Rekombinant granülosit koloni uyarıcı faktörün biyopolimerlerle enzimatik konjugasyonu ve proteinin özellikleri üzerindeki etkilerinin araştırılması üzerinde çalışmalar
Enzymatic conjugation of recombinant granulocyte colony stimulating factor with biopolymers and studies on the effects on protein properties
Yazar: AYŞE GÖKSU KAYA ÖZSAN
Danışman: PROF. DR. AYŞE FİLİZ ÖNER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Granülosit koloni stimülan faktör = Granulocyte colony stimulating factor

Özet:
Son yıllarda ikinci kuşak protein ilaçlar üzerinde araştırmalar yapılmakta ve ürünler geliştirilmektedir. Bu tez çalışmasında proteinlerle ikinci kuşak ilaç geliştirme yaklaşımlarına bir yenisini eklemek amaçlanmıştır. Bu amaçla filgrastimin mikrobiyal transglutaminaz aracılığı ile daha önce bu yaklaşımla üzerinde çalışma yapılmamış bir polimer ile konjugatının hazırlanması planlanmıştır. Konjugasyon çalışmaları polisakkarit yapıda doğal bir polimer olan kitosanın hidrolizatları ile yapılmıştır. SEC-HPLC, RP-HPLC, Fourier transform infrared spektroskopisi, kütle spektroskopisi, SDS-PAGE jel elektroforezi, izoelektrik odaklama ve western blot ile yapılan analizlerle konjugat oluşumu gösterilmiştir. Ayrıca HPLC, FTIR ve kütle spektroskopisi analizlerinde konjugatın birbirine yakın büyüklükte üç farklı moleküler yapıdan oluştuğu belirlenmiştir. Konjugat oluşumu başarıldıktan sonra sıcaklık, bekletme süresi, pH, bileşenlerin farklı oranları gibi etkenlerin konjugat oluşumu ve dayanıklılığı üzerindeki etkileri incelenmiş ve konjugat oluşumunda polimerin oranının etkili olduğu görülmüştür. Konjugatın çözeltisinin ve liyofilize formunun kararlılığının dört ay 5±3o C derecelik bekletme koşulunda değişmediği görülmüştür. Konjugat çözeltisinin biyoetkinliği hücre kültürü çalışmaları ile Avrupa Farmakopesi'ne uygun şekilde NFS-60 hücreleri kullanılarak araştırılmış ve referans filgrastime göre oluşan konjugatın daha etkili olduğu görülmüştür.

Abstract:
Second generation protein products are studied and products are developed in recent years. Aim of this thesis is to add a new alternative to second generation drug development approaches with filgrastim. For this purpose, enzymatic conjugation of filgrastim with transglutaminase is designed by using a polymer which is not used for this aim before. Conjugation studies are conducted with hydrolysates of chitosan, which is a natural polymer in the polysaccharide structure. Conjugate formation is shown by SEC-HPLC, RP-HPLC, Fourier transform infrared spectroscopy, mass spectroscopy, SDS-PAGE gel electrophoresis, isoelectric focusing and western blot analysis. In addition, HPLC, FTIR and mass spectral analysis showed that conjugate is formed of three similar molecular weight subfraction. After the conjugate formation, effects of parameters such as temperature, reaction period, pH and different ratios of components on the formation and stability of conjugates are studied. Polymer ratio is found to be the main factor on conjugate formation. Solution and lyophilized forms of conjugate is found stable at 5±3oC for four months. Bioactivity of the conjugate solution is studied on cell cultures complying with the European Pharmacopeia by using NFS-60 cells and conjugate is seen more active than reference filgrastim.