Aşırı aktif mesanede mikroRNA ilişkisi ve klinik korelasyon
The role of microRNA in over active bladder: Relationship and clinical correlation
Yazar: KÜRŞAT KÜÇÜKER
Danışman: PROF. DR. ZAFER AYBEK
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Üroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Üroloji = Urology
Dizin: Mesane = Urinary bladder ; Mesane hastalıkları = Urinary bladder diseases ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; RNA = RNA

Özet:
Aşırı aktif mesane idrara çıkma sıklığında artma, ani sıkışma hissi, idrar kaçırma gibi semptomlar ile yaşam kalitesini olumsuz etkileyen bir hastalıktır. Semptomları net olarak açıklayacak herhangi bir lokal patolojik ya da metabolik nedenin olmaması ve etiyolojisinin net bir biçimde açıklanamaması sebebiyle tedavisi çeşitli ilaçlarla semptomları ortadan kaldırmaya yöneliktir. Epigenetik faktörlerin posttranskripsiyonel gen ekspresyonlarının regülasyonunda miRNA lar önemli görülmektedir. 
   Mesane kontraksiyonları esas olarak M3 reseptör alt grubu tarafından kontrol edilir. Guanin nükleotid değiştirici faktörler (GEF) ve Rho ilişkili kinaz (ROK/ROCK) proteinleri de işeme fizyolojisindeki kolinerjik yolakta yer alan önemli proteinlerdendir. Mesane düz kasının gevşemesi ise β3 alt tipinin esas rol aldığı adrenerjik reseptörler tarafından kontrol edilir. ADRB3 ise β3 reseptörünü kodlayan gendir. Çalışmamızda adrenerjik reseptör geni olan ADRB3 ve kolinerjik reseptör yolağında görevli ARHGEF10 ve ROCK2 genlerinin regülasyonunu etkileyebilecek miRNA'ların aşırı aktif mesaneyle ilişkisini tespit etmeyi amaçladık. Saptanılan miRNA'ların klinik bulgular ve tedavi yanıtları arasında bir korelasyonu olup olmadığını araştırmayı hedefledik. Ayrıca miRNA ların tanıda daha etkin kullanılabilirliğini değerlendirmeyi amaçladık.
   Araştırmaya aşırı aktif mesane tanısı alan 60 hasta ve kontrol grubu olarak sağlıklı 60 kişi örneklem olarak alınmıştır. Tüm hastalara türkçe valide edilmiş AAM sorgu formu doldurulmuştur, 1 aylık tedavi sonrasında hastalar kontrol AAM sorgu formu ile değerlendirilmiştir. Bu çalışmada nörojen mesaneli, mesane çıkım tıkanıklığı ve taş, tümör gibi üriner sistem hastalıkları veya enfeksiyonu olan hastalar dışlama kriteri olarak uygulanmıştır. Tüm hasta ve kontrol grubundaki sağlıklı gönüllülerden alınan venöz tam kan örneklerinden RNA izolasyonu ilgili ticari kit protokolüne göre uygulanmıştır. RNA izolasyonundan sonra, RT-PCR yöntemi ile miRNA ekspresyon tayini gerçekleştirilmiştir. Literatürde daha önce aşırı aktif mesaneli hastalarda az sayıda miRNA çalışması bulunmaktadır. Bu nedenle ADRB3, ARHGEF10, ROCK2 gen bölgelerini hedef alan miRNA'lar olarak, targetscan, mirtarbase, microrna.org, dianatools ve mirDB veri tabanlarında tarandı. Yüksek skora sahip en az dört veri tabanında da bulunan, bu genlerle ilişkisi en yüksek düzeyde olabilecek 15 miRNA seçildi. ADRB3 gen bölgesi için hsa-let-7a-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p; ROCK2 gen bölgesi için hsa-miR-138-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-300, hsa-miR-381-3p, hsa-miR-200b-3p; ARHGEF10 gen bölgesi için hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-520e, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-373-5p, hsa-miR-372-3p seçildiler.
   Çalışmada hasta grubunda ortalama boy ve ağırlık 156,67cm ve 73,97 kg, kontrol grubunda 158,78 cm ve 72,02 kg idi. Hasta grubu ortalama 56,48 yaştayken kontrol grubu 55,82 yaşındaydı. Hasta ve kontrol grubuyla boy, ağırlık, vücut kitle endeksi-body mass indeks (BMI) ve yaş ortalamasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki yoktu (p>0,05).  Yapılan genetik çalışmanın sonucunda hasta grubunda ADRB3 ile ilişkili olan hsa-let-7a-5p (6,8 (0,02-97,68)), hsa-let-7c-5p (23,1 (0,31-259,57)), hsa-let-7e-5p (7,42 (0,34-44,08)), hsa-let-7f-5p (40,93 (0,03-484,38)), hsa-let-7g-5p (17,75 (0,44-855,13)) genomları yüksek düzeyde anlamlılık içerecek şekilde yüksekti (p=0,0001). Aşırı aktif mesane tanısı olmayan sağlıklı grupta ARHGEF10, ROCK2 gen bölgelerini hedef alan miR-135b-5p (0,36 (0,04-79,58)), hsa-miR-300 (2,23 (0,14-11,63)), hsa-miR-372-3p (5,06 (0,1-49,77)), hsa-miR-373-5p (4,54 (0,02-61,18)), hsa-miR-381-3p (33,18 (5,16-446,39)), hsa-miR-520a-3p (0,7 (0,01-9,13)), miR-520d-3p (2,59 (0,03-72,86)), hsa-miR-520e (3,27 (0,14-19,53)) genomları yüksek düzeyde anlamlılık içerecek şekilde yüksekti (p=0,0001). Hasta ve kontrol grubunda anlamlı farklılık içermeyen hsa-miR-138-5p (p=0,557) ve hsa-miR-200b-3p (p=0,157) iki genomda fark yoktu. 
   Hasta grubunda antikolinerjik ajanlarla tedavi yöntemlerinin sonucunda, AAM skorunda %50 ve üzerinde düzelme görülen hastalarda iki miRNA da anlamlı farklılık tespit edilmiştir. Hsa-let-7f-5p , semptom düzelmesi sağlayan hastalarda 147,86 (0,06-484,38) iken düzelme olmayan grupta 32 (0,03-426,91) olarak görülmüştür (p=0,045) ve miR-135b-5p semptom düzelmesi sağlayan hastalarda 0,06 (0,03-0,21) iken düzelme olmayan grupta 0,3 (0,01-14,32) olarak görülmüştür (p=0,036). 
   AAM hayat kalitesini ciddi seviyelerde azaltabilen bir hastalıktır. Hastalığın etiyopatogenezinin tam anlaşılamamış olması nedeniyle günümüzde kullandığımız tedaviler yakınmaları azaltmaya yöneliktir. Özellikle antikolinerjik ilaçların hastaların bir kısmında çok az veya hiç fayda sağlamadığı görülmektedir. Bazı hastalar ise yan etkileri nedeniyle tedavisini bırakmaktadır. Biz çalışmamızda adrenerjik reseptör geni ADRB3 ile ilişkili miRNA larda hasta grubunda anlamlı şekilde yükseklik belirledik. Artmış miRNA seviyeleri, hedef genin çeşitli yollarla inhibisyonu ile AAM semptomlarının ortaya çıkmasına yol açabilir. Yine çalışmamıza göre kolinerjik yolakta görevli genler üzerinde etkili miRNA seviyelerinin kontrol grubuna göre az ölçülmesi, hedef gen üzerindeki inhibisyon etkinin azalmasında ve AAM semptomlarının görülmesinde etkili olabilir. Hedef gen ve miRNA lar arasındaki sinyal yolaklarının daha iyi anlaşılması spesifik tedavilerin bulunmasını sağlayabilir. Bunun için kapsamlı çalışmalara gerek vardır. AAM skorunda %50 ve üzeri azalma olan grupta, ADRB3 reseptör geni ile ilişkili hsa-let-7f-5p nin diğer gruba göre daha yüksek olması ve ROCK2 gen bölgesi ile ilişkili miR-135b-5p nin diğer gruba göre daha düşük olması hangi hastaların tedaviden daha fazla fayda göreceği konusunda da klinisyene ışık tutabilir. Bu durum hastaların gereksiz antikolinerjik kullanımı ile bunların yan etkilerine maruz kalmalarının önüne geçebilecek, kişiye özel daha özgül tedavi stratejilerinin ortaya çıkmasının, tedavi takibinde kullanılabilecek yeni biyobelirteçlerin keşfedilmesinin önünü açabilecektir. Ayrıca bu çalışmanın daha fazla hasta sayısıyla desteklenmesi ve diğer gen poliformizmleriyle karşılaştırılması gerekmektedir.

Anahtar Kelimeler: Aşırı aktif mesane, polimorfizm, mikroRNA

Abstract:
Hypothesis / aims of study: Overactive bladder (OAB) is a disease that negatively affects the quality of life and occurs symptoms such as increased frequency of urination, urgecy and urinary incontinence. The absence of any local pathological or metabolic cause to clearly explain the symptoms and treatment is aimed at eliminating symptoms with various drugs because of unclear etiology. At this stage, epigenetic factors of the mechanism of overactive bladder have been the subject of research. miRNAs are considered important in regulation of posttranscriptional gene expression of epigenetic factors. In our study, we aimed to determine the relationship between miRNAs, which may affect the regulation of ADRB3, the adrenergic pathway receptor gene, and ARHGEF10 and ROCK2 the cholinergic receptor pathway, genes, and and overactive bladder. We also investigated whether the detected miRNAs correlated with clinical findings and treatment responses. Additionnaly we aimed for the effective usability of miRNAs for diagnosis and treatment.
    Study design, materials and methods: This study was approved by local ethics committee to single-center clinical study. The study included 60 patients with overactive bladder and 60 healthy individuals as a control group. Detailed medical history, physical examinations, necessary laboratory tests and drug use history of all patients were obtained. In this study, patients with neurogenic bladder, bladder outlet obstruction and urinary system diseases or infections such as stones and tumors were applied as exclusion criteria. In healthy volunteers, those with pelvic surgery, any urinary complaints, or drug use were not included in the study. Turkish validated OAB questinnaire form was filled in all patients in the OAB group before and after treatment at the first month. Peripheral venous blood samples were taken from all patient and control groups and RNA isolation was performed according to the relevant commercial kit protocol. After RNA isolation, miRNA expression determination was performed by RT-PCR method. Bladder contractions are mainly controlled by the M3 receptor subgroup. Guanine nucleotide exchange factor (GEF) and Rho associated kinase (ROK / ROCK) proteins are also important proteins in the cholinergic pathway in voiding physiology. The relaxation of the bladder smooth muscle is controlled by adrenergic receptors, in which the subtype of β3 plays an important role and ADRB3 is the gene that encodes the β3 receptor. MiRNAs targeting ADRB3, ARHGEF10, ROCK2 gene regions were scanned in targetscan, mirtarbase, microrna.org, dianatools and mirDB databases. Found in four databases and have the highest level of association with these genes that 15 miRNAs were selected. For ADRB3 gene; hsa-let-7a-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, for ROCK2 gene; için hsa-miR-138-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-300, hsa-miR-381-3p, hsa-miR-200b-3p and for ARHGEF10 gene hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-520e, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-373-5p, hsa-miR-372-3p were determined. The data were analyzed using SPSS 25 version with Mann Whitney U test and MCNemar test for binary categorical comparison.
    Results: The patient group was on average 56.48 years old, while the control group was 55.82 years old. In the study, the average height and weight were 156.67 cm and 73.97 kg in the patient group, and 158.78 cm and 72.02 kg in the control group. As a result of the genetic study, the hsa-let-7a-5p (6,8 (0,02 - 97,68)), hsa-let-7c-5p (23,1 (0,31 - 259,57)), hsa-let-7e-5p (7,42 (0,34 - 44,08)), hsa-let-7f-5p (40,93 (0,03 - 484,38)), hsa-let-7g-5p (17,75 (0,44 - 855,13)) genomes associated with ADRB3 in the patient group were high with a high level of significance (p = 0.0001). miR-135b-5p (0,36 (0,04 - 79,58)), hsa-miR-300 (2,23 (0,14 - 11,63)), hsa-miR-372-3p (5,06 (0,1 - 49,77)), hsa-miR-373-5p (4,54 (0,02 - 61,18)), hsa-miR-381-3p (33,18 (5,16 - 446,39)), hsa-miR-520a-3p (0,7 (0,01 - 9,13)), miR-520d-3p (2,59 (0,03 - 72,86)), hsa-miR-520e (3,27 (0,14 - 19,53)) genomes targeting ARHGEF10 and ROCK2 gene regions were found statistically high in the control group (p = 0.0001). There was no significant difference in hsa-miR-138-5p (p=0,557) and hsa-miR-200b-3p (p=0,157) genomes in the patient and control groups. At the end of treatment with 1 month anticholinergic agents in the patient group, a significant difference was detected in both miRNAs (hsa-let-7f-5p and miR-135b-5p) in patients with a clinical improvement of 50% and above in the OAB score. hsa-let-7f-5p genome was 147.86 (0.06 - 484.38) in patients with symptom improvement, while it was 32 (0.03 - 426.91) in the group without improvement (p = 0.045). miR-135b-5p genome was found 0.06 (0.03 - 0.21) in patients providing symptom improvement, while it was 0.3 (0.01 - 14.32) in the group without improvement (p = 0.036).
    Interpretation of results: The patient group was on average 56.48 years old, while the control group was 55.82 years old. In the study, the average height and weight were 156.67 cm and 73.97 kg in the patient group, and 158.78 cm and 72.02 kg in the control group. As a result of the genetic study, the hsa-let-7a-5p (6,8 (0,02 - 97,68)), hsa-let-7c-5p (23,1 (0,31 - 259,57)), hsa-let-7e-5p (7,42 (0,34 - 44,08)), hsa-let-7f-5p (40,93 (0,03 - 484,38)), hsa-let-7g-5p (17,75 (0,44 - 855,13)) genomes associated with ADRB3 in the patient group were high with a high level of significance (p = 0.0001). miR-135b-5p (0,36 (0,04 - 79,58)), hsa-miR-300 (2,23 (0,14 - 11,63)), hsa-miR-372-3p (5,06 (0,1 - 49,77)), hsa-miR-373-5p (4,54 (0,02 - 61,18)), hsa-miR-381-3p (33,18 (5,16 - 446,39)), hsa-miR-520a-3p (0,7 (0,01 - 9,13)), miR-520d-3p (2,59 (0,03 - 72,86)), hsa-miR-520e (3,27 (0,14 - 19,53)) genomes targeting ARHGEF10 and ROCK2 gene regions were found statistically high in the control group (p = 0.0001). There was no significant difference in hsa-miR-138-5p (p=0,557) and hsa-miR-200b-3p (p=0,157) genomes in the patient and control groups. At the end of treatment with 1 month anticholinergic agents in the patient group, a significant difference was detected in both miRNAs (hsa-let-7f-5p and miR-135b-5p) in patients with a clinical improvement of 50% and above in the OAB score. hsa-let-7f-5p genome was 147.86 (0.06 - 484.38) in patients with symptom improvement, while it was 32 (0.03 - 426.91) in the group without improvement (p = 0.045). miR-135b-5p genome was found 0.06 (0.03 - 0.21) in patients providing symptom improvement, while it was 0.3 (0.01 - 14.32) in the group without improvement (p = 0.036).
    Concluding message:	OAB is a disease that can significantly reduce the quality of life and the treatment we use today is aimed at reducing the complaints because of the etiopathogenesis of the disease is not fully understood. Today, anticholinergic agents are the most preferred drugs in the medical treatment of OAB. In particular, it appears that anticholinergic drugs do not provide sufficient benefit in some patients. Some patients discontinue treatment due to their side effects. In our study, we determined a significant elevation in miRNAs associated with the adrenergic receptor gene ADRB3 in the patient group. Increased miRNA levels can lead to symptoms of OAB by inhibition of the target gene in several ways. Also, according to our study, miRNA levels effective on the genes in cholinergic pathway were found to be lower than the control group. This may be reducing the inhibition effect on the target gene and in the appearance of AAM symptoms. Better understanding of signaling pathways between the target gene and miRNAs can provide specific treatment strategies, and extensive studies are needed for this area. In the group with a decrease of 50% or more in the OAB score, the hRa-let-7f-5p associated with the ADRB3 receptor gene was higher than the other group and the miR-135b-5p associated with the ROCK2 gene region was lower than the other group. This can also assist the clinician in determining his treatment strategy that who will benefit more. Also, this may prevent patients from unnecessary anticholinergic use and exposure to their side effects, leading to the emergence of more specific treatment strategies and the discovery of new biomarkers that can be used for follow-up treatment. In addition, this study should be supported by more patients and compared with other gene polymorphisms.

Keywords:  Biochemistry, Detrusor Overactivity, Overactive Bladder, Urgency/Frequency, Molecular Biology