Schizosaccharomyces pombe'de glukoz metabolizmasının biyoinformatik ve transkriptomik analizi
Bioinformatics and transcriptomic analysis of glucose metabolism in schizosaccharomyces pombe
Yazar: MEDET TAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SEMİAN KARAER UZUNER
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Glukoz çoğu organizmada tercih edilen bir karbon kaynağı olarak kullanılmasının yanı sıra, çeşitli metabolik aktivitelerin, bölünme ve büyüme gibi farklı süreçlerin düzenlenmesinde rol oynar. Mayalarda şekerler ile farklı yapı ve işleve sahip uyarı moleküllerinin algılanması ve uygun sinyal iletiminin oluşturulması, genel olarak heterotrimerik G-proteini ile G proteinine bağlı hücre yüzey reseptörlerinden oluşan bir sistem aracılığıyla yapılır. Glukozun algılanmasıyla birlikte cAMP/Protein kinaz A (cAMP/PKA) sinyal iletim yolu aktif hale geçer. Daha sonra, glukozun hücre içine alınması hücre membranında bulunan heksoz taşıyıcı proteinler aracılığıyla yapılmaktadır. Sitoplazmada glukoz, karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılmak üzere hekzokinazlar tarafından fosforile edilerek glikolize yönlendirilir.

Glukozun algılanması ve sinyal iletimi ile ilgili yolaklar Saccharomyces cerevisiae'da ayrıntılı bir şekilde ortaya çıkarılmıştır. Ancak Schizosaccharomyces pombe'de bu yolaklara ilişkin ayrıntılı bilgi bulunmamaktadır. Bu çalışma ile S. cerevisiae'da heksoz transportunu düzenleyen RGT1 transkripsiyon faktörü geninden yola çıkarak S. pombe'de glukoz algılanması ve glukoz sinyaliyle ilgili yolakların biyoinformatik yaklaşımlarla araştırılması, benzerlik ve farklılıkların açığa çıkarılması, gerçek zamanlı PCR tekniğiyle bu genin S. pombe'deki gen anlatım profillerinin incelenmesi amaçlanmıştır. 

S. cerevisiae RGT1 ve S. pombe ortoloğu SPCC320.03 tahmini transkripsiyon faktörü üzerinde yapılan biyoinformatik çalışmalar ile, bu iki genin dizi benzerliği yanında, fonksiyonel ortolog olabileceklerine dair bulgular elde edildi. Önce RGT1 ile S. pombe SPCC320.03 proteinlerinin BLAST analizi yapıldı. RGT1'in DNA bağlayan domeni (46-76 amino asitleri) dahil protein dizisinin tamamının SPCC320.03'de oldukça korunmuş olduğu saptandı. SPCC320.03 proteininin GO ("Gene Ontology") anotasyonu ve domen tahmini analizinde SPCC320.03'ün transkripsiyon faktörü olduğuna dair bulgular desteklendi.

Elde edilen biyoinformatik bulguları desteklemek üzere SPCC320.03'ün, S. pombe heksoz transporter genleri (GHT) üzerindeki etkisi, gerçek zamanlı PCR ile incelendi. S. pombe SPCC320.03 geninin delesyonunun, GHT1 ve GHT2 derepresyonunda artışa, GHT3 ve GHT4 derepseyonunda ise düşmeye sebep olduğu gösterildi. S. pombe SPCC320.03'ün S. cerevisiae RGT1'in fonksiyonel ortoloğu olduğu ve GHT1, GHT2, GHT3 ve GHT4 heksoz transporter genlerinin anlatımlarını glukoz varlığına bağlı olarak düzenlediği sonucuna varıldı.

Abstract:
Glucose as well as being a preferred carbon source in most organisms, is also involved in the regulation of various metabolic activities and different processes such as growth and cell division. In yeasts, detection of sugars and stimulant molecules with diverse structures and functions, and subsequent signal transduction are done through a system consisting of heterotrimeric G-protein and G protein-coupled cell surface receptors. As glucose is detected, cAMP / protein kinase A (cAMP / PKA) signal transduction pathway is activated. Then, glucose is transported into cell by hexose transporters located in cell membrane and is phosphorylated by hexokinases in cytoplasm and is directed to glycolysis for use as a carbon and energy source.

Although glucose sensing and signaling pathways are revealed in detail in Saccharomyces cerevisiae, there is no detailed data on these pathways in Schizosaccharomyces pombe. With this study, we aimed to investigate glucose sensing and glucose signaling pathways in S. pombe using bioinformatics approaches, with the help of RGT1 transcription factor gene, the regulator of hexose transporters in S. cerevisiae, and to reveal homologies, differences, and to analyze gene expression profiles of this gene in S. pombe with real time PCR technique.

By performing bioinformatics studies on S. cerevisiae RGT1 and its S. pombe orthologue, a putative transcription factor SPCC320.03, we obtained findings that these two genes as well as having sequence similarity might be functional orthologs. BLAST analysis of RGT1 and SPCC320.03 proteins were performed first. The entire protein sequence including the DNA binding domain of RGT1 (amino acids 46-76) was found to be highly conserved in SPCC320.03. The findings of GO (Gene Ontology) anotation and domain prediction analysis of SPCC320.03 protein, supported the findings that SPCC320.03 is a transcription factor.

The effect of SPCC320.03 on S. pombe hexose transporter genes (GHT) was investigated by real-time PCR to support the bioinformatics findings obtained. Deletion of SPCC320.03 gene in S. pombe, was shown to cause increased derepression of GHT1 and GHT2; and reduced level of derepression of GHT3 and GHT4. It is concluded that S. pombe SPCC320.03 is a functional ortholog of S. cerevisiae RGT1, and regulates expression of GHT1, GHT2, GHT3 and GHT4 hexose transporter genes in response to glucose.