Fenilketonüri tanısı için kağıt-tabanlı mikroakışkan analitik cihaz geliştirilmesi
Mi̇croflui̇di̇c paper-based analytical device for detection of phenylketonuria
Yazar: PELİN KAZANCI
Danışman: DOÇ. DR. MEMED DUMAN ; PROF. DR. RIZA KÖKSAL ÖZGÜL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Fenilketonüri = Phenylketonuria

Özet:
Fenilketonüri (FKU), fenilalaninin metabolize edilememesi, kanda ve diğer vücut sıvılarında artması sonucu kişinin beyninde hasara sebep olan bir hastalıktır. Hastalığa sahip bireylerde kan fenilalanin seviyesinin düzenli aralıklarla takibi zorunlu olup, bu testler zaman alıcı, yüksek maliyetli ve uygulamadaki teknik zorluklar ile teknik ekipman ve uzman personel gerektirmesi nedeniyle özellikle hastalığın yaygın olduğu kırsal kesimlerde yeterince uygulanabilir değildir. Gözenekli yapısı, yüzey özelliklerinin geniş bir ölçekte kontrol edilebilmesi ve istenilen uygulamaya göre biyolojik olarak kolay modifiye edilebilmesi nedeniyle kağıt, sensör uygulamaları başta olmak üzere çeşitli biyolojik çalışmalarda sıklıkla kullanılan bir sistemdir. Kağıt tabanlı mikroakışkan sistemlerin üretiminde kullanılan en temel yöntemlerden biri mürekkep püskürtmeli yazıcılardır. Bu yöntemde yazıcı, pikolitre mertebesine kadar inen test sistemi başına örnek sarfiyatı ile, yüksek keskinlik ve tekrarlanabilirlik ile istenilen molekülün test sistemine aktarılmasını sağlar.
Üretilen test kiti üzerinde gerçekleştirilen enzimatik ve kolorimetrik reaksiyonlar kapsamında, fenilalanin dehidrojenaz enzimi NAD+ varlığında fenilalanin ile tepkimeye girmektedir. Açığa çıkan NADH, reaksiyonun ikinci basamağında mPMS ile yükseltgenerek son ürün olarak formazan üretmektedir. Ortamdaki fenilalanin derişimine bağlı olarak üretilen formazan miktarı test bölgesinde mor tonlarında bir renk değişimine sebep olmakta ve renk seviyesinin optik karakterizasyon yöntemiyle analizi sonucu fenilalanin derişimi tayinine imkan sağlamaktadır. 
Yazıcı ile üretilen test sistemi için hesaplanan tayin sınırı 4.01 mg/dL olarak ölçülmüştür. Cihazın kolorimetrik cevap süresi 8 dakika olarak hesaplanırken, toplam üretim süresi 5 dakikaya düşürülmüştür. Püskürtme oranlarının elektronik olarak kontrol edilebilmesi üretim sırasında reaktif madde derişimini daha hassas bir şekilde ayarlama imkanı yaratmış; bu durum da test kitinin doğrusal olarak çalıştığı derişim aralığı olan 0-22 mg/dL bölgesini kontrol etme yetisi kazandırırken, bağımsız üretilen kitler arasındaki ölçüm tekrarlanabilirliğini arttırmıştır.  
Sunulan tez çalışması ile fenilketonüri hastalığının takip gerektiren seviyesi, orta hiperfenilalaninemi, orta dereceli fenilketonüri ve klasik fenilketonüri olmak üzere dört ayrı derecesini kolorimetrik olarak anlamlı bir şekilde ölçmesinde kullanılmak üzere üretimi kolay, maliyeti düşük, cevap süresi hızlı bir test sistemi başarıyla geliştirilmiştir.

Abstract:
Phenylketonuria (PKU), is a disease caused by the failure of phenylalanine metabolization and resulting accumulation at blood and other body fluids causing brain damage. Despite periodic phenylalanine monitoring is a necessity for PKU patients; due to being a time consuming test with high costs and requirement of analytical grade equipment along with trained personnel, it is not widely accessible especially at the rural areas where the disease is more common.  
Porous structure, precisely controllable surface properties and easy biological modification makes paper a commonly used material in biology, especially in sensor applications. One of the most widely used fabrication methods for preparation of paper based microfluidic systems is inkjet printing. This method enables fast and vast production of test systems with very high pattern resolution and repeatability with regant volumes as low as picoliters per test strip.
The first stage of detection mechanism which is an enzymatic process, is the reaction between phenylalanine and phenylalanine dehydrogenase in the presence of NAD+. This reaction results with reduction of NAD+ to NADH. In the second stage, NADH is oxidized again by mPMS and produce formazan as end-product. Consequently the amount of produced formazan is a function of the input phenylalanine concentration. Significantly different color of formazan comparing all the input samples and by-products allow us to detect formazan quantity on test specimen therefor input phenylalanine concentration.
Calculated limit of detection for ink-jet printer fabricated test system is 4.01 mg/dL. Colorimetric response time is calculated as 8 minutes while fabrication time is reduced to 5 minutes. By printer fabrication, the ability to control spraying ratio electronically enables us to control the reactant concentration resulting a better control over the linear range of test system which is 0-22 mg/dL. Same feature also drastically improve sensor-to-sensor repeatability.
Within this study; a low cost and fast responsive test system with minimal fabrication requirement has been successfully developed which can identify monitor required phenylketonuria, mid-hyperalaninemia, mid-phenylketonuria and classic phenylketonuria with colorimetric technique with high trust rate.