Kronik myeloid lösemide Philadelphia Kromozomu ve BCR/ABL Füzyon Transkripti belirlenmesinde Real Time PCR,FISH ve sitogenetik yöntemlerin karşılaştırmalı değerlendirilmesi
Compare the diagnostic and clinical practicability of cytogenetics,FISH and qRT-PCR in Ph1 and CML cases
Yazar: FATMA EKİCİ
Danışman: PROF. DR. GÖNÜL OĞUR
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: FISH = FISH ; Floresan = Fluorescence ; Füzyon = Fusion ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Philadelphia kromozomu = Philadelphia chromosome ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sitogenetik = Cytogenetics ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
KML, olguların %95' inden fazlasında hastalık patogenezinde önemli rolü olduğu bilinen, Philadelphia kromozomu adı verilen, özellikli bir translokasyon ile karakterize, klonal bir hematopoetik kök hücre hastalığıdır. Ph1 translokasyonu sonucu ortaya çıkan bcr/abl füzyon geni Kronik Myeloid Lösemide patogenezin başlıca sorumlusudur. Ph1 translokasyonunu ya da bcr/abl transkriptini tanımlayan sitogenetik analiz, FISH ve qRT-PCR metotları, KML hastalarının tanı ve takiplerinde etkin olarak kullanılan yöntemlerdir. Klinik göstergeler ve rutin laboratuar testleri hastanın prognozu hakkında bilgi verse de, genetik değişiklikler hastanın uzun süre hayatta kalması ve tam remisyonun başarısı için dikkat edilmesi gereken en önemli göstergelerdir.Çalışmamızın amacı, ph1+ KML vakalarında, Sitogenetik, FISH ve qRT-PCR' ın tanısal ve klinik kullanışlılığını karşılaştırmaktır.Çalışmamızda 4' ü çocuk hasta olmak üzere 81 olguya ait toplam 161 materyalde eş zamanlı uygulanan sitogentik, FISH ve qRT-PCR analizi sonuçlarını karşılaştırmalı olarak değerlendirdik. Ph1/bcr-abl pozitifliği saptama oranı qRT-PCR da sitogenetik ve FISH e göre anlamlı oranda yüksek bulunmuştur (sitogenetik, 71/161 (%47,3); FISH, 76/163 (%46.6); qRT-PCR, 132/194 (%68.0). Sitogenetik analizde, remisyon dışı evrelerde (kronik faz, relaps, akselere, blastik evre ve dirençli durumda) Ph1 pozitiflik oranı yüksek bulunmuş ve %57.0-%100.0 sınırları içinde saptanmıştır. Kronik fazda bu oran %94.3 bulunmuştur. Sitogenetik analizde, klinik remisyon evresinde %16.5 oranında Ph1 pozitifliği saptanmıştır (Aritmetik ortalama %3). Sitogenetik analizde 22 hastada Ph1 dışında, ek kromozom anomalileri saptandı. Trisomi 8 ve del(6q) en sık görülen anomalilerdi. Moleküler sitogenetik (FISH) analizinde remisyon dışı evrelerde (kronik faz, relaps,akselere, blastik evre ve dirençli durumda) Ph1 pozitiflik oranı yüksek bulunmuş ve %65.0-%100.0 sınırları içinde saptanmıştır. Kronik fazda bu oran %93.4 bulunmuştur. FISH analizinde, klinik remisyon evresinde %13.4 oranında bcr/abl füzyon pozitifliği saptanmıştır (Aritmetik ortalama %2).FISH analizleri remisyon dışı hastalarda, 63 analizde klasik füzyon, 13 hastada ise atipik füzyon gösterdi. Sitogenetik ve FISH analizleri karşılaştırıldığında, her 2 yaklaşımın da Ph1 kromozomu ya da bcr/abl i tanımında aynı etkinlikte olduğu görüldü. ?Remisyon dışı? tüm evrelerde 0.0225-0.1074 sınırları içinde pozitiflik saptanmıştır. Klinik remisyona ait qRT-PCR oran sonuçları, 0,000543±0,001149 bulunmuştu. qRT-PCR sonuçları, remisyon evresinde, bcr/abl transkript tanımlamada, sitogenetik ve FISH ile karşılaştırıldığında en duyarlı metod olarak belirlenmiştir. Kronik faz ve remisyon dışı fazlarda qRT_PCR'ın sitogenetik ve FISH ile aynı etkinlikte olduğu gözlenmiştir.Sonuç olarak KML hastalarının denetiminde ?kronik faz, relaps, akselere faz, blastik faz, ve dirençli durumlarda? sitogenetik, FISH ve qRT-PCR aynı etkinlikte olmakla birlikte, her 3 ünün de farklı avantajları olduğundan, her üç yöntem birlikte uygulanmalıdır. Böylece atipik seyirli ve yüksek riskli olguları önceden belirlemek (sitogenetik ve FISH) olanaklı olacaktır. Ayrıca qRT-PCR' ın bu kırık noktalarını o hasta için tanıyıp tanımadığını bilmek temelinde qRT-PCR eşliği de önemlidir. ?Remisyon fazında? ve ?major moleküler yanıt? değerlendirmesinde ise qRT-PCR yeterli görülmektedir. Elde edilen aritmetik ortalamalar, qRT-PCR monitorizasyonunun laboratuarımızda uygulanan şekli ile hasta denetiminde etkin olduğunu düşündürmektedir.Anahtar Kekimeler: Kronik Myelositer Lösemi, Philadelphia Kromozomu, Floresan In Situ Hibridizasyon, Kuantitatif Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu, Tanı ve Takip.

Abstract:
CML, is a clonal, hematopoietic stem cell disease, stemmed from a chromosome called Philadelphia which characterized by a specialized translocation and known to have a prominent role in the pathogenesis in the 95% of the cases. Ber/abl fusion gene which originates from the Ph1 translocation is the leading factor in the pathogenesis in the Chronic Myeloid Leukemia. The sitogenetical analysis which defines Ph1 translocation or ber/abl transcript called FISH and qRT-PCR method, are the effective procedures that are used in the diagnosis and follow-up of the patients with CML. Altough the clinical parameters and routine laboratory tests give important factors about the prognosis of the disease, the most important signs for the survival of the patients and the success for the full remission are the genetic changes.Our aim in this study is to compare the diagnostic and clinical practicability of sitogenetics, FISH and qRT-PCR in Ph1 and CML cases.In our study, we comparatively assessed the results of sitoogenetic, FISH and qRT-PCR analysis in 161 materials, composed of 81 cases which 4 of them were children. The ratio of positivity in the Ph1-ber/abl were significantly higher in a qRT-PCR compared to sitogenetics and FISH [sitogenetic; 71/161 (47.3%), FISH; 76/163 (46.6%), qRT-PCR; 132/194 (68.0%)]. In sitogenetical analysis, in non-remission phases (chronic phase, relapse, acceleration phase, blastic phase and resistant state) the Ph1 positivity rate is found higher between the borders of 57.0% and 100.0%. In chronic phase this ratio is found 94.3%. In sitogenetical analysis, at the phase of clinic remission the rate of Ph1 positivity is found 16.5% (arithmetic mean 3%). In sitogenetical analysis, in 22 patients, apart from Ph1, extra chromosome anomalies has been found. Trisomy 8 and del(6q) were the most common anomalies. In molecular sitogenetic analysis (FISH), in non-remission phases (chronic phase, relapse, acceleration phase, blastic phase and resistant state) the ratio of Ph1 positivity is found higher between ratios of 65.0% and 100.0%. In chronic phase, this ratio is found 93.4%. In FISH analysis, at the phase of clinical remission, the ber/abl fusion positivity is found in the ratio of 13.4% (arithmetic mean 2%). FISH analysis, in non-remission patients, showed classic fusion in 63 and atypical fusion in 13 of the patients. When sitogenetic and FISH analysis are compared, it?s been seen that both are in equal effectivity in defining the Ph1 chromosome or ber/abl. In all phases except ?non-remission?, the positivity has been found in the borders of 0.0225-0.1074. The qRT-PCR results has been found the most sensitive method when compared to sitogenetics or FISH in defining bcr/abl transcript at the remission phase. In chronic phase and non-remission phases, it?s been seen that qRT-PCR has the equal effectivity with sitogenetics and FISH.As a result, when assessing patients with CML, however, sitogenetics, FISH and qRT-PCR has the equal effectivity at the times of ?chronic phase, relaps, acceleration phase, blastic phase and resistant state?, all three of them should be used together since every one of them has different advantages. By this strategy, it will be possible to detect the atypical and high risk types beforehand (sitogenetic and FISH). In addition, the application of qRT-PCR is important on the basis that if it can define the broken point in that patient or not. But in ?remission phase? and ?major molecular response? assessment, qRT-PCR is sufficient. The arithmetic means which has been obtained, has shown that qRT-PCR monitorization, like the way performed as in our laboratory, is effective in patient research.Key Words: Chronic Myeloid Leukemia, Philadelphia Chromosome, Flourescence In Sıtu Hybridization, Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, Diagnosis and Follow-Up.