Ekstrasellüler genom materyallerinin meme kanseri üzerine etkisi
The effect of extracellular genome materials on breast cancer
Yazar: BÜŞRA YAŞA ÇEVİK
Danışman: PROF. DR. SELÇUK SÖZER TOKDEMİR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Meme kanseri =

Özet:
Amaç: Meme kanseri, her yıl 2 milyondan fazla yeni vaka ile kadınlar arasında en yaygın görülen kanser türüdür. Kanser hücrelerinde gözlemlenen genomik kararsızlık kanserin ilerlemesinde kritik bir rol oynar. Kanser hücrelerinin kan ve lenfatik sistemler aracılığıyla sağlıklı hücrelere yayılıp onları etkileme süreci metastaz olarak adlandırılır. Bu süreçte, kanser hücreleri tarafından salgılanan ekstraselüler veziküller ve hücre dışı DNA (hdDNA) gibi ekstrasellüler genom materyallerin (EGM), sağlıklı hücrelerde genomik kararsızlık oluşturma potansiyeli ve metastazdaki rolü büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu bağlamda, hipotezimiz "Meme kanseri hücrelerinden kaynaklanan EGM'lerin genometastaz mekanizmasıyla sağlıklı hücrelerde genomik kararsızlığı tetiklediği" yönündedir.
Yöntem: Çalışmamızda, meme kanseri MCF-7, SKBR3 ve MDA-MB231 hücre hatları ile Luminal A, HER2 pozitif (HER2+) ve Üçlü Negatif alt gruplara ait hastaların ameliyat öncesi ve sonrası perifer kan örnekleri ile ameliyat sonrası alınan doku örneklerinden izole edilen EGM'ler kullanılarak bir in-vitro sağlıklı hücre-kanserleşme modeli oluşturulmuştur. Çalışmada, Luminal A tanısı almış 13 hasta, HER2(+) tanısı almış 5 hasta ve Üçlü negatif tanısı almış 2 hasta kullanılmıştır.  Bu kurguda, hücre hatlarından ve hastalardan elde edilen EGM'ler için optimum miktar tespit edilmiş ve akabinde eksozom (5 mg/ml), hdDNA (2 ng/µl) ve toplam serum (100 µl) sağlıklı meme epitel hücre hattı MCF10A (5x104 hücre) üzerine pasif transfekte edilmiş ve transfekte edilmemiş kontrol MCF10A hücreleriyle kıyaslanmıştır. Çalışma kapsamında, apoptoz tayini, hücre göçünü değerlendirmek için migrasyon analizi, iki katına çıkma süresi ölçümleri, mRNA transkriptom analizi ve bu analizlerden elde edilen verilere dayanarak seçilen genomik kararsızlıkla ilişkili genlerin anlatım deneyleri gerçekleştirilmiştir.
Bulgular: İn-vitro deneylerde hücre hatlarından ve hastalardan elde edilen EGM'lerin MCF10A hücrelerinde kontrol hücrelerine kıyasla apoptoz ve migrasyon seviyelerinde anlamlı bir artışa yol açtığı gözlemlenmiştir (p<0.001, p<0.001). Ancak, hasta EGM'lerinin oluşturduğu apoptoz yanıtta anlamlı değişim görülmemiştir (p>0.91). Ayrıca, hücre hatlarından elde edilen eksozom ve total serum ile MDA-MB231 hücre hattından elde edilen hdDNA'nın ve hasta örneklerinden elde edilen eksozom ve total serumun pasif transfeksiyonu, MCF10A hücrelerinde ikiye katlanma süresinin anlamlı şekilde azaldığını ortaya koymuştur (p<0.05). Genomik kararsızlık genleri ile ilgili hücre hatları EGM ile pasif olarak transfekte edilen MCF10A hücrelerinde yapılan araştırmada EXO1, RASSF1, POLQ, SUMO1, PIM1, XRCC1 ve CHFR seçilmiş ve bu genlerin hastalardan elde edilen EGM'ler ile doğrulaması yapılmıştır. Buna göre, hasta Luminal A kaynaklı eksozom ile EXO1, hasta Luminal A kaynaklı hdDNA ile RASSF1 ve hasta üçlü negatif kaynaklı hdDNA ile de CHFR anlatımında anlamlı bir artış tespit edilmiştir (p<0.05). Diğer seçilen genler ve EGM alt grup eşleşmeleri ise istatistiksel olarak anlamlı sonuç vermemiştir. 
Sonuç: Bu bulgular, EGM'lerin genomik kararsızlık ve sağlıklı hücre davranışları üzerindeki alt grup-spesifik etkilerini, ameliyat öncesi ve sonrası EGM'lerin oluşturduğu farklılıkları ortaya koymaktadır. Özellikle Luminal A meme kanseri alt gruplarında belirlenen genlerin biyobelirteç olarak potansiyel rollerine ve EGM'lerin terapötik hedefler olarak değerlendirilmesine ilişkin güçlü kanıtlar sunmaktadır. 
Anahtar Kelimeler: Meme Kanseri, Eksozom, hücre-dışı DNA, Pasif Transfeksiyon, Genomik Kararsızlık
Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi (BAP) ve Türkiye Sağlık Enstitüleri Başkanlığı (TUSEB) tarafından desteklenmiştir. (BAP Proje No: 38195) (TUSEB Proje No:27803)

Abstract:
Objektive: Breast cancer is the most common type of cancer among women, with over 2 million new cases diagnosed annually. Genomic instability observed in cancer cells plays a critical role in cancer progression. The process by which cancer cells spread through the blood and lymphatic systems to healthy cells is referred to as metastasis. In this process, extracellular genomic materials (EGMs) such as extracellular vesicles secreted by cancer cells and cell-free DNA (cfDNA) have the potential to induce genomic instability in healthy cells; however, their role in metastasis remains largely unknown. In this context, our hypothesis is that "EGMs derived from breast cancer cells trigger genomic instability in healthy cells through the genometastasis mechanism.
Methods: In our study, an in vitro healthy cell-cancer model was created using pre- and postoperative peripheral blood samples and EGMs isolated from postoperative tissue samples of patients with breast cancer MCF-7, SKBR3 and MDA-MB231 cell lines and Luminal A, HER2 positive (HER2+) and Triple Negative subgroups. The study included 13 patients diagnosed with Luminal A, 5 patients with HER2(+), and 2 patients with Triple-Negative breast cancer. In this framework, the optimal amounts of EGMs obtained from cell lines and patients were determined. Subsequently, exosomes (5 mg/ml), cfDNA (2 ng/µl), and total serum (100 µl) were passively transfected onto a healthy breast epithelial cell line, MCF10A (5x10⁴ cells), and compared with non-transfected control MCF10A cells. The study included apoptosis assays, migration analyses to evaluate cell motility, doubling time measurements, mRNA transcriptome analysis, and expression studies of genes associated with genomic instability, selected based on the transcriptome data.
Results: In in vitro experiments, EGMs obtained from cell lines and patients were observed to cause a significant increase in apoptosis and migration levels in MCF10A cells compared to control cells (p<0.001 for both). However, no significant change was observed in the apoptosis response induced by patient-derived EGMs (p>0.91). Furthermore, the passive transfection of exosomes and total serum obtained from cell lines, hdDNA from the MDA-MB231 cell line, and exosomes and total serum from patient samples significantly reduced the doubling time of MCF10A cells (p<0.05). In the investigation of genomic instability-related genes in MCF10A cells passively transfected with cell line-derived EGMs, the following genes were selected for further analysis: EXO1, RASSF1, POLQ, SUMO1, PIM1, XRCC1, and CHFR. Validation with patient-derived EGMs revealed significant increases in the expression of EXO1 with Luminal A-derived exosomes, RASSF1 with Luminal A-derived hdDNA, and CHFR with Triple-Negative-derived hdDNA (p<0.05). Other selected genes and EGM subgroup pairings did not yield statistically significant results.
Conclusion: These findings reveal the subgroup-specific effects of EGMs on genomic instability and healthy cell behaviors, as well as the differences induced by pre- and post-surgery EGMs. Notably, they provide strong evidence regarding the potential roles of the identified genes in Luminal A breast cancer subgroups as biomarkers and highlight the therapeutic potential of EGMs as targets for intervention.
Key Words: Exosome, Cellfree DNA, Breast Cancer, Passive Transfection, Genomic Instability
This study was supported by Istanbul University Scientific Research Project Foundation (BAP) and Health Institutes of Türkiye (TUSEB). (BAP Project No: 38195) (TUSEB Project No: 27803)