Sucul çevrelerden lignolitik enzim üretici mikroorganizmaların izolasyonu, tanılanması ve endüstriyel atıkların parçalanması için ortam optimizasyonu
Isolation and identification of lignolytic enzymes producing microorganisms from aquatic environments and media optimization for biodegredation of industrial pollutants
Yazar: SULTAN KÜBRA TOKER
Danışman: DOÇ. DR. ALİ KOÇYİĞİT
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Deniz biyolojisi = Marine biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Mikrobiyolojik ayrışma = Microbiological decomposition ; Mikrobiyolojik teknikler = Microbiological techniques ; Su mikrobiyolojisi = Water microbiology ; Sucul mantarlar = Aquatic fungi

Özet:
Bu tez çalışmasında sucul sistemlerden izole edilen aktinobakteriler ve funguslardan lignolitik enzimler kalitatif ve kantitatif olarak araştırılmış olup, besiyeri optimizasyonu ortogonal matriks metoduyla gerçekleştirilmiştir. En yüksek lakkaz aktivitesinin saptandığı izolat seçilerek, farklı kimyasal yapılardaki endüstriyel boyaların renk giderimi spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Kalitatif taramalar Nişasta maya özütü agar (NMÖA), Soy gliserol agar (SGA), Boyd & Kohlmeyer agar (B&KA), Malt ekstrakt agar (MEA) besiyerlerinde 2,2'-azinobis-3-etilbentiazolin-6-sülfonat (ABTS), guaiacol ve Remazol Brillant Blue-R (RBBR) indikatör bileşikleriyle yapılmıştır. Lakkaz aktivitesi ölçümü ise Nişasta maya özütü ve Soy gliserol sıvı ortamında ABTS oksidasyonuna bağlı olarak belirlenmiştir. Aktinobakterilerde lignolitik enzim varlığı saptanamazken; altı deniz orjinli fungusun lignolitik enzim aktivitesinin varlığı tespit edilmiştir. İzolatların moleküler identifikasyonu, NSI1 ve NLB4 primerleri kullanılarak 18S rRNA geninin kısmi bölgesi, ITS1, 5.8S rRNA geni, ITS2'nin tam bölgeleri ve 28S rRNA geninin kısmi bölgesi belirlenerek gerçekleştirilmiştir. Tanılanan lignolitik deniz orjinli fungusların saptanan en yüksek lakkaz aktiviteleri ve en yüksek aktiviteyi gösterdikleri günler şu şekildedir: Alternaria sp. izolat D11 (Accession no: MH029119) 6. gün 29 U/L, Alternaria sp. izolat D21 (Accession no: MH029120) 5.gün 60 U/L, Cadophora sp. izolat D43 (Accession no: MH029121) 4. gün 1,8 U/L, Cadophora luteo-olivacea izolat D51 (Accession no: MH029122) 7. gün 0,54 U/L, Phoma sp. izolat K2BR (Accession no: MH029123) 5. gün 32 U/L, Phoma sp. izolat K21 (Accession no: MH029124) 4. gün 30,5 U/L. En yüksek lakkaz aktivitesine sahip izolat (Alternaria sp. izolat D21), farklı kimyasal yapılara sahip endüstriyel boyaların renk giderimi çalışmaları için seçilmiştir. Optimize edilmiş ortamda lakkaz aktivitesi 65 U/L olarak belirlenen izolatın endüstriyel boyalar üzerindeki dekolorizasyon oranları (144 saat sonunda); Metil turuncusu için % 98, Asit yeşili 3 için % 93, Metilen mavisi için % 78, Remazol Brillant Blue R için % 71, Kristal viyole için % 58 ve Kongo kırmızısı için % 53 olarak saptanmıştır.
Önemli bir dekolorizasyon başarısı gösteren Alternaria sp. izolat D21 (Accession no: MH029120) ileri enzim ve biyomühendislik araştırmaları için önem arz etmektedir ve bu alanlara entegrasyonu sağlanmalıdır. Boyalar ile kirlenmiş deniz ve ilgili su sistemleri gibi endüstriyel atıkların hızlı ve ekonomik olarak giderilmesi için ileri çalışmalar yapılmalı ve geliştirilmelidir.

Abstract:
In this thesis, production of lignolytic enzymes from actinobacteria and fungi isolated from aquatic systems were investigated qualitatively and quantitatively and the medium optimization was carried out by the orthogonal matrix method. The isolate which had the highest laccase activity was selected and color removal of industrial dyes with different chemical structures was measured spectrophotometrically. Qualitative screenings were performed using 2,2'-azinobis-3-ethylbutiazoline-6-sulphonate (ABTS), guaiacol and Remazol Brilliant Blue-R (RBBR) indicator compounds in Starch yeast extract agar, Soy glycerol agar, Boyd & Kohlmeyer agar, Malt extract agar media. The measurement of laccase activity was determined according to ABTS oxidation in Starch yeast extract and Soy glycerol liquid media. Ligninolytic enzyme activity was not determined in actinobacteria, whereas it was detected in six marine derived fungi. Molecular identification of the isolates were performed by determining the partial region of 18S rRNA gene, the complete regions of ITS1, 5.8S rRNA gene, ITS2 and the partial region of the 28S rRNA gene by using NSI1 and NLB4 primers. The highest laccase activity and the day of the highest activity of identified ligninolytic marine derived fungi were as follows: Alternaria sp. isolate D11 (Accession no: MH029119) 6th day 29 U/L, Alternaria sp. isolate D21 (Accession no: MH029120) 5th day 60.0 U/L, Cadophora sp. isolate D43 (Accession no: MH029121) 4th day 1.8 U/L, Cadophora luteo-olivacea isolate D51 (Accession no: MH029122) 7th day 0.54 U/L, Phoma sp. isolate K2BR (Accession no: MH029123) 5th day 32.0 U/L, Phoma sp. isolate K21 (Accession no: MH029124) 4th day 30.5 U/L. The isolate (Alternaria sp. isolate D21) with the highest laccase activity has been selected for decolorization studies of industrial dyes with different chemical structures. Decolorization ratios on industrial dyes of the isolate of which laccase activity was measured as 65 U/L in an optimized medium (after 144 hours) were detected as 98% for methyl orange, 93% for acid green 3, 78% for methylene blue, 71% for Remazol Brilliant Blue R, 58% for Crystal violet, and 53% for Congo red.
Alternaria sp. isolate D21 (Accession no: MH029120) which showed a significant decolorization success, is important for further enzyme and bioengineering investigations and it should be integrated to these fields. Further studies should be increased and developed for fast and economic color removal of industrial wastes, such as marine and related aquatic systems contaminated with dyes.