Aspartam ve Swi6 İlişkisinin Schizosaccharomyces pombe'de İncelenmesi
Investigation of the Relationship between Aspartame and Swi6 in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: BESTE BAYRAK
Danışman: DOÇ. DR. BEDİA PALABIYIK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Enerji metabolizması = Energy metabolism ; Gıda katkı maddeleri = Food additives ; Maya hücreleri = Yeast cells ; Mikrobiyolojik analiz = Microbiological analysis ; Moleküler biyoloji = Molecular biology

Özet:
Aspartam (APM) dünya çapında 1981'den beri ilaçlar da dahil olmak üzere birçok üründe yaygın olarak kullanılan ve besin değeri olmayan birinci kuşak bir yapay tatlandırıcıdır. Her ne kadar FDA tarafından onaylı bir madde olsa da yapılan medikal çalışmalarda lenfoma ve lösemiye sebep olduğu tespit edilmiştir. Moleküler çalışmalarda ise TP53 tümör baskılayıcı geninin ve c-Myc ve Ha-ras onkogenlerinin ekspresyonlarında artış yarattığı; metabolize edilmesi sonucu oluşturacağı formaldehitin DNA-DNA ve DNA-protein kovalent bağlantılarına, kardeş kromatid değişimine yol açabileceği kanıtlanmıştır. Bulunan bu sonuçlar ile aspartamın kanserojenik etkileri teyit edilmiştir.
Çalışmada, bu etkileri ortaya çıkaran moleküler mekanizmaların hücre işleyişi memelilere benzeyen ancak daha basit yapılı bir model organizma olan Schizosaccharomyces pombe'de incelenmesi amaçlanmış, inceleme için insan HP1 ailesi ortologu olan swi6 geni seçilmiştir. Swi6 telomer, sentromer ve eşleşme tipi lokuslarında heterokromatin yapının düzenlenmesini sağlayan bir proteindir. Öte yandan, HP1 proteininin ise çeşitli kanser tiplerinde gen anlatımının düştüğü belirlenmiştir. Histon etkileşimi ile kromatin yeniden düzenleme, Cdc18 etkileşimi ile hücre döngüsü, kohezin etkileşimi ile mitoz gibi süreçlerle ilişkili olması Swi6'nın da kanser veya apoptoz yolağında rol üstlenebilmesini olası hale getirmektedir.
Aspartamın kanserojenik etkilerinin Swi6 ile ilişkili olup olmadığı hipotezini test etmek için S. pombe parental ve swi6Δ ırkları; hücre canlılığı, hücre içi oksidasyon, glukoz tüketimi, nukleus DAPI boyama ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) gibi analizlere tabii tutuldu. Buna göre 1 mg/mL APM'nin her iki ırk için de canlılık ile glukoz tüketimine etki etmediği ve reaktif oksijen türleri (ROT) oluşumuna yol açmadığı belirlendi. Mikroskopik incelemeler sonucu ise APM'nin nuklear fragmentasyonu tetiklemezken hücre boyutunu arttırdığı saptandı. Ayrıca swi6Δ ırkı parentali ile kıyaslandığında üreme ile glukozu tüketme hızının yavaş olduğu, hücre içi ROT bulundurduğu ve hücre boyutunun uzun olduğu tespit edildi. Hücre boyutu farklılığı APM ile Swi6 arasındaki istatistiki ilişki analizinde de anlamlı bulundu. GZ-PZR verilerine göre ise parentalde swi6 anlatımının düştüğü ve APM etkisine bağlı olarak parental ile swi6Δ arasında fbp1, hxk2, tup11, sod1 ve ctt1 genleri için anlamlı bir fark olduğu saptandı.
Bulgular bir araya getirildiğinde, S. pombe parental ırkın stres yolağını aktifleştirerek APM etkisine adapte olduğu ve swi6Δ'nın anlamlı bir yanıt oluşturmadığı görüldü. Böylece APM ile Swi6 arasında bir ilişki olduğu ve APM'nin etkisini Swi6 üzerinden gerçekleştirebileceği önerildi. Fakat bu etkiler swi6Δ ırkının fenotipi ile karşılaştırıldığında zayıf kaldığından aspartamın kanser oluşumunda yeterli bir ajan olmadığı anlaşıldı.

Abstract:
Aspartame (APM) is a non-nutritive first generation artificial sweetener used widely in many products including pharmaceuticals since 1981. Although it is a substance that is approved by FDA, previous medical studies have shown that it induces lymphomas and leukaemias. Molecular studies have found that it alters the expression of tumor suppressor gene TP53 and oncogenes c-Myc and Ha-ras; the formaldehyde it metabolizes to, forms DNA-DNA and DNA-protein crosslinks and sister chromatid exchanges. With these results, it has been confirmed that aspartame is a carcinogenic substance.
In this research, our aim is to reveal molecular mechanisms of such effects in a simpler model organism Schizosaccharomyces pombe which has similar cellular processes with mammals. For the evaluation, human HP1 (heterochromatin protein 1) family ortholog of Swi6 is selected. Swi6 is a telomere, centromere, and mating-type locus binding protein for the regulation of heterochromatin structure. On the other hand, it has been found that HP1 gene expression decreases in several cancer types. Since Swi6 interacts with cell cycle through Cdc18, mitosis through cohesin, and chromatin remodeling through histones, it is possible that Swi6 also plays a key role in cancer or apoptosis.
To verify if the carcinogenic effects of APM is related to Swi6; S. pombe parental and swi6Δ strains were analyzed with cell viability, intracellular oxidation, glucose consumption, nucleus DAPI staining and real time polimerase chain reaction (qRT-PCR) methods. According to the results, 1 mg/mL APM did not affect viability or glucose consumption and did not cause reactive oxygen species (ROS) production for both strains. But microscopic examinations showed that while APM did not induce nuclear fragmentation, cell size of the parental strain was increased. Additionally, when swi6Δ was compared with parental strain, slower rate of growth and glucose consumption, presence of intracellular ROS and cell size elongation were detected. Cell size difference was also found significant in the statistical interaction analysis of Swi6 and APM. Furthermore, qRT-PCR data showed a decrease in the expression of swi6 in parental and expression differences between parental and swi6Δ in fbp1, hxk2, tup11, sod1 and ctt1 genes were found significant, depending on the effect of APM.
Taken together, it has been seen that S. pombe parental strain has adapted to APM effects by activating the stress response pathway and swi6Δ did not present a meaningful response. Thus, we proposed that there is a relationship between APM and Swi6, and that APM may be carrying out its effects through Swi6. Nevertheless, it is understood that aspartame is not an efficient agent for carcinogenesis, since its effects are weak when compared with swi6Δ phenotype.