Laktik asit bakterilerinden antimikrobiyal peptid üretimi ve prostatkanserine karşı antikanserojenik etkilerinin belirlenmesi
Antimicrobial peptide production from lactic acid bacteria anddetermination of anticarcinogenic effects against prostate cancer
Yazar: CEYDA ÖZEN
Danışman: PROF. DR. ALPER AKKAYA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Antikanser = Anticancer ; Antimikrobiyal peptidler = Antimicrobial peptides ; Lactobacillus casei = Lactobacillus casei ; Lactococcus lactis = Lactococcus lactis ; Pankreas kanseri hücre hattı =   ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
Kanser, dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir. Direnç, özgüllük eksikliği, şiddetli toksisite gibi konvansiyonel kemoterapinin sakıncaları, kanser tedavisi için alternatif bir yaklaşım bulma ihtiyacını ortaya çıkarmıştır. Kanser tedavilerinde uygulanan kemoterapi ve radyoterapi yöntemlerinin organizma üzerinde yarattığı olumsuz etkileri azaltmak veya tamamen ortadan kaldırmak amacıyla kanser tedavisinde kullanılması olası alternatif yeni biyomoleküllerin ve bunların kullanım potansiyellerinin araştırılması önem taşımaktadır. Birkaç çalışma; antikanser peptidleri (ACP'ler) olarak sınıflandırılan, antitümör aktiviteye sahip, katyonik düşük moleküler ağırlıklı peptidlerin varlığını ortaya koymuştur. Aslında çeşitli organizmalardan izole edilen ve tarihsel olarak antimikrobiyal aktiviteleri ile bilinen katyonik peptidler, 1985 yılında incelenmiş ve güçlü antikanser ajanlar olarak tanımlanmıştır. Fakat kanser tedavisinde uygulanan tedavi yöntemlerinin sınırlayıcı ve olumsuz etkileri günümüzde antikanser peptidlere olan ihtiyaç ve önemi ön plana çıkarmıştır.
ACP'lerin seçici hedefleri olan, kanser hücrelerinin negatif yüklü membran lipitlerine sahip olması nedeniyle, bu peptidlerin kanseri tedavi etmek için kullanımı önemli ölçüde ön plana çıkmıştır. Ek olarak, kanser hücresi zarları birçok mikrovillusa sahiptir ve bu nedenle sağlıklı hücrelere kıyasla ACP'lerle etkileşim için daha büyük bir yüzeye sahiptir.
Bu noktadan hareketle; yapılan bu tez çalışmasında antimikrobiyal madde oluşturma yeteneklerinde önemli bir paya sahip olan bakteriyal suşlardan, doğal antimikrobiyal maddeler ya da doğal koruyucular olarak bilinen protein yapısındaki bakteriyosin orijinli antimikrobiyal peptidlerin (AMP), kanser tedavisinde kullanım olanaklarının araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda planlanan çalışmalar sonucunda prostat kanseri üzerinde etkili, yeni ACP'lerin tanımlanması hedeflenmiştir. Tez denemeleri; mikrobiyolojik, biyoproses, hücre kültürü gibi yöntemlerden yararlanılarak yürütülmüştür. Bu denemeler kapsamında, GRAS olarak 3 laktik asit bakterisi (Lactococcus lactis (ATCC 7962), Lactobacillus casei (ATCC 393) ve Enterococcus faecalis (ATCC 51299)) belirlenmiştir. AMP üretimi için de besiortamı, pH, sıcaklık optimizasyonları yapılmış, üretilen AMP'ler antimikrobiyal testler kullanılarak tespit edilmiştir. 
 L. lactis (ATCC 7962)'ten üretilen AMP, 56 saat sonunda pH 6'da MRS broth ortamında en yüksek zon çapını gösterirken; L. casei (ATCC 393)'den üretilen AMP, 52 saat sonunda pH 6'da MRS broth ortamında en yüksek zon çapını göstermiştir. Üretici suşlardan E. faecalis (ATCC 51299), belirlenen AMP üretim ortamlarından hiçbirinde zon çapı vermemiş olup deneysel aşamaların devamında kullanılmamıştır. Optimum koşullarda üretilen AMP'lerin saflaştırılması amacı ile sırasıyla amonyum sülfat çöktürmesi, ultrafiltrasyon, Sephadex-G75 jel filtrasyon kromotografisi ve hem katyonik hem de anyonik peptidlerin tespiti amacı ile DEAE Sephadex ve CM-52 iyon değişim kromatografileri yapılmıştır. Yapılan denemeler sonunda elde edilen AMP fraksiyonları -86°C'de muhafaza edilmiştir. AMP fraksiyonlarının konsantrasyonu, BCA protein tespiti ile belirlenirken moleküler ağırlıkları hakkında bilgiye, gerçekleştirilen Tris-Tricine SDS-PAGE ile ulaşılmıştır. Tris-Tricine SDS-PAGE ile gerçekleştirilen deneme sonunda elde edilen 4 AMP fraksiyonunun da 5kDa'dan küçük ağırlığa sahip olduğu bulunmuştur. En yüksek zon çapının elde edildiği test mikroorganizması S. Mutans'a karşı hücre çeperindeki morfolojık değişimlerin gözlenmesi amacı ile SEM ile görüntüleme yapılmıştır. AMP'lerin üretim ve saflaştırma işlemlerinin tamamlanmasının ardından, PC-3 prostat kanseri hücre hattı üzerinde etkin dozları belirlenmiştir. Etkin dozlarda, AMP ilavesi ile PC-3 üzerinde adhezyon, invazyon, apoptoz ve morfolojik değişimleri incelenmiştir. Elde edilen veriler ışığında her bir AMP, adhezyon testleri sonucunda eşit sayıda hücre ekimi gerçekleştirilen flasklara, etkin dozlarda peptid ilavesinden 24 saat sonrasında elde edilen hücre sayılarına bakılarak, AMP'lerin tamamının en az %50 olacak biçimde adhere olma yeteneklerinde kayba yol açtığı tespit edilmiştir. Sırası ile C4, C5, L5 ve L4 AMP'lerinin PC-3 kanser hücre hattının adhere olma yeteneğini baskıladığı görülmüştür.
Hücre göçünü ve aynı zamanda yara iyileşmesini gösteren invazyon denemelerinde ise; 56,48182 µm bir yarık ile 48 saatlik başlatılan kontrol denemesi tamamen kapanırken; L4 için 33,33 µm'den 18,26 µm 'ye, L5 29,14 µm'den 21,72 µm'ye; C4 59,50µm'den 34,06 µm 'ye, C5 64,89µm'den 34,53µm 'ye olmak üzere %100-45,22 - 25,47 - 42,75 - 46,78 kapanma oranı göstermiş olup adhezyon denemesini destekler nitelikte sonuçlar vermiştir. Benzer şekilde etkin dozlarda AMP ilavesi ile gerçekleştirilen apoptoz denemesinde PI ile boyama yapılmış olup, floresans mikroskop kullanılarak tahlil yapılmıştır. Deneme sonunda elde edilen değerler birbirine oldukça yakın ve %50'nin üzerindedir. Bu gözlem beklenmekte olan bir sonuçtur. Etkin dozlarda ilave edilen AMP'lerde hali hazırda IC50 değeri esas alındığından dolayı %50'lik bir ölüm sergilemesi beklenmektedir. Bunun yanı sıra hazırlık sürecinde Tripsin-EDTA ile kaldırılan ve propidium iyodür ile karanlık ortamda bekletilen örneklerde bir miktar ölüm olması beklenmektedir. Aynı zamanda floresan mikroskop altında apoptoza yeni giren (dış çeperi kırmızı fakat iç kısımları halen yeşil gözüken ) birçok hücre görülmüş olup bu hücreler apoptotik indekste ölü olarak sayılmıştır. Son olarak bakteriler üzerindeki etkilerinin gözlenmesinin yanısıra benzer hücre çeperlerine sahip kanser hücresi üzerinde de durumun tespiti amacı ile etkin dozlarda AMP ilave edilen hücrelere SEM görüntülemesi yapılmış olup kontrol olarak bırakılan kanser hücreleri ile karşılaştırılmıştır.
Özetle, dağıtımlarını kolaylaştırabilen yeterli sistemlerin geliştirilmesi, sınırlayıcı sorunlardan biri olmaya devam etse de bugüne kadar AMP'ler, hem bakteriyel enfeksiyonlarda hem de kanserde savaşabilen tek ilaç sınıfı haline gelmesi için tüm temel özelliklere potansiyel olarak sahiptir. Bu tez kapsamında yürütülen çalışmalar, AMP olan bakteriyosinlerin anti-tümörojenik etkideki rollerinin belirlenmesi ve ACP olarak kullanılıp kullanılamayacağının araştırılması açısından hem medikal alanda hem de gıda ve özellikle klinik beslenme alanında önemli etkiler yaratacaktır.

Abstract:
Cancer is one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide. The drawbacks of conventional chemotherapy such as resistance, lack of specificity and severe toxicity have revealed the need to find an alternative approach for cancer treatment. In order to reduce or completely eliminate the negative effects of chemotherapy and radiotherapy methods on the organism, it is important to investigate alternative new biomolecules and their potential for use in cancer treatment.
Several studies have revealed the existence of cationic low molecular weight peptides with antitumour activity, classified as anticancer peptides (ACPs). In fact, cationic peptides isolated from various organisms and historically known for their antimicrobial activity were analysed in 1985 and identified as potent anticancer agents. However, the limiting and negative effects of the treatment methods applied in cancer treatment have brought the need and importance of anticancer peptides to the forefront.
Since cancer cells have negatively charged membrane lipids, which are the selective targets of ACPs, the use of these peptides to treat cancer has come to the fore significantly. In addition, cancer cell membranes have many microvilli and therefore have a larger surface for interaction with ACPs compared to healthy cells.
From this point of view, in this thesis study, it was aimed to investigate the possibilities of using bacteriocin-derived antimicrobial peptides (AMPs) of bacterial strains, which have an important share in their ability to form antimicrobial substances, known as natural antimicrobial substances or natural preservatives, in cancer treatment. As a result of the studies planned for this purpose, it was aimed to identify new ACPs effective on prostate cancer. Thesis experiments were carried out by using methods such as microbiological, bioprocess, cell culture.
Within the scope of these experiments, 3 lactic acid bacteria (Lactococcus lactis (ATCC 7962), Lactobacillus casei (ATCC 393) and Enterococcus faecalis (ATCC 51299)) were identified as GRAS. The media, pH and temperature were optimised for AMP production and the AMPs produced were detected using antimicrobial tests.
AMP produced from L. lactis (ATCC 7962) showed the highest zone diameter in MRS broth medium at pH 6 after 56 hours, while AMP produced from L. casei (ATCC 393) showed the highest zone diameter in MRS broth medium at pH 6 after 52 hours. E. faecalis (ATCC 51299), one of the producer strains, did not show any zone diameter in any of the AMP production media and was not used in the rest of the experimental stages. Ammonium sulphate precipitation, ultrafiltration, Sephadex-G75 gel filtration chromatography and DEAE Sephadex and CM-52 ion exchange chromatography were performed for the purification of AMPs produced under optimum conditions. The AMP fractions obtained at the end of the experiments were stored at -86°C. While the concentration of AMP fractions was determined by BCA protein detection, information about their molecular weight was obtained by Tris-Tricine SDS-PAGE. At the end of the experiment performed with Tris-Tricine SDS-PAGE, it was found that all 4 AMP fractions obtained had a weight less than 5kDa. SEM imaging was performed to observe the morphological changes in the cell wall against the test microorganism S. mutans, in which the highest zone diameter was obtained. After the production and purification of AMPs, their effective doses were determined on PC-3 prostate cancer cell line. Adhesion, invasion, apoptosis and morphological changes were examined on PC-3 with the addition of AMP at effective doses. In the light of the data obtained, it was determined that all of the antimicrobial peptides caused a loss of adherence ability of at least 50% by looking at the cell numbers obtained 24 hours after the addition of effective doses of peptides to the flasks in which equal numbers of cells were seeded as a result of adhesion tests. C4, C5, L5 and L4 antimicrobial peptides suppressed the ability of PC-3 cancer cell line to adhere, respectively.
In the invasion experiments showing cell migration and wound healing at the same time; while the control experiment initiated for 48 hours with a slit of 56,48182 µm was completely closed; 33,33 µm to 18,26 µm for L4, 29,14 µm to 21,72 µm for L5; C4 from 59,50µm to 34,06 µm, C5 from 64,89µm to 34,53µm, showing a closure rate of 100-45,22 - 25,47 - 42,75 - 46,78%, supporting the adhesion experiment. Similarly, in the apoptosis experiment performed with the addition of effective doses of AMP, PI staining was performed and assayed using fluorescence microscope.

The values obtained at the end of the experiment are very close to each other and above 50%. This observation is an expected result. AMPs added at effective doses are expected to exhibit a 50% mortality since the IC50 value is already taken as basis. In addition, some mortality is expected in the samples removed with Trypsin-EDTA and kept in the dark with propidium iodide during the preparation process. At the same time, under fluorescence microscope, many cells that had just entered apoptosis (the outer wall was red but the inner parts were still green) were observed and these cells were counted as dead in the apoptotic index. Finally, in addition to the observation of the effects on bacteria, SEM imaging was performed on cells to which AMP was added at effective doses in order to determine the situation on cancer cells with similar cell walls and compared with cancer cells left as control.
 The studies carried out within the scope of this thesis will have important effects both in the medical field and in the field of food and especially clinical nutrition in terms of determining the role of AMP bacteriocins in anti-tumourigenic effect and investigating whether they can be used as ACP.  
In summary, although the development of adequate systems capable of facilitating their delivery remains one of the limiting issues, to date AMPs potentially possess all the essential properties to become the only class of drugs capable of fighting both bacterial infections and cancer.