Alginat+karagenan jellerde Candida rugosa lipazı ve defne lipazının immobilizasyonu
Immobilization of Candida rugosa lipase and lorel lipase in alginate+carragenan gels
Yazar: SİNEM TUNA
Danışman: DOÇ. DR. HÜLYA YAĞAR
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada; mikrobiyal kaynaklı Candida rugosa lipazı ve bitkisel kaynaklı defne lipazı alginat+karagenan jellere immobilize edildi. Elde edilen immobilize enzimlerin optimum pH ve sıcaklık, Km ve Vmax kinetik sabitleri, termal kararlılık, yeniden kullanılabilirlik ve depo kararlılığı gibi bazı biyokimyasal özellikleri belirlendi ve serbest enziminkiyle karşılaştırıldı.Ticari bir mikrobiyal lipaz olan Candida rugosa lipazı ve bitkisel kaynaklı defne lipazı alginat+karagenan jellerde tutuklanrken damlatma çözeltisi olarak % 4'lük (w/v) CaCl2 kullanıldı. Protein tayinleri Bradford yöntemi uygulanarak gerçekleştirildi. Candida rugosa için immobilizasyon yüzdesi % 65 ve defne lipazı için % 77 olarak belirlendi. İmmobilize enzimin spesifik hidrolitik aktivitesi Candida rugosa için 54 U/mg protein ve defne lipazı için de 33 U/mg protein olarak belirlendi. Candida rugosa lipazının alginat+karagenan boncuklarda immobilizasyon koşullarının optimizasyonunda; optimum karagenan konsantrasyonu % 0.6, CaCl2 konsantrasyonu % 4, optimum yüklenen enzim konsantrasyonu 62.5 mg/mL, optimum boncuk boyutu 0.2 mm ve optimum boncuk miktarı 0.25 gr olarak belirlendi.Alginat+karagenan jellerde tutuklanan Candida rugosa lipazının optimum pH'ı serbest enzim için pH 6.0 ve immobilize enzim için pH 6.5, defne lipazının optimum pH'ı serbest enzim için pH 7.0 ve immobilize enzim için pH 8.0 olarak belirlendi. Serbest ve immobilize Candida rugosa lipazı için optimum sıcaklık 40 ? C olarak bulundu. Serbest defne lipazı için optimum sıcaklık 40 ? C, immobilize enzim için ise 50 ? C olarak bulundu. İmmobilize Candida rugosa lipazı ve defne lipazının termal kararlılıklarını tutuklama sonrasında da nispeten korudukları gözlendi.Serbest enzim ve alginat+karagenan jel boncuklarda tutuklanan Candida rugosa lipazının Km ve Vmax kinetik sabitleri sırasıyla, 0.111 g ile 71.43 U/ mg protein, 0.222 g ile 19.6 U/mg protein olarak bulundu. Serbest enzim ve alginat+karagenan jel boncuklarda tutuklanan defne lipazının Km ve Vmax kinetik sabitleri sırasıyla, 0.203 g ile 16.1 U/ mg protein, 0147 g ile 22.72 U/ mg protein olarak bulundu. Yeniden kullanılabilirlik çalışmasında alginat+karagenan boncuklara immobilize Candida rugosa lipazında ilk 5 döngü süresince boncukların aktivitesinin yaklaşık % 85 kadarını, g alginat+karagenan boncuklara immobilize defne lipazında % 60 kadarını koruyabildiği belirlendi. Substrat spesifitesi için gliseriltristearat, trikaprilin, aspir yağı, soya yağı, fındık yağı, kanola yağı, ayçiçeği yağı, zeytinyağı ve ham mısır yağı substrat olarak denendi. Depolama kararlılığı çalışmasında serbest ve immobilize Candida rugosa ve defne lipazının serbest ve immobilize enzimlerinin her ikisi de aktivitesini 20 gün boyunca koruduğu gözlendi.

Abstract:
In this study, Candida rugosa lipase which is microbial lipase and laurel lipase which is plant lipase were immobilized in alginate+carrageenan gels. Some properties of obtained immobilized enzymes such as optimum pH and temperature, kinetic parameters (Km and Vmax), thermal stability, reuse and storage stability were determined and compared to these of free enzyme.When Candida rugosa lipase which is the commercial microbial lipase and laurel lipase were entrapped in alginate+carrageenan gels, CaCl2 (% 4 w/v) was used as dropping solution. Protein determinations were done by using Bradford method. The immobilization percentage for Candida rugosa lipase and laurel lipase were determined to be 65 % and 77 %, respectively. The specific hydrolytic activities of Candida rugosa lipase and laurel lipase were found to be 54 U/mg and 33 U/mg, respectively. The optimization of immobilization conditions of Candida rugosa lipase was done, optimum carrageenan concentration was determined as 0.06 % (w/v). Optimum CaCl2 concentration is 4 % (w/v). Optimum bead diameter is 0.2 mm. Optimum bead? amount was determined to be of 0.25 g. The loading enzyme concentration was determined to be 62.5 mg/mL.The optimum pHs of both free and immobilized Candida rugosa lipase in alginate+ carrageenan gels were determined as 6.0 and 6.5, respectively. The optimum pHs of both free and immobilized laurel lipase in alginate+carrageenan gels were determined as 7.0 and 8.0, respectively. Optimum temperatures of both free and immobilized Candida rugosa lipase in alginate+carrageenan gels were found to be 40 ? C, while optimum temperatures of free and immobilized laurel lipase in alginate+carrageenan gels were determined to be 40 ? C and 50 ? C, respectively.It was observed that immobilized Candida rugosa lipase and laurel lipase relatively preserved their thermal stabilities. Km and Vmax values of both free and immobilized Candida rugosa lipase were determined to be 0.111 g -71.43 U/mg protein and 0.222 g -19.6 U/mg protein, respectively. These values were 0.203 g - 16.1 U/mLdak and 0147 g -22.72 U/mg protein for free and immobilized laurel lipase, respectively. In the reusing study, immobilized Candida rugosa lipase and laurel lipase saved about 85% and 60 % of their activities during 5 cycles, respectively. Substrate specifities of both enzymes were carried out by using glyceryl tristearate, tricaprylin, safflower oil, soybeans oil, hazelnut oil, canola oil, sunflower oil, olive oil, corn oil as substrates. It was observed in storage stability study free and immobilized forms of both enzymes saved its activity during 20 days.