Canine parvovirus ve canine coronavirus etkenlerin eş zamanlı teşhisine yönelik kit geliştirilmesi
Development of a diagnostic kit for the simultaneous diagnosis of canine  parvovirus and canine coronavirus agents
Yazar: ÇAĞRI AVCİ
Danışman: PROF. DR. SİBEL YAVRU
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Köpek Parvovirusu (CPV) ve Köpek Coronavirusu (CCoV), evcil ve yabani köpeklerde sıklıkla 
görülen enfeksiyöz hastalıklardandır. Bu iki virus, çoğu vakada birlikte de teşhis edilebilmektedir. Bu 
virusların teşhisinde IFAT, PCR, RT-PCR veya ELISA gibi teknikler kullanılmaktadır.  
Bu çalışmanın amacı, CPV ve CCoV etkenlerini eş zamanlı teşhis edebilecek, immunfloresans 
temelli ve 96 gözlü mikropleytte uygulanacak bir teşhis metodu geliştirmektir.  
Çalışmada kullanılmak üzere 380 adet köpek dışkı numunesi toplandı. Nükleik asit ekstraksiyonları 
yapılan örnekler RT-PCR tekniği ile hem CPV hem de CCoV yönünden test edildi ve pozitiflik durumlarına 
göre sınıflandırıldı. Bu veri, geliştirilen test tekniğinin (MIFADA) validasyonu, sensitivite ve spesifitesinin 
hesaplanmasında kullanıldı.  
Solid faz olarak 96 gözlü mikropleyt kullanıldı. Her gözün sol tarafına karbonat bikarbonat tamponu 
içerisinde 1µl Anti-CPV (H69D), sağ tarafına ise 1 µl Anti-CCoV (M87073) primer monoklonal antikoru 
damlatıldı ve 16 saat inkübe edildikten sonra bloklama işlemi yapılarak pleyt hazır hale getirildi. Antikor 
seçimleri bir dizi ayrıntılı in-silico analizden elde edilen verilere göre yapıldı. Kontrol örneklerinin eklenmesi 
ve inkübasyonunu takip eden süreçte CPV ve CCoV için FITC etiketli konjugat kullanılarak kaplama 
bölgeleri demonstre edildi ve floresans mikroskobunda fotograflandı. Test optimizasyon çalışmalarında 
doğruluğu artırmak ve hassas ölçüm yapabilmek için GPU destekli yazılımsal görüntü iyileştirmeleri 
yapılacak ve testte kullanılması gereken yakalayıcı antikor ve konjugat titreleri hesaplandı. Optimize edilen 
teknik, RT-PCR ile teşhis edilen örnekler ile uygulandı ve sonuçlar karşılaştırıldı. Bu karşılaştırmaya göre 
testin sensitivitesinin RT-PCR'a kıyasla %94, spesifitesinin ise %100 olduğu görüldü.  
Bu bilgiler ışığında geliştirilen test kitinin, gelecek çalışmalarla test üretim tekniğinin iyileştirilmesi 
ve farklı antijenleri/antikorları teşhis edebilme yeteneğinin araştırılması ile hızlı, kolay uygulanan, ekonomik, 
güvenilir ve yüksek doğrulukla sonuç verebilen bir test kiti olarak kullanılmaya aday olduğu ortaya konuldu.

Abstract:
Canine Parvovirus (CPV) and Canine Coronaviruses (CCoV) are infectious diseases frequently 
observed in domestic and wild dogs. These viruses can often be diagnosed together in most cases. The 
techniques such as IFAT, PCR, RT-PCR, or ELISA are employed for the diagnosis of these viruses. 
The aim of this study is to develop a diagnostic method based on immunofluorescence, applicable to 
a 96-well microplate, capable of simultaneously diagnosing CPV and CCoV pathogens. A total of 380 canine 
fecal samples were collected for use in the study. The extracted nucleic acids from these samples were tested 
for both CPV and CCoV using the RT-PCR technique, and the results were categorized based on positivity. 
This data was utilized for the validation of the developed test technique (MIFADA) and for calculating 
sensitivity and specificity. 
A 96-well microplate was used as the solid phase. On the left side of each well, 1 µl of Anti-CPV 
(H69D) in carbonate-bicarbonate buffer was added, and on the right side, 1 µl of Anti-CCoV (M87073) 
primary monoclonal antibody was dropped. After a 16-hour incubation, the plate was blocked to make it 
ready for use. The antibody selections were based on detailed in-silico analyses. Control samples were added, 
and following incubation, coating areas for CPV and CCoV were demonstrated using FITC-labeled conjugate 
and photographed under a fluorescence microscope. 
In the optimization process, GPU-supported software image enhancements were implemented to 
increase accuracy and enable precise measurements. The capture antibodies and conjugate titers required for 
the test were calculated. The optimized technique was applied to samples which diagnosed by RT-PCR, and 
the results were compared. According to this comparison, the test demonstrated a sensitivity of 94% 
compared to RT-PCR and a specificity of 100%. 
As a result of this information, it was revealed that the developed test kit has the potential to be used 
as a rapid, easily applicable, economical, reliable, and highly accurate diagnostic method. Further research is 
recommended to improve the test production technique and explore the ability to diagnose different 
antigens/antibodies in future studies.