TWIST1 transkripsiyon faktörünün aktivasyon mekanizmasının ve doğal inhibitörlerinin araştırılması
Investigation of activation mechanism and natural inhibitors of TWIST1 transcription factor
Yazar: SURAY PEHLİVANOĞLU
Danışman: PROF. DR. OSMAN NİDAİ ÖZEŞ
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Epitel = Epithelium ; Genler = Genes ; Genler-TWIST = Genes-TWIST ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Protein kinazlar = Protein kinases ; Transkripsiyon-genetik = Transcription-genetic

Özet:
Epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT), kanser metastazına neden olan temel mekanizmadır. Bu süreçte, ekstraselüler matriks (ECM) proteinlerinin ya degradasyonu ya da ekspresyonlarının baskılanması tümör hücrelerinin hareketi ile sonuçlanır. EMT'de tümör hücrelerinin invazyon oranına bağlı olarak kanserle ilişkili ölüm oranları artar. Bu ölümlerin büyük bir çoğunluğu (yaklaşık olarak % 90) kanser metastazı ile ilişkilidir. Son zamanlarda tanımlanan ve bazik Heliks-Loop-Heliks (b-HLH) yapısal özelliği gösteren bir transkripsiyon faktörü olan TWIST1, ECM ana elemanlarından olan E-Kaderin transkripsiyonunu baskılaması nedeniyle EMT ile ilişkilendirilmiştir. TWIST1 ekspresyon artışına bağlı olarak EMT ve kanser metastazı artmaktadır. TWIST1'in EMT süreci ile ilişkisini bilmemize rağmen aktivasyon mekanizması hakkındaki bilgilerimiz sınırlıdır. TWIST1'in protein dizisini incelediğimizde RxRxxS/T konsensus motifi yapısında 3 adet  AKT bağlanma bölgesini belirledik. İnsan TWIST1 yapısında bunlar Ser42, Tre121 ve Ser123 amino asitleridir. Çalışmamızda, doku özgü büyüme faktörleri ile aktive edilen AKT'nin belirlenen amino asitlerden TWIST1'i fosforile ettiğini gösterdik. Bu amino asit rezidularının anlamlılığını belirlemek için ilgili amino asitleri fosforile olamayan Alanin ve fosforilasyonu taklit eden negatif yüklü Gutamik asid formlarına çevirdik. Alanin mutantları TWIST1'i inaktive ederken Glutamik asid mutantları ise aktive etmektedir. Elde ettiğimiz sonuçlara göre; TWIST1, AKT tarafından fosforile edilmektedir ve bu fosforilasyon aktivasyonu için gereklidir. Öngörüldüğü gibi aktive olan TWIST1 E-Kaderin transkripsiyonunu baskılarken N-Kaderin ve Vimentin ekspresyonlarını ise indükler. Sonuç olarak, TWIST1 aktivasyonu AKT tarafından fosforilasyona ihtiyaç duyar ve bu durum EMT regülasyonu için gereklidir.

Abstract:
Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) is a major mechanism that causes cancer metastasis. In this process, proteins of extracellular matrix (ECM) are either degraded or their expression is supressed resulting in mobilization of tumor cells. Depending on tumor dissemination, cancer associated mortality rates increases with EMT. The majority of deaths (about 90%) associated with cancer are due to the metastasis. Recently discovered transcription factor TWIST, a transcription factor with bHLH motif, is tightly associated with EMT because of its ability to repress transcription of E-Cadherin, a major constituent of ECM. Therefore, increased expression of TWIST1 contribute to EMT and cancer metastasis. Although, we know the involvement of TWIST1 in EMT, little is known about the mechanism of activation of TWIST1. By searching the amino acid sequence of TWIST1 we have found 3 conserved AKT/PKB phosphorylation sites in the consensus RxRxxS/T motif. These sequences are Ser42, Thr121, and Ser123 in human TWIST1. In our study, we showed that AKT is activated by tissue specific growth factors and  phosphorylate TWIST1 at indicated sites. To further analyse the significance of phosphorylation of these sites, we converted above residues to unphosphorylatable Alanine or phosphorylation mimicking negatively charged Glutamic acid. Alanine mutants of TWIST1 turn out to be inactive whereas Glutamic acid mutants are active. Our results indicate that TWIST1 is phosphorylated by AKT and this phosphorylation is required for its activation. As anticipated, activated TWIST1 respresses the transcription of E-Cadherin while inducing the expresssion of N-cadherin and Vimentin.  In conclusion, TWIST1 activation requires phosphorylation by AKT and this is necessary for TWIST1-regulated EMT.