Tekrarlayan implantasyon başarısızlığında, doku ve dolaşımdaki MikroRNA'ların etkisi
The role of the serum exosomal and endometrium MicroRNAs in recurrent implantation failure
Yazar: FATEMEH AZHARI ZARNAGH
Danışman: PROF. DR. SADRETTİN PENÇE
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı / Moleküler Tıp Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Embriyo implantasyonu = Embryo implantation ; Endometriyum = Endometrium ; Fertilizasyon = Fertilization ; Fertilizasyon-in vitro = Fertilization-in vitro ; Mikro RNA = Micro RNA ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA

Özet:
Tekrarlayan implantasyon başarısızlığı (TİB), ardışık en az üç in-vitro fertilizasyon (IVF) uygulaması sonrası iyi kalitede embriyo transfer edilmesine rağmen gebelik elde edilememesi olarak tanımlanmıştır. TİB, IVF uygulamasında ortaya çıkabilen en önemli sorunlardan biridir. Hastalığın gelişiminde ve fonksiyonunda önemli etkenlerden biri gen anlatımının epigenetik düzenlenmesidir ve bu olaylarda görev yapan en önemli moleküllerden biri de mikroRNA (miRNA)'lardır. Endometriyuma özgü miRNA'ların menstruasyon döngüsü sürecinde endometriyum dokusunda ve maternal serumda anlatım seviyelerinin farklı olduğu tespit edilmiştir. 
miRNA'ların kantitatif olarak anlatım seviyesi değişimleri çeşitli yöntemlerle ölçülebilir; bu yöntemlerin en önemlisi qReal-Time PCR tekniğidir. Bu teknik kullanılarak biyolojik bir örnekte bulanan hedef miRNA'ların anlatım seviyesi kantitatif olarak yüksek hassasiyetle ölçülür.
Bu çalışmanın en önemli özelliği TİB hastalarının hem dokularında hem de serumlarında bulunan miRNA'ların anlatım seviyelerini araştıran ilk çalışma olmasıdır. Bu araştırmada hedeflenen ilk amaç miRNA'ların anlatım seviyelerinin istatistiksel sonuçlarından elde edilen verilerle hastalığın biyolojik sürecine dahil olan faktörlerin açığa çıkarılmasıdır. İkincisi, ileride bu hastaların potansiyel tedavisi için strateji geliştirebilme açısından temel oluşturmaktır. Son hedefimiz ise maternal serumda anlamlı şekilde anlatım seviyesi değişen miRNA'ların tanı amaçlı bir girişimsel olmayan (non-invazif) moleküler biyobelirteç olarak kullanılmasıdır.
Bu araştırmada TİB problemi olan hastalardan (n=12) ve gönüllü normal bireylerden (n=8) menstruasyon döngüsünün iki farklı fazında örnek toplanmıştır. Menstrual döngünün 7-10. günlerdeki proliferatif fazda (PF) ve 20-24. günlerdeki sekretuar fazda (SF) alınan endometriyum dokusu ve periferik kan örnekleri üzerinde çalışılmıştır. İmplantasyonla ilişkili olduğunu düşündüğümüz aday miRNA'ların (hsa-miR-31, hsa-miR-30b, hsa-miR-145 ve hsa-miR-23b) anlatım seviyeleri ve biyoinformatik analizi RT-qPCR ile gerçekleştirilmiştir. RT-qPCR analiz sonucunda endometriyum örneklerinde TİB ve sağlıklı grubu karşılaştırmasında 4 aday miRNA anlatımında anlamlı şekilde (P<0.05) PF'de artma ve SF'de azalma tespit edilmiştir. Serum örneklerinde miR-145 ve miR-23b'de her iki fazda (PF ve SF) anlamlı şekilde anlatım azalması saptanmıştır. Anlatımlarında anlamlı şekilde değişim olan miRNA'ların hedef gen analizi güncel biyoinformatik veri tabanlarında ("Target Scan", "Miranda" ve "Pictar") gerçekleştirilmiş ve hedef genlerin ilgili yolakları ("miRò2" veri tabanı) kullanılarak tesit edilmiştir. Elde edilen yolakların hücrelerde çoğalma, apoptoz, invazyon, adesyon ve farklılaşma gibi önemli biyolojik süreçler ile ilgili oldukları saptanmıştır ve bu süreçlerin embriyo implantasyonuyla ilişkili olabileceği düşünülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Tekrarlayan implantasyon başarısızlığı, mikroRNA, epigenetik, eksozom, serum, endometriyum.

Abstract:
Recurrent implantation failure (RIF) refers to the failure to achieve a clinical pregnancy after transfer of at least three good-quality embryos in in-vitro fertilization (IVF). RIF is a major problem encountered in IVF. An important factor in the development and function of the RIF disorder is epigenetic regulation of gene expression, in which one of the most noteworthy molecules are microRNAs (miRNAs). In the menstrual cycle, it has been identified that endometrium specific miRNAs have different expression levels in endometrial tissues and maternal serum. 
Quantitative miRNAs expression level can be measured in a biological sample by different methods which the most important method is quantitative real-time PCR (qRT-PCR) technique. This technology quantitatively measures the expression of targeted miRNA in a biological sample with high sensitivity. 
The significant feature of this study is that this is the first study to analyse of miRNA expression level in two different types of samples in same cases. The first aim in the study is revealing the factors involved in the biological process of disease by targeted expression of miRNAs. Second aim is to create a basis for developing a new theory for the potential treatment of RIF patients and the last aim of study is that significantly different expressed miRNAs can be used for non-invasive molecular biomarkers in early diagnosis of RIF disorder.
In this study, it was studied on 12 RIF samples and 8 samples from normal and fertile individuals which are collected as two peripheral venipunctures (5 mL) and two endometrial biopsies; one in the proliferative phase (CD 7-10) and one in the implantation phase (CD 20-24). In first step RNA was isolated from endometrium tissue and sera exosomes, Expression levels and bioinformatics analysis of candidate miRNAs (hsa-miR-31, hsa-miR-30b, hsa-miR-145 and hsa-miR-23b) which we think are related to implantation were performed. The statistical analysis showed that four selected miRNAs (hsa-miR-145, hsa-miR-23b, hsa-miR-31and hsa-miR-30b) were significant (P<0.05) up-regulated in proliferative phase and down-regulated in secretory phase of endometrium samples. In serum samples, only two miRNAs (hsa-miR-145 and hsa-miR-23b) were significantly down-regulated in both of proliferative phase and secretory phase. Target analysis for dysregulated miRNAs in different and updated target scan databases (Target Scan, Miranda and Pictar) identified important target genes. Pathway analysis of targeted genes showed critical pathways which are related to important cell functions such as proliferation, apoptosis, invasion, adhesion, and differentiation which are hypothesized to be related to the embryo implantation process.

Keywords: Recurrent implantation failure, microRNA, epigenetics, exosome, serum, endometrium