Deneysel alkali yanık modelinde amnion zarı implantasyonu ve kollajen crosslinking işleminin inflamasyon, neovaskülarizasyon ve ülserasyon mekanizmaları üzerine etkisinin karşılaştırılması
The comparison of amniotic membran implantation and collagen crosslinking treatment's effect on inflammation, neovascularization and  ulceration mechanisms with experimental model of alkali burn
Yazar: SEVGİ SUBAŞI
Danışman: PROF. DR. ÖZGÜL ALTINTAŞ
Kocaeli Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Amnion = Amnion ; Göz = Eye ; Kazalar = Accidents ; Kornea = Cornea ; Neovaskülarizasyon = Neovascularization ; Transplantlar = Transplants ; Yanıklar = Burns ; Yanıklar-kimyasal = Burns-chemical ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries ; Ülser = Ulcer

Özet:
Amaç ve Kapsam: Alkali yanık tedavisinde stromal erime, inflamasyon ve neovaskülarizasyonu  engellemek amacıyla akut dönemde uygulanabilecek yeni bir tedavi önerisi olarak CXL tedavisinin etkisinin amnion zarı implantasyonuyla klinik ve histolojik olarak karşılaştırılması amaçlanmıştır. Aynı zamanda , alkali yanığın hücre içi mekanizalarını protein analizi ile tanımlamak ve uyguladığımız tedavilerin bu mekanizmalara etkisini aydınlatmak amacıyla proteomiks analizi yapılmıştır.
Gereç ve Yöntem : 32 adet  Avustralya-Yeni  Zelanda Irkı  erkek tavşanın sağ göz santral kornelarına 1N NaOH emdirilmiş  8mm çaplı Watman filtre kağıtları  uygulanarak alkali yanık modeli oluşturuldu. Model ardından denekler Kontrol grubu, Amnion implantasyon grubu ,Crosslinking grubu ve Amnion +Crosslinking grubu olarak sekizerli dört gruba ayrıldı. Tüm deneklerin  7. gün,14.gün ve 18. gün epitelyal iyileşme , opasifikasyon , ülserasyon ve neovaskülarizasyon değerlendirilmesi amacıyla ön segment optik koherans tomografi ve ön segment kornea fotoğrafları çekildi. 21. Gün denekler sakrifiye edilerek korneaları limbus sınırından alındı. Santralden iki parçaya bölünerek yarısı histolojik ve immünohistokimyasal amaçla incelenmek üzere histoloji laboratuvarına ve diğer yarısı proteomiks yapılması amacıyla proteomiks laboratuvarına verildi.
Bulgular: Epitelyal iyileşme açısından tedavi gruplarında son vizitte en iyi sonuç CXL grubunda alınmıştır.(p=0.013) Stromal ödem ve neovaskülarizasyon açısından gruplar arasında istatistiksel anlamlı fark gözlenmemiştir.(p= 0.183,0.053)Opasite açısından da gruplar arasında istatistiksel anlamlı fark görülmemiştir. (p=0.303) Ülserasyon değerlendirmesinde CXL grubunda hiçbir denekte ülserasyon saptanmamıştır. İnflamasyon açısından makrofaj markeri olan CD68 immünohistokimyasal değerlendirmesinde istatistiksel olarak anlamlı düzeyde  farklılık olduğu görülmüştür. (p= 0.001). Gruplar arasındaki istatistiksel farkı oluşturan CXL grubu ile kontrol grubu arasında (p= 0.001) ve CXL+Amnion ile kontrol grubu arasındaki farktır.(p=0.039) Stromal apoptozun göstergesi olan TUNEL pozitif hücre sayısı  açısından gruplar arasında istatistiksel anlamlı fark mevcuttur(p= 0.020).Farkı yaratan ise CXL grubu ile kontrol grubu arasındaki değişimlerdir (p= 0.044). 
   Yapılan MALDI /TOF-TOF analizi sonuçlarına ve IPA analizine  göre alkali kornea hasarında korneal pentoz fosfat yolağında bozulma olduğu gösterilmiştir. Yanık sonrası keratin tip 2 sitoskeletal 1 düzeylerinde ciddi bir up regülasyon ve PHF finger protein düzeylerinde ciddi bir down regülasyon görülmüştür. Amnion implantasyonunun en belirgin bulgusu PHF ve transketolaz düzeylerindeki yükselme ve keratin tip2 sitoskeletal 2 düzeylerindeki azalma olduğu görülmüştür. CXL grubunda en önemli değişim ise PHF ve Transketolaz düzeylerindeki amniona benzer yükselmeyle birlikte amniondan farklı olarak  GAPDH , S100 A11 düzeylerindeki artıştır. CXL+Amnion grubunda tedavilerin ayrı ayrı toplamlarına yakın bulgular mevcuttur. PHF düzeyinde 53 katlık bir upregülasyon dikkat çekicidir. GAPDH , S100 A11 ve transketolaz düzeylerinde  de artış mevcuttur.
Sonuç: CXl tedavisi alkali yanık tedavisinde akut dönemde kullanımı reepitelizasyon, inflamasyonun azaltılması ve ülserasyonun engellenmesi açısından umut vadetmektedir. Amnion zarı implantasyonu tedavisinin  ise akut dönem yerine inflamasyon baskılandıktan sonra uygulanmasının daha efektif etkili olacağı düşünülmüştür. Amnion implantasyonunun optimum zamanlaması konusunda ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
PURPOSE: We aimed  to show the effect of CXL treatment on inflammation, neovascularization and ulceration mechanisms related the acute alkali burn and to comparison with amniotic membran implantation. And also  we aimed to show the effect of alkali burn and treatments on intracellular mechanisms .
METHOD : The right corneas  of twenty two  New Zelland rabbits were burned using a 8mm Wathman filter paper with  1N solution of NaOH and the animals were then divided into four groups: Control group submitted to clinical treatment alone, an amnion implantation group that was  treated 1 h after injury with amniotic membran implantation , a crosslinking group that was treated 1 h after injury with CXL and an amnion implantation +CXL  group that was  treated 1 h after injury with CXL and amniotic membran implantation respectivelly. All groups were followed by the same clinical treatment as administered to the controls. Clinical parameters were evaluated post-injury at 1, 7, 14, and 18 days by two independent observers. Following this evaluation, the corneas were excised in 21. days and examined histologically and proteomic analyses.
RESULTS: The best results in terms of epithelial healing were in the CXL group.(p=0.013). There were no statistically significant differences in stromal edema, opacity and neovascularization, respectively (p=0.183,0.303,0.053). In evaluation of ulceration in the  CXL group there was no ulcerated cornea. In the evaluation of inflamation, a macrophage marker (CD68) were used and were found to be statistically significant differences. (P = 0.001). Difference between CXL group and the control group (p = 0.001) and the difference  between the CXL + Amniotic with the control group (p = 0.039) were responsible from  statistical difference between groups.Terms of the number of stromal TUNEL-positive cells which are indicators of apoptosis has a statistically significant difference (p = 0.020), Difference  between CXL group and the control group (p=0.044) was responsible from  statistically  difference
   
         MALDI-TOF/TOF and IPA anlyses had shown degradation in corneal pentose  phosphate  pathway. Up regulation of keratin type 2 cytoskeletal 1 and down regulation of PHF finger protein were realized after injury. The most obvious contribution of amnion implantation was increase of the levels of  transketolase and PHF finger protein and decrease of the levels of keratin type2 cytoskeletal 2 when it was compared with control group. The most significant change in the CXL group were increase of the levels of  transketolase and PHF finger protein like amnion implantation group and decrease of the levels of GAPDH , S100 A11 unlike amnion implantation grup when it was compared with control group. Amnion+ CXL group had the highest increase  in the level of PHF and this group had increased levels of GAPDH , S100 11 and transketolase  when it was compared with control group. 
      CONCLUSION: CXL treatment seems useful for  reepithelialization, reducing inflammation and preventing ulceration in acute alkali burn treatment. The implantation of amniotic membrane treatment is thought to be more effective implementation after supressing  of acute inflammation. There is need for further studies on the optimal timing of the implantation of amniotic  membrane.