Glukagon benzeri peptid-1 analoğu ekzenatidin glukoz ve fruktoz ile indüklenen nöronal toksisite üzerine koruyucu etkisinin araştırılması
The investigation of protective effects of glukagon-like peptide-1 (glp-1) analogue-exenatide- on glucose and fructose induced neurotoxicity
Yazar: ASGHAR KHALILNEZHAD
Danışman: PROF. DR. DİLEK TAŞKIRAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Fizyoloji = Physiology

Özet:
Giriş ve Amaç: Diyabetes mellitus, günümüzde en sık görülen metabolik hastalıklardan biri olup klinik olarak insülinin eksikliği veya insülin direncine bağlı gelişen hiperglisemi ile karakterizedir. Birçok klinik çalışmada diyabetik bireylerde Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların görülme riskinin yükseldiği bildirilmiştir. Son yıllarda glukagon benzeri peptid-1 (GLP-1) metabolik etkilerinin yanısıra nörodejeneratif hastalıklarda potansiyel tedavi ajanı olarak da ilgi çekmektedir. Bu çalışmada yüksek doz glukoz ve fruktozun kültür ortamındaki nöron hücreleri üzerine toksik etkilerini değerlendirmeyi ve GLP-1 analoğu olan ekzenatidin glukoz ve fruktozla indüklenen nörotoksisite üzerinde koruyucu etkisinin olup olmadığını araştırmayı amaçladık.
         Yöntemler: Çalışmada glukoz ve fruktozun toksik etkilerini belirlemek amacıyla insan SH-SY5Y nöroblastoma hücre dizisi kullanıldı. Nörotoksisite deneyleri için hücreler 24, 48 ve 72 saat boyunca çeşitli dozlardaki (0-100 mM) glukoz ve fruktoz ile inkübe edildi. Glukoz ve fruktozun etkin toksik dozu belirlendikten sonra ortama 24 saat boyunca çeşitli dozlarda ekzenatid (0- 500 nM) eklenerek koruyucu etkisi araştırıldı. Hücre canlılığının tayininde MTT yöntemi kullanıldı. Glukoz ve fruktoz toksisitesinin altta yatan mekanizmasını aydınlatmak amacıyla apopitotik hücre ölümü Hoechst 33258 ve kaspaz-3 ölçümü ile araştırıldı. İleri glikasyon son ürünlerinin (AGE) glukoz ve fruktoz toksisitesindeki rolü sitozolik fraksiyonlarda AGE ölçümü ile değerlendirildi. Çalışmanın sonuçları tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile incelendi. Farkın anlamlı bulunduğu değişkenler için post-hoc testi uygulandı. Sonuçlar ortalama ± ortalamanın standart hatası olarak ifade edildi.
         Bulgular: Kültür ortamına glukoz ve fruktoz eklenen kültürlerde nöron canlılığı doza ve süreye bağlı olarak anlamlı şekilde azaldı. 24 saatlik inkübasyon sonucunda hücre canlılık oranı, kültür ortamına 50 mM glukoz eklendiğinde % 88.47 ± 2.23, 50 mM fruktoz eklendiğinde % 89.9 ± 1.08, glukoz ve fruktoz 50 mM olarak birlikte eklendiğinde ise % 75.12 ± 1.18 olarak ölçüldü. Ortama ekzenatid eklenmesi ise doza bağlı şekilde hücre ölümünü azalttı. En anlamlı etki 100 nM ekzenatid eklenen gruplarda gözlendi. Hoechst 33258 ile yapılan incelemelerde yüksek doz glukoz ve fruktoza maruz kalan hücrelerde apopitotik hücre ölümünün, sitozolik fraksiyonlarda ise kaspaz-3 aktivitesinin ve AGE oluşumunun arttığı saptandı. Bu gruplara ekzenatid uygulaması ise apopitotik hücre ölümünü ve kaspaz-3 aktivitesini azaltırken, AGE oluşumunda anlamlı etki gözlenmedi.
         Sonuç: Çalışmamızın sonuçları yüksek dozlardaki glukoz ve fruktozun nörotoksisiteye yol açtığını ve GLP-1 in nöronal hasara karşı koruyucu etkilerinin olabileceğini gösterdi. Ayrıca sonuçlarımız GLP-1 in nöroprotektif etkilerinin altında anti-apopitotik mekanizmaların rolünün olduğu yönündeki görüşleri destekledi.

Abstract:
Aim: Diabetes mellitus is one of the most common metabolic disorders characterized by hyperglycemia due to insufficiency of insulin and/ or insulin resistance. Clinical studies have revealed a higher risk of neurodegenerative disorders such as Alzheimer or Parkinson's disease in diabetic patients. Recently, glucagon-like peptide (GLP-1) is an attractive potential treatment modality for various neurodegenerative diseases. In our study, we aimed to investigate the toxic effects of both high glucose and fructose on neuronal cells. Also, we aimed to assess whether exenatide, a GLP-1 analogue, has neuroprotective effects against glucose and fructose-induced toxicity.
         Materials and Methods: Human SH-SY5Y neuroblastoma cell lines were used to evaluate the toxic effects of glucose and fructose. Neurotoxicity was induced by incubating SH-SY5Y cells with different doses (0-100 mM) of glucose and fructose for 24, 48 and 72 hours. Following determination of the significant toxic doses of glucose and fructose, various doses of exenatide (0-500 nM) were added in the culture medium to assess its protective effect. MTT assay was used to measure cell viability in the cultures. In order to clarify the underlying mechanism of glucose and fructose induced-neurotoxicity, we evaluated apoptotic cell death by Hoechst 33258 staining and caspase-3 activity. Also, we measured AGE levels in cytosolic fractions of treated cells. Data were evaluated by one way analysis of variance (ANOVA) and post-hoc test. Data were expressed as mean ± standart error of mean.
         Results: Both glucose and fructose treatments decreased cell viability in neuronal cells dose and time-dependently. The cell viability was measured 88.47 ± 2.23 % and 89.9 ± 1.08 % for 50 mM glucose and 50 mM fructose-treated medium for 24 hour, respectively. Glucose and fructose- treated groups showed increased numbers of apoptotic cells, caspase-3 activity and AGE levels in cytosolic fractions. However, addition of exenadite in growth medium significantly prevented cell death in a dose-dependent manner. The most prominent effect was observed in 100 nM exenatide-treated cultures. Treatment of the cells with exenatide decreased apoptotic cell death and caspase-3 activity. However, no significant change was observed in cytosolic AGE contents in exenatide treated groups. 
         Conclusion: Our results suggest that high doses of glucose and fructose may lead to neurotoxicity and GLP-1 may have neuroprotective effects against neuronal damage by suppressing anti-apoptotic pathways.