Fosfolipaz A2 enzimiin afinite-ultrafiltrasyon ile saflaştırılması
Purification of phospholipase A2 by affinity-ultrafiltration
Yazar: MUSTAFA TEKE
Danışman: PROF.DR. AZMİ TELEFONCU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
ÖZETFOSFOLİPAZ A2 ENZİMİNİNAFİNİTE-ULTRAFİLTRASYONİLE SAFLAŞTIRILMASITEKE, MustafaDoktora Tezi, Biyokimya Anabilim DalıTez Danışmanı: Prof. Dr. Azmi TELEFONCUAğustos 2006,181 SayfaFosfolipaz A2'ler (PLA2; EC 3.1.1.4) fosfogliseridlerin sn-2 yağasidi ester bağını hidrolizleyerek serbest yağ asitleri ve lizofosfolipitleriayıran çeşitli enzim ailesidir. sn-2 pozisyonundaki yağ asidi çoğunluklaaraşidonik asittir (AA). Prostaglandinler, prostasiklinler vetromboksanlar siklooksigenaz yoluyla, lökotrienler lipoksigenaz yoluylaAA'den sentezlenirler. PLA2 hidroliz ürünü olan lizofosfolipit hücresinyal iletiminde, fosfolipidin yeniden modellenmesinde ve membranınbozulmasında çok önemlidir. Bu rollere ek olarak PLA2, son zamanlardasistematik ve akut inflamator şartlardan kansere kadar değişen geniş birpatofizyolojik durumun içinde yer almakla tanınmaktadır. Gittikçe artansayıdaki bir çok farmakolojik inhibitör fizyolojik koşullarda PLA2'lerinrolünü tanımlamaya yardımcı olacaktır. Bu sebeple farklı kaynaklardanPLA2'lerin saflaştırılması ve karakterizasyonu son derece önemlidir.Memeli PLA2 enzimleri büyüklükleri, salgılanma kapasiteleri vekalsiyuma bağımlılıkları açısından sınıflandırılmak istenirse; düşükmolekül kütleli Ca2+-bağımlı salgılanan enzimler(sPLA2), yüksekmolekül kütleli Ca2+-bağımlı sitozolik enzimler (cPLA2) ve Ca2+-bağımsız enzimler(iPLA2) olarak sınıflandırılır. Memeli pankreası veyılan zehirinde PLA2'ler oldukça fazla miktarda bulunmaktadır ve bunedenle saflaştırılmış ve kapsamlı olarak çalışılmıştır. Buna karşın, diğerhücre ve doku kaynaklarında da bulunan bu enzimler eser miktardadır veiyi tanımlanmamıştır. Bu enzimler sığır bağırsağı, tavşan ve sıçaninflamator salgıları, sıçan ve insan plateletleri, sıçan dalağı, sıçankaraciğeri ve romatizmalı hastaların eklem sıvılarından saflaştırılmıştır.Bu çalışmada, üç farklı afinite reçinesi tarafımızdan sentezlendi.%Verim ve saflaştırma katı açısından en iyi sonucu kitosan-glutaraldehid-substratla oluşturulan reçine verdi. Bu reçine, bir PLA2substratı olan fosfatidiletanolaminin kitosanla ilişkilendirilerek sudaçözünür makromoleküler bir reçinenin geliştirilmesi esasındagerçekleştirilmiştir. Ultrafiltrasyon teknikleriyle birlikte makroligand,sığır pankreasından PLA2'nin saflaştırılmasında kullanılmıştır.Reçineden bağlı PLA2'nin elüsyonu için optimum koşullar incelendi.Ayrıca saf enzimin bazı karakteristik özellikleri ve kinetiği belirlendi.Reçinenin tekrar kullanılabilirliliği de incelendi.Anahtar kelimeler: Pankreatik Fosfolipaz A2, PLA2 saflaştırılması,afinite-ultrafiltrasyon

Abstract:
ABSTRACTPURIFICATION OF PHOSPHOLIPASE A2 BYAFFINITY-ULTRAFILTRATIONTEKE, MustafaPhD in BiochemistrySupervisor: Prof. Dr. Azmi TELEFONCUAugust 2006, 181 pagesPhospholipases A2 (PLA2; EC 3.1.1.4) are a diverse family ofenzymes that hydrolyze the sn-2 fatty acid ester bond ofphosphoglycerides, liberating free fatty acids and lysophospholipids. Thefatty acid at the sn-2 position is mainly arachidonic acid(AA). From AAprostaglandins, prostacyclins and thromboxanes are formed by thecyclooxygenase-dependent pathway and leukotrienes are synthesized bythe lipoxygenase-dependent pathway. The other product of PLA2 action,lysophospholipid, is very important in cell signaling, phospholipidremodeling, and membrane perturbation. In addition to its roles,phospholipase A2 has recently been recognized to be involved in a widenumber of pathophysiological situations, ranging from systematic andacute inflammatory conditions to cancer. A growing number ofpharmacologic inhibitors will help define the role of particularphospholipase A2s in physiological conditions. Because of these factsthe purification and characterization of phospholipase A2 from differentsources has a great importance. The mammalian PLA2 enzymes, ifsubdivided on the basis of size, secretory capabilities and calciumrequirements, fall broadly into three groups: low molecular weight Ca2+-dependent secreted enzymes(sPLA2), high molecular weight Ca2+-dependent cytosolic enzymes(cPLA2) and the Ca2+-independentenzymes(iPLA2). PLA2 from mammalian pancreas and snake venomsare abundant and consequently have purified and extensively studied.PLA2 from other cell and tissue sources, in contrast, are trace enzymesand not well defined. Related enzymes have been purified from bovineintestine, rabbit and rat inflammatory exudate, rat and human platelets,rat spleen, rat liver, and from the joint fluid of patients with rheumatoidsarthritis.In this study, we have synthesized three different affinity resins.Chitosan-glutaraldehyde-substrate resin given the best result in terms ofyield% and purification fold for PLA2 purification. The resin, thedevelopment of a macromolecular water soluable resin based on chitosanbearing phosphatidylethanolamine, a PLA2 substrate, was attempted.Together with ultrafiltration techniques, the macroligand was employedto purify PLA2 from bovine pancreas. The optimum conditions forelution of bound PLA2 from the resin were investigated. Furthermore,some characteristic properties of the purified enzyme and the kineticswere determined. Reusability of the resin was also investigated.Keywords: Pancreatic PhospholipaseA2, PLA2 purification,affinity-ultrafiltration