Genç ve yaşlı sıçanlarda bellek oluşumu ve depolanmasının, zaman bağımlı olarak beynin farklı bölgelerinde DNA metilasyonu yönünden incelenmesi
Investigation of time-dependent DNA methylation in different regions of the brain in related with memory formation and storage in young and aged rats
Yazar: ÇİĞDEM YAZICI MUTLU
Danışman: PROF. DR. EYÜP SABRİ AKARSU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Sinir Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Bellek = Memory ; DNA = DNA ; DNA metilasyon = DNA methylation ; Genler = Genes ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Metilasyon = Methylation ; Sıçanlar = Rats ; Yaşlanma = Aging

Özet:
Bilginin depolamasına aracılık eden nöronal devrelerdeki sinaptik etkinliğin nükleusta gen transkripsiyonunu ile düzenlendiği bilinmektedir. Belleğin nasıl depolandığını anlayabilmek için son çalışmalar, nükleusta gen transkripsiyonunu düzenleyen mekanizmalardan biri olan DNA metilasyonuna yönelmiştir. 
Çalışmada, korku belleğinin oluşumu ve sürdürülmesi sırasında, genç ve yaşlı sıçan beyninin hipokampus, prefrontal korteks, amigdala bölgelerinde, CaN, Reln ve Egr1 genlerin promotor bölgesinde farklı zaman noktalarındaki (1. saatte, 24. saatte, 7. ve 21. günde) DNA metilasyon değişimlerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla 3-4 aylık 63 adet ve 19-20 aylık 63 adet olmak üzere 126 adet Sprague-Dawley erkek sıçanda bağlamsal korku şartlanması modeli kullanılmıştır. Beynin hipokampus, prefrontal korteks ve amigdala bölgeleri izole edilmiştir. Bu nöroanatomik bölgelerde CaN, Reln ve Egr1 genlerinin promotor bölgesindeki DNA metilasyonu değişimleri MeDIP RT-PCR analiz yöntemi ile incelenmiştir. Donma davranışı verilerine göre, genç sıçanlarda tüm zaman noktalarında korku belleği oluştuğu görülmüştür. DNA metilasyon verileri, hipokampus bölgesinde korku belleğinin oluşmasında CaN ve Reln metilasyonuna ilişkin bir düzenleme olmayabileceğini göstermiştir. Prefrontal kortekste elde edilen 1. saatteki CaN ve Reln metilasyonu artışı bu genlerin kısa süreli korku belleğinin oluşmasında yer alabileceğini düşündürmektedir. Prefrontal korteks bölgesinde CaN ve Reln metilasyonunun azalma yönündeki zamansal farklılaşmaların uzun süreli korku belleğinin depolanmasını etkilemediği görülmüştür. Amigdala bölgesinde CaN metilasyonundaki azalma bulgusu bu değişimin belleği bozmayabileceği şeklinde yorumlanmıştır. Donma davranışı verilerine göre, yaşlı sıçanlarda 1. ve 7. günde bellek oluşmadığı, 24. saatte ve 21. günde bellek oluştuğu görülmüştür. DNA metilasyon verilerinde, yaşlı sıçanlarda hipokampus bölgesinde CaN ve Reln metilasyonuna ilişkin bir düzenleme görülmemiştir. Prefrontal kortekste CaN metilasyonundaki azalmanın kısa süreli korku belleğinin oluşmasını engelleyebileceği öne sürülebilir. Korku belleğinin oluşması için prefrontal kortekste meydana gelen CaN metilasyon değişikliklerinin daha belirleyici olduğu, amigdala bölgesinde oluşan CaN metilasyonundaki artışın ise bellek oluşumu için yeterli olmayabileceği görülmektedir. Amigdala bölgesinde Reln metilasyonuna ilişkin bir düzenleme gözlenmemiştir. Bu durum Reln metilasyon değişimlerin bellek oluşumuyla sistematik olarak etkileşmeyebileceğini düşündürmektedir.Egr1 geninin metilasyonunu değerlendirebilmek üzere, hem genç hemde yaşlı sıçan beyin örneklerinden yeterince büyük bir sinyal elde edilememiştir.
Sonuç olarak korku belleğinin oluşması ve depolanmasında bu genlerin metilasyonundaki farklılaşmanın artma ya da azalma yönünde zamansal olarak değişebileceği ve bu durumun korku belleğinin depolanması için mutlak bir gereklilikten çok, hücre içinde bir düzenlemeye (homeostazis) yönelik olabileceği ileri sürülebilir.

Abstract:
It is known that the synaptic activity in the neuronal circuits mediating information storage is regulated by gene transcription in the nucleus. Recent studies to understand how the memory is stored have indicated the possible role of DNA methylation, one of the mechanisms that regulate gene transcription in the nucleus.
This study is aimed to determine DNA methylation at different time points (1st hour, 24th hours, 7th and 21st days) in the promotor region of CaN, Reln and Egr1 genes in the hippocampus, prefrontal cortex, amygdala regions of young and aged rat brains during the formation and maintenance of fear memory. For this purpose, 126 Sprague-Dawley male rats, 63 for 3-4 months and 63 for 19-20 months, were used. The contextual fear conditioning model was also been used to provide the formation of a long-term memory. The hippocampus, prefrontal cortex and amygdala regions of brain were isolated. DNA methylation changes in the promoter region of CaN, Reln and Egr1 genes in these neuroanatomical regions were examined by MeDIP RT-PCR analysis method. The behavioral data show that fear memory formation is significantly observable at all time-points in young rats. DNA methylation data indicate that there may be no regulation of CaN and Reln methylation in the formation of the fear memory in the hippocampus region. An increased methylation of CaN and Reln at 1st hour in the prefrontal cortex suggests that these genes may be involved in the formation of short-term fear memory. Temporal changes such as  the reduction of CaN and Reln methylation in the prefrontal cortex area does not seem to affect the long-term storage of the fear memory. The finding of a decrease in CaN methylation in the amygdala region suggests that this change may not distort memory storage. According to the behavioral data, fear memory was not successfully formed on the 1st hour and 7th day in the aged rats, meanwhile, fear memory was intact on the 24th hour and 21th day. Based on the DNA methylation data, tit appears that there is no regulation of CaN and Reln methylation in the hippocampus region in aged rats. It can be argued that a reduction in CaN methylation in the prefrontal cortex may have an interfering effect on the formation of short-term fear memory. It seems that CaN methylation changes in the prefrontal cortex may have more decisive role the formation of fear memory. On the other hand, an increase in CaN methylation in the amygdala region may not be sufficient for memory formation. No regulation of Reln methylation has been observed in the amygdala region. This suggests that Reln methylation changes may not systematically interact with memory formation.
Data show that methylation levels of these genes change temporarily in the evaluated neuroanatomical sites during formation and storage of fear memory. These changes may be related with more general cellular homeostasis rather than a specific involvement with fear memory.