Çeşitli hematopoetik kaynaklardan çok küçük embriyonik (VSEL) kök hücrelerin elde edilmesi ve tanımlanması
Characterization and isolation very small embryonic-like (VSEL) stem cells obtained from various human hematopoietic cell sources
Yazar: DOLAY DAMLA ÇELİK
Danışman: PROF. DR. SERAP ERDEM KURUCA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Embriyo = Embryo ; Fetal kan = Fetal blood ; Hematopoetik kök hücreler = Hematopoietic stem cells ; Kan bileşenlerini ayırma = Blood component removal ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Kök hücre (KH) nakli malin kan hastalıkları, kemik iliği (Kİ)  yetmezlikleri ve doğumsal kan hastalıklarının tedavisinde kullanılan yöntemdir. Bu amaçla daha çok Kİ, periferik kan projenitör hücreleri (PKPH) ve kordon kanı (KK) kullanılır. Son yıllarda insan embriyonik kök hücrelerinin sahip olduğu pluripotansiyel özelliği bulunan yeni bir KH türü tanımlandı. Çok küçük embriyonik benzeri (VSEL) kök hücreler olarak adlandırılan bu hücrelerin, yetişkin bireyde periferik kan (PK), Kİ, KK ve bütün vücut dokularında bulunduğu iddia edilmektedir. Bu çalışmadaki amacımız VSEL kök hücrelerini çeşitli insan hematopoetik kaynakları kullanarak elde etmek ve tanımlamaktır. Kaynaklar olarak PK, KK ve aferez materyali kullanılmıştır. Donörlerden alınan materyaller, eritrosit lizis ve fikol gradient yöntemi ile hem mononükleer hemde eritrosit katmanındaki hücrelerden, VSEL hücreleri izole edilerek akış sitometri ve immünfloresan boyama ile NANOG, OCT4, SSEA-4 ve CXCR-4 embriyonal reseptörlerin varlığı incelenmiştir. Western blot yöntemiyle NANOG ve OCT4 proteinlerinin varlığı araştırılmıştır. Akış sitometri sonuçlarına göre debris katmanında, VSEL belirteci taşıyan hücre sayısı CD45- populasyonuna göre daha yüksek bulunmuştur. Elde edilen western ve immünfloresan sonuçlarına göre üç materyalde de yüksek miktarda OCT4 ve NANOG ekspresyonu  görülmüştür. Aynı zamanda bu proteinlerin hücre içinde hem sitoplazmada hem de çekirdekde bulunduğu gösterilmiştir. Pluripotent kök hücre belirteci olarak bilinen bu proteinlerin yetişkin PK'da yüksek miktarda ekspresyonu bu proteinlerin farklılaşmış dokularda nasıl bir görev edindiği sorusunu gündeme getirmektedir. Fikol yöntemiyle izolasyon işlemlerinde KH kaybının yüksek miktarda olduğu gösterilmiştir. Bu bulgular; PK, KK ve mobilize PK materyallerinde pluripotent belirteçler taşıyan yeni bir KH populasyonu bulunduğu tezini güçlendirerek bu konuda yapılacak ileriye dönük klinik çalışmalar içinde temel oluşturmaktadır. 

Anahtar Kelimeler: Çok küçük embriyonik benzeri (VSEL) kök hücreler,  Kordon kanı,  Aferez, Periferik kan, Pluripotent kök hücre belirteçleri

Abstract:
Stem cell transplantation is considered one of the available treatments for leukemia, lymphoma,  hereditary blood diseases and bone marrow failure. Bone marrow (BM), peripheral blood progenitor cells (PBPC), and cord blood (CB) are the predominant source of stem cells. Recently new type of stem cell with a pluripotent potential has been identified. These cells named as 'very small embriyonic like stem cells (VSELsc)'. They claimed that VSEL stem cells found in adult BM, peripheral blood (PB), CB and other body tissues. This study is designed to characterize and isolate VSEL stem cells from different human hematopoietic sources; cord blood, peripheral blood and apheresis material. VSEL stem cells isolated from MNC and erythrocyte layers for all materials by using centrifugation and ficoll gradient method. We determined embryonic markers by flow cytometry, immunofluorescence and western blotting methods. The results from western blotting and immunofluorescence show high level of NANOG and OCT4 protein expression in PB, apheresis material and CB. And also immunofluorescence images show cytoplasmic and nuclear presence of these proteins. Flow cytometry results show higher expression of VSEL markers on debris layer than CD45- population. And also higher expression on CB then PB. As a result, these findings show that it is necessary to investigate the function of pluripotent stem cell markers in differentiated adult cells. Another conclusion is, among the lysis and ficoll gradient method, lysis method has the highest cell recovery amount. Consequently this study gives us new informations and viewpoints about expression of PSC markers in adult tissues. 

Keywords: Very Small Embryonic-like (VSEL) stem cells, Apheresis, Cord blood, Peripheral blood, Pluripotent stem cell markers