Rubus türlerinde yeni tanımlanan virüslerin moleküler yöntemlerle taranması ve raspberry bushy dwarf vırus (Idaeovirus rubi)'nin yüksek kapasiteli dizileme yöntemi ile tüm genom analizi
Screening of newly identified viruses in rubus species by molecular methods and whole genom analysis of raspberry bushy dwarf virus (Idaeovirus rubi) by high throughput sequencing method
Yazar: KIVILCIM ÖRDEK
Danışman: PROF. DR. KADRİYE ÇAĞLAYAN
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Rubus cinsine ait bitkileri enfekte eden 40'tan fazla virüs bulunmakla birlikte ülkemizde en yaygın olanı raspberry bushy dwarf virus (RBDV) olarak saptanmıştır. RBDV, böğürtlen dışındakırmızı ve siyah ahududuları, bazı hibrit üzümsü meyveleri de enfekte edebilmekte, bitkilerde bodurlaşma, yapraklarda sararma, meyvelerde dağılma gibi simptomların yanı sıra bazı koşullarda hiçbir belirti vermeden de enfeksiyon yapabilmektedir.Bu çalışmada, 2019-2022 yıllarında ülkemizde önemli Rubus spp.yetiştiriciliği yapılan illerden toplanan böğürtlen ve ahududu örneklerinin yeni tanımlanan virüslerden strawberry necrotic shock virus (SNSV), blackberry chlorotic ringspot virus (BCRV), blackraspberry necrosisvirus (BRNV), blackberry yellow vein associated virüs (BYVaV), raspberry leaf mottle virus (RLMV)ve  bilinen virüslerden tomato ringspot virüs (ToRSV) vetobacco ringspot virus (TRSV)'ye karşı RT-PCR analizleriyle taranması ve ülkemizde enyaygın virüs olarak tespit edilen RBDV'nin "Yüksek Kapasiteli Dizileme''(YKD) teknolojisi ile tüm genom analizlerinin yapılması amaçlanmıştır.Farklı illerden toplanan 303 örnek RBDV dışındaki diğer virüsler açısından negatif bulunurken, RBDV'nin RNA3 bölgesini çoğaltan tanı primerleri kullanılarak yapılan RT-PCR analizlerinde 81 örnek pozitif bulunmuştur.YKD analizleri için Hatay böğürtlen örneklerinden karma bir örnek hazırlanarak"virüsle ilişkili nükleik asit (virion associated nucleic acid=VANA)" yöntemi ile RNA izolasyonu yapılmış ve  RBDV tüm  genom verileri elde edilmiştir.RBDV pozitif bulunan örneklerden tüm genom analizi için izolatların seçiminde coğrafik orijinleri, virüsün yaygınlık durumu ve bitki türü göz önünde bulundurularakHatay'dan 5 böğürtlen, Bursa'dan 5 ahududu,Ankara'dan  2 ahududu ve  2 böğürtlen olmak üzere 4 örnek, Isparta'dan 4 ahududu, Bartın'dan 2 ahududu örneği  seçilmiştir. YKD analizleriyle elde edilen RBDV tüm genomunu Sanger dizileme yöntemiyle doğrulamak amacıyla RBDV'nin RNA 1 bölgesi için 8,  RNA 2 bölgesi için ise 4 farklı primer çifti tasarlanarak PCR ile çoğaltılmış ve elde edilen ürünler klonlanmıştır. Ülkemize ait RBDV izolatlarının RNA1 ve RNA2 bölgesi için çizilen filogenetik ağaçlarda tüm ahududu izolatları böğürtlenlerden ayrı bir grupta diğer dünya izolatları ile birlikte kümelenme göstermiştir. Böğürtlen izolatları içerisinde de Hatay'dan elde edilen böğürtlen izolatları,  her iki filogenetik ağaçta da ayrı kollarda gruplanarak RBDV'nin en önemli doğal konukçusu olan Rubus türlerinden elde edilen izolatlarla değil bağ ve kiraz gibi RBDV'nin son yıllarda doğal konukçusu olarak bildirilen daha varyant izolatlarla birlikte gruplanmıştır. Bu durum, RBDV'nin genetik çeşitliliğinin bugüne kadar bilinenden çok daha geniş olduğunu ve konukçu bazlı bir gruplandırmanın olmadığını göstermiştir.

Abstract:
Although there are more than 40 viruses that infect Rubus spp., the most common one in our country has been identified as raspberry bushy dwarf virus (RBDV). Besides blackberries, RBDV can infect red and black raspberries, some hybrid berry fruits, and causes stunting in plants, yellowing of leaves, scattering in fruits and in some conditions RBDV infected plants can be symptomless. The aim of this study was screening of strawberry necrotic shock virus (SNSV), blackberry chlorotic ringspot virus ( BCRV), blackraspberry necrosisvirus (BRNV), blackberry yellow vein associated virus ( BYVaV), raspberry leaf mottle virus (RLMV) which are new emerging viruses and tomato ringspot virus (ToRSV) andtobacco ringspot virus (TRSV)by RT-PCR analysis in the provinces where important Rubus spp. cultivation takes place in our country.In addition, the whole genome analysis of RBDV-Turkish isolates, was performed byhighthroughput sequencing (HTS) technology.Among tested 303 Rubusspp. samples collected from different provinces, 81 was found positive for RBDVby using detection primers amplifying RNA3 however all samples were negative for all other viruses by RT-PCR. For HTS analyses, a mixed sample was prepared from Hatay blackberry samples andRNA was isolated by using virion associated nucleic acids (VANA) method, and RBDV whole genome data was obtained.In the selection of isolates for whole genome analysis from RBDV positive samples, 5 blackberries from Hatay, 5 raspberries from Bursa, 2 raspberries and 2 blackberries from Ankara, 4 raspberry samples from Isparta and 2 raspberry samples from Bartın were taken into consideration, taking into account their geographical origin, the prevalence of the virus and the plant species.In order to confirm the RBDV whole genome obtained by HTS analyses by Sanger sequencing method, 8 different primer pairs were designed for the RNA 1 and 4 different primer pairs were designed for the RNA 2 region of RBDV, used in PCR tests and the resulting products were cloned.RNA1 and RNA2 sequences of Turkish RBDV isolates showed a similar phylogenetic grouping in the phylogenetic trees drawn for 2 different genomic regions of the virus, and all raspberry isolates clustered together with other world isolates in a separate group from blackberries.Among blackberry isolates, Hatay isolates are grouped in separate branches in both phylogenetic trees, not together with isolates obtained from Rubus spp., which are the most important natural hosts of RBDV, but with more variant isolates such as  grapevine  and cherry, which have been reported as natural hosts of RBDV in recent years. This situation showed that the genetic diversity of RBDV is much wider than previously known and that there is no host-based grouping.