PMA/kantitatif real-time PCR kullanarak biyosidal ürünlerin mikobakterisidal etkinliğinin saptanmasında hızlı bir yöntem
A rapid method for determination of mycobactericidal effects of biocidal products using PMA / quantitative real-time PCR method
Yazar: ECE HALAT
Danışman: PROF. DR. GÜVEN ÖZDEMİR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu tez çalışmasında dezenfektanların mikobakterisidal etkinliklerinin tespit edilmesi için klasik kültürel yöntemlere dayanan, test süresi 1 aydan uzun zaman alan EN metotlarına (European Standards) alternatif olacak, bu metotlarda ortaya çıkan zaman kayıplarını, kontaminasyon riski ve diğer zorlukları ortadan kaldıracak hızlı ve güvenilir bir metodun geliştirilmesi amaçlanmıştır. 
Bu çalışmada, dezenfektanların mikobakterisidal etkinliklerinin belirlenmesinde kullanılan klasik kültürel yöntemlerin yerine hızlı ve güvenilir bir moleküler metot olan PMA/Real time PCR metodunun geliştirilmesi amacıyla 6 farklı dezenfektan aktif maddesinin M.terrae ve M.avium bakterileri üzerine etkinlikleri test edilmiştir. Mikobakterilerden DNA izolasyonunda farklı kit prosedürleri ve manuel prosedür kullanılmış ve High Pure PCR Template Preparation  kitiyle (Roche) uygulanan prosedürün uygulanan diğer prosedürlere göre daha yüksek geri kazanıma, tekrarlanabilirliğe ve saflığa sahip olduğu ve her tespit edilmiştir. Isıl işlemle yapılan PMA optimizasyon çalışmalarında 6 Ct'lik fark sağlanmış olup, sıcaklığın Mycobacterium türlerinin membran yapısının bütünlüğünü bozmada, kimyasal ajanlar kadar etkili olmadığı gözlenmiştir.  Kültürel metot ve moleküler metot ile yapılan paralel çalışmalarda en uyumlu sonuçlar ise izopropil alkol ve ortofitalaldehit etken maddeleri ile alınmış olup, PHMB(polihekzametilen biguanid), glutaraldehit, aktif klor ve perasetik asitte her iki organizma için de anlamlı sonuçlar elde edilememiştir.

Abstract:
In this thesis study, it was aimed to develop a rapid and reliable method for determining the mycobactericidal efficacy of disinfectants, which will be an alternative to EN methods (European Standards) based on classical cultural methods and exceeds 1 month period.
In this study, the effectiveness of 6 different disinfectant active agents on M.terrae and M.avium bacteria were tested in order to develop a fast and reliable molecular method instead of classical methods used to determine mycobactericidal efficacy of disinfectants. Different kit and manual procedures were used to isolate DNA from mycobacteria, and it was determined that the procedure with High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche) had higher recovery, reproducibility and purity than other procedures. PMA optimization studies performed by heat treatment showed a difference of 6 Ct and it was observed that the high temperatures were not as effective as chemical agents in disrupting the integrity of the membrane structure of Mycobacterium species. In parallel studies with cultural method and molecular method, the most compatible results were obtained with isopropyl alcohol and orthophitalaldehyde active substances and no significant results were obtained for both organisms with PHMB (polyhexamethylene biguanide), glutaraldehyde, active chlorine and peracetic acid.