Biyolojiklerde ve biyoteknolojik ürünlerde alternatif test yaklaşımı olarak in vitro pirojenite test uygulaması ve değerlendirilmesi
In vitro pyrogenicity test applications and evaluations as one of the alternative test approaches on biologics and biotechnological products
Yazar: MELTEM DOĞAN
Danışman: PROF. DR. GONCA ÇAKMAK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Farmasötik Toksikoloji = Pharmaceutical Toxicology
Dizin: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyolojik analiz = Microbiological analysis ; Mikrobiyolojik değişimler = Microbiological changes ; Mikrobiyolojik yöntem = Microbiological method ; Pirojenite testleri = Pyrogenicity test ; Testler = Tests ; Teşhis testleri = Diagnostic tests ; İnsan kökenli biyolojik maddeler = Biological materials of human origin

Özet:
Vücuda alınması ile bağışıklık sistemini uyararak ateş yükselmesine sebep olan pirojenler; bakteriler (gram negatif ve gram pozitif), hücre, virüs, mantar, plastik, adjuvan, küf, hücre, protein, doku, gen kaynaklı tedavi ürünleri, hava ve üretim kaynaklı olabilmektedir. Aşı, antiserum, kan ürünleri gibi biyolojik ürünler kullanıma girmeden önce pirojenite testinden geçmek zorundadır. Son gelişmelerle, vücut içi kullanılan tıbbi cihazlarda da pirojenite testleri zorunlu hale gelmiştir. Günümüze kadar in vivo tavşan pirojenite testi (RPT), bütün regülasyon otoriteleri tarafından pirojen tayininde geçerli yöntem olarak kullanılmış hala da kullanılmaktadır. Ancak, bu yöntem endotoksin kaynaklı pirojenleri RPT belirleyememektedir. Ayrıca, deney hayvanları ile ilgili 3R kuralı olan yerine koyma (Replacement), azaltma (Reduction) ve iyileştirme (Refinement) ile şekillenen test yaklaşımlarının kullanımı regülasyon otoriteleri için öncelikli olmuştur. Pirojen tayininde Monosit Aktivasyon Testi (MAT), deney hayvansız bir alternatif yöntem olarak valide edilmiştir. Test, Avrupa İlaç Otoritesi (EMA) ve Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Otoritesi (FDA) rehberlerine ve farmakopelere girmiştir. Hollanda, Almanya, İngiltere, İtalya, İsviçre gibi Avrupa Ülkelerinin bazılarında ve ABD, Rusya, Çin, Hindistan, Brezilya'da da kullanımı kabul edilmektedir. MAT ülkemizde izlenen kılavuz ve farmakopelerde de yer almaktadır. Ancak, Avrupa regülasyonlarını izleyen ülkemiz sağlık otoriteleri, biyolojik ürünlerde pirojen tayini için in vivo testleri kullanmaya devam etmektedir. Çalışmamıza, endotoksin kaynaklı pirojenleri de belirleyebilen MAT'ı, apirojen olarak piyasada bulunan biyolojik ürünleri temsil eden aşı, antiserum, biyobenzer örnek ve bir tıbbi cihaz olan vajinal ovül için ülkemizde ilk kez uygulanmıştır. Sonuçlarımıza göre, çalışılan piyasadaki ürünlerin MAT ile apirojen olduğu onaylanmıştır. Ancak apirojen olduğu bilgisi ile kullanımda olan vajinal ovülde endotoksin kaynaklı pirojen varlığı MAT ile saptanmıştır. Pirojen tayininde in vivo olarak kullanılan RPT'nin deney hayvanı kullanımına bağlı maliyeti (deney hayvanı gerekliliği, beslenme, barınma, sağlık kontrolleri, veteriner hekim zorunluluğu vb.), test hata payının yüksek olması, test tekrarlarında yeniden hayvan kullanımı gerekliliği, test için ayrılan zaman ve emeğin yoğun olması ve endotoksin kaynaklı pirojenleri belirleyememesi gibi durumlar söz konusudur. Araştırmamız, güncel bir başlıkta ilk kullanım özelliği taşımaktadır. Etkili ve seçici olduğu gösterilen MAT'nin, ülkemizde de kullanımına başlanması önerilmektedir. Araştırıcıların, MAT'yi ülkemizde de yerli olarak üretmek ile ilgili de hedefleri bulunmaktadır.

Abstract:
Pyrogens that induce fever by stimulating the immune system when taken into the body can be caused by bacteria (gram negative and gram positive), cell, virus, fungus, plastic, adjuvant, mold, cell, protein, tissue, gene-based treatment products, air and production. Biological products such as vaccines, antiserum and blood products must pass the pyrogenicity test before they can be used. With recent developments, pyrogenicity tests have become mandatory for medical devices used inside the body. To date, the in vivo rabbit pyrogenicity test (RPT) has been used by all regulatory authorities as the valid method for pyrogen determination and is still in use. However, the RPT method cannot detect endotoxin-derived pyrogens. In addition, the use of test approaches shaped by the 3R rule of replacement, reduction and refinement, which is the 3R rule for experimental animals, has been a priority for regulatory authorities. The Monocyte Activation Assay (MAT) for pyrogen determination has been validated as an alternative method without experimental animals. The test has entered European Medicines Authority (EMA) and United States Food and Drug Authority (FDA) guidelines and pharmacopoeias. Its use is accepted in some European Countries such as the Netherlands, Germany, England, Italy, Switzerland, and in the USA, Russia, China, India, Brazil. MAT is also included in the guidelines and pharmacopeias followed in our country. However, our country's health authorities that follow European regulations continue to use in vivo tests for pyrogen determination in biological products. In our study, MAT, which can also detect endotoxin-derived pyrogens, has been applied for the first time in our country for a vaccine, antiserum, a biosimilar sample and a medical device such as a vaginal insert, all of the mentioned representing nonpyrogenic biological products available in the market. According to our results, the products in the studied market were confirmed to be nonpyrogenic by MAT. However, MAT detected the presence of endotoxin-induced pyrogen in the vaginal insert known and used as being nonpyrogenic. The cost of RPT, used in vivo in pyrogen determination, related to the use of experimental animals (the need of an experimental animal, its nutrition, shelter and health controls, veterinary obligation etc.), high margin of test error, necessity of re-using animals in test repetitions, time and effort intensiveness allocated for the test and the failure to detect endotoxin-induced pyrogens are in question. Our research has the feature of being the first use in the current field. It is recommended that MAT, which has been shown to be effective and selective, should be used in our country as well. Researchers also have goals to produce MAT as a local product in in our country.