Asetilkolinesteraz enziminin insan eritrositlerinden afinite kromatografisi ile saflaştırılması
Purification of acetylcholinesterase from human erythrocyte by affinity chromotography
Yazar: HABİBE BUDAK KAYA
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; Enzimler = Enzymes ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Asetilkolinesteraz (AChE) (E.C.3.1.1.7) beyinin gri cevherinde, sinir hücrelerinde, kasta, akciğer, dalak ve eritrositlerde bulunur. Aynı zamanda sarkoplazmik retikulum, lökosit, trombosit, kemik iliği ve plasentada da mevcuttur. Asetilkolinesteraz kolinerjik sinapsiste nörotransmitter asetilkolini hidroliz eder ve birçok fiziksel olayın düzenlenmesinde önemli rol oynar.Bu çalışmada, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B matriksine tirozin uzantı kolu olarak takıldı. Enzimin inhibitörü olan 9-aminoakridine molekülü tirozine kenetlendirilerek yeni bir afinite jeli hazırlandı ve bu jelden asetilkolinesteraz enzimi insan eritrositlerinden saflaştırıldı. Kan numunelerinde plazma ve lökosit tabakaları santrifüjlenerek ayrıldı. Tüplerin altında kalan eritrosit peleti %0,9 (izotonik) NaCl çözeltisi ile üç defa yıkandı. Her defasında 2500xg'de 15 dakika santrifüj edildi. Elde edilen eritrositler hacimlerinin 3 katı kadar buzlu hemoliz çözeltisi ile hemoliz edildi ve +4 ºC'de 13.000xg'de 60 dakika santrifüj yapıldı. Çökelek kısmı (membranlar) alınarak 5mL 0,1 M (pH: 7,4) Na-fosfat tamponu içinde süspanse edildi ve %1'lik Triton X-100 ile çözündürüldü. Santrifügasyondan sonra (4oC de, 13.000xg'de 60 dk) üst kısımdaki süpernatant alındı. Hazırlanan 5 mL hemolizat afinite kolonuna verildi. Saflaştırma basamakları sonucunda 0,0153 mg AChE, %23,5 verimle 658 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve tek bant bulundu (80 kDa). Enzim aktivite ölçümünde pH:7,4'de asetiltiyokolin iyodat substratı kullanıldı. Saflaştırılan AChE 'ın 20oC'de pH:7,4'de KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,372 mM ve 0,065 EÜ/mL.dk olarak belirlendi. Hazırlanan afinite kolonunda bağlanma kapasitesi 2oC'de pH:7,4 ve 0,1 M iyonik şiddet konsantrasyonunda 0,07 mg/g jel ve ligand olarak kullanılan takrin inhibitörü I50 değeri 4,5.10-5mM olarak belirlendi.Anahtar Kelimeler: Afinite, Asetilkolinesteraz, Kinetik, İnhibisyon

Abstract:
u Acetylcholinestrerase (AChE) (E.C.3.1.1.7) is found into gray substance of brain, nerve cells, muscles, lung and eryyhrocytes.Acetylcholinestrerase cholinergic makes neurotransmitter acetycholine hydrolized at synapsis and it has an important role in arranging several physical phenomenons.In this study, Sepharose-4B was joined as an helping arm to matrix a new affinity gel was prepared to join that enzyme inhibutor by 9 aminoacridine and acetylcholinestrerase enzyme of this gel was purifield from the human erythrocytesin blood sample, plasma and leukocyte layer were seperated from each other by centrifuge Erythrocytes pellet remaining down tubes have been washed with %0,9 (isotonic) NaCl solution three times.It has been centrifuged at 2500 xg during 15 minutes in each time. They have been hemolized as more as three times with ice obtaining erythrocytes volumes by hemolysis solution and at + 4ºC, 13.000 xg and 60 minutes, centrifuge has been made.After centrifuge, Up supertanant has been received (at 4 C de, 13.000xg 60 minutes). As picking up sediment part (membranes) into 5mL 0,1 M (pH: 7,4) Na-phosphate buffer has been made dispersible and it has been solubilized by %1?lik Triton X-100.Arranged 5 ml hemolysis has been given to affinity column. At the result of purifying phases,0,0153 mg AchE has been purified with %23,5 efficiency 658 floor.Enzyme purity of purified has been controlled withSDS-PAGE and single band has been found(80 kDa).At enzyme activity measure, acetylcholine iodate substract has been used.Purified AChE at 20ºC, at pH:7,4 Km and Vmax values respectively as 0,372mM and 0,065 EÜ/mL.minutes have been determined. Affinity column arranged column bonding capacity at 2ºC pH:7,4 and 0,1 M ionic intensity concentration as using 0,07 mg/g gel and ligand tacrine inhibitor I50 value as 4,5.10-5mM has been determined.Keyword: Affinity, acetylcholinesterase kinetics, inhibition