Akut organotipik kültür ortamında oluşturulan iskemi modelinde zeatinin terapötik etkilerinin incelenmesi
Therapeutic effects of zeatin on ischemia model in acute organotypic culture environment
Yazar: ELİF MUTLU ABUIYADA
Danışman: DOÇ. DR. PINAR ÖZ
Üsküdar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Nörobilim Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Beyin = Brain ; Hipokampus = Hippocampus ; Serebral ventriküller = Cerebral ventricles ; Serebral ventrikülografi = Cerebral ventriculography ; Zeatin = Zeatin ; İnme = Stroke ; İskemi = Ischemia

Özet:
İnmelerin yaklaşık %85'ini oluşturan iskemik inmeler, ani gelişen besin ve oksijen eksikliği ile dokuda nöron kayıplarına sebep olmaktadır ve beyindeki lokalizasyonuna bağlı olarak geniş spektrumda farklı nörolojik hasarlara sebep olmaktadır. Bununla birlikte, hipokampus yapısının iskemiye karşı seçici hassasiyeti son derece yüksek olup, iskemik koşullardan en yüksek derecede etkilenen beyin bölgesidir. Hipokampus yapısındaki subgranüler zon (SGZ) ile lateral beyin ventrikülleri dış duvarında bulunan subventriküler bölge (SVZ), yetişkin beyninde nörogenezin devam ettiği iki ana bölgedir. İskemik ve hipoksik koşullar uzun dönemde SVZ nörogenez seviyesinde artışa sebep olsa da iskeminin ilk sürecinde sebep olduğu hücre ölümleri ile beyin dokusunda geri dönüşümsüz hasarlara yol açmaktadır.
       Akut beyin kesitleri, üç boyutlu mimarinin devamlılığı, sinaptik bağlantıların korunması, manipülasyonunun kolaylığı, kullanılacak deney hayvanı sayısını en aza indirmesi gibi avantajlara sahip olması sebepleri ile son yıllarda deney hayvanları ve hücre kültürü çalışmalarına alternatif olarak sıklıkla kullanılmaktadır. Oksijen glukoz deprivasyon tekniği ile akut beyin kesitleri üzerinde iskemik koşulların modellenebildiği gösterilmiştir.
       Bir adenozin türevi olarak sitokinin sınıfına dahil olan zeatinin etkileri kanser, depresyon ve hafıza gibi konularda incelenmiştir. Bu çalışma ile zeatinin akut beyin kesitleri üzerinde modellenen iskemiye karşı terapötik etkilerinin histolojik boyama tekniği ile incelenmesi amaçlanmıştır. Ayrıca çalışma, zeatinin terapötik etkisinin akut organotipik beyin kesitleri üzerinde nörojenerasyon bakımından incelenmesi bilimsel literatüre orijinal bir katkı sağlamıştır.
       Çalışmada 30-45 günlük 7 adet dişi Wistar Albino deney hayvanı kullanılmıştır. Kontrol grubu (-/-) kesitleri yapay beyin omurilik sıvısında 60 dakika boyunca inkübe edilmiş ve herhangi bir manipülasyonda bulunulmamıştır. İskemi grubu (+/-) kesitleri ise oksijensiz ve glukozsuz şekilde yapay beyin omurilik sıvısında 60 dakika bekletilmiştir. 1.deney grubu (-/+) kesitleri yapay beyin omurilik sıvısında bekletilirken 3 farklı dozda (50-75-100 µM) zeatin uygulanmıştır. Son olarak, 2. deney grubu oksijensiz ve glukozsuz yapay beyin omurilik sıvısında bekletilip 2 farklı dozda (75-100 µM) zeatin uygulanmıştır. Gruplar arasındaki fark, iskemik koşullara maruziyet olup olmaması iken grup içi fark zeatinin farklı dozlarının uygulanmış olmasıdır.
       Çalışmada, kesitlerin histolojik analizi için basit bir boyama yöntemi olan Nissl boyama tekniği kullanılarak nörodejenerasyon ve nörogenez düzeyleri incelenmiştir. Böylece zeatinin iskemiye karşı terapötik etkisi değerlendirilmiştir.
       Çalışmanın sonucuna göre, OGD modeli öngörüldüğü şekilde hücre sayısını kontrol grubuna göre anlamlı şekilde düşürmüştür (p=0.007). Oluşturulan iskemi modeli üzerinde uygulanan 50 µM zeatinin toksik bir etki yarattığı, bununla birlikte zeatinin 75 µM ve 100 µM dozlarının iskeminin sebep olduğu hasarı anlamlı bir şekilde geri döndüremediği görülmüştür. Kontrol grubuna uygulanan 100 µM zeatinin ise kontrol grubuna göre hücre sayısını anlamlı olarak arttırdığı tespit edilmiştir (p=0.043). Sonuç olarak, iskemi modeli üzerindeki terapötik etkilerin ileri değerlendirmesine yönelik olarak toksisite testleri, in vivo deneyler gibi devam çalışmalarının yapılması ve zeatinin protektif etkilerinin de incelenmesi önerilmektedir.

Abstract:
Ischemic strokes, which constitute approximately 85% of strokes, cause neuronal losses in the tissue with sudden nutrient and oxygen deficiency and cause different neurological damage in a wide spectrum depending on their localization in the brain. Additionally, the selective vulnerability of the hippocampus structure to ischemia is extremely high, and it is the brain region that will be most affected by ischemic conditions. The subgranular zone (SGZ) in the hippocampus structure and the subventricular zone (SVZ) located in the outer wall of the lateral brain ventricles are the two main regions in the adult brain where the neurogenesis continues. Although ischemic and hypoxic conditions cause an increase in the level of SVZ neurogenesis in the long term, they cause irreversible damage to the brain tissue with cell death caused by ischemia in the first process.
Acute brain sections are frequently used as an alternative to experimental animals and cell culture studies in recent years due to their advantages such as the continuity of three-dimensional architecture, preservation of synaptic connections, ease of manipulation, and minimizing the number of experimental animals to be used. It has been shown that ischemic conditions can be modeled on acute brain sections with the oxygen-glucose deprivation technique.
The effects of zeatin, which is included in the cytokinin class as an adenosine derivative, have been studied on issues such as cancer, depression and memory. The aim of this study was to investigate the therapeutic effects of zeatin against ischemia modeled on acute brain sections by histological staining technique. In addition, the study made an original contribution to the scientific literature to examine the therapeutic effect of zeatin on acute organotypic brain sections in terms of neurogeneration.
The experiment was carried out on 7 healthy adult female Wistar Albino rats (30-45 days old). Control group (-/-) sections, were incubated in artificial cerebrospinal fluid for 60 minutes and no manipulation was made. Ischemia group (+/-) sections were kept in artificial cerebrospinal fluid for 60 minutes without oxygen and glucose. While the 1st experimental group (-/+) sections were kept in artificial cerebrospinal fluid, 3 different doses of zeatin (50-75-100 µM) were applied. Finally, the second experimental group (+/-) was kept in artificial cerebrospinal fluid without oxygen and glucose and zeatin was administered in 2 different doses (75-100 µM). The difference between the groups were whether there was exposure to ischemic conditions and the difference within the groups is administration of different doses of zeatin.
Neurodegeneration and neurogenesis levels were investigated by using Nissl staining technique, which is a simple staining method for histological analysis of brain sections. Thus, the therapeutic effect of zeatin against ischemia was evaluated.
According to the results of the study, the OGD model significantly decreased the cell number compared to the control group as predicted (p=0.007). It was observed that 50 µM zeatin applied on the ischemia model created a toxic effect, however, 75 µM and 100 µM doses of zeatin could not significantly reverse the damage caused by ischemia. It was determined that 100 µM zeatin administered to the control group significantly increased the number of cells compared to the control group (p=0.043). In conclusion, it is recommended to carry out follow-up studies such as toxicity tests, in vivo experiments for further evaluation of the therapeutic effects of the zeatin on the ischemia model, and to examine the protective effects of zeatin.