Trombosit gamma-glutamil transferazının prooksidan etkisinin incelenmesi
The investigation of prooxidant role of platelet gamma-glutamyl transferase
Yazar: ÖZGE DAĞDEVİREN ÇEVİK
Danışman: DOÇ. DR. AZİZ ŞENER
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Hematoloji = Hematology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Transferrin = Transferrin

Özet:
Son yıllarda yapılan çalışmalar hücrede ekstraselüler ortamda bulunan glutatyonun (GSH) gamma-glutamil transferaz tarafından yıkılımı sırasında demir gibi geçiş metallerinin varlığında reaktif oksijen türlerinin (ROT) oluşumuna neden olabildiğini göstermektedir. Çünkü GSH'ın GGT aracılı yıkımı sırasında çok güçlü indirgeyici yeteneğe sahip olan sisteinilglisin oluşur. Bu çalışmada demir ve transferrin varlığında GGT aracılı demir indirgenmesi; trombositlerde oksidatif modifikasyonlara, hücre içi antioksidan düzeylerine ve trombosit apoptozisine muhtemel etkisinin var olup olmadığını araştırmak amaçlanmıştır.Çalışmamızda izole trombositler kullanıldı. Lipid peroksidasyon ve protein karbonil içerikleri demir ve transferrin varlığında GGT aktivitesi inhibe edildikten (akivisin and L-serin/borik asit karışımı ) veya GGT aktivitesi uyarıldıktan (GSH, glisilglisin) sonra araştırıldı.Trombosit kaspaz-3, glutatyon peroksidaz (GPx) aktiviteleri ve GSH içerikleri GGT substratları ve/veya inhibitörleri ile 1 saat inkübasyon sonrası tayin edildi. Trombosit GGT aktivitesinin uyarılması ve inhibisyonu, trombosit erken ve geç apoptozisine etkileri Anneksin ?V ve Propidyum İodid kullanılarak flov sitometrik olarak ölçüldü.Bulgularımızda demir ve transferrin varlığında GGT aktivitesi uyarılan trombositlerin lipid peroksidasyon ve protein oksidasyon düzeylerinde, GGT aktivitesi inhibe edilen trombositlere göre anlamlı artışlar bulundu. Ortamda demir ve transferrin varken GGT aktivitesi uyarılan trombositlerin GSH içerikleri azalırken, aynı grubun GPx düzeyleri GGT aktivitesi inhibe edilen gruba göre anlamlı olarak arttı. Grupların kaspaz-3 düzeyleri arasında anlamlı farklılık gözlenmedi. Bununla birlikte erken apoptoz ve aktivasyon göstergesi olan fosfatidil serinin hücre iç membranından dışına hareketi, GGT aktivitesi uyarılan trombositlerde inhibe edilen trombositlere göre daha yüksek bulundu. Transferrin grubunda GGT aktivitesinin uyarılması trombositlerde geç apoptozun artışına neden oldu.GGT aktivitesi/GSH/demir veya transferrin sistemleri trombositlerde oksidatif modifikasyonları ve trombosit erken apoptozisini indükleyebilir. Böylece, trombosit GGT aktivitesi ortamdaki ROT'ların artışına katkıda bulunabilir.Anahtar Kelimeler: Apoptozis, Demir, Gamma-glutamil transferaz, Glutatyon, Oksidatif değişiklikler, Transferrin, Trombosit.

Abstract:
Recent experimental studies indicate that extracellular cleavage of glutathione (GSH) by gamma-glutamyl transferase (GGT) may also be involved in the generation of reactive oxygen species (ROS) in the presence of iron or other transition metals. That is because the cleavage of GSH by GGT gives rise to the thiol dipeptide cysteinylglycine, whose?SH group is provided in particular with a much stronger iron-reducing ability. The present study was aimed to verify the possibility that platelet GGT mediated iron reduction may initiate oxidative modifications and apoptosis?activation on platelets in the presence of free iron or transferrin.In this study, isolated platelets were used. Lipid peroxidation and protein carbonyl contents in platelet crude membrane were investigated after inhibiting platelet GGT activity with or without two inhibitors (acivicin and L-serine/boric acid complex) and stimulating platelet GGT activity with its substrates (GSH, glycylglycine) in the presence of iron or transferrin. Caspase-3 activity, GSH contents and glutathione peroxidase (GPx) of platelets were determined after incubating for 1 hour with GGT substrates and/or inhibitors. The effects of inhibition and stimulation of platelet GGT activity on early and end stage apoptosis in platelets were measured using flow cytometry with annexin V and propidium idodide (PI).The resulting data showed a significantly higher levels of lipid peroxidation and protein oxidation in the GGT activity-stimulated platelets in comparison with the GGT activity-inhibited platelets in the presence of iron or transferrin. While GSH contents of GGT activity-stimulated platelets in the presence of iron or transferrin were significantly reduced, GPx levels of the same group were increased compared to GGT activity-inhibited groups. No significant difference was observed between caspase-3 activities of the platelets of each group in the presence of iron and transferrin. However, phosphotidyl serine (PS) externalization, a marker of early apoptosis and activation, in GGT activity-stimulated platelets were increased compared to the GGT activity-inhibited platelets. In the presence of transferrin not iron, platelet end stage apoptosis of GGT activity-stimulated platelets was increased compared to GGT activity-inhibited groups.Platelet GGT activity/GSH/iron or transferrin systems can induce oxidative modifications and PS externalization on human platelets. Thus, platelet GGT activity may contribute to the increase of ROS in its microenviroment.Key words: Apoptosis, Gamma-glutamyl transferase, Glutathione, Free iron, Oxidative modifications, Platelets, Transferrin.