Kolon kanseri tanılı olgularda MS-MLPA metodu ile MMR (Mismatch Repair=Hatalı eşleşme tamiri) genlerinde metilasyon sıklığının saptanması
Detection of methylation pattern at MMR (mismatch repair) genes by MS-MLPA method in cases of colon cancer
Yazar: İBRAHİM ÇEKEN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SERAP TUTGUN ONRAT
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Diğer tümör tiplerinde olduğu gibi, kolon kanserinde de, onkogenlerin aktivasyonunu, tümor suppressor ve DNA-tamir genlerinde değişiklikler meydana gelmektedir. Genetik değişimlere ek olarak, sitozin metilasyonu gibi epigenetic abormaliler de gözlenmektedir. DNA'daki en önemli tamir mekanizmalarından birisi olan MMR (mismatch repair) genlerindeki mutasyonlar kolon kanserinde önemli rol oynamaktadırlar, özellikle MLH1 ve MSH2.1. MMR genlerinde 1500 den fazla değişik varyantın olduğu bildirilmiştir.Çalışmamızda parafin dokuya gömülü olarak elde edilen kolon kanseri örnekleri kullanılmıştır. 4 tane kontrol ve 70 tane çalışma grubu olmak üzere, toplam 70 örnek çalışılmış ve bu örneklerin 49 tanesi (%70) adenokarsinoma ve 21(30.0%) karsinomadır. MLPA tekniğinin bir modifikasyonu MS-MLPA (methylation-specific multiplex ligation dependent probe amplification)tekniği kullanılarak kopya sayısı değişimleri elde edilmiştir. MS-MLPA probları metilasyon için özeldir ve metilasyona hassas olan HhaI restriksiyon enzimi ile de kesim yapılmıştır. Gende metilasyon olan kısımların belirlenmesi amacıyla MS-MLPA yöntemini çalışmak üzere ME001 tumor-suppressor kit (MRC Holland) kullanılmıştır. Amplifiye edilen ürünler sekans tip kapiller elektroforez kullanılarak (ABI 310; Applied Biosystems, Foster City, California, USA) analiz edilmiştir. Elde edilen pik büyüklükleri ve arealar Excel dosyasına aktarılarak, kolon kanseri örneklerindeki genlerin metilasyon durumlarını belirlemek üzere kesilen ve kesilmeyen bölgeler karşılaştırılarak sonuçlar elde edilmiştir. Metilasyon duyarlı enzim kesim bölgesi içeren MLH1, MSH2, MSH6, MSH3, MLH3, PMS2, MGMT genlerine ait toplam 21 adet özgül hedef bölgenin prob amplifikasyonu yapıldı. Analiz sonuçlarına göre çalışılan genlerin metilasyon oranları sırası ile MLH1 (97.14%), MSH2 (24.28%), MSH6 (67.14%), MSH3 (78.57%), MLH3 (75.71%), PMS2 (65.71%), MGMT (82.85%) olarak bulunmuştur. Genomik instabiltenin tanımlanması için MMR (Mismatch Repair) genlerindeki metilasyon değişimi parametreleri kolon kanseri değerlendirmelerinde çok önemli bir kriter olarak kullanılabilir.Anahtar Kelimeler: Kanser, Kolon Kanseri, Hatalı-Eşleşme Tamir Genleri, DNA Metilasyonu, MLPA (Multipleks Ligasyon Esaslı Prob Amplifikasyonu)

Abstract:
Like other tumor types, colon carcinoma is thought to arise following the activation of oncogenes and inactivation of tumor suppressor and DNA-repair genes. In addition to genetic alterations, epigenetic abnormalities, such as changes in genomic DNA cytosine methylation patterns, are associated with all cancer types. The syndrome is caused by germline mutations in DNA mismatch repair (MMR) genes, predominantly MLH1 and MSH2.1. More than 1,500 different variants in MMR genes have been reported, approximately half of which may be pathogenic.In our study with a diagnosis of colorectal cancer tissue samples embedded in paraffin were used. With total 70 samples were studied, adenocarcinoma is 49 (70.0%) of samples, carcinoma is 21(30.0%) of total consists of samples. A modification of the MLPA technique, MS-MLPA (methylation-specific multiplex ligation dependent probe amplification) allows the detection of both copy number changes and unusual methylation levels of 10-50 different sequences in one simple reaction. MLPA probes for methylation quantification are similar to normal MLPA probes, except that the sequence detected by the MS-MLPA probe contains the sequence recognized by the methylation-sensitive restriction enzyme HhaI. Gene methylation status was evaluated by (MS-MLPA), using the ME001 tumor-suppressor kit (MRC Holland). A total of 24 genes were studied, using 20?200 ng of sample DNA. The amplified products were analyzed by sequence-type capillary electrophoresis (ABI 310; Applied Biosystems, Foster City, California, USA). The peak sizes and areas were exported to an Excel file, and the normalized areas from the digested and undigested samples were compared to determine the methylation status of the genes in colon cancer patients. According to the results of this amplification mean MLH1 methylation rates (97.14%), MSH2 (24.28%), MSH6 (67.14%), MSH3 (78.57%), MLH3 (75.71%), PMS2 (65.71%), MGMT (82.85%) were found to be. The Mismatch Repair (MMR) system is critical for the maintenance of genomic stability.Key Words : Cancer, Colorectal Cancer, Mismatch Repair Genes, DNA Methylation, MLPA (Multiplex Ligation Dependent Prob Amplifiaction)