Farklı antimikrobiyal ajanların enterococcus faecalis üzerine inhibitör etkilerinin in siliko modelleme yöntemleri ile incelenmesi
Investigation of the inhibitory effects of different antimicrobial agents on enterococcus faecalis using in silico modelling methods
Yazar: İPEK NUR BERBEROĞLU
Danışman: PROF. DR. TAMER TÜZÜNER
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Pedodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2024
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry

Özet:
Çocuk hastaların süt dişlerinde meydana gelen pulpal enfeksiyonlar, süt dişlerinin erken yaşta kaybına neden olmaktadır. Süt dişi pulpal enfeksiyonlarının tedavisinde başta Enterococcus Faecalis olmak üzere patojen bakterilerin elimine edilmesi gerekmektedir. Süt dişlerinin erken yaşta kaybını önlemek için lezyon sterilizasyonu ve doku tamiri tedavisi antibiyotik pat kombinasyonları ile uygulanmaktadır. Kullanılan antibiyotik pat kombinasyonları metronidazol, siprofloksasin, minosiklin ve amoksisilin trihidrat gibi antibiyotiklerden oluşmaktadır. Antibiyotikli patların dişlerde renklenme, alerjik reaksiyon ve direnç gelişimi gibi dezavantajları bulunmaktadır. Bu dezavantajlardan dolayı güvenilir, gelişmiş etkinliğe sahip ve yan etkileri azaltılmış doğal kaynaklı antimikrobiyal ilaçların tasarımına ihtiyaç duyulmaktadır. Bundan dolayı bu çalışmada, Enterococcus Faecalis enzimlerine (dihidrofolat redüktaz, ß-ketoaçil-açil taşıyıcı protein sentaz III, agmatin deiminaz, alanin rasemaz ve enterokokal yüzey proteini) karşı inhibitör etkili flavonoid ve kalkon türevli bileşiklerin inhibisyon mekanizmalarının ve yapısal özelliklerinin moleküler düzeyde belirlenmesi için moleküler modelleme yönteminden faydalanılmıştır. Bu sayede bu çalışmanın ilerde yapılacak olan deneysel çalışmalara rehber olması amaçlanmıştır. Çalışmanın 1. safhasında; hedef enzimlerin 3 boyutlu yapısı ve inhibitör bileşiklerin bağlanma bölgeleri belirlenmiştir ve flavonoid ve kalkon türevli ligand bileşiklerin 3 boyutlu yapıları hazırlanmıştır. İkinci safhada; kontrol grubu bileşikleri (metronidazol, amoksisilin trihidrat, doksisiklin, klorheksidin ve siprofloksasin) ile flavonoid ve kalkon türevli bileşikler, hedef enzimler ile moleküler kenetlenme yöntemi kullanılarak serbest bağlanma enerjileri hesaplanmıştır. Üçüncü safhada; kontrol grubu bileşiklerinin farmakokinetik özellikleri değerlendirilmiştir. Son safhada ise, enzim-ligand yapılarının bağlanmasında rol oynayan aminoasitler moleküler seviyede analiz edilmiştir. Çalışma sonucunda dihidrofolat redüktaz enzimi için 9 numaralı ligand bileşiği (C15H11NO4) -8.45 kcal/mol bağlanma enerjisi ile en iyi bağlanma afinitesi gösteren bileşik olarak belirlenmiştir. Ayrıca dihidrofolat redüktaz enziminin bağlanma bölgesinde bulunan ve inhibisyon mekanizmasında oldukça önemli rol oynayan olan Val102 amino asidi ile hidrojen bağı oluşturmuştur. ß-ketoaçil-açil taşıyıcı protein sentaz III enzimi 2 numaralı ligand bileşiği (C15H11BrO2) moleküler kenetlenmesi sonucu -8.41 kcal/mol bağlanma enerjisi en iyi bağlanma afinitesi gösteren bileşik olarak bulunmuştur. 2 numaralı bileşik ß-ketoaçil-açil taşıyıcı protein sentaz III enziminin bağlanma bölgesinde bulunan ve inhibisyon mekanizmasında oldukça önemli rol oynayan olan Asn280 amino asidi ile hidrojen bağı oluşturmuştur. Flavonoid ve kalkon türevli bileşikler ile yapılan kenetlenme çalışmaları sonucunda ise 20 numaralı ligand bileşiği (C16H13BrO3) -8.82 kcal/mol bağlanma enerjisi ile hedef enzim agmatin deiminaza karşı en iyi bağlanma afinitesi gösteren bileşik olarak belirlenmiştir. Flavonoid ve kalkon türevli bileşikler ile yapılan kenetlenme çalışmaları sonucunda ligand seçilen 20 bileşik de hem kontrol grubu bileşiklerinden hem de referans bileşikten daha etkin bağlanma göstermiş, bu bileşikler içerisinden 9 numaralı ligand bileşiği -8.94 kcal/mol bağlanma enerjisi ile hedef enzim alanin rasemaza karşı en iyi bağlanma afinitesi gösteren bileşik olarak bulunmuştur. Bağlanma bölgesinde bulunan ve inhibisyon mekanizmasında oldukça önemli rol oynayan Arg139, His169, Ser207 amino asitlerine bağlanma göstermektedir. Moleküler kenetlenme analizi sonucunda enterokokal yüzey proteini enzimi ile flavonoid ve kalkon türevli bileşikler arasından da -9.81 kcal/mol bağlanma enerjisi ile en yüksek bağlanma enerjisine sahip 20 numaralı ligand bileşiği olarak saptanmıştır. Bu çalışma sonucunda, süt dişi pulpal enfeksiyonlarının önlenmesine yönelik Enterococcus Faecalis enzimlerine etki eden ve spesifik bağlanma gösteren doğal kaynaklı kimyasal bileşiklerin in siliko yöntemi ile kısa sürede test edilerek geliştirilmesine katkıda bulunulmuştur.

Abstract:
Pulpal infections in the deciduous teeth of paediatric patients lead to the loss of deciduous teeth at an early age. In the treatment of pulpal infections in deciduous teeth, it is necessary to eliminate pathogenic bacteria, especially Enterococcus Faecalis. In order to prevent the premature loss of deciduous teeth, lesion sterilization and tissue repair treatment have been applied with antibiotic paste combinations. The antibiotic paste combinations used consist of antibiotics such as metronidazole, ciprofloxacin, minocycline and amoxicillin trihydrate. The antibiotic pastes have disadvantages such as causing discoloration of the teeth, resistance and the development of allergic reactions. Because of these disadvantages, there is a need for the design of reliable, highly effective, and side-effect reduced antimicrobial drugs derived from natural sources. Therefore, in this study, molecular modelling methods were utilized to determine the inhibition mechanisms and structural properties of flavonoid and chalcone derived compounds with inhibitory effects against Enterococcus Faecalis enzymes (dihydrofolate reductase, ß-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III, agmatine deiminase, alanine racemase, and enterococcal surface protein) at the molecular level. In this way, this study is intended to guide future experimental studies. In the first phase of the study, the three dimensional structures of the target enzymes and the binding sites of the inhibitor compounds were determined; three dimensional structures of flavonoid and chalcone derived ligand compounds were prepared. In the second phase, free binding energies of control group compounds (metronidazole, amoxicillin trihydrate, doxycycline, chlorhexidine and ciprofloxacin) along with flavonoid and chalcone derived compounds were calculated using molecular docking method with target enzymes. In the third phase, the pharmacokinetic properties of the control group compounds were evaluated. In the final stage, the amino acids involved in the binding of enzyme-ligand structures were analysed at the molecular level. As a result of the study, compound number 9 (C15H11NO4)  has been identified as the compound showing the highest binding affinity with the dihydrofolate reductase enzyme, with a binding energy of -8.45 kcal/mol. Additionally, compound number 9 has been formed a hydrogen bond with Val102 amino acid, which is located in the binding region of the dihydrofolate reductase enzyme and plays a significant role in the inhibition mechanism. The molecular docking of ß-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III enzyme with ligand compound number 2 (C15H11BrO2)  has been resulted in a binding energy of -8.41 kcal/mol, exhibiting the best binding affinity. Compound number 2 has been formed a hydrogen bond with Asn280 amino acid, a residue located in the binding site of β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III enzyme, playing a crucial role in its inhibition mechanism. As a result of docking studies with flavonoid and chalcone derived compounds, compound number 20 (C16H13BrO3)  has been determined as the compound with the best binding affinity against the target enzyme agmatine deaminase with a binding energy of -8.82 kcal/mol. For alanine racemase enzyme all selected ligand compounds have been found to be more effective than both control group compounds and the reference compound, among these ligand compound number 9, with a binding energy of -8.94 kcal/mol, has been identified as the compound exhibiting the best binding affinity against the target enzyme alanine racemase. Ligand compound number 9 has been bound to the amino acids Arg139, His169, and Ser207 located in the binding site, playing a significant role in the inhibition mechanism. Based on the results of molecular docking analysis, the ligand compound number 20 has been identified as having the highest binding affinity with a binding energy of -9.81 kcal/mol among the flavonoid and chalcone-derived compounds, when interacting with the enterococcal surface protein enzyme. As a result of this study, we have contributed to the development of inhibitors of natural chemical compounds that act on Enterococcus Faecalis enzymes and show specific binding by testing them in silico method in a short time for the prevention of primary tooth pulpal infections.