Cryptosporidium parvumun hücre kültüründe üretilmesi ve üremenin farklı yöntemlerle belirlenmesi
Production of Cryptosporidium parvum in cell-culture and detection of proliferation with different methods
Yazar: SIRRI KAR
Danışman: PROF. DR. AYŞE ÇAKMAK
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Buzağılar = Calves ; Cryptosporidium = Cryptosporidium ; Hücre kültürü = Cell culture ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Cryptosporidium parvum'un Hücre Kültüründe Üretilmesi veÜremenin Farklı Yöntemlerle BelirlenmesiÇalışmada, Cryptosporidium parvum'un HCT-8 hücre kültüründe üretilmesi amacı ile kullanılabilecek tekniklerin başarısı ve meydana gelen üremenin ortaya konması konusunda klasik PCR, real-time PCR, interferens kontrast mikroskobi, Giemsa ve Haematoxylin-Eosin boyama tekniklerinin birbirlerine göre üstünlüklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.Bu çalışmada, Almanya/Leipzig Parazitoloji Enstitüsünde, buzağılarda pasajlanarak +4 oC'de muhafaza edilen 3, 9 ve 12 aylık Cryptosporidium parvum oocystleri HCT-8 hücre kültürüne farklı 6 yöntem kullanılarak ekilmişlerdir. Söz konusu 6 tekniğin birincisinde, oocystler 4 saat süre ile, hücre kültüründe %0,4'lük sodium taurocholate eşliğinde ekskistasyona bırakılmış, arkasından besiyeri değiştirilerek 24 saat inkube edilmiş, ikincisinde ilkinden farklı olarak inkubasyon süresi 48 saate, üçüncüsünde ise 72 saate çıkarılmıştır. Dördüncü yöntemde 4 saatlik inkubasyonu takiben besiyeri değiştirilmemiş, onun yerine 1:8 oranında dilüe edilmiş, 24. saat sonra ilgili değişiklik yapılmış ve kültür 48. saate kadar devam ettirilmiştir. Beşinci yöntemde oocystler önce 10 mM HCl ile 37 oC'de 10 dk, arkasından %0,1 sodium taurocholate ile 15 oC'de 10 dk inkube edilmiş ve kültüre ekilmişlerdir. Bu yöntemde, oocystler hücre kültüründe sodium taurocholate ile inkube edilmemiş olup diğer işlemler 2. yöntemde olduğu gibi yapılmıştır. Altıncı yöntem ise bir önceki yönteme benzer şekilde, oocystler sadece HCl ile muamele edilmişler, arkasından kültüre alınıp 4 saat %0,1 sodium taurocholate ile muamele edilmişlerdir; geri kalan süreç yine 2. yöntemdeki gibi gerçekleştirilmiştir. Uygulamaların bütününde, belirtilen kültür süresi sonunda DNA ekstaraksiyonu yapılmış ve klasik PCR uygulanmıştır. Elde edilen DNA'lardan karşılaştırma açısından önem taşıyan 14 tanesi seçilmiş ve real-time PCR ile spesifik DNA yoğunlukları taranmıştır.Kültürde gelişen formları gözleyebilmek amacıyla, hücre ekiminden hemen önce kültür pleytlerine yerleştirilen lameller, kültürün 24. 48. ve 72. saatinde alınmış, bir kısmı alkol tespiti sonrası Giemsa ve Haematoxylin-Eosin ile bir kısmı ise formalin tespiti sonrası yine Haematoxylin-Eosin ile boyanmış ve mikroskop altında x100 büyütmede taranmışlardır. Bu arada dönemlere ait interferens mikroskop taramaları da düzenli olarak gerçekleştirilmiş ve gereken kayıtlar tutulmuştur.Gerek PCR'dan, gerekse de direkt mikroskobik taramalardan elde edilen sonuçlar, 72 saatlik inkubasyon esasına dayanan uygulamanın diğerlerine göre daha başarılı olduğunu, bu süre zarfında parazite ait biyolojik formların hemen hepsinin gözlemlenebileceğini ortaya koymuştur. Ancak, oocystlerdeki canlılık farkının belirlenmesi açısından ise 24 saatlik inkubasyonun ideal olduğu anlaşılmıştır. HCl uygulamaları ile ilgili olarak, bu yöntemin oocystlerde canlılıkla paralel, etkili bir ekskistasyonu sağladığı, ancak aynı zamanda enfektivitelerini de baskıladığı görülmüştür. Yine elde edilen sonuçlar, oocystlerin +4 oC'de, antibiyotik ve antimikotik destekli PBS içerisinde muhafaza edildiğinde zamanla canlılıklarının azaldığını ancak bu durumu en az 12 ay devam ettirebildiklerini göstermiştir.Yapılan incelemeler, kültürde gelişen parazite ait formların etkili bir şekilde gözlemlenebilmesi için interferens kontrast mikroskobun, takibinde de Giemsa boyama tekniğinin belli avantajlara sahip olduğunu, formalin ile tespit sonrası gerçekleştirilen Haematoxylin-Eosin boyamanın ise hücrelerde meydana gelen değişiklikleri ortaya koyabilmek açısından avantajlı bir konumda bulunduğunu göstermiştir. Taramalarda, interferens mikroskop ile kültürde merontların ve mikrogametlerin, boyama yöntemleri ile de sadece merontların net olarak tanımlanabileceği, ancak diğer parazit formları ile ilgili kesin adlandırmanın zor olduğunu anlaşılmıştır.

Abstract:
Production of Cryptosporidium parvum in cell-culture and detection of proliferation with different methodsThe objective of this study has been to determine the efficacy of the techniques used for Cryptosporidium parvum propogation in cell culture and it has also been intended to evaluate and compare classical PCR, real-time PCR, interference contrast microscopy, Giemsa and Haematoxylin-Eosin staining methods to find out their superiorities with respect to each other in terms of the exhibited proliferation.In this study, 3, 9 and 12 months old Cryptosporidium parvum oocysts passaged in calves and stored at +4 oC at Germany/Leipzig Parasitology Institute were seeded into HCT-8 cell culture using 6 different methods. In the first method, oocysts were incubated with 0,4 % sodium taurocholate for excystation, then this medium was exchanged with growth medium and culture was incubated for 24 hours; whereas the incubation period was increased up to 48 hours and 72 hours in the second and third methods respectively. In the fourth method, the medium was not exchanged following the 4 hours incubation, instead the medium was diluted with a ratio of 1:8, the medium replacement took plece after 24 hours and the culture was preserved till the 48 th hour. In the 5th method, oocysts were inoculated into the cell culture after treatment with 10 mM HCl at 37 oC for 10 minutes and later %0,1 sodium taurocholate at 15 oC for 10 minutes. In this method, oocysts were not incubated with sodium taurocholate in the cell culture, butthe remaining steps were exactly carried out as in the second method. In the sixth method, oocysts were first only treated with HCl similar to the previous case and then with 0,1% sodium taurocholate for 4 hours after having been inoculated into the cell culture, the following remaining processes were as in the second method. During all the methods, DNA extraction was carried out at the end of the mentioned incubation periods and classical PCR was applied. The 14 samples containing DNA that were important for comparison reasons were selected and their spesific DNA amounts were scanned with real-time PCR.Coverslip assay was used for the analysis of the foci developed in cell culture. The coverslips placed at the bottom of culture plate well before the initial seed of the cells were removed at the 24th, 48th and 72nd hours of the cultivation. Two fixatives, methanol and formaline, and two staining methods, Giemsa and Haematoxylin-Eosin, were compared in order to select the better method for controlling the foci of Cryptosporidium parvum in cell culture. After the process, coverslips were monitored under x100 magnification. Meanwhile, all of the wells were controlled under interference microscope and the results were recorded.Both the PCR and direct microscopy results indicate that a technique based on a 72 hours of incubation is much more successful than the others as far as the observation of the full foci of the parasite is concerned. On the other hand, it was found out that incubation period of 24 hours is ideal to determine the oocysts viability differences. Although HCl treatment provided excessive excystation rates especially for 3 months old oocysts, the results showed that such applications also decrease the viability of oocysts. Furthermore, although the oocyst viability decreased by time when they were stored in antibiotic and antimicotic buffered PBS at +4 oC, it was shown that they could survive at least 12 months under these conditions.The study showed that interference microscopy and to some extend Giemsa staining method have some special advantages for monitoring the foci, on the other hand Haematoxylin-Eosin staining method used after formaline fixation is superior to other methods to exhibit the changes within the culture cells. The result showed that both meronts and microgamets could be identified under the interference microscope while only meronts could be clearly identified using the staining methods. It had been noticed that an accurate identification of the other foci would be extremelly diffucult.