Kronik hepatit B hastalarında, hepatit B virüsü (HBV) S gen bölgesi mutasyonlarının karakterizasyonu
Characterization of hepatitis B virus (HBV) S gene region mutations in patients with chronic hepatitis B
Yazar: MUSLIFATU TAGOE
Danışman: PROF. DR. SEDA TEZCAN ÜLGER
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Dizi analizi = Sequence analysis ; Hepatit B = Hepatitis B ; Hepatit B virüsü = Hepatitis B virus ; Hepatit B yüzey antijenleri = Hepatitis B surface antigens ; Mutasyon = Mutation

Özet:
Hepatit B virus (HBV) enfeksiyonu tüm dünyada mevcut olan yaygın bir sağlık problemidir.  HBV'nün preS ve S gen bölgelerinde oluşan mutasyonlar; immün ve tanısal kaçak mutantlara neden olabilmektedir.   Çalışmada kronik hepatit B hastalarında, DNA dizi analizi ile HBV S gen bölgesi olası mutasyonların oranının belirlenmesi, mutasyon patterninin karekterizasyonu ve bu konudaki literatüre katkıda bulunulması amaçlandı.   
Çalışmaya, Aralık 2021 - Temmuz 2022 tarihleri arasında Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Bilim Dalı Polikliniği'ne başvuran, 41 adet HBV  ile kronik enfekte hastadan ve 6 adet kronik inaktif taşıyıcı HBV hastası dahil edildi. HBV genomunun S gen dizisinin 155 nt. ve 785 nt arasındaki 633 bp'lik oldukça korunmuş bölgesi nested PCR yöntemi ile amplifiye edildi.  Elde edilen PCR ürünleri, işaretli dideoksinükleotidleri içeren "Bigdye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit" (Applied Biosystems, ABD) kullanarak, sense zinciri "Cycle Sequence" PCR'ı yapıldı. Reaksiyon ürünlerinin elektroforez işlemi "ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer" (Applied Biosystems, ABD) otomatize DNA dizi analizi cihazında gerçekleştirildi. Dizisi çıkarılan örnekler, NCBI (National Center for Biotechnology Information) veri tabanında yayınlanmış referans HBV dizi verileri ile karşılaştırılarak olası mutasyonlar belirlendi.
Kronik hepatit B'li toplam 47 hastaya ait toplanan serum örneklerinden 9 tanesinde tespit edilebilir düzeyde HBV DNA'sı PCR ile pozitif bulundu. Çalışmamızda dizi analizi yapılan 9 örneğin 6 (%66.6)'sında S gen bölgesinde toplam 13 farklı pozisyonda mutasyona neden olan nükleotid değişikliğine rastlandı. Bunlardan 2 (%15,4, 2/13)'si "a" determinant bölgesinde, 1 (%7,7, 1/13)'i MHR'da ve kalan 10 (%76,9, 10/13)'u MHR dışında kalan bölgelerde saptandı. Genel olarak saptanan mutasyon paternleri "a" determinant bölgesinde Y134F (TAT→TTT) ve S143L (TCG→TTG) şeklinde belirlendi. MHR'de saptanan mutasyon I110L (ATT→CTY[T/C]) olarak belirlendi. MHR dışında kalan bölgelerde saptanan mutasyonlar ise Q30K (CAG→AAG), Q30R (CAG→CGG), N40S (AAT→ART[A/G]), T45N (ACT→AAY[C/T]), L49P (CTT→CCT), S58C (TCC→TMC[C/G]), N59S (AAT→ART[A/G]), W74L (TGG→TTG), R79H (CGT→CRT[A/G]), I82T (ATC→ACC) ve M198T (ATG→ACG) olarak belirlendi.
Bu çalışmada, özellikle MHR'da daha önce kaçış mutasyonlarından görüldüğü P120. pozisyonda sessiz mutasyon iki hastada gösterildi. Bu hastaların inaktif taşıyıcı olması, horizontal ve vertikal olarak virusun toplum içinde sirkülasyonuna katkı sağlama olasılığına vurgu yapmak istiyoruz. Doğal olarak oluşan HBV S gen varyantlarının kronik HBV ile enfekte hastalarda bulunmasının ve karaciğer hastalığının ilerlemesini üzerine etkilerinin takip edilmesi gereklidir. Gelecekte, karaciğer hastalığının patogenezinin her aşamasının yer alan S varyantlarının moleküler mekanizmalarını araştıracak daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Hepatitis B virus (HBV) infection is a common health problem worldwide. Mutations in the preS and S gene regions of HBV; can cause immune and diagnostic escape mutants. This study aimed to determine the rate of possible mutations in the HBV S gene region by DNA sequence analysis, to characterize the mutation pattern and to contribute to the literature on this subject in chronic hepatitis B patients.  
The study included 41 chronically infected patients with HBV and 6 chronic inactive carrier HBV patients who applied to Mersin University Medical Faculty Gastroenterology Department Polyclinic between December 2021 and July 2022. The highly conserved 633 bp region of the S gene sequence of the HBV genome between 155 nt and 785 nt was amplified by the nested PCR method. The obtained PCR products were performed by sense and antisense chain "Cycle Sequence" PCR using the "Bigdye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit" (Applied Biosystems, USA) containing labeled dideoxynucleotides. Electrophoresis of the reaction products was performed on the automated DNA sequence analysis device of the "ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer" (Applied Biosystems, USA). Possible mutations were determined by comparing the sequenced samples with the reference HBV sequence data published in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database.
Detectable HBV DNA was found positive by PCR in 9 of the serum samples collected from 47 patients with chronic hepatitis B. In our study, nucleotide changes that cause mutations in a total of 13 different positions in the S gene region were found in 6 (66.6%) of 9 samples analyzed. Of these, 2 (15,4%, 2/13) are detected in the "a" determinant region, 1 (7,7%, 2/13) is in MHR, and the remaining 10 (76.9%, 10/13) are in out of MHR. The mutation patterns detected in general were determined as Y134F (TAT→TTT) and S143L (TCG→TTG) in the "a" determinant region. Mutations detected in MHR was identified as I110L (ATT→CTY[T/C]). Mutations in out of MHR are detected as Q30K (CAG→AAG), Q30R (CAG→CGG), N40S (AAT→ART[A/G]), T45N (ACT→AAY[C/T]), L49P (CTT→CCT), S58C (TCC→TMC[C/G]), N59S (AAT→ART[A/G]), W74L (TGG→TTG), R79H (CGT→CRT[A/G]), I82T (ATC→ACC), and M198T (ATG→ACG).
In this study, silent mutations were shown in two patients, especially in the P120 position in which MHR had previously seen from escape mutations. We would like to emphasize the possibility of this patient being an inactive carrier and contributing to the circulation of the virus in the community horizontally and vertically. The presence of naturally occurring HBV S gene variants in chronic HBV-infected patients and their effects on the progression of liver disease should be monitored. Further studies are needed in the future to explore the molecular mechanisms of S variants involved in all stages of liver disease pathogenesis.