Yüksek performanslı sıvı kromatografisi için immobilize enzim reaktörlerinin geliştirilmesi ve kinetik karakterizasyonu
Development and kinetic characterization of immobilized enzyme reactors for high performance liquid chromatography
Yazar: BEKİR ÇELEBİ
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN ALİ TUNCEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Tez kapsamında yüksek performanslı sıvı kromatografisi için immobilize enzim reaktörleri (Immobilized Enzyme Reactor, IMER) kolay bağlanma ve glutaraldehit aktivasyonu yöntemleri ile geliştirilmiş ve elde edilen kolonların kinetik karakterizasyonu yapılmıştır. IMER sentezleri partikül bazlı ve monolitik olmak üzere iki farklı şekilde gerçekleştirilirken yüzey alanı ölçümleri BET sisteminde, morfolojik yapı taramalı elektron mikroskobunda (SEM), gözeneklilik civa porosimetrede incelenmiş; kromatografik çalışmalar partikül bazlı kolonlar için sırasıyla HPLC ve µHPLC sistemlerinde, monolitik kolonlar için yalnızca µHPLC sisteminde yapılmıştır. Kinetik verilerin Michaelis-Menten modeli ile uyumu incelenmiş ve kinetik parametreler model yardımı ile bulunmuştur.Partikül bazlı immobilize enzim reaktörü (IMER), yüksek performanslı sıvı kromatografisi için ?-kemotripsin enziminin monodispers makrogözenekli poli(2,3-dihidroksipropil metakrilat etilen dimetakrilat), poli(DHPM-EDM) partiküllere kolay bağlanma yöntemi ile bağlanmasıyla elde edilmiştir. ?-kemotripsin immobilize partiküller daha sonra paslanmaz çelik HPLC kolonlarına (50x4.6 mm ID) yüksek basınç altında doldurulurarak IMER elde edilmiştir. Kolonun kinetik davranışı HPLC sisteminde mobil faz akış hızı, substrat beslenme konsantrasyonu ve sıcaklık değiştirilerek incelenmiş, bunun yanında tekrarlanabilirlik davranışı belirlenmiştir. Takip eden bölümde, monodispers-makrogözenekli formda poli(glisidil metakrilat-co-etilen dimetakrilat), poli(GMA-EDM) partiküllere glutaraldehit aktivasyonu ile ?-kemotripsin enzimi kovalent olarak bağlanmıştır. ?-kemotripsin immobilize partiküller paslanmaz çelik µHPLC kolonlarına (100x1.0 mm ID) yüksek basınç altında doldurulurak elde edilen IMER'ın kinetik davranışı µHPLC sisteminde aynı değişkenler değiştirilerek incelenmiştir.Kapiler monolitik formda immobilize enzim reaktörleri, ?-kemotripsin'in poli(GMA-EDM) monolite glutaraldehit aktivasyonu ile kovalent olarak bağlanmasıyla elde edilmiştir. Bu amaçla epoksi grubu içeren monolitik kolon (200 mm, 530 µm ID), amonyak çözeltisi ile etkleştirilerek, monolit yüzeyine primer amin grupları bağlanmıştır. Amin gruplu monolitik yapının glutaraldehit ile aktivasyonunun ardından ?-kemotripsin enziminin monolite kovalent olarak bağlanması sağlanmıştır. Kapiler formda, monolitik immobilize enzim reaktörü (µHPLC-IMER), aynı zamanda ?-kemotripsin enziminin poliDHPM-EDM) monolite kolay bağlanma yöntemi ile bağlanması ile elde edilmiştir. Her iki formdaki IMER'ın kinetik davranışı µHPLC yardımı ile mobil faz akış hızı, substrat beslenme konsantrasyonu ve sıcaklık değiştirilerek incelenmiştir. Elde edilen partikül bazlı ve monolitik IMER'ların kinetik davranışları karşılaştırmalı olarak incelenmiş ve kütle aktarım özellikleri tanımlanmıştır.

Abstract:
In the scope of thesis, immobilized enzyme reactors (IMER) were developed for high performance liquid chromatography by using the methods of click chemistry and glutaraldehyde activation. Moreover, obtained columns were characterized kinetically. IMER synthesis were made in two ways which based on particles and monolith. The surface areas were measured by using BET system, morphological structures were observed by using scanning electron microscope (SEM) and the porosity was determined by using mercury porosimeter. Furthermore, the chromatographic studies were conducted in both HPLC and µHPLC systems for the particle based columns and in only µHPLC for the monolithic columns. In addition, the consistency of kinetic data to Michaelis-Menten model was analyzed and the kinetic parameters were obtained by the help of this model.Particle based immobilized enzyme reactor (IMER) was developed by the attachment of ?-chymotrypsin to monodisperse-macroporous poly(2,3- dihydroxypropyl methacrylate ethylene dimethacrylate), poly(DHPM-EDM) particles, using the method of click chemistry. Then, stainless-stain HPLC columns (50x4.6 mm ID) were packed with ?-chymotrypsin immobilized particles under high pressure. The kinetic behavior of column was analyzed in HPLC system by changing the variables of mobile phase flow rate, substrate feed concentration and temperature. In addition to this, the reproducibility was tested. In the following part, ?-chymotrypsin was covalently attached to monodisperse-macroporous poly( glysidyl methacrylate-co-dimethacrylate), poly(GMA-EDM) particles via glutaraldehyde activation. Then, stainless-stain µHPLC columns (100x1.0 mm ID) were packed with ?-chymotrypsin immobilized particles under high pressure. The kinetic behavior was analyzed in µHPLC system by changing the same variables.Immobilized enzyme reactor in the capillary monolithic form, ?-chymotrypsin was covalently attached onto the poly(GMA-EDM) based monolithic structure via glutaraldehyde activation. For this purpose, monolithic column including epoxy group (200 mm, 530 µm ID) was interacted with ammonia solution and the primary amine groups were attached to the monolithic surface. Following to glutaraldehyde activation of monolithic structure including amine groups, ?-chymotrypsin was covalently linked. The capillary monolithic immobilized enzyme reactor (µHPLC-IMER) was also obtained by the attachment of ?-chymotrypsin onto the poly (DHPM-EDM) monolith via click chemistry. The kinetic behavior of IMER in both forms was determined in µHPLC by changing the variables of mobile phase flow rate, substrate feed concentration and temperature. The kinetic behaviors of the particle and monolith based IMERs were determined and their mass transfer properties were described.