Nöroblastomalarda PI3-K sağkalım sinyal iletimini değiştirerek oluşan apoptozis sensitizasyonu
Apoptosis sensizition of neuroblastoma by altering PI3-K mediated survival signaling
Yazar: ÇAĞDAŞ KUŞ
Danışman: DOÇ. DR. DR. İ OĞUZ KARA
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Onkoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Fosfatidilinozitoller = Phosphatidylinositols ; Hücre kültürü = Cell culture ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Nöroblastomalar, genellikle bebeklerde, çocuklarda, genç yetişkinlerde rastlanan malign tümörlerdir. Bu tümörlerin sinir sistemi gelişmeden kalan primitif (farklılaşmamış) sinir hücreleri olduğu düşünülmektedir. Nöroblastomanın düzenleyici hücre ölüm yolaklarını daha iyi anlamak, moleküler hedefli tedavilerin tasarımı için yeni fırsatlar sağlayacaktır. En önemli hücre ölüm yolağı apoptozistir. Bu çalışmadaki amaç, PI3-K sinyallerinin apoptozis mekanizmaları üzerindeki etkisini araştırmaktır. PI3-K mekanizmaları, apoptozis mekanizmasıyla ilişkili sağkalım sinyal iletimi yolağı ailesidir. PI3-K sinyalleri, tümör formasyonu ve tümör progresyonunda merkezi bir rol oynamaktadır. PI3-K sinyallerinin iletim yolaklarının araştırılması nörolastoma hastalarının klinik gelişiminde umut verici bir hedef olacaktır. Elde edilecek sonuçlar özellikle hücre siklusunda tanımlanan noktalara yönelik yeni hedeflenmiş tedavi yöntemleri geliştirilebilmesi için olanak sağlayacaktır.Bu çalışmada apoptozisin düzenlenmesinde PI3-K sinyallerinin rolü SH-EP, lan 5, kelly nöroblastoma hücre hatlarında in vitro olarak araştırılmıştır. İnhibitör olarak spesifik sinyal moleküllerini içeren BGT 226, BEZ 235 ve BKM 120 kullanılmıştır. Kombine tedavi deneylerinde sitotoksik ajan olarak doksorubisin kullanılmıştır. Spesifik proteinleri bulmak için western blotting, apoptotik hücrelerin nicel yüzdesini ölçmek için nicoletti prosedürü uygulanmıştır. Veriler excel programında ortalamaları ve standart sapmaları alınarak grafiklere aktarılmış, MANN WHİTNEY U testi ile değerlendirilmiştir.Çalışmanın sonucunda farklı zamanlı tedavi (12 saat fark) deneylerinin sonucunda 3 farklı PI3-K inhibitöründe de kontrol grubuyla olan fark anlamlı olduğu bulunmuştur (p<0.05). Genetik özellikleri farklı olan nöroblastoma hücrelerinin PI3-K inhibitörlerine tepkisi farklı bulunmuştur. Lan 5 hücreleri bu inhibitörlere en duyarlı hücreler, SH-EP hücreleri PI3-K inhibitörlerine en az duyarlı hücreler olarak bulunmuştur. SH-EP hücrelerinin PI3-K inhibitörlerinin temel hedefi olduğu bulunmuştur. PI3-K inhibitörlerinin farklı konsantrasyonlarının tek ajan olarak denendiği değerlerde hücrelerin tepkisi farklı bulunmuştur. 24 saat, 48 saat, 72 saat zaman aralıklarında lan 5 hücreleri haricinde anlamlı fark bulunmamıştır. Nöroblastoma hücrelerinde gerçekleşen apoptozisin kaspaz bağımlı olarak gerçekleştiği ispat edilmiştir. PI3-K inhibitörleri etkilerine göre BGT 226>BKM 120>BEZ 235 şeklindedir. p53 ve Bcl-2 geninin bu döngülerdeki etkileri incelenmiştir. Bu çalışma için unutulmaması gereken şudur ki; toksik maddelerin yüksek konsantrasyonları apoptozis haricinde nekroza da yol açmaktadır. Bu çalışmada nicoletti yöntemiyle facs analizleri yapılarak nicel apoptozis yüzdelerine bakılmıştır. Çalışmanın ilerleyen aşamalarında propidium iodide boyasıyla apoptotik veya nekrotik hücreler saptanabilir. Ayrıca dapi yöntemi, Anneksin 5 metoduyla apoptotik, nekrotik ve canlı hücreler ayırt edilebilir. Bu çalışmanın benzeri kanser olmayan insan hücrelerinde in vitro ortamda denenmeli sonuçlar karşılaştırılmalıdır.

Abstract:
Neuroblastomas are malignant tumors of the central nervous system that usually are found in infants, children, and young adults. These tumors are thought to arise from primitive (undifferentiated) nerve cells left over from the development of the nervous system. Better understanding of the regulatory cell death pathways in neuroectodermal tumors is anticipated to provide new opportunities for design of innovative, molecular targeted therapies. The most important pathway is apoptosis. The aim of this study; to investigate PI3-K signal the impact of mechanism to apoptosis. Beside of them PI3-K is one of the apoptosis related survival transduction pathway proteins. Deregulated PI3-K/Akt signaling often play central role in tumor formation and progression and frequently observed in a variety of human cancer. Thus PI3-K signaling appears to be promising target in the clinical management neuroblastoma patients. Results to be obtained will be allowed especially for cell cycle defined point for developing new targeting therapies.In this study, role of PI3-K/Akt signalling in apoptosis regulation were investigated in neuroblastoma cell lines; SH-EP, lan 5, Kelly. Inhibitors are specific signalling molecules including BGT 226, BEZ 235, BKM 120. As Cytototoxic agent doxorubicin has been used for combine treatment. To find specific proteins; western blotting, to measure the percentage of quantitavie apoptotoic cells nicoletti procedures were applied.As a result of study, differences post treatment between 3 different PI3-K inhibitors, with control group were found significant differences (p<0.05). The neuroblastoma cell lines, have different genetic properties, different responses to inhibitors which were used. Lan 5 cells most sensitive, SH-EP cells were found to be least sensitive cells to this PI3-K inhibitors. SH-EP cells were found to be main target of PI3-K inhibitors. Different concentrations of PI3-K inhibitors as a single agent have been tried in this experiments, it was different response in these cells. There is unsignificant difference between 24 hour, 48 hour and 72 hour other than lan 5 cell line. The apoptosis which occurred in this neuroblastoma cell lines is proved to be caspase dependent apoptosis. Effects of PI3-K inhibitors : BGT 226>BKM 120>BEZ 235. p53 and Bcl-2 genes were investigated in this cycle. For this study should not forget the fact that high concentrations of toxic agents which lead to necrosis other than apoptosis. In this study with nicoletti procedurses, quantitative apoptosis percentage can be performed with the facs analysis. In later stages in this study apoptotic or necrotic cells can be detected with propidium iodide. Method of annexin 5 or with dapi method, apoptotic cells, necrotic cells, live cells can be distinguished. Similar to this study should be try cells of human but not cancer and to compare with this results.