Rekombinant transmembran proteinlerin kromatografik yöntemlerle saflaştırılması
Purification of recombinant transmembrane proteins with chromatographic techniques
Yazar: LEVENT TURA
Danışman: DOÇ. DR. MURAT TOPUZOĞULLARI ; DOÇ. DR. TÜLİN ÖZBEK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Son yıllarda bakterilerin antibiyotiklere karşı geliştirdikleri dirençte önemli bir artış olması, Staphylococcus aureus (S. aureus) gibi birçok patojenden kaynaklı hastalıkların tedavisini zorlaştırmaktadır. Bu sebeple, bu tip patojenlere karşı yeni tedavi yöntemlerinin ve ilaç moleküllerinin geliştirilmesi elzem hale gelmiştir. Bu amaçla geliştirilen ve rekombinant olarak üretilen antibakteriyel etkili transmembran proteinlerin dirençli patojenlere karşı kullanılabilecek önemli bir strateji olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Ancak, transmembran proteinlerin ekspresyonu sonrası lipit çift tabakaya çok geçişli olarak konumlanması, bu proteinlerin rekombinant üretimi sonrasında saflaştırılmasında çeşitli zorlukları beraberinde getirmektedir. Rekombinant transmembran proteinlerin lipit çift tabakada bulunan α-sarmal kısımları proteine hidrofobik bir özellik katmaktadır. Bu durum, kolon kromatografisi için etkin ve yüksek verimli bir metodun geliştirilmesini gerektirmektedir.
Çalışmada, S. aureus patojenine karşı antibakteriyel aktivite göstermesi öngörülen bir transmembran proteininin kromatografik yöntemlerle saflaştırılması amaçlanmıştır. Çalışılan transmembran proteinin kromatografik saflaştırmasının tasarımından önce saflaştırma etkinliğini en üst düzeye çıkarabilmek amacıyla disülfit bağı potansiyeli, hidrofobik amino asitlerin bulunma sıklığı, zincir uzunluğu ve moleküler ağırlığı gibi veriler değerlendirilmiştir. Hedef rekombinant proteinin histidin ve GST etiketlerine sahip olması nedeniyle öncelikle HisTrap™ FF ve GSTrap™ kolonları ile afinite kromatografisi uygulanmıştır. Sonrasında, proteinin hidrofobik özelliğinden yararlanarak HiTrap™ Butyl HP kolonu ile tuz ortamında artan hidrofobisite ilkesi ışığında saflaştırma yöntemi oluşturulmaya çalışılmıştır. Son olarak ise, ilgili rekombinant proteinin teorik izoelektrik noktası hesaplanarak HiScreen™ Capto DEAE kolonu ile iyon değişim kromatografisi, farklı gradient türleri ile artan iyonik yük koşulunda uygulanmıştır. Gerçekleştirilen afinite kromatografileri ve hidrofobik etkileşim kromatografisi yöntemleri ile yüksek saflıkta protein saflaştırılması gerçekleştirilememiş olmasına rağmen iyon değişim kromatografisi ile önemli ölçüde saf fraksiyonlar elde edildi. Elde edilen saf fraksiyonların SDS-PAGE, Western blot ve MALDI TOF kütle spektroskopisi gibi karakterizasyon analizleri gerçekleştirilerek hedef rekombinant proteinin yapısı doğrulanmıştır.
Farklı kromatografi türlerinin hedef rekombinant proteinin saflaştırma stratejisine etkisi araştırılarak, sağlık, gıda, tarım, kozmetik gibi bakteriyel kontaminasyonların sıkça rastlandığı alanlarda yüksek saflıkta antibakteriyel transmembran protein üretimi tartışılmıştır.

Abstract:
In recent years, there has been a significant increase in the resistance of bacteria to antibiotics, making the treatment of diseases caused by many pathogens such as Staphylococcus aureus (S. aureus) difficult. Consequently, it has become essential to develop new treatment methods and drug molecules against this type of pathogen. It has been shown in studies that transmembrane proteins with antibacterial effect, developed for this purpose and produced recombinantly, are an important strategy that can be used against resistant pathogens. However, the multi-pass positioning of transmembrane proteins into the lipid bilayer after expression brings along various challenges in the purification of these proteins after recombinant production. The α-helical portions of recombinant transmembrane proteins in the lipid bilayer add a hydrophobic property to the protein. This requires the development of an efficient and high-throughput method for column chromatography.
In this study, it was aimed to purify a transmembrane protein that is predicted to show antibacterial activity against S. aureus pathogen by chromatographic methods. Before the design of the chromatographic purification of the studied transmembrane protein, data such as disulfide bond potential, frequency of presence of hydrophobic amino acids, chain length and molecular weight were evaluated in order to maximize the purification efficiency. Since the target recombinant protein has histidine and GST tags, affinity chromatography was first performed with HisTrap™ FF and GSTrap™ columns. Afterwards, a purification method was tried to be established in the light of the principle of increasing hydrophobicity in the salt environment with the HiTrap™ Butyl HP column by utilizing the hydrophobic property of the protein. Finally, by calculating the theoretical isoelectric point of the relevant recombinant protein, ion exchange chromatography with HiScreen™ Capto DEAE column was performed under the increasing ionic load condition with different gradient types. Although high purity protein purification could not be achieved by affinity chromatography and hydrophobic interaction chromatography methods, significantly pure fractions were obtained by ion exchange chromatography. The structure of the target recombinant protein was confirmed by performing characterization analyzes such as SDS-PAGE, Western blot and MALDI TOF mass spectroscopy of the pure fractions obtained.
The effects of different types of chromatography on the purification strategy of the target recombinant protein were investigated, and the production of high-purity antibacterial transmembrane protein in areas where bacterial contamination is frequently encountered such as health, food, agriculture and cosmetics was discussed.