Spektrofotometrik homosistein tayini
Spectrophotometric determination of homocysteine
Yazar: DİLEK SAĞDIÇ
Danışman: PROF. DR. ESMA TÜTEM
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2004
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
ixÖZET1SPEKTROFOTOMETRİK HOMOSİSTEİN TAYİNİHomosistein (2-amino-4-merkaptobütirik asit), metabolizmada metiyoninindemetilasyonu sonucu açığa çıkan endojen bir amino asittir. Genetik hastalıklara ya dayanlış beslenme sonucu B6, B12 vitamini eksikliğine bağlı olan enzimatik bozukluklar,kronik böbrek hastalıkları, yaş, cinsiyet gibi fizyolojik faktörler, yaşam alışkanlıkları(alkol, sigara tüketimi), bazı ilaçların kullanımı gibi sebeplerden ötürü plazmadakihomosistein miktarının 15 ÂµM'ı geçmesi hiperhomosisteinemi olarak adlandırılır.Hiperhomosisteinemi, folat ve kobalamin (B12 vit) eksikliğinin duyarlı bir belirteci vekalp-damar hastalıkları için bağımsız bir risk faktörüdür. Plazmadaki toplamhomosistein derişimi ayrıca hamilelik komplikasyonları, akıl hastalıkları ve yaşlılıktagörülen zihinsel bozukluklarla da ilişkilidir. Bu nedenlerden dolayı başta plazma olmaküzere biyolojik sıvılarda homosistein tayini giderek önem kazanmaktadır.Çalışmamızda homosistein (hCys), yapısındaki serbest tiyol grubundan faydalanılarakpH 9.2'de en çok kullanılan türevlendirme ayıraçlarından olan o-fıtalaldehit (OPA) iletürevlendirildi. Oda sıcaklığında hemen oluşan ve en az Â½ saat kararlılığını koruyabilenhCys-OPA türevinin 600 -200 nm arası spektrumu çizilerek homosisteinin tek başınabulunduğu durumda 280 nm'deki absorbansından yararlanılarak tayin edilebileceğigörüldü. Homosisteinin organizmada transmetilasyon reaksiyonları ile sistein veyatekrar metiyonine metabolize olduğu bilindiğinden homosisteinin sistein ve metiyoninile yan yana analizi şartları da incelendi. Aynı türevlendirme koşullarında Cys-OPA vemet-OPA türevleri hazırlanarak spektrumları çizildiğinde sistein için 273 nm'demetiyonin için ise 244 nm'de maksimum absorbanslar elde edilmesine rağmenspektrumlarda girişimler olduğu görüldü. Her üç amino asit-OPA türevine ait ikincitürev spektrumları alındığında homosistein ve metiyoninin düğüm noktalarınınbulunduğu 265 nm'de sistein tayini, 280 ve 300 nm'lerdeki toplam türev absorbansdeğerlerinden ise homosistein ve metiyonin tayininin yapılabileceği sonucuna varıldı.hCys, Cys ve met için ikinci türev absorbans değerleri ile elde edilen LOD değerleri,hCys için 280 ve 300 nm'lerde sırasıyla 0.8 ppm ve 1.05 ppm, Cys için 265 nm'de5.34 ppm ve met için 300 nm'de 0.6 ppm'dir. Geliştirilen yöntemin homosistein tayinsınırı, hiperhomosisteineminin ilk evresi içindedir. Teşhis açısından büyük önemi olanbu mertebedeki homosistein miktarını, sistein ve metiyonin miktarları ile birarada tayinedebilen bu yöntem, üç amino asidin sentetik karışımlarına başarıylauygulanabilmektedir. Yöntemin, hCys tayininin önemli olduğu plazma gibi karmaşık birmatrikse klasik kromatografik ve immünolojik yöntemlerin çoğundan daha basit, ucuzve hızlı bir şekilde uygulanabilmesi için diğer amino asitlerin bozucu etkilerininkemometrik bir yaklaşımla ortadan kaldırılması gerekmektedir.1Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yürütücü Sekreterliği tarafındanT-414/08032004 sayılı proje ile desteklenmiştir.

Abstract:
xSUMMARY1SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF HOMOCYSTEINEHomocysteine ( 2-amino-4-mercaptobutyric acid) is an endogenous amino acid, whichis generated by the demethylation of methionine. Hyperhomocysteinemia is describedfor upper levels than 15 ÂµM plasma hCys level in due to the enzymatic failures, whichwas the results of the inherited disorders of the main enzymes of homocysteinemetabolism or the nutritional deficiencies of the vitamin cofactors such as B6, B12 or thediseases (i.e. chronic renal failure, cancer), the physiological factors (i.e., age, sex), thelifestyle determinants (smoking, coffee consumption), the usage of some medicines, etc.Hyperhocysteinemia is a sensitive marker of folate and cobalamin (vitamin B12)deficiencies and independent risk factor for cardiovascular diseases (CVDs). Plasmatotal (thCys) concentrations are also related pregnancy complications, psychiatricdisorders and cognitive impairment in the elderly. Because of these reasons, themeasurement of thCys in the biological fluids (expecially in plasma) is potentially ofgreat importance.In our study, homocysteine (hCys) was derivatized with o-phtaldehyde (OPA), thecommon derivatizating reagent, at pH 9.2 utilizing from free thiol moiety of itsstructure. It was observed that hCys that was alone could be determined by using theabsorbance at 280 nm drawing the spectrum of hCys-OPA derivative, which wasformed immediately, and stable at least Â½ hour at room temperature. Because it wasknown that homocysteine metabolized to cysteine or methionine by trasmethylationreactions, the conditions of simultaneous determination of hCys, Cys and met wereinvestigated. The spectra of Cys-OPA and met-OPA derivatives prepared at the samederivatization conditions had maxima at 273 nm for Cys and at 244 nm for met butthere were interferences. It was concluded that Cys could be determined at 265 nm,crossing point for hCys and met spectra, hCys and met could be determined using totalderivative absorbance values at 280 nm and 300 nm from the second-derivative spectraof each of three amino acid-OPA derivatives. Limit of detection values (LOD) obtainedfrom second derivative absorbance values were, 0.8 ppm and 1.05 ppm for hCys at 280and 300 nm, respectively 5.34 ppm for Cys at 265 nm and 0.6 ppm. for met at 300 nm.Limit of quantitation of the developed method was in the first interval ofhyperhomocysteinemia (moderate hyperhomocysteinemia). This method that couldsimultaneous determine the moderate amount of hCys that was important for diagnosiswith Cys and met amounts was successfully applied to the synthetic mixtures of thesethree amino acids. But, for being applicable the proposed method as simpler, cheaperand faster than most of the classical chromatographic methods and immunoassays to thecomplex matrix such as plasma in which hCys determination is important, it wasnecessary to use a chemometric approach for overcoming the interferences of the otheramino acids.1This study was supported by Istanbul University Scientific Research Project Center with the projectnumber T-414/08032004