Koyun orijinli escherıchıa colı O157:H7 izolatlarının moleküler karakterizasyonu
Molecular characterization of escherichia coli O157:H7 isolates from sheep origin
Yazar: YILMAZ EMRE GENÇAY
Danışman: PROF. DR. MURAT YILDIRIM
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Halk Sağlığı = Public Health ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Escherichia coli = Escherichia coli ; Escherichia coli enfeksiyonları = Escherichia coli infections ; Karkas özellikleri = Carcass characteristics ; Koyunlar = Sheep ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Virülans = Virulence ; İmmünolojik testler = Immunologic tests

Özet:
Bu çalışmada, Haziran 2012 – Mayıs 2013 ayları arasında Kırıkkale ilindeki mezbahada kesimleri yapılan toplam 100 Akkaraman ırkı koyundan kesim işlemini takiben alınan 100'er adet rektoanal mukozal svap (RAMS) ve karkas sünger sürüntü (KSS) örneği olmak üzere toplam 200 örnek toplanarak, örneklerden IMS bazlı kültür tekniği ile Escherichia coli O157 varlığı araştırıldı. İzolatların PCR tekniği ile E. coli O157 olarak doğrulanmasını veya E. coli O157:H7 olarak identifikasyonunu takiben, çeşitli virülens genleri (stx1, stx2, eaeA, hly, lpfA1-3, espA) ve varyantlarının (eae-α1, eae-α2, eae-β, eae-β1, eae-β2, eae-γ1, eae-γ2/θ, stx1c, stx1d, stx2c, stx2d, stx2e, stx2f, stx2g) bulunuşu incelenerek moleküler karakterizasyonları yapıldı. Koyunlarda E. coli O157 ve E. coli O157:H7 prevalansına mevsimin, cinsiyetin ve yaş aralığının etkisi değerlendirildi. 
Analiz edilen toplam 100 koyunun 18'inde (% 18) E. coli O157 tespit edildi. Etken, koyunların 10'unda (% 10) KSS örneklerinden, 4'ünden (% 4) RAMS örneklerinden ve 4'ünde (% 4) hem KSS hem de RAMS örneklerinde belirlendi. Ondört KSS ve 8 RAMS örneğinden toplam 75 sorbitol negatif (NSF) ve 4 sorbitol pozitif (SF) E. coli O157 kolonisi izole edildi. Yapılan PCR analizleri ile 79 izolatın 11'i (7 NSF ve 4 SF) (% 13.9) E. coli O157:H7-, 68'i (% 86.1) E. coli O157:H7+ olarak identifiye edildi ve koyunların 6'sında (% 6) E. coli O157 (4 örnekten NSF ve 2 örnekten SF), 12'sinde (% 12) ise NSF E. coli O157:H7 belirlendi. Elde edilen 79 izolatın hiç birinin stx1 barındırmadığı ancak 68 E. coli O157:H7'den 45'inin (% 57) stx2c yönünden pozitif olduğu tespit edildi. Bunun yanı sıra, bütün izolatların lpfA1-3 genini barındırdığı (% 100), yalnız bir izolatın hly- olduğu, SF E. coli O157 izolatlarının espA genine sahip olmamasına karşın diğer tüm izolatların espA+ olduğu ve tüm eaeA+ izolatların (77/79, % 97.4) eaeγ1 varyantı olduğu belirlendi. Bu sonuçlara göre toplam 100 koyundan 8'inin (% 8) KSS örneklerinde Shigatoksijenik E. coli O157:H7 belirlenmiştir.
Yapılan analizlerde E. coli O157:H7 prevalansına mevsimin, cinsiyetin ve yaşın istatistiki olarak önemli bir etkisi bulunmamasına karşın; soğuk aylarda sıcak aylara oranla, erkek hayvanlarda dişi hayvanlara oranla, 6-12 ay arası toklularda 12 aydan erişkin hayvanlara oranla daha sık etkene rastlandığı belirlendi. 
Elde edilen bulgular neticesinde, koyunların diğer pek çok ülkede bildirilenden daha yüksek oranda Shigatoksijenik E. coli O157:H7 taşıdıkları ve mezbahaların teknik ve hijyenik yetersizliği sonucu karkasların ciddi oranda kontamine olduğu belirlendi. Bu nedenle, halk sağlığının korunması amacıyla, resmi otoriteler tarafında mezbahaların teknik ve hijyenik şartlarının iyileştirilmesi, koyun eti ve koyun eti içeren ürünlerin tüketimlerinden önce yeterli ısı işlemi gördüğünden emin olunması ve gerek koyunlarla temastan sonra, gerekse koyunların dolaştığı veya koyundan elde edilen gübrelerin kullanıldığı alanlarda hijyen uygulamalarının titizlikle gerçekleştirilmesi koyun kaynaklı E. coli O157:H7 infeksiyonlarından korunma ve kontrolde alınması gereken önemli tedbirlerdendir.

Abstract:
In the study, the presence of Escherichia coli O157 in 200 samples, 100 of each rectoanal mucosal swap (RAMS) and carcass sponge samples (KSS), of 100 Akkaraman race sheep brought to slaughterhouse in Kirikkale was analyzed by IMS based cultivation technique between June 2012 and May 2013. Isolated strains were either verified as E. coli O157 or identified as E. coli O157:H7 and then, molecular characteristics were determined by analysis of various virulence factors (stx1, stx2, eaeA, hly, lpfA1-3, espA) and variants (eae-α1, eae-α2, eae-β, eae-β1, eae-β2, eae-γ1, eae-γ2/θ, stx1c, stx1d, stx2c, stx2d, stx2e, stx2f, stx2g) by PCR. The effects of season, sex and range of age on E. coli O157 and E. coli O157:H7 prevalence in sheep were determined.
E. coli O157 was found in 18 (18 %) of 100 sheep included in the study. In 10 (10 %) of the 100 sheep agent was isolated from KSS, while in 4 (4 %) from RAMS, and in 4 (4 %) both from KSS and RAMS. A total of 75 sorbitol-negative (NSF) and 4 sorbitol-positive (SF) E. coli O157 colonies were isolated from 14 KSS and 8 RAMS. Six (6 %) and 12 (12 %) of the sheep were determined to harbor E. coli O157 (NSF from 4 and SF from 2 samples) and E. coli O157:H7, respectively as; 11 (7 NSF and 4 SF) (13.9 %) of 79 isolates were verified as E. coli O157:H7- while the remaining 68 (86.1 %) isolates were identified as E. coli O157:H7+ by PCR. None of the isolates were harboring stx1 while 45 (57 %) of 68 E. coli O157:H7 were stx2c positive. Additionally, all isolates were and lpfA1-3 positive, only one isolate was hly-. All eaeA positive isolates (77/79, % 97.4) showed the intimin variant eaeγ1 and besides SF E. coli O157 isolates all were harboring espA. As a result, 8 (8 %) of the sheep KSS were found to harbor Shigatoxigenic E. coli O157:H7. 
No statistical significance effect of season, sex or age range was observed on prevalence of E. coli O157:H7 in sheep. However, prevalence was higher; in colder than warmer season, in male than female and in 6 to 12 months yearling lambs than mature sheep of above 12 months. 
In conclusion, a high prevalence of Shigatoxigenic E. coli O157:H7 carriage of sheep, that subsequently results in a high percentage of carcass contamination with the pathogen due to the technical and hygienic insufficiency at slaughterhouses than in many other countries was determined. Thus, for protection of public health, national authorities must ensure the technical and hygienic improvement of slaughterhouses, adequate cooking of meats of sheep origin or derived products before consumption must be ensured and thorough hygienic applications must be applied following contact with sheep or sheep grazed or sheep manure applied fields.