Farklı lösemi tiplerinde nükleer manyetik rezonans tabanlı metabolomik profilleme
Nuclear magnetic resonance based metabolomic profiling in different types of leukemia
Yazar: AYŞE ZEHRA GÜL
Danışman: PROF. DR. ŞAHABETTİN SELEK
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Lösemi, çocukluk çağında %30'luk oran ile en sık görülen kanser türü olup, tüm kanserler içerisinde 3.2%' lik oranı kapsamaktadır. Lenfomalar ise orijin aldığı doku açısından lösemi ile ayrışmakla beraber ortak semptomlar gösterebilmektedir. Hastalık gelişiminde temelde beyaz kan hücrelerinin kemik iliği/ lenfoid organlardaki maturasyon bozukluğu yer almaktadır. Literatürde lösemi ve lenfomada metabolik profilleme çalışmaları mevcut olup, belirlenen biyobelirteç adayı metabolitlerin erken tanı, prognoz, tedaviye cevapta kullanılabilirliği tartışılmaktadır. Yüzlerce metaboliti kapsayan metabolomiks çalışmalarında çok yönlü istatistiksel modelleme kullanılarak bu aday belirteçlerin ilişkili olduğu yolaklar belirlenebilmekte, kişiselleştirilmiş tedaviler için değerli bilgiler sunulabilmektedir. Bunu mümkün kılan analitik kimya tekniklerinden ve metabolomiksin en önemli enstrümanlarından nükleer manyetik rezonans (NMR) ile kütle spektrometresi (MS), birbirini tamamlayıcı şekilde farklı moleküllerin ölçümünde başarılıdır ve entegre analizlerde analit spektrumun tamamına yakınını kapsamaktadır. NMR; yüksek tekrarlanabilirlik, tek internal standartla yüzlerce metabolit kantitasyonuna olanak vermesi, uzun stabilite, kalibrasyon gerektirmemesi gibi avantajlarıyla son yıllarda metabolomikste artan sıklıkta kullanılmaktadır. Öte yandan rutin kullanımı oturmuş MS ise yüksek sensitivitesi ve proteomik-lipidomik moleküllerin başarılı tespiti ile pratik kullanımda halen en ön sırada yer almaktadır. Güncel tez çalışması, sık görülen lösemi/ lenfoma tiplerini kapsayacak şekilde bütüncül yaklaşımla kantitatif NMR ve kalitatif MS metodlarını entegre eden bir çalışma düzeni içerisinde gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla her bir grupta (AML, KLL, NHL) yer alan 30 yetişkin hastaya ait serum ile lökosit izolatlarında bir ve iki boyutlu 1H NMR ile yüksek-rezolüsyonlu MS (HR-MS) analizleri tamamlandıktan sonra diferansiyel metabolitler ile ilgili metabolik yolaklar tek değişkenli-çok değişkenli istatistiksel metotlarla MetaboAnalyst ve TidyMass çevrimiçi platformlarında belirlenmiştir. 1D deneylerde kimliklendirilen metabolitler, 2D NMR analizleri ile doğrulanmıştır. Lökosit izolatları ise HRMS platformunda serum örnekleri ile eşit koşullar altında çalışılarak bu matrikste kontrollere kıyasla anlamlı eksprese edilen metabolitler belirlenmiştir (TidyMass). Serum NMR analizlerinde ortaya konan bulgulara göre; AML grubunda kontrol bireylere kıyasla artış gösteren metabolitler (VIP skoru> 1) metilguanidin, izobütirat, glisin, 2-hidroksiizobütirat, glukoz, üre, betain ve azalanlar (VIP skoru> 2) piroglutamat, 3-hidroksiizovalerat, alanin olarak kaydedilmiştir. KLL grubunda artan metabolitler içerisinde AML ile ortak bulunanlar haricinde kreatinin-kreatin fosfat, tirozin ve fosfoetanolamin molekülleri de yer almaktadır. Burada her üç grupta da artan moleküllerin protein degredasyon ürünü olmaları, hematolojik malignitelerde gözlenen hızlı protein turnoverını doğrulamaktadır. VIP skoru 2.5' ten büyük bulunan fumarat ve asetat moleküllerinin azalışı da KLL ve NHL gruplarında ortak öne çıkan farklılıklar olarak Krebs siklusu ara bileşenlerinin prolifere olan lökoblastlarda yoğun tüketimine işaret etmektedir. Ayrıca NHL grubuna özgü bir farklılık olarak düşük bulunan serum karnitin seviyesi (VIP skoru> 1), lenfoma hastalarında artan enerji ihtiyacının beta oksidasyon artışı ile kompanse edildiğini düşündürmektedir. Serum NMR sonuçlarını kapsayan alıcı özelliği (ROC) analizi ile AML için 10, KLL için 3 ve NHL için 20 en anlamlı metabolit ile eğri altı alanı>  0.98 olan tanısal biyobelirteç modelleri oluşturulmuştur. Grup bazlı değişim gösteren yolak analizlerinde glutatyon, glukojenik ile dallı zincirli amino asit metabolizması ve kolin oksidasyonu AML' de birinci sıradayken; KLL ve NHL gruplarında ise Krebs ve üre siklusu öne çıkmaktadır. Serum HRMS sonuçlarında ise yüksek sensitif metodoloji yardımıyla çeşitli polar lipitler (yağ asitleri ve fosfolipitler) tanımlanarak özellikle AML grubunda anlamlı artan doymamış yağ asitleri dokozatrienoik ve cis-13-dokozenoik asit (p=0.002 ve 0.003, sırasıyla, Tidymass) olarak kaydedilmiştir. Serum HRMS sonuçlarına göre KLL grubunda anlamlı bulunan oleamid artan ve gliserofosfokolin ile piroglutamat ise NMR sonuçlarını doğrulayan şekilde düşük seviyelerde bulunmuştur (p=0.001 ve 0.000, sırasıyla, Tidymass).  Öte yandan NHL serum HRMS bulguları artan doymamış yağ asitleri açısından AML ve oleamid açısından KLL ile; azalan piroglutamat seviyeleri açısından ise KLL ile benzerlik göstermektedir. Lökosit izolatlarında gerçekleştirilen HRMS analizlerinde ise seruma göre daha az sayıda anlamlı metabolit tanımlanmış olup; spermin ve uzun zincirli yağ asitlerinin (serumda sonuçlarını destekleyen biçimde) artan, biyotin gibi koenzimlerin ise düşük seviyeleri her üç grupta da ortak olarak kaydedilmiştir. Sonuç olarak güncel çalışmada, lösemi/ lenfoma hastalarında NMR ve MS metodolojilerinin komplementer kullanımı ile oldukça geniş metabolit spektrumu içeren serum-lökosit matriks profillemesi gerçekleştirilmiştir. Literatürde bir ilk olarak, farklı hematolojik malignitelerde serum metabonomu kantitatif yaklaşımla belirlenmiş ve HR-MS teknolojisi ile yapılan global tarama ile entegrasyon sağlanarak geniş kapsamlı parametre araştırması yapılmıştır. Bir diğer yenilik ise, global serum araştırması yanı sıra lökosit izolatlarında MS analizi ile hücresel düzeyde anlık metabolik profilleme ile bireysel etyolojilere dair önemli veriler sunulmasıdır. Grup bazlı değişiklikleri ortaya çıkaran mevcut bulgular bireysel itici güçlerin yanı sıra farklı alt sınıflarda yaygın olarak gözlemlenen patojenik mekanizmalar hakkında da ipuçları sağlamaktadır. Tüm bunlarla birlikte sunulan güncel sonuçların, her grup için oluşturulacak geniş kohort ve omiks teknolojilerinden gelen tamamlayıcı veriler ile doğrulanması gerekmektedir.

Abstract:
Leukemia is the most common cancer in childhood with a frequency of %30 and has a 3.2% incidence among all new cancer cases. Lymphoma in other respects differs in tissue origin but may manifest with similar symptoms to leukemia. Disease pathogenesis involves impairments that may belong to any maturation step of white blood cells in bone marrow/ lymphoid organs. Metabolomics literature harbors various works investigating whether defined biomarker molecules would be valuable for early diagnosis-prognosis or monitoring treatment response in leukemia/ lymphoma patients. In fact, these studies covering hundreds of metabolites offer great opportunities for identifying affected pathways related to the biomarkers and submit valuable information for individualized therapy options via multivariate statistical analysis. Nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry (MS) constitute the two elemental instruments of metabolomics that precede each other in the measurement of different molecules because of their innate characteristics and so studies combining the two methods may cover the whole metabolite spectrum. NMR has several advantages as having high reproducibility, allowing real-time quantitation with only one internal standard for each run, long stability, and not requiring frequent calibration procedures. However, MS has still wider applications in the field with its high sensitivity allowing the detection of low-abundance molecules in mixtures, and being able to define a proteomic-lipidomic profile with high accuracy makes it the first choice in routine laboratories. The current dissertation study was designed to integrate the two methods of analyzing common types of leukemia and lymphoma with a global metabolomic profiling approach. In detail, serum and leukocyte isolate samples of acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, and non-Hodgkin's lymphoma patients (30  participant for each) were investigated on 1D, 2D 1H NMR and high-resolution MS platforms. For the metabolic profiling, quantitative 1H NMR (qNMR) and untargeted HR-MS methods were applied, and data were analyzed with univariate-multivariate statistics to identify differential metabolites and pathways (MetaboAnalyst, Tidymass). Metabolites identified in 1D experiments were confirmed by 2D NMR analyses. Leukocyte isolates were studied on the HRMS platform under equal conditions with serum samples, and metabolites that were significantly expressed compared to controls were determined (TidyMass). According to the serum NMR analysis; metabolites increased in the AML group compared to controls (VIP score > 1) were recorded as methylguanidine, isobutyrate, glycine, 2-hydroxyisobutyrate, glucose, urea, betaine, and those that decreased (VIP score > 2) were pyroglutamate, 3-hydroxyisovalerate, alanine. The metabolites increased in the CLL group (apart from common ones with AML) included creatinine-creatine phosphate, tyrosine and phosphoethanolamine molecules. The fact that the molecules increased in all groups are protein degradation products confirms the rapid protein turnover observed in hematological malignancies. The decrease in fumarate and acetate molecules with a VIP score greater than 2.5 also indicates the intense consumption of Krebs cycle intermediate components in proliferating leukoblasts, as common differences in the CLL and NHL groups. In addition, the low serum carnitine level (VIP score > 1), which is a specific difference in the NHL group, suggests that the increased energy need in lymphoma patients is compensated by an increase in beta oxidation. The receiver operating characteristic (ROC) analyzes including serum NMR results showed area under the curve values greater than 0.98 for diagnostic biomarker models with 10 top metabolites for AML, 3 for CLL, and 20 for NHL. In pathway analyzes showing group-based variation; glutathione, glucogenic/ branched-chain amino acid metabolism and choline oxidation ranked first in AML while Krebs and urea cycle were prominent in the CLL and NHL groups. According to the serum HRMS results, distinct polar lipids (fatty acids and phospholipids) were identified with the help of highly sensitive methodology, and the unsaturated fatty acids that increased significantly in the AML group were recorded as docosatrienoic with cis-13-docozenoic acid (p=0.002 and 0.003, respectively, Tidymass). Serum HRMS results also revealed that oleamide was significantly increased in the CLL group, and glycerophosphocholine and pyroglutamate were found to be at low levels, confirming the NMR results (p = 0.001 and 0.000, respectively, Tidymass). NHL serum HRMS findings were similar to AML in terms of increased unsaturated fatty acids and to CLL in terms of oleamide while decreased pyroglutamate levels were observed as CLL. In HRMS analyzes performed on leukocyte isolates, fewer significant metabolites were identified compared to serum as increased levels of spermine and long-chain fatty acids (supporting the serum results) with low levels of coenzymes such as biotin that were common in all groups. In conclusion, complementary use of NMR-MS methodologies expanding the metabolite spectrum in both matrixes allowed comprehensive profiling of leukemia patients. The current findings eliciting group-based changes provide essential tips about pathogenetic mechanisms commonly observed in distinct subclasses along with individual driving forces. In the perspective of personalized medicine, identifying custom targets and monitoring aberrant changes in affected individuals is of great importance and could only be possible by virtue of using strengths of metabolomics tools as NMR and MS. Hence, this work also contributed to the future construction of a workflow for hematological malignancy inspection to be used in routine hospital laboratories in the metabolomics boom era. Yet, emerging results need to be validated with wider cohorts and omics information for each patient within the frame of personalized medicine approach.