Streptomyces alboniger BA2'nin yeni doğal ürünlerinin karakterizasyonu ve biyolojik aktiviteleri
Characterization and biological activity of new natural products from Streptomyces alboniger BA2
Yazar: EVLİN MIZRAKLI
Danışman: PROF. DR. EBRU İNCE BOSTANCI
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Doğal ürünler, bitkiler, mantarlar ve mikroorganizmalar tarafından üretilen ve farklı biyoaktivitelere sahip sekonder metabolitlerdir. Bunların içerisinde mikrobiyal metabolitler, çeşitli kimyasal yapılara sahip olup, antimikrobiyal, antikanser, antiviral ve antidiyabetik gibi pek çok farklı biyolojik aktiviteye sahip oldukları için hastalıklarla mücadelede ilaç olarak kullanılırlar. Aktinomisetler, doğal mikrobiyal metabolitlerin önemli bir kaynağını oluşturur ve bunların içerisinde özellikle Streptomyces türleri biyoaktif ürünlerin en önemli kaynakları arasındadır. Bu bakteriler tarafından üretilen streptomisin, sefalosporin, kloramfenikol ve tetrasiklin gibi antibiyotikler tıpta antibiyotik çağını başlatmıştır.
Antibiyotiklerin aşırı kullanımı, bakteriler arasında direncin hızla yayılmasına neden olmakta ve her geçen gün yeni antibiyotik direncine sahip hastane patojenlerine rastlanmaktadır. Bu yüzden, çeşitli etki mekanizmalarına sahip yeni antimikrobiyal bileşiklerin keşfedilmesi bir ihtiyaç haline gelmiştir. Farklı kimyasal yapılara sahip yeni antibiyotiklerin keşfedilmesi için farklı stratejiler mevcuttur. Bunlar arasında, farklı ve sıradışı ortamlardan yeni bakterilerin izolasyonu, bunların yenilikçi kültür stratejileri ile üretilmesi ve ürettikleri metabolitlerin omik yaklaşımlar kullanılarak hızlı ve doğru biçimde tanımlanması gelmektedir.  Genomik ve metabolomik yaklaşımlar kullanılarak son yıllarda kayda değer sayıda ve çeşitte yeni biyoaktif metabolit keşfedilmiştir. 
Araştırma grubumuz tarafından daha önce bitki köklerinden izole edilmiş, tanımlanmış ve genom dizilimi yapılmış olan Streptomyces alboniger BA2 bakterisinin genomunda sekonder metabolitlerin sentezinden sorumlu biyosentetik gen kümelerinin (BGC) yüksek sayıda olduğu, fakat kültür ortamında bu gen kümelerinin çoğunun aktif olmadığı tespit edilmiştir. Bu bilgiler ışığında, bu çalışmadaki amacımız; S. alboniger'ın farklı kültür stratejileri ile biyosentetik gen kümelerinin aktive edilerek yeni doğal ürünleri üretme potansiyellerinin açığa çıkarılmasıdır. Bu amaçla, S. alboniger, İndol Asetik Asit (IAA) ve Jasmonik Asit (JA) gibi iki farklı bitki hormonu varlığında katı ve sıvı kültür rejimlerinde üretilmiş, metabolitleri organik solventler ile elde edilmiş, özütlerin antibakteriyel aktiviteleri tespit edilmiş ve içerisindeki metabolitler LC-MS/MS kullanılarak analiz edilmiştir.
S. alboniger BA2, M2 sıvı besiyerinde farklı konsantrasyonlarda IAA ve JA varlığında durağan faza kadar üretildi. Kültürler etil asetat ile ekstrakte edilerek disk dizfüzyon yöntemi ile antimikrobiyal aktivite incelendi. Antimikrobiyal aktivite taraması için altı farklı test organizması kullanıldı. S. alboniger BA2 aynı zamanda IAA ve JA içeren M2 katı besiyerlerinde üretildi ve çarpraz çizgi yöntemiyle test organizmalarına karşı in vivo olarak analiz edildi. Özütlerin içerdiği bileşikler LC-MS/MS verilerinin GNPS veri tabanında bulunan bileşik kütüphanelerinde incelenmesi ile tespit edildi.
Sıvı besiyerinde üretilen S. alboniger BA2'nin Gram negatif ve Gram pozitif test organizmalarına karşı geniş spektrumda ve etki gücü yüksek bir antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu görüldü. Bitki hormonu varlığında kontrole göre antimikrobiyal etkide bir artış gözlenmemiş olsa da, metabolomik çalışmaların sonuçlarında bitki hormonları varlığında Streptomyces sp. BA2 tarafından sıvı ve katı besiyerlerinde daha önce bu izolatta tespit edilmemiş bileşiklerin varlığı gözlemlendi. Sadece IAA varlığında futalosine, 3-hydroxyoctanoic acid ve quinoxaline-2-carboxylic acid, sadece JA varlığında ise futalozin gibi mikrobiyal metabolitlerin derplike olduğu görüldü. Katı kültürden yapılan antimikrobiyal metabolit analizlerinde, JA varlığında biraraya getirilen S. alboniger BA2 izolatı ve test organizmalarından,  E. coli'ye karşı geliştirilen zondan taxifolin, E. coli ve K. Pneumoniae'ye karşı geliştirilen zondan ise GNPS veri tabanında yer alan fakat yapısı henüz aydınlatılmamış B27A19 isimli yeni bileşik de dereplike oldu.
Mevcut çalışma, yalnızca S. alboniger BA2 izolatından daha önce keşfedilmemiş antimikrobiyal aktiviteler ve yeni metabolitler ortaya koyması açısından değil, aynı zamanda yenilikçi kültür stratejileri ve farklı kültür rejimlerinde mikrobiyal metabolit üretim profillerinin değişiklik gösterdiğini ortaya koyması açısından önem arz etmektedir.

Abstract:
Natural products are secondary metabolites produced by plants, fungi, and microorganisms, possessing various bioactivities. Among these, microbial metabolites exhibit a range of chemical structures and are utilized as drugs in the fight against diseases due to their antimicrobial, anticancer, antiviral, and antidiabetic activities. Actinomycetes are a significant source of natural microbial metabolites, with Streptomyces species being among the most important sources of bioactive products. Antibiotics produced by these bacteria, such as streptomycin, cephalosporin, chloramphenicol, and tetracycline, have ushered in the antibiotic era in medicine.
The overuse of antibiotics has led to the rapid spread of resistance among bacteria, resulting in the emergence of new antibiotic-resistant hospital pathogens. Therefore, there is an urgent need for the discovery of new antimicrobial compounds with various mechanisms of action. Different strategies are available for the discovery of new antibiotics with diverse chemical structures. These include isolating new bacteria from unusual environments, cultivating them using innovative culture strategies, and rapidly and accurately identifying the metabolites they produce using omics approaches. In recent years, a significant number and variety of new bioactive metabolites have been discovered using genomic and metabolomic approaches.
Our research group previously isolated, characterized, and sequenced the genome of Streptomyces alboniger BA2 from plant roots. It was found that there are a high number of biosynthetic gene clusters (BGCs) responsible for the synthesis of secondary metabolites in the genome; however, most of these gene clusters were not active in the culture medium. In light of this information, the aim of this study is to reveal the potential for producing new natural products by activating the biosynthetic gene clusters of S. alboniger through different culture strategies. To achieve this, S. alboniger was cultivated in solid and liquid culture regimes in the presence of two different plant hormones, indole-3-acetic acid (IAA) and jasmonic acid (JA). The metabolites were extracted using organic solvents, and the antibacterial activities of the extracts were determined. The metabolites were analyzed using LC-MS/MS metabolomic approaches.
S. alboniger BA2 was grown in M2 liquid medium in the presence of different concentrations of IAA and JA until reaching the stationary phase. The cultures were extracted with ethyl acetate, and antimicrobial activity was investigated using the disk diffusion method. Six different test organisms were used for antimicrobial activity screening. S. alboniger BA2 was also cultivated in solid media containing IAA and JA and was analyzed in vivo against the aforementioned test organisms using the cross-streak method. The compounds and metabolite profiles contained in the extracts were identified by analyzing the LC-MS/MS data against compound libraries in the GNPS database.
It was observed that S. alboniger BA2, produced in liquid culture medium, has a broad spectrum and high potency antimicrobial activity against both Gram-negative and Gram-positive test organisms. Although no increase in antimicrobial effect was observed in the presence of plant hormones compared to the control, the results of metabolomic studies revealed the presence of compounds not previously detected in this isolate by S. alboniger BA2 in both liquid and solid media. In the presence of only IAA, microbial metabolites such as futalosine, 3-hydroxyoctanoic acid, and quinoxaline-2-carboxylic acid were dereplicated, while in the presence of only JA, futalozin was dereplicated. In antimicrobial metabolite analyses from solid culture, Streptomyces sp. BA2 isolate and test organisms were co-cultured in the presence of JA. According to these results, the taxifolin compound isolated from the zone against E. coli and the newly identified compound B27A19, which is listed in the GNPS database but whose structure has not yet been elucidated, also dereplicated against E. coli and K. pneumoniae.
This study is significant not only for uncovering previously unreported antimicrobial activities and new metabolites from the S. alboniger BA2 isolate, but also for demonstrating that innovative culture strategies and different culture regimes result in variations in microbial metabolite production profiles.