Zeytin (Olea europaea L.) dal kanseri hastalık etmeni Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'nin kantitatif real-time membran bio-PCR ile tanısı ve epifitik popülasyonun tespiti
Identification and detection of Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi ,the causal agent of olive knot disease and it's epiphytic population by quantitative real-time membran bio-PCR
Yazar: DOĞANCAN AKTAŞ
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN BASIM
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: PCR =   ; Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi = Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi ; Zeytin = Olive

Özet:
Bu çalışmada zeytin yetiştiriciliğinde ekonomik açıdan önemli kalite ve ürün kayıplarına neden olan Zeytin Dal Kanseri hastalık etmeni Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'ye özel dizayn edilen primer seti ve LNA (Locked Nucleic Acid) prob kullanılarak geliştirilen hassas ve seçici Real-Time PCR yöntemi ile tanıları ve tespitleri yapılmıştır.

Real-Time PCR yöntemi için Indoleacetate-lysine ligase (iaaL) gen dizisi kullanılarak Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'ye özel primer seti ve prob geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob setlerinin spesifikliğinin belirlenmesi amacıyla Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatları ve farklı bitki patojeni bakteriyel izolatlar ve zeytin DNA'sı test edilmiştir. Test edilen tüm yerli ve yabancı Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatlarında 69 bp'lik amplifikasyon gerçekleşirken, farklı bitki patojeni bakterilerin genomlarında ve zeytin genomik DNA'sında hiçbir amplifikasyon tespit edilmemiştir. Bu çalışmada geliştirilen yöntemin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı 2 hücre ve DNA düzeyindeki hasasiyet sınırı ise 11.8 pg olarak tespit edilmiştir.

Epifitik populasyon içerisindeki sadece canlı Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'leri tespit etmek ve değişimleri kantitatif olarak belirlemek amacıyla Kantitatif Real-Time Membran Bio-PCR yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntem ile Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'nin zeytin ağaçları üzerindeki epifitik popülasyon oranı tespit edilebilmiştir. Yöntemin, farklı bölgelerde veya aynı bölgede farklı zamanlarda uygulanmasıyla epifitik popülasyonlarının değişim oranlarının tespit edilebilmesine olanak sağlamıştır.

Sonuç olarak, Kantitatif Real-Time Membran Bio-PCR yöntemini kullanarak Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'nin hem bakteriyel hücreden hem de hastalıklı bitki dokularından hızlı (24 dk) ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği, epifitik popülasyonun ve bu popülasyonun içierisindeki sadece canlı bakterilerin kantitatif olarak tespit edilebileceği ortaya konulmuştur.

Abstract:
In this study, a sensitive and selective Real-Time PCR method using LNA (Locked Nucleic Acid) probe was developed for identification and detection of Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Pss) which causes olive knot disease and results in significant loss of quality and product in economic aspects of olive farming.

For Real-Time PCR method, Indoleacetate-lysine ligase (iaaL) gene sequence of Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi was used in order to develop a specific primer set and probe. Pss isolates, different plant pathogenic bacteria genus and total genomic DNA of olives were tested for determination of the specificity of the designed primer and probe sets. Results showed no amplification for the genomes of different plant pathogenic bacteria and olive genomic DNA. On the other hand all local and foreign Pss isolates showed amplification at 69 bp. In this study, cell sensitivity limit was 2 cells and the  sensitivity limit on DNA level was determined as 11,8 pg.

Quantitative Real-Time Membrane Bio-PCR method was used to detect only alive Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi in the epiphytic population and quantitatively determine the population density. By this method, the epiphytic population rate of Pss on olive trees could be determined. The method allowed the detection of the rate of change in the epiphytic populations by applying in different regions or in the same region at different times.

In conclusion, Quantitative Real-Time Membrane Bio-PCR method using LNA probes developed in this study, can be used for rapid (24 min), sensitive and quantitatively identification and detection of Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi strains from direct bacterial cell and diseased olive plant and also can be used for determination of epiphytic population and only alive bacteria within this population.