Türkiye'deki Vipera anatolica anatolica ve Vipera anatolica senliki alttürlerine ait yılanların zehirlerinin sitotoksik, anti-anjiyojenik ve apoptotik etkilerinin araştırılması
Investigation of cytotoxic, anti-angiogenic and apoptotic effects of venom of snakes belonging to Vipera anatolica anatolica and Vipera anatolica senliki species in Turkey
Yazar: BURAK KURT
Danışman: DOÇ. DR. HARİKA ATMACA İLHAN
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Zooloji = Zoology
Dizin: Anjiyogenez = Angiogenesis ; Apoptozis = Apoptosis ; Kanser =   ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Yılan zehirleri = Snake venoms

Özet:
Yılan zehirleri, çeşitli biyokimyasal aktivitelere sahip biyoaktif proteinler ve peptitlerin karışımlarıdır. Ülkemizde yaygın olarak bulunan zehirli yılanlar Viperidae familyası üyeleridir. Bu familyaya ait bazı türlerin zehir proteinlerinin elektroforetik yöntemlerle protein içerikleri araştırılmıştır ancak etki mekanizmalarına dair detaylı araştırmalar yapılmamıştır. Yılan zehirleri içerdikleri toksinlerin güçlü biyolojik aktivitesi nedeniyle potansiyel olarak değerli terapötik bileşiklerin kaynağını temsil etmektedirler. Bu tez çalışması ile ülkemizde zehirli yılanların oluşturduğu Viperidae familyası üyelerinden Vipera anatolica türüne ait Vipera anatolica anatolica (VAA) ve Vipera anatolica senliki (VAS) alttürlerinden elde edilen zehirlerin sitotoksik, anti-anjiyojenik ve apoptotik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. 
VAA ve VAS türlerine ait zehirler Antalya ili ve çevresinde arazi koşullarında toplanmış ve +4℃'de Eppendorf tüplerinde laboratuvar ortamında liyofilize edildi. Protein konsantrasyonu tayini Bradford yöntemiyle yapıldı. Sitotoksik etkiyi belirlemek için MTT yöntemi kullanıldı. Hücrelerin %50'sini öldüren konsantrasyon (IC50) değerleri, CalcuSyn programı kullanılarak hesaplandı. Apoptotik hücreler, Annexin V Apoptoz Tespit Kiti kullanılarak akış sitometrisinde belirlendi. Anti-anjiyogenik etkiyi araştırmak için hücre migrasyon miktarını tespit eden yara tamiri yöntemi kullanıldı.
VAA ve VAS zehirlerinin protein miktarları sırasıyla 124.6±0.4 mg/mL ve 141.8±1.2 mg/mL olarak belirlendi. Her iki yılan zehrinin de hem kanser hücrelerinde hem de tümörijenik olmayan hücrelerde konsantrasyona ve zamana bağlı olarak sitotoksik etki gösterdiği belirlendi (p<0.05). VAA zehrinin PC-3, MCF-7, H69 ve HEK-293 hücrelerindeki IC50 değerleri sırasıyla 4.0 ± 0.8, 4.1 ± 1.2, 6.3 ± 0.6 ve 6.0 ± 1.1 olarak belirlendi. VAS zehrinin PC-3, MCF-7, H69 ve HEK-293 hücrelerindeki IC50 değerleri ise sırasıyla 5.8 ± 0.2, 5.2 ± 0.7, 6.2 ± 1.0 ve 8.1 ± 1.2 olarak belirlendi.
VAA ve VAS zehirleri test edilen tüm kanser hücrelerinde 48. saatte kuvvetli apoptotik etki gösterdi (p<0.05). VAA zehrinin IC50 değeri ile 48 saat muamele edilen PC-3 hücrelerinde %22.7 erken apoptotik, %17.9 geç apoptotik hücre, MCF-7 hücrelerinde %50.6 erken apoptotik, %33.1 geç apoptotik hücre, H69 hücrelerinde %25.7 erken apoptotik, %66.2 geç apoptotik hücre oranı belirlendi. VAS zehrinin IC50 değeri ile 48 saat muamele edilen PC-3 hücrelerinde ise %8.0 erken apoptotik, %20.9 geç apoptotik hücre, MCF-7 hücrelerinde %40.8 erken apoptotik, %19.5 geç apoptotik hücre, H69 hücrelerinde %25.7 erken apoptotik, %66.2 geç apoptotik hücre oranı belirlendi (p<0.05). Yara tamiri sonuçları VAA ve VAS zehirlerinin 48. saatte kanser hücrelerinin migrasyonunu engellediğini ortaya koydu. 
Bu tez çalışması ile VAA ve VAS'tan elde edilen zehirlerin sitotoksik etkilerinin olduğu ve sitotoksik etkilerinin apoptotik hücre ölümünü indüklediği, bunun yanı sıra potansiyel anti-anjiyojenik etkileri olduğu ilk kez gösterilmiştir. Yılan zehirlerinden elde edilecek ön verilerin yeni farmasötik peptitlerin ortaya koyulmasına ve kanser veya diğer hastalıklar için daha etkili tedavi yöntemlerinin ortaya çıkarılmasına olanak sağlayabileceği öngörülmektedir. Mevcut tez çalışması ile VAA ve VAS zehirlerinin anti-kanser etkilere sahip olduğu gösterilmiş olup, bu etkilerin in vivo yöntemlerle doğrulanmasına ihtiyaç vardır.

Abstract:
Snake venoms are mixtures of bioactive proteins and peptides with various biochemical activities. Venomous snakes commonly found in our country are members of the Viperidae family. The protein contents of some species belonging to this family have been investigated by electrophoretic methods, but detailed studies on their mechanism of action have not been carried out. Snake venoms represent a source of potentially valuable therapeutic compounds due to the potent biological activity of the toxins they contain. In this thesis thesis, the cytotoxic, anti-angiogenic and apoptotic effects of Vipera anatolica anatolica (VAA) and Vipera anatolica senliki (VAS) venoms belonging to the Vipera anatolica species, were investigated. 
Venoms belonging to VAA and VAS species were collected in field conditions in Antalya province and its surroundings and lyophilized in Eppendorf tubes at +4℃ to the laboratory environment. Protein concentration determination was made by the Bradford method. The MTT method was used to determine the cytotoxic effect. The concentration (IC50) values that killed 50% of the cells were calculated using the CalcuSyn program. Apoptotic cells were determined in flow cytometry using the Annexin V Apoptosis Detection Kit. The scratch assay method, which detects the amount of cell migration, was used to investigate the anti-angiogenic effect.
Protein amounts of VAA and VAS poisons were determined as 124.6±0.4 mg/mL and 141.8±1.2 mg/mL, respectively. It was determined that both snake venoms showed cytotoxic effects in both cancer cells and non-tumorigenic cells depending on concentration and time (p<0.05). The IC50 values of VAA venom in PC-3, MCF-7, H69 and HEK-293 cells were determined as 4.0 ± 0.8, 4.1 ± 1.2, 6.3 ± 0.6 and 6.0 ± 1.1, respectively. The IC50 values of VAS venom in PC-3, MCF-7, H69 and HEK-293 cells were determined as 5.8 ± 0.2, 5.2 ± 0.7, 6.2 ± 1.0 and 8.1 ± 1.2, respectively.
With the IC50 value of VAA venom, PC-3 cells treated for 48 hours were 22.7% early apoptotic, 17.9% late apoptotic cells, MCF-7 cells 50.6% early apoptotic, 33.1% late apoptotic cells, H69 cells 25.7% early apoptotic, 66.2% late apoptotic cell rate was determined. The IC50 value of VAS venom and the rate of 8.0% early apoptotic 20.9% late apoptotic cells in PC-3 cells treated for 48 hours, 40.8% early apoptotic 19.5% late apoptotic cells in MCF-7 cells, 25.7% early apoptotic 66.2% late apoptotic cells in H69 cells determined. (p<0.05). Wound repair results revealed that VAA and VAS poisons inhibited the migration of cancer cells at 48 hours.
With this thesis, it was shown for the first time that venoms obtained from VAA and VAS have cytotoxic effects and that their cytotoxic effects induce apoptotic cell death, as well as have potential anti-angiogenic effects. It is anticipated that the preliminary data to be obtained from snake venoms may enable the discovery of new pharmaceutical peptides and the discovery of more effective treatment methods for cancer or other diseases. With the current thesis, it has been shown that VAA and VAS poisons have anti-cancer effects, and these effects need to be confirmed by in vivo methods.