Türkiye'de levrek kuluçkahaneleri ve işletmelerinde viral nervöz nekrozis (VNN) virusu'nun araştırılması, epidemiyolojisi ve moleküler karakterizasyonu
Investigation, epidemiology and molecular characterisation of viral nervous necrosis (VNN) virus in european sea bass hatcheries and farms in Turkey
Yazar: MURAT KAPLAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET TANER KARAOĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Balıklar = Fishes ; Balıkçılık = Fisheries ; Betanodavirüs = Betanodavirus ; Kuluçkahaneler = Hatcheries ; Levrek balığı = Sea bass ; Prevalans = Prevalence ; Virüs hastalıkları = Virus diseases ; Virüsler = Viruses

Özet:
Bu çalışma, Türkiye'de tüm levrek kuluçkahaneleri ve bazı yetiştirme işletmelerinde, levreklerde önemli viral bir hastalık olan Viral Nervöz Nekrozis (VNN) etkeni betanodavirus yaygınlığının araştırılması amacıyla gerçekleştirilmiştir. Çalışmada ayrıca, OIE tarafından önerilen Real Time RT-PCR metodunun kantitatif olarak optimizasyonu gerçekleştirilerek analitik sensitivite, lineer tespit aralığı, minimum tespit limiti, spesifite, tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik validasyon çalışmaları yapılan VNN teşhisi akredite bir metot olarak Balık Hastalıkları Ulusal Referans Laboratuvarına kazandırılmıştır. 
Türkiye'de betanodavirus yaygınlığı faaliyette bulunan tüm levrek kuluçkahanelerinde (n:16) döllenmiş yumurta, prelarva (0-5 gün), postlarva (5-40 gün), fry (40-80 gün) ve fingerling (80-120 gün) olmak üzere tüm üretim aşamalarından ve bazı levrek yetiştirme işletmelerinden (n:20) epidemiyolojik temelli örnekleme ile araştırılmıştır. Bu kapsamda; her grup 10-30 örnekten oluşmak üzere, 8 kuluçkahaneden 15 grup döllenmiş yumurta, 9 kuluçkahaneden 14 grup prelarva, 13 kuluçkahaneden 22 grup postlarva, 13 kuluçkahaneden 43 grup fry ve 9 kuluçkahaneden 41 grup fingerling olmak üzere toplam 135 çalışma grubu oluşturulmuş ve toplamda 2460 örnek kuluçkahane; 720 levrek örneği de yetiştirme işletmeleri araştırmasında kullanılmıştır. 
Betanodavirus RNA'sı, bir kuluçkahanede fingerling boylarda ve bir yetiştirme işletmesinde de küçük boy balıklarda sırasıyla 4,82x102, 3,10x102 kopya/µl olmak üzere düşük viral yük ile tespit edilmiştir. Türkiye kuluçkahanelerinde prevalans % 6,25 (1/16); yetiştirme işletmelerinde ise % 5 olarak hesaplanmıştır. Virus SSN-1 hücre kültüründe üretilmiş, vakuolizasyon ve lizis ile karakterize CPE meydana getirmiştir. Virus tespit edilen kuluçkahane ve ilişkili olduğu bilinen kuluçkahanelerde yapılan epidemiyolojik çalışmada virus tekrar tespit edilememiştir. Yetiştirme işletmesinin ise virus tespit edilen kuluçkahanenin devamı niteliğinde olduğu ve aynı lokalizasyonda oldukları belirlenmiştir. Virus, biyogüvenlik önlemlerinin uygulanmadığı deniz suyunun direkt kullanıldığı adaptasyon bölümünde bulunan fingerling boy levreklerde tespit edilmiştir. Tespit edilen virusların hem RNA1 hem RNA2 segmentinin kısmi genom analizinde, Akdeniz havzasında endemik olarak bulunan Redspotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV) genotipi oldukları belirlenmiştir. Genotipi belirlenen pozitif örneklerin hem RNA1 hem RNA2 segmentine göre tüm genom ve filogenetik analiz çalışmaları yapılmıştır. İzolatların RNA1 ORF (Protein A) tüm dizilerinin İtalya, ardından Tayvan ve Singapur izolatları ile; RNA2 ORF (kapsid protein) tüm dizilerinin ise Çin, ardından Japonya, İspanya ve İsrail izolatları ile benzerlik gösterdiği ortaya konulmuştur. 
Sonuç olarak bu çalışma ile, Türkiye'de tüm levrek kuluçkahaneleri ve yetiştirme işletmelerindeki betanodavirus yaygınlığı tüm yaş gruplarını kapsayacak şekilde araştırılmış ve sadece fingerling boy balıklarda virus tespit edilmiştir. Virusun izole edildiği kuluçkahane ve işletmede mortalitelerin olmaması, levreklerin sağlıklı görünümde olmaları ve tespit edilen viral yükün düşük olması enfeksiyonun subklinik olduğunu, biyogüvenliğin uygulandığı diğer yaş gruplarında virusun tespit edilmemesi aktif bir enfeksiyon olmadığını göstermektedir. Bu bilgiler ışığında kuluçkahanelerde betanodavirus sirkülasyonunun olmadığı, tespit edilen virusun ise deniz suyu kaynaklı olabileceği değerlendirilmiştir.

Abstract:
This study was carried out with the aim of investigating Viral Nervous Necrosis caused by Betanodavirus which is an important viral disease in all sea bass hatcheries and some aquaculture farms in Turkey. In this study, Real Time RT-PCR method proposed by OIE was quantitatively optimized, validation studies on analytical sensitivity, linear detection range, minimum detection limit, specificity, repeatability and reproducibility were performed and VNN diagnosis was introduced to the National Laboratory of Fish Diseases as an accredited method.
The prevalence of betanodavirus in Turkey has been investigated in all operational sea bass hatcheries (n:16) in all productive stages including actively fertilized eggs, pre-larvae (0-5 days), post-larvae (5-40 days), fry (40-80 days) and fingerling (80-120 days) and in some sea bass farms (n: 20) by epidemiological based sampling. In this concept, a total of 2460 samples were divided into 135 work groups with each group consisting of 10-30 fish. Work groups consisted of 15 groups of fertilized eggs from 8 hatcheries, 14 groups of pre-larvae (0-5 days old) from 9 hatcheries, 22 groups of post-larvae (5-40 days old) from 13 hatcheries, 43 groups of fry (40-80 days old) from 13 hatcheries and 41 groups of fingerlings (80-120 days old) from 9 hatcheries and 720 sea bass farm samples were used. 
Betanodavirus RNA was detected in fingerlings in a hatchery and in small fish in a sea bass farm with a low viral load of 4,82x102, 3,10x102 copy/µl, respectively. The prevalence of betanodavirus in Turkish hatcheries and sea bass farms were calculated to be 6.25% (1/16) and % 5, respectively. The virus was propagated in SSN-1 cell line and produced CPE characterized by vacuolization and lysis. In the epidemiological study performed in the hatcheries where the virus was detected and the hatcheries known to be related, the virus could not be detected again. It was found out that the sea bass farm was a continuation of the hatchery where the virus was detected and they were in the same location. The virus was detected in fingerlings in the adaptation section where sea water was used directly, without biosecurity measures. Partial genome analysis of both RNA1 and RNA2 segments of the virus revealed that it was the Red spotted grouper nervous necrosis virus genotype which is endemic in the Mediterranean basin. Whole genome studies and phylogenetic analysis of the positive samples were performed according to both RNA1 and RNA2 segments. Whole sequences of RNA1 ORF (Protein A) of the detected viruses showed similarity with Italy isolates, followed by Taiwan and Singapore isolates; whole sequences of RNA2 ORF (capsid protein) were found to be similar to those of China, followed by Japan, Spain and Israel.
As a result of this study, the prevalence of betanodavirus of all production stages of all hatcheries and some sea bass farms in Turkey including all age groups of sea bass have been investigated and it was only detected in fingerling-size fish. The absence of mortality in the hatchery and the farm where the virus was detected, the healthy appearance of the sea bass and the low viral load indicate that the infection might be subclinical. Also, the fact that the virus was not found in other age groups where biosecurity measures were implemented, shows that is not active infection. In the light of these findings, it can be concluded that there are no circulating betanodavirus in hatcheries and the detected virus could be of sea-water origin.