Sinop ili topraklarından izole edilen pseudomonas türlerinin moleküler karakterizasyonu
Molecular characterization of Pseudomonas species isolated from soil of si̇nop provinces
Yazar: NUR ALTINDAL
Danışman: PROF. DR. İSMET BERBER
Sinop Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Çalışmamızda Eylül-Aralık 2014 tarihleri arasında Sinop'un çeşitli bölgelerinden toplanan toprak örneklerinden 59 adet Pseudomonas spp. izole edilmiştir. İzolasyonu yapılan 59 örneğin Pseudomonas suşunun fenotipik karakterizasyonu, antibiyotik duyarlılıkları, İndüklenebilir Beta-Laktamaz (İBL) varlığı, SDS-PAGE toplam hücre protein profilleri, plazmid DNA profilleri, ve Enterobakteriyal Tekrarlanan İntergenik Konsensüs Element (ERIC-PCR) ve ayrıca 21 P. aeruginosa suşu için virülans genleri ve (GTG)5 yöntemlerine göre moleküler karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.
Morfolojik ve fizyolojik özelliklerine göre, bütün yerel izolatların Pseudomonas spp. olduğu tespit edilmiştir. Tüm suşların antibiyotik duyarlılığı 10 standart ilaca karşı disk-diffüzyon yöntemi kullanılarak yapılmıştır. İzolatların antibiyotik dirençlilikleri sırasıyla; imipeneme %6.7, piperasillin-tazobaktama  %6.7, sefepime  %3.3, seftazidime %8.4,  aztreonama %35.5,  gentamisine  %15.2, amikasine %10.1, sefotaksime %38.9, seftriaksona %57.6 ve meropeneme %30.5 olarak tespit edilmiştir. Bütün suşların İBL üretiminin tespiti disk indüksiyon yöntemine göre yapılmıştır. Sonuçlara göre izolatların 28'sinde (%47,4) İBL üretimi tespit edilirken, 31'inde (%52.5) tespit edilmemiştir.
Yapılan biyokimyasal testler sonucunda P. aeruginosa olarak tanımlanan 21 izolatın 14'ünde lasB (300 bp), 14'ünde algD (1310 bp) ve 13 tanesinde rhlAB (151 bp) geni tespit edilmiştir.
SDS-PAGE toplam hücre protein profilleri esas alınarak yapılan nümerik analiz, 59 adet Pseudomonas izolatının benzerlik düzeyi %77 ve üzerinde 2 majör gruba ayrıldığını ortaya koymuştur. 
Plazmid DNA analiz sonuçları, suşların 48 tanesinde 23.440 bp ve 9.326 bp arasında değişen farklı plazmidlerin varlığını doğrulanmıştır.
İzolatların ERIC-PCR ve (GTG)5-PCR tekniklerinin kullanımı ile elde edilen DNA bant profillerinin UPGMA metoduna göre nümerik analizleri yapılmıştır. Yapılan ERIC-PCR tekniği sonucunda oluşturulan dendrogram, bant üreten 1 adet referans suşu olmak üzere toplam 60 suşun %48 benzerlik düzeyi ve üzerinde 2 major gruba ayrıldığını ortaya koymuştur. (GTG)5 primerleri kullanılarak oluşturulan dendrogramda ise bant üreten toplam 21 adet suşun benzerlik düzeyi %75 ve üzerinde yine 2 major gruba ayrıldığını göstermiştir. 
Sonuç olarak, bu çalışmada izole edilen Pseudomonas spp. suşlarının ayırımında morfolojik ve fizyolojik özellikler, SDS-PAGE tekniğiyle elde edilen toplam hücre protein profillerinin nümerik analizi tür seviyesinde yeterli olurken, tür altı düzeyde ayırım için ERIC-PCR tekniğinin daha faydalı ve hızlı bir yöntem olduğunu ortaya koymuştur.

Abstract:
In this study; a total of 59 Pseudomonas spp. were isolated from soil samples collected from different regions in Sinop, between December and September 2014. Identified Pseudomonas species, phenotypic characterization of Inducible Beta-Lactamase (IBL) production of antimicrobial susceptibility, plasmid DNA profiles, SDS-PAGE total cell protein profiles, Enterobacterial Repatitiv to Intragenic Consensus Elements (ERIC-PCR) and in addition, virulence genes and (GTG)5-PCR for the 21 P. aeruginosa strains were investigated.  
According to morphological and physiological properties, it was determined that the native isolates belonged to Pseudomonas species. The antibiotic susceptibility of all strains against 10 standard drugs was tested using disc diffusion method. The antibiotic resistivities of the isolates were determined as imipenem %6.7 , piperacillin-tazobactam %6.7, cefepime %3.3, ceftazidime %8.4, aztreonam 35.5%, gentamicin %15.2, amikacin %10.1, cefotaxime %38.9, ceftriaxone %57.6 and meropenem %30.5, respectively. The IBL producing strains of Pseudomonas were performed according to the determination of the induction disk production method. Detection of the IBL was made with disc induction method and 28 (47,4%) of total 59 Pseudomonas isolates were found as the IBL producers.
İdentified as P. aeruginosa at 21 isolates were determined 14 of them lasB (300 bp), 14 of them rhlAB (151 bp) gene  and 13 of  them algD (1310 bp) genes at the result of biochemical tests.
The numerical analysis of SDS-PAGE whole cell protein profiles revealed that Pseudomonas strains were separated to 2 major groups at similarity levels of 77% or above.
Plasmid DNA analyses results confirmed that 48 strains consisted of plasmids molecular weight changing between 23.440 bp and 9.326 bp.
A numerical analysis of the DNA band profiles obtained by using the ERIC-PCR and (GTG)5-PCR technique of strains were carried out by using UPGMA method. A dendrogram generated by using ERIC-PCR revealed that 60 strains (include 1 reference) produced bands divided into 2 major clusters at similarity levels of 48% or above. In addition, a dendrogram generated by using (GTG)5-PCR displayed that the 21 P. aeruginosa strains produced bands scattered into 2 major clusters at similarity levels of 75% and over.
As a result was revealed that while the morphological and physiological properties, the numerical analysis of whole cell protein profiles produced by SDS-PAGE technique at the discrimination of isolated Pseudomonas strains were enough at the species level. However, ERIC-PCR technique can be provide fast and more useful differentiation at the strain level.