Asmada (Vitis vinifera L.) CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi ile küllemeye (Erysiphe necator) dayanıklı bitkilerin geliştirilmesi
Development of powdery mildew (erysiphe necator) resistant plants in grapevine (Vitis vinifera l.) using CRISPR/Cas9 genome editing technology
Yazar: SELCEN DOĞAN
Danışman: PROF. DR. NEDİM MUTLU
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Dünya çapında asma yetiştiriciliğinde ekonomik açıdan en büyük kayıplar Erysiphe necator'un neden olduğu külleme hastalığından kaynaklanmaktadır. Dünyada toplam üzüm üretiminin yaklaşık %90'ına karşılık gelen çeşitlerin oluşturduğu Vitis vinifera L. türüne ait asmaların yaklaşık tamamının bu hastalığa hassas olduğu kabul edilmektedir. Patojenin dünyadaki üzüm yetiştirme bölgelerine yayılmış olması, bağcılıkta sık ilaçlama programlarının kullanımını gerektirmektedir. Bu amaçla kullanılan kimyasallar, yetiştiriciler için ek üretim maliyeti olmakla birlikte bağda çalışanlar ve bağda bulunan faydalı organizmaların sağlığını da olumsuz etkilemektedir. Son yıllarda pek çok araştırma, S (susceptible) genleri olarak tanımlanan, bitki ve patojen arasındaki uyumlu etkileşime olanak sağlayan genlerin dirençli tür ıslahında kullanım potansiyeli bulundurduğunu göstermektedir. MLO adı verilen lokuslarda bulunan S-genlerinin susturulması ile bitkilere külleme direnci kazandırılabileceğine yönelik çeşitli araştırmalar bulunmaktadır. A. thaliana, arpa, domates gibi bitkilerde bu uygulamanın başarılı sonuçları, asmada MLO genleri ile gerçekleştirilecek gen susturma çalışmaları için umut olmuştur. 
Çalışmada, CRISPR teknolojisinin uygulama alanlarından; gen susturma ve baz düzenlemesi birlikte kullanılarak MLO ve ALS (asetolaktat sentaz) genlerinde mutasyonlar oluşturulması hedeflenmiştir. Bunun için Agrobacterium tumefaciens ve CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak, ilgili kılavuz RNA'lardan asmaya hem geçici hem de kalıcı olarak aktarılanların seçilmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda,  MLO genlerini susturmaya yönelik hazırlanmış vektör tasarımının yanında ALS (asetolaktat sentaz) genlerini hedefleyen ek bir tasarım, bitkiye A. tumefaciens EHA105 suşu aracılığıyla entegre edilmiştir. Bunun için öncelikle ALS genlerine yönelik hazırlanan transformasyon vektörünün ilgili genlerde baz değişimi (C→U(T))  gerçekleştirmesi, Prolin (ALS1 geni için Pro 74, ALS2 geni için Pro175) amino asidinin Serin'e dönüştürülmesi hedeflenmiştir. Bu değişikliğin bitkilerde sülfonil üre grubu herbisitlere karşı dayanım geliştirdiği literatürde yer alan çok sayıda çalışma ile gösterilmiştir. Geçici transformasyon sonrası seçilen embriyojenik kalluslar sülfonil üre grubu herbisit seleksiyonundan geçirilerek bitki rejenerasyonları sağlanmıştır. 
Çalışma sonunda Siyah Kişmiş çeşidinde rejenere edilen 132 bitkinin 28'inde transformasyonun kalıcı olarak gerçekleştiği belirlenmiştir. Bunlar arasında 2 bitkide Gly177 rezidülerde tek baz mutasyonları izlenmiştir. Geçici entegrasyonun değerlendirildiği, kalan 104 bitkide mutasyon izlenmemiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçların, asmada Siyah Kişmiş çeşidinde izlenecek gen aktarma çalışmalarında etkin olarak kullanılabileceği, transgen taşımayan ve MLO genleri yönünden mutant bitkilerin elde edilmesi için ise gelecekte yapılacak çalışmalara yol göstereceği beklenmektedir.

Abstract:
The economic losses in grape cultivation worldwide are largely attributed to the powdery mildew disease caused by Erysiphe necator. It is generally accepted that almost all varieties of Vitis vinifera L., which represent approximately 90% of the total grape production worldwide, are susceptible to this disease. The global spread of the pathogen necessitates frequent pesticide applications in viticulture. The chemicals used for this purpose not only result in additional production costs for growers but also adversely affect the health of workers in the vineyard and beneficial organisms present in the vineyard. In recent years, numerous studies have indicated the potential use of genes known as S (susceptible) genes, which enable a harmonious interaction between the plant and pathogen, in breeding for resistance. Various research has explored the possibility of imparting powdery mildew resistance to plants by knocking out S-genes located in loci called MLO. Successful outcomes of such applications in plants like A. thaliana, barley, and tomatoes have provided hope for gene knock-out studies targeting MLO genes in grapevine.
In this study, the application of CRISPR technology aims to create mutations in MLO and ALS (acetolactate synthase) genes through the combined use of gene knock-out and base editing. Agrobacterium tumefaciens and the CRISPR/Cas9 system are employed to select both transient and stable transfers of guide RNAs prepared for grapevines. In this context, in addition to the vector design prepared for knocking-out MLO genes, an additional design targeting ALS (acetolactate synthase) genes has been integrated into the plant using Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain. For this purpose, the transformation vector prepared for ALS genes is designed to perform a base substitution (C→U(T)) in the relevant genes, converting Proline (Pro 74 for ALS1 gene and Pro 175 for ALS2 gene) amino acid to Serine. Numerous studies in the literature have demonstrated that this modification imparts resistance to sulfonylurea herbicides in plants. The embryogenic calli used in the transformation studies have been exposed to a sulfonylurea herbicide to monitor the events of transient transformation.
At the end of the study, it was determined that 28 out of 132 plants regenerated in Black Khismish variety transformed in a stable manner. Among them, single-base mutations were observed in the Gly177 residues in 2 plants. No mutations were observed in the remaining 104 plants evaluated for transient transformation. The results obtained from the study are expected to be effectively used in gene transfer studies to be followed in the Black Khismish variety, and they are anticipated to guide future studies for obtaining non-transgenic and mutant plants in terms of MLO genes.