İstiridye kaynaklı defensin ve prolince zengin antimikrobiyal peptidlerin pichia pastoris'te rekombinant olarak üretimi
Recombinant production of oyster defensin and proline rich antimicrobial peptides in pichia pastoris
Yazar: MİNE ERDEM BÜYÜKKİRAZ
Danışman: PROF. DR. ZÜLAL KESMEN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Antimikrobiyal peptidler (AMP), mikroorganizmalara karşı inhibitör etkili bileşikler olup, prokaryotlardan insanlara kadar hemen hemen tüm canlılar tarafından doğal olarak üretilirler. AMP'ler, bu özelliklerini, mikroorganizmaların hücre zarı yapısını değiştirerek veya hücre fizyolojisini bozarak göstermektedirler. AMP'lerin, antibiyotiklerden, antimikrobiyal etkili gıda koruyucularına kadar değişen geniş bir aralıktaki mikrobiyal inhibitörlere alternatif bileşikler olduğu kabul edilmektedir. 

Bugün rekombinant yöntemler, başta tıpta kullanılan töropatik proteinler, enzimler ve antikorlar olmak üzere ticari değeri yüksek pek çok protein için rutin bir üretim yöntemi haline gelmiştir. Dolayısıyla, rekombinant yöntemler kullanılarak çeşitli konakçılarda, standart aktivitede, etki mekanizması bilinen, düşük maliyetli ve sürekliliği olan AMP'lerin üretimi, doğal kaynaklardan izolasyonun yerini alabilecek cazip bir alternatif olarak düşünülmektedir. 

Bu nedenle araştırma kapsamında Gram-pozitif ve Gram-negatif bakterilerde bakteriyel büyümeyi inhibe ettiği bilinen ve istiridyeden (Crassostrea gigas) izole edilen prolince zengin peptid (Cg-Prp) ve defensin (Cg-Def) AMP'lerinin rekombinant teknikler kullanılarak üretilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla Cg-Prp ve Cg-Def peptidlerini kodlayan nükleotit sekansları rekürsif PCR tekniği ile elde edildikten sonra hem klonlama hem de ekspresyon vektörü olan pPICZaA'ya bağlanmış ve daha sonra Pichia pastoris GS115 hücrelerine transfer edilmişlerdir. Diğer taraftan sinerjist etki gösterdiği bilinen Cg-Prp ve Cg-Def peptidlerinin aynı konak hücrede ekspres edilmesi amacıyla her hedef AMP'nin gen bölgelerini içeren hibrit ekspresyon kasetleri de pPICZaA plazmidinde birleştirilerek P. pastoris'e transfer edilmişlerdir. Rekombinant AMP'lerin, P. pastoris hücreleri tarafından üretimi, %0,5'lik metanol indüksiyonu ile tamponlanmış karışık metanol besiyerinde (BMMY) 96 saat süreyle gerçekleştirilmiştir. Kültür ortamından saflaştırılan rekombinant Cg-Prp, Cg-Def ve hibrit peptidlerin konsantrasyonları, sırasıyla 1067,6 pg/L, 4802 pg/L ve 4848,8 pg/L olarak belirlenmiştir. Üretim sonrasında besi ortamından izole edilen rekombinant peptidler, test edilen konsantrasyonlarda Gram-negatif test bakterileri üzerinde herhangi bir antimikrobiyal etki göstermezken, Gram-pozitif bakterilerden, Staphylococcus aureus, Metisilin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), Listeria monocytogenes ve Bacillus cereus'un gelişmesini başarılı bir şekilde inhibe ettiği belirlenmiştir. Rekombinant Cg-Prp, Cg-Def ve hibrit peptidlerin Gram-pozitif test bakterileri üzerindeki minimum inhibisyon konsantrasyonları (MİK değeri) ise sırasıyla 12,5-25 pg/mL,  18,75-75 pg/mL ve 5,80-11,60 pg/mL aralıklarında bulunmuştur.

Sonuç olarak, bu araştırma kapsamında üretilen rekombinant peptidlerin, antimikrobiyal aktivite yönünden başarılı sonuçlar vermekle birlikte üretim verimlerinin çok düşük olduğu tespit edilmiştir. Dolayısıyla söz konusu peptidlerin uygulamaya aktarılabilmesi için üretim verimlerinin artırılmasına yönelik çalışmalara ihtiyaç olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Antimicrobial peptides (AMP) have inhibitory activity against microorganisms and are produced naturally by almost all organisms, from prokaryotes to humans. AMPs exhibit these properties by altering the cell membrane structure of microorganisms or disrupting cell physiology. AMPs are considered alternative compounds to a wide range of microbial inhibitors ranging from antibiotics to food preservatives with antimicrobial activity. 

Today, recombinant techniques have become a routine production method for many proteins of high commercial value, particularly therapeutic proteins, enzymes and antibodies used in medicine. Thus, the production of low-cost and sustained AMPs with known mechanism of action at standard activity in various hosts using recombinant methods is considered as an attractive alternative to replace isolation from natural sources. 

Therefore, the aim of this study was to produce oyster-derived (Crassostrea gigas) proline rich peptide (Cg-Prp) and defensin (Cg-Def) AMPs which are known to inhibit bacterial growth in Gram-positive and Gram-negative bacteria, by using recombinant techniques. For this purpose, the nucleotide sequences encoding the Cg-Prp and Cg-Def peptides were obtained by the recursive PCR technique, and then ligated into both cloning and expression vector pPICZaA, and after that were transformed into Pichia pastoris GS115 cells. On the other hand, hybrid expression cassettes containing the gene regions of each target AMP were also transformed into P. pastoris to express the Cg-Prp and Cg-Def peptides known to have synergistic effect in the same host cell. The production of recombinant AMPs by P. pastoris cells was performed with 0.5% methanol induction in buffered methanol complex medium (BMMY) for 96 hours. The concentrations of recombinant Cg-Prp, Cg-Def and hybrid peptides purified from the culture medium were determined to be 1067.6 pg/L, 4802.0 pg/L and 4848.8 pg/L, respectively. While the recombinant peptides did not show any antimicrobial effect on Gram-negative bacteria tested in the tested concentrations, the recombinant AMP's successfully inhibited the growth of tested Gram-positive bacteria, including Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant S. aureus (MRSA), Listeria monocytogenes and Bacillus cereus. The minimum inhibition concentrations (MIC) of recombinant Cg-Prp, Cg-Def and hybrid peptides on Gram-positive test bacteria were 12.5-25.00 pg/mL, 18.75-75.00 pg/mL and 5.80-11.60 pg/mL, respectively.