Difteri toksinine karşı moleküler baskılama yöntemi ile geliştirilen plastik antikorun ın vitro etkinliğinin belirlenmesi
Determination of in vitro activity of plastic antibody developed for diphtheria toxin by molecular imprinting
Yazar: SÜLEYMAN SERDAR ALKANLI
Danışman: DOÇ. DR. HANDAN AKÇAKAYA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Antikorlar = Antibodies ; Difteri = Diphtheria ; Floresan antikor tekniği = Fluorescent antibody technic ; Hücre kültürü = Cell culture ; Nötralizasyon = Neutralization ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Toksinler = Toxins

Özet:
Alkanlı SS. Difteri Toksinine Karşı Moleküler Baskılama Yöntemi İle Geliştirilen Plastik Antikorun In Vitro Etkinliğinin Belirlenmesi. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyofizik AD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul. 2018.

Antikorlar, tamamlayıcı üç boyutlu yüzeyler arasındaki çok zayıf elektrostatik, hidrofobik ve hidrojen bağlayıcı etkileşimleri ile hedef molekülleri tanırlar. Plastik antikorlar geliştirildikleri molekülleri tanıma, bağlama ve serbest bırakma özellikli moleküler baskılanmış polimerlerdir. Moleküler baskılamada moleküler düzeyde bir hedef molekül bulunur. Fonksiyonel grupları taşıyan monomerler, hedeflenen molekülün etrafında toplanarak çapraz bağlanma ile kopolimerizasyon gerçekleştirirler. Böylece hedef molekülün etrafında polimer yapıdaki kalıp oluşturulur. Kalıp içerisinden molekülün çıkartılmasıyla oluşan bağlanma bölgeleri, molekülü fonksiyonel gruplarının boyutu, şekli ve konumu yönünden tamamlayan bölgelerdir. Bu polimerler biyolojik kökenli yapay antikorların aksine, üretimleri hızlı ve ekonomiktir. Deney hayvanları kullanılmadan üretilebilirler. Fiziksel ve kimyasal kararlıdırlar.

Baskılanmış polimerin uygulamalarında kimyasal afinite ile ayırma, yapay immünometik sistemlerin geliştirilmesi ve sensörlerin oluşturulması yer almaktadır. 

Difteri, Corynebacterium diphtereriae bakterilerinden kaynaklanan bir solunum yolu ve deri hastalığıdır. Bu bakteri 0,1 mg/kg vücut ağırlığının altındaki dozlarda bile insanlar için ölümcül olan difteri toksinini salgılar. Difteri toksini, molekül ağırlığı yaklaşık 62 kDa olan, 535 amino asit içeren, A (22 kDa) ve B (40 kDa) fragmentlerinden oluşan bir ekzotoksindir. Enfeksiyonlarda toksin hücre zarı ile bağlanır. A fragmenti sitoplazmaya girerek ADP-ribozilasyonunu ve uzama faktörü 2'nin (EF-2) inaktivasyonunu katalize eder. Böylece ökaryotik hücreyi ribozomal translokasyonu inhibe ederek öldürür.

Bu tez çalışmasında, difteri toksininin hücreler üzerindeki sitotoksik etkileri incelenmiştir. Difteri toksininin hücreler üzerindeki sitotoksik etkilerini azaltmak amacıyla A fragmenti baskılanarak üretilen plastik antikorun, in vitro etkinliği belirlenmiştir. Çalışmanın sonunda plastik antikorun difteri toksininin sitotoksik etkisini azalttığı hücre canlılığı ve immünfloresan boyama çalışmaları ile gösterilmiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçlar, farklı patojenlere karşı geliştirilecek plastik antikorların tedavi amacıyla kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Anahtar Kelimeler: Difteri Toksini, Plastik Antikor, Moleküler Baskılama, Hücre Kültürü, Nötralizasyon, İmmünfloresan, Sitotoksisite.

Bu çalışma, TÜBİTAK 1001, Proje No: 115S224, ve İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP), BAP Proje No: TYL-2017-25648 tarafından desteklenmiştir.

Abstract:
Alkanli SS. Determination of In Vitro Activity Of Plastic Antibody Developed For Diphtheria Toxin By Molecular Imprinting. İstanbul University, Institute of Health Science, Biophysics Department Master Thesis. İstanbul. 2018.

Antibodies recognize target molecules with very weak electrostatic, hydrophobic, and hydrogen bonding interactions between three-dimensional surfaces. Plastic antibodies are molecular imprint polymers that recognize, bind and release the molecules they develop. There is a target molecule in molecular imprinting. Monomers carrying functional groups perform co-polymerization with cross-linking. Thus, the polymer matrix forms around the target molecule. Formed bonding regions complete the molecule in terms of the size, shape, and position of the functional groups. Polymers, can be produced quickly and economically. They can be produced without experimental animals. They have physical and chemical stability.

Polymers can be used for separation, immunomatic systems and construction of sensors. Diphtheria is a respiratory and skin disease caused by Corynebacterium diphtereriae. This bacterium releases diphtheria toxin, which is lethal to humans even at doses below 0.1 mg/kg. Diphtheria toxin (62 kDa) is an exotoxin consisting of A (22 kDa) and B (40 kDa) fragments, containing 535 amino acids. During infection, the toxin binds to the cell membrane. FA enters cytoplasm and catalyzes the inactivation of ADP-ribosylation and elongation factor 2 (EF-2). Thus, FA inhibits ribosomal translocation and kills eukaryotic cells.

In this thesis, the cytotoxic effects of diphtheria toxin on cells have been examined. To reduce cytotoxicity, the activity of the FA imprinted plastic antibody was determined. In the study, cell viability and immunofluorescence staining studies have shown that plastic antibody reduces cytotoxic effect of diphtheria toxin. The results suggest that plastic antibodies to be developed against different pathogens may be used for treatment.

Keywords: Diphtheria Toxin, Plastic Antibody, Molecular Impression, Cell Culture, Neutralization, Immunofluorescence, Cytotoxicity.

This study was supported by TUBITAK 1001, Project No: 115S224, and Istanbul University Scientific Research Projects (BAP), BAP Project No: TYL-2017-25648.