SMN2 geni promotorunun klonlanması ve karakterizasyonu
Cloning and characterization of the SMN2 gene promotor
Yazar: MERVE DEMİR
Danışman: DOÇ. DR. ESRA TOKAY ; PROF. DR. FERAY KÖÇKAR
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Moleküler genetik = Molecular genetic

Özet:
Spinal Müsküler Atrofi (SMA) omurilikte bulunan alfa motor nöronların dejenerasyonuyla meydana gelen ve beraberinde simetrik kas zayıflıklarına yol açan otozomal resesif kalıtsal bir hastalıktır. SMN geni 20 kb uzunluğunda 8 ekzondan oluşmakta ve 294 aminoasitlik SMN proteini kodlamaktadır. Bu geninin telomerik (SMN1) ve sentromerik (SMN2) olmak üzere iki kopyası bulunmakta, kopyalar birbirinin homoloğu olup aralarında ekzon 7 de yer alan 5 nükleotitlik bir fark bulunmaktadır. SMA hastalarının %95'inden fazlasında SMN1 geninin 7. ekzonunun homozigot delesyonu söz konusudur. SMN2 geni tam uzunlukta ancak işlevsel olmayan SMN protein sentezi yapabilmektedir. Literatürde, mutant SMN1 geni taşıyan SMA hastalığının tedavisi için, SMN2 ekspresyon seviyelerini arttırarak hastalık şiddetini azaltmak ya da seyrini yavaşlatmak gibi çözümler ortaya sunulmuştur. Bu tez çalışması, SMN2 geninin ifadesinin arttırılmasını sağlamak amacıyla SMN2 geninin promotor bölgesi tespit edilerek detaylı biyoinformatik analizi gerçekleştirildi. Promotor bölgesinde spesifik primerler belirlendi. 4 adet GC adası belirlendi. Sekonder yapının     ΔG=-375.95 kcal/mol olarak belirlendi. Muhtemel transkripsiyon bağlanma bölgeleri SP1, AP2, CEBP ve E2F belirlendi. Tezin ikinci aşamasında, SMN2 geninin promotor bölgesi 5 adet 5' delesyonlu parçaları oluşturmak üzere (888 bç, 618 bç, 457 bç, 223 bç ve 116 bç'lik) promotor parçası pGEM-T Easy vektörüne ve akabinde pMetLuc vektörüne alt klonlandı ve dizi analizi ile doğruluğu teyit edildi. Midi prep izolasyonları yapılarak promotor parçaları tezin ikinci aşamasında hücre kültürüne taşınmış olup Hep3B hücrelerine transfekte edildi. Lusiferaz ve SEAP aktivite yöntemleri kullanılarak promotorların bazal aktivitesine bakıldı. SMN2 promotor bölgesine ait 5 konsrakttan en yüksek olarak 223bç'lik konsrakt belirlendi.

Abstract:
Spinal Muscular Atrophy (SMA) is an autosomal recessive inherited disease that occurs with the degeneration of alpha motor neurons in the spinal cord and causes symmetrical muscle weakness. It is known that there are 5 types of SMA disease. Type 0 is the type where patients are most severely affected. They die before birth or within the first 6 months of their life. The SMN gene consists of 8 exons with a length of 20 kb and encodes the SMN protein of 294 amino acids. There are two copies of this gene, telomeric (SMN1) and centromeric (SMN2), the copies are homologous to each other, with a difference of 5 nucleotides located in exon 7. More than 95% of SMA patients have homozygous deletion of exon 7 of the SMN1 gene. The SMN2 gene can synthesize full-length but non-functional SMN protein. In the literature, solutions have been presented for the treatment of SMA, such as reducing the severity of the disease or slowing its course by increasing the SMN2 expression levels. In this thesis, in order to increase the expression of the SMN2 gene, the promoter region of the SMN2 gene was determined and detailed bioinformatics analysis was performed. Specific primers were identified in the promoter region. 4 GC islands were determined. The secondary structure was determined as ΔG=-375.95 kcal/mol. Possible transcription binding sites SP1, AP2, CEBP and E2F were identified. In the second step of the thesis, the promoter region of the SMN2 gene was clonned into the pGEM-T Easy vector and then subclonned into the pMetLuc vector to form 5' deletion fragments (888 bp, 618 bp, 457 bp, 223 bp and 116 bp) and verified using sequence analysis with accuracy. Midi prep isolations were made and the promoter parts were transferred to cell culture in the second stage of the thesis, transfected to Hep3B cell line and basal activity of the promoters was examined by using Luciferase and SEAP activity methods. It was determined that 223 bp contruct of SMN2 promotor region was the highest basal activity.