Optik ve elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin genetik hastalık ve mikroorganizma tayinine yönelik tasarımı ve uygulamaları
The design and applications of optical and electrochemical biosensors for genetic diseases and microorganism detection
Yazar: YASİN UĞUR KAYRAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. DİLŞAT ARIKSOYSAL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Kimya = Chemistry
Dizin: Biyosensörler = Biosensors ; DNA = DNA ; DNA hasarı = DNA damage ; DNA mutasyon analizi = DNA mutational analysis ; Genetik hastalıklar-doğuştan = Genetic diseases-inborn

Özet:
OPTİK VE ELEKTROKİMYASAL DNA BİYOSENSÖRLERİNİN GENETİK HASTALIK VE MİKROORGANİZMA TAYİNİNE YÖNELİK TASARIMI VE UYGULAMALARIDNA'de meydana gelen mutasyonların tayinini yapabilecek ve uzun süre boyunca kullanıma hazır bir şekilde saklanabilecek bir elektrokimyasal DNA biyosensör tasarımı, DNA hibridizasyon esasıyle patojen tayinine yönelik SPR biyosensör tasarımı gerekleştirildi.DNA'nın yapısı aydınlatıldıktan ve önemi anlaşıldığından bu yana DNA anazlizleri için yeni yöntemler geliştirilmesi, moleküler biyoloji ve nanoteknoloji alanındaki gelişmelere paralel olarak ilerlemektedir. Bu gelişmelerle birlikte analiz sistemlerinin boyutları giderek küçültülmekte, hassasiyet ve özgüllükleri giderek arttırılmaktadır.Tez çalışması kapsamında DNA'da mutasyon tayinine yönelik bir elektrokimyasal DNA biyosensör, ve patojen tayinine yönelik yüzey plazmon rezonans (SPR) DNA biyosensör tasarımı gerçekleştirildi.Tez çalışmasının ilk bölümünde şizofreni, alzehmir gibi psikolojik rahatsızlıklardan sorumlu olduğu bilinen bir enzim olan katekol-o-metil transferaz (E.C.2.1.1.6.) sentezinden sorumlu gende gerçekleşen tek nokta polimorfizm (SNP) tayini yapıldı. Kalem grafit elektroda (PGE) tutturulan inozin işaretli prob DNA'lar kullanılarak, sentetik oligonükleotidlerde ve polimer zincir reaksiyonu (PCR) ile üretilen ürünlerde hibridizasyonun tayini gerçekleştirildi. Hibridizasyon tayini guanin yükseltgenme sinyallerinin diferansiyel puls voltametri (DPV) tekniği kullanılarak ölçülmesi ile gerçekleştirildi. Biyosensör tasarımdan etanolaminin (ETA) hibridizasyona olan etkisi zamana bağlı olarak incelendi. En uygun saklama koşullarında ( -20°C, +4°C, +25°C) nekadar süre ile saklanabilecekleri inceledi. Ölçümler asetat tamponu (pH: 4,8) içersinde gerçekleştirildi. Hibridizasyondan önce elektrot yüzeyinden guanin yükseltgenme yanıtı alınmazken, hedef dizi ile hibritleşme sonrasında elde edilen yanıtın yüksek olduğu gözlendi. Probun hedef dizi ile hibridizasyonunun yanı sıra prob, hedef diziden bir baz farklı dizilime sahip ve bazları tamamen farklı olan iki ayrı hedef ile de etkileştirildi. Hibridizasyon sonrası alınan guanin sinyalleri, öngörüldüğü üzere, hedef ile hibridizasyon durumunda en yüksek iken, tek bazı farklı olan hedefle hibridizasyonda biraz daha düşük, rastgele diziyle yapılan hibridizasyonda ise en düşüktür. ETA'nın yüzeydeki boşukları kapladığını böylece sensör elektrotun uzun süre saklanabilmesine olanak verdiği buna karşın, elektron transferini zorlaştırdığı için yanıtlarda düşüşe neden olduğu gözlendi. Belirli sıcaklıklarda (-200C, +40C, +250C) saklanarak, planlanan zamanlarda hedef ile etkileştirilerek hibridizasyon analizi gerçekleştirilen elektrotların, +40C'de 150 gün süresince seçiciliğini kaybetmeden saklanabildiği görüldü. Tasarlanan sensörde kullanılan PGE'lerin tek kullanımlık ve ucuz olması, hazırlanan sensör elektrotların uzun süre bozulmadan bekleyebilir olması fabrikasyona ve seri üretime uygun olabileceği fikrini düşündürmüştür. COMT geni üzerindeki SNP'nin enzim aktivitesinde 4 kata kadar etkili olması ve enzimdeki bozuklukların psikolojik rahatsızlıklardan sorumlu olduğunun düşünülmesi, bu SNP'nin tayininin gerçekleştirilmesini gerekli kılmıştır. Tasarlanan biyosensör ile kısa sürede (21dk) yapılan mutasyon tayini klasik yöntemlere farklı güçlü bir alternatif getirmiştir. Hesaplanan tayin sınırı sentetik hedeflerde 1,184pmol/30µL, PCR ürünlerinde ise 6,09x105 moleküldür. Bu biyosensör yanlızca hızlı, ucuz ve kolay analiz sağlamakla kalmayıp aynı zamanda uzun bir kullanım süresine sahiptir.Tez çalışmasının ikinci kısmında insan, kuş ve bazı memelilerde hastalığa sebep olan İnfluenza B virüsünün tayinine yönelik SPR biyosensörü tasarımı gerçekleştirildi. İnfluenza B virüsünü tanımlayan, tiyol grubu işaretli 21mer oligonükleotit prob olarak kullanıldı. İlk önce prob DNA çip yüzeyine enjekte edildi. Oligonükleotitler tiyol gruplarından ince altım filmle kovalent olarak bağlandı. Bu etkileşim SPR sensöründe yanıta sebep oldu. Yanıt hesaplandı ve prob DNA'nın yanıtı olarak kaydedildi. Daha sonra prob DNA ve hedef PCR ürünü (influenza B PCR ürünü) ile etkileştirildi ve Prob DNA-hedef PCR (hibrit DNA) çip yüzeyine gönderilerek yüzey plazmon rezonans yanıtları hesaplandı. Hibrit DNA ile elde edilen yanıtların, prob DNA ile elde edilen yanıtlardan yaklaşık 2 kat kadar daha yüksek olduğu gözlendi. Hedef PCR ürünü yerine rastgele PCR ürünü (influenza A PCR ürünü) prob DNA ile etkileştirildikten sonra çip yüzeyine gönderilmesi ile elde edilen yanıtların prob DNA yanıtları kadar olduğu gözlendi.Geliştirilen bu biyosensör ile seçilecek özgül prop dizilerle kolayca ve gerçek zamanlı olarak tür tayini yapılmasına sağlamıştır. Klasik tayin yöntemlerine yeni bir alternatif getirmiştir. Tayin sınırı 6,88x105 molekül olarak hesaplanmıştır.Tez çalışması kapsamında geliştirilen her iki biyosensörde hazırlama kolaylığı, kullanım kolaylığı ve düşük maliyeti özellikleri sayesinde fabrikasyona geçirilebilmeye uygundur.

Abstract:
THE DESIGN AND APPLICATIONS OF OPTICAL AND ELECTROCHEMICAL BIOSENSORS FOR GENETIC DISEASES AND MICROORGANISM DETECTIONIn this study, by the principle of DNA hybridization, a SPR biosensor that is capable of detecting patogens and an electrochemical DNA biosensor, ready to use for a long time, that will detect the mutations exist in DNA a were designed.After the enlightening the structure of DNA and understanding its importance, for DNA analysis, new metods have been developed parellel to the developments of molecular biology and nanotechnology. By these advancements, the dimensions of analysis systems have been gradually decreased while the sensitivity and specifity have been gradually increased.In this dissertation study, an electrochemical DNA biosensor for detection of DNA mutation and a surface plasmon resonance (SPR) DNA biosensor for detection of pathogens were developed.In the first part of the study, an electrochemical DNA sensor designed to detect single nucleotid polimorphism (SNP) on COMT gene. The gene is responsible for the enzyme, cathecol-o-methyl transferaz enzyme, which causes the psycological diseases like schizophrenia and alzhemier. By the usage of inosine substituted probes that were immobilized on to the surface of pencil graphite electrode (PGE), hybridization between the probe and synthetic target oligonucleotides and polimer chain reaction (PCR) amplicons was achieved. The detection of hybridization was done by evaluation of guanine oxidation signals recorded by differential pulse voltammetry. The effect of ethanolamine on hybridization was examined with respect to time. Also, the maximum duration of the electrodes at the optimum storage conditions ( -20°C, +4°C, +25°C) was specified. The measurements were done in acetate buffer solutions (pH : 4.8). Before hybridization, no guanine oxidation signal was recorded, after the hybridization of immobilized probe with target sequence, the recorded oxidation signal of guanine was relatively high. In addition to the hybridization of probe with its complementary target, probe was hybridized with a non-complementary target and a mismatch target. The purpose of doing this is, to prove the nonexistence of hybridization between probe and target that is not fully complementary to the probe. As expected, the guanine oxidation signals recorded after hybridization was seen to be highest in the case of full complementarity and decreasing from mismatch to noncomplementary. It was observed that, the usage of ETA enables the storage of electrode for a long time due to its covarage of electrode surface, although, the signals were seemed to be lowered since it makes difficult the electron transfer. Also, it was proved that, it is possible to store the electrodes for 150 days at +4 0C according to the tests repeated at different temperatures for specific duration periods. The idea of fabrication and mass production of PGEs due to their disposiblity, cheapness and long shell life was supposed as a future aspect. It makes necessary to detect the Single nucleotide polimorphism (SNP) due to the fact that, the SNP on COMT gene, affects the enzyme activity up to 4 fold and this failure of enzymes are responsible for psycological diseases. By the designed biosensor, a new powerful alternative to the classical mutation methods was brought in. This biosensor not only rapid (21dk), cheap and enables easy analysis, but also has a long shell life. Detection limit calculated 1,184pmol/30µL for synthetic target and 6,09x105 molecules for PCR products.In the second part of the dissertation study, a design of a SPR biosensor that is capable of detecting influenza B virus that causes the disease in human beings, birds and some mammals were done.Thiol attached 21mer oligonucleotid which, represents the influenza B virus was used as probe DNA. Firstly probe DNA enjected to the chip surface. The oligonucleotid attached covalently with gold thin metal film on chip surface. This interaction caused a response from SPR sensor. The response calculated and saved as probe response. After that probe DNA and target PCR product (influenza B PCR product) interacted than, probe DNA-target PCR product (hybrid DNA) was send to the chip surface and the responses of plasmon resonance were calculated. The response belonging to hybrid DNA was seen to be approximately two times higher than the responses of probe DNA. It was observed that, the signal recorded after sending the interacted probe with non-complementary PCR product (influenza A PCR product) instead of target PCR product to the chip surface, was as much as the signal of probe.This developed biosensor enabled the detection of specimen by specific probe sequences and is an alternative method to classical detection methods. Detection limit calculated as 6,88x105 molecules.Both biosensors developed throughout this study are suitable for fabrication due to their ease of use and low cost features.