Betülinik asidin endometrial kanser hücrelerinde mTOR yolağı aracılı olası antikanser etkilerinin araştırılması
Investigation of possible anticancer effects of betulinic acid mediated by mTOR
Yazar: GÖZDE KORKUSUZ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SEMA SERTER KOÇOĞLU
Balıkesir Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Endometrial kanser dünya çapında en yaygın jinekolojik kanserlerden biridir ve her yıl dünya çapında tahminen 42.000 kadın bu kanserden hayatını kaybetmektedir. Günümüzde endometrial kanser için kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi gibi tedavi yöntemleri kullanılmaktadır. Şu anda kemoterapi için kullanılan ilaçlar, iyileşme oranını arttırmada sınırlı bir başarıya sahiptir. Bu nedenle endometrial kanser tedavisinde kullanılabilecek doğal, zararsız ve maliyeti düşük bileşiklere acil ihtiyaç vardır. Lupan tipi triterpen olan ve bitkiler âleminde yaygın olarak bulunan betülinik asit tümör büyümesini seçici olarak inhibe edebilmesi ve hücre apoptozunu indükleyebilmesi gibi özellikleriyle son yıllarda kanser tedavisi için dikkat çekmektedir. Bu çalışmanın amacı betülinik asitin insan endometrial kanser hücrelerinde mTOR yolu aracılı anti kanser etkilerinin araştırılmasıdır. Betülinik asitin Ishikawa hücre canlılığı üzerine etkisi CCK-8 yöntemi ile, apoptoz ve mTOR yolağında görevli olan genlerin ekspresyonu üzerine etkisi gerçek zamanlı PCR, mTOR yolağında görevli proteinlerin ekspresyonu üzerine etkisi immünohistokimya ve Western blot ile apoptoz üzerine etkileri ise Annexin V ile belirlenmiştir. Betülinik asitin Ishikawa hücrelerinde IC50 dozu 48. Saate 50 µM olarak belirlenmiştir. Betülinik asit uygulaması Ishikawa hücrelerinde Bcl2 (P=0.008)  ekspresyonunun anlamlı azalmasına ve kaspaz 8 (P=0.001)  ekspreyonunun artmasına neden olmuştur. Annexin V sonuçları ile betülinik asit uygulamasının Ishikawa hücrelerinde apoptozu tetiklediği desteklenmiştir. Betülinik asit uygulanan grupta apoptoza uğrayan hücrelerin oranı ortalama %22±3.23 (P=0.02) iken kontrol grubunda %2.31±0.2'dir.  mTOR ile ilişkili genlere bakıldığında betülinik asit, AKT1 (P=0.0001) ekspresyonunun anlamlı azalmasına RAPTOR (P=0.00002) ekspresyonunun ise anlamlı artmasına neden olmuştur. Betülinik asit uygulaması mTOR yolağında görevli proteinlerinin ekspresyonunda da anlamlı bir azalmaya yol açmıştır. Ishikawa hücrelerinde p-PI3K, p-AKT ve p-mTOR pozitif hücre yüzdesi kontrol grubunda sırasıyla, %89.39 ± 5.19, %74.84 ± 5.07 ve %82.02 ± 6.14'tür. BA uygulanan grupta bu değerler sırasıyla %49.12 ± 19.12 (P=0.002), %44.46 ± 7.39 (P<0.001) ve %53.70 ± 8.94 (P<0.001)'tür. Çalışma sonuçlarımıza göre betülinik asitin Ishikawa hücrelerinde mTOR sinyal yolağını hedef alarak hücre proliferasyonunu azalttığı ve apoptozu tetiklediği, ayrıca betülinik asit endometrial kanser tedavisinde potansiyel bir anti-kanser ajan olabileceği gösterilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Apoptoz, Betülinik asit, Ishikawa, mTOR

Abstract:
Endometrial cancer is one of the most common gynecological cancers worldwide, and an average of 42,000 women die each year. Chemotherapy, radiotherapy, and surgery are among the treatments available for endometrial cancer. Currently, drugs used for chemotherapy have had limited success in increasing the cure rate. Betulinic acid, a lupane-type triterpene widely found in the plant kingdom, has attracted attention for cancer treatment in recent years due to its ability to inhibit tumor growth and induce cell apoptosis selectively. The aim of this study is to investigate the mTOR pathway-mediated anti-cancer effects of betulinic acid in human endometrial cancer cells. The effect of betulinic acid on Ishikawa cell viability was determined by the CCK-8 method, the effect on the expression of genes involved in apoptosis and mTOR pathway, real-time PCR, the effect on the expression of proteins in the mTOR pathway, immunohistochemistry, and Western blot, and the effects on apoptosis with Annexin V. The IC50 dose of betulinic acid in Ishikawa cells was determined as 50 µM at 48th hour. Betulinic acid administration caused a significant decrease in Bcl2 (P=0.008) expression and increased caspase 8 (P=0.001) expression in Ishikawa cells. The results of Annexin V supported that betulinic acid administration triggered apoptosis in Ishikawa cells. The mean rate of apoptotic cells in the betulinic acid group was 22±3.23% (P=0.02), while it was 2.31±0.2% in the control group. Betulinic acid caused a significant decrease in the expression of AKT1 (P=0.0001) and a significant increase in the expression of RAPTOR (P=0.00002). Betulinic acid administration also significantly decreased the expression of proteins involved in the mTOR pathway. The percentage of p-PI3K, p-AKT, and p-mTOR positive cells in Ishikawa cells was 89.39 ± 5.19%, 74.84% ± 5.07, and 82.02% ± 6.14 in the control group, respectively. In the betulinic acid group, these values were 49.12 ± 19.12%(P=0.002), 44.46 ± 7.39% (P<0.001), and 53.70 ± 8.94% (P<0.001), respectively. The results of this study showed that betulinic acid decreased cell proliferation and triggered apoptosis by targeting mTOR signaling pathway in Ishikawa cells, and betulinic acid may be a potential anti-cancer agent in the treatment of endometrial cancer.

Keywords: Apoptosis, betulinic acid, Ishikawa, mTOR