Karbapeneme dirençli klebsiella pneumoniae suşlarında direnç genleerinin belirlenmesi ve direnç plazmitlerinin polimeraz zincir reaksiyonu temelli  replikon tiplendirmesi
Characterization of resistance genes and polymerase chain reaction based replicon typing in carbapenem resistant klebsiella pneumoniae, department of clinical microbiology
Yazar: FATMA ERDEM
Danışman: PROF. DR. ZERRİN AKTAŞ
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Elektroforez-agar jel = Electrophoresis-agar gel ; Genler = Genes ; Karbapenemler = Carbapenems ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae ; Plazmitler = Plasmids ; İlaç alerjisi = Drug hypersensitivity ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
1500 yataklı İstanbul Tıp Fakültesi hastanesinde,  2012-2016 yılları arasında  yatan hastaların  çeşitli klinik örneklerinden izole edilen ve disk difüzyon yöntemi ile ertapenem, meropenem veya imipeneme dirençli bulunan  toplam 50  K. pneumoniae izolatı çalışmaya alındı. 
Suşların antibiyotik duyarlılıkları başlangıçta disk difüzyon yöntemi ile CLSI kriterlerine uygun olarak araştırıldı. Karbapenem grubu antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri gradiyent test ve mikrodilüsyon yöntemleri ile belirlendi. Karbapenemaz aktivitesini saptamaya yönelik fenotipik yöntemlerden;  çift disk sinerji testi (ÇDS), boronik asit çift disk sinerji testi, metallo beta laktamaz E test (MBL)  ve modifiye hodge testi (MHT)  uygulandı. Genotipik testlerde; antibiyotik direncinden sorumlu olan Sınıf A (KPC, GES), sınıf B  (IMP, VIM, NDM, SPM ve SIM), sınıf D karbapenemazlardan OXA beta laktamaz genleri (OXA-23, OXA-24, OXA-51, OXA-58 ve OXA-48), CTX-M, TEM, SHV beta laktamazları ve kazanılmış AmpC beta laktamaz üretiminden sorumlu genler polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) deneyleri ile araştırıldı. Plazmit tiplendirmesi  polimeraz zincir reaksiyonu temelli replikon tiplendirmesi (PBRT) ile yapıldı. Suşlar arasındaki klonal ilişki Pulsed Field Jel Elektroforez (PFGE) yöntemi ile araştırıldı. Ayrıca kolistine dirençli bulunan bir suşa tam genom dizi analizi, plazmit dizi analizi ve Multi Lokus Sekans Tiplendirme (MLST) yöntemi uygulandı. 
Karbapenemlerin MİK değerleri; ertapenem için 2- >32 mg/L, meropenem için 0.5 - >32 mg/L, imipenem için 0.5 - >32 mg/L ve doripenem için 0.5 ->32 mg/L arasında bulundu. K. pneumoniae izolatlarının %86 (n=43/50)'sı OXA-48 tipi karbapenemaz geni taşırken, %14 (n=7/50)'ünde NDM tipi karbapenemaz varlığı tespit edildi. Araştırılan karbapenem direncinden sorumlu diğer genlerin varlığı saptanmadı.  Suşların   %62 (n=31)'sinde TEM, %78 (n=39)'inde SHV, %50 (n=25)'sinde CTXM-1, %10 (n=5)'inde CTXM-2 tipi beta- laktamaz saptandı. Suşların %42 (n=21)'sinde  CTXM -1 ve SHV, %56 (n=28)'sında TEM ve SHV, %38 (n=19)'inde CTXM-1 ve SHV, %36 (n=18)'sında  TEM, SHV, CTXM-1, %10 (n=5)'nunda CTXM-1 ve CTXM-2 tipi beta laktamaz birlikte saptanmıştır. Bu çalışmada 66, 69, 76, 77 ve 78 no'lu suşlar, NDM veya OXA-48 genleriyle birlikte SHV, CTX-M-1 ve CTX-M-2 grubu direnç genlerini taşıyan hibrit suşlar olarak tanımlandılar. Suşların hiçbirinde multipleks PZR yöntemi ile plazmidik AmpC genleri (FOX, CIT, MOX, DHA, ACC, EBC) saptanmadı. Plazmit tiplendirme yöntemleri ile 50 izolatın %50 (n=25)'sinde IncR tipi replikon saptanırken,  %40 (n=20)'ında   IncA/C tipi replikon, %18(n=9)'nde IncFIIK tipi replikon bulunmuştur. On suş ise  PBRT ile tiplendirilememiştir. Transformasyon deneyleri sonucunda OXA-48 geninin FIIk plazmiti üzerinde alıcı hücreye transfer edildiği tespit edilmiştir. R plazmitinin OXA-48 genini aktarmadığı gösterilmiştir. İzolatların PFGE sonuçlarına göre 10 farklı küme ve 46 farklı genotip  saptandı. Baskın klon ya da salgın tespit edilmedi. D kümesinde iki suş, F kümesinde iki suş klonal olarak ilişkili bulundu. Bir numaralı suşa yapılan tam genom dizi analizi sonucunda Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286 ile %100 benzer olduğu tespit edildi. Suşun  OXA-181, CTXM-15, NDM, arr-3, aac(6′)-Ib-cr, rmtF ve  catB1genlerini taşıdığı belirlendi. NDM geninin plazmit üzerinde taşındığı plazmit dizi analizi ile gösterildi. ISEcp1  üzerinde üç kopya OXA-181 ve bir kopya CTXM-15 bulunduğu gösterildi. MLST analizi sonucunda suşun ST14 sekans tipinde  olduğu belirlendi. 
Bu çalışma sonuçlarına göre, hastanemizde OXA-48 karbapenemaz enziminin en yaygın karbapenemaz tipi olduğu tespit edildi, NDM-1 tipi karbapenemaz enzimini taşıyan suş oranında  artış olduğu gözlendi. OXA-48 ve  NDM-1 tipi karbapenemazların plazmit üzerinde taşındığı transformasyon, tam genom ve plazmit genom dizi analizi  çalışmaları ile  gösterildi. Bu çalışmada tam genom dizi analizi  ilk defa uygulanmış ve kolistin direncine de neden olan ve OXA-181 tipi karbapenemaz enziminin varlığı Türkiye'den ilk defa bildirilmiştir. Bu çalışma sonuçları uzun dönemde çok merkezli moleküler epidemiyoloji çalışmalarının yapılması gerekliliğini ortaya koymaktadır.

Abstract:
The clinical isolates of Klebsiella pneumoniae were obtained from 1500 inpatients in Istanbul Faculty of Medicine. Therefore, 50 isolates of K. pneumoniae isolated from various clinical samples between 2012 and 2016 that were found resistant against ertapenem, meropenem or imipeneme using disc diffusion, were included in the study. 
First, antibiotic sensitivity of strains were investigated in accordance with the Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) criteria using disc diffusion. Minimum inhibitor concentration (MIC) values of carbapeneme group antibiotics were identified using the gradiant test and a microdilution assay. The phenotype tests of double-disc synergy, boronic acid double-disc synergy, metallo-beta-lactamase E test, and the modified Hodge test (MHT) were performed to identify the carbapenemase activity. Class A (KPC, GES), Class B carbapenemases (IMP, VIM, NDM, SPM, SIM), OXA beta lactamase genes (OXA-23, OXA-24, OXA-51, OXA-58 and OXA-48) from Class D carbapenemases, CTX-M, TEM and SHV beta lactamases, and genes responsible for the reproduction of the acquired AmpC beta lactamase enzymes were investigated by performing polymerase chain reaction (PCR) experiments. Plasmid typing was performed using PCR-based replicon typing. The clonal relationship between the strains were investigated using pulse-field gel electrophrosesis. In addition, complete genome sequence analysis and multilocus sequencing analysis were used on strains found resistant against colistin. The MIC values of carbapenemes were as follows: 2 - >32 mg/L for ertapenem, 0.5 - >32 mg/L for meropenem, 0.5 - >32 mg/L for imipenem, and 0.5 - >32 mg/L for doripenem. OXA–48-type carbapenemase-type genes were detected in 86% (n=43/50) of K. pneumoniae isolates, whereas NDM-type carbapenemase genes were detected in 14% (n=7/50) of the isolates. No other genes responsible for carbapeneme resistance were detected. TEM in 62% (n=31), SHV in 78% (n=39), CTXM-1 in 50% (n=25), and CTXM–2-type beta-lactamase in 8% (n=4) of the strains were detected. CTXM -1 and SHV in 42% (n=21), TEM and SHV in 56% (n=28), CTXM-1 and SHV in 38% (n=19), and TEM, SHV, CTXM-1 in 36% (n=18) and in 10%(n=5) CTXM-1 and CTXM-2 of the strains were found concomitant. No of 66, 69, 76, 77, 78 strains producing SHV, CTXM-1 and CTXM-2 concomitant in addition to OXA-48 or NDM-1 were described as hibrid strains. No plasmidic AmpC genes (FOX, CIT, MOX, DHA, ACC, EBC) were detected in multiplex PCR. Inc R-type replicon was detected in 50% (n=25) of 50 isolates with plasmid typing, whereas IncA/C-type replicon in 40% (n=20), and Inc FIIK-type replicon was detected in 18% (n=9) of the isolates. Ten strains could not be classified in any type. Outcomes of the transformation experiments revealed that OXA-48 gene was carried to the receiver cell on FII plasmids, and plasmid R did not transfer the OXA-48 gene. Ten different groups and 46 different genotypes were detected through the PFGE results of the isolates. No dominant clone or epidemia were detected. Two strains in group D and 2 strains in group F were found clonally-related. Strain number 1 was found 100% identical to Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286 according to the outcomes of complete genome sequence analysis, and the strain carried the genes OXA-181, CTXM-15, NDM, arr-3, aac(6′)-Ib-cr, rmtF and catB1. The outcomes of the study showed that NDM-type carbapenemase gene was carried on the plasmid. Three copies of OXA-181 and one copy of CTXM-15 were proven to be on ISEcp1. Outcomes of MLST analysis revealed that the strain was a ST14 sequence-type strain. 
In conclusion, OXA-48 carbapenemase was detected as the most prevalent type of enzyme in our hospital, and presence of NDM–1-type carbapenemase carrying strain and an increase in their rate were detected. Transformation and complete genome analysis studies proved that OXA-48 and NDM–1¬-type carbapenemases were carried on plasmids. Complete genome sequence analysis was performed for the first time in our laboratory in this study. The present study is the first Turkish report of OXA–181-type carbapenemase causing colistin resistance. Our findings suggest that there is a need for long-term multi-centered molecular epidemiologic studies.