Pinealektomi ve eksojen melatoninin sıçanlarda α-naftiltiyoüre tarafından ı̇ndüklenen pulmoner ödem üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of pinealectomy and exogenous melatonin on pulmonary edema induced BY α-naphtylthiourea in RATS
Yazar: MOHAMMED RAED ABDULLAH AL GBURI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MEHMET DEMİR
Karabük Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Alfa naftiltiyoüre = Alpha naphthylthiourea ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Melatonin = Melatonin ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Pinealektomi = Pinealectomy ; Pulmoner ödem = Pulmonary edema ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Akciğer ödemi, sıklıkla akut solunum yetmezliğine yol açan, yaygın klinik bir durumdur. Bu durum genellikle artmış sempatik sinir sistemi aktivitesi sonucu görülen pulmoner vazokonstriksiyon ile ilişkilidir. Pulmoner vasküler basınçlardaki ve pulmoner kan hacmindeki belirgin artışlar, artan pulmoner kapiller basıncın hidrostatik etkisi nedeniyle pulmoner ödem üretir. Fizyolojik olarak alveolar-kapiller membran, optimum gaz değişimi sağlarken, alveolar boşlukta sıvı birikimini önleyerek ve çözünen büyük maddelerin difüzyonunu sınırlandırarak bir bariyer görevi görmektedir. Alveolar sıvı absorbsiyonu ve sekresyonu arasındaki denge, alveolar boşlukta optimal gaz değişimini sürdürmek için kritik bir öneme sahiptir. Akciğer ödeminde alveolar-kapiller bariyerin geçirgenliğindeki artmanın sonucu protein bakımından zengin sıvının interstisyum ve alveolar boşluklara geçişi söz konusudur. 
Plevral boşlukta anormal miktarda plevral sıvı birikmesi plevral efüzyon, olarak tanımlanmaktadır ve bu durum çeşitli mekanizma ve hastalıkların neden olduğu yaygın bir sorundur. Hemen hemen her akciğer hastalığı ve akciğer dışı hastalıkların çoğu plevral efüzyonla ilişkili olabilir. Plevral efüzyon, özellikle solunum sistemini tehlikeye atan yaşa bağlı normal değişiklikler göz önüne alındığında, solunum sistemi üzerinde önemli etkiler yaratır. Özellikle pulmoner gaz değişimini yetersiz hale getirir, ancak sıvı hacmiyle orantılı olarak pulmoner fonksiyonda kısıtlayıcı değişikliklere neden olur ve akciğer kompliyansını azaltır.
Alfa-naftiltiyoüre (ANTU), rodendisit olarak geliştirilmiş kimyasal bir ajan olup doza bağlı bir şekilde özellikle kapiller endotel hücreleri hedef almaktadır. Yapılan çalışmalarda ANTU' nun yetişkin sıçanlarda pulmoner vasküler geçirgenliği arttırdığı bunun yanında akut pulmoner ödem ve plevral efüzyona neden olduğu gösterilmiştir. ANTU' nun pulmoner toksisitesi ve pulmoner vasküler geçirgenlik artışına yol açması ANTU' yu sıçanlarda birçok morfolojik çalışmada kullanılmak için akciğer ödeminin yaygın bir modeli haline getirmektedir. Standart deney modelinde sıçanlara intraperitoneal olarak ANTU uygulandığında 4 saat içinde akciğer ödemi ve plevral efüzyon ciddi düzeylere ulaşmaktadır. Oluşan ödem 24-48 saat içinde ya tamamen iyileşebilmektedir ya da durum giderek kötüleşerek ölüm ile sonuçlanabilmektedir. 

ANTU pnömotoksisitesinde, reaktif oksijen radikallerinin rol oynadığı gösterilmiştir Reaktif oksijen türleri (ROS), endojen kaynaklı normal oksijen metabolizmasının doğal bir yan ürünü olarak oluşabildiği gibi eksojen bir uyarana bağlı olarak da ortaya çıkan son derece reaktif moleküllerdir. Endojen olarak oluşan ROS (hidrojen peroksit, süperoksit anyon, hidroksil radikali), hücre homeostazında önemli rollere sahiptir. Aşırı üretildiğinde veya antioksidan seviyeleri ciddi şekilde tükendiğinde bu reaktif türler hücrenin lipid, protein ve DNA' sına saldırarak oksidatif hasara sebep olurlar. Süperoksit dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz ve ferroksidaz gibi endojen antioksidan enzimler, ROS aktivitelerini sonlandırabilmektedirler. Oksidatif stres kronik inflamasyona yol açabilir ve bu da kanser, diabetes mellitus, kardiyovasküler, nörolojik ve pulmoner hastalıklar gibi birçok hastalığın 
patogenezinde rol oynamaktadır. Reaktif oksijen ve nitrojen türleri, akciğerlerdeki patolojik inflamatuvar sürecin oluşumunda aracılık etmektedir ve akciğer epitelinin hasar görmesine neden olmaktadırlar. Akciğerdeki inflamatuvar yanıt sırasında, makrofajlar, nötrofiller ve lenfositler dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri aktive olur ve interleukin-1 beta (IL-1β), Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) ve benzerlerini serbest bırakır. IL-1β ve TNF-α, güçlü proinflamatuvar aktivitelere sahip oldukları ve çeşitli proinflamatuvar mediatörlerin salgılanmasını destekleyebildikleri için en önemli proinflamatuvar sitokinlerdir.
Başlıca pineal bezden sentezlenen melatonin (MLT), nöroendokrin bir hormondur. MLT, beyin-omurilik sıvısı, tükürük, safra, eklem sıvısı, amniyotik sıvı ve anne sütü de dahil olmak üzere tüm biyolojik sıvılar içinde mevcut bulunmaktadır. MLT, hidrofobik olması nedeniyle pasif difüzyonla membranları ve kan-beyin bariyerini geçme yeteneğine sahiptir. Pineal bezden ritmik MLT salgılanması, hipotalamusun suprakiyazmatik çekirdeğindeki sirkadiyen saat tarafından yönlendirilir. Bu saat, retinal ışığa maruz kalma yoluyla aydınlık/karanlık döngüsü ile senkronize edilmektedir. Sirkadiyen ritimler, bireylerin yaşadıkları çevredeki günlük değişikliklere göre fizyolojik ve patolojik yanıtların oluşturulmasında önemli rol oynamaktadırlar. Sirkadiyen ritmi düzenlemek için salgılanan MLT, reaktif türleri doğrudan süpürme ve antioksidan enzimlerin aktivitelerini arttırarak antioksidan savunma sistemini modüle etme kapasitesi sayesinde oksidatif stresi azaltan güçlü bir antioksidandır. Birçok çalışmada MLT'in oksidatif/nitrozatif strese karşı korumada etkili olduğu gösterilmiştir. MLT'in oksidatif stres üzerine etkisini, reaktif oksijen ve reaktif nitrojen türlerinin detoksifikasyonu şeklinde gösterdiği ileri sürülmektedir. Dolaylı etkisini ise pro-oksidan enzimlerin aktivitesini bastırırken antioksidan enzimleri uyararak göstermektedir. MLT ve metabolitleri bu etkileri sayesinde çeşitli hastalıklara karşı koruyucu etkilere sahiptirler. MLT'in pulmoner düzeyde de antioksidan ve vazodilatör özelliklere sahip olduğu ileri sürülmektedir. 

Bu çalışmanın amacı, ratlarda MLT yoksunluğunun (pinealektomi) ve eksojen MLT uygulamasının ANTU ile oluşturulmuş pulmoner ödem üzerine etkilerini gözlemlemekti. 
Bunun için akciğer dokularında malondialdehit (MDA), indirgenmiş glutatyon (GSH), toplam antioksidan durumu (TAS), toplam oksidan durumu (TOS), katalaz (CAT) ve süperoksit dismutaz (SOD) düzeyleri olmak üzere oksidatif stres belirteçleri belirlendi. IL-1β ve TNF-α çok sayıda inflamatuvar akciğer hastalığının gelişimine aracılık etmektedir. Bu yüzden çalışmamızda akciğer dokusunda IL-1β ve TNF-α seviyeleri araştırıldı. Akciğer dokusunda histopatolojik inceleme yapıldı.

Melatonin ve metabolitleri, hem serbest radikalleri temizleme yetenekleri hem de doku antioksidan kapasitesini artırma potansiyelleri sayesinde geniş spektrumlu antioksidanlardır. Melatonin'in farelerde siklofosfamid kaynaklı oksidatif akciğer toksisitesine karşı etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada GSH seviyeleri ile SOD ve CAT aktivitelerini önemli ölçüde düzelttiği ayrıca fare akciğer dokularında oksidatif toksisiteyi önlemeye yardımcı olduğu ortaya konmuştur. Yetişkin C57BL/6J farelerde akciğer iskemi-reperfüzyon hasarında melatoninin etkisinin araştırıldığı bir çalışmada ise, bu hasar neticesinde dolaşımdaki TNF-α ve IL-1β seviyelerinde artış bildirilmiştir. Melatoninin, oksidatif stres ve inflamasyonun inhibisyonu yoluyla akciğer iskemi-reperfüzyon hasarını hafiflettiği ortaya konmuştur. Bizim çalışmamızda ANTU uygulaması öncesi 30 gün boyunca melatonin takviyesi yapılması melatonin tedavi yapılmayan gruba göre (ANTU) akciğer IL-1β ve TNF-α seviyelerinde ciddi düşüşe sebep olmuştur. İlave olarak pinealektomi sonrası ANTU uygulaması yapılması, pinealektomi yapılmadan melatonin takviyesi yapılarak ANTU uygulaması yapılmasına kıyasla IL-1β ve TNF-α seviyelerinde ciddi artış gözlenmesine neden olmuştur. Çalışmamızda histopatolojik olarak ANTU grubunda konjesyon, yaygın inflamatuvar hücre infiltrasyonu ve interstisyel pulmoner ödem tespit edildi. ANTU+PINX grubunda hasarın şiddeti artmıştı. Melatonin injeksiyonu yapılan ANTU+MLT ve ANTU+PINX+MLT gruplarında hasarın ve histopatolojik değişikliklerin belirgin olarak azaldığı tespit edildi. Melatonin tedavisi akciğer efüzyon ve ödeminin gerilemesini ve akciğer mimarisinin iyileşmesini destekledi. 
Bu sonuçlar, kronik melatonin tedavisinin doğrudan süpürücü etkilerinin yanı sıra, nötrofil infiltrasyonunu inhibe ederek, oksidan-antioksidan durumunu dengeleyerek ve inflamatuvar mediatörlerin oluşumunu düzenleyerek melatoninin akciğer hasarına karşı antioksidan ve antiinflamatuvar bir etki sağladığını göstermektedir. Toplu olarak bu sonuçlar; melatoninin inflamasyonu baskıladığını ve melatoninin inflamatuvar bozuklukların tedavisi için potansiyel bir aday ajan olabileceğini desteklemektedir

Abstract:
Pulmonary edema is a common clinical condition and often leads to acute respiratory failure. This condition is generally associated with pulmonary venoconstriction, which is seen as a consequence of overactivity of the sympathetic nervous system. Significant increases in pulmonary vascular pressure and pulmonary blood volume lead to pulmonary edema due to the hydrostatic effect of increased pulmonary capillary pressure. Physiologically, the capillary-alveolar membrane provides optimal gas exchange, and acts as a barrier by preventing fluid accumulation in the alveolar space and limiting the diffusion of large solutes. The balance between alveolar fluid uptake and secretion is critical to maintaining optimal gas exchange in the alveolar space. As a result of the increase in the permeability of the alveolar-capillary septum in pulmonary edema, the protein-rich fluid passages into the interstitial and alveolar spaces.
 The abnormal accumulation of pleural fluid in the pleural space is defined as pleural effusion, this leads to a common problem caused by various mechanisms and diseases. Almost every pulmonary disease and most non-pulmonary diseases may be associated with pleural effusion. Pleural effusion has significant effects on the respiratory system, especially the normal age-related changes that compromise the respiratory system. especially, it makes pulmonary gas exchange insufficient, however causes restrictive changes in lung function proportional to the fluid volume and reduces lung compliance.
Alpha-naphthylthiourea (ANTU) is a chemical agent developed as a rodenticide that specifically targets capillary endothelial cells in a dose-dependent manner. Studies have shown that ANTU increases pulmonary vascular permeability in adult rats, as well as causes acute pulmonary edema and pleural effusion. The pulmonary toxicity and increased pulmonary vascular permeability of ANTU make ANTU a popular model for pulmonary edema that uses in several morphological studies in rats. In the standard experimental model, when ANTU is administered intraperitoneally to rats, pulmonary edema and pleural effusion reach dangerous levels within 4 hours. Edema that occurs can completely heal within 24-48 hours or the condition may gradually worsen and lead to death.

Reactive oxygen radicals have been shown a role in ANTU pneumotoxicity. Reactive oxygen species (ROS) are highly reactive molecules that can occur as a natural by-product of endogenous normal oxygen metabolism, or as a result of an exogenous stimulus. Endogenously formed ROS (hydrogen peroxide, superoxide anion, hydroxyl radical) has important roles in cell homeostasis. When ROS overproduced or when antioxidant levels are severely depleted, these reactive species cause oxidative damage by attacking cell lipids, protein, and DNA. Endogenous antioxidant enzymes such as superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and peroxidase can terminate the activities of ROS. ROS Oxidative stress can lead to chronic inflammation that plays a role in the pathogenesis of many diseases such as cancer, diabetes and cardiovascular, neurological, and pulmonary diseases. Reactive oxygen and nitrogen species mediate the pathological inflammatory process in the lungs and cause damage to the lung epithelium.
 
During the inflammatory response in the lung, released immune cells including macrophages, neutrophils, lymphocytes are activated and release interleukin-1-beta (IL-1β), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α). IL-1β and TNF-α are the most important proinflammatory cytokines for having strong stimulatory activities, also they can support the secretion of many inflammatory mediators.

Melatonin (MLT), is a neuroendocrine hormone, which is primarily made by the pineal gland MLT is found in all biological fluids, including cerebrospinal fluid, saliva, bile, joint fluid, amniotic fluid, and breast milk. Being hydrophobic, MLT has the ability to pass through membranes and the blood-brain barrier by passive diffusion. Rhythmic MLT secretion from the pineal gland is driven by the circadian clock in the suprachiasmatic nucleus of the hypothalamus. This clock is synchronized with the light/dark cycle by exposure to light in the retina. Circadian rhythms play an important role in the formation of physiological and pathological responses according to daily changes in the environment of individuals live. MLT Secreted to regulate circadian rhythm, MLT is a powerful antioxidant that reduces oxidative stress, its ability to directly seek reactive species and modulate the antioxidant defense system by increasing the activities of antioxidant enzymes. Several studies have shown that MLT is effective in protecting against oxidative/nitrous stress. It is suggested that MLT effect on oxidative stress by detoxification of reactive oxygen and reactive nitrogen species. Its indirect effect is shown by suppressing the activity of pro-oxidant enzymes while stimulating antioxidant enzymes. for these effects, MLT and its metabolites have protective effects against various diseases. MLT also have antioxidant and vasodilator properties at the pulmonary level.
 
The aim of this study was to observe the effects of lack of MLT (pinealectomy) and the addition of exogenous MLT on ANTU-induced pulmonary edema in rats. For this purpose, markers of oxidative stress were determined, including malondialdehyde (MDA) levels, low glutathione (GSH), total antioxidant status (TAS), total redox status (TOS), catalase (CAT), and superoxide dismutase levels (SOD). IL-1β and TNF-α mediate the development of several inflammatory lung diseases. 
Therefore, in our study, the levels of IL-1β and TNF-α in lung tissues were examined. Histological examination was performed on lung tissue.

Melatonin and its metabolites are broad spectrum antioxidants due to their ability to scavenge free radicals and their ability to increase tissue antioxidant capacity. In a study investigating the effects of melatonin against cyclophosphamide-induced oxidative lung toxicity in mice, it was revealed that it significantly improved GSH levels and SOD and CAT activities, and also helped prevent oxidative toxicity in mouse lung tissue. In a study investigating the effect of melatonin on lung ischemia-reperfusion injury in adult C57BL/6J mice, an increase in circulating TNF-α and IL-1β levels was reported as a result of this damage. Melatonin has been shown to alleviate lung ischemia-reperfusion injury through inhibition of oxidative stress and inflammation. In our study, supplying melatonin for 30 days before ANTU administration caused a serious decrease in lung IL-1β and TNF-α levels compared to the untreated group. In addition, supplying the ANTU after pinealectomy caused a significant increase in IL-1β and TNF-α levels compared to supplying the ANTU with melatonin supplementation without pinealectomy. In our study, histopathologically, congestion, diffuse inflammatory cell infiltration, and interstitial pulmonary edema were detected in the ANTU group. The severity of the injury increased in the ANTU+PINX group. It was determined that damage and histopathological changes were significantly reduced in ANTU+MLT and ANTU+PINX+MLT groups that received melatonin injection. Melatonin treatment promoted regression of pulmonary effusion and edema and improvement of lung architecture. 
These results show that, in addition to the direct scavenging effects of chronic melatonin therapy, melatonin provides an antioxidant and anti-inflammatory effect against lung injury by inhibiting neutrophil infiltration, balancing oxidative antioxidant status, and regulating the formation of inflammatory mediators. Collectively, these results support that melatonin suppresses pro-inflammatory mediators and that melatonin may be a potential candidate agent for the treatment of proinflammatory disorders.