Sultan sazlığı yöresinde sivrisinek türlerinde wolbachıa endobakterisinin PCR ile araştırılması ve moleküler genotiplendirilmesi
Investigation of wolbachia endobacteria in mosquito species in kayseri province BY PCR and molecular genotyping of the isolates
Yazar: GAMZE YETİŞMİŞ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Bakteriler = Bacteria ; Genotip = Genotype ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sivrisinekler = Culicidae ; Sultan sazlığı = Sultan marshy ; Türkiye = Turkey ; Wolbachia sp. = Wolbachia sp.

Özet:
Bu çalışma, Kayseri'deki Sultan Sazlığı yöresinden toplanmış sivrisinek örneklerinde Wolbachia endobakterisinin moleküler olarak araştırılması ve saptanan pozitif izolatların genotiplendirilmesi amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenen TYL-2014-5176 kod no'lu araştırma projesi kapsamında, araştırma yöresinden toplanmış toplam 400 sivrisinek türünün 296'sı Culex pipiens, 63'ü Aedes vexans ve 41'i Culiseta annulata olarak identifiye edilmiştir. İdentifikasyonları yapılan erkek ve dişi ergin sineklerden bireysel olarak genomik DNA ekstrakte edilmiş ve DNA'lar Wolbachia yüzey protein (wsp) gen bölgesinin amplifikasyonu yönünden incelenmiştir. DNA ekstraksiyonunu takiben wsp gen bölgesinin yaklaşık 600 bp'lik kısmını amplifiye eden Wolbachia spesifik primerler ile PCR analizleri yapılmıştır. İncelenen 119 (%40,2) Cx. pipiens dişisinde Wolbachia pozitifliği saptanırken, erkek Cx. pipiens örneklerinin hiçbirinde pozitiflik belirlenmemiştir. Bunun yanında Ae. vexans ve Cs. annulata örneklerinde de Wolbachia DNA'sı saptanmamıştır. Pozitif izolatlardan seçilen 10 izolata (EruWolCpip1-10) ait amplikonlar PCR primerleri ile klonlanmış ve plasmid pürifikasyonundan sonra sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen DNA dizilerinin GenBank kayıtları gerçekleştirilmiş (KT964223- KT964232) ve GenBank'ta kayıtlı mevcut diğer bazı Wolbachia suşları ile ikili analizleri ve çoklu hizalamaları yapılarak filogenisi araştırılmıştır. Filogenetik analiz sonucu EruWolCpip1-10 izolatlarının Wolbachia B süper grubu ve wPip grubu içinde yer aldıkları belirlenmiştir. Filogenetik kıyaslamalara göre EruWolCpip1-9 izolatlarının kendi aralarında %100 identik oldukları ve bu izolatların EruWolCpip10 izolatıyla %0,5 genetik farklılık gösterdikleri saptanmıştır. Türkiye'den daha önce Kayseri yöresindeki Cx. pipiens örneğinden izole edilmiş ve GenBank'a girilmiş olan WolKys1 (JX474753) izolatının EruWolCpip1-9 izolatlarıyla %100 benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Benzer şekilde EruWolCpip1-9 izolatlarının wPip grubunda yer alan Cx. pipiens (DQ900652, AF301012, AF020060-61), Peribadotes rhomboidaria (EU288014), Agriocnemis femina femina (Brauer) (AY173941) ve Eurema hecabe (AB278203) Wolbachia izolatlarıyla da %100 identik oldukları belirlenmiştir. Daha önce Çankırı yöresindeki Ankara keçilerinden toplanmış Bovicola limbata bit örneklerinden oluşturulmuş genomik DNA havuzlarından elde edilerek GenBank kaydı yapılan ve wPip grubunda yer alan TrERUWolLice1 (KJ700416) izolatının da EruWolCpip1-9 izolatlarıyla %100 identiklik gösterdiği görülmüştür. wPip grubu içindeki ortalama genetik farklılık %0,28±0,11 olarak belirlenirken, wPip grubu ile aynı süper grup (B) içerisinde yer alan Dei,  Con ve Ori grupları arasındaki ortalama genetik farklılık ise sırasıyla %16,9±2,3, %12,5±1,9 ve %19,9±2,5 bulunmuştur. Bunun yanında A süper grubunda yer alan Haw, Riw, Mel, Aus, Mors, Uni, Pap ve Alba grupları ile B süper grubundaki wPip grubu arasındaki genetik farklılık ise sırasıyla %23,5±3,0, %17,6±2,3, %19,1±2,5, %22,0±2,8, %21,0±2,7, %22,3±2,9, %22,0±2,8 ve %20,5±2,6 olarak saptanmıştır. 
Sonuç olarak bu çalışma ile Kayseri Sultan Sazlığı yöresindeki sivrisinek populasyonlarında Wolbachia endobakterisinin moleküler yaygınlığı ve genetik karakterleri hakkında bilimsel veriler elde edilmiştir. 

Anahtar sözcükler: Sivrisinek, moleküler karakterizasyon, Türkiye, Wolbachia

Abstract:
ABSTRACT
This study was performed to investigate Wolbachia endobacteria molecularly in the mosquito specimens collected from Sultan Sazligi ecosystem in Kayseri from Turkey and to genotype the positive isolates. For this aim, a total of 400 mosquito samples collected from the study area was identified as 296 Culex pipiens, 63 Aedes vexans and 41 Culiseta annulata within the scope of research Project (No: TYL-2014-5176) supported by Erciyes University Research Fund. Genomic DNA was extracted from the identified mosquito specimens and examined by using the amplification of surface protein gene (wsp) region of the Wolbachia individually. After the DNA extraction, PCR analyses were carried out with Wolbachia specific primer pair which was amplified an approximately 600 bp region of the wsp gene. Wolbachia was determined in 119 (40.2%) female Cx. pipiens whereas no positivity was found in any male Cx. pipiens. In addition, no positivity was detected in any Ae. vexans and Cs. annulata specimens. The amplicons belonging to 10 selected positive isolates (EruWolCpip1-10) were cloned and sequenced following the plasmid purification. The obtained DNAs were deposited to GenBank (KT964223- KT964232) and pair wise analyses of the sequences and multiple alignments with some other Wolbachia strains available in the GenBank were performed and phylogenies were investigated. The phylogenetic analyses revealed that the obtained EruWolCpip1-10 isolates belong to Wolbachia super group B and wPip group. According to the phylogenetic comparisons, the EruWolCpip1-9 showed 100.0% identity within each other whereas these isolates exhibited 0.5% genetic difference with the EruWolCpip10 isolate. The WolKys1 (JX474753) isolate which was deposited to GenBank from Turkey previously and isolated from Cx. pipiens in Kayseri exhibited 100.0% identity with EruWolCpip1-9 isolates. Similarly, EruWolCpip1-9 isolates showed 100.0% identity with Cx. pipiens (DQ900652, AF301012, AF020060-61), Peribadotes rhomboidaria (EU288014), Agriocnemis femina femina (Brauer) (AY173941), and Eurema hecabe (AB278203) Wolbachia isolates in wPip group. TrERUWolLice1 (KJ700416) isolate in wPip group which was obtained from the genomic DNA pools constructed from Bovicola limbata louse specimens from Angora goats in Cankiri province previously was found 100.0% identical with EruWolCpip1-9 isolates. While the mean genetic difference within the wPip group was determined as 0.28%±0.11, the mean genetic difference among wPip and the other Dei,  Con and Ori groups which are in the same super group (B) with wPip was found as 16.9%±2.3, 12.5%±1.9 and 19.9%±2.5, respectively. In addition, the genetic differences among the wPip and the other Haw, Riw, Mel, Aus, Mors, Uni, Pap and Alba groups which belongs to A super group was detected as 23.5%±3.0, 17.6%±2.3, 19.1%±2.5, 22.0%±2.8, 21.0%±2.7, 22.3%±2.9, 22.0%±2.8 and 20.5%±2.6.
In conclusion, scientific data were obtained with this study about the molecular prevalence and genetic characters of Wolbachia endobacteria in mosquito populations in Sultan Sazligi ecosystem in Kayseri.

Key words: Molecular characterization, mosquito, Turkey, Wolbachia