Tip60 geninin demir metabolizmasının düzenlenmesindeki rolünün fare karaciğer dokusunda araştırılması
Investigation of the role of Tip60 gene in the regulation of iron metabolism in mouse liver
Yazar: NURDAN GÖNÜL
Danışman: DOÇ. DR. HARUN BUDAK
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics

Özet:
Demir; oksijen taşınması, enerji yapımındaki birçok enzimin katalizlenmesi, DNA, RNA ve protein sentezi gibi birçok biyolojik süreçte yer alan önemli bir biyoelementtir. Demir metabolizmasında meydana gelen düzensizlikler anemi, kardiyovasküler hastalıklar, solunumla ilgili hastalıklar, kanser, nörodejeneratif hastalıklar (Azheimer, Parkinson vb.), beta talasemi, demir eksikliği anemisi ve organ hasarlarına neden olabilmektedir. Birçok metabolik süreç gibi demir homeostaziside epigenetik mekanizmalarla düzenlenmektedir. Histon asetiltransferaz (HAT) aktivitesine sahip TİP60 proteini MYST enzim ailesinin bir üyesidir ve doğrudan veya dolaylı olarak transkripsiyonel regülasyon, DNA hasar tamiri, hücre döngüsü, apoptozis yolağı, kanser, sirkadiyen sistem ve hücresel sinyal mekanizmaları gibi önemli ve hayati bir fonksiyona sahiptir. Yapılan çalışmalarda, Alzheimer hastalığında görülen demir düzensizlikleri ve bu düzensizliklerden sorumlu olduğu düşünülen Amiloid Prekürsör Protein (APP) ile TİP60 proteini arasındaki ilişkinin gösterilmesi ve Tip60 geni silinmiş fare karaciğer dokularında demir homeostazisinin düzenlenmesinden sorumlu hepsidin hormonunun ekspresyonunun önemli derecede azalması TİP60 proteinin, demir düzenleyici yolaklar üzerinde etkili olabileceği fikrini oluşturmuştur. Bu tezde, demir metabolizmasının düzenlenmesinden sorumlu yolaklar üzerine yeni bir aktör olabileceği düşünülen Tip60 geninin etkisi gösterilmeye çalışılacaktır. Bu amaçla kontrol, sistemik demir yüklemesi oluşturulmuş ve karaciğer spesifik Tip60 nakavt fare gruplarından elde edilen karaciğer dokularında demir homeostazisindeki genlerin (Fth, Fpn, Tfr1, Tfr2, Bmp6, Smad4, Smad1/5/9, Hamp) ekspresyonlarındaki kantitatif değişiklikler, Real Time PCR kullanarak ölçüldü. Western blot yönemiyle gen seviyesinde oluşan etkinin protein seviyesi üzerine kantitatif etkisi araştırıldı. İmmünohistokimya yöntemiyle western blot sonuçları doğrulandı ve sistemik demir yüklenmesi oluşturulması sonrasında TİP60 ve diğer proteinlerin doku üzerindeki subselülar lokalizasyonlarına bakıldı. TİP60 proteinin demir homeostazının sağlanmasında görevli protein ve genlerle olabilecek direkt veya dolaylı ilişkisi immünopresipitasyon (IP) gösterildi. Sonuç olarak, demir yolağının karaciğer dokusundaki düzenlenmesinde Tip60'ın gen ve protein seviyesinde önemli rol oynadığı gösterildi.

Abstract:
Iron; is an important bioelement involved in many biological processes such as oxygen transport, catalysis of many enzymes in energy production, DNA, RNA, and protein synthesis. Disorders in iron metabolism might cause anemia, cardiovascular diseases, respiratory diseases, cancer, neurodegenerative diseases (Azheimer, Parkinson), beta thalassemia, iron deficiency anemia, and organ damages. Iron homeostasis is regulated by epigenetic mechanisms like many metabolic processes. TIP60 protein, which has histone acetyl transferase (HAT) activity, is a member of the MYST enzyme family. It has an important and vital function, such as direct or indirect transcriptional regulation, DNA damage repair, cell cycle, apoptosis pathway, cancer, circadian system, and cellular signaling mechanisms. Studies have shown that iron irregularity is a factor for Alzheimer's disease and the relationship between the Amyloid Precursor Protein (APP), which is a causal agent in the pathogenesis of Alzheimer's disease, and TIP60 protein has been demonstrated. Furthermore, the expression of the hepcidin hormone, which is responsible for the regulation of iron homeostasis, was significantly decreased in Tip60 gene-deleted mouse liver tissue. These knowledge help us to create an idea that Tip60 may have effects on iron regulatory pathways. In this thesis, we will try to show the effect of the Tip60 gene which is thought to be a new actor on the pathways responsible for the regulation of iron metabolism. For this purpose, the expression profile of iron homeostasis pathway genes (Fth, Fpn, Tfr1, Tfr2 Bmp6, Hjv, Smad4, Smad1/5/9, Hamp) was investigated in liver specific Tip60 conditional knockout mice, iron overload generated mice, and control group mice liver tissues by using Real Time PCR analysis. The effects of the changes of the quantitative gene expression on the quantitative protein expression was investigated by western blot analysis. Western blot results were confirmed by the method of immunohistochemistry, and the subcellular localization of TIP60 and other proteins was shown in liver cells after systemic iron overload. Immunoprecipitation (IP) was performed to demonstrate the direct or indirect association of the TIP60 protein with the proteins that are responsible for the iron homeostasis. Consequently, it has been shown that Tip60 plays an important role in the regulation of iron pathway in mouse liver tissue at gene and protein level.