Larinks kanserinde kras-3'UTR-LCS6 varyantı (RS61764370) ile ıl-6/JAK2/STAT3 sinyal yolağı arasındaki ilişkisinin incelenmesi
Investigation of the relationship between kras-3'UTR-LCS6 variant (RS61764370) and il-6/JAK2/stat3 signaling pathway in laryngeal carcinoma
Yazar: MUHAMMED BURAK KAPLAN
Danışman: PROF. DR. TÜLÜN ÇORA
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Baş-Boyun Kanserleri (BBK) dünya genelinde en sık görülen 7. kanser türüdür. BBK'lar arasında ikinci sırada yer alan larinks kanseri, tüm kanser ölümlerinin %1,57'sinden sorumludur. Larinks kanserinde birçok farklı gende mutasyonlar tanımlanmıştır. Bunlardan en önemlilerinde biri KRAS gen mutasyonlarıdır. Bir onkogen olan KRAS geninin 3'UTR bölgesinde miRNA let-7'nin bağlanma bölgesi olan LCS6 (let-7 complementary site 6)'daki T>G nükleotid değişikliğinin (rs61764370), klinik çalışmalarda birçok kanserde; kanser gelişimini, tedaviye dirençliliği ve metastazı arttırdığı, bunun yanında hastalarda yaşam süresini (survival) azalttığı yönünde bulgular elde edilmiştir. Önceki projemizde, bu varyantın metastatik etkisi in vitro ve in vivo (xenograft fare deneyleri) deneyler ile araştırılmıştır. LCS6 varyantının larinks kanserinde tümör gelişimi ve metastazı arttırdığı, ancak bu etkiyi RAF/MEK/ERK ve PI3K/AKT/mTOR yolakları üzerinden yapmadığı saptanmıştır. LCS6 varyantının bu etkisini hangi hücre içi yolak üzerinden gerçekleştirdiği halen bilinmemektedir.
Bu çalışmada ise larinks kanserinde, KRAS-3'UTR-LCS6 varyantının, bir diğer kanser metastaz yolağı olan IL-6/JAK2/STAT3 sinyal yolağı üzerine etkisi araştırıldı. Bunun için öncelikle KRAS-CDS-G12V mutasyonu ve KRAS-3'UTR-LCS6 varyantını içeren KRAS genleri, lentiviral yöntemle HEp2 hücrelerine transfekte edildi. Daha sonra bu hücrelerde IL-6/JAK2/STAT3 sinyal yolağı genleri RT-qPZR ile mRNA düzeyinde ve ELISA analizi ile protein düzeyinde ekspresyon analiz edildi. Elde edilen bulgulara göre; LCS6 varyantının NF-κB, IL-6, STAT3 ekspresyonunu azalttığı, JAK2 ve AKT ekspresyonunu ise değiştirmediği tespit edildi. IL-6 proteini açısından ise LCS6 varyantı, total hücre proteininde IL-6 seviyesini azaltırken, hücre kültürü süpernatantında IL-6 seviyesini arttırdığı gözlendi. Bu durum, IL-6'nın pleiotropik etkisiyle uyumludur.
Sonuç olarak, LCS6 varyantının, metastatik etkisini oluştururken IL-6/JAK2/STAT3 sinyal yolağını baskıladığı, PI3K/AKT/mTOR yolağını ise etkilemediği sonucuna ulaşıldı.

Abstract:
Head and neck cancer (HNC) is the seventh most common cancer worldwide. Laryngeal carcinoma, which is the second most common type of HNC, causes 1.57% of all cancer deaths. Numerous mutations have been identified in various genes in laryngeal carcinoma, and one of the most important ones is KRAS gene mutations. The T>G nucleotide change (rs61764370) in the let-7 complementary site 6 (LCS6) of the 3' untranslated region (UTR) of the KRAS gene, which is an oncogene, has been identified as a critical mutation in many cancers. It has been shown in clinical studies to promote cancer development, treatment resistance, and metastasis, while also reducing patient survival.
In our previous project, the metastatic effect of this variant has been investigated through in vitro and in vivo (xenograft mouse models) experiments. It has been found that the LCS6 variant increases tumor development and metastasis in laryngeal carcinoma, but this effect is not mediated through the RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT/mTOR pathways. The intracellular pathway through which the LCS6 variant exerts its metastatic effect is still unknown.
In this study, the effect of the KRAS-3'UTR-LCS6 variant on the IL-6/JAK2/STAT3 signaling pathway, another cancer metastasis pathway, was investigated in laryngeal carcinoma. For this purpose, KRAS genes containing the KRAS-CDS-G12V mutation and the KRAS-3'UTR-LCS6 variant were transfected into HEp2 cells using lentiviral methods. Then, expression analyses of IL-6/JAK2/STAT3 signaling pathway genes were performed at the mRNA level using RT-qPCR and at the protein level using ELISA analysis in these transfected cells. According to the results, the LCS6 variant was found to decrease the expression of NF-κB, IL-6, and STAT3, but did not affect the expression of JAK2 and AKT. In terms of IL-6 protein, while the LCS6 variant decreased the level of IL-6 in total cell protein, it increased the level of IL-6 in the cell culture supernatant. This is also consistent with the pleiotropic effect of IL-6.
In conclusion, it was found that the LCS6 variant suppressed the IL-6/JAK2/STAT3 signaling pathway while creating its metastatic effect, but did not affect the PI3K/AKT/mTOR pathway.