Birincil membranöz glomerülonefritte 4CD varlığının ve yoğunluğunun böbrek hasarlanma derecesi ve böbrek sağkalımı ile birlikteliği
Association of the presence and quantity of C4D with the severity of the kidney injury and the kidney longevity in patients with primary membranous glomerulonephritis
Yazar: ESRA GÖKÇE
Danışman: PROF. DR. CANER ÇAVDAR
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Nefroloji = Nephrology
Dizin: Böbrek hastalıkları = Kidney diseases ; Böbrek yetmezliği = Kidney failure ; Böbrek yetmezliği-kronik = Kidney failure-chronic ; Glomerülonefrit-membranöz = Glomerulonephritis-membranous ; Sağkalım = Survival ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Amaç ve hipotez: Bu çalışmanın amacı birincil membranöz glomerülonefritli hastalarda glomerüler C4d boyanmasının demografik, klinik ve histopatolojik bulgularla ve renal sağkalım ile birlikteliğini değerlendirmektir. Glomerüler C4d pozitif boyanan birincil membranöz nefropatili hastalarda komplemanın lektin yolunun aktive olduğu düşünülmektedir; böylelikle bu hastalarda böbrek hasarlanma derecesinin ciddi ve böbrek sağkalım oranının düşük olması beklenmektedir. 
Yöntem: 2005 Eylül ile 2014 Eylül tarihleri arasında başvuran ve biyopsi ile membranöz glomerülonefrit tanısı elde edilen 50 hastadan, Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi (DEÜTF) Nefroloji Bilim Dalı tarafından değerlendirilerek birincil membranöz nefropati tanısı almış 18 yaş ve üzeri olan 20 hasta bu araştırmaya dahil edilmiştir.  Hastalar bölüme davet edilerek birebir klinik görüşme ortamında, biyopsi örneklerinin ve dosya-arşiv bilgilerinin kullanımı açısından kendilerinden gönüllü aydınlatılmış onam formu ile onay alınmıştır. DEÜTF arşivinde yer alan hasta dosyaları retrospektif olarak incelenmiştir. Hastaların tamamında biyopsiler Nefroloji Bilim Dalı tarafından elde edilmiş ve tanıda ve çalışma sırasında biyopsi örneklerinin değerlendirilmeleri DEÜTF Patoloji Anabilim Dalı tarafından gerçekleştirilmiştir. Patoloji Ana Bilim Dalı tarafından saklanmış böbrek dokuları C4d kiti (Cell Marque R C4d/SP91 monoklonal antikoru) ile yeniden boyanarak değerlendirilmiştir. Glomerüler C4d boyanması immünhistokimyasal yöntemle gerçekleştirilmiştir. Glomerüler C4d boyanma dereceleri negatif (glomerüler bazal membranın %25'inden azının boyanması), hafif (ince granüler), orta (kalın granüler) ve şiddetli (kaba depozitlenmeler) dereceler olarak belirlenmiştir. Buna göre hastalar ilk olarak negatif ve hafif derecede boyananlar ile orta ve şiddetli derecede boyananlar olarak iki gruba ayrılmıştır. Bu gruplar demografik veriler (yaş, cinsiyet, takip süresi) ile klinik ve laboratuar izlem verileri (biyopsi sırasında ve takibin 3. ayında, 6. ayında ve sonunda proteinüri miktarı; serum kreatinin düzeyi; serum albumin düzeyi; MDRD formülüne göre kreatinin klerensi; tanı sırasında hipertansiyon varlığı; sadece konservatif tedavi veya bağışıklık baskılayıcı tedavi başlanma durumu; izlemde serum kreatinin düzeyinde iki katına çıkma ve glomerüler filtrasyon hızında yarıya düşme süreleri ve renal replasman tedavisi varlığı) ve ayrıca histopatolojik veriler (ışık mikroskopisinde glomerüler bazal membran bulguları, global ve segmental sklerotik glomerül yüzdeleri, interstisyel fibrozis ve tübüler atrofi varlığı, arteriol ve arter çeperlerinde kalınlaşma ve mezangial hipersellüarite varlığı; immünfloresan incelemede IgG, IgA, IgM, Ig kappa ve lambda, kompleman C1q ve C3 birikimi) açısından karşılaştırıldı. Daha sonra C4d boyanma paternine göre ise hastalar segmental (bir glomerülün %50'den azında C4d boyanması) paternde boyananlar ve global (bir glomerülün tamamına yakınında C4d boyanması) paternde boyananlar olarak gruplandırıldı. Bu gruplar da aynı demografik, klinik, ve histopatolojik veriler açısından karşılaştırıldılar. İstatistiksel analizde SPSS 15.0 programı kullanıldı ve p değerinin 0,05'ten küçük saptanması durumunda bulgular istatistiksel açıdan anlamlı olarak değerlendirildi. Sayısal veri analizi için ki-kare testi ve Fisher kesin testi, ölçümle belirlenen değişken analizi için Mann-Whitney U testi ve korelasyon analizi kullanıldı. Glomerüler C4d boyanmasının renal sağkalım üzerine olan etkisini değerlendirmek için Kaplan-Meier ve Cox oransal risk analizlerinin kullanılması planlandı. 
Bulgular: Membranöz glomerülonefrit tanılı biyopsi elde edilmiş 50 hastadan 23'ünde klinik olarak birincil membranöz glomerülonefrit tanısı ve ikincil nedenlerin eklenmediği düzenli takip kaydedilmiştir. Bu hastalardan 3'ü yetersiz biyopsi örneği eldesi nedeniyle çalışmadan dışlanmıştır. Geriye kalan 34 ile 72 yaş arasındaki 20 hastanın %'55'inin erkek (n=11 ve yaş ortalaması 48.83 yıl) ve %45'inin kadın olduğu (n=9, yaş ortalaması 51.33 yıl) görülmüştür. Glomerüler C4d boyanması hastaların %90'ında (n=18) pozitif ve %10'unda (n=2) negatif olarak belirlenmiştir. Ortalama 43.7 ay (en kısa 6; en uzun 130 ay) süren izlemde, serum kreatinin düzeyi iki katına çıkmadığından veya GFR'de %50'den fazla azalma görülmediğinden ve renal replasman ihtiyacı gelişmediğinden renal sağkalım analizi yapılamamıştır. C4d negatif ve hafif derecede boyananlar ile orta ve şiddetli derecede boyanan gruplar karşılaştırıldığında; C4d birikim derecesinin şiddeti ile demografik ve klinik veriler arasında istatistiksel anlamlı birliktelik bulunmamıştır. Histopatolojik verilerden ise segmental skleroz yüzdesinin (p=0.017); immünglobulin A birikiminin (p=0.044) ve kappa ile lambda proteinlerinin (sırasıyla p=0.029, p=0.049) negatif-hafif derecede C4d boyanan grup ile anlamlı birlikteliği saptanmıştır. Negatif ve hafif derecede C4d boyanan grupta bu bulguları global skleroz yüzdesi ve IgG birikimi de istatistiksel düzeye ulaşmamakla birlikte eşlik etmektedir. C4d orta-şiddetli derecede boyanan grupta; daha ileri evrelerde bazal membran kalınlığı ile daha fazla sayıda hastada arter duvar kalınlaşması ve interstisyel enflamasyon istatistiksel anlamlılığa ulaşmamakla birlikte dikkat çekicidir. Hastalar segmental ve global paternde iki grup olarak değerlendirildiğinde 6 hastanın segmental ve 12 hastanın ise global boyandığı belirlenmiştir. Global paternde boyanma, orta ve şiddetli derecelerde C4d boyanması ile anlamlı olarak birlikte bulundu (p=0.001). Bunun üzerine segmental/global paternde boyanma çarpan skoruna göre segmental ve global paterndeki gruplardan global patern grubu C4d boyanma derecelerinde orta-ağır derecede C4d boyanması ile istatistiksel anlamlı olarak birlikte saptanmıştır (p<0.01). Segmental ve global paternde boyanan gruplar klinik ve demografik açısından karşılaştırıldığında, proteinürinin hafif, orta ve ağır dereceler olarak sınıflandırıldığı analizde 3. aydaki proteinüri düzeyi global paternde boyanan grupta daha yüksek bulunmuştur (p=0,027). 
Sonuçlar ve Tartışma: C4d birikimi immünhistokimyasal yöntemle geriye dönük olarak gösterilebilmektedir. Ancak prognostik bir risk faktörü olup olmadığı gösterilememiştir. Çalışmamızda C4d'nin hem boyanma derecesi olarak hem de boyanma paterni olarak geleneksel risk faktörleri ile korelasyon göstermediği bulunmuştur. Histopatolojik bulgulardan segmental skleroz yüzdesinin C4d'nin negatif ve hafif derecede boyandığı grupta istatistiki anlamlılıkta yüksek saptanması ve global skleroz yüzdesinin de istatistiksel anlamlılığa ulaşmadan aynı grupta daha yüksek ortalamada bulunması dikkat çekicidir. Bu bulgu, sklerozun komplemana bağlı hasardan farklı bir mekanizma ile de oluşabilen bağımsız bir risk faktörü olmasına bağlanmıştır. C4d negatif ve hafif derecede boyananlarda IgA'nın ve kappa ile lambdanın anlamlı birlikteliği; birincil membranöz nefropati dışında enfeksiyon gibi ikincil nedenlere bağlanmıştır. İstatistiksel anlama ulaşmasa da interstisyel enflamasyon varlığı ile bazal membranda ve arterlerde kalınlaşma gibi histopatolojik bulgularla C4d boyanmasında şiddetli derecelerin birlikteliği dikkati çektiğinden; C4d'nin histopatolojik risk faktörlerinden vasküler duvar kalınlaşması ile birlikteliğini aydınlatmada daha fazla sayıda hastaya ihtiyaç olduğu düşünülmüştür. C4d'nin global paterninin şiddetli derecelerde C4d boyanması ile birliktelik göstermesi yetişkin membranöz nefropatisinde global paternde immün birikimin daha yaygın olmasına bağlı olarak düşünülmüştür. C4d'nin burada, aktif ve şiddetli hastalık ataklarının zamanla çözünmeden ortamda kalan bir işareti olduğu akla gelmektedir. Çalışmamız yetişkin birincil membranöz nefropatisinde C4d'nin prognoz üzerinde etkisi olup olmadığını kapsamlı şekilde ele alan ilk çalışmadır. C4d komplemanın klasik ve lektin yollarında açığa çıkan bir yan üründür. Lektin yolunun belirteci olarak C4d ile bulguların negatif korelasyonu düşünüldüğünde, farklı bir mekanizma olarak alternatif yolun da hastalıkta aktifleşebileceği akla gelmektedir. C4d'nin lektin yolu üzerinden prognoz ve sağkalım üzerine etkisi olup olmadığının araştırılmasında, patolojik biyopsilerde membran fosfolipaz A2 reseptörünün ve alternatif yol bileşenlerinden faktör-B'nin değerlendirildiği ve ayrıca daha fazla sayıda hastanın dahil edildiği çalışmalara ihtiyaç vardır.

Anahtar kelimeler: C4d, membranöz glomerülonefrit, renal hasarlanma

Abstract:
Object and hypothesis: The aim of this study is to evaluate the correlation between the glomerular C4d staining and demographic, clinic, histopathologic findings and kidney longevity of patients with idiopathic membranous glomerulonephritis. Lectin pathway of the complement system is thought to be activated in patients with C4d positive glomerular staining, thus, in those patients severe renal injury and decreased renal survival rate is expected. 
Methodology: Of the 50 patients who applied to Dokuz Eylül University School of Medicine (DEUTF) Department of Nephrology between September 2007 and September 2014 and on whom performed biopsy that diagnosed as membranous nephropathy by DEUTF Department of Pathology and evaluated as idiopathic membranous nephropathy by (DEUTF) Department of Nephrology , 23 patients are included. After the 23 patients with age of 18 and older and which were followed properly as primary (idiopathic) membranous glomerulonephritis by DEUTF Department of Nephrology choosen, they were invited to the department and discussed face to face, written informed volunteer consent was obtained for staining with C4d on previus kidney biopsy material and for the usage of history of disease data. Patients' files in the archive of hospital of DEUTF researched retrospectively. İn all of cases, biopsy specimens were obteined by Department of Nephrology, and evaluated both at the time of biopsy and reassesment for C4d staining by Department of Pathology. Kidney tissue specimens in the Department of Pathology archival were analysed for glomerular C4d staining with C4d kit (Cell Marque R; C4d SP91 monoclonal antibody). Glomerular C4d staining was performed via immunohistochemistry method. Glomerular C4d staining degrees are determined as negative (staining less than %25 in one glomerulus), mild degree (fine granular staining), intermediate degree (thichened granular) and severe degree (coarse deposites). According to these degrees of C4d, at first patients grouped as negative and mild degree stained and intermediate-severe stained. Those groups were compared according to their demographical (age, sex, follow up period) , clinical and laboratory follow up variables (proteinuria of 24 hours, serum creatinine level, creatinine clerence in terms of MDRD formula, serum albumine level at initial, in term of 3th month, in term of 6th month and last visit; existance of hypertension, conservative treatment and/or immunosupressive treatment, doubling time of serume creatinine level, %50 decrease in glomerular filtration range and existance of renal replacement) and also histopathologic (glomerular basal membrane properties, percentages of global and segmental sclerotic glomerulus, interstitial fibrosis and tubular atrophy, thickening in arteries and arteriols, existance of mesangial hypercelluarity and interstitial inflamation at light microscopy; examination of IgG, C3, Ig kappa and lambda stainings at immonofluorescence microscopy) findings. After determining the groups according to C4d staining degrees; groups which based on C4d staining pattern was composed as segmental pattern group (C4d staining less than %50 of a glomerulus) and global pattern group (C4d staining in almost full of glomerulus) were composed. Segmental and global staining pattern groups were also compared according to the same demographic, clinical, laboratory follow up variables and histopathologic variables. For statistical analysis SPSS 15.0 was used; findings were evaluated as statistically significant if p value is to be found less than 0.05. For categorical data analysis Chi-square and Fisher's exact test; for analysis of variance Mann-Whitney U and correlation analyses tests are used. Kaplan-Meier and Cox proportional hazard analyses were planned to be performed to evaluate the effect of glomerular C4d staining on renal survival. 		
Results: Of the patients who were between ages of 34 and 72, %60 were (n=12, mean 48.83 years) male and %40 were (n=8, mean 51.75 years) female. Of 20 patients, %90 were identified as glomerular C4d-positive (n=18), and %10 (n=2) as negative. During mean follow up of 43.7 months (minimum 6; maximum 130 months), as neither any of the patients needed renal replacement theraphy, nor creatinine levels increased two-fold and GFR decreased half during the periods; we could not perform renal survival analysis. When we compared the negative-mild degreed C4d staining group with the intermediate-severe degreed C4d staining group; we did not find correlation between severity of C4d staining degrees and between demografical, clinical findings statistically. Among histopathogical variables, percentage of segmental sclerosis, deposites of immunoglobulin A, kappa and lambda staining degrees were associated with negative and mild degreed C4d staining group (p=0.017, p=0.029, p=0.049 respectively).in the same group, global glomerulosclerosis was also dominant according to intermediate-severe degreed C4d staining group, but was not statistically significant. Mean value of IgG staining degrees accompanied to global sclerosis dominancy in the same group as we compared to the intermediate-severe C4d staining group. However, yet not statistically significant; further thickening in basal membranes and arteries and interstitial inflamation in more patients attracted notice. When we evaluated gruops based on C4d staining of pattern; we determined 6 biopsies that C4d stained in segmental pattern and 12 biopsies that C4d stained as global. Staining in global pattern was statistically associated with further degrees (intermediate and severe) of C4d staining (p=0.001). After this finding, groups based on global and segmental pattern compared to groups based on C4d staining degrees in the name of segmental/global pattern factor scoring. Group with the global pattern showed statistically significant correlation with the further degrees of C4d stainig in the extent of segmental/global pattern factor scoring too (p<0.01). Also about the clinical and laboratory follow up variables, in the groups based on C4d staining pattern it was found that group of global C4d staining was associated with higher levels of proteinuria according to segmental groups when the findings analysed via proteinuria classification (p=0.027). 
Conclusions:. C4d staining can be confirmed usually by the immunohistochemically methods retrospectively. But it could not be shown statistically if C4d is a marker of poor prognosis in idiopathic membranous nephropathy. İn our study we found that both C4d staining degree and pattern was not correlated with traditional prognostic factors and renal survival markers. Among histopathologic findings,  the significant finding of the segmental sclerosis percentage which correlated with the C4d negative and mild degreed staining statistically; and accompanied global sclerosis of glomeruli correlated with the same group without statistical meaning was remarkable. This finding is considered to focal glomerulosclerosis was a independent worse renal outcome predictor that affected by many factors and could exist from variable pathologies. The assocation between negative-mild degreed C4d staining and IgA, kappa and lambda is considered to be associated with secondary factors like post-infectious situation except primary membranous nephropathy. Yet it is not significant statistically; there were some other histopathological findings like interstitial inflamation, also thickening of basale membrane and arteries correlated with further degreed C4d staining, new studies should be performed with more patients to evaluate the correlation between thickening in arteries and degrees of C4d staining. The finding in which C4d with global pattern was highly correlated with further degrees of C4d is found to be concerned with the prevalance of global pattern of immune deposites in primary membranous nephropathy in adults. Here, C4d is considered to be a stigmate of the previous or ongoing execarbations or relapses in illness. Our study is the first report involving if C4d is effective on prognosis of idiopathic membranous glomerulonephritis in adults extensively. C4d is a split product of classical and lectin pathway of complement, so with our negatively correlated findings of C4d with prognostic factors; it comes to mind that alternative pathway is also affective on pathogenesis as a different mechanism. To research that if C4d is efficient on prognosis and renal survival in idiopathic membranous nephropathy; it is suggested that more investigations which membrane phospholipase A2 antibody and factor-B the component of alternative pathway are concluded should be performed with more patient series and longer follow-up periods.

Keywords: C4d, membranous nephropathy, renal injury