Belirli mikoplazma türlerinin tanısına yönelik optik biyosensör tasarımı
Development of optic biosensors to detect certain mycoplasma species
Yazar: BURCU İNANÇ
Danışman: DOÇ. DR. A. YAVUZ ORAL ; DOÇ. DR. FERRUH ÖZCAN
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Biyosensörler = Biosensors ; Kırınım = Diffraction ; Mikoplazma = Mycoplasma ; Mikroskopi-elektron taramalı = Microscopy-electron scanning ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Yüzey plazmonları = Surface plasmons

Özet:
Hücre kültürü çalışmaları, tibbi ve biyolojik bilimlerin yanısıra, kanser kökhücre araştırmalarında da en önemli deney sistemlerinden biridir. Mikoplazmakontaminasyonları ilgili deneylerin sonuçlarını güvenilmez kılmakta, değerli hücresoylarının kaybolmasına, materyal ve zaman kaybına neden olmaktadır. Bakteri vemantar enfeksiyonlarının aksine, mikoplazmaların, hücre kültürlerinde gözle görülendeğişiklikler oluşturmamasından dolayı, araştırmacı tarafından belirlenmelerioldukça uğraştırıcı ve zordur. Çalışmamızda hücre ve doku kültürlerindekontaminasyona neden olan belirli mikoplazma türlerinin hızlı ve etkin bir biçimdebelirlenmesine yönelik SPR temelli ve dalga kılavuzu temelli sol-jel tabanlı optikbiyosensörlerin tasarlanması hedef alınmıştır.SPR temelli DNA biyosensörü oluşturulması amacıyla mikoplazma16SrDNA'sına özgül tiyol modifiye DNA probları, altın yüzeyine immobilizeedilerek, yüzey özellikleri SEM ile incelenmiştir. Tiyol modifiye probların yüzeyeadsorpsiyonunu takiben, biyosensörün DNA hibridizasyon verimliliği, eşleniksentetik oligonükleotitler kullanılarak belirlenmiştir. Deneysel olarak, çeşitlilaboratuvarlardan toplanarak mikoplazma bakımından incelenmiş hücre kültürlerineait denature PCR ürünleri ve genomik DNA örnekleri kullanılmıştır. Tasarımıyapılan SPR temelli biyosensörün, sentetik oligonükleotitler ve mikoplazma 16SrDNA'sından çoğaltılan PCR ürünlerine özgül ve tekrar tekrar kullanılabilir olduğugösterilmiştir. Fakat mikoplazmaya ait genomik DNA örnekleriyle yapılanölçümlerde, kırılma indisi değişimine (?RIU) rastlanmamıştır.Sol-jel yapıda optik dalgakılavuzu temelli DNA biyosensörü, boyut artışınedeniyle, SPR temelli biyosensörlere göre yaklaşık 100 kat artmış hassaslığasahiptir. Bunun yanısıra, sol-jel matrisi hibridizasyon reaksiyonu vebiyomoleküllerin kararlığını sağlamak üzere sulu bir ortam sunmaktadır. Sol-jelyapısındaki sensör yüzeyinin prizma çiftleyici cihazında dalgakılavuzu olarakkullanılabileceği gösterilmiştir. Prizma çiftleyici ile yapılan effektif refraktif indisölçümleri, amin modifiye tek zincirli DNA probunun sol-jel yüzeyine aminkimyasıyla başarılı bir şekilde immobilize olduğunu göstermektedir.İmmobilizasyonun oranı, eşlenik floresan işaretli oligonükleotitler kullanılarakfloresan mikroskobunda incelenmiştir. Her ne kadar bağlanmış oligonükleotitlerinmiktarını sayısal olarak belirlemek zor olsa da kontrol örnekleriylekarşılaştırıldığında, elde edilen floresan yoğunlukları tatmin edicidir. Gelecekte,16SrDNA'ya özgül probların sol-jel yüzeyinde immobilizasyonunun geliştirilmesive yüzeyin optik, mikroskobik aletler kullanılarak karakterize edilmesiplanlanmaktadır.Bu çalışmada, geliştirilen SPR temelli DNA biyosensörü şu an içinmikoplazma genomik DNA'sının belirlenmesi için yeterli duyarlılıkta değildir, fakatsentetik oligonükleotitler ve PCR ürünlerinin analizi için etkin bir sistem olarakortaya çıkmaktadır. Bundan dolayı, bu koşullar altında SPR sinyalini arttırabilmekiçin, hedef DNA molekülleri floresan veya kütle artışı sağlayacak işaretlerle,birleştirilmelidir. Ancak, SPR biyosensörlerine göre yaklaşık 100 kat daha hassasolduğundan, sol-jel temelli mikoplazma özgül biyosensörde, bu gereklilik ortadankaldırılabilir.

Abstract:
Cell culture systems are important tools for basic research in medicine andbiological sciences as well as for the stem cell and cancer research. Mycoplasmacontaminations cause unreliable results in cell culture experiments leading to loss ofvaluable cell lines, materials, and time. Unlike from bacterial and fungalcontamination, mycoplasma does not produce any visible change in cell culturesmaking its detection a very cumbersome and formidable task for the scientist. In thisstudy we aimed to develop a novel optical DNA biosensor based on SPR and a solgelbased optical waveguide sensor for fast and effective detection of Mycoplasmasin cell cultures.In order to construct a DNA biosensor based on SPR, thiol derived DNAprobes specific to mycoplasma 16S rDNA are directly immobilized onto goldsurface and the characterization of the surface was made by SEM. Followingadsorption of modified oligonucleotides onto surface, DNA hybridization efficiencywas tested using complementary synthetic oligonucleotides. Experimental set upincluded both denaturized PCR products and genomic DNA samples isolated fromtested cell cultures collected from various laboratories. We demonstrated that thedesigned SPR based biosensor was suitable for repeated uses and robust for thespecific hybridization reactions with synthetic oligonucleotides and specific PCRproducts from mycoplasma 16S rDNA. However, we were not able to producesignificant refractive index (?RIU) change with the mycoplasma genomic DNAsamples.Sol-gel based optical waveguide DNA biosensor promises ~100 foldincreased sensitivity compared to SPR based sensors due to the increased dimension.Besides sol-gel matrix provides aqueous environment for the hybridization reactionand for the stability of biomolecules. It has been shown that the sensor surface in thesol-gel structure can be used as a waveguide in the prism coupler. The effectiverefractive index measurements made by prism coupler have suggested that theamine-derivatised ss-DNAs successfully immobilized on the sol-gel surface viaamine chemistry. Primarily we tested the immobilization efficiency by usingfluorescent labeled complementary oligonucleotides to the immobilized probes underfluorescent microscope. Although it is quantitatively hard to calculate boundoligonucleotides, the relative fluorescent intensities suggest that there is a decentamount of bound oligonucleotide compared to control samples. We are planning tofurther characterize and improve the sol-gel immobilization of 16S rDNA specificprobes using both optic and microscopic instruments.SPR based DNA sensor designed in this study is currently below the requiredresolution level for detecting mycoplasma genomic DNA but it appears ratherefficient for detecting synthetic oligonucleotides and PCR products. Therefore underdefined circumstances either fluorescent or bulk tag should be conjugated to targetDNA molecules to enhance SPR signal. However, sol-gel based mycoplasmaspecific biosensor may remove this requirement by providing ~100 fold increasedsensitivity over SPR based sensors.