SK-MEL-30 hücre hattında NRAS geni Q61K mutasyonuna CRISPR/Cas9 tekniğinin uygulanması
Application of CRISPR/Cas9 technique to the nras gene Q61K mutation in SK-MEL-30 cell line
Yazar: TUĞÇE DURAN
Danışman: PROF. DR. TÜLÜN ÇORA
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Genler = Genes ; Genler-RAS = Genes-RAS ; Genom = Genome ; Hücre dizisi = Cell line ; Melanom = Melanoma ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Onkogenler = Oncogenes

Özet:
Malign melanom, melanositlerin veya melanositlerden gelişen hücrelerin neoplazmıdır. Melanoma önceleri seyrek görülen bir hastalık olmasına rağmen, son yıllarda melanomadan kaynaklı ölümlerin yıllık insidansı çarpıcı bir şekilde artmaktadır. İnsanlardaki 3 RAS geni (HRAS, KRAS ve NRAS) insan kanserinde tespit edilen en yaygın onkogenlerdir; Ras'ı kalıcı olarak aktive eden mutasyonlar, tüm insan tümörlerinin % 20 ila 25'inde ve bazı kanser türlerinde ise % 90'a kadar bulunmaktadır. NRAS geninin 12, 13 ve 61.kodonlarındaki mutasyonları, tüm melanomların % 15-20'sinde ortaya çıkmaktadır. Bu değişiklikler agresif klinik davranış ve kötü prognoz ile ilişkilendirilmiştir. Yakın zamana kadar, NRAS mutant melanoma için genetik olarak hedeflenmiş gelecek vaat eden tedavi yaklaşımları az olup, bu konuda sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır (ve genel olarak mutant RAS maligniteleri).
Bu çalışmada, genom-düzenleme için günümüzün en etkili tekniklerinden biri olarak kabul edilen CRISPR/Cas9 tekniği kullanılarak, malign melanoma kanserine neden olan Q61K mutasyonunun düzeltilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, Q61K mutasyonunu içeren malign melanoma SK-MEL-30 hücre hattı kullanılmıştır. Hedef mutasyon için gRNA'lar dizayn edildikten sonra, plazmidlere aktarılmış ve klonlanmıştır. Sonra, plazmidler ve donör dizi elektroporasyon tekniği kullanılarak malign melanoma cilt kanseri hücrelerine aktarılmıştır. Başarılı transforme olan hücreler GFP+ hücrelerdir, floresan mikroskop ve flow sitometri kullanılarak diğer hücrelerden ayrılmıştır. HDR-aracılı tamir mekanizması ile hücrelerde sırasıyla knock-out ve knock-in hedeflenmiştir. Yapılan real-time PCR analizleri ile bazı hücrelerde, hedef bölgede knock-out ve knock-in işleminin başarıyla gerçekleştiği gösterilmiştir. Buna ek olarak, end-point analizi de, çalışma sonuçlarını başarıyla desteklemektedir.
Bu projede, bir nokta mutasyonunun bile CRISPR/Cas9 tekniği ile düzeltilebileceğinin mümkün olduğu ispatlanmıştır. CRISPR tekniği kullanılarak, benzer mutasyonların çalışılması açısından literature yeni bir vizyon kazandırdığımız kanaatindeyiz.

Abstract:
Malignant melanoma is a neoplasm of melanocytes or of the cells that develop from melanocytes. Although melanoma was once considered an uncommon disease, the annual incidence has increased dramatically over the past few decades, as have deaths from melanoma. The 3 Ras genes in humans (HRas, KRas, and NRas) are the most common oncogenes in human cancer; mutations that permanently activate Ras are found in 20% to 25% of all human tumors and up to 90% in certain types of cancer NRAS mutations in codons 12, 13, and 61 arise in 15–20 % of all melanomas. These alterations have been associated with aggressive clinical behavior and a poor prognosis. Until recently, there has been a paucity of promising genetically targeted therapy approaches for NRAS-mutant melanoma (and RAS-mutant malignancies in general).

In this study, it was aimed to correct the Q61K mutation causing malignant melanoma cancer using the CRISPR / Cas9 technique, which is considered as one of the most effective techniques for genome editing. For this purpose, malignant melanoma SK-MEL-30 cell line containing the Q61K mutation was used. Once the gRNAs for the target mutation have been designed, they are transferred to plasmids and cloned. Then, plasmids and donor sequence were transferred to malignant melanoma skin cancer cells using electroporation technique. Successful transformed cells which are GFP + cells, sorted from other cells using fluorescence microscopy and flow cytometry. With the HDR-guided repair mechanism, knock-out and knock-in were targeted respectively. Real-time PCR analysis showed successful knock-out and knock-in in target cells in some cells. In addition, end-point analysis supports the results of working successfully.

In this project, it has been proved that even a point mutation can be corrected by the CRISPR / Cas9 technique. Using the CRISPR technique, we believe that we have given literature a new vision in terms of studying similar mutations.