İnsan glioblastoma U87 hücre hattında piceatannol ve EGFR inhibitörü erlotinib kombinasyonunun hücre proliferasyonu, hücre döngüsü ve apoptoz üzerine etkisi
The effects of piceatannol and EGFR inhibitor erlotinib combination on cell proliferation, cell cycle and apoptosis in human glioblastoma U87 cell line
Yazar: TOURKIAN CHASAN
Danışman: PROF. DR. OĞUZHAN DOĞANLAR
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Glioblastoma multiforme (GBM), evre IV astrositoma olarak bilinen en yaygın ve agresif primer beyin tümörlerinden biridir. Cerrahi, radyoterapi, kemoterapi ve kombine tedaviyi içeren multimodalite tedaviye rağmen prognoz hala kötüdür ve hastalar genellikle tanıdan 6-14 ay sonra ölürler. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), GBM'nin % 60'ında aşırı eksprese edilen bir reseptör tirozindir. EGFR aktivasyonu, RAS/RAF/MAPK, PI3K/AKT/mTOR ve JAK/STAT dahil olmak üzere çoklu aşağı akış sinyal yolaklarının otofosforilasyonuna yol açar. Erlotinib, güçlü bir geri dönüşümlü EGFR tirozin kinaz inhibitörüdür. Doğal bir polifenolik stilben bileşiği olan Piceatannol ise antikanser özelliklere sahiptir.
Bu çalışmanın amacı, Erlotinib ve Piceatannol kombinasyonunun EGFR aktivasyonu ile tetiklenen sinyal yolakları üzerindeki etkilerini açıklamak ve GBM tedavisindeki rolünü araştırmaktır. Güçlü sinerjistik etkiyi ortaya çıkaran en etkili dozlar MTT testi ile belirlenmiştir. Her ajanın tekli ve kombinasyon uygulamalarının sinyal yolakları üzerindeki etkileri qRT-PCR ve western blot analizi ile araştırılmıştır. Kombinasyonun apoptoz yolağı üzerindeki etkisini incelemek için hücre döngüsü testi, Annexin V/PI boyama ve floresan moleküler görüntüleme yapılmıştır.
Erlotinib ve Piceatannol uygulamaları ile hücre canlılığı U87-MG hücrelerinde doza ve zamana bağlı olarak önemli düzeyde azalmıştır. U87-MG hücrelerinde Bliss skoru 25 olan 10 μΜ Erlotinib ve 20 μΜ Piceatannol kombinasyonu, hücre proliferasyonunu sinerjik olarak inhibe etmiştir. Kombinasyon uygulamasında EGFR gen ekspresyonu, EGFR, Ras ve Raf protein ekspresyonları kontrole göre önemli ölçüde azalmıştır. Erlotinib ve Piceatannol kombinasyonu, insan glioblastoma hücrelerinde JAK2/STAT3 yolağını da baskılamıştır. Ayrıca, Erlotinib ve Piceatannol, G1/S kontrol noktası hücre döngüsü tutuklanmasına yol açmış ve kombine uygulaması, iki ajandan herhangi birinin tek başına uygulanmasından daha etkili bir şekilde intrinsik apoptozu indüklemiştir.
Bu sonuçlar, Erlotinib ve Piceatannol kombinasyon terapi modelinin, GBM tedavisinin etkinliğini arttırmada umut verici, hedeflenmiş güçlü bir strateji olarak kabul edilebileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most common and aggressive primary brain tumours, known as grade IV astrocytoma. Despite the multimodality treatment which includes surgery, radiotherapy, chemotherapy and also the combined treatment, the prognosis is still poor and patients generally died within 6-14 months of diagnosis. Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a receptor tyrosine which is overexpressed in 60% of GBM. EGFR activation leads to autophosphorylation of multiple downstream signalling pathways including the RAS/RAF/MAPK, PI3K/AKT/mTOR and JAK/STAT. Erlotinib is a potent reversible EGFR tyrosine kinase inhibitor. Piceatannol, a natural polyphenolic stilbene compound, has anticancer properties.
The aim of this study is to investigate the effects of Erlotinib and Piceatannol combination on signaling pathways triggered by EGFR activation and to determine its role in GBM therapy. The most effective doses that reveal strong synergistic effect were determined by an MTT assay. The effects of single and combination treatments of each agent on cellular signalling pathways were investigated by qRT-PCR and western blot analysis. Cell cycle distribution, Annexin V/ PI staining and fluorescent molecular imaging were performed to examine the impact of combination on the apoptosis pathway.
The cell viability significantly decreased by Erlotinib and Piceatannol treatments dose- and time- dependent manner in U87-MG cells. The combination of 10 μΜ Erlotinib and 20 μΜ Piceatannol with Bliss score of 25 synergistically inhibited cell proliferation in U87-MG cells. EGFR gene expression, EGFR, Ras and Raf protein levels significantly decreased in combination treatment compared to the control. Combining Erlotinib and Piceatannol also suppressed the JAK2/STAT3 pathway in human glioblastoma cells. Moreover, Erlotinib and Piceatannol were led to G1/S checkpoint cell cycle arrest and the combined treatment was induced intrinsic apoptosis more effectively than either of the two agents alone.
These results suggest that the combination therapy model of Erlotinib plus Piceatannol may be considered as a promising targeted potent strategy in enhancing the efficacy of GBM treatment.