Gyromitra esculenta (Pers.) Fr. türünün biyoaktif bileşiklerinin elde edilmesi ve yapılarının aydınlatılması
Gyromitra esculenta (Pers.) Fr. obtainig and elucidating structures of bioactive compounds
Yazar: KÜBRA ELİK
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Analitik kimya = Analytical chemistry ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Asetilkolinesteraz = Acetylcholinesterase ; Butirilkolinesteraz = Butyrylcholinesterase ; Gaz likid kromatografisi = Gas liquid chromatography ; Kimya = Chemistry ; Makromantarlar = Macrofungi ; Ters faz kromatografisi = Reverse phase chromatography ; Yüksek basınç sıvı kromatografisi =   ; İnce tabaka kromatografisi = Thin layer chromatography

Özet:
Bu tez çalışmasında, Türkiye'de doğal olarak yetişen, çiğ tüketildiğinde zehirli olan ancak pişirildiğinde lezzetli bir gıda olan Gyromitra esculenta mantarı çalışıldı. Bu amaçla, Gyromitra esculenta, Muğla köylü pazarından 2015 yılında yağışların bol olduğu Aralık ayında satın alındı. Mantarın teşhisi yapıldıktan sonra 2 eşit parçaya ayrıldı. Mantarın bir kısmı çiğ halde kurutulurken, diğer kısmı 200 ̊C'de 20 dakika etüvde tutularak pişirildikten sonra kurutuldu. Kurutulan her iki örnek öğütülerek sırası ile petrol eteri, aseton ve metanol ile oda koşullarında ekstre edildiler. Ekstrelerin çözücüleri döner buharlaştırıcı yardımı ile uçurularak kuru ekstreler elde edildi. Buna ilaveten, metanol ekstraksiyonundan kalan mantarın 80 ̊C'de infuzyonu alındı. İnfüzyona hacminin üç katı kadar etil alkol eklenerek alkolde çözünmeyen maddelerin çökmesi sağlandı. Filtre edilerek elde edilen çökeltiye HWEP, etil alkol ile çözünen kısma HWES kodu verildi. Mantarın hem çiğ hem de pişirilmiş örneklerinden elde edilen aseton, metanol ve HWEP su ekstresinin antioksidan, antikolinesteraz, üreaz inhibisyon ve tirozinaz inhibisyon aktiviteleri belirlendi. Ayrıca tüm ekstrelerin sitotoksik aktivitesi rahim ağzı (HeLa) ve meme (MCF-7) kanser hücre hatlarına karşı test edildi. Antioksidan aktivite β-karoten-linoleik asit, DPPH serbest radikali giderimi, ABTS katyon radikali giderimi, CUPRAC ve metal bağlama yöntemleri kullanılarak belirlendi. Asetilkolinesteraz, bütirilkolinesteraz, tirozinaz ve üreaz inhibisyon testleri spektrofotometrik metotlar kullanılarak belirlendi. Sitotoksik testler ise MTT metodu kullanılarak yapıldı. Antioksidan, enzim inhibisyon ve sitotoksik aktivite gösteren ekstreler silika jel kolon üzerinden fraksiyonlandırıldı. Elde edilen fraksiyonların miktarları ve ince tabaka kromatografisindeki temizlikleri dikkate alınarak yapılan ileri fraksiyonlandırmalardan 17 adet madde saflaştırıldı ve yapıları spektroskopik yöntemlerle aydınlatıldı.
Antioksidan aktivite sonuçlarına göre, tüm ekstrelerin konsantrasyonlarının artışına paralel olarak antioksidan aktivitelerinin de arttığı izlendi. Hem çiğ hem de pişirilmiş metanol ve aseton ekstreleri, antioksidan aktivite yöntemlerinde yüksek aktivite göstererek antioksidan standartlara en yakın aktivite sergilediler. Üreaz ve tirozinaz enzim inhibisyonu aktivitelerinde pişirilmiş metanol ekstresi (GEC3) standartlara en yakın sonuç verdi. Asetilkolinesteraz inhibisyonu aktivitesinde metanol (GEN3 ve GEC3) ekstrelerinde daha yüksek inhibisyon görülürken; bütirilkolinesteraz inhibisyonu aktivitesinde aseton (GEN2 ve GEC2) ekstrelerinin inhibisyonlarının daha yüksek olduğu görüldü.
HeLa kanser hücre hattına karşı 75.0 µg/mL konsantrasyonda sırası ile çiğ ve pişirilmiş aseton ile çiğ ve pişirilmiş metanol ekstreleri %28-%38 ile %50-%35 canlılık oranı gösterirken; aynı sıra ve konsantrasyonda MCF-7 kanseri hücre hattına karşı %58-%60 ile %10-%28 canlılık oranı gösterdikleri belirlendi. Ekstrelerin biyoaktivitelerinin sonuçlarına göre kromatografik çalışmalarla GEN2, GEC2, GEN3 ve GEC3 ekstrelerinden maddelerin saflaştırılması yapıldı. 
GEN2, GEC2, GEN3 ve GEC3 ekstrelerinden saf madde izolasyonu kolon kromatografisi yöntemiyle silika jel adsorban kullanılarak yapıldı. İnce tabaka kromatografisi, preparatif ince tabaka kromatografisi ve recycle preperatif HPLC-UV-RI cihazı ile uygun adsorbanlar kullanılarak toplamda 17 madde saflaştırıldı. G. esculenta'dan saflaştırılan GEN-A-1 (1), GEN-A-3 (2), GEN-A-5 (3), GEN-A-4 (4), GEC-A-4 (5), GEC-A-5 (6) GEC-A-6 (7), GEC-A-19 (8), GEN-M-18 (9), GEN-M-17 (10), GEN-M-20 (11), GEN-M-16 (12), GEC-M-8 (13), GEC-M-9 (14), GEC-M-11 (15), GEC-M-12 (16) ve GEC-M-13 (17) kodlu bileşiklerin yapılarını aydınlatmak için UV, IR, NMR ve MS teknikleri kullanıldı. Spektroskopik çalışmalar sonucu benzer yapılar göz önüne alındığında 12 farklı madde tayin edildi. Yapılan spektroskopik çalışmalarla, 1, 9, 12, 14 kodlu maddelerin ergosta-5,22-dien 3β-ol, 2 kodlu maddenin ergosta-5,22-dien 3-O-β-ᴅ-glukopiranozit, 3 ve 7 kodlu maddelerin ergosta-7,9,22-trien 3β-ol, 4 kodlu maddenin ergosta-7,9,22-trien 3-O-β-ᴅ- glukopiranozit, 5 kodlu maddenin N-[1,3,4-trihidroksi, oktadesil]-2'-hidroksi tetrakosanamit, 6 kodlu madde etanediyal, 1,2-bis[2-formil-2-metilhidrazon, 8 ve 16 kodlu maddelerin adenozin, 10 kodlu maddenin 1-(1'-hidroksisinnamoil)-2-asetoksi-3-metoksi inositol, 11 kodlu maddenin ergosterol endoperoksit, 13 kodlu maddenin 5α,8α-epoksi-ergosta-6,22-dien 3β-ol, 15 kodlu maddenin urasil ve 17 kodlu maddenin mannitol olduğu belirlendi. 5 kodlu madde ilk defa bu çalışma ile elde edildi. Elde edilen maddelerin antioksidan ve sitotoksik aktiviteleri aynı metotlar ile belirlendi.

Anahtar Kelimeler: Gyromitra esculenta, Zehirli mantarlar, Kromatografik yöntemler, Antioksidan aktivite, Sitotoksik aktivite

Abstract:
In this thesis, Gyromitra esculenta mushroom naturally growing in Turkey was studied. When the mushroom consumed raw it is poisonous. However, it is edible and consumed by the local people when cooked well. For this purpose, Gyromitra esculenta was purchased from Muğla local market during December 2015. After the identification of mushroom, it was divided into two parts. One part of the mushroom was dried directly using drier machine, while other part was baked at 200 ̊C for 20 minutes, and then dried. Both dried samples were ground, and were extracted using petroleum ether, acetone and methanol in room temperature, successively. The solvents were evaporated using rotary evaporator to obtain crude extracts. In addition, the infusion of remaining mushroom materials was obtained using 80  C water after organic solvents extraction. After filtration, three times volume of ethyl alcohol was added to the cooled infusion. The precipitated part was filtered and coded as HWEP. The solvent of supernatant was removed under vacuum using rotary evaporator, and coded as HWES. Antioxidant, anticholinesterase, and urease and tyrosinase inhibitory activities of acetone, methanol and HWEP water extracts obtained from both raw and cooked samples were determined. In addition, cytotoxic activity of the all extracts against the cervical (HeLa) and breast (MCF-7) cancer cell lines were also tested. Antioxidant activity was determined using β-carotene-linoleic acid, DPPH free radical scavenging, ABTS cation radical scavenging, CUPRAC and metal chelating methods. The acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, tyrosinase and urease inhibition tests were determined using spectrophotometric methods. Anticancer tests were performed using the MTT method. The extracts exhibiting antioxidant, enzyme inhibitory and cytotoxic activity were fractionated on silica gel column. Seventeen compounds were purified from further fractions which are selected for their purity and their amounts on thin layer chromatography. The structures of isolated compounds (1-17) were elucidated by spectroscopic methods. 
The antioxidant activity of all extracts was increased in parallel to the increasing of concentrations. Both raw and cooked methanol and acetone extracts exhibited higher activity among the other extracts and demonstrated close activity to those of antioxidant standards. In the urease and tyrosinase enzyme inhibitory activities, cooked methanol extract (GEC3) gave close activity to those of standards. While both methanol (GEN3 and GEC3) extracts exhibited high inhibitory activity against acetylcholinesterase, the both acetone (GEN2 and GEC2) extracts indicated higher inhibitory activity against butyrylcholinesterase.
The cell viabilities (%) of raw and cooked acetone extracts at 75.0 μg/mL were 28-38% against HeLa cancer cell lines while the cell viabilities of raw and cooked methanol extracts were 50-35% at the same conditions. Against MCF-7 cancer cell lines, however, the cell viabilities (%) of acetone extracts were 58-60% while the cell viabilities of methanol extracts were 10-28% at the same conditions, respectively. According to the bioactivity results, GEN2, GEC2, GEN3 and GEC3 extracts were decide to fractionation to obtain biologically active compounds.
Silica gel column chromatography was used to isolate biologically active compounds from GEN2, GEC2, GEN3 and GEC3 extracts. Totally 17 compounds were purified using thin layer chromatography, preparative thin layer chromatography and preperative recycle HPLC-UV-RI machine. UV, IR, NMR and MS techniques were used to elucidate the compounds coded as GEN-A-1 (1), GEN-A-3 (2), GEN-A-5 (3), GEN-A-4 (4), GEC-A-4 (5), GEC-A-5 (6) GEC-A-6 (7), GEC-A-19 (8), GEN-M-18 (9), GEN-M-17 (10), GEN-M-20 (11), GEN-M-16 (12), GEC-M-8 (13), GEC-M-9 (14), GEC-M-11 (15), GEC-M-12 (16) and GEC-M-13 (17). 
Totally 11 different compounds were obtained after the all compounds were identified. The spectroscopic studies revealed that the compounds 1, 9, 12 and 14 were elucidated as ergosta-5,22-diene 3β-ol, and 2 as ergosta-5,22-diene 3-O-β-ᴅ-glucopyranoside, 3 and 7 as ergosta-7,9,22-trien 3β-ol,  4 as ergosta-7,9,22-trien 3-O-β-ᴅ- glucopyranoside, 5 as N-[1,3,4-trihydroxy, octadecyl]-2'-hydroxy tetracosanamide, 6 as etanedial, 1,2-bis[2-formyl-2-methylhydrazone, 8 and 16 as adenosine, 10 as 1-(1'-hydroxycinnamoyl)-2-acetoxy-3-methoxyinositol,  11 as ergosterol endoperoxide, 13 as 5α, 8α-epoxy-ergosta-6,22-diene 3β-ol, 15 as uracil, and 17 as mannitol. Among them compound 5 is a new compound. The antioxidant and cytotoxic activities of the isolated compounds using same methods were also performed.

Keywords: Gyromitra esculenta, Poisinous mushrooms, Chromatographic methods, Antioksidant activity, Cytotoxic activity