Çeşitli bitki ekstrelerinin hücre ölüm mekanizmaları üzerine etkilerinin doku kültüründe araştırılması
Investigation of the effects of various plant extracts on cell death mechanisms on tissue culture
Yazar: ÖZLEM DAĞDEVİREN ÖZSÖYLEMEZ
Danışman: PROF. DR. FATMA GÜL ÖZCAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Radyobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Bu tez çalışmasında, ülkemize endemik Colchicum cinsinden 2 farklı türün bitki ekstrelerinin
normal ve kanser hücreleri üzerine sitotoksik etkilerini araştırmak ve bu etkinin kanser
hücrelerinde hangi hücre ölüm mekanizmalarını tetiklediğini ortaya koymak amaçlandı. Bu
bağlamda, C-4 I (kanser kökenli hücre) ve Vero (normal hücre) hücrelerine uygulanan
Colchicum sanguicolle K.M. Perss ve Colchicum baytopiorum C.D. Brickell metanol bitki
ekstrelerinin 6 farklı konsantrasyonunun (2.5, 1, 0.25, 0.1, 0.025, 0.01 mg/ml) hücre indeksi
üzerine etkileri ve IC50 konsantrasyonları belirlenmesinde xCELLigence sistemi kullanıldı.
Bitki ekstrelerinden hazırlanan 6 farklı konsantrasyonun IC50 değerleri Colchicum sanguicolle
bitki ekstresinin C-4 I için 0.40 mg/ml ve Vero için 0.42 mg/ml; Colchicum baytopiorum bitki
ekstresinin C-4 I için 0.01mg/ml ve Vero için 0.04 mg/ml olduğu saptandı. Colchicum
baytopiorum bitki ekstresinin yüksek seçicilik [seçicilik indeksi (SI)=4] gösterdiği belirlendi.
Colchicum sanguicolle ve Colchicum baytopiorum bitki ekstrelerinin IC50 konsantrasyonlarının
uygulanması sonucu hücrelerde ortaya çıkan sitotoksik etki ve bu etkide hücre ölüm
mekanizmalarının rolleri araştırıldı. Apoptotik hücre ölümüne ait morfolojik değişiklikler, faz
kontrast ve 4'-6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile floresan mikroskopta gösterildi. Daha sonra
apoptoz oranı, apoptotik indeks (AI) parametresi ile değerlendirildi. C-4 I ve Vero hücreleri
üzerine bitki ekstreleri uygulanmasının 24., 48. ve 72. saatteki AI değerinin konsantrasyon ve
saate bağlı olarak arttığı saptandı (p˂0.01).
ÇEŞİTLİ BİTKİ EKSTRELERİNİN HÜCRE ÖLÜM MEKANİZMALARI
ÜZERİNE ETKİLERİNİN DOKU KÜLTÜRÜNDE ARAŞTIRILMASI
xvi
Yüksek seçicilik gösteren 0.01 mg/ml konsantrasyondaki Colchicum baytopiorum bitki
ekstresinin C-4 I hücreleri üzerine 24, 48 ve 72 saat uygulanmasından sonra QIAxcel Advanced
cihazında kapiller jel elektroforez sistemi kullanılarak DNA fragmentasyonu incelendi. Ayrıca,
kaspaz 3,7 ve kaspaz 9'un zamana bağlı aktiviteleri, spektroflorometre ile tespit edildi. Kaspaz
3,7 ve kaspaz 9 aktivasyonunun artmış olduğu saptandı (p ˂0.05).
Hücre ölüm tiplerinden apoptoz, otofaji, entoz, nekroptoz ve anoikis ile ilgili genlerin
anlatımlarının incelenmesi ve bunlarla ilgili moleküler mekanizma yolaklarının
değerlendirilmesi için qRT-PCR yöntemi kullanıldı. Kaspaz 3, 8, 9, bcl-xL, bid, bad, bax, bak,
bcl-2, mcl-1, Puma, Noxa, Akt1, TRAF2, Fas, FADD, TRADD, TNFα, TNFR1, bif-1, BNIP-3,
Atg5, Atg12, Atg16, Beclin1, LC3, ERK1, Bim, Bit1, FAK, MAP kinaz, ILK, Src kinaz, Rho,
ROCK, Atg 7, RIP1, RIP3, CYLD, FLIP, IAP genlerinin mRNA seviyelerine bakıldı. Elde
edilen bulgulara göre, C-4 I hücrelerinde Atg12, Atg16, Atg5, Atg7, bad, bak, bax, bcl-xL,
Beclin1, kaspaz3, FLIP, Puma, LC3, mcl-1, Bit1, Rho, RIP1, ROCK ve TRAF2 genlerinin
mRNA anlatım seviyelerinin kontrol grubuna göre anlamlı oranda (FC≥ |1.5|) arttığı gözlendi.
IAP, Src kinaz ve TNF genlerinin mRNA düzeyinde ise aşağı regülasyon saptandı.
Sonuç olarak değerlendirilen parametreler doğrultusunda, Colchicum baytopiorum bitkisinin
yaprak kısmından hazırlanan ekstrenin 0.01 mg/ml konsantrasyonunun yüksek seçicilik
gösterdiği belirlendi. Colchicum baytopiorum bitki ekstresinin bu etkisinin yanında, C-4 I
hücrelerinde apoptoz ile beraber otofajik hücre ölümü yolağında genlerin anlatımlarını arttırdığı
ortaya konularak literatüre katkı sağlandı.

Abstract:
In this thesis, it was aimed to investigate the cytotoxic effects of plant extracts of two different
species from Colchicum genus, which are endemic for our country, on normal and cancer cells;
and to determine which cell death mechanisms in cancer cells are triggered with its effect. In
this context, Effects of Colchicum sanguicolle K.M. Persler and Colchicum baytopiorum C.D.
Brickell which on cell index under the case of 6 different concentrations (2.5, 1, 0.25, 0.1, 0.025,
0.01 mg/ml) of the methanol extracts are applied on C-4 I (cancer-acquired cell) and Vero
(normal cell) cells and IC50 concentrations of this plants were determined by the xCELLigence
system. IC50 values of 6 different concentrations, which were prepared from the plant extracts
were detected as 0.40 mg/ml in C-4 I and 0.42 mg/ml in Vero for Colchicum sanguicolle; 0.01
mg/ml in C-4 I and 0.04 mg/ml in Vero for Colchicum baytopiorum. It was determined that
Colchicum baytopiorum plant extract has high selectivity [selectivity index, SI=4].
The cytotoxic effect which occured as a result of the application of IC50 concentrations of
Colchicum sanguicolle and Colchicum baytopiorum plant extracts and the role of cell death
mechanisms in this effect were investigated. The morphological changes belong to the apoptotic
cell death was shown by using phase contrast and fluorescence microscopies with 4'-6-
Diamidino-2-phenylindole (DAPI). After that, apoptosis rate was assessed by apoptotic index
(AI) parameter. It was determined that AI values of the plant extract treatment on C-4 I and
Vero cells in 24th, 48th, and 72nd hours increased depending on concentration and time (p
˂0.01).
INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF VARIOUS PLANT EXTRACTS
ON CELL DEATH MECHANISMS ON TISSUE CULTURE
xviii
DNA fragmentation was investigated using capillary gel electrophoresis system in QIAxcel
Advanced after 24, 48 and 72 hours of treatment of Colchicum baytopiorum plant extract at
0.01 mg/ml concentration on C-4 I cells which shows high selectivity. In addition, the timedependent
activities of caspase-3,7 and caspase-9 were determined with spectrofluorometer.
Caspase 3,7 and caspase 9 activation were found to be increased (p ˂0.05).
The qRT-PCR method was used to investigate the expression of the genes related to the
apoptosis, autophagy, entosis, necroptosis and anoikis among the cell death types and evaluate
their molecular mechanisms. The mRNA levels were examined in the genes of caspase 3, 8, 9,
bcl-xL, bid, bad, bax, bak, bcl-2, mcl-1, Puma, Noxa, Akt1, TRAF2, Fas, FADD, TRADD,
TNFα, TNFR1, bif-1, BNIP-3, Atg5, Atg12, Atg16, Beclin1, LC3, ERK1, Bim, Bit1, FAK, MAP
kinase, ILK, Src kinase, Rho, ROCK, Atg 7, RIP1, RIP3, CYLD, FLIP, IAP. It was observed
that mRNA expression of Atg12, Atg16, Atg5, Atg7, bad, bax, bax, bcl-xL, Beclin1, caspase3,
FLIP, Puma, LC3, mCl-1, Bit1, Rho, RIP1, ROCK and TRAF2 genes in the C-4 I cell line was
significantly increased (FC≥ |1.5|) according to the control group. It was observed downregulation
on mRNA levels of IAP, Src kinase and TNF genes.
As a result, it was determined that the 0.01 mg/ml concentration of extract prepared from the
leaves of Colchicum baytopiorum plants showed high selectivity. In addition to this effect of
Colchicum baytopiorum plant extract, an increasing expression of genes in autophagic cell
death pathways with apoptosis on C-4 I cells was contributed to the literature.