İnsan akciğer (a-549), meme (mcf-7) ve melanoma (a-2058) kanser hücrelerinde alfa-pinen, gama-terpinen ve p-cymen'nin apoptozis yoluyla In vitro ve In vivo antitümoral etkinliğinin araştırılması
Investigation of In vitro and In vivo antitumoral activity of alfa-pinene, gamma-terpinene and p-cymen by apoptosis in human lung (a-549), breast (mcf-7) and melanoma (a-2058) cancer cells
Yazar: FUNDA ÇİMEN AÇIKGÜL
Danışman: PROF. DR. NİZAMİ DURAN
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Alfa pinen = Alpha pinene ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Gama-terpinen = Gama-terpinene ; Melanom = Melanoma ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; P-cymen = P-cymen

Özet:
Kanser her yıl dünya çapında milyonlarca insanın ölüme yol açan ciddi bir halk sağlığı problemidir. Biz bu çalışmada üç farklı insan kanseri [meme (MCF-7), akciğer 
(A-549), melanoma (A-2058)] hücreleri üzerinde Alfa-Pinen, Gama-Terpinen ve 
P-Cymen'in antikanserojen aktivitelerini, bu fitokimyasallar ile Paklitaksel ve Dakarbazin'in ikili, üçlü ve dörtlü kombinasyonlarının sinerjistik etkinliklerini araştırdık.
Antikanserojen etkinlik veya sinerjistik aktivite çalışmaları fitokimyasalların toksik olmayan konsantrasyonları dahilinde gerçekleştirildi. Deneylerde p53, Bax, NF-κB, Bcl-2, Bcl-xL ve kaspaz-3 (MCF-7 hücreleri hariç) gen ekspresyonları Real-Time PCR yöntemiyle, protein ekspresyonları da Western blotlama yöntemiyle incelendi. Ftokimyasalların ve kombinasyonlarının konak üzerinde antitümoral aktiviteleri ise deneysel olarak oluşturulmuş deri altı fare tümör modelinde araştırıldı. 
Alfa-Pinen, Gama-Terpinen ve P-Cymen'in non-sitotoksik konsantrasyonları sırasıyla 0.078, 0.625 ve 1.25 g/ml olarak tespit edildi. Kanser hücrelerini en yüksek düzeyde apoptoza uğratan Alfa-Pinen, Gama-Terpinen ve P-Cymen konsantrasyonlarının, sırasıyla 0.019, 0.078 ve 0.625 g/ml olduğu tespit edildi. Deneylerde fitokimyasalların hücre tipine göre etkinliklerinin de değiştiği tespit edildi. Çalışmada A-549 hücreleri üzerinde Gama-Terpinen ve P-Cymen'in, A-2058 hücreleri üzerinde ise özellikle Gama-Terpinen'in kaspaz-3 aktivitesini anlamlı düzeyde arttırdığı tespit edildi. Sözgelimi A-549 hücreleri üzerinde Alfa-Pinen'in Bcl-2 gen ekspresyonunu, Gama-Terpinen ve P-Cymen'in Bcl-xL gen ekspresyonunu anlamlı düzeyde inhibe ettiği tespit edilirken, Alfa-Pinen ve Gama-Terpinen'in NF-κB gen ekspresyonunu anlamlı derecede inhibe ettiği tespit edildi. Kombinasyon deneylerinde de tekli kullanımlarda olduğu gibi fitokimyasalların etkinliklerinin hücre tiplerine göre anti-apoptotik ve pro-apoptotik gen eksresyonlarınının farklı düzeyde etkiledikleri tespit edildi. Fitokimyasalların kombine kullanımları durumunda hücre tipine göre farklılık görülse de bazı gen ekspresyonları üzerinde güçlü sinerjistik etkinlikler tespit edildi. Sözgelimi MCF-7 hücreleri üzerinde yapılan kombine etkinlik deneylerinde, Gama-Terpinen artı Alfa-Pinen, Gama-Terpinen artı Paklitaksel ve Gama-Terpinen artı Alfa-Pinen artı P-Cymen artı Paklitaksel kombinasyonlarının anti-apoptotik genlerden Bcl-2 gen ekspresyonunu anlamlı derecede azalttığı tespit edildi. In vivo deneylerde, Alfa-Pinen tedavi grubunda akciğer ve karaciğer dokularında melanosit metastazının sırasıyla %30 ve %20 oranında azaldığı, Gama-Terpinen tedavi grubunda hem akciğer ve hem de karaciğer metastazının %50 oranında azaldığı tespit edilirken, Alfa-Pinen artı Dakarbazin kombine tedavi grubunda akciğer ve karaciğer metastazının sırasıyla %70 ve %80 oranında azaldığı tespit edildi. Alfa-Pinen artı Gama-Terpinen artı P-Cymen artı Dakarbazin tedavi grubunda ise farelerin yalnızca %10'unda deri ve %10'unda ise akciğer dokusunda melanosit varlığı tespit edildi.
Alfa-Pinen, Gama-Terpinen ve P-Cymen'in kombinasyonları ve kanser ilaçlarıyla farklı kombinasyonlarının özellikle Bcl-2 ve p53 gibi bazı genlerin ekspresyonlarını arttırıcı ya da inhibe edici yönde güçlü sinerjiler oluşturmuştur. Fitokimyasallarla kemoterapötik ajanların kombine kullanımı, antikanserojen olarak kullanılan ilaçların etkinliğini artırmış ve hücreler üzerindeki sitotoksisiteyi de azaltmıştır. Böylece, kanser tedavisinin kemoterapotiklerle tedavi başarı oranları da artacaktır. Bu fitokimyasalların Paklitaksel ve Dakarbazin ile ikili, üçlü ve dörtlü kombinasyonlarının yapılması, bu üç kanser türü üzerinde tarafımızdan ilk kez araştırılmış olup, bu kombinasyonların güçlü etkinlikler sergilediği tespit edilmiştir. İnsan meme, akciğer ve melanoma kanserlerine karşı bu fitokimyasalların çeşitli kombinasyonlarının oldukça güçlü etkinlik göstermeleri, bu kanser türlerinin tedavilerinde oldukça umut vaad edici olarak değerlendirilmiştir.
Anahtar kelimeler: Alfa-Pinen, Gama-Terpinen, P-Cymen, sinerjistik etki, deri altı tümör modeli.

Abstract:
Cancer is a serious public health problem that kills millions of people around the world each year. In this study, we investigated the anticarcinogenic activities of Alpha-Pinene, Gamma-Terpinene and P-Cymen on three different human cancer cells, as well as the synergistic effects of these phytochemicals and combinations of Paclitaxel and Dacarbazine double, triple and quadruple. 
Anticancer activity or synergistic activity studies were performed in non-toxic concentrations of phytochemicals. Gene expressions of p53, Bax, NF-κB, Bcl-2 and Bcl-xL and caspase-3 (excluding MCF-7 cells) were analyzed by Real-Time PCR method and protein expressions were analyzed by Western blotting method. Antitumoral activities of phytochemicals and their combinations on the host were investigated in an experimental subcutaneous mouse tumor model. 
Non-cytotoxic concentrations of Alpha-Pinene, Gamma-Terpinene and P-Cymen were determined as 0.078, 0.625 and 1.25 g/ml, respectively. The concentrations of Alpha-Pinene, Gamma-Terpinene, and P-Cymen that induce the highest level of apoptosis in cancer cells were 0.019, 0.078 and 0.625 g/ml, respectively. In the experiments, differences were found in the activities of phytochemicals according to the cell type. It was determined that Gamma-Terpinen and P-Cymen on A-549 cells and especially Gamma-Terpinen on A-2058 cells significantly increased caspase-3 activity. For example, on A-549 cells Alpha-Pinene significantly inhibited the expression of Bcl-2, while Gamma-Terpinene and P-Cymen significantly inhibited the expression of Bcl-xL. Alpha-Pinene and Gamma-Terpinen significantly inhibited NF-κB gene expression on the same cells. In combination experiments, it was determined that the activities of phytochemicals affect different levels of antiapoptotic and proapoptotic gene expressions according to cell types, as in the single use of phytochemicals. Although the activities of the combinations of phytochemicals differ according to cell type, strong synergistic activities were detected on some gene expressions. For example, in combined efficacy experiments on MCF-7 cells, combinations of Gamma-Terpinene plus Alpha-Pinene, Gamma-Terpinen plus Paclitaxel and Gamma-Terpinene plus Alpha-Pinene plus P-Cymen plus Paclitaxel significantly increased Bcl-2 gene expression from anti-apoptotic genes. It was found to decrease. In in-vivo experiments, it was found that melanocyte metastasis in the lung and liver tissues decreased by 30% and 20%, respectively, in the Alpha-Pinene treatment group, and both lung and liver metastases were reduced by 50% in the Gamma-Terpinen treatment group. However, it was found that lung and liver metastasis decreased by 70% and 80%, respectively, in the combined therapy group of Alpha-Pinene plus dacarbazin. In the Alpha-Pinene plus Gamma-Terpinen plus P-Cymen plus Dakarbazin treatment group, melanocyte presence was detected in only 10% of the mice and the lung tissue in 10% of the mice.
Combinations of Alpha-Pinene, Gamma-Terpinene and P-Cymen and their different combinations with cancer drugs have created strong synergies to increase or inhibit the expression of some genes, especially Bcl-2 and p53. Combined use of phytochemicals and chemotherapeutic agents increased the efficacy of drugs used as anticarcinogen and decreased cytotoxicity on cells. Thus, the success rates of cancer treatment with chemotherapeutics will increase. Double, triple and quadruple combinations of these phytochemicals with Paclitaxel and Dakarbazin have been investigated by us for the first time on these three types of cancer and it has been determined that these combinations exhibit strong activities. The strong efficacy of various combinations of these phytochemicals against human breast, lung and melanoma cancers has been evaluated as highly promising in the treatment of these cancer types.
Keywords: Alpha-Pinene, Gamma-Terpinen, P-Cymen, synergistic effect, subcutaneous tumor model.