Akciğer kanseri tedavisinde kullanılan AKT inhibisyonunun anti-tümör aktivitesinde RHOB molekülünün regülatif rolünün incelenmesi
Investigation of the regulative role of RHOB molecule on anti-tumor activity of AKT inhibition used in lung cancer treatment
Yazar: NURULLAH AKGÜN
Danışman: PROF. DR. ZEKAİ HALICI
Atatürk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Apoptozis = Apoptosis ; Fosfoinositid 3-kinaz = Phosphoinositide 3-kinase ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücre hattında (A549) sağlanan Akt inhibisyonunun anti-tümör etkinliğinde RhoB molekülünün regülatif rolünün varlığını araştırmaktır.
Materyal ve Metod: Çalışmamızın tüm aşamalarında A549 hücreleri kullanıldı. Belirlenen tedavi gruplarında Akt inhibitörü perifosin; A549 hücrelerine, siRNA aracılığıyla RhoB susturulmuş A549 hücrelerine ve deksametazon aracılığıyla RhoB up-regüle edilmiş A549 hücrelerine ayrı ayrı uygulandı. Hücre proliferasyonları xCELLigence® Gerçek Zamanlı Hücre Analizi ile tespit edildi. RhoB, pAkt ve Bcl2l11 molekülleri ELISA yöntemi ile analiz edildi. Akım sitometrisi ile apoptoz oranları belirlendi.
Bulgular: 72 saatlik deney sonucuna göre siRNA aracılığıyla RhoB susturulmuş hücrelere Akt inhibitörü uygulanan grup, kontrol ve diğer tedavi gruplarına göre en fazla anti-proliferatif etki gösteren grup oldu. RhoB up-regülasyonunun Akt inhibitörünün anti-proliferatif etkinliğini azalttığı da gözlemlendi. Moleküler analizlere göre siRNA aracılığıyla RhoB susturulmuş hücrelere Akt inhibitörü uygulanan grupta, pAkt seviyesi diğer gruplara göre anlamlı şekilde düşmüş olarak tespit edildi. Ayrıca siRNA-RhoB ile RhoB molekülünün başarılı bir şekilde susturulduğu ve deksametazonun RhoB molekülünü up-regüle ettiği tespit edildi. Apoptotik bir protein olan Bcl2l11 seviyesinde ise siRNA aracılığıyla RhoB susturulmuş hücrelere Akt inhibitörü uygulanan grupta, diğer tedavi gruplarına göre anlamlı bir artış tespit edildi. Akım sitometrisi sonuçlarına göre siRNA aracılığıyla RhoB susturulmuş hücrelere Akt inhibitörü uygulanan gruptaki apoptoz yüzdesi, sadece RhoB baskılanmış ve sadece Akt inhibitörü uygulanan gruplara göre anlamlı şekilde daha yüksek tespit edildi. 
Sonuç: RhoB molekülünün küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde Akt inhibisyonunun anti-tümör etkinliği üzerinde negatif yönlü bir regülatör olduğu hem proliferasyon testlerinde hem de apoptoz testlerinde tespit edildi. Bu regülasyonun mekanizmasını aydınlatmak için yapılan moleküler analizlerde hücre içinde pAkt seviyesi üzerinde RhoB'nin doğrudan etkisi olduğu belirlendi. Akt inhibitörünün fosforillenmiş Akt'yi inhibe etme yeteneğinin, RhoB up-regülasyonuyla azalırken, RhoB'nin baskılanmasıyla arttığı gözlemlendi.

Abstract:
Aim: The aim of this study is to investigate the regulatory role of RhoB molecule in the anti-tumor activity of Akt inhibition in non-small cell lung cancer cell line (A549).
Material and Method: A549 cells were used in all stages of our study. Akt inhibitor perifosine in the specified treatment groups; It was administered separately to A549 cells alone, to RhoB silenced A549 cells via siRNA and to RhoB up-regulated A549 cells via dexamethasone. Cell proliferations were detected by xCELLigence® Real-Time Cell Analysis. RhoB, pAkt and Bcl2l11 molecules were analyzed by ELISA method. Apoptosis rates were determined by flow cytometry. 
Results: According to the results of the 72-hour experiment, the group in which Akt inhibitor was applied to the RhoB-silenced cells via siRNA was the group that showed the most anti-proliferative effect compared to the control and other treatment groups. RhoB up-regulation was also observed to reduce the anti-proliferative activity of the Akt inhibitor. According to the molecular analyzes, the pAkt level was found to be significantly lower in the group in which Akt inhibitor was applied to the RhoB-silenced cells via siRNA, compared to the other groups. It was also found that siRNA-RhoB were successfully silenced RhoB molecule and dexamethasone up-regulated RhoB molecule. There was a significant increase in the level of Bcl2l11, an apoptotic protein, in the group treated with Akt inhibitor to RhoB-silenced cells via siRNA, compared to other treatment groups. According to the results of flow cytometry, the percentage of apoptosis in the group in which Akt inhibitor was applied to the RhoB-silenced cells via siRNA was found to be significantly higher than in the RhoB-suppressed group and Akt-inhibitor alone applied group.
Conclusion: It was determined in both proliferation tests and apoptosis tests that the RhoB molecule was a negative regulator of the anti-tumor activity of Akt inhibition in non-small cell lung cancer. In molecular analyzes carried out to elucidate the mechanism of this regulation, it was determined that RhoB had a direct effect on the level of pAkt in the cell. It was observed that the ability of the Akt inhibitor to inhibit phosphorylated Akt decreased with RhoB up-regulation and increased with suppression of RhoB.