Rat gözlerinde korneal neovaskülarizasyon üzerine riboflavin-uva çapraz bağlama ve rose bengal-yeşil ışık  çapraz bağlama etkilerinin karşılaştırılmalı incelenmesi
A comparative study on the impacts of riboflavin-uva cross linking and rose bengal green light in the corneal neovascularization in rat eyes
Yazar: MERVE ORAL
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET CÜNEYT ÖZMEN
Gazi Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases

Özet:
Amaç: Rat gözlerinde kornea neovaskülarizasyonu üzerine riboflavin-UVA çapraz bağlama ve rose bengal-yeşil ışık çapraz bağlama yöntemlerinin karşılaştırmalı etkisini değerlendirmek amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Çalışmada 40 adet Wistar cinsi dişi albino rat kullanılmıştır. Deneklerin her 2 gözünde korneaya 3 adet sütür atılması ile kornea neovaskülarizasyonu modeli oluşturulmuştur. Takiben 3. gün denekler randomize olarak 4 gruba ayrılmıştır: Kontrol (grup-1), riboflavin-UVA KKÇB (grup-2), rose bengal-yeşil ışık KKÇB (grup-3), yeşil ışık grubu (grup-4). Çapraz bağlama ve yeşil ışık uygulamaları 3. gün yapılırken denekler 0-3-7-14. günlerde değerlendirilmiştir. Vizitlerde ÖS-OCT ve ön segment fotoğrafları çekilmiştir. Her gruptan deneklerin yarısı 7. gün sakrfiye edilirken, kalan yarısı 14. gün sakrifiye edilmiştir. Deneklerin sağ korneaları limbus sınırından alınarak VEGF, LYVE-1, CD68 immünhistokimya, hematoksilen-eozin boyama ve TUNEL analizi için değerlendirilirken, sol korneaları ise kantitatif analiz amacıyla ELISA yöntemi ile VEGF ve CD68 düzeyleri analiz edilmiştir.
Bulgular: Vaskülarize alan riboflavin-UVA KKÇB grubunda hem 7 hem 14. günlerde kontrole ve diğer gruplara kıyasla anlamlı olarak daha düşük izlenmiştir (p=0,002, p<0,001, sırasıyla). Rose bengal-yeşil ışık KKÇB grubunda ise 7. gün vaskülarize alan yeşil ışık grubuna kıyasla daha düşük izlenmiştir (p<0,001). ELISA VEGF analizinde kontrole kıyasla 7. günde tüm gruplarda düzey daha düşük iken, 14. günde riboflavin-UVA KKÇB grubunda düzey kontrole kıyasla daha düşüktür (p<0,001, p=0,047, sırasıyla). VEGF immünhistokimya incelemesinde ise 7. ve 14. günlerde riboflavin-UVA KKÇB grubunda skor kontrole kıyasla daha düşük izlenmekle birlikte, yeşil ışık grubu ile aralarındaki fark anlamlıdır (p=0,024, p=0,015, sırasıyla). LYVE-1 değerlendirmesi de benzer şekilde izlenmiş olup, 7 ve 14. günlerde riboflavin-UVA KKÇB grubunda yeşil ışık grubu ile aralarındaki fark anlamlıdır (p=0,046, p=0,014, sırasıyla). Rose bengal-yeşil ışık KKÇB grubunda ise VEGF ve LYVE-1 boyanması her iki zaman noktasında da daha düşük izlenmekle birlikte farklılık anlamlı izlenmemiştir (p>0,005). İnflamasyon bulguları değerlendirildiğinde ELISA CD68 düzeyi 14. gün rose bengal-yeşil ışık KKÇB grubunda kontrole kıyasla daha düşük izlenirken (p=0,017), CD68 immünhistokimya boyanması iki çapraz bağlama grubunda da hem 7 hem 14. günlerde anlamlı olarak daha düşük izlenmiştir (p=0,002, p=0,002, sırasıyla). Hematoksilen-eozin boyanma ile lökosit sayıları benzer şekilde çapraz bağlama gruplarında 7. ve 14. günlerde daha düşüktür (p=0,003, p=0,002, sırasıyla). Dokuda keratosit sayıları çapraz bağlama gruplarında 7. ve 14. günlerde daha düşük değerlendirilmekle birlikte (p<0,001, p<0,001, sırasıyla), TUNEL analizinde de apoptozis diğer gruplara kıyasla riboflavin-UVA KKÇB grubunda en fazla izlenirken rose bengal-yeşil ışık KKÇB grubunda da kontrol ve yeşil ışık gruplarına kıyasla daha yüksektir (p<0,001, p<0,001, sırasıyla).
Tartışma ve Sonuç: Çalışmamızda her iki çapraz bağlama yönteminin de korneada inflamasyonu baskılarken, hemanjiyogenez ve lenfanjiyogenez üzerine etkili oldukları izlenmiştir. Vaskülarizasyon üzerine riboflavin-UVA KKÇB'nin rose bengal yeşil ışık KKÇB'ye kıyasla daha etkili olduğu izlenmiştir.

Abstract:
Purpose: To evaluate the comparative effects of riboflavin-UVA cross-linking (CXL) and rose bengal-green light cross-linking on corneal neovascularisation in rat eyes.
Materials and Methods: 40 Wistar albino rats were included in the study. Corneal neovascularisation was induced by sutur placement into the cornea of each eye of the animals. Subsequently, on the 3rd day, the animals were randomly divided into 4 groups: Control (group-1), riboflavin-UVA CXL (group-2), rose bengal-green light CXL (group-3), green light group (group-4). Cross-linking and green light applications were performed on the 3rd day and each corneas were evaluated on days 0-3-7-14. Anterior segment optical coherence tomography (AS-OCT) and anterior segment photographs were taken at each visits. Half of the animals from each group were sacrificed on day 7, while the remaining half were sacrificed on day 14. The right corneas of the animals were removed from the limbus border and examined for VEGF, LYVE-1, CD68 immunohistochemistry, haematoxylin-eosin staining and TUNEL analysis, while the left corneas were analysed for VEGF and CD68 levels by ELISA method for quantitative analysis. 
Results: Vascularised area in the riboflavin-UVA CXL group was significantly lower compared to the control and other groups on 7 and 14th days (p=0,002, p<0,001, respectively). Vascularised area was also significantly lower in the rose bengal-green light CXL group compared to the green light group receiving on day 7 (p<0,001). In ELISA VEGF analysis, while the level was lower in all groups on day 7 compared to the control, the level was lower in the riboflavin-UVA CXL group on day 14 compared to the control (p<0,001, p=0,047, respectively). In VEGF immunohistochemistry examination, although the score was lower in the riboflavin-UVA CXL group on the 7th and 14th days compared to the control, the difference between them and the green light group was significant (p=0,024, p=0,015, respectively). Although VEGF and LYVE-1 immunohistochemistry staining was lower in the rose bengal-green light CXL group at both time points, the difference was not significant (p>0,005). When inflammation findings were evaluated, ELISA CD68 level was significantly lower in rose bengal-green light CXL group on day 14 compared to control (p=0,017), while CD68 immunohistochemistry staining was significantly lower in both cross-linking groups on both days 7 and 14 (p=0,002, p=0,002, respectively). Leukocyte counts with haematoxylin-eosin staining were similarly lower in the cross-linking groups on the 7th and 14th days (p=0,003, p=0,002, respectively). While keratocyte counts were lower in the cross-linking groups on the 7th and 14th days (p<0,001, p<0,001, respectively), apoptotic index assessed by TUNEL analysis was highest in the riboflavin-UVA CXL group compared to the other groups, then higher in the rose bengal-green light CXL group compared to the control and green light groups (p<0,001, p<0,001, respectively).
Discussion and Conclusion: Both cross-linking methods suppressed corneal inflammation and were effective on haemangiogenesis and lymphangiogenesis; however, riboflavin-UVA CXL was more effective than rose bengal green light CXL.