İnsan fibroblast hücrelerinin viral olmayan taşıyıcı kullanılarak yeniden programlanması ve elde edilen IPSClerin kardiyomiyositlere farklandırılması
Reprogramming of human fibroblast cells to IPSC using a non-viral carrier and differantiating cardiomyocyte
Yazar: HANİFE SEVGİ VARLI MA
Danışman: PROF. DR. NELİSA TÜRKOĞLU
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC), çeşitli gen transfer yöntemleri ve yeniden programlama faktörleri ile somatik hücrelerin geriye programlanması ile elde edilen kök hücre grubudur. IPSC'ler, üç farklı germ hattına farklanma potansiyeline sahip çok önemli bir hücre grubudur.
Bu çalışma, öncelikle insan fibroblast hücrelerini (CCD1072-SK) indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC) yeniden programlamak için katı lipid nanopartiküller (OCTNP) gen transfer aracı olarak kullanan, sonrasında elde edilen iPSC'leri karakterize ederek 5-azasitidin ile kardiyomiyositlere farklandıran yeni bir yaklaşımı incelemektedir. Bu amaçla, lipid tabanlı nanopartiküller sentezlenmiş ve karakterizasyon çalışmaları tamamlanmıştır. Sentezlenen nanopartiküllerin CCD1072-SK hücreleri üzerinde farklı konsantrasyonlarındaki toksisitesi değerlendirildiğindirilmiştir.
Hücrelerin yeniden programlanması için kullanılan plazmid, yeniden programlama faktörlerini kodlamasının yanı sıra GFP işaret genini de içeren bir plazmid DNA tercih edilmiştir. Bu sayede, GFP gen ifadesi takip edilerek transfeksiyon çalışmalarının kontrolü sağlanmıştır. Transfeksiyon çalışmaları tamamlanan hücreler daha sonra Matrigel membran kaplamalı plakalara ekilmiş ve morfolojik değişiklikler, GFP ifadesi ve hücrelerin koloni oluşum eğilimlerini 15 gün boyunca izlenmiştir. Kültür sonunda elde edilen iPSC'lerin kapsamlı karakterizasyon çalışmaları immunofluoresans boyama, alkalen fosfataz analizi, iPSC hücrelerine özgü antikorlar ile akış sitometrisi ve yeniden programlama faktörlerine özgü primerler ile real time PCR aracılığıyla gerçekleştirilmiştir. 
Ayrıca, çalışmamız iPSC'lerden 5-azasitidin (5-aza) kullanarak kardiyomiyosit elde etmek için özgün bir farklanma stratejisi sunmaktadır. Sitotoksisite değerlendirmeleri, 1 µM ve 5 µM konsantrasyonlardaki 5-aza %70'in üzerinde hücre canlılık oranları sergilediğini ortaya koyulmuştur. Farklanma sırasında morfolojik değişiklikler, elde edilen induklenmiş pluripotent kök hücrelerden farklandırılmış kardiyomiyositleri (iPSC-CM'ler) benzeyen uzunlamasına veya çubuk şeklinde hücrelere dağılan koloniler 15 gün boyunca izlenmiştir. Morfolojik değişikliklere ek olarak, kardiyomiyosit farklanması hücrelerdeki GATA-4 ifadesi ile karakterize edilmiştir.
Bu çalışma, insan fibroblast hücrelerini lipid bazlı nanopartiküller (OCTNP) kullanarak iPSC'lere ve daha sonra kardiyomiyositlere farklandıran ilk çalışma olarak literatüre katkıda bulunmaktadır. Yapılan araştırmanın sonuçları, ilerideki iPSC eldesi ve kardiyak hücre hattına yönelik etkili ve güvenli farklandırma yöntemlere dair umut vaat eden bir yöntemi sunmaktadır.

Abstract:
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed somatic cells capable of differentiating into all three germ layers, facilitating the production of diverse tissues and organs. This study introduces a novel approach to generate iPSCs from human fibroblast cells (CCD1072-SK) using solid lipid nanoparticles (OCTNPs) as a gene delivery tool and subsequently differentiates them into cardiomyocytes using 5-azacytidine.
Lipid-based nanoparticles were synthesized, characterized, and evaluated for cytotoxicity, showing no adverse effects on CCD1072-SK cells at different concentrations. The reprogramming plasmid encoded reprogramming factors alongside a GFP marker gene, enabling transfection efficiency monitoring. Post-transfection, cells were cultured on Matrigel-coated plates, and GFP expression, morphological changes, and colony formation were monitored for 15 days. Comprehensive characterization of the derived iPSCs was conducted using immunofluorescence staining, alkaline phosphatase analysis, flow cytometry, and real-time PCR for reprogramming gene expression.
To induce cardiomyocyte differentiation, iPSCs were treated with 5-azacytidine (5-aza) at concentrations of 1 µM, 5 µM, and 10 µM. Cytotoxicity analyses revealed that 1 µM and 5 µM maintained over 70% cell viability. Differentiation was tracked over 15 days, revealing morphological changes such as dispersed colonies with elongated or rod-shaped cells reminiscent of cardiomyocytes. Cardiomyocyte differentiation was further validated through the expression of GATA-4, a key cardiac-specific transcription factor.
This study is the first to utilize OCTNPs for iPSC generation and differentiation into cardiomyocytes, providing a non-viral, biocompatible, and efficient platform. The findings offer significant potential for advancing regenerative medicine, iPSC technology, and cardiac research by presenting a safer and effective alternative for iPSC generation and cardiac lineage commitment.