Geleneksel tekniklerle üretilen yoğurtlardan ve doğadaki bitkisel örneklerden yoğurt kültürlerinin izolasyonu identifikasyonu ve karakterizasyonu
Isolation, identification and characterization of yoghurt cultures from traditionally poduced yoghurts and natural plant samples
Yazar: HAKAN TAVŞANLI
Danışman: PROF. DR. RECEP ÇIBIK
Uludağ Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Besin Hijyeni ve Teknolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Besin Hijyeni ve Teknolojisi = Food Hygiene and Technology
Dizin: Bitkiler = Plants ; Lactobacillus delbrueckii = Lactobacillus delbrueckii ; Streptococcus = Streptococcus ; Yağmur = Rain ; Yoğurt = Yoghurt

Özet:
Tez çalışması geleneksel yöntemlerle üretilen yoğurtlardan, aynı zamanda bitki, yağmur suyu ve çiy damlalarından yoğurt üretilerek, üretilen yoğurtlarda doğal ortamda bulunan laktik asit bakterilerinin izolasyonu, tanımlanması ve suşların teknolojik karakterizasyonlarını belirlemek amacıyla yapıldı.  Bu amaç ile 100 adet geleneksel yöntemlerle üretilmiş yoğurt numunesi organoleptik özelliklerine bakılarak Ege ve Marmara bölgelerinin kırsal alanlarından toplandı.  Doğal kaynaklardan yoğurt bakterilerinin izolasyonu için farklı alanlardan toplanan 100 adet bitki, 100 adet yağmur suyu ve 100 adet çiy damlası sütün pıhtılaştırılması ve yoğurt üretimi için kullanıldı. Toplanan numunelerden bitki örneklerinin 17, yağmur suyu örneklerinin 20, çiy damlası örneklerinin ise 18 tanesinin sütü pıhtılaştırdığı gözlendi.
Pıhtının şekillendiği örneklerde yoğurt kıvam ve tadının oluşması için gerekli bakteri sayısına (107-108 kob/g) inkubasyonun 12. saatten sonra ulaşıldığı belirlendi.  Duyusal analizlerde örneklerin bir kısmının kabul edilebilir niteliğe sahip olduğu saptandı.  Temel biyokimyasal testlerle tanımlanan izolatların, matriks ile desteklenmiş lazer iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi (MALDI-TOF) ile tanımlanması neticesinde, geleneksel yöntemlerle üretilen yoğurtlardan 27 adet, bitki kullanarak pıhtılaştırılan sütlerden 3 adet, yağmur suyu ile pıhtılaştırılan sütlerden 8 adet ve çiy damlaları ile pıhtılaştırılan sütlerden 7 adet olmak üzere toplam 45 adet Lactobacillus delbrueckii suşu izole edildi.  Aynı şekilde, geleneksel yöntemlerle üretilen yoğurtlardan 42 adet, bitki kullanarak pıhtılaştırılan sütlerden 4 adet, yağmur suyu ile pıhtılaştırılan sütlerden 8 adet ve çiy damlaları ile pıhtılaştırılan sütlerden 12 adet olmak üzere toplam 66 adet Streptecoccus thermophilus suşu elde edilmiştir.
Tanımlanan suşların asidifikasyon, proteoliz, bakteriyoliz gibi teknolojik özellikleri ile antibiyotik dirençlilik profilleri de çalışmanın bir parçası olarak değerlendirildi.  Suşların asidifikasyon özellikleri; laktoz ile zenginleştirilmiş tamponlu sıvı besiyerinde ve yağsız süt tozundan hazırlanmış ortamda 24 saat boyunca pH'daki değişim olarak ölçülmüştür. Geleneksel yoğurt, bitki, yağmur suyu ve çiy damlasından elde edilen suşların yeniden yapılandırılmış yağsız süt tozunda zamana bağlı olarak pH değeri ortalamaları incelendiğinde her iki yoğurt bakterisi için 2. saatler arasındaki farklılık istatistikî açıdan    ( p < 0,01) önemli bulunmuştur.
Suşların proteolitik aktiviteleri ve laktoz kullanımları FSD Agar (Fast Slow Differention Agar) belirlendi.  L. delbrueckii suşlarının 17 tanesi (% 38) kuvvetli, 12 tanesi (% 26) orta ve 16 tanesi (%37) zayıf proteolitik aktivite gösterirken S. thermophilus suşlarının 9 tanesi (% 14) kuvvetli, 26 tanesi (% 39) orta ve 31 tanesi (% 47) zayıf proteolitik aktivite gösterdi.
Baktyeriyolizis yoğurt oluşumunda asidifikasyonu kısıtladığından dolayı yüksek bakteriyolitik özelliğe sahip suşlar tercih edilmemektedir.  Çalışmamızda suşların bakteriyolitik özellikleri tamponlanmış potasyum fosfat ortamında türbidimetrik olarak belirlendi. Bakteriyolizisin suşa göre değişkenlik gösterdiği ve L. delbrueckii suşlarının 2. saatin sonunda bakteriyolitik hız olarak % 3 ile 35 arasında değişen liz oranı gösterdikleri 24 saatin sonunda ölçülen son bakteriyoliz noktasının ise % 18 ile 95 arasında değiştiği gözlendi. S. thermophilus suşlarının da benzer şekilde suşa bağlı değişkenlik gösterdiği ve 2 saatte % 3-42 oranında bakteriyolitik hız gösterdikleri saptandı.  Bakteriyolizisin son noktası olarak ise laktobasillere nazaran nispeten daha düşük bir seviyede kaldı ve % 16 ile 76 arasında değiştiği görüldü.
Suşların antibiyotik dirençlilik profilleri disk difüzyon yöntemine göre belirlendi.       L. delbrueckii suşlarının tamamı quinupristin/dalfopristin, tetrasiklin ve kloramfenikole duyarlılık gösterdi.  Sekiz suşun tüm antibiyotiklere duyarlı olduğu, 21 suşun sadece bir antibiyotiğe direnç gösterdiği ve çoklu direnç profili olarak da 1 suşun 7 adet antibiyotiğe dirençli olduğu belirlendi.  S. thermophilus suşlarının 8 tanesinin kullanılan 14 antibiyotiğin tamamına duyarlı olduğu, 3 adedinin ise sadece 1 antibiyotiğe dirençli olduğu saptanmıştır. Ayrıca 45 suşun gentamisine, 43 suşun streptomisine, 40 suşun eritromisine dirençli oldukları tespit edildi.  Çoklu antibiyotik dirençliliği olarak değerlendirildiğinde 31 adet (% 47) suşun 6 ve daha üzeri antibiyotiğe direnç gösterdiği saptanmıştır.
Sonuç olarak bu doktora tez çalışmasında geleneksel yöntemlerle üretilmiş yoğurtlardan, bitkilerden direk olarak ya da yağmur suyu ve çiy damlaları gibi doğal kaynaklardan L. delbrueckii ve S. thermophilus suşlarının izolasyonu ve identifikasyonu gerçekleştirildi.  Elde edilen suşların süt endüstrisinde yoğurt yapımında starter kültür olarak kullanılabilirliklerine ilişkin bazı temel testler de gerçekleştirilse de daha detaylı çalışmalar ile suşların karakterizasyonunun ve yoğurt fermantasyonuna ilişkin uygunluklarının belirlenmesi gerekmektedir.

Abstract:
The present Ph D thesis outlines the isolation and identification of lactic acid bacteria, particularly yoghurt bacteria Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus from natural environments such as traditionally produced homemade yogurts, plants collected from the wild environment, rainwater washed plants and from dew drops in spring time.  For this aim, a total of 100 yoghurt samples were selected for their organoleptic properties from villages in a relatively extended geographical area in Marmara and Aegean regions.  One hundred samples from each of plants, rainwater washed plants and dew drops were also collected from the same regions.  Thereafter, these last samples were tested for their milk clotting properties after inoculation into pasteurized milk.  17 of plants samples, 20 of rainwater samples and 18 of dew drops samples were able to coagulate milk after incubation process.  
In the samples where the clotting formed, the number of lactic acid bacteria reached to desired level after 12 h incubation (107-108 cfu / g), and typical yoghurt consistency and taste were observed in some samples.  Even, some of the samples exhibited acceptable quality level by sensorial analyses.  Isolated bacteria were then identified by basic biochemical tests and matrix- assisted lazer ionization time of flight, mass spectrometry (MALDITOF-MS) analysis and 45 isolates were confirmed as L. delbrueckii ssp. 27 of isolates were from traditionally produced yoghurts, 3 from plants, 8 from rainwater washed plants and 7 from drew drops.  Moreover, 66 strains of S.thermophilus were identified by the same technique, of which, 42 were from naturally produced yogurts, four from plants, eight from rainwater washed plants and 12 from dew drops.  
Some technologically important properties of strains such as acidification, proteolysis, bacteriolysis as well as antibiotic resistance profiles were assessed as a part of the study. Acidification the strains was measured as the change in pH in buffered medium and reconstituted skim milk after incubation for 24 hours.  Statistically important difference was observed between lactobacillus and streptococcus strains in term of their acidification at 2. h of incubation (p < 0.01).
Proteolytic activity and lactose utilization of the strains were determined on FSD Agar (Fast Slow DifferentialAgar).  Strong [17 lactobacillus (38 %), 9 streptecoccus (14 %)], moderate [12 lactobacillus (26 %), 26 streptecoccus (39%)] and weak [16 lactobacillus (37%), 31 streptecoccus (47%)] level of proteolytic activity were noted for strains. 
Higher bacteriolytic property exhibiting strains are not preferred in yogurt production because of the retardation of acidification which is the main step in yoghurt production. Bacteriolysis which is a strain dependent character was measured turbidimetrically in potassium phosphate buffer.  The rate of bacteriolysis as measured at 2. h of incubation was found to vary between 3 and 35% and its extend varied between 18 and 95% after 24 h incubation for L. delbrueckii. For S. thermophilus, the rate varied between 3-42%, and the extend varied between16 and 76%. This provides evidence that lactobacilli have higher bacteriolysis compared to streptococcus.  Antibiotic resistance profile of strains was determined by the disk diffusion method.  L. delbrueckii strains were susceptible to quinupristin / dalfopristin, tetracycline and chloramphenicol and 21 strains were shoved resistance to only one antibiotic.  On the other hand, eight strains were sensitive to all tested antibiotics.  One strain showing multi-drug resistance profile was determined to be resistant to 7 different antibiotics.  As for the streptococcus strains, eight of which were sensitive to all tested antibiotics, and three were resistant to only one antibiotic.  The resistance to gentamicin (45 strains), streptomycin (43 strains) and erythromycin (40 strains) was very common among the strains.  Interestingly, multiple antibiotic resistances were also quite common and 31 strains (47%) showed resistance to 6 or more antibiotics.
As a result, L. delbrueckii and S. thermophilus have been isolated from a range of natural sources such as traditionally produced yogurts, plants, rainwater washed plants and dew drops.  Some technologically important characters of the strains were also determined. The probable use of these strains in dairy technology as starter requires some additional tests and manufacturing trials.