Fare embriyonik kök hücrelerinin hücreler arası madde yoğunluğunun değiştirilerek farklılaştırılma süreçlerinin araştırılması
Investigation of the differentiation course of mouse embryonic stem cell depending on the extracellular matrix concentration
Yazar: BERRİN ÖZDİL
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN AKTUĞ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Doku formunu oluşturan hücresel bileşenlerin sürekliliği ve özelleşmesi hem yetişkin hem de gelişmekte olan organizmalarda önemli işlemlerdir. Pluripotent embriyonik kök hücreler, primitif organizmanın iç hücre kütlesinden elde edilir. Bu hücrelerin farklılaşması kademeli olarak gerçekleşir ve hücrelerin pluripotent özellikleri giderek azalır. Hücreler, hem hücre içi hem de hücre dışı sinyalleri sürekli olarak alırlar, böylelikle iç metabolik aktivitelerini düzenlerler. Niş, kök hücrelerin farklılaşmanın en önemli belirleyicilerinden biri olarak bilinir ve in vitro koşullarda in vivo ekstra selüler matriks (ESM) modelini taklit etmek için kullanılan birçok hidrojel vardır. En yaygın olarak kullanılan hidrojellerden biri matrijeldir. Bununla birlikte, kök hücrenin farklılaşma kapasitesi için matrijelin katkısı ve bu hidrojelin protein konsantrasyonu hakkında literatürde sınırlı bilgi vardır. Farklılaşmayı moleküler seviyede tespit etmek ve ayırt etmek için, evre-spesifik embriyonik antijen 1 (stage specific embryonic antigen 1=SSEA-1) ve Octamer-Binding Transcription Factor ¾ (Oct3/4) olarak adlandırılan embriyonik kök hücre belirteçleri kullanılır. SSEA-1 belirteci, diferansiye olmamış fare embriyonik kök hücre (fEKH) tanımlamasında kullanılır. Osteopontin (OPN = SPP1), farklılaşmada osteojenik belirteçlerden biridir ve osteoblastik hücrelerde eksprese edildiği bilinmektedir. Çalışmamızda, hücre döngüsü ve immünofloresan (IF) boyamalar aracılığıyla fEKH kapasitesi ve farklılaşma kabiliyeti manipüle edilerek sürecin geliştirmesi amaçlandı. Üç farklı konsantrasyon (2, 4, 6 mg/ml) ve üç zaman noktasına odaklanıldı (gün 1, 3, 6). Kök hücre kimliğini ve osteoblastik farklılaşmayı gözlemlemek için sırayla SSEA-1 ve OPN proteinlerine özel boyamalar yapıldı. fEKH'lerin kök hücre özelliklerinin, hücre döngüsü ve IF ile gösterilen ekstraselüler matriks protein konsantrasyonuna bağlı olarak değiştiği sonucuna varıldı. Gelecekteki çalışmalarda, in vitro olarak kök hücre farklılaşmasındaki ilerlemeler ile rejeneratif tıp alanında hücre-doku bazında replasman altyapısı sağlanacaktır. Dahası, ekstraselüler matriks ile fEKH etkileşimleri, ortak sinyal yolları kullandıkları için karsinogenez, epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) ve fibrotik bağ doku kökenli mekanizmaları da aydınlatabilir.

Abstract:
Maintenance and specification of the cellular components with constitution of the tissue form are important processes in both in the adult and developing organisms Pluripotent embryonic stem cells are obtained from the inner cell mass. Differentiation of embryonic stem cells gradually occurs and pluripotency of the cells progressively decreases. Cells continuously receive both intracellular and extracellular signals, in this way, regulate the inner metabolic activity. Niche of the stem cells are known to be one of the most important determinants for the differentiation and there are several hydrogels used for mimicking the extracellular matrix (ECM) pattern in vivo in in vitro conditions. One of the most widely used hydrogels is matrigel. However, there is limited knowledge about the additive effect of the matrigel and its protein concentration for differentiation capacity of the stem cell. To detect and distinguish differentiation at molecular level, there are several embryonic stem cell markers as stage-specific embryonic antigen 1 (SSEA-1) and Oct3/4. SSEA-1 markers are used in the mouse undifferentiated embryonic stem cell identification. OPN is one of the osteogenic markers in differentiation, and known to be expressed in osteoblastic cells. Our study aimed to improve our ability to manipulate the mouse Embryonic Stem Cell (mESC) capacity and differentiation capability via cell cycle, immunofluorescence (IF). We selected three different concentrations (2, 4, 6 mg/ml) and focused on three time points (day 1, 3, 6). To observe stem cell identity and osteoblastic differentiation, we stained SSEA-1 and osteopontin (OPN=SPP1), respectively. We concluded that the characteristics of the mESCs vary due to ECM protein concentration, shown by cell cycle and IF. In future studies, improvement the knowledge about stem cell differentiation in vitro will be the groundwork of the cell-tissue replacement in the field of regenerative medicine. Moreover, mESC interactions with ECM may shed light upon the carcinogenesis, epithelial mesenchymal transition (EMT) and fibrotic connective tissue based mechanisms, since they use common signaling pathways.