Hemofili A gen tedavisi için transgenik kök hücre platformunun geliştirilmesi ve in vitro etkinliği
Development and in vitro efficacy of transgenic stem cell platform for hemophilia A gene therapy
Yazar: CANSU HEMŞİNLİOĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ELİF SİBEL ASLAN
Biruni Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler ve Tıbbi Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Gen tedavisi = Gene therapy ; Hemofili A = Hemophilia A ; Kök hücreler = Stem cells ; Lentivirüs = Lentivirus

Özet:
Hemofili hastalarının yaklaşık %80' ini etkileyen Hemofili A, Faktör VIII (FVIII) eksikliği sonucu gelişen X' e bağlı resesif kalıtımsal bir kanama bozukluğudur.  Hastalar eklem içi ve kas içi kanamalarla ile karakterize olurken, faktör eksikliğinin derecesi, kanama sıklığını ve şiddetini belirlemektedir. Kanamanın kontrolü ve tedavisinde plazma türevli tedaviler ve rekombinant faktör konsantreleri kullanılmaktadır. Araştırmamızda Hemofili A hastalığından sorumlu olan FVIII eksikliğine yönelik gen tedavisi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda promotörü EF-1 alpha olan, B domaini silinmiş FVIII gen sekansı ile CD45 R0 truncated yüzey belirteci taşıyan (EF1α - FVIII.CC - CD45R0t) lentiviral vektör dizayn edilmiştir. Tasarladığımız lentiviral vektörün mezenkimal kök hücreleri transdükte etmesi sağlanarak immün cevaptan korunabilen, sahip olduğu yüzey belirteci (CD45R0t) sayesinde in vivo uygulamalarda takip edilebilen, toksik olmayan ve fonksiyonel FVIII sekresyonu sağlayabilen bir gen tedavisi hedeflenmiştir. Faktör VIII kodlayan lentivirüsün karakterizasyon ve kalite kontrol testlerinin ardından mezenkimal kök hücreler ile transdüksiyon verimliliği, FVIII kalıcılık ve ekspresyon analizleri gerçekleştirilmiştir. Faktör VIII proteinin varlığı Western Blot yöntemiyle de doğrulanmıştır. Geliştirilen lentivirüsün (LTR sekansı) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizleri ile replikatif olmadığı, güvenliliği test edilmiştir. FVIII sekresyonunun zamana bağlı değişimi Elisa yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. Faktör VIII proteinin fonksiyonelitesi ise karıştırma testi (mixing test) ile aktive parsiyel tromboplastin zamanı (aPTT) ve FVIII düzeyleri üzerinden gösterilmiştir. Zamana bağlı gerçekleştirilen FVIII sekresyon analizlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olmadığı, stabil seviyelerde FVIII varlığı saptanmıştır (p > 0.05). Karıştırma testi (mixing test) kullanılarak gerçekleştirilen analizlerde ise gen tedavisi uygulanmış ve gen tedavisi uygulanmamış FVIII içermeyen insan plazma ürünleri aPTT ve FVIII seviyesi açısından karşılaştırılmıştır. aPTT seviyeleri değerlendirildiğinde;  gen tedavisi uygulanmamış gruba ait ortalamanın 92.69 ± 11.38 sn olduğu ancak gen tedavisi uygulanan grupta ise bu ortalamanın 38.60 ± 13.38 sn' ye düştüğü görülmüştür (p < 0.001).  Faktör VIII seviyeleri değerlendirildiğinde ise gen tedavisi uygulanmamış grubun FVIII seviye ortalamasının 0.41 ± 0.03  IU/dL olduğu, gen tedavisi uygulanmış grubun ise  FVIII seviye ortalamasının %25.41 ± 33.38  IU/dL' ye yükseldiği saptanmıştır (p < 0.01). Bu araştırma ile literatürdeki çalışmalara alternatif olarak Hemofili A gen tedavisinde yeni bir yöntemin geliştirilmesi sağlanmış, in vivo hayvan modelleri ve klinik denemelere katkı sağlayacak bir çalışmanın ilk adımları atılmıştır.

Abstract:
Hemophilia A affecting approximately %80 of patients with hemophilia, is an X-linked recessive inherited bleeding disorder caused by deficiency of Factor VIII (FVIII) protein. While patients are presented with intra-articular and intramuscular bleeding, the degree of factor deficiency determines the frequency and severity of bleeding. Plasma- derived therapies and recombinant factor concentrates are used to control and treat the bleeding symptoms. The objective of this study is to design a gene therapy for FVIII deficiency, which is responsible for Hemophilia A. For this purpose, a lentiviral vector with EF-1 alpha promoter, B domain deleted Factor VIII gene sequence, and CD45 R0 truncated surface marker (EF1α - FVIII.CC - CD45R0t) was designed. The goal of the current study is to develop a gene therapy that can be secured from the immune response by transducing mesenchymal stem cells, can be tracked in vivo due to its surface marker (CD45R0t) and can provide non - toxic and functional FVIII secretion. After the characterization and quality control tests of FVIII encoding lentivirus, transduction efficiency with mesenchymal stem cells, FVIII persistence, and expression analyzes were performed. The presence of the FVIII protein was also confirmed by the Western Blot method. The lentivirus (LTR sequence) developed has been tested to be non-replicative, safe by polymerase chain reaction (PCR) analysis. Time-dependent alterations of FVIII secretion was evaluated using the Elisa method. The functionality of the factor VIII protein was demonstrated using mixing test through activated partial thromboplastin time (aPTT) and FVIII levels. There was no statistically significant difference in FVIII secretion over time, signifying that stable levels of FVIII were achieved (p > 0.05). In the mixing test analyses, FVIII deficient human plasma products with and without gene therapy were compared in terms of aPTT and FVIII levels. When aPTT levels were evaluated; it was observed that mean aPTT  levels of  the group that did not receive gene therapy was 92.69 ± 11.38 seconds, while the mean aPTT levels of the group that received the gene therapy were decreased to 38.60 ± 13.38 seconds (p < 0.001). When FVIII levels were evaluated, it was found that the mean FVIII level of the group that did not receive gene therapy was 0.41 ± 0.03 IU/dL, while the mean FVIII levels of the group that received gene therapy increased to 25.41 ± 33.38 IU/dL (p < 0.01). As an alternative to previous studies, the current study introduces a new method in Hemophilia A gene therapy, the first steps to contribute to in vivo animal models and clinical trials have been taken.