Preimplantasyon embriyo gelişim sürecinde DNMT1 ve DNMT3A genlerinin rolleri
The roles of DNMT1 and dnmt3a genes during preimplantation embryo development
Yazar: FATMA UYSAL
Danışman: PROF. DR. ALP CAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Embriyo gelişimi = Embryonic development ; Embriyo implantasyonu = Embryo implantation ; Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Gen susması = Gene silencing ; Genler = Genes ; RNA = RNA

Özet:
Bir epigenetik mekanizma olan DNA metilasyonu, memelilerde ovogenez ve erken embriyo gelişim süreçlerinde önemli rol oynar. Ek olarak, DNA metilasyonu ovosit ve erken dönemdeki embriyonun gelişim süreçlerinde kritik rol oynayan genlerin transkripsiyonunda aktivatör veya baskılayıcı olarak rol alır. DNA metilasyonu, CpG adacıklarında ya da CpG adacığı olmayan alanlarda sitozin nükleotidinin beşinci karbon atomuna metil grubunun bağlanmasıyla gerçekleşir. Sürdürme ve de novo (yeni baştan) metilasyonu olmak üzere iki biçimde gerçekleşen bu mekanizmalar DNA metiltransferaz (DNMT) enzimleri tarafından katalizlenir. Memelilerde altı farklı DNMT enzimi (DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3C ve DNMT3L) tanımlanmıştır, DNMT1 sürdürme metilasyonundan sorumluyken DNMT3A de novo metilasyonunda görev alır. Bilindiği üzere, sürdürme ve de novo metilasyonu erken dönemdeki embriyonun gelişiminde gerçekleşir. Bu çalışmanın amacı Dnmt1 and Dnmt3a genlerinin susturulmasıyla preimplantasyon dönemindeki embriyonun gelişimi üzerine olan etkisini araştırmaktır. Bu amaçla fare embriyolarının in vitro ortamda gelişimi modeli üzerinde dört grup oluşturuldu; kontrol, Dnmt1 siRNA, Dnmt3a siRNA ve hedef olmayan geni içeren siRNA grubu. Dnmt genlerini susturmadaki başarı protein seviyesinde immünfloresan ve Western blot yöntemi yöntemiyle değerlendirildi. Dnmt1 ve Dnmt3a genlerini 1 hücreli aşamada susturduktan sonra, embriyonun gelişimi kapasitesi ve global DNA metilasyonu analizi immünfloresan yöntemle blastokist aşamasında analiz edildi. Fare embriyolarında Dnmt genlerini başarılı olarak susturuldu. Bu genlerin preimplantasyon dönemindeki embriyolarda kritik olduğunu saptandı. İlginç olarak; Dnmt1 siRNA uygulanan gruptaki blastokistlerde global DNA metilasyonu kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalmış ve Dnmt3a siRNA uygulanan gruptaki blastokistlerde ise kontrol grubuna göre anlamlı artış saptandı (P<0,05). Bu sonuçlar Dnmt genlerinin farede preimplantasyon dönemindeki embriyonun gelişimine katkı sağladığını göstermektedir ve bu genlerin insanda da önemli rol oynayıp oynamadığının araştırılması gerekmektedir.

Abstract:
DNA methylation is one of the epigenetic mechanisms and plays important roles during oogenesis and early embryo development in mammals. In addition, DNA methylation have important roles on transcriptional repression or activation of genes which critical during early oocyte and embryo development. DNA methylation is basically known as adding a methyl group to the fifth carbon atom of cytosine residues within cytosine-phosphate-guanine (CpG) and non-CpG dinucleotide sites. This mechanism is composed of two main processes: de novo methylation and maintenance methylation, both of which are catalyzed by specific DNA methyltransferase (DNMT) enzymes. To date, six different DNMT enzyme have been characterized in mammals defined as DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3C, and DNMT3L. While DNMT1 primarily functions in maintenance methylation, DNMT3A is essentially responsible for de novo methylation. As it is previously shown, either maintenance or de novo methylation processes appears in early embryo development. The aim of the present study was to investigate the role of Dnmt1 and Dnmt3a genes in preimplantation embryo development by knocking down Dnmt1 and Dnmt3a genes. For this purpose, the following groups were created in an in vitro mouse embryo model: control, Dnmt1 siRNA, Dnmt3a siRNA and non-targeted siRNA groups. Knockdown of Dnmt genes using siRNA was confirmed by analyzing the proteins using immunofluorescence and Western blot techniques. Following knockdown of Dnmt1 and Dnmt3a in one-cell mouse embryos, we analyzed the developmental competence of embryos and global DNA methylation levels by immunofluorescence in blastocyst stage. We found that both Dnmt genes were successfully knockeddown in mouse embryos and found out that these genes play critical roles in mouse preimplantation embryo development. Interestingly, we found that global DNA methylation level significantly decreased in Dnmt1 knockdown group while increased in Dnmt3a knockdown group (P <0,05). These results suggested that Dnmt genes could contribute to the mouse preimplantation embryo development; therefore, there is a need to study whether they also a play role in the human preimplantation embryos.