Dirençli akciğer kanser kök hücrelerine moleküler mühendislik ile hedeflendirilmiş eksozom-enkapsüle siRNA'larla hücrelerdeki ilaç direncinin önlenmesi
Prevention of resistance by targeting exosome-encapsulated siRNAs to resistant lung cancer stem cells by molecular engineering
Yazar: BAHAR DEMİR CEVİZLİDERE
Danışman: DOÇ. DR. AYLA EKER SARIBOYACI
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Eksozomlar = Exosomes ; Gen ifadesi = Gene expression ; Nanobiyoteknoloji = Nanobiotechnology ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells ; İlaç hedefleme = Drug targeting ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-çoklu = Drug resistance-multiple

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında Gemsitabin ile dirençli hale getirilen
A549'lardan izole edilen kanser kök hücreleri (dKKH; CD326+CD133+CD44+) ile
ko-kültüre edilen siRNA (KKH'de yüksek düzeyde eksprese olan çoklu ilaç
direnç genlerinden ABCB1 genine özgü) transfekte ve Hyaluronik asitle(HA)
enkapsüle edilmiş insan sinoviyal sıvı kökenli mezenkimal kök hücre
eksozomlarının dKKH'lerdeki MDR1 susturulması-aracılı etkisinin araştırılması
amaçlanmıştır.
Yöntem: Gemsitabin dirençli A549 hücrelerinden CD326+CD133+CD44+
Hücre izolasyonları gerçekleştirildikten sonra CFU analizi, 3 Boyutlu sfer
oluşturabilme yetenekleri, MTT yöntemiyle sitotoksisite analizi, büyüme eğrisi,
immunofloresan işaretleme ve flow sitometri yöntemleriyle pozitiflikleri
karakterize edildi. MKH'lerden eksozom izolasyonlarından sonra flow sitometri
ve TEM analizleriyle karakterizasyon analizleri gerçekleştirildi. MDR1-
siRNA'lar eksozomlara transfekte edilerek yüklenme kapasiteleri araştırıldı. HAkaplanmış-
siRNA-transfekte-eksozomların KKH'lerdeki başarısı flow sitometri
ve PCR analizleriyle gösterildikten sonra IF işaretlemeyle Aktif Kaspaz-3
boyaması, flow sitometri ile Annexin V/PI ve bazı apoptoz genleri için qPCR ile
apoptotik analizler gerçekleştirildi. Ayrıca flow sitometriyle hücre döngüsü
analizi ile tedavi stratejilerinin etkileri araştırılmıştır.
Bulgular: A549 hücrelerine Gemsitabin direnci kazandırılarak sitotoksisite
analizi ile IC50 değerlerinin yükseldiği ve hücrelerin belirgin, canlılık oranı
yüksek ve iki boyutlu koloni oluşturma yetenekleri gösterildi. d-A549'lardan
CD326+CD133+CD44+ izolasyonları gerçekleştirildi ve izolasyonların
verimliliğinin yüksek saflık ve canlılıkta olduğu belirlendi. siRNA transfekte
eksozomların A549, KKH ve dKKH gruplarındaki MDR1 seviyelerindeki
azalmalar belirlendi. Apoptotik ve hücre döngüsü analizlerinde KKH'lerdeki
Gemsitabin direncinin kırıldığı ve hücrelerin apoptoza yönlendirilebildiği
belirlendi.
Sonuç: Bu tez çalışmasından elde edilen verilere göre d-KKH'lerde
eksozom aracılı siRNA'ların hedef genleri başarıyla sessizleştirebileceği ve
ABCB1 gen ekspresyonunun azalması ile KKH'lerde kemodirencin azalarak
kemoterapötiklerin yeniden kullanılabileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
Objective: In this thesis study, it was aimed to investigate the MDR1
silencing-mediated effect on lung resistant CSC (rt-CSC;D326+CD133+CD44+),
which is isolated from Gemsitabine-resistant A549 cells. For this purpose, MDR1
spesific siRNA (specific to ABCB1 gene, one of the multidrug resistance genes
highly expressed in CSC) were transfected to exosomes and were coated with
Hyaluronic acid(HA) and this combinations were co-cultured with rt-CSC.
Methods: After isolation of CD326+CD133+CD44+cells from
Gemsitabine-resistant-A549 their positivity was characterized by CFU analysis,
ability to form 3D (3D) spheres, cytotoxicity analysis, growth curve,
immunofluorescence labeling and flow cytometry methods. After MSC-derivedexosome
isolations, characterization analyzes were performed with flow
cytometry and TEM analyzes. MDR1 siRNAs were transfected into exosomes
and their loading capacity was investigated. After the success of HA-coatedsiRNA-
transfected-exosomes in CSCs was demonstrated by flow cytometry and
PCR analysis, Active Caspase-3 staining with IF labeling, Annexin V/PI with
flow cytometry, and apoptotic analyzes with qPCR were performed. In addition,
the effects of cell cycle analysis and treatment strategies were investigated.
Results: Gemcitabine resistance was proven in A549 cells, with
cytotoxicity analysis were increased and the cells were prominent, viable, and had
the ability to form two-dimensional colonies. CD326+CD133+CD44+ isolations
from resistant-A549 were performed and it was determined that the efficiency of
the isolations was of high purity and viability. Decreases in MDR1 levels in
A549, CSC and rt-CSC groups of siRNA-transfected exosomes were determined.
In apoptotic and cell cycle analyzes, it was determined that Gemcitabine tolerance
was re-established in rt-CSCs and cells could be directed to apoptosis.
Conclusions: According to the data obtained from this thesis study, it was
concluded that exosome-mediated siRNAs can successfully silence target genes in
rt-CSCs and that chemotherapeutics can be reused by decreasing chemoresistance
in rt-CSCs with decreased ABCB1 gene expression.