Bakteriyel kaynaklı termoasidofilik alfa-L-arabinofuranosidaz enzimlerinin in siliko karakterizasyonları
In silico characterization of thermoacidophilic alpha-L-arabinofuranosidaze enzymes of bacterial origin
Yazar: AHMET ENES URAY
Danışman: PROF. DR. HASAN MURAT VELİOĞLU ; DOÇ. DR. YUSUF SÜRMELİ
Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Ligninolitik enzimler = Ligninolytic enzymes ; Mikrobiyal enzimler = Microbial enzymes

Özet:
Bu çalışmada, dört termoasidofilik özelliğe sahip bakteriyal alfa-L-arabinofuranosidaz enzimlerinin in siliko karakterizasyonunun yapılması ve bu sonuçlara göre en iyi özelliklere sahip bakteriyal termoasidofilik alfa-L-arabinofuranosidaz belirlenmesi amaçlanmaktadır. Bu amaçla, UniProt/TrEMBL veri tabanında gözden geçirilmemiş alfa-L-arabinofuranosidaz enzimlerinin amino asit dizileri taranmıştır, teorik pI, teorik Tm, alifatik indeks ve instabilite indeks değerlerine dayalı olarak termoasidofilik özelliği en fazla olan dört enzim seçilmiştir. Bu dört enzimin dizi ve yapı düzeyinde analizler yoluyla in siliko karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Analizler sonucunda arabinofuranosidaz enzimlerinin 65°C'nin üzerinde bir Tm sergilediğini göstermiştir. Ek olarak izoelektrik noktaları (pI), 4.57 ila 4.72 aralığına düşmüştür. Bu çalışmada, sırasıyla 70oC ve 6.0 optimum sıcaklık ve pH'da çalışan Geobacillus stearothermophilus Abf enzimi (Q9XBQ3) 5.56'lık bir pl'ye ve 55-65°C'lik bir Tm aralığına sahipken, optimal olarak pH 6.0 ve 60°C'de çalışan (Taylor vd., 2006) Acetivibrio thermocellus'tan (A3DIH0) Arabinofuranosidaz enzimi, 5.43'lük bir pl'ye sahip olduğu gözükmüş ve 55-65°C Tm aralığında olduğu belirlenmiştir. Ayrıca Abf enzimlerinin alifatik indeksleri (85.45-93.41) AbfA ve A3DIH0 ile karşılaştırılabilir düzeyde ve instabilite indeksleri AbfA ve A3DIH0'dan daha düşük çıkmıştır. Dört Abf arasında en büyük alifatik indeks ClAbf'ye ait olduğu belirlenmiştir. Dört enzimin evrimsel ilişkisini bulmak için yapılan filogenetik çalışmada dört Abf enziminin tamamının GH51 ailesi altında kategorize edildiğini ortaya çıkarmıştır. Yapı tahmini için alfafold modeli kullanılmıştır. Tahmini modeller çeşitli araçlar kullanılarak kaliteleri belirlenmiştir. stride aracılığıyla elde edilen Abf modellerinin ikincil yapılarını tasvir edilmiştir yine Procheck grafiğinden elde edilen sonuçlar, Abfs'deki kalıntıların önemli bir yüzdesinin (%89.3 ila %91.1 arasında değişen) en uygun bölgelerde konumlandırıldığını göstermiştir. Arabinofuranosidazlara yönelik alfafold modellerinin genel kalitesi ProSA'nın Z-puanları kullanılarak değerlendirilmiştir. Sonuçlar -9,64 ile -10,62 arasında değişen Z-puanlarını ortaya çıkarmıştır. Verify3D değerlendirmesi, tüm Abf yapılarındaki amino asitlerin %82.63-88.87'si için ortalama 3D-1D puanının ≥ 0,2 olduğunu doğrulamıştır. Abfs, -0.34 ile 0.19 arasında değişen, sıfıra yaklaşan Niteliksel Model Enerji Analizi (QMEAN) puanları sergilemiştir ve bu, yerel yapılara yüksek düzeyde benzerlik olduğunu göstermiştir BANΔIT analizine göre, dört Abf'nin hepsinin B'-faktörü profilleri benzerlikler sergilemiştir. Dört Abf'nin de 21 bölgesindeki (3-23) B'-faktörleri AbfA'ya kıyasla daha düşük olmuştur.  
Anahtar Kelimeler: in siliko, termoasidofilik, hayvan yem katkısı, arabinofuranosidaz, Endüstriyel enzim

Abstract:
The aim of this study was to perform in silico characterization of bacterial alpha-L-arabinofuranosidase enzymes with four thermoacidophilic properties and to identify the bacterial thermoacidophilic alpha-L-arabinofuranosidase with the best properties based on these results. For this purpose, the amino acid sequences of unreviewed alpha-L-arabinofuranosidase enzymes in the UniProt/TrEMBL database were screened and four enzymes with the highest thermoacidophilic properties were selected based on theoretical pI, theoretical Tm, aliphatic index and instability index values. In silico characterization of these four enzymes was performed through sequence and structure level analyses. The analysis showed that arabinofuranosidase enzymes exhibited a Tm above 65°C. In addition, their isoelectric points (pI) decreased to the range of 4.57 to 4.72. In this study, the Geobacillus stearothermophilus Abf enzyme (Q9XBQ3) operating at an optimum temperature and pH of 70oC and 6.0, respectively, had a pI of 5.56 and a Tm range of 55-65°C, while the Acetivibrio thermophilus Abf enzyme (Q9XBQ3) operating optimally at pH 6.0 and 60°C (Taylor et al, 2006) from Acetivibrio thermocellus (A3DIH0), operating optimally at pH 6.0 and 60°C, appeared to have a pl of 5.43 and a Tm range of 55-65°C. In addition, the aliphatic indices of Abf enzymes (85.45-93.41) were comparable to AbfA and A3DIH0 and the instability indices were lower than AbfA and A3DIH0. ClAbf was found to have the highest aliphatic index among the four Abf. Phylogenetic study to find the evolutionary relationship of the four enzymes revealed that all four Abf enzymes were categorized under the GH51 family. The alphafold model was used for structure prediction. The predicted models were qualitatively characterized using various tools. The secondary structures of the Abf models obtained through stride were depicted, again the results from the Procheck plot showed that a significant percentage of residues in Abfs (ranging from 89.3% to 91.1%) were positioned in the most favorable regions. The overall quality of the alphafold models for arabinofuranosidases was assessed using ProSA's Z-scores. The results revealed Z-scores ranging from -9.64 to -10.62. Verify3D evaluation confirmed an average 3D-1D score ≥ 0.2 for 82.63-88.87% of amino acids in all Abf structures. Abfs exhibited Qualitative Model Energy Analysis of Energy (QMEAN) scores approaching zero, ranging from -0.34 to 0.19, indicating a high level of similarity to native structures. According to BANΔIT analysis, the B'-factor profiles of all four Abfs exhibited similarities. All four Abfs had lower B'-factors in 21 regions (3-23) compared to AbfA. 

Keywords: In silico, thermoacidophilic, animal feed additive, alpha-L-arabinofuranosidase, industrial enzyme