Safran ekstratı olan krosetin'in baş-boyun kanser hücreleri üzerindeki etkisinin incelenmesi
Investigation of effect of crocetin extracted from saffron on head and neck cancer cell lines
Yazar: BİLGE KALYONCU
Danışman: DOÇ. DR. ESRA GÜNDÜZ
Turgut Özal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Genetik = Genetics ; Kulak Burun ve Boğaz = Otorhinolaryngology (Ear-Nose-Throat) ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Bitki özütü = Plant extract ; Genler-Bax = Genes-Bax ; Genler-Bcl-2 = Genes-Bcl-2 ; Kafa ve boyun neoplazmları = Head and neck neoplasms ; Krosetin = Crocetin ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Safran = Saffron ; Tıbbi bitkiler = Plants-medicinal

Özet:
Dünyada her yıl yaklaşık 12 milyon kişiye kanser tanısı konulmakta ve 7.6 milyon kişi kanserden yaşamını yitirmektedir. Yeni tedavi yöntemleri bulunmaması durumunda 2030 yılında dünya genelinde 26 milyon yeni kanser vakasına ve 17 milyon ölüme ulaşılacağı tahmin edilmektedir. Türkiye'de ise her yıl 200 bin yeni kanser vakasının ortaya çıktığını bilinmektedir. 
Baş boyun kanseri erken teşhis edilemediğinde tedavisi çok güç olan bir kanser türüdür ve diğer kanserlerden farklı olarak vücudun diğer bölgelerine metastazının yanısıra, bulunduğu bölgede de ciddi hasarlar oluşturur. Bu nedenle hastada fiziksel ve psikolojik olarak oldukça yıkıcı bir hastalıktır. Baş ve boyun kanserlerinin %30'unun sigara ve alkol kullanımı gibi spesifik faktörlere uzun süre maruz kalmayla yakın ilişkisi olduğu yapılan araştırmalarla ortaya konulmuştur. 
Krosetin; safrana rengini veren krosinin, kimyasal yapısının merkezini oluşturan doğal bir karotenoid dikarboksilik asittir. Çiğdem çiçeklerinde bulunur ve safrandan ekstrakte edilmektedir. 285°C'de ergiyen kırmızı kristaller oluşturur. Yapılan deneysel hayvan modellerinde ve hücre kültürü çalışmalarında, krosetin antitümör ajan olarak önemli bir potansiyel göstermiştir. Krosetin, antioksidan özelliğinden dolayı serbest radikalleri bağlayıcı etki göstermektedir. Ayrıca nükleik asit sentezini inhibe eder, büyüme faktörleri sinyal yolaklarını engelleyerek ve apoptozu indükleyerek kanser hücrelerinin büyüyüp gelişmelerini engeller. Krosetinin etkisi şu ana kadar, meme, serviks, kolorektal, akciğer, karaciğer, pankreas ve cilt kanserleri üzerinde araştırılmış ve her birinde çeşitli etkiler gözlemlenmiştir. Aynı zamanda krosetin, kan kolesterol seviyesini dolaylı olarak düşürür ve ateroskleroz şiddetini yani kalp krizi riskini azaltır. Bizim çalışmamızda krosetinin etkisi baş boyun kanserinde iki farklı yönüyle (tümör ve metastatik olmak üzere) incelenmiş aynı zamanda sağlıklı fibroblast (HUC-F) hücre hattı kontrol grubu olarak kullanılmıştır.  Literatürde ilk kez yapılmış olan bu çalışma ile baş boyun kanseri hücre hattında krosetinin etkisi ortaya konmuştur. Çalışmamıza en yakın olan diğer bir çalışma özefagus skuamoz kanseri üzerinde yapılmıştır. Bu çalışmada sadece tek bir kanser hücre hattında krosetinin etkisini inceleyen deneyler yapılmıştır. Sözkonusu çalışmada da bizim sonuçlarımızı destekleyici sonuçlar elde edilmiştir. 
Krosetin; özellikle kanser hücrelerinde apoptoza giden yolda etkili olan Bcl-2 ailesinin ekspresyonunu etkilemektedir. Proapoptotik gen olan Bax'ın ekspresyonunu artırıcı ve anti-apoptotik gen olan Bcl-2'nin ekspresyonunu inhibe edici etkisi saptanmıştır. Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) Bcl-2 gen ailesinde tanımlanan ve apoptozu regule eden proteindir. Bcl-2 geninde meydana gelen hasarın, prostat, meme ve cilt kanseri gibi bir dizi kanserin nedeni olduğu tespit edilmiştir. Bax geni Bcl-2 protein ailesinin ilk tanımlanan proapoptotik üyesidir. Bax geni ifadesi, tümör baskılayıcı protein olan p53 tarafından regule edilir bu nedenle Bax, p53 aracılı apoptozda yer alır. Hücre proliferasyonu ve apoptoz arasındaki homeostatik denge bozulduğunda kanserleşme başlar. Anti-apoptotik genlerin ekspresyonunun artması ve proapoptotik genlerin ekspresyonunun azalması kanserleşme ile sonuçlanabilir.
Bu çalışmada, daha önce yapılmış olan çalışmalardan farklı olarak; daha önce çalışma yapılmamış olan UT-SCC 74A (Baş boyun kanseri primer tümör hücre hattı), UT-SCC-74B(Baş boyun kanseri metastatik hücre hattı) ve kontrol grubu olarak HUC-F (fibroblast) hücre hatları üzerinde araştırma yapıldı ayrıca sadece proliferasyon değil, MTT, migrasyon, kaspaz3 aktivitesi analizleri yapıldı ve real time PCR analizi ile apoptoz ilişkili genler olan Bax ve Bcl-2'nin gen ekspresyonlarında meydana gelen değişiklikler incelendi. Diğer yandan Western Blotting ile krosetinin etkisini bu gen ürünlerinin proteinlerini görüntüleyerek ekspresyon farklıkları doğrulandı. Çalışmamız sonucunda baş boyun kanseri üzerinde krosetinin anti-tümör etkisinin gözlemlendi. Bu şekilde farklı kanser çeşitleri üzerinde de bu etkilerin incelenmesinin yolu açılmış oldu ve krosetin kemoterapi ilaçları ile birlikte yan etkileri azaltmak amacıyla kullanılabilir.

Anahtar Kelimeler: Krosetin, Baş-boyun kanseri, Metastaz, Bax, Bcl-2, Apoptoz

Abstract:
Every year worldwide 12 million people are diagnosed with cancer and 7.6 million people lose their lives to this disease.  If no significant progress has been made, it is estimated that in the year 2030 these numbers will rise to 26 million diagnoses and 17 million deaths annually. In Turkey alone, every year 200,000 new cases of cancer develop. 
The treatment of Head and Neck Cancer is difficult from other types of cancer if it is not early diagnosed. Head and neck cancer does metastasis into other organs as well as seriuos problems around face and head. So it causes physical and physicological problems on the patient. Head and neck cancer generally occurs because of drinking and smoking.
Crocetin is a natural carotenoid dicarboxylic acid. It is found in Crocus Sativus flowers and it used to make saffron extract.  It has a melting point of 285°C and forms red cyrstals. Crocetin has been shown to have significant anti-tumor potential in both in vitro (cell culture) experiments and in animal models. Saffron is a commonly used spice and is also used as a food coloring agent. In ancient Arab, Indian and Chinese cultures, saffron was used as an herbal remedy for a number of illnesses including cancer. Crocetin affects the growth of cancer cells by enhancing the anti-oxidant system, inhibiting the synthesis of nucleic acids, hindering growth factor signalling pathways and by inducing apoptosis. To date, it has been shown to have numerous effects on many types of cancer including those of the breast, cervix, colorectal, lung, liver, pancreas and skin. In particular, in cancer cells it affects the expression of Bcl-2 family genes which are involved in apoptosis. It was shown that the expression of the pro-apoptotic gene Bax was increased and expression of the anti-apoptitic gene Bcl-2 was inhibited.
Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) is a Bcl-2 family protein which regulates apoptosis. The damage which occur in Bcl-2 gene is responsible for prostate, breast and skin cancers. Bax was the first Bcl-2 familly protein to be identified as pro-apoptotic. Bax gene expression is upregulated by the tumor suppressor p53 and is involved in p53-mediated apoptosis. Cancer development results from a loss of homeostatic balance between cell proliferation and apoptosis.  
In our experiment, we investigated the antiproliferative effect of crocetin, which was extracted from saffron, and search for Bax and Bcl-2 genes' expression changes on primary and metastatic head and neck cancer paired cell lines. We used head and neck cancer primary tumor (74A) and metastatic(74B) cell lines and fibroblasts(HUC-F), investigated the poliferation, migration, cell cycle and apoptosis of crocetin treated cells. 
The cell lines were treated with different dosages of crocetin and their proliferation changes were recorded by using CELLigence device. The result of the different concentrations of crocetin on cell lines was showed an inverse proportion with proliferation.  After crocetin treatment on 74A, 74B and HUC-F cell lines for 24h, RNA isolations with following cDNA synthesis were performed of the crocetin treated 74A, 74B and HUC-F cell lines for 24h. mRNA expression changes of Bax and Bcl-2 genes were determined and compaired with control groups. For the first time we showed that crocetin treatment on 74A and 74B cell lines significantly increased mRNA expression and protein expression of Bax gene and significantly decreased mRNA expression and protein expression of Bcl-2 when compared with expression levels of mRNA and protein of HUC-F cells. When we compared the results of Real time PCR and western blotting, the changes of mRNA expression levels and protein expression levels are parallel to each other. The future studies should be continued on other cancer types and crocetin can be used with chemoterapic agents and may be obtained a better way to decraese side affects.

Keywords: Crocetin, Head and Neck Cancer, Metastasis, Bax, Bcl-2, Apoptosis