Mitokondriyal dna'nın kontrol bölgesindeki olası non-cpg metilasyonların sperm hareketi üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of possible non-cpg methylations in the control region of mitochondrial dna on sperm movement
Yazar: MUSTAFA ABUSAK
Danışman: PROF. DR. İLHAN ONARAN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Amaç: Erkek infertilitesinin önemli nedenlerinden biri olan spermatozoa motilite bozukluğunun altında yatan patolojilerden birinin de yeterli enerjinin üretilememesi olduğu öne sürülmektedir. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyondan temin edilen adenozin trifosfat (ATP) bu enerjinin bir bölümünü temin etmektedir. Son yıllardaki çalışmalar, mitokondri genomunda yer alan transkripsiyon kontrol bölgesindeki CpG ve non-CpG olarak yer alan bazların metillenmiş sitozin seviyelerindeki değişikliklerin bazı patolojilerle ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu tür değişikliklerin erkek infertilitesi ile ilişkili olup olmadığı bilinmediğinden, bu tez çalışmasında ilgili bölgenin CpG ve non-CpG metilasyon seviyesi ve bunun  spermatozoa hareketi ile ilişkisi araştırılmıştır.
Gereç ve Yöntem : İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Üroloji Anabilim Dalı, Androloji Polikliniği'ne başvuran 25 astenospermik ve 24 kontrol (normospermik) vaka olmak üzere toplam 49 spermatozoa örneği çalışmaya dahil edildi. Semen örneklerinden elde edilen spermatozoaların DNA'larından bisülfit modifikasyon sonrası mtDNA D-loop promotör bölgesi CpG metilasyon düzeyleri Metilasyona Duyarlı Erime Eğrisi vasıtasıyla analiz edildi. Non-CpG metilasyon durumunu belirlemek için Non-CpG adalarına özgül metile ve unmetile bölgeleri çoğaltmaya yönelik primer dizileri tasarlandı. İlgili bölgelerin metilasyon miktarı Eş Zamanlı PZR yöntemiyle belirlendi. Sonrasında elde edilen veriler ve spermatozoa parametreleri ile metilasyon düzeyleri arasındaki ilişkiler istatistiksel olarak değerlendirildi.
Bulgular: sonuçlarımız, astenospermik vakalara ait spermatozoa mtDNA'sındaki D-loop bölgesinde yer alan CpG adacıklarının metilasyon düzeylerinin kontrol grubuna göre 1,9 kat daha fazla olduğunu göstermektedir. Ancak aynı bölgedeki non-CpG adacıklarındaki metilasyon düzeyleri, ikili karşılaştırmada istatistiksel olarak anlamlı değildi (p>0,05). İlgili parametreler için değişkenlik katsayıları yüksek hesaplanmıştır. Bulgularımız,  Spearman's Rho testi analizi ile astenozoospermi ve kontrol gruplarına ait spermatozoa progresif motilite yüzdesi ile mtDNA D-loop bölgesi sitozin metilasyon yüzdesi arasında korelasyon olmadığını gösterdi. 
Sonuç: Çalışmamızın bulguları astenospermisi olan infertil vakalardan elde edilen  spermatozoalarının mitokondri genomunda yer alan transkripsiyon kontrol bölgesindeki Non-CpG adacıklarından ziyade CpG adacıklarındaki sitozinlerin metilasyon seviyelerinde bir artış olduğunu göstermiştir. Parametrelerde gözlemlenen bireysel farklılıkların nedenleri, iki bölgedeki profil farklılıkları ve mekanizma ile ilişkili diğer komponentlerin rolünü ortaya çıkartacak çalışmaların spermatozoa hareket bozuklarının mekanizmalarının açıklanmasına katkıda bulanabileceği görüşündeyiz.

Abstract:
Objective: It is suggested that one of the significant causes of male infertility, sperm motility disorder, is due to the inability to produce sufficient energy. Adenosine triphosphate (ATP) obtained from mitochondrial oxidative phosphorylation provides a portion of this energy. Recent studies have shown that changes in the levels of methylated cytosines in CpG and non-CpG bases in the transcription control region of the mitochondrial genome are associated with some pathologies. As it is unknown whether such changes are related to male infertility, this thesis investigates the CpG and non-CpG methylation levels of the relevant region and their relationship with sperm motility.
Materials and Methods: A total of 49 sperm samples were included in the study, consisting of 25 asthenospermic and 24 control (normospermic) cases, who applied to the Andrology Clinic of the Department of Urology, Istanbul University-Cerrahpaşa, Cerrahpaşa Faculty of Medicine. CpG methylation levels of the mtDNA D-loop promoter region were analysed through Methylation-Sensitive High-Resolution Melting Curve Analysis from the DNA of the sperm obtained from the semen samples after bisulfite modification. Primer sequences were designed to replicate the specific methylated and unmethylated regions of Non-CpG islands to determine the non-CpG methylation status. The methylation levels of the relevant regions were determined by the Simultaneous PCR method. Subsequently, the relationships between the obtained data, sperm parameters, and methylation levels were statistically evaluated. Results: According to the results of the studies, Non-CpG methylation increase is observed in the D-loop region in asthenosperm disease spermatozoa. When we look at the results of our study, there was an increase in mtDNA methylation in diseased spermatozoa compared to normal spermatozoa, but it shows that it is not related to ATP concentration. 
Results: Our results showed that the CpG island methylation levels in the mtDNA D-loop region of spermatozoa in asthenospermic cases were 1.9 times higher than those in the control group. However, the methylation levels in the non-CpG islands in the same region were not statistically significant in the pairwise comparison (p>0.05). The variability coefficients were also found to be high for the relevant parameters. Our findings showed no correlation between progressive motility percentage of spermatozoa and cytosine methylation percentage in the mtDNA D-loop region for both asthenozoospermic and control groups, according to Spearman's Rho test analysis.
Conclusion: Our study findings have shown an increase in the methylation levels of CpG sites rather than non-CpG sites in the transcription control region of the mitochondrial genome in spermatozoa obtained from infertile cases with asthenospermia. The reasons for the observed individual differences in the parameters may contribute to explaining the mechanisms of spermatozoa motility disorders, revealing the differences in profiles between the two regions and the role of other components related to the mechanism. We believe that further studies can shed light on this matter.