Üçüncü nesil tirozin kinaz inhibitörü ponatinib' e duyarlı ve dirençli KML hücrelerine stat5 inhibitörü pimozid uygulamasının lösemik hücre yanıtı üzerine etkilerinin araştırılması
The investigation of effects on leukemic cell response of stat5 inhibitor pimozide applied on CML cell which is sensitive and resistant to third generation tyrosine kinase inhibitor ponatinib
Yazar: NURCAN GÜMÜŞ
Danışman: DOÇ. DR. BURÇİN KAYMAZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: ErbB reseptörleri = ErbB receptors ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Onkogenler = Oncogenes ; Pimozid = Pimozide ; Ponatinib = Ponatinib

Özet:
Hematopoietik kök hücrenin klonal bir miyeloproliferatif bozukluğu olan kronik miyeloid lösemi (KML), t(9; 22) resiprokal translokasyonu sonucunda oluşan BCR/ABL onkogeni ile karakterizedir. Bu onkogen sürekli tirozin kinaz aktivitesine neden olur ve KML lökomogenezinden sorumludur. 
Tirozin kinaz inhibitörü (TKI) İmatinib, KML tedavisinde yeni bir çığır açmıştır. Fakat, KML olgularının zamanla İmatinibe karşı direnç geliştirdiği gözlenmiştir. Bu nedenle II. nesil (Dasatinib, Nilotinib, Bosutinib) ve III. nesil TKI'leri (Ponatinib) geliştirilmiştir. Kazanılmış İmatinib direnci; Dasatinib, Nilotinib, Bosutinib ve Ponatinib için de azalmış etkinlik ve artmış direnç ile ilişkilendirilmiştir. 
JAK/STAT yolağında bulunan STAT proteinleri, birer transkripsiyon faktörüdür ve lösemi gelişiminde önemli rol oynamaktadırlar. Özellikle aktif STAT5, lösemik hücrelerin sağ kalımını ve proliferasyonunu sağlayan temel proteinlerdendir. Lösemide artan STAT5 gen ekspresyonunun baskılanmasıyla lösemik hücre apoptozunun indüklenmesinin ve TKI tedavisine karşı gelişebilecek direncin üstesinden gelinmesinde anahtar bir role sahip olduğunun gösterilmesi; STAT' ları, KML' ye karşı geliştirilen yeni anti-kanser ilaçların, birinci hedefi haline gelmiştir. 
Çalışmamızda, FDA onaylı psikotropik ilaç olan "Pimozide" etken maddesinin aynı zamanda STAT5 inhibitörü olmasından yola çıkarak, STAT5 protein fosforilasyonunun inhibe edilmesiyle KML hücrelerinin proliferasyonu, apoptozu, hücre döngü aresti, çeşitli biyolojik fonsiyonları bulunan genlerin mRNA seviyesindeki ekspresyonları ve STAT5' lerin protein ekspresyonu gibi hücresel yanıtlar üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla, KML hücre hattı modeli atasal K562 ve onun 1 nM Ponatinib' e direnç kazandırılmış K562/Pon1 dirençli hücrelerinde moleküler düzeyde analizler gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, Ponatinib + Pimozide kombinasyon deneyleri de tez kapsamında araştırılmış, hücresel yanıt analizleri bu deney grupları için de gerçekleştirilmiştir.
Bu çalışmada kullanılan lösemi hücre hatlarında Pimozide etken maddesinin sitotoksik etkisi WST-1 analizi kullanılarak zaman ve doza bağımlı olarak değerlendirilmiştir. Hücrelere uygulanan Pimozide, Ponatinib dozlarının ve kombinasyon dozlarının hücreler üzerinde oluşturduğu apoptotik etki Annexin V yöntemine göre değerlendirilirken, hücre döngüsü üzerindeki etki "BD Cycletest Plus DNA Reagent Kit" ile değerlendirilmiştir. Doz uygulamalarının hücreler üzerinde oluşturduğu gen ekspresyon değişimleri, tüm doz grupları ve kontrol gruplarından elde edilen mRNA'larla RT-qPCR ile belirlenmiştir. Son olarak proteinlerin kantitatif tayinleri için western blot yöntemi kullanılmıştır.
Pimozide etken maddesinin 72. saat IC50 dozu K562 hücreleri için 5,06 μM belirlenirken, K562/Pon1 hücreleri için 8,72 μM olarak belirlenmiştir. Gen ekspresyon ve western blot çalışmalarımızın ortak sonucu olarak Pimozidenin STAT5 inhibitörü olduğu ve hem STAT5A hem de STAT5B genlerini inhibe ettiği belirlenmiştir. Ayrıca STAT3, JAK2, SOCS1 gibi JAK/STAT yolağında çeşitli görevlere sahip olan proteinlerinin ekspresyonu değiştirmesi, bu yolağı etkilebilecek önemli bir ajan olduğunu düşünmekteyiz. Pimozide etken maddesinin hücreler üzerinde apoptotik etkiye sahip olduğunu ve hücre döngüsünde G0-G1 arrestine neden olduğu tespit edilmiştir.
Pimozidenin K562 hücrelerindense K562/Pon1 hücrelerinde daha effektif olduğu belirlenmiştir. Bu sayede, KML' de gelişmiş olan ilaç direncini kırmada kullanılabilecek effektif bir ajan olabileceğini düşünmekteyiz. Ayrıca K562/Pon1 hücrelerinde ponatinible kombine olarak kullanıldığında; Ponatinib ilacının DRI 3,49 olarak belirlenmiştir. Kullanılan Ponatinib dozunun azaltılabilecek olmasından dolayı normal hücrelerin üzerinde oluşan sitotoksitenin  azaltacağı düşünülmektedir.

Anahtar kelimeler: KML; Pimozide; STAT5

Abstract:
Chronic myeloid leukemia (CML), a clonal myeloproliferative disorder of the hematopoietic stem cell, is characterized by BCR/ABL oncogenesis resulting from t(9;22) reciprocal translocation. This oncogene causes continuous tyrosine kinase activity and is responsible for CML leukomogenesis.
Tyrosine kinase inhibitor (TKI) İmatinib has opened a new era in the treatment of CML. However, it has been observed that CML cases develop resistance to İmatinib over time. For this reason II. (Dasatinib, Nilotinib and Bozutinib) and III. generation TKIs (Ponatinib) have been developed. Earned İmatinib resistance; Dasatinib, Nilotinib, Bosutinib and Ponatinib have also been associated with decreased efficacy and increased resistance.
STAT proteins on the JAK / STAT pathway are transcription factors and play important roles in the development of leukemia. Particularly active STAT5 is the basic protein that ensures survival and proliferation of leukemic cells. Demonstration of leukemic cell apoptosis induced by suppression of increased STAT5 gene expression in the leukemia and a key role in the pathogenesis of resistance to TKI therapy; STATs have become the primary target of new anti-cancer drugs developed against CML.
In our study, the FDA-approved psychotropic drug "Pimozide" was found to be a STAT5 inhibitor at the same time. The inhibition of STAT5 protein phosphorylation investigated the proliferation of CML cells, apoptosis, cell cycle arrest, the expression at the mRNA level of genes with various biological functions, and the effect of STAT5 on cellular responses such as protein expression. For this purpose, the KML cell line model ancestral K562 and its 1 nM Ponatinib-resistant K562 / Pon1 resistant cells were analyzed at the molecular level. In addition, Ponatinib + Pimozide combination experiments were investigated within the scope of the thesis, and cellular response analyzes were also performed for these experimental groups.
The cytotoxic effect of the pimozide active agent in the leukemia cell lines used in this study was assessed as time and dose dependent using WST-1 analysis. The apoptotic effect of pimozide, ponatinib doses and combination doses on cells was assessed according to the Annexin V method and the effect on cell cycle was evaluated with "BD Cycletest Plus DNA Reagent Kit".The gene expression changes produced by the dose applications on the cells were determined by RT-qPCR with mRNAs from all dose groups and control groups. Finally, the western blot method was used for the quantitative determination of proteins.
For the 72 hour IC50 doxed K562 cells of the pimozide active substance, 5.06 μM and 8.72 μM for K562 / Pon1 cells was determined. Our gene expression studies and western blot studies have shown that Pimozidenin STAT5 inhibitor is a common result and inhibits both STAT5A and STAT5B genes. We also think that proteins such as STAT3, JAK2, SOCS1, which have various functions in JAK / STAT pathway, are an important agent that can affect this pathway.  It has been determined that the pimozide active substance has apoptotic effect on the cells and causes G0-G1 arrest in the cell cycle.
Pimozidenin was found to be more effective in K562 / Pon1 cells than K562 cells. At this point, we think that CML may be an effective agent that can be used in the crushing of drug resistance developed in the leukemia. Furthermore, when ponatinib is used in combination with K562 / Pon1 cells; Ponatinib was determined as DRI 3,49. Since the dose of Ponatinib used can be reduced, it is thought that cytotoxicity on normal cells will decrease.

Anahtar kelimeler: KML; Pimozide; STAT5