Endokrin bozucu bileşiklerin sığır luteal hücre kültüründeki progesteron sentezi üzerine etkileri
Effects of endocrine disrupting compounds on progesterone secretion by cultured bovine luteal cells
Yazar: RUHİ KABAKÇI
Danışman: PROF. DR. AYŞE ARZU YİĞİT
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Fizyoloji = Physiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Bisfenol A = Bisphenol A ; Corpus luteum = Corpus luteum ; Difenileter = Diphenyl ether ; Endokrin sistem hastalıkları = Endocrine system diseases ; Hücre kültürü = Cell culture ; Over = Ovary ; Plastikler = Plastics ; Progesteron = Progesterone ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Üreme hormonları = Reproductive hormones

Özet:
Endüstriyel ve teknolojik gelişmelerle birlikte, yoğun bir şekilde çevreye yayılan endokrin bozucu bileşikler (EBB), canlıların başta üreme ve gelişme olmak üzere birçok hayati fonksiyonlarını tehdit eder hale gelmiştir. Günlük hayatta kullanılan plastik içerikli birçok ürünün yapısına katılan Bisfenol A (BPA), Dietilheksil Fitalat (DEHP) ve Pentabromlu difenileter 99 (PBDE 99), yaygın bir şekilde kullanılan ve canlıların üreme fizyolojileri üzerine etkilerinin olduğu bilinen EBB'lerdendir. Bu çalışmanın amacı, inek korpus luteumundan elde edilen luteal hücrelerin progesteron sentezi üzerine BPA, DEHP ve PBDE 99'un etkisini araştırmaktır.
	Çalışmada kullanılan luteal hücreler, mezbahada kesilen sağlıklı ineklerin midluteal dönemdeki ovaryumlarından elde edildi. Korpus luteum enzimatik işlemlerden geçirilerek luteal hücreler ayrıştırıldı. Elde edilen hücreler her kuyucuğa 3x104 canlı hücre olacak şekilde içerisinde 2 mL kültür medyumu bulunan 6 kuyucuklu pleytlere dağıtıldı ve 120 saat inkübe edildi. İnkübasyonun ilk 24 saatinde hücrelerin pleyt tabanına yapışması için yeni doğan buzağı serumu (NCS) dışında hücrelere herhangi bir uygulama yapılmadı. Daha sonra medyum, serum yerine ITS (İnsülin Transferrin, Sodyum Selenit) içeren ve belirli konsantrasyonlarda BPA (1, 3, 10 ve 30 µM), DEHP (1, 3, 10 ve 30 µM) ve PBDE 99 (0.1, 0.3, 1 ve 3 µM) içeren medyumla değiştirilerek, hücreler EBB'lere maruz bırakıldı. İnkübasyonun 96. ve 120. saatinde toplanan medyumlar progesteron ölçümü yapılıncaya kadar -20 °C'de saklandı.
	Araştırma sonucunda inkübasyonun 96. saatinde kontrol grubuna göre BPA'nın tüm dozları, DEHP'in özellikle 3 ve 30 µM'lık dozları, PBDE 99'un ise sadece en yüksek dozu (3 µM) progesteron düzeyini önemli oranda (p<0.05) düşürdü. İnkübasyonun 120. saatinde ise BPA'nın 1 µM'dan büyük tüm dozları (3, 10 ve 30 µM), DEHP'in tüm dozları ve PBDE 99'un 1 ile 3 µM'lık dozları progesteron üretimini önemli oranda (p<0.05) baskıladı. Pentabromlu difenileter 99'un 0.1 ve 0.3 µM'lık dozları hem 96. hem 120. saatlerde progesteron sentezini artırdı. İnkübasyon periyotlarına göre kıyaslandığında (96. ve 120. saatler arasında), BPA'nın sadece kontrol ve en yüksek doz grubunda (30 µM), DEHP'in kontrol dahil tüm dozlarında, PBDE 99'un ise 0.3, 1 ve 3 µM'lık dozlarında 120. saatte 96. saate göre daha az progesteron üretimi oldu.
	Ovaryumun hormonal dengesinin korunması sağlıklı bir üreme fizyolojisi için oldukça önemlidir. Çalışmanın bulguları EBB'lerden BPA ve DEHP'in inek luteal hücrelerinin progesteron üretimini azaltarak, PBDE 99'un da düşük dozlarda progesteron üretimini artırarak ve yüksek dozda azaltarak luteal steroidogenez sürecini etkilediğini ve ovaryumun hormonal dengesini bozduğunu ortaya koymuştur. Etkilenme süresi uzadıkça progesteron üretimini azaltıcı etkisi özellikle DEHP uygulanan grupta daha belirgin olmuştur. Zamana bağlı olarak BPA'nın yalnızca kontrol ve 30 µM'lık en yüksek dozu, PBDE 99'un ise 0.3, 1 ve 3 µM'lık dozlarının etkileri daha belirginleşmiştir. Sonuç olarak endüstriyel kirlenme sonucu maruz kalınan EBB'lerden BPA, DEHP ve PBDE 99'un progesteron sentezi üzerindeki olumsuz etkileriyle ineklerin östrus sikluslarında bozukluklara ve gebe kalmada sorunlara yol açarak hayvanın üreme verimini düşürebileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Along with industrial and technological developments, endocrine disrupting compounds (EDCs), which spread intensely in the environment, have become a threat to many vital functions of living beings, especially reproduction and growth. Bisphenol A (BPA), Diethylhexyl phthalate (DEHP) and Pentabrominated diphenylether 99 (PBDE 99), which are involved in the structure of many products made by plastic used in everyday life, are EDCs that are widely used and known to have effects on the reproductive physiology of living beings. The aim of this study is to investigate the effects of BPA, DEHP and PBDE 99 on progesterone synthesis of bovine luteal cells. 
	Luteal cells used in the study were obtained from the midluteal ovaries of healthy cows slaughtered in the abattoir. Luteal cells were separated from the corpus luteum by enzymatic digestion. The isolated cells were seeded as 3×104 viable cells per well in the six well plates with 2 mL of medium and incubated for 120 hours. In the first 24 hours of incubation, any treatment was made to cells except the NCS to adhesion of cells to the bottom of the plate. Then, the medium was replaced with new medium containing ITS (Insulin Transferrin, Sodium Selenit) instead of NCS and different concentrations of BPA (1, 3, 10 and 30 μM), DEHP (1, 3, 10 and 30 μM) and PBDE 99 (0.1, 0.3, 1 and 3 μM). Media collected at hour 96 and hour 120 of incubation were stored at -20 ° C until progesterone measurement.
	As the results of the study, all doses of BPA, particularly 3 and 30 μM doses of DEHP, and only the highest dose (3 μM) of PBDE 99 significantly reduced the progesterone level at the 96th hour of incubation compared to the control group (p<0.05). At hour 120 of incubation, all doses higher than 1 μM of BPA (3, 10 and 30 μM), all doses of DEHP and doses of 1 and 3 μM of PBDE 99 significantly suppressed progesterone production (p <0.05). Doses of 0.1 and 0.3 μM of PBDE 99 enhanced progesterone synthesis at both 96 and 120 hours. When the incubation periods compared (between 96th and 120th hours), only the control and the highest dose group of BPA (30 μM), and all doses of DEHP including control, and doses of 0.3, 1 and 3 μM PBDE 99 had less progesterone production at 120 hours than at 96 hours.
	The keeping of the hormonal balance of the ovary is very important for a healthy reproductive physiology. Findings of the study show that it was affected the luteal steroidogenesis process and disrupted the hormonal balance of the ovary by reducing the progesterone production of bovine luteal cells with BPA and DEHP and increasing progesterone production at low doses and decreasing at high dose of PBDE 99. As the exposure was longer, that suppressive effect became more evident, especially in the group of DEHP. The effects of only the control and the highest dose, 30 μM, of BPA and the doses of 0.3, 1 and 3 μM of PBDE 99 became more evident depending on the time. In conclusion, exposed EDCs, BPA, DEHP and PBDE 99 because of the industrial pollution have adverse effect on progesteron synthesis may decrease the reproductive efficiency of the animal by leading disorders in estrous cycle of cows and getting pregnant problems.