Kemik rejenerasyonu için bor-katkılı doku iskelelerinin geliştirilmesi
Development of boron-doped tissue scaffolds for bone regeneration
Yazar: EZGİ ŞENGÜL
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Bor = Boron ; Kitosan = Chitosan ; Nanopartiküller = Nanoparticles

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, kemik doku rejenerasyonunu destekleyecek özelliklere sahip bor-katkılı kitosan doku iskelelerinin üretiminin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak, üretilen doku iskelelerinin karakterizasyon çalışmaları yapılmış ve uygun özelliklere sahip doku iskeleleri seçilmiştir. Seçilen doku iskeleleri ile hücre kültür çalışmaları yürütülerek, bor katkısının öncül kemik hücreleri üzerindeki etkisi incelenmiştir.Tez kapsamında yapılan çalışmaların ilk aşamasında, yaklaşık 100 ? m gözenek çapına sahip kitosan doku iskeleleri (9 mm çap, 2 mm kalınlık, 0.0051±0.0005 g kuru ağırlık) dondurarak kurutma yöntemi ile üretilmiştir. Bor katkılı doku iskeleleri ise, i) bor çözeltisinin kitosan doku iskelelerine emdirilerek yüklenmesi, ii) bor çözeltisinin kitosan jellerle karıştırılması ve iii) bor çözeltisi yüklenmiş kitosan nanopartiküller içeren kitosan doku iskeleleri hazırlanması olmak üzere üç farklı yöntem ile hazırlanmıştır. Bor çözeltisi olarak borik asit-manitol karışımı kullanılmıştır.Kitosan nanopartikül (174±2.5 nm) emdirilmiş doku iskelelerinin daha büyük gözeneklere ve içsel bağlantılara sahip olmasının yanında mekanik dayanımının da arttığı görülmüştür. Kitosan nanopartiküllere bor enkapsülasyonu %97 oranında gerçekleşmiş ve doku iskelesi başına 0.097 mg ile 0.291 mg arasında bor yüklenebilmiştir. Nanopartikül yüklü doku iskelelerinden bor salımı ilk 1 saatteki ani salımı (burst etki) takiben 120. saate kadar devam etmiştir. .Tez çalışmasının son aşamasında, doku iskelelerinin osteojenik aktiviteleri preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri kullanılarak, durgun koşullarda yürütülen hücre kültür çalışmaları ile incelenmiştir. Bu amaçla, boş kitosan doku iskelesi (Kitosan), serbest borik asit ortamında bulunan kitosan doku iskelesi (Kitosan-BA) ve nanopartikül yüklü kitosan doku iskelesi (NP-Kitosan) kullanılmıştır. Hücre morfolojileri SEM (taramalı elektron mikroskobu) ile görüntülenmiştir. Hücre farklılaşması, Von Kossa boyaması ve alkalen fosfataz (ALP) aktivitesinin ölçümü ile belirlenmiştir. RT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) ile ise MC3T3-E1 hücrelerinin kollajen I seviyeleri belirlenmiştir. Sonuçlar, nanopartikül yüklü kitosan doku iskelelerinin (NP-Kitosan), hücrelerin üremesini ve farklılaşmasını desteklediğini göstermiştir.Çalışmalardan elde edilen bulgular, borun MC3T3-E1 osteoblastik hücreleri üzerindeki olumlu etkilerini göstererek, osteoindüktif ajan olarak kullanılabileceğini kanıtlamış ve ayrıca bor-katkılı nanopartikül yüklü kitosan doku iskelelerinin kemik doku mühendisliği uygulamaları için uygun malzemeler olabileceğini göstermiştir.

Abstract:
In this study, the production of boron-doped chitosan tissue scaffolds, which has the ability to support the regeneration of bone tissue, was aimed. For this purpose; characterization studies of produced tissue scaffolds were done and the appropriate tissue scaffolds were chosen. Executing the cell culture studies with the selected tissue scaffolds, the contribution of boron on precursor bone cells were investigated.In the first part of the study; chitosan tissue scaffolds which have approximately 100 µm pore diameter (9 mm diameter, 2 mm thickness, 0.0051±0.0005 g dry weight) were produced by freeze-drying method. Besides, boron doped tissue scaffolds were produced by three different methods, i.e., i) embedding of boron solution to chitosan tissue scaffolds, ii) mixing the boron solution with chitosan gels iii) preparing the chitosan tissue scaffolds including boron solution loaded chitosan nanoparticles. Mannitol-boric acid mixture was used as boron solution.It is observed that chitosan nanoparticle (174.0±2.5nm) embedded tissue scaffolds have larger and interconnected pores, also increased mechanical strength. Boron encapsulation to the chitosan nanoparticles realized by ratio of 97% and for each tissue scaffold between 0.097 mg and 0.291 mg boron was loaded. Boron release from nanoparticle loaded tissue scaffolds after the sudden release period of first 1 hour (burst effect), maintained almost 120 hours.In the last part of the study; by using preosteoblastik MC3T3-E1 cells, osteogenic activities of the tissue scaffolds were analyzed with cell culture studies under steady conditions. For this purpose, an empty chitosan scaffold (chitosan), chitosan scaffold in free boric acıd solution (Chitosan-BA) and nanoparticle loaded chitosan scaffold (NP-Chitosan) were used. Cell morphologies were viewed by SEM (scanning electron microscope). Cell differentiation was determined by Von Kossa staining and by measuring the alkaline phosphatase (ALP) activities. In addition, by using RT-PCR (real time polymerase chain reaction) the collagen levels of the MC3T3-E1 cells were determined. The results showed that; nanoparticle loaded chitosan scaffolds (NP-Chitosan) support the proliferation and differentiation of the cells.The results of the studies proved that the boron can be used as an osteoinductive agent by showing its positive effects on MC3T3-E1 osteoblastik cells and also showed that boron-doped nanoparticle loaded chitosan scaffolds can be evaluated as appropriate materials for bone tissue engineering applications.