Analitik kalibrasyon standardı olarak kullanılması amacıyla patulin üretimi
Patulin production to use as an analytical calibration standard
Yazar: MURAT DAĞ
Danışman: DOÇ. DR. CEMALETTİN BALTACI
Gümüşhane Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Kimya = Chemistry
Dizin: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikotoksinler = Mycotoxins ; Patulin = Patulin

Özet:
Mikotoksinler; tarlada, depolama esnasında ya da daha sonraki ısı ve nem açısından uygun koşullar altındaki gıda zincirinde yer alan Aspergillus, Penicillium ve Fusarium vb cinslerin bazı türleri tarafından üretilen ikincil metabolitlerdir. Gıda ve yemlerin mikotoksinler ile bulaşması insan ve hayvan sağlığı açısından çok önemli bir risk oluşturmaktadır. Mikotoksinler ile bulaşmış gıda ve yemlerin tüketilmesinden sonra insan ve hayvanlar için akut ya da kronik zehirlenme ve vücutta bazı hasarların oluşumuna sebep olabilmektedir. Bu zararlara ilaveten mikotoksinler üretim yapılan ülkelerde çok büyük ekonomik kayıpların meydana gelmesine neden olmaktadır. Türk Gıda Kodeksi Bulaşanlar Yönetmeliğinde Aflatoksinler (B1, B2, G1, G2, M1), Okratoksin A, Zearalenon, Fumonisinler (B1, B2),  Patulin,  Deoksinivalenol olmak üzere toplam 11 adet Mikotoksin metaboliti için maksimum residu limitleri (MRL)  verilmiştir.
Bu mikotoksinlerden olan patulinin, çürümüş elmaların işlenmesiyle üretilen elma sularındaki patulin derişimi çok yüksek sevide olabilmektedir. Patulin genellikle Penicillium, Aspergillus ve Byssochlamys cinsindeki bir dizi küf türü tarafından üretilen ikincil bir metabolittir. Patulin birçok küflü meyve, sebze, tahıl ve diğer gıdalarda bir kirletici olarak tespit edilmiştir. Başlıca bulaşma kaynakları elma ve elma ürünleridir. İthalat, ihracat ve piyasa  denetimi esnasında  yönetmelikte belirtilen ürünlerde patulin analizinin yapılma zorunluluğu vardır. Patulinin çeşitli analiz metotları  kullanılmak süretiyle analizi yapılmaktadır. Diğer mikotoksinler gibi patulin için yapılacak miktar tayini analizlerinde analitik kalibrasyon standartlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tezde, patulinin analitik kalibrasyon standardı üretimi için çalışmalar yapılmıştır.
Yapılan bu çalışmada doğal olarak çürütülmüş elmalarda oluşan küf türleri ilk olarak renklerine göre izole edilmeye çalışılıldı ve bu renklere göre kodlandı.  Renklerine göre izole edilen bu küf türleri daha sonra MALDİ-TOF/MS yöntemi kullanılarak teşhis edildi. Bu analiz sonucunda kodlanan küflerin, Penicillium chrysogenum, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum oldukları tespit edildi. Bu küf türlerinden, P. chrysogenum, kırmızı elmalarda 13.48 mg/kg, sarı elmalarda 45.91 mg/kg ve yeşil elmalarda 25.07 mg/kg patulin üretti. P. expansum   kırmızı elmalarda 24,47 mg/kg, sarı elmalarda 49.80 mg/kg ve yeşil elmalarda  28.22 mg/kg patulin üretti. Küf türleri içersinde en fazla  patulin üretimini P. expansum   yaptı. P. digitatum, kırmızı elmalarda 8.36 mg/kg, sarı elmalarda 10.83 mg/kg ve yeşil elmalarda 9.48 mg/kg patulin üretti. Küf türleri içersinde en az patulin üretimini P. digitatum yapmıştır. P. italicum, kırmızı elmalarda 4.68 mg/kg, sarı elmalarda 22.40 mg/kg ve yeşil elmalarda  8.50 mg/kg patulin üretti. Literatürde P. italicum' un patulin üretimi ile ilgi bir çalışmaya rastlanmadı. Farklı elma türlerine göre (kırmızı, sarı, yeşil) patulin üretme kapasitesine bakıldığında genel olarak sıralama sarı > yeşil > kırmızı  şeklinde olduğu  görüldü. Fakat bazı durumlarda yeşil elmalarda patulin miktarının fazla olduğu görüldü. Genel olarak kırmızı elmalarda patulin miktarının düşük olduğu, sarı ve yeşil olanlarda daha yüksek olduğu görüldü. Çalışılan elma türleri, Gümüşhane ve Erzincan yerel elma türleridir. Bu elmalardan küfler izole edilerek türleri tespit edilen bu küflerin ürettikleri  patulinin  çeşitli kromatografik yöntemler kullanılarak analizi yapıldı. Üretimi yapılan patulinin HPLC ile kontrolü yapıldığında saflığı ≥ 98.0 % olarak tespit edildi. Yapılan bu tez çalışmasında izlenilen yöntem ile analitik kalibrasyon standardı kullanılabilinecek saflıkta patulin üretimi gerçekleştirildi.

Abstract:
Mycotoxins; They are secondary metabolites produced by some species of Aspergillus, Penicillium and Fusarium, etc. in the food chain, which are in the field, during storage, or later under favorable conditions for heat and humidity. Contamination of food and feed with mycotoxins poses a very important risk for human and animal health. After consuming food and feeds contaminated with mycotoxins, it may cause acute or chronic poisoning and some damage to the body for humans and animals. In addition to these losses, mycotoxins cause huge economic losses in the countries of production. In the Turkish Food Codex Contaminants Regulation, maximum residual limits (MRL) are given for a total of 11 Mycotoxin metabolites including Aflatoxins (B1, B2, G1, G2, M1), Ochratoxin A, Zearalenone, Fumonicins (B1, B2), Patulin, Deoxynvalenol.
Patulin concentration from these mycotoxins can be very high in the apple juice produced by processing rotten apples. Patulin is a secondary metabolite usually produced by a number of mold species in the genus Penicillium, Aspergillus and Byssochlamys. Patulin has been identified as a contaminant in many moldy fruits, vegetables, grains and other foods. The main sources of contamination are apples and apple products. Patulin analysis is mandatory for products specified in the regulation during import, export and market control. Patuline is analyzed by using various analysis methods. Analytical calibration standards are needed in the assay analysis for patulin like other mycotoxins. In this thesis, studies were carried out for the production of the analytical calibration standard of patulin.
In this study, the types of mold formed in naturally rotten apples were first tried to be isolated according to their color and coded according to these colors. These mold types, which were isolated according to their color, were subsequently diagnosed using the MALDI-TOF / MS method. As a result of this analysis, the coded molds were determined to be Penicillium chrysogenum, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum. Of these mold species, P. chrysogenum produced 13.48 mg / kg in red apples, 45.91 mg / kg in yellow apples and 25.07 mg / kg in green apples. P. expansum produced 24.47 mg / kg of red apples, 49.80 mg / kg of yellow apples, and 28.22 mg / kg of patulin in green apples. P. expansum produced the most patulin production among mold species. P. digitatum produced 8.36 mg / kg in red apples, 10.83 mg / kg in yellow apples and 9.48 mg / kg patulin in green apples. P. digitatum produced the least amount of patulin in mold species. P. italicum produced 4.68 mg / kg in red apples, 22.40 mg / kg in yellow apples and 8.50 mg / kg in green apples. There is no study related to the production of patulin of P. italicum in the literature. Considering the capacity of producing patulin according to different apple types (red, yellow, green), it was seen that the ranking was generally yellow> green> red. However, in some cases, the amount of patulin was observed in green apples. It was seen that the amount of patulin was low in red apples and higher in yellow and green ones. The apple types studied are local apple types in Gümüşhane and Erzincan. The molds of these molds, which were identified by isolating molds from these apples, were analyzed using various chromatographic methods. When the produced patulin was checked by HPLC, its purity was determined as 98.0%. The produced patulin was obtained purely using the method I used in my thesis and produced as an analytical standard.