Magnezyum sülfatın sıçanlarda siklofosfamide bağlı ovaryum hasarı üzerindeki etkilerinin ışık ve elektron mikroskopik düzeyde incelenmesi
Light and electron microscopic evaluation of the effects of magnesium sulphate on cyclophosphamide-induced ovarian damage in rats
Yazar: TUĞBA EKİZ
Danışman: PROF. BÜLENT AHISHALI
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Magnezyum sülfat = Magnesium sulfate ; Mikroskopi-elektron = Microscopy-electron ; Mikroskopi-ışık = Microscopy-polarization ; Over = Ovary ; Siklofosfamid = Cyclophosphamide ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Alkilleyici kemoterapötik bir ilaç olan siklofosfamidin (CYP) ovaryum folikülleri üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Magnezyumun çok sayıda enzimin aktivasyon ve inhibisyonunda, hücre proliferasyonu, siklusu ve farklılaşmasında düzenleyici rolleri vardır. Çalışmamızda CYP'nin ovaryumda folikülogenez üzerinde oluşturduğu hasara magnezyum sülfat (MgSO4)'ün etkilerinin araştırılması amaçlandı.28 günlük immatür Wistar Albino dişi sıçanlara gebe kısrak serum gonadotropini (15 IU, i.p.) uygulanarak 1. jenerasyon preovulatuvar folikül gelişimi sağlandı. Takiben deney gruplarındaki hayvanlara CYP (100 mg/kg, i.p), MgSO4 (270 mg/kg yükleme ve 27 mg/kg idameX12, i.p) ve MgSO4+CYP uygulamaları yapıldı. İn vivo 5-bromo-2-deoksiüridin (BrdU) işaretlemesinden sonra sakrifiye edilen hayvanların ovaryumları parafine ve Epona gömüldü. Parafin kesitlerde BrdU, kaspaz 3, p27 immünohistokimyası ile TUNEL boyaması yapıldı. Gruplar arası immünohistokimyasal değişiklikler H skoru analiziyle belirlendi. Epon kesitlerde ultrastrüktürel değişiklikler elektron mikroskobunda değerlendirildi.CYP uygulaması ovaryum folikül tiplerinde genel olarak BrdU işaretlenmesini anlamlı düzeyde azaltırken kaspaz 3 immünoreaktivitesi ile TUNEL işaretlenmesini anlamlı düzeyde arttırdı. Bu hayvanlarda MgSO4 BrdU işaretlenmesi ve aktif kaspaz 3 immünoreaktivitesinde anlamlı bir değişiklik oluşturmazken TUNEL işaretlenmesini kümülüs hücreleri dışında anlamlı düzeyde azalttı. CYP grubunda p27 immünoreaktivitesi granüloza ve teka hücrelerinin nukleusunda anlamlı düzeyde artarken bu hayvanlara MgSO4 uygulaması artmış p27 immünoreaktivitesini anlamlı düzeyde azalttı. Ultrastrüktürel olarak CYP grubundaki erken ve ileri dönem foliküllerin granüloza ve teka hücrelerinde apoptotik sürecin arttığı, MgSO4 uygulaması sonucu apoptotik belirtilerin hafiflediği izlendi.Sonuç olarak, bulgularımız CYP'nin ovaryum folikül hücrelerinde proliferasyon oranını azalttığını ve apoptotik süreci uyardığını göstermektedir. Çalışmamız MgSO4'ün kemoterapinin ovaryum folikül hücrelerinde neden olduğu şiddetli apoptotik hasarı hafifletici etkisiyle fertiliteyi korumaya yönelik farmakolojik tedavi seçeneklerine yeni bir bakış açısı sağlayabileceğini düşündürmektedir.Alkilleyici kemoterapötik bir ilaç olan siklofosfamidin (CYP) ovaryum folikülleri üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Magnezyumun çok sayıda enzimin aktivasyon ve inhibisyonunda, hücre proliferasyonu, siklusu ve farklılaşmasında düzenleyici rolleri vardır. Çalışmamızda CYP'nin ovaryumda folikülogenez üzerinde oluşturduğu hasara magnezyum sülfat (MgSO4)'ün etkilerinin araştırılması amaçlandı.28 günlük immatür Wistar Albino dişi sıçanlara gebe kısrak serum gonadotropini (15 IU, i.p.) uygulanarak 1. jenerasyon preovulatuvar folikül gelişimi sağlandı. Takiben deney gruplarındaki hayvanlara CYP (100 mg/kg, i.p), MgSO4 (270 mg/kg yükleme ve 27 mg/kg idameX12, i.p) ve MgSO4+CYP uygulamaları yapıldı. İn vivo 5-bromo-2-deoksiüridin (BrdU) işaretlemesinden sonra sakrifiye edilen hayvanların ovaryumları parafine ve Epona gömüldü. Parafin kesitlerde BrdU, kaspaz 3, p27 immünohistokimyası ile TUNEL boyaması yapıldı. Gruplar arası immünohistokimyasal değişiklikler H skoru analiziyle belirlendi. Epon kesitlerde ultrastrüktürel değişiklikler elektron mikroskobunda değerlendirildi.CYP uygulaması ovaryum folikül tiplerinde genel olarak BrdU işaretlenmesini anlamlı düzeyde azaltırken kaspaz 3 immünoreaktivitesi ile TUNEL işaretlenmesini anlamlı düzeyde arttırdı. Bu hayvanlarda MgSO4 BrdU işaretlenmesi ve aktif kaspaz 3 immünoreaktivitesinde anlamlı bir değişiklik oluşturmazken TUNEL işaretlenmesini kümülüs hücreleri dışında anlamlı düzeyde azalttı. CYP grubunda p27 immünoreaktivitesi granüloza ve teka hücrelerinin nukleusunda anlamlı düzeyde artarken bu hayvanlara MgSO4 uygulaması artmış p27 immünoreaktivitesini anlamlı düzeyde azalttı. Ultrastrüktürel olarak CYP grubundaki erken ve ileri dönem foliküllerin granüloza ve teka hücrelerinde apoptotik sürecin arttığı, MgSO4 uygulaması sonucu apoptotik belirtilerin hafiflediği izlendi.Sonuç olarak, bulgularımız CYP'nin ovaryum folikül hücrelerinde proliferasyon oranını azalttığını ve apoptotik süreci uyardığını göstermektedir. Çalışmamız MgSO4'ün kemoterapinin ovaryum folikül hücrelerinde neden olduğu şiddetli apoptotik hasarı hafifletici etkisiyle fertiliteyi korumaya yönelik farmakolojik tedavi seçeneklerine yeni bir bakış açısı sağlayabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
The adverse effects of alkylating chemotherapeutic agent cyclophosphamide (CYP) on folliculogenesis are well-known. Magnesium has a variety of effects in organism owing to its catalytic function on the activation and inhibition of many enzymes with its regulatory function on cell proliferation, cell cycle and differentiation. This study aims to evaluate the effects of magnesium sulphate (MgSO4) on CYP-induced ovarian damage.28-day-old immature Wistar-Albino female rats were treated with pregnant mare serum gonadotrophin to develop the first generation of preovulatory follicles. Rats were then treated with CYP (100 mg/kg, i.p) and MgSO4 (270 mg/kg loading dose; 27 mg/kg maintenance doseX12, i.p) alone or in combination in experimental groups. Following in vivo 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) labeling, animals were sacrificed and ovaries were embedded in paraffin and Epon. TUNEL-labeling and immunohistochemistry for BrdU, caspase-3 and p27 were performed.Decreased BrdU-labeling, increased caspase-3 immunoreactivity and TUNEL-labeling were observed in CYP-treated rats. In these animals, while MgSO4 did not alter BrdU-labeling and caspase-3 immunoreactivity, it significantly reduced the increased TUNEL-labeling. In CYP group while p27 immunoreactivity significantly increased in the nuclei of granulosa and theca cells MgSO4 co-treatment significantly reduced the immunoreactivity. Ultrastructurally, frequent apoptotic profiles were observed in granulosa and theca cells in early and advanced stage of follicles in CYP group and MgSO4 co-administration led to ultrastructural alleviation of apoptotic process.In conclusion, our data suggest that MgSO4 may represent an option of pharmacologic treatment for preserving fertility owing to its beneficial effects on chemotherapy-induced aggravation of follicular apoptotic process.