Genetik füzyon yoluyla floresan işaretli rekombinant antikorların tanıya yönelik geliştirilmesi
Development of fluorescently labeled recombinant antibodies for diagnostic purposes
Yazar: ÖZNUR ÖZLEM İBRAHİMOĞLU
Danışman: DR. BERRİN ERDAĞ
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Antikorlar = Antibodies ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Hepatit B yüzey antijenleri = Hepatitis B surface antigens ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic

Özet:
Amaç: Bu çalışmada floresan ELİSA veya hücre görüntüleme çalışmalarında kullanılması için genetik füzyon ile mCherry floresan protein işaretli anti-HBsAg fragmentlerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda anti-HBsAg rekombinant antikoru kodlayan gen bir floresan protein (mCherry) kodlayan geni içeren pQE-30 ekspresyon vektörüne klonlanmıştır.Yöntemler: Bu çalışmada daha önce faj gösterim teknolojisi ile geliştirilen anti-HBsAg scFV kullanıldı. İlk olarak bu anti-HBsAg scFv KpnI ve SalI restriksiyon enzim kesim bölgeleri içeren spesifik primerler kullanılarak PZR ile amplifiye edildi. Daha sonra PZR ürünleri ve pQE30 vektörü KpnI ve Sall restriksiyon endonukleazları ile kesildi. Kesim ürünleri T4 DNA ligaz enzimi ile birleştirildikten sonra E.coli JM109 hücrelerine kalsiyum klorür yöntemi ile transforme edildi. Pozitif koloniler koloni PZR ve sonrasında DNA dizi analizi yöntemi ile doğrulandı. Hücreler 1 mM IPTG ile indüklendi ve His-tag afinite kolon kromatografisi ile saflaştırıldı. Saflaştırılmış proteinlere SDS PAGE ve Western Blotlama analizleri uygulandı.Sonuçlar: Anti-HBsAg scFv kodlayan gen PZR yöntemi ile amplifiye edilmiştir ve mCherry-pQE30 vektörüne klonlanmıştır. Moleküler klonlama koloni PZR ve DNA sekans analizi ile doğrulanmıştır. Genetik füzyon ürününün protein ekspresyonu SDS PAGE ve Western blot yöntemleri ile kontrol edilmiştir. Yaklaşık olarak beklenilen 55.4 kDa değerinde protein bandı elde edilmiştir.Tartışma: Yapılan çalışma sonucunda scFv /mCherry füzyon proteini başarılı şekilde eksprese edilmiştir. ELİSA sonuçlarına göre saflaştırılmış proteinler HBsAg'ye zayıf bağlanma göstermişlerdir. Floresan rekombinant antikor füzyon yapısı ELISA çalışmalarında düşük bağlanma göstermesinin nedeni füzyon yapının doğru katlanmamış olmasından kaynaklanma ihtimali bulunmaktadır. Bu nedenle ileriki çalışmalarda öncelikle farklı koşullarda ?refolding? çalışmalarının yapılması gerekmektedir.

Abstract:
Aim: In this study we aimed to develop mCherry fluorescent protein labeled anti-HBsAg fragments by genetically fusion in order to use in fluorescent ELISA or in cell imaging studies. In this context an anti-HBsAg recombinant antibody (scFv) coding gene was cloned into a pQE30 expression vector containing the gene encoding a fluorescent protein (mCherry).Methods: In this study, an anti HBsAg scFv previously developed in the project `Development of recombinant antibody against Hepatit B surface antigen by Phage display technology? was used. The anti-HBsAg scFv was first amplified by PCR using specific primers comprising Kpn I and Sal I restriction enzyme sites. Then the amplified PCR product and the pQE30 vector was digested with KpnI and SalI restriction endonucleases. Digestion products were ligated with T4 DNA ligase then transferred into E.Coli strain JM109 by calcium chloride transformation. Positive clones were confirmed by coloni PCR then by DNA sequencing. The fusion protein was induced with 1mM IPTG and purified with HIS tag affinity columns. Purified proteins were analyzed with SDS PAGE and Western blot.Results: The scFv encoding gene was amplified by PCR and cloned into the mCherry-pQE30 vector. The cloning was confirmed by DNA sequence analysis. The protein expression of the genetic fusion product was controlled with SDS PAGE and werstern blot and protein band of approximately 55.4 kDa was detected as expected.Conclusion: In this study a genetically fused scFv/mCherry fusion protein was successfully expressed. The results of ELISA show a low binding of the fluorescent recombinant antibody. This could because of the misfolding of the fusion protein. In order to overcome to this problem different refolding conditions must be tried.