Barsak enflamasyonu oluşturulan hücre kültür modelinde, timokinonun biyolojik aktiviteleri ile metabolomik profillemesinin araştırılması
Investigation of the biological activities and metabolomic profiling of thymoquinone in an in vitro model of intestinal inflammation
Yazar: ÖZNUR YAŞAR
Danışman: PROF. DR. ABDURRAHİM KOÇYİĞİT
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Gastrointestinal sistem (GIS), vücutta sindirim işlemini düzenleyen ve besin maddelerinin emilimini sağlayan anatomik ve fonksiyonel bir sistemdir. GIS boyunca hücresel bariyer hattı oluşturan barsak epiteli mukozal hemostazın korunmasında oldukça önemlidir. Barsak epiteli, besin emilimini gerçekleştirmenin yanında, mukus, antimikrobiyal peptidler ve sIgA  üreterek bağışıklık üzerine de etki eder. Ancak, bazı durumlarda barsakların normal işlevleri enflamasyon adı verilen, dengeli olduğu takdirde organizmayı doku hasarından koruyan bir süreçle etkilenebilir. Enflamasyon, vücudun zararlı etkenlere veya yaralanmalara karşı savunma mekanizmasıdır. Ancak, kronik enflamasyon (uzun süreli ve aşırı enflamasyon) GIS'i olumsuz etkileyebilir. Barsaklardaki kronik enflamasyon, başta enflamatuvar barsak hastalığı (EBH) olmak üzere bir dizi kronik hastalığa sebep olabilir. 
 EBH, gastrointestinal sistemin kronik ve tekrarlayan bir enflamasyonu olarak bilinir ve enflamasyona sebep olarak reaktif oksijen türleri/reaktif nitrojen türleri  (ROT/RNT) artışı, Nf-B yolak aktivasyonu gösterilse de patogenezi tam olarak anlaşılamayan bir durumdur. Ayrıca EBH genetik yatkınlıkla da ilişkilendirilmiş, remisyon ve alevlenme dönemleri ile giden, ekstraintestinal belirti ve bulguların mevcut olduğu ve uzun vadede malignite riski taşıyan hastalıklardır. EBH patogenezi tam olarak bilinmediği gibi, tanısında kesin bir biyobelirteç bulunamamıştır. Son dönemlerde biyobelirteç çalışmalarında, doku, biyolojik sıvı veya hücre özütünün metabolitlerini, niteliksel ve niceliksel olarak karakterize etmek için proton nükleer manyetik rezonans [1H-NMR] spektroskopisi veya kütle spektrometrisi [MS] gibi analitik kimya tekniklerinin oldukça sık kullanıldığı metabolomik çalışmalardan faydalanılmaktadır.  EBH moleküler patogenezi ve biyobelirteç tayininde de birçok metabolomik çalışma yapılmış, sonuçlarda enflamatuvar biyomoleküller ön planda anlamlı yüksek bulunmuş ancak net bir biyobelirteç ya da patogenez tayini saptanamamıştır.
 EBH tedavisinde sadece enflamasyonu kontrol altına almaya yönelik kortikosteroidler gibi ilaçlar mevcut olup bu ilaçlar da ciddi yan etkilere sahiptir. Bu ilaçlardan olan ve güncel tez çalışmasında da kullanılan budesonid barsak enflamasyonunu kontrol altına alabilmenin yanında, immünbaskılama, osteoporoz gibi ciddi yan etkilere sahiptir.İlaçların bu istenmeyen etkileri yan etki profili daha düşük olan ajanların arayışına yol açmıştır. Antioksidan, anti-enflamatuvar, immunomodülatör özellikleriyle bilinen polifenoller EBH başta olmak üzere enflamatuvar hastalıkların tedavisi için bilimsel çalışmalara çokça konu olmuştur. Bu polifenolik bileşiklerden olan timokinon (TQ) Nigella sativa (çörek otu)nın ana bileşeni olup ciddi antioksidan ve antienflamatuvar özellikleri olduğu önceki çalışmalarla gösterilmiştir. Çalışma ile amacımız, hücre kültürü ile barsak enflamasyonu modeli oluşturarak TQ'nun anti-enflamatuvar terapötik etkinliğini, yüksek çözünürlüklü NMR spektoskopisi ve LC-MS/MS kullanarak hastalık metobolomik profillemesini yaparak araştırmak ve bir anti-enflamatuvar ajan olan  budenosid ile karşılaştırmaktır. Bunun için öncelikle lipopolisakkarit (LPS) verilerek Raw 264.7 makrofaj hücrelerinde enflamasyon oluşturulmuş, ardından bu enflamasyonlu besiyeri alınarak HT-29 kolon kanseri hücreleri üzerine verilmiştir. Böylece hücre kültüründe barsak enflamasyon modeli tasarlanmış, ardından bu model üzerinde TQ ve budesonidin etkileri incelenmiştir. 
 Enflamasyon gelişiminde ana mediyatörlerden olan ROT ile RNT enflamasyon grubunda anlamlı derecede yüksek bulunmuş, TQ uygulanmasıyla bu türlerin seviyeleri düşmüş ancak en yüksek düşüş budesonid grubunda saptanmıştır. Yine EBH patogenezinde önemli rol oynayan sıkı bağlantı proteinleri, okludin ve klaudin-5 proteinlerinin ifade seviyeleri TQ gruplarında artmış, budesonid grubunda en yüksek artış görülmüştür. Tüm bu sonuçlar TQ'nun anti-enflamatuvar ve doku iyileştirici etkisinin olduğunu bize göstermiştir. NMR ile yapılan metabolomik analizlerde enflamasyon grubunda kontrole göre ksantin metaboliti anlamlı seviyede düşüklük göstermiş, yolak zenginleştirme analiziyle daha ayrıntılı incelendiğinde pürin metabolik yolağının etkilendiği görülmüştür. Bu sonuç enflamasyon oluşumunun ksantin oksidaz enziminin, pürin metabolik yolağındaki aktivasyonuna bağlanarak superoksit radikali üretimi üzerinden olabileceğini düşündürmektedir. HRMS ile bu sonuç doğrulanarak aynı metabolik yolağın etkilendiği bulunmuştur. Yine NMR analizinde; laktat, galaktarat fumarat ve dimetilamin düzeyleri enflamasyon grubunda kontrole göre artış göstermiş (VIP skoru > 1), glikolat, 2-hidroksiizobütirat, glisin, asetat, sitrakonat ise kontrol grubunda enflamasyon grubuna göre anlamlı artış (VIP skoru > 1) göstermiştir. Laktat artışı enflamasyon sırasında Warburg etkisine bağlı aerobik glikoliz yolağına kaymayı düşündürürken asimetrik dimetilarginin(ADMA) yıkım ürünü olan dimetilamin artışı, ADMA yıkım artışına bağlı NOS (nitrik oksit sentaz) inhibisyonunun ortadan kalktığını ve bunun enflamasyon oluşumuna katkıda bulunduğunu düşündürmüştür. Yine kontrol grubunda artan metabolitlerden olan glisinin glutatyon sentezinde rol alan aminoasitlerden olması, glikolatın serin ve glisin üzerinden antioksidan sistemi aktive eden metabolit olması, sitrakonatın ise güçlü Nrf2 aktivatörü olması bu metabolitlerin antioksidan ara metabolitleri olduğunu düşündürmektedir. TQ verilen enflamasyonlu gruplarla yapılan NMR analizinde genotoksik, apoptotik özellikleri bilinen N-nitrozodimetilamin (NDMA)'nın  enflamasyon gurubuna göre anlamlı derecede düşük bulunduğu saptanmıştır. TQ verilen enflamasyonlu gruplarla yapılan NMR analizinde enflamasyon grubuna göre anlamlı metabolik yolak bulunamazken, HRMS ile nikotinat-nikotinamit metabolizmasının ve eter-lipid metabolizmasının anlamlı derecede etkilendiği görülmüştür. Yine bu iki yolağın budesonid verilen enflamasyonlu gruplarda, sadece enflamasyon oluşturulan gruba göre etkilenmiş olduğu bulunmuş ve bu sonuç TQ'nun anti-enflamatuvar etkisini bu yolaklar üzerinden gerçekleştirebileceğini düşündürmüştür.  Sonuç olarak güncel çalışmada, barsak enflamasyonu oluşturulan hücre kültürü modelinde metabolitlerin analizinde NMR ve MS metotlarının birlikte kullanımı ile oldukça geniş metabolit spektrumu içeren metabolomik profilleme gerçekleştirilmiştir. Bu yolla TQ'nun antienflamatuvar etkisini hangi olası metabolik yolakla gerçekleştirebileceği tartışılmış ve yine enflamasyon sırasında farklılık gösteren metabolitler belirlenerek hücre kültürü ile biyobelirteç çalışmalarına zemin hazırlanmıştır. Ayrıca daha önce EBH hastalarından elde edilen metabolomik çalışmalarla kıyaslanarak benzer metabolit profilleri bulunmuş bu da hücre kültürürünün metabolomik analizlerde kullanılabilirliği tezini güçlendirmiştir. Her ne kadar benzer metabolit profilleri elde edilse de hücre kültürü ile elde edilen sonuçlar tam olarak insan metabolizmasını yanıstmadığı için ileri in vivo çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir. 
Anahtar Kelimeler:  enflamasyon, timokinon,   metabolomik, hücre kültürü

Abstract:
Gastrointestinal System (GIS) is an anatomical and functional system that regulates the process of digestion and facilitates the absorption of nutrients in the body. The intestinal epithelium, forming a cellular barrier throughout the GIS, is crucial for maintaining mucosal hemostasis. In addition to facilitating nutrient absorption, the intestinal epithelium influences immunity by producing mucus, antimicrobial peptides, and secretory IgA. However, under certain conditions, the normal functions of the intestines can be affected by inflammation, a process that, when balanced, protects the organism from tissue damage in response to harmful agents or injuries.
Inflammation is the body's defense mechanism against harmful agents or injuries. Nevertheless, chronic inflammation (prolonged and excessive inflammation) can adversely affect the GIS. Chronic inflammation in the intestines can lead to various chronic diseases, with inflammatory bowel disease (IBD) being a prominent example.
IBD is characterized by chronic and recurrent inflammation in the gastrointestinal system. Although an increase in reactive oxygen species/reactive nitrogen species (ROS/RNS) and activation of the NF-κB pathway have been implicated as causes of inflammation, the pathogenesis of IBD is not fully understood. Genetic predisposition is also associated with IBD, and it is a disease with periods of remission, flare-ups, extra-intestinal symptoms, and long-term malignancy risk.
The molecular pathogenesis and biomarker determination of IBD have been the focus of numerous metabolomic studies in recent years. Proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) spectroscopy and mass spectrometry (MS), analytical chemistry techniques, are frequently used in metabolomic studies to characterize the metabolites of tissues, biological fluids, or cell extracts qualitatively and quantitatively.
The treatment of IBD currently involves drugs such as corticosteroids aimed at controlling inflammation, but these medications have serious side effects. Budesonide, a corticosteroid used in the current thesis, has been shown to control intestinal inflammation but is associated with adverse effects such as immunosuppression and osteoporosis. The search for agents with a lower side effect profile has led to the investigation of polyphenols, known for their antioxidant, anti-inflammatory, and immunomodulatory properties, as potential therapeutic options for inflammatory diseases, including IBD.
Thymoquinone (TQ), a polyphenolic compound and the main component of Nigella sativa (black seed), has demonstrated significant antioxidant and anti-inflammatory properties in previous studies. The aim of this study is to investigate the anti-inflammatory therapeutic efficacy of TQ and to profile the disease metabolomics using high-resolution NMR spectroscopy and LC-MS/MS by establishing an in vitro model of intestinal inflammation through cell culture. This research also aims to compare the effects of TQ with budesonide, an anti-inflammatory agent.
To create the in vitro model of intestinal inflammation, inflammation was induced in Raw 264.7 macrophage cells by administering lipopolysaccharide (LPS). Subsequently, the inflamed medium was transferred to HT-29 colon cancer cells. The effects of TQ and budesonide on this model were then examined.
Reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS), which are key mediators in the development of inflammation, were significantly elevated in the inflammation group. Treatment with TQ resulted in a reduction in the levels of these species, with the most significant decrease observed in the budesonide group. Furthermore, the expression levels of tight junction proteins, occludin and claudin-5, which play a crucial role in the pathogenesis of IBD, increased in the TQ groups, with the highest increase observed in the budesonide group. These results indicate the anti-inflammatory and tissue-healing effects of TQ.
Metabolomic analysis using NMR revealed a significant decrease in the xanthine metabolite in the inflammation group compared to the control group, suggesting an impact on the purine metabolic pathway. High-resolution mass spectrometry (HRMS) confirmed this result, indicating the affected pathway. Additionally, several metabolites showed altered levels during inflammation, including lactate, galactarate, fumarate, and dimethylamine, which increased, and glycolate, 2-hydroxyisobutyrate, glycine, acetate, and citraconate, which decreased in the inflammation group compared to the control group. These metabolites are indicative of metabolic changes associated with inflammation.
The increase in lactate suggests a shift towards aerobic glycolysis due to the Warburg effect during inflammation. The increase in dimethylamine, a degradation product of asymmetric dimethylarginine (ADMA), implies that the inhibition of nitric oxide synthase (NOS) due to increased ADMA degradation is alleviated during inflammation, contributing to its development. The elevated levels of glycine, glycolate, and citraconate in the control group suggest their roles as antioxidant intermediates in glutathione synthesis, activators of the antioxidant system through serine and glycine, and potent Nrf2 activators, respectively.
NMR analysis of the inflammation group treated with TQ revealed a significant decrease in N-nitrosodimethylamine (NDMA), known for its genotoxic and apoptotic properties, compared to the inflammation group. However, no significant metabolic pathway was identified in the inflammation group compared to the control group using NMR analysis, while HRMS indicated a significant impact on the nicotinate-nicotinamide metabolism and ether-lipid metabolism. Budesonide treatment affected only these pathways compared to the inflammation group without inducing inflammation, suggesting that TQ may exert its anti-inflammatory effects through these pathways.
In conclusion, the current study employed a combined NMR and MS approach for the comprehensive metabolomic profiling of an in vitro model of intestinal inflammation. The analysis shed light on the potential metabolic pathways through which TQ may exert its anti-inflammatory effects. Furthermore, distinct metabolites that varied during inflammation were identified, laying the groundwork for biomarker studies using cell culture. The similarity of the metabolite profiles obtained from cell culture to those from previous metabolomic studies in IBD patients strengthens the utility of cell culture in metabolomic analyses. However, further in vivo studies are necessary to validate the results obtained from cell culture, as the outcomes may not fully reflect human metabolism.

Keywords: inflammation, thymoquinone, metabolomics, cell culture