Salep içeriğinin tespitinde kullanılabilecek moleküler marker geliştirilmesi üzerine araştırmalar
Studies on the development of molecular markers for the detection of salep
Yazar: EDA KABACAOĞLU
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BARÇIN KARAKAŞ BUDAK
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Salep, günümüzde ticari ölçekte yetiştirilemeyen, doğadan toplanan Orchidaceae familyasından bitkilerin yumrularından çeşitli işlemler sonrasında elde edilerek tüketime sunulan ve çok yüksek fiyatlara alıcı bulan bir gıda maddesidir. Salep çoğu zaman toz formda satışa sunulur. Toz salebin temel bileşimi nişasta ve glukomannan olduğu için taklit veya tağşiş edilebilir nitelikte bir ürün söz konusudur. Diğer yandan pahalı olması sebebiyle de sıvı veya toz formda salep üreten firmalar ürünlerinde saf salebi çok az miktarlarda kullanırlar. Salep aynı zamanda, koruma altında olan (herhangi bir formunun ihracatı yasak olan) bir üründür. Henüz toz formda bir gıda ürününde salebin varlığını veya miktarını tespit etmeyi sağlayacak lisanslı bir yöntem mevcut değildir.
Bu tez çalışmasında salepe özgü tanılama imkanı sağlayacak genetik markerlerin tespiti için bütünsel yaklaşımla türe özgü RAPD parçalarından ve ayrıca ITS2 bölgesi DNA dizilerinden spesifik marker geliştirme çalışmaları yürütülmüştür. Gen havuzu olarak salep üretiminde kullanılan cinsleri içeren kuru ve yaş yumru salep örnekleri kullanılmıştır. ITS2 bölgesi dizilerinden faydalanarak tasarlanan primerler seti kullanılarak, ticari salep ürünleri ve tağşiş/dolgu/katkı amaçlı kullanılan diğer maddeler test edilmiştir. Gerçekleştirilen klasik PZR analizi ile tasarlanan bu markerler salebin tespitinde kullanılabilmiştir. Gerçek zamanlı PZR denemeleri tasarlanan ITS2a spesifik primer çifti ile 18SrRNA evrensel primer çifti kullanılarak yürütülmüş ve kalibrasyon eğrisi oluşturularak primerlerin PZR verimlilikleri belirlenmiştir. Patates nişastası veya mısır unu ile toz salepten izole edilen DNA kalıpları gerçek zamanlı PZR ile analiz edilmiş ve uygulanan yöntemlerin duyarlılığı ve uygulanabilirliği araştırılmıştır. Miktar belirlemeye yönelik yöntem geliştirme çalışmalarında farklı miktarlarda patates nişastası ve salep içeren paçallardan elde edilen DNA ile ΔΔCt metodu kullanılarak kalibrasyon eğrisi elde edilmiş, yöntemin doğruluğu belirlenmiş ve son olarak ticari örnekler test edilmiştir.

Abstract:
Salep, is a non-cultivable product which is obtained by collecting tubers of the Orchidaceae plants from the wild. Following various processes the tubers are available for consumption as a highly valued food ingredient. Salep is most often marketed in powder form. As the main components in salep are glucomannans and starch, it is a powder material which may be mimicked or adulterated. Original salep finds high market value thus, manufacturers of commercial salep powders or drinks use very little of the original ingredient, adding starch or gums as bulking agents. On the other hand, salep is a product protected under the law (export of salep in any form is strictly prohibited). There is presently no method to test the presence of salep in a food powder or to evaluate salep authenticity. 
The aim of this study is the determination genetic marker(s) that may be used in detection, determination and authentication of salep. To this end, with a holistic approach, RAPD fragments were obtained for the development of SCAR markers. Additionally, specific primers designed from the ITS2 locus were analyzed. Tuber samples representative of genera used in salep production were used to construct the gene pool. Methods were validated by testing against a collection of salep samples as well as possible adulterants/bulking agents/additives. Sequences of the ITS2 region were utilized in designing a primer set which could be used in real time PCR experiments to obtain a calibration curve that could be applicable for quantification. The sensitivity of the developed methods were validated by testing with powder salep mixtures mixed with predetermined amounts of starch or corn flour in real time PCR set up with designed ITS2a specific primers and 18S rRNA universal primers.