Bazı fenolik asitlerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi ve insan karbonik anhidraz izoenzimleri (HCA-I ve HCA-II) üzerine etkilerinin incelenmesi
Determinaton of some fenolic acids? antioxidant capacity and investigation of their effects on human carbonic anhydrase izoenzymes (HCA-I and HCA-II)
Yazar: SEVİM BEYZA ÖZTÜRK SARIKAYA
Danışman: DOÇ. DR. İLHAMİ GÜLÇİN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Mevcut çalışmada elajik asit, gallik asit, ferulik asit, kuersetin, p-kumarik asit, p-hidroksibenzoik asit ve sirinjik asit gibi bazı fenolik asitlerin muhtemel antioksidan ve radikal giderme aktiviteleri değerlendirildi. Ayrıca bu fenolik asitlerin insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (HCA-II ve HCA-II) üzerine inhibisyon etkileri incelendi.Fenolik asitlerin antioksidan ve radikal giderme aktivitelerini değerlendirmek için 2,2´-azino-bis(3-etilbenztiyoazolin-6-sülfonik asit) radikal (ABTS?+) giderme aktivitesi, 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil serbest radikal (DPPH?) giderme aktivitesi, N,N-dimetil-p-fenilendiamin radikal (DMPD?+) giderme aktivitesi, süperoksit anyon radikali (O2?-) giderme aktivitesi, potasyum ferriksiyanit indirgeme metodu ile total indirgeme kuvveti, Kuprak metodu ile kuprik iyonları (Cu2+) indirgeme kapasitesi, hidrojen peroksit giderme aktivitesi ve ferröz iyonları (Fe2+) şelatlama aktivitesi çalışıldı. Ayrıca BHA, BHT ?-tokoferol ve troloks referans antioksidan olarak kullanıldı. Kullanılan fenolik asitler bütün metotlarda kuvvetli antioksidan ve radikal giderme aktivitesi sergilediler.Ayrıca çalışmanın ikinci kısmında ise fenolik asitlerin insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (HCA-II ve HCA-II) üzerine in vitro inhibitör etkileri araştırıldı. Öncelikle HCA-I ve HCA-II izoenzimleri sırasıyla Sepharose-4B-L-Tirozin afinite kolon kromatografisi ile %48,8, %63 verimle 112,5 ve 837,9 kat saflaştırıldı. Enzim saflığını belirlemek için, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapıldı ve tek bant gözlendi.Bundan sonra I50 değerlerini bulmak için, hidrataz aktivitesi kullanılarak fenolik asitlerin karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (HCA-I ve HCA-II) üzerine inhibisyon etkileri araştırıldı. Ayrıca fenolik asitlerin karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (HCA-I ve HCA-II) üzerine inhibisyon etkileri 4-nitrofenil asetat substratı ile esteraz aktivite metodu kullanılarak da araştırıldı. Ellajik asit, gallik asit, ferulik asit, kuersetin, p-kumarik asit, p-hidroksibenzoik asit ve sirinjik asit, HCA-I icin 98,6-1061,3 ?M arasında ve HCA-II için de 105,0?697,0 ?M arasında Ki değerlerine sahip oldukları gözlendi. Kuersetin (HCA-I için), p-kumarik asit (HCA-I, II için) ve gallik asit (HCA-I,-II için) yarıyarışmalı inhibisyon, kuersetin (HCA-II için) yarışmalı inhibisyon gösterirken diğer fenolik asitlerin hepsi (HCA-I, II için) 4-nitrofenill asetat substratı ile yarışmasız inhibisyon gösterdiler. Çalışmada kullanılan fenolik asitler klinik olarak kullanılan süfanilamid ve asetazolamide benzer inhibisyon etkisi gösterdiler. Bu inhibitörler antioksidan özelliklerinden dolayı HCA-I ve HCA-II için daha güvenli olarak kullanılabilir.Anahtar kelimeler: Antioksidan aktivite, karbonik anhidraz, fenolik asit, HCA-I, HCA-II, enzim inhibitör

Abstract:
In the present study, some phenolic acids such as ellagic acid, gallic acid, ferulic acid, quercetin, p-coumaric acid, p-hydroxybenzoic acid and syringic acid were evaluated for possible antioxidant and radical scavenging activity. Also the inhibitory effects of these phenolic acids were used on human erythrocyte izoenzymes I and II (HCA-I and HCA-II).In order to evaluate antioxidant and radical scavenging activity of phenolic acids, different in vitro methods such as 2,2´-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) radical (ABTS?+) scavenging activity, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl free radical (DPPH?) scavenging activity, N,N-dimethyl-p-phenylenediamine radical (DMPD?+) scavenging activity, superoxide anion radical (O2?-) scavenging activity, total reducing power by potassium ferricyanide reduction method, cupric ion (Cu2+) reduction capacity by Cuprac method, hydrogen peroxide scavenging activity and ferrous ions (Fe2+) chelating activities were performed separately. Also, BHA, BHT, ?-tocopherol and trolox, a water-soluble analogue of ?-tocopherol, were used as the reference antioxidant compounds. The phenolic acids exhibited powerfull antioxidant and radical scavenging effects in used all methods.Also in the second part of this study, the in vitro inhibitory effects of some phenolic acids on erythrocyte carbonic anhydrase isoenzymes (hCA-I and hCA-II) were investigated. Firstly, hCA-I and hCA-II were purified by Sepharose-4B-L-Tirozin affinity chromatography column with a yield of 48,8 %, 63 %, 112,5 and 837,9 -fold purification of each isoenzyme, respectively. For determination of enzyme purity, sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed and single band was observed. Then, for determination of I50 values, some phenolic acids? inhibition effects on human carbonic anhydrase (HCA, EC 4.2.1.1) isozymes I and II, were investigated by using hidratase assay. The inhibition of human carbonic anhydrase (HCA, EC 4.2.1.1) isozymes I and II, with a series of phenolic acids was investigated by using the esterase assay, with 4-nitrophenyl acetate as substrate. Ellagic acid, gallic acid, ferulic acid, quercetin, p-coumaric acid, p-hydroxybenzoic acid and syringic acid showed KI values in the range of 98,6-1061,3 ?M for hCA I and of 105,0?697,0 ?M against HCA-II, p-coumaric acid (for hCA-I, II) and gallic acid (for HCA-I, II) exhibited uncompetitive, quercetin (for hCA II) exhibited competitive, inhibitory effect. All of the other phenolic acids were found as non-competitive inhibitors with 4-nitrophenylacetate as substrate for hCA I and hCA II. These phenolic acids investigated here showed effective hCA II inhibitory effects, in the same range as the clinically used sulfonamide acetazolamide, and can be used as safer HCA I and HCA II izoenzyme inhibitors due to their antioksidant properties.Keywords: Antioxidant activity, Carbonic anhydrase, phenolic acid, HCA-I, HCA-II; enzyme inhibitor