Glioblastom ve nöroblastom in vitro hücre kültürlerinde antiepileptiklerin mitotik proliferasyon üzerine etkileri
Effects of anti-epileptics on mitotic proliferation on in vitro glioblastoma and neuroblastoma cell cultures
Yazar: ZEYNEP VARGÜN
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM KAYIM YILDIZ
Cumhuriyet Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Nöroloji = Neurology
Dizin: Antikonvülsanlar = Anticonvulsants ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Hücre kültürü = Cell culture ; Mitotik indeks = Mitotic index ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; İn vitro = In vitro

Özet:
Beyin tümörlerinde direkt yayılım, metabolik ve vasküler etkiler ile hastalığın herhangi bir döneminde (ameliyat öncesi, ameliyat sonrası ve ameliyatın mümkün olmadığı durumlarda) epileptik nöbet görülebilir.
Beyin tümörlü hastalarda epileptik nöbetlerin kontrol altına alınması tedavinin önemli bir kısmını oluşturur. İyi kontrol edilmiş beyin tümörlü hastalarda, epileptik nöbetlerin eklenmesi, beyin tümörü dışında morbiditeyi olumsuz yönde etkiler. Beyin tümörlü hastalarda epileptik nöbetler lezyonun lokalizasyonuna göre değişmekle birlikte sekonder jeneralize olan yada olmayan parsiyel ve kompleks nöbetler şeklindedir.
Beyin tümörlü hastalarda epilepsi insidansı, tümörün tipine göre değişmekle birlikte, %30 dur (1). Beyin tümörlü epileptik hastaların %30-50'sinde nöbetler ilk klinik bulgu iken, %10-30 unda hastalığın ileri evrelerinde yada post operatif dönemde ortaya çıkar.
Malign tümör hücrelerinin çoğalmasında esas etkili olan atipik mitotik proliferasyondur.
Daha önceki çalışmalarda bazı antiepileptiklerin mitotik proliferasyon üzerinde olumlu ve olumsuz etkileri gösterilmiştir. Beyin tümörlü hastalarda ise büyük çoğunluğu antiepileptik kullanmasına rağmen bütün antiepileptiklerin mitotik proliferasyon üzerindeki etkileri karşılaştırılmalı olarak araştırılmamıştır.
Üniversitemizde daha önce yapılan bir çalışmada gabapentin, pregabalin, valproik asit, levetirasetam, zonisamid, fenitoin, karbamazepinin glioblastom ve nöroblastom hücre kültürlerinde invitro şartlarda antimitotik etkileri araştırıldı. Fenitoin, levetirasetam ve valproik asit'in glioblastom hücre kültürlerinde doz bağımlı antimitotik etkilerinin olduğu, zonisamid ve pregabalinin tüm dozlarda antimitotik etkilerinin olduğu, karbamezepinin antimitotik etkisinin olduğu fakat 25 μg/ml üzerindeki konsantrasyonlarda antimitotik etkisinin azaldığı, gabapentinin ise antimitotik etkisinin olmadığı izlendi.
Nöroblastom hücre kültürlerinde sadece valproik asit ve zonisamid'in antimitotik etkili olduğu fenitoin, levetirasetam, karbamezepin, gabapentin ve pregabalinin ise antimitotik etkili olmadığı izlendi.
Bu çalışmada ki amacımız glioblastom ve nöroblastom hücre kültüründe in vitro şartalarda antiepileptiklerin mitotik proliferasyon üzerindeki etkilerini karşılaştırmalı olarak göstererek tedavi önceliğini belirlemekti.
Çalışmamızda kullanılan antiepileptiklerden lakozamid, lamotrijin, okskarbazepin, primidon, topiramat, vigabatrinin in vitro glioblastom (GB) ve nöroblastom (NB) hücre kültürlerinde mitotik proliferasyon üzerine etkileri gerçek zamanlı hücre analiz sistemi ile değerlendirildi. Çalışmada E-plate 16 isimli, herbir kuyucuğu 250 µL hacminde, zemin çapı 5mm olan ve 16 kuyucuktan oluşan plateler kullanıldı. İlk olarak her bir kuyucuğa hücre içermeyen, 100 µL besiyeri karışımı konularak cihazda bir baseline okuma yaptırılarak ardından flasklardan tripsinizasyon ve santrifüjasyon (800 RPM, 10 dakika) yoluyla toplanan hücreler kuyucuklara 100 µL hacim içerisinde ekildi.
Kanser hücre hatları laminer flow içerisinde kuyucuklara ekildikten sonra plate inkübatörün içerisine yerleştirildi ve 1'er saatlik zaman aralıkları ile hücre büyümeleri takip edildi. Kuyucuklara ekilen tümör hücreleri kuyucuk tabanına yapıştı ve burada uygun besin ve O2/CO2 ortamında büyümeleri sağlandı. Kuyucuk tabanına yerleştirilmiş olan altın plak elektrik akımını kullanarak bölünen hücrelerin elektrik yük empedanslarını ölçerek, hücrelerin büyüme indekslerini tespit etmemizi sağladı. Hücrelerin hızlı büyüme fazına girmelerinin ardından (Log fazı), deney grubu olarak belirlenen kuyucuklara antitümör etkinliği değerlendirilecek ajanlar 10 µL hacim içerisinde, değişen konsantrasyonlarda uygulandı. Bu uygulamayı takiben plate yeniden inkübatörün içerisine yerleştirildi. İlaç uygulamasının ardından 1'er saatlik ölçümlere devam edildi ve takip 24-72 saat boyunca sürdü.
X celligence testi ile materyallerin C6 ve T98G hücreleri üzerindeki antimitotik etkisi değerlendirildi ve bulgular ile her materyale ait ortalama hücre proliferasyon yüzdeleri hesaplanarak elde edilen değerler karşılaştırıldı.Topiramat ve Okskarbezepinin tüm dozlarda antimitotik etki gösterdiği, lamotrijin ve primidonun doz bağımlı antimitotik etki gösterdiği, vigabatrin ve lakozamidin antimitotik etkisi olmadığı izlendi.
Gruplar arasındaki fark varyans analizini (ANOVA testi) takiben, post hoc TUKEY testi ile araştırıldı.
Sonuç olarak bu çalışmada xCELLİgence yönteminin antiepileptiklerin mitotik proliferasyonunu belirlemede kolay ve hızlı bir yöntem olduğunu ve antiepileptiklerin tümör hücreleri üzerine farklı antimitotik etkileri olduğunu göstermiştir. Antiepileptiklerin antitümöral etkisini anlamak için, antiepileptiklerin mitotik proliferasyon etkileri ile ilgili daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir

Abstract:
Epileptic seizures can be observed at any time during the course of disease (preoperative or postoperative periods or inoperable conditions) due to direct extension, and metabolic and vascular effects of brain tumors. Controlling epileptic seizures comprises an important aspect of management in patients with brain tumors. Addition of epileptic seizures affects morbidity negatively in patients with well-controlled brain tumor. Although epileptic seizures vary based on localization of the lesion, they are secondary generalized or non-generalized partial and complex seizures.
Although the incidence of epilepsy varies depending on tumor type, it is reported as 30% in patients with brain tumor. Seizures are first clinical sign in 30-50% in epileptic patients with brain tumor, while they develop at advanced stages or post-operative period in 10-30%. Atypical mitotic proliferation is the primary mechanism in the growth of malignant tumor cells. Positive and negative effects of some anti-epileptics on proliferation were shown in previous studies; however, effects of all anti-epileptics on mitotic proliferation have not been investigated in comparative manner although most patients with brain tumor use anti-epileptic agents. In a previous study which performed in our university, antimitotic effect of gabapentin, pregabalin, valproic acid, levatiracetam, zonisamide, phenytoin and carbamazepine was investigated as in-vitro in glioblastoma and neuroblastoma cell cultures. In this study, it was found that phenytoin, levatiracetam and valproic acid had an dose-dependent antimitotic effect, zonisamide and pregabalin had an dose-independent antimitotic effect (for all doses), carbamazepine had an antimitotic effect which reduced at concentrations above 25 μg/ml but gabapentin had no antimitotic effect in glioblastoma cell culture. In neuroblastoma cell cultures, only valproic acid and zonisamide had an antimitotic effect but phenytoin, levatiracetam, carbamazepine, gabapentin and pregabalin had no antimitotic effect.
In the present study, our aim is to determine therapeutic priority by demonstrating effects of anti-epileptics on mitotic proliferation on in vitro glioblastoma and neuroblastoma cell cultures in comparative manner.
In our study, in vitro anti-tumoral activities of lacosamide, lamotrigine, oxcarbazepin, primidone, topiramate and vigabatrin were assessed by using a real-time cell analysis system. In the study, E-Plate 16 was used, which has 16 wells with base diameter of 5 mm and volume of 250 µL. Firstly, 100 µL growth medium was placed to each well and a baseline reading was performed. Then, cells harvested by trypsinization and centrifugation (800 rpm for 10 minutes) were inoculated into each well with a volume of 100 µL.
Cancer cell lines were inoculated into wells under laminar flow; then, plate was placed into incubator and cell proliferation was monitored by one-hour intervals. Tumor cells were adhered to base of wells where they proliferated under appropriate nutritional and O2/CO2 conditions. Proliferation indices were detected by measuring electric charge impedances of mitotic cells using electric current via gold plate placed to the base of each well. After onset of rapid proliferation phase (log phase), differential concentrations of agents in which anti-tumoral effects would be assessed were added to each well in a volume of 10 µL. Then, plate was placed into incubator again. Measurements were performed by one-hour intervals over 24-72 hours after drug administration.
By utilizing xCELLIgence test, the antimitotic effect of materials on C6 and T98G cells was assessed, then using findings of this study average cell proliferation percentage of each material was calculated and results were compared. It was observed that Topiramate and Oxcarbazepine showed antimitotic effect at all doses, lamotrigine and primidone showed dose-dependent antimitotic effect, and vigabatrin and lacosamid had no antimitotic effect.
The difference between groups was assessed by using variance analysis (ANOVA test); followed by post-hoc Tukey test.
In conclusion, it was shown that xCELLIgence system is a simple and rapid method in determination of mitotic proliferation of anti-epileptics and that anti-epileptics have different cytotoxic activities on tumor cells. Further studies on effects of anti-epileptics on mitotic proliferation are needed to understand anti-tumoral effects of anti-epileptics.