Deneysel pulmoner fibroziste MiR-26b ve MiR-27b  ekspresyonları ile quercetin'in fibrozis üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of quercetin on fibrosis by MiR-26b and MiR-27b expression in experimental pulmonary fibrosis
Yazar: ÇAĞRI TOKER
Danışman: PROF. DR. UFUK ÖZGÜ METE
Çukurova Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Kuersetin = Quercetin ; Mikro RNA = Micro RNA ; Pulmoner fibroz = Pulmonary fibrosis ; İnce yapı = Ultrastructure

Özet:
Amaç: Kronik, ilerleyici bir hastalık olan İdiyopatik Pulmoner Fibrozis (İPF) alveol duvarında yıkım, miyofibroblast hiperplazisi, hücre dışı matriks birikimi ve akciğer interstisyumunun yeniden şekillenmesi ile karakterizedir. Patogenezi tam olarak aydınlatılamamakla birlikte alveoler epitelyal hücre hasarı ve anormal onarım pulmoner fibrozise yol açan ana mekanizmalardır. Günümüzde İPF'de etkinliği kanıtlanmamış, sınırlı sayıda tedavi seçeneği bulunmaktadır. Çeşitli bitkilerde bulunan bir flavonoid olan Quercetin'in güçlü antioksidan özelliği sayesinde serbest radikallerin yol açtığı hücre hasarını önlediği araştırmacılar tarafından kaydedilmiş olup Bleomisin ile indüklenen pulmoner fibrozisi hafiflettiğini bildiren çalışmalar da bulunmaktadır. Son zamanlarda birçok çalışmada miRNA'ların organ gelişiminde, normal fizyolojide ve çeşitli hastalıkların patogenezinde etkili olduğu ve İPF'de de önemli rol oynadığı rapor edilmiştir. Bu çalışmalar sonucu miR-27b fibroblast aktivasyonunu inhibe eden bir anti-fibrotik miRNA olarak belirlenmiş olmakla birlikte benzer fibrozis modellerinin uygulandığı farklı organlarda miR-26b ekspresyonlarının gösterildiği ancak pulmoner fibrozisteki rolünün yeterince bilinmediği görülmüştür. Çalışmamızda Bleomisin'le oluşturulmuş pulmoner fibroziste miR-26b ekspresyonunun ilk kez gösterilerek hastalığın patogenezindeki rolünün ortaya konulması, Quercetin'in tedavi edici etkilerinin ışık ve elektron mikroskobik yöntemlerle incelenerek miR-26b ve miR-27b'nin ekspresyon düzeyleri ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
         Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada 48 adet Wistar sıçan rastgele dağıtılarak başlangıçta 4 deney grubu oluşturuldu. 3. ve 4. gruplar uygulanan tedavi ve yaşam süresine göre daha sonra tekrar 2 alt gruba ayrıldı (n=8). 1. grupta (kontrol grubu) deneyin 0. gününde % 10'luk serum fizyolojik (SF) intratrakeal olarak verildi. 8. gününden başlanarak 21 gün süresince SF intraperitoneal (i.p.) olarak uygulandı.                                   2.grupta (Quercetin kontrol grubu) deneyin 8. gününden başlanarak 21 gün süresince 50 mg/kg dozunda Quercetin i.p. olarak verildi. 3. Grupta (Hasar grubu) deneyin 0. gününde 10 mg/kg dozunda Bleomisin Sülfat intratrakeal tek doz verildi. Bu hayvanlar 2 alt gruba ayrılarak; yarısı 22. günde (Grup 3A) kalan yarısı (Grup 3B) ise 29. günde sakrifiye edildi. 4. grupta (Tedavi grubu) deneyin 0. gününde 10 mg/kg dozunda Bleomisin Sülfat intratrakeal tek doz verildi. Bu hayvanlar 2 alt gruba ayrılarak; yarısına (Grup 4A) 8. günden başlanarak 50 mg/kg dozunda Quercetin 14 gün süresince, diğer yarısına ise (Grup 4B) 8. günden başlanarak 50 mg/kg dozunda 21 gün süresince i.p. olarak verildi. Sakrifikasyon işleminin ardından elde edilen akciğer dokuları ışık ve elektron mikroskobik, immünohistokimyasal ve moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak incelendi. 
       Bulgular: Işık ve elektron mikroskobik incelemelerde hasar gruplarında interalveolar septumda yoğun şekilde kollajen birikerek alveolar yapının bozulduğu ve enflamatuvar hücre sayısında belirgin bir artış olduğu gözlenirken, Quercetin tedavisiyle fibrotik cevabın azaldığı ve alveolar yapıda iyileşme olduğu tespit edildi. İmmünohistokimyasal olarak α-SMA ekspresyonları hasar gruplarında yüksek seviyede iken tedavi gruplarında hasar gruplarına kıyasla daha düşük seviyede olduğu, E-Kaderin ekspresyonlarının ise hasar gruplarında azaldığı, tedavi gruplarında ise hasar gruplarına göre daha güçlü immünreaktivite gösterdiği görüldü. MiR-26b ve miR-27b ekspresyonlarının hasar gruplarında kontrol gruplarına göre düşük seviyede olduğu, tedavi gruplarında ise hasar gruplarından daha yüksek seviyede olduğu ve kontrol gruplarının seviyelerine yaklaştığı bulundu.
	Sonuç: Elde edilen bulgular değerlendirildiğinde, Bleomisin'le oluşturulan İdiyopatik Pulmoner Fibrozis modelinde Quercetin'in fibroziste azalan miR-26b ve miR-27b ekspresyon seviyelerini artırması ve gelişen histopatolojik değişiklikler üzerinde tedavi edici etkilerinin olması nedeniyle yeni bir tedavi ajanı olarak değerlendirilebileceği kanısına varıldı.

Abstract:
Introduction: Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a chronic, progressive disease characterized by destruction of the alveolar wall, myofibroblast hyperplasia, extracellular matrix deposition and remodeling of the lung interstitium. Although the pathogenesis is not fully elucidated, alveolar epithelial cell injury and abnormal repair are the main mechanisms leading to pulmonary fibrosis. Currently, there are limited treatment options with unproven efficacy in IPF. Quercetin, a flavonoid found in various plants, has been noted by researchers to prevent cell injury caused by free radicals due to its strong antioxidant property, and there are studies reporting that it alleviates Bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Recently, many studies have reported that miRNAs are effective in organ development, normal physiology and the pathogenesis of various diseases and play an important role in IPF. As a result of these studies, miR-27b was determined as an anti-fibrotic miRNA that inhibits fibroblast activation. In our study, it was aimed to reveal the role of miR-26b in the pathogenesis of the disease by showing the expression of miR-26b in Bleomycin-induced pulmonary fibrosis for the first time, and to evaluate the therapeutic effects of Quercetin by light and electron microscopic methods, and to compare the expression levels of miR-26b and miR-27b.
       Materials and Methods: In this study, 48 Wistar rats were randomly distributed and initially 4 experimental groups were formed. Groups 3 and 4 were further divided into 2 subgroups according to the treatment and life expectancy (n=8). In the 1st group (Control group), 10% saline (SF) was given intratracheally on the 0th day of the experiment. Starting from the 8th day, SF was administered intraperitoneally (i.p.) for 21 days. In the second group (Quercetin control group), Quercetin was given i.p. at a dose of 50 mg/kg for 21 days starting from the 8th day of the experiment. In Group 3 (Injury group), a single intratracheal dose of 10 mg/kg Bleomycin Sulfate was given on day 0 of the experiment. These animals are divided into 2 subgroups; half were sacrificed on the 22nd day (Group 3A) and the remaining half (Group 3B) on the 29th day. In the 4th group (Treatment group), a single intratracheal dose of 10 mg/kg Bleomycin Sulfate was given on the 0th day of the experiment. These animals are divided into 2 subgroups; half of them (Group 4A) were given 50 mg/kg of Quercetin starting from day 8 for 14 days, and the other half (Group 4B) was given i.p. at a dose of 50 mg/kg for 21 days starting from day 8. Lung tissues obtained after sacrification were examined using light and electron microscopic, immunohistochemical and molecular biological methods.
       Results: In light and electron microscopic examinations, it was observed that the alveolar structure was deteriorated by dense collagen accumulation in the interalveolar septum and a significant increase in the number of inflammatory cells was observed in the injury groups, while the fibrotic response was decreased and the alveolar structure improved with Quercetin treatment. Immunohistochemically, α-SMA expressions were higher in the injury groups, but lower in the treatment groups compared to the injury groups, while E-Cadherin expressions were decreased in the injury groups and showed stronger immunoreactivity in the treatment groups compared to the injury groups. It was found that miR-26b and miR-27b expressions were lower in the injury groups than in the control groups, and higher in the treatment groups than in the injury groups and approached the levels of the control groups.
        Conclusion: When the findings were evaluated, it was concluded that Quercetin can be considered as a new treatment agent in the Idiopathic Pulmonary Fibrosis model induced with Bleomycin, since it increases the expression levels of miR-26b and miR-27b, which decreases in fibrosis, and has therapeutic effects on the developing histopathological changes.