Tampon sistemlerinde lipazların katalitik performans ve ikincil yapısına süperkritik akışkanların etkisi
The effect of supercrtical fluids on the catalytic performance and secondary structureof lipases in buffer systems
Yazar: ZEYNEP AKÇAY
Danışman: PROF. DR. UĞUR SALGIN
Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Enzimlerin yer aldığı biyokimyasal reaksiyon mühendisliğinde ya da kiral seçici özelliğe ve katalitik aktiviteye sahip olan proteinler ile enantiyomerik bileşiklerin ileri düzeyde ayırma ve saflaştırma proseslerinde toplam üretim ya da ayırma maliyetinin yaklaşık % 20'si bu ortamlarda kullanılan enzimler için harcanmaktadır. Bu proseslerde reaksiyonun ya da ayırmanın seçimliliği ve verimliliği kullanılan enzimlerin modifikasyonu ya da proses işletme koşullarının iyileştirilmesi ile arttırılabilir. Bu çalışmada basınçlandırılmış karbondioksit (CO2) ortamında liyofilize edilmiş toz formdaki Candida rugosa lipazı (CRL) kullanılmıştır. CRL'nin basınçlandırılmış CO2 ile ön işlem görmesi sonucunda 7.2 ve 7.5'luk pH değerlerinde, 31-60 oC sıcaklık ve 73.8-300 bar basınç koşullarında enzimin konformasyonel yapısını oluşturan bileşenlere bu sıcaklık ve basınç koşullarının etkisi incelenmiştir. Lipaz enziminin ikincil yapısındaki değişimlerin belirlenebilmesi için Fourier Transform Infrared (FTIR) spektroskopi cihazı kullanılmıştır. Gürültü/sinyal oranının minimizasyonu için 256 eş-tarama sayısı ile gerçekleştirilen analizlerdeki tarama hızı 0.2 cm/s ve çözünürlük değeri 4 cm-1 olarak ayarlanmış ve elde edilen spektrumların karakterizasyonunun değerlendirilmesi bir bilgisayar yazılım programı olan PeakFit aracılığıyla gerçekleştirilmiştir. Bu değerlendirme sonucunda en iyi pik şiddetinin elde edildiği basınç ve sıcaklık değeri pH'ın 7.2 olduğu koşul için  40 oC ve 150 bar, pH'ın 7.5 olduğu koşul için ise 40 oC ve 73.8 bar olarak belirlenmiştir. Enzimin hidrolitik aktivitesi UV-vis spektrofotometre cihazında 404 nm dalga boyunda ve 25 oC sıcaklıkta ölçülmüştür. Basınçlandırılmış CO2'in aktif konum üzerindeki etkisini incelemek amacıyla hem süperkritik CO2 (scCO2) ile ön işlem görmeden önce hem de scCO2 ile ön işlem gördükten sonra farklı sıcaklık ve basınç koşulları altında düzenli/düzensiz α-heliks ve β-sheet yapılarının yüzde alan değişimleri hesaplanarak katalitik aktivite üzerine etkileri incelenmiştir. Lipaz enziminin katalitik aktivitesinin en yüksek değeri pH'ın 7.2 olduğu koşulda 60 oC ve 100 bar değerinde elde edilmiştir. pH'ın 7.5 olduğu koşulda ise 40 oC sıcaklık ve 300 barlık en yüksek basınç değerinde saptanmıştır. CRL enzim çözeltisinin ön işlem görmemiş haline kıyasla ön işlem görmüş halinin zeta potansiyelleri ve boyut dağılımındaki değişimleri Zetasizer NanoZS cihazında belirlenmiştir. En yüksek zeta potansiyeli 40 oC ve 200 bar değerinde elde edilmiştir. Zeta potansiyelinin belirlenen en yüksek değerinde agregasyonun minimize olması söz konusu olduğundan boyut dağılımı incelenmesi sonucunda en düşük boyut dağılımı da pH 7.2 için 60 oC 200 bar olarak belirlenirken pH 7.5 için de en iyi koşulun aynı basınç ve sıcaklık değeri olduğu saptanmıştır.

Abstract:
In biochemical reaction engineering involving enzymes or in advanced separation and purification processes of enantiomeric compounds using chiral selectivity and catalytically active proteins, approximately 20% of total production or separation costs is spent for enzymes in which use these environments. In these processes the  selectivity and the efficiency of reaction or separation can be increased with modification of enzymes or  improvement of the process operating conditions. In this study, the lyophilized powder form of Candida rugosa lipase (CRL) in the pressurized carbon dioxide (CO2) environment were used. Using CRL enzyme dissolved in buffer systems (pH=7.2 and 7.5). The effects of operating temperature and pressure on the conformational structure components of the enzyme which is pre-treated with pressurized CO2 were investigated at the range of 31-60 oC and 73.8-300 bar respectively. Changes in secondary structure of the lipase enzyme can be determined by Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy. The analysis conditions for  minimization of noise/signal ratio  were performed with the scanning number of 256 at the scan rate of 0.2 cm/s and the resolution of 4 cm-1, and the evaluation of the characterization of the obtained spectra was carried using the Peakfit software program. As a result of these evaluations, the best peak intensities for pH=7.2 and 7.5 were obtained at 40 oC/150 bar and 40 oC/73.8 bar, respectively. Hydrolytic activity of the enzyme were determined by Uv-vis spectrophotometer at a wavelength of 404 nm and a constant temperature of 25 oC. To investigate the effects of pressurized CO2 on the active position, The changes in regular/irregular α-helix and β-sheet structures which  pretreated with supercritical CO2 (scCO2) under different temperature and pressure conditions and without was determined with the aid of calculation of the percent change in areas for examine the effect on the catalytic activity. The maximum value of the catalytic activity of lipase was obtained in the condition of 60 °C/100 bar for pH=7.2, but the maximum catalytic activity in the case of pH=7.5 was obtained in the condition 40 °C/300 bar. The changes in the zeta potentials and size distribution of CRL enzyme, in which was pre-treated with pressurized CO2 in order to compare with the untreated state were identified by Zetasizer Nano ZS. The maximum zeta potential value was obtained at 40 °C/200 bar. As regards as size distribution analysis, the lowest size distribution for pH=7.2 and pH=7.5 was determined at 60 °C/200 bar since the highest value of zeta potential gave rise to minimize the aggregation process of enzyme.