Tricholoma caligatum (Viv.) Ricken ve T. fracticum (Britzelm.) Kreisel türlerinden biyoaktivite gösteren sekonder metabolitlerin izolasyonu ve yapılarının aydınlatılması
Isolation and structure elucidation of bioactive secondary metabolites from Tricholoma caligatum (Viv.) Ricken and Tricholoma fracticum (Britzelm.) Kreisel
Yazar: EBRU EROL
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Sitotoksik etki = Cytotoxic effect ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Ricken ve Tricholoma fracticum (Britzelm.), Tricholomataceae (matsutake) ailesinin ve Tricholoma cinsinin bir üyesi olup, Muğla yöresinde doğal olarak yayılış gösteren mantarlardır. Bu doktora tez çalışması kapsamında bu iki mantar türünün biyoaktivite gösteren sekonder metabolitlerinin izolasyonu amaçlanmıştır. Bu amaçla, toplanan mantar örnekleri gölgede kurutulduktan sonra öğütüldü ve maserasyon yöntemi ile sırasıyla petrol eteri, aseton, metanol ile ekstre edilerek çözücüleri vakum altında döner buharlaştırıcıda kuruluğa kadar uçuruldu. Geri kalan mantar kalıntısı 80 °C'de su ile ekstre edildi. Soğutulduktan sonra filtre edilen su ekstresi hacminin üç katı kadar etanol ile karıştırılıp büyük moleküllerin çökmesi sağlandı. Çöken kısım süzülerek HWEP kodu verilirken, etanol ile çözünen kısmın çözücüsü döner buharlaştırıcıda kuruluğa kadar uçurulup HWES kodu verildi. Elde edilen ekstrelerin β-karotenlinoleik asit, DPPH serbest radikali giderimi, ABTS katyon radikali giderimi, CUPRAC, metal bağlama yöntemleri ile antioksidan aktiviteleri ve HepG2 hücre hattında reaktif oksijen türleri (ROT) inhibisyonuyla hücresel antioksidan potansiyelleri test edildi. Elde edilen ekstrelerin antienflamatuvar potansiyelleri NF-κB inhibisyon (nükleer transkripsiyon faktörü κB), iNOS inhibisyon (endüklenebilir nitrik oksit sintazı), NAG-1 inhibisyon (NSAID'ler ile aktive edilmiş geni-1) ve Nfr-2 aktivitesi (nükleer faktör eritroid 2 ile ilişkili faktör 2) gibi bir dizi hücresel deney ile analiz edildi. Ayrıca, ekstrelerin sitotoksik aktivitesi akciğer (H1299) ve meme kanser hücresi (MCF-7) ile fibroblast (L929) hücre hatlarına karşı WST-1 metoduyla belirlendi. Sitotoksik aktivite aynı hücre hatlarına karşı gerçek zamanlı hücre proliferasyonları ile desteklendi. Ekstrelerin apoptoz ve nekroz testleri ise ikili boyama yöntemiyle yapıldı.
Antioksidan ekstreler silika jel ve Diaion HP-20 kolon dolgu maddeleri kullanılarak fraksiyonlandırıldı. Fraksiyonlardan madde izolasyonu DPPH• ve ABTS•+ giderim aktiviteleri kontrollü olarak yapıldı. İzole edilen maddelerin yapıları UV, FTIR, 1D-, 2D-NMR ve MS spektroskopisi teknikleri ile tayin edildi. T. caligatum'un petrol eteri ekstresinden ergosterol, trametenolik asit (1), ergosterol peroksit (2) ve 5α,6α-epoksiergosta-7,22-dien 3β-ol; T. caligatum'un aseton ekstresinden 5α,6α-epoksi ergosta-7,22-dien 3β-ol, Cerebroside B (3), trametenolik asit, T. caligatum'un metanol ekstresinden lasvicol (4), 8-epi-lasvicol (5), 8-demetoksilasvicol (6), (4'R)-caligalactam (7), (4'S)-caligalactam (8), fenilalanin (9), α-D-glukopiranoz (11) izole edilerek yapıları aydınlatıldı. T. fracticum'un aseton ekstresinden ise üridin (12), adenosin (13), 5α,6α-epoksi-ergosta-7,22-dien 3β-ol (14), fumarik asit ve T. fracticum'un metanol ekstresinden de cerebrosides B, Len II (15), fumarik asit (16), üridin, 5α,6α-epoksi ergosta-7,22-dien 3β-ol, ergosterol (17) maddeleri izole edildi ve yapıları aydınlatıldı. Ayrıca, T. caligatum'un metanol ekstresi fraksiyonlarından lasvicol maddesi bakımından zengin fraksiyon kullanılarak yarı-sentez reaksiyonu ile 5-metoksi-2,4-dimetilindol (10) bileşiği sentezlendi. Literatür taraması sonucu, her iki mantar türünden 17 farklı madde olmak üzere toplamda 25 madde izole edildi ve bu maddeler arasından 5, 6, 7 ve 8 kodlu maddelerin yeni maddeler oldukları belirlendi. Elde edilen maddelerin (1-25) NF-κB inhibisyon ve iNOS inhibisyon yöntemleri ile antienflamatuvar, ROT inhibisyonuyla hücresel antioksidan potansiyelleri test edildi. Ergosterol (7,5 μg/mL), ergosterol peroksit (4,5 μg/mL), trametanolik asit (14.0 μg/mL), Len II (12 μg/mL) ve 8-demetoksilasvicol (15.0 μg/mL) maddeleri iNOS inhibisyonu aktivitesini standarda en yakın olarak gösterirlerken, sadece ergosterol (16.0 μg/mL) NF-kB inhibisyonu aktivitesi gösterdi. 
Bu doktora tez çalışması, Tricholoma caligatum (Viv.) Ricken ve Tricholoma fracticum (Britzelm.) mantarlarının sekonder metabolitleri üzerine yapılan ilk araştırma olup tüm maddeler bu türlerden ilk defa izole edildi. Ayrıca, her iki mantar türünün antienflamatuvar potansiyelleri ilk kez bu çalışma ile belirlendi ve literatüre 4 yeni madde kazandırıldı.

Abstract:
members of Tricholomataceae (matsutake) family, and the genus Tricholoma is naturally distributed in Mugla region in our country. In this thesis, it was aimed to isolate of the bioactive secondary metabolites of two mushrooms. For this purpose, the collected mushroom samples were dried under shadow, milled and extracted with petroleum ether, acetone and methanol, successively using maceration method. The solvents were evaporated to get the crude extracts using rotary evaporator under vacuum. The remaining mushroom residue was extracted with hot water at 80 °C. After cooled, the filtered water part was mixed three-fold of ethanol to precipitate the ethanol insoluble molecules. The ethanol-insoluble extract was filtered and coded as HWEP. The solvent of the ethanol-soluble part was evaporated to dryness using rotary evaporator, and the crude extract was coded as HWES. The obtained extracts were tested for their antioxidant activity using β-carotene-linoleic acid, DPPH free radical scavenging, ABTS cation radical scavenging, CUPRAC and metal chelating methods. Cellular antioxidant potentials of the extracts were also tested by reactive oxygen species (ROT) inhibition in HepG2 cell lines. The anti-inflammatory activity of mushrooms extracts was tested through a series of cellular assays targeting NAG-1 inhibitory (NSAIDs-activated gene-1), NF-κB inhibitory (nuclear transcription factor κB), iNOS inhibitory (inducible nitric oxide synthase) and NRF-2 (the nuclear factor erythroid 2–related factor 2) assays. In addition, the cytotoxic activity of the extracts was determined by WST-1 method against lung cancerous (H1299), and breast cancerous (MCF-7), and fibroblast (L929) cell lines. Cytotoxic activity was verified by real-time cell proliferation against same cell lines. Apoptosis and necrosis tests of the extracts were done by double staining method. 
Antioxidant extracts were fractionated over silica gel and Diaion HP-20 packing materials using column chromatography. The isolation of bioactive compounds from the extracts were performed by activity guided fractionation of DPPH• and ABTS•+ scavenging assays. The structures of the isolated compounds were elucidated using UV, FTIR, 1D-, 2D-NMR and MS spectroscopy techniques. The petroleum ether extract of T. caligatum afforded ergosterol, tramethanolic acid
(1), ergosterol peroxide (2) and 5α,6α-epoxy-ergosta-7,22-diene 3β-ol while the acetone extract of T. caligatum gave 5α,6α-epoxy-ergosta-7,22-diene 3β-ol, cerebrosides B (3), trametenolic acid and the methanol extract of T. caligatum possessed lasvicol (4), 8β-lasvicol (5), 8-demethoxylasvicol (6), 4'(R)-caligalactam (7), 4'(S)-caligalactam (8), phenylalanine (9), α-D-glucopyranose (11). The acetone extract of T. fracticum, however, afforded uridine (12), adenosine (13), 5α, 6α-epoxy ergosta-7,22-diene-3β-ol (14), fumaric acid and the methanol extract of and T.fracticum gave cerebroside B, Len II (15), fumaric acid (16), uridine, 5α, 6α-epoxy ergosta-7,22-diene-3β-ol and ergosterol (17). Furthermore, 5-methoxy-2,4-dimethylindole (10) was synthesized by semi-synthetic reaction using lasvicol rich methanol extracts fraction of T. caligatum. As a result of the literature review, a total of 25 compounds were isolated from both mushroom species. Among them, 17 of which have different class and the compounds coded 5, 6, 7 and 8 were isolated for the first time in this study. The iNOS and NF-κB inhibitory activities of isolated compounds (1-25) were evaluated for their antiinflammatory activity. Furthermore, the antioxidant activity of 1-25 was carried out by ROS. Ergosterol (7.5 μg/mL), ergosterol peroxide (4.5 μg/mL), trametenolic acid (16.0 μg/mL) which are closest to that of standards exhibited inhibitory activity of iNOS, while only ergosterol (16.0 μg/mL) was active to inhibit NF-kB.
This was the first study on the secondary metabolites of Tricholoma caligatum (Viv.) Ricken and Tricholoma fracticum (Britzelm.) Kreisel. In addition, antiinflammatory potentials of both mushroom species were studied for the first time. What's more, 4 new compounds were added to the literature.