Komagataella phaffii'de  ısı ile indüklenebilir bir heterolog protein ekspresyon sisteminin geliştirilmesi ve azurin proteininin üretimi
Improvement of a heat-inducible heterologous protein expression system and production of azurin protein in Komagataella phaffii
Yazar: İBRAHİM DAĞCI
Danışman: DOÇ. DR. YAĞMUR ÜNVER ; PROF. DR. AHMET MAVİ
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Rekombinant proteinlerin üretimi için yaygın olarak kullanılan Komagataella phaffii, metanolle indüklenebilir AOX promotörü sayesinde yüksek seviyede protein üretimine olanak tanımaktadır. Ancak, metanolün yanıcı ve toksik olması, petrol krizi durumunda maliyetinin artacağının ön görülmesi gibi önemli dezavantajları bulunmaktadır. Bu dezavantajlı durumları ortadan kaldırmak için gerçekleştirilen bu tez çalışmasının amacı, şimdiye kadar literatürde yer alan mevcut metanol bağımsız stratejilerden farklı olarak manyetik veya manyetik olmayan ısıtma yöntemiyle indüklenebilir yeni bir protein ekspresyon sistemi geliştirmek ve kültür ortamına metanol ilave etmeden rekombinant protein üretimini gerçekleştirmektir. Bu sistemde, metanol ile indüklenebilir AOX promotörü yerine ısı ile indüklenebilir HSP (HSP; Heat Shock Protein, ısı şok protein) promotörü kullanıldı. Bu sayede, metanol ilavesi olmadan sadece ortam sıcaklığının artırılmasıyla promotör aktive edildi ve rekombinant protein üretimi gerçekleştirildi. 
Geliştirilen yeni ekspresyon sisteminde moleküler klonlama teknikleri kullanılarak pPICZαA-Azu'da yer alan AOX1 promotörünün yerine Drosophila melanogaster'e ait regülatör dizi+HSP promotör dizisi yerleştirildi. Böylece ısı ile indüklenebilir promotör bölgenin akış aşağısında (downstream) yer alan genin ekspresyonu, kültür ortamına metanol ilave etmeden, yalnızca ortam sıcaklığı artırılarak başlatıldı ve rekombinant protein üretimi gerçekleştirildi. Metanol bağımsız indüksiyon ile protein ekspresyonu, AC (alternating current) manyetik alan varlığında veya AC manyetik alandan bağımsız olarak gerçekleştirildi. AC manyetik alan varlığında promotör indüksiyonu için ortam sıcaklığının artışını sağlayacak manyetik nanopartiküller (MNP'ler) sentezlenerek karakterize edildi. MNP'lerin maya hücreleri üzerindeki toksisitesinin belirlenmesinin ardından hücreler, MNP'ler ile immobilize edildi. Farklı indüksiyon yöntemleri ile gerçekleşen protein ekspresyon seviyeleri western blot analizi ile tespit edildi. Sonuç olarak, bu tez çalışmasında, K. phaffii ekspresyon sistemi kullanılarak önemli birçok farmasötik ve endüstriyel proteininin rekombinant protein üretiminde kullanılabilecek yeni bir yöntem geliştirildi

Abstract:
Komagataella phaffii, widely used for the production of recombinant proteins, enables high levels of protein production thanks to its methanol-inducible AOX promoter. However, methanol has significant disadvantages such as being flammable and toxic, and its cost is predicted to increase in the event of an oil crisis. In order to overcome these disadvantages, the aim of this thesis is to develop a new inducible protein expression system by magnetic or non-magnetic heating method different from the existing methanol independent strategies in the literature so far and to realize recombinant protein production without adding methanol to the culture medium. In this system, the heat-inducible HSP (HSP; Heat Shock Protein) promoter was used instead of the methanol-inducible AOX promoter. In this way, the promoter was activated only by increasing the ambient temperature without the addition of methanol and recombinant protein production was realized. 
In the new expression system developed, molecular cloning techniques were used to replace the AOX1 promoter in pPICZαA-Azu with the regulatory sequence+HSP promoter sequence of Drosophila melanogaster. Thus, the expression of the gene located downstream of the heat-inducible promoter region was induced without adding methanol to the culture medium, only by increasing the ambient temperature, and recombinant protein production was realized. Protein expression with methanol-independent induction was performed in the presence of AC (alternating current) magnetic field or independent of AC magnetic field. Magnetic nanoparticles (MNPs) were synthesized and characterized to increase the ambient temperature for promoter induction in the presence of AC magnetic field. After determining the toxicity of MNPs on yeast cells, the cells were immobilized with MNPs. Protein expression levels realized by different induction methods were determined by western blot analysis. As a result, in this thesis, a new method was developed for the recombinant protein production of many important pharmaceutical and industrial proteins using the K. phaffii expression system.