Çocukluk çağı solid tümörlerinde retinoik asitin PI3K/AKT ve RAS/MAPK yolakları üzerine etkisinin western blot yöntemi ile saptanması
Determining the effect of retinoic acid on PI3K/AKT and RAS/MAPK  pathways on childhood solid tumors by using western blot
Yazar: ÖZDE ELİF GÖKBAYRAK
Danışman: PROF. DR. SAFİYE AKTAŞ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Fosfoinositid 3-kinaz = Phosphoinositide 3-kinase ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; Onkogenler = Oncogenes ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Sisplatin = Cisplatin ; Takrolimus = Tacrolimus ; Tretinoin = Tretinoin ; Çocuklar = Children

Özet:
Nöroblastom (NB) , nöral krestten köken alan embriyonik bir tümördür. 5 yaş altı çocuklarda en sık görülen ekstrakranyal solid tumördür. İleri evre hastalıkta yoğun protokoller ve alternatif tedaviyaklaşımlarına rağmen iki yıllık sağkalım yüzdesi %30–40'lara ancak ulaşmaktadır. Kanser hücrelerinin ajanlarla uyarılarak diferansiye edilmesi, anti-neoplastik tedavide umut verici birstrateji haline gelmiştir. Retinoik asit (RA) klinik olarak nöroblastomda hücresel diferansiasyonu indükleme özelliği açısından kullanılmaktadır. RA in vitro ve in vivoçalışmalarda terapötik potansiyelin açısından halen incelenmeye devam eden bir ajandır.Retinoidlerin hücrelerdeki biyolojik etkileri, retinoik asit reseptör (RAR) ve retinoid X reseptör (RXR)'ye bağlanan ligandlar aracılığıyla gerçekleşmektedir. PI3K/AKT ve RAS/MAPKyolakları kanserde sırası ile survival ve hücre proliferasyonu ilişkili yolaklardır. Bugüne deknöroblastom ve medulloblastom hücrelerinde özellikle PI3K/AKT yolağı daha yoğun incelenmiştir. Buna karşın NB hücrelerinde RAS/MAPK ve ilişkili ERK1/2 yolağı RAve sisplatin ile ilişkisi incelenmemiştir. Bu çalışmanın amacı çocukluk çağı solid kanserlerinin önemli bir grubunu oluşturan NB iki adet hücre hattı olan KELLY ve LAN5 hücrelerinde hücrelerinde diferansiye edici ajan RA ve sisplatin (CDDP) ve Takrolimus 'un (Tac) etkisini incelemektir. 
Bu amaçla hücre kültüründe üretilen KELLY ve LAN5 hücrelerine LD50 saptanarak bu dozlar uygulanmıştır. PI3K/AKT ve RAS/MAPK ilişkili ERK1/2 yolağı üzerinde etkisi için Akt, p44 (Erk1/2), Ras ve EGFR protein ekspresyonları immunsitokimyasal ve Western Blot yöntemi ile değerlendirilmiştir.  Diferansiyasyon Toludin Blue boyamasında morfolojik olarak değerlendirilmiştir. İstatistiksel olarak non-parametrik Mann-Whitney U ve Ki- Kare testleri, p < 0,05 anlamlılık düzeyinde kullanılmıştır.
RA, PI3K/AKT ve RAS/MAPK ilişkili ERK1/2 yolağı üzerine istatistiksel anlamlı düzeyde etki etmediği ancak diferansiyasyon ve proliferasyon durdurucu etkisinin ön planda olduğu saptanmıştır. 
Tac, Akt ekspresyonunu arttırdığı için NB'de iyi bir tedavi adayı değil gibi gözükmektedir. RA'nın RA, PI3K/AKT ve RAS/MAPK ilişkili ERK1/2 yolağı üzerine etkili olmaması, aday bir metronomik diferansiye edici ajan olma önemini desteklemektedir. Diferansiye edici bir ajanın bu yolağı anti- kanser yönde etkilemesi beklenmemektedir. 

Anahtar Kelimeler: Nöroblastom, Retinoik Asit, Sisplatin, Sinyal Yolakları

Abstract:
Neuroblastoma is an embryonic tumor originating from the neural crest. It is the most common extracranial solid tumor in children under 5 years of age. Despite intensive protocols andalternative treatment approaches in advanced-stage disease, the two-year survival rate is only30-40%. Differentiation ofcancer cells by stimulation with agents has become a promising strategy in anti-neoplastictherapy. Retinoic acid (RA) has been clinically used to induce cellular differentiation inneuroblastoma. RA is an agent that continues to be investigated in terms of therapeutic potentialin in-vitro and in- vivo studies. The biological effects of retinoids in the cells are mediatedthrough ligands that bind to retinoic acid receptor (RAR) and retinoid X receptor (RXR). PI3K/AKT and RAS/MAPK are pathways that associated with survival and cell proliferationin cancer. Up to date, PI3K/AKT pathway has been studied more intensively in neuroblastomacells. In contrast, the relationship between RAS/MAPK and associated ERK1/2 pathway, RA and cisplatin in NB cells has not been investigated. The aim of this study is to determine the effect of RA, cisplatin and combinations on the proteinexpressions of AKT, Bcl-2, MAPK (Erk1/2), and Ras related to PI3K/AKT and RAS/MAPK-related ERK1/2 pathways in two childhood solid tumor types of NB cells. 
For this purpose, LD50 was detected in KELLY and LAN5 cells produced in cell culture and these doses were applied. For the effect on PI3K / AKT and RAS / MAPK-associated ERK1 / 2 pathway, Akt, p44 (Erk1 / 2), Ras and EGFR protein expressions were evaluated by immunocytochemical and Western Blot method. Differentiation was morphologically evaluated in Toludin Blue staining. Non-parametric Mann-Whitney U and Chi-square tests were used statistically.


RA showed no significant effect on PI3K / AKT and RAS / MAPK-associated ERK1 / 2 pathway, but differentiation and proliferation inhibiting effect were at the forefront.

Tac appears to be not a good candidate for treatment because it increases Akt expression. The fact that RA is not effective on RA, PI3K / AKT and RAS / MAPK-related ERK1 / 2 pathway supports the importance of being a candidate metronomic differentiation agent. It is not expected that a differentiating agent will affect this pathway in an anti-cancer direction.

Keywords: Neuroblastoma, Retinoic Acid, Cisplatin, Signal Pathways