İnsan dişlerinde periapikal hastalıklara sebep olan bazı patojen bakterilerin polimeraz zincir reaksiyonu ve Porphromonas gingivalisin eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile nicel olarak tespiti
Detection of some pathogen bacteria which causes periapical diseases at human teeth by polymerase chain reaction and quantitative detection of Porphyromonas gingivalis by real time polymerase chain reaction
Yazar: İBRAHİM ARAZ
Danışman: PROF. DR. LEYLA AÇIK
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Akut apikal inflamasyon, periapikal dokularda hasara yol açan sınırlandırılmış veya yaygın likefaksiyon şeklinde olabilen lezyonlardır. Her ne kadar oluşan enfeksiyon bakterilere ve pulpada nekroz oluşturan irritan başka maddelere bağlı olabileceği ileri sürülse de mikroorganizmalar dişin pulpası ve periapikal dokuları ile ilgili hastalıklarda en önemli etiyolojik faktörler olarak kabul edilmektedir. Kanal içindeki bakteriler de periapikal lezyona sebep olabilir. Bu nedenle bakteriler kanal içinden ve kök kanal sisteminden uzaklaştırılmalıdır. Bu sayede tedavide başarı sağlanabilir. Kök kanalı içinde inflamasyona (abse) yol açan çok sayıda bakteri bulunmaktadır ve bu karışık flora hem aerobik hem de anaerobik mikroorganizmalardan oluşmaktadır. Son yıllarda kök kanalı enfeksiyonları ve periapikal hastalıkların büyük çoğunluğundan anaerobik bakterilerin sorumlu olduğu rapor edilmektedir. Bu nedenle kanal içindeki aerob veya anaerob tüm mikroorganizmalar, kök kanal sisteminden uzaklaştırılmadığı sürece tedavide başarısızlıklar olabilecektir. Son yıllarda toplumumuzda uygunsuz antibiyotik kullanımı veya çoklu ilaç direncine sahip mikroorganizmaların sayısında artış görülmesi nedeniyle özellikle inatçı ve tekrarlayan enfeksiyonlarda kanal içinde bulunan mikroorganizmaların türlerinin belirlenmesi, tedavi için gerekli antibiyotik seçimine karar verilmesi açısından önem taşımaktadır. Bu nedenle enfekte alanlardan alınan örneklerin kültürünü yapılması gibi klasik, konvansiyonel mikrobiyolojik yöntemler kullanılarak mikroorganizma türünün tespit edilmesi gerekmektedir. Ancak ağız içi bakterilerinin çoğunun geç ve güç üreyen bakteriler olması, bir kısmının anaerob koşullarda inkübasyon sürelerinin uzun olması nedeniyle kültür yöntemi ile tespiti uzun zaman almaktadır. Bununla birlikte karışık floradan tür düzeyinde tanımlanması çok fazla besiyeri ve tanımlama kiti kullanımı gerektirdiği için masraflı ve zor olmakta, ayrıca her mikroorganizma türünün de in vitro kültürünün yapılabilmesi mümkün olamamaktadır. Bu çalışmada kök kanal enfeksiyonlarında en sık görülen bakterilerin tanımlanmasında hızlı, özgül ve güvenilir bir yöntem olarak kabul edilen ve karışık flora içinde bile hızlı tür tayinine imkân sağlayan polimeraz zincir yöntemi (PZR) ve mikroorganizmaların nicel değerlendirilmesinde kullanılan nicel eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPZR) teknikleri uygulanmıştır. Materyal olarak pulpal ve periapikal enfeksiyon hastalıkları olan dişlerin kök kanalından aseptik şartlarda kültür örnekleri Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Endodonti bölümünde alınmıştır. Alınan örneklerin DNA izolasyonları yapılmış ve Porphyromonas gingivalis türü bakteri için tasarlanan 16S rRNA bölgesine özgü primerlerle PZR işlemi yapılmıştır. Daha sonra Porphyromonas gingivalis türü PZR pozitif olarak bulunan örneklerden eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPZR) lightcyler 480 (Roche, İsviçre) ile nicel analizleri yapılmıştır.Anahtar Kelimeler: Moleküler Hücre Biyolojisi, Endodontal Mikroorganizmalar, Eş Zamanlı PZR

Abstract:
ABSTRACTAcute apical inflammation which is a localized or defused liquefaction lesion has caused periapical tissue damage. Although it has been claimed that infections has become due to the bacteria and nonbacterial irritants as well dental pulp and periapical tissue infections, microorganisms has been accepted as the most important etiologic factors at these kind of infections. The presence of bacteria in the canal may cause periapical lesion, too. For this reason the bacteria must be removed from the interdentinal or the root canal system. So, the treatment will be successful. There are many bacteria existing in the root canal that may lead to inflammation (abscess) and this flora contains either aerobic or anaerobic microorganisms. It has been reported that anaerobic microorganisms were mostly responsible for the root canal infections and periapical diaesases. Recently, because of the inappropriate usage of the antibiotic and the elevation in the number of multidrug resistant microrganisms in our society, there may be failures in the treatment if the aerobic and anaaerobic bacteria couldn?t be removed of the root canal. Especially for the resistant and recurrent infections, type identifications of the microorgnisms in the root canal shall be important for the antibiotic selection in treatment. Thus, classical, conventional microbiological methods such as culture are needed. But this will take time because of the fastitious and/or slowly growing bacteria and also some of them are uncultivable bacteria. Besides for identification of the species within a mix population/flora will be needed more media, chemical agents and identification kits. So this will take long time and cost will be higher. On the other hand, it was impossible to type every isolated strains by in vitro cultures. Polimerase chain reaction (PCR) is accepted as a rapid, specific, sensitive and reliable technique which enables identification of the species even among a mixed flora specifically. Real time PCR (qPCR) technique is a kind of PCR technique which gives a quantitative results besides typing the microrganisms. These techniques will be used in this study. Interdentinal samples taken from the patients aseptically from the root canal of the patients who has pulpal and periapical infections in Ankara University Faculty of Dentistry, Department of Endodontics. Then the bacterial DNA were isolated from the samples and amplification of the DNA samples with oligonucleotid primers targeted to the type specific region of 16S rRNA of Porphyromonas gingivalis strain in the study. Then electrophoresis of the PCR samples in agarose gel and imaging of them were done. The PCR products will be processed with the real time PCR technique by using species-specific oligonucletide primers with a dye in 5?-3? in the lightcyler 480 quantitatively (Roche®, İsviçre).Key Words: Molecular Cell Biology, Endodontic Microorganisms, Real Time PCR(qPCR)