Buğday tanelerinden aflatoksijenik Aspergillus section Flavi izolatlarının moleküler karakterizasyonu
Molecular characterization of aflatoxigenic Aspergillus section Flavi isolates from wheat grains
Yazar: MUHAMMED NUR HACCAR
Danışman: PROF. DR. IŞIL VAR ÖNGEL
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Türkiye'de en çok üretilen tahıl olan buğday, hasat, taşıma, depolama ve işleme süreçlerinde Aspergillus section Flavi üyeleri (Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nominus, A. niger) tarafından kontamine olmaktadır. Bu çalışmada A. section Flavi üyelerinin buğdaylarda yaygınlığı ve toksin üretme potansiyellerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla A. section Flavi üyelerine ait türlerin izolasyonu, morfolojik ve moleküler olarak tanımlamaları gerçekleştirilmiştir. Bunun için ilk olarak buğday taneleri PDA besiyerine yerleştirilmiş ve 25℃'de 5-7 gün inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyonun ardından şüpheli Aspergillus izolatları PDA besiyerinde saflaştırılmıştır. Morfolojik olarak tanımlamalar sonucunda elde edilen 25 izolatın tamamı şüpheli A. flavus olarak tanımlanmıştır. Bu izolatların moleküler tanımlamaları ITS, β-tubulin, IGS gen bölgeleri taranarak gerçekleştirilmiştir. Bunun yanı sıra aflatoksin üretim genleri olarak norA, norB, pksA, ver-1, afIR de değerlendirmeye alınmıştır. PCR analizleri sonucunda, ITS, β-tubulin ve IGS gen bölgesi için sırasıyla 600 bp, 340 bp, 674 bp; norA, norB, pksA, ver-1 ve afIR genleri için ise sırasıyla 759 bp, 452 bp, 416 bp, 785 bp, 798 bp büyüklüğünde bantlar elde edilmiştir. Çalışmaya RFLP analizi ile devam edilmiş ve bu amaçla ITS1/ITS4 primerleriyle çoğaltılan 25 PCR ürünü HhaI restriksiyon enzimi ile kesilmiştir. Sonuç olarak ITS gen bölgesinden farklı boyutlarda dört fragman elde edilmiştir. Bu PCR ürünleri A. flavus olarak değerlendirilmiştir. Rastgele seçilen beş A. flavus izolatının β-tubulin ve ITS gen bölgeleri amplifiye edilerek BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analizine tabi tutulmuş ve GenBank veri tabanındaki türlerle karşılaştırıldığında %99-100 aralığında nükleotid benzerliği göstermiştir. β-tubulin ve ITS gen bölgelerinden elde edilen DNA dizilerinin, MEGA X programı yardımıyla Neighbor-Joining metodu kullanılarak oluşturulan filogenetik ağaçta filogenetik ilişkileri gösterilmiştir. Bu çalışmada, buğday tanelerinden elde edilen Aspergillus izolatlarının yapılan analizler sonucunda A. flavus olduğu görülmüştür. Bunun yanı sıra aflatoksin üretim gen bölgelerinin gösterilmesi, bu izolatların aflatoksijenik A. flavus olma ihtimalini düşündürtmüştür. 

Anahtar Kelimeler: Aspergillus section Flavi, buğday, aflatoksin, aflatoksin biyosentez genleri

Abstract:
Wheat, the most extensively produced cereal in Turkey, is subject to contamination by members of Aspergillus section Flavi (Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nominus, A. niger) during harvesting, transportation, storage, and processing. This study aimed to determine the presence and toxin-producing potential of A. section Flavi members in wheat. For this purpose, wheat grains were first placed in PDA medium and incubated at 25℃ for 5-7 days. After incubation, suspected Aspergillus isolates were purified in PDA medium. Morphological identification determined that all 25 isolates were presumptive as A. flavus. Molecular identification of these isolates was conducted by screening ITS, β-tubulin, and IGS gene regions. Additionally, aflatoxin biosynthesis-related genes (norA, norB, pksA, ver-1, and afIR) were evaluated. PCR analyses yielded bands of 600 bp, 340 bp, and 674 bp for the ITS, β-tubulin, and IGS gene regions, respectively, while norA, norB, pksA, ver-1, and afIR genes produced bands of 759 bp, 452 bp, 416 bp, 785 bp, and 798 bp, respectively. The study was continued with RFLP analysis and for this purpose, 25 PCR products amplified with ITS1/ITS4 primers were cut with HhaI restriction enzyme. As a result, four fragments of different sizes were obtained from the ITS gene region. These PCR products were evaluated as A. flavus. Subsequently, β-tubulin and ITS gene regions of five randomly selected A. flavus isolates were amplified and subjected to BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analysis. When compared with the species in the GenBank database, these isolates exhibited 99-100% nucleotide similarity. DNA sequences of the β-tubulin and ITS gene regions were used to construct a phylogenetic tree employing the Neighbor-Joining method in MEGA X software to determine phylogenetic relationships. Based on the analyses, Aspergillus isolates obtained from wheat grains were identified as A. flavus. Furthermore, the presence of aflatoxin biosynthesis-related gene regions suggested the potential aflatoxigenicity of these isolates.

Keywords: Aspergillus section Flavi, wheat, isolation, aflatoxin biosynthesis genes