İnsan serum bütirilkolinesterazının olası lipolitik aktivitesi-lipid metabolizması ile ilişkisi
Potential lipolytic activity of human serum butyrylcholinesterase-its function in lipid metabolism
Yazar: MÜSLÜM GÖK
Danışman: PROF. DR. EBRU BODUR
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Asetilkolinesteraz = Acetylcholinesterase ; Butirilkolinesteraz = Butyrylcholinesterase ; Fosfolipidler = Phospholipids ; Gaz kromatografisi = Gas chromatography ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Lipidler = Lipids ; Palmitik asit = Palmitic acid ; Trigliseridler = Triglycerides ; Yüksek basınç sıvı kromatografisi =

Özet:
Kolinesterazlar (AChE ve BChE), başlıca kas-sinir kavşaklarındaki kolinerjik sinapslarda asetilkolin uyarılı nörotranmisyonu sonlandırır. BChE ekspresyonunun esansiyel yağ asitleri tarafından düzenlendiğini daha önce göstermiştik. Lipazların ve kolinesterazların (ChE) katalitik bölgesinin benzeşmesi, ChE'lerin da çeşitli lipit ve fosfolipitleri hidroliz edebilecekleri hipotezini öne sürmemize neden oldu. ChE'lerin serbest yağ asitleri, trigliseritler ve fosfatidilkolin-sfingomiyelin gibi zar fosfolipitlerinin olası hidrolizi kromatografik ve spektrofotometrik-florometrik yöntemlerle incelendi. Ticari BChE-AChE ve insan plazmasından saflaştırılan BChE'nin lipolitik aktiviteleri farklı kaynaklardan kontrol enzimleri (Pankreatik (PanL) ve buğday tohumu (BTL) lipaz, fosfolipaz (PLA2), sfingomiyelinaz) ile birlikte değerlendirildi. BChE'nin PLA2 ve sfingomiyelinaz aktiviteleri tarandı. BChE'nin kısmi PLA2 aktivitesi gösterdiği, ancak sfingomiyelinaz aktivitesi göstermediği bulundu. Substrat olarak serbest yağ asidi hidrolizi, 4-mu palmitat ile gerçekleştirildi. Sonuçlar, saflaştırılan BChE'nin 4-mu palmitat'ı BTL kadar etkin hidroliz edebildiğini gösterdi. Michaelis-Menten kinetik sonuçları substrat olarak 4-mu palmitat kullanan enzimlerin afinitesini şu şekilde sıralar: BTL (10,4 µM)> Safl BChE (34,2 µM)> PanL (129,8 µM)> tic BChE (186 µM). Kolinesterazların trioleik asit (TO) hidrolizi GC-MS ve LC-MS/MS ile analiz edildi. TO hidrolizinin GC-MS sonuçları, saflaştırılan BChE'nin PanL'nin %7'si kadar oleik asiti ortama saldığını gösterdi. LC-MS/MS sonuçları PanL'nin diğer enzimlerden daha yüksek TO hidrolitik aktivitesi (18593 ppm/dk/mg protein enzim) olduğunu gösterdi (p<0,001). TO hidroliz yetisi olduğu bugüne kadar gösterilmemiş olan saflaştırılan BChE'nin aktivite değeri (714,3 ppm/dk/mg protein enzim), BTL'den (80,7 ppm/dk/mg protein enzim) daha yüksekti (p=0,024). Aynı çalışmalar ticari AChE ile gerçekleştirildi. Ancak AChE'nin adı geçen substratları hidroliz etmediği gözlendi. BChE aktivitesinin spesifik inhibitörü IsoOMPA varlığında ve BChE'nin lektin afinite kromatografisi sonrası elde edilen süpernatanda lipolitik aktivitesi çok düşüktü. Bu sonuç lipolitik aktivitenin BChE'ye ait olduğunu ve BChE'nin 4-mu palmitat ile trioleik asiti hidroliz ettiğini göstermektedir.

Abstract:
Cholinesterases (AChE and BChE) terminate acetylcholine-induced neurotransmission at cholinergic synapses in muscle-nerve junctions. We previously showed BChE expression is regulated by essential fatty acids. The similarity of catalytic domain of lipases with cholinesterases (ChE) led us to hypothesize that ChEs can hydrolyze various lipids and phospholipids. The possible hydrolysis of free fatty acids, triglycerides and membrane phospholipids such as phosphatidylcholine-sphingomyelin by cholinesterases was investigated, using chromatographic and various spectrophotometric-fluorometric methods. Lipolytic activity of BChE purified from human plasma, commercial BChE-AChE were compared with control enzymes from various sources (pancreatic (PanL) and wheat germ (BTL) lipase, phospholipase (PLA2), sphingomyelinase). PLA2 and sphingomyelinase activity of BChE were measured. PLA2 activity of BChE was partial, but there was no sphingomyelinase activity. Free fatty acid hydrolysis was studied with 4-mu palmitate as substrate. Results showed purified BChE can hydrolyze 4-mu palmitate as effectively as BTL. Michaelis-Menten kinetic results sort the affinity of the enzymes, that uses 4-mu palmitate as substrate, as follows: BTL (10.4 µM)> Pure BChE (34.2 µM)> PanL (129.8 µM)> tic BChE (186 µM). Trioleic acid (TO) hydrolysis of cholinesterases were analyzed by GC-MS and LC-MS/MS. According to GC-MS TO hydrolysis results, oleic acid released by BChE corresponded to 7% released by pancreatic lipase. LC-MS/MS results showed that TO hydrolytic activity of PanL (18593 ppm/min/mg protein enzyme) was higher than other enzymes (p<0.001). TO hydrolytic activity of purified BChE (714.3 ppm/min/mg protein enzyme), whose TO hydrolysis ability hasn't been demonstrated to date, was higher than BTL (80.7 ppm/min/mg protein enzyme) (p=0.024). All studies were performed also with commercial AChE. However, AChE didn't hydrolyze the substrates used here. The lipolytic activity of BChE in the presence of IsoOMPA, a specific inhibitor of BChE, and the supernatant obtained after BChE-treated lectin affinity chromatography was very low. This result shows the lipolytic activity belongs to BChE, and BChE hydrolyzes both trioleic acid and 4-mu palmitate.