Farelerde ovaryum kriyoprezervasyonu ve transplantasyonu sonrasında meydana gelen folikül kaybında anti-Müllerian Hormon uygulamasının koruyucu rolü
Protective effect of Amh treatment on expression of proteins that control primordial follicle reserve after ovarian tissue cryopreservation and retransplantation in mice
Yazar: SONER ÇELİK
Danışman: PROF. DR. ÇİLER ÇELİK ÖZENCİ
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Antimüllerian hormon = Antimullerian hormone ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Fareler = Mice ; Foliküler faz = Follicular phase ; Over = Ovary ; Transplantasyon = Transplantation

Özet:
Amaç: ODKT sonrasında oluşan en önemli sorunlardan biri PF havuzunun büyük oranda hızla tükenmesidir. Büyüyen foliküllerden salgılanan Amh'un rekombinant formunun uygulanmasının kanser kemoterapisi sebebiyle kaybedilen PF havuzunu koruduğu yeni bir bilgidir. ODKT sonrasında PF'lerin büyük oranda kaybına yol açan süreçte Amh'nin rolü̈ tam olarak bilinmemektedir. Bu çalışmanın hipotezi; "ODKT sonrasında Amh uygulanmasının PF havuzunu koruduğudur". Bu hipotezi test etmek için ODKT sonrasında rAmh uygulamasının PF havuzunu koruyup korumadığını ve bu sürecin mekanizmasını araştırılmıştır.
Yöntem: Farelerde; kontrol, ULO-T, BLO-T ve BLO-T+AMH grupları oluşturulmuştur. Transplantasyondan sonraki ikinci haftanın sonunda ovaryum greftleri parafin doku takibine alınmıştır. Öncelikle, tüm gruplardan elde edilen OD seri kesitlerinde, normal ve atretik primordiyal ve büyüyen foliküllerin sayısı değerlendirilmiştir. Ardından, PF'lerin büyümesinde görevli olan KitL, Bmp15, Gdf9, p-s6K, Tsc1 ve p27 protein ifadeleri immünohistokimya yöntemiyle, büyüyen foliküllerin proliferasyonu PCNA immünohistokimyası ile ve hücre ölümü ise TUNEL yöntemiyle değerlendirilmiştir. Son olarak, tüm gruplarda Amh düzeyleri ELISA yöntemiyle değerlendirilmiştir.
Bulgular: ULO-T ve BLO-T gruplarında PF rezervi kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalmıştır ve BLO-T+AMH grubundaki PF'lerin sayısı anlamlı olarak yüksektir. KitL, Bmp15, p-s6k ve p27 ifadeleri, ULO-T, BLO-T ve BLO-T+AMH gruplarında kontrole göre anlamlı olarak azalmıştır. ULO-T ve BLO-T gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalan Tsc1 ifadesi ve anlamlı olarak artan Gdf9 ifadesi, BLO-T+AMH grubunda kontrole benzerdir. Gruplar arasında büyüyen foliküllerdeki proliferasyon ve hücre ölümü benzer bulunmuştur. Kontrol grubuna kıyasla, BLO-T grubunda transplantasyonunun 9. gününden itibaren azalan plazma Amh düzeyi, BLO-T+AMH grubunda 28. güne kadar kontrol grubu ile benzer düzeyde kalmıştır. 
Sonuç: Bu çalışma, ovaryumların unilateral ya da bilateral olarak çıkarılarak kriyoprezervasyonu re-transplantasyonunun sonrasında Amh seviyesinin azalmasıyla birlikte, PF havuzunun anlamlı ölçüde azaldığını ortaya koymuştur. Diğer yandan, ovaryumların bilateral çıkarılmasının ardından kriyoprezervasyonu ve re-transplantasyonu sonrasında 28 gün rAmh uygulaması PF rezervini Tsc1 ve Gdf9 ekspresyonunu düzenleyerek korumuştur. Bu çalışma ile, ODKT sonrası ekzojen rAmh uygulamasının PF kaybını önemli düzeyde önleyebileceğini mekanistik olarak açıklamış ve yeni araştırmalar için önemli temel bilgi sağlamıştır.

Abstract:
Objective: One of the most critical problems after OTCT is the rapid depletion of the PF pool. However, the role of Amh in rapid PF loss mechanism after OTCT is not known. The hypothesis of this study is as follows; "rAmh treatment after OTCT preserves the PF pool via regulating inhibitory and activatory proteins that have role in primordial to primary follicle transition". To test this hypothesis, we investigated whether long term rAmh application after OTCT protects the PF pool and the underlying mechanisms.
Method: Mice were randomly distributed to control, ULO-T, BLO-T, and BLO-T and BLO-T+AMH groups. The number of normal and atretic primordial and growing follicles was evaluated in OT serial sections obtained from all groups. KitL, Bmp15, Gdf9, and p-s6K, Tsc1, and p27 protein expressions were evaluated by immunohistochemistry. The proliferation of growing follicles was evaluated by PCNA immunohistochemistry and cell death was assessed by TUNEL method. Amh levels in all groups were evaluated by the ELISA. 
Results: PF reserve significantly decreased in the ULO-T and BLO-T groups compared to the control group. Although rAmh administration could not completely prevent follicular depletion, the number of PFs in the BLO-T+AMH group was significantly higher than in the ULO-T and BLO-T groups. Expressions of KitL, Bmp15, p-s6k, and p27 decreased significantly in the ULO-T, BLO-T, and BLO-T+AMH groups. Tsc1 expression in the ULO-T and BLO-T groups decreased significantly while its expression was similar to the control group in BLO-T+AMH group. Gdf9 expression increased significantly in the ULO-T and BLO-T groups decreased significantly while its expression was similar to the control group in BLO-T+AMH group. Cell proliferation and DNA fragmentation rates in the growing follicles were similar between the groups. Plasma Amh level decreased significantly beginning from the 9th day of re-transplantation in the BLO-T group and in the BLO-T+AMH group, its level was maintained as similar to the level of the control group until day 28th.
Conclusion: This study showed that after either unilateral or bilateral removal and transplantation of the ovaries Amh levels and PF pool reduces significantly. Twenty-eight days of rAmh treatment after OTCT preserves the PF reserve by regulating Tsc1 and Gdf9 expression. The results of this study provided the basis for new approaches to fertility preservation in the clinic by which exogenous administration of rAmh after OTCT could prevent PF.