+4 °C ve +38 °C taşıma ve depolama sıcaklıklarında köpek oositlerinin in vitro olgunlaştırılmasına BSA ve FCS'nin etkileri
Effects of BSA and FCs on in vitro maturation of bitch oocytes at transportation and storage temperatures of +4 Cº and +38 Cº
Yazar: MEHMET ÇETİNKAYA
Danışman: PROF. DR. HAKAN SAĞIRKAYA
Bursa Uludağ Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2020
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Köpekler = Dogs ; Olgunlaştırma = Ripening ; Oositler = Oocytes ; Over = Ovary ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu çalışma iki temel bölümden oluşmaktadır. İlk bölümde ovariohisterektomi yöntemiyle elde edilen köpek ovaryumlarının +4 °C ve +38,5 °C taşıma sıcaklığında transportunun maturasyona üzerine etkilerinin neler olduğu hedeflenmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde ise köpek oositlerinin in vitro olgunlaştırılması için medyumuna katılan %0,3 BSA ve % 5 FCS protein kaynaklarının etkilerinin karşılaştırılması amacıyla planlanmıştır.
 Ovario-histerektomi yapılmış köpeklerden alınan ovaryum çiftlerinden biri +4 °C'da diğeri +38,5 °C'da  antibiyotik katkılı (Gentamisin Sülfat, 50 mg/ml) PBS solüsyonunu içeren iki farklı kab içersinde 2 saat süresinde laboratuvar ortamına getirilmiştir. Ovaryumlar çevresindeki fazla yağ ve dokudan arındırıldıktan sonra yıkanıp (+38 ºC) PBS içine konuldu. Slicing yöntemiyle elde edilen oositler yıkama petrilerine aktarıldı. In vitro olgunlaştırma için ayrılacak oositlerin seçiminde sağlam bir zona pellusida, en az 3-4 sıra kumulus hücresi, homojen ve zona içini dolduran koyu renkli vitellüs varlığı kriterleri göz önünde bulunarak oosit seçimleri yapıldı.
 Her iki ısı derecesi içinde üçerli çalışma grupları en az iki saat öncesinden hazırlanmış, üzeri mineral yağ (Sigma) ile örtülmüş, antibiyotik katılmış  (Gentamisin Sülfat, 50 mg/ml) +38 °C ve %5 CO2 'liinkübatör ortamında bekletilmiş bulunan altı farklı olgunlaşma medyumuna   (Hepes Modifikasyonlu TCM 199, Sigma M-2520) aktarılmıştır.
+4 ºC Taşıma Sıcaklığı İçin;
1. Grup (Kontrol):TCM 199+2,2 gr/lt NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol),
2. Grup (BSA):TCM199+% 0,3 BSA (Fraction V, Sigma A8806)+ 2,2 gr/lt  NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol),
3. Grup(FCS):TCM199+%5 FCS (Fetal Calf Serum Biochrom S 0115)+ 2,2 gr/lt NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol)
+38,5 ºC Taşıma Sıcaklığı İçin;
4. Grup (Kontrol):TCM 199+2,2 gr/lt  NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol),
5. Grup (BSA):TCM199+% 0,3 BSA (Fraction V ,Sigma A8806)+ 2,2 gr/lt  NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol),
6. Grup (FCS):TCM199+%5 FCS (Fetal Calf Serum Biochrom S 0115)+ 2,2 gr/lt  NaHCO3+0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7,3; Ozmalite:288 mOsmol)  
Daha sonra oositler Germinal Vezikül (GV) aşamasından MII aşamasına gelebilmesi için % 5 CO2 ve % 100'e yakın nemin sağlandığı  +38,5 ºC'lık inkübatör ortamında 72 saat olgunlaştırıldı. Olgunlaşma süresinin sonunda oositlerin kumulüs hücreleri vorteks kullanılarak mekanik olarak uzaklaştırıldı. Ardından % 0,7 lik KCl solüsyonunda 4-5 dakika bekletildikten sonra lam-lamel arasında sıkıştırılarak sabitlendi. Hoechst 33258 solüsyonu ile boyandı. Oositlerin değerlendirilmesinde Ki Kare testi kullanıldı.  P<0,05 düzeyinin istatistiksel fark bakımından önemli olduğu kabul edildi. Gruplar arasında bir tek (M II)  aşamasını tamamlamış olanların istatiksel karşılaştırılmasında; +4 °C'da  ki BSA  grubu diğer kontrol gruplarından +4 °C ve +38 °C daki FCS gruplarından daha üstün olduğu belirlenmiştir (p<0,05). 

      Sonuç olarak, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar doğrultusunda, köpek oositlerinin in vitro olgunlaşma çalışmalarında medyum proteininin katılmasının gerekli olduğu; olgunlaşmayı destekleyici olarak protein kaynağı olarak % 0,3 BSA 'nın, % 5 FCS' a göre ve +4 °C 'deki taşıma sıcaklığının + 38,5 °C 'da kinden daha etkili olduğu söylenebilir.

Anahtar Kelimeler: Dişi köpek, Oosit, In vitro Olgunlaşma, BSA, FCS, Taşıma sıcaklıkları

Abstract:
This study consists of two basic parts. In the first chapter, it is aimed to determine the effects of transport of ovaries obtained by ovariohystectomy method on maturation at transport temperature of +4 ° C and +38.5 ° C. In the second part of the study, it was planned to compare the effects of 0.3% BSA and 5% FCS protein sources, which are added to the medium for in vitro maturation of dog oocytes.
 One of the ovarian pairs taken from ovario-hysterectomized dogs was brought to the laboratory environment in two different containers containing antibiotics (Gentamicin Sulfate, 50 mg / ml) PBS solution at +4 ° C and the other at +38.5 ° C. After removing the excess oil and tissue around the ovaries, they were washed (+38 ºC) and placed in PBS. Oocytes obtained by slicing method were transferred to washing petrils. In the selection of oocytes to be separated for in vitro maturation, oocyte selections were made considering a solid shingles pellucida, at least 3-4 rows of sandulus cells, homogeneous and dark colored vitellus presence filling the shingles.
Within two temperatures, three working groups were prepared at least two hours before, covered with mineral oil (Sigma), added antibiotics (Gentamycin Sulfate, 50 mg / ml) +38 ° C and 5% CO2 in a liincurator environment. transferred to ripening medium (TCM 199 with Hepes Modification, Sigma M-2520).
For +4 ºC Transport Temperature;
1st Group (Control): TCM 199 + 2,2 gr / lt NaHCO3 + 0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7.3; Osmality: 288 mOsmol),
2nd Group (BSA): TCM199 + 0.3% BSA (Fraction V, Sigma A8806) + 2.2 gr / lt NaHCO3 + 0.23 mM Na Pyruvate (pH: 7.3; Osmality: 288 mOsmol),
Group 3 (FCS): TCM199 + 5% FCS (Fetal Calf Serum Biochrom S 0115) + 2.2 gr / lt NaHCO3 + 0.23 mM Na Pyruvate (pH: 7.3; Osmality: 288 mOsmol)
For +38.5 ºC Transport Temperature;
Group 4 (Control): TCM 199 + 2,2 gr / lt NaHCO3 + 0,23 mM Na Pyruvate (pH: 7.3; Osmality: 288 mOsmol),
5. Group (BSA): TCM199 + 0.3% BSA (Fraction V, Sigma A8806) + 2.2 gr / lt NaHCO3 + 0.23 mM Na Pyruvate (pH: 7.3; Osmality: 288 mOsmol),
Group 6 (FCS): TCM199 + 5% FCS (Fetal Calf Serum Biochrom S 0115) + 2.2 g / lt NaHCO3 + 0.23 mM Na Pyruvate (pH: 7.3; Osmality: 288 mOsmol)
Then, oocytes were matured for 72 hours in a +38.5 ºC incubator environment where 5% CO2 and 100% humidity was provided in order to reach the MII stage from the Germinal Vesicle (GV) stage. At the end of the maturation period, the sand cells of the oocytes were mechanically removed using vortex. Then it was immersed in 0.7% KCl solution for 4-5 minutes and then it was fixed by squeezing between the coverslip. It was stained with Hoechst 33258 solution. Chi Square test was used to evaluate oocytes. P <0.05 level was accepted to be important in terms of statistical difference. 

In statistical comparison of those who completed a single (M II) stage between the groups; The BSA group at +4 ° C was determined to be superior to the other control groups than the FCS groups at +4 ° C and +38 ° C (p <0.05In conclusion, in line with the results obtained in the study, it is necessary to add the medium protein in the in vitro maturation studies of dog oocytes; It can be said that 0.3% BSA as protein source as a supplement to maturation is more effective than + 38.5 ° C compared to 5% FCS and transportation temperature at +4 ° C. 

Keywords: Female dog, Oocyte, In vitro Maturation, BSA, FCS, Transport temperatures