Kıkırdak doku rejenerasyonunda kitosan doku iskelesi destekli biyoreaktör performansının incelenmesi
Investigation of chitosan scaffold containing bioreactor performances for cartilage tissue regeneration
Yazar: RAHİME SEDA TIĞLI
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: Biyoreaktörler = Bioreactors ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Kitosan = Chitosan ; Kıkırdak = Cartilage

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, kıkırdak doku rejenerasyonunu destekleyecek kitosan doku iskelelerinin üretimi ve biyoreaktörlerin kıkırdak doku oluşumu üzerindeki etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Üç boyutlu, gözenekli kitosan doku iskeleleri çeşitli biyosinyal molekülleri ile fonksiyonel hale getirilmiş, hücre kültür çalışmaları önce durgun ortamda ve ardından döner duvarlı biyoreaktörlerde gerçekleştirilmiştir. Farklı kaynaklardan temin edilen hücrelerin kıkırdak doku oluşturma potansiyelleri incelenmiş ve ardından perfüzyon biyoreaktörlerde hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Son olarak, döner duvarlı biyoreaktörlerde ortam koşulları hesaplamalı akışkanlar dinamiği yazılımlarından biri olan FLUENT ile simüle edilmiştir.Tez kapsamında yapılan çalışmaların ilk aşamasında, farklı deasetilasyon derecelerine (DD) (%75-85 ve %85) ve bileşimlere (%2 ve %3 (w/v)) sahip gözenekli kitosan doku iskeleleri dondurarak-kurutma tekniğiyle hazırlanmış ve hücresel etkileşimleri in vitro koşullarda incelenmiştir. %85 DD'ne ve %2 bileşime sahip olan kitosan doku iskelelerinin ~100 µm gözenek boyutuna sahip ve içsel bağlantıları olduğu ve 0.917 N/mm2 sıkıştırma elastik modül değerine sahip olduğu belirlenmiştir. L929 fare fibroblastik hücreler ile yapılan hücre kültür çalışmaları fibroblastik hücre yapışması ve üremesinin DD'den etkilendiğini ortaya koymuştur. %85 DD'ne sahip olan kitosan doku iskelelerinin hücre yapışmasını ve üremesini daha güçlü biçimde desteklediği saptanmıştır. Çalışmalar sonucunda, en yüksek özgül üreme hızına (0.017 sa-1) ulaşılan %85 DD ve %2 bileşimdeki kitosan doku iskelesinin tezin geri kalan kısmında yapılacak çalışmalar için uygun doku iskelesi olduğu saptanmıştır.Çalışmanın bir sonraki aşamasında, kitosan doku iskeleleri Arg-Gly-Asp (RGD) dizisi ve epidermal büyüme faktörü (EGF) ile kovalent immobilizasyonla; kemik morfogenetik protein-6 (BMP-6) ise emdirme yöntemiyle işlevsel hale getirilmiştir. FTIR, floresan mikroskop gözlemleri ve kantitatif ölçümler, biyosinyal moleküllerinin kitosan doku iskelelerine başarıyla immobilize edildiğini göstermiştir. ATDC5 fare kondrojenik hücreleri 28 gün süresince durgun koşullarda, kitosan doku iskeleleri üzerinde kültüre edilmiştir. RGD immobilize edilmiş kitosan iskelelerdeki hücrelerin 24 saat sonunda en yüksek özgül üreme hızlarına (0.049 sa-1) sahip olduğu saptanmıştır. MTT analizi sonucunda EGF-kitosan doku iskelelerinde hücrelerin yüksek üreme eğilimlerine sahip oldukları belirlenmiştir. Bununla beraber, RGD ve EGF immobilize edilmiş kitosan doku iskelelerinde hücre fenotiplerinin korunamadığı belirlenmiştir. 4 haftalık durgun inkübasyon sonunda BMP-6 yüklü kitosan doku iskelelerinin yüksek glikozaminoglikan (GAG) (16.97 mg GAG/g kuru doku iskelesi) içeriğine sahip olduğu ve kollajen II içeriklerinin kitosan iskelelerle karşılaştırıldığında belirgin derecede yüksek olduğu belirlenmiştir (p=0.0003). BMP-6 yüklü kitosan doku iskelelerinde, hücrelerin farklılaşmasından sonra hücre morfolojilerinde gözlemlenen hipertrofiye karşın kondrojenik fenotiplerin korunarak kondrogenezin desteklendiği saptanmıştır. Döner duvarlı bioreaktörlerde inkübe edilen BMP-6 yüklü kitosan doku iskelelerindeki yüksek GAG ve kollajen II miktarlarına bağımlı olarak erken kondrogenezin desteklendiği saptanmış ve ATDC5 hücrelerinin hipertrofik morfolojiden yoksun bir şekilde kondrojenik fenotiplerini korudukları sonucuna varılmıştır.Tez çalışması kapsamında farklı kaynaklardan elde edilen insan kökenli hücrelerin kitosan doku iskeleleri üzerinde kıkırdak doku oluşturma potansiyelleri incelenmiştir. Çalışılan hücre kaynaklarından embriyonik kök hücrelerden türetilmiş mezenkimal kök hücrelerin (ED1 MSCs) yüksek agregan (AGC) ve kollajen II (Col II) ve düşük kollajen I (Col-I) transkripsiyon seviyeleri ile farklılaşma potansiyellerinin yüksek olduğu saptanmıştır. ED1 MSCs'in kullanıldığı hücre kültür çalışmalarında, dinamik koşulların incelenmesi amacıyla perfüzyon biyoreaktörler kullanılmıştır. Yapılan biyokimyasal testlerin sonucunda, perfüzyon biyoreaktörlerin iskelelerdeki GAG, Kollajen II, DNA içeriklerini arttırdığı saptanmış ve ek olarak perfüzyon biyoreaktörlerde kültüre edilen hücrelerinde tüm kıkırdak-bağımlı genlerin transkripsiyon seviyeleri yüksek bulunmuştur. Dinamik koşullarda kültüre edilen hücre-iskele yapılarının sıkıştırma elastik modüllerinin ise statik ortamda kültüre edilen hücre-iskele yapılarıyla karşılaştırıldığında ~2 kat daha yüksek olduğu belirlenmiştir.Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) modeli kullanılarak döner duvarlı biyoreaktörlerde yapılan simülasyon çalışmalarında, doku iskelelerine etki eden kayma gerilimleri 0.276-0.755 dyne/cm2 olarak hesaplanmıştır. Simülasyon çalışmaları sonucunda, döner duvarlı biyoreaktördeki oksijen kontuarlarının, sadece doku iskeleleri çevresinde değiştiği belirlenmiştir. Dolayısıyla, biyoreaktörün sürekli sistemde çalışmasının doku oluşumu açısından bir avantaj olduğu saptanmıştır.Anahtar Kelimeler: Kıkırdak doku mühendisliği, kitosan, RGD, EGF, BMP-6, döner duvarlı biyoreaktör, perfüzyon biyoreaktör, FLUENT, CFD.

Abstract:
The aim of the present study was to fabricate chitosan scaffolds to support cartilage tissue regeneration and to investigate the effects of bioreactors on cartilage tissue formation. Three dimensional and porous chitosan scaffolds were functionalized by three biosignal molecules i.e. Arg-Gly-Asp (RGD), epidermal growth factor (EGF) or bone morphogenetic protein-6 (BMP-6). The cell culture studies were performed under static conditions and then in rotating wall bioreactors. The cartilage tissue formation potential of cells, which were obtained from several sources, was investigated and then cell culture studies were performed in perfusion bioreactors. In the last part of the study, the environmental conditions of rotating wall bioreactors were simulated by computational fluid dynamics software, FLUENT.In the first part of the study, chitosan scaffolds, having different deacetylation degrees (DD) (75-85% and 85%) and compositions (2% and 3% w/v), were prepared by freeze-drying technique and in vitro cellular interactions were investigated. 85% deacetylated chitosan scaffolds in 2% (w/v) composition were found to be having ~100 µm pores with interconnected structure and having 0.917 N/mm2 elastic modulus. Cell culture studies, performed by L929 fibroblasts, resulted that DD strongly affected cell attachment and growth. Results concluded that chitosan scaffolds (85% DD and 2% composition) in which the highest specific growth rate (0.017h-1) was reached, were selected as the most appropriate scaffold for the rest of the study.In the next part of the study, chitosan scaffolds were functionalized with fibronectin sequence of RGD or EGF by covalent immobilization technique; with BMP-6 by embedding method. The results obtained from FTIR, fluorescence microscope observations and quantitative analysis showed that biosignal molecules were successfully immobilized to the chitosan scaffolds. ATDC5 murine chondrogenic cells were cultured in chitosan scaffolds for 28 days under static conditions. Cells cultured in RGD immobilized chitosan scaffolds showed the highest specific growth rate (0.049 h-1) after 24 h of incubation. According to the results of MTT analysis, considerable increase in cell proliferation was only detected in EGF-chitosan scaffolds. However, cells could not preserve their phenotypes in RGD and/or EGF immobilized chitosan scaffolds. After 4 weeks of incubation period, BMP-6 loaded chitosan scaffolds showed high glycosaminoglycan (GAG) contents(16.97 mg GAG/g dry scaffold). In addition, collagen II contents were found to be considerably higher (p=0.0003) than that of chitosan scaffolds. Results showed that BMP-6 loaded chitosan scaffolds supported chondrogenesis. However, the results obtained from morphological observations suggested hypertrophic differentiation of ATDC5 cells in the presence of BMP-6 under stationary conditions. The influence of mechanical stimulation appeared significantly with differentiated cells, cultured in rotating wall bioreactors, showing the effect of retaining their phenotypes without hypertrophy. Regarding to biochemical analysis of engineered constructs for GAG, collagen II and DNA assays, the results emphasize that dynamic culture conditions strongly supported early chondrogenesis.In the next part of this study, cellular responses of human cells obtained from different sources were assessed for chondrogenic potential in 3D culture. Embryonic stem cells derived from MSCs (ED1 MSCs) showed unique characteristics with preserved chondrogenic phenotype in chitosan scaffolds with regard to chondrogenesis, as determined by having high aggregan (AGC) and collagen II (Col II) but low collagen I (Col I) transcription levels. In order to investigate dynamic conditions in cell culture studies, ED1 MSCs in chitosan scaffolds were cultured in perfusion bioreactors. According to the biochemical analysis, GAG, DNA and collagen II contents of scaffolds were found to be increased in perfusion bioreactors. Moreover, all cartilage-related genes in cells showed higher transcription levels in perfusion bioreactors than in cells cultured under static conditions. Elastic modulus of cell-scaffold constructs cultured in perfusion bioreactors increased ~2 fold.According to simulation studies, which were performed by computational fluid dynamics (CFD) model in rotating wall bioreactors, the shear stress values on chitosan scaffolds were calculated as in the range of 0.276-0.755 dyne/cm2. Results showed that oxygen contuars in rotating wall bioreactors were only changed around the scaffolds. Therefore, it was concluded that using continuous system operating conditions in rotating wall bioreactors have been crucial advantages with regard to tissue formation.Key words: Cartilage tissue engineering, chitosan, RGD, EGF, BMP-6, rotating wall bioreactor, perfusion bioreactor, FLUENT, CFD.