Organofosfat metabolitlerinin insan hücre kültürlerinde nörotoksisitesinin değerlendirilmesi
Evaluation of organophosphate metabolites neurotoxicity in human cell cultures
Yazar: BURAK DEMİRBAĞ
Danışman: DOÇ. DR. SERMET SEZİGEN
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Gülhane Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi KBRN Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Acil Tıp = Emergency Medicine ; Farmasötik Toksikoloji = Pharmaceutical Toxicology ; Savunma ve Savunma Teknolojileri = Defense and Defense Technologies
Dizin: Kan beyin bariyeri = Blood brain barrier ; Kimyasal silahlar = Chemical weapons ; Kitle imha silahları = Mass destruction weapons ; N-asetilsistein = N-acetylcysteine ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; İnsektisidler-organofosfat = Insecticides-organophosphates

Özet:
Kimyasal harp maddesi olan sinir ajanları ile aynı fiziksel ve kimyasal yapıya sahip olan organofosforlu pestisitler halen tarımda yaygın olarak kullanılmakta ve her yıl binlerce insanın büyük oranda kazayla ve nispeten çok daha az oranda intihar amaçlı kullanımı nedeniyle hayatını yitirmesine sebep olmaktadır. 2000'li yıllara kadar sinir ajanları ile ilgili bilgilerimiz asetilkolin birikiminin neden olduğu semptomlarla sınırlıyken, son zamanlarda sinir ajanlarının neden olduğu oksidatif stres ve buna bağlı organ hasarı belirtileri hemen hemen tüm sistemlerde görüldüğü hakkında birçok çalışma bulunmaktadır. Çalışmamızda paraokson molekülünün Kan Beyin Bariyeri (KBB) (BMVEC/ACBRI/Kırkland WA) ve Nöroblastoma (NB) (SH-SY5Y /CRL-2266, ATCC) hücre hatlarının canlılığı üzerindeki toksik etkileri, bu hücre hatlarında neden olduğu oksidatif hasar ve en sık kullanılan antioksidanlardan N-asetil sistein (NAC) molekülünün antioksidan etkinliği incelendi. 
SH-SY5Y hücre hattında organofosfat metaboliti olan Paraokson Etil (PE) ve Paraokson Metil (PM) IC50 dozları 24 saatte 0,5 ve 0,6 milimolar (mM), 48 saatte 0,5 ve 0,72 mM ve BMVEC hücre hattında ise sırasıyla 24 saatte 0,66 ve 0,76 mM ve 48 saatte ise 0,5 ve 0,5 mM olarak ölçülmüştür. xCELLigence testlerinde SH-SY5Y hücre hatlarında PE maruziyetinde 33. saat, PM maruziyetinde 20. saatten sonra NAC'ın proliferatif etkisinin belirginleştiği ve BMVEC hücre hatlarında ise NAC'ın koruyucu etkisinin hemen gözlenmeye başladığı, bu etkinin PE ile 24 saatten ve PM ile 48 saatten sonra azalmaya başladığı gözlenmiştir. Oksidatif stres testlerinde BMVEC hücre hatlarında; PE ve PM'nin ilk 24 saatte T-GSH düzeylerini yükselttiği, GPx düzeylerini düşürdüğü ve NAC'ın bu etkileri ilk 24 saatte tersine çevirdiği, SH-SY5Y hücre hatlarında ise PE, PM ve NAC'ın T-GSH seviyelerine üzerine etkilerinin benzer olduğu ancak SH-SY5Y hücre hatlarında GPx seviyelerinde anlamlı bir değişiklik olmadığı gözlenmiştir. 
Organofosfat zehirlenmesine bağlı kolinerjik semptomları takip eden nörolojik semptomların bir nedenin de artmış oksidatif stres olduğu değerlendirilmektedir. Bu nedenle oksidatif dengeyi; etkilenen kurbanlar lehine değiştirecek olan NAC molekülünün standart tedavi protokollerine eklenmesinin sağlayacağı faydaya yönelik ileri seviye çalışmalara ihtiyaç olduğu değerlendirilmektedir.

Abstract:
Organophosphorus pesticides, which have the same physical and chemical structure like nerve agents as a chemical warfare agent, are still widely used in agriculture and cause thousands of people to die every year, mostly due to accidental use and to a much lesser extent for suicidal use. Until the 2000's, our knowledge about nerve agents was limited with the symptoms due to the accumulation of acetylcholine but recent studies investigate nerve agent dependent oxidative stress and especially neurotoxicity almost in all systems. In our study, the effects of paraoxon molecule on the viability of blood-brain barrier (BBB) (BMVEC/ACBRI/Kırkland WA) and neuroblastoma (NB) (SH-SY5Y /CRL-2266, ATCC) cell lines, the oxidative damage in these cell lines, and the antioxidant activity of N acetyl cysteine (NAC) which is one of the most used antioxidants, were investigated.
Paraoxon Ethyl (PE) and Paraoxon Methyl (PM) are both organophosphate metabolites. Their IC50 doses in the SH-SY5Y cell line are 0.5 and 0.6 milimolar (mM) in 24 hours, 0.5 and 0.72 mM in 48 hours, and in BMVEC cell line 0.66 and 0.76 mM at 24 hours, and 0.5 and 0.5 mM at 48 hours, respectively. In xCELLigence tests, the proliferative effect of NAC became evident in SH-SY5Y cell lines after 33 hours of PE exposure and after 20 hours of PM exposure. It was observed that protective effect of NAC began immediately in BMVEC cell lines and this effect decreased after 24 hours in PE exposed cells and after 48 hours in PM exposed cells. In oxidative stress tests of BMVEC cell lines, it was found that PE and PM increased T-GSH levels in the first 24 hours, decreased GPx levels. NAC reversed these effects in the first 24 hours, whereas PE, PM, and NAC had similar effects on T-GSH levels in SH-SY5Y cell lines. However, no significant change was observed in GPx levels in SH-SY5Y cell lines.
Increased oxidative stress is one of the causes of neurological symptoms following cholinergic symptoms due to organophosphate poisoning. Therefore, it is evaluated that there is a need for advanced studies about the benefit of adding the NAC molecule, which will change it in favor of the affected victims, to the standard treatment protocols.