Bitki solunum zinciri: Farklı azot kaynaklarına cevapta hücresel redoks homeostazisi ve alternatif oksidazın redoks yanıtları
The plant respiration chain: Cellular redox homeostasis in response to different nitrogen sources and redox responses of alternative oxidase
Yazar: TURGAY ÇAKMAK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. RAHMİ DUMLUPINAR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyoloji = Biology ; Botanik = Botany
Dizin: Amonyum halojen = Ammonium halide ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Arabidopsis thaliana = Arabidopsis thaliana ; Azot = Nitrogen

Özet:
Bu araştırmada, azot kaynağındaki değişmeyle birlikte durağan olmayan bir redoks ortamında homeostazisin sağlanması için kullanılan temel biyokimyasal proseslerden ve muhtemel oksidatif stresten doğacak hücresel redoks durumunda meydana gelen değişime bitki fizyolojisi ve moleküler biyolojisi çalışmalarında model organizmalar olarak kullanılan Arabidopsis thaliana ekotip Colombia-0 bitkisinin kök ve Nicotiana tobacum cv. Bright Yellow-2 hücrelerinin verdiği cevapları tanımlamak amaçlanmıştır.Azot kaynağı olarak amonyum ve nitrat sağlanan A. thaliana köklerinin redoks durumu ve transkriptomlarını karşılaştırmak için fizyolojik olarak gerçekçi hidroponik büyüme sistemleri kullanıldı. Yeterli büyüklüğe ulaşan A.thaliana bitkileri 26 saat azot açlığına bırakılmış, daha sonra büyüme ortamlarına azot kaynağı olarak 1 mM konsantrasyonda amonyum veya nitrat ilave edilmiş ve azot kaynağı ilavesinden 0, 1.5 ve 8 saat sonra hasat edilen köklerde mikrodizi analizleri, real time PCR analizleri, NAD(H)/NADP(H) ve askorbat/glutatyon oksidasyon durumları, bazı antioksidant enzim aktiviteleri, lipid peroksidasyonu, protein karbonilasyonu ve H2O2 düzeylerindeki değişimler araştırılmıştır. Yine azot kaynağı olarak amonyum veya nitrat içeren besi yerinde kültüre alınan Nicotiana tobacum cv. Bright Yellow-2 hücrelerinin, hücresel ve alternatif solunum hızlarıyla birlikte alternatif oksidaz proteininin aktivasyon durumunda ve miktarında meydana gelen değişimler araştırılmıştır.A. thaliana kökleri kullanılarak gerçekleştirilen mikrodizi analizlerine göre azotla regüle edilen genlerin yaklaşık %60'ı amonyum ve nitrata ortak cevaplar sergilerken, önemli oranda ?nitrat-spesifik? ve ?amonyum-spesifik? gen setleri de tanımlanmıştır. Sitokinin cevabında ve indirgeyici üretimi/dağılımını içeren metabolik yollar nitrata cevapta değişirken, amonyum-sağlanmış köklerde kompleks bir biotik stres cevabı ve nodulin gen ekspresyonunda değişimler tanımlanmıştır.Azot kaynağı olarak nitrat uygulanmış A.thaliana köklerinde muhtemelen mitokondriyal matriksten sitosole artan oranda indirgeyicilerin transferinden dolayı H2O2 üretiminde hızlı bir azalma gözlenmiştir. Farklı azot kaynaklarına cevapta NAD(H)/NADP(H) ve askorbat/glutatyon oksidasyon durumunda önemli bir değişim olmadığı belirlenmiştir. Yeni azot kaynağı ilavesinden özellikle 1.5 saat sonra amonyum uygulanmış köklerde ölçülen tüm antioksidant enzimlerde kontrole (0. saat) ve nitrata kıyasla artış belirlenmiştir. Yine amonyum sağlanmış grupta protein karbonilasyonunda hem kontrole hem de nitrat grubuna kıyasla önemli artış belirlenmiş, bunun yanında lipid peroksidasyonunda önemli bir değişim gözlenmemiştir.Azot kaynağı olarak amonyum içeren ortamlarda kültüre alınmış N. tabacum hücrelerinin hem hücresel ve hem de alternatif solunum hızlarının nitrat kontrollerine kıyasla daha yüksek düzeyde olduğu belirlenmiştir. Yine protein immünoblot analizleri sonucunda indirgenmiş alternatif oksidaz proteininin miktarında amonyuma cevapta çok önemli düzeyde artış olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this research, responses of Arabidopsis thaliana ecotype Colombia-0 roots and Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow-2 cells, the major plant model organisms, to changes in cellular redox status which would arise from possible oxidative stress and fundamental biochemical processes required for the regulation of homeostasis in an immobile redox environment stemming from the changes in nitrogen source were aimed to be investigated.Physiologically realistic hydroponic growth systems were used to compare the transcriptomes and redox status of the roots of ammonium- and nitrate-supplied A. thaliana roots. When plants were grown enough, they were nitrogen-starved for 26 hours, and then the nitrogen-depleted plants were supplied with 1 mM nitrate or 1 mM ammonium just after nitrogen starvation, and microarray analysis, real time PCR analyses, NAD(H)/NADP(H) and ascorbate/glutathione oxidation states, enzymatic antioxidant activities, lipid peroxidation, protein carbonilation and changes in H2O2 levels were investigated in the roots harvested at 0, 1.5 and 8 hours after new nitrogen source supply. Besides this, Nicotiana tobacum cv. Bright Yellow-2 cells, cultured in nutrient media including ammonium or nitrate as a sole nitrogen source, were used in order to examine the changes in cellular and alternative respiration levels, and the activation state of alternative oxidase protein and its quantity responsive to ammonium or nitrate.Acording to the microarray analysis of A.thaliana root transcriptome while approximately 60% of nitrogen-regulated genes displayed common responses to both ammonium and nitrate, significant ?nitrate-specific? and ?ammonium-specific? gene sets could be identified. Pathways involved in cytokinin response and reductant generation/distribution were specifically altered by nitrate, while a complex biotic stress response and changes in nodulin gene expression were characteristic of ammonium-supplied plant roots.A rapid decrease in H2O2 production was observed in nitrate-supplied A.thaliana roots, potentially due to an increased export of reductant from the mitochondrial matrix to the cytosol. Ascorbate/glutathione, and NAD(H)/NADP(H) oxidation state did not differentiate responsive to different nitrogen sources. When compared to control (time 0) and nitrate, all antioxidant enzymes studied showed increased activities in response to ammonium especially 1.5 hours after new nitrogen source supply. Besides, protein carbonilation levels increased in ammonium-supplied roots while lipid peroxidation levels did not change.N. tabacum cells, cultured in nutrient media including ammonium as a sole nitrogen source, showed higher cellular and alternative respiration levels in comparison to their nitrate controls. Protein immunoblot analysis revealed that reduced alternative oxidase protein quantity showed significant increase in response to ammonium.