Dispeptik yakınmalı hastalarda helicobacter pylori varlığı, direnç ve virulans faktörlerinin moleküler yöntemler ile değerlendirilmesi
Evaluation of the helicobacter pylori, resistance and virulance factors by molecular methods in patients with dyspepsia
Yazar: EBRU DEMİRAY GÜRBÜZ
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM YILMAZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Clarithromycin = Clarithromycin ; FISH = FISH ; Helicobacter pylori = Helicobacter pylori ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Virülans = Virulence ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
H. pylori'de klaritromisin direncinin tedavi başarısızlığının en önemli nedeni olduğu düşünülmektedir. Çalışmamızda H. pylori'yi saptamak ve 23S rRNA geninin A2142G (A2146G), A2142C (A2146C), A2143G (A2147G), A2143C ve A2144G pozisyonlarındaki nokta mutasyonlarına bağlı oluşan klaritromisin direncinin floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemi, real-time PCR yöntemi, geleneksel kültür ve antimikrobiyal duyarlılık testleri ile belirlenmesi, cagA gen varlığının ve vacA genotiplerinin araştırılması amaçlanmıştır. Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Gastroenteroloji Polikliniği'ne dispeptik yakınmaları ile başvuran endoskopi endikasyonu konulan 234 (65 E, 169 K; yaş ortalaması 43.8±14.0) hasta çalışmaya alındı. Antrum ve korpus biyopsi örneklerine uygulanan hızlı üreaz testi, histopatoloji ve kültürün en az ikisinin pozitif olduğu olgular H. pylori enfeksiyonu olumlu olarak değerlendirildi. H. pylori suşlarının cagA pozitifliği PCR ile ürün uzunluğu 370-570 bp olarak saptandı. H. pylori suşlarının vacA genotipleri PCR ile ürün uzunlukları m1 bölgesi için 290 bp, m2 bölgesi için 350 bp, s1 bölgesi için 176 bp, s2 bölgesi için 200 bp olarak saptandı. Dört yüz altmış sekiz antrum ve korpus formalin-fikse-parafine-gömülü biyopsi kesitlerine FISH (BACTfish, Hungary) (23SrRNA gen bölgesinde 2143 ve 2144 pozisyonunda) yöntemi uygulandı. Dört yüz altmış sekiz antrum ve korpus biyopsi örneğinin DNA'ları QIAamp DNA mini kit ile ekstrakte edildi ve Real-time PCR (23SrRNA gen bölgesinde A2142G,A2142C,A2143G üç nokta mutasyonu) yöntemi uygulandı. İzole edilen H. pylori suşlarında klaritromisin duyarlılığı E-test ile değerlendirildi. En az iki test pozitifliğinde, 164 (%70.1) hasta H. pylori enfeksiyonu olumlu saptandı. Yüz altmış dört hastanın 114 (%69.5)'ü kültür olumlu, 137 (%83.5)'si FISH olumlu, 157 (%95.7)'si real-time PCR olumlu saptandı. Kültür duyarlılığı (%69.5) ve özgüllüğü (%100) ile karşılaştırıldığında, H. pylori'nin saptanmasında FISH yönteminin duyarlılığı (%83.5) daha iyi, özgüllüğü ise (%91.4) daha düşük saptandı. Real-time PCR yönteminin ise duyarlılığı %95.7, özgüllüğü %70 saptandı. H. pylori olumlu hastalarda antrum ve korpus birlikte değerlendirildiğinde; FISH ile klaritromisin direnci %20.2, E-test ile %28.0, real-time PCR ile %34.4 olarak saptandı. E-test ile, FISH arasındaki uyum %89.5, real-time PCR arasındaki uyum ise %75.4 saptandı. H. pylori kültür olumlu 114 hastadan 53 (%46.5)'ü cagA olumlu saptandı. Klaritromisin direnci ile cagA pozitifliği arasında ilişki saptanmadı. Yirmi-dokuz (%25.4) hastada vacA m1s1 genotipi (21 CagA+); bir (%0.9) hastada m1s2 genotipi; 40 (%35.1) hastada m2s2 genotipi (4 CagA+), 35 (%30.7) hastada m2s1 genotipi (25 CagA+), 9 hastada ise miks suş saptandı ve vacA genotipleri ile klaritromisin duyarlılığı arasında bir ilişki saptanmadı. vacA m1s1 ve m2s1 genotipi CagA pozitifliği ile, vacA m2s2 genotipi ise CagA negatifliği ile ilişkili saptandı. Sonuç olarak, FISH yöntemi geleneksel kültür yöntemi ile karşılaştırıldığında H. pylori'nin saptanmasında duyarlılığı belirgin şekilde arttırmaktadır. FISH dispeptik yakınmalı hastaların tanı ve tedavisinin belirlenmesinde hızlı karar verilmesi gerekliliği açısından kullanışlı, güvenilir ve yüksek duyarlılığa sahip bir tekniktir.

Abstract:
Clarithromycin resistance in H.pylori is considered an important cause for treatment failure. We aimed to detect H. pylori and determine clarithromycin resistance which is due to A2142G (A2146G), A2142C (A2146C), A2143G (A2147G), A2143C and A2144G point mutations in 23S rRNA gene by fluorescence in situ hybridization (FISH), real-time PCR, conventional culture and antimicrobial susceptibility testing and also to identify cagA positivity and vacA genotypes. Two-hundred-thirty-four patients with dyspepsia (65M, 169F; mean age 43.8±14.0 years) admitted to Gastroenterology Outpatient Clinic at Dokuz Eylül University Hospital were taken into the study. The diagnosis of H. pylori infection was defined as positive for at least two positive results with rapid urease test, histopathology and culture which were applied to antrum and corpus biopsy specimens. H. pylori cagA positive PCR products ranging 370-570 bp were amplified. H. pylori vacA genotypes PCR products; 290 bp for m1 region, 350 bp for m2 region, 176 bp for s1 region, 200 bp for s2 region were amplified. Formalin fixed paraffin embedded 468 antrum and corpus tissue sections were applied FISH (BACTfish, Hungary) (2143 and 2144 positions in 23SrRNA gene) method. DNA of 468 antrum and corpus biopsy specimens were extracted by QIAamp DNA mini kit and Real-time PCR (A2142G,A2142C,A2143G three point mutations in 23SrRNA gene) methods were applied to them. E-test was used to assess clarithromycin susceptibility in the isolated H. pylori strains. One-hundred-sixty-four (70.1%) patients were H. pylori positive according to at least two positivity. One-hundred-fourteen (69.5%) of 164 patients were culture positive, and 137 (83.5%) were positive by FISH, 157 (95.7%) were positive by real-time PCR. The sensitivity of FISH (83.5%) was significantly better, but not the specificity (91.4%) for detection of H. pylori, when compared with culture sensitivity (69.5%) and specificity (100%). The sensitivity and specificity of real-time PCR was 95.7%, 70%, respectively. Among H. pylori-positive patients, FISH detected clarithromycin resistance in 20.2%, E-test in 28.0%, real-time PCR in 34.4% of samples considering both antrum and corpus. The concordance between E-test and FISH was 89.5%. The concordance between E-test and real-time PCR was 75.4%. Among H. pylori-culture positive patients; 53 (46.5%) were cagA positive and no correlation was found between cagA positivity and clarithromycin resistance. m1s1 genotypes of vacA is in 29 (25.4%) patients (21 cagA+); m1s2 genotypes in 1 (0.9%) patient; m2s2 genotypes in 40 (35.1%) patients (4 cagA+) ; m2s1 genotypes in 35 (30.7%) patients (25 cagA+) were detected. Nine patients have mixed genotype strains. No relationship between vacA genotypes and clarithromycin susceptibility were found. As expected, vacA m1s1 and m2s1 were associated with CagA positivity and vacA m2s2 was associated with CagA negativity. As a conclusion, FISH significantly increases the sensitivity to detect H. pylori in the clinical microbiology laboratory when compare with traditional culture techniques. FISH technique is a reliable and highly sensitive method, especially useful when a quick decision is necessary for the management of diagnosis and treatment for patient with dyspepsia.