Ganoderma lucidum ekstraktının karbonmonoksit zehirlenmesi oluşturulmuş fare modelinde kalp üzerindeki etkilerinin histopatolojik olarak incelenmesi
Histopathological investigation of the effects of ganoderma lucidum extract on the heart in a mouse model of carbon monoxide poisoning
Yazar: TUĞBA YILMAZ
Danışman: PROF. DR. AYTEN TÜRKKANI
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Gülhane Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Amaç: Karbonmonoksit zehirlenmesi dünya genelinde zehirlenmeye bağlı mortalite ve morbiditenin en yaygın nedeni olarak kabul edilmektedir. Karbonmonoksit zehirlenmesinde nörolojik ve kardiyovasküler tutulum morbidite ve mortaliteden önemli ölçüde sorumludur. Karbonmonoksit kaynaklı toksisitenin kesin bir antidotu bulunmamakla birlikte güncel tedavi normobarik veya hiperbarik oksijen uygulamasıdır. Bu tedavilerin kalp tutulumu ve mortaliteye etkileri tartışmalıdır. Kültür mantarları arasında, Gonaderma Lucidum besin değerinden ziyade farmasötik değeri ön planda olan ve yıllardır tıbbi kullanımı mevcut bir mantar türüdür. Çalışmamızın amacı; kalp hasarına neden olan fakat henüz net bir tedavisi bulunamayan karbonmonoksit zehirlenmesinde kardiyotoksik hasarın önlenmesi veya azaltılmasına yönelik yeni bir bitkisel ajanın etkilerini araştırmaktır. Bu sebeple yüksek doz karbonmonoksitin kalp dokusunda meydana getirdiği hasarın ve Ganoderma Lucidum'un bu hasar üzerine doz bağımlı etkilerinin histolojik ve biyokimyasal yöntemlerle ortaya konulması hedeflenmiştir. 
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda, karbonmonoksit zehirlenme modeli uygulanarak tedavi gruplarına 9 gün oral gavaj ile Ganoderma Lucidum verilmiş; 10. günde sakrifiye edilmiş olan toplam 20 adet farenin sakrifikasyon sonrası arşiv kalp dokuları kullanılmıştır. Eksize edilen kalplerin ventriküllerinden, sistematik rastgele örnekleme ile frozen kesitler alınarak histokimyasal boyama yapılmış ve bağ dokusu miktarı FIJI programı ile analiz edilmiştir. Frozen kesitlerin bir kısmı da apoptozisin tespiti için TUNEL testinde kullanılmıştır. Kalplerin apeks bölümleri elektron mikroskobik inceleme için gerekli doku takibine alınarak yarı ince ve ince kesitler alınmış; ince kesitler elektron mikroskop altında incelenmiştir. Yarı ince kesitler toluidin mavisi ve polikromatik boyama ile boyanmıştır. Toluidin mavisi boyalı kesitler ışık mikroskop ile görüntülenip ortalama kardiyomiyosit çapları hesaplanarak KF Viewer yazılımı ile analizi yapılmıştır. Polikromatik boyalı kesitlerdeki kardiyomiyosit yapısı ve ekstraselüler alanlar da ışık mikroskop ile görüntülenip incelenmiştir. Kalp dokularının atriyumları ise oksidatif hasarın tespiti için biyokimyasal (MDA) analizde kullanılmıştır. 
Bulgular: Işık mikroskobik görüntülemede; picrosirius red ile boyanan kesitlerin analizleri sonucunda, kollajen lif (fibrozis) alanı/kesit alanı oranı pozitif kontrol grubunda, negatif kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde (p<0,05) yüksek bulunmuştur. Ayrıca bu oran, pozitif kontrol grubunda; yüksek doz Ganoderma Lucidum tedavi grubuna göre de istatistiksel olarak anlamlı derecede (p<0,05) yüksek tespit edilmiştir. Toluidin mavisi ile boyanan kesitlerin analizleri sonucunda; pozitif kontrol ve optimum doz tedavi grubundaki kardiyomiyosit çapları, negatif kontrol grubuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir fark (p<0,001) göstererek düşük bulunmuştur. Pozitif kontrol ve optimum doz tedavi grubunun kardiyomiyosit çapları, yüksek doz Ganoderma Lucidum tedavi grubundakilerden de istatistiksel olarak anlamlı şekilde (p<0,001) düşük tespit edilmiştir. TUNEL testinde; pozitif kontrol grubunun apoptotik indeksi, negatif kontrol grubu ile kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde (p<0.001) yüksek tespit edilmiştir. Ayrıca optimum doz ve yüksek doz tedavi grubunun apoptotik indeksi; pozitif kontrol grubuna göre de istatistiksel olarak anlamlı şekilde (p<0.05) düşük bulunmuştur. 
Elektron mikroskobik görüntülemede; pozitif kontrol grubuna ait kesitlerde mitokondriyonlarda diğer gruplara göre kondensasyon ve krista kaybı, optimum doz tedavi grubunda ise küçük mitokondriyal vakuoller gözlenmiştir. Ayrıca pozitif kontrol grubunda perivasküler ve interstisyel alanlarda belirgin kollajen lif artışına rastlanmıştır. Yüksek doz tedavi grubunda, negatif kontrol grubuna göre belirgin bir değişiklik gözlenmeyip optimum doz tedavi grubunda ise negatif kontrol grubuna kıyasla interstisyel ödem belirgin bir şekilde artmış olarak gözlenmiştir.
MDA analizi sonuçlarına göre; negatif kontrol grubu ve yüksek doz Ganoderma Lucidum tedavi grubunda; pozitif kontrol grubuna kıyasla, istatistiksel olarak anlamlı derecede (p<0,05) düşük oksidatif hasar saptanmıştır.
Sonuç: Kalp dokusu üzerinde, yüksek doz karbonmonoksitin miyofibril dejenerasyonu, oksidatif hasar, fibrozis ve apoptozis gibi kardiyotoksik etkileri olduğunu ve yüksek doz Ganoderma Lucidum tedavi grubunda; diğer gruplara kıyasla bu etkilerde anlamlı bir düşüş olduğunu gözlemledik. Karbonmonoksit zehirlenmesinde, yüksek doz Ganoderma Lucidum'un kalp üzerinde koruyucu etkilerinin olabileceğini ileri sürmekle birlikte karbonmonoksit zehirlenmesine bağlı meydana gelen kardiyotoksisitenin patogenezinin ve Ganoderma Lucidum'un bu sürece etkilerinin ortaya konulabilmesi için daha fazla deneysel çalışmaya ihtiyaç vardır.

Abstract:
Objective: Carbon monoxide poisoning is accepted as the most common cause of mortality and morbidity related to poisoning worldwide. Neurological and cardiovascular involvement is responsible for morbidity and mortality in carbon monoxide poisoning. Although there is no definitive antidote for carbon monoxide-induced toxicity, the current treatment is normobaric or hyperbaric oxygen administration. The effects of these treatments on cardiac involvement and mortality are controversial. The need for new treatment methods has arisen because hyperbaric oxygen therapy is difficult to access, its cost is high, and its effectiveness in cardiotoxicity due to carbon monoxide poisoning has not been clearly demonstrated in the literature. Among cultivated mushrooms, Ganoderma Lucidum is a type of mushroom that has pharmaceutical value rather than nutritional value and has been used medicinally for years. The aim of our study; The aim of this study is to investigate the effects of a new herbal agent for the prevention or reduction of cardiotoxic damage in carbon monoxide poisoning, which causes heart damage but has not yet found a clear treatment. For this reason, it is aimed to reveal the damage caused by high dose carbon monoxide in the heart tissue and the dose-dependent effects of Ganoderma Lucidum on this damage by histological and biochemical methods. 
Materials and Methods: In our study, using the carbon monoxide poisoning model, the treatment groups were given Ganoderma Lucidum by oral gavage for 9 days and the archive heart tissues of 20 mice, which were sacrificed on the 10th day, were used after sacrification. Frozen sections were taken from the ventricles of the excised hearts with systematic random sampling, histochemical staining was performed and the amount of connective tissue was analyzed with the FIJI program. Some of the frozen sections were also used in the TUNEL test for the detection of apoptosis. The apex parts of the hearts were taken under tissue follow-up for electron microscopic examination, and semi-thin and thin sections were taken; thin sections were examined under an electron microscope. Semi-thin sections were stained with toluidine blue and polychromatic staining.
Toluidine blue stained sections were viewed with a light microscope, and mean cardiomyocyte diameters were calculated and analyzed with CF Viewer software. The cardiomyocyte structure and extracellular areas in the polychromatic stained sections were also visualized and examined with a light microscope. The atria of the heart tissues were used in biochemical (MDA) analysis for the detection of oxidative damage.
Results: In light microscopic imaging; as a result of the analysis of the sections stained with picrosirius red, the ratio of collagen fiber (fibrosis) area/section area was found to be statistically significantly higher in the positive control group than in the negative control group (p<0.05). In addition, this rate was in the positive control group; It was also found to be statistically significantly (p<0.05) higher than the high-dose Ganoderma Lucidum treatment group. As a result of the analysis of the sections stained with toluidine blue; cardiomyocyte diameters in the positive control and optimal dose treatment groups were found to be lower, with a statistically significant difference (p<0.001) compared to the negative control group. The cardiomyocyte diameters of the positive control and optimum dose treatment group were found to be statistically significantly (p<0.001) lower than those in the high dose Ganoderma Lucidum treatment group. In TUNEL test; The apoptotic index of the positive control group was found to be statistically significantly higher (p<0.001) when compared to the negative control group. In addition, the apoptotic index of the optimum dose and high dose treatment group; it was found to be statistically significantly (p<0.05) lower than the positive control group. In electron microscopic imaging; Condensation and loss of cristae were observed in the mitochondria in the sections belonging to the positive control group compared to the other groups, and small mitochondrial vacuoles were observed in the optimum dose treatment group. In addition, significant collagen fiber increase was observed in the perivascular and interstitial areas in the positive control group. In the high-dose treatment group, no significant change was observed compared to the negative control group, while interstitial edema was observed to be significantly increased in the optimum-dose treatment group compared to the negative control group. According to the results of MDA analysis; Statistically significant (p<0.05) lower oxidative damage was detected in the negative control group and high dose Ganoderma Lucidum treatment group compared to the positive control group.
Conclusion: We observed that high-dose carbon monoxide had cardiotoxic effects on heart tissue such as myofibril degeneration, oxidative damage, fibrosis and apoptosis, and there was a significant decrease in these effects in the high-dose Ganoderma Lucidum treatment group compared to the other groups. Although it is suggested that high doses of Ganoderma Lucidum may have protective effects on the heart in carbon monoxide poisoning, more experimental studies are needed to reveal the pathogenesis of cardiotoxicity due to carbon monoxide poisoning and the effects of Ganoderma Lucidum on this process.