Prematüre ovaryan yetmezlik modelinde foliküler atrezi ile granüloza hücrelerinin hücre ölüm mekanizmaları açısından ilişkisinin incelenmesi
Investigation of the relation between follicular atresia and granulosa cells in terms of cell death mechanisms in premature ovarian failure model
Yazar: DAMLA AKOĞULLARI
Danışman: DOÇ. DR. ELGİN TÜRKÖZ ULUER
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Foliküler atrezi = Follicular atresia ; Foliküler atrezi = Follicular atresia ; Granüloza hücreleri = Granulosa cells ; Hücre ölümü = Cell death ; Otofaji = Autophagy ; Over = Ovary ; Over yetmezliği-prematür = Ovarian failure-premature ; Overyan folikül = Ovarian follicle ; Siklofosfamid = Cyclophosphamide

Özet:
Amaç: Prematüre ovaryan yetmezlik (POY) özellikle 40 yaşından önce kadınlarda klinik olarak amenore, yüksek gonadotropin ve düşük östrojen seviyeleri ve ovaryumda gelişen folikül kaybına bağlı ovaryum rezervlerinin erken tükenmesi ile ortaya çıkan önemli bir infetilite nedenidir ve etiyolojisi hala tam olarak anlaşılamamıştır. Ovaryumda oosit ve folikül gelişimine metabolik destek sağlayan granüloza hücrelerinin aşırı kaybı ile tetiklenen foliküler atrezi sürecinde rol oynayan hücre ölüm mekanizmalarının araştırılması yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Son zamanlarda POY etiyolojisinin araştırılmasında kematerapötiklerle indüklenmiş hayvan modelleri kullanılmaktadır. Kanser tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir kemoteröpatik ajan olan siklofosfamid, ovaryumlara sitotoksik etki yaparak foliküler atreziyi tetiklemektedir. Çalışmamızda, siklofosfamid ile C57BL/6 cinsi dişi farelerde prematüre ovaryan yetmezlik modelinin oluşturulması, alınan kan ve doku örnekleri ile modelin oluşumunun biyokimyasal ve histopatolojik yönden doğrulanması ve foliküler atrezi sürecinde rol oynayan hücre ölüm mekanizmalarından apoptoz, otofaji ve paraptozun immünohistokimyasal yöntemlerle değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Gereç Yöntem: C57BL/6 cinsi dişi fareler rastgele kontrol, sham ve POY olmak üzere 3 gruba ayrıldı (n:6, herbir grup için). Prematüre ovaryan yetmezlik modeli siklofosfamid uygulaması ile oluşturuldu. Kontrol grubuna herhangi bir uygulama yapılmadı. POY grubuna siklofosfamid, sham grubuna ise aynı oranda serum fizyolojik uygulandı. Siklofosfamid 3 hafta boyunca her 2 günde 1 intraperitoneal, ilk doz 70 mg/kg, devam eden dozlar 30mg /kg olarak uygulandı. 3 hafta sonunda hormon serum seviyelerinin analizi için tüm gruplardan genel anestezi altında intrakardiyak 3ml kan alındıktan sonra hayvanlar servikal dislokasyonla sakrifiye edilerek ovaryumları alındı ve histolojik takip yöntemleri uygulanarak elde edilen kesitlere histopatolojik değerlendirme için hematoksilen-eozin boyaması yapıldı. Tüm gruplara ait kesitlerde ışık mikroskobu altında folikül sayımı yapıldı. Kanda serum FSH, LH ve östradiol seviyeleri ELİSA yöntemiyle çalışıldı. Hücre ölüm mekanizmaları belirteçlerinden apoptoz için kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9, otofaji için Lamp1 ve MAP LC3β, paraptoz için ise GRP78 ve CHOP primer antikorları ile immünohistokimyasal boyama yapıldı. Apoptotik hücre varlığının tespiti için TUNEL analizi uygulandı.  Sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi.
Bulgular: Kontrol ve sham grubuna göre POY grubunda serum FSH ve LH seviyelerinde artış gözlenirken östradiol seviyelerinde düşüş saptandı. Gruplardan alınan ovaryum dokularının histopatolojik değerlendirmesinde, kontrol ve sham grubuna oranla POY grubunda ovaryum dokusundaki bozulma, foliküler atrezinin bir belirteci olan gelişen folikül kaybı ve atrezik folikül sayısında belirgin bir artış gözlendi. Folikül sayımı ile kontrol ve sham grubuna göre POY grubunda gelişen folikül sayısının azaldığı benzer oranda atrezik foliküllerde artış olduğu izlendi. İmmunohistokimyasal boyamalar sonucunda; kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9 immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise kaspaz 3 hafif/orta, kaspaz 8 ve kaspaz 9'un orta şiddette; Lamp1 ve MAP LC3β immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise Lamp1 hafif/orta, MAP LC3β orta şiddette; CHOP ve GRP78 immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise orta şiddette gözlendi. TUNEL analizi sonucunda, POY grubu ovaryum kesitlerinde kontrol ve sham grubuna göre daha fazla apoptotik hücre tespit edildi. 
Sonuçlar: Prematüre ovaryan yetmezlik modelinin siklofosfamid uygulaması ile C57BL/6 dişi farelerde başarılı bir şekilde oluşturulduğu biyokimyasal ve histopatolojik olarak doğrulanmıştır. Foliküler atrezi sürecinde görülen hücre ölüm mekanizmalarından apoptoz, otofaji ve paraptozun varlığı immünohistokimyasal olarak gösterilmiştir. TUNEL analizi ile hastalık grubundaki apoptotik hücre artışı tespit edilmiştir. Bu çalışmada prematüre ovaryan yetmezliğe yol açan foliküler atrezi sürecinde apoptoz ve otofajinin yanı sıra paraptozun da rol aldığının gösterilmesi, yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

Anahtar Kelimeler: Prematüre Ovaryan Yetmezlik, Siklofosfamid, Foliküler atrezi,
Apoptoz, Otofaji, Paraptoz

Abstract:
Aim: Premature ovarian failure (POF); especially generates early depletion of ovarian reserves due to follicular loss in the ovary in women under 40 ages who have clinically amenorrhea, higher gonadotropin and low estrogen levels; is the important cause of infertility and its etiology is still not clearly understood. Investigation of cell death mechanisms that play a role in the follicular atresia triggered by excessive loss of granulosa cells that provide metabolic support for oocyte and follicle development in the ovary will help to develop new treatment protocols. Recently, animal models induced by chemotherapeutics have been used to investigate POF etiology. Cyclophosphamide, a chemotherapeutic drug commonly used in the treatment of cancer, triggers follicular atresia by making a cytotoxic effect on ovaries. In this study, it was aimed to establish the premature ovarian failure model in C57BL/6 mice that induced by cyclophosphamide with the confirmation of the model formation by blood and tissue samples, and then, evaluation of apoptosis, autophagy and paraptosis via indirect immunohistochemistry method in order to determine the cell death mechanism that play a role in follicular atresia process.
Material and Methods: C57BL/6 female mice randomly divided into 3 groups as control, sham and POF (n:6, for each group). Premature ovarian failure model has been established with cyclophosphamide treatment. No treatment was applied to the control group. POF group was treated with cyclophosphamide and the sham group were given an equal amount of saline. Cyclophosphamide was administered intraperitoneally one every 2 days for 3 weeks; the first dose was 70 mg/kg, the ongoing doses were 30 mg/kg. At the end of 3 weeks, 3 ml of blood was taken intracardiac under general anesthesia from all groups for analysis of hormone serum levels and then animals sacrificed by cervical dislocation and ovaries were taken. Follicle counts were performed under light microscope in sections of all groups. FSH, LH and estradiol serum levels in the blood were studied by ELİSA assay. Among the markers of cell death mechanisms, immunohistochemical staining was performed with caspase 3, caspase 8 and caspase 9 for apoptosis, Lamp1 and MAP LC3β for autophagy, and GRP78 and CHOP primer antibodies for paraptosis. TUNEL analysis was performed to detect the presence of apoptotic cells. The results were evaluated statistically.
Results: A decrease in estradiol levels was observed when the serum FSH and LH levels were increased in the POF group according to the control and sham group. Histopathological evaluation of ovarian tissues from groups showed a significant increase in ovarian tissue impairment in the POY group compared with the control and sham group, loss of developing follicle as a marker of follicular atresia, and a significant increase in the number of atresic follicles. It was confirmed by follicle counting that in the POF group there was an increase in the atresic follicle, the number of follicles developing was decreased according to the control and sham group. As a result of immunohistochemical staining; caspase-3, caspase-8, and caspase-9 immunoreactivities were mild in the control and sham groups, caspase-3 immunoreactivity was mild to moderate in the POF group, caspase-8 and caspase-9 immunoreactivities were moderate; Lamp1 and MAP LC3β immunoreactivities were mild in the control and the sham groups, while in the POF group, Lamp1 immunoreactivity was mild to moderate and MAP LC3β immunoreactivity was moderate; CHOP and GRP78 immunoreactivities were observed to be moderate in the control and sham group and moderate in the POF group. As a result of TUNEL analysis, more apoptotic cells were detected in the POF group than in the control and sham group in the ovary sections.
Conclusions: Biochemical and histopathologic confirmation of the premature ovarian failure model was successfully established with cyclophosphamide administration in C57BL/6 female mice. Apoptosis, autophagy and paraptosis are demonstrated immunohistochemically from the cell death mechanisms seen in the follicular atresia process. Apoptotic cell increase in the disease group was detected by TUNEL analysis. The demonstration that apoptosis and autophagy as well as paraptosis play a role in the follicular atresia leading to premature ovarian failure in this study will help to develop new treatment protocols.

Keywords: Premature Ovarian Failure, Cyclophosphamide, Follicular Atresia,
Apoptosis, Autophagy, Paraptosis.