Symphytum offıcınale l. süspansiyon hücre kültürü ekstraktının insan fibroblast hücrelerinde (CRL-2076) yaşlanma karşıtı genlerin ekspresyonlarına etkisinin belirlenmesi
Symphytum officinale l. suspension cell culture extract on expression of anti-aging related genes on human fibroblast cells (CRL-2076)
Yazar: AYŞENUR ÇALLI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞENAY VURAL KORKUT
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Fibroblastlar = Fibroblasts ; Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) = Reverse transcription polimerase chain reaction ; Süspansiyon kültürü = Suspension culture ; Özüt = Extract

Özet:
Cilt yaşlanması kolajen, elastin ve hyaluronik asit sentezinin azalması ve dermal kolajen ve elastin yapılarının bozulmasıyla karakterize edilen biyolojik bir süreçtir. Bu çalışmada Symphytum officinale L. (Karakafes otu) hücre süspansiyon kültürlerinden elde edilen ekstraktın yaşlanma karşıtı aktivitesinin belirlenmesi için insan normal fibroblast hücrelerinde (CRL-2076) yaşlanma karşıtı aktivite ile ilişkili genlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişikliklerin belirlenmesi amaçlanmıştır. 
Bu amaçla karakafes otu bitkisi yaprakları kullanılarak in vitro ortamda uygun bitki büyüme düzenleyicileri ile fideler elde edilmiştir. In vitro ortamda büyütülen fidelerin yaprak eksplantları yaralanarak kallus kültürleri oluşturulmuş, kırılgan kalluslar kullanılarak süspansiyon kültürleri elde edilmiştir. Karakafes otu hücre süspansiyon kültüründen (KOHSK) elde edilen ekstraktta toplam fenolik içerik Folin Ciocalteu yöntemiyle, antioksidan aktivite DPPH metodu ile belirlenmiştir. KOHSK ekstraktının in vitro sitotoksitesi CRL-2076 hücreleri üzerinde MTT deneyi ile değerlendirilmiştir. KOHSK ekstraktının CRL-2076 hücreleri üzerinde yaşlanma karşıtı aktivitesinin belirlenmesi için Kolajen tip 1 alfa 1 (COL1A1), elastin (ELN) ve hyaluronan sentaz 3 (HAS3) genlerinin gen anlatımına etkisi RT-qPCR ile analiz edilmiştir. 
Yapılan çalışmalar sonucunda KOHSK liyofilizatları ile hazırlanan ekstraktlarda %70 etanol ekstraktının 1181 µM gallik asit eşdeğeri ile en yüksek toplam fenolik içeriğe sahip olduğu sonucuna ulaşılmıştır. KOHSK ekstraktının yarılanma konsantrasyonu (IC50 değeri) DPPH deneyi ile 83 µg/ml olarak belirlenmiştir. Yapılan RT-qPCR çalışmasında 100 µg/ml KOHSK ekstraktı uygulanan CRL-2076 hücrelerinde kontrol grubuna kıyasla COL1A1 geninin ifadesinin 1,2 kat, ELN geninin ifadesinin 1,4 kat ve HAS3 geninin ifadesinin 1,4 kat oranında arttığı belirlenmiştir. 200 µg/ml KOHSK ekstraktı uygulanan CRL-2076 hücrelerinde ise COL1A1 geninin ifadesinin 1,3 kat, ELN geninin ifadesinin 2,7 kat ve HAS3 geninin ifadesinin 1,7 kat oranında arttığı sonucuna ulaşılmıştır. 
Bu tez çalışmasında elde edilen veriler değerlendirildiğinde KOHSK ekstraktının yaşlanma karşıtı aktivite gösterme potansiyeline sahip olduğu ve yaşlanma karşıtı etken hammadde olarak kullanılabileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
Skin aging is a biological process characterized by decreased synthesis of collagen, elastin, and hyaluronic acid and degradation of dermal collagen and elastin structures. This study, it was aimed to determine the changes in the expression levels of genes associated with antiaging activity in human normal fibroblast cells (CRL-2076) to determine the antiaging activity of the extract obtained from Symphytum officinale L. (Comfrey) cell suspension cultures.
For this purpose, seedlings were obtained with suitable plant growth regulators in vitro by using comfrey plant leaves. Callus cultures were created by wounding leaf explants of seedlings grown in vitro, suspension cultures were obtained using friable callus. Total phenolic content in the extract obtained from comfrey cell suspension culture (CCSC) was determined by Folin Ciocalteu method and antioxidant activity was determined by DPPH method. In vitro cytotoxicity of CCSC extract was evaluated by MTT assay on CRL-2076 cells. To determine the anti-aging activity of CCSC extract on CRL-2076 cells, the effects of collagen type 1 alpha 1 (COL1A1), elastin (ELN), and hyaluronan synthase 3 (HAS3) genes on gene expression were analyzed by RT-qPCR.
As a result of the studies, it was concluded that the 70% ethanol extract has the highest total phenolic content with 1181 µM gallic acid equivalent in the extracts prepared with CCSC lyophilisates. The half-life concentration (IC50 value) of the CCSC extract was determined as 83 µg/ml by DPPH experiment. In the RT-qPCR study, it was determined that the expression of the COL1A1 gene increased by 1.2-fold, the expression of the ELN gene by 1.4-fold and the expression of the HAS3 gene by 1.4-fold, compared to the control group, in CRL-2076 cells treated with 100 µg/ml CCSC extract. It was concluded that the expression of the COL1A1 gene increased by 1.3-fold, the expression of the ELN gene increased by 2.7-fold and the expression of the HAS3 gene increased by 1.7-fold in the CRL-2076 cells treated with 200 µg/ml CCSC extract.
When the data obtained in this thesis study were evaluated, it was concluded that the CCSC extract has the potential to show anti-aging activity and can be used as an anti-aging raw material.