Biyolojik örneklerde peroksil radikali süpürme etkinliği ölçümü için spektroflorometrik yöntem geliştirilmesi
Development of a spectrofluorometric method for measurement of peroxyl radical scavenging activity  in biological samples
Yazar: GÜLŞAH KIBRISLIOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. KUBİLAY GÜÇLÜ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Oksijen yaşam için gereklidir, ancak vücut üzerinde zararlı etkileri de vardır. Oksijen, insan vücudunda solunum zinciri içersinde süperoksit anyon radikali, singlet oksijen, hidroksil radikali, peroksil radikali vb. reaktif oksijen türlerini (ROS) oluşturmaktadır. Reaktif oksijen birikimi organizmada mevcut olan veya gıdayla alınan antioksidanlarla dengelenmediği taktirde; oluşan oksidatif stres koşulları altında biyolojik yapıların hasarına neden olabilen radikalik zincir reaksiyonları meydana gelmektedir. Peroksil radikalleri sentetik antioksidanlar veya gıdalarla alınan antioksidanlar tarafından süpürülmektedir. Bu nedenle antioksidanların peroksil radikali süpürme aktivitesinin belirlenebilmesi için basit, duyarlı ve hızlı yöntemler gereklidir. Tez kapsamında geliştirilen spektroflorometrik yöntemde amaç; peroksil radikali gibi reaktif ve zararlı bir türün süpürme aktivite tayini için literatürdeki mevcut yöntemlerin eksikliklerini ve kısıtlamalarını ortadan kaldırabilmektir. Bunun için peroksil radikali (ROO.) süpürülmesine dayalı antioksidan aktivite tayini için yeni bir florometrik yöntem geliştirilmiştir. 

Bu tez çalışmasıyla birlikte literatürde ilk kez peroksil radikali süpürme aktivite tayini için prob olarak p-amino benzoik asit (PABA) bileşiği kullanılmıştır. PABA probunun eksitasyon ve emisyon dalga boyu sırasıyla 267 nm ve 334 nm olarak belirlenmiş, tiyol tipi antioksidanlar, amino asitler ve plazma antioksidanlarının aktiviteleri bu dalga boylarında probdaki florometrik değişimler üzerinden ölçülmüştür. Geliştirilen yöntemde peroksil radikali, 2,2?-azobis(2-metil propionamidin) dihidroklorür (AAPH)?ün termal bozunmasından yararlanılarak elde edilmiştir. PABA probunun peroksil radikali ile inkübasyonu sonucunda oksidasyon ürünü veya ürünlerinin oluşumu nedeniyle proba ait floresans şiddeti azalmaktadır, çünkü PABA floresan özellikte olduğu halde oksidasyon ürün ya da ürünleri değildir. Süpürücü bileşik varlığında ve yokluğunda ölçülen floresans şiddetlerinin farkından yararlanarak peroksil radikali süpürme aktivitesi tayin edilmiştir. Geliştirilen yeni florometrik yöntem ile bulunan sonuçlar referans yöntemler olarak seçilen spektoroflorometrik esaslı ORAC yöntemi ve spektrofotometrik esaslı Krosin ağartma (beyazlatma) yöntemleriyle karşılaştırılmıştır. 

Geliştirilen florometrik yönteme göre, çalışılan antioksidanlar içerisinde en düşük IC50 (probdaki floresans kaybını yarısına düşüren, yani %50 inhibe eden derişim) değerine sahip antioksidan (en yüksek peroksil radikali süpürme aktivitesi) albumin (IC50= 0.6 ?M) olarak bulunmuştur. Ayrıca tiyol tipi antioksidanlar arasında peroksil radikal süpürme aktivitelerine göre homosistein > glutatyon (GSH) > sistein > N-asetil sistein (NAC) > 1,4-ditiyoeritritol (DTE) > sisteamin şeklinde bir sıralama ortaya çıkmıştır. 

Tez çalışmasında peroksil radikali süpürme etkinliği için geliştirilen yöntemde kullanılan prob (p-amino benzoik asit) HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) yöntemiyle belirlenerek (antioksidan varlığında ve yokluğunda prob derişimindeki değişimler ölçülerek) sonuçların istatistiksel karşılaştırılması yoluyla geliştirilen yöntem valide edilmiştir. 

Çalışılan tez kapsamında geliştirilen spektroflorometrik yöntem biyolojik bakımdan önemli antioksidanlara (tiyol-tipi antioksidanlar, amino asitler ve plazma antioksidanları) ek olarak doku homojenizatlarına (karaciğer, böbrek ve kalp)  uygulanarak gerçek örnekler için % inhibisyon değerleri hesaplanmış ve kalp doku homojenizatının en yüksek peroksil radikal süpürme aktivitesi gösterdiği bulunmuştur.

Abstract:
Oxygen is essential for life, but it may also have harmful effects on the organism. Oxygen may form various reactive oxygen species (ROS) in the respiratory chain, namely superoxide anion, singlet oxygen, hydroxyl radical, peroxyl radical etc. If the ROS accumulation is not balanced by existing or food injested antioxidants in the organism, radicalic chain reactions may occur under oxidative  stres conditions that may cause tissue damage. Peroxyl radicals are scavenged by either synthetic or food-injested antioxidants. So, simple and sensitive methods for the determination of of the peroxyl radical  scavenging activity of  antioxidants are necessary. The aim of the developed spectrophotometric procedures are to resolve shortcomings and limitations of the available methods in literature for the determination of reactive species scavenging activity. Therefore, a new fluorometric method has been developed for peroxyl radical scavenging activity assay.

In this thesis, p-amino benzoic acid (PABA) has been firstly used as a probe for the determination of peroxyl radical scavenging activity. Excitation and emission wavelengths of PABA were determined at 267 nm and 334 nm, respectively, and  radical scavenging activity of thiol type antioxidants, amino acids and plasma antioxidants was measured at these wavelengths by following the changes in probe fluorescence. In this new fluorometric assay, peroxyl radicals  were generated by thermal decomposition of 2,2?-azobis(2-methyl propionamide) dihydrochloride (AAPH). PABA probe can be oxidized with peroxyl radical, and the fluorescence intensity of PABA is diminished as a result of its reaction with peroxyl radical, because PABA is fluorescent while its oxidation product(s) are not. The attenuation in the fluorescence intensity loss of PABA probe is dependent upon the peroxyl radical scavenging activity of the tested compound. With the aid of PABA fluorescence values recorded in the presence and absence of scavengers, the peroxyl radical scavenging activity of scavengers can be calculated. The peroxyl radical  scavenging activity measured by the fluorometric method was compared to those of the reference ORAC and crocin bleaching methods. 

Albumin (IC50 = 0.6 µM) had the lowest IC50 value among the studied antioxidants (highest peroxyl radical scavenging activity) with respect to the developed fluorometric method. In addition, the peroxyl radical scavenging activity of thiol-type antioxidants were found in the following order: homocysteine > glutathione (GSH) > cysteine > N-acetyl cysteine (NAC) > 1,4-dithioerythritol (DTE) > cysteamine.

The developed methods for measurement of peroxyl radical scavenging activity were validated by quantifying the probe (PABA) and its oxidation product(s) by HPLC (high performance liquid chromatography) method, followed by statistically comparing the results. 

In addition to biologically important antioxidants (thiol-type antioxidants, amino acids and plasma antioxidants), the peroxyl radical scavenging activity of tissue homogenates (e.g., liver, kidney and heart) were determined by the developed spectrofluorometric method as percentage inhibition values of the incubation reaction mixture. The heart tissue homogenate was shown to exhibit the higher peroxyl radical scavenging activity with the developed mehod.