Hidatik kist skolekslerinde farklı ajanların in vitro etkilerinin değerlendirilmesi
Evaluation of in vitro effects of different agents on hydatid cyst scolices
Yazar: FURKAN AYAN
Danışman: PROF. DR. ERTAN BÜLBÜLOĞLU
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Genel Cerrahi = General Surgery

Özet:
Amaç: Kist hidatik genellikle Echinococcus granulosus nedeniyle oluşan, insanların tesadüf olarak konak olduğu zoonotik bir hastalıktır. Kist hidatikte en sık tutulan organ karaciğerdir. Semptomlar kist büyüklüğü belli bir boyuta ulaşana kadar genellikle non-spesifik olduğundan tanı koymak güçleşebilmektedir. Tedavi kist boyutu, kist konumu, radyolojik evre, komplikasyon varlığı gibi faktörlere göre değişmektedir. Takip, medikal tedavi, perkütan girişimsel işlemler ve cerrahi tedavi seçenekleri arasında yer almaktadır. Echinococcus granulosus geniş bir coğrafyaya yayılmaktadır ve Türkiye de endemik bölgeler arasında yer almaktadır. Uygulanan tedavilerde nüks oranları değişkenlik gösterebilmektedir. Günümüzde medikal tedavide yaygın olarak kullanılan ilaç albendazoldür. Cerrahi loju, peritoneal boşluğu koruyarak ve kist içinde sterilizasyonu sağlayarak serpilmeyi önlemek, nüks oranlarını azaltmak amacıyla ameliyat sırasında ve perkütan girişimsel işlemlerde skolosidal ajanlar kist içine enjekte edilmektedir. Enjeksiyon için sıklıkla hipertonik salin ve etanol kullanılmakta olup, skolosidal aktivitesi kanıtlanmış farklı ajanlar da mevcuttur. Ancak intra-kistik yapılan enjeksiyonlarda kullanılan ajanların hipernatremi, sklerozan kolanjit, safra yollarında striktür, peritonit, toksisite gibi istenmeyen yan etkileri vardır. İntra-kistik yapılan enjeksiyonda kullanılan ajanın skolosidal aktivitesi yüksek, kısa sürede etkili olması ve istenmeyen yan etkilerinin olmaması gerekmektedir. Bu nedenle yeni skolosidal ajan arayışı halen sürmektedir. Bu kapsamda bitki ekstreleri ve etken maddeleri de değerlendirilmektedir. Özellikle sıtmaya karşı etkinliği gösterilmiş ajanların, Echinococcus türlerine karşı da etkili olabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle tarafımızca, sıtmaya karşı etkisi kanıtlanmış Artemisia annua ve Cinchona officinalis bitki ekstrelerinin skolosidal aktivitesinin araştırılması hedeflenmiştir. Başka parazitlerde etkisi kanıtlanmış Camellia sinensis ve Commiphora molmol bitki ekstreleri de araştırılarak skolosidal ajan arayışına katkıda bulunulmak amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Karaciğerde Gharbi tip 3 hidatik kist ile uyumlu büyük soliter karaciğer kisti olan bir hastanın operasyonda kist içeriği, sıvısı aspire edilerek gavaj enjektöründe toplandı. Kist çatısı açıldıktan sonra kız veziküller açılmayacak şekilde toplanıp izotonik solüsyon ile yıkandı ve deney için ayrıldı. Steril şekilde deney için ayrılan kız veziküller, aspire edilen kist sıvısı içinde açıldı ve ardından bütün kist içeriği cam silindirlerde toplandı. Belli bir süre bekledikten sonra protoskoleksler dibe çöktü ve üst kısımda kalan süpernatant atıldı. Ardından protoskoleksler fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkandı. Protoskolekslerin canlılığını koruduğu hem eozin ile boyanmadığından hem de hareketliliğinden teyit edildi. Yapılan incelemede 200.000/cc protoskoleks sayıldı ve canlılık oranının %95'ten fazla olduğu tespit edildi. Cinchona officinalis, Camellia sinensis, Commiphora molmol bitki ekstreleri tarafımızca hazırlandı ve Artemisia annua bitki ekstresi hazır olarak dışarıdan temin edildi. Her bir bitki ekstresinin 25 mg/ml, 12,5 mg/ml ve 6,25 mg/ml olmak üzere üç farklı konsantrasyonu dimetil sülfoksit'te (DMSO) çözülerek hazırlandı. Negatif  kontrol grubu olarak DMSO, pozitif kontrol grubu olarak %20 hipertonik salin kullanıldı. Test edilecek ajanın üç farklı konsantrasyonundan da 0,05 ml alınarak kuyucuklu plakta sıralandı ve üstlerine 0,05 ml hacminde protoskoleksleri içeren kist sıvısı eklendi. Dört bitki ekstresinin de her bir konsantrasyonu 5 dakika, 15 dakika ve 25 dakika sonunda %0,1 eozin solüsyonu ile birlikte lamlara damlatılarak ışık mikroskobunda sayımlar gerçekleştirildi. Ölen protoskoleksler eozin ile kırmızıya boyanırken, yaşayanlar eozin ile boyanmamaktadır. Her bir deney üç kez tekrarlandı. Işık mikroskobu altında ölü bulunan skolekslerin sayısı, tüm skolekslere oranlanarak skolosidal aktivite yüzdesel olarak hesaplandı.
Bulgular: Camellia sinensis ve Commiphora molmol ekstreleri kullanılan en yüksek konsantrasyonda bile etkin bir skolosidal aktivite gösteremedi. 25 mg/ml'lik Camellia sinensis ekstresi 5, 15 ve 25 dakika sonunda gözlenen skolosidal aktivite ortalaması sırasıyla %46,15, %58,83, %76,81 olarak hesaplandı. 25 mg/ml'lik Commiphora molmol ekstresi ise 5, 15 ve 25 dakika sonunda sırasıyla ortalama %31,51, %34,2, %45,25 oranlarında skolosidal aktivite gösterdi. En yüksek skolosidal aktiviteyi Cinchona officinalis ekstresi gösterdi. 25 mg/ml konsantrasyonda kullanıldığında her zaman diliminde %20 hipertonik salinden daha yüksek oranda etkili olduğu gözlendi. Sırasıyla 5, 15 ve 25 dakika sonunda ortalama %89,08, %95,01 ve %100 skolosidal aktivite gösterdi. %20 hipertonik salinin ortalama skolosidal aktivitesi ise 5. dakika sonunda %62,8, 15. dakika sonunda %76,95 ve 25. dakika sonunda ise %89,65 olarak hesaplandı. Artemisia annua ekstresi ise 25 mg/ml konsantrasyonda 25 dakika sonunda en yüksek etkisine ulaşıp, bu zamandaki ortalama skolosidal aktivitesi %87,25 olarak gözlendi. En zayıf etki negatif kontrol grubu olarak kullanılan DMSO'da gözlendi. 25 dakika sonunda ortalama %15,78 skolosidal aktivite göstererek, açık ara en güçsüz ajan oldu.
Sonuç: Yapılan bu çalışma ile birlikte Cinchona officinalis ve Artemisia annua'nın kist hidatik tedavisinde skolosidal ajan olarak bir alternatif oluşturabileceği in vitro olarak gösterildi. %20 hipertonik salin ile Cinchona officinalis arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamamış olmasına rağmen, 25 mg/ml'lik Cinchona officinalis ekstresi %20 hipertonik salinden üç zaman diliminde de daha aktif oldu ve %100 skolosidal etkiye 25 dakika sonunda ulaşan tek ajan oldu. Skolosidal ajan arayışı için etkili bulduğumuz ajanların, in vivo yapılacak yeni araştırmalar ile desteklenmesi gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: Kist hidatik, kistik ekinokokkoz, karaciğer kisti, in vitro, skolosidal ajan, Cinchona officinalis, Artemisia annua, hipertonik salin, Commiphora molmol, Camellia sinensis

Abstract:
Objective: Hydatid cyst, is a zoonotic disease primarily caused by Echinococcus granulosus, with humans being accidental hosts. The liver is the most commonly affected organ in hydatid cyst disease. Symptoms are usually nonspecific until the cyst reaches a certain size, making diagnosis challenging. Treatment varies depending on factors such as cyst size, location, radiological stage, and the presence of complications. Treatment options include observation, medical treatment, percutaneous interventions, and surgery. Echinococcus granulosus is widely distributed geographically and is endemic also in Turkey. Recurrence rates may vary with different treatment modalities. Albendazole is commonly used in medical treatment today. In surgical interventions and percutaneous procedures, scolicidal agents are injected into the cyst to prevent spillage by preserving the peritoneal cavity and ensuring sterilization within the cyst, aiming to reduce recurrence rates. While hypertonic saline and ethanol are commonly used for injection, other agents with proven scolicidal activity are also available. However, agents used for intra-cystic injections may have undesirable side effects such as hypernatremia, sclerosing cholangitis, biliary strictures, peritonitis, and toxicity. Therefore, the search for new scolicidal agents continues. An ideal scolicidal agent for intra-cystic injections should have high scolicidal activity, rapid effectiveness, and no adverse effects. In this context, plant extracts and their active compounds are also being evaluated. Particularly, agents proven effective against malaria are considered to potentially be effective against Echinococcus species as well. Therefore, our aim was to investigate the scolicidal activity of Artemisia annua and Cinchona officinalis plant extracts, which have shown efficacy against malaria, and also to contribute to the search for scolicidal agents by studying the extracts of Camellia sinensis and Commiphora molmol, which have demonstrated effectiveness against other parasites.
Materials and Methods: The contents of a large solitary hepatic cyst consistent with Gharbi type 3 hydatid cyst were aspirated and collected in a syringe during surgery from a patient. After opening the cyst roof, daughter cysts were collected without opening and were washed with isotonic solution to prepare them for the experiment. Daughter cysts prepared for the experiment were opened within the aspirated cyst fluid and then all cyst contents were collected in glass cylinders. After waiting for a certain period, protoscoleces settled at the bottom, and the supernatant remaining at the top was discarded. Then, protoscoleces were washed three times with phosphate buffered saline (PBS). Their viability was confirmed by their failure to be stained with eosin and their motility. In the examination, 200.000 protoscoleces/cc were counted, and a viability rate of over 95% was determined. Extracts of Cinchona officinalis, Camellia sinensis, Commiphora molmol, and Artemisia annua were prepared by us, and the Artemisia annua extract was obtained ready-made from an external source. Each plant extract was prepared in three different concentrations of 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, and 6,25 mg/ml dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO). DMSO was used as the negative control group, and 20% hypertonic saline was used as the positive control group. 0,05 ml of each concentration of the agent to be tested was dispensed into wells of a well plate, and 0,05 ml of cyst fluid containing protoscoleces was added on top. The counts were performed by dropping 0,01% eosin solution onto slides together with each plant extract at 5, 15, and 25 minutes under a light microscope. Dead protoscoleces were stained red with eosin, while live ones remained unstained. Each experiment was repeated three times. The number of dead scoleces found under the light microscope was calculated as a percentage to all scoleces to determine the scolicidal activity.
Results: Extracts of Camellia sinensis and Commiphora molmol showed no effective scolicidal activity even at the highest concentration used. The average scolicidal activity observed after 5, 15, and 25 minutes of using 25 mg/ml of Camellia sinensis extract was calculated as 46,15%, 58,83%, and 76,81% respectively. Similarly, 25 mg/ml of Commiphora molmol extract showed scolicidal activity at rates of 31,51%, 34,2%, and 45,25% after 5, 15, and 25 minutes respectively. The highest scolicidal activity was demonstrated by Cinchona officinalis extract. When used at a concentration of 25 mg/ml, it was observed to be consistently more effective than 20% hypertonic saline at all time intervals. At 5, 15, and 25 minutes, it showed an average scolicidal activity of 89,08%, 95,01%, and 100% respectively. The average scolicidal activity of 20% hypertonic saline was calculated as 62,8% at 5 minutes, 76,95% at 15 minutes, and 89,65% at 25 minutes. Artemisia annua extract reached its highest effectiveness at 25 minutes with an average scolicidal activity of 87,25% at a concentration of 25 mg/ml. The weakest effect was observed in the negative control group using DMSO, showing an average scolicidal activity of 15,78% at 25 minutes, making it by far the least effective agent.
Conclusion: This in vitro study demonstrates that Cinchona officinalis and Artemisia annua could serve as alternatives as scolicidal agents in the treatment of hydatid cysts. Although no statistically significant difference was found between Cinchona officinalis and 20% hypertonic saline, 25 mg/ml of Cinchona officinalis extract was consistently more active than 20% hypertonic saline at all three time intervals and was the only agent to achieve 100% scolicidal efficacy at 25 minutes. In the search for new scolicidal agents, the agents we find effective need to be supported by new in vivo studies.
Keywords: Hydatid cyst, cystic echinococcosis, liver cyst, in vitro, scolicidal agents, Cinchona officinalis, Artemisia annua, hypertonic saline, Commiphora molmol, Camellia sinensis