Nörotoksisiteye karşı probiyotik ve D vitamininin nöroprotektif etkisinin in vitro araştırılması
In vitro investigation of the neuroprotective effect of probiotics and vitamin D against neurotoxicity
Yazar: FATMA HAZAN GÜL
Danışman: PROF. DR. NALAN HAKİME NOĞAY ; DOÇ. DR. GÖKHAN ÜNAL
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Beslenme ve Diyetetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Beslenme ve Diyetetik = Nutrition and Dietetics
Dizin: Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Nörotoksinler = Neurotoxins ; Probiyotik bakteriler = Probiotic bacteria ; Vitamin D = Vitamin D

Özet:
Nörotoksisite sonucu oluşan nörodejenerasyon, reaktif oksijen türlerinin artması, proteinlerin agregasyonu, ubikitin yolağının disfonksiyonu ve yaşlanma gibi birçok faktörden etkilenerek ortaya çıkan bir durumdur. Nörodejeneratif hastalıkların etyopatogenezini aydınlatmak ve yeni tedavi stratejileri geliştirmek amacıyla in vivo ve in vitro hastalık modelleri oluşturulmaktadır. Bunlardan birisi özellikle Parkinson hastalığı modelinde kullanılan rotenon modelidir. Rotenon, mitokondrideki elektron taşıma sistemi Kompleks 1 inhibisyonu yoluyla oksidatif stresi arttıran organik bir pestisittir. Probiyotikler yeterli miktarda alındığında bağırsaklarda mikrobiyal homeostazın sağlanmasında rol oynayan yararlı bakterilerdir. D vitamini ise yağda çözünen ve steroid yapıda hormon olarak nitelendirilen bir vitamindir. Probiyotik ve D vitamininin ayrı ayrı nörotoksisite üzerine nöroprotektif etki gösterdiği yapılan çalışmalarda açıkça görülmektedir. Fakat her ikisinin kombine bir şekilde kullanılarak oksidatif stres ve apoptoz üzerindeki sinerjistik etkileri ile ilgili literatürde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışma, pre-inkübasyon, ko-inkübasyon ve post-inkübasyon olacak şekilde üç farklı zamanda rotenonla nörotoksisite oluşturulmuş SH-SY5Y hücre hattında probiyotik ve D vitamininin sinerjistik nöroprotektif etkinliğini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla ilk olarak hücre hattında sitotoksisite oluşturan rotenon konsantrasyonu belirlenmiştir. Etkin konsantrasyon değeri 150 nM olarak tespit edilmiştir ve deney gruplarında da bu konsantrasyon değeri kullanılmıştır. Probiyotik ve D vitamininin 24 saatlik uygulamasından sonra en etkili protektif konsantrasyonları belirlenmiştir (probiyotik: 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.01 mg/ml; D vitamini: 5 µM, 2.5 µM, 1.25 µM). Konsantrasyon belirleme çalışmaları MTT testi ile yapılmıştır. Total antioksidan kapasiteyi belirlemek için ELİSA testleri kullanılmıştır. ELİSA testlerinde i) Protein Tirozin Kinaz (PTK); ii) Super Oksit Dismutaz (SOD); iii) Glutatyon Peroksidaz (GSH); iv) Glutatyon Redüktaz (GSR); v) Katalaz (CAT) antioksidan enzim aktiviteleri değerlendirilmiştir. Çalışma sonucunda elde edilen bulgular rotenonun SH-SY5Y hücrelerinde nörotoksik olduğunu ve hücre ölümünü indüklediğini göstermiştir. Test sonuçları, probiyotik ve D vitaminin düşük konsantrasyonlarda rotenon kaynaklı sitotoksisiteye karşı hücre sağ kalımını arttırarak nöroprotektif bir etkiye sahip olduğunu, probiyotiklerin hücreler üzerinde herhangi bir sitotoksik etkisi olmadığı için bu artışın daha çok D vitamini aktivitesinden kaynaklanabileceğini ortaya koymuştur. Fakat daha etkili sonuçlar elde etmek için probiyotik ve D vitamininin farklı konsantrasyonları ve uygulama süresi ile ilgili kapsamlı çalışmalar yapılmalıdır.

Abstract:
Neurodegeneration as a result of neurotoxicity is a condition influenced by many factors such as increased reactive oxygen species, aggregation of proteins, dysfunction of ubiquitin metabolism, and aging. In vivo and in vitro disease models are being created to explore the etiopathogenesis of neurodegenerative diseases and to develop new treatment strategies. One of them is the rotenone model, which is used especially in Parkinson's disease. Rotenone is an organic pesticide that increases oxidative stress by inhibiting the electron transport system complex 1 in mitochondria. Probiotics are beneficial bacteria that, when taken in sufficient amounts, play a role in maintaining microbial homeostasis in the gastrointestinal tract. Vitamin D, is a fat-soluble vitamin that belongs to the steroid hormones. In studies, it is clear that probiotics and vitamin D separately have a neuroprotective effect on neurotoxicity. However, there is no study in the literature on the synergistic effect of these two substances on oxidative stress and apoptosis when used in combination. This study was performed to compare and determine the synergistic neuroprotective efficacy of probiotics and vitamin D in the SH -SY5Y cell line in which neurotoxicity was induced with rotenone at three different times: pre-incubation, co-incubation, and post-incubation. For this purpose, the concentration of rotenone causing cell line toxicity was first determined. The effective concentration was set at 150 nM, and this concentration was also used in the experimental groups. The most effective protective concentrations of probiotic and vitamin D were determined after 24 hours of administration (probiotic: 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.01 mg/ml; vitamin D: 5 µM, 2.5 µM, 1.25 µM). The concentration determination studies were performed using the MTT test. ELISA assays were used to determine total antioxidant capacity. In the ELISA assays, i) protein tyrosine kinase (PTK), ii) superoxide dismutase (SOD), iii) glutathione peroxidase (GSH), iv) glutathione reductase (GSR), and v) catalase (CAT) were tested for their antioxidant enzyme activity. The results of the study show that rotenone is neurotoxic in SH-SY5Y cells and induces cell death. The test results showed that probiotics and vitamin D have a neuroprotective effect by increasing cell survival against rotenone-induced toxicity at low concentrations, but this increase is likely to be mainly due to vitamin D activity, as probiotics have no toxic effects on cells. However, more comprehensive studies on the concentration and duration of application of probiotics and vitamin D should be conducted to obtain more effective results.