Eritrosit içi okside, redükte ve toplam glutatyon miktarını ölçen yeni kolorimetrik bir yöntem geliştirilmesi
Development of a new colorimetric method to measure oxidized, reduced and total glutathione levels of intraerythrocyte
Yazar: MURAT ALIŞIK
Danışman: PROF. DR. ÖZCAN EREL
Sağlık Bakanlığı / Ankara Atatürk Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Oksijen taşıyan hücreler olması ve hemoglobin içermeleri nedeniyle eritrositler diğer somatik hücrelere kıyasla daha fazla oksidatif strese maruz kalırlar. Bunun yanında eritrositler güçlü antioksidan sistemle donatılmıştır. Eritrosit içinin en önemli antioksidanı bir tripeptit olan glutatyondur ve yapısında bulunan sistein aminoasidi sayesinde tiyol grubu içerir. Okside glutatyon seviyesi oksidatif durumu gösterirken, redükte glutatyon seviyesi antioksidan kapasiteyi göstermektedir. Okside ve redükte glutatyon düzeylerini belirlemek için günümüze kadar birçok yöntem tariflenmiştir. Tariflenmiş spektrofotometrik yöntemler reaktiflerinde enzim ve koenzim kullanan pahalı yöntemlerdir. Bu tez çalışmasında eritrosit içi okside ve redükte glutatyon düzeylerini ölçen, yeni, ucuz, kolay uygulanabilir, yüksek doğruluğu, tekrarlanabilirliği ve kesinliği olan bir spektrofotometrik yöntem geliştirilmiştir. 
Yeni geliştirilen yöntem iki aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada ortamdaki redükte glutatyon düzeyleri belirlenmiş ve nativ glutatyon olarak ifade edilmiştir. Sonrasında ise okside glutatyonlar sodyum borohidrat ile GSH'a indirgenerek toplam glutatyon düzeyi belirlenmiştir. Toplam glutatyon ile nativ glutatyonun farkının yarısı okside glutatyon olarak verilmiştir.
Yeni geliştirilen yöntemin 0 ile 3000 µmol/L arasında doğrusal olduğu görüldü (r2=0,999). Geliştirilen yöntemde bulunan parametrelerin geri kazanım yüzdeleri %93,1 ile 105,9 arasındaydı. Toplam presizyonlar toplam glutatyon, nativ glutatyon ve okside glutatyon için sırasıyla %2,70, %1,02 ve %6,65'ti. Ticari spektrofotometrik yöntem ile yeni geliştirilen yöntemdeki toplam glutatyon, nativ glutatyon ve okside glutatyon parametreleri için korelasyonlar sırası ile 0,901 (p<0,001), 0,913 (p<0,001) ve 0,603 (p<0,001) idi. Diyabetik hasta grubunda ölçülen nativ glutatyon düzeyleri anlamlı olarak düşük iken, okside glutatyon düzeyleri anlamlı olarak yüksekti (p<0,05). HbA1c düzeyleri ile nativ glutatyon düzeyleri arasında negatif korelasyon var iken okside glutatyon ile pozitif korelasyon vardı (p<0,05). 
Sonuç olarak, yüksek doğruluk, kesinlik ve tekrarlanabilirlik niteliklerine sahip olan bu yöntemin daha kolay uygulanabilir olması nedeniyle, eritrosit içinin oksidan ve antioksidan düzeylerindeki değişimler kolaylıkla belirlenebilir.

Abstract:
Due to the its oxygen carrying function and hemoglobin ingredient, erythrocytes are exposed to oxidative stress more than other somatic cells. However, erythrocytes are covered with a powerful antioxidant system. The most important antioxidant for erythrocytes is glutathione, which is a tripeptide containing thiol group comes from its cysteine moiety. While oxidized glutathione levels show oxidative state, reduced glutathione levels present antioxidant capacity. So far, various methods have been described to determine the levels of oxidized and reduced glutathione. All of the described spectrophotometric methods are using enzymes and coenzymes, and they are expensive methods. In this thesis; a new, inexpensive, easily applicable, spectrophotometric method with high accuracy, reproducibility and precision was developed to measure intra-erythrocyte oxidized and reduced glutathione levels. 
The newly developed method consists of two steps. In the first step, the levels of reduced glutathione in the sample were determined and expressed as native glutathione. Subsequently, the total glutathione levels were determined by reducing the oxidized glutathione with sodium borohydride. Half of the difference between total glutathione and native glutathione is given as an oxidized glutathione.
New method was linear between 0 and 3000 μmol/L (r2 = 0.999). The percentages of recovery of the parameters of developed method were between 93.1% and 105.9%. The total precisions of the total glutathione, native glutathione and oxidized glutathione were 2.70%, 1.02%, and 6.65%; respectively. The correlations of total glutatione, native glutathione and oxidized glutathione between commercial spectrophotometric method and the newly developed method were 0.901 (p<0.001), 0.913 (p<0.001) and 0.603 (p<0.001); respectively. Native glutathione levels were significantly lower in the diabetic patients, while oxidized glutathione levels were significantly higher (p<0.05). There was a negative correlation between HbA1c levels and native glutathione levels, while there was a positive correlation with oxidative glutathione (p<0.05).
In conclusion, because of easy to apply of this method with high accuracy, precision and reproducibility, it is expected that changes in oxidant antioxidant levels of intra-erythrocytes will be readily detectable.