Koyun hidatid kist izolatlarında Eg.P29 geninin moleküler karakterizasyonu, ekspresyonu ve rekombinant Eg.P29 antijeninin serodiagnostik etkinliğinin değerlendirilmesi
Molecular characterization, expression, and evaluation of the serodiagnostic efficacy of the Eg.P29 gene in hydatid cyst isolates from sheep
Yazar: GÖZDE ŞAHİNGÖZ DEMİRPOLAT
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu çalışmada, Echinococcus granulosus enfeksiyonlarının özellikle insanlarda tanısı için potansiyel bir belirteç olarak nitelenen Eg. P29 proteinini kodlayan gen bölgesi İç Anadolu Yöresinde koyunlarda belirlenen hidatid kist izolatlarında karakterize edilmiş, amino asit ve protein özellikleri üzerine özgün veriler sağlanmıştır. İncelenen 25 hidatid kist izolatının Eg.P29 gen bölgesi sekanslarının benzer olarak 717 bp büyüklükte olduğu, 243 amino asit zinciri uzunluğunda ve 27,1 kDA büyüklükte bir proteini ifade ettiği belirlenmiştir. Nükleotid sekanslarının analizinde elde edilen izolatlar ve GenBank'da mevcut olan Echinococcus izolatları arasında Eg.P29'un yüksek düzeyde korunmuş olduğu belirlenmiştir. Amino asit sekanslarının analizlerinde Eg.P29 proteininin uzunluğu 7-13 aa ve antijenik skoru da 1048-1167 arasında değişen toplam 8 antijenik bölgeyi içerdiği saptanmıştır. Eg.P29 gen sekansları temelinde sentezletilen rekombinant proteinin (rEg.P29) farelerde gerçekleştirilen immunizasyon çalışmaları sonucu ile SDS PAGE ve Western Blot analizleriyle 27,1 kDa proteinin konfirmasyonu sağlanmış ve yüksek düzeyde immunojenik olduğu saptanmıştır. Çalışmada geliştirilen rEg.P29 tabanlı ELISA'nın 0.94 OD cut-off değerinde özgünlügünün %100 ve duyarlılığının da %80 olduğu tespit edilmiştir. rEg.P29 ELISA ile araştırma yöresinde incelemesi yapılan toplam 250 koyun serumunda KE seroprevalansı %17,6 olarak belirlenmiştir.    
Sonuç olarak bu çalışma ile koyunlarda KE enfeksiyonunun serolojik tanısı için potansiyel antijenlerden biri olan Eg.P29 antijeni, yöresel izolatlar kullanılarak gen, amino asit ve protein düzeyinde karakterize edilmiş, ve rEg.P29'un özgün tanı ve ayrıca immunizasyon için uygun bir antijenik bölge olduğuna dair kanıtlar sağlanmıştır. Geliştirilen rEg.P29 antijen tabanlı serolojik teşhis yaklaşımının özellikle enfeksiyonun yayılmasında primer arakonak rolü üstlenen koyunlarda enfeksiyonun kontrolü için surveyans çalışmalarında kullanılmasının faydalı olacağı kanaatine varılmıştır. 

Anahtar kelimeler: Echinococcus granulosus, ekspresyon, Eg.P29, moleküler karakterizasyon, ELISA, koyun

Abstract:
In this study, the gene region encoding the 29 kDa Eg.P29 protein, which is characterized as a potential marker for the diagnosis of Echinococcus granulosus infections in humans, was characterized in hydatid cyst isolates from sheep in the Central Anatolia region. Specific data on amino acid and protein properties were provided. The Eg.P29 gene sequences of the examined 25 hydatid cyst isolates were found to be similar, with a size of 717 bp, encoding a protein of 243 amino acids in length and 27.1 kDa in size. The analysis of nucleotide sequences revealed that Eg.P29 was highly conserved among the isolates obtained in this study and Echinococcus isolates available in GenBank. The analysis of amino acid sequences identified a total of 8 antigenic regions within Eg.P29 protein, ranging from 7 to 13 amino acids in length and with antigenic scores between 1048 and 1167. Confirmation of the 27.1 kDa protein was achieved through SDS-PAGE and Western blot analyses following immunization studies in mice with the recombinant protein synthesized based on Eg.P29 gene sequences, demonstrating its high immunogenicity. The rEg.P29-based ELISA developed in the study showed a specificity of 100% at the 0.94 OD cutoff value and a sensitivity of 80%. The seroprevalence of cystic echinococcosis (CE) was determined as 17.6% in a total of 250 sheep serum samples examined in the research area using rEg.P29 ELISA.
In conclusion, this study characterized the Eg.P29 antigen at the gene, amino acid, and protein levels using regional isolates, highlighting its potential as a serological marker for the diagnosis of CE infection in sheep. Evidence was provided to support the specificity and immunogenicity of rEg.P29, making it a suitable antigenic region for both diagnostic and immunization purposes. The development of a serological diagnostic approach based on rEg.P29 antigen is considered beneficial for surveillance studies aimed at controlling the infection in sheep, which play a primary role as an intermediate host in the transmission of the disease.
Keywords: Echinococcus granulosus, expression, Eg.P29, molecular characterization, ELISA, sheep