Bazı bacillus izolatlarında L-asparajinaz aktivitesinin incelenmesi, enzimin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu
Evaluation of the L-asparaginase activity in some isolates of bacillus, partial purification and characterization of enzyme
Yazar: İREM LÜLECİ
Danışman: PROF. DR. RENGİN ELTEM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bacillus = Bacillus ; Biyolojik üretim = Biological production ; Biyoproses teknikleri = Bioprocess techniques ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Biyoteknolojik prosesler = Biotechnological process ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim üretimi = Enzyme production ; Enzimler = Enzymes

Özet:
Çalışmamızda çeşitli kaynaklardan yapılan izolasyon çalışmaları sonunda oluşturulan ?Biyomühendislik Bölümü Kültür Koleksiyonunda? yer alan 250 adet mezofilik Bacillus izolatında, 60 adet endospor içeren termofilik bakteri izolatında ve B.licheniformis NRRL-1001, B.circulans NRRL B-381, B.circulans NRRL B-378, Geobacillus stearothermophilus NRRL-1102 türlerinde L-Asparajinaz EC-3.5.1.1 enzimi taranması katı besiyerinde renk değişimi temelli olarak yapılmıştır. Daha sonra, substrat olarak L-Asparajin içeren sıvı kültür ortamında 300C'de 48 saat inkübasyonun ardından aktivite tayini 370C'de gerçekleştirilmiştir. Buna göre, petri plağında taranan 253 adet mezofilik suş ve izolatın % 41'inde L-Asparajinaz aktivitesi belirlenmiş, 61 adet termofilik suş ve izolatın hiçbirisinde L-Asparajinaz aktivitesi saptanamamıştır. Bu veriler ışığında suşlardan en yüksek aktivite veren mezofilik Bacillus Ege. B.1.d.6 izolatından ölçek büyütülerek derin kültür fermentasyon yöntemiyle üretilen L-Asparajinazın; santrifügasyon, amonyum sülfat ile çöktürme, diyaliz, ultrafiltrasyon, jel filtrasyon kromatografi yöntemleri ile kısmi saflaştırması yapılmış ve her adımda enzim aktivitesi, total aktivite, protein miktarı, spesifik aktivite ve verim hesaplanmıştır. Moleküler ağırlığı SDS-PAGE ile gösterilmiştir. Ardından, L-Asparajinaz enziminin farklı inkübasyon sürelerindeki stabilite değişimi ile farklı pH ve sıcaklık aralıklarındaki aktivitesi ölçülerek kısmi karakterizasyonu yapılmıştır.

Abstract:
In our study, in 250 mesophilic and 60 endospor containing thermophilic isolates contained by the "Bio-engineering Program Culture Collection" and in B.licheniformis NRRL-1001, B.circulans NRRL B-381, B.circulans NRRL B-378, Geobacillus stearothermophilus NRRL-1102 type cultures, L-Asparaginase enzyme EC-3.5.1.1 was scanned in solid growth environment on the basis of color change. Later, in the liquid culture environment containing L-Asparagin as substrate, after 48 hours of incubation at 30ºC, activity was determined at 37ºC. Accordingly, 41% of the 253 mesophilic strains and isolates scanned in the petri plate were found to have L-Asparaginase activity. None of the 61 thermophilic strains and isolates showed an L-Asparaginase activity. On the basis of these data, L-Asparaginase, produced by deep culture fermentation method by means of scale growing from mesophilic Bacillus Ege. B.1.d.6 isolate which is the highest activity strain, was partially purified using centrifugation, ammonium sulfate settlement, dialysis, ultrafiltration, gel filtration chromatography and at each step, enzyme activity, total activity, protein content, specific activity and yield were calculated. The molecular weight was shown using SDS-PAGE. Later, with the stability change of the L-Asparaginase enzyme at different incubation times, its activity at different pH and temperature ranges was measured for a partial characterization.