Beyin tümörlerinde uyarılmış pluripotent kök hücre (UPKH)'lerden elde edilmiş nöral kök hücre (NKH) kullanarak terapi yaklaşımları
Therapeutic approaches using induced pluripotent stem cell (IPS)-derived neural stem cells (NSCS) in brain tumors
Yazar: NASTARAN LANGARIZADEH
Danışman: PROF. DR. SİNAN AKGÖL ; YRD. DOÇ. DR. TUĞBA BAĞCI ÖNDER
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Nöral kök hücreler (NKH'lar), temel tıp araştırmalar için eşsiz ve son derece güçlü araçlar olmakla birlikte, nörodejeneratif hastalıkların ve rejeneratif tıp araştırma alanında kullanılmaktadır. Bu tez çalışma kapsamında, Meningioma (MNG) ve Glioblastoma multiform (GBM) tedavisinde NKH sistemlerinin geliştirilmesi yapılmıştır. Bu amaca ulaşmak için yeniden programlama yöntemiyle OSKM (pCXLE-SK, pCXLE-Oct3/4-shp53, pCXLE-hUL) transkripsiyon faktörlerinin sağlıklı, MNG ve GBM hastalarından toplanan fibroblast hücrelerine epizomal transfeksiyon yöntemiyle aktarılması ve Uyarılmış pluripotent kök hücreleri (uPKH)'lerin oluşturulması yapıldı. Elde edilen uPKH'lerin morfolojik incelemesi, Karyotipleme, gen ekspresyon analizi, immunofloresan boyama ve teratoma oluşturma gibi farklı karekterizasyon testleri yapıldı. Bu testler yeniden programlanan hücrelerin gerçek uPKH olduklarını, pluripotens belirteç genlerinin ifadelerinin artması ve in vivo koşullarda ektoderm, mezoderm, endoderm oluşturma yeteneğine sahip oldukları teyit edildi. Hedefe yönelik uPKH'ler iki farklı farklılaştırma yöntemi kullanarak upNKH elde edildi. Nörosfer oluşturan upNKH'ler in vitro ortamlarda nöron ve astrosit oluşturma kapasiteye sahip hücreler tanımlanırlar. upNKH'lerin gen ekspresyon düzeyde Nestin, PAX6, GLAST, Blp, Sox1 gen ifade örüntülerinin standart upNKH'lara benzerlik göstermesi, aynı zamanda protein ekspresyonu için IF deneyleri ile Nestin protein miktarının ekspressyonu ve farklılaşma koşullarında nöron ve astrosit farklılaşması tespit edildi. Bu çalışmaların sonucunda, her hastalarına özgü, terapötik upNKH'lerin oluşturulması yapıldı. Bu yeni sistem geliştirilecek MNG ve GBM hastasından izole edilerek oluşturuldu. Elde edilen upNKH yönteminin prensipte nasıl çalıştığının incelenmesi ileride tasarlanacak klinik deneylere ışık tutacaktır.

Abstract:
Neural stem cells (NSCs) suggestion for a unique and extremely powerful tool for basic research by personalizing regenerative treatment and generate novel human disease models to neurodegenerative diseases for research and therapeutic testing. During the course of this thesis, NSCs systems were developed in the treatment of Meningioma (MNG) and Glioblastoma multiforme (GBM). We generated and characterized integration-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) lines derived from healthy, MNG and GBM-patient fibroblasts using reprogramming technology by applying the episomal vectors (PCXLE-SK, pCXLE-Oct3/4-shp53, pCXLE-hUL). iPSCs were characterized by morphological, karyotyping, gene expression analysis, IF staining and teratoma formation assay, all of which demonstrate that reprogrammed cells are true iPSCs and pluripotent genes were expressed. All three germ layers including endoderm, mesoderm and ectoderm are observed in Teratoma. Then, using directed differentiation techniques, to differentiate iPSCs into iP-NSCs, embryoid body formation and monolayer culture protocol was used. Characterized their in vitro properties. I show that MNG-iP-NSCs are able to form the neurospheres and can be propagated over many passages and have the potential to differentiate into two neural lineages (neurons and astrocytes). Also, analysis of gene expression data showed that MNG-iP-NSCs were characterized by gene expression, all of which express Nestin, PAX6, GLAST, Blp, Sox1 genes. IF staining assay results demonstrate the presence of the proteins such as Nestin which is similar to the levels with standard NSCs. Our studies provided insight into the generation of MNG and GBM-patient specific iP-NSCs. Demonstrating the proof-of-principle of this technology in animal models of MNG and GBM might help in the future design of clinical studies utilizing ip- NSCs as "armed" vehicles for MNG and GBM patients.