Gıda ve yem analizlerinde kullanılan bazı analitik mikotoksin standartlarının üretimi üzerine araştırmalar
Research on the production of some analytical mycotoxin standards used in food and feed analysis
Yazar: HÜSEYİN KARAKAYA
Danışman: PROF. DR. MURAT YILMAZTEKİN
İnönü Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Aflatoksinler = Aflatoxins ; Cevap yüzey yöntemi = Response surface methodology ; Mikotoksinler = Mycotoxins ; Zearalenon = Zearalenone

Özet:
Bu çalışmada, küf izolatları kullanılarak aflatoksin, okratoksin A (OTA), deoksinivalenol (DON) ve zearalenon (ZEA) mikotoksinlerinden en az bir tanesinin yüksek saflıkta (≥%90) üretilmesi amaçlanmıştır. İlk olarak, Türkiye pazarından temin edilen gıda örneklerinden toplam 126 adet küf izolatı elde edilmiştir. Makroskobik ve mikroskobik gözlemler yapılarak Aspergillus, Penicillium ya da Fusarium sp.'ye ait olabilecek izolatlar belirlenmiştir. Seçili izolatların tür tanımlamaları, Internal Transcribed Spacer (ITS1-4) bölgelerine ait dizi sonuçlarının NCBI veritabanı ile karşılaştırılması şeklinde yapılmıştır. Potansiyel mikotoksijenik izolatlar sıvı besi ortamında geliştirilmiş ve ortamdaki mikotoksin miktarları Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi kullanılarak belirlenmiştir. Analiz sonuçlarına göre IK5-D2 A. flavus (AFB1 ve AFB2 üreticisi) ve B1-D1 F. culmorum (ZEA üreticisi) izolatlarının yüksek miktarlarda mikotoksin üretebildiği tespit edilmiştir. Belirtilen mikotoksinlerin üretim miktarlarının arttırılması için üç bağımsız değişkenle (pH, sıcaklık ve inkübasyon süresi) Box-Behnken deneme dizaynı oluşturulmuştur. Sonuçlar, Yanıt Yüzey Yöntemi'ne göre değerlendirilmiş ve süreç matematiksel olarak modellenmiştir. Optimize edilmiş koşullarda üretilen AFB1, AFB2 ve ZEA miktarları sırasıyla 27244.5 ng/mL, 681.8 ng/mL ve 6645.9 ng/mL olarak bulunmuştur. Deneysel sonuçların matematiksel modellerden elde edilen tahminler ile uyumlu olduğu saptanmıştır. Besi ortamından ekstraksiyonla alınan mikotoksinler yarı-preparatif kromatografi yöntemi kullanılarak saflaştırılmıştır. Asetonitril çözeltisi şeklinde hazırlanan mikotoksin fraksiyonlarının saflık oranları AFB1, AFB2 ve ZEA için sırasıyla %90.3, %99.6 ve %95.4 olarak bulunmuştur. Besiyerinden geri kazanım oranları ise sırasıyla %73.2, %82.8 ve %91.0 olarak hesaplanmıştır. Yüksek saflıkta üretimi gerçekleştirilen mikotoksin çözeltilerinin toksikolojik çalışmalarda ya da gıda ve yem analizlerinde analitik standart madde olarak değerlendirilme potansiyeline sahip olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
In this study, it was aimed to produce at least one of aflatoxin, ochratoxin A (OTA), deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEA) mycotoxins at high purity (≥%90) using mold isolates. Firstly, a total of 126 mold isolates were obtained from food samples supplied from the Turkish market. The isolates that may belong to Aspergillus, Penicillium or Fusarium sp. were determined by making macroscopic and microscopic observations. Species identification of selected isolates was made by comparing the sequence results of the Internal Transcribed Spacer (ITS1-4) regions with the NCBI database. Potentially mycotoxigenic isolates were grown in broth medium and mycotoxin amounts were determined using High Performance Liquid Chromatography. According to the analysis results, it was determined that IK5-D2 A. flavus (AFB1 and AFB2 producer) and B1-D1 F. culmorum (ZEA producer) isolates were able to produce high amounts of mycotoxins. A Box-Behnken experimental design was created with three independent variables (pH, temperature and incubation time) to increase the production amount of the specified mycotoxins. The results were evaluated according to Response Surface Methodology and the process was mathematically modeled. The amounts of AFB1, AFB2 and ZEA produced under optimized conditions were found as 27244.5 ng/mL, 681.8 ng/mL and 6645.9 ng/mL, respectively. It has been determined that the experimental results were compatible with the predictions obtained from mathematical models. Mycotoxins extracted from the medium were purified using semi-preparative chromatographic method. The purity ratios of the mycotoxin fractions which prepared in acetonitrile solution were 90.3%, 99.6% and 95.4% for AFB1, AFB2 and ZEA, respectively. Recovery rates from the medium were calculated as 73.2%, 82.8% and 91.0%, respectively. It is thought that mycotoxin solutions produced at high purity have the potential to be evaluated in toxicological studies or as analytical standard material in food and feed analysis.