İnsan adipoz kökenli mezenşimal kök hücre kaynaklı eksozom ve nanoveziküllerin, insan (HGRC1) ve sıçan (SIGC) granüloza hücre hatlarında siklofosfamid ile oluşturulan hasar üzerine koruyucu etkisinin incelenmesi
Investigation of the protective effect of human adipose mesenchymal stem cells-derived exosomes and nanovesicles against cyclophosphamide-induced damage on human (HGRC1) and rat (SİGC) granulosa cell lines
Yazar: MUSTAFA ÖZTATLICI
Danışman: PROF. DR. MAHMUT KEMAL ÖZBİLGİN
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Eksozomlar = Exosomes ; Granüloza hücreleri = Granulosa cells ; Hücre dizisi = Cell line ; Kök hücreler = Stem cells ; Siklofosfamid = Cyclophosphamide ; İlaç tedavisi = Drug therapy

Özet:
Amaç: Bu çalışmada, in vitro şartlarda hem insan (HGrC1) hem de sıçan (SIGC) granüloza hücre hatlarında 4-hidroperoksi siklofosfamit (4-HC) ile apoptoz indüklenerek ADMSC'lerden elde edilen eksozom (EXO) ve nanoveziküllerin (NV) antiapoptotik ve terapötik etkilerinin incelenmesi amaçlanmaktadır.
Gereç ve Yöntem: ADMSC'lerden EXO ve NV'ler izole edilerek karakterizasyonları flow sitometri yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. EXO ve NV'ler, HGrC1 ve SIGC hücre hatları ile hem tek başlarına hem de 4-HC ile birlikte kokültüre edilerek hücre canlılığı MTT yöntemi kullanılarak tespit edildi. Tüm uygulamalar sonrası apoptoz (Kaspaz 3, Bax ve Bcl-2) ve hücre proliferasyon (Ki-67) belirteçlerinin hem protein hem de mRNA ifade seviyeleri indirekt immunositokimya ve qRT-PCR yöntemleri ile analiz edildi. Ayrıca tüm gruplardaki hücre döngüsü analizleri flow sitometri yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi.
Bulgular: ADMSC EXO ve NV'lerinin tek başlarına HGrC1 ve SIGC hücre hatları ile kokültüre edilmesi sonrası granüloza hücre proliferasyonlarını indükledikleri saptandı. Her iki hücre hattında da 4-HC grubuna kıyasla 4-HC ile birlikte EXO ve NV ile kokültüre edilen gruplardaki Kaspaz 3 ve Bax ifadelerinin azaldığı Bcl-2 ve Ki-67 ifadelerinin ise arttığı tespit edildi. Buna ek olarak EXO ve NV'ler ile kokültüre edilen gruplarda S fazında tutulan hücre yüzdelerinin azaldığı, G2/M fazındaki hücre yüzdelerinin ise arttığı gözlendi.
Sonuçlar: EXO ve NV'lerin, her iki granüloza hücre hattı üzerinde de sitostatik veya sitotoksik etkilerinin olmadığı, 4-HC'nin apoptotik etkisine karşı koruyucu kapasitelerinin olduğu ve bununla birlikte granüloza hücre proliferasyonunu indükledikleri gözlendi. Bu çalışma ile literatürde ilk defa ADMSC'lerden yapay olarak elde edilen NV'lerin, EXO'lar gibi benzer terapötik etkinliklerinin olduğu gösterildi. Bu sonuçlar, EXO ve NV'lerin, POI'nin önlenmesi ve tedavisinde etkili ve yeni bir yöntem olabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Aim: In this study, it is aimed to investigate the antiapoptotic and therapeutic effects of exosomes (EXO) and nanovesicles (NV) derived from ADMSCs by inducing apoptosis with 4-hydroperoxy cyclophosphamide (4-HC) in both human (HGrC1) and rat (SIGC) granulosa cell lines under in vitro conditions.
Material and method: EXOs and NVs were isolated from ADMSCs and their characterization was performed using flow cytometry method. EXOs and NV's were cocultured with HGrC1 and SIGC cell lines both alone and together with 4-HC and cell viability was determined by using the MTT method. After all applications, both protein and mRNA expression levels of apoptosis (Caspase 3, Bax and Bcl-2) and cell proliferation (Ki-67) markers were analyzed by indirect immunocytochemistry and qRT-PCR methods. Moreover, the cell cycle analyzes in all groups were performed by using flow cytometry method.
Results: It was determined that EXOs and NVs derived from ADMSC induced granulosa cell proliferation after coculturing with HGrC1 and SIGC cell lines. In both cell lines it was found that Caspase 3 and Bax expressions decreased and Bcl-2 and Ki-67 expressions increased in the groups which cocultured EXOs and NVs together with 4-HC compared to the only 4-HC group. In addition, it was observed that the percentage of cells kept in S phase decreased and the percentage of cells in the G2/M phase increased in the groups cocultured with EXOs and NVs.
Conclusions: It was found that EXOs and NVs had no cytostatic or cytotoxic effects on both granulosa cell lines, they had protective capacities against the apoptotic effect of 4-HC and they also induced granulosa cell proliferation. It was found that EXO and NV do not have cytostatic or cytotoxic effects on both granulosa cell lines, they have protective capacities against the apoptotic effect of 4-HC and they also induced granulosa cell proliferation. With this study, it was shown for the first time in the literature that artificially generated NVs from ADMSCs have similar therapeutic effects like EXOs. These results suggest that EXO and NV's can be an effective and new method in the prevention and treatment of POI.