Sütte plazmin ve kimozin aktivitesi üzerine bazı fenolik bileşiklerin etkisi ve süreçlere uyarlanabilirliği
Effects of some phenolics on the activity of plasmin and chymosin in milk and its application to the processes
Yazar: SEDA ELİKOĞLU
Danışman: PROF. DR. HALİL VURAL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Fenolik bileşikler, epidemiyolojik araştırmalarla kanıtlanan sağlık üzerine olumlu etkilerinden dolayı gıda bilimi ve teknolojisi alanında da son yıllarda gittikçe artan bir ivme ile araştırılmaya devam etmektedir. Yoğurt, dondurma ve peynir gibi birçok süt ürününde gerek kaliteyi geliştirmek, gerekse de ürünlere fonksiyonellik katmak amacı ile polifenollerin kullanılmasına yönelik çalışmalar mevcuttur. Fenolik bileşiklerin çeşitli enzimlerin inhibisyonuna yol açtığı da birçok araştırmacı tarafından rapor edilmiştir. Ancak, süt endüstrisi için önem taşıyan proteolitik enzimler ile polifenollerin etkileşimleri ve bu etkileşimlerin doğurduğu sonuçlar üzerine çok az çalışma bulunmaktadır. 

Bu tez çalışması kapsamında plazmin ve kimozin enzimleri ile fenolik bileşiklerin etkileşimleri moleküler düzeyde incelenerek olası enzim inhibisyonları değerlendirilmiş ve enzim aktivitesinde meydana gelen değişimlerin peynir yapımı ve olgunlaştırma süreçlerine etkisi tartışılmıştır. Çalışmadan elde edilen bulgular ile, kimozin enzimi ile fenolik bileşiklerin enzim inhibisyonuna yol açacak güçte interaksiyona giremediği ve /veya olası etkileşimlerin kimozinin korunaklı aktif bölgesinde konformasyonal değişikliğe yol açmaması nedeniyle inhibisyon görülmediği sonucuna ulaşılmıştır. Bunun yanı sıra, çalışmada kullanılan fenolik bileşiklerden epikateşin gallat (ECG), epigallokateşin gallat(EGCG), kuersetin (QUER), myrisetin (MYR), ve kurkuminin  (CURC) plazmin enzimini %60, 86, 65, 90, 52 oranında inhibe ettiği, süt proteinleri varlığında ise inhibisyon oranlarının sıra ile %35, 47, 44, 46 ve 40'a düştüğü gözlenmiştir. Yürütülen kalorimetrik ve spektroskopik çalışmalar ile, plazmine karşı inhibitör özellik gösteren flavonoidlerin, H-bağları ve elektrostatik etkileşimlerin baskın olduğu interaksiyonlar ile plazmine bağlanarak, plazminin doğal haldeki baskın düzensiz yapısını daha düzenli ikincil yapılara doğru değiştirdiği belirlenmiştir. İnhibisyon kinetikleri incelendiğinde EGCG, QUER ve MYR'in yarışmasız; ECG ve CURC'in ise karışık tip inhibisyona yol açtığı bulunmuştur. 

Model sistemlerdeki denemelerin ardından, peynir yapımı ve olgunlaştırma sürecinde yürütülecek denemeler için yeşil çay ekstraktının (YÇE) kullanılmasına karar verilmiştir. Peynir yapımı sürecinde kimozin ile pıhtılaşma kinetiklerinin eklenen yeşil çay fenoliklerinden etkilendiği ve pıhtılaşmanın ilk aşaması olan enzimatik faz sürecinde kazeinomakropeptit (CMP) oluşum hızının yeşil çay fenolikleri varlığında düştüğü belirlenmiştir. Ayrıca koagülasyonun ikinci aşamasında (flokülasyon fazı), misel agregasyonunun yeşil çay ekstraktı ilavesi ile yavaşladığı dinamik ışık saçılımı spektrofotometresi (DLS) ile belirlenmiştir. 

Peynir yapımı aşamasında süte ilave edilen plazmin, olgunlaşma sürecinde YÇE ilavesinden etkilenmemiş; buna karşın kimozin aktivitesi YÇE'li peynirlerde kontrol peynir örneklerine oranla daha düşük seviyede seyretmiştir. Peynir örneklerinde olgunlaşmanın belirteci olarak nitelendirilebilecek pH 4.6'da çözünür azotlu madde analizlerinden elde edilen sonuçlar, YÇE'li peynir örneklerindeki birincil proteolizin kontrol örneklere göre istatistiksel olarak önemli ölçüde düşük olduğunu göstermektedir. Bu verilerin yanısıra, olgunlaşma sürecinde sütün asal proteinlerinden αs1-kazeinin hidrolize uğrama hızının YÇE'li örneklerde daha yavaş olduğu,  β-kazein hidrolizinde ise kontrol ve YÇE'li örnekler arasında önemli bir fark olmadığı üre-PAGE analizleri ile belirlenmiştir. Olgunlaşma sürecinde kazeinlerin proteolizi ile açığa çıkan peptitlerin RP-HPLC ile izlenen profilleri değerlendirildiğinde, YÇE ilavesinin ekstra peptit oluşumuna yol açmadığı ancak bazı peptitlerin oluşum hızını yavaşlattığı sonucuna ulaşılmıştır. Böylelikle, peynirlerde plazmin ve kimozin aktivitesi sonucu elde edilen verilerin de proteoliz süreci ile paralellik gösterdiği belirlenmiştir.

Çalışma kapsamında fenolik bileşiklerin kimozin ve plazmin aktivitesi üzerine etkileri model sistemlerde moleküler düzeyde tanımlanmış, ancak peynir üretimi ve olgunlaşma aşamalarında elde edilen analiz sonuçları model sistemler ile uyumluluk göstermemiştir. Peynir matrisinin olgunlaşma süreci boyunca sürekli değişen parametrelere sahip, dinamik bir yapı olduğu düşünüldüğünde, bu durumun enzim-fenolik etkileşimlerini de önemli oranda etkileyebileceği düşünülmektedir. Yine de, elde edilen veriler ışığında, fenolikçe zenginleştirilmiş süt ürünleri üretiminde, sürece katılan proteolitik enzimler ile fenoliklerin etkileşimlerinin ve bu etkileşimlerin sonuçlarının son derece kritik olduğu düşünülmektedir. 


Anahtar Kelimeler: enzimatik koagülasyon, süt, olgunlaşma süreci, rennet, kimozin, plazmin, enzim inhibisyonu, fenolik

Abstract:
Phenolic compounds have been of great interest to food scientists and technologists due to epidemiologically approved health benefits. There are a number of studies investigating possible use of polyphenols in dairy such as yoğurt, ice cream and cheese for developing final product quality and functionality. Besides, inhibitory properties of several phenolics against diverse enzymes have also been reported. However, the interactions between proteolytic enzymes important for dairy industry and polyphenols have been studied to a lesser extent.

In this thesis, the potential inhibition of plasmin and chymosin via phenolic compounds have been investigated with molecular and kinetic studies and the consequences of changes in enzyme activities during cheesemaking and ripening were evaluated. The findings of this study revealed that, interactions between chymosin and phenolics are not strong enough or/and the possible interactions does not lead a conformational change on active site of chymosin leading to unchanged chymosin activity upon binding of polyphenols. However, ECG, EGCG, QUER, MYR and CURC showed 60, 86, 65, 90, 52 % inhibition against plasmin, respectively. The inhibition ratios, however, diminished to  35, 47, 44, 46 ve 40 % in the presence of milk proteins. Spectroscopic and calorimetric studies showed that, the interactions between inhibitory phenolics and plasmin were dominated by H-bonds and electrostatic attractions which leads to a change in secondary structure elements of plasmin, having more ordered structure upon binding to polyphenols. Inhibition modes of plasmin by EGCG, QUER ve MYR were non-competitive, whereas ECG and CURC showed a mixed-type inhibition against plasmin.

Green tea extract (GTE), as a natural source of phenolics,  was preferred for model cheesemaking and ripening  studies. During cheesemaking, kinetics of rennet coagulation were affected by GTE addition. CMP (caseinomacropeptide) formation rate was found to be decreased by GTE phenolics during enzymatic phase of renneting. In addition, aggregation of para-casein micelles measured by dynamic light scattering spectroscopy (DLS) also retarded in the presence of GTE. 

Plasmin activity did not change in the presence of GTE whereas, residual chymosin activity decreased in GTE-added cheeses, compared to control cheese samples. The results of pH 4.6 soluble nitrogen amount analysis, as an indicator of ripening in cheese, showed that the primary proteolysis in GTE cheeses was hindered to some extent. Besides, urea-PAGE anaylysis revealed that, αs1-casein hydrolysis rate was higher for control cheese samples. However, the difference of β-casein hydrolysis among control and GTE added cheeses was statistially insignificant. RP-HPLC anaylsis was carried out in order to evaluate the peptide profile of cheese samples during ripening period. The results revealed that, green tea phenolics did not cause any change in proteolysis pathway, whereas the formation rate of some peptides were found to be less in the presense of GTE phenolics. These results were in agreement with enzyme activity results during ripening.

The effects of phenolics on plasmin and chymosin activity in model systems were described in molecular level. However, the findings observed during cheesemaking and ripening period were not in agreement with model system studies. Knowing the fact that the structure of cheese matrice during ripening has a dynamic structure due to the changes in many parameters, the phenolic-enzyme  interactions were probably affected during this processes. Nevertheless, in the light of the findings of this study, the interactions between phenolics and the proteolytic enzymes and the consequences of these interactions were thought to be critical. 



Keywords: enzymatic coagulation, milk, ripening period, rennet, chymosin, plasmin, enzyme inhibition, phenolics