Plazmid dna saflaştırılması için kriyojel esaslı saflaştırma kitlerinin geliştirilmesi
Development of cryogel based plasmid dna purification kits
Yazar: GÜNEŞ KİBAR
Danışman: PROF. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Plazmid DNA gen terapisi başta olmak üzere, bakteri ve hayvan hücre transformasyonu, transkripsiyonu, ligasyonu, sekans analizi, vb. gibi birçok genetik araştırmada ve uygulamada yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak bu tür uygulamalar için plazmidlerin saf olarak üretilmiş ve etkin formda olması gerekmektedir. Günümüzde plazmid DNA saflaştırma kitleri oldukça pahalı ve çok çeşitli formlarda satılmaktadır. Bu çalışmanın amacı çeşitli kriyojeller üreterek plazmid DNA saflaştırmak ve ekonomik yönden kazanç sağlarken yüksek saflıkta daha verimli ürün elde etmektir. Çalışma süresince E.Coli bakteri süspansiyonu içerisinde üretilen plazmid DNA'yı saflaştırma amaçlı, tezde kriyojel tekniği kullanılarak poliakrilamid kriyojel kolonlar farklı oranlarda DMAPM eklenip polimerde pozitif yük sağlanarak serbest radikalik reaksiyonla sentezlenmiştir. Monomer çözeltisi oda sıcaklığında saf su ile hazırlanmış ve polimerizasyonu hızlandırıcı ajan TEMED eklenerek 10dk soğutulmuştur. Bu sırada başlatıcı APS taze olarak hazırlanmış ve süre bitiminde çözeltiye ilave edilmiştir. Çözelti bir ucu kapalı 8 mm çaplı kalıplara dökülüp azot atmosferi sağlandıktan sonra 1 saat süresince -200C'de dondurulmuştur ve -120C'de 16 saat süresince kriyostat da bekletilmiştir. Daha sonra +40C'de 1 saat bekletilip oda sıcaklığına alınmış ve saf su ile yıkama işlemi uygulanmıştır. En son aşamada +400C'de kurutularak saflaştırma kolonları elde edilmiştir. Kolonların karakterizas- yonu için FTIR, DSC, TGA analizleri, mekanik testleri ve pozitif yük tayinleri yapılmış; SEM görüntülemeleri incelenmiş ve akış profilleri çıkartılmıştır. E. Coli bakteri süspansiyonunda üretilen plazmid DNA'nın basit alkalil lizis yöntemiyle ilk saflaştırması yapılmıştır. Daha sonraki aşamalarda, üretilen kriyojel kolonlarının bakteri lizatanıdan plazmid DNA saflaştırma verimleri uygun tampon çözeltilerle adsorpsiyon, yıkama ve desorpsiyon olmak üzere üç aşamada elektroforez tekniği kullanılarak verimi bilinen ticari kolon ile karşılaştırmalı incelenmiştir.

Abstract:
Plasmid DNA is widely used such as many genetic researches and applications, in particularly gene therapy, the transformation, transcription, ligation, sequence analysis, etc. of bacteria and animal cells. However, for these kinds of applications plasmid produced pure and active form is necessarily required. Nowadays, DNA plasmid purification kits are quite expensive and many are sold in various forms. The purpose of this works by producing a variety of cryogels for purification of plasmid DNA and is to obtain more efficient products in high-purity while earning economic gain. During the study providing positive charge by adding DMAPM in different ratios to Polyacrylamide columns were synthesized by free radicalic reaction with using cryogelation technique for the aim of thesis to purify Plasmid DNA produced in E. Coli bacteria suspension. Monomer solution was prepared with distilled water at room temperature and polymerization accelerator agent, TEMED was added and cooled for 10min. In the meantime, fresh initiator APS solution was prepared and was added to the solution at the end of cooling time. Solution was poured into 8 mm diameter of a closed-end mold at nitrogen atmosphere then frozen at -200C during 1 hour and kept it waiting at -120C for 16 hours in cryostad. After waited at 40C for 1 hour, taken out at room temperature and washing process with distilled water was applied. In the latest phase purification columns were obtained by drying at 400C. Characterization of columns has been made by FTIR, DSC, TGA analysis, mechanical tests and determination of positive charge, SEM photos were examined and flow profiles were determined.. The first simple purification of Plasmid DNA which is producing in E.coli bacteria suspension was made with alkaline lysis procedure. At later parts the plasmid DNA isolation efficiency from bacterial lysate of produced cryogel columns were studied comparatively with commercial column having well-known yield at there stages adsorption, washing and desorption by using electrophoresis techniques with appropriate buffer solutions.