Farklı nanopartiküler sistemler ve polimerik nanofiberler ile hazırlanan kombinasyon ürünlerinin geliştirilmesi
Development of combination products prepared with different nanoparticular systems and polymeric nanofibers
Yazar: GÜLÇİN ARSLAN AZİZOĞLU
Danışman: PROF. DR. KEVSER ÖZGEN ÖZER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Farmasötik kimya = Chemistry-pharmaceutical ; Farmasötik teknoloji = Technology-pharmaceutical ; Fibronektinler = Fibronectins ; Melatonin = Melatonin ; Nanolif = Nanofiber ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Polimerler = Polymers ; Yara iyileşmesi = Wound healing ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers

Özet:
Bu tez çalışmasında, yara iyileşmesinde kullanılmak üzere modüler yapı gösteren, hastaya ve yaraya göre birlikte sunulabilecek kombine sistemler hazırlanmıştır. Bu amaçla, tabaka tabaka kaplama yöntemi kullanılarak melatonin yüklü çok katlı nanopartiküller, elektro-çekim yöntemi ile nanofiberler hazırlanmıştır. Hazırlanan nanofiberler fibronektinin 9'uncu ve 10'unci Tip III tekrarından oluşan FNIII9*10 rekombinant peptit dizisi ile modifiye edilerek işlevselleştirilmiştir. Çok katlı nanopartiküllerin FNIII9*10 ile işlevselleştirilen nanofiberler ile birleştirilmesi ile kombine yara bakım ürünleri hazırlanmıştır. 
Tabaka tabaka kaplama yöntemi ile iki farklı yöntem kullanılarak ve üç farklı çekirdek malzeme ile çalışılarak çok katlı nanopartiküller hazırlanmıştır. Bu amaçla gümüş nanopartiküller ve poli(laktik asit-ko-glikolik asit) (PLGA) nanopartiküller ile çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Melatonin'in hem çekirdeğe hem de tabakalara yüklenmesi çalışmaları ayrı ayrı denenmiştir. En yüksek melatonin enkapsülasyonu %11.44 oranı ile PLGAMEL1 kodlu nanopartiküller ile elde edilmiş ve kitozan ile kaplanmıştır.  Önerilen kitozan kaplı melatonin yüklü PLGA çok katlı nanopartiküllerinin (PLGAMEL1/CHI) 0.15 partikül büyüklüğü dağılımına ve 280 nm partikül boyutu büyüklüğüne sahip küresel yapılar olduğu, fosfat tamponu içerisinde +56 mV zeta potansiyel değeri gösterdikleri tespit edilmiştir. In vitro salım çalışmaları bu sistemden melatoninin 3 saatte tamamen salındığını göstermiştir. 
Elektro-çekim yöntemi ile polietilenoksit (PEO), polivinil alkol (PVA) ve polikaprolakton (PCL) polimerleri ile nanofiberler elde edilmiştir. PCL nanofiberleri FNIII9*10 rekombinant peptidi ile modifiye edilerek işlevselleştirilmiştir ve protein miktar tayini çalışmaları ile %53.9 oranında peptidin PCL nanofiberlere tutunduğu tespit edilmiştir. Melatonin yüklü PCL nanofiberleri hazırlanmış ve bu formülasyon ile 5 günlük in vitro salım çalışması gerçekleştirilmiştir. 4°C, 25°C %60 nem ve 40°C %75 nem koşullarında 2 ay boyunca etkin madde miktarnda bir değişiklik gözlenmeyen melatonin yüklü PCL nanofiberlerin, melatonin yüklü PLGA nanopartiküllere göre melatonini daha yavaş saldığı tespit edilmiştir.  
Sonuç formülasyon olarak, FNIII9*10 peptidi ile işlevseleştirilmiş PCL nanofiberleri üzerine kitozan kaplı ve melatonin yüklü PLGA nanopartikülleri eklenerek liyofilizasyon işlemi sonucu kombine yara örtüsü elde edilmiştir. Melatonin yüklü PCL nanofiberleri ve FNIII9*10 ile işlevselleştirilmiş PCL nanofiberleri de son formülasyonlar olarak değerlendirilmiş, bu üç formülasyon ile hücre kültüründe etkinlik çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
Hücre kültürü çalışmaları ile MRC-5 insan akciğer fibrolastlarında melatonin'in proliferatif etki gösteren dozunun 125 µM'dan başladığı tespit edilmiştir. Buna göre 250 µM melatonin içeren formülasyonlar hazırlanarak insan deri fibroblast BJ hücre hattı ve insan immortalize keratinosit HACAT hücre hattında biyouyumluluk çalışması gerçekleştirilmiş ve önerilen formülasyonların bu hücre hatlarında herhangi sitotoksik bir etki göstermediği ve proliferasyonu kontrole göre artırdığı tespit edilmiştir. Hücrelerin nanofiberlere adezyonu floresan mikroskobu ve SEM ile alınan görüntüler ile gösterilmiştir. 2-kuyucuklu silikon insertler kullanılarak hücre kültüründe yara kapama deneyi hücre kültürü plakaları üzerinde formülasyonlarda kullanılan FNIII9*10, melatonin ve bu iki maddenin bileşiminin çözeltileri ile gerçekleştirilmiştir. 24 saatlik çalışma sonucunda sadece FNIII9*10 ve FNIII9*10 ve melatonin uygulanan hücrelerde oluşturulan yara modelinin tamamen kapandığı gözlenmiştir. 
Sonuç olarak, ESM'yi, hem fiziksel olarak hem de içeriğindeki maddeler ile biyokimyasal olarak taklit eden kombine yara bakım ürünleri başarılı bir şekilde hazırlanmış ve yapılan in vitro hücre kültürü çalışmaları ile etkinlikleri gösterilmiştir.

Abstract:
In this thesis, melatonin loaded multilayer nanoparticles were prepared by using layer-by-layer coating technology of nanoparticles and nanofibers were prepared by electrospinning method for modular wound healing applications. For this purpose, nanofibers were modified and functionalized with the FNIII9*10 recombinant peptide sequence, consisting of 9th and 10th type III repeats of fibronectin. Combined wound care products were prepared by combining multilayer nanoparticles with FNIII9*10 functionalized nanofibers.
Multilayer nanoparticles were prepared by layer coating technology of nanoparticles with three different core materials using two different methods. To achieve that, silver nanoparticles and poly(lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles were studied. Melatonin loading into both the core and the layers has been tried separately. Maxiumum melatonin encapsulation was achieved with PLGAMEL1 coded nanoparticles with a 11.44% encapsulation value and then this nanoparticles were coated with chitosan. Chitosan coated and melatonin loaded PLGA multilayerd nanoparticles (PLGAMEL1/CHI) were preapared as proposed formulation with a narrow particle dispertion value of 0.15, particle size of 280 nm and a zeta potential of +56 mV in phosphate buffer. In vitro dissolution studies revealed that all melatonin content in nanoparticles were released in 3 hours.
Polymers, such as polyethylene oxide (PEO), polyvinyl alcohol (PVA) and polycaprolactone (PCL) were used to obtain nanofibers via electrospinning method. PCL nanofibers were functionalized by FNIII9*10 recombinant peptide and protein quantification studies revealed that 53.9% of the peptide was succesfully attached to the nanofibers. Melatonin loaded PCL nanofibers were also prepared and an in vitro release study was performed for 5 days. Melatonin loaded PCL nanofibers showed a slower melatonin release than melatonin loaded PLGA nanoparticles. No significant changes were observed in drug content of melatonin loaded PCL nanofibers during 2 months stability testing in 4°C, 25°C 60% and 40°C 75% relative humidity conditions. 
Multilayer nanoparticles were combined with FNIII9*10 functionalized PCL nanofibers using lyophilization technique as one of the proposed final formulation. For this purpose, PLGAMEL1/CHI multilayered nanoparticle dispersion was added and mixed with FNIII9*10 functionalized PCL nanofibers in multiwell plates seperately and then the water content was lyophilized for two days to achieve the final wound healing scaffold. Melatonin loaded PCL nanofibers and FNIII9*10 functionalized PCL nanofibers were also evaluated as final formulations and cell culture studies were performed with these 3 final formulations.
MRC-5 human lung fibroblast cell line was used to determine the proliferative dose of melatonin. It was observed that significant cell proliferation starts from 125 µM melatonin application in this cell line. Final formulations consisting of 250 µM melatonin was prepared and biocompatibility studies were performed in human skin fibroblast, BJ and immortalized human keratinocyte, HACAT cell lines. No cytotoxicity effect was observed with the proposed final formulations. In fact, all formulations significantly improved cell proliferation values compared to the control. The adhesion of the cells to the nanofibers was demonstrated by fluorescence and electron microscopy. In vitro wound closure assay was performed using 2-well silicone inserts using solutions of FNIII9*10, melatonin and their mixture on cell culture plates. It was observed with optical imaging studies that, FNIII9*10 only and FNIII9*10 and melatonin mixture applications fully closed the wound area in 24 hours.
Finally, wound dressings that mimic ESM both physically and biochemically are successfully prepared and their activity and efficiency were demonstrated using in vitro cell culture studies.