İnsan serum butirilkolinesteraz aktivitesi üzerine Benactyzine ve Drofenine'nin etkileri
Inhibition effects of benactyzine and drofenine on human serum butyrylcholinesterase
Yazar: EBRU BODUR
Danışman: DOÇ.DR. AYŞE NEŞE ÇOKUĞRAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 1999
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Benactyzine = Benactyzine ; Butirilkolinesteraz = Butyrylcholinesterase ; Drofenine = Drofenine ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Butirilkolinesteraz (BKE; açilkolin açilhidrolaz E.C. 3.1.1.8) insan serumundan % 55-70 asitli amonyum sülfat kesitlemesi ve Prokainamid-Sepharose 4B afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Örnek iki kez afinite kolonuna uygulanarak 17813 kez saflık sağlandı. Saflık kontrolü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile yapıldı. Substrat olarak butiriltiyokolin (BTK) kullanılarak, saflaştırılan enzimin benactyzine ve drofenine adlı ilaçlarla inhibisyon kinetikleri çalışıldı. Sabit bir BTK derişiminde artan benactyzine ve drofenine derişimlerinde ilk hızlar ölçülerek yapılan ön çalışmada, v değerlerine karşılık bu iki ilacın derişimleri grafiklendiğinde, benactyzine derişiminin artması ile hızın sıfıra ulaştığı gözlendi. Bu tip bir davranış kompetetif ya da lineer karışık tipteki inhibisyonlarda gözlenir. Drofenine ile 0.4 mM'ın üzerindeki derişimlerde deney ortamındaki bulanıklık yüzünden ölçüm yapılamadı. Benactyzine'in inhibisyon tipini saptayabilmek için artan benactyzine derişimlerinde, fakat farklı ve sabit BTK derişimlerinde ilk hızlar ölçülerek 1/v değerlerine karşı [I] değerleri grafiklendi. Çizilen grafikte farklı BTK derişimine ait doğruların ikinci bölgede kesiştiği gözlendi. Bu tip bir davranış hem kompetetif hem de lineer karışık tipte inhibisyonlarda gözlenir. Bu nedenle [S]/v değerlerine karşı artan [I] değerleri grafiklenerek, elde edilen doğruların birbirine paralel olduğu saptandı. Bu sonuç inhibisyonun kompetetif olduğunu gösterir. Artan BTK derişimlerinde drofenine'in farklı derişimleri ile yapılan deneyler sonucunda elde edilen verilerle Lineweaver-Burk grafikleri çizildiğinde doğruların 1/v ekseninde kesiştiği saptandı. Bu tip bir davranış kompetetif inhibisyonda gözlenir. Systat (version 5.03, 1991) non-lineer regresyon analizi programı kullanılarak yapılan hesaplamalar ile benactyzine için Kj değeri 0.01 0± 0.001 mM, drofenine için ise 0.003 ± 0.000 mM olarak bulundu. Buna göre drofenine BKE'ın, benactyzine'den daha etkin bir kompetetif inhibitörüdür.

Abstract:
Butyrylcholinesterase (BChE; acylcholine acylhydrolase E.C. 3.1.1.8) was purified from human serum using the procedure including 55 - 70 % acidic ammonium sulfate precipitation and Procainamide- Sepharose 4B affinity chromatography. The enzyme was eluted twice from the affinity column yielding a final purity of 17813 which was verified by Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE). Using butyrylthiocholine(BTCh) as substrate the inhibition kinetics of the purified enzyme with benactyzine and drofenine were studied. In a preliminary study using a constant concentration of BTCh with increasing concentrations of benactyzine and drofenine, it was found that as the concentration of benactyzine increased the rate of the reaction slowly decreased and finally reached zero. This type of behavior is observed in competetive and lineer mixed type inhibition. For drofenine in concentrations above 0.4 mM the enzyme rate could not be determined due to turbidity. For the determination of inhibition type of benactyzine, the initial velocity of the enzyme at increasing benactyzine concentrations using constant but different BTCh concentrations was determined and they were plotted in a graph of 1/v vs. [I]. It was found that the lines corresponding to different BTCh concentrations intersected in the second quadrant. This type of behavior can also be observed in both competetive and lineer mixed type inhibitions. Therefore to differentiate the type of inhibition, a graph of [S]/ v vs. [I] values was plotted, and the type of inhibition benactyzine was determined as competetive because the lines were found to be parallel to each other. In the study with increasing BTCh concentrations but with constant and different drofenine concentrations, the data were plotted in a 1/v vs.1/[S] graph and the lines were found to intersect at the 1/v axis. This type of behavior is observed as competetive inhibition. The Kj values (dissociation constants of benactyzine and drofenine) were calculated to be 0.010±0.001 mM and 0.003± 0.000 mM, respectively using Systat (version 5.03, 1991) non-lineer regression analysis software package. According to these parameters drofenine is more potent competetive inhibitor of BChE than benactyzine.