Çay (Camellia sinensis L.) bitkisinden grelin-benzeri immünoreaktif maddelerim izolasyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Isolation, purification and characterization of ghrelin-like immunoreactive substances from tea (Camellia sinensis L.)
Yazar: EMİNE ÇİÇEK
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA CALAPOĞLU
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Grelin, büyüme hormonu (GH) salgılatıcı hormon reseptörü 1a (GHRH-R1a)'nın  endojen bir ligandı olarak insan ve sıçan midesinden izole edilmiş 28 amino asitlik bir peptidtir. Grelin başlıca mide oksintik mukozanın X/A benzeri hücrelerinde üretilmektedir. Fakat grelin aynı zamanda düşük miktarlarda hipotalamust, hipofiz, troid, pankreas, böbrek, karaciğer, kalp, akciğer, plasenta, tükrük bezleri, ince barsak, meme ve testislerde de üretilmektedir. Grelin memeliler, balıklar, kurbağalar, kuşlar, sürüngenler ve bazı bitkilerde tesbit edilmiştir ve grelin sekansı evolüsyon boyunca iyi korunmuştur.
Bu çalışmada amaç, çay (Camellia sinensis L.) bitkisinin taze dokularında grelin-benzeri immünoreaktif maddeleri tesbit etmektir. Çay bitkisinin taze dokularından total protein izolasyonu, çeşitli ekstraksiyon yöntemler kullanılarak (TCA/aseton presipitasyonu, TCA/aseton presipitasyonu/fenol ekstraksiyonu, PBS ekstraksiyonu, QB ekstraksiyonu) ekstrakte edildi. Çay bitkisi ekstraklarında grelin bezleri immünoreaktif maddeler direk ELISA yöntemi ile belirlendi. Çay bitkisinden TCA/aseton presipitasyonu, TCA/aseton presipitasyonu/fenol ekstraksiyonu, PBS ekstraksiyonu, QB ekstraksiyonu ve SDS tamponu ekstraksiyonu yöntemleri ile elde edilen ekstraklarda grelin immünorekativitesi, sırasıyla 0,067 ± 0,021 µg/mL, 0,05  ± 0,020 µg/mL, 0,037 ± 0,017 µg/mL, 0,192  ± 0,039 µg/mL ve 0,048  ± 0,019 µg/mL olarak bulundu. Çay bitkisi ekstraklarında insan grelin-benzeri immünoreaktif maddeler ayrıca trisin-SDS-PAGE ve immünoblot teknikleri ile de karakterize edildi. Sonuç olarak çay bitkisinin taze vejetatif dokularında trisin-SDS-PAGE ve western blot ile 12 kDa'lık moleküler kütleye sahip tek bir grelin-benzeri protein bandı gözlendi. Çalışma verilerine göre, grelinin hem hayvanlar alemi ve hem de bitkiler aleminde evrensel bir peptid olabileceğini göstermektedir. Sonuç olarak bitkiler de farklı düzeylerde bulunan grelin-benzeri immünoreaktif maddeler, insan kilo denetimine katkı sağlayabilir.

Anahtar Kelimeler: Grelin, çay (Camellia sinensis L.), grelin-benzeri immünoreaktive maddeler, trisin-SDS-PAGE, western blot

Abstract:
As an endogenous ligand for the GH releasing hormone receptor (GHS-R1a). Ghrelin is a 28 amino-acid peptide isolated from human, rat stomach. Ghrelin is mainly produced by the X/A-cells in the oxyntic mucosa of the stomach, but small amounts are also produced in the hypothalamus, the pituitary, the thyroid, the pancreas, the kidney, the liver, the heart, the lung, the placenta, the salivary glands, the small intestine, the breast and the testes.Ghrelin has been identified in mammals, fish, amphibians, birds, reptiles and some plants and ghrelin sequence has been well preserved during the evolutionary process.
The aim in this study is to determine ghrelin-like immunoreactive substances in fresh vegetative tissue of tea plant (Camellia sinensis L.). Total protein was extracted from the plant samples by using different extraction methods (TCA/acetone precipitation, trichloroacetic acid (TCA)/acetone precipitation followed by SDS and phenol extraction, PBS, QB extraction methods). Ghrelin-like immunoreactive substances in the tea plant extracts were investigated with ELISA method. The ghrelin immunoreactivity of tea extracs obtained by TCA/acetone precipitation, trichloroacetic acid (TCA)/acetone precipitation followed by SDS and phenol extraction, PBS, QB extraction methods were found to be 0,067 ± 0,021 µg/mL, 0,05 ± 0,020 µg/mL, 0,037 ± 0,017 µg/mL, 0,192 ± 0,039 µg/mL and 0,048 ± 0,019 µg/mL, respectively. From the tea plant samples human-ghrelin-like immunorective substances were isolated and characterized using tricine-SDS-PAGE and immunoblotting techniques. As a result, in fresh vegetative tissues of tea a single ghrelin-like protein band with a molecular mass of 12 kDa was observed using tricine-SDS-PAGE and western blotting. Results show ghrelin can be a universal peptide both in the animal and the plant world. As a result ghrelin-like immunorective substances found in plants in various amounts, may contribute weight control in humans.

Keywords: Ghrelin, ghrelin-like immunoreactive, tea (Camellia sinensis L.), tricine-SDS-PAGE, western blotting