Meme kanseri epitel hücrelerinde pan-aurora kinaz inhibitörü danusertib ile apijenin 8-Cglukozidin (viteksin) antikanser etkilerinin araştırılması
Investigation of the anti-cancer effects of apigenin 8-C glucoside (vitexin) with the pan-aurora kinase inhibitor danusertib in breast cancer epithelial cells
Yazar: HEDİYE KILIÇ
Danışman: PROF. DR. AHMET ATA ÖZÇİMEN
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Viteksin = Vitexin

Özet:
Kanser gelişmesi ve ilerlemesi sessiz, aynı zamanda tedaviye karşı direnç göstermesi nedeniyle tedavisi zor bir hastalıktır. Kanserin oluşum ve ilerleme mekanizmalarının aydınlatılması amacı ile çok sayıda çalışma yürütülmektedir. Kanser hücrelerinin çoğalmalarının durdurulması için farklı yöntemler aranmaktadır. Tedavi metodları geliştirilirken tedavi amaçlı pek çok molekül kullanılmaktadır. Bu projede Pan-Aurora kinaz inhibitörü olan Danusertib ile birlikte Apijenin 8-C Glukozid (Viteksin) maddesinin birlikte etkisi incelenmiştir. Danusertib ve Viteksin için WST-8 kiti kullanılarak sitotoksik IC50 değeri 24., 48. ve 72. saatlerde tespit edilmiştir. Danusertib için 0.3µM doz ve Viteksin için 1µM doz değerleri meme kanseri hücresi olan MCF-7 hücrelerine uygulanmıştır. Danusertib ve Viteksin'nin MCF-7 hücrelerinde apoptotik etkisini incelemek için AnnexinV /PI Boyama metodu kullanılmıştır. Danusertib ve Viteksin'in MCF-7 hücresi üzerinde 48.saatte ayrı ayrı ve birlikte apoptotik etkisine flow sitometri cihazında bakılmıştır. Flow sitometri cihazından alınan veriler analiz edildiğinde Viteksin (1µM) apoptotik etkisi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında primer apoptoz 2.24±0.59 (PK/V  < 0.05). Danusertib-Viteksinin birlikte apoptotik etkisi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında primer apoptoz 3,07±0,37 (PK/D+V < 0,05) bulunmuştur.Danusertib ve Viteksin'nin MCF-7 hücrelerinde gen ekpresyonu düzeyine etkisini incelemek içinqRT-PCR metodu kullanılmıştır. qRT-PCR metodu ile apoptoz ilişkili genlerden Kaspaz-3 (Casp3), Kaspaz-8 (Casp8), Kaspaz-9 (Casp9); Metastaz ilişkili VEGF; Hücre döngüsünde mitoz bölünmede etkili AURK-B gen ifade düzeylerine bakılmıştır. qRT-PCR metodu ile Danusertib ve Viteksinin MCF-7 hücreleri üzerinde 48. saatte gen ifade düzeyleri üzerinde ayrı ayrı ve birlikte etkisine bakılmıştır. qRT-PCR metodu ile elde edilen veriler analiz edildiğinde Danusertib ve Viteksin'in ayrı ayrı ve birlikte uygulandığı tüm deney gruplarında Casp3 gen ifade düzeyinde azalmaya neden olmuştur. Casp8 gen ifade düzeyinde artış ise sadece Danusertib ve Danusertib-Viteksinin birlikte uygulandığı gruplarda tespit edilmiştir. Sadece Viteksin uygulanan deney gruplarında Casp8 gen ifade düzeyinde azalma tespit edilmiştir. Casp9 gen ifade düzeyinde Danusertib ve Viteksin'in ayrı ayrı ve Danusertib-Viteksin'in birlikte uygulandığı tüm deney gruplarında azalma tespit edilmiştir. Metastaz ilişkili gen VEGF seviyesinde ise sadece Viteksin uygulanan grupta azalma tespit edilmiştir. Viteksin grubunun VEGF gen ifadesi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 0,1347±0,01 (PC/V< 0,001) tespit edilmiştir. Bu elde edilen veri Viteksin'in metastazda hücre migrasyonunu azalttığını düşündürmektedir.Danusertib ayrı ve Danusertib-Viteksin birlikte uygulanan deney gruplarında VEGF gen ifade seviyesinde artış tespit edilmiştir. Hücre döngüsünde mitoz bölünmede etkili olan AURK-B gen ifade düzeyinde sadece Viteksin uygulanan deney gruplarında azalma tespit edilmiştir. Danusertib ve Viteksin'nin MCF-7 hücrelerinde metastazda hücre migrasyonuna etkisini incelemek için Wound Healing (yara iyileşme)  metodu kullanılmıştır. Danusertib ve Viteksin'in ayrı ayrı ve Danusertib-Viteksin'in birlikte uygulandığı deney gruplarında 48.saatte yara açılan bölgede hücre göçleri sonucu kapanma tespit edilememiştir. Deney gruplarında yara açılan bölgeye doğru hücre migrasyonu durmuştur.Danusertib (0.3µM) primer apoptotik etki göstermiştir fakat sekonder apoptotik etki göstermemiştir. Viteksin (1µM)primer apoptotik etki göstermiştir fakat sekonder apoptotik etki göstermemiştir. Ancak Viteksin antimigratif ve antimetastatik etki gösterdiği tespit edilmiştir. Bu etki ile de Viteksinin potansiyel bir antimetastatik ajan olabileceği öngörülebilir.

Abstract:
Cancer is a disease that is difficult to treat because of it's silent development and progression, and it's resistance to treatment.Numerous studies are carried out with the aim of elucidating the formation and progression mechanisms of cancer. Different methods are sought to stop the proliferation of cancer cells.While developing treatment methods, many molecules are used for therapeutic purposes.In this project, the combined effect of Danusertib, a Pan-Aurora kinase inhibitor, and Apigenin 8-C Glucoside (Vitexin) was investigated.The cytotoxic IC50 value was determined at 24, 48 and 72 hours for Danusertib and Viteksin using the WST-8 kit.The dose values of 0.3µM for Danusertib and 1µM for Vitexin were applied to MCF-7 cells, which are breast cancer cells.AnnexinV /PI Staining method was used to examine the apoptotic effect of Danusertib and Vitexin in MCF-7 cells. The apoptotic effect of Danusertib and Vitexin on MCF-7 cells separately and together at 48 hours was examined in a flow cytometry device.	 When the data obtained from the flow cytometry device were analyzed, the apoptotic effect of Vitexin (1µM) was 2.24±0.59 (PK/V< 0.05) compared to the control group.	When the co-apoptotic effect of Danusertib-Vitexin was compared with the control group, primary apoptosis was found to be 3.07±0.37 (PK/D+V < 0.05).	The qRT-PCR method was used to examine the effects of Danusertib and Vitexin on the level of gene expression in MCF-7 cells.Caspase-3 (Casp3), Caspase-8 (Casp8), Caspase-9 (Casp9) from apoptosis-related genes by qRT-PCR method; Metastasis-associated VEGF; AURK-B gene expression levels, which are effective in mitosis in the cell cycle, were examined.With the qRT-PCR method, the effects of Danusertib and Vitexin on MCF-7 cells on the gene expression levels at 48th hour, separately and together, were examined.When the data obtained by the qRT-PCR method were analyzed, it caused a decrease in Casp3 gene expression level in all experimental groups in which Danusertib and Vitexin were applied separately or together. The increase in Casp8 gene expression level was detected only in the groups in which Danusertib and Danusertib-Vitexin were applied together. A decrease in Casp8 gene expression level was detected only in the experimental groups to which Vitexin was applied.A decrease in Casp9 gene expression level was detected in all experimental groups in which Danusertib and Vitexin were applied separately and Danusertib-Vitexin was applied together. On the other hand, there was a decrease in the level of the metastasis-related gene VEGF, only in the Vitexin group.VEGF gene expression of the vitexin group was 0.1347±0.01 (PC/V< 0.001) when compared with the control group. These data suggest that Vitexin reduces cell migration in metastasis.These data suggest that Vitexin has an effect on cell migration in metastasis.An increase in VEGF gene expression level was detected in the experimental groups applied Danusertib separately and Danusertib-Vitexin together.A decrease in the AURK-B gene expression level, which is effective in mitosis in the cell cycle, was detected only in the experimental groups to which Vitexin was applied.Wond Healing method was used to examine the effect of Danusertib and Vitexin on cell migration in Metastasis in MCF-7 cells.In the experimental groups in which Danusertib and Vitexin were applied separately and Danusertib-Vitexin was applied together, closure could not be detected as a result of cell migration in the area where the wound was opened at 48th hour. Cell migration towards the wound site stopped in the experimental groups.As a result, Danusertib (0.3 µM) showed a primary apoptotic effect but did not show a secondary apoptotic effect. Vitexin (1µM) showed a primary apoptotic effect but did not show a secondary apoptotic effect.However, it has been determined that Viteksin has an antimigratory and antimetastatic effect. With this effect, it can be predicted that Vitexin may be a potential antimetastatic agent.