Prepubertal dönemde 2,3,7,8-tetraklorodibenzo-p-dioksin (TCDD) ile oluşturulmuş testiküler hasar üzerine chrysin'in etkileri
Effects of chrysin on testicular damage induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) during prepubertal period
Yazar: SONGÜL YILMAZ
Danışman: PROF. DR. NERİMAN ÇOLAKOĞLU
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Dioksinler = Dioxins ; Ergenlik = Puberty ; Histokimya = Histochemistry ; Krisin = Chrysin ; Prepubertal dönem = Prepubertal period ; Testiküler hastalıklar = Testicular diseases ; Testis = Testis

Özet:
2,3,7,8- tetraklorodibenzo-p-dioksin (TCDD) çevrede uzun süre kalıcılığı
olan, yapısal olarak aynı mekanizmayla toksisite oluşturup, canlılarda biyolojik
olarak benzer etkiler gösterebilen 75 farklı bileşik içeren dioksin ailesinin
prototipidir. Bu bileşikler içinde en zehirli yapıda olması nedeniyle TCDD toksisite
çalışmalarında standart olarak kullanılmaktadır. Araba egzozlarında ve sigara
dumanında bulunan TCDD, insektisitlerin üretiminde, belediyelere ait katı atıkların
yakılması esnasında bir yan ürün olarak ortaya çıkan çevresel bir kirleticidir.
İnsanlar TCDD' yi çoğunlukla beslenme yoluyla almakta ve yıkılabilir özelliğinin
düşük olması nedeniyle kanda ve yağ dokusunda birikme eğilimi göstermektedir.
Uluslararası Kanser Araştırmaları Kuruluşu TCDD'yi grup I kanserojen olarak
tanımlamıştır. TCDD, membran fosfolipitlerinden araşidonik asidin salınımını
artırarak enflamasyona ve reaktif oksijen türleri (ROS)'nin üretimine yol açarak
oksidatif strese dolayısıyla hücre hasarına neden olur.
Doğal bir flavon olan Chrysin (CH) antioksidan, antiinflamatuar,
antiapoptotik, antiviral özelliklere sahiptir. CH'nin damar koruyucu ve spasmolitik
etkilere sahip olduğu bilinmektedir. 
 Bu çalışmada TCDD'nin testis dokusunda meydana getirmesi muhtemel
oksidatif hasara karşı, güçlü bir antioksidan olan CH'nin etkilerinin incelenmesi
amaçlanmıştır.
 Bu deneysel çalışmada 4 haftalık, ortalama 105-130 g ağırlıklarındaki 28
adet Wistar-Albino cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar grup I (Kontrol), grup
II (TCDD uygulanan), grup III (TCDD + CH uygulanan) ve grup IV (sadece CH
uygulanan ) olmak üzere rastgele 4 gruba ayrıldı.
 Grup II ve grup III'e haftada bir kez 25 μg/kg TCDD intraperitonal (ip.)
olarak uygulandı. Ayrıca grup III ve grup IV'e günlük 50 mg/kg zeytinyağında CH
çözdürülerek oral gavaj yolu ile verildi.
 5 haftalık deney süresi sonunda tüm gruplardaki sıçanlar tartıldıktan sonra
anestezi altında dekapite edildi. Testis dokuları alınıp hızlıca tartıldı ve Bouin's
solüsyonunda tespit edildi. Biyokimyasal incelemeler için kan örnekleri
santrifüjlenip, elde edilen serumlar daha sonra yapılacak olan testosteron tayini için
-20 0C de saklandı. Testis dokularından histolojik inceleme için parafin bloklar
hazırlandı. Parafin bloklardan 5 μm kalınlığında kesitler alındı. Alınan kesitler
histokimyasal ve TUNEL teknikleri kullanılarak boyandı.
TCDD ve TCDD+CH gruplarındaki sıçanların ortalama vücut ağırlık
değişim yüzdesinde ve rölatif testis ağırlıklarında, kontrol grubu ile 
karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir düşüş gözlendi. CH grubu ile
kontrol grubu arasındaki fark ise istatistiksel açıdan önemsiz bulundu.
Işık mikroskop incelemesinde, kontrol grubuna ait testis dokularında
seminifer tübül germinal epitelini oluşturan spermatogenik seriye ait hücreler ve
Sertoli hücreleri, interstisyel alan ve bu alanda yer alan Leydig hücreleri normal
yapıda izlenirken TCDD uygulanan deneklere ait dokularda, germinal epitelde
atrofi, vakuolar dejenerasyon, germ hücreleri arasında ayrılma, spermatid dev
hücreleri ve bazı tübüllerde mayoz bölünmenin belli aşamalarında duraksama ayırt
edildi. TCDD toksisitesine karşı koruyucu amaçla CH uygulanan gruba ait
testiküler dokuda nispeten koruyucu etki sağlandı. Sadece CH uygulanan gruba ait
kesitlerde testis dokusu kontrol grubu gibi normal görünümlü olarak ayırt edildi.
Apoptotik hücre ölümünün belirlenmesi için TUNEL tekniği kullanılarak
yapılan boyamanın ışık mikroskopta incelenmesinde, kontrol grubu kesitlerinde
TUNEL (+), TCDD grubunda TUNEL (+++) , TCDD + CH grubunda TUNEL (+),
sadece CH uygulanan grupta ise TUNEL (+) yaygınlığında işaretlenme gözlendi.
TCDD ve TCDD+CH uygulanan gruplardaki sıçanların serum testosteron
seviyelerinde, kontrol ve CH grubu ile kıyaslandığında anlamlı bir azalma gözlendi.
CH grubu ile kontrol grubu arasındaki fark ise istatistiksel açıdan önemsiz bulundu.
Sonuç olarak yapılan bu deneysel çalışmada TCDD toksisitesinin serum
testosteron düzeyini azalttığı spermatogenezi olumsuz yönde etkilediği saptandı. 
Ayrıca seminifer tübül germinal epitelinde atrofi ve apoptotik hücre ölümüne yol
açarak son derece önemli hasara yol açtığı gözlendi. Antioksidan özelliği ile ön
plana çıkan CH'in bu olumsuz etkileri nispeten azalttığı saptandı. Bu bulgular,
çevresel bir kirletici olan TCDD'nin erkek üreme sağlığını menfi anlamda
etkileyebileceğini ve buna karşı önlemler alınması gerekliliğinin olduğunu
göstermektedir.

Abstract:
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) that persists in the
environment for a long time is a prototype of dioxin family that contains 75 distinct
compounds having similar biological effects on organisms and causing toxicity
with same structural mechanism. TCDD has been employed as a standard in toxicity
assays due to its characteristic of being the most toxic one among those compounds.
TCDD existing also in exhaust and cigarette smoke is an environmental pollutant
which is a by-product of insecticide production and solid waste combustion of
municipalities. People generally take TCDD through nutrition and it tends to
accumulate in blood and adipose tissues due to its low degradability. International
Cancer Research Foundation has described TCDD as group I carcinogenic. TCDD
causes inflammation by increasing arachidonic acid from membrane phospholipids
and oxidative stress and also cell damage by producing reactive oxygen species
(ROS).
Being a naturally occurring flavone, chrysin (CH) has antioxidant, antiinflammatory,
anti-apoptotic and anti-viral effects. It is also known that chrysin has
vascular protective and spasmolytic effects.
The present study was designed to investigate the effects of CH on possible
oxidative testicular damage induced by TCDD.
 In this experimental study, 4-week-old 28 Wistar-Albino male rats
about 105-130 g weight were used. The rats were grouped into four random groups, 
i.e. Group I (Control), Group II (TCDD-treated), Group III (TCDD+CH-treated)
and Group IV (only CH-treated).
 Group II and III were treated with 25 μg/kg TCDD once a week
intraperitoneally (ip.). In addition, Group III and IV were treated daily with 50
mg/kg CH dissolved in olive oil through gavage feeding.
 After 5 weeks, all rats were weighed and decapitated under anaesthesia.
Testicle tissues were weighed immediately and fixated in Bouin's solution. For
biochemical examinations, blood samples were centrifuged and the serums were
stored at -20Ԩ for subsequent testosterone assay. Paraffin blocks from testicle
tissues were prepared for histological examination. 5 μm-thick cross-sections of
paraffin blocks were prepared and stained by using histochemical and TUNEL
techniques.
When compared with the control group, the groups of TCDD and
TCDD+CH showed statistically significant decrease in the percentage of body
weight variation and relative testicle weight. The difference between the groups CH
and control was found to be insignificant statistically.
 During the microscope examination, Spermatogenic cells forming
seminiferous tubule germinal epithelium and Sertoli cells, interstitial region and
Leydig cells were found to have normal appearance in testicular tissues of the
control group while atrophy in germinal epithelium, vacuolar degeneration,
separation among germ cells, giant spermatid cells and arrest in certain stages of
meiosis in some tubules were distinguished in tissues of TCDD-treated group.
Relative protective effect was observed in testicular tissues of the CH-treated group
against TCDD toxicity. Testicular cross-sections of only CH-treated group was
observed normally as in control group. 
Apoptotic cell death was examined by TUNEL staining and the labelling
results were observed as TUNEL (+) for control group, TUNEL (+++) for TCDD
group, TUNEL (+) for TCDD+CH and TUNEL (+) for CH group.
When compared to the control and CH groups, a significant decrease in
serum testosterone levels of the rats treated with TCDD or TCDD+CH was
observed. The difference between the control and CH group was found to be
insignificant statistically.
In conclusion, it was determined that TCDD toxicity decreased serum
testosterone level and had a negative impact on spermatogenesis. Moreover, it
caused serious cell damage that contain atrophy in seminiferous tubule germinal
epithelium and apoptotic cell death. Prominent with its antioxidant effect, CH
relatively reduced these negative impacts. These findings suggest that TCDD, an
environmental pollutant, can affect male reproductive health individually and there
is necessity for taking precautions against this threat.