Genişlemiş spektrumlu beta laktamaz oluşturan E.coli ve Klebsiella suşlarında izoelektrik fokuslama yöntemi ile beta laktamaz tiplerinin saptanması ve plazmid profil analizi
Detection of beta lactamase types of extended spectrum beta lactamase producing E.coli and Klebsiella spp by method for isoelectric focusing and plasmid profile analysis
Yazar: LÜTFİYE ÖKSÜZ
Danışman: PROF.DR. NEZAHAT GÜRLER
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Genişlemiş spektrumlu beta laktamazlar, sefotaksim, seftazidim, aztreonam ve diğeroksimino beta laktamlara direnç gösteren, ancak sefamisinleri ve karbapenemleri hidrolizeedemeyen enzimlerdir. GSBL enzimleri, çoğunlukla klavulanat, tazobaktam veya sulbaktamgibi inhibitörlerle inhibe edilirler. Bu çalışmanın amacı, hastanemizde GSBL oluşturan E.colive Klebsiella suşlarındaki beta laktamazları saptamaktı. Temmuz 2002- Mart 2004 tarihleriarasında İstanbul Tıp Fakültesi'nin Yoğun Bakım, Hematoloji, Onkoloji, Yenidoğan,Transplantayon ve Çocuk Cerrahisi birimlerinde yatan hastaların çeşitli örneklerinden GSBLoluşturan 12 E.coli ve 32 Klebsiella spp (28'i K.pneumoniae, 4'ü K.oxytoca) suşu izoleedilmiştir. Antibiyotik duyarlılık deneyleri NCCLS'e göre disk difüzyon yöntemi ileyapılmıştır. İmipeneme ve meropeneme dirençli suş bulunmamıştır. Karbapenemlerden sonraen etkili antibiyotiğin amikasin olduğu bulunmuştur. Sefotaksim ve seftazidim MİK'ları agardilüsyon ve E-test GSBL ile saptanmıştır. E.coli ve Klebsiella suşlarında sefotaksim içinMİK50 ve MİK90 sırasıyla 16 ug/ml ve 64 ug/ml olarak bulunmuştur. GSBL varlığınısaptamak için, sefotaksim, seftazidim ve amoksisilin klavulanik asit arasında sinerji olupolmadığı incelenmiştir. GSBL üretimi, E-test GSBL ve agar dilüsyon ile araştırılmıştır.Suşların tümü, çift disk sinerji ile GSBL fenotipi göstermiştir. İzoelektrik fokuslama,Matthew'un önerdiği yönteme göre yapılmıştır. İzoelektrik fokuslama sonuçlarına göre, suşlar1-4 arası beta laktamaz taşımaktadır. Suşların beta laktamazları, pI: 5.4-9.0 arasındabulunmuştur. TEM, SHV ve CTX-M genlerine spesifik primerler kullanılarak PCRyapılmıştır. 27 suşun (% 61.4) TEM, 30 suşun (% 68.2) SHV ve 32 suşun (% 72.7) CTX-Mtaşıdığı bulunmuştur. RAPD-PCR ile suşların 170-1500 bp arasında bantlara sahip olduğugörülmüştür. K.pneumoniae'de 10, K.oxytoca'da üç ve E.coli'de altı grup belirlenmiştir. Sıvıaktarım yöntemiyle konjugasyon yapılmış, alıcı suş olarak E.coli J62-2 kullanılmıştır. 44suşun 31'inde (% 70.45) antibiyotik direnci alıcı suşa aktarılabilmiştir. Plazmidekstraksiyonu, alkali lizis yöntemiyle yapılmıştır. Transkonjugatların 20'sinin (% 64.5) tek birplazmide (>48 kb), 11'inin (% 35.5) ise birden fazla plazmide (10-100 kb) sahip olduğusaptanmıştır. Sonuç olarak hastanemizde izole edilen E.coli suşlarında CTX-M betalaktamazının, TEM ve SHV'den daha yaygın olduğu bulunmuştur.Anahtar kelimeler: GSBL üretimi, E.coli, K.pneumoniae, PCR, plazmid profil analizi

Abstract:
Extended spectrum beta lactamases (ESBL) confer resistance to aztreonam, cefotaxime,ceftazidime and related oxyimino beta lactams, but are unable to hydrolyse cephamycins orcarbapenems. In most instances, ESBL enzymes are inhibitable by clavulanate or other inhibitors suchas tazobactam or sulbactam. The aim of this study was to detection the beta lactamases in E.coli andKlebsiella spp strains that produce extended spectrum Î²-lactamases in our hospital. Our study strainsconsisted of 12 E.coli and 32 Klebsiella spp isolated from various specimens of patients hospitalizedin the Intensive Care, Hematology, Oncology, Neonatology, Transplantation and Pediatric SurgaryUnits of the Istanbul Medical Faculty Hospital between July 2002-March 2004. Antimicrobialsusceptibility tests were performed by disc diffusion according to the latest NCCLS guidelines.According to antimicrobial susceptibility test results, resistance to imipenem or meropenem was notdetected. Except carbapenems, amikacin was the most effective antibiotic against to the strains. MICsof cefotaxime and ceftazidime were determined by agar dilution method and by the E-test ESBL.MIC50 and MIC90 for cefotaxime were found 16 ug/ml, 64 ug/ml in Klebsiella spp and E.coli strainsrespectively. The presence of ESBL was suggested by the synergies detected between clavulanic acidand third-generation cephalosporins (ceftazidime, cefotaxime) in the disc diffusion assay. All isolatesdemonstrated an ESBL phenotype using double-disk synergy test. Isoelectring focusing (IEF) wasperformed by the method of Matthew et al. IEF showed that the isolates produced 1-4 beta lactamases.pI?s of the isolates were between 5.4-9.0. A polimerase chain reaction (PCR) was performed usingprimers spesific for the blaTEM, blaSHV and blaCTX-M genes. Among the 44 isolates, rates of TEM,SHV, CTX-M beta lactamases were found 61.4 %, 68.2 % and 72.7 % , respectively. The profilesgenerated with ERIC-2 PCR primer contained several bands, ranging in size from 170 to 1500 bp. Tengroups for K.pneumoniae, three groups for K.oxytoca and six group for E.coli were seperated.Conjugation was carried out by broth mating. A rifampicin-resistant E.coli strain (J62-2) was used asthe recipient. Thirty-one of the isolates (70.45 %) were able to transfer their resistance to recipientE.coli strain by conjugation. Plasmid extraction was performed by the alkaline-lysis method. Twentyof the transkonjugants (64.5 %) were found to carry only one plasmid (> 48 kb). Eleven strains (35.5%) harbored more then one plasmid, with sizes ranging from 10 to 100 kb. In conclusion, we foundthat CTX-M was the most common than TEM and SHV beta lactamases in E.coli strains in ourhospital.Key words: ESBL production, E.coli, K.pneumoniae, PCR, plasmid profile analysis.