Gosspypium hirsutum format dehidrogenaz enziminin oksidatif stabilitesinde yüzey metionin kalıntılarının etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of surface methionine residues on the oxidative stability of gosspypium hirsutum format dehydrogenase enzyme
Yazar: SİNEM KURT
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Optikçe saf kiral bileşiklerin eldesi hem ürün kalitesi hem de insan sağlığı için önemlidir. Kimyasal yöntemlerle elde edilen kiral bileşikler sonucunda rasemik karışımlar elde edilmektedir. Rasemik karışımlar farmasötik, gıda, tarım gibi optik olarak saf ürün gerektiren sektörlerde problem yaratmaktadır. Kiral moleküllerin sentezinde kimyasal yöntemler yerine enzimlerin kullanılması optikçe saf ürünlerin eldesine imkân sağlamaktadır. Endüstriyel üretimde, optikçe saf kiral ürün
eldesinde oksidoredüktaz grubu enzimler kullanılmaktadır. Ancak bu enzimlerin kullanımı için oldukça pahalı bir koenzim olan NAD(P)H gerekmektedir. NAD+ bağımlı format dehidrogenazlar, formatı CO2'e okside ederken; NAD+'nin NADH'e indirger ve NADH varlığında ise, CO2'in indirgenmesini katalizlerler. Bu nedenle pahalı bir koenzim olan NAD(P)H'ın rejenerasyonu ve CO2'den hidrojen yakıtının stabilize bir formu olan formik asit üretimi araştırmalarında önemlidir. Bitkilerde çevresel stres koşulları ile mücadelede anahtar rol oynayan FDH enzimi ıslah çalışmaları için de önemlidir. Literatürdeki CbFDH, PsFDH, SoyFDH gibi rekombinant enzimlerinin gerek aktivite gerekse kararlılıkları açısından geliştirilmesi gerekmektedir. Bu nedenle yeni FDH'lerin araştırılması ve geliştirilmesi önemlidir. Mikrobiyal kaynaklı FDH'ler hakkında geniş bir literatür bulunmakla beraber, bitkisel FDH'lerin biyoteknolojik potansiyeli yeteri kadar
değerlendirilmemiştir. Protein yüzeyindeki metionin amino asitleri oksidatif strese karşı hassastır ve reaktif oksijen türleri ile metionin sülfokside dönüştürülebilirler. Bu nedenle proteinin konformasyonunun değişmesinde ve aktivitesinin kaybolmasında kritik bölgelerdir. Sülfür grubu nedeniyle oksidasyona meyilli metioninin, oksidasyona dirençli bir lösin amino asidi ile değiştirilmesi oksidatif kararlılığın arttırılmasında önemli bir stratejidir. Bu yüksek lisans tezinde yönlendirilmiş mutagenez yöntemi ile GhFDH protein yüzeyinde M225L, M234L, M243L, M225/243L ve M225/234/243L mutasyonları yapılarak yüzey metioninlerinin oksidatif kararlılığa olan etkisi araştırılmıştır. Sonuçlar, M234L (0,72 s − 1 mM − 1) ve M225/234/243L (0,55 s − 1 mM − 1), yabanıl tipten daha yüksek katalitik etkinliğe sahip olduğunu göstermiştir. Kimyasal kararlılıkta en dikkat çekici sonuçlar, ikili ve üçlü mutantlarda görülmüştür. M225/243L ve M225/243L/234L, kef in faktörünü (sırasıyla 12,3x10-5 ve 12,8x10-5s-1) azaltmıştır.

Abstract:
Optically pure chiral compounds, which are very important for product quality and human health, are obtained by chemical methods and form racemic mixtures. Enzymatic methods can be used instead of chemical in the synthesis of chiral molecules. In industrial production, oxidoreductase enzymes are used to obtain optically pure chiral products. However, these enzymes require NAD(P)H, a rather expensive coenzyme. NAD+ dependent FDHs, while oxidizing the formate to CO2; It reduces NAD+ to NADH and in the presence of NADH it reduces CO2. Therefore, it is important in the regeneration of NAD(P)H, an expensive coenzyme, and the production of formic acid, a stabilized form of hydrogen fuel from CO2. FDH enzyme, which plays a key role in combating stress in plants, is also important for breeding studies. The activity and stability of existing recombinant enzymes need to be
improved. Therefore, it is important to research and develop new FDHs. While there are many studies on microbial FDHs, the biotechnological potential of plant FDHs has not been emphasized. Methionine on the protein surface are susceptible to oxidative stress and can be converted to methionine sulfoxide with ROS. The conformation of oxidized proteins may change and their activity may be lost. Replacing methionine, which is prone to oxidation due to its sulfur group, with oxidation-resistant leucine is an important strategy in increasing oxidative stability. In this master's thesis, M225L M234 and M243L mutations were made on the GhFDH protein surface with the directed mutagenesis method and their effect on oxidative stability was investigated. The results showed that M234L (0.72 s -1mM-1) and M225/234/243L (0.55 s -1mM-1) had higher catalytic activity than wild type. The most remarkable results in chemical stability were seen with double and triple mutants. Double (12.3x10-5 s-1) and triple mutant (12.8x10-5 s-1) reduced the factor in kef in.