Imatinib mesilat-dirençli ve dirençsiz kronik myeloid lösemi hücre hatlarında bim ve bid proapoptotik genlerinin polikomb grup proteinleri tarafından epigenetik regülasyonu
Epigenetic regulation of bim and bid proapoptotic genes by polycomb group proteins in imatinib mesylate resistant and non-resistant chronic myeloid leukemia cell lines
Yazar: SÜREYYA BOZKURT
Danışman: PROF. DR. ASUMAN SUNGUROĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Metilasyon = Methylation ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İmatinib mesilat = Imatinib mesilat

Özet:
Bu projenin amacı; KML blastik fazda görülen imatinib mesilat dirençliliği üzerine Bim ve Bid proapoptotik genlerinin etkilerinin araştırılmasıdır. Bu sebeple Bim ve Bid genlerinin epigenetik olarak regüle edilip edilmediği incelenmiştir. Bim ve Bid proapoptotik genlerinin promotor metilasyon durumları ve bunun üzerine PRC4 kompleks proteinlerinin etkileri araştırılmıştır.Çalışmada imatinib mesilat dirençli K-562/IMA-3 hücre dizisi ile İmatinib dirençli olmayan K-562 hücre dizilerinde PRC4 kompleksinde yer alan EZH2, EED2, SUZ12, SIRT1 genleri ile proapoptotik genler olan Bim ve Bid'in mRNA seviyeleri belirlenmiştir. H3K27 üçlü metilasyonu yapan EZH2'nin, Bim ve Bid genlerine bağlanıp bağlanmadıkları ve bu genlerin H3K27 üçlü metilasyon modifikasyonu ChIP deneyi ile araştırılmıştır. Daha önce yapılan çalışmalar ile özellikle EZH2 ve SIRT1'in bağlandığı bölgeye DNMT enzimlerini çekme yolu ile ilgili genlerin promotor metilasyonuna yol açtığı ve gen ifadelerini epigenetik olarak susturduğu gösterildiğinden, Bim ve Bid genlerinin metilasyon durumu MSP-PZR ile belirlenmiştir. Ayrıca her iki hücre dizisinin taşıdığı sitogenetik anomaliler Giemsa bantlama (GTG) metodu ile belirlenmiş ve karşılaştırılmıştır.Araştırma sonunda PRC4 grubuna ait proteinlerin iki hücre hattında da ifade edildiği eş-zamanlı PZR ile belirlendi. Ancak beklenilenin tersine K-562/IMA-3 hücrelerinde Imatinib duyarlı olan K-562 hücrelerine göre PRC4 genlerinin ifadeleri daha düşük, Bim ve Bid genlerinin ifadeleri ise daha yüksek bulundu.ChIP deneyleri sonucunda ise her iki hücre hattında Bim geninin promotorunun kromatin bölgesinde PRC4 protein grubu üyesi olan EZH2 enziminin ve DNMT1 enziminin bağlı olduğu bulundu. Ayrıca her iki hücre hattında EZH2 tarafından yapıldığı düşünülen H3K27me3 modifikasyonu da belirlendi. Imatinib duyarlı K-562 hücrelerinde yapılan ChIP deneyleri sonucunda ise Bid geni promotor bölgesine EZH2 ve DNMT1 enzimleri bağlı bulundu ve Bid promotorunda H3K27me3 modifikasyonu tespit edildi.Imatinib mesilat direnci geliştirilmiş K-562/IMA-3 hücrelerinde ise Bid geni promotoruna EZH2 ve DNMT1 enzimleri bağlı bulunmadı. Ve genin kromatin bölgesinde ise H3K27me3 modifikasyonunu tespit edildi. Bir diğer ChIP deneyi sonucuna göre ise Imatinib mesilat direnci geliştirilmiş K-562/IMA-3 hücrelerinde Bim geninin promotoruna EZH2 ve DNMT1 bağlı bulundu. ve H3K27me3 modifikasyonu tespit edildi. Yapılan MS-PZR deneyleri sonucunda ise Bim ve Bid genlerinin promotor bölgesi homozigot olarak metillenmemiş bulundu.Bu araştırmada yapılan deneyler sonucunda Imatinib mesilat direnci geliştirilmiş K-562/IMA-3 hücre hattında ilaç dirençliliğinde rol oynadığını düşündüğümüz apoptoz direncinde Bim ve Bid genlerinin epigenetik olarak modifiye edilmelerine rağmen direkt olarak bir rol oynamadığını söyleyebiliriz.Anahtar Sözcükler: DNA metilasyonu, Histon modifikasyonları, kanser epigenetiği, KML, PcG proteinleri.

Abstract:
The aim of this study is to investigate the effects of the Bim and Bid proapoptotic genes on Imatinib mesilat resistance in which seen CML blastic phases. For this purpose, it was investigated that whether Bim and Bid genes are regulated as epigenetically. The promoter methylation status of the Bim and Bid proapoptotic genes and the effects of the PRC4 protein complex on it were investigated.In this study, mRNA levels of EZH2, EED2, SUZ12, SIRT1 genes which belongs to PRC4 complex and Bim and Bid proapoptotic genes were determined in the Imatinib mesilate resistant K-562/IMA-3 cell lines and the non-resistant K-562 cell lines. Additionally, whether EZH2 protein which cause H3K27 trimethylation bind to Bim and Bid genes or not and H3K27 trimethylation modification of this genes were searched by ChIP assays.It was shown that the EZH2 and SIRT1 may cause promotor methylation of related genes via taking the enzyme of the DNMT to its bounded region and cause to silence of the genes as epigenetically in the previous studies. For that reason the methylation status of the Bim and Bid genes were determined by specific PCR technique. Cytogenetic anomalies of the cell lines were determined by the Giemsa banding tecnique (GTG) and compared with each other.It was detected that the proteins that belong to group of the PCR4 expressed in the both cell lines by the real time PCR technique. Despite to our expectation the expression of the PRC4 genes were deteced at lower level and the expression of the Bim and Bid genes were detected at higher lever in the K-562/IMA-3 cells than imatinib non-resistant K-562 cells.It was founded from CHIP experiment that the E2H2 enzyme which is belong to PRC4 protein family bounded to the DNMT1 enzyme in the promoter region of the BİD genes in the both cell lines. Furthermore, the modification of H3K27me3, thought ınduced by the EZH2 have been detected in the both cell lines. Additionally the modification of the H3K27me3 in the promoter region of Bid genes and linkage between the EZH2 and DBNT1 enzymes and the promoter region of the the Bid was detected at the end of the study.The EZH2 and DNMT1 enzymes were not founded as bounded to the promoter region of the Bid gene in the imatinib resistant K-562/IMA-3 cell lines. And a H3K27me3 type modification was detected in the promoter region of the gene. Beside this, according to result of CHıP experiment, The EZH2 and DNMT1 enzymes were not founded as bounded to the promoter region of the Bim gene in the imatinib resistant K-562/IMA-3 cell lines. And a H3K27me3 type modification was detected. As a result of RT-PCR experiments the promoter region of the Bid and Bim genes were founded as homozygous methylated.As a result of experiments made it can be postulated that the Bid and Bim genes are not take a role in the resistance of apoptosis which lead to drug resistance in the imatinib resistant K-562/IMA-3 cell lines.Key Words: DNA methylation, histon modifications, cancer epigenetics, CML, PcG proteins