Omurilik hasarında kullanılmak üzere polimerik doku iskelelerinin hazırlanması, optimizasyonu ve kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler ile etkileştirilmesi
Preparation and optimization of polymeric scaffolds for spinal cord injury and their interactions with bone marrow-derived mesenchymal stem cells
Yazar: SEVİL ARSLAN
Danışman: PROF. DR. DUYGU UÇKAN ÇETİNKAYA
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Kimya = Chemistry ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Son yıllarda kronik spinal kord yaralanmalarında rejenerasyon ile ilgili transplantasyon çalışmaları yaygınlaşmıştır. Bu amaçla; kendilerini yenileme, çevrelerindeki hasara yönlenme, rejenerasyon ve endojen ve/veya ekzojen uyaranlara cevaben istenen yönde farklılaşabilme gibi özelliklere sahip olan kök/progenitör hücreler kullanılmaya başlanmıştır.MKH'lerin diğer hücre tiplerinin oluşumunu desteklemesi, başta bağ doku kökenli hücreler (kemik, kıkırdak, yağ, tendon, stroma) olmak üzere birçok değişik doku hücresine farklılaşabilmesi, bağışıklık sistemini baskılayıcı özellikleri ile otolog ve allojenik olarak uygulanabilmesi, genetik çalışmalara elverişli olması gibi birçok avantajı vardır.Spinal kord hasarı ile ilgili olarak yürütülmüş çalışmalarda; oluşan skar dokusundan dolayı transplantasyon yapılan hücrelerin hasarlı alanda tutunamadıkları ve rejenerasyon sürecinde transplantasyon sırasında canlılıklarını kaybettikleri gözlenmiştir. Bu sorun 3 boyutlu tüp şeklinde hazırlanan çeşitli doku iskelelerinin (kılavuz kanal/guidance channel) hasarlı bölgeye implantasyonu ile aşılmaya çalışılmaktadır. Bu çalışmada spinal kord hasarına yönelik olarak farklı yüzey konfigürasyonlarında sentezlenen nPHB doku iskeleleri ile insan kemik iliği MKH'lerin etkileşimleri incelenmiştir.Doku iskelesi olarak, rastgele düzenlenmiş nanoboyutta fibriller (örülmüş nPHB doku iskelesi) ve aynı yöne yönlendirilmiş nanoboyutta fiberler içeren (yönlendirilmiş nPHB doku iskelesi) 2 farklı yüzey konfigürasyonuna sahip doku iskelesi kullanılmıştır. Hazırlanan doku iskelelerinin MKH'ler ile etkileşimini araştırmak amacı ile insan kemik iliğinden mononüklear hücreler (MNH) izole edilerek kültür edilmiştir. Doku kültür kabına yapışan hücrelerin morfolojik, farklılaşma (adipojenik ve osteojenik) ve yüzey molekül özellikleri belirlenerek analizleri yapılmış ve MKH oldukları belirlenmiştir. Daha sonra MKH'ler doku iskelesi üzerinde çoğaltılmış; yapışma oranlarına ve canlılıklarına, apoptoz yüzdelerine (MTT Assay, tam zamanlı hücre analizi, population doubling, Anneksin V analizi), farklılaştırma analizlerine (adipojenik ve osteojenik farklılaştırma) ve yüzey molekül özelliklerindeki değişimlere (akım sitometrik analiz) bakılarak bu hücrelerin karakteristik özelliklerini koruma oranlarına ve ayrıca hücrelerin doku iskeleleri üzerindeki yönlenmelerine konfokal mikroskop analizi ve SEM ile bakılmıştır. Kontrol olarak tüm deneylerde eş zamanlı olarak polisistiren doku kültür kaplarında üretilen MKH'ler ile yapılan analizler kullanılmıştır.Yapılan analizlerin sonucunda PHB'den üretilen farklı yüzey morfolojisine sahip her iki doku iskelesinde de MKH'lerin karakteristik özelliklerini korudukları gözlenmiştir. Bununla birlikte 3 farklı analizin sonucuna göre hücreler doku iskelelerine yapışabilmekte ve canlılıklarını koruyabilmektedir. nPHB doku iskeleleri karşılaştırıldığında ise MKH'lerin yönlendirilmiş nPHB doku iskelesine daha iyi yapıştıkları gözlenmiştir. Hücrelerin yapışma oranı örülmüş nPHB doku iskelesinde daha az olmasına karşın çoğalma oranlarının yönlendirilmiş nPHB doku iskelesine göre daha iyi olduğu görülmüştür. Doku iskeleleri üzerine ekilen hücrelerin yönlenmelerine bakıldığında ise beklendiği üzere yönlendirilmiş nPHB doku iskelesi üzerinde çoğalan hücreler iğsi morfolojide olup, fibrillerin yönü doğrultusunda konumlanmıştır. Örülmüş nPHB doku iskelesinde ise hücreler homojen dağılım göstermiş ve poligonal morfolojilerini korumuştur.Tez kapsamında yapılan çalışmalar ile nanofiber yapıda hazırlanan PHB doku iskelesi üzerinde çoğaltılan MKH'lerin multipotent özelliklerinin korunduğu; böylece spinal kord yaralanmalarında mikroçevre tamirinde etkili olabilecek bir doku mühendisliği yaklaşımı sağlayabileceği öngörülmüştür. Ayrıca PHB doku iskelelerinin spinal kord yaralanma modeli dışında yağ ve kemik doku mühendisliği alanında da etkin olarak kullanılabileceği saptanmıştır.

Abstract:
Recently, transplantation studies in the scope of regenerative therapy have started for chronic spinal cord injuries, because of the inadequate endogenous responses of adult central nervous system against trauma. By this purpose, stem or progenitor cells have started to be used via their important features such as self-renewal, regeneration, orientation to the damaged site in their environment and/or differentiation into the desired direction as a response to endogenous and/or exogenous stimuli.Mesenchymal stem cells (MSC) can be suitable ethically for cellular therapy in spinal cord injuries because of their differentiation ability into the other cell types (bone, cartilage, adipose, stroma, tendon), availibility for autolog and allogenic transplantation with their immunsuppressive properties and also availibility for genetic applications. They create more interest by these properties and also their significant differentiation capacities, which support maintaining of organ functions by assisting healing of the injured tissue.Previous studies about spinal cord injury have showed that scar tissue formation prevents homing of transplanted cells and decreases cell viability during regeneration process. This problem can be overcomed by an implantation of tissue scaffolds in the form of 3-dimensional tube into the damaged site. In our current study, interactions between bone marrow derived mesenchymal stem cells and the spinal cord tissue scaffolds synthesized with different surface configuration will be investigated.As a tissue scaffold, polyhydroxybutyrate (PHB) membrane with its two different kinds of surface features as randomly arranged nanoscale fibers and nanoscale fibers oriented in one direction will be used. MSCs were isolated from bone marrow mononuclear cells in order to investigate the interactions between tissue scaffolds and MSCs. Isolated MSCs were cultivated up to passage 3 and then they were characterized in terms of their morphological and antigenic properties and differantiation capacities. Characterized MSCs were expanded on two different tissue scaffolds that they had different surface morphology and then cells were evaluated in terms of their orientation on tissue scaffolds by confocal and scanning electrone microscopes. They were also investigated according to their adhesion and viability (MTT Assay, real time cell analysis, population doubling methods and Annexin V Assay); differentiation (adipogenic and osteogenic) and surface antigen properties. Control group of the study composed of MSCs that were cultivated in polystren tissue culture flasks.The results of analysis showed that MSCs conserve their stem cell properties, adhesiveness and viability when they were expanded on both types of tissue scaffolds. While adhesiveness of MSCs that were expanded on oriented tissue scaffolds was more than knitted ones, proliferation rates was lower. Although, MSCs on oriented nPHB tissue scaffolds showed spindle shape morphology and they were positioned in the direction of spindles; MSCs on knitted nPHB tissue scaffolds distributed homogenously by conserving their poligonal morphology.In the present study, it was found that MSCs cultivated on nanofiber PHB tissue scaffolds conserved their multpotentiality; therefore they may provide effective tissue engineering approach by repairing cellular microenvironment in spinal cord injuries. In addition to this finding, PHB tissue scaffolds can be used in tissue engineering approaches to repair adipogenic and osteogenic tissue related injuries.