Sülfür mustard yakıcı ajanının biyobelirteçlerinin ölçüm yönteminin optimize edilmesi
Optimizing measurement methods of sulfur mustard biomarkers
Yazar: RUŞEN KORAY EYİSON
Danışman: PROF. DR. LEVENT KENAR
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Gülhane Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kimyasal Biyolojik Radyolojik ve Nükleer Tıbbi Savunma Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Savunma ve Savunma Teknolojileri = Defense and Defense Technologies ; İlk ve Acil Yardım = Emergency and First Aid
Dizin: Biyokimyasal analiz = Biochemical analysis ; Gaz kromatografisi = Gas chromatography ; Hardal = Mustard ; Kimya teknikleri-analitik = Chemistry techniques-analytical ; Kimyasal silahlar = Chemical weapons ; Kromatografi-gaz = Chromatography-gas ; Kükürt = Sulfur ; Spektrofotometri = Spectrophotometry ; Yanıklar-kimyasal = Burns-chemical

Özet:
Sülfür mustard  (2,2'-diklorodietil sülfür, bis-2,2'-dikloroetil sulfür, HD), harp halinde silah olarak kullanılan ve kimyasal savaş (KS) maddeleri arasında en yaygınlarıdır. Bu maddeler solunum ve cilde temas sonucu emilimle alınırlar. Gözleri, solunum sistemini ve deriyi öncelikle tahriş ederek sonrasında da hücresel zararla etkilerler. Hayatı tehdit edici ciddi ve geniş deri yanıklarına neden olmaları sebebiyle yakıcı ajanlar olarak isimlendirilirler. 
Sülfür mustard (SM)'ın ilk sentezi 1822 yılında Alman bilim adamı Despretz tarafından yapıldı. İlk kez, 1917 yılında, Ypres'de Alman ordusu tarafından Kanada ve İngiliz ordusuna karşı I. Dünya Savaşında kullanıldı. O zamandan beri hem terör amaçlı hem de savaşlarda (İran-Irak Savaşı-Halepçe,1988) en çok tercih edilen kimyasal savaş ajanı olmuştur. 21 Ağustos 2015 tarihli Marea-Suriye'de sivil halka karşı Sülfür mustard içeren top mermileriyle ve 8 Mart 2016 tarihinde Tazahurmatu-Irak'da sivil halka karşı Sülfür mustard içeren roketlerle saldırı düzenlenmiştir. Özellikle İran-Irak (1980-1988) savaşında yaygın bir şekilde kullanılmış ve 100,000 den fazla yaralıya neden olmuştur. Bununla birlikte uzamış etkileri nedeniyle bu yaralılardan 30,000'den fazlasının ölümüne yol açmıştır. Sülfür mustard maruziyeti sonrası hayatta kalabilen yaklaşık 70,000 den fazla İranlı halen tıbbi tedavi görmeye devam etmektedir.
Birleşmiş Milletler Genel Sekreterliği tarafından 1997 yılında yürürlüğe koyulan ve 150'den fazla ülkenin imzaladığı Kimyasal Silahlar Sözleşmesine göre bu tehlikeli maddelerin üretimi, depolanması ve geliştirilmesi yasaklanmış olmasına rağmen alınan istihbarat raporlarına göre bu kimyasal harp maddesinin günümüzde de tehdit olmaya devam ettiği ve her an kullanılma potansiyelinin bulunduğu değerlendirilmektedir. Kan ve idrar gibi biyomedikal örneklerde biyolojik belirteçlerin analizinin yapılması bu kimyasal savaş ajanının ortamda kullanılıp kullanılmadığına ilişkin kanıtları sağlamak ve tedavi öncesinde tanısını koymak için gereklidir. ABD, İngiltere, Almanya, Rusya, Çin, Finlandiya, İsveç ve Hollanda gibi başlıca ülkelerde bulunan gelişmiş ve KSYÖ tarafından akredite edilmiş laboratuvarlarda, bu maddelere yönelik spesifik çalışmalar günümüzde yapılmaya devam etmektedir. 
Bu ajanların gerek çevresel gerekse biyolojik örneklerde saptanması için spesifik olarak Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (GC-MS) ve Likid Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (LC-MS) kullanılmaktadır. Birleşmiş Miletler bünyesinde yer alan Kimyasal Silahların Yasaklanması Örgütü (Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons, OPCW) tarafından kimyasal savaş ajanlarının tanısına yönelik araştırmalar büyük bir ciddiyetle ve tüm dünyada üye laboratuvarların katılımıyla sürdürülmektedir.  Bu kapsamda, bu tez ile mevcut tehdidi değerlendirerek oluşabilecek kaza veya kötü niyetli kullanımlarda Sülfür mustard maruziyetinin kesin tanısını koyabilmek ve yukarıda belirtilen deneyimli laboratuvarlar arasında ülke olarak yerimizi alabilmeyi öngörmekteyiz.
Bu çalışmada, sülfür mustard (SM) maruziyetini kesin olarak gösteren bir biyobelirteç olarak ajanın glutatyon (GSH, vücudun başlıca antioksidanı olarak bilinmekte olup sistein, glisin ve glutamat amino asitlerinden oluşur ve insan vücudunun hemen her hücresinde bulunabilir)  ile reaksiyonu sonucu oluşan metabolitleri (SBMTE, MSMTESE ve SBMSE) GCMSMS ile analiz edilmiştir. Bu kapsamda Beta Liyaz metabolitleri idrar numunesinde çalışılmıştır. 
Tez çalışmasında kullanılan GCMSMS (gaz kromatografisi ardışık kütle spektrometresi) cihazı, ileri düzey kromatografik bir cihazdır. Deteksiyon limitlerinin düşük olması ve ölçüm kesinliğinin fazla olması gibi nedenlerle günümüzde kimyasal savaş ajanlarının ve bunların parçalanma ürünlerinin analizinde sıklıkla tercih edilen bir cihazdır. Yöntemde, çeşitli ön işleme tabi tutulmuş numune enjeksiyonu yapılan GC ile ayrımı yapılan analit molekülleri MS kısmına gönderilerek moleküllerin o maddeye spesifik iyonlarına parçalanması sağlanır. Literatür çalışması yapılarak çalışmada kullanılan kimyasallar, GCMSMS çalışma şartları ve uygulanan ön işlemler belirlenmiş olup, GC ve MS şartları, enjeksiyon sonrası alınan sonuçlara göre modifiye edilerek optimizasyon sağlanmaya çalışılmıştır.

Abstract:
Sulfur mustard (2,2'-dichlorodiethyl sulfide,HD) is one of the mostly used chemical warfare agents. These toxic agents are absorbed through inhalation and via skin after the exposure. In addition to the toxic effect  on eyes, respiratory system and skin, it furtherly affects the cellular membrane. It's also named as vesicating agent due to its life threatening effect causing serious and severe skin burns. 
Sulfur mustard which was firstly synthsized in 1822 by German scientist Despretz was commonly by German Forces against Canada and British Armies in 1917 of First World War. Since this time, it has been the choice of chemical weapon used in both terror incidents and battlefield conflicts (mainly at Halabja in war between Iran and Iraq). At recent times, attacks by Syria including sulfur mustard in Marea on 21 August 2015 and rocket missiles with mustard agent against civilian people in Tazahurmatu-Iraq on 08 March 2016 were recorded in history of chemical warfare. It was particularly used in Iran-Iraq war(1980-1988) and caused victims more than 100.000. Prolonged effects of SM exposure complicated death of 30.000 of those victims and the other 70.000 Iranian people who survived are still undergo medical treatment and care.
Chemical weapons convention which was signed by more than 150 States throughout the World and put into force by United Nations General Secretary in 1997 has addressed that the production, storage and development of these chemical toxic materials is thouroughly prohibited. However, intelligency reports state that this chemical warfare agent has been possesed by some of our neighbouring countries and some terrorist groups supported by some states. Therefore, in any incident by chemical warfare agent, performing the analysis of biological indicators in biomedical samples like blood and urine is so important in terms of the proper identification of the agent and providing the evidences leading the accurate first-aid and treatment. In accredited and developed laboratories in countries including USA, UK, Germany, Russia, China, Rebuplic of Czech, Finland, Sweden and the Netherlands, specific research and studies on Chemical Warfare Agents are still continuing to be performed. 
Instruments like gas chromatography-mass spectrometry (GCMS) and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LCMS) have been used as the essential instruments for the detection and identification of these agents. Research and development has been generally conducted by specific laboratories of member states via Proficiency Tests seriously organized by OPCW. The origin of the present project is to be able to put a definite diagnosis of Sulfur Mustard in incidents or bad intentions that may arise from evaluating the next danger and to become more steps furthers as the reference CBRN laboratory for chemical weapon identification in our country in behalf of proper detection and diagnosis of sulfur mustard exposures and application of this is expected as another profit from this Project.
In this Project, the analyses of metabolites of gluthatione derivatives (SBMTE, MSMTESE ve SBMSE) were carried out via GCMSMS as the certain bioindicators of sulfur mustard exposure. Glutathione (GSH) is often referred to as the body's master antioxidant. Composted of three amino acids - cysteine, glycine, and glutamate - glutathione can be found in virtually every cell of the human body. The mentioned metabolites like β-lyase products are aimed to study from the urine samples.
GCMSMS (Gas chromatography tandem mass spectrometry) is a high tech instrument which uses an analytical technique to quantify the bioactive compounds present in any sample. It is also a cost effective method which has very-low detection limits with high precision values and high accuracy and is commonly used in the laboratory detection of chemical warfare agents. In this technique, analyte molecules seperated on GC via sample injection are delivered to MS section of the instrument where these molecules are decayed to specific ions. GCMSMS conditions, preconditioning and sampling procedures are entirely specified and GCMS runing conditions have been modified and optimized following the results obtained after injections.