Histamine bağlanan peptitlerin faj gösterim yöntemi ile belirlenmesi
Identification of histamine binding peptides by phage display technology
Yazar: HAFİZE ÖZ
Danışman: DOÇ. DR. FAHRİYE CEYDA DUDAK ŞEKER
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Bilimleri Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Gıdalarda en çok rastlanılan biyojenik aminlerden biri olan histamin, toksikolojik
etkilerinden dolayı halk sağlığını tehdit etmektedir. Bu nedenle gıdalardaki histamin
seviyesinin hızlı ve hassas tayini, insan sağlığı ve gıda güvenliği açısından büyük önem
taşımaktadır. Biyolojik tanıyıcı ajan olarak histamin spesifik enzimlerin veya antikorların
kullanıldığı biyoanaliz kitleri ve biyosensörler histaminin hızlı, hassas ve kolay tayinine
olanak sağlamaktadır. Ancak histamin gibi düşük moleküler ağırlığa sahip immün cevap
oluşturmayan hedeflere karşı antikor üretimininin oldukça zor olması uygulanabilirliği
azaltmaktadır. Biyolojik tanıyıcı moleküllerin üretimlerinin zahmetli ve maliyetli
olmasının yanında çevresel koşulların değişmesiyle aktivitelerini kolayca kaybetmeleri,
yapay tanıyıcı ajanların geliştirilmesini ve biyoanalizlerde kullanılmasının önünü
açmıştır. Faj gösterim teknolojisi ile çeşitli hedef moleküllere seçici olarak bağlanan
yapay tanıyıcı moleküller geliştirilebilmektedir. Günümüzde faj gösterim teknolojisi, düşük moleküler ağırlıklı birçok organik moleküle seçici olarak yüksek afinite ile
bağlanan peptit ligandların belirlenmesinde kullanılabilmektedir.
Tez çalışmasında, faj gösterim yöntemi kullanılarak gıda kaynaklı kimyasal
intoksikasyon etmeni olan histamine spesifik bağlanan peptitlerin belirlenmesi
amaçlanmıştır. Bu amaçla, 12mer faj gösterim peptit kütüphanesi, BSA-histamin
immobilize edilmiş kuyucuklara eklenmiş ve inkübe edilmiştir. Ardından yıkama işlemi
ile bağlanmayan fajlar uzaklaştırılmış ve bağlanan fajlar kuyucuklardan geri alınmıştır.
Bağlanan fajlar çoğaltılarak aynı seçim döngüsü üç defa tekrarlanmıştır. Son seçim
döngüsünde histamine benzer yapıda olan histidin amino asiti ilave edilerek histidine
bağlanan fajların uzaklaştırılması amaçlanmıştır. Böylelikle histamine bağlanan
birbirinden farklı peptit dizilimi taşıdığı düşünülen 41 adet faj klonu izole edilmiştir. Faj
klonlarının histamine gösterdikleri afinite, faj-ELISA yöntemi ile incelenmiş ve yüksek
afinite gösterdiği belirlenen 7 faj klonuna ait DNA'lar izole edilmiş ve peptit dizilimleri
belirlenmiştir. Dizi analizi sonucunda en yüksek afiniteye sahip ve birbirinden farklı
sekansta olan 4 peptit (HBF5, HBF10, HBF14 ve HBF26) sentezlenmiş ve bağlanma
özelliklerine ait termodinamik özellikleri izotermal titrasyon kalorimetrisi kullanılarak
belirlenmiştir. SGFRDGIEDFLW peptit dizilimine sahip HBF10 ve IPLENQHKIYST
dizilimine sahip HBF26 peptitlerinin histamine yüksek afinite gösterdiği gözlenmiş,
histamine yapıca benzer olan histidin amino asitine ise her iki peptitin de afinite
göstermediği görülmüştür. HBF26 dizilimine sahip peptite ait dairesel dikroizm
spektrskopisi kullanılarak incelenmiştir. HBF10 peptitinin suda çözünürlüğü düşük
olduğundan dairesel dikroizm spektrumu elde edilememiştir. Çalışma sonunda faj
gösterim yöntemi kullanılarak belirlenen HBF10 ve HBF26 peptitlerinin histaminin
tayinine yönelik çeşitli biyoanaliz ve biyosensör sistemlerinde kullanım potansiyeline
sahip olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
Histamine, one of the most frequently found biogenic amines in foods, threatens public
health due to its high toxicity. Therefore, rapid, and sensitive quantification of histamine
in food samples has vital importance in terms of human health and food safety. Bioassays
and biosensors, in which histamine specific enzymes or antibodies are used as biological
recognition agents, allow rapid, sensitive, and easy detection of histamine. However, the
difficulties in the production of antibodies against low molecular weight targets such as
histamine, reduce their applicability. The laborious and costly production of biological
recognition molecules and easy loss of their activity due to changes in environmental
conditions, bring up the development of artificial recognition agents and their use in
bioassays. Therefore, there is an urgent need for the development of histamine binding
artificial recognition agents to be used in bioassays. Phage display technology has been
used frequently in the selection and development of novel recognition agents that show
affinity to various target molecules. Today, phage display technology is used to identify 
peptide ligands that bind selectively to many low molecular weight organic molecules
with high affinity.
In this study, it was aimed to identify peptides that bind specifically to a food-borne
chemical intoxication agent, histamine, using the phage display method. For this purpose,
the 12mer phage display peptide library was added to BSA-histamine immobilized
microtiter well and incubated. Then the non-binding phages were discarded by washing
and the bound phages were eluted from the wells. The same panning cycle was repeated
three times after amplification of the bound phages. In the last panning cycle, histidine
binding phages were eliminated by adding the histidine amino acid, which has a similar
structure to histamine for enhancing the selectivity of the histamine binding phages. Thus,
41 phage clones thought to have different peptide sequences that bind to histamine, were
isolated. The affinity of phage clones to histamine was examined by the phage-ELISA
method and DNAs belonging to 7 phage clones showing high affinity were isolated and
peptide sequences were determined. Following the sequence analysis, 4 peptides (HBF5,
HBF10, HBF14, and HBF26) with the highest affinity and different sequences were
synthesized and the thermodynamic properties of their binding properties were
determined by using isothermal titration calorimetry. It was observed that HBF10
peptides with SGFRDGIEDFLW peptide sequence and HBF26 with the sequence of
IPLENQHKIYST showed a high affinity for histamine, and both peptides did not show an
affinity for histidine amino acid, which is similar in structure to histamine. The secondary
structures of the HBF26 peptide were examined using circular dichroism spectroscopy.
The circular dichroism spectrum could not be obtained due to the low solubility of the
HBF10 peptide in water. At the end of the study, it is thought that the HBF10 and HBF26
peptides determined by using the phage display method have the potential to be used in
various bioassay and biosensor systems for the determination of histamine.