İnsan, koyun ve sığır kistik ekinokokozis izolatlarının nad-1 gen bölgesinin moleküler karakterizasyonu
Molecular characterization of the NAD1 gene region of human, sheep and cattle cystic echinococcosis isolates
Yazar: GALİP SARISU
Danışman: PROF. DR. ZEYNEP TAŞ CENGİZ ; YRD. DOÇ. DR. YUNUS EMRE BEYHAN
Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: DNA mutasyon analizi = DNA mutational analysis ; Diziler = Sequences ; Echinococcus = Echinococcus ; Echinococcus granulosus = Echinococcus granulosus ; Genler = Genes ; Genotip = Genotype ; Koyunlar = Sheep ; NAD-ADP ribosyltransferase = NAD+ADP ribosyltransferase ; İnekler = Cows ; İnsan = Human

Özet:
Sarısu G. İnsan, koyun ve sığır kistik ekinokokkozis izolatlarının NAD1 gen bölgesinin moleküler karakterizasyonu. Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı Doktora Tezi, Van, 2017. Bu çalışmanın amacı Van yöresinde insan, koyun ve sığırlara ait kist örneklerinde mitokondrial NAD1 gen bölgesinin moleküler karakterizasyonu yaparak suşları ve varsa meydana gelen mutasyonları belirlemektir. Çalışma 17.03.2016 - 01.09.2017 tarihleri arasında Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Araştırma Laboratuarında yürütülmüştür. Çalışma kapsamında kullanılan materyallerden insana ait 75 kist materyali, Yüzüncü Yıl Üniversitesi Dursun Odabaş Tıp Merkezinde Patolojik inceleme için Patoloji Laboratuvarına gönderilen kist örneklerinin artanlarından; sığır ve koyunlara ait 25'er kist materyali ise Van yöresinde hayvan kesimi yapılan çeşitli mezbahane ve tesislerden alınmıştır. Elde edilen toplam 125 numune Echinococcus granulosus'un NAD1 mitokondrial gen bölgesinin moleküler karekterizasyonu için gerekli aşamalardan geçirilmiştir. Ayrıca çalışmaya dahil edilen 125 izolat protoskoleks ve çengel yapıları yönünden değerlendirilmiştir. Çalışmada, protoskoleks ve germinal membranlardan elde edilen genomik DNA'ların parazitin mitokondriyal NAD1 gen bölgesini çoğaltan NAD1F ve NAD1R primerleriyle PCR amplifikasyonu yapılmıştır. Dizi analizi sonuçları Blast'a girilerek ve SnapGen programı kullanılarak GenBank'taki referans suşların dizi analizleri ile karşılaştırılıp gerekli raporlamalar yapılmıştır. İnsanlardan elde edilen kist hidatik örneklerinin organ dağılımına bakıldığında erkek ve kadınlarda akciğer yerleşim oranları benzerlik gösterirken; karaciğer yerleşimlerinde erkeklerdeki oranın daha yüksek olduğu dikkati çekmektedir. Nadir yerleşimli kist örneklerinde organ yerleşiminin erkeklerde safra kesesi; kadınlarda uterus+kolon ve safra kesesi olduğu görülmüştür. Kistlerin organ lokalizasyonunda, sığırlarda karaciğer yerleşimi, koyunlarda ise akciğer yerleşiminin ilk sırada olduğu saptanmıştır. Amplifikasyon sonucunda 125 örneğin tamamında 864 bp büyüklüğünde bant elde edilmiştir. Jel elektroforez görüntülerinde üç konak için de istenilen bölgede bantlar tespit edilip görüntülenmiştir. Çalışmamızda, maliyetler ve proje destek miktarının göz önünde bulundurulması gerektirdiğinden 75 insan örneğinden 30'u, 25 sığır örneğinden 15'i ve yine 25 koyun örneğinden 15'i olmak üzere toplam 60 adet mitokondrial NAD1 gen bölgesine ait PCR ürünü önce saflaştırma işlemine tabi tutulmuş, daha sonra çift yönlü DNA dizi analizi yaptırılmıştır. Kontrolden geçmiş izolatların sekans sonuçlarının Genbank'a daha önce girilmiş sonuçlarla karşılaştırılması ile toplanan tüm örneklerimizin E. granulosus sensu stricto olduğu tespit edilmiştir. Bu örneklerden dokuz tanesinin G3, geriye kalan 51 örneğin ise G1 suşu olduğu saptanmıştır. Konaklara göre suş dağılımına bakıldığında; 30 insan örneğinin 24'ünün G1, 6'sının G3, 15 koyun örneğinin 13'ünün G1, 2'sinin G3, 15 sığır örneğinin 14'ünün G1, 1'inin G3 suşuna ait olduğu görülmüştür. G1 suşuna ait 51 örnek Genbank'ta yer alan referans G1 suşları ile kıyaslandığında 42 tanesinin %100 eşleştiği; geriye kalan 9 örnekte ise farklı bölgelerde mutasyonlar olduğu ilk kez tespit edilmiştir. Bu mutasyonlar insan örneklerinde sırasıyla VANH3 nolu izolatda 2 farklı bölgede, VANH7, VANH19, VANH23, VANH25, VANH27, VANH29 ve VANH30 nolu izolatlarda, sığırlarda VANC4 nolu izolatda farklı bölgelerde olmak üzere birer noktada tespit edilmiştir. Fertilite 75 insan örneğinin 56 (%74,6)'sında, 25 koyun örneğinin 16 (%64)'sında ve 25 sığır örneğinin 4 (%16)'ünde olmak üzere toplam 76 örnekte belirlenmiştir. Çengellerin boy uzunluklarının büyükten küçüğe doğru sırasıyla sığır koyun, insan şeklinde olduğu görülmüştür. Sonuç olarak çalışmamızda insan, koyun ve sığırlardan elde edilen kist hidatik izolatlarında G1'in her üç konakta da baskın suş olduğu ve çeşitli mutasyonların varlığı tespit edilmiştir. Elde edilen bulgular ile, kistik ekinokokkozisin moleküler epidemiyolojik verilerine katkı sağlamıştır.
sağlamıştır

Abstract:
Sarısu G. Molecular characterization of the NAD1 gene region of human, sheep and cattle cystic
echinococcosis isolates. Van Yuzuncu Yil University Health Sciences Institute, Department of
Medical Parasitology, Ph.D. Thesis, Van, 2017. The purpose of this study is to determine the strains,
and if any, the mutations that occur, by performing molecular characterization of the mitochondrial NAD1
gene region in human, sheep and cattle cyst samples in Van region. The study was carried out between
March 17th 2016 and September 01st 2017 at Yuzuncu Yil University Medical Faculty Parasitology
Research Laboratory. From the materials used in the study, 75 human cystic material from the remains of
the cyst samples sent to the Pathology Laboratory for pathological examination at Yuzuncu Yil
University Dursun Odabas Medical Center; the cyst material belonging to cattle and sheep, 25 each, were
taken from various slaughterhouses and facilities where animals were cut in Van province. A total of 125
samples obtained were passed through the required stages for the molecular characterization of the NAD1
mitochondrial gene region of Echinococcus granulosus. In addition, 125 isolates included in the study
were evaluated for protoscolex and hook structures. In the study, PCR amplification was performed with
NAD1F and NAD1R primers amplifying the mitochondrial NAD1 gene region of parasites of genomic
DNAs obtained from protoskoleks and germinal membranes. Sequence analysis results are entered into
Blast and compared with sequence analyzes of reference strains in GenBank using the SnapGen program
and the necessary reports are conducted. When the organ distribution of cyst hydatic samples obtained
from humans is examined, the lung localization rates in males and females show similarity; it is
noteworthy that the proportion in males is higher in liver localizations. In the samples of rare localized
cysts, it was seen that the organ localization was the gall bladder in men and uterus + colon, and gall
bladder in women. In the organ localization of cysts, liver localization in cattle and lung localization in
sheep was found to be the first place. As a result of the amplification, a stripe in the size of 864 bp was
obtained in all of 125 samples. In the gel electrophoresis images, the stripes were detected and visualized
for the three hosts at the desired region. Since the cost and project support amount should be taken into
account in our study, a total of 60 mitochondrial NAD1 gene region PCR products, 30 of which were from
75 human samples, 15 from 25 cattle samples and 15 from 25 sheep samples, were first purified, and
followed by bi-directional DNA sequence analysis. It was determined that all of our collected samples
were E. granulosus sensu stricto by comparing the sequence results of controlled isolates with the results
previously entered into Genbank. Nine of these samples were identified as G3, and the remaining 51 were
identified as G1 strains. When we look at the distribution of strains according to the hosts; of the 30
human samples, 24 were found to belong to G1, 6 to G3, 13 of 15 sheep samples to G1, 2 to G3, 14 of 15
cattle samples to G1, 1 to G3 strain. When 51 samples of G1 strains compared with the reference G1
strains of GenBank, it was determined that 42 from these samples were 100% matched , and the
remaining 9 samples were the first to identify mutations in different regions. These mutations were
detected in human samples in VANH3 isolates at two different regions, and in VANH7, VANH19,
VANH23, VANH25, VANH27, VANH29 and VANH30 isolates at one point, and in the cattle in
VANC4 isolates at different regions at one point. The fertility was determined in a total of 76 samples,
including 56 (74.6%) of the 75 human samples, 16 (64%) of the 25 sheep samples and 4 (64%) of the 25
cattle samples. It is seen that the lengths of the hooks are in the form of cattle, sheep, human, respectively,
from large to small. As a result, in our study, it was determined that G1, in all three hosts, was the
dominant strain in hydatic cyst isolates obtained from human, sheep and cattle, and the presence of
various mutations has been detected. With the obtained results, it has been contributed to the molecular
epidemiological data of cystic echinococcosis.