Escherichia coli tayini için yatay akış immünoassay platformlarının geliştirilmesi
Development of lateral flow immunoassay platform for Escherichia coli detection
Yazar: AYŞEN GÜMÜŞTAŞ
Danışman: PROF. DR. BENGİ USLU ; PROF. DR. UĞUR TAMER
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kimya = Chemistry ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Escherichia coli = Escherichia coli ; Escherichia coli enfeksiyonları = Escherichia coli infections ; Kimya teknikleri-analitik = Chemistry techniques-analytical ; Metal nanopartiküller = Metal nanoparticles ; Raman spektroskopisi = Raman spectroscopy ; İmmünoassay = Immunoassay

Özet:
Bakterilerin hızlı bir şekilde tespit edilmesi hastalık tanısı, çevre ve gıda analizleri için son zamanlardaki en önemli konulardan biridir. Bakterilerin varlığını gösteren en doğru ve güvenilir yöntemler kültürel yöntemlerdir, ancak bu analizlerin sonuçlanması 24 saat ya da daha uzun süreler gerektirmektedir. Bu uzun bekleme sürelerini ortadan kaldırmak için antijen-antikor reaksiyonunu temel alan hızlı antijen testleri geliştirilmiştir. Fakat hızlı antijen testlerinin en önemli dezavantajı düşük doğruluk ve düşük duyarlılıktır. 

Yatay akış immunoassay sistemleri ucuz ve hızlı bir alternatif olarak son yıllarda oldukça önem kazanmıştır. Ancak bu sistemlerde nicel analiz için renk değişimi ölçümlerinin yerine, daha düşük tayin limitlerine ulaşabilecek yüksek hassasiyet ve doğrulukta tayin yöntemlerine ihtiyaç vardır. Bu amaçla tez kapsamında geliştirilen kâğıt tabanlı yatay akış immunoassay sistemi yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopi (SERS) tekniği ile tayin edilmiştir. Hedef bakteri olarak seçilen E.coli tayini, yıkama işlemlerine gerek kalmadan ve SERS etiketi sisteme önceden yerleştirilerek gerçekleştirilmiştir. Yatay akış immunoassay platformu örnek pedi, konjugasyon pedi, nitroselüloz membran ve absorban ped olmak üzere dört bölgeden oluşacak şekilde inşa edilmiştir. Örneğin sisteme verilmesi ile konjugasyon pedindeki nanopartikül-antikor-bakteri kompleksi test pedindeki antikorlar ile yakalanmış ve bu şerit üzerinden E.coli tayini için SERS ölçümleri gerçekleştirilmiştir. 

Yöntemin seçiciliği Salmonella Enteritidis, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus bakterileri ile test edilmiş ve bu bakterilerin SERS ölçümleri ile gerçekleştirilen E.coli tayininde girişim etkisi gözlenmemiştir. E.coli için kalibrasyon grafiğinde doğrusal aralık 2,7x101 - 1,0x106 kob/mL dir. Tayin için toplam analiz süresi bir saatten az ve teşhis sınırı ise 10 kob/mL olarak tespit edildi. Bakteri tayini için kullanılabilecek nanopartiküllerin tasarımı, sentezi ve yüzey modifikasyonu, karmaşık bir numuneden E.coli bakterisinin etkili bir şekilde ayrılmasına olanak sağlamış ve ayrıca biotinli antikorların kontrollü bir şekilde avidin-bağlı nanopartikül yüzeyine immobilizasyonu ile de yatay akış immunoassay platformları üzerinden SERS sinyali alınarak veri analizi yapılmıştır. 

Hızlı bakteri tayin yöntemleri ülke ve dünya ekonomisinde günden güne önem kazanmaktadır, gerçekleştirilecek olan kâğıt tabanlı yatay akış immunoassay ölçümlerinin geçerli bir alternatif yöntem olarak çok yüksek bir ekonomik potansiyele sahip olduğu açıkça görülmektedir.

Abstract:
The fast detection of pathogenic bacteria has one of the most significant and recent subject for food industry, environment and diagnostic analysis. The most accurate and reliable methods for the presence of bacteria are cultural methods, but the results of these analyzes require 24 hours or more. Rapid antigen tests based on the antigen-antibody reaction have been developed to eliminate these long waiting times. However, the most important disadvantage of rapid antigen tests is low accuracy and low sensitivity.

Lateral flow immunoassay systems have gained considerable importance in recent years as a cheap and fast alternative. However, in these systems, instead of color change measurements for quantitative analysis, high accuracy and accuracy determination methods are needed which can reach lower detection limits. For this purpose, the paper-based lateral flow immunoassay system developed within the scope of the thesis was determined by Raman spectroscopy (SERS) technique on the surface. The determination of E.coli as the target bacteria was carried out without the need for washing and pre-placing the SERS label on the system. The lateral flow immunoassay platform is constructed of four zones: sample pad, conjugation pad, nitrocellulose membrane and absorbent pad. After the sample was introduced into the system, the nanoparticle-antibody-bacteria complex on the conjugation pad was captured with the antibodies on the test pad and SERS measurements were performed for the determination of E.coli on this strip. 

The selectivity of the method was tested with Salmonella enteritidis, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus and no interference effect was observed for the determination of E.coli by SERS measurements. The linear range in the calibration for E.coli is 2.7x101-1.0x107 cfu/mL. The total analysis time for the assay was less than one hour and the diagnostic limit was 10 cfu/mL. The design, synthesis and surface modification of the nanoparticles that can be used for bacterial determination enabled efficient separation of E. coli bacteria from a complex sample and also by controlled immobilization of biotinylated antibodies to the avidin-bound nanoparticle surface and data analysis by means of lateral flow immunoassay platforms.

Rapid bacterial determination methods are gaining importance day by day in the country and world economy. It is clear that the paper-based lateral flow immunoassay measurements to be performed have a very high economic potential as a viable alternative method.