Denizanası venom proteinlerinin salım sistemi uygulamaları ve antitümör aktivitelerinin belirlenmesi
Release system applications of jellyfish venom proteins and determination of their antitumor activities
Yazar: SÜMERAY EZGİ AYAN
Danışman: DOÇ. DR. YASEMİN İSPİRLİ DOĞAÇ ; DOÇ. DR. NURÇİN KİLLİ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 2022 raporuna göre, 10 milyon kişi kanser nedeniyle hayatını kaybetmiştir. Kanser tedavisi ile ilgili bilimsel çalışmalar devam ederken, tedavi süreci kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi yöntemlerle sürdürülmektedir. Kanser hastalıklarının tedavisine yönelik klasik ilaçlar, kanser hücrelerinin DNA replikasyonunu önleyerek etki gösterirler. Fakat bilimsel verilere göre, ilaçların kanser hücrelerine seçiçi bir etki yarattığını söylemek güçtür. Çoğunlukla sağlıklı hücrelere de aynı etkiyi gösterdikleri için, alternatif yöntem arayışları, yüzyıllar boyunca geleneksel olarak tedavi amaçlı kullanılan ve doğal kaynaklardan elde edilen biyotoksinlerle antikanser ilaç geliştirilmesi çalışmalarına yönlenmiştir. Bu çalışmalar kapsamında, çeşitli hayvan türlerinin (yılan, akrep, kurbağa, arı ve deniz anemonu gibi) venom proteinleri kansere karşı terapötik potansiyel göstermiştir. Bu bakış açısından yola çıkarak hazırlanan bu tez çalışmasının ilk aşamasında, ülkemiz kıyılarında görülen denizanası türlerinden biri olan Aurelia aurita türünün örneklenmesi yapılarak, örneklerin ekstraksiyonu ile ham venom elde edildi. Ham venomun saflaştırılması için önce boyut dışlama (SEC) kromatografisi, sonra da iyon değişim (IEX) kromatografisi kullanıldı. Fraksiyonlardaki proteinlerin molekül kütleleri ise SDS-PAGE ile belirlendi. SEC'den sonra yüksek protein miktarına ulaşan iki fraksiyona IEX uygulandı. IEX sonrası ise, protein miktarları yüksek üç fraksiyon elde edildi. Hem SEC hem de IEX fraksiyonları ayrı ayrı SDS-PAGE'de yürütüldü. Burada, molekül kütleleri, 119.3 kDa, 70.0 kDa, 52.0 kDa, 44.0 kDa olarak belirlen dört protein bandı gözlendi. Ham venom ve IEX sonrası elde edilen yüksek proteinli iki fraksiyonun antitümör aktivitelerinin araştırılması aşamasına geçildi. Ham venomun, kanser tedavisinde arzu edildiği gibi tüm kanserli hücrelerde doza bağlı olarak hücre ölümünün arttığı, sağlıklı hücrelerde ise yalnızca yüksek dozlarda ölüme neden olduğu gözlendi. Bununla birlikte, özellikle MDA-MB-231 meme ve CaCO2 kolon kanseri hücre hatlarına diğer kanser türlerinin hücre hatlarına oranla daha sitotoksik olduğu bulundu. Fakat aynı etki elde edilen protein fraksiyonlarında gözlenmedi. Ardından, venomun yüklenmesi için ZrO2 kaplı MnFe2O4/aljinat core-shell manyetik kompozit malzemeler sentezlendi. Bu malzemenin TGA ve SEM analizleri ile karakterizasyonu gerçekleştirildi. Bu manyetik malzemenin termogravimetrik analizlerinde, polimer kısım belirli sıcaklıklarda tamamen yanmaya uğrarken, yapısal özellikleri nedeniyle manyetik partiküllerde ve kaplamada kullanılan ZrO2'de önemli derecede yanma gerçekleşmedi. SEM analizleri ile ZrO2 kaplı MnFe2O4/aljinat core-shell manyetik kompozit yapıların küresel oluşları, eş boyutlulukları yüzeyinin morfolojik pürüzlülüğü (yüksek yüzey alanı) gösterildi. EDS spektrumları ile kompozitleri oluşturan atomik içerikler doğrulandı. Sentezlenen ZrO2 kaplı MnFe2O4/aljinat core-shell manyetik kompozit yapıların şişme oranları, venom salım deneylerinde de kullanılan pH 2.0, pH 6.8 ve pH 7.4 ortamları için ayrı ayrı araştırıldı. Tüm örneklerin 200-250 dakika (~4 saat) arasında şişme dengesine ulaştıkları görüldü. Nötral pH yakınlarında yani pH 6.8 ve pH 7.4'de, ZrO2 kaplı MnFe2O4/aljinat manyetik kompozitlerin %70-80 oranında şiştiği ve bu iki pH'da benzer şişme davranışları sergiledikleri ve şişme oranlarının oldukça iyi oldukları görüldü. Asidik ortamda yani pH 2.0'de ise, ZrO2 kaplı MnFe2O4/aljinat manyetik kompozitlerin şişme oranlarında %15-20 oranında düşme görülse de yapılar asidik ortamda da kararlıklarını korumaya devam etti. Venom salım deneylerinde, venom miktarı ön denemelerle belirlenerek, 0.3 mg/ml olarak sabit tutuldu. Taşıyıcı parametreleri ise, şişme deneyleri göz önüne alınarak %2 (w/v) ZrO2, %2.5 (w/v) aljinat ve 50 mg/ml MnFe2O4 miktarında sabit tutuldu Tüm örneklerdeki salım deneyleri mide, kalın bağırsak-rektum, kan pH'ı dikkate alınarak pH 2.0, pH 6.8 ve pH 7.4'de in vitro olarak gerçekleştirildi. Sonuçlar, manyetik polimerik taşıyıcılarla hazırlanan venom salım sistemleri ile elde edilen bulgular, ilaç salım sistemleri için kullanılan Korsmeyer-Peppas, Higuchi, birinci derece ve sıfırıncı derece modelleri esas alınarak grafiğe geçirildi. Hazırlanan tüm core-shell yapılı ve venom taşıyan salım sistemlerinin, çalışılan tüm pH değerlerinde, Korsmeyer-Peppas modeli ve birinci derece modele uyduğu yani polimerik yapılardan oluşan taşıyıcıların salımı geciktirmediği, ani salıma neden olmadığı, salınmayan etken madde miktarının zamanla logaritmik olarak azaldığı ve kontrollü bir salım sistemi olduğu görüldü.

Abstract:
According to the World Health Organization (WHO) 2022 report, 10 million people died due to cancer. While scientific studies on cancer treatment continue, the treatment process continues with chemotherapy, radiotherapy and surgical methods. Classical drugs for the treatment of cancer diseases work by preventing the DNA replication of cancer cells. However, according to scientific data, it is difficult to say that drugs have a selective effect on cancer cells. Since they mostly show the same effect on healthy cells, the search for alternative methods has been directed towards the development of anticancer drugs with biotoxins obtained from natural sources, which have been traditionally used for therapeutic purposes for centuries.Within the scope of these studies, venom proteins of various animal species (such as snakes, scorpions, frogs, bees and sea anemone) have shown therapeutic potential against cancer. In the first stage of this thesis study prepared from this perspective, the Aurelia aurita species, one of the jellyfish species seen on the coasts of our country, was sampled and crude venom was obtained by extraction of the samples. To purify crude venom first, size exclusion (SEC) chromatography and then ion exchange (IEX) chromatography were used, and the molecular masses of the proteins were determined by SDS-PAGE. After SEC, IEX was applied to two fractions that reached high protein amounts. After IEX, three fractions with high protein amounts were obtained. Both SEC and IEX fractions were run separately on SDS-PAGE. Here, four protein bands with molecular masses of 119.3 kDa, 70.0 kDa, 52.0 kDa, and 44.0 kDa were observed.
The antitumor activities of crude venom and two high-protein fractions obtained after IEX were investigated. It was observed that crude venom increased cell death dose-dependently in all cancerous cells, as desired in cancer treatment, while death occurred in healthy cells only at high doses. However, it was found to be more cytotoxic, especially to MDA-MB-231 breast and CaCO2 colon cancer cell lines, compared to cell lines of other cancer types. However, the same effect was not observed in the protein fractions obtained. Then, ZrO2 coated MnFe2O4/alginate core-shell magnetic composite materials were synthesized. Total load venom characterization of this material was carried out by TGA and SEM analyses. In the thermogravimetric analysis of this magnetic material, while the polymer part completely burned at certain temperatures, no significant burning occurred in the magnetic particles and ZrO2 used in the coating due to their structural properties. SEM analysis demonstrated the sphericality, uniformity and morphological roughness of the surface (high surface area) of the ZrO2 coated MnFe2O4/alginate core-shell magnetic composite structures. The atomic contents of the composites were confirmed by EDS spectra. The swelling ratios of the synthesized ZrO2 coated MnFe2O4/alginate core-shell magnetic composite structures were investigated separately for pH 2.0, pH 6.8 and pH 7.4 environments, which were also used in venom release experiments. It was observed that all samples reached swelling equilibrium within 200-250 minutes (~4 hours). It was observed that near neutral pH, i.e. pH 6.8 and pH 7.4, ZrO2 coated MnFe2O4/alginate magnetic composites swelled by 70-80% and exhibited similar swelling behaviors at these two pHs and their swelling ratios were quite good. In an acidic environment, that is, at pH 2.0, although there was a 15-20% decrease in the swelling ratios of ZrO2 coated MnFe2O4/alginate magnetic composites, the structures continued to maintain their stability in the acidic environment. In venom release experiments, the amount of venom was determined in preliminary experiments and kept constant at 0.3 mg/ml. Carrier parameters were kept constant at 2% (w/v) ZrO2, 2.5% (w/v) alginate and 50 mg/ml MnFe2O4, taking into account swelling experiments. Release experiments in all samples included stomach, large intestine-rectum, blood pH. It was carried out in vitro at pH 2.0, pH 6.8 and pH 7.4, taking into account the The results were plotted based on the findings obtained with venom release systems prepared with magnetic polymeric carriers and the Korsmeyer-Peppas, Higuchi, first-order and zero-order models used for drug release systems. All prepared core-shell structured and venom-carrying release systems complied with the Korsmeyer-Peppas model and the first-order model at all pH values studied, that is, the carriers consisting of polymeric structures did not delay the release, did not cause sudden release, the amount of the unreleased active substance decreased logarithmically over time and was controlled in a controlled manner. It was seen that there was a controlled release system.