M125-4 aktinomiset izolatı kullanılarak keratinöz atıklardan keratinaz üretim optimizasyonu ve karakterizasyonu
Optimization of the keratinase production from actinomycetes m125-4 using keratinous wastes and characterization of keratinase
Yazar: DENİZ KUŞCUOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. E. ESİN HAMEŞ KOCABAŞ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Tez çalışmasında, mevcut aktinomiset izolatlarının proteaz ve keratinaz aktivitesi açısından taranarak seçilen izolattan keratinöz atık kullanılarak keratinaz üretiminin optimizasyonu ve karakterizasyonun yapılması amaçlanmıştır.Bu kapsamda; ilk aşamada, 180 adet alkalifilik aktinomiset izolatı proteaz aktivitesi açısından taranmış ve seçilen iyi üreticiler substrat olarak keratinöz atıklar (tavuk tüyü, koyun yünü) kullanılarak derin kültür fermentasyon çalışmasına alınmıştır. Fermentasyon sıvıları keratinaz aktiviteleri açısından değerlendirilerek izolat M125-4 ve substrat olarak tavuk tüyü ileri çalışmalar için seçilmiştir. Çeşitli özellikleri incelenen izolatın S. albidofalavus grubunda yer aldığı belirlenmiştir. Daha sonra pH, inokulum miktarı ve zaman değişkenlerinin keratinaz üretiminde birbirleri ile olan etkileşimi yanıt yüzeyi yöntemi (YYY) ile incelenmiş ve buna göre keratinaz üretimi için optimum koşullar pH 7.0, 30°C ve 4 gün olarak belirlenmiştir. Ardından substrat miktarınının optimizasyonu YYY ile elde edilen koşullar altında gerçekleştirilerek, en iyi enzim üretiminin 15g/L tavuk tüyü ile 12 U/ml olduğu belirlenmiştir. Optimizasyon çalışmaları sonucunda enzim üretimi, % 50 oranında arttırılmış ve fermentasyon süresi 2 gün kısaltılmıştır. Enzim iyon değişim kromatografi kolonundan elüsyon sonucu % 13.7 verimlilik ile 44.1 kat saflaştırılmıştır. Enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık ve pH değeri 37°C, pH 9.0 olarak belirlenmiş, 1 saat süre sonunda 45°C'de % 80 ve pH 12'de ise % 84 aktivitesini koruduğu tespit edilmiştir. Keratinazın moleküler kütlesi 20 kDa olarak tahmin edilmiştir. Bunu takiben; çeşitli substratların, inhibitörlerin, deterjanların ve organik solventlerin farklı derişimlerde enzimatik reaksiyona etkisi belirlenmiştir.

Abstract:
The aim of the thesis is to optimize the production of keratinase using keratin based wastes from actinomycete isolates that screened for their ability to produce proteases and to perform enzymes? purification and characterization.In this study primarily a total of 180 actinomycetes isolate were investigated for their extracellular protease producing capacities and the best producers were evaluated for keratinase production in shake flask fermentation. Isolate M125-4 which have a potential to produce keratinase in specified level of literature or more than that was chosen for further studies. The selected isolate was identified in Streptomyces albidoflavus clade on the basis of its various characteristics. In the second step of the thesis based on preliminary studies three variables; temperature, initial pH and incubation time were selected and optimized by Response Surface Methodology (RSM). Also amount of substrate in fermentation was optimized using One variable at a time (OVAT) method. For the production of keratinase optimum conditions were determined as pH 7.0, 30°C, 4 days and 15 g/L chicken feather. As a result of optimization studies, the enzyme production was increased 50 % and also the fermentation time of the enzyme was shortened 2 days. Following the optimization, enzyme was purified 44.1 fold by ion exchange chromography with 13.7 % yield. The optimal temperature and pH for the keratinolytic activity were determined 37ºC and 9.0 respectively. Temperature and pH stability of the keratinase after 1 hour at 45°C and pH 12 were defined as 80 % and 84 % respectively. The enzyme molecular mass was estimated 20 kDa by SDS-PAGE analysis. Finally for the determination of the various substrates, inhibitors, detergents and organic solvents effects of enzyme activity they added to enzymatic reaction to certain concentrations.