Ürik asit tayini için yeni bir biyosensör geliştirilmesi
The development of a new biosensor for the determination of uric acid
Yazar: ESRA AKYÜZ
Danışman: PROF. DR. AYTEN SAĞIROĞLU
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Lactobacillus casei = Lactobacillus casei

Özet:
Günümüzde ürik asit tayininde çeşitli kolorimetrik, polarografik, kromatografik, spektrofotometrik yöntemler kullanılmaktadır. Ancak bunlar genel olarak özel ekipman ve uzman gerektiren zaman alıcı ve pahalı sistemlerdir.Biyosensörler; enzim, hücre ve doku gibi biyolojik unsurların uygun bir iletim sistemiyle birleştirilmesi ile oluşan biyoanalitik cihazlardır. Biyosensörlerin diğer yöntemlere karşı en önemli avantajı, tayin edilecek maddeler için ekonomik, pratik ve spesifik ölçümlere imkan vermesidir.Saf enzimleri içeren dokuların kullanılmasıyla hazırlanan doku temelli biyosensörler, saf enzimlerin immobilize edilmesiyle hazırlanan biyosensörlerle kıyasladıklarında oldukça ucuz, yüksek kararlılıklı ve yüksek aktiviteli tayin sistemlerini oluşturmaktadır.Bu çalışmada, Lactobacillus casei probiyotik bakterisi doğal enzim kaynağı olarak kullanılarak ürik asit tayini için bakteriyal temelli bir biyosensör hazırlandı. L. casei bakterisinin liyofilize formu ile hazırlanan biyosensörün optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirildi. Çalışmalarda ana substrat olarak ürik asit kullanıldı. İlk önce biyosensörün biyoaktif tabaka bileşenlerini oluşturan bakteri miktarı, jelatin ve glutaraldehid miktarlarının biyosensör cevapları üzerine etkisi incelendi. Sırasıyla bakteri, 10 mg, jelatin ve glutaraldehid miktarları 10 mg ve % 0,5 olarak tayin edildi.Biyosensörün karakterizasyon çalışmalarında, belirlenen optimum biyoaktif tabaka bileşen miktarları kullanılarak hazırlanan biyosensör ile ürik asit tayini için lineer konsantrasyon aralık sınırları 10 ? 40 mM olarak belirlendi.Deney koşullarının optimizasyonu için; hazırlanan biyosensörün, lineer cevapları üzerine tampon pH'ı, tampon konsantrasyonu ve sıcaklık değişimlerinin etkileri incelendi. Kullanılan fosfat tamponu için biyosensörün optimum pH 8.0, tampon konsantrasyonu 150 mM ve optimum sıcaklığı 40 º C olarak belirlendi.Biyosensörün karakterizasyon testlerine geçildiğinde; ölçümlerin tekrarlanabilirliğinin belirlenmesinde; her defasında 10 mM ürik asit kullanılarak hazırlanan biyosensör ile optimum koşullarda arka arkaya 7 ölçüm alındı. Ölçümlerde Xort = 10,022 mM karşılık, standart sapma (S.D.) ± 0,045, varyasyon katsayısı (C.V.) % 4,39 olarak belirlendi. Bu değerler hazırlanan biyosensörün, ürik asit tayini için kararlı ve uygun bir sistem olduğunu gösterdi.Geliştirilen biyosensörün depo kararlılığı optimum koşullarda; 22 gün boyunca belirli aralıklarla alınan ölçümlerde ilk 10 gün, aktivite % 100 korundu. 18. günde biyosensörün başlangıç aktivitesinin % 80'sini koruduğu gözlendi. 19 günden sonra, biyosensör hızlı bir şekilde aktivitesini kaybettiği gözlendi.Optimum koşulları belirlenen, karakterizasyon testleri yapılan bakteri esaslı ürik asit biyosensörü kullanılarak; hasta ve sağlıklı kişilerin kan ve idrar örneklerindeki ürik asit tayininde uygulanabilirliği incelendi. Yapılan ölçümlere ait standart sapma ve varyasyon katsayıları dikkate alındığında; analizi yapılan bütün örneklerde ürik asit tayini için uygulanabileceği görüldü.Anahtar kelimeler: Biyosensör, ürik asit, Lactobacillus casei, probiyotik bakteri, ürikaz

Abstract:
Nowadays, various colorimetric, polarographic, chromatographic, spectrophotometric methods are used for uric acid determination. However these are in general time consuming and expensive systems which require special equipment and expertise.Biosensors are bio-analytical devices which combine such biological components as enzymes, cells and tissues in an appropriate transmission system. The most important advantage of biosensors against other methods is that it enables economic, practical and specific measurements for substances to be determined.Being prepared by using tissues containing pure enzymes, the tissue based biosensors create considerably cheap determination systems with high stability and high activity compared to the biosensors prepared by immobilizing pure enzymes.In this study, a bacteria-based biosensor has been used as the source of natural enzyme for uric acid determination using L.casei probiotic bacterium. Optimization and characterization studies of bacteria-based biosensor prepared with lyophilized form of L.casei bacterium have been performed. In the studies, uric acid was used as main substrate. Firstly the effect of quantities of bacteria, gelatin and glutaraldehyde which are the components of bioactive layer of the biosensor, on the biosensor responses has been investigated. The quantities have been determined as 10mg, 10mg and 0,5% respectively for bacteria, gelatin and glutaraldehyde.In the characterization studies of the biosensor, the linear concentration range was established 10 ? 40 mM for uric acid determination by the biosensor prepared using the determined bioactive layer component quantities.For the optimization of test conditions, the effects of buffer pH, buffer concentration and temperature changes on the linear responses of the biosensor prepared have been studied and pH has been determined as 8.0, phosphate buffer concentration as 150mM and optimum temperature as 40°C as the optimum values.In the durability tests of biosensor, seven consecutive measurements were taken in determining the repeatability of measurements by using proposed biosensor and each time using 10 mM uric acid. Upon measurements, the followings have been determined; Xort=10,022 mM, standard deviation (S.D.) ± 0,045, coefficient of variation (C.V.) 4,39%. This result demonstrated that the biosensor prepared is a suitable and stable system for uric acid determination.For determination of storage stability of the biosensor developed, measurements were taken at certain intervals during 22 days under optimum conditions. During the first 10 days, activity was maintained at 100%. Then it was observed that biosensor maintained 80% of its initial activity at the 18th day. After the 19th day, biosensor started to lose its activity quickly.Using the bacteria biosensor whose optimum conditions were determined and durability tests were performed, its practicability in determining uric acid in the blood and urine specimens of sick and healthy persons has been studied. In consideration of the standard deviations and coefficients of variation pertaining to the measurements made using the biosensor developed; it has been observed that it could be applied in all specimens subject to uric acid analysis.Key words: Biosensor, uric acid, Lactobacillus casei, probiotic bacteria, uricase.