İnsan hepatoselüler karsinom hücre hattında (HEPG2) lipotoksik ve mitotoksik streste mitokondriyon yanıtı
Mitochondrial response to lipotoxic and mitotoxic stress in human hepatocellular carcinoma cell line (HEPG2)
Yazar: YAPRAK YALÇIN
Danışman: PROF. DR. FATMA BELGİN ATAÇ
Başkent Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Genler = Genes ; Hücre dizisi = Cell line ; Karsinoma = Carcinoma ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Mitokondriler = Mitochondria ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Ototoksisite = Ototoxicity ; Palmitik asit = Palmitic acid

Özet:
Beslenmede doymuş yağ asiti alımı arttıkça obezite, tip 2 diyabet (T2DM) ve non-alkolik yağlı karaciğer hastalığının (NAYKH) görülme sıklığı da artmaktadır.  Bu hastalıkların patogenezindeki ortak nokta ise artan serbest yağ asidi miktarının karaciğer, iskelet kası, kalp ve pankreas gibi non-adipoz dokularda birikmeye başlamasıdır. Lipotoksisite olarak tanımlanan bu durum, artan lipid birikimi ile organel fonksiyon bozukluğuna, hücre hasarına, metabolik bozukluklara, kronik inflamasyona, hücresel fonksiyon kayıplarına ve non-adipoz doku ölümüne sebep olmaktadır. Lipotoksisiteye bağlı mitokondriyonda stres meydana geldiğinde lipid peroksidasyonu, ROS artışı ve buna bağlı olarak hücre ölümü tetiklenmektedir. Diyette ve serumda en fazla bulunan doymuş serbest yağ asidi Palmitik Asit (PA) olup; 16 karbonlu uzun zincirli bir yağ asididir. Altında yatan mekanizma tam olarak bilinemese de yağ asitlerinin trigliseride (TG) dönüşümü sitotoksisiteye neden olmaktadır. PA'nın TG'ye dönüşümü daha az olduğundan daha fazla toksik özellik göstermektedir. Bir diğer stres kaynağı ise karbonil siyanid 3-klorofenilhidrazon (CCCP)'dir. CCCP hücrelerde mitotoksisiteye sebep olan bir ajan olup mitofaji çalışmalarında yaygın kullanılanılan kimyasaldır. 
Tüm bu verilerin ışığında çalışmamızda insan HepG2 hücre hattında ayrı ayrı lipotoksik ve protonofor stresi uygulanarak mitokondriyonun verdiği stres yanıtı farklılığının araştırılması hedeflenmiştir. Böylece farklı uyaranlara karşı mitokondriyonun verdiği  otofaji mitofaji yanıtlarında görev alan proteinler hakkında daha detaylı bilgi edinilmesi hedeflenmiştir. Ek olarak uygulanan stresin süresi ve çeşitliliğinin de yanıt farklılığındaki etkisi araştırılmıştır.

Bunun için mitokondriyonla ilişkili stres ve mitofaji genlerinden CHOP, HSP10, HSP60 ve Parkin ve otofajide adaptör/ reseptör görevi yapan Optineurin, HACE1, TBK1, p62 ve LC3-II genlerinin ifadelenmesine bakılmıştır.
Sonuç olarak hücresel stres yanıtının PA uygulanan grupta daha erken başlayıp, azaldığı; CCCP uygulanan grupta ise, daha geç başlayıp daha uzun sürdüğü görülmüştür. PA uygulanan grupta en etkili saatin 12. saat olurken CCCP grubunda 24. saat olduğu görülmüş olup, özellikle mitokondriyal streste görev alan CHOP geninin ve mitofajide görev alan  Parkin, OPTN, HACE1, TBK1, P62 ve LC3-II genlerinin ifadelenmelerinin arttığı görülmüştür.

Abstract:
As dietary saturated fatty acid intake increases, the prevalence of obesity, type 2 diabetes (T2DM) and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) increases. The common point in the pathogenesis of these diseases is that the increased amount of free fatty acids begins to accumulate in non-adipose tissues such as liver, skeletal muscle, heart and pancreas. This condition, defined as lipotoxicity, causes organelle dysfunction, cell damage, metabolic disorders, chronic inflammation, loss of cellular function and death of non-adipose tissue with increasing lipid accumulation. When stress occurs in the mitochondria due to lipotoxicity, lipid peroxidation, ROS increase, and consequently cell death are triggered. Palmitic Acid (PA) is the most saturated free fatty acid found in diet and serum. It is a long chain fatty acid with 16 carbons. Although the underlying mechanism is not fully known, the conversion of fatty acids to triglycerides (TG) causes cytotoxicity. Since the conversion of PA to TG is less, it shows more toxic properties. Another source of stress is carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). CCCP is an agent that causes mitotoxicity in cells and is widely used in mitophagy studies.
In the light of all these data, the aim of this study was to investigate the difference in the stress response of mitochondria by applying lipotoxic and protonophore stress separately in human HepG2 cell line. Thus, it is aimed to obtain more detailed information about the proteins involved in the responses of mitochondria to autophagy, mitophagy against different stimuli. In addition, the effect of duration and variety of stress applied on response difference was investigated.

For this purpose, expression of CHOP, HSP10, HSP60, Parkin, which are mitochondria-related stress and mithophagy genes, and Optineurin, HACE1, TBK1, p62 and LC3-II genes that act as adapters/ receptors in autophagy were examined.
As a result, cellular stress response started and decreased earlier in the PA group; In the CCCP group, it was observed that it started later and lasted longer. In the PA group, the most effective time was 12 hours, whereas in the CCCP group it was 24 hours, especially the expression of CHOP gene in mitochondrial stress and Parkin, OPTN, HACE1, TBK1, P62 and LC3-II genes in mitochondrial stress were increased.