Thermus Scotoductus K6' Dan İzole Edilen Yeni, Kriptik, Küçük, Çok Kopyali Bir Plazmitin (pHIG22) Fonksiyonel Analizi
Functional Analysis Of A Novel, Cryptic, Small And Multicopy Plasmid (pHIG22) From Thermus Scotoductus K6
Yazar: HALİL İBRAHİM GÜLER
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Moleküler biyoloji = Molecular biology

Özet:
Bu çalışmada, Thermus scotoductus K6 bakterisinden izole edilen ve tanımlanan, 2222 bp uzunluğunda,yeni, kriptik, küçük, çok kopyalı, çift zincir, % 62,78 GC içerikli yeni bir plazmit (pHIG22) karakterize edildi ve fonksiyonel analizi yapıldı.
pHIG22 plazmitinin 387. bazı ile 614. bazı arasında kalan 2012 bp'lik bölgenin replikasyondan sorumlu minimal replikonu olduğu belirlendi. TEM analizleri ile plazmitin "Teta" tip replikasyon moduna sahip olduğu, replikasyon orijininin 46. baz ile 239. baz (BamHI kesim bölgesi '0' noktası kabul edildiğinde ve ters oryantasyonda) arasındaki bölge olduğu tespit edildi. pHIG22'nin her iki zincirinden transkript kodlandığı belirlendi. RACE ve LACE analizleri sonucunda, Transkript 1'in 1622 bp büyüklükte (329-1950), Transkript 2'ninde 1712 bp büyüklükte (2103-329) olduğu tespit edildi. Transkriptlerin proteine dönüşüp dönüşmediğinin belirlenmesi için yapılan çalışmalarda; SDS-PAGE, Zimogram, 2D jel analizi ve MALDI-TOF/TOF analizleri sonucunda transkriptlerin herhangi bir protein kodlamadığı sonucuna varıldı. Transkriptlerin düzenleyici bölgeleri incelenerek, her iki zincirde promotör diziler olduğu belirlendi. E.coli suşlarında replike olmadığı belirlenen pHIG22'nin T. scotoductus K6 bakterisindeki kopya sayısı Real-time qPCR tekniği ile 148 olarak hesaplandı. pHIG22 minimal replikonu ve farklı DNA parçaları kullanılarak, E.coli-Thermus suşlarında replike olabilen pUCHIGK shuttle klonlama vektörü ve pHIGKE2 shuttle ekspresyon vektörü dizayn edildi.

Abstract:
In this study, a small, novel, cryptic, multicopy and double strand plasmid (pHIG22) which has 2222 bp in long and with a total G + C content of 62,78 from Thermus scotoductus K6 was characterized and functionally analyzed. A 2012 bp region among 387 and 614 bp of pHIG22 was determined as minimal replicon of plasmid.
Replication mode of pHIG22 was identified as 'Teta' and rep origin of it was determined as a region among 46 and 239 (BamHI recognition site is accept as '0' point) bp by TEM analysis. Two transcripts were detected from the both strands of pHIG22. According to RACE and LACE analysis results, Transcript 1 (329-1950) and Transcript 2 (2103-329) were determined 1622 bp in long and 1712 bp in long, respectively. Analysis of SDS-PAGE, Zimogram, 2D gel analysis and MALDI-TOF/TOF analysis show that transcripts do not encode any proteins, and these studies were performed to understand that transcripts whether encode or not encode proteins. The regulator regions of transcripts were investigated and promotor sequences were detected on both strands. The copy number of pHIG22, which has no ability to replicate in E.coli strains, in T. scotoductus K6 was calculated as 148 by using Real-time qPCR technique. pUCHIGK shuttle cloning vector and pHIGKE2 shuttle expression vector, which can replicate in E.coli-Thermus strains, were constructed by using pHIG22 minimal replicon and various DNA fragments.