Biyokontrol ajanı olarak Trichoderma mikropropagüllerinin sıvı kültür fermentasyonu ile üretim optimizasyonu
Optimization of production conditions for Trichoderma micropropagules as a biocontrol agent by using liquid fermentation
Yazar: DERYA MARAL
Danışman: PROF. DR. RENGİN ELTEM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Çalışmamızda ilk aşama olarak daha önceki çalışmalarda mikoparazitik aktiviteye sahip olduğu belirlenmiş ve moleküler tanılaması yapılmış olan altı Trichoderma izolatı ile bir ticari Trichoderma harzianum suşunun farklı inkübasyon sıcaklıklarında aydınlık ve karanlık koşullarda koloni büyümesi ve spor oluşumları incelenmiştir. Ayrıca modifiye Czapek Ortamına (MCM) eklenen 8 farklı azot ve 16 farklı karbon kaynağının, izolatların koloni büyüme hızlarına ve spor oluşumlarına etkisi değerlendirilmiştir. Daha sonra Trichoderma izolatlarının litik aktivitelerinin belirlenmesi amacıyla temel karbon kaynağı olarak % 0,5 oranında kitin içeren modifiye ?Trichoderma Sıvı Enzim Üretim Ortamı?nda iki farklı inkübasyon sıcaklığında (27 ve 30ºC) 4 ve 7 gün süreyle büyütülen izolatlarda kitinaz, ß-1,3-glukanaz ve proteaz aktiviteleri incelenmiştir. Tüm izolatlar çeşitli yönlerden (litik aktivite, büyüme sıcaklık aralığı, sporlanma dereceleri ve önceden saptanmış olan mikoparazitik aktiviteleri) değerlendirilerek biyokontrol ajanı olabilecek etkinlikteki suş olarak Trichoderma citrinoviride P7 belirlenmiştir.Çalışmamızda ikinci aşama olarak ise, Trichoderma citrinoviride P7 suşunun statik ve derin kültür fermentasyonu ile üretiminde optimizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Statik kültür fermentasyonu için öncelikle optimum besin ortamı (Tanaka's Medium), inkübasyon süresi (3 gün), parçalama süresi (180 sn), sıcaklık değeri (35ºC) ve inokülüm miktarı (106 spor/ml) belirlendikten sonra Yanıt Yüzeyi Yöntemi (RSM) kullanılarak optimum glikoz miktarı (73,5 g/l), mısır ıslatma katısı miktarı (9,59 g/l) ve pH değeri (5) belirlenmiştir. Gerçekleştirilen tüm optimizasyon çalışmaları sonucu maksimum hacimsel verimlilik değeri 3,93x109 kob L-1sa-1 olarak elde edilmiştir. Daha sonra ise çelik ve cam tepsilerde statik kültür fermentasyon yöntemi ile üretim gerçekleştirilmiştir ve maksimum hacimsel verimlilik değeri 6x106 kob L-1sa-1 olarak elde edilmiştir. Ancak bu değerin çok düşük olması sonucu bu yöntemin T. citrinoviride P7 suşunun üretimi için uygun olmadığına karar verilmiştir. Derin kültür fermentasyonu için öncelikle optimum besin ortamı (M-CSL), inkübasyon süresi (3 gün), parçalama süresi (90 sn), sıcaklık değeri (35ºC) ve inokülüm miktarı (109 spor/ml) belirlendikten sonra Yanıt Yüzeyi Yöntemi kullanılarak optimum melas miktarı, glikoz miktarı ve mısır ıslatma katısı miktarı belirlenmeye çalışılmıştır. Ancak olumlu sonuç elde edilememiştir ve klasik optimizasyon yöntemleri kullanılmaya devam edilerek optimum pH değeri (6), inokülüm şekli (miseliyal kültür) ve oranı (%5) belirlenmiştir. Erlenlerde yapılan çalışmalar sonucu maksimum hacimsel verimlilik değeri 5,11x108 kob L-1sa-1 olarak elde edilmiştir. Son olarak tüm optimum değerler kullanılarak farklı havalandırma ve karıştırma hızında biyoreaktör üretimi gerçekleştirmiştir ve T.citrinoviride P7 suşunun biyoreaktör ile üretiminde maksimum hacimsel verimlilik değeri 8,17x108 kob L-1sa-1 olarak elde edilmiştir.

Abstract:
In the present study, growth and spore formation of six Trichoderma isolates of which molecular identification was made and found to be possess microparasitic activity in previous studies and the growth of one commercial Trichoderma harzianum strain in light and dark conditions at different incubation temperatures were examined as the first step. Furthermore, effects of 8 different nitrogen and 16 different carbon sources added to the Modified Czapek?s medium (MCM) on colonial growth rate and spore formation of the isolates were also examined. Then chitinase, ß-1,3-glukanaz and protease activities were examined for the isolates grown for 4 to 7 days at two different incubation temperatures (27ºC and 30ºC) in modified ?Trichoderma Liquid Enzyme Production Medium? (TLE medium) containing 0.5% PG chitin as basic carbon source in order to determine lytic activity of the Trichoderma isolates. All isolates were evaluated for several features (e.g., lytic activity, growth temperature range, sporulation degrees and mycoparasitic activities determined previously) and Trichoderma citrinoviride P7 was determined as the strain that might be biocontrol agent and this strain was used in the studies of production optimization for liquid culture fermentation.As the second step in the current study, optimization studies were conducted for production of Trichoderma citrinoviride P7 strain through static culture fermentation. For the static culture fermentation, optimal growth medium (Tanaka?s medium), incubation time (3 days), destruction time (180 sec.), temperature value (35ºC) and amount of inoculum (106 spore/ml) were determined and then optimal glucose amount (73.5 g/L), corn steep solid amount (9.59 g/L) and pH (5) were determined using response surface methodology (RSM). Based on all optimization studies performed, volumetric productivity rate of 3.93x109 cfu L-1h-1 was obtained. Then, production was made through static culture fermentation method on steel and glass trays and maximal volumetric productivity rate of 6.0x106 cfu L-1h-1 was obtained. However, based on the fact that this value was very low, it was concluded that this method was not suitable for production of T. citrinoviride P7 strain.As the third step in the present study, optimization studies were conducted for producing T. citrinoviride P7 strain through submerged culture fermentation. For the submerged culture fermentation, optimal growth medium (M-CSL), incubation time (3 days), destruction time (90 sec.), temperature value (35ºC) and amount of inoculums (109 spore/mL) were determined and then optimal amount of molasses, glucose and corn steep solid were tried to be determined using response surface methodology (RSM). No positive response, however, was obtained and optimal pH (6), inoculum form (mycelial culture) and rate (5%) were determined by using classical optimization methods. Based on the studies performed on shake flasks, maximal volumetric productivity rate of 5.11x108 cfu L-1h-1 was obtained. Finally, reactor production was made at different aeration rates and agitation speeds using all optimal values and maximal volumetric productivity rate of 8.17x108 cfu L-1h-1 was obtained with the production of T. citrinoviride P7 strain in reactor.