Polisiklik aromatik hidrokarbonlardan krizen ve benzo-a-pirenin, köpek ve insan plasental östrojen reseptörü ifadesi etkilerinin araştırılması ve estradiol ölçümü için biyosensör geliştirilmesi
Investigation of the effects of polycyclic aromatic hydrocarbons chrysene and benzo-A-pyrene on dog and human placental estrogen receptor expression and development of biosensors for estradiol measurement
Yazar: YAĞMUR TURGUT
Danışman: DOÇ. DR. BEGÜM YURDAKÖK DİKMEN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Halk Sağlığı = Public Health ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Benzo(a)piren = Benzo(a)pyrene ; Biyosensörler = Biosensors ; Kirleticiler = Pollutants ; Polimerler = Polymers ; Reseptörler-östrojen = Receptors-estrogen ; Toksikoloji = Toxicology ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Östrojenik maddeler-konjüge = Estrogenic substances-konjugated ; Östrojenler = Estrogens

Özet:
Plasenta, gebeliğin devamı ve fetüsün gelişimi için önemli olan; annenin rahim duvarı ve fetüsün kendi dokusu olmak üzere iki farklı genetiğe sahip organizma tarafından şekillenen, yapı ve işlev yönüyle benzersiz özelliğe sahip bir organdır. Gebelik sırasında, bazı türlerde, 17-ß-estradiol (E2) üretiminin yaklaşık olarak seksen katına yükseldiği ve plasentanın östrojenleri spesifik olarak bağladığı bulunmuştur. Plasentada östrojen reseptörü-1 (ER-1) proteininin ekspresyonunu ve bunun villöz sitotrofoblast (CT), vasküler perisitler ve amniyotik fibroblastlarda lokalize olmaktadır. İnsan plasentasının E2'ye bağlandığı ve östrojenlerin insanlarda, primatlarda plasental fonksiyon ve fetal gelişiminin çeşitli yönlerini etkilediği gösterilmesine rağmen, tür bakımından insan ve köpeklerde plasentanın östrojenler için hedef olarak gösterildiği çalışmalar bulunmamaktadır. Östrojene verilen fizyolojik yanıtların en az iki östrojen reseptörü (ER), ER1 ve ER2 tarafından spesifik dokularda aracılık ettiği bilinmektedir. Polisiklik aromatik hidrokarbonlardan (PAH'lar), Benzo-a-piren (BaP) ve krizenin 17-ß-östradiol ile yapısal benzerliği vardır ve ER'ler ile etkileşime girdiği gösterilmiştir. Ortamdaki endokrin bozucu kimyasal konsantrasyonu düşük olsa da kronik maruziyet hayvanlar ve insanlar üzerinde zararlı biyolojik etkilere neden olabilir. Bu problemlerin çözümü için bu maddelerin belirlenmesinde basit, hızlı, hassas ve doğru yöntemlerin kullanılması gerekmektedir. Gerçek maruziyet koşullarıyla ilişkilendirme (epidemiyolojik) ve deneysel koşullarda bu ilişkilerin araştırılması amacıyla doktora tezi 3 aşama ile tamamlandı. Doktora tezinin birinci aşamasında plasenta dokularında BaP ve krizen kalıntıları araştırıldı (GC/MS analizi), östrojen ve östrojen reseptörü ifadesine mikroarray ve RNAsek analizleri ile bakıldı ve biyoinformatik analiz ve in siliko analiz yöntemleriyle ilişkilendirildi. İkinci aşamada, insan plasental hücre hattı HTR-8/SVneo hücrelerinde, BaP ve Krizen varlığında östrojen ve ER reseptör ifadesi in vitro (sitotoksisite, PZR, Western Blot, ELISA) olarak incelendi. Üçüncü aşama ise, östrojen için elektrokimyasal ölçüm yapan moleküler baskılanmış polimer teknolojisi ile biyosensör geliştirildi.  İnsan ve köpek plasenta numunelerinde benzo-a-piren tespit edilemedi. İnsan plasenta numunelerinde krizen 4,062-1518,938 ng/g; köpek plasenta örneklerinde 5,580-14,800 ng/g aralığında tespit edildi. In siliko analiz sonuçlarında krizene kıyasla benzo-a-piren ESR1 ve ESR2'ye daha yüksek affinite gösterdi. Krizen maruziyeti gözlenen insan plasenta örneklerinde; KEGG yolak analizlerinde östrojen reseptör aktivasyonu, östrojen sinyalizasyon yolağı ve östrojen metabolik proses ile ilişkili yolaklar bulundu. Krizen maruziyeti gözlenen köpek plasenta örneklerinde; östrojen metabolik proses ile ilişkili yolaklar bulundu. Geliştirilen sensörün LOD değerleri tampon çözelti, serum ve trofoblast hücreleri için sırasıyla; 5,49x10-18M, 1,35x10-17M ve 2x10-17M bulundu.

Anahtar Sözcükler: Biyosensörler, Östrojen Reseptör, Plasenta Toksikolojisi, Veteriner Toksikoloji

Abstract:
The placenta is important for the continuation of pregnancy and the development of the fetus; placenta is shaped by two different genetic organisms, the uterus wall of the mother and the tissue of the fetus, and has a unique feature in terms of structure and function. During pregnancy, 17-ß-estradiol (E2) production has been found to increase approximately eighty-fold in some species, and the placenta specifically binds estrogens. Expression of estrogen receptor-1 (ER1) protein in the placenta and its localization in villous cytotrophoblast (CT), vascular pericytes and amniotic fibroblasts. Although the human placenta has been shown to bind to E2 and estrogens have been shown to affect various aspects of placental function and fetal development in humans and primates, there are no studies that have shown the placenta as a target for estrogens in humans and dogs in terms of species. Physiological responses to estrogen are known to be mediated in specific tissues by at least two estrogen receptors (ER), ER1 and ER2. From polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), Benzo-a-pyrene (BaP) and chrysene have structural similarity to 17-ß-estradiol and have been shown to interact with ERs. Although the concentration of endocrine disrupting chemicals in the environment is low, chronic exposure can cause harmful biological effects on animals and humans. In order to solve these problems, simple, fast, sensitive and accurate methods should be used in the determination of these substances. The doctoral thesis was completed in 3 sections in order to associate with real exposure conditions (epidemiological) and to investigate these relationships in experimental conditions. In the first step of the doctoral thesis, BaP and chrysene residues were investigated in placental tissues (GC/MS analysis), estrogen and estrogen receptor expression were examined with microarray and RNAseq analyzes and correlated with bioinformatics analysis and in silico analysis methods. In the second step, estrogen and ER receptor expression in human placental cell line HTR-8/SVneo cells in the presence of BaP and chrysene was examined in vitro (cytotoxicity, PCR, Western Blot, ELISA). In the third step, a biosensor was developed with molecularly imprinted polymer technology that makes electrochemical measurements for estrogen. No benzo-a-pyrene has detected in human and dog placenta samples. Chrysene has found between 4,062-1518,938 ng/g in human placenta samples; in dog placenta samples chrysene has found in the range of 5,580-14,800 ng/g. In silico analysis results has shown that, benzo-a-pyrene showed higher affinity for ESR1 and ESR2 compared to chrysene. In human placenta samples with chrysene exposure; Estrogen receptor activation, estrogen signaling pathway and estrogen metabolic process related pathways were found in KEGG pathway analyzes. In dog placenta samples with chrysene exposure; pathways associated with the estrogen metabolic process were found. LOD values of the developed sensor for buffer solution, serum and trophoblast cells, respectively; 5.49x10-18M, 1.35x10-17M and 2x10-17M were found.

Keywords: Biosensors, Estradiol, Estrogen Receptors, Placental Toxicology, Veterinary Toxicology