Şap hastalığına karşı DNA aşı modeli geliştirilmesi
DNA vaccine model development against FMDV
Yazar: SULTAN GÜLÇE İZ
Danışman: PROF. DR. S. İSMET DELİOĞLU GÜRHAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Aşılar = Vaccines ; DNA = DNA ; İmmünite = Immunity ; Şap hastalığı = Foot and mouth disease

Özet:
Şap hastalığı, şap virüsünün neden olduğu çift tırnaklı çiftlik hayvanlarının çok bulaşıcı bir hastalığıdır. Şap hastalığı, ekonomik olarak Türkiye ve şap virüsünün endemik olduğu pek çok ülkede, en önemli hayvan sağlığı problemidir. Bu çalışmanın amacı, şap virüsüne karşı bir DNA aşı modeli geliştirilmesidir. Bu amaçla, çift promotorlu pIRESEGFP DNA aşı vektörü kullanılmıştır. pIRESEGFP vektörünün ilk promotoru sonrasına ScFv gen bölgesi ile şap virüsü B ve T hücre epitopları, ikinci promotoru sonrasına ise Bcl-xL anti-apoptotik proteini gen bölgeleri eklenmiştir. Böylece, pIRES2EGFP/ScFvBCBOTCTC/Bcl-xL DNA aşı vektörü oluşturulmuştur.ScFv, dendritik hücrelere özgü bir monoklonal antikorun tek zincirli değişken bölgesidir. Bu çalışmada şap virüsü antijenik epitopları ile füzyon şeklinde eksprese edilmekte antijenlerin dendritik hücrelere hedeflenmesini sağlamak için DNA aşı vektöründe kullanılmaktadır. Bunun yanında, DNA aşı vektörüne, aşılanan hücrelerin yaşam ömrünün uzatılması amacıyla Bcl-xL anti-apoptotik proteini eklenmiştir. İşlemler sonucunda, Bcl-xL anti-apoptotik proteinini eksprese eden hücrelerde, şap virüsü antijenik epitoplarının uzun süreli ekspresyonunun sağlanması ve hayvan modelinde, şap virüsü antijenik epitoplarına karşı gelişen bağışık yanıtın arttırılması amaçlanmıştır.Bu çalışmada geliştirilen DNA aşısı ve kontrol vektörleri kullanılarak DNA aşı vektörünün etkinliği in vitro hücre kültüründe ve in vivo hayvan modelinde belirlenmiştir. İn vitro hücre kültüründe, DNA aşı vektörü ile transfeksiyon sonrası, Bcl-xL anti-apoptotik proteinin ve ScFv proteini ile füzyon şeklinde şap virüsü epitoplarının ekspresyonu Western blot analizi ile gösterilmiştir. Bcl-xL anti-apoptotik proteininin etkilerinin gösterilmesi için serum yoksunluğu ile apoptozis uyarılmış ve aktive kaspaz 3 oranı akış sitometrisi ile ölçülmüş Bcl-xL anti-apoptotik protein ekspresyonunun transfekte hücrelerde ölüm sürecini geciktirdiği gösterilmiştir. Farelerde yapılan in vivo hayvan denemelerinde salgısal bağışık yanıt, serum nötralizasyon testi ve peptit ELISA ile hücresel bağışık yanıtlar ise akış sitometrisi ile CD4+ ve CD8+ T lenfositlere ait hücre içi IFN-? ve IL-4 salgılayan hücre oranının saptanması, sitokin ELISA ile hücre dışına salgılanan IFN-? ve IL-4 miktarlarının tayini ile belirlenmiştir.Geliştirilen DNA aşı modelinin etkinliğinin araştırılması için farklı fare gruplarına sadece DNA aşısı, DNA aşısı sonrası son doz olarak peptit aşısı veya sadece peptit aşısı uygulanmıştır. Elde edilen bulgulara göre CD4+ ve CD8+ T lenfositlere ait hücre içi IFN-? salgılanmasının en güçlü şekilde DNA aşısı ve ikinci en yoğun olarak da DNA aşısı sonrası soz doz olarak uygulanan peptit aşısı ile sağlanması, şap virüsüne karşı hücresel bağışık yanıtın başlıca DNA aşısı tarafından uyarıldığını göstermektedir.Bu çalışmada elde edilen veriler ışığında, şap virüsüne karşı nötralizan antikor, özgün IgG2a antikoru, CD4+ ve CD8+ T lenfositlere ait hücre içi IFN-? salgılanan geniş yelpazeli bir bağışık yanıt oluşturulması istendiğinde, öncelikle DNA aşısı ile hücresel bağışık yanıtın oluşturulması ve sonrasında oluşan hücresel bağışık yanıtın DNA aşısı sonrası son doz olarak peptit aşısının uygulanması ile salgısal yönünün güçlendirilmesinin önemli olacağı sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Foot and mouth disease (FMD) is highly contagious disease of cloven-hoofed livestock which is caused by foot and mouth disease virus (FMDV). FMD is the most economically important animal health problem for Turkey and for most of FMDV endemic countries. The aim of this study is to generate a DNA vaccine model against FMDV. For this purpose, a dual promoter pIRESEGFP DNA vaccine vector was used. After the first promoter single chain variable fragment (ScFv) in frame with FMDV B and T cell epitopes were inserted, after the second promoter Bcl-xL anti-apoptotic protein was inserted to have pIRES2EGFP/ScFvBCBOTCTC/Bcl-xL DNA vaccine vector.ScFv is a monoclonal antibody specific for dendritic cells. In this study, ScFv is expressed as fusion protein with FMDV epitopes to target the FMDV antigens to dendritic cells in the DNA vaccine vector. In addition, Bcl-xL anti-apoptotic protein was inserted in the DNA vaccine vector for prolonging the survival of the vaccinated cells. It?s aimed to have a higher immune response against FMDV antigenic epitopes in the animal model due to the longer expression of the FMDV antigenic epitopes in the Bcl-xL anti-apoptotic protein expressing cells.The efficacy of the DNA vaccine vector was determined with in vitro cell cultures and mice model in vivo. In the in vitro cell culture system, after transfection with DNA vaccine vector, expression of Bcl-xL anti-apoptotic protein and FMDV epitopes fused with ScFv were determined by Western blot analysis. To determine the effects of Bcl-xL anti-apoptotic protein, apoptosis were induced by serum deprivation and active caspase 3 were measured by flow cytometry. It?s shown that, Bcl-xL anti-apoptotic protein expression delayed the death period of transfected cells. With in vivo mice model, humoral immune responses were assayed by serum neutralization assay and peptide ELISA, cellular immune responses were determined by flow cytometry and ELISA. Intracellular IFN-? and IL-4 secretion from CD4+ and CD8+ T lymphocytes were determined by flow cytometry and extracellular IFN-? and IL-4 secreation were measured by ELISA.Different mice groups were vaccinated by only DNA vaccine, DNA vaccine prime + peptide boost and only peptide vaccine. The findings of this study demonstrated that the most powerful immune response was induced by only DNA vaccine group which is followed by DNA vaccine prime + peptide boost which indicates that the cellular immune response against FMDV is induced by DNA vaccination.In the light of the findings of this study, to have a broader immune response against FMDV which includes neutralization antibody response, specific IgG2a response and intracellular CD4+, CD8+ spesific IFN-? response; first cellular immune responses must be primed with DNA vaccination after the cellular immune response must be boosted by peptide vaccination to enhance the humoral immune response against FMDV.