Schizosaccharomyces pombe'de FAP1 proteininin apoptozdaki etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of FAP1 protein on apoptosis in schizosaccharomyces pombe
Yazar: İREM KARAN
Danışman: PROF. DR. BEDİA PALABIYIK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Endoplazmik retikulum (ER) ökaryot hücrelerde yer alan,  proteinin sentezlenmesi,taşınmasının yanısıra kalsiyum depolanması ve lipitlerin sentezinde de önemli bir rol oynayan organeldir. ER çeşitli etkenlerden kaynaklı strese maruz kaldığı durumlarda homeostazi bozulur ve yanlış katlanmış ya da katlanmamış olan proteinler hücre içerisinde birikmeye başlar. Bu duruma ER stresi adı verilmektedir. Hücreler ER stresi durumunda, homeostazinin tekrardan eski durumuna dönebilmesi amacıyla ilk olarak bu yanlış katlanma ya da katlanamama sonucu olarak UPR olarak adlandırılan yolak meydana getirir. Oluşan bu UPR yolağı insanda ve mayada farlılık göstermektedir.  Ire1 (inositol gerekli enzim 1), ATF6 (aktive edici transkripsiyon faktörü 6), PERK (protein kinaz RNA benzeri ER kinaz), insanda bulunan bağımsız 3 yolaktır. Mayalarda ise bunlardan sadece korunmuş bir şekilde Ire1 (inositol gerekli enzim 1) fazla miktarda yer almaktadır. UPR yolağı çeşitli sebeplerle oluşan yanlış katlanmış veya katlanmamış proteinlerin birikimini indirgeyebilmek için protein yıkım mekanizmasını çalıştırır. Ayrıca ER stresini azaltabilmek için aktif hale gelen UPR yolağı proteinlerin doğru bir şekilde katlanabilmesini sağlar. Hücre gereğinden fazla şiddette ya da sürede strese maruz kaldığında homoeostazın sağlanabilmesi mümkün olmaz. Bunun sonucuna bağlı olarak otofaji  ve apoptoz gibi programlanmış hücre ölümleri UPR yolağı tarafından tetiklenir. ER stresinin tetiklediği apoptozda moleküler mekanizmaların aydınlatılması için yapılan çalışmalarda S.pombe büyük önem taşımaktadır. S. pombe SPBC354.15 (fap1) geni L-pipekolat oksidaz, ("L-pipecolate oxidase") enzimini şifreler. Pipekolat enziminin memeli hücrelerinde H2O2 stresine karşı koruma sağladığı bilinmektedir. Bu çalışmada, S.pombe'de tunikamisin ile tetiklenen ER stresine karşı geliştirilen hücresel yanıtlardan biri olan apoptoz sürecinde fap1 proteininin rolü ve hücresel stres yanıt yolakları araştırılmıştır. S. pombe fap1 geni kuvvetli bir nmt1 promotörü ve 3' klonlama bölgesinde GFP marker geni içeren pSGP572 plazmidinde klonlanlandı ve rekombinant plazmid (pSGP:fap1, IK02) S. pombe parental ve fap1 delesyonlu ırklara transfer edilerek rekombinant ırklar oluşturuldu. Elde edilen rekombinant İK02 plazmidindeki fap1:GFP füzyon proteininin hücre içi yerleşimi konfokal mikroskopta izlendi. Tunikamisin ile tetiklenen ER stresine karşı fap1 proteininin gösterdiği etkiler incelendi.

Abstract:
Endoplasmic reticulum (ER) is an organelle located in eukaryotic cells that plays an important role in protein synthesis and transport, as well as calcium storage and lipid synthesis. When the ER is exposed to stress due to various factors, homeostasis is disrupted and misfolded or unfolded proteins begin to accumulate within the cell. This situation is called ER stress. In case of ER stress, cells first create a pathway called UPR as a result of this misfolding or failure to fold, in order to restore homeostasis. This UPR pathway differs in humans and yeast. Ire1 (inositol required enzyme 1), ATF6 (activating transcription factor 6), PERK (protein kinase RNA-like ER kinase) are 3 independent pathways found in humans. In yeast, only Ire1 (inositol essential enzyme 1) is present in large amounts in a conserved form. The UPR pathway activates the protein degradation mechanism to reduce the accumulation of misfolded or unfolded proteins that occur for various reasons. In addition, the UPR pathway, which is activated to reduce ER stress, ensures that proteins can be folded correctly. When the cell is exposed to stress of greater intensity or duration than necessary, it is not possible to maintain homoeostasis. As a result, programmed cell deaths such as autophagy and apoptosis are triggered by the UPR pathway. S.pombe is of great importance in studies carried out to elucidate the molecular mechanisms in apoptosis triggered by ER stress. The S. pombe SPBC354.15 (fap1) gene encodes the enzyme L-pipecolate oxidase. It is known that the pipecolate enzyme provides protection against H2O2 stress in mammalian cells. In this study, the role of fap1 protein and cellular stress response pathways in the process of apoptosis, which is one of the cellular responses developed against ER stress triggered by tunicamycin in S.pombe, were investigated. The S. pombe fap1 gene was cloned in the pSGP572 plasmid containing a strong nmt1 promoter and the GFP marker gene in the 3' cloning region, and the recombinant plasmid (pSGP: fap1, IK02) was transferred to S. pombe parental and fap1 deletion strains to create recombinant strains. The intracellular localization of the fap1: GFP fusion protein in the resulting recombinant İK02 plasmid was monitored under a confocal microscope. The effects of fap1 protein against ER stress triggered by tunicamycin were examined.