Endoplazmik retikulum stres modeli oluşturulan insan meme kanseri (MCF-7) hücrelerinde linearolün endoplazmik retikulum stres markerleri üzerine etkilerinin araştırılması
IInvestigate the effects of linearol on the endoplasmic reticulum markers by using the endoplasmic reticulum stress generated model of human breast cancer cells (MCF-7).
Yazar: HALİL TURHAN
Danışman: DOÇ. DR. İBRAHİM HAKKI CİĞERCİ
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kanser, hücrelerin kontrolsüz çoğalmalarına, bağışıklık sisteminin denetiminden kaçmalarına ve sonuç olarak dokularda metastazlar oluşturmalarına neden olan işlevsel  ve davranışsal farklılıklar geçirdikleri çok aşamalı bir süreçtir. Meme kanseri, meme epitel dokusundaki kötü huylu hücrelerin kontrolsüz büyümesiyle karakterizedir. Hastalık her iki cinsiyette de etkili olabilmektedir. Endoplazmik retikulum (ER) protein sentezinin düzenlenmesi, proteinlerin katlanması, kalsiyum depolaması, kolesterol ve lipid-membran biyosentezinin kontrolü gibi normal hücresel süreçler için gerekli olan önemli bir organel türüdür. ER'de yanlış katlanmış proteinlerin birikmesi, yeni başlayan protein sentezini azaltan, protein katlanmayı kolaylaştıran ve yanlış katlanmış proteinlerin proteozomal bozunmasını arttıran bir koruyucu tepki olarak katlanmamış protein yanıtı (UPR) oluşturulur.
Bu araştırmada, insan meme kanseri (MCF-7) hücrelerinde thapsigargin (T) ile endoplazmik retikulum stresi oluşturularak, strese girmiş hücrelerde linearol kaynağı olarak Sideritis akmanii'nin aseton ekstresinin (SAE) sitotoksisitesi 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid  (MTT) yöntemiyle belirlendi. Hücrelere SAE 1000, 750, 500, 250, 100, 50, 25 µg/mL konsantrasyonlarda ve kontrol olarak hücrelere % 1 dimetilfülfoksit (DMSO) uygulandı. MTT yöntemi ile SAE'nin MCF-7 hücreleri üzerindeki olası etkisi mikroplak okuyucu ile 540 nm'de okutularak sonuçlar yüzde olarak ifade edildi. Kontrol yüzde yüz canlı olarak kabul edilerek SAE'nin letal dozu (LD50) probit analizi ile  38,851 µg/mL olarak  belirlendi.
Çalışmada ayrıca SAE ER stresi ile ilgili genler olan aktive edici transkripsiyon faktörü-4 (ATF4), aktive edici transkripsiyon faktörü-6 (ATF6), protein kinaz RNA (PKR) benzeri ER kinaz (PERK) ve glukoz ile düzenlenen protein 78 (GRP78) ile inflamatuvar yanıtta rol alan genlerin (tümör nekroz faktör alfa (TNFα), interferon gama (IFN-γ), interlökin-6 (IL-6), interlökin-8 (IL-8), interlökin-12 (IL-12)) mRNA ekspresyonlarına etkisi belirlendi. Araştırmamızın sonuçlarına göre ER stresinde UPR yanıtta rol alan GRP78 geninin SAE50 ve SAE50+T uygulama gruplarında ekspresyon seviyelerinin kontrole göre attığı görüldü. ER stresinde UPR yanıtta rol alan PERK geninin bütün uygulama gruplarında baskılandığı ancak SAE100+T uygulanmasında kontrolle kıyaslandığında artış olduğu gözlenmiştir. Ayrıca  ER stresinde UPR yanıtta rol alan ve GRP78 kontrolünde olan ATF-6'nın GRP78 gibi SAE50 ve SAE50+T uygulama gruplarında ekspresyonu arttığı bulunmuştur.
SAE'nin IL-6 sitokininin ekspresyon seviyeleri kontrolle kıyaslandığında bütün uygulama gruplarında artış gözlenmiştir. Bir kemokin olan IL-8 gen ekspresyon düzeyleri ise SAE10, SAE10+T ve SAE50+T  uygulamalarında baskılanırken diğer uygulamalarda artış göstermiştir. SAE'nin IL-12 ve TNFα genleri üzerindeki etkisi benzer olduğu görülüp bütün uygulama gruplarında baskılanmışlardır. IFN-γ geni sitotoksiste testi ile elde edilen konsantrasyonunda kontrolle aynı etkiyi gösterirken, diğer uygulama gruplarında baskılanmıştır.
SAE ve thapsigargin uygulamasının sonuçlarına göre en yüksek DNA hasar skoru, 100 µg/mL S. akmanii ekstresi + Thapsigargin uygulanan grupta 94,00±5,29 olarak bulundu.
Sonuç olarak S. akmanii'nin MCF-7 hücreleri üzerinde genotoksik ve sitotoksik etkilerinin olabileceği düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: MCF-7, ER stresi, Komet Yöntemi, Sideritis akmanii, Real Time PCR, genotoksisite, sitotoksisite, endemik bitki

Abstract:
Cancer is a multi-stage process in which functional and behavioral differences occurs in the cell and cell escapes from the control of the immune system, which consequently leads to form metastases in the tissue. Breast cancer is characterized by uncontrolled growth of malignant cells in the breast epithelium tissue. The disease can be effective in both sexes. Endoplasmic reticulum (ER) is an important organelle species required for normal cellular processes such as regulation of protein synthesis, folding of proteins, calcium storage, control of cholesterol and lipid-membrane biosynthesis. Accumulation of misfolded proteins in the ER creates the UPR response as a protective response that reduces the synthesis of new-on-protein, facilitates protein folding, and increases proteosomal degradation of misfolded proteins.
In this study, the  endoplasmic reticulum stress was induced by thapsigargin in human breast cancer (MCF-7) cells and the cytotoxicity of acetone extract of Sideritis akmanii (S. akmanii) as a linearol source in stressed cells was determined by 3- (4,5-dimethyltriazol- diphenyltetrazolium bromide (MTT) method.  Following doses (1000, 750, 500, 250, 100, 50, 25 μg / ml) of  S. akmanii were employed and 1% DMSO was used as a solvent control. The possible effect of the MTT method on the MCF-7 cells by the  S. akmanii  was studied with a microplate reader at 540 nm and the results were expressed as a percentage. Control was accepted as 100% live and was determined to be 38,851 μg / mL by the proband analysis of lecithin (LD50) of SAE.
In our study, the effect of the acetone extract of S. akmanii as a linearol source in MCF-7 cells with normal and ER stress was further studied by the expression level of ATF-4, AFT-6, PERK, Grp78, TNFα, IFN-γ, IL-6, IL-8 and IL-12 genes by real time PCR. According to the results of our study, the expression levels of Grp78 gene in the SAE50 and SAE50 + T treatment groups, which were involved in UPR response in ER stress, were found to be higher than control levels. It was observed that the PERK gene involved in UPR response in ER stress was suppressed in all application groups but increased in SAE100 + T administration compared to control. It was also found that ATF-6, which is involved in UPR response in ER stress and in control of Grp78, increases expression in SAE50 and SAE50 + T treatment groups like Grp78.
An increase in IL-6 gene expression was observed in all treatment groups compared to that of control.  IL-8 gene expression levels was suppressed in SAE10, SAE10 + T and SAE50 + T applications and increased in other treatment groups. Similar expression was observed in IL-12 and TNFα genes whereas these were suppressed in all other treatment groups. The IFN-γ gene showed the same effect as the control at the LD50 concentration obtained by the cytotoxicity test, but suppressed in the other treatment groups.
The highest DNA damage score was found as 100 μg / mL (94.00 ± 5.29) in the Thapsigargin treated group.
it was concluded that S. akmanii has genotoxic and cytotoxic effects on MCF-7 cells.

Key Words: MCF-7, ER stress, Comet Assay, Sideritis akmanii, Real Time PCR, Genotoxicity, Cytotoxicity, Endemic plant