Escherichia coli ve enterococcus faecalis bakterilerinin gözenekli silisyum yüzeyinde depolanmasında elektrik alanın etkisi
Effect of electrical field in storage of eschericia coli and enterococcus faecalis bacteria on the porous si̇li̇con surface
Yazar: SEVİNÇ GÜLER
Danışman: DOÇ. DR. ÇİĞDEM ORUÇ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Fizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Fizik ve Fizik Mühendisliği = Physics and Physics Engineering

Özet:
Mikroorganizmaların hassas ve hızlı bir şekilde tayin edilebilmesi; gıda güvenliği, hastalıkların teşhisi gibi konularda önem arz etmektedir. Gözenekli silisyumun boşluklu yapısı, büyük yüzey alanı, elektrokimyasal anodizasyon parametrelerinin değiştirilerek gözenek boyutlarının ayarlanabilir olması nedeniyle biyosensör tasarımı için bir sensör platformu olarak kullanılması mümkündür. 
Elektrik alan etkisi kullanılarak mevcut bakteri sensörlerinin ölçüm hassasiyetinin arttırılabileceği düşünülmüştür. Bakteriler, elektriksel yük taşırlar. Bu nedenle elektrik alanda hareket ettirilebilirler. GS tabanlı sensör platformuna uygulanan elektrik alanın ileri yönünün negatif yüklü bakterileri gözenekli silisyum yüzeyine yaklaştırabileceği, ters yönde uygulanan elektrik alanın ise bakterileri gözeneklerden uzaklaştırabileceği gösterilmiştir.
Bu tez çalışmasında, gözenekli silisyum sensör platformlarını elde etmek için n tipi tek kristal silisyum kullanılarak farklı parametrelerde uygulanan elektrokimyasal anodizayon işlemi sonucu %60 makro (5-15 μm) gözenek boyutlarında ve % 52 küçük gözenekli makro (1-5 μm) gözenek boyutlarında olmak üzere iki farklı özellikte In/Si/GS/Ag yapılar elde edilmiştir. 
Bu yapılar öncelikle elektrik alanın uygulanmadığı ortamda, sırasıyla, 1,7x107 cfu.mL-1, 2,9x107cfu.mL-1, 4x107cfu.mL-1, 4,4x107cfu.mL-1, 4,8x107cfu.mL-1 ve 5,6x107cfu.mL-1  Escherichia coli (E. coli) ve sırasıyla, 1,1x107cfu.mL-1, 1,3x107cfu.mL-1, 2 x107cfu.mL-1,  2,6 x107cfu.mL-1,  3x107cfu.mL-1 ve 4,1x107cfu.mL-1 Enterococcus faecalis (E. faecalis)' in farklı bakteri konsantrasyonu içeren sıvıları içine daldırılarak 5Hz ile 100 kHz frekans aralığında frekansa bağlı empedans değerleri incelenmiştir. Bakteri konsantrasyon değerlerinin artmasıyla empedansta azalma meydana geldiği gözlemlenmektedir.
Elektrik alanın etkisini inceleyebilmek için iki Al levha arasına yerleştirilen makro gözenekli In/Si/GS/Ag yapılar, 4x107 cfu.mL-1 E. coli  sabit bakteri konsantrasyonu içeren sıvıya daldırılarak 0-10 kV/cm aralığında, 2x107 cfu.mL-1 E. faecalis sabit bakteri konsantrasyonu içeren sıvıya daldırılarak 0-5 kV/cm aralığında  çeşitli elektrik alan değerlerine maruz bırakılmıştır. Taban (alt) elektroda pozitif voltaj, tavan (üst) elektroda ise negatif voltaj uygulayarak (ileri yön elektrik alan) elektrik alanın artıdan eksiye doğru bir yönelimi olması nedeniyle sıvı içerisinde bulunan negatif yüklü bakterilerin ileri yönde bir elektrik alanın etkisi ile hareketi GS yapının empedans spektroskopisindeki azalma şeklinde yorumlanmıştır. 
Taban elektroda negatif voltajın uygulanması sonucu, ters yönde uygulanan elektrik alanın etkisi ile bakterilerin gözeneklerden uzaklaşabildiği yorumlanmıştır. Ters yönde uygulanan elektrik alanın artmasıyla gözeneklere birikmiş olduğu düşünülen bakteriler uzaklaştığı için GS tabanlı yapının empedans spektroskopisinde artış meydana gelmiştir.
 İki Al levha arasına yerleştirilen makro gözenekli In/Si/GS/Ag yapılar, 1,5x107 cfu.  mL-1 E. coli  sabit bakteri konsantrasyonu içeren sıvıya daldırılarak 0-5 kV/cm aralığında çeşitli elektrik alan değerlerine maruz bırakılarak deneyler tekrar edilmiştir.
Ayrıca, ileri ve ters yönde uygulanan sabit elektrik alan değerinde, elektrik alanın uygulanma süresinin canlı ve ölü E. coli ve E. faecalis bakterilerin gözeneklere birikme durumunun empedans spektrumları üzerindeki etkisi incelenmiştir. Makro gözenekli In/Si/GS/Ag yapılar 0,5-3 saat aralığı boyunca, canlı 4x107 cfu.mL-1 E. coli  sabit bakteri konsantrasyonu içeren sıvıya daldırılarak 12 kV/cm, canlı 2x107 cfu.mL-1 E. faecalis sabit bakteri konsantrasyonu içeren sıvıya daldırılarak 7 kV/cm sabit ileri ve ters yönde elektrik alana maruz bırakılmıştır. İleri ve ters yönde uygulanan elektrik alan süresinin artmasıyla empedans değerlerinde değişim gözlemlenmiştir. İleri yönde uygulanan sabit elektrik alan şiddetinin uygulanma süresi arttıkça GS tabanlı yapıda bulunan gözeneklere daha çok bakteri yerleşmiş ve empedans değerleri azalmıştır. Ters yönde uygulanan sabit elektrik alan şiddetinin süresinin artmasıyla gözeneklerde bulunan bakteriler uzaklaşarak empedans değerlerinde bir artma meydana getirmiştir. Makro gözenekli In/Si/GS/Ag yapılar 0,5-3 saat aralığı boyunca, canlı 1,5x107 cfu.mL-1 E. coli  sabit bakteri konsantrasyonu içeren sıvıya daldırılarak 7 kV/cm sabit ileri ve ters yönde elektrik alana maruz bırakılmış ve  deneyler tekrar edilmiştir.
Sabit elektrik alanın uygulanma süresinin gözeneklere yerleşen bakteri sayısı üzerindeki etkisini netleştirebilmek için aynı deneyler ölü bakteri hücreleri üzerinde tekrarlanmıştır.  Makro gözenekli In/Si/GS/Ag yapılar 0,5-3 saat aralığı boyunca, 121 0C de 1,5 atm basınçta 20 dakika süre ile otoklavlanmış 4x107 cfu.mL-1 E. coli  sabit bakteri konsantrasyonu içeren sıvıya daldırılarak 12 kV/cm, 2x107 cfu.mL-1 E. faecalis sabit bakteri konsantrasyonu içeren sıvıya daldırılarak 7 kV/cm sabit ileri ve ters yönde elektrik alana maruz bırakılmıştır. Otoklavlanma işlemi nedeniyle bakteri hücre duvarı zarı zarar görerek hücre duvarı içinde kalan iyonlar sıvı içerisine dağılmakta ve ortamdaki serbest iyon konsantrasyonunun artmasına neden olmaktadır. Elektrik alanın ileri ve ters yönde uygulanması sonucunda; ölü bakteri konsantrasyonundaki empedans değerleri canlı bakteri konsantrasyonunda incelenen empedans değerlerine göre daha düşüktür. Elektrik alanın uygulanma süresine bağlı olarak ölü bakteri konsantrasyonuna ait empedans değerlerinde kayda değer bir değişim gözlemlenmemiştir.  Makro gözenekli In/Si/GS/Ag yapılar 0,5-3 saat aralığı boyunca, otoklavlanmış 1,5x107 cfu.mL-1 E. coli  sabit bakteri konsantrasyonu içeren sıvıya daldırılarak 7 kV/cm sabit ileri ve ters yönde elektrik alan maruz bırakılmış ve deneyler tekrar edilmiştir.
Tüm deneyler küçük gözenekli makro (1-5μm) In/Si/GS/Ag yapılar için tekrar edilmiştir. Hem E. coli hem de E. faecalis bakteri konsantrasyonlu sıvılarda elde edilen sonuçlar, makro gözenek boyutlarındaki GS tabanlı yapı için yapılan deney sonuçları ile örtüşmektedir.

Abstract:
Precise and rapid determination of microorganisms; It is important in issues such as food safety, diagnosis of diseases. It is possible to use it as a sensor platform for biosensor design because the porous structure of porous silicon, large surface area, electrochemical anodization parameters are changed and pore sizes are adjustable.
It is thought that the measurement accuracy of existing bacteria sensors can be increased by using the electric field effect. Bacteria carry electrical charges. Therefore, they can move in the electric field. It has been shown that the forward direction of the electric field applied to the PS-based sensor platform can bring the negatively charged bacteria closer to the porous silicon surface, and the electric field applied in the reverse direction can remove the bacteria from the pores.
In this thesis study, 60% macro (5-15 μm) pore sizes and 52% small porous macro (1-5 μm) pore sizes as a result of electrochemical anodization process applied in different parameters using n type single crystal silicon to obtain porous silicon sensor platforms In/Si/PS/Ag structures with two different properties were obtained.
These structures are primarily in an environment where the electric field is not applied, 1,7x107 cfu.mL-1, 2,9x107cfu.mL-1, 4x107cfu.mL-1, 4,4x107cfu.mL-1, 4,8x107cfu.mL-1 and 5,6x107cfu.mL-1  Escherichia coli (E. coli) and 1,1x107cfu.mL-1, 1,3x107cfu.mL-1, 2 x107cfu.mL-1,  2,6 x107cfu.mL-1,  3x107cfu.mL-1 ve 4,1x107cfu.mL-1 Enterococcus faecalis (E. faecalis) were immersed in fluids containing different bacterial concentrations and frequency-dependent impedance values were investigated in the frequency range of 5Hz to 100 kHz. It is observed that impedance decreases with increasing bacteria concentration values.
In order to examine the effect of the electric field, macro porous In/Si/PS/Ag structures placed between two Al plates are immersed in a liquid containing a constant bacteria concentration of 4x107 cfu.mL-1 E. coli and in the range of 0-10 kV / cm and 2x107 cfu.mL-1 E. faecalis was immersed in liquid containing constant bacterial concentration and exposed to various electric field values in the range of 0-5 kV / cm.
Due to the fact that the electric field has a positive and negative orientation by applying positive voltage to the base (bottom) electrode and negative voltage to the ceiling (upper) electrode, the motion of the negatively charged bacteria in the liquid with the effect of an electric field in the forward direction in the impedance spectroscopy of the PS structure interpreted as a decrease.
As a result of applying negative voltage to the base electrode, it is interpreted that bacteria can move away from the pores by the effect of the electric field applied in the opposite direction. Since the bacteria that are thought to have accumulated in the pores with the increase of the electric field applied in the opposite direction, the impedance spectroscopy of the PS-based structure has increased.
The experiments were repeated by immersing the macroporous In/Si/GS/Ag structures placed between the two Al plates in the liquid containing 1,5x107 cfu.  mL-1 E. coli constant bacteria concentration and exposure to various electric field values in the range of 0-5 kV / cm.
In addition, the effect of the application time of the electric field on the impedance spectra of the live and dead E. coli and E. faecalis bacteria in the pores at the constant electric field value applied forward and reverse were investigated.
Macroporous In/Si/GS/Ag structures are immersed in a liquid containing constant bacteria concentration of 4x107 cfu.mL-1 E. coli for a period of 0.5-3 hours, 12 kV / cm, live 2x107 cfu.mL-1 E. faecalis It was immersed in a liquid containing a constant bacterial concentration and exposed to a constant forward and reverse electric field at 7 kV / cm. The change in the impedance values was observed with the increase of the electric field applied in the forward and reverse direction. As the application time of the constant electric field intensity applied in the forward direction increases, more bacteria have been placed in the pores in the PS-based structure and the impedance values have decreased. With the increasing duration of constant electric field intensity applied in the opposite direction, the bacteria in the pores moved away, causing an increase in impedance values. Macroporous In/Si/PS/Ag structures were submerged in a liquid containing a constant bacteria concentration of 1,5x107 cfu.mL-1 E. coli  for a period of 0.5-3 hours, and exposed to a constant forward and reverse electric field. and the experiments were repeated.
In order to clarify the effect of the application time of the fixed electric field on the number of bacteria settled in the pores, the same experiments were repeated on the dead bacteria cells. Macroporous In/Si/PS/Ag structures are immersed in a liquid containing autoclaved 4x107 cfu.mL-1 E. coli   constant bacteria concentration for 20 minutes at a pressure of 1.5 atm at 121 0C for a period of 0.5-3 hours. cm, 2x107 cfu.mL-1 E. faecalis was immersed in a liquid containing a constant bacterial concentration and exposed to a constant forward and reverse electric field of 7 kV/cm. Due to the autoclaving process, the bacterial cell wall membrane is damaged and the ions remaining in the cell wall are dispersed into the liquid, causing an increase in the free ion concentration in the medium. As a result of the electric field forward and reverse application; The impedance values in the dead bacteria concentration are lower than the impedance values examined in the live bacteria concentration. No significant change in impedance values of dead bacteria concentration was observed depending on the application time of the electric field. 
Macroporous In/Si/PS/Ag structures were immersed in a liquid containing autoclaved 1,5x107 cfu.mL-1 E. coli constant bacteria concentration for a period of 0.5-3 hours and exposed to a constant forward and reverse electric field at 7 kV/cm. and the experiments were repeated.
All experiments were repeated for small porous macro (1-5μm) In/Si/PS/Ag structures. The results obtained in both E. coli and E. faecalis bacterial concentration fluids coincide with the experimental results for the PS-based structure in macro pore sizes.