Kanser kemoterapisinde kullanılan Paklitaksel'in uzun süreli hücre kültürlerindeki sitotoksisitesinin ve bu sitotoksisite üzerine kalsiyum kanal blokeri olan Amlodipin'in olası iyileştirici etkilerinin araştırılması
The cytotoxicity of Paclitaxel that is used in cancer chemotherapy to the long term-cultered cells, and possible terapeutic effects of Amlodipine, a calcium channel blocker, on the paclitaxel cytotoxicity
Yazar: SALTUK BUĞRA KARAHAN
Danışman: PROF. DR. ELVAN ÖZBEK
Atatürk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Amlodipine = Amlodipine ; Amnion = Amnion ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kalsiyum kanal blokerleri = Calcium channel blockers ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Paklitaksel = Paclitaxel ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Spektrofotometri = Spectrophotometry ; İn vitro = In vitro

Özet:
Kanser hastalarına uygulanan kemoterapi, sınırlı sayıda ilaçların kullanımı ile yapılan ve sonuçları önceden tam olarak kestirilemeyen bir tedavi yöntemidir. Ancak kanser ilaçlarının sağlıklı hücreler üzerine de olumsuz etkiler yaptığı bilinmektedir. Bu çalışmada, kanser kemoterapisinde kullanılan ilaçlardan biri olan Paklitaksel'in amniyon hücre kültürlerindeki toksik etkileri ve bu sitotoksisite üzerine Amlodipin'in (kalsiyum kanal blokeri) olası iyileştirici etkileri araştırıldı.Bu tez çalışması, Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin Histoloji ve Embriyoloji, Tıbbi Genetik ve Tıbbi Farmakoloji Anabilim Dallarının ortak çalışmasıyla gerçekleştirildi.Tıbbi Genetik Anabilim Dalı laboratuarlarına gönderilmiş olan amniyosentez örneklerinin rutin inceleme ve sonuçlandırmalarından sonra geriye kalan fazla amniyon hücre kültürleri, bu çalışmada kullanılmak üzere flasklara aktarıldı ve 37oC ısıda %5 CO2 içeren etüve konuldu. Yedinci günde, invert mikroskopta hücrelerin üremesi kontrol edildikten sonra medium değiştirmesi yapılarak tekrar aynı etüve bırakıldı. Her iki günde bir hücrelerin üreme durumuna bakılarak 14. gün sonunda kültürler çıkarıldı. Flask içerisine 3 ml Trypsin EDTA-C konularak hücreler yapıştıkları ortamdan kaldırıldı ve tüplere aktarılarak 400 g'de 10 dk santrifüj edildi. Süpernatant atıldıktan sonra, tüpün dibindeki hücrelerin üzerine 6 ml medium konuldu. Takiben bu hücre kültürü, her bir kuyucuğa 250 µl olacak şekilde plate'lere aktarıldı ve plate'ler etüvde inkübasyona bırakıldı. On-ondört günlük inkübasyon sonunda plate'lerdeki hücre kültürlerine amlodipin (Norvasc® 5 mg tablet, Pfizer) ve paklitaksel (Taxol® 6 mg/ml flakon, Bristol-Myers Squibb) uygulandı. Dört gün boyunca her gün kültür hacminin 1/10'u kadar (15-30 µl) amlodipin 10?5 M, 10?6 M ve 10?7 M konsantrasyonlarında verildi. Bunu takiben 5. günde, bu kuyucuklardan bazılarının üzerine yine kültür hacminin 1/10'u kadar (15-30 µl) 10?7 M veya 10?8 M konsantrasyonlarındaki paklitaksel bir sefere mahsus olmak üzere ilave edildi. Bazı kuyucuklardaki hücrelere ise amlodipin ve paklitaksel tek başına uygulandı. Kontrol grubuna ait kuyucuklara ise ilaç yerine, aynı miktarlarda medium konuldu. Bu şekilde toplam 12 deney grubu [Grup1 (kontrol), Grup2 (10-7 Paklitaksel), Grup3 (10-8 P), Grup4 (10-7 A+10-8 P), Grup5 (10-7 A+10-7 P), Grup6 (10-5 Amlodipin), Grup7 (10-6 A), Grup8 (10-5 A+10-7 P), Grup9 (10-6 A+10-7 P), Grup10 (10-5 A+10-8 P), Grup11 (10-6 A+10-8 P), Grup12 (10-7 A)] oluşturuldu. Deney sonunda, kültür plate'lerindeki hücrelerin viabiliteleri (canlılıkları) mQuant spektrofotometre ile ölçüldü. Deney gruplarına ait sayısal viabilite değerleri istatistiksel olarak birbiriyle kıyaslandı.Sonuç olarak; tek başına amlodipin (Grup 6, 7 ve 12), hücre viabilitesinde azalmaya yol açsa da, kontrol grubuyla kıyaslandığında istatistiksel olarak önemli bir sitotoksik etki oluşturmadığı görüldü (p>0,05). Tek başına paklitaksel, her iki konsantrasyonda da (10?7 ve 10?8 M, Grup 2 ve 3) anlamlı derecede sitotoksisiteye sebep oldu (p<0,05). Ancak, paklitaksel ile amlodipinin birlikte uygulandığı Grup 4, 5, 8-11 ile kontrol grubu (Grup 1) arasında istatistiksel yönden anlamlı bir fark olmadığı (p>0,05) ve böylece paklitaksele ait sitotoksik etkinin amlodipin tarafından ortadan kaldırıldığı saptandı. Özellikle Grup 2 ile Grup 4, 5, 10 ve 11 kıyaslandığında oldukça anlamlı istatistiksel fark bulundu (p<0,05).Anahtar kelimeler: Kanser kemoterapisi, paklitaksel, sitotoksisite, amlodipin, kalsiyum kanal blokeri, amniyon, hücre kültürü, in vitro, viabilite, spektrofotometre

Abstract:
Chemotherapy applied to the patients with cancer is a treatment method carried out by limited number of medicines and having unpredictable results. But, it is well known that cancer drugs cause negative effects on healthy cells. In this study, we investigated toxic effects of paclitaxel, one of the drugs used in the treatment of cancer, on the cells of amnion culture, and possible recovering effects of amlodipine, a calcium canal blocker, on this cytotoxicity.This mastery thesis was carried out by co-studying of Departments of Histology and Embryology, Medical Genetics and Medical Pharmacology in the Medical School of Atatürk University.Surplus amnion cell cultures of the amniosynthesis samples sent to Medical Genetic Laboratory for routine examination were transmitted to the flasks in order to be used in this study. They were put into an incubator including CO2 of 5% at 37 0C. On the seventh day, the change of medium was carried out after the growing of the cells was controlled in an invert microscope, and they were put into the same incubator again. On every two days, the growing of the cells was checked. At the end of 14th day, the cultures were removed from the incubator. The cultured cells were removed by adding 3 ml of trypsin EDTA-C into the flask, and subsequently they were transmitted into the tubes and centrifuged for 10 minutes at 400 g. After supernatant was thrown, 6 ml medium was added on the cells culture. Then, it was transmitted into microplates in such a way that it will be 250 µl in each of wells, and left the same incubator for growing. After the 14-day-incubation, amlodipine (Norvasc® 5 mg tablet, Pfizer) and paclitaxel (Taxol® 6 mg/ml flacon, Bristol-Myers Squibb) were applied to the cell cultures in the microplates. Each day, amlodipine was added into the cultures by using it in different concentrations such as 10?5, 10?6 and 10?7 M through out four days. Following this, the 10?7 M- and 10?8 M-solutions of paclitaxel were added onto some of these amlodipine-applied wells only once. Amlodipine and paclitaxel was applied alone into some of the cell cultures. The medium in same amount of the drugs was put into the control wells instead of drugs. Thus, total 12 experiment groups [Group 1 (control), Group 2 (10?7 Paclitaxel), Group 3 (10?8 P), Group 4 (10?7 A+10?8 P), Group 5 (10?7 A+10?7 P), Group 6 (10?5 A), Group 7 (10?6 A), Group 8 (10?5 A+10?7 P), Group 9 (10?6 A+10?7 P), Group 10 (10?5 A+ 10?8 P), Group 11 (10?6 A+ 10?8 P) and Group 12 (10?7 A)] were formed. At the end of the experiment, the viabilies of the cells in the culture plates were measured using mQuant spectrophotometer. Numerical values of cell viability belonging to the experimental groups were statistically compared to each other.In conclusion, even if amlodipine that was applied alone caused a decrease in cell viability, it didn?t lead statistically a significant toxic effect comparing to the control group (p>0.05). Paclitaxel in both concentrations (10?7 and 10?8 M, in Groups 2 and 3) caused cytotoxicity significantly (p<0.05). But, it was detected that there was no a significant statistical difference between the control group (Group 1) and the drug combinations-given groups (Groups 4, 5, 8-11) (p>0.05). So, it was observed that cytotoxic effect of paclitaxel was pretended by amlodipine. Particularly, when Group 2 was compared with 4th, 5th, 10th and 11th groups, a significant statistical difference was found (p<0.05).Key words: Cancer chemotherapy, paclitaxel, cytotoxicity, amlodipine, calcium canal blocker, amnion, cell culture, in vitro, viability, spectrophotometer