Recombinant production of surface receptors of SARS-COV-2 in CHOncells with new model UCOE designs
SARS-COV-2' ye ait yüzey reseptörlerinin yeni model UCOE tasarımıyla rekombinant olarakCHO hücrelerinde üretilmesi
Yazar: PINAR KÖSE
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖMER FARUK ANAKÖK
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Aşılar = Vaccines ; COVID 19 = COVID 19 ; Klonlama = Cloning ; SARS virüsü = SARS virus ; Transdüksiyon-genetik = Transduction-genetic ; Transfeksiyon = Transfection

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19)'a karşı rekombinant protein aşısı geliştirilmektedir. Bu bağlamda tasarlanan projede hedeflenen antijenik proteinlerin memeli ekspresyon sisteminde Evrensel Kromatin Açıcı Elementler (UCOE – Ubiquitous Chromatin Opening Elements) teknolojisi ile proteinlerin üretimi, saf olarak elde edilmesi ve üretilen proteinlerin antijenik özelliklerinin ve aşı olarak kullanılma kapasitelerinin karşılaştırılması amaçlanmaktadır. 
Yöntem: Mevcut yeni nesil UCOE modelleri ve kontrol grubu olarak kullanılacak standard plazmit vektörleri tedarik edildi. Ardından yeterli stok üretimi ve klonlama deneyleri için PCR yöntemi ile ilgili sekanslar çoğaltıldı. Jel elektroforezinde yürütülerek plazmit vektördeki doğrulaması yapıldı. 293T hücrelerinin tranfeksiyonu ise antijen genlerini taşıyan klon plazmitler ve lentiviral vektörlerin üretimi için lenti virüs ünitelerinin genetik bilgisini taşıyan plazmitler ile yapıldı. Bu aşamadan sonra 293T hücreleri antijen genlerini taşıyan lentiviral vektörleri üretti. Bu vektörlerin hasatı ise 48. ve 72. saatte gerçekleştirildi. Hasatı yapılan vektörlerin mikrolitrede ve mililitredeki miktarını hesaplamak için flow sitometri ile titre hesabı yapıldı. Daha sonra uygun miktarda lentiviral vektörler ile CHO hücrelerinin transdüksiyonu gerçekleştirildi. İlgili besiyerinden hedeflenen proteinlerin izolasyonları ve saflaştırmaları HPLC ve Q-TOF yöntemleriyle yapıldı. 
Bulgular: Hedef antijen genleri PCR ile verimli bir şekilde çoğaltıldı ve agaroz jel elektroforezi yöntemi ile görüntülendi. PCR ürünleri taşıdıkları restriksiyon enzimi ile kesildikten sonra UCOEs plazmitlere entegre olup olmadığı farklı restriksyon enzimleriyle kesimi ile teyit edildi. Daha sonra yeterli miktarda üretilen klon UCOEs ve lentivirüs plazmitleri ile 293T hücreleri transfekte edildi. 293T hücre grupları arasında yeni nesil UCOEs plazmitlerini alan gruplarda daha verimli lentiviral vektör üretiminin olduğu saptanmıştır. Ayrıca yeni nesil UCOEs plazmitlerini taşıyan lv'ler ile transdükte edilen CHO hücrelerinin kültür besiyerlerinde standart UCOEs plazmitlerini taşıyanlara nazaran daha yüksek miktarda antijen üretiminin olduğu HPLC ve Q-Tof yöntemi ile tespit edilmiştir.
Sonuç: COVID-19'a karşı birçok çalışma devam etse de UCOE teknolojisi ile yapılan rekombinant protein üretimi literatürde yer alan diğer yöntemlere göre daha verimli elde edilebildiği görülmüştür. Ayrıca bu yöntem ile ürtilen proteinik yapılarda istenmeyen post translasyonel modifikasyonların önüne geçilmiştir.

Abstract:
Purpose: In this thesis, a recombinant protein vaccine is being developed against coronavirus disease 2019 (COVID-19). In this context, the aim of the project designed in this project is to produce proteins with the Universal Chromatin Opening Elements (UCOE - Ubiquitous Chromatin Opening Elements) technology in the mammalian expression system of the targeted antigenic proteins, to obtain them in pure form and to compare the antigenic properties of the produced proteins and their capacity to be used as vaccines.
Methods: Existing new-generation UCOE models and standard plasmid vectors to be used as control group were provided. Then, the sequences related to the PCR method were amplified for sufficient stock generation and cloning experiments. Verification in the plasmid vector was carried out in gel electrophoresis. Transfection of 293T cells was performed with clone plasmids carrying antigen genes and plasmids carrying genetic information of lentivirus units for the production of lentiviral vectors. Afterwards, 293T cells produced lentiviral vectors carrying antigen genes. Harvesting of these vectors was carried out during 48th and 72nd hours. Titrate calculation was carried out by flow cytometry to calculate the quantity of harvested vectors in microliter and milliliter. Afterwards, CHO cells were transduced with appropriate quantity of lentiviral vectors. Isolation and purification of targeted proteins from the relevant medium were performed by HPLC and Q-TOF methods. 
Findings: Targeted antigen genes were efficiently amplified by PCR and visualized by agarose gel electrophoresis. After the PCR products were digested with the restriction enzyme they carry, it was confirmed whether they were integrated into the UCOE plasmids or not by cutting with different restriction enzymes. Then, 293T cells were transfected with clone UCOEs and lentivirus plasmids were produced sufficiently. Among the 293T cell groups, it was determined that there was more efficient lentiviral vector production in the groups that received the new generation UCOEs plasmids. In addition, it was determined by HPLC and Q-Tof method that CHO cells transduced with LVs carrying new generation UCOEs plasmids had higher antigen production in culture media than those carrying standard UCOEs plasmids.
Results: Although there are many ongoing studies for COVID-19, it has been seen that recombinant protein production with UCOE technology can be obtained more efficiently than other methods in the literature. In addition, undesirable post-translational modifications in the protein structures produced by this method are prevented.