Termofilik Geobacillus sp. DF20 suşundan esterazın saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of esterase from a thermophilic bacterium, Geobacillus sp. DF20
Yazar: ESRA ÖZBEK
Danışman: PROF. DR. AHMET ÇOLAK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Esterazlar = Esterases ; Karakterizasyon = Characterization ; Saflaştırma = Purification ; Termofilik bakteriler = Thermophilic bacteria ; İyon değişim kromotografisi = Ion exchange chromatography

Özet:
Bu çalışmada, Q-Sapharose iyon değişim kromotografisi ile termofilik Geobacilillus sp. DF20 suşundan esteraz saflaştırıldı ve karakterize edildi. Saflaştırılan enzim doğal PAGE' de çift bant halinde gözlendi ve substrat boyama ile bu bantların esteraz olduğu kanıtlandı. Enzim maksimum aktivitesini, substrat olarak p-nitrophenyl butirat (pNPB) kullanıldığında pH 7,0 ve 50 °C'de gösterdi. Km ve Vmaks değerleri sırasıyla 0,120 mM ve 54,6 U/mg protein olarak hesaplandı. Enzimin +4oC, 50oC ve 70oC sıcaklıklarında yapılan kararlılık denemelerinde 5.saat sonunda 70oC`de aktivitesini tamamen kaybettiğini 72 saat sonunda ise +4oC'de aktivitenin %100 korunurken 50oC'deki aktivitenin azaldığı görülmüştür. pH kararlılık denemelerinde +4oC sıcaklıkta pH 5 ve pH 7'de yapılan denemelerde 5 günlük inkübasyonda enzim aktivitesinin düştüğü fakat pH 5'deki aktivitenin daha yüksek olduğu görülmüştür; optimum sıcaklık olan 50oC'de pH 5 ve pH 7'de yapılan kararlılık denemelerinde 2.gün sonunda pH 5'de hiç aktivite kalmazken pH 7'de ise aktivitenin 3.gün sonuna kadar %100 korunduğu gözlenmiştir. Bazı metal iyonu ve kimyasalların enzim aktivitesi üzerine etkisi ayrıca incelenmiştir.Bu çalışmadan elde edilen veriler saflaştırılan esterazın bazı çözücüler varlığında aktivite göstermesi ve bunun yanında pH ve ısıl kararlı olması onu bazı endüstriyel uygulamalarda kullanışlı olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
The esterase from a thermophilic bacterium, Geobacillus sp. DF20, was purified using Q-Sepharose ion exchange column and characterized. Native polyacrilamid gel electrophoresis stained by p-naphtyl acetate and Fast Blue B indicated the presence of two active esterase. Enzyme show highest activity in presence of p-nitrophenyl butirate (p-NPB) as a substrate at pH 7.0 and 50 ? C. The Km and Vmax values of the enzyme were calculated as 0.120 mM and 54.6 U/mg protein, respectively. The stability experiments of enzyme were carried out at +4 ? C, 50 ? C and 70 ? C. At the end of 5th hour, the enzyme lost the activity at 70 ? C. By the end of 72 hours, while the activity was protecting 100%, the activity had decreased at 50 ? C.When the enzyme incubated in buffer solution pH 5.0 and 7.0 at 4 ? C, the enzyme retained its original activity 70% and 50% respectively after 3 days. At 50 ? C, the enzyme activity lost its activity at pH 5.0 after 2 days incubation and conserved 95% its activity after 3 days. The effects of metal ions and some chemicals on the activity were also investigated.These data support that the esterase from Geobacillus sp. DF20 has some advantages for industrial or biotechnological applications.