Sivas yöresinde yaygınlık gösteren culıcoıdes türlerinin komple mitokondriyal genom bazlı karakterizasyonu ve haemosporidian parazitler yönünden vektörlük potansiyellerinin araştırılması
Complete mitochondrial genome characterization of culicoides species distributed in sivas region and investigation of their vector potential for haemosporidian parasites
Yazar: CANAN CANER KÜLİĞ
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı / Veteriner Parazitoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
SİVAS YÖRESİNDE YAYGINLIK GÖSTEREN CULICOIDES TÜRLERİNİN KOMPLE MİTOKONDRİYAL GENOM BAZLI KARAKTERİZASYONU VE HAEMOSPORİDİAN PARAZİTLER YÖNÜNDEN VEKTÖRLÜK POTANSİYELLERİNİN ARAŞTIRILMASI

Canan CANER KÜLİĞ

T.C. Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Veteriner Parazitoloji Anabilim Dalı
Doktora Tezi, Mayıs 2024
Danışman: Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM

ÖZET

Culicoides (Diptera:Ceratopogonidae) cinsinde yer alan sinekler en küçük hematofaj insektler olarak bilinmekte olup Antarktika ve Yeni Zelanda hariç neredeyse tüm kıtalarda ve iklim bölgelerinde yayılış gösterirler. Culicoides türleri 50'den fazla farklı arbovirüs ve çeşitli nematod ve protozoon parazitlere potansiyel vektörlük yapmaları açısından da medikal ve veteriner öneme sahiptir. Bu çalışmada Sivas yöresinde beş farklı örneklem bölgesinde yayılış gösteren Culicoides türlerinin belirlenerek taksonomik olarak kompleks olan bu cins için detaylı genomik veriler sağlanması amacıyla tespit edilen türlere ait örneklerin mitokondrial genom karakterizasyonlarının yapılması ve genom bazında Culicomorpha alt takımı içinde filogenetik ilişkilerin ayrıntılı olarak ortaya konulması hedeflenmiştir. Mayıs-Ağustos 2022 ayları arasında araştırma bölgelerinden toplam 895 Culicoides örneği (652 dişi, 243 erkek) toplanmış ve morfolojik ve mt-COI barkod teşhisleriyle toplam sekiz türün varlığı belirlenmiştir. Araştırma yöresinde en yaygın tür %29,4 ile C. punctatus belirlenmiş bunu %16,6 ile C. subfasciipennis, %16,5 ile C. puncticollis, %12,8 ile C. newsteadi %10,2 ile C. riethi, %7,6 ile C. simulator, %5,1 ile C. odiatus ve %1,7 ile C. salinarus izlemiştir. Culicoides nesillerinin en yüksek %64,5 ile Temmuz ayında yakalandığı, bunu sırasıyla %14,2, %13,5 ve %7,8 ile Ağustos, Haziran ve Mayıs aylarının izlediği belirlenmiştir. Çalışma kapsamında morfolojik teşhis ve mt-COI barkodlama ile tür konfirmasyonu yapılan her bir Culicoides türünden birer örneğe ait gDNA izolatında mitokondrial genomu (mitogenom) komple olarak çoğaltmak için dizayn edilen primerlerle long PCR analizleri yapılmıştır. Çoğaltılan fragmentlere ait amplikonlar uygun konsantrasyonda birleştirilerek Next Generation Sequencing (NGS) platformunda (Illumina, MiSeq)  sekanslanmış ve her örnek için mitogenom minimum 1.357X ve 8.251X kapsama aralığında başarılı bir şekilde elde edilmiştir. NGS ham okumaları referans genoma haritalandırılarak ve aynı zamanda DeNovo analizi ile işlenip birleştirilerek konsensüs dizilimler elde edilmiştir. Elde edilen mitogenom sekanslarının biyoinformatik araçlarla karakterizasyonu sağlanmış ve filogenetik analizleri gerçekleştirilmiştir. Karakterizasyonu sağlanan C. subfasciipennis, C. odiatus, C. riethi, C. newsteadi, C. puncticollis, C. punctatus, C. salinarus ve C. simulator, olmak üzere sekiz Culicoides türünün komple mitokondrial genomunun sırasıyla 15.883 bp, 15.534 bp, 15.461 bp, 15.663 bp, 15.431 bp, 15.704 bp, 15.651 bp ve 15.823 bp olmak üzere birbirine yakın büyüklükte olduğu 13 protein kodlayan gen (PCG), 22 tRNA ve iki rRNA (rrnL ve rrnS) ve bir de kodlama yapmayan bölge (D-loop) içerdiği tespit edilmiştir. Tüm türlerde ağır ipliğin (H-ipliği) genlerin çoğunu (dokuz PCG ve 14 tRNA) kodladığı, hafif ipliğin (L-ipliği) ise geri kalan ters tamamlayıcı genleri (dört PCG, sekiz tRNA ve iki rRNA) içerdiği belirlenmiştir. Karakterize edilen Culicoides türlerinin mitokondrial genomunun AT içerikleri %74,5-%76,1 olarak bulunmuştur. Culicoides türlerinin mitogenomlarının PCGs'in 3724 ila 3732 amino asit (aa) kodladığı ve kodon kullanımında A+T'nin (%75.0-%77.0) daha sık olduğu belirlenmiştir. Tüm sekiz Culicoides türünün mitogenomunda, NNA ve NNU kodonları (~%82,00), NNC ve NNG kodonlarından (~%18,00) önemli ölçüde daha yaygın bulunmuş ve 13 PCG arasında, Leu2 en sık kullanılan amino asit kodonu belirlenmiş bunu Ile ve Phe takip etmiştir. Cys ise en az kullanılan amino asit kodonu olmuştur. Culicoides türlerinin tamamında yirmi iki tRNA'nın tümü tanımlanmış ve uzunluklarının 60 ila 74 bp arasında değiştiği belirlenmiştir. Basitleştirilmiş bir dihydrouridine (DHU) koluna sahip olan trnS1 (GCT) hariç geri kalan tRNA genleri, klasik yonca yaprağı ikincil yapıları sergilemiştir. Culicoides mitokondriyal genleri arasındaki ortalama nükleotid çeşitliliği, sırasıyla NAD6, ATP8, genlerinin en değişken mitokondriyal belirteçler olduğunu ve bunları NAD2, NAD3 ve NAD5 genlerinin izlediğini göstermiştir. Filogenetik analizler Ceratopogonidae'nin Chaboridae ile birlikte Culicomorpha içinde dış takson oluşturduğunu, Chironomidae'nin, Culicidae + Dixidae + (Thaumaleidae + Simuliidae) grubuna dış takson olarak yerleşim gösterdiğini ortaya koymuştur. Çalışmada ayrıca, karakterize edilen Culicoides türlerine ait toplam 613 dişi örnekten oluşturulmuş toplam 63 havuz ile 39 bireysel dişi örneğinden elde edilen gDNA izolatlarının haemosporidian parazitlerin DNA'sı yönünden moleküler analizi sonucunda hiçbir havuzda ve bireysel örnekte pozitiflik belirlenmemiştir.      
Anahtar kelimeler: Culicoides, prevalans, mt-COI barkodlama, mitokondrial genom, moleküler karakterizasyon, filogenetik analiz, vektör, Haemosporidian parazit, Sivas

Abstract:
COMPLETE MITOCHONDRIAL GENOME CHARACTERIZATION OF CULICOIDES SPECIES DISTRIBUTED IN SIVAS REGION AND INVESTIGATION OF THEIR VECTOR POTENTIAL FOR HAEMOSPORIDIAN PARASITES 
Canan CANER KÜLİĞ
Erciyes University, Graduate School of Health Science
Department of Veterinary Parasitology
PhD Thesis, May 2024
Supervisor: Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM

ABSTRACT
Flies in the genus Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) are known as the smallest hematophage insects and are distributed in almost all continents and climatic zones except Antarctica and New Zealand. Culicoides species are of medical and veterinary importance as potential vectors of more than 50 different arboviruses and various nematode and protozoan parasites. In this study, it was aimed to determine the Culicoides species distributed in 5 different sampling regions in Sivas region and to provide detailed genomic data for this taxonomically complex genus by characterizing the mitochondrial genome of the samples belonging to the identified species and to reveal the phylogenetic relationships within the Culicomorpha suborder. A total of 895 Culicoides specimens (652 females and 243 males) were collected from the study areas between May and August of 2022 and a total of eight species were identified by morphological and mt-COI barcode identification. The most common species in the study area was C. punctatus with 29.4%, followed by C. subfasciipennis with 16.6%, C. puncticollis with 16.5%, C. newsteadi with 12.8%, C. riethi with 10.2%, C. simulator with 7.6%, C. odiatus with 5.1% and C. salinarus with 1.7%. The highest percentage of Culicoides generations was 64.5% in July, followed by August, June and May with 14.2%, 13.5% and 7.8%, respectively. Within the scope of the study, long PCR analyses were performed with primers designed to completely amplify the mitochondrial genome (mitogenome) in the gDNA isolate of one sample from each Culicoides species, which was confirmed by morphological identification and mt-COI barcoding. Amplicons of the amplified fragments were combined at the appropriate concentration and sequenced on the NGS platform (Illumina, MiSeq), successfully obtaining mitogenome minimum coverage of 1,357X and 8,251X for each sample. Consensus sequences were obtained by mapping the NGS raw reads to the reference genome and also processed and assembled by DeNovo analysis. The mitogenome sequences obtained were characterized with bioinformatics tools and phylogenetic analyses were performed. The complete mitochondrial genomes of eight Culicoides species, namely C. subfasciipennis, C. odiatus, C. riethi, C. newsteadi, C. puncticollis, C. punctatus, C. salinarus and C. simulator, were characterized as 15,883 bp, 15,534 bp, 15. 461 bp, 15.663 bp, 15.663 bp, 15.431 bp, 15.704 bp, 15.651 bp and 15.823 bp, respectively, containing 13 protein-coding genes (PCG), 22 tRNAs and two rRNAs (rrnL and rrnS) and one non-coding region (D-loop). In all species, the heavy strand (H-strand) encoded most of the genes (nine PCGs and 14 tRNAs), while the light strand (L-strand) contained the remaining reverse complement genes (four PCGs, eight tRNAs and two rRNAs). The AT content of the mitochondrial genome of the characterized Culicoides species was found to be 74.5%-76.1%. The mitogenomes of Culicoides species encoded 3724 to 3732 aa of PCGs and A+T (75.0%-77.0%) was more frequent in codon usage. In the mitogenome of all eight Culicoides species, NNA and NNU codons (~82.00%) were significantly more common than NNC and NNG codons (~18.00%) and among the 13 PCGs, Leu2 was the most frequently used amino acid codon, followed by Ile and Phe. Cys was the least frequently used amino acid codon. All twenty-two tRNAs were identified in all Culicoides species and ranged in length from 60 to 74 bp. With the exception of trnS1 (GCT), which has a simplified dihydrouridine (DHU) arm, the remaining tRNA genes exhibited classic alfalfa leaf secondary structures. The average nucleotide diversity among Culicoides mitochondrial genes showed that NAD6, ATP8, NAD2, NAD3 and NAD5 genes were the most variable mitochondrial markers, followed by NAD6, ATP8 and ATP8, respectively. Phylogenetic analyses revealed that Ceratopogonidae, together with Chaboridae, formed an out taxon within Culicomorpha, while Chironomidae was placed as an out taxon in the group Culicidae + Dixidae + (Thaumaleidae + Simuliidae). In the study, the molecular analysis of gDNA isolates obtained from 63 pools formed from a total of 613 female specimens and 39 individual female specimens of the identified Culicoides species for haemosporidian parasites DNA, revealed no positivity in any pool or individual specimens. 
Key words: Culicoides, prevalence, mt-COI barcoding, mitochondrial genome, molecular characterization, phylogenetic analysis, vector, Haemosporidian parasite, Sivas