Klinik örneklerden izole edilen candida norvegensis izolatlarının moleküler epidemiyolojisi, virülans faktörleri ve antifungal duyarlılık paternlerinin araştırılması
Investigation of the molecular epidemiology, virulance factors and antifungal sensitivity patterns of candida norvegensis isolates isolated from clinical samples
Yazar: OSMAN KÜÇÜKOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. FATMA MUTLU SARIGÜZEL ; PROF. DR. AYŞE NEDRET KOÇ
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Antifungal duyarlılık testleri = Antifungal sensitivity tests ; Candida inconspicua = Candida inconspicua ; Candida norvegensis = Candida norvegensis ; Epidemiyoloji = Epidemiology ; Kandida = Candida ; Virülans faktörleri = Virulence factors

Özet:
Amaç: Candida norvegensis özellikle immunsuprese bireylerde, başta solunum yolu enfeksiyonları olmak üzere çeşitli enfeksiyonlara neden olmaktadır. Flukonazole karşı azalmış duyarlılık göstermesiyle son zamanlarda önemi gittikçe artan bu patojen, fenotipik açıdan Candida inconspicua ile yüksek düzeyde benzerlik gösterdiği için konvansiyonel tanı yöntemleriyle bu iki türün ayrımında çoğunlukla hatalı tanımlamalar olmaktadır.
Bu çalışmada, çeşitli örneklerden izole edilen C. norvegensis izolatlarının moleküler
epidemiyolojisi, virülans faktörleri ve antifungal duyarlılık paternlerinin değerlendirilmesi amaçlandı.
Gereç ve yöntem: Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastaneleri'nde Ocak 2015-Temmuz 2021 tarihleri arasında takip edilmiş 40 hastadan alınan klinik örnekler çalışmaya dahil edildi. İzolatlar rutin konvansiyonel yöntemlerle tanımlandı. Ayrıca, rutin tanımlamada bulunmayan eskülin hidroliz aktivitesi de değerlendirildi. Bu izolatlardan 30 tanesi için rDNA'daki üç gen bölgesi kullanılarak dizi analizi gerçekleştirildi. Evrimsel yakınlığın belirlenmesi için çalışmadaki suşlarla birlikte
Genbank veri tabanında kayıtlı Pichia captophilia kladındaki bazı referans suşlar ve dış grup olarak C. krusei referans suşu kullanılarak neighbour-joining yöntemiyle filogenetik ağaç oluşturuldu. Virülans faktörleri fenotipik olarak araştırıldı. Suşların MİK (Minimum inhibitör konsantrasyon) değerleri, CLSI M60-Ed2 rehberinin önerdiği sıvı mikrodilüsyon ve kolorimetrik temelli Sensititre™ YeastOne™ AST Plate (Thermo Fisher Scientific™, ABD) ticari mikrodilüsyon yöntemleriyle belirlendi.
Verilerin analizinde SPSS v28.0 (IBM Co, New York, ABD) programı kullanıldı.Değişkenlerin ortalama, ortanca ve yüzde değerleri hesaplandı. Kategorik değişkenler için "Fisher exact ki kare" ve "ki kare" testleri; parametrik olmayan sayısal değişkenler için ise "Wilcoxon T" testi kullanıldı. p<0,05 değeri istatiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Bulgular: Konvansiyonel yöntemlerle C. norvegensis olarak tanımlanan suşlar, ITS1-5,8S-ITS2 (Internal transcribed spacer1-2), EF-1 (Elongation factor-1) alfa ve D1/D2 gen bölgeleri kullanılarak yapılan dizi analizi sonucunda C. inconspicua olarak tanımlandı. Evrimsel yakınlığın değerlendirilmesinde kullanılan gen bölgelerinin tür içi nükleotid varyasyonları göstermediği ve suşların tamamında benzer olduğu görüldü. Suşların izole edildiği klinik örneklerin gönderildiği bölümler ve gönderilme zamanları dikkate alındığında, salgını düşündürecek bir klonal ilişki bulunamadı.
Suşların tamamında esteraz aktivitesi, %97,5 (39/40)'inde fosfolipaz aktivitesi ve %37,5 (15/40)'inde biyofilm formasyonu pozitif olarak bulundu. Bütün suşlarda proteinaz aktivitesi negatifti. Sıvı mikrodilüsyon ve SensititreTM YeastoneTM AST Plate (Thermo Fisher Scientific™) yöntemleriyle en yüksek MİK50/MİK90 değerlerinin sırasıyla flukonazol ve 5-florositozine ait olduğu saptandı. Her bir yöntem için 24 ve 48. saatteki MİK değerleri karşılaştırıldığında, MİK ortanca ve minimum-maksimum değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulundu (p<0,05).
Sonuç: C. norvegensis ve C. inconscipua ayrımında konvansiyonel yöntemlerin yetersiz olduğu; ITS1-5,8S-ITS2, EF-1 alfa ve D1/D2 gen bölgeleri hedeflenerek gerçekleştirilen dizi analizinin tür düzeyinde kesin ayrım gösterdiği belirlenmiştir. Bu gen bölgelerinin filogenetik analizinin suşlar arasındaki moleküler epidemiyolojik ilişkiyi ortaya koymada yeterli olmadığı; bu nedenle MLST (Multi- Locus Sequence Typing), PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) gibi farklı moleküler yaklaşımlara ihtiyaç olduğu düşünülmüştür. Eskülin hidrolizi testinin diğer konvansiyonel yöntemlere kıyasla yüksek ayrım gücüne sahip olduğu ve moleküler tanı testlerinin bulunmadığı durumlarda başvurulabilecek alternatif bir test olduğu belirlenmiştir. Esteraz, fosfolipaz aktiviteleri ve biyofilm formasyonunun bu türün virülansında rol oynayabileceği düşünülmüştür. Ek olarak,flukonazole karşı invitro saptanan yüksek MİK değerlerinin antifungal tedavi seçiminde göz önünde bulundurulması gerekmektedir.
Anahtar kelimeler: Antifungal duyarlılık, Candida norvegensis, Candida inconspicua, Filogenetik analiz, Ribozomal DNA analizi, Virülans.

Abstract:
Objective: Candida norvegensis causes various infections, especially respiratory tract infections, in particular immunosuppressed individuals. This pathogen, which has become increasingly important recently due to its decreased susceptibility to fluconazole, has a high level of similarity with Candida inconspicua in terms of phenotypic, so there are often erroneous definitions in the distinction of these two species by conventional diagnostic methods.
In this study, it was aimed to evaluate the molecular epidemiology, virulence factors and antifungal sensitivity patterns of C. norvegensis isolates isolated from various samples.
Materials and methods: Clinical samples taken from 40 patients followed in Erciyes University Medical Faculty Hospitals between January 2015 and July 2021 were included in the study. Isolates were identified by conventional methods in the routine diagnostic process. In addition, esculin hydrolysis activity, which is not included in the routine identification, was also evaluated. Sequence analysis was performed for thirty of all isolates using three gene regions in the rDNA. In order to determine evolutionary closeness was used to the neighbor-joining method. Phylogenetic tree
was created using some reference strains from the clade Pichia captophilia registered in the Genbank database, together with the strains in the study, and the C. krusei reference strain as the outgroup. Virulence factors were investigated by phenotypically. MIC (Minimum inhibitory concentration) values of the strains were obtained by broth microdilution and colorimetric-based Sensititre™ YeastOne™ AST Plate (Thermo Fisher Scientific™, USA) commercial microdilution methods
recommended by the CLSI M60-Ed2 guideline. SPSS v28.0 (IBM Co, New York, USA) program was used in the analysis of the data. Mean, median and percentage values were calculated for the variables. "Fisher exact chi-square" and "chi-square" tests for categorical variables; "Wilcoxon T" test was used for non-parametric numerical variables. A p value of <0.05 was considered statistically significant.
Results: Strains defined as C. norvegensis by conventional methods were defined as C. inconspicua as a result of sequence analysis using ITS1-5.8S-ITS2 (Internal transcribed spacer1-2), EF-1(Elongation factor-1) alpha and D1/D2 gene regions. It was observed that the gene regions used in the evaluation of evolutionary closeness did not show intraspecies nucleotide variations and were similar in all strains. No clonal association was found to suggest an outbreak, considering the departments where the strains in the study were isolated from and the time of sending the clinical samples. Esterase activity was positive and secretory aspartyl proteinase activity was negative in all of the strains. In addition, biofilm formation was positive in 37.5% (15/40) and phospholipase activity was positive in 97.5% (39/40). High MIC50/MIC90 values were determined for fluconazole by all three methods, for 5-fluorocytosine by broth microdilution and SensititreTM YeastoneTM AST Plate methods. When the MIC
values determined at 24 and 48 hours for each method were compared, a statistically significant difference was found between the median and minimum-maximum values of the MIC (p<0.05).
Conclusion: Conventional methods are insufficient for the differentiation of C. norvegensis and C. inconspicua species. Sequence analysis performed by targeting ITS1-5.8S-ITS2, EF-1 alpha and D1/D2 gene regions could definitely discrimination of between these species. The phylogenetic analysis of these gene regions is not sufficient to reveal the molecular epidemiological relationship between the strains; For this purpose, it is thought that different molecular approaches such as MLST (MultiLocus Sequence Typing) and PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) are needed. It has been determined that the esculin hydrolysis test has a high discrimination power compared to other conventional methods and is an alternative test that can be applied in cases where molecular diagnostic tests are not available. Esterase, phospholipase activities and biofilm formation were thought to play a role in the virulence of this species. In addition, high MIC values detected in vitro against fluconazole should be considered in the selection of antifungal therapy.
Keywords: Antifungal susceptibility, Candida norvegensis, Candida inconspicua, Phylogenetic analysis, Ribosomal DNA analysis, Virulence.