Aljinat bazlı yara örtüsünün insan deri keratinosit hücreleri üzerinde yara iyileşme etkinliğinin belirlenmesi
Evaluation of wound healing bioefficiency of alginate based dressing using human keratinocyte skin cells
Yazar: MERVE TOSUN
Danışman: PROF. DR. NELİSA TÜRKOĞLU ; DR. YÜKSEL ÇETİN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Hastane enfeksiyonları arasında maliyet ve hasta kayıpları açısından ilk sıralarda yer alan yara tedavisinde yara iyileştirici pansumanlar çok önemli bir yere sahiptir. Bu çalışmada, aljinat bazlı üç hidrojelin biyolojik değerlendirilmesi belirlendikten sonra yara iyileşmesi üzerindeki biyoaktiflikleri incelenmiştir. Hidrojellerin in vitro biyouyumlulukları: sitotoksisite testleri kolorimetrik MTT ve floresan canlı-ölü hücre metodu, Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi (RhE) modeli üzerinde irritasyon testi, insan hücre hattı aktivasyon testi (h-CLAT) metoduyla hassaslaştırma testi ile Uluslararası Standardizasyon Örgütü (ISO) 10993 standardı takip edilerek gerçekleştirilmiştir. Hidrojellerin biyouyumluluğunu test etmek için fare fibroblastı (L-929), insan derisi keratinositi (HaCaT), insan derisi fibroblastı (HSF) ve insan monosit (THP-1) hücre hatları kullanılmıştır. L-929, HaCaT ve HSF hücre hatlarının, 24 saat boyunca hidrojellerin ekstraktlarına maruz bırakıldıktan sonra hücre canlılıklarının %80'den daha yüksek olduğu ve sitotoksik olmadıkları (>%70), tespit edilmiştir. HaCaT hücreleri kullanılarak üç boyutlu (3B) yapılandırılmış stratum korneuma (RhE) hidrojellerin uygulanmasından sonra, aljinat bazlı hidrojellerin tahriş edici/irritant olmadığı bulunmuştur. Hidrojellerin cilt hassaslaştırma potansiyelini değerlendirmek için THP-1 hücre hattı üzerindeki hücre yüzeyi markörlerinin ekspresyonundaki (CD86 ve CD54) değişiklikleri ölçen h-CLAT yöntemi uygulanmış, ekspresyon seviyelerinin artmadığı belirlenmiştir. 
Geliştirilen hidrojellerin yara iyileşmesindeki biyoaktivitesi, in vitro yara iyileşmesi hücre çizik testi, iyileşmede rol oynayan proteinlerin hücre yara modelindeki üretim seviyelerini belirlemek için immünofloresan boyama ve gen ekspresyonlarını belirlemek için gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonları (qRT-PCR) uygulanmıştır. Geliştirilen 1. ve 2. hidrojel uygulamasında hem diyabetik hem de diyabetik olmayan koşullarda yara kapanması kontrol grubundan daha önce gerçekleşmiş, 3. hidrojelde ise diyabetik koşullarda yara kapanması gerçekleşmemiştir. İmmünofloresan hücre boyamalarında da benzer şekilde 1. ve 2. hidrojel uygulamasında lorikrin, sitokeratin 5, sitokeratin 10 kontrole göre daha yoğunken, laminin antikoru 3. hidrojelde daha yoğun gözlemlenmiştir. Geliştirilen üç hidrojel uygulamalarının qRT-PCR çalışmalarında dönüştürücü büyüme faktörü (TGF) β-1, TGFβ-2, İnvolukrin, Sitokeratin 5 genlerinin ekspresyonlarında anlamlı herhangi bir farklılık gözlemlenmemiştir.
Bu çalışma kapsamında belirlenen biyouyumluluk ve biyoaktivite sonuçlarına göre 1. ve 2. nolu hidrojellerin ex vivo ve in vivo modellerde ileri çalışmalar yürütülerek antimikrobiyel aktivitesi ve biyoaktifliği araştırılarak en iyi ürünün patent ve ticarileştirme çalışmalarının yürütülmesi önerilmektedir.

Abstract:
Wound healing dressings have a crucial role in the treatment of wound repair which is in the first rank among hospital acquired infections in terms of cost and patient losses. In this study, biological evaluation of the alginate-based hydrogels was investigated by following International Organization for Standardization (ISO) 10993 guidlines. In vitro biocompatibity of the hydrogels testing cell viability and proliferation, irritation, and sensitization were examined by performing colorimetric MTT and fluorescence Live/Dead assay, Reconstructed Human Epidermis irritation test, and the human cell line activation with h-CLAT method, respectively. Mouse fibroblast (L-929), human skin keratinocyte (HaCaT), human skin fibroblast (HSF), and human monocyte (THP-1) cell lines were used for testing bicompatibility of the hydrogels. Cell viability of L-929, HaCaT and HSF cell lines was found to be higher than 80% of the control upon exposure to the extracts of the hidrogels for 24 h. After application of hydrogels to the stratum corneum (Reconstructed human epidermis, RhE), 3D structured using HaCaT cells, the alginate-based hydrogels were found to be non-irritant. The h-CLAT method that quantifies changes of cell surface markers' expression (CD86 and CD54) on THP-1 cell line was applied to evaluate the snesitization potential of the hydrogels. The results demonstrated that the surface markers` levels were not increased therefore, the developed hydrogels did not have any sensitization potetial. In conclusion, the biological evaluation of the developed hydrogels was resulted in good biocompatibility range as required in the standards as a medical device. 
The bioefficiency of the developed hydrogels in wound healing was determined by in vitro wound healing cell scratch assay, immunofluorescent cell staining for certain proteins, and real-time polymerase chain reactions (qRT-PCR) studies for certain gene expressions. The developed 1st and 2nd hydrogels were applied for healing wound created in the HaCaT monolayer. Wound closure occurred earlier than the control group in both diabetic and non-diabetic conditions, and wound closure did not occur in the 3rd hydrogel in diabetic conditions. Similarly, in immunofluorescent cell staining, loricrin, cytokeratin 5 and cytokeratin 10 were more intense in the 1st and 2nd hydrogel applications, while laminin antibody was observed more intensely in the 3rd hydrogel. No significant difference was observed in the expressions of TGFβ-1, TGFβ-2, Involukrin, Cytokeratin 5 genes as a result of qRT-PCR analysis of the three hydrogel applications. As a result, when the obtained findings are examined, it is thought that the developed alginate-based 1st and 2nd hydrogels may be beneficial for chronic wound care.