Mesane kanserinde kukurbitasin B ve sisplatin'in anti-proliferatif etkilerinin hücre ölüm yolaklarında araştırılması
Investigation of anti-proliferative effects of cucurbitacin B and cisplatin on the cell death pathways in bladder cancer
Yazar: YENER KURMAN
Danışman: PROF. DR. ECE KONAÇ
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Cucurbitacin = Cucurbitacin ; Fareler = Mice ; Hücre çoğalması = Cell proliferation ; Mesane hastalıkları = Urinary bladder diseases ; Mesane neoplazmları = Urinary bladder neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Otofaji = Autophagy ; Sisplatin = Cisplatin

Özet:
Mesane kanseri, dünya çapında kanser ölümlerinin önemli bir kısmından sorumlu olan bir malignitedir. Sisplatin (Sis) bazlı kemoterapi, mesane kanseri hastaları için standart tedavi rejimidir, ancak etkinliği yüksek toksisite ve ilaç direncinin gelişmesi ile sınırlıdır. Birçok çalışmada Kukurbitasin B (KuB)'nin apoptoz ve otofajiyi uyararak anti-kanserojen etkiler gösterdiği bildirilmiştir. Bu tez çalışmasında KuB'nin MB49 mesane singeneik fare tümör modeli üzerindeki potansiyel rolü araştırılmıştır. MB49 hücre hattına KuB ve sisplatinin tekli ve kombine dozları uygulanarak hücre canlılığı WST-1 yöntemi ile ölçülmüştür. Tümör modeli oluşturulduktan sonra, fareler dört gruba ayrılarak belirtilen doz ve sürelerde KuB ve sisplatin uygulanmıştır. Apoptoz (Bcl-2, Bax, Kaspaz-3, bölünmüş Kaspaz-3) ve otofaji proteinlerinin (Beklin-1 ve LC3I, LC3II) ifade seviyeleri Western Blot yöntemi ile tespit edilmiştir. PI3K-Akt sinyal yolu ile ilişkili proteinlerin göreceli fosforilasyon seviyelerini belirlemek için fosfo-protein array analizi yapılmıştır. Ajan uygulamaları sonrası tümör dokuları ve organlar, hematoksilen-eozin boyanarak analiz edilmiştir. Bulgularımız, KuB'nin, Bcl-2 ifadesini inhibe ettiğini; Bax ve bölünmüş kaspaz 3'ün ifadelerini arttırdığını göstermiştir. LC3II miktarı, KuB ile tedavi edilen hücrelerde belirgin şekilde artmıştır. KuB; p27, PRAS40 ve Raf-1 proteinlerinin fosforilasyonunu azaltmıştır. KuB ve Sis kombinasyonu sinerjik olarak AKT, ERK1/ERK2, mTOR, BAD proteinlerinin fosforilasyonunu azaltırken, AMPKα fosforilasyonunu artırmıştır. PI3K/AKT/mTOR, KuB'nin hedeflerinden olan bir sinyal yolağı olarak bulunmuştur. KuB ve Sis kombinasyonu tümör gelişimini önemli ölçüde azaltmış ve aynı zamanda akciğer, karaciğer, böbrek, kalp ve mesane üzerinde toksik etki göstermemiştir. Sonuçlarımız, KuB'nin mesane kanserinde geleneksel tedaviyi destekleyebilen yeni bir ajan olabileceğini göstermektedir. Çalışmamız mesane kanseri tedavisinde yeni yolların aydınlatılması ve yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından önemlidir.

Abstract:
Bladder cancer is a malignancy that is responsible for a significant proportion of cancer deaths around the world. Cisplatin (Cis)-based chemotherapy is the standard regimen for bladder cancer patients, but its effectiveness is limited by high toxicity and the development of drug resistance. It has been reported in many studies that Cucurbitacin B (CuB) has anti-carcinogenic effects by stimulating apoptosis and autophagy. Here we explored the potential role of CuB on MB49 bladder syngeneic mouse tumor model. Single and combined doses of CuB and Cis were applied to MB49 cell line and the cell viability was determined by WST-1 method. After the tumor model was established, the mice were divided into four groups and administered CuB and cis at the indicated doses and times.The expression levels of apoptosis (Bcl-2, Bax, Caspase-3, cleaved Caspase-3) and autophagy proteins (Beclin-1 and LC3I, LC3II) were detected by Western Blot. Phospho-protein array analysis was performed to determine the relative levels of phosphorylation of proteins which are associated with the PI3K-Akt signaling pathway. After agent applications, tumor tissues and organs were analyzed by staining hematoxylin-eosin. Our findings showed that CuB inhibits Bcl-2 expression and increases the expression of Bax and cleaved caspase 3. LC3II is markedly up-regulated in CuB-treated cells. CuB reduced the phosphorylation of p27, PRAS40, and Raf-1 proteins. CuB and Cis combination synergistically decreased phosphorylation of AKT, ERK1/ERK2, mTOR, BAD levels and increased the level of AMPKα. PI3K/AKT/mTOR has been found to be a signaling pathway that is one of the targets of CuB. The combination of CuB and Cis significantly reduced tumor growth and also had no toxic effects on the lung, liver, kidney, heart and bladder. Our results show that CuB may be a new agent that can support traditional treatment for bladder cancer. Our study is important in enlightening new ways in the treatment of bladder cancer and developing new treatment methods.