Klinik örneklerden izole edilen kolistin dirençli klebsiella pneumoniae suşları üzerinde glisirhizik asit ve kolistinin sinerjistik etkinliğinin araştırılması
Investigation of the synergy effectiveness of glycyrrhi̇zi̇c acid and colisti̇n on colistin resistant klebsiella pneumoni̇ae strains isolated from clinical samples
Yazar: FERHAT ZENGİN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ZAFER HABİP
İstanbul Medeniyet Üniversitesi / Göztepe Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Glisirizik asit = Glycyrrhizic acid ; Klebsiella = Klebsiella ; Klebsiella enfeksiyonları = Klebsiella Infections ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae ; Kolistin = Colistin ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Amaç: Kolistin dirençli  Klebsiella pneumoniae enfeksiyonu tedavisine yönelik çalışmalara katkıda bulunmak amacıyla, kolistin dirençli ve duyarlı Klebsiella pneumoniae'lar üzerinde kolistin ile birlikte glisirhizik asitin kombine etkinliğini incelemektir.
Yöntem: Çalışmamıza İstanbul Medeniyet Üniversitesi Göztepe Eğitim ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarına 30.06.2017-04.07.2019 tarihleri arasında gelen klinik örneklerinden izole edilmiş, 30 adet kolistin duyarlı ve 30 adet kolistin dirençli Klebsiella pneumoniae izolatı dahil edildi. Toplanan suşlarda sıvı mikrodilüsyon yöntemi kullanılarak kolistin ve glisirhizik asit için MİK değerleri belirlendi. Daha sonra 60 izolat üzerinde kolistin-glisirhizik asit kombine etkinliği dama tahtası yöntemi kullanılarak araştırıldı. Elde edilen fraksiyonel inhibitör konsantrasyon değerlerine göre fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksi hesaplamaları yapılarak kombine etkinlik değerlendirildi.
Bulgular: Çalışılan 60 adet suş fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksi değerlerine göre incelendiğinde 13'ünde (%21,7) indiferans, 13'ünde additif(%21,7), 9'unda(%15) sinerjistik, 21'inde (%35) antagonizma saptandı, 4'ünde (%6,7) ise fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksi değeri saptanamadı.
Kolistin dirençli grup incelendiğinde n=19(%63,3) antagonizma, n=6(%20) indiferans, n=3(%10) additif etki saptanırken, 2 adet izolatta fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksi değeri saptanamamıştır. Kolistin duyarlı suşlar incelendiğinde ise n=10(%33) additif, n=9(%30) sinerjizm, n=7(%23) indiferans, n=2(%6,7) antagonizma saptanmış ve 2 adet izolatta fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksi değeri hesaplanamamıştır. Kolistin duyarlı ve dirençli grup kendi içinde değerlendirildiğinde; kolistin duyarlı grupta additif ve sinerjistik etkinlik, kolistin dirençli grupta ise antagonistik etkinlik diğer gruba oranla istatiksel olarak anlamlı derecede yüksek saptanmıştır (p=0,001).
Her bir suş için sadece bir kuyucuk fraksiyonel inhibitör konsantrasyon  indeksi değeri hesaplaması üzerinden (fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksi hesaplanamayanlar dışarıda tutularak) duyarlı ve dirençli suşların fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksi ortalamaları alındığında dirençli grup 4,04, duyarlı grup ise 1,05 olarak bulunup iki grup arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır(p=0,001).
Her bir suş için fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksi değeri hesaplaması yapılmış tüm kuyucuklar değerlendirilerek (fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksi değeri hesaplanamayanlar dışarıda tutularak) duyarlı ve dirençli grup ortalamaları alındığında; Dirençli grupta 301 adet kuyucuk ortalaması 2,01 olurken, duyarlı grupta 171 kuyucukta 1,14 olarak hesaplanmıştır. İki grup arasındaki fark istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p=0,001).
Sonuç: Bizim çalışmamızda kolistin dirençli ve duyarlı K.pneumoniae suşları üzerinde kolistin-glisirhizik asit kombine etkinliği değerlendirilmiştir. Kolistin dirençli suşlarda antagonizma, kolistin duyarlı suşlarda ise additif ve sinerjistik etkinlik ön planda saptanmıştır. Buradan yola çıkarak kolistin dirençli enfeksiyonlarda, gıda sektöründe tatlandırıcı olarak kullanımı yaygın olan glisirhizik asitin kullanımının kolistinin etkinliğinde antagonistik etkinlik gösterebileceğini söyleyebiliriz. Buna karşın kolistin duyarlı suşlarda sinerjizm ve additif etkinlik ön planda olduğundan glisirhizik asit bileşiği içeren maddelerin tüketimi kolistinin etkinliğini arttırabilir. 
 Son yıllarda kolistin direnç sorununa yönelik çalışmalar yapılmaktadır. Çoklu antibakteriyel ajanlarla yapılan kombinasyon çalışmalarında, birbiri ile çelişkili sonuçlar görülebilmektedir. Bazı çalışmalarda etkili görülen antibiyotik kombinasyonu, diğer çalışmalarda etkisiz olarak bulunabilmektedir. Bu farklılığın, kullanılan test metodu ve antibakteriyel maddelerin standart bir prosedür içerisinde uygulanmamasından kaynaklanabileceğini düşünmekteyiz.   İleriki çalışmaların daha sağlıklı ve tutarlı sonuç verebilmesi için, direnç mekanizmaları moleküler olarak ispatlanmış suşlarla, aynı özelliklere sahip etken maddeler kullanılarak invivo ve invitro çalışmaların yapılması gerekli olduğu kanaatindeyiz.

Abstract:
OBJECTİVE: The aim of this study is to investigate the combined efficacy of colistin and glycyrrhizic acid on colistin-resistant and susceptible Klebsiella pneumoniae in order to contribute to the studies on the treatment of colistin-resistant Klebsiella pneumoniae infection.
METHODS: 30 colistin susceptible and 30 colistin resistant Klebsiella pneumoniae isolates from clinical samples received between 30.06.2017-04.07.2019 to the Medical Microbiology Laboratory of Göztepe Training and Research Hospital of Istanbul Medeniyet University were included in the study. MICs for colistin and glycyrrhizic acid were determined using liquid microdilution method in the strains collected. Combined efficiency of colistin-glycyrrhizic acid on these 60 isolates was investigated using the checkerboard method according to the pre-determined MIC values. Combined efficacy was evaluated by calculating fractional inhibitor concentration index according to obtained fractional inhibitor concentration values.
RESULTS: When 60 strains were examined according to their fractional inhibitory concentration index values, 13 (21.7%) indifferent, 13 additive (21.7%), 9 (15%) synergistic, 21 (35%) antagonistic effect were found and no fractional inhibitor concentration index value was found in 4 (6.7%) patients.
When the colistin resistant group was examined, n = 19 (63.3%) antagonism, n = 6 (20%) indifference, n = 3 (10%) additive effect were detected, but no fractional inhibitor concentration index value was detected in 2 isolates. When colistin susceptible strains were examined, n = 10 (33%) additive effect, n = 9 (30%) synergism, n = 7 (23%) indifference, n = 2 (6.7%) antagonism were detected and fractional inhibitor concentration index value in 2 isolates could not be calculated. When the sensitive and resistant group of colistin is evaluated within itself; additive and synergistic efficacy in colistin susceptible group and antagonistic efficacy in colistin resistant group were statistically higher than the other group significantly (p = 0.001).
When inhibitor concentration index value was calculated for each strain considering only one well (excluding those whose fractional inhibitor concentration index could not be calculated), the fractional inhibitor concentration index of the resistant and susceptible strains were found to be 4.04 and 1.05 respectively and the difference between the two groups was statistically significant (p = 0.001).
When means for each strain was calculated considering all of the wells which had a fractional inhibitor concentration index value (excluding those whose fractional inhibitor concentration index value could not be calculated)  ,sensitive and resistant group means were found ; the mean of 301 wells of the resistant group and the mean of hte susceptible group were 2.01 and 1.14 respectively where the the difference between the two groups was statistically significant (p = 0.001).

CONCLUSION: In our study, the combined efficacy of colistin- glycyrrhizic acid on colistin-resistant and susceptible K.pneumoniae strains were evaluated. In colistin-resistant strains, antagonism, and in colistin-sensitive strains, additive and synergistic efficacy were prominent. Regarding this we can say that use of glycyrrhizic acid, which is widely used as a sweetener in the food sector,  may show antagonistic activity in colistin resistant infections. However, since the synergism and additive efficiency on colistin susceptible strains are prominent, consumption of substances containing glycyrrhizic acid compound may increase the efficacy of colistin.
In recent years, studies have been conducted about the colistin resistance problem. Contradictory results can be seen in studies with multiple antibacterial agents combinations. Antibiotic combinations which are found to be effective in some studies may be found ineffective in other studies. We think that this difference may be due to the fact that the test methods and antibacterial agents used in the studies are not applied in a standard procedure. We believe that in order to obtain more robust and consistent results, it is necessary to perform in vivo and in vitro studies including same active ingredients using strains with resistance mechanisms proven molecularly.