Akciğerin büyük hücreli karsinomlarında immünhistokimyasal alt tiplendirme
Immunohistochemical subtyping of large cell carcinomas of the lung
Yazar: CANAN ŞAKAR
Danışman: PROF. DR. PINAR FIRAT
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sitokeratinler = Cytokeratins ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Amaç: Küçük hücreli dışı akciğer karsinomlarında (KHDAK), histolojik tipe göre etkinliği ve/veya toksisitesi değişen tedavilerin gündeme gelmesiyle, alt tiplendirmenin önemi büyük ölçüde artmıştır. Genellikle küçük biyopsiler ya da sitoloji ile tanı alan bu tümörlerde alt tipi belirlemek için immunhistokimyasal belirteçler yaygın olarak kullanılmakta ve küçük biyopsilere yaklaşım algoritmaları yayınlanmaktadır. Buna karşılık rezeksiyon materyalleri için halen geçerliliğini koruyan 2004 Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) akciğer kanserleri sınıflaması morfoloji temelli bir sınıflamadır; tümörlerin immunhistokimyasal ve moleküler özelliklerini de kapsayacak şekilde yenilenmesi güncel bir tartışma konusudur. 
Büyük hücreli karsinomlar (BHK) tüm akciğer kanserlerinin %3-9'unu oluşturmakta, adenokarsinom ve skuamöz hücreli karsinomun morfolojik özelliklerini içermeyen, küçük hücreli karsinom özelliklerini taşımayan indiferansiye karsinomlar olarak tanımlanmaktadırlar. Buna karşılık immunhistokimya uygulandığında BHK'ların bir kısmında adenoid ya da skuamöz belirteçlerin pozitif reaksiyon verdiği bilinmektedir. 
Bu çalışmadaki amacımız, morfolojik olarak (2004 DSÖ sınıflamasına göre) BHK kategorisinde yer alan olguları derlemek, bu tümörlerde immünhistokimyasal olarak adenoid ya da skuamöz diferansiasyon varlığını araştırmak, elde edilen sonuçların farklı varyantlar ile ilişkisini sorgulamak, bu uygulamaların olguların ne kadarında olası bir tanı değişikliğine yol açabileceğini saptamak ve DSÖ akciğer tümörleri sınıflaması konusundaki tartışmalara katkı sağlamaktır. 
Materyal-Method: 2000-2013 yılları arasında İstanbul Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı'nda incelenmiş toplam 853 olguya ait KHDAK tanılı akciğer rezeksiyon materyallerinin arşiv verilerine ulaşıldı. Bu olgular içerisinde yer alan tüm BHK, solid veya solid baskın adenokarsinom ve az diferansiye skuamöz hücreli karsinom olguları tekrar değerlendirildi. Büyük hücreli nöroendokrin karsinomlar çalışma dışı bırakıldı.           Çalışmaya alınan toplam 91 olguya, histokimyasal olarak d-PAS ve immunhistokimyasal olarak TTF-1, Napsin- A, sitokeratin 5/6, p40 uygulandı.       Morfolojik, histokimyasal ve immunhistokimyasal bulgular birbirinden bağımsız olarak değerlendirildi. Adenokarsinom ve skuamöz hücreli karsinomlar üzerinden immun belirteçlerin duyarlılık ve özgüllüğü belirlendi. Bu güvenilirlik sınırları ile morfolojik ve histokimyasal olarak BHK kategorisinde yer alan olgular immunfenotiplerine göre alt tiplere ayrıldı ve BHK'ların ne oranda daha ileri tiplendirilebileceği saptandı. Morfolojik sınıflama ve immunfenotipik sınıflamaya göre olguların klinik özellikleri karşılaştırıldı.
Bulgular: Morfolojik ve histokimyasal inceleme (d-PAS) ile 25 olgu adenokarsinom (solid ve solid-baskın) 19 olgu az diferansiye skuamöz hücreli karsinom, 47 olgu büyük hücreli karsinom olarak sınıflandırıldı. Büyük hücreli karsinom olgularından 36'sı daha ileri tiplendirilemeyen (NOS), 3'ü rabdoid tip, 4'ü berrak hücreli tip, 3'ü bazaloid tip, 1'i lenfoepitelyoma benzeri olarak değerlendirildi. 
TTF-1 ve Napsin-A'nın solid-solid baskın adenokarsinomlar için duyarlılığı sırasıyla %56 ve %52, özgüllüğü %100 bulundu. Bu seride yer alan az diferansiye adenokarsinomlar için en duyarlı testin d-PAS olduğu dikkati çekti (duyarlılık %80, özgüllük %100) . SK 5/6 ve p40'ın az diferansiye skuamöz hücreli karsinomlar için duyarlılık ve özgüllüğü sırasıyla %94.7 ve %96, %89,4 ve %96 olarak belirlendi. Bu güvenilirlik sınırları içinde, büyük hücreli karsinomların %59.5'inde adenoid ya da skuamöz yönde diferansiasyon saptandı. Üçü rabdoid, biri berrak hücreli olmak üzere toplam 16 BHK olgusunda (%34) TTF-1 ve/veya Napsin-A ile pozitif reaksiyon izlendi. Biri berrak hücreli, biri bazaloid ve bir diğeri de lenfoepitelyoma benzeri varyant olmak üzere toplam 12 BHK olgusunda ise (%25.5), SK 5/6 ve/veya p40 ile pozitivite görüldü. Her iki yönde immunekspresyon gösteren herhangi bir olgu izlenmedi. 
Morfolojik sınıflama temel alındığında, büyük hücreli karsinomların tüm KHDAK olgularının %5,6'sını oluşturduğu; immunfenotiplerine göre bir kısmı adenokarsinom veya skuamöz hücreli karsinom olarak yorumlanırsa bu oranın %2,25'e düşeceği görüldü. 
Morfolojik ve immunfenotipik sınıflama ile elde edilen alt gruplarda klinik özellikler karşılaştırıldığında, her iki sınıflama için de alt tipler ile tümörün yerleşim yeri (santral/periferik) arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulundu (p<0.001 ve p=0.003); ancak diğer klinik parametreler açısından alt tipler arasında anlamlı bir fark saptanmadı.
Sonuç: Küçük hücreli dışı indiferansiye karsinomlar olarak tanımlanan büyük hücreli karsinomların önemli bir kısmı immunhistokimyasal olarak tiplendirilebilmektedir. Akciğer karsinomlarını detaylı olarak sınıflamaya çalışmamızın nedeni, prognostik ve prediktif veri elde etmek, nüks ve metastazlarda tedaviyi yönlendirebilmektir. Sonuçlarımızın bu anlamda klinik bir öneminin olabilmesi için, immunhistokimyasal çalışma ile belirlenen alt tiplerde başta EGFR mutasyonu ve ALK yeniden düzenlenmesi olmak üzere moleküler analizler yapılması yararlı olacaktır. Bu çalışmalar sonucunda, immunhistokimyasal olarak adenoid ve skuamöz diferansiasyon gösteren tümörlerde, sırası ile adenokarsinom ve skuamöz hücreli karsinomlarda beklenen moleküler değişikliklerin saptanması, büyük hücreli karsinom olgularının immunhistokimya ile sınıflanmasını anlamlı hale getirecek; aksi takdirde, immun belirteçler ile sınıflamanın, bugün için DSÖ'nün benimsemiş olduğu morfolojik sınıflamaya üstün olduğunu söylemek güçleşecektir.

Abstract:
Objectives: As a result of the emergence of new treatment options that demonstrate differing efficacy and/or toxicity based on histological subtypes, the importance of subtyping has substantially increased for non-small cell lung carcinoma (NSCLC). In general, immunohistochemical markers are widely used to determine the subtype of tumors diagnosed by small biopsies or cytology, and the algorithmic approaches to small biopsies are published. On the other hand, 2004 World Health Organization (WHO) classification for resection materials that retains all its validity is a classification based on morphology; the renewal of classification depending on the immunohistochemical and molecular characteristics of tumors is a subject of current debate.
Large cell carcinoma (LCC) accounts for about 3-9% of all primary pulmonary malignancies. . LCC is defined as an 'undifferentiated  non-small cell carcinoma that lacks glandular or squamous differentiation and the cytologic and architectural features of small cell carcinoma' This definition based on morphology observed in surgical resection specimens in current classification; however studies show that, by using immunohistochemical tecniques, a relevant percentage of LCCs could be positive with squamous and glandular markers.
In this study, we aim to compile the cases which are morphologically classified as LCC (according to 2004 WHO classification), investigate the existence of glandular or squamous differentiation with immunohistochemical markers, determine possible diagnostic changes in the cases that these applications could lead and contribute to the debate on the subject of lung tumors classification.
Materials and Methods: The archival data of 853 cases diagnosed as NSCLC by resection specimens between the years 2000-2013 in Istanbul Faculty of Medicine Department of Pathology is obtained.  All cases of LCCs, solid- solid predominant adenocarcinoma and poorly differentiated squamous cell carcinomas were re-examined. Large cell neuroendocrine carcinomas were excluded from the study. A total of 91 cases were included in the study, and d-PAS was performed as histochemical, and TTF-1, Napsin-A, cytokeratin 5/6, p40 were performed as immunohistochemical markers to all these 91 cases. Morphological, histochemical and immunohistochemical findings were evaluated independently from each other. Sensitivity and specificity of immune markers were identified through adenocarcinomas and squamous cell carcinomas. With this confidence limits, cases taking part morphologically and histochemically in the LCC classification were divided into subtypes based on their immunophenotypes, and it was determined how much LCCs could be subtyped. Clinical features of the cases were compared based on the morphologic and immunophenotypic classification.
Results: Based on morphological and histochemical stain (d-PAS), 25 cases were reclassified as adenocarcinoma (solid and solid predominant) and 19 as poorly differentiated squamous cell carcinomas; 47 of the cases were unclassifiable. Of these LCCs, 36 were evaluated LCC-NOS,3 as rhabdoid type, 4 as clear cell type, 3 as basaloid type and 1 as lyphoepithelioma like.
The sensitivities of TTF-1 and Napsin-A were found to be 56%, 52%, respectively; specifities were found to be 100% for both in solid and solid predominant adenocarcinomas. In these series, we noticed that the most sensitive test for poorly differentiated adenocarcinomas was d-PAS (sensitivity 80%, specifity 100%). The sensitivities of cytokeratin 5/6 and p40 were found to be 94.7%, %96 respectively;  specifities were found to be %89,4 and %96 for both, respectively in poorly differentiated squamous cell carcinomas. With this confidence limits, 59,5% of LCCs were determined as adenoid or squamoid differentiation. Including 3 rhabdoid and one clear cell type at all, 16 (34%) of LCCs were stained with TTF-1 and/or Napsin-A. Including one clear cell type, one basaloid type and one lyphoepithelioma like variant at all, 12 (25,5%) of LCCs were stained with cytokeratin 5/6 and/or p40. There was no co-expression with these immunomarkers for squamoid and glandular differentiation  .
When the morphology-based classification was used, the LCCs were accounting for 5,6% of all NSCLC cases. Interpreting LCCs as adenocarcinoma or squamous cell carcinoma depending on immunohistochemical markers, the rate decreased to 2,25%.
Comparing the clinical parameters and histopathological subtypes of tumors which are classified as morphologically and immunophenotypically, the difference for tumor localization between groups were statistically significant (p<0.001 and p=0.003). However, there were no statistically significant differences between groups, when the other clinical parameters and histopathological subtypes of tumors were compared.
Conclusions: A significant portion of large cell carcinomas  defined as non small cell undifferentiated carcinomas can be categorized immunohistochemically. The reason why we try to classify lung carcinomas in detail is to obtain prognostic and predictive data and direct the treatment in the condition of recurrence and metastasis. In this sense, to have clinical significance of our results, it will be useful to perform molecular analysis including particularly EGFR mutation and ALK rearrangement for immunohistochemically determined subtypes. As a result of these studies, in tumors  with immunohistochemical adenoid and squamous differentiation, determination of expected molecular changes in adenocarcinomas and squamous cell carcinomas will make the classification of large cell carcinoma cases by immunohistochemistry  meaningful. Otherwise, it will be difficult to say that the classification with immune markers is superior to the morphological classification adopted by the WHO today.