İshali olan immünsupresif hastalarda fırsatçı ve fırsatçı olmayan protozoonların sıklığının konvansiyonel yöntemler ve multipleks PZR ile araştırılması
Investigation of the frequency of opportunistic and NON-opportunistic protozoa in immunosuppressive patients with diarrhea by conventional methods and multiplex PCR
Yazar: FATMA ESENKAYA TAŞBENT
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM DERİNBAY EKİCİ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Periodontoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Coccidia = Coccidia ; Diyare = Diarrhea ; Paraziter hastalıklar = Parasitic diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Protozoa = Protozoa ; İmmünosüpresyon = Immunosuppression ; İntestinal hastalıklar = Intestinal diseases

Özet:
İmmün yetmezliği olan hastalar normal konaklara göre gastrointestinal enfeksiyonlar açısından daha büyük risk altındadırlar. Bu hastalarda gelişen enfeksiyonlarda paraziter etkenler önemli bir yere sahiptir. Bağırsak parazitlerinin tanımlanması tüm parazitlerin tespitini sağladığı için temel olarak mikroskobik incelemeye dayalıdır. Her ne kadar görsel olması açısından değerli olsa da mikroskobik değerlendirme; yüksek deneyim ve eğitim gerektirmektedir. Diğer yandan geliştirilen polimeraz zincir reaksiyonu tabanlı moleküler yöntemler yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptirler. Ancak DNA izolasyonu protozoonların kist ya da ookistlerinin kalın duvar yapısı nedeniyle bakteriyel ve viral etkenlere göre daha zordur ve gaita içerdiği PCR inhibitörleri nedeniyle moleküler çalışmalar için zor bir örnek türüdür. 
Bu çalışmada bir üniversite hastanesi parazitoloji laboratuvarına rutin parazitolojik inceleme için gönderilen immün yetmezlikli hastalara ait 100 gaita örneği çalışmaya dahil edilmiştir. Bu hastalarda fırsatçı patojenlerden Cryptosporidium spp. ve C. cayetanensis; fırsatçı olmayan etkenlerden E. histolytica, G. intestinalis ve D. fragilis sıklığı en az iki yöntemle araştırılmıştır. Ayrıca modifiye aside dirençli boyada pozitif bulunan C. belli ookistleri kaydedilmiştir. Konvansiyonel yöntemler olarak G. intestinalis ve D. fragilis için wheatley's trikrom boyama, Cryptosporidium spp, C. belli, C. cayetanensis için modifiye aside dirençli Ziehl-Neelsen boyama kullanılmıştır. E. histolytica için mikroskobik bakı geçerli yöntem olarak alınmamış, ELISA yöntemi ile E. histolytica'ya spesifik adezin antijeni araştırılmıştır. Çalışmada ayrıca multipleks real time PCR ile E. histolytica, G. intestinalis, D. fragilis ve Cryptosporidium spp. araştırılırken, C. cayetanensis için de real time PZR çalışması yürütülmüştür. 
İmmün yetmezlikli hasta örneklerinde çalışılan yöntemlerden en az biriyle toplam 4 örnekte E. histolytica, 12 örnekte G. intestinalis, 8 örnekte D. fragilis,  12 örnekte C. belli, 9 örnekte Cryptosporidium spp. ve 2 örnekte C. cayetanensis tespit edilmiştir. Çalışmada ishali olan immün yetmezlikli hastalarda araştırılan protozoal etkenlerin sıklığı %39 olarak bulunurken, bunlar içerisinde fırsatçı etken sıklığı ise %19 olarak tespit edilmiştir. Çalışma sonuçları; protozoal etkenlerin immün yetmezlikli hasta grubunda önemli bir gastroenterit etkeni olduğunu göstermiştir.
Bu hasta grubunda protozoal etkenleri, diğer enfeksiyon etkenlerinden ve enfeksiyona bağlı olmayan ishal nedenlerinden ayırt edebilmek doğru tedavi yaklaşımı açısından önemli olduğundan, birden fazla tanı yönteminin bir arada kullanılmasının faydalı olacağı sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Immunocompromised patients are at greater risk for gastrointestinal infections than normal hosts. Parasitic agents have an important place in the infections that develop in these patients. Identification of intestinal parasites is mainly based on microscopic examination as it enables the detection of all parasites. Although microscopic evaluation is valuable because of being visual, it requires high experience and education. On the other hand, the developed polymerase chain reaction based molecular methods have high sensitivity and specificity. However, DNA isolation is more difficult than bacterial and viral agents due to the thick wall structure of protozoan cysts or oocysts, and stool is a difficult sample type for molecular studies due to PCR inhibitors it contains.
In this study, a hundred stool samples of immunocompromised patients who were sent to a university hospital parasitology laboratory for routine parasitological examination were included in the study. In these samples, Cryptosporidium spp., C. cayetanensis as opportunistic agents and E. histolytica, G. intestinalis and D. fragilis as non-opportunistic agents were investigated by at least two methods. In addition, positivity of C. belli oocysts in the modified acid-fast dye have been recorded. Wheatley's trichrome staining for G. intestinalis and D. fragilis, modified acid-fast Ziehl-Neelsen staining for Cryptosporidium spp, C. belli, C. cayetanensis were used as conventional methods. Microscopic examination was not taken as a valid method for E. histolytica, and the specific adhesive antigen for E. histolytica was investigated by ELISA method. In addition E. histolytica, G. intestinalis, D. fragilis and Cryptosporidium spp. were investigated with a multiplex real time PCR, while C. cayetanensis was carried out with a real time PCR. 
In the study, the frequency of protozoal agents investigated in immunocompromised patients with diarrhea was found to be 39%, while the frequency of opportunistic agents was found to be 19% among them. Study results showed that protozoal agents are an important factor of gastroenteritis in the immunocompromised patient group. Since it is important for the right treatment approach to distinguish protozoal agents from other infectious agents and non-infectious diarrhea causes in this patient group, it was concluded that it would be beneficial to use more than one diagnostic method together.