Kemik morfogenetik protein-2 geninin lipid bazlı nanopartikül ile mezenkimal kök hücrelere transfeksiyonu
Bone morphogenetic protein-2 gene transfection of mesenchymal stem cells via lipid based nanoparticle
Yazar: ŞEYDA AYDIN
Danışman: PROF. DR. NELİSA TÜRKOĞLU ; PROF. DR. SEZGİN ÇELİK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics

Özet:
Mezenkimal kök hücreleri (MKH'ler), rejeneratif tıp ve doku mühendisliği uygulamalarında önemli bir potansiyele sahiptir. Ancak klinikte MKH'lerin kullanımı günümüzde sınırlıdır, çünkü istenilen hücre tipine farklılaşma gibi hücresel davranışları kontrol etmenin etkili bir yolu bulunmamaktadır. Bu noktada, genetik modifikasyon, MKH'lerin daha aktif bir şekilde kontrol edilmesine olanak sağlayabilir. Fakat MKH'lerin genetik manipülasyonuyla ilgili en büyük zorluk, verimli ve güvenli bir gen aktarım sisteminin henüz bulunmamış olmasıdır. Gen aktarım sistemleri, viral ve viral olmayan olmak üzere iki ana sınıfa ayrılır. Viral vektörler, gen transferi için virüslerin kullanıldığı sistemleri içerir. Viral olmayan vektörler ise biyouyumlu ve biyogüvenli materyaller aracılığıyla gen transferini gerçekleştirir. Bu bağlamda, viral olmayan gen aktarım yöntemlerinden biri olan katı lipid nanopartiküller, plazmid taşıyıcısı olarak kullanılmıştır. Yüzeyindeki pozitif yük nedeniyle nanopartiküller, negatif yüklü DNA ile stabil bir kompleks oluşturur. Oktadesilamin bazlı katı lipid nanopartiküller, (y/s) tekli emülsifikasyon-çözücü uçurma yöntemi ile sentezlenmiştir. Elde edilen nanopartiküllerin boyut ve yük analizleri Zetasizer cihazında gerçekleştirilmiştir. Nanopartiküllerin ortalama büyüklüğü 484.6±211.8 nm, Polidispersite Endeksi (PdI) 0.153 ve yükü 31.8±5.40 mV ölçülmüştür. Nanopartiküllerin sitotoksisitesi MTT analizi ile belirlenmiştir. Nanopartikül ile BMP-2 kodlayan plazmid kompleksi oluşturulmuştur. Komplekslerin stabilitesi agaroz jelde yürütülerek ile değerlendirilmiştir. Nanopartikül-pBMP-2 kompleksi ile MKH'ler transfekte edilmiştir. Transfeksiyon etkinliği %88.2±0.5 olarak hesaplanmıştır. Transfeksiyon sonrası, BMP-2 gerçek zamanlı PCR ile mRNA ve ELISA ile protein düzeyinde tespit edilmiştir. Transfeksiyon çalışmaları süresince MKH'lerin senesense girmediği SA-β-gal boyaması ile belirlenmiştir.

Abstract:
Mesenchymal stem cells (MSCs) hold significant potential in the field of regenerative medicine and tissue engineering. However, the clinical utilization of MSCs is currently limited due to the lack of an effective method to control cellular behaviors such as differentiation into the desired cell type. At this juncture, genetic modification may provide an opportunity to actively control MSCs. However, the major challenge in the genetic manipulation of MSCs lies in the absence of an efficient and safe gene transfer system. Gene transfer systems can be broadly categorized into two main classes: viral and non-viral vectors. Viral vectors employ viruses for gene transfer, while non-viral vectors utilize biocompatible and bio-safe materials for gene delivery. In this context, one of the non-viral gene transfer methods, solid lipid nanoparticles have been designed for use as a plasmid carrier. Solid lipid nanoparticles, owing to their positive surface charge, form a stable complex with negatively charged DNA. Octadecylamine-based solid lipid nanoparticles were synthesized using (o/w) single emulsification-solvent evaporation method. The size and charge analyses of the obtained nanoparticles were performed using a Zetasizer device, revealing an average size of 484.6±211.8 nm, a Polydispersity Index (PdI) of 0.153, and a charge of 31.8±5.40 mV. The cytotoxicity of the nanoparticles was determined through MTT analysis. A complex of nanoparticles and plasmid encoding BMP-2 was formed, and the stability of these complexes was evaluated through agarose gel electrophoresis. MSCs were transfected with the nanoparticle-pBMP-2 complex, with a transfection efficiency of 88.2±0.5%. Following transfection, BMP-2 was detected at the mRNA level through real-time PCR and at the protein level through ELISA. Senescence of the MSCs was assessed using SA-β-gal staining throughout the course of transfection studies.