Mikroakışkan sistemler yardımıyla bakteri tayini için analitik yöntemler geliştirilmesi
Development of analytical methods for bacteria detection by using microfluidic devices
Yazar: MERVE ERYILMAZ
Danışman: PROF. DR. UĞUR TAMER
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Analiz teknikleri = Analysis techniques ; Bakteriler = Bacteria ; Görüntü analizi = Image analysis ; Lipozomlar = Liposomes ; Mikro akışkanlar = Microfluidics ; Raman spektroskopisi = Raman spectroscopy ; Salmonella = Salmonella ; Salmonella enteritidis = Salmonella enteritidis ; Streptococcus = Streptococcus ; İmmünoassay = Immunoassay

Özet:
Patojen mikroorganizmaların hızlı ve doğru tayini çözüm bekleyen problemler arasındadır. Bunların içerisinden patojen bakteri tayini amacıyla kültür yöntemi altın standart olarak uygulanmaktadır fakat iki gün süren analiz süresi ve uzman kişi bilgi gereksinimi en büyük dezavantajlarıdır. Bu sebeple tez çalışması kapsamında A grubu Streptococcus pyogenes bakterisi için kültür yöntemine kıyasla en doğru ve daha hızlı tayin yöntemleri geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu bakterinin analizi boğazdan eküvyon çubuklarıyla alınan numune ile başlamaktadır ve bu nedenle tez çalışmasının ilk bölümünde eküvyon çubuklarının etkinliği geliştirilen yüzeyde zenginleştirilmiş Raman spektroskopisi (YZRS) tabanlı baç immunoassay yöntemi ile çalışılmış ve bakterinin eküvyon çubukları ile deneyinde %94,3 oranında analizde kaldığı gösterilmiştir. Baç analizin her basamağı optimize edilmiş ve kültür yöntemi ile doğrulanmıştır. Bu çalışmayı takiben tez çalışmasının ikinci bölümünde kâğıt tabanlı mikroakışkan test şeritleri inşa edilmiş ve hem renk değişimine hem de YZRS ölçümüne dayalı analiz gerçekleştirilmiştir. Yatay akışlı immunoassay test şeritleri ile 30 dakika içerisinde ASP bakterisi 100 KOB/mL seviyesine kadar tayin edilebilmiş ve teşhis sınırı 1,0 KOB/mL olarak hesaplanmıştır. Aynı zamanda bu çalışma ile patojen bakterilerin hücre duvarı özelliklerinin yatay akış test şeritlerinde yapılan analizleri etkilediği gösterilmiştir. Tez çalışmasının üçüncü bölümünde ise yine aynı bakteri için görüntü analizi yardımıyla bir kolorimetrik yöntem geliştirilmiştir. Bir nitel bakteri tanımlama testi olan PYR, bu tez çalışması ile ilk kez nicel bir analiz yöntemi haline gelmiştir. Renk değişiminin çıplak gözle takip edilebilmesine ek olarak görüntü analizi Image J programı ile yapılmıştır ve elde edilen veriler ile yöntem valide edilmiştir. Nanopartiküller destekli PYR enzim testi ile 4 saat içerisinde 104 KOB/mL bakteri tayin edilebilmiştir. Tez çalışmasının son bölümünde Salmonella Enteritidis bakterisi için immunolipozomlar varlığında bir immunoassay yöntemi tasarlanmıştır. Sinyal molekülü taşıma özellikleri ile sensör uygulamalarında giderek önem kazanan lipozomlar tez çalışmasında homojen bir immunoassay sistemde çalışılmış ve bakteri tayininde uygulanabilirliği gösterilmiştir.

Abstract:
Rapid and accurate detection of pathogen microorganisms remains its importance in the related fields. For the detection of pathogen bacteria, culture method is the most popular technique and known as the gold standard, however it is time-consuming and needs labor. For this reason, this thesis study aims to detect group A-Streptococcus pyogenes as accurate as the gold standard, but in a faster manner. The detection of this bacteria starts with a swab sampling from the throat and as a first step of the thesis study, the efficiency of the swab sampling was proposed with surface enhanced Raman spectroscopy-based batch assay. Each step of the assay was controlled by the plate-counting method and it was shown that 94.3% of bacteria remains in the analysis. Secondly, paper based microfluidic test strips were constructed for the detection of same bacteria and both colorimetric and SERS measurements were performed. This study enabled the detection of 100 CFU/mL bacteria in 30 minutes with a LOD of 1.0 CFU/mL. Besides, this study was featured with the discussion of the whole cell and pretreated cell detection of pathogens with lateral flow test strips. In the third chapter of the thesis study, nanoparticle assisted PYR assay with image analysis was proposed and up to 104 CFU/mL bacteria could be detected in four hours with this assay. PYR is normally known as an identification test, but with this proposed work it has become a quantitative assay. Besides observing color changes with naked eye, image analysis with Image J enables the analytical validation of the method. Finally, in the last chapter of the thesis study, Salmonella enteritis was detected with antibody modified liposomes called immunoliposomes. These liposomes have been used as labels in the immunoassay with metal organic framework nanoparticles in the pathogen detection. The use of liposomes as a signal molecule carrier agent have become very popular in sensors, therefore feasibility of the concept has been showed in the last chapter of the thesis.