Kanser tanısı için monoklonal antikor yüklü radyofarmasötiklerin geliştirilmesi ve etkinliğinin in vitro/in vivo çalışmalarla değerlendirilmesi
Development of monoclonal antibody loaded radiopharmaceuticals for cancer diagnosis and evaluation of efficacy with in vitro/in vivo studies
Yazar: MELİHA EKİNCİ
Danışman: DOÇ. DR. DERYA İLEM ÖZDEMİR
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Radyofarmasi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Radyofarmasötikler = Radiopharmaceuticals ; Teknesyum Tc-99m = Technetium Tc-99m ; Teşhis = Diagnosis ; İn vitro = In vitro ; İn vivo = In vivo

Özet:
Bu tezin amacı, erken evre küçük hücreli dışı akciğer kanseri tanısı için, hedef dokuda yüksek tutulum göstererek sintigrafik ayırımın iyi, hedef dışı dokudaki radyasyon hasarının düşük olacağı nükleer onkoloji hastalarında tanı amacı ile kullanılabilecek atezolizumab içeren nanopartiküler yapıda biyoradyofarmasötik geliştirmektir.
Bu amaçla, öncelikle çeşitli parametrelerin etkisi değerlendirilerek PLA/PVA nanopartikülleri hazırlandı ve formülasyonlar fizikokimyasal karakterizasyon ve yüzey ve morfolojik özellik analizlerinden sonra optimize edildi. Bu nanopartiküller, 6 ay boyunca 25±2 °C sıcaklık, % 60±5 bağıl nem içeren ve 40±2 °C sıcaklık, % 75±5 bağıl nem içeren stabilite kabinlerinde bekletilerek partikül büyüklüğü ve dağılımları ve zeta potansiyelleri açısından değerlendirildi.
Daha sonra, ideal özelliklere sahip formülasyon ile çalışıldı ve üç farklı hazırlama yöntemi kullanılarak (çözücü buharlaştırma, adsorbsiyon ve kovalent bağlanma) küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücrelerindeki PD-L1 ligandına aktif olarak hedeflemeyi sağlayabilmek için PLA/PVA nanopartiküllerin yüzeyi atezolizumab ile fonksiyonlandırılarak PLA/PVA/Atezolizumab nanopartikülleri hazırlandı. Hazırlanan PLA/PVA/Atezolizumab nanopartikülleri yükleme verimi, enkapsülasyon etkinliği ve hızlandırılmış stabilite çalışmaları açısından değerlendirildi ve en uygun hazırlama yönteminin çözücü buharlaştırma yöntemi olduğu tespit edilerek sonraki çalışmalarda bu yöntem ile hazırlanan PLA/PVA/Atezolizumab nanopartikülleri kullanıldı. Hazırlanan nanopartiküller, 99mTc radyonüklidi ile indirgen ajan olarak kalay klorür kullanılarak işaretlendi. Yapılan kalite kontrol çalışmaları sonucunda işaretleme verimlerinin %99'un üzerinde olduğu tespit edildi.
99mTc ile işaretlenen PLA/PVA/Atezolizumab nanopartikülleri ile in vitro kalite kontrol, sitotoksisite ve hücre kültürü çalışmaları yapıldı. 99mTc-PLA/PVA/Atezolizumab nanopartiküllerinin Tümör/Normal hücre tutulum oranları A-549 (küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücresi) ve L-929 (sağlıklı fibroblast hücresi) hücre hatları kullanılarak yapılan çalışmalar ile karşılaştırmalı olarak incelendi. Yapılan çalışmalar sonucunda geliştirilen formülasyonların kanserli hücrede sağlıklı hücreden daha yüksek bir tutulum gösterdiği tespit edildi. Alınan akım sitometri ve MTT analiz sonuçlarından, hücre hatlarında etkin bir biçimde tutuldukları ve sitotoksisite göstermedikleri görüldü.
Akciğer kanseri taşıyan nude farelerde gerçekleştirilen biyodağılım çalışmaları sonucunda, 99mTc ile radyoişaretli atezolizumab ile aktif hedefli nanopartikül formülasyonunun aktif hedefli olmayan nanopartikül formülasyona göre tümör dokusunda daha yüksek oranda tutulduğu (>14 kat) görüldü.
Tüm bu çalışmalar sonucunda geliştirilen formülasyonun (99mTc-PLA/PVA/Atezolizumab nanopartikülleri) sahip olduğu; uygun partikül boyutu (230,6±1,768 nm) ve dağılımı (0,163±0,036), zeta potansiyeli (-2,23±0,55 mV), yüksek antikor bağlanması (% 80,58), yüksek radyoişaretleme verimi (˃ % 99) ve stabilitesi, yüksek Tümör/Normal doku tutulum oranı (>14 kat) sebebiyle küçük hücreli dışı akciğer kanseri tanısında kullanımının ve akciğer kanseri hastalarında tedaviye verilen yanıtın değerlendirilmesinde umut vaad edici olduğu saptandı.

Abstract:
The aim of this thesis is to develop a nanoparticular bioradiopharmaceutical containing atezolizumab that can be used for the diagnosis of early stage non-small cell lung cancer in nuclear oncology patients with high involvement in the target tissue with good scintigraphic separation and low radiation damage in non-target tissue.
For this purpose, PLA/PVA nanoparticles were prepared by evaluating the effect of various parameters and the formulations were optimized after physicochemical characterization and surface and morphological property analysis. These nanoparticles were kept in stability cabinets containing 25±2 °C temperature, 60±5% relative humidity and 40±2 °C temperature, 75±5% relative humidity for 6 months and evaluated in terms of particle size and distributions and zeta potentials.
Then, the formulation with ideal properties was studied and PLA/ PVA/Atezolizumab nanoparticles were prepared to actively target the PD-L1 ligand in non-small cell lung cancer cells using three different preparation methods (solvent evaporation, adsorption and covalent binding). The prepared PLA/PVA/Atezolizumab nanoparticles were evaluated in terms of loading efficiency, encapsulation efficiency and accelerated stability studies and the most suitable preparation method was determined to be solvent evaporation method, and in subsequent studies, PLA/PVA/Atezolizumab nanoparticles prepared by this method were used. The nanoparticles were then labeled with 99mTc radionuclide using stannous chloride as the reducing agent. As a result of the quality control studies, it was determined that the labeling efficiency was over 99%.
In vitro quality control, cytotoxicity and cell culture studies were performed with 99mTc labeled PLA/PVA/Atezolizumab nanoparticles. 99mTc-PLA/PVA/Atezolizumab nanoparticles Tumor/Normal cell binding rates were compared with studies using A-549 (non-small cell lung cancer cell) and L-929 (healthy fibroblast cell) cell lines. As a result of the studies, it was found that the formulations developed in the cancerous cell showed more than the uptake of the healthy cell. It was seen from the flow cytometry and MTT analysis results that they were effectively retained in cell lines and did not show cytotoxicity.
As a result of biodistribution studies performed in nude male mice carrying lung cancer tumors, it was observed that active targeted nanoparticle formulation was more retained in tumor tissue than non-active targeted nanoparticle formulation (> 14 times).
The formulation developed as a result of all these studies has; suitable particle size (230.6±1.768 nm) and distribution (0.163±0.036) and zeta potential (-2.23±0.55 mV), high antibody binding (80.58%), high radiolabeling efficiency (99%) and stability, high Tumor/Normal tissue uptake ratio (>14 times) it was considered that 99mTc-PLA/PVA/Atezolizumab nanoparticles might be used in the diagnosis of non-small cell lung cancer and in evaluating the response to treatment in lung cancer patients was found to be promising.