D vitamini metabolitlerinin tek analiz ile ölçümü için LC/MSMS yöntemi geliştirilmesi, validasyonu ve örnek saklama koşullarının belirlenmesi
Development and validation A lc/msms method for simultaneous quantification of vitamin D metabolites and determination of sample storage conditions
Yazar: ALİ YAMAN
Danışman: PROF. DR. ÖNDER ŞİRİKÇİ
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Metabolitler = Metabolites ; Teşhis testleri = Diagnostic tests ; Vitamin D = Vitamin D ; Vitamin D eksikliği = Vitamin D deficiency

Özet:
D vitamini eksikliği, prevelansının yüksek olması nedeniyle günümüzde önemli bir halk sağlığı problemi haline gelmiştir. 25(OH)D ve diğer D vitamini metabolitlerinin plazma konsantrasyonları, D vitamini depolarının yeterliliği ve fonksiyonel ilişkilerini belirlemek için belirteç olarak kullanılır. Çalışmamızda, D vitamininin önemli metabolitlerinden olan 25(OH)D3, 1,25(OH)2D3, 24R,25(OH)2D3, 25(OH)D2 ve 3-epi-25(OH)D3'ü aynı anda ölçecek bir yöntem geliştirmeyi ve alınan örneklerde bu metabolitlerin farklı saklama koşullarından ne kadar etkilendiklerini belirlemeyi amaçladık.
D vitamini metabolitlerinin plazma örneklerinde miktar tayinini yapabilmek için standart ve internal standart çözeltilerini kullanarak bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi-sıralı kütle spektrometresi (HPLC-MS/MS) yöntemi geliştirdik. CLSI C62-A kılavuzuna uygun şekilde metot validasyonunu tamamladıktan sonra gönüllülerden elde edilen plazma örneklerinin saklandığı sıcaklık (+25°C, +4°C, -20°C) ve saklanma süresinin (1-10 gün) D vitamini metabolitleri stabilitelerine etkilerini inceledik.
Geliştirdiğimiz yöntem; D vitamini metabolitlerinin klinik karar verdirici düzeylerini belirleyerek oluşturduğumuz ölçüm aralıklarında, kesinlik ve doğrusallık kriterlerini karşıladı. Kesinlik çalışmaları için metabolitlerin farklı konsantrasyonlarında yapılan analizlerde, tüm %CV sınıflamalarında %9,3'ü geçmeyen sonuçlar elde edildi. Doğruluk analizinde, NIST tarafından sertifikalandırılmış referans materyal örnekleri (SRM972a) ölçüldüğünde 25(OH)D3, 24R,25(OH)2D3, 25(OH)D2 ve 3-epi-25(OH)D3 analizlerinde elde edilen en yüksek %bias değerleri sırasıyla (+%1,3), (-%3,8), (-%8,0) ve (-%8,0) olarak hesaplandı. D vitamini metabolitlerinin test ettiğimiz farklı saklama koşullarına dayanıklı olduğu görüldü.
LC/MSMS cihazı ile duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek metotlar geliştirilip D vitamini metabolitlerinin çeşitli klinik durumlardaki değişimleri izlenebilir.

Abstract:
Vitamin D deficiency has become an important public health problem due to it's high prevalence. Plasma concentrations of 25(OH)D and other vitamin D metabolites are used as biomarkers to detect vitamin D deficiency or to investigate vitamin D metabolism. In our study, we developed a method that can simultaneously measure the frequently investigated vitamin D metabolites (25(OH)2D3, 24R,25(OH)2D3, 25(OH)D2 and 3-epi-25(OH)D3) and determined how different storage conditions affect these metabolites' stability in samples.
We developed a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) based method by using vitamin D metabolites' standard and internal standard solutions to quantitate the vitamin D metabolites in plasma samples. After validating the method according to CLSI C62-A guideline, we examined the stability of vitamin D metabolites in samples obtained from volunteers at different storage temperatures (+25°C, +4°C, -20°C) and durations (1-10 days).
The method developed met the linearity and imprecision criteria within the measuring ranges chosen in accordance with the clinical decision-making levels of vitamin D metabolites. In imprecision studies; coefficient of variations of metabolites at different concentrations did not exceed 9.3% at all CV% classifications evaluated. The highest bias% results obtained from the measurement of the certified reference materials by NIST (SRM972a) for 25(OH)D3, 24R,25(OH)2D3, 25(OH)D2 and 3-epi-25(OH)D3 were (+1,3%), (-3,8%), (-8%) and (-8%), respectively. Vitamin D metabolites were found to be stable in the different storage conditions tested.
LC/MSMS based methods have high sensitivity and specificity and can be used to monitor changes on vitamin D metabolites' concentrations in various clinical situations. Precise and accurate results can be obtained with carefully and accurately validated methods.