Terpenlerin enzimatik polimerizasyonu ve reaksiyon kinetiğinin modellenmesi
Enzymatic polymerization of terpenes and modeling of reaction kinetics
Yazar: ÖZLEM ÖZMEN
Danışman: PROF. DR. ABDURRAHMAN TANYOLAÇ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyolojik aktivite = Biological activity ; Karvakrol = Carvacrol ; Reaksiyon kinetiği = Reaction kinetics

Özet:
Bu çalışmada, ülkemiz için önemli esansiyel yağlardan olan kekik yağının ve kekik yağının ana bileşenlerini oluşturan karvakrol ve timol monoterpenlerinin enzimatik oksidatif polimerleşme reaksiyonları ile farklı fiziksel ve kimyasal özellikte özgün polimerik yapıların üretilmesi hedeflenmiştir.Timol, karvakrol ve kekik yağının (substrat) enzimatik polimerleşme reaksiyonlarının optimizasyonu için bağımsız sistem parametreleri (değişkenleri) olarak enzim derişimi, çözücü miktarı, substrat derişimi ve pH; bağımlı cevap parametreleri olarak polimer verimi, polimer miktarı ve polimerin ağırlıkça ortalama molekül ağırlığı seçilmiştir. Bağımsız değişkenlerin aralıkları belirlenmiş ve her substrat için uygun çözücüler saptanmıştır. Her üç substrat için seçilen en iyi çözücüler için Design Expert 6.0 (deneme sürümü) istatistiksel programı yardımıyla istatistiksel deney setlerinin tasarımı yapılmış ve bu deneyler gerçekleştirilmiştir. Deneysel optimizasyonu için yüzey cevap yöntemi (YCY) kullanılmış ve optimizasyon olarak maksimum polimer miktarı hedeflenmiştir. Sistem parametreleri (bağımsız değişkenler) ile cevap parametreleri (bağımlı değişkenler) arasındaki ilişkiler üç boyutlu grafiklerle kalitatif olarak incelenmiştir.Karvakrol, timol ve kekik yağının enzimatik oksidatif polimerleşme reaksiyonları 250 ml ağzı parafilm kaplı erlenler içinde 100 ml net reaksiyon hacminde sulu tampon ve çözücü karışımında sabit sıcaklık (25oC) ve çalkalama hızında (150 rpm) lakkaz enzimi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Polimerleşme reaksiyonunu başlatmak için ticari bir enzim olan Novozym®51003 kodlu lakkaz enzimi kullanılmıştır. Her substrat ve çözücü için Design Expert programı tarafında tasarlanan deney setleri içinden maksimum polimer miktarını ve polimer verimini veren deney koşulları optimize edilmiştir.Kinetik model belirleme çalışmalarında farklı substrat ve çözünmüş oksijen derişimlerinde deneyler yapılarak başlangıç polimerizasyon reaksiyon hızları bulunmuştur. Polimerleşme reaksiyonun kinetiğinin modellenmesi için yapılan deneylerde 620 mL net reaksiyon hacmine sahip Pyrex® camdan yapılmış dört boyunlu reaktör kullanılmıştır. Her substrat için yapılan kinetik deneylerin sonucunda, doğrusal olmayan regresyon yapabilen SYSTAT 10 (deneme sürümü) paket programı kullanılarak değişik enzim kinetiği ifadelerinin ikili kombinasyonlarıyla oluşturulan en iyi uyumlu kinetik mekanistik modeller seçilmiştir. Bu modellerde substratların reaksiyon sistemlerini tanımlayan biyokinetik katsayılar bulunmuştur. Farklı sıcaklıklarda elde edilen polimerleşme reaksiyon hızlarının Arrhenius eşitliği ile değerlendirilmesi ile aktivasyon enerjileri hesaplanmıştır.Design Expert programıyla tasarlanan deneylerin sonucunda her substrat ve farklı çözücü için elde edilen polimerik ürünlerin ortalama molekül ağırlıkları tespit edilmiştir. Bu polimerlerin substrat ve çözücü cinsine göre en yüksek ve en düşük ortalama molekül ağırlık değerleri belirlenmiştir. Polimerlerin ortalama molekül ağırlıklarının sistem parametreleriyle olan ilişkileri istatistiksel olarak araştırılmıştır.Karvakrol, timol ve kekik yağından elde edilen polimerlerin FTIR, UV-VIS ve TGA analizleri göz önüne alınarak karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır.Karvakrol polimeri için biyolojik aktivite testleri yapılmış ve substratına yakın biyoaktivite özellikler gösterdiği tespit edilmiştir.Bu çalışma ile farklı fonksiyonel özellikleri olan, literatürde ve patent kayıtlarında şimdiye kadar rastlanmamış doğal polimerik yapıların tekrarlanabilir sentezleri gerçekleştirilmiş ve reaksiyon kinetikleri modellenerek biyopolimerizasyon mekanizması aydınlatılmıştır.

Abstract:
In this study, production of individual polymeric substances with novel physical and chemical properties through enzymatic oxidative polymerization reactions from thyme oil (oregano oil), an important essential oil for our country, and its main constituents, carvacrol and thymol monoterpenes, is aimed.Independent system parameters (variables) of enzyme concentration, solvent concentration, substrate concentration and pH; and (dependent) response parameters of polymer amount, polymer yield and average molecular weight of products were chosen to optimize enzymatic polymerization reactions of substrates carvacrol, thymol and thyme oil (oregano oil). The intervals of independent parameters and appropriate solvents were determined for each substrate. The design of statistical experiment sets for each substrate with appropriate solvents was carried out using Design Expert 6.0 (trial version) program and these runs were accomplished in accord with the design. Response Surface Methodology (RSM) was employed for experimental optimization and maximum polymer amount was aimed for optimization. The interactions between system parameters (independent variables) and response parameters (dependent variables) were examined qualitatively by 3D graphs of Design Expert.Enzymatic oxidative polymerization reactions of carvacrol, thymol and thyme oil (oregano oil) were carried out batchwise in 100 ml net reaction mixture comprising aqueous buffer, solvent, substrate and laccase enzyme of 250 ml Erlenmeyers mouth coated with parafilm, at constant temperature (25°C) and constant shaking rate (150 rpm). A commercial laccase enzyme, specifically Novozym®51003, was used to start the polymerization reaction. For each substrate and solvent, optimum experimental conditions yielding maximum polymer amount and polymer yield was navigated and found by Design Expert Program.Initial polymerization reaction rates were determined through batch runs with different substrate and dissolved oxygen concentrations in kinetics studies. A four necked reactor made of Pyrex® having 620 ml net reaction volume was used for the runs to model polymerization reaction kinetics. For each substrate, the most appropriate models of kinetics was determined by evaluating binary mechanistic reaction models of enzyme kinetics through nonlinear regression in SYSTAT 10 (trial verison) packet program. Biokinetic constants identifying reaction kinetics for each substrate were also found in these models. The activation energies were estimated from initial polymerization reaction rates at different temperatures using Arrhenius equation.Average molecular weights of polimeric products for each substrate and different solvents were evaluated in the results of Design Expert designed runs. Maximum and minimum average molecular weight values were determined according to substrate and solvent type of these polymers. The interactions between average molecular weight of polymers and independent system parameters were statistically investigated.The characterization studies were accomplished in regard to FTIR, UV-VIS, and TGA analysis of polymers produced from carvacrol, thymol, and thyme oil. Biological activity tests for carvacrol polymer were done and it was noted that the polymer has bioactivity properties close to its substrate.In this study, the reproducible syntheses of natural polymeric substances having different functional properties, which have not been encountered yet in literature and patent records, were accomplished and the biopolymerization mechanisms were disclosed by modeling reaction kinetics.