Subtractıve cDNA hibridizasyon kütüphanesinden seçilen taube nuss geninin fonksiyonel analizi
Functional Analysis of Taube Nuss Gene Selected from Subtractive cDNA Hybridization Library.
Yazar: AYŞE BERNA YÜZBAŞIOĞULLARI
Danışman: PROF. DR. NİHAN ERGİNEL-ÜNALTUNA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Genetik = Genetics ; Genetik belirteçler = Genetic markers ; Hücre döngüsü = Cell cycle ; Hücre kültürü = Cell culture ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA ; Transkripsiyon-genetik = Transcription-genetic

Özet:
Subtractive cDNA kütüphaneleri doku veya hücre dizilerinde farklı olarak eksprese edilen genlerin izolasyonu ve tanımlanmasında güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Laboratuvarımızda daha önceden oluşturulmuş olan subtractive cDNA kütüphanesinde saptanan genler kalbe özgü biçimde eksprese olmaktadır. Önemli bir transkripsiyon faktörü olan Taube Nuss (Tbn) genine ait bir transkript bu kütüphanede saptanmıştır. Bu çalışmanın amacı önce bu genin ekspresyonunu kalp kası dokusunda göstermek ve sonra da kalp hücrelerinde RNAi yöntemi geni ile baskılayarak diğer bazı önemli genlere bu baskılanmanın etkisini saptamaktır.Taube Nuss (Tbn) geni erken fare embriyolarının pluripotent hücrelerin yaşaması ve kalp gelişimi için önemli bir gendir ve hem fare, hem de insanda korunmuştur. Tbn proteininin yokluğunda embriyonik hücrelerin apoptoza girdiği belirlenmiştir. Tbn geninin insandaki homoloğunun Taf8 olduğu saptanmıştır. Bu gen, TFIID (transkripsiyon faktör II D)'nin alt ünitelerinden birini kodlar. Taf8 proteininin etkilediği en önemli hedef gen ise Ppar?'dır.Bu çalışmada gen ekspresyonları Northern Blot ve RT-Qpzr ile gösterilmiş ve RNAi yöntemiyle gen baskılaması gerçekleştirilmiştir. Northern Blot için fare kas ve kalp dokuları kullanılmış ve RT-qPZRiçin kültüre edilmiş ve baskılanmış hücreler kullanılmıştır. Northern Blot ile Tbn geninin kalp ve iskelet kasında eksprese olduğu gösterildikten sonra, gen baskılanması işlemleri Tbn-siRNA molekülleri kullanılarak sıçan kardiyomyoblast H9c2 hücre hattında gerçekleştirilmiştir. Bu hücrelerden elde edilen total RNA, ekspresyon analizi için RT-qPZR'da kullanılmıştır.Transfeksiyon sonrasında 24. ve 48. saatlerde, Tbn baskılanmasıyla birlikte Myocd gen ekspresyonunun azaldığı gözlenmiştir. Yine, 24. saatte Tbn baskılanması ile Ppar? gen ekspresyonu artışı saptanmıştır.Myokardin geni düz ve kalp kasına özgü önemli transkripsiyonel kofaktörlerdendir. Myocd kalp kası ve iskelet kası hücrelerinin farklılaşmasını ve gen ekspresyonlarının düzenlenmesini sağlayan faktörlerdendir. Tbn gen baskılanmasını takip eden Myocd ekspresyonundaki azalma, Tbn geninin de Myokardin'e benzer biçimde, kalp gelişiminde önemli bir rol üstlenebileceğine işaret etmektedir. Ppar? ise Tbn geninin erken embriyonik dönemde etkilediği genlerden biridir. Bu çalışmada kardiyomyoblastlarda Ppar? ekspresyonunun Tbn gen baskılanması ile arttığı saptanmıştır. Önceki bir çalışmada ise Tbn proteininin Ppar? genini baskıladığı bildirilmişti. Her iki bulguya paralel olarak, Tbn'nin Ppar? gen regülatörü olabileceği hipotezi ileri sürülebilir.

Abstract:
Subtractive cDNA libraries provide a powerful approach for identifying and isolating genes that are differentally expressed in defined tissues or cell lines. The genes in the substractive cDNA hybridisation library, which is created in our laboratory are heart-spesific genes. A transcript of Taube Nuss (Tbn) gene, which is an important transcription factor, was idenitified in this library. In this study our aim is to show the expression of Tbn gene in heart tissue and to explore the affect of this gene on other important genes by silencing it in the heart cells using RNAi technique.Taube Nuss gene has a very important impact for heart development. It is a novel gene essential for the survival of pluripotent cells of early mouse embryos. The lack of Tbn protein causes embryonic cell death of apoptosis. Tbn is conserved in human and mouse. The human homolog of Taube Nuss is TAF8. TAF8 is a component of TFIID (transcription factor IID). The main target of TAF8 is PPAR?.In this study we used Northern Blot and RT-qPZRto determine the expression of the gene and RNAi to silence it. mRNA from mouse skeletal and heart tissues were isolated and used for the Northern Blots. Cultured and siRNA treated cells were used in QRT-qPZR. Tbn-siRNA molecules were used to silence the gene expression in H9c2 rat cardiomyocyte cell line. Then this cells were isolated and used in RT-qPCR for expression analysis.After 24 and 48 hours of Tbn-siRNA transfection, Myocd gene expression was shown to be reduced, but Ppar? gene expression increased.Myocardin is a smooth and cardiac muscle-specific transcriptional coactivator. It regulates the expression of a set of cardiac and smooth muscle-specific genes. The reduction of Myocd expression levels by Tbn silencing shows that Tbn may be playing a role in heart development such as Myocd. Ppar? is one of the Tbn gene targets in early embryonic period. This study showed that Tbn gene silencing increased the expression of Ppar?. Previous studies showed that Tbn decreases the expression of Ppar?. Our results confirm a possible role of TBN as a Ppar? regulator.