Dopaminerjik nöronal hasarda gsk-3β enzim inhibisyonu ile nrf2/are yolağı arasındaki ilişkinin incelenmesi
The investigation of the relationship between gsk-3β enzyme inhibition and nrf2/are pathway in dopaminergic neuronal injury
Yazar: ELVİN SEVGİLİ
Danışman: DOÇ. DR. GÜLİZ ARMAGAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Nörodejeneratif hastalıklar tüm dünyada pek çok insanı etkileyen sinir sistemi ile ilişkili bir grup hastalıktır. Nörodejenerasyonun temelinde; anormal katlanmış protein agregasyonu, nöronal apoptoz, oksidatif stres, mitokondriyal disfonksiyon, proteozomal veya otofajik disfonksiyonve kronik nöroinflamasyon gibi patolojik mekanizmalar yatmaktadır. Bu hastalıklar arasında en sık karşılaşılan ikisi Alzheimer ve Parkinson Hastalığı'dır. Parkinson Hastalığı'nda motor bulgular, beynin
substantia nigra bölgesindeki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu sonucu ortaya çıkmakta ve dopaminerjik nöron kaybında oksidatif stres başta olmak üzere çeşitli mekanizmalar etkili
olmaktadır. Nrf2 (nükleer NFE2 ilişkili faktör-2), hücresel antioksidan cevabın regülasyonunda anahtar bir transkripsiyon faktörüdür ve bu yolak oksidatif stresi etkisizleştiren majör koruma mekanizması olarak tanımlanmaktadır. Nrf2, inflamasyon ya da hasar sonucu oluşan oksidatif strese karşı antioksidan protein ekspresyonunu düzenler. Oksidatif stresi tetikleyen her türlü patolojik durumda Nrf2'nin sitozolik ve nükleer konsantrasyonunun belirlenmesi ve hem oksijenaz-1 (HO-1), NADPH dehidrogenaz kinon-1 (NQO1), glutamat sistein ligaz katalitik alt birim (GCLC), glutamat sistein ligaz regulatör alt birim (GCLM), glutatyon redüktaz gibi Nrf2 ile ilişkili enzimlerin düzeyindeki değişimin gösterilmesi dokunun antioksidan durumu hakkında bilgi vermektedir. Nrf2'nin, glikojen sentaz kinaz-3β (GSK-3β) enzimi tarafından direkt veya dolaylı (Fyn aracılığı ile) fosforile olduğu ve ubikitin aracılığı ile degredasyona uğradığı bilinmektedir. GSK-3β'nın protein
kinazlar aracılı fosforilasyonu veya inhibitörler aracılığı ile inaktivasyonunun Nrf2'yi degredasyona karşı koruduğu ve antioksidan aktiviteyi arttırdığı bilinmektedir. Bu nedenle Nrf2'nin
degradasyonunu sağlayan mekanizmaları inhibe eden ajanlar (GSK-3β enzim inhibitörleri, Nrf2 aktivatörleri gibi), hücre içinde antioksidan sistemleri devreye sokması açısından, oksidatif stresin arttığı tüm hastalıklarda potansiyel tedavi alternatifleri arasında yer almaktadır. Tideglusib; tiyadiazolidindion grubu non-ATP kompetitif GSK-3β inhibitörüdür ve GSK-3β'nın rol oynadığı nörodejeneratif süreçlerde bu terapötik ajanın etkisini ortaya koymanın yeni moleküler hedefler belirmede rehber olacağı düşünülmektedir. Tez çalışmasında, SH-SY5Y insan nöroblastoma hücre hattında 1-metil-4-fenilpiridinyum iyonu (MPP+) kullanılarak in vitro dopaminerjik nöronal hasar oluşturulmuş; MPP+ aracılı nöronal hasar süre-yanıt, doz-yanıt deneyleri yapılarak hücre canlılığı analizleri ile tespit edilmiştir. Dopaminerjik nöronal hasarda bir GSK-3β enzim inhibitörü olan tideglusibin potansiyel nöroprotektif etkinliği araştırılmıştır. Ajanın enzimi inhibe ettiği, hücre içi pGSK-3β (Ser9) düzeylerindeki artışın gösterilmesi ile doğrulanmıştır. Deney modelinde serbest radikal üretimi, mitokondriyal membran potansiyelindeki değişim ilesüperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon peroksidaz (GPx) gibi antioksidan enzimlerin aktiviteleri spektrofotometrik ve spektrofluorometrik teknikler kullanılarak ölçülmüştür. Bununla birlikte uygulamaları takiben hem Nrf2 (sitozolik/nükleer) hem de Nrf2/ARE yolağı ile ilişkili protein (HO-1, NQO1, Keap1) düzeylerindeki değişim western blot yöntemi ile incelenmiştir. Deney gruplarında tüm örnekler en az beş kez çalışılmıştır ve gruplar arasındaki istatistiksel farklar ANOVA (analysis of variance) yöntemi ile %95 güven aralığında değerlendirilmiştir. Elde ettiğimiz sonuçlar; tideglusibin MPP+ ile oluşturulan dopaminerjik nöronal hasarda koruyucu olduğunu ve nöroprotektif etkiyi gösterirken Nrf2/ARE yolağını etkin olarak kullandığını göstermektedir. Nörodejeneratif hastalıkların sıklıkla karşılaşılıyor olması ve henüz tamamen patogenezinin aydınlatılamaması bu yönde yapılan çalışmaları oldukça önemli kılmaktadır. Dopaminerjik nöronal hasarın yaygın görüldüğü Parkinson Hastalığı gibi hastalıklar açısından, elde edilen sonuçlar ve ileri tekniklerin kullanıldığı deneysel ve klinik çalışmalar hastaların yaşam kalitesini arttırma ve tedavi maliyetlerini azaltma açısından yarar sağlayacaktır.

Abstract:
Neurodegenerative diseases are a group of disease which related with nervous system and affect many people all over the world. Pathological mechanisms including proteasomal or autophagic dysfunction and chronic neuroinflammation, abnormally folded protein aggregation, neuronal apoptosis, oxidative stress, mitochondrial dysfunction are very common in the basis of neurodegeneration. Alzheimer and Parkinson diseases are two of the most common neurodegenerative diseases. Motor symptoms of
Parkinson's disease occur as a result of degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra of the brain and various mechanisms, particularly oxidative stress, are known to have
a role in loss of dopaminergic neurons.Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) is a key
transcription factor in the regulation of cellular antioxidant response and this pathway is defined as a major protective mechanism to neutralize the oxidative stress. Nrf2 regulates antioxidant protein expression against oxidative stres resulting from inflammation or injury. Showing the changes in levels of proteins associated with Nrf2 such as cytosolic and nuclear concentration of Nrf2, heme oxygenase-1 (HO-1), NADPH dehydrogenase quinone-1 (NQO1), glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC), glutamate cysteine ligase regulator subunit (GCLM), glutathione reductase
provides information about the antioxidant status of the tissues in pathological conditions that trigger oxidative stress. It is known that Nrf2 is directly or indirectly (by means of Fyn)
phosphorylated by glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) and undergo degradation through the ubiquitin. Protein kinase mediated phosphorylation of GSK-3β or deactivation via inhibitors protects Nrf2 against degradation and is known to increase the antioxidant activity. Therefore; inhibitors of Nrf2 degradation (such as GSK-3β enzyme inhibitors, Nrf2 activators) for the insertion of antioxidant systems in cell are among the potential treatment approaches for the diseases where oxidative stres increase. Tideglusib is a non-ATP competitive inhibitor of GSK-3β that members of tiadiazolidindiones. Reveal the impact of the this therapeutic agents in the
neurodegenerative process believed that will guide the emergence of new molecular targets. In this thesis, in vitro dopaminergic neuronal damage was induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+) in human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) and cell viability analyzes were determined by performing the time-response, dose-response experiments. Potential neuroprotective effect of tideglusib (GSK-3β
enzyme inhibitor) was investigated in dopaminergic neuronal damage. Inhibition of the enzyme was confirmed by showing that the increase in level of intracellular pGSK-3β (Ser9). Free radical
production in the experimental model, the change in mitochondrial membrane potential with activity of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx) have
been measured using spectrophotometric and spectrofluorometric techniques. At the same time; the changes in the protein levels of Nrf2 (cytosolic/nuclear) and Nrf2/ARE pathway associated proteins
(HO-1, NQO1, Keap1) were analyzed by western blot method following treatments. Measurements were performed at least five times for each sample and statistical differences between groups evaluated by ANOVA (analysis of variance) method with a 95% confidence interval. Our results have shown that tideglusib shows protection in dopaminergic neuronal damage induced by MPP+ and this agent seems to have a role on the regulation of Nrf2/ARE pathway. In conclusion, obtained results and experimental and clinical studies on the use of advanced technology will benefit in terms of reduction of treatment costs and improving the quality of life for patients when dopaminergic neuronal loss occurs.