A 549 akciğer adenokarsinom ve SK-MES-1 akciğer skuamöz hücreli karsinom hücre kültürleri üzerinde, alfa-bungarotoksin (alfa 7 nikotinik asetilkolin reseptör antagonist) ile sisplatinin (alkilleyici-benzer ajan) tek tek ve kombine kemoterapötik etkinliklerinin değerlendirilmesi
The evaluation of the effectiveness of alpha bungarotoxin (alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor antagonist) individually and combined with cisplatin (alkylating-like drug) on A549 lung adenocancer cell line and SK-MES-1 lung squamous cell cancer cell line
Yazar: YAKUP ARSLAN
Danışman: DOÇ. DR. ARZU BALKAN
GATA / Tıp Fakültesi / Göğüs Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Göğüs Hastalıkları = Chest Diseases
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Asetilkolin = Acetylcholine ; Karsinoma-yassı hücreli = Carcinoma-squamous cell ; Nikotin = Nicotine ; Sisplatin = Cisplatin

Özet:
Nikotin, tütün içeriğinin temel aktif komponentidir. Nikotinin, akciğer epitel hücreleri dahil olmak üzere, nöronal olmayan alanlarda varolduğu gösterilen nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChR) ve özellikle de alfa (?)7-nAChR'leri üzerinde agonistik aktivite göstererek normal ve kanseröz hücrelerin hem proliferasyonunu stimüle ettiği, hem de bu hücreleri ekstraselüler stres ve antikanser ilaçlarla indüklenen apoptozise karşı koruduğu gösterilmiştir.Çalışmamızda, ?lfa-Bungarotoksin (?-Bgtx) ve sisplatinin tekli ve kombine olarak SK-MES-1 hücre kültürü üzerinde uygulanması sonrası XTT ile yapılan ölçümde kontrole göre tüm dozlarda (p=0,001), sisplatin ile elde edilen sitotoksisitenin kontrol grubu kabul edilerek yapılan ölçümde de, A-549 üzerinde sadece 1 nM ?-Bgtx'nin (p=0,006), SK-MES-1 üzerinde de 1 nM ve 1 pM ?-Bgtx'nin (p<0,001) istatistiksel olarak anlamlı sitotoksisite oluşturduğu tespit edildi. Sitotoksisitenin RTCA XCelligence ile değerlendirmesin de de, ne tekli ne de kombine uygulamada A 549 üzerinde istatistiksel olarak anlamlı sitotoksisite gözlenmezken, SK-MES-1 üzerinde hem tekli hem de kombine uygulamada istatistiksel olarak anlamlı düzeyde sitosoksisite elde edildi (p<0,001). Sisplatin ile elde edilen sitotoksisitenin kontrol grubu olarak kabul edilerek yapılan karşılaştırmada ise ?-bgtx'nin 1pM ve 1nM konsantrasyonlarında tekli sisplatinle kombine uygulamada istatistiksel olarak anlamlı düzeyde sitotoksisite oluşturduğu bulundu (p<0,001). Apoptotik etkinlik değerlendirilmesi, öncelikle bax, bcl-2 ve kaspaz-3 genlerinin m RNA düzeylerinin kontrol değerleri ile karşılaştırılması ve erken apoptotik hücre yüzdesinin tespiti ile yapıldı. SK-MES-1 hücre kültüründe BAX (proapoptotik) gen düzeyinin, hem 0,1 µM sisplatin (p=0,004) hem de ?-bgtx'nin tekli 1p M (p=0,001) ile tekli 1 n M ve kombine 1pM ve 1nM konsantrasyonlarında (p<0,001), BCL-2 (antiapoptotik) gen düzeyinin de hem 0,1 µM sisplatin (p=0,016) hem de ?-bgtx'nin tekli ve kombine 1pM ve tekli 1nM ( p=0,001) ve kombine 1 n M (p<0,001) konsantrasyonlarında, KASPAZ-3 gen düzeyinin de hem 0,1 µM sisplatin (p=0,006) hem de ?-bgtx'nin tekli 1nM (p=0,016) ve kombine 1pM (p=0,001) ve 1nM (p=0,001) konsantrasyonlarında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığı tespit edilmiştir. A 549 hücre kültüründe BAX gen düzeyinin ?-bgtx'nin tekli 1pM (p=0,001) ve 1nM (p<0,001) ve kombine 1nM (p=0,004) konsantrasyonlarında, BCL-2 gen düzeyinin hem 0,1 µM sisplatinin (p=0,001) ve kullanılan diğer dozlarda ?-bgtx'nin tekli 1pM ve 1nM ( p=0,001) ve kombine 1pM (p=0,001) ve 1nM (p<0,001) konsantrasyonlarında ve KASPAZ-3 gen düzeyinin hem 0,1 µM sisplatin (p=0,006) hem de ?-bgtx'nin kombine 1pM (p=0,001) ve 1nM (p=0,006) konsantrasyonlarında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığı tespit edilmiştir. Erken apoptotik hücre yüzdesinin değerlendirilmesinde de; ?-bgtx ve sisplatinin SK-MES-1 hücre kültürü üzerinde tekli ve kombine uygulanmasında (p<0,001), A549 hücre kültürü üzerinde sadece 1pM ve 1 nM ?-bgtx (p<0,001) uygulanmasında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığı tespit edilmiştir. Alfa-Bgtx'nin tekli ve sisplatin ile kombine olarak kullanımı ile etiyolojisinde tütün kullanımının daha yüksek oranda bulunduğu SK-MES-1 akciğer skuamöz hücreli kanser hücre kültüründe gerek sitotoksisite ve gerekse apoptotik etkinlik açısından istatistiksel olarak daha anlamlı sonuçlar elde ettik. İnvitro olarak hücre kültürleri üzerinde elde ettiğimiz bu sonuçların invivo çalışmalara temel teşkil ederek akciğer kanser tedavisine yeni bir boyut getireceğini ümit etmekteyiz.Anahtar Kelimeler: alfa-bungarotoksin, alfa-7nAChR, nikotin, akciğer kanseri

Abstract:
Nicotine is the essential active component of the tobacco involvement. It has been demonsrated that, nicotine stimulates the proliferation of normal and cancerogenic cells, and protects these cells against the apoptosis induced by anticancer agents and extracellular stress acting as an agonist on the nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) especially on alpha 7 nAChR which identified on the non-neuronal tissues including the lung airway epithelium.We had used alpha bungarotoxin (?-bgtx), with and without cisplatin on SK-MES-1 cancer cell line, the cytotoxic effects of all dosage were considered to be significant (p=0,001). When we had accepted the result of 0,1 µM of cisplatin as a new control group, the cytotoxicity of the 1nM of ?-bgtx on both A549 (p=0,006) and SK-MES-1 (p<0,001) and 1 pM of ?-bgtx on SK-MES-1 (p<0,001) were considered to be significant. Detecting cytotoxicity of all with RTCA XCelligence system on A549 cell line were not considered to be significant, on SK-MES-1 were considered to be significant ( p<0,001). When we had accepted the cytotoxicity result of cisplatin as the control group, the results of ?-bgtx with and without cisplatin were considered to be significant ( p<0,001). The evaluation of apoptotic effects were accomplished firstly by comparison of m RNA level of BAX, BCL-2 and CASPASE-3 genes and second ly by counting the percentage of early apoptotic cells measured on the cell lines after the the drug usages with the control group. On SK-MES-1 cell line; the level of BAX gene (proapoptotic gene) as the results of 0,1µM of cisplatin(p=0,004 ) and with the dosage of 1 pM of ?-Bgtx (p=0,001), and the results of other usages (p<0,001), the level of BCL-2 gene (anti-apoptotic gene) as the results of 0,1µM of cisplatin (p=0,016 ) and combined 1 nM (p<0,001), and the results of other usage (p=0,001) , the level of CASPASE-3 had been measured as heightened with the results of 0,1µM cisplatin (p=0,006 ) and with the dosage of 1 nM of ?-Bgtx.(p=0,016), combined form of 1 pM and 1 nM of ?-Bgtx (p=0,001) were considered to be significant. On A549 cell line; the level of BAX gene had been measured as heightened with the results of 1 pM of ?-Bgtx.(p=0,001), 1 nM of ?-Bgtx. (p<0,001) and both combined form of 1 nM of ?-Bgtx ( p=004), the level of BCL-2 gene had been measured as heightened with the results of 0,1 µM of cisplatin (p=0,001 ) and with the dosage of 1 pM and 1 nM of ?-Bgtx. (p=0,001), combined 1 pM of ?-Bgtx (p=0,001) and combined 1 nM of ?-Bgtx (p<0,001), and the level of CASPASE-3 had been measured as heightened with the results of 0,1µM of cisplatin (p=0,006 ) and with the combined dosage of 1 pM of ?-Bgtx. (p=0,001), and 1 nM of ?-Bgtx.(p= 0,006) and were considered to be significant.On detecting the percentage of early apoptotic cells; on SK-MES-1, the usage of the all dosages of the drugs with alone and combined (p<0,001) and only 1 p M of ?-Bgtx on A 549 cell line were considered to be significant (p<0,001).When all the results had been evaluated thoroughly, the result of using ?-Bgtx with and without cisplatin were considered to be significant especially on SK-MES-1 squamous lung cancer line on which the tobacco using was the main responsible agent with a great percentage.We hope that, the results of our study will be an era on lung cancer treatment and will form essentials for following in vivo studies.Keywords : alpha-bungarotoxin, alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) antagonist, nicotine, lung cancer.