High resolution melting curve (hrm) analiz yönteminin delesyon tipi mutasyonlarin saptanmasinda kullanimi
High resolution melting curve (HRM) analysis technique for detection of deletion type mutations
Yazar: ASLI KUZPINAR
Danışman: PROF.DR. ŞÜKRİYE AYTER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Genetik hastalıkların klinik tanısının doğrulanması, genotip?fenotipilişkisinin kurulması ve doğum öncesi tanı verilebilmesi için buhastalıklara yol açan mutasyonların tanımlanması gereklidir. Bunedenle, değişik mutasyon tarama yöntemleri geliştirilmiştir. Buyöntemlerden biri de High Resolution Melting Curve (HRM) analizidir.HRM analizi DNA'nın sıcaklıkla denatürasyonunun floresan boyaölçümü ile takibi esasına dayanır, Polimeraz Zincir Reaksiyonu(PZR)'nun yapıldığı tüpte, 10?15 dakika içerisinde gerçekleştiğindendiğer tarama yöntemlerinin yerini alabilecek niteliktedir. Tezçalışmasında, HRM analizinin delesyon tipi mutasyonları saptamadakietkinliğinin araştırılması ve delesyon boyutu, DNA amplikon boyutu,GC içeriği, Mg2+ ve DNA konsantrasyonu, DNA thermal cycler cihazı vefloresan işaret veren boya gibi değişkenlerin HRM analizinindelesyonları saptama hassasiyetine olan etkilerinin incelenmesiamaçlanmıştır. Bu doğrultuda, NF1 geni ekzon 4b'de bulunan 496delGTve 499delTGTT; ekzon 12a'da bulunan 1758delTA; ekzon 22'de bulunan3759delCTACC ve 3818delCT ve CFTR geni ekzon 10'da bulunan ?F508mutasyonları incelendi. Çift zincirli DNA'ya bağlanma özelliğine sahipfloresan boya olan SYTO9 varlığında PZR yapıldı ve yüksekçözünürlüklü DNA denatürayon eğrileri elde edildi. Heterozigot vehomozigot dizi farklılıkları normalize ve türev eğrilerin analizedilmesiyle belirlendi. Mutasyon taşıyan örnekler, normal örneklerdeneğrilerin şekline ve durumuna göre ayırt edildi. Çalışılan 4 ekzondaincelenen 6 delesyonun tümü saptandı. Amplikon boyutunun ve GCoranının arttığı ekzonlarda, kompleks eğriler oluştu. 2-8 ng/?larasındaki DNA konsantrasyon değerlerinde HRM analizinin etkinliğideğişmedi. Mg2+ konsantrasyonunun artması sonucunda Tm derecesininarttığı belirlendi. DNA amplifikasyonun gerçekleştirildiği thermal cyclercihazının HRM analizi sonuçlarını değiştirmediği saptandı. Ayrıca,HRM analizi ile delesyon saptanmasında SYBR Green boyasınınkullanılamayacağı belirlendi. Sonuç olarak, HRM analizinin delesyonsaptamak için kullanılabilecek uygun bir yöntem olduğu gösterilmiştir.Anahtar Kelimeler: DNA denatürasyonu, floresan işaretleme, DNA Tmderecesi, Real-time PZR, genetik test

Abstract:
Detection of mutations in genetic diseases isimportant for the confirmation of clinical diagnosis, for theestablishment of genotype-phenotype correlation and prenatal diagnosis.For that reasons, a variety of mutation scanning techniques have beendeveloped. High Resolution Melting Curve (HRM) analysis is one ofthese techniques. It is based on the measurement of fluorescent dyeduring thermal DNA denaturation. Mutation detection takes place inthe same reaction tube as the amplification and it takes only 10 ? 15minutes, therefore it may replace the other scanning methods. In thisthesis, our aim is to search efficiency of HRM analysis for the detectionof deletion type mutations, and define the parameters such as deletionsize, DNA amplicon size and GC content, Mg2+ and DNA concentration,type of DNA thermal cycler machine and flourescent dye which canaffect HRM analysis. For this purpose, we investigated the mutations inthe NF1 gene which are 496delGT and 499delTGTT (exon 4b),1758delTA (exon 12a), 3759delCTACC and 3818delCT (exon 22) and?F508 (exon 10) mutation in the CFTR gene. PCR was performed in thepresence of the double stranded DNA binding dye SYTO9 and highresolutionmelting curves were obtained. Heterozygous and homozygoussequence variations were analyzed from normalized and derivatedgraphs. Mutant genotypes were distinguished from the wild-type interms of melting curve shape and position and all of 6 deletions weredetected. However complex curves are obtained for the large ampliconsbecause of the increased amount of the GC domains. The efficiency ofHRM analysis did not change in DNA concentrations between 2-8 ng/?l.It was determined that Tm degree increases with increasing amount ofMg2+ concentrations. The type of PCR equipment where the DNAamplifications were performed did not change the results of HRManalysis. Also, it was determined that SYBR Green dye can not be usedfor detection of the deletions with HRM analysis. In the light of theseresults, HRM analysis can be used to detect deletion type mutations andas a prescreening test for unknown mutations.Key Words: DNA denaturation, fluorescent labeling, DNA Tm Degree,Real-time PCR, genetic test