Kerevitte (astacus leptodactylus) varsayılan voltaj kapılı sodyum kanalı α alt birimi geninin klonlanması ve kanal proteininin moleküler özelliklerinin belirlenmesi
Cloning putative voltage gated sodium channel alpha subunit gene in the crayfish (astacus leptodactylus) and molecular characterization of the channel protein
Yazar: ÇAĞIL COŞKUN
Danışman: PROF. DR. NUHAN PURALI
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Aksiyon potansiyelleri = Action potentials ; Astacus leptodactylus = Astacus leptodactylus ; Gen klonlama = Gene cloning ; Genler = Genes ; Kerevit = Crayfish ; Klonlama = Cloning ; Sodyum kanalları = Sodium channels

Özet:
Membran potansiyeli değişimleri etkisinde açılıp kapanarak sodyum akımını üreten voltaj kapılı sodyum kanalları, uyarılabilir hücrelerde bilgi akışının birim sinyali olan "Aksiyon Potansiyeli"' nin oluşmasında ve yayılmasında kritik bir role sahiptirler. Pek çok memeli ve omurgasız türü için sodyum kanalı ve ilişkili proteinleri kodlayan genler klonlanmış ve dizileri açığa çıkarılmıştır. Sinirbilim alanındaki çalışmalarda sıklıkla model deney hayvanı olarak kullanılan kerevitte sodyum kanalının varlığı bilinmesine rağmen ilgili kanal geni ve proteini hakkında herhangi bir bilgi henüz mevcut değildir. Bu tez çalışmasında, kerevit ganglion dokusundan ters transkripsiyon yöntemiyle sentezlenen cDNA örnekleri ve benzer genlerde korunmuş bölgeler esas alınarak tasarlanmış olan primerler kullanılarak, ilk olarak bazı gen kısımları, daha sonra spesifik primerlerle ara kısımlar ve nihai olarak da RACE yöntemiyle 3' ve 5' uçları da tamamlanarak, 5793 bç uzunluğunda, kerevite ait voltaj kapılı sodyum kanalını kodladığı varsayılan kanal geni ilk defa olarak tarafımızdan klonlanmıştır. Varsayılan genin kodlayıcı açık okuma çerçeve dizisi KT187402.1 kodu ile Genbank üzerinden erişime açılmıştır. Klonlanan gene ait nükleotit dizisinin karşılık geldiği protein dizisine çevrilmesiyle elde edilen 1930 aa' lık peptit dizisinin, diğer türlere ait bilinen sodyum kanallarına, filogenetik komşulukla ilişkili olarak yüksek oranda (% 69-82) benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca, elde edilen bu dizi sanal ortamda transmembran topoloji analizi ve hirofobisite testine tabi tutularak, klonlanan kısmın bazı yapısal ve moleküler özellikleri de belirlenmiştir. Bu bulgular değerlendirildiğinde, klonlanan genin, tipik bir voltaj kapılı sodyum kanalının sahip olduğu temel özelliklere sahip olduğu belirlenmiştir. Klonlanan genin dokuya özgü ifadesini belirlemek için yapılan kantitatif amplifikasyon çalışmaları sonucunda da, beklenildiği gibi bu genin en çok sinir dokusunda ifade olduğu gösterilmiştir.

Abstract:
Voltage gated sodium channels, opening and closing in response to membrane potential changes, have some essential roles in initiation and propogation of action potential which is the unit signal of information flow in excitable cells. Voltage gated sodium channels and associated protein coding genes have already been cloned in many mammalian and invertebrate species. In the crayfish, which have been used as a model in many types of neuroscience experiments, there is no data available about the sodium channel protein coding gene though, the presence of the channels have been shown by some functional studies. In the present thesis study; initially some gene fragments were cloned by using a set of degenerated primers, designed by considering the homology in the sodium channel genes of the closely related species, and cDNA samples, produced from the ganglia RNA extracts by a reverse transcription reaction. Later the flanking regions between the fragments have been cloned by using specific primers and finally the 5' and 3'end were completed by using a RACE method. We have firstly cloned a gene for the crayfish voltage gated sodium channel, having a size of 5793 bp. Open reading frame of putative coding gene is available in Genbank (Accession number: KT187402.1). Corresponding peptide sequence which was obtained by converting nucleotide sequence to amino acid sequence, was significantly similar (%69-82) to the protein sequences of other known sodium channels. Molecular and structural properties of the cloned region were revealed with the help of transmembrane topology analysis and hydrophobicity test. The results indicated that cloned gene have many fundamental properties of a typical voltage gated sodium channel. Tissue specific expression pattern of cloned gene were determined by a quantitative amplification experiment and as expected, the gene has highest expression level in ganglion tissue.