Kolorektal karsinoma tanısı alan hastalarda KRAS, BRAF onkogen yapısal mutasyonları ve bazı tümör süpresör genlerin (HIC-1, P16, DAPK1, SFRP2 ve MGMT) dokuya özgü metilasyon profillerinin karşılaştırılması
Comparision of KRAS, BRAF oncogene mutations and tissue spesific promoter hypermethylation of some tumor suppressor genes (HIC-1, P16, DAPK1, SFRP2 and MGMT)
Yazar: BİNNUR KÖKSAL
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MUSA SARI
Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Kanser genomda meydana gelen genetik ve epigenetik değişimlerin neden olduğu kontrolsüz hücre bölünmesidir. Kolorektal kanser dünya genelinde hem kadın hem de erkeklerde 3. en sık kanser türüdür. Bu güne kadar kolorektal kanser genetiği ile ilgili pek çok onkogen mutasyonu ve tümör süpresör gen hipermetilasyonu değerlendirilmiş ve kolorektal kanser oluşumundaki yerleri belirlenmeye çalışılmıştır. Bu tez kapsamında kolorektal kanser dokularında KRAS ve BRAF onkogen mutasyon sıklıkları, HIC1, SFRP2, P16, DAPK1 ve MGMT tümör süpresör genlerinin promotör hipermetilasyon profilleri ve bu genlerdeki hipermetilasyonların onkogen mutasyonları ile olası ilişkisinin araştırılması amaçlanmıştır.Bu amaçla çalışmaya 93 adet kolorektal kanser dokusu (32 kadın, 61 erkek; ortalama yaş 65.59±14.19) ve 14 adet (5 kadın, 9 erkek; ortalama yaş 63,89±5.9) kolorektal kanserli bireylere ait normal kolon mukozası dahil edilmiştir. Dokulardan izole edilen genomik DNA'larda 12 adet KRAS mutasyonu (kodon 12Val, kodon 12Asp, kodon 12Leu, kodon 12Ser, kodon 12Ala, kodon 12 Ile, kodon 12Cys, kodon 12Arg, kodon 13Cys, kodon 13Asp) revers-hibridizasyon strip test yöntemi ile araştırılmıştır. BRAF V600E mutasyonu restriksiyon fragment uzunluk polimorfizmi (RFLP) yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Tümör süpresör genler DNA'nın bisülfit modifikasyonunun ardından metil spesifik PCR (MSP) ile amlifiye edilmiş ve revers-hibridizasyon strip test tekniği ile promotör hipermetilasyon profilleri belirlenmiştir.Yapılan deneyler sonrasında hasta grubunda KRAS mutasyon frekansı % 54.84 (n=51), BRAF mutasyon frekansı % 12.9 (n=12) olarak saptandı. SFRP2, DAPK1, MGMT, HIC1 ve p16 genlerinin promotör hipermetilasyon frekansları sırası ile % 66.7, % 45.2, % 40.9, %40.9, % 15.1 olarak belirlendi. KRAS gen mutasyonu ve tümör süpresör gen promotör hipermetilasyon birliktelikleri istatistiksel olarak anlam ifade etmezken BRAF V600E mutasyonları ile hipermetile SFRP2 (p=0.005) ve hipermetile p16 genlerinin (p=0.016) birlikte bulunmalarının anlamlı derecede sık olduğu saptandı.Sonuç olarak; bu araştırmadan elde edilen bulgular ışığında KRAS mutasyonu ve SFRP2 hipermetilasyonu kolorektal kanser onkogenezinde önemli rol oynamaktadır. BRAF V600E mutasyonu tümör süpressör gen hipermetilasyonu ile ilişkili bulunmuştur. Genetik ve epigenetik analizler tüm kanser türleri için kanser başlaması, seyri ve tedavi yöntemlerini seçimi için belirleyici rol üstlenmektedirler.

Abstract:
Cancer is uncontrolled cell proliferation which is caused by genetic and epigenetic alterations occurred in genome. Colorectal cancer is third frequent cancer in both woman and man worldwide. Until today a lot of oncogene mutations and tumor suppressor genes promoter hypermethylation were evaluated and the roles of these genes in colorectal carcinogenesis were tried to determine. Within the context of current thesis, frequencies of oncogen KRAS and BRAF mutations, promoter hypermethylation profiles of tumor suppressor genes HIC1, SFRP2, P16, DAPK1 and MGMT and possible associations between hypermethylations of these genes and KRAS and BRAF mutations were aimed to find out.For this purpose 93 colorectal cancer tissue (32 woman, 61 man; mean age: 65.59±14.19) and 14 normal colon mucosa which belong to colorectal cancer patients were included in the study. In the isolated genomic DNA, twelve KRAS gene mutation (codon 12Val, codon 12Asp, codon 12Leu, codon 12Ser, codon 12Ala, codon 12 Ile, codon 12Cys, codon 12Arg, codon 13Cys, codon 13Asp) were investigated with using reverse-hybridisation strip assay method. BRAF V600E mutations were investigated with using restriction fragment length polymorphism (RFLP). Tumor suppressor genes were amplified with MSP after bi-sulphide modification of DNA and by using reverse-hybridisation strip assay method, tumor suppressor gene promoter hypermethylation profiles of five genes were determined.In the patient group KRAS and BRAF frequency mutation were determined as 54.84% (n=51) and 12.9% (n=12) respectively. Promoter hypermethylation frequencies of tumor suppressor genes SFRP2, DAPK1, MGMT, HIC1 and p16 were determined as 66.7%, 45.2%, 40.9%, 40.9 %, 15.1% respectively. No statistically significant associations were found between KRAS gene mutation and tumor suppressor gene hypermethylation. Statistically significant associations were found between BRAF gene mutations and SFRP2 and p16 tumor suppressor gene hypermethylation (p=0.005 for SFRP2 and p=0.016 for p16).As a result in the ligth of the findings which are obtained from this study, KRAS mutations and SFRP2 tumor suppressor gene promoter hypermethylations play important role in colorectal cancer oncogenesis. BRAF V600E mutation was found to be related with tumor suppressor gene hypermethylation. Genetic and epigenetic analyses have determining role for all cancer types in the oncogenesis, prognosis and selection of treatment regimens.