Lipaz-katalizli ayçiçek yağın metanoliz reaksiyon mekanizmasının HPLC ile incelenmesi
Monitoring lipase-catalyzed methanolysis of sunflower oil by HPLC: Elucidation of the mechanisms of lipases
Yazar: ŞABAN KALAY
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ALİ TÜRKAN
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada, Novozym 435 (Novo 435), Lipozyme TL IM (TL IM) veLipozyme RM IM (RM IM) sabit (immobilize) lipazlar tarafından katalizlenenayçiçek yağı (TAG) ile metanol (MeOH) arasındaki transesterifikasyonreaksiyonların mekanizmaları, yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ileaydınlatılmaya çalışılmıştır. Bu amaçla, transesterifikasyon reaksiyonu süresinceoluşan maddelerin belirlenmesi ve zamana karşı konsantrasyonlardaki değişimi takipedebilmek için, yeni iki ayrı ters-faz HPLC metodu oluşturulmuştur. Lipaz-katalizlitransesterifikasyon reaksiyonları süresince oluşan ürün ve araürünlerin tam tayiniHPLC/APCI-MS (HPLC/atmosferik basınç kimyasal iyonizasyon-kütlespektrometre) ile yapılmıştır. Ayrıca, reaksiyon süresince oluşan metil linoleat vemetil oleat miktarları, kalibrasyon eğrileri kullanılarak tayin edilmiştir.40oC'de, Novo 435-katalizli reaksiyonlarda fazla bir mono- ve diaçil gliserolaraürünleri oluşmamakta; fakat TL IM ve RM IM-katalizli reaksiyonlarda, oldukçafazla sn-2 monoaçil ve sn-1,2 diaçilgliserol ürünleri oluşmaktadır. Daha yükseksıcaklıklarda (50ºC ve 60ºC), Novo 435-katalizli reaksiyonlarda da araürün oluşumuartmaktadır. Reaksiyon ortamındaki MeOH konsantrasyonu azaldıkça, lipazlar açilgöçü reaksiyonlarını, yani sn-2 monoaçillerin sn-1 monoaçillere ve sn-1,2 diaçillerinise sn-1,3 diaçilgliserollere dönüşümünü katalizlemektedir.Ayrıca, sabit lipaz sistemlerinin her birisi ile farklı sıcaklıklarda, farklıyağ/alkol mol oranlarında, farklı enzim miktarlarında reaksiyonlar yapılıp optimumşartlar tespit edilmiştir. Yağa göre 2.0 molar ekivalentten daha fazla MeOHkullanıldığında Novo 435 lipaz; 1.5 molar ekivalentten daha fazla MeOHkullanıldığında ise TL IM ve RM IM lipazların aktiviteleri önemli ölçüde azalmıştır.Enzim matrikslerinin adsorpladığı gliserol, ter-bütanol ve hekzan yıkamalarıyapılarak uzaklaştırılmıştır. Diğer taraftan lipaz katalizli reaksiyonlarda tek katalizörkullanmak yerine iki katalizörün birleştirilerek kullanılması araürünlerin daha azoluşmasını sağlamakta ve aynı zamanda da reaksiyon süresi daha da kısalmaktadır.vNovo 435, TL IM ve RM IM ile heptan solvent ortamında yapılan kinetikçalışmalarda, MeOH konsantrasyonu sabit tutulup TAG konsantrasyonuapp appdeğiştirilerek, kinetik parametreler ( Vmax ve K m ) hesaplanmıştır. Bu şartlarda: aynıappTAG konsantrasyonunda MeOH konsantrasyonu arttıkça, Novo 435'in Vmax değeriapppek değismemekte, fakat K m değeri artmaktadır; RM IM ve TL IM lipazlarda ise,app appbenzer şartlarda hem Vmax değerleri hem de K m değeri artmaktadır. Ayrıca RM IMkinetik çalışmasında yağ konsantrasyonu MeOH konsantrasyonundan düşükolduğunda başlangıç reaksiyon hızları azalmış, yağ konsantrasyonu MeOHkonsantrasyonundan fazla olduğunda ise başlangıç reaksiyon hızları artmıştır.Böylece yapılan kinetik çalışmalar ile her bir lipazın reaksiyon mekanizmasınınfarklı olduğu bulunmuştur.

Abstract:
In this study, the mechanisms of three immobilized lipases, namely Novozym435 (Novo 435), Lipozyme TL IM (TL IM) and Lipozyme RM IM (RM IM) inmethanolysis of sunflower oil were investigated using high-performance liquidchromatography (HPLC). Two reversed-phase HPLC procedures were proposed tomonitor the major compounds occurring during the lipase-catalyzedtransesterification reactions. HPLC/mass spectrometry with an ion trap analyzer andatmospheric pressure chemical ionization source (HPLC/APCI-MS) was used for theidentification of the individual compounds. Individual calibration curves obtainedwith UV detection at 210 nm were found to be of use for quantitative analyses ofmethyl esters and acylglycerols. On the contrary to Novo 435-catalyzed reactions, inTL IM- and RM IM-catalyzed reactions, significant amounts of mono- (2-L and 1-Lmainly) and diacylglycerol (1,2-LL and 1,3-LL mainly) intermediates formed at40oC. At 50oC and 60oC, significant amounts of mono- and diacylglycerolintermediates also formed in Novo 435-catalyzed reactions. At depleting MeOHconcentrations, all three lipases catalyzed acyl migrations (i.e., conversion of sn-2MAGs to sn-1 MAGs and similarly sn-1,2 DAGs to sn-1,3 DAGs). As soon as thesecond molar equivalent of MeOH was added, sn-1 MAGs and sn-1,3 DAGs werethe preferred substrates for the lipases.The optimum conditions (i.e., oil:MeOH ratio, temperature, the amount ofenzyme etc.) were also determined for all three lipase systems. Based on the results,using 10% (w/w oil) enzyme and three step addition (1 molar equivalent at each step)of MeOH were suggested. Before addition of second and third molar equivalents ofMeOH, the immobilized enzymes were washed with hexane followed by ter-BuOHto get rid of the glycerol absorbed onto the matrices.Moreover, kinetic studies at which MeOH concentration (50, 100 or 200 mM)was kept constant while changing the oil concentration (between 50-500 mM) werecarried out with all three lipases. With increasing MeOH concentration, the initialviiappvelocities of Novo 435-catalyzed reactions decreased ( Vmax values were constant, butappK m values increased), whereas that of TL IM-catalyzed reactions increased (bothapp appVmax and K m increased). On the other hand, the initial velocities of RM IM-catalyzed reactions decreased at the oil concentrations lower than the concentrationof MeOH, but increased at the oil concentrations higher than the concentration ofMeOH. Overall, these results suggest that the reaction mechanisms of threeimmobilized-lipases are different.