Sferoid yüklü ECM--mimetik peptit amfifil hidrojellerle çip-üstü-karaciğer geliştirilmesi
Development of liver-on-chip with spheroid loaded ECM--mimetic peptide amphiphile hydrogels
Yazar: ŞEYMA BEKTAŞ
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışma, "İlaçların Toksisitesini Belirlemede Kullanılacak Karaciğer Çipinin Geliştirilmesi" başlıklı (proje numarası FBA-2017-12820) proje kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Koordinasyon Birimi tarafından ve Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) 2210-C Öncelikli Alanlara Yönelik Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı kapsamında maddi olarak desteklenmiştir. Sunulan tez çalışmasında amaç karaciğerin görevlerini etkin olarak gerçekleştirebilecek, ilaç tarama ve toksisite testlerinde kullanılmak için "çip-üstü-karaciğer" sistemi geliştirmektir. 
Tezin ilk aşamasında karaciğerin fonksiyonel açıdan en küçük biriminde yer alan hepatosit (HepG2 hücre hattı) ve endotel hücrelerinden (HUVEC hücre hattı) asılı damlacık yöntemi ile sferoid üretimi gerçekleştirilmiştir. Hepatositlerin endotel hücrelerle 2:1 oranında birleştirildiği 1500 hücre içeren sferoidlerin 5 günlük inkübasyon sonunda 428±45 µm çapa sahip olduğu görülmüş ve tez kapsamında çalışmalara bu sferoidler ile devam edilmiştir. Sferoidlerin Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) görüntülerinde yer alan kürenin dış yüzeyindeki 2-3 µm çapındaki porlar karaciğerdeki safra kanalcıkları (1-3 µm) ile benzer özelliktedir. Sferoidlerdeki hücrelerin işlevselliğini incelemek amacı ile yapılan immünositokimyasal boyama sonucu hepatositlerin, karaciğerin spesifik fonksiyonu olan albumin sentezi ve ilaç dönüşümü işlevlerini devam ettirdiği görülmüştür. Sferoidlerdeki HepG2 ve HUVEC hücre organizasyonunu ve damarlanmayı incelemek için von Willebrand Faktör boyaması yapılmış ve konfokal görüntülerinde HUVEC hücrelerinin HepG2 hücrelerini çevrelediği ve dış yüzeyden merkeze doğru 35 µm'lik tübüler yapılar oluşturduğu görülmüştür. Konfokal görüntüleri HepG2 ile HUVEC arasındaki kendiliğinden düzenlenme ve hücre sıralanma prosesinin gerçekleştiğini kanıtlamıştır. Yapılan analizler sonucunda sferoidlerin damarlı yapıda ve işlevsel olduğu bulunmuştur.
Tezin ikinci aşamasında sferoidlere hücresel davranışları destekleyen yapay mikroçevrelerin oluşturulması için kolajen-mimetik (PA-GFOGER) ve fibronektin-mimetik (PA-RGDS) peptit amfifiller kullanılmıştır. PA-RGDS negatif yüke (-1), PA-GFOGER ise pozitif yüke (+4) sahip olduğu için 4:1 oranında karıştırılarak ECM-mimetik (PA-GFOGER+RGDS) hidrojel elde edilmiştir. Kalsiyum eklenmesi sonrası nanofiber düzenlemenin β-tabaka ikincil yapı üzerinden gerçekleştiği bulunmuştur. PA-GFOGER ve PA-GFOGER+RGDS hidrojellerin kendiliğinden düzenlenme ve jelleşme sonrasında birleşerek 75-100 nm çapa sahip fiber demetlerini oluşturduğu görülmüştür. Ayrıca PA-GFOGER+RGDS hidrojeli, ECM bileşenlerinin hiyerarşik organizasyonunu sağlamıştır. Reoloji analizi sonucunda tüm hidrojellerin viskoelastik karakterde olduğu ve depo modülünün kolajen katkılaması ile düştüğü gözlenmiştir.
Tezin son aşamasında şırınga pompası, kültür ortam rezervuarı, polidimetilsiloksan (PDMS) çip ve bağlantı elemanlarından oluşan bir "çip-üstü-karaciğer" sistemi oluşturulmuştur. Hidrojel ile enkapsüle edilen sferoidlerin durgun ve dinamik koşullardaki kültürü hidrojelsiz sferoidlerle karşılaştırmalı olarak gen ifadesi, albumin ve üre salımı açısından değerlendirilmiştir. Sferoidler dinamik kültür koşulları altında 7 günün sonunda 2,023±409 ng albumin ve 31,003±3595 nmol üre; durgun koşullar altında ise 1,444±92 ng albumin ve 1,279±40 nmol üre salımı gerçekleştirmiştir. Özellikle hidrojel ile enkapsüle edilen sferoidlerin dinamik kültür ALBUMİN ve CYP 2E1 gen ifadeleri sırasıyla 4 ve 28,343 kat artış göstererek anlamlı düzeyde fark oluşturmuştur. 
Tüm bu sonuçlar ışığında perfüzyon biyoreaktörde 5 µL/dk akış hızıyla gerçekleşen dinamik kültürün sferoid performansını arttırdığını ve çip üstü organ sistemlerinde hidrojel kullanımının hücre canlılığı ve işlevselliği açısından daha iyi sonuç verdiğini ortaya koymaktadır. Bununla birlikte bu tez kapsamında geliştirilen çip üstü organ sistemi ile daha ileri uygulamalar gerçekleştirilebilmek için işletim koşullarının optimize edilmesi gerektiği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
This study was financially supported by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit with a project entitled "Development of the liver-on-chip to be used in determining the toxicity of drugs" (project number FBA-2017-12820) and The Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) under 2210-C Primary Subject National Scholarship Program for MSc Students. The aim of this study is to develop a liver-on-chip system, which can effectively perform liver tasks, for drug screening and toxicity tests.
In the first step of the study, spheroid production was carried out by hanging drop method from hepatocyte (HepG2 cell line) and endothelial cells (HUVEC cell line), which are located in the smallest functional unit of the liver. Spheroids containing 1500 cells, in which hepatocytes were combined in 2:1 ratio with endothelial cells, were found to have a diameter of 428 ± 45 μm after 5 days of incubation and these spheroids were used within the scope of the thesis. Scanning Electron Microscopy (SEM) images demonstrated that the pores with a diameter of 2-3 μm on the outer surface of the spheroid are similar to the bile canals in the liver (1-3 μm). Immunocytochemical staining of hepatocytes that were performed with the aim of investigating the function of cells in spheroids showed that the cells maintained the liver-specific function of albumin synthesis and drug conversion. Von Willebrand Factor staining was performed to examine the HepG2 and HUVEC cell organization and vascularization in spheroids, and resulting confocal microscopy images showed that HUVEC cells covered HepG2 cells and formed tubular structures from the external surface to the center of the spheroid in 35 μm depth. Confocal images have proved that the self-assembly and cell arrangement process between HepG2 and HUVEC has been achieved. As a result it is found that the spheroids are vascular and functional.
In the second part of the thesis, collagen-mimetic (PA-GFOGER) and fibronectin-mimetic (PA-RGDS) peptide amphiphiles were used to construct artificial microenvironments that support cellular behavior in spheroids. Since PA-RGDS has a net negative charge (-1) and PA-GFOGER is positively charged (+4), ECM-mimetic (PA-GFOGER + RGDS) hydrogel was obtained by mixing these two hydrogels in the ratio of 4:1. After the addition of calcium ions, it was found that the nanofiber organization occurred via β-sheet secondary structure. PA-GFOGER and PA-GFOGER + RGDS hydrogels were found to form fiber bundles with a diameter of 75-100 nm after self-assembly and gelation. Additionally, PA-GFOGER+RGDS hydrogel provided a hierarchical organization similar to ECM components. As a result of the rheology analysis, it was observed that all the hydrogels were viscoelastic and the storage module is decreased by collagen deposition.
In the final part of the thesis, a "liver-on-chip" system was established consisting of a syringe pump, culture medium reservoir, polydimethylsiloxane (PDMS) chip and fitting elements. The culture of hydrogel-encapsulated spheroids under static and dynamic conditions was evaluated in terms of gene expression, albumin and urea release in comparison with hydrogel-free spheroids. At the end of 7 days, it was found that 2023 ± 409 ng albumin and 31003 ± 3595 nmol urea was released under dynamic culture conditions of spheroids, whereas under static conditions 1444 ± 92 ng albumin and 1279 ± 40 nmol urea was released. In particular, dynamic culture of hydrogel encapsulated spheroids significantly increased ALBUMIN and CYP 2E1 gene expressions by 4 and 28343 folds, respectively.
In the light of these findings, it can be stated that the dynamic culture with the use of a perfusion bioreactor at 5 μL/min flow rate improved spheroid performance and hydrogel use in the organ-on-chip systems gave better results in terms of cell viability and functionality. However, it is concluded that the operating conditions in the present organ-on-chip system should be optimized for advanced applications.