Tavşanlarda intravitreal golimumab uygulamasının retina üzerine histopatolojik etkisinin incelenmesi
The histopathological effects of intravitreal golimumab injection on the retina of rabbit eyes
Yazar: CEREN DURMAZ ENGİN
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN SAATCİ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Golimumab = Golimumab ; Histopatoloji = Histopathology ; Retina = Retina ; Tavşanlar = Rabbits ; Tümör nekroz faktörleri = Tumor necrosis factors ; Vitreus = Vitreous

Özet:
Amaç: Tavşanlarda intravitreal uygulanan Golimumab'ın (anti-TNF) retina üzerine histopatolojik etkisinin değerlendirilmesi amaçlandı.

Yöntem: Çalışmaya 16 adet tavşan (Yeni Zelanda albino tavşan) dahil edildi. Çalışmaya dahil edilen tavşanlar 3 gruba ayrılarak, deneklerin sağ gözüne intravitreal Golimumab enjeksiyonu [grup 1 (n=6): 5 mg/0.05 ml, grup 2 (n=6): 10 mg/0.1 ml, grup 3 (n=4): 20 mg/0.2 ml], sol göze ise eş volümde sham enjeksiyon (Dengeni Tuz Solüsyonu-BSS) yapıldı. Tavşanların gözleri bir hafta boyunca günlük takip edildi. Bir haftalık takibin ardından sakrifikasyon sonrası, gözleri enüklee edilerek dokuları ışık mikroskopisinde apopitotik aktivasyonu gösteren immünohistokimyasal (TUNEL ve Kaspaz-3 boyama) ve elektron mikroskopi incelemeleri için hazırlandı.

Sonuçlar: Hematoksilen-eozin (H&E) boyama ile yapılan incelemede, çalışma gözlerinin histolojik kesitlerinin hiçbirinde makroskopik olarak retina tabakalarında kayba rastlanmadı. Tüm dozlarda (5 mg/0.05 ml, 10 mg/0.1 ml ve 20 mg/0.2 ml), aynı volümde BSS enjeksiyonu yapılan kontrol gözlerine göre, Golimumab enjekte edilen gözlerde, H&E boyamada dış nükleer (sırasıyla p=0.001, p=0.044 ve p=0.045) ve iç nükleer (sırasıyla p=0.047, p=0.045 ve p=0.048) tabakalarda  azalmış hücre sayısı görülürken; ganglion hücre sayısında anlamlı farklılık gözlenmedi. (sırasıyla p=0.11, p=0.067 ve p=0.20)  5 mg/0.05 ml Golimumab enjeksiyonu yapılan gruplardaki tavşan gözlerinde dış nükleer tabakada TUNEL ile kontrole göre boyanma yüzdesinde farklılık görülmezken; Kaspaz-3 boyanma yüzdesi kontrol grubuna göre istatistiksel anlamlı olarak daha fazla saptandı. (sırasıyla p=0.061 ve p=0.048) Aynı dozda iç nükleer tabakada ise TUNEL ve Kaspaz-3 boyanma yüzdeleri, kontrol grubuna göre istatistiksel anlamlı olarak daha fazla bulundu. (sırasıyla p=0.018 ve p=0.015) 10 mg/0.1 ml ve 20 mg/0.2 ml dozlarında ise hem dış hem iç nükleer tabakada TUNEL ve Kaspaz-3 boyanma yüzdeleri, kontrol grubuna göre istatistiksel anlamlı olarak daha fazla saptandı. (TUNEL boyama ile sırasıyla p=0.009, p=0.020, p=0.029 ve p=0.029, Kaspaz-3 boyama ile sırasıyla p=0.041, p=0.041, p=0.048, p=0.041) Golimumab enjekte edilen gözlerin ganglion hücre tabakasında gerek TUNEL gerekse Kaspaz-3 boyamasında kontrol grubuna göre pozitif boyanan hücre yüzdesinde üç dozda da anlamlı farklılığa rastlanmadı. (TUNEL boyama ile sırasıyla p=0.937, p=1.000 ve p=1.000, Kaspaz-3 boyama ile sırasıyla p=0.064, p=0.163 ve p=0.198) Kaspaz-3 boyanmada, artan dozlarda gruplar arasında her üç tabakada da apoptosis oranı açısından istatistiksel olarak anlamlı doz bağımlı ilişki bulunmadı (Kaspaz-3 boyama ile sırasıyla p=0.555, p=0.092 ve p=0.877).

Tartışma: Tavşanlarda intravitreal olarak uygulanan TNF-α antagonisti Golimumab, retinal
fotoreseptör ve bipolar hücrelerde apopitoza neden olmuştur. Uygulanan üç farklı dozda (5 mg/0.05 ml, 10 mg/0.1 ml ve 20 mg/0.2 ml) da retina hücrelerinde kontrole göre artan hücre ölümü gözlendiğinden, tedavi planlaması esnasında bu dozlarda yapılacak intravitreal Golimumab enjeksiyonunun retina için toksik olabileceği göz önüne alınmalıdır.

Anahtar kelimeler: Apopitozis, Golimumab, intravitreal anti-TNF ilaçlar, retina

Abstract:
Purpose: The aim of this study is to evaluate the histopathological effect of intravitreal injection of Golimumab (anti-TNF) on the retina in rabbit eyes.

Methods: 16 rabbits (New Zealand albino rabbits) were included in the study. The rabbits were divided into 3 groups. Intravitreal injections of Golimumab [group 1 (n=6): 5 mg / 0.05 ml, group 2 (n=6): 10 mg / 0.1 ml, group 3 (n=4): 20 mg / 0.2 ml] were performed to the right eyes, while sham injections with the same volume were administrated to the left eyes. The eyes of the rabbits were followed daily for a week. After one week of follow-up, the rabbits were sacrified and the eyes were enucleated.  Eye tissues were prepared for light microscopic immunohistochemical examination (TUNEL and Caspase-3 staining) which showed apoptotic activation and ultrastructural examination under electron microscopy.

Results: In hematoxylin-eosin (H&E) staining, none of the histological sections of the study eyes showed any evidence of retinal layer loss macroscopically. In all of the three different doses (5 mg / 0.05 ml, 10 mg / 0.1 ml and 20 mg / 0.2 ml), while number of the cells in outer nuclear (p=0.001, p=0.044 and p=0.045 respectively)  and inner nuclear (p=0.047, p=0.045 and p=0.048 respectively) layers were decreased in Golimumab group compared to sham group; there was no significant difference in ganglion cell count (p = 0.11, p = 0.067 and p = 0.20, respectively) between three groups. In 5 mg/0.05 ml Golimumab injected eyes, there was no significant difference in the percentage of TUNEL staining in outer nuclear layer compared to control group, while the percentage of Caspase-3 staining of the same layer was significantly higher than the control group. (p = 0.061 and p = 0.048, respectively). For the same dose, in inner nuclear layer, TUNEL and Caspase-3 staining percentages were significantly higher in Golimumab group compared to control group. (p = 0.018 and p = 0.015, respectively) For 10 mg / 0.1 ml and 20 mg / 0.2 ml doses, TUNEL and Caspase-3 staining percentages in the outer and inner nuclear layers were found to be significantly higher than the control groups. (For TUNEL staining, p = 0.009, p = 0.020, p = 0.029 and p = 0.029 respectively, for Caspase-3 staining p = 0.041, p = 0.04, p = 0.048 and p = 0.041 respectively). In ganglion cell layer, for all dose groups, neither TUNEL nor Caspase-3 staining percentages showed any significant difference between Golimumab and control groups (For TUNEL staining, p = 0.937, p = 1.000 and p = 1.000 respectively, for Caspase-3 staining p = 0.064, p = 0.163 and p = 0.198 respectively). Caspase-3 staining didn't show any significant higher apoptosis rates in increasing doses of Golimumab, therefore we didn't find any statistically significant dose-dependent relationship (p = 0.555, p = 0.092 and p = 0.877, respectively).

Discussion: Intravitreally administered TNF-α antagonist Golimumab caused apoptosis in both photoreceptors and bipolar cells in rabbit retina. Since there was increased retinal cell death in Golimumab injected eyes compared to control eyes for all of the three different doses (5 mg / 0.05 ml, 10 mg / 0.1 ml and 20 mg / 0.2 ml), potential toxicity of intravitreal Golimumab injections at these doses should be considered during treatment plan.

Keywords: Apoptosis, Golimumab, intravitreal anti-TNF drugs, retina