Sağlıklı ve diabet oluşturulmuş farelerin karaciğer dokusunda glutatyon peroksidaz enziminin immunohistokimyasal lokalizasyonu ve RT PCR ile gen ekspresyonu
The immunohistochemical localization and gene expression by RT-PCR profiles of glutathione peroxidase in liver of healthy and diabetic mice
Yazar: TURGAY DEPREM
Danışman: PROF. DR. NURHAYAT YECAN GÜLMEZ
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Glütatyon peroksidaz = Glutathione peroxidase ; Histoloji = Histology ; Karaciğer = Liver ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Bu araştırma, sağlıklı ve diabetik farelerin karaciğerlerinde glutatyon peroksidaz 1 enziminin gen ekspresyon düzeyini, enzimin dokudaki lokalizasyonunu ve karaciğerde meydana gelen yapısal değişikleri histolojik olarak incelemek amacıyla yapıldı. Çalışmada, materyal olarak 36 adet swiss albino fare kullanıldı.Çalışmada deneme grubuna, Na sitrat tamponu içinde çözdürülen streptozotosin (100 mg/kg), sham grubuna ise Na sitrat tamponu i.p. olarak uygulandı. Deney süresince standart fare yemi ve su ile ad libitum beslenen deneklerin tümünden karaciğer örnekleri 3, 15 ve 30. günlerde alındı. Glutatyon peroksidazın gen ekspresyon düzeyini tespit etmek için RT-PCR yöntemi kullanıldı. Glutatyon peroksidaz enziminin dokudaki lokalizasyonu immunohistokimyasal olarak incelendi. Histolojik incelemeler için hematoksilen eosin (HE), Crossmanın üçlü boyaması ve periodik asit Shiff (PAS) boyama yöntemleri kullanıldı. Enzimin protein aktivite tayini Matkowich ve arkadaşlarının yöntemine göre yapıldı. Ayrıca, grupların canlı ağırlık ve karaciğer ağırlıkları da karşılaştırıldı.Çalışmada diabetik grupta kan glikoz değeri ortalamasının diabetin oluşumunun teyit edildiği 3. günden itibaren 30 günlük süreç içerisinde 300 mg/dl üzeri devam ettiği tespit edildi. GPx 1 enzim aktivitesinin hem sham ve kontrol gruplarına göre hem de denemenin kendi içinde düşük olduğu, GPx 1 gen ekspresyonu yönünden deneme ile sham grupları arasında bir fark olmadığı ancak deneme grubu içinde istatistike yansımayan bir azalma olduğu tespit edildi. Tüm gruplarda GPx 1'in benzer özellikte immunolokalizasyon gösterdiği ancak deneme grubunda diğer gruplara göre daha zayıf olduğu tespit edildi. GPx 1 immunoreaktivitesinin, bazı hepatositlerde sitoplazmik, bazılarında ise hem sitoplazmik hem de nükleer tarzda olduğu ve özellikle vena sentralis ile Kiernan aralığı civarındaki hepatositlerde daha yoğun olduğu gözlendi. Deneme grubu karaciğer hepatositlerinin sitoplazmalarında karaciğer lipidozisi, bazı hepatositlerin taşlı bir yüzük şeklini aldığı, hepatositlerde ve çekirdeklerinde büyüme ve çekirdek içi inklüzyon cisimciklerine de rastlandı. Deneme grubunda, diğer gruplara göre canlı ağırlıkta azalma karaciğer ağırlığında ise artış olduğu bulundu.Yapılan araştırmada 30 günlük deney sürecinde diabetin, GPx 1 gen ekspresyonu üzerinde istatistiksel düzeyde anlamlı bir etkisinin olmadığı tespit edildi. Bununla birlikte araştırmanın daha ileri teknikler kullanılarak yapılacak olan diabet araştırmalarında yardımcı olabileceği sonucuna varıldı.

Abstract:
The objective of the present study was to evaluate gene expression patterns of glutathione peroxidase 1, its tissue localization by immunohistochemistry method and the structural aberration of healty and diabetic mouse liver by routine histological techniques. In this study, 36 swiss albino mice were used.In this study, Streptozotosin (STZ, 100 mg / kg ) prepared within Na citrate buffer solution was apllied for treatment group and Na citrate buffer solution was applied for sham group as intra peritoneal injection. Animals were feeded with standard mouse feed as ad libitum during the experiments. All liver samples from subjects from 3rd, 15th and 30th days were included. To determine the level of glutathione peroxidase 1 gene expression level, RT-PCR technique was used. Tissue localization of glutathione peroxidase 1 enzyme was analysed by immunohistochemical methods. Haematoxylin and eosin (H & E), Crossmans modification of triple staining and Periodic acid Shiff (PAS) staining methods were used for histological examination. Matkowich's method was used for determination of enzyme activity of glutathione peroxidase 1. In addition, groups were compared with body weight and liver weight.The average value of blood glucose in diabetic study group confirmed the formation of the diabetes with over the value of 300 mg/dl starting from 3rd day of the experiment to the end of the 30-day period. Both sham and control groups of GPx enzyme activity was seen low in the experiment itself whereas gene expression of GPx 1 experiment was not found to be different. However, a decrease not reflected by statistical methods was observed within the experimental groups. Similar features in all groups of GPx 1 immunolocalization were observed whereas this immunstaining was relatively weak comparing with the other groups. The nuclear and cytoplasmic immunoreactivity of GPx 1 was found in all hepatocytes with the high intensity in hepatocytes surrounding kiernan area. Lipidosis, ring-like nucleus transformation and kernel inclusion were found in hepatocytes of experimental group. The treatment group had lower body weights along with the increased liver weights compared with the control and sham groups.It was found in this study that diabetes has no statistically significant effect on GPx 1 gene expression. This finding may help for further investigation on diabetic research using detailed techniques.