Telomeraz inhibitörü "GRN163L" nin A549-Luc akciğer kanseri ve MDA-MB 231-Luc meme kanseri hücre serileri üzerindeki in vivo ve in vitro etkilerinin incelenmesi
In vitro and in vivo effects of GRN163L, a novel telomerase inhibitor, on A549-Luc lung cancer and MDA-MB 231-Luc breast cancer cells
Yazar: ZELİHA GÜNNUR DİKMEN
Danışman: PROF.DR. PAKİZE DOĞAN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2005
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Kromozomların 3' uçlarına TTAGGG tekrarlarının eklenmesinden sorumlu hücresel bir ribonükleoprotein olan telomeraz enziminin, kanserlerin % 85-90'nında pozitif bulunması, telomerazı hem kanser tanısında hem de yeni terapötik ajanların geliştirilmesinde yeni bir hedef haline getirmiştir. Bu çalışmada, telomeraz inhibitörü olan GRN163L'nin lusiferaz eksprese eden A549-Luc ve MDA-MB 231-Luc hücreleri üzerindeki in vitro ve in vivo etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Telomeraz RNA' sının 11 bazlık kalıp bölgesine komplementer bir oligonükleotid olan GRN163L (Geron Corporation, USA), telomerazm aktif bölgesini kapatarak enzimin telomer DNA' sına bağlanmasını engellemektedir. Çalışmamızda A549-Luc ve MDA-MB 231 hücrelerine uygulanan tek doz 1 uM GRN163L'den 72 saat sonra telomeraz aktivitesinin inhibe olduğu TRAP ile gösterildi. Hücrelere 12 hafta boyunca uygulanan GRN163L (1 uM) tedavisinin, telomer kaybına yol açtığı TRF ve Telo- FISH analizleri ile saptandı. A549-Luc ve MDA-MB 231-Luc hücrelerinin, GRN163L ile 1 haftalık ön tedaviyi takiben bir araya gelerek klon oluşturabilme yeteneklerini kaybettikleri, 4-5 haftalık ön tedaviyi takiben soft ağarda oluşturdukları koloni sayılarının ve invazyon kapasitelerinin kontrol grubuna göre belirgin şekilde azaldığı tespit edildi. S-GRN163L kullanılarak ilacm hücre içine alınımı ve doku dağılımı değerlendirildi. GRN163L ön tedavisi ile kemoterapi ve rayoterapi kombinasyonunun sinerjistik etkiye yol açtığı tespit edildi. Lusiferaz eksprese eden A549-Luc ve MDA-MB 231-Luc hücreleri ile oluşturulan ksenogaft meme kanseri ve akciğer metastaz modellerinde farklı dozlardaki GRN163L'nin in vivo etkisi biyoluminesans görüntüleme sistemi (BLI) ile incelendi. Sonuç olarak, bu çalışmada telomeraz inhibitörü olan GRN163L ile sağlanan telomeraz inhibisy onunun hücreler üzerinde antiproliferatif etkili olduğu, akciğer metastazlarının gelişmesini ve meme tümörlerinin büyümesini engellediği gözlendi.Anahtar kelimeler: Telomeraz inhibitörleri, tiyo-fosforamidat oligonükleotidler, ksenograft akciğer metastaz ve meme kanseri modeli, biyoluminesans görüntüleme sistemi

Abstract:
Telomerase is a cellular ribonucleoprotein enzyme responsible for adding TTAGGG repeats onto the 3' ends of chromosomes. Telomerase activity has been found in 85-90% of all human tumors but not in adjacent normal cells which makes telomerase a target not only for cancer diagnosis but also for the development of novel therapeutic agents. The aim of our study was to evaluate in vivo and in vitro effects of GRN163L, a novel telomerase inhibitor on luciferase-expressing A549-Luc and MDA-MB 231 -Luc cells. GRN163L (Geron Corporation, USA) is a lipidated N3'-> P5'/fc*o-phosphoramidate which is complementary to the 11 -base template region of hTR and behaves like classical active site enzyme inhibitors, it blocks binding of telomerase to telomeric DNA with high affinity and specificity. In our study, short-term in vitro treatment (72 hrs) of A549-Luc and MDA-MB 231 -Luc cells with GRN163L led to inhibition of telomerase activity as shown by the TRAP assay. For long-term treatment, cells were treated with 1 um GRN163L every 3-4 days for 12 weeks which led to progressive telomere shortening as determined using TRF and Telo-FISH analyses. When plated at low density for clonal efficiency assay, 1 week pretreated A549-Luc and MDA-MB 231 -Luc cells lose the ability to form colonies. Additionally, following 4-5 weeks of GRN163L pretreatment, the number of colonies formed was reduced compared to untreated cells as shown by soft agar. Combination of GRN163L pretreatment with radiotherapy and chemotherapy showed synergistic effects. A549-Luc ve MDA-MB 231 -Luc cells were used for xsenograft breast cancer and lung metastasis models and bioluminescence imaging (BLI) was used to show in vivo effects of GRN163L treatment. As a result, our results suggest that the inhibition of telomerase by GRN163L has antiproliferative effects on tumor cell lines and inhibits growth of lung and breast tumors in addition preventing lung metastasis.Key words: Telomerase inhibitor, #H'o-phosphoramidate oligonucleotides, xsenograft lung metastasis and breast cancer model, bioluminescence imaging