Kolesterolün ve fenolik bileşiklerin tayini için amperometrik enzim elektrotların hazırlanması
Preparation of amperometric enzyme electrodes for determination of cholesterol and phenolic compounds
Yazar: DERYA KOYUNCU ZEYBEK
Danışman: PROF. DR. ŞULE PEKYARDIMCI
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Amperometri = Amperometry ; Fenolik bileşikler = Phenolic compounds ; Kolesterol = Cholesterol

Özet:
Bu çalışmada, kolesterol ve fenolik bileşiklerin amperometrik tayini için polimer film temelli amperometrik biyosensörler hazırlandı. Bu amaçla, platin elektrotlar o-fenilendiamin (oPD) veya oPD ve 3-metiltiyofen (3MT) içeren asetonitril-su ortamı kullanılarak dönüşümlü voltametri tekniği ile polimer filmlerle kaplandı. Kolesterol oksidaz (COx) veya polifenol oksidaz (POx) enzimleri Pt/PoDP ve Pt/PoPD-3MT elektrotların yüzeyine immobilize edildi. Pt/PoPD/COx ve Pt/PoPD-3MT/POx elektrotların sırasıyla kolesterol ve fenolik bileşiklerin tayini için uygun oldukları gözlendi ve optimizasyon çalışmaları bu enzim elektrotları kullanılarak yapıldı. Kolesterol tayini enzimatik olarak oluşan hidrojen peroksidin Ag/AgCl'e karşı +0,70 V'da yükseltgenmesine dayanılarak yapıldı. Pt/PoPD/COx enzim elektrodu için optimum tampon cinsi, tampon derişimi, pH'sı, optimum çalışma sıcaklığı sırasıyla fosfat tamponu; 0,05 M; 7,5 ve 40 °C olarak belirlendi. Enzim elektrodun, kolesterol için doğrusal çalışma aralığı 9,8×10-6-1,1×10-2 mM, gözlenebilme sınırı 9,8×10-6 mM, cevap süresi 150 s ve raf ömrü yaklaşık bir hafta olarak bulundu. Kolesterol oksidaz enzim elektrot üzerine gerçek numunelerde bulunan bazı muhtemel bozucu türlerin etkisi incelendi. Serum numunelerinde toplam kolesterol tayini hazırlanan Pt/PoPD/COx enzim elektrot kullanılarak yapıldı ve sonuçların spektroskopik olarak elde edilen sonuçlarla uyumlu olduğu görüldü. Fenolik bileşikler, enzimatik olarak oluşan o-kinonun Ag/AgCl'e karşı ? 0,20 V'da indirgenmesi yolu ile ölçüldü ve pirokateşol model substrat olarak kullanıldı. Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrot için optimum tampon cinsi, derişimi, pH'sı, optimum çalışma sıcaklığı ve optimum çalışma potansiyeli sırasıyla fosfat tamponu; 0,10 M; 7,0; 25°C ve Ag/AgCl'e karşı ? 0,20 V olarak belirlendi. Enzim elektrodun, pirokateşol için doğrusal çalışma aralığı 1,96×10-3-3,50×10-2 mM, alt tayin sınırı 1,96×10-3 mM, cevap süresi 100 saniye ve raf ömrü yaklaşık 2 hafta olarak bulundu. Ayrıca, enzim elektrodun bazı diğer fenolik bileşikler için duyarlıkları karşılaştırıldı ve standart referans maddede toplam fenolik bileşiklerin tayini yapıldı.

Abstract:
In this study, the polymer-based amperometric biosensors were prepared for amperometric detection of cholesterol and phenolic compounds. For this purpose, platinum electrodes were coated by polymer films from asetonitrile-water media containing o-phenylendiamine (oPD) or o-PD and 3-methylthiophene (3MT) with the cyclic voltammetry technique. Cholesterol oxidase (COx) or polyphenol oxidase (POx) enzymes were immobilized on to the surface of Pt/PoPD and Pt/PoPD-3MT electrodes. It was observed that Pt/PoPD/COx and Pt/PoPD-3MT/POx electrodes were appropriate for determination of cholesterol and phenolic compounds, respectively and these electrodes were used for optimization studies. The determination of cholesterol was performed via monitoring oxidation current of enzymatically produced H2O2 at +0.70 V vs. Ag/AgCl. Optimum buffer type, concentration, pH and optimum working temperature were determinated as phosphate, 0.05 M, 7.5 and 40° C, respectively for Pt/PoPD/COx named enzyme electrode. It was determined the linear working ranges of Pt/PoPD/COx enzyme electrode to cholesterol as 9.8×10-6-1.1×10-2 mM, detection limit as 9.8×10-6 mM, response time as 150 s and life time as about one week. The effects of possible interference species present in real samples on cholesterol oxidase enzyme electrode were examined. Analysis of total cholesterol in serum samples were performed by using proposed Pt/PoPD/COx enzyme electrode and good correlation was obtained between enzyme electrode results and those obtained by spectroscopic methods. Phenolic compounds were estimated by reduction of enzymatically liberated o-quinone at -0.20 V vs. Ag/AgCl and pyrocatechol was used as a substrate model. Optimum buffer type, concentration, pH, optimum working temperature, optimum working potential were determinated as phosphate, 0.10 M, 7.0, 25° C and -0.20 V vs. Ag/AgCl, respectively for Pt/PoPD-3MT/POx enzyme electrode. It was determined the linear working ranges of enzyme electrode for pirocatechol as 1.96×10-3-3.50×10-2 mM, detection limit as 1.96×10-3 mM, response time as 100 s and life time as about two weeks. Additionally, the sensitivity of enzyme electrode for many other phenolic compounds was compared and total phenolic compounds detection was performed in reference standard sample.