Doku mühendisliği ile anizotropik yapılı kalp kapakçığının üretilmesi
Production of anisotropic heart valve by tissue engineering
Yazar: BETÜL GÜRBÜZ
Danışman: PROF. DR. ERKAN TÜRKER BARAN
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Hamidiye Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doku Mühendisliği Anabilim Dalı / Doku Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
DOKU MÜHENDİSLİĞİ İLE ANİZOTROPİK YAPILI KALP KAPAKÇIĞININ ÜRETİLMESİ
ÖZET

Amaç: Bu doktora tez çalışmasının amacı, güncel tedavi yöntemlerine alternatif olarak doğal kalp kapakçığının anizotropik, biyomekanik ve moleküler özellikleri göz önüne alınarak; kapakçık yapısını oluşturan fibröz, spongioz ve ventriküler katmanların doku mühendisliği yöntemiyle üretimidir.

Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada, kardiyovasküler doku mühendisliği temelli 3-boyutlu basım (3B) tekniği ve elektroeğirme yöntemi  kullanılarak kalp kapakçığı üretilmiştir. Üç farklı mikro-desenli kalıp tasarımı ile kalp kapakçığı doğal yapısında bulunan fibröz'ü  Polikaprolakton(PCL) /Kolajen(COL)/ Polisülfon(PSf); 2.Katman sponioz'u Polikaprolakton(PCL)/ Jelatin(GEL)/ Glikoaminoglikan(GEL);  3. katman ventriküler'i ise; Polikaprolakton(PCL)/ Poli(gliserol)sebakat(PGS)/ Polisülfon(PSf); polimerleri kullanılarak ve yapıların morfolojileri gözetilerek elektroeğirme ile üretilmiştir. Daha sonra; oluşturulan doku iskelesinin üzerine İnsan Göbek Kordon Ven Endotel Hücresi (HUVEC) ve Fibroblast (3T3)  hücreleri ekilerek, Rezasurin ile hücre canlılığı, DAPI-FITC boyama ile hücre morfoloji analizi, histolojik ve immunofloresan boyama ile in vitro hücre fonksiyonelliği çalışmaları yapılmıştır. 

Bulgular: Elektroeğirme optimizasyon deneyleri sonucunda nanaofiber çapları PCL/COL/PSf, PCL/GEL/GAG ve PCL/PGS/PSf  yaprakçık katmanları için sırasıyla; 343, 376 ve 556 nm olarak bulundu. TCP-kontrol ve HUVEC yüklü PCL/COL/PSf, PCL/GEL/GAG ve PCL/PGS/PSf doku iskelelerinin hücre canlılıkları karşılaştırıldığında istatiksel olarak anlamlı büyüme profili sergiledikleri görülmüştür. DAP-FITC boyamaları ve SEM görüntü verilerine bakıldığında hücrelerin doku iskeleri yapılarında yapıştığı, yayıldığı ve çoğaldığı açıkça görülmüştür. Hücre morfolojileri yönelimleri +/- 10° değer aralığında analitik olarak incelendiğinde; Fibröz katmanını taklit eden HUVEC yüklü PCL/COL/PSf doku iskelesindeki hücrelerin % 72 çevresel, ventriküler katmanı taklit eden PCL/PGS/PSf doku iskelesindeki hücrelerin ise; % 82 radyal olarak hizalandığı bulunmuştur. Immünofloresan boyama verilerine göre; PCL/COL/PSf, PCL/GEL/GAG ve PCL/PGS/PSf doku iskelelerinde 7, 14 ve 21.günde vimentin ekspresyonu gözemlenirken, bu doku iskeleleri için alfa-düz kas aktini (α-SMA) ekspresyonu 21.gün sonunda gözlemlenmiştir.  

Sonuç: Doku mühendisliği prensibi ile aort kapakcığın üç katmanlı yapısı elektroeğirme ve 3B basım tekniği taklit edilmiştir. Kalp kapakçığının  mekanik davranışını taklit ederken, yüksek hücre canlılığı sağlayabilen, aynı zamanda vimentin ve alfa- SMA ekspresyonunu destekleyen bu kalp kapakçığının, ileri de yapılacak klinik çalışmalara katkı sağlaması ve kalp kapakçığı hastalıklarına çözüm sağlama potansiyeline sahip, umut verici bir aday olması beklenmektedir.

Anahtar Kelimeler: Anisotropik Biyomalzeme, Doku Mühendisliği, Elektroeğirme, İnsan Göbek Kordon Ven Endotel Hücresi (HUVEC), Triküspid Kalp Kapakçığı, 3 Boyutlu Basım

Abstract:
PRODUCTION OF ANISOTROPIC HEART VALVE BY TISSUE ENGINEERING
ABSTRACT

Aim: The aim of this PhD thesis is to produce the fibrous, spongiose and ventricular layers of the heart valve structure by tissue engineering, taking into account the anisotropic, biomechanical and molecular properties of the natural heart valve as an alternative to current treatment methods.

Materials and Methods: In this study, a heart valve was fabricated using cardiovascular tissue engineering based 3D printing technique and electrospinning method. Fibrosa, the 1st layer in the natural structure of the heart valve, is made of Polycaprolactone(PCL)/Collagen (COL)/Polysulfone(PSf); 2nd layer Sponigosa is made of Polycaprolactone (PCL)/ Gelatin(GEL)/Glycoaminoglycan(GAG); 3rd layer Ventricularis is made of Polycaprolactone (PCL)/Collagen (COL)/Polysulfone (PSf)  and were produced by electrospinning with using three different micro-patterned mold designs. After that, the stent produced by 3-D printing and the layers produced by the electrospinning method were combined to obtain a heart valve scaffold. Finally, Human Umbilical Cord Vein Endothelial Cell (HUVEC) and Fibroblast (3T3) cells were seeded on the scaffold, and cell viability with Rezasurin, cell morphology with DAPI-FITC staining, and in vitro cell studies with histological and immunofluorescence staining were performed.

Results: As a result of electrospinning optimization experiments, nanofibers diameters were found to be 343, 376, and 556 nm for PCL/COL/PSf, PCL/GEL/GAG, and PCL/PGS/PSf scaffolds, respectively. When the cell viability of PCL/COL/PSf, PCL/GEL/GAG, and PCL/PGS/PSf scaffolds and TCP were compared, it was observed that they exhibited a statistically significant growth profile. DAP-FITC staining and SEM image data clearly show that the cells adhere, spread and proliferate in the tissue scaffolds. When the orientations of the cell morphologies were analytically examined in the +/- 10° range, it was found that the HUVEC cells in the PCL/COL/PSf scaffold which mimicked the fibrous layer were 72% circumferentially aligned. Also, the cells in the PCL/PGS/PSf scaffold which mimicked the ventricular layer were 82% radially aligned. According to immunofluorescence staining data, vimentin expression was observed in PCL/COL/PSf, PCL/GEL/GAG and PCL/PGS/PSf scaffolds on the 7th, 14th and 21st day, while alpha-smooth muscle actin (α-SMA) expression was observed at the end of the 21st day for these scaffolds.

Conclusion: Electrospinning and 3D printing techniques were used to imitate the aortic valve's three-layer structure. As a promising candidate with potential to provide solutions to heart valve diseases, the heart valve, whose show high cell viability while mimicking the mechanical behavior  and supporting the expression of vimentin and alpha-SMA, will contribute to future clinical studies.

Keywords: Anisotropic Biomaterials, Tissue Engineering, Electrospinning, HUVECs, Tricuspid Heart Valve, 3D Printing