idrar yolu enfeksiyon etkeni E.coli izolatlarında fosfomisin direnç genlerinin  moleküler karakterizasyonu
Molecular characterization of fosfomycin resistance genes in E.coli isolates
Yazar: FUNDA YAĞ
Danışman: DOÇ. DR. FİKRİYE MİLLETLİ SEZGİN
Kırşehir Ahi Evran Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: DNA replikasyonu = DNA replication ; Escherichia coli enfeksiyonları = Escherichia coli infections ; Fosfomisin = Fosfomycin ; Genler = Genes ; Konjugasyon = Conjugation ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Üriner sistem enfeksiyonları = Urinary tract infections ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İntegronlar = Integrons

Özet:
Bu Çalışmada, Ahi Evran Üniversitesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarına gelen idrar örneklerinden izole edilen 24 fosfomisin dirençli E.coli izolatı dâhil edilmiştir. İzolatların tür tayini ve antibiyotik duyarlılık çalışmaları Vitek 2 Compakt (bioMérieux, Fransa) otomatize sistemi ve disk difüzyon yöntemleri ile gerçekleştirilmiştir. Çalışmaya dahil edilen E.coli izolatlarında fosfomisin direncinden sorumlu olduğu bilinen plazmit kaynaklı fosA, fosA3, fosB, fosC, fosC2, fosX genleri spesifik primerler kullanılarak PCR yardımı ile taranmıştır. E.coli izolatlarının ayrıca beta-laktam ve kinolon grubu antibiyotiklerine karşı dirençten sorumlu olan blaTEM, blaSHV, blaOXA-1, blaPER-1, blaGES, blaVEB, blaCTX-M, qnrA, qnrB, qnrS, aac-(6')-ıb-cr genlerin ve Sınıf-1 ve Sınıf-2 integron varlığı spesifik primerler kullanılarak PCR yardımı ile taranmıştır. İzolatların Klonal ilişkileri REP PCR yardımı ile çalışılmıştır. İzolatlardan elde edilen konjugatif ve transformant plazmitlerin replikasyon orijinleri PCR-temelli replikasyon orijini belirleme yöntemine göre gerçekleştirilmiştir.
Fosfomisin direncini belirlemek için yapılan PCR işlemi sonucunda 24 örnekten 1 (FF25)'i fosA3 geni bakımından pozitif bulunmuştur. Örneklerin 11'inde blaTEM, 6'sında blaOXA-1, 3'ünde blaSHV geni varlığı tespit edilmiştir. blaCTX-M geni için yapılan PCR sonucunda ürünler dizin analizine gönderilmiş ve 14 pozitif sonucun hepsinin CTX-M15 grubuna ait olduğu tespit edilmiştir. İzolatların hiçbirinde blaPER-1, blaGES, blaVEB genleri tespit edilememiştir. E.coli izolatlarının 6'sı qnrB ve qnrS, 9'u aac-(6^')-ıb-cr geni içerdiği tespit edilmiştir. İzolatların hiçbiri qnrA geni içermemektedir. Sınıf-1 ve Sınıf-2 integron içerikleri araştırıldığında; izolatların 3'ünün Sınıf-1, 5'inin de Sınıf-2 integron içerdikleri tespit edilmiştir.
Yapılan konjugasyon çalışmaları sonucunda 24 bakteri izolatının 1'inin konjugatif plazmit taşıdığı tespit edilmiştir. Transformasyon deneyleri sonucunda da 2 izolatın fosfomisin direncinin plazmit üzerinde taşıdığı tespit edilmiştir. Transformant plazmitlerin fosfomisin direnç genleri tanımlanamamıştır.
Çalışmada elde edilen epidemiyolojik veriler ve literatür araştırmaları sonucu fosfomisin antibiyotiği alternatif ajan olarak kullanılma girmesi ile direnç oranı yükselmeye başlamıştır. Bu çalışma direncin hem ülkemizde hem de dünyada yayılımının belirlenmesinde oldukça önemli ipuçları verecektir. Aynı zamanda bundan sonra yapılacak olan çalışmalar için çok önemli bir veri tabanı olacaktır.

Abstract:
In this study, 24 fosfomycin resistant E. coli isolates isolated from urine samples from Ahi Evran University Training and Research Hospital, Microbiology Laboratory were included. Species identification and antibiotic susceptibility studies of isolates were carried out with the automated system of Vitek 2 Compact (bioMérieux, France) and disk diffusion methods. The plasmid-derived fosA, fosA3, fosB, fosC, fosC2, fosX genes, which are known to be responsible for the phosphomycin resistance in the E.coli isolates included in the study, were screened with the aid of PCR using specific primers. E.coli isolates are also responsible for resistance to beta-lactam and quinolone group antibiotics, blaTEM, blaSHV, blaOXA-1, blaPER-1, blaGES, blaVEB, blaCTX-M, qnrA, qnrB, qnrS, aac-(6')-ıb-cr The presence of aac-(6')-ıb-cr genes and Class-1 and Class-2 integron were screened with the aid of PCR using specific primers. Clonal relationships of isolates were studied with the help of REP PCR. The replication origins of conjugative and transformant plasmids obtained from the isolates were determined according to the PCR-based replication origin determination method.
As a result of the PCR procedure to determine the phosphomycin resistance, 1 (FF25) of 24 samples was found positive for the fosA3 gene. The presence of blaTEM, gene in 11, blaOXA-1, in 6 and blaSHV gene in 3 were detected. As a result of PCR for the blaCTX-M gene, the products were sent to index analysis and all 14 positive results were found to belong to the CTX-M 15 group. No blaPER-1, blaGES, blaVEB genes were detected in any of the isolates. It was determined that 6 of E. coli isolates contain qnrB and qnrS, 9 of them contain aac-(6^')-ıb-cr gene. None of the isolates contain the qnrA gene. When Class-1 and Class-2 integron contents are researched; It was determined that 3 of the isolates contain Class-1 and 5 of them contain Class-2 integron.
In conjugation and transformation situations that caused genetic changes in bacteria, transformation and conjugation experiment was performed on 24 bacterial isolate samples. According to the experimental findings, one of the samples was identified as transconjugant and both were transformant bacteria.
As a result of the epidemiological data obtained in the study and literature researches, the resistance rate started to increase with the use of fosfomycin antibiotic as an alternative agent. This study will give very important clues in determining the spread of resistance both in our country and in the world. It will also be a very important database for future studies.