Kan kültürlerinden izole edilen Escherichia coli suşlarında integron gen kasetlerinin moleküler karakterizasyonu
Molecular characterization of integron gene cassettes in Escherichia coli strains isolated from blood cultures
Yazar: AHU REİS
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN KILIÇ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Bakteriyoloji Bilim dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases

Özet:
Antibiyotiklerin insan sağlığında çok önemli rol oynadıkları bilinmektedir. Fakat yanlış ve aşırı kullanılmaları sonucu dirençli bakterilerin artışına ve direnç genlerinin hızlı bir şekilde yayılması ile beraber pek çok bakterinin çoklu antibiyotik dirençli olmasına yol açmaktadır. Kazanılan bu direnç plazmid, transpozon ve integron gibi çeşitli hareketli genetik elemanlarla bakteriler arasında yayılmaktadır. İntegronlar birçok antibiyotik direnç determinantını kodlayan, belirli gen kasetlerini taşıma veya entegre olma yeteneğine sahip genetik elemanlardır. 
Bu çalışmada Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi Farabi Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Eğitim ve Hizmet Laboratuvarı'na Ocak - Aralık 2014 tarihleri arasında gönderilen kan kültüründen izole edilen 112 E. coli izolatında integron gen kaset varlığı ve içerdiği direnç paternlerinin belirlenmesi, ayrıca integronların aktarılmalarında rol oynayan konjugatif plazmidlerin varlığının belirlenmesi ve bu plazmidlerin incompatibility (Inc) gruplarının replikon tiplendirme yöntemiyle gruplandırılması amaçlanmıştır.
Bu amaçla 112 E. coli izolatında sınıf 1 integrona ait integraz gen bölgesinin belirlenmesi için intI1 genine özgü primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) işlemi gerçekleştirildi. Buna göre 112 E. coli izolatının 51'i (%45.5) intI1 pozitif olarak saptandı. Sınıf 2 integrona ait integraz gen bölgesinin belirlenmesi için intI2 genine özgü primerler kullanılarak yapılan PZR işlemi sonucu 112 E. coli izolatının 7'si (%6.3) intI2 pozitif olarak belirlendi. Sınıf 1 ve sınıf 2 integron varlığının belirlenmesi amacıyla yapılan PZR reaksiyonu sonucu 112 izolatın 38'inde (%33.9) sınıf 1 integron varlığı belirlenirken 13 izolatın boş integron içerdiği belirlendi. Sınıf 2 integron için 112 izolatın 7'sinde (%6.3) sınıf 2 integron varlığı belirlendi.
Sınıf 1 integron içeren 38 izolata yapılan sekans analizi sonucu trimetoprim ve streptomisin-spektinomisin direncinden sorumlu dfrA7, dfr17-aadA5, dfrV, dfrA1-aadA1 ve dfrA12-aadA2 olarak adlandırılan 5 tip gen kaseti belirlendi. Sınıf 2 integron amplifikasyonu sonucunda pozitif bulunan 7 izolatın yapılan sekans analizi sonucu dfrA1-sat2-aadA1 ve dfrA1-sat2-aadA30 olarak belirtilen 2 tip gen kaseti bulundu. 14 izolatın sekans analiz sonuç verileri elde edilemedi.
Konjugasyon deneyleri sıvıda çiftleşme yöntemiyle gerçekleştirildi. Sınıf 1 ve sınıf 2 integron içeren 45 izolatın donor olarak kullanıldığı konjugasyon deneylerinde 35 E. coli J53-2 transkonjugantı elde edildi. Konjugasyon etkinliklerinin 10-6 ve 10-10 arasında oldukları belirlendi.
Otuzbeş transkonjuganttaki plazmitlerin Inc gruplarının belirlenmesi amacıyla yapılan PZR reaksiyon sonucuna göre 6 plazmidin (%17) IncN, 1 plazmidin de (%3) IncQ pozitif olduğu belirlendi. Hiçbir transkonjugantta IncP ve IncW gruplarına ait plazmide rastlanmadı.

Abstract:
Antibiotics are known to play a very important role in human health. However, incorrect and excessive use leads to multiple antibiotic resistance of many bacteria and the rapid spread of resistance genes.
These resistance genes are spreading among bacterial species with various mobile genetic elements such as plasmids, transposons and integrons. Integrons are known genetic elements that encode many antibiotic resistance determinants and have the ability to carry or integrate specific gene cassettes.
In this study, identification of the presence of integron gene cassette and its resistance patterns in 112 E. coli isolates isolated from blood cultures sent to Farabi Hospital Medical Microbiology Training and Service Laboratory of Karadeniz Technical University between January and December 2014, and determination of the resistance patterns of the conjugative plasmids involved in the transfer of integrons, and the incompatibility (Inc) groups of these plasmids were grouped by replicon typing method.
Polymerase chain reaction (PCR) was performed by using intI1 gene specific primers to identify the integron gene region of the class 1 integron in the 112 E. coli isolates. Based on PCR results, in 51 (45.5%) of the 112 E. coli isolates were detected positive for intI1. For the identification of the integrase gene region of the class 2 integron, in 7 of the 112 E. coli isolates (6.3%) were identified as intI2 positive using intI2 gene specific primers. It was determined that 13 isolates contained empty integrons while class 1 integron presence was detected in 38 (33.9%) of the 112 isolates resulting from the PCR reaction to determine the presence of class 1 and class 2 integron.  In 7 (6.3%) of 112 isolates class 2 integrons were present.
Sequence analysis of 38 isolates with class 1 integron revealed 5 types of gene cassettes called dfrA7, dfr17-aadA5, dfrV, dfrA1-aadA1 and dfrA12-aadA2, which are responsible for resistance to trimethoprim and streptomycin-spectinomycin resistance. Sequence analysis of 7 isolates found to be positive for class 2 integron amplification revealed two types of gene cassettes identified as dfrA1-sat2-aadA1 and dfrA1-sat2-aadA30. Sequence analysis results of 14 isolates could not be obtained.
Conjugation experiment was performed based on the principle of broth mating method. Of the 45 E. coli having class 1 and class 2 integron tested, 35 (78%) of them were found to be conjugated to the recipient cell (E. coli J53-2 met pro RifR) and conjugation efficiency was ranged from 10-6 to 10-10.
PCR amplification for the identification of Inc groups in the 35 transconjugant containing conjugated plasmid resulted in IncN in 6 (17%) isolates, IncQ in 1 (3%) isolates. And no isolates were found in IncP and IncW.