Tümör nekroz faktör alfa ve trombosit nitrik oksit sentetaz izoenzimleri arasındaki ilişki: in vivo ve in vitro çalışma
The relationship between tumor necrosis factor-alpha and nitric oxide isoenzymes in platelets: in vivo and in vitro study
Yazar: ÖZGE ÇEVİK
Danışman: DOÇ. DR. AZİZE ŞENER
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Kan trombositleri = Blood platelets ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Tümör nekroz faktörleri = Tumor necrosis factors ; İzoenzimler = Isoenzymes

Özet:
İnflamasyon, çeşitli patolojik durumlarda trombotik ve hemostatik bozukluklara katkıda bulunan bir faktör olarak kabul edilmektedir. Bu çalışmada inflamatuar bir sitokin olan ve hücre regülasyonu, farklılaşması ve apoptotik süreçte önemli rol oynayan tümör nekroz faktör alfanın (TNF-?) trombosit NOS izoenzimleri ile arasındaki ilişki incelenmiş ve bu ilişkinin apoptoza etkisi araştırılmıştır. Çalışmada öncelikle trombositlerdeki TNF-? reseptörlerinin (TNF-R1 ve TNF-R2) düzeyi belirlenmiştir. Daha sonra çalışmanın in vitro bölümünde TNF-?'nın (100pg/ml) eNOS, iNOS, kaspaz-3 ve kaspaz-9 düzeylerine etkisi, enzim ve gen ekpresyonu düzeylerindeki değişiklikler flow sitometri, qRT-PCR ve Western Blot yöntemleri kullanılarak ölçülmüştür. Ayrıca TNF-?'nın trombositlerde P-selektin ekspresyonuna, cGMP, Ca+2, sitokrom-c ve tiyoredoksin redüktaz düzeylerine etkisi de belirlenmiştir. In vitro çalışmalarda TNF-? reseptör inhibitörü olarak WP9QY (1µM), iNOS inhibitörü olarak 1400W (50µM) ve uyarıcı ajan olarak ADP (5µM) kullanılmıştır. TNF-? düzeyleri yüksek iskemik inme hastalarında aynı parametreler ölçülerek sağlıklı kontrollerle karşılaştırılmıştır. In vivo ve in vitro trombosit protein ekpresyonlarındaki değişimler ESI-Q-TOF-LC/MS/MS ile analiz edilmiştir. Çalışmamızda trombositlerde TNF-R1 ve TNF-R2'lerinin varlığı gösterildi ve TNF-R1 düzeyinin daha fazla olduğu bulundu. In vivo bölümde inme hastalarında sağlıklı kişiler ile karşılaştırıldığında trombositlerde aktivasyon düzeylerinin anlamlı derecede arttığı görüldü. In vitro bölümde ADP varlığında TNF-?'nın trombositlerde eNOS salınımını azalttığı ve iNOS salınımını arttırdığı bulundu. TNF-?'nın apoptoz belirteçlerinde artışına neden olduğu protein ve gen düzeyinde gözlendi. Apoptoz göstergelerindeki artışın iNOS ile ilişkili olabileceği gözlendi. Proteomik analizlerde ile yüksek güvenilirlikte tanımlanan proteinlerin ekpresyonlarında değişim olduğu tespit edildi. Sonuç olarak TNF-? trombositler üzerindeki reseptörlerine bağlanmakta, bazı sinyal yolaklarını kullanarak iNOS aktivitesi üzerinde etki göstermekte ve trombosit apoptozunu artırmaktadır. Bu çalışma inflamasyona bağlı olarak bazı hastalıklarda gelişebilen trombositopeniye ışık tutabilir.

Abstract:
Inflammation is considered to be a contributing factor in various pathological conditions, thrombotic and hemostatic disorders. In this study, tumor necrosis factor alpha (TNF-?), which is an inflammatory cytokine, and plays an important role in the process of cell regulation, differentiation, and apoptosis, is examined in terms of its relationship between platelet NOS isoenzymes, and investigated on the basis of its effects on apoptosis. The study primarily determines the level of TNF-? receptors (TNF-R1 ve TNF-R2) in platelets. Then, it measures the effects on the eNOS, iNOS, caspase-3, caspase-9 levels of TNF-? (100pg/ml), and the changes in the levels of protein and gene-expression in vitro study by applying flow cytometry, qRT-PCR and Western blotting methods. In addition, the effect of platelet P-selectin expression, cGMP, Ca +2, cytochrome-c and thioredoxin reductase levels of the TNF-? are determined. In vitro studies, as a TNF-? receptor inhibitor WP9QY (1?M), iNOS inhibitor 1400W (50?M) and stimulating agent ADP (5?M) are used. High levels of TNF-? in ischemic stroke patients are compared with healthier controls by measuring the same parameters. In vivo and in vitro changes in platelet protein expression are analyzed by ESI-Q-TOF-LC/MS/MS. In our study, TNF-R1 and TNF-R2 are shown in platelets and TNF-? have been found to be more. In vivo platelet activation levels in stroke patients are significantly increased compared to healthy individuals. In vitro, TNF-? reduces the release of eNOS and increases the release of iNOS in the presence of ADP in platelets. It is observed that TNF-? causes increasing markers of apoptosis both gene and protein level. Apoptosis indices are associated with the increase of iNOS. Proteomic analysis shows that changes in protein expression identified with high reliability. As a result, TNF-? binding to their receptors on platelets, using some of the signal pathways for the effect on the activity of iNOS increases platelet apoptosis. This study could shed light on some of the illnesses that can develop thrombocytopenia due to inflammation.