Keçi tereyağında nükleik asit izolasyon yöntemi optimizasyonu ve gerçek zamanlı PCR yöntemiyle olası tağşiş oranlarının tespiti
Optimization of nucleic acid isolation method in goat butter and determination of possible adulteration rate by real-time PCR method
Yazar: ERDEM ARTUVAN
Danışman: DOÇ. DR. SALİH AKSAY
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Yağlı gıdalar = Fatty foodstuffs ; İşlenmiş gıdalar = Processed foods

Özet:
Nükleik asit temelli analiz metotlarında analizin ilerleyen aşamalarında doğruya en yakın sonucu elde edebilmek için yeterli konsantrasyonda ve kalitede nükleik asit izolasyonu yapılması önemlidir. RT-PCR metotlarında, yeterli kalitede nükleik asit zinciri ile reaksiyona başlanması gerekmektedir. Nükleik asit izolasyonunda, gıdanın bileşimi, son ürüne işleme basamakları ve gıdanın tekstürel yapısı belirleyici faktörlerdendir. Özellikle yüksek yağ içeren ürünlerde nükleik asit izolasyon verimini yükseltmek için bazı ek uygulamalara ihtiyaç duyulmaktadır. Tereyağı ve kaymak gibi çok yüksek yağ içeren gıdalar, son ürüne ulaşıncaya kadar nükleik asit stabilitesinin bozulabileceği birçok işlem basamağından geçmektedir. Piyasada yoğun olarak tüketime sunulan inek, koyun, keçi, manda ürünleri, %100 tek tür hayvan sütü etiketi ile alıcı bulmaktadır. Bu sütlerin birbirleri arasında besleyicilik, sağlığa yararlılık durumu ve sindirilebilirlik gibi farklılıklar vardır. Bu farklılıklar, bu sütlerin tercih edilebilirliği üzerinde çok etkilidir. Sütlerin fiyatlandırılmasında da aynı etkiler söz konusudur. Sütlerin birbirlerine olan üstünlükleri, onlardan üretilen ürünlerde, genelde daha ucuz olan süt ile tağşiş yapılmasına yol açabilmektedir. Bu olası tağşişin analizler ile tespit edilebilmesi, tüketicilerin zarar görmemeleri ve güvenli gıdaya ulaşmaları yolunda elzemdir. RT-PCR metotları farklı gıda analizlerinde son yıllarda oldukça yoğun olarak kullanılmakta, hızlı ve güvenilir sonuçlar vermektedir.
Yapılan çalışmada yüksek yağ içeren keçi tereyağı ürününde, izole edilen DNA veriminin arttırılması için farklı inkübasyon sıcaklığı (65, 75, 85ºC), inkübasyon süresi (30, 60, 120 d) ve numune miktarı (0.2, 0.5, 1 g) uygulamaları yapılmıştır. Optimum izolasyon şartları olarak otomatik izolasyon cihazında, 1 g numune miktarı, 85ºC inkübasyon sıcaklığı ve 120 d inkübasyon süresi belirlenmiş ve RT-PCR cihazında süt karışım oranı tespiti analizlerinde bu metotla izolasyonlar yapılmıştır.
RT-PCR cihazında analiz edilmesi amacıyla, %100 inek ve %100 keçi tereyağlarından karışımlar hazırlanmıştır. Cihazda, %100 inek ve %100 keçi tereyağlarının dilüsyonları ile her süt türüne özgü kalibrasyon tabloları hazırlanmış ve bu kalibrasyon tablolarında karışım tereyağlarının keçi ve inek oranları hesaplanmıştır. Kantitatif analizleri neticesinde, %100 keçi tereyağı %102,17±2,36; %75 keçi tereyağı %73,87±1,74; %50 keçi tereyağı %53,35±5,05, %25 keçi tereyağı %37,22±3,00 ve %100 inek tereyağı %76,00±6,01 olarak tespit edilmiştir. Karışım tereyağlarında GC ile yağ asitleri kompozisyonu analizleri yapılmış ve keçi tereyağlarına inek tereyağı karıştırılması durumunda yağ asitleri kompozisyonundaki değişim belirlenmiştir. Yağ asitleri kompozisyonundaki değişimin karışım yağ oranları ile paralellik gösterdiği saptanmıştır.

Abstract:
Nucleic acid isolation is important for obtaining accurate results in the later stages of nucleic acid-based analysis methods. In RT-PCR methods, the reaction should be started with a nucleic acid chain of sufficient quality. In nucleic acid isolation, the composition of the food, the processing steps to the final product, and the textural structure of the food are determining factors. Especially in products with high fat content, some additional applications are needed to increase the yield of nucleic acid isolation. Foods with very high fat content, such as butter and cream, go through many processing steps where the stability of nucleic acids can be disrupted before reaching the final product. Products made from cow, sheep, goat, and buffalo milk, which are heavily consumed in the market, are sold with the label of 100% single animal milk. There are differences between these milks in terms of nutritional value, health benefits, and digestibility. These differences are very effective on the preference of these milks. The same effects are also present in the pricing of milks. The superiority of milks over each other can lead to adulteration, generally with cheaper milk, in products made from them. The detection of this possible adulteration by analyses is essential for consumers to avoid harm and to reach safe food. RT-PCR methods have been used intensively in various food analyses in recent years, providing fast and reliable results.
In the study, different incubation temperatures (65, 75, 85 °C), incubation times (30, 60, 120 min), and sample amounts (0.2, 0.5, 1 g) were applied to increase the yield of isolated DNA in high-fat goat butter. The optimum isolation conditions were determined as 1 g sample amount, 85 °C incubation temperature, and 120 min incubation period in an automatic isolation device, and isolations were performed with this method in the analysis of milk mixture ratio detection in the RT-PCR device.
Mixtures were prepared from 100% cow and 100% goat butters for analysis in the RT-PCR device. In the device, calibration tables were prepared for each milk type with dilutions of 100% cow and 100% goat butters, and the goat and cow ratios of the mixture butters were calculated in these calibration tables. As a result of the quantitative analyses, 100% goat butter was detected as 102.17±2,36; 75% goat butter as 73.87±1,74; 50% goat butter as 53,35±5,05; 25% goat butter as 37,22±3,00; and 100% cow butter as 76.00±6,01. GC analysis of fatty acid composition was performed in mixture butters, and the change in fatty acid composition was determined when cow butter was mixed with goat butter. It was found that the change in fatty acid composition was parallel to the mixture fat percentages.