Organik çözgene dayanıklı bakteri temelli mikrobiyal biyosensör ve moleküler damgalanmış polimer tabanlı biyosensör sistemleri geliştirilmesi, karakterizasyonu ve bazı steroidlerin tayininde kullanılması
Development, characterization of organic solvent resistant bacteria based microbial biosensor  and molecularly imprinted polymer based biosensor systems  and use in determination of some steroids
Yazar: ERHAN CANBAY
Danışman: PROF. DR. EROL AKYILMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Steroidlerin tayini genel olarak immunoassay yöntemler ve kromatografik yöntemlerle yapılmaktadır. Söz konusu yöntemler zaman alıcı ön işlemler ve pahalı ekipmanlar içerir. Ancak mikrobiyal biyosensörler ve moleküler  damgalanmış polimer (MIP) tabanlı elektrokimyasal sensörlerin kullanılmasıyla hızlı, duyarlı, ucuz ve seçimli steroid tayini yapılabilir. Bu tez çalışmasında kortizol-kortizon ve prednisolona yönelik MIP sensörleri, kolesterole yönelik ise mikrobiyal biyosensör sistemi geliştirilmiştir. MIP sensörleri altın nanopartikül kaplanmış grafit elektrot yüzeyinde pirolün kalıp molekül varlığında elektropolimerizasyonu yöntemi ile hazırlanmıştır. Sensör cevapları  Diferansiyel Puls (DP) yöntemi ile Ferri/Ferro çözeltisinden izlenmiştir. Kortizon-kortizol ve prednisolona yönelik geliştirilen MIP sensörlerinde kalıp molekül/monomer oranı, inkübasyon ve ekstraksiyon süresi optimizasyonları yapılmıştır. Kortizon-MIP sensörünün doğrusal tayin aralığı 1-100 M, tayin limiti 0,25 M olarak bulunurken Prednisolon-MIP sensörünün doğrusal tayin aralığı 1-75 M, tayin limiti ise 0,35 M olarak bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik denemesinde Kortizon-MIP sensörünün 50 M kortizon için (n=10) ortalama (¯x), standart sapma   (±S.S.) ve % varyasyon katsayısı (%VK) değerleri sırasıyla 48,10 M, ±2,42M ve %5,04 olarak bulunurken,  50 M prednisolon için (n=10) ortalama (¯x), standart sapma ve % Varyasyon katsayısı değerleri sırasıyla 48,69 M, ±1,06 M ve %2,19 olarak bulunmuştur.  MIP sensörleri ile substrat spesifikliği, girişim etkisi ve depo kararlılığı denemeleri yapılmıştır. Ayrıca geliştirilen MIP sensörleri ile liyofilize idrar ve serum örneklerinde kortizol ve prednisolon tayini yapılmıştır. Mikrobiyal biyosensör geliştirilmesi aşaması kapsamında biyoalgılayıcı olarak kolesterol metabolizması indüklenmiş ve organik çözgene dayanıklı Pseudomonas sp. türü bakteriler ve katalaz enzimi kullanılmıştır. Pseudomonas sp. ve katalaz enzimi çok duvarlı karbon nanotüp (MWCNT)/iyonik sıvı (IL)/karbon pasta elektrot (CPE)  içerisine immobilize edilmiştir.  Biyosensörün immobilizasyon aşamaları CV ve impedans spektroskopisi ile karakterize edilmiştir. Ölçümlerde mediyatör sistemi olarak hidrokinon kullanılmıştır. Amperometrik çalışma potansiyeli -0,2 V olarak bulunmuştur. Optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları amperometrik yöntem ile yapılmıştır. Mikrobiyal biyosensörün çalışma koşullarının optimizasyonu denemeleri yapılmış ve optimum sıcaklık 35 °C, optimum pH : 7,0 (Fosfat tamponu, 50 mM) olarak bulunmuştur. Bakteri miktarının biyosensör cevabı üzerine etkisi incelenmiştir. Kolesterol tayinine yönelik olarak geliştirilen bu mikrobiyal biyosensörün doğrusal tayin aralığı 5-600 M tayin limiti ise 1,52 M olarak bulunmuştur. Substrat spesifikliği ve girişim etkisi denemelerinde kortizon, kortizol, testosteron, β-sitosterol ve östradiol gibi steroid bileşiklerle glukoz, askorbik asit gibi endojen analitlerin varlığının biyosensör cevabına etkisi incelenmiştir. Optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları tamamlanan mikrobiyal biyosensörün doygun siklohegzandaki kolesterol cevabı incelenmiş ve sulu ortamla karşılaştırılmıştır. Geliştirilen mikrobiyal biyosensörle liyofilize serum örneklerinde hem sulu fazda hem de siklohegzan fazında kolesterol tayini yapılmıştır.

Abstract:
The determination of steroids is generally performed by immunoassay methods and chromatographic methods. Such methods include time consuming preprocessing and expensive equipment. However, using microbial biosensors and MIP based electrochemical sensors, rapid, sensitive, inexpensive and selective steroid detection can be performed. In this thesis, MIP sensors for cortisol-cortisone and prednisolone and microbial biosensor system for cholesterol have been developed. MIP sensors were prepared by electropolymerization method in the presence of pyrole and template molecule on gold nanoparticle coated graphite electrode surface. Sensor responses were monitored by Ferri / Ferro solution with Differential Pulse (DP) method. Template molecule / monomer ratio, incubation and extraction duration optimizations were performed in the MIP sensors that developed for cortisone-cortisol and prednisolone. The linear detection range of the Cortisone-MIP sensor was found to be 1-100 M and the detection limit 0.25 M, while the linear detection range of the Prednisolon-MIP sensor was found to be 1-75 M and the detection limit 0.35 M. In the reproducubility experiments average value (¯x), standard deviation (±) and  variation coefficient (CV %) values for the 50 M cortisone (n = 10) by the Cortisone-MIP sensor were calculated to be 48.10 M, ± 2.42 M and 5.04%, respectively, and for the prednisolone (n = 10) were found as 48.69 M, ± 1.06 M and 2.189% respectively. MIP sensors have been used to test substrate specificity, interference effect, and storage stability. In addition, the developed MIP sensors were tested for cortisol-cortisone and prednisolone in lyophilized urine and serum samples. Within the microbial biosensor development step, cholesterol metabolism induced and organic phase tolerant Pseudomonas sp.  and catalase enzyme were used as a biocomponent of biosensor. Pseudomonas sp. and the catalase enzyme were immobilized into multi-wall carbon nanotube (MWCNT) / ionic liquid (IL) / carbon paste electrode (CPE). Immobilization steps of the biosensor were characterized by CV and impedance spectroscopy. Hydroquinone was used as the mediator system in the measurements. The amperometric working potential was found to be -0.2 V. Optimization and characterization studies were also carried out by amperometric method. The optimization of working conditions of microbial biosensor were carried out and optimum temperature and  pH were found to be 35 °C and 7.0 (Phosphate buffer, 50 mM). The effect of amounts of bacteria on the biosensor responses was investigated. The linear range of this microbial biosensor that developed for the determination of cholesterol was found to be 5-600 M and the detection limit was found as 1.52 M. The effect of steroid compounds such as cortisone, cortisol, testosterone, β-sitosterol and estradiol, and the presence of endogenous analytes such as glucose and ascorbic acid on the biosensor response was investigated in substrate specificity and interference effect experiments. After optimization and characterization studies of the microbial biosensor, the biosensor response to cholesterol in saturated cyclohegzan was investigated and also responses obtained were compared with response obtained by water phase. Cholesterol determination was carried out both in cyclohegzan and in water phase by developed microbial biosensor.