Lakkaz enziminin b. licheniformis o12 bakterisinden saflaştırılması, bakteri dna'sından rekombinant üretimi, karakterizasyonu, biyoteknolojik uygulamaları
Purification of laccase enzyme from b. licheniformis o12 bacteria, recombinant production from bacteria dna, characterization, biotechnological applications
Yazar: ARZU ÖZTÜRK KESEBİR
Danışman: PROF. DR. ÖMER İRFAN KÜFREVİOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Amaç: Çoklu bakır içeren lakkaz (benzendiol: oksijen oksidoredüktaz; EC 1.10.3.2) enzimleri, fenolik ve fenolik olmayan ligninle ilişkili bileşikleri okside edebildiği gibi, biyolojik yıkıma dirençli çevre kirleticilerini de oksitleyebilmektedirler. Elektron alıcısı olarak moleküler oksijeni kullanmaları ve toksisitesi olan hidrojen peroksite ihtiyaç duymamalarından dolayı, lakkaz enzimleri son zamanlarda oldukça ilgi çeken bir araştırma alanı oluşturmaktadır. 
Yöntem: Bu çalışmada, Bacillus licheniformis O12 yerel suşundan yabanıl ve rekombinant lakkaz enzimi üretildi. Önce besiyeri optimizasyonu yapıldı ve elde edilen enzim ilk kez Sepharose 4B-L-tirozin ρ-aminobenzoikasit afinite kolonundan saflaştırıldı. Çalışmanın ikinci kısmında aynı bakteri DNA'sı PCR ile çoğaltılarak pET SUMO vektörüne TA klonlama yöntemi ile aktarıldı. Elde edilen rekombinant DNA, kompetent OneShot Mach1 E. coli hücrelerine transforme edildi. Bu plazmid, E. coli BL21DE3 hücresinde eksprese edildi. Rekombinant füzyon lakkaz, Ni-NTA afinite kolonu ile saflaştırıldı. Sonuçta SUMO vektörü kullanılarak 1mM IPTG ve 37°C'de çözünebilir formda başarılı bir şekilde eksprese edildi. 
Bulgular: Yabanıl ve rekombinant lakkaz enzimlerinin karakterizasyon çalışmalarında yabanıl lakkaz enzimi için optimum iyonik şiddet değeri 0,5 mM; optimum pH değeri pH 4,0; optimum sıcaklık değeri ise 92°C olarak belirlendi. Füzyon formdaki rekombinant lakkaz enziminin optimum iyonik şiddet değeri 0,1 M; optimum pH değeri 5,0 ve optimum sıcaklık değeri 92°C olarak belirlendi. 
Sonuç: Rekombinant ve yabanıl lakkaz enzimlerinin; organik çözücülerden yüzey aktif maddelere göre daha çok etkilendiği, fakat aktivitesini tamamen kaybetmediği görülmüştür. Son olarak hem yabanıl hem de füzyon haldeki rekombinant lakkaz enzimi kullanılarak bazı tekstil boyalarının renk giderimindeki etkileri araştırıldı ve her iki enzimin de genel olarak etkili olduğu, füzyon haldeki rekombinant lakkaz enziminin daha başarılı sonuçlar verdiği görüldü. 
Anahtar kelime: Yabanıl, Bacillus licheniformis, rekombinant klonlama, rekombinant enzim üretimi, recombinant lakkaz, kinetik, renk giderme.

Abstract:
Purpose: Multiple copper-containing laccase enzymes (benzenediol: oxygen oxidoreductase; EC 1.10.3.2) can oxidize both phenolic and non-phenolic lignin-related compounds, as well as environmental pollutants that are resistant to biodegradation. They use molecular oxygen as an electron acceptor and do not require toxic peroxide hydrogen, so laccase enzymes have recently been a very interesting area in research. 
Method: In this study, wild laccase enzyme was produced from Bacillus licheniformis O12 local strain and was purified using Sepharose 4B-L-tyrosine ρ-aminobenzoic acid affinity column. Then, the laccase enzyme gene was amplified by PCR method using protein gene specific primers with DNA obtained from B. licheniformis 012 local strain. The laccase gene was transferred to the pET SUMO vector by TA cloning. The obtained recombinant DNA was transformed into competent OneShot Mach1 E. coli cells by heat-shock method. These plasmids were expressed in E. coli BL21DE3 cells. Recombinant fusion laccase enzyme was purified by Ni-NTA affinity column. Recombinant laccase enzyme was successfully expressed in soluble form in 1mM IPTG and at 37°C by using pET SUMO vector. 
Finding: In the characterization studies, the optimum ionic intensity for the wild laccase enzyme is 0.5 mM; optimum pH value pH 4.0; and the optimum temperature value was determined as 92°C. Optimum ionic strength, optimum temperature and optimum pH values of the sumofusion enzyme were determined as 0.1 M, 92°C and pH 5.0 respectively. 
Results: It has been observed that effects of organic solvents on enzyme activity are more than influence of surface active agents but the both laccase enzymes activity are not completely lost. Finally, the effects of some textile dyes on color removal were investigated using both the wild and fused recombinant laccase enzyme, and both enzymes were found to be generally effective, and the fused recombinant laccase enzyme yielded more successful results. 
Keyword: Wild, Bacillus licheniformis, recombinant cloning, recombinant enzyme production, recombinant laccase, kinetic, color removal.