Yeşil mikroalg chlamydomonas reinhardtii'de piruvat, ortofosfat dikinaz (PPDK) kodlayan iki genin izolasyonu, klonlaması ve ekspresyon analizi
Isolation, cloning and expression analysis of two genes encoding pyruvate, orthophosphate dikinase (PPDK) in the green microalgae chlamydomonas reinhardtii
Yazar: FADİME DEMİREL
Danışman: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Günümüzde mikroalgler yenilenebilir enerji, ilaç, gıda ve kozmetik endüstrilerindeki geniş uygulama alanları nedeniyle dünya çapında büyük ilgi görmektedir. Yeşil alg Chlamydomonas reinhardtii, fotosentetik hücrenin kullanışlı bir modelidir ve bir dizi fizyolojik sürecin araştırılması için yoğun bir şekilde kullanılmaktadır. Son zamanlarda, C. reinhardtii' ye nükleer ve organel transformasyon (nükleer, kloroplast ve mitokondriyal) sistemleri, RNA etkileşimi, CRISPR vb. dahil olmak üzere birçok moleküler teknoloji uygulanmıştır. Bu nitelikler, C. reinhardtii' yi mikroalglerde lipit birikimini artırmak amacıyla C. reinhardtii' nin genetik ve metabolik mühendisliğini gerçekleştirmek için ideal bir alg organizması yapmaktadır. Şu anda mikroalglerde yağ birikimini kontrol eden moleküler mekanizmalar hakkında çok az bilgi mevcuttur. C4 fotosentez metabolik yolları (C4 metabolik yolu ile CO2 fiksasyonu) bitkilerde yüksek oranda karbondioksit fiksasyonu için gereklidir. Alglerin yüksek biyokütle birikimi için yüksek fotosentez oranları önemlidir. Bununla birlikte şaşırtıcı bir şekilde, C. reinhardtii' deki fosfoenolpiruvat karboksilaz genlerinin moleküler karakterizasyonuna odaklanan çabalar dışında, C4 yolu enzimleri ve düzenleyici faktörleri herhangi bir yeşil algde moleküler seviyede incelenmemiştir.
Bu çalışmada, yeşil mikroalg C. reinhardtii' den iki Piruvat, ortofosfat dikinaz (PPDK) geni ilk kez izole edilerek klonlanmış ve farklı büyüme koşullarında ekspresyon analizi yapılmıştır. İki PPDK geninin C. reinhardtii' de fonksiyonel aktif PPDK enzimlerini kodladığını ve her iki genin de C- ve N-yanıt veren genler olduğunu ve büyüme sırasında [CO2] veya [NH4+]' deki değişikliklerle yukarı/aşağı regüle edildiğini gösterdik. PPDK1 ve PPDK2' nin ve diğer PPDK' lerin sayısının filogenetik analizi, üç genel grupta bir kümelenme ortaya çıkardı: (i) CrPPDK2, CrPPDK1 ve VcPPDK' nin (Volvox carteri, C. reinhardtii ile yakından ilişkili) uzak üyeler olduğu tipik vasküler bitki enzimleri; ii) bakteriyel ve iii) protozoal PPDK' ler. CrPPDK2, bitki PPDK' leri ile daha fazla benzerlik gösterirken, CrPPDK1 ise, VcPPDK ile daha fazla benzerlik göstermektedir. Bitki ve alg PPDK proteinleri, bakterilerden çok bazı protozoa ile yakından ilişkilidir. Kolektif bulgular, ökaryotik alglerde PPDK1 ve PPDK2 genleri ve karşılık gelen PPDK enzimleri hakkında temel moleküler bilgiler sağlamaktadır. Bu çalışmalar, alg biyokütlesini artırma ve yağ açısından zengin algler üretmek için alg hücrelerinde protein depolamaya karşı yağ depolama seviyelerini değiştirmeye yönelik uygulamalar üzerinde önemli bir etkiye sahip olacaktır.

Abstract:
Recently, microalgae have attracted significant interest around the world due to their wide range of different applications in renewable energy, pharmaceutical, food and cosmetic industries. The green algae Chlamydomonas reinhardtii is a useful model of a photosynthetic cell and has been intensively used for studies of a number of physiological processes. Recently, several molecular technologies including nuclear and organellar transformation (nuclear, chloroplast and mitochondrial) systems, RNA interference, CRISPR etc. have been applied to C. reinhardtii. These attributes make C. reinhardtii an ideal algal organism to perform genetic and metabolic engineering of C. reinhardtii to increase oil accumulation in microalgae. At the moment a little information is available for molecular mechanisms that control oil accumulation in microalgae. C4 photosynthesis metabolic pathways (CO2 fixation by C4 metabolic pathway) are essential for high rates of carbon dioxide fixation in plants.  High rates of photosynthesis are important for high biomass accumulation of algae. However, surprisingly C4 pathway enzymes and its regulatory factors have not been studied at the molecular level in any green algae, except the efforts which were focused on the molecular characterization of phosphoenolpyruvate carboxylase genes in C. reinhardtii.
In this study, two Pyruvate, orthophosphate dikinase (PPDK) genes from green microalga C. reinhardtii were isolated and cloned for the first time and performed expression analysis at different growth conditions. We demonstrate that two PPDK genes encode functional active PPDK enzymes in C. reinhardtii and both genes are C- and N-responsive genes and up-/down-regulated by changes in [CO2] or [NH4+] during growth. Phylogenetic analysis of PPDK1 and PPDK2 and number of other PPDKs revealed a clustering into three general groupings: (i) the typical vascular-plant enzymes, of which CrPPDK2, CrPPDK1 and VcPPDK (Volvox carteri, closely related C. reinhardtii) are distant members; ii) bacterial and iii) protozoal PPDKs. CrPPDK2 shows more similarity with plant PPDKs, while CrPPDK1 has more similarity with VcPPDK. Notably, plant and algal PPDK proteins are more closely related to some protozoa than to bacteria. Collective findings provide key molecular insight into the PPDK1 and PPDK2 genes and corresponding PPDK enzymes in the eukaryotic algae. These studies will have a significant impact on applications for increasing algae biomass and altering oil storage levels versus protein storage in algae cells to produce oil-rich algae.