Helicobacter pylori cagA proteininin hücre Unfolded Ptotein Response (UPR) sinyal yolağı üzerine etkisinin incelenmesi
Effects of helicobacter pylori cagA on the cellular Unfolded Protein Response (UPR) signaling pathway
Yazar: BABAK NAMİ MOLLALOU
Danışman: PROF. DR. HASAN ACAR
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Helicobacter pylori = Helicobacter pylori ; Mide neoplazmları = Stomach neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Gastrik (mide) kanser dünyada dördüncü sık görünen ve ikinci ölümcül kanser tipidir. Gastrik kanser oluşumunda Helicobacter pylori (Hp) CagA proteini birçok hücre içi fizyolojisine müdahale ederek mide hücre tümörleşmesinde önemli bir role sahip olduğu düşünülmektedir. Ayrıca unfolded protein response (UPR) olayı, hücre tümörleşmesindeki rolü ispatlanmıştır. Ancak eksojen CagA proteinin UPR yolağı üzerindeki etkisine dair literatürde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Gastrik kanser gelişiminde ve progresyonunda etkisi bilinen Hp CagA proteinin hücrede UPR yolağı üzerindeki etkisi incelenmesi amaçlanmıştır. 
Mevcut projemizde, eksojen CagA proteinin, normal hücre hattı olan HEK293 ve gastrik kanser kökenli non metastatik AGS ve metastatik MKN45 hücrelerinde Unfolded Protein Response (UPR) üzerinde etkisi incelendi. Bu yolak üzerindeki temel elamanlar moleküler biyolojik ve genetik yöntemler kullanılarak incelendi. Bunun için; hücrelere 2 ve 4 saat 1 µg/ml rekombinant C-terminus CagA ile muamele edildi ve UPR faktörleri ATF4,CHOP, GRP78 ve GRP94 gen ekspresyonunu real time qPCR ile incelendi. Ayrıca XBP1 mRNA işlenmesini PCR-elektroforez sistemi ve ATF6 proteinin translokasyonu ise immünofloresans boyama yöntemi ile araştırıldı. Hücre proliferasyonu 24, 48 ve 72 saat muamele sonunda MTT assay uygulanarak değerlendirildi. Çalışmadan elde edilen bulgulara göre eksojen CagA proteini, UPR elemanlarının ekspresyonunu artırdığı tespit edildi. Aynı zamanda, eksojen CagA bütün hücrelerde XBP1 genin mRNA işlenmesi ve HEK293 ve AGS hücrelerinde ATF6 translokasyonu gerçekleştirdiği tespit edildi. Bu bulgular, eksojen CagA'nın UPR genleri up-regüle ettiğin gösterildi. Ayrıca, MTT analizi sonucu, eksojen CagA'nın hücre proliferasyonunu inhibe ettiği tespit edildi.
Elde edilen bulgulara göre eksojen CagA, gastrik kanser hücrelerinde UPR yolağını up-regüle ederek hücre ölümüne sebep olmaktadır. Bu bulgular çerçevesinde,CagA'nın eksojen formunda başka hücre yolakları üzerine etkisinin araştırılması ve ER hedefli kemoterapi ilaçlarınınin in vitro hücre sistemlerinde etkisinin incelenmesi ve de Hp CagA+ gastrik kanser hayvan modellerinde araştırılmasını gerekmektedir.



Anahtar Sözcükler: Gastrik kanser; Helicobacter pylori; CagA; UPR; ER stresi

Abstract:
Gastric cancer is the fourth common and second deadliest cancer type worldwide. Helicobacter pylori (Hp) CagA has a key role in development of gastric cancer by intrusion in many cellular processes regarding to cell death and survival. Unfolded protein response (UPR) is an essential process for protein regulation and prevents tumorgenesis by promotion apoptosis that failure is associated with many cancers. However, in the literature, there are no reports regarding to the effects of the CagA proteinon the pathways of UPR and ER stress in cancer models cells and normal cells. In this project, it was hypothesized that there was an effect of CagA protein, which was known the development and progression of gastric cancer, on the cellular UPR.
In this study, we aimed to investigate exogenous Hp CagA effects on the UPR signaling of gastric cancer cells as well as normal cell line. The cells were treated with 1 µg/ml of CagA for 2 and 4 hours and then transcriptional expression analysis of ATF4, CHOP, GRP78 and GRP94 genes were carry out by applying real time qPCR technique. The mRNA splicing of XBP1 was investigated by using PCR and SDS-PAGE systems and ATF6 protein translocation was analyzedby by using the immunofluorescence assay. The effect of CagA protein on the cell proliferation rate was also determined by using the MTT assay. 
The results showed that exogenous CagA could promote expression of, ATF4, CHOP, GRP78, and GRP49, genes in cancer cell lines. The mRNA splicing of XBP1 was also determined in the cells, which were treated with exogenous CagA protein. Addionally, translocation of ATF6 protein was detected only in HEK293 and AGS cells. Moreover, reduced proliferation rate under the influence of exogenous CagA was determined in all cell types. All results suggest that exogenous CagA protein up-regulatesthe signal of UPR and also actuated the cells to death through promotion UPR. We suggest that the examine of exogenous form of HP CagA on human cells also assisment of UPR targeted drugs in in vitro cells and Hp+ animal models with gastric cancer may give more prospering outcomes.


Key Words: Gastric cancer; Helicobacter pylori; CagA; UPR; ER stress