Poli(3-hidroksi bütirat)/poli(bütilen adipat-ko-tereftalat)/ipek- bazlı tendon doku iskeleleri: Karakterizasyon ve tenojenik aktivite
Poly(3-hydroxy butyrate)/poly(butylene adipate-co-terephthalate) /silk-based tendon scaffolds: Characterization and tenogenic activity
Yazar: BURCU SARIKAYA
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Büyüme faktörleri = Growth factors ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Kök hücreler = Stem cells ; Polihidroksibütirat = Polyhydroxybutyrate ; İpek fibroini = Silk fibroin

Özet:
Tendonlarda, mekanik stres birikimi, yaşlanma, genetik yatkınlık ve travma gibi etkenler sonucunda oluşan inflamasyon ve lezyonlara bağlı olarak tendon rüptürleri (kopma) sıklıkla görülmektedir. Tendon dokusunun düşük miktarlarda hücre içermesi, zayıf vaskülarizasyon ve düşük yenilenme potansiyeli nedeniyle hasarlı bölgede sağlıklı rejenerasyon gerçekleşmesi için tendon doku mühendisliği yaklaşımlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Sunulan tez çalışmasında tendon rejenerasyonunda yama olarak kullanılabilecek ipek fibroin/poli(3-hidroksibütirat) (SF/P3HB) ve ipek fibroin/poli(bütilen adipat-ko-tereftalat) (SF/PBAT) hizalı nanofibröz matrikslerin geliştirilmesi ve bu matrikslerde sıçan adipoz kökenli mezenkimal kök hücreler (rAdMSC), büyüme faktörü ve dinamik kültür koşulları varlığında in vitro tenojenik aktivitenin belirlenmesi hedeflenmiştir.
Tez çalışmasının ilk aşamasında klasik elektroeğirme yöntemi kullanılarak SF/P3HB ve SF/PBAT nanofiberlerin üretimi gerçekleştirilmiştir. Her 2 malzeme için de optimum elektroeğirme koşulları "response surface methodology" (RSM) yaklaşımı ile belirlenmiş ve hedeflenen şekilde hizalı ve ortalama 700 nm çap değerine sahip SF/P3HB ve SF/PBAT nanofibröz matriksler elde edilmiştir.
İkinci aşamada ise, hizalı nanofibröz matrikslere uygulanan stabilizasyon işlemi sonrası ipek fibroine ait α-heliks yapısının β-tabaka yapısına geçişinin indüklendiği ve her iki nanofibröz matriksin mekanik dayanım açısından tendon dokuda kullanıma uygun olduğu, ancak SF/PBAT nanofibröz matriksin tendon dokuya benzerlik açısından daha üstün mekanik özellikler sergilediği belirlenmiştir. Stabilizasyon ve sterilizasyon işlemlerinin matrikslerin yüzey ıslatılabilirlik ve kristalinite özelliklerini etkilemediği, ancak otoklavda sterilizasyonu yapılan SF/P3HB nanofibröz matrikslerde hücre canlılığının etilen oksit yöntemine göre daha yüksek olduğu bulunmuştur. SF/PBAT nanofibröz matrikslerin ise ısıl işlemler için uygun olmadıkları belirlenmiştir. Ayrıca, SF/P3HB nanofibröz matrikslerin bakteriyostatik etkiye sahip olduğu bulunmuştur.
Tez çalışmasının üçüncü aşamasında, hizalı SF/P3HB ve SF/PBAT nanofibröz matrikslerde rAdMSC'ler ile büyüme/farklılaşma faktörü-5 (GDF-5) varlığında/yokluğunda 21 günlük statik kültür çalışması yapılmış ve tenojenik farklılaşma karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Hücrelerin kültür boyunca yüksek canlılıkta olduğu ve hizalanmaya uygun olarak matriksler üzerinde organize olduğu görülmüştür. Kültür sonunda bozunmaya bağlı olarak her iki doku iskelesinde de mekanik özelliklerde azalma tespit edilmiştir. SF/PBAT doku iskeleleri üzerinde kültüre edilen rAdMSC hücrelerinin SF/P3HB'e oranla daha yüksek COL1A1, COL3A1, SCX, TNC ve düşük PPAR gen ifadeleri nedeniyle tenojenik aktivite açısından daha uygun oldukları belirlenmiştir. Ayrıca, GDF-5 büyüme faktörü, gen ifadelerinde artışa yol açarak hücre iskeletinin düzenlenmesini ve farklılaşmayı indüklemiştir. Hizalı topografya rAdMSC hücrelerinin tenojenik farklılaşmasında oldukça etkin olmasına rağmen gen ekspresyonları açısından yeterli bulunmamıştır. Mekanik uyarım biyoreaktöründe yapılan çalışmalarda SF/P3HB doku iskelelerinin dinamik kültür çalışmaları için yeterli mekanik özelliklere sahip olmadığı belirlenmiştir.
Tez çalışması sonunda, hizalı SF/PBAT nanofibröz matrikslerin tenojenik aktivite açısından SF/P3HB nanofibröz matrikslere göre daha üstün özellikler gösterdiği ve tendon rejenerasyonunda yama materyali olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Tendon ruptures are frequently seen in tendons due to inflammation and lesions caused by factors such as mechanical stress accumulation, aging, genetic predisposition, and trauma. Tendon tissue engineering approaches are required for healthy regeneration in the damaged area due to the low number of cells in the tendon tissue, poor vascularization, and low regeneration potential. In the presented thesis, the development of silk fibroin/poly(3-hydroxybutyrate) (SF/P3HB) and silk fibroin/poly(butylene adipate-co terephthalate) (SF/PBAT) aligned nanofibrous matrices that can be used as a patch for tendon regeneration were aimed. The investigation of the in vitro tenogenic activity of rat adipose-derived mesenchymal stem cells (rAdMSC) in these matrices in the presence of growth factor and dynamic culture conditions were also performed.
In the first part of the thesis study, SF/P3HB and SF/PBAT nanofibers were produced using the conventional electrospinning method. Optimum electrospinning conditions were determined by the "response surface methodology" (RSM) approach for both materials. Aligned SF/P3HB and SF/PBAT nanofibrous matrices were obtained with an average diameter of 700 nm.
In the second part, it was found that the transition of the α-helix structure of silk fibroin to the β-sheet structure was induced after the stabilization process applied to the aligned nanofibrous matrices, and both nanofibrous matrices were suitable for use in tendon tissue in terms of mechanical strength, but SF/PBAT nanofibrous matrix was superior in terms of similarity to tendon tissue as mechanically. It was obtained that stabilization and sterilization processes did not affect the surface wettability and crystallinity of the matrices, but cell viability was higher in autoclave sterilized SF/P3HB nanofibrous matrices compared to the ethylene oxide method. It has been determined that SF/PBAT nanofibrous matrices are not suitable for heat treatment. In addition, SF/P3HB nanofibrous matrices were found to have a bacteriostatic effect.
In the third part of the thesis study, a 21-day static culture study was performed with rAdMSCs in aligned SF/P3HB and SF/PBAT nanofibrous matrices in the presence/absence of growth/differentiation factor-5 (GDF-5), and tenogenic differentiation was comparatively examined. Cells were found to be highly viable throughout the culture and organized on the matrices because of alignment. A decrease in mechanical properties was detected in both scaffolds due to the matrix degradation at the end of the culture. It was determined that rAdMSCs cultured on SF/PBAT scaffolds were more suitable for tenogenic activity compared to SF/P3HB due to higher COL1A1, COL3A1, SCX, TNC, and low PPAR gene expressions. In addition, the GDF-5, growth factor that is induced cytoskeletal regulation and differentiation, leading to increased gene expressions. Although the aligned topography is highly effective in the tenogenic differentiation of rAdMSC cells, it was not found to be sufficient in terms of gene expression. In the studies performed with mechanical stimulation bioreactor, it was determined that the SF/P3HB scaffolds did not have sufficient mechanical properties for dynamic culture studies.
It was concluded that aligned SF/PBAT nanofibrous matrices showed superior properties in terms of tenogenic activity compared to SF/P3HB nanofibrous matrices and could be used as patch material in tendon regeneration.