Degrade adli örnekler için mitokondriyal dna amplifikasyon ve dizileme stratejisi geliştirme
Developing mitochondrial dna amplification and sequencing strategy for degraded forensic samples
Yazar: PETER MATOVU
Danışman: PROF. DR. AYŞE SERİN
Çukurova Üniversitesi / Bağımlılık ve Adli Bilimler Enstitüsü / Adli Bilimler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine

Özet:
İnsan mitokondriyal DNA'sının (mtDNA) analizi, stabilitesi ve hücre başına çok sayıda genom kopyası içermesi nedeniyle yüksek oranda bozunmuş iskelet kalıntılarının adli kimliğini test etmek için güçlü bir araç olmuştur. İleri düzeyde bozunmuş numuneler, boyut olarak ciddi şekilde kısıtlanmış DNA molekülü içerdiğinden, bu ürünlerin mtDNA dizi analizinde başarılı sonuçlar elde etmek için çeşitli alternatifler geliştirilmiştir. Yüksek oranda bozunmuş iskelet kalıntılarında mtDNA kontrol bölgesi dizi analizini kolaylaştırmak ve mtDNA profili elde edebilmek için midi ve mini primerlerle multipleks PCR setleri tasarlanmıştır.
Bu çalışmada ileri derecede bozunmuş iskelet kalıntılarında midi ve mini multipleks PCR setlerinin etkinliğini araştırmak amacıyla 22-93 yaşları arasında, 3-68 yıllık toplam 14 kişiye ait diş veya femur kemiğine ait DNA örnekleri kullanılmıştır. Kısmen modifiye silika temelli DNA ekstraksiyon yöntemi ile 1 gr kemik tozundan izole edilen DNA örneklerinde mtDNA profili elde edebilmek için çeşitli uzunluklarda amplikon üretilebilecek iki ayrı multipleks PCR seti hazırlanmıştır. Multipleks PCR için seçilen primer setlerinden biri mtDNA'nın ortalama 250 bp uzunluğunda fragmanların amplifikasyonuna izin veren midi primer seti olup, 2 multipleks reaksiyon; diğeri ise daha ileri seviyede degrade örneklerde kullanılabilecek olan 100-150 bp uzunlukta fragmanların amplifikasyonuna izin veren mini primer seti olup, 3 multipleks reaksiyondan oluşmaktadır. Mini primer seti ile 68 yıla kadar iskelet kalıntılarında başarılı sonuçlar alınırken, midipleks set ile 45 yıla kadar olan iskelet kalıntılarında başarılı sonuçlar alınmıştır. 
Bu primer setleri başta iskelet kalıntıları olmak üzere ileri derecede bozunmuş DNA örneklerinde kullanılabilecektir. Monopleks ve multipleks setlerde ortalama aynı miktar DNA kullanıldığından, multipleks setler ile analiz için kullanılan genomik DNA miktarı azalmış ve örnek kaybı en aza indirilmiştir. Ayrıca monopleks analizler için kullanılan malzeme ve iş gücü karşılaştırıldığında, multipleks setlerle hem iş gücü hem de maliyetin önemli ölçüde azaltılması mümkün olacaktır.

Abstract:
Analysis of human mitochondrial DNA (mtDNA) is a powerful tool for testing the forensic identity of highly degraded skeletal remains due to its stability and large number of genome copies per cell. Since highly degraded samples contain DNA molecules that are severely restricted in size, several alternatives have been developed to achieve successful results in mtDNA sequencing of these products. Multiplex PCR sets with midi and mini primers were designed to facilitate the sequencing of mtDNA control region in highly degraded skeletal remains and to obtain mtDNA profile.
DNA samples from teeth or femur bones buried between 3 and 68 years, of 14 individuals aged between 22-95 years, were used to investigate the effectiveness of midi and mini multiplex PCR sets in severely degraded skeletal remains in this study. To obtain mtDNA profile in DNA samples isolated from 1 g bone powder by partially modified silica-based DNA extraction method, two separate multiplex PCR sets were prepared to produce amplicons of various lengths. One of the multiplex sets is the midiplex set, which allows the amplification of fragments of mtDNA with an average length of 250 bp, and the other is the miniplex set, which allows the amplification of fragments of 100-150 bp lengths, which can be used in further degraded samples. Midiplex set included 2 reactions, miniplex set included 3 reactions.  While successful results were obtained for skeletal remains up to 68 years with the mini primer set, successful results were obtained for skeletal remains up to 45 years with the midiplex set.
These primer sets can be used in highly degraded DNA samples, especially skeletal remains, in the forensic DNA laboratory. Since the same amount of DNA is used on average in monoplex and multiplex sets, the amount of genomic DNA used for analysis with multiplex sets is reduced and sample loss is minimized. It has also been possible to significantly reduce both labor and cost with multiplex sets when compared to the materials and labor used for monoplex analysis.