Kâğıt tabanlı elektrotlar kullanılarak empedans spektroskopik analiz yöntemi ile eksozom tayini
Determination of exosome by empedance spectroscopic analysis method using paper-based electrodes
Yazar: SEVDA AKAY SAZAKLIOĞLU
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN ÇELİKKAN
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Eksozomlar = Exosomes ; Elektrokimyasal empedans spektroskopisi = Electrochemical impedance spectroscopy ; Kalibrasyon = Calibration

Özet:
Günümüzde tümörün erken bir aşamada saptanması, kanser kaynaklı ölüm oranını düşürmektedir. Eksozomlar, kansere bağlı hastalıkların erken teşhisi ve prognoz tahmininde önemli rol oynayan potansiyel biyobelirteçlerdir. Bu tez çalışmasında, eksozomların vücut sıvılarındaki miktarını tespit etmek amacıyla elektrokimyasal impedans spektroskopisi (EIS) yöntemi kullanılarak üç farklı biyosensör geliştirilmiştir. Elektrot malzemeleri disk, ekran baskılı ve kağıt tabanlı olmak üzere üç farklı elektrot malzemesiyle geliştirilmiştir. CD63 ve CD9 eksozom yüzey antijenleri hedeflenen kanser biyobelirteçleridir. Biyosensör hazırlanmasında, ara yüzey olarak merkaptoundekanoik asit (MUA) kullanılmıştır. Anti-CD63 ve anti-CD9 ise geliştirilen sensörlerin biyotanıma elementleridir. Elektrot yüzeyinde yapılan modifikasyonların teşhisinde elektrokimyasal teknikler (Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopi, Dönüşümlü Voltametri) ve morfolojik teknikler (Taramalı Elektron Mikroskobu) kullanılmıştır. Geliştirilen yöntemin gözlenebilme sınırı, tayin sınırı, seçiciliği, tekrarlanabilirliği ve raf ömrü izlenmiştir. Ek olarak, biyosensörlerin klinik başarısını izlemek için yapay idrar, hücre kültürleri ve idrar örneklerinde eksozom tayini gerçekleştirilmiştir. ELISA testi ile kıyaslama yapılarak, geliştirilen yöntemin doğruluğu belirlenmiştir. Tezin ilk kısmında, eksozom tayini sonucunda gözlenen sinyaller ile dört farklı kalibrasyon eğrisi oluşturulmuş ve bu eğrilerin kalibrasyon katsayısı ve LOD değerlerine yönelik kıyaslamalar yapılmıştır. Bu çalışmada kübik polinom modeli ile 3,9×1011 partikül µL-1 olarak elde edilen LOD, sensörün özellikle hücre kültürü gibi numunelerde hassas ve güvenilir olarak kullanılabileceğini göstermiştir.  İkinci olarak ekran baskılı altın elektrotlar (G-SPE) ile eksozom tayini için yöntem geliştirilmiş ve LOD değeri 2,0×103 partikül mL-1 olarak bulunmuştur. Aynı elektrot ile referans yapay idrar örneğinde eksozom geri kazanımı % 93,67 olarak elde edilmiştir. Tezin üçüncü kısmında ise nitroselüloz membran kullanılarak eksozom standartları için kâğıt tabanlı sensör tasarlanmıştır. Bu sensör ile 5 μL örnek hacmi kullanılarak eksozom tayininde LOD değeri 5,07×102 partikül mL-1 olarak bulunmuştur.

Abstract:
Today, detecting the tumor at an early stage reduces the cancer-related death rate. Exosomes are potential biomarkers that play an important role in the early diagnosis and prognosis prediction of cancer-related diseases. In this thesis, three different biosensors were developed using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) method to detect the amount of exosomes in body fluids. Electrode materials have been developed with three different electrode materials: disc, screen-printed and paper-based. CD63 and CD9 exosome surface antigens are targeted cancer biomarkers. In the preparation of the biosensor, mercaptodecanoic acid (MUA) was used as the interface. Anti-CD63 and anti-CD9 are the biorecognition elements of the developed sensors. Electrochemical techniques (Electrochemical Impedance Spectroscopy, Cyclic Voltammetry) and morphological techniques (Scanning Electron Microscopy) were used to diagnose the modifications made on the electrode surface. Limit of detection, limit of quantification, selectivity, repeatability and shelf life of the developed method were monitored. In addition, exosome determination was performed in artificial urine, cell cultures and urine samples to monitor the clinical success of the biosensors. The accuracy of the developed method was determined by comparing with the ELISA test. In the first part of the thesis, four different calibration curves were created with the signals observed as a result of the exosome determination and comparisons were made for the calibration coefficient and LOD values of these curves. In this study, the LOD obtained as 3.9×1011 particles µL-1 with the cubic polynomial model showed that the sensor can be used sensitively and reliably, especially in samples such as cell culture. Secondly, a method was developed for the detection of exosomes with screen-printed gold electrodes (G-SPE) and the LOD value was found to be 2.0×103 particles mL-1. With the same electrode, exosome recovery was obtained as 93.67% in the reference artificial urine sample. In the third part of the thesis, paper-based sensor was designed for exosome standards using nitrocellulose membrane. The LOD value was found to be 5.07×102 particles mL-1 in exosome determination using 5 μL sample volume with this sensor.