Biyokatalitik olarak enantiyoseçimli alfa-hidroksiketon üretim prosesinin geliştirilmesi
Development of biocatalytical enantioselective alpha-hydroksi ketone production process
Yazar: ÇİĞDEM BABAARSLAN
Danışman: PROF. DR. AYHAN SITKI DEMİR ; PROF. DR. ÜLKÜ MEHMETOĞLU
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Bu tez kapsamında çeşitli izole enzimler ve mikroorganizmalar biyokatalizör olarak kullanılarak enantiyomerik saflıkta benzoin üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretim için farklı yöntemler kullanılmıştır. İncelenen yöntemlerden ilki P. fluorescens biovar I katalizörlüğünde benzaldehitten C-C bağı oluşumu yoluyla enantiyomerik saflıkta benzoin üretimidir. BAL kaynağı olarak kullanılan P. fluorescens farklı üretim ortamlarında çoğaltılmış ve benzoin üretiminde kullanılmıştır. İncelenen tüm ortamlarda tepkimeyi katalizleyen BAL üretimi gözlenememiş, dolayısıyla benzoin elde edilememiştir.İkinci olarak farklı izole lipaz ve mikroorganizmalar (bakteri ve küf) ile rasemik benzoinin kinetik rezolüsyonu incelenmiş, çözücü, açil verici ve moleküler elek gibi ortam koşullarının benzoin enantiyoseçimliliği üzerine etkisi belirlenmiştir. Farklı biyokatalizörlerin kullanılması ve ortam koşullarının değiştirilmesi rasemik benzoin ee'sini önemli ölçüde değiştirmemiştir. En yüksek ee ve dönüşüm sırasıyla % 21 ve % 48 olarak P. fluorescens kullanıldığında S-benzoin için n-hekzan çözücü olarak kullanıldığında elde edilmiştir. Üçüncü olarak R. oryzae CBS-111718 küfü kullanılarak ras-benzoinin derasemizasyonu incelenmiştir. Rasemik benzoinin derasemizasyonu farklı pH'larda üreme ve tampon ortamlarında gerçekleştirilmiş ve pH'ın enantiyoseçimliliği önemli ölçüde etkilediği belirlenmiştir. Üreme ortamında en yüksek ee (%) değeri >99 olarak benzoinin S-enantiyomeri için pH: 6'da elde edilmiş, bu süre içerisinde benzoinin benzile dönüşümü % 49 olarak belirlenmiştir. Derasemizasyon tampon ortamında gerçekleştirildiğinde en yüksek ee değeri % 84 olarak pH:9'da S-enantiyomer için bulunmuş, bu süre içerisinde benzile dönüşüm ise % 24 hesaplanmıştır.Son olarak enantiyoseçimli benzoin üretimi R. oryzae CBS-111718 küfü katalizörlüğünde benzilin indirgenmesi ile gerçekleştirilmiştir. Üreme ortamında % 33 dönüşümle S-enantiyomer için en yüksek ee değeri % >99 olarak pH: 9'de bulunmuştur. Dondurarak kurutulmuş hücrelerle tampon ortam pH'sının ee üzerine etkisi incelendiğinde 9 en uygun pH olarak belirlenmiştir. Mikroorganizma üretim koşullarının ee'ye etkisi araştırıldığında en yüksek ee değerine pH: 7 de 2 gün üretilen hücrelerle ulaşılmış ve ee S-benzoin için % 92 bulunmuştur. Tampon ortamında ise en yüksek dönüşüm ve ee değeri 8. gün sonunda % 31 dönüşümle % 88 olarak S- benzoin için elde edilmiştir. Koenzim rejenerasyonunu arttırmak için kosubstrat olarak farklı karbonhidrat ve alkollerin tepkime ortamına ilavesi dönüşümü arttırmış, genel olarak ee'yi ise etkilememiştir. Ultrasound ile hücrelerin parçalanması tepkimeyi hızlandırmış, ee'yi ise düşürmüştür.

Abstract:
The production of enantiomerically pure benzoin was performed using isolated lipase and microorganisms as biocatalyst within this thesis. Different methods were used for production. The first one was production of enantiomerically pure benzoin via P. fluorescens biovar I- catalyzed C-C bond formation from benzaldehyde. P. fluorescens used BAL enzyme source was growth in different mediums and used for production of benzoin. Because of generation of BAL could not be performed using the microorganism, benzoin wasn?t obtained in reaction media.Secondly, kinetic resolution of benzoin using different isolated enzymes and microorganisms (bacteria and fungus) was investigated. The effect of medium conditions as solvent, acyl donor and molecular sieve was researched on enantioselective benzoin production. To use different biocatalysts and change the medium conditions did not change the enantiomeric excess of benzoin markedly. The highest ee and conversion were found as 21 % and 48 %, respectively for S-benzoin using hexane. Optically pure benzoin production was achieved via deracemisation of rac-benzoin using R. oryzae CBS-111718 as a third. Deracemisation of benzoin was performed in growth and buffer having different pH. As a result, it was found that pH influenced enantioselectivity markedly. In growth medium, the highest ee was obtained for S-benzoin as >99 % at pH:6 and conversion of benzoin to benzil was found 49 %. In buffer medium, the best ee was found for S-benzoin as 84 % at pH:9 and conversion of benzoin to benzil was calculated as 24 %.Finaly, the production of enantioselective benzoin was performed with R. oryzae CBS-111718- catalyzed benzil reduction. In growth medium, the best ee and conversion were found as >99 % and 33 %, respectively for S-enantiomer at pH:9. In buffer medium, highest ee and conversion was found for S-benzoin 31 % and 88 %, respectively in 8 day. To increase coenzyme regeneration adding different carbohydrates and alcohols as cosubstrate enhanced the conversion but ee was not affected generaly. Disruption of microorganism using ultrasound increased the reaction rate but ee value decreased.