Farklı bölge buğday unlarından üretilen ekşi hamurlardan izole edilen endojen mayaların bazı teknolojik ve immünojenik özelliklerinin belirlenmesi
Determination of some technological and immunogenic properties of endogenous yeasts isolated from sourdoughs produced from different regions' wheat flours
Yazar: ECE KONURALP
Danışman: PROF. DR. SAİT AYKUT AYTAÇ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Caco-2 = Caco-2

Özet:
Bu çalışmada Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden toplanan buğday unlarından ekşi hamurlar hazırlanarak bunlardan ve hazır 1 adet ekşi hamurdan maya kolonileri izole edilmiştir. MALDI-TOF Kütle Spektrometresi'yle tanımlaması yapılan izolatların 37 santigrat derecede ve yüksek şeker konsantrasyonunda gelişmeleri incelenmiştir. MALDI-TOF MS ile yapılan ön tanımlamaya göre 12 maya izolatının 10 tanesi Saccharomyces cerevisiae'dir. Sadece E1 kodlu izolat yüksek şeker konsantrasyonunda gelişebilmiştir. 37 santigrat derecede GPY agarda Bi1, Bi5, Bi7; GPY sıvı besiyerinde ise sadece Bi1 kodlu izolat gelişememiştir. İzolatların ekmekçilik açısından önemli olabilecek özellikleri (optik yoğunluğa dayalı gelişme hızı, glukoz-şeker fermantasyonu, çeşitli tuz derişimlerinde gelişme, düşük pH değerlerinde gelişme, killer aktivite, duyarlılık, proteolitik aktivite) araştırılarak uygun izolatların sekans analizi yaptırılmıştır. Tüm izolatlar glukozu fermente edebilmiştir. Ch1 kodlu izolat sakarozu; Bi1, Bi5, Bi7 kodlu izolatlar ise fruktozu 24 saatte fermente etmiştir. Bi5 kodlu izolat glukoz fermantasyonu besiyerinde; PeC, Bi1, Bi5 kodlu izolatlar ise şeker fermantasyonu besiyerinde 24 saat içerisinde glukozu tamamen fermente etmiştir. Tüm izolatlar pH 2.5-3.5-4.5-6.57'de ve yüzde 2-3-4-5 (w/v) tuz konsantrasyonlarında gelişmiştir. İzolatların hiçbiri killer özellik ve proteolitik aktivite göstermemiştir. PeC ve PeA1 kodlu izolatlar hariç tüm izolatlar K1 ve K2 killer toksinlerine duyarlı bulunmuştur. Optik yoğunluğa dayalı gelişme hızı testinde Saccharomyces cerevisiae izolatlarından en yüksek sayıya 24. saatin sonunda M2 kodlu izolat ulaşırken Saccharomyces uvarum/ Saccharomyces bayanus izolatlarından Bi5 ulaşmıştır. Sekans analiziyle 6 izolatın (C1, Ch1, E1, M2, PeF, PeA2) Saccharomyces cerevisiae olduğu doğrulanmıştır. MTT testiyle bazı izolatların sitotoksisitesinin araştırılması için Caco-2 (İnsan kolon adenokarsinoma hücre hattı) ve THP-1 (İnsan monositik hücre hattı) hücreleri kullanılmıştır. MTT testine göre BY1-1, E1, M2, PeA2, PeF ve Ch1 kodlu izolatlar THP-1 ve Caco-2 hücrelerinin çoğalmasına neden olmuştur. Maya izolatlarının immüne regulasyona etkisinin belirlenmesi amacıyla THP-1 hücreleri PMA uygulamasıyla makrofaja dönüştürülerek inaktif maya izolatlarıyla etkileştirilmiştir. Hücrelerden TNF-alfa, IL-4, IL-5 ve IL-10 sekresyonu hücre kültürü süpernatantlarından ELISA yöntemiyle ölçülmüştür. İzolatların sitokin seviyeleri negatif kontrol ile kıyaslanarak t-testi ve çift yönlü ANOVA yapılmıştır. İzolatlar arasındaki fark tek yönlü ANOVA'yla değerlendirilmiştir. PeF, C1, BY1-1 ve M2 kodlu izolatlar makrofajlardan önemli düzeyde TNF-alfa salınımına neden olmuştur (p<0.05). TNF-alfa salınım düzeyi bakımından izolatlar arasındaki fark önemli bulunmuştur (p<0.05). Bi5 ve Ch1 kodlu izolatların IL-4 seviyesi negatif kontrol değerinden düşük olup, makrofajlardan IL-4 salınımını azaltmışlardır. IL-4 salınım düzeyi bakımından izolatlar arasındaki farkın önemli olmadığı belirlenmiştir (p>0.05). En fazla IL-5 salınımı C1 kodlu izolatta olup negatif kontrolden farkı anlamlı bulunmuştur (p<0.05). Bi5, Bi7, Ch1, PeA2 ve PeA1 kodlu izolatların IL-5 düzeyleri negatif kontrol değerinden düşük olup aralarındaki fark anlamlı bulunmuştur (p<0.05). IL-5 salınım düzeyi bakımından izolatlar arasındaki fark önemli bulunmuştur (p<0.05). M2, Bi7, C1, PeF, BY1-1, PeC ve PeA1 kodlu izolatların makrofajlardan IL-10 salınımını arttırmış ve bu anlamda izolatlar arasındaki fark önemli bulunmuştur (p<0.05). Buna göre PeF ve M2 kodlu izolatlar teknolojik özellikleri bakımından ekmek üretiminde maya starteri olarak kullanılma potansiyeline sahip olup, Türkiye'ye özgü endemik suş olup olmadıkları hususunda ve ticarileştirilebilmeleri için daha kapsamlı çalışmalar yapılmalıdır. Maya izolatlarının THP-1 ve Caco-2 kanser hücre hatlarına etkisinin yanı sıra makrofajlarla etkileşimleriyle açığa çıkan TNF-alfa, IL-4, IL-5 ve IL-10 sitokinlerinin seviyeleri ortaya konularak mayaların insan sağlığı üzerinde olası etkilerine ilişkin yapılabilecek çalışmalar için projeksiyon tutulmuştur.

Abstract:
In this study, yeast colonies were isolated from sourdoughs that were prepared with wheat flours which were collected from Turkey's different areas meanwhile one of them was readymade sourdough. The isolates that were identified by MALDI-TOF Mass Spectrometry were analysed for their growth at 37 centigrade degrees and in high sugar concentration. 10 of 12 isolates were Saccharomyces cerevisiae according to the pre-idenficiation which was done by MALDI-TOF MS. Only E1 (coded isolate) could grow in high sugar concentration. Bi1, Bi5, Bi7 couldn't grow in GPY agar at 37 centigrade degrees. Only Bi1 couldn't grow in GPY broth at 37 centigrade degrees. The properties which can be important for bread making (optical density dependant growth rate, glucose-sugar fermentation, growth in several salt concentrations, growth at low pH values, killer activity, sensivity, proteolytic activity) of the yeast isolates were investigated and the convenient isolates' sequence analysis was performed. All of the yeast isolates could ferment glucose. Ch1 could ferment saccharose within 24 hours. Bi1, Bi5, Bi7 could ferment fructose within 24 hours. Bi5 fermented glucose in glucose fermentation medium within 24 hours. PeC, Bi1, Bi5 fermented glucose in sugar fermentation medium within 24 hours. All of the isolates were grown at pH 2.5-3.5-4.5-6.57 values and at 2-3-4-5 percent (w/v) salt concentrations. Neither of the isolates showed killer and proteolytic activity. All of the isolates were found sensitive to K1 and K2 killer toxins except PeC and PeA1. While M2 reached the highest number at the end of 24 hours among the Saccharomyces cerevisiae isolates, Bi5 reached the highest number at the end of 24 hours among the Saccharomyces uvarum/ Saccharomyces bayanus isolates in the optical density dependant growth rate experiment. 6 of the isolates (C1, Ch1, E1, M2, PeF, PeA2) verified as Saccharomyces cerevisiae with sequence analysis. Caco-2 (Human colon adenocarcinoma cell line) and THP-1 (Human monocytic cell line) cells were used to investigate cytotoxicity of the some isolates with MTT Assay. BY1-1, E1, M2, PeA2, PeF and Ch1 caused growth of THP-1 and Caco-2 cells according to MTT Assay. THP-1 cells were differentiated to macrophages by applying PMA and were interacted with the inactive yeast isolates to determine effect of the yeast isolates to immune regulation. TNF-alpha, IL-4, IL-5 and IL-10 secretion from the cells was measured from the cell culture supernatants with ELISA method. t- Test and two way ANOVA were implemented by comparing the isolates' cytokine levels with the negative control. Differences between the isolates were evaluated by using one way ANOVA. PeF, C1, BY1-1 and M2 caused significant amounts of TNF-alpha release from macrophages (p<0.05). The difference between the isolates was found significant in terms of TNF-alpha release level (p<0.05). IL-4 levels of Bi5 and Ch1 were lower than the negative control value and they decreased IL-4 release from macrophages. The difference between the isolates was not determined significant in terms of IL-4 release (p>0.05). The highest IL-5 release was in C1 and its difference from the negative control was found significant (p<0.05). IL-5 levels of Bi5, Bi7, Ch1, PeA2 and PeA1 were lower than the negative control value and the difference between them was found significant (p<0.05). The difference between the isolates in terms of IL-5 release level was found significant (p<0.05). M2, Bi7, C1, PeF, BY1-1, PeC and PeA1 increased IL-10 release from macrophages and the difference between the isolates was found significant in this respect (p<0.05). PeF and M2 have a potential to be used as yeast starter for bread making in terms of their technological properties accordingly. More extensive studies should be performed about whether they are endemic strains indigenous to Turkey or not and to commercialize them. The subject was lighted up for the studies that will be able to done about possible effects of yeasts to human health by presenting the effects of the yeast isolates to THP-1 and Caco-2 cancer cell lines as well as presenting levels of TNF-alpha, IL-4, IL-5 and IL-10 cytokines which come out with the interaction between the yeasts and macrophages.