Ratlarda renal iskemi-reperfüzyon hasarında sitratın önkoşullayıcı etkisinin histopatolojik yöntemler ve oksidatif stres parametreleri ile değerlendirilmesi
Evaluation of the pre-conditioning effect of citrate in renal ischemia-reperfusion damage in rats by histopathologic methods and oxidative stress parameters
Yazar: ABDULLAH KAYGISIZ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ FERDA YILMAZ İNAL
İstanbul Medeniyet Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Anesteziyoloji ve Reanimasyon Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Anestezi ve Reanimasyon = Anesthesiology and Reanimation

Özet:
Amaç: Sitratın sıçanlarda böbrek iskemi-reperfüzyon hasarı üzerindeki
önkoşullayıcı etkisini total oksidan/antioksidan seviyeleri, tiyol/disülfit
dengesi, paraoksonaz-1 enzim seviyesi, iskemi modifiye albümin düzeyleri
gibi biyokimyasal yöntemler ve histopatolojik yöntemlerle değerlendirmeyi
amaçladık.
Metot: Çalışmamızda ağırlıkları 285-370 g arasında değişen toplam 24 adet
erişkin Wistar-Albino cinsi erkek sıçan kullanıldı. Tüm sıçanlara genel
anestezi uygulandıktan sonra trakeostomi açılıp invazif mekanik ventilasyon
uygulandı. Tüm gruplarda çalışma süresince arteryel basınç değerleri ve kalp
atım hızı sayısı femoral artere yerleştirilen kateter ile ölçülerek kaydedildi.
Sıçanlar kapalı zarf usulü ile 4 gruba ayrıldı. Sham operasyon grubuna (Grup
S) laparotomi uygulandıktan sonra kan örneği alınıp böbrekleri çıkartıldı.
İskemi-reperfüzyon grubunun (Grup İR) bilateral renal pediküllerinden
klemplenerek böbrekleri 40 dk. boyunca iskemiye maruz bırakıldı. Daha
sonra klempler kaldırılarak 60 dk. reperfüze edildi. Sitrat grubuna (Grup C)
bir kuyruk veninden 90 dk. süresince %4'lük sodyum sitrat solüsyonundan
1 mmol/kg/saat dozunda, diğer kuyruk veninden ise %10'luk kalsiyum
glukonat solüsyonundan 2 ml/kg/saat dozunda uygulandı. İskemireperfüzyon + sitrat grubuna (Grup İR+C) kuyruk venlerinden 60 dk.
boyunca %4'lük sodyum sitrat 1 mmol/kg/saat dozunda ve %10'luk
kalsiyum glukonat 2 ml/kg/saat dozunda infüzyon şeklinde uygulandı.
İnfüzyonların durdurulmasının ardından böbrekler 40 dk. boyunca
klemplendi. İskemi sonrası klempler kaldırıldı ve böbrekler 60 dk. reperfüze
edildi. Reperfüzyonun ilk 30 dakikasında sodyum sitrat ve kalsiyum
infüzyonları aynı dozlarda tekrar uygulandı. Çalışma sonunda tüm gruplarda
çıkartılan böbrekler %10'luk nötral formaldehit solüsyonunda fikse edildi.
Böbrek spesmenleri hematoksilen-eosin ile boyandıktan sonra histopatolojik
olarak incelendi. İntersitisyel alanlarda kapiller vazodilatasyon/ konjesyon,
tübüllerde dilatasyon / cast formasyonu, tübül epitelinde fırçamsı kenar
kaybı, vakuolizasyon, epitelin lümene dökülmesi, intersitisyel yapıda inflamasyon / fibrozis varlığı, glomerüllerde morfolojik değişiklikler
değerlendirilerek skorlandı. Biyokimyasal olarak serumdan üre, kreatin, total
oksidan seviye, total antioksidan seviye, oksidatif stres indeksi, total tiyol ile
native tiyol seviyeleri, tiyol-disülfit oranı, paraoksonaz-1 seviyesi, iskemi
modifiye albümin seviyesi ölçüldü. Çalışma verilerinin istatistiksel analizinde
(SPSS versiyon 20) Mann-Whitney U testi, Kruskal-Wallis testi, Dunn testi,
Wilcoxon işaretli sıralar testi, Friedman testi ve Pearson ki-kare testi
kullanıldı.
Bulgular: Grupların başlangıçta arteryel hattan alınan kan örneklerinden
çalışılan kan gazı parametrelerinin karşılaştırılmasında fizyolojik sınırlar
içerinde sonuca etkisinin olacağı düşünülmeyen değerler dışında istatistiksel
olarak farklılık saptanmadı. Grup İR'de başlangıçtaki, iskemi sonrası
40.dakikadaki, reperfüzyon 70.dakikadaki ve reperfüzyon 100.dakikadaki
klor değerleri (p=0.02) ve kalsiyum (p=0.03) değerleri arasında istatistiksel
olarak anlamlı fark saptandı. Grup C'nin başlangıçtaki HCO3 düzeyi ile sitrat
infüzyonu 90.dakikadaki HCO3 düzeyi arasında istatistiksel olarak anlamlı
fark görüldü (p=0.04). Grup C'nin başlangıçtaki Ca düzeyi ile sitrat infüzyonu
90.dakikadaki Ca düzeyi arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı
(p=0.03). Grup İR+C'nin başlangıçtaki, sitrat infüzyonu sonrası
60.dakikadaki, iskemi sonrası 100.dakikadaki, reperfüzyon 130.dakika ve
reperfüzyon 160.dakikadaki Cl değerleri arasında (p=0.009), Ca değerleri
arasında (p=0.002), laktat değerleri arasında (p=0.01), glukoz değerleri
arasında (p=0.008), HCO3 değerleri arasında (p<0.001) ve BE değerleri
arasında (p=0.004) istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı. Dört çalışma
grubunun kreatin düzeyleri arasında (p<0.001) ve üre düzeyleri arasında
(p<0.001) istatistiksel olarak anlamlı fark gözlemlendi. Grupların
histopatolojik skorları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark görüldü
(p=0.001). TOS düzeyleri arasında (p=0.048) ve TAS düzeyleri arasında
(p=0.016) istatistiksel olarak anlamlı fark görülürken OSİ değerleri arasında
anlamlı fark görülmedi. T-Tiyol düzeyleri (p=0.002) ve N-Tiyol düzeyleri
açısından istatistiksel olarak anlamlı fark (p<0.001) olduğu saptandı.
Tiyol/disülfit düzeyleri karşılaştırıldığında sonuç istatistiksel olarak anlamlı
görüldü (p<0.001). Gruplar arasında PON-1 düzeyleri (p<0.001) ve İMA
düzeyleri açısından istatistiksel olarak anlamlı fark olduğu tespit edildi
(p=0.001).
Sonuç: Çalışmamızda böbreklerde oluşturduğumuz İR hasarının oksidatif
hasara yol açtığını gözlemledik. Sodyum sitrat infüzyon uygulaması oksidatif
hasarı TAS seviyesini artırıp TOS seviyesini azaltarak hafifletmiştir ve
tiyol/disülfit dengesine tiyoller yönünde olumlu katkıda bulunmuştur.
Histopatolojik incelemelerde sitratın önkoşullayıcı etkisinin böbreği İR
hasarından koruduğunu gözlemledik. Sonuç olarak sitratın, böbrek İR
hasarının olumsuz etkilerini azaltmada faydalı olabileceği kanısındayız.

Anahtar kelimeler: Böbrek iskemi reperfüzyon hasarı; Oksidatif Stres; TAS, TOS, OSİ; Tiyol/Disülfit Dengesi; PON-1; İMA

Abstract:
Aim: We aimed to investigate the preconditioning effect of citrate on kidney
ischemia-reperfusion injury in rats by biochemical methods such as total
oxidant/antioxidant levels, thiol/disulfide balance, paraoxonase-1 enzyme
level, ischemia modified albumin levels and by histopathological methods.
Materials and Methods: A total of 24 adult male Wistar-Albino rats weighing
between 285-370 g were used in our study. After general anesthesia,
tracheostomy was opened and invasive mechanical ventilation was applied to
all rats. In all groups, arterial pressure and heart rate were measured and
recorded with a catheter placed in the femoral artery. The rats were divided
into 4 groups by closed envelope method. In the sham operation group (Group
S), blood samples were taken after laparotomy and the kidneys were removed.
In the ischemia-reperfusion group (Group IR), bilateral renal pedicles were
clamped and the kidneys were exposed to ischemia for 40 minutes. Then the
clamps were removed and reperfused for 60 min. Citrate group (Group C) was
administered 4% sodium citrate solution at a dose of 1 mmol/kg/hour from
one tail vein and 10% calcium gluconate solution at a dose of 2 ml/kg/hour
from the other tail vein for 90 min. In the ischemia-reperfusion + citrate group
(Group IR+C), 4% sodium citrate was infused at a dose of 1 mmol/kg/hour
and 10% calcium gluconate at a dose of 2 ml/kg/hour through the tail veins
for 60 min. After the infusions were stopped, the kidneys were clamped for
40 min. After ischemia, the clamps were removed and the kidneys were
reperfused for 60 min. In the first 30 minutes of reperfusion, sodium citrate
and calcium infusions were reapplied at the same doses. At the end of the
study, the removed kidneys in all groups were fixed in 10% neutral
formaldehyde solution. Kidney specimens were stained with hematoxylineosin and examined histopathologically. Capillary vasodilatation / congestion
in interstitial areas, dilatation / cast formation in tubules, loss of brushy edge
in tubule epithelium, vacuolization, shedding of epithelium into the lumen,
presence of inflammation / fibrosis in interstitial structure, morphological
changes in glomeruli were evaluated and scored. Biochemically, urea, creatine, total oxidant level, total antioxidant level, oxidative stress index,
total thiol and native thiol levels, thiol-disulfide ratio, paraoxonase-1 level,
ischemia modified albumin level were measured. Mann-Whitney U test,
Kruskal-Wallis test, Dunn test, Wilcoxon signed-rank test, Friedman test and
Pearson chi-square test were used for statistical analysis (SPSS version 20).
Results: There was no statistical difference in the comparison of the blood
gas parameters studied from the blood samples taken from the arterial line
at the beginning of the groups, except for the values within the physiologic
limits which were not thought to have an effect on the result. There was a
statistically significant difference between the chlorine (p=0.02) and calcium
(p=0.03) values of Group IR at baseline, 40 minutes after ischemia, 70
minutes after reperfusion and 100 minutes after reperfusion. There was a
statistically significant difference between the baseline HCO3 level of Group
C and the HCO3 level at 90 minutes of citrate infusion (p=0.04). There was a
statistically significant difference between the baseline Ca level of Group C
and the Ca level at 90 minutes after citrate infusion (p=0.03). There were
statistically significant differences between the baseline Cl levels (p=0.009),
Ca levels (p=0.002), lactate levels (p=0.01), glucose levels (p=0.008), HCO3
levels (p<0.001) and BE levels (p=0.004) of Group IR+C at baseline, 60
minutes after citrate infusion, 100 minutes after ischemia, 130 minutes of
reperfusion and 160 minutes of reperfusion. Statistically significant
differences were observed between creatine levels (p<0.001) and urea levels
(p<0.001) of the four study groups. A statistically significant difference was
observed between the histopathologic scores of the groups (p=0.001).
Statistically significant differences were observed between TOS levels
(p=0.048) and TAS levels (p=0.016), but no significant difference was
observed between OSI values. A statistically significant difference (p<0.001)
was found between T-thiol levels (p=0.002) and N-thiol levels. When
thiol/disulfite levels were compared, the result was statistically significant
(p<0.001). There was a statistically significant difference between the groups
in terms of PON-1 levels (p<0.001) and IMA levels (p=0.001).
Conclusion: In our study, we observed that IR injury caused oxidative
damage in the kidneys. Sodium citrate infusion alleviated the oxidative
damage by increasing the TAS level and decreasing the TOS level and
contributed positively to the thiol/disulfide balance in the direction of thiols.
In histopathological examinations, we observed that the preconditioning
effect of citrate protected the kidney from IR injury. In conclusion, we believe
that citrate may be useful in reducing the adverse effects of renal IR injury.

Key words: Renal ischemia-reperfusion injury; Oxidative stress; TAS, TOS, OSI; Thiol/Disulfide Equilibrium; PON-1; IMA