Sirna taşıyıcı sistem geliştirme ve değerlendirme çalışmaları
Developing and evaluating studies on sirna delivery systems
Yazar: BEHİYE ŞENEL
Danışman: PROF. DR. YASEMİN YAZAN ; YRD. DOÇ. DR. GÜLAY BÜYÜKKÖROĞLU
Anadolu Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Gen tedavisi = Gene therapy ; Genler-Bcl-2 = Genes-Bcl-2 ; Kitosan = Chitosan ; Lipidler = Lipids ; Polimerler = Polymers ; RNA = RNA ; Transfeksiyon = Transfection ; İlaç formülleri = Formularies ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers ; İlaçlar = Drugs ; İlaçlar-araştırma safhasında = Drugs-investigational

Özet:
Kontrolsüz hücre çoğalması, kitle veya tümör oluşumu ile karakterize olan kanser günümüzün en önemli sağlık sorunlarından birisidir. Kontrolsüz gerçekleşen çoğalma, DNA'da meydana gelen mutasyonlar sonucu (onkojen aktivasyonu, tümör süpresör gen inaktivasyonu, vb) hücre apoptozunun gerçekleşememesi ile ortaya çıkmaktadır.Memeli hücrelerinde 2001'de Tuschl ve ark. tarafından ilk kez keşfedilen siRNA, bugüne kadar kanser tedavisinde, anjiyojenezin inhibe edilmesinde, çeşitli onkojenlerin inhibisyonu ve hücre-içi sinyal iletim sistem genlerinin inhibisyonu ile tümör gelişiminin durdurulması ve apoptozun indüklenmesinde, radyo veya kemo hassaslığının arttırılması çalışmalarında kullanılmaktadır.Bu tez çalışmasındada farklı lipidik ve polimerik sistemlerin siRNA teknolojisi için kullanılması hedeflenmiştir. Lipidik yapıdaki sistemler için `Katı Lipit Nanopartiküller' (KLN), polimerik yapı için ise yeni geliştirilmiş ve yine çok fazla çalışılmamış suda çözünebilen kitosan polimerleri kullanılmıştır. Genetik materyal olarak Bcl-2 siRNA'sı seçilmiştir.KLN hazırlanmasında çeşitli yöntemler kullanılmış (sonikasyon ve yüksek hızda karıştırma ile basit emülsiyon) ve zeta potansiyel, parçacık büyüklüğü, siRNA bağlayabilme özelllikleri açısından değerlendirilmiştir. Bu özellikler açısından en uygun olduğuna karar verilen sonikasyon ile ve yüksek hızda karıştırma ile hazırlanan birer formülasyon tranfeksiyon çalışmaları için kullanılmıştır.. Kitosan çalışmasında ise polimerik formülasyon hazırlamak için farklı moleküler ağırlığa sahip kitosanlar kullanılmıştır. Bu formülasyonlarda da karakterizasyon çalışmaları yapıldıktan sonra siRNA bağlama ve sitotoksisite açısından değerlendirildiğinde en fazla 10 kDa moleküler ağırlıklı kitosanın (K4) transfeksiyon için uygun olduğu saptanmıştır.A549 ve MCF-7 hücrelerinde yapılan transfeksiyon çalışmaları sonucunda sonikasyon ile hazırlanan formülasyon kontrol olarak kullanılan Lipofektamin®2000'e yakın transfeksiyon etkinliği gösterirken, Kitosan formülasyonu (K4) çok fazla etkinlik gösterememiştir. Transfeksiyon etkinliğinin analizi için yapılan Western Blot çalışmasında 72. saatte Lipofektamin'in Bcl-2 proteini basklılayabildiği tespit edilirken sonikasyon ile hazırlanan formülasyonun kitosan ile hazırlanan formülasyona göre daha çok baskılama özelliği gösterdiği saptanmıştır.

Abstract:
Cancer, which is one of today's most important health problem, lead to the formation of mass or tumor which is characterized by uncontrolled cell proliferation. Uncontrolled proliferation was the result of unrealized apoptosis due to mutations in DNA (activation of oncogene, inactivation of tumor supressor genes etc.).siRNA was first discovered in mammalian cells by Tuschl et al. in 2001. And since than it is being used for the treatment of many cancer cases for the both inhibition of angiogenesis and various oncogenes and intracellular signal transduction system genes to stop tumor growth and induction of apoptosis and also increasement of the sensitivity of the radio or chemotherapy.In this study, we aimed to use of different lipidic and polymeric systems for this technology. We formulated ?Solid Lipid Nanoparticles? (SLN) and water soluble chitosan polymers which are newly developed and not much studied on as lipidik and polymeric structure respectively Bcl-2 siRNA was choosen as the genetic material.A variety of methods (sonication, simple emulsion with high speed mixing) were used for the preparation of SLN and were evaluated for the zeta potential, particle size, cytotoxicity, siRNA binding ability. S5 was the best formulation that was prepared with sonication and also G2 was the best formulation thar was prepared with high speed stirring in terms of the all features and was selected as the most appropriate formulation for transfection studies. In chitosan studies, for the preparation different molecular-weight water soluble chitosans were used the polymeric formulations. And also they were evaluated for characterisation, cytotoxicity, efficacy of siRNA binding. When the results were evaluated, The 10 kDa molecular weight Kitosan (K4) was the best candidate for further transfection studies.As the results of the transfection stdies, When the S5 formulations have showed closer transfection actvitiy compared to Lipofectamin®2000 which was used as a control, K4 showed not much activity in A549 and MCF-7 cells. In the Westen blot sudies which is made for the analysis of the effectiveness of transfection, especially in the 72th hours, the inhibition of Bcl-2 protein was observed with S5 formulations according to K4.