Karaciğer iskemi reperfüzyonunda nötral sfingomyelinaz inhibisyonun endoplazmik retikulum stresine ve apoptotik hücre ölümüne olan etkisi
Neutral sphingomyelinase inhibition alleviates apoptosis, but not er stress, in liver ischemia-reperfusion injury
Yazar: HAZAL TUZCU BALABAN
Danışman: PROF. DR. MUTAY AYDIN ASLAN
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Hücre ölümü = Cell death ; Karaciğer hastalıkları = Liver diseases ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; Seramidler = Ceramides ; Sfingomiyelinler = Sphingomyelins ; Sinyal nakli = Signal transduction ; İskemi = Ischemia

Özet:
Amaç: Önceki çalışmalar karaciğer (KC) ılık iskemi reperfüzyon (IR) hasarından sonra nötral sfingomyelinaz (N-SMase)/seramid yolağının hepatik dokuda aktive olduğunu göstermiştir. Fazla miktarda seramid birikiminin apoptotik stimulus oluşturduğu bilinmekte ve hepatik IR hasarından sonra apoptozis ve endoplazmik retikulum (ER) stresi arasında bağlantı kurulmaktadır. Bu sebeplerden dolayı mevcut çalışmada sıçan KC IR modelinde N-SMase inhibisyonunun ER stresi ve apoptotik biyobelirteçler üzerindeki etkisi incelenmiştir.
Yöntem: Selektif N-SMase inhibitörü intraperitoneal enjeksiyonlar ile verildi. Karaciğer IR hasarı orta ve sol lateral hepatik loblara giden kan damarlarının 60 dakika klampe edilmesi ve sonrasında 60 dakika reperfüzyon ile sağlandı. Karaciğer dokusundaki sfingomyelin ve seramid düzeyleri optimize çoklu reaksiyon izleme (MRM) metoduyla ultrahızlı sıvı kromatografi ve tandem kütle spektrometri (MS/MS) ile ölçüldü.. Gen ekspresyon düzeyleri gerçek zamanlı revers transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile belirlendi.
Bulgular: Tüm IR gruplarında sfingomyelin düzeyleri kontrollere göre anlamlı bir artış gösterdi. Spesifik N-SMase inhibitörüyle tedavi IR gruplarında ölçülen seramid düzeylerini anlamlı olarak azalttı. İskemi reperfüzyon hasarında ER stresi biyobelirteci olan C/EBP-homolog protein (CHOP) ve 78 kDa glukoz-regüle protein (GRP78) düzeyleri anlamlı olarak arttı. Karaciğer IR hasarında N-SMase inhibisyonu ER stresi biyobelirteçlerinde anlamlı bir etki göstermedi. İskemi reperfüzyon hasarında N-SMase inhibisyonu phospho NF-kB seviyelerinde, heptatik TUNEL boyanmasında, sitozolik sitokrom c, kaspaz-3, -8 ve -9 aktivitelerinde anlamlı bir azalma sağladı.
Sonuç: Elde edilen bulgular KC IR hasarında seramid artışının apoptotik hücre ölümüne sebebiyet verdiğini doğruladı. Mevcut modelde N-SMase inhibisyonunun koruyucu etkisi apoptotik uyarıyı azaltmak suretiyle oluştu. Çalışmanın sonuçları KC IR hasarının önlenmesinde N-SMase inhibitörlerinin kullanılmasını destekler.
Anahtar Kelimeler: Karaciğer; iskemi–reperfüzyon hasarı; seramid; nötral sfingomyelinaz.

Abstract:
Objective: Previous studies have revealed the activation of neutral sphingomyelinase (N-SMase)/ceramide pathway in hepatic tissue following warm liver ischemia reperfusion (IR) injury. Excessive ceramide accumulation is known to potentiate apoptotic stimuli and a link between apoptosis and endoplasmic reticulum (ER) stress has been established in hepatic IR injury. Thus, this study determined the role of selective N-SMase inhibition on ER stress and apoptotic markers in a rat model of liver IR injury.
Methods: Selective N-SMase inhibitor was administered via intraperitoneal injections. Liver IR injury was created by clamping blood vessels supplying the median and left lateral hepatic lobes for 60 min, followed by 60 min reperfusion. Levels of sphingmyelin and ceramide in liver tissue were determined by an optimized multiple reactions monitoring (MRM) method using ultrafast-liquid chromatography (UFLC) coupled with tandem mass spectrometry (MS/MS). Gene expression levels were determined by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
Results: Spingomyelin levels were significantly increased in all IR groups compared with controls. Treatment with a specific N-SMase inhibitor significantly decreased all measured ceramides in IR injury. A significant increase was observed in ER stress markers C/EBP-homologous protein (CHOP) and 78 kDa glucose-regulated protein (GRP78) in IR injury, which was not significantly altered by N-SMase inhibition. Inhibition of N-SMase caused a significant reduction in phospho NF-kB levels, hepatic TUNEL staining, cytosolic cytochrome c, and caspase-3, -8, and -9 activities which were significantly increased in IR injury. 
Conclusion: Data herein confirm the role of ceramide in increased apoptotic cell death and highlight the protective effect of N-SMase inhibition in downregulation of apoptotic stimuli responses occurring in hepatic IR injury. 
Key words: Liver; ischemia–reperfusion injury; ceramide; neutral sphingomyelinase.