3 boyutlu yazıcı ile metakrilatlanmış jelatin/prp hidrojel ve mezenkimal kök hücre içeren osteokondral gradyan sistemlerin hazırlanması ve in-vitro etkinliklerinin belirlenmesi
Preparation of osteochondral gradient systems including methacrylated gelatin/prp hydrogel and mesenchymal stem cells by 3d-bioprinter and investigation of their in-vitro effectiveness
Yazar: GÜLSEREN IRMAK
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan doktora tezinin amacı, osteokondral hasarların tedavisinde kullanılmak üzere fotoaktifleştirilmiş plateletçe zengin plazma (PRP) gradyanı ve 3B biyobaskılama yöntemi kullanılarak adipoz kökenli mezenkimal kök hücreleri (AdMSC) yüklü gradyan hidrojel sistem geliştirmektir.

Doktora tez çalışmasının ilk aşamasında kemik doku mühendisliği çalışmaları yürütülmüştür. Öncelikle, geleneksel yaklaşımdan farklı olarak mikrodalga enerjisi (Mw) ile yüksek oranda metakrilatlanmış (≥%90) jelatin (Jel-MA) sentezi gerçekleştirilmiştir. Preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri Jel-MA'ya ilave edilerek oluşturulan biyoçözelti 3B biyobaskılandıktan sonra kararlı hidrojel yapıyı oluşturmak üzere fotobaşlatıcı (Irgacure) varlığında UV (300-500 nm) ile çapraz bağlanmıştır. Böylelikle mekanik dayanımı yüksek, elastik yapıda, düşük biyobozunma oranına (35 günde %27±1.9) sahip ve in-vitro kemik oluşumunu destekleyen hidrojeller elde edilmiştir.

Tez çalışmasının ikinci aşamasında ise kıkırdak doku mühendisliği çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu bölümde büyüme faktörlerini yapısında bulunduran PRP, kondrojenik farklılaşmayı yönlendirici ajan olarak kullanılmıştır. İlk olarak PRP, geleneksel aktivasyon yöntemlerinden farklı olarak polikromatik ışık kaynağı (PAC, 600-1200 nm) ile fotoaktive edilmiştir. Böylece, periyodik olarak fotoaktive edilen PRP'den kontrollü ve uzun dönemde büyüme faktörü salımı sağlanmıştır. PRP'ye, Jel-MA ve ATDC5 kondrojenik hücrelerinin eklenmesiyle oluşturulan PRP biyoçözeltisi biyobaskılandıktan sonra, PAC ile fotoaktive edilmiştir. Ardından, hidrojeller, kararlı yapının elde edilebilmesi için Irgacure varlığında UV ile çapraz bağlanmıştır. Sonuçta, periyodik olarak PAC uygulaması ile mekanik dayanımı yüksek, uzun süreli ve sabit hızda büyüme faktörü salan ve in-vitro hiyalin kıkırdak oluşumunu destekleyen hidrojeller elde edilmiştir.

Tez çalışmasının son aşamasında, adipoz kökenli mezenkimal kök hücreler (AdMSC'ler) Jel-MA, Jel-MA/PRP1:0.5 ve Jel-MA/PRP1:1 çözeltilerine ayrı ayrı ilave edildikten sonra gradyan sistemi oluşturacak şekilde aşamalı olarak biyobaskılanmış ve fotoçapraz bağlanmıştır. PRP'nin Jel-MA ile aşamalı olarak karıştırılması ile oluşturulan gradyan kompozit yapı, AdMSC'lerin kıkırdak, ara yüzey ve kemik fazlarına farklılaşmasında sinerjik bir etki yaratmıştır. Osteoindüktif ve osteokondüktif özelliklere sahip Mw-Jel-MA ve yapısında bulundurduğu yüksek çeşitlilikteki biyoaktif ajanların aktivasyon bağımlı salınması ile osteokondral rejenerasyonu arttırıcı etkisi bulunan PRP, AdMSC'lerin osteokondral dokuya farklılaşmaları için uygun bir ortam sunmuştur. Yapılan hücre canlılığı, histoloji, immünositokimya, gen ekspresyonu ve biyokimyasal analizler sonuçlarına göre hücre kültürü süresince periyodik olarak PAC uygulanan hidrojel sistemler, aşamalı olarak hiyalin kıkırdak, hipertropik kıkırdak, subkondral kemik ve kalsifiye kemiğe sahip in-vitro osteokondral doku oluşumunu desteklemiştir. 

İlgili literatür incelendiğinde AdMSC yüklü fotoktifleştirilmiş-Jel-MA/PRP kompozit biyoçözeltisi ile 3B biyoyazıcı kullanılarak oluşturulmuş gradyan sistem ve in-vitro koşullarda elde edilmiş osteokondral gradyan doku oluşumu bulunmamaktadır. Çalışma bu açıdan özgündür. Mikrodalga destekli metakrilatlama prosesi ile Jel-MA'nın mekanik dayanımının iyileştirmesi ve PRP/Jel-MA biyoçözeltisinin fotoaktifleştirilmesi çalışmanın diğer özgün yanlarını oluşturmaktadır.

Abstract:
The aim of the presented doctoral thesis is to develop a gradient hydrogel system which loaded adipos tissue derived stem cells (AdMSCs) by using photoactivated platelet-rich plasma (PRP) gradient and 3D bioprinting method for using in the treatment of osteochondral damages.

At the first stage of the doctoral thesis, bone tissue engineering studies were carried out. Primarily, differently from the traditional approach, synthesis of highly methacrylated (≥90%) gelatin (Gel-MA) was accomplished with the microwave energy. The bio-ink formed by the mixing of preosteoblastic MC3T3-E1 cells to the Gel-MA was crosslinked with UV (300-500 nm) in the presence of a photoinitiator (Irgacure) to form a stable hydrogel structure after 3D bioprinting. Thus, hydrogels with high mechanical strength, elastic structure, low biodegradation ratio (27%±1.9 at 35 days), and that support in-vitro bone formation were obtained.

In the second stage of the thesis, cartilage tissue engineering studies were carried out. In this section, PRP which has growth factors was used as a guiding agent for chondrogenic differentiation. Primarily, PRP was photoactivated by a polychromatic light source (PAC, 600-1200 nm) differently from the traditional activation methods. Thus, controlled and long-term growth factor release was achieved from periodically photoactivated PRP. The PRP bio-ink formed by the addition of Gel-MA and ATDC5 chondrogenic cells to the PRP was photoactivated by PAC after the printing process. Then, the hydrogels were crosslinked with UV in the presence of Irgacure to form a stable hydrogel structure. As a result, hydrogels with high mechanical strength, which release growth factors for long term and constant rate and support in-vitro hyaline cartilage formation were acquired with the periodically PAC application.

In the final step of the thesis study, adipose derived mesenchymal stem cells (AdMSCs) were separately mixed to Gel-MA, Gel-MA/PRP1:0.5 and Gel-MA/PRP1:1 solution, and then bio-inks gradually printed and photo crosslinked to form a gradient system. Gradient composite structure formed by the gradual mixing of PRP with Gel-MA has a synergistic effect on the differentiation of AdMSCs into cartilage, interface and bone phases. Mw-Gel-MA with osteoinductive and osteoconductive properties and PRP with activation-dependent release of a wide variety of bioactive agents in its structure have provided a favorable environment for differentiation of AdMSCs into osteochondral tissue. According to the results of cell viability, histology, immunocytochemistry, gene expression and biochemical analysis hydrogel systems which were periodically PAC-treated during cell culture supported the formation of in-vitro osteochondral tissue with progressively hyaline cartilage, hypertrophic cartilage, subchondral bone, and calcified bone.

When the related literature is examined, there is no gradient system formed by using 3D bioprinter and AdMSC loaded photoactivated-Gel-MA/PRP composite bioinks and there is no in-vitro osteochondral gradient formation. This study is unique in this respect. Improvement of mechanical strength of Gel-MA with the microwave assisted methacrylation process and photoactivation of PRP/Gel-MA bioink the other unique aspects of the study.