Gastrik biyopsi ve dışkı örneklerinden izole edilen Helicobacter pylori genomik DNA'sında klaritromisin ve levofloksasin duyarlılığının moleküler yöntemler ile belirlenmesi
Determination of clarithromycin and levofloxacin susceptibility by molecular methods in Helicobacter pylori genomic DNA isolated from gastric biopsy and stool specimens
Yazar: TUBA BECERİKLİ
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM YILMAZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyopsi = Biopsy ; Clarithromycin = Clarithromycin ; DNA = DNA ; Dışkı = Feces ; Helicobacter pylori = Helicobacter pylori ; Levofloksasin = Levofloxacin ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Klaritromisin ve levofloksasin direnci, Helicobacter pylori enfeksiyonu tedavi başarısızlığının en önemli nedenidir. Çalışmamızda GenoType HelicoDR testinin, fenotipik duyarlılık testi ve moleküler metodların yanısıra eş zamanlı olarak H. pylori saptanması ve klaritromisin ve levofloksasin duyarlılığının belirlenmesindeki etkinliğinin ve dışkı örneklerine uygulanabilirliğinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Dispeptik yakınmalı 58 (40K, 18E; 41.1 ± 13.5 yaş) hasta çalışıldı. Çalışmamızda uygulanan tüm metodlar hem antrum hem de korpus biyopsi örneklerine ve hastaların dışkı örneklerine uygulandı. Kültür, histopatoloji ve hızlı üreaz testinin en az ikisinin pozitifliğinde H. pylori pozitif olarak değerlendirildi. Klaritromisin ve levofloksasin duyarlılıkları konvansiyonel E-test yöntemi ile saptandı. H. pylori saptanması, klaritromisin ve levofloksasin duyarlılığının belirlenmesinde GenoType HelicoDR testi non-invaziv bir moleküler metod olarak dışkı örnekleri için modifiye edildi ve aynı zamanda GenoType HelicoDR testi gastrik biyopsi örneklerine de uygulandı. Ayrıca, FRET-real-time PCR H. pylori saptanması ve klaritromisin duyarlılığının belirlenmesinde hem biyopsi hem de dışkı örneklerine uygulandı. Farklı metodlar ile klaritromisin ve levofloksasin duyarlılık sonuçları farklı olan hastaların biyopsi ve koloni DNA örnekleri sekans analizine gönderildi. Elli bir (%87.9)  hasta H. pylori pozitif saptandı. Kırk dokuz (%84.5) kültür pozitif saptandı. Klaritromisin ve levofloksasin için E-test metodu ile 35 (%71.4), 35 (%71.4) hasta duyarlı, 10 (%20.4), 9 (%18.4) hasta dirençli ve 4 (% 8.2), 5 (%10.2) hastanın antrum ve korpus gastrik biyopsi örneğinde miks enfeksiyon (duyarlı ve dirençli bakteri) saptandı. Tüm hastalar GenoType HelicoDR testi ile H. pylori pozitif saptandı; klaritromisin ve levofloksasin için 37 (%63.8), 33 (%56.9) hasta duyarlı; 5 (%8.6), 11 (%19) hasta dirençli; 16 (27.6%), 14 (24.1%) hastada miks enfeksiyon saptandı. GenoType HelicoDR testi dışkı örneklerine de adapte edilmiştir. Dışkı GenoType HelicoDR testi ile 54 (%98.2) hasta H. pylori pozitif, 1 (%1.8) hasta H. pylori negatif saptandı. Dışkı ve doku GenoType HelicoDR testi sonuçları klaritromisin için 35 (%63.6) hastada, levofloksasin için 40 (%72.7) hastada uyumlu saptandı. Dışkı GenoType HelicoDR testinin duyarlılığı %100 (κ = 0.225) saptandı. FRET-real-time PCR ve GenoType HelicoDR metodlarının uyumu dışkı örneklerinde %81.0 ve doku örneklerinde % 66.7 saptandı. Üç hastanın sekans analizinde üç yeni mutasyon (C2136T, C2310A, C2428T) saptandı ve bu hastalarda klaritromisin direnci ile ilişkili bilinen üç nokta mutasyon açısından sekans analizi ile wild type saptandı. Bu üç hasta aynı zamanda E-test yöntemi ile de klaritromisin dirençli saptandı. GenoType HelicoDR ve FRET-real-time PCR; hızlı ve kültürden bağımsız, direkt biyopsi örneklerinden çalışılabilen ve hem wild type hem de dirençli H. pylori suşlarını içeren miks enfeksiyonları saptayabilen yöntemlerdir. Bununla birlikte, GenoType HelicoDR testinin en önemli avantajlarından biri özellikle klaritromisin direncinin yüksek olduğu bölgelerde levofloksasin duyarlılığının eş zamanlı klaritromisin ile birlikte saptanabilmesidir. Non-invaziv bir yöntem olarak GenoType HelicoDR testinin dışkı örneklerinde uygulanabilmesi, klinik yaklaşımda antimikrobiyal duyarlılığın tedavi öncesi invaziv girişim olmadan saptanmasını sağlaması nedeniyle büyük önem taşımaktadır.

Abstract:
Clarithromycin and levofloxacin resistance are the most important cause for treatment failure of Helicobacter pylori infection. We aimed to assess the efficacy of GenoType HelicoDR method and its applicability for stool specimens to detect H. pylori and determine clarithromycin and levofloxacin susceptibilities, simultaneously besides the phenotypic susceptibility testing and molecular methods. Fifty-eight patients with dyspepsia (40F, 18M; 41.1 ± 13.5 years) were studied. All tests used in this study were performed to both antrum and corpus biopsy specimens and stool specimens of these patients. H.pylori positivity was defined according to at least two positivity of culture, histopathology and rapid urease test. Clarithromycin and levofloxacin susceptibilities were determined by E-test as a traditional method. We modified GenoType HelicoDR test for stool specimens as a non-invasive molecular method to detect H. pylori and to determine clarithromycin and levofloxacin susceptibilities. GenoType HelicoDR test was also performed to gastric biopsy specimens. Furthermore, FRET-real-time PCR was performed to both biopsy and stool specimens for melecular detection of H. pylori and determination of clarithromycin susceptibility. Biopsy and colony DNA specimens of the patients which had discrepant clarithromycin and levofloxacin susceptibility results among used different methods were sent for sequencing. Fifty-one (87.9%) patients were H.pylori positive. Fourty-nine (84.5%) patients were culture positive. Thirty-five (71.4%), 35 (71.4%) patients were susceptible; 10 (20.4%), 9 (18.4%) were resistant; 4 (8.2%), 5 (10.2%) patients' antrum and corpus presented a double population of susceptible and resistant bacteria by E-test for clarithromycin and levofloxacin, respectively. All patients were H. pylori positive by GenoType HelicoDR; 37 (63.8%), 33 (56.9%) were susceptible; 5 (8.6%), 11 (19%) were resistant; 16 (27.6%), 14 (24.1%) presented a double population for clarithromycin and levofloxacin, respectively. GenoType HelicoDR test was adapted successfully for stool specimens. Fifty-four (98.2%) patients were positive and 1 (1.8%) patient was negative for H. pylori by stool Genotype HelicoDR. Stool GenoType HelicoDR results of 35 (63.6%) and 40 (72.7%) patients were correlated with the gastric biopsy results of GenoType HelicoDR for clarithromycin and levofloxacin, respectively. The sensitivity of stool GenoType HelicoDR was 100% (κ = 0.225). Correlation between FRET-real-time PCR and GenoType HelicoDR methods to determine clarithromycin susceptibility was 81.0 % and 66.7 % in gastric biopsy and stool specimens, respectively. Three new mutations (C2136T, C2310A, C2428T) were determined in three patients' sequence analyses conferring wild type for known main three mutations associated with clarithromycin resistance. E-test results of these patients were also resistant for clarithromycin. GenoType HelicoDR and FRET-real-time PCR methods are rapid and culture independent tests with the ability to study directly from biopsy specimens and also has capability for detection of mixed infections including both wild type and resistant H. pylori strains. However,  molecular determination of levofloxacin susceptibility simultaneously with claritromycin susceptibility is the best advantage of GenoType HelicoDR test especially in the region which is clarithromycin resistance is high. As a non-invasive molecular method, ability of using stool GenoType HelicoDR is very valuable in clinical setting providing to determine antimicrobial susceptibility prior to the treatment without invasive sampling.