Mikrosatellit stabil ve instabil endometrium kanserleri arasında tedavi hedefi olabilecek immünhistokimyasal belirteçlerin morfolojik ve klinik parametreler eşliğinde karşılaştırılması
Comparison of immunohistochemical markers that can be used for targeted therapy between microsatellite stable and instable endometrial cancers, together with morphological and clinical parameters
Yazar: EZGİ DİCLE SERBES
Danışman: DOÇ. DUYGU ENNELİ
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology ; Patoloji = Pathology

Özet:
Amaç: Çalışmamızda, CD3, CD4, CD8, CD45, PD-L1 antikorları kullanılarak,
mikrosatellit instabil ve stabil endometrioid tip endometrium kanserlerinin, tümör immün
mikroçevresi açısından farklılıklarını değerlendirmek; tümör immün mikroçevresinin,
histopatolojik veriler ile birlikte hastaların prognozu üzerindeki etkisini araştırmak
amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: AÜTF Tıbbi Patoloji Anabilim dalında Ocak 2020 – Aralık 2022
yılları arasında endometrioid tip endometrium kanseri tanısı almış ve MMR sistem defekti
açısından immünhistokimyasal olarak araştırılmış, çalışmaya dahil edilme kriterlerini sağlayan,
108 hasta seçildi. Bunlardan 51'inde immünhistokimya ile MMR sistem defekti gösterilmişti
(MMRd). 57'sinde İHK ile MMR protein kaybı mevcut değildi (MMRp). 51 MMRd vakası
içerisinden, PCR-MSI testi veya NGS ile mikrosatellit instabilitesi gösterilen vakalar
"MSI/MMRd" grup (n=35) olarak belirlendi. Moleküler analizler ile mikrosatellit instabilitesi
gösterilememiş 16 vaka ve 57 MMRp vaka birlikte "MSS/MMRp" grubu (n=73) oluşturdu.
Hastalara ait HE ve MSH2, MSH6, PMS2, MLH1, ER, PR, p53 boyalı preparatlara patoloji
arşivinden ulaşıldı. Tüm vakalarda, FIGO evre, FIGO histolojik derece, prognostik risk grubu,
lenfovasküler invazyon varlığı ve yaygınlığı, lenf nodu metastazı, myometrial invazyon
derinliği, MELF tipi invazyon varlığı ve yaygınlığı, farklı diferansiyasyon paternleri (skuamöz,
müsinöz) ve paternlerin yaygınlığı, histolojik varyantlar, nekroz varlığı ve yaygınlığı,
komedonekroz, psammomatöz kalsifikasyon varlığı, tümör lokalizasyonu, ER ve PR ile tümör
hücrelerinin boyanma yüzdeleri, MSH6, PMS2, MLH1, MSH2 ve p53 ekspresyon durumları
yeniden değerlendirildi. Vakaların tümörlü arşiv bloklarından, her vaka için en az 2 en çok 5
adet, 1 milimetre çapa sahip kor seçilerek, 6 adet doku mikrodizin bloğu oluşturuldu. Doku
mikrodizin bloklarından hazırlanan CD3, CD4, CD8, CD45 boyalı kesitler dijital patoloji
ünitesinde tarandıktan sonra bilgisayar ortamında değerlendirildi, tümör içinde ve tümör
stromasında, milimetrekaredeki CD3, CD4, CD8 ve CD45 pozitif boyanan lenfosit sayıları
(dansite) hesaplandı. Doku mikrodizin bloklarından hazırlanan PD-L1 kesitleri dijital ortamda
değerlendirildi, pozitif boyanan neoplastik hücreler ve boyanmayan neoplastik hücreler
sayılarak kombine pozitif skor ve milimetrekaredeki pozitif tümör hücre sayısı hesaplandı.
Ayrıca, PD-L1 ile pozitif boyanan stromal mononükleer inflamatuar hücrelerin, tümör
stromasının yüzdece ne kadarını kapladığı belirlendi. Tümördeki ve stromal lenfositlerdeki PDL1 boyanması 2 şekilde gruplandırıldı. Öncelikle, "negatif", "<%1", "%1-25", ">%25"
2
şeklinde dörtlü, ardından "negatif" ve "pozitif: (<%1) + (%1-25) + (>%25)" şeklinde ikili grup
oluşturuldu. Verilerin analizi, SPSS 23.0 (IBM, Armank, NY, ABD) programı ile yapıldı,
p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Bulgular: MSI/MMRd grup, MSS/MMRp gruba göre daha ileri evre, yüksek histolojik
derece, büyük tümör boyutu göstermiş; daha sık ve daha yaygın MELF tipi invazyon, LVİ ve
nekroz içermişti. MSI/MMRd grupta lenf nodu metastazı, komedonekroz ve psammom daha
sıktı. İntratümöral CD3 ve CD8 pozitif lenfosit yoğunluğu, total CD8 pozitif lenfosit
yoğunluğu, stromal lenfositlerdeki ve tümöral hücrelerdeki PD-L1 yoğunluğu MSI/MMRd
grupta anlamlı olarak daha fazlaydı. Yaygın MELF tipi invazyon izlenen vakalarda, stromal
lenfositlerdeki PD-L1 miktarında artış izlendi. Yapılan sağkalım analizlerinde, mikrosatellit
instabilitesi/MMR sistem defektinin sağkalım, nüks, metastaz üzerinde etkisi izlenmemekle
birlikte; ileri yaş, lenfovasküler invazyon, lenf nodu metastazı, yüksek derece ve ileri evre,
psammom, yaygın nekroz, derin myometrial invazyon yüksek prognostik risk grubu azalmış
sağkalım ile ilişkili bulundu. Bunlardan, yaygın LVİ, yaygın nekroz ve derin myometrial
invazyon nüks/metastaz gelişimi ile de ilişkiliydi. LVİ, nekroz yaygınlığı, FIGO derecesi ve
myometrial invazyon parametreleri kullanılarak yapılan çok değişkenli Cox analizinde,
sağkalım üzerinde, FIGO derecesi ve nekroz yaygınlığı bağımsız prognostik etki
göstermekteydi. Ayrıca PD-L1 ile tümör hücrelerinde boyanma izlenmeyen "negatif" grupta
sağkalım anlamlı olarak azalmıştı. Tümör içi CD8 pozitif lenfosit yoğunluğunda azalma
MSI/MMRd grupta azalmış sağkalım ile ilişkili iken, MSS/MMRp grupta stromal CD4 pozitif
lenfositlerde artış, azalmış sağkalım ile ilişkiliydi.
Sonuç: MSI/MMRd grupta kötü prognostik morfolojik bulgular daha sık izlenmektedir;
buna rağmen, MSI/MMRd tümörlerin, sağkalım ve nüks/metastaz gelişimi açısından
MSS/MMRp gruptan farklılık göstermemesinin nedeni, kuvvetle muhtemel immün
mikroçevrelerinin birbirinden farklı olmasıdır. MSI/MMRd grupta, intratümöral CD8
yoğunluğundaki artışın uzamış sağkalım ile ilişkili bulunması da bu düşünceyi kanıtlamaktadır.
Tümör hücrelerinde ve stromal lenfositlerde PD-L1 ifadesinin prognostik önemine dair
literatürde çelişkili sonuçlar mevcuttur. Bizim çalışmamızda, tümör hücrelerinde artan PD-L1
ifadesinin uzamış sağkalım ile ilişkili bulunması, PD-L1 ve CD8 pozitif hücre miktarlarının
korelasyon göstermesi ile ilişkili olabilir.
Anahtar Kelimeler: Endometrial karsinoma, mikrosatellit instabilitesi, tümör mikroçevresi,
prognoz, immün kontrol noktası.

Abstract:
Aim: The purpose of our study was to evaluate the differences in tumor
microenvironments of microsatellite instabile and stable endometrioid type endometrial
carcinomas by using CD3, CD4, CD8, CD45, PD-L1 antibodies. It was aimed to investigate the
prognostic effect of tumor immune microenvironment together with histomorphological
features which may help predicting response to immunotherapy.
Materials and methods: The study group consisted of 108 patients who were diagnosed
as endometrioid type endometrial carcinoma at Ankara University Medical School, Pathology
Department between January 2020 – December 2022 and met the inclusion criterias. In 51 of
these, MMR system deficiency was demonstrated by immunohistochemistry (MMRd group).
57 had no MMR protein loss with IHC (MMRp group). Among MMRd group, the cases
showing microsatellite instability by PCR-MSI test or NGS were determined as "MSI/MMRd"
group (n=35). Remaining 16 cases that did not show MSI by molecular analyses, and 57 MMRp
cases together constituted the "MSS/MMRp" group (n=73). Archival HE, MSH2, MSH6,
PMS2, MLH1, ER, PR, p53 stained sections of all cases were reevaluated for FIGO grade,
stage, prognostic group, presence and extent of lymphovascular invasion, lymph node
metastasis, depth of myometrial invasion, presence and extent of MELF type invasion, presence
and extent of squamous and mucinous differentiation, presence and extent of necrosis,
comedonecrosis, psammomatous calcification, tumor localisation, hormone receptor status,
MMR proteins and p53 expressions. Six tissue-microarray (TMA) blocks were constructed in
which each case was represented by at least 2 (max 5) cores of 1 mm size. CD3, CD4, CD8,
CD45, PD-L1 stained TMA sections were scanned and evaluated on digital images. CD3, CD4,
CD8, CD45 positive lymphocyte densities were calculated for both intratumoral and stromal
compartments as follows: number of positive cells/mm2
. For PD-L1, both density and combined
positive scores were calculated for neoplastic cells. For stromal PD-L1 evaluation, percentage
of tumor stroma that was covered by PD-L1 positive stromal mononuclear inflammatory cells
were estimated. Two different categorisations were used for both stromal and tumoral PD-L1
staining by using %1 and %25 cut-offs (negative, <1%, 1-25%, >25%) followed by "negative"
and "positive" groups. Statistical analyses was performed using SPSS 23.0 (IBM, Armank, NY,
USA), p<0.05 was considered statistically significant.
4
Results: The MSI/MMRd group showed more cases with advanced stage, high
histological grade, larger tumor size than the MSS/MMRp group. LVI, tumor necrosis and
MELF type invasion was more frequent and extensive in the MSI/MMRd group. Lymph node
metastasis, comedonecrosis and psammomatous calcification were more common in the
MSI/MMRd. Intratumoral CD3 and CD8 positive lymphocyte density, total CD8 positive
lymphocyte density, PD-L1 density in stromal lymphocytes and tumor cells were significantly
higher in the MSI/MMRd. In cases with extensive MELF, an increase in the PD-L1 staining in
stromal lymphocytes was observed. Although there was no difference in terms of survival,
recurrence or metastasis between MSI/MMRd and MSS/MMRp cases; clinicopathological
features like older age, LVI, lymph node metastasis, high grade, advanced stage, psammoma
bodies, extensive necrosis, deep myometrial invasion were found to be associated with
decreased survival. Of these, LVI, extensive necrosis and deep myometrial invasion were also
associated with recurrence/metastasis. Multivariate Cox analysis using LVI, extent of necrosis,
FIGO grade and myometrial invasion showed that FIGO grade and extent of necrosis were
independent prognostic factors for survival. In addition, survival was significantly decreased in
the group that PD-L1 was totally negative in neoplastic cells. Moreover, increase in
intratumoral CD8 positive lymphocyte density was associated with prolonged survival time in
the MSI/MMRd group. While, increase in stromal CD4 positive lymphocyte density was
associated with decreased survival in the MSS/MMRp.
Conclusions: Although poor prognostic morphological findings were more common in
the MSI/MMRd group, there was no difference in terms of survival, recurrence or metastasis
between MSI/MMRd and MSS/MMRp cases. The reason of this is thought to be related with
the differences in tumor microenvironment among tumor groups. Increased intratumoral CD8
positive lymphocyte density being correlated with better survival as shown in our study which
can be considered as a proof of this argument. There are conflicting results in the literature
regarding the prognostic significance of PD-L1 expression of neoplastic cells and stromal
lymphocytes. In our study, increased PD-L1 expression on tumor cells was found to be
associated with prolonged survival, which in fact may be related to the correlation between PDL1 and CD8 positive cells among all compartments.
Anahtar Kelimeler: Endometrial carcinoma, microsatellite instability, tumor
microenvironment, prognosis, immun checkpoint.