Biyofiziksel çalışmalar için DsRed (mCherry) floresan proteinin Escherichia coli'de üretilmesi
Expression of DsRed (mCherry) fluorescence protein in Escherichia coli for biophysical studies
Yazar: BAHADIR ATAMAN
Danışman: PROF. DR. İSA GÖKÇE
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Bakteri proteinleri = Bacterial proteins ; Genetik-biyokimyasal = Genetics-biochemical ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production

Özet:
Yeni bir biyoteknolojik çalışma alanı olarak görülen floresan proteinlerin keşif ve uygulama serüveni on yıllar öncesine dayanmaktadır. İlk keşfedilen ve ilk defa ekspresyonu yapılan floresan protein olan Yeşil Floresan Protein 'den (GFP) sonra birçok floresan protein bulunmuş ve üretimi yapılmıştır. Birçok araştırma sahasında geniş bir kullanım alanı olan floresan proteinlerin yeni keşfedilenlerinden birisi de Kırmızı Floresan Proteindir (RFP). Bu çalışmamızda daha ileri çalışmalarda kullanmak üzere Kırmızı Floresan Proteinin (RFP) bir varyantı olan DsRed (mCherry) floresan proteininin uygun bir vektör sistemi kullanılarak Escherichia coli ekspresyon sisteminde üretimi hedeflenmiştir. Çalışmamızda ilk olarak mCherry proteinini kodlayan gen biyoinformatik çalışmalar ile tespit edilerek ticari olarak sentezlettirilmiştir. Bir vektör içerisinde gelen gen, farklı restriksiyon enzimleriyle kesilerek izole edilmiş ve sonrasında ligasyon ile oluşturulan pET28mCherry vektörü kullanılarak E coli DH5α hücreleri transformasyona uğratılmıştır. Rekombinant plazmitlerin doğrulama kesimleri yapıldıktan sonra mCherry proteininin sentezlenebilmesi için E. coli BL21 pLysE kompetent hücreleri transformasyona uğratılmıştır. Son olarak da expresyonu gerçekleştirilen mCherry proteini E. coli hücrelerinden afinite kolon kromotografisi kullanılarak saflaştırılmıştır.

Abstract:
The discovery and application adventure of fluorescent proteins as a new biotechnological research field goes back decades. After the Green Fluorescent Protein (GFP), which was the first discovered and expressed, a lot of different colour fluorescent proteins has also been found and produced. Red Fluorescent Protein (RFP) which is one of the recently discovered fluorescent proteins that has a very wide usage in research. The aim of this study that producing DsRed (mCherry) fluorescent protein, which is a variant of Red Fluorescent Protein (RFP) in Escherichia coli expression system using a suitable vector for further investigation.

In this research, the gene encoding for mCherry fluorescent protein was first modified by bioinformatical tools and then commercially synthesized. The mCherry gene that arrived in a plasmid vector was first isolated by cutting with different restriction enzymes and E. coli DH5α cells were transformed using ligated pET28mCherry vector. The confirmation of the recombinant mCherry plasmids have been made by restriction enzyme digestion. E. coli BL21 pLysE competent cells was transformed using pET28mCherry vector for mCherry protein production. Finally, the expressed mCherry protein was purified from the E. coli cells using affinity column chromatography.