Escherichia coli ve klebsiella pneumoniae suşlarında vıtek-2, çift disk sinerji ve kombine disk yöntemi ile GSBL(genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz ) araştırılması ve 3 testin karşılaştırılması
Investigation of esbl production (extended spectrum beta-lactamase) in escherichia coli and klebsiella pneumoniae strains by vitek-2, double disk synergy and combined disk methods, and comparison of the methods
Yazar: MUSTAFA YILMAZ
Danışman: DOÇ. DR. ÖZNUR AK
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Dr. Lütfi Kırdar Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Beta laktamazlar = Beta lactamases ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Amaç: 1 Kasım 2016-31 Ocak 2017 tarihleri arasında Sağlık Bilimleri Üniversitesi Kartal Dr.Lütfi Kırdar Eğitim ve Araştırma Hastanesi  İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda çeşitli klinik örneklerden infeksiyon etkeni olarak izole edilen 131 E.coli ve 53 K.pneumoniae izolatları çalışmamızda değerlendirilmiştir. Bizim yaptığımız araştırmada, GSBL varlığını saptamada VITEK 2 (bioMérieux, Fransa) tam otomatize sistemi ile çift disk sinerji ve kombine disk testi arasında fark olup olmadığının karşılaştırılmalı olarak araştırılması amaçlanmıştır.
Yöntem: Daha önce VITEK 2 (bioMérieux, Fransa) sistemi ile duyarlılık testleri yapılmış GSBL pozitif veya negatif E.coli veya K.pneumoniae izolatlarına çift disk sinerji ve kombine disk testleri uygulanmıştır. Bunun için kolonilerden 0.5 McFarland bulanıklığında bakteri süspansiyonu hazırlanıp Mueller Hinton Agar plağına inokule edilmiştir. Çift Disk Sinerji Testi: Petri kutusunun merkezine bir amoksisilin-klavulanik asid (AMC) (20/10 µg) diski ve çevresine 25 mm uzaklıkta ışınsal olarak seftazidim (CAZ) (30 µg), seftriakson (CRO) (30 µg), sefoksitin (FOX) (30 µg), sefotaksim (CTX) (30 µg) diskleri yerleştirildikten sonra, CAZ, CRO, FOX veya CTX disklerinin çevresindeki inhibisyon zonlarında AMC diskine doğru bir genişleme veya arada bakteri üremeyen bir sinerji alanının bulunması GSBL üretimi olarak değerlendirilmiştir. Kombine disk testi: Bu yöntemde seftazidim (CAZ) (30 µg), seftazidim-klavulanik asit (CCA) (30/10 µg), sefotaksim (CTX) (30 µg), sefotaksim-klavulanik asit (CCT) (30/10 µg) diskleri kullanıldı.  Mueller-Hinton agar besiyerine 0.5 MacFarland'a göre hazırlanmış bakteri süspansiyonu steril bir eküvyonla yayıldı. CAZ ve CCA diskleri aralarında 30 mm olacak şekilde petriye yerleştirildi, aynı işlem CTX ve CCT diskleri için de uygulandı. Petriler 35ºC'de 18 saat inkübe edildi ve sonuçlar EUCAST kriterlerine göre değerlendirildi.  Sefalosporin diski ile klavulanatlı sefalosporin diski arasında 5 mm ve üzeri fark GSBL üreticiliği olarak değerlendirildi.
Bulgular: Çalışmamızda hastaların çoğunluğu(%68.5) kadındı. Ek hastalık olarak en sık hipertansiyon(%21.2) saptandı. İzolatların geldiği klinik ve materyal dağılımına bakıldığında ilk sırada üroloji (%33.7) kliniğinden gelen idrar kültürünün olduğu, son üç ay içinde kullandıkları antibiyotikler açısından ilk sırada aminopenisilin (%13) grubunun yer aldığı görüldü. 184 E.coli ve K.pneumoniae suşuna doğrulama testlerini uyguladığımızda VITEK 2'nin pozitif sonuç verdiği 98 suştan 91 (%92.9)'inde kombine disk ve ÇDS yöntemi ile pozitif, VITEK 2'nin negatif sonuç verdiği 86 suştan 86 (%100)'sında kombine disk ve ÇDS  ile negatif olarak bulundu. Böylece kullandığımız otomatize sistemin sonuçlarını doğrulama testleri ile karşılaştırdığımızda sistemin duyarlılığı %100, özgüllüğü %92.4, pozitif prediktif değeri %92.8, negatif prediktif değeri %100 olarak bulundu. Son 3 ay içinde antibiyotik kullanımı ile GSBL üretimi açısından karşılaştırıldığında aminopenisilin (p=0.009), 2. ve 3.kuşak sefalosporin (p=0.006, p=0.023) ve florokinolon (p=0.034) kullanımının GSBL üretimine etkisi istatistiksel olarak anlamlı bulundu.

Sonuç: GSBL-pozitifliği Gram-negatif bakterilerde önemli bir direnç sorunudur, en önemli risk faktörlerinden biri antibiyotik kullanımıdır. Bu sebeple uygun endikasyonda uygun antibiyotiklerin kullanılmasına dikkat edilmelidir. Laboratuvarlarda VITEK 2 otomatize sisteminin GSBL pozitifliği saptanmasında doğrulama testleri ile uyumlu olduğu bulunmuştur.

Abstract:
131 E. coli and 53 K.pneumoniae isolates were isolated from various clinical specimens in Microbiology Laboratory of Infectious Diseases and Clinical Microbiology Department at Kartal Dr. Lütfi Kırdar Training and Research Hospital, from 1 November 2016 to 31 January 2017. In our research, it was aimed to investigate  ESBLproduction and compare double-disk synergy and combined disc testing with the fully automatic system of VITEK 2 (bioMérieux, France) methods in detecting ESBL.
Double disc synergy and combined disc tests were performed on ESBL positive or negative E. coli or K. pneumoniae isolates that had been previously tested for sensitivity with the VITEK 2 (bioMérieux, France) system. The bacterial suspension of 0.5 McFarland turbidity standard was prepared from the colonies and inoculated onto the Mueller Hinton Agar plate. Double Disk Synergy (DDS) Test: Amoxicillin-clavulanic acid (AMC) (20/10 μg) was  put in the center of the petri dish and ceftazidime (CAZ) (30 μg), ceftriaxone (CRO) (30 μg), cefoxitin (FOX) (30 μg) and cefotaxime (CTX) (30 μg) discs were placed at a distance of 25mm radially around it. The presence of a synergistic field with an expansion towards the AMC disk or a zone of synergy with no bacterial growth around the CAZ, CRO, FOX, or CTX discs has been interpreted as ESBL production. Combined disc test: In this method, ceftazidime (CAZ) (30 μg), ceftazidime-clavulanic acid (CCA) (30/10 μg), cefotaxime (CTX) (30 μg), cefotaxime-clavulanic acid (CCT) (30/10 μg) discs were used. Bacterial suspension of 0.5 McFarland turbidity standart was spread to Mueller-Hinton agar medium with a sterile swab. CAZ and CCA discs were placed in petri dishes with a distance of 30 mm, and the same procedure was applied for CTX and CCT discs. The petri dishes were incubated at 35°C for 18 hours and the results were evaluated according to EUCAST criteria. Five milimeters or more difference  between the inhibition zones of cephalosporin disc and the clavulanate cephalosporin disc was evaluated as ESBL production.
The majority of the patients (68.5%) were female in our study. The most common comorbidity was hypertension (21.2%). Most of the isolates were isolated from urine cultures from Urology clinic (%33.7), and it was observed that aminopenicillin (13%) group took the first place in terms of the antibiotics  used in the last three months. When we performed validation tests on 184 E.coli and K.pneumoniae strains, we found that 91 (92.9%) of 98 isolates with VITEK 2 positive results were positive with combined disc and DDS method, 86 (100%) of the 86 isolates with negative results of VITEK 2 were negative with combined disc and MDC. When we compared the results of the automated system we used, with the validation tests, we found that the system had a sensitivity of 100%, a specificity of 92.4%, a positive predictive value of 92.8% and a negative predictive value of 100%. When we compare antibiotic use in the last 3 months and ESBL production, the effects of aminopenicillin (p = 0.009), second and third generation cephalosporin (p = 0.006, p = 0.023) and fluoroquinolone (p = 0.034) on ESBL production were statistically significant.
ESBL-positivity is a major resistance problem in Gram-negative bacteria, one of the most important risk factors is the use of antibiotics. For this reason, care should be taken to use appropriate antibiotics at appropriate indications. VITEK 2 automated system was found to be compatible with validation tests for ESBL positivity.