Kadınlarda düşük etkeni zoonotik bakterilerin identifikasyonu için simpleks ve multipleks pzr protokollerinin geliştirilmesi
Development of simplex and multiplex pcr protocols for the identification of abortive zoonotic bacteria in women
Yazar: DİLŞAD SARP
Danışman: PROF. DR. BİRGÜL ÖZCAN ; DOÇ. DR. ZAFER CANTEKİN
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Zoonotik bakteriler kadınlarda düşüğe neden olabilen önemli enfeksiyon ajanları olarak kabul edilmektedir. Kadınlarda düşüğe neden olan mikrobiyal ajanların diğer hastalıklarda görülen benzer semptomlara sahip olması, hastalık etmeni olduğu düşünülen mikroorganizmaların birlikte değerlendirmeye alınması gerekliliğini ortaya koymaktadır. Etkenlerin tek tek araştırılmasının zor, zaman alıcı ve yüksek maliyetli olmasının yanısıra yüksek düzeyde biyogüvenlik ve teknik gereksinimlerinin bulunması ve serolojik testlerin yanlış pozitiflik verme olasılığı nedeniyle çoklu, aynı anda ve yüksek doğrulukta analiz olanağı sağlayan moleküler metotları tercih edilir kılmaktadır.
Bu çalışmada spontan düşüklere neden olduğu bilinen zoonotik bakterilerden Brucella abortus, Coxiella burnetii, Chlamydia abortus ve Listeria monocytogenes tanısı için simpleks/multipleks PZR protokolü geliştirilmesi amaçlanmıştır. 
Brucella abortus (IS711, omp2b), Coxiella burnetii (com1, IS1111a), Chlamydia abortus (ompA, pmp 90/91) ve Listeria monocytogenes (hly, iap)'in gen bölgelerine spesifik tasarlanan ve ilk kez bu çalışmada kullanılan primer çiftleri ile önce simpleks PZR çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Sonrasında her bir organizma için seçilen primer çiftleri ile farklı ikili ve üçlü kombinasyonlarda dubleks ve tripleks olmak üzere multipleks PZR'ler yapılmıştır. Farklı DNA konsantrasyonları ile yapılan amplifikasyon çalışmaları sonucunda seçilen primerlerin hassasiyet ve spesifiteleri kalitatif olarak belirlenmiştir.
B. abortus için BaısF2/BaısR2 (304 bp), C. burnetii için CbısF3/CbısR3 (430 bp), C. abortus için CapmpF3/CapmpR3 (588 bp) ve L. monocytogenes için LmhlyF1/LmhlyR1 (526 bp) primer çiftlerinin yüksek hassasiyet ve spesifite gösterdiği belirlenmiştir. Bu primer çiftleri ile tüm kombinasyonlar göz önüne alınarak yapılan dubleks ve tripleks PZR çalışmaları sonucunda ilgili bölgelerin 10-1 konsantrasyondaki kalıp DNA varlığında net amplifikasyonu gözlenmiştir. Çalışmamıza özgün tasarlanmış primerlerle gerçekleştirilen multipleks PZR protokolü, Brucella abortus, Coxiella burnetii, Chlamydia abortus ve Listeria monocytogenes türlerinin aynı anda tanısına olanak sağlayacaktır.

Abstract:
Zoonotic bacteria can be considered as important infectious agents that can cause miscarriage in women. Microbial agents that cause miscarriage in women have similar symptoms seen in other diseases. This situation reveals the necessity to evaluate all factors thought to cause the disease. Investigating each factor individually is difficult, time consuming and costly, it requires biosafety practices and technical skills. For this reason, molecular methods that provide multiple analyzes are preferred because of the false positivity in serological tests of the disease in the acute period.
It was designed primer pairs specifically for the genes squence of Brucella abortus (IS711, omp2b), Coxiella burnetii (com1, IS1111a), Chlamydia abortus (ompA, pmp 90/91) and Listeria monocytogenes (hly, iap). These primer pairs were designed specifically for this study, first time. Firstly, simplex PCR studies were carried out with the primer pairs selected for each organism then multiplex PCR studies including duplex and triplex in different double and triple combinations were carried out with the primer pairs selected for each organism. The sensitivity and specificity of the primers selected as a result of amplification studies with different DNA concentrations were qualitatively determined.
	Primer pairs; BaısF2/BaısR2 (304 bp) for B. abortus, CbısF3/CbısR3 (430 bp) for C. burnetii, CapmpF3/CapmpR3 (588 bp) for C. abortus and LmhlyF1/LmhlyR1 (526 bp) for L. monocytogenes were showed high sensitivity and specificity. Duplex and triplex PCR studies were carried out to all combinations with these primer pairs. As a result, clear amplification of the relevant genes sequences in the presence of 10-1 concentration of template DNA was observed. Multiplex PCR protocol performed with primers specially designed for our study will allow simultaneous diagnosis of Brucella abortus, Coxiella burnetii, Chlamydia abortus and Listeria monocytogenes species.