İnsan küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücrelerinde sodyum kanal inhibitörü fenitoin'in terapötik etkisinin değerlendirmesi: metastatik aktivite ve apoptoz
Evaluation of therapeutic effect of sodium channel inhibitor phenytoin on human non-small cell lung cancer cells: metastatic activity and apoptosis
Yazar: DİDEM SEZGİN
Danışman: PROF. DR. SEYHAN ALTUN
İstanbul Kültür Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Fenitoin = Phenytoin

Özet:
2020 yılı Küresel Kanser İstatistikleri raporuna göre, akciğer kanseri, tahmini olarak 1,8 milyon ölümle dünya çapında kanserden meydana gelen ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Sigara içenler yüksek oranda akciğer kanseri riski ile karşı karşıyadır ancak, hiç sigara içmemiş kişilerde de akciğer kanseri ortaya çıkabilir. Genellikle 75 yaş ve üzeri kişilerde görülmektedir. 1987'den beri akciğer kanseri, kadınlarda meme kanserinden daha fazla ölüme neden olmaktadır. Akciğer kanserinin küçük hücreli olmayan tipi, vakaların %87'sinden fazlasını oluşturan en yaygın formudur. Bozulan hücre siklusları ve kendi büyüme faktörlerini üreterek, kazandıkları anjiogenez yeteneği ile kanser hücreleri; apoptoza direnç göstererek, antikanser tedavilerin başarısını azaltmaktadır. Cerrahi, kemoterapi, radyoterapi ve hedefe yönelik ilaçlar gibi tedavi yönetemlerine karşın, son yıllarda kanserden kaynaklanan ölümlerin %90'ının metastaz sebebiyle olduğu tespit edilmiştir. Bu çerçevede de metastazı engellemeyi hedefleyen yöntem ve tedavi stratejileri büyük önem kazanmıştır. Hücre membranındaki voltaj kapılı sodyum kanallarının (VGSC) aşırı ekspresyonu veya bozukluğu, vücutta pek çok işlev bozukluğuna yol açmakta ve epilepsi, aritmi gibi hastalıklara neden olmaktadır. Ayrıca meme kanseri, kolon kanseri ve prostat kanseri çalışmalarında hücrelerin voltaj kapılı sodyum kanal ekspresyonlarının arttığı saptanmış ve metastaz ile ilişkilendirilmiştir. Kanser hücrelerinin proliferasyonunun yanı sıra metastaza gidişinde VGSC'lere odaklanılmış olup, hücrenin hareketi yani migrasyon/motilite ve invazyonunu etkileyen VGSC'ler ile hedefe yönelik terapiler geliştirmek üzere pek çok çalışma yürütülmektedir. 
VGSC inhibitörü olan fenitoin (PHT), anti-epileptik olarak günümüzde epilepsi tedavisinde kullanılmaktadır. Literatürde meme ve prostat kanseri üzerinde fenitoinin, hücre migrasyon ve invasyonunu  inhibe ederek, metastazı azalttığına dair çalışmalar bulunmaktadır. 
Çalışmada VGSC inhibitörü PHT'nin yüksek metastatik H460 ve düşük metastatik A549 insan küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücrelerinin metastatik aktivitesine ve apoptoza olan etkisi değerlendirilerek, mortalitenin yüksek olduğu akciğer kanseri metastazına karşı, yeni bir tedavi protokolünün geliştirilmesi hedeflenmiştir. 
PHT'nin yüksek metastatik H460 ve düşük metastatik A549 akciğer kanseri hücrelerinin proliferasyonuna etkisi, hücrelerin koloni oluşturma potansiyelleri ve apoptotik aktivite ile metastatik aktiviteye olan etkileri/migrasyonu, hücrelerde eksprese edilen Nav1.7 protein miktarı ve ekspresyonu araştırılmıştır. 
Hücre proliferasyonu üzerinde etki göstermeyen 1 μM ve 5 μM PHT konsantrasyonlarının düşük metastatik A549 hücrelerine kıyasla, yüksek metastatik H460 hücrelerinde, hücre motilitesini yüksek oranda inhibe ettiği saptanmıştır. NaV 1.7 protein ve mRNA ekspresyonları da motilite sonuçları ile paralellik göstermekte ve H460 hücrelerinde yüksek seviyelerde olan Nav1.7 ekspresyonları PHT ile inhibe edilmektedir. 5 μM PHT'nin yüksek metastatik H460 hücreleri üzerinde TTX den daha yüksek bir aktivite gösterdiği de ortaya konmuştur.
Sonuç olarak; NaV 1.7 VGSC aktivitesinin yüksek olduğu metastatik H460 hücrelerinde PHT'nin hücre migrasyonu ile protein ve mRNA seviyesinde Nav1.7 ekspresyonunu inhibe ettiği ve böylece, PHT'nin Nav 1.7 üzerinde de etki göstererek metastatik aktiviteyi baskıladığı saptanmıştır. Oligometastatik hastalık olan akciğer kanseri metastazına karşı PHT'nin muhtemel bir tedavi yöntemi olabileceği ilk kez ortaya konmuş olup, in vivo olarak da değerlendirildikten sonra, yeni bir tedavi stratejisi olarak, epilepsiden farklı bir alanda daha tedavi seçeneği olma potansiyeli taşıyacağı açıktır. 

Anahtar Kelimeler: Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri, Voltaj kapılı sodyum kanalı (VGSC), Fenitoin, A549 hücreleri, H460 hücreleri, Metastatik aktivite.

Abstract:
According to the 2020 Global Cancer Statistics report, lung cancer continues to be one of the leading causes of cancer-related deaths worldwide, with an estimated 1.8 million deaths. Smokers are at a high risk of lung cancer, but lung cancer can also occur in people who have never smoked. It is usually seen in people aged 75 and over. Since 1987, lung cancer has caused more deaths in women than breast cancer. The non-small cell lung cancer is the most common form, accounting for more than 87% of cases. With disrupted cell cycles and the ability to produce their own growth factors and gain angiogenesis, cancer cells resist apoptosis, reducing the success of anticancer treatments. Despite treatment methods such as surgery, chemotherapy, radiotherapy and targeted drugs, it has been determined that 90% of cancer-related deaths are due to metastasis in recent years. In this context, methods and treatment strategies aimed at preventing metastasis have gained great importance. Overexpression or dysfunction of voltage-gated sodium channels (VGSC) in the cell membrane leads to many dysfunctions in the body and causes diseases such as epilepsy and arrhythmia. In addition, in breast cancer, colon cancer and prostate cancer studies, it has been determined that the voltage-gated sodium channel expressions of the cells are increased and associated with metastasis. VGSCs have been focused on in the proliferation and metastasis of cancer cells, and many studies are being conducted to develop targeted therapies with VGSCs that affect the movement of the cell, i.e. migration/motility and invasion.
Phenytoin (PHT), a VGSC inhibitor, is currently used as an anti-epileptic in the treatment of epilepsy. There are studies in the literature that phenytoin reduces metastasis by inhibiting cell migration and invasion in breast and prostate cancer.
In this study, the effect of VGSC inhibitor PHT on metastatic activity and apoptosis of high metastatic H460 and low metastatic A549 human non-small cell lung cancer cells was evaluated, and a new treatment protocol was aimed to be developed against lung cancer metastasis, which has high mortality.
The effect of PHT on the proliferation of high metastatic H460 and low metastatic A549 lung cancer cells, the colony formation potential of the cells and their effects on apoptotic activity and metastatic activity/migration, the amount and expression of Nav1.7 protein expressed in the cells were investigated.
It was determined that 1 μM and 5 μM PHT concentrations, which did not affect cell proliferation, inhibited cell motility to a high extent in high metastatic H460 cells compared to low metastatic A549 cells. NaV 1.7 protein and mRNA expressions also show parallelism with motility results and high levels of Nav1.7 expressions in H460 cells are inhibited by PHT. It has also been demonstrated that 5 μM PHT has a higher activity than TTX on highly metastatic H460 cells.
As a result; It has been determined that PHT inhibits cell migration and Nav1.7 expression at protein and mRNA levels in metastatic H460 cells with high NaV 1.7 VGSC activity and thus, PHT suppresses metastatic activity by also acting on Nav 1.7. It has been demonstrated for the first time that PHT may be a possible treatment method against lung cancer metastasis, which is an oligometastatic disease, and after being evaluated in vivo, it is clear that it will have the potential to be a treatment option in a different area than epilepsy as a new treatment strategy.

Keywords: Non-small cell lung cancer, Voltage-gated sodium channel (VGSC), Phenytoin, A549 cells, H460 cells, Metastatic activity.