Osteokondral defektlerin onarımında kullanılmak üzere kriyojel-nanofiber çift katmanlı doku iskelelerinin üretimi ve karakterizesyonu
Production and characterization of cryogel-nanofiber bi-layered scaffolds for use in the repair of osteochondral defects
Yazar: BURCU SAKIM
Danışman: PROF. DR. NİMET KARAGÜLLE
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kimya Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Osteokondral defektler, aynı anda hem eklem kıkırdağı hem de subkondral kemikte hasarın görüldüğü durumları ifade eder. Dejeneratif hastalıkların neden olduğu osteokondral defektlerde kendi kendine iyileşme sağlamak zordur. Bu hastalıkların tedavisi için kıkırdak, kemik ve kıkırdak-kemik arayüzünün fiziksel ve kimyasal özelliklerini dikkate alan yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Bu nedenle alternatif tedavi yöntemleri üzerinde yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Bu yöntemler arasında kemik doku mühendisliği yaklaşımı ile üretilen doku iskeleleri osteokondral yaralanmaların tedavisinde öne çıkmaktadır. Çift katmanlı doku iskelelerinin en önemli avantajı, kıkırdak ve kemik gelişimine özgü fiziksel veya kimyasal bileşenler içermesidir. Doku mühendisliğinde, kriyojeller ve nanolifler sıklıkla doku iskelesi olarak kullanılır.
	 Bu çalışmada poli(ɛ-kaprolakton) (PCL) nanofiber doku iskeleleri elektrospinning yöntemiyle elde edilmiştir. PCL içeren çözeltiler %15 (w/v) konsantrasyonda hazırlanmıştır. Çözücü olarak kloroform ve dimetilformamid (30:70, v:v) sistemi kullanılmıştır. Çözeltiye uygulanan voltaj 13 kV ve polimer çözeltisini içeren şırınga ucu ile toplayıcı arasındaki uzaklık 10 cm olarak sabit tutulmuş ve besleme hızı 1 ml/h olarak ayarlanmıştır. Bu parametreler sabit tutularak elektrospinning yöntemi ile nanofiberler doku iskeleleri üretilmiştir. Kitosan:jelatin temelli kriyojel doku iskeleleri kriyojelasyon yöntemi kullanılarak üretilmiştir. Kitosan ve jelatin, toplam polimer konsantrasyonu %2 (w/v) ve kitosan:jelatin  oranı 50:50 (w:w) olacak şekilde, asetik asidin %6'lık sulu çözeltisinde çözünmesiyle hazırlanmıştır. Çapraz bağlayıcı olarak %6 (v/v) gluteraldehit solüsyonu kullanılmıştır. Nanofiber ve kriyojel katmanlarının entegrasyonu soğutmalı sirkülatörde -16 °C kriyojelasyon sıcaklığında çapraz bağlanma ile gerçekleştirilmiştir. Kıkırdak rejenerasyonunu destekleyecek yapıdaki PCL nanofiberler, kemik dokuyu taklit edebilecek özelliklere sahip, biyobozunur, farklı oranlarda (%10, 30, 50, 100) hidroksiapatit (HA) ile güçlendirilmiş kitosan:jelatin kriyojeller ile başarılı bir şekilde entegre edilmiştir.  Üretilen doku iskelelerinin yüzey morfolojisi SEM analizi ile incelenmiştir. Kriyojel katmanının gözenek çapı ortalaması, 36.87±6.79 µm ile 20.30±58 µm aralığında değişim göstermiştir. HA miktarındaki artış gözenek çapının küçülmesine sebep olmuştur. PCL nanofiberlerin morfolojisi boncuksuz ve pürüzsüz ağ yapı olarak gözlemlenmiştir. Ortalama fiber çapı 258 ± 35 nm olarak hesaplanmıştır.  İki katmanın entegrasyonu SEM görüntüleriyle kanıtlanmıştır. Doku iskelelerinin kimyasal yapısı FTIR ile araştırılmıştır. Spektrumlar incelendiğinde çift katmanlı doku iskelesinde, PCL nanofiber ve kitosan:jelatin kriyojele ait piklere rastlanmıştır. Ayrıca kriyojel katmanında hidroksiapatite ait piklerde gözlemlenmiştir. Şişme davranışları incelendiğinde, en yüksek şişme oranına sahip kitosan:jelatin kriyojel ve poli(ɛ-kaprolakton) nanofiber çift katmanlı doku iskelesinin (CS:Gel Cr/PCL Nf) yüksek oranda degredasyonunun gerçekleştiği görülmüştür. En düşük şişme ve degredasyon oranına sahip doku iskelesi %100 hidroksiapatit eklenen kitosan:jelatin kriyojel ve poli(ɛ-kaprolakton)  nanofiber çift katmanlı doku iskelesi (100HA-CS:Gel Cr/PCL Nf) olarak belirlenmiştir. HA miktarındaki artış şişme oranını ve degredasyon oranını düşürmüştür. Çift katmanlı doku iskelelerinin mekanik performansı incelendiğinde numunelerin ortalama mekanik dayanımı değeri 24 ± 11 ile 60 ± 25 kPa arasında, Young modül değerleri 24±11 ile 60±25 kPa/% arasında ölçülmüştür. Çift katmanlı doku iskelelerine HA eklenmesi mekanik dayanım özelliklerinin artmasını sağlamıştır. 
	Çalışma sonucunda geliştirilen kriyojel/nanofiber çift katmanlı doku iskelelerinin kemik doku mühendisliği uygulamalarında osteokondral defektlerin onarımı için kullanılabilinecek potansiyel bir ürün olduğu ortaya koyulmuştur.

Abstract:
Osteochondral defects refer to conditions in which damage to both articular cartilage and subchondral bone is seen simultaneously. Self-healing of osteochondral defects caused by degenerative diseases is difficult. There is a need for approaches that take into account the physical and chemical properties of cartilage, bone and the cartilage-bone interface for the treatment of these diseases. For this reason, intensive studies are carried out on alternative treatment methods. Among these methods, tissue scaffolds produced with the bone tissue engineering approach come to the fore in the treatment of osteochondral injuries. The most important advantage of bi-layer scaffolds is that they contain physical or chemical components specific to cartilage and bone development. In tissue engineering, cryogels and nanofibers are often used as tissue scaffolds.
	In this study, Poly(ɛ-caprolactone) (PCL) nanofiber scaffolds were obtained by electrospinning method. Solutions containing PCL were prepared at a concentration of 15% (w/v). Chloroform and dimethylformamide (30:70, v:v) system was used as solvent. The voltage applied to the solution was 13 kV and the distance between the syringe tip containing the polymer solution and the collector was kept constant as 10 cm and the feed rate was adjusted as 1 ml/h. By keeping these parameters constant, nanofiber scaffolds were produced by electrospinning method. Chitosan:gelatin-based cryogel scaffolds were produced using the cryogelation method. Chitosan and gelatin were prepared by dissolving acetic acid in 6% aqueous solution with a total polymer concentration of 2% (w/v) and a chitosan:gelatin ratio of 50:50 (w:w). 6% (v/v) glutaraldehyde solution was used as crosslinker. Integration of nanofiber and cryogel layers was carried out by crosslinking at -16 °C cryogelation temperature in a cooled circulator. PCL nanofibers, which have a structure that will support cartilage regeneration, have been successfully integrated with chitosan:gelatin cryogels reinforced with biodegradable, hydroxyapatite (HA) at different rates (10, 30, 50, 100%) with properties that can mimic bone tissue. The surface morphology of the fabricated scaffolds was examined by SEM analysis. The mean pore diameter of the cryogel layer varied between 36.87±6.79 µm and 20.30±5.8 µm. The increase in the amount of HA caused a decrease in the pore diameter. The morphology of PCL nanofibers was observed as bead-free and smooth network structure. The mean fiber diameter was calculated as 258±35 nm. The integration of the two layers has been demonstrated by SEM images. The chemical structure of the scaffolds was investigated by FTIR. When the spectra were examined, peaks of PCL nanofiber and chitosan:gelatin cryogel were found in the bi-layer tissue scaffold. In addition, peaks of hydroxyapatite were observed in the cryogel layer. When the swelling behavior was examined, it was observed that the high rate of degradation of chitosan:gelatin cryogel and poly(ɛ-caprolactone) nanofiber bilayer scaffold (CS:Gel Cr/PCL Nf) with the highest swelling ratio occurred. The scaffold with the lowest swelling and degradation rate was determined as 100% hydroxyapatite added chitosan:gelatin cryogel and poly(ɛ-caprolactone nanofiber bi-layer scaffold (100HA-CS:Gel Cr/PCL Nf). The increase in the amount of HA decreased the swelling rate and the degradation rate. When the mechanical performance of the bi-layer scaffolds was examined, the average mechanical strength value of the samples was between 2 ±11 and 60±25 kPa, and Young's modulus values were between 24±11 and 60±25 kPa/%. Addition of HA to bi-layer scaffolds increased the mechanical strength properties.
	As a result of the study, it has been revealed that the developed cryogel/nanofiber bi-layer scaffolds are a potential product that can be used for the repair of osteochondral defects in bone tissue engineering applications.