Mikrobiyal biyofilm tabakası üzerine farklı fiziksel ve kimyasal etkenlerin incelenmesi
Investigation of different physical and chemical agents on microbial biofilm layer
Yazar: CANSU VATANSEVER
Danışman: DOÇ. DR. İRFAN TÜRETGEN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Biyofilm sistemleri = Biofilm systems ; Biyofilmler = Biofilms ; Legionella pneumophila = Legionella pneumophila ; Legionellosis = Legionellosis ; Lejyoner hastalığı = Legionnaires disease ; Soğutma kuleleri = Cooling towers

Özet:
Suda yaşayan mikroorganizmalar çeşitli sebeplerden dolayı bir yüzeye tutunarak biyofilm tabakası meydana getirirler. Bu tabaka, canlı veya cansız bir yüzeye tutunarak, kendi ürettikleri polimerik yapıda jelsi matriks (EPS) içinde yaşayan mikroorganizma topluluğu olarak tanımlanır. Mikroorganizmalar tarafından meydana getirilen EPS tabakası bir çimento gibi rol oynayarak mikroorganizmaların yüzeye geri dönüşümsüz olarak tutunmalarını sağlarken, aynı zamanda bakterileri besinsizlik, avcı protozoonlar, sıcaklık ve pH dalgalanmaları, dezenfektan uygulamaları, biyositler, toksinler ve kuruluk gibi değişen çevresel şartlara karşı da korumaktadır.Biyofilmler, Legionella cinsini de kapsayan farklı cinsteki mikroorganizmaları da barındırabilirler. Özellikle soğutma kulesi suyunun uygun derecedeki sıcaklığı nedeniyle biyofilm yapısı içinde hayatta kalabilen ve üreyebilen Legionella türleri, soğutma kulesi fanları tarafından meydana getirilen aerosoller aracılığıyla çevreye yayılmaktadırlar. Legionella pneumophila, insanda Legionelloz'un en yaygın sebebidir ve yetişkinlerde, hastane kaynaklı ve toplulukla ilişkili pnömoni'nin ortak nedenidir.Soğutma kuleleri dışında, su dağıtım sistemleri, borular, depolar, diş üniteleri, gıda üretim ekipmanları gibi su ile temas eden pek çok yüzeyde biyofilm tabakası meydana gelmektedir. Söz konusu yüzeylerde meydana gelen biyofilm tabakası ile mücadelede gerek fiziksel gerekse kimyasal yöntemler kullanılmaktadır. Fakat EPS tabakası, mikroorganizmaları bir kalkan gibi koruduğundan dolayı pek çok metot mücadelede yetersiz kalmaktadır. Ortamın sıcaklığında, pH ve ozmotik yoğunluğunda meydana gelen değişimler, biyofilm bakterileri tarafından algılanmakta ve bakteriler arasında veya bakteri içinde yapılan genetik düzenlemelerle biyofilm içinde bulunan bakteriler direnç kazanmaktadırlar. Bununla birlikte jelsi yapıdaki matriks, dezenfektanların biyofilmin iç kısmındaki bakterilere ulaşmasını engelleyerek veya geciktirerek mikroorganizmaları korumaktadır.Ülkemizde hastane, alış veriş merkezi, endüstriyel tesisler ve otel gibi çok katlı binaların büyük bir kısmında soğutma kuleleri kullanılmaktadır. Kule suyunun mikroorganizmalardan arındırılması için en sık kullanılan metot dezenfeksiyon uygulamasıdır. Fakat yapılan rutin uygulamaların, biyofilm üyesi mikroorganizmalar ve özellikle Legionella bakterisi üzerindeki etkisi ile ilgili çalışmaların sayısı oldukça azdır. Ayrıca, hipotez konumuz olan farklı fiziksel ve kimyasal stres kaynaklarının biyofilm tabakasındaki bakteriler üzerindeki etkileri konusunda fazla çalışma bulunmamaktadır.Bu çalışmada, soğutma kulesinden alınan kule suyu ve Legionella pneumophila ATCC 33152 suşu aşılanmış soğutma kulesi model sisteminde 6 aylık süre boyunca sisteme yerleştirilen cam kuponlar üzerinde biyofilm tabakası oluşumuna olanak sağlanmıştır. Aylık olarak alınan toplam 22 adet kupon, 24 saat süreyle her bir parametre için 2'şer adet olmak üzere, farklı sıcaklık, pH, ozmotik konsantrasyon ve farklı dozlardaki dezenfektana maruz bırakılmıştır. 24 saatin bitiminde söz konusu parametrelerin L. pneumophila ve aerobik mezofilik heterotrofik bakterilere (HB) etkisi izlenmiştir ve epifloresan mikroskop yardımıyla ölü/canlı mikroorganizma sayıları tespit edilmiştir. Ayrıca cam kupon yüzeyinde oluşan biyofilm tabakası kantitatif olarak ölçülmüştür.Çalışma sonucunda biyofilm tabakasındaki L. pneumophila ve aerobik heterotrofik bakterilerin, sıcaklık ve pH değişimleri ile ozmotik şok ve şok dezenfeksiyona karşı direnç gösterdikleri tespit edilmiştir. Ayrıca kullanılan klasik kültür metodu ve epifloresan mikroskopi tekniğinin sonuçları karşılaştırıldığında, mikroorganizmaların karşılaştıkları olumsuz şartlar karşısında canlılıklarını korudukları fakat kültüre edilebilirliklerini kaybederek VBNC (viable but non culturable) fazına geçtikleri tespit edilmiştir.

Abstract:
Microorganisms which are living in water can adhere to the surfaces because of many different reasons and develop biofilm layers on surfaces. This layer can described as a `Bacterial community which adhering to live or dead surface by producing a polymeric matrix called extracellular polymeric substances (EPS)?. This EPS layer acts as cement for microorganisms for irreversible attachment to surfaces and can protect microorganisms from nutrient limitations, temperature and pH alteration, biocides, toxins or short-term drying.Biofilm can harbor variety of different genera, including Legionella. Particularly, the suitable water temperature range in cooling tower water favors the growth and survival of L. pneumophila in cooling tower and this microorganism can disseminated over a wide field through the aerosols which are produced by cooling tower fan. L. pneumophila is the most frequent cause of human legionellosis and a relatively common cause of community-acquired and nosocomial pneumonia in adults.Besides cooling towers, surfaces that subject to biofilms are systems which include water as network water pipes, dental units, food producing equipments and some medical equipments. Some chemical and physical decontamination weak against methods are biofilm layer. EPS layer can protect microorganisms as a shield. Exchanges of environment?s temperature, pH and concentration sensed by biofilm microorganisms and bacteria become more achieve resistant trough genetic regulations. Furthermore, matrix can protect the bacteria through the medium of inhibit or delay disinfectant?s penetration to biofilm bacteria.In our country, cooling towers are frequently used in some buildings such as hospitals, shopping centers, hotels. Disinfection is most widely used method for controlling microorganisms, but so far no reliable data was found about the effect of routine applications on biofilm microorganisms and L. pneumophila.In this study, biofilm formation has been allowed for six month-period on glass microscope slides in a cooling tower water added model system which is experimentally infected by L. pneumophila ATCC 33152 and some cooling tower as primer inoculum. Totallay 22 coupons have been taken and analyzed after 24 hours exposition to different conditions of temperature, pH, concentration and different doses of disinfectants, and at the end of the 24 hours of exposure, effects of these parameters on aerobic heterotrophic bacteria and L. pneumophila are followed. Furthermore, number of live/dead microorganisms were analyzed by epifluorescence microscopy. Additionally, the biofilm amount on glass slides were analyzed quantitatively.It has determined that biofilm layer can protect microorganisms from pH and temperature alterations, osmotic shock and shock disinfection. According to the results of culture and epifluorescence microscopy, it is revealed that microorganisms started to enter VBNC (viable but not culturable) phase.