Brusellozun tanısında kullanılabilecek gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon yönteminin geliştirilmesi
Improvement of the real-time polymerase chain reaction method used in the diagnosis of brucellosis
Yazar: HASAN ZEYBEK
Danışman: PROF. DR. RIZA DURMAZ
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Ankara Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Brusella = Brucella ; Brusella-abortus = Brucella-abortus ; Bruselloz = Brucellosis ; Moleküller = Molecules ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Seroloji = Serology ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis teknikleri ve prosedürleri = Diagnostic techniques and procedures

Özet:
Bruselloz; dünya genelinde çeşitli klinik bulgulara, rölapslara ve komplikasyonlara neden olabilen, morbiditesi yüksek, mortalitesi düşük bir zoonozdur. İnsanlarda brusella enfeksiyonunun gerçek insidansı tam olarak bilinmese de endemik bölgelerde insidansın <0,01 ile >0,002 arasında olduğu bildirilmektedir. Rutin laboratuvar tanı sıklıkla kültür ve seroloji ile konmaktadır. Ancak kültür yöntemlerinin duyarlılığı hastalığın evresine, Brucella türlerine, kültür ortamına ve kullanılan kan kültürü tekniğine göre değişkenlik gösterebilmektedir. Ayrıca rutinde daha sık kullanılan serolojik yöntemlerin de çapraz reaktif mikroorganizmalara karşı gelişen antikorlar sebebiyle özgüllüğü düşüktür. Konvansiyonel tanı testlerinde karşılaşılan bu olumsuzluklar nedeniyle Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) temelli yaklaşımlar tanıda önem kazanmıştır. Bu yöntemler brusellozun hızlı ve güvenilir teşhisinde iyi bir alternatiftir. 
Bu çalışmada, brusellozun erken tanısında kullanılabilecek hızlı, özgün, duyarlı ve güvenilir bir mültipleks Gerçek Zamanlı PZR (mGz-PZR) yöntemi geliştirilmesi ve bu yönteminin konvansiyonel tanı testleri ile karşılaştırılması amaçlandı. mGz-PZR yönteminin en düşük saptama limiti (EDSL), 108-101 cfu/ml konsantrasyonda hazırlanan ve Brucella melitensis ATCC 23456 standart suşu içeren simüle serum ve tam kan örneklerinde araştırıldı. Bu örnekler öncelikle, Thermo ve Norgen DNA izolasyon kitleri ile ekstrakte edildi. Daha sonra Rotor-Gene (Corbett RG 6000, Australia) ve Bio-Rad (CFX-96 C1000 Touch Real-time system) cihazlarında, Maxima SYBR green, QuantiTect ve Ampliqon Tempase PZR master miksleri kullanılarak yöntemin EDSL'si belirlendi. Optimize edilen metodun validasyon çalışmaları yapıldıktan sonra yöntemin etkinliği, bruselloz şüpheli 57 hastaya ait serum örnekleri ve pozitif üreme sinyali veren 21 kan kültür şişesi üzerinde değerlendirildi.
Yöntemin EDSL'si; Maxima SYBR green 2x master miks ile çalışıldığında, her iki thermal cycler cihazında 104 cfu/ml bulundu. Daha düşük konsantrasyonlardaki DNA'yı saptamak için kullanılan prob bazlı QuantiTect ve Ampliqon Tempase master miksleri ile kurulan reaksiyonlarda 102 cfu/ml yoğunluktaki örneklerde amplifikasyon sağlandı. Optimize edilen metodun validasyonu Thermo DNA ekstraksiyon kit-Ampliqon master miks ile serum örneklerinde yapıldı. Validasyon çalışmalarında yöntemin doğruluk, tekrarlanabilirlik, özgüllük ve duyarlılık değerlerinin oldukça yüksek olduğu belirlendi. Çalışmaya dahil edilen toplam 57 hastanın 33'ünün (%57,8) serum örneklerinde Gz-PZR ile pozitiflik saptandı. Kan kültürü mevcut olan 41 hastanın 21'inden Brucella spp. izole edildi ve bu 21 hastanın tamamının serum PZR'si B. melitensis varlığını gösterdi. İlaveten; kan kültürü negatif olup serolojik testlerin en az birinde anlamlı pozitiflik (STAT ≥1/160 ve/veya Coombs titre ≥1/320) saptanan 20 hastanın -ki bu hastalar CDC laboratuvar tanı kriterlerine göre olası bruselloz kapsamındadırlar- 12'sinde serum PZR pozitifliği kaydedildi. Yöntemimiz gerek serum örnekleri gerekse tam kan veya diğer klinik örnekler ile kan kültür şişesinden bruselloz tanısında güvenle kullanılabilir.

Anahtar Kelimeler: Bruselloz, B. melitensis, Moleküler tanı, Gerçek zamanlı PZR, 
Optimizasyon, Seroloji

Abstract:
Brucellosis; is a zoonosis with high morbidity and low-mortality which can cause various clinical findings, relapses and complications around the world. Although the true incidence of Brucella infection in humans is not exactly known, it is reported that the incidence is between <0.01 and >0.002 in endemic areas. Routine diagnosis of brucellosis is often performed by culture and serology. However, the sensitivity of culture methods may vary depending on the disease stage, Brucella species, culture medium and blood culture technique. In addition, the specificity of serological methods is low due to antibodies against cross-reactive microorganisms. Polymerase Chain Reaction (PCR) based approaches have gained importance to diagnose because of these adversities in conventional diagnostic tests. These methods are good alternative in the rapid and reliable diagnosis of human brucellosis.
In this study, we aimed to develop a rapid, specific, sensitive and reliable multiplex Real-time Polymerase Chain Reaction (mRt-PCR) method that can be used in the early diagnosis of brucellosis and to compare this method with conventional diagnostic tests. The lowest detection limit of the mRt-PCR method was investigated in simulated serum and whole blood samples containing Brucella melitensis ATCC 23456 standard strain with different concentration varying between 108 and 101 cfu / ml. These samples firstly were extracted with Thermo and Norgen DNA isolation kits. Then the lowest detection limit of the method was determined by using Maxima SYBR green, QuantiTect and Ampliqon Tempase PCR master mixes in Rotor-Gene (Corbett RG 6000, Australia) and Bio-Rad (CFX-96 C1000 Touch Real-time system) thermal cycler devices. Validation studies of the optimized method were performed, then the efficacy of the method was evaluated on 21 blood culture bottles with positive reproductive signal and 57 serum samples of brucellosis suspicious patients.
The lowest detection limit of the method was found 104 cfu / ml in both thermal cycler when the Maxima SYBR green 2x master mix was used. The amplification was provided at a concentration of 102 cfu / ml in the reactions that set up with the probe-based QuantiTect and Ampliqon Tempase master mixes. The validation studies of the optimized method was performed in serum samples with Thermo DNA extraction kit-Ampliqon master mix. It has been determined that the method showed high level accuracy, precision, specificity and sensitivity by performing the validation studies. Positive mRt-PCR results were detected in 33 (57.8%) serum samples of 57 patients. Only the 41 patients had blood culture samples and Brucella spp. was isolated from 21 of them. Moreover, serum PCR results of all Brucella positive blood culture samples were positive as Brucella melitensis. Additionally; serum PCR positivity was recorded in 12 of 20 patients whose blood culture was negative and at least one of the serologic tests showed significant positive results (STAT ≥1 / 160 and / or Coombs titer ≥1 / 320). These patients are diagnosed as ''presumptive case'' according to the CDC laboratory criteria for diagnosis of brucellosis. Our method can be used safely in the diagnosis of brucellosis from both serum and whole blood samples or other clinical specimens and blood culture bottles.

Key Words: Brucellosis, B. melitensis, Molecular assay, Real-time PCR, Optimization, Serology