Spinal musküler atrofide (SMA) oksidatif stres yolaklarının aydınlatılması
Identification of the effect of oxidative stress pathways on spinal muscular atrophy
Yazar: AYŞE SEVGİ KÖSTEL
Danışman: PROF. DR. HAYAT ERDEM YURTER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Kas atrofisi-spinal = Muscular atrophy-spinal ; Kurkumin = Curcumin ; Nörolojik hastalıklar = Neurological diseases ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Spinal musküler atrofi (SMA) ön boynuz motor nöron hücrelerini etkileyen genetik, nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalıkta eksik olan SMN1 proteini tüm hücrelerde bulunmasına rağmen, proteinin eksikliğinde özgül ön boynuz motor nöron hasarı görülmektedir. Son yıllarda, oksidatif strese bağlı nörodejenerasyonun özgül motor nöron hasarına neden olabileceği öne sürülmüştür. Ayrıca hasta örneklerinde yapılan incelemelerde oksidatif strese bağlı DNA hasarının olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle spinal musküler atrofide oksidatif strese yatkınlık olabileceği ve antioksidan bir bileşik olan kurkuminin oksidatif strese karşı hücreyi koruyabileceği hipotezi doğmuştur. Dihidrodiklorofloresein diasetat (DCFDA) ile hücre içi reaktif oksijen bileşiklerinin miktarları ölçüldüğünde, oksidatif stresin hastalarda sağlıklı ve taşıyıcı gruba göre daha yüksek olduğu bulunmuştur. Bu nedenle gerçek zamanlı PZR array sistemi kullanılarak spinal musküler atrofide gen ifade düzeyinde oksidatif strese yanıtın araştırılması hedeflenmiştir. İlk aşamada, sağlıklı ve hasta fibroblast hücreleri kullanılarak bazal düzeyde antioksidan gen ifadelerinin farklı olup olmadığı araştırılmıştır. Bazal düzeyde antioksidan yanıt genlerinden selenoprotein p (SEPP1), aldehid oksidaz (AOX), dehidrokolesterol redüktaz (DHCR24) ve titin (TTN) ifade düzeyinde artış; antiinflamatuar olarak bilinen siklooksijenaz 2 (COX2) geninde dikkat çekici bir azalış saptanmıştır. İkinci aşamada ise, antioksidan yanıtta belirgin farklılık izlenen hücrelere kurkumin uygulanmıştır. Kurkumin uygulaması, DCFDA sonuçlarına bakıldığında, hasta hücrelerde reaktif oksijen bileşikleri miktarlarında düşüş sağlarken, sağlıklı ve taşıyıcılarda artışa neden olmuştur. Bunun üzerine hasta ve sağlıklı hücrelerde kurkumin uygulamasının antioksidan genlerin ifade düzeylerine etkisi değerlendirilmiştir. SEPP1, AOX1, TTN, DHCR24 genlerinde kurkumin uygulaması sonrasında anlamlı bir değişim bulunmamıştır; ancak hem sağlıklı hem de hasta hücrelerde kurkumin sonrası glutatyon peroksidaz (GPX), tiyoredoksin, peroksiredoksin ve sülfiredoksin düzeylerinde farklılık saptanmıştır. Ayrıca sağlıklı hücrelerde sikloksijenaz 2 (COX2) düzeylerinde düşüş izlenirken, hasta hücrelerde araşidonat 12 lipoksijenaz (ALOX12) düzeylerinde artış saptanmıştır. Bütün bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde SMAlı hücrelerde oksidatif strese yatkınlık olduğu, kurkuminin peroksit yolağı üzerinden antioksidan yanıta katkıda bulunduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıca bu çalışma, siklooksijenaz enziminin SMA gelişimindeki önemine ve ileride hastalık patogenezinde araştırılmaya değer bir aday molekül olduğuna işaret etmektedir.

Abstract:
Spinal muscular atrophy, leading genetic cause of infantile mortality, is an autosomal recessive neuromuscular disorder causing progressive degeneration on anterior horn ?-motor neurons of the spinal cord. Although SMN is a ubiquitously expressed protein found in all somatic cells, the reason for specific vulnerability of spinal ?-motor neurons has not yet been illuminated. Recently, because the neuronal cells are more susceptible to oxidative damage, a scenario based on oxidative stress has been proposed as a contributing factor for the motor neuron degeneration. In a study on the autopsy materials of SMA patients, positive markers of oxidative insult were illustrated. Consequently, the idea of the susceptibility to oxidative stress in spinal muscular atrophy aroused and an antioxidant, curcumin was proposed as an alternative therapy modality. In order to evaluate the role of SMN depletion in causing oxidative stress in SMA cells we first quantified the amount of reactive oxygen species through dihydrodichorofluorescein diacetate ROS (Reactive oxygen species) quantification assay and observed that SMA type I fibroblasts are significantly rich in reactive oxygen species compared to healthy and carrier subjects. We then performed RT2 ProfilerTM PCR Array for the identification of antioxidant gene expression differences in SMA type I cells compared to the healthy ones. We observed an increase in the basal expression levels of selenoprotein p (SEPP1), aldehyde oxidase (AOX), dehydrocholesterol reductase (DHCR24) and titin (TTN) in SMA fibroblasts compared to the healthy ones; a robust decrease in cyclooxygenase 2 (COX2) was observed. As a second step, we applied curcumin to both healthy and SMA type I fibroblasts. ROS content of the SMA type I cells decreased, an increase was observed in healthy and carrier subjects. When RT2 ProfilerTM PCR Array was performed; no change in the levels of SEPP1, AOX1, TTN, DHCR24 genes was observed; however it was observed that curcumin increases the expression of glutathione peroxidase (GPX), thioredoxin, peroxiredoxin and sulphiredoxin, which form the second line antioxidant defence. In addition, in healthy fibroblasts, cyclooxygenase 2 (COX2) was lower; however in fibroblasts with SMA type I arachidonate 12 lipoxygenase (ALOX12) was higher after the curcumin application. Collectively, all these results lead us to the conclusion that, in SMA there is a susceptibility to oxidative stress at the cellular level and curcumin has a potential positive effect against oxidative damage through the manipulation of peroxide response. This study points out that cyclooxygenase and arachidonic acid pathway may have an important role in the pathogenesis of SMA and are good candidates for further research.