Kahve örneklerinde fenolik asitlerin HPLC ile tayini için metot geliştirilmesi ve validasyonu
Method development and validation for determination of phenolic acids in coffee samples by HPLC
Yazar: PELİN KÖSEOĞLU YILMAZ
Danışman: PROF. DR. UFUK KOLAK
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Fenolik asit = Phenolic acid ; Kafeik asit = Caffeic acid ; Kahve = Coffee ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid

Özet:
Bu doktora tezi kapsamında, kahvede bulunan fenolik asitlerin (5-O-kafeoilkinik asit, kafeik asit, 3-O-kafeoilkinik asit, 4-O-kafeoilkinik asit, ferulik asit, sinapik asit, protokateşik asit, p-hidroksibenzoik asit ve vanilik asit) kantitatif tayini için yeni bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi yöntemi geliştirildi ve valide edildi. Geliştirilen yöntemde ayırmalar C18 koruyucu kolon (2,1 × 10 mm, 3 µm ID) ve C18 analitik kolon (2,1 × 50 mm, 3 µm ID) ile gerçekleştirildi. Hareketli faz olarak % 0,08'lik o-fosforik asit çözeltisi (suda) ile metanol/su/asetonitril (85:10:5) çözeltisi kullanıldı ve gradient program uygulandı. Spektrofotometrik dedektör ile çalışıldı ve dedeksiyon dalga boyu 5-O-kafeoilkinik asit, kafeik asit, 3-O-kafeoilkinik asit, 4-O-kafeoilkinik asit, ferulik asit ve sinapik asit için 325 nm, protokateşik asit, p-hidroksibenzoik asit ve vanilik asit için 215 nm olarak belirlendi. Kolon sıcaklığı 40ºC'ye ayarlandı. Doğrusal aralık 5-O-kafeoilkinik asit, kafeik asit, ferulik asit, sinapik asit, protokateşik asit, p-hidroksibenzoik asit ve vanilik asit için 0,50-75,00 mg/L, 3-O-kafeoilkinik asit 0,50-1000,00 mg/L ve 4-O-kafeoilkinik asit için 0,50-250,00 mg/L olarak belirlendi. Gözlenebilme ve tayin sınırları sırasıyla 0,48-0,84 mg/L ve 1,45-2,54 mg/L aralıklarında bulundu. Kesinlik ve doğruluk değerleri 1,00 ve 25,00 mg/L'lik standart çözeltilerin ve 2 farklı miktarda (1,00 ve 25,00 mg/L) standart katılmış kahve örneğinin analiz sonuçları ile hesaplandı. Fenolik asitlerin kahve örneklerinden ekstraksiyonu hidrofilik-lipofilik denge kartuşları kullanılarak katı faz ekstraksiyonu yöntemiyle gerçekleştirildi. Farklı menşeli 7 adet kahve örneği ile çalışıldı. Sonuç olarak, geliştirilen ve valide edilen yöntemin kahve örneklerinde 9 adet fenolik asidin yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik ile aynı anda kantitatif tayini için uygun olduğu saptandı.

Abstract:
In this PhD thesis, a new high performance liquid chromatography method for quantitative determination of phenolic acids (5-O-caffeoylquinic acid, caffeic acid, 3-O-caffeoylquinic acid, 4-O-caffeoylquinic acid, ferulic acid, sinapic acid, protocatechuic acid, p-hydroxybenzoic acid and vanillic acid) in coffee was developed and validated. Separations were performed using C18 guard column (2.1 × 10 mm, 3 µm ID) and C18 analytical column (2.1 × 50 mm, 3 µm ID) in the developed method. 0.08 % o-Phosphoric acid solution (aqueous) and methanol/water/acetonitril (85:10:5) solution were used as mobile phase and gradient program was applied.  Spectrophotometric detector was used, and detection wavelength was determined as 325 nm for 5-O-caffeoylquinic acid, caffeic acid, 3-O-caffeoylquinic acid, 4-O-caffeoylquinic acid, ferulic acid, sinapic acid, and 215 nm for protocatechuic acid, p-hydroxybenzoic acid and vanillic acid. Column temperature was fixed at 40ºC. Linear range was 0.50-75.00 mg/L for 5-O-caffeoylquinic acid, caffeic acid, ferulic acid, sinapic acid p-hydroxybenzoic acid and vanillic acid, 0.50-1000.00 mg/L for 3-O-caffeoylquinic acid and 0.50-250.00 mg/L for 4-O-caffeoylquinic acid. Limits of detection and quantification were in the range of 0.48-0.84 mg/L and 1.45-2.54 mg/L, respectively. Precision and accuracy values were calculated by analysis results of standard solutions at 1.00 and 25.00 mg/L and coffee sample spiked at 2 different amounts (1.00 and 25.00 mg/L). Extraction of phenolic acids from coffee samples were performed by solid phase extraction method using hydrophilic-lipophilic balance cartridges. Seven coffee samples from different origins were studied. As a result, the developed and validated method was found to be appropriate for simultaneous quantitative determination of 9 phenolic acids in coffee samples with high accuracy and repeatability.