Kayseri yöresindeki atlarda parascarıs equorum'un moleküler prevalansı ve filogenisi
Molecular prevalence and phylogeny of parascaris equorum in horses in Kayseri region
Yazar: EMRE ÖZCAN
Danışman: PROF. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu araştırma, Kayseri bölgesindeki evcil ve yabani atların dışkı örneklerinde Parascaris equorum türünün moleküler prevalansının incelenmesi ve filogenetik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla yapılmıştır. Kayseri yöresindeki 120 atın dışkı örneklerinde P. equorum yumurtalarının varlığı, doymuş tuzlu su flotasyon yöntemi ile kontrol edilmiş ve pozitif örnekler belirlenmiştir. Atlara ait dışkı örneklerinden hazırlanan yumurta süspansiyonlarından genomik DNA ekstraksiyonu yapılması, ön homojenizasyon işlemlerini takiben gerçekleştirilmiştir. Parascaris equorum'un moleküler karakterizasyonu ve filogenetik analizleri için mt-cox1 gen bölgesinin yaklaşık 783 bp'lik kısmını amplifiye etmek için orijinal olarak tasarlanmış primerlerle nested PCR analizleri yapılmıştır. Pozitif amplikonların sekans analizleri, nested primerleri kullanılarak çift yönlü olarak gerçekleştirilmiş ve final dizilimler elde edilmiştir. Homolog veya yakın izolatlara ait ilgili gen bölgesi sekanslarıyla yapılan çoklu hizalamalar, Geneious Prime 2023.0.4 yazılımı üzerinden gerçekleştirilmiş ve GenBank kayıtları yapılmıştır. Maximum Likelihood (ML) analizleri için en uygun substitution modelin belirlenmesinde jModelTest v.0.1.1 kullanılmış ve belirlenen modeller, filogenetik ağaçların oluşturulmasında kullanılmıştır. ML analizleri, Geneious Prime 2023.0.4 yazılımı üzerinden sırasıyla PhyML plugin kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Oluşturulan ağaçların güvenilirliğini belirlemek için 1000 tekrarlı Bootstrap testi kullanılmıştır. Toplanan 120 at dışkısının morfolojik analizlerinde, 11 (%9,2) dışkı örneğinin Parascaris yumurtaları yönünden pozitif olduğu saptanmıştır. Nested PCR analizlerinde ise 13 (%10,8) örnek pozitif olarak tespit edilmiştir. PCR analizleri sonucunda belirlenen 13 izolatın sekans analizleri, P. equorum türü olduğunu ortaya koymuştur ve tüm örneklerin birbirleriyle %100 uyumlu olduğu saptanmıştır. Aynı haplotipe ait örneklerden temsili bir izolatın GenBank kaydı (OR545366) gerçekleştirilmiştir. Türkiye ve dünyanın çeşitli bölgelerinden kaydedilmiş P. equorum, P. univalens, Baylisascaris laevis, B. columnaris, B. procyonis, T. cati, T. canis, T. vitulorum, T. malaysiensis, Toxascaris leonina, Ascaris lumbricoides, A. suum, Ancylostoma caninum ve Anisakis pegreffii izolatlarını içeren toplam 27 sekanslık mt-cox1 veri seti oluşturulmuştur. Filogenetik analizlerde, Kayseri bölgesinden izole edilen TR-ERUPeq-1 izolatının P. equorum izolatları ile aynı kümeye yerleştiği ve P. univalens türlerine oldukça benzeyen izolatlar olduğu belirlenmiştir. Ancak, bu iki tür arasında benzerliklerin %100 olduğu bazı GenBank kayıtları, tartışmalı olan sinonim olup olmadıkları konusunda dikkat çekmiştir. TR-ERUPeq-1 izolatının en yüksek benzerliği (%99,88), bu iki türe ait izolatlarla paylaştığı belirlenmiştir. Bu iki türe ait diğer gruplarla benzerlik oranları %98,86-99,73 arasında değişmektedir. Pozitif izolatın diğer askarid türleriyle genetik farklılıkları %10,22-14,68 arasında değişmektedir.
Sonuç olarak, bu tez çalışmasıyla Kayseri bölgesindeki atlardan izole edilen P. equorum türlerinin moleküler prevalansı ve mt-cox1 gen bölgesinin moleküler karakterleri ortaya çıkarılmış, dünyadaki benzer izolatlarla filogenetik benzerlikleri belirlenmiş ve mt-cox1 gen bölgesi açısından Türkiye'den ilk GenBank kaydı sağlanmıştır.
Anahtar Kelimeler: At, filogenetik karakterizasyon, moleküler prevalans, Kayseri, Parascaris equorum

Abstract:
This study was conducted to investigate the molecular prevalence of the Parascaris equorum species in fecal samples of domestic and wild horses in the Kayseri region and to determine their phylogenetic characteristics. The presence of P. equorum eggs in fecal samples from 120 horses in the Kayseri region was examined using the saturated salt flotation method, and positive samples were identified. Genomic DNA extraction from egg suspensions prepared from fecal samples of horses was performed following pre-homogenization procedures. Nested PCR analyses were carried out with originally designed primers to amplify approximately 783 bp of the mt-cox1 gene region for the molecular characterization and phylogenetic analysis of P. equorum. Sequence analyses of positive amplicons were conducted bidirectionally using nested primers, and final sequences were obtained. Multiple alignments with relevant gene region sequences of homologous or closely related isolates were performed using Geneious Prime 2023.0.4 software, and GenBank records were created. jModelTest v.0.1.1 was used to determine the most suitable substitution model for Maximum Likelihood (ML) analyses, and the identified models were used in constructing phylogenetic trees. ML analyses were performed sequentially using the PhyML plugin in Geneious Prime 2023.0.4 software. A 1000-replicate Bootstrap test was employed to determine the reliability of the generated trees. Morphological analysis of the collected 120 horse feces revealed that 11 (9.2%) samples were positive for Parascaris eggs. In nested PCR analyses, 13 (10.8%) samples were identified as positive. Sequence analyses of the 13 isolates identified through PCR revealed that they belonged to the P. equorum species, and it was determined that all samples were 100% identical to each other. A representative isolate belonging to the same haplotype was recorded in GenBank (OR545366). A total of 27 sequences comprising P. equorum, P. univalens, Baylisascaris laevis, B. columnaris, B. procyonis, T. cati, T. canis, T. vitulorum, T. malaysiensis, Toxascaris leonina, Ascaris lumbricoides, A. suum, Ancylostoma caninum, and Anisakis pegreffii isolates from various regions of Türkiye and the world were included in the mt-cox1 dataset. In phylogenetic analyses, the TR-ERUPeq-1 isolate from the Kayseri region clustered together with P. equorum isolates and showed significant similarity to P. univalens species. However, some GenBank records indicated 100% similarity between these two species, raising questions about whether they are synonymous. The highest similarity of the TR-ERUPeq-1 isolate (99.88%) was determined with isolates belonging to these two species. Similarity rates with other groups of these two species ranged from 98.86% to 99.73%. The genetic differences of the positive isolate with other ascarid species ranged from 10.22% to 14.68%.
In conclusion, this thesis revealed the molecular prevalence of P. equorum species isolated from horses in the Kayseri region and the molecular characteristics of the mt-cox1 gene region. It identified phylogenetic similarities with similar isolates worldwide and provided the first GenBank record from Türkiye for the mt-cox1 gene region.
Keywords: Horse, phylogenetic characterization, molecular prevalence, Kayseri, Parascaris equorum