Terpinolen'in insan glioma hücrelerindeki stres proteinleri üzerine etkileri
Effects of Terpinolene on stress proteins in human glioma cells
Yazar: ALPER ÇALIŞKAN
Danışman: PROF. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Neoplazm hücreleri = Neoplastic cells ; Stres proteinleri = Stress proteins

Özet:
Gliomalar hem yetişkinlerde hem de çocuklarda en sık görülen beyin tümörü tipidir. Cerrahi
müdahale, kemoterapi ve radyoterapi uygulamalarına rağmen, gliomalar nüks edebilen en
malignant tümörler arasında yer almaktadır. Diğer kanser türlerinde olduğu gibi, gliomalarda
da bazı proteinlerin anlatım seviyelerinin değiştiği bilinmektedir.
Isı şoku proteinleri (HSP), stres koşullarına tepki olarak hücreler tarafından sentezlenen
moleküler şaperonlardır ve birçok tümörde anlatımlarının arttığı saptanmıştır. Protein
katlanması, proteinlerin hücre içerisinde taşınması, hücre döngüsünün düzenlenmesi gibi
fonksiyonları üstlenen HSP'lerin, kanser başlangıcı, ilerlemesi ve metastazında da çok önemli
roller oynadığı kanıtlanmıştır. Benzer şekilde hücre içinde birçok farklı foksiyonu üstlenen 14-
3-3 proteinlerinin de kanser hücrelerinde anlatımlarının değiştiği gösterilmiştir. Yapılan
çalışmalarda glioma hücrelerinde, bazı HSP'lerin (Hsp27, Hsp70 vb.) ve 14-3-3 izoformlarının
anlatımlarının arttığı ortaya konulmuştur. Hücre içi anlatım seviyesi artmış bu proteinlerin
hücre proliferasyonu, apoptoz inhibisyonu ve kemoterapi direnci ile ilişkili olduğu
bildirilmiştir.
Günümüzde kullanılan kemoterapi ajanları, sağlıklı hücreler üzerinde istenmeyen yan etkiler
ortaya koymaktadır. Bu nedenle son yıllarda tedavi sürecindeki yan etkileri hafifletebilecek ve
tedaviye yardımcı olarak kullanılabilecek doğal bileşiklerin belirlenmesi önem kazanmıştır.
Esansiyel yağlarda bulunan bir terpenoid alt sınıfı olarak, monoterpenler kanser araştırmalarında kullanılan doğal bileşikler olarak literatüre girmiştir. Bu tez çalışmasında
monoterpen ailesinin bir üyesi olan terpinolenin, U87-MG insan glioma hücrelerindeki bazı
proteinlerin anlatım seviyelerinin değişimleri üzerindeki etkileri ilk kez değerlendirilmiştir.
Bu kapsamda öncelikle terpinolenin U87-MG hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri
incelenmiştir. Hücrelere faklı konsantrasyonlarda uygulanan terpinolenin 24, 48 ve 72 saatlik
toksik etkileri MTT yöntemi ile değerlendirilmiş ve IC50 değerleri sırasıyla 1816 µM, 1412 µM
ve 2218 µM olarak saptanmıştır. Deneysel çalışmalarda kullanılacak terpinolen
konsantrasyonlarının, 500 μM (hücreler üzerinde herhangi bir toksik etkisi bulunmayan doz)
ve 1000 μM (%25 hücre ölümüne neden olan doz) olmasına karar verilmiştir. Hücrelere 48 saat
süreyle terpinolen uygulanmasını takiben hücre içi bazı proteinlerin (HSP60, HSP70, HSP90,
14-3-3 ζ, 14-3-4 τ/θ ve PARP) anlatım seviyelerinin değişimi immünolojik analizlerle
incelenmiştir. Kontrol grubuna kıyaslanarak gerçekleştirilen analizlere göre terpinolen
uygulamalarının HSP60, HSP70 ve HSP90 anlatımlarını istatistiksel açıdan anlamlı bir şekilde
düşürdüğü saptanmıştır. Bununla birlikte 1000 μM terpinolen uygulamasına bağlı olarak 14-3-
3 ζ ve 14-3-4 τ/θ izoformlarının anlatımlarının azaldığı belirlenmiştir. Apoptotik bir belirteç
olan PARP proteininin ise hem 500 μM hem de 1000 μM terpinolen uygulamasına bağlı olarak
istatistiksel açıdan anlamlı bir şekilde attığı görülmüştür.
Bu tez kapsamında terpinolenin U87-MG hücrelerindeki HSP60, HSP70, HSP90, 14-3-3 ζ ve
14-3-3 τ/θ proteinlerinin anlatım seviyelerini azalttığı, apoptoz sinyal yolağının son
basamaklarından biri olan PARP proteininin anlatım seviyesini ise arttırdığı saptanmıştır.
Özellikle glioma hücresine sağ kalım avantajı sağladığı bilinen proteinlerin anlatımlarının
terpinolen aracılığıyla düşürülmüş ve hücrelerin apoptoza yönlendirilmiş olması, bu
monoterpenin kanser tedavisinde kullanım olasılığını arttırmaktadır. Bu bağlamda terpinolenin
moleküler etki mekanizmalarının aydınlatılması için yeni çalışmaların yapılması
gerekmektedir.

Abstract:
Gliomas are the most common type of brain tumor in both adults and children. Despite surgical
intervention, chemotherapy and radiotherapy, gliomas are among the most malignant tumors
with the highest recurrence rate. As in other types of cancer, it is known that the expression
levels of some proteins change in gliomas.
Heat shock proteins (HSP) are molecular chaperones synthesized by cells in response to stress
conditions, and their expression is increased in many tumors. It has been proven that HSPs,
which undertake functions such as protein folding, protein transport within the cell, regulation
of the cell cycle, also play very important roles in cancer initiation, progression and metastasis.
Similarly, it has been shown that the expression of 14-3-3 proteins, which take on many
different functions in the cell, also changes in cancer cells. Studies have shown that expression
of some HSPs (Hsp27, Hsp70, etc.) and 14-3-3 isoforms are increased in glioma cells. It has
been reported that these overexpressed proteins are associated with cell proliferation, inhibition
of apoptosis and chemotherapy resistance.
Chemotherapy agents used today reveal undesirable side effects on healthy cells. For this
reason, it has gained importance in recent years to identify natural compounds that can alleviate
the side effects in the treatment process and that can be used as an adjunct to treatment. As a
terpenoid subclass found in essential oils, monoterpenes have entered the literature as natural compounds used in cancer research. In this thesis, the effects of terpinole, a member of the
monoterpene family, on the changes in expression levels of some proteins in U87-MG human
glioma cells were evaluated for the first time.
In this context, first of all, the cytotoxic effects of terpinole on U87-MG cells were investigated.
The toxic effects of terpinole applied to cells at different concentrations at 24, 48 and 72 hours
were evaluated by MTT method and IC50 values were determined as 1816 µM, 1412 µM and
2218 µM, respectively. The terpinolene concentrations to be used in experimental studies were
decided to be 500 μM (dose without any toxic effect on cells) and 1000 μM (dose causing 25%
cell death). Changes in expression levels of some intracellular proteins (HSP60, HSP70,
HSP90, 14-3-3 ζ, 14-3-4 τ/θ and PARP) following terpinolene treatment to cells for 48 hours
were investigated by immunological analysis. According to the analyzes performed by
comparing the control group, it was determined that terpinolene applications significantly
decreased the expression of HSP60, HSP70 and HSP90. However, it was determined that the
expressions of 14-3-3 ζ and 14-3-4 τ/θ isoforms decreased depending on the application of 1000
μM terpinolene. It was observed that PARP protein, which is an apoptotic marker, increased
statistically significantly depending on both 500 μM and 1000 μM terpinolene treatment.
Within the scope of this thesis, it was determined that terpinole decreased the expression levels
of HSP60, HSP70, HSP90, 14-3-3 ζ and 14-3-3 τ/θ proteins in U87-MG cells and increased the
expression level of PARP protein, which is one of the last steps of the apoptosis signaling
pathway. In particular, the expression of proteins known to provide survival advantage to
glioma cells is reduced by terpinolene and the cells are directed to apoptosis, increasing the
possibility of using this monoterpene in cancer treatment. In this context, new studies are
needed to elucidate the molecular action mechanisms of terpinole.