Schizosaccharomyces pombe'de gua1 geninin knock-out tekniği ile delesyona uğratılması
Deletion of gua1 gene with knock-out technique in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: MERVE YILMAZER
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SEMİAN KARAER UZUNER
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Bu çalışmada tek hücreli ve ökaryotik bir model organizma olan Schizosaccharomyces pombe'de guanozin monofosfatın (GMP) de novo biyosentezinin ilk aşamasını katalizleyen inozin monofosfat dehidrogenaz (IMPDH) enzimini şifreleyen gua1 geninin "knock-out" tekniği ile delesyona uğratılması amaçlandı.
Schizosaccharomyces pombe'de PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) temelli gen hedefleme yöntemi esas alınarak PCR tekniğiyle "knock-out" kaseti oluşturuldu ve bu kaset Schizosaccharomyces pombe'ye transforme edildi. Çalışmada yabani ırk (972h-) , ura4h- mutant ırkı ve diploid Schizosaccharomyces pombe ırkları kullanıldı. pFA6-kanMX4 plazmidi taşıyan E.coli DH5α ırkından pFA6-kanMX4 plazmidi izole edildi ve "knock-out" kaseti için kalıp olarak kullanıldı. Schizosaccharomyces pombe'nin 972h – (yabani ırk) genom DNA'sı kalıp olarak kullanılarak gua1 geninin iki yanında bulunan 653 ve 285 bç'lik diziler elde edildi ve pFA6 plazmidi kullanımı ile kanamisin direnç genini de içeren kaset meydana getirildi. 653 ve 285 bç'lik diziler ilk PCR sonrası oluşturulurken kaset ikinci PCR sonrasında elde edildi. Lityum asetat yöntemiyle transformasyon sonrası bu kasetin Schizosaccharomyces pombe genomunda gua1 geni içindeki bölgeye homolog rekombinasyonla girişi amaçlandı.
Transformasyona uğratılmış hücreler, "geneticin" içeren YEA besiyerine ekildi. Böylece kaseti genomuna almış olan 972h-, ura4h- mutantı ve diploid koloniler seçildi. Seçilim sonrası diploid kolonilerin haploidizasyonu gerçekleştirildi. Yabani ırk (972h-), ura4h- mutant ırkı ve haploid koloniler "geneticin" içeren YEA, YEA, guanin içeren MMA, urasil ve guanin içeren MMA ve MMA seçici besiyerlerine ekildi. Bu aşamada
xi
guanin mutantı olabilecek koloniler belirlendi. Son olarak delesyonun doğru bölgede gerçekleşip gerçekleşmediği ise koloni PCR ile kontrol edildi. Koloni PCR sonrası bir kolonide beklenen sonuç elde edildi.

Abstract:
In this study, we aimed to deletion of gua1 gene that encodes inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) in eukaryotic model organism Schizosachharomyces pombe. IMPDH catalyzes the first step in de novo biosynthesis of guanosine monophosphate (GMP).
Knock-out cassette was constructed with PCR (Polymerase Chain Reaction)-based gene targeting technique in Schizosaccharomyces pombe and this knock-out cassette was transformed to Schizosaccharomyces pombe. In this study, we used wild type (972h-), ura4h- mutant strain and diploid strain of Schizosaccharomyces pombe. The pFA6-kanMX4 plasmid was isolated from DH5α strain of E.coli that contains pFA6-kanMX4 plasmid and this plasmid was used as template for knock-out cassette. Cassette contains 653 and 285 bp sequences which are upstream and downstream of gua1 gene in S.pombe genome and kanamycin resistance gene obtained from pFA6 plasmid. 653 and 285 bp products were obtained after the first PCR. Template in the first PCR was S.pombe genome. On the other hand, the knock-out cassette was produced after the second PCR. After transformation with lithium acetate method we aimed that this cassette replace with the sequences of gua1 gene via homologous recombination.
The cells cultured in YEA medium with geneticin after transformation. Thus, we could select 972h-, ura4h- mutant and diploid colonies which integrated knock-out cassette to genome via homologous recombination. Haploidizations of diploid colonies were performed and then wild type (972h-), ura4h- and haploid colonies were selected in YEA (yeast extract agar) with geneticin, YEA, MMA (minimal medium agar), MMA
xiii
with guanine and MMA with guanine and uracil. In this step we determined posible mutant colonies in gua1 gene. Finally colony PCR techniques were performed to control whether the deletion is made in the right place or not. After colony PCR expected result was obtained in one single transformant colony.