Tebukonazolün Fusarium referans suşları üzerindeki etkisinin hücresel ve moleküler gösterimi
Cellular and molecular display of the effect of tebuconazole on Fusarium reference strains
Yazar: ÖZLEM SEFER
Danışman: PROF. DR. GÜLRUH ALBAYRAK ; DOÇ. DR. EMRE YÖRÜK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu yüksek lisans tezi kapsamında tarım alanlarında sıklıkla kullanılan tebukonazol aktif maddesinin F. graminearum PH-1ve F. culmorum FcUK99 referans suşlarında moleküler ve hücresel seviyedeki etkileri araştırılmıştır. 
Bu amaçla referans suşlarının agar dilüsyon tekniği ile tebukonazol uygulanarak suşların üremesini %50 oranında düşüren etkili konsantrasyon (EC50) değeri belirlendi. PH-1 suşunun EC50 değeri 0.94µg/mL iken FcUK99 suşunu EC50 değerinin 0.8 µg/mL olduğu tespit edildi. cyp51A geninin varlığı ve dizilimi her iki izolatta dizilenerek dizi varyasyonu ile etki mekanizması arasındaki ilişki irdelendi.  EC50 değerine göre aktif maddenin Fusarium türleri üzerinde hücre canlılığına etkisi WST-1 analizi ile araştırıldı ve PH-1 suşunda %57.43 oranında, FcUK99 suşunda %64.24 oranında canlılığın baskılandığı görüldü. Floresan mikroskop analizlerinde tebukonazolün apoptotik sürece katkısı akridin turuncusu/etidyum bromür (AO/EB) ikili boyaması yapılarak araştırılırken, oksidatif stres üzerindeki etkinliği ise 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) tekli boyaması ile incelendi. Bununla birlikte katalaz aktivitesinin F. culmorum ve F. graminearum'da sırasıyla 3.076 ve 4.062 kat arttığı tespit edildi.  Aktif maddenin hedef geni olan cyp51A ile Fusarium türleri için elzem olan mgv1 genlerinin anlatımında meydana gelen değişimler gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (ing., "quantitative polymerase chain reaction; qPCR,) ile araştırıldı. Ortalama E değeri 2.04±0.03 olarak hesaplandı. cyp51A geninin anlatımının FcUK99 suşunda 7.426±0.48, PH-1 suşunda 15.47±0.75 kat arttığı tespit edildi. mgv1 geninin anlatımında da artış görülmüş olup FcUK99 için  3.056±0.16, PH-1 için ise 2.113±0.04 kat olduğu hesaplandı. Bu çalışmadan elde edilen bulgular, tebukanozolün apoptoz ve oksidatif stres oluşturarak Fusarium hücrelerine zarar verdiğini ve iki farklı türde bilinen inhibisyon mekanizması dışındaki hücresel ve moleküler etkilerini anlamamızı sağlayacak veri oluşturmuştur. Çalışmadan elde edilen bulgular, Fusarium patojenleriyle mücadelede kullanılacak stratejiler için değerli veriler sunmaktadır.

Abstract:
In the master thesis, the effect of tebuconazole active substance, which is frequently used in agricultural fields, on F. graminearum PH-1 and F. culmorum FcUK99 reference strains were investigated at molecular and cellular levels.
In this context, the effective concentration (EC50) value, which reduces the growth by 50%, was determined by applying tebuconazole to reference strains with agar dilution technique. The EC50 value was calculated 0.94µg/mL for the PH-1 strain while the EC50 value for FcUK99 was detected 0.8µg/mL. After the presence of the cyp51A gene was determined and sequenced in both isolates, the relationship between the sequence variations and the mechanism of action of tebuconazole was examined. After the presence and sequence of the cyp51A gene were sequenced in both isolates and the relationship between sequence variation and mechanism of action was investigated. According to EC50 value, the effect of active substance on cell viability on Fusarium species was investigated by WST-1 analysis. It was observed that cell viability was suppressed at a rate of 57.43% in PH-1 and 64.24% in FcUK99. In fluorescence microscopy analysis, the effect of tebuconazole on the apoptotic process was revealed by performing with acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) dual staining and on oxidative stress with 2', 7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) single staining. Moreover, it was determined that catalase activity increased 3.076 and 4.062 times in F. culmorum and F. graminearum, respectively. Changes in expression of cyp51A, which is the target gene of the active substance, and mgv1, which is an essential for Fusarium species, were detected by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). The average E value was calculated as 2.04 ± 0.03. It was calculated that cyp51A gene expression increased 7.426 ± 0.48 fold in FcUK99 and 15.47 ± 0.75 fold in PH-1 strains. At the same time, increase in the expression of the mgv1 was also detected. Values were found as 3.056 ± 0.16 fold for FcUK99 and 2.113 ± 0.04 fold for PH-1. The findings revealed that tebucanozole was effective on the viability of Fusarium species both by activating the apoptotic process and by causing oxidative stress. It also enabled us to understand the cellular and molecular mechanisms of this active compound beside its known inhibition effect. Therefore, the data obtained from the master's thesis has a high potential to be used in the fight against Fusarium pathogens in plant pathology field.