Babil'de yaşayan ishal hastalarından izole edilen Salmonella Enterıca'nın metagenomik analizi ve bazı virülans genlerinin tanımlanması
Metagenomic analysis of Salmonella Enterica isolated from diarrhea patients living in Babylon and identification of some virulence genes
Yazar: SHAHAD SAFAA ABBAS AL-AZZAWI
Danışman: DOÇ. TARKAN YORULMAZ
Çankırı Karatekin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışma sırasında, her yaştan ve her iki cinsiyetten sulu ishal veya mukus, irin, az 
miktarda kan şikâyeti olan hastalardan toplam 130 klinik dışkı örneği toplanmıştır. 
Dışkı örnekleri Ocak-Mart 2023 tarihleri arasında Babil vilayetindeki İmam Sadık ve 
Al-Hillah Cerrahi Eğitim Hastanesi'ne başvuran kişilerden alınmıştır. Daha sonra 
örnekler seçici besiyerlerinde kültüre edilmiş ve bakteriyolojik ve biyokimyasal testler 
ve spesifik primerler kullanılarak tanımlanmıştır. 130 numunenin sadece 41'inde 
(%31.5) kültür ve vitek 2 kompakt sistemi ile S. enterica izolatları tespit edilmiştir. 
Bununla birlikte, spesifik gen kullanılarak, 24 (%70.58) S. typhimurium ve 10 (%29.41) 
S. enteritidis izolatı dahil olmak üzere toplam 34 (%82.9) izolatın spesifik genler için 
pozitif olduğunu belirlenmiştir. Salmonella enterica izolatlarının bazı virülans faktörleri 
hilA, stn geni olarak incelenmiş ve bu izolatlardan elde edilen genomik DNA üzerinde 
spesifik primer kullanılarak PCR gerçekleştirilmiştir. Bu genlerin PCR 
amplifikasyonunda sırasıyla 33 izolatın (%97,06) hilA, 32 (%94,12) izolatın ise stn 
genlerine sahip olduğu tespit edilmiştir. Salmonella enterica izolatlarının mikrobiyal 
duyarlılığını ve direncini tespit etmek için vitek 2 kompakt sistemi ile antibiyotik 
duyarlılık testi yapılmıştır. Buna göre, izolatlar Trimethoprim/Sulfamethoksazole, 
Imipenem ve Tigecycline için %100, %91.18 oranında Piperacillin/Tazobactam, 
Cefepime ve Ertapenem, %82.35 oranında Ceftazidime, Ceftriaksone karşı yüksek 
duyarlılık göstermiştir. Bununla birlikte, izolatlar Ampisilin, Siprofloksasin ve 
Nitrofurantoine sırasıyla (%61.76, %61.76 ve %50) oranlarında orta derecede duyarlılık 
göstermektedir. Ayrıca, sonuçlar bazı izolatların Sefazolin, Sefoksitin ve 
Levofloksasine %82,35 oranında dirençli olduğunu ortaya koymuştur. Bunlara ek 
olarak, izolatlar Amikasin ve Gentamisin'e %88,23 oranında dirençlidir. Genomik 
düzeyde, bu çalışmada metagenom dizilimi kullanılarak yakın ilişkili izolatlar olan 
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (5TMM) ve Salmonella 
enterica subsp. enterica serovar Entretidis (13SE) izolatları arasında ayrım yapılmıştır. 
Buna göre, S. enterica serovarlarının 5TMM ve 13SE kromozomlarının çok az farklılık 
gösterdiği ve 5TMM'nin genomik boyutunun (4.902.206 bp, filtrasyondan önce %52,3 
GC, filtrasyondan sonra %52,28 GC), 13SE (5.032.992 bp, filtrasyondan önce %52,2 
ii
GC, filtrasyondan sonra %52,23 GC) genomundan daha büyük olduğu belirlenmiştir. 
Karşılaştırmalı genom analizinden sonra, incelenen tüm S. enterica genomları (5TMM 
ve 13SE) birbirleriyle veya referans genomla farklı evrimsel olay modelleri 
göstermiştir. Bu çalışmada, yeni nesil meptagenom sekans tekniği ile tüm genom 
sekanslama ham eşleştirilmiş uç okumaları üretmiştir. Salmonella enterica subsp. 
enterica serovar Typhimurium 5TMM'nin GC içeriği %52,35, Salmonella enterica
subsp. enterica serovar Entretidis'de ise 13SE'nin GC içeriği %52,57 olarak 
belirlenmiştir. Genom boyutu Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 
(5TMM) için 4.583.358 bp ve Salmonella enterica subsp. enterica serovar Entretidis
(13SE) için 4.292.569 bp'dir. Ayrıca, 5TMM ve 13SE taslak genomları 83 ve 102 
kontig içermektedir. Ek olarak, S. enterica serovarlarının dizi benzerliği referans genom 
ile karşılaştırmalı olarak incelenmiş ve 13SE suşundaki dizi benzerliğinin 5TMM 
suşundan daha yüksek olduğu, 5TMM'nin 13SE'den daha fazla boşluğa sahip olduğunu 
ortaya konmuştur. Ayrıca, bu çalışmada 5TMM genomunda 4,548CDS, 71 tRNA, 3 
rRNA ve 428 Hipotetik protein, 13SE genomunda ise 4,213 CDS, 68 tRNA, 4 rRNA ve 
344 Hipotetik protein bulunduğu tespit edilmiştir. Çalışılan genomların varyant 
sayımına göre, 5TMM genomunda %99,09 (24203) SNP, %0,46 (112) ekleme ve 
%0,45 (109) silme içeren (24424) varyantın varlığı gösterilirken, 13SE genomunda %99 
(42027) SNP, %0,49 (207) ekleme ve %0,51 (215) silme içeren (42449) varyant 
bulunmaktadır. Buna uygun olarak, dizi varyasyonunun türünü belirlemek için her 
SNP'deki baz değişikliği sayısı hesaplanmıştır. Çalışılan tüm genomlar, en yaygın baz 
değişimi modellerinin C↔️ T ve G↔️ A değişimleri olduğu benzerlik varyasyon 
modelleri göstermiştir. Bu kalıplar, SNP'lerden sonra çalışılan tüm genomlarda 
Transversiyon ikamesinden ziyade Geçiş ikamesini temsil etmektedir.

Abstract:
During this study, a total of 130 clinical stool samples were collected from patients of 
all ages and both sexes with watery diarrhoea or mucus, pus and a small amount of 
blood. Stool samples were collected from patients attending Imam Sadiq and Al-Hillah 
Surgical Teaching Hospital in Babil province between January and March 2023. The 
samples were then cultured on selective media and identified using bacteriological and 
biochemical tests and specific primers. Only 41 (31.5%) of 130 samples were identified 
as S. enterica isolates by culture and vitek 2 compact system. However, using the 
specific gene, a total of 34 (82.9%) isolates were positive for specific genes, including 
24 (70.58%) S. typhimurium and 10 (29.41%) S. enteritidis isolates. Some virulence 
factors of Salmonella enterica isolates were analysed as hilA, stn genes and PCR was 
performed using specific primers on genomic DNA obtained from these isolates. In 
PCR amplification of these genes, it was determined that 33 (97.06%) and 32 (94.12%) 
isolates had hilA and stn genes, respectively. Antibiotic susceptibility test was 
performed with vitek 2 compact system to determine the microbial susceptibility and 
resistance of Salmonella enterica isolates. Accordingly, the isolates showed 100% 
susceptibility to Trimethoprim/Sulfamethoxazole, Imipenem and Tigecycline, 91.18% 
to Piperacillin/Tazobactam, Cefepime and Ertapenem, 82.35% to Ceftazidime and 
82.35% to Ceftriaxone. However, the isolates showed moderate susceptibility to 
Ampicillin, Ciprofloxacin, and Nitrofurantoin (61.76%, 61.76% and 50%) respectively. 
Furthermore, the results revealed that some isolates were resistant to Cefazolin, 
Cefoxitin and Levofloxacin by 82.35%. In addition, the isolates were resistant to 
Amikacin and Gentamicin by 88.23%. At the genomic level, this study used 
metagenome sequencing to differentiate between the closely related isolates Salmonella 
enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (5TMM) and Salmonella enterica subsp. 
enterica serovar Entretidis (13SE). Accordingly, it was determined that the 
chromosomes of S. enterica serovars 5TMM and 13SE differed slightly and the 
genomic size of 5TMM (4,902,206 bp, 52.3% GC before filtration, 52.28% GC after 
filtration) was larger than that of 13SE (5,032,992 bp, 52.2% GC before filtration, 
52.23% GC after filtration). After comparative genome analysis, all S. enterica genomes 
iv
examined (5TMM and 13SE) showed different evolutionary event patterns with each 
other or with the reference genome. In this study, whole genome sequencing with the 
next generation meptagenome sequencing technique produced crude paired-end reads. 
The GC content of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 5TMM 
was 52.35% and the GC content of 13SE in Salmonella enterica subsp. enterica serovar 
Entretidis was 52.57%. The genome size was 4,583,358 bp for Salmonella enterica 
subsp. enterica serovar Typhimurium (5TMM) and 4,292,569 bp for Salmonella 
enterica subsp. enterica serovar Entretidis (13SE). Furthermore, the 5TMM and 13SE 
draft genomes contain 83 and 102 contigs. In addition, the sequence similarity of S. 
enterica serovars was analysed in comparison with the reference genome, and it was 
revealed that the sequence similarity in the 13SE strain was higher than that in the 
5TMM strain, while 5TMM had more gaps than 13SE. In addition, in this study, 4,548 
CDS, 71 tRNA, 3 rRNA and 428 hypothetical proteins were found in the 5TMM 
genome, while 4,213 CDS, 68 tRNA, 4 rRNA and 344 hypothetical proteins were found 
in the 13SE genome. According to the variant counts of the studied genomes, the 
5TMM genome showed the presence of 99.09% (24203) SNPs, 0.46% (112) insertions 
and 0.45% (109) deletions (24424), while the 13SE genome had 99% (42027) SNPs, 
0.49% (207) insertions and 0.51% (215) deletions (42449). Accordingly, the number of 
base changes in each SNP was calculated to determine the type of sequence variation. 
All genomes studied showed patterns of similarity variation, where the most common 
base substitution patterns were C↔️ T and G↔️ A substitutions. These patterns represent 
Transition substitution rather than Transversion substitution in all genomes studied after 
SNPs.