Çeşitli kaynaklardan izole edilen bacillus sp. izolatlarının kitosanaz aktivitesinin ve antifungal etkisinin belirlenmesi
Investigation of chitosanase activity and antifungal effect of bacillus strains isolated from different sources
Yazar: ÖZLEM İMAMOĞLU
Danışman: PROF. RENGİN ELTEM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bacillus spp. tarafından üretilen küf hücre duvarını parçalayan kitosanaz gibi hidrolitik enzimler ve birçok antifungal antibiyotik, toprak kaynaklı fungal hastalıklara karşı antagonistik etki sağlamaktadır. Çalışmamızda incir ve çekirdeksiz üzümlerde özellikle hasat öncesi periyotta mikotoksin oluşumunun azaltılmasında biyokontrol amaçlı strateji geliştirmek için kitosanaz aktivitesi yüksek olan Bacillus izolatlarının belirlenmesi amaçlanmıştır.Çalışmamızda çeşitli kaynaklardan yapılan izolasyon çalışmaları sonunda 508 tane Bacillus izolatı elde edilmiştir.?Soluble Chitosanase Detection Agar (SCDA)?da yapılan tarama çalışmaları sonucunda sadece 184 tanesinde (% 36) kitosanaz aktivitesi belirlenmiş ve bunların enzimatik indeks değerleri hesaplanmıştır.Kitosanaz aktivitesi ile enzimatik indeks değerine göre seçilen toplam 18 Bacillus izolatının Aspergillus niger EGE-KL-213, Aspergillus foetidus EGE-KL-211, Aspergillus ochraceus EGE-K-217 ve Fusarium solani KCTC 6328 test küflerine karşı antagonistik özellikleri incelenmiş ve hepsinde antagonistik aktivite saptanmıştır. Daha sonra potansiyel biyokontrol ajanı olan bu izolatların Kitosanaz Ortamı II' de maksimum kitosanaz (0,84 U/ml-11,60U/ml), kitinaz (0,84-2,88 U/ml), n-asetil-ß-heksoamidaz (0,97-5,98 U/ml) ve proteaz (1,64-92,42U/ml) enzim aktiviteleri ile toplam protein (0,059-0,117mg/ml) miktarları saptanmıştır.18 potansiyel biyokontrol ajanı Bacillus izolatının kitosanaz aktivitesinin en yüksek olduğu saatten alınan fermentasyon sıvılarının Aspergillus niger'in spor çimlenmesine ve biyokütle gelişimine karşı 12 saat sonundaki etkileri incelenmiştir. Fermentasyon sıvılarının A.niger'in spor çimlenmesinde meydana getirdikleri azalma oranları % 14,7 ile % 61,6 arasında buna karşılık biyokütle üretiminin azalma oranları ise % 10,9 ile % 30,4 arasında belirlenmiştir.Yapılan çeşitli invitro denemeler sonucunda; potansiyel biyokontrol ajanı olarak belirlenmiş 18 tane Bacillus izolatının arasından kitosanaz enzim aktivitesi ve kitosanaz enzim stabilitesi, kitinaz, n-asetil-ß-hexoaminidaz, proteaz enzim aktiviteleri, toplam protein miktarı ve bu Bacillus izolatlarının her birinin fermentasyon sıvısının Aspergillus niger EGE-KL-213 küfünün spor çimlenmesi ve biyokütle miktarında meydana getirdiği indirgenme oranları ile yayılma hızına göre en etkin 5 tanesi (Bacillus sp. EGE.B.6.1m, Bacillus sp. EGE.B.4.2i; Bacillus sp. EGE.B.1.23, Bacillus sp. EGE.B.8.1m, Bacillus sp. EGE.B.19.3) belirlenmiştir.

Abstract:
Hydrolytic enzymes such as chitosanases, lyse fungal cell wall, and several antifungal antibiotics are produced from Bacillus spp. have antagonistic effect against soil born fungal diseases. In our study we aimed that to select and determine Bacillus isolates having high chitosanase activity as potential biocontrol agents for mycotoxin management on vineyards and orchards especially during preharvest period.In our study, 508 Bacillus isolate were isolated from different sources. After screening period on ?Soluble Chitosanase Detection Agar (SCDA)?, chitosanase activity were detected on 184 isolates (36%) and enzymatic index values were calculated.18 Bacillus isolates were selected according to their chitosanase activities and enzymatic index values and they were investigated against Aspergillus niger EGE-KL-213, Aspergillus foetidus EGE-KL-211, Aspergillus ochraceus EGE-K-217 and Fusarium solani KCTC 6328. All the 18 isolates were detected to have antagonistic activities. Maximum chitosanase (0,84 U/ml-11,60U/ml), chitinase (0,84-2,88 U/ml), protease (1,64-92,42U/ml), n-acetyl-ß-D-hexosaminidase (0,97-5,98 U/ml) activities and total protein amount (0,059-0,117mg/ml) of these potential biocontrol agents were determined on Chitosanase Medium II.Fermentation broth samples were taken of 18 potential Bacillus isolates at incubation time with the highest chitosanase activity and their effects on misel growing and spore germination of Aspergillus niger EGE-KL-213 for 12 hour period were investigated. While fermentation broth decreasing rates on spore germination of Aspergillus niger EGE-KL-213 were changed between 14.7%-61.6% , decreasing rates on biomass production of Aspergillus niger EGE-KL-213 were changed between 10.9%-30.4%.As a result of in vitro studies, 5 Bacillus isolates (Bacillus sp. EGE.B.6.1m, Bacillus sp. EGE.B.4.2i; Bacillus sp. EGE.B.1.23, Bacillus sp. EGE.B.8.1m, Bacillus sp. EGE.B.19.3) out of total 18 potential Bacillus isolates were determined the most effective biocontrol agents according to chitosanase activity, chitosanase enzyme stability, chitinase, n-acetyl-ß-D-hexosaminidase, protease activities, total protein amount and their fermentation broth decreasing rates on misel growing and spore germination of Aspergillus niger EGE-KL-213 and their spreading characteristics.