Farklı besi ortamlarında yetişen Chlorella vulgaris Beyerinck [Beijerinck] 1890 türüne ait protein ve amino asit komposizyonunun karşılaştırılması
Comparison of total protein and amino acid compositions of microalgae Chlorella vulgaris Beyerinck [Beijerinck] 1890 grown in different growth media
Yazar: MERVE KAVASBAŞIOĞLU
Danışman: PROF. DR. İLHAMİ TÜZÜN
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, üçüncü nesil hammadde kaynağı olarak bilinen mikroalglerden Chlorella vulgaris türünün biyokütlesi, amino asit- değerli biyobileşikleri- içeriği ve kompozisyonu açısından endüstriyel kullanım potansiyelinin değerlendirilmesi amacıyla incelenmiştir. Biyokütle üretimi esnasında atık su kullanılmasıyla üretim maliyetlerinin düşürüleceği öngörülmüştür. 
Kırıkkale Kapulukaya barajından izole edilen ve TAP (Tris-Acetate-Phosphate) besiyeri, Nitrat eklemeli TAP medium (N-TAP), Kırıkkale Üniversitesi kampüs gölü (GÖL), Makina ve Kimya Endüstrisi Kurumu (MKEK) atık suyu olmak üzere 4 farklı besi ortamında yetiştirilen mikroalg Chlorella vulgaris'in büyüme parametreleri (hücre sayımı, Optik Dansite ve Klorofil-a) takip edilmiştir. 
Hızlı büyüme evresi boyunca olan besin tuzlarından azotun besi yeri konsantrasyonları tedrici olarak azalmasına rağmen, büyümede kullanılan diğer temel element olan fosforun azalmayıp yatay şekilde değerler gösterdiği saptanmıştır. Alglerin kimyasal strateji olarak ortamda baskın bulunduğu düşünülen H2PO4- formunun kullanılmasına öncelik verdiği, bu formun tükenmesini takiben HPO42- formunu (besi yerlerine göre MKEK ve GÖL için 8. gün, TAP ve N-TAP için 12. gün) kullanmaya başladıkları tahmin edilmektedir. Durağan evrede, MKEK ve GÖL besi yerine ait alg biyokütle değerleri TAP ve N-TAP besi yerine göre belirgin derecede yüksek olarak tespit edilmiştir. Onbeşinci günden itibaren ölüm fazına geçen ve hasatı gerçekleştirilen alglerin protein miktarları sırasıyla; N-TAP (2,17 mg/BSA), TAP (1,96 mg/BSA), MKEK atık suyu (0,87 mg/BSA) ve GÖL besi ortamı (0,69 mg/BSA) olarak saptanmıştır. Bu durum, mikroalglerin hücre kültürü süresince en iyi hayatta kalma yöntemlerini seçerken, makroelementler arasındaki dönüşümlere başvurduğu ve hasat sonunda nihai bir sonuç olarak ortaya çıktığı şeklinde değerlendirilmiştir. İyon kromatografi kullanılarak yapılan besi ortamı anyon ölçümleri değerlendirildiğinde, MKEK ve GÖL SUYU besi ortamında yetişen Chlorella vulgaris türünde fosfat sınırlamasının diğer TAP ve N-TAP ortamlarına göre daha erken oluştuğu sonucuna varılmıştır. Makromoleküller arasındaki değişimlerin besi yeri ortamına göre ortaya çıkan farklılıkları göz önüne alındığında (FT-IR analizi), besin tuzu (N veya P veya her ikisi aynı anda) açlığına dayalı stres koşullarının büyümeyi yavaşlattığı buna karşın metabolik karbon ihtiyacının karbohidratlardan sağlandığı anlaşılmıştır. 
Amino asit ölçümleri HPLC cihazında C18 ODS-4 kolonu kullanılarak, 0,6ml/dk akış hızında ve mobil faz A, 0.1 mol  Na/Acasetonitril (97:3, v/v; pH 6.5)  ve mobil faz B, asetonitril-su (4:1, v/v) olarak yapılmıştır. Gradient metod; 0-13 dakika,% 100-93 A; 13–23 dk, % 93-77 A; 23-29 dak, 77-65% A; 29–35 dk,% 65-60 A; 35-40 dak; % 60-0 A; 40-45 dakika,% 100 B olarak ayarlanmıştır. Amino asit ölçüm sonuçlarında tüm besi ortamlarında Arjinin amino asidi en yüksek olarak bulunmuştur. Amino asit ölçüm sonuçlarında tüm besi ortamlarında Arjinin amino asidi en yüksek olarak bulunmuştur. Çalışmada kullanılan atık su ve doğal su ortamları, N-TAP ve TAP besi yeri kontrol ortamlarıyla rekabet eder seviyede bulunmamıştır. Bunun sebebi, yeterli azot konsantrasyonlarına karşın fosforun sınırlayıcı rolünün daha belirgin olmasıdır.

Abstract:
In this study, microalgae Chlorella vulgaris biomass, considered to be a member of third generation feedstock, was utilized to explore the amino acid potential for a probable industrial application of value added bio-compounds. It was assumed that the use of waste water integrated to the study would alleviate the cost of biomass production. 
The microalgae species, Chlorella vulgaris, isolated from Kapulukaya Reservoir (Kırıkkale), were subjected to four different growth media, being (i) Tris-Acetat-Phosphate (TAP), (ii) Tris-Acetat-Phosphate enriched with N (N-TAP), (iii) Kırıkkale University Campus Lake Water (LW) and (iv) Waste Water from Mechanical and Chemical Industry Company (MKEK) in order to compare its growth by monitoring the parameters, cell count (CC), Optical density (OD) and Chlorophyll-a (Chl-a).
During the log phase, gradual decreases detected at nitrogen concentrations in all media except for N riched medium (N-TAP) were not pronounced at phosphorus concentrations. This was speculated that H2PO4-, being one of the two species of phosphorus applied for growth, was used preferably until exhaustion, and then the other species HPO42- was resorted to utilize on day 8 for MKEK and LW, and day 12 for TAP and N-TAP medium. During the stationary phase, microalg biomasses of MKEK and LW were found to be notably higher than those of TAP and N-TAP growth medium. Following the end of the experiments, amounts of total protein measured on the harvested biomass were found to be 2,17 mg/BSA (N-TAP), 1,96 mg/BSA (TAP), 0,87 mg/BSA (MKEK) and 0,69 mg/BSA (LW), respectively. Results from anion measurements in the media suggested the idea that phosphate (P) limitations occurred during growth but being onseted earlier in the MKEK and LW medium than that in the TAP and TAP-N medium. 
When the differences on the respective amounts of macromolecules occurring as a results of different media and the algal growth on them were analysed, stress conditions due to either P or N starvation or both caused declines at growth but evoked the use of carbohydrates as a carbon source for metabolic demand. The greater biomasses found in MKEK and LW media corresponded with similarly lower lipid values according to Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR analysis). 
Amino acids were identified and their content measured by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with C18 ODS-4 colon at 0,6ml/min flow rate and in a mobile phase A of 0.1 mol NaAcasetonitril (97: 3, v/v; pH 6.5) followed by mobile phase B asetonitril-water (4: 1, v/v) was used fort he elusion of amino acids. A gradient method was applied as 0-13 min. 100-93% A; 13–23 min. 93-77 % A; 23-29 min. 77-65% A; 29–35 min. 65-60 % A; 35-40 min. 60-0 % A; 40-45 min. 100 % B. The amount of arginine was profoundly higher amongst amino acids. Both essential and non-essential amino acids were five-fold higher in N-TAP and TAP media compared to waste water (MKEK) and LW. This suggested a general conclusion that the used natural waters (MKEK and LW) were not compatible enough with the controlled media (TAP and TAP-N media) due mainly to that in natural waters phosphorus limited the growth despite efficient N levels.