Mesane kanserlerinde CALD1 ve JAK/STAT sinyal yolu ve PD-L1 gen ekspresyon ilişkilerinin incelenmesi
CALD1 and JAK/STAT signaling pathway and PD-L1 in bladder cancers investigation of gene expression relationships
Yazar: İBRAHİM HALİL BALOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. SERDAR ARISAN ; DR. NİHAT TÜRKMEN
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Şişli Hamidiye Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Üroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Onkoloji = Oncology ; Üroloji = Urology

Özet:
Amaç: 
Mesane, böbrekler tarafından üretilen idrarın dışarı atılmasında görev alan en içte 
mesane ürotelyumu ile kaplı içi boş bir organdır. Mesane ürotelyal karsinomu insidans ve 
prevelansı yaşla birlikte artmaktadır. Gelişimi için sigara kullanımı, kimyasal maruziyeti, 
yaş, kronik inflamasyon gibi bir çok risk faktörü bulunmaktadır. Mesane kanseri temel 
olarak kasa invaze ve kasa invaze olmayan mesane kanseri olmak üzere 2 alt tipte 
sınıflandırılır. PD-L1 ekspresyon düzeyinin incelenmesi hali hazırda uygulanan 
immunoterapilerin yanıtını belirlemede kullanılmaktadır. Bunun yanı sıra CALD1 
ekspresyonunun ise mesane kanseri için prognostik olabileceği düşünülmektedir. Ayrıca 
JAK/STAT yolunun aktivasyonu PD-L1 ekspresyonunu artırabilir. Hipotezimiz; mesane 
tümörlerinde immünoterapi hassasiyeti ilişkili hedef genlerden CALD1 aracılı PD-L1 in 
mRNA ekspresyon seviyesinin ve JAK1 ekspresyon düzeyinin mesane kanseri için 
prognostik olabileceğini göstermektir. 
Materyal ve Metot:
Çalışma 27 adet mesane tümörü 28 adet sağlıklı hasta popülasyonu örnekleri 
içerecek şekilde 2 grupta planlandı. Tümör grubu rezeke edilen tümör materyali örnekleri 
ve sağlam grup mesane örnekleri ayrı ayrı -80°C de saklandı. Protein ifadesinin 
belirlenmesi için alınan doku örnekleri bir dizi hazırlık işlemi sonrasında oda sıcaklığında 
getirilmiş kemilüminesans madde ile 1 dakika boyunca muamele edildiler ve 
kemilüminesans ölçen cihaz yardımıyla band profilleri incelendi. Gen ifadesinin 
belirlenmesi için RNA izolasyonu RNAzol kullanımı ile elde edilmiş.qRT PCR ile ilgili 
primerler tanımlanmıştır. Pfaffl formülasyonuna göre PCR reaksiyonlarındaki GAPDH 
ile her bir seçili mRNA ifadesi normalize edilmiştir.
Bulgular:
Toplamda 55 hasta çalışmaya dahil edilmiştir. Kontrol grubu 28 tümör grubu ise 
27 hastadan oluşmaktaydı. Tümör grubu yaş ortalaması 68+/-10,1 kontrol grubu yaş 
ortalaması 60,78+/-7,82 olarak belirlendi. 6 hastada KİMK 21 hastada KİOMK mevcuttu. 
1 hastada mikropapiller varyant, 1 hastada kordoid karsinom saptandı. 6 hastada ise CIS
pozitifliği mevcuttu. CALD1 proteini tümör dokusunda örneklerinde kontrol grubu doku 
örneklerine göre anlamlı düzeyde daha yüksek belirlenmiştir (p=0,0001). Dokularda 
JAK1 protein düzeyi ise tümör grubunda düşük saptanmış olup kontrol grubuyla farklılık 
izlenmiştir (p=0,01). Ancak düşük seviye antikor bağlanması, tümör ve kontrol grubu 
arasında anlamlı farklılığı net olarak ortaya koyamamaktadır. STAT5 protein düzeyinin 
ise tümör grubunda anlamlı farklılık gösterdiği tespit edilmiştir (p=0,0001).
CALD1, PD-L1, JAK1, STAT5 gen ifadeleri belirlemesi için toplanan RNA 
örnekleri arasında tümör grubunda tüm moleküllerde RNA ekspresyonunda artış 
saptanmıştır (Sırasıyla p=0,0001; p=0,0001; p=0,0001; p=0,0001) mRNA 
ekspresyonunun sınır değeri CALD1 için 1,625; PD-L1 için 1,5; JAK1 için 1,975; STAT5 
için 1,563 olarak belirlenmiştir. CALD-1 ve PD-L1 gen ifadesinin beraber 
değerlendirmesinde tümör grubundaki gen ifadesi benzer artış ve azalma trendi 
göstermiştir (p<0,0005). Bu durumun kontrol grubundaki örnekler için anlamlı olmadığı 
belirlenmiştir (p=0,4014).
Sonuç:
Proje kapsamında elde edilen sonuçlar ürotelyal karsinom için seçilen 4 gen hedefi 
olan CALD1, PD-L1, STAT5 ve JAK1 için tanımlanmıştır. CALD1 tümör örneklerinde 
mRNA ve protein düzeyinde artış gösteren ifade düzeyi ile dikkat çekmiştir. Kontrol 
örneklerinde ise CALD1 bazal ifade düzeyinde temsil edilmiştir. Benzer şekilde STAT 5 
in de ifade düzeyindeki değişiklikler benzerlik göstermiştir. JAK1 ise protein düzeyi zayıf 
antikor bağlanmasına bağlı gruplar arası net olarak ayırt edilememiştir. Ancak mRNA 
düzeyinde belirgin ekspresyon artışı yalnızca tümör grubunda izlenmiştir. mRNA 
düzeyinde CALD-1/PD-L1 ve JAK1/STAT5 ikili belirteçleri yüksek korelasyon ile tümör 
dokularında etkili biyobelirteçlerdir. Bu kapsamda hem CALD1 in hem de PD-L1 tümör 
gruplarında kontrol grubuna göre seçici olduğu belirlenmiştir. JAK1 ve STAT5 ise 
potansiyel seçici biyobelirteçlerdir.

Anahtar kelimeler: Mesane tümörü, İmmunoterapi, PD-L1, CALD1, JAK1, STAT5

Abstract:
Aim:
The bladder is a hollow organ covered with innermost bladder urothelium, 
responsible for excreting the urine produced by the kidneys. The incidence and 
prevalence of bladder urothelial carcinoma increase with age. Risk factors for its 
development include smoking, chemical exposure, age, and chronic inflammation. 
Bladder cancer is basically classified into two subtypes: muscle-invasive and nonmuscle-invasive bladder cancer. Examining the PD-L1 expression level is used to 
determine the response to currently applied immunotherapies. Additionally, it is thought 
that CALD1 expression may be prognostic for bladder cancer. Moreover, activation of 
the JAK/STAT pathway may increase PD-L1 expression. Our hypothesis is that the 
mRNA expression level of CALD1-mediated PD-L1 and JAK1 expression level, which 
are immunotherapy sensitivity-related target genes in bladder tumors, may be prognostic 
for bladder cancer.
Materials and Methods:
The study was planned in two groups, including 27 samples from bladder tumors 
and 28 samples from the healthy patient population. Resected tumor material samples 
from the tumor group and bladder samples from the intact group were stored separately 
at -80°C. Tissue samples taken to determine protein expression were treated with 
chemiluminescence material at room temperature for 1 minute after a series of 
preparations, and band profiles were examined with the help of a chemiluminescence 
measuring device. RNA isolation to determine gene expression was obtained using 
RNAzol. Primers for qRT-PCR were defined. The expression of each selected mRNA 
was normalized by GAPDH in PCR reactions according to the Pfaffl formulation.
Results:
A total of 55 patients were included in the study. The control group consisted of 
28 patients, and the tumor group consisted of 27 patients. The average age of the tumor 
group was 68+/-10.1, and the average age of the control group was 60.78+/-7.82. CIBC 
was present in 6 patients, and NMIBC was present in 21 patients. The micropapillary
variant was detected in 1 patient, and chordoid carcinoma was detected in 1 patient. CIS 
was positive in 6 patients. CALD1 protein was determined to be significantly higher in 
tumor tissue samples than in control group tissue samples (p = 0.0001). The JAK1
protein level in tissues was found to be low in the tumor group, and a difference was 
observed with the control group (p = 0.01). However, low-level antibody binding does 
not clearly reveal a significant difference between the tumor and the control group. It 
was determined that the STAT5 protein level showed a significant difference in the 
tumor group (p = 0.0001).
Among the RNA samples collected to determine CALD1, PD-L1, JAK1, STAT5 
gene expressions, an increase in RNA expression was detected in all molecules in the 
tumor group (p=0.0001; p=0.0001; p=0.0001; p=0.0001, respectively.) The cutoff value 
of mRNA expression is 1.625 for CALD1; 1.5 for PD-L1; 1,975 for JAK1; For STAT5, 
it was determined as 1.563. When CALD-1 and PD-L1 gene expressions were evaluated 
together, gene expression in the tumor group showed a similar increasing and decreasing 
trend (p<0.0005). It was determined that this situation was not significant for the samples 
in the control group (p = 0.4014).
Conclusions:
The results obtained within the scope of the project identified gene expressions 
for CALD1, PD-L1, STAT5, and JAK1, which are the four gene targets selected for the 
UK. CALD1 attracted attention with its increased expression level at mRNA and protein 
levels in tumor samples. In control samples, CALD1 was represented at the basal 
expression level. Similarly, changes in the expression level of STAT5 were similar. The 
JAK1 protein level could not be clearly distinguished between groups due to weak 
antibody binding. However, a significant increase in expression at the mRNA level was 
observed in the tumor group. CALD-1/PD-L1 and JAK1/STAT5 dual markers at the 
mRNA level are effective biomarkers in tumor tissues with high correlation. In this 
context, it was determined that both CALD1 and PD-L1 were selective in tumor groups 
compared to the control group. JAK1 and STAT5 are potential selective biomarkers.

Keywords: Bladder Cancer, immunotherapy, PD-L1, CALD1, JAK1,STAT5