Koenzim Q10 nefropatisinde koenzim Q10 içerikli nanoterapötiklerin tedavi etkinliğinin araştırılması ve in vitro modelde mitokondriyal fonksiyonlarının karşılaştırılması
Investigation of treatment efficacy of coenzyme Q10 containing nanotherapeutics in coenzyme Q10 nephropathy and comparison of mitochondrial functions in in vitro model
Yazar: HAMİDE SENA ÖZBAY
Danışman: PROF. DR. SAMİYE YABANOĞLU ÇİFTÇİ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Koenzimler = Coenzymes ; Metabolomikler = Metabolomics ; Mitokondriler = Mitochondria ; Nano yapı = Nano structure ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Terapötik yöntemler = Therapeutics

Özet:
KoenzimQ10 (CoQ10) biyosentezinde rol alan genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanan CoQ10 eksikliği başta böbrekler olmak üzere birçok sistemi etkilemektedir. Bunlardan COQ8B mutasyonları, adölesan yaş grubunda ortaya çıkan kronik böbrek yetmezliğinin önemli bir nedeni olarak tanımlanmıştır. COQ8B mutasyonu olan hastalar proteinüri evresinde iken teşhis edilip ekzojen oral CoQ10 tedavisine başlandığında proteinürinin azaldığı ve böbrek fonksiyonlarının korunabildiği ortaya konmuştur. Ancak CoQ10, yüksek molekül ağırlığı ve lipofilik özelliği nedeniyle biyoyararlanımı düşük ve doku dağılımı yüksek bir moleküldür. CoQ10'un mitokondrideki lokal konsantrasyonunun artırılması daha etkin bir tedavi sağlama ve bu hastalarda böbrek yetmezliğini tamamen önleyebilme potansiyeline sahiptir. Bu tez kapsamında, CoQ10 eksikliğine neden olan mutasyonlara ikincil gelişen CoQ10 nefropatisinin önlenmesi/iyileştirilmesi için mitokondrilere hedeflendirilmiş CoQ10 içerikli poli (laktid-ko-glikolik asit)-blok-poli (etilen glikol)-(5-karboksipentil) trifenil fosfonyum bromür nanopartiküller (CoQ10-TPP-NP) geliştirilmiştir. Geliştirilen bu NP'ler boyut, yüzey yükü, partikül dağılımı, ilaç enkapsülasyon etkinliği ve morfolojik özellikleri bakımından karakterize edilmiştir. CoQ10-TPP-NP'ler yaklaşık 150 nm boyut ve +20 mV yüzey yükü ile aktif hedeflendirme için uygun özelliklere sahiptir. Bu NP'lerin ilaç yükleme etkinliği yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile belirlenmiş ve yaklaşık %40 oranında CoQ10 enkapsülasyon etkinliğine sahip olduğu bulunmuştur. İn vitro ortamda insan böbrek proksimal tübül epitel hücre hattına (HK-2) uygulanan bu NP'lerin (NP11) hücreler üzerinde toksik etkisinin olmadığı XTT deneyi ile gösterilmiştir. HK-2 hücrelerinde siRNA aracılığı ile COQ8B geni susturularak (COQ8B-/- hücre hatları) in vitro hastalık modeli oluşturulmuş, bunun için farklı doz ve sürelerde siRNA uygulaması yapılmıştır. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon (PCR) deneyleri ile en etkili gen inhibisyonu 100 nM siRNA ile 48 saat sürenin sonunda elde edilmiş ve Western Blot analizleri ile bu sonuç doğrulanmıştır. Formüle edilen NP'lerin COQ8B-/- hücreleri üzerindeki etkinliği metabolomik analizler yapılarak mitokondri fonksiyonları üzerinden değerlendirilmiştir. Elde edilen bulgulara göre, siRNA uygulanan hücre grubuna uygulanan CoQ10-TPP-NP'nin trikarboksilik asit (TCA) döngüsü hızını artırmada serbest CoQ10'a kıyasla daha etkili olduğu saptanmıştır. 

Anahtar Kelimeler: KoenzimQ10, COQ8B, polimerik nanopartikül, mitokondri, aktif hedefleme, metabolomiks

Abstract:
CoQ10 deficiency caused by genetic mutations affects many organs, especially the kidneys. Among these genetic mutations, COQ8B mutations have been identified as an important cause of chronic renal failure in the adolescent age group. Oral CoQ10 supplementation at the early stage of failure can reduce proteinuria and stabilize kidney function. However, CoQ10 is a molecule with low bioavailability and high tissue distribution due to its high molecular weight and lipophilic characteristics. More effective treatment can be provided by increasing the local CoQ10 concentration in the mitochondria, and renal failure can be prevented entirely in these patients. In this study, mitochondria-targeted CoQ10 loaded PLGA-b-PEG-TPP nanoparticles (CoQ10-TPP-NPs) have been formulated to prevent/cure CoQ10 nephropathy secondary to mutations causing CoQ10 deficiency. These nanoparticles were characterized by determining surface charge, particle distribution, drug entrapment efficiency and morphological properties. CoQ10-TPP-NPs were found to have a size of approximately 150 nm and a zeta potential of +20 mV. The entrapment efficiency of the nanoparticles was determined as 40% by the HPLC method. Cytotoxicity studies with the XTT assay have shown no effect on the viability of the human kidney proximal tubule epithelial cells (HK-2) exposed to CoQ10-TPP-NPs. An in vitro disease model was developed in HK-2 cells by silencing the COQ8B gene (COQ8B-/- cell lines) with different doses of siRNA for 48 and 72 hours. According to the results of real-time polymerase chain reaction (rt-PCR) experiments, the most effective gene inhibition was obtained by 100 nM siRNA after 48 hours. This result was confirmed by Western Blot analysis. The efficacy of the formulated nanoparticles on COQ8B-/- cells was evaluated through mitochondrial functions by metabolomic analyzes. The findings have shown that the treatment of COQ8B-/- cells with CoQ10-TPP-NPs is more effective in increasing the TCA cycle rate compared to free COQ10.

Keywords: CoQ10, COQ8B, polymeric nanoparticle, targeting mitochondria, metabolomics