Sıçanlarda apandisit modeli: Akut faz reaktanları ve oksidatif hasar belirteçlerinin karşılaştırılması
Appendicitis model in rats : Comparison of acute phase reactants and oxidative damage markers
Yazar: MUCAHİT TAN
Danışman: DOÇ. DR. ERCÜMENT LEVENT ELEMEN
Kocaeli Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Çocuk Cerrahisi = Pediatric Surgery

Özet:
Amaç: Bu çalışmada, deneysel sıçan apandisit modelinde doku inflamasyon sürelerinin interlökin 1 (IL?1), interlökin 6 (IL?6), tümör nekrotizan faktör (TNF), C reaktif protein (CRP), serum amiloid A acute phase reactant(SAA), beyaz küre (BK), oksidatif stres ve toplam inflamasyon skoru üzerindeki etkisi araştırıldı.Denekler ve Yöntem: Apendiks mezo damarları dışarıda bırakılarak 2/0 polglactin dikişle bağlanan 42 sıçan altışar denek içeren 7 gruba rastgele olarak ayrıldı (Grup 1?7). Birinci grupta bağlanmış olan appendiks hemen eksize edildi. Diğer gruplarda sırasıyla, 6., 12., 24., 48., 72 ve 96. saatlerde deneklere re-laparotomi yapıldı. Sıçanlardan kan örnekleri alınarak BK hemen çalışılırken akut faz reaktanları (AFR) için santrifüje edilen serum -70 santigrat derecede saklandı. Daha sonra serumdaki IL?1, IL?6, TNF, CRP, SAA değerlerine bakıldı. Inflame appendiks eksize edildi ve serum fizyolojik ile temizlenerek doku biyokimyası tetkikleri ve histopatolojik inceleme için iki eşit parçaya bölündü. Doku biyokimyası tetkikleri için ayrılan parçalar -70 santigrat derecede, histopatolojik inceleme için ayrılan parçalar ise % 10 formalin içinde saklandı. Doku biyokimyası analizi için homojenizasyonun ardından dokular +4 santigrat derecede santrifüje (Jouan G412) edildi ve ultraviyole spektrofotometre (Heraeus 400, Kendro Laboratory Product, Osterode, Germany) ile toplam thiol (T-SH), protein thiol (P-SH), ileri oksidasyon protein ürünleri (advanced oxidation protein products) (AOPP), protein karbonil (PCO) ve 8-hydroxy?2'-deoxyguanosine (8-OHdG) düzeyleri çalışıldı. Dokulardaki toplam protein miktarı Bradford yöntemi ile belirlendi. Histopatolojik incelemede inflamasyon sınıflaması modifiye Biert-Verhofstad skalası ile yapıldı. Nekroz, polimorfonükleer lökosit sayısı (PMNL), makrofaj sayısı, lenfosit, peritonit ve perforasyon değerlendirildi ve toplam inflamasyon skorları kaydedildi. Sonuçlar, ortalama ± standart sapma olarak, Kruskal-Wallis H Testi, One-Way ANOVA ve Tukey yöntemleri ile değerlendirildi. P<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.Sonuçlar: Sıçanların IL?1 (p<0,05), IL?6 (p<0,05), TNF (p<0,05), CRP(p<0,05) ve SAA (p<0,05) değerleri gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklı bulunurken grupların BK (p>0,05) değerleri birbirine benzer bulundu. IL?1 ile IL?6, TNF ve SAA arasında, IL?6 ile IL?1, TNF, SAA ve CRP arasında, TNF ile IL?1, IL?6, SAA ve CRP arasında, SAA ile IL?1, IL?6 ve TNF arasında, CRP ile IL?6 ve TNF arasında istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) korelasyon izlendi. Beyaz kürenin diğer AFR ile korelasyonu izlenmedi. İnflamasyonun 6. saatinde IL?6 ve TNF artarken, IL?1 ve SAA'nın 12. saatte arttığı görüldü. İnflamasyon süresince CRP'de yükseliş tespit edilmedi. IL?6, IL?1 ve TNF değerlerinin 24.saat ve sonrasında hızla düşmeye başladığı tespit edildi. Grupların AOPP değerleri birbirine benzerdi (p>0,05). P-SH (p<0,05), PCO (p<0,05), T-SH (p<0,05), P-SH (p<0,05), toplam doku protein (p<0,05) ve 8-OHdG (p<0,05) değerleri gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklı idi. T-SH, P-SH, PCO ve 8-OHdG değerleri apendiks ligasyonunun süresine bağlı olarak artmakta, AOPP ve toplam protein değerleri ise azalmakta idi. Dokuların toplam inflamasyon skorları Grup 1 (0,51±0,33), Grup 2 (3,66±1,63), Grup 3 (5,00±2,00), Grup 4 (7,16±1,32), Grup 5 (9,00±2,00), Grup 6 (7,83±1,72) ve Grup 7 (10,50±1,64) (p<0,05) olarak bulundu. Peritonit ile nekroz 6.saatte, perforasyon ise 12. saatte görülmeye başlandı. Perforasyon tüm gruplardaki 42 sıçanın 19'unda (%45) görülürken 24. saat ve sonrasındaki 24 sıçanın 17'sinde (%70) görüldü.Tartışma: Enflamatuar süreç ile birlikte IL?1, IL?6, TNF, SAA, CRP ve BK'nin arttığı bilinmektedir. Çalışmamızda inflamasyonun 6. saatinde IL?6 ve TNF'nin, 12. satte IL?1 ve SAA'nın yükseldiği ve 24. saatten sonra bu değerlerin giderek azaldığı görüldü. Bu sonuçlar, sitokinlerin iflamasyonun şiddetli olduğu durumlarda tükenmeye başladığı ya da vücutta kompansasyon mekanizması ile seviyelerinin düşürüldüğünü söylenebilir. Apandisitin erken döneminde IL?1, IL?6, TNF ve SAA'nın tanıda yardımcı olabileceğini düşünmekteyiz. Enflamatuar süreçlerde oksidatif stresin rolü iyi bilinmektedir. PCO protein oksidasyonunun en kullanışlı belirtecidir. T-SH, P-SH, AOPP, 8-OHdG ise oksidatif stres belirleyicileridir. Çalışmamızda günler içinde iflamasyonun ilerlemesi ile anlamlı olarak düşen toplam protein ve AOPP değerleri dokunun bu süre içinde ileri derecede harap olduğunu göstermektedir. Artmış T-SH ve P-SH değerleri ise doku hasarına karşın mitokondri hasarını engelleyici thiol içeren enzimlerin arttığını göstermektedir. Dokularda elde edilen oksidatif stres belirteçleri ile klinikte akut apendisit tanısının konulmasının pratik bir yararı bulunmamaktadır, ancak çalışmamızdan çıkan sonuçlar ışığında bu hastaların takiplerinde kan oksidasyon parametrelerinin izleminin yararlı olabileceğini düşünmekteyiz. Sıçanlara ait apendikslerin toplam inflamasyon skorlarının inflamasyon süresi ile doğru orantılı olarak arttığı ve 12. saat gibi erken sürede de perforasyonun görülebileceği tespit edildi. Bu nedenle apandisit tanısı alan vakalarının bekletilmeden tedavi edilmesi gerektiğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Aim: To evaluate acute phase sitokins and reactants and the oxidative stres parameters in the rat appendicites model related to the degree of the inflammation.Material and Methods: Forty-two rats, that had previously created appendicitis by simple ligation of the appendix while preserving the mesenteric vessels, were randomly located in seven groups. In Group 1 appendectomy was carried out simultaneously. In rest of the groups re-laparotomy was performed on the 6th, 12th, 24th, 48th, 72nd and 96th post-operative hours respectively and appendectomy was performed. White blood cell (WBC), and serum interleukin?1 (IL?1), interleukin?6 (IL?6), tumor necrosis factor (TNF), C-reaktive protein (CRP) and serum amyloid A (SAA) levels were measured just before appendectomy was performed. Excised appendices were divided into two equal pieces for tissue biochemical analzes and histopathological evaluations. Following homogenization the tissues were centrifuged at +4 degrees Celsius and tissue preotein carbonyl (PCO), total thiol (T-SH), protein thiol (P-SH) and advanced oxidation protein products (AOPP) levels were measured by a UV?visible spectrophotometer. Total protein assay was performed by Bradford method. Inflammation was evaluated with modified Biert-Verhofstad classification. Necrosis, polimorphonuclear leukocyte count, macrophage count, peritonitisi, perforation, hemorhage and edema were evaluated and total scores were determined. The values were presented as mean ± Standard deviation and the statistical analyzes were performed with Kruskal-Wallis H-Test, One-Way ANOVA and Tukey tests. P was significant at <0.05.Results: Serum IL?1, IL?6, TNF, CRP and SAA levels revealed significant differences (p<0.05) while WBC levels showed similarities between groups (p>0.05). Statistically significant correlations were archieved between IL?1 and IL?6, TNF, SAA; between IL?6 and IL?1, TNF, SAA, CRP; between TNF and IL?1, IL?6, SAA, CRP; between SAA and IL?1, IL?6, TNF; between CRP and IL?6, TNF. No correlation was significant between WBC and other parameters. IL?6 and TNF levels elevated on 6th hour while IL?1 and SAA levels elvated on 12th hour. CRP levels didn?t show an elevation during inflammation. IL?6, IL?1 and TNF levels decreased rapidly after 24 hours. The AOPP levels were similar between the groups (p>0.05), but evaluation of P-SH (p<0.05), PCO (p<0.05), T-SH (p<0.05), P-SH (p<005) and total protein levels (p<0,05) revealed significant differences. Tissue T-SH, P-SH and PCO values were found to increase while total protein and AOPP levels were decreasing with respect to the duration of the inflammation. Total histological scores in Group 1 (0.51±0.33), Group 2 (7.83±2.22), Group 3 (9.16±2.92), Group 4 (8.16±1.47), Group 5 (11.33±1.86), Grup 6 (8.66±2.16) and Group 7 (10,83±1,47)(p<0,05) were significantly different (p<0.05)Discussion: It has exactly documented that IL?1, IL?6, TNF, SAA, CRP and WBC levels elvate during the inflammatory process. In our experimental model, IL?6 and TNF levels elevated on 6th hour, IL?1 and SAA levels elevated on 12th hour. However these levels all decreased after 24 hours of inflammation. This consequence suggests an extinction of sitokins while the inflammation is severe either a compensatory response. From this point of view we advocate that serum IL?1, IL?6, TNF and SAA levels may be key points in the diagnosis of appendisitis at the early stages of inflammation. The role of oxidative stres is well documented in the inflamattory processes. Tissue PCO content is a valuable index in protein oxidation. Similarly, tissue T-SH, P-SH and AOPP levels demonstrate the oxidative stress. The progressive decrease found in the total protein levels was due to the progressive damage of the tissues. The relative decrease in AOPP levels was probably due to the decrease in the protein content of the tissues. On the other hand, increased T-SH and P-SH values indicate the increase in thiol-containing enzymes in the mitochondria as a protective measure against the tissue damage. Of course, measurement of tissue oxidative stress parameters is of no value in the clinical practice, but we may speculate that the evaluation of plasma oxidative stress parameters may be beneficial in the medical follow-up of the appendicitis patients.