Trombin ve lizozimin özgün aptamer kullanılarak zenginleştirilmeleri ve kütle spektrometresi ile tayinleri
Enrichment of thrombin and lysozyme using specific aptamer and their detection by mass spectrometer
Yazar: ÜLKÜ GÜLER
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry

Özet:
Aptamerler, çok farklı özelliklerde sentezlenebilen, hedef moleküle yüksek seçicilikle bağlanan, deoksiribonükleik asit (DNA) ve ribonükleik asit (RNA) oligonükleotitleridir. Aptamerler, hedef moleküllerin (peptitler, proteinler, fosfolipitler, karbonhidratlar, nükleik asitler, ilaçlar, boyalar, enzimler ve aminoasitler gibi) üç boyutlu yapılarını yüksek afinite ve seçicilik ile tanıyabilmektedir. Aptamerler, afinite ve duyarlılıkları bakımından antikorlara alternatif adaylardır. Protein-antiprotein etkileşimleri protein-aptamer etkileşimlerine göre daha zayıftır. Protein- aptamer kompleksleri için ayrışma denge sabitinin (Kds) değeri 10-9-10-12 M aralığındadır.Aptamerlerin yukarıda bahsedilen uygun olan özelliklerinden dolayı, tez kapsamında yapılan çalışmalarda, kan serumunda düşük miktarlarda bulunan lizozim enziminin ve trombin proteinin aptamer bağlı polimerik yüzeylerde yüksek seçicilikle zenginleştirilmesi amaçlanmıştır. İlk olarak, Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon/İyonlaştırmalı Kütle Spektrometresi (MALDI-Kütle Spektrometresi) ile yapılacak analizlerde kullanılacak en uygun matriksin tespit edilmesi çalışmaları lizozim enzimi, lizozim aptameri ve lizozim enzimi-aptamer kompleksleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Analizler için uygun olan matriksler tespit edildikten sonra, lizozim enzimi zenginleştirilmesinde kullanmak amacıyla, amin fonksiyonel gruplu polistiren divinil benzen (PS-DVB) polimerik yüzeylerine Sülfo-Süksinimidil-4-(N-maleimidometil) siklohekzan-1- karboksilat (Sulfo-SMCC) çapraz bağlayıcısı aracılığıyla, 5' ucunda -SH fonksiyonel grubu bulunan lizozim aptamerinin kovalent olarak bağlanmasıyla aptamer bağlı yüzeyler elde edilmiştir. Lizozim enzimiyle muamele edilen yüzeyler üzerinde tripsin enzimi ile parçalama işlemi gerçekleştirildikten sonra elde edilen ürünler, MALDI-Kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. Alınan sonuçlar değerlendirildiğinde, 0.07 pmol/µL gibi çok düşük lizozim enzimi derişimine sahip örnek içerisinden lizozim enziminin başarıyla zenginleştirilebildiği görülmüştür. Ayrıca, farklı proteinlerin de içerisinde bulunduğu karmaşık örnek çözeltileri kullanılarak MALDI-Kütle spektrometresi ile yapılan zenginleştirme çalışmalarında geliştirilen malzeme ve yöntem kullanılarak lizozim enziminin yüksek seçicilikle zenginleştirildiği gözlenmiştir. Trombin proteininin zenginleştirme çalışmaları da aynı yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Trombin proteini zenginleştirmesi için kullanılan amin fonksiyonel gruplu PS-DVB polimerik yüzeylere de Sulfo-SMCC çapraz bağlayıcısı aracılığıyla, 5' ucunda SH fonksiyonel grubu bulunan trombin aptameri kovalent olarak bağlanarak aptamer bağlı yüzeyler elde edilmiştir. Trombin proteini ile muamele edilen yüzeyler üzerinde tripsin enzimi ile parçalama işlemi gerçekleştirildikten sonra elde edilen peptit türleri, MALDI-Kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. Alınan sonuçlara göre, 0.0007 pmol/µL derişimdeki trombin, bulunduğu örnek içerisinden başarıyla zenginleştirilmiştir. Ayrıca, farklı proteinlerin de içerisinde bulunduğu karmaşık örnek çözeltileriyle yapılan zenginleştirmelerde, MALDI-Kütle spektrometresi ile yapılan analizler sonucunda, lizozim enzimine ait peptit fragment kütlelerinin sinyalleri, seçiciliğin yüksek olduğunu göstermiştir. Son olarak, doğal örnek olarak kullanılan kan plazmasından trombin proteininin zenginleştirilmesi çalışmaları yapılmıştır. MALDI-Kütle spektrometresi ile yapılan analiz sonuçlarına göre, tez kapsamında geliştirilen malzeme ve yöntem kullanılarak trombin proteininin kan serumundan yüksek seçicilikle zenginleştirilebildiği gözlenmiştir.

Abstract:
Aptamers are Deoxyribonucleic acid (DNA) and Ribonucleic acid (RNA) oligonucleotides that can be synthesized in a variety of properties and bind to target molecule with very high selectivity. Aptamers recognize the three dimensional structure of the target molecules (such as peptides, proteins, phospholipids, carbohydrates, nucleic acids, drugs, dyes, enzymes and amino acids) with high specificity and affinity. Aptamers are alternative candidates to antibodies in respect to their sensitivities and affinities. Protein - antiprotein interactions are weaker than the interactions between protein and aptamer. Dissociation equilibrium constants of protein- aptamer complexes (Kds) are in the range of 10-9-10-12 M.Due to the convenient properties of the aptamers mentioned above, in the scope of this thesis, the aim of the study is to enrich the lysozyme and thrombin on the aptamer attached polymeric surfaces. Firstly, proper Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization-Mass Spectrometry (MALDI-MS) matrices were chosen for analysis of lysozyme enzyme, lysozyme aptamer and lysozyme enzyme-lysozyme aptamer complexes. After determining the matrices for lysozyme enrichment, lysozyme aptamer, which has the SH- functional group at 5? end, was attached to the amine functionalized polystyrene divinyl benzene particles (PS-DVB) covalently using Sulfo-Succinimidyle-4-(N-maleimidomethyl) siklohexane-1- carboxylate (Sulfo-SMCC) crosslinker. After the incubation of lysozyme enzyme solutions with the aptamer attached polymeric surfaces, the tryptic digestion was applied. Then the digest solution was being analyzed using MALDI-MS. When the analysis results were taken into consideration, it was seen that even very low concentration of lysozyme such as 0.07 pmol/µL could be detected as the result of enrichment. Also, enrichment of the lysozyme process was applied to the complex sample solutions which include a number of proteins were analyzed using MALDI-MS and it was observed that lysozyme enzyme could be enriched with high selectivity from the very complicated protein matrix solutions. The same procedure was also applied to the enrichment of thrombin protein. For thrombin enrichment, thrombin aptamer which has the SH- functional group at 5? end was attached to the amine functionalized PS-DVB particles covalently using Sulfo-SMCC crosslinker. The aptamer attached polymeric particulates were incubated with thrombin solution and then tryptic digestion was applied. When the digest solution was analyzed using MALDI-MS following the enrichment, it was noticed that 0.0007 pmol/µL thrombin could be detected. The process was also applied to the enrichment of thrombin from the complex sample solution which includes different type of proteins at high concentrations. The results obtained from MALDI-MS showed that thrombin could be enriched from the complex solution with high selectivity. Finally, the enrichment of the thrombin from human plasma as a real complex sample was studied. According to the results obtained from MALDI-MS, it was observed that thrombin could be enriched from the human blood plasma sample with high selectivity using the efficient materials developed in this study.