Nonylphenol ile oluşturulan ovaryum hasarı üzerine kemik iliği kaynaklı mezenşimal kök hücre ve folik asitin etkisi
Effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cell and folic acid on ovarium damage induced by nonylphenol
Yazar: AYŞE CEYHAN
Danışman: PROF. DR. ARZU  YAY
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Nonylphenol (NP) güçlü östrojenik aktiviteye sahip, günlük hayatta pek çok alanda sıklıkla kullanılan toksik etkileri olan kimyasal bir maddedir. Ovaryum dokusunda folikülogenez sürecini değiştirerek infertiliteye neden olduğu bilinmektedir. İnfertilite tedavisinde kullanımı her geçen gün artan kemik iliği kaynaklı mezenşimal kök hücre (Kİ-MKH)'ler ve doku onarımında bir diğer önemli faktör olan folik asit (Fa)'in ovaryum hasarında 7 ve 14 günlük tedavi ve takip planının uygulanarak etkilerin karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmada, 130 adet Wistar albino türü dişi şıçan kullanıldı ve 13 gruba ayrıldı (n=10). 7 gün tedavi uygulanan ve takip edilen gruplar NP7, Fa7, Kh7, NP+Fa7, NP+Kh7, NP+Kh+Fa7 grupları olarak belirlendi. 14 gün tedavi uygulanan ve takip edilen gruplar NP14, Fa14, Kh14, NP+Fa14, NP+Kh14, NP+Fa+Kh14 gruplarıydı. NP uygulanan gruplardaki (NP7, NP+Fa7, NP+Kh7, NP+Kh+Fa7, NP14, NP+Fa14, NP+Kh14, NP+Kh+Fa14) sıçanlara 7 gün boyunca gavaj yoluyla 100 µl mısır yağında çözdürülerek 50 µl dozda NP uygulandı ve ovaryum hasarı oluşturuldu. 7 günün sonunda Kh uygulanacak gruplara ( Kh7, NP+Kh7, NP+Kh+Fa7, Kh14, NP+Kh14, NP+Kh+Fa14) tek sefer 2,5x106 Kİ-MKH'ler kaudal ven yoluyla intravenöz (i.v) injeksiyonla verildi. Aynı gün Fa uygulanacak gruplara (Fa7, NP+Fa7, NP+Kh+Fa7, Fa14, NP+Fa14, NP+Kh+Fa14) gavaj yolu ile 20 mg/kg/gün olacak şekilde Fa uygulamasına başlandı. 7 gün boyunca Fa uygulandı ve sonrasında 7 günlük tüm gruplar sakrifiye edildi. 14 gün Fa uygulanacak gruplara ise Fa uygulamasına devam edildi ve 14 güne tamamlandı. Sonrasında tüm 14 günlük gruplar sakrifiye edildi. Ovaryum dokuları ve kan örnekleri alındı. Ovaryum dokularından elde edilen kesitler Hematoksilen&Eozin ve Masson Trikrom boyama yöntemleri ile boyandı ve ovaryum rezervini belirlemek için folikül sayımı yapıldı. Ovaryum dokularında Anti-Müllerian Hormon (AMH), TNFα (Tümör Nekrosis Faktör Alfa), IL6 (İnterlökin 6) ve TGFβ1 (Transforming Growth Factor Beta 1) ekspresyonları belirlendi. TUNEL yöntemi ile apoptotik hücreler sayıldı. Malondialdehit (MDA), süperoksit dismütaz (SOD) ve katalaz (CAT) düzeylerini belirlemek için ELISA yöntemi uygulandı. Ayrıca antioksidan parametrelerden Total Antioksidan Kapasite (TAS) ve oksidan parametrelerden Total Oksidan Kapasite (TOS) düzeyleri analiz edildi. 
NP'ün ovaryumda oluşturduğu hasar sonrası uygulanan Kİ-MKH'lerin 7. ve 14. günde ovaryumda varlıkları gösterildi. Histopatolojik bulgular Fa ve Kh'nin birlikte uygulandığı tedavi gruplarında fibrozisin azaldığı ve ovaryum histopatolojik bulgularının düzeldiği gözlendi. Folikül sayım sonuçları, NP+Fa+Kh7 ve NP+Fa+Kh14 gruplarının tek uygulama yapılan gruplara oranla primordiyal ve gelişmekte olan diğer foliküllerin sayısının kontrol grubuna daha yakın değerde olduğunu gösterdi. Foliküllerdeki AMH immünreaktivite yoğunluğu NP+Fa+Kh14 grubunda kontrole benzer değerde ölçüldü. TNFα, IL6 ve TGFβ1 immünreaktivite yoğunluğu sonuçları Fa ve Kİ-MKH'nin ve ikisinin birlikte uygulandığı grupların tadavi edici etki gösterebileceği yönündeydi. Apoptotik hücre sayımı sonuçları özellikle Kİ-MKH uygulanan tedavi gruplarının apoptotik hücre sayısını azaltmada daha etkili olduğunu gösterdi. Tedavi gruplarından MDA, SOD, CAT, TAS ve TOS ölçüm sonuçları Kh ve Fa'in birlikte uygulandığı gruplar kontrol grubuna yakın değerler gösterdiği gözlendi.
Fa ve Kİ-MKH'nin tedavi amaçlı birlikte kullanımının ovaryum histopatolojisi üzerine olumlu etkileri olduğunu ve Fa'in Kİ-MKH'lerin terapötik etkilerini güçlendirdiği birlikte kullanımlarının biyokimyasal olarak ovaryum fonksiyonlarını düzenleyebileceği ve iyileştirebileceği bir klinik yaklaşım getirebilir.  

Anahtar kelimeler: Folik Asit; Kİ-MKH; Nonylphenol; Ovaryum; Sıçan.

Abstract:
Nonylphenol (NP) is a chemical substance with strong estrogenic activity and toxic effects frequently used in many areas of daily life. It is known that it causes infertility by changing the folliculogenesis process in the ovarian tissue. It was aimed to compare the effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs), which are increasingly used in the treatment of infertility, and folic acid (Fa), another important factor in tissue repair, on ovarian damage by applying a 7 and 14- day treatment and follow-up plan.
In the study, 130 female Wistar albino rats were used and randomly divided into 13 groups (n = 10). The groups that were treated and followed for 7 days were determined as NP7, Fa7, Kh7, NP+Fa7, NP+Kh7, and NP+Kh+Fa7 groups. The groups that were treated and followed for 14 days were NP14, Fa14, Kh14, NP+Fa14, NP+Kh14, NP+Fa+Kh14 groups. Rats in the NP-administered groups (NP7, NP+Fa7, NP+Kh7, NP+Kh+Fa7, NP14, NP+Fa14, NP+Kh14, NP+Kh+Fa14) were given a dose of 50 µl by dissolving it in 100 µl corn oil via gavage for seven days. NP was applied, and ovarian damage was caused. At the end of 7 days, 2,5x106 BM-MSCs were given as a single intravenous (i.v) injection via the caudal vein to the groups to be administered Kh (Kh7, NP+Kh7, NP+Kh+Fa7, Kh14, NP+Kh14, NP+Kh+Fa14). On the same day, Fa administration was started via gavage at a dose of 20 mg/kg/day to the groups to be administered Fa (Fa7, NP+Fa7, NP+Kh+Fa7, Fa14, NP+Fa14, NP+Kh+Fa14). Fa was applied for 7 days and then all groups were sacrificed within 7 days. For the groups that were to receive the Fa for 14 days, the Fa application continued and was completed in 14 days. Afterward, all 14-day-old groups were sacrificed. Ovarian tissues and blood samples were taken. Sections obtained from ovarian tissues were stained with Hematoxylin & Eosin, Masson Trichrome and follicle counting was performed to determine ovarian reserve. Anti Müllerian Hormone (AMH), TNFα (Tumor Necrosis Factor Alpha), IL6 (Interleukin 6), TGFβ1 (Transforming Growth Factor Beta 1) expression was determined in ovarian tissues. Apoptotic cells were counted using the TUNEL method. ELISA method was applied to determine malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) levels. Additionally, Total Antioxidant Capacity (TAS), one of the antioxidant parameters, and Total Oxidant Capacity (TOS), one of the oxidant parameters, were analyzed.
It was shown that BM-MSCs applied after the damage caused by NP in the ovary were present in the ovary on the 7th and 14th days. Histopathological findings: It was observed that fibrosis decreased and ovarian histopathological findings improved in the treatment groups where Fa and Kh were applied together. Follicle count results showed that the number of primordial and other developing follicles in the NP+Fa+Kh7 and NP+Fa+Kh14 groups were closer to the control group than the single-application groups. AMH immunoreactivity density in the follicles was measured in the NP+Fa+Kh14 group at a value similar to the control. TNFα, IL6 and TGFβ1 immunoreactivity intensity results showed that Fa and BM-MSCs and the groups administered together may have a therapeutic effect. Apoptotic cell count results showed that the treatment groups, especially BM-MSCs, were more effective in reducing the number of apoptotic cells. It was observed that the MDA, SOD, CAT, TAS and TOS measurement results of the treatment groups, in which Kh and Fa were applied together, showed values close to the control group.
It may be suggested that the combined use of Fa and BM-MSCs for therapeutic purposes has a positive effects on ovarian histopathology and that Fa strengthens the therapeutic effects of BM-MSCs and can bring a clinical approach in which they are combined use can biochemically regulate and improve ovarian functions.

 
Keywords: BM-MSCs; Folic acid; Nonylphenol; Ovary; Rat.