Hipoksik ve normoksik ortam şartlarında osteojenik nesile farklılaştırılmış insan adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin gen/mikrorna ifade profillerinin karşılaştırmalı analizi
Comparative evaluation of the gene/microrna expression profiles of hypoxic and normoxic conditions on the osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells
Yazar: OYA ÇELİKAĞ
Danışman: PROF. DR. AYŞE ESER ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Kök Hücre ve Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Hipoksi = Hypoxia ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kök hücreler = Stem cells ; Mikro RNA = Micro RNA ; RNA = RNA

Özet:
Hücresel tedaviler kapsamında, kök hücrelerin in vitro çoğaltılma ve farklılaştırma işlemlerinin gerçekleştirildiği ortamın oksijen düzeyine bağlı olarak, hücre çoğalma dinamiğinde, elde edilen hücresel ürünün özelliklerinde ve transplantasyon sonrası etkinlik düzeyi bakımından farklı sonuçlara ulaşıldığı rapor edilmektedir. Sunulan tez çalışmasında hipoksik ve normoksik şartlar altında karşılaştırmalı olarak insan yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin karakteristik özellikleri ve osteojenik nesile farklılaşma potansiyellerinin incelenmesi amaçlanmıştır.Yapılan çalışmada insan yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücreler hem normoksik (%20 O2) hem de hipoksik (%2 O2) ortam koşullarında kültüre edildi. Kültüre edilen hücrelerin mezenkimal kök hücre karakteri taşıdığı akım sitometri bulguları, soy analizi ve mikroskop görüntüleri ile gösterildi. Hücreler %70-80 bolluğa ulaştıklarında osteojenik farklılaştırma besiyerine geçildi. Osteojenik farklılaşma alkalin fosfataz aktivesi (ALP) ve Ca+2 tayini, immunohistokimya (OSC, BSP) ve histokimya (von Kossa, Alizarin kırmızısı) boyamaları ile tespit edildi. Belirlenen zaman noktalarında (7., 14., 21., 28. gün) hücre kültürlerinden total RNA izolasyonu gerçekleştirildi. RNA izolasyonundan sonra cDNA sentezi yapılarak hücrelerin miRNA ekspresyon seviyeleri RT-PCR kullanılarak analiz edildi.Çalışma sonucunda kültüre edilen hücrelerin hem hipoksik hem de normoksik ortam şartlarında mezenkimal kök hücre karakteri taşıdığı yapılan analizler ile gösterildi. Yapılan osteojenik farklılaşma sonucunda her iki ortamda histokimya ve immunohistokimya boyamaları pozitif olarak görülse de hipoksik ortamda günlere bağlı olarak bir azalma gözlenmiştir. Hücrelerde her iki ortamda da ALP aktivitesi 14.günden sonra düşmüştür. Ca+2 analizi sonucunda da 7.günden itibaren bir düşüş gözlenmiştir. Belirlenen zaman noktalarında gerçekleştirilen RNA izolasyonunda, RNA miktarlarının ve saflığının çalışma için yeterli olduğu görülmüştür. Yapılan miRNA analizi sonucunda miR106, miR148b, miR26a ve miR22 ekspresyonlarının hipoksik koşullarda arttığı gözlenmiştir. Sonuç olarak hipoksik ortamda miRNA ekspresyonunundaki artışın osteojenik farklılaşmayı baskıladığı düşünülebilir.

Abstract:
For cellular therapies, the oxygen concentration of the medium used for the expansion and differentiation of stem cells, affects the dynamics of cell proliferation, the properties of the cell products and the post-transplant effectiveness of grafted cells. In this study, we have investigated the effects of normoxic and hypoxic conditions on the osteogenic differentiation potential of the adipose-derived stem cells.Human adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured in normoxic (20%) and hypoxic (2%) conditions. The mesenchymal properties of the cultured cells were confirmed using flow cytometry, lineage analysis and imaging techniques. Upon 70-80% of  confluence, the medium was switched to osteogenic. Osteogenic differentiation was documented by measuring the alkaline phosphatase activity (ALP) and Ca+2 assay, histochemistry (von Kossa, Alizarin Red) and immunohistochemistry (OCN, BSP). Total RNA isolation was performed at previously set time-points (7th, 14th, 21th, 28th days). Upon cDNA synthesis miRNA levels were detected the using RT-PCR technique.Final analyses confirmed that the cells displayed mesencymal stem cell characteristics in both hypoxic and normoxic conditions. Following osteogenic differentiation, histochemical and immunohistochemical stainings were positive for both groups, however hypoxia group showed a decreased differentiation capacity through the time-points. ALP activity was decreased for both groups at day 14. Ca+2 assay results was similarly lower at day seven for both groups. RNA isolation performed at pre-designated time-points has proven that the amount and purity of RNA was optimal. miRNA analyses have shown that the expression levels of miR106, miR148b, miR26a and miR22 has increased under hypoxic conditions. This study confirms that the measured expression of miRNA suppresses osteogenic differentiation capacity in adipose-derived mesenchymal cells.