Fenoksazin ve fenotiyazin yapılı ligandların insan bütirilkolinesterazına bağlanma noktalarının bölge yönelimli mutagenez yöntemi ile araştırılması.
Investigation of binding sites of phenoxazine and phenothiazine structured ligands on human butyrylcholinesterase by site-directed mutagenesis.
Yazar: ZEYNEP SEZGİN
Danışman: DOÇ. DR. ÖZDEN TACAL
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Butirilkolinesteraz = Butyrylcholinesterase ; Kolinesterazlar = Cholinesterases ; Metilen mavisi = Methylene blue ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Mutagenez = Mutagenesis ; İlaç maddeleri = Drug substances ; İlaçlar = Drugs

Özet:
Katyonik fenoksazin/fenotiyazin yapılı bileşiklerin [metilen mavisi (MetB), meldola mavisi (MB), nil mavisi (NB)] insan bütirilkolinesterazı (BChE) üzerindeki bağlantı noktalarını belirlemek ve inhibisyon mekanizmalarını detaylandırmak amacıyla; bölge yönelimli mutagenez yöntemi kullanılarak, moleküler docking sonuçlarına göre insan BChE'nın aktif merkez oyuğunda mutasyonlar yapıldı. MetB, MB ve NB'nin nativ ve rekombinant BChE'lar (doğal tip, Y332A, T120F, Y440A, W231A, A328Y) üzerindeki inhibitör etkileri, spektrofotometrik olarak 25 oC'de 100 mM 3-(N-morfolino)propansülfonik asit (MOPS) pH 8.0 ortamında, 0.125 mM 5,5'-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit), 0.025-0.4 mM bütiriltiyokolin (BTC) ve 0-30 µM ligand kullanılarak araştırıldı. Yapılan kinetik değerlendirmeler sonucunda; MetB ve MB'nin, Y332A mutantı dışında tüm rekombinant BChE'ların ve nativ BChE'ın nonlineer inhibisyonuna neden olarak çoklu bağlanma modeli ile uyumlu sonuçlar verdiği bulundu. MetB ve MB, Y332A mutantında ise, tek bölgeye bağlanma ile uyumlu; lineer karışık inhibisyona neden oldu. Ki değerleri açısından nativ BChE (Ki=0.042 ? M) ile karşılaştırıldığında; MetB'nin Y332A ve T120F mutantları üzerinde, sırasıyla; 40 ve 350 kat daha zayıf inhibitörü olarak etki ettiği gözlendi. NB ise, nativ ve tüm rekombinant BChE'ların nonlineer inhibisyonuna neden oldu. NB'nin Y332A mutantı üzerindeki inhibitör etkisi, nativ BChE (Ki=0.004 ? M) ile karşılaştırıldığında 540 kat daha zayıftı. Bulgular birlikte değerlendirildiğinde; fenoksazin/fenotiyazin yapılı ligandların insan BChE'ına bağlanmasında 332. ve 120. pozisyonda bulunan tirozin ve treonin amino asitlerinin önemli olduğu sonucuna varıldı.

Abstract:
To determine binding points of cationic phenoxazine/phenothiazine structured ligands [methylene blue (MetB), meldola blue (MB), nile blue (NB)] on human butyrylcholinesterase and to elaborate inhibition mechanisms of enzyme, depending upon molecular docking results, the mutations were created at active site gorge of human butyrylcholinesterase by site-directed mutagenesis. The inhibitory effects of MetB, MB and NB on native and recombinant BChEs (wild type, Y332A, T120F, Y440A, W231A, A328Y) were spectrophotometrically studied at 25 oC, in 100 mM 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) buffer pH 8.0, using 0.125 mM 5,5?-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), 0.025-0.4 mM butyrylthiocholine and 0-30 µM ligand. Kinetic analyses yielded the following information: MetB and MB were found to cause nonlinear inhibition of native and all recombinant BChEs except Y332A and yield results pointing to multi-site binding model. MetB and MB caused linear mixed inhibition of Y332A mutant, compatible with a single binding mode. Comparing the inhibitory effects in aspect of Ki values with native BChE (Ki=0.042 ? M), MetB was found to be 40- and 350-fold less effective as an inhibitor of Y332A and T120F, respectively. NB caused nonlinear inhibition of native and all recombinant BChEs. The inhibitory effect of NB on Y332A mutant was 540-fold lower, compared to native BChE (Ki=0.004 ? M). Considering these results together, it was concluded that tyrosine and threonine at position 332 and 120 are critical amino acids in binding of phenoxazine/phenothiazine structured ligands to BChE.