SARS-CoV-2 virüsü spike proteininin genomik analizi
Genomic analysis of SARS-CoV-2 virus spike protein
Yazar: ELİF GÜLSÜM TORUN
Danışman: PROF. DR. KEZBAN TÜLAY YALÇINKAYA
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: COVID 19 = COVID 19 ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Korona virüs enfeksiyonları = Coronavirus enfections ; Korona virüsler = Coronaviridae ; Mutasyon = Mutation ; Proteinler = Proteins ; SARS virüsü = SARS virus

Özet:
Giriş ve Amaç: Aralık 2019'da, Çin'in Hubei eyaletine bağlı Wuhan şehrinde nedeni
bilinmeyen bir pnömoni salgını yaşandı. Salgından sorumlu yeni koronavirüs ve ilişkili
pnömoni sırasıyla şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) ve
koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) olarak adlandırıldı. Koronavirüslerin spike
proteini viral enfeksiyon, bulaşıcılık ve antijenitede önemli rol oynar. Bu nedenle,
SARS-CoV-2'deki spike proteininin genetik karakteri, kökeni ve evrimine ışık tutabilir.
Genetik varyans analizleri, salgını kontrol altına alacak önlemler almak için bu yeni
virüs hakkındaki bilgileri genişletmede artık çok önemli bir rol oynamaktadır.
Mutasyonların sürekli izlenmesi, virüsün bireyler arasındaki ve coğrafi alanlar
arasındaki hareketini izlemede de çok önemli olacaktır. Çalışmamızda SARS-CoV-2
virüsünün spike gen bölgesinde meydana gelen genetik değişiklikleri analiz etmeyi
amaçladık.
Materyal ve Metot: 2021 Ağustos ayında, KSÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji
Laboratuvarı'na gönderilen kombine burun-boğaz sürüntü örneklerinden SARS-COV-2
Realtime PCR testi pozitif bulunan 60 örnek çalışmaya dahil edildi. Örneklerden
HibriGen Genel RNA İzolasyon Kiti ile viral RNA izolasyonu yapıldı. İzolasyon
sonucu elde edilen RNA örneklerinden revers transkripsiyonla cDNA sentez edildi.
Bunun için abmgood OneScript® Plus cDNA Sentez Kiti kullanıldı. cDNA örneklerine
Solis Biodyne HOT FIREPol® DNA Polimeraz Kiti kullanılarak PCR işlemi uygulandı.
Oluşan ürünlerin nükleotid dizi analizi KSÜ ÜSKİM Merkez Sekans Laboratuvarında
Sanger yöntemiyle yapıldı. Elde edilen nükleotid dizileri, SARS-CoV-2 Wuhan izolatı
(NC_045512.2) referans alınarak Sequencher 5.4.6 programında birleştirildi ve konsensus dizileri çıkarıldı. Konsensus dizilerindeki mutasyonların analizinde, soy
belirlenmesinde ve dendrogram oluşturulmasında Nextclade v1.7.1 platformu kullanıldı.
Bulgular: Çalışmamızda incelediğimiz 60 SARS-CoV-2 izolatının S gen bölgesi,
referans Wuhan (NC 045512.1) S dizisi ile karşılaştırıldığında izolatların tamamında
çeşitli mutasyonlar tespit edildi. Saptanan mutasyonlardan 36'sı nonsinonim (yanlış
anlamlı), 19'u sinonim (sessiz) mutasyonlardı. Nonsinonim mutasyonlar T19R (n=60),
T478K (n=60), D614G (n=60), P681R (n=60), D950N (n=60), L452R (n=59), G142D
(n=58), T95I (n=37), I850L (n=8), T29A (n=5), T250I (n=4), E1202Q (n=3), E281Q
(n=2), D1163Y (n=2), V915I (n=1), T696S (n=1), G1219C (n=1), V1228L (n=1),
I742N (n=1), Q1071L (n=1), A27V (n=1), A372S (n=1), P330L (n=1), D442A (n=1),
W258R (n=1), G1124C (n=1), D1118H (n=1), P174S (n=1), G769V (n=1), N185D
(n=1), G1267R (n=1), R21I (n=1), V1122L (n=1), M153I (n=1), V382L (n=1) ve A67T
(n=1) olarak tespit edildi. Sinonim mutasyonlar ise C23557T (n=7), C21721T (n=4),
T22261C (n=2), T23521C (n=1), C23086T (n=1), G24124A (n=1), G24928T (n=1),
C24865T (n=1), C22783T (n=1), T23794G (n=1), T22849C (n=1), C22597T (n=1),
C23683T (n=1), C22993T (n=1), C21772A (n=1), G24526A (n=1), C23290T (n=1),
C22858T (n=1) ve G22708A (n=1) olarak bulundu. Ayrıca tüm izolatların 22029-22034
nükleotid pozisyonlarında iki aminoasite karşılık gelen delesyon saptandı (E156-,
S:F157-, S:R158G). En sık saptanan nükleotid mutasyonu C>T (n=15; 10'u sinonim, 5'i
nonsinonim), ikinci sıklıkta G>T (n=11; 10'u nonsinonim, 1'i sinonim) idi. Referans
dizisi ve izolatlar Nextclade v1.7.1 (clades.nextstrain.org) ile karşılaştırılıp dendrogram
oluşturulduğunda 60 örneğin tamamı 21A (Delta) soyu ile gruplanmıştır.
Sonuç: Çalışmamızda S gen bölgesinde meydana gelen mutasyonları incelemek için
örneklere dizi analizi yapılmıştır. Kısa zaman aralığında ve az sayıda örnekle yapmış
olduğumuz çalışmamızda birçok farklı mutasyon tespit edilmiştir. SARS-CoV-2 genetik
çeşitliliğini ve pandemide ortaya çıkan mutasyonları izlemek, evrimini anlamak
COVID-19'a karşı tanı, tedavi ve aşı etkiniliğini sağlamak için çok önemlidir. SARSCoV-
2 mutasyonları diğer RNA virüslerine kıyasla daha düşük oranda gözlenmesine
karşın, enfekte kişi sayısının yüksek olması yeni varyantların ortaya çıkmasını
kolaylaştırmaktadır. S genindeki mutasyonların virüsün ACE2 reseptörü ile etkileşimini
etkileme potansiyeline sahip olması nedeniyle yeni mutasyonlar açısından S gen dizilerinin izlenmesi önemlidir. COVID-19 pandemisinin ciddi etkileri göz önünde
bulundurulduğunda, bu konuda daha fazla araştırma yapılmasına gereksinim vardır.

Abstract:
Introduction and Purpose: In December 2019, there was an epidemic of pneumonia of
unknown cause in the city of Wuhan, Hubei province of China. The novel coronavirus
responsible for the outbreak and associated pneumonia were named severe acute
respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) and coronavirus disease 2019
(COVID-19). The spike protein of coronaviruses plays an important role in viral
infection, infectivity and antigenicity. Therefore, the genetic character of the spike
protein in SARS-CoV-2 may shed light on its origin and evolution. Genetic analysis of
variance plays a very important role in learning new information about the virus in
order to take measures to control the epidemic. Continuous monitoring of mutations will
also be crucial in tracking the movement of the virus between individuals and between
geographic areas. In our study, we aimed to analyze the genetic changes in the spike
gene region of the SARS-CoV-2 virus.
Materials and Methods: Among the combined nose-throat swab samples sent to KSU
Medical Faculty Medical Microbiology Laboratory in August 2021, 60 samples with
positive SARS-COV-2 Realtime PCR test were included in the study. Viral RNA was
isolated from the samples with the HibriGen General RNA Isolation Kit. cDNA was
synthesized by reverse transcription from RNA samples obtained as a result of isolation.
For this, abmgood OneScript® Plus cDNA Synthesis Kit was used. The cDNA samples
were PCRed using the Solis Biodyne HOT FIREPol® DNA Polymerase Kit. The
nucleotide sequence analysis of the resulting products was performed in KSÜ ÜSKİM
Central Sequence Laboratory using the Sanger method. The resulting nucleotide sequences were assembled in the Sequencher 5.4.6 program with reference to the
SARS-CoV-2 Wuhan isolate (NC_045512.2) and consensus sequences were extracted.
Nextclade v1.7.1 platform was used for analysis of mutations in consensus sequences,
lineage determination and dendrogram creation.
Results: When the S gene region of 60 SARS-CoV-2 isolates we examined in our study
was compared with the reference Wuhan (NC 045512.1) S sequence, various mutations
were detected in all isolates. Of the detected mutations, 36 were nonsynonymous
(missense) and 19 were synonymous (silent) mutations. Nonsynonymous mutations
T19R (n=60), T478K (n=60), D614G (n=60), P681R (n=60), D950N (n=60), L452R
(n=59), G142D (n=58) , T95I (n=37), I850L (n=8), T29A (n=5), T250I (n=4), E1202Q
(n=3), E281Q (n=2), D1163Y (n=2), V915I (n=1), T696S (n=1), G1219C (n=1),
V1228L (n=1), I742N (n=1), Q1071L (n=1), A27V (n=1), A372S (n=1), P330L (n=1),
D442A (n=1), W258R (n=1), G1124C (n=1), D1118H (n=1), P174S (n=1), G769V (
n=1), N185D (n=1), G1267R (n=1), R21I (n=1), V1122L (n=1), M153I (n=1), V382L
(n=1), and A67T (n=1) = 1) was detected. Synonym mutations are C23557T (n=7),
C21721T (n=4), T22261C (n=2), T23521C (n=1), C23086T (n=1), G24124A (n=1),
G24928T (n=1) ), C24865T (n=1), C22783T (n=1), T23794G (n=1), T22849C (n=1),
C22597T (n=1), C23683T (n=1), C22993T (n=1) , C21772A (n=1), G24526A (n=1),
C23290T (n=1), C22858T (n=1) and G22708A (n=1). In addition, deletions
corresponding to two amino acids were detected at nucleotide positions 22029-22034 of
all isolates (E156-, S:F157-, S:R158G). The most common nucleotide mutation was
C>T (n=15; 10 synonymous, 5 nonsynonymous), the second most common was G>T
(n=11; 10 nonsynonymous, 1 synonymous). When the reference sequence and isolates
were compared with Nextclade v1.7.1 (clades.nextstrain.org) and the dendrogram was
established, all 60 samples were grouped with the 21A (Delta) strain.
Conclusion: Sequence analysis was performed on the samples to examine the mutations
in the S gene region in our study. Many different mutations were detected in our study,
which we conducted in a short time period and with a small number of samples.
Monitoring the genetic diversity of SARS-CoV-2 and the mutations that occur in the
pandemic, understanding its evolution is very important to ensure diagnosis, treatment
and vaccine effectiveness against COVID-19. Although SARS-CoV-2 mutations are
observed at a lower rate compared to other RNA viruses, the high number of infected people facilitates the emergence of new variants. Since mutations in the S gene have the
potential to affect the interaction of the virus with the ACE2 receptor, it is important to
monitor the S gene sequences for new mutations. Considering the serious effects of the
COVID-19 pandemic, more research is needed on this subject.