"Subtractive" hibridizasyon cDNA kütüphanesinden elde edilen kalbe özgü yeni genlerin genomik organizasyonlarının belirlenmesi ve fonksiyonel analizleri
Prediction of genomic organization and functional analysis of the heart specific novel genes isolated from the subtractive hybridization cDNA library
Yazar: BİLGE ŞADAN ÖZSAİT SELÇUK
Danışman: PROF. DR. NİHAN ÜNALTUNA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Genetik = Genetics ; Kardiyoloji = Cardiology
Dizin: DNA = DNA ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genom = Genome ; Kalp = Heart ; Midnolin = Midnolin ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA

Özet:
Farklılaşmış gen ekspresyonu, araştırılan hücre veya doku tipinin yapısal ve işlevsel özelliğini yansıtmaktadır. "Subtractive" Hibridizasyon, doku veya hücreler arasında ekspresyon düzeyinde farklılık olan genlerin belirlenmesinde oldukça etkin bir yaklaşımdır. Çalışma ekibimiz tarafından daha önce yürütülen çalışmalar kapsamında, yetişkin BALB/c fare kalbine özgü transkriptleri içeren "Subtractive" Hibridizasyon cDNA kütüphanesi oluşturulmuştur. İlerleyen çalışmalarda kalbe özgü olduğu tespit edilen genlerin yetişkin ve embriyonik dönemlerde ekspresyon analizleri yapılmış ve seçilen genlerin fonksiyonel olarak araştırılmasına başlanmıştır.Bu tez çalışmasında, ilk evrede biyoinformatik analiz sonrasında kütüphaneden dört adet aday gen seçilmiş ve qRT-PZR ile gen ekspresyonları araştırılmıştır. Ardından, bu genlerden birisi olan Midnolin (Midn) geninin, kalp dokusunda iskelet kasına oranla 2,4 kat fazla ekspresyonunun olduğu belirlenmiş, primer kardiyomiyoblast kültüründe fonksiyonel olarak araştırılmış ve genomik organizasyonunu belirlenmesine yönelik analizler gerçekleştirilmiştir. Fonksiyonel analizlerin kapsamında primer kardiyomiyoblast hücrelerine Midn genine özgü siRNA transfeksiyonu yapılmıştır. Çalışmanın son evresinde ise Midn geni ile aynı hücresel yolakta olabileceği düşünülen hedef genler belirlenmiş ve bu genlerin siRNA transfeksiyonu sonrasında ekspresyon seviyesindeki değişimler araştırılmıştır. Analizin sonucunda, kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında Midn geninin sessizleştirildiği hücre grubunda, Bat3'ün 3,76 kat, Nedd8'in 2,14 kat, Ubb'nin ise 2,43 kat daha fazla eksprese olduğu belirlenmiştir.İşlevi hakkında kesin bir bilgi olmayan Midn'in, hücresel süreçlerde beraber fonksiyon gördüğü genler ve kardiyomiyoblast hücrelerindeki ekspresyonu ilk defa bu çalışma ile araştırılmıştır. Bu çalışmadan elde edilen bilgilere dayanarak, Midn geninin dahil olduğu hücresel süreçlerin belirlenmesine yönelik araştırmalara devam edilecektir.

Abstract:
Differentiated gene expression reflects the structural and functional characteristics of the studied cells or tissues. Subtractive Hybridization is a valuable approach to determine the differences between cells or tissues at the gene expression level. A Subtractive Hybridization cDNA library, which was specific to adult BALB/c mouse heart tissue, was constructed within the previous studies of our study group. In the next experiments, heart tissue specific genes were analyzed at embryonic, neonatal and adult stages. At present, the study has been expanded with the functional analyses of the selected genes.In the first stage of this study project, four candidate genes were selected from the cDNA library and their gene expressions were analyzed by qRT-PCR. The selection was done depending on the results obtained from the bioinformatics analyses of the entire cDNA library. We found that, one of the candidate genes, Midnolin (Midn), was expressed 2.4 fold higher in heart tissue compared to skeletal tissue. In order to predict the genomic organization of the Midn gene, bioinformatics analyses were performed. Furthermore, in the scope of the functional analyses, cardiomyoblast cells were transfected with siRNA specific to Midn gene. After the silencing of Midn gene, the expression of the target genes that were predicted to be in the Midn pathway were analyzed. We found that, some of the target genes had differentiated expression. As a result, in the cardiomyoblast cells treated with siRNA, the target genes Bat3, Nedd8 and Ubb had 3.76, 2.14 and 2.43 fold higher expressions respectively.As a recently identified protein, no clear function was attributed to Midn. Its expression in cardiomyoblast cells and its co-existing genes has been revealed for the first time with this study. The result derived from this study will be a start point for the next analyses of the Midn pathway.