Taşıyıcılı ve taşıyıcısız sistemlerde peroksidaz enziminin karakterizasyonu
Characterization of immobilized enzyme systems on carrier-bound and carrier-free systems
Yazar: CEREN TOPÇULAR
Danışman: DOÇ.DR. HAKAN AYHAN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan bu çalı manı amacı HRP (horseradish peroksidaz) enzimininn ;ı lıve taş cız immobilizasyonunu gerçekleşı sıtaş cıyı yı tirmek, immobilizasyonkoş ulları ve immobilize enzim setlerinin özelliklerini belirlemek ve tekstilnısektörü ağ artma iş leminden arta kalan H2 O2 'nin hazı rlanan immobilize enzimşsetleri ile parçalanması sağ nı lamaktı Çalı r. manı ilk bölümünde monodispersnPGMA (poliglisidilmetakrilat) partikülleri; GMA (glisidilmetakrilat) monomerininıetanol dağtma ortamı nda baş cıolarak AIBN (azobisizobutironitril) velatıstabilizör olarak PAA (poliakrilikasit) varlıı dispersiyon polimerizasyonuylağndaısentezlenmiş Sentezlenen PGMA mikrokürelerin boy ve boy dağlıtir. mları nnıiçin taramalıelektron mikroskobu (SEM) kullanı ş elde edilensaptanması lmı ,larak sayı ortalama çap (Dn ) 1,166 ï­fotoğ raflardan mikroküreler sayı ca m,ağ kça ortalama çap (D w) 1,166 ï­ ve polidispersite indeksi (PDI) 1.000ırlı m,ş ı k)olarak hesaplanmı r. Gravimetrik yöntemle tayin edilen %88,67 (%ağrlıtıdeğ ise toplam monomer dönüşeri üm oranı n yeterince yüksek olduğnı unugöstermektedir. Karakterizasyon sonuçları göre polimerizasyon reçetesininnaşbaş yla kullanıarı labileceğ öngörülmüşi tür. Çalı manı ikinci bölümünde,nı sı ı cı tirilmiş İtaş cız ve taşyılıolarak enzim immobilizasyonu gerçekleşyı tir. lkolarak; karakterizasyonu yapı lan mikroküreler, Horseradish peroksidazenziminin immobilizasyonunda taş cı partikül olarak kullanı şr.ıyı lmıtıİ ı yammobilizasyonda, taş cı bağ yı lama yöntemi olarak kovalent bağ lama metodudenenmiş Kovalent bağtir. lanma metodunda uzatma kolu (spacer-arm) olarakçift fonksiyonel bir reaktif olan glutaraldehit kullanı ş r. İ lmı tı mmobilizasyonunardı ndan immobilize enzim miktarları Modifiye Lowry toplam protein tayini ile,immobilize enzim setlerinin H2O 2 ortamı nda gösterdikleri aktivite ise uygunşr.aktivite tayin yöntemi ile saptanmıtı Mikrokürelere bağ lanan enziminşimmobilizasyon çalımaları sonucunda optimum koş ullar; immobilizasyon süresi7.2, immobilizasyon sı ğ 25o C, ve başcaklıı10 dak. immobilizasyon pH'ı langı çenzim deriş imi 0,05 mg protein/ml olarak bulunmuş tur. Bu aş amanı nı sıtamamlanması n ardı nı ndan enzimin taş cız immobilizasyonuna geçilmişyı tir.İmmobilizasyon çözünmüş enzimden, BSA (bovin serum albumin) veglutaraldehit varlıı ğnda, çapraz bağ lıçözünmez enzim agregatları(CLEA)şoluş turulması gerçekleşile tirilmiş Bu amaçla yapı çalıtir. lan maları sonundanoptimum koş ullar; baş langı enzim deriş 0.05 mg/ml, BSA deriş 62.5ç imi imişr.mg/ml, glutaraldehit deriş ise 4Âµl/ml enzim çözeltisi olarak saptanmıtıimiİ şr.mmobilizasyonun ardı ndan immobilize enzim setlerinin aktiviteleri saptanmıtıLineweaver-Burk grafikleri ile hesaplanan kinetik parametreler ise; serbestı lıenzim için Km=2.33 mmol H2O2 /l; Vm= 0.760 mmol H2 O2 /l.sn., taş cı enzim yıı sıiçin Km= 96.00 mmol H2O2 /l; Vm= 0,175 mmol H2 O2/l.sn., taş cı z enzim için yıÖz iiKm= 33.40 mmol H2O2 /l; Vm= 0.127mmol H2O 2 /l.sn. ş şeklindedir. Çalı manı sonnaş aması nda, immobilize enzim setlerinin ağartma işlemi sonrası arta kalanndaH2O2 'i parçalamada gösterdikleri performans incelenmiş immobilize enzim,ı rmayasetlerinin gösterdikleri aktivite değ erleri serbest enzimle karş tı laşı lıve taş cı zı sıgidilmiş Bu performans testleritir. ile hazırlanan taş cıyı yıimmobiilize enzim setlerinin atı sudan H2 O2 `i tamamen temizlemede baş lık arıolduğ görülmüşu tür.Anahtar Kelimeler: HRP, polimerik mikroküreler, enzim immobilizasyonu,CLEAşDanı man: Doç.Dr. Hakan AYHAN, Hacettepe Üniversitesi, Kimya MühendisliğiBölümü, Kimyasal Teknolojiler ABD.

Abstract:
The aim of the submitted study is to realize carrier-bound and carrier-freeimmobilization of HRP (horseradish peroxidase) enzyme, to determinate theoptimum immobilization conditions, to investigate the properties of immobilizedenyzme sets and eliminate H2 O2 remaining from bleaching process in textileindustry. In the first step of the submitted study, PGMA (polyglysidilmetacrylate)particles were synthesized by dispertion polymerization method from the GMA(glysidilmethacrylate) monomer, dissolved in an ethanol medium, by using AIBN(asobisisobutyronitrile) as initiator and PAA (polyacrylicacid) as stabilizer. Sizeand size distribution of the synthesized microspheres were determined by SEM(scanning electron microscope). By counting the particles from the obtainedphotographs the following results were calculated: average diameter by number(Dn); 1,166ï­ average diameter by weight (Dw ); 1,166ï­ polydispersity indexm, m,(PDI); 1,000. The calculated monomer transformation value (%88,67 by weight),which was determined by gravimetric methods, indicates that the total monomertransformation rate is satisfactory. The obtained characterization resultssupported that the formulation could be used succesfully. In the second step ofthe study, enzyme immobilization was realized by carrier-bound and carrier-freemethods. For the carrier-bound immobilization process, covalent binding methodonto a carrier technique has been applied. Glutaraldehyde, a bifunctionalreactive, has been used as the spacer arm in the covalent binding method. The?immobilized enzyme amount? results obtained from The Modified Lowry totalprotein analysis enzyme and ?immobilized enzyme activity? was specified byproper activity determination method. The optimum conditions found at the endof the experiments for the enzyme to be immobilized onto the surface-modifiedmicrospheres are: immobilization time 10 min, immobilization pH; 7.2,temperature of immobilization medium; 25 oC and initial enzyme concentration;0.05 mg protein/ml. Then carrier-free enzyme immobilization was realised byforming cross-linked enzyme aggregates (CLEA?s). BSA (bovine serum albumin)was used as proteic feeder and glutaraldehyde was used as crosslinking agentduring forming CLEA?s. The ?immobilized enzyme activity? was specified byactivity determination method. The optimum conditions found at the end of theexperiments for the cross-linked enzyme aggregates are: the initial enzymeconcentration; 0.05 mg protein/ml, BSA concentration; 62.5 mg/ml,glutaraldehyde concentration; 4Âµl/ml. In the last section of the study,performances of the immobilized enzyme sets were compared with treatment oftextile industry waste water. The kinetic parameters were calculated byLineweaver-Burk plots such as; Km=2.33 mmol H2O2/l; V m=0.760 mmolH2 O2/l.sec for native enzyme, Km =96.00 mmol H2 O2/l; Vm =0.175 mmolH2 O2/l.sec for carrier-bound immobilized enzyme and Km =33.40 mmol H 2O2/l;Vm= 0.127 mmol H 2O2 /l.sec for carrier-free immobilized enzyme. At the lastsection of the study; the performance of immobilized enzyme sets wasinvestigated to refine remaining H2 O2 from bleaching process. The performancetests verified that both carrier-bound and carrier-free enzyme sets wereadequate to eliminate the H2O2 content of waste water of textile industry.Keywords: HRP, polymeric microspheres, enzyme immobilization, CLEAAdvisor: Assoc. Prof. Dr. Hakan AYHAN, Hacettepe University, Chemical Eng.Dept., Chemical Technology Division.