ATP-biyolüminesans yöntemiyle pastörize sütlerin mikrobiyal kalitesinin belirlenmesi
Determining the microbial quality of pasteurized milk through the ATP-bioluminescence method
Yazar: PELİN EVREN
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA OSKAY
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Adenozin trifosfat = Adenosine triphosphate ; Biyolojik ölçüm yöntemleri = Biological measurement methods ; Gıda güvenliği = Food safety ; Gıda kalitesi = Food quality ; Gıda mikrobiyolojisi = Food microbiology ; Pastörize süt = Pasteurized milk

Özet:
Pastörize sütlerin tüketimden önce mikrobiyolojik kalitesinin belirlenmesi önemli bir adımdır. Günümüzde pastörize sütlerin mikrobiyal kalitesinin belirlenmesinde zahmetli ve uzun zaman alan kültür temelli, örneklemeden sonra 1-3 gün arasında sonuç alınabilen standart metotlar kullanılmaktadır. ATP biyolüminesans tekniği, pastörize süt kalitesinin belirlenmesinde yeni bir teknolojidir. Bu çalışma, pastörize sütlerin kalite kontrollerinin ATP biyolüminesans yöntemiyle yapılması, kültürel yöntemler ile korelasyonunun belirlenmesi ve nihayetinde seçilen mikroorganizmaların biyokimyasal ve moleküler olarak tanımlanmasını kapsamaktadır.
Pastörize süt örnekleri, Manisa ili yerel marketlerinden belli zaman aralıklarında örnekleme planı yapılarak uygun miktarlarda temin edilmiş ve kültürel yöntemlerle mikrobiyolojik analize alınmıştır. Mikrobiyolojik sayımlar sonucunda toplam aerobik mikroorganizma 105 kob/mL'lik pastörize süt bozulma sınırının altında bulunmuştur. Enterobacteriaceae, test edilen numunelerin %34 (n=17)'ünde belirlenmiş olup 104 kob/mL'nin altında kalmıştır, bütün süt örnekleri koliform açısından negatif sonuç vermiştir. Aerobik bakteriyel spor varlığı 33 (%66) örnekte tespit edilmiş; en düşük ve en yüksek olarak sırasıyla 1.0 x 101 ve 7.6 x 102 kob/mL olarak hesaplanmıştır. Termodurik mikroorganizma sadece 2 (%4) örnekte belirlenmiş olup en yüksek 2.0 x 102 kob/mL'dir. Petrifilm hazır kültürel besiyerlerine yapılan ekimler sonucu toplam aerobik mikroorganizma sayısı, 1.0 x 101 ila 1.1 x 103 kob/mL arasında değişen ortalama değerler göstermiştir. Enterobacteriaceae 34 örneğin 2 (%6)'sinde en yüksek 1.2 x 102 kob/mL olarak sayım limitinin altında bulunmuştur. Bununla birlikte, analize alınan örneklerin 1 (%3)'inde tipik E. coli tespit edilmiştir. Örneklerin hiç birinde maya/küf belirlenmemiştir.
ATP biyolüminesans tekniği ile analize alınan 50 farklı pastörize süt örneğinin ölçüm değerleri 46-9858 RLU arasında değişmektedir. Elde edilen standart değerlerimizle ATP biyolüminesans ölçüm değerlerini karşılaştırdığımızda pastörize süt örneğinin 4 (%8)'ünün kalitesinin kötü, 5 (%10)'nin şüpheli ve diğer geri kalanların kaliteli (%82) olduğu sonucuna varılmıştır. Ancak pastörize sütlerin farklı selektif besiyerleri ve petrifilm kültürleri ile elde edilen koloni sayımları ile ATP biyolüminesans ölçüm değerleri arasında korelasyon zayıf bulunmuştur.
Kültürel yöntemlerle izolasyonlar sonucu seçilen 11 farklı bakteri morfolojik, kültürel karakteristikleri, biyokimyasal testler ve 16S rRNA sekans verileri aracılığıyla tanımlanmışlardır. Belirlenen türler sırasıyla, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter johnsonii (2 izolat), Acinetobacter junii (2 izolat), Escherichia coli, Aeromonas media (2 izolat) ve Aeromonas hydrophila,'dır. Ayrıca 2 bakteri ise cins bazında Escherichia sp. ve Acinetobacter sp. olarak tanımlanmıştır. Pastörize süt örneklerinden izole edilen ve tanımlanan bu bakteri türleri fırsatçı patojenlerdir.
Kültürel çalışmalar ve ATP yöntemi bulgularının topluca değerlendirilmesi ve nihai olarak fırsatçı patojenlerin tanımlanması ile 8 (%16) adet pastörize sütün kalitesinin standartlara uygun olmadığı sonucuna varılmıştır. Araştırma bulgularına göre, ATP biyolüminesans yöntemi ile pastörize sütlerin mikrobiyal yükünün belirlenmesinin mümkün olabileceği ancak patojenlerin tespiti için kültürel ve ileri testlerin yapılmasının zaruri olduğu sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
Microbiological control of pasteurized milk quality is an important step before it consumed. Current standard methods for determination of pasteurized milk microbial quality are culture based, which are laborious and time-consuming, where results not are available before one to three days after sampling. ATP bioluminescence technique is a new technology in determining the quality of pasteurized milk. This study presents the quality control of pasteurized milk by ATP bioluminescence method, correlation with cultural methods and finally biochemical and molecular identification of selected microorganisms.
Pasteurized milk samples were collected from local markets in Manisa province at certain time intervals and obtained in appropriate amounts and taken to microbiological analysis by cultural methods. As a result of microbiological counts, total aerobic microorganism was found below 105 cfu/mL pasteurized milk spoilage limit. Enterobacteriaceae was determined in 34% (n=17) of the samples tested and was below 104 cfu/mL, all milk samples were negative for coliform. The presence of aerobic bacterial spore was detected in 33 (66%) samples; the lowest and highest values were calculated as 1.0 x 101 and 7.6 x 102 cfu/mL, respectively. The thermoduric microorganism was determined in only 2 (4%) samples with a maximum of 2.0 x 102 cfu/mL. The total number of aerobic microorganisms, as a result of the cultivation on Petrifilm ready culture media, showed average values ranging from 1.0 x 101 to 1.1 x 103 cfu/mL. Enterobacteriaceae was found to be below the counting limit as 1.2 x 102 cfu/mL in 34 of 2 (6%) samples. However, typical E. coli was detected in 1 (3%) of the samples. Yeast/mold was not detected for none of the milk samples.
The measured values of 50 different pasteurized milk samples analyzed by ATP bioluminescence technique ranged from 46-9858 RLU. When we compared the measured values of ATP bioluminescence with our standard values, it was concluded that 4 (8%) of the 50 pasteurized milk samples were analyzed bad quality, 5 (10%) were suspicious and the rest were good quality (82%). However, between colony counts obtained with petrifilm cultures or different selective media and ATP bioluminescence measurement values of pasteurized milk were found to be weak correlation.
11 selected different bacteria as a result of isolation by cultural methods are identified by morphological, cultural characteristics, biochemical tests and 16S rRNA sequence data. The identified species are Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter johnsonii (2 isolates), Acinetobacter junii (2 isolates), Escherichia coli, Aeromonas media (2 isolates) and Aeromonas hydrophila, respectively. In addition, 2 bacteria on the genus level were identified as Escherichia sp. and Acinetobacter sp. These bacterial species isolated and identified from pasteurized milk samples are opportunistic pathogens.
It is concluded that the quality of 8 (16%) pasteurized milk is not in accordance with the standards by collectively evaluating the cultural studies and ATP method findings and ultimately identifying opportunistic pathogens. According to the research findings, it is possible to determine the microbial load of pasteurized milk by ATP bioluminescence method but it is necessary to conduct cultural and advanced tests for the detection of pathogens.