Farklı klinik candida suşlarının çeşitli malzemeler üzerinde oluşturdukları biyofilmlerin ve bu biyofilmler üzerine etkisi olan farklı bitkisel maddelerin araştırılması
Investigation of biofilms formed by different clinical candida strains on various materials and effects of different plant substances on these biofilms
Yazar: GÜLCAN ŞAHAL
Danışman: DOÇ. DR. IŞIL SEYİS BİLKAY
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
İnsan vücudunda zarar görmüş çeşitli dokuların ve organların yerini alan veya destekleyen biyomateryaller ile ilgili karşılaşılan en önemli sorun; biyofilm ilişkili enfeksiyonlardır. Bu enfeksiyonlara karşı yeni stratejiler geliştirilmesi, biyomateryal kullanan kişilerin yaşam kalitelerini artırmaya yardımcı olacaktır. Bu çalışmada, yüksek seviyede biyofilm oluşturan Candida türlerinin biyomateryal ilişkili biyofilm oluşumlarına karşı mücadele edilmesi hedeflendi. Bu bağlamda, Candida türlerinin biyofilm oluşumları saptandı ve yüksek seviyede biyofilm oluşturan Candida türlerine karşı en etkili olan antifungal ilaçlar belirlendi. Ardından farklı biyomalzemeler üzerindeki biyofilm oluşum seviyeleri belirlenen Candida türlerinin, biyofilm oluşumları üzerine, bazı bitkisel maddelerin antibiyofilm etkileri incelendi. Sonuçlarımıza göre; çoğu Candida cinsi suşun; C. tropicalis ve C.  parapsilosis oldukları ve bütün Candida suşlarının vajen materyali ile kadın hastalardan en yüksek oranlarda izole edildikleri belirlendi. Yüksek seviyede biyofilm oluşturan Candida cinsi suşların ise; C. tropicalis, C. glabrata, C. orthopsilosis ile C. parapsilosis türlerine ait oldukları ve vajen, trakeal aspirat, idrar ile balgamdan, diğer materyallere kıyasla daha yüksek oranda izole edildikleri saptandı. Yüksek seviyede biyofilm oluşturan Candida türlerinin antifungal ilaçlara karşı duyarlılıklıkları incelendiğinde; en etkili antifungalin; 5-Flusitosin olduğu görüldü. İlave olarak; bütün yüksek seviyede biyofilm oluşturan C. glabrata ve C. parapsilosis suşlarının, Amfoterisin B antifungaline karşı da duyarlı oldukları gözlenirken, tüm yüksek seviyede biyofilm oluşturan Candida türlerinin, en yüksek oranda direnç gösterdikleri antifungaller; Itrakonazol ve Vorikonazol olarak saptandı (%88). Yüksek seviyede biyofilm oluşturan Candida suşlarının farklı malzemeler üzerinde biyofilm oluşumları incelendiğinde; C. tropicalis T26 suşunun, polietilen malzemesi (θw:71±5) üzerinde; C. tropicalis V89 suşunun teflon malzemesi (θw:96±10) üzerinde; C. tropicalis İ71 suşunun ise teflon ve polietilen malzemelerinin her ikisi üzerinde birden, cam malzemeye (θw:22±5) kıyasla daha yüksek seviyede biyofilm oluşturdukları saptandı. Esansiyal yağların Candida türlerine karşı etkileri incelendiğinde; Hollanda'dan temin edilen limonotu yağının, bütün Candida türlerine karşı düşük konsantrasyonda en etkili antifungal yağ olduğu gözlendi. İlave olarak, Türkiye'den ve Hollanda'dan temin edilen her iki limonotu yağının birden, bütün Candida türlerinde biyofilm inhibisyonlarına yol açtıkları saptandı. Bunlardan farklı olarak, limon ve tarçın yağlarının, C. parapsilosis türünde; kimyon yağının ise; C. glabrata ile C. parapsilosis türlerinde biyofilm oluşumu artışına neden oldukları gözlendi. Çalışmamızın devamında, idrardan izole edilen C. tropicalis İ71 suşu ile vajenden izole edilen C. tropicalis V89 ve C. parapsilosis V92 suşlarının biyofilm oluşumlarının; %8 limonotu yağı ile kaplanmış silikon-lastik malzemesi üzerinde 24 saatlik inkübasyon sonunda azaldıkları saptandı. Yüksek seviyede biofilm oluşturan C. tropicalis İ71 suşunun; yüksek adhezyon hızına (j0:353±19 cm 2.s 1); daha hidrofobik özelliğe (θw:54°) ve kendisinden daha düşük biyofilm oluşturan C. glabrata T17 suşuna göre ( 7.5±0.5 mV) daha yüksek negatiflikte zeta potansiyaline sahip olduğu ( 13.8±0.8 mV) gözlendi. İlave olarak, her iki limonotu yağı ile limon ve kimyon yağlarının; C. tropicalis İ71 suşunun polietilen, cam ve teflon malzemeleri üzerindeki biyofilm oluşumunu inhibe ettikleri gözlendi. Tarçın yağının ise, aynı suşun cam üzerindeki biyofilm oluşumunu artırdığı saptandı. Çalışmamızın son aşamasında; flow chamber sistemi kullanılarak biyofilm oluşturması sağlanan C. tropicalis İ71 suşunun 24 saatlik biyofilmleri, 30 μl/ml limonotu yağı ile 1ml/dakika akış hızıyla yıkandı ve yıkama esnasında Optikal Koherans Tomografisi ile yapılan gerçek-zamanlı incelemeler; söz konusu biyofilmlerin yapısında parçalanmalar ve kopmalar meydana geldiğini gösterdi.

Anahtar Kelimeler: Antibiyofilm, Antifungal İlaçlar, Biyomalzemeler, Candida Türleri, Esansiyal Yağlar

Abstract:
The most important problems among biomaterials which substitutes or supports various human tissues and organs, are biofilm associated infections. The development of new strategies against these infections will help to improve the quality of life of individuals who use biomaterials. In this study, it is aimed to fight biomaterial associated biofilm formations of high level biofilm forming Candida species. In this respect, biofilm formations of Candida species were determined and the most efficient antifungal drugs against high level biofilm forming Candida species were established. Then, antibiofilm effects of some plant substances on biofilm formation of Candida species whose biofilm formation levels were identified on different materials, were investigated. According to our results; it was observed that, most of the Candida strains were C. tropicalis ve C. parapsilosis and all Candida species were isolated from vagen specimens and woman patients in highest rates. As for high level biofilm forming Candida strains, it was determined that; they belong to; C. tropicalis, C. glabrata, C. orthopsilosis and C. parapsilosis species, and were isolated more frequently from vagen, tracheal aspirate, urine and sputum, compared to other clinical speciemens. When the susceptibilities of high level biofilm forming Candida species against antifungal drugs were examined; the most efficient antifungal was seen as 5 Flucytosine. In addition, all high level biofilm forming C. glabrata and C. parapsilosis strains were observed as susceptible also to Amphotericin B; whereas, the highest rates of antifungal resistance among all high level biofilm forming Candida species were established against antifungals of Itraconazole and Voriconazole (%88). When the biofilm formations of high level biofilm forming Candida strains on different biomaterials were examined; it was observed that, biofilm formation levels of C. tropicalis T26 strain on polyethylene (θw:71±5); C. tropicalis V89 strain on teflon (θw:96±10) and C. tropicalis I71 strain on both polyethylene and teflon were higher, compared to their biofilm formation levels on glass (θw:22±5). When the effects of essential oils against Candida species were examined; lemongrass oil which was obtained from Holland (Netherlands), was observed to be the most efficient essential oil with lowest concentrations against all Candida species. In addition, it was established that; both lemongrass oils which were obtained from Turkey and Netherlands caused inhibitions on biofilm formations of all Candida species. Apart from these, increases in biofilm formations of C. glabrata and C. parapsilosis with cumin oil and C. parapsilosis with lemon and cinnamon oils were observed. In the next part of our study; it was established that biofilm formations of urine isolate of C. tropicalis I71 and vagina isolates of C. tropicalis V89 and C. parapsilosis V92 strains decreased on 8% lemongrass oil coated silicone-rubber material after 24 hours. High level biofilm forming C. tropicalis I71 strain was observed to have a high adhesion rate (j0:353±19 cm 2.s 1); more hydrophobic property (θw:54°) and more negative zeta potential ( 13.8±0.8 mV), compared to the zeta potential of less biofilm forming C. glabrata T17 strain ( 7.5±0.5 mV). In addition; both two lemongrass oils, lemon and cumin oils inhibited biofilm formation of C. tropicalis I71 on polyethylene, glass and teflon materials; whereas cinnamon oil was observed to increase biofilm formation of the same strain on glass. In the last part of our study, 24 hours old biofilms of C. tropicalis I71 which were obtained by using flow chamber system, were rinsed with 30 μl/ml lemongrass oil at 1ml/min flow rate and real-time observations which were done by Optical Coherence Tomography during rinsing; showed that there were disruptions and detachments on this biofilm structure.


Key Words: Antibiofilm, Antifungal Drugs, Biomaterials, Candida Species, Essential Oils