Laktik asit bakterilerinde laktat dehidrojenaz (LDH) geninin mutasyonu
Mutation of lactate dehydrogenase (LDH) gene in lactic acid bacteria
Yazar: KALBİYE SERDAROĞLU
Danışman: YRD. DOÇ. DR. İSMAİL AKYOL
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Lactococcus cremoris = Lactococcus cremoris ; Laktat dehidrogenaz = Lactate dehydrogenase ; Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria

Özet:
Laktik asit bakterileri (LAB) endüstriyel gıda fermentasyonunda ve süt endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. LAB'ın patojen olmaması ve endüstriyel olarak önemli olmalarından dolayı moleküler çalışmaların referans mikroorganizması konumundadır. Fermentasyonda kullanılan mikroorganizmalar doğal suşlar olduğu gibi metabolit özellikleri genetik olarak iyileştirilmiş suşlar da olabilmektedir. LAB'ın metabolik mühendisliği pirüvat metabolizmasının genetik olarak değiştirilmesine ve istenilen aroma metabolitlerinin üretimine odaklanmıştır. Gıda için oluşturulan food grade mutant suşlar gıda orijinli olmayan yabancı DNA ve antibiyotik dirençlilik geni içermemelidir. Bu çalışmanın amacı peynir endüstrisinde ekonomik öneme sahip LAB olan Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 suşundan, pORI plazmit sistemi kullanılarak ldh geninin silinmesidir. Sekansı tamamlanmış MG1363 kromozomu üzerinden tasarlanan spesifik primer çiftleri kullanılarak ldh geninin üst ve alt bölgeleri PCR ile çoğaltılmış ve integratif pORI280 plazmitine klonlanmıştır. Oluşturulan plazmit (pBGML121) MG1363 suşuna aktarılmış ve sıcaklığa duyarlı yardımcı plazmit pVE6007 plazmidi kullanılarak kromozoma integre edilmiştir (tekli geçiş sistemi). Tekli geçiş (s.c.o) sistemini takiben, üst ve alt bölgeler kromozomda bulunan homologları ile eşleşerek, çiftli geçiş (d.c.o) sistemi ile ldh geni kromozomdan silinmiştir. PCR ile ldh mutant koloniler (ldhd) teyit edilmiş ve HPLC tekniği ile ldhd ve MG1363 suşlarının oluşturduğu laktat, asetat, asetoin, pirüvat ve format metabolitleri analiz edilmiştir. MG1363 suşu hem aerobik hem de anaerobik şartlarda pirüvattan büyük oranda laktat üretmiştir. Diğer taraftan ldhd suşu aerobik şartlarda, iz miktarda laktat ve artan miktarlarda asetat ve asetoin üretmiş ve anaerobik şartlarda ise ldhd suşu artan miktarlarda format, asetat ve asetoin üretmiştir. Metabolik yoldaki genetik modifikasyon aerobik şartlarda bile heterofermentasyonu homofermentasyona dönüştürebilmektedir. Bu çalışmadaki elde edilen sonuçlar ve kullanılan teknikler, gıda endüstrisi ve gerçekleştirilecek moleküler çalışmalar için oldukça ümit vericidir.

Abstract:
Lactic acid bacteria (LAB) are widely used in industrial food fermentations and dairy industry. Industrially important non pathogens LAB are reference microorganisms for molecular studies. Not only natural isolated strains but also metabolites features genetically improved strains could be used in fermentation. Metabolic engineering in LAB has focused on redirection of pyruvate metabolism genetically and production of desired flavor compounds. Mutant strain constructed as food grade should not contain antibiotic resistance genes and foreign DNA which has not origin from food. The main aim of this study is deleting ldh gene using pORI plasmid system in Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 strain which is economically important for cheese industry. Specific primers for upstream and downstream of ldh gene were designed from completed MG1363 chromosome sequence and both fragments were amplified with PCR and cloned to integrative pORI280 plasmid. Created plasmid (pBGML121) were transferred to MG1363 strain and integrated to chromosome with thermo sensitive helper plasmid pVE6007 (single crossover). Following single crossover (s.c.o) process upstream and downstream region recombined with homologous on chromosome and ldh gene were deleted from chromosome by double crossover (d.c.o) process ldh mutant (ldhd) colonies were confirmed using PCR and lactate, acetate, acetoin, pyruvate and formate metabolites of ldhd and MG1363 strains were analyzed using HPLC technique. Under aerobic and anaerobic conditions MG1363 strain produced high amount of lactate from pyruvate. On the other hand ldhd strain produced fewer amounts of lactate but high amount of acetate and acetoin under aerobic conditions. Under anaerobic condition higher amount of formate, acetate and acetoin were observed in ldhd strain. Genetic modification on metabolic pathways can shift homofermentation to heterofermentation even in aerobic conditions. These results and used techniques are promising for food industry and further molecular studies.