Dioik Ficus carica L. (İncir)' de dişi, gal ve erkek çiçek gelişiminin mikroskobik ve moleküler yöntemler ile karşılaştırılması
Comparison of female, gall and male flower development with microscopic and molecular tecniques in dioecious Ficus carica L. (FIG)
Yazar: ÖZLEM AYTÜRK
Danışman: PROF. DR. MERAL ÜNAL
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, dioik Ficus carica türünün dişi, gal ve erkek çiçeklerinin karşılaştırmalı ontogenik gelişimi mikroskobik ve moleküler yöntemler ile araştırıldı. Morfolojik özellikler stereo- ve taramalı elektron mikroskop ile belirlendi. Üç çiçekte, dikkate değer yapısal ve gelişimsel değişimler ışık, floresan ve konfokal mikroskoplar ile karşılaştırıldı. 
F. carica'nın dişi ağaçlarında yalnızca dişi çiçekler, erkek ağaçlarında ise gal ve erkek çiçekler oluşur. Pistil, yalnızca uzun stiluslu ve ovaryumunda arı içermeyen dişi çiçeklerde olgun hale gelir. Stilusun, ovaryumun üzerinde iki parçalı küçük bir çıkıntı olarak ve ortasında bir kanal oluşturarak gelişimine başladığı ve olgunlaştıkça kanalın derinliğinin arttığı ve genişlediği belirlendi. Anatrop tipte tohum taslağı ve Polygonum tipi embriyo kesesi taşıyan dişi çiçeklerde, hipostase dokusu saptandı. Embriyo kesesinde serbest nukleuslu endosperma görüldü. Pistilde gelişimin tüm evrelerinde PAS boyama ile belirlenen nişasta taneleri görüldü. Aynı evrelerde, Auromine O ile lipid ve Coomassie brillant blue ile protein birikimi olduğu dikkati çekti. Bu türde sadece, dişi ağaçlardaki sikonyumların yenilebilir meyve ürettiği gözlemlendi. Dişi çiçekte, stamenlerin farklılaşmadığı saptandı. Tozlaşmadan sonra stigma, stilus ve nusellusda programlı hücre ölümü (PCD) DAPI ve TUNEL yöntemiyle ortaya çıkarıldı. PCD geçiren hücrelerde kromatin yoğunlaşması, düzensiz şekilli nukleuslar, vakuolleşme ve sitoplazma büzülmesi görüldü.
Gal çiçekte pistil gelişiminin dişi çiçektekine benzer şekilde başladığı ve stilusun iki parça halinde ve ortasında bir kanal oluşturacak şekilde uzadığı görüldü. Polygonum tipteki olgun embriyo kesesine, arı Blastophaga psenes L. (Agaonidae)'in bir yumurta bıraktığı (ovipozisyon) evreye kadar dişi ve gal gelişimi benzerdi. Ovipozisyondan sonra stilus ve nusellus dokularında arıya yanıt olarak çarpıcı değişiklilerin olduğu dikkati çekti. Arının, ovipozisyonun etkisiyle oluşan partenogenetik endospermadan ve nusellusdan beslenerek büyüdüğü belirlendi. Bunun dışında stilus ve nusellusta parlak sarımsı-yeşil floresan veren, bitkilerde savunma maddesi olan kalloz birikimi görüldü. Ardı sıra, stilus ve nusellus hücrelerinde arının etkisiyle hücresel bozuklukların oluşmaya başlaması PCD'nin olabileceğini düşündürdü. Bu hücrelerde DAPI ve TUNEL teknikleriyle detaylı çalışma yapıldı. Arı ve pistil gelişim evreleri eş zamanlı ortaya çıkarıldı. Gal çiçek pistilinde nişasta, yağ ve protein değişimi dişi çiçekte olduğu gibi takip edildi. Gal çiçekte de, dişide olduğu gibi, stamen farklılaşması görülmedi. 
Erkek çiçekte pistil gelişimi dişi ve gal çiçek ile aynı şekilde başladı. İlerleyen evrede, stigmanın farklılaştığı dönemde, pistilin PCD'ye uğrayıp gelişimin sonuna kadar kalıntı halinde kaldığı saptandı. Erkek çiçekte dişi ve galden farklı olarak stamenlerin olgunluğa eriştiği ve polen ana hücrelerinden mitoz bölünme sonucunda iki hücreli polenlerin meydana geldiği belirlendi. Bu çiçekte hem pistilde hem de stamende nişasta, yağ ve protein değişimine bakıldı ve diğer iki çiçekle karşılaştırıldı.
Pistil dokusu hücrelerinde, floresan ve konfokal mikroskop ile belirlenen mikrotübül organizasyonu, PCD den önce ve PCD sırasında incelendi. PCD ile ilişkili mikrotübül organizasyonu değişimi, gal çiçekte polinatör arının girişinden sonra, erkek çiçekte pistil gelişiminin durdurulması sırasında ve tozlaşma sonrası dişi çiçekte görüldü. PCD'nin etkisiyle stilus ve nusellus dokusunda, mikrotübül dağılımında dikkate değer değişimler görüldü. PCD'den önce mikrotübüllerin hücre korteksine paralel uzandıkları, nukleusun ve vakuolün etrafını sardıkları belirlendi. PCD sırasında ise hücre korteksi, nukleus ve vakuol etrafında kümelenme, bölgesel olarak kalınlaşma ve rastgele bir dağılım sergiledikleri saptandı. Mikrotübüllerin dağılımındaki değişikliklerin derecesi, arı ve çiçek gelişimi ile birlikte uyumlu olarak çoğaldı.

Abstract:
In the present study, the ontogenic development of female, gall and male flowers was compared by microscopic and molecular methods in dioecious F. carica. The morphological characteristics were analyzed by stereo- and scanning electron microscopy. The structural and developmental features were compared by light, fluorescence and confocal microscopy tecniques.
A female tree of F. carica bears only female flowers, whereas a male tree contains female (gall) and male flowers. The pistil reachs to maturity only in female flowers with long style and ovary without wasp. Style starts to develop as a small protrusion on both sides of the ovary leaving a narrow canal. The canal gradually expands in width and length. The hipostase was detected in anatropous ovule of the female flowers. The embryo sac development follows Polygonum type and endosperm is free nuclear. Starch grains were identified by appling PAS and they locate in the pistil tissue throughout the development. Lipids and proteins were defined by Auromine O and Coomassie brillant blue, respectively. In this species, only syconia of female trees produce edible fruits. The stamens don't differentiate in the female flowers. After pollination, programmed cell death (PCD) was monitored with DAPI and TUNEL methods in the stigma, style and nucellus. The characteristics of cells exposed PCD are the condensation of chromatin, irregular shaped nuclei, vacuolisation and collapse of cytoplasm that they were observed in these cells.
In a gall flower, pistil development starts in similar way with female and the style extends as a small protrusion on both sides of the ovary leaving a narrow canal. The wasp Blastophaga psenes L. (Agaonidae) lays its egg into an ovule (oviposition). The mature embryo sac is Polygonum type. Pistil development in gall flowers takes place in the same way with female up to oviposition. After loading of wasp's egg in an ovary, the striking changes were clearly noticed in style and nucellar tissues of gall flowers  in response to oviposition. The parthenogenetic endosperm is formed and the wasp feeds on partenogenetic endosperm and nucellar tissue, as it is growing up. Apart from that, callose accumulation was detected in the style and nucellus in the form of bright blue fluorescence, which is the defence response in plants. Immediately after, cellular disorders start to become visible in the style and nucellus tissues with the effect of B. psenes visit. These events pointed out that programmed cell death takes place in these cells, as revealed through DAPI and TUNEL techniques. The developmental stages of wasp and pistil were simultaneously analysed. The changes in amount of starch, lipids and proteins in the pistil tissues of galls were identified in similar tecniques with female. The stamens don't differentiate in galls as in female flowers.
The pistil initiation of male flowers starts in a similar manner with female and gall. Further, at the stigma differentiation stage, the pistil development undergoes programmed cell death (PCD) and pistil remains as residual through the end of development. Stamens develop up to maturity and 2-celled pollen grains are formed in male flowers in contrast to gall and female flowers. Starch, lipid and protein contents were also analysed with cytochemical tests in the pistil tissue of male flowers. 
Microtubule organization identified by fluorescence and confocal microscopy was determined in the pistil tissue cells before and in the course of PCD event. The changes in the microtubule organization occur not only in the cells undergoing PCD caused by pollinator wasp in the gall flower but also in arrested pistil tissue cells of male flower and in the pistil cells of female flower after pollination. The striking changes, microtubule distribution occuring in style and nucellus tissues in response to programmed cell death were clearly observed. Before PCD, it was noticed that microtubules organize paralel to the cell cortex and  circumferentially surround the nucleus and vacuole. Whereas they show  random aggregations and locally oriented thick bundles in cell surface, around nucleus and vacuole in the course of the PCD. The degree of microtubule reorganiztion increases simultaneously the wasp and flower development.