Adli farmakogenetikte CYP2D6 polimorfizminin önemi
The ımportance of CYP2D6 polymorphısm ın forensıc pharmacogenetıc
Yazar: SELDA MERCAN
Danışman: DOÇ. DR. MÜNEVVER AÇIKKOL
İstanbul Üniversitesi / Adli Tıp Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Genetik = Genetics
Dizin: Adli bilimler = Forensic sciences ; Enzimler = Enzymes ; Farmakogenetik = Pharmacogenetics ; Genler = Genes ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; Psikotik bozukluklar = Psychotic disorders ; Sitokrom P 450 = Cytochrome P 450 ; Trankilizan ajanlar = Tranquilizing agents

Özet:
İlaçlar ile tedavi yüzyıllardır uygulanmakta olan bir yöntemdir. Ancak her insanın ilaçlara verdiği yanıt birbiri ile aynı değildir ve yanıtların değişkenliği advers ilaç etkisi şeklinde ya da ölüme kadar varabilen daha ciddi toksik reaksiyonlar şeklinde sonuçlanabilir. Bireyler ve toplumlar arası farklılıklar kişilerin yaş, beslenme, cinsiyet, eş zamanlı ilaç kullanımı ve fizyolojik durumuna bağlı olduğu kadar; ilaç etken maddelerini metabolize eden enzimlerin gen düzeyindeki farklılığına da bağlıdır.Çalışmanın amacı, CYP2D6 enzimi ile metabolize edilen risperidon, olanzapin ve sertralin ilaç etken maddelerini kullanan psikiyatrik hastaları; CYP2D6 gen kopya sayıları, CYP2D6*3 ve *4 tek nükleotid polimorfizmi, idrar ve kandaki madde ve metabolit konsantrasyonları yönünden inceleyerek farmakogenetiğin adli bilimlerle olan ilişkisini ortaya koymaktır.Bu çalışmada, 77 kişiden oluşan psikiyatrik hasta grubu ve 38 gönüllü kişiden oluşan kontrol grubu ile çalışıldı. Çalışmanın genetik basamakları olan gen kopya sayısının belirlenmesi ve allel polimorfizminin tayini Gerçek Zamanlı-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) yöntemi ile; kanda ve idrardaki ilaç ve metabolit düzeyi tayini ise Sıvı Kromatografi-Ardışık Kütle Spektrometresi (LC-MS/MS) sistemi ile gerçekleştirildi.Elde edilen bulgulara göre, hasta ve kontrol grubunda CYP2D6*3 allel frekansları eşit iken (0,01); CYP2D6*4 için hasta frekansı 0,15 ve kontrol grubu için 0,04'tür. Her iki grubun *4 için gözlenen frekansları Hardy Weinberg eşitliğine göre farklı bulundu (Ki-Kare testi p<0,05). 77 hastadan 21'inin CYP2D6*4 için en az bir mutant allel taşıdığı saptandı. Bunlardan yalnızca 2 hastanın homozigot mutant (*4/*4) olduğu görüldü. Kontrol grubunda ise CYP2D6*4 için mutanat allel taşıyanların sayısının 3 olduğu ve hepsinin heterozigot olduğu tespit edildi. CYP2D6*3 için ne hasta grubunda ne de kontrol gurubunda homozigot mutant (*3/*3) bireye rastlanmadı; her iki grupta da heterozigot genotipler (*3/wt) olduğu saptandı. Ki-Kare (X2) testinin sonuçlarına göre hastalar ile kontrol grubu arasında allel *4'ün genotip frekanslarında %90 güven aralığında anlamlı fark tespit edildi; (p<0,1); allel *3'ün genotip frekanslarında anlamlı fark tespit edilmedi (p=0,873).Gen ekspresyonu için yapılan DNA miktar tayini bulguları (Cp), R= 2-??Cp formülünde, iç referans gen olan Albümine göre hesaplanarak bağıl gen oranları tayin edildi. Hasta ve kontrol grubunun ekson 9 için gen kopya sayıları arasındaki fark anlamlı (p<0,05) bulundu (sd=102). İntron 6 için gen kopya sayıları arasındaki farkın ise anlamlı olmadığı (p=0,376) bulundu (sd=102). İntron 6 ve ekson 9 bölgelerinden elde edilen gen kopya sayıları arasında anlamlı korelasyon tespit edildi (p<0.05).LC-MS/MS sistemi ile kanda ve idrarda Sertralin, Olanzapin, Risperidon ve Paliperidon için yapılan miktar tayini yönteminde Reboksetin iç standart olarak kullanıldı. Tüm analitler için yöntemin, idrarda ve kanda doğrusal olduğu gözlendi (r>0,999). LOD değerleri; Sertralin için, kanda 3,59 ng/mL, idrarda 3,54 ng/mL; Olanzapin için kanda 0,27 ng/mL, idrarda 0,06 ng/mL; Risperidon için kanda ve idrarda 0,006 ng/mL, Paliperidon için kanda 0,019 ng/mL, idrarda 0,012 mg/mL bulundu. Kan ve idrardaki geri kazanım yüzdeleri; Sertralin için %85,5-109,6 arasında; Olanzapin için %80,45-107,9 arasında; Risperidon için %86,6-105,0 arasında; Paliperidon için %89,53-114,1 arasında bulundu ve tüm maddelerin gün içi ve günler arası tekrar edilebilirlikleri ?13,94 (%CV); doğruluk (% hata) çalışmasının sonuçları 0,78-14,86 arasında bulundu. Hastaların kan ve idrarlarındaki etken maddeler hastaların aldıkları günlük dozdan bağımsız olarak (konsantrasyon/doz) hesaplanarak değerlendirildi. Risperidon'un metaboliti olan Paliperidon'un konsantrasyonu Risperidon konsantrasyonuna bölünerek, aralarındaki orantı gen aktivitesi yönünden incelendi.Sonuç olarak piskiyatrik hastaların CYP2D6*4 allel frekansı kontrol grubuna göre anlamlı şekilde yüksek bulundu. Ayrıca *4 alleli taşıyan hastaların kan ve idrarlarındaki olanzapin konsantrasyonunun *4 alleli taşımayanlara oranla daha yüksek olduğu; aynı şekilde Paliperidon/Risperidon oranının, *3 veya *4 mutasyonu olan hastaların kan ve idrarında daha düşük; normal metabolizörlerde ise daha yüksek olduğu görüldü.Psikiyatrik hastalar oldukça uzun süren tedavi süreçleri ve eşzamanlı olarak aldıkları birçok antipsikotik ve antidepresan ilaç nedeni ile gerek adli bilimler gerekse farmakogenetik açıdan özel bir gruptur. Bireyler ve toplumlar arası farklılık günümüzde, bireye ve popülasyonlara özgü tedavi anlayışını gündeme getirmiştir. Çalışmamızın sonuçları bu gerçeği bir kez daha vurgulamıştır. Farmakogenetik araştırmalar sadece klinik yönden değil; adli bilimler yönünden de değerlendirilmesi gereken, bir alandır. Bireye ait farmakogenetik bilgi postmortem bulguların yorumlanmasını kolaylaştırabilir ve ?Toksikolojik bulmaca?nın çözülmesine katkıda bulunabilir. Farmakogenetik biliminin adli bilimlerde uygulamaya girmesi gerektiği ve bunun için ülkemizde post-mortem düzeyde pilot bir çalışmaya ihtiyaç olduğu kanısındayız.

Abstract:
Drug therapy method has been practiced for centuries. However responses to drug are variable for each individual and variation of responses may cause to adverse drug reactions or severe toxic reactions even that can lead to death. Differences inter- individuals and populations due to the polymorphism of drug metabolising enzymes as well as age, gender, nutrition, co-medication and physiological conditions.The aim of the study was to determine CYP2D6 gene copy numbers and CYP2D6*3 ve *4 single nucleotide polymorphisms of psychiatric patients medicated by risperidone, olanzapine and sertraline active substances which metabolize by CYP2D6 enzyme and also to quantitate the concentrations of these drugs and their metabolites in urine and blood. By this way we aimed to emphasize the importance of the relationship of pharmacogenetic with forensic sciences.This study consisted of 77 psychiatric patients and 38 control group. Genetic analysis parts of the study, such as determination of gene copy number and allele polymorphism were analyzed by Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) method, also quantitation of drug and metabolite levels in blood and urine were analyzed by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) system.According to obtained results, while CYP2D6*3 allele frequencies were identical for both patient and control group (0.01); CYP2D6*4 allele frequencies were 0.15 for patient and 0.04 for control group. According to Hardy Weinberg equilibrium, the observed frequencies for allele *4 between groups were found statistically different (Chi-square test p<0,05). It was determined that 21 of 77 patients had at least one mutant *4 allele. Only two of them were seen as homozygote mutant (*4/*4). It is also determined in control group that only 3 volunteers had mutant *4 allele and all were heterozygote. No homozygote mutant *3 allele were seen neither for patient nor control group; but heterozygote genotypes (*3/wt) were determined in both groups. According to the Chi-square test results; statistically significant difference with 90% confidence interval found for *4 genotype frequencies between groups (p<0,1); but not for *3 genotype frequencies (p=0,873).DNA quantitation results (Cp) that analyzed for gene expression calculated with the formula of R= 2-??Cp according to Albumin internal reference gene and gene ratios were determined. Gene copy numbers for Exon 9 between two groups were found statistically different (p<0,05) (df=102), but not for Intron 6 (p=0,376) (df=102). Difference between Exon 9 and Intron 6 for patients? gene copy number were statistically correlated (p<0.05).Sertraline, Olanzapine, Risperidone and Paliperidone quantitation from blood and urine by LC-MS/MS, Reboxetine were used as internal Standard. The method were found linear in blood and urine for all analytes (r>0,999). LOD values were; 3,59 ng/mL in blood, 3,54 ng/mL in urine for Sertraline; 0,27 ng/mL in blood, 0,06 ng/mL in urine for Olanzapine; 0,006 ng/mL in blood and urine for Risperidone, 0,019 ng/mL in blood, 0,012 mg/mL in urine for Paliperidone. Recoveries in blood and urine were founded between 85,5-109,6% for Sertraline; 80,45-107,9% for Olanzapin; 86,6-105,0% for Risperidone; 89,53-114,1% for Paliperidone. Inter and intra day repeatability for all analytes were ?13,94 (CV%); accuracy (Bias%) were between 0,78-14,86. Drug levels in blood and urine were interpreted by calculating independently from daily doses received by the patient (concentration/dose). Paliperidone (Metabolite of Risperidone) concentrations were divided to the concentration of Risperidone and evaluated in terms of gene activity.As a result, CYP2D6*4 allele frequency of the psychiatric patients was found significantly higher than control group. In addition, concentration of olanzapine in blood and urine of the patients which had * 4 allele were observed higher than the patients which had not *4 allele. Likewise it was concluded that Paliperidone/Risperidone ratio was lower in blood and urine samples of the patients with *3 and *4 mutation, but higher in normal metabolizers.Since the psychiatric patients have long-lasting treatment process and receive many antipsychotic and antidepressant drugs simultaneously, they are special population both in forensic science and pharmacogenetic aspects. Recently, the differences between individuals and populations were brought into question understanding of specific treatment for the individual and populations. Results of our study was emphasized the fact that once. Pharmacogenetic research is field, which should be assessed not only in the clinical aspects but also in terms of forensic sciences. Additional information about an individual?s pharmacogenetics may possibly facilitate the interpretation of the post-mortem result and contribute to solve the ?toxicological puzzle?. We believe that it is essential that the pharmacogenetics is needed to practice into forensic science and a pilot study with post-mortem levels to do so.