Myelodisplastik sendrom (MDS) ve akut myeloid löseminin (AML) epigenetik profillerinin belirlenmesi suretiyle MDS ve AML prognozunda yeni moleküler belirteçlerin tanımlanması
Identification of new molecular markers for the prognosis of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia through the determination of epigenetic profile of MDS and AML
Yazar: HÜLYA SÜMER ÇELEBİ
Danışman: PROF. DR. HİLAL ÖZDAĞ
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Myelodisplastik sendrom (MDS), hematopoiezisin bozulması ile ortaya çıkan, hücresel fonksiyon bozukluğu ile karakterize ve akut myeloid lösemiye (AML) dönüşme riski yüksek olan bir hastalıktır. Hematopoietik kök hücrelerin nicelik ve niteliğinde meydana gelen hasarlar sonucunda MDS hastalarının %35-40'ında giderek kötüleşen sitopeni ile birlikte AML'ye dönüşüm görülmektedir. Heterojen özelliğe sahip olan MDS hastalığında daha etkin teşhis ve tedavi sağlanması amacıyla FAB (French-American-British) ve WHO (Dünya Sağlık Örgütü) tarafından yapılan sınıflandırmalarda çeşitli kriterler dikkate alınmış olmasına rağmen MDS'ye ilişkin prognozun öngörülmesinde henüz tam anlamıyla başarı sağlanamamıştır.
Bugüne kadar MDS'nin patogenezine ait moleküler mekanizmanın aydınlatılmasında önemli katkılar sağlayan pek çok araştırma yapılmış ve hastalıkla ilişkilendirilen sitogenetik, genetik ve epigenetik değişimler tespit edilmiştir. Özellikle bazı tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonuyla sonuçlanan metilasyon paternindeki değişikliklerin hastalığın ortaya çıkmasına neden olan epigenetik süreçlerin arasında olduğu belirlenmiştir ancak yine de yapılan tüm bu çalışmalar ve eldeki veriler MDS'nin moleküler mekanizmasını, alt tiplerini, alt tipleri birbirinden ayıran moleküler sınırları ve hastalığın prognozunu bütünüyle açıklamakta yetersiz kalmaktadır. Bu durum MDS'ye yönelik tedavi rejimlerinin spesifitesini ve etkinliğini de olumsuz etkilemektedir. MDS'nin moleküler mekanizmasında önemli bir bileşen olan epigenetiğin tedavide kullanılabileceğinin anlaşılması ile tedavi protokolüne giren ve demetile edici bir ajan olan 5-azasitidin'in yüksek riskli MDS hastalarının %50'sinde sitopeniyi iyileştirdiği bilinmektedir. Bu bilgilerden yola çıkılarak planlanan tez çalışmasında MDS ve MDS-AML hastalarında 5-azasitidin'in epigenetik profil üzerine etkisinin değerlendirilmesi ile teşhis ve tedavide kullanılabilecek yeni moleküler belirteçlerin tanımlanması amaçlanmıştır.
Tez çalışması kapsamında 18 hastanın tedavi öncesi ve sonrası, 15 hastanın sadece tedavi öncesi ve 5 sağlıklı kontrolün kemik iliği örneği alınmıştır. CD34+/CD117+/CD133+ hücrelerden izole edilen DNA kullanılarak promotor arraylerle metilasyon analizleri yapılmıştır. Biyoinformatik analiz ile tespit edilen genlerin ekspresyon seviyeleri ise RNA örnekleri üzerinden QRT-RT PCR ile belirlenmiştir.
5-azasitidin'in genom ebadında metilasyon profili üzerine olan etkilerinin MDS ve MDS-AML hasta örnekleri kullanılarak ilk kez incelendiğinde bu çalışmada gerçekleştirilen metilasyon analizleri sonucunda tedavi öncesi ve sonrası karşılaştırmasında 58, tedavi öncesi (eşli) örnekler ve kontrol karşılaştırmasında 452, tedavi öncesi (tek) ve kontrol karşılaştırmasında 614, tedavi öncesi tüm örnekler ve kontrol karşılaştırmasında 415 ve tedavi sonrası ve kontrol karşılaştırmasında ise 377 farklı metilasyon gösteren bölge tespit edilmiştir. Karşılaştırmalarda, doğal öldürücü hücre aracılı sitotoksisite, fokal adezyon, kemokin sinyal yolağı, endositozis ve aktin hücre iskeleti regülasyonu ön plana çıkan yolaklardır. Bu çalışma ile MDS'nin moleküler patogenezinde önemli bir yeri olan epigenetik regülasyonun rolü MDS ve MDS-AML hastalarında DNA metilasyon değişimleri seviyesinde ortaya konmuştur.

Abstract:
Myelodysplastic syndromes (MDS) are a group of clonal hematopoietic stem cell diseases characterized by cytopenias, dysplastic morphological and immunophenotypical changes in one or more cell lines, ineffective hematopoiesis and increased risk of development of acute myeloid leukemia (AML).  The genetic and molecular changes on stem cells cause leukemic transformation of dysplastic clone in about %35 to %40 of the cases during the course of the disease. MDS covers a heterogeneous group of diseases which could carry difficulties on diagnosis and effective treatment. The diagnostic criteria were described formerly by FAB classification. Today updated WHO (2008) classification is used for diagnosis of the diseases within this spectrum. Although the diagnostic criteria are described, the prognosis of the disease could be different for the patients presenting the same disease.
There have been many studies shedding light on the molecular mechanism of MDS pathogenesis revealing cytogenetic, genetic and epigenetic changes. Previous research on the pathogenesis of the disease revealed the inactivation of some tumor suppressor genes by methylation. But these data is not enough to explain all of the molecular changes and their correlation with morphological types or prognosis of the disease. Lack of knowledge on the full aspect of the molecular pathogenesis of the disease prevents effective specific therapy solutions against the disease.
5-azacitidine has been used as a demethylating agent on MDS therapy especially for high risk MDS patients. This drug can successfully treat cytopenia in %50 of the patients. In this study, our aim was to evaluate the effects of the 5-azacitidine in MDS and MDS- AML patients epigenetic profile and to identify new molecular markers for diagnosis and treatment.
In this dissertation, we collected bone marrow samples from 18 patients before and after therapy with 5-azacitidine, 15 patients only before therapy and 5 healthy controls. DNA was extracted from CD34+/CD117+/CD133+ cells for methylation analysis using promoter arrays in order to evaluate the methylated genes. Expression level of genes determined through bioinformatic analysis was analyzed with QRT-RT PCR.
In this study, the impact of 5-azacitidine on genome-wide methylation profile was evaluated on MDS and MDS-AML patients for the first time. The methylation analysis identified 58 differentially methylated region (DMR) in pre-treatment vs post-treatment, 452 DMR in pre-treatment (single) samples vs control, 614 DMR in pre-treatment (single) samples vs control, 415 DMR all in pre-treatment samples and control, 377 DMR in post-treatment samples and control comparisons. The pathways that were highlighted in this comparisons were natural killer cell mediated cytotoxicity, focal adhesion, chemokine signaling pathway, endocytosis and regulation of actin cytoskeleton. This study revealed  the role of the epigenetic regulation which is important in the molecular pathogenesis of the MDS in MDS and MDS-AML patients with DNA methylation differentiation levels.