Ekşi hamurdan fitaz aktivitesi yüksek maya ve laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve bu izolatların tam buğday ekmeği üretiminde kullanılması
Isolation of high phytase active yeasts and lactic acid 
bacteria from sourdough and their usage in the 
production of whole wheat bread
Yazar: KEVSER KARAMAN
Danışman: PROF. DR. OSMAN SAĞDIÇ
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Ekşi hamur = Sour dough ; Fitik asit = Phytic acid ; Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria

Özet:
Bu çalışmada, farklı bölgelerden toplanmış ekşi hamur örneklerinden izole edilerek saflaştırılan laktik asit bakterisi (LAB) ve mayaların model besiyeri ortamında fitik asidi parçalama kapasitelerinin belirlenerek, fitaz pozitif suşların FTIR (Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi) ve moleküler teknikler ile tanımlanması ve ardından farklı kombinasyonlar şeklinde tam buğday ekmeği üretiminde kullanılması sonucunda son üründe meydana gelen bazı fizikokimyasal, besinsel, duyusal ve tekstürel özelliklerdeki değişimler incelenmiştir. Bu amaçla, ülkemizin farklı bölgelerinden toplanan örneklerden LAB ve maya izolatları elde edilmiştir. Elde edilen izolatların fitatlı besiyeri ortamında fitaz aktiviteleri belirlenmiş, fitaz pozitif suşların ekstraselüler olarak da fitaz aktivitesi tespit edilerek tanımlama işlemine alınmıştır. Bu kapsamda izolatlar öncelikle FTIR tekniği ile tanımlanarak kümeleme işlemine tabi tutulmuş ve oluşturulan soy ağacında her bir kümeyi temsilen bir izolat seçilerek elde edilen toplam 8 adet LAB ve 8 adet maya, genotipik olarak tanımlama işlemine tabi tutulmuştur. Genotipik olarak tanımlanmış LAB ve maya suşları uygun ortamlarda aktifleştirilerek farklı kombinasyonlar şeklinde tam buğday ekmeği üretiminde kullanılmak üzere hazırlanan ekşi hamur örneklerinin üretilmesinde kullanılmıştır. Üretilen ekmekler, spontan fermentasyon ile hazırlanan ekşi hamur katkılı tam buğday ekmeği ve doğrudan sadece ticari ekmek mayası ilavesi ile üretilen tam buğday ekmeği örnekleri ile kıyaslanmıştır. Çalışma kapsamında ekşi hamur örneklerinin fermentasyon başlangıcı ve sonunda (0. saat ve 20. saat) LAB ve maya sayıları, pH ve asitlik gelişimleri belirlenmiştir. Daha sonra bu ekşi hamur örnekleri ile hazırlanan tam buğday ekmeği hamurlarında ise pH, titrasyon asitliği ve reolojik analizler çerçevesinde örneklerin elastik modülü (G'), viskoz modülü (G''), kompleks modülü (G*) ve kompleks viskozite (?*) değerleri ölçülmüştür. Üretilen tam buğday ekmeği örneklerinde ise pH, titrasyon asitliği, ekmek iç ve kabuk rengi, spesifik hacim, fitik asit miktarı ve parçalama oranları, tekstür profil analiz (TPA) parametreleri, mineral kompozisyonu (Ca, K, Mg, Fe, Zn) ile ekmek örneklerinin duyusal karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Katı besiyerinde fitaz pozitif olarak belirlenen izolatların ekstraselüler fitaz aktivitesi LAB izolatları için 703.1-1153.8 U/ml aralığında hesaplanırken, bu değerler maya izolatları için 352.2-943.4 U/ml değerleri arasında belirlenmiştir. Toplanan izolatların önce FTIR ile kümeleme, ardından da genotipik olarak tanımlanması neticesinde iki farklı maya türü (Saccharomyces cerevisiae, Pichia membranifaciens) ile beş farklı LAB türü (Weissella viridescens, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus brevis, Lactobacillus parabuchneri) tanımlanmıştır. Bu izolatların farklı şekillerde kombine edilmesi ile farklı kültür içeriğine sahip ekşi hamur örneklerinin 0. saat LAB sayıları 2.39-7.84 log kob/g aralığında tespit edilirken, 20 saatlik fermentasyon işlemi sonrasında LAB sayıları 8.03-8.37 log kob/g olarak belirlenmiştir. Fermentasyon işleminin başlangıcında örneklerin maya sayıları 1.54-5.52 log kob/g aralığında değişim göstermiş, 20 saat sonunda ise maya sayısı 4.60-7.41 log kob/g aralığında bulunmuştur. Fermentasyon ile birlikte örneklerin asitliğinde meydana gelen değişime bağlı olarak pH değerleri 3.96-5.07 aralığında ölçülmüştür. Ekşi hamur katkısı ile hazırlanan tam buğday ekmeği hamurlarının pH değerleri 5.09-6.10, asitlik değerleri ise 2.98-4.70 ml aralığında belirlenmiştir. Hamur örneklerinin elastik modülü değerlerinin viskoz modülüne nazaran daha yüksek çıktığı ve viskoelastik hamur özelliği sergilediği görülmüş, hamurlara uygulanan frekans değerinin artışına bağlı olarak örneklerin elastik ve viskoz modülü değerleri artarken, kompleks viskozite değerleri düşüş göstermiştir. Üretilen tam buğday ekmeği örneklerinin ise pH değerleri 5.11-5.98, asitlik değerleri 2.98-5.70 ml, spesifik hacim değerleri 1.13-2.25 ml/g aralığında belirlenmiştir. Ekmek içi renk ölçüm sonuçlarına göre L* değeri 48.13-58.97 aralığında, a* değeri 4.79-5.40 aralığında ve b* değeri de 11.64-17.96 aralığında ölçülürken, ekmek dış rengi kapsamında L* değeri 44.27-59.39 aralığında, a* değeri 7.89-11.41 aralığında ve b* değeri de 13.63-24.12 aralığında tespit edilmiştir. Ekmek örneklerinde sertlik değeri 556.9-1607.6 g aralığında belirlenmiş ve spontan ekşitilen ekşi hamur katkılı tam buğday ekmeği örneklerinin daha sert olduğu görülmüştür. Fitik asit içeriği bakımından örnekler arasında kullanılan kültür kombinasyonuna göre farklılıklar olmakla birlikte, tam buğday unu ve sadece ticari maya katkısı ile üretilen kontrol ekmeğine kıyasla, ekşi hamur katkılı ekmeklerde önemli düzeyde azalmalar meydana gelmiştir. Fitik asitin parçalanması sonucunda en fazla düşüş (%43.4) S.cerevisiae+Pediococcus pentosaceus kültür kombinasyonu içeren ekmek örneğinde belirlenmiştir. En az fitik asit parçalanması gözlenen ekmek ise Pichia membranifaciens+Lb. brevis kombinasyonu ile hazırlanan ekşi hamur katkılı ekmek olmuştur. Ekmek örneklerinin mineral madde kompozisyonu kapsamında çinko (Zn) içerikleri 6.84-26.2 ?g/g, demir (Fe) içerikleri 26.14-39.03 ?g/g, magnezyum (Mg) içerikleri 178.9-644.5 ?g/g, potasyum (K) içerikleri 160-3335,9 ?g/g ve kalsiyum (Ca) içerikleri de 41.11-80.60 ?g/g aralığında tespit edilmiştir. Duyusal değerlendirmeler neticesinde ise beğenisi en düşük olan ekmek spontan fermentasyon ile hazırlanmış ekşi hamur katkılı tam buğday ekmeği olmuş (3.61), bu örneği ise Pichia membranifaciens+Lb. brevis kültür kombinasyonu ile hazırlanmış ekşi hamur katkılı ekmek örneği takip etmiştir. En çok beğenilen örnek ise S.cerevisiae+Weissella viridescens (S5) kültür kombinasyonu ile hazırlanmış ekşi hamur katkılı tam buğday ekmeği olmuştur. Ancak istatistiksel anlamda S1, S2, S3, S4, S6, S8 ve S9 kodlu ekmekler ile aralarında fark tespit edilmemiştir. S2 kodlu örneğin hem en düşük fitik asit içeriği sergilemesi hem de genel beğeni anlamında yüksek puanlar alması çalışma kapsamında Saccharomyces cerevisiae+Pediococcus pentosaceus kombinasyonunu ön plana çıkarmıştır. Ekmek örneklerinin temel bileşen analizi (PCA) sonucunda ilk iki temel bileşenin (TB1 ve TB2) toplam varyansın %65.25'lik kısmını temsil ettiği belirlenmiştir. Örnekler arasında ticari maya ile üretilmiş olan S11 kodlu tam buğday ekmeği ile spontan fermentasyon ile üretilen S10 kodlu örnek hem birbirinden hem de diğer kültür kombinasyonu ile üretilmiş örneklerden TB2 ile net bir şekilde farklılık göstermiş, kültür kombinasyonu ile üretilen diğer hamur örnekleri ise birbirleriyle olan yakın ilişkiden dolayı aynı küme içerisinde yer almışlardır. Saccharomyces yerine Pichia mayası kullanılarak üretilen S7 örneği ise diğer kültür kombinasyonu ile üretilmiş olan örneklerden de TB1 ile ayrılmış ve aynı küme içerisinde yer almamıştır. Sonuç olarak, uygun LAB ve maya suşları seçilerek üretilen ekşi hamur, tam buğday ekmeğinin fitik asit içeriğini düşürmede ve böylece ekmeğin biyoyararlılığının artırılmasında önemli bir rol alabilir.

Abstract:
In this study, the sourdough samples were collected from the different locations and lactic acid bacteria (LAB) and yeasts isolation from the samples were conducted and purified to determine their ability of phytic acid degradation. Then the phytase positive species were identified by FTIR and some molecular techniques and they were used as different culture combination in the whole wheat bread production to determine the effects on the final product in terms of physicochemical, nutritive, sensory and textural properties. For this purpose, LAB and yeast isolates were obtained from the sourdough samples collected from different locations. Phytase activities of the obtained isolates were determined in the phytate added medium and then extracellular phytase activity of phytase positive strains was determined spectrophotometrically. After that, the isolates were first identified by FTIR technique and subjected to clustering process, and a total of 8 LAB and 8 yeasts obtained by selecting an isolate representing each cluster in the generated family tree were subjected to genotyping characterization. Genotypically defined LAB and yeast strains were activated in suitable media and used in the production of sourdough which would be used in the production of whole wheat bread in different combinations. The produced breads were compared to whole wheat bread added with sourdough prepared by spontaneous fermentation and whole wheat bread added with only commercial yeast additives. In the study, LAB and yeast counts, pH and acidity were determined at the beginning and end of the fermentation (0. and 20 h) of sourdough samples. The elastic modulus (G'), viscous modulus (G''), complex modulus (G*) and complex viscosity (?*) as rheological properties, pH and titratable acidity of the whole wheat bread doughs prepared with these sourdough samples were characterized. pH, titratable acidity, bread crumb-crust color, specific volume, amount of phytic acid and degradation ratios, textural profile analysis (TPA) parameters, mineral composition (Ca, K, Mg, Fe, Zn) and sensory properties were determined in whole wheat bread samples. The extracellular phytase activity of phytase-positive isolates in solid medium was calculated as 703.1-1153.8 U/ml for LAB isolates, and these values were determined as 352.2-943.4 U/ml for yeast isolates. Two different yeast species (Saccharomyces cerevisiae, Pichia membranifaciens) and five different LAB species (Weissella viridescens, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus brevis, Lactobacillus parabuchneri) were identified on the basis of the clustering and subsequent genotyping identifications among the collected isolates. When these isolates were combined to produce sourdough culture, the LAB counts of the sourdough samples were determined at the range of 2.39-7.84 log cfu/g at the beginning of fermentation, while the LAB counts after the 20 h fermentation process were 8.03-8.37 log cfu/g. At the beginning of the fermentation process, the yeast numbers of the samples varied between 1.54-5.52 log cfu/g and after fermentation, the yeast count was determined to be 4.60-7.41 log cfu/g. pH values of sourdoughs were determined in the range of 3.96-5.07 depending on the change in acidity of the samples. pH and acidity values of whole wheat bread doughs prepared with these sourdoughs were determined in the range of 5.09-6.10 and 2.98-4.70 ml, respectively. The elastic modulus values of the dough samples were higher than those of the viscous modulus and viscoelastic dough properties were observed. The elastic and viscous modulus values of the samples increased while the complex viscosity values decreased with the increase of the frequency value applied to the doughs. The pH, acidity and specific volume values of whole wheat bread samples were detected in the range of 5.11-5.98, 2.98-5.70 ml and 1.3-2.25 ml/g, respectively. According to the results of bread crumb color, L* value was measured in the range of 48.13-58.97, a* value was in the range of 4.79-5.40 and b* value was measured in the range of 11.64-17.96, while the L* value was in the range of 44.27-59.39, a* value was found between 7.89-11.41 and b *value was found between 13.63-24.12 for the crust color of bread samples. The hardness values of breads were monitored in the range of 556.9-1607.6 g and the samples produced with spontaneous fermentation were found to be harder than breads made with culture added sourdoughs. In terms of phytic acid content, there are significant differences in the culture added breads compared to the control bread produced with commercial yeast and spontaneous fermentation. As a result of the degradation of phytic acid, greatest reduction (43.4%) was determined in bread samples containing S.cerevisiae+Pediococcus pentosaceus culture combination. The least phytic acid degradation was monitored in the breads produced with Pichia membranifaciens+Lb. brevis combination. Zinc (Zn), iron (Fe) magnesium (Mg) potassium (K) and calcium (Ca) contents of bread samples were evaluated in the range of 6.84-26.2, 26.14-39.03,178.9-644.5, 160-3335.9, 41.11-80.60 ?g/g, respectively. In the sensory analysis, the lowest rated breads were spontaneously fermented breads (3.61), and the breads produced with Pichia membranifaciens+Lb. brevis combination followed it. The highest rated samples were breads prepared by S. cerevisiae+Weissella viridescens (S5) culture combination. However, no statistically significant difference was found between breads coded as S1, S2, S3, S4, S6, S8, S9 and S5. Because of having the lowest phytic acid content and high scores in terms of general appreciation, S2 coded sample (S. cerevisiae+Pediococcus pentosaceus) highlighted in the study. It was determined that the first two major components (PC1 and PC2) of the bread samples represented 65.25% of the total variance as a result of the principal component analysis (PCA). Among the samples, S10 (produced with spontaneous fermentation) and S11 (produced by commercial yeast) were clearly differentiated with PC2 from each other and the samples produced by other culture combinations. While the other bread samples produced by the culture combinations were in the same cluster because of similar properties. S7 which was produced using Pichia yeast instead of Saccharomyces, was also separated by PC1 from the samples produced by other culture combinations and was not included in the same cluster. As a result, the sourdough produced by selecting the appropriate LAB and yeast strains may play an important role in reducing the phytic acid content of the whole wheat bread and thereby increasing the bioavailability of bread.