Termofilik kaynaklardan izole edilen bacıllus cinsi bakterilerin hekzavalent krom indirgemesi ve ekzopolisakkarit üretim potansiyellerinin belirlenmesi
Reduction of hexavalent chromium by bacillus bacteria isolated from thermophilic sources and determination of thei̇r exopolysaccaride production potential
Yazar: GÜLÜMSER ACAR DOĞANLI
Danışman: PROF. DR. NAZİME MERCAN DOĞAN
Pamukkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada Pamukkale Termal Bölgeden alınan su ve toprak örneklerinden kroma dirençli 10 adet suş izole edilmiştir. Bu izolatlar biyokimyasal test kiti olan API identifikasyon kiti ve 16S rRNA sekans analizi ile Bacillus sp. olarak tayin edilmiştir. 16S rRNA sekans analizine göre filogenetik ağaç, izolatların üç gruba ayrıldığını göstermiştir. İzole edilen bakterilerden 6 tanesi Bacillus licheniformis, 2 tanesi Lysinibacillus fusiformis, 2 tanesi Lysinibacillus sphericus olarak tanımlanmıştır. Seçilen iki bakterinin (B. licheniformis B22 ve L. fusiformis B26) Cr(VI) indirgeme ve ekzopolisakkarit üretim potansiyelleri araştırılmış ve hem krom indirgeme prosesinin hem de ekzopolisakkarit (EPS) üretiminin optimizasyonu için çeşitli faktörlerin etkileri çalışılmıştır. Bakteriyel Cr(VI) indirgemeye çeşitli faktörlerin etkisini belirlemek için doğal organik asitlerin (galaktronik asit, glukuronik asit, humik asit, aljinik asit, sitrik asit), başlangıç inokulasyon yüzdesinin (%2, %4, %6, %8), pH?ın (6,0-7,0-8,0-9,0-10,0), sıcaklığın (40, 45, 50 ºC) ve başlangıç Cr(VI) konsantrasyonunun (75, 100, 150 mg/l) etkileri araştırılmıştır. Galaktronik asit, glukuronik asit, humik asit, aljinik asit ve sitrik asit gibi organik asitlerin ilavesi bakteriyel krom indirgemeyi önemli derecede hızlandırmıştır. B. licheniformis B22 izolatının krom indirgemesini en fazla hızlandıran galaktronik asit, L. fusiformis B26 izolatının krom indirgemesini en fazla hızlandıran humik asit olmuştur. Organik asitlerin ayrıca ikili ve üçlü kombinasyonları da test edilmiştir. Organik asit kombinasyonları krom indirgeme oranında önemli bir artışa neden olmuştur. Her iki izolatın krom indirgemesi için optimum başlangıç inokulasyon oranı %8, pH?ı 7,0±0,2 olarak bulunmuştur. 50 ºC?de, 40 ve 45 ºC?ye göre bakteri hücrelerinin Cr(VI)?yı daha etkili bir şekilde indirgediği tespit edilmiştir. Bunun yanında ICP-MS analizleri bakteriyel Cr(VI) indirgemesinin çözünür Cr(III) son ürünlerinin oluşumuna neden olduğunu, Cr(III)?ün Cr(OH)3 olarak çökelmediğini göstermiştir. Ayrıca ölü hücreler tarafından Cr(VI)?nın biyosorpsiyonu da çalışılmıştır. B22?nin ölü hücreleri yaklaşık %4, B26?nın ölü hücreleri yaklaşık %5 kromu akümüle etme kapasitesine sahiptir. SEM görüntülerine bakıldığında ise B. licheniformis hücreleri?nin 100 mg/l Cr(VI)?ya maruz kaldıklarında şekillerinin bozulduğu görülmektedir. 
Cr(VI) indirgeme deneylerinin yanı sıra EPS saflaştırması ve karakterizasyonu yapılmış ve EPS üretiminin Cr(VI) ile ilişkisi belirlenmiştir. Hem B. licheniformis B22 hem de L. fusiformis B26 bakterilerinden ekstrakte edilen EPS?lerin monosakkarit kompozisyonu LC-MS ve HPLC analizleri ile belirlenmiştir. Analiz sonuçlarımız, EPS?lerin ramnoz, mannoz, galaktoz, glukoz, fruktoz, arabinoz ve ksiloz içerdiğini göstermiştir. Bunun yanında farklı doğal organik asitlerin (galaktronik asit, glukuronik asit, sitrik asit, aljinik asit ve humik asit), pH?ın (6.0, 7.0 and 8.0), sıcaklığın (40, 45 ve 50 ºC) ve Cr(VI) konsantrasyonunun (100 ve 150 mg/L) mikrobiyal EPS üretimi üzerine etkisi laboratuvar çalışmaları ile belirlenmiştir. Sonuçlarımız organik asitlerin EPS salınımını arttırdığını göstermiştir. Her iki bakteri için Aljinik asit EPS üretimini arttıran en etkili organik asittir. Optimum pH 6.0-7.0 olarak belirlenmiş ve en fazla EPS üretimi 50 ºC?de gözlenmiştir. Cr(VI)?nın hücreler üzerindeki toksik etkisinden dolayı, gelişme ortamında kromun artması EPS üretimini arttırmıştır. Maksimum EPS üretimi gelişme ortamına 150 mg/l Cr(VI) eklendiğinde gözlenmiştir. Yapılan bu çalışma ile mikrobiyal Cr(VI) remediasyon çalışmalarında kullanım potansiyeline sahip iki yeni Bacillus sp. izolatı belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, ten chromate-resistance strains were isolated from the soil and water samples taken from Pamukkale Thermal resources. The bacterial isolates were identified as Bacillus sp. by the API identification kit and 16S rRNA sequence analyze. Phylogenetic tree analyze indicated the isolates can be divided into three groups. Six of them were Bacillus licheniformis, two of them were Lysinibacillus fusiformis, and two of them were Lysinibacillus sphericus. Cr(VI) reduction and exopolysaccaride production potentials of selected two bacteria (B. licheniformis B22 and L. fusiformis B26) were investigated. For the optimization of both chromium reduction process and exopolysaccaride production, the effect of various factors was studied. In order to determine the effects of various factors on bacterial Cr(VI) reduction, the effects of natural organic acids (galacturonic acid, gulucuronic acid, humic acid, alginic acid, citric acid), initial inoculation rates (2%, 4%, 6%, 8%), pH (6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0), temperature (40, 45, 50 ºC) and initial Cr(VI) concentrations (75, 100, 150 mg/l) were investigated. Bacterial Cr(VI) reduction was enhanced significantly by addition of organic acids such as galacturonic acid, glucuronic acid, humic acid, alginic acid and citric acid. It is galacturonic acid that accelerates the chromium reduction of B. licheniformis B22 isolate most, and it is humic acid that accelerates the chromium reduction of L. fusiformis B26 isolate most. Organic acids were also tested in double and triple combinations. Combination of organic acid caused a dramatic increase in the rate of chromate reduction. It was found as the optimum initial inoculation rate was 8% and pH was 7,0±0,2 for Cr(VI) reduction of both isolate. It was determined the bacterial cells reduced Cr(VI) more efficiently at 50 ºC, compared with that at 40 and 45 ºC. Moreover, ICP-MS analysis revealed that the bacterial Cr(VI) reduction led to the production of soluble Cr(III) end products and not the precipitation of Cr(III) as Cr(OH)3. In addition, biosorption of Cr(VI) in dead cells was also determined. Dead cells of B22 and B26 strains had the capacity to accumulate nearly 4% and 5% respectively. B. licheniformis cells lost their shape and size after exposure to 100 mg/l as revealed from SEM examination. 
As well as chromium reduction experiment, it is also EPS purified and characterized and determined the relationship between Cr(VI) and EPS production. The monosaccharide composition of the EPS extracted from both B. licheniformis B22 and L. fusiformis B26 was determined by LC-MS and HPLC. Our analysis indicated that the EPSs consisted of rhamnose, mannose, galactose, glucose, fructose, arabinose and xylose. Additionally, laboratory batch experiments were performed characterize the effects of different natural organic acids (galacturonic acid, glucuronic acid, citric acid, alginic acid and humic acid), pH levels (6.0, 7.0 and 8.0), temperatures (40, 45 and 50 ºC) and Cr(VI) concentrations (100 and 150 mg/l) on microbial EPS production. Our results indicate that organic acids caused enhanced EPS release. Alginic acid was the most efficient organic acid at EPS production in both of the bacteria. The optimum pH level was 6.0-7.0 and the highest EPS production was observed at 50 ºC. In addition, EPS production increased with increased chromium in the growth medium due to the toxic effect of Cr(VI) on cells. Maximum EPS production was observed when 150 mg/l Cr(VI) was added to the medium. By this study, two new Bacillus strains were isolated having microbial Cr(VI) remediation potential.