Monoamin oksidaz substratlarının enzimin aktif bölgesi içinde QM/MM yöntemi ile modellenmesi
Modeling of the monoamine oxidase substrates in the enzyme active site by QM/MM method
Yazar: MEHMET ALİ AKYÜZ
Danışman: DOÇ.DR. SAFİYE ERDEM
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry

Özet:
ÖZETMONOAMİN OKSİDAZ SUBSTRATLARININ ENZİMİN AKTİFBÖLGESİ İÇİNDE QM/MM YÖNTEMİ İLE MODELLENMESİSon yıllarda MAO-A ve MAO-B enzimlerinin x-ışını yapılarınınaydınlatılması, her iki enzimde de birbirine hemen hemen paralel ve 7.8 Ã uzaklıktakonumlanmış iki aromatik tirozin grubu bulunduğunu göstermiştir; öyle ki, substratolan amin katalizleme sırasında flavine yaklaşabilmek için bu iki aromatik halkanınarasından geçmek zorundadır. Flavine dayalı amin oksitleme işlevi yapan diğerenzimlerde de benzer yapıların bulunması, bu grupların önemli bir işleve sahipolabileceğini düşündürmektedir. Yakın zamanda, MAO-B Tyr435 mutant enzimleriüzerinde gerçekleştirilen kinetik ve kristal yapı çalışmaları, mutant enzimlerinaktivitesinde azalma göstermiştir. Bu azalma aromatik kafesin işlevinin, substratınnükleofilik karakterini arttırarak flavin koenzimine saldırısını güçlendirmek olduğuşeklinde yorumlanmıştır. Bu tez çalışmasında, aromatik kafes için önerilen işlevleilgili daha detaylı bilgi sağlamak amacıyla, aşağıda tarif edildiği gibi 4 bölümdenoluşan hesaplamalar gerçekleştirilmiştir:1. İlk amaç, uygun bir aktif bölge model yapısı ve hesapsal yöntem tespitetmektir. Enzimin kristal yapısından başlayıp, flavini ve p-nitrobenzilaminsubstratının etrafını saran amino asitleri alıp, enzimin geri kalan kısmını silerek aktifbölge model yapısı oluşturuldu. Bu yapıdaki substrat QM/MM (kuantummekanik/moleküler mekanik) ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) yöntemi ile optimizeedildi. Elde edilen yapısal parametreler, p-nitrobenzilamin bağlı MAO-B kristalyapısı ile iyi bir uyum sağladı; böylece, kullanılan aktif bölge modelinin ve hesapsalyöntemin bu araştırma için uygun olduğu tespit edildi.2. Aromatik kafesin işlevini araştırmak amacıyla benzilamin ve p-nitrobenzilamin substrat olarak seçilmiştir. Flavin N(5) atomu ile substratın Î±karbonu arasındaki mesafe art arda on değerde sabit tutularak her bir substratıngeometrisi ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) yöntemi ile optimize edilmiştir. Dahasonra tüm yapının enerjisi tek nokta HF/6-31G* yöntemi ile hesaplanmıştır. Heriki substratın da aktif bölge içindeki en kararlı yerlerinin, aromatik kafesinmerkezinde bulundukları konumlar olduğu gözlenmiştir. Bu sonuç, aromatik kafesin,gerekli konformasyon ve enerji değişikliklerini sağlayarak, kararlı bir enzim-substratöncül kompleksi oluşmasına yardım ettiğini göstermektedir. Substratların aromatikkafesin içinden geçerek flavine ilerlemeleri esnasında, yapılarında ve elektroniközelliklerinde oluşan değişiklikler incelenmiştir. Elde edilen bulgular, substratınamin azotunun negatif yükünün, substrat serbest halde veya aromatik kafesindışındayken sahip olduğu yükten daha fazla olduğunu göstermiştir.3. ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) yönteminin amin azotu üzerindeki yükartışını tespit edebilmede ne kadar hassas olduğunu kontrol etmek amacıyla, küçükmodel sistemler (benzen-amonyak ve model aromatik kafes-amonyak) üzerine çeşitliyüksek seviye hesaplamalar yapılarak incelenmiştir. Bu hesaplamalardan, aromatikhalkalar arasına yerleştirilen bir aminin nükleofilik karakterinin artmasına, aromatikÏ-elektronları ile amin hidrojeni arasındaki H-bağı etkileşimlerinin sebep olduğuanlaşılmıştır.4. İkinci bölümde tarif edilen hesaplamalar MAO-B Tyr435 mutant enzimleri(Tyr435Phe, Tyr435His, Tyr435Leu veTyr435Trp)için tekrarlanmıştır. Substrataromatik kafesin merkezinde iken, mutant enzimlerdeki amin azotunun negatifyükünün doğal enzimdekinden daha düşük olduğu hesaplanmıştır. Bu konumdakidört mutant enzim için, azot yükünde hesaplanan azalma, deneysel verileri mevcutolan katalitik etkinlik değerleri, â(âG#), ile çok iyi bir doğrusal ilişki (R2 = 0.81)vermiştir. Bu sonuç ve bu tezde elde edilen diğer elektronik özellikler, aromatikkafes için önerilen rolü doğrulamakta ve MAO enziminin kataliz mekanizması ileilişki göstermektedir.Ocak 2007 Mehmet Ali AKYÜZ

Abstract:
SUMMARYMODELING OF THE MONOAMINE OXIDASE SUBSTRATESIN THE ENZYME ACTIVE SITE BY QM/MM METHODRecent elucidation of the x-ray structures of MAO-A and MAO-B showedthat in both enzymes, two aromatic tyrosyl residues are situated 7.8 Ã apart in anapproximately parallel configuration such that the amine substrate must pass betweenthe two aromatic tyrosyl rings to reach the flavin for catalysis. This type of structureis also observed in other flavin-dependent amine oxidizing enzymes and appears tohave functional significance. Recent kinetic and crystallographic studies on Tyr435mutants of MAO-B showed a decrease in the activity of mutant enzymes, whichsuggests that functional role of this aromatic cage is to activate the amine substrateby enhancing its nucleophilicity for attack on the flavin coenzyme. In this thesis, toprovide further insights into the proposed roles suggested for the aromatic cage, weperformed computational studies in 4 parts as described below:1. The first aim is to find the suitable active site model and the computationalmethod. The model of the enzyme active site was built by starting from the enzymecrystal structure, including flavin and the aminoacid residues surrounding the p-nitrobenzylamine substrate and deleting rest of the enzyme. The substrate in theactive site model was then optimized by using QM/MM-ONIOM(HF/6-31G*: PM3:UFF) method. Structural parameters obtained were in good agreement with theavailable crystal structure of p-nitrobenzylamine bound to MAO-B, suggesting thatthe model and the method used were suitable for this type of investigation2. In order to investigate the function of the aromatic cage, benzylamine andp-nitrobenzylamine were selected as substrates. The geometry of each substrate wasoptimized at ten successive distances constrained between the substrate Î±C and theflavin N(5) by using ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) method. Energy of the overallsystem was further minimized by single point HF/6-31G*. The most stable positionof each substrate at the active site corresponds to the center of the aromatic cage.This implies that aromatic cage facilitates the formation of a stable pre-reactiveenzyme-substrate complex providing the necessary energetic and conformationalchanges. Alterations in the structural and electronic properties of the substrates wereinvestigated as they pass through the aromatic cage toward the flavin. Resultsshowed that the negative charge on the substrate?s amine nitrogen was larger alongthe path in the aromatic cage relative to the charge on the free substrate and outsidethe aromatic cage.3. Small model systems, benzene-ammonia complex and model aromatic cage-ammonia complex, were investigated in detail with various high level calculations totest the accuracy of ONIOM(HF/6-31G*: PM3: UFF) method in predicting theincrease in electronic charge of amino nitrogen. Calculations showed that theincrease in nucleophilicity of the amine placed between the aromatic rings is due tothe H-bonding interactions between the amine hydrogen and the aromatic Ï-electrons.4. The same procedure described in part 2 was repeated for the MAO-BTyr435 mutants (Tyr435Phe, Tyr435His, Tyr435Leu, and Tyr435Trp). The negativecharge on amino nitrogen in the mutant enzymes was calculated to be smaller thanthe charge in the wild type enzyme when the substrate is located at the center of thearomatic cage. At this location, calculated decrease in the nitrogen charge showed avery good linear correlation (R2 = 0.81) with the experimentally available catalyticefficiency, â(âG#), for four mutant enzymes. This result and other electronic featuresobtained in this thesis support the proposed role of the aromatic cage and haverelevance to the MAO catalytic mechanism.January 2007 Mehmet Ali AKYÜZ