Çoklu ilaç dirençli Pseudomonas aeruginosa izolatlarına karşı litik bakteriyofajın izolasyonu, karakterizasyonu ve fajın n-asetil sistein ile biyofilm üzerindeki etkisi
Isolation and characterization of a lytic bacteriophage against multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa isolates and its effect on n-acetyl cysteine and biofilm
Yazar: MAJDA LICINA
Danışman: PROF. DR. AHMET YILMAZ ÇOBAN
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: Kistik fibrozis (KF) hastalarında baskın enfeksiyon kaynağı olan Pseudomonas aeruginosa izolatlarına karşı etkili litik bakteriyofaj izole etmek ve bu fajın N-asetil sistein (NAC) ile birlikte P. aeruginosa biyofilm oluşumu üzerindeki etkisini değerlendirmek.
Yöntem: Bu çalışmada, bakteriyofajlar geleneksel kültür yöntemleri kullanılarak izole edilmiştir. Biyolojik karakterizasyon kapsamında fajın litik spektrumu, pH stabilitesi, termal stabilitesi, enfeksiyon çokluğu, tek adımda büyüme ve patlama boyutu belirlenmiştir.  Genomik karakterizasyon, faj DNA ekstraksiyonu, restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi (RFLP) ve faj genom analizini kapsamıştır. KF P. aeruginosa izolatlarının in vitro biyofilm oluşumu, kristal viyole boyama ile mikrotitre plak testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Bulgular: MLPa10 fajı, KF hastalarından izole edilen P. aeruginosa, özellikle P. aeruginosa 1Pa ve P. aeruginosa 316Pa, indikatör konak olarak kullanılarak kanalizasyon suyundan izole edilmiştir. KF hastalarından izole edilen klinik P. aeruginosa izolatlarının %94,11'ine karşı bakteriyofaj MLPa10, güçlü litik aktivite göstermiştir.  Fajın latent ve patlama süreleri sırasıyla 30 ve 40 dakika, patlama boyutu ise 89 PFU/enfekte hücre olarak ölçülmüştür. MLPa10 fajı, pH 6 ve pH 8'de ve 1 saat boyunca 40, 50, 60°C'de stabil kalmıştır. Bu fajın genom analizi, taksonomik olarak Caudoviricetes sınıfından litik bir faj olarak olduğunu çıkarmıştır. Faj genomunda, hiçbir virülans faktör veya antimikrobiyal direnç geni tespit edilmemiştir. Çalışma, MLPa10 fajının KF P. aeruginosa izolatlarının %76,9'unda olgun biyofilmleri etkili bir şekilde azalttığını ve aynı zamanda olguların %65,38'inde biyofilm oluşumunu engellediğini göstermiştir. Ek olarak, NAC tek başına da biyofilmlere karşı etkinlik göstermiştir. Bununla birlikte, MLPa10 fajı NAC ile birleştirildiğinde daha düşük etkinlik göstermiştir.
Sonuç: MLPa10 fajının kapsamlı karakterizasyonu, KF P. aeruginosa enfeksiyonlarına karşı terapötik bir ajan olarak kullanılma potansiyelinin altını çizmektedir.

Abstract:
Objective: To isolate lytic bacteriophage effective against Pseudomonas aeruginosa isolates, the main source of infection in cystic fibrosis (CF) patients, and to evaluate the effect of this phage together with N-acetyl cysteine (NAC) on P. aeruginosa biofilm formation.
Method: In this study, bacteriophages were isolated using traditional culture methods. Biological characterization included determination of lytic spectrum, pH stability, thermal stability, multiplicity of infection, one-step growth and burst size.  Genomic characterization included phage DNA extraction, restriction fragment length polymorphism (RFLP) and phage genome analysis. In vitro biofilm formation of CF P. aeruginosa isolates was performed using microtiter plate assay with crystal violet staining.
Results: MLPa10 phage was isolated from sewage water using P. aeruginosa isolated from CF patients, specifically P. aeruginosa 1Pa and P. aeruginosa 316Pa, as indicator hosts. The bacteriophage MLPa10 showed strong lytic activity against 94.11% of clinical P. aeruginosa isolates from CF patients.  The latent and burst periods of the phage were 30 and 40 minutes, respectively, and the burst size was measured as 89 PFU/infected cell. MLPa10 phage was stable at pH 6 and pH 8 and at 40, 50, 60°C for 1 hour. Genome analysis of this phage revealed it to be taxonomically a lytic phage of the class Caudoviricetes. No virulence factors or antimicrobial resistance genes were detected in the phage genome. The study showed that MLPa10 phage effectively reduced mature biofilms in 76.9% of CF P. aeruginosa isolates and also inhibited biofilm formation in 65.38% of cases. In addition, NAC alone also showed efficacy against biofilms. However, the MLPa10 phage showed lower efficacy when combined with NAC.
Conclusion: The extensive characterization of MLPa10 phage underlines its potential as a therapeutic agent against CF P. aeruginosa infections.