Benzohidrazid türevleri ile laktoperoksidaz enziminin afinite tekniği kullanılarak memeli sütlerinden saflaştırılması
Purification of lactoperoxidase enzyme from mammals milk benzohydrazi̇de derivatives prepared by using affinity technique
Yazar: NESLİHAN MACİT
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada hidrazin türevi olan 4-amino-2-metoksibenzohidrazid, 4-amino-3-bromobenzohidrazid ve 4-amino-3-klorobenzohidrazid molekülleri laktoperoksidaz (LPO) enziminin saflaştırılmasında ligand olarak kullanıldı. CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B-L-tirozin matriksine ligandlar kovalent bağlanarak afinite kolonları hazırlandı. 4-amino-2-metoksibenzohidrazid molekülü ile yapılan saflaştırma sonucunda LPO enzimi; keçi sütünden  %1,54 verimle 41,62 kat, manda sütünden  %12,83 verimle 137,5 kat, sığır sütünden %5 verimle 900 kat ve koyun sütünden %9,42 verimle 135,41 kat saflaştırıldı. 4-amino-3-bromobenzohidrazid ile LPO; keçi sütünden %6,25 verimle 166,6 kat, manda sütünden %19,3 verimle 291,66 kat, sığır sütünden %15 verimle 1519 kat ve koyun sütünden %8,72 verimle 261 kat saflaştırıldı. 4-amino-3-klorobenzohidrazid afinite kolonundan ise keçi sütünden  %19,8 verimle 260 kat, manda sütünden %35,3 verimle 580,6 kat, sığır sütünden  %14,4 verimle 1321 kat saflaştırılırken koyun sütünden LPO enzimi %23,3 verimle 892,2 kat saflaştırıldı. Enzimlerin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve tek bant yaklaşık 80 kDa olarak bulundu. Bu sonuçlardan hareketle benzohidrazid moleküllerinin LPO enziminin saflaştırılmasında kullanılabileceği ilk defa bu çalışmada gösterildi. Çalışılan 3 molekül arasında 4-amino-3-bromo benzohidrazid molekülünün memeli sütlerinden LPO saflaştırılmasında kullanılabilme potansiyeline sahip olduğu belirlendi. 4-amino-3-bromo benzohidrazid afinite kolonu için LPO'nun bağlanma kapasitesi 10°C'de pH:8,5 ve 0,40 M iyonik şiddet konsantrasyonunda 0,110 mg/g jel olarak belirlendi.

Abstract:
In this study, 4-amino-2-methoxybenzohydrazide, 4-amino-3-bromobenzohydrazide and 4-amino-3-chlorobenzohydrazide molecules which were hydrazine derivatives were used in purification of Lactoperoxidase (LPO) as affinity chromatography ligands. Affinity columns were prepared by binding ligand molecules to Sepharose-4B-L-tyrosine matrix aktivated by CNBr. The purification values of LPO enzyme 4-amino-2-methoxybenzohydrazide molecule from goat, buffalo, cow and sheep milks were determined to be 41,62 fold with a yield of 1,54%, 137,5 fold with a yield of 12,83%, 900 fold with a yield of 5% and 135,41 fold with a yield of 9,42%, respectively. LPO enzyme purified using 4-amino-3-bromobenzohydrazide from goat, buffalo, cow and sheep milks 166,6 fold with a yield of 6,25%, 291,66 fold with a yield of 19,3%, 1519 fold with a yield of 15% and 261 fold with a yield of 8,72%, respectively.When 4-amino-3-chlorobenzohydrazide column was used, purified LPO enzyme values obtained from goat, buffalo, cow and sheep milks were found as  260 fold with a yield of 19,8%, 580,6 fold with a yield of 35,3%, 1321 fold with a yield of 14,4% and 892,2 fold with a yield of 23,3%, respectively. The purities of the enzymes were checked by SDS-PAGE and one band was found about 80 kDa. The results obtained from present study showed that benzohydrazide molecules will be used in purification of Lactoperoxidase (LPO). In addition, it was determined that 4-amino-3-bromobenzohydrazide molecule among the 3 molecules was more effective than other molecules in purification of Lactoperoxidase (LPO) from ruminant milks. For 4-amino-3-bromobenzohydrazide column the binding capacity of the LPO at 10°C, pH 8.5 and 0.40 M ionic strength, concentration was determined as 0.110 mg/g gel.