Ascidiacea sınıfına dahil Microcosmus vulgaris'den biyoaktif etken madde izolasyonu ve yapı tayini
Isolation and structure elucidation of bioactive secondary metabolites from sea squirt Microcosmus vulgaris
Yazar: MELEK SERTDEMİR
Danışman: PROF. DR. BELMA KONUKLUGİL
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Deniz Bilimleri = Marine Science ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry

Özet:
Doğal kaynaklı etkili maddelerin eldesi, farmasötik endüstrisinde kullanılmak üzere üretilecek bileşiklerin ilk adımıdır. Bu amaçla elde edilen birçok doğal kaynaklı etkili madde, yapılan uzun çalışmalar sonucu, hastalıklara çözüm olacak ya da kozmetik olarak kullanılabilecek ürünlere dönüşmüştür. Bitki kaynaklı doğal ürünlerin yanı sıra, yeni bir alan olan deniz kaynaklı doğal ürünlerin araştırılması  birçok farklı bileşiğin keşfini de beraberinde getirmiştir. Deniz kaynaklı olarak izole edilen ve ilaç haline dönüştürülen Prialt®, Lovaza®/Omacor®,  Halaven®, Adcetris®, Carragelose® bunlardan bazılarıdır (1).  Yondelis ® ilacının etken maddesi olan trabektedin kanser tedavisinde kullanılan ve bir tunikat olan Ecteinascidia turbinata' dan izole edilmiş bir bileşiktir (2). Aplidin® ve Lurbinektedin 173' de yine tunikat kaynaklı ve sırasıyla Faz III ve Faz I/II çalışmaları devam eden kanser ilacı adaylarıdır (3). 
Bu çalışmada Kordalılar şubesine ve Ascidae sınıfına dahil bir tunikat olan Microcosmus vulgaris ile çalışılmıştır. Bu amaçla biyoaktivite (Sitotoksik, antioksidan, antimikrobiyal ve asetilkolinesteraz inhibisyon biyoaktiviteleri) ve izolasyon çalışmaları yapılmıştır.
Kloroform-metanol (1:1) ile ekstre hazırlanmıştır. Hazırlanan bu ekstre sıvı-sıvı ekstraksiyona tabi tutulmuştur. n- bütanol fazı alınmış ve vakum sıvı kromatografisine uygulanmıştır.  Buradan alınan 2. fraksiyon kolon kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Buradan alınan ürün NMR'a verilmiş ve yapı 5α- 6α- epoxyergosta 7-en- 3β- ol olarak tespit edilmiştir.
Ham ekstrenin Hep-2 hücreleri (Human epidermoid cancer cells)' ne karşı sitotoksik aktivitesi incelenmiş  ve IC50 değeri 40.0754 μg/ ml olarak tespit edilmiştir. Antioksidan aktivitesi ise süperoksit radikali süpürücü aktivitesi ölçülerek yapılmış ve 800 μg/ ml konsantrasyonda % 10'un altında bir aktivite göstermiştir. Bu sebeple SO radikal süpürücü etkisi yok denecek kadar azdır.  İzole edilen 5α- 6α- epoxyergosta 7-en- 3β- ol'ün de antioksidan etkisine bakılmıştır. Bileşiğin aktivitesi, ham ekstreninkinden fazla olsa da dikkate değer bir aktivite bulunmamıştır. Ham ekstrenin, antibakteriyal ve antifungal aktivitesine bakılmıştır. Ekstrenin, Acinetobacter  haemolyticus ATCC 19002, Staphylococcus aureus JCSC 4744, Cryptococcus neoformans NIH 68, Cryptococcus gattii NIH 112 türlerine karşı düşük seviyede antimikrobiyal aktivite gösterdiği görülmüştür. Asetilkolinesteraz inhibisyon aktivitesi ölçülmüş ve ham ekstrenin inhibisyon aktivitesinin % 40'ın altında kalması nedeniyle inaktif olduğu görülmüştür.

Abstract:
Isolation of natural products is the very first step for a product which can be apply to pharmaceutical industry. For this purpose, lost of natural products have been isolated and with long time studies they became products to use as pharmaceuticals, cosmetics, nutritional supplements, molecular probes, fine chemicals and agrochemicals (4). Isolation of natural products from marine organisms is a new trend in the world and especially in Turkey. In recent years, a significant number of novel metabolites with potent pharmacological properties has been discovered from the marine organisms (1).  Attention has been focused more recently on ascidians because of their biologically active metabolites (5). Trabectedin is a novel alkaloid and  the active substance of Yondelis® which is isolated from a tunicate Ecteinascidia turbinata. Trabectedin was found to be especially effective against solid tumors. Aplidin® and Lurbinectedin 173 are compounds isolated from tunicates Aplidium albicans and Ecteinascidia turbinata that still in Phase III and Phase II studies for cancer treatment (6). Ascidians have a great potential to be discovered by scientists.
Microcosmus vulgaris collected by scuba-diving by Dr. Bülent Gözcelioğlu from Agean Sea. Sample was cut into small pieces and  homogenized and extracted with chloroform- methanol (1:1). This extract was then subjected to repeated column chromatography, to obtain steroids. Isolation of 5- 6- Epoxy sterol from n- butanol fraction was done by coloumn chromatography with using silica gel as stationary phase and dicholoromethane- methanol with gradient elution as mobile phase. Initial analysis for compound done by Thin Layer Chromatogrphy (TLC). Structure eludication of 5α- 6α- epoxyergosta 7-en- 3β- ol was done by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.  
Cytotoxicty of M. vulgaris extract against Hep-2 cell line was determined with MTT method. IC50 value of extract determined as 40.0754 μg/ ml. Antioxidant activty of extract determined with radical scavenging activity. Extract showed under 10% of activty at 800 μg/ ml concantration. Antioxidant activty of 5α- 6α- epoxyergosta 7-en- 3β- ol was more than crude extract but again not very high. According to antimicrobial activty assay, extract showed low activty againts Acinetobacter  haemolyticus ATCC 19002, Staphylococcus aureus JCSC 4744, Cryptococcus neoformans NIH 68, Cryptococcus gattii NIH 112. Extract revealed to be inactive on the AChE inhibition assay.