Bazı Thermoanaerobacter suşları ile siklodekstrin glikoziltransferaz (SGTaz) enzimi üretimi, karakterizasyonu ve siklodekstrin üretiminin optimizasyonu
Production and characterization of cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) by some thermoanaerobacter strains and the optimization of cyclodextrin production
Yazar: AYŞE AVCI
Danışman: PROF. DR. SEDAT DÖNMEZ
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada ülkemizdeki çeşitli ekstrem bölgelerden izole edilen bazı termofilik anaerobik bakterilerin siklodekstrin glikoziltransferaz (SGTaz) üretimleri araştırılmış, bu enzimi ürettiği belirlenen iki bakterinin SGTaz üretim koşulları belirlendikten sonra, enzimi saflaştırılmış ve bu enzim ile siklodekstrin üretimi gerçekleştirilmiştir.Bazı morfolojik, biyokimyasal ve 16S rDNA dizi analizlerine göre, Thermoanaerobacter sp. P4 ve Thermoanaerobacter sp. 5K olarak isimlendirilen izolatların Thermoanaerobacter cinsine ait yeni türler olduğu ve genetik benzerliklerinin sırası ile % 91.5-98.3 ve % 91-97 arasında değiştiği belirlenmiştir.Thermoanaerobacter sp. P4 ve Thermoanaerobacter sp. 5K suşları 30 g/L patates nişastasından, 65ºC'de ve başlangıç pH 7.5-8.0, azot kaynağı olarak kazein ve maya özütü içeren ortamda en yüksek SGTaz'ı ürettikleri saptanmıştır. Enzim, amonyum sülfat ile çöktürme ve afinite kromatografisi ile iki aşama da saflaştırılmıştır. Thermoanaerobacter sp. P4 ve Thermoanaerobacter sp. 5K'nın saflaştırılan SGTaz'larının spesifik aktiviteleri sırası ile 157.2 ve 373.1 U/mg protein; saflaştırma verimleri ise % 11 ve % 5 olarak belirlenmiştir. Thermoanaerobacter sp. P4 suşunun SGTaz'ının molekül ağırlığı 68.7 kDa, Thermoanaerobacter sp. 5K'nın ise 70.6 kDa ve optimum sıcaklıklarının 80-90 oC, pH'larının ise 7.0 olduğu belirlenmiştir.Thermoanaerobacter sp. P4 suşunun SGTaz'ı paselli SA2'den 80 oC'de, Thermoanaerobacter sp. 5K'nın SGTaz'ı ise patates nişastasından, 80-85 oC'de en yüksek oranda siklodekstrinleri üretmişlerdir. Thermoanaerobacter sp. P4 ve Thermoanaerobacter sp. 5K suşlarının SGTaz'ları ile 40 g/L patates nişastasından 80 ºC'de üretilen ?-SD ile ß-SD ve ?-SD'lerin oranı sırası ile % 38:% 62 ve % 60:% 40 olarak belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) productions of thermophilic anaerobic bacteria, isolated from different extreme areas in Turkey, were investigated and two of the isolates were determined as CGTase producers. CGTase production conditions of these strains were determined and after the purification of the enzymes cyclodextrin productions were performed.According to some morphological, biochemical and 16S rDNA analysis, the strains were identified as the members of genus Thermoanaerobacter. The similarities of Thermoanaerobacter sp P4 and Thermoanaerobacter sp. 5K with the strains of genus Thermoanaerobacter are 91.5-98.3 % and 91-97 %, respectively.It was detected that both Thermoanaerobacter sp. P4 and Thermoanaerobacter sp. 5K strains produced maximum amount of CGTase from 30 g/L potato starch, using yeast extract and casein as nitrogen sources, with an initial pH of 7.5-8.0 at 65 oC. The enzyme was purified in two steps including ammonium sulfate precipitation and sepharose 6B affinity chromatography. Specific activities of the purified CGTases of Thermoanaerobacter sp. P4 and Thermoanaerobacter sp 5K were found as 157.2 and 373.1 U/mg protein and the purification yields as 11 % and 5 %, respectively. Molecular weights of Thermoanaerobacter sp. P4 and Thermoanaerobacter sp. 5K were determined as 68.7 kDa and 70.6 kDa, respectively. Optimum pH and the temperatures of the CGTases from both strains were detected as 7.0 and 80-90 oC, respectively.CGTase from Thermoanaerobacter sp P4 produced maximum amounts of CDs by using 40 g/L paselli SA2 at 80oC, and that from Thermoanaerobacter sp. 5K produced maximum amount of CDs with 40g/L potato starch at 80-85oC. The ratios of ?-CD and ß-CD+?-CD produced by CGTases of Thermoanaerobacter sp. P4 and Thermonanerobacter sp. 5K from 40 g/L potato starch at 80oC were found as 38 %:60 % and 60 %:40 %, respectively.