Kronik Hepatit B' li hastalarda tedavi sırasında viral polimeraz geninde oluşan antiviral direnç mutasyonlarının değerlendirilmesi
Evaluation of antiviral resistance mutations in viral polimerase gene during the treatment period of patients with chronic hepatitis B
Yazar: ERGİN ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. A. MİTHAT BOZDAYI
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Hepatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Hepatit B virüsü karaciğerde geçici ve kronik enfeksiyonlara sebep olur. Dünya genelinde hepatit B kaynaklı karaciğer kanserinden ölen insan sayısı yılda yaklaşık bir milyon kadardır. Kronik Hepatit B tedavisi temel olarak immün sistemi harekete geçiren interferon (IFN) ve viral eşlenmeyi azaltan nükleotit analogları ile yapılmaktadır. Nükleo (tit/zit) analogları (NA), IFN tabanlı tedavilere göre daha az yan etkiye sahiptir. Bununla birlikte NA'larla yapılan tedavilerde, 48 haftalık uzun tedavi rejimi sonunda viral baskılama çoğunlukla gerçekleşmemektedir. Uzun süren NA tedavisi, sonuç olarak kişide ilaç direncinin gelişimine sebep olmaktadır. Bu sebeple ilaç, direnç gelişiminin hastada mümkün olduğunca erken tespit edilmesi tedavinin gidişatının değerlendirilmesinde kritiktir. İlaç direnç gelişiminin tespiti genomik boyutta yapılmaktadır. Terminal Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi (T-RFLP), daha çok kompleks bakteriyel komünitelerin analizi için geliştirilmiş bir yöntemdir. T-RFLP ile komünite çeşitliliğinin değerlendirilmesi aynı yöntemin `quasispecies' özellik gösteren hepatit B viral havuzunun değerlendirilmesinde de kullanılabileceğini akla getirmektedir.Bu çalışmada HBV genomunda ters transkriptaz kodlayan DNA dizisine özgü PZT yapıldı ve RFLP yöntemiyle mutant tip ırkların yaban tip ırklardan ayrımı yapılmıştır. Yine yaban tip ve mutant tip HBV genomları içeren plazmitlerle yapay `quasispecies' havuzlar yapılıp T-RFLP yönteminin alt populasyonları yakalamadaki başarısı değerlendirildi. Son olarak yöntemin seçilen geleneksel yöntemle karşılaştırılması yapılarak genotiplemedeki belirleyiciliği gösteridi.T-RFLP yönteminin viral havuz içerisinde en çok %1 lik alt populasyonları yakalayabildiği gösterildi. Ayrıca yöntem genotiplemede belirleyicilik yönünden dizi analizi yöntemi ile uyumlu bulundu.T-RFLP yöntemi hepatit B viral `quasispecies' havuzunun değerlendirilmesinde diğer yöntemlere kıyasla yüksek duyarlılıkla çalışmaktadır. T-RFLP diğer genotipleme yöntemlerine alternatif olarak hepatit B klinik araştırmalarında tercih edilebilir.Anahtar Sözcükler: Kronik Hepatit B, nükleotit analoğu, viral quasispecies, antiviral direnç, T-RFLP

Abstract:
Hepatitis B virus causes transient and chronic infections in liver cells. In a worl wide approximately one million death per year are attributed to HBV mediated hepatocellular carsinoma. Interferons (IFN) which stimulate Immun response and nucleo(t/s)ide analogues (NA) reducing viral replication are principally used for the treatment of chronic hepatitis B. NA treatments have less side effects than IFN treatments. However in NA treatments, viral suppression usually are not achived after the 48 week long treatment regimes. Finally long period NA treatments cause antiviral resistance development in patients. Therefore, detection of antiviral resistance in patients as early as possible is critical to manage NA treatment appropriatelly. Detection of antiviral drug resistance is done in genomic level. Terminal Restriction Length Polymorphism (T-RFLP) is especially developed to analyse complex bacterial communities. Evaluating the diversity of communities with T-RFLP brings to mind evaluation of hepatitis B viral populations which display quasispecies.In this study, HBV genome parts encoding reverse transcriptase were amplified by polymerase chain reaction. Discrimination of mutant type strains from wild type strains were done by RFLP method . Using recombinant plasmids containing mutant type and wild type HBV genomes we composed artificial quasispecies populations to determine the sensitivity of T-RFLP method in detecting minor populations. Finally by comparing with a traditional genotyping method, we demonstrated the specificity of T-RFLP.As a result it was shown that T-RFLP is able to detect minor populations representing at most %1 of the whole viral population. In addition to this result, T-RFLP showed concordance with the traditional DNA sequencing method in genotyping the viral populations.As a conclusion, relative to other genotyping methods, T-RFLP has high sensitivity to evaluate hepatitis B viral quasispecies populations. T-RFLP, can be prefered alternatively to other genotyping methods in hepatitis B clinical researches.Key Words: Chronic Hepatitis B, Nucleotide Analogue, Viral Quasispecies, Antiviral Resistance, T-RFLP