Bor stresine maruz kalmış buğday bitkisine eksojen nitrik oksit (NO) ilavesinin fizyolojik etkilerinin incelenmesi
Investigation of physiologic effects of exogenous nitric oxide (NO) application on wheat exposed to boron stress
Yazar: HAFİZE DİLEK TEPE
Danışman: PROF. DR. TÜLİN AYDEMİR
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Bor = Boron ; Buğday = Wheat ; Glütatyon = Glutathione ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Organik asitler = Organic acids ; Poliaminler = Polyamines

Özet:
Türkiye, özellikle Batı Anadolu Bölgesi, dünyadaki Bor (B) rezervlerinin % 61'ine sahiptir ve bu bölgedeki B toksisitesi tarım alanlarını etkileyen önemli bir problemdir. Türkiye'de önemli bir tarım ürünü olan buğday da bu bölgelerde yetişmekte ve B toksisitesinden oldukça etkilenmektedir. Nitrik oksit (NO), bitki büyümesi, gelişmesi ve farklı hücre içi süreçlerde rol alan önemli bir sinyal molekülüdür. Bu tez çalışmasında, 10 mM B stresi uygulanan Bezostoya (B hassas) ve Kutluk 94 (B dayanıklı) buğday türlerine farklı konsantrasyonlarda Sodyum Nitroprussid (SNP) (NO donörü) eklenerek, NO'nun iyileştirici etkileri araştırıldı. Bunun için her iki buğday türünde; gövde ve kök uzunlukları, ağırlıkları, % elektrolitik iletkenlik (%EL), Malondialdehit (MDA), Prolin, Hidrojen Peroksit (H2O2) içerikleri, Glutatyon Peroksidaz (GPX), Glutatyon Redüktaz (GR), Glutatyon S Transferaz (GST), Nitrat Redüktaz (NR) enzim aktiviteleri, Düşük Molekül Ağırlıklı Organik Asit içerikleri (LMWOA), metal içerikleri, Poliamin (PA) içerikleri, Sistein, Redükte Glutatyon (GSH), Okside Glutatyon (GSSG), Fitoşelatin (PC2) içerikleri ve Nitrat Redüktaz enzimine ait gen ekspresyon düzeyleri analiz edildi.
	Bor stresiyle birlikte buğday bitkisinin her iki türünde de gövde, kök ağırlıklarında azalmalar elde edildi. On mM bor derişimine 0,2 mM SNP ilave ettiğimizde Bezostoya ve Kutluk 94 buğday gövde ağırlıklarında sırasıyla %64 ve %103 oranlarında artışların olduğu gözlendi. Bezostoya ve Kutluk 94 buğday gövdelerinde H2O2 içeriğinde 10 mM bor stresinde kontrol grubuna göre sırasıyla %102 ve %70 oranında artış elde edildi. On mM bor derişimine 0,2 mM SNP ilave edildiğinde Bezostoya ve Kutluk 94 buğday türlerinde H2O2 içeriğinde sırasıyla %13 ve %23 oranında azalmalar elde edildi. GPX aktivitesi Bezostoya ve Kutluk 94 buğday türü gövdelerinde 10 mM bor konsantrasyonuyla birlikte kontrol gruplarına göre sırasıyla %33 ve %14 oranında azaldı. Bor stresine 0,2 mM SNP ilave edildiğinde enzim aktivitesinde sırasıyla %32 ve %9,8 oranında artışlar elde edildi. Bezostoya ve Kutluk 94 buğday gövdelerinde 10 mM bor stresinde NR enzim aktivitelerinde kontrol grubuna göre sırasıyla %57,43 ve %25,76 oranında azalmalar gözlendi. 10 mM bor konsantrasyonuna 0,2 mM SNP ilave ettiğimizde NR enzim aktivitesi Bezostoya ve Kutluk 94 buğday türlerinde sırasıyla %220,67 ve %70,33 oranında arttı. Bezostoya gövdelerine 10 mM bor uyguladığımızda kontrol gurubuna göre benzoik, malik, oksalik asit içeriklerinde sırasıyla %49, %36, %40 oranında, Kutluk 94 türünde ise %19, %16, %23 oranında azalmalar elde edildi. Ortama ilave edilen SNP konsantrasyonlarından 0,2 mM'da benzoik, malik, oksalik asit düzeyleri Bezostoya türünde %118, %42, %90, Kutluk 94 türünde ise %22, %54, %39 oranında arttı. Hem Bezostoya hem de Kutluk 94 buğday türlerinin kök ve gövdelerinde 10 mM bor ilavesiyle bor içeriklerinde artış gözlendi. Kutluk 94 buğday gövdelerinde 10 mM bor stresli ortama 0,1, 0,2 ve 0,5 mM SNP ilave edildiğinde bor içerikleri %12, %40 ve %32,5 oranında azaldı. Poliamin içeriklerinde 10 mM bor stresinde kontrol grubuna göre Bezostoya buğday türünün gövdelerinde putresin, spermidin ve spermin içeriklerinde sırasıyla %60,47, %27,24 ve %68,57, Kutluk 94 buğday türünde ise %46,94, %24,27 ve %37,39 oranında artışlar elde edildi. Bor stresi ortamına ilave edilen SNP, stresten dolayı artan poliamin miktarlarını azalttı. Ancak en iyi cevap 0,2 mM SNP konsantrasyonundan elde edildi. Kutluk 94 türü köklerinde, sistein, GSH ve GSSG oranları 10 mM bor konsantrasyonunda kontrol grubuna göre %38,80, %31,06 ve %52,87 oranında azalırken Bezostoya buğday türünde ise %39,60, %41,87 ve %56,89 oranında azaldı. 
	Bezostoya buğday türü gövdelerinde 10 mM bor stresinde kontrol grubuna göre PC2 içeriği %94,49 oranında artış gösterdi. Bu artış Kutluk 94 buğday türünde %80,44 olarak bulundu. On mM bor stresine 0,1, 0,2 ve 0,5 mM SNP uyguladığımızda Bezostoya türünde PC2 içeriklerinde sırasıyla %19,02, %36,42 ve %51,60 oranında azalmalar elde edilirken Kutluk 94 türünde bu oranlar %22,98, %39,35 ve %45,08 olarak bulundu. NR enzimine ait RT- PCR sonuçlarına göre enzimin ekspresyon oranı, gövdelerde kontrol grubuna göre değişim, 10 mM bor ilavesiyle Bezostoya türünde 4,5 kat, Kutluk 94 türünde 2,6 kat oranında azaldı. Ortama 0,2 mM SNP ilave edilmesiyle NR enzim ekspresyonunda 10 mM bor stresine göre Bezostoya ve Kutluk 94 gövdelerinde sırasıyla 10,57, 6,65 kat oranında artışlar elde edildi.
	Bu sonuçlar, NO'nun, B stresine karşı buğday bitkisinin büyümesi ve gelişmesinde hayati önem taşıyan birçok metabolik süreçte iyileşmelere neden olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, B toksisitesinin problem oluşturduğu buğday tarımının yapıldığı alanlarda, NO'nun bitkiye dışarıdan uygulaması ile bitkideki stresin negatif etkileri ortadan kaldırılabilir.

Abstract:
Turkey, especially West Anatolia Region, has 61% of the boron (B) reserves of the world and B toxicity in this region is a major problem for cultivated areas. Wheat which is an important crop product in Turkey grows in this area and affected from B toxicity. Nitric oxide (NO) is an important signal molecule which plays a role in plant growth, development and various intracellular processes. In this thesis study, ameliorative effect of NO in Bezostoya (B sensitive) and Kutluk 94 (B tolerant) wheat cultivars exposed to 10 mM B stress by addition of different concentrations of a NO donor, Sodium nitroprusside (SNP). For this aim, shoot and root lengths, % electrolyte leakage (EL%), malondialdehyde (MDA), proline, hydrogen peroxide (H2O2), Glutathione peroxidase (GPX), Glutathione reductase (GR), Glutathione S-transferase (GST), Nitrate reductase (NR), low molecular weight organic acid (LMWOA), polyamine (PA), cysteine, GSH, GSSG and phytochelatine (PC2) contents and NR gene expression levels were investigated in both wheat cultivars. 
	Reductions in shoot and root weights were determined in both wheat cultivars exposed to B stress. When 0.2 mM SNP was added to 10 mM boron concentration, shoot weight levels of Bezostoya and Kutluk 94 wheats were increased by %64 and %103 respectively. By 10 mM boron stress, H2O2 content of wheat shoots of Bezostoya and Kutluk 94 plants was increased by %102 and %70 respectively, as compared to control group. H2O2 levels of Bezostoya and Kutluk 94 wheat plants were reduced by %13 and %23 respectively, when 0.2 mM SNP was added to 10 mM boron concentration. 10 mM boron concentration caused decreased GPX activity in Bezostoya and Kutluk 94 wheat shoots by %33 and %14 respectively as compared to the control group. Enzyme activity levels were increased by %32 and %9.8 when 0.2 mM SNP was added to boron stress. NR enzyme activity levels of Bezostoya and Kutluk 94 wheat shoots were decreased by %57.43 and %25.76 respectively, under the 10 mM boron stress when compared to control group. When 0.2 mM SNP was added to 10 mM boron concentration, NR enzyme activity levels of Bezostoya and Kutluk 94 wheat shoots were increased by %220.67 and %70.33 respectively. When 10 mM boron was applied; benzoic, malic and oxalic acid levels of Bezostoya shoots decreased by %49, %36, %40 and these acid levels of Kutluk 94 shoots decreased by %19, %16, %23 respectively. Addition of 0.2 mM SNP concentration increased the benzoic, malic and oxalic acid levels of Bezostoya shoots by %118, %42, %90 and increased the acid levels by %22, %54, %39 of Kutluk 94 shoots respectively. Boron levels of the roots and shoots of Bezostoya and Kutluk 94 wheat cultivars increased after 10 mM boron addition. 0.1, 0.2 ve 0.5 mM addition of SNP to 10 mM boron stress caused reduction of boron levels of Kutluk 94 wheat shoots by %12, %40 and %32.5. Putrescine, spermidine and spermine contents of Bezostoya wheat cultivars were increased by %60.47, %27.24 and %68.57 respectively, however, in Kutluk 94 wheat cultivars there were %46.94, %24.27 and %37.39 increases in polyamine contents by 10 mM boron stress as compared to control group. Addition of SNP to boron stress environment decreased the polyamine levels which caused by stress. However, best response obtained by 0.2 mM SNP concentration. Cysteine, GSH and GSSG levels of Kutluk 94 roots exposed to 10 mM boron concentration, decreased by %38.80, %31.06 and %52.87; while these levels in Bezostoya wheat plant roots decreased by %39.60, %41.87 and %56.89. 
	By 10 mM boron stress, PC2 levels of Bezostoya wheat shoots increased by %94.49 as compared to the control group. This increase was %80.44 in Kutluk 94 wheat shoots. When 0.1, 0.2 and 0.5 mM SNP applied to 10 mM boron stress, PC2 levels of Bezostoya wheat plant decreased by %19.02, %36.42 and %51.60; while these levels were %22.98, %39.35 and %45.08 in Kutluk 94. RT-PCR results of NR enzyme expression levels were decreased by 4.5 fold in Bezostoya wheat plant and 2.6 fold in Kutluk 94 by the addition of 10 mM boron. By 0.2 mM SNP addition, NR expressions were increased by 10.57, 6.65 fold in Bezostoya and Kutluk 94 shoots, respectively, as compared to 10 mM boron stress.
	These results show that NO ameliorated many metabolic processes having vital importance in wheat growth and development. Thus, exogenous NO may be used as an amendatory in wheat cultivation areas having B toxicity problem.