Difteri Toksini etkisinde K562 ve HL-60 hücrelerinde programlanmış hücre ölümü (apoptoz) sürecinde rol alan bazı proteinlerin mRNA düzeyinde gen ekspresyon oranlarının belirlenmesi ve karşılaştırılması.
Determination and comparison of mRNA level gene expression rates of several proteins which play role in programmed cell death (apoptosis) in DT exposed K562 and HL-60 cells.
Yazar: BAŞAR OKU
Danışman: PROF. DR. SİNA GÖKÇE
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyofizik = Biophysics

Özet:
ÖZET

Oku B.

Difteri Toksini etkisinde K562 ve HL-60 hücrelerinde programlanmış hücre ölümü (apoptoz) sürecinde rol alan bazı proteinlerin mRNA düzeyinde gen ekspresyon oranlarının belirlenmesi ve karşılaştırılması

İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyofizik ABD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul. (2006).

DT, NAD varlığında eEF2'yi ADP-ribozilleyerek inaktifleştirir, böylece protein sentezinin durmasına yol agar. K562 gibi bazı hücre soylarında, DT protein sentezini etkin biçimde durdurmasına karşın, sitotoksik bir etki göstermemektedir. DT protein sentezinin inhibisyonunun yanı sıra hücre iskeletinin yıkımına ve nükleozomlararası DNA kırılmasına yol açar Bu çalışmada, protein sentezinin inhibisyonu ile toksine bağlı hücre ölümü arasındaki ilişki mRNA düzeyinde açıklanmaya çalışılmıştır. Bu amaçla DT varlığında ve yokluğunda DT^ne duyarlı HL-60 ve DT'ne dirençli K562 hücrelerinden DT verildikten sonra 0., 1., 3., 6. ve 12. saatlerde örnekler alınıp RNA izolasyonu yapıldı. Daha sonra cDNA elde edildi ve apoptozla ilişkili Bcl-2, Kaspaz 3, Kaspaz 9 ve Sitokrom C genlerinin ekspresyonları gerçek zamanlı Q-PCR yöntemi kullanılarak incelendi. Bu çalışmada, K562 hücrelerinde DT varlığında Sitokrom C geninin ekspresyonunun azaldığı, HL-60 hücrelerinde ise çok daha fazla azaldığı gözlenmiştir. K562 hücrelerinde DT varlığında Bcl-2 geninin ekspresyonunun arttığı, HL-60 hücrelerinde ise DT varlığında Bcl-2 geninin ekspresyonunun yok denecek kadar azaldığı gözlenmiştir. DT varlığında 0. ve 3. saatler arasında Kaspaz 3'ün ekspresyonunda anlamlı bir artış gözlenmiştir・ Ancak bu çalışma protein düzeyinde başka yöntemlerle de doğrulanmalıdır. Her iki hücre tipinde de Kaspaz 9 geninin ekspresyonunda Kaspaz 3'e göre gen ekspresyonu çok daha azdır. HL-60 hücrelerinde DT varlığında Kaspaz-9 geninin ekspresyonunun yok denecek kadar az olduğu gözlenmiştir. K562 hücrelerinde ise Kaspaz-9 gen ekspresyonunda anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir. Ayrıca yapılan canlılık tayini sayımlarında hem K562 hem HL-60 hücrelerinde DT uygulanmış hücrelerde ölüm yüzdesi kontrol hücrelere göre daha yüksek çıkmıştır・ Bu çalışmanın verilerinin, mRNA düzeyinde ekspresyonuna baktığımız genlerin protein düzeyinde de aynı zaman diliminde ve aynı miktarda DT varlığında farklı yöntemlerle karşılaştırılması uygun olacaktır ・ Çalışmamızın sonuçlarının bundan sonraki araştırmaların planlanmasına zemin hazırlayacak öncü veriler olarak değerlendirilmesi uygun olacaktır.

Anahtar Kelimeler: Difteri Toksini, Apoptoz, Kaspazlar, Kantitatif PCR, Bcl-2

Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimse] Araştırma Projeleri Birimi tarafından T-823/27122005 no9lu proje olarak desteklemiştir.

Abstract:
ABSTRACT

Oku, B. Determination and comparison of mRNA level gene expression rates of several proteins which play role in programmed cell death (apoptosis) in DT exposed K562 and HL-60 cells. Istanbul University, Institute of Health Science, Biophysics Department. İstanbul. 2006.

DT catalyzes transfer of ADP-ribose moiety of NAD into a covalent linkage with eEF2. ADP-ribosylation results in inactivation of eEF2 and respectively inhibition of protein synthesis. The inhibition of protein synthesis due to ADP-ribosylation of eEF2 has been regarded as the primary, if not sole event in DT-induced cytotoxicity. DT induces programmed cell death aside from its inhibitory effects on protein synthesis. Cells exposed to such toxins reveal internucleosomal DNA cleavage and also increase in caspase-3-like activity, which are characteristics of apoptosis. Indeed, DT inhibits protein synthesis, without exerting any cytotoxic effect in cell lines like K562. The findings suggest that protein synthesis inhibition itself is necessary, but may not be sufficent to induce apoptosis, and additional mechanisms likely come into play to unfold the cytotoxic effect. The clarification of these mechanism(s) is necessary in order to gain further insight into the sequence of DT-promoted events leading to cell death. We isolated total RNA and prepared cDNA from our cell cultures. We analysed the expression of the Casp-3, Casp-9, Bcl-2 and Cytochrome C genes using real-time quantitative PCR (QPCR) method. We observed that in both K562 and HL-60 cell lines the gene expression of Cytochrome C protein decreased when DT was added. Also we observed that in K562 cell lines the expression of Bcl-2 protein increased while in HL-60 cell lines the expression of Bcl-2 decreased when DT was added. We could not observe any significant difference in the expression of Casp-9 in K562 cell lines but in HL-60 cell lines the expression of Casp-9 gene decreased when DT was used. We also observed that the death percent in both cell lines were higher when DT was added. Also we observed that in both of the cell lines the expression of Casp-3 protein increased in the first 3 hours. This study provided new insights about the expression of Casp-3, Casp-9, Bcl-2 and Cytchrome C genes but should be examined by protein protocols as well.

Key Words: Diphtheria Toxin (DT), Apoptosis, Caspases, Q-PCR, Bcl-2

This study was supported by The Research Support Unit of Istanbul University as the project no T-823/27122005.