Pyrococcus furiosus kitinazının rekombinant üretimi ve analizi
Production and analysis of recombinant chitinase from Pyrococcus furiosus
Yazar: TUĞBA AKSOY
Danışman: DOÇ. DR. BİLGE HİLAL ÇADIRCI
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kitinazlar (EC 3.2.1.14) kitindeki N-asetil glukozaminler arasında bulunan β-1,4 glikozit bağını hidrolizleyebilen enzimlerdir. Arke domaini içinde, genetik ve moleküler bilgi açısından şimdiye kadar sadece 10 öriarkeal kitinaz bulunmuştur. Bunların çoğu bilinen homoloji genom işleme ile belirlenmiştir. Sulfolobus tokodaii, Halobacterium salinarum, Thermococcus chitinophagus, T. kodakaraensis KOD1 ve Pyrococcus furiosus'un rekombinant teknikler de dahil olmak üzere kitinolitik aktiviteleri üzerine çalışılmış ancak gerçek kitin parçalayabilme yetenekleri henüz ortaya çıkarılamamıştır. P. furiosus'un genom veritabanında kitinolitik özellik gösteren iki ORF homoloğu bulunmuştur. P. furiosus'un iki bitişik ORF'sinde arada bir adet insersiyon olan, iki kitin bağlama domaini ve iki katalitik domain bulunmuştur. Konu ile ilgili olan en güncel çalışmada rekombinant enzimin kristal kitine karşı aktivitesi incelenmiştir. Enzimin aktivitesi kitin substratının serbest indirgen ucunun ölçümüyle belirlenmiştir ve 1.6 μmol/mg olarak hesaplanmıştır. Çalışmamızda P. furiosus arkesine ait olan kitinaz enziminin aktivitesini arttırmak ve moleküler özelliklerinin belirlenmesi amacıyla katalitik aktivitesi yüksek olduğu literatürde bildirilen kitin bağlama bölgesi ve ilgili
katalitik domain, pET 28a(+) ifade vektörüne aktarıldıktan sonra Escherichia coli rosetta (DE3) bakterisinde ifadelendirilmiştir. P. furiosus kitinaz ekspresyonu, 0.2 M IPTG varlığında gerçekleşmiş ve protein moleküler ağırlığı yaklaşık 55 kDa olarak belirlenmiştir.

Abstract:
Chitinase (EC 3.2.1.14) the enzymes which are capable of hydrolyzing the β-1,4 bonds
between N-acetyl glucosamines in chitins. In archaea domain, in terms of genetic and
molecular information it has been found so far only 10 euryarcheal chitinase. Most of
them have been identified similarities between known genes by the genome mining.
Investigations are mostly focused on Sulfolobus tokodaii, Halobacterium salinarum,
Thermococcus chitinophagus, T. kodakaraensis KOD1 and Pyrococcus furiosus
chitinases including recombinant techniques, but the ability to break down the actual
chitins has not yet been revealed. Two homologous ORF which showed chitinolytic
activity was found in P. furiosus genome database. P. furiosus two adjacent ORFs in
combination with one insertion, were binding domain of the two continents and two
catalytic domains. In the latest study, the recombinant enzyme activity against the
crystal chitins were examined. The enzyme activity was determined by measuring the
free reducing end of the chitin substrate and calculated as 1.6 μmol/mg. In our study, in
order to increase the activity of the P. furiosus chitinase and determine the properties,
the claimed molecular chitin binding region and the corresponding catalytic domain
according to the literature, were transferred into pET 28b (+) expression vector and
expressed in Escherichia coli Rosetta (DE3). P. furiosus chitinase was expressed in the
presence of 0.2 M IPTG and protein molecular weight was determined approximately
55 kDa.