Antiviral tedavide kullanılmak üzere ivermektin içeren lipozomal ilaç taşıyıcı sistemin geliştirilmesi
Development of liposomal drug delivery system containing ivermectin for antiviral therapy
Yazar: MERYEM KOÇAŞ
Danışman: PROF. DR. TANSEL ÇOMOĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı / Farmasötik Teknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: İlaç dağıtım sistemleri = Drug delivery systems ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers

Özet:
Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin (SARS-CoV-2) neden olduğu pandemik koronavirüs hastalığı (COVID-19), önemli morbidite ve mortalite ile dünya çapında hızla yayılmıştır. Virüs yükü, COVID-19 hastalarında patolojik çeşitliliğin altında yatan ana belirleyici etken olup COVID-19 hastalarının prognozunu iyileştirmek için etkili bir antiviral tedavi gerekmektedir. Spesifik antiviral ajanların yokluğunda, viral hastalıklarda virüsü kontrol altına almak için antiviral potansiyeli olan çeşitli ilaçlar kullanılmaktadır. 
İvermektin (İVM) 1975 yılında keşfedilmiş ve 1980'lerin başında ticarileştirilmiş FDA onaylı bir antiparaziter olup nadir görülen tropikal hastalıkların tedavisinde ve hayvanlarda antiparaziter olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. İVM'in in vitro olarak SARS-CoV-2 replikasyonunun güçlü bir inhibitörü olduğunu bildirilmiştir ancak SARS-CoV-2'ye karşı etkin bir formülasyon bulunmamaktadır. 
İVM, suda pratik olarak çözünmeyen, metilen klorürde serbestçe çözünen ve etanolde çözünen son derece hidrofobik bir etkin maddedir. Bu özellik, farmakolojik etkilerini optimize etmek için yeni ilaç taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesini gerektirir. Farmasötik yönden, İVM'nin farmakolojik etkilerini optimize etmek için farklı ilaç formülasyonları ve taşıyıcı sistemleri geliştirmek için en umut verici yaklaşım, iyi tanımlanmış fizikokimyasal özelliklere sahip taşıyıcıların kullanılmasıdır. 
Lipozomların ilaç taşıyıcısı olarak kullanılması; lipofilik ve amfifilik ilaçlarda artan çözünürlük, bağışıklık sistemi hücrelerine özellikle mononükleer fagositik sistem hücrelerine pasif hedefleme yapabilme, sistemik veya lokal olarak uygulanan lipozomların sürekli salım sistemi olarak verilebilmesi, hidrofilik yüklü moleküllerin geliştirilmiş transferi, dokulara gelişmiş penetrasyon sağlaması gibi avantajlara sahiptir. 
Bu çalışmanın amacı, lipit film hidrasyonu ve etanol enjeksiyon yöntemlerini kullanarak İVM yüklü çeşitli lipozomal formülasyonları değerlendirmek ve karşılaştırmaktır. Üç farklı lipit (DOPC, SPC ve DSPC); üç farklı molar oran (1,85; 3; 7) ve iki farklı üretim yöntemi (film hidrasyon ve etanol enjeksiyonu) kullanılarak lipozomal formülasyonlar hazırlanmıştır. Faktöriyel tasarımla, partikül boyutu, polidispersite indeksi (PDI), zeta potansiyeli ve yükleme etkinliği değerlendirilerek formülasyonlar seçilmiştir. Seçilen formülasyonların (F6, F9, F11, F23, F24) ortalama partikül boyutu, PDI ve zeta potansiyel değerleri sırasıyla 196,40±44,60 nm; 0,39±0,09; -40,24±9,17 mV ve enkapsülasyon etkinliği %80'in üzerinde bulunmuştur. In vitro çalışmalarla TEM, FTIR, etkin madde salımı, sitotoksistesi, hücre içi alımı ve SARS-CoV-2'ye karşı antiviral aktivite değerlendirilmiştir. Piyasa tabletlerinden 30 dk süre sonunda İVM %90 oranında salınırken, lipozomlardan İVM salımı salımı 48 sürecinde gerçekleşmiştir. Serbest İVM ve İVM yüklü lipozomlar için yarı-maksimum sitotoksik konsantrasyonlar (CC50) sırasıyla 10 μM ve <110 μM olarak belirlenmiştir. İVM yüklü lipozomların hücresel alımı %13-60 arasında değişirken, serbest İVM yalnızca %2 alım göstermiştir. Lipozomal formülasyonlar, daha düşük IC50 değerleri göstererek serbest İVM'ye kıyasla üstün antiviral aktivite göstermiştir. Bulgularımız, İVM'nin lipozomal taşıyıcı sisteme yüklenmesinin, sitotoksisitesini azaltırken hücresel emilimini ve antiviral etlinliğini önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Bu çalışmanın sonuçları, İVM yüklü lipozomların viral aktiviteyi inhibe etmedeki etkinliğini vurgulayarak, antiviral tedavi için umut verici adaylar olarak potansiyellerini vurgulamaktadır.

Abstract:
Pandemic coronavirus disease (COVID-19), caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), has spread rapidly worldwide with significant morbidity and mortality. Viral load is the main determinant underlying pathological variation in COVID-19 patients, and effective antiviral therapy is required to improve the prognosis of COVID-19 patients. In the absence of specific antiviral agents, various drugs with antiviral potential are used to control the virus in viral diseases. 
Ivermectin (IVM) was discovered in 1975 and commercialized in the early 1980s, is an FDA-approved antiparasitic and is widely used in the treatment of rare tropical diseases and as an antiparasitic in animals. IVM is a potent inhibitor of SARS-CoV-2 replication in vitro, but there is no effective formulation against SARS-CoV-2.  
IVM is an extremely hydrophobic drug, practically insoluble in water, freely soluble in methylene chloride and soluble in ethanol. This property requires the development of new drug delivery systems to optimize its pharmacological effects. From a pharmaceutical point of view, the most promising approach to develop different drug formulations and delivery systems to optimize the pharmacological effects of IVM is the use of carriers with well-defined physicochemical properties. 
The use of liposomes as drug carriers has advantages such as increased solubility of lipophilic and amphiphilic drugs, passive targeting to immune system cells, especially mononuclear phagocytic system cells, sustained release system of systemically or locally applied liposomes, improved transfer of hydrophilic charged molecules, and improved penetration into tissues. 
The aim of this study was to evaluate and compare various liposomal formulations loaded with IVM using lipid film hydration and ethanol injection methods. Liposomal formulations were produced using three lipids (DOPC, SPC and DSPC); three different molar ratios (1.85;3;7) and two different production methods (film hydration and ethanol injection). Optimum formulations were determined by factorial design by looking at particle size, polydispersity index (PDI), zeta potential and loading efficiency. The average particle size, PDI and zeta potential of the selected formulations (F6, F9, F11, F23, F24) were 196.40±44.60 nm; 0.39±0.09; -40.24±9.17 mV, respectively, and the encapsulation efficiency was found to be over 80%. In vitro studies evaluated Transmission Electron Microscopy (TEM), Fourier Transform Infrared Spektroskopy (FTIR), drug release, cytotoxicity, intracellular uptake, and antiviral activity against SARS-CoV-2. In commercially available IVM tablets, 90% of the IVM was released at the end of 30 minutes, whereas in IVM-loaded liposomes, 90% of the IVM was released up to 48 hours. Half-maximal cytotoxic concentrations (CC50) for free IVM and IVM-loaded liposomes were determined as 10 μM and >110 μM, respectively. Cellular uptake of IVM-loaded liposomes ranged from 13% to 60%, while free IVM showed only 2% uptake. Liposomal formulations showed superior antiviral activity compared to free IVM, showing lower IC50 values. Our findings indicate that encapsulation of IVM into liposomes significantly increased its cellular uptake and antiviral efficacy while reducing its cytotoxicity. The results of this study highlight the efficacy of IVM-loaded liposomes in inhibiting viral activity, highlighting their potential as promising candidates for antiviral therapy.