SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinde curcuminin trpm2 katyon kanalları üzerine etkisinin patch-clamp sistemi ile araştırılması
Investigation of the effect of curcumin on TRPM2 cation channels in SH-SY5Y neuroblastoma cells BY patch-clamp SYSTEM
Yazar: AHMİ ÖZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ÖMER ÇELİK
Süleyman Demirel Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Apoptozis = Apoptosis ; Kalsiyum kanalları = Calcium channels ; Katyonlar = Cations ; Kurkumin = Curcumin ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; Oksidatif stres = Oxidative stress

Özet:
Nöronal hücrelerde Ca+2 iyonlarının hücre içerisine fizyolojik sınırların üzerinde girmesi ve buna bağlı olarak hücre içi oksidatif stres seviyesinin yükselmesi nöronal hasar oluşumunu tetikleyen başlıca faktörlerden biridir. Oksidatif stres aracılı TRPM2 katyon kanallarının aktivasyonu, nöronal hücre ölümüyle ilişkilidir. Curcumin, hücre içi reaktif oksijen türlerini güçlü bir şekilde ortadan kaldırma potansiyeline sahip bir antioksidan molekül olarak değerlendirildiğinden nörolojik hastalıkların tedavisinde etkili bir rolü olabileceği düşünülmüştür. Curcuminin, oksidatif stresle indüklenen nöronal hasara etkilerini daha iyi karakterize etmek için TRPM2 kanal akımları ile oksidatif stres ve apoptoz üzerine olan etkisi SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinde araştırılmıştır. 
Hücreler deneyler için toplamda dört gruba ayrıldı. Birinci grup kontrol grubu olarak kullanıldı. İkinci grup curcumin uygulanan gruptu.  Üçüncü ve dördüncü gruplar TRPM2 pc DNA'sı ile transfekte edildi ve dördüncü grup transfeksiyondan sonra curcumin ile inkübe edildi. Tüm gruplardan Patch-Clamp ve Kalsiyum Sinyali kayıtları alındı. TRPM2 katyon kanal akımları ile hücresel oksidatif stres parametreleri arasındaki ilişkiyi araştırmak üzere; apoptosis, kaspaz 3 ve 9, hücre içi ROT üretimi, mitokondriyal membran depolarizasyonu analizleri yapıldı. PARP ve apoptosis yolaklarındaki iki öncül enzim olan prokaspaz 3 ve 9 ekspresyon seviyeleri ise Western Blot ile tayin edildi. Analizler sonucunda curcuminin hücre içi serbest kalsiyum konsantrasyonunu ve TRPM2 kanal akım yoğunluklarını, apoptosis, kaspaz 9 ve kaspaz 3, mitokondriyal membran depolarizasyonu, hücre içi ROT üretimini düzenlediği gözlemlendi. 5 µM curcumin inkübasyonunun; PARP, prokaspaz 3 ve prokaspaz 9 enzim ekspresyonlarını azalttığı diğer analizlere ek olarak gösterildi. 
Sonuç olarak, curcumin uygulamasının TRPM2 katyon kanal akımlarını güçlü bir şekilde inhibe ettiği gösterildi. Bu çalışma, nöronal hücreye oksidatif stresle başlatılan TRPM2 kanalları aracılı katyon akışı ve Ca+2 girişinde curcuminin düzenleyici rolü olabileceğini gösteren yeni bir bildirimdir. Nöronal hücre ölümü ve TRPM2 kanal aktivitesinin curcumin uygulaması ile düzenlenmesi, Ca+2 girişi ve apoptozise karşı potansiyel nöroprotektif etkisi olabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Neuronal injury can arise from overload of oxidative stress-induced calcium ion (Ca2+) entry and oxidative stress. Activation of TRPM2 during oxidative stress have been linked to neuronal cell death. Curcumin has been considered as a potent antioxidant that detoxifies a variety of reactive oxygen species (ROS) in neurological diseases. In order to characterize the actions of curcumin better in oxidative stress-induced neuronal injury through modulation of TRPM2 channel currents, we tested the effects of curcumin on apoptosis and oxidative stress in the oxidative stress-induced SH-SY5Y neuroblastoma cell line. 
SH-SY5Y neuroblastoma cells were divided into four groups for the experiments. The first group was used as control. The second group was used as the curcumin administrated group. The third and fourth groups were transfected with TRPM2 pcDNA, and the last group incubated with curcumin after transfection. Whole-cell Patch-Clamp and calcium signaling recordings were acquired from     SH-SY5Y neuroblastoma cells in all groups. Moreover, apoptosis, caspase 3 and caspase 9, ROS production, mitochondrial membrane depolarization analyses were performed to investigate the relationship between cellular oxidative stress and TRPM2 cation channel currents. PARP and two precursor enzymes of apoptotic pathway, procaspase 9 and procaspase 3 expression levels were determined by Western Blotting. We observed that modulator role of curcumin on intracellular free Ca2+ concentrations, current densities of TRPM2 channel, apoptosis, caspase 3 and caspase 9, mitochondrial membrane depolarization, intracellular ROS production levels in the SH-SY5Y neuroblastoma cells. In addition, it was proved that extracellular 5 µM curcumin administration can decrease procaspase 3 and 9 activities and PARP expression levels.
In conclusion, in our study, TRPM2 channel currents can inhibited strongly by curcumin treatment. It is a novel report which shows the modulator role of curcumin on oxidative stress induced cationic currents and Ca2+ influx through TRPM2 channels. Neuronal cell death and modulation of TRPM2 channel activity by curcumin treatment has neuroprotective activity against apoptosis and Ca2+ entry.