HT-29 hücre hattında epigallokateşin gallat ve 5- florouracil (5-FU)'nun notch sinyal yolağı reseptörleri, transkripsiyon faktörleri, kaspaz3/7 üzerine etkisi
Effect of epigallocatechin gallate and 5-fluorouracil (5-FU) on notch signaling pathway receptors, transcription factors, caspase3/7 in HT-29 cell line
Yazar: IŞILSU ÇAĞLAR
Danışman: PROF. DR. YUNUS KASIM TERZİ ; DOÇ. ÖZGE KAHRAMAN ILIKKAN
Başkent Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antikanser = Anticancer ; DNA mutasyon analizi = DNA mutational analysis ; Dizi analizi-RNA = Sequence analysis-RNA ; Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) = Reverse transcription polimerase chain reaction ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; PCR =   ; RNA = RNA ; RNA-haberci = RNA-messenger ; Somatik mutasyon = Somatic mutation ; Tıbbi onkoloji = Medical oncology

Özet:
Epigallokateşin gallat  (EGCG) ve 5-florourasil (5-FU) maddelerinin kemoduyarlılığı arttırdığı bilinmektedir. Son çalışmalarda epigallokateşin gallat (EGCG) ile eş zamanlı tedaviye bağlı olarak kolorektal kanser hücrelerinin 5-florourasil (5-FU) ile duyarlılığında bir artış olduğu bulunmuş ve HT29 hücreleri 5-FU, EGCG ve eşmolar bir karışım ile tedavi edilmiştir.
İki maddenin kullanımı ile hücre canlılığı belirlenmiş olup, 5-FU net bir aktivite sergilerken, EGCG tek başına herhangi bir aktivite göstermemiştir. Ancak hücrelere 5-FU ve EGCG'nin birlikte verilmesiyle EGCG'nin güçlü bir etkisi kanıtlanmıştır. Daha önce EGCG'nin NOTCH sinyal yolağına etkisi HT-29 hücrelerinde NOTCH 1,2,3 üzerinde gösterilmiş fakat NOTCH 4, HES/HEY, kaspazlar ve SOX9 üzerinde gösterilmemiştir. HES1 ve SOX9'un kolorektal kanser tedavisinde yeni bir terapötik olabileceği düşünülmektedir. Kolon kanseri üzerinde SOX9 ekspresyonunu değerlendiren çalışma bulunmaktadır. İn vitro deneyler, artan SOX9 ekspresyonunun tümörijenezde önemli bir rol oynadığını göstermektedir.  Kolon kanserindeki SOX9'un moleküler mekanizmalarını daha iyi anlamak için daha fazla deneysel çalışmanın ele alınması gerektiği de ayrıca belirtilmiştir. Kaspaz-3/7 sitotoksik ilaçlara, radyoterapiye veya hücresel maruziyet sırasında aktive olan apoptozun ana aracısıdır. Genellikle kanser tedavisinin etkinliği için bir belirteç olarak kullanılır. Bu nedenle, kaspaz-3/7'nin tümör progresyonundaki rolü net olarak tanımlanmamıştır. Çalışmada hücrelere tek başına EGCG ve 5-FU uygulamalarının yanı sıra 100 µM veya 200 µM EGCG eklenerek kombinasyonları da hücrelere uygulandı. EGCG, HT-29 hücreleri üzerinde 5-FU'nun direncini tersine çevirmiştir.
EGCG ve 5-FU kombinasyonunun, Notch sinyal reseptörlerinin mRNA seviyelerini azalttığı gözlenmiştir. Bu çalışmada Notch3 de incelenmiş ve tek başına EGCG uygulamasının reseptör ifadelenmesini inhibe ettiği ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, 100 µM EGCG, 5-FU ile birlikte uygulandığında, gen ekspresyonu yalnızca 72 saatlik muameleden sonra inhibe edilirken, 200 µM EGCG, 5-FU ile birlikte uygulandığında, gen ifadelenmesinin 72 saat sonra arttığı gözlenmiştir. Bu durum Notch3 için doza bağımlı bilinmeyen bir mekanizmanın ortaya çıkmasıyla açıklanabilir.
Transkripsiyon faktörlerinin ifadelenme durumu incelendiğinde ise, mevcut araştırmada çalışılan diğer gen ifadelenmelerine paralel olarak 100 µM EGCG'nin 5-FU ile kombinasyonunun genel olarak transkripsiyon faktörlerinin ifadelenmesini azalttığı gözlenmiştir. Epigallokateşin gallat ve 5-Florourasil'in birlikte kullanımı, HT-29 hücre hattında yeni bir terapötik hedef olarak NOTCH1, SOX9 ve HES1 ifadelenmesini azaltmıştır. Bu çalışma, belirlenen hedef genlerin yeni terapötik yaklaşımlarda kullanımına yönelik hızlı bir tarama yapılmasını sağlayacaktır.

Abstract:
Epigallocatechin gallate (EGCG) and 5-fluorouracil (5-FU) increase chemosensitivity. Recent studies have shown that cotreatment with epigallocatechin gallate (EGCG) increases the sensitivity of colorectal cancer cells to 5-fluorouracil (5-FU), and HT29 cells were treated with a mixture of 5-FU, EGCG, and equimolar EGCG.
We determined the cell viability by using both substances, and 5-FU showed an apparent efficacy, while EGCG alone did not show any effectiveness. However, EGCG showed a strong effect when cells were treated with 5-FU and EGCG. Previously, the result of EGCG on the NOTCH pathway was shown on NOTCH 1,2,3 but not on NOTCH 4, HES/HEY, caspases, and SOX9 in HT-29 cells. HES1 and SOX9 may be novel therapeutic targets in the treatment of colorectal cancer. There are studies evaluating SOX9 expression in colorectal cancer. In vitro experiments suggest that increased SOX9 expression is vital in tumorigenesis.  It is also noted that more experimental data are needed to decipher the molecular mechanisms of SOX9 in colon cancer. Caspase-3/7 is the primary mediator of apoptosis activated by cytotoxic drugs, radiotherapy, or cellular exposure. It is often used as a marker for the efficacy of cancer treatment. Therefore, the role of caspase-3/7 in tumor progression remains to be clearly defined.
It was observed that the combination of EGCG and 5-Fu decreased the mRNA levels of Notch signaling receptors. In this study, Notch3 was also examined, showing that EGCG administration alone inhibited receptor activity. However, when 100 µM EGCG was co-administered with 5-Fu, gene expression was inhibited only after 72 hours of treatment. In contrast, when 200 µM EGCG was co-administered with 5-FU, gene expression was increased after 72 hours. The emergence of an unknown dose-dependent mechanism for Notch3 may explain this.
When the expression status of transcription factors was examined, it was observed that combining 100 µM EGCG with 5-FU generally decreased the expression of transcription factors in parallel with other gene expressions studied in the present study. Co-administration of epigallocatechin gallate and 5-Fluorouracil reduced the expression of Notch1, Sox9, and Hes1 as novel therapeutic targets in the HT-29 cell line.
This study will allow rapid screening for the use of identified target genes in novel therapeutic approaches.