Diş pulpası kök hücrelerinin in vitro epitelyal ve fibroblastik hücrelere farklılaşması
In vitro epithelial and fibroblastic differentiation of dental pulp stem cells
Yazar: BELMA MELDA ABİDİN
Danışman: PROF. DR. ERDAL KARAÖZ ; PROF. DR. S. İSMET DELİLOĞLU GÜRHAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Diş Hekimliği = Dentistry ; Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Dental pulpa = Dental pulp

Özet:
Hücresel tedavi ve doku/organ mühendisliği uygulamaları için diş pulpası kaynaklı kök hücreler (DP-KH) önemli bir potansiyele sahiptir. Bu çalışmanın amacı, önceki çalışmalarda nörojenik, adipojenik, miyojenik, odontojenik/osteojenik farklılaşmaları gösterilen iDP-MKH'lerin fibroblastik ve epitelyal hücre dizilerine farklılaşma potansiyelinin belirlenmesidir.Bu araştırmada, lokal anestezi altında çekilen gömük yirmi yaş dişleri (n=5) kullanılmıştır. Açığa çıkarılmış olan pulpa dokusu kollajenaz ile sindirilme işleminden geçirilerek ayrıştırılan hücreler uygun besi ortamında kültüre alınmıştır. Her pasaj sonrası (P1'den P5'e kadar) akış sitometri cihazında ve immunohistokimyasal (İHK) yöntemler ile immunofenotipleme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda, iDP-MKH'lerin hematopoetik hücre belirteçlerini (CD14, CD34, CD45, CD117, HLA-DR gibi) eksprese etmedikleri, buna karşın MKH belirteçleri CD13, CD44 ve CD90 için yüksek düzeylerde pozitif oldukları tespit edilmiştir. Ayrıca, iDP-MKH'lerin vimentin, fibronektin, ? -düz kas aktin, beta-tubulin, osteokalsin, osteonektin ve embriyonik kök hücre belirteci SSEA-4 eksprese ettikleri gözlenmiştir. Bununla birlikte, iDP-MKH'lerin in vitro koşullarda osteojenik ve adipojenik hücre serilerine farklılaşabildikleri görülmüştür. Osteojenik farklılaşmış hücreler osteokalsin, ostenektin ve BMP4 için kuvvetli pozitif immun reaksiyon göstermiş ve adipositlere farklılaşan iDP-MKH'lerin sitoplazmalarında yağ vakuolleri tespit edilmiştir.Epitelyal farklılaşması EGF, HGF, KGF ve IGF-2 büyüme faktörleri ile uyarılan iDP-MKH'lerin kübik morfolojik farklılaşma ve epitelyal hücre belirteçleri (sitokeratin 18 ve 19) için kuvvetli immun-reaksiyon gösterdikleri buna karşılık nestin ekspresyonlarının azaldığı tespit edilmiştir. Ayrıca, epitel-benzeri hücrelerde vimentin ekspresyonunda artış gözlenmiştir. Fibroblastik farklılaşması bFGF+TGFß ve EGF+ TGFß ile uyarılan iDP-MKH'lerde, fibronektin, fibroblast yüzey proteini, vimentin ve tenaskin-C için kuvvetli pozitif buna karşılık CD105 ve tip II kollajen için negatif immun-reaksiyon tespit edilmiştir. Nestin ekspresyonlarında ise belirgin bir azalma gözlenmiştir. Epitelyal ve fibroblastik farklılaşma gruplarının tümünde, telomeraz aktivitelerinde gerçekleşen azalma ve üremedeki yavaşlık farklılaşan iDP-MKH'lerin somatik hücre karakteristiğine sahip olduğunu göstermiş ve iDP-MKH'lerin in vitro epitelyal ve fibroblastik farklılaşmasını desteklemiştir.Sonuç olarak, bu çalışmada elde edilen veriler iDP-MKH'lerin epitelyal ve fibroblastik farklılaşmalarının in vitro koşullarda uygun uyaranlarla yönlendirilebileceğini ve bu hücrelerin hücre tabanlı klinik tedaviler ve doku mühendisliği uygulamaları için uygun alternatif bir kaynak olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Mesenchymal stem cells derived from human dental pulp have considerable potential for cell therapies and tissue engineering. The aim of the present study is to determine fibroblastic and epithelial differentiation capacities of hDPSCs which have the ability to differentiate into neurogenic, adipogenic, myogenic, odontogenic/osteogenic cell lines according to the previous studies.In this study, normal human impacted third molars (n=5) extracted under local anesthesia were used. The pulp tissues were digested in collagenase and cells were cultured in appropriate media. For all passages (P1-P5), immunophenotypic assays were performed with immunohistochemical methods (IHC and IF) and flow cytometry. DPSCs expressed mesenchymal cell markers (CD13, CD44 and CD90) in high levels but did not express the hematopoietic cell markers (CD14, CD34, CD45, CD117, HLA-DR). DPSCs also expressed vimentin, fibronectin, ?-smooth muscle actin, beta-tubulin, osteocalcin, osteonectin and embryonic stem cell marker SSEA-4. Furthermore, DPSCs were directionally differentiated to osteogenic and adipogenic cell lineages. After induction, osteocalcin, osteonectin and BMP4 were expressed by osteogenic differentiated cells and oil vacuols were detected in the ctyoplasm of adipogenic differentiated cells.To induce epithelial differentiation, DPSCs were cultured using EGF, HGF, KGF and IGF-2 growth factors. Differentiated cells were further characterized both morphologically and functionally by their capacity to express markers with specificity for epithelial lineage. Epithelial-like cells expressed cytokeratin 18 and 19 but did not express nestin. Also, vimentin expression was in high levels compared with untreated DPSCs. The treatment with bFGF+TGFß and EGF+ TGFß on cultured DPSCs to induce fibroblastic differentiation was resulted increase in fibronectin, fibroblast surface protein, vimentin and tenascin-C (Tn-C) contents by 2 and 4 weeks while decreasing nestin expressions. In addition, CD105 and type II collagen negative fibroblast-like cells were detected. Increased telomerase activity and proliferation in both epithelial and fibroblastic differentiation groups showed that differentiated cells have the characteristics of somatic cells and supported fibroblastic and epithelial differentiation of hDPSCs.In conclusion, DPSCs can be induced to differentiate towards epithelial and fibroblastic lineage and may serve a suitable source for cell-based clinical therapies and tissue engineering.