İmmatür sığır oositlerinin vitrifikasyon tekniği ile etilen glikol ve DMSO kullanarak payetlerde dondurulması
Cryopreservation of immature bovine oocytes by vitrification with ethylene glycol and DMSO in straws
Yazar: YUNUS ÇETİN
Danışman: PROF.DR. AYHAN BAŞTAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2004
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
58 ÖZET İmmatür Sığır Oositlerinin Vitrifikasyon Tekniği ile Etilen Glikol ve DMSO Kullanarak Payetlerde Dondurulması Bu çalışmanın amacı; immatür sığır oositlerinin vitrifikasyon tekniği ile etilen glikol ve DMSO kullanarak klasik payetlerde dondurulması ve bu tekniğin oosit maturasyonu üzerine etkilerinin ortaya konulmasıdır. Çalışmada materyal olarak, Çubuk Mezbahasında kesilen hayvanlardan toplanan 238 adet ovaryumdan follikül aspirasyonuyla elde edilen 575 adet kumulus oosit kompleks kullanıldı. Kullanılan kryoprotektana göre, etilen glikol kullanılanlar Grup EG, dimetil sülfoksit kullanılanlar Grup DMSO, bu iki kryoprotektanın birlikte kullanılması ile Grup Karma ve kontrol grubu olmak üzere 4 grup oluşturuldu. Çalışma gruplarındaki, etrafı en az 3 kat sıkı kumulus ile çevrili, homojen stoplazmalı oositler, seleksiyondan sonra vitrifikasyon işlemine tabi tutulurken, kontrol grubu herhangi bir işlem uygulanmaksızın in vitro maturasyona alındılar. Grup EG için, birinci basamak vitrifikasyon solüsyonu olarak %20 oranında etilen glikol, ikinci basamak için %40 etilen glikol + 1M sükroz içeren içeren temel medyum (%20 serum FCS+HEPES'li TCM199) hazırlandı. Grup DMSO'da ise birinci basamak için %20 oranında DMSO, ikinci basamak için %40 DMSO + 1M sükrozlu temel medyum kullanıldı. Karma grupta %10 EG + %10 DMSO kapsayan temel medyum ilk basamak için kullanılırken, diğer basamak için %20 EG + %20 DMSO + 1M sükroz içeren temel medyum kullanıldı. Vitrifikasyon yapılacak oositler, birinci basamakta 45 s, ikinci basamakta 25-30 s kadar vitrifikasyon solüsyonlarında bırakıldıktan sonra, payetlenerek sıvı azota atıldılar. Sıvı azot içinde yaklaşık 1 ay bekletilen oositler, 3 basamaktan oluşan çözdürme solüsyonlarından geçirilerek, in vitro maturasyona alındılar, in vitro maturasyon işlemi, HEPES'Iİ TCM 199 medyumu kullanılarak, %5 C02 içeren maksimum nemli etüvde 39 °C'de 24 saatte yapıldı. Maturasyon sonrası, tüm oositlerde kutup hücresi incelemesi yapıldıktan sonra, fikse edilip, Giemsa solüsyonu ile boyanarak çekirdek maturasyonu değerlendirildi. Stereomikroskop incelemesi sonrasında Grup EG'de 139 oositten 44'ünde (%31,65) kutup hücresinin bulunduğu (KH+), 82'sinde (%59) kutup hücresinin görülmediği (KH-) ve 13 oositin (%9,35) ise dejenere olduğu belirlendi. Grup DMSO'da, 11 oositin (%7,59) KH+, 112 oositin (%77,24) KH- ve 22 oositin (%15,17) dejenere olduğu saptandı. Grup Karma'da 25 oositte (%13,30) kutup hücresi saptanırken, 121 oositte (%64,36) kutup hücresinin olmadığı ve 42 oositin (%22,34) ise dejenere olduğu belirlendi. Kontrol grubunda ise 77 oositte (%74,76) kutup hücresi tespit edilirken, 21 oositte (%20,39) kutup hücresinin bulunmadığı 5 oositin (%4,85) ise dejenere olduğu saptandı. Grup EG'de çekirdek boyaması yapılan 120 oositin 46'sının (%38,34) GV, 27 tanesinin (%22,5) ise GVBD-MI, 41'inin (%34,16) M II döneminde olduğu belirlenirken, 6 tanesinin (%5) çekirdek durumu tespit edilemedi. Grup DMSO'da ise 114 oositin 87'si (%76,31) GV, 7 (%6,14) oosit GVBD-MI, 17 oosit (%14,91) M II döneminde iken, 3 oositin (%2,64) durumu saptanamadı. Karma grupta 140 oositin 76'sı (%54,28) GV, 16 (%11,43) oosit GVBD-MI, 29'u (%20,71) M II safhasındayken, 19 (%13,58) oositin dönemi belirlenemedi. Kontrol grubunda ise 98 oosit boyandı. Değerlendirilen oositlerden 12'sinin (%12,24) GV, 5'inin (%5,1) GVBD-MI, 78'inin (%79,60) M II, 3 adedinin (%3,06) ise tanımsız olduğu saptandı. Yapılan istatistiki hesaplamalarda EG ile Karma grup ve DMSO ile Karma grup maturasyon dağılımları arasındaki fark59 önemsiz bulundu (p>0,05). Bunun dışındaki gruplar arasındaki farklar önemliydi (p<0,001). Çalışma bulguları genel olarak değerlendirildiğinde EG grubunda DMSO ve Karma grubuna göre daha başarılı sonuçlar elde edildi. Vitrifikasyon yapılan tüm gruplarda, kontrol grubuna göre daha düşük maturasyon oranlan saptandı. Dimetil sülfoksit grubu, maturasyon açısından en düşük sonuçları veren grup idi. Karma grubun maturasyon oranlan ise DMSO ve EG arasında yer aldı. Sonuç olarak, immatür sığır oositlerinin klasik payetlerde vitrifikasyon tekniği ile dondurulabileceği, kullanılan kryoprotektana bağlı olarak maturasyon başarısının değişebileceği, çalışma sonuçları değerlendirildiğinde maturasyon oranları açısından en avantajlı kryoprotektanın etilen glikol olduğu kanısına varıldı. Ancak, daha başarılı sonuçlar immatür sığır oositleri için özelleştirilmiş vitrifikasyon tekniklerinin geliştirilmesi ile sağlanabilecektir. Anahtar Sözcükler: dimetil sülfoksit, etilen glikol, immatür sığır oositi, vitrifikasyon

Abstract:
60 SUMMARY Cryopreservation of Immature Bovine Oocytes by Vitrification with Ethylene Glycol and DMSO in Straws The aim of this study was cryopreservation of immature bovine oocytes by vitrification with ethylene glycol and DMSO in straws and to investigate the effects of vitrification on oocyte maturation. A total of 575 cumulus oocyte complexes obtained by follicle aspiration from 238 ovaries taken from cows slaughtered at a local abattoir. Following selection, oocytes with compacted cumulus cells and evenly granulated ooplasm were vitrified using one of three solutions (Ethylene Glycol= Group EG, Dimethyl Sulphoxide=DMSO, Ethylene Glycol + Dimethyl Sulphoxide= Group Mix) and a non- vitrified group served as control. Hepes buffered TCM-199 medium supplemented with 20% FCS was used as a basic media throughout the experiment. First step vitrification solution contained 20% EG while second step vitrification solution contained 40% EG + 1 M sucrose in a basic media used in group EG. First and second step vitrification solutions used in group DMSO contained 20%DMSO and 40% DMSO + 1 M sucrose in basic media, respectively. While 10% EG + 10 % DMSO solution in basic media used for first step vitrification in Mix group, second step vitrification solution contained 20% + 20% DMSO + 1 M sucrose in basic media. Oocytes were loaded into straws and plunged into LN2 after being exposed to first and second steps of vitrification solutions which lasted about 45 and 25-30 s respectively. Oocytes were kept in LN2 for approximately 1 month, diluted in 3 solutions in a step wise fashion and maturated in vitro. Oocytes were matured in HEPES buffered TCM 199 medium for 24 h at 39 °C in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air. Oocytes were fixed following evaluation for polar body formation, stained with Giemsa solution and nuclear maturation was examined. Forty-four (31.65%) oocytes were polar body positive (PB+), 82 (59%) oocytes were polar body negative (PB-) and 13 (9.35%) oocytes were degenerated in group EG. Eleven (7.59%) oocytes in group DMSO were PB+ while 1 12 (77.24%) oocytes were PB- and 22 (15.17%) oocytes were degenerated. The number of PB+, PB- and degenerated oocytes in group Mix were 25 (13.30%), 121 (64.36%) and 42 (22.34%), respectively. Control group had 77 (74.76%) PB+, 21 (20.39%) PB- and 5 (4.85%) degenerated oocytes. Nuclear staining revealed that 46 (38.34%) oocytes were at GV stage (germinal vesicle), 27 (22.5%) were at GVBD-MI (germinal vesicle break down- metafaz I) stage, 41 (34.16%) were at M II (metafaz II) stage groups EG while the stage of 6 (5%) oocytes could not been determined. Number of oocytes at stages GV, GVBD-MI and M II were 87 (76.31%), 7 (6.14%) and 17 (14.91%) in group DMSO respectively. Stages of 3 (2.64%) oocytes in group DMSO were undetermined. In group Mix; 76 (54.28%), 16 (11.43%) and 29 (20.71%) oocytes were at GV, GVBD-MI and M II respectively. Nuclear stage of 19 (13.58%) oocytes could not been determined in group Mix. Control group had 12 (12.24%), 5 (5.1%), 78 (79.60%) and 3 (3.06%) oocytes at GV, GVBD-MI, M II and undetermined nuclear stages, respectively.61 Maturation rate distribution in group Mix was not statistically different when compared to maturation rate distributions in groups EG and DMSO (p>0.05). Differences between other groups were significant (p<0.001). Altogether, better results were obtained in EG group compared to DMSO and Mix groups. Maturation rate was lower in all treatment groups than the control group. The lowest maturation result were obtained in DMSO group. Maturation rate in group Mix was between maturation rates of EG and DMSO groups. In conclusion, immature bovine oocytes could be vitrified in straws, maturation success differs due to cryoprotectant used and the most advantageous cryoprotectant in this study was ethylene glycol. However, for better results, new cryopreservation techniques specified for immature bovine oocytes need to be improved. Key Words: dimethyl sulphoxide, ethylene glycol, immature bovine oocyte, vitrification