Mezenkimal kök hücre ve conditioned medium'un kıkırdak greft yaşayabilirliğine etkisi
The effect of mesenchymal stem cell and conditioned medium on cartilage graft viability
Yazar: ABDULLAH ÜNLÜ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSTAFA SÜTÇÜ
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Kök hücreler = Stem cells ; Kıkırdak = Cartilage ; Transplantlar = Transplants ; Şartlandırılmış medyum = Conditioned medium

Özet:
Travma, tümör rezeksiyonları, konjenital anomali onarımı ve estetik cerrahide sık kullanılmasından dolayı kıkırdak greftlerinin popülerliği giderek artmaktadır. Vücudumuzda kıkırdak grefti için dönor alanlar sınırlıdır. Kıkırdağın beslenmesi cilt ve kemik dokunun aksine difüzyon ile sağlamaktadır. Bu da kıkırdak greftinin yaşayabilirliğini azaltmaktadır. Greft sonrası geç dönemde kıkırdak greftinin boyutunda azalma, şeklinin değişmesi ve rezorbe olması problemlerin başında gelmektedir. Bu çalışmanın amacı  mezenkimal   kök hücre ve onun besi yeri olan conditioned mediumun  kıkırdak greft yaşayabilirliğine etkisini araştırmaktır.
           Kıkırdak greft hayvan modeli için New Zealand tipi tavşanların kulak kıkırdağı kullanıldı. 21 adet tavşan randomize şekilde 3 grubu ayrıldı. Kulak kıkırdağında 10x10mm otojen kıkırdak greft oluşturuldu. Grup 1 kontrol grubu olarak seçildi. Grup 2 kıkırdak greftlemesi sonrasında adipoz kökenli mezenkimal kök hücre enjekte edildi. Grup 3 kıkırdak grefti sonrasında conditioned medium enjekte edildi. Tüm tavşanlar 120 gün takip edildi. Kıkırdak greftleri etrafında 5 mm sağlam kıkırdak içerek şekilde eksize edildi. Kıkırdak greftleri histolojik değerlendirme için hematoksilen eozin ve masson trikrom boyama ile değerlendirildi. İmmünohistokimyasal değerlendirme için tip 2 kollajen boyaması yapıldı. Elektron mikroskobunda kıkırdak üretimi incelendi. 
         Histolojik değerlendirme sonrasında CM enjekte edilen grup 3'te kondroblast oluşumu, migrasyonu ve yeni kıkırdak oluşumu grup 1 ve grup 2'ye göre daha yüksek saptanmıştır ve istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Kök hücre enjekte edilen grup 2'de kontrol grubuna göre kondroblast oluşumu, migrasyonu ve yeni kıkırdak oluşumu yüksek olarak belirlenmiştir ve istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. İmmünohistokimyasal boyama sonrasında tip 2 kollajen miktarı CM enjekte edilen grup 3'te grup 1 ve grup 2'ye göre daha fazla görülmüştür. İstatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Kök hücre enjekte edilen grup 2'de kontrol grubu (grup 1) göre tip 2 kollajen miktarı fazla olarak belirlenmiştir. Bu sonuç istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur.
              Travma, yanıklar, cilt kanseri rezeksiyonu ve rekonstrüksiyon gerektiren konjenital deformiteler, burun ve kulak kemiği defektlerini içeren yüz defektleri birçok kişiyi etkilemektedir. Kıkırdak deformitelerinin onarımı için alloplastik implantlar, allogreftler, otolog dokular kullanılmaktadır. Kıkırdak gerektiren rekonstrüksiyonlarda sentetik implantların yüksek enfeksiyon oranları, ekpozisyon gibi sorunlar nedeniyle kullanımı sınırlıdır. Allojenik kıkırdak greftleri yüksek rezorpsiyon oranları (>% 70) ve hastalık bulaşma riski nedeniyle problemler oluşturur (Tuan, Chen, and Klatt 2013). Otolog kıkırdak greftleri bu seçenekler arasında halen altın standart olarak gösterilmektedir. Otolog kaynakların donör saha morbiditesi ve rezorbsiyona uğraması günümüz rekonstrüktif ve estetik cerrahi alanında ciddi bir problemdir. Kıkırdak greft gerektiren durumların bu kadar fazla oluşu ve kıkırdak greftlerindeki rezorbsiyon oranının yüksek olması greft yerleştirildikten sonra geç dönemde istenmeyen sonuçlara neden olmaktadır. 
          Mezenkimal kök hücreler kendi kendilerini yenileyebilme, farklı dokulara diferansiye olabilmesi ve immünomodülatör özellikleri nedeniyle rejeneratif tıpta önemli bir yere sahiptir. Mezenkimal kök hücreler enjekte edildikleri yerde osteosit, adiposit ve kondrosite dönüşebilme potansiyeline sahiptirler (Goldberg, Mitchell et al. 2017). Bu multipotent hücreler kemik iliği kaynaklı olabileceği gibi yağ doku, kan, dişten de elde edilebilir. Yağ dokudan elde edilen kök hücre kemik iliği kaynaklı kök hücreye göre daha kolay elde edilmesi ve dönor alan problemleri nedeniyle günlük pratikte daha sık tercih edilmektedir (Oh, Park et al. 2018). Tüm bu kaynaklar mezenkimal kök hücreler, kıkırdak greft iyileşmesinde çok önemli avantajlar sunabilir. Kondrojenik diferansiasyon kapasitelerinin yüksek oluşu yanı sıra, mezenkimal kök hücreler in vivo direkt terapötik etkileri göstermektedirler. MSC enjeksiyonları ile çok sayıda parakrin etki gösteren biyoaktif molekül salınımı olur. Bu parakrin etki antiapopitotik, immün modülasyon, antiskar ve kemoatraktan fonksiyonları sağlar (Griffin, Ritter, and Mahon 2010). İmmünomodülasyon etki derecesi çevreye, matriks ve yüzey çevresine yerel enflamatuar koşullara bağlıdır. Wei ve ark. çalışmasında mezenkimal kök hücrelerin kartilaj yapımı ve rejenerasyonunda etkili olduğu gösterilmiştir. Khalilifar ve ark. yaptıkları çalışmada yeni kartilaj üretiminde kulaktan elde edilen mezenkimal kök hücre, kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre, yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücre karşılaştırılmış ve hepsinde kıkırdak üretiminin arttırıldığı gösterilmiştir (Khalilifar, Baghaban Eslaminejad et al. 2019). Literatüre uygun şekilde kök hücre verilen grup kontrol grubundan daha anlamlı bulundu. Kök hücrelerin kullanımı tümöre dönüşüm ve immün reddi ile ilgili sorunlar günümüzde halen devam etmektedir (Ben-David and Benvenisty 2011).
     CM içerisinde bulunan büyüme faktörleri sayesinde kondrositleri tetiklediği ve ortamda bulunan hücreleri aktive ederek kıkırdak üretimini arttırdığı düşünülmektedir.  Kıkırdak üretiminde ilk etapta ortamda yüksek miktarda tip 2 kollojen bulunmaktadır. Mezenkimal kök hücrelerde diferansiyasyon hangi yöne gideceği tam olarak bilinmediği için CM'da ortamda kondrojenik yolağı aktive etmesi kök hücreye karşı büyük bir avantaj olarak görülmektedir. İçerisinde kök hücre bulunmadan sadece CM verilen 3. Grupta kondrojenik yolağın aktive olduğu, yeni kondrositlerin oluştuğu, tip 2 kollojenden zengin ekstrasellüler matriks meydana geldiği görüldü. Kıkırdak greft rezorbisyonunu engellemede ve yeni kıkırdak üretimine katkı sağlama açısından CM klinik pratikte herhangi bir tümöral etkisi olmadan ve herhangi bir immün reaksiyon oluştırmadan, dönor alan gerektirmemesi ile  güvenle kullanılabileceğini düşünmekteyiz.
Anahtar Sözcükler: Conditioned Medium, Kök Hücre, Kıkırdak Greft

Abstract:
The popularity of cartilage grafts is increasing due to their frequent use in trauma, tumor resections, congenital anomaly repair and aesthetic surgery. In our body, the donor areas for cartilage grafting are limited. The nutrition of the cartilage is provided by diffusion, unlike the skin and bone tissue so that reduces the viability of the cartilage graft. after the graft has healed, reduction in the size, change in shape and resorption of the cartilage graft are among the leading problems. The aim of this study is to investigate the effect of mesenchymal stem cell and  conditioned medium, on cartilage graft viability.
             Ear cartilage of New Zealand type rabbits was used for the cartilage graft animal model. 21 rabbits were randomly divided into 3 groups. 10x10mm autogenous cartilage graft was created in the ear cartilage. Group 1 was chosen as the control group.  group 2 is after cartilage grafting, adipose-derived mesenchymal stem cells were injected.  group 3 is after cartilage grafting, conditioned medium was injected. All rabbits were followed for 120 days. The cartilage grafts were excised with 5 mm of intact cartilage around them. Cartilage grafts were evaluated with hematoxylin eosin and Masson trichrome staining for histological evaluation. Type 2 collagen staining was performed for immunohistochemical evaluation. Cartilage production was examined under the electron microscope.
           After histological evaluation, chondroblast formation, migration and new cartilage formation were found to be higher in group 3, which was injected with CM, compared to group 1 and group 2, and it was found to be statistically significant. Chondroblast formation, migration and new cartilage formation were found to be higher in stem cell injected group 2 compared to the control group and were found to be statistically significant. immunohistochemical staining, the amount of type 2 collagen was higher in group 3, which was injected with CM, compared to group 1 and group 2 and Statistically significant. The amount of type 2 collagen was determined to be higher in stem cell injected group 2 compared to the control group (group 1). This result was found to be statistically significant.
            Trauma, burns, congenital deformities requiring skin cancer resection and reconstruction, facial defects including nasal and ear cartilage defects affect many people. Alloplastic implants, allografts, autologous tissues are used for the repair of cartilage deformities. The use of synthetic implants in cartilage-requiring reconstructions is limited due to problems such as high infection rates and exposure. Allogeneic cartilage grafts problems due to their high resorption rate (>70%) and risk of disease transmission. Autologous cartilage grafts are still shown as the gold standard among these options. Donor site morbidity and resorption of autologous graft is a serious problem in today's reconstructive and aesthetic surgery field. The higher of conditions requiring cartilage grafts and the high rate of resorption in cartilage grafts cause undesirable results in the late period after graft.
            Mesenchymal stem cells have an important place in regenerative medicine due to their self-renewal, differentiation into different tissues and immunomodulatory properties. Mesenchymal stem cells have the potential to transform into osteocytes, adipocyte and chondrocyte where they are injected. These multipotent cells can be derived from bone marrow as well as from adipose tissue, blood, and teeth. Stem cells obtained from adipose tissue are preferred more frequently in daily practice due to their easier obtaining and donor area problems compared to bone marrow-derived stem cells. All these resources mesenchymal stem cells can offer very important advantages in cartilage graft healing. Besides their high chondrogenic differentiation capacity, mesenchymal stem cells show direct therapeutic effects in vivo. MSC injections, a large number of bioactive molecules with paracrine effects are released. This paracrine effect provides antiapoptotic, immune modulation, antiscar and chemoattractant functions. The degree of immunomodulation effect depends on the environment, matrix and surface environment, local inflammatory conditions. Wei et al. In this study, it was shown that mesenchymal stem cells are effective in cartilage formation and regeneration. Khalilifar et al. In their study, mesenchymal stem cells obtained from the ear, mesenchymal stem cells derived from bone marrow, mesenchymal stem cells derived from adipose tissue were compared in the production of new cartilage and it was shown that cartilage production was increased in all of them. In accordance with the literature, the group given stem cells was found to be more significant than the control group. Problems related to the use of stem cells, tumor transformation and immune rejection still continue today.
             It is thought that the growth factors in the conditioned medium activated chondrocytes and increase the cartilage production by activating the cells in the environment. In the production of cartilage, there is a high amount of type 2 collagen in the environment firstly. Since it is not known exactly in which direction the differentiation will take in mesenchymal stem cells, activating the chondrogenic pathway in the medium in CM is seen as a great advantage against stem cells. It was observed that the chondrogenic pathway was activated, new chondrocytes were formed, and an extracellular matrix rich in type 2 collagen was formed in the 3rd group, in which only CM was given without stem cells. In terms of preventing cartilage graft resorption and contributing to the production of new cartilage, we think that CM can be used safely in clinical practice without any tumoral effects and without causing any immune reaction, as it does not require a donor area.
Keywords: Conditioned Medium, Stem cell, Cartilage Graft