Babesıa bıgemına Kayseri/Türkiye suşlarının apıcal membrane antıgen-1 (AMA-1) proteininin moleküler genotiplendirilmesi, ekspresyonu ve immunolojik karakterizasyonu
Molecular genotyping, expression and immunological characterization of the apical membrane antigen-1 (AMA-1) from babesia bigemina Kayseri/Turkey strains
Yazar: ARİF ÇİLOĞLU
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH İNCİ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Babesia = Babesia ; Babesiosis = Babesiosis ; Filogenetik = Phylogenetic ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genotip = Genotype ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Moleküller = Molecules ; Türkiye = Turkey

Özet:
Bu çalışma, in vivo ve in vitro kültivasyonu yapılmış ve pasajlanmış (in vivo: 1. pasaj; in vitro: 1. pasaj) olan "Babesia bigemina Kayseri/Türkiye" suşlarının AMA-1 proteinlerinin moleküler genotiplendirilmesi, ekspresyonu ile immunolojik karakterizasyonunu belirlemek, söz konusu proteinin attenüasyona bağlı poliformizm gösterip göstermediğini ortaya koymak ve yeni aşıların geliştirilmesinde hedef protein olarak güvenilirliğini belirlemek amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla, %4,1 ve %11 parazitemiye sahip suşlardan; AMA-1 gen bölgesini kodlayan nükleotid dizilimlerinin belirlenmesi, belirlenen nükleotid dizilimlerinin intron içerip içermediğinin tespiti ve elde edilen sekansların ekspresyon analizleri öncesinde açık okuma çerçevesi [open reading frame (ORF)] veri tabanında değerlendirilmesi amacıyla genomik DNA (gDNA) izolasyonu yapılmıştır. Elde edilen gDNA izolatları, B. bigemina AMA-1 (BbigAMA-1) geninin tamamını amplifiye eden spesifik primerler ile PCR analizine tabii tutulmuştur. PCR sonrasında BbigAMA-1 geni pJET1.2/blunt vektörüne klonlanmıştır. Elde edilen rekombinant plazmidler sekanslanarak GenBank'a kaydedilmiş  (KP000032-33) ve Dünyadaki diğer BbigAMA-1 izolatları ile çoklu ve ikili hizalamaları yapılarak filogenetik analizleri gerçekleştirilmiştir. Ekspresyon analizleri öncesinde elde edilen nükleotid ve amino asit dizileri ORF veri tabanında değerlendirilmiş ve ekspresyon analizleri için yeni primerler dizayn edilmiştir. Daha sonra, aynı suşlar ekspresyon analizleri için RNA ekstraksiyonuna tabii tutulmuş ve takiben revers transkripsiyon ile cDNA sentezi yapılmıştır. Sentezlenen cDNA'lar, BbigAMA-1 fragmentleri için dizayn edilen primerler ile tekrar PCR analizine tabii tutulmuş ve sonrasında elde edilen ürünler ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlama sonrasında rekombinant plazmidler E. coli BL21 (DE3) hücrelerine tranforme edilmiş ve IPTG ile indüklenerek rekombinant BbigAMA-1 genlerinin ekspresyonu sağlanmıştır. Ekspresyon ürünlerinde hedef protein bandı SDS-PAGE ve Western Blot teknikleri ile analiz edilmiş ve BbigAMA-1'in her iki suş için de moleküler ağırlıkları hesaplanmıştır. Nükleotid dizilimlerinin çoklu ve ikili hizalamalar ile filogenetik analizler sonucu Kayseri/Turkey IV1 ve Kayseri/Turkey IT2 suşları kendi aralarında %99,77 identiklik gösterirken her iki suş en yüksek identikliği GenBank'a kayıtlı "Turkey" suşu (GenBank aksesyon no: JN572801) ile göstermiştir. Aynı izolatların amino asit dizilimlerinin ikili hizalamaları yapıldığında benzerlik oranı %99,83 olarak belirlenmiş ve elde edilen bu oranın, nükleotid sekans dizilimlerinin 103. nükleotidlerindeki mutasyondan ileri geldiği tespit edilmiştir. Bunun yanında, SDS-PAGE ve Western Blot analizleri ile söz konusu iki suşun 72 kDa moleküler ağırlıklarla farklı zaman dilimlerinde eksprese oldukları da belirlenmiştir. Çalışmadan elde edilen veriler, AMA-1'in B. bigemina için uygun bir aşı adayı hedef protein olup olmadığı noktasında tartışmalı olduğunu ve hususun aydınlığa kavuşması için Türkiye'ye özgü çok sayıda homolog suşa ait  BbigAMA-1 proteinin in vivo ve in vitro ortamlarda immun reaksiyon denemelerine tabii tutulması gerektiğini göstermiştir.
Sonuç olarak bu çalışma ile B. bigemina'nın iki farklı pasajında yer alan hedef AMA-1 proteinlerinin moleküler karakterizasyon ve ekspresiyonları karşılaştırmalı olarak ilk defa yapılmış ve iki suş arasında mutasyonel farklılıkları gösteren attenüasyona bağlı polimorfik alanlar tespit edilmiştir.

Abstract:
This study was performed to genotyping, expression and immunogenic characterization of AMA-1 protein molecules of in vivo and in vitro cultivated and passaged (in vivo: 1st passage; in vitro: 1st passage) "Babesia bigemina Kayseri/Türkiye" strains, and also to detect the polymorphisms of these molecules depend on the attenuation of the strains. For this aim, total genomic DNAs were extracted from the B. bigemina in vivo and in vitro cultured strains which have 4.1% and 11% parasitemia, respectively in order to determinate the nucleotide sequences of AMA-1, research the intronless genes in the obtained sequences and analyzed the fragments in open reading frame (ORF). The PCR was carried out with specific AMA-1 primers which amplified full-length B. bigemina AMA-1 (BbigAMA-1) gene. The PCR products were purified and cloned into pJET1.2/blunt vector. The cloned isolates were sequenced and the obtained sequences were deposited in GenBank with accession numbers KP000032-33. Pairwise analyses of the sequences and multiple alignments with some other BbigAMA1 isolates available in GenBank were performed and phylogenies were investigated. The truncated open reading frames (ORF) of the BbigAMA-1 fragments were obtained and new primers were designed for expressions. Total RNAs were extracted from the same strains and the cDNAs were prepared from the obtained RNA samples. The obtained cDNAs were amplified by PCR using predesigned expression specific primers and cloned into the expression plasmid vectors. The plasmids were subsequently transformed into E. coli BL21 (DE3) cells and expressed with IPTG concentrations. The expressed samples were analyzed by using SDS-PAGE and Western Blot techniques and target protein weights were calculated. Pairwise alignment of the sequences from Kayseri/Turkey IV1 strain from in vivo passage 1 and Kayseri/Turkey IT2 strain from in vitro passage 1 of B. bigemina showed 99.77% identity to each other. According to the phylogenetic comparisons, Kayseri/Turkey IV1 strain and Kayseri/Turkey IT2 strains showed most similarity to "Turkey" strain (GenBank accession no: JN572801). Moreover, the amino acid sequences of these two strains showed 99.83% identity to each other because of a mutation in 103rd nucleotides. BbigAMA-1 strains were expressed with a molecular mass of 72 kDa in different expression periods. Depend on the data obtained from this study, BbigAMA-1 was evaluated some controversial as target protein for vaccine candidate to developing immunization against B. bigemina infections in cattle. Because of, this protein should be tested with both of in vitro and in vivo experimental immunoreactions using homolog local B. bigemina strains in all regions of Turkey.
In conclusion, molecular characterization and expression level of target AMA-1 protein found in the two different passages of B. bigemina were comparatively and firstly determined with this study and polymorphic regions were revealed due to the attenuation which showed mutational differences between these two strains.