İnsan Kemik Morfogenetik Protein 2'nin (BMP2) rekombinant olarak üretilmesi, biyokimyasal karakterizasyonu ve biyolojik aktivitelerinin araştırılması
Recombinant expression, biochemical characterization and biological activities of the Human Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2)
Yazar: YASİN AYDIN
Danışman: PROF. DR. İSA GÖKÇE
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Kemik Morfogenetik Proteinler (BMP), Transforme Edici Büyüme Faktöreleri β (TBFβ) süperfamilyasına mensup multifonksiyonel büyüme faktörleridir. BMP'ler temelde kıkırdak ve kemik gelişimde önemli rol oynamaktadır. Bu proteinler mezenkimal hücrelerin osteogenik hücrelere farklılaşmasını ve embriyonik ve postnatal dönem hücre proliferasyonunu uyarırlar ve yetişkin dönem kemik homeostasisinde önemli rol oynarlar. İnsan rekombinant BMP2 (rhBMP2) ise, ortopedik tedavilerde ve dişçilik alanında sıklıkla kullanılan kilinik ve ticarî açıdan önemli bir terapötik proteindir. BMP2 proteini E. coli ekspresyon sistemlerinde ifade edildiğinde büyük oranda inklüzyon cisimcikleri şeklinde çözünür olmayan bir forma dönüşerek agregasyona uğramaktadır. Bu çalışmada, rhBMP2 proteininin ilk başta Süperfolder Yeşil Floresan Protein (sfGFP) ile füzyon şeklinde E. coli BL21(DE3) pLysE hücrelerinde ekspresyonu sağlanmıştır. Sonrasında farklı şaperon proteinlerini ifade eden pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2 ve pTf16 plazmitleri ile E. coli BL21-AI hücrelerinde ko-ekspresyon gerçekleştirilmiştir. Yapılan ölçümler neticesinde ko-ekspresyon için optimum faydanın sağlandığı tig şaperonu üreten pTf16 plazmiti tercih edilmiştir. Yüksek saflıkta ve doğru katlanmış protein eldesi için ayrıca bazı alternatif yeniden katlama işlemleri uygulanmıştır. Sonuçta sfGFP-rhBMP2 füzyon proteini 6xHis- etkiketi ile nikel bazlı afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılmış ve sonrasında SDS-PAGE yöntemi ile kalitatif analizi yapılmıştır. Optimum koşullarda elde edilip saflaştırılan sfGFP-rhBMP2 proteini insan osteosarkoma-2 (Saos-2) hücreleri üzerinde test edilerek hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
Bone Morphogenetic Proteins (BMP) are multifunctional growth factors belonging to the Transforming Growth Factors β (TBFβ) superfamily. BMPs basically play an important role in cartilage and bone development. These proteins are effective in stimulating the differentiation of mesenchymal cells into osteogenic cells. They are also effective in cell proliferation and functions in the embryonic and postnatal period, and in bone homeostasis in the adult period. BMP2 is a clinically and commercially important protein that is frequently used in orthopedic treatments and dentistry. When expressed in E. coli expression systems, the human recombinant BMP2 (rhBMP2) protein transform into an insoluble form, largely in the form of inclusion bodies, than undergo aggregation. In this study, rhBMP2 protein was initially expressed in E. coli BL21(DE3) pLysE cells as a fusion with Superfolder Green Fluorescent Protein (sfGFP). For higher production efficiency, co-expression was performed in E. coli BL21-AI cells with plasmids pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2 and pTf16 using a system containing five different chaperone plasmids. As a result of the measurements, the pTf16 plasmid, which produces the tig chaperone with optimum benefit for co-expression, was preferred. Alternative refolding processes were also applied to obtain a high purity and correctly folded product. Ultimately, the sfGFP-rhBMP2 fusion protein was purified with the 6xHis-tag using nickel-based affinity chromatography and then qualitatively analyzed by SDS-PAGE method. Cell culture studies were carried out by testing sfGFP-rhBMP2 protein, which was obtained and purified under optimum conditions, on human osteosarcoma-2 (Saos-2) cell lines.