Elektrokimyasal HE4 immünosensörünün geliştirilmesi
Development of electrochemical HE4 immunosensor
Yazar: AYLA YILMAZ AKTAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MELİKE BİLGİ KAMAÇ
Çankırı Karatekin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu araştırmada, bir kanser biyobelirteci olan insan epididimis protein 4'ün (HE4) elektrokimyasal tayini için yeni bir immünosensör geliştirilmiş ve insan kan serumu numunelerinde uygulaması gerçekleştirilmiştir. Çalışmada yüzey baskılı karbon elektrotlar (SPCE) ilk olarak indirgenmiş grafen oksit (RGO) ile modifiye edilmiş ardından elektropolimerizasyon tekniği uygulanarak elektrot yüzeyi politiyonin ile kaplanmış, son olarak elektrodepozisyon ile altın nanoparçacıklar (AuNP) yüzeyde oluşturulmuştur. SPCE/RGO/PTH/AuNP elektrodunun elektrokimyasal karakterizasyonu dönüşümlü voltametri (CV), diferansiyel puls voltametri (DPV), kare dalga voltametri (SWV) ve elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) metotları kullanılarak yapılmıştır. SPCE/RGO/PTH/AuNP elektrotların yüzeyine Anti-HE4'ün immobilizasyonu 3-merkaptopropiyonik asit (3-MPA) ve 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) karbodiimid/N-hidroksisüksinimid (EDC/NHS) kullanılarak kovalent bağlama yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan HE4 immünosensörünün optimum çalışma parametreleri DPV ve EIS metotları ile belirlenmiş ve optimum Anti-HE4 konsantrasyonu 33,33 µg/mL, optimum Anti-HE4 inkübasyon süresi 45 dk ve optimum HE4 inkübasyon süresi 30 dk olarak bulunmuştur. Optimum şartlarda elektrokimyasal HE4 immünosensörünün analitiksel karakterizasyonu yapılmıştır. EIS, DPV ve SWV metotları ile belirlenen doğrusal tayin aralıkları 1-100 pg.mL-1, tespit limitleri sırasıyla 2,16 pg.mL-1, 1,04 pg.mL-1 ve 1,16 pg.mL-1 olarak belirlenmiştir. HE4 immünosensörünün tekrarlanabilirliği 50 ng.mL-1 HE4 konsantrasyonu için test edilmiş ve bağıl standart sapma (R.S.D.) değerleri EIS, DPV ve SWV metotları için sırasıyla  %4,09 (n=10), %4,29 (n=10) ve %1,95 (n=10)  olarak hesaplanmıştır. Geliştirilen HE4 immünosensörünün uygulama kararlığı 60 gün boyunca, depolama kararlığı ise 12 hafta depolama süresince voltametrik metotlarla incelenmiştir.  HE4 immünosensörünün seçiciliği 9 farklı antijen karışımı varlığında HE4'ün analizinin yapılmasıyla test edilmiş ve antijen karışımının % 3,67'lik bir girişim yaptığı bulunmuştur. Hazırlanan HE4 immünosensörleri insan kan serumu örneklerine bilinen miktarda ilave edilen farklı konsantrasyonlardaki HE4'ün analizi için kullanılmış ve %95'in üstünde geri kazanımlar elde edilmiştir.

Abstract:
In this study, a new immunosensor was developed for the electrochemical determination of human epididymis protein 4 (HE4) that is a cancer biomarker and its application was performed on human blood serum samples. In this work, firstly the screen printed carbon electrodes (SPCE) were modified with reduced graphene oxide (RGO), then the electrode surface was coated with poly(thionine) by applying the electropolymerization technique, and finally, gold nanoparticles (AuNP) were created by electrodeposition on the surface. Electrochemical characterizations of the SPCE/RGO/PTH/AuNP electrode were performed using cyclic voltammetry (CV), differential pulse voltammetry (DPV), square wave voltammetry (SWV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) methods. Immobilization of Anti-HE4 to the surface of SPCE/RGO/PTH/AuNP electrodes were carried out by covalent binding method using 3-mercaptopropionic acid (3-MPA) and 1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimide/N-hydroxy succinimide (EDC/NHS). The optimum working parameters of the prepared HE4 immunosensor were determined by DPV and EIS methods. The optimum Anti-HE4 concentration, incubation time of Anti-HE4 and incubation time of HE4 were found to be 33.33 µg/mL, 45 min and 30 min, respectively. The analytical characterization of electrochemical HE4 immunosensors were performed under the optimum working parameters. It was calculated that the linear ranges were 1-100 pg.mL-1 by EIS, DPV and SWV methods, limit of detections (LOD) were 2.16 pg.mL-1, 1.04 pg.mL-1 and 1.16 pg.mL-1, respectively. The repeatability of the HE4 immunosensor was tested for 50 ng.mL-1 HE4 concentration and relative standard deviation (R.S.D.) values were calculated as 4.09% (n = 10), 4.29% (n = 10) and 1.95% (n = 10) for EIS, DPV and SWV methods, respectively. The operation stability of the developed HE4 immunosensor was examined by voltammetric methods for 60 days, and the storage stability for 12 weeks. The selectivity of the HE4 immunosensor was tested by performing HE4 analysis in the presence of 9 different antigen mixes and it was found that the antigen mixture made a 3.67% interference. The prepared HE4 immunosensors were used for the analysis of different concentrations of HE4 added to the human blood serum samples in a known amount and over 95% recoveries were obtained.