İn vitro diyabetik ülser modelinde fotostimülasyonun yara iyileşmesi üzerine etkisinin incelenmesi
Investigation of photostimulation effect on wound healing in in-vitro diabetic ulcer model
Yazar: AYFER KOYUNCU
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Bu çalışma ''İn Vitro Diyabetik Ülser Modelinde Fotostimülasyonun Yara İyileşmesi Üzerine Etkisinin İncelenmesi'' başlıklı Doktora Tez Projesi (FDK-2019-18072) ve ''Fotoaktive Edilmiş Trombositten Zengin Plazma (PRP)'nın Yara İyileşmesi Üzerindeki Etkisinin İncelenmesi'' başlıklı kapsamlı araştırma projesi (FBA-2021-19013) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi (BAP) tarafından desteklenmiştir.
Sunulan doktora tez çalışmasında amaç, kronik yara iyileşmesine yönelik olarak PRP (Trombositten Zengin Plazma) ve fotostimülasyonun bir arada kullanıldığı etkin bir tedavi yöntemi geliştirmektir. PRP içeriğinde hücre proliferasyonunu, göçünü ve farklılaşmasını uyaran pek çok büyüme faktörü bulundurmaktadır. Fotostimülasyon ise 600-1200 nm dalga boyundaki ışınları bir arada sunan polikromatik bir ışık kaynağı ile uygulanarak hem trombositlerin aktivasyonu hem de fibroblastların hücresel aktivitelerinin uyarılması sağlanmıştır.
Çalışmanın ilk aşamasında farklı hacimsel oranlara (1:1, 1:3 ve 3:1) sahip kitosan/jelatin doku iskeleleri dondurarak kurutma yöntemi ile üretilmiştir. Üretilen iskeleler genipin (GP) veya EDC/NHS ile çapraz bağlanmış, ardından etanol veya sodyum hidroksit ile nötralizasyon/stabilizasyon işlemi uygulanmıştır. Doku iskelelerinin karakterizasyon aşamasında SEM analizi ile doku iskelelerinin içsel bağlantılara sahip gözenekli bir yapı sergiledikleri belirlenmiş ve gözenek çaplarının yaklaşık 125 μm, gözenekliliğin ise %90 civarında olduğu bulunmuştur. ATR-FTIR analizi ile polimerlerin ve çapraz bağlayıcı ajanların doku iskelelerindeki varlığı kanıtlanmıştır. İnsan kökenli dermal fibroblast hücre (BJ, CRL-2522) hattı ile yürütülen kültür çalışmasında genipin ile çapraz bağlanan CHT/GEL3:1 doku iskelesinin hücresel aktivite açısından en uygun olduğu bulunmuş ve tez kapsamındaki deneylerde bu iskelenin kullanılmasına karar verilmiştir.
Hacettepe Üniversitesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu 05.05.2020 tarih ve GO 20/372 karar numaralı onayının ardından, gönüllü bireylerden alınan kan ile plateletçe zengin plazma (PRP) izolasyonu kit protokolüne göre gerçekleştirilmiştir. Doku iskelelerine (CHT/GEL3:1), PRP yüklenmiş ardından fibroblast hücreler ekilmiş ve belirlenen optimum koşullarda fotostimülasyon (PAC+) uygulaması yapılarak hem PRP hem de BJ hücreleri aktive edilmiştir. Hücre kültürü çalışmalarının sonuçları dikkate alınarak in vitro koşullarda oluşturulan modelde hücre göçünün etkinliği gösterilmiştir.
Çalışmanın son basamağında hiperglisemik ortam ortam koşullarına maruz bırakılan BJ fibroblastları ile 2 ve 3 boyutlu in vitro diyabetik yara (ülser) modelleri oluşturularak hücrelerin yara bölgesinden göçü ışık varlığında ve yokluğunda araştırılmıştır. F-aktin/DAPI boyama ve SEM analizi ile hücre içermeyen bölgelere hücre göçünün gerçekleştiği ve hiperglisemik ortamda ışık varlığında hücrelerin metabolik aktivitelerini sürdürdüğü belirlenmiştir. 
Tez kapsamında gerçekleştirilen çalışma sonuçları otolog kaynaklı PRP içeren doku iskelelerinin herhangi kimyasal bir ajan kullanılmadan foto-biyouyarım yapılarak başarılı bir şekilde aktifleştirildiğini ve PRP'den uzun süreli olarak salınan yararlı ajanların ve ışığın etkisi ile ortamdaki hücresel aktivitenin hızlandığını göstermiştir. Deneysel bulgular in-vivo deneyler sonrası kronik yaraların tedavisi için klinik açısından önem arz etmektedir.

Abstract:
This study was supported by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit (BAP) within the scope of the PhD Thesis Project (FDK-2019-18072) titled "Examination of the Effect of Photostimulation on Wound Healing in an In Vitro Diabetic Ulcer Model " and the comprehensive research project (FBA-2021-19013) titled " Investigation of the Effect of Photoactivated Platelet-Rich Plasma (PRP) on Wound Healing".
The aim of the presented doctoral thesis is to develop an effective treatment method for chronic wound healing in which PRP (Platelet-Rich Plasma) and photostimulation are used together. PRP contains many growth factors that stimulate cell proliferation, migration and differentiation. Photostimulation, on the other hand, is applied with a polychromatic light source that presents rays with a wavelength of 600-1200 nm, both activating platelets and stimulating the cellular activities of fibroblasts.
In the first stage of the study, chitosan/gelatin scaffolds with different volumetric ratios (1:1, 1:3 and 3:1) were produced by freeze-drying method. The scaffolds produced were crosslinked with genipin (GP) or EDC/NHS, followed by neutralization/stabilization with ethanol or sodium hydroxide. During the characterization phase of the scaffolds, it was determined by SEM analysis that the scaffolds exhibited a porous structure with internal connections, and it was found that the pore diameters were approximately 125 μm and the porosity was around 90%. The presence of polymers and crosslinking agents in scaffolds was proven by ATR-FTIR analysis. In the culture study carried out with the human dermal fibroblast cell (BJ, CRL-2522) line, the CHT/GEL3:1 scaffold cross-linked with genipin was found to be the most suitable in terms of cellular activity and it was decided to use this scaffold in the experiments within the scope of the thesis.
After the approval of Hacettepe University Non-Interventional Clinical Research Ethics Committee dated 05.05.2020 and decision number GO 20/372, the isolation of platelet-rich plasma (PRP) with blood taken from volunteers was carried out according to the kit protocol. Tissue scaffolds (CHT/GEL3:1) were loaded with PRP, then fibroblast cells were seeded and both PRP and BJ cells were activated by applying photostimulation (PAC+) under the determined optimum conditions. Considering the results of cell culture studies, the efficiency of cell migration has been demonstrated in the model created under in vitro conditions.
In the last step of the study, 2 and 3 dimensional in vitro diabetic wound (ulcer) models were created with BJ fibroblasts exposed to hyperglycemic ambient conditions, and the migration of cells from the wound area was investigated in the presence and absence of light. With F-actin/DAPI staining and SEM analysis, it was determined that cell migration occurred to cell-free regions and that cells continued their metabolic activities in the presence of light in a hyperglycemic environment.
The results of the study carried out within the scope of the thesis showed that tissue scaffolds containing autologous PRP were successfully activated by photo-biostimulation without the use of any chemical agent, and the cellular activity in the environment accelerated with the effect of long-term beneficial agents released from PRP and light. Experimental findings are clinically important for the treatment of chronic wounds after in-vivo experiments.