Centella asıatıca bitki özütü ile kaplı gümüş nanopartikül içeren polimer liflerin yara iyileştirici etkisinin ın vıtro ve ın vıvo araştırılması
In vitro and in vivo investigation of wound healing effect of polymer fibers containing silver nanoparticles coated with centella asiatica plant extract
Yazar: OGÜN BOZKAYA
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM VARGEL ; PROF. DR. MUSTAFA YİĞİTOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Nanolif = Nanofiber

Özet:
Bu çalışmada, Centella asiatica'nın (CA) terapötik bitki ekstraktını kullanarak gümüş iyonlarından fonksiyonel gümüş nanopartikülleri (AgNPs) sentezledik. CA fonksiyonel grupları ile kaplı AgNP'ler (CA-AgNPs) oluşumu, yaklaşık 420 nm dalga boyunda karakteristik yüzey plazmon rezonans (SPR) pikleri ile kanıtlanmıştır. CA-AgNP'lerin ortalama zeta boyutu ve zeta potansiyeli, sırasıyla 29,5 nm ve -24,5 mV olarak bulunmuştur. Elde edilen nanopartiküllerin negatif yüzey yüküne sahip olduğu belirlenmiş ve sonuçlar CA-AgNP'lerin kararlı olduğunu göstermiştir. CA-AgNP'lerin fonksiyonel grup analizi, fourier transform kızılötesi spektroskopisi (FTIR) ile araştırılmış ve gümüş iyonlarının AgNP'lere indirgenmesinde karboksilat ve hidroksil gruplarının rol oynadığı belirlenmiştir. Ayrıca CA-AgNP'lerin, geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) incelemeleri ile nano boyutlu ve küresel olduğu gösterilmiştir. CA ekstraktı ve CA-AgNP'lerin termal özellikleri, termogravimetrik analiz (TGA) ve diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC) ile incelenmiş, CA-AgNP'lerin nano boyutlu metalik gümüş içerdiği literatürde ilk kez TGA yöntemi ile fiziksel olarak kanıtlanmıştır. Sentezlenen CA-AgNP'lerin hem gram pozitif Staphylococcus aureus hem de gram negatif Escherichia coli üzerinde antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir. CA ve farklı derişimlerdeki CA-AgNPs örneklerinin L929 fibroblast üzerindeki sitotoksisite etkileri MTT testi ile araştırılmış, 1mM'ın üzerindeki derişimlerde CA-AgNP'lerin sitotoksik etkiye sahip olduğu belirlenmiştir. Elektroeğirme yöntemi ile hibrit nanofiber örtü eldesinde; öncesinde PCL ve PEO'in uygun çözücüler ile farklı derişimlerde çözeltileri hazırlanmıştır. PCL için kloroform/metanol (7/3,v/v) karışımı, PEO için ise saf su çözücü sistemi olarak kullanılmıştır. %3,5'luk PEO ve %12'lik PCL çözeltileri ile optimum elektroeğirme koşullarında boncuksuz, pürüzsüz, uzun ve düzgün fiberler elde edilmiş, PEO ve PCL'in ortalama fiber çapları sırasıyla 177±21 nm ve 412±93 nm olarak belirlenmiştir. pH 7,4'e ayarlanmış 1mM CA-AgNPs çözeltisinden % 1, %5 ve %10 (v/v) CA-AgNPs içeren PEO (%3,5) çözeltileri hazırlanmış ve optimum elektroeğirme parametrelerinde boncuksuz ve sürekli nanofiberler (90 nm-160 nm) sentezlenmiştir. Hazırlanan CA-AgNPs-PEO ve PCL çözeltilerinin optimum elektroeğirme parametrelerinde, karşılıklı olarak eğrilmesiyle elde edilen hibrit nanofiberler FE-SEM, SEM-EDS, FT-IR, XRD, XRF, TGA, DSC, BET yöntemleri ile karakterize edilmiştir. Ayrıca sentezlenen nanofiberlerin mekanik özellikleri, hava geçirgenliği, su tutma kapasitesi, su temas açısı, in vitro degredasyonu, in vitro Ag salımı davranışları araştırılmıştır. Yapılan antimikrobiyal çalışmalarla %5 ve %10 CA-AgNPs içeren PEO/PCL nanofiberlerin S. aureus, E. coli ve C. albicans türlerine karşı etkili olduğu görülmüştür. Nanofiberlerin MTT testi ile sitotoksik özellikleri araştırılmış ve bütün konsantrasyonlarda hücre canlılığının %70'in üzerinde olduğu belirlenmiştir. Yara örtüsü olarak tercih edilen %10 CA-AgNPs-PEO/PCL nanofiberlerin in vitro çalışmalarla hücre tutunması, apoptotik-nekrotik, hemolitik ve genotoksik etkileri araştırılmıştır.
%10 CA-AgNPs-PEO/PCL nanofiber örtünün in vivo deneylerle deri irritasyon, deri sensitizasyon ve yanık yarasını iyileştirme etkilerinin değerlendirildiği çalışmalarda; deri irritasyonu için sağlıklı genç yetişkin albino tavşanlar, deri sensitizasyon için sağlıklı genç yetişkin albino kobaylar (Guinea pig) ve yanık yarası için Sprague-Dawley cinsi sıçanlar kullanılmıştır. Ayrıca, sıçanların yara bölgelerinden alınan doku örnekleri üzerinde histolojik değerlendirmeler yapılmış, böylece nanofiber yara örtüsünün uygulandığı yüzeyin epitelizasyon üzerindeki etkisi de incelenmiştir.

Abstract:
In this study, we synthesized functional silver nanoparticles (AgNPs) from silver ions using the therapeutic plant extract of Centella asiatica (CA). The formation of AgNPs coated with CA functional groups (CA-AgNPs) is evidenced by characteristic surface plasmon resonance (SPR) peaks at a wavelength of about 420 nm. The mean zeta size and zeta potential of CA-AgNPs were found to be 29.5 nm and -24.5 mV, respectively. It was determined that the obtained nanoparticles had a negative surface charge and the results showed that the CA-AgNPs were stable. Functional group analysis of CA-AgNPs was investigated by fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and it was determined that carboxylate and hydroxyl groups play a role in the reduction of silver ions to AgNPs. In addition, CA-AgNPs have been shown nano-sized and spherical by transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM) examinations. The thermal properties of the CA extract and CA-AgNPs were investigated by thermogravimetric analysis (TGA) and differential scanning calorimetry (DSC), and it was physically proven for the first time in the literature that CA-AgNPs contain nano-sized metallic silver. It has been observed that the synthesized CA-AgNPs have antibacterial activity on both gram positive Staphylococcus aureus and gram negative Escherichia coli. The cytotoxicity effects of CA and CA-AgNPs in different concentrations on L929 fibroblast were investigated with the MTT test, and it was determined that CA-AgNPs had a cytotoxic effect at concentrations above 1 mM. In the production of hybrid nanofiber dressing by electrospinning method; before this, solutions of PCL and PEO with different concentrations were prepared with suitable solvents. Chloform/methanol (7/3, v/v) mixture was used for PCL and pure water was used as the solvent system for PEO. Bead-free, smooth, long and uniform fibers were obtained with 3.5% PEO and 12% PCL solutions under optimum electrospinning conditions, and mean fiber diameters of PEO and PCL were determined as 177±21 nm and 412±93 nm, respectively. Before the synthesis of hybrid nanofiber blanket by electrospinning method; Solutions of PCL and PEO in different concentrations were prepared with suitable solvents. Chloroform/methanol (7/3, v/v) mixture was used for PCL and pure water was used as the solvent system for PEO. Bead-free, smooth, long and uniform fibers were obtained with 3.5% PEO and 12% PCL solutions under optimum electrospinning conditions, and mean fiber diameters of PEO and PCL were determined as 177±21 nm and 412±93 nm, respectively. PEO (3.5%) solutions containing 1%, 5% and 10% (v/v) CA-AgNPs were prepared from 1mM CA-AgNPs solution adjusted to pH 7.4 and bead-free and continuous nanofibers (90 nm-160 nm) was synthesized. Hybrid nanofibers obtained by mutual spinning of the prepared CA-AgNPs-PEO and PCL solutions at optimum electrospinning parameters were characterized by FE-SEM, SEM-EDS, FT-IR, XRD, XRF, TGA, DSC, BET methods. In addition, the mechanical properties, air permeability, water uptake capacity, water contact angle, in vitro degradation and in vitro silver release behavior of the synthesized nanofibers were investigated. With antimicrobial studies, PEO/PCL nanofibers containing 5% and 10% CA-AgNPs were found to be effective against S. aureus, E. coli and C. albicans species. The cytotoxic properties of nanofibers were investigated by MTT test and cell viability was determined to be above 70% at all concentrations. Cell adhesion, apoptotic-necrotic, hemolytic and genotoxic effects of 10% CA-AgNPs-PEO/PCL nanofibers, which are preferred as wound dressings, were investigated by in vitro studies. In studies by evaluating the effects of 10% CA-AgNPs-PEO/PCL nanofiber dressing on skin irritation, skin sensitization and healing of burn wounds by in vivo experiments; healthy young adult albino rabbits were used for skin irritation, healthy young adult albino Guinea pigs for skin sensitization, and Sprague-Dawley rats for burn wound. In addition, histological evaluations were made on tissue samples taken from the wound sites of rats, thus the effect of the nanofiber dressing on the epithelialization of the surface on which it was applied was also investigated.