İyonize radyasyonun fare beyni üzerine olan etkilerinin epigenetik olarak değerlendirilmesi
Epigenetic evaluation of the effects of cranial irradiation on mice brain
Yazar: TURAN KOÇ
Danışman: PROF. DR. HAKAN ÖZTÜRK ; YRD. DOÇ. DR. NAİL CAN ÖZTÜRK
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Anatomi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Anatomi = Anatomy ; Biyoloji = Biology ; Fizyoloji = Physiology
Dizin: DNA = DNA ; Fareler = Mice ; Hipokampus = Hippocampus ; Metilasyon = Methylation ; Radyasyon = Radiation ; Radyasyon lezyonları-deneysel = Radiation injuries-experimental ; Radyasyon-iyonizan = Radiation-ionizing ; Radyasyondan korunma = Radiation-protection

Özet:
Kraniyel radyasyon terapisi malignensilerin tedavisinde etkili bir araç olmasıyla birlikte kısa ve uzun dönemde istenmeyen yan etkiler gösterdiği bilinmektedir. Kognitif kusurlar kraniyel radyoterapinin uzun dönemde ortaya çıkabilen esas etkilerinden biri olarak kabul edilmektedir.
Rodentlerde beynin yeni gelişmeye başladığı dönemlerde kraniyel radyasyona maruziyeti, erişkin döneme gelindiğinde bu uygulamanın hipokampal nörogenezde değişikliklere yol açabildiği gösterilmiştir. Çalışmamızda C57BL6/J fare beyinlerine erken dönemdeki kraniyal radyasyon uygulamasının erişkin dönemdeki hipokampal nörogenezi azaltmasının yanında, epigenetik olaylarda da değişikliklere neden olduğu gösterilmiştir. Deneysel tasarımımızda; postnatal 14. Günde (P14) yavrulara tek doz olarak 8 Gray (Gy) (Rad+  grubu) ile P14 ve P21 de birer doz 8 Gy olmak üzere çift doz (toplam16 Gy) (Rad++) tüm kraniyel radyasyon uygulanmıştır. Ayrıca yaş ve vücut ağırlığı bakımından eş bir grup yavru da sham (anestezik) ve normal kontrol grupları olarak deneye dahil edilmiştir. Kraniyel radyasyon uygulamasından 7 ay sonra, bütün gruplar ilk önce lokomotor aktivitelerinin sınanması açısından Açık Alan Testi'ne daha sonrasında ise hipokampal bağımlı mekansal öğrenme ve uzun dönem hafızayı değerlendirmek için Morris Su Tankı Testi (MSTT) paradigmasına tabi tutulmuşlardır. Açık Alan testinde gruplar arasında önemli farklılıklar görülmemiştir. Fakat MSTT'nde Rad+ ve Rad++ gruplarında kontrol gruplarına kıyasla kognitif becerilerde çeşitli derecelerde azalma kaydedilmiştir. Ayrıca, bu farklılığın önemli derecede doza bağımlı olduğu anlaşılmıştır. MSTT testlerini takiben, tüm gruplara ait P231 beyinlerinin hipokampuslarında mevcut nörogenezi ve epigenetik olayları değerlendirebilmek için fenotipik nöronal ve epigenetik işaretleyiciler kullanılarak immünhistokimyasal boyamalar gerçekleştirilmiştir. Radyasyona maruz bırakılan fare beyinlerinde gyrus dentatus'un iç granüler tabakasında kontrol gruplarına kıyasla Doublecortin (DCX) (olgunlaşmamış nöron işaretleyicisi) ile işaretlenmiş hücre popülasyonunda önemli miktarda azalma tespit edilmiştir. Çalışmamızda ayrıca aynı hipokampal bölgelerde en temel DNA metilasyon faktörlerinden biri olarak kabul gören Methyl-CpG Binding Protein 2 immünohistokimyasal ekspresyonunun radyasyona bağlı olarak belirgin düzeyde azaldığı gösterilmiştir.
Bütün bulgularımız ışığında genel olarak erken dönemdeki kraniyal radyasyon uygulamasının sadece nörogenezi değil, aynı zamanda MSTT deneylerinde gözlenen zayıflamış kognitif yeteneklerin hücresel düzeydeki yansıması olan erişkin hipokampusundaki epiegenetiği de değiştirdiğini gösterilmiştir. İyonize radyasyonun epigenetik programlamayı ne şekilde etkilediğinin mekanizmalarının anlaşılması radyasyon maruziyetinin zararlı etkilerine karşı alınabilecek önlemlerin gelişmesine ışık tutacaktır.

Anahtar Kelimeler: Erişkin Hipokampal Nörogenez, Kraniyal Radyasyon Maruziyeti, DNA metilasyonu, Epigenetik

Abstract:
Cranial radiotherapy is an effective tool in the treatment of pediatric malignancies but it is associated with adverse side effects, both short and long term. One of the cardinal late onset effects is cognitive deficits. Exposure of cranial irradiation to the early brain in rodents has been shown to potentially change the hippocampal neurogenesis levels in adulthood. Here, we demonstrated that epigenetics is also altered accompanying with the reduced hippocampal neurogenesis in the adult brain of C57BL6/J mice after the early cranial irradiation. 
For the experimental design, a single dose of 8 Gray (Gy) whole cranial irradiation at postnatal day 14 (P14) (Rad+ Group) or double doses (Rad++ Group) of 8 Gy both at P14 and P21 (total of 16 Gy) were administered to the pups. Additionally, a group of age and body weight matched mice were assigned as sham (anesthetic) or naive controls. Seven months after the cranial irradiation, three main groups of mice (Control, Sham and Rad) were first assigned for Open Field test to measure the locomotor activity, and afterwards for Morris Water Maze paradigm to test the hippocampal dependent spatial learning and long term memory. No significant difference was observed between the groups in Open Field test. Meanwhile, in the Morris Water Maze experiments, Rad+ and Rad++groups displayed significantly weaker cognitive abilities as compared to the controls. Lastly, a significant dose-dependent difference of irradiation was also detected. 
Following Morris Water Maze experiments, we employed immunohistochemical stainings (im) with phenotypic neuronal and epigenetic markers to test the ongoing neurogenesis and epigenetic events in the P231 hippocampi. We found a significant decrease of Doublecortin (DCX)-im (immature neuron marker) at the inner granule cell layer of dentate gyrus of irradiated mice as compared to the controls. In the same hippocampal regions, there were also significant reduction of Methyl-CpG Binding Protein 2-im positive cells a well-known DNA methylation determinant. 
Our overall data suggests that exposure of cranial irradiation to the young brain alters not only the neurogenesis but also the epigenetic profile in adult hippocampus which may reflect the cellular base of the weakened cognitive abilities observed in the Morris Water Maze experiments. understanding the mechanisms by which ionizing radiation affects epigenetic programming will provide insight into how to develop protection against the potentially harmful risks associated with radiation exposure.

Keywords: Adult Hippocampal Neurogenesis, Cranial Irradiation, DNA methylation, Epigenetics