PĠWĠ-piRNA yolağında rol alan TDRD9 VE MİWİ  proteinlerinin polikistik over sendromu oluşturulmuş fare modelinde incelenmesi
Investigation of TDRD9 and MIWI proteins playing role in a mouse model with polycystic ovarian syndrome
Yazar: ÖZLEM DELİBAŞ
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN ERAY BULUT
Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Genital hastalıklar = Genital diseases ; Genital hastalıklar-kadın = Genital diseases-female ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Lüteinleştici hormon = Luteinizing hormone ; Polikistik over sendromu = Polycystic ovary syndrome ; RNA = RNA ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Polikistik over sendromu (PKOS), doğurganlık yaşındaki kadınların yaklaşık %6-10'unda görülen ve farklı nedenlerden dolayı ortaya çıkan bir endokrin sistem bozukluğudur. PKOS'un fizyopatolojisi tam olarak açıklanamamış olmakla birlikte, hastalarda ovaryan hiperandrojenizm, hiperinsülinemi, artan luteinleştirici hormon (LH) sekresyonu, menstrual fonksiyon bozukluğu, hirşutizm ve infertilite gözlenmektedir. piRNA'lar (piwi-interacting RNA) germ hücrelerinin genom bütünlüğünü sağlamada  rol alan önemli RNA molekülleridir. Bu çalışmada PKOS modeli oluşturulan farede, yüksek LH ve östrojen hormonuna bağlı olarak  bozulan  folikül içi mikroçevrede PİWİ-piRNA yolağının baskılanabileceğini veya etkisinin azalabileceğini bunun sonucunda oositle kümülüs hücreleri arasındaki etkileşimin bozularak oosit maturasyonunu negatif yönde etkileneceğini düşünmekteyiz. Çalışmamızda piRNA biyogenezinde yer alan TDRD9 ve MİWİ genlerinin ekspresyonları RT-PCR ve immünohistokimyasal yöntemlerle belirlendi.
Çalışmada 25 günlük Swiss albino dişi fareler kullanıldı ve 3 gruba ayrıldı. 20 gün süre ile intraperitoneal olarak 0,2 ml olacak şekilde, kontrol grubuna serum fizyolojik, PKOS oluşturulacak gruba susam yağı içinde çözdürülmüş dehidroepiandrosteron (DHEA, 6 mg/100g/gün) ve Sham grubuna susam yağı enjekte edildi. Enjeksiyon süresi sonunda sakrifiye edilen hayvanlardan alınan ovaryum dokuları immünohistokimya ve immünofloresan işaretleme yöntemleri için kullanıldı. Ayrıca RT-PCR için her 3 gruptan  toplanan GV oosit,  M2 oosit ve Kumulus hücresinde TDRD9 ve MİWİ'nin  mRNA ekspresyonlarına bakıldı.
Kontrol grubunda ve PKOS grubunda MİWİ (PİWİL1) primodiyal folikül aşamasında zayıf bir ekspresyonla başlayıp  primer folikül, sekonder folikül, antral folikül ve tersiyer foliküldeki oosit sitoplazmasında daha güçlü eksprese olduğu immünohistokimyasal ve immünofloresan tekniklerle belirlendi. Ayrıca hem kontrol grubunda hem de PKOS grubunda kumulus hücresinde PİWİL1 ekspresyonu saptanmadı. TDRD9 ise kontrol grubunda primordiyal foliküldeki oositte ekspresyonu izlenirken, PKOS grubundaki ovaryum kesitlerinde primordiyal foliküldeki oositte ekspresyonunun olmadığı immünohistokimyasal yöntemle belirlendi. RT-PCR sonuçlarında ise MİWİ (PİWİL1)'in oositte mRNA ekspresyonunun olduğunu belirledik. PİWİL1'in kontrol grubundaki GV oosit  temel alınarak PKOS grubu GV oositte ekspresyonunun arttığı fakat bunun istatiksel olarak anlamlı olmadığını belirledik. RT-PCR sonuçlarına göre TDRD9'un oositte ve kümülüs hücrelerinde mRNA ekspresyonunun olmadığını saptandı. Sonuç olarak MİWİ (PİWİL1)'nin sağlıklı bir folikülogenez için ekspresyonunun olması gerekmektedir. PKOS'ta bozulan endokrin etkileşimde MİWİ (PİWİL1) geni ekspresyonu korunmaktaydı. PKOS'ta primordiyal folikül aşamasındaki oositte TDRD9'un ekspresyonunun olmaması, normal folikülogenezi bozabileceğini ve kadınlarda infertilite veya subfertiliteye neden olabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Polycystic ovarian syndrome (PCOS) is an endocrine system disorder which is seen about 6-10% women in their reproductive ages and occurs because of different reasons.  Although the physiopathology of PCOS is yet to be understood, ovarial hyperandrogenism, hyperinsulinemia, increasing secretion of LH, menstrual function disorders, hirsutism and infertility are commonly seen in those patients.
piRNAs (piwi-interacting RNA) are important RNA molecules that play crucial roles in preserving the genome integrity in germ cells.
In the present study, disrupted inner follicular microenvironment as a result of high levels of LH and estrogen could suppress the PİWİ-piRNA pathway or could decrease its effects causing that the oocyte maturation was negatively affected in mice with PCOS.  In the present study, the expressions of TDRD9 and MİWİ genes taking place in piRNA biogenesis have been determined by RT-PCR and by immunohistochemical techniques.
Twenty five female Swiss albino mice were divided into 3 groups.  While the control group mice were injected 0.2 ml serum physiologic, the PCOS group mice were injected dehydroepiandrosteron (DHEA) (6 mg/10 g/ day).  On the other hand, the sham group animals were injected sesame oil only.  At the end of the injection process, animals were sacrificed and ovarial tissues were collected for immunohistochemical and immunoflourscence techniques.  In addition, GV oocytes, M2 oocytes and cumulus cells were collected from 3 groups in order to detect TDRD9 and MİWİ expressions using RT-PCR.
The control group and the PCOS group MİWİ (PİWİL1) expressions started weakly in the primordial follicles and have stronger expressions in primary, secondary and tertiary follicles.  On the other hand, there were no PİWİL1 expression in cumulus cells both in the control and the PCOS groups.  While TDRD9 expression was detected in the control group primordial follicles, it had no expression in oocytes of primordial follicles in the PCOS group. MİWİ (PİWİL1) mRNA expressions was detected in oocytes determined by RT-PCR.  The PİWİL1 mRNA expression was increased in the PCOS group GV oocytes when compared to the control group, however, it was not statistically significant. TDRD9 mRNA expression was not detected neither in oocytes nor in cumulus cells in all groups.
In conclusion, it could be suggested that MİWİ (PİWİL1) is necessary for a healthy folliculogenesis. MİWİ (PİWİL1) gene expression was preserved in disrupted endocrine interaction in PCOS. Lacking TDRD9 expression in PCOS ovarial primordial follicle oocytes could block the normal folliculogenesis and could cause infertility or subfertility in those women with PCOS.

Key Words: Polycystic Ovarian Syndrome, PCOS, piRNA, TDRD9, MİWİ, PİWİL1