Karadeniz alabalığı (Salmo trutta Labrax) böbrek, karaciğer, solungaç ve kas dokularından karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification and characterization of carbonic anhydrase enzyme from black sea trout (Salmo trutta Labrax) tissues and inhibition effects of some metal ions on the enzyme activity
Yazar: MURAT KÜÇÜK
Danışman: PROF. DR. İLHAMİ GÜLÇİN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Alabalıklar = Trouts ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Karbonik anhidraz = Carbonic anhydrases ; Salmo trutta labrax = Salmo trutta labrax

Özet:
Bu tez kapsamında Karadeniz alabalığı (Salmo trutta Labrax) böbrek, karaciğer, solungaç ve kas dokularından karbonik anhidraz (CA) enzimi sırasıyla 603.77, 561.79, 1395.35 ve 297.03 EÜ/mg spesifik aktiviteleriyle birlikte, %35.5, 18.6, 71.1 ve 75.0 verimlerle Sepharose-4B-L-tirozin-sülfanilamid afinite kolon kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Karadeniz alabalığının böbrek, karaciğer, solungaç ve kas dokuları CA enzimi için saflaştırma kat sayıları sırasıyla 349.00, 362.45, 1116.28 ve 471.47 olarak tespit edildi.
Enzimin saflığını kontrol etmek ve alt birim molekül kütlelerini tespit etmek amacıyla   SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve tek bant gözlendi. Enzimin alt birim molekül kütlesi böbrek doku için 29.71 kDa, karaciğer doku için 29.50 kDa, solungaç doku için 32.00 kDa ve kas doku için 28.80 kDa olarak belirlendi.
Tüm dokulardan saflaştırılan CA enzimi için optimum iyonik şiddet 1 M Tris-SO4 tamponu olarak belirlendi. Optimum ve stabil pH değerleri 4°C'de 1 M Tris-SO4 ve fosfat tamponları kullanılarak hesaplandı. CA enziminin optimum sıcaklık, aktivasyon enerjisi (Ea), aktivasyon entalpisi (∆H)  ve Q10 değerleri Arrhenius grafiğinden elde edildi. Saflaştırılan enzimlerin KM ve Vmax değerleri  Lineweaver-Burk grafiklerinden hesaplandı. Karadeniz alabalığının böbrek, karaciğer, solungaç ve kas dokuları CA enzimi kcat değerleri sırasıyla 688.05, 1505.62, 1824.29 ve 1222.78 s-1 olarak hesaplandı. Bununla birlikte, Karadeniz alabalığı dokularından saflaştırılan CA enzimi aktivitesi üzerine bazı ağır metal iyonlarının (Fe2+, Pb2+, Co2+, Ag+ ve Cu2+) inhibisyon etkileri esteraz metodu kullanılarak in vitro şartlarda incelendi. Enzim aktivitesinin %50'sinin inhibe edildiği metal konsantrasyonları (IC50) tüm dokulardan saflaştırılan CA enzimleri için belirlendi. Son olarak bu dokular için Ki değerleri ve inhibisyon tipleri Lineweaver-Burk grafiklerinden hesaplandı.

Anahtar Kelimeler: Karadeniz alabalığı, Salmo trutta Labrax, enzim saflaştırma, enzim karakterizasyon, karbonik anhidraz, ağır metal

Abstract:
In this thesis, carbonic anhydrase (CA) enzyme was purified from black sea trout (Salmo trutta Labrax) kidney, liver, gills and muscle tissues with a specific activity of 603.77, 561.79, 1395.35 and 297.03 EU/mg and a yield of 35.5%, 18.6, 71.1 and 75,0% using Sepharose-4B-L-tyrosine-sulphanilamide affinity column chromatography, respectively. The overall purifications from black sea trout kidney, liver, gills and muscle tissues CA enzymes were approximately 349.00, 362.45, 1116.28 and 471.47 fold purified respectively.
For determination of enzyme purity and subunit molecular weights, SDS-gel electrophoresis was performed and single band was absorved for each tissue. The subunit molecular weight of enzymes were evaluated as 29.71 kDa for kidney, 29.50 kDa for liver, 32.00 kDa for gills and 28.80 kDa for muscle tissues.
Optimum ionic strengths for CA enzymes from all tissues were obtained as 1 M Tris-SO4 buffer. Optimum and stable pHs were determined 1 M Tris-SO4 and phosphate buffers at 4°C. The optimum temperature, activation energy (Ea), activation enthalpy (∆H) and Q10 values were obtained from Arrhenius plot for CA enzymes. Then KM and Vmax values for p-nitrophenilacetate of the purified enzymes were calculated from Lineweaver-Burk graphs. Kcat values of the black sea trout's kidney, liver, gills and muscle tissues CA enzymes were calculated as 688.05, 1505.62, 1824.29 and 1222.78 s-1 respectively. Also, the inhibitory effects of different heavy metal ions (Fe2+, Pb2+, Co2+, Ag+ ve Cu2+) on black sea trout CA enzyme activities were investigated by using esterase method under in vitro conditions. The heavy metal concentrations inhibiting 50% of enzyme activity (IC50) were obtained for CA enzymes from all tissues. Finally, Ki values and inhibition types for these tissues were also calculated from Lineweaver-Burk graphs.

Keywords: Black sea trout, Salmo trutta Labrax, enzyme purification, enzyme characterization, carbonic anhydrase, heavy metal