Absans epilepside duyusal nöronlarda kalsiyum homeostazisi ve sinyalleşmesinin genetik epileptik WAG/RİJ sıçanlardan izole edilen trigeminal gangliyon hücrelerinde incelenmesi
Investigation of calcium homeostasis and signalling in absence epilepsy using trigeminal ganglion cells isolated from genetic epileptic WAG/RİJ rats
Yazar: BÜŞRA PERİHAN YÜCEL
Danışman: PROF. DR. AHMET AYAR
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Ağrı = Pain ; Elektrofizyoloji = Electrophysiology ; Epilepsi = Epilepsy ; Epilepsi-absans = Epilepsy-absence ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kalsiyum = Calcium ; Migren hastalıkları = Migraine disorders ; Nöronlar = Neurons ; Sıçanlar = Rats ; Trigeminal ganglion = Trigeminal ganglion

Özet:
Epilepsi sendromlarında migren gibi baş ağrısı görülme sıklığının fazla olması, epileptogenezin ağrı duyarlılaşmasına neden olabileceğini düşündürmektedir. Trigeminal gangliyon (TG) nöronları tipik nosiseptörlere örnek olup; ağrı/nosisepsiyonla alakalı reseptör ve iyon kanallarının çoğunun ifade edildiği bu yapılar baş ve yüz bölgesi ile alakalı sinyallerin başlamasının ilk kademesini teşkil eder. Bu süreçte, hücre içi serbest kalsiyum ([Ca+2]i) seviyesindeki artış ağrı oluşum ve iletiminde kritik öneme sahiptir. Epileptiklerde yüksek seyreden migren/baş ağrısının TG ile temsil edilen nosiseptörlerin aktivasyon mekanizmasından mı yoksa bu ağrının santral işlenmesinden mi kaynaklandığı bilinmemektedir. Bu amaçla TG nöronlarda kalsiyum homeostazisi ve algojenik ajanlara [Ca+2]i artışı cevapları WAG/Rij epileptik ve sağlıklı Wistarlar arasında karşılaştırıldı. 
Yetişkin WAG/Rij (absans epileptik nöbet geçiren) ve Wistar sıçanlardan izole edilen TG'ler enzimatik ve mekanik işlemlerle TG nöronlarına ayrıştırılarak kültüre edildi. Daha sonra kalsiyuma duyarlı floresan boya olarak fura-2 AM ile yüklenen TG nöronları; kapsaisin (1 µM, acı biberin etken maddesi, algojenik ajan olarak), yüksek hücre dışı KCl (60 mM, non-spesifik membran depolarizasyonu) ve ATP (100 mM, purinerjik agonist olan algojenik ajan) ile uyarıldı. Bu uyarılarla indüklenen [Ca+2]i (Eksitasyon: 340 nm/380 nm, emisyon @ 510 nm) cevapları, dijital mikroskobik görüntü analiz sistemiyle kayıt edildi ve kalsiyum kanal blokeri diltiazemin [Ca+2]i cevapları üzerine etkisi, ajanlar uygulanmadan önce 50 saniye (s) ön-muamale yapılarak incelendi. Hücrelerin 340 nm/380 nm floresan oranında artış [Ca+2]i belirteci olarak kullanıldı. Bulguların istatistiksel değerlendirilmesinde Student t-testi kullanıldı.   
WAG/Rij sıçan TG hücreleri ATP uygulamasına [Ca+2]i düzeyinde artışla cevap verdi. Normal koşullarda WAG/Rij sıçanlardan izole edilen TG hücrelerinde pik ATP cevabı 340 nm/380 nm oranı [1.40±0.17 (n=19)] düzeyinde iken; diltiazem ile ön-muamele sonrası bu cevap [1.28±0.12 (n=10)] düzeyinde baskılanmış olarak gerçekleşti (p<0.05). Wistar sıçanlardan izole edilen TG nöronlarında bazal şartlardaki pik ATP cevabı [1.66±0.21 (n=14)] oranındayken diltiazem ön-muamelesi sonrası bu değer [1.27±0.16 (n=14)], yani anlamlı düzeyde düşüktü (p<0.005). TG nöronlarının nosiseptif uyaran kapsaisine cevabı WAG/Rij grubunda [2.78±0.52 (n=9)] Wistar grubunda ise [2.42±0.79 (n=20)] olarak tespit edildi (p<0.05).  Hem Wistar hem WAG/Rij sıçan duyusal nöronları nosiseptif uyarılara [Ca+2]i artışı ile cevap verdi. 
Bu tez çalışmasının bulguları epileptik WAG/Rij sıçanların TG nöron nosiseptif kalsiyum sinyallerinin sağlıklı Wistarlarınkine benzer olduğunu göstermektedir. Epilepside daha yüksek olan baş ağrısının oluşmasına TG nöronlarında kalsiyum sinyalleşmesinin anlamlı deredece aracılık etmediği düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: Ağrı, epilepsi, migren, trigeminal gangliyon

Abstract:
The high incidence of comorbidities of migraine headache and epilepsy syndromes suggest that epileptogenesis may cause pain sensitization. Trigeminal ganglion (TG) neurons, are typical nociceptors,  express most of the ion channels and receptors involved in nociception/pain, and their activation represents the first stage in pain signals from the orofacial region. In this process, the increase in intracellular free calcium ([Ca+2]i) level has a critical role in the generation and transmission of pain signals. It is not clear whether the increased incidence of migraine/ headache in epileptics arises from altered activation of peripheral nociceptors, represented by TG neurons, or from central mechanisms of this signaling pathway. For this purpose, it was aimed to determine whether there is a dissimilarity in calcium homeostasis and [Ca+2]i responses to algogenic agents in TG neurons from epileptic WAG/Rij and healthy Wistar rats.
TGs were obtained from adult WAG/Rij and Wistar rats by enzymatic and mechanical procedures and isolated TG neurons were cultured. Then, the cells were loaded with the calcium-sensitive fluorescence dye, fura-2 AM and effects of capsaicin (1 µM, algogenic agent, the ingredient of hot pepper), high extracellular KCl (60 mM, non-specific membrane depolarizing agent), ATP (100 mM, the purinergic agonist, algogenic agent) on [Ca+2]i in TG cells from epileptic and normal rats were investigated. Response ratios to excitation (excitation: 340 nm/380 nm, emission@ 510 nm) were recorded and quantified by using digital microscopic image analysis system. Effects of calcium channel blocker diltiazem (10 µM) to [Ca+2]i level responses were investigated by applying about 50 seconds (s) via pre-treatment before adding agents. The 340 nm/380 nm fluorescence ratios are regarded as an indicator of [Ca+2]i levels. Student t-test was used for statistical analysis of data.
The TG neurons from WAG/Rij rats responded to the ATP application by increase in [Ca+2]i. Under normal recording conditions, the peak of [Ca+2]i response was [1.40±0.17 (n=19)] which was significantly attenuated by after diltiazem pre-treatment to [1.28±0.12 (n=10)] (p<0.05). The TG neurons from Wistar group, the peak response to ATP was [1.66±0.21 (n=14)] and highly significantly attenuated to [1.27±0.16 (n=14)] after diltiazem pretreatment (p<0.005). The  [Ca+2]i responses of TG neurons to capsaicin was [2.78±0.52 (n=9)]  and attenuated to [2.42±0.79 (n=20)] after diltiazem pretreatment (p<0.05).
TG neurons from both epileptic WAG/Rij and healthy Wistars responded to nociceptive stimuli by the increase in [Ca+2]i. The data from this thesis study indicates that the calcium signaling responses of TG neurons from WAG/Rij and Wistars were very similar in general terms. Calcium signaling in TG neurons may not play a significant role in the high incidence of headache in epilepsy.

Keywords: Epilepsy, migraine, pain, trigeminal ganglion