Uvabain aracılıklı hücresel cevaplarda rho-kinaz enziminin olası rolünün proteomik yöntemlerle incelenmesi
Analysing of possible involvement of rho-kinase in ouabain mediated cellular responses by proteomics method
Yazar: EMRAH BAYRAM
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA ARK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Elektroforez-jel-iki boyutlu = Electrophoresis-gel-two dimensional ; Ouabain = Ouabain

Özet:
Bir integral membran proteini olan Na+/K+-ATPaz, hücrelerdeki iyonik dengenin sağlanmasında rol oynamaktadır. Kardiyak glikozitlerden uvabain ise, bu iyon pompasının spesifik inhibitörüdür. Hücreler uzun süre uvabaine maruz bırakıldıklarında apoptotik hücre ölümleri gözlemlenmiştir. Ama bu mekanizmanın nasıl olduğu tam olarak aydınlatılamamıştır. Rho-kinazlar (rho-kinaz 1 ve rho-kinaz 2), küçük G proteinleri içerisinde en çok araştırılan efektörlerden biridir. Apoptozisdeki birçok biyokimyasal ve morfolojik olayda görev almaktadırlar. Bu çalışmada uvabain ile indüklenmiş apoptotik hücre ölümlerinde, rho-kinazın olası rolünü proteomik yaklaşımlar kullanarak değerlendirdik.İnsan umbilikal ven endotel hücreleri, spesifik rho-kinaz inhibitörü Y27632 varlığı veya yokluğu durumunda 16 saat süreyle uvabaine (10µM) maruz bırakılmıştır. Hücre homojenatları, 2-D jel elektroforezi ile ayrılmış ve coomassie blue ile boyanmıştır. Uvabain uygulaması sonucunda, 54 spotun değiştiği tespit edilmiştir. Uvabain + Y27632 uygulamasında değiştiği gözlenmiş olan 7 protein, MALDI-TOF MS yöntemi ile tanımlanmak üzere seçilmiştir. Caspase-7 ve protein-unc-119 homolog B proteinlerinin miktarları uvabain uygulaması ile artmış, Y27632 ön uygulaması ile azalmıştır. Buna ek olarak neurensin-2, C-type lectin domain family-2 member D ve putative FERM domain-containing protein FKSG-43 proteinleri uvabain uygulaması ile azalmış ve Y27632 uygulaması ile artmıştır.Bu sonuçlar, bu proteinlerin ekspresyonlarındaki değişiklikler üzerinde rho-kinaz yolağının önemini göstermektedir. Bununla birlikte sonuçlarımızın doğrulanması ve bu proteinlerin öneminin belirlenmesi için daha başka çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Na+/K+-ATPase is an integral membrane protein that maintains ionic balance in the cells. Ouabain, a cardiac glycoside, is a specific inhibitor of the pump. It has been shown that prolonged exposure to cells to ouabain results in an apoptotic cell death. However the exact mechanism of this effect was not completely understood. Rho kinases (Rho kinase-1 and Rho kinase-2), one of the most studied effectors of small G protein Rho, involve in several biochemical and morphological events in apoptosis. In the current work, we evaluated possible involvement of rho kinase in the ouabain-induced apoptotic cell death using a proteomic approach.Human umbilical vein endothelial cells were exposed to ouabain (10 µM) for 16 hours in the presence and absence of the specific rho kinase inhibitor Y-27632. Cell homogenates were separated by 2D gel electrophoresis and stained with coomassie blue. It was detected that 54 spots were changed with the ouabain treatment. Seven spots, changed with ouabain plus Y-27632 treatment, were excised and subjected to MALDI-TOF MS to indentify the proteins of interest. Caspase-7 and protein unc-119 homolog B proteins, increased with the ouabain treatment, were decreased by the pretreatment with Y-27632. In addition, neurensin-2, C-type lectin domain family-2 member D and putative FERM domain-containing protein FKSG43 proteins decreased with ouabain treatment, were increased by the pretreatment with Y-27632.These results indicate that rho kinase pathway may involve in the expression changes of these proteins. However, further studies are needed to confirm our results and to determine the importance of these proteins.