Safra asidinin neden olduğu hepatotoksisiteye karşı C3A hücre hattında propolis ekstraktının olası koruyucu etkilerinin araştırılması
Investigation of possible protective effects of propolis extract against bile acid induced hepatotoxicity in C3A cell line
Yazar: ÜMMÜGÜLSÜM BENEK
Danışman: PROF. DR. KENAN GÜMÜŞTEKİN
Abant İzzet Baysal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Akridinler = Acridines ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kenodeoksikolik asit = Chenodeoxycholic acid ; Kolestaz = Cholestasis ; Propolis = Propolis ; Safra = Bile ; Safra kanalları = Bile ducts

Özet:
Kolestaz, bilier basıncın artması, safra kanalının tıkanması ve safra tuzlarının karaciğer içinde birikimiyle karakterize patofizyolojik bir durumdur. Propolis, polifenolik bileşikler ve flavonoidler açısından zengin, antitümöral, antiinflamatuar, antioksidatif,  antimutajenik özellikleri araştırılmış bir arı ürünüdür. Çalışmamızda Propolis ekstraktının safra asit kaynaklı hepatotoksisiteye karşı hepatosit canlılığı üzerine olası koruyucu etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmada insan hepatoma hücre hattı olan C3A kullanıldı. Hücreler %10FCS, %1antibiyotik içeren DMEM/F12 hücre medyumunda %5CO2, 37°C'lik nemli atmosfer altında çoğaltıldı. Çoğalan hücreler tripsin/EDTA ile toplandı ve hemositometreyle sayıldı. 3x104 hücre/100µl konsantrasyonda 96 kuyucuklu plakaya ekildi. Hücrelerin tamamının plakaya yapışması için 1 gün beklendi. Hücrelerin üzerine glikokenodeoksikolik safra asidi(GCDCA) (0.5, 0.75, 1, 1.5, 2mM) uygulandı (n=3). Safra asidi uygulamasından 24 saat sonra MTT testi kullanılarak etkili toksik dozun 1mM olduğu belirlendi. Etkin dozu belirlenen safra asidi uygulamasından 3 saat önce ve sonra propolis ekstraktının etanolde ve suda çözünmüş hali 50, 10, 5, 1µg/ml olarak uygulandı. Olası koruyucu etkileri 24 saat sonra MTT testi kullanılarak ölçüldü. Hücreler üzerine uygulanan etanol oranı %0.05'in altında tutuldu. Hücre morfolojileri akridin turuncusuyla boyanarak florasan mikroskopla değerlendirildi. 
Propolis ekstraktlarının tek başına hücreler üzerinde kontrol grubuyla kıyaslandığında anlamlı bir etki oluşturmadığı görüldü(p>0.05). 1mM GCDCA toksisitesinden önce uygulanan propolis su ekstraktının bütün dozlarında, 1mM GCDCA toksisitesinden sonra ise propolis su ekstraktının sadece 50 ve 10µg/ml hücre canlılığını anlamlı derecede artırdığı görüldü(p<0.05). 1.5mM GCDCA toksisitesinden önce uygulanan propolis su ekstraktının ise 50 ve 10µg/ml dozlarının hücre canlılığı üzerine olumlu etkisi olduğu görüldü(p<0.05). 1mM GCDCA'yla indüklenmiş toksisiteden önce ve sonra uygulanan propolis alkol ekstraktının sadece 1µg/ml dozunun olumlu etkisi olduğu görüldü(p<0.05). 1.5mM GCDCA ile indüklenmiş toksisiteden önce ve sonra uygulanmış propolis alkol ekstraktının hücre canlılığına olumlu bir etkisi görülmedi(p>0.05). 
Kolestazis ameliyatları öncesi bekleme süresinde karaciğerin korunmasına yönelik henüz yeterli bir tedavi yaklaşımının bulunmamasından ve bu çalışma ile propolisin in-vitro olarak koruyucu etkisinin görülmesinden dolayı bu konuda yapılacak in-vivo çalışmalar değerli olacaktır.

Abstract:
Cholestasis is a pathophysiological condition that characterized by the accumulation in the liver of bile salts, biliary pressure increase, bile duct occlusion. Propolis, a bee products, is rich about polyphenolic compounds and flavonoids. İts antitumor, anti-inflammatory, anti-oxidative, antimutagenic properties were researched. We aimed to possible protective effect of propolis extract against bile acid induced hepatotoxicity on viability of hepatocyte.
We used C3A human hepatoma cell line in this study. Cells were grown in DMEM/F12 medium containing %10 FCS and %1 antibiotic under condition with humidified atmosphere (37°C, %5 CO2). Cells were harvested using trypsin/EDTA and were counted with a hemocytometer. Cells were seeded at concentration of 3x104 hücre/100µl into 96 well plate. We allowed for all cells attach to plate during a day. GCDCA (concentration of 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2 mM) was added in medium of cells (n=3). After 24h administration of the bile acid, we determinated toxic dose of GCDCA is 1 mM by MTT assay. Ethanol and aqueous extracts of propolis (concentration of 50, 10, 5, 1 µg/ml) were administered before and after 3h treatment of determinated effective dose of bile acid. Possible protective effects of propolis were measured by using MTT assay 24h later. Ethanol content of propolis solution applied on cells was kept below 0.05%. The cell morphology was evaluated by acridine orange staining under the fluorescent microscope.
Comparing alone treatment group of ethanol and aqueous propolis extracts with the control group did not show significant effects (p>0.05). It shown that all dose of aqueous extract of propolis treatment before toxicity induced by 1 mM GCDCA and 10 to 50 µg/ml aqueous extract of propolis after toxicity induced by 1 mM GCDCA significantly increased cell viability(p<0.05). Before toxicity induced by 1.5 mM GCDCA, 10 to 50 µg/ml aqueous extract of propolis shown positively effect on cell viability(p<0.05).  Before and after toxicity induced by 1 mM GCDCA, 1 µg/ml ethanol extract of propolis shown positively effect(p<0.05).  Before and after toxicity induced by 1.5 mM GCDCA, ethanol extract of propolis did not show positively effect(p>0.05).
Because of to be scarcely therapy for protection of the liver during the waiting period before operation of cholestasis and to be seen in-vitro protective effect of propolis by this study, in-vivo study about this event is reqiured.