Malign melanomda hipoksik süreç ve ilişkili genlerin araştırılması
Analysis of hypoxic process and related genes in malignant melanoma.
Yazar: MUSTAFA EMRE ERCİN
Danışman: PROF. DR. ÖNDER BOZDOĞAN
Kırıkkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology ; Patoloji = Pathology
Dizin: Melanom = Melanoma

Özet:
Basamaklı karsinogenez sürecinde neoplazinin içinde bulunduğu mikroçevre oldukça önemli bir yere sahiptir. Hipoksi de tümör gelişimi ve progresyonuna katkıda bulunan mikroçevresel etmenlerden biridir. Artmış proliferasyon ve metabolik gereksinim sonucu fizyolojik oksijen düzeyinin düşmesi solid tümörlerin tipik özelliğidir ve tümör hipoksisi olarak adlandırılır. Tümör hücresi meydana getirmiş olduğu bu hipoksik mikroçevreye adaptasyonu sağlamak ve bu negatif durumu kendi lehine çevirmek için aracı olarak önemli bir protein olan hipoksi indüklenebilir faktörü (HIF-1) kullanır. 
HIF-1, hipoksinin en önemli düzenleyici proteinidir. HIF-1, alfa ve beta (ARNT) olmak üzere iki komponentten oluşur. Normoksik koşullarda HIF-1 alfa proteini hızla ubikitinlenip proteozomda yıkılırken, hipoksik koşullarda stabilize edilip sitoplazmada birikir. Biriken HIF-1 alfa çekirdek içine göç eder ve nükleusta beta alt ünite ile birleşip hipoksiye cevap veren genlerin aktive olmasını sağlar. Hedefe yönelik tedavide hipoksi ile ilişkili genler araştırılmaktadır.
Biz bu çalışmamızda malign melanom hücre hatlarında (CRL-1675, CRL-1676) hipoksik süreç ve ilişkili gen ekspresyonlarının araştırılmasını amaçladık. Primer ve metastatik hücre hatları uygun ortamda  büyütülerek,  Real-Time  PCR  yöntemiyle  hipoksi  ile  ilişkili  84  genin  ekspresyonları incelenmiştir.  Ayrıca  primer  malign melanom hücre  hattında  hiposik ortam  oluşturularak,  1. ,  4. ve  8.  saatlerde  gen ekspresyonları  arasında  farklılıklar  araştırılmıştır.  Çıkan  sonuçlar  literatür  eşliğinde değerlendirilerek saptanan aday üç genin (HIF-1 Beta, JMJD6, NDRG-1) kodladığı proteinlerin nevüs,  melanom  ve  metastazlarında  ekspresyonları,  doku  array  ve  arşiv  materyallerinde incelenmiştir. 
Primer  ve  metastatik  hatlar   karşılaştırıldığında  toplam  37  genin  2  kat  ve  üstü  farklılık gösterdiği görülmüştür.  Primer kutanöz melanomlarda intradermal nevüslere göre NDRG-1 düzeylerinin düştüğü, HIF-1 Beta sitoplazmik boyanmanın ise arttığı saptandı. Yumuşak dokuda saptanan  melanomlarda  JMJD6  proteinin  daha  yüksek  oranda  ifade  bulduğu  görüldü.  Tüm gruplarda üç protein arasında değişik düzeylerde istatistiksel ilişki saptandı. 
Çalışmamızda  primer  ve  metastatik  hücre  hatlarında  ekspresyon  patternlerinin farklılığının    saptanması  metastatik   tümör  klonlarında  hipoksiye  yanıtın  farklı  olduğunu düşündürmüştür.  Ayrıca  benign  lezyonlara  göre  hipoksik  proteinlerin   melanomlarda  farklı  bir profil  ortaya  çıkardığı  dikkati  çekmiştir.  Bu bulgular, melanomlarda hipoksik süreçlere ışık tutacak ve tedaviye katkı sağlayacak bilgileri sağlamıştır.

Abstract:
Tumor microenvironment has a significiant role in the multistep carcinogenesis process. Hypoxia is one of the microenviromental factors that contributes to tumor development and progression. Decreasing physiological O2 levels due to increased proliferation and metabolic demand, is a characteristic feature of solid tumors and known as tumor hypoxia. To adapt this hypoxic microenvironment and turn this unfavorable condition in its favor, tumor cell uses HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1) which is an important protein as a messenger.
       HIF-1 is the most important regulatory protein of hypoxia. It is composed of two subunits: α and β (ARNT). HIF-1 α is rapidly ubiquinated and degraded in proteozome in normoxia whereas it is stabilized and increased in cytoplasm in hypoxia. Accumulated HIF-1 α then migrates into nucleus and activates hypoxia responsive genes by binding with β subunit. Hypoxia related genes are investigated in targeted therapy.  
In our study we aimed to analyze hypoxic process and related gene expressions in malignant melanoma cell lines (CRL-1675, CRL-1676). Expressions of  hypoxia-related  84  genes  were investigated  by  RT-PCR  method  in  cell  lines  which  were  grown  in  convenient  medium conditions.  Besides,  differences  between  gene  expressions  were  examined  in  primary malignant melanoma cell  lines which  were  exposed  to  1,  4  and  8  hours  hypoxia.  Expressions  of  proteins  encoded  by  three candidate genes (HIF-1 Beta, JMJD6, NDRG-1), selected after evaluation of our study results  by literature,  in  nevi,  melanoma  and  their  metastases  were  studied  in  tissue  arrays  and  archival materials. 
Totally  37  genes  were  exhibited  ≥2  fold  differences in  metastatic melanoma vis-à-vis primary melanoma. NDRG-1 total staining scores were decreased in primary melanoma than nevi. On the other hand, HIF-1 Beta cytoplasmic staining score was increased. JMJD6 protein levels were up-regulated in soft tissue localized melanoma. Statistically correlations were determined between three genes in all study groups. 
It  was  suggested  that  hypoxic  response  was  different  in  metastatic  tumor  lineages  after differences  were  detected  between  primary  and  metastatic  melanomas  expression  patterns. Furthermore, hypoxic proteins were demonstrated distinct profiles in melanoma with compared benign lesions.  These  findings  will  shed light  to  hypoxic  processes  in  melanoma  and  provide data for development of new treatment strategies.