Kıkırdak doku onarımı için hiyalüronik asit temelli yapı iskelelerinin geliştirilmesi ve hücre kültürlerinde kullanımı
Preparation of hyaluronic acid-based-scaffolds for cartilage tissue repair and their use in cell cultures
Yazar: BERMALİ DEMİRDÖGEN
Danışman: PROF. DR. Y. MURAT ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) ve hiyalüronik asit-elastin (HA-El) iskeleler liyofilizasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. İskelelerin morfoloji ve kimyasal bileşimleri sırasıyla taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve foruier transform infrared analizi (FTIR) ile belirlenmiştir. İskelelerin şişme ve in vitro bozunma oranları pH 7,4'e tamponlanmış fosfat tuzu çözeltisi (PBS) içerisinde ve 37°C'da inkübe etmek suretiyle analiz edilmiştir. İskele sistemlerinin biyolojik davranışlarının analizi için HA-C iskelelere sıçan kemik iliği mezenkimal hücreleri (MKH) ve sıçan artiküler kondrositleri ekilmiş, HA-EL iskelelere ise sıçan kemik iliği mezenkimal hücreleri ekilmiştir. Hücre yüklenmiş iskeleler 37oC'da, %5 CO2 içeren nemlendirilmiş atmosferde kültüre edilmiştir. Mezenkimal kök hücrelerin farklılaştırılması ve kondrositlerin yeniden farklılaştırılması için TGF-ß1 kullanılmıştır. Belirlenmiş zaman noktalarında örnekler kültür kaplarından alınmış ve fikse edilmiştir. Kompozit iskelelerin hücre adezyonu, çoğalması ve morfoloji değişimleri üzerine etkileri ışık mikroskopisi, histolojik ve immünohistokimyasal analizler ile incelenmiştir. Iskelelere ekilen hücrelerin yaşayabilirliği ve çoğalması belirli zaman noktalarında MTT testi ile belirlenmiştir. HA-C iskelelere ekilen mezenkimal hücrelerin farklılaşmasının tayini için hücrelerce sentezlenen toplam sGAG miktarını ölçen bir dimetilmetilen mavisi boya bağlanma testi kullanılmıştır. SEM bulguları HA-C ve HA-El iskelelerin gözenek boyutları sırasıyla 50-100 ?m ve 100-220 olan oldukça gözenekli bir yapı gösterdiğini işaret etmiştir. İskelelerin FTIR spektrumları, kompozit iskelelerin, iskeleleri oluşturan polimerleri yapısında bulundurduğunu göstermiştir. In vitro bozunma çalışmaları iskelelerin kültür koşullarında stabil olduğunu ortaya koymuştur. İskelelere ekilen hücreler yapıştı ve yayıldı oldu. MTT testi sonuçları hücrelerin iskelelerde yaşayabilirliğinin iyi olduğunu, hücrelerin HA-C ve HA-El iskelelerde çoğalmaya devam ettiklerini, histolojik incelemeler ise kondrojenik koşullar altında kondrogenezin gerçekleştiğini gösterdi. HA-C-hücre yapılarının toplam GAG analizi, sGAG miktarının zamanla artma eğilimi gösterdiğini dolayısıyla kondrojenik farklılaşmayı doğruladığını işaret etmiştir. Hücreli ve hücresiz HA-C iskelelerle yapılan ilk in vivo deneyler hafif düzeyde doku reaksiyonuna neden olmuş ve MKH ekilmiş HA-C iskele örneğinde ektopik yeni kıkırdak oluşumu gözlenmiştir. Mevcut çalışmanın nihai hedefi kıkırdak doku mühendisliği için hiyalüronik asit temelli hibrit iskelelerin geliştirilmesidir. Bu sonuçlara göre HA-C ve HA-El iskeleler hücre yapışması ve çoğalması için iyi birer destek materyali olarak değerlendirilebilir.

Abstract:
In this study hyaluronic acid-chitosan (HA-C) scaffolds and hyaluronic acid-elastin scaffolds (HA-El) were prepared by lyophilization method. The morphology and chemical composition of the scaffolds was determined by scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transformed infrared (FTIR), respectively. Swelling ratio and in vitro degradation rate of the scaffolds were analyzed by incubation of the scaffolds in phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4) at 37°C. To analyze the biological behaviour of the scaffold systems, rat bone marrow mesenchymal cells (rMSC?s), and rat articular condrocyte cells were seeded onto HA-C scaffolds and rat bone marrow mesenchymal cells (rMSC?s) were seeded onto HA-El scaffolds. The cell-loaded scaffolds were cultivated at 37oC in 5%CO2 humidified atmosphere. TGF-beta1 used to induce chondrogenic differentiation of the mesenchymal cells and re-differentiation of the chondrocytes. Samples were taken at predetermined time points from culture plates and fixed. The effects of the composite scaffolds on cell adhesivity, proliferation and morphological changes were analyzed by light microscopy, histological and immunohistochemical analyses. Cell viability and proliferation of the cells that seeded on the scaffolds were determined by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay at specific time points. For determination of chondrogenic differentiation of the mesenchymal stem cells seeded on the HA-C scaffolds, a dimethylmethylene blue (DMMB) dye binding assay was used which quantifies total sGAG amounts synthesized by the cells. For in vivo studies the cell-loaded HA-C scaffolds were transplanted subcutaneously into 4-month-old Wistar rats. After 7, 14, 21 and 28 days the animals were sacrificied and the grafts were explanted. The explanted samples were analysed histologically. SEM observations indicated that HA-C and HA-El scaffolds showed a highly porous structure with the pore size of 50-100 ?m and 100-220 ?m, respectively. The FTIR spectra of the scaffolds showed that the composite scaffolds contain the polymers that comprised the scaffolds. In vitro degradation studies revealed that the scaffolds are stabil under culture conditions. The seeded cells onto scaffolds adhered and expanded. Results from the MTT assay showed the cells had good cellular viability within the scaffolds indicating that the cells continued to proliferate inside both HA-C and HA-El scaffolds, and histological examinations showed that under the chondrogenic conditions, chondrogenesis occurred. Total GAG analysis of HA-C-cells construct pointed out that the amount of sGAG produced has a tendency of increase with time confirming chondrogenic differentiation. Preliminary in vivo studies with both the cell loaded and cell free scaffold showed a mild level of tissue reaction and in the case of the MSCs-loaded HA-C scaffold, ectopic formation of neocartilage was observed. The final goal of the current study was to develop hyaluronic acid based hybrid scaffolds for cartilage tissue engineering. According to these results HA-C scaffolds and HA-El scaffolds can be considered as good supports for cell adhesion and proliferation.