Selülaz enzim kompleksinin manyetik partiküllere immobilizasyonu
Immobilization of cellulase enzyme complex to magnetic particles
Yazar: HİLAL DAL
Danışman: PROF. DR. MUHAMMET ŞABAN TANYILDIZI
Fırat Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Son yıllarda manyetik nanopartiküllerin enzim immobilizasyonunda destek materyali olarak kullanılmasına olan ilgi giderek artmaktadır. Bu çalışmada destek materyali olarak birlikte çöktürme yöntemiyle sentezlenen manyetit (Fe3O4) kullanılarak,  selülaz enzim kompleksinin kovalent olarak immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen manyetik nanopartiküllerin üzeri silisyum ile kaplanarak manyetik nanopartiküllerin stabilizasyonu sağlanmıştır (A-MNP). Yüzey modifikasyonu APTES ile yapılan manyetik nanopartiküller gluteraldehit ile aktifleştirilmiş (G-MNP) ve ardından selülaz enzimi immobilize edilmiştir (E-MNP). MNP, A-MNP, G-MNP ve E-MNP'nin karakterizasyonu için SEM, EDX, FTIR analizleri yapılmıştır. Sentezlenen MNP'lerin ortalama boyutunun 200 nm olduğu bulunmuştur. Serbest ve immobilize selülaz enzimlerinin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 70 ℃ ve optimum pH değerleri serbest enzim için 5 ve immobilize enzim için 4,8 olarak belirlenmiştir. Enzim sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi amacıyla, serbest ve immobilize selülaz enziminin 60 ℃ sıcaklıkta 5 saat boyunca yürütülen sıcaklık stabilite çalışmaları sonucunda serbest ve immobilize selülaz enziminin sırasıyla % 29,9 ve % 38 oranında aktivitesini korunduğu belirlenmiştir. Farklı substrat derişimlerinde ölçülen aktiviteler sonucu serbest selülaz enzimi için Km, Vmax değerleri sırasıyla 155,25 mg/ml, 2500 μmol/ml.dk, immobilize selülaz enzimi için ise 23,64 mg/ml , 108,69 μmol/ml.dk olarak CMC aktivite ölçümü ile 4. döngünün sonunda enzim aktivitesinin % 20 oranında korunduğu belirlenmiştir. Depolama stabilitesi çalışmaları sonucunda kalan % bağıl aktivite oranları serbest ve immobilize selülaz enzimi için sırasıyla % 73.3 ve % 91.2 olarak belirlenmiştir. Fiziksel ve kimyasal ön işlem gören atık gazete kağıtlarının serbest ve immobilize selülaz enzimi ile 48 saat boyunca süren enzimatik hidroliz işlemi sonucunda elde edilen % şeker verimleri, serbest selülaz enziminde, 0,25 g atık gazete kağıdı için  % 10,2 ve 0,5 g atık gazete kağıdı için  % 8,19, immobilize selülaz enziminde ise 0,25 g atık gazete kağıdı için  % 3,87 ve 0,5 g atık gazete kağıdı için  % 3,27 olarak belirlenmiştir.

Abstract:
In recent years there has been an increasing interest in the use of magnetic nanoparticles as support material in enzyme immobilization. In this study, covalent immobilization of cellulase enzyme complex was carried out by using magnetite (Fe3O4) synthesized by co-precipitation method as support material. The synthesized magnetic nanoparticles were coated with silane to stabilize the magnetic nanoparticles (A-MNP). Surface modification The magnetic particles coated with APTES were activated with glutaraldehyde (G-MNP) followed by cellulase enzyme immobilization (E-MNP). SEM, EDX. FTIR analyzes were used for the characterization of MNP, A-MNP, G-MNP and E-MNP. The approximate size of MNPs was found to be 200 nm. Maximum activity of free and immobilized cellulase enzymes was determined at 70 °C. The optimum pH values were 5 and 4,8 for immobilized enzyme, free enzyme, respectively. Residual enzyme activity was determined as 29,9 % and 38 % for free and immobilized cellulase enzymes, respectively, after 5 hours at 60 °C. The cellulase activities measured at different substrate concentrations. Km, Vmax values were calculated as 155,25 mg/ml, 2500 μmol/ml.dk and 23,64 mg/ml, 108,69 μmol/ml.dk for free and immobilized cellulase enzyme, respectively. To investigate the reusability of the immobilized cellulase enzyme, the CMC method was used and it was determined that enzyme activity was maintained at 20%  at the end of the 4th loop. The stability of free and immobilized cellulase enzymes was determined to be 73.3 % and 91.2 %, respectively, at the end of 20 days at 4 °C. The sugar yields obtained by the enzymatic hydrolysis of the physically and chemically pretreated waste papers with the free and immobilized cellulase enzyme for 48 hours. Glucose yields were found as 10,2 %  for 0,25 g waste newspaper and 8,19 %  for 0,5 g waste newspaper for free enzyme. Glucose yields were found as 3,87 %  for 0,25 g waste newspaper and 3,27 %  for 0,5 g waste newspaper in the immobilized cellulase enzyme.