Pseudomonas fluorescens (NRRL B-2641) bakterisi kullanılarak lipaz üretimi
Lipase production by Pseudomonas fluorescens (NRRL B-2641)
Yazar: MEHTAP TANYOL
Danışman: YRD. DOÇ. DR. GÜLŞAD USLU
Fırat Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Çevre Teknolojileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering
Dizin: Fermentasyon = Fermentation ; Lipaz = Lipase ; Pseudomonas = Pseudomonas

Özet:
Bu çalışmada, bir gram (-) bakteri olan Pseudomonas fluorescens kullanılarak kesikli fermantasyon ile hücre dışı lipaz enzim üretimi gerçekleştirilmiş ve enzim üretimi üzerine ortam parametrelerinin etkisi incelenmiştir.Araştırmanın ilk bölümünde; sentetik fermantasyon ortamında kullanılan karbon ve azot kaynakları ile iz elementler değiştirilmiş ve optimum enzim üretim ortamı belirlenmiştir. Fermantasyon ortamına eklenen farklı karbon kaynakları içerisinde en yüksek aktivite %1 mısır yağı konsantrasyonunda elde edilmiştir. Farklı azot kaynağı konsantrasyonlarında P.fluorescens, organik azot kaynaklarında hem daha iyi büyüme hem de daha yüksek aktivite göstermiştir. Azot kaynakları içerisinde en yüksek aktivite % 0.4 pepton içeren fermantasyon ortamında bulunmuştur. Daha sonra fermentasyon ortamında bulunan fosfat konsantrasyonu değiştirilmiş ve en yüksek aktivite % 0.1 KH2PO4 ve K2HPO4 içeren ortamda elde edilmiştir. İyonlarının etkisini incelemek için Ca2+ ve Na+ iyonları kullanılmış ve % 0.03 CaCl2.2H2O içeren fermantasyon ortamında enzim aktivitesi yükselmiştir. Optimize edilen fermantasyon ortamında (% 1 mısır yağı, % 0.4 pepton, % 0.1 KH2PO4, % 0.1 K2HPO4, % 0.0005 MgSO4.7H2O, % 0.03 CaCl2.2H2O) en yüksek aktivite 3.425 U/mL olarak bulunmuştur.Optimize edilen fermantasyon ortamında (CaCl2.2H2O kullanılmadan); karbon kaynağı olarak atık kızartma yağların kullanıldığı ortamda, en yüksek enzim aktiviteleri patates ve tatlı kızartılmış atık yağlar için sırasıyla, 3.850 ve 3.975 U/mL olarak elde edilmiştir. Bu sonuç, atık kızartma yağlarının enzim üretimi için daha etkin bir substrat olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca fermantasyon ortamında bulunan yağ asitleri analiz edilmiş ve yağ asitlerinin P.fluorescens'in kullanımı sonucu zamanla azaldığı gözlenmiştir.Çalışmanın ikinci bölümünde; karbon kaynağı olarak bir katı substrat olan ayçekirdeği küspesi kullanılmış ve P.fluorescens'in lipaz enzimi üretilebilirliği araştırılmıştır. Mikroorganizmanın fermantasyon ortamı; musluk suyu, % 10 ayçekirdeği küspesi ve % 1 pepton içerdiği zaman maksimum 6.100 U/mL lipaz enzimi ürettiği belirlenmiştir. Doğal bir substrat olan ayçekirdeği küspesi kullanıldığında enzim aktivitesinin arttığı görülmüştür.Çalışmanın son aşamasında, laboratuar ölçekli 6 L hacmindeki biyoreaktör kullanılarak, farklı karıştırma ve hava akış hızlarında; enzim aktivitesi, sıvı faz hacimsel kütle transfer katsayıları (kLa) ve oksijen tüketim hızları (ro) hesaplanmış, en yüksek aktivite 0.32 vvm hava akış hızı ve 350 rpm karıştırma hızında, 2.350 U/mL olarak bulunmuştur. Bu ortamda en yüksek kLa ve ro değerleri ise sırasıyla 0.0423 s-, 0.0273 mg/L/s olarak elde edilmiştir. Biyoreaktörde gerçekleştirilen üretimlerde hava ve karıştırma hızları ile enzim miktarının arttığı, dolayısıyla da lipaz üretim prosesinde oksijen transferlerinin önemli olduğu görülmüştür.

Abstract:
Lipase Production by Pseudomonas fluorescens (NRRL B-2641)In this study, the production of extracellular lipase by a gram (-) bacterium Pseudomonas fluorescens was studied in a batch system and the effects of system parameters on the production of lipase were investigated.In the first stage of the research; carbon and nitrogen sources and phosphate concentration used in synthetic fermentation medium were changed and the composition of the optimum enzyme production medium was determined. The highest activity was obtained at concentration of 1 % corn oil used as carbon sources. P.fluorescens showed better growth and higher activity in organic nitrogen sources. The highest activity was obtained in the fermentation medium containing 4 % peptone. Then, KH2PO4 and K2HPO4 concentrations in the fermentation medium were changed and the highest activity was obtained at 0.1 % KH2PO4 and K2HPO4. The effect of Ca2+ and Na+ ions were investigated. The enzyme activity increased in the fermentation medium containing 0.03 % CaCl2.2H2O. Maximum activity was determined as 3.425 U/mL in the optimized fermentation medium (corn oil 1 %, peptone 0.4 %, KH2PO4 0.1 %, K2HPO4 0.1 %, 0.0005 % MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O % 0.03).Waste oils such as fried potato oil and fried sweet oil were also used as carbon sources. The highest enzyme activities were obtained as 3.850 and 3.975 U/mL, for fried potato oil and fried sweet oil, respectively. This result indicates that waste fried oils are more effective substrates for lipase production than synthetic fermentation medium. Fatty acids in fermentation medium were also analyzed and it was observed that, fatty oil acids were consumed by P. fluorescens.In the second stage, sunflower seed meal was used as a solid state carbon source and lipase producibility of P.fluorescens was investigated. Maximum enzyme production (6.100 U/mL) was produced in the fermentation medium containing tap water, 10 % sunflower seed meal and 1 % peptone. The enzyme activity increased when sunflower seed meal was used as a natural substrate.In the last stage; enzyme activity, liquid phase volumetric mass transfer coefficients (kLa) and oxygen consumption rates (ro) at the different mixing and air flow rates were determined in 6 L laboratory-scale bioreactor. The highest activity was obtained as 2.350 U/mL in agitation speed of 350 rpm and air flow rate of 0.32 vvm. In this medium, the highest values of kLa and ro were found as 0.0423 s-, 0.0273 mg/L/s, respectively. Enzyme production increased with increasing air flow and stirred rates and transfer of oxygen were therefore found to be an important parameter of lipase production.