Karaturp peroksidaz enziminin saflaştırılması ve benzohidrazidlerle inhibisyon kinetiğinin incelenmesi
Purification of black rudish peroxidase (POD) enzyme and investigation of inhibition kinetic with benzohydrazides
Yazar: SERPİL GERNİ
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada karaturp peroksidaz enziminin (POD), inhibitörleri olan 3-Amino benzohidrazid ve türevi moleküller kullanılarak tek basamakta saflaştırılması hedeflendi. Bu amaçla, literatürde bulunan bitki POD saflaştırma çalışmalarına katkı sağlamak için 3-amino benzohidrazid ve onun türevleri olan 5-amino 2-metil benzohidrazid, 3-amino 5-metil benzohidrazid, 3-amino 4-nitro benzohidrazid ve 3-amino 2-metil benzohidrazid molekülleri sentezlendi ve POD enziminin saflaştırılmasında kullanıldı. Türev moleküllerin metilbenzoat formlarından hidrazin sentezleri yapılarak, karaturp POD enzimi üzerine inhibisyon etkileri incelendi. Dönüşümlü inhibisyon gösteren moleküller Sepharose-4B-L-Tirozin jel materyaline bağlanarak elde edilen afinite jelleri ile tek kademede karaturp POD enzimi saflaştırılması gerçekleştirildi. 3-Amino benzohidrazid molekülü kullanıldığında karaturp POD enzimi, %11,9 verimle 246,6 kat, 5-amino 2-metil benzohidrazid ile %43 verimle 733,5 kat, 3-amino 5-metil benzohidrazid ile %6,09 verimle 221,2 kat, 3-amino 4-nitro benzohidrazid ile %14,6 verimle 249,6 kat ve 3-amino 2-metil benzohidrazid ile %21,4 172,5 kat saflaştırma yapıldı. Bu kolonlardan saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı ve saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi. Karaturp POD enziminin molekül ağırlığı için 43-47 kDa'da tek bant gözlendi. Tüm kolonların saflaştırma sonuçları karşılaştırıldı ve en iyi kolon materyali olan Sepharose-4B-L-Tirozin-5-amino-2-metil benzohidrazid kolonu için kolon tutma kapasitesi, karaturp POD enzimi için değişik pH, sıcaklık, iyonik şiddetlerde çalışıldı. Karaturp POD enzimi için optimum şartlar: pH 7,0, sıcaklık 15°C, iyonik şiddet ise 0,4 M olarak belirlendi.

Abstract:
In this study, it was aimed to establish a purification procedure in one step for black rudish Peroxidase (POD) enzymes by using 3-amino benzohydrazide and its derivatives. which are the inhibitors of the POD enzymes. In this aim, in order to contribute to the purification studies in the literature of plant peroxidase enzymes, 3-amino benzohydrazide and its derivatives which are 5-amino 2-methyl benzohydrazide, 3-amino 5-methyl benzohydrazide, 3-amino 4-nitro benzohydrazide and 3-amino 2-methyl benzohydrazide molecules were synthesized and firstly used at the study of purification of POD enzyme. The inhibition effects on  POD enzyme were investigated by making hydrazine synthesis from the methyl benzoate forms of the 3-amino benzohydrazide derivative molecules. The purification of the single-stranded black rudish Peroxidase (POD) enzyme with affinity gels obtained by binding Sepharose-4B-L-Tyrosine gel material of molecules which have alternating inhibition effect was performed. The black rudish POD enzyme is purified using 3-amino benzohydrazide molecule with a yield of 11.9%, 246.6 fold, using 5-amino 2-methyl benzohydrazide molecule with a yield of 43%, 733.5 fold, using 3-amino 5-methyl benzohydrazide with a yield of 6.09%, 221.2 fold, using 3-amino 4-nitro benzohydrazide with a yield 14.6 fold 249.6 fold, using 3-amino 4-nitro benzohydrazide with a yield of 14.6%, 249.6 fold and using 3-amino 2-methyl benzohydrazide molecule with a yield of 21.4%, 172.5 fold. The molecular weight and enzyme purity of the POD enzymes purified from all the column materials were controlled by SDS-PAGE. Single band were observed at 43-47 kDa for the black rudish peroxidase enzyme. The purification results of all the column material were compared and the column holding capacity for Sepharose-4B-L-Tyrosine-5-amino-2-methyl benzohydrazide showing the result of being the best column, for POD were studied different pH, temperature and ionic strengths. Optimum parameter for radish POD were determined as 7.0 for pH, 15°C for temperature, 0.4 M for ionic intensity.