Myastenia gravis hastalığında regülatör T hücre (Treg) fonksiyonlarının incelenmesi
The function evaluation of T regulatory cells in myasthenia gravis
Yazar: MAHDI ALAHGHOLI HAJIBEHZAD
Danışman: PROF. DR. GÜHER SARUHAN DİRESKENELİ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İmmünoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology
Dizin: Myasthenia gravis = Myasthenia gravis ; Süpresyon-genetik = Supression-genetic ; Vitamin D = Vitamin D ; Vitamin D eksikliği = Vitamin D deficiency ; İnterlökin 21 = Interleukin 21 ; İnterlökin 5 = Interleukin 5

Özet:
Bu çalışma, anti-asetilkolin reseptörü (AChR) ve kasa özgü  kinaza (MuSK) karşı otoantikor pozitif myastenia gravis (MG) hastalarında regülatör T hücrelerinin (Treg) değerlendirilmesini hedeflemektedir. Treg hücrelerinin süpresyon kapasitesi ve MG  patogenezindeki rolü ve 1,25-dihidroksi vitamin D3 (VitD3) ile interlökin 21 (İL-21)'in Treg aracılığıyla meydana gelen baskılamadaki etkisi araştırılmıştır .
Çalışmaya 66 AChR-MG, 27 MuSK-MG ve 53 sağlıklı donör (KON) dâhil edildi. Treg hücrelerinde "programmed cell death-1" (PD-1), "PD-1 ligand-1" (PD-L1) "glucocorticoid induced tumor necrosis factor related receptor" (GITR) ve hücre içi "forkhead box P3" (FOXP3) ekspresyonu akım sitometrisi ile analiz edildi. Treg ve CD4+CD25-  (standart T hücre, STH) hücreler ayrıldı ve Treg süpresyon yüzdesi rIL-21 ve VitD3'ün varlığı ya da yokluğunda ölçüldü. 
AChR-MG'de Treg hücrelerin oranında KON'a göre anlamlı artış olmasına rağmen (p= 0,04) FOXP3 ekspresyonu AChR-MG ve MuSK-MG'de KON grubu ile kıyaslandığında düşüktü (p< 0,001 ve p< 0,001).  Treg yüzeyinde GITR oranında AChR-MG grubunda azalma gözlemlendi (p< 0,001). AChR-MG (p= 0,02) ve MuSK-MG (p= 0,005) gruplarında kontrol grubuna göre PD-L1 ekspresyonu açısından azalma görülürken, PD-1 ekspresyonu farklı değildi.
Treg süpresyon yüzdesi AChR-MG'de KON grubuna göre düşük bulundu (p< 0,001). VitD3 Treg hücrelerin süpresyon gücünü, AChR-MG (p= 0,001) ve KON'da (p< 0,001) anlamlı derecede arttırdı. Ancak VitD3'ün etkisi AChR-MG ve KON arasında anlamlı bir fark oluşturmadı. rİL-21 hem AChR-MG grubunda (p< 0,001),  hem kontrol grubunda (p= 0,002) Treg hücrelerin süpresyon gücünü anlamlı derecede baskıladı, bu baskılama MG grubunda daha güçlüydü (p= 0,05). 
AChR-MG grubunda Treg sayısı artış göstermesine rağmen bu hücrelerde fonksiyon bozukluğu gözlemlendi. Treg fonksiyonunda önemli rol oynayan FOXP3, PD-L1 ve GITR ekspresyonlarında bir düşüş görüldü. AChR-MG'de VitD3'ün Treg süpresyon gücünü arttırması nedeniyle, VitD3 kullanımının AChR-MG hastalarında Treg fonksiyonlarının arttırılmasında yararlı olabileceği düşünülmektedir. İn vitro ortamda İL-21'in Treg süpresyon gücünü azaltması, bu sitokinin Treg üzerine bir rolü olduğunu düşündürmektedir.

Abstract:
The purpose of this study is to evaluate peripheral blood regulatory T cells (Tregs) in anti-acetylcholine receptor (AChR) and muscle specific kinase (MuSK) antibody positive myasthenia gravis (MG) and their suppressive capacity with respect to pathogenesis of the disease. In addition, the role of 1,25-dihydroxyvitamin D3 (VitD3) and IL-21 on Tregs suppression were investigated.
Tregs from 66 AChR-MG and 27 MuSK-MG patients and 53 healthy controls (HC) were analyzed for programmed cell death-1 (PD-1), PD-1 ligand-1 (PD-L1) glucocorticoid induced tumor necrosis factor related receptor (GITR) and intracellular forkhead box P3 (FOXP3) expression by multicolor flow cytometry. Tregs and CD4+CD25- (conventional T cell, Tconv) cells were sorted and suppression assays were performed with/without IL-21 and VitD3.
Although the frequencies of Tregs were increased in AChR-MG patients (p= 0.04), FOXP3 expression in Tregs was significantly decreased both in AChR-MG and MuSK-MG compared to HC (p< 0.001 and p< 0.001). We observed a significant decrease of GITR+ Tregs in AChR-MG (p< 0.001). PD-L1 expression on Tregs was significantly decreased in AChR-MG (p= 0.02) and MuSK-MG (p=0.005) compared to HC, whereas PD-1 expression on Tregs was not different.
A strong suppressive effect of Tregs was demonstrated in HC and this suppressive effect was attenuated in AChR-MG (p< 0.001). VitD3 significantly increased the suppressive capacity of Tregs both in AChR-MG (p=0.001) and HC (p< 0.001). However, the increase of suppression was not significantly different between AChR-MG and HC. IL-21 significantly decreased Tregs suppression both in AChR-MG (p< 0.001) and HC (p=0.002) with stronger effect in patients (p= 0.05). 
A higher number of Tregs in AChR-MG, but a severe functional defect in their regulatory activity was found together with a decreased expression of the FOXP3, PD-L1 and GITR which have a role for T cell regulatory function. Treg-mediated suppression of Tconv was impaired in AChR-MG and the addition of VitD3 significantly increased Tconv suppression by inhibiting Tconv proliferation. The use of VitD3 could be considered for the improvement of Tregs function in AChR-MG. Moreover, a possible regulatory role of IL-21 on suppression of Tregs can be assumed, as IL-21 caused an attenuation of the suppression in vitro.