Toksikolojide in vitro hücre temelli sitotoksisite çalışmaları
In vitro cell-based cytotoxicity studies in toxicology
Yazar: MERVE NENNİ
Danışman: PROF. DR. HANDE GÜRER ORHAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Amentoflavon = Amentoflavon ; Apigenin = Apigenin ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Toksikoloji = Toxicology ; Toksinler = Toxins ; Toksisite = Toxicity ; Toksisite testleri = Toxicity tests ; İn vitro = In vitro

Özet:
Yeni ilaç keşif ve geliştirme çalışmalarında en büyük zaman, maliyet ve emek kaybına neden olan durumlardan birinin çalışmaların geç evrelerinde aday bileşiklerin toksisiteye sahip olduğunun görülmesi ve o aşamaya kadar yapılan tüm çalışmaların bir kenara atılması olduğu ifade edilmektedir. Bu nedenle ilaç endüstrisi ve yasal düzenleyici kuruluşlar, ilaç keşif ve geliştirme çalışmalarının erken evrelerinde uygulanacak in vitro hızlı tarama testleri ile maddelerin sitotoksisitelerinin araştırılmasının bu kayıpları kısmen de olsa önleyeceğini ifade etmektedir. Bu bilgi ve öneriden hareketle bu tez proje çalışmasında bitkisel diyet destek ürünleri içerisinde yer alan bir flavonoid (apigenin) ve bir biflavonoid (amentoflavon) yapısında iki bileşiğin sağlıklı bir hücre hattı olan Çin Hamster Over (CHO) hücrelerinde olası sitotoksik etkileri 3 farklı yöntem ile araştırılmıştır. Bunlar; ölü hücrelerin boyanması ve mikroskop altında sayımı esasına dayanan "Tripan Mavisi Deneyi", hücrenin metabolik aktivitesinin göstergesi olan "MTT Deneyi" ve membran hasarı/bütünlüğünün göstergesi olarak Laktat Dehidrojenaz enzimi (LDH) Sızma Testi'dir. Öncelikle yöntemlerin bilinen sitotoksik bir referans madde varlığında kısmi validasyonları gerçekleştirilmiş, ardından maddelerin her üç yöntemle sitotoksik potansiyelleri araştırılmıştır. Bu maddelerden amentoflavonun son yıllarda bazı yararlı biyolojik etkileri olabileceği yönünde çalışmalar yapılmakta ancak literatürde toksisite potansiyeli konusunda veri bulunmamaktadır. Dolayısı ile bu çalışmada amacımız amentoflavonun olası sitotoksik etkisini ortaya koymak ve üç farklı mekanizma üzerinden etkinin belirlendiği bu testlerle olası sitotoksik etkisinin mekanizmasını aydınlatmaktır. 
Bulgularımız her üç yöntem içinde tripan mavisi deneyinin en yüksek standart sapma değerlerine sahip olduğunu ve MTT deney bulgularının daha hassas sonuç verdiğini göstermiştir. Amentoflavonun tripan mavisi, LDH ve MTT deneylerinde aynı konsantrasyonda sitotoksisite göstermesi bu maddenin 100 µM konsantrasyonda hücre membran hasarı ile hücre ölümüne yol açtığını düşündürmektedir. Apigeninin membran hasarına bağlı hücre canlılığının belirlenmesinde kullanılan tripan mavisi ve LDH deneylerinde korelasyon görülmemiştir ancak MTT deneyinde sitotoksik konsantrasyonu 33.3 µM olarak bulunmuştur. Bu nedenle apigeninin sitotoksik etkisinin mitokondriyal hasarla gerçekleştiği düşünülmektedir. Ayrıca bu bilgiden hareketle MTT deneyinin sitotoksisitenin belirlenmesinde mitokondriyal enzim aktivitesini esas aldığı için hücre hasarının erken aşamada belirlenmesinde yararlanılacak bir yöntem olduğu ortaya konmuştur.

Abstract:
During the drug discovery and development studies, one of the conditions leading to great time, cost and labor loss is to figure out  that the toxicity of the candidate compound in the later stages of the process, and that all work done so far has been taken off the edge. For this reason, the pharmaceutical industry and regulatory agencies express that in vitro rapid screening tests to be conducted in the early stages of drug discovery and development studies and the investigation of the cytotoxicity of substances will prevent, in part, these losses. Based on this information and suggestion, in this thesis project, probable cytotoxic effects of two flavonoids (apigenin) and biflavonoid (amentoflavon) were investigated by 3 different methods in Chinese hamster over (CHO) cells which are healthy cell lines. These; "Trypan Blue Experiment" based on the staining of dead cells and counting under the microscope, "MTT Experiment", which is indicative of the metabolic activity of the cell, and Lactate Dehydrogenase Enzyme (LDH) Extraction Test, as a measure of membrane damage / integrity. Firstly, partial validations of the methods were carried out in the presence of a known cytotoxic reference substance. Then the cytotoxic potentials of the materials were investigated by all three methods. One of these substances; amentoflavone, has been studied in recent years to have some beneficial biological effects, but there is no data on the toxicity potential of the substance.
 Therefore, our aim in this study is to elucidate possible cytotoxic effects of amentoflavone and to elucidate the mechanism of the possible cytotoxic effect of amentoflavone with these tests, which are determined by three different mechanisms.
Our findings show that the trypan blue assay has high standard deviations and the MTT test results are more accurate in all three methods. Amentoflavone' s cytotoxicity was found the same in trypan blue, LDH and MTT assays and we suggests that this substance causes cell death by cell membrane damage at 100 μM concentration. No correlation was observed in the trypan blue and LDH assays used to determine cell viability due to membrane damage of apigenin, but the cytotoxic concentration in the MTT assay was found to be 33.3 μM. Therefore, the cytotoxic effect of apigenin is thought to be caused by mitochondrial damage. In addition, MTT assay has been shown to be an effective method for early detection of cell damage because, it is based on mitochondrial enzyme activity in determining cytotoxicity.