Astrosit ve mikroglianın süt dişi pulpa nöroenflamasyonundaki rolü
Roles of astrocyte and microglia in neuroinflammation of primary tooth pulp
Yazar: AYBÜKE BAHADIR SEZER
Danışman: DOÇ. DR. HÜSNİYE GÜMÜŞ ; PROF. DR. ŞAZİYE SARI
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Pedodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Astrositler = Astrocytes ; Dental pulpa = Dental pulp ; Mikroglia = Microglia ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases

Özet:
Bu çalışmada nöroenflamasyonda görev alan astrosit ve mikroglianın sağlıklı, reversibl pulpitisli ve irreversibl pulpitisli süt dişi pulpalarındaki yoğunluklarını kantitatif olarak değerlendirerek süt dişi pulpasının immün mekanizmasındaki işlevlerini ve pulpa dokusundaki morfolojik etkilerini belirlemek amaçlanmıştır.
Bu amaçla astrosit ve mikroglia immünreaktivitesini belirlemek için sırası ile GFAP ve Iba-1 ekspresyon miktarları incelenmiştir. Çalışmaya 5-9 yaş arası 11 çocuk hastanın radyolojik ve klinik muayenesi sonrası çekim endikasyonu koyulan sağlıklı pulpalı, reversible pulpitisli ve irreversible pulpitisli 12 süt dişi çalışma gruplarına eşit sayıda ayrılacak şekilde dahil edilmiştir. Çekimin hemen sonrasında dikkatlice toplanan pulpa dokuları fosfatla tamponlanmış serum içinde çözünmüş %2'lik paraformaldehit tamponuna aktarılarak uygun saklama koşullarında labaratuar ortamına aktarılmıştır. Her diş için 5 µm'lik transvers kesitler alınarak slidelarda GFAP ve Iba-1 tespiti için immünfloresan boyama yapılmıştır. Slidelar boyama sonrası lazer taramalı konfokal mikroskop ile incelenmiştir. Seçilen her bir alan için analizler ImageJ programının analiz-ölçüm yardımcısı kullanılarak yapılmıştır. Veriler GraphPad Prism versiyon 9.5 kullanılarak analiz edilmiştir. Verilerin normalliği Shapiro-Wilk testi kullanılmıştır. Varyansların homojenliği, değerlendirilen her parametre için Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Gruplar arasındaki farklılıkları belirlemek için post hoc testi olarak Fisher's LSD testi kullanılmıştır. İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edilmiştir.
Mikroglia için Iba-1 immünoreaktivitesi incelendiğinde Iba-1 değerleri sağlıklı süt dişi pulpasında 36 ± 20, reversible pulpitis grubunda 69 ± 50 ve irreversible pulpitis grubunda 104 ± 71 olarak elde edilmiştir. Sağlıklı pulpa grubu ve irreversible pulpitisli grup arasındaki Iba-1 artışı istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,001). Astrosit için GFAP immünoreaktivitesi sonuçlarına göre GFAP değerleri sağlıklı süt dişi pulpasında 49 ± 23, reversible pulpitis grubunda 102 ± 75 ve irreversible pulpitis grubunda 81 ± 66 olarak elde edilmiştir. Sağlıklı pulpa grubu ile reversible pulpitisli grup arasındaki GFAP artışı istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p=0,015). Diğer parametreler arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.
Çalışmamızın sonucunda immunohistokimyasal incelemelerin değerlendirilmesi ile astrositlerin ve mikrogliaların hem sağlıklı hem de enflame pulpada görev aldıkları gösterilmiştir. İrreversible pulpitis grubunda reversible pulpitis grubuna göre GFAP miktarının azalırken Iba-1' ın arttığı tespit edilmiştir. Bu durum süt dişi pulpasında da sinir hücrelerinde olduğu gibi aktif astrositlerin aktif mikroglialar üzerinde negatif geri bildirim mekanizmasının olduğunu göstermiştir. Reversible pulpitisli ve irreversible pulpitisli doku örneklerinde GFAP ve Iba-1 ekspresyonu sağlıklı pulpa dokusu örneklerine göre kantitatif olarak artış göstermiştir. Çalışmamızın sonuçları süt dişi pulpasının kendine özgü bir immün savunma sistemine sahip olduğunu düşündürmektedir.

Abstract:
In this study, it was aimed to quantitatively evaluate the densities of astrocytes and microglia, which are involved in neuroinflammation, in healthy, reversible, and irreversible primary tooth pulps. Additionally, the study aimed to determine the functions of the immune mechanism of primary tooth pulp and its morphological effects on the pulp tissue.
For this purpose, GFAP and Iba-1 expression amounts were examined to determine astrocyte and microglia immunoreactivity, respectively. In the study, a total of 12 deciduous teeth were included, each with indications for extraction following radiological and clinical examinations of 11 pediatric patients aged 5-9 years. These teeth comprised cases of healthy pulps, reversible pulpitis, and irreversible pulpitis. The teeth were selected to ensure an equal distribution among the study groups. After careful collection immediately following extraction, the pulp tissues were transferred to a 2% paraformaldehyde buffer dissolved in phosphate-buffered serum and then moved to the laboratory environment under suitable storage conditions. For each tooth, transverse sections of 5 µm were obtained, and immunofluorescent staining was conducted on the slides to detect GFAP and Iba-1. After staining, the slides were examined using a laser scanning confocal microscope. Analyses for each selected area were conducted using the analysis-measurement assistant of the ImageJ program. Data were analyzed using GraphPad Prism version 9.5. Normality of the data was assessed using the Shapiro-Wilk test. The homogeneity of variances was evaluated using the One-Way Analysis of Variance (ANOVA) test for each evaluated parameter. Fisher's LSD test was used as a post hoc test to determine the differences between the groups. The significance level was accepted as p<.05 to determine statistical significance.
When assessing Iba-1 immunoreactivity for microglia, Iba-1 values were as follows: 36 ± 20 in healthy deciduous tooth pulp, 69 ± 50 in the reversible pulpitis group, and 104 ± 71 in the irreversible pulpitis group. The increase in Iba-1 between the healthy pulp group and the group with irreversible pulpitis was found to be statistically significant (p<0.001). According to the results of GFAP immunoreactivity for astrocyte, GFAP values were obtained as 49 ± 23 in healthy primary tooth pulp, 102 ± 75 in the reversible pulpitis group and 81 ± 66 in the irreversible pulpitis group. The increase in GFAP between the healthy pulp group and the group with reversible pulpitis was statistically significant (p=.015). Differences between other parameters were not statistically significant.
As a result of our study, we have demonstrated that astrocytes and microglia are involved in both healthy and inflamed pulp through immunohistochemical examinations. It was determined that while the amount of GFAP decreased in the irreversible pulpitis group compared to the reversible pulpitis group, Iba-1 increased. This showed that active astrocytes have a negative feedback mechanism on active microglia in primary tooth pulp as well as in nerve cells. The expression of GFAP and Iba-1 in tissue samples with reversible pulpitis and irreversible pulpitis was quantitatively increased compared to healthy pulp tissue samples. The results of our study suggest that the primary tooth pulp possesses a unique immune defense system.