Ankara'daki topraklardan izole edilen Bacillus türlerinin tanımlanması, moleküler düzeyde tiplendirilmesi ve biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi
Identification, moleculer typing and determination of biological activities of Bacillus species isolated from soils in Ankara
Yazar: FATMA ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. LEYLA AÇIK
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Arastırmada Ankara'nın farklı yerlerinden alınan toprak örneklerindenBacillus türlerine ait toplam 60 bakteri izole edilerek, Analitik Profil ndeks(API) test kitleri ile tanımlanmıstır. Biyolojik kontrolde kullanılan Bacillusthuringiensis türlerinin tanımlanması 16S rRNA dizi analizi ile yapılmıstır.zolatların toplam hücre proteinleri izole edilmis ve sodyum dodesil sülfatpoliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edilmistir. Her bir izolataait protein bantları birbiri ile karsılastırılarak POPGEN istatistik programındaizolatlar arasındaki genetik uzaklıklar hesaplanmıs ve dendrogramolusturulmustur. Bireyler arasındaki genetik uzaklıkların %0- %95 arasındaoldugu bulunmustur. Elde edilen dendrograma göre izolatlar iki ana gruptatoplanmıstır. Birinci ana grupta, B. cereus, B. anthracis ve B. thuringiensis' inyer aldıgı, ikinci ana grupta ise B. sphaericus, B. subtilis, B. licheniformis, B.laterosporus, B. pumilus, B. megaterium, B. stearothermophilus, B. brevis, B.firmus ve B. circulans türlerinin yer aldıgı belirlenmistir. Bakterilerin plazmitDNA'ları izole edilmis ve büyüklükleri hesaplanmıstır. zolatlardan 57tanesinde plazmit DNA tespit edilmis, 3 tanesinde ise plazmit DNA tespitedilememistir. zolatların 1,1 kb ile 19,3 kb arasında degisen büyüklüklerde 1?9adet plazmit DNA tasıdıkları belirlenmistir.vBacillus thuringiensis izolatlarının kristal genlerinin tanımlanması polimerazzincir reaksiyonu-restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (PZR-RFLP) ileyapılmıstır. Sonuçlar B. thuringiensis FÖ21 izolatının cry1 (272 bp) ve cry2(1556 bp) genlerini içerdigini göstermistir. lave olarak B. thuringiensis FÖ16 veB. thuringiensis FÖ19 izolatlarında da sadece 1556 bp'lik cry2 genini tasıdıklarıbelirlenmistir. cry2 genleri tiplerinin için DdeI enzimi ile kesilmistir. DdeIenzimi ile kesimi sonucunda elde edilen fragmentlere göre üç izolatın da cry2Aave cry2Ab genlerini birlikte tasıdıkları belirlenmistir. Kristal proteinler izoleedilmis ve SDS-PAGE ile analiz edilmistir. zolatların 130 kDa ve 65 kDabüyüklügünde iki adet kristal protein tasıdıkları belirlenmistir. B. thuringiensisizolatlarının tasımıs oldukları parasporal kristal yapılarının morfolojikincelemeleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile yapılmıstır. Yapılaninceleme sonunda izolatların hepsinin baklava dilimli, kübik ve yuvarlak sekilliparasporal kristal yapılar tasıdıkları bulunmustur. Parasporal kristal tasıyanizolatların toksik etkileri Ephestia kuehniella (Lepidoptera) ve Trogodermagranarium (Coleptera) 3. dönem larvaları kullanılarak yapılan biyolojikdenemelerle belirlenmistir. zolatların LC50 ve LC99 degerleri Probit analizi ilelarvaların % ölüm oranları ise Abbot's formülü ile hesaplanmıstır. FÖ21, FÖ16ve FÖ19 izolatlarının E. kuehniella larvaları üzerindeki ölüm oranları sırasıyla%83, %80 ve %57 olarak belirlenmistir. Bacillus thuringiensis FÖ21 ve Bacillusthuringiensis FÖ19 izolatlarının test edilen kontrol suslarından daha etkilioldugu tespit edilmistir. Elde edilen sonuçlar bu çalısma kapsamında izoleedilen Bacillus thuringiensis izolatlarının biyolojik kontrol ajanı olarakkullanılabilecegine isaret etmektedir.

Abstract:
In this study, 60 Bacillus strain were isolated from different soil samples inAnkara and identified with Analitic Profile Index (API). Bacillus thuringiensiswas also identified by 16S rRNA sequence analysis. Total proteins of eachisolates were isolated and analysed by sodium dodecyl sulphate gelelectrophoresis (SDS-PAGE). The protein banding patterns of the isolates werecompared with each other, genetic distances were calculated and dendrogramwas established. The genetic distances between isolates cahnged from 0% to95%. According to the dendrogram isolates were divided into two main clusters.The first cluster contains B. cereus, B. anthracis and B. thuringiensis. Thesecond cluster B. sphaericus, B. subtilis, B. licheniformis, B. laterosporus, B.pumilus, B. megaterium, B. stearothermophilus, B. brevis, B. firmus and B.circulans. Plasmid DNAs of the isolates were isolated and their sizes werecalculated. 57 of the isolates contained 1-9 plasmid DNA changing from 1,1 kband 19,3 kb in size while 3 isolates had no plasmid DNA. A polymerase chainreaction- restriction fragment lenght polymorphism (PCR-RFLP) method foridentification of cry genes from B. thuringiensis was established. The resultsshowed that Bacillus thuringiensis FÖ21 contained cry1 (272 bp) and cry2 (1556bp) genes, while Bacillus thuringiensis FÖ16 and Bacillus thuringiensis FÖ19contained only cry2 gene. cry2 gene was restricted with DdeI enzyme in order toviifind cry2 types. All three isolates had cry2Aa and cry2Ab genes. The crystalproteins of the isolates were analysed by SDS-PAGE. The results showed thatisolates had two crystal proteins (130 kDa and 65 kDa weight). Themorphological structure of parasporal crystals of the B. thuringiensis wereinvestigated by Scanning Electron Microscopy (SEM) morphologically. Resultsshowed that all the isolates carried bipyramidal, spherical and cuboidalstructures. The toxic effects of the isolates carrying parapsoral crystals weredetermined by the bioassay using third instars larvae of Ephestia kuehniella(Lepidoptera) and Trogoderma granarium (Coleoptera). The LC50 and LC99values of the isolates were determined by Probit analyse and mortality werecalculated by Abbot?s formula. Mortality of the Bacillus thuringiensis FÖ21,Bacillus thuringiensis FÖ16 and Bacillus thuringiensis FÖ19 against E.kuehniella larvae were 83%, 80%, and 57% respectively. Toxic effect ofBacillus thuringiensis FÖ21, Bacillus thuringiensis FÖ19 were found better thanthe reference strain tested. In conlusion, the results show that the B.thuringiensis isolates obtained in this study could be used as an effectivebiological control agent.