Gentamisin, amoksisilin ve sefazolin sodyum antibiyotiklerinin fare karaciğer ve böbrek glutatyon redüktaz enziminin aktivite, protein ve gen ekspresyon düzeyleri üzerine etkilerinin incelenmesi
The investigation of the effects of gentamicin, amokcicilin and cefazolin sodium antibiotics on the enzyme activity, protein and gene expression levels of glutathione reductase in mouse liver and kidney
Yazar: PINAR TAŞER
Danışman: PROF. DR. MEHMET ÇİFTCİ
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Glutatyon Redüktaz enzimi (GR; E.C.1.8.1.7) düşük veya yüksek molekül kütleli disülfür substratları ile indirgenmiş piridin nükleotidleri arasında elektron transferini katalizler. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi hem karaciğer hastalıklarında hem de akut ya da kronik böbrek hastalıkları gibi çeşitli renal hastalıklarda rol oynamaktadır. Bu nedenle ilaçların bilinçsizce tüketildiği günümüzde, vücudumuzu ROS'un zararlı etkilerinden koruyan endojen antioksidan savunma sistemin önemli bir parçası olan GR enziminin karaciğer ve böbrek dokularında gen ve protein ekspresyonları düzeyleri ve aktivitesi üzerine gentamisin (aminoglikozid grubu), amoksisilin (penisilin grubu) ve sefazolin sodyum (sefalosporin grubu) antibiyotiklerinin etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. İlk olarak GR enzimi 2',5'-ADP sepharose 4B afinite kromatografisi yöntemi ile karaciğer dokusundan 84,615 EÜ/mg spesifik aktiviteyle %8,659 verimle 1725,73 kat, böbrek dokusundan ise 9,63 EÜ/mg spesifik aktiviteyle %27,136 verimle 43,74 kat saflaştırıldı. Söz konusu antibiyotiklerin GR aktivitesi üzerine inhibisyon etkileri incelendi. İlaç konsantrasyonlarına karşı %Aktivite grafikleri çizilerek ve inhibisyon gösteren antibiyotikler için IC50 değerleri hesaplandı. İnhibisyon türleri ve Ki sabitleri Lineweaver Burk grafikleri çizilerek belirlendi. Sefazolin sodyum fare karaciğer ve böbrek GR enzimi aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi göstermezken, gentamisin sülfat antibiyotiğinin karaciğer GR için IC50 değeri 43,32 mM Ki sabiti 52,62±21,94 mM, inhibisyon türü ise yarışmasız, amoksisilin antibiyotiğinin karaciğer GR için IC50 değeri 13,63 mM Ki sabiti 5,61±1,9 mM, inhibisyon türü yarışmalı, böbrek GR için IC50 değeri 86 mM, Ki sabiti 140±55 mM, inhibisyon türü ise yarışmasız olarak bulundu. Ayrıca bahsi geçen ilaçların in vivo etkileri de araştırıldı, her üç ilacın da enzimi hem karaciğer hemde böbrek dokusunda inhibe ettiği görüldü. Karaciğer dokusunda gentamisin gen ekspresyon düzeyini azaltırken, sefazolin sodyum her iki dokuda da Gr'nin gen ekspresyon düzeyini arttırdı, amoksisilin ise etkilemedi. Western Blot analizi sonucuna göre amoksisilin ve gentamisin karaciğer ve böbrek dokusunda protein ekspresyon seviyesini değiştirmezken, sefazolin sodyum böbrekde protein ekspresyonunu arttırdı.

Abstract:
Glutathione reductase (GR; E.C.1.8.1.7) catalyses the electron transfer between low or high molecular mass disulphide substrate and reduced pyridine nucleotides. The production of reactive oxygen species (ROS) is involved in both liver diseases and various renal diseases such as acute or chronic kidney diseases. GR is an important part of the endogenous antioxidant defence system that protects our body from the harmful effects of ROS. Therefore, todays that drugs unconsciously consumed, it is aimed to investigate that the effects of gentamicin (aminoglycoside group), amoxicillin (penicillin), and cefazolin sodium (cephalosporin group) antibiotics on the activity of GR. Firstly, GR enzyme was purified by 2',5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography method from the mouse liver with a specific activity of 84.615 EU/mg protein, % 8.659 yield, 1725.73 fold, and from kidney with a specific activity of 9.63 EU/mg protein, % 27.136 yield, 43.74 fold. Inhibitory effects of in question antibiotics were investigated on GR activity. IC50 values for antibiotics showing inhibition were calculated by ploting drug concentration vs. Activity% graphs. Inhibition types and Ki constants were determined by drawing Lineweaver Burk plots. It was found that while cefazolin sodium did not show inhibitory effect on the GR activity in both tissue, IC50 value of gentamicin for hepatic GR is 43.32 mM, Ki constant is 52.62±21.94 mM, and the inhibition type is noncompetitive, IC50 value of amoxicillin for hepatic GR is 13.63 mM, Ki constant is 5.61±1.9 mM, and inhibition type is competitive, for kidney GR IC50 value of amoxicillin is 86 mM, Ki constant is 140±55 mM, and inhibition type is noncompetitive. Also in vivo effects of the medication at issue were investigated, it was seen that all three drugs inhibited the enzyme in both tissues. While gentamicin reduced the level of Gr gene expression only in liver, cefazolin sodium increased the level of the Gr gene expression in both tissues and amoxicillin did not show any effect. According to the results of Western Blot analysis amoxicillin and gentamicin did not change the level of protein expression of GR in liver and kidney but cefazolin sodium increased protein expression in kidney.