Yaygın değişken immün yetmezlik tanılı hastalarda LRBA defektinin araştırılması
Investigation of LRBA defect in patients with common variable immunodeficiency
Yazar: DENİZ NAZİRE ÇAĞDAŞ AYVAZ
Danışman: PROF. DR. FEYZİ İLHAN TEZCAN
Hacettepe Üniversitesi / Çocuk Sağlığı Enstitüsü / İmmünoloji Ana Bilim Dalı / İmmünoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Mutasyon = Mutation ; İmmün yetmezlik = Immun deficiency ; İmmünite = Immunity

Özet:
Primer immün yetmezlikler immün sistemle ilişkili genlerde sık görülen genellikle Mendelyan geçiş sonucunda ortaya çıkan heterojen bir hastalık grubudur. "Yaygın değişken immün yetmezlik" (YDİY) ise primer immün yetmezlikler içerisinde en sık görülen hastalık grubudur. Primer antikor eksikliği ve antikor cevap yokluğu ile karakterizedir. 2012'den sonra tanımlanan LRBA 'LPS responsive beige-like anchor protein' gen defekti hipogamaglobulinemi, antikor eksikliği ve özellikle otoimmünite ve inflamatuvar barsak hastalığı benzeri bulgularla başvuran hastalarda düşünülmesi gereken defektlerden biridir.
Çalışmamızda amaç, Pediatrik İmmünoloji Ünitesi'ne Eylül 2013 - Eylül 2014 arasında başvuran ve hipogamaglobulinemi, otoimmünite ve lenfoproliferasyon ile seyreden YDİY hastalarında, hastalığın genetik etmeni olabileceği düşünülen LRBA gen mutasyonlarını gen ve protein düzeyinde araştırmaktı.
Pediatrik İmmünoloji Ünitesi'ne başvuran ve hipogamaglobulinemi ve otoimmünite klinik bulgularıyla seyreden hastalarımızdan 30'u LRBA gen defekti açısından protein analizi ile tarandı. Üç hastamızda Western Blot analizi ile protein yokluğu, dört hastada da Sanger sekans analizi ile LRBA gen defekti gösterildi. Toplam beş hastada LRBA protein ve/veya gen defekti saptanmıştır. Otuz hastaya ek olarak LRBA gen defekti bilinen bazı hastaların kardeşlerinde ve HLA uyumlu akraba donörlerinde de defekt bölgesi Sanger sekans analizi ile değerlendirildi. Bazı donörler Western blot analizi ile protein düzeyinde de değerlendirildi. 
Kardeş ve donörlerin bazılarında mutasyonlar heterozigot olarak saptanırken homozigot mutasyona rastlanılmadı. Ayrıca kök hücre nakli yapılan bir hastanın da nakil sonrası LRBA protein ekspresyonu Western Blot analizi ile nakil öncesi ile karşılaştırmalı olarak değerlendirildi. Nakilden sonra ekspresyonun artmış olduğu tespit edildi. Çalışmamızla tanı alan iki hasta ile birlikte toplam beş hastaya Sanger sekans analizi ile defekt olmadığı saptanan HLA uyumlu donörlerinden hematopoietik kök hücre nakli planlanmış, dördüne nakil yapılmıştır, biri izlemde kaybedilmiştir.
LRBA defekti tanılı hastaların klinik durumları değerlendirildiğinde hastalığın oldukça ağır, nakil yapılmadığı takdirde fatal seyirli bir tablo olduğu görülmektedir. Bu nedenle YDİY ve ALPS fenotipi olan hastaların bu defekt açısından değerlendirilmesinin hızla gerçekleştirilmesi gerektiği açıktır. Bu çalışma ile hastalıkla ilişkili genotip fenotip karşılaştırmasının doğru yapılabilmesi için, LRBA ile ilişkili olarak yapılan araştırmanın sadece protein düzeyde yapılmasının yanlış sonuçlara götürebileceği görülmektedir. Bu nedenle hem genetik hem de protein düzeyinde araştırma yapılması amaç olmalıdır. Ayrıca Western Blot analizi sırasında LRBA proteininin moleküler ağırlığı büyük bir protein olması nedeniyle degredasyon riski gözönünde bulundurulmalıdır.
Çalışmamız sonucunda iki hastada moleküler defekt hem protein analizi hem de sekans analizi ile kesinleşmiştir. Hastalıklarını açıklayacak defekt bulunmayan diğer hastaların da daha ayrıntılı yeni nesil genom dizileme ile yani YDİY hastalığına neden olabilecek genetik defektlerin panel şeklinde çalışılması veya tüm genom analizleri ile değerlendirilmeleri gerekmektedir.  
Anahtar Sözcükler: LRBA eksikliği, YDIY

Abstract:
Primary immunodeficiencies are extremely heterogeneous group of disorders generally caused by Mendelian inheritance. "Common Variable Immunodeficiency" (CVID) is considered as one of the most common disease of the primary immune deficiencies. It is characterized by primary antibody deficiency and lack of antibody response. The LRBA defect, which was defined after 2012, is one of the defects to be considered in patients with hypogammaglobulinemia, antibody deficiency and especially those with autoimmune and inflammatory bowel disease-like findings.
The aim of our study was to investigate LRBA mutations which are thought to be genetic cause of the disease in gene and protein level, in patients with CVID, who admitted to the Pediatric Immunology Unit with hypogammaglobulinemia and autoimmunity.
Thirty patients who were admitted to the Pediatric Immunology Unit and having clinical features of hypogammaglobulinemia, lymphoproliferation and autoimmunity were evaluated for LRBA gene defect. In three patients, by Western blot analysis protein absence is shown and in four patients by Sanger sequence analysis LRBA defect was shown. Totally in five patients LRBA was found to be defective in protein and/or gene level. In addition to thirty patients, the defect site was also assessed by Sanger sequence analysis in the siblings of patients with known LRBA gene defects and in HLA-matched related donors.
Some donors were also assessed at the protein level by Western blot analysis. While heterozygosity was detected in some of the siblings and donors, homozygous defects were not found. In addition, post-transplant LRBA protein expression in a patient with stem cell transplantation was compared with pre-transplant expression by Western Blot analysis. It was determined that the expression was increased after the transplantation. A total of five patients, including two which was diagnosed with our study were planned to be treated with hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) from their HLA-compatible donors who were found to have no LRBA defect by our study, HSCT is performed in four, one is diseased in the follow-up. 
When the clinical status of patients with LRBA defects is evaluated, it is seen that the disease is very severe and fatal when transplantation is not performed. Therefore, it is clear that patients with CVID and ALPS phenotypes should be evaluated rapidly for this defect. In this study, it can be seen that if we want to compare the disease-related genotype phenotype correctly, LRBA-related research only performed at the protein level can lead to incorrect results. For this reason, both genetic and protein level research should be the aim. In addition, the risk of degradation must be predicted during Western Blot analysis as the molecular weight of the LRBA protein is high.
As a result of our study, the molecular defects in two patients were confirmed by both protein analysis and sequence analysis. Other patients who have no defects to explain their disease need to be evaluated with next-generation genome sequencing. Genetic defects that may cause CVID disease should be evaluated by gene panels or by whole genome sequencing.
Keywords: LRBA deficiency, CVID