Pichia pastoris'te rekombinant bakteriyel alfa amilaz üretimi
Production of recombinant bacterial alpha amylase in Pichia pastoris
Yazar: ŞEYDA GÜLLÜ
Danışman: PROF. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Endüstriyel amilazların en önemli ve sık kullanılan formlarından biri olan α-amilazlar; gıda, ilaç, tekstil, deterjan, biyoyakıt üretimi ve kirli suların arıtılması gibi birçok alanda tercih edilen bir biyokatalizördür. α-amilazlar (α-1,4-glukan-glukanohidrolaz, EC 3.2.1.1), nişasta molekülündeki α-(1,4)-glikozidik bağlarının iç kısımlarına etki ederek nişastanın hidrolizini katalizler. Bunun sonucunda α-amilazlar; glikoz, maltoz, maltotrioz ve α-limit dekstrin gibi; α-konformasyonuna sahip monomerleri ve farklı uzunluktaki polimerleri oluştururlar. α-amilazlar birçok bitki, hayvan, bakteri ve mantarda yaygın olarak bulunmaktadır. Ancak kullanım alanlarında duyulan ihtiyaca bağlı olarak; yüksek verimlilikte enzim üretimi ve endüstriyel koşullarda arzu edilen özelliklere sahip α-amilazların eldesi için rekombinant suşlar tercih edilmektedir. Pichia pastoris (Komagataella phaffii) rekombinant protein üretiminde sıklıkla kullanılan metilotrofik bir mayadır. P. pastoris birçok promotora sahip olmasına rağmen, etanol metabolizmasında sorumlu olan ADH2 (alkol dehidrogenaz) promotoru, yüksek ekspresyon seviyesi nedeniyle dikkat çekmektedir.
Bu çalışmada, Bacillus subtilis PY22 α-amilaz geni (AmyE); tam uzunluktaki ve olgun formunu kodlayan dizinin, sentetik ADH2 (ADH2SNT5) promotorunu içeren ekspresyon vektörüne ligasyonu gerçekleştirilmiş ve P. pastoris GS115 suşuna klonlanmıştır. Elde edilen klonlardan, gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonları (GT-PZR) analizi ile tek kopya olduğu belirlenen; P. pastoris GS115-pADH2SNT5α-α-Amilaz-Full Lenght (FL) ve P. pastoris GS115-pADH2SNT5α-α-Amilaz-Mature (MF) üretim klonları olarak seçilmiştir. FL ve MF klonları, engelli erlende, 96 saat boyunca etanol ile indüklenerek rekombinant protein üretimi gerçekleştirilmiştir. FL ve MF klonunun en yüksek α-amilaz aktiviteleri sırasıyla 74.2±0.94 U/ml ve 215±3.18 U/ml olarak hesaplanmıştır. FL ve MF klonlarının üretimi arasında yaklaşık 3 kat fark olması nedeni ile büyük ölçekli üretim için uygun olan klon MF klonu olarak seçilmiştir. 
MF klonu, 5 L hacimli biyoreaktörde, 28°C, pH 6.0 ve normoksik koşullarda (çözünür oksijen oranı %20), sabit µ (µ: 0.028 sa-1) stratejisine uygun şekilde etanol ile indüklenerek 90 saat süresince α-amilaz üretimi gerçekleştirilmiştir. MF klonunun büyük ölçekli üretimi sonucunda α-amilaz enzimi zamana bağlı olarak artış göstermiş ve en yüksek α-amilaz aktivitesi 90. saatte 2219±52.18 U/ml (1403 U/mg) olarak hesaplanmıştır. Engelli erlen ile biyoreaktör üretimi karşılaştırıldığında α-amilaz enziminin yaklaşık 10 kat arttığı gözlenmiştir. 
Rekombinant α-amilaz enziminin karakterizasyonu gerçekleştirilmiş ve SDS-PAGE analizi sonucu proteinin moleküler ağırlığının yaklaşık 80 kDa boyutlarında olduğu saptanmıştır. Enzimin optimum çalışma koşulları 60°C sıcaklık ve pH 7.0 olarak belirlenmiştir. α-amilazın, 1 saat süresince farklı sıcaklıklarda inkübe edilmesi sonucunda, 50°C'de %81 ve 60°C'de %65 aktivitenin korunduğu tespit edilmiştir. Enzim aktivitesi 1 saat sonunda pH 6.0-7.5 değerleri arasında %80'nin üzerinde stabil kalmıştır. 10 mM konsantrasyonundaki Ca2+ ve Mg2+ iyonları enzim aktivitesini artırırken, aynı konsantrasyondaki Fe2+, Zn2+ ve Cu2+ iyonları aktiviteyi düşürmüştür.
Bu çalışma sonucunda, rekombinant bakteriyel kaynaklı α-amilaz enziminin, P. pastoris ekspresyon sisteminde güçlü ve alternatif olarak kullanılabilecek ADH2 promotorunun kontrolünde, büyük ölçekli üretimde, başarıyla ifade edildiği saptanmıştır.

Abstract:
α-amylase which is one of the most important and commonly used forms of industrial amylases, is a biocatalyst preferred in many fields such as food, pharmaceutical, textile, detergent, biofuel production and treatment of contaminated water. α-amylases (α-1,4-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.1), catalyze the hydrolysis of starch by acting on the inner parts of α-(1,4)-glucosidic bonds in the starch molecule. As a result, α-amylases create of monomers and polymers of different lengths with α-conformation such as glucose, maltose, maltotriose and α-limit dextrins. α-amylases are commonly found in many plants, animals, bacteria and fungi. However, depending on the need in applications, recombinant strains are preferred for the production of high efficiency enzymes and to obtained of α-amylases having desirable properties in industrial conditions. Pichia pastoris (Komagataella phaffii) is a methylotrophilic yeast which is used in commonly recombinant protein production. Despite P. pastoris has several promotors, ADH2 (alcohol dehydrogenase) promoter which is responsible for ethanol metabolism is remarkable because of high expression level.
In this study, Bacillus subtilis PY22 α-amylase gene (AmyE); the sequence encoding the full-length and mature form was ligated into the expression vector containing the synthetic ADH2 (ADH2SNT5) promoter and was cloned to P. pastoris GS115 strain. The obtained clones were selected P. pastoris GS115-pADH2SNT5α-α-Amylase-Full Lenght (FL) and P. pastoris GS115-pADH2SNT5α-α-Amylase-Mature (MF) production clones which were determined single copy by Real-Time Polymerase Chain Reactions (RT-PCR) analysis. This clones (FL and MF) were produced recombinant protein by inducing with ethanol during 96 hours in shake flasks. The highest α-amylase activities of FL clone and MF clone are 74.2±0.94 U/ml and 215±3.18 U/ml, respectively. Due to approximately 3-fold difference between the production of FL and MF clones, the MF clone was chosen for large scale production.
 The MF clone was induced with ethanol according to the constant µ (µ: 0.028    sa-1) strategy, at 28°C, pH 6.0 and normoxic conditions (dissolved oxygen %20), in 5 L volume bioreactor and α-amylase production was carried out during 90 hours. As a result of the large scale production of MF clone, α-amylase enzyme was increased in time and the highest α-amylase activity (90th hour) was calculated 2219±52.18 U/ml (1403 U/mg). When the production of bioreactor and shake flask were compared, it was observed that α-amylase enzyme increased approximately 10 times.
The characterization of the recombinant α-amylase enzyme was carried out and according to SDS-PAGE analysis, the molecular weight of the protein was detected approximately 80 kDa. The optimum working conditions of the enzyme were determined temperature of 60°C and pH 7.0. Consequently, incubation of the α-amylase at different temperatures for a hour, it was found that 80% and 65% activity was maintained at 50°C and 60°C, respectively. The enzyme activity was stable above 80% at pH 6.0-7.5 during a hour. The α-amylase activity was increased by Ca2+ and Mg2+ ions at 10 mM concentration but it was decreased by Fe2+, Zn2+ and Cu2+ ions at the same concentration.
As a result of this study, it was observed that recombinant bacterial α-amylase enzyme was successfully expressed in large scale production under the control of ADH2 promoter, which is strong and can used as alternative in P. pastoris expression system.