Gıda katkı maddesi olarak kullanılabilecek rekombinant jelatin üretimi için COL1A1 gen fragmanlarının maya sisteminde (Pichia pastoris) transkripsiyonu
Transcription of COL1A1 gene fragmans in yeast system (Pichia pastoris) for production of recombinant gelatin used as food additive
Yazar: AYTEN GÜLLÜCE
Danışman: DOÇ. DR. ZÜLAL KESMEN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Gıda endüstrisi = Food industry ; Gıda katkı maddeleri = Food additives ; Jelatin = Gelatin ; Kollajen = Collagen

Özet:
Gıda sanayinde çok amaçlı bir gıda katkı maddesi olarak kullanılan jelatinin hammaddesi, sığır ve domuz gibi hayvanların derisi ve kemiklerini içine alan kesimhane yan ürünleridir. Jelatin elde edilirken kullanılan hayvansal kaynakların inanç ve kültürel değerlere uygun olmama ihtimali (örn; domuz deri ve/veya kemikleri ya da usulüne uygunolarak kesilmemiş herhangi bir hayvana ait kesimhane yan ürünleri) veya helal olmayan hayvansal kaynaklardan elde edilme ihtimali tüketicilerde büyük endişeye sebep olmaktadır. Diğer taraftan hayvansal kaynaklardan elde edilen jelatin, hayvanlarda görülen Spongiform Encephalopathy'lere (TSEs, Transmissible spongiform encephalopathies) sebep olan etkenlerin kontaminasyonuna yol açabilmesi gibi sağlık açısından da risk oluşturmaktadır. Dolaysıyla gerek sağlık ve gerekse inanç hassasiyetlerinin korunmasına katkı sağlamak amacıyla hayvansal kaynaklar dışında jelatin elde edilebilecek farklı kaynakların geliştirilmesi gereği ortadadır. Son yıllarda daha çok medikal uygulamalarda kullanılmak üzere, hayvansal kaynaklı jelatine alternatif mikrobiyal kollajen ve jelatin üretimi öne çıkmıştır. Ancak bu alanda yapılan çalışmalar arasında gıda endüstrisinde kullanılmak üzere jelatin veya kollajen üretmeye yönelik bir araştırmaya rastlanmamıştır. 

Gıda sanayinde kaynağı itibari ile güvenilir jelatine duyulan ihtiyaç göz önünde bulundurularak yapılan bu araştırma ile hem sağlık açısından risk taşımayan hem de tüketicilerin inanç değerleri ile çelişmeyen, mikrobiyal jelatin üretim yönteminin sanayi ve tüketicilerin kullanımına sunulması amaçlanmıştır. Araştırma kapsamında sığır (Bos taurus) kollajen, tip I, alfa 1 (COL1A1), mRNA dizisi üzerinde belirlenmiş farklı uzunluktaki 2 farklı gen fragmanı Pichia pastoris (P. pastoris) GS115 ve KM71 maya hücrelerine elektroporasyon uygulaması ile transfer edilmiştir. Transformantlar tarafından hedef gen bölgelerininin transkripsiyonu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile kontrol edilmiş ve hedef gen fragmanları ile örtüşen yaklaşık 800 ve 100 bç'lik PCR ürünleri agaroz jelde görüntülenmiştir. Aynı zamanda PCR ürünlerinin doğruluğu dizi analizi ile de doğrulanmıştır. Analiz sonuçları gen bankası veri tabanında tarandığında Bos taurus collagen, type I, alpha 1 (COL1A1), mRNA dizisi ile eşleştiği görülmüştür. 
Sonuç olarak P.pastoris hücrelerinde kollajen gen fragmentlerinin başarı ile transkript edilebildiği ancak gıda sanayi için uygun fonksiyonel rekombinant jelatin eldesi için bu alanda daha çok çalışma yapılması gerektiği görülmüştür.
Anahtar kelimeler: Kollajen, Jelatin, Rekombinant jelatin, P. pastoris, Gıda katkı maddesi

Abstract:
The gelatin that used as a multipurpose food additive in the food industry, is commonly derived from pig skin, bovine hides and pig and cattle bones. Gelatin is an hidrolized protein that is obtained from acid or alkalin extracted collagen from animal tissue. Consumers and manufacturers have some hesitations about animal derivated gelatin usage in food and pharmacology. Because in Islamic beliefs consuming of products derived from non-halal sources (such as porcine gelatin or slaughter in non-helal conditions)  is certainly forbidden. On the other hand gelatin derived from animal tissues is a potantional source of transported Spongiform Encephalopathy (TSEs Transmissible Spongiform Encephalopathies) contaminats, so that it can cause health risks. In order to contribute to the protection of health and religion precision alternative gelatin sources must be developed instead of animal derived gelatin. In recent years, especially for medical aplications, microbial gelatin or collagen production receive attention as an alternative to animal-derived collagen. Up to the our knowledge there is no study on the production of recombinant gelatin for food purposes.
This research was conducted by taking into the consideration that reliable gelatin sources are needed for the food industry. Thus a microbial gelatin having no risk in terms of both health and belief considerations, a procedure for biotechnological production of recombinant gelatin has been developed for the concious consumers and manufacturers. In this study, two different fragment of cattle (Bos taurus) collagen, type I, alpha 1 (COL1A1), mRNA sequence were transfered to Pichia pastoris (P. pastoris) GS115 and KM71 yeast strains cells by electroporation, and transcription of these gene fragments checked by polymerase chain reactions (PCR). About 800 and 1000 bp PCR products were obtained as targeted gene fragments and accuracy of  PCR products accuracy was checked by sequence analysis. The resulting sequences were screened on gene bank data base, and it was seen that sequence analysis results matches with Bos taurus collagen, type I, alpha 1 (COL1A1) mRNA sequence.
As a result, it was seen that collagen gene fragments can be transcripted in P. pastoris cells successfully, but there is more research need to achieve optimal functional recombinant gelatin for the food industry.
Keywords: Collagen, Gelatin, Rekombinant gelatin, P. pastoris, Food additive