Fibroblast büyüme faktörü-2 bloklamasının tavuk embriyosunda kraniyal sütür gelişimine etkileri
The effects of fibroblast growth factor- 2 blocking on development of chick embryo cranial sutures
Yazar: TAMAY ŞİMŞEK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. YUSUF KURTULUŞ DURANSOY
Celal Bayar Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Embriyo = Embryo ; Fibroblast büyüme faktörü = Fibroblast growth factor ; Histoloji = Histology ; Kraniyosinostozlar = Craniosynostoses ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Sütürler = Sutures ; Tavuklar = Chickens

Özet:
Kranial kubbenin normal büyümesi ve morfogenezi, sütürlerdeki hücre proliferasyonu ile kranial kemiklerin kenarlarındaki osteogenez arasındaki dengeyi yansıtmaktadır. Klinik bir durum olan kraniyosinostozda, erken osteojenik farklılaşmadan dolayı sütürler prematür birleşir ve kraniofasiyal malformasyon meydana gelir. Günümüzde, bazı fibroblast büyüme faktör (FGF) reseptör genlerindeki mutasyonlar major kraniyosinostotik sendromlar için sorumlu tutulmuştur. Tavuk embriyosu kranial kubbelerindeki endojen FGF-2 ligandlarının seviyelerini manipüle etmek ve morfogenezi bozmak için antikor bloklama yöntemi kullanılmıştır. FGF-2'nin yüksek ve düşük seviyeleri farklı tepkiler verilmesine neden olmaktadır. Bu farklı seviyeler arasındaki denge normal kranial morfogenezi sağlamaktadır. Bu çalışmada, literatür bilgileri ışığında deneysel model olarak tavuk embriyosu gelişimi kullanılarak FGF-2 bloklaması ile kranial sütür gelişimi, deneysel kraniyosnostoz oluşumuna etkisi ve kemikleşme öncesi ve sonrasında oluşabilecek değişikliklerin morfolojik, histolojik ve protein düzeyinde incelenmesi amaçlandı. Bu süreçte oksidatif stres ile hücre ölümünün ilişkisi araştırıldı.
Çalışmamızda Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü'nden temin edilen spesifik patojen içermeyen (SPF, specific pathogen free) 120 adet tavuk yumurtası kullanıldı. Yumurtalar, 37,5oC sıcaklıkta, yaklaşık %60-80 nem orana sahip etüvde inkübe edildi. Dört deney grubu oluşturuldu. Birinci grup kontrol grubu 20 denek. İkinci grup fosfat tampon solüsyonu (PBS; Posphate buffer solution) verilen, üçüncü grup 0,01 μg/ml anti-bFGF-2 ve dördüncü grupta 0,1 μg/ml anti-bFGF-2 ile bloklama yapılan grup olarak oluşturuldu. İkinci üçüncü ve dördüncü gruplar içinde uygulama yapılan günlere göre E2 (2. gün), E4 (4. gün), E6 (6.gün), E8 (8. gün) olmak üzere 4 alt grup oluşturuldu. PBS verilen 2. grupta her alt grup için 5'er adet toplam 20 adet, anti-FGF-2 ile bloklama yapılan 3. ve 4. gruptada her alt grupta 10'ar adet toplam 80 adet denek kullanıldı. Gelişimin farklı aşamalarında anti-temel fibroblast büyüme faktörü-2 (anti basic fibroblast growth factor 2, anti-bFGF-2) uygulandı. Fertilize yumurtalar inkübatörde 15 gün süresince inkübe edilerek 2., 4., 6. ve 8. günlerde her gruba ameliyat mikroskobu yardımı ile 1 doz olmak üzere umblikal kord etrafına 0,1 ve 0,01µg/ml olacak şekilde PBS içinde antikor ile bloklama uygulandı. E15 günü sakrifiye edildikten sonra alınan örnekler Bouin tespit solüsyonu ile fikse edildi, rutin doku takibine alınarak parafine gömüldü ve 5 μm'lik seri kesitler alındı. Makroskobik gelişim etkilenmesi morfolojik olarak, mikroskobik etkileşim Hematoksilen-Eozin, Mason Trikrom, Vonkossa ve Alizerin Red ile histokimyasal ve oksidatif stres için anti-eNOS, çoğalma için anti-PCNA ve hücre ölümü için TUNEL ile immunositokimyasal yöntemle boyanarak incelendi. Gelişimin makroskobik karşılaştırmaları morfometrik ölçümler ile boyamaların karşılaştırmaları skorlama ile gerçekleştirildi. Farkların ortaya konmasında Graphpad istatistik yazılımı kullanıldı. Tek yönlü ANOVA analizi ile yapılan karşılaştırmalarda p<0,05 anlamlı olarak kabul edildi.
E4 ile E8 embriyolarının antikor ile bloklanması sonrasında E15 günü yapılan morfolojik, histolojik ve immunositokimyasal bulgularda beklenen kraniyosnostoz oluşumunun gerçekleşmediği, yerine kıkırdak hâkimiyetinin varlığı saptandı. Örneklerde morfolojik bozukluk, anomali veya gelişme geriliği gibi patolojiler saptanmadı. Antikor bloklaması ile oluşan ancak sistemik yapıyı etkilemeyen FGF-2 için sütürlerdeki eNOS boyaması ile gösterilen oksidatif stres durumunu değiştirerek PCNA ile saptanan çoğalmanın devamına ve apoptoz ile belirlenen hücre ölümüne etki yaptığı gözlendi. Bu etkilerin en belirgin bir biçimde E8 embriyolarında görüldüğü ve oluşan etkinin ve farklılıkların istatiksel olarak anlamlı olduğu saptandı.
Bulgularımız FGF-2'nin anlamlı ve tekrarlanabilir bir biçimde kranial gelişimde önemli rol oynadığını, bloklandığı takdirde sütür kapanmasında gecikmeye neden olduğunu gösterdi. FGF'ün normalde kemik gelişimini hızlandırdığı ancak sütürlerde kapanmayı geciktirdiği bilgisine parelel olarak bu faktörü bloklamanın kapanmayı erkenleştirmesini beklerken tam tersi bir etkinin varlığı saptandı. Sütür aralarının bu beklenmedik etki ile daha da genişlediği izlendi. Bu sonuçlar, bloklamaya bağlı başka yan etkiler görülmemesi nedeni ile antikor ile bloklamanın kraniyosnostozlularda tedavi amaçlı kullanılabileceğini düşündürdü. Kraniyosnostoz ve fibroblast büyüme faktörü-2 ilişkisinin ve kullanılan oksidatif stres ve apoptoz ilişkisinin ileri teknikler ile daha ayrıntılı incelenmesi bu hastalıktan mağdur olan insanlara daha kaliteli bir yaşam sunmak için önemli bilgiler oluşmasını sağlayacaktır.

Anahtar Kelimeler: Fibroblast Büyüme Faktörü, Tavuk embriyo, kranial sütür, kraniyosinostoz, histoloji, oksidatif stress, apoptoz.

Abstract:
Normal growth and morphogenesis of the cranial dome, reflects the balance between cell proliferation in the cranial sutures and osteogenesis in the bone edges. In craniosynostosis, due to early osteogenic differentiation, sutures closure prematurely and craniofacial malformations occur. Nowadays, mutations in fibroblast growth factor (FGF) receptor's genes have been implicated as a major factor in craniosynostotic syndromes. In chicken embryo cranial dome, antibody blocking method is used to disrupt morphogenesis and to manipulate the endogenous FGF-2 ligand. High and low levels of FGF-2 are caused to different reactions. The balance between these different levels is provided normal cranial morphogenesis. In this study, chicken embryos were used as experimental models. The effects of FGF-2 blocking on development of cranial sutures and experimentally formation of the craniosynostosis were investigated. Also morphological, histological and changings that may occur before and after ossification at the protein level was examined. In this process, the relationship between oxidative stress and cell death was investigated.
In our study, chicken eggs which obtained from Bornova Veterinary Control and Research Institute were used. Eggs were incubated at 37.5 degrees Celsius in the oven for about 60-80% humidity and four experimental groups were formed. First group was control group and consisted 20 eggs. Second group was included sterile phosphate buffered saline and others (group 3 and 4) were FGF-2 blocking groups. Group 3 and 4 were included 0,1 and 0,01 μg/ml anti-bFGF-2 respectively. Second, 3rd and 4th groups subdivided into 4 groups as E2, E4, E6 and E8. While second group included 5 eggs for each subdivision group (total :20 eggs), 3rd and 4 th groups  included 10 eggs  for each subdivision groups (total: 80 eggs). In 3rd and 4th group, FGF-2 blocking was done in E2nd, E4th, E6th and E8th days. Anti-basic fibroblast growth factor-2 (anti-bFGF-2) was applied at different stages of development. Fertilized eggs were incubated for 15 days in an incubator and 0.1 and 0.01 µg/ml antibody (in one dose) in PBS was applied under operating microscope around the umbilical cord at 2nd, 4th ,6th and 8th days to each group for blocking. Samples were taken on E15th day after sacrifization and were fixed with Bouin's fixing solution. Tissues were embedded in paraffin according to routine follow-up and 5 µm sectiones were cut. While macroscopic development was examined morphologically, microscopic interactions were evaluated after Hematoxylin-eosin, Mason trichrome, Vonkossa and Alizer Red staining histochemically. Also oxidative stress, proliferation and cell death were examined after immuncytochemically staining with anti-eNOS, anti-PCNA and TUNEL respectively. While comparison of the macroscopic development was done by morphometric measurements, comparison of staining was done by scoring. Graphpad statistical software was used to exposed differences. The comparison was done with the one-way ANOVA test and p value as <0.05 was considered as statistically significant.
Embryos which were blocked with antibody on E4th and E8th days evaluated on E15th day with morphologically, histologically and immunocytochemically. Findings revealed the presence of cartilage sovereignty instead of craniosynostosis. In the examples, pathologies such as morphological disturbance, abnormalities or growth retardation were not detected. We observed that, antibody blocking did not affect the systemic structure. It changed the oxidative stress in sutures which is shown by eNOS staining and affected the continuation of proliferation and cell death which were detected by PCNA and apoptosis respectively. These effects were seen most clearly in the E8th embryos and the difference was statistically significant.
Our findings showed that, FGF-2 plays an important role in the development of the cranium and blocking of FGF-2 causes to delays in the closure of the sutures. Normally, on the one hand FGF accelerate the normal bone development, on the other cause to delay in suture closure. While our expectation was acceleration of the suture closure by blocking of this factor, opposite effect was observed. The distance between sutures was increased more which was unexpected result. These results suggested that, blocking with antibody can be used for treatment of craniosynostosis. The relationship between craniosynostosis, FGF-2, oxidative stress and apoptosis should be examined in more detail with advanced techniques. So, more important information could be obtained to provide better quality of life to these patients.

Keywords: Fibroblast Growth Factor; Chicken embryo; Cranial sutures; craniosynostosis; histology; oxidative stress; apoptosis.