C6 glioma hücre hattında, pentilentetrazol PTZ) ile oluşturulan glial hasarlanma üzerine tosilizumab'ın etkisi
The effect of tocilizumab on pentylenetetrazol (PTZ)-induced glial injury in c6 glioma cell line
Yazar: ÖMER FARUK ÖNEROĞLU
Danışman: DOÇ. DR. AHMET KEMAL FİLİZ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ FATİH YULAK
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Pentilentetrazol = Pentylenetetrazole

Özet:
Amaç: Tez çalışmasında amaç; Tosilizumabın, pentilentetrazol (PTZ) ile oluşturulan glial hasarda interlökin-6 (IL-6) inhibisyonu yoluyla etkisini değerlendirmek. Tosilizumabın PTZ ile oluşturulan hasarlanmada nöroinflamasyon süreçlerindeki ilişkisini açıklamak amaçlanmıştır.
Materyal ve Metot: C6 glioma hattı üç defa pasaj yapıldıktan sonra kullanıldı. Tosilizumab yapılan ön çalışmalar neticesinde 100, 50, 25, 12,5 μM olacak şekilde kullanıldı. Pentilentetrazol (PTZ) toksisitesi yapılan doz çalışması neticesinde 35 mM ve 24 saat inkübasyon süresi olacak şekilde uygulandı. Hücreler dört ana gruba ayrıldı; kontrol grubuna herhangi bir işlem yapılmadı, PTZ grubuna 35 mM PTZ uygulandı, PTZ ve tosilizumabın beraber uygulandığı gruba önce 100, 50, 25, 12,5 μM dozlarında tosilizumab 1 saat sonra 35 mM PTZ eklendi, sadece tosilizumab grubuna ise belirlenen dozlarda tosilizumab uygulandı. Hücre gruplarına 24 saat inkübasyon uygulandı. Hücre lizatlarına hücre canlılık testi (XTT), TAS, TOS, NO ve iNOS ticari ELISA kitleriyle ölçüm testleri yapıldı. Bölünmüş kaspaz-3 floresan boyama yöntemiyle değerlendirildi. Sonuç verileri için ANOVA (istatistiksel analizde tek yönlü varyans analizi) kullanıldı. Anlamlılık istatistiksel p<0,05 olarak kabul edildi.
Bulgular: C6 hücre lizatlarına 35 mM PTZ uygulaması sonrası kontrol grubuyla kıyaslandığında hücre canlılığı azalmıştır. Tosilizumabın 12,5 μM dozunda IL-6 inhibisyonu sonrası PTZ uygulaması tek başına PTZ uygulanan grupla kıyaslandığında hücre canlılığını artırmış korumuştur. ELISA test sonuçlarında TOS, NO, iNOS seviyelerinde apoptotik hücre sayısı tosilizumab inhibisyonu sonrası PTZ uygulanan grupla sadece PTZ uygulanan grup kıyaslandığında istediğimiz şekilde azalmıştır (p<0,05). İmmun floresan boyama B-kaspaz-3 protein seviyesi, C6 hücrelerine 35 mM PTZ uygulaması kontrol grubuyla kıyaslandığında anlamlı olacak şekilde artmıştır (p<0,05). IL-6 protein seviyesi, tosilizumabla birlikte PTZ uygulanan grupla sadece PTZ uygulanan grup karşılaştırıldığında anlamlı olacak şekilde azalmıştır (p<0,05).
Sonuç: Tez çalışma sonuçları; C6 hücrelerinde PTZ ile oluşturulan glial hasarlanmada IL-6 inhibitörü tosilizumab, hasarlanmayı önlemiş ve nöroinflamasyon sürecinde de azaltıcı etki göstermiştir. Nöroinflamasyonun önlenmesinde tosilizumab etkisini oksidatif stres üzerinden gerçekleştirdiğini düşünmekteyiz. Fakat araştırma konusuyla alakalı in vitro ve in vivo gibi çalışmalara gereksinim vardır.

Abstract:
Aim: The aim of the thesis study was to evaluate the effect of Tocilizumab on pentylenetetrazol (PTZ)-induced glial damage via interleukin-6 (IL-6) inhibition. It was aimed to explain the relationship between Tocilizumab and neuroinflammatory processes in PTZ-induced damage.
Materials and Methods: The C6 glioma line was used after three passages. Tosilizumab was used at 100, 50, 25, 12.5 μM as a result of preliminary studies. Pentylenetetrazol (PTZ) toxicity was applied at 35 mM and with a 24-hour incubation period as a result of the dose study. The cells were divided into four main groups; no treatment was applied to the control group, 35 mM PTZ was applied to the PTZ group, tocilizumab and tocilizumab were applied together with PTZ and tocilizumab, first 100, 50, 25, 12.5 μM doses of tocilizumab were added and 35 mM PTZ was added 1 hour later, and tocilizumab alone was applied at the determined doses. The cell groups were incubated for 24 hours. Cell lysates were subjected to cell viability test (XTT), TAS, TOS, NO and iNOS commercial ELISA kits. Cleaved caspase-3 was evaluated by fluorescent staining method. ANOVA (one-way analysis of variance in statistical analysis) was used for the result data. Significance was accepted as statistical p<0.05.
Results: After application of 35 mM PTZ to C6 cell lysates, cell viability decreased compared to the control group. After IL-6 inhibition with tocilizumab at a dose of 12.5 μM, PTZ application increased and preserved cell viability compared to the group applied PTZ alone. In the ELISA test results, the number of apoptotic cells in TOS, NO, iNOS levels decreased as expected when compared to the group applied only PTZ after tocilizumab inhibition (p<0.05). Immunofluorescence staining B-caspase-3 protein level significantly increased when compared to the control group after application of 35 mM PTZ to C6 cells (p<0.05). IL-6 protein level significantly decreased when compared to the group applied only PTZ with tocilizumab (p<0.05).
Conclusion: Thesis study results; IL-6 inhibitor tocilizumab prevented damage and showed a reducing effect on the neuroinflammation process in PTZ-induced glial damage in C6 cells. We think that tocilizumab's effect in preventing neuroinflammation is through oxidative stress. However, in vitro and in vivo studies are needed related to the research topic.