Wharton jölesi mezenkimal kök hücrelerinin endotel hücrelere farklılaşmasında antioksidan moleküllerin rolünün incelenmesi
Determination of the role of antioxidant molecules in differentiation processes of wharton's jelly mesenchymal stem cells into endothelial cells
Yazar: ÖZGE TEZCAN
Danışman: PROF. DR. PINAR AKAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Endotelyal hücreler = Endothelial cells ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Kök hücreler = Stem cells ; Moleküller = Molecules ; Oksidatif stres = Oxidative stress

Özet:
Giriş ve amaç: Rejeneratif tıp alanında kök hücre terapisinin başarısı, stres ortamında kök hücrelerin hayatta kalma ve hasarlı dokuları yenileme yetenekleri ile ilişkilidir. Kök hücrelerin işlevsel olarak olgunlaşmış erişkin hücrelere farklılaşması sırasında hücre içinde farklı metabolik süreçlerin devreye girdiği bilinmektedir. Kök hücre farklılaşma sürecinde olası metabolik değişim sürecini tetikleyen en önemli faktörlerden birinin hücrelerin maruz kaldığı oksidatif stres olduğu ileri sürülmektedir. Ancak kök hücrelerin endotelyal hücrelere farklılaşması esnasındaki oksidatif metabolizma değişimleri henüz net olarak tanımlanmamıştır.
Çalışmamız ile multipotent mezenkimal kök hücrelerin (MKH) endotelyal hücrelere farklılaşma sürecindeki reaktif oksijen  tür (ROT) düzeylerinin ve antioksidatif enzim aktivite değişimlerinin belirlenmesi amaçlandı. Ayrıca oksidatif stres üzerinde etkili olabilecek uygulamaların hücre canlılığı ve farklılaşma sürecine etkilerinin belirlenmesinin yanı sıra, WJ-MKH' lerinin izolasyonu, endotelyal hücrelere farklılaşması ve karakterizasyonu için uygulanabilir etkin bir protokolün kendi laboratuvar koşullarımızda oturtulması da hedeflendi.
Yöntemler: Göbek kordonu Wharton jölelesinden (WJ) enzimatik ve eksplant yöntemi ile MKH'ler elde edilerek,  proliferasyon kapasitesileri karşılaştırıldı. İzolasyon sonrası MKH karekterizasyonu için CD44,  CD90, CD105 yüzey antijenlerinin gen ve protein ekspresyon düzeyleri kantitatif PZR, immunohistokimya ve akış sitometrisi yöntemleri ile gösterildi. Elde edilen MKH'lerin endotelyal hücrelere farklılaştırılma sürecine antioksidan moleküllerin etkisinin incelenmesi için N-asetil sistein (NAC), askorbik asit (AAP) ve sodyum selenit (NaSe) uygulamasının etkileri değerlendirildi.Kök hücrelerin kendi kendini yenileme ve farklılaşması sürecinde hücresel MDA, total ROT miktarı ve antioksidan enzim aktivite düzeylerinin değişimi fotometrik ve florometrik olarak incelendi. Antioksidan enzimlerin gen ekspresyon düzeyleri kantitatif PZR ile değerlendirildi. Ayrıca H2O2 ile oluşturulan oksidatif stres modelinde kök hücrelerin ve progenitör endotelyal hücrelerin reaktif oksijen türleri yanı sıra  CAT, SOD ve GPx enzimlerinin değişimleri de analiz edildi. 
Bulgular: WJ-MKH ve entotelyal hücre karakterizasyonu kapsamında yapılan deneylerde ileri pasaj sayısının (>4-5) MKH karakterizasyonunda azalmaya yol açtığı saptandı. WJ-MKH'lerinde NAC (2mM) hücre canlılığı artırdığı gözlendi (p<0.05) Endotelyal hücrelerde ise NAC ve askorbik asit uygulaması hücre canlılığını sırası ile ortalama ~%40 ve ~%20 oranında artırırken, Na-selenit uygulamasının olumlu bir etkisi görülemedi. Endotelyal hücrelerde total ROT ve MDA miktarının WJ-MKH'lerine göre sırası ile ortalama~  7 ve ~ 2 kat arttırdığı belirlendi. Endotelyal farklılaşma sürecinde katalaz ,glutatyon peroksidaz enzim  aktivitelerinin anlamlı arttığı gösterildi (p<0,05). Oksidatif stres oluşturmak amacı ile üç saatlik H202 (300 µM) uygulamasının kök hücre canlılığını kontrol grubuna göre ~%60 oranında azalttığı ve antioksidan enzim düzeylerini belirgin olarak düşürdüğü gösterildi. NAC, uygulamasının WJ-MKH'lerini H202  toksisitesine karşı  koruduğu ancak endotelyal farklılaşması indüklenmiş hücrelerde ise oksidatif stres düzeyini tam olarak baskılayamadığı gözlendi. 
Sonuç: Sonuç olarak literatür taramalarımıza göre bu tez çalışması ile  ilk kez NaSe, AAP ve NAC uygulamalarının WJ-MKH'lerinin kendi kendini yenilemesi ve endotelyal farklılaşma süreci üzerine etkileri gösterildi. WJ-MKH lerin izolasyon protokolü laboratuvar koşullarımızda optimize edilerek, elde edilen hücrelerin MKH karakterleri protein ve gen ekspresyonları düzeyinde gösterildi. Endotelyal farklılaşma protokolü kendi laboratuvar koşullarımızda uygulanabilir hale getirilerek, bu süreçteki oksidatif strese bağlı metabolik değişimler belirlendi. Çalışmamız ile elde edilen veriler ve protokollerin daha sonra planlanabilecek rejeneratif tıp uygulamaları kapsamındaki projeler için temel bir basamak oluşturabilecek kapasitede olduğu düşünülmektedir.
Anahtar Sözcükler: Wharton Jölesi, Mezenkimal Kök Hücre, Endotelyal Farklılaşma, Oksidatif Stres

Abstract:
Introduction and aim: The success of stem cell therapy in regenerative medicine is related to the ability of stem cells to survive and to restore damaged tissues in a stressful environment. When differentiating stem cells into functionally mature adult cells, different metabolic processes are involved in the cell. It is suggested that one of the most important factors triggering the process of possible metabolic change in the process of stem cell differentiation is the oxidative stress to which the cells are exposed. However, oxidative metabolism changes during the differentiation of stem cells to endothelial cells have not been clearly defined.
In our study, it was aimed to determine the reactive oxygen species (ROS) levels and antioxidative enzyme activity changes in the differentiation process of multipotent mesenchymal stem cells (MSCs) to endothelial cells. Also to determine the effects of the applications that may be effective on oxidative stress on cell viability and differentiation process of WJ-MSCs into endothelial cells were aimed.
Methods: MSCs were obtained from Wharton's jelly of the umbilical cord by enzymatic and explant method and their proliferation capacity was compared. The gene and protein expression levels of CD44, CD90, CD105 surface antigens were determined by quantitative PCR, immunohistochemistry and flow cytometry methods. 2 mM N-acetyl cysteine (NAC), 300 uM ascorbic acid (AAP) and 40 nM sodium selenite (NaSe) were applied to investigate the effect of antioxidant molecules on the differentiation of MSCs to endothelial cells. In addition, 200 μM H2O2 was applied to determine the oxidative stress that is thought to affect the differentiation process. Fluorometric measurement was performed by using carboxymethyl dichlorofolorosein diacetate (CM-H2DCFDA) probe to determine ROT level against oxidative stress in WJ-MSCs. MDA analysis was also performed by HPLC method to determine cellular oxidative stress damage. The change in catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx) enzyme activities in the differentiation process were evaluated by using colorimetric enzyme activity measurement kits. Antioxidant molecules and changes in gene expression of CAT, SOD and GPx enzymes against H2O2 were analyzed by quantitative PCR.
Results: In the experiments conducted under WJ-MSC and entothelial cell characterization, the number of advanced passages (> 4-5) was found to lead to a decrease in MSC characterization. It was observed that the treatment with NAC(2mM) increased the cell viability in WJ-MSCs (p <0.05). In endothelial cells, NAC and ascorbic acid application increased cell viability by ~ 40% and ~ 20% respectively, whereas Na-selenite application did not have a positive effect.  It was determined that total ROT and MDA levels in endothelial cells increased by ~ 7 and ~ 2-fold, respectively, according to WJ-MSCs.  In the endothelial differentiation process, it was shown that catalase and glutathione peroxidase enzyme activities increased significantly (p <0.05). It was shown that three-hour treatment with H202 (300 uM) decreased 60% of stem cell viability compared to control group , significantly decreased antioxidant enzyme levels ,induced oxidative stress in WJ-MSC. NAC application protected WJ-MSCs against to H202 toxicity, but in the endothelial differentiated cells, oxidative stress level was not to be fully suppressed.
Conclusion: As a result, according to our literature reviews, the effects of NaSe, AAP and NAC on WJ-MSCs' self-renewal and endothelial differentiation process were shown for the first time.The isolation protocol of WJ-MSCs was optimized in our laboratory conditions and the MSC characters of the cells were shown at the level of protein and gene expression.The endothelial differentiation protocol was made available in our laboratory conditions and metabolic changes due to oxidative stress were determined in this process. The data and protocols obtained by our study are thought to be the basic step for the projects that can be planned later in the scope of regenerative medicine applications.
Keywords: Wharton's Gel, Mesenchymal Stem Cell, Endothelial Differentiation, Oxidative Stress