Bazı bitki özütlerinin antibiyotik dirençli klinik izolatlara karşı antibakteriyel aktivitelerinin belirlenmesi
Determination of antibacterial activity of some plant extracts against antibiotic resistant clinical isolates
Yazar: EDA AYDEMİR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AYŞEGÜL SARAL
Artvin Çoruh Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Acinetobacter baumannii  aerobik, pleomorfik ve hareketsiz bir Gram negatif basildir. Fırsatçı bir patojen olan A. baumannii özellikle uzun süre (> 90 gün) hastanede yatanlar olmak üzere bağışıklığı baskılanmış kişiler arasında yüksek bir insidansa sahiptir. Organizma, bakteriyemi, zatürree, menenjit, idrar yolu enfeksiyonu ve yara enfeksiyonu dahil olmak üzere enfeksiyonların salgınlarına neden olur. Antimikrobiyal direnç, özellikle izolatlar antimikrobiyal ajanların karbapenem sınıfına dirençliyse, bu organizma ile enfekte olan hastalar için terapötik seçenekleri büyük ölçüde sınırlar. K. pneumoniae, çoğunlukla zayıflamış bağışıklık sistemine sahip kişileri etkileyen ve nozokomiyal enfeksiyonlara neden olma eğiliminde olan fırsatçı bir patojendir. K. pneumoniae izolatları antibiyotiklere giderek daha dirençli hale gelmiştir. Çok ilaca dirençli Acinetobacter ve Klebsiella enfeksiyonları için terapötik seçenekler sınırlı olduğundan, yeni ajanların keşfi önemlidir. Bitkilerin bakteri tarafından ifade edilen direncin üstesinden gelen sinerjik sekonder metabolitleri ürettiği bilinmektedir. Bu nedenle, yeni ajanların keşfi için bitki metabolitlerinin antimikrobiyal etkisi ve antibiyotiklerle kombinasyonlarının sinerjik etkileri çalışılmaktadır.
Bu tez çalışmasında, tarçın, kekik, ısırgan otu, beyaz çay ve kuşburnu bitkileri aktardan temin edilerek metanol özütleri hazırlandı. Bitki metanol özütlerinin antibakteriyal aktivitesi Trabzon Fatih Devlet Hastanesi'nden izole edilen antibiyotik dirençli A. baumannii ve K. pneumoniae'ya karşı sıvı mikrodilüsyon metodu ile araştırıldı. Isırgan otunun metanol özütünün denenen konsantrasyon aralığında A. baumannii'ye karşı antibakteriyal aktivitesi gözlenmedi. Kuşburnu, tarçın, kekik, beyaz çay metanol özütlerinin A. baumannii'ye MİK değerleri sırasıyla 0.07825 gr/mol, 0.015125 gr/mol, 0.030625 gr/mol, 0.00796875 gr/mol olarak belirlendi. Kekik, ısırgan otu, beyaz çay ve kuşburnu metanol özütlerinin denenen konsantrasyon aralıklarında K. pneumoniae'ye karşı antibakteriyal aktivitesi gözlenmedi. Tarçın metanol özütünün K. pneumoniae'ye karşı MİK değeri 0.0605 gr/mol olarak bulundu. Antibakteriyal aktivite gösteren bitki metanol özütleri ve antibiyotik kombinasyonlarının in vitro etkisi damatahtası metodu ile araştırıldı. Sonuç olarak, A.baumannii için imipenemin tarçın, beyaz çay ve kuşburnu metanol özütleri ile kombinasyonları aditif/indiferan etki gösterirken imipenemin kekik metanol özütü ile kombinasyonunun antagonistik etki gösterdiği belirlendi. K. pneumoniae için imipenemin tarçın metanol özütü ile kombinasyonunun antagonistik etki gösterdiği gözlendi. Tarçın metanol özütünün imipenem ile kombinasyonu K. pneumoniae için antagonistik etki gösterirken A.baumannii için aditif/indiferan etki gösterdi. Sonuç olarak, bitki özütlerinin antibakteriyal aktivitesi olduğunu, kullanılan bitki metanol özütlerinin imipenem ile sinerjik etki göstermediği bulundu.
Antibakteriyel etkisi belirlenen bitkilerde bulunan epigallokateşin 3-gallat, kuersetin, sinnamaldehit, karvakrol ve timol fitobileşiklerinin A. baumannii'de bulunan OXA-23 beta laktamazı için inhibitör adayı olma potansiyelleri in siliko olarak değerlendirildi. OXA-23'ün aktif bölgesine epigallokateşin 3-gallat, kuersetin, sinnamaldehit, karvakrol, timol, imipenem (substrat), avibaktam (inhibitör) moleküler yerleştirme metodu ile yanaştırılmıştır. İnhibitöre (avibaktam) en yakın bağlanma enerjisinin epigallokateşin 3-gallatın sahip olduğu ve bu fitokimyasalın Lys82, Lys216, Arg259, Asp222 rezidüleri ile dört tane hidrojen bağı yaptığı tespit edildi. Aynı zamanda bu fitokimyasalın imipenemin bağlanma enerjisinden (-5.40 kcal/mol) daha yüksek bağlanma enerjisine (-5.82 kcal/mol) sahip olduğu görüldü. Bağlanma enerjileri açısından fitokimyasallar karşılaştırıldığında en yüksekten düşüğe bağlanma enerjileri, epigallokateşin-3-gallat, kuersetin, sinnamaldehit, karvakrol, ve timol için sırasıyla -5.82 kcal/mol, -5.77 kcal/mol, -4.98 kcal/mol, -4.18 kcal/mol, -4.00  kcal/mol idi. 
In siliko çalışmalardan elde edilen sonuçlar epigallokateşin 3-gallat, kuersetin, sinnamaldehit, karvakrol, timol bitki bileşiklerinin OXA-23 β-laktamazı için non-kovalent ihbitör adayı olabileceklerini düşündürdü. Bu sonuçlar gelecekte deneysel çalışmalarla desteklenerek OXA-23 β-laktamazına karşı yeni innibitörlerin keşfedilmesine olanak sağlayabilir.

Abstract:
Acinetobacter baumannii is an aerobic, pleomorphic and immobile Gram negative bacillus. A. baumannii, an opportunistic pathogen, has a high incidence among immunocompromised individuals, especially those who are hospitalized for a long time (> 90 days). The organism causes outbreaks of infections, including bacteremia, pneumonia, meningitis, urinary tract infection, and wound infection. Antimicrobial resistance greatly limits therapeutic options for patients infected with this organism, particularly if the isolates are resistant to the carbapenem class of antimicrobial agents. K. pneumoniae is an opportunistic pathogen that mostly affects people with weakened immune systems and tends to cause nosocomial infections. K. pneumoniae strains have become increasingly resistant to antibiotics. The discovery of new agents is important as therapeutic options for multidrug-resistant Acinetobacter and Klebsiella infections are limited. Plants are known to produce synergistic secondary metabolites that overcome the resistance expressed by bacteria. Therefore, the antimicrobial effect of plant metabolites and their combinations with antibiotics are studied for the discovery of new agents.
In this thesis study, cinnamon, thyme, nettle, white tea and rosehip herbs were obtained from the herbalist and methanol extracts were prepared. Antibacterial activity of plant methanol extracts was investigated against antibiotic resistant A. baumannii and K. pneumoniae isolated from Trabzon Fatih State Hospital by liquid microdilution method. The antibacterial activity of methanol extract of nettle against A. baumannii was not observed in the tested concentration range. The MIC values of rosehip, cinnamon, thyme, white tea methanol extracts for A. baumannii were determined as 0.07825 g/mol, 0.015125 g/mol, 0.030625 g/mol, 0.00796875 g/mol, respectively. Antibacterial activity was not observed against K. pneumoniae in the concentration ranges of thyme, nettle, white tea and rosehip methanol extracts. The MIC value of cinnamon methanol extract against K. pneumoniae was found to be 0.0605 g/mol. The in vitro effects of plant methanol extracts showing antibacterial activity and antibiotic combinations were investigated by the checkerboard method. As a result, combinations of imipenem with cinnamon, white tea and rosehip methanol extracts showed additive/indifferent effects for A.baumannii, while the combination of imipenem with methanol extract of thyme showed antagonistic effect. It was observed that the combination of imipenem with cinnamon methanol extract had an antagonistic effect for K. pneumoniae. The combination of cinnamon methanol extract with imipenem showed antagonistic effect for K. pneumoniae and an additive/indifferent effect for A.baumannii. As a result, it was found that plant extracts have antibacterial activity, plant methanol extracts used did not show synergistic effect with imipenem.
The potential of epigallocatechin 3-gallate, quercetin, cinnamaldehyde, carvacrol and thymol phytocompounds found in plants with antibacterial effects to be inhibitor candidates for OXA-23 β-lactamase in A. baumannii was evaluated as in silico. Epigallocatechin 3-gallate, quercetin, cinnamaldehyde, carvacrol, thymol, imipenem (substrate), avibactam (inhibitor) were attached to the active site of OXA-23 by molecular docking method. It was determined that epigallocatechin 3-gallate had the closest binding energy to the inhibitor (avibactam) and this phytochemical made four hydrogen bonds with the residues Lys82, Lys216, Arg259, Asp222. It was also observed that this phytochemical had higher binding energy (-5.82 kcal/mol) than imipenem binding energy (-5.40 kcal/ mol). When phytochemicals are compared in terms of binding energies, the highest binding energies are -5.82 kcal/mol, -5.77 kcal/mol, -4.98 kcal/mol, -4.18 kcal/mol -4.00 kcal/mol for epigallocatechin-3-gallate, quercetin, cinnamaldehyde, carvacrol, and thymol, respectively. 
Results from in silico studies suggested that epigallocatechin 3-gallate, quercetin, cinnamaldehyde, carvacrol, thymol plant compounds could be non-covalent inhibitor candidates for OXA-23 β-lactamase. These results may be supported by experimental studies in the future and may allow the discovery of new inhibitors against OXA-23 β-lactamase.