Akut lösemilerin yüzeyde zenginleştirilmiş raman spektrometresi ile incelenmesi
Investigation of acute leukemias via surface enhanced raman spectrometer
Yazar: FATİH ÖKTEM
Danışman: DOÇ. DR. MUZAFFER KEKLİK
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Algoritmalar = Algorithms ; Lösemi = Leukemia ; Makine öğrenmesi = Machine learning ; Raman spektroskopisi = Raman spectroscopy ; Spektrometri = Spectrometry

Özet:
Giriş ve Amaç: Akut lösemiler, lökositlerin kemik iliği erken gelişim süreçlerinde kontrolsüz çoğalması sonucu immatür hematopoetik hücrelerin hem kemik iliğini işgal ederek normal kan hücrelerinin değişimini ve gelişimini engellemesi hem de kemik iliği ve periferik dolaşımda sağlıklı kan hücrelerinin yerini alması sonucu ortaya çıkan hastalıklardır. Başlangıcı ani olup, tedavi edilmeyen hastaların kısa sürede kaybedildiği bu hastalık grubunun kesin tanısı, periferik kan ve kemik iliğinden alınan örneklerin morfolojik, immunfenotipik ve sitogenetik incelemesi neticesinde konulur. Oldukça zaman ve efor gerektiren ayrıca bir hayli maliyetli olan bu tanı yöntemlerinin söz konusu dezavantajlarını giderebilecek basit, hızlı, güvenilir sonuçlar verebilen ve az miktarda kan örneği ile analiz gerçekleştirebilen yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu amaca yönelik olarak planlanan çalışmamızda, akut lösemi tanısında yüzeyde zenginleştirilmiş Raman saçılması (YZRS) yönteminin kullanılabilirliğinin araştırılması planlanmıştır.
Hastalar ve Metod: Bu ileri dönük tek merkezli çalışmada, Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji kliniğinde Nisan 2022-Aralık 2022 tarihleri arasında akut lösemi tanısı konulan hastalardan ve sağlıklı gönüllülerden alınan serum örneklerinden YZRS kullanılarak akut lösemilerin tanımlanması planlanmıştır. Bu analiz için; söz konusu bireylerden 4-5 ml kan örneği alınıp, 3000 rpm'de 5 dakika santrifüj edildikten sonra serum kısmı eppendorf tüplere aktarılarak -80°C'de kullanana kadar saklanmıştır. Elde edilen serum örneklerinin YZRS spektrumlarını toplamak için hazırlanan gümüş nanopartikül (AgNP) bazlı YZRS aktif yüzey üzerinde plazma örnekleri incelenmiştir. Serum örneklerinden 400-1800 cm-1 aralığında spektrumlar toplanmıştır. Toplanan spektrumlara data ön işleme adımları uygulanarak standardizasyon yapılmıştır. Standardize edilen spektrumları sınıflandırmak için klasik makine öğrenmesi algoritmaları kullanılmıştır.
Bulgular: Çalışma grubunu 20 (%36,4) kadın, 35 (%63,6) erkek olmak üzere 55 hasta ile 13 (%54,2) kadın, 11 (%45,8) erkek olmak üzere 24 sağlıklı gönüllü oluşturmuştur. Hasta grubundan akut miyeloid lösemi (AML) tanısı alanların 22'si (%40) yeni tanı, 21'i (%38,2) nüks AML olarak saptanmıştır. Akut lenfoblastik lösemi (ALL) grubunda ise 7 (%12,7) yeni tanı, 5 (%9,1) nüks ALL olgusu saptanmıştır. Sağlıklı, AML ve ALL grupları için 496, 532, 590, 639, 726, 812, 885, 1004, 1135 ve 1201 cm-1'deki Raman kaymaları ortaktır. 765, 1096, 1275, 1369, 1393 ve 1441 cm-1'deki Raman kaymaları ağırlıklı olarak sağlıklı grubunda gözlenmiştir. 1073 ve 1254 cm-1'deki Raman kaymaları AML ve ALL gruplarında gözlenirken sağlıklı grupta saptanmamıştır. AML ve ALL serum spektrumlarına baktığımızda tirozin ve adeninle ilişkilendirilen 639 ve 726 cm-1'deki kaymalarda benzer yoğunluklar olmakla birlikte 639 cm-1'deki kayma AML'de daha yoğun iken 726 cm-1'deki kayma ALL grubunda daha yoğundur. Nüks AML grubundan elde edilen spektrumlarda tirozinden kaynaklanan 960 cm-1'deki kayma yeni tanı AML grubuna göre daha yoğun olarak tespit edilmiştir. Benzer spektral profiller daha yoğun şekilde yeni tanı ALL ile nüks ALL grubunda da görülmüştür. Diğer taraftan, AML, ALL ve sağlıklı serum spektrumlarına uygulanan Hiyerarşik Kümeleme Analizi (HKA) sonucu elde edilen dendrogram grafiğinde gruplarda ayrı kümeler oluştuğu görülmüştür. AML, ALL ve sağlıklı serum spektrumları en iyi Rastgele Orman (RO) algoritması ile sınıflandırılmıştır. AML ve ALL hastaları içerisinde yeni tanı ve nüksü sınıflandırmada en iyi performansı RO algoritması göstermiştir. 
Sonuç: Çalışma sonunda YZRS ile akut lösemi tanısı ve hatta yeni tanı ile nüks lösemi ayırıcı tanısında potansiyel olarak yararlı ve güçlü bir klinik araç olduğu tespit edilmiştir. Yanı sıra, lösemik hücreleri aynı soydan gelen normal hücrelerden ayırt etmek için makine öğrenmesi ile RO, KYEK (k en yakın komşular) algoritmalarının yüksek doğruluk oranları ile kullanılabilirliği de gösterilmiştir.
Anahtar kelimeler: Akut Lösemi, Yüzeyde Zenginleştirilmiş Raman Spektroskopisi, Makine Öğrenmesi

Abstract:
Aim: Acute leukemias (AL) are diseases that occur as a result of the uncontrolled proliferation of immature hematopoietic cells in the early development processes of the bone marrow of leukocytes. Morphological, immunophenotypic, and cytogenetic methods are used for AL diagnosis from samples taken from peripheral blood and bone marrow. However, the current diagnostic methods have some drawbacks such as time consumption, high-cost reagent, and complex sample preparation steps. Therefore, there is a need for methods that can provide simple, rapid, reliable results and perform analysis with a small amount of blood sample. In our study, Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) was used to investigate its usability in the diagnosis of acute leukemia.
Materials and Methods: In this study, acute leukemias were identified using SERS from serum samples taken from patients diagnosed with acute leukemia and healthy volunteers between April 2022 and December 2022 in the Hematology Clinic of Erciyes University Faculty of Medicine. To achieve this, 4-5 mL of blood samples were taken from volunteers, centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes, and then serum was transferred to Eppendorf tubes and stored at -80°C until using. Serum samples were mixed with silver nanoparticle (AgNP)-based SERS substrate to collect the SERS spectra. The spectra were collected in the range of 400-1800 cm-1. Standardization was carried out by applying data preprocessing steps to the collected spectra. Then, traditional machine learning algorithms were used to classify the standardized spectra.
Results: The blood samples were acquired from 55 patients, 20 (36.4%) women and 35 (63.6%) men, and 24 healthy volunteers, 13 (54.2%) women and 11 (45.8%) men. The patient samples were diagnosed with acute myeloid leukemia (AML), 22 (40%) were newly diagnosed and 21 (38.2%) were recurrent AML, and with acute lymphoblastic leukemia (ALL), 7 (12.7%) were newly diagnosed and 5 (9.1%) were recurrent ALL. Raman shifts at 496, 532, 590, 639, 726, 812, 885, 1004, 1135, and 1201 cm-1 are common for the healthy, AML, and ALL groups. Whereas Raman shifts at 765, 960, 1096, 1275, 1369, 1393, and 1441 cm-1 were observed only in the healthy group. Furthermore, Raman shifts at 1073 and 1254 cm-1 were observed in the AML and ALL groups; but not in the healthy group. When the AML and ALL serum spectra were examined, it was observed that there was a differentiation in the shifts at 639 and 726 cm-1. The intensity of these shifts is associated with tyrosine and adenine. In the spectra obtained from the recurrent AML group, the shift at 960 cm-1 caused by tyrosine was detected more intensely than in the newly diagnosed AML group.
Similar spectral profiles were seen more intensely in the newly diagnosed ALL and recurrence ALL group. On the other hand, in the dendrogram graph obtained as a result of Hierarchical Clustering Analysis (HCA) applied to AML, ALL, and healthy serum spectra, it was observed that separate clusters were formed in the groups. It shows that AML, ALL, and healthy serum spectra are best classified by the Random Forest (RF) algorithm. The RF algorithm showed the best performance in classifying new diagnoses and recurrence among AML and ALL patients.
Conclusion: As a result of the study, it has been determined that SERS is a potentially useful and powerful clinical tool in the diagnosis of acute leukemia and even in the differential diagnosis of recurrent leukemia with a new diagnosis.
In addition, the ability of machine learning in acute leukemia identification was demonstrated. Random forest and k-nearest neighbor algorithms could distinguish leukemic cells from normal cognate cells with high accuracy.
Key Words: Acute Leukemia, Surface-enhanced Raman spectroscopy, Machine Learning