Argan yağı tağşişi ve kalitesini belirlemede hat-üstü sıvı kromatografik yöntemler geliştirilmesi
Development of on-line liquid chromatographic assays for the detection of argan oil adulteration and quality
Yazar: ADEL ASFOOR
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SALİHA ESİN ÇELİK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid

Özet:
Argan yağı, Fas'ta yetişen argan ağacının (Argania spinosa L.) yemişlerinden elde edilen bir bitkisel yağdır. Antioksidan içeriği yüksek olup tokoferol, karoten, yağ asitleri ve fenolik bileşikler ihtiva etmektedir. Yüksek antioksidan içeriği sayesinde kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve obezitenin önlenmesinde önemli bir role sahip olup sıklıkla kozmetik amaçlı olarak saç, tırnak ve cilt bakımında kullanılmaktadır. Argan yağı oldukça değerli ve pahalı bir yağ olduğundan zeytinyağı, ayçiçek yağı vb. ucuz yağlarla karıştırma (tağşiş) gibi illegal yollarla hazırlanma riskleri vardır. Dolayısıyla, ekonomik, sosyal, sağlık açısından yağ kalitesi ve olası tağşişin kontrolünün yapılması önem arz etmektedir. Literatürde, bu alanda kullanılan mevcut analitik yöntemler oldukça kısıtlıdır. Bu bağlamda, argan yağının aslına uygunluğunu test edebilmek için duyarlı, hızlı, kolay uygulanabilen yeni yöntemlerin geliştirilmesi bu sahteciliği önemli ölçüde önlemek için gereklidir. Bu tez projesinin öncelikli amacı, argan yağının belgelenmesinde kromatografi esaslı ve uygun spektrofotometrik yöntemlerle birleştirilmiş yeni bir hat-üstü HPLC yönteminin geliştirilmesi ve pratik olarak uygulanabilirliğinin araştırılmasıdır. 
Bu tez çalışmasında, argan yağında tağşişi belirlemek amacıyla parmak izi bileşenler olarak antioksidan karakterine sahip -, - ve - tokoferol seçilmiş ve incelenmiştir. Yağ matriksinde bulunan -, - ve - tokoferolün 295 nm'de kromatografik yolla ayrılmasından sonra kolon çıkışında yer alan bir reaksiyon sarmalında kromojenik Cu(II)-neokuproin reaktifini indirgeme yeteneklerinden yararlanılmıştır ve her bir tokoferol türüne eşdeğer oranda açığa çıkan Cu(I)-neokuproin kelatının 450 nm'de hızlı bir şekilde karakteristik CUPRAC (bakır(II) iyonu indirgeyici antioksidan kapasite) pikleri oluşturması esasına dayanan bir hat-üstü HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografisi) yöntemi geliştirilmiş ve valide edilmiştir. Geliştirilen yöntemde pik rezolüsyonu ve analitik duyarlılık HPLC yöntemine (295 nm) oranla daha iyidir.
Argan yağı örnekleri (%100 saf-sertifikalı ve diğer ticari argan yağı örnekleri) ile tağşiş amaçlı kullanılan zeytinyağı, ayçiçek yağı, soya yağı, pamuk yağı vb. diğer bitkisel yağlar 1:1 oranında asetonda çözülüp ön ekstraksiyon işlemlerine gerek kalmaksızın sisteme enjekte edilerek  -, - ve - tokoferol miktarları ve antioksidan kapasiteleri eş zamanlı olarak tespit edilmiştir. Argan yağının saflık kontrolünde, γ-tokoferolün antioksidan kapasitesinin α-tokoferolünkine oranı [-toc/-toc] tağşiş faktörü olarak seçilmiştir. Saf (%100 sertifikalı) argan yağı, çeşitli seviyelerde (%5-20) ayçiçek yağı ve zeytinyağı ile tağşiş edilerek analiz edilmiştir. Sonuçlar, tağşiş edilmiş argan yağlarının tokoferol bileşimlerinde meydana gelen değişimden yararlanılma yoluyla [-toc/-toc] kapasite oranlarının muhtemel yeni bir parmak izi belirteci olarak kullanılabileceğini doğrulayacak niteliktedir. Tağşiş oranı arttıkça tağşiş faktörünün belirgin bir şekilde azaldığı görülmüştür. Bu yöntemin  %5 ve üzeri tağşiş edilmiş bir argan yağının yaklaşık 20 dakikalık bir analiz süresinde hızlı bir şekilde dedekte edilebileceği saptanmıştır. Kısmi en küçük kareler diskriminant analiz yöntemi yardımıyla tüm deneysel verilerden yararlanarak 16 farklı değişkenin kullanıldığı çoklu veri analizi yapılmış ve istatistiksel modellemenin hassasiyeti ve seçiciliği oldukça yüksek bulunmuştur.  Bu durum, saf ve tağşiş edilmiş argan yağı örnekleri arasında net bir ayrımın elde edildiğini göstermektedir. Sonuç olarak, önerilen kromatografik esaslı hat-üstü HPLC-CUPRAC yönteminin argan yağının tağşişini belirlemede alternatif bir parmak izi yöntemi olarak kullanılabilecek, pratik olarak uygulanabilir, hassas ve çok yönlü bir yöntem olduğu görülmektedir.

Abstract:
Argan oil is an herbal oil that is extracted from Argan tree which is found in Morocco. This oil has high antioxidant content and contains tocopherol, carotene, fatty acids and phenolic compounds. Due to its high antioxidant content, argan oil is not only highly effective in preventing diseases like cancer, cardiovascular diseases and obesity but is also frequently used in hair, nail and skin care products for cosmetic purposes. Argan oil is highly valuable and expensive, so there is a risk of mixing and adulterating with cheap oils i.e. olive and sunflower oil during its preparation. Therefore from economic, social and health point of view, it is important to control the quality of oil and possible adulteration. In the literature, existing analytical methods used in this area are rather limited. In this context, to determine the purity of the oil, development of new methods that are sensitive, fast, and easy to apply is essential in order to prevent fraudelent products. The primary objective of this thesis project is to develop a novel chromatography-based on-line HPLC assay coupled with spectrophotometric methods and investigate its practical applicability for argan oil authentication. 

In this thesis study, -, - and - tocopherol with antioxidant properties were selected and investigated as fingerprint components to determine argan oil adulteration. It was utilized for the reducing ability of -, - and - tocopherol for chromogenic reagent Cu(II) -neocuproine in a coil tube after they were separated from the oil matrix at 295 nm using chromatographic method and an on-line HPLC assay based on monitoring Cu(I)-neocuproine chelate which rapidly forms characteristic CUPRAC (copper (II) ion reducing antioxidant capacity) peaks at 450 nm in equivalent ratio for each tocopherol type was developed and validated. In the developed method, high peak resolution and analytical sensitivity was found compared to HPLC assay (295 nm). 

Argan oil samples (100% pure-certified and other commercial samples of argan oil) and other herbal oils which may use for adulteration i.e. olive oil, sunflower oil, soya oil, cotton oil etc. were dissolved in acetone in a ratio of 1:1 (v/v) and injected into the system without the need for pre-extraction, so that amounts of -, - and - tocopherol and antioxidant capacities were simultaneously detected. In the light of results obtained from the authentication process of argan oil, the ratio of the antioxidant capacity of γ-tocopherol to α-tocopherol [-toc/α-toc] was selected as an adulteration factor. Pure (100% certified) argan oil was adulterated using different amounts of sunflower oil and olive oil (5-20 %) and analyzed afterwards. The results confirmed that the capacity ratio of [-toc/α-toc] can be used as a potential new fingerprint marker due to the changes in the tocopherol composition of the adulterated argan oils. The distinct decreasement in adulteration factor was monitored by the increase of adulteration rate. It was found that argan oil samples which were adulterated at a ratio of 5% or higher can be detected rapidly in 20 min-analysis time. Multi-data analysis was performed with 16 different variables using all experimental data by utilizing partial least square discriminant analysis. A quiet high selectivity and specificity of statistical model was obtained. It shows the clear difference between pure and adulterated argan oil samples. As a result, proposed chromatographic based on-line HPLC-CUPRAC assay can be used as an alternative fingerprinting method to determine argan oil adulteration which is practically applicable, sensitive and versatile.