Kohlear çekirdekte bulunan yıldız ve çalı nöronlarında asite duyarlı iyon kanallarının (ASIC) incelenmesi
Investigation of acid sensing ion channels (ASIC) of stellate and bushy neurons in the cochlear nucleus
Yazar: ZİYA ÇAKIR
Danışman: PROF. DR. RAMAZAN BAL
Gaziantep Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Elektrofizyoloji = Electrophysiology ; Koklea = Cochlea ; Nöronlar = Neurons ; Sinyal nakli = Signal transduction ; İyon kanalları = Ion channels ; İşitme = Hearing ; İşitme yolları = Hearing pathways

Özet:
Asit duyarlı iyon kanalları (ASIC); proton kapılı, voltajdan bağımsız, merkezi sinir sistemi ve periferik sinir sisteminde yaygın olarak bulunan hidrojen iyonuna duyarlı iyon kanallarıdır. Bu tez çalışmasında ASIC'lerin kohlear çekirdek nöronlarının uyarılabilirliğini etkileyerek, işitme sinyallerinin işlenmesinde önemli rol alacağı hipotezinin test edilmesi amaçlanmıştır. 
Bu çalışmada albino BALB/c ırkı fareler kullanılarak, kohlear çekirdek dokusunda Real time-polimeraz zincir reaksiyon tekniğiyle ASIC gen ekspresyonları mRNA düzeyinde ve kohlear çekirdekteki yıldız ve çalı hücrelerinin ASIC akımları yama kenetleme (patch clamp) tekniği ile karakterize edildi.
Real-time PZR analizi ile 16 günlük, 75 günlük ve 2 yaşındaki fare kohlear çekirdek dokularında ASIC1, ASIC2 ve ASIC3 genlerinin ifadesi gösterildi. Voltaj kenetleme çalışmalarında kohlear çekirdek nöronlarına, asidik solüsyon uygulanmasıyla içe doğru (inward) akımlar oluştu. Kaydedilen ASIC akımlarının yarı aktivasyon pH değeri (pH50) yıldız hücreleri için 5,84, çalı hücreleri için 5,81 olarak bulundu. ASIC blokeri amilorid bu akımları doza bağımlı olarak inhibe etti. Amiloridin yarı maksimum inhibisyon değeri (IC50)  yıldız hücrelerinde 32,5± 0,4 µM (n=30), çalı hücrelerinde ise 32,1 ± 0,2 µM (n=12) olarak bulundu. Sodyum içermeyen solüsyonda düşük pH ile indüklenen ASIC akımı büyük oranda azaldı (%87,5, p<0.05) (n=13), bu da kaydedilen ASIC akımlarının esas olarak Na+ iyonu tarafından taşındığını göstermektedir. Asit uygulamasıyla oluşan ASIC akımının hücre dışı Ca2+ ve Pb2+ (10 µM) tarafından inhibe edilmesi, bu hücrelerde ASIC1a altbiriminin varlığına işaret etmektedir. Zn2+ (300 µM)'nun ekstraselüler olarak uygulanması sonucu ASIC akımları %20 (n=13) oranında artmıştır. Bu da fonksiyonel ASIC2a alt birimini içeren homomerik kanalların varlığına işaret etmektedir. Sodyum salisilat (1 mM) ASIC akımlarını istatistiki olarak anlamlı düzeyde etkilemedi (p>0.05 n= 13). Bu da ASIC3 kanallarının bulunmadığını göstermektedir. Akım kenetleme çalışmalarında ise asidik solüsyon uygulanmasının kohlear çekirdek yıldız ve çalı nöronlarında depolarizasyona neden olduğu belirlendi. 
Sonuç olarak elde edilen veriler kohlear çekirdek hücrelerindeki ASIC akımının ASIC1a ve ASIC2a kanalları tarafından taşındığını göstermektedir. ASIC kanallarının merkezi işitsel sistemdeki nöronların uyarılabilirliklerini etkilediğini ve dolayısıyla bunların işitsel bilgiyi işlemede rolünün olabileceğini ve /veya patolojik süreçlerde olası rolü bulunacağına işaret etmektedir.

Abstract:
Acid sensing ion channels (ASICs) are voltage–independent and proton–gated channels commonly found in the both central and peripheral nervous systems. In this study, it was aimed to test the hypothesis that whether ASICs could have important roles in processing of auditory signals by affecting excitability of cells in the cochlear nucleus.   
In this study, ASIC gene expressions in the cochlear nuclei of albino BALB/mice were determined in terms of mRNA levels by using real time polymerase chain reaction and ASIC currents in stellate and bushy cells were characterized by using path clamp technique. 
ASIC1, ASIC2 and ASIC3 gene expressions were detected in 16 day-old, 75 day-old and 2 year-old mice. In the voltage-clamp experiments, inward currents were recorded upon application of acidic solution to the cochlear nucleus cells, whose half–maximum activation pH values (pH50) were 5,84 and 5,81 for stellate and bushy cells respectively. Amiloride, which is ASICs blockers, inhibited the acid induced-currents in a dose–dependent manner. Half–maximal inhibition concentration (IC50) of amiloride was 32,5 ± 0,4 µM (n=30) for stellates and 32,1 ± 0,2 µM (n=12)  for bushy cells. ASIC current was significantly depressed (%87,5, p<0.05) (n=13) in sodium free solution, which indicates that the ASIC current is primarily carried by Na+. Inhibition of the ASIC currents by extracellular Ca2+ and Pb2+ (10 μM) was a significant evidence for the existence of homomeric ASIC1a subunits. ASIC currents were increased by 20 % upon extracellular application of Zn2+ (300 μM) (p<0.05, n=13), which indicates the presence of functional homomeric ASIC2a subunits. Sodium salicylate (1 mM) did not significantly affect the amplitudes of ASIC currents (p>0.05 n= 13), which indicates that there are no ASIC3 channels. In current–clamp experiments, application of acidic extracellular solution resulted in depolarization of stellate and bushy cells of the cochlear nucleus.
The results shows that the ASIC currents in the cochlear nucleus cells is carried by the ASIC1a and ASIC2a channels. ASIC channels affects excitability of the stellate and bushy cells and therefore they likely to have a role in processing of auditory information and / or pathological processes in the central auditory system.