Kan kültürlerinde üreyen biyofilm oluşturan ve oluşturmayan klebsiella pneumoniae izolatlarında in-vitro antimikrobiyal etkileşimlerin gösterilmesi
Demonstration of in-vitro antimicrobial interactions in klebsiella pneumoniae isolates that produce and do not produce biofilms grown in blood cultures
Yazar: GÜLDEN DURSUN MANYASLI
Danışman: DOÇ. DR. TUBA MÜDERRİS
İzmir Katip Çelebi Üniversitesi / İzmir Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Antibiyotikler-kombine = Antibiotics-combined ; Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Biyofilmler = Biofilms ; Kan kültürü = Blood culture ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae

Özet:
Giriş ve Amaç: Klebsiella pneumoniae gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde kan dolaşımı enfeksiyonlarına en sık neden olan bakterilerdendir. Özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda hastane kaynaklı enfeksiyonda majör bir patojendir.  K. pneumoniae bakteriyemisi, tıp alanındaki ve sağlık hizmetindeki tüm gelişmelere rağmen yüksek morbidite ve mortalite oranına sahiptir. Ek olarak biyofilm yapısının da antimikrobiyal dirençte etkili olabileceği bilinmektedir. Çok ilaca dirençli K. pneumoniae için tedavi seçenekleri oldukça kısıtlıdır bu nedenle kombine antimikrobiyal tedavilerine gereksinim duyulmaktadır. Bu çalışmada biyofilm yapan veya yapmayan izolatlarda, ayrıca biyofilm yapan izolatlarda biyofilm öncesi ve sonrası dönemlerde çeşitli antibiyotik kombinasyonlarının in-vitro etkileşimlerinin gösterilmesiyle yeni tedavi protokollerinin oluşturulmasına katkı sağlanması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışma, 01.01.2019 - 31.12.2020 tarihleri arasında İKÇÜ Tıp Fakültesi Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı'na gelen kan kültürlerinde üreyen kolistine dirençli olduğu saptanmış, 15 biyofilm oluşturan ve 15 biyofilm oluşturmayan K. pneumoniae izolatında gerçekleştirilmiştir. Bu izolatlarda öncelikle antibiyotik duyarlılıkları belirlenmiş ve biyofilmli izolatlarda biyofilm oluşumu sonrası duyarlılıklar tekrar çalışılmıştır. Dama tahtası yöntemi ile üç antibiyotik kombinasyonu (kolistin-meropenem, kolistin-tigesiklin, kolistin-rifampisin) hem biyofilm oluşumu öncesi hem de biyofilm oluşumundan sonra çalışılarak in-vitro etkileşim varlığı araştırılmıştır. 
Bulgular: Çalışmamıza dahil edilen 30 K. pneumoniae izolatından 15 (%50)'inin biyofilm üretimi için negatif olduğu, 8 (%26.7)'inin orta derecede biyofilm üreticisi ve 7 (%23.3) izolatın güçlü biyofilm üreticisi olduğu saptandı. Sıvı mikrodilüsyon çalışmalarına göre 30 izolatın tamamı (%100) kolistine dirençliydi. Meropenem için ise 27 izolatın (%90) dirençli, 3 izolatın (%10) ise artmış dozda duyarlı olduğu görüldü. K. pneumoniae'da tigesiklin ve rifampisin için sınır değerleri bulunmamaktadır. Biyofilmde sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile belirlenen biyofilm inhibitör konsantrasyonu (BİK) değer aralıkları dört antibiyotik için de MİK değer aralıklarına göre yüksek bulundu. Dört antibiyotik için de BİK ile MİK değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark görüldü (p<0,05). Antibiyotik kombinasyon çalışmaları sonuçlarına göre kolistin-rifampisin kombinasyonu izolatların tamamında sinerjik etkiliydi. Kolistin-meropenem kombinasyonunda %83 (n=25) sinerji, %10 (n=3) additif, %7 (n=2) indiferans etkileşim görüldü. Kolistin-tigesiklin kombinasyonunda ise %67 (n=20) sinerji, %30 (n=9) additif, %3 (n=1) indiferans etki saptandı. Yapılan ikili analizlerde, kolistin-meropenem grubunun FİKİ değerinin kolistin-rifampisin grubundan (p<0,001), kolistin-tigesiklin grubunun FİKİ değerinin kolistin-rifampisin grubundan anlamlı derecede daha yüksek olduğu izlendi (p<0,001). Bununla birlikte, kolistin-tigesiklin ve kolistin-meropenem gruplarının FİKİ değerleri benzerdi (p=0,498). Biyofilm oluşumu sonrasında yapılan kombinasyon çalışmalarında kolistin-rifampisin %54 (n=8) sinerjik, %33 (n=5) additif, %13 (n=2) indiferans etkili idi. Kolistin-meropenem %73 (n=11) sinerjik, %20 (n=3) additif, %7 (n=1) indiferans etkili bulundu. Kolistin-tigesiklin kombinasyonu ise %33 (n=5) sinerjik, %47 (n=7) additif, %20 (n=3) indiferans olarak saptandı. İzolatların planktonik ve sesil gruplarında çalışılan üç antibiyotik kombinasyonunun tümünde FİKİ değerlerinde artış görüldü ve iki grup arasında anlamlı fark olduğu saptandı (p<0.05).
Sonuç: Kolistin dirençli K. pneumoniae izolatlarının planktonik ve sesil formlarında kolistin-meropenem, kolistin-tigesiklin ve kolistin-rifampisin kombinasyonlarının etkinliği değerlendirilmiştir. Bakterilerin sesil formlarında kombinasyonların sinerjik etkinlikleri planktonik forma göre anlamlı olarak azalmıştır. Biyofilmsiz durumda en etkili kombinasyon kolistin-rifampisin iken biyofilm oluşumu sonrası kolistin-meropenem daha etkin bulunmuştur. Verilerimiz ışığında yapılacak olan, direnç genleri saptanmış daha fazla izolatın kullanıldığı ve in-vivo sonuçların dahil edildiği yeni çalışmaların literatüre faydalı bilgiler vereceğini düşünmekteyiz. 
Anahtar Kelimeler: Klebsiella pneumoniae, biyofilm, dama tahtası, antibiyotik kombinasyonları

Abstract:
Introduction and Aim: Klebsiella pneumoniae is one of the most common bacteria causing bloodstream infections in developed and developing countries. It is a major pathogen in hospital-acquired infections, especially in immunocompromised patients. Despite all the advances in medicine and health care, K. pneumoniae bacteremia has a high morbidity and mortality rate. In addition, it is known that the biofilm structure may also be effective in antimicrobial resistance. Treatment options for multidrug-resistant K. pneumoniae are very limited, so combined antimicrobial therapies are needed. In this study, it is aimed to contribute to the creation of new treatment protocols by demonstrating the in-vitro interactions of various antibiotic combinations in biofilm-forming or non-biofilm-forming isolates, as well as in the pre- and post-biofilm periods.
Material and Methods: This study was carried out on 15 biofilm-forming and 15 non-biofilm-forming K. pneumoniae isolates, which were found to be resistant to colistin grown in blood cultures from IKCU Faculty of Medicine Atatürk Training and Research Hospital Medical Microbiology Laboratory between 01.01.2019 - 31.12.2020. First of all, antibiotic susceptibilities of these isolates were determined and susceptibilities were re-studied after biofilm formation in isolates with biofilms. The presence of in-vitro interaction was investigated by studying the combination of three antibiotics (colistin-meropenem, colistin-tigecycline, colistin-rifampicin) with the checkerboard method both before and after biofilm formation.
Results: It was determined that 15 (50%) of the 30 K. pneumoniae isolates included in our study were negative for biofilm production, 8 (26.7%) were moderate biofilm producers and 7 (23.3%) isolates were strong biofilm producers. According to the broth microdilution studies, all 30 isolates (100%) were resistant to colistin. For meropenem, 27 isolates (90%) were found to be resistant, and 3 isolates (10%) were found to be susceptible at increased doses. There are no breakpoints for tigecycline and rifampicin in K. pneumoniae. The biofilm inhibitor concentration (BIC) value ranges determined by the broth microdilution method in the biofilm were found to be higher than the MIC value ranges for all four antibiotics. There was a statistically significant difference between BIC and MIC values for all four antibiotics (p<0.05).According to the results of antibiotic combination studies, the combination of colistin-rifampicin was synergistic in all isolates. In colistin-meropenem combination, 83% (n=25) synergy, 10% (n=3) additive and 7% (n=2) differential interaction were observed. In colistin-tigecycline combination, 67% (n=20) synergy, 30% (n=9) additive effect, and 3% (n=1) indifferential effect were detected. In the paired analyzes, it was observed that the FICI value of the colistin-meropenem group was significantly higher than that of the colistin-rifampicin group (p<0.001), and the FICI value of the colistin-tigecycline group was significantly higher than the colistin-rifampicin group (p<0.001). However, FICI values of colistin-tigecycline and colistin-meropenem groups were similar (p=0.498). In combination studies performed after biofilm formation, colistin-rifampicin was effective in 54% (n=8) synergistic, 33% (n=5) additive, and 13% (n=2) indifferential effects. Colistin-meropenem was found to be synergistic in 73% (n=11), additive in 20% (n=3), and indifferential in 7% (n=1). Colistin-tigecycline combination was found to be 33% (n=5) synergistic, 47% (n=7) additive, and 20% (n=3) indifferential. FICI values were increased in all three antibiotic combinations studied in planktonic and sessile groups of isolates, and a significant difference was found between the two groups.
Conclusion: The efficacy of colistin-meropenem, colistin-tigecycline and colistin-rifampicin combinations in planktonic and sessile forms of colistin-resistant K. pneumoniae isolates was evaluated. The synergistic activities of the combinations were significantly decreased in the sessile forms of bacteria compared to the planktonic form. While the most effective combination was colistin-rifampicin in the absence of biofilm, colistin-meropenem was found to be more effective after biofilm formation. We think that new studies in the light of our data, using more isolates with resistance genes and including in-vivo results, will provide useful information to the literature.
Keywords: Klebsiella pneumoniae, biofilm, checkerboard, antibiotic combinations