Denizkestanesi, Paracentrotus lividus'un immün sistem hücrelerinde glikan profilinin CapLC-ESI-MS/MS sistemi ve floresan mikroskobu ile belirlenmesi
Determining the glycan profile of the sea urchin (Paracentrotus lividus) immune system cells via the CapLC-ESI-MS/MS system and the fluorescence microscope
Yazar: ECEM ŞENER
Danışman: DOÇ. DR. REMZİYE DEVECİ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Glikoproteinlerin glikozilasyon profilleri, işlevleri üzerinde doğrudan etkilidir. Farklılaşma, yaşlanma ve ölüm mekanizmalarının yanı sıra, pek çok hastalık da glikokonjugatlardaki glikozilasyon değişmeleriyle ve/veya glikanların tanınmasıyla ilgili olarak ortaya çıkmaktadır. Bağışıklık sisteminde temel mekanizma bağışıklık sistem hücrelerinin patojenleri ve parazitleri tanıyarak, tutunup onları yok etmesidir. Hücreler arasındaki tutunma ve tanıma olaylarını, hücrelerde bulunan glikolipitlerin, glikoproteinlerin ve proteoglikanların kısaca glikokonjugatlardaki şeker birimleri ve üzerinde taşıdıkları ek gruplar (sübstütientler) belirler. Bu nedenle çalışmanın amacı; bağışıklık sistem fonksiyonlarında (hücre tanıma-tutunma ve sinyal iletimi gibi) da çok önemli görevleri olan glikanların, denizkestanesi immün sistem hücrelerindeki dağılımını analitik (CapLC-ESI-MS/MS) ve mikroskobik (floresan) yöntemlerle belirlemektir.
Çalışma materyali, denizkestanesi P.lividus'un ergin bireylerinden alınan immün sistem hücreleridir. Denizkestanelerinin vücut boşluğundan alınan sölomik sıvı içerisine pıhtılaşmayı engelleyen isosmotik solüsyon (ISO-EDTA) eklenmiştir. İmmün sistem hücrelerindeki glikan profilinin Cap-LC-ESI-MS/MS sistemi ile analizi için örnekler hidroliz, reasetilasyon ve türevlendirme işlemlerinden sonra cihaza verilmiştir. Floresan Mikroskobu ile glikan profilinin belirlenmesi için ise FITC işaretli WGA (Triticum vulgaris agglutinin), WGA-suc (Triticum vulgaris-succsinyl agglutinin), PSL (Polyporus squamosus), HPA (Helix pomatia agglutinin) ve PNA (Arachis hypogaea agglutinin) lektinleri ile hücreler inkübe edilmiş ve floresan ataçmanlı araştırma mikroskobunda fotoğraflanmıştır.
İmmün sistem hücrelerinin CapLC-ESI-MS/MS sistemi ile analizi sonucu mannoz, riboz, N-asetilglukozamin, glukoz, N-asetilgalaktozamin, galaktoz, arabinoz, ksiloz ve fukoz monosakkaritleri belirlenmiştir. Pik alanlarının hesaplanmasıyla sırasıyla en fazla glukoz, galaktoz ve fukoz bulunmuştur. İmmün sistem hücre tiplerine göre glikan profilinin belirlenmesi için uygulanan FITC işaretli lektinlerden ß-GlcNAc ve sialik asit (Sia) yapılarına özgün WGA lektin ile ışımalar Sia'ya özgün olmayan WGA-suc lektin ile ışımalara göre daha yoğun olarak belirlenmiştir. Bu bulgu immün sistem hücrelerinde Sia varlığını göstermektedir. 5. Karbonundan asetilli Sia'nın (Neu5Ac), ?-2,6 bağına özgün olan PSL lektinlerle işaretlenme oranları düşüktür. P.lividus'ta Neu5Gc'nin temel Sia olması, bu sonuçla uyumludur. ?-GalNAc yapısına özgün HPA lektinle floresan ışımalar ß-Gal yapısına özgün PNA lektine oranla daha fazladır.
Denizkestanesi bağışıklık sisteminde görev alan immün hücrelerinin glikan yapılarının belirlenmesi ve diğer omurgasız ve omurgalı sistemlerle benzerliklerinin açıklanması ile yüksek omurgalıların bağışıklık sisteminin eksik ve karmaşık noktalarının anlaşılması açısından önemlidir.
Anahtar Kelimeler: İmmün sistem hücreleri, Sölomosit, Glikanlar, CapLC-ESI-MS/MS, FITC işaretli lektin, Denizkestanesi Paracentrotus lividus

Abstract:
The glycosylation profiles of glycoproteins are directly involved in their function. Differentiation, aging and death mechanisms as well as many diseases are associated with the glycosylation modifications of glycoconjugates and/or the recognition of glycans. The essential mechanism within immune systems is the recognition of pathogens and parasites by the immune system cells, which attach to their targets and destroy them. The saccharide units and additional substituents attached to glycolipids, glycoproteins and proteoglycans ?i.e. glycoconjugates-, determine such inter-/intracellular recognitions and bindings. Hence, the aim of this study is to determine the distribution of glycans, which play essential roles within the immune system (inter-/intracellular recognition-binding and signal transduction etc.), on the sea urchin immune system cells via analytical (CapLC-ESI-MS/MS) and microscopic (fluorescence) methods. 
The study material is the immune system cells obtained from adult sea urchin P.lividus. The coelomic fluid obtained from the body cavity of sea urchins was mixed with an anticoagulant isosmotic solution (ISO-EDTA). In order to analyze the glycan profiles of the immune system cells with the CapLC-ESI-MS/MS system, the samples underwent hydrolyzation, reacetylation and derivatization steps followed by their flow through the device. In order to determine the glycan profile via the fluorescence method, the cells were incubated with FITC conjugated WGA (Triticum vulgaris agglutinin), WGA-suc (Triticum vulgaris-succsinyl agglutinin), PSL (Polyporus squamosus), HPA (Helix pomatia agglutinin) and PNA (Arachis hypogaea agglutinin) lectins and then photographed with a fluorescence microscope. 
As a result of the CapLC-ESI-MS/MS analysis of immune cells; mannose, ribose, N-acetylglucosamine, glycose, N-acetylgalactosamine, galactose, arabinose, xylose and fucose monosaccharides were detected. A peak-area calculation analysis revealed the most prevalent saccharides as glycose, galactose and fucose respectively. Fluorescence analysis, which was performed in order to determine the cell-specific glycan profiles, came out with higher intensity emission signals obtained from the FITC-conjugated lectin WGA, which is specific to ß-GlcNAc and sialic acid (Sia), in comparison to the emission obtained from the Sia unspecific WGA-suc lectin. This finding indicates the existence of Sia within immune system cells. Staining levels of Sia, which is acetylated on its 5' carbon (Neu5Ac), with PSL lectins specific to ?-2,6 bond are low. This finding is in line with the fact that the Neu5Gc is the main Sia in the P.lividus. Fluorescent emissions from the HPA lectin, which is specific to ?-GalNAc, were detected at a higher level compared to those obtained from the PNA lectin, which is specific to ß-Gal. 
Determination of the glycan structures of the sea urchin immune system cells and elucidating their similarities among other invertebrate and vertebrate systems is vital in terms of understanding the uncovered complex features of the immune systems of higher vertebrates. 
Key words: Immune system cells, Coelomocyte, Glycans, CapLC-ESI-MS/MS, FITC conjugated lectin, Sea urchin Paracentrotus lividus