Çocukluk çağı tümörlerinde seskiterpen laktonların etkisi
The effect of sesquiterpene lactone in childhood cancer
Yazar: AYLİN EROL
Danışman: PROF. DR. SAFİYE AKTAŞ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Laktonlar = Lactones ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Seskiterpenler = Sesquiterpenes ; Çocuklar = Children ; İnula viscosa = Inula viscosa

Özet:
Çocukluk çağı kanserleri, tedavi ve sağkalım oranlarında ilerleme görülmesine karşın, yeni tedavi stratejilerine gereksinim duyulan bir kanser grubudur.Seskiterpen laktonlar (SL) 100'den fazla çiçekli bitki familyasında bulunan çeşitli doğal ürünler grubudur. SL'lar geleneksel olarak kullanılan birçok tıbbi bitkinin aktif bileşenleridir. SL'lerin değişik kanser gruplarında anti-kanser etkisi kanıtlanmış olup, çocukluk çağı kanserlerinde bu konuyla ilgili yapılmış çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmanın amacı ; dehydroleucodine(DhL) ve yapısında bir çok aktif  SL bulunduğu bilinen  Inula viscosa (Yapışkan Andız Otu) bitkisinin ekstraktlarının etkisinin sisplatin (CDDP) ile karşılaştırılmalı olarak çocukluk çağı kanserlerinde araştırılmasıdır.
In vitro çalışmada, nöroblastom hücre hattı olan KELLY, Ewing sarkom hücre hattı olan SK-ES ve çocukluk çağı karaciğer kanseri hücre hattı olan Hep-G2 hücreleri kullanılmıştır. DhL ve CDDP ticari olarak satın alınmıştır. Inula viscosa  Ağustos 2018' de Manisa Spil Dağı'ndan toplanmıştır. Tür tayini Ege Üniversitesi Botanik Bahçesinde yapılmıştır. Bitkinin ekstraktı, Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'nde katı-sıvı ekstraksiyon yöntemiyle elde edilmiştir. Ekstraktlardan  DPPH yöntemi ile antioksidan aktivite , alüminyum klorit yöntemi ile total flavonoid miktarı ve Folin Coicalteu yöntemi ile total fenolik madde tayinleri yapılmıştır. İnce tabaka kromatografi yöntemi ile ekstraktların analiz ve görüntülenmesi yapılmıştır. Hücre hatları kültüre edilip, 96 well platede dört farklı çözücü ile hazırlanmış ekstrakt, DhL ve CDDP'in LD50 dozları MTT hücre canlılık testi ile saptanmıştır. Etkin bulunan LD50 dozları 6 well platede tüm hücre hatlarına uygulanmış, canlılık ve sonra akım sitometride Annexin V+PI testi ile apoptoz ve nekroz yüzdeleri saptanmıştır.Toluidin mavisi boyaması ile hücrelerdeki morfolojik değişiklikler incelenmiştir. Bu kapsamda proliferasyon indeksi olarak Ki67, apoptoz mekanizmasını belirleme amacıyla Kaspaz 3,8,9 ile immünohistokimyasal incelemeler yapılmıştır. 
Bulgularımız Mann Whitney U testi ile p<0,05 düzeyinde karşılaştırılmıştır. Nöroblastom hücre hattı Kelly için CDDP proliferasyon ve apoptoz üzerinde beklenen güçlü etkiyi göstermiştir. DhL ve Metanol çözücülü bitki ekstraktı (MBE) 'nin ise CDDP 'ye göre proliferasyonu daha az azalttığı halde hücreleri apoptoza sürüklediği görülmüştür. Çocukluk çağı karaciğer kanseri hücre hattı HEP-G2 için CDDP, MBE, DhL 'nin  proliferasyonda benzer miktarda azalmaya sebep olduğu , her üç ajanında hücreleri apoptoza sürüklediği ve apoptotik intrinsik yolağı daha çok kullandığı görülmüştür. Ewing sarkom hücre hattı SK-ES için DhL ve MBE 'nin proliferasyonu CDDP' e göre daha az azalttığı fakat hücreleri bariz biçimde apoptoza sürüklediği görülmüştür.
Klinikte tedavide kullanılan bir ajan olan CDDP  kıyasla bakıldığında her iki madde benzer ve istatistiksel olarak anlamlı şekilde anti-kanser aktivite göstermiştir. Ve bu etkiyi apoptoz ve nekroptoz üzerinden yapmıştır. Bu ajanlarla ilgili in vivo deneylerin de planlanması gerekmektedir. In vivo deneylerinin tamamlanması ve moleküler mekanizmalarının tam olarak açıklanması sonrasında ülkemizde doğal olarak bulunan bu bitki  klinikte işlevsel olarak kullanılan bir, pediatrik anti-kanser ajan olma adayıdır.


Anahtar Kelimeler:Çocukluk çağı tümörleri,Seskiterpen Lakton,Inula viscosa,

Abstract:
Childhood cancer, although there is a progress in treatment and survival rates, is a cancer group in which new strategies for treatment are required. Sesquiterpene lactones (SLs) are a group of natural products found in more than 100 flowering plant families. SLs are active components of many conventional medicinal plants. The anti-cancer effect of SLs had been proved, yet there has not been any related research conducted in childhood cancer. The aim of this study is to investigate the effects of dehyroleucodine (DhL) and extracts of Inula viscosa, which contains high levels of active SLs, on childhood cancers comparatively with cisplatin (CDDP) used in classical chemotherapy. 
In in vitro study; Neuroblastoma cell line KELLY, Ewing sarcoma cell line SK-ES and Hepatocellular Carcinoma cell line Hep-G2 cells were used. DhL and CDDP were commercially purchased. Inula viscosa was gathered from Spil Mountain in Manisa, in August 2018. Identification of the species was conducted in Ege University Botanical Garden. The extract of the plant was obtained by solid-liquid extraction method at Ege University Faculty of Pharmacy. The antioxidant activity was determined by DPPH method, total flavonoid amount by aluminum chloride method and total phenolic substance determination by using Folin Coicalteu method. Thin layer chromatography method was used to analyze and visualize the extracts. Cell lines were cultured and 96 well-plated extracts prepared with four different solvents, LD50 doses of  DhL and CDDP were determined by MTT cell viability test. Active LD50 doses were applied to all cell lines in 6 well-plates and viability and apoptosis and necrosis percentages were determined by Annexin V + PI test in flow cytometry. Morphological changes in cells were investigated with Toluidine Blue staining. In this context, Ki67 as a proliferation index, Caspase 3, 8, 9 for identifying apoptosis mechanism and immunohistochemical studies were performed. 
Our results were compared with Mann Whitney U test at p <0.05 level. For Kelly, a Neuroblastoma cell line, CDDP showed the expected strong effect on proliferation and apoptosis. It was observed that DhL and plant extract with methanol solvent (MBE) led to apoptosis although it reduced the proliferation less than CDDP.
It is found that CDDP, MBE, and DhL, for childhood liver cancer cell line HEP-G2, caused a similar reduction in proliferation, the three agents led to apoptosis in cells and used apoptotic intrinsic pathway further. For SK-ES, an Ewing sarcoma cell line, DhL and MBE have been shown to reduce proliferation less than CDDP, but evidently, lead to apoptosis. 
When compared to CDDP, a drug used in the cancer treatment, both items showed similar and statistically significant anti-cancer activity. They also demonstrated this effect via apoptosis and necroptosis. In vivo experiments related to these agents should also be planned. This plant, which is naturally found in our country, after completion of in vivo experiments and full disclosure of molecular mechanisms, is a candidate for being a pediatric anti-cancer agent functionally used in the clinic.


Keywords:Childhood cancer,Sesquiterpene Lactone,Inula viscosa,