Transplantasyon başarisinda etkili olan donöre özgün alloreaktif hafiza B hücre rezervinin değerlendirilmesi
Assessment of the donor specific alloreactive memory B cell reserve affecting the transplantation success
Yazar: HANDE AKALAN
Danışman: DOÇ. DR. DUYGU YAŞAR ŞİRİN
Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; B lenfositleri = B lymphocytes ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Poliklonal antikor = Polyclonal antibody ; Transplantasyon = Transplantation ; İmmünoloji =   ; İmmünolojik faktörler = Immunologic factors

Özet:
Alloantikorlara ek olarak, alloreaktif hafıza B hücre (mBC) rezervi, transplantasyon süreçleri sırasında immünolojik risk değerlendirmesi için bir potansiyele sahiptir. Şu anda alloreaktif mBC değerlendirmesi için, HLA tetramer boyama kullanılarak doğrudan Akış Sitometrik (FC) analizi bir seçenektir. Poliklonal olarak uyarılmış alloreaktif mBC'ler tarafından üretilen alloantikorların in vitro kültür sisteminde değerlendirilmesi, başka bir yararlı yaklaşım gibi görünmektedir, ancak bunun daha fazla ek uygulaya ihtiyacı vardır. Bu çalışmada, mBC tespiti için in vitro poliklonal olarak aktive edilmiş mBC kültür süpernatanlarının ve potansiyel donörün lenfositlerinin kullanıldığı Akış Sitometrik Çapraz Eşleştirmenin (FCXM-süpernatant) yararlılığını araştırdık. Allosensitize edilmiş 10 böbrek nakli hastasından elde edilen poliklonal olarak aktive edilmiş mBC'lerin kültür süpernatanları ile bunların alloimmünize edilmemiş donörlerinin lenfositleri ve tam tersi olacak şekilde FCXM-süpernatant deneyleri yapıldı. HLA tiplemesi SSP yöntemi ile yapıldı. İn vitro aktifleştirilmiş alloreaktif mBC'ler tarafından üretilen anti-HLA antikorları da Luminex testleri ile değerlendirildi. mBC'lerin in vitro poliklonal aktivasyonunun başarısı, toplam IgG ELISA testi ve FC tarafından antikor salgılayan hücre analizleri ile değerlendirildi. Donöre özgü alloreaktif mBC'ler, allosensitize edilmiş 10 vakanın %45'inde FCXM-süpernatant tarafından tespit edildi. Güçlü allosensitize vakalarda tespit oranı %85 (7'de 6) idi. Allosensitizasyon olmayan kontrol vakalarında hiçbir alloreaktif mBC tespit edilmedi. Allosensitize vakaların FCXM süpernatant negatif sonuçları, süpernatanların toplam IgG antikor testleri ile değerlendirilen düşük düzeyde allosensitizasyon ve yetersiz poliklonal stimülasyon ile ilişkiliydi. Bu çalışmada, doku tipleme laboratuvarlarında gerçekleştirilen rutin bir teste kolayca dönüştürülebilmesi için FCXM-süpernatant testi kullanılarak donöre özel bir şekilde alloreaktif mBC tespiti için pratik bir metodoloji sunuyoruz.

Abstract:
In addition to alloantibodies, alloreactive memory B cell (mBC) evaluation has a potential for immunological risk assessment during transplantation processes. For the alloreactive mBCs evaluation currently, direct Flow Cytometric (FC) analysis using the HLA tetramer staining is an option. Evaluation of alloantibodies produced by the polyclonally stimulated alloreactive mBCs in in vitro culture system seems to be another useful approach, but this needs further downstream applications. In this study, we investigated the usefulness of the Flow Cytometric Cross Match (FCXM-supernatant) in which in vitro polyclonally activated mBCs culture supernatants and potential donor's lymphocytes being used for the mBC detection. FCXM-supernatant assays were performed between culture supernatants of polyclonally activated mBCs obtained from allosensitized 10 renal transplant patients, and their non-alloimmunized donors' lymphocytes, and vice versa. HLA typing was performed by SSP method. Anti-HLA antibodies produced by in vitro activated alloreactive mBCs were also evaluated by the Luminex assays. The success of in vitro polyclonal activation of mBCs was evaluated by a total IgG ELISA test and antibody secreting cell analyses by FC. Donor specific alloreactive mBCs were detected by FCXM supernatant in 45% of the 10 allosensitized cases. Detection rate was 85% (6 out of 7) in the strongly allosensitized cases. No alloreactive mBCs was detected in control cases without allosensitization. FCXMsupernatant negative results of the allosensitized cases were related to low level of allosensitization and insufficient polyclonal stimulation evaluated by total IgG antibody tests of the supernatants. We herein report a practical methodology for alloreactive mBC detection as a donor specific manner using the FCXM-supernatantassay so that this would easily be transformed into a routine test performed in tissue typing laboratories.