İnsan yağ dokusundan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu, devamlı kültürünün yapılması, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonu
Human adipose tissue derived mesenchymal stem cell isolation, long-term culture, characterisation and cryopreservation
Yazar: SERAP YEŞİLKIR
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MELAHAT BAĞIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Günümüzde adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler (AD-MKH) ile ilgili çalışmalara olan ilgi hızla artmaktadır. Bunun nedeni adipoz dokunun kemik iliği (Kİ), periferik kan (PK) ve kordon kanı (KK) ile kıyaslandığında daha fazla mezenkimal kök hücre (MKH) içermesidir. Adipoz doku MKH'lerinin uzun süreli kültürü mevcut olan zorluklardan dolayı dünyanın sayılı laboratuarlarında yapılmaktadır. Ülkemizde ise bu konu ile ilgili çalışmalar oldukça sınırlıdır.Buna göre de bu çalışmanın amacı farklı vericilerin adipoz dokusundan MKH izolasyonunu, in vitro kültürde adaptasyonunu, uzun süreli kültürünün yapılmasını ve kriyoprezervasyonunu incelemek olmuştur.Çalışmamızda farklı vericilerin lipoasipirat örnekleri kullanıldı. Deneylerde MKH izolasyonu (kolajenaz tip II ile muamele, basit santrifügasyon ile ayırma), hemasitometre ile hücre sayımı, Tripan mavisi ile hücre canlılık tayini, flow sitometrik immünfenotipleme (CD90 ve CD34), histokimyasal analiz (Oil Red O ve Alizarin Red S), klasik kültür, mikrokültür (MKM) ve kriyoprezervasyon yöntemleri kullanılmıştır.İzole edilen ve uzun süreli kültürü yapılan hücrelerin MKH olmasını belirlemek amacı ile yapılan morfolojik, immüfenotipik (CD90+ %95,98 ve CD34- %98,94), histokimyevi (adipojenik ve osteojenik farklılaştırma) incelemeler elde edilen hücrelerin MKH olduğunu göstermiştir.Çalışmamızda ilk kez olarak MKH'lerin farklı besiyerlerinde (%10 FBS içeren DMEM, IMDM ve DMEM/F12) kültürünün yapılması karşılaştırılarak incelendiğinde % 10 FBS içeren DMEM besiyerinin MKH'ler için en uygun kültür ortamı olduğu ve kültürü zor yapılan veya az sayıda MKH içeren örneklerin kültürünün yapılmasında mikrokültür yönteminin uygulanmasının, MKH'lerin kriyoprezervasyonunda ise hücre sayısının önemli olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca MKH'lerin elde edilen uzun süreli kültürü laboratuarımızda polimerlerin toksisitesinin ve enfeksiyon-kök hücre etkileşiminin incelenmesinde uygulanmıştır.Sonuç olarak bu çalışmada elde edilen yeni bilgiler ışığında farklı donörlerden elde edilen MKH'lerin devamlı kültürü ve kriyoprezervasyonu optimize edilmiştir. Ayrıca bu çalışmada elde edilen sonuçlar, TÜBİTAK tarafından yayınlanan 2003-2023 Teknoloji Öngörü Çalışmasında, Türkiye'de kök hücre teknolojilerinin geliştirilmesi ve kök hücrelerin özellikle rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilir hale gelmesi gerekliliği talebine de uygun olarak yapılmıştır.

Abstract:
Recent studies about adipose tissue derived stem cells (AD-MSCs) have more concern than usual. Reason of this is that adipose tissue includes more MSCs when compared to bone marrow (BM), peripheric blood (PB) and umbilical cord blood (UCB). The studies of AD-MSCs are performing in a few laboratories around the world because of difficulties in their long term culture. Meanwhile these studies are also so limited in our country.Accordingly, the reason of that study is checking isolation, adaptation as in vitro culture, process a long term culture and cryopreservation of MSCs in the adipose tissue?s from different task donors.In our study, we used sample of different donors? lipoasipirate. In experiments, MSCs isolation (treat as collagenase type II, separation with simple centrifugation), cell counting with hematocytometer, cell activity designation with Tripan blue, flow cytometric immunphenotyping (CD90 and CD34), histochemical analysis (Oil Red O and Alizarin Red S), classic culture method, micro culture method (MCM) and cryopreservation method were processed.Morphological, immuphenotypic (CD90+ 95,98% and CD34- 98,97%), histochemical (Oil Red O and Alizarin Red S stainning for adipojenic and osteojenic differentiation) studies were maintained to make the insulated and long term cultured cells as MSCs. Then all of the cells has obtained as MSCs in these experiments.For the first time, in the experiments, we found that the optimum culture environment for AD-MSCs is DMEM media including 10 % FBS when we compared with DMEM, IMDM and DMEM/F12 media. Also, we demonstrated that MC method is so important for adaptation of cells to long term culture as a first step and number of the cells are so important in cryopreservation of AD-MSCs. Besides, the long term culture that obtained from MSC was used in determination of polymers? toxicity and infection-stem cell interaction experiments in our laboratory.As a result, according to the knowledge from this experiments, we optimized long-term culture and cryopreservation of adipose derived stem cells from different donors. Additionally, obtained results from this project have been prepared dependent on the request of ?Improvement of stem cells technologies and to convert the stem cells as useful cells for regenerative clinic experiments? in ?Study of Technological Predictions? which published on ?2003-2023? by TUBITAK.