Ratlarda spinal kord yaralanmasında bevacizumabın etkilerinin araştırılması
An investigation of the effects of bevacizumab in spinal cord injury in rats
Yazar: ALİ SAMET TOPSAKAL
Danışman: PROF. DR. ERTUĞRUL ÇAKIR
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroşirürji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Bevacizumab = Bevacizumab ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Spinal kord = Spinal cord ; Spinal kord yaralanmaları = Spinal cord injuries ; Sıçanlar = Rats ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors

Özet:
Giriş-Amaç: Spinal kord travmatik hasarı günümüzde halen büyük bir sorun teşkil etmekte ve tedavisinde en çok zorlanılan hastalıklardan biri olmaya devam etmektedir. Bu travma hem hastalar hem de toplum için hem psikolojik hem de maddi bir sorundur. Bu yüzden günümüz de yeni çıkan moleküller spinal kord hasarlarının tedavisine denenmekte ve umut olabilmektedir. Spinal kord travmasının primer (birincil) ve sekonder (ikincil) yaralanma olarak iki aşaması vardır. Birincil yaralanma, ilk travmatik olayın neden olduğu, bir omur gövdesinin çıkması veya kırılması sonucu komşu omurilik segmentine mekanik bir bası sonucu oluşan omurgada ve omurilikteki yapısal hasardır. Birincil yapısal yaralanmalara ek olarak, spinal kord içerisinde ve çevresindeki glial hücreler ve sinir hücreleri de yaralanır. Bu durum hücresel düzeydeki inflamatuar kaskadları başlatır. Spinal kordun perfüzyonu bozulur bu hipoksik durum glial hücrelerde yapısal hasar meydana getirir. İkincil yaralanma kademesini tetikleyen bu ilk yapısal ve hücresel hasardır. Adından da anlaşılacağı gibi, ikincil yaralanma kaskadı, primer hasardan sadece birkaç saat sonra başlayan ve ilk yaralanmadan 6 ay sonra devam edebilen bir dizi değişikliktir ve genellikle birbiri ardına gelişir. Bu süreçler sonunda spinal cord beslenmesi bozulur, ödem artışı olur sinir hücrelerinde yenilenme için çalışmalar başlar ancak zayıftır. Genel olarak deneysel tedaviler sekonder hasarı engelleme ve nörorejenerasyona katkı sağlamaya yöneliktir. Yapılan çalışmalar göstermiştir ki spinal kord yaralanması sonrası başlayan sekonder hasar ve iyileşme dönemindeki en önemli durumlardan bir tanesi ödemin azaltılması bir diğeri de revaskülarizasyon ile hem travmatik bölgedeki yeniden kanlanmayı ve hücresel düzeyde beslenmeyi sağlamak hem de travma alanındaki serbest radikalleri ve zararlı maddeleri uzaklaştırmaktır. Ancak bu dönemde meydana gelen revaskülarizasyonun belirli bir dengede olması gerekir, travma olan hasarlı spinal kord alanında yeterli damarlanmanın olmaması da gereğinden fazla olması da bir sorundur. 
VEGF türündeki ilaçlar bu hasar modellerinde daha önce deneysel olarak kullanılmış ve vaskülarizasyonu arttırarak sekonder hasarı azaltıcı etkileri, travma sonrası hasarlanan nöral dokularda nöroprotektif yönde etkileri de gösterilmiştir. Ancak son zamanlarda Anti VEGF türündeki ilaçların da gereğinden fazla olan vaskülarizasyonu engelleyerek spinal kord yaralanmalarından sonra iyileşme üzerinde pozitif yönde etki edebileceği düşünülmüştür. Bu etkilerini basitçe spinal kord hasarı sonrası ödemi azaltarak oksijenin ve enerji kaynaklarının hücrelere iletimini kolaylaştırarak yaptığı, limitli bir anjiyogenez sağlayarak aşırı glial skar dokusu oluşumunu engelleyerek ve bu sayede sinir hücrelerinin beslenmesinde verimliliği arttırarak yaptığı, böylece nöroprotektif etkilerinin olabileceği düşünülmüştür

Gereç&Yöntem: Çalışmada her grupta 10 adet (n=10) olacak şekilde 6 grupta toplam 60 adet (30 erkek ve 30 dişi) sıçan kullanılmıştır. Gruplar kontrol grubu, travma grubu, profilaksi grubu, travma ve düşük doz bevacizumab uygulanan grup, travma ve orta doz bevacizumab uygulanan grup, travma ve yüksek doz bevacizumab uygulanan grup olmak üzere 6 gruba ayrılmıştır. Tüm deneklere motor koordinasyon testeleri (Rotarod), termal plantar testler ve bilateral alt ekstremite EMG testleri yapılmıştır. Sonrasında sıçanlara torakal laminektomi yapılarak klipleme ile spinal kord travması modeli oluşturulmuştur. Profilaksi grubuna travmadan 1 saat önce 2mg/kg `a, tedavi gruplarına ise travmadan hemen sonra sırası ile düşük doz tedavi grubuna 2mg/kg `a, orta doz tedavi grubuna 5mg/kg`a, yüksek doz tedavi grubuna 10mg/kg`a Bevacizumab (Anti VEGF) intraperitoneal yol ile uygulanmıştır. Tüm gruplar işlemlerden sonra bir hafta boyunca bakıma alınmıştır. Sıçanlar 1 haftanın sonunda tekrar motor koordinasyon testlerine, termal plantar teste ve EMG ölçümlerine tabi tutulmuş, ardından dekapitasyon yöntemi ile sakrifikasyon işlemi yapılmış, spinal kordlar travma oluşturulan alanın 2 cm kranial ve 2 cm kaudal yönünde çıkartılmış ve histopatolojik olarak incelenmiştir.
Bulgular: Bevacizumab (Anti VEGF), travmatik spinal kord hasarında uygun dozlarda kullanıldığında anjiyogenezi sınırlandırarak ödemi azaltmakta, omurilik travmasında lezyon bölgesinin iyileşmesine nörorejenerasyona pozitif katkı sağlamaktadır. Bu sayede motor ve duyusal nörolojik fonksiyonlarda travma grubu ile yüksek doz tedavi alan gruplar arasında motor fonksiyonların düzelmesinde anlamlı fark bulunmuştur(p:0,031). Bevacizumab kullanarak spinal kord hasarında duyusal fonksiyonlarda nörolojik olarak anlamlı bir iyileşme ve düzelme sağlandığı bulunmuştur. (p:0,036) Bu bulgular nörofizyolojik çalışmalarla desteklenmiş ve elektromiyografi (EMG) sonuçlarında travma grubu ile yüksek doz tedavi grubu arasında anlamlı fark bulunmuştur (0,007). Bevacizumab (Anti VEGF) histopatolojık olarak travma sonrası ödemi azaltmıştır. Ayrıca korunmuş fonksiyone görünümdeki nöron sayısı da travma grubuna göre artmıştır. 
Sonuç: Sonuç olarak spinal kord travmasında, Bevacizumab (Anti VEGF) tedavisi, limitli bir anjiyogenez sağlayarak, anti ödem etkisi ve glial skar dokusu oluşumunu baskılayarak motor ve duyusal nörolojik fonksiyonların düzelmesinde katkı sağlamış aynı zamanda EMG bulgularında da düzelmeler oluşturmuştur.


Anahtar Kelimeler: Spinal kord hasarı, Bevacizumab, Anti VEGF, Nörorejenerasyon, Omurilik travması

Abstract:
Spinal cord injury, which is still a major problem today, continues to be one of the most difficult diseases to treat. It can be an important issue for the patient and society, both psychologically and financially. Therefore, promising results can be obtained by studying newly released molecules for the treatment of spinal cord injuries. 
Spinal cord trauma has basically two stages as primary and secondary injury. Primary injury is structural damage to the spine and spinal cord caused by the first traumatic event as a result of mechanical compression on the spinal cord segment. In besides to primary structural injuries, glial cells and nerve cells in the spinal cord are also injured. By initiation of cellular inflammatory cascades; perfusion of the spinal cord is impaired, and thereby hypoxic state causes structural damage to glial and nerve cells. The resulting structural and cellular damage triggers secondary injury.  As the name suggests, the second injury cascade that develops after the primary injury encompasses a series of changes that begin a few hours later and last up to 6 months. As a result of these processes, spinal cord nutrition deteriorates and edema increases, and efforts for regeneration in nerve cells begin, but are mostly insufficient. 
In general, experimental treatments are aimed at preventing secondary damage and contributing to neuroregeneration.  According to the studies, it is possible to provide neuroregeneration by both providing revascularization and reducing the edema occurring in the secondary damage and recovery period; by increasing blood supply and removing harmful substances such as free radicals in the trauma area.  However, the revascularization must be in a certain balance. In addition to the lack of sufficient vascularization in the damaged spinal cord area, it can also be a problem if it is more than necessary.
VEGF-type drugs have been used experimentally in these damage models before, and besides their effects on reducing secondary damage by increasing vascularization, neuroprotective effects on neural tissues damaged after trauma have been shown. However, it has recently been thought that anti-VEGF drugs may have a positive effect on recovery after spinal cord injuries by preventing excessive vascularization. It is thought that these effects are achieved basically by reducing edema after spinal cord injury, facilitating the delivery of oxygen and energy resources to the cells, providing a limited angiogenesis, preventing excessive glial scar tissue formation, and thus increasing the efficiency in the nutrition of nerve cells. Due to these properties, it is estimated that they may have neuroprotective effects.
Material&Methods: In the study, a total of 60 (30 male and 30 female) rats were used in 6 groups, with 10 rats (n=10) in each group. The groups were divided into 6 groups as control group, trauma group, prophylaxis group, trauma and low dose bevacizumab administered group, trauma and medium dose bevacizumab administered group, trauma and high dose bevacizumab administered group. 
Motor coordination tests (Rotarod), thermal plantar tests and bilateral lower extremity EMG tests were performed on all subjects. Afterwards, thoracic laminectomy was performed on the rats and a spinal cord trauma model was created by clipping the spinal cord with a temporary aneurysm clip (Yasargil Aesculap FE 721K)
Bevacizumab 2mg/kg was administered intrapertoneally to the prophylaxis group 1 hour before the trauma , to the treatment groups 2mg/kg to the low dose treatment group, 5mg/kg to the medium dose treatment group and 10mg/kg to the high dose treatment group immediately after the trauma. Bevacizumab was administered intraperitoneally. All groups were taken into care for one week after the procedures. At the end of one week, rats were subjected to motor coordination tests, thermal plantar test and EMG tests. Then sacrificed by decapitation, spinal cords were removed 2 cm cranial and 2 cm caudal to the injury site and examined histopathologically.
Results: Bevacizumab (anti-VEGF), when used in appropriate doses in traumatic spinal cord injury, reduces edema by limiting angiogenesis and contributes positively to neuroregeneration in the healing of the traumatized area in spinal cord. In this way, a significant difference was found in the improvement of motor functions between the trauma group and the groups receiving high-dose treatment in motor and sensory neurologic functions (p=0.031). Neurologically significant improvement and improvement in sensory functions was found in spinal cord injury using bevacizumab. (p=0.036) These findings were supported by neurophysiological studies and a significant difference was found between the trauma group and the high-dose treatment group in electromyography (EMG) results (p=0.007). Bevacizumab (anti-VEGF) reduced post-traumatic edema histopathologically. In addition, the number of neurons with preserved function increased in those who received high-dose bevacizumab compared to those who did not.
Conclusions: In conclusion, in the spinal cord trauma model in rats, Bevacizumab (anti-VEGF) treatment contributed to the improvement of motor and sensory neurological functions and partially EMG findings by suppressing edema and glial scar formation, by providing limited angiogenesis.


Key Words: Spinal cord injury, Bevacizumab, anti VEGF, Neuroregeneration, Spinal cord trauma