Kayseri yöresinde culex pipiens biyotipleri ve culex torrentıum'un real-tıme pcr ile araştırılması ve moleküler karakterizasyonu
Investigation of culex pipiens biotypes and culex torrentium by real-time pcr in kayseri region and molecular characterization of the isolates
Yazar: GÖZDE ŞAHİNGÖZ DEMİRPOLAT
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH İNCİ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Culex pipiens = Culex pipiens ; Culex torrentium = Culex torrentium ; Kayseri = Kayseri ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Parazitoidler = Parasitoids ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu çalışmada, Haziran-Ağustos 2014 tarihleri arasında Kayseri yöresinde çeşitli bölgelerden toplanmış sivrisinek örneklerinde Culex pipiens kompleks biyotipleri ve Cx. torrentium moleküler olarak araştırılmıştır. Saha çalışmaları boyunca toplam 1052 dişi sivrisinek örneklemesi yapılmış ve bunların 315'i (%29,9) morfolojik identifikasyon analizleriyle Cx. pipiens kompleks ve/veya Cx. torrentium olarak teşhis edilerek ayrılmıştır. Ayrılan örneklere ait genomik DNA izolatlarının ilk basamak Real Time PCR analizlerinde tamamının Culex pipiens kompleks nesillerine ait oldukları saptanmış, Cx. torrentium pozitifliği belirlenmemiştir. İkinci basamak Real Time PCR analizlerinde Cx. pipiens komplekste belirlenen izolatların, 311'inin Cx. pipiens form pipiens nesillerine ait oldukları belirlenmiş, Cx. pipiens form molestus pozitifliği görülmemiştir. Kalan 4 örnek analizlerde her iki biyotip yönünden de amplifikasyon göstermemiştir. Real Time PCR sonuçlarının konfirmasyonu ve hibrit nesillerin araştırılması amacıyla tüm örneklere ait izolatların ACE-2 ve CQ11 microsatellite DNA analizleri gerçekleştirilmiştir. Analizlerde Cx. pipiens form pipiens olarak belirlenen tüm izolatların ilgili DNA markerları ile pipiens biyotipine özgü bant profilleri sergilediği saptanmış ve izolatların konfirmasyonu sağlanmıştır. Real time PCR analizlerinde biyoformlar yönünden amplifikasyon göstermeyen 4 izolatın microsatellite DNA analizleriyle Cx. pipiens form pipiens ve Cx. pipiens form molestus hibritleri oldukları tespit edilmiştir. Cx. pipiens form pipiens ve hibrit nesillere ait birer izolatın mitokondrial cytochrome oxidase I (mt-COI) gen bölgesine göre barkodlaması yapılmış ve filogenetik analizleri gerçekleştirilmiştir. Her iki izolatın sekans analiz sonuçlarına göre yeni bir haplotip oldukları belirlenmiş ve haplotip bazında Cx. pipiens komplekse ait nesillerle filogenetik ilişkileri ortaya konmuştur.

Abstract:
The biotypes of Culex pipiens complex and Cx. torrentium were molecularly investigated in the mosquito specimens collected from different regions of Kayseri between June and August 2015 in this study. A total of 1052 female mosquito specimens were sampled during the field surveys and 315 (29.9%) out of these were morphologically identified and reserved as Cx. pipiens complex and/or Cx. torrentium. The first step Real Time PCR analyses of genomic DNA isolates from these reserved specimens revealed that all the specimens were belong to Culex pipiens complex and there was no Cx. torrentium positivity. Among the isolates determined in Culex pipiens complex, 311 were determined as belong to lineages of Cx. pipiens form pipiens according to second step Real Time PCR analyses and there was no positivity for Cx. pipiens form molestus. The remaining 4 isolates showed no amplification for both two biotypes. ACE-2 and CQ11 microsatellite DNA analyses were carried out on the isolates from all specimens in order to confirm the real time PCR results and investigate the hybrid lineages. All the isolates determined as Cx. pipiens form pipiens showed specific banding pattern for pipiens biotype with the related DNA markers in the analyses result in the confirmation of the isolates. The 4 isolates that did not show amplification for both biotypes in real time PCR assays were designated as the hybrids of Cx. pipiens form pipiens and Cx. pipiens form molestus with the microsatellite DNA analyses. DNA barcoding and phylogenetic analyses were performed on one isolate belong to each Cx. pipiens form pipiens pipiens and hybrids based on mithocondrial cytochrome oxidase I (mt-COI) gene region. Both isolates were determined as new haplotypes according to the sequence analyses and their phylogenetic relations based on haplotypes with the linages belong to Cx. pipiens complex were revealed.