SARS-CoV-2 spike proteinine karşı monoklonal antikor geliştirilmesi
Generation of monoclonal antibody against SARS-CoV-2 spike protein
Yazar: ZEHRA FIRAT KARAGÖZ
Danışman: PROF. DR. ERKAN YILMAZ
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Hücre füzyonu = Cell fusion ; Korona virüs enfeksiyonları = Coronavirus enfections ; Korona virüsler = Coronaviridae ; Monoklonal antikorlar =   ; RNA virüs enfeksiyonları = RNA virus infections ; RNA virüsleri = RNA viruses ; SARS virüsü = SARS virus ; Viral aşılar = Viral vaccines ; İmmünizasyon-pasif = Immunization-passive

Özet:
Dünya Sağlık Örgütü'nün 2019 Aralık ayında SARS-CoV-2 virüsünü resmen tanımlaması ve global pandemi etiyolojik ajanı olarak ilan etmesinden sonra, dünya genelinde yaklaşık 2 milyon kişinin ölümüne sebep olan ve 100 milyon kişiyi enfekte eden COVID19, tüm dünyada hız kesmeden etkisini sürdürmeye devam etmektedir. Ülkeler arasında tedavi yönergeleri değişiklik gösterse de henüz virüse özel geliştirip onaylanmış kesin bir tedavi yöntemi bulunmamaktadır. Bu etiyolojik ajana karşı özel bir tedavi yönteminin bulunmaması  dolayısıyla, dünya genelinde enfekte olmuş kişiler, pandeminin kontrol altına alınabilmesi için, sosyal izolasyonla karantina altında tutulmaya çalışılmış ve mevcut ilaçlarla virüs üzerinde etkinliği net olarak bilinmeden tedavi edilmiştir. Tedavide yüksek doz ilaç kullanımı sistemik yük oluşturmuş ve akut böbrek, karaciğer hasarı, sekonder enfeksiyonların gelişmesi gibi sistemik hasarlara yol açmıştır. Özellikle de multipl kronik hastalığı olan bireylerde tedavinin yetersiz kalması ciddi dezavantajları da beraberinde getirmiştir. Mevcut durum COVİD19 a karşı kullanılabilecek spesifik bir ajan/antikor geliştirilmesi yönündeki ihtiyacın aciliyetini vurgulamıştır. Bu konuda yürütülen bilimsel araştırmalardan elde edilecek veriler, hem virüsün daha iyi tanınmasını sağlama hem de  global kullanım potansiyeline sahip biyoteknolojik ürün geliştirme ihtimali taşıdığından kritik seviyede önemlidir. Bu tez çalışmasında, SARS-CoV-2 virüsünün bağlanma füzyon ve hücresel girişinde önemli rol oynayan Spike (S) proteinine karşı hibridoma teknolojisi ile 146 klon toplandı. Pozitifliği kanıtlanan 8 klon içinden, IgG1 kappa isotipinde  yüksek doz monoklonal antikor üreten 3 adet klon seçildi.. İndirekt ELISA testinde en yüksek pozitifliği veren klonun ürettiği antikor saflaştırıldıktan sonra immünblotlama ile inaktif virüs üzerinde etkinliği doğrulandı. Üretilen monoklonal antikorun nötralizan etkisi 1x10-8 titrasyonda SARS-CoV-2 virüsü ile inoküle edilen Vero E6 hücreleri kullanılarak araltırıldı. İnoküle Vero E6 hücrelerinde sitopatik etki gözlemlendiğinden mevcut antikorların nötralizan etkiye sahip olmadığına karar verildi. Çalışma ürünü olarak elde edilen bu antikor, humanizasyonu sonrasında pasif immünizasyon geliştirmede kullanılacak önemli biyoteknolojik ajan olacaktır.

Abstract:
The World Health Organization officially identified the SARS-CoV-2 virus in December 2019 and declared it as a global pandemic etiological agent. COVID19, which caused the death of approximately 2 million people and infected 100 million people worldwide, still continues to be effective all over the world without a sign of a slight decrease. Although the treatment guidelines vary between countries, there is no virus-specific treatment method developed yet. Due to the lack of a special treatment procedure against this etiological agent, infected people all around the world were tried to be kept under social isolation in quarantine in order to control the pandemic and were treated with existing drugs without knowing their effectiveness on this virus. The use of high doses of these drugs has created systemic burden and caused damages such as acute kidney and liver damage, and the development of secondary infections. In particular, inadequate treatment in individuals with multiple chronic diseases brought serious disadvantages. The current situation has emphasized the urgency of the need to develop a specific agent / antibody that can be used against COVID19. The data to be obtained from scientific studies conducted on this subject are critically important, as they have the possibility of both ensuring better recognition of the virus and developing biotechnological products with global use potential. In this thesis study, among generated 146 clones, 8 clones in IgG1 kappa isotype showed positivity against Spike protein. 3 clones were chosen as monoclonal antibodies producing the best positivity against Spike (S) protein, which plays an important role in binding fusion and cellular entry of SARS-CoV-2 virus. After the antibody producing clone with the highest positivity detected by indirect ELISA test, the antibody was purified using protein G agarose binding column and its effectiveness on detection of the inactive virus was confirmed by immunoblotting. Whether the produced monoclonal antibody had a neutralizing effect was checked by using Vero E6 cells inoculated with SARS-CoV-2 virus at  1x10-8 titration. Since cytopathic effect was observed in inoculated Vero E6 cells, it was decided that the existing antibodies did not have neutralizing effect. By product of the thesis study after its humanization will be at great importance to be used as biotechnologic agent generating passive immunity.