Sinoviyal kökenli mezenkimal  kök hücrelerin polarizasyonunda  yer alan gen-protein expresyonu  ve farmakolojik modülasyonu
Gene-protein expression of sinovial derived stem cell polarization and its pharmalogical modulation
Yazar: MUHAMMET OCAK
Danışman: PROF. DR. AFİG BERDELİ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases

Özet:
Amaç:  Juvenil İdiopatik Artrit(JIA) patogenez basamakları iyi anlaşılamamış kronik, inflamasyon sebebiyle dokusal erozyonun sonucunda oluşan bir hastalıktır. Hastalık tanısı konulmasında birçok klinik ve laboratuvar kriteri söz konusudur. JIA patogenezinde meydana gelen değişimler arasında immün hücrelerin gruplar halinde Sinoviyal sıvıya migrasyonu da vardır. Bu migrasyon dokunun kendini rejenere etme kabiliyetinde görev alan mekanizmalarda aksamalara yol açmaktadır. Hem sinoviyal hem de sinoviyal sıvıya göç eden immün hücrelerin polaritesindeki moleküler değişimler bu tip immün hasarlanmada önemli olduğu tartışılmaktadır. Hücre içi polarite WNT sinyal yolakları tarafından kontrol edilir. Non kanonik sinyal yolağında görev alan proteinler PARD3, DVL1, SCRIB ve Ca+2 yolağında rol alan DMP1 proteinleri hücrelerin şekillerini, birbirleriyle olan bağlantılarını, stabil durumda formasyonlarını ve ekstrasellüler alandan gelen sinyale bağlı olarak göç etme mekanizmasını kontrol ederler.  Bu çalışmada, sinoviyal kök hücre hasar taklit modelinde hücre polaritesinde yer alan proteinlerin fonksiyonel değişimini değerlendirmek için gen ekspresyon düzeylerini saptayarak, JIA patogenezinde hücre polaritesinde yerini ve bu değişimin farmakolojik modülasyonunu araştırmak amaçlanmıştır.  
 
Gereç ve Yöntem: Bu amaçla JIA hasar taklidi Sinoviyal kökenli kök hücreleri kültür modelinde immün uyarılar ile polarite değişimi ve farmakolojik modülasyonunu ortaya koymak için bahsi geçen WNT yolağının önemli proteinlerinin ekspresyon seviyeleri ve invitro ilaç etkileri değerlendirilmiştir. Deneyde 6 kuyucuklu 3 plate'de Sinoviyal kökenli kök hücreler kültürlendi. Toplam 18 kuyucuğun 3 kuyusu normal kültür, sırasıyla 3'er kuyusu IL-1, TNF-a, IL-1+TNF-a, IL-1+Canakinumab, TNFa+Adalimumab olacak şekilde 48 saatte bir pasajlanarak 2 pasaj şeklinde manipüle edildi. Ardından kültür ortamından alınan örneklerden mRNA izolasyonu yapıldı ve izole mRNA'lardan Reverse-Transkriptaz PCR ile cDNA elde edildikten sonra cDNAların RealTime PCR ile daha önce sipariş verilen PARD3, DVL1, SCRIB, 
III 
 
DMP1 Taqman hazır probları kullanılarak ekspresyon seviyeleri Ct değeri olarak ABI7000 RT-PCR cihazında ölçüldü. Çıkan sonuçlar Ct hesabı ile değerlendirildi.    Bulgular: Değerlendirmelere göre JIA hasar taklitleri ve farmakolojik modülasyonlarda hücre içi polarite yolaklarının değişime uğradığı gözlemlendi. IL-1 ve TNF-a hasar taklitlerinde polarite proteinlerinin ortamda azalmasına sebep olacak bir gen ekspresyonu azalması gözlemlendi. Bunun yanında stabil halde formasyonu koruyan hasar anında mineralizasyon başlangıcı olan DMP1 proteini hasar taklidi ile ekspresyon seviyesini artırmıştır. Farmakolojik modülasyonlarda elde edilen bulgularda ekspresyon seviyelerindeki değişimler daraltılmıştır ancak tamamen durdurulduğu sadece hücre içinde diğer yaşamsal yolaklara da yardım eden DVL1 proteini kodlayan Dvl1 geninde gözlemlenmiştir.  
 
Tartışma ve Yöntem:  Bulgularımızda elde edilen verilere göre JIA çerçevesinde gerçekleşen hasarın hücre içi polariteye ve dolaylı olarak hücre-hücre bağlantılarına verdiği internal zarardan dolayı kök hücrelerinde dokularda tutunma yetisini kaybettiği ve bunun sonucunda erozyona maruz kaldığı, kök hücrelerin rejenerasyon yetilerinin bağlanma/polarite kaybı sonucunda azaldığı ancak mineralizasyon gibi acil önlemlerin daha iyi çalıştığı kanaatine varıldı.

Abstract:
Goal: Juvenile idiopathic arthritis (JIA) is a chronic, inflammation-induced textural erosion that is not well understood by the pathogenesis stages. There are many clinical and laboratory criteria in the diagnosis of disease. Among the changes that occur in the pathogenesis of JIA are migration of synovial fluid in groups of immunocytes. This migration leads to dislocations in mechanisms that play a role in self-regenerating touch. Molecular changes in polarity of immunocytes that migrate to both synovial and synovial fluid are discussed as important for such immunological damage. Intracellular polarity is controlled by WNT signaling pathways. Proteins involved in non-canonical signaling pathways DMP1 proteins involved in the pathways PARD3, DVL1, SCRIB and Ca+2  control the shape of cells, their connections to each other, their formation in a stable state, and the mechanism of migration due to signal from the extracellular domain. In this study, we aimed to investigate the localization of cell polarity in JIA pathogenesis and to investigate the pharmacological modulation of this change, by determining gene expression levels to evaluate the functional changes of the proteins involved in cell polarity in the synovial stem cell damage mimetic model. 
 
Materials and Methods: Implications of JIA damage for this purpose In order to demonstrate the polarity change and pharmacological modulation by immunostimulants in the synovial root cell culture model, expression levels and in-vitro drug effects of important proteins of the wild-type WNT pathway were evaluated. In experiment, 3 cells of 6 wells were cultured with Sinovial stem cells. A total of 18 well, 3 wells were manipulated in the form of 2 passages with a 48-hour passage through the normal culture as 48 wells, respectively, as well as IL-1, TNF-a, IL-1 + TNF-a, IL-1 + Canakinumab, TNF-a + Adalimumab It was. Then, mRNA isolation was performed from the samples taken from the culture medium. After cDNA was obtained by reverse transcriptase PCR from isolated mRNAs, cDNAs were amplified using ABI7000 RT-PCR as expression levels Ct value using PARD3, DVL1, SCRIB, DMP1 Taqman prepared probes previously ordered with RealTime PCR Was measured in the device. The results were evaluated by Ct. 
V 
 
  Results: According to the evaluations, it was observed that the intracellular polarity pathways were changed in JIA damage imitations and pharmacological modulations. A decrease in gene expression was observed in IL-1 and TNF-a impairments that would result in reduced polarity proteins in the environment. In addition, the level of expression was enhanced by mimicking DMP1 protein damage, which is the initial mineralization at the time of damage, which protects the formation in a stable state. The changes in expression levels in the pharmacological modulations were narrowed but observed only in the Dvl1 gene encoding the DVL1 protein, which is also completely stopped in the cell, which also helps other life pathways. 
 
Discussion and Method: According to the results obtained in our findings, the JIA frame damage is lost due to internal damage to stem cells, due to internal damage to the cell polarity and indirectly to the cell-cell junctions and consequently, the regeneration ability of the stem cells is decreased due to binding / polarity loss, It was concluded that the measures worked better.