Yeni nesil kemik döngüsü biyobelirteçlerinden olan sfingozin-1 fosfat'ın farklı hastalık gruplarında önerilen geleneksel biyobelirteçleri ile karşılaştırılmasının deneysel olarak gösterilmesi
Experimental demonstration of a new generation bone turnover biomarker, sphingosine-1 phosphate, in different disease groups in comparison with proposed traditional biomarkers
Yazar: BURCU ESER
Danışman: PROF. DR. AYLİN SEPİCİ DİNÇEL
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Kemik döngüsü belirteçleri(BTM) günümüzde yaygın olarak görülen Osteoporoz(OP) ve Romatoid Artrit(RA)'in tanı, tedavi ve takibi için kritik öneme sahiptir. Noninvaziv olması sebebiyle ayrıca önemi giderek dahada artmaktadır. Membran lipitleri olan sfingolipit metabolitlerinden Sfingozin-1–fosfat (S1P) osteoklast öncüllerinin kan ve kemik arasındaki göçünü kontrol eder ve osteoklast öncülerini kemik yüzeylerinden uzak tutarak kemik bozulmasını azaltır, böylece kemik yıkımını önler. Ayrıca S1P, osteoblastlarda RANkL'ı (Reseptör aktivatör NF-κB ligandı) artırarak osteoblastların proliferasyonunu, hayatta kalmasını ve göçünü ve osteoklast farklılaşmasını etkiler. Deney hayvan çalışması şeklinde planlanan bu çalışmada, tavşanlarda önce OP ve RA hastalık modelleri oluşturulmuş ardından bu hastalıkların yaygın olarak kullanılan tedavi yöntemleri uygulanarak takipleri yapılmıştır. Tüm bu hastalık oluşum ve tedavi süresince hayvanlardan numuneler toplanarak kullanılan geleneksel biyobelirteçlere karşılık RANkL ve S1P ölçümleri yapılmıştır. Ovariektomi ve kortikosteroid tedavisinin kombinasyonu ile OP geliştikten sonra tavşanlar denosumab ile tedavi edilmiştir. RA oluşumu için OVA/FCA diz içine enjekte edilmiş sonrasında ise tedavi için NSAID ve kortikosteroid kullanılmıştır. Serum 25(OH)D, PTH, Kalsitonin, Ca, P, ALP, Alb, Kol, HDL, CTX ve P1NP düzeyleri klinik biyokimya analizörleri ile ölçülmüştür. RANkL düzeyleri analizi ise ELİSA metodu ile gerçekleştirilmiştir. Serum S1P düzeyleri LCMS/MS cihazı kullanılarak ölçülmüştür. Çalışmada ACE-3-C18(50mmx2.1mmx5μm) kolonu kullanılmıştır. S1P için m/z 380,8→264,7 ve 81,7 iyon değerleri kullanılmıştır. S1P düzeyleri OP grubunda başlangıç, hastalık oluşum-1 ve 2 ve tedavi-1 ve 2 aşamasında sırasıyla ortalama 85,50ng/mL, 51,98ng/mL; 36,01ng/mL; 44,37ng/mL; 36,07ng/mL olarak ölçülüştür. RA grubunda ise başlangıç, hastalık oluşum, tedavi-1 ve 2 aşamasında sırasıyla 55,32ng/mL; 35,42ng/mL; 25,14ng/mL; 31,70ng/mL olarak ölçülmüştür. RANkL ise sırasıyla OP grubu: 86,46pg/mL; 54,15pg/mL; 65,44pg/mL; 104,14pg/mL; 145,58pg/mL; RA grubu: 77,86pg/mL; 89,54pg/mL; 105,61pg/mL ve 104,91pg/mL idi. OP grubu sırasıyla CTX düzeyleri: 9,49pg/ml; 7,46 pg/ml; 3,09 pg/ml; 1,52pg/ml; 1,32pg/mL; P1NP ise sırasıyla: 2,07ug/L; 1,76ug/L; 1,79ug/L; 1,95ug/L; 1,98ug/L olarak ölçülmüştür. RA grubu CTX düzeyleri sırasıyla: 7,49pg/ml; 5,47pg/ml; 6,73pg/ml; ve 9,68pg/mL; P1NP ise sırasıyla: 1,96ug/L; 1,87ug/L; 1,65ug/L; ve 1,68ug/L olarak ölçülmüştür. OP grubunda S1P ve RANkL düzeyleri hastalık ile uyumlu iken tedavi için anlamlı değişiklikler izleyemedik. RA grubunda ise S1P ve RANkL düzeyleri hastalık ve tedavi süreçleri ile uyumlu idi. Çalışmamızda elde ettiğimiz veriler her ne kadar OP ve RA için anlamlı olsada kemik metabolizmasında biyobelirteç olarak kullanılması için daha fazla veriye ihtiyaç vardır.

Abstract:
Bone turnover markers (BTM) are of critical importance for the diagnosis, treatment and follow-up of Osteoporosis (OP) and Rheumatoid Arthritis (RA), which are common today. Due to its non-invasiveness, its importance is increasing day by day. Sphingosine-1-phosphate (S1P), one of the sphingolipid metabolites that are membrane lipids, controls the migration of osteoclast precursors between blood and bone and reduces bone degradation by keeping osteoclast precursors away from bone surfaces, thus preventing bone destruction. In addition, S1P affects the proliferation, survival and migration of osteoblasts and osteoclast differentiation by increasing RANKL (receptor activator of NF-κB ligand) in osteoblasts. In this study, which was planned as an experimental animal study, first OP and RA disease models were created in rabbits, and then these diseases were followed up by applying commonly used treatment methods. During all this disease formation and treatment, samples were collected from animals and RANkL and S1P measurements were made for against the traditional biomarkers used. Rabbits were treated with denosumab after development of OP with a combination of ovariectomy and corticosteroid therapy. OVA/FCA was injected into the knee for RA formation, and then NSAID and Corticosteroid were used for treatment. Serum 25(OH)D, PTH, Calcitonin, Ca, P, ALP, Alb, Kol, HDL, CTX and P1NP levels were measured by biochemistry auto-analyzers, RANkL levels were measured by ELISA. Serum S1P levels were measured with an LCMS/MS device. The analysis was carried out on an ACE-3 C18 (2.1mm×50mmx5μm) reversed-phase analytical column. Detection was performed using at m/z 380,8→264,7 and 81,7 for S1P. S1P levels were measured as mean 85,50ng/mL, 51,98ng/mL; 36,01ng/mL; 44,37ng/mL; 36,07ng/mL at the initial, disease formation-1 and 2 and treatment stages-1 and 2, respectively, in the OP group. In the RA group, 55,32ng/mL; 35,42ng/mL; 25,14ng/mL; 31,70ng/mL were measured at the initial, disease formation and treatment-1 and 2 stages, respectively. RANkL of the OP group was 86,46pg/mL; 54,15pg/mL; 65,44pg/mL; 104,14pg/mL; 145,58pg/mL; respectively. RA group was: 77,86pg/mL; 89,54pg/mL; 105,61pg/mL ve 104,91pg/mL. The mean CTX levels were measured as 9,49pg/ml; 7,46 pg/ml; 3,09 pg/ml; 1,52pg/ml; 1,32pg/mL and P1NP as 2,07ug/L; 1,76ug/L; 1,79ug/L; 1,95ug/L; 1,98ug/L in the OP group, respectively. The mean CTX levels were measured as 7,49pg/ml; 5,47pg/ml; 6,73pg/ml; ve 9,68pg/mL and P1NP as 1,96ug/L; 1,87ug/L; 1,65ug/L; ve 1,68ug/L in the RA group, respectively. In the OP group; While S1P and RANkL levels were consistent with the disease, we could not observe significant changes for treatment. In the RA group, S1P and RANkL levels were consistent with the disease and treatment processes. Although the data we obtained in our study are significant for OP and RA, more data is needed for its use as a biomarker in bone metabolism.