Ketaminin ve memantinin tedavi edici etkinliği üzerinde TRPV1 kanallarına etkisinin hücre kültür ortamında incelenmesi
Study of TRVPV-1 channels' influence on the therapeutic effect of the drugs ketamine and memantine, using cell culture
Yazar: FATMA KAPLAN BAŞAL
Danışman: DOÇ. DR. İNCİ MELTEM ATAY
Süleyman Demirel Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Ruh Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Psikiyatri = Psychiatry
Dizin: Antidepresif ajanlar = Antidepressive agents ; Aspartik asit = Aspartic acid ; Depresif bozukluk = Depressive disorder ; Depresyon = Depression ; Hücre kültürü = Cell culture ; Ketamin = Ketamine ; Memantine = Memantine

Özet:
Amaç:  Major depresyon; yineleme ve kronikleşme oranı yüksek olan, fiziksel, ruhsal, sosyal ve mesleki yeti yitimine neden olan önemli bir sağlık sorunudur. Günümüzde kullanılan antidepresanlarla hastaların ancak %30-40'ının tam olarak iyileştiği, %60-70'inin depresif belirtilerinin devam ettiği, hatta bu hastaların %10-15'inin tamamen tedaviye yanıtsız kaldığı görülmüştür. Bunun önemli nedenlerinden biri, depresyon etiyolojisinin tam olarak aydınlatılmamış olmasıdır.
TRPV1 kanalları son 20-30 yıl içinde keşfedilmiştir. Yakın zamanda yapılan çalışmalarda birçok nörolojik ve psikiyatrik hastalığın etiyolojisinde bu kanalların rol oynadığı gösterilmesine rağmen; TRPV1 kanalları ile depresyon arasındaki ilişkiyi araştıran çalışmalar kısıtlı sayıdadır. Ketamin uzun süredir kullanılan disosisiatif anestezik bir ajandır. Son zamanlarda depresyonda hızlı ve kısa süreli antidepresan ve antisuisidal etkinliği gösterilmiştir. Bu etki tek doz uygulamayla saatler içinde başlamakta birkaç gün ile hafta arasında sona ermektedir. Ketaminin antidepresan etkinliğinin moleküler mekanizması henüz aydınlatılamamıştır. Memantin Alzhemier Hastalığında kullanılan nörorotektif bir ajandır. 
Ketaminin ve memantinin ikisi de NMDA reseptörlerini antagonize etmelerine rağmen klinik etkileri arasında belirgin farklar vardır. Bu farkın sebebinin moleküler düzeyde gösterilmesi ketaminin etkisinin neden kısa süreli olduğunu açıklayabilir. Bu çalışmanın amacı ketaminin TRPV1 kanalları üzerinde duyarlılık artışı veya azaltıcı etkisinin olası hızlı ve geçici antidepresan etkisiyle ilişkisinin gösterilmesidir.
Materyal-Metod: Bu çalışmada, hücre hattı olarak glioblastoma hücreleri kullanılmıştır. Hücreler kontrol (n=6), ketamin (n=6), ketamin+CAPZ(n=6), ketamin+ MK-801 (n=6), ketamin+CAPZ+MK-801 (n=6), memantin (n=6), memantin+CAPZ (n=6), memantin+MK-801(n=6), memantin+CAPZ+MK-801(n=6) olmak üzere 9 gruba ayrılmıştır ve kontrol grubu hariç her grup 3'e bölünüp ketaminli gruplar 24 saat, 48 saat ve 72 saat 0,01mM ketamin ile memantinli gruplar 0,01mM memantin ile inkübe edildikten sonra Path-Clamp, hücre içi kalsiyum, hücre içi ROT, apopitoz, kaspaz3 ve kaspaz 9, hücre canlılığı (MTT) analizleri yapılmıştır. İstatiksel analizlerde Mann Whitney U Testi kullanılmış p<0.05 anlamlı kabul edilmiştir.
Bulgular: Analizler sonucunda ketaminin 24. saatte kapsaisin ile stimüle edilmiş TRPV1 kanalıyla  hücre içine geçen  kalsiyum düzeyini kontrole kıysala azalttığı (p<0.001), 48. Saatte 24.saate kıyasla arttırdığı (p<0.001), 72. saatte 48.saate kıyasla azalttığı (p<0.001)  bulunmuştur. Memantinin ise hücre içi serbest kalsiyumu kontrole kıyasla azalttğı (p<0.001) fakat bu etkide zamanla anlamlı bir değişiklik olmadığı saptanmıştır. Ayrıca ketaminin hücre içi ROT, kaspaz 3, kaspaz 9,  mitokondriyal membran depolarizasyonuna etkisinin hücre içi kalsiyum düzeylerine paralel şekilde değiştiği saptanmıştır. Apopitoz ve hücre canlılığı üzerinde anlamlı etki görülmemiştir.
Sonuç: Bu çalışma sonucunda, memantinin ve ketaminin TRPV1 kanalları aracılığıyla sitozole Ca+2 girişini etkilediği; memantinin sitozole kalsiyum girişini zamanla değişmeyen şekilde azalttığı; ketaminin hücre içi kalsiyum, hücre içi ROT ve kaspas3, 9 seviyelerine etkisinin zaman içinde değişkenlik gösterdiği ve bu etkinin ketaminin hızlı ve geçici antidepresan etkinliğinin olası nedenlerinden biri olabileceği düşünülmüştür. Bu nedenle, depresyonda TRPV1 aracılı Ca+2 girişinin daha ileri çalışmalarla araştırılması ve buna yönelik ilaç geliştirilmesinin hızlı antidepresan etkinlikte önemli olduğu gözükmektedir. 

Anahtar Kelimeler: Ketamin, memantin, depresyon, TRPV1 kanalları, Hücre 
           Kültürü

Abstract:
Aim: Major depressive disorder is a recurrent disease with high chronicity, causing physical, mental, social and occupational disability. Studies have shown that only 30-40% of patients recover fully, in 60-70% of them depressive symptoms continue, and in 10-15% of these patients remain disease persists even with treatment. One of the important reasons for this is that the etiology of depression is not fully understood.
TRP channels have been discovered in the last 20-30 years. Although recent studies have shown that these channels play a role in the etiology of many neurological and psychiatric disorders, studies investigating the relationship between TRPV1 channels and depression are limited. Ketamine is a long-lasting dissociative anesthetic agent. Recently, rapid and short-term antidepressant and antisuicidal efficacy have been demonstrated in depression and treatment-resistant depression. This effect lasts for several days to weeks when starting within a few hours with a single dose application. And the underlying molecular mechanism of this effect has not yet been elucidated.  
Although both ketamine and memantine antagonize the NMDA receptors, there are significant differences between clinical effects. Showing the molecular level of the cause of this difference reveals the effect of ketamine. The aim of this study is to demonstrate that ketamine is associated with a rapid or transient antidepressant effect on the susceptibility-enhancing or reducing interaction on TRPV1 channels.
Materials and Methods: In this study, glioblastoma cells were used for cell lines. The cells were divided into 9 groups; control (n=6), ketamine (n=6), ketamine + MK-801 (n = 6), ketamine + CAPZ + MK-801 (n = 6), memantine (n = 6), memantine + CAPZ (n = 6), memantine + MK-801 (n = 6) and memantine + CAPZ + MK-801. Cells were incubated with memantine (0.01 mM) and ketamine (0.01 mM) during for 24 hours, 48 hours and 72 hours, except control group. After incubation, Patch-Clamp, intracellular calcium, intracellular ROT, apoptosis, caspase 3 and caspase 9 and MTT analyses were obtained. Mann-Whitney U test was used for statistical analysis and significance was considered at p < 0.05.
Results: According to these analyses, ketamine decreased capsaicin-stimulated intracellular calcium levels via TRPV1 channel at 24th hour (p <0.001) compared to control, at 48th hour (p <0.001) increased compared to 24th hour (p<0.001), at 72th hour, decreased compared to 48th hour (p<0.001). Memantine reduced intracellular free calcium compared to control (p <0.001), but this effect was not found to change significantly over time. It was also found that the effect of ketamine on intracellular ROT, caspase 3, caspase 9, mitochondrial membrane depolarization changes in paralel with intracellular calcium levels. There was no significant effect on apoptosis and cell viability.
Conclusion: This study suggest that memantine and ketamine affect cytosolic Ca + 2 entry via TRPV1 channels; Memantine reduces calcium intake in the cytosol over time; Ketamine decreased on the first day, increased on day 2, and decreased on day 3 again. It was thought that ketamine could be one of the possible causes of rapid and transient antidepressant activity. For this reason, further investigation of TRPV1 mediated Ca + 2 entry in depression and the development of drugs for this seem to be important for rapid antidepressant activity.

Keywords: Ketamine, memantine, major depression, TRPV1 channels, Cell Culture