JAR ve JEG-3 koryokarsinom insan hücre kültüründe lipozomal doksorubisin ve karoten etkisinin incelenmesi
The examination of the effect of liposomal doxorubicin and carotene on jar and JEG-3 choriocarcinoma human cell culture models
Yazar: SEYİT AHMET EROL
Danışman: PROF. DR. MEHMET İBRAHİM HARMA
Bülent Ecevit Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Apoptozis = Apoptosis ; Doksorubisin = Doxorubicin ; Hücre kültürü = Cell culture ; Karotenoidler = Carotenoids ; Karsinoma = Carcinoma ; Lipozomlar = Liposomes ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Amaç: Gestasyonel Trofoblastik Hastalıklar, insanda plasentadan gelişen bir grup hastalıktır ve koryokarsinom bunların malign formudur. Etyolojisinde, retinoik asit eksikliği ve A vitamini alımının azlığının, hastalık riskini arttırdığı çeşitli çalışmalarda saptanmıştır. Medikal tedavide, hastalığın evresine göre, tek başına veya kombine kemoterapotik ajanlarla uygulanan pek çok tedavi rejimi bulunmaktadır. Doğal bir antioksidan olan Karoten'in peroksit radikallerinin yakalanması ve detoksifikasyonunda rol alarak özellikle kimyasal karsinogenezde koruyucu rol aldığı bilinmektedir. Karoten' in hücre çoğalmasını azaltıcı, apopitozu uyarıcı, invazyonu inhibe edici etkileri bildirilmiştir. Lipozomal doksorubisin antrasiklin türevi kemoterapötiktir, hidrokloridin pegile lipozomlar içerisine gömülmesiyle oluşturulmuş uzun salınımlı bir formülasyondur. DNA içine enterkalasyon yapar, transkripsiyon esnasında DNA'nın açılmasını sağlayan Topoizomeraz II enziminin ilerlemesini ve DNA ikili sarmalının tekrar birleşmesini engeller. Bu formül artmış kardiyak riskli metastatik meme kanseri hastalarında, platinum bazlı kemoterapinin başarısız olduğu ileri evre over kanseri olgularında ve kaposi sarkomu ile ilişkili kazanılmış immun yetmezlik sendromlarında kullanılır. Ayrıca multipl myelom, mide, akciğer, tiroid, mesane kanserikemoterapi rejimleri içersinde yer almaktadır.
Çalışmamızın amacı, farklı hücre kültürü modelleri (JAR, JEG) kullanılarak Lipozomal Doksorubisin ve Karoten'in tek başına veya kombine kullanıldığında, koryokarsinom tedavisindeki etkinliğinin araştırılmasıdır.
Gereç ve Yöntem: İnsan koryokarsinom benzeri JAR ve JEG-3 hücrelerin RPMI-1640 ortamında  %10 fetal dana serumu, penisilin-steptomisin varlığında 37°C, %95 hava, %5 CO2 içeren atmosferde çoğaltıldı. Lipozomal Doksorubisin (LD) ve Karoten'in uygulama grupları aşağıdaki gibi belirlendi;
Tek ilaç uygulaması için LD'nin 1 μg/ml, 2 μg/ml, 5 μg/ml; Karoten'in 1 μg/ml'lik, 5 μg/ml'lik ve 10 μg/ml'lik dozları kullanılmıştır. 
LD ve Karoten kombinasyonunda; LD'nin 1 μg/ml'lik, 2 μg/ml'lik ve 5 μg/ml'lik, dozları ile Karoten'in 5μg/ml'lik dozu kullanılmıştır.
Maddeler hücrelere aynı anda verilmiştir. İlaç uygulamasını izleyen 72. saatte hücreler Tripsin-Etilen Diamin Tetraasetik Asit (EDTA) solüsyonu ile kaldırılıp, apopitoz çalışmasına alınmıştır. Bu çalışmada JAR ve JEG-3 hücrelerinde apoptozun derecesi Flowsitometri (FCM) ile belirlenmiş, sadece bir set için tripsin öncesi süpernatan toplanıp, β-hCG ve h-hCG ölçümü için derin dondurucuda saklanmıştır. İmmünoenzimatik yöntemle β-hCG ve h-hCG ölçümü literatürde ilk kez birlikte yapılmıştır. SPSS 19.0 ve Minitab 17 istatistik programları kullanılarak istatistiksel analiz yapılmıştır.
Bulgular: Yaptığımız çalışmada Karoten'in tek başına artan dozlarda kullanıldığında JAR hücre serileri üzerinde ki apopitotik etkilerinin istatistiksel olarak arttığı ancak JEG-3 hücre serileri üzerinde ki apopitotik etkilerinin istatistiksel olarak artmadığı görülmüştür. LD'nin tek başına artan dozda ve bu iki ilacın kombine edilip Karoten dozu sabit tutulurken LD'nin dozu arttırılarak kullanıldıklarında JAR ve JEG-3 hücre serisi üzerinde apoptotik etkilerinin istatistiksel olarak arttığı görülmüştür.
Sonuç: İnsan Koryokarsinom hücre hattı modelleri olan JAR ve JEG-3 üzerinde LD ve Karoten'in tek ajan ve kombine kullanımları ayrıca immünoenzimatik yöntemle β-hCG ve h-hCG ölçümü, her iki hücre hattında birden literatürde ilk kez yapılmıştır. Elde edilen sinerjistik apoptotik veriler LD ve Karoten'in Koryokarsinom tedavisinde karşılaşılan çoklu ilaç direnciyle mücadelede kullanılabilecek seçeneklerden biri olabileceğini göstermektedir. Ancak ilaçların etkileri ve kombinasyonlarındaki etkilerin in vivo sistemlerde farklı olabileceğinden, veriler ilk olarak hayvan deneyleri ve sonra klinik araştırmalarla da desteklenmelidir.

Abstract:
Aim: Gestational trophoblastic diseases are the group of diseases that originates from human placenta and choriocarcinoma which is the malignant form. In several studies it is showed that retionic acid and vitamin  A deficiency increase the risk of this disease at the etiology of these diseases. There are many medical treatment methods with single or combined chemotherapotic agents, depend on stage of the disase. Taking part in the capture and detoxification of peroxide radicals, carotene is a natural antioxidant known to particularly protective role in chemical carcinogenesis. Carotene in reducing cell proliferation, stimulating apoptosis, invasion inhibitory effects has been reported.
Liposomal Doxorubicin is an anthracycline derivated chemotherapeutic that hydrochloride pegylated liposomes formed by buried in extended-release formulation. It makes intercalation into DNA, blocks the progression of the enzyme topoisomerase II and providing the opening of the DNA during transcription rejoining of DNA double helix. This formula is an increased cardiac risk in patients with metastatic breast cancer, who have failed platinum-based chemotherapy in advanced stage ovarian cancer and is used in cases of Kaposi's sarcoma associated with acquired immune deficiency syndrome. In addition, multiple myeloma, stomach, lung, thyroid, bladder cancer is located within the chemotherapy regimens.
The aim of our study is research the effectiveness of single agent use and combined chemotherapy with Liposomal Doxorubicin and Carotene on JAR and JEG-3, human choriocarcinoma cell line models for treatment of choriocarcinoma.
Materials and Methods: Human choriocarcinoma like JAR and JEG-3 cells were cultured at conditions 37°C, O2 95%, CO2 5% in RPMI-1640 environment that include 10% fetal bovine serum, penicillin-streptomycin. Liposomal Doxorubicin (LD) and Carotene trial groups are determined as shown below;
For single drug trial; LD 1 μg/ml, 2 μg/ml, 5 μg/ml; Carotene 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml dosages were maintained.
For the combination of  LD and Carotene; LD 1 μg/ml, 2 μg/ml, 5 μg/ml dosages were maintained with Carotene 5 μg/ml dosage.
Drugs were given to the cells at the same time. Following drug administration at the 72nd hour the cells were detached by the Trypsine- Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) solution. The degree of apoptosis was obtained by flow cytometry (FCM). Supernatant was collected before trypsine application for only one set, and stored in deep-freeze to investigate β-hCG and h-hCG levels. β-hCG and h-hCG levels were investigated by immunoenzymatic method. SPSS 19.0 and Minitab 17 programmes were used to make statistical analysis.
Findings: We observed that in our study Caroten's single application with increasing dosages cause to statistically significant increase of apoptosis ratios on the JAR cell lines but statistically significant increase of apoptosis ratios on the JEG-3 cell lines hasn't shown. We showed that there's been increase of apoptosis ratios on the both of JAR and JEG-3 cell lines when we apply the fixed dose of Carotene with the increasing dosages of LD.
Result: The single or combined application of  LD and Carotene on the JAR and JEG-3 human choriocarcinoma cell line models, also β-hCG and h-hCG with immunoenzymatic methodmeasured, is made in both cell lines for the first time in the literature. The obtained synergistic apoptotic data indicated that; the combination of LD and Carotene could be used as one of the options in the struggle against multi-drug resistance encountered in the treatment of choriocarcinoma. However, the effect of the drugs with single application and with combination methods may be different in vivo systems, therefore the data should be supported initially by animal experiments and then clinical trials.