Bacillus mojavensis TH309 suşundaki pektat liyaz (BmoPelC) enziminin klonlanması ve ifadesi üzerine çalışmalar
Studies on cloning and expression of the pectate lyase (BmoPelC) enzyme from Bacillus mojavensis TH309
Yazar: NURAYAN AYDIN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞRUL DORUK
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gen klonlama = Gene cloning ; Gram pozitif bakteriler = Gram positive bacteria ; Mikrobiyal enzimler = Microbial enzymes ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Moleküler genetik = Molecular genetic

Özet:
Enzim teknolojisinin hızla gelişmesi, bu teknolojiden elde edilen ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerlerinin yüksek olması, mikrobiyal enzimlere duyulan talebin artmasına sebebiyet vermektedir. Enzimlerin kullanıldığı işlemler genellikle yüksek sıcaklıklarda gerçekleştiğinden, bu sıcaklıklara dayanıklılık gösteren mikroorganizmalar enzim kaynağı olarak kullanılmaktadır. Hücre duvarında yer alan pektinin β-eliminasyon reaksiyonları ile parçalanmasında görev alan pektat liyazlar başta tekstil endüstrisi olmak üzere endüstrinin birçok alanında kullanılmaktadır.
Bacillus mojavensis TH309 biyo-bozunmuş plastik parçalarından izole edilmiş Gram-pozitif, sporlu, termofilik ve tuz toleranslı bir bakteridir. Bu çalışmada B. mojavensis TH309 genomunda bulunan ve pektat liyaz enzimini (BmoPelC) kodlayan gen dizisi (pel), pET14b plazmitinde T7 promotoru altına klonlandıktan sonra E. coli Rosetta (DE3) pLysS hücresine aktarılmıştır. Heterolog ifadesi gerçekleştirilen enzimin kısmi saflaştırılmasının ardından yapılan zimogram analizi sonucunda pektat liyaz aktivitesi tespit edilmiştir. Enzimin karakterizasyonu çeşitli biyokimyasal yöntemler ile araştırılmıştır. Ayrıca enzimin endüstriyel kullanım potansiyeli pamuğun boyanabilirliği üzerine yapılan çalışmalar ile ortaya çıkarılmaya çalışılmıştır. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucunda yüksek derecede ısıya dayanıklı ve geniş bir pH aralığında aktivitesini sürdürme kabiliyetine sahip olduğu anlaşılan enzimin, optimum çalışma pH ve sıcaklığının sırasıyla pH 9.0 ve 90 °C olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca yapılan karakterizasyon çalışmalarında farklı divalent katyonların, organik çözücülerin ve kimyasalların enzim aktivitesi üzerine etkileri değerlendirilmiştir. Farklı organik çözücülerin %10 ve %30 oranlarında yapılan enzim aktivite ve kararlılık analizlerinde tüm çözücülerin pektat liyaz enzimin aktivitesini yüksek oranda etkileyerek arttırmış olduğu gözlemlenmiştir. 
Enzimin endüstriyel uygulama potansiyeli ticari olarak kullanılan enzim ile karşılaştırılarak pamuk liflerinin boyanabilirliği üzerine test edilmiştir. Sonuç olarak, heterelog ifadesi gerçekleştirilen pektat liyaz enziminin tekstil endüstrisi ile birlikte birçok biyoteknolojik uygulamalarda kullanım potansiyeline sahip olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
The rapid development of enzyme technology, the diversity of usage areas and high economic values of products obtained from this technology cause an increase in the demand for microbial enzymes. Because enzymes are often used at high temperatures, microorganisms that are resistant to these temperatures are used as enzyme sources. Pectate lyases, which are involved in the degradation of pectin in the cell wall with β-elimination reactions, are used in many areas of industry, especially in the textile industry.
Bacillus mojavensis TH309 is a Gram-positive, spore-forming, thermophilic and salt-tolerant bacterium isolated from biodegraded plastics. In this study, the coding sequence of pectate lyases enzyme (E.C.4.2.2.2) from Bacillus mojavensis TH309 genome was cloned under the T7 promoter in the pET14B plasmid and transferred to the E. coli Rosetta (DE3) pLysS cell. After heterologous expression the enzyme was partially purificated and activity of enzyme was determined using zymogram analysis. The characterization of the enzyme has been investigated by various biochemical methods. In addition, the industrial potential of the enzyme has been revealed by studies on the dyeability of cotton. As a result of the characterization studies, it has been showed that the enzyme was highly heat resistant and capable of maintaining its activity in a wide pH range. Optimum working pH and temperature of the enzyme are pH 9.0 and 90 °C, respectively. The effects of different divalent cations, organic solvents and chemicals on the enzyme activity were also evaluated in the characterization studies. In enzyme activity and stability analyzes performed at 10% and 30% of different organic solvents, it was observed that all solvents increased the activity of pectate lyase enzyme in positive manner.
The industrial application potential of the enzyme was tested on the dyeability of cotton fibers by comparing with commercial enzyme. As a result, it has been showed that the heterologous expressed and purificated enzyme has the potential to be used in not only textile industry.but also many biotechnological applications.