Kışlık ekmeklik buğday (Triticum aestivum L.)'da sarı pas hastalığına dayanıklılığın biyoteknolojik yöntemlerle incelenmesi
Investigation of yellow rust disease resistance in winter type bread wheat (Triticum aestivum L.) using biotechnological methods
Yazar: ÖZGE KARAKAŞ
Danışman: DOÇ. DR. AHU ALTINKUT UNCUOĞLU ; DOÇ. DR. FİLİZ GÜREL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Buğday = Wheat ; Moleküler markerler = Molecular markers ; Sarı pas hastalığı = Yellow rust disease

Özet:
Puccinia striiformis f. sp. tritici'nin neden olduğu sarı pas hastalığı dünyada buğday üretiminin en önemli sınırlayıcısıdır ve gıda güvenliği için ciddi bir tehdittir. Bu çalışmada Türkiye'de yetişen ve sarı pasa hassasiyetleri daha önce belirlenmiş olan bazı kışlık ekmeklik buğday genotiplerinde genetik çeşitliliğin belirlenebilmesi ve bu hastalığa dayanıklılıkla ilişkili markır bulunması amacıyla EST (anlatım yapan işaretlenmiş diziler) kökenli kontigler, singletonlar ve RGA (direnç gen analogları)-EST'leri incelenmiştir. Bu amaçla sarı pas uygulanmış buğdaya ait toplam 1549 EST'den biyoinformatik analiz ile 136 adet kontig ve 989 adet singleton elde edilmiştir. BlastX taramasına göre kontiglerin %29'u (39) ve singletonların %10'u (96) Triticum aestivum genleri ile homoloji göstermiştir. Kontig ve singletonlarla eşleşen veri tabanı (BlastX) protein sentezi, fotosentez, metabolizma ve enerji, stres proteinleri, transporter proteinler, protein parçalanma ve yeniden dönüşümü, hücre büyüme ve bölünmesi, reaktif oksijen süpürücüleri gibi 8 fonksiyonel gruba ayrılmıştır. Kontig ve singletonlardan tasarlanan primerlerle gerçekleştirilen PZR analizleri kontiglerde en polimorfik fonksiyonel kategorinin fotosentez; singletonlarda ise en polimorfik fonksiyonel kategorinin metabolizma ve enerji olduğunu göstermiştir. EST kökenli primerler ile yapılan PZR analizi çalışmalarında çeşitli derecelerde polimorfizm görülmesine karşın, hassas ve dayanıklı bireyleri ayıracak moleküler markır elde edilememiştir. Elde edilen DNA bandı paternleri buğday genotiplerinde genetik uzaklığı araştırmada kullanılmıştır. Sonuç olarak, en yakın çeşitler Harmankaya99 ve Sönmez2001 (0.2359) iken, en uzak çeşitler ise Aytın98 ve Izgi01 (0.3973) olmuştur.Genetik çeşitlilik çalışmalarında ayrıca NBS-LRR (lösince zengin tekrarlar) sınıfına ait buğday dizilerinden kökenlenen ve RGA-EST'lerini içeren 77 NBS, kullanılmıştır. PZR analizlerinde 77 RGA-EST primeri kullanılmış ve 38 tanesi genotipler arasında polimorfik bant profili göstermiştir. Sonuçlar EST kökenli dizilerin genetik çeşitlilik çalışmalarında son derece değerli kaynaklar olabileceğini ve hastalık direnç genlerinin etiketlenebileceği haritalama populasyonlarının geliştirilmesinde kullanılabileceğini göstermektedir.Çalışmada, sarı pas bulaşmış hassas ve dayanıklı buğday çeşitleri kullanılarak EST temeline dayanan çoklu gen anlatım analizleri gerçekleştirilmiştir. Bunun için sadece stres ve stresle ilişkili kontig ve singletonlar kullanılmıştır. Ayrıca ilgili veritabanlarında hastalık dayanıklılığından sorumlu genler belirlenerek bu dizilerden GeXP sistemine uygun primerler tasarlanmıştır. Çoklu gen anlatım analizleri hem sarı pas bulaştırılmış hem de kontrol bitkilerin RNA örneklerinde gerçekleştirilmiştir. Hastalık dayanıklılık mekanizmasını tetikleyecek koşulları taklit edebilmek amacıyla 5 farklı zaman aralığı (0., 8., 12., 24. ve 48. saat) seçilmiştir. Altı buğday genotipi (Triticum aestivum L. cvs. PI178383, Izgi01, Sönmez2001- sarı pasa dayanıklı genotipler ve Triticum aestivum L. cvs. Harmankaya99, ES14, Aytın98-sarı pasa hassas genotipler) seçilen zaman aralıklarında gen anlatım analizlerinde kullanılmıştır. Sonuç olarak, hastalıkla inoküle olmuş bitkilerde anlatımları artan genler arasında PR5 (Patogenezle ilişkili gen), PR2 (singleton CA598181'in BlastX homoloğu) ve GRAB2 (singleton CA597983'ün BlastX homoloğu) genleri öne çıkmış, bu genlerin anlatımları kontrol bitkilerde belirlenmemiştir. Bu genlerin, bitkilerde patojen saldırısına yanıtta önemli rol oynadığı bilinmektedir.

Abstract:
Wheat yellow rust, caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici, is a major constraint in wheat production and is a serious threat to food security worldwide. In this study, EST (Expressed Sequence Tag)-derived contigs, singletones and RGA (Resistance Gene Analogue)-ESTs were used to assess genetic diversity and in order to identify molecular markers related to yellow rust disease resistance among some Turkish wheat genotypes which have been cultivated and examined for their sensitivity to yellow rust disease previously. For this purpose, 136 contigs and 989 singletones were obtained from 1549 ESTs (belong to wheat treated by yellow rust) which were present in databases by a bioinformatics study. Results of the BlastX search showed that 29% (39) of contigs and 10% (96) of singletones have homology to genes of Triticum aestivum. The database-matched contigs and singletones (BlastX) were assigned to 8 functional groups such as protein synthesis, photosynthesis, metabolism and energy, stress proteins, transporter proteins, protein breakdown and recycling, cell growth and division and reactive oxygen scavengers. PCR analyses with primers designed from contigs and singletones showed that the most polymorphic functional category of contigs were photosynthesis and the most polymorphic functional category of singletones were metabolisms and energy. As a result of the PCR analyses with EST-derived primers, a numbers of polymorphic bands obtained however those do not include markers to distinguish sensitive and resistance parents. Instead, DNA banding patterns were used to analyse genetic variability among the resistant and susceptible wheat genotypes, and the mean genetic distance between the genotypes was pointed in this study. The lowest genetic distance was determined between Harmankaya99 and Sönmez2001 (0.2359), and the highest genetic distance between Aytın98 and Izgi01 (0.3973).77 Wheat NBS (Nucleotide Binding Site) containing RGA-ESTs derived from two NBS regions from wheat sequences of the NBS-LRR (Leucine Rich Repeat) class, were also used for genetic diversity analysis. 77 RGA-EST derived primers were used for PCR analysis and 38 of them showed polymorphic banding profile between the genotypes. The results indicated that EST-derived sequences can be used for genetic diversity studies as highly valuable sources and they were useful in the identification of suitable parents for the development of mapping populations for tagging disease resistance genes.EST-based multiplex gene expression analyses were performed by using yellow rust infected susceptible and resistant wheat varieties. Only stress and stress related contigs and singletones were selected for the analyses. In addition, the genes responsible for the disease resistance were determined in the related databases and used for primer design proper to GeXP system. Multiplex gene expression analyses were conducted using RNA samples from yellow rust infected and control plants. 5 different time points (0h, 8h, 12h, 24h and 48h) were chosen to mimic the conditions, trigger disease resistance mechanism. Six bread wheat genotypes (Triticum aestivum L. cvs. PI178383, Izgi01, Sönmez2001- yellow rust resistant cultivars and Triticum aestivum L. cvs. Harmankaya99, ES14, Aytın98- yellow rust susceptible cultivars) were used in the chosen time points for the gene expression analyses. As a result, PR5 (Pathogenesis related gene5), PR2 (BlastX homolog of singletone CA598181) and GRAB2 (BlastX homolog of singletone CA597983) were the genes with high expression levels in inoculated plants while there was no expression in the controls. These genes are known to have important roles in defense response mechanisms during the pathogen attacks in plants.