Embriyonik döneme ait koşullu mediumların indüklenmiş pluripotent kök hücreler üzerindeki etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of embryonic period-conditioned media on induced pluripotent stem cells
Yazar: ALEYNA DEMİR
Danışman: PROF. DR. GÜLPERİ ÖKTEM
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Temel Bilimler Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Bir sperm ve yumurta hücresinin birleşmesiyle oluşan zigot, hızla bölünerek önce morulayı, ardından blastosisti meydana getirir. Blastosist aşaması, bu minik hücre topluluğunun gelişiminde kritik bir dönemeçtir. Blastosistin dış yüzeyinde trofoblast hücrelerinin yer aldığı trofoektoderm adı verilen bir yapı, iç kısmında ise embriyonun tüm organ ve dokularını oluşturacak olan iç hücre kitlesi yer alır. Trofoektodermde yer alan trofoblast hücreleri plasentayı oluştururken, iç hücre kitlesi pluripotent hücrelerden oluşur ve bu hücreler ileride embriyonun tüm vücut hücrelerine dönüşme potansiyeline sahiptir. Embriyonik kök hücreler de bu iç hücre kitlesinden üretilir. Ancak, embriyonik kök hücrelerin etiksel kullanım sınırlamaları nedeniyle indüklenmiş pluripotent kök (induced Pluripotent Stem-iPS) hücreler gibi alternatif çözümler önem kazanmıştır ve bu nedenle iPS hücreleri memeli gelişimini in vitro ortamda incelemek için güçlü bir model sunar. 
Pluripotent kök hücreler, çevrelerindeki tüm hücrelerde farklılaşmayı tetikleyebilme yeteneğine sahiptir ve bu etkiyi salgıladıkları biyolojik maddeler, yani sekretomlar aracılığı ile gerçekleştirir. Sekretomların farklılaşmayı teşvik edebileceğini gösteren birçok çalışma bulunmaktadır. Bunun yanı sıra, hücrelerin içinde bulundukları mikroçevre, bu farklılaşmayı yönlendiren kritik bir unsurdur. Mikroçevrenin kimyasal, biyolojik ve fiziksel özellikleri, pluripotent hücrelerin yönelimini doğrudan etkileyebilir. Bu nedenle, güncel bir yaklaşım olarak mikroçevreyi destekleyen sekretomlar ve dolayısıyla koşullu medyumlar, araştırma ve geliştirme çalışmalarında sıkça konu olmaktadır. iPS hücreleri kullanılarak in vitro blastoidlerin üretimi, etik sorunları azaltabilir ve erken dönem memeli gelişimiyle ilgili temel araştırmalar için yeni alternatif modeller sunabilir.
Bu tez çalışmasında, çeşitli koşullu medyumlar kullanılarak iPS hücrelerinin blastoide farklılaşabilme potansiyeli incelenmiştir. Üç germ yaprağını oluşturmaya hazır olan blastosist sekretomu ile trofoblast ve iPS hücrelerinden elde edilen sekretomların bu farklılaşmayı nasıl etkilediği araştırılmıştır. Başka bir deyişle, bu çalışma kapsamında, embriyonik döneme ait blastosist koşullu medyum, trofoblast koşullu medyum ve iPS koşullu medyum + Trofoblast koşullu medyum ile kültüre edilen iPS hücrelerinin blastoid oluşumu yönünde bir gelişim gösterip göstermediğini belirlemek amaçlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan blastosist sekretomu, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Üremeye Yardımcı Tedavi Merkezi'ne gelen hastalardan elde edilmiş olup, doğal ortamında hem embriyonik kök hücre hem de trofoblast sekretomlarını içermektedir. Bu koşullu medyum, embriyonik döneme ait medyumların iPS hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için önemli bir kaynak sağlamaktadır. Embriyonik döneme ait medyumların, iPS hücreleri üzerinde farklılaşmayı tetikleyici etkileri olup olmadığı bu projenin kilit sorularından biridir ve bu konuda literatürde sınırlı bilgi bulunmaktadır.
Blastoid yönünde bir gelişimi izlemek için ilk olarak iPS hücreleri belirtilen koşullu medyumlar ile 6 gün boyunca kültüre edilmiş ardından iç hücre kitlesi yani pluripotensi biyobelirteçleri (Oct4, Nanog, Sox2, Klf4)  ve trofoektoderme özgü (Cdx2, Krt7) biyobelirteçler ile immünofloresan analizler yapılmıştır. Ardından taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizi ile hücre morfolojileri incelenmiştir.
Elde edilen sonuçlar, kullanılan koşullu medyumların iPS hücreleri üzerinde belirgin bir farklılaştırıcı etki yarattığını ortaya koymaktadır. Morfolojik değerlendirmeler, deney gruplarında oluşan yapıların standard iPS hücre morfolojisinden uzaklaşarak blastoid benzeri bir görünüme kavuştuğunu, ancak boyut açısından gerçek blastoidlere tam olarak uymadığını göstermiştir. İmmünofloresan analizi sonuçlarına göre, deney gruplarındaki hücrelerde pluripotensi biyobelirteçlerinin ekspresyonlarının azalması ve sadece deney gruplarında Cdx2 ve Krt7 ekspresyonlarının görülmesi, WT-1 iPS hücrelerinin trofoblastik bir farklılaşma yönünde olabileceğini göstermektedir.

Anahtar Kelimeler; indüklenmiş Pluripotent Kök (iPS) hücre; trofoblast; blastosist; sekretom; mikroçevre; koşullu medyum

Abstract:
The zygote, formed by the fusion of a sperm and an egg cell, undergoes rapid divisions to form a morula, followed by the blastocyst. The blastocyst stage is a critical turning point in the development of this small cluster of cells. The outer surface of the blastocyst comprises the trophoblast cells, forming a structure known as the trophectoderm, while the inner cell mass, located within, consists of pluripotent cells that will give rise to all the organs and tissues of the embryo. The trophoblast cells in the trophectoderm contribute to the formation of the placenta, whereas the inner cell mass, composed of pluripotent cells, has the potential to differentiate into all cell types of the embryo. Embryonic stem cells are also derived from this inner cell mass. However, due to ethical limitations surrounding the use of embryonic stem cells, alternative solutions such as induced pluripotent stem (iPS) cells have gained significance, offering a robust model for studying mammalian development in vitro.
Pluripotent stem cells possess the ability to induce differentiation in surrounding cells, a process mediated through the biological substances they secrete, known as secretomes. Numerous studies have demonstrated the potential of secretomes to promote differentiation. Furthermore, the microenvironment in which cells reside plays a critical role in directing this differentiation. The chemical, biological, and physical characteristics of the microenvironment can directly influence the trajectory of pluripotent cells. Consequently, secretomes that support the microenvironment, and thus conditioned media derived from them, have become focal points in research and development. The use of iPS cells for the production of in vitro blastoids not only addresses ethical concerns but also offers novel alternative models for fundamental research into early mammalian development.
In this thesis, the potential of iPS cells to differentiate into blastoids using various conditioned media was investigated. The study examined how blastocyst secretome, which is prepared to form the three germ layers, as well as secretomes derived from trophoblast and iPS cells, influence this differentiation. In other words, the aim was to determine whether iPS cells cultured in blastocyst conditioned medium, trophoblast conditioned medium, and iPS conditioned medium + trophoblast conditioned medium exhibited developmental progression toward blastoid formation. The blastocyst secretome used in this study was obtained from patients at the Ege University Faculty of Medicine Assisted Reproductive Treatment Center and naturally contain both embryonic stem cell and trophoblast secretomes. This conditioned medium provided a valuable resource for examining the effects of embryonic period media on iPS cells. Whether embryonic period media have differentiation-inducing effects on iPS cells is one of the key questions of this project, and there is limited information on this topic in the literature.
To observe potential blastoid development, iPS cells were first cultured for six days in the specified conditioned media. Subsequently, immunofluorescence analyses were performed to examine pluripotency biomarkers (Oct4, Nanog, Sox2, Klf4) associated with the inner cell mass and biomarkers specific to the trophectoderm (Cdx2, Krt7). Cell morphology was then analyzed using scanning electron microscopy (SEM).
The findings indicate that the conditioned media applied exert a pronounced differentiating effect on iPS cells. Morphological assessments show that the structures formed in the experimental groups deviated from standard iPS cell morphology, adopting a blastoid-like appearance, although they did not fully align with the size criteria of real blastoids. According to the immunofluorescence analysis results, the decrease in the expression of pluripotency biomarkers in the experimental groups and the observation of Cdx2 and Krt7 expression exclusively in these groups suggest that WT-1 iPS cells might be directed toward trophoblastic differentiation.

Keywords; induced Pluripotent Stem (iPS) cells; trophoblast; blastocyst; secretome; microenvironment; conditioned medium