Epididimal rat spermi kriyoprezervasyonunda sulandırıcıya ilave edilen L-glutathione ve alpha-tocopherol'ün sperm kalitesi üzerine etkileri
Effects of L-glutathione and alpha-tocopherol added to extenders on sperm quality in epididymal rat sperm cryopreservation
Yazar: RAMAZAN ÖRDEK
Danışman: PROF. DR. CENGİZ YILDIZ
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum,Jinekoloji ve Suni Tohumlama (Veterinerlik) Anabilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Sunulan çalışmada, rat sperminin dondurulabilirliği üzerine, %8 laktoz ve %23 yumurta sarısı ve %10'luk tris solüsyonu içeren sperm kriyoprezervasyon medyumuna ilave edilen farklı dozlardaki L-Glutathione (2.5 mM, 5 mM ve 10 mM) ve Alpha-Tocopherol (0.1 mM, 0.2 mM ve 0.5 mM)'ün etkileri araştırıldı. Araştırmada rat sperminin dondurulmasında antioksidan ilave edilmeyen %8 laktoz, %23 yumurta sarısı ve %10'luk tris solüsyonu karışımı kontrol grubu olarak tutuldu. Araştırmada 12-16 haftalık yaşta, 7 farklı çalışma grubunda toplam 56 adet Wistar-Albino ırkı erkek rat kullanıldı (n=8). Ratların servikal dislokasyon yöntemiyle sakrifiye edilmesiyle kaudalarından elde edilen spermler kontrol ve çalışma grubu medyumları içerisinde sulandırıldı. Kryopreserve edilen sperm payetleri 37oC'lik su banyosunda 30 saniye süreyle çözdürüldü. Dondurulup çözdürülen payetlerde motilite, ölü spermatozoon oranı, anormal akrozom oranı, plazma membran bütünlüğü, HTF (Human Tubal Fluid) içerisinde 90 dakikalık motilite dayanıklılık ve hücre apoptozu yönlerinden analizler yapıldı. Dondurma çözdürme sonrası %12.50±1.36'lik kontrol grubu ile karşılaştırıldığında en yüksek motilite %23.89±1.82 ile 0.1 mM Alpha-Tocopherol ve %28.00±2.71 ile 2.5 mM L-Glutathione gruplarında tespit edildi (p<0.01). Ölü spermatozoon ve anormal akrozom oranları bakımından araştırma grupları ile kontrol grubu arasında önemli bir fark bulunmadı (p>0.01). Sağlam plazma membran oranları %27.78±2.39'luk 0.1 mM Alpha-Tocopherol ve %31.40±1.12'lik 2.5 mM L-Glutathione gruplarında, %22.39±2.00'lik kontrol grubundan daha yüksek bulundu (p<0.01). Dondurma ve çözdürme sonrası, 90. dakikaya kadar en iyi motilite dayanıklılık (longevity) süresi, kontrol gurubu ile karşılaştırıldığında 0.1 mM Alpha-Tocopherol ve 2.5 mM L-Glutathione gruplarında belirlendi (p<0.01). Çözüm sonrası, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında en düşük apoptotik ve nekrotik ölü hücre oranı 0.1 mM Alpha-Tocopherol ve 2.5 mM L-Glutathione gruplarında tespit edildi (p<0.01).  
Sonuç olarak, rat spermi kriyoprezervasyon medyumuna 0.1 mM Alpha-Tocopherol veya 2.5 mM L-Glutathione ilavesinin dondurup çözdürme sonrası motilite, fonksiyonel plazma membran bütünlüğü, motilite dayanıklılığını artırdığı, apoptotik ve nekrotik hücre oranını düşürdüğü ve böylece rat spermi dondurma medyumunda başarılı bir şekilde kullanılabileceği belirlendi.

Anahtar Kelimeler: Rat Spermi, Kriyoprezervasyon, Antioksidan, Alpha-Tocopherol, L-Glutathione, Sperm Analiz, Apoptozis.

Abstract:
In the presented study, the effects of different doses of L-Glutathione (2.5 mM, 5 mM and 10 mM) and Alpha-Tocopherol (0.1 mM, 0.2 mM and 0.5 mM) added to sperm cryopreservation medium containing 8% lactose, 23% egg yolk and 10% tris solution on the freezability of rat sperm were investigated. In the study, a mixture of 8% lactose, 23% egg yolk and 10% tris solution without added antioxidants was kept as the control group fort he freezing of rat sperm. A total of 56 Wistar-Albino male rats (n=8) aged 12-16 weeks were used in the study in 7 different study groups. The rats were sacrificed by cervical dislocation method and the sperm obtained from their caudas were diluted in control and study group media. Cryopreserved sperm straws were thawed in a 37oC water bath for 30 seconds. Motility, dead spermatozoon rate, abnormal acrosome rate, plasma membrane integrity, 90-minute motility durability in HTF (Human Tubal Fluid) and cell apoptosis were analyzed in the frozen-thawed straws. After freezing and thawing, the highest motility was detected in the 0.1 mM Alpha-Tocopherol group with 23.89±1.82% and in the 2.5 mM L-Glutathione group with 28.00±2.71% compared to the control group with 12.50±1.36% (p<0.01). There was no significant difference between the study groups and the control group in terms of dead spermatozoon and abnormal acrosome rates (p>0.01). Intact plasma membrane rates were found to be higher in the 0.1 mM Alpha-Tocopherol group (27.78±2.39%) and 2.5 mM L-Glutathione group (31.40±1.12%) than in the control group (22.39±2.00%) (p<0.01). After freezing and thawing, the best motility endurance (longevity) period until the 90th minute was determined in the 0.1 mM Alpha-Tocopherol and 2.5 mM L-Glutathione groups compared to the control group (p<0.01). After thawing, the lowest apoptotic and necrotic dead cell rates were detected in the 0.1 mM Alpha-Tocopherol and 2.5 mM L-Glutathione groups compared to the control group (p<0.01). 
As a result, it was determined that the addition of 0.1 mM Alpha-Tocopherol or 2.5 mM L-Glutathione to rat sperm cryopreservation medium increased motility, functional plasma membrane integrity, motility durability after freezing and thawing, and reduced the rate of apoptotic and necrotic cells, thus it can be used successfully in rat sperm freezing medium.

Keywords: Rat Sperm, Cryopreservation, Antioxidant, Alpha-Tocopherol, L-Glutathione, Sperm Analysis, Apoptosis.