Yağ dokusu kökenli mezenşimal kök hücrelerinin farklı pasajlarda karakterizasyonu
Characterization of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in different passages
Yazar: MİNELA JUSOVİC
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ ONUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Yağ dokusu, hücresel tedavi ve rejeneratif tıp için dikkat çekici ve bol bulunan bir kök hücre kaynağıdır. Mezenşimal kök hücreler (MKH) hasar bölgesine göç, tutunma ve dokuya yerleşme yetenekleri sayesinde ve salgıladıkları moleküller aracığıyla önemli derecede tedavi edici potansiyele sahiptir.  MKH'ler cilt altı yağ dokusundan primer eksplant kültür yöntemi ile kolaylıkla izole edilebilir ve in vitro kültür ortamında kolaylıkla çoğaltılabilir. MKH'ler immunofenotiplerini belirleyen bir çok yüzey antijeni ifade eder.  Bu çalışmada MKH'ler 10 farklı pasajda beş farklı yüzey antijeni (CD13, CD29, CD54, CD90 ve CD34) için immunofloresan boyama yöntemi ile karakterize edilmiştir. MKH'ler Wistar albino sıçanlardan primer kültür yöntemi ile izole edilmiş ve standart koşullarda kültürü yapılmıştır. 10 pasajda da MKH'ler kültür kaplarının yüzeyine tutunarak fibroblastik morfoloji göstermiştir. Hücreler tam konfluent hale geldikten sonra pasajlanmış, ve bütün pasajlarda yüzey antijenlerinin ifadesi % olarak hesaplanmıştır. Pasajlar arasında yüzey antijenlerin ifade bakımından farklılık olup olmadığı Kruskal-Wallis test yöntemi ile istatistiksel olarak gösterilmiştir. İstatistiksel önem kontrolü p≤ 0,05 düzeyinde yapılmıştır.  
Sonuçlar hücreler uzun süre kültür edildikleri zaman yüzey antijenlerinin ifadesinde değişiklikler olduğunu göstermiştir. 
CD13 ve CD54 artan pasajlarda ifade oranında bir değişiklik olmazken, CD29 ve CD90 ifadesi farklı pasajlarda değişmektedir ve en yüksek ifade oranı ilk pasajlarda görülürken ilerleyen pasajlarda ifade oranı düşmektedir. CD34, MKH'lerde ifade edilen bir diğer yüzey antijenidir. Ancak, bu yüzey antijenin ifadesi diğer yüzey antijenleri ile kıyaslandığında belirgin derecede düşük olmaktadır. 
MKH'lerin yüzey antijenlerinin profiline bakıldığında, ilk pasajlarda yüzey ifadesi bakımından daha kararlı oldukları ve in vivo uygulamalar için P3, P4, P5 ve P6'nın en uygun pasajlar olduğu söylenebilir. Bu pasajlarda hücrelerin morfolojileri değişmemekte ve immunofenotipik özelliklerini devam ettirmektedirler. 
Heterojen bir hücre populasyonu olduğu için, bir çok yüzey antijeninin ifadesi, ilk pasajlarda hücre kültüründe salgılanmış çeşitli faktörler ve sitokin molekülleri tarafından etkilenmekte ve in vitro yüzey antijenlerinin ifadesi, in vivo daki ifadeleri ile her zaman örtüşmemektedir.

Abstract:
Adipose tissue represents an attractive and abundant stem cell source for both cellular therapy and regenerative medicine. It is clear that mesenchymal stem cells (MSCs) have significant therapeutic potential because of their ability to secrete various molecules, which are important for their adhesion, migration and homing to the site of injury.  MSC can be isolated from subcutaneous adipose tissue by primary explant culture method, can be easily expanded in vitro. MSCs express many of surface molecules that define their immunophenotype. 
In this study, MSCs were characterized in 10 different passages for five surface antigens including CD13, CD29, CD54, CD90 and CD34 by using immunofluorescence staining method. MSCs were isolated by primary explant culture method from Wistar albino rats, and cultured under standard culture conditions. In the culture medium cells showed plastic adherent properties, and exhibited fibroblastic morphologies in all of 10 different passages. Cells were subcultured when nearly complete confluence was reached. Expression profile (%) of five different surface antigens were determined separately in all passages. 
By using independent samples Kruskal-Wallis test expression profile of each surface antigen was compared between passages. P-value of  p≤ 0,05 was considered statistically different.  Results obtained showed that some surface antigens were changed when cells are cultured for longer time. The expression of CD13 and CD54 did not change with increasing passage number. However, expression of CD29 and CD90 was variable between passages, and was mostly expressed highly in first passages, with decline in later passages. CD34 was also detected on the surface of MSCs, but its expression was considerably lower than other normally positively expressed surface antigens. 
Based on surface profile of the characterized MSCs it can be concluded that the expression profile is mostly stable in first passages, and for any further in vivo application these cells should be used at P3, P4, P5, P6 passages. In the mentioned passages cells maintained their morphologies and kept their immunophenotypic characteristics. 
Because of the heterogenous cell population, it is important to note that differences in cell surface expression of many markers may be influenced by factors secreted by other cells in the initial passage, and the in vitro expression of some markers by MSCs does not always correlate with their expression patterns in vivo.