Sünme etmeni Bacillus türü bakterilerin hücre dışı peptidaz üretme yeteneklerinin belirlenmesi, peptidaz üretiminin kısmi optimizasyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Determination of extracellular peptidase producing ability of rope-forming strains of Bacillus, partial optimization, purification and characterization of the peptidase
Yazar: FUNDAGÜL EREM
Danışman: PROF. DR. MUHARREM CERTEL
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmada; Bacillus türlerinin peptidaz üretme kapasitelerinin ve bu peptidazların endüstriyel kullanım için uygun olup olmadıklarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, üretilen peptidazların kısmi optimizasyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu yapılmıştır.
Çalışmanın ilk aşamasında sünmüş ekmekten izole edilmiş 39 adet Bacillus türü hemolitik (Hbl) ve hemolitik olmayan (Nhe) enterotoksin üretimi açısından toksin kitleri yardımıyla taranmıştır. Ardından bu toksinlerin her ikisini de üretmediği tespit edilen 14 adet suşun 30 °C, 37 °C, 50 °C ve 55 °C'de hücre dışı peptidaz üretme yetenekleri, peptidaz aktivitesinin ölçülmesi suretiyle belirlenmiştir. Peptidaz üretiminde kullanmak üzere bu 14 suştan ünite/ml cinsinden peptidaz aktivitesi en yüksek olan K1 ve K10 suşları ile ünite/ml/OD cinsinden aktivitesi en yüksek olan N8 suşu seçilmiştir. Karşılaştırma sağlayabilmek için Bacillus subtilis PY22, B. subtilis RSK 244 ve B. subtilis RSK 246 suşlarının da peptidaz aktivitesi belirlenmiştir.
Çalışmanın ikinci aşamasında; bir kerede bir faktör yaklaşımı kullanılarak seçilen K1, K10 ve N8 suşları için en uygun enzim üretim besiyeri bileşimi ve koşulları belirlenmiştir. Bu amaçla en iyi aktivite değerini sağlayan karbon ve azot kaynağı ile karbon/azot oranı, çalkalama hızı ve ön kültür besiyeri maliyet unsuru da göz önünde bulundurularak tespit edilmiştir. En iyi karbon ve azot kaynağının sırasıyla, glukoz ve maya ekstraktı olduğu saptanmıştır. Ayrıca karbon/azot oranının 1:5, çalkalama hızının 250 rpm olması durumunda ve ön kültür hazırlanması için enzim üretim ortamı ile aynı besiyeri kullanıldığında daha iyi aktivite değeri elde edilmiştir.
Çalışmanın üçüncü aşamasında; bir önceki aşamada en iyi peptidaz aktivitesi sağlayan K1 suşu kullanılarak yanıt yüzey yöntemi ile peptidaz üretiminin optimizasyonu çalışması yapılmış; sıcaklık, besiyeri başlangıç pH'sı ve inokülasyon oranı faktör olarak seçilmiştir. Peptidaz üretimi açısından K1 suşu için en uygun sıcaklık 33.4 °C, besiyeri başlangıç pH'sı 6.62, inokülasyon oranı %2.3 olarak belirlenmiştir. Bu koşullarda peptidaz aktivitesi 49.17 ünite/ml olarak ölçülmüş, spesifik aktivite ise 504.77 ünite/mg olarak hesaplanmıştır.
Son aşamada ise optimum koşullarda üretilen ham enzim çözeltisi (peptidazlar), afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılıp bazı özellikler açısından karakterize edilmiştir. Peptidazlar %25 verim ve 1.53 katlık saflaştırma katsayısı ile kısmi olarak saflaştırılabilmiştir. Kısmi saflaştırılan peptidaz çözeltisinin optimum pH'sının 7.5 olduğu ve pH 7.0-8.5 arasında 37 °C'de 2 saat inkübasyon sonunda aktivitesini yaklaşık %90 oranında koruduğu tespit edilmiştir. Kısmen saflaştırılan peptidaz çözeltisinin optimum sıcaklığının 60 °C olduğu ancak 50 °C'de aktivitesini 60 °C'ye göre daha uzun süre koruduğu belirlenmiştir. Kısmi olarak saflaştırılan enzim çözeltisinin O-FEN ve EDTA (1-4 mM) varlığında inaktive olması, baskın peptidazın metalopeptidaz olduğunu göstermiştir. Ayrıca SDS-PAGE ve zimografi analizlerinin  karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi ile kısmen saflaştırılan enzim çözeltisindeki metalopeptidazın molekül ağırlığının 36 kDa civarında olduğu tespit edilmiştir. Enzim aktivitesini 5 mM K+1 %4, 5 mM Mn+2 iyonu da %6 oranında artırırken; Hg+2 ve Fe+3 iyonları, enzimi inaktive etmiştir. Kısmi saflaştırılan enzim çözeltisinin SDS (%0.1-1.0 w/v) varlığında inaktive olduğu; %0.1-1.0 (v/v) Triton X-100, Tween 20, Tween 80 ile %1-20 (v/v) ksilen, etanol, aseton ve asetonitril varlığında ise bu maddelerin konsantrasyonuna da bağlı olmak üzere 37 °C'de 30 dakika inkübasyon sonunda aktivitesini büyük ölçüde koruduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, the aim was to evaluate the peptidase producing capacity of Bacillus species and whether they are suitable for industrial use. For this purpose, partial optimization, purification and characterization of the peptidases produced was performed.
In the first part of the study 39 Bacillus species isolated from ropy bread were investigated by toxin kits for the production of hemolytic (Hbl) and non-hemolytic (Nhe) enterotoxins. Then, 14 of the strains which were found not to produce either of these toxins were analysed for their extracellular peptidase production capacity at 30 °C, 37 °C, 50 °C and 55 °C, by measuring the peptidase activity. Among these 14 strains, K1 and K10 which has the highest peptidase activity in unit/ml and N8 which has the highest activity in unit/ml/OD were selected for use in the production of peptidase. Peptidase activity of Bacillus subtilis PY22, B. subtilis RSK 244 and B. subtilis RSK 246 were also determined for comparison purposes.
In the second part of the study, the optimum enzyme production media composition and conditions were determined for the strains K1, K10 and N8 selected by using one factor at a time method approach. For this purpose, carbon source, nitrogen source, carbon/nitrogen ratio, agitation rate and inoculum culture media which ensure the best peptidase activity were determined by considering the cost-effectiveness. The best carbon and nitrogen source was determined as glucose and nitrogen, respectively. Furthermore, better enzyme activity was obtained with a carbon/nitrogen ratio of 1:5, agitation rate of 250 rpm and use of the same media for preparing inoculum culture as for enzyme production.
The third part of the study involved the optimization of peptidase production through response surface methodology using the K1 strain, which yielded the best peptidase activity in the previous part. Temperature, initial pH of media and inoculation rate were used as the factors for this process. The optimum temperature, initial pH of media and inoculation rate in terms of peptidase production were found as 33.4 °C, 6.62 and 2.3% respectively. Peptidase activity of 49.17 unit/ml was measured and specific activity of 504.77 units/mg was calculated for the crude enzyme under these conditions.
In the last part of the study crude enzyme solution (peptidases) produced under the optimum conditions mentioned above were purified by affinity chromatography and characterized in terms of some of their properties. Peptidases could be partially purified with an efficiency of 25% and a purification coefficient of 1.53. It was determined that the optimum pH of partially purified peptidase solution was 7.5 and the peptidases retained approximately 90% of its initial activity between the pH range of 7.0-8.5 after an incubation at 37 °C for 2 hours. It was found that the optimum temperature for the partially purified peptidase was 60 °C, however, the enzyme mixture did retain its activity for a longer period of time at 50 °C. The inactivation of the partially purified enzyme in the presence of O-FEN and EDTA (1-4 mM) showed that the peptidases produced were metallopeptidase. Furthermore, it was determined with the use of SDS-PAGE and zymography analysis that the approximate molecular weight of the partially purified enzyme was 36 kDA. Five mM of K+1 and 5 mM of Mn+2 ions increased the enzyme activity by 4 and 6% respectively, on the other hand, Hg+2 and Fe+3 ions inactivated the enzyme. It was determined that the partially purified enzyme was inactivated in the presence of SDS (%0.1-1.0 w/v), however the enzyme retained most of its activity upon incubation at 37 °C for 30 minutes in the presence of %0.1-1.0 (v/v) Triton X-100, Tween 20, Tween 80 and %1-20 (v/v) xylene, ethanol, acetone and acetonitrile.