Biber (Capsicum annum L.) ıslah materyallerinden dihaploid hatların üretimi
Production of doubled haploid lines from pepper (Capsicum annuum L.) breeding materials
Yazar: FATMA NUR KAPLAN
Danışman: DOÇ. DR. ALİ RAMAZAN ALAN
Pamukkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Biber (Capsicum annuum L.) Solanaceae familyasına ait olan önemli bir sebze türüdür. Biber meyveleri taze, kuru, salça, baharat, ve sos şeklinde tüketilir. Bu önemli sebze türünde yeni çeşitlerin üretilmesi için yapılan ıslah çalışmalarında kullanılan klasik kendileme uygulaması ile saf hatların üretilmesi için en az 5 generasyon gereklidir. Dihaploidi (DH) uygulamlarının mümkün olduğu durumda tek generasyonda tüm özellikleri açısından saf hale getirilmiş olan bitkiler mümkün olabilmektedir. Biberlerde anter kültürü ve mikrospor kültürü yoluyla haploid embriyoların üretilebileceği bilinmektedir. Androgenesis tekniği uygulanarak haploid embriyo uyartımı teknolojisinin bu önemli sebze türünde kullanılabilmesi ile ilgili yayınlanmış olan rapor sayısı çok sınırlı sayıdadır. Yayınlanmış araştırmalara göre ön uygulamalar, uyartım ve rejenerasyon ortamları ve çiçek tomurcuğu donörü bitkinin genotipi gibi faktörler androgenesis uyartımında önemlidir. Bu çalışmada Pamukkale Üniversitesi Bitki Genetiği ve Tarımsal Biyoteknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezi (PAÜ BİYOM) tarafından ıslah çalışmalarında kullanılan açık tozlanan seleksiyon hatları ve standart ticari çeşitlerin androgenesis potansiyeli araştırılmıştır. Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden toplanan seleksiyon ıslahı yoluyla elde edilmiş 73 genotip ve 11 standart ticari genotipler kullanılmıştır. Bitkiler tohum ekiminden tomurcuk ve meyve oluşturmasına kadar bütün dönemlerinde uygun sera büyütme koşullarında tutulmuştur. Çalışmada haploid embriyo uyartımı amacıyla anter kültürü tekniği kullanılmıştır. Anter kültürü çalışmalarında üç farklı medya uygulaması yapılmıştır. Bu bitkilerden taç ve çanak yaprakları yaklaşık aynı boyda olan çiçek tomurcuklarından alınan anterler uyartım medyalarında kültüre alınmışlardır. Bu aşamadaki çiçek tomurcuklarında anterler içinde bulunan mikrosporların erken çift çekirdekli dönemde olduğu tahmin edilmektedir. Steril hale getirilmiş çiçek tomurcuklarından alınan anterler farklı konsantrayonlarda NAA, 2,4-D, BAP ve kinetin hormonları içeren MS (Murashige ve Skoog, 1962: İM-1, İM-2 ve İM-3) ve CP (Chambonnet, 1982) ortamlarına ekilmişlerdir. Genelde uyartım kültürleri bir inkübatörde 8 gün karanlıkta ve 35o C'de ön uygulamaya tabi tutulurken bazıları normal büyütme koşullarına konulmuşlardır. İM-1, İM-2 ve İM-3 kültürlerinde kallus oluşturan kültürler başlangıçtan 1 ay sonra normal MS medyasına transfer edilmişlerdir. CP medyalarına konan anterler 8 günlük ön uygulama ve 4 günlük normal kültür şartlarda tutulduktan sonra R1 medyasına transfer edilmişlerdir. Kültürler her hafta periyodik olarak gözlenmiş ve değişiklikler kayıt edilmiştir. Bu çalışmada 84 biber genotipinden toplam 7343 adet anter kültüre alınmıştır. Bu kültürlerden 72 adet (% 0.98) androgenik kallus üretilmiştir. Bu kalluslardan embriyoya dönüşmeden büyümeye devam etmişlerdir. Toplam 11 kallustan izole edilen çekirdek DNA örnekleri ile yapılan flow sitometri analizleri kalluslarda kromozom sayısı anormallikleri olduğunu göstermiştir. Biber anterlerinden elde edilen kallus örneklerinin sadece bir tanesi haploid çekirdek DNAsı taşırken, 2 anöploid, 2 miksoploid, 1 poliploid ve 4 diploid çekirdek DNA'sı taşıyan kallusların olduğu bulunmuştur. Çalışma sonucunda biber anter kültürlerinden embriyo veya sürgün gelişimi gözlenmemiştir. Sonuç olarak Türk biberlerinde androgenesis uyartım protokollerinin geliştirilmesi için çalışmalara devam edilmesi gerekmektedir.Anahtar Kelimeler: Androgenesis, Anter Kültürü, Bitki Büyüme Düzenleyicileri, Capsicum annuum L., CP, Haploid Bitki, MS, Solanaceae

Abstract:
Pepper (Capsicum annum L.) is an important vegetable crop from Solanaceae family. Pepper fruits are consumed in various ways such as fresh, dried, paste, spice, sauce. In this important crop species, at least 5 generations of selfing are required in order to produce inbreds through classical breeding efforts. When applicable, doubled haploid (DH) applications can provide completely pure plant lines for all characteristics. It is known that pepper haploid embryos can be produced via anther and microspore cultures. However, there are a limited number of publications about the application of androgenesis based haploid embryo induction technology in this important vegetable species. According to published studies androgenic response in pepper anther cultures is influenced by factors such as pretreatments, induction and regeneration media and the genotype of flower bud donor plants. In this study, the androgenesis potential of open pollinated selection lines and standard commercial pepper lines, which are used in a breeding program carried out in Pamukkale University Plant Genetics and Agricultural Biotechnology Application and Research Center (PAU BIYOM) was determined. Seventy-three genotypes selected from pepper materials collected from different regions of Turkey and 11 standard commercial genotypes were used in the experiments. Donor pepper plants were grown in a greenhouse under standard growing conditions. In this study, anther culture technique has been used for haploid embryo induction. Three different induction media were used to test whether they can induce androgenesis in pepper anther cultures. Anthers were collected from the flower buds when sepals and petals were about the same length. This type of bud is considered to contain microspores at the early binucleate stage in pepper. Anthers extracted from surface sterilized flower buds were cultured on MS (Murashige and skoog, 1962: IM1, IM2 and IM3) containing various concentrations of NAA, 2,4-D, BAP, kinetin and CP (Chambonet, 1982) media. In general, induction cultures were pretreated for 8 days in dark in an incubator set for 35o C before transfer to a culture room, which was set for 25o C/16 hrs light and 18o C/8 hrs dark. Some induction cultures were directly placed in the culture room. Calli producing cultures established in IM1, IM2, IM3 were transferred to MS with no hormones one month after culture initiation. Anther cultures established in CP plates were kept in the pretreatment incubator for the first 8 days and then transferred to culture room where they were kept for 4 more days before transfer to plates containing R1 medium (Chambonet, 1982). Anther cultures were observed weekly and findings were noted. In this study, a total of 7535 anthers from 84 genotypes were placed in induction media. These cultures produced 72 androgenic calli (% 0.95). Androgenic calli continued to grow without forming embryos. Flow cytometry analysis of nuclear DNA samples isolated from 11 calli showed the existance of chromosomal abnormalities in these calli. Among the samples tested only one of the pepper androgenic calli contained haploid nuclei and four of them contained diploid nuclei. Flow cytometry analysis detected two aneuploid, two mixoploid and one polyploid androgenic pepper callus. In this study, no embryo or shoot development were observed from pepper anther cultures. In conclusion, studies for the development of androgenesis induction protocols suited for Turkish pepper genotypes should be continued.Key Words: Androgenesis, Anther Culture, Plant Growth Regulators, Capsicum annuum L., CP, Haploid Plant, MS, Solanaceae