisole (0,1 % g) in the fat body of G. mellonella when compared to the control group. All tested concentrations of levamisole added to the artificial diet significantly reduced SOD activity in the hemolymph and midgut of G. mellonella compared with the control group. In fat body, only 0,01 g concentration of levamisole significantly increased the SOD activity of the insect. While the highest concentration of levamisole (0,1 % g) significantly increased the CAT activity in midgut of insect, it was determined that all tested concentrations of levamisole significantly decreased the CAT activity in the hemolymph and midgut compared to the control group. Artificial diet containing levamisole concentrations significantly reduced GST activity in the hemolymph of G. mellonella. Levamisole concentrations including 0,001 % g and 0,01 g of levamisole significantly increased GST activity in the midgut and fat body of the insect compared to the control group, but this increase was not statistically significant in the midgut. While the GPx activity in the hemolymph and midgut of G. mellonella was significantly decreased, in the fat body of the insect, 0,01 % g and 0,1 % g concentrations of levamisole significantly increased GPx activity when compared to the control group. It has been shown that the levamisole concentrations tested in our study have a negative effect on the survival and development parameters, life span and oxidative stress markers of the insect. According to the obtained results from this study, it has been thought that experimented levamisole concentrations can be used an alternative chemical in agricultural areas and also new proposal to antimicrobial agents added on artificial diets in order to prevent microbial contamination in mass production under laboratory conditions.