Kumarinin mercimek bitkisi (Lens culinaris Medik) üzerindeki sitotoksik, biyokimyasal ve genotoksik etkileri
Determination of cytotoxic, biochemical, and genotoxic effects of coumarin on lentil (Lens culinaris Medic)
Yazar: BURCU YÜKSEL
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM AKSOY
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Lens culinaris = Lens culinaris ; RAPD-PCR = RAPD-PCR

Özet:
Bu araştırmada; tarım, tıp, boya ve gıda sanayii gibi  alanlarda kullanılan ve sekonder bir bileşik olan  kumarin  maddesinin model organizma olarak seçilen Lens culinaris Medik. üzerindeki etkilerinin ortaya çıkarılması amaçlandı. Bunun için deney gruplarının çimlenme yüzdeleri hesaplandı, kök uzunlukları ölçüldü, çimlenen ve çimlenmeyen tohum sayıları belirlenerek Probit analizi ile EC50 değeri belirlendi. 72 saatlik uygulama  sonucunda probit analizine göre EC50 değeri kumarin  için 278,86 ppm olarak bulundu. Ölçümlerin daha kolay yapılabilmesi için alt ve üst sınır aralığında bulunan 300 ppm değeri  EC50 değeri olarak alındı. Saptanan EC50 değeri ve EC50x2 (600 ppm) olmak üzere iki farklı konsantrasyon ve kontrol grubu olarak Hoagland çözeltisi ile deneyler yapıldı. Sitolojik  çalışmalarda, örneklerin mitotik indeks yüzdeleri hesaplandı ve kromozom anormallikleri belirlendi. Kontrol ile karşılaştırıldığında, artan kumarin konsantrasyonunun mitotik indeksi azalttığı, kromozomal anormaliklere sebep olduğu gözlendi. Biyokimyasal çalışmalarda, deney gruplarının çözünebilir protein miktarı ve  SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile protein bant profilleri belirlendi. Prolin, lipid peroksidasyonu ve  hidrojen peroksit miktarlarının yanısıra α-amilaz, CAT (katalaz) ve  SOD (süpeoksit dismutaz) enzim aktiviteleri de incelendi. Sonuçlar, kontrol ile karşılaştırıldığında, protein konsatrasyonu EC50x2'de arttığı ve SDS-PAGE ile yapılan analizler sonucunda, bant profillerinde farklılık oluştuğu, Malondialdehit, prolin miktarlarında artma, H2O2 miktarında ve katalaz aktivitesinde önce azalma sonra artma belirlendi. SOD ve α-amilaz aktivitesinde ise  azalma tespit edildi. Moleküler çalışmalarda, kumarinin genotoksik etkilerini belirlemek için RAPD ve Real Time PZR teknikleri kullanıldı. RAPD analizlerinde uygulanan kumarin maddesinin doza bağlı olarak bant profillerinde polimorfizm  artışına ve genomik kalıp stabilitesi oranında azalmaya neden olduğu tespit edildi. Real Time PZR analizlerinde abiyotik stresle ilişkili olan (CAT, Cu/Zn SOD ve Mn SOD)  3 farklı genin anlatımı incelendi. Kumarin stresinin CAT ve Cu/Zn SOD genlerinin anlatımını azalttığı buna karşın Mn SOD anlatımında hem artma ve hem de azalma tespit edildi. Kumarinin; sitotoksik, genotoksik ve biyokimyasal hasarlar oluşturduğu belirlendi. Bu tez, kumarin  stresi altında yetiştirilen L.culinaris bitkisinin  sitolojik, biyokimyasal ve  genotoksik  açıdan araştırıldığı ilk detaylı çalışmadır.

Abstract:
The aim of this study was to investigate the effects mechanisms of the  coumarin, which is a secondary compound in plants used in different fields such as agriculture, medicine, dye and food industry, on L. culinaris Medik. Germination percentages of the experimental groups were calculated, root lengths were measured, germinated and ungerminated seed were counted, and EC50 value was determined by Probit analysis. As a result of 72 hours of application, the EC50 value for coumarin was determined as 278,86 ppm based on the probit analysis.  In order to make the measurements easier, the EC50 value was taken as 300 ppm, which is between the lower and upper limit. Experiments were carried out with two different concentrations, the EC50 value and the EC50x2 (600 ppm), and the Hoagland solution was used as the control group. In cytological studies, mitotic index percentages of samples were calculated and chromosomal abnormalities were detected. Compared with the control, it was observed that the increasing concentration of coumarin decreased the mitotic index and caused chromosomal abnormalities. In biochemical studies, protein band profiles were determined by the amount of soluble protein in the experimental groups and by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). Proline, lipid peroxidation and hydrogen peroxide quantities as well as α-amylase, CAT (catalase) and SOD (superoxide dismutase) enzyme activities were investigated. The results of the study showed that protein concentration increased at EC50x2 and analysis by SDS-PAGE revealed differences in band profiling, increased amounts of MDA, proline, a decrease in H2O2 and a decrease in catalase activity when compared to the control. A decrease in SOD and α-amylase activity was detected. In molecular studies, RAPD and Real time PZR techniques were used to determine the genotoxic effects of coumarin. It was determined that the coumarin we applied in the RAPD analysis caused polymorphism and increased the band profiles due to the polysaccharide and decrease in genomic pattern stability. In Real Time PZR analysis, three different genetic expressions related to abiotic stress (CAT, Cu / Zn SOD and Mn SOD) were examined. Coumarin stress reduced the expression of CAT and Cu / Zn SOD genes where both an increase and decrease of the expression of Mn SOD was detected. The results also revealed that coumarin caused cytotoxic, genotoxic and biochemical damages. This study is the first detailed investigation of the effects of L.culinaris plant grown under coumarin stress in terms of cytological, biochemical and genotoxical analysis.