Deneysel interstisyel sistit modelinde intravezikal hyaluronik asit uygulamasının inflamatuar hücreler üzerine etkisinin değerlendirilmesi
The evaluation of intravesicale hyaluronic acid application effect at the inflammatory cells in the experimental model of interstitial cystitis
Yazar: İLKER FATİH ŞAHİNER
Danışman: PROF. DR. AHMET DANIŞMAN
Akdeniz Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Üroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Üroloji = Urology
Dizin: Glikozaminoglikanlar = Glycosaminoglycans ; Hyalüronik asit = Hyaluronic acid ; Hücreler = Cells ; Mesane = Urinary bladder ; Sistit = Cystitis ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Ağrılı Mesane Sendromu (AMS) / Interstisyel Sistit (IC) üroloji dünyasında büyük önemini sürdürmektedir. Tanımı, terimlendirilmesi hatta epidemiyolojisi henüz kesinlik kazanmamış olup, doğal seyri hala takip edilmektedir.
Steril bir mesane hastalığı olan IC daha çok genç ve orta yaş kadınlarda görülen ve bu bulgulara neden olabilecek diğer patolojilerin dışlanması ile ortaya konulan bir hastalıktır. IC 6 aydan uzun süren idrara sık çıkma ve irritatif semptomlar, suprapubik/pelvik ağrı gibi klinik semptomları olan steril bir mesane hastalığıdır.
IC etiyoloji kesin olarak bilinmemekle birlikte, teoriler arasında enfeksiyon, otoimmunite, genetik, idrarda toksik maddelerin varlığı, sigara, kötü diyet ve psikiyatrik sebepler belirtilmiştir.
Her ne kadar IC başlı başına bir mesane problemi olarak görülse de, ek hastalıkların yaygınlığını araştıran modern çalışmalar IC'nin "kronik pelvik ağrısı" denilen ve mesane rahatsızlığı belirtilerinden daha geniş sistemik visseral problemlerle ortaya çıkan bir tablo olduğunu ortaya koymuştur.
Sıklıkla beraberinde bulunabilen hastalıklar inflamatuar barsak hastalığı, endometriozis, fibromyalji, panik bozukluklar jinekolojik hastalıklar, crohn hastalığı sıralanabilir.
Sebebi kesin bilinememekle birlikte, mesane semptomları transizyonel epitel hücre duvarında lokalize olan bariyerin impermeabilite eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Normalde mesane ürotelyumu memeli membranlar içinde en az geçirgenliğe sahiptir. IC durumunda ürotelyum şemsiye hücrelerinin kısmi kaybından kaynaklı disfonksiyonel bir hal almakta ve düz kaslarda multipl değişikliklerin diferansiyasyonundan ve bariyer kaynaklı proteinlerdeki bozukluklardan ortaya çıkabilmektedir.
Birçok teori ortaya atılmasına karşın IC patogenezindeki merkezi rolün inflamasyon olduğu elektron mikroskobu kullanılan hayvan ve insan çalışmalarında teyit edilmiştir. Etiyoloji ne olursa olsun eğer zararlı uyaran kronik olarak devam ediyorsa inflamasyona neden olur. Sonuç olarak bu kısır döngü mesane epitelyumunda ve glikozaminoglikan (GAG) tabakasında yaralanma ile sonuçlanır. 
Normal mesane epitelyumu kondroitin sülfat, hyaluronik asit, müsin gibi glikozaminoglikan tabakası ile kaplıdır. IC sonucunda ise üroepitelyumun bu musinöz ve GAG tabakasında artmış permabilite artışı ve K gibi üriner katyonlara karşı değişken geçirgenlik söz konusu olur. Hasar ayrıca ürotelyumda aşırı sitokin üretimi ve mast hücre aktivasyonu ile sonuçlanır. K iyonu permabilitesindeki değişkenlik ise bu aktivasyonu tetikler. Üroepitelyumdaki artan sitokinler, nörotransmitterler, antiproliferatif faktör (AFP) ve mast hücreleri ise IC'li hastalarda hiperaljezi ile sonuçlanır. AFP normal ürotelyal epitelde permabilite artışına neden olurken, aynı zamanda sitokinlerin salınımını ise arttırır. Enflamasyon sonucunda submukoza tabakasında ve daha az oranda olmak üzere detrusör tabakasında lenfosit, plazma hücreleri ve mast hücre sayısı artışı izlenir. Daha az olarak nötrofil eozonofil lenfositler ve histiyositler izlenir.
 Klasik olarak IC'li hastanın mesane mukazasında Hunner's ülseri görülür. İmmunohistokimyasal tekniklerle yapılan incelemelerde klasik ülseratif IC vakalarında inflamatuar hücre infiltrasyonu 6-10 kat artarken, klasik olmayan non-ülseratif IC vakalarında yaklaşık 2 kat artış gösterir.
IC'de birkaç tedavi etkili olmakla birlikte, bunlar arasında en etkili olanı GAG'ın intravezikal olarak hasta mesanelerindeki eksik GAG tabakasına eklenmesidir. Hyaluronik asitin intravesikal uygulanması mesane yüzeyini korumak için düşünülmektedir ve klinik çalışmalarda yararlı olduğu gösterilmiştir. Yapılan bir klinik çalışmada 4 haftalık intravesikal hyaluronik asit tedavisi sonucu faydalanım %56, yedi haftalık tedavi sonrasında ise faydalanım %71 olarak hesaplanmıştır. Akut asit hasarlı fare ve sıçan mesanelerini kullanan çalışmalar intravesikal hyaluronik asit tedavisinin IL-6 seviyesini azaltmasının yanı sıra inflamasyonu ve işeme sıklığını da azalttığı yönündedir. IL-6 seviyesi ise inflamasyonun şiddeti ve işeme sıklığı ile doğru orantılıdır.
Çalışmamızda inflamasyonun ve inflamatuar hücrelerin gösterilmesi için rabbit poliklonal antikorlar ve miyeloperoksidaz aktivitesi kullanıldı. T lenfosit infiltrasyonunu göstermek için CD3, monosit infiltrasyonunu göstermek için CD14, B lenfosit infiltrasyonunu göstermek için CD19, natural killer infiltasyonunu göstermek için CD56 nötrofil yanıtını değerlendirmek için miyeloperoksidaz aktivitesi ve inflamasyon yanıtını değerlendirmek için IL-6 poliklonal antikorlarına bakıldı.
Çalışmanın sonucunda kimyasal sistit sonrasında hyaluronik asit ile intravezikal tek doz tedavi edilen grupta miyeloperoksidaz aktivitesinin kontrol grubuna yaklaştığı saptandı. Rabbit poliklonal antikorlarla bakılan ve semi-kantitatif değerlendirme ile hesaplanan inflamasyon ve inflamatuar diğer hücrelerin seviyelerinin (B lenfosit, T lenfosit, Natural Killer, Monosit) tedavi grubunda çalışma sonrasında kontrol grubundaki seviyelere yaklaştığı saptandı.
Bu çalışma sonucunda intravezikal hyalüronik asit tedavisi ile inflamatuar hücreler olan nötrofil (miyeloperoksidaz aktiviesi), monosit (CD14), natural killer (CD56), T lenfosit (CD3) ve B lenfosit (CD19) hücrelerinin baskılandığı, mesane mukozal bütünlüğünün korunduğu ve böylece histopatolojik düzelme saptandığı görülmüştür.

Anahtar kelimeler: İnterstisyel sistit, GAG, hyaluronik asit, inflamasyon.

Abstract:
The great importance of painful bladder syndrome/interstitial cystitis is continuing in the urology. Definition, nomenclature even the epidemiology has not obtained certainly, the natural progress has been still following up.
Interstitial cystitis (IC) complex is a syndrome characterized by a variety of symptoms lasting longer than 6 months-lower abdominal pain, compression and irritative symptoms. IC is a disease often seen in young and middle-aged women and revealed by exclusion of other pathologies without basing on any reason. It is thought that autoimmunity, subclinical and/or chronic infection, smoking poor diet and etc. may cause the genetic etiology of IC of which the exact cause is still unknown. Much as IC is mainly considered as a bladder problem, modern studies investigating the prevalence of comorbid diseases have revealed the fact that IC can be found along with systemic visceral problems called as "chronic pelvic pain" which have broader symptoms than bladder disease. Inflammatory bowel diseases, endometriosis, fibromyalgia, panic disorders, gynecological diseases, Crohn's disease and etc. are the diseases usually accompanied with it.
Nevertheless, although the cause is still not known precisely, bladder symptoms stem from the lack of impermeability of the barrier is localized in the cell wall of transitional epithelium. Normally, the bladder urothelium has the least permeability in mammalian membranes, however in case of IC, it becomes dysfunctional due to the partial loss of the urothelium umbrella cells and as we mentioned earlier this case may occur because of the differentiation of multiple changes in the smooth muscles and the protein disorders due to barrier. Although many theories have been put forward, it has been confirmed in animal and human studies in which electron microscope is utilized that inflammation has the central role in the pathogenesis of IC. Whatever the etiology is, persisting noxious stimulus causes chronic inflammation. As a result, this vicious cycle results with injury in bladder epithelium and the glycosaminoglycan (GAG) layer. Normal bladder epithelium is covered by a glycosaminoglycan layer such as chondroitin sulfate, hyaluronic acid and mucin. As a result of IC, increased permeability in this mucinous and GAG layer and variable permeability against urinary cations such as K take place. Damage can also result in excessive production of cytokines in urothelium and mast cell activation. Variability in the K ion permeability triggers the activation. The cytokines, neurotransmitters, antiproliferative factor (AFP) and mast cells increasing in the urothelium result in hyperalgesia in the IC patients. AFP may cause increase in permeability in normal urothelial epithelium and increases the release of cytokines at the same time. An increase in number of mast cells both in the submucosal layer and the detrusor layer in observed as a result of inflammation. Hunner's ulcer is seen classically in the bladder mucosa of the patient. Mast cells have increased by 6 to 10 times in examinations performed with immunohistochemical techniques in classic cases of ulcerative IC while increase of mast cells in the non-classical ulcerative IC cases is approximately by 2 times.
Although several treatments are effective in the treatment of IC the most effective one among them is the replacement of GAG with deficient GAG layer in the bladder of patients. Applying hyaluronic acid intravesically is thought to protect the bladder surface and has proved to be useful in clinical studies. In a clinical study benefit obtained from a 4-week intravesical hyaluronic acid therapy was calculated as 56% and as 71% after a 7-week treatment. Studies using acute acid damaged mouse and rat bladders have revealed that intravesical hyaluronic acid treatment reduces the IL-6 level as well as reducing the inflammation and frequency of urination. And IL-6 level is directly proportional to the severity of inflammation and frequency of urination.
In our study we used rabbit polyclonal antibodies and myeloperoxidase activity to indicate inflammation and inflammatory cells. We investigated CD3 to indicate T cell Lymphocytes infiltration, CD14 to indicate the monocyte infiltration, CD19 to indicate the B cell lymphocytes infiltration, CD56 to indicate the natural killer infiltration, myeloperoxidase activity to evaluate the response of the neutrophils, IL-6 to evaluate the response of inflammation.
At the and of the study, it was seen that the activity at MPO in the group which was treated with single dose intravesical hyaluronic acid was close to that in the control group. Also it was found that the levels of inflammation and inflamatuar cells (B cell Lymphocytes, T cell lymphocytes, Naturel killer, Monocytes) in the therapy group determined by usin rabbit polyclonal antibodies and were evaluated with semi-quantitative methods were close to that in the control group.
The result of this study with the intravesical hyaluronic aside treatment inflammatuar cells neutrophils (myeloperoxidase activity), monocytes (CD14), Naturel killers (CD56), B cell Lymphocytes (CD19), and T cell lymphocytes (CD3) are suppressed, bladder mucosal integrity is protected, thus histopathologic improvement is detected.

Key words: Interstitial cystitis, GAG, hyaluronic acid, inflammation.