Sığırlarda ı̇nfluenza D vı̇rusunun saptanması, ı̇zolasyonu, moleküler karakterı̇zasyonu ve oluşan ı̇mmun yanıtın araştırılması
Detection, isolation, molecular characterisation and immune response to influenza D virus in cattle
Yazar: HASAN EMRE TALİ
Danışman: PROF. DR. AYSUN YILMAZ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı / Viroloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) = Reverse transcription polimerase chain reaction ; RNA virüs enfeksiyonları = RNA virus infections ; RNA virüsleri = RNA viruses ; Seroprevalans = Seroprevalence ; Solunum yolları enfeksiyonları = Respiratory tract infections ; İnfluenza virüs = Influenza virus

Özet:
İnfluenza D virusu (IDV) sığırlarda solunum yolu infeksiyonlarına neden olmaktadır. Dünya çapında farklı ülkelerde ve ülkemizde tespit edilen IDV, farklı oranlarda morbidite göstermiş ve sığırlarda önemli ekonomik kayıplara neden olan sığırların kompleks solunum yolu hastalığı (Bovine Respiratory Disease Complex=BRDC) ile ilişkili bulunmuştur. Günümüzde henüz IDV aşısı yoktur ve bu nedenle IDV için uygulanan koruma ve kontrol stratejileri hijyen ve iyi yönetim uygulamaları şeklinde yapılmaktadır. Bu tez çalışmasında IDV'nin saptanması, izolasyonu, moleküler karakterizasyonu ve immun yanıtının araştırılması amacıyla ülkemizde Marmara Bölgesi'nden örnekler toplandı. Solunum yolu hastalık belirtileri gösteren sığırlardan (n=279) alınan nazal svab ve kan örneklerinde moleküler ve serolojik yöntemler kullanılarak İnfluenza D virusu ve oluşan immun yanıt araştırıldı. Real time RT-PCR ile IDV yönünden pozitif bulunan örneklerde HRT-18 hücreleri ve embriyolu tavuk yumurtaları kullanılarak virus izolasyon çalışmaları yapıldı. Virus izolasyonu sonrasında kısmi ve tüm HEF geni temelinde sekanslama yöntemi ile filogenetik analizler gerçekleştirildi. İzole edilen virusun hemaglutinasyon (HA) titresi belirlendi ve viral proteinleri SDS-PAGE ile ayrıştırıldı ve protein bantları görüntülendi. Alınan kan örneklerinde antikor taraması amacıyla ELISA testi yapıldı. Antikor tespiti yapılan serum örneklerinde hemaglütinasyon inhibisyon (HI) testi ile titre tespiti gerçekleştirildi. Yüksek HI titresi saptanan bir serumla, IDV infeksiyonu sonucu oluşan antikorların virusun hangi ağırlıktaki (kDa) proteinlerine karşı immun yanıt oluşturduğu Western blotting yöntemiyle araştırıldı. Yapılan çalışmalar sonucunda, solunum sistemi belirtileri gösteren 279 sığırdan toplanan nazal svab örneklerin 5 tanesinde IDV-RNA'sı tespit edildi (%1,79). RT-PCR ile pozitif bulunan örneklerle HRT-18 hücre kültüründe ve embriyolu tavuk yumurtasında virus izolasyonu çalışması yapıldı. Beş (5) nazal svab örneğinden IDV izole edildi. Bu örneklerin hepsinde kısmi HEF geni ve 4 tanesinde tüm HEF geni sekanslandı. IDV'nin HEF genine ait farklı bölge ve ülkelerden araştırmacıların bildirdiği sekanslar GenBank'tan temin edildi ve bu tez çalışmasında elde edilen sekans dizileri ile filogentik analiz yapılarak soyağacı oluşturuldu. Pozitif saptanan örneklerden 2020-2021 yıllarında toplanan örnekler D/OK genogrubunda kümelenirken 2024 yılında toplanan örnekler D/Yama2019 genogrubunda kümelendiği bulundu. ELISA ile yapılan antikor tarama çalışmalarında, 279 hayvana ait serumlardan 79 tanesinde IDV antikorları tespit edildi (%28,3). Antikor saptanan örneklerde hemaglutinasyon inhibisyon testi yapılarak bu serumların HI titreleri belirlendi. Serum örneklerinde HI değerleri 128-512 HI ünitesi arasında değişkenlik gösterdi. İzole edilen virusun SDS-PAGE yöntemiyle viral proteinleri ayrıştırıldı ve bantlar görüntülendi. Yüksek HI titresi saptanan bir serumla yapılan Western blotting ile antikorların virusun hangi kDa proteinlerine bağlandığı araştırıldı ve IDV'nin 100 kDa civarında bir proteinine bağlandığı tespit edildi.
Sonuç olarak, Marmara Bölgesi'nde sirküle olan IDV'lerin ülkemizde izolasyonu ilk kez yapıldı ve viruslara karşı oluşan serolojik yanıt ELISA, HI ve Western blotting ile ilk kez araştırıldı ve yüksek oranda (%28,3) seropozitiflik bulundu. Western immunobloting çalışmalarında saha infeksiyonu sonucu oluşan antikorların IDV'nin 100 kDa ağırlığındaki proteinine karşı reaksiyon verdiği görülmüş olması, aşı çalışmalarında bu proteinin dikkate alınması gerekliliğini ortaya koymuştur. Ayrıca, HEF geninin tüm genom çalışmaları sonucunda, virusun D/OK ve D/Yama2019 suşuna benzer olduğu tespit edildi. Bu nedenle, ülkemize özgün otojen aşı üretilmesi durumunda bu virusların kullanılması aşılama stratejileri açısından önem arz etmektedir.

Abstract:
Influenza D virus (IDV) causes respiratory system infections in cattle. IDV has been reported globally in several countries including Turkiye with various degrees of morbidity. It has been reported that IDV contributes to Bovine Respiratory Disease Complex (BRDC) in cattle which causes great economical loses. There are no vaccines available for IDV yet and hereby strategies for prevention and control of IDV include hygiene and good management pratices. In this thesis, detection, isolation, molecular characterisation and immun response to IDV in cattle were aimed. For this purpose, samples (n=279) was collected from Marmara region of Turkiye. These samples were collected from animals with respiratory disease symptoms and include nasal swabs and blood. Virus isolation and antibody response were investigated using molecular and serological techniques. Followed by IDV-RNA detection by real time RT-PCR, virus isolation on cell culture and embryonated eggs were performed. After virus isolation, positive samples were confirmed by RT-PCR and phylogenetic anaylses were carried out on partial and whole HEF gene. In addition, hemaglutination (HA) titers were determined and viral proteins were separated by SDS-PAGE. For antibody response, ELISA and hemagglutination inhibition (HI) tests were performed. A serum with high antibody titre was used in Western blotting to determine the molecular weight (kDa) of which viral proteins binds to antibodies produced by IDV post- infection. According to the results, out of 279 nasal swabs, IDV-RNA was detected in five cattle (1,79%). These 5 samples found to be positive by real time RT-PCR were subjected to virus isolation on HRT-18 cell cultures and embryonated eggs. Sequences of partial HEF gene was obtained from 5 samples and whole HEF gene of 4 samples. Sequences reported from different regions and countries in the world were provided from GenBank and these sequences were used for the phlogenetic analyses to generate phlogenetic trees with the sequences obtained in this thesis. Positive samples which were collected in 2020-2021 were aligned in D/OK lineage and samples collected in 2024 were aligned in D/Yama2019 lineage. ELISA results indicated that IDV antibodies were detected in 79 (28,3%) of 279 cattle sera. Positive samples were also analysed by HI to determine hemagglutination inhibition titers and HI unites were found to be between 128 and 512. A serum with high HI titer was used for western blotting to investigate antibodies bind to which viral proteins and antibodies were reacted with a 100kDa protein of IDV. In conclusion, IDV which has been circulating in Marmara region was isolated and the seroprevalance was investigated by ELISA, HI and Western blotting for the first time and antibodies to IDV were detected in 28,3% cattle. In Western immunoblotting studies, it was observed that antibodies formed as a result of field infection reacted with the 100 kDa protein of IDV, which indicate that this protein should be taken into consideration in vaccine studies. In addition, as a result of whole genome studies of the HEF gene, it was determined that the virus was similar to the D/OK and D/Yama2019 strains. Therefore, it is important to use these viruses in terms of vaccination strategies in case of production of autogenous vaccines specific to our country.