Nörofibromatozis tip 1 geninde belirlenen kırpılma bölgesi varyasyonlarının RNA düzeyindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of splicing region variations determined in neurofibromatosis type 1 gene on RNA level
Yazar: CEYHAN ÜNLÜ
Danışman: DOÇ. DR. SELMA DEMİR
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Nörofibromatozis tip 1, Nörofibromin 1 (NF1) tümör baskılayıcı geni üzerinde gerçekleşen mutasyonların sebep olduğu, otozomal dominant kalıtılan bir tümör yatkınlık sendromudur. Nörofibromatozis tip 1'in ortalama küresel prevalansı 1/ 3.000'dir. Bütün etnik gruplarda görülebilen bu rahatsızlık sıklıkla dermatolojik, ortopedik, merkezi ve periferik sinir sitemlerini etkileyen multisistemik bir hastalıktır.  
Bu çalışma kapsamında, Trakya Üniversitesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı Genetik Hastalıklar Değerlendirme Merkezi'nde DNA'dan yapılan analizlerde NF1 geni kırpılma bölgesi varyasyonları tespit edilmiş dört NF1 olgusunun genomik DNA'da belirlenen varyasyonlarının RNA düzeyindeki sonuçlarının, olgulara ait iki farklı dokuda iki farklı Yeni Nesil Dizi Analizi yaklaşımı ve Sanger sekans ile karşılaştırmalı olarak analizi gerçekleştirilmiş, aynı zamanda, olguların ve sağlıklı kontrollerin cilt biyopsisi ve kan dokularına ait transkriptom verileri karşılaştırılarak nörofibromatozisle ilişkili olabilecek gen ekspresyon farklılıkları araştırılmıştır. Çalışmamızda, daha önce herhangi bir çalışmada RNA düzeyindeki etkisi bildirilmemiş (NF1): c.730+2T>G varyasyonun çerçeve kayması sonucu erken dur kodonu oluşumuna neden olduğu iki farklı dokuda ilk olarak gösterilmiştir. Literatürde daha önce kan dokusundan izole edilen RNA'da c.7970+4_7970+7del sonucu erken terminasyona neden olduğu bildirilen varyasyonunun, aynı mutasyonu taşıyan olgumuzda, iki farklı dokuda farklı sonuçlara neden olduğu; olgumuzun cilt biyopsisinde 54. ekzonun atlanması sonucu erken dur kodonu oluşturduğu ancak kandan izole edilen RNA'da az sayıda transkriptte iki ekzonun atlanarak takip eden intronun kısmen dahil edildiği ek bir alternatif kırpılmaya neden olduğu ilk kez gösterilmiştir. Çalışmamız kapsamında, olgu ve kontrollere ait tüm transkriptom verilerinin karşılaştırılması sonucunda, cilt biyopsilerinde melanin biyosentezi ile ilgili önemli bir yolak olan L-dopakrom yolağı elemanlarının transkript düzeylerinin anlamlı farklılıklar gösterdiği (p<0.05), mRNA translasyonunda stresle ilişkili sinyallerin işlenmesinde görev alan EIF2 sinyal yolağınının olgularda, kontrollere oranla anlamlı düzeyde aktive olduğu yapılan kanonik yolak analizleri ile belirlenmiştir. 
Başlangıç materyali olarak DNA yerine RNA'nın kullanıldığı genetik analiz algoritmaları tüm dünyada rutin uygulamalarda henüz tam anlamıyla optimize olmuş değildir. Yaptığımız çalışmada, tüm transkriptom analizlerinde NF1 geni transkript düzeylerinin kontrollere göre anlamlı oranda düşüş gösterdiği ve bu nedenle, olguların klinik bilgileri ile birlikte değerlendirildiğinde RNA'dan tanıya gidilmesi halinde Nörofibromatozis Tip 1 tanısı için yönlendirici olabileceği görülmüştür. Ancak, NF1, genel olarak düşük düzeyde ifade edilen bir gen olduğu için tüm ekzonlarda yüksek derinlikli okumaların elde edilmesi, tüm transkriptom verileri içerisinde mümkün olmamış, kırpılma bölgesi mutasyonunun oluşturduğu yeni transkriptin tam olarak karakterizasyonu için RNA'nın hedefli Yeni Nesil Dizi Analizi ve Sanger ile dizilenmesinin daha belirleyici olduğu görülmüştür. Bununla birlikte, olgu ve kontroller arasında transkriptom verilerinin karşılaştırılmasının hedeflenebilir yolaklar ve moleküler patolojik mekanizmalar ile ilgili önemli bilgiler sağladığı, Nörofibromatois Tip 1 hastalığına neden olan kırpılma bölgesi varyasyonları özelinde gösterilmiştir.  Bu pilot çalışma, sağlıklı gönüllülere ait cilt biyopsisi ve kan örneklerinden izole edilen RNA kütüphanelerinin masif paralel sekanslanması ile elde edilen transkriptom verilerinin, merkezimizin ileriki RNA temelli çalışmaları için altyapı oluşturması bakımından da önem arz etmektedir.

Abstract:
Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal dominant tumor predisposition syndrome caused by mutations in the neurofibromin 1 (NF1) tumor suppressor gene. The average global prevalence of neurofibromatosis type 1 is 1 in 3.000. This condition, which can occur in all ethnic groups, is a multisystemic disease that often affects the dermatological, orthopedic, central, and peripheral nervous systems.
In this study, the genomic DNA of four NF1 cases with identified NF1 gene splicing region variations was analyzed using two different Next-Generation Sequencing approaches and Sanger sequencing. The results of these variations at the RNA level were compared in two different tissues from the cases. Additionally, gene expression differences that may be associated with neurofibromatosis were investigated by comparing the transcriptome data of the cases and healthy controls from skin biopsies and blood tissues. In our study, it was first demonstrated that the c.730+2T>G variation in the NF1 gene resulted in a frameshift and premature stop codon formation at the RNA level in two different tissues, which has not been reported previously at the RNA level in any study. The c.7970+4_7970+7del variation, previously reported to cause premature termination in RNA sample isolated from blood tissue, was shown to have different outcomes in two different tissues in our case carrying the same mutation. In the skin biopsy of our case, it led to the formation of a premature stop codon by skipping exon 54, but in RNA isolated from blood, it caused an additional alternative splicing where the subsequent exon was partially included after skipping the two exons, which was shown for the first time. In our study, when all transcriptome data of the cases and controls were compared, significant differences in the transcript levels of elements in the L-dopachrome pathway, an important pathway related to melanin biosynthesis in skin biopsies, were observed (p<0.05). Canonical pathway analysis determined that the EIF2 signaling pathway, involved in processing stress-related signals in mRNA translation, was significantly activated in the cases compared to the controls.
Genetic analysis algorithms that use RNA instead of DNA as the starting material have not yet been fully optimized in routine applications worldwide. In our study, significant decreases in NF1 gene transcript levels compared to controls were observed in all transcriptome analyses. Therefore, when evaluated together with the clinical information of the cases, it was observed that RNA-based diagnosis could be guiding for the diagnosis of neurofibromatosis type 1. However, since NF1 is generally a lowly expressed gene, obtaining high-depth reads in all exons was not possible within whole transcriptome data. It was found that targeted Next-Generation Sequencing and Sanger sequencing of RNA were more conclusive for the full characterization of the novel transcript created by the aplicing region mutation. Nevertheless, comparing transcriptome data between cases and controls provided important information about targeted pathways and molecular pathological mechanisms, specifically regarding splicing region variations causing Neurofibromatosis type 1. This pilot study is also important for establishing backgroundfor our center's future RNA-based studies, as it involves the massive parallel sequencing of RNA libraries isolated from skin biopsies and blood samples of healthy volunteers.