Tetrahymena thermophila'da rekombinant ilaç üretim verimliliğini düşürebilecek bir proteaz geninin gen silme yöntemiyle genomdan silinmesi ve karakterizasyonu
Elimination and characterization of a Tetrahymena thermophila protease gene that can reduce recombinant drug production efficiency by gene knock-out method
Yazar: ŞEYMA DURAN
Danışman: PROF. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
Eskişehir Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Peptid hidrolazlar = Peptide hydrolases ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production ; Sistein = Cysteine

Özet:
Bu tez çalışması ile T. thermophila'nın doğal olarak salgıladığı proteazların dış ortama salgılanan protein yapılı rekombinant biyofarmosötikleri parçaladığı ve üretim verimliliğini düşürdüğü hipotezi test edilmiştir. Literatür araştırması ve biyoinformatik yaklaşımlarla belirlenen sekretom proteaz genlerinden yüksek ekspresyona sahip CTH34 geni somatik homolog rekombinasyon, CYP6, CTH40, CTH90 ve CTH115 genleri ise co-Delesyon yöntemleriyle makroçekirdek genomundan silinmiş, doğal hücre ırkı ile mutant hücre sekretomlarının proteolitik aktivitesi kazein ve rituksimab substratlarına karşı in vitro olarak ölçülmüş ve SDS-PAGE ile substrat degredasyonu tanımlanmıştır. CTH34'ün KO edildiği ırkta sekretomal proteolitik aktivite %34,3 oranında düşerken büyüme eğrisinin logaritmik ve durağan faz hücre sayısında ~%50 oranında azalma bulunmuştur.  CYP6-KO ırkında ise rituksimab substratının parçalanmasında belirgin bir düşüş SDS-PAGE'de gözlemlenirken büyüme eğrisinin durağan faz hücre sayısında ~%25 civarında azalma görülmüştür. T. thermophila'nın verimli bir şekilde rekombinant protein ilaç üretimine CTH34 ve CYP6 genleri gibi proteaz genlerinin genomdan silinmesiyle uygun hale getirilebileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
In this thesis, the hypothesis that naturally secreted proteases of T. thermophila degrede protein-structured recombinant biopharmaceuticals secreted externally, and that reduce production efficiency has been tested. Five of highly expressed secretome protease genes were determined via literature research and bioinformatics approaches, and CTH34 gene was deleted by somatic homologous recombination while CYP6, CTH40, CTH90 and CTH115 were deleted by co-deletion, followed by mutant strain confirmation using PCR after antibiotic selection. The proteolytic activity of wild type and mutant culture secretomes was measured in vitro assays against casein and rituximab substrates, and substrate degradation was confirmed by SDS-PAGE. While secretomal proteolytic activity decreased by 34.3% in the CTH34-KO strain, cell number of the flask population in the logarithmic and stationary phase of the growth curve also decreased by ~50%. Besides, it is observed that degradation of the rituximab substrate was significantly reduced by CYP6-KO strain secretome compared to wild type whereas the cell number in the stationary phase of the growth curve also diminished by ~25%. According to forementioned findings, it was concluded that T. thermophila can be efficiently tailored for recombinant protein drug production by deletion of protease genes such as CTH34 and CYP6 from the genome.