Yerli kara sığır ırkında hastalıklara direnç ilişkili lokusların moleküler genetik analizi
Molecular genetic analysis of loci associated with resistance to diseases in anatolian black cattle
Yazar: FERİT CAN YAZDIÇ
Danışman: PROF. DR. MEHMET SAİT EKİNCİ
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Genetik = Genetics ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Genler-MHC-klas 2 = Genes-MHC-class 2

Özet:
Bu çalışmada Türkiye'nin yerli sığır ırklarından olan Yerli Kara sığır ırkında hastalıklara direnç ile ilişkili BoLA bölgesinde bulunan DMA, DMB, DQA, DQB, DRA, DRB2, DRB3, DYA, DYB, LMP2 ve LMP7 genlerindeki bazı ekzon bölgelerinin nükleotid dizileri belirlenerek, polimorfizm özellikleri ve filogenetik yapıları analiz edilmiştir. Ayrıca Yerli Kara sığır ırkının doğal bağışıklık sisteminin temelini oluşturan genetik direnç özellikleri ile ilişkili referans veriler elde edilmiştir. Çalışmada kullanılan hayvan materyali, Amasya ve Kars illerinden toplanan, saf ırkın belirgin özelliklerinin taşıyan sığırlara ait toplam 67 adet (29, ♂ - 38, ♀) tam kan örneği kullanılmıştır. Toplanan tüm kan örneklerinden fenol-kloroform yöntemi veya ticari kit yardımıyla genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. Yerli kara sığır örneklerinde BoLA-DMA-E2,3,4, -DMB-E2, -DQA1-E2, -DQA2-E3, -DQA5-E2, -DQB-E2, -DRA-E2, -DRB2-E2, -DRB3-E2, -DYA-E1, -DYA-E2, -DYA-E3,4, -DYB-E3, LMP2-E2 ve LMP7-E3,4,5 bölgelerini çoğaltmak için gerekli ileri ve geri primerler tasarlanmıştır. PZR ile amplifikasyon yapılan örnekler nükleotid dizi analiz cihazı ile ekzon dizi bilgileri elde edilmiştir. PZR ürünleri doğrudan ya da vektöre klonlanarak, üniversal primerler ile nükleotid dizileri belirlenmiştir. Nükleotid dizi datalarındaki heterozigot pozisyonlar ileri ve geri primerler ile toplanarak düzeltilip tanımlanmış ve elde edilen nükleotid diziler NCBI'ya yüklenmiştir. Ayrıca muhtemel protein dizileri incelenerek referans veriler elde edilmiştir. Son olarak önceki çalışmalarda elde edilen allel bilgilerinden faydalanılarak, hastalıklara direnç özellikleri incelenmiş ve tür içindeki bireyler arasındaki varyasyonun derecesi araştırılmıştır.  Çalışılan her bölge için toplam bölge sayısı, G+C oranı (%), polimorfik bölge sayısı (s), haplotip sayısı (h), haplotip farklılığı (Hd) ve nükleotid farklılığı (Pi) hesaplanmıştır. Yerli kara sığır ırkından elde edilen haplotip sayısı (2-129), yüksek nükleotid (Pi: 0,051±0,0014) ve haplotip farklılığı (Hd: 1,000±0,0010) değerleri ile dünyadaki diğer sığır ırkları karşılaştırıldığında elde edilen sonuçlar, Türkiye'nin sığır ırklarını evciltilmesinde merkezi bir nokta olduğunu göstermektedir.  Sonuç olarak, bu çalışmada elde edilen bulgular; Türkiye'deki sığır ırklarının bağışıklık özelliklerinin geliştirilmesine yardımcı olacak bilgiler sağlayarak, infeksiyonlara karşı daha dirençli çiftlik hayvanların yetiştirilmesine katkı sağlayacaktır. Ayrıca BoLA haplotiplerinin çoğunluğu yerli kara sığır ırkına özgüdür ve ortak haplotiplerin çok azı farklı sığır ırklarında gözlemlenmiştir.

Abstract:
In this study, nucleotide sequences of some exon regions of the DMA, DMB, DQA, DQB, DRA, DRB2, DRB3, DYA, DYB, LMP2 and LMP7 genes in the BoLA locus, which are related to diseases in Anatolian black cattle breed of Turkey, and their polymorphic features and phylogenetic structures were analysed. Reference data, associated with the genetic resistance properties of the natural immune system of the Anatolian black cattle breed were obtained. Whole blood samples of 67 (29, ♂ - 38, ♀) Anatolian black cattle carrying the distinctive features of pure breed according to their morphological characters, bred in the cities of Amasya and Kars, were used for DNA analysis. Genomic DNA extraction was carried out using phenol-chloroform method or commercial isolation kits.  The forward and reverse primers were designed to amplify BoLA-DMA-E2,3,4, -DMB-E2, -DQA1-E2, -DQA2-E3, -DQA5-E2, -DQB-E2, -DRA-E2, -DRB2-E2, -DRB3-E2, -DYA-E1, -DYA-E2, -DYA-E3,4, -DYB-E3, LMP2-E2 and LMP7-E3,4,5 regions from extracted and purified DNAs. Exon sequence data were obtained using the nucleotide sequence analyser by either direct sequencing or by cloning in vector systems using universal primers. The nucleotide sequence data were controlled and corrected accordingly and made public in the web site of NCBI. Reference data were obtained using estimated protein sequences. Finally, the resistance abilities were analysed and degree of possible polymorphic variations among the individuals were determined using the basic information of alleles reported in previous studies. For each region studied, total number of regions, G + C ratio (%), polymorphic region number (s), haplotype number (h), haplotype difference (Hd) and nucleotide difference (Pi) were determined. When the numbers of haplotypes (2-129), high nucleotides (Pi: 0,051 ± 0,0014) and haplotype difference rates (Hd: 1,000 ± 0,0010) obtained from domestic black cattle breeds compared to other cattle breeds in the world, it could be suggested that Turkey has been situated in a central position during the domestication process of cattle. Finally, findings of current thesis may also contribute to the development of more resistant farm animals against various infections by providing basic information that will help improve the immunity characteristics of the cattle breeds. Moreover mast majority of the BoLA haplotypes are found to be specific to Anatolian black cattle, and only few of the common haplotypes have been observed in different cattle breeds.