Sinop ili deniz suyu ve kara midye (Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819)'nin mikrobiyolojik analizi ve izole edilen Escherichia coli suşlarının moleküler karakterizasyonu
Microbiological analysis of seawater and black mussels (Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819) of Sinop province and molecular characteriziation of isolated Escherichia coli strains
Yazar: CUMHUR AVŞAR
Danışman: DOÇ. DR. İSMET BERBER
Sinop Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Elektroforez-poliakrilamid jel = Electrophoresis-polyacrylamide gel ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Fekal kirlilik = Fecal pollution ; Fekal streptokok = Fecal streptococcus ; Mikrobiyal duyarlılık testleri = Microbial sensitivity tests ; Mikrobiyal kirlilik = Microbial contamination ; Mikrobiyolojik analiz = Microbiological analysis ; Mytilus galloprovincialis =   ; Plazmit DNA = Plasmit DNA ; RAPD-PCR = RAPD-PCR

Özet:
Kıyı sularında fekal koliform ve fekal Streptococcus kontaminasyonu bütün dünyada yaygın bir halk sağlığı sorunudur. Bu çalışmada, Mayıs-2011 ve Ekim-2011 tarihleri arasında Sinop ilinde belirlenen 15 farklı istasyondan alınan deniz suyu ve midye (Mytilus galloprovincialis) örneklerinin fiziko-kimyasal ve mikrobiyolojik analizleri yapıldı. Ayrıca, bu örneklerden izole edilen 40 yerel ve 1 adet referans olmak üzere toplam 41 adet Escherichia coli suşunun; fenotipik karekterizasyonu, antibiyotik duyarlılıkları, toplam hücre ve hücre dışı protein profilleri, plazmid DNA profilleri ve rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA (RAPD) yöntemlerine göre karakterizasyonu gerçekleştirildi.Yapılan mikrobiyolojik analizler, deniz suyu ve midye örnekleri için bazı istasyonların fekal koliform ve fekal streptokok sayılarının tavsiye edilen değerlerin üzerinde olduğunu gösterdi. Farklı istasyonlardan alınan deniz suyu örneklerinin mikrobiyolojik analizleri; her bir istasyon için toplam koliform, fekal koliform ve fekal streptokok sayıları arasındaki farkın önemli (p<0.05) olduğu, toplam aerop bakteri sayıları için ise anlamsız (p>0.05) olduğunu ortaya koydu. Ayrıca, farklı istasyonlardan toplanan midye örnekleri için yapılan tüm sayım sonuçları arasındaki farkın anlamsız (p<0.05) olduğu da tespit edildi.Morfolojik ve fizyolojik özelliklerine göre, bütün yerel izolatların E. coli türüne ait oldukları belirlendi. Bütün suşların 7 farklı antibiyotiğe karşı duyarlılıkları disk difüzyon yöntemi kullanılarak test edildi. Antibiyogram sonuçlarına göre, suşlardaki antibiyotik dirençliliği; basitrasin (%100), novobiyosin (%100), ampisilin (%12.5), tetrasiklin (%7.5), seftazidim (%5) ve imipenem (%2.5) olarak belirlendi. Buna karşın, suşların hepsinin polimiksin B (%100)'ye duyarlı oldukları da bulundu.Toplam hücre protein profilleri (41 adet E. coli) esas alınarak yapılan nümerik analiz, E. coli suşlarının benzerlik düzeyi %72, %78 ile %87 ve üzerinde iki major gruba ayrıldığını ortaya koydu. Ayrıca, suşların hücre dışı protein profilleri (31 adet E. coli) esas alınarak yapılan nümerik analizde ise benzerlik düzeyi %75 ile %78 ve üzerinde iki major grup oluşturdu. Sonuçta, hücre dışı protein profillerinin toplam hücre protein profillerine göre daha iyi ayırım sağladığı belirlendi.Plazmid DNA analiz sonuçları, suşların 22 tanesinde moleküler ağırlığı 24.500-1.618 bp arasında değişen farklı plazmidlerin varlığını doğruladı. Bu suşların 21 tanesinde moleküler ağırlığı 14.700 bp olan plazmidin ortak olduğu bulundu.Araştırmada izole edilen 20 adet E. coli suşunun RAPD tekniği ile 2 farklı primer kullanılarak elde edilen bantların UPGMA metoduna göre nümerik analizleri yapıldı. RBM-6 primeri kullanılarak oluşturulan dendrogram, bant üreten toplam 13 suşun benzerlik düzeyi %12 ve üzerinde 2 major gruba ayrıldığını ortaya koydu. COL-I primeri kullanılarak oluşturulan dendrogram ise bant üreten toplam 14 suşun benzerlik düzeyi %26 ve üzerinde yine 2 major gruba ayrıldığını gösterdi.Sonuç olarak, bu çalışmada bazı istasyonlarda alınan su ve midye örneklerinin mikrobiyolojik analiz sonuçları, istasyonlardaki mikrobiyal kirlilik düzeyinin ciddi boyutlara ulaştığını gösterdi. Ayrıca, bu çalışmada izole edilen E. coli suşlarının ayırımında morfolojik ve fizyolojik özellikler, SDS-PAGE tekniğiyle elde edilen toplam hücre ve hücre dışı protein profillerinin nümerik analizi tür seviyesinde yeterli olurken, tür altı düzeyde ayırım için RAPD-PCR tekniğinin daha faydalı ve hızlı bir yöntem olduğu belirlendi.Anahtar kelimeler: Fekal koliform, E. coli, Antibiyogram, SDS-PAGE, Protein Profilleri, Plazmid, RAPD-PCR

Abstract:
Fecal coliform and fecal streptococcus contamination at coastal waters is one of the common problems of public health all over the world. In this study, the physico-chemical and microbiological analysis of seawater and mussel (Mytilus galloprovincialis) samples collected from 15 different stations in Sinop between May-2011 and October-2011 were investigated. The characterization of a total of 41 strains of Escherichia coli including 40 native isolates and 1 reference strain also were carried out according to phenotypic characterization, antibiogram, whole cell and extracellular protein profiles, plasmid DNA profiles and randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method.According to microbiological analyses, it was shown that the numbers of fecal coliform and fecal streptococcus for the seawater and mussel samples were over recommended values in some stations. Further, the microbiological analyses of seawater examples collected from different stations showed that the difference between total coliform, fecal coliform and fecal streptococcus numbers (p<0.05) was significant for each station, while the difference was not significant for total aerobe bacteria numbers (p>0.05). In addition, the difference between whole counting results for mussel samples collected from different stations was not significant (p<0.05), too.According to morphological and physiological properties, it was determined that the native isolates belonged to E. coli species. The antibiotic susceptibility of all strains against 7 standard drugs was tested using disc diffusion method. In accordance with the result of antibiogram, the antibiotic resistivities of the isolates were as bacitracine (100%), novabiosin (100%), amphicilline (12.5%), tetrasiklin (7.5%), seftazidim (5%) and imipenem (2.5%), respectively. On the other hand, it was found that whole strains were susceptible to polimiksin B (100%).The numerical analysis of whole cell protein profiles revealed that E. coli strains were separated to 2 major groups at similarity levels of 72%, 78% and 87% or above. Moreover, the numerical analysis of extracellular protein profiles of strains were generated 2 major groups at similarity levels of 75%, 78% or above. Eventually, it was pointed out that extracellular protein profiles provided better distinction than whole cell protein profiles.Plasmid DNA analyses results confirmed that 22 strains consisted of plasmids molecular weight changing between 24.500-1.618 bp. The plasmid molecular weighing 14.700 bp was found as common 21 of these strains.A numerical analysis of the DNA band profiles obtained by using 2 different primers of 20 E. coli strains was carried out by using UPGMA method. A dendrogram generated by using RBM-6 primer revealed that 13 strains produced bands divided into 2 major clusters at similarity levels of 12% or above. However, a dendrogram generated by using COL-I primer displayed that 14 strains produced bands scattered into 2 major clusters at similarity levels of %26 and over.Consequently, in the study, the microbiological analysis results of the samples of seawater and mussel collected from some stations indicated that microbial pollution degree had reached to serious size. It was also determined that while the morphological and physiological properties, the numerical analysis of whole cell and extracellular protein profiles produced by SDS-PAGE technique at the discrimination of isolated E. coli strains was enough at the species level, RAPD-PCR technique can be provide fast and more useful differentiation at the strain level.Keywords: Fecal coliform, E. coli, Antibiogram, SDS-PAGE, Protein Profiles, Plasmid, RAPD-PCR