Miyokardiyal rejenerasyon için sıçan kemik iliği kök hücrelerinden kardiyomiyositlerin farklılaştırılması ve karakterizasyonu
Differentiaiion and characterization of cardiomyocytes from rat bone marrow mesenchymal stem cells for myocardial regeneration
Yazar: HANDAN SEVİM
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ ONUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoloji = Biology ; Fizyoloji = Physiology
Dizin: Desmin = Desmin ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Kemik iliği = Bone marrow ; İmmünofloresan = Immunofluorescence

Özet:
Bu çalışmada kemik iliği mezenşimal kök hücreleri 5-Azacytidine (5-Aza) uygulaması ile kardiyomiyosit yönünde farklılaştırılmış ve karakterize edilmiştir.Deneysel çalışmanın ilk aşamasında steril koşullar altında sıçan tibia ve femurundan kemik iliği toplanmış ve mezenşimal kök hücreler yoğunluğa bağlı çöktürme yöntemi ile izole edilmiştir. Standart kültür koşullarında inkübe edilen hücrelerin 4. pasaja kadar gelişimi takip edilmiştir. Başlangıç hücreleri (P0) ve diğer pasajlardaki (P1, P2, P3, P4) kemik iliği mezenşimal kök hücrelerinin karakterizasyonu, aminopeptidaz-N (CD13) ve integrin-?1 (CD29) yüzey proteinlerinin Teksas Red (TR) florokromuna özgü antikorlarla immunofloresan olarak boyanmasıyla yapılmıştır. 5-Aza'nın kemik iliği mezenşimal kök hücrelerinin canlılığına olan etkisi MTT yöntemi ile incelenmiştir. Karakterizasyon ve MTT analiz sonuçlarına göre seçilen pasajlardaki (P2 ve P3) kemik iliği mezenşimal kök hücreleri, kardiyomiyositlere farklılaştırmak amacıyla farklı yoğunluklardaki (1, 3, 5, 10 ve 50 µM) 5-Aza ile 24 saat muamele edilmiş ve uygulama yapılmayan grup kontrol olarak değerlendirilmiştir. Farklılaştırılan hücreler dört hafta boyunca inkübe edilmiş ve karakterizasyon için 1., 2., 3. ve 4. haftalarda desmin ve kardiyak troponin-T ile TR ve FITC florokromuna özgü antikorlarla immunofloresan yöntemle boyanarak gösterilmiş, hücrelerdeki kardiyak troponin-I miktarı ise ELISA yöntemi ile ölçülmüştür.Sonuçlar farklı pasajlardaki (P2 ve P3) kemik iliği mezenşimal kök hücrelerinin 5-Aza uygulaması ile kardiyomiyositlere farklılaştığını göstermiştir. Farklılaşan hücrelerin öncelikle hücre kümeleri oluşturduğu ve özellikle bu kümelerin desmin ve kardiyak troponin-T bulundurduğu gösterilmiştir. Karakterizasyonda immunofloresan boyamalar sonucunda en iyi görüntü ikinci pasajda ve iki haftalık inkübasyon süresinde elde edilmiştir. Kardiyak troponin-I ELISA yöntemi sonuçlarına göre en yüksek ölçümler 3 ve 5 µM 5-Aza içeren gruplarda elde edilmiştir.Bu sonuçlar, günümüz koşullarında kalp hastalıkları için kullanılan tedavi yöntemleri düşünüldüğünde farklılaştırılan mezenşimal kök hücrelerin kalp kası hasarının tedavisi amacıyla kullanılmasında hücresel boyutta tedavi için ümit vericidir. Bu nedenle bu çalışmanın hücresel kaynaklı kalp kası hasarı tedavisinde ilk adımı oluşturabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
In this study, cardiomyocytes were differentiated and charecterized from bone marrow mesenchymal stem cells with 5-Azacytidine (5-Aza) treatment.At the first step of the experimental study, bone marrow were collected from tibia and femura of rats and the mesenchymal stem cells were isolated with a density gradient method under sterile conditions. Bone marrow mesenchymal stem cells were incubated at the standart culture conditions until passage 4 and their growth potential was observed under inverted microscope. For the characterization of bone marrow mesenchymal stem cells, at starting point (P0) and the other passages (P1, P2, P3 and P4), immunoflorescein staining method was performed by using Teksas Red (TR) fluorochroms for specific cell surface proteins aminopeptidase-N (CD13) and integrin ?-1 (CD 29). The effects of 5-Aza on bone marrow mesenchymal stem cell viability were examined by MTT method. Bone marrow mesenchymal stem cells at P2 and P3 were sellected for cardiomyocyte differentiation according to the results of characterization and MTT analysis. P2 and P3 cells were exposed to different concentrations (1, 3, 5, 10 and 50 µM) of 5-Aza for 24 hours, untreated cells used as the control group. Differentiated cells were incubated for 4 weeks and stained with cardiomyocyte specific markers desmin and cardiac troponin-T by using TR and FITC fluorochroms and cardiac troponin-I levels was measured with ELISA method for the cardiomyocyte characterization.The results showed that bone marrow mesenchymal stem cells at different pasages (P2 and P3) can differentiate into cardiomyocytes with 5-Aza treatment. Differentiated cells started to form cell colonies and expecially these colonies stained with desmin and cardiac troponin-T. On the strenght of immunofluorescein staining methods the best results were taken at second passage and 2 week?s incubation period. In respect of ELISA method results 3 µM and 5 µM 5-Aza dilution displayed the highest amount of cardiac troponin-I.Considering today's treatment methods that are used for heart disease differentiated mesencyhmal stem cells are considered to have significant applications in cellular approaches for regeneration of heart muscle losses. It can be said that this study seems to provide a new approach for cellular cardiac therapy.