Tetrahymena thermophila insülin benzeri proteinlerininimmüno-afinitik tabanlı belirlenmesi, rekombinant üretimive hormonal karakterizasyonu
Immuno-affinity based determination, recombinantproduction and hormonal characterization of tetrahymenathermophila insulin-like protein(s)
Yazar: AYÇA FULYA ÜSTÜNTANIR DEDE
Danışman: DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
Eskişehir Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; İnsülin = Insulin

Özet:
İnsülin (INS), relaksin (RLN) ve insülin-benzeri büyüme faktörlerinden (IGF-I ve IGF-II) oluşan insülin süperailesi, yüksek ökaryotlarda glikoz metabolizmasını düzenler. Literatürde, düşük ökaryot silli tekhücreli Tetrahymena türlerinde insülin reseptörlerinin varlığının gösterilmesi ile memeli insülinlerinin hücre içine glikoz alımını tetiklemesi, insülin kodlayan genlerin varlığının hipotezlenmesine neden olmuştur. Bu çalışmada ise, insülin benzeri genler ve kodladığı proteinler; T. thermophila'dan immünoçöktürme, aktivite tabanlı amonyum sülfat çöktürmesi, gen büyüklüğü, sinyal peptid varlığı, dizi benzerliği, korunmuş sistein motifi ve filogenetik analiz gibi yöntemler kullanılarak belirlenmiştir. İlk belirlenen T. thermophila insülin benzeri protein TtINS2, 66 amino asitten oluşmaktadır ve bu preproproteinin N-ucunda 17 amino asitlik hücre dışına salgılatma sinyal dizisi hipotetik olarak tespit edilmiştir. Proprotein ise 49 amino asit uzunluğunda ve 7 adet korunmuş sistein içermektedir. T. thermophila'da rekombinant üretilen TtINS2-10XHis'in monomer formu 6,5 kDa büyüklüğünde olup insan insülini
gibi hücre dışına salgılanarak dimer, tetramer ve hekzamerler oluşturmaktadır. TtINS2-sfGFP füzyon proteini, fluoresan mikroskop analizlerine göre sil kökleri ile salgı keselerine lokalize olmaktadır. Saflaştırılan TtINS2 proteini, T. thermophila'da hücre dışından hücre içine glikoz alımını tetiklemesinin yanında, hücre bölünmesini arttırıcı ve hücre ölümünü geciktirici hormon aktivitelerine sahiptir. Bu tez çalışmasında tek hücreli
organizmalarda (Protista) insülin benzeri TtINS2 hormonu ilk defa karakterize edilmiş ve böylelikle düşük ökaryotlarda insülin hormon ailesinin ve insülin sinyal yolağının varlığı ispatlanmıştır.

Abstract:
The insulin superfamily composed of insulin, insulin-like growth factors (IGF-I and IGF-II), and relaxins regulates glucose metabolism in higher eukaryotes. In literature, the demonstration of the presence of insulin receptors and the induction of glucose uptake by mammalian insulins in lower eukaryotic unicellular Tetrahymena species led to the
hypothesis of the presence of genes encoding insulin family members. These target proteins were identified by using the activity-based ammonium sulfate precipitation and immunoprecipitation from T. thermophila, high eukaryotic insulin sequence similarities, the presence of signal peptide, gene size, conserved cysteine motif, and phylogenetic
analysis. The first identified T. thermophila insulin-like protein TtINS2 consists of 66 amino acids, and the extracellular signal sequence of 17 amino acids at the N-terminus of this preproprotein was hypothetically determined. The proprotein is 49 amino acids long and contains 7 conserved cysteines. The monomer form of TtINS2-10XHis was produced recombinantly in T. thermophila and secreted out of the cell as 6.5 kDa, like human insulin, forming dimers, tetramers, and hexamers. TtINS2-sfGFP fusion protein was localized to cilia roots/membrane and secretory vesicles according to the fluorescent microscope analysis. Purified TtINS2 protein had hormone activities in T. thermophila that increases cell division and delays cell death, as well as triggered glucose uptake from
outside of the cell into the cell. In this thesis study, insulin-like TtINS2 hormone has been characterized for the first time in unicellular organisms (Protista) and thus the existence of insulin hormone family and insulin signaling pathway in low eukaryotes was proved.