Pankreatik lipaz enziminin kompozit taşıyıcılarda immobilizasyonu ve karakterizasyonu
Immobilization and characterization of pancreatic lipase enzyme on composite carriers
Yazar: DİLEK GÜNAL
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE DİNÇER
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Bölümü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Lipazlar (triaçilgliserol hidrolazlar, EC 3.1.1.3), yağların hidrolizini veya sentezlenmesini katalizleyen enzimlerdir. Biyokimyasal ve fizyolojik özelliklerinin yanında endüstriyel uygulamaları nedeniyle de araştırma konusu olmaktadırlar. Lipazlar, katı ve sıvı yağları, serbest yağ asitleri, diaçilgliseroller, monoaçilgliseroller ve gliserollere hidroliz eden, oldukça yaygın olarak bulunan enzimlerdir. Bunun yanı sıra organik çözgenlerde esterifikasyon, transesterifikasyon, aminoliziz gibi çok çeşitli reaksiyonun katalizini de gerçekleştirirler. Katalizledikleri bu çok çeşitli reaksiyonlar nedeniyle rasemik karışımların ayrılması, yeni sürfaktanların ve farmasötiklerin sentezi, yağ dönüşümleri, deterjan üretimi gibi oldukça geniş endüstriyel kullanım alanına sahiptirler. Ekonomik açıdan düşünüldüğünde, lipazın endüstriyel ölçekte kullanımı immobilizasyonunu gerektirmektedir. İmmobilize enzimler birçok kez ve uzun süre kullanılabilmesi, sürekli işlemlere uygulanabilmesi, kararlı olması, çevre koşullarına(pH, sıcaklık, vs) dayanıklı olması gibi sebeplerden dolayı doğal enzimlere göre daha çok tercih edilirler.
Bu çalışmada porsin pankreatik lipaz enzimi doğada bol miktarda bulunan, ekonomik ve ucuz bir biyopolimer olan kitosan ile hazırlanan kompozit taşıyıcılar üzerine kovalent olarak immobilize edildi. Kitosan laboratuvar ölçekli çalışmalarda enzim immobilizasyonu için yaygın olarak kullanılmasına rağmen endüstriyel uygulamalarda bazı engeller vardır. Çapraz bağlı kitosan boncukları büyük mekanik dayanıklılığa sahiptir ancak yine de operasyonel uygulamalarda sorunlarla karşılaşılmaktadır. Boncuk yoğunlukları suya çok yakındır ve dokusu çok yumuşaktır. Bu çalışmada kitosan, mekanik kararlılığı artırmak için karbon nanotüp (Multiwalled carbon nanotube, MWCN) ve perlit gibi materyaller ile karıştırıldı, hazırlanan süspansiyon tripolifosfat içerisine damlatılıp kompozit boncuklar oluşturuldu. Bu şekilde kitosan boncukların yoğunluk ve mekanik gücü artacak ve uygulama alanları genişleyecektir. Hazırlanan kompozit taşıyıcıların kararkterizasyonu fourier transform infrared (FTIR) spektroskopisi, taramalı elektron mikroskopu (SEM) ve termal gravimetrik analiz (TGA) ile yapıldı. İmmobilizasyon koşulları optimizasyonu amacıyla çapraz bağlama süresinin etkisi, enzim bağlama süresinin etkisi ve enzim konsantrasyonunun etkisi incelendi. ECH ile optimum çapraz bağlama süresi kitosan-perlit kompozit boncuklar için 4 saat, kitosan-MWCNTs kompozit boncuk için 17 saat bulundu. Lipaz enziminin optimum bağlanma süresi çapraz bağlı her iki kompozit boncuk içinde 24 saat ve optimum enzim konsantrasyonu 2 mg/ml bulundu. Bununla birlikte hem serbest hem de immobilize lipaz aktivitesi üzerine pH'ın etkisi ve sıcaklığın etkisi incelendi. Optimum pH değeri serbest enzim için pH 7,0, iki farklı taşıyıcıya immobilize edilmiş enzim için ise bir birim alkali bölgeye kayarak pH 8,0 bulundu. Serbest enzim için optimum sıcaklık düzeyi 40 °C olarak belirlenirken kitosan-perlit ve kitosan-MWCNTs için bu değer 50 °C olarak belirlendi. Serbest ve immobilize enzimin sıcaklık, pH ve depolama stabiliteleri karşılaştırılarak, immobilize lipaz enziminin tekrar kullanılabilirliği incelendi. Kompozit taşıyıcılar üzerine immobilize edilen lipaz enziminin yüksek sıcaklıklarda serbest enzime göre daha stabil olduğu görüldü. Geliştirilen yöntemle immobilize lipazın her pH düzeyinde stabilitesinin arttığı ve pH stabilite aralığının genişlediği görüldü. Serbest ve immobilize enzimlerin depolama stabiliteleri incelendiğinde, immobilize enzimlerin serbest enzime kıyasla daha yüksek stabilite gösterdiği gözlemlendi. 40 günün sonunda; +4 °C de kitosan-perlit kompozit boncuk üzerine immobilize edilen lipaz için % kalan aktivite değeri %59; kitosan-MWCNTs kompozit boncuklar üzerine immobilize edilen lipaz için % kalan aktivite değeri %63 olarak hesaplanırken bu değer serbest enzimde %20 olarak ölçüldü. Oda sıcaklığında ise kitosan-perlit kompozit boncuk üzerine immobilize edilen lipaz için % kalan aktivite değeri %48; kitosan-MWCNTs kompozit boncuklar üzerine immobilize edilen lipaz için % kalan aktivite değeri %55 olarak belirlenirken bu değer serbest enzimde %5 olarak bulundu. Ayrıca immobilize lipazın tekrar kullanılabilirliği incelendiğinde; kitosan- perlit ve kitosan- MWCNTs kompozit taşıyıcı üzerine immobilize edilen lipaz enziminin sırasıyla 15 kez ve 13 kez tekrar kullanım sonrasında % 50 aktivitesini koruduğu gözlendi.

Abstract:
Lipases (triacylglycerol hydrolases, EC 3.1.1.3) are the enzymes which catalyze the hydrolysis or synthesis of fats and oils. In addition to biochemical and physiological properties of lipases, they become subject of research due to industrial applications. Lipases are commonly found enzymes which hydrolyze solid-liquid oils to free fatty acids, diacylgliserols, monoaçilgliseroller and glycerol. They also catalyze reactions like esterification, transesterification, aminolysis in the organic solvents. Because of a wide variety of reactions they can be use in the separation of racemic mixtures, synthesis of new surfactants and pharmaceuticals, oil transformations and detergent manufacturing. Given the economic point of view, the use of lipase in industrial scale, an immobilization is required. Immobilized enzymes are preferred to natural enzymes because they can be reused for many times, and for a long time, they can be applied to continuous operations, they are stabile and resistant to environmental conditions (pH, temperature, etc.). 
In this study, porcine pancreatic lipase enzyme was immobilized on composite carries which was prepared by economical and inexpensive biopolymer such as chitosan. Chitosan is widely used in laboratory-scale studies for immobilization of enzymes although there are some obstacles for industrial applications. Cross-linked chitosan beads have greater mechanical strength, but they still have problems with operational applications. Density of the beads is very close to water and its texture is very soft. In this study, chitosan mixed with carbon nanotube (Multiwalled carbon nanotube, MWCNTs) and perlite for increasing the mechanical strength than the suspension dropped in tripolyphosphate solution. Characterization of composite beads was done by fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, scanning Electron microscopy (SEM) and the thermal gravimetric analysis (TGA). To optimize the immobilization conditions, effect of crosslinking time, enzyme immobilization time and effect of lipase concentration were examined. Optimum ECH crosslinking time was found as 4 hours and 17 hours for chitosan-perlite and chitosan-MWCNTs respectively. Optimum enzyme immobilizasyon time was found as 24 hours for chitosan-perlite and chitosan-MWCNTS composite beads.  Optimum enzyme concentration was determined as 2 mg/ml for both of them.  In addition, effect of pH and temperature on the activity of free and immobilized lipase was examined. The optimum pH of the immobilized lipase was shifted slightly to the alkaline region relative to the free enzyme and it was found as pH 8.0 for both carriers. Optimum temperature of free lipase was reported as 40 ˚C and it was found as 50 ˚C for the enzyme immobilized on  both chitosan-perlite and chitosan-MWCNTs. Also, thermal, pH and storge stability of free and immobilized enzyme was compared and the reusability of immobilized lipase was examined. The thermal stability of immobilized lipase was better than that of the free lipase. The immobilized enzyme was more stable than its free form in this pH range. For the developed method, immobilization lipase was showed greater storage stability than free enzyme. At the end of 40 days, while free lipase had 20% remaning activity, this value was calculated as 59 % and 63 % for lipase immobilized on chitosan-perlite and chitosan-MWCNTs composite beads respectively at +4 0C.  At the end of same period of storage, free lipase had 5 % remaning activity and this value was calculated as 48 % and 55 % for lipase respectively at room temperature. When reusability of immobilized lipase was examined, it retained 50 % of its original activity after 15 and 13 reuses when lipase immobilized on chitosan-perlite and chitosan-MWCNTs composite beads respectively.