Akciğer kanseri radyoterapisinde eksozom kaynaklı circRNA ekspresyon paternlerinin değerlendirilmesi
Evaluation of exosome derived circRNA expression patterns in LUNG cancer radiotherapy
Yazar: SAINA RAHIMI
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE CANER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Eksozomlar = Exosomes ; Gen ifadesi = Gene expression ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Radyoterapi = Radiotherapy

Özet:
Amaç: Akciğer kanseri, dünyada en sık görülen ve kansere bağlı ölümlerin en önde gelen nedenleri arasındadır. Günümüzde bu kanserin erken tanısında ve tedavisinde hala zorluklar bulunmaktadır. Radyoterapi akciğer kanseri tedavisinde kullanılan etkili bir yöntemdir. Ancak radyoterapinin klinik belirtilerini erken bir aşamada değerlendirmek çok zordur ve ilgili kriterler çok sınırlıdır. Son yıllarda circRNA'ların spesifik yapıları nedeniyle kanserin tanı, tedavi ve progresyonunda önemli rol oynadıkları gösterilmiştir. Ayrıca circRNA'ların eksozomlarda daha fazla miktarda bulunduğu ve daha stabil bir yapı içerdikleri belirtilmiştir. Bu nedenle köken aldığı hücrenin özelliklerini taşıyan ve çeşitli vücut sıvılarında bulunan eksozomal circRNA'ların, kanserin tanısı ve tedavi değerlendirmesi için uygun bir biyobelirteç olma kapasitesine sahip oldukları düşünülmektedir. Bu tez çalışmasında eksozomal circRNA'ların küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde ve radyoterapi ile ekspresyon seviyelerindeki değişiklikleri değerlendirerek biyobelirteç olma potansiyellerini araştırdık.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada akciğer kanseri epiteli (A549) ve sağlıklı akciğer fibroblast (WI38) hücre hatları kullanıldı. Ayrıca radyoterapinin etkisini değerlendirmek için öncelikle her iki hücre hattına radyasyon uygulandı ve koloni testi yapıldı. Analiz sonrasında her iki hücre hattı 4Gy ile ışınlandı ve ultrasantrifüj yöntemiyle eksozomlar izole edildi. Eksozomlar, flow sitometri ve dinamik ışık saçılma parçacık boyut analizi ile karakterize edildi. Daha sonra eksozomlardan total RNA izolasyonu ve cDNA sentezi yapılarak 40 eksozomal circRNA'nın ekspresyon seviyeleri RT-qPCR ile incelendi. Ayrıca deney gruplarında eksprese olan eksozomal circRNA'ların etkileşimde bulunduğu olası miRNA'lar biyoinformatik yöntemler ile tespit edildi. Daha sonra, eksprese edilen eksozomal circRNA'ların parental genleri ve radyoterapi ile ilişkileri, TCGA veri bankasından küçük hücreli olmayan akciğer kanseri olan hastalara ait veriler ile karşılaştırılarak değerlendirildi.
Bulgular: Analizler sonucunda ışınlanmış kanser hücrelerinden salınan eksozomların, kanser hücrelerinden salınanlardan daha yüksek yoğunlukta ve büyüklükte olduğu tespit edildi. Eksozomal circRNA'dan, 4 circRNA'nın, A549, WI38, ışınlanmış A549 ve ışınlanmış WI38 hücre gruplarından en az birinde eksprese edildiği bulundu. Özellikle tüm deney gruplarda eksprese olan hsa_circ_0001900 geninin kanser hücre hatlarında sağlıklı hücrelere göre daha fazla eksprese olduğu tespit edildi. Işınlamadan sonra hsa_circ_0001900 gen ekspresyonunun kanser hücrelerinde anlamlı seviyede arttığı gözlenirken sağlıklı hücrelerde önemli oranda düştüğü saptandı. Hsa_circ_0014235 geninin de kanser hücre hatlarında sağlıklı hücre hattına göre daha fazla eksprese olduğu fakat ışınlamadan sonra hem kanser hem de sağlıklı hücrelerde eksprese olmadığı saptandı. Bunun yanında, hsa_circ_0000190 geni sadece kanser hücrelerinde eksprese olurken, hsa_circ_0000003 geninin her iki hücrenin ışınlamasından sonra eksprese olduğu ve bu ekspresyonun sağlıklı hücrede anlamlı seviyede daha yüksek olduğu tespit edildi. Daha sonra bu circRNA'lar ile etkileşimde olan miRNA'lar tanımlandı ve bu miRNA'larin çoğunun akciğer kanseri veya diğer kanser ile ilişkili olduğu saptandı. Ayrıca, bu circRNA'ların köken aldığı parental genlerin ekspresyon seviyeleri küçük hücreli olmayan akciğer kanser hastalarında ve radyoterapi uygulanması sonrasında değerlendirildi. Bu parental genlerden hsa_circ_0014235 geninin köken aldığı S100A2 gen ekspresyonunun tümörlü dokuda anlamlı seviyede yüksek seviyede olduğu tespit edildi. Radyoterapi uygulanan ve uygulanmayan hastalarda ise bu parental genlerin ekspresyon değerlerinde ise herhangi anlamlı bir fark olmadığı saptandı. 
Sonuçlar: Vücut doku ve sıvılarında bulunan eksozomal kaynaklı circRNA'lar, stabil ve dirençli yapıları nedeniyle kanser tanısında ve tedavi takibinde potansiyel biyobelirteç adayları olabilir. Eksozomal circRNA'ların akciğer kanserinin tanısında ve önemli bir tedavi yöntemi olan radyoterapinin izlenmesinde biyobelirteçler olabileceğini düşündürmektedir. 
Anahtar Kelimeler; Eksozom; CircRNA'lar; Akciğer Kanseri; Radyoterapi; Biyobelirteçler

Abstract:
Background: Lung cancer is one of the most common and leading causes of cancer-related deaths in the world. Today, there are still difficulties in the early diagnosis and treatment of this cancer. Radiotherapy is an effective method used in the treatment of lung cancer. However, it is very difficult to assess the clinical manifestations of radiotherapy at an early stage and the relevant criteria are very limited. In recent years, it has been shown that circRNAs play an important role in the diagnosis, treatment and progression of cancer due to their specific structures. It was also stated that circRNAs are more abundant in exosomes and contain a more stable structure. For this reason, it is thought that exosomal circRNAs, which have the characteristics of the cell of origin and are found in various body fluids, have the capacity to be a suitable biomarker for the diagnosis and treatment evaluation of cancer. In this thesis, we investigated the potential of exosomal circRNAs as biomarkers by evaluating the changes in expression levels in non-small cell lung cancer and radiotherapy.
Material and Method: In this study, lung cancer epithelial (A549) and healthy lung fibroblast (WI38) cell lines were used. In addition, to evaluate the effect of radiotherapy, radiation was applied to both cell lines and colony test was performed. After analysis, both cell lines were irradiated with 4Gy and exosomes were isolated by ultracentrifugation method. Exosomes was characterized by flow cytometry and dynamic light scattering particle size analysis. Then, total RNA isolation from exosomes and cDNA synthesis were performed and expression levels of 40 exosomal circRNAs were examined by RT-qPCR. In addition, possible miRNAs interacting with exosomal circRNAs expressed in the experimental groups were determined by bioinformatics methods. Parental genes of expressed exosomal circRNAs and their association with radiotherapy were then evaluated by comparing them with data from patients with non-small cell lung cancer from the TCGA database.
Results: As a result of the analysis, it was determined that the exosomes released from irradiated cancer cells were higher in density and size than those released from cancer cells. Of the exosomal circRNA investigated, 4 exo-circRNAs were found to be expressed in at least one of the groups, including A549, WI38, irradiated A549 and irradiated WI38 cell lines. In particular, hsa_circ_0001900, which was found to be expressed in all groups, was more upregulated in cancer cell lines than healthy cell line. After irradiation, hsa_circ_0001900 expression level increased significantly in cancer cells while significantly decreased in healthy cells. Similarly, hsa_circ_0014235 was also more upregulated in cancer cell line than healthy cell line. However, it was found not to be expressed in both cell lines after irradiation.
In addition, it was determined that the hsa_circ_0000190 gene was expressed only in cancer cells, while the hsa_circ_0000003 gene was expressed after irradiation of both cells and this expression was significantly higher in irradiated healthy cells. Later, miRNAs that interact with these circRNAs were identified and most of these miRNAs were found to be associated with lung cancer or other cancers.
In addition, the expression levels of parental genes, which are the source of these circRNAs, were evaluated in NSCLC patients and after radiotherapy. Of these parental genes, S100A2 gene expression, which is originate of hsa_circ_0014235 gene, was found to be significantly high in tumor tissue. No difference was found in the expression values of these parental genes with the tissues of patients under radiotherapy.
Conclusions: The stable and resistant structures of exosomal-derived circRNAs found in body tissues and fluids can be potential biomarker candidates in cancer diagnosis and treatment follow-up. It suggests that exosomal circRNAs may be biomarkers in the diagnosis of lung cancer and in monitoring radiotherapy, which is an important treatment method.
Keywords; Exosome; CircRNAs; Lung Cancer; Radiotherapy; Biomarkers