Akciğer havayolu modellemesine yönelik oluşturulan deselülerize doku iskeleleri ile 3B hücre kültür sistemlerinin kurulması
Establishment of 3B cell culture systems with decellularized scaffolds for lung airway modeling
Yazar: SEÇİL SUBAŞİ
Danışman: DOÇ. DR. İBRAHİM ÇAĞATAY KARAASLAN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Akciğerler, hücreler için gerekli oksijeni sağlamak ve metabolik olaylar sonucu oluşan karbondioksiti dışarı taşıma görevine sahiptir. Soluk alıp-verme olarak isimlendirdiğimiz bu süreç boyunca akciğerler, proteaz özelliğe sahip alerjen, virüs, bakteri, hava kirliliğine neden olan partiküller, sigara dumanı ve toksik kimyasallar gibi birçok zararlı madde ile karşılaşır. Havayoluna giren bu zararlı maddeler epitel hücre bütünlüğünü sağlayan sıkı bağlantı molekülleri üzerinde yıkıcı etki göstererek yapısal bütünlüğünün bozulmasına yol açar ve epitel bariyer hasarına neden olur. Çevresel etkenler ve genetik yatkınlıklar, astım, KOAH gibi kronik havayolu hastalıklarının ortaya çıkmasına neden olmakta ve hastalık şiddetinin artması veya azalmasında rol almaktadır. Kronik havayolu hastalıkları nedeniyle her yıl binlerce kişi hayatını kaybetmektedir. Bu hastalık mekanizmalarının anlaşılması ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi için çeşitli deneysel modellere ihtiyaç duyulmaktadır. Son yıllarda hızla gelişen rejenaratif tıp ve doku mühendisliği uygulamaları hastalık mekanizmalarının anlaşılması ve geliştirilmesinde önemli bir yere sahip olmuştur. Doku mühendisliği uygulamalarından biri olan doku ve organ deselülerizasyon (hücresizleştirme) yöntemi uzun zamandır hem deney hayvanlarında pre-klinik çalışmalar hem de klinik uygulamalarda başarılı şekilde kullanılmaktadır. Dokunun sahip olduğu doğal ekstraselüler matriks bileşeninin korunarak, olası immün yanıt hücrelerin uzaklaştırılmasıyla elde edilen deselülerize iskeleler, hücre kültür sistemlerinin geliştirilmesi için in vitro ortamlarda kullanılabildiği gibi donör organ yetersizliğini karşılamak amacıyla in vivo çalışmalarda kullanılabilecek olması bakımından oldukça önemlidir. Akciğer transplantasyonu için her zaman sağlıklı donör akciğerleri kullanıldığından; doku mühendisliği çalışmaları için üzerinde çeşitli hücre popülasyonlarının tutunup büyüyebileceği alternatif akciğer kaynaklarına ihtiyaç vardır. 
Bu tez çalışması kapsamında, insan akciğerine ksenojenik bir alternatif olarak hali hazırda bulunan koyun akciğeri önerilmiştir. Çalışmada koyun akciğer dokusu üzerinde fiziksel ve kimyasal deselülerizasyon yöntemleri uygulanarak doku iskelesi üretimi gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında karıştırma/çalkalama tekniğiyle SDS, Triton X-100 ve CHAPS gibi akciğer deselülerizasyonunda yaygın olarak kullanılan deterjanların yanında Sodyum kolat hidrat, NP-40 ve ASB-14 gibi akciğer deselülerizasyonunda kullanılmamış olan deterjanlarla akciğer dokusu için optimum bir hücresizleştirme metodu oluşturulması amaçlanmıştır. Fiziksel deselülerizasyon yöntemi olarak sCO2 kullanılmıştır. Fiziksel ve kimyasal yöntemlerle elde edilen sonuçlar karşılaştırılarak her iki metodun koyun akciğeri üzerindeki etkisi ortaya konulmuştur.
Çalışmanın ikinci aşamasında ise elde edilen hücresizleştirilmiş akciğer doku iskelelerinin karakterizasyonu ve hidrojel sentezi gerçekleştirilmiştir. Karakterizasyon için öncelikli olarak deselülerize edilmiş ekstraselüler matriksin içerdiği DNA'nın doğal dokuya oranla yapıdan ne kadar uzaklaştırıldığı nicel olarak tayin edilmiştir. Ardından histolojik boyama yöntemiyle dokular nitel olarak değerlendirilmiştir. Doku iskelelerinde kalan kolajen, glukozaminoglikan (GAG) ve elastin oranlarına bakılarak nicel analizlerle etkinlikleri araştırılmıştır. Elde edilen iskelelerin yüzey karakterizasyonu için SEM görüntüleme analizleri yapılmıştır. Bu analiz sonucunda etkili olan koşula ait dokulardan hidrojel sentezi ve karakterizasyonu yapılarak, hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
Karakterizasyon işlemi sonucunda akciğer deselülerizasyonu üzerinde etkili olan ASB-14, sodyum kolat hidrat ve SDS deterjanlarıyla yapılan yöntemler seçilmiştir. Bu yöntemler içerisinde ASB-14 ile elde edilen deselülerize dokudan hidrojel sentezi gerçekleştirilerek üzerine BEAS-2B hücre ekimi yapılmış ve ALI kültür üzerinde hücre çoğalması ve farklılaşması değerlendirilmiştir.

Abstract:
The lungs have the task of providing the necessary oxygen for the cells and carrying out the carbon dioxide formed as a result of metabolic events. During this process, which we call breathing, the lungs encounter many harmful substances such as allergens with protease properties, viruses, bacteria, particles that cause air pollution, cigarette smoke, and toxic chemicals. These harmful substances entering the airway have a destructive effect on the tight junction molecules that provide epithelial cell integrity, leading to the deterioration of its structural integrity and cause epithelial barrier damage. Environmental factors and genetic predispositions cause chronic airway diseases such as asthma and COPD and play a role in increasing or decreasing the severity of the disease. Thousands of people die every year due to chronic airway diseases. Various experimental models are needed to understand these disease mechanisms and to develop treatment methods. Regenerative medicine and tissue engineering applications, which have been developed rapidly in recent years, have an essential place in the understanding and development of disease mechanisms. The tissue and organ decellularization method, which is one of the tissue engineering applications, has been used successfully in both pre-clinical studies and clinical applications in experimental animals for a long time. Decellularized scaffolds obtained by preserving the natural extracellular matrix component of the tissue and removing possible immune response cells are essential in that they can be used in vitro to develop cell culture systems and in vivo studies to meet donor organ deficiency. Since healthy donor lungs are always used for lung transplantation, alternative lung sources on which various cell populations can attach and grow are needed for tissue engineering studies. 
Within the scope of this thesis, sheep lung has been proposed as a xenogenic alternative to human lungs. In the study, it was aimed to produce tissue scaffolds by applying physical and chemical decellularization methods on sheep lung tissue. In the first stage of the study, it was aimed to create an optimum decellularization method for lung tissue by using detergents that used in lung decellularization such as SDS, Triton X-100 and CHAPS, as well as detergents that were not used in lung decellularization, such as Sodium cholat, NP-40 and ASB-14, by the mixing/shaking technique. sCO2 was used as the physical decellularization method. By comparing the results obtained by physical and chemical methods, the effect of both methods on sheep lungs was revealed.
In the second stage of the study, the characterization processes of the obtained decellularized lung tissue scaffolds and hydrogel synthesis from these tissues were carried out. For characterization, it was quantitatively determined how much the DNA contained in the decellularized extracellular matrix was removed from the structure compared to the natural tissue. Then, the tissues were evaluated qualitatively by the histological staining method. Efficacy was investigated by quantitative analyzes of the collagen, glucosaminoglycan (GAG), and elastin ratios remaining in the tissue scaffolds. To analyze the surface characterization of the scaffolds obtained, SEM imaging were performed. After these analyses, hydrogel synthesis and characterization was performed from the tissues of the effective condition and cell culture studies were carried out.
As a result of the characterization process, methods with ASB-14, sodium cholate hydrate, and SDS detergents, effective on lung decellularization, were selected. Among these methods, hydrogel synthesis was performed from the decellularized tissue obtained with ASB-14, BEAS-2B cells were cultivated on it, and cell proliferation and differentiation were evaluated on ALI culture.