Kalvaryal defektlerin onarımında jelatin/hidroksiapatit esaslı kriyojel doku iskelelerinin etkisi
Effect of gelatin/hydroxyapatite based cryogel scaffolds for calvarial defect repair
Yazar: İLYAS İNCİ
Danışman: DOÇ. DR. İBRAHİM VARGEL ; PROF. DR. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Hidroksiapatitler = Hydroxyapatites ; Jelatin = Gelatin

Özet:
Sunulan tez çalışmasının amacı gözenekli kriyojel doku iskelelerinin hazırlanması ve hazırlanan doku iskelelerinin büyüme faktörleri (BMP-2 ve TGF beta-1) ile birlikte veya büyüme faktörleri olmaksızın kemik doku mühendisliğinde uygulanabilirliklerinin araştırılmasıdır.Çalışmanın ilk bölümünde kriyojel doku iskeleleri hazırlanmış ve karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Bunun için hidroksiapatit karakterizasyonu için XRD, hazırlanan kriyojellerde çapraz bağlayıcı olarak kullanılan okside dekstranın karakterizasyonu için 1H-NMR, gözenek büyüklüğünü ve gözenek dağılımını ölçmek için civalı porozimetre ve SEM çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca kriyojel örneklerinin su alarak şişme davranışları, mekanik özellikleri ve sıvı ortamda bozunma hızları incelenmiştir. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucunda kriyojellerin doku mühendisliği için uygun gözenek yapısı ve dağılımına sahip olduğu, yüksek miktarlarda su alarak şişebildikleri ve mekanik özelliklerinin birçok doku mühendisliği uygulamaları için yeterli olduğu ortaya çıkmıştır. Farklı oranlarda hidroksiapatit ve okside dekstran kullanılarak hazırlanan kriyojel örneklerden en uygun özelliklere sahip olduğuna karar verilen doku iskelesi örnekleri çalışmanın sonraki basamaklarında kullanılmıştır.Çalışmanın ikinci basamağında hazırlanan kriyojel doku iskeleleri hücrelerle etkileştirilerek in vitro çalışmalar yapılmıştır. Biyouyumluluk çalışmaları için MTT, alkalen fosfataz testi yapılmıştır. Buna ek olarak SEM ve konfokal mikroskop kullanılarak hücre adhezyon çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca glutaraldehit buharı ile çapraz bağlanan jelatin filmlere yüklenen BMP-2 ve TGF beta 1 büyüme faktörlerinin in vitro salım çalışmaları yapılmıştır. In vitro çalışmalar sonucu kriyojel örneklerin oldukça biyouyumlu olduğu ve hücreler için toksik etkilerinin olmadığı ortaya çıkmıştır.Çalışmanın son basamağı olan in vivo çalışmalardaWistar Albino sıçanlarda kritik büyüklükte kalvaryal defekt oluşturularak kriyojel doku iskeleleri ve büyüme faktörleri defekte uygulanmıştır. Çalışma 4 ay boyunca yürütülmüştür. Çalışmada 2.ay ve 4.aylarda örnekler alınarak bilgisayarlı mikro tomografi (µ-CT) ve histolojik yöntemler ile kemik doku oluşumu incelenmiştir. Erken dönem gen ifadelenmesi çalışmaları için 2.hafta ve 4.haftalarda örnekler alınmıştır. Kemik oluşumu sırasında eksprese edildikleri bilinen alkalen fosfataz, kollajen I ve osteokalsin genlerinin ifadelenmeleri incelenmiştir. Histoloji ve µ-CT sonuçları doku mühendisliği yöntemlerinin uygulandığı gruplarda negatif kontrol grubuna göre (boş defekt) belirgin kemik doku oluşumları olduğunu göstermiştir. Gen ifadelenmesi çalışmalarında özellikle BMP-2'nin kemik oluşum genlerinin ifadelenmelerini belirgin şekilde arttırdığı fakat TGF beta-1'in ters etkisinin olduğu ortaya çıkmıştır.Anahtar Kelimeler: Jelatin, hidroksiapatit, kriyojel, kemik doku mühendisliği, kemik morfogenetik proteini-2, dönüştürücü büyüme faktörü beta-1

Abstract:
The aim of this thesis is preparation of porous cryogel scaffolds and investigation of applicability of prepared tissue scaffolds with or without tissue growth factors (BMP-2 and TGF beta-1) in bone tissue engineering.In the first part of the study cryogel tissue scaffolds were prepared and characterization studies were carried out. For this purpose, XRD characterization of hydroxyapatite was done via XRD, characterization of oxidized dextran which was used as a cross-linker was performed via 1H-NMR. Pore size and pore size distribution was carried out by using mercury intrusion porosimetry and SEM. In addition swelling behaviors, mechanical properties and degradation rates in liquid media of cryogel samples were investigated. As a result of the characterization studies, pore structure and pore size distribution, mechanical properties, swelling properties with high quantities of water and degradation rates of cryogels appeared to be available for many tissue engineering applications. Samples were prepared with different ratios of hydroxyapatite and oxidized dextran and then the most appropriate scaffold ratio was chosen according to characterization results for using in next parts of the study.In the second part of the study, cryogel samples were interacted with cells and in vitro studies were carried out. MTT and alkaline phosphatase tests were done for biocompatibility studies. In addition, cell adhesion studies were carried out by using confocal microscopy and SEM. BMP-2 and TGF-beta 1 were loaded into cross-linked gelatin films which were prepared by using glutaraldehyde vapor and then in vitro release of growth factors were carried out. As a result of in vitro studies, it was found that cryogels are highly biocompatible and have no toxic effects to the cells.In the last part of the study, in vivo studies were carried out by using Wistar Albino rats. Critical-sized calvarial defect was created and then cryogel tissue scaffolds and growth factors were applied to defect area. In vivo studies were carried out for 4 months. Tissue samples were investigated for bone tissue formation by using micro computerized tomography (?-CT) and histological methods on 2nd month and 4th month. Tissue samples were taken on 2th week and 4th week for early phase gene expression studies. Expressions of alkaline phosphatase, collagen type I and osteocalcin genes were investigated and it is well known these genes are expressed during the formation of bone. Histology and ?-CT results showed there were significant bone tissue formation in tissue engineering methods applied groups compared with negative control groups (empty defect). In gene expression studies especially BMP-2 significantly increased expressions of bone formation genes, but the effect of TGF beta-1 was opposite.Key Words: gelatin, hydroxyapatite, cryogel, bone tissue engineering, bone morphogenetic protein-2, transforming growth factor beta-1