Eksozomal inhibitörlerin epigenetik regülasyondaki rolü
The role of exosomal inhibitors in epigenetic regülation
Yazar: ŞEYMA GÜL DURGUT
Danışman: DOÇ. DR. NURAY VAROL
Afyonkarahisar Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: DNA = DNA ; DNA metilasyon = DNA methylation ; Eksozomlar = Exosomes ; Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Metiltransferaz = Methyltransferase ; Prostat hastalıkları = Prostatic diseases ; Prostat neoplazmları = Prostatic neoplasms ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
DNA metilasyonu, epigenetik gen düzenlenmesinin temel mekanizmalarından biri olup en iyi bilinen epigenetik modifikasyondur. Bu epigenetik modifikasyon, DNA metiltransferazlar (DNMT'ler) tarafından katalize edilir ve işlevlerine göre iki gruba ayrılır: sürdürme DNMT (DNMT1) ve de novo DNMT'ler (DNMT 3A ve DNMT3B).  DNA metilasyon aberasyonları, prostat kanserinde sıklıkla görülmekte ve bu durum DNMT enzim ifadelenmesinin artmasıyla ilişkilendirilmiştir. Eksozomlar, hücre-hücre iletişiminde anahtar mekanizmalarından biri olup sadece tümör progresyonunda değil, aynı zamanda alıcı hücrelerde mutasyonel olmayan epigenetik yeniden programlamada da önemli rol oynarlar. Bu bilgiler ışığında, öncelikle DNA metiltransferaz enzimlerinin prostat kanseri hücrelerinden derive eksozomal kargo molekülleri arasında transkripsiyonel ve translasyonel düzeyde yer alıp almadığını belirlemeyi, sonrasında eksozomal DNMT'lerin alıcı hücrelerde DNMT ifadelenmesini nasıl etkilediğini ve son olarak da spesifik eksozom inhibitörlerinin DNMT'lerin ifadelenmesi üzerindeki etkisini belirlemeyi amaçladık. 
Çalışmamızda DNMT genlerinin (DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B) ifadelenmesi,  qPCR ile analiz edildi. Protein ekspresyonu, immünblotlama yöntemi ile belirlendi. Eksozomlar ise 'exosome isolation reagent' kullanılarak izole edildi. 
Bu çalışma ile ilk kez, prostat kanseri-derive eksozomlarda DNMT mRNA'larının (DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B) eksozomal kargo molekülleri arasında yer aldığını gösterdik. Sonrasında, konsantrasyon ve zamana bağlı olarak PC3 hücrelerinden derive eksozomlarla muamele edilen PC3 hücrelerinde DNMT mRNA seviyelerinde, özellikle de DNMT3A'da artış gözlemledik. Son olarak, dozdan bağımsız bir şekilde, spesifik eksozom inhibitörü GW4869'un, transkripsiyonel düzeyde eksozom içeren PC3 hücrelerinde DNMT'lerin ifadelenmesini azalttığını belirledik. Bununla birlikte, GW4869'un hem eksozom içeren hem de eksozom içermeyen PC3 hücrelerinde DNMT mRNA'larının ifadelenmesini önemli ölçüde azalttığını gözlemledik. 
Sonuç olarak elde ettiğimiz bulgular, DNMT mRNA'ları içeren prostat kanseri-derive eksozomların alıcı hücrelerde DNA metilasyonunun yeniden programlanmasına katkıda bulunabileceğini gösterdi. Biz de bu bulgulara dayanarak eksozom inhibitörlerinin yeni DNMT inhibitörleri olarak kullanılabileceğini önermekteyiz. Sonuçlarımızı desteklemek için bu konu ile ilgili  daha fazla çalışma yapılmasına ihtiyaç vardır.

Abstract:
DNA methylation is one of the main mechanisms of epigenetic gene regulation and the most well-known epigenetic marks. This epigenetic modification is catalyzed by DNA methyltransferases (DNMTs) and are divided into two groups based on their functions; maintenance DNMT (DNMT1) and de novo DNMTs (DNMT 3A and DNMT3B). Aberration of DNA methylation occurs frequently in  prostate cancer and has been associated with increased DNMT enzyme expression. Exosomes are one of the key mechanisms  in cell-cell communication and play an important role in not only tumor progression but also non-mutational epigenetic reprogramming in recipient cells. In the light of this information, we aimed to determine, firstly whether DNA methyltransferase enzymes are among the exosomal cargo molecules derived from prostate cancer cells at transcripsional and translational levels, secondly how exosomal DNMTs affect the expression of DNMTs in recipient cells, and finally the effect of spesific exosome inhibitors on the expression of DNMTs. 
The expression of DNMTs (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) were analyzed by qPCR in exosome, recipient cells with/without treatment with an exosome inhibitor (GW4869).Protein expression was determined by immunoblotting. Exosome was isolated using exosome isolation reagent. 
For the first time, we show that DNMT mRNAs (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B) were involved among exosomal cargo molecules in prostate cancer-derive exosomes. Thereafter, we observed an increase in DNMT mRNA levels, especially DNMT3A, in PC3 cells treated with  exosomes derived from PC3 cells depending on concentration and time. Finally, we determined that in a dose-independent manner, the specific exosome inhibitor GW4869 decreased the expression of DNMTs in PC3 cells containing exosomes at the transcriptional level. However, we observed that GW4869 significantly diminished the expression of DNMT mRNAs in both PC3 cells containing exosomes and non exosome. 
Our findings showed that prostate cancer derive exosome containing DNMT mRNAs may  contribute to the reprogramming of DNA methylation in the recipient cells and we also suggest that exosome inhibitors can be used  as new DNMT inhibitors. Further studies are needed to support  our results.