Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis
Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
Yazar: EVRİM KAPUCU
Danışman: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Rekombinant proteaz üretimi = Recombinant protease production ; Serin alkali proteaz = Serine alkaline protease

Özet:
Enzimler, canlıda meydana gelen biyokimyasal reaksiyonları katalize eden ve genelde protein yapıda bulunan biyolojik katalizörler olarak bilinir. Bu katalizörler yer aldıkları spesifik reaksiyonların aktivasyon enerjisini düşürerek reaksiyonun gerçekleşme hızını arttırır. Geçtiğimiz on yıllar boyunca, enzimler birçok farklı endüstriyel ürün ve süreçte, çevre dostu ürünler oluşturmaları ve biyolojik olarak bozunabilir olmaları sebebiyle kullanılmaktadır.  Enzimler, deterjan, gıda, bira üretimi, fotoğraf uygulamaları, deri işleme, atık giderimi, tıbbi uygulamalar gibi çeşitli alanlarda kullanılmaktadır ve sürekli olarak yeni uygulama alanları eklenmektedir.  Bununla beraber, biyolojik katalizörlerin endüstriyel işlemlerde kullanılabilmeleri için ekstrem koşullara dayanıklı olmaları gerekmektedir. Enzimlerin olağanüstü potansiyellerine rağmen, endüstriyel koşullar altında kararlı olmamaları ve sıklıkla yüksek sıcaklık, basınç, organik çözücü varlığındaki zayıf performansları enzim kullanımını sınırlamaktadır. Pek çok endüstriyel alanda, yüksek tuz konsantrasyonunda ve/veya düşük su içerikli ortamlarda daha iyi verimliliğe ve kararlılığa sahip olan yeni enzimler aranmaktadır. Bu kısıtlamaları ortadan kaldırmak için, protein mühendisliği, nanoteknoloji, metabolik mühendislik, metagenomik, immobilizasyon ve ileri DNA teknoloji uygulamaları da dahil olmak üzere enzimlerin endüstriyel kullanımlarının iyileştirilmesine yönelik çeşitli yaklaşımlar uygulanmaktadır. 
Bir hidrolaz alt sınıfı olan proteaz enzimi, proteinleri polipeptit zincirlerindeki peptit bağlarını hidrolize ederek parçalarlar. Katalitik mekanizmalarına göre proteinler farklı sınıflara ayrılmaktadır. Tüm proteazların yaklaşık üçte birini oluşturan serin proteazlar aktif bölgelerinde nükleofilik serin kalıntısı içermektedir ve alkali pH civarında maksimum aktivite gösterirler. Deterjan, deri, ilaç, kozmetik, kimya, et işleme, peynir yapımı, kağıt ve kağıt hamuru, gümüş geri kazanımı, ipek zamk giderme, biyoremediasyon işlemleri ve atık su arıtma gibi birçok endüstrideki önemli uygulamaları nedeniyle, proteazlar toplam enzim pazarının % 60'ını oluşturmaktadır. Endüstriyel alanda proteaz enzimine talep çok fazla olduğundan, novel proteaz enzimlerinin eldesi ve protein mühendisliği yaklaşımlarıyla enzim iyileştirme çalışmaları son zamanlarda artıştadır.
Metagenomik, herhangi bir ortamda yaşayan mikroorganizmaların kültüre edilmeksizin DNA dizilerine bağlı olarak tanımlanıp, biyoteknolojik önemlerinin ortaya çıkarılmasında başvurulan bilim dalıdır. İnsan, kalın bağırsak florası, deniz suyu, kaplıcalar, göller, toprak, madenler, çeşitli gıda fermantasyon ortamları ve birçok çevresel kaynak metagenomik havuzlarıdır. Metagenomik yaklaşım ile ortamda bulunan tüm mikroorganizmanın genetik materyalinin kazanımı sağlanmaktadır. Çevresel örneklerdeki ekstremofilik mikrooganizmalardan elde edilmiş metagenomlar sayesinde çeşitli ekstremozimler keşfedilmektedir.
Ekstremozimler, uzun zamandır proteinler için yıkıcı olduğu düşünülen endüstriyel süreçlerdeki sert koşullara dayanabilen, ekstremofilik mikroorganizmalardan elde edilen enzimlerdir. Ekstremofillerin her bir grubu, enzimlere çok çeşitli uygulama olanakları sağlayan benzersiz özelliklere sahiptir. Ekstremozimler, büyük sağlamlıkları nedeniyle aşırı koşullara karşı çok dirençlidirler. Eksteremofillik organizmalardan biri olan halofillerden üretilen halofilik enzimler sadece yüksek tuz konsantrasyonlarında kararlı olmakla kalmayıp aynı zamanda birden fazla ekstrem koşul altında (yüksek sıcaklıkta, yüksek pH değerinde, sürfaktanların varlığında) etkili bir şekilde reaksiyon gösterebilirler. Optimize edilmiş stabilizasyon parametreleri sadece daha verimli bir enzime yol açmayacak, aynı zamanda mevcut enzimatik süreçlere ve kararsızlıklarından dolayı enzimlerin kullanılmadığı yeni alanlara entegre edilmesiyle ekonominin ve yeni araştırma hattının gelişmesi için yeni fırsatlar sunacaktır.
Protein mühendisliği, moleküler biyoloji tekniklerinin kullanılarak protein dizisi ve yapısında yapılan değişiklikler ile yüksek aktivite, kararlılık ve seçiciliğe sahip biyokatalizörlerin üretilmesi için yapılan çalışmalardır.  Arzu edilen özellikleri geliştirmek için birçok protein mühendisliği stratejisi geliştirilmiştir. Rasyonel tasarım, yönlendirilmiş evrim ve yarı rasyonel tasarım en yaygın olarak kullanılan üç ana stratejidir. Rasyonel Tasarım stratejisi olarak bilinen bölgeye yönelik mutagenez metodu proteinin amino asit dizisinde ekleme, silme ve yerine koyma gibi tekli veya çoklu nükleotid mutasyonları ile enzimin aktif bölgesinde, substrat bağlanma bölgesinde, üç boyutlu yapısında farklılıklara neden olmaktadır. Bölgeye yönelik mutagenez için Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) tabanlı teknikler kullanılmaktadır. İlk olarak, gen üzerinde değiştirilmek istenen nükleotidlere özgü mutajenik primerler tasarlanır ve Polimeraz Zincir Reaksİyonu ile istenen mutasyon elde edilir. 
Daha önceki çalışmalarda, Acıgöl (Burdur, Türkiye)'den elde edilen Virgibacillus sp.  AGTR suşunun halofilik serin proteaz geninin 330. baz konumunda adenin delesyonu mutasyonuna sahip olduğu bulunmuştur. Bu mutasyonun, protein sentezi tamamlanmadan bir durdurma kodonu oluşturduğu bulunmuştur. Enzim gen tarafından üretilemediğinden, protein saflaştırma işlemi gerçekleştirilememiş ve enzimatik özellikler incelenememiştir. Bu çalışmada, enzimle ilgili daha ileri araştırmalar için halofilik serin proteazın bölgeye yönelik mutagenezi gerçekleştirilmiştir ve adenin bazı 330. pozisyona yeniden eklenmiştir.  Daha önceki çalışmalarda Acıgöl'den toplanan mikroorganizma kültürlerinden izole edilmiş olan serin proteaz kodlayan gen, pET-28a (+) vektörüne aktarılarak Escherichia coli C43 kompetent hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, bölgeye yönelik mutagenez işlemi için gerçekleştirilen örtüşme uzatma PZR reaksiyonlarında template DNA olarak serin proteaz genini içeren pET-28a (+) plazmidi kullanılmıştır. Bu PZR için, önceden tasarlanmış bölgeye yönelik mutasyonu içeren mutajenik primerler kullanılarak uygulandı. Polimeraz zincir reaksiyonu ile mutasyon yapıldıktan sonra, PZR ürünleri ilgilenilen genin uygun şekilde amplifiye edilip edilmediğini görmek için jel altında görüntülendi. Uygun boyutlarda amplifiye edilen PZR ürünü ve pET-28a (+)  EcoRI ve SacI endonükleaz enzimleri ile kesildikten sonra konsantrasyonları ve saflıkları NanoDrop ile belirlendi.  İlgili enzimlerle kesildikten sonra oluşan yapışkan uçları bağlamak için T4 DNA ligaz enzimi kullanılmıştır. Ligasyon adımından sonra, elde edilen plasmid DNA'sı E. coli C43 (DE3) kompetent hücrelerine transforme edildi. Elde edilen kültürler kanamisin içeren LB agar platelere ekilmiş ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edilmiştir. Seçilen kolonilerden plazmid izolasyonu sonrası, agaroz jel elektroforezi ile plasmit DNA boyutları doğrulanmıştır. Mutasyon kontrolü için, örnekler dizi analizine gönderilmiştir. Dizileme sonucunda, örtüşme uzantı PZR yöntemi kullanılarak 330. baza adeninin başarılı bir şekilde yerleştirildiği görülmüştür ve protein ekspresyonuna başlanmıştır. Optimum protein ekspresyonunu belirlemek üzere üzere 0.1, 0.5 ve 1 mM IPTG ile 30°C'de 1, 2, 4 ve 6 saat boyunca indüklemeler yapılmıştır. Protein ekspresyonunun optimizasyonu, 30 °C'de 1 mM IPTG varlığında 6 saat indüksiyon sonrası en fazla miktarda protein eldesiyle sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, proteinin çoğunun pelette inklüzyon cisimcikleri halinde kaldığı gözlenmiştir. Protein ekpresyonunun, 1 mM IPTG ile indüksiyonu sonrası 18 saat boyunca 18 °C'de gerçekleştirilmesi, çözünür protein verimini önemli ölçüde etkilememiştir. Gen başarıyla ifade edildikten sonra protein, "His-taq" yöntemi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırma işlemi, SDS-PAGE ve western blot analizi kullanılarak teyit edilmiştir. 
SDS-PAGE analizinin sonuçlarına bakıldığında, saflaştırmadan sonra yaklaşık 55 kDa, 40 kDa, 25 kDa ve 15 kDa moleküler ağırlığa karşılık gelen bantlar gözlemlenmiştir. Western Blot analizi, yalnızca 43 kDa bandında gözlemlenen proteinin "His-taq" uzantılı N-Terminal bölgesini içerdiğini göstermiştir. Bu gözlenen ekstra bantların Ni- NTA'ya bağlanan spesifik olmayan proteinlere mi ait yoksa istenilen serin proteaza mı ait olduğunu anlayabilmek amacıyla western blot analizi yapılmıştır. Kullanılan antibody, C-Terminalde bulunan histidin amino asit ekli  kısma spesifiktir. Western blot analizinin sonuçlarına bakıldığında, yaklaşık 55 kDa, 40 kDa ve 25 kDa'lık moleküler ağırlığa karşılık gelen bantlar gözlenmiştir. Tüm bu bilgiler ışığında proteazın, enzimin zimojen (inaktif) formunun moleküler ağırlığının 55 kDa olduğu, ve proteazın zaman içerisinde N-terminal bölgesinden kendini parçalayarak 40 kDa molüker ağırlığa sahip olgun formuna geçtiği söylenebilir. Bu durum, literatürde çalışmalar ile kanıtlanmış olan proteazların zimojen olarak sentezlendiği ve N-terminal kısmında bulunan bir amino asit dizisinin ayrılmasıyla aktif forma geçtiği bilgisi ile tutarlıdır. Olgun forma geçtiğinde otoliz ile kendini parçalayarak inaktif forma geçtiği 25 kDa'lık moleküler ağırlığa karşılık gelen bantların enzimin parçaları olduğu söylenebilir. Proteinin aktivitesinin belirlenmesinde, floresan izotiyosiyanat (FITC) kullanılarak etiketlenmiş FTC-kazein substrat olarak kullanılmıştır. Aktivite deneyleri sonucunda, 42 °C'de enzim aktivitesinin maksimum olduğu gösterilmiştir. Ayrıca enzim aktivitesi, 1mM ve 5 mM PMSF varlığında test edilmiştir. Artan PMSF konsantrasyonunun enzimin aktivitesini inhibe etmesi onun bir serin proteaz olduğunu doğrulamıştır.
Sonuç olarak, Virgibacillus sp. AGTR suşundan elde edilen serin proteaz gen bölgesi kullanılarak, bölgeye yönelik mutagenez yöntemi sonucunda E. coli organizmasında aktif formda rekombinant serin proteaz üretilmiştir. Serin proteaz enziminin sonraki çalışmalarda kapsamlı bir şekilde karakterizasyonun yapılması hedeflenmektedir. Elde edilen bu enzim çeşitli endüstriyel uygulamalarda kullanım için bir aday olabilir.

Abstract:
Enzymes are known as biological catalysts that catalyze the biochemical reactions that occur in living cells and are usually protein-based. These catalysts lower the activation energy of specific reactions and increase the rate of reaction. Over the past decades, enzymes have been used in many different industrial products and processes because they form environmentally friendly products and are biodegradable. Enzymes are used in various fields such as detergent, food, brewing, photographic applications, leather processing, waste removal, medical applications, and new fields of application are constantly being added. However, biological catalysts must be resistant to extreme conditions to be used in industrial processes. Despite the extraordinary potential of enzymes, their instability under industrial conditions and their poor performance in the presence of high temperature, pressure, and organic solvents limit their use. Many industrial areas are looking for new enzymes with better efficiency and stability in extreme environments with high salt concentration and/or low water content. To overcome these limitations, various approaches have been implemented to improve industrial uses of enzymes, including protein engineering, nanotechnology, metabolic engineering, metagenomics, immobilization and advanced DNA technology applications. 
The protease enzyme, a subclass of hydrolases, breaks down proteins by hydrolyzing the peptide bonds in polypeptide chains. Proteins are divided into different classes according to their catalytic mechanism. Serine proteases, which cover about one-third of all proteases, contain nucleophilic Ser residues in their active site and show maximum activity around alkaline pH. Because of their important applications in many industries such as detergent, leather, pharmaceutical, cosmetics, chemistry, meat processing, cheese making, paper and pulp, silver recovery, silk degumming, bioremediation processes and wastewater treatment, proteases account for 60 % of the total enzyme market. Since the demand for protease enzymes in the industrial applications is very high, the production of novel protease enzymes and also improvement of enzymes by protein engineering approaches have recently been increasing. 
Metagenomics is a discipline used to identify microorganisms living in any environment according to their DNA sequences without being cultured and to reveal their biotechnological importance. Human, large intestine flora, sea water, hot springs, lakes, soil, mines, various food fermentation environments and many environmental resources are metagenomic pools. With the metagenomic approach, the genetic material of all microorganisms in the environment is obtained. Various extremozymes are being discovered thanks to metagenomes obtained from extremophilic microorganisms in environmental samples.
Extremozymes are enzymes derived from extremophilic microorganisms that can withstand the harsh conditions of industrial processes that have long been thought to be destructive to proteins. Each group of extremophiles has unique properties that provide enzymes with a wide variety of application possibilities. Extremozymes are very resistant to extreme conditions due to their great robustness. Halophilic enzymes obtained from halophiles, one of the extremophilic organisms, are not only stable at high salt concentrations, but can effectively react under multiple extreme conditions (high temperature, high pH, presence of surfactants). Optimized stabilization parameters will not only lead to a more efficient enzyme, but will also offer new opportunities for the development of the economy and new research lines by integrating them into existing enzymatic processes and new areas where enzymes are not used due to their instability. 
Protein engineering studies are carried out to produce biocatalysts with high activity, stability and selectivity with changes in protein sequence and structure using molecular biology techniques. Many protein engineering strategies have been developed to improve the desired properties. Rational design, directed evolution, and semi-rational design are the three main strategies most commonly used. The site-directed mutagenesis method which is a well known rational design strategy application, causes differences in the enzyme's active site, substrate binding site, and three-dimensional structure with single or multiple nucleotide mutations such as insertion, deletion and substitution in the amino acid sequence of the protein. Polymerase chain reaction (PCR)-based techniques are used for site-directed mutagenesis. First, mutagenic primers specific to the nucleotides desired to be changed on the gene are designed and the desired mutation is obtained by Polymerase Chain Reaction. 
In previous studies, Virgibacillus sp. AGTR strain obtained from Acıgöl (Burdur, Turkey) has been found to have adenine deletion mutation in the location of the 330th base of the halophilic serine protease gene. This mutation causes a stop codon to be formed before protein synthesis is complete. Since the enzyme could not be produced by the gene, protein purification could not be performed and enzymatic properties could not be examined. In this study, site-directed mutagenesis of halophilic serine protease was performed for further investigation of the enzyme, and an adenine base was inserted at position 330. In the previous studies, the gene encoding serine protease, which was isolated from the cultures of microorganisms collected from Acıgöl, was transferred to the pET-28a (+) vector and transformed into Escherichia coli C43 (DE3) competent cells. In this study, pET-28a (+) plasmid containing the serine protease gene as template DNA was used in overlap extension PCR reactions performed for site-directed mutagenesis. This PCR was performed using mutagenic primers containing the previously designed site-directed mutation. After mutation by polymerase chain reaction, PCR products were visualized under gel to see if the gene of interest was amplified properly. Concentration and purity of the PCR product amplified in appropriate sizes and pET-28a (+) were determined by Nano Drop after they were cut with EcoRI and SacI endonuclease enzymes. T4 DNA ligase enzyme was used to bind the sticky ends formed after cutting with the relevant enzymes. After the ligation step, the obtained plasmid DNA was transformed into Escherichia coli C43 (DE3) competent cells. The resulting cultures were plated on LB agar plates containing Kanamycin and incubated overnight at 37 °C. After plasmid isolation from selected colonies, plasmid DNA sizes were confirmed by agarose gel electrophoresis. Samples were sent for sequence analysis to find out if the mutation was constructed successfully. As a result of sequencing, it was observed that the adenine was placed at base 330 using the overlap extension PCR method and protein expression was initiated. Inductions were made with 0.1, 0.5, and 1 mM IPTG for 1, 2, 4, and 6 hours at 30 °C to determine optimal protein expression. Optimization of protein expression resulted in the greatest amount of protein after 6 hours of induction in the presence of 1 mM IPTG at 30 °C. However, it was observed that most of the protein remained in the pellet as inclusion bodies. Performing protein expression at 18 °C for 18 h after induction with 1 mM IPTG did not significantly affect the soluble protein yield. After the gene was successfully expressed, the protein was purified using the His-tag method. Purification was confirmed using SDS-PAGE and western blot analysis.  
Looking at the results of the SDS-PAGE analysis, bands corresponding to the molecular weight of about 55 kDa, 40 kDa, 25 kDa and 15 kDa were observed after purification. Western blot analysis was performed to understand whether these observed extra bands belong to non-specific proteins binding to Ni-NTA or to the fragments desired serine protease. The antibody used is specific for the C-Terminal His-tag. Looking at the results of the western blot analysis, bands corresponding to molecular weights of about 55 kDa, 40 kDa and 25 kDa were observed. In the light of all this information, it can be said that the molecular weight of the zymogen (inactive) form of the protease is 55 kDa, and the protease cleaves itself from the  N-terminal region which is 10 kDA and converts into its mature form which is 40 kDa. This situation is consistent with the knowledge that proteases, which have been proven by studies in the literature, are synthesized as zymogens and pass into the active form by cleaving an amino acid sequence in the N-terminal part. Based on the idea that it self-degrades by autolysis when it enters the active form, it can be said that the bands corresponding to the molecular weight of 25 kDa are the parts of the enzyme itself. FTC-casein has been labelled using fluorescent isothiocyanate (FITC) was used as the substrate to determine the activity of the protein. As a result of the activity experiments, it has been shown that the enzyme activity is maximum at 42 °C. In addition, enzyme activity was tested in the presence of 1mM and 5mM PMSF. Increasing PMSF concentration inhibited the enzyme's activity, confirming that it is a serine protease.
In conclusion, the active form of the recombinant serine protease from Virgibacillus sp. AGTR strain was produced in Escherichia coli as a result of site-directed mutagenesis method. It is aimed to comprehensively characterize the serine protease enzyme in future studies. The resulting enzyme may be a candidate to be used in various industrial applications.