Toxoplasma gondii aşı adayı SAG 1 geninin moleküler karakterizasyonu, protein ekspresyonu ve antijenik yapısı
Molecular characterization, expression and antigenic structure of SAG 1 gene and its protein, a candidate for toxoplasma gondii vaccine
Yazar: ABDÜSSAMED AKŞİT
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Antijenler = Antigens ; Aşılar = Vaccines ; DNA = DNA ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic ; Toksoplazma = Toxoplasma

Özet:
Toxoplasma gondii kozmopolit dağılıma sahip bir parazit olmasının yanı sıra mortaliteye sebep olması ve transplasental yolla yavrulara geçişi nedeni ile oldukça önemli bir halk sağlığı sorunudur. Toxoplasmosis'in tanısı ve hastalığa karşı aşı geliştirilmesi amacıyla geçmişten günümüze parazite ait birçok antijen araştırılmış ve etkinlikleri değerlendirilmiştir. Bu çalışmada Türkiye Halk Sağlığı Kurumundan temin edilen T. gondii takizoitleri kullanılarak yüzey antijenleri arasında önem arz eden SAG1 proteinini kodlayan genin moleküler karakterizasyonun yapılması, rekombinant protein ve DNA'nın elde edilmesi, immunreaktivitenin gösterilmesi ve rekombinant SAG1 antijeninin ELISA tabanlı teşhisteki duyarlılık ve özgünlüğünün ortaya konulması amaçlanmıştır.  Bu amaçla T. gondii takizoitlerden genomik DNA (gDNA) izolasyonunu takiben SAG1 gen bölgesi dizayn edilen özgün primerlerle amplifiye edimiş ve sonrasında plazmit vektörlere klonlanmıştır. Klonlama sonrası elde edilen plazmit DNA sekanslanarak SAG1 geninin nükleotid ve amino asit sekansları elde edilmiş ve moleküler karakterizasyonları ortaya konulmuştur. Hem nükleotid hem de amino asit sekans ve filogenetik analizleri SAG1 geninin korunmuş bir gen bölgesi olduğunu göstermiştir. Moleküler karakterizasyonu takiben elde edilen TrToxSAG1 izolatına ait amplikonlar DNA aşı adayı olarak pcDNA™3.1/V5-His TOPO® ekspresyon vektörüne başarılı bir şekilde klonlanmış ve rekombinant DNA izolasyonu yapılarak uygun şartlarda muhafaza altına alınmıştır. TrToxSAG1 izolatına ait gDNA optimize edilen primerlerle PCR'da çoğaltılmış ve elde edilen amplikonlar pet100 ekspresyon sisteminde klonlanarak rekombinant antijen ekspresyonu ve izolasyonu sağlanmıştır. İlgili proteini kodlayan amino asitlerin in-silico analizleri ile rekombinant antijenin SDS-PAGE ve Western Blot analizleri SAG1 proteininin yaklaşık 35 kDa büyüklüğünde olduğunu ortaya koymuştur. Elde edilen rekombinant SAG1 antijeni ELISA yöntemiyle işlenmiş ve referans tanı kiti eşliğinde farklı konsantrasyonlardaki antijenlerin etkinlikleri değerlendirilmiştir. Rekombinant SAG1 ELISA'nın %84,2 duyarlılığa ve %81,0 özgünlüğe sahip olduğu belirlenmiş ve aynı zamanda kappa istatistik testi sonuçlarına göre referans ticari kitsonuçları ile arasında iyi bir korelasyonun bulunduğu tespit edilmiştir. 
Sonuç olarak bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez T. gondii'nin önemli yüzey antijenlerinden biri olan SAG1'in moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar, ülkemize özgü izolatlar kullanılarak parazitin spesifik tanısı ve hastalığa karşı aşı geliştirilmesi üzerine yeni araştırmalar için model oluşturmuştur. 
Anahtar kelimeler: Toxoplasma gondii, SAG1geni, Moleküler karakterizasyon, Klonlama, Rekombinant protein, DNA Aşısı, ELISA

Abstract:
Toxoplasma gondii is a cosmopolitan parasite that is found all over the world. This parasite can cause mortality and also it is an important public health problem because of transplacental passage from pregnant women to babies. In order to diagnose toxoplasmosis and develop a vaccine against the disease, many antigens have been investigated and their activities have been evaluated from past to present.
This study aimed to perform molecular characterization of the gene encoding the SAG1 protein, which is an important surface antigen, using tachyzoites of T. gondii taken from Turkey Public Health Agency, and also to obtain recombinant protein and DNA, to demonstrate immune reactivity and to illustrate the sensitivity and specificity of recombinant SAG1 antigen in ELISA-based diagnosis. For this purpose, after isolation of genomic DNA (gDNA) from T. gondii tachizoids, SAG1 gene region was amplified using originally designed primers and then cloned into plasmid vectors.
Through sequencing of the plasmid DNA obtained by cloning, nucleotide and amino acid sequences of the SAG1 gene and protein were obtained and their molecular features were demonstrated. It was shown that the SAG1 gene was a conserved gene region by using nucleotide and amino acid sequence based phylogenetic analysis.
The amplicons of the TrToxSAG1 isolate following the molecular characterization were successfully cloned into the pcDNA ™ 3.1 / V5-His TOPO® expression vector as a DNA vaccine candidate and recombinant DNA was isolated and kept under appropriate conditions. The gDNA of TrToxSAG1 was amplified in PCR with optimized primers and the resulting amplicons were cloned in the pet100 expression system, recombinant antigen expression and isolation were performed. 
The in-silico analysis of amino acids encoding the protein of SAG1 and SDS-PAGE and Western blot analysis of the recombinant antigen have shown that SAG1 is approximately 35 kDa. The obtained recombinant SAG1 antigen was utilized in ELISA and the efficacy of different concentrations of the antigen was evaluated in parallel with the reference diagnostic kit. Recombinant SAG1 ELISA had a sensitivity of 84.2% and a specificity of 81.0% respectively, and it was also found that there was a good correlation between the results of Recombinant SAG1 ELISA and the reference commercial kit results using kappa statistical test.
In conclusion, in this study, molecular characterization of SAG1, one of the important surface antigens of T. gondii, was performed for the first time in Turkey. The obtained results have been a basis for new research on the specific diagnosis of parasites and development of a vaccine against the disease by using the isolates specific to our country.

Key words: Toxoplasma gondii, SAG1 gene, Molecular Characterization, Cloning, Recombinant protein, DNA Vaccine, ELISA