Melanom hücre hattında Karbonik Anhidraz-IX inhibisyonunun B-RAF proteini üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of Carbonic Anhydrase-IX inhibition on B-RAF protein in melanoma cell line
Yazar: BEYZA ECEM ÖZ BEDİR
Danışman: PROF. DR. ÖZEN ÖZENSOY GÜLER
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kanser Biyolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Melanomda önemli bir biyolojik belirteç olan CA-IX,  tümör hücrelerinde yüksek derecede eksprese olan ve inhibisyonu yoğun şekilde çalışılan önemli bir enzimdir. Bu transmembran yapıdaki enzimin IC kuyrukları aracılığıyla karsinogenezde rolleri olan bazı yolakları etkilediği keşfedilmiştir. Hücre dışı sinyallerden hücre içi yanıtlara geçişte önemli olan ve birçok hücresel işlevi düzenleyen MAPK yolağı tümör oluşumu ile de ilişkilidir. CA-IX'un ekspresyonunun, MAPK yolağının bileşenleri tarafından düzenlendiği bilinmektedir. Bu yolağın mutasyona uğramış BRAFV600E tarafından aktivasyonu melanom büyümesini, hayatta kalmasını ve anjiyogenezi uyarır. CA-IX inhibisyonunun MAPK yolağı üzerindeki etkisi bugüne kadar aydınlatılmamıştır. Bu tez çalışmasında, CA-IX proteininin inhibisyonunun, MAPK yolağında yer alan B-Raf proteini üzerine olan etkisinin araştırılması amaçlanmıştır.
Söz konusu çalışmada, AZA ve VMF inhibitörleri BRAFV600E mutasyonu olan A375 melanom hücrelerine uygulanmıştır.  Hücre proliferasyonu WST-1 deneyi ile belirlenmiştir. Bu hücrelerde CA9 ve HIF1A ekspresyonları qRT-PCR yöntemi ile araştırılmıştır. CA-IX protein düzeyine AZA inhibitör uygulamasının etkisi ELISA testi ile gösterilmiştir. HIF-1α, CA-IX, B-Raf ve ERK proteinlerinin lokalizasyonları ve ekspresyonları, AZA uygulanmış ve uygulanmamış melanom hücrelerinde immünofloresan boyama ile incelenmiştir. Ayrıca Western Blot analizi ile HIF-1α, B-Raf, p-B-Raf, ERK ve p-ERK proteinleri değerlendirilmiştir.
Bu tez çalışmasında, AZA ile CA-IX inhibisyonunun p-B-Raf ve p-ERK protein düzeylerinde azalmaya sebep olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlara göre; AZA uygulamasının MAPK yolağındaki B-Raf proteini üzerine olan inhibisyon  etkisi, CA inhibitörlerini bu yolak için potansiyel bir ajan olarak düşündürmektedir.

Abstract:
CA-IX, an important biomarker in melanoma, is an crucial enzyme that is highly expressed in tumor cells and its inhibition has been extensively studied. It has been discovered that this transmembrane enzyme affects some pathways that have roles in carcinogenesis via IC tails. The MAPK pathway, which is important in the transition from extracellular signals to intracellular responses and regulates many cellular functions, is also associated with tumor formation. It is known that the expression of CA-IX is regulated by components of the MAPK pathway. Activation of this pathway by mutated BRAFV600E stimulates melanoma growth, survival, and angiogenesis. The effect of CA-IX inhibition on the MAPK pathway has not been determined until now. The main purpose of this study to investigate the effect of inhibition of CA-IX on B-Raf protein which has a critical role in MAPK pathway.
In this study, AZA and VMF inhibitors were treated to A375 melanoma cells which has BRAFV600E mutation. Cell proliferation was determined by WST-1 assay. Furthermore, CA9 and HIF1A expressions in these cells were investigated using qRT-PCR method. Also, the effect of AZA treatment on CA-IX protein levels was demonstrated by ELISA test. The localizations and expressions of HIF-1α, CA-IX, B-Raf and ERK proteins were examined by immunofluorescence in AZA-treated and non-treated melanoma cells. Besides, HIF-1α, B-Raf, p-B-Raf, ERK and p-ERK proteins were examined by Western Blot analysis.
The preliminary results indicate that inhibition of CA-IX by AZA causes decreased p-B-Raf and p-ERK protein levels. According to the results of this study; effect of AZA treatment on B-Raf  in the MAPK  pathway suggests that CA inhibitors can be considered as a potential agent for this pathway.