DZNep ve spironolakton kombinasyonunun akciğer kanseri hücre soyunda sitotoksik/apoptotik etkilerinin araştırılması
Investigation of cytotoxic/apoptotic effects of DZNep and spironolactone combination on lung cancer cell line
Yazar: SELİN KAYMAZ
Danışman: PROF. DR. ENGİN ULUKAYA
İstinye Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kanser Biyolojisi ve Farmakolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: 3-Deazaneplanosin A = 3-Deazaneplanosin A ; Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Apoptozis = Apoptosis ; DNA onarımı = DNA repair ; Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Spironolakton = Spironolactone

Özet:
Akciğer kanseri, günümüzde teşhisi konulan tüm kanserlerin büyük kısmını oluşturmaktadır ve kanser ölümlerinin önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Akciğer kanserlerinin tedavisi için ameliyat, radyoterapi, kemoterapi, hedefe yönelik tedaviler, hormon terapi, immünoterapi gibi çeşitli opsiyonlar vardır. Ancak, günümüzde hala kesin bir tedavi bulunabilmiş değildir. Kansere karşı etkin tedavi oluşturulmasındaki en büyük iki zorluk, tedavinin kanser hücrelerini öldürebilecek kadar güçlü olamaması ya da tedavinin sağlıklı hücreleri de yüksek oranda öldürecek kadar toksik olmasıdır. Kanser durumlarında tedavi öncesi ya da tedavi sonrası karşılaşılan problemler arasında ise metastaz, invazyon, nüks, tedaviye direnç (çoğunlukla kemodirenç) görülmektedir. Bu sebeplerden dolayı, etkin ve doğru bir tedavi arayışında mevcut problemlerin olabildiğince çözülmeye çalışılması ve bu yönde gerekli analizlerin gerçekleştirilmesi son derece önemlidir.
Epigenetik bir ajan olan DZNep, histon metiltransferaz inhibitörüdür. DZNep'in, EZH2'nin protein ekspresyonunu inhibe ederek histon H3 üzerindeki lizin 27'nin trimetilasyonunu (H3K27me3) azalttığı bilinmektedir. Son hücre temelli taramalar, Spironolakton'a DNA hasarına dayalı kanser kemoterapisinde yardımcı maddeler olarak çeşitli roller tanımlamıştır. Spironolakton, doğrudan DNA hasarına yol açmaz ve DNA onarım sisteminde HDR ve NER mekanizmalarını engelleyerek hatalı olan DNA'nın onarımına engel olur. Spironolakton'un DNA'ya zarar veren kemoterapötik bir ajan ile halihazırda tedavi edilmiş sağlıklı hücrelere toksisite eklemediği bilinmektedir. 
Epigenetik ajan DZNep'in Spironolakton ile kombinasyon tedavisinin A549 hücrelerinin canlılığı üzerine etkisi sulforhodamine B (SRB) testi yöntemiyle belirlendi ve hücre canlılığı üzerinde istatiksel açıdan anlamlı azalmalara yol açtığı bulundu. Hücre ölümünün apoptotik yolla gerçekleştiği akış sitometrisinde anneksinV-FITC pozitiflik ve kaspaz-3/7 aktivitesi testleriyle kanıtlandı. CalcuSyn Version 2.1 (Biosoft, UK) yazılımı kullanılarak Chou-Talalay metoduna göre hesaplanan kombinasyon indeks değerlerinin analizleri, ilaçların kombinasyonunun A549 kanser hücreleri üzerinde sinerjistik etki gösterdiğini ve Beas2B sağlıklı hücreler üzerinde bu sinerjizmin azaldığını ortaya çıkardı. Kombinasyon tedavisinin kanser hücrelerinin migrasyon yeteneği üzerine olan etkisini tespit etmek amacıyla yara iyileşmesi testi gerçekleştirildi ve kombinasyonun hem negatif kontrole göre hem de ilaçların tekli uygulamalarına göre istatiksel açıdan anlamlı olarak migrasyonu engellediği bulundu. Bu kombinasyonun ümit vaat edici olduğu ve yeni bir tedavi modalitesi olarak etkinliğinin doğrulanması için in-vivo ileri analizlere gerek duyulduğu sonucuna varıldı.

Abstract:
Lung cancer remains the majority of all cancers diagnosed today and the leading cause of cancer death. There are several options to treat lung cancer like surgery, radiotherapy, chemotherapy, targeted therapies, hormone therapy, and immunotherapy. However, no definitive treatment has been found yet. The two biggest challenges in the effective treatment of cancer comprise either the treatment is not strong enough to kill cancer cells or is too toxic and kills healthy cells at high rates. Metastasis, invasion, recurrence, and resistance to treatment (mostly chemoresistance) are among the problems encountered before or after treatment in cancer cases. Thus, it is extremely important to solve the existing problems that search for effective and correct treatment and perform relevant analyzes in this direction. 
DZNep is an epigenetic agent that inhibits histone methyltransferases. It affects the trimethylation of lysine 27 on histone H3 (H3K27me3) through the inhibition of the EZH2 protein. Recent cell-based screenings have identified several roles for Spironolactone as an adjuvant in DNA damage-based cancer chemotherapy. Spironolactone does not directly cause DNA damage and prevents the repair of defective DNA by inhibiting the HDR and NER mechanisms in the DNA repair system. It is known that spironolactone does not cause toxicity in healthy cells that have already been treated with a DNA-damaging chemotherapeutic agent.
The effect of the combination treatment with DZNep and Spironolactone on cell viability of A549 cells were analyzed by the sulforhodamine B (SRB) assay and it was found to cause statistically significant decreases in cell viability. The presence of apoptotic cell death was investigated by annexin-V-FITC positivity and caspase-3/7 activity in flow cytometry. Analysis of the combination index values calculated according to the Chou-Talalay method using CalcuSyn Version 2.1 (Biosoft, UK) software and revealed that the combination therapy had a synergistic effect on A549 cancer cells and this synergism was reduced on Beas2B healthy cells. The wound-healing assay was performed to determine the effect of the combination therapy on the migration ability of cancer cells, and it was found that the combination inhibits migration significantly both compared to the negative control and compared to the single administration of the drugs. It was concluded that this combination is promising and further in-vivo analyzes are needed to confirm its efficacy as a new treatment strategy.