Kronik roflumilast kullanımının sıçanlarda testis dokusu üzerine apoptotik ve otofajik etkilerinin immunohistokimyasal ve immunfloresans yöntemler ile incelenmesi
Examination of apoptotic and autophagic effects of the chronic use of roflumilast on rat testicular tissue by immunohistochemical and immunofluorescence methods
Yazar: ARZU GEZER
Danışman: PROF. DR. EBRU KARADAĞ SARI
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Floresan antikor tekniği = Fluorescent antibody technic ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Otofaji = Autophagy ; Roflumilast = Roflumilast ; Sıçanlar = Rats ; Testis = Testis ; Testosteron = Testosterone ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Bu çalışma ile Roflumilast'ın farklı dozlarda kronik kullanımının testis dokusuna ve testosteron seviyesine olası etkilerinin histopatolojik, immunohistokimyasal, immunfloresans ve biyokimyasal yöntemler kullanılarak belirlenmesi amaçlandı.
Deneyde, 40 günlük, ortalama 180-200 gr ağırlığında, 36 adet Sprague-dawley erkek sıçan kullanıldı. Sıçanlar; Kontrol grubu (n=8), Sham grubu (n=8), 0,5 mg/kg Roflumilast grubu (n=10) ve 1 mg/kg Roflumilast grubu (n=10) olmak üzere, rastgele bir biçimde dört gruba ayrıldı. Kontrol grubundaki sıçanlara hiçbir uygulama yapılmadı. Sham grubundaki sıçanlara çözücü olarak kullanılan serum fizyolojik, her gün aynı saatte, günde bir kere 1ml olacak şekilde oral gavaj yolu ile 4 hafta boyunca verildi. 0,5 mg/kg Roflumilast grubundaki sıçanlara her gün aynı saatte, günde bir doz olmak üzere 0,5 mg/kg Roflumilast oral gavaj yolu ile 4 hafta boyunca verildi. 1 mg/kg Roflumilast grubundaki sıçanlara her gün aynı saatte, günde bir doz olmak üzere 1 mg/kg Roflumilast oral gavaj yolu ile 4 hafta boyunca verildi. Testis dokusunda histopatolojik incelemeler için Hematoksilen-eozin ve Crosman'ın üçlü boyamaları, Kaspaz-3, Apoptoz indükleyici faktör ve Hafif zincir 3β  ekspresyon düzeyi için immunohistokimyasal ve immunflouresans incelemeler, serumda testosteron düzeyini belirlemek için ise biyokimyasal incelemeler yapıldı. 
Sonuç olarak; dozun artmasıyla orantılı olarak Roflumilast grubundaki sıçanlarda kontrol ve sham grubuna göre canlı ağırlık kaybı ve histopatolojik olarak hücreler arasında bir ayrışma, deskuamasyon, interstisyel ödem ve dejeneratif değişiklikler belirlendi. Kaspaz-3, apoptoz indükleyici faktör ve hafif zincir 3 Beta seviyeleri ile belirlenen apoptoz ve otofaji, kontrol ve sham gruplarında birbirine yakın ve oldukça az seviyelerde iken, Roflumilast uygulanan gruplarda önemli derecede artan apoptotik ve otofajik değişiklikler ve immunpozitiflikler tespit edildi. 1 mg/kg Roflumilast grubunda serum testosteron seviyesinin kontrol, sham ve 0,5 mg/kg Roflumilast gruplarına kıyasla daha düşük olduğu görüldü. Bu sonuçlardan yola çıkarak Roflumilast etken maddesinin fertilite üzerinde olası olumsuz etkilerinin göz önünde bulundurulması gerektiği düşünülmüştür. 

Anahtar Kelimeler: Apoptoz, Otofaji, Roflumilast, Testosteron, Testis

Abstract:
The aim of this study was to determine the therapeutic potential of chronic use of Roflumilast in different doses on testicular tissue and testosterone level by using histopathological, immunohistochemical, immunofluorescence, and biochemical methods.
A total of 36 male 40-day-old Sprague-Dawley rats weighing 180-200 g were used for the experiments. The rats were randomly divided into four groups: Control group (n=8), Sham group (n=8), 0,5 mg/kg Roflumilast group (n=10), and 1 mg/kg Roflumilast group (n=10). No administration was performed for rats in the control group. Rats in the Sham group were administered 1 ml saline solution via oral gavage, one dose daily, for 4 weeks, at the same time for each day. Rats in the 0,5 mg/kg Roflumilast group were administered 0,5 mg/kg Roflumilast via oral gavage, one dose daily, for 4 weeks, at the same time for each day. Rats in the 1 mg/kg Roflumilast group were administered 1 mg/kg Roflumilast via oral gavage, one dose daily, for 4 weeks, at the same time for each day. Histopathological analysis of testicular tissue was performed by hematoxylin-eosin stains and Crossman triple stain. Immunohistochemical and immunofluorescence investigations were performed for the quantification of the Caspase-3, Apoptosis-inducing factor (AIF) and Light chain 3β (LC3B) expression levels. Biochemical examinations were performed to determine serum testosterone levels.
As a result; body weight loss and histopathological changes such as intercellular separation, desquamation, interstitial edema, and degenerative changes were observed in rats in the Roflumilast group compared to rats in the Control and Sham groups, in proportion to the increase in dose. While the levels of apoptosis and autophagy determined by Caspase-3, Apoptosis-inducing factor, and Light chain 3 Beta levels were close to each other and at very low levels in the Control and Sham groups; significantly increased apoptotic and autophagic changes and immunity were determined in the Roflumilast administered groups. Serum total testosterone levels were found to be lower in the 1 mg/kg Roflumilast group, compared to the Control, Sham and 0,5 mg/kg Roflumilast groups.
Based on these results, it was thought that the potential adverse effects of the active substance Roflumilast on fertility should be considered.
Key Words: Apoptosis, Autophagy, Roflumilast, Testosterone, Testis