Yeni sekonder sülfonamidlerin sentezi ve in vitro karbonik anhidraz izoenzimleri üzerine inhibisyon aktivitelerinin incelenmesi
Synthesis of novel secondary sulfonamides and their in vitro carbonic anhydrase isozymes inhibition effects
Yazar: TANER GÖKÇEN
Danışman: PROF. DR. TURAN ÖZTÜRK ; DOÇ. DR. AHMET C. GÖREN
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Karbonik anhidraz enzimleri tüm canlı organizmalarda bulunan ve geri dönüşümlü bir reaksiyon olan karbondioksitin bikarbonata ve protona dönüştüğü reaksiyonu katalizleyen bir metaloenzim ailesidir (EC 4.2.1.1). Karbonik anhidraz enziminin yapısı  260 adet aminoasitten oluşmaktadır ve bu enzim doğal hali kürecik şeklinde olan bir protein zinciridir. Karbondioksitin hidratasyonu haricinde, COS ve CS2 hidratasyonu, siyanamid hidratasyonu, ester hidrolizleri gibi reaksiyonlar da bu enzim süper ailesi tarafından katalizlenmektedir. Bu reaksiyonların katalizlenmeleri diğer tüm  karbonik anhidraz katalizleme reaksiyonlarında olduğu gibi metal hidroksitin nükleofil olarak davranması yoluyla gerçekleşir. 
Karbonik anhidraz enzim aileleri, katalizleme işlemi sırasında aktif bölgede bulundurdukları metal iyonuna göre farklılık göstermektedirler. Enzimin aktif bölgesi koni biçiminde geniş bir alana yayılmış, molekülün merkezine kadar uzanan oyuk şeklindedir ve çinko iyonu oyuğun alt kısmına bitişik durumdadır.
Tüm karbonik anhidraz ailelerinde katalitik reaksiyon iki kademeden oluşur. İlk kademede enzimin aktif kısmı olan metal hidroksit kısmı (EM2+-OH-) nötr pH ortamında güçlü bir nükleofil gibi davranarak karbondioksit molekülü ile bikarbonat enzim kompleksi oluşturur ve sonrasında bu bikarbonat molekülü su molekülüyle yer değiştirir. İkinci kademede enzim metal kompleksine bağlı su molekülü (EM2+- H2O) enzimin aktif kısım kalıntısına veya bir proton alıcısına (B) proton transfer ederek enzim metal hidroksit kompleksi oluşturur (EM2+- OH-).
α-karbonik anhidraz ailesi insanlarda bulunan türüdür ve  şimdiye kadar bu türe ait 16 farklı izoenzim bulunmuştur. Bunların beş tanesi (CA I, II, III, VII ve XIII) sitozolik, dört tanesi (CA IV, IX, XII ve XIV) membrana bağlı, iki tanesi  (CA VA ve VB) mitokondriyal, bir tanesi (CA VI) tükürük salgısında ve sütte bulunur. CA XV insanlarda ve günümüz primatlarında gözlenmez fakat kemirgenlerde ve yüksek omurgalılarda gözlenir. Üç adet de katalitik özellik göstermeyen ve karbonik anhidrazla alakalı proteinler olarak adlandırılan türü mevcuttur (CARP-VIII, CARP-X ve CARP-XI).
CA I enzimi kırmızı kan hücreleri ve kalın bağırsakta yaygın olarak bulunmasına rağmen plazmada bulunan klorür ve bikarbonat ile inhibe olması fizyolojik fonksiyonlarıyla ilgili soru işaretleri oluşturmaktadır ve genellikle araştırmacıların hedefinde pek yoktur. Fakat yapılan bazı araştırmalar bu enzimin eritrositlerdeki aktivitesinin azalmasının kansızlık ve kronik asidoz ile ilişkili olduğu, ve hücre dışı ortamda yüksek seviyede bulunmasının diabetik maküler ödem ve çoğalan diabetik iltihapsız retina hastalığı gibi durumlara yol açan aşırı retinal damar geçirgenliğiyle ilişkili olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir.
Tüm bunların ötesinde, CA I'in kendisi  CA II ve CA IV ile birlikte, Hippel-Lindau tümörleri, ilerleyen polikistik böbrek hastalığı, acinar-ductal pankreatik karsinom, veya bağışıklık sistemi/idyopatik kronik pankreatitis gibi hastalıklarla ilişkilendirilmiş ama henüz tam olarak fonksiyonları ortaya konulamamıştır.
Diğer yandan, CA I'in sadece yüksek seviyelerinin değil bazı durumlarda düşük seviyelerinin de patolojik durumlarla ilişkili olduğu gözlemlenmektedir ve tip II diyabet hastalarının eritrositlerinde CA I seviyelerindeki düşüklük buna örnek olarak verilebilir.
CA II enzimi, kırmızı kan hücrelerinde baskın fizyolojik özellikleriyle bulunan izoenzimdir. Bu izoenzim sitozolik bir karbonik anhidraz izoenzimidir ve tüm omurgalılarda birçok hücre, doku ve organda yaygın olarak bulunmaktadır. Çok önemli bazı görevlerin yanında insan CA II izoenziminin (hCA II) görev aldığı, karbondioksitin bikarbonata ve protona dönüştürülmesi gibi spesifik görevleri de vardır.
Görev aldığı diğer fonksiyonlar ise, idrarın oluşturulması ve börek kanallarında bikarbonatın geri absorplanması, glikoneojenez, lipojenez ve ürejenez gibi biyosentetik reaksiyonlar, kemik erimesi, kireçlenme ve henüz yeterli olarak anlaşılamamış birçok fizyolojik/patolojik reaksiyon. Bu izoenzimin aktivitesindeki düzensizliklerin önemli patolojik sonuçları olmaktadır, bunlar (i) gözde aşırı göz sıvısı salgılanması sonucu oluşan göz içi basıncın arttığı glokom; (ii) CA II'nin böbrekte diğer izoformlardan bazılarıyla birlikte rol aldığı prosesler sonucu idrarda yeterli miktarda sıvı salgılanmaması veya elimine edilmemesi sonucu vücütta sıvı birikmesiyle oluşan ödem; (iii) epilepsi; (iv) bazı kanser türlerinde, CA II izoenziminin  CA IX ve CA XII gibi diğer bazı izoenzimlerle birlikte seviyelerinde gözlenen yükseklikler.
Yukarıda bazı örneklerini verdiğimiz ve bu enzimlerin seviyelerinde gözlenen yükseklikle ilişkilendirilen patolojik durumlar dolayısıyla bu enzimlerin inhibisyonları önem arz etmektedir. On yıllarca yıldır yapılan çalışmalar nedeniyle günümüzde artık inhibisyon mekanizmaları birçok durumda detaylı olarak anlaşılmıştır. Şimdiye kadar yapılan çalışmalar doğrultusunda dört farklı karbonik anhidraz inhibitör grubu ortaya konulmuştur:
(i) Sülfonamidler ve onların izosterik eşdeğerleri gibi Zn2+ iyonuna bağlananlar,
(ii) fenoller, poliaminler, sülfokumarinler gibi çinko iyonuna koordine su molekülüne/hidroksit iyonuna tutunanlar,
(iii) kumarinler ve onların izosterik eşdeğerleri gibi enzimin aktif bölgesinin girişini kapatanlar;
(iv) ve henüz inhibisyon süreci yeterli olarak anlaşılamamış sekonder/tersiyer sülfonamidler, imatinib, nilotinib ve diğerleri.
İlk olarak 1930'larda antibakteriyel özellikleri keşfedilen sülfonamidler aynı zamanda en önemli karbonik anhidraz inhibitör sınıfıdır ve asetazolamid, methazolamid, etoksazolamid, sultiyam, diklorofenamid, dorzolamid, brinzolamid, sulpirid ve zonisamid gibi örnekleri yıllardır klinik olarak idrar söktürücü, glokom veya epilepsi tedavisinde kullanılmaktadırlar.
Fenoller hidroksil grubunda bulunan hidrojeni vererek, lipitlerin ve protein, karbonhidrat, nükleikasitler gibi diğer biyomoleküllerin serbest radikallerle okside olmalarını önlerler. Antioksidan özelliklerinin dışında fenollerin, antikanserojen, antimutajen, antibakteriyel, antiviral ve antienflamatuar özelliklerinin olduğu raporlanmıştır.
Fenoller yukarıda saydığımız özelliklerinin dışında potansiyel birer karbonik anhidraz enzimi inhibitörüdürler. Fenolün CA II enzimiyle oluşturmuş olduğu kompleksin X ışını kristal yapısı incelendiğinde daha önce öngörülmemiş şekilde hidroksil grubu vasıtasıyla enzimin çinko iyonuna bağlı su/hidroksit iyonuyla ve Thr199'un NH grubuyla bağ kurduğu görülmüştür.
Bu çalışmada her biri ayrı ayrı farklı biyolojik özellikler ihtiva eden ve aynı zamanda her biri farklı inhibisyon mekanizmasına sahip karbonik anhidraz inhibitör grubu olan sülfonamidler ve fenoller tek bir molekülde birleştirilerek, yeni sekonder sülfonamid grubu oluşturulmuş ve bunların insan kanındaki eritrosit hücrelerinden Sepharose-4B-L-tirozin-sülfanilamid afinite kromatografisi kullanılarak elde edilen hCA I ve hCA II izoenzimlerinin in vitro inhibisyonu etkileri incelenmiştir. Bu çalışmada kullanılan sülfonamidler, zamanında antibakteriyel ve değişik amaçlarla klinik olarak kullanılmış ve bir kısmı hala aktif olarak kullanılmakta olup, birçok meyve ve bitkide doğal olarak bulunmakta olan ve antioksidan, antikanserojen gibi özellikler göstermekte olan p-hidroksibenzoik asit ve 3,4,5-trihidroksibenzoik asit gibi fenollerle birleştirilerek, üzerlerinde tiyazol, pirimidin, piridin, izosoksazol, tiyadiazol, metizol ve dimetoksin gibi gruplar içeren yeni asetoksi benzamid ve hidroksi benzamid grupları elde edilmiştir. Yapılan in vitro hCA I ve hCA II inhibisyon çalışmalarından elde edilen sonuçlar incelendiğinde genel itibariyle elde edilen yeni moleküllerin başlangıç moleküllerinden daha iyi birer karbonik anhidraz inhibitörü oldukları, ve bazı moleküllerin ise klinik olarak kullanılmakta olan asetazolamid bileşiğinden daha etkin birer karbonik anhidraz inhibitörü olduğu görülmektedir.

Abstract:
Carbonic anhydrase isozymes are abundant in all life kingdoms and is a super family of metalloenzyme (EC 4.2.1.1) that catalyze the reversible hydration of carbon dioxide to bicarbonate and proton. It has a globular form and is a protein chain builded up from 260 aminoacids. In addition to hydration of carbon dioxide they also catalyze hydariton of  COS and CS2, hydration of cyanamide and hydrolysis of esters. All these processes are achieved in a simple way where, activated metal hydroxide act as a nucleophile. 
All carbonic anhydrases are metalloenzymes and all six distinct families (α-, β-, γ-, δ-, ζ- and η-CAs) discovered up to now differ in their presence for metal ions used within the active site for performing the catalysis. Active site of the enzyme is widespread in a conical shape cavity reach out way to the center of the enzyme and the zinc ion is next to the underside of this cavity.
In all CA classes, the reversible hydration of carbon dioxide to bicarbonate and proton ( CO2 + H2O ↔ HCO3- + H+) follows a two step catalytic mechanism, where an enzyme metal hydroxide adduct (E-M2+-OH-) is the catalytically active species. At neutral pH, this enzyme metal hydroxide adduct act as a strong nucleophile on the carbon dioxide molecule bound in a hydrophobic pocket nearby by with consequent formation of  bicarbonate ion, and then it is displaced from the active site by a water molecule. At the second step of the reaction, proton transfer from the water molecule bound to metal ion to an exogenous proton acceptor regenerates the metal hydroxide species again. This second step is the rate-determining step of the catalytic turnover in many enzymes. For some α- and ζ-carbonic anhydrases achieves kcat / KM values bigger than 108 M-1xs-1, making carbonic anhydrases among the most effective catalysts known in the nature.
Human carbonic anhydrases (hCAs) belong to the α-class of this super enzyme family; 15 different isoforms out of 16 in this group described in humans so far. 12 of them are catalytically active (CAs I-IV, VA, VB, VI, VII, IX, and XII-XIV) and 3 of them do not exhibit any catalytic acitivity so called CA-related proteins (CARPs). The catalytically active human carbonic anhydrases differ on their subcellular localization and can be grouped in four different subclasses; hCAs I, II, III, VII and XIII are cytosolic, hCAs IV, IX, XII and XIV are membrane-associated, hCAs VA and VB exist in mitochondria, hCA VI is secreted in saliva and milk. These isozymes are involved in various crucial physiological processes and can be found in many tissues and organs through out the body.
CA I isozyme is in general not in the target of scientists although it is prevalently expressed in red blood cells and colon. Since it can be inhibited by clorine and bicarbonate ions, there are question marks raising about its physiological functions. However, several evidences demonstrated that changing levels of this isozyme are correlated with several pathological processes. For example, studies showed up that there is a correlation between some types of anemia and chronic acidosis with a decrease of CA I activity in erythrocytes. Another discovery reported by Gao et al. is that the excessive retinal vascular permeability was correlated with a high level of CA I in the extracellular medium.
CA I was also associated alone or together with some other CA isozymes, with vasogenic edema, colorectal cancers, prostate cancer, von Hippel-Lindau tumors, progressive kidney disease, acinar-ductal pancreatic carcinomas, or autoimmune/idiopathic chronic pancreatitis.
Not only high levels, but also lower levels of CA I is associated to pathological processes, such as low levels of CA I in erythrocytes have been evidenced in type II diabetic patients.
CA II is a ubiquitously cyctosolic carbonic anhydrase isoform which is first discovered in the red blood cells with essential physiological functions over than 80 years ago, and it is widespread in a multitude of cells, tissues, and organs in all vertebrates. CA II has crucial and specialized functions, and among them the human carbonic anhydrase (hCA II) is involved in the transport of carbondioxide/bicarbonate from tissues where it is generated to the lungs. Blood of mammals comprise two carbonic anhydrase isoforms, CA I and CA II, and the total concentration can be as high as 0.2 mM. The catalytic activity of CA II is much higher than CA I isozyme. In addition to catalytic acitivity for the conversion of water and carbondioxide to bicarbonate and proton, CA II has several functions include urine formation and bicarbonate reabsorption in the kidney tubules, biosynthetic reactions, such as ureagenesis, lipogenesis and gluconeogenesis, bone resorption and calcification.
To regulate the irregular activities of this isoform in one or more tissues is or can be a solution for some pathological processes associated with it, such as, increase in the intraocular pressure due to excessive aqueous humor secreted in the eye (glaucoma), fluid accumulation in the body due to in adequate fluids are secreted/eliminated in the urine (edema) (due to processes in the kidney associated to CA II with other carbonic anhydrase isozymes such as CA IV, XII and XIV), processes associated with CA II with other brain isoforms which causes epilepsy, and some forms of cancers associated to increased quantities of CA II alone or with other cancer related isoforms CA IX and CA XII. In addition to pathologies above, CA II is involved in acute mountain sickness (AMS), atherosclerosis and also osteoporosis.
Due to the pathological processes associated with CA activities, inhibition of these enzymes become an essential task. Due to the investigations done for decades on the inhibition of these enzymes, inhibition mechanisms are well known in detail today. If we need to categorize, we can sum the CA inhibitors into four main groups:
(i) Inhibitors that bind to metal ions, for example sulfonamides and their isosteres (such as sulfamates, sulfamides and N-hydroxy-sulfonamides), the dithiocarbamates and their isosteres (such as the xanthates), the hydroxamates.
(ii) Inhibitors that anchor to the zinc-coordinated water molecule/hydroxide ion, such as phenols, polyamines and sulfocoumarins.
(iii) Inhibitors that occlude the entrance of the enzyme active site, such as coumarins and their isosteres.
(iv) Inhibitors that bind in an unknown manner such as secondary/tertiary sulfonamides, imatinib and nilotinib.
Sulfonamides are best known carbonic anhydrase inhibitors, and since their first discovery in 1930s as antibiotics they become solution for many other pathologies such as glaucoma, epilepsy and diuretic. Today several sulfonamides such as acetazolamide, methazolamide, ethoxazolamide, sulthiame, dichlorophenamide, dorzolamide, brinzolamide, sulpiride, zonisamide, topiramate, saccharin, celecoxib, chlorothiazide, furosamide and bumethanide are still in clinical use as diuretics, antiglaucoma agents and antiepileptics.
Phenols prevent biomolecules such as lipids, proteins, carbohydrates and nucleic acids to get oxidized by giving proton of their hydroxyl group. In addition to their antioxidant properties, anticarcinogen, antimutagenic, antibacterial, antiviral and antiinflammatory effects are also reported by various studies.
Phenols are also potentially a carbonic anhydrase inhibitors in addition to properties we mentioned above. Phenol is also the first compound reported to inhibit CA by different mechanism than binding to zinc ion. In this group of inhibitors, the inhibitor is not in a direct contact with the metal ion, instead by a presence of anchoring group which is attached to a scaffold that can interact with the two halves of the active side of the enzyme. Further studies on the X-ray crystallographic examinations of adduct formed by CA II enzyme and phenol evidenced that, hydroxyl group of phenol interacts with zinc-coordinated water/hydroxide ion and NH moiety of Thr199 by forming hydrogen bonds.
In this work new secondary sulfonamides are synthesized by combining primary sulfonamides with naturally occuring phenols in one molecule. Sulfonamides used in this work are clinically approved for various applications, and phenols (p-hydroxybenzoic acid and 3,4,5-trihydroxybenzoic acid) are naturally occuring in various plants and evidenced that they comprise properties such as antioxidant, antibacterial and anticarcinogen. These new secondary sulfonamides are classified in four groups, (i) acetoxybenzamide, (ii) triacetoxybenzamide, (iii) hydroxybenzamide and (iv) trihydroxybenzamide, all having thiazole, pyrimidine, pyridine, isoxazole and thiadiazole moieties and their inhibitory effects were studied in vitro on two metalloenzymes, i. e. human carbonic anhydrase isozymes (hCA I and II), purified from human erythrocyte cells by Sepharose-4B-L tyrosine-sulfanilamide affinity chromatography. In comparison to starting primary sulfonamides, new compounds in general has better inhibition activity and also some of them showed better activity than acetazolamide which is a CA inhibitor in clinical use.