Yapısında birden fazla fonksiyonu barındıran hetero nano-enzim yapılar ve elısa uygulamaları
Hetero nano-enzyme structures having multiple functions and their elisa applications
Yazar: ENDER KÖSE
Danışman: PROF. DR. RIDVAN SAY
Anadolu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay

Özet:
Bu çalışmada rutenyum tabanlı amino asit monomerleriyle fotosensitif çapraz bağlama (ANADOLUCA) yöntemi kullanılarak, yapısında birden fazla enzim barındıran nano yapılar sentezlenmiş ve sentezlenen bu nano-enzimlerin ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)  uygulamalarında kullanımları incelenmiştir. Bu amaçla ilk olarak horseradish peroksidaz (HRP) ve alkalen fosfataz (ALP) enzimleri, bis (2-2'-bipiridil) (MATyr)2 rutenyum (II)  fotosensitif monomeri ile çapraz bağlı nano yapılar mikro emülsiyon polimerizasyon yöntemi ile gün ışığında, azot atmosferinde ve oda sıcaklığında sentezlenmiş ve bu nano yapılar geçirgenlik elektron mikroskobu (TEM), atomik kuvvet mikroskobu (AFM), zetametre ile boyut ve potansiyel analizi ile karakterize edilmiştir.
Çalışmanın ikinci aşamasında, HRP ve ALP'nin çapraz bağlandığı hetero nano-enzim ile kinetik çalışmalar yapılmıştır. Kinetik çalışmalar sonucunda hetero nano-enzimin tetrametilbenzidin substratına karşı optimum pH' ı 5, Km= 26 mM ,Vmak=1,24 x 10-2 U ve p-nitrofenilfosfat substratına karşı optimum pH' ı 10, Km=0,516 mM  ,Vmak= 1,70 x 10-4 U olarak bulunmuştur. Yüksek sıcaklıklarda serbest enzimler denatüre olurken sentezlenen hetero nano-enzim yapı aktivitesini kaybetmemiştir. Tekrarlanabilirlik çalışmaları, metil alkol ile yıkanan nano yapının aktivitesinde on beşinci tekrarda bile önemli bir düşüş olmadığını göstermiştir. 
Çalışmanın son aşamasında nano enzim yapısı antikor  ile konjuge edilerek ELISA uygulamaları gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
In this study, nanoparticles having multiple functions were synthesized using ruthenium based photosensitive amino acid monomers by cross-linking technique (ANADOLUCA) and the use of synthesized nanoparticles in ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) applications was investigated. For this purpose, firstly, cross-linked nano structures were prepared by microemulsion polymerization technique at room temperature under daylight and nitrogen atmosphere using horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP) enzymes and bis (2-2'-bipyridyl) (MATyr)2 rutenium (II) photosensitive monomers. Then, these structures were characterized by transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscopy (AFM), zeta potential measurements. 
In the second part of the study, kinetic studies of the nanoenzymes were carried out. The obtained results showed that hetero nano-enzyme exhibited maximum activity towards tetramethylbenzidine (TMB) and paranitrophenyl phosphate (p-NPP) as substrates at pH 5 and pH 10, respectively. The kinetic parameters Km and Vmax values were 26 mM and 1,24 x 10-2 U for TMB and 0,516 mM, 1,70 x 10-4 U for p-NPP. The free enzymes denaturate at high temperatures. However, hetero nano-enzyme structure has not loss its activity. The reusability studies showed that there is no significant loss of activity of the nanostructure washed with ethanol even after 15 cycle.
In the final step of the study, nano enzyme structure was conjugated with antibody and ELISA applications were carried out.