Mezenşimal kök hücrelerden farklılaştırılmış işaretli kardiyomiyositlerin in vivo implantasyon sonrası ektopik göç potansiyelinin incelenmesi
Investigation of ectopic migration potential of labeled cardiomyocytes differentiated from mesenchymal stem cells after in vivo implantation
Yazar: ESİN AKBAY
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ ONUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışma kapsamında, sıçan yağ dokusundan izole edilen mezenşimal kök hücreler 5-Aza ile kardiyomiyosite farklılaştırıldıktan sonra BrdU ile işaretlenmiştir. İyonik olan ve olmayan deterjanlar ile muamele sonucunda aselülerize edilmiş kalp doku iskelelerine bu farklılaştırılmış işaretli hücrelerin uygulanması ve bu hücre ekili yapı malzemesi kompozitinin sıçan retroperitoneumuna implantasyonu ve implante edilen hücrelerin ektopik göçü incelenmiştir.   
Çalışmanın ilk bölümünde sıçan gonadal ve subkutan yağ dokusu izole edilmiştir. Kardiyomiyojenik farklılaştırma faktörü olarak kimyasal ajan olan 5-Aza kullanılmıştır. Farklılaştırma prosedürü sırasında besi ortamı haftada iki kez değiştirilmiş ve hücreler dört hafta boyunca 37oC'de ve %5CO2-%95O2'de standart kültür koşullarında inkübe edilmiştir. Hücre farklılaşmasını takiben karakterizasyon için kardiyomiyositlere özgül moleküllerle floresan boyaması yapılmıştır. Kardiyak genlerin ifadesinin araştırılması için RT-PCR analizi yapılmıştır. Kardiyomiyosite farklılaştırıldığı düşünülen kök hücreler BrdU (5-bromo-2-deoksiüridin) ile kültür ortamında 24 saat süre ile inkübe edilerek işaretlenmiştir. Hücrelerin işaretlenmesinden sonra tripsinizasyon ile süspanse halinde elde edilen hücreler aselülerize edilmiş kalp doku iskeleleri ile 24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrasında (a) hücre içeren doku iskelesi (b) hücre içermeyen doku iskelesi ve (c) kontrol grubu olacak şekilde üç farklı grup ile in vivo çalışmalar yapılmıştır.  Anesteziye alınan tüm deney hayvan grupları implantasyonu takiben 1., 2. ve 4. haftalarda sakrifiye edilmiştir. İmplante edilen doku iskelesi ile bazı dokular (karaciğer, dalak, abdominal aorta, böbrek ve kalp) toplanmıştır. Elde edilen dokular immünohistokimyasal tekniği ve RT-PCR ile incelenmiştir. 
Sonuç olarak; kardiyomiyosite farklılaşan hücrelerin kardiyogenezis öncülü olan genleri (MEF2B, GATA-4, ACTC-1) ifade ettiği gösterilmiştir. AdMSC'ler için BrdU işaretleme yöntemi optimize edilmiştir. 1µM BrdU ile 24 saat inkübasyonun işaretleme için ideal olduğu gösterilmiştir. Aselülerize doku yapı iskelesinin eldesinde, hücre uygulaması için düşük konsantrasyonlardaki iyonik ve iyonik olmayan deterjan solüsyonlarını içeren yöntemin en verimli yöntem olduğu gösterilmiştir. İmplante edilen doku iskelelerinin herhangi bir immünolojik reaksiyona neden olmadığı, implantasyon bölgesinde enfeksiyona yol açmadığı gösterilmiştir. Aynı zamanda doku iskelesi üzerine uygulanan hücrelerin zaman içerisinde kardiyomiyosite özgü genleri ifade etme potansiyellerinin arttığı gösterilmiştir.

Abstract:
In this study, mesenchymal stem cells were isolated from the rat fat tissue. Obtained cells were labeled by BrdU after mesenchymal stem cells were differentiated by 5-Aza to cardiomyocytes. Acellularised cardiac tissue scaffolds were acquired by applying of ionic and non ionic detergents and labeled differentiated cells were implemented to the obtained asellularized scaffolds. Implantation of these cells structure material composite to the rat retroperitoneum and ectopic migration of the implanted cells were examined by different techniques.
The rat gonadal and subcutaneous adipose tissue was isolated in the first part of the study. 5-Aza, a chemical agent, was used as a cardiomyogenic differentiation factor. The medium was changed twice per week during the differentiation procedure and the cells were incubated for four weeks at 37 °C and 5%CO2- 95%O2 in standard culture conditions. Fluorescent staining with specific molecules for cardiomyocytes were selected for characterization following the cell differentiation. RT-PCR analysis was performed to investigate the expression of cardiac specific genes. The stem cells which were expected to differentiate to the cardiomyocytes were labeled using the BrdU (5-bromo-2-deoxyuridine) by incubation for 24 hours in standart culture medium. After the labeling the cells, the cells which are obtained as suspended by trypsinization were incubated with the acellularised cardiac tissue scaffolds for 24 hours.  After incubation, three different groups are worked with as (a) tissue scaffold comprising cells (b) cell-free tissue scaffolds and (c) control group. All experimental animal groups which received anesthesia were sacrificed at 1st, 2nd and 4th weeks following the implantation. The implanted tissue scaffolds and some tissues (liver, spleen, abdominal aorta, kidney and heart) were collected. The collected tissues were examined by immunohistochemical techniques and RT-PCR.
In conclusion, it had been shown that differentiated cardiomyocytes expressed the genes (MEF2B, GATA-4, ACTC-1) which are known as cardiomyocyte precursors. BrdU labeling method was optimized for AdMSCs. It had been found that 1µM BrdU with 24 hour incubation time is ideal for marking. Also, the method comprising the ionic and non-ionic detergent solution at low concentrations for cell application had been shown as the most efficient method to obtain acellularized tissue scaffold. Implanted tissue scaffolds did not cause any immunological reaction and infection around implantation area. In addition,  cardiomyocyte specific gene expression potential increased over time by the cells applied on the tissue scaffolds.