Kemoterapi ajanı Doksorubisin'in Escherichia coli üzerindeki etkisi ve dirençle ilgili genlerin genom boyu kütüphane zenginleştirme ve tarama çalışmaları ile araştırılması
Investigation of the effect of the chemotherapy agent doxorubicin on escherichia coli and the genes related to resistance by genome-wide library and screening studies
Yazar: ANI ALTUĞ CURNA
Danışman: DOÇ. DR. MEHTAP KILIÇ EREN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Doksorubisin = Doxorubicin ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Genom = Genome ; Genom bilimi = Genomics ; Kemoterapi =   ; İlaç tedavisi = Drug therapy

Özet:
Kanser hastalıklarının tedavisinde kullanılan kemoterapik ilaçlara karşı, kanser hücreleri zaman zaman direnç gösterebilmektedir. Kanser hücresi, bazı genlerin yapısını ve ifadesini değiştirerek ilaçtan kaçabilmekte ve kanserin nüksetmesi ile ölümcül sonuçlar görülebilmektedir. Direncin moleküler mekanizmasında görevli olabilecek genler ve proteinlerin tespiti, hem temel bilimler açısından, hem de tedavi açılımları sunması bakımından önemlidir. 
Doksorubisin, kanser tedavisinde rutin olarak kullanılan, aynı zamanda da antibakteriyel etkiye sahip, yaygın bir kemoterapik ajandır. Bu ilaç bir hücreye verildiği zaman, DNA'ya hasar vermekte ve hücrenin ölümüne neden olmaktadır. Ancak, bu ilaca karşı da kanser hücresinin direnç geliştirebildiğine dair raporlar mevcuttur. İlacın hem moleküler hedeflerinin bulunması, hem de direnç gelişiminde doğrudan veya dolaylı olarak rolü olan genlerin tespit edilmesi farklı hücresel sistemlerde araştırılmalıdır.
Bu tez çalışmasının amacı, bakteri hücresini model olarak kullanarak, artan doksorubisin konsantrasyonlarında, 4123 genin taranarak, hücreye direnç kazandıran gen adaylarının araştırılmasıdır. Burada, Escherichia coli genlerinin bir ekspresyon plazmidine klonlanması ile elde edilen ASKA klon seti kullanılmıştır. 57 adet mikroplakadan oluşan bu set, 4123 adet gen ile ilaç ilişkisini farklı açıdan irdelememizi sağlayan eşsiz bir genomik kaynaktır. Her bir genin ifadesi IPTG ile indüklenebildiği için, genler taranabilmekte ve yabanıl tipin öldüğü ilaç konsantrasyonunda yaşayan klonun içerdiği gen, direnç fenomeni ile doğrudan veya dolaylı olarak ilişkili olduğu yaklaşımı esas alınmaktadır. 
 Bu çalışmada, ilk olarak, birkaç farklı E. coli yabanıl tip bakteri suşları ile yapılan ön deneylerde, doksorubisinin hangi E. coli suşunu, hangi konsantrasyonda öldürdüğü, minimum inhibe edici konsantrasyon (MIC) deneyleri, büyüme eğrisi deneyleri, spot testleri ve disk difüzyon yöntemleri ile belirlenmiştir. Daha sonra, 4123 adet klonun "genom boyu plazmid kütüphanesi" stokları kullanılarak, ısı şoku yöntemi ile E. coli D10Hb suşuna transforme edilmiştir. Optimizasyon deneylerinden elde edilen konsantrasyon verileri kullanılarak, göreceli olarak yüksek doksorubisin içeren ortamlarda yaşayabilen klonların tespit edilmesi amacıyla, gradient ekim, direkt ekim ve zenginleştirme ile seleksiyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Doksorubisin toleransına sahip, 129 adet koloni ile onaylama çalışmaları yapılmıştır. Daha sonra göreceli olarak en yüksek tolerans değerine sahip 34 koloni seçilmiştir. Seçilen rekombinant plazmidlerin içerdikleri gen dizileri, sanger sekanslama analizi ile belirlenmiştir. Elde edilen sekanslar kullanılarak, Blast analizleri ile gen bilgileri bulunmuştur. Çalışmalar sonucunda, göreceli olarak yüksek doksorubisin konsantrasyonlarında yaşayan E. coli klonlarının plazmidlerinde yer alan genlerin recA (n=23 klon) ve mdtK (n=11 klon) olduğu tespit edilmiştir. Bu genlerin DNA hasarı onarımında ve Na+ kanallarını kullanarak ilacı hücrenin dışına atabilmede görevli olabileceği tartışılmıştır. Ayrıca bu genlerin insan genomunda homologları araştırılmıştır.
 Bu çalışma, binlerce genin (n=4123) bir ilaçla ilişkisini tarayan ve bakteriyel model hücre yaklaşımı ile kanser konusuna farklı bir açıdan yaklaşan, moleküler biyoloji, mikrobiyoloji ve genomik disiplinlerini kullanan, kapsamlı, orijinal ve yol gösterici sonuçlar veren bir tez çalışmasıdır. 

Anahtar Kelimeler: Direnç, doksorubisin, Escherichia coli, gen, genomik, mdtK, recA

Abstract:
Cancer cells may occasionally develop resistance against chemotherapeutic drugs used in the treatment of cancer diseases. The cancer cell can escape from the drug by changing the structure and expression of some genes, and with cancer recurrence, fatal results can be seen. The identification of the genes and proteins that may be involved in the molecular mechanisms of resistance is important both in terms of basic science and in terms of offering treatment options. 
Doxorubicin is a common chemotherapeutic agent that is routinely used in the treatment of cancer, but also has an antibacterial effect. When this drug is given to a cell, it damages DNA and can cause the death of the cell. However, there are reports that the cancer cell can also develop resistance to this drug. The determination of the molecular targets of the drug and the identification of the genes that have a direct or indirect role in the development of resistance should be investigated in different cellular systems. 
The aim of this thesis study is to find the gene candidates that provide resistance to the cell, and to achieve this, 4123 genes will be screened at increasing doxorubicin concentrations by using the bacterial cell as a model. Here, the ASKA clone set obtained by cloning the genes of Escherichia coli into an expression plasmid was used. This set, composed of 57 microplates, is a unique genomic source that allows to examine the relationship between the drug and 4123 genes in a different manner. Since the expression of each gene can be induced by IPTG, screening can be conducted at various expression levels. The approach is based on the following criteria. The clone that survives at the drug concentration in which the wild type dies is determined and the gene within the particular clone is considered to be related to resistance phenomena directly or indirectly. 
In this study, first, the preliminary experiments with several different E coli wild-type bacterial strains were conducted and the concentrations that have bactericidal effect on the strains were determined using minimum inhibitory concentration (MIC) experiments, growth curve experiments, spot tests and disc diffusion methods. Then, "genome-wide plasmid library" of 4123 clones was transformed into E. coli D10Hb strain by the heat shock method. Using concentration data obtained from optimization experiments, selection experiments were carried out with gradient cultivation, direct cultivation and enrichment in order to identify the clones that can live in environments with relatively high doxorubicin. Validation studies were carried out with 129 colonies that had doxorubicin tolerance. Then 34 colonies with the highest tolerance were selected. The gene sequences contained in the selected recombinant plasmids were determined by Sanger sequencing analysis. Using the sequences obtained, gene information was found by Blast analysis. As a result of the studies, it was determined that the genes in the plasmids of E. coli clones living at relatively high doxorubicin concentrations were recA (n = 23 clones) and mdtK (n = 11 clones). It has been discussed that these genes are involved in repairing DNA damage and expelling the drug out of the cell using Na+ channels. In addition, homologs of these genes in the human genome were searched. 
This thesis study, approaching the topic of cancer from a different angle, where the bacterial cell is used as a model system has successfully analyzed the relationship between thousands of genes (n=4123) and a drug using molecular biology, microbiology and genomic disciplines and ended up in producing comprehensive, original and guiding results.

Key words: Doxorubicin, Escherichia coli, gene, genomics, mdtK, recA, resistance