Bazı liken türlerinin doku kültürü yoluyla çoğaltılması ve sekonder metabolitlerin değişiminin incelenmesi
Tissue culture of some lichen species and investigation of alteration of their secondary metabolites
Yazar: MELEK IŞIK COŞKUN
Danışman: PROF. DR. AYHAN ŞENKARDEŞLER
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Botanik = Botany

Özet:
Bu çalışmada, Türkiyenin Ödemiş-Bozdağ lokasyonundan toplanan 8 liken türüne (Cladonia foliacea, C.humilis, Evernia prunastri, Physcia adscendens, Pleurosticta acetabulum, Usnea substerilis, Xanthoparmelia pulla ve X. tinctina) ait örneklerin doku kültürü yoluyla çoğaltılması ve liken asidinin kromatografik yöntemlerle belirlenerek sekonder metabolit içeriğinin karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Araştırmanın birinci aşamasında, bu türlerden yüzey sterilizasyonu yapılmış ve mikroskopta bakılarak hem mantar hem de alg hücrelerini içeren parazitsiz tallus parçaları kültür eldesi için Lilly-Barnett (LBM) ile hazırlanan besi yerinde mikobiyont gelişimi açısından kütlesel artışa ulaştırılmıştır.
İkinci aşamada, likenlerle yapılan araştırmalar göz önüne alınarak liken asiti eldesi için ortamdaki dokuyu strese sokmak gerektiğinden: sukroz, PEG, glisin ve asparagin gibi aminoasit eklemesiyle ayrıca UV-B ile stres koşulları gerçekleştirilmiş olan Malt-Yeast Extract (MYE) ve Water-Agar (WA) gibi çeşitli besi ortamları kullanılarak alt kültür çalışmalarına devam edilmiştir. Mikobiyont tabakanın düzgün gelişimi ve misellerde oluşan kararmalar gözlenmiştir, CR ve GR oranlarına bakılmıştır. 
Çalışmanın üçüncü aşamasında doğadan toplanmış liken türlerinin içerdiği liken asitleri ve bu türlerin doku kültüründe gözlenen liken asitleri Yüksek Performanslı İnce Tabaka Kromatografisi (HPTLC) yöntemi kullanılarak karşılaştırılmıştır.
Besi ortamlarına PEG 600 eklenince liken asidi gözlenmezken PEG 6000 eklenmiş alt kültürlerde liken asidi gözlenmiştir: Cladonia foliacea türünde 1. örnek (UV-B) LB %4 PEG 6000 %2 Glisin ve 3. örnek MYE %4 PEG 6000 içeren ortamlarda usnik asit gözlenmiştir. Cladonia humilis türünde tüm örneklerde atranorin'in öncülü olan kloratranorin gözlenmiştir. Evernia prunastri türünde 1. örnek LB %4 PEG 6000  %2 Glisin, 2. örnek LB %4 PEG 6000 %2 Glisin %2 Asparagin, 3. örnek MYE %4 PEG 6000 ve 4.örnek MYE %4 PEG 6000 %2 Glisin içeren ortamlarda evernik asidin öncülü olarak düşünülen bir liken asidi gözlenmiştir. Physcia adscendens türünde 1. örnek (UV-B) LB %4 PEG 6000 %2 Glisin, 2. örnek (UV-B) LB%4 PEG 6000 %2 Glisin %2 Asparagin ve 4.örnek WA %4 PEG 6000 içeren ortamlarda kloratranorin gözlenmiştir. Usnea substerilis türünde 1. örnek LB %4 PEG 6000 %2 Glisin, 2. örnek (UV-B) LB %4 PEG 6000  %2 Glisin, 3. örnek LB%4 PEG 6000 %2 Glisin  %2 Asparagin, 4. örnek (UV-B) LB %4 PEG 6000 %2 Glisin  %2 Asparagin ve 5. örnek MYE %4 PEG 6000 içeren ortamlarda alektoronik asit gözlenmiştir. 3. örnek LB %4 PEG 6000 %2 Glisin %2 Asparagin, 4. örnek (UV-B) LB %4 PEG 6000  %2 Glisin %2 Asparagin, 5. örnek MYE %4 PEG 6000,  6.örnek (UV-B)WA %4 PEG 6000 ve 7. örnek WA %4 PEG 6000 içeren ortamlarda usnik asit gözlenmiştir. Xanthoparmelia pulla türünde 1. örnek LB %4 PEG 6000 %2 Glisin, 2. örnek LB%4 PEG 6000 %2 Glisin %2 Asparagin, 3. örnek MYE %4 PEG 6000 ve 4. örnek MYE %4 PEG 6000 %2 Glisin içeren ortamlarda stenosporik asit, divarikatik asit ve glomelik asit gözlenmiştir. Xanthoparmelia tinctina türünde 1. örnek LB %4 PEG 6000 %2 Glisin %2 Asparagin, 2. örnek (UV-B) LB %4 PEG 6000 %2 Glisin %2 Asparagin, 3. örnek (UV-B) MYE %4 PEG 6000 ve 5. örnek (UV-B) WA %4 PEG 6000 içeren ortamlarda usnik asit ve salazinik asit gözlenmiştir.

Abstract:
In this study, 8 lichen species (Cladonia foliacea, C.humilis, Evernia prunastri, Physcia adscendens, Pleurosticta acetabulum, Usnea substerilis, Xanthoparmelia pulla and X. tinctina) collected from Ödemiş-Bozdağ location of Turkey were cultivated in vitro and their secondary metabolite content were compared by chromatographic methods.
At first, parasite-free thallus fragments containing both fungal and algae cells were sterilised, examined under a microscope and their fungal mycelium were incubated in Lilly-Barnett(LBM) medium for tissue culture.
Secondly, to obtain lichen secondary substances, stress conditions were applied to the cultures acccording to related publications. Subculture studies were continued using various media such as Malt-Yeast Extract (MYE) and Water-Agar (WA), which were stressed with UV-B and the addition of sucrose, PEG, amino acids like as asparagine and glycine. Mycobiont part growth was well but there were samples showing black dots on their fungal mycelium. CR and GR ratios were determined from mycelium part. 
In the third stage of the study; lichen species collected from their natural habitat which already have a lichen acid were compared by HPTLC method with the ones that have increased lichen acid by tissue culture technique. In Cladonia foliacea species, usnic acid was observed in nutrient medium of 1: (UV-B) LB with 4% PEG 6000 and 2% Glycine and sample 3: MYE with 4% PEG 6000. Chloratranorin was observed in all species of Cladonia humilis samples. In Evernia prunastri species an acid, which we think may be a precursor to evernic acid, was observed in nutrient medium 1: LB with 4% PEG 6000 and 2% Glycine, medium 2: LB with 4% PEG 6000, 2% Glycine and 2% Asparagine, medium 3: MYE with 4% PEG 6000 and medium 4: MYE with 4% PEG 6000 and 2% Glycine. Chloratranorine was observed in species of Physcia adscendens in the 1st medium: (UV-B) LB with 4% PEG 6000 and 2% Glycine, 2nd medium (UV-B) LB with 4% PEG 6000, 2% Glycine and 2% Asparagine and 4th medium: WA with 4% PEG 6000. In species of Usnea substerilis alectoronic acid were observed in nutrient mediums: 1st LB with 4% PEG 6000 and 2% Glycine, 2nd (UV-B) LB with 4% PEG 6000 and 2% Glycine, 3rd LB with 4% PEG 6000, 2% Glycine and 2% Asparagine, 4th (UV-B) LB with 4% PEG 6000, 2% Glycine and 2% Asparagine and 5th MYE with 4% PEG 6000. Also usnic acid was observed in the medium 3th LB with 4% PEG 6000, 2% Glycine and 2% Asparagine, 4th (UV-B) LB with 4% PEG 6000, 2% Glycine and 2% Asparagine, 5th MYE with 4% PEG 6000, 6th (UV- B) WA with 4% PEG 6000 and 7th WA with 4% PEG 6000. In species of Xanthoparmelia pulla stenosporic acid, divaricatic acid and glomelic acid were observed in nutrient medium 1st LB with 4% PEG 6000 and 2% Glycine 2nd  LB with 4% PEG 6000, 2% Glycine and 2% Asparagine, 3rd MYE with 4% PEG 6000 and 4th MYE with 4% PEG 6000 and 2% Glycine. In species of Xanthoparmelia tinctina, usnic acid and salazinic acid were observed in nutrient medium 1th LB with 4% PEG 6000, 2% Glycine and 2% Asparagine, 2nd (UV-B) LB with 4% PEG 6000, 2% Glycine and 2% Asparagine, 3th (UV-B) MYE with 4% PEG and 5th (UV-B)WA with 4% PEG 6000.