Fındıktan (Corylus maxima miller) üreazın saflaştırılması ve çeşitli taşıyıcılara immobilizasyonu
Purification of urease from hazelnut (Corylus maxima miller) and its immobilization on various supports
Yazar: SEVİM TUNALI
Danışman: PROF. DR. REFİYE YANARDAĞ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzim immobilizasyonu = Enzyme immobilization ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Fındık = Hazelnut ; Üreaz = Urease

Özet:
Fındıktan (Corylus maxima Miller) üreazın saflaştırılması ve çeşitli taşıyıcılara immobilizasyonuÇalışmamızda Türkiye'de Giresun ili ve civarında oldukça bol miktarda yetiştirilen fındıktan (Corylus maxima Miller) üreaz (üre amidohidrolaz, E.C. 3.5.1.5) enzimi ilk defa saflaştırıldı ve kinetik özellikleri incelendi. Saflaştırılan üreaz çeşitli taşıyıcılara immobilize edildi.Fındıklar 25 mM fosfat tamponu (pH=7.0) ile homojenize edildi. Üreaz aktivitesi gösteren homojenizata soğuk aseton-etil alkol ile çöktürme ve asid aşamaları uygulandı. Daha sonra bu kesit sırasıyla DEAE-sellüloz ve hidroksilapatit kolonlarına uygulandı. Saflaştırma işlemlerinde protein miktar tayini Bradford ve E280/E260 Warburg yöntemlerine göre; enzim aktivitesi ise Weaterherburn yöntemine göre 630 nm'de spektrofotometrede tayin edildi. Bu şekilde üreaz fındıktan 30 kez saflaştırıldı.Saflaştırılan üreazın PAGE elektroforezi sonucunda 545 kDa mol ağırlığı olan tek pik içerdiği saptandı. SDS-PAGE elektroforezi sonucunda saflaştırılan enzimin hekzamer yapıda ve molekül ağırlığının 89.321 kDa olduğu bulundu.Fındıktan saflaştırılan üreazın optimum pH'sının 7.6, optimum sıcaklığının 25°C olduğu bulundu.Enzimin çeşitli substratlara karşı ilgisi incelendiğinde, üreazın ilgisinin en fazla 4-dimetilaminobenzaldehid'e olduğu ve bu substrata karşı Km ve Vmax değerlerinin sırasıyla 0.128 mM ve 0.555 U/mL olduğu saptandı.pH, sıcaklık, depolama kararlılığı, optimum reaksiyon süresinin tayini, uygun enzim ve substrat konsantrasyonu belirlendi. Bunların yanı sıra enzim üzerine çeşitli organik ve anorganik bileşiklerin ve organik çözücülerin etkileri incelendi.Fındıktan saflaştırılan üreaz alümina, Amberlit IRA-900 ve deniz kumu üzerine immobilize edilerek immobilize üreazların optimum pH, optimum sıcaklık, enzim taşıyıcı miktarının aktiviteye etkisi, optimum reaksiyon suresinin tayini, ve organik ve anorganik bileşiklerin etkileri gibi kinetik özellikleri de incelendi.İmmobilize enzimin saflaştırılmış enzimle benzer kinetik özellikler gösterdiği, ancak alümina ve Amberlit IRA-900 üzerine immobilize edilmiş üreazın optimum sıcaklığının 40°C olduğu gözlemlendi.

Abstract:
Purification of urease from hazelnut (Corylus maxima Miller) and its immobilization on various supportsIn our study, urease (urea amidohydrolase 3.5.1.5) was purified for the first time from hazelnut (Corylus maxima Miller) being abundant in Giresun (Turkey) and surroundings and the kinetic properties of the enzyme were investigated. Purified urease was immobilized on various supports.Hazelnuts were homogenized with 25 mM phosphate buffer (pH=7.0). The homogenizate with urease activity was precipitated with precooled aceton-ethyl alcohol and then was applied the acid step. Subsequently, this fraction was applied respectively to DEAE-cellulose and hydroxyapatite columns. In the purification process, the protein content was determined by Bradford and E280/E260 Warburg methods and urease activity was measured spectrophotometrically at 630 nm according to Weaterherburn?s method. Urease was purified from hazelnut 30 times by this processes.It was determined after PAGE electrophoresis that the purified urease contained a single peak corresponding to 545 kDa molecular weight. The purified enzyme, which showed a six bands SDS-PAGE, had a molecular weight of 89.321 kDa.It was also found that urease from hazelnut had an optimum pH value pH=7.6 and an optimum temperature of 25°C.When the affinity of the enzyme against several substrats was examined, the highest value was obtained with 4-dimethylaminobenzaldehyde, with Km and Vmax values of 0.128 mM and 0.555 U/mL, respectively.The optimum pH and temperature, storage stability, optimum reaction time, appropriate concentrations of the enzyme and its substrate were investigated, the effects of several organic and inorganic compounds and organic solvents were also determined.After the immobilization of urease purified from hazelnut on several supports (alumina, Amberlite-IRA 900, sea sand), kinetic properties such as optimum pH and temperature, effect of enzyme carrier amount on activity, optimum reaction time and effects of organic and inorganic compounds were also examined.It has been observed that immobilized enzyme has the same kinetic properties with purified enzyme, but optimum temperature of immobilized urease on alumina and Amberlite IRA-900 is 40°C.