Deneysel subaraknoid kanama modelin Osthole'ün erken dönem beyin hasarı ve serebral vazospazm üzerine etkisi
Effect of Osthole on early brain injury and cerebral vasospasm in experimental subarachnoid hemorrhage model
Yazar: CİHAT KARAGÖZ
Danışman: PROF. DR. ERKİN ÖZGİRAY
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Subaraknoid kanama = Subarachnoid hemorrhage

Özet:
Amaç: Subaraknoid kanamanın (SAK) mortalite ve morbiditesini artıran en önemli komplikasyonlar erken dönem beyin hasarı (EDBH) ve serebral vazospazmdır. SAK sonrası nörovasküler hasar bifazik bir seyir sergiler; ilk 72 saat içinde gelişen EDBH ve ardından %30-40 oranında görülen vazospazm ilişkili gecikmiş serebral iskemi (GSİ) dönemi. Bu komplikasyonların önlenmesi SAK ilişkili mortalite ve morbiditenin önüne geçilmesi açısından önemlidir. Uzun yıllardan beri üzerinde birçok çalışma yapılmasına rağmen günümüzde uygulanan tedavi yöntemleri henüz istenen aşamada değildir. 
Osthole (ostol), kumarin türevi bir ajandır. Güçlü anti-oksidan ve anti-apoptotik etkileri bilinmektedir. Vazodilatör etkileri gösterilmiştir. Bu nedenle nöroprotektif etkileri olabileceği de düşünülmektedir.
Çalışmamızda ostolün, deneysel SAK sonrası gelişen EDBH, GSİ ve serebral vazospazm üzerindeki tedavi edici etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır.
Gereç ve yöntem: Anevrizmatik subaraknoid kanama (aSAK) modeli oluşturulurken literatürde sıklıkla uygulanan 'otolog kanın sisterna magnaya enjeksiyonu' modeli kullanıldı. Ağırlıkları 250-400 g arasında değişen 40 adet Wistar Albino türü rat çalışmaya alındı. Denekler 10'ar rat içeren dört gruba ayrıldı. Birinci grup kontrol (sham) grubu (n=10); 2.grup (n=10) sadece SAK oluşturulan grup; 3.grup (n=10) SAK oluşturulmayan ve sadece osthole verildiği grup; 4.grup (n=10) SAK oluşturulduktan sonra osthole uygulanan grup olarak ayrılmıştır. SAK modeli 2. ve 4. gruplardaki deneklere kuyruklarından alınan otolog kanın sisterna magnaya ponksiyon yapılarak verilmesi suretiyle oluşturulmuştur. Tedavi denek gruplarımız olan 3. grup ve 4.grup ratlara 5 gün boyunca günde bir kez 30 mg/kg tedavi intraperitoneal olarak verildi.
Beşinci gün tüm denekler sakrifiye edilerek beyin, beyincik ve beyin sapı çıkarıldı. Histopatolojik inceleme amacıyla hematoksilen-eozin (H&E) boyama metodu ile hazırlanan beyin sapı ve baziler arter transvers kesitleri ışık mikroskobu altında yapılan ölçümler ile incelendi. Denek grupları arasında lümen çapı ve damar duvarı kalınlığı karşılaştırıldı. İmmünohistokimyasal boyama ile, hipoksi ile indüklenen faktör 1 alfa (HIF-1α) ve apoptoz belirleyicileri olan bcl 2 ve caspase 3 proteinlerinin ekspresyonları incelendi. Sakrifikasyon sonrası baziler arter çevresi parankimal dokulardan alınan örneklerde luminol ve lusigenin ile kemilüminesans ölçümü yapılarak reaktif oksijen türlerinin (ROT) düzeyleri değerlendirildi.
Bulgular: H&E ile yapılan boyama sonuçlarında SAK grubunda baziler arter duvarında kalınlaşmanın ve damar lümeninde gözlenen daralmanın, osthole tedavisi ile belirgin olarak azaldığı görülmüştür. İmmünohistokimyasal boyamalarla yapılan değerlendirmede SAK sonrası caspase-3 proteinin arttığı, bcl-2 proteinin azaldığı; osthole tedavisi ile bu durumun tersine çevrildiği saptanmıştır. HIF-1α için yapılan immünohistokimyasal boyamalarda ise SAK'da artan HIF-1α düzeyinin osthole ile azaldığı gözlenmiştir. Oksidatif stres değerlendirmesi için lusigenin ve luminol ile yapılan kemilüminesans ölçümlerinde SAK oluşturulan grupta kontrol grubuna göre ROT artışı görülmüştür. Osthole tedavisinin SAK varlığında artan ROT düzeylerini anlamlı ölçüde azalttığı saptanmıştır.
Sonuç: Araştırmamızda, ratlarda oluşturulan SAK modelinde, osthole tedavisinin anti-apoptotik ve oksidatif stresi azaltıcı etkileri gözlemlendi. Ayrıca, bu ajanın serebral vazospazma karşı vazodilatör etkiler gösterdiği görüldü. Bu bulgular, osthole 'ün EDBH, serebral vazospazm ve GSİ tedavisi için potansiyel terapötik bir ajan olabileceğini işaret etmektedir.

Abstract:
Objective: The most significant complications that increase mortality and morbidity in subarachnoid hemorrhage (SAH) are early brain damage and cerebral vasospasm. Neurovascular damage following SAH exhibits a biphasic course; early brain injury develops within the first 72 hours, followed by a period of delayed cerebral ischemia associated with vasospasm, seen in 30-40% of cases. Preventing these complications is of great importance in reducing the mortality and morbidity associated with subarachnoid hemorrhage. Despite many years of research, current treatment methods are not yet at the desired level. Osthole is a coumarin derivative agent with strong antioxidant and anti-apoptotic effects. It has also been shown to have vasodilatory effects, suggesting potential neuroprotective properties. Our study investigates the therapeutic efficacy of osthole on early brain injury, delayed cerebral ischemia, and cerebral vasospasm in an experimental subarachnoid hemorrhage model.
Material and methods: The autologous blood injection into the cisterna magna model, frequently used in the literature, was employed to create the subarachnoid hemorrhage model. The study included 40 Wistar Albino rats weighing between 250-400 g. These subjects were divided into four groups, each containing 10 rats. The first group was the control (sham) group (n=10); the second group (n=10) was where only SAH was induced; the third group (n=10) consisted of rats where SAH was not induced, and only osthole was administered; the fourth group (n=10) underwent osthole treatment post-SAH induction. The SAH model was created by injecting autologous blood, drawn from the tail, into the cisterna magna of the rats in the second and fourth groups. 30 mg/kg osthole was administered intraperitoneally once daily for 5 days to groups 3 and 4. On the fifth day, all subjects were sacrificed, and their brains, cerebellums, and brainstems were removed Hematoxylin-eosin (H&E) stained transverse sections of the brainstem and basilar artery were examined under a light microscope to measure lumen diameter and wall thickness. The expressions of hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α) and the apoptosis markers bcl 2 and caspase 3 were examined with immunohistochemical stains. Reactive oxygen species levels were evaluated by measuring chemiluminescence with luminol and lucigenin in samples taken from parenchymal tissues surrounding the basilar artery post-sacrifice.
Results: H&E staining showed that osthole treatment significantly reduced basilar artery wall thickening and luminal narrowing in the SAH group. Immunohistochemical staining revealed increased caspase-3 and decreased bcl-2 protein expression in the SAH group, which was reversed by osthole treatment. HIF-1α expression was also increased in the SAH group and decreased with osthole treatment. Chemiluminescence measurements showed increased ROS levels in the SAH group compared to the control group, which was significantly reduced by osthole.
Conclusion: This study demonstrates the anti-apoptotic, antioxidant, and vasodilatory effects of osthole in an experimental SAH model. These findings indicate that osthole may be a potential therapeutic agent in the treatment of early brain injury, cerebral vasospasm, and delayed cerebral ischemia.