Hidrofobik etkileşim kromatografisi ile plazmid dna saflaştırılması
Plasmid dna purification by using hydrophobic interaction chromatography
Yazar: RECEP ÜZEK
Danışman: PROF. DR. SERAP ŞENEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics ; Kimya = Chemistry
Dizin: Dondurarak kurutma = Freeze drying ; Hidrofilik membran = Hydrophilic membrane ; Hidrofobik etkileşimler = Hydrophobic interactions ; Hidrofobik kromatografi = Hydrophobic chromatography ; Kriyojenik yöntem = Cryogenic method ; Plazmit DNA = Plasmit DNA

Özet:
Plazmid DNA (pDNA) izolasyon ve saflaştırılması için Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi (HIC) tercih edilmiştir. Bu amaçla, nano-iğneler içeren poli(2-hidroksietilmetakrilat-matekriloilamidofenilalanin), poli(HEMA-MAPA) kriyojeller hazırlanmıştır. MAPA monomeri L-fenil alaninin metakriloil klorür ile reaksiyonu sonucunda sentezlenmiştir. Yapısı 1H NMR ve FTIR yöntemleri ile incelenmiştir. Kriyojel sentezinde klasik yöntem izlenmiş, nano-iğneler oluşturarak yüzey alanının artırılması için dondur-kurut (freeze-drying) basamağı eklenmiştir. Karşılaştırma amacıyla poli(HEMA) kriyojelleri de sentezlenmiştir. BET analizleriyle poli(HEMA) kriyojelinin yüzey alanı 21.35 m2/g ve poli(HEMA-MAPA) kriyojelinin ise 36.00 m2/g olarak belirlenmiştir. Hazırlanan poli(HEMA-MAPA) kriyojelinin yapısına giren MAPA miktarı 67.12 µmol/g polimer olarak elementel analiz sonuçlarıyla belirlenmiştir. Yapı içerisindeki MAPA monomerinin varlığı FTIR analizleri ile de ispatlanmıştır. Kriyojellerin içyapısı ve yüzey özellikleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir.Sulu çözeltiden pDNA izolasyonu için 5 mL hacimde (1.20 cm çapında) kolonlar kullanılarak sürekli sistemde adsorpsiyon kapasitesini etkileyen bazı parametreler araştırılmıştır. DNA derişimi UV-görünür spektrofotometrede 260 nm'de ölçülen absorbans değerleri ile hesaplanmıştır. 25oC'de, optimum pH 5.5'de DNA adsorpsiyon kapasitesi 13.98 mg DNA/g kriyojel'dir. Başlangıç derişiminin adsorpsiyon kapasitesine olan etkisi incelendiğinde maksimum adsorpsiyon kapasitesi poli(HEMA) için 8.28 mg/g ve poli(HEMA-MAPA) için ise 45.31 mg/g'dır. Adsorpsiyon kapasitesi iyonik şiddet artışı (maksimum kapasite Na2SO4 ile elde edilmiştir) ve sıcaklık artışı ile (40oC'de maksimum kapasite 15.69 mg/g'dır) artmıştır. Desorpsiyon ajanı asetat (pH 5.5) tamponudur. 1 saatlik uygulama süresi için desorpsiyon oranı %91.57`dir. İzlenen 15 çevrim için adsorpsiyon kapasitesindeki küçük değişmeler (13.65 mg/g'dan 12.50 mg/g'a) matrisin tekrar kullanılabilirliğinin göstergesidir.Adsorpsiyon verileri Langmuir modeline uymuştur. Adsorpsiyon kinetiği yalancı-ikinci derece modeline daha uygun bulunmuştur. Farklı sıcaklıklarda Langmuir modeli uygulanarak ?Ho, ?So ve ?Go değerleri hesaplanmıştır.Poli(HEMA-MAPA) kriyojelleri ile E.coli lizatından izole edilen pDNA'nın saflığının ve molekül ağırlığının belirlenmesi için agaroz jel elektroforez çalışmaları yapılmıştır. Kriyojel süper sarmal (SC) pDNA ile kuvvetli etkişime girmektedir ve elüsyondaki pDNA'nın SC formunun baskın olması bunun göstergesidir. İzole edilen pDNA'nın yaklaşık 7000 baz çifti'ne (bç) sahip olduğu bulunmuştur.Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) tekniğiyle poli(HEMA-MAPA) kriyojellerinin safsızlıklara göre pDNA'ya 237.5 kat daha fazla seçicilik sağladığı bulunmuştur.

Abstract:
?Hydrophobic Interaction Chromatography? (HIC) technique was chosen for isolation and purification of pDNA. Poly(2-hydroxyethyl metacrylate-metacryloylamidophenylalanine), poly(HEMA-MAPA) cryogel containing nano needles was prepared for this purpose. Firstly, the MAPA monomer was synthesized by reaction of L-phenyl-alanine with methacryloyl chloride. The structure was examined by 1H NMR and FTIR methods. A conventional method was followed for cryogels synthesis, except introducing a freeze-drying step to create the nano needles to increase the surface area. Poly(HEMA) cryogels were also prepared for comparison. The surface area determined by BET analysis was 21.35 m2/g and 36.00 m2/g for poly(HEMA) and poly(HEMA-MAPA), respectively. The MAPA content of resulting cryogels was 67.12 µmol/g polymer, based on elementel analysis results. The inclusion of MAPA into the structure was also proven by FTIR spectra. The surface and internal structures of cryogels were identified by SEM micrographs.Several parameters effecting adsorption capacity were examined in continuous mode using columns of 5 mL (diameter: 1.20 cm) in volume to isolate pDNA from aqueous solutions. DNA concentration was determined by absorbance measurements at 260 nm by a UV-visible spectrophotometer. The DNA adsorption capacity was 13.98 mg pDNA/g cryogel at 25oC and for optimum pH of 5.5. The maximum DNA adsorption capacities, 8.28 mg/g for poly(HEMA) and 45.31 mg/g for poly(HEMA-MAPA) were obtained when the effect of initial DNA concentration was examined. The adsorption capacity increased with increasing ionic strength (the maximum capacity was obtained for Na2SO4), and increasing temperature (the maximum capacity was 15.69 mg/g at 40oC). The acetate buffer (pH 5.5) was used as the desorption agent. The desorption ratio was 91.57 % for 1 h treatment. The negligible decrease in adsorption capacity (from 13.65 mg/g to 12.50 mg/g) negligible decrease, proved the reusability of the matrix after 15 cycles applied.The adsorption data fitted to Langmuir model. The adsorption kinetics followed the pseudo-second order model. Using Langmuir model at severel temperatures, ?Ho, ?So and ?Go values were calculated and reported.The purity and molar mass of pDNA isolated from lysate of E.coli by poly(HEMA-MAPA) cryogel were examined by agarose gel electrophoresis studies. The cryogel was in a stronger interaction with SC pDNA, and the approximate base pair of pDNA purified was 7000. SC pDNA was still the dominant form following the elution.Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) technique proved that the poly(HEMA-MAPA) cryogel adsorbed pDNA with a 237.5 fold selectivity with respect to impurities.