Farelerde oluşturulan enflamatuvar hiperaljezi modelinde dokozahekzaenoik asidin traf6/IKK/NF-KB yolu üzerindeki etkisinin antienflamatuvar NLRX1 ile ilişkilendirilerek araştırılması
Investigation of the effect of docosahexaenoic acid on traf6/IKK/NF-KB pathway in relation to antiinflammatory NLRX1 in lipopolysaccharide-induced inflammatory hyperalgesia model in mice
Yazar: DİLŞAH EZGİ YILMAZ
Danışman: PROF. DR. BAHAR TUNÇTAN
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antiinflamatuar ajanlar = Anti inflammatory agents ; Dokosahekzaenoik asitler = Docosahexaenoic acids ; Fareler = Mice ; Hiperestezi = Hyperesthesia ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Nükleer faktör-kappa B = Nuclear factor-kappa B

Özet:
Bu tezde, lipopolisakkarit (LPS) ile farelerde oluşturulan enflamatuvar hiperaljezi modelinde
dokozahekzaenoik asit (DHA)'nın tümör nekrozlaştırıcı faktör reseptörü ile ilişkili faktör (tumor
necrosis factor receptor-associated factor; TRAF) 6/κB inhibitörü (inhibitor of κB; IκB) kinaz
(IκB kinase; IKK)/IκB-α/nükleer faktör-κB (nuclear factor-κB; NF-κB) sinyal ileti yolu üzerindeki etkisi, antienflamatuvar nükleotit bağlayıcı oligomerizasyon alanı (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor; NLR) X1 (NLRX1) ile ilişkilendirilerek araştırılmıştır. Deneylerde 7 gruba ayrılan fareler kullanılmıştır: (1) Serum fizyolojik (SF), (2) LPS, (3) LPS+DHA (1 mg/kg), (4) LPS+DHA (2 mg/kg), (5) SF+DHA (3 mg/kg), (6) LPS+DHA (3mg/kg) ve (7) LPS+DHA (10 mg/kg). DHA, SF ya da LPS (10 mg/kg) ile birlikte uygulanmıştır. SF veya LPS enjeksiyonundan 6 saat sonra farelerin 30 saniye içinde termal uyarıya tepki verme süreleri değerlendirilmiştir. Farelerin beyin ve omuriliklerinde NLRX1 veya IKKγ ile TRAF6, IKKα, IKKβ, fosforile IKKα/IKKβ, IKKγ, fosforile IKKγ, K63 U veya K48 U proteinlerinin birlikteliklerini belirleyebilmek amacıyla ko-immünopresipitasyon çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca, dokularda IκB-α, fosforile IκB-α, NF-κB p65, fosforile NF-κB p65 ve interlökin (interleukin; IL)-1β proteinlerinin ekspresyonu immunoblotting yöntemiyle ölçülmüştür. LPS uygulanmasından 6 saat sonra farelerin termal uyarıya yanıt verme sürelerindeki azalma 3 ve 10 mg/kg dozlarda DHA ile önlenmiştir. DHA etkili olan düşük dozunda (3 mg/kg) uygulandığında, immünopresipitasyonun NLRX1 ile yapıldığı dokularda LPS'nin neden olduğu
K63 U ve IκB-α ekspresyonundaki azalma ile fosforile IKKα/IKKβ, fosforile IKKγ, fosforile IκB-α,
NF-κB p65, fosforile NF-κB p65 ve IL-1β ekspresyonundaki artma önlenmiştir. LPS ve/veya DHA uygulanan farelerin immünopresipitasyonun NLRX1 ile yapıldığı dokularında K48 U ekspresyonu değişmemiştir. IKKγ ile immünopresipitasyonun yapıldığı dokularda ise, DHA, LPS'nin neden olduğu fosforile IKKα/IKKβ, K63 U ve K48 U ekspresyonundaki artmayı önlemiştir. İmmünopresipitasyonun NLRX1 veya IKKγ ile yapıldığı dokularda, LPS'nin NLRX1, TRAF6, IKKα, IKKβ ve/veya IKKγ ekspresyonunda neden olduğu değişiklikleri DHA önlememiştir. Bulgularımız, NLRX1 ligandı DHA'nın enflamatuvar hiperaljeziyi önleyici etkisine, LPS'ye yanıt olarak santral sinir sisteminde TRAF6'dan ayrılan NLRX1'in, K63 U bağlantısı üzerinden poliubikuitinlenmesindeki artışın ardından IKK kompleksine bağlanması sonucunda IKKα/IKKβ, IKKγ, IκB-α ve NF-κB etkinliği ile IL-1β protein ekspresyonundaki azalmanın katkıda bulunabileceğini düşündürmüştür.

Abstract:
The aim of thesis was to investigate the effect of docosahexaenoic acid (DHA) on tumor necrosis
factor receptor-associated factor (TRAF) 6/inhibitor of κB (IκB) kinase (IKK)/IκB-α/nuclear factor (NF-κB) pathway in relation to antiinflammatory nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor (NLR) X1 (NLRX1) in lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory hyperalgesia model in mice. Mice were divided into 7 groups: (1) Saline, (2) LPS, (3) LPS+DHA (1 mg/kg), (4) LPS+DHA (2 mg/kg), (5) saline+DHA (3 mg/kg), (6) LPS+DHA (3 mg/kg) ve (7) LPS+DHA (10 mg/kg). DHA was injected simultaneously with saline or LPS (10 mg/kg). Reaction time to thermal stimuli within 30 seconds was evaluated in mice that received either saline or LPS after 6 hours. In the brains and spinal cords of mice, co-immunoprecipitation studies were conducted to determine the association of NLRX1 or IKKγ with TRAF6, IKKα, IKKβ, phosphorylated IKKα/IKKβ, IKKγ, phosphorylated IKKγ, K63 U, or K48 U proteins. In addition, IκB-α, phosphorylated IκB-α, NF-κB p65, phosphorylated NF-κB p65, and interleukin (IL)-1β protein expression by using the immunoblotting method. It was observed that 6 hours after LPS administration, the response time of mice to thermal stimulation was prevented with 3 and 10 mg/kg doses of DHA. When DHA was administered at a low effective dose (3 mg/kg), it prevented the LPS-induced decrease in the expression of K63 U and IκB-α and the increase in the expression of phosphorylated IKKα/IKKβ, phosphorylated IKKγ, phosphorylated IκB-α, NF-κB p65, phosphorylated NF-κB p65, and IL-1β in the NLRX1-immunoprecipitated tissues of LPS-treated mice. K48 U expression was not changed in the NLRX1-immunoprecipitated tissues of LPS- and/or DHA-treated mice. In the IKKγ-immunoprecipitated tissues, DHA prevented the increase in the phosphorylated IKKα/IKKβ, K63 U, and K48 U expression. DHA did not prevent the LPS-induced changes in the expression of NLRX1, TRAF6, IKKα, IKKβ, and/or IKKγ in the NLRX1- or IKKγ-immunoprecipitated tissues. Our findings suggested that, in the central nervous system, a decrease in the activity of IKKα/IKKβ, IKKγ, IκB-α, and NF-κB in addition to IL-1β protein expression as a result of binding to the IKK complex after increased polyubiquitination via the K63 U linkage following dissociation of NLRX1 from TRAF6 in response to LPS contributes to the preventive effect of NLRX1 ligand, DHA, against inflammatory hyperalgesia.