Fitalatların nörogelişimsel etkilerinin ve etki mekanizmalarının glial hücre kültüründe değerlendirilmesi
Evaluation of the neurodevelopmental effects and mechanisms of phthalates in glial cell culture
Yazar: ELİF KELEŞ GÜLNERMAN
Danışman: PROF. DR. HAYRUNNİSA BOLAY BELEN ; PROF. DR. LATİFE ARZU ARAL
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Nörobilim Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Di-2-etil-heksil-fitalat = Di-2-ethyl-heksyl phtalate ; Ferroptoz = Ferroptosis ; Fitalat = Phthalate ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases ; Nöroloji = Neurology

Özet:
Fitalatlar, sert plastik olan polivinilkloriti esnek plastiğe çevirmede kullanılırlar. Fitalatlardan Di-(2-etilheksil) fitalat (Di-(2-ethylhexyl) phthalate; DEHP), polivinl klorür (polyvinyl chloride; PVC) ürünlerinin plastikleştiricisi olarak gıda ambalajı, giyim eşyası, araba ürünleri, çocuk ürünleri, sivrisinek öldürücüler ve kan transfüzyon torbaları gibi tıbbi malzemelerde sıklıkla kullanılır. Fitalatlar plasentayı, kan beyin bariyerini geçebilirler. DEHP'nin hem in vivo hem de in vitro nörogelişimsel bozukluğa neden olduğu gösterilmiştir fakat bu etkiye yönelik moleküler mekanizmalar aydınlatılamamıştır. Sunulan proje, neonatal nörolojik gelişiminde, fitalat maruziyetinin etkisinin araştırılmasını amaçlamaktadır. Bu amaç doğrultusunda, fare kökenli neonatal mikrogliya hücreleri olan BV-2 hücre serisi seçilmiştir. BV-2 hücrelerine, değişen oranlarda DEHP uygulanmış ve bu uygulamaların hücre canlılığına, hücre içi demir ve reaktif oksijen ürünlerinin (reactive oxygen species; ROS) birikimine, lizozomal ve mitokondriyal bütünlüğün korunmasına ve nöroinflamasyona etkileri moleküler yöntemlerle belirlenmiştir. Çalışma sonucunda elde edilen veriler, DEHP uygulamasının, hücre içi Fe2+ ve total demir ile ROS düzeylerinde artışa neden olduğunu göstermiştir. DEHP'nin aynı zamanda, artan demir, ROS ve demir metabolizması üyesi proteinlerin değişen seviyelerine rağmen ferroptozu engellemeye çalışırken lizozomal ve mitokondriyal bütünlüğü bozarak hücre ölümünü tetiklediği görülmüştür. Kritik olarak, DEHP uygulamasının IL-1β ve IL-18 düzeylerini arttırdığı görülmüştür. Sunulan çalışma ile fitalat maruziyetinin demir ve reaktif oksijen ürünleri aracılı ferroptoz yolağı başta olmak üzere çoklu inflamatuvar yolak üzerinden mikrogliyal hasara neden olduğu gösterilmiştir. DEHP maruziyetinin beyin gelişimi sırasında nöroinflamasyon ve mikrogliyal hasar ile ilişkili olduğu gösterilmiş ve özellikle neonatal nörogelişiminde fitalat marzuiyetinin önlenmesi gerektiğinin altı çizilmiştir.

Anahtar Kelimeler	:	Fitalat, Mikrogliya, Nörogelişimsel Hasar, Ferroptoz, 	Nöroinflamasyon

Abstract:
Phthalates are used to convert the hard plastic polyvinyl chloride into a flexible plastic. The most common phthalate, "Di-(2-Ethylhexyl) phthalate (DEHP)," is frequently used as a plasticizer of PVC products in medical materials such as food packaging, clothing, car products, children's products, mosquito killers, and blood transfusion bags. Phthalates can cross the placenta and the blood-brain barrier. DEHP has been shown to cause neurodevelopmental impairment in vivo and in vitro, but the molecular mechanisms for this effect have not been elucidated. BV-2 neonatal microglial cells were cultured and incubated with phthalate at doses of 1 nM-10 mM overnight. Cellular toxicities were determined by MTT assay. Intracellular ferrous (Fe2+) and total iron levels, intracellular reactive oxygen species (ROS) levels were measured by spectrophotometric approach. Cell death mechanisms were followed by Apoptosis/Necrosis Ratio by Acridine Orange/Ethidium Bromide dual staining. Lysosomal and mitochondrial integrity was figured out by Hoechst/Neutral Red/Janus Green B triple staining. Ferritin and CD11b immunoreactivity were evaluated by IFA and IL-1β, and IL-18 cytokine levels were followed by ELISA method. Expression levels of iron metabolism-related genes (ferritin analysis, DMT1 (importer) and ferroportin (exporter)) were determined by RT-qPCR To establish that it produces neuroinflammation via ferroptosis, a ferroptosis inhibitor was applied; it was observed that the increase in cell viability.The expression of GPX4 and ACSL4 was quantified using real-time polymerase chain reaction (qPCR) to determine whether the ferroptosis pathway's essential enzymes are involved. All tests were repeated three times separately and data were analyzed by either Student's t test or ANOVA, and were significant when p<0.05. Intracellular Fe2+ levels increased dramatically at 1 nM-10 mM concentrations of phthalate. Total iron levels, which mediate the reduction of Fe+3 ion to Fe+2 ion, also increased statistically. Free iron was found to be higher than total iron for phthalate-treated cells. At 1-5 mM of phthalate doses, apoptosis increased compared to non-treated controls. It was observed that the lysosomal and mitochondrial integrity was impaired, ferritin and CD11 staining, IL-1β and IL-18 cytokine levels, Ferritin-L, and Ferroportin expressions were increased upon phthalate treatment. GPX4 enzyme expression was also found to be statistically increased with increasing DEHP levels of exposure. It has been shown that exposure to phthalate causes inflammation and microglial death via the mainly ferroptosis and other inflamatory regulated cell death pathways mediated by iron and ROS. It is predicted that exposure to DEHP is associated with neuroinflammation and  microglial loss in the developing brain, especially in hospitalized children and infants.

Keywords	: Phthalate, Glia, Neurodevelopmental Damage, Ferroptosis, Neuroinflammation