Klinik örneklerden izole edilen haemophilus türlerinin antibiyotik direnç profillerinin belirlenmesi ve moleküler karakterizasyonu
Determination of antibiotic resistance profiles and molecular characterization of haemophilus species isolated from clinical samples
Yazar: HATİCE HANIM YURTTAKAL
Danışman: DOÇ. DR. PINAR SAĞIROĞLU
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Beta laktamazlar = Beta lactamases ; Hemofilus = Haemophilus ; Hemofilus enfeksiyonları = Haemophilus infections ; Kinolonlar = Quinolones ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Solunum fonksiyon testleri = Respiratory function tests ; Trimetoprim = Trimethoprim ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Amaç: Haemophilus türleri; solunum yolu enfeksiyonları başta olmak üzere çeşitli 
enfeksiyonlarda karşımıza çıkmakta ve artan antibiyotik dirençleriyle toplum
sağlığını tehdit etmektedir. Bu çalışmada, klinik örneklerden izole edilen
Haemophilus türlerinin doğru tanımlanması, antibiyotik direnç profilinin saptanması,
beta laktam, kinolon ve trimetoprim-sülfametoksazol dirençlerinin moleküler
karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Merkez Laboratuvarı
Bakteriyoloji Ünitesinde Haziran 2020-Aralık 2021 tarihleri arasında izole edilen 96
Haemophilus kökeni çalışmaya dahil edildi. İzolatlar XV faktör gereksinimi, MALDI
Biotyper® sirius (Bruker, Almanya) ve H. influenzae Real Time PCR Tespit Kiti
(Bioeksen, Türkiye) kullanılarak tanımlandı. Lam aglütinasyon yöntemi ile H.
influenzae tip b ve sefinaz diskiyle beta laktamaz üretimi araştırıldı. Kökenlerin
antibiyotik duyarlılıkları disk difüzyon testi, sıvı mikrodilüsyon testi/gradiyent strip
test yöntemiyle belirlendi. Ampisilin dirençli kökenlerde bla
TEM
, bla
ROB
, ftsI, kinolon
dirençli kökenlerde QRDR (gyrA, gyrB, parC, parE) ve trimetoprim-sülfametoksazol
dirençli kökenlerde sul1, sul2 genleri PCR ile amplifiye edildi. ftsI geni ve QRDR
genlerinin dizi analizi yapıldı. 
Bulgular: Çalışma sonuçları COVID-19 pandemisi sırasında değişen hasta ve
antibiyotik duyarlılık profilini temsil etmekteydi. Kökenlerin çoğu solunum yolu
örneklerinden (%94.7), erkek cinsiyetten (%68.7) ve 18 yaş üzeri (%89.5)
hastalardan izole edilmişti. MALDI-TOF MS ile dört, XV ile iki izolat tür düzeyinde
yanlış tanımlandı. H. influenzae'ların 12'si (%24.4) serotip b olarak bulundu.
İzolatların disk difüzyon testine göre %46.8'i ampisiline, %96.8'i amoksisilin
klavulanata, %76'sı siprofloksasin, %77'si trimetoprim-sülfametoksazole duyarlı
bulundu. Dokuz suşun nitrosefin hidrolizi pozitif olarak bulundu. PCR ile 12
kökende blaTEM geni saptandı. blaROB geni, çalışılan hiçbir kökende saptanmadı. Beta
laktam antibiyotiklere ana direnç mekanizması olarak ftsI gen mutasyonları gözlendi.
Kinolon dirençli 23 kökenin hepsinde QRDR genlerinde mutasyon saptandı. Trimetoprim-sülfametoksazol dirençli 25 kökenin 22'sinde sul1+sul2, birinde ise sadece sul1 geni saptandı.
Sonuç: Haemophilus türlerinin tür düzeyinde doğru tanımlanmasının, antibiyotik
direnç profillerinin bölgesel ve ulusal olarak takibi ve dirence yol açan
mekanizmaların saptanmasının; tedavi protokollerinin ve direnç yayılımını önlemeye
yönelik politikaların oluşturulmasında önemli rol oynayacağı sonucuna varıldı.

Abstract:
Aim: Haemophilus species; It occurs in various infections, especially respiratory
tract infections, and threatens public health with increasing antibiotic resistance. This
study aimed to identify correctly Haemophilus species isolated from clinical
specimens, determine the antibiotic resistance profile, and perform molecular
characterization of beta-lactam, quinolone, and trimethoprim-sulfamethoxazole
resistances.
Materials and Methods: Haemophilus strains isolated in Erciyes University
Medical Faculty Central Laboratory Bacteriology Unit between June 2020 and
December 2021 were included in the study. XV factor requirement, MALDI
Biotyper ® sirius (Bruker, Germany), and H. influenzae Real-Time PCR Detection
Kit (Bioeksen, Turkey) were used to identify the strains. H. influenzae type b was
investigated by the slide agglutination method, and beta-lactamase production was
determined with cefinase disc. Antibiotic susceptibility of strains determined by disc
diffusion test, broth microdilution test/gradient strip test method. The genes of
bla
TEM
, bla
ROB
, and ftsI in ampicillin-resistant isolates, QRDR (gyrA, gyrB, parC,
parE) in quinolone-resistant isolates, and sul1, sul2 genes in trimethoprimsulfamethoxazole

resistant isolates were amplified by PCR. ftsI gene and QRDR
genes were sequenced. 
Results: Study results were representative of the changing patient and antibiotic
susceptibility profile during the COVID-19 pandemic. Most patients were isolated
from respiratory specimens (94.7%),  male (68.7%) and over 18 (89.5%) years old.
Four isolates with MALDI-TOF MS and two with XV were misidentified at the
species level. Twelve (24.4%) H. influenzae were found to be serotype b.
Haemophilus tested in the study according to the disk diffusion test results, 46.8%
was susceptible to ampicillin, 96.8% to amoxicillin-clavulanate, 76% to
ciprofloxacin, 77% to trimethoprim-sulfamethoxazole Nine strains of nitrocefin
hydrolysis were positive. The bla TEM gene was detected in 12 strains by PCR. The
bla ROB gene was not detected in any of the studied strains. The main resistance mechanism to beta-lactam antibiotics in these strains was ftsI gene mutations. Mutations in QRDR genes were detected in all 23 quinolone resistant strains. In 25 isolates resistant to trimethoprim-sulfamethoxazole, 22 isolates harbored sul1+sul2 together, and the sul1 gene was found solely in one isolate. 
Conclusion: Identifying the Haemophilus strains at the species level, monitoring
antibiotic resistance profiles regionally and nationally, and determining the leading to
resistance mechanisms; will play an essential role in developing treatment protocols
and policies to prevent the spread of resistance.