Serebral iskemi reperfüzyon hasarı modelinde visnagin'in farklı dozlardaki nöroprotektif potansiyelinin incelenmesi
Investigation of neuroprotective potential of visnagin at different doses in a cerebral ischemia reperfusion injury model
Yazar: MEHMET SALİH ATAMA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ İBRAHİM BAŞAR
Dicle Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery

Özet:
Giriş ve Amaç: Serabral iskemi, beynin kan akışının azalmasına sekonder olarak nöral dokular için gerekli olan oksijenasyonun kesintiye uğramasıdır. Morbidite ve mortalitenin en önemli nedenleri ararısında iskemik inme yer alır. İnme; hemorajik inme ve iskemik inme olarak ikiye ayrılır. Yaklaşık olarak inmelerin %88'ini iskemik inme oluşturur. İskemik inmelerin çoğunluğunu MCA'dan beslenen alanlarda görülür. İskemik inmede günümüzde 2 tip tedavi yaklaşımı öne pılandadır. Bunlar rekanalizasyon ve nöroproteksiyondur. Rekanalizasyonda kabul edilen tek medikal tedavi seçeneği rtPA'dır. rtPA'nın iskemik inmede ilk 4,5 saatte kullanılabilmesi sebebiyle kullanımı sınırlıdır. Bu nedenle kullanımı daha geniş tedavi protokolleri üzerinde çalışılmaktadır.
	İskemik inmede bir dizi farklı mekanizmalar rol oynamaktadır. Nöroproteksiyon, bu biyokimyasal ve moleküler olayların önlenip veya yavaşlatılmasıyla ilgili beyni iskemiye karşı koruma gayretidir. Bu amaca uygun birçok antioksidan, antiinflamatuvar, antiapoptotik ve antisitotoksik ajanlar kullanılmıştır. 
	Kromon ve furan'ın bir bileşik türevi olan visnagin furanokromonu halk arasında kürdan otu olarak ta bilinen hıltan bitkisinde yoğun miktarda bulunmaktadır. Latince adı Ammi visnaga olan hıltan bitkisi yenilebilir yabani bitkiler arasında yer almakta ve Türkiye ve Fas gibi ülkelerde bulunmakta ve toplumda geleneksel tıpta yoğun şekilde kullanılmaktadır. Yapılan toksikolojik incelemelerde visnagin'in majör kaynağı olan kürdanotu'nun deney hayvanlarında yüksek dozlarda dahi toksikolojik bir etki göstermedi bildirilmiştir.
 Bu bitkisel ürün ile yakın dönemde yapılmış olan araştırmalarda visnagin'in anti-inflamatuvar potansiyele sahip olduğu ve vazodilatör etki gösterdiği bildirilmiştir.  Yaptığımız çalışmada visnagin'in nöroprotektif etkisinin literatür göz önünde bulundurularak belirlenen düşük, orta ve yüksek doz uygulamalarında serebral iskemi reperfüzyon sonrası koruyucu etkisini araştırdık.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmamızda rastgele seçilmiş 328,53 ± 47,20gr ağırlıkları olan 35 adet Sprague Dawley cinsi dişi sıçanlar kullanıldı. 10 mg/kg ksilazin ve 80 mg/kg ketamin ile anestezi uygulandıktan sonra sağ common karotid arterden girerek internal karotid artere doğru yönlendirilen sütur internal karotid arterden ilerletilerek MCA oklüde edildi. 90 dakika bekletip iskemi oluşturulduktan sonra sütur geri çekilip reperfüzyon sağlandı. Sıçanlar 7'li 5 gruba ayrıldı. 1. Grup: işlem yapılmayan grup, 2. Grup: iskemi oluşturulan grup, 3. Grup: iskemi sonrası düşük doz olan 10mg/kg Visnagin verilen grup, 4. Grup: iskemi sonrası orta doz kabul edilen 30mg/kg visnagin verilen grup ve 5. Grup: iskemi sonrası yüksek doz kabul ettiğimiz 60mg/kg Visnagin verilen grup olarak belirlendi. İlk dozlar reperfüzyon sağlandıktan sonra diğer dozlar 24 saat arayla toplam 3 doz visnagin tedavisi verildi. Tüm visnagin tedavi dozları yapıldıktan sonra yeniden anestezi uygulanan sıçanlar önce torakotomi ile intrakardiyak kanları alındı. Sonra sıçanlar sakrifiye edilip beyin dokuları steril şartlarda çıkarıldı. Çıkarılan dokular oda sıcaklığında %10'luk formaldehit içerisinde fikse edildi.
	Elde edilen kesitler hemtatoksilen&eosin ile boyandı. Kesitlerde konjesyon, perinöral ve perivasküler ödem, hücre çekirdeklerinde piknozis ve reperfüzyon sonrası kanama odakları değerlendirildi. Alınan kesitler ayrıca parafin bloklarına gömülerek üzerlerine Bax, TNF-α, CD86 ve CD163 antikorları damlatılıp oluşan sinyaller gözlendi.
Bulgular:  Deneyimizde beyin dokusunda hemorajik alanlar, perinöral ödem, vasküler yataklarda konjesyon, nöron ve glial hücre çekirdeklerinde piknozis, İmmünohistokimya olarak Bax, TNF-α CD86 ve CD163 ekspresyonları incelendi. İskemi grubunda diffüz ve fokal ve hemorajik alanlar, nöron ve glialarda piknotik çekirdek miktarında artış, vasküler lümende konjesyon, perinöral ödem, Bax düyeyinde artış, CD163 immunpozivitesinde azalma, TNF-α ve CD86 düzeyinde artış saptandı. İskemiden sonra 10mg/kg visnagin verilen grupta hemoraji alanlarının kısmen kaybolduğu, nöron ve glial hücrelerde piknotik çekirdekli hücrelerin oldukça azaldığı, Perinöral ödemin kısmen azaldığı, Bax düzeyi, CD86, CD163  immunopozivitesi ve TNF-α  ekspresyonunun iskemi grubuna benzer olduğu görüldü. İskemiden sonra 30mg/kg visnagin verilen grupta hemoraji alanlarının önemli oranda azaldığı,  perinöral ödem, nöron ve glial hücrelerde piknozis görülse de iskemi grubuna kıyasla bu oranın oldukça azaldığı görüldü. Bax düzeyinin azaldığı, CD86 immunopozivitesi 10mg visnagin verilen gruba göre azaldığı, CD163 immunopozivitesinin kısmen arttığı, TNF-α  ekspresyonunda ise azalma izlendi. İskemi sonrası 60mg/kg visnagin verilen grupta ise subaraknoid kanama izlerinin neredeyse tamamen ortadan kalktığı, beyin dokusuna geçen kan doku hücrelerinin büyük oranda ortadan kalktığı görüldü, perinöral ödemin kaybolduğu, nöron ve glial hücrelerde piknotik çekirdekli hücrelerin azaldığı izlendi. 60mg/kg visnagin tedavisi verilen grupta Bax düzeyinin kontrol grubuna çok yakın olduğu, özellikle ödemli ve hemorajik beyin doku alanlarında CD163 immunopozivitesi artmış olup kontrol grubuna benzer olduğu izlendi, CD86 immunopozivitesinde anlamlı düşüş olduğu görüldü. TNF-α  düzeyinin ise çok düşük eksprese edildiği görüldü.
Sonuç:  Serebral İskemik inme reperfüzyon hasarında visnagin tedavisinin nöroprotektif olduğu, reperfüzyon sonrası kanamayı azalttığı ve apoptozu önlediği görülmüş olup Visnagin in bu etkileri yüksek doz kabul ettiğimiz 60mg/kg dozunda daha etkin biçimde görülmüştür. Bu yüzden iskemik inme reperfüzyon hasarı tedavi protokollerinde kullanılabileceği sonucuna ulaşılmıştır.
Anahtar kelimeler: iskemia, reperfüzyon, apoptoz, visnagin, nöroprotektif

Abstract:
Introduction and Aim: Cerebral ischemia is the interruption of oxygenation required for neural tissues secondary to decreased blood flow to the brain. Ischemic stroke is among the most important causes of morbidity and mortality. Stroke; It is divided into hemorrhagic stroke and ischemic stroke. Ischemic stroke accounts for approximately 88% of strokes. The majority of ischemic strokes occur in areas fed MCA.
 Currently, two types of treatment approaches are prominent in ischemic stroke. These are recanalization and neuroprotection. The only accepted medical treatment option in recanalization is rtPA. Since rtPA can be used in the first 4.5 hours in ischemic stroke, its use is limited. Therefore, its use is being studied on wider treatment protocols.
A number of different mechanisms play a role in ischemic stroke. Neuroprotection is the effort to protect the brain against ischemia by preventing or slowing down these biochemical and molecular events. Many antioxidant, anti-inflammatory, antiapoptotic and anticytotoxic agents have been used for this purpose.
Visnagin furanochromone, which is a compound derivative of cromon and furan, is found in high amounts in the hiltan plant, also known as toothpick grass among the people. The hiltan plant, whose Latin name is Ammi visnaga, is among the edible wild plants and is found in countries such as Turkey and Morocco and is used extensively in traditional medicine in the society. In the toxicological studies, it was reported that toothpick, which is the major source of visnagin, did not show a toxicological effect in experimental animals even at high doses.
In recent studies with this herbal product, it has been reported that visnagin has anti-inflammatory potential and has a vasodilator effect. In our study, we investigated the protective effect of visnagin's neuroprotective effect after cerebral ischemia reperfusion in low, medium and high dose applications determined by considering the literature.

Materials and Methods: In this study, randomly selected 35 female Sprague Dawley rats weighing 328.53 ± 47.20gr were used. After anesthesia with 10 mg/kg xylazine and 80 mg/kg ketamine, the suture directed towards the internal carotid artery by entering from the right common carotid artery was advanced from the internal carotid artery to oclude the MCA. After 90 minutes of ischemia, the suture was withdrawn and reperfusion was achieved. Rats were divided into 5 groups of 7.
 1st Group: no treatment group, 2nd Group: ischemia-induced group, 3rd Group: 10mg/kg Visnagin group given as low dose after ischemia, 4th Group: 30mg/kg visnagin group which is considered medium dose after ischemia, and 5 Group: 60mg/kg Visnagin, which we accepted as high dose after ischemia, was determined as the group. After the first dose of reperfusion was achieved, other doses of visnagin were given 24 hours apart, in total, 3 doses. After all visnagin treatment doses were administered, the rats were re-anesthetized and their intracardiac blood was taken first by thoracotomy. Then the rats were sacrificed and the brain tissues were removed under sterile conditions. The excised tissues were fixed in 10% formaldehyde at room temperature.
The obtained sections were stained with hematoxylin&eosin. Congestion, perineural and perivascular edema, pycnosis in the cell nuclei, and bleeding foci after reperfusion were evaluated in the sections. The sections taken were also embedded in paraffin blocks, and Bax, TNF-α, CD86 and CD163 antibodies were dripped on them and the resulting signals were observed.

Results: In our experiment, hemorrhagic areas in brain tissue, perineural edema, congestion in vascular beds, pycnosis in neuron and glial cell nuclei, Bax, TNF-α CD86 and CD163 expressions as immunohistochemistry were examined. Diffuse and focal and hemorrhagic areas, increase in the amount of pycnotic nuclei in neurons and glia, congestion in the vascular lumen, perineural edema, increase in Bax level, decrease in CD163 immunopositivity, increase in TNF-α and CD86 levels were found in the ischemia group. 
 In the group given 10mg/kg visnagin after ischemia, the hemorrhage areas partially disappeared, the cells with pycnotic nuclei in neuron and glial cells were considerably reduced, the perineural edema was partially reduced, the Bax level, CD86, CD163 immunopositivity and TNF-α expression were similar to the ischemia group.
 In the group given 30mg/kg visnagin after ischemia, the areas of hemorrhage were significantly reduced, and although perineural edema, pycnosis in neurons and glial cells were observed, this rate was considerably reduced compared to the ischemia group. It was observed that Bax level decreased, CD86 immunopositivity decreased compared to the group given 10mg visnagin, CD163 immunopositivity increased partially, and TNF-α expression decreased.
 In the group given 60mg/kg visnagin after ischemia, it was observed that the subarachnoid hemorrhage traces were almost completely eliminated, the blood tissue cells transferred to the brain tissue were largely eliminated, the perineural edema disappeared, and the pycnotic nucleated cells in the neurons and glial cells were decreased. In the group given 60mg/kg visnagin treatment, Bax level was very close to the control group, CD163 immunopositivity was increased especially in edematous and hemorrhagic brain tissue areas, and it was similar to the control group, and there was a significant decrease in CD86 immunopositivity. It was observed that TNF-α level was expressed very low.
Conclusion: It has been observed that visnagin treatment is neuroprotective, reduces post-reperfusion bleeding and prevents apoptosis in cerebral ischemic stroke reperfusion injury. Therefore, it was concluded that it can be used in ischemic stroke reperfusion injury treatment protocols.
Key words: ischemia, reperfusion, apoptosis, visnagin, neuroprotective