İmmortal beta hücre hattı kaynaklı mikroveziküllerin mezenkimal kök hücrelerin insülin üreten hücrelere farklılaşma potansiyeline etkisi
The effect of immortal beta cell line microvesicles on insulin-producing cell differentiation of mesenchymal stem cells
Yazar: ESRA ALBAYRAK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ GÖKHAN DURUKSU
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre ve Doku Yenilenmesi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Eksozomlar = Exosomes ; Endokrin bezler = Endocrine glands ; Hiperglisemi = Hyperglycemia ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücreler = Cells ; Kök hücreler = Stem cells ; Sinyal nakli = Signal transduction ; İnhibisyon = Inhibition ; İnsülin = Insulin

Özet:
Amaç: Ortak kültür yöntemi kullanılarak insan Wharton jeli (göbek bağı) kaynaklı mezenkimal kök hücre (iWJ-MKH)'lerin beta hücrelerinden salınan eksozomlar ile insülin sentezleyen beta benzeri hücrelere farklılaşması amaçlanmıştır. Diyabet, günümüzde toplumun her kesimini etkileyen ve henüz kesin bir tedavisi bulunamamış önemli bir sorundur. Bu hastaların %10 'unu oluşturan Diabetes Mellitus Tip 1 hastalarında devamlı olarak gerçekleşen beta hücre yıkımı sonucunda insülin azlığı veya yokluğu oluşur. Glikoz homeostazının tekrar sağlanabilmesi için hücresel tedavi yöntemleri geliştirilmektedir. Kök hücrelerin farklılaşma özellikleri kullanılarak diyabet hastalığında kaybedilen beta hücrelerini yerine koyma, sıkça araştırılan konulardan birisidir. Kök hücrelerin farklılaşmaya yönlenmesinde, bulunduğu mikroçevrenin etkinliği birçok çalışmayla denenmiştir. Hücrelerden mikroçevrelerine salgılanan veziküllerden biri olan eksozomların hücreler arası iletişimde rolü olduğu ve içeriğinde salgılandığı hücreye özgü gen transkripsiyon faktörlerinin ve proteinlerin bulunduğu gösterilmiştir.
Yöntem: Bu doğrultuda iWJ-MKH'ler çoğaltıldıktan sonra, kök hücre karakterizasyonu için adipojenik, osteojenik, kondrojenik hücre farklılaşma çalışması ve akış sitometri ile analiz edilmiştir. iWJ-MKH'ler kimyasal uyarıcılar ile endokrin hücre farklılaşmasına yönlendirilmiştir. Bu sürece ek olarak beta hücrelerinden elde edilen eksozomlar kimyasal olarak uyarılmış kök hücreler ile ortak kültüre alınmıştır. Hedgehog sinyal yolağının susturulması için GANT61 eksozomlar ile birlikte inkübe edilerek eksozomlar modifiye edilmiş ve hücrelerde aktif olan Hedgehog sinyal yolağı da bu modifiye eksozomların kültür ortamına eklenmesiyle susturulmuştur. 
Bulgular: Hücreler 21 gün boyunca endokrin hücre farklılaştırma sürecine alınmış ve gen düzeyinde hücrelerin farklılaştığı gözlemlenmiştir. Kimyasal uyarı grubu ile Kimyasal uyarı + Eksozom grubu hücreleri karşılaştırılmış ve beta hücre belirteçlerinin gen  
ekspresyonları açısında iki grup arasında belirgin bir fark bulunmamıştır (p>0,05). Bu durum eksozomların kimyasal uyarıcıların varlığında hücre farklılaşması yönünde belirgin bir etkisinin olmadığını göstermektedir. GANT61 ile modifiye edilen eksozomların kullanımı sonucunda MKH'lerde Hedgehog sinyal yolağı susmuş ve GANT61 + Kimyasal uyarı + Eksozom grubu hücrelerde SHH1 ekspresyonu 4,17 kat düşmüştür. Susmanın gerçekleştiği hücre grubunda, susturulmamış hücre grubuna göre İnsülinin 1,8 kat ve Ngn3'ün 4,32 kat daha yüksek ifade edildiği belirlenmiştir (p<0,05).
Sonuç: Bu çalışmada eksozomlar kimyasal bir inhibitörle modifiye edilerek kök hücrelerde Hedgehog sinyal yolağının susturulacağı ve bu yolağın etkisizleşmesiyle iWJ-MKH'lerinin endokrin hücrelere farklaşması veriminin artırılabileceği ortaya konmuştur.

Abstract:
Aim: It was aimed to differentiate human Wharton's jelly mesenchymal stem cells (hWJ-MSCs) by co-culture with exosomes derived from beta cells into insulin-secreting beta-like cells. Diabetes is a critical issue that affects every part of society today without any definitive treatment yet. In Diabetes Mellitus Type 1 patients, which constitute 10% of these patients, insulin deficiency or absence occurs as a result of continuous beta cell disruption. Cellular therapies are being developed to restore glucose homeostasis in this patients. Replacing beta cells lost in diabetes using the stem cells after the differentiation is one of the hot researched topics. During the committment of stem cells to differentiate, the effect of micro-environment has been practicing in many studies. It has been shown that exosomes, one of the micro-vesicles secreted from the cells, play a role in intercellular communication and in the differentiation induction with their content of cell-specific transcription factors and proteins.
Method: In this direction, hWJ-MSCs were cultured, and the cells were characterized by the differentiation into adipogenic, osteogenic, chondrogenic cell lines and flow cytometry. hWJ-MSCs were committed to endocrine cell differentiation with chemical stimuli. In addition to this process, exosomes obtained from 1.1B4 beta cells were co-cultured with chemically stimulated stem cells. To silence the Hedgehog signal pathway, the exosomes were modified by incubation with GANT61. Exosomes with GANT61 was used to silence the hedgehog signal pathway, which was still active in hWJ-MSCs.
Results: The cells at 21th day of the endocrine differentiation were collected and differentiation was confirmed by gene expression analyses. Compared with the chemical stimulant group, the chemical stimuli + exosomal group cells were compared and there was no significant difference between them in terms of gene expression of beta cell markers (p> 0,05). This suggests that exosomes did not have a significant effect on cell differentiation in the presence of chemical stimulants. In the exosomes modified with GANT61, the hedgehog signal pathway in MSCs was inactivated and the expression of SHH1 in GANT61+Chemical stimulation+Exosomal group cells decreased by 4.17 fold. It was determined that insulin expression increased by 1.8 times and Ngn3 expression was improved by 4.32 times compared to that in the non-silent group (p <0,05).
Conclusion: In this study, exosomes were modified with a chemical inhibitor, and Hedgehog signaling pathway in stem cells was achieved to be silenced, and the differentiation efficiency of hWJ-MSCs into endocrine cells could be improved by inactivating this pathway.