Pluripotent kök hücre sinyal yolaklarına etki eden kimyasal uyaranlarının değerlendirilmesi
Evaluation of chemical inducers influencing on pluripotent stem cell signaling pathways
Yazar: HAKAN DARICI
Danışman: PROF. DR. MERAL ÖNCÜ
Süleyman Demirel Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Genetik = Genetics ; Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Genetik = Genetics ; Kök hücreler = Stem cells ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Kök hücreler, sınırsız kendini yenileme özellikleri ile canlıda varlıklarını sürdürürken, farklılaşma özellikleriyle de gerektiğinde organ ve dokuya özgü hücrelere dönüşerek organizmanın yaşamının devamlılığını sağlayan hücrelerdir. Sadece erken embriyonal dönemde gözlenebilen Pluripotent Kök Hücreler (PKH), yetişkin vücudundaki tüm hücre tiplerini oluşturabilme potansiyeline sahiptir. Son yıllara kadar, yaygın olarak kullanılan PKH kaynağı, atık insan embriyolarından elde edilebilen ve bu nedenle de üretimi ve kullanımı etik açıdan kısıtlı olan Embriyonik Kök Hücrelerdi.
2006 yılında, Takahashi ve Yamanaka'nın çığır açan çalışmasında; Oct4, Sox2, Klf-4 ve c-Myc adlı dört transkripsiyon faktörü, virüsler aracılığıyla fare fibroblastlarına aktarıldığında, somatik hücrelerin geriye programlanarak, kök hücrelere dönüştürülebildiği gösterilmiştir. Etik sıkıntı taşımayan bu yeni kök hücre tipine 'indüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler (iPKH)' adı verilmiş ve bu çalışmayla, pluripotent kök hücre araştırmaları büyük bir ivme kazanmıştır.
Son yıllardaki çalışmalar, Yamanaka'nın kullandığı, mutasyon nedeni olabilecek viral transfeksiyon yöntemine alternatifler geliştirme üzerine yoğunlaşmıştır. Bu bağlamda, hücre sinyal yolaklarına etki eden çeşitli küçük moleküllerin, iPKH üretimini arttırdığı ortaya çıkarılmıştır.
Araştırmamızda, PKH sinyal yolaklarına etkilerinden dolayı seçtiğimiz 12 küçük molekülün, pluripotensi yolakları ile bağlantılarını ortaya çıkarmayı ve pluripotensiyi aktive etmedeki potansiyellerini belirlemeyi amaçladık. İncelediğimiz kimyasalların etkileri, reporter assayler, hücre proliferasyon analizleri, immünositokimya ve Real-Time-PCR yöntemleri ile incelendi. Sadece küçük moleküller kullanılarak geriye programlama deneyleri sonucunda, incelediğimiz moleküllerden 10 adedinin belirli dozlardaki bir kombinasyonunun, insan fibroblastlarında pluripotensi belirteçlerini büyük ölçüde aktive ettiği ve hücrelerin, yüksek etkinlikte ve kısa sürede kısmi olarak geriye programlandığını ortaya koyulmuştur. Araştırmamızın, tamamen kimyasal yolla insan iPKH'lerinin üretilmesi yolunda önemli bir basamak olduğunu düşünmekteyiz.

Anahtar sözcükler: İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre (iPKH), Mezenkimal Kök Hücre (MKH), küçük moleküller, epigenetik, geriye programlama

Abstract:
Stem cells retain their existence in body with their infinite self-renewal ability and enable the continuity of organism's life via differentiating into specific cells of the organs and tissues when needed. Pluripotent Stem Cells (PSC), which only exist during early embryonal period, have ability to differentiate into every cell type of an adult body. Until recent years, most common source of the PSCs were Embryonic Stem Cells which are obtained from disposed embryos therefore had limited use because of ethical restrictions.
In 2006, Takahashi and Yamanaka's groundbreaking study showed that somatic cells can be reprogrammed into stem cells by transfecting mouse fibroblasts via viruses, carrying four transcription factors; Oct3/4, Sox2, Klf-4 and c-Myc. This new type of stem cells, named induced Pluripotent Stem Cells (iPSC), had no ethical problems therefore greatly accelerated PSC research.
Studies of the last few years focused on developing alternative approaches to replace Yamanaka's method, which carried risks of mutation with viral transfection. Meanwhile, various small molecules, effecting a range of cellular pathways, were identified to increase iPSC generation efficiency.
We aimed to investigate the connections of 12 small molecules, selected because of their effects on PSC signaling pathways with pluripotency pathways and also their potential in reactivating pluripotency. The effects of the molecules were analyzed with reporter assays, cell proliferation analyses, immunocytochemistry and Real-Time-PCR. During reprogramming experiments, we found a combination of 10 small molecules activated pluripotency markers on human fibroblasts and reprogrammed cells at least partially in a short time and with high efficiency. We believe, our study represents an important step at full-chemical reprogramming of human cells.

Keywords: Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC), Mesenchymal Stem Cell(MSC), small molecules, epigenetics, reprogramming