Sıçan pankreatik beta hücre hattında (INS-1E) lipotoksisiteye verilen cevapta fonksiyon gösteren parkin proteininin regülasyonunda rol alan mikroRNA'ların saptanması
Detection of microRNAs in the regulation of parkin protein functioning in the response to lipotoxicity in rat pancreatic beta cell line (INS-1E)
Yazar: HATİCE PINAR BAYSAN ÇEBİ
Danışman: DOÇ. DR. BALA GÜR DEDEOĞLU
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Mikro RNA = Micro RNA ; Mitokondriler = Mitochondria ; Otofaji = Autophagy ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Tip 2 diyabet (T2D); hiperglisemiye neden olan, periferal insülin direnci ve pankreatik beta (β) hücrelerinden bozulmuş insülin salınımı ile karakterize endokrin ve metabolik bir bozukluktur. Endoplazmik Retikulum (ER) ve Mitokondriyon'da (Mt) oluşan problemler sonucu bozulan lipit ve kalsiyum homeostazı, ER stresi, Mt fonksiyon bozukluğu, ER ve Mt arası iletişim bozuklukları, otofaji mekanizmasının bozulması ve T2D sürecinde; insülin direnci ve pankreatik β hücre fonksiyon kaybı olarak kendini göstermektedir. Park2 geninin ürünü ve bir E3 ubikuitin protein ligaz olan Parkin proteini otofaji ve mitofajiye aracılık eden aynı zamanda sahip olduğu ubikuitinasyon yeteneği sayesinde; DNA onarımı, transkripsiyon, translasyon, organel trafiği, proliferasyon, inflamasyon ve hücre ölüm/sağkalım yolaklarında aktif rol almaktadır. İnsülin direnci ve T2D'in en temel nedenlerinden olan lipotoksisiteye karşı Parkin proteininin hücre sağkalımını otofaji üzerinden desteklediği, Parkin proteininin yokluğunda ise hücrenin apoptoza yönelim gösterdiği bilinmektedir.
Minimal lipotoksisite farklılıklarında Park2 geni ifade düzeyi ve proteinin fonksiyonunda hızlı değişimler meydana gelmektedir. Bu durum Parkin protein regülasyonunun hızlı hareket eden RNA interferans (RNAi) mekanizması üyesi mikroRNA'lar (miRNA) ile düzenlenebileceği hipotezini ortaya çıkarmıştır. Buradan yola çıkarak bu tez çalışmasında biyoinformatik yaklaşımlar ve deneysel analizler bir arada kullanılarak ER ve Mt'de organel stresine neden olan palmitik asitle (PA) oluşturulan lipotoksik koşullarda Parkin proteini varlığında ve siRNA aracılı olarak Park2 geninin sessizleştirildiği koşullarda pankreatik beta hücrelerinde meydana gelen miRNA ifade farklılıkları incelenmiştir. 
Gerçekleştirilen miRNA profillemesi ve yapılan ileri biyoinformatik analizler ile validasyon çalışmaları sonunda hücre sağkalımında rolü olan Parkin proteininin regülasyonunda görev aldığı düşünülen rno-miR- 96-5p, rno-miR-153-3p, rno-miR-30e-3p ve rno-miR-344a-5p miRNA'ları öne çıkmıştır. Bu miRNA'ların özellikle, hücre sağkalım, otofaji, apoptoz, T2D ve insülin sinyalizasyon yolaklarında etkin olduğu gösterilmiştir. Aday miRNA'ların hedeflediği genlerin ifadelerinin validasyonları için gerçekleştilen Gerçek Zamanlı PZR çalışmaları da seçilen miRNA'ların bu süreçteki düzenleyici rollerini destekler niteliktedir.

Abstract:
Type 2 diabetes (T2D); is an endocrine and metabolic disorder characterized by peripheral insulin resistance and impaired insulin secretion from pancreatic beta (β) cells, causing hyperglycemia. Lipid and calcium homeostasis deteriorated as a result of problems in the Endoplasmic Reticulum (ER) and Mitochondrion (Mt), ER stress, Mt dysfunction, communication disorders between ER and Mt, disruption of autophagy mechanism, and in the T2D process; It manifests itself as insulin resistance and loss of pancreatic β-cell function. The product of the Park2 gene and the Parkin protein, which is an E3 ubiquitin-protein ligase, mediates autophagy and mitophagy, and at the same time, thanks to its ubiquitination ability; It plays an active role in DNA repair, transcription, translation, organelle traffic, proliferation, inflammation, and cell death/survival pathways. It is known that the Parkin protein supports cell survival through autophagy against lipotoxicity, which is one of the leading causes of insulin resistance and T2D. In the absence of the Parkin protein, the cell tends to apoptosis.
In minimal lipotoxicity differences, rapid changes occur in the expression level of the Park2 gene and the function of the protein. This has led to the hypothesis that Parkin protein regulation may be regulated by microRNAs (miRNAs) that are members of the fast-acting RNA interference (RNAi) mechanism. Based on this, in this thesis study, bioinformatics approaches and experimental analyzes were used together and miRNA expression differences in pancreatic β cells in the presence of Parkin protein in lipotoxic conditions induced by palmitic acid (PA), has been studied which causes organelle stress in ER and Mt, and in conditions where the Park2 gene was silenced by siRNA.
As a result of miRNA profiling and further bioinformatic analyzes and validation studies, miRNAs thought to be involved in the regulation of Parkin protein, which has a role in cell survival, are         rno-miR-344a-5p, rno-miR- 96-5p, rno-miR-153-3p, and rno-miR-30e-3p. These miRNAs have been shown to be particularly active in cell survival, autophagy, apoptosis, T2D, and insulin signaling pathways. qRT- PCR studies for the validation of the expressions of the genes targeted by the candidate miRNAs also support the regulatory roles of the selected miRNAs in this process.