Gypsophila Pilulifera Boiss. türünden elde edilen ekstrelerin saflaştırılmış alkalen proteaz ve DNA hasarı üzerine etkileri ile antioksidan kapasitelerinin araştırılması
Investigation of antioxidant capacity and effects on purified alkalen protease and DNA damage of extracts of Gypsophila Pilulifera Boiss
Yazar: SERCAN ÖZBEK YAZICI
Danışman: PROF. DR. İSMAİL ÖZMEN
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Gypsophila = Gypsophila ; Plazmit DNA = Plasmit DNA ; Saponinler = Saponins ; Yüzey aktif maddeleri = Surfactants

Özet:
Çalışmanın amacı, Bacillus subtilis ATCC 6633'den alkalen proteaz enziminin saflaştırılması ve Gypsophila pilulifera Boiss.&Heldr. türünden elde edilen ham saponin ekstresinin saflaştırılan enzim aktivitesi üzerine etkisinin incelenmesidir.Çalışmada Bacillus subtilis ATCC 6633 suşundan enzim üretimi için nutrient broth besiyeri kullanılmıştır. Bacillus suşunun besiyerinde 48 saat inkübasyonu sonrası kültür ortamı santrifüjlenerek hücreler uzaklaştırılmıştır. Kültür üst sıvısındaki proteinler %70 (NH4)2SO4 çöktürmesi ve daha sonra jel filtrasyon kromatografisi ile %7,29 verimde ve 27,2 kat saflaştırılmıştır. Saflaştırılan enzim SDS-PAGE analizinde tek band olarak gözlenmiş ve molekül ağırlığının 30,1 kDa olduğu tespit edilmiştir. Doğal surfaktan olan saponinin proteaz enzimi üzerine etkisini incelemek için G. pilulifera'den elde edilen ham saponin ekstresi kullanılmıştır. Sonuç olarak ekstre varlığında enzim aktivitesinde artış gözlenmiştir.Çalışmada ayrıca, G. pilulifera'den elde edilen ham saponin ekstresinin toplam fenolik içeriği ve antioksidan özellikleri araştırılmıştır. Ekstrenin toplam fenolik miktarı Folin-Ciocalteau metoduna ile tespit edilmiş olup 6,5 µg (GAE)/mg (ekstre) olarak bulunmuştur. Antioksidan aktivite değerleri ise; DPPH (1,1-diphenyl-2-picril-hidrazil) radikal giderme aktivitesi, FRAP (demir indirgeme kapasitesi), CUPRAC (bakır indirgeme kapasitesi) ve ß-karoten-linoleik asit metodları kullanılarak değerlendirilmiştir. DPPH metodu ile saptanan IC50 değeri 4,56 mg/ml'dir. FRAP metodu kullanarak antioksidan gücü 23,5 µg (troloks)/g (ekstre) iken CUPRAC metodu ile 0,083 mmol(troloks) /kg (ekstre) troloks eş değeri antioksidan kapasitesi olarak bulunmuş ve ekstrenin linoleik oksidasyonunu engellemede yetersiz olduğu saptanmıştır. Sonuçlara göre, tüm metodlarda ekstrenin düşük antioksidan kapasiteye sahip olduğu görülmektedir. Ayrıca plazmid DNA (pBR322), farklı konsantrasyonlarda ham saponin ekstresi ile inkübe edilmiş ve ekstrenin plazmid DNA yapısı üzerine etkisi jel elektroforez metodu ile araştırılmıştır. Ekstrenin konsantrasyonuna bağlı olarak plazmid DNA süpersarmal yapısının bozulmasına ve diğer formların artışına neden olduğu gözlenmiştir.

Abstract:
The aim of the study is purified alkaline protease produced by Bacillus subtilis ATCC 6633 strain and is investigated the effect of the crude saponin extract obtained from Gypsophila pilulifera Boiss.&Heldr. on the purified enzyme.Alkaline protease production from Bacillus subtilis ATCC 6633 strain was carried out in nutrient broth medium and for 48 hour by growth of the Bacillus strain. After cultivation, the culture medium was centrifuged to remove cells. The dissolved proteins in the supernatant were precipitated by the addition of ammonium sulphate to 70% saturation. The enzyme was purified 27,2 fold by gel filtration chromatography followed by (NH4)2SO4 precipitation with 7,29% yield. The purified enzyme was showed single band protein on SDSPAGE and molecular mass was estimated to be 30,1 kDa. To examine the effect of surfactant on the alkaline protease activity, the crude saponin extract from Gypsophila pilulifera were used. It was observed that the activity of enzyme increased in the presence of the extract.In this study, it was also examined to the antioxidant properties and total phenolic content of extract. Total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteau method and found as 6,5 µg gallic acid equivalence (GAE)/mg (extract). Antioxidant properties were evaluated by DPPH (1.1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) free radical scavenging activity, FRAP (ferric-ion reducing antioxidant parameter), CUPRAC (cupric reducing antioxidant capacity) and ß-caroten-linoleic acid method. The IC50 value of extract by DPPH assay was 4,56 mg/ml. Reducing power of the extract was found to be 23,5 µg (trolox)/g (extract) by using FRAP method whereas the TEAC value (trolox equivalent antioxidant capacity) determined by the CUPRAC method was 0,083 mmol (trolox) /kg (extract). However, it was found the extract was not effectively able to inhibit the linoleic acid oxidation. The present results are showed that the extract possesses slight antioxidant activity for studied all in vitro models. Also, the plasmid DNA (pBR322) was incubated with different concentrations of the crude saponin extract and effect of the extract on plasmid DNA was determined by agarose gel electrophoresis. It was observed that the extract was caused conversion of supercoiled DNA structure to other forms as concentration-dependent.