TİMP-2 ve GFP genlerini kodlayan plazmitin hazırlanması ve primer düz kas hücreleri hücre kültür ortamında polimerik vektörler kullanılarak transfeksiyonu
Preparation of plasmid encoding TİMP-2 and GFP and transfection of primary smooth muscle cell in cell culture using polymeric vectors
Yazar: NELİSA TÜRKOĞLU
Danışman: PROF.DR. ERHAN BİŞKİN ; PROF.DR. TÜLİN KUTSAL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kardiyoloji = Cardiology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Anjiyoplasti ve stent operasyonları sonrası restenoz oluşumu her iki yöntem içindeengelleyici ana etkendir. Restenozun önlenmesi için birçok ilaç terapisikullanılmaktadır, ancak genellikle yeterli olmamaktadır. Bu çalışmada amaç hasargören primer düz kas hücrelerinin, TİMP-2 (21kDa protein, matriksmetalloproteinaz 2 enziminin inhibitörü) kodlayan plazmitin, non-viral vektörkullanılarak transfekte edilmesi ve TİMP-2 proteinin erken ekspresyonununsağlanmasıdır. İlk olarak, primer düz kas hücrelerinin transfeksiyonunda sudaçözünen sıcaklığa duyarlı polikatyonik non-viral vektör poli(N-izopropilakrilamit-ko-2-metakrilamidohistidin) kopolimeri (Poli(NİPA-ko-MAH)) kullanılmıştır. Tümdenemelere karşın bu polimerik taşıyıcılar ile yapılan çalışmalar çok başarılıolmayınca, araştırma grubumuzda başka bir tez kapsamında üretilen polikatyoniknanopartiküllerle çalışmaya devam edilmiştir. Polikatyonik eşit boyutlunanopartiküler poli(stiren/poli(etilenglikol)etileter metakrilat/N-[3-(dimetilamino)propil] metakrilamid) {poli(St/PEG-EEM/DMAPM}, iki farklı boyda 78nm ve 200 nm (kısa adları EEM 78 ve EEM 200) mikroemülsiyon polimerizasyonyöntemiyle üretilmiştir.EEM 78 ve EEM 200 nanopartiküllerin DKH'leri üzerindeki sitotoksitesi, sırasıyla% 4 ve % 15 olarak belirlenmiştir. Poli(NİPA-ko-MAH) kopolimeri için canlı hücreoranı % 90 civarında tespit edilmiştir. Daha sonra EEM 78/pEGFP-N2, EEM200/pEGFP-N2 ve Poli(NİPA-ko-MAH)/pEGFP-N2 konjugatları hazırlanmıştır.Poli(NİPA-ko-MAH)'ın DKH içine alımı % 85 iken, Poli(NİPA-ko-MAH)/pEGFPN2'nin gen ekspresyon verimi kopolimerin düşük zeta-potansiyel yükünden dolayıazdır. EEM 78/ pEGFP-N2 ve EEM 200/pEGFP-N2 konjugatları ile yapılantransfeksiyon çalışmalarında sırasıyla % 68 ve % 64 oranında gen ekspresyonutespit edilmiştir. Hazırlanan EEM 78/pBLAST TİMP-2 konjugatı transfeksiyonçalışmasında kullanılmıştır ve TİMP-2 protein ekspresyonu western blot yöntemiile tespit edilmiştir. Transfekte edilen hücrelerin 64. saat lizatından elde edilen21kDa büyüklüğündeki bant protein ekspresyonunun gerçekleştiğini göstermiştir.Anahtar Kelimeler: Katyonik, eşboyutlu, stiren, polietilenglikol etil eter metakrilat,nanopartikül, poli(NİPA-ko-MAH), uyarı-cevap, DKH, restenoz, GFP, TİMP-2

Abstract:
Restenosis after angioplasty or stenting remains the major limitation of bothprocedures. A vast array of drug therapies has been used to prevent restenosis,but they have proven to be predominantly unsuccessful. It was our hypothesis inthis study; the plasmid encoding TIMP-2 (21 kDa protein known asmetalloproteinase inhibitor 2) by using a nonviral vector (which is designed in ourlabouratory) transfer to SMCs immediately after injury that would result inincreased levels of TIMP-2 and its earlier expression. Firstly, poly(Nisopropylacrylamide-co-2-methacrylamidohistidine) copolymer (Poly(NIPA-co-MAH)) as water-soluble thermo- sensitive polycationic non-viral vector for genetransfection of primary aortic smooth muscle cells. Then highly chargedmonosized poly(styrene/ poly(ethylene glycol) ethyl ether methacrylate)/ N-[3-(dimethylamino)propyl] methacrylamide/ [poly(St/PEG-EEM/DMAPM)] cationicnano- particles with different particle size and charges were synthesized byemulsifier-free emulsion polymerization.Experimental data for In-vitro cytotoxicity (primary SMCs) of nanoparticules EEM78 and 200 showed cytotoxity around 4 % and 15 %. Cell viability for thePoly(NIPA-co-MAH) was around 90 %. Conjugates of EEM 78/ pEGFP-N2,EEM 200/pEGFP-N2 and Poly(NIPA-co-MAH)/pEGFP-N2 conjugates wereprepared. Poly(NIPA-co-MAH) uptake efficiency in SMCs were around 85 %, butgene expression efficiency were low with Poly(NIPA-co-MAH)/pEGFP-N2because of low zeta potential of copolymer. GFP expression efficiencies afterSMC transfections by conjugates EEM 78/pEGFP-N2 and EEM 200/pEGFP-N2were 68 % and 64 %, respectively. EEM 78/pBLAST TIMP-2 conjugate wasprepared and used for transfection of SMCs. To investigate TIMP-2 proteinexpression we used western blot method. A clearly detectable 21 kDa band wasnoted in transfected cells collected 64 hours later.Keywords: Cationic, monosize, styrene, polyethyleneglycol ethyl ethermethacrylate, nanoparticle, poly(NIPA-co-MAH), smart polymers, SMC,restenosis, GFP, TIMP- 2