Proteomik yaklaşımla atıksu kaynaklı mikroorganizmalarda Cr(VI) direnç yollarının araştırılması
The investigation of Cr(VI) resistance mechanisms with a proteomic approach in microorganisms isolated from wastewater
Yazar: NUR KOÇBERBER KILIÇ
Danışman: PROF. DR. GÖNÜL DÖNMEZ
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Atık su = Waste water ; Biyobirikim = Bioaccumulation

Özet:
Tez çalışması, Cr(VI) içeren atıksulardan izole edilen dört farklı mikroorganizmanın (Ochrobactrum sp. Pseudomonas aeruginosa, Bacillus thuringiensis ve B. cereus) Cr(VI) biyobirikim kapasitelerinin belirlendiği bir çalışmadır. Bu mikroorganizmaların ağır metallere karşı oluşturduğu direnç mekanizmaları 2D jel elektroforezi ve kütle spektrofotometrisi çalışmaları ile aydınlatılmıştır.Mikroorganizmaların biyobirikim kapasiteleri 300 ppm Cr(VI) içeren nutrient broth besiyerlerinde belirlenmiştir. Çalışmada kullanılan bakterilerin bu ortamda ağır metal biyobirikimi yapmadığı fakat 300 ppm Cr(VI) konsantrasyonunu tolere ederek gelişebildiği görülmüştür.Krom(VI) ağır metaline karşı oluşturulan mikrobiyel direnç mekanizmalarının belirlenmesi için izolatlar, nutrient broth besiyerinde geliştirilmiştir. Kirleticiye cevap olarak daha fazla sentezlenen proteinlerin bulunması için, Cr(VI) içermeyen ve 300 ppm Cr(VI) içeren ortamlarda geliştirilen bakterilerden sitozol ve toplam zar proteinleri izole edilmiştir.Ochrobactrum sp. bakterisinin kirleticiye maruz bırakıldığında daha fazla sentezlediği proteinler, stres proteinleri (Moleküler şaperonlar), protein biyosentezinde görevli proteinler (ribozomal proteinler), taşıyıcı proteinler, enerji üretiminde görevli proteinler (ATP sintaz, flavoprotein), dış zar proteinleri gibi başlıklar altında toplanmıştır. P. aeruginosa bakterisinde ise kirletici olan ortamda daha fazla sentezlenen proteinler, stres proteinleri (Moleküler şaperonlar), protein biyosentezinde görevli proteinler (Ribozomal proteinler, inozin-5-monofosfat dehidrogenaz ve uzama faktör Tu), enerji üretiminde görevli proteinler (ATP sintaz, flavoprotein, malat dehidrogenaz ve fruktoz-1,6-bisfosfataz), serbest radikal oluşumunu önleyen proteinler (Glutatyon-S-transferaz ve GSH sentetaz), dış zar proteinleri ve serin proteaz (MucD) gibi gruplara ayrılmıştır. B. thuringiensis ve B. cereus'un 300 ppm Cr(VI) içeren ortamda daha fazla sentezlenen proteinleri, protein biyosentezinde görevli proteinler (Ribozomal proteinler, hipoksantin-guanin fosforibozil transferaz, uzama faktör Tu), enerji üretiminde görevli proteinler (ATP sintaz, pirüvat dehidrogenaz, alanin dehidrogenaz, bütirat kinaz; transaldolaz), stres proteinleri (Peptidil prolil izomeraz) ve yüzey tabaka proteinleri gibi gruplara ayrılmıştır.Tanımlanan proteinlere göre bakterilerin Cr(VI) ağır metaline karşı geliştirdikleri direnç mekanizmaları metali hücre dışına taşıma ve/veya hücre dışında tutma gibi sistemlerdir. Biyobirikim çalışmalarında ortama uygulanan Cr(VI) konsantrasyonunun inkübasyon süresi boyunca sabit kalması, belirlenen mikrobiyel direnç sistemlerinin Ochrobactrum sp., P. aeruginosa, B. thuringiensis ve B. cereus bakterileri tarafından kullanıldığını kanıtlamaktadır.

Abstract:
This thesis is a study of the Cr(VI) bioaccumulation capacities of four different microorganisms (Ochrobactrum sp. Pseudomonas aeruginosa, Bacillus thuringiensis and B. cereus) isolated from wastewaters containing Cr(VI). 2D gel electrophesis and mass spectrophotometry were used to explain the mechanisms by which microorganisms develop resistance against heavy metals were explained by.Bioaccumulation capacities of microorganisms were determined on nutrient broth media with 300 ppm Cr(VI). In this media, it was determined that the bacteria used in the study did not bioaccumulate the heavy metal, but grow by tolerating 300 ppm Cr(VI) concentration.To determine microbial resistance mechanisms developed against Cr(VI), the isolates were cultivated in nutrient broth media. The cytosolic and the total membrane proteins of the bacteria cultivated in media with 300 ppm Cr(VI) and without Cr(VI) were isolated to determine which proteins were upregulated in response to the pollutant. For Ochrobactrum sp., the following proteins were upregulated: stress proteins (molecular chaperons), proteins responsible for protein biosynthesis (ribosomal proteins), transporters, and proteins responsible for energy production (ATP synthase, flavoprotein), and outer membrane proteins. The corresponding proteins for P. aeruginosa were stress proteins (molecular chaperones), proteins responsible for protein biosynthesis (ribosomal proteins, inosine-5-monophosphate dehydrogenase and elongation factor Tu), proteins responsible for energy production (ATP synthase, flavoprotein, malat dehydrogenase, fructose-1,6-bisphosphatase), proteins preventing formation of free radicals (Glutathione-S-transferase and GSH synthetase), outer membrane proteins and serine protease (MucD). Finally, for B. thuringiensis and B. cereus the following proteins were observed to be upregulated: proteins responsible for protein biosynthesis (ribosomal proteins, hypoxantine-guanine phosphoribosil transferase, elongation factor Tu), proteins responsible for energy production (ATP synthase, pyruvat dehydrogenase, alanine dehydrogenase, butyrate kinase, transaldolase), stress proteins (peptdyl prolyl isomerase), and and s-layer proteins. Based on these proteins, we propose that the prevailing Cr(VI)-resistance mechanisms involved transporting the metal to the outside of the cell and/or binding the metal outside of the cell. In bioaccumulation studies, the stability of Cr(VI) concentration during the incubation period proved that the microbial resistance mechanisms identified was used by Ochrobactrum sp. P. aeruginosa, B. thuringiensis and B. cereus.