DNA ile beslenen aç Tetrahymena thermophila hücrelerinde deoksiribonükleaz (DNaz) aktivitesinin gen ifadesi açısından karakterizasyonu
Characterization of deoxyribonuclease (DNase) activity in DNA-fed starved Tetrahymena thermophila cells based on gene expression
Yazar: ERHAN ASLAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
Anadolu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Deoksiribonükleazlar, çift ya da tek iplikli DNA moleküllerini kesen dizi bağımsız enzim grubudur. Bu enzimlerin in vivo da, apoptosis sırasında DNA parçalanması ve yabancı DNA?ların hücre içine girişini önlemek gibi çeşitli biyolojik görevleri vardır. In vitro?da ise RNA ve protein izolasyonu gibi rutin laboratuar çalışmalarında DNA kontaminasyonunu önlemek için DNaz kullanılır. Tek hücreli ökaryotik silli Tetrahymena thermophila, sistem ve moleküler biyoloji çalışmalarında yaygın şekilde kullanılan iyi tanımlanmış, ancak DNaz enzimleri yeterince araştırılmamış bir model organizmadır. Yaşam döngüsü; vejetatif, açlık ve konjugasyon olmak üzere üç evreden oluşmaktadır. Son yıllarda Tetrahymena?nın ökaryotik protein üretim konakçısı olma potansiyelinin artması nedeniyle, DNaz aktivite tanımlamasının yapılması önem arz etmektedir. Çünkü yüksek DNaz aktivitesi bir organizmanın DNA ile transformasyonunu zorlaştıran bir parametredir. Bu tez çalışması kapsamında Tetrahymena genomunda yapılan biyoinformatik taramalarla olası 5 adet DNaz II genlerinin DNaz II?lere özgü katalitik TxDHSKW motifi taşıdığı bulunmuştur. Tetrahymena DNaz II proteinleri ile yapılan filogenetik analizler ise bu grubun yüksek ökaryotların DNaz II?lerine göre atasal karakterler taşıdığını ortaya koymuştur. Deneysel olarak; aç ve vejetatif (tok) Tetrahymena hücrelerinin DNaz aktivite karakterizasyonu toplam protein üzerinden zimogram analizi ile gerçekleştirilmiş ve 28-69 kDa aralığında 5 farklı aktivite bandı belirlenmiştir. Ayrıca maksimum DNaz aktivitesi pH 5.0 civarında görülmüş olup Mg+2 iyonunun pH 7.5?te gözlenen aktivite bantlarını önemli derecede inhibe ettiği bulunmuştur. DNA ile muamele edilmiş aç Tetrahymena hücrelerinde ise zimogram deneyleri, hücre dışına salgılanan 32 kDa?luk bir DNaz aktivite bandında kısmi bir artış meydana geldiğini göstermiştir. Sonuç olarak; gelecekte Tetrahymena?nın ökaryotik rekombinant protein üretim konakçısı olarak yaygın kullanımı, bu çalışma bulguları ile daha kolaylaşmış olacaktır.
Anahtar kelimeler:  Tetrahymena, DNaz aktivitesi, DNaz II, DNA ile muamele.

Abstract:
Deoxyribonucleases (DNases) are a group of enzyme that breaks down the single or double stranded DNA molecules in a non-specific sequence manner. These enzymes have myriad biological functions in vivo for instance DNA fragmentation in apoptosis and being defense barrier for the exogenous DNA uptake. In vitro, during routine laboratory works, it is necessary to use a DNase to prevent DNA contamination in protein and RNA isolations. Tetrahymena thermophila, a unicellular eukaryotic ciliate, is a well-known model organism which is widely used for regulatory, system and molecular biology studies; however, there is no extensive DNase study in this organism. Its life cycle consists of three stages namely, vegetative, starvation and conjugation. Due to the increasing potential of being a eukaryotic protein expression host in recent years, it is found that characterization of DNase activity in Tetrahymena is crucial. So far as, DNase activity is a parameter that makes the transformation of an organism more difficult. In this study, bioinformatics analyses showed that Tetrahymena genome encodes five DNase II genes. All of these proteins possess catalytic TxDHSKW motif, which is specific for DNase II proteins. Phylogenetic analyses also showed that Tetrahymena DNase II proteins have ancestral characteristics comparing to higher eukaryotic DNases. Experimentally, characterization of DNase activity of vegetative and starved cells was performed with agarose and zymogram assays by using whole cell extracts. As a result of zymography, a total of five DNase activity bands, ranging between 28-69 kDa, were identified. Highest DNase activity was obtained at acidic pH (pH 5) and Mg2+ ions inhibit neutral DNase activities significantly. DNA treatment of starved cells partially increased extracellular DNase activity of a 32 kDa protein.  As a result, the findings of this study will help to simplify the usage of Tetrahymena as a eukaryotic recombinant protein expression host.
Key words: Tetrahymena, DNase activity, DNase II, DNA-treatment.