Farelerde deneysel kolon kanseri modelinde ve HT-29 hücre hattında astragalusmicrocephalus wild bitkisinin etanolik ekstraktı ile 5-fluorourasilin etkilerinin araştırılması
The investigation of the effects of ethanol extract of astragalus microcephalus wild plant and 5-fluorouracil i̇n an experimental colon cancer model in mice and on the HT-29 cell line
Yazar: ALPER SERHAT KUMRU
Danışman: PROF. DR. HAKİ KARA
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
FARELERDE DENEYSEL KOLON KANSERİ MODELİNDE VE HT-29 HÜCRE HATTINDA ASTRAGALUS
MİCROCEPHALUS WİLD BİTKİSİNİN ETANOLİK EKSTRAKTI İLE 5-FLUOROURASİLİN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Alper Serhat KUMRU
Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü 
(Sivas Cumhuriyet Üniversitesi Ortak) 
Veterinerlik Farmakoloji ve Toksikolojisi Anabilim Dalı 
Doktora Tezi, Ağustos  2024
Danışman: Prof. Dr. Haki KARA
ÖZET
Bu çalışma, 5-Fluorourasil (5-FU) ve Astragalus microcephalus wild bitkisinin (AST) etanol ekstraktının tek başlarına ve kombine olarak HT-29 kolon kanser hücresi hattında ve erkek Balb/c farelerde oluşturulan deneysel kanser modelindeki antikanserojenik etkilerini belirlemeyi amaçlamıştır. Çalışma in vitro ve in vivo olmak üzere iki aşamada gerçekleştirilmiştir. İn vitro deneylerde HT-29 hücre hattına AST 400 μg/ml, 500 μg/ml ve 750 μg/ml dozlarda, 5-FU ise 96,1 µM, 192,2 µM ve 384,4 µM dozlarda ve AST+5-FU ise belirtilen dozlarda kombine olarak uygulanmış; hücre canlılığı, sitotoksisite ve kaspaz 3, 8 ve 9 aktiviteleri ölçülmüş ve kaspazların yoğunlukları immunfloresans boyama ile gösterilmiştir. İn vivo çalışmada ise her grupta 8 hayvan olacak şekilde 5 grup oluşturulmuş ve toplam 40 erkek Balb/c faresi kullanılmıştır. Azoksimetan ve dextran sülfat sodyum uygulamasından 8 hafta sonra kanser modelinin oluşması beklenmiştir. Kanser oluşumundan sonraki 8 haftalık periyotta hayvanlar gruplara ayrılarak tedavi protokolü uygulanmıştır. Grup 1 kontrol (serum fizyolojik 0,1 ml), grup 2 azoksimetan (AOM) (10 mg/kg, i.p.) tek doz+dekstran sülfat sodyum (DSS) (%1.5 oral), grup 3 AOM+DSS+5-FU (50 mg/kg, i.p.), grup 4 AOM+DSS+AST (100 mg/kg ekstrakt oral gavaj) ve grup 5 AOM+DSS+5-FU (50 mg/kg)+AST (100 mg/kg ekstrakt) uygulanmıştır. Tüm gruplar 8. haftanın sonunda makroskobik incelemelere tabi tutulmuş ve histopatolojik muayene için kolonları alınmıştır. İn vitro sonuçlar incelendiğinde, 5-FU, AST ve kombine uygulama yapılan HT-29 hücre hattında artan doza bağlı olarak canlılık oranının azaldığı, sitotoksisitede artış ve kaspaz 3, kaspaz 8, kaspaz 9 aktivitesinde artış gözlemlenmiştir. Özellikle 750 μg/ml ekstrakt AST ile 384,4 µM 5-FU kombine verilen gruplarda belirgin değişiklikler gözlemlenmiştir. İmmunfloresan boyamada kaspaz 3, 8 ve 9 düzeylerinde belirgin artışlar görülmüş olup, en belirgin artış 750 μg/ml AST ile 384,4 µM 5-FU kombine verilen gruplarda gözlemlenmiştir. İn vivo histopatoloji sonuçlarına bakıldığında, AOM+DSS uygulanan grupta kriptlerde displazi, hemoraji, mononükleer hücre infiltrasyonları ve fibrozis şiddetli düzeyde görülürken, tedavi gruplarından 5-FU ve AST kombine uygulanan grupta bu parametreler hafif düzeyde gözlenmiştir. Bu sonuçlara göre, 5-FU'nun AST ile kullanımında daha etkili sonuçlar elde edildiği gözlemlenmiştir. Bu etkilerin, hücre siklusu basamaklarından intrinsik ve ekstrinsik kaspaz yolaklarını tetikleyerek apoptotik aktiviteyi değiştirmesiyle ilgili olduğu görüşüne varılmıştır. Sonuç olarak, AST'nin kanser tedavisinde hem tek başına hem de 5-FU ile birlikte kullanıldığında antikanserojenik etkinlik oluşturabileceği sonucuna varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: 5-Fluorourasil; apoptoz; astragalus; kanser.

Abstract:
"THE INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF ETHANOL EXTRACT OF ASTRAGALUS MICROCEPHALUS WILD PLANT AND 5-FLUOROURACIL İN AN EXPERİMENTAL COLON CANCER MODEL IN MICE AND ON THE HT-29 CELL LİNE"
Alper Serhat KUMRU
Erciyes University, Institute of Health Sciences  
(In collaboration with Sivas Cumhuriyet University)
Department of Veterinary Pharmacology and Toxicology
PhD Thesis, August 2024
Supervisor: Prof. Dr. Haki KARA
ABSTRACT
This study aimed to determine the anti-cancer effects of 5-Fluorouracil (5-FU) and Astragalus microcephalus wild plant (AST) ethanol extract, both alone and in combination, on the HT-29 colon cancer cell line and in an experimental cancer model in male Balb/c mice. The study was conducted in two phases: in vitro and in vivo. In the in vitro experiments, AST was applied to the HT-29 cell line at doses of 400 μg/ml, 500 μg/ml, and 750 μg/ml, 5-FU was applied at doses of 96.1 µM, 192.2 µM, and 384.4 µM, and AST+5-FU was applied in combination at the specified doses. Cell viability, cytotoxicity, and caspase 3, 8, and 9 activities were measured, and the densities of caspases were demonstrated through immunofluorescence staining. In the in vivo study, five groups were formed with 8 animals in each group, totaling 40 male Balb/c mice. It was expected that the cancer model would develop 8 weeks after the administration of azoxymethane and dextran sulfate sodium. During the 8-week period following cancer development, the animals were divided into groups and subjected to the treatment protocol. Group 1 was the control (0.1 ml physiological serum), Group 2 received azoxymethane (AOM) (10 mg/kg, i.p.) single dose + dextran sulfate sodium (DSS) (1.5% oral), Group 3 received AOM+DSS+5-FU (50 mg/kg, i.p.), Group 4 received AOM+DSS+AST (100 mg/kg extract oral gavage), and Group 5 received AOM+DSS+5-FU (50 mg/kg) + AST (100 mg/kg extract). At the end of the 8th week, all groups were subjected to macroscopic examinations, and their colons were collected for histopathological examination. In vitro results showed that with increasing doses, cell viability decreased, cytotoxicity increased, and activities of caspases 3, 8, and 9 increased in the HT-29 cell line treated with 5-FU, AST, and their combination. Significant changes were observed particularly in the groups treated with 750 μg/ml AST combined with 384.4 µM 5-FU. Immunofluorescence staining revealed significant increases in caspase 3, 8, and 9 levels, with the most pronounced increase seen in the groups treated with 750 μg/ml AST and 384.4 µM 5-FU combination. Histopathological results from in vivo studies showed severe dysplasia, hemorrhage, mononuclear cell infiltrations, and fibrosis in the crypts of the AOM+DSS treated group, while these parameters were observed at a mild level in the 5-FU and AST combined treatment group. Based on these results, it was observed that the use of 5-FU in combination with AST yielded more effective results. It was concluded that these effects are related to the alteration of apoptotic activity by triggering intrinsic and extrinsic caspase pathways from the cell cycle stages. In conclusion, it was found that AST, both alone and in combination with 5-FU, could provide anti-cancer activity in cancer treatment.
Keywords: 5-Fluorouracil; apoptosis; astragalus; cancer.