Origanum hypericifolium'un deride ultraviyole radyasyonu hasarları üzerindeki sitolojik ve histokimyasal etkilerinin araştırılması
Investigation of cytological and histochemical effets of origanum hypericifolium on ultraviolet-induced skin damages
Yazar: PINAR İLİ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. NAZAN KESKİN
Pamukkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Deri = Skin

Özet:
Origanum hypericifolium, Sandras Dağı'nda (Beyağaç, Denizli, Türkiye) yetişen ve Lamiaceae familyasına ait olan endemik bir bitkidir. Bitkinin esansiyel yağı başlıca simen, karvakrol, timol ve ?-terpinen gibi monoterpenleri içerir. Monoterpenler, antifungal, antibakteriyel, antioksidan, antikanser, antispazmodik, hipotansif ve vazorelaksan etkilere sahiptir. Güneşin ultraviyole (UV) ışınları, özellikle UVB (280-320 nm), deride eritem, ödem, hiperplazi, hiperpigmentasyon, güneş yanığı hücrelerinin oluşumu, immün baskılanma ve tümörogenezise neden olur. UV radyasyonuna kronik olarak maruziyet deride, kollajen sentezinde azalma, kollajen demetlerinde dejeneratif değişiklikler, elastotik materyal birikimi gibi ekstrasellüler matriks değişimlerine neden olur. Bu değişimler, deri kalınlığında artış, deri elastikiyetinde azalma ve kırışık oluşumuyla karakterize olan fotoyaşlanmaya yol açar. UV radyasyonu, deride mast hücrelerinin sayılarında artışa, stratum korneum ve sebase bezleri lipitlerinde artışa, lipitlerin peroksidasyonuna ve sebase bez hiperplazisine neden olur. Ayrıca, UV'ye maruz kalan hücrelerde laminin sekresyonunun arttığı ve keratinositlerde galektin-3 mRNA'sının sentezinin geçici olarak uyarıldığı bilinmektedir. Bununla birlikte, UV radyasyonu ile indüklenen DNA hasarlarının, farklılaşma, proliferasyon ve apoptoziste de değişikliklere yol açabileceği bildirilmiştir. Son zamanlarda, birçok in vitro ve in vivo çalışma ile, UV'ye maruz kalmış deride botanik ajanların etkisi araştırılmaktadır.Bu çalışmada, endemik bir tür olan O. hypericifolium esansiyel yağının deride UV radyasyonu hasarları üzerindeki etkileri, ışık mikroskobik ve stereolojik yöntemlerle araştırılmıştır. Bitkiden su distilasyonu yoluyla esansiyel yağ elde edilmiş ve içeriği, gaz kromotografisi-kütle spektroskopisi (GC-MS) kullanılarak tayin edilmiştir. Dorsal derileri tıraşlanmış Balb/c ırkı dişi farelerden 4 grup oluşturulmuştur (Grup 1: kontrol, Grup 2: UVB uygulanan, Grup 3: yağ uygulanan, Grup 4: UVB ve yağ uygulanan). UVB uygulanmadan önce, bir hafta süresince bir gün arayla dorsal derileri tıraşlanan farelere seyreltilmemiş yağ uygulanmaya başlanmıştır. Daha sonra, 4 hafta süresince haftada 3 kez artan dozlarda UVB'ye maruz bırakılmışlardır. Süre sonunda alınan deri örnekleri parafine gömülmüş ve ayrıca bir kısmıda -86oC'de saklanmıştır. Parafin kesitlere, hematoksilen-eozin (genel histoloji, deri kalınlığı), Mallory'nin fosfotungstik asit-hematoksilen (kollajen fibriller), Taenzer-Unna orsein (elastik fibriller) ve toluidin mavisi (mast hücreleri) boyama yöntemleri uygulanmıştır. Deri yüzey ve sebase bez lipitleri, laminin ve galektin-3, bazı karbohidrat moleküllerinin yoğunluğu ve DNA fragmentasyonu/apoptozis'i araştırmak için, frozen kesitlere, sırasıyla, Oil Red O boyama, laminin ve galektin-3 immünhistokimya, lektin histokimya [Lektinler: N-asetil glikozamine ß(1?4) bağı ile bağlı galaktoza spesifik olan Datura stramonium agglutinin (DSA), uç mannoz uzantılarına spesifik olan Galanthus nivalis agglutinin (GNA) ve galaktoza ?(2?3) bağlı sialik asitlere spesifik olan Maackia amurensis leucoagglutinin (MAL)] ve TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) yöntemleri uygulanmıştır.O. hypericifolium esansiyel yağı GC-MS ile analiz edilmiştir. Yağda, simen, karvakrol, timol ve ?-terpinen gibi monoterpenlerden oluşan 15 bileşen tespit edilmiştir. Derinin genel histolojisinde, tüm gruplarda, en dış tabaka epidermis ile sebase bezleri, kıl folikülleri ve şaftlarını içeren dermis ayırt edilmiştir. Derin dermiste, yağ ve iskelet kas dokusu yer almaktadır. Epidermal kalınlık, Grup 3 ve 4'de, istatistiksel olarak Grup 1 ve 2'den anlamlı fark göstermiştir (p<0,05). Grup 3 ve 4'de dermisde, mast hücreleri ile degranüle olmuş mast hücreleri gözlenmiştir. Grup 4'de mast hücre sayısı Grup 1'e göre istatistiksel olarak farklılık göstermiştir (p<0,05). Tüm gruplarda deri yüzey lipitleri ile sebase bez lipitlerinin nötral lipit ve yağ asitleri yoğunlukları benzerlik göstermiştir. Kollajen demetleri, Grup 3 ve 4'de homojen ve yoğundur. Elastik fibriller, deney gruplarında birikimler göstermemiştir. Laminin reaksiyonu, dermal-epidermal bağlantı bölgelerinde, Grup 3'de yaygın dağılmış, Grup 4'de düzensiz ve devamsız bir şekilde gözlenmiştir. Grup 3'de, dermiste galektin-3-pozitif reaksiyon gösteren hücreler ayırt edilmiştir. Reaksiyon, epidermal hücrelerin zarlarında, dermiste, kıl folikülü çevresinde ve hücrelerinin zarlarında, sebase bezleri çevresinde ve hücrelerinin zarlarında, kas demetleri çevresinde, ter bezi hücre zarlarında izlenmiştir. Grup 4'de, dermiste, fibril yapılarda yoğun galektin-3-pozitif reaksiyon izlenmemiştir. Epidermiste reaksiyon daha çok hücre zarlarında gözlenmiştir. Sebase bezi ve kıl folikülü çevresinde ve hücrelerinin zarlarında, kas demetleri çevresinde de reaksiyon gözlenmiştir. GNA+ reaksiyon; Grup 3'de, epidermiste az yoğun, dermiste yoğun; Grup 4'de, epidermiste az, dermiste biraz daha yoğun olarak görülmüştür. DSA+ reaksiyonu; Grup 3'de, epidermiste az yoğun, dermiste daha yoğun; Grup 4'de, epidermiste az, dermiste biraz daha yoğundur. MAL+ reaksiyonu ise, Grup 3 ve 4'de, epidermiste az yoğun, dermiste fibril yapılarda oldukça yoğundur. Grupların epidermisindeki TUNEL-pozitif hücre sayıları ise şu şekildedir: Grup 2 > Grup 3> Grup 4> Grup 1. İstatistiksel olarak, Grup 2, 3 ve 4, Grup 1'e göre anlamlı derecede fark göstermiştir (p<0,05).Sonuç olarak, O. hypericifolium esansiyel yağının kollajen ve elastik fibriller üzerinde, UVB ile indüklenen değişimleri önleyebileceği, yağın olasılıkla konsantrasyonuna bağlı olarak epidermal kalınlığı arttırabileceği söylenebilir. UVB/yağ uygulanan grupta, mast hücre sayısı kontrol grubuna göre istatistiksel olarak farklıdır. Yağın, deri yüzey ve sebase bezlerinin nötral lipit ve yağ asitlerinin yoğunluklarına bir etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Ayrıca, yağın UVB radyasyonunun neden olduğu laminindeki yıkılım ve düzensiz dağılım üzerinde bir etkisi yoktur. Yağ uygulanan deride, dermiste galektin-3-pozitif hücreler gözlenmiştir. O. hypericifolium esansiyel yağı deride bazı karbohidratlarda değişime neden olabilir. UVB, yağ, UVB ile yağ birlikte, TUNEL-pozitif hücre sayısında artışa neden olabilmektedir. Bununla birlikte, bulguların yağın farklı konsantrasyonları ile yapılacak benzer uygulamaların sonuçları ile karşılaştırılmasına ve bulguların desteklenmesi için daha ileri moleküler analizlerin yapılmasına gerek vardır.

Abstract:
Origanum hypericifolium is an endemic plant growing in Sandras Mountain, Denizli-Turkey and it belongs to Lamiaceae family. The main constituents of the essential oil are monoterpenes such as cymene, carvacrol, thymol and ?-terpinene. Monoterpenes have antifungal, antibacterial, antioxidant, anticancer, antispasmodic, hypotensive and vasorelaxant effects. Ultraviolet (UV) radiation, particularly UVB (280?320 nm) from sunlight, causes erythema, edema, hyperplasia, hyperpigmentation, sunburn cells, photoaging, immunosuppression and tumorigenesis in the skin. Chronic UV exposure leads some alterations in the extracellular matrix components of the skin such as decrease in the collagen synthesis, degenerative changes on dermal collagen bundles and elastotic material accumulation. These alterations lead to photoaging which is characterized by increased epidermal thickness, decreased skin elasticity and wrinkle formation. UV radiation causes increase in the mast cells numbers, amount of the stratum corneum and sebaceous gland lipids, lipid peroxidation and sebaceous gland hyperplasia in the skin. Also, it is known that, the increased secretion of laminin in the UV-irradiated cells and the transiently upregulation of galectin-3 mRNA synthesis in UV-irradiated keratinocytes. However, it was reported that DNA damages induced by UV radiation can lead to alterations in the differentiation, proliferation and apoptosis. In recent years, many in vivo and in vitro studies have investigated the effects of botanical agents on UV irradiated skin.In this study, the effects of the essential oil of O. hypericifolium, an endemic species, on damages of UV radiation in the skin were investigated by means of light microscopic and sterologic methods. The essential oil was extracted from plants by hydrodistillation and its composition was determined by means of gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Dorsal skins shaved of female Balb/c mice were allocated to four groups (Goup 1: control, Group 2: UVB-irradiated, Group 3: oil applied, Group 4: UVB-irradiated and oil applied). The undiluted oil was applied topically on the dorsal skin shaved of mice on alternate days for one week before the irradiation period. Then, they were irradiated 3 times per week with increasing doses of UVB for 4 weeks. At the end of the experimental period, dorsal skin samples were embedded in paraffin and also some were stored at -86oC. Haematoxylin and Eosin (for general histology and measurement of epidermal thickness), Mallory?s phosphotungstic acid haematoxylin (for collagen fibers), Taenzer-Unna Orcein (for elastic fibers) and Toluidin blue (for mast cells) staining methods were applied on paraffin sections. Oil Red O stain, laminin and galectin-3 immunohistochemistry, lectin histochemistry [Lectins: Datura stramonium agglutinin (DSA) specific for galactose ß(1?4) N-acetylglycosamine, Galanthus nivalis agglutinin (GNA) specific for terminal mannose residues, Maackia amurensis leucoagglutinin (MAL) specific for sialic acid?(2?3)Galactose] and TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) methods were applied on frozen sections for investigation of skin surface and sebaceous gland lipids, laminin and galectin-3, the intensity of some carbohydrate molecules and DNA fragmentation/apoptosis, respectively.The essential oil of O. hypericifolium was analyzed by GC-MS. The plant oil was found to contain 15 compounds, including monoterpens such as cymene, carvacrol, thymol and ?-terpinene. In the general histology of the skin of all groups, the epidermis, the outermost layer of the skin, and the dermis which contains sebaceous glands, hair follicles and shafts were distinguished. Adipose tissue and skeletal muscle tissue were found in the deeper dermis. Epidermal thickness of the groups 3 and 4 were significantly different from groups 1 and 2 (p<0.05). In the dermis of groups 3 and 4, mast cells and degranulated mast cells were observed. Mast cells number of group 4 were statistically different from group 1 (p<0.05). The intensities of neutral lipids and fatty acids of the skin surface and sebaceous gland lipids were similar in all groups.Collagen bundles were homogenous and intense in groups 3 and 4. In groups 3 and 4, the accumulation of elastic fibers in dermis was not observed. The laminin reaction was observed as a diffuse distribution pattern in group 3 and irregular and discontinuous patterns in group 4 at the dermal-epidermal junction. In group 3, galectin-3-positive cells were distinguished in dermis. The reaction was observed in the cell membranes of epidermal cells, dermis, around the hair follicles and their cell membranes and also around the muscle bundles and sweet glands cell membranes. In group 4, intense galectin-3-positive reaction was not observed in fibrils of dermis. The reaction was generally observed on epidermal cell membranes. It was visualized around the sebaceous glands and hair follicles and their cell membranes, and also around the muscle bundles. In group 3, epidermis showed a weak, dermis showed strong; in group 4, epidermis showed a weak, dermis showed a moderate GNA+ reactions. In group 3, epidermis showed a weak, dermis showed strong; in group 4, epidermis showed a weak, dermis showed a moderate DSA+ reactions. A weak MAL+ reactions in epidermis and strongly intense MAL+ reactions in fibrils of dermis were observed in groups 3 and 4. The number of the epidermal TUNEL-positive cells in the groups are in the following order: Group 2 > Group 3> Group 4> Group 1. Groups 2, 3 and 4 were statistically significantly different from group 1 (p<0.05).As a result, it can be assumed that essential oil of O. hypericifolium can prevent UVB-induced alterations in collagen and elastic fibrils, increases the epidermal thickness which is presumably due to concentration of the oil. The number of mast cells in UVB/oil applied group is statisticaly different compared to the control group. It was observed that the plant?s essential oil has no effect on the intensity of neutral lipids and fatty acids of skin surface and sebaceous gland lipids. Also, it has not any effect on the degradation and the irregular distribution of laminin caused by UVB irradiation. Galectin-3-positive cells were observed in the dermis of the skin of the oil applied group. O. hypericifolium essential oil can cause some of the carbohydrate changes in the skin. UVB, essential oil, and both UVB and essential oil may cause an increase in the number of TUNEL-positive cells. However, similar studies using different concentrations of the plant?s essential oil are needed for comparison with the findings. Also, further molecular analysis are needed in order to support the findings.