Mikrobiyal kökenli proteaz üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
The production, prufication and characterization of microbial orginated protease
Yazar: MESUT TOLAN
Danışman: DOÇ. DR. BİLGE HİLAL ÇADIRCI
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada proteaz üreticisi mikroorganizmalar topraktan izole edilmiş ve kalitatif olarak en yüksek proteolitik aktivite gösterdiği belirlenen suş, 16S rRNA dizi analizi ile Bacillus sp. olarak tanılanmış ve Bacillus sp. MT01 olarak adlandırılmıştır.  Ekstraselüler olarak üretilen proteaz enzimi gradient (NH4)2SO4 çöktürmesi yöntemiyle %42.72 verimde 1,12 kat kısmi olarak saflaştırılmıştır. Sonrasında Sephacryl S-200 jel filtrasyon kromotografisi ve daha sonra DEAE Sepharose iyon değişim kromotografisi ile % 0.27 verimde 0,26 kat saflaştırılmıştır. Enziminin molekül kütlesi SDS-PAGE ile 32 kDa olarak tespit edilmiştir. Enziminin optimum reaksiyon sıcaklığı ve pH'sı sırasıyla 50 oC ve pH 7.5 olarak bulunmuştur. Proteaz enzimi 30oC'de 36 saat boyunca aktivitesinin %53'ünü koruduğu görülmlüştür. Enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde, Fe+2, Na+1, Ca+2, Mn+2, Zn+2, Co+2 ve Mg+2 iyonlarının aktivatör etki gösterdiği, Cu+2 metal iyonunun ise inhibitör etki gösterdiği görülmüştür. Enzim aktivitesi üzerine organik çözücüler ve yüzey aktif maddelerin etkisi incelenmiş, Aseton, 2-Propanol ve Etil alkol varlığında sırasıyla aktivitede %46.6, 25.8 ve 17.8 oranında, DMSO, Toluen ve Benzen varlığında ise çok az aktivite kaybı gözlemlenmiştir. Artan H2O2 konsantrasyonu, proteolitik aktiviteyi artırırken, %1'lik Tween-80 ve Triton X-100 konsantrasyonu aktivite kaybına neden olmuştur. Enzim, kazein, BSA ve fibrinojen substratları arasından en yüksek aktiviteyi kazein substratı üzerinde göstermiştir. Enzim aktivitesi EDTA ile tamamen inhibe olurken, serin proteaz inhibitörü 5 mM PMSF ile %86,64 oranında inhibe olmuştur. Bu inhibisyon sonuçları enzimin metallo proteaz olduğunu düşündürmüştür. Enzimin Km ve Vm kinetik sabitleri ise sırasıyla 0.574 mg/ml ve 338.1234 µmol/ml dk şeklinde bulunmuştur.

Abstract:
In this study, protease producing microorganisms were isolated from soil and the strain which has the highest proteolytic activity by kalitative screening methods was identified as Bacillus sp. by 16S rRNA sequence analysis and called Bacillus sp. MT01. Extracellular protease was partially purified 1,12 fold by gradient (NH4)2SO4 precipitation method with 42.72 %  efficiency. Protease was purified chromatographically 0,26 fold by Sephacryl S-200 gel filtration and then DEAE Sepharose ion exchange chromatography with a yield of 0.27%. The molecular mass of the enzyme was determined as 32 kDa by SDS-PAGE. Optimum reaction temperature and pH of the enzyme was found to be 50 ° C and pH 7.5, respectively. Protease enzyme showed its 53% of activity for 36 hours at 30 ° C. When the effect of metal ions on enzyme activity is analyzed, Fe + 2, N + 1, C +2, Mn +2, Zn +2, Co +2 and Mg +2 ions were detected as activators, and Cu+2 metal ions was observed as inhibitors. Effects of organic solvents and surfactants on enzyme activity were examined. In the presence of acetone, 2-propanol and ethanol, enzyme loses it activity by 46.6%, 25.8 % and 17.8 %, respectively. But, it is observed that precence of DMSO, toluene and benzene have very small activity lost. While the higher concentrations of H2O2 increased the activity Tween-80 and Triton X-100 has caused the loss of activity. Through the substrates like casein, BSA and fibrinogen, protease showed the highest activity against casein. While EDTA completely inhibits enzyme activity, the serine protease inhibitor PMSF inhibited the 86,64% of the activity. The results of this inhibition suggests that the Bacillus sp. MT01 protease is a metallo protease. The kinetic constants of the enzyme Km and Vm is measured as 0.574 mg/ml, 338.1234 µmol/ml.min, respectively.