Hayvan modellerinde ?TGF-ß3? ve ?BMP-2? salan doku iskeleleri ile damak yarığı onarımı
Cleft palate repair in animal models with ?TGF-ß3? ve ?BMP-2? releasing scaffolds
Yazar: AYBÜKE ALICI
Danışman: PROF. DR. ERHAN PİŞKİN ; YRD. DOÇ. KAMİLE ÖZTÜRK
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tezin amacı, damak yarıklarının onarımında kullanılmak üzere farklı rejimlerde büyüme faktörü salan doku iskelelerinin üretilmesidir. Tez kapsamında ilk olarak, hazırlanan jelatin filmlere (%3 m/v damıtık su içerisinde) 2 farklı büyüme faktörü yüklenmiştir. Büyüme faktörlerinden ilki, hücre transformasyonunu tetikleme yeteneği sebebiyle ve eksikliklerinde damak yarıklarının oluşumuna sebep olan dönüştürücü büyüme faktörü ß3 (TGF-ß3), ikincisi mineralize kemik oluşumunu uyarma potansiyeli sebebiyle kemik morfogenetik protein 2 (BMP-2)' dir. Büyüme faktörü içermeyen, yalnız BMP-2, TGFß-3 ve BMP-2'nin birlikte yüklendiği üç farklı formda jelatin film daha sonra poli(L-laktat) (PLA) ve poli(?-kaprolakton) (PCL) polimerik gözenekli doku iskelelerine yerleştirilmiştir.Tez çalışmasının ikinci bölümünde deney hayvanlarında (Wistar sıçanları) cerrahi işlem ile kendiliğinden iyileşmeyen (kritik boyutlu) alveol defektleri oluşturulmuştur. Hasarlı bölgeye, biyoaktif ajan yüklenmemiş (boş), yanlız BMP-2 yüklenmiş ve ayrı ayrı TGF-ß3 ve BMP-2 yüklenmiş jelatin filmleri içeren 3 farklı türdeki laminat doku iskeleleri deney hayvanlarına yerleştirilmiştir. Negatif kontrol grubu olarak seçilen grubta alveol defekti oluşturulup denekler başka işleme maruz bırakılmamıştır. Pozitif kontrol grubu olan otogreft grubunda ise deneğin iliyak kemiğinden alınan otogreft hasarlı bölgeye implante edilmiştir. 2 farklı zaman diliminde incelenecek olan toplam 10 grubun her birinde 7 deney hayvanı kullanılmıştır (10 grup; n=70). 1. ve 4. aylarda sakrifiye edilen hayvanların defekt bölgelerinden alınan örnekler önce makroskopik olarak ve sonrasında mikro-CT analizleri yapılarak yeni kemik dokusunun hacimsel değeri hesaplanmıştır. Yapılan micro-CT incelemelerinde 1 aylık dönemin sonunda otogreft grubunda yeni kemik oluşumu gözlenirken, grupların kendi içlerindeki zamana bağlı karşılaştırılmalarında yalnız TG-ß3/BMP-2 grubu anlamlı bir farklılık göstermiştir. Örnekler micro-CT incelemeleri sonrasında histolojik incelemeye tabi tutulmuştur. Bu incelemelerde hematoksilin, eozin ve masson trikrom ile boyanmış, kesitler defekt iyileşmesi, yeni kemik oluşumu ve doku cevabı açısından değerlendirilmiştir. Histolojik çalışmalardan elde edilen veriler 1. ve 4. aylarda otogreft grubunda hızlı bir iyileşmenin olduğunu gösterirken 4. ayda BMP-2 ve TGF-ß3/BMP-2 gruplarının otogreft grubundaki yeni kemik oluşum değerlerine en yakın sonuçları verdiği saptanmıştır.Ayrıca osteoblastlarca kana salınan alkalen fosfotaz'ın (ALP) kemiğe özgü formu olan kemik spesifik alkalen fosfataz (BALP) tayini için 21. günde ve 4. ayda deneklerden kan toplanmış ve serumlarından ELİZA yöntemi ile BALP derişimi incelenmiştir. Elde edilen sonuçlarda 21. günde ölçülen BALP derişiminde anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Fakat 4.ayda BALP aktivitesinde otogreft ve TGF-ß3/ BMP-2 gruplarında anlamlı bir artış saptanmıştır. Paralel olarak yapılan moleküler testler ile TGF-ß3 ve BMP-2'nin in vivo kemik oluşumuna etkisi, osteoblast farklılaşması ve çoğalmasında moleküler belirteç olarak kullanılan genlerin (osteokalsin, osteonektin, alkalen fosfataz, kemik siyaloproteini, runt ilişkili transkripsiyon faktörü 2 ve tip I-kollajen) ifade düzeylerinin saptanmasıyla moleküler düzeyde değerlendirilmiştir. Gen ifade düzeyleri, gerçek zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemi kullanılarak saptanmıştır (5 grup; n=25). Gen ifade düzeylerinin zamana bağlı değişimi 7. günde biyopsi alınıp, 21. günde sakrifiye edilen deneklerden alınan örneklerle çalışılarak değerlendirilmiştir. Her grupta sözü geçen genlerin ifade düzeylerinde anlamlı farklılıklar gözlenmiştir. Diğer sonuçlarla da paralellik göstererek TGF-ß3/ BMP-2 grubunda kemik oluşumunda rol oynayan genlerin ifade düzeylerinde oldukça anlamlı artışlar gözlenmiştir

Abstract:
The aim of this thesis is to produce scaffolds that release growth factors in different regimes in order to use them in cleft palate repair. In the context of the study, 2 different growth factors were loaded to gelatin films (3% m/v in H2O). The first growth factor was TGF-ß3 since in the abscence of it cleft palate may appear and at the same time it has the ability to trigger the cell transformation and the second factor was BMP-2 due to its potential to induce the mineralized bone generation. In this part of the thesis, gelatin films were prepared in 3 different groups as unloaded (no growth factor were loaded), BMP-2 loaded and TGFß-3 loaded. The gelatine films, both unloaded and loaded with growth factors, were placed into the poly(L-lactate) (PLA) and poly(?-caprolaktone) (PCL) polymeric scaffolds.In the second part of the thesis, cleft palates were created with surgical operation in the experimental animals (Wistar rats). The scaffolds without bioactive agents and ?TGF-ß? and ?BMP-2? loaded gelatine films containing scaffolds were placed into the defects of the experimantal animals (10 group ;n=70) in a suggested model (only BMP-2 loaded gelatine film placed scaffolds, separately loaded ?TGF-ß? and ?BMP-2? placed at the same scaffold). An alveolar defect was created in the negative control group and no other operations exposed to these animals. In the positive control group, the otogreft which was taken from animal?s iliac bone was implanted to the defect side. 7 experimental animals were used for each group in 2 different time periods, and the volumetric values of the newly formed bone tissues were measured through first taking microscopic and then micro-computerized tomography (micro-CT) from the defect areas of the animals, by sacrificiying at the 1st and the 4th month. After the period of a month new bone formation observed in the autogreft group whereas due to time dependent comparison of groups within themselves only TGF-ß3/BMP-2 group showed a significant difference.Samples were put into histological observation after micro-CT analysis. Fractions that were dyed with haematoxylin, eosin and masson trichrome were evaluated in the contex of recovering defects, new bone generation and tissue response. Data obtained from histological studies showed that there was a quick regeneration in autogreft group in 1st and 4th months whereas BMP-2 and TG-ß3/BMP-2 groups showed closer results to new bone generation values of autogreft groups in 4th month.Morever, for the measurement of BALP, which is the specific bone form of the ALP that is released to the blood via osteoblasts, in each 21th days and 4th months, blood has been gathered and from their serum, BALP concentrations were examined through the ELISA method. BALP concentrations measured on 21th day no significant difference was observed. However in the 4th month there was a significant increase in BALP activity in autogreft and TG-ß3 / BMP-2 groups. The genes that were used as molecular indicators (osteocalsin, osteonectine, alkaline phosphotase, bone sialoprotein, runt related transcription factor and type I collagen) for the formation of in vivo, bone, osteoblast differentiation and proliferation were selected and the level of gene expressions were determined to evalute the effect of TGF-ß3 and ?BMP-2?. Gene expression levels were determined using real time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) method (5 groups, n=25). Time dependent changes of gene expression levels was assessed by working with the samples that were obtained from experimental animals from which biopsy were taken on 7th day and which were sacrificed on 21th day. Significant differences were obtained in expression levels of the genes mentioned. Paralel to the other results there observed very significant increases in the expression levels of genes that play role in bone regeneration in TGF-ß3 / BMP-2 groups.