Kanserde heterojenite ve klinik önemi
Heterogeneity in cancer and clinical signifigance
Yazar: TEKİNCAN ÇAĞRI AKTAŞ
Danışman: PROF. DR. HATİCE NUR OLGUN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Onkoloji Ana Bilim Dalı / Temel Onkoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Kanser =   ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Neoplazmlar-embriyonal ve mikst = Neoplasms-embryonal and mixed

Özet:
Amaç: Tümör heterojenitesi, aynı tümör numunesindeki kanser hücreleri arasındaki farklılıkları tanımlar. Nöroblastoma (NB), tümör heterojenitesinin tedavisini zorlaştırdığı bir kanser türüdür. Bu çalışma, rutin moleküler testler ve yeni nesil dizileme (NGS) ile tespit edilen NB'deki moleküler heterojenliğin rolünü araştırmayı amaçlamaktadır.
Gereç ve Yöntemler: Çalışmaya 71 hasta dahil edildi. NB örnekleri 2012-2020 yılları arasında moleküler testlerle değerlendirilen 1400 NB örneği arasından Türk Pediatrik Onkoloji Grubu protokolü yönergelerine göre seçildi. Tümörün iki farklı bölgesinden (blastik zon ve diferansiye zon) (senkron) veya iki farklı zamanda (metakron) alınan örneklerde moleküler incelemeler (toplam 142 örnek) yapıldı. Heterojenite sorgulaması için yapılan testler; MYCN amplifikasyonu, gerçek zamanlı PCR ile tanımlanan 1p36LOH, 11q23 delesyonu ve 17q25 kazancı ile akış sitometrisi ile tanımlanan DNA ploidisi ve NB ile ilgili 49 genin NGS ile sekanslanması olarak sıralanabilir. NGS analizi, özel tasarım paneli hedefleyen ˙Illumina MiniSeq kullanılarak yapıldı. DNA izolasyonundan sonra kütüphane oluşturuldu ve amplifikasyon sonrası sekanslandı. FASTQ verileri filtrelendi ve mutasyonlar tespit edildi.
Bulgular: Rutin moleküler testlerde MYCN için %22,53, 1p36LOH için %36,62, 11q23del için %29,58 ve 17q25 kazancı için %40,85 oranında heterojenite gözlenirken, DNA ploidisi %36,4 oranında heterojendi. Moleküler heterojenite, metakron ve senkron vakalar arasında istatistiksel olarak farklılık göstermedi. Yüksek riskli vakalar, her iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmaksızın daha sık moleküler heterojenite sergiledi. NGS için senkron grupta mutasyon profilinin heterojenliği %65,2, metakron grupta %80.2'dir. Blastik zonlarda mutasyon olup diferansiye zonlarda mutasyon olmayan genler TBCD, CNTN1,NGF, RPIA'dır. Diferansiye zonlarda mutasyon olup blastik zonlarda olmayan genler ise GSTP1, CD5, T P73, ARID1A, RTN4, PTAFR'dir. Birincil tümörlerde en yaygın mutasyon ve heterojenite RECQL5'teydi.
Sonuç: Bulgularımız moleküler heterojenitenin bir tümörün farklı bölgelerinde ya da aynı hastada farklı zamanlarda görüldüğünü desteklemektedir. Tümör doku örneklerinde birden fazla moleküler analiz yapılması faydalı olacaktır. Ek olarak, metakron metastazlardan nüksler veya yeniden biyopsi örnekleri, NB vakalarında moleküler testler kullanılarak yeniden değerlendirilmelidir.
Anahtar kelimeler: Nöroblastom, MYCN, Moleküler Heterojenite, NGS

Abstract:
Aim: Tumor heterogeneity describes the differences between cancer cells in the same tumor sample. Neuroblastoma (NB) is a type of cancer where tumor heterogeneity complicates its treatment. This study aims to explore the role of molecular heterogeneity in NB detected by routine molecular tests and next generation sequencing (NGS).
Materials and Methods: Seventy-one patients were included in the study. NB samples were chosen among 1400 NB samples that were evaluated using molecular tests between 2012-2020 according to the guidelines of Turkish Pediatric Oncology Group protocol.  Molecular investigations were performed (total 142 samples) obtained from two different areas (blastic zones and differentiated zones) of the tumor (synchronous) or at two different times (metachronous). Heterogeneity was questioned for different tests: MYC amplification, 1p36LOH, 11q23 deletion and 17q25 gain (identified with real-time PCR) and DNA ploidy (identified with flow cytometry); and for 49 custom designed NB related genes sequenced by NGS. NGS analysis was made using ˙Illumina MiniSeq targeting custom design panel. After DNA isolation library was built and sequenced post-amplification. FASTQ data was filtered, and mutations were detected.
Results: For routine molecular tests, heterogeneity was observed for MYCN in 22.53%, for 1p36LOH in 36.62%, for 11q23del in 29.58%, and for 17q25 gain in 40.85% of cases, while DNA ploidy was heterogeneous in 36.4% of cases. Molecular heterogeneity did not show statistical difference among metachronous and synchronous cases.  High-risk cases more frequently displayed molecular heterogeneity without any statistically significant difference between both groups. For NGS, heterogeneity of mutation profile is 65.2% in synchronous group and 80.2% in metachronous group. Genes that have mutation in blastic zones but not in differentiated zones are TBCD, CNTN1, NGF, RPIA. Genes that have mutation in differentiated zones but not in blastic zones are GSTP1, CD5, TP73, ARID1A, RTN4, PTAFR. There is a case with bone marrow metastasis that have CADM1+NBAS mutation unique to metastasis and ARID1A,FOX2B,NM1 mutation in primary tumor. Most common mutation and heterogeneity were in RECQL5.
Conclusion: Our findings support the fact that molecular heterogeneity either exists in different areas of a tumor or seen in the same patient at different times. It will be beneficial to perform more than one molecular analysis on the tumor tissue specimens.  In addition, recurrences, or re-biopsy specimens from metachronous metastases shall be re-evaluated using molecular tests in cases of NB.   
Key words: Neuroblastoma, MYCN, Molecular Heterogeneity, NGS