Difteri toksininin klonlanması ve toksinin endozomal süreçte aktinle ilişkisi
Cloning of diphtheria toxin and relationship between toxin and actin in endosomal process
Yazar: EBRU HACIOSMANOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. MUHAMMET BEKTAŞ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics
Dizin: Aktinler = Actins ; Difteri = Diphtheria ; Difteri antitoksini = Diphtheria antitoxin ; Elongasyon faktörü 2 = Elongation factor 2 ; Endozom = Endosome ; Klonlama = Cloning ; Riboz = Ribose ; Toksinler = Toxins

Özet:
Difteri toksini gerek yapısı gerekse etkisi açısından iyi tanımlanmıs bakteritoksinlerinden biridir. Sınırlı proteolitik sindirim sonrası toksin iki parçayaayrılmaktadır. Toksin, N-terminal ucuna karsılık gelen, enzimatik islevi olan (ADPriboziltransferaz)A fragmenti (FA) ve holotoksinin hücreye baglanmasını saglayan Bfragmentinden (FB) olusur. Toksinin enzimatik parçası (FA), endositik süreçtesitoplazmaya ulasmaktadır. Hücre içine giren FA protein sentez inhibisyonuna, DNAkırpılmasına, aktin iskeletinin yıkımına ve apoptoza neden olmaktadır. Aktin iskeleti,endositik vesiküllerin olusmasına ve bu vesiküllerin hücre içinde erken endozomlarayönelmesine dinamik destek verir.Bu bilgilerin ısıgında, toksinin FB parçasının ileriye yönelik çalısmalardakullanılmak üzere antikorununun eldesi için rekombinant teknikler kullanılarak FB'ninklonlanması gerçeklestirildi. Corynobacterium diphtheria susundan DNA izolasyonuyapılarak FB'nin bulundugu bölge PZR yöntemiyle çogaltıldı. Plasmide aktarılarakE.coli susunda proteinin ekspresyonu saglandı ve GST-Trap yöntemi ile kimerik proteinsaflastırıldı. Kimerik FB, (GST-FB) trombin varlıgında kırpılarak gel filtrasyonkromatografisi (Sephacryl S-100) ile ayrıstırıldı.Hücre içersindeki FA'nın hücre içi kalımlılıgı elektroforez ve bagısık emdirimyöntemiyle farklı zaman dilimlerinde gösterildi. Hücredeki FA'nın enzimatik (ADPriboziltransferaz,ADP-ribazilhidrolaz, polyPhe) etkinliginin sitokalesin D etkisindeazaldıgı görüldü. Toksine duyarlı HUVEC hücrelerinde toksin sonrası endozomlardasisme görüldü. Ayrıca bu hücrelere CD ve amonyumklorür ile muamele edilerek hücreiçi endozom yerlesimi ve boyutlarındaki degisiklikler karsılastırıldı. Toksin veSitokalesin D varlıgında endozomlar saflastırılarak içerisindeki FA etkinligi saptandı.Saflastırılan endozomlar üzerine F-aktin ve ökaryotik Elongasyon faktör 2 ilaveedildiginde FA'nın endozomlardan dısarı salındıgı gösterildi.

Abstract:
Diphtheria toxin is one of the well-characterised bacterial toxins, both in termsof its structure and mode of action. After limited proteolytic digestion, toxin isseparated into two fragments. Toxin comprises of Fragment A (FA) has enzymaticactivity (ADP-ribosyltransferase) at the end of the N-terminal end and Fragment B thatis providing connection between the cell and holotoxin. FA in the cell leads to proteinsynthesis inhibition, DNA fragmentation, actin degredation and apoptosis. Actinsupports endosome vesicles to early endosomes in the cell.FB was cloned with the recombinant techniques in order to obtain the FBantibody for the future studies. DNA isolation from the Corynobacterium diphtheria theFB site was amplificated with PCR and integrated to plasmid in E. coli. Then proteinexpression was perfomed and chimeric protein was purified by GST-Trap. In thepresence of thrombine, chimeric FB (GST-FB) was digested and fractioned with gelfiltration chromatography (Sephacryl S-100).FA in the cell was established both with electrophoresis and bagısık blotting invarious time periods. It was determined that FA enzymatic activity ADP-ribosyltransferase, ADP-ribosyl hydrolyse, poy-Phe) in the cell was decreased in the presenceof Cytochalasin D (CD). In toxin sensible HUVEC (Human Umbilical Vein EndothelialCells) following DT incubation endosyme enlargement was observed. BesidesHUVECs were incubated with CD and ammonium chloride thus, the endosomelocalization as well as the changes in the endosome size was compared. In the presenceof diphtheria toxin and CD endosomes were purified and the FA activity was identified.FA release from the endosomes was observed by adding F-actin (filamenteous actin)and eukaryotic elongation factor 2.