Aronya (Aronia melanocarpa (Michx) Elliot) meyve suyu antosiyaninlerinin ısıl ve depolama stabilitelerinin belirlenmesi
Determination of the thermal and storage stabilities of aronia (Aronia melonacarpa (Michx) Elliot) fruit juice anthocyanins
Yazar: AYSUN ÖZTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. OKTAY YEMİŞ
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında; ülkemizde ilk defa 2012 yılında yetiştiriciliğine başlanan 'Viking' ve 'Nero' aronya çeşitlerine ait 2017 ve 2018 yıllarında hasat edilen meyvelerin bazı biyo-kimyasal özellikleri incelenmiştir. Aronya meyvesinin fenolik bileşiklerce (1564‒1739 mg GAE/100 g) oldukça zengin olduğu ve buna paralel olarak antioksidan aktivitesinin (DPPH yöntemiyle; 122‒147 ve ABTS yöntemiyle; 106‒128 µmol TE/g) yüksek olduğu tespit edilmiştir. Yapılan analizlerle aronya çeşitlerinin pH, toplam fenolik madde (TFM), toplam antosiyanin miktarları (TAM) ve antioksidan aktiviteleri bakımından yıllar arasında, toplam titre edilebilir asitlik (TTA), suda çözünür kuru madde (SÇKM) ve kuru madde (KM) oranları bakımından ise hem çeşitler hem de yıllar arasında farklılıklar olduğu belirlenmiştir (p<0,01). 
Bu doktora tezinin birinci basamağında, aronya fenolik bileşiklerinin beş farklı solvent karışımı ile ultrases-destekli ekstraksiyonu optimize edilmiştir. Test edilen solvent karışımlarının ekstraksiyon verimleri açısından istatistiki olarak farklı olmadığı tespit edilmiştir (p>0,05). Metanol/formik asit (95:5, v/v) solvent karışımı, diğer karışımlara kıyasla hızlı evapore edilmesinden dolayı ekstraksiyon solventi olarak seçilmiştir. Ayrıca, her biri 20 saniye olan ekstraksiyon süresi, üç tekrarlı olarak (60 saniye) gerçekleştirilmiş olup hedef  fenolik grupların (antosiyaninler, hidroksisinamik asitler ve flavonoller) başarılı bir şekilde ekstrakte edildiği saptanmıştır. Bir ön işlem olarak dondurarak kurutma ile ekstraksiyonda ürünün toz formda kullanılması, elde edilen değerlerin daha düşük varyasyon katsayılarına sahip olmasına neden olmuştur. Ekstraksiyon optimizasyonundan sonra, elde edilen metanolik ekstrakt hem HPLC hem de UHPLC tekniği ile analiz edilmiştir. Valide edilen her iki yöntemden, UHPLC'nin HPLC'ye göre fenolik bileşikleri 2,3 kat daha hızlı ayırdığı ve daha az solvent tükettiği tespit edilmiştir. Her iki çeşitte de 4 siyanidin grubu antosiyanin, 2 hidroksisinnamik asit ve 5 kuersetin grubu flavonol fenolik bileşik, HPLC-DAD-ESI-MSn tekniği ile tanımlanmıştır. Bu bileşiklerin sırasıyla toplam miktarları 425–438 mg/100 g, 173–179 mg/100 g ve 37–37 mg/100 g (taze ağırlık) aralığında tespit edilmiştir. 
Çalışmanın ikinci basamağında, aronya meyvelerinden berrak meyve suyu elde etmek için mayşe enzimasyon, durultma ve filtrasyon basamaklarının optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Aronya sularına bentonit, jelatin ve Becosol 30 yardımcı maddeleri kullanılarak sıcak durultma işlemi uygulanmıştır. Mayşe enzimasyonu için en uygun enzim dozajı 0,086 mL/kg (Pectinex Ultra Color), durultma işlemi için ise en uygun dozajlar ise 2 g/L bentonit, 0,2 g/L jelatin ve 1 g/L Becosol 30 olarak belirlenmiştir. Daha sonra Viking çeşidinden 1,52 NTU bulanıklık ve 20,8 °Briks, Nero çeşidinden ise 1,95 NTU bulanıklık ve 20,0 °Briks düzeylerinde aronya suları üretimleri gerçekleştirilmiştir. Her iki çeşide ait aronya suyu proses basamaklarında meydana gelen değişiklikler incelenmiş ve prosesler sonunda toplam antosiyanin miktarlarının %75, hidroksisinnamik asitlerin %59, flavonollerin %54–55 ve toplam fenolik bileşiklerin %70 oranlarında azaldığı saptanmıştır. 
Çalışmanın son basamağında ise, çeşitlere ait aronya suyu ve konsantrelerinde antosiyaninlerin farklı sıcaklıklardaki ısıl (80, 90 ve 100°C) ve depolama (4, 20 ve 37°C) stabiliteleri araştırılmıştır.  Antosiyanin degradasyonlarının incelenen tüm ortamlarda birinci derece reaksiyon kinetiğine uygun olarak gerçekleştiği belirlenmiştir. Çalışma bulgularına göre sıcaklık ve süre artıkça, aronya suyu ve konsantrelerinde antosiyaninlerin degradasyon hızlarının arttığı tespit edilmiştir. Viking aronya sularının 80, 90 ve 100°C sıcaklıklarda yarılanma süreleri (t1/2) sırasıyla; 6,8; 3,2 ve 1,5 saat, aktivasyon enerjisi (Ea) 81,23 kJ mol–1 olarak hesaplanmıştır. Aynı sıcaklıklarda Nero aronya sularının t1/2 değerleri sırasıyla; 6,4; 2,8 ve 1,5 saat ve Ea 79,63 kJ mol–1 olarak bulunmuştur. Bunun yanı sıra 4, 20 ve 37°C depolanan Viking aronya suyu konsantrelerinin (68° Briks )  t1/2 sırasıyla; 866, 122 ve 17 gün ve Nero çeşidine ait konsantrelerde (68° Briks ) ise;  693, 120 ve 15 gün olarak saptanmıştır. Viking ve Nero aronya suları konsantrelerinin depolama sıcaklıklarına ait Ea değerleri ise sırasıyla; 84,89 ve 83,31 kJ mol–1 olarak belirlenmiştir. Ayrıca aronya suyu ve konsantrelerinin antosiyanin parçalanma ölçütleri de hesaplanmış sıcaklık ve süre arttıkça bu değerlerden renk yoğunluğu azalırken, polimerik renk ve polimerik renk oranının arttığı görülmüştür. Örneğin 80, 90 ve 100 °C'lerde ısıtılan Viking aronya suyu örneklerinde polimerik renk oranı başlangıçta %17 iken 14 saat sonunda sırasıyla; %55, %73 ve %87 oranlarına kadar artış belirlenmiştir. Aynı çeşide ait konsantre örneklerinde ise başlangıçta %20 olarak hesaplanan polimerik renk oranının 4°C'de 18 ay depolama sonunda %46, 20°C'de 12 ay depolama sonunda %57 ve 37°C'de 3 ay depolama sonunda %71'e kadar arttığı saptanmıştır. Benzer artışlar, Nero çeşidine ait hem aronya suyu hem de konsantre örneklerinde gözlenmiştir.
Aynı zamanda Viking ve Nero aronya suyu konsantrelerinin farklı sıcaklıklarda depolanması süresince toplam fenolik madde (TFM) miktarları, antioksidan aktiviteleri (ABTS, DPPH ve CUPRAC yöntemleriyle) ve reflektans renk (L*, a*, b*) değerlerinin değişimleri incelenmiştir. Yapılan analiz bulgularına göre depolama sıcaklık ve süre artışına bağlı olarak konsantrelerin TFM miktarlarının ve antioksidan aktivitelerinin azaldığı görülmüştür. Nero aronya suyu konsantrelerinin 4, 20, 37°C'de sırasıyla; 18, 12 ve 3 ay depolama sonrasında TFM miktarlarındaki azalma oranları sırasıyla; %23, 46 ve 45, Viking aronya suyu konsantrelerinde ise; %23, 52 ve 48 olarak belirlenmiştir. Çeşitlerin aronya suyu konsantrelerinde en yüksek antioksidan aktivitelerin CUPRAC yöntemi sonuçlarına ait olduğu Viking örneklerinde 580,91 µmol TE/g ve Nero örneklerinde ise 474,51 µmol TE/g olarak bulunmuştur. Tüm sıcaklıklarda depolama sonunda her iki çeşide ait konsantre örneklerinde L* parlaklık değerlerinin arttığı, a* ve b* değerlerinin ise azaldığı ve bu değişimlerin istatiksel olarak önemli olduğu (p<0,05) tespit edilmiştir.

Abstract:
Chokeberry or Aronia is a deciduous shrub of the Rosaceae family. Native to North America, it spread to Europe and Russia. Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot (black), A. arbutifolia (L.) Pers. (red), and A. prunifolia (Marshall) Rehder (purple) are three well known chokeberry species. Among them, cvs. `Viking´ and `Nero´ are two prominent European cultivars of economic importance. In Türkiye, cultivation of these cultivars were started in 2012 and gradually spread to larger areas. The plant bears edible, cherry-like fruits that are commonly used for the production of juice, jam, tea, and wine. Owing to its high anthocyanin content, black chokeberry has a large potential in the food industry, e.g., as a natural colorant. Black chokeberry is currently of particular interest due to its phenolic composition, being rich in anthocyanins along with several phenolic acids, flavonols, and proanthocyanidins. Geographic location, agronomic practices, and seasonal differences have been reported to largely impact the accumulation of phenolic compounds in the berries. A previous study has already shown the differences in the phenolic contents of black chokeberries grown in Germany and Poland. The phenolic composition of black chokeberries cultivated in Türkiye has not existed in previous studies.
In this study; some bio-chemical properties of fruits harvested in 2017 and 2018 belonging to 'Viking' and 'Nero' aronia varieties, which were first time grown in Türkiye in 2012, were examined. The results revealed that pH values, total phenolic content (TPC), total anthocyanin content (TAC) and antioxidant activities of aronia cultivars were statistically found to be different between years. It was determined that there were differences between both cultivars and years for total titratable acidity (TTA), water-soluble dry matter (WSDM) and dry matter (DM) ratios (p<0,01). It was confirmed that Aronia fruit was a rich source of phenolic compounds (1564‒1739 mg GAE/100 g), and had a high antioxidant capacity (with DPPH method; 122‒147 and ABTS method; 106‒128 µmol TE/g).
Extraction is a critical step for analysis of phenolic compounds as their physicochemical properties largely differ, ranging from highly water-soluble anthocyanins to mid-polar quercetins. A comprehensive approach aiming at exhaustive extraction of all individual phenolic compounds is a prerequisite for their accurate quantitation. As an alternative to the commonly applied stirring- and high-shear force homogenization-based methods, ultrasound-assisted extraction is often the method of choice providing fast extraction and low solvent consumption. Most recently, a report about ultrasound-assisted extraction followed by determination of total phenolic and anthocyanin contents has become available. However, this promising method for screenings has not been considered for the quantitation of individual phenolic compounds from black chokeberry. 
The present study aimed at establishing a fast and exhaustive ultrasound-assisted extraction method for the subsequent liquid chromatographic determination of phenolic compounds from black chokeberry cultivated in Türkiye. In the first step of this doctoral study, ultrasound‒assisted extraction of aronia phenolic compounds with five different solvent mixtures was optimized. It was found that the tested solvent mixtures were not statistically different in terms of extraction efficiency. The methanol/formic acid (95:5, v/v) solvent mixture was chosen as the extraction solvent due to its rapid evaporation compared to other mixtures. In addition, it was determined that the phenolic groups (anthocyanins, hydroxycinnamic acids, and flavonols) were successfully extracted by three cycles (60 seconds) of each with an extraction time of 20 seconds. The use of powder form obtained by freeze-drying as a pre‒treatment resulted in the lower coefficients of variation in the yield of phenolic extraction. After extraction optimization, the obtained methanolic extract was analyzed by both HPLC and UHPLC techniques. The results revealed that UHPLC achieved the separation of aronia phenolic compounds 2,3 times faster and consumed less solvent than HPLC. In both cultivars, 4 cyanidin group anthocyanin, 2 hydroxycinnamic acid and 5 quercetin group flavonol phenolic compounds were identified by HPLC-DAD-ESI-MSn technique. The total amounts of these compounds were 425–438 mg/100 g, 173–179 mg/100 g and 37–37 mg/100 g (fresh weight), respectively. Both cultivars from Turkey displayed similar phenolic compositions that resembled the profile previously reported in literature. Noteworthy, merely a few contributions have assessed Aronia fruit cultivated in a Mediterranean climate.  Consequently, from a nutritional point of view, chokeberries from Turkey may be considered equally rich in the studied phenolic compounds as compared to berries from other provenances. The validated extraction and (U)HPLC methods established in this contribution may be applied in the food industry, e.g., for quality control and authentication of black chokeberry products. 
In the second step of the study, optimization of mash enzymation, clarification and filtration steps was carried out to obtain clear juice from aronia fruits. A hot clarification process was applied to aronia fruit juices by using clarifying agents which consist of bentonite, gelatin, and Becosol 30. The most suitable enzyme dosage for mash enzymation was 0.086 mL/kg of Pectinex Ultra Color. The most appropriate dosages for clarification process were 2 g/L of bentonite, 0,2 g/L of gelatin, and 1 g/L of Becosol 30. After the optimization, juice were produced from Viking and Nero variety of Aronia fruit.  The turbidity of Viking aronia juice with 20,8 °Brix was 1,52 NTU, while Nero aronia juice with 20,0 °Brix had a turbidity of 1,95 NTU. The changes in phenolic compounds at main steps of juice production were investigated during the processing of aronia juice for both cultivars, and it was observed that the total amount of anthocyanins decreased by 75%, hydroxycinnamic acids by 59%, flavonols by 54–55%, and total phenolic compounds by 70% at the end of the processing.
In the last step of the study, the thermal (80, 90, 100°C) and storage (4, 20, 37°C) stability of anthocyanins in aronia juice and concentrates of both varieties were determined. Anthocyanin degradations in both juice and concentrate followed to the first-order reaction kinetics. Kinetic data showed that the degradation rates of anthocyanins in aronia juice and concentrates increased with increasing temperature and time. The half-life times (t1/2) for anthocyanins in Viking aronia juices were 6,8; 3,2 and 1,5 h at 80, 90, 100°C, respectively, and activation energy (Ea) was calculated as 81,23 kJ mol-1. At the same temperatures, the t1/2 values of anthocyanins in Nero aronia juice were 6,4; 2,8 and 1,5 h, respectively, and Ea were found as 79,63 kJ mol-1. In addition, t1/2  values of anthocyanins in Viking aronia juice concentrates (68° Brix) stored at 4, 20 and 37°C were 866, 122 and 17 days, respectively, while t1/2 values in Nero aronia juice concentrates (68° Brix) were determined as 693, 120 and 15 days. The Ea values for the degradation of anthocyanin in Viking and Nero aronia juice concentrates during storage at the range of 4–37°C were 84,89 and 83,31 kJ mol-1, respectively. In addition, the color intensity, the ratio of polymeric color and polymeric color formation, which are the primary color indices, were calculated to determine the color degradation in aronia juice and concentrates.  As expected, the color intensity in juices and concentrates decreased with increasing temperature and time while the ratio of polymeric color and polymeric color formation increased. For example, a 55%, 73% and 87% increases in juice samples heated at 80, 90, 100°C were observed at the end of 14 hours while Viking aronia juice samples had a 17% of the initial polymeric color ratio. In the concentrate samples of the same variety, the polymeric color ratio was 20% at beginning of storage. The initial value increased up to 46% at the end of 18 months of storage at 4°C, 57% at 12 months of storage at 20°C, and 71% at 3 months of storage at 37°C has been found to increase. Similar increases were also observed in both aronia juice and concentrate samples of Nero variety.
In addition, the changes in TPC, antioxidant activities (with ABTS, DPPH and CUPRAC methods) and reflectance color (L*, a*, b*) values were also evaluated at different temperatures during the storage of Viking and Nero aronia juice concentrates. It was observed that the TPC and antioxidant activities of the concentrates decreased with increasing temperature and time of storage. For example, the reduction rates in TPC contents of Nero aronia juice concentrates at 4, 20, 37°C were 23%, 46% and 45%, respectively, at the end of 18, 12 and 3 months of storage. These losses in Viking aronia juice concentrates were 23%, 52% and 48%. Increases in the L* brightness values of the concentrate samples of both cultivars were observed, while the a* and b* values decreased at the end of storage at all temperatures, and these changes were statistically significant (p<0,05).