Geobacillus sp. 71 endoksilanaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve enzimin karakterizasyonu
Cloning, expression and characterisation of endoxylanase from Geobacillus sp. 71
Yazar: ZELİHA CEVHER
Danışman: DOÇ. DR. SABRİYE ÇANAKÇI
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Ksilan, doğada ikinci sırada sıklıkta bulunan bir polisakkarittir. Endoksilanazlar da ksilanın hidrolizinden sorumlu bir enzim grubu olup başta kağıt ve kağıt hamuru endüstrileri olmak üzere endüstride en çok kullanılan enzimlerden biridir. Termofilik mikroorganizmaların ksilanazları sıcaklık ve pH değişikliklerine karşı dirençli olduklarından dolayı endüstiyel süreçlerde önemli rolleri vardır.Bu çalışma da Geobacillus sp. 71 izolatı olarak isimlendirilen termofilik bir bakterinin ısıl kararlı ksilanaz gen sırasının invers PCR yöntemi ile bulunması, bir E. coli ekspresyon vektörüne klonlanması, saflaştırılması ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Geobacillus sp. 71 endoksilanazı kodlayan 1224 nt`lik genin baz dizilimi belirlenerek pET20b+ vektörüne klonlandı. Geni içeren vektör, E.coli BL21 hücresine aktarılarak ksilanaz ekspres edildi ve MagneHisTM Protein Saflaştırma Sistem kiti kullanılarak enzim saflaştırıldı. Saflaştırılan Geo71 Endoksilanaz enziminin optimum çalışma sıcaklığının 75 ºC ve optimum pH'nın ise 7,0 olduğu bulundu. Oat spelt xylan için olan Km değerinin 0,425 mM olduğu ve bu değerin diğer ksilanaz enzimlerine göre daha düşük olduğu belirlendi. Vmaks değeri 500 U/mg olarak belirlendi. Metal iyonlarının ve çeşitli kimyasalların enzime olan etkileri değişik konsantrasyonlarda gerçekleştirilen çalışmalar sonucunda belirlendi ve 10 mM konsantrasyonda Hg2+ bivalent metal iyonunun enzim aktivitesini neredeyse tamamen inhibe ettiği tespit edildi. Enzimin molekül ağırlığı 47 kDa olup amino asit benzerliğine göre family 10 glikosil hidrolaz sınıfı bir enzim olduğu belirlendi. Geo71 endoksilanaz enziminin oat spelt xylan substratını hidrolizlemesi sonucu ortaya çıkan şekerlerin başlıca ksilobioz, ksilotetroz olduğu ayrıca bunların yanında az miktarda da olsa ksilotrioz ve diğer bazı oligosakkaritlerinde oluştuğu ince tabaka kromotografisinde (TLC) ile ortaya çıkarıldı.Elde edilen veriler ışığında, enzimin biyokimyasal özellikleri, enzimin önemli bir endüstriyel enzim olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Xylan is the second most abundant polisaccaride in nature. Endoxylanases, responsible for hydrolysis of the xylan, are an enzyme group used commonly in industry which is used especially at paper and pulp industries. In specially, xylanases from thermophiles are expected to play a significant role in industrial processes, since they are thermostable and resistant to pH changes.In this study determining the thermal stable xylanase gene sequence of a thermophilic bacterium which is called Geobacillus sp. 71 by inverse PCR, cloning of this gene to an E. coli expression vector, its purification and characterization are realized. A 1224 bp endoxylanese gene coding from Geobacillus sp. 71 sequenced and cloned into pET20b+ vector. Vector encoding this gene was transformed into E.coli BL21, expressed and enzyme was purufied by MagneHisTM Protein Purification System and characterized. The Geo71 Endoxylanase enzyme showed optimal activity at 75 °C in pH 7,0. It was determined that the enzyme had a lower Km 0,425 mM for oat spelt xylan than most of the xylanases and Vmax of value 500 U/mg. Effects of metal ions and some chemicals on the enzyme was determined by the studies that were conducted with different concentrations. Hg2+ (10 mM) almost strongly inhibited the enzyme activity. On the basis of amino acid sequence similarities, this 47 kDa enzyme could be assigned to family 10 of the glycosyl hydrolase classification system. Purified enzyme catalyzed the hydrolysis of oat spelt, the level of xylobiose and xylotetraose was high along with xylotriose and some oligosaccharides analyzed on TLC.In the light of all data it has been suggested that the enzyme?s biocatalytic properties proved to be one of the important industrial enzymes.