Rasemik benzoin asetattan mikrobiyal hidroliz tepkimesi ile enantiyomerik saflıkta benzoin üretimi
Production of enantiomerically pure benzoin with microbial hydrolysis reaction of racemic benzoin acetate
Yazar: RAHİME SONGÜR
Danışman: PROF. DR. ÜLKÜ MEHMETOĞLU
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Benzoin = Benzoin ; Enansiyometrik ayrıştırma = Enantiomeric resolution

Özet:
Bu çalışmada farmasötik önemi bulunan ?-hidroksi ketonlardan biri olup birçok değerli ilaç etken maddesinin çıkış bileşeni olan optikçe saf benzoinin rasemik benzoin asetattan Rhizopus oryzae mikroorganizması ile hidroliz tepkimesi sonucu üretimi amaçlanmıştır.Substrat olarak kullanılan rasemik benzoin asetat kimyasal olarak sentezlenmiştir. Lipaz kaynağı olarak Rhizopus oryzae (CBS 111718) mikroorganizması kullanılmıştır. Tepkimeler sıcaklık ve karıştırma hızı kontrollü orbital çalkalayıcılarda gerçekleştirilmiştir. Elde edilen ürünler HPLC'de Chiralcel OB kolonu kullanılarak analizlenmiştir.Çalışmalar sırasında öncelikle enzim kaynağı olan mikroorganizmanın ortamda homojen bir şekilde bulunması için parçalama türünün etkisi incelenmiştir. Bu amaçla, 20 kHz frekansta ses ötesi dalga ve mekanik parçalama yöntemleri uygulanmış ve en iyi sonuç mikroorganizmaya 20 kHz frekansında ses ötesi dalga uygulandığında 5. günde yaklaşık %100 dönüşüm ve %77 ee olarak bulunmuştur. Daha sonra, önemli bir parametre olan üreme ortamının başlangıç pH'ının etkisi (pH 4, 5, 6, 6.5) 20 kHz frekansta ses ötesi dalga uygulanmış mikroorganizmalarla araştırılmış ve en yüksek ee(P) değeri %89 olarak pH 5'te 6. günde yaklaşık %100 dönüşümde bulunmuştur. Ayrıca ses ötesi dalga uygulanmadan üreme ortamının başlangıç pH'ının (pH 4, 5, 6, 7) etkisi de araştırılmış ve en yüksek ee(P) değeri pH 5'te 4. günde %77 olarak bulunmuştur. Ses ötesi dalganın tepkimeye etkisi incelendiğinde enantiyoseçimliliği artırdığı saptanmıştır. Mikroorganizmanın liyofilizasyonunun etkisi araştırılmış ve enantiyoseçimliliğe önemli bir etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Farklı mikroorganizma derişimlerinin (40, 20, 13, 3 g/L) etkisi incelenmiştir. En yüksek enantiyomerik aşırılık değerleri 3. günde yaklaşık % 100 dönüşümde deneydeki en yüksek mikroorganizma derişimi olan 40 g/L ve daha seyreltik 13 g/L ile sırasıyla %70 ve %71 olarak elde edilmiştir. Optikçe saf benzoin üretimine substrat derişiminin etkisi (5, 10, 20, 50 mM) incelenmiş ve farklı substrat derişimlerinde %ee değerlerinin zamanla değişiminin birbirine yakın olduğu gözlenmiştir.Yapılan çalışmalar sırasında; mikroorganizma ile gerçekleştirilen tepkimelerde sadece kinetik rezolüsyon değil, bunun yanında rasemizasyon tepkimesinin de gerçekleştiği görülmüştür. Rasemizasyon tepkimesinin varlığını kanıtlamak amacıyla rasemik benzoinin derasemizasyonu incelenmiş ee(P) değeri 5. günde %62 olarak bulunmuştur. Rasemizasyon mekanizmasını araştırmak amacıyla ortamdaki ve hücre içindeki alkol dehidrojenaz (ADH) enzim aktiviteleri belirlenmiş ve rasemizasyonun rasemaz enzimi katalizörlüğünde rasemizasyonun yanında ADH enzimi katalizörlüğünde yükseltgenme-indirgenme tepkimeleri ile gerçekleştiği sonucuna varılmıştır. Böylece rasemik benzoin asetattan optikçe saf benzoin üretim mekanizması açıklanmıştır. Tüm tepkimeler sonucunda (S)-benzoin elde edilmiştir.Anahtar Kelimeler: Benzoin, rasemik benzoin asetat, enantiyomerik aşırılık, hidroliz, mikrobiyal, Rhizopus oryzae, ?-hidroksi keton, rasemizasyon

Abstract:
In this study, the production of optically pure benzoin with microbial hydrolysis reaction of racemic benzoin acetate catalysed by Rhizopus oryzae was aimed. Benzoin is one of the pharmacologically important ?-hydroxy ketones and it is a important structucal unit in many drugs.The substrate, rasemic benzoin acetate was synthesized chemically. The fungus Rhizopus oryzae (CBS 111718) was used as the lipase source. The reactions were carried out on temperature and agitation rate controlled orbital shaker. The samples were analysed by HPLC using Chiralcel OB column.During the studies, firstly the effects of homogenization methods were investigated to obtain homogenized cells in the medium. For this reason, ultrasonic (20 kHz) and mechanic homogenization methods were applied separately and the best result was obtained with 20 kHz ultrasonic homogenization in 5 days as 77% ee at about 100% conversion. Then, an important parameter, the effect of initial pH value of growing medium (pH 4, 5, 6, 6.5) was investigated with the cells which were homogenized by using 20 kHz ultrasonic homogenizer. The highest ee% was obtained at pH 5, as 89% ee and about 100% conversion in 6 days. Also, the effect of initial pH value of growing medium (pH 4, 5, 6, 7) was investigated with the cells which were not homogenized. The highest ee% was obtained at pH 5 as 77% ee in 4 days. When the effect of ultrasound was investigated, it was determined that ee% values were increased by ultrasonic homogenization. It was investigated the effect of lyophilization and it was observed that ee% was not effect by using lyophilized cells. The effect of microorganism concentration (40, 20, 13, 3 g/L) in the reaction medium was investigated. The highest value of ee% was obtained 70% and 71% with 40 g/L and 13 g/L microorganism concentrations respectively (3 days). The effect of substrate concentration (5, 10, 20, 50 mM) was investigated and it was observed that using different substrate concentration did not effect ee% values so much.During the study, it was observed that not only kinetic resolution but also racemization reaction was performed in this process. In order to demonstrate the presence of racemization reaction, deracemization of racemic benzoin was investigated, 62% ee was obtained in 5 days. In order to clarify the mechanism of deracemization process, ADH activity was investigated inside the cell and medium. It was determined that racemization was carried out by both racemase enzymes catalyzed racemization reaction and ADH catalyzed oxidation/reduction reactions. So, the mechanism of optically pure benzoin production was clarified. (S)-benzoin was obtained in all reactions.Key Words: Benzoin, racemic benzoin acetate, enantiomeric excess, hydrolysis, microbial, Rhizopus oryzae, ?-hydroxy ketone, racemization