Reseptör tirozin kinaz benzeri orphan reseptör-1 (ROR1)'e karşı monoklonal antikor geliştirilmesi
Development of monoclonal antibody against receptor tyrosine kinase like orphan receptor-1 (ROR1)
Yazar: RÜMEYSA DOĞAN ŞAHİN
Danışman: DOÇ. DR. ARZU ATALAY
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antikanser = Anticancer ; Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Hibridoma teknolojisi = Hybridoma technology ; Meme kanseri =   ; Monoklonal antikorlar =

Özet:
Reseptör tirozin kinaz ailesinin bir üyesi olan reseptör tirozin kinaz benzeri orphan reseptör-1 (ROR1), embriyogenez süresince nöral, işitsel, iskelet ve vasküler organogenezde hücre sinyalizasyonu, hücresel polarite, farklılaşma, anjiyogenez, hücre göçü ve invazyon gibi kritik fizyolojik süreçlerde rol oynar. Yapılan araştırmalar, fetal gelişim döneminde yüksek düzeylerde ifade edilen ROR1'in, yetişkin dokularda adipoz doku ve pankreas dışında genellikle düşük seviyelerde ya da hiç ifade edilmediğini göstermiştir. Ligandı WNT5a'nın bağlanmasıyla, ROR1 reseptörünün homo- veya hetero-dimerizasyonu çeşitli adaptör proteinleri etkinleştirerek AKT/ERK, Rho/Rac1 GTPazlar, PI3K/AKT ve Hippo-YAP/TAZ gibi sinyal yolaklarını tetiklemektedir. Bu süreçlerin anormal aktivasyonu, hücre proliferasyonu, migrasyonu, farklılaşması ve kemorezistans gibi biyolojik sonuçlara yol açar. Son yıllarda yapılan çalışmalar, ROR1'in normal dokularda düşük düzeylerde ifade edilmesine karşın, birçok kanser hücresinde aşırı ifade edildiğini ve ilişkili sinyal yolaklarının aşırı aktivasyonunun, ROR1'i bilimsel araştırmalar, tanı ve tedavi için önemli bir terapötik hedef haline getirdiğini ortaya koymuştur. Bu çalışmada, rekombinant insan ROR1 antijeni ile fareler immünize edilmiş ve ardından hibridoma teknolojisi kullanılarak stabil anti-ROR1 monoklonal antikor salgılayıcı klon (8D4-F2-A6-A8-A1) elde edilmiştir. Stabil salgılayıcı klondan üretilen antikor başarıyla saflaştırılmış ve IgG2b-kappa tipinde olduğu belirlenmiştir. Antikorun rekombinant ROR1 (rROR1) antijenine bağlanma kapasitesi, ELISA ve immünblotlama yöntemleriyle doğrulanmıştır. Ayrıca antikorun endojen ROR1 ifadesini tespit yeteneği immünblotlama ve immünpresipitasyon teknikleri ile değerlendirilmiş; kanser hücreleri üzerindeki etkinliği ise WST-1 hücre canlılık testi ve xCELLigence gerçek zamanlı analiz sistemi ile test edilmiştir. Antikorun hücre döngüsüne olan etkisi ve olası apoptotik etkileri akım sitometri ile değerlendirilmiştir. Ayrıca antikorun CDR bölgelerinin analiz edilebilmesi için ağır ve hafif zincir PCR ile çoğaltılmıştır. 8D4-F2-A6-A8-A1 anti-ROR1 monoklonal antikoru bilimsel literatüre katkı sağlayabilecek potansiyelde olup, diyagnostik ve terapötik etkinliğinin belirlenmesi için kapsamlı ileri araştırmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor-1 (ROR1), a member of the receptor tyrosine kinase family, plays a critical role in physiological processes such as cell signaling, cellular polarity, differentiation, angiogenesis, cell migration, and invasion during embryogenesis, particularly in neural, skeletal, and vascular organogenesis. Studies have shown that ROR1 expression declines significantly after fetal development and is either absent or expressed at low levels in most adult tissues, except for adipose tissue and the pancreas. Upon binding with its ligand, WNT5a, ROR1 undergoes homo- or hetero-dimerization, activating signaling pathways such as AKT/ERK, Rho/Rac1 GTPases, PI3K/AKT, and Hippo-YAP/TAZ through the activation of various adaptor proteins. Dysregulation of these pathways results in biological processes such as cell proliferation, migration, differentiation, and chemoresistance.Recent studies have revealed a strong association between ROR1 and various human cancers. While ROR1 expression is low or absent in most normal tissues, its overexpression in multiple cancer cells and the hyperactivation of related signaling pathways have established ROR1 as a significant therapeutic target for cancer diagnosis and treatment.In this study, mice were immunized with recombinant human ROR1 antigen, and a stable anti-ROR1 monoclonal antibody-secreting clone (8D4-F2-A6-A8-A1) was generated using hybridoma technology. The antibody produced from this stable clone was successfully purified and characterized as an IgG2b-kappa subtype. The binding capacity of the antibody to recombinant ROR1 (rROR1) antigen was confirmed using ELISA and immunoblotting techniques. Furthermore, the antibody's ability to detect endogenous ROR1 expression was evaluated using immunoblotting and immunoprecipitation assays, while its effects on cancer cells were assessed through the WST-1 cell viability assay and the xCELLigence real-time cell analysis system. The impact of the antibody on the cell cycle and its potential apoptotic effects were evaluated using flow cytometry. Additionally, the antibody's CDR regions were analyzed by amplifying the heavy and light chains through PCR. The 8D4-F2-A6-A8-A1 anti-ROR1 monoclonal antibody holds significant potential for contributing to the scientific literature, and further comprehensive studies are required to determine its diagnostic and therapeutic efficacy.