Stat-3 inhibitörü cryptotanshinone ile meme kanseri hücrelerinde kalsiyum ile aktive edilen klorür iyon kanalı TMEM16A'nın inhibisyonunun kanser hücrelerinin proliferasyonu üzerine etkileri
Effects of inhibition of calcium-activated chloride ion channel TMEM16A in breast cancer cells with stat-3 inhibitor cryptotanshinone on the proliferation of cancer cells
Yazar: BERRİN ÜSTÜNDAĞ
Danışman: PROF. DR. YUSUF ÇAMLICA
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Cryptotanshinone = Cryptotanshinone ; Hücre kültürü = Cell culture ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; İyon kanalları = Ion channels

Özet:
İyon kanalları, yaşayan hücrelerin temel yapı taşlarındandır. Birçok önemli fizyolojik süreçte merkezi rol oynayan iyon kanallarının yapısal veya işlevsel bozuklukları, özellikle uyarılabilme özelliği olan her türlü hücreyi, dokuyu ve organı etkileyen, ''kanalopatiler'' olarak adlandırılan çeşitli hastalıklara yol açmaktadır. Son araştırmalar iyon kanallarının çeşitli kanser türlerin patojenezine özelliklerine dahil olarak, tümör oluşumunda ve kanserin gelişiminde önemli roller üstlendiğini göstermektedir. Bir iyon kanalının seçici olarak bloke edilmesi, özel bir molekülün bir hücrede fizyolojik bir yanıt oluşturmak için iyon kanalının açılmasını önleyen biyolojik mekanizmadır. Böylece, kanalın açılması ile oluşan yanıtı engellerler. Kanser hücrelerinin özelliklerinden olan sürekli anjiyogenez, doku istilası ve metastaz kritik olarak Ca2+'yi taşıyan iyon kanallarına bağlıdır. TMEM16A (ANO1) bunlardan biridir. TMEM16A'nın aşırı ifadesinin, meme kanserinde nasıl bir rol oynadığı belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle tez çalışmasının literatürdeki var olan kısıtlı çalışmalara katkı sağlaması ve yeni ilaç hedeflerine ışık tutması amaçlanmıştır. Bu çalışmada, inhibitör etkisi olduğu bilinen Cryptotanshinone'un farklı konsantrasyonlarının uygulandığı meme kanseri hücre hattı (MCF-7) üzerindeki anti-proliferatif etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, Cryptotanshinone'nin etkisi üç farklı yöntem ile MCF-7 hücrelerinde test edildi. Birincisi, Cryptotanshinone'un sitotoksik etkisini incelemek ve diğer deneylerde kullanılacak dozları belirlemek için MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolyum bromür) yöntemi, ikincisi ANO1 kanalı gen ifadesini incelemek için qRT-PCR yöntemi ve üçüncüsü ANO1 kanal akımını ölçmek amacıyla elektrofizyolojik bir yöntem olan patch clamp tekniği kullanılmıştır. Yapılan MTT analizi sonucunda gen ifadesi ve patch clamp çalışmalarında kullanılmak üzere 10, 20 ve 30 μM doz grupları olarak belirlenmiştir. Patch clamp deneylerinde bu üç doz grubu için 0. dk. kayıtları kontrol olarak değerlendirilmiş ve 15. dakikada elde edilen verilerden maksimum akım değerleri ölçülmüştür. Buna göre dozlar arasında TMEM16A kanalını en yüksek miktarda inhibe eden grup, 30 µM doz grubu olarak belirlenmiştir. Gen ifadesi deneylerinde ise gruplar arasında anlamlı bir farklılık olmasa da 24. saate ait veriler için, kontrole göre değerlendirme yapıldığında ANO1 gen ekspresyon düzeyinin 10 µM doz grubunda %65 oranında azaldığı, 20 µM doz grubunda %71 oranında azaldığı ve 30µM doz grubunda %83 oranında azaldığı belirlenmiştir. Çalışmadan elde edilen bu verilere göre, Cryptotanshinone'un MCF-7 hücrelerinde sitotoksik etki göstererek kanser hücrelerini azalttığı, ANO1 kanal akımını bloke ettiği ve kanal gen ifadesini azalttığı gözlenmiştir. Bu çalışma, Cryptotanshinone'un meme kanserinde tedavi edici ilaç olarak kullanılabilirliğine dair literatürdeki çalışmalara katkı sağlayacaktır. Ayrıca günümüzde meme kanserinde uygulanan tedavi yöntemlerinin etkinliğini artırma amacıyla kullanılabilirliğine dair literatürde bulunan çalışmalara ve yeni ilaç hedeflerine katkısı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Ion channels are the basic building blocks of living cells. Structural or functional disorders of ion channels, which play a central role in many important physiological processes, cause various diseases called "channelopathies" that affect all kinds of cells, tissues, and organs, especially those with excitability. Recent studies show that ion channels play important roles in tumour formation and cancer development, including in various cancer features. Selective blocking of an ion channel is the biological mechanism that prevents a particular molecule from opening the ion channel to induce a physiological response in a cell. These inhibitors inhibit the response that occurs when the channel is opened. Persistent angiogenesis, tissue invasion, and metastasis, characteristics of cancer cells, are critically dependent on ion channels that transport calcium. TMEM16A (ANO1) is one of them. It remains unclear what the role of overexpression of TMEM16A in the pathogenesis of breast cancer is. For this reason, it is aimed that the thesis study will contribute to the limited studies in the literature and shed light on new drug targets. This study aimed to investigate the anti-proliferative effect of an inhibitor of the ANO1, Cryptotanshinone, on a breast cancer cell line (MCF-7) to which different concentrations were applied. The effect of Cryptotanshinone was tested in MCF-7 cells by three different methods First, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) method was used to examine the cytotoxic effect of Cryptotanshinone. This is important to determine the doses to be used in other experiments. Secondly, the qRT-PCR method to examine ANO1 channel gene expression. Third, the patch-clamp technique, an electrophysiological method, was used to measure the current in the ANO1 channel. As a result of the MTT analysis, 10, 20 and 30 μM dose groups were used in gene expression and patch-clamp studies. The results obtained from 0. min was used as the control for patch-clamp experiments. Maximum current values were measured at the 15th min. 30 µM dose of Cryptotanshinone was the most effective on the TMEM16A channel. Although there was no significant difference between the exposure groups in gene expression analysis, the level decreased by 65% in the 10 µM dose group, decreased by 71% in the 20 µM dose group, and decreased by 83% in the 30µM dose group compared to control at 24-h. According to the data obtained from the study, it was observed that Cryptotanshinone showed a cytotoxic effect on MCF7 cells and reduced cancer cell number, blocked ANO1 channel current, and decreased channel gene expression. This study contributed to the literature on the use of Cryptotanshinone as a therapeutic drug in breast cancer. In addition, it is thought that it will contribute to the literature regarding the new drug targets and the usability of the treatment methods applied in breast cancer today to increase their effectiveness.