Kangal balığının (Garra rufa) farklı dokularından karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı metal iyonların etkilerinin incelenmesi
Purification and characterization of carbonic anhydrase from different tissues of kangal fish (Garra rufa) and inhibition effects of some metal ions on the enzyme activity
Yazar: ÜMİT MUHAMMET KOÇYİĞİT
Danışman: PROF. DR. İLHAMİ GÜLÇİN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada Sivas Kangal balıklı kaplıcalardaki doktor balıklar olarak bilinen Kangal balığının (Garra rufa) solungaç, kas ve göz dokularından karbonik anhidraz enzimi ilk kez saflaştırılmış ve karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Balığın solungaç, kas ve göz dokularından saflaştırılan CA enzimleri sırasıyla 12.77, 34.36 ve 17.50 EU x mg-1 spesifik aktiviteleriyle, %15.4, %34.4 ve %21.2 verimleriyle ve 240.9, 203.3 ve 388.9 saflaştırma katsayıları ile Sepharose-4B-L-tirozin-sülfanilamid afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. 
Enzimlerin saflığını kontrol etmek amacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapıldı ve her bir doku için tek bant gözlendi. Tüm dokulardan saflaştırılan CA'lar için bazı kinetik özellikler araştırıldı. Bunun için, optimum iyonik şiddet 1M Tris-SO4 tamponu olarak belirlendi. Optimum ve stabil pH değerleri 4oC'de 1 M'lık sırasıyla Tris-SO4 ve fosfat tamponlarında hesaplandı. Ayrıca, her bir doku için optimum sıcaklık, aktivasyon enerjisi (Ea), aktivasyon entalpisi (ΔH), Q10 ve değerleri Arrhenius grafiğinden elde edildi. KM ve Vmax değerleri p-nitrophenylacetate substratı kullanılarak Lineweaver-Burk grafiklerinden hesaplandı. Kangal balığının  solungaç, kas ve göz dokuları CA'larının kcat değerleri sırasıyla 114.9, 19.2 ve 66.9 s-1 olarak bulundu. Bunun yanı sıra, Kangal balığının dokularından saflaştırılan CA aktiviteleri üzerine bazı ağır metal iyonlarının (kobalt, kadmiyum, bakır, kurşun ve demir) inhibitör etkileri esteraz metodu kullanılarak in vitro şartlarda incelendi. Doku CA enzimleri aktivitelerinin %50'sinin inhibe edildiği ağır metal konsantrasyonları (IC50) hesaplandı. Son olarak Lineweaver-Burk grafiklerinden inhibisyon sabitleri (Ki) tüm dokulardan saflaştırılan CA enzimleri için belirlendi.

Abstract:
In the present study, carbonic anhydrase enzyme (CA) was firstly purified and characterized from gill, muscle and eye tissues from Kangal fish (Garra rufa) as known doctor fish, in which living Sivas Kangal spring. CA, which purified from gill, muscle and eye tissues was purified using by Sepharose-4B-L tyrosine-sulfanilamide affinity gel chromatography with specific activities of 12.77, 34.36 and 17.50 EU x mg-1, yields of 12.44%, 34.36% and 25% and purification folds of 241, 201 and 389, respectively. 
To check the purities of enzymes, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed, and single band was observed for each tissue. Some kinetic properties were performed. For this, optimum ionic strengths for the CAs from all tissues were found as 1 M Tris-SO4 buffer. Optimum and stable pH values were determined in 1 M Tris-SO4 and phosphate buffers at 4oC, respectively. In addition, the optimum temperature, activation energy (Ea), activation enthalpy (ΔH) and Q10 values were calculated from Arrhenius plot for tissues. KM and Vmax values were determined from Lineweaver-Burk graphs using p-nitrophenylacetate as a substrat. Kcat values of the Kangal fish gill, muscle and eye CAs were found as 114.85, 19.21 and 66.88 s-1, respectively. Also, the inhibitory effects of different heavy metals (cobalt, cadmium, copper, lead and iron) on Kangal fish gill, muscle and eye CAs activities were investigated using by esterase method under in vitro conditions. The heavy metal concentrations, inhibited in vitro 50% of tissue CA enzymes activity, were obtained for CA enzymes from all tissues. Finally, Ki values for these substances were also calculated from Lineviewer-Burk graphs.