İşlenmiş sığır eti ürünlerinde çoklu gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) yöntemi ile tek tırnaklı hayvan etinin belirlenmesi için metot geliştirilmesi
Development of a multiplex real time pcr assay for detection and quantification of equine meat in processed bovine meat products
Yazar: SEVDA GÖKBORA
Danışman: PROF. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Et, özellikle esansiyel aminoasitler, zengin vitamin, mineral ve yağ içeriği ile birlikte insan beslenmesindeki en önemli temel gıda maddelerinden birisidir. Dünya nüfusunun giderek artması ile birlikte, gıda maddelerine ve dolayısıyla et ve et ürünlerine olan talep giderek artmaktadır. Dünyada nüfus artışının en hızlı olduğu ülkelerden biri olan Türkiye'de de sağlıklı ve dengeli beslenmenin sağlanabilmesi için kırmızı et tüketimi büyük önem taşımaktadır. Günümüzde et ürünlerinde en sık karşılaşılan problem tağşiş ve orijinalliktir. 
2000-2015 yılları arasında Türkiye,  İrlanda ve Meksika'yı da kapsayan dünyanın çeşitli bölgelerinde et ürünlerinde yüksek oranda yanlış etiketleme vakaları rapor edilmiştir. Farklı hayvan türlerine ait etler sucuk, salam, sosis ve köfte gibi ürünlere katıldıklarında tüketiciler tarafından algılanması zordur. Etlerin başka etlerle karıştırılıp tüketime sunulması gıda güvenilirliği konusunda halkı endişelendiren konuların başında gelmektedir. Et ürünlerinde kullanılan et türlerinin tanımlaması ve etiketin doğrulanması, ekonomik sebepler, din ve sağlıkla ilgili faktörler ve haksız rekabetin önlenmesi açısından önemlidir.  
Yapılan bu çalışmada at ve eşek mitochondri sitokrom b (cytb) genine spesifik primerler kullanılarak Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (GZ-PZR) yöntemi ile hem tür tayini hem de miktar analizine olanak sağlayan bir metot geliştirilmiştir. Referans olarak sığır eti içinde bilinen miktarlarda at ve eşek eti bulunan üçlü et karışımları hazırlanmış ve DNA izolasyonları yapılmıştır. DNA dilüsyon serilerinin kalıp olarak kullanıldığı at ve eşek primerleri ile tekli, ikili ve üçlü reaksiyonlar hazırlanmış ve %0,05 ile %50 aralığında yüksek lineer korelasyon değerine ve reaksiyon verimliliğine sahip kalibrasyon eğrileri elde edilmiştir. Ayrıca, at ve eşek eti için önceden doğrulanmış bir metotla analiz edilen 40 adet işlenmiş et örneği, geliştirilen kantifikasyon yöntemi ile yeniden analiz edilmiştir. Örneklerin 15'i at ve eşek eti için pozitif sonuç veren örneklerdir. Nicel yöntem, işlenmiş et ürünlerinde at ve eşek etini % 1-50 seviyesinde belirleyebilmiştir. Sonuçlar, ülkemizde teftişlerin ve güvenilir analiz yöntemlerinin önemini bir kez daha göstermiştir.Elde edilen sonuçlar, ülkemizde denetimlerin ve güvenilir analiz yöntemlerinin ne kadar önemli olduğunu bir kez daha göstermiştir. 
Sonuç olarak, işlenmiş sığır etine karıştırılması muhtemel at ve eşek etlerinin tespiti için,  kolay, hızlı, güvenilir ve kantitatif bir GZ-PZR yöntemi geliştirilmiştir. Ayrıca, yüzde % 0,3 oranında tespit, %1 oranında miktar tayini yapılabildiğinden gerçek bir tağşiş mi yoksa metottan kaynaklı yanlış pozitif sonuç mu olduğu konusunda bu yöntem ile doğru sonuç elde edilebilmektedir.

Abstract:
Meat is one of the most important foodstuffs in human nutrition, especially in terms of its highly rich content of essential amino acids, vitamins, minerals and fat. With the gradual increase of the world population, the demand for foodstuffs and therefore meat and meat products is also steadily increasing. As one of the countries with the fastest growing population in the world, Turkey, too, the consumption of red meat is of utmost importance in order to ensure a healthy and balanced diet. Today, the most common problem in meat products is adulteration and originality. 
In various regions of the world including Turkey , Ireland and Mexico, a high rate of mislabeling cases of meat products have been reported between 2000-2015. For customers, it is difficult to perceive the meat of different animal species when they are mixed in products such as sausage, salami, and meatballs. The fact that meat is mixed with other meats and presented for consumption is one of the issues that worries the public about food adultaration. Identification of the meat source in meat products and verification of the label are important in terms of economic reasons, religion and health related factors as well as the frouds. 
In this study, a method has been developed which allows both species identification and quantitative analysis by using Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real Time PCR) method using specific primers for horse and donkey mitochondrial cytochrome b (cytb) gene. As a reference, triple meat mixtures containing horse and donkey meat were prepared in known quantities in bovine meat and DNA isolations were performed. Single, double and triple reactions were prepared with horse and donkey primers in which DNA dilution series were used as template, and the calibration curves with high linear correlation value and reaction efficiency between 0.05% and 50% were obtained. Furthermore, forty processed meat samples which already analyzed for horse and donkey meat by a validated method were re-analyzed by the quantification method developed. Fifteen out of forty samples were positive for horse and donkey meat. The quantitative method was able to determine the horse and donkey meat at the level of 1- 50% in a processed meat. The results have once again shown the importance of inspections and reliable methods of analysis in our country.
As a result, an easy, fast, reliable and quantitative Real-Time PCR method has been developed for the detection of possible horse and donkey meats. In addition, with value of 0.3% and 1% of LoD and LoQ, respectively, it is possible to obtain correct results with this method as to whether it is a real adulteration or a false positive result due to the used method.