Klorokin ve gama radyasyonunun oluşturduğu ince bağırsak hasarına karşı aposininin etkileri
The effects of apocynin against chloroquine and gamma radiation induced intestinal injury
Yazar: AYÇA SEZEN US
Danışman: PROF. DR. NİHAL ÖMÜR BULAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Genel Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology
Dizin: Aposinin = Apocynin ; Gama radyasyonu = Gamma radiation ; Klorokin = Chloroquine ; Otofaji = Autophagy ; İnce bağırsak = Small intestine

Özet:
Radyoterapi günümüzde en etkili kanser tedavi yöntemlerinden biri olarak önemini korumaktadır. Bazı kanser hücrelerinde sağlıklı hücrelerde olduğu gibi besin ve oksijen yetersizliğinde hücrenin sağkalımı için otofajik bir süreç devreye girer. Radyoterapiye yanıt olarak gelişen otofaji bu tedavi yöntemini kısıtlar. Klorokin (CQ) anti malaryal bir ilaç olarak seksen yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır. Son yıllarda CQ bir otofaji inhibitörü olarak gösterilmiş ve yoğun ilgi görmeye başlamıştır. CQ uygulanan bazı tümör hücrelerinin otofaji yapamadığı ve enerjisini tüketerek öldüğü çeşitli çalışmalar ile gösterilmiştir. Radyoterapiye cevap olarak otofaji baskılandığında hücrelerin apoptoza gitme oranında ciddi bir artış ve sonuçta tümör boyutunda ciddi bir küçülme olduğu gösterilmiştir. İndirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) oksidaz (NOX), reaktif oksijen türlerinin (ROT) üretiminden sorumlu membrana bağlı enzimatik bir komplekstir. Yapılan çalışmalarda NOX kaynaklı ROT'un otofajiyi başlattığı tespit edilmiştir. Aposinin (APO) etkili bir NOX inhibitörü olarak bilinen antioksidan ve antiapoptotik özellikleri olan bir maddedir. Çalışmamızda kanser tedavisinde radyoterapiye destek olarak CQ kullanılmasının sağlıklı dokular üzerinde nasıl bir hücresel yanıt oluşturacağının belirlenmesi ve bu kombine tedavi yanıtında antioksidan rolü ile APO'nun koruyucu etkilerinin ilk kez ortaya konması amaçlanmıştır. 
Bu çalışmada rastgele seçilen laboratuvar hayvanları her birinde 7'şer adet Wistar albino sıçan bulunan sekiz gruba ayrıldı. Birinci ve ikinci gruba fizyolojik tuzlu su, üçüncü ve beşinci gruba CQ, dördüncü ve altıncı gruba APO, yedinci ve sekizinci gruba CQ ve APO enjekte edildi. Tüm enjeksiyonlar intraperitoneal (i.p.) yolla ve 5 gün boyunca 24 saatte bir olmak üzere beş kez yapıldı. Beşinci enjeksiyonlardan bir saat sonra ikinci, beşinci, altıncı ve yedinci gruplara 8 Gray (Gy) tüm vücut radyasyon ışınlaması yapıldı. Radyasyon verildikten bir gün sonra disekte edilen sıçanlardan ince bağırsak dokuları alındı. İnce bağırsak dokusunda meydana gelen histolojik değişimler hematoksilen-eozin (HE), Masson'un üçlü boyası (Masson) ve Periyodik Asit Schiff (PAS) reaksiyonu uygulanarak, otofaji inhibisyonu otofagozomun spesifik kargo proteini (p62) belirteci ile, hücre proliferasyonu prolifere hücre nuklear antijeni (PCNA) belirteci ile immünohistokimyasal olarak belirlendi. Biyokimyasal olarak otofaji için otofagozomal biyobelirteç olarak mikrotübül ile ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3 (LC3) ve lizozomal inhibisyon için lizozomal membran ile ilişkili protein 2 (LAMP 2), apoptoz için sistein aspartat spesifik proteaz 3 (kaspaz-3) ve B-hücre lenfoma 2 (BCL-2), oksidatif stresin varlığı ve değişimi için NOX, miyeloperoksidaz (MPO) ve malondialdehit (MDA), inflamasyonun varlığı ve değişimi için Tümör nekroz faktör -α (TNF- α) belirteçleri ile enzime bağlı immünosorban yöntem (ELISA) yöntemi kullanıldı. Ayrıca rutin biyokimyasal yöntemler ile oksidatif stresin varlığı ve değişimi için lipit hidroperoksit (LPO), antioksidan etkinin varlığı ve değişimi için total antioksidan kapasite (TAK), süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (KAT) ve glutatyon (GSH) belirteçleri kullanıldı. 
Sonuç olarak çalışmamızda, radyasyonun sıçan ince bağırsağında önemli ölçüde histolojik hasar oluşturduğunu, oksidatif hasar parametrelerinde belirgin bir artışa, antioksidan sistemde zayıflamaya sebep olduğunu, antiproliferatif, inflamatuvar ve apoptotik etkilere sahip olduğunu aynı zamanda otofajiyi uyardığını belirledik. RAD ile verilen CQ'nun oksidatif stresi arttırdığını, antioksidan kapasiteyi zayıflattığını, antiproliferatif ve antiinflamatuvar etkilere sahip olduğunu, apoptoz üzerinde ise tek başına önemli bir değişime sebep olmadığını tespit ettik. CQ'nun otofajinin lizozomal basamağındaki inhibisyon etkisiniden dolayı bu grupta  p62, LC3 II ve LAMP 2 seviyelerinde önemli artış gözlemledik  APO'nun RAD ve CQ'nun meydana getirdiği bu değişimleri önemli ölçüde tersine çevirmesi ise koruyucu etkisini göstermektedir. Sonuçlarımızın klinik uygulamalara ışık tutabileceğini öngörmekteyiz.

Abstract:
Today, radiotherapy maintains its importance as one of the most effective cancer treatment methods. As in healthy cells, in some cancer cells, an autophagic process is activated for the survival of the cell in nutrient and oxygen deficiency. Autophagy, which develops in response to radiotherapy, limits this treatment modality. Chloroquine (CQ) has been used as an antimalarial drug for over eighty years. In recent years, chloroquine has been shown as an autophagy inhibitor and has begun to attract great attention. Various studies have shown that some tumor cells treated with CQ cannot autophagy and die by consuming their energy. It has been shown that when autophagy is suppressed in response to radiotherapy, there is a significant increase in the rate of apoptosis of cells, resulting in a significant reduction in tumor size. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase (NOX) is a membrane-bound enzymatic complex responsible for the production of reactive oxygen species (ROT). Studies have shown that NOX-induced ROT initiates autophagy. Aposine (APO) is a substance with antioxidant and antiapoptotic properties, known as an effective NOX inhibitor. In our study, it was aimed to determine how the use of CQ as a support to radiotherapy in cancer treatment will create a cellular response on healthy tissues and to reveal the protective effects of APO with its antioxidant role in this combined treatment response for the first time.
In this study, randomly selected animals were divided into eight groups with 7 Wistar albino rats each. Physiological saline to the first and second groups, CQ to the third and fifth groups, APO to the fourth and sixth groups, CQ and APO to the seventh and eighth groups, were injected. All injections were administered intraperitoneally (i.p.) five times, every 24 hours for 5 days. One hour after the fifth injection, 8 Gray (Gy) total body irradiation was applied to the second, fifth, sixth and seventh groups. Small intestine tissues were obtained from dissected rats one day after radiation administration. Histological changes in the small intestine tissue were applied by hematoxylin-eosin (HE), Masson's triple dye (Masson) and Periodic Acid Schiff (PAS) reaction, inhibition of autophagy with the specific cargo protein (p62) marker of autophagosome, cell proliferation, proliferation of cell nuclear antigen (PCNA) was determined by immunohistochemistry. Biochemically, microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3) as autophagosomal biomarker for autophagy and lysosome membrane-associated protein 2 (LAMP 2) for lysosomal inhibition, cysteine aspartate-specific protease 3 (caspase-3) and B-cell lymphoma 2 (BCL-2) for apoptosis, NOX, myeloperoxidase (MPO) and malondialdehyde (MDA) markers for the presence and change of oxidative stress, Tumor necrosis factor -α (TNF-α) markers for the presence and change of inflammation were determined using enzyme-linked immunosorbent method (ELISA). In addition, lipid hydroperoxide (LPO) markers for the presence and change of oxidative stress, total antioxidant capacity (TAK), superoxide dismutase (SOD), catalase (KAT) and glutathione (GSH) markers for the presence and change of antioxidant effect were determined with routine biochemical methods.
As a result of our study, we determined that radiation caused significant histological damage in the rat small intestine, caused a significant increase in oxidative damage parameters, weakened the antioxidant system, had antiproliferative, inflammatory and apoptotic effects, and also stimulated autophagy. We found that CQ given together with RAD increased oxidative stress, weakened antioxidant capacity, had antiproliferative and anti-inflammatory effects, and did not cause a significant change on apoptosis by itself. Due to the inhibition effect of CQ on the lysosomal step of autophagy, we observed a significant increase in p62, LC3 II and LAMP 2 levels in this group. The fact that APO significantly reverses these changes caused by RAD and CQ shows its protective effect. We anticipate that our results may shed light on clinical applications.