Botulinum toksininin ve nikotinin sıçan karın derisi perforatör flebinde viyabiliteye ve anjiyogeneze etkisi
Effects of botulinm toxin and nicotine on rat abdominal perforator flap viability and anioenesis
Yazar: ENGİN YOSMA
Danışman: PROF. DR. AHMET DEMİR
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Anjiyogenez inhibitörleri = Angiogenesis inhibitors ; Botulinum toksinleri = Botulinum toxins ; Cerrahi flepler = Surgical flaps ; Cerrahi-plastik = Surgery-plastic ; Nikotin = Nicotine ; Sıçanlar = Rats ; Transplantlar = Transplants

Özet:
Deri flepleri, doku defektlerinin  onarımında sık başvurulan onarım yöntemlerindendir. Flep cerrahisinde başarılı bir onarım için flebin beslenme yeteneği oldukça önemlidir. Son yıllarda plastik cerrahide doku kayıplarının onarılmasında perforatör flepler giderek artan sıklıkta kullanılmaktadır. Perforatör fleplerde meydana gelen kayıplar, tedavi süresi ve maliyeti artırmanın yanında ek morbidite de yaratmaktadır. Cerrahi komplikasyonların en önemli önlenebilir nedenlerinden biri sigara kullanımıdır. Botulinum toksini günümüzde estetik amaçlı kullanımının dışında başka alanlarda da yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada nikotin ve botulinum toksininin perforatör fleplere olan etkileri kontrol grubu ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir.  
Çalışmada 40 adet sıçanda, sağ süperior derin epigastrik arter ikinci kranial perforatör bazlı 6 cm x 6 cm boyutlarında perforatör deri flebi kaldırıldı. Bütün gruplarda flepler kaldırılıp tekrar yerine adapte edildi. Kontrol grubunda hiçbir ilaç uygulanmadı. Nikotin grubuna bir ay boyunca günlük olarak 2 mg/kg subkutan/deri altına nikotin verildi. Botulinum toksin (BTx) grubuna cerrahi işlemden 5 gün önce, pedikülün gireceği bölge dışında kalan toplam 8 adet noktaya 1 IU intradermal botulinum toksin uygulandı. Nikotin + BTx grubuna nikotin ve BTx grubundaki işlemler kombine olarak uygulandı. Çalışmada cerrahi sonrası 7. günde çekilen fotoğraflarda fleplerin nekroz oranları ölçüldü, bu alanlar istatistiksel olarak karşılaştırıldı. Ayrıca alınan doku örnekleri gen ekspresyonu, histopatolojik ve immunhistokimyasal olarak değerlendirildi.
Gruplarda nekrotik flep alanının tüm flebe oranı sırasıyla, kontrol grubunda % 43,43± 18,79 nikotin grubunda % 46,29± 23,36, botulinum toksin grubunda % 25,15± 6,23, nikotin+ botulinum toksin grubunda % 30,20± 5,31 olarak hesaplandı. Nekroz oranları bakımından kontrol ve nikotin grupları karşılaştırıldığında anlamlı fark bulunmadı ( p=0,089). Kontrol grubu ve botulinum toksin grubu karşılaştırıldığında nekroz oranının anlamlı şekilde azaldığı  (p= 0,01), kontrol grubu ve nikotin + botulinum toksin grubu karşılaştırıldığında nekroz oranının anlamlı şekilde azaldığı görüldü (p= 0,041).
Gen ekspresyon analizinde ise; nikotin grubunda Beta 2 Mikroglobulin, CD 34, Hif 1 alfa ve VEGF A genlerinde kontrol grubuna göre anlamlı bir fark olmadığı görülmüştür (p>0,05). Botulinum toksin grubu ile kontrol grubu karşılaştırıldığında Beta 2 Mikroglobulin ve VEGF A gen ekspresyon analiz sonuçlarında anlamlı bir fark olmadığı görülmüştür (p >0,05).  Botulinum toksin grubunda bakılan CD 34 ve  Hif 1 alfa  gen ekspresyon analizi sonuçları ise kontrol grubuna göre anlamlı olarak düşük çıkmıştır (p=0,009, p=0,047). Nikotin+ botulinum toksin grubunda Beta 2 Mikroglobulin ve VEGF A gen ekspresyon analizi sonuçlarında  kontrol grubuna göre anlamlı bir fark olmadığı görülmüştür (p >0,05). Nikotin + botulinum toksin grubunda çalışılan CD 34 ve  Hif 1 alfa gen ekspresyon analizi sonuçları kontrol grubuna göre anlamlı olarak düşük çıkmıştır ( p=0,001, p =0,027).
Histopatolojik değerlendirmede ise; inflamatuar hücre sayısı, fibroblast sayısı, kollajen yoğunluğu ve yeni oluşan damar sayıları hesaplanmıştır. Kontrol grubu ile kıyaslandığında hiçbir grupta inflamatuar hücre sayısı, fibroblast sayısı, kollajen yoğunluğu bakımından anlamlı fark bulunmadı (p>0,05). Yeni oluşan damar sayısı kıyaslandığında ise; kontrol grubu ve nikotin grubu karşılaştırıldığında nikotin grubunda anlamlı şekilde azaldığı (p=0,013), kontrol grubu ve botulinum toksin grubu karşılaştırıldığında botulinum toksin grubunda anlamlı şekilde arttığı (p= 0,03), kontrol grubu ve nikotin + botulinum toksin grubu karşılaştırıldığında nikotin+ botulinum toksin grubunda anlamlı şekilde arttığı görüldü (p= 0,003).
İmmunhistokimyasal değerlendirmede ise; CD 34 açısından kontrol grubu ve nikotin grubu arasında anlamlı fark bulunmamıştır (p=0,084). Kontrol grubu ve botulinum toksin grubu karşılaştırıldığında bu değerin anlamlı şekilde arttığı (p=0,001), yine kontrol grubu ve nikotin + botulinum toksin grubu karşılaştırıldığında anlamlı şekilde arttığı görüldü (p=0,02). Hif 1 alfa açısından kontrol grubu ve nikotin grubu arasında anlamlı fark bulunmamıştır (p=0,09). Kontrol grubu ve botulinum toksin grubu karşılaştırıldığında bu değerin anlamlı şekilde arttığı (p=0,003), yine kontrol grubu ve nikotin + botulinum toksin grubu karşılaştırıldığında anlamlı şekilde arttığı görüldü (p=0,05). VEGF antikoru ile yapılan immun boyamalar farklı sulandırma oranları ve farklı sürelerde tutulmasına rağmen başarılı olamadığından değerlendirme yapılamamıştır.
Sonuç olarak, bu deneysel çalışmada, perforatör flep yapılan sıçanlarda botulinum toksininin tek başına veya nikotin ile beraber uygulanmasının kontrol grubuna göre flep yaşayabilirliğine ve anjiogeneze olumlu etkilerini göstermiş olduğumuz için ileride ameliyat öncesi uygulanmasının faydalı olabileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Skin flaps are commonly used to resurface tissue defects, and perforator flaps have an increasing popularity in this field. The flap's blood supply is critical for the success of the procedure and flap failure imposes additional cost, duration of treatment and morbidity. Many agents have been tested for their effects on flap sustainability but difficulties of their availability and accessibility are limited their clinical use. Smoking is the most preventable reason of surgical complications. Botulinum toxin injections are often used besides their aesthetic applications. In this study, effects of botulinum toxin and nicotine in perforator flap viability and angiogenesis are investigated.
In this study, 40 rats were used in four groups. In each subject, 6x6 cm in sized, skin flaps based on the right second cranial perforators of the superior deep epigastric arteries were raised and adapted back on their places. In the control group no further measures were undertaken. In the nicotine group, 2 mg/kg/day subcutaneous nicotine was injected for a month. In the botulinum toxin group, 1 IU intradermal toxin was injected for 8 points expect pedicle zone at preoperative 5- day. In the nicotine + botulinum toxin group nicotine and botlinum toxin were injected as described in group 2 and 3. In postoperative 7 days, flaps were photographed and the necrotic areas were measured and compared. Also tissue specimens were harvested for gene expression, histolopathological and immunohistochemical analyses.
The ratio of necrotic areas were % 43.43± 18.79, % 46.29± 23.36, % 25.15± 6.23,       % 30.20± 5.31 or the control, nicotine, botulinum toxin and nicotine + botulinum toxin groups, respectively. While there is no significant difference between control and nicotine group (p=0,089), however, in botulinum toxin and nicotine+ botulinum toxin group flap, necrotic areas were signifcantly lesser than those of the control group (p=0.001, p=0.041).
In the gene expression analysis, the levels of Beta 2 Mikroglobulin, CD 34, Hif 1 alpha and VEGF A genes were compared between the groups. There is no significant difference between control and nicotine group (p>0.05).  In the botulinum toxin group, there is no significant difference at the levels of Beta 2 Mikroglobulin and VEGF A in comparison to the control group (p>0.05), but CD 34 and Hif 1 alpha levels shown significant difference.        (p= 0.009, p=0.047) In the nicotine + botulinum toxin group, there is no significant difference at the levels of Beta 2 Mikroglobulin and VEGF A in comparison to the control group (p>0.05), but CD 34 and Hif 1 alpha levels shown significant difference ( p=0.001, p=0.027).
Histologically; the numbers of inflammatory cell, fibroblast, neoangiogenesis and collagen density were evaluated.  There is no significant difference in terms of the inflammatory cell numbers, fibroblast numbers and collagen density among the all groups (p>0,05). In comparison to the control group, nicotine group yielded significantly decreased neoangiogenesis (p=0.013) while botulinum toxin and nicotine + botulinum toxin groups, these values were significantly increased (p=0.03, p=0.003).
Immunhistochemically; levels of CD 34, Hif 1 alpha proteins  were compred between the groups. There is no significant difference between control and nicotine group ( p=0.084, p=0.09). In comparison to the control group, botulinum toxin group yielded significantly increased of CD 34, Hif 1 alpha proteins (p=0.001, p=0.003). In comparison to the control group,  nicotine + botulinum toxin group yielded significantly increased of CD 34, Hif 1 alpha proteins (p=0.02, p=0.05).
In conclusion, our experimental study has shown that preoperative intradermal injection of botulinum toxin increases the perforator flap viability and angiogenesis when compared with control group. Also botulinum toxin injection can reverse harmful effects of nicotine when compared with controls. Our findings suggest that preoperative botulinum toxin injection can improve the surgical outcomes while using perforator flap.