Moleküler dinamik simülasyonları kullanılarak lösin taşıyıcı proteinlerin ve dinein motor proteinlerin termodinamik özelliklerinin incelenmesi
Investigation of thermodynamic properties of leucine transporters and dynein motor proteins using molecular dynamics simulations
Yazar: SEMA ZEYNEP YILMAZ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MERT GÜR
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Moleküler biyoloji = Molecular biology

Özet:
Hücrelerin düzgün bir şekilde çalışabilmesi ve canlılığın devamı için proteinler temel unsurlardır. Taşıyıcı ve motor proteinler hücrede çok çeşitli görevleri yerine getirerek hücrelerin organizasyonu ve düzenlenmesinde önemli rol alırlar. Biyomoleküler makina olarak çalışan bu proteinler fonksiyonlarını gerçekleştirmek için termodinamik bir çevrim üzerinde çalışır ve çevrim boyunca yapısal bir geçişi tamamlarlar. Çevrim boyunca proteinin termodinamik özellikleri değişmektedir ve proteinin yapı ve fonksiyonunu kavramak için bu değişimin anlaşılması çok önemlidir. Bu tez çalışmasında, iki protein için çevrim boyunca değişen farklı termodinamik özellikler moleküler dinamik (MD) simülasyonları ve istatistiksel termodinamik yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. İlk olarak MD simülasyonları ve istatistiksel termodinamik yöntemleri kullanılarak lösin taşıyıcı proteinin (LeuT) termodinamik çevrimi boyunca serbest enerji yüzeyi oluşturulmuş ve bu proteinin çevrim boyunca çift katmanlı lipit tabaka üzerine yaptığı basınç profili elde edilmiştir. İkinci olarak dinein motor proteininin mikrotübüle (MT) bağlanma ve kopması MD simülasyonları ile modellenmiş ve bu bağlanma kopma çevrimi boyunca proteinin serbest enerji profili Jarzynski eşitliği kullanılarak hesaplanmıştır.
LeuT, hücre zarına gömülü halde bulunur ve lösin, alanin gibi küçük amino asitleri hücre zarı boyunca taşımada görevlidir. Bu protein sodyum simport taşıyıcıları (neurotransmitter: sodium symporter, NSS) ailesine aittir. NSS taşıyıcı proteinler ikincil taşıyıcı proteinlerdir ve bu proteinler hücre zarı boyunca iyonların konsantrasyon gradyanından gelen enerjiyi kullanarak substratların taşınmasını sağlarlar. LeuT dimerik bir yapıya sahiptir ve yapıdaki her bir monomer 12 transmembran (TM) sarmaldan oluşur. Bu sarmallar iki ters 5-sarmal tekrarı (TM1-5 TM6-10) halinde düzenlenmişlerdir ve TM1-TM6 ile TM3-TM8 sarmallarının orta kısımları substrat bağlanma bölgesi olarak bulunur. LeuT, lösin veya alanin amino asitlerine ek olarak iki adet sodyum bağlanma bölgesine (Na1 ve Na2) sahiptir. Termodinamik çevrimi boyunca LeuT'nin TM1a-TM6b ve TM1b-TM6a sarmalları hücre içine bakan (IF) ve hücre dışına bakan (OF) yapılar oluşturmak üzere hareket ederler. LeuT IF ve OF yapıları ise hücre içi ve dışı ortamlarına açık (IFo ve OFo) ve kapalı (IFc ve OFc) halde bulunabilmektedir. Substrat taşıma çevrimi boyunca LeuT hücre dışına bakan açık halinden hücre içine bakan açık halleri arasında geçiş yaparken çeşitli termodinamik hallerden geçmektedir. Bu termodinamik haller boyunca LeuT yapısal olarak değişir ve bu değişim çift katmanlı lipit tabaka üzerinde bir basınca neden olur.
Bu tez çalışması ile LeuT'nin IFo→OFo halleri arasındaki TM sarmallarının hareketlerindeki değişim geçiş ölçekte MD simülasyonları ile incelenmiş ve bu simülasyonlardan gelen basınç verileri kullanılarak lipit tabaka üzerindeki basınç profilleri 7 farklı termodinamik hal için elde edilmiştir. Gur ve diğ. (2015) tarafından dimerik formdaki LeuT kullanılarak LeuT monomerinin serbest enerji yüzeyi oluşturulmuştur. Bu tez çalışmasında Gur ve diğ. (2015) tarafından oluşturulan enerji yüzeyinden apo LeuT'nin OFo⇌IFo halleri boyunca görülen 7 termodinamik hali temsilen monomer haldeki yapılar seçilmiştir. Seçilen monomer yapılar VMD programı kullanılarak çift katmanlı lipit tabakanın merkezine yerleştirilmiştir. Daha sonra lipit tabaka üzerine yerleştirilen protein yapıları fizyolojik şartların sağlanması için VMD programının "Solvate v1.5" eklentisi kullanılarak su içinde çözülmüş ve "Autoionize v1.5" eklentisi kullanılarak NaCl ile iyonize edilmiştir. Elde edilen sisteme NAMD programı kullanılarak ilk başta minimizasyon ve dengeleme simülasyonları yapılarak sistemin dengeye gelmesi sağlanmıştır. Dengeye gelen sistemlerin yapısal geçişi boyunca lipit tabaka üzerindeki basınç değişiminin anlaşılması için her bir hal için 150 ns MD simülasyonları yapılmıştır ve bu simülasyonlardan basınç verileri elde edilmiştir. Yapılan MD simülasyonlarından gelen geniş yapısal değişiklik verileri kullanılarak Gur ve diğ. (2015) tarafından oluşturulan serbest enerji yüzeyi monomer haldeki apo LeuT yapıları için yeniden elde edilmiştir. Elde edilen simülasyon verileri kullanılarak lipit tabaka üzerinde oluşan basınç profili basınç hesabı yapılarak oluşturulmuştur. Gur ve diğ. (2015) tarafından dimerik formdaki LeuT kullanılarak oluşturulan serbest enerji yüzeyi LeuT'nin monomer hali için tekrardan simülasyon verilerinden oluşturulmuştur. Gerçekleştirilen MD simülasyonlarıyla LeuT monomer yapısının toplamda 7 minimum noktadan geçtiği ve bu noktaların sırasıyla IFo, IFc1, IFc2a, IFc2b, IFc2c, IFc3 ve OFo hallerini temsil ettiği bu tez çalışması ile belirlenmiştir. Monomer haldeki LeuT için yapılan MD simülasyonlarından her termodinamik hal için ayrı ayrı basınç profili çıkarılmıştır.
Dinein motor proteini hücre içinde bulunan organeller, virüsler, transkripsiyon faktörleri, proteinler ve mRNA gibi kargoları MT'nin eksi ucuna taşımakla görevlidir. Dinein iki özdeş ağır zincirden oluşan homodimerik haldedir ve her bir ağır zincirde bir motor bölgesi bulunmaktadır. Bu motor bölgesinde baş olarak adlandırılan ve 6 AAA+ bölgesinin bir araya gelmesinden oluşan bir hekzamerik halka bulunmaktadır. Motor bölgesi baş bölgesine ek olarak kuvvet kolu, sap ve payanda olarak adlandırılan ve AAA halkasında uzanan üç çıkıntı içerir. Kuvvet kolunun devamında kuyruk bölgesi bulunmaktadır ve bu bölge dineinin taşıdığı kargoların bağlanmasında görev alır. AAA halkasında AAA1-4 bölgeleri ATP bağlanmasında ve hidrolizinde görev alır ve AAA1 bölgesi dineinin hareketinden sorumludur. ATP hidrolizinden çıkan enerji ile kuvvet kolu hareket eder ve mekanik iş üretir. ATP hidrolizi ile kuvvet kolu AAA3-AAA4 pozisyonundaki düz yapısından AAA2-AAA3 pozisyonundaki bükük yapısına geçer. Dinein sapı CC1 ve CC2 sarmallarından oluşmaktadır ve bu sarmallar birbiriyle etkileşerek sarmal-bobin yapısı oluştururlar. Sapın alt kısmında mikrotübül bağlama bölgesi (MTBB) bulunmaktadır ve bu bölge altı alfa sarmaldan (H1-H6) oluşmaktadır. MTBB'nin H1 sarmalı sapın CC1 sarmalı ile doğrudan bağlanır. Dinein termodinamik çevrimi boyunca en az 5 termodinamik halden (TH1-TH5) geçer ve bu haller ATP bağlanma, hidrolizi ve salınmasına göre değişir. Çevrim, nükleotit bağlı olmayan apo haldeki dinein ile başlar ve bu halde (TH1) kuvvet kolu düz bir yapıdayken dineinin MTBB'si MT'ye bağlı durumdadır. Dineinin AAA1 bölgesine ATP bağlanmasıyla dinein sapının sarmal bobin yapısında bir kayma oluşur ve dinein MT'den kopar (TH2). MT'den kopma üzerine ATP hidrolizi başlar ve kuvvet kolu düz yapıdan bükük yapıya geçer (TH3). Dinein MT'ye tekrar bağlanır ve fosfat salınır (TH4). Fosfat salınmasıyla dineinin kuvvet kolu yeniden düz hale geçer (TH5) ve ADP salınır. ADP salınması ile dinein bir termodinamik çevrimi tamamlar ve başlangıç yapısına tekrar döner.
Bu tez çalışması ile dineinin MT'ye bağlanması ve kopması ileri MD simülasyonları kullanılarak modellenmiş ve simülasyonlardan elde edilen veriler Jarzynski eşitliği kullanılarak serbest enerji değişiminin hesaplanması için kullanılmıştır. Dineinin MT'e bağlanmasının modellenmesi için ilk olarak eksiksiz bir dinein yapısı ile MT yapısı VMD programı kullanılarak üst üste getirilmiştir. Üst üste getirilen yapıda dinein sap kısmından kesilip MT'e bağlı halde MTBB-sap yapısı elde edilmiştir. MTBB ile MT arasında yapısal çakışma gözlemlenmesinden dolayı dinein MT'den bir miktar uzaklaştırılmış ve yeni yapı oluşturulmuştur. Oluşturulan bu yapı fizyolojik şartların sağlanması için VMD programının "Solvate v1.5" eklentisi kullanılarak su içinde çözülmüş ve "Autoionize v1.5" eklentisi kullanılarak NaCl ile iyonize edilmiştir. Hazırlanan sistem NAMD programı kullanılarak minimizasyon ve dengeleme simülasyonları yapılarak dengeye getirilmiştir. Dengeye gelen sistem MT'ye bağlı MTBB yapısının modellenmesi için 200 ns MD simülasyonu gerçekleştirilmiştir. Daha sonra MT'ye bağlanan dinein yapısının tekrardan koparılması için yönlendirilmiş MD (İngilizcesi steered MD, SMD) simülasyonları yapılmıştır. Bu SMD simülasyonlarında başlangıç noktaları olarak, MD simülasyonlarından elde edilen MT'ye bağlı dinein yapısının 50. ve 100. ns'lerinden anlık yapıların 1 ns aralıklarla 5 kez örneklenmesiyle elde edilen 10 farklı yapı kullanılmıştır. Her bir yapı için ayrı ayrı 10 ns SMD simülasyonu yapılarak dinein MTBB'sinin MT'den kopması modellenmiştir. SMD simülasyonları boyunca elde edilen veriler ve Jarzynski eşitliği kullanılarak serbest enerjinin MTBB-MT arasındaki mesafeye göre değişimini hesaplanmıştır. Dineinin MT'ye bağlanması sırasında oluşan elektrostatik etkileşimlerin analiz edilmesi için literatürdeki MTBB-MT bağlı yapılar incelenmiş ve bu farklı afinitedeki yapıların MTBB ile MT arasındaki etkileşimleri belirlenmiştir. Daha sonra MTBB'nin MT'ye bağlandığı MD simülasyonları incelenerek, literatürdeki etkileşimler ile MD simülasyonlarındaki etkileşimler detaylı olarak karşılaştırılmıştır. Buna ek olarak MD simülasyonları boyunca söz konusu etkileşimlerin değişimleri incelenmiş ve elde edilen etkileşimlerin simülasyon süresi boyunca değişen Mesafe-Zaman ve Mesafe-Yüzde Dağılım grafikleri elde edilmiştir.

Abstract:
Proteins are essential for the proper functioning of cells and the maintenance of viability. Proteins such as transporters and motors, are involved in a wide variety of roles in the cell which are providing the regulation and organization of cell function. Operating as a biomolecular machine, these proteins work on a thermodynamic cycle to perform their functions and complete a structural transition. During the cycle, thermodynamic properties of the protein change and it is important to understand the structure and function of the protein. In this thesis, change in the different thermodynamic properties of two proteins during their cycle are investigated using molecular dynamics (MD) simulations. Firstly, energy landscapes during the thermodynamic cycle of leucine transporter (LeuT) was constructed and the pressure profile of this protein on the lipid bilayer during cycle was generated using MD simulations. Secondly, the binding and release of the dynein motor protein to the microtubule (MT) was modeled by MD simulations and the free energy profile of the protein during the thermodynamic cycle was generated using the Jarzynski equality.
LeuT is embedded in the cell membrane and is responsible for transporting small amino acids such as leucine and alanine along the cell membrane. This protein belongs to the family of neurotransmitter: sodium symporters (NSS) which are secondary active transporters. NSS members transports substrates using energy arising from the movement of ions down their concentration gradient along the cell membrane. LeuT has a dimeric structure and each monomer in the structure consists of 12 transmembrane (TM) helices. These helices are arranged in two inverted 5-helix repeats (TM1-5 TM6-10). The substrate binding site is located in the middle regions of TM1-TM6 and TM3-TM8 helices. LeuT has two sodium binding sites (Na1 and Na2) in addition to the leucine or alanine amino acids. During the thermodynamic cycle, the TM1a-TM6b and TM1b-TM6a helices of LeuT move to form the inward-facing (IF) and the outward-facing (OF) states. Based on their accessibility to the intra and extracellular mediums those states can be classified as closed (IFc and OFc) and open (IFo and OFo) (sub)states. During the LeuT OF⇌IF transitions, LeuT visits several (sub)states. The structure and dynamics of LeuT changes during transitions, which in turn affects the pressure on the lipid bilayer.
In this thesis, the movement of TM helices during the IFo→OFo LeuT transition pathway were examined by MD simulations. By using pressure data from these simulations, the pressure profiles on the lipid bilayer were obtained for 7 different thermodynamic states. The energy landscape of LeuT monomer was generated by Gur et al. (2015) using LeuT in dimeric form. The monomeric conformers of apo LeuT were selected from the energy landscape generated by Gur et al. (2015) to represent the 7 thermodynamic states seen during the IFo→OFo transitions. The selected monomers were placed in the center of the lipid bilayers and structures were merged with the "MergeStructs v1.1" tool of VMD. The protein structures placed on the lipid bilayer were then solvated in water with "Solvate v1.5" tool of VMD. Using "Autoionize v1.5" tool in VMD, obtained system was ionized with NaCl to provide the ionic charge balance. To equilibrate the generated systems, firstly minimization and equilibrium simulations were performed using NAMD software. In order to understand the pressure profile of the protein on the lipid bilayer during its structural transition, a set of MD simulations each of 150 ns length were performed. Energy landscape generated by Gur et al. (2015) was reconstructed using the conformational transition data obtained from the new set of apo LeuT monomer MD simulations. The following 7 minima along the IFo→OFo transitions were identified; IFo, IFc1, IFc2a, IFc2b, IFc2c, IFc3 and OFo states. Pressure profiles for each thermodynamic state were obtained from the MD simulations performed for apo LeuT monomers.
Dynein motor protein is responsible for transporting cargoes such as organelles, viruses, transcription factors, proteins and mRNA to the minus end of MT. Dynein is in homodimeric structure consisting of two identical heavy chains each having a motor domain. In this motor domain, 6 AAA+ site is arranged as a hexameric ring, called the head. In addition to the head region, the motor domain comprises three protrusions, called the linker, the stalk and the buttress, all extend from the AAA ring. In addition to these protrusions, a tail domain extends from the N terminus of the linker. For dimerization and cargo binding of dynein, this tail domain is necessary. The AAA1-4 sites in the AAA ring are involved in ATP binding and hydrolysis, but only the AAA1 site is responsible for the motility of dynein. With the energy from the ATP hydrolysis, the linker produces a mechanical work with the conformational change. By ATP hydrolysis, linker undergoes a conformational change and moves from straight conformation in which linker is positioned in AAA3-AAA4 to bent conformation in which linker is positioned in AAA2-AAA3. The stalk consists of the two helices (CC1 and CC2), which interact with each other to form a coiled coil. At the end of the stalk, there is microtubule binding domain (MTBD) consists of six alpha helices (H1-H6). During mechanochemical cycle of dynein, there are five thermodynamic states associated with ATP binding, hydrolysis, and release. The cycle begins with apo dynein, which is non-nucleotide bound, and in this state (1) the MTBB is bound to the microtubule (MT) with the linker in its straight conformation. Following the binding of ATP to AAA1, a shift occurs in the coiled coil stalk and MTBD of dynein is released from MT (2). Upon release from MT, ATP hydrolysis begins and linker transforms into the bent conformation (3). Dynein rebinds to the MT and phosphate is released (4). Linker of ADP bound dynein returns back to its straight conformation (5) and dynein releases ADP. With the release of ADP, a thermodynamic cycle of dynein is completed, returning back to its initial state.
In this thesis, MTBD binding to MT and MTBD release from MT were modeled using advanced MD methods and data obtained from simulations were used for calculations of free energy change by Jarzynski equality. In order to model the MT binding of dynein, firstly complete dynein structure and MT structure were superimposed using VMD. MT bound MTBD-stalk structure was obtained from superimposed structure by truncating the structures other than stalk and MTBD of dynein. Due to a steric clash observed between MTBD and MT, dynein was first slightly moved away from MT without changing its relative pose to the MT. To provide physiological conditions, this structure was solvated in water using "Solvate v1.5" tool of VMD and ionized with NaCl using "Autoionize v1.5" tool in VMD. Subsequently, system was equilibrated by minimization and equilibrium MD simulations using NAMD software.
In order to model the binding of dynein MTBD to MT, MD simulations of the equilibrated system were performed for 200 ns. Subsequently, steered MD (SMD) simulations were performed to investigate the work required to release unbind dynein from MT. As the starting structure of these SMD simulations, the structures were selected from the 50. and 100. ns of the MD simulations for 200 ns. These structures were sampled 5 times at 1 ns interval by MD simulations and 10 different structures were obtained. For each structure, 10 ns SMD simulation was performed and the unbinding of the dynein MTBD from MT was modeled. Using the data obtained from the SMD simulations and the Jarzynski equality, the free energy profile as a function of the distance between MTBD and MT was constructed. MTBD-MT bound structures in the literature were analyzed and the interactions between MTBD and MT in these different affinity structures were determined. MD simulations of binding of MTBD to MT were investigated and compared in detail with the literature. In addition, the changes of these interactions during MD simulations were investigated, and distance-time and distance distribution graphs for the residues involved in those interactions were constructed.