Nicotiana benthamiana bitkisinde G protein varyantlarının mühendisliği, üretimi, karakterizasyonu ve hayvanlarda immünojenisite çalışmaları
Engineering, production, characterization of G protein variants in Nicotiana benthamiana and animal immunogenicity studies
Yazar: GULSHAN MAMMADOVA
Danışman: PROF. DR. NEDİM MUTLU
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Aşılar = Vaccines ; DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; G proteinleri = G proteins ; Kuduz virüsü = Rabies virus

Özet:
Kuduz, merkezi sinir sistemini etkileyen ve nihayetinde beyin hastalıgına ve ölüme yol açan kuduz virüsünün (Lyssavirus) neden olduğu viral bir hastalıktır. Kuduz genellikle evcil köpekler ve vahşi etçil hayvanlar arasında genelikle ısırık yoluyla bulaşır. Kuduz virüsü (RABV), merkezi sinir sistemini enfekte ederek beyinde hastalığa ve ölüme neden olmaktadır. Kuduz hastalığı tedavi edilmezse %100 ölümcüldür ve sonuçta dünya çapında, özellikle gelişmekte olan ülkelerdeki çocuklar arasında yılda 70.000'den fazla ölüme neden olmakdadır. Kuduz aşı ile önlenebilir.  Kuduza karşı birkaç insan ve hayvan aşısı mevcut olmasına rağmen, bunlar yüksek maliyetli ve nispeten düşük immünojenikliğe sahip ve ayrıca üretilmesi de zordur. Bu nedenle, büyük miktarlarda üretilebilen daha ucuz, daha immünojenik ve güvenli kuduz aşılarına acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Geçici bitki ekspresyon sistemi, aşılar, antikorlar, memeli kompleks proteinleri dahil terapötik proteinler gibi çok çeşitli rekombinant proteinlerin ekspresyonu için daha çekici ve umut verici bir platform haline gelişdirildi. Bu çalışmada, Nicotiana benthamiana bitkisinde ilk kez geçici ekspresyon sistemini kullanarak kuduz virüsünün kesilmiş bir glikoprotein (G proteini) varyantlarının monomerik (RG2) ve trimerik (RG3) formalarını tasarladık ve üretildi.  Bitki tarafından üretilen RG2 ve RG3 proteinleri, Ni-NTA kolon kromatografisiyle saflaştırıldı. RG2 proteinin saflaştırma verimi ~32, RG3 proteinin saflaştırma verimi ise ~ 20 mg/kg bitki yaprağı olmuştur. İmmünojenisite çalışmalarının sonuçları, bitkinin G-protein varyantlarının üretildiğini, farelerde önemli ölçüde yüksek antikor titrelerini ortaya çıkardığını gösterdi. 5 ug RG3 ile aşılanan fareler, aynı miktarda RG2 protein ile aşılanan ile karşılaştırıldığında daha yüksek titreli antikor ortaya çıkardı. Bitki tarafından üretilen G-protein varyantları, uygun maliyetli, güvenli ve yüksek oranda immünojenik bir kuduz aşısı aday olabilecektir.

Abstract:
Rabies is a viral disease caused by the rabies virus (Lyssavirus) that affects the central nervous system, ultimately leading to death and brain defects. Rabies usually transmitted through a bite among domestic dogs and wild carnivorous animals. The rabies virus (RABV) infects the central nervous system causing disease in the brain and death.  Rabies is 100% fatal if untreated and ultimately causing more than 70,000 deaths annually worldwide, especially among children in developing countries. Rabies can be prevented by vaccination and can be cured immediately after infection. Although several human and animal vaccines against rabies are available, they are expensive, have relatively low immunogenicity and also difficult to produce. Therefore, less expensive, more immunogenic and safe rabies vaccines that can be produced in the large quantities are urgently needed. The transient plant expression system has become a more attractive and promising platform for the expression of a wide range of recombinant proteins such as vaccines, antibodies, therapeutic proteins, including mammalian complex proteins. In this study, we engineered and produced truncated forms of glycoprotein (G protein) variants, namly RG2 (monomoeric) and RG3 (trimeric) of rabies virus in Nicotiana benthamiana plant for the first time, using transient expression system. Plant produced RG2 and RG proteins were purified through Ni-NTA column chromatography. The purification yields of RG2 was about ~32, the purification yield of RG3 was ~20 mg/ kg plant leaf. The results of immunogenicity studies showed that the plant produced G-protein variants elicited significantly high antibody titers in mice. Mice immunized with 5 g of RG3 elicted higher titer antibody compared to that of RG2 immunized with the same amount of protein. Plant-produced G-protein variants could be a cost-effective, safe and highly immunogenic rabies vaccine candidate.