Belinostat'ın (PCD101) MCF-7 meme kanseri kök hücrelerinde etkinliğinin araştırılması
Investigation of the effect of belinostat (PXD101) on MCF-7 breast cancer stem cells
Yazar: ZELİHA TUNCER
Danışman: PROF. DR. ERCAN KURAR
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Belinostat = Belinostat ; Kök hücreler = Stem cells ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Meme kanseri dünya genelinde olduğu gibi Türkiye'de de kadınlar arasında en sık görülen kanser türü olmaya devam etmektedir. Tümör gelişimi ve metastazından sorumlu olduğu düşünülen 'kanser kök hücreleri' kanser kitlesi içinde bulunan hücre popülasyonudur. Normal kök hücreler gibi kanser kök hücrelerde birçok farklı hücreye farklılaşabilme özelliğine sahiptir. Kanser kök hücreleri terapötik direncin gelişimde rol alan kilit bir mekanizmada önemli rolü bulunmaktadır. Epigenomikteki son gelişmeler, epigenetik düzenlemenin kanser tedavisine katkıda bulunduğu anahtar mekanizmaları aydınlatmıştır. Epigenetik modüle edici ilaçlar, kanser tedavisi için kanser kök hücreleri hedefleyen yeni yaklaşımlar ile umut vaat etmektedir. Belinostat, periferal T hücreli lenfoma tedavisi için FDA tarafından 2014'te onaylanan bir histon deasetilaz inhibitörüdür. Son zamanlarda Belinostat maling ve maling olmayan hastalıkların tedavisinde yaygın şekilde kullanılmaya başlanmıştır. Bu yüzden, Belinostat'ın meme kanseri kök hücreleri üzerindeki etkisinin araştırılmasının literatüre katkı sağlayacağı düşünülmüştür. 

	Belinostat'ın MCF-7 kanser hücrelerinde hücre canlılığına etkisi XTT yöntemi ile belirlenmiştir. Belinostat'ın MCF-7 hücrelerinde kaspaz-3 aktivitesi, kaspaz-3 analizi ile belirlenmiştir. Belinostat uygulaması sonrası MCF-7 hücrelerinden FACS yöntemi ile CD44+/CD24-  kanser kök hücreler elde edilmiştir. FACS yöntemi ile elde edilen kanser kök hücrelerinin tümörfaz oluşumu incelenmiştir. HEK-293, MCF-7 ve MCF-7 kanser kök hücrelerden RNA izolasyonu ve cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Apoptoz, Metastaz, Wnt, Hedgehog, Notch ve kök hücre belirteçleri ile ilişkili genlerin ifadesindeki değişiklikler kantitatif gerçek zamanlı PZR (qPZR) ile analiz edilmiştir. 

	Belinostat'ın MCF-7 kanser hücrelerinde IC50 değeri 48 saat için 5 μM olarak bulunmuştur. Kaspaz-3 aktivitesinde anlamlı olmayan bir artış tespit edilmiştir. FACS analizi sonuçlarına göre MCF-7 kanser hücrelerinin %2'sinin kanser kök hücre olduğu saptanmıştır ve Belinostat'ın IC50 değeri muamelesi sonrasında MCF-7 hücre miktarında %44 ve MCF-7 CD44+/CD24- kök hücre miktarında ise %66 oranında azalma gözlenmiştir. Tümörfaz ile kök hücre varlığı doğrulanmıştır. qPZR sonuçlarına göre, Belinostat uygulaması sonrası, MCF-7 kanser kök hücrelerinde Wnt, metastaz, Notch, Hedgehog kendini yenileme yolaklarında önemli genler ile kök hücre belirteci genlerinde anlamlı azalışa neden olduğu saptanmıştır.  

Çalışmadan elde edilen bulgular, Belinostat'ın meme kanseri kök hücrelerinde farklılaşma ve kendini yenileme yolakları üzerinden etkili olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Breast cancer continues to be the most common type of cancer among women worldwide as well as in Turkey. Cancer stem cells which are thought to be responsible for tumor development and metastasis, are the cell population within the cancer mass. Cancer cells, like normal stem cells, have the ability to differentiate into many different cells. Cancer stem cells have a key mechanism of therapeutic resistance. Recent developments in epigenomics have highlighted key mechanisms in which epigenetic regulation contributes to cancer treatment. Epigenetic modulating drugs promises novel approaches targeting cancer stem cells for cancer treatment. Belinostat is a histone deacetylase inhibitor approved by the FDA in 2014 for the treatment of peripheral T-cell lymhoma. Recently, Belinostat has been widely used in maling and non-maling diseases. Therefore, it is thought that investigating the effect of Belinostat on breast cancer stem cells will contribute to the literature.
	
	The effect of Belinostat on cell viability in MCF-7 cancer cells was determined by XTT method. Caspase-3 activity in MCF-7 cells of Belinostat was determined by the Caspase-3 assay kit. After Belinostat application, CD44+/CD24- MCF-7 cancer stem cells were isolated from by FACS method. Tumor sphere formation were examined using the cancer stem cells obtained by the FACS method. RNA isolation and cDNA synthesis were performed from HEK-293, MCF-7 and MCF-7 cancer stem cells. Changes in expression of genes associated with apoptosis, metastasis, Wnt, Hedgehog, Notch, and stem cell markers were analyzed by quantitative real-time PCR (qPZR).

	The IC50 value of Belinostat in MCF-7 cancer cells was found to be 5 μM for 48 hours. No significant change in caspase-3 activity was detected. According to FACS analysis, 2% of MCF-7 cancer cells were found to be cancer stem cells and after treatment of the IC50 value of Belinostat. MCF-7 cell count was decreased by %44 and MCF-7 CD44+/CD24- stem cell count was decreased by %66. Stem cells presence were confirmed by tumor sphere assay. According to the qPZR results, it was found that in the gene expression of apoptosis, metastasis, Wnt, Notch, Hedgehog, stem cell marker genes were downregulated in general after Belinostat application.

According to the results of this study Belinostat is effective in differentiation and self- renewal of breast cancer stem cells.