Farklı hücre hatlarında tıbbi sülük salgı ekstraktının in vitro etkisinin araştırılması
Investigation of in vitro effect of medical leech saliva extract on various cell lines
Yazar: NİHAN TIRIK
Danışman: DOÇ. DR. KÜBRANUR ÜNAL
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Anjiyogenez = Angiogenesis ; Apoptozis = Apoptosis ; Hücre dizisi = Cell line ; Proliferasyon = Proliferation ; Sülük = Leech ; Sülük tedavisi = Leeching ; Yara iyileşmesi = Wound healing ; İn vitro = In vitro

Özet:
Amaç: Çalışmamızda tıbbi sülük salgısının hücre canlılığı, yara iyileşmesi, apoptoz ve bu etkilerden sorumlu gen ekspresyonlarını incelemek amaçlandı. Yöntem: Çalışmamızda Hirudo verbana cinsi steril tıbbi sülüklerden sağım yöntemi ile sülük salgısı elde edildi. Bu salgıdan total protein konsantrasyonu tayin edilerek, seri dilüsyon ile doz miktarları (400 µg/ml,200 µg/ml,100 µg/ml ve 50µg/ml) ayarlandı. Bu çalışmada insan göbek kordon veni endotel hücresi (HUVEC-CRL-1730), meme fibroblast (HTB-125) ve mezenkimal kök hücre (PCS-500-012) hattı kullanıldı. Hücre kültürü ile üretilen hücreler üzerine belirlenen dozlarda sülük salgısı uygulandı. Hücre canlılığı ve proliferasyonun değerlendirilmesi için MTT testi yapıldı. Sülük salgısının yara iyileşmesi üzerine etkisi in vitro yara modeli ile değerlendirildi. Farklı dozlarda sülük salgısı uygulanan hücrelerdeki VEGF, EGF ve FGF gen ekspresyon tayininde RT-PCR yöntemi kullanıldı. Sülük salgısının apoptozis üzerine olası etkisi flow sitometri ile araştırıldı. Bulgular: Hücre proliferasyonu açısından, sülük salgısının farklı dozları uygulanan meme fibroblast hücre hattındaki hücre canlılığı kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek bulundu(p<0,001). İn vitro yara modeli uygulamasında tüm hatlarda 50 µg/ml dozunun 24. veya 48. saatte tüm alanları hücreler ile kapattığı gözlemlendi. RT-PCR analizinde, 200 µg/ml'lik sülük salgısı uygulanan HUVEC ve meme fibroblast hücre hatlarında EGF ve VEGF gen ekspresyon düzeylerinin kontrol ve diğer dozdaki gruplara göre anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0,001). Flow sitometri analizinde HUVEC ve meme fibroblast hücre hattında %100'e yakın hücre canlılık oranları gözlemlenirken mezenkimal kök hücre hattında ise nekroz olduğu tespit edildi. Sonuç: Farklı dozlardaki sülük salgısı uyguladığımız sağlıklı hücre hatlarında hücre canlılığı, hücre proliferasyonu, yara iyileşmesi ve anjiyogenez için gen ekspresyonu üzerine önemli etkileri olduğu bulundu.

Abstract:
Objective: In our study, it was aimed to examine the cell viability, wound healing, apoptosis and possible gene expressions responsible for these effects of medicinal leech secretion. Method: In our study, leech saliva was obtained from sterile medicinal leeches of Hirudo verbana genus by milking method. By determining the total protein concentration from this secretion, dose amounts (400 µg/ml, 200 µg/ml, 100 µg/ml and 50 µg/ml) were adjusted by serial dilution. In this study, human umbilical cord vein endothelial cell (HUVEC-CRL-1730), Breast fibroblast (HTB-125) and esenchymal stem cell (PCS-500-012) lines were used. The certain doses of leech secretion have been applied on cells produced in cell culture. MTT test was used to evaluate cell viability and cell proliferation. The effect of leech saliva extract on wound healing was evaluated with the in vitro wound model. RT-PCR method was used for VEGF, EGF and FGF gene expression determination in cells treated with leech saliva at different doses. The possible effect of leech saliva on apoptosis was investigated by flow cytometry. Results: In terms of cell proliferation, cell viability in Breast fibroblast cell lines applied with different doses of leech saliva was found to be significantly higher than in the control group (p<0.001). In in vitro wound model assay, it was observed that 50 µg/ml dose covered all areas with cells at 24 or 48 hours in all cell lines. In RT-PCR analysis, EGF and VEGF gene expression levels were found to be significantly higher in HUVEC and Breast fibroblast cell lines treated with 200 µg/ml leech secretion compared to control and other dose groups (p<0.001). In the flow cytometry analysis, cell viability rates close to 100% were observed in HUVEC and Breast fibroblast cell lines, while necrosis was detected in the Mesenchymal stem cell line. Conclusion: In this study, it was found that leech saliva applied at different doses had significant effects on cell viability, cell proliferation, wound healing and gene expression for angiogenesis.