Propolis yüklü polimerik nanopartiküllerin hazırlanması ve karakterizasyonu, immünomodülatör etkilerinin makrofaj hücrelerinde incelenmesi
Preparation and characterization of propolis-loaded polymeric nanoparticles, investigation of their immunomodulatory effects on macrophage cells
Yazar: TOGHRUL SADIKHOV
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA ; PROF. DR. ADIL ALLAHVERDIYEV
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Bağışıklık yanıtı = Immune response ; Kuersetin = Quercetin ; Polikaprolakton = Polycaprolactone ; Propolis = Propolis ; Sitokinler = Cytokines

Özet:
Hücre kültürlerinde ve hayvan modellerinde yapılan çalışmalar, çeşitli arı ürünlerinin (bal, propolis, arı poleni vb.) ve içerdikleri bazı bileşiklerin önemli farmakolojik aktivitelere sahip olduklarını göstermiştir. Bu nedenle arı ürünleri, sağlıklı beslenme, apiterapi ve biyokozmetik üretimi gibi çeşitli alanlarda yoğun kullanım alanı bulmaktadır. Önemli bal arısı ürünlerinden biri olan ve 300'den fazla biyoaktif madde içeren propolis (arı tutkalı), içinde bulunduğumuz yüzyılda keşfedilen mükemmel doğal ilaç özellikleri ile daha da önem kazanmaktadır. Propolis, menşeine bağlı olarak şekerler, amino asitler, flavonoidler, fenolik asitler, yağ asitleri, alkoller, aldehitler ve steroidler gibi çeşitli bileşikler içerir. Propolisin biyolojik aktiviteleri genellikle zengin fenolik içeriğiyle ilişkilidir. Propolis ile içerdiği flavonoidlerden biri olan kuersetin, anti-alerjik, anti-mikrobiyal, anti-enflamatuvar, anti-kanser, anti-oksidan gibi çeşitli biyolojik özellikler taşır.
Güçlü yapışkan davranışı, keskin tadı ve suda az çözünmesi propolisin sağlığı destekleyici ürün olarak kullanımını sınırlandırmaktadır. Bu dezavantajları ortadan kaldırmak ve biyoyararlanımı artırmak için, nanoteknolojik kapsülleme teknikleri kullanılabilir.
Bu tezde, propolis etanolik ekstresi, ticari kuersetin ve bunların polikaprolakton (PCL) ile kapsüllenmiş formlarının, immün yanıtla ilişkili bazı sitokinler (IL-4, IFN-γ ve IL-1β) ve nitrik oksit (NO) düzeyleri üzerindeki etkileri J774 makrofaj hücre hattında incelendi.
Öncelikle yerli propolisten etanolik bir ekstre hazırlandı ve deneylerde Propolis örneği olarak bu ekstre kullanıldı. Daha sonra, ikili emülsiyon çözücü buharlaştırma yöntemi kullanılarak propolis ekstresinin ve kuersetinin PCL ile enkapsüle edilmiş nanoformları (Propolis-PCL ve Kuersetin-PCL) üretildi. Nanopartiküllerin yapısı UV-VIS spektrofotometri, zeta potansiyeli ölçümü, FTIR, SEM ve XRD analizleri ile karakterize edildi. Çalışmanın sonraki aşamasında hazırlanan örneklerin (Propolis, Kuersetin, Propolis-PCL ve Kuersetin-PCL) J774 makrofaj hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri MTT yöntemi ile incelendi ve toksik olmayan konsantrasyonları belirlendi. J774 makrofaj hücrelerinde sitokinlerin anlatımı ve NO salınımı, Escherichia coli (serotype O111:B4) kaynaklı lipopolisakkaritin (LPS) toksik olmayan dozu uygulanarak indüklendi. Son olarak, Propolis, Kuersetin, Propolis-PCL ve Kuersetin-PCL uygulanmış ve uygulanmamış hücrelerde immün yanıtla ilişkili sitokinlerin (IL-4, IFN-γ ve IL-1β) sitokinlerin düzeyleri ELISA yöntemiyle saptandı. Ayrıca, immün yanıtın belirteçlerinden biri olan nitrik oksit (NO) salımı Griess reaksiyonu ile analiz edildi.
Propolis-PCL ve Kuersetin-PCL nanoformülasyonları başarılı bir şekilde üretilerek karakterize edildi ve immünmodülatör etkileri Propolis ve Kuersetinin etkileriyle karşılaştırıldı. Test edilen konsantrasyonlarda (5, 25, 50 ve 100 µg/mL) tüm örneklerin LPS ile indüklenmiş J774 hücrelerinde NO salımını inhibe ettiği belirlendi. Tüm örneklerin 100 µg/mL konsantrasyonları IL-4 düzeyini artırırken nanoformların, en çok da Propolis-PCL'nin indüktif etkisi daha yüksekti. Propolis-PCL'nin sadece 50 µg/mL konsantrasyonu IFN-γ düzeyini artırdı. Ayrıca, IL-1β düzeyini düşüren tek örneğin 100 µg/mL Propolis olduğu belirlendi. 
Sonuç olarak, bu çalışmada propolis ve içeriğindeki bileşenlerden biri olan kuersetin ile bu maddelerle yüklü polimerik nanopartiküllerin immünomodülatör etkilerine ilişkin önemli verilere ulaşıldı. Bu veriler gelecekte, immün yanıtla ilişkili sitokinlerin anlatımını ve NO salımını hedef alan, biyoyararlanımı daha yüksek propolis nanoformülasyonlarının ve yeni arı ürünlerinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Abstract:
Studies in cell cultures and animal models have shown that various bee products (honey, propolis, bee pollen, etc.) and some of the compounds they contain have important pharmacological activities. For this reason, bee products find intensive use in various fields such as healthy nutrition, apitherapy and biocosmetics production. Propolis (bee glue), which is one of the important honey bee products and contains more than 300 bioactive substances, becomes more important with its excellent natural medicine properties discovered in the current century. Depending on its origin, propolis contains various compounds such as sugars, amino acids, flavonoids, phenolic acids, fatty acids, alcohols, aldehydes, and steroids. Biological activities of propolis are generally associated with its rich phenolic content. Propolis, and one of its flavonoids, quercetin, have various biological properties such as anti-allergic, anti-microbial, anti-inflammatory, anti-cancer, anti-oxidant.
Its strong sticky behavior, pungent taste and low water solubility limit the use of propolis as a health-supporting product. To overcome these disadvantages and increase bioavailability, nanotechnological encapsulation techniques can be used.
In this thesis, the effects of propolis ethanolic extract, commercial quercetin and their polycaprolactone (PCL)-encapsulated forms on some immune response-related cytokines (IL-4, IFN-γ and IL-1β) and nitric oxide (NO) levels were investigated in J774 macrophage cell line.
First, an ethanolic extract was prepared from local propolis and this extract was used as a Propolis sample in the experiments. Then, PCL-encapsulated nanoforms of propolis extract and quercetin (Propolis-PCL and Quercetin-PCL) were produced using the dual emulsion solvent evaporation method. The structure of the nanoforms was characterized by UV-VIS spectrophotometry, zeta potential measurement, FTIR, SEM, and XRD analyses. In the next stage of the study, the cytotoxic effects of the prepared samples (Propolis, Quercetin, Propolis-PCL and Quercetin-PCL) on J774 macrophage cells were examined by MTT method, and their non-toxic concentrations were determined. Expression of cytokines and release of NO in J774 macrophage cells were induced by administering a non-toxic dose of lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli (serotype O111:B4). Finally, the levels of immune response-related cytokines (IL-4, IFN-γ and IL-1β) in Propolis, Quercetin, Propolis-PCL and Quercetin-PCL treated and untreated cells were determined by ELISA method. In addition, the release of nitric oxide (NO), one of the markers of immune response, was analyzed by the Griess reaction.
Propolis-PCL and Quercetin-PCL nanoformulations were successfully produced and characterized, and their immunomodulatory effects were compared with those of Propolis and Quercetin. It was determined that all samples at the tested concentrations (5, 25, 50 and 100 µg/mL) inhibited NO release in LPS-induced J774 cells. While 100 µg/mL concentrations of all samples increased the IL-4 level, the inductive effect of nanoforms, most notably Propolis-PCL, was higher. Only 50 µg/mL concentration of Propolis-PCL increased the IFN-γ level. In addition, it was determined that the only sample that reduced IL-1β level was 100 µg/mL Propolis.
As a result, in this study, important data were obtained regarding the immunomodulatory effects of propolis and one of its components, quercetin, and polymeric nanoparticles loaded with these substances. In the future, these data may contribute to the development of more bioavailable propolis nanoformulations and new bee products that target the expression of immune response-related cytokines and NO release.