Sıcaklığa dirençli amilaz genlerinin klonlanması üzerine çalışmalar
Studies on cloning of thermostable amylase genes
Yazar: BAHRİ DEVRİM ÖZCAN
Danışman: PROF.DR. NUMAN ÖZCAN
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
ÖZDOKTORA TEZİSICAKLIĞA DİRENÇLİ AMİLAZ GENLERİNİNKLONLANMASI ÜZERİNE ÇALIŞMALARBahri Devrim ÖZCANÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİFEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜZOOTEKNİ ANABİLİM DALIDanışman : Prof.Dr. Numan ÖZCANYıl: 2005, Sayfa: 122Jüri : Prof.Dr. Numan ÖZCANProf.Dr. Hasan Rüştü KUTLUProf.Dr. Halil KASAPProf.Dr. Mehmet TOPAKTAŞDoç.Dr. Mehmet Sait EKİNCİYapılan bu çalışma ile Bacillus stearothermophilus'a ait sıcaklığa dirençli Î±-amilaz genini taşıyanpC194Î± rekombinant vektörü, Bacillus subtilis YB886 ve Bacillus subtilis BR151 suşlarına elektroporasyontekniği ile aktarılmıştır. Î±-amilaz enziminin konakçıda hücre dışına salındığı gerek nişasta içeren LB/Agarbesiyerlerinde, gerekse SDS-Nişasta-PAGE'de zymogram analizleri ile gösterilmiştir. Ayrıca rekombinantbakterilerden izole edilen rekombinant plazmidlerin Hind III enzimi ile kesimi sonucu agaroz jelde 5.25 kbç'liksıcaklığa dirençli Î±-amilaz genini taşıyan DNA bandı ile 2.9 kbç'lik pC194 bandı gözlenmiştir. Rekombinant B.subtilis suşlarına ait hücre dışı sıvılarının 80 ºC'de 15 dakika inkübasyonu ile B. subtilis kökenli mezofilikproteinler denatüre edilirken, sıcaklığa dirençli Î±-amilaz enziminden sorumlu bant SDS-PAGE ve SDS-Nişasta-PAGE'de gösterilmiştir.Diğer taraftan sıcaklığa dirençli Î²-amilaz geni Thermoanaerobacterium thermosulfurogenesDNA'sından PCR tekniği ile izole edilerek pBluescript II KS/SK, pL2 ve pNW33N klonlama vektörleri ileEscherichia coli'de, pUB110 klonlama vektörü ile de Bacillus subtilis BR151 ve Bacillus amyloliquefaciensbakterilerinde klonlanmıştır. Rekombinant bakterilerden izole edilen plazmidlerin Bam HI enzimi ile kesilip Î²-amilaz genine ait 1.935 kbç'lik DNA parçasının agaroz jelde gösterilmesiyle gen entegrasyonunun tamamlandığıanlaşılmıştır. LB/Nişasta/Agar plaklarına ekilen rekombinant Escherichia coli kolonilerinin I2 boyaması sonucupozitif zon vermesi ile üretilen proteinin aktif olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca rekombinant vektörler kalıp olarakkullanılmış ve sıcaklığa dirençli Î²-amilaz geni PCR ile çoğaltılarak elde edilen ürün agaroz jelde gösterilmiştir.Buna ilaveten, elde edilen PCR ürününün Hind III enzimi ile kesilmesi sonucu elde edilen yaklaşık 1.5 ve 0.5kbç'lik fragmentlerin agaroz jel elektroforezde gösterilmesi genin klonlanmasına yönelik bulguları dadesteklemiştir. Fakat sıcaklığa dirençli Î²-amilaz geni B. subtilis BR151 ve B. amyloliquefaciens'deklonlanmasına karşın LB/Nişasta/Agar plaklarında enzim aktivitesi görülmemiştir. Buna karşılık hücre dışıenzimlerin denatüre edilerek SDS-Nişasta-PAGE'de elektroforezi ve arkasından tekrar renatüre edilerekortamdaki substratı parçalaması sonucu zymogram analizinde enzimatik aktivite görülmüştür.Anahtar Kelimeler: Bacillus stearothermophilus, Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes, Î±-amilaz, Î²-amilaz, KlonlamaI

Abstract:
ABSTRACTPhD THESISSTUDIES ON CLONING OF THERMOSTABLEAMYLASE GENESBahri Devrim ÖZCANDEPARTMENT OF ANIMAL SCIENCEINSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCESUNIVERSITY OF ÇUKUROVASupervisor : Prof.Dr. Numan ÖZCANYear: 2005, Pages: 122Jury : Prof.Dr. Numan ÖZCANProf.Dr. Hasan Rüştü KUTLUProf.Dr. Halil KASAPProf.Dr. Mehmet TOPAKTAŞDoç.Dr. Mehmet Sait EKİNCİIn this study, the recombinant pC194Î± vector carrying thermostable Î±-amylase gene from Bacillusstearothermophilus was transformed into Bacillus subtilis YB886 and Bacillus subtilis BR151 by electroporationtechnique. It was showed on LB/Agar plates and zymogram analyses on SDS-Starch-PAGE that recombinantstrains synthesized thermostable Î±-amylase extracellularly. Hind III digestion of recombinant plasmids yielded5.25 kbp fragment of DNA carrying the gene encoding thermostable Î±-amylase and 2.9 kbp fragment of pC194vector on agarose gel electrophoresis. Furthermore, extracellular proteins of recombinant strains were treated atemperature of 80 ºC for 15 minutes and thus mesophilic proteins origined from Bacillus subtilis weredenaturated and thermostable Î±-amylase enzyme showed on both SDS-PAGE and SDS-Starch-PAGE.On the other hand thermostable Î²-amylase gene from Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes wascloned in Escherichia coli using pBluescript II KS/SK, pL2 and pNW33N, in Bacillus subtilis BR151 andBacillus amyloliquefaciens using pUB110 by PCR technique. Digestion of plasmids isolated from recombinantstrains by Bam HI was showed the 1.935 kbp Î²-amylase gene band following agarose gel electrophoresis. OnLB/Starch/Agar plates, all recombinant Escherichia coli colonies showed positive zones with I2 staining.Thermostable Î²-amylase gene was isolated from recombinant plasmids by PCR and visualized by agarose gelelectrophoresis. In addition, 1.5 ve 0.5 kbp fragments produced by digestion of PCR products with Hind IIIvisualized by agarose gel electrophoresis supported the results. Although the thermostable Î²-amylase cloned in B.subtilis BR151 and B. amyloliquefaciens, these microorganisms didn?t show enzymatic activity onLB/Starch/Agar plates. But after denaturing and electrophoresis of extracellular proteins on SDS-Starch-PAGEand hydrolysis of substrat by renaturated protein, enzymatic activity have been seen by zymogram analysis.Key Words: Bacillus stearothermophilus, Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes, Î±-amylase, Î²-amylase,CloningII