C-di-gmp bağlanma proteini bcse regülasyonunun farklı salmonella biyofilm morfotipleri üzerindeki virülanslık rolü
The role of c-di-gmp binding protein bcse regulation virulence on different salmonella biofilm morphotypes
Yazar: CANER ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA AKÇELİK
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu tez çalışmasında Salmonella Typhimurium DMC4 ve Salmonella Group C1 (DMC2) suşlarında bcsE geninin ve bu genin kodladığı BcsE proteininin bakteri fizyolojisi ve patojenitesi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Doğal suşların bcsE geni bozulmuş mutantlarında polistiren yüzeylerde biyofilm ve sıvı-hava ara fazında pelikül oluşumunun gerçekleşmediği saptanmıştır. Ayrıca doğal suşlardaki "rdar" biyofilm morfotipinin mutantlarda belirgin bir şekilde kaybolduğu gözlenmiştir. bcsE geni bakımından mutant suşlarda "swimming" ve "swarming" hareket, agar besiyeri yüzeylerinde, doğal suşlara oranla çok yüksek bir artış gösterirken, selüloz polisakkariti ve selülaz  enzimi üretimi aynı oranlarda düşüş göstermiştir. Salmonella bcsE geni pET28 plazmid vektörü kullanılarak Escherichia coli BL21 suşuna klonlanmış ve bu suşta üretilen his-tag işaretli protein saflaştırılarak BALB/c farelerde poliklonal antikorlar elde edilmiştir. Söz konusu antikorlar BscE proteinine belirgin bir antijen spesifitesi gösterdiği Western blot yöntemi ile tanımlanmıştır. BALB/c farelerle yürütülen immünizasyon ve sistemik kalıcılık testleri sonucunda; BscE proteininin hümoral (IgG1 ve IgG2a) yanıtları ve hücresel tepkiyi yüksek düzeyde (Th1 sitokin üretimi, IgG2a/IgG1>1) tetiklediği ve bcsE geni bakımından mutant suşlarda karaciğer ve dalak örneklerindeki sistemik kalıcılığın sırasıyla % 99,99 ve % 100 oranında düştüğü tespit edilmiştir. HT-29 epitel hücreleri ile yürütülen invazyon denemelerinde de doğal suşlarda % 24,6 ile % 26,2 oranında gerçekleşen invazyonun, bu suşların bcsE geni bakımından mutant suşlarında invazyon yeteneğinin tamamen ortadan kalktığı belirlenmiştir. Bu bulgular bcsE geninin Salmonella fizyolojisi, çevresel adaptasyonu ve patojenitesinde önemli bir rol üstlendiğine dair literatürdeki ilk bulgulardır.

Abstract:
In this thesis, the effects of bcsE gene and BcsE protein encoded by this gene on bacterial physiology and pathogenicity in Salmonella Typhimurium DMC4 and Salmonella Group C1 (DMC2) strains were investigated. It was found that biofilm formation on the polystyrene surfaces and pellicle formation in the liquid-air intermediate phase did not occur in the bcsE gene mutants of wild type strains. In addition, it was observed that the "rdar" biofilm morphotype in wild type strains disappeared significantly in the mutants. In terms of the bcsE gene, the "swimming" and "swarming" movement in the agar medium surfaces in mutant strains showed a very high increase compared to the natural strains, while cellulose polysaccharide and cellulase enzyme production decreased at the same rates. The Salmonella bcsE gene was cloned into Escherichia coli BL21 strain using the pET28 plasmid vector, and the his-tagged protein produced in this strain was purified to obtain polyclonal antibodies in BALB/c mice. The antibodies in question were identified by the Western blot method, in which it showed marked antigen specificity to the BscE protein. As a result of immunization and systemic persistence tests carried out with BALB/c mice; BscE protein was found to trigger high levels of humoral (IgG1 and IgG2a) responses and cellular response (Th1 cytokine production, IgG2a / IgG1> 1), and systemic persistence in the liver and spleen samples decreased by 99,99% and 100% in mutant strains in terms of bcsE gene, respectively. In the invasion trials conducted with HT-29 epithelial cells, it was determined that the invasion that occurred in wild type strains between 24,6% and 26,2%, the invasion ability of their mutant strains in terms of bcsE gene completely disappeared. These findings are the first data in the literature that bcsE gene plays an important role in Salmonella physiology, environmental adaptation and pathogenicity.