Probiyotik Lactobacillus plantarum BHC03 suşunun sideroforlarının saflaştırılması, tanılanması ve bazı probiyotik özellikleri ile ilişkilerinin incelenmesi
Purification, diagnosis of the siderophorus of the probiotic Lactobacillus plantarum BHC03 strain and investigation of their relationship with some probiotic properties
Yazar: NAZLICAN COŞGUN
Danışman: PROF. DR. BİLGE HİLAL ÇADIRCI EFELİ
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: FTIR = FTIR ; Kromatografi = Chromatography ; NMR =   ; Probiyotikler = Probiotics ; Siderofor = Siderophore

Özet:
Bu çalışmada siderofor üreticisi mikroorganizmalar laboratuvar kültür koleksiyonundan kullanılmış %92 oranında en yüksek siderofor üretim verimi gösterdiği belirlenen suş, 16S rRNA dizi analizi ile Lactobacillus plantarum olduğu tanılanmış ve L. plantarum BHC03 olarak adlandırılmıştır. Ardından L. plantarum BHC03 suşu için siderofor üretim optimizasyonu yapılmıştır ve sırasıyla en yüksek siderofor üretimi; 37 C'de, pH 7'de, FeCl 3 ilavesinin yapılmadığı ortamda ve azot kaynağı olarak maya ekstresi, karbon kaynağı olarak ise maltoz kullanılarak tayin edilmiştir. Başlangıç siderofor üretimi %92 oranında olan L. plantarum BHC03 suşu için yapılan optimizasyon sonrası %5 oranında arttırılarak %97 olarak gerçekleştirilmiştir. Optimize edilen koşullar kullanarak büyük
ölçekli siderofor üretimi gerçekleştirilmiş ve liyofilizasyon işlemi yapılarak saflaştırma işlemi için konsantre hale getirilmiştir. Ekstraselüler olarak üretilen siderofor sephadex LH-20 dolgu maddesi kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma işleminin ardından toplanan fraksiyonlar siderofor varlığının tayin edilmesi ve karakterizasyonu için sırasıyla TLC kromatografi, FT-IR, HPLC ve 1 H-NMR analizleri yapılmıştır. Yapılan analizlerin sonucunda toplanan fraksiyonlar içerisindeki 3 ve 5 numaralı fraksiyonun katekolat tipi siderofor içerdiği belirlenmiş ve katekolat tipi sideroforun L. plantarum BHC03 suşunun probiyotik özellikleri üzerindeki etkisi incelenmiştir.
Yapılan in vitro testlerin sonucunda; L. plantarum BHC03 suşunun % 0.5 fenol toleransı, % 0.3 safra tuzu toleransı ve %8 NaCl toleransı olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte pH 2.5'a kadar direnç göstermiş ve hemolitik aktivitelerinin olmadığı tespit edilmiştir. Ayrıca % 92 oranında otoagregasyon ve %93 oranında hidrofobisite yeteneklerinin olduğu bulunmuştur. L. plantarum BHC03 suşunun streptomycin, gentamicin ve levoflovacin'e karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir. Sideroforların kolesterol asimilasyonu üzerinde pozitif etkisinin olduğu ve bakterinin kolesterol
asimilasyon yeteneğini arttırdığı belirlenmiştir. Bununla birlikte sideroforların probiyotiklerin bakteriyosin aktivitesi üzerinde pozitif etkilerinin olduğu ve hemolitik aktiviteyi etkilemediği tespit edilmiştir. Yapılan in vitro testlerin sonucunda L. plantarum BHC03 suşunun probiyotik bakteri olarak kabul edilebilmesi için gerekli şartları taşıdığı ve katekolat sideroforların bakteriyosin aktivitesi ve hemolitik aktivite üzerine pozitif etkilerinin olduğu kanıtlanmıştır.

Abstract:
In this study, siderophore producing microorganisms were obtained from the laboratory culture collection and the strain determined to have the highest siderophore production efficiency of 92% identified by 16s rRNA sequencing as Lactobacillus plantarum and called the strain as L. plantarum BHC03. Then, siderophore production optimization of L. plantarum BHC03 strain was performed and the highest siderophore production, respectively; It was determined at 37 °C, pH 7, in the absence of FeCl 3 addition and using yeast extract as nitrogen source and maltose as carbon source. The initial siderophore production was increased by 5 % after the optimization of the L. plantarum BHC03 strain, which was 92 %, and reached 97 %. Large-scale production of siderophores was carried out using optimized conditions and concentrated for purification by lyophilization. The extracellularly produced siderophore was purified by size exclusion chromatography using sephadex LH-20 resin. TLC chromatography, FT- IR, HPLC and 1H-NMR analyzes were performed for the determination and characterization of the presence of siderophores in the collected fractions after purification. As a result of the analyzes, it was determined that the 3rd and 5th fractions in the collected fractions contained catecholate-type siderophores and the effect of the catecholate-type siderophore on the probiotic properties of L. plantarum BHC03 strain was investigated. As a result of in vitro tests; L. plantarum BHC03 strain was shown to have 0.5 % phenol tolerance, 0.3 % bile salt tolerance and 8 % NaCl tolerance. However, it showed resistance to life up to pH 2.5 and was found to have no hemolytic activities. In addition, they were found to have 92 % autoaggregation and 93 % hydrophobicity abilities. L. plantarum BHC03 strain was found to be resistant to streptomycin, gentamicin and levoflovacin. It has been determined that siderophores have a positive effect on cholesterol assimilation and increase the cholesterol assimilation ability of the bacteria. However, it has been determined that siderophores have positive effects on the hemolysis and bacteriocin activity of probiotics. As a result of in vitro tests, it has been proved that L. plantarum BHC03 strain has the desired conditions to be accepted as probiotic bacteria and that catecholate siderophores have positive effects on bacteriocin activity and hemolytic activity.