Fotostimülasyonun 2 ve 3 boyutlu in vitro hiperglisemik modellerde insan dermal fibroblast, keratinosit ve endotel hücreleri üzerindeki etkinliğinin incelenmesi
Investigation of the efficacy of photostimulation on human dermal fibroblasts keratinocyte and endothelial cells in 2d and 3d in vitro hyperglycemic models
Yazar: SİMGE ÇITAK
Danışman: DOÇ. DR. ÖZER AYLİN GÜRPINAR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Bu çalışma "2-Boyutlu ve 3-Boyutlu in vitro Diyabetik Ülser Modellerinde Fotostimülasyonun Etkinliğinin Araştırılması" başlıklı kapsamlı araştırma projesi (FBA-2022-20162) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi (BAP) tarafından desteklenmiştir.
Sunulan tez çalışmasında fotostimülasyonun insan dermal fibroblast, keratinosit ve endotel hücreleri üzerindeki biyolojik etkilerinin diyabetik koşulları taklit eden 2 ve 3 boyutlu in vitro hiperglisemik modellerde incelenmesi amaçlanmıştır. Diyabetik hastalarda sıklıkla karşılaşılan kronik yaralar, özellikle hiperglisemi nedeniyle hücresel proliferasyonun ve göçün azalması, yetersiz anjiyogenez, re-epitelizasyon, artan oksidatif stres gibi birçok faktörle ilişkilidir. Bu kapsamda fotostimülasyonun yara iyileşmesindeki hücresel ve moleküler süreçler üzerindeki etkilerinin in vitro çalışmalarla araştırılıp diyabetik yara tedavisindeki kullanım potansiyelinin ortaya koyulması hedeflenirken, tedavi yaklaşımlarının denenebileceği in vitro hiperglisemik modellerin geliştirilmesi de hedeflenmiştir.
Gerçekleştirilen in vitro çalışmalarda ilk olarak insan dermal fibroblast (HDF), keratinosit (HS2) ve endotel hücrelerinin (HUVEC) kültürü yapılmıştır. Hücreler farklı glikoz konsantrasyonları kullanılarak oluşturulan ortamlardaki proliferasyon ve morfoloji özellikleri incelenerek bir hiperglisemik koşul belirlenmiştir. Belirlenen hiperglisemik koşullarda ve normal koşullarda fotostimülasyon uygulaması yapılarak hücrelerin morfoloji, proliferasyon, ECM sentezi, göç ve anjiyogenez üzerindeki etkileri çeşitli analiz yöntemleri ile incelenmiştir. Hücre proliferasyonu MTT analizi, hücre göçü scratch analizi, ECM sentezi immünositokimyasal analizler, anjiyogenez ise tübül oluşumu ve gen ekspresyonu analizleri ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. Daha sonra fibroblast ve keratinosit hücreleri ile polikaprolakton (PCL) / kitosan-jelatin doku iskelesi üretilerek 3-boyutlu bir hiperglisemi modeli oluşturulmuştur. Oluşturulan modelde, fotostimülasyonun yara iyileşmesi üzerine etkisini incelemek üzere 600-1200 nm dalga boyunda, yakın kızılötesi (NIR) polikromatik ışın sağlayan plazma ark ışık kaynağı kullanılarak fotostimülasyon uygulaması yapılmıştır. Bu uygulama karşısında hücre canlılığı, morfolojisi ve ECM yoğunluğu üzerindeki etkisi SEM ve MTT analizleri ile incelenmiştir.  
Çalışmada gerçekleştirilen analizler doğrultusunda fotostimülasyonun 2 ve 3-boyutlu modellerde hücresel proliferasyonu, göçü, ECM sentezini ve anjiyogenez sürecinde kritik rolü olan tübül oluşumunu desteklediği görülmüştür. Ayrıca hücrelerin biyolojik yanıtları göz önünde bulundurulduğunda keratinositlerin, fotostimülasyona en duyarlı hücreler olduğu, endotel hücrelerinin ise hiperglisemik koşullardan en çok etkilenen hücreler olduğu belirlenmiştir. Bu sonuçlar, fotostimülasyonun diyabetik yara tedavisinde potansiyel tedavi yöntemi olarak kullanılabileceğine dair umut vermektedir. Ancak bununla birlikte yapılacak olan yeni analizlerle bu 3-boyutlu hiperglisemik modelin optimize edilmesinin, in vivo ve klinik çalışmalar öncesinde önemli bir basamak oluşturacağı düşünülmektedir.

Abstract:
This study is supported by the Scientific Research Projects Coordination Unit (BAP) of Hacettepe University as part of the comprehensive research project titled "Investigation of the Effectiveness of Photostimulation in 2-Dimensional and 3-Dimensional in vitro Diabetic Ulcer Models" (FBA-2022-20162). 
In the present study aims to investigate the biological effects of photostimulation on human dermal fibroblasts, keratinocytes, and endothelial cells in 2D and 3D in vitro hyperglycemic models that mimic diabetic conditions. Chronic wounds commonly encountered in diabetic patients are associated with many factors, particularly reduced cellular proliferation and migration due to hyperglycemia, inadequate angiogenesis, re-epithelialization, and increased oxidative stress. In this context, the aim is to investigate the effects of photostimulation on cellular and molecular processes in wound healing through in vitro studies and to reveal its potential use in the treatment of diabetic wounds, while also developing in vitro hyperglycemic models where treatment approaches can be tested.
Human dermal fibroblast (HDF), keratinocyte (HS2), and endothelial cells (HUVEC) were cultured initially for in vitro cell culture study. A hyperglycemic condition has been determined by examining the proliferation and morphology characteristics of cells in using different glucose concentrations. The effects of photostimulation applied under established hyperglycemic conditions and normal conditions on cell morphology, proliferation, ECM synthesis, migration, and angiogenesis have been investigated using various analytical methods. Cell proliferation was evaluated comparatively through MTT analysis, cell migration through scratch analysis, ECM synthesis through immunocytochemical analyses, and angiogenesis through tube formation and gene expression analyses. Later, a 3-dimensional hyperglycemia model was created by producing a tissue scaffold of polycaprolactone (PCL) / chitosan-gelatin using fibroblast and keratinocyte cells. In the created model, photostimulation was applied using a plasma arc light source that provides polychromatic light in the near-infrared (NIR) wavelength range of 600–1200 nm to investigate the effect of photostimulation on wound healing. The effect of this application on cell viability, morphology, and ECM density has been examined using SEM and MTT analyses. 
The analyses conducted in the study revealed that photostimulation supports cellular proliferation, migration, ECM synthesis, and the formation of tubules, which play a critical role in the process of angiogenesis, in both 2D and 3D models. Furthermore, considering the biological responses of the cells, keratinocytes have been identified as the most responsive cells to photostimulation, while endothelial cells are the most affected by hyperglycemic conditions. These results suggest that photostimulation could be used as a potential treatment method in the healing of diabetic wounds. Nonetheless, it is assumed that further refinement of this 3-dimensional hyperglycemic model through additional analyses will represent a crucial preliminary phase prior to advancing to in vivo and clinical investigations.