Altın nanopartiküllerde polimer kaplamanın oksidatif stres ve DNA hasarı üzerine etkileri
The effects of polymer coating of gold nanoparticles on oxidative stress and DNA damage
Yazar: GAMZE TİLBE ŞEN
Danışman: PROF. DR. BELMA KOÇER
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Altın nanopartikülleri (Au NP), yüzeylerinin kolaylıkla işlevsel hale getirilebilmesi ve yakın infrared (NIR) bölgede ışığı absorblamaları gibi özellikleri nedeniyle biyolojik ve medikal uygulamalarda sıklıkla tercih edilir. Au NP özellikle izleme ve görüntüleme, biyo-algılama, gen, kanser tedavisi, fototermal tedavi ve ilaç taşınımı gibi farklı uygulamalarda kullanılır. Literatürdeki bazı çalışmaların sonuçları Au NP'lerin hücre içi oksidatif stresi artırabildiği ve DNA hasarına neden olabildiğine işaret etmektedir; ancak bu alandaki çalışmaların sonuçlarının çelişkili olduğu görülmektedir. Toksik etkilerinin azaltılabilmesi için Au NP'lerin yüzeysel özelliklerinin değiştirilmesi önerilmektedir. Bu amaçla, polietilenglikol (PEG) ve polietilenimin (PEI) kaplamalar kullanılabilir. PEG, nötr ve yüksek oranda hidrofiliktir; böylece Au NP'nin retikuloendotelyal sistem tarafından alımı ve spesifik protein adsorpsiyonunu önler; nanopartiküllerin vücutta dolaşım süresini uzatır. Aynı zamanda nanopartiküle kararlılık, biyouyumluluk ve çoklu işlevsellik gibi özellikler kazandırır. Diğer taraftan, PEI'nin de biyouyumlu olması nedeniyle Au NP'lerin kararlılık ve biyouyumluluğunu artırdığı bildirilmiştir. Ancak, literatürde Au NP'lerde yapılan bu değişikliklerin oksidatif stres üzerine olan etkileri detaylı olarak araştırıldığı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu tez çalışmasının amacı Au NP'nin sitotoksisite, oksidan/antioksidan statü parametreleri ve DNA hasarı üzerine etkilerinin insan hepatoma hücreleri (HepG2) üzerinde detaylı olarak incelenmesi ve PEG ile PEI kaplamanın toksisite üzerindeki etkilerinin araştırılmasıdır. Bu amaçla, Au NP'leri (45 nm), PEG veya PEI (molekül ağırlığı 2000 ve 25000) ile kaplanmış; çalışma grupları kontrol, Au, Au-PEG, Au-PEI 2000 ve Au-PEI 25000 olarak belirlenmiştir. HepG2 hücrelerinin Au NP'lerinin farklı konsantrasyonlarına 24 saat inkübasyonunu takiben 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) yöntemi ile tayin edilen yarım maksimal inhibitor konsantrasyon 50 (IC50) değerleri, Au, Au-PEG ve Au-PEI 2000 için sırasıyla 167 µg/ml, 257 µg/ml ve 198 µg/ml olarak belirlenmiştir. Au-PEI 25000 grubu için IC50 değeri belirlenmemiştir. Çalışma gruplarında, hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS), antioksidan enzim aktiviteleri [glutatyon peroksidaz 1 (GPx1), katalaz (CAT), süperoksit dismutaz (SOD)]; total glutatyon (GSH), lipit peroksidasyonu ve protein oksidasyon düzeyleri ve DNA hasarı incelenmiştir. Au NP, HepG2 hücre hattında IC30 konsantrasyonda 24 saat maruziyeti sonucu hücre içi ROS düzeylerinde artışa neden olurken, incelenen diğer parametrelerde kontrol grubuna kıyasla anlamlı düzeyde bir farklılığa neden olmamıştır. Kaplama yapılan tüm gruplarda da hücre içi ROS düzeylerinin kontrol grubuna kıyasla önemli düzeyde arttığı gözlenmekle birlikte; incelenen diğer parametrelerde (protein oksidasyon düzeyleri hariç) Au-PEG grubunda Au grubuna kıyasla anlamlı bir farkın oluşmadığı belirlenmiştir. Au-PEI 2000 grubunda antioksidan enzim aktivitelerinde (SOD, GPx1) kontrol grubuna kıyasla önemli düzeyde artışların gözlendiği; Au-PEI 25000 grubunda ise, tüm oksidan/antioksidan statü parametrelerinde anlamlı düzeyde değişikliklerin oluştuğu belirlenmiştir. DNA baz hasarının bir göstergesi olan 8-hidroksi-2'-deoksiguanosin (8-OHdG) düzeylerinde tüm çalışma gruplarında kontrol grubuna kıyasla anlamlı bir farklılık saptanmamıştır. Çalışmanın sonuçları, IC30 dozunda Au NP'lerinin HepG2 hücre hattında oksidatif stres ve DNA hasarını önemli düzeyde etkilemediğini; PEG ile kaplamanın toksisite üzerinde bir etkisi olmadığını; ancak Au NP'lerini PEI ile (özellikle de PEI 25000 ile) kaplanmasının oksidatif stresi indükleyebileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Gold nanoparticles (Au NPs) are preferred in many biological and medical applications due to their easy surface functioning property and their ability to absorb light in near infrared (NIR) region. Au NPs are specifically used in many applications like monitoring and visualization, biosensoring, gene and cancer therapy, photothermal therapy and drug delivery.  The results of some studies in literature pointed out that Au NPs could increase intracellular oxidative stress and cause DNA damage; however results of studies in this field are contradictory. In order to reduce their toxic effects, it is suggested that the surface properties of Au NPs should be changed. For this reason, polyethyleneglycol (PEG) and polyethyleneimine (PEI) coatings can be used. PEG is neutral and highly hydrophilic; therefore it prevents the uptake of Au NPs by reticuloendothelial system, inhibits specific protein adsorption and increases their circulation period in the body. In addition, it adds several properties to nanoparticles, including stability, biocompatibility and multi-functioning. On the other hand, as PEI is also biocompatible, it was indicated that it can also increase the stability and biocompatibility of Au NPs. However, there is not any comprehensive study in literature that compares the effects of the variations of Au NPs on oxidative stress. The aim of this thesis is to examine the effects of Au NPs on cytotoxicity, oxidant/antioxidant parameters and DNA damage in human hepatoma cells (HepG2) in detail and to search for the protective roles of PEG and PEI coatings. For this, Au NPs (45 nm) were coated with PEG or PEI (molecular weights of 2000 and 25000) and the study groups were determined as control, Au, Au-PEG, Au-PEI 2000 and Au-PEI 25000. After incubating HepG2 cells with different concentrations of Au NPs for 24 hours, the half maximal inhibitory concentration (IC50) values using (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dphenyltetrazolium bromide (MTT) assay for Au, Au-PEG and Au-PEI 2000 were found to be 167 µg/ml, 257 µg/ml, and 198 µg/ml, respectively. The IC50 value for the Au-PEI 25000 group was not determined. In the study groups, intracellular reactive oxygen species, antioxidant enzyme activities [glutathione peroxidase 1 (GPx1), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD)]; total glutathione (GSH), lipid peroxidation and protein oxidation levels as well as DNA damage were determined. After HepG2 cells were exposed to IC30 concentrations of Au NPs, intracellular ROS levels were increased; however no other changes were determined in any of the measured parameters in the Au group vs. control. In all of the coated Au groups, the intracellular ROS levels were significantly higher vs control; however other than intracellular ROS levels, no significant alterations (except an increase in protein oxidation) were observed in Au-PEG group vs. Au group. In Au-PEI 2000 group, there were significant changes in some of the antioxidant enzyme activities (SOD, GPx1) vs. control; however, in Au-PEI 25000 group, all of the oxidant/antioxidant parameters were markedly altered vs. both control and Au group. 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) levels were measured as a marker of DNA base damage and 8-OHdG levels were not different in any of the study groups when compared to control. The results of this study suggest that at IC30 doses, Au NPs does not affect oxidative stress and DNA damage significantly; PEG coating does not have an impact on toxicity; however coating Au NPs with PEI (particularly by PEI 25000) can induce oxidative stress.