Probiyotik laktik asit bakterileri kullanılarak bitkisel süt ikamelerinden fermente içecek tasarımı
Production of novel vegetal based beverages fermented by probiotic lactic acid bacteria
Yazar: BÜŞRA DEMİRCAN
Danışman: PROF. DR. ZEYNEP DİLEK HEPERKAN
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Geleneksel işlenmiş ve doğal gıdaya artan taleple birlikte gıda endüstrisi araştırma ve geliştirmeye ayrılan bütçeyi arttırıp inovatif gıda üretimi denemeleri yapmaya başlayarak toplumun sürdürülebilirlik ve doğallık gerekliliklerini yerine getirmeye çalışmaktadır. Süt ve et ürünlerindeki geniş fermente ürün pazarına rağmen bitkisel kaynaklı fermente ürünlere olan talep artmakta sebebi ise şöyle sıralanmaktadır; laktoz ve kolesterol ihtiva etmeyen, diyet lifi, mineral, vitamin ve antioksidan gibi besinsel değerler açısından zengin gıdalardır. Tüm bu sebepler ve sonuçlar toplandığında, arz ve talebin bitkisel kaynaklı fermente gıdalar için artmakta olduğu görülmekte ve bunun sebeplerinin ise geleneksel ve güvenilir tarihinin olması, fonksiyonel son ürün oluşturması ve sağlık üzerinde pozitif etkisi etkisinin bulunmasıdır. Fermente gıdaların potansiyel sağlık etkileri ve avantajları ise şu şekildedir; antihipertansif etkinlik, kan şekerinin düşürülmesi, antidiyareik ve antitrombotik özelliklerdir, fermente gıdaların içeriğinin kapsamlı bir değerlendirmesi ve sağlık yararlarının sebeplerinin araştırılması sonucunda, fermantasyonun vitamin, mineral, aminoasit, yağ asitleri ve fitokimyasal değerlerini arttırdığı ve/veya gıdada mevcut bulunan bu içeriklerin transformasyona neden olduğu, bu yüzden sağlık etkisinin gıdanın fermente olmamış formuyla kıyaslandığında arttıdığı anlaşılmıştır. Gıda ürünlerine probiyotik takviye yapılması, ya da gıda ürünlerinin probiyotik mikroorganizmalar ile fermente edilmesi bağırsak mikroflorasını düzenlemekte bunun yanı sırada da sağlık üzerinde pozitif pek çok etkisinin olması bilimsel camia tarafından yoğun olarak araştırılan konulardan birisidir. Son zamanlarda, süt ya da et ihtiva etmeyen ürünlerin özellikle tahıl ve baklagillerin maya ve bakteri fermantasyonu inovatif ve fonksiyonel gıda araştırmaları ve üretiminde önemli bir yer tutmaktadır.
Bu çalışmanın amacı, bitkisel kaynaklı süt ikamesi olarak kullanılacak soya sütü, pirinç sütü, soya-pirinç sütlerinin karışımlarının probiyotik laktik asit bakterileriyle (LAB) olan fermantasyonu sonucunda; oluşturulan ürünlerin mikrobiyolojik, metabolik özelliklerini incelemek ve gerek akademik çalışmalar, gerekse içecek sektörü için yeni probiyotik fermente bitkisel içecek üretiminde önemli olabilecek bilgiler sunmaktır. Bu bağlamda kullanılacak 12 Lactobacillus ve 2 Bifidobacterium probiyotik suşlarının, fermente bitkisel süt ürünlerininde fizyokimyasal ve metabolik davranışları incelenmiştir. Yapılan çalışma 2 kısıma ayrılmıştır, çalışmanın birinci "tarama" kısımında 12 Lactobacillus probiyotik suşunun soya ve pirinç sütündeki 0, 6, ve 24. saatteki mikrobiyal gelişmeleri ve pH değişimleri incelenmiştir. 12 Lactobacillus suşu arasından fermantasyon aktivitesine göre karar verilen 2 probiyotik Lactobacillus suşu çalışmanın ikinci kısmında kullanılmıştır. Ayrıca, çalışmanın tarama kısmında 12 Lactobacillus ve 2 Bifidobacterium suşları ile 24 saat fermentasyonda bırakılan bitkisel sütlerin ve fermantasyondan önceki halleri (sıfırıncı saat) için protein/peptit profilleri incelenmiştir. Çalışmanın ikinci kısmında ise, soya ve pirinç sütleri 25% ,50%, 75 % (v/v) oranlarında karıştırılmış ve 3 farklı içecek tasarımı yapılmıştır, tarama kısmından karar verilen 2 Lactobacillus ve 2 Bifidobacterium çeşidi LAB bakterileri ile tekli veya kokteyl olarak tasarlanan içecekler fermente edilmiş, 6. ve 24. saat pH değerleri ve bu saatlerdeki mikrobiyal gelişmeleri belirlenmiştir, ayrıca 24 saatlik inkübasyon sonucu antioksidan ve protein/peptit profilleri de incelenmiştir.
xx
Deneyin ilk kısmında; soya sütü ve pirinç sütünün 24 saatlik fermantasyonu sonucunda Lb. rhamnosus C243, Lb. helveticus CNBL, B. bifidum 700795, B. longum 12 türlerinin 6. ve 24. saatteki pH düşürme ve mikrobiyal gelişmelerine bakılarak en iyi fermantasyon yeteneği göstermiş olan suşlar olarak belirlenmiştir. Deneyin ikinci kısmında ise kullanımına karar verilen laktik asit bakterisi probiyotik suşları, hem tekli inoküle edilmiş hem de 2 tane kokteyl hazırlanarak inoküle edilmiştir. Kokteyl 1: Lb. rhamnosus C243+ Lb. helveticus CNBL+ B. bifidum 700795 ve kokteyl 2: Lb. rhamnosus C243, Lb. helveticus CNBL+ B.longum 12' dan oluşmaktadır. Bütün bitkisel süt karışımlarında inokülümler 24 saatlik fermantasyon sonucunda 9,46-10,28 log kob/ml mikrobiyal gelişme gösterip pH değerleri ise 3,71-4,39 arasında değişmiştir. Ayrıca, 6. saatte, aynı orandaki süt karışımları içerisindeki tüm inokülumların pH değerleri istatistiksel olarak p <0,05'den farklı bulunurken, mikrobiyal büyüme en az 9 log kob/ml olarak gözlemlenmiştir. Genel olarak, süt karışımlarındaki soya oranı arttıkça her bir inokülüm için mikrobiyal gelişme ve pH da artış gözlemlenmektedir. Süt karışımlarının protein/peptit profilleri SDS-Jel elektroforezi ile incelenmiş olup, 24 saat fermente edilmiş süt karışımları ile fermente edilmemiş kontrol süt karışımlarının protein/peptit profilinin neredeyse tamamen değiştiği gözlemlenmiştir. Ayrıca, fermente edilmiş süt karışımlarının neredeyse tamamında molekül ağırlığı 37 kDa'dan büyük proteinlere rastlanmazken, fermente örneklerde molekül ağırlığı 25 kDa' dan küçük peptit miktarı artmıştır ve en yüksek artış 75%soya sütü+ 25% pirinç sütü içeren karışımın Lb. rhamnosus C243 ile fermantasyonu sonucunda gözlemlenmiştir. Antioksidan aktivite ABTS+ metodu ile incelenmiş olup, μg Askorbik Asit eq/ml olarak ifade edilmiştir. Fermente edilmemiş süt karışımlarında antioksidan aktivite gözlemlenmezken, fermente edilmiş süt karışımlarının tamamı antioksidan aktiviteye sahiptir ve 37,46-50,39 μg AA eq/ml arasında değişmektedir. En yüksek antioksidan aktivite gösteren örnek ise yine 75%soya sütü+ 25% pirinç sütlerini içeren karışımın Lb. rhamnosus C243 ile fermantasyonu sonucunda gözlemlenmiştir.
Sonuç olarak, deneyin birinci kısmında kullanımına karar verilen 14 farklı probiyotik LAB suşları, soya sütü ve pirinç sütü içerisindeki 24 saatlik fermantasyonları sonucunda pH düşürme aktivitesi ve mikrobiyal gelişme göstermiş, deneyin ikinci kısmı için seçilen 2 Lactobacillus ve 2 Bifidobacterium suşları yine soya-pirinç süt karışımları içerisinde tekli veya kokteyl olarak gelişme göstermiştir. Ayrıca laktik asit bakterileriyle yapılan 24 saatlik fermantasyon sonucunda antioksidan aktivitenin, düşük molekül ağırlıklı peptit bileşenlerinin arttığı gözlemlenmiştir. Fonksiyonel gıdalardan sağlık yararları elde edebilmek için, uygulanabilir probiyotik suşların muhafaza edilmesi ve büyümesinin desteklemesi beklenmektedir, ayrıca ürünlerin son kullanma tarihlerinde minimum 6 log kob/ ml düzeyinde (veya g-1) probiyotik suş içermeleri gerekmektedir ve deneyde kullanılan probiyotik suşların tamamı 24 saatlik fermantasyon sonunda en az 9 log kob/ml gelişme göstermiş olup, probiyotik içecek olma gerekliliğini yerine getirmiştir. Bu bağlamda, bu çalışmanın sonuçları probiyotik kültürlerinin starter kültür olarak kullanımıyla elde edilecek fermente bitkisel içeceklerin tasarımı için değerli bilgiler sağlayabilir.

Abstract:
Fermented foods and beverages are generally defined as processing of raw product through controlled microbial growth and enzymatic conversions of major and minor food component to develop new product as different in terms of nutritional value, texture, and color from raw material. There is substantial evidence of improvements in nutritional status and value arising from controlled fermentations. Further, there are some of the potential health benefits of fermented foods and beverages that have been explored.
Fermentation of food and beverages with lactic acid bacteria have become important due to the some benefits on products; antimicrobial substances, sugar polymers, aromatic compounds, useful enzymes and probiotic properties of lactic acid bacteria lead to increase application in industry, these properties can be summarized as increasing functional properties of products with health effects, increasing organoleptic and nutritional properties, and increasing the shelf life of food with decrease usage of preservatives. Consideration of functional properties of fermented food and beverage with lactic acid bacteria, how they may provide health benefits, has led to the targeted identification of certain vitamins, minerals, amino acids, and phytochemicals like phenolics, fatty acids, and peptides that distinguish fermented foods from their nonfermented forms.Nowadays, in accordance with increasing demand for traditional processed and natural products, food and beverage industry have started to try innovative products which meet sustainability and naturalness requirements of population. Besides huge dairy and meat fermented product markets, vegetal based fermented products are demanded because of many reasons like lactose free, cholesterol free, rich in some nutritional components. As results of these, supply and demands most particularly increase for vegetal based fermented products because of wontedly consumption, functional, health promoting aspects. There are lots of vegetal based substrates as mainly fruit juices, vegetables and cereals that have been started to use as substitute in industry or searched in academia as alternative to conventional dairy substrates for the design of fermented and/or probiotic beverages. Currently, most of the studies have been conducted related with non-dairy fermented and/or probiotic milks on fruits, cereals and soy based products where colour and rheological evaluations, sensory analysis performed. Most of these vegetal based fermented innovative products are found in literature that were developed by using Bifidobacteria, Lactobacillus and Streptococus genera. Also, innovative fermented products could have some added values if starter microorganisms are probiotics, based on health benefits that probiotics exhibit.
xxii
Soy has whole proteins, dietary fiber, low cholesterol, lactose free, and high levels of bioactive phenolic compounds. Isoflavones, classified as flavonoids and phytoestrogens, are characteristic phenolic components of soybean. During fermentation of soy products, complex organic compounds are broken down into smaller molecules by lactic acid bacteria, which exert various physiological functions beyond their nutritional properties such as improves the biofunctional properties due to the increase in free isoflavones and peptides that are inactive within the sequence of the parent structure. Soy milk has an unpleasant flavor according to majority of western people, this specific flavor is described as stale or beany which are due to some volatile compounds produced by the self-oxidation of polyunsaturated fatty acids or from the enzymatic action of lipoxygenase. From a nutritional point of view soy milk is a precious product should be improved as sensorial and fermentable aspects.
The aim of this study is the characterization of microbiological and functional properties of soy and rice plant based milks prior and after fermentation with different Lactobacilli and Bifidobacteria strains, which have probiotic activity to provide important information to the literature and beverage industry for the production of novel plant based probiotic fermented beverages. On this purpose, fermentation was conducted inoculating the lactic acid bacteria strains at 1% v/v and a concentration of 0,9 unit of OD 600. The fermentation was prolonged for 24 hours at 37°C in microaerobic condition and the physicochemical parameters were determined according to the official methods, microbial growth and pH values were assayed and monitored through all the period of fermentation. Fermented milk samples were investigated as; Protein/peptide profiles were observed by means of SDS-PAGE, antioxidant activities were determined with ABTS+ method and compared with unfermented milk samples.
In this order, the experimental procedure was splitted in two parts. In the first, soy milk and rice milk were used separately to be fermented with a set of different bacterial species, including twelve different strains of Lactobacilli spp. and two strains of Bifidobacterium spp. Among these all, the bacterial strains that performed the best outputs of fermentation were selected to conduct the second part of the experimental procedure, employing soy and rice milks in different mixes, namely mix 1 (25% of soy and 75% of rice); mix 2 (50% of both milks) and mix 3 (75% of soy and 25% of rice). The best bacterial strain were selected on the basis of pH, growth, antioxidant and proteolytic activity.
The results obtained from the first part of the experiment showed that the strains Lb. rhamnosus C243, Lb. helveticus CNBL, B. bifidum 700795, B. longum 12 were the best promising strains, according to pH decrease and quantification of relative colony forming units (cfu) in both soy and rice milk after six and 24 hours.
On the second part, the three milk mixtures were prepared so: (1) 25% soy milk+ 75% rice milk, (2) 50% soy milk+ 50% rice milk, (3) 75% soy milk+ 25% rice milk. Along with individual inocula of Lb. rhamnosus C243 and Lb. helveticus CNBL strains, additionally two cocktail were prepared as follow: cocktail 1, composed by Lb. rhamnosus C243+ Lb. helveticus CNBL+ B. bifidum 700795 and cocktail 2, composed by Lb. rhamnosus C243, Lb. helveticus CNBL+ B.longum 12. All bacterial strains in all milk mixtures showed that at the late time point of fermentation (24 hours) quantification of their relative cfu ranged between 9,46-10,28 log cfu/ml and pH measured between 3.71 and 4.39.
xxiii
Further, pH values after 6 hours of fermentation were for all inocula in same ratio milk samples were found statistically different from each other p<0,05, while microbial growth up to 8 log cfu/ml for each. Generally, when soy milk ratio increase in milk mixtures pH and microbial growing also increase for each inocula.
Protein/peptide profiles of fermented and not fermented milk mixtures obtained with SDS-Gel electrophoresis showed that after 24 hours of fermentation, the profile of milks mixtures at the beginning of the experiment, thus still not fermented, completely changed in comparison to those attained after 24 hours of fermentation.
Further, proteins with a molecular weight higher than 37 kDa were not detected for fermented milk mixtures, while peptides of molecular weight lower than 25 kDa increased. The results of SDS gel electrophoresis showed that the highest increment of peptides of molecular weight lower than 25 kDa was observed in mix 3 (75% soy and 25% rice) inoculated with Lb. rhamnosus C243. ABTS+ method was used to determine the antioxidant activity (expressed as μg ascorbic acid eq/ml) of samples of the second part of experiment after 24 hours of fermentation. ABTS+ results showed that the milk mixtures have antioxidant activity ranging between 37 and 50 μg AA eq/ml, and that the highest antioxidant activity was detected in mix 3 fermented with Lb. rhamnosus C243.
Overall, al the lactic acid bacteria strains used for this experiment showed the ability to grow in soy milk, rice milk and soy-rice milk mixtures with pH decreasing ability already after 6 hours of fermentation at 37°C. Moreover, fermentation with the strains tested increased antioxidant activity of soy and rice milks and their mixes, incremented low molecular weight peptides with richness and abundance.
In this regard, the results of this study could provide valuable insights in ordered to design novel probiotic fermented beverages with exploited functional properties. Further studies should evaluate shelf life of fermented probiotic beverage, viability of probiotic cultures in-situ and in-vivo conditions. Additionally, product flavor profile should be improved and sensorial consumer studies carried out in order to assess current products' acceptance by target consumers.