Fare kuyruğunda oluşturulan sekonder lenfödem modelinde embriyonik kök hücre ve kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin lenfanjiyogenez üzerine etkisi
Embryoni̇c stem cells and bone marrow-deri̇ved mesenchymal stem cells effect of lymphangi̇ogenesi̇s on the created secondary lymphedema mi̇ce model
Yazar: HASAN GÜÇ
Danışman: DOÇ. DR. CENK DEMİRDÖVER
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Cerrahi Tıp Bilimleri Bölümü / Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Büyüme maddeleri = Growth substances ; Embriyo = Embryo ; Fareler = Mice ; Kemik iliği = Bone marrow ; Kök hücreler = Stem cells ; Lenfödem = Lymphedema ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors

Özet:
Lenfödem, lenfatik disfonksiyon sonucu proteinden zengin interstisyel sıvının deri ve subkutan doku içerisinde birikmesidir. Tüm dünyada 140-200 milyon lenfödem olgusunun var olduğu tahmin edilmektedir. Lenfödem etiyolojisine göre primer ve sekonder lenfödem şeklinde sınıflandırılır. Etiyolojisi bilinmeyen ya da konjenital lenfatik fonksiyon bozukluğu sonucu oluşan olgular primer lenfödem olarak adlandırılır. Var olan bir nedene ikincil gelişen diğer tüm olgular sekonder lenfödem olarak adlandırılır.
Sekonder lenfödem edinsel bir problemdir. Enfeksiyon, travma, cerrahi ablasyon, radyasyon, tümör, lenfoproliferatif hastalıklar ya da yaralanmaya bağlı gelişebilir ABD'de malignite ve radyoterapi en sık sekonder lenfödem sebepleridir.
Cerrahi dışı tedavi için temel stratejiler manüel lenf drenaj, ekstremite elevasyonu, kompresyon tedavisi ve lenfatik akışa yönelik egzersizlerin kombinasyonu olarak tanımlanabilir. Lenfödem tedavisinde cerrahi prosedürler genelde temel yaklaşımlardan biri değildir. Cerrahi tedavi temelde ablatif prosedürler ve fizyolojik prosedürler olarak ikiye ayrılmaktadır. Kronik lenfödem hastalarının yaşam kalitesinde önemli miktarda bozulmakta, bu hasta popülasyonu ciddi beden imge bozuklukları gözlenmektedir. Hastalar dönem dönem akut enflamatuar ataklar geçirmekte ağrı, cilt kalitesinin bozulması ve ciddi hareket kısıtlılıkları yaşamaktadırlar. Yaşam boyu düzenli bakım ve yoğun kontroller altında olmalarından dolayı ciddi tedavi maliyetleri gözlenmektedir.Lenfanjiyogenez üzerine etkili birden fazla büyüme faktörü tanımlanmıştır, yapılan son çalışmalar bu büyüme faktörlerinin lenfatik sistemin gelişiminde anahtar rol oynayarak düzenleyici görevi üstlendiğini göstermiştir. Hastalıkların patogenezlerinin daha ayrıntılı anlaşılması, hücresel düzeyde birçok reseptör ve molekül tanımlanmasıyla birlikte tedavi yöntemleri de moleküler hedeflere yönelik geliştirilmeye başlamıştır. Böylelikle lenfanjiyogenez, lenfödem için umut verici tedavi yöntemi olarak gündeme gelmiştir ve lenfatik büyüme faktörleri ile ilgili araştırmalar artış göstermiştir. Bu sitokinler vasküler endotelyal büyüme faktörü-C (VEGF-C) ve D, hepatosit büyüme faktörü (HGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF-2), adrenomedullin ve anjiyopoetin-1 ve -2'yi içerir. Ancak sitokinlerin etkinliğinin kısa süreli olduğu bilinmektedir. 
Yüksek bir prevalansta görülen ve ciddi morbiditeye neden olan lenfödem tedavisinde yeni modalitelere ihtiyaç duyulmaktadır. Lenfanjiyogenez lenfödem için umut verici tedavi yöntemi olarak gündeme gelmiştir. Bu çalışmada fare kuyruğunda sekonder lenfödem modeli oluşturularak tedavide lenfanjiyogenezin etkisinin araştırıldı. Bu amaçla farklı gruplara diferansiye edilmiş embriyonik kök hücre, diferansiye edilmiş kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre, embriyonik kök hücre vasatı, mezenkimal kök hücre vasatı ve serum fizyolojik tedavileri verilerek lenfanjiyogenez üzerine olan etkileri gözlemlendi.
Çalışmada 50 adet 28-35 gram ağırlığında Bulb-C suşu kullanıldı, farelerin kuyruğunda sekonder lenfödem modeli oluşturulmasının ardından her grupta dokuz fare olmak üzere fareler toplam beş gruba ayrıldı. Postoperatif beşinci gün birinci gruba diferansiye edilmiş embriyonik kök hücre, ikinci gruba diferansiye edilmiş kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre, üçüncü gruba embriyonik kök hücre vasatı, dördüncü gruba mezenkimal kök hücre vasatı ve kontrol grubuna %0,9 NaCI verildi. Farelerin günlük olarak kuyruk çap ölçümleri yapıldı ve 15. günde sakrifiye edildi. Kuyruktaki lenfanjiyogenez gelişimi ve lenfödemin durumu histolojik olarak HE ve immunohistokimyasal olarak değerlendirildi. İmmunohistokimyasal belirteç olarak VEGF, FGF-2, LYVE-1 ve Prox kullanıldı.Makroskobik sonuçlar gözden geçirildiğinde embriyonik ve mezenkimal kök hücre verilen gruplarda diğer üç gruba oranla belirgin olarak kuyruk çaplarında küçülme ile lenfödem miktarında azalma saptandı ve istatistiksel olarak yapılan değerlendirmede bu değişim anlamlı bulundu.
Histolojik olarak yapılan değerlendirmede VEGF, FGF-2, LYVE-1 ve Prox immunohistokimyasal belirteç olarak kullanılarak tedavilerin lenfanjiyogenez üzerindeki etkileri karşılaştırıldı. Embriyonik kök hücre grubunda serum fizyolojik kontrol grubu ve vasat gruplarına göre belirgin derecede lenfanjiyogenezin tetiklendiği görüldü. Mezenkimal kök hücre grubunda da serum fizyolojik kontrol grubu ve vasat gruplarına göre lenfanjiyogenezi gösteren histolojik belirteçlerin artmış ekspresyonları saptandı. Bununla beraber farklı kök hücre kaynaklarından elde edilmiş olan embriyonik ve mezenkimal kök hücre grupları arasında tedavi etkinliği açısından farklılık gözlenmedi. Sonuç olarak diferansiye edilmiş embriyonik ve mezenkimal kök hücrenin lenfödem tedavisinde başarıyla kullanılabileceği hayvan modelinde gösterildi.

Abstract:
Lymphedema is an accumulation of the protein-rich interstitial fluid in the skin and subcutaneous tissue as a result of lymphatic dysfunction. All over the world, 140 to 200 million cases of lymphedema is estimated to exist. Lymphedema is classified as primary and secondary lymphedema by etiology. The cases which has unknown etiology or results from congenital lymphatic dysfunction are called primary lymphedema. All other cases secondary to an existing cause are called secondary lymphedema.
Secondary lymphedema is an acquired problem. It may be due to infection, trauma, surgical ablation, radiation, tumor, lymphoproliferative disease or injury. Malignancy and radiotherapy are the most common cause of secondary lymphedema in the USA.
Basic strategies for non-surgical treatment can be defined as a manual lymph drainage, limb elevation, compression therapy and combination of exercises for lymphatic flow. Surgical procedures in the treatment of lymphedema are not usually one of the main approaches. Surgical treatments are basically divided into two sections as ablative procedures and physiological procedures. Life quality of the patients with chronic lymphedema deteriorates substantially, severe body image disturbances are observed in this patient population. The patients undergo acute inflammatory attacks from period to period and experience the pain, impairment of skin quality and severe limitation of motion. Serious treatment costs are observed because of that they are under regular maintenance and intensive checks for lifetime.
Multiple growth factors have been identified which affect lymphangiogenesis, recent studies showed that this growth factors take on the task of regulating by playing a key role in the development of the lymphatic system. Treatment methods intended molecular targets began to develop in conjunction with more detailed understanding of the pathogenesis of diseases and identification of many receptors and molecules at the cellular level. Thus, lymphangiogenesis has been raised as a promising treatment method for lymphedema and research activities related to the lymphatic growth factors has been increased. These cytokines include vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and D, hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor (FGF-2), adrenomedullin and angiopoetin-1 and -2. However the effectiveness of cytokines are known to be short-lived.In the treatment of lymphedema which has a high prevalence and significant morbidity, new modalities is needed. Lymphangiogenesis have emerged as a promising treatment for lymphedema. In this study, the effect of lymphangiogenesis on the treatment by means of creating secondary lymphedema model on the tail of a mouse is investigated. For this purpose, differentiated embryonic stem cells, differentiated bone marrow-derived mesenchymal stem cells, embryonic stem cell medium, mesenchymal stem cell medium and saline were administered to the different groups and their effects on lymphangiogenesis were observed.
50 Bulb-C strain between 28-35 grams were used in the study. The mice were categorized into five group which contains nine mice subsequent to establishment of secondary lymphedema on mice tail. At post-operatively day 5, differentiated embryonic stem cells were given to the first group, differentiated bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the second group, embryonic stem cell medium to the third group, mesenchymal stem cell medium to the fourth groups and 0.9%NaCl to the control group. Tail diameter measurements of the mice were performed on a daily and all of mice were sacrificed at day 15. The development of lymphangiogenesis and lymphedema status on the tail were evaluated histologically HE and immunohistochemically. VEGF, FGF-2, LYVE-1 and Prox were used as immunohistochemically markers.Looking at the macroscopic results, significant reduction in diameter of the tail and a decrease in the amount of lymphedema were determined in the groups given embryonic and mesenchymal stem cell compared with the other three groups, and this change in the evaluation found a statistically significant
In histological evaluation, the effects of lymphangiogenesis on the treatments were compared by using VEGF, FGF-2, LYVE-1 and Prox as markers. Lymphangiogenesis was triggered in embryonic stem cell group compared with saline control group and medium groups. Increased expression of histological markers showing lymphangiogenesis were determined in the mesenchymal stem cell group compared with saline control group and medium groups. However, no significant differences between embryonic and mesenchymal stem cell groups which derived from different stem cell sources were observed in terms of treatment effectiveness. Consequently, it was shown in animal models that differentiated embryonic and mesenchymal stem cells can be used successfully in the treatment of lymphedema.