Rat hipotalamusunda deksmedetomidinin indüklediği hipertermi mekanizmasının proteomiks analizi ile araştırılması
Investigation of the mechanism of dexmedetomidine-induced hyperthermy in the rat hypothhalamus by proteomics analysis
Yazar: ÜMRA GÖKÇE DEMİR
Danışman: DOÇ. DR. HAYRETTİN DAŞKAYA
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Anesteziyoloji ve Reanimasyon Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Anestezi ve Reanimasyon = Anesthesiology and Reanimation
Dizin: Ateş = Fever ; Deksmedetomidin = Dexmedetomidin ; Deksmedetomidin = Dexmedetomidin ; Hipertermi-yapay = Hyperthermia-induced ; Hipotalamus = Hypothalamus ; Proteomikler = Proteomics ; Sıçanlar = Rats ; İlaç kullanımı = Drug utilization

Özet:
AMAÇ: Oldukça selektif bir α2 adrenerjik reseptör agonisti olan deksmedetomidine bağlı vucut sıcaklığı yükselmesinin ayrıntılı santral mekanizmasını aydınlatmak amacıyla rat hipotalamus hücrelerinde proteomiks ve biyoinformatik analiz aracılığı ile değişen proteom profilleri gösterilmek istenmiştir.  
GEREÇ VE YÖNTEM: Deney Hayvanları Etik Kurulundan alınan onay sonrasında 8-10 haftalık yetişkin erkek 10 adet rat, 2 ayrı gruba ayrıldı. Deney grubuna 0,15 µg/gr deksmedetomidin ve kontrol grubuna aynı volümde serum fizyolojik 24 saatte 5 kez intraperitoneal olarak uygulandı. Sedasyon skalasına göre saatlik puanlama yapıldı, sedasyon süresince saatlik kalp atım hızı, saturasyon ve vücut sıcaklıkları kaydedildi. 24 saatin sonunda tüm denekler %70 karbondioksit inhalasyonu ve ardından giyotin ile sakrifiye edildi. Diseksiyon yapılarak hipotalamuslar -80°C'de dondurucuda saklandı. 	FASP (Filter-Aided Sample Preparation) protokolü ile ayrıştırılan dokuya Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi (LC-MS/MS) ile yüksek çözünürlüklü proteomiks analizi yapılmıştır. PLGS Threshold Inspector ve PLGS 3.0.1 biyoinformatik araçlar kullanılarak protein tayini yapıldı. Fazla sayıda örneğin toplu halde karşılaştırmalı analizli için Progenesis QIP yazılımı kullanıldı. Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA) ile rat dokusundan elde edilen proteinler insan ortologlarına çevirildi ve normalleştirilmiş zenginleştirme skorlarına (NES) göre ön plana çıkan yolaklar belirlendi.
BULGULAR: İki grup hipotalamus örnekleri arasında proteomiks analizine göre tanımlanan 866 protein içinden toplamda 49 protein istatistiksel olarak (p ≤0,05), 9 adet protein kat değişimi açısından (≥1.4-kat değişimi) anlamlı bulunmuştur. STIP 1 (Stress-induced-phosphoprotein 1) ve MTCO2 (Sitokrom c oksidaz subunite 2) hem istatistiksel hem de kat değişimi açısından anlamlı bulunan en önemli 2 protein olarak ön plana çıkmıştır. NES'e göre up regülasyon gösteren yolaklar; biyolojik oksidasyonlar, yağ asidi metabolizması, interlökin 12 stimülasyonu sonrası jak stat sinyali ile gen ve protein ekspresyonu, proteozom, çözünür ekzojen antijen endozomlarının çapraz sunumu, poliaminlerin metabolizması, IL12 sinyali, IL12 ailesi sinyali, eksternal uyaranlara hücresel tepkiler, strese hücresel yanıt olarak belirlenmiştir. NES'e göre down regülasyon gösteren yolaklar; G alfa I sinyal olayları, insülin salgısının düzenlenmesi, iyon kanalı transportu, opioid sinyali, gpcr ile sinyal, demir uptake ve transportu, reseptör tirozin kinazlarla sinyal, nörotransmitter reseptörleri ve postsinaptik sinyal iletimi, oksidatif fosforilasyon, kimyasal sinapslardan iletim, nöronal sistem, küçük moleküllerin taşınması olarak belirlenmiştir.
SONUÇ: Çalışmamızda up regülasyon ve down regülasyon gösteren yolaklar ve anlamlı proteinler ile daha önce hipertermi- hipotalamus üzerinde çalışılmış makalelerde ön plana çıkan yolaklar ve anlamlı proteinler karşılaştırılmıştır. STIP 1 (Stress-induced-phosphoprotein 1) ve MTCO2 (Sitokrom c oksidaz subunite 2), PSMC6 (26S proteosome subunite) ve temsil ettikleri Eksternal uyarlara hücresel cevap, biyolojik oksidasyo ve proteozom  yolaklarının up regüle olması, oksidatif fosforilasyon yolağının down regülasyon göstermesi hipotalamusta ateş gibi fizyolojik bir stresin varlığını düşündürmektedir.

Abstract:
AIM: In this study it was aimed to invastigate the changing proteome profiles in rat hypothalamus cells via proteomics and bioinformatic analysis to elucidate the detailed central mechanism of body temperature rise due to dexmedetomidine which is a highly selective α2 adrenergic receptor agonist.
MATERIALS AND METHODS: After obtaining the ethical approval from Experimental Animals Ethics Committee, 10 adult male rats aged 8-10 weeks were divided into 2 separate groups. 0.15 µg/gr dexmedetomidine was administered intraperitoneally to the experimental group and the same volume of physiological saline was administered intraperitoneally to the control group, for four times in 24 hours. According to the sedation scale hourly scoring was done alongside heart rate, saturation and body temperatures were recorded hourly during sedation. At the end of 24 hours, all subjects were sacrificed using 70% carbon dioxide inhalation followed by guillotine. The hypothalamus were dissected and stored at -80°C in the freezer. High resolution proteomics analysis was performed with Liquid Chromatography-Mass Spectrometer (LC-MS/MS) on the tissue separated by FASP (Filter-Aided Sample Preparation) protocol. Protein identification was performed using PLGS Threshold Inspector and PLGS 3.0.1 bioinformatics tools. For mass comparative analysis of large numbers of samples The Progenesis QIP software was used. Obtained proteins from rat tissue were translated into human orthologs by Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), and prominent pathways were determined according to normalized enrichment scores (NES).
FINDINGS: Between the two groups of hypothalamus samples, 49 out of 866 proteins identified according to proteomics analysis were statistically significant (p ≤0.05), and 9 protein fold changes (≥1.4-fold change) were found to be statistically significant. STIP 1 (Stress-induced-phosphoprotein 1) and MTCO2 (Cytochrome c oxidase subunit 2) came to presence as the two most important proteins in terms of both statistical significance and fold change. Biological Oxidations, Fatty Acid Metabolism, Gene And Protein Expression By JAK STAT Signalıng After Interleukın 12 Stımulatıon, Proteasome, Cross Presentation Of Soluble Exogenous Antigen Endosomes, Metabolism of Poliamins, IL12 Signaling, IL12 Family Signaling, Cellular Responses To External Stimuli, Cellular Responses of Stress were the pathways that are up-regulated according to NES. G Alpha I Signalling Events, Regulation Of Insulin Secretion, Ion Channel Transport, Opioid Signaling, Signaling By GPCR, Iron Uptake And Transport, Signaling By Receptor Tyrosine Kinases, Neurotransmitter Receptors And Postsynaptic Signal Transmission, Oxidative Phosphorylation, Transmission Across Chemical Synapses, Neuronal System, Transport Of Small Molecules were the pathways that are down-regulated according to NES.
CONCLUSION: In our study, pathways that are showing up- and down-regulation and significant proteins were compared with the pathways and significant proteins that were prominently studied in relation to hyperthermia-hypothalamus in  articles published previously.  STIP 1 (Stress-induced-phosphoprotein 1) and MTCO2 (Cytochrome c oxidase subunit 2), PSMC6 (26S proteasome subunit) and the Cellular Responses To External Stimuli Biological Oxidations they represent, up-regulation of proteasome pathways, down-regulation of Oxidative Phosphorylation pathway are proves the existence of a physiological stress such as fever.