Tekrarlanan döküm işleminin temel metal alaşımında biyouyumluluk üzerindeki etkisinin in vitro değerlendirilmesi
In vitro evaluation of the effect of recasting on biocompatibility of base metal alloy
Yazar: PINAR DURKAYA
Danışman: PROF. DR. GÜLAY KANSU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Protetik Diş Tedavisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Biyouyumluluk = Biocompatibility ; Dental restorasyon = Dental restoration ; Döküm yöntemleri = Casting methods ; Isıl işlem = Heat treatment ; Metal alaşımlar = Metal alloys ; Nikel = Nickel ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Bu araştırmada, ağızda sabit protetik restorasyonlar için sıklıkla kullanılan Ni-Cr alaşımında, belirli bir deneysel protokol çerçevesinde dökümün tekrarlanma işleminin; bileşim (kütle ve yüzey), mikroyapı (yüzey topoğrafyası, tane boyutu, kirlilikler, defektler, yüzey pürüzlülüğü), element salınımı (Ni, Cr ve Mo elementleri için) ve sitotoksisite üzerindeki etkisinin incelenmesi ve sitotoksisite testleri sonucunda meydana gelebilecek patolojilerin, sitokimyasal yöntemler kullanılarak bazı biyokimyasal parametrelerin (olası apoptotik gelişim) sorgulanması suretiyle aydınlatılması amaçlanmıştır. 
Ni-Cr alaşımından ICP-MS yöntemi ile bileşim analizi için 18 adet silindir (8 x 15 mm); diğer analizler için ise 174 adet disk (3 x 5 mm) şeklinde örnekler, %100 yeni alaşım, %50 artık alaşım ilave edilmiş yeni alaşım ve %100 artık alaşım şeklinde üç farklı döküm prosedürü ile hazırlandı. Daha sonra her bir gruba ait örneklerin yarısı porselen fırınında (Programat® X1, Ivoclar Vivadent, Schaan, Principality of Liechtenstein), alaşımı üreten firmanın önerdiği markalardan (Vita VMK 95®, Vident, California, USA) birine ait olan fırınlama sıcaklıklarına tabi tutuldu. Porselen uygulamaksızın gerçekleştirilen fırınlama simülasyonunun her aşamasını takiben örneklerin oda sıcaklığında kendi kendi soğuması beklendikten ve siklus tamamlandıktan sonra hem ısıl işlem uygulanan hem de uygulanmayan örneklerin yüzeylerine klinik olarak kabul edilebilir bir düzeye kadar polisaj işlemi yapıldı. Isıl işlem uygulanmayan örnekler, klinik uygulamalardaki tam kronları; ısıl işlem uygulanan örnekler ise porselen bağlı metal restorasyonları temsil etmektedir. 
Temizlik, dezenfeksiyon ve sterilizasyon için standart işlemler uygulandı. Sitotoksisite testlerinde, apoptozun saptanmasında ve element salınımının belirlenmesinde alaşımlardan elde edilen ekstraktlar kullanıldı. Örnekler, %2 FBS (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) ve 2/1000 antibiyotik (Linco-spectin, Pfizer, Puurs, Belgium) ilave edilmiş DMEM [Dulbecco?s modified essential medium (Sigma-Aldrich, St Louis, USA)] içerisinde 7 ve 30 gün süre ile 37 °C ve %5 CO2?li ortamda bekletildi. Örneğin yüzey alanının daldırma sıvısı hacmine oranı ISO 10993-12 (2002) [1,25 cm2/ml (± %10)]?de belirtilen şekilde 0,767 ml olarak ayarlandı. Sitotoksisite testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmak üzere saf bakır; negatif kontrol olarak kullanılmak üzere ise serum ve antibiyotik katkılı DMEM, test örnekleri ile aynı koşullar altında hazırlandı. Apoptoz testinde negatif kontrol olarak sitotoksisite testlerinde kullanılan solüsyon; pozitif kontrol olarak ise üretici firmanın önerdiği şekilde DNase I kullanıldı.
İnsan gingival fibroblastlar üzerine sitotoksik etkiler MTT ve LDH testleri ile; olası apoptotik gelişim ise TUNEL test kiti ile belirlendi. Element salınımı ve kimyasal bileşim ICP-MS yöntemi ile belirlendi. Elemental bileşim SEM/EDS; yüzey bileşimi ve derinlik profili ise XPS ile belirlendi. Yüzey morfoloji-mikroyapı ve pürüzlülük ise SEM, profilometre ve AFM yöntemleri ile incelendi. 
Çalışmamızın sonucunda, sitotoksisite testlerine göre tekrarlayan döküm ve porselen fırınlama işleminin, alaşımların biyouyumluluğu üzerine etkisi yoktur. Ek olarak, alaşımları daldırma sıvısında bekletme süresinin artması ile sitotoksik etkide bir değişim gözlenmemiştir. Olası apoptozisin belirlenmesi amacıyla yapılan test sonucunda pozitif bir bulguya rastlanmamıştır. Bu durum sitotoksisite sonuçları ile uyumludur. Element salınımı bakımından alaşımlar incelendiğinde ısıl işlemin salınıma etkisi olmadığı bununla birlikte, yeni alaşıma %50 oranında artık alaşım ilave edilen grubun ısıl işlem uygulanmadığında, %100 yeni alaşım grubuna oranla tüm şartlandırma periodlarında daha fazla Ni salınımına sebep olduğu gözlenmiştir. Kısa-dönem ile uzun-dönem arasında element salınımı açısından farklılık gösteren tek grup, ısıl işlem uygulanmayan 2. gruptur (30 günlük ekstrakttan, 7 günlüğe oranla daha fazla Mo salınımı olmuştur). Hem kimyasal bileşim hem de elemental bileşim analizinde tekrarlayan döküm ve ısıl işlem uygulamasının, alaşımların bileşimine etkisi olmadığı gözlenmiştir. Yüzey bileşimi ve derinlik profili incelemelerinde, tüm deneysel koşullarda alaşımların yüzeylerindeki oksit tabakasının Cr2O3, NiO ve MoO3?den oluştuğu ve oksit tabakası oluşumuna en çok katılan elementin Cr olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Tekrarlayan döküm ve ısıl işlemin makroboyutta pürüzlülüğe bir etkisi yokken yüzeyler, nanoboyutta incelendiğinde ısıl işlem uygulanan grupların yüzeylerinin daha pürüzlü olduğu gösterilmiştir. SEM görüntülerinde tüm deneysel koşullarda, ikinci, üçüncü ve oksit fazları olduğu düşünülen koyu ve açık renkli alanlar gözlenmiştir.

Abstract:
In this study, it was aimed to investigate the effects of recasting procedure on the composition (mass and surface), micro-structure (surface topoghraphy, grain-size, impurities, defects, surface roughness), element release (for Ni, Cr and Mo) and cytotoxicity of Ni-Cr alloys and to determine the pathologies occured as a result of cytotoxicity by using cytochemical tests in correlation with the biochemical parameters (potential apoptosis). 
Eighteen cylinders (8 x 15 mm) for the composition analysis (ICP-MS) and 174 discs (3 x 5 mm) for other series of analysis were prepared as 100% new alloy, 50% once recasted alloy added to new alloy and 100% once recast alloy. Then half of the samples from each group were exposed to temperatures from the brands (Vita VMK 95®, Vident, California, USA) that recommended by alloy manufacturer in porcelain oven (Programat® X1, Ivoclar Vivadent, Schaan, Principality of Liechtenstein). All of the specimens? surfaces were polished on a clinical acceptable level after cooling down to the room temperature following the each stage of firing simulation and completion of porcelain firing cycle without porcelain application. Alloys that did not receive heat treatment represent full crowns in clinical applications and heat treated specimens represent porcelain-fused-to-metal restorations. 
Standart processes were applied for cleaning, disenfection and sterilisation. Extracts from alloys were used in cytotoxicity testings in order to determine apoptosis and element release. Alloys were conditioned in 2% FBS (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) and 2/1000 antibiotic (Linco-spectin, Pfizer, Puurs, Belgium) supplemented DMEM [Dulbecco?s modified essential medium (Sigma-Aldrich, St Louis, USA)] for 7 and 30 days at 37 °C and 5% CO2 environment. The ratio of surface area to volume of conditioning solution was arranged as 0.767 ml according to ISO 10993-12 (2002) [1.25 cm2/ml (± 10%)]. In cytotoxicity testings, pure copper was used as a positive control. Serum and antibiotic added DMEM was used as a negative control. Both control groups were prepared under the same conditions with test specimens. In apoptosis testings, the same solution with the negative control of the cytotoxicity tests and DNase I was used as a positive control according to manufacturer recommends.
By MTT and LDH testings cytotoxic effects on human gingival fibroblasts and with TUNEL testing kit potential apoptosis were determined. Element release and chemical composition were determined by ICP-MS method. Elemental composition and surface composition-depth profile were determined with SEM/EDS and XPS, respectively. Surface morphology-microstructure and roughness were analyzed with SEM, profilometry and AFM methods. 
According to the results of our study, it was concluded that recasting and porcelain firing process had no significant effect on the biocompatibility of the alloys due to cytotoxicity tests. In addition, increasing the conditioning period did not affect the cytotoxicity of the specimens. No evidence of apoptosis was observed in accordance with the cytotoxicity results. According to the analysis of element release, it was clarified that heat treatment had no effect on the element release. The specimens consisting of 50% recasted alloy caused higher Ni release in all conditioning periods compared to the 100% new alloy group when these specimens were not subjected to heat treatment. Only group showing differences in element release between long-term and short-term was the second group (higher Mo release from 30 days-extract than 7 days-extract). Recasting and heat treatment process presented no effect on the alloy composition according to both chemical and elemental composition analysis. Considering the results of surface composition and depth profile analysis, oxide layer of alloy surfaces were consisted of Cr2O3, NiO and MoO3. Cr was the most participated element on the formation of oxide layer.
The macro-roughness was not affected by recasting and heat treatment. However, on the surfaces of heat-treated groups, it was observed that heat treatment caused roughness in a nanoscale. 
Under the all experimental conditions, SEM images showed dark- and light-coloured areas, which were considered as the second, third and oxide phases.