Obezitede RAN geni anlatımının adipogenez ile ilişkisinin araştırılması
Investigation of RAN gene expression in obesity relation with adipogenesis
Yazar: SİNEM BANU DEMİR
Danışman: PROF. DR. BELGİN SÜSLEYİCİ DUMAN
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Obezitede RAN Geni Anlatımının Adipogenez ile İlişkisinin Araştırılması
Çalışmamızda preadiposit, olgun adiposit ve yaşlandırılmış adipositler olmak üzere farklı gelişim evrelerindeki adipositlerde Ras ile ilişkili nüklear proteine (Ran) ait gen anlatımının, olgun adipositlerin değişik dozlarda oksidatif stres faktörlerine (stearik asit, linoleik asit, etanol ve hidrojen peroksit) maruz bırakılmasına karşı yanıt olarak hücre proliferasyonlarının ve bu olgun adipositlerdeki RAN gen anlatımının ne yönde değişim gösterdiği araştırıldı.
Çalışmamız, literatür taramalarımıza göre adipogenik süreçte RAN geninin obezite ile bağlantısını ortaya koyan ilk çalışma olma niteliğini taşımaktadır.
Çalışmamızda RAN geninin obezitedeki rolünü belirlemek amacıyla fare kökenli 3T3-L1 fibroblast hücreleri, iCELLigence sistemi ile gerçek zamanlı olarak gözlemlenerek, preadiposit, olgun adiposit ve yaşlandırılmış adipositlere farklılaştırıldı. Olgun adipositler farklı konsantrasyonlarda sitotoksik ajanlara maruz bırakılarak hücre proliferasyonları gerçek zamanlı hücre izleme sistemi (iCELLigence) ile izlendi. Elde edilen hücrelerden haberci RNA izolasyonu, haberci RNA'dan tamamlayıcı DNA sentezi ve elde edilen genetik materyalde sitotoksik ajanlara yanıt olarak, RAN geninin anlatımındaki değişimler TaqMan gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile tespit edildi.
Oksidatif stres ajanlarının çeşitli konsantrasyonlarının uygulama süreleri, iCELLigence sistemi ile IC50 değeri elde edilerek saptandı. 24 saat hidrojen peroksit (H2O2) uygulaması sonucu IC50 değeri 807 μM olarak saptandı. 24 saat 1 mM H2O2 uygulaması 3T3-L1 olgun adiposit hücrelerinde letal etkiye sahipken, 50-250 μM konsantrasyon aralığındaki H2O2 uygulamalarının olgun adiposit proliferasyonu üzerine istatistiksel anlamlı bir etkisi olmadığı belirlendi. 
Olgun adipositlerde RAN gen anlatımı, oksidatif stres faktörü uygulanmayan kontrol adipositlere kıyasla, dört ve beş saatlik 600 ve 800 μM H2O2 uygulaması sonrası artarken; 24 saat 50 μM stearik asit, 24 saat 90 mM etanol ve 4 saat 400 μM ve 24 saat'lik 600 μM H2O2 uygulaması sonrası azaldığı tespit edildi. Linoleik asit uygulaması sonrasında ise RAN geni anlatımının ortadan kalktığı gözlendi.
600 μM H2O2'e dört saat maruz bırakılan olgun adipositlerde RAN geni anlatımı kontrol hücrelere kıyasla iki kat artarken, aynı dozda beş saat muamele edilen hücrelerde gen anlatımının altı kata yakın arttırdığının gözlenmesi, farklılaşmış adiposit hücrelerinde glikoz homeostazının bozulduğunu düşünmemize neden oldu. 90 mM/24 saat'lik etanol uygulaması neticesinde RAN gen anlatımında saptanan azalmanın, insülin direncinin artmasına katkıda bulunabileceği düşüncesindeyiz.
Anahtar kelimeler: RAN; obezite; adiposit; gen ekspresyonu; iCELLigence.

Abstract:
In our study the Ras-related nuclear protein (Ran) gene expression levels were evaluated in the adipocytes of different developmental stages such as; preadipocytes, mature adipocytes and senescent adipocytes.  Also the RAN gene expression change together with cell proliferation activities as a response to, oxidative stress markers (stearic acid, linoleic acid, ethanol and hydrogen peroxide) were searched in mature adipocytes.
Our study is the first study, according to literature review, about RAN gene expression in adipogenic process.
In our study, to determine the role of the RAN gene in obesity, we differentiated Mouse derived 3T3-L1 fibroblast cells into preadipocytes, mature adipocytes and adipocytes under senescense by observing with real-time cell observation system (iCELLigence). These cells were exposed to cytotoxic markers at different concentrations and cell proliferations were monitored with iCELLigence system. The messenger RNA isolation from the obtained cells, complementary DNA synthesis from messenger RNA and the changes of RAN gene expression in response to cytotoxic markers obtained from the genetic material were identified by TaqMan real-time polimerase chain reaction.
The implementation periods of oxidative stress markers were determined by iCELLigence after applying their various concentrations by obtaining IC50 value. After 24 hours application of hydrogen peroxide (H2O2), IC50 value was found as 807 μM. 24 hours application of 1 mM H2O2 was found to have lethal effect on mature 3T3-L1 cells. We did not observe any significant effect of H2O2 applications in the concentration range of 50-250.
The RAN gene expression in mature adipocytes were determined to increase in 4hr and 5 hr 600 and 800 μM H2O2 administration; and to decrease in 24 hr 50 μM stearic acid, 24 hr 90 mM ethanol and 4 hr 400 μM as well as 24 hr 600 μM H2O2 applications compared to no oxidative stress factor applied control adipocytes. As a result of linoleic acid administration, we did not observe any RAN gene expression. 
The observation of RAN gene expression to increase two fold in 4 hr 600 μM H2O2 applied mature adipocytest compared to control cells, while five hours of exposure to the same dose to increase nearly six fold may suggest the deterioration of glucose homeostasis in differentiated adipocyte cells. We think the fact of ethanol decreasing RAN gene expression contributes to the increase of insulin resistance.
Keywords: RAN; obesity; adipocytes; gene expression; iCELLigence.