Astenozoospermide mitokondriyal otofajinin oksidatif stresle ilişkisinin araştırılması
Investigation of the relationship between mitochondrial autophagy and oxidative stress in asthenozoospermia
Yazar: KÜBRA NUR UZUN
Danışman: DOÇ. DR. ŞULE AYLA ; PROF. DR. İLKNUR KESKİN
İstanbul Medipol Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Otofaji = Autophagy ; Sperm = Spermatozoa ; İnfertilite =

Özet:
Hasarlı mitokondrilerin ortadan kaldırılması mitofaji olarak adlandırılmaktadır. Bu süreçte meydana gelen herhangi bir aksaklık sperm hareketi için gerekli enerjiyi üreten mitokondrilerin fonksiyonundaki bozulmaları artırarak oksidatif stres ve apoptozla ilişkili daha büyük problemlere yol açabilmektedir. Astenozoospermide mitofajinin insan sperminde ilk defa değerlendirildiği bu çalışmada otofaji ilişkili protein ATG-5 ve erken apoptoz belirteci sitokrom c (cyt-c) proteini immünfloresan görüntülendi, protein miktarları western blot ile incelendi.  Mitokondrilerin işlevselliğini gösteren mitokondriyal membran potansiyeli JC-1 boyası ile ölçüldü. Ayrıca mitofajinin oksidatif stresle ilişkisini değerlendirmek için oksidatif stres belirteçleri MDA ve AOPP ile antioksidanlardan GSH-Px , SOD, GSH ve FRAP seviyeleri astenozoopermi ve normosperm örneklerinde incelenmiştir. Son olarak mitokondrilere dair görsel değerlendirme için elektron mikroskobik takip yapılmıştır. Sonuçlarımıza göre yüksek MMP'li sperm yüzdesi astenozoospermi grubunda oldukça düşük bulunmuştur. Astenozoospermi grubunda MDA ve AOPP seviyelerinin arttığı ve dolayısıyla oksidatif stresin arttığı görülmüştür. Bununla beraber antioksidan seviyeleri normospermi grubunda daha yüksek bulunmuştur. ATG-5 ve cyt-c ifadeleri spermlerin baş, boyun ve kuyruk bölgelerinde lokalizeydi. Dolayısıyla ATG-5'in boyunda ifadesi ve o bölgede mitokondrilerin yoğun bulunması mitofajide rol oynadığını düşündürmektedir. Protein ekspresyonları incelendiğinde ATG-5 ve cyt-c astenozoospermi grubunda normosperm grubuna göre daha yüksek bulunarak anlamlı fark göstermiştir. Bu nedenle ATG-5 astenozoospermide artmış mitofaji aktivasyonu ile ilişkili bulunmuştur. ATG-5 ve cyt-c ekspresyonları arasında korelasyonun bulunması otofaji ve apoptoz arasındaki çapraz etkileşimi göstermektedir. İnce yapısal düzeyde sperm boyun kısmı ve mitokondriler incelendiğinde krista organizasyonunda bozulmalar, mitokondrilerde şişme ve otofagozom benzeri membran oluşumlarına astenozoospermi grubunda rastlanmıştır. Bulgular doğrultusunda astenozoospermide oksidatif stresin artmasına paralel olarak hem mitofajinin hem de apoptozun arttığı ve bunun spermlerde hareket problemine neden olduğu sonucuna varılmıştır. Mitofajideki artış hasarlı mitokondrilerin hücreden hızlıca uzaklaştırılmasını sağlama maksatlı olsa da ATG-5'in aşırı üretimi spermlerin apoptoza gitme oranını artırmıştır.

Abstract:
The elimination of damaged mitochondria is called mitophagy. Any disruption that occurs during this process can lead to disturbances in the function of mitochondria that produce the necessary energy for sperm motility, increasing oxidative stress and potentially leading to more significant problems associated with apoptosis. In this study, mitophagy was evaluated for the first time in human sperm in asthenozoospermia. Autophagy-related protein ATG-5 and the early apoptosis marker cytochrome c (cyt-c) protein were visualized by immunofluorescence, and protein levels were examined with western blot. Mitochondrial membrane potential (MMP), which indicates the functionality of mitochondria, was measured with JC-1 dye. Additionally, oxidative stress markers MDA and AOPP, as well as antioxidant levels of GSH-Px, SOD, GSH, and FRAP, were examined in asthenozoospermia and normosperm samples to evaluate the relationship between mitophagy and oxidative stress. Finally, electron microscopy was conducted for a visual assessment of mitochondria. According to our results, a high percentage of sperm with high MMP was found to be significantly lower in the asthenozoospermia group. In the asthenozoospermia group, MDA and AOPP levels were increased, indicating an increase in oxidative stress. Furthermore, antioxidant levels were higher in the normosperm group. ATG-5 and cyt-c expressions were localized in the head, neck, and tail regions of the sperm. Therefore, the expression of ATG-5 in the neck region, where mitochondria are densely found, suggests its role in mitophagy. When protein expressions were examined, ATG-5 and cyt-c were found to be significantly higher in the asthenozoospermia group compared to the normosperm group, indicating increased mitophagy activation associated with ATG-5 in asthenozoospermia. The correlation between ATG-5 and cyt-c expressions suggests cross-talk between autophagy and apoptosis. At the ultrastructural level, disruptions in cristae organization, mitochondrial swelling and autophagosome-like membrane formations, were observed in asthenozoospermia. In line with these findings, it was concluded that an increase in both mitophagy and apoptosis occurred in asthenozoospermia parallel to the increase in oxidative stress, leading to motility problems in sperm. While an increase in mitophagy aims to quickly remove damaged mitochondria, the overproduction of ATG-5 increased the rate of sperm undergoing apoptosis.