Bazı bitkisel östrojenlerin Drosophila melanogaster'de genotoksik etkilerinin belirlenmesi ve folik asit kullanılarak bu etkilerin iyileştirilmesi üzerine araştırmalar
The determination of the genotoxic effects of some phytoestrogens on Drosophila melanogaster and studies on the improvement of these effects by using folic acid
Yazar: HAKAN AŞKIN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. HANDAN UYSAL
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, insan ve hayvanların beslenmesinde kullanılan doğal ve kültüre alınmış bitkilerde biyolojik etkileri birbirine benzeyen 6 farklı bitkisel östrojenin (genistein, daidzein, glisitein, koumestrol, kuersetin ve zearalenone) olası genotoksik etkileri ile folik asidin antimutajenik etkileri Drosophila kanat somatik mutasyon ve rekombinasyon testi (SMART) ile araştırıldı. Deneylerimizin tümünde Drosophila melanogaster'in mwh/flr3 genotipine sahip 72±4 saatlik trans-heterozigot larvaları kullanıldı. Larvalar, bitkisel östrojenlerin farklı dozlarını içeren Drosophila instant medium ile kronik olarak beslendi. Kullanılan bitkisel östrojenlerin etkileri, uygulama sonunda larvalardan çıkan ergin sineklerin kanat imajinal disk hücrelerindeki genetik değişimler (nokta mutasyon, delesyon, ayrılmama, rekombinasyon) sonucunda oluşan mutant trikomlara göre değerlendirildi. Mutant trikom değerlendirmeleri, küçük tek tip, büyük tek tip, ikiz klon, toplam mwh ve toplam klon sınıflandırmaları esas alınarak yapıldı.Genotoksik etkileri araştırılan 6 bitkisel östrojenin her birisi için dört doz çalışıldı. Bu dozların genotoksik etkilerini belirlemek için 1, 2, 5 ve 10 mM dozlar kullanıldı. Ancak, genistein, daidzein, kuersetin ve zearalenonun yüksek dozlarda (özellikle 5-10 mM) Drosophila larvalarına toksik etki göstermesi ve bundan dolayı bu dozlar da birey elde edilemediği için uygulamalar daha seyreltik dozlar olan 1, 3, 5 ve 10 µM'lık bir seri halinde uygulandı.Çalışmamızın ikinci aşamasında tüm bu bitkisel östrojenlerin en yüksek dozu olan 10 µM ile birlikte folik asidin 10 µM dozu larvalara aynı besi ortamında uygulandı. Hem bitkisel östrojen, hem de bitkisel östrojen + folik asit uygulama grupları ayrı ayrı olmak üzere, elde edilen bireylerin kanat preperatları mwh/flr3 (normal kanat fenotipi) genotipi ve mwh/TM3 (serrat kanat fenotipi) genotipi için ayrı ayrı 40 kanat çifti olacak şekilde hazırlandı.Uygulamalar sonucunda, glisitein ve koumestrol tüm dozlarda genotoksik açıdan negatif ya da önemsiz genotoksisite, diğer dört bitkisel östrojen ise doz artışına bağlı olarak genellikle pozitif genotoksisite gösterdi. Normal kanat fenotipi için toplam mutasyon frekansına bakıldığında, genotoksisite sırası kuersetin (%0.89), zearalenon (%0.64), genistein (%0.58) ve daidzein (%0.53) olarak belirlendi.Bu çalışmada kullanılan bitkisel östrojenlerin negatif ya da pozitif genotoksisik etkileri belirlenerek folik asidin bu etkilere karşı anti-genotoksik olduğu tespit edildi.

Abstract:
In this study, the potential genotoxic effects of six different phytoestrogens (genistein, daidzein, glisitein, koumestrol, quercetin and zearalenone) whose biological effects bear similarities in natural and cultured plants which are used in feeding animals and human beings, and antimutagenic effects of folic acid were researched via using Drosophila wing somatic mutation and recombination test (SMART). In the experiments, larvae of 72±4 hours trans-heterozygote which have the mwh/flr3 genotype of Drosophila melanogaster, were used. The larvae were fed chronically with Drosophila instant medium containing different concentrations of phytoestrogens. The effects of phytoestrogens used were evaluated considering the mutant trichomes. These trichomes came into being as a result of the genetic changes (point mutation, deletion, non-disjunction, and recombination) on the wing imaginal disc cells of the mature flies emerging from the larva after the experiment. The evaluations of mutant clones were done based on small single, large single, twin, total mwh and total spot classifications.We worked on four concentrations of each of the 6 phytoestrogens whose genotoxic effects were researched. In order to determine the genotoxic effects of these doses in a wider spectrum we used concentrations of 1, 2, 5 and 10 mM. However since genistein, daidzein, quercetin and zearaleon cause toxic effects on Drosolphila larvae at high concentrations (especially 5-10 mM) and as individuals can not be obtained in these concentrations, the experiments were carried out at a serial of 1, 3, 5 and 10 µM concentrations which are more diluted.In the second stage of our study, we applied by far the highest dosage of these phytoestrogens, which is 10 µM, together with the 10 µM dosage of folic acid on the larva in the same feeding environment. The wing preparates of the obtained individuals were prepared as 40 wing couples respectively for mwh/flr3 (normal wing phenotype) and mwh/TM3 (serrat wing phenotype) genotype. As a result of the applications glisitein and koumestrol yielded in all concentrations either negative or inconclusive genotoxicity in terms of genotoxic. However the other four phytoestrogens on the whole showed positive genotoxicity depending on the increase in concentration. With regard to the total mutation frequency for normal wing phenotype the order of the genotoxicity was: quercetin (0.89%), zearalenon (0.64%), genistein (0.58%), and daidzein (0.53%). The negative or positive genotoxic effects of the plant estrogens used in this study were determined and it was found out that folic acid is anti-genotoxic against these effects.