Acinetobacter baumannii izolatlarında virülans faktörleri ve antimikrobiyal direnç profilleri ile ilişkisi
The relationship between the virulence factors of acinetobacter baumannii isolates and the antimicrobial resistance profiles
Yazar: NİLÜFER UĞUR ÖZLÜK
Danışman: PROF. DR. CANAN KÜLAH
Bülent Ecevit Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Acinetobacter baumannii = Acinetobacter baumannii ; Acinetobacter baumannii = Acinetobacter baumannii ; Enfeksiyon = Infection ; Galleria mellonella = Galleria mellonella ; Virülans = Virulence ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Amaç: Fırsatçı patojen olan Acinetobacter baumannii'nin son yıllarda yapılan çalışmalarda, daha dirençli ve virülan hale gelerek temel nozokomiyal bir tehdit oluşturduğu gösterilmiştir. Farklı birtakım mekanizmalar kullanarak birçok antibiyotik grubuna karşı direnç geliştirebilen A.baumannii'de gelişen bu direnç beklenmeyen fizyolojik, fenotipik ve genotipik değişikliklere neden olabilmektedir Antibiyotiklere karşı oluşan adaptasyon sürecinde, antibiyotik direnci kazanmış bakterinin virülans özelliklerinde azalma olduğunu gösteren çalışmalar bulunmaktadır. Bakteriye ait bugüne kadar az sayıda virulans faktörü tanımlanmış olup, bu faktörler ile duyarlı ve dirençli A.baumannii suşları arasındaki ilişkinin araştırıldığı çalışma sayısı sınırlıdır ve sonuçlar henüz netleşmemiştir. Bu çalışmada A.baumannii izolatlarının virulans özelliklerinin, ilaçlara karşı direnç durumuyla karşılaştırılarak incelenmesi ve yeni geliştirilecek anti-virülans tedavi stratejileri için yol gösterici olması hedeflenmiştir.
Gereç ve yöntem: Çalışmaya, laboratuvarımıza 2005-2007 tarihleri arasında gönderilen klinik örneklerden izole edilen, daha önceki yıllarda farklı çalışmalarda kullanılmış olan 18 izolat ile Ocak 2015 -Aralık 2015 tarihleri arasında laboratuvara rutin olarak gönderilen çeşitli klinik örneklerden izole edilen 12 izolat, toplamda 30 Acinetobacter baumannii izolatı olacak şekilde dahil edilmiştir. Antibiyotik duyarlılık testleri, Clinical and Laboratory Standarts Institute (CLSI) önerileri doğrultusunda, Kirby Bauer disk difüzyon yöntemi ile yapılmıştır. İzolatlar antibiyotik duyarlılık test profillerine göre üç gruba ayrılmıştır. Birinci grupta üç gruptan daha az antibiyotiğe dirençli bulunan (Duyarlı)10 şuş, ikinci grupta üç ya da daha fazla antibiyotik grubuna dirençli olan (Multidrug resistant, MDR) 10 suş, üçüncü grup ise iki ya da daha az grup antibiyotiğe duyarlı olan (Extreme-drug resistant, XDR) 10 suş belirlenerek incelemeye alınmıştır.
Çalışmada Galleria mellonella enfeksiyon modeli kullanılmıştır. Virulans faktörlerinden biyofilm oluşumu, spektrofotometrik mikroplak yöntemi ile; siderofor üretimi, Chrome Azurol-S agarda fenotipik olarak; serum direnci, PBS içerisinde %40 konsantrasyondaki normal insan serumu ve ısı ile inaktive edilmiş serumda izolatların üreme oranları hesaplanarak; twitching hareketi, %1 oranında agar içeren Mueller Hinton besiyerinde; swarming hareketi % 0.25 oranında agar içeren Luria Bertani besiyerinde; proteolitik aktivite, azoalbumin deneyi uygulanarak spektrofotometrik değerlendirme ile; fosfolipaz C aktivitesi kromojenik substrat p-nitrofenilfosforilkolin (NPPC) kullanılarak mikroplak yöntemi ile test edilerek spektrofotometrik ölçüm ile değerlendirilmiştir.
Bulgular: G.mellonella enfeksiyon modelinin kullanıldığı çalışmamızda duyarlı izolatlardan oluşan birinci grup ile çok ilaca dirençli izolatlardan oluşan ikinci grubun mortalite hızlarının birbirine yakın düzeylerde oldukları görülmüş olup, ekstrem dirençli izolatlardan oluşan üçüncü grubun mortalite hızının ise 24. - 96. saat aralıklarında diğer iki gruptan istatistiksel olarak anlamlı oranda düşük olduğu tespit edilmiştir. Tüm izolatların biyofilm oluşturduğu tespit edilmiştir. Bunlardan 8'i (%26.7) güçlü, 11'i (%36.7) orta, 11'i (%36.7) ise zayıf düzeyde biyofilm oluşturmuştur. Birinci grupta yer alan duyarlı izolatların, biyofilm oluşturma yeteneğinin diğer gruplardaki dirençli izolatlara oranla daha yüksek olduğu gözlenmiş ancak istatistiksel olarak anlamlı bulunamamıştır. Üçüncü gruptaki zayıf biyofilm oluşturan beş suştan üç tanesinin kolistine dirençli izolatlar oldukları tespit edilmiştir. Hiçbir izolatta "twitching" hareketi tespit edilemezken,  dirençli bakterilerden ikisinde  "swarming" gözlenmiştir. Birinci grupta ortalama normal insan serum direnci %36.8, ikincide %63.5, üçüncü grupta ise %58.1 olarak tespit edilmiştir. Birinci gruptaki serum direnci, dirençli olan ikinci ve üçüncü gruplarla karşılaştırıldığında daha düşük bulunmuş, serum direnci açısından gruplar arasındaki fark anlamlı bulunmuştur. Üç gruptaki izolatların hepsinin inaktif serum direnci yüksek bulunduğundan gruplar arasından anlamlı bir fark bulunamamıştır.  Tüm izolatlarda  fosfolipaz C aktivitesi,  proteolitik aktivite ve  siderofor üretiminin var olduğu tespit edilmiştir. Üç grup karşılaştırıldığında ise  fosfolipaz C aktivitesi, proteolitik aktivite düzeyleri  ve siderofor üretimi açısından anlamlı bir fark bulunamamıştır.
Sonuç: Çalışmamızda, tüm izolatlarda biyofilm oluşturma, fosfolipaz C aktivitesi,  proteolitik aktivite ve  siderofor üretimi saptanmıştır.  Duyarlı, çoğul ve ekstrem dirençli bakteri gruplarına göre sonuçlar karşılaştırıldığında ise sadece normal serum direnci açısından anlamlı fark bulunmuş olup, duyarlı grupta serum direncinin daha düşük düzeyde olduğu tespit edilmiştir. Ekstrem ilaç direnci bulunan üçüncü gruptaki izolatların ise enfeksiyon modelinde daha düşük virülans gösterdikleri görülmüştür. Bakterinin klinik başarısı ve ilaç direncinden tek bir virülans faktörünün sorumlu olmadığı, A.baumannii'nin virulansında multifaktöryel ve kombine bir stratejinin rol oynadığı düşünülmüştür.

Anahtar kelimeler: Acinetobacter baumannii, virülans faktörleri, antimikrobiyal direnç, Galleria mellonella enfeksiyon modeli

Abstract:
Objective: Acinetobacter baumannii, an opportunistic pathogen, has been shown in studies done in recent years to have become more resistant and virulent, posing a fundamental nosocomial threat. This resistance, which has developed in A.baumannii, and which can develop resistance against several antibiotic groups using certain different mechanisms, can lead to unexpected physiological, phenotypic and genotypic changes. Studies showing that the virulence properties of antibiotic resistant bacteria are reduced during the adaptation process against antibiotics exist. A small number of virulence factors pertaining to the bacteria have been identified so far and the number of studies investigating the relationship between these factors and the susceptible and resistant A.baumannii strains is limited, whose results have not yet become clear. In this study, it was aimed to investigate the virulence properties of A.baumannii isolates by comparing them with resistance to drugs and for this to provide guidance in developing new anti-virulence treatment strategies.
Materials and method: The study included a total of 30 Acinetobacter baumannii isolates consisting of 18 isolates which were isolated from clinical samples sent to our laboratory between 2005-2007 and had been used in different studies in previous years and 12 isolates isolated from various clinical samples sent routinely to the laboratory between January 2015-December 2015. Antibiotic susceptibility tests were conducted using the Kirby Bauer disk diffusion method in accordance with Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) recommendations. The isolates were divided into three groups according to their antibiotic susceptibility test profiles. The first group included 10 strains which were found to be resistant to less than three groups of antibiotics (Susceptible), the second group included 10 strains which were resistant to three or more antibiotic groups (Multidrug resistant, MDR) and the third group included 10 strains which were susceptible to two or less groups of antibiotics (Extreme-drug resistant, XDR) to be investigated.
The Galleria mellonella infection model was used in the study. Of the virulence factors, biofilm formation was evaluated using the spectrophotometric microplate method, siderophore production was evaluated phenotypically in a Chrome Azurol-S agar, serum resistance was evaluated by calculating the growth rates of isolates in normal human serum with a 40% concentration in PBS and heat inactivated serum, twitching motility was evaluated in a Mueller Hinton medium containing 1% agar, swarming motility was evaluated in a Luria Bertani medium containing 0.25% agar, proteolytic activity was evaluated with a spectrophotometric assessment using an azoalbumin assay and phospholipase C activity was evaluated with spectrophotometric measurement by testing with the microplate method using chromogenic substrate p-nitrophenylphosphorylcholine (NPPC).
Findings: In this study using the G.mellonella infection model, the mortality rates of the first group consisting of susceptible isolates and the second group consisting of multidrug resistant isolates were seen to be at close levels to one another and the mortality rate of the third group consisting of extreme-drug resistant isolates was found to be lower to a statistically significant degree than the other two groups at the 24th-96th hour intervals. All isolates were found to form biofilms. Of these, 8 (26.7%) formed strong biofilms, 11 (36.7%) formed moderate biofilms and 11 (36.7%) formed weak biofilms. The biofilm forming ability of susceptible isolates found in the first group was observed to be higher compared to resistant isolates found in the other groups but it wasn't found to be statistically significant. Three out of the five strains in the third group that formed weak biofilms were found to be colistin resistant isolates. While no "twitching" motility was detected in any isolates, "swarming" was observed in two of the resistant bacteria. Average normal human serum resistance was found as 36.8% in the first group, 63.5% in the second group and 58.1% in the third group. Upon comparison with the resistant second and third groups, the serum resistance of the first group was found to be lower and the difference between the groups in terms of serum resistance was found to be significant. Because the inactive serum resistance of all of the isolates in the three groups was found to be high, no significant difference was found between the groups. Phospholipase C activity, proteolytic activity and siderophore production were detected in all isolates. When the three groups were compared, no significant difference was found in terms of phospholipase C activity, proteolytic activity levels and siderophore production.
Conclusion: In this study, biofilm formation, phospholipase C activity, proteolytic activity and siderophore production were detected in all isolates. When the results were compared according to the susceptible, multiple and extreme resistant bacteria groups, the only significant difference was found in terms of normal serum resistance and serum resistance was found to be lower in the susceptible group. The isolates in the third group with extreme-drug resistance showed lower virulence in the infection model. It was inferred that a single virulence factor is not responsible for the clinical success and drug resistance of the bacteria and that a multifactorial and combined strategy plays a role in the virulence of A.baumannii. 

Keywords: Acinetobacter baumannii, virulence factors, antimicrobial resistance, Galleria mellonella infection model.