Tirmit (Lacterius volemus) mantarından saflaştırılıp karakterize edilen fitaz enziminin, magnetik kitosan nanopartiküller üzerine immobilize edilmesi ve gıda endüstrisinde kullanılabilirliğinin araştırılması
Immobilized phytase enzyme which was purifed from tirmit mushroom (Lactarius volemus) and characterizated onto magnetic chitosan nanoparticles and investigation of it's usability in the food industry
Yazar: HİCRAN ÖNEM
Danışman: PROF. DR. HAYRUNNİSA NADAROĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı / Nanoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
Fitaz (myo-inositol hekzakifosfat fosfohidrolaz, EC 3.1.3.8), fitik asiti (myo-inositol hekzafosfat), inorganik monofosfat, myo-inositol fosfat ve serbest myo-inositol'e hidroliz reaksiyonunu katalizleyen enzimdir. Fitik asit gıda maddelerinden tahıl, baklagil ve yağlı tohumlarda yer alan fosforun ana depo kaynağı olarak bulunmaktadır. Yaptığımız çalışmada fitaz enzimi %40-80 aralığında amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE selüloz iyon değişim kromatografisi ve Sephakril S200 jel filtrasyon kromatografisi teknikleri kullanılarak Tirmit (Lactarius volemus) mantarından %11.6 verimle 120.2 kat saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Kitosan molekülü Fe3O4 nanopartikülleri ile magnetik hale getirildikten sonra, L-glutaraldehit ara kolu kullanılarak enzim magnetik kitosan nanopartiküllere kovalent olarak bağlanmıştır. Hem serbest hem de immobilize fitaz enziminin aktivite gösterdiği optimum pH 5.5, optimum sıcaklığı ise 50°C olarak belirlenmiştir. Tirmit mantarından saflaştırılan serbest ve bağlı fitaz enziminin aktivitesi üzerine CuCl2, HgCl2, FeCl2, MgCl2, ZnCl2, CaCl2 gibi bazı metal iyonlarının etkisi araştırılmış ve bağlı enzimin serbest enzime göre metal iyonlarına karşı daha yüksek bir aktivite kararlılığına sahip olduğu belirlenmiştir. Serbest enzimin alt birim sayısı SDS-PAGE elektroforez yöntemi ile belirlenirken jel filtrasyon kromotografisi kullanılarak enzimin molekül ağırlığı 45 kDa olarak belirlenmiştir. Serbest ve bağlı enzimin substrat spesifikliğini belirlemek için keçi boynuzu gamı, jelatin, selüloz, nişasta ve ksilen substratları ile ayrı ayrı aktivite ölçümleri yapılmış ve Lineweaver burk grafikleri çizilerek Vmax ve Km değerleri hesaplanmıştır. Ayrıca, immobilize ve serbest enzimin pirinç, kuru fasulye, mercimek, bakla, börülce, nohut, barbunya, yulaf, çavdar ve buğday gibi bazı kuru baklagillerdeki fitik asitin sindirimini etkileyip etkilemediği araştırılmıştır. Elde edilen bulgulardan tirmit (Lactarius volemus) mantarından saflaştırılan ve immobilize edilen fitaz enziminin sahip olduğu karakteristik özelliklerinden dolayı gıda endüstrisinde kullanımının büyük avantaj sağlayacağı görülmüştür.

Abstract:
Phytase (myo-inositol hexakiphosphate phosphohydrolase, EC 3.1.3.8) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis reaction to form from phytic acid (myo-inositol hekzafosfat) to inorganic monophosphate, free myo-inositol and myo-inositol phosphate. Phytic acid acts as a main store source of phosphorus which is included in grains, legumes and oil seeds as the foodstuff.
In this study, phytase enzyme was purified 120.2 times and characterized with 11.6 percentage of yield in the range of 40-80% from Tirmit (Lactarius volemus) by using ammonium sulfate precipitation, DEAE cellulose ion exchange chromatography and Sephacryl S200 gel filtration chromatography techniques.
At first, chitosan molecules were magnetized by using Fe3O4 nanoparticles. After that, enzyme was covalently bounded to magnetic chitosan nanoparticles by using L-glutaraldehyde. For free and immobilized phytase enzyme, the optimum pH and temperature were determined as 5.5 and 50°C, respectively. The effects of some metal ions such as CuCl2, HgCl2, FeCl2, MgCl2, ZnCl2, CaCl2 were researched onthe  activities of free and immobilized phytase enzymes from Tirmit mushroom, and it was detected that immobilized phytase enzyme has higher activity stability to metal ions than free phytase enzyme. The subunit number of free enzyme was determined by SDS-PAGE electrophoresis method, and the molecular weight of the enzyme was determined as 45 kDa by using gel filtration chromatography. Substrate specificity was determined for free and immobilized enzymes using locust bean gum, gelatin, cellulose, starch and xylene substrates, respectively. And Vmax and Km values were calculated by drawing Lineweaver burk graphs. It was also investigated whether immobilized and free enzymes were hydrolzed the phytic acid in some dry legumes such as rice, dried bean, lentil, broad bean, kidney bean, oat, rye and wheat or not. The obtained data showed that purified from Tirmit mushroom (Lactarius volemus) and immobilized phytase enzyme could be provided big advantages to the food industry.