Asetilkolinesterazin farkli polimerik yüzeylere immobilize edilmesi
Immobilization of acetylcholinesterase on different polymeric surfaces
Yazar: KHADIJA KHALED M ALI
Danışman: PROF. DR. AYŞE OGAN ; DOÇ. DR. EMRAH ÇAKMAKÇI
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Asetilkolinesteraz (AChE; EC 3.1.1.7),  bir nörotransmitter olan asetil kolinin, kolin ve asetatata  dönüşümünü katalizleyen bir hidrolazdır ve yaşam için büyük bir önem taşır.   Pestisitlerde kullanılan etken maddeler kuvvetli AChE inhibitörleridir ve bu maddelerin eser miktarları bile canlılar için tehlike oluşturabilir. AChE inhibisyonu ölçülmesi, pestisitlerin tarımda çalışanlara ve çevreye verdiği zararı belirlemek için önemli bir biyobelirteç olarak kullanılmaktadır. Hızlı ve hassas AChE ölçümü için biyosensör tasarımının ilk ve en kritik basamağını, AChE enziminin bir elektrot yüzeyine immobilizasyonu oluşturmaktadır. Bu çalışmada AChE enzimini immobilize etmek için hızlı ve tek basamaklı bir yöntem geliştirilmesi amaçlanmıştır. Tasarlanan sistemde pirolün ve tiyol-en bileşenlerinin eş zamanlı polimerizasyonu ile elektriksel olarak iletken ve fonksiyonel gruplara sahip polimerik yüzeylerin elde edilmesi planlanmıştır.  İletken tiyol-en kürlenebilen için öncelikle pentaeritritoltetrakis (3merkaptopropiyonat) (4SH), 1,3,5-Trialil-1,3,5-triazin-4,6 (1H,3H,5H)-trionTTT) ve alil glisidil eter (AGE) ve pirol belirli oranlarda karıştırılıp fotobaşlatıcı ve UV ışığı eşliğinde polimerleştirilmesiyle elde edilen filmlere epoksi grupları üzerinden AChE immobilize edildi. Ayrıca ikinci bir yol olarak, bu reaksiyona girmemiş serbest epoksi grupları polietilenimin (PEI) ile modifiye edilip ardından glutaraldehit ile enzim immobilizasyonu gerçekleştirildi. İmmobilizasyon öncesi ve sonrası filmlerin Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) tekniği ile fonksiyonel grupları incelendi.  
İmmobilizasyon ile enzimin optimum sıcaklığı her iki polimer için serbest enzime göre 30°C'den 50°C'ye çıkarken, optimum pH değeri 8.0 den, 8.5'a çıkmıştır. Serbest enzim için Michaelis-Menten sabiti (Km) ve Vmaks değerleri sırasıyla 1.25 mM, 1.53 mM/dakika bulunurken, epoksi grupları taşıyan polimere immobilize edilen enzim için 0.182 mM, 0.416 mM/dakika, PEI modifiye polimer için 0.5 mM, 0.018 mM/dakika bulunmuştur. İmmobilize edilen enzim üzerine Mn+2,Mg+2,Cu+2,Zn+2,Ca+2 metallerinin etkisi araştırıldığında en fazla inhibisyona Cu+2'ın sebep olduğu anlaşılmıştır. 10 deneme sonrasında polimerik desteklere immobilize edilen enzim ilk aktivitesininin %51'ini korumuştur. 60 günün sonunda serbest enzim aktivitesini tamamen kaybederken, immobilize enzim aktivitesinin %29.1'ini kaybetmiştir. Sonuçlarımıza göre her iki polimer üzerine immobilize edilen enzimin kararlılığı ve dayanıklılığı arttığı görülmektedir. Ürettiğimiz bu polimerler sağlam, kullanışlı ve düşük maliyetli bir AChE biyosensör tasarımında kullanılabilir.

Abstract:
Acetylcholinesterase (AChE; EC 3.1.1.7) is a hydrolase which converts neurotransmitter; acetylcholine to choline and acetate and substantial for living organisms. Active ingredients found in pecticides are very effective acetylcholinesterase inhibitors and even trace amounts of these agents can represent a considerable hazard to health for living things. Measurement of AChE inhibition has been used  as a biomarker for the monitoring of exposure to pesticides in occupational and environmental health.  The initial and most critical step for the fabrication of AChE biosensors with superior accuracy and speed involves the immobilization of AChE enzyme onto an electrode surface. A rapid and single step procedure has been aimed in this study. In the designed system; with the simultenous polymerization of  pyrole and thiol-en complexes, synthesis of polymeric surfaces with cunductive and functional groups have been planned. Firstly, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) (4SH), 1,3,5-Triallyl-1,3,5-triazine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione (TTT) and  allyl glycidyl ether (AGE) and  pyrole were mixed in certain proportions  and  were  polymerized in conjunction with photoinitiator and UV light. AchE was immobilized on to the membranes through the epoxy functional groups.  Also as a second way, free epoxy groups which did not enter this reaction were modified with polyethyleneimine (PEI) and then the enzyme was  immobilized with glutaraldehyde. Functional groups of the films were elucidated in terms of its functional groups by fourier transform infrared spectroscopy (FTIR)  before and after the  immobilization process.  
The temperature resistance of the enzyme was enhanced and the optimal temperature increased from 30°C to 50 °C and the optimal pH increased from 8.0 to 8.5 by the immobilization process. The Michaelis–Menten constants (Km), and Vmax, for  the immobilized enzyme  bearing epoxy and PEI groups  were found as 1.25 mM/min, 1.53 mM/min and 0.018 mM/min respectively. The effect of metals; Mn+2,Mg+2,Cu+2,Zn+2,Ca+2  was examined on the activity of immobilized enzyme through epoxy and EPI groups  and Cu+2 caused a considerable inhibition for both.  The immobilized enzyme retained 51% of its original activity after 10 runs. The free enzyme lost its activity on the 60th day while the immobilized ones lost literally 29.1% of their original activity. According to our results; stability and  durability of immobilized AChE  increases for both of the supports.  In future  a robust, low-cost and beneficial AChE biosensor may be designed by using these as supporting materials.