Silimarinin insan sperm kriyopreservasyonunda antioksidan etkisi
Antioxidant effect of silimarin on human sperm cryopreservation
Yazar: SEDA ATAY
Danışman: PROF. ENDER ERDOĞAN
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Silimarin = Silymarin ; Sperm = Spermatozoa

Özet:
Bu çalışma insan sperm kriyopreservasyonu sırasında, spermde meydana gelen kriyohasarın sonucu olarak, sperm parametrelerinde meydana gelen olumsuz etkiyi azaltmak için, dondurma ortamına eklenen silimarin antioksidanın etkisini araştırmak üzere yapılmıştır.  Silimarin, devedikeni (Silybum marianum) bitkisinin tohum ve meyvelerinin ektresinden elde edilen bir flavonoiddir. Silimarin, uzun yıllarıdır klinik olarak alkole bağlı karaciğer hastalıklarının tedavisinde ve anti-hepatotoksik ajan olarak kullanılmaktadır. Fakat silimarinin asıl aktivitesi; içerdiği flavano-lignanlar ve diğer polifenolik bileşikler ile güçlü antioksidan özellik göstermesidir. 20 normospermik bireyin semen örneği çalışmaya dahil edilmiş olup, örnekler çalışma için 6 gruba ayrılmıştır. İlk grup kriyopreservasyon işleminin spermde oluşturduğu kriyohasarın tespiti için taze semen örneğinin kullanıldığı kontrol grubudur. Diğer gruplar ise eklenen farklı konsantrayonlarda silimarinin dondurulup çözülen sperm üzerinde etkisinin araştırılması için oluşturulmuştur. Bunun için örnek 5'e bölünmüş ve sırasıyla 0, 20, 100, 500 ve 1000 µg/ml silimarin, sperm dondurma ortamına eklenmiştir. 72 saat boyunca -196 Co'lik likit azot tankında saklama işlemi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra örnekler 37 Co'de çözdürülmüş ve tüm gruplarda: motilite, plazma membran bütünlüğü, mitokondriyal aktivite, akrozomal bütünlük ve apopitozis parametrelerine bakılmıştır.  Dondurup çözme işleminin sperm parametreleri üzerindeki etkisine bakmak için taze semen örneği ile silimarin eklenmeden (0 µg/ml) dondurulup çözülmüş grup karşılaştırılmış ve kriyopreservasyon işleminin sperm parametrelerinin tümünü anlamlı (p˂0,05) düzeyde olumsuz etkilediği görülmüştür. Kriyohasar üzerine silimarinin etkisinin araştırılması içinde sperm dondurma ortamına değişen dozlarda silimarin eklenen gruplarda sperm parametreleri karşılaştırılmıştır. Motilite, plazma membran bütünlüğü ve mitokondriyal aktivite için en etkili silimarin konstrasyonun: 100 µg/ml ve 500 µg/ml olduğu bulunmuştur. Akrozomal bütünlüğün ise en iyi 1000 µg/ml silimarin eklenen grupta korunduğu görülmüş ve apopitozis değerlendirmesi için kullanılan % kaspaz 3 değeri en düşük 20 µg/ml ve 100 µg/ml silimarin içeren gruplarda olduğu bulunmuştur. Sonuçlarımıza göre: sperm kriyopreservasyon ortamına silimarin antioksidanın takviyesi dondurup çözme işlemi sonrası spermde meydana gelen hasarı önemli derecede azaltmıştır. Hücrede doğrudan serbest radikal temizleme ve mitokondri üzerinde koruyucu etki özelliği olan silimarinin, kriyohasarın ana sebebi olarak görülen serbest oksijen radikalleri (ROS)'un oluşturduğu zararlı etkiyi baskılayabildiği gösterilmiş olup, insan sperm kriyopreservasyonunda kullanılabileceğini gösteren ilk çalışma olmuştur.

Abstract:
This study was conducted to investigate the effect of silymarin antioxidant added to the freezing medium in order to reduce adverse effects on sperm parameters as a consequence of cryoinjury during human sperm cryopreservation. Silymarin is a flavonoid derived from the extracts of seeds and fruits of the milk thistle (Silybum marianum)plant. Silymarin has been used for many years in the treatment of alcoholic liver diseases clinically and as an anti-hepatotoxic agent. But the actual activity of silimarin is; contain flavano-lignans and other polyphenolic compounds and exhibit strong antioxidant properties. Samples of 20 normospermic individuals were included in the study and the samples were divided into 6 groups for study. The first group is the control group in which fresh semen samples are used to detect cryoinjury to the sperm of the cryopreservation process.The other groups were established to investigate the effect of silymarin on frozen spermatozoa in different concentrations. For this, the sample was divided into 5 and added to the freezing medium of 0 μg / ml, 20 μg / ml, 100 μg / ml, 500 μg / ml and 1000 μg / ml silymarin sperm respectively. Storage was carried out in a 196°C liquid nitrogen tank for 72 hours.The samples were then thawed at 37°C and the motility, plasma membrane integrity, mitochondrial activity, acrosomal integrity and apoptosis parameters were examined in all groups. In order to see the effect of freezing and thawing on the sperm parameters, frozen-thawed group was compared without addition of silymarin (0 μg / ml) with fresh sample of sperm and the cryopreservation process was found to negatively affect sperm parameters as a whole (p˂0.05). Sperm parameters were compared in groups of 0, 10, 100, 500, and 1000 μg / ml silymarin added to sperm freezing medium in the investigation of the effect of silimarin on cryoinjury.The most effective silymarin constructions for motility, plasma membrane integrity and mitochondrial activity were found to be 100 μg / ml and 500 μg / ml. Acrosomal integrity was best preserved in the 1000 μg / ml silymarin added group and the% Caspase 3rate used for apoptosis evaluation was found to be lowest in groups containing 20 μg / ml and 100 μg / ml silymarin. According to our results, the addition of silymarin antioxidant to the sperm cryopreservation medium reduced freezing damage to the sperm after freezing and thawing. Direct free radical scavenging and direct protective action on mitochondria have been shown to silymarin inhibit the deleterious effect of caused by free oxygene radicals (ROS), the main cause of cryoinjury, and have been the first study showing that it can be used in cryopreservation of human sperm