Tuz stresi etkisindeki arpa bitkilerinin gen anlatım profilleri
Gene expression profiles under salt stress in barley
Yazar: CÜNEYT UÇARLI
Danışman: PROF. DR. AYŞE FİLİZ GÜREL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Tuzluluk kurak ve yarı kurak bölgelerde bitki gelişimi ve ürün verimliliğini kısıtlayan en önemli abiyotik stres nedenlerinden birisidir. Yüksek tuzluluk bitkiyi su stresi, iyon toksisitesi, zar bütünlüğünün bozulması, metabolik süreçlerin değişmesi, hücre genişleme ve bölünmesinin azalması yoluyla etkiler. Tüm bu etkiler bitkinin büyüme ve gelişimini yavaşlatır hatta yaşamına son verebilir. 
Bu tez çalışmasında tuza doğal olarak tolerant özellikte olan arpa (Hordeum vulgare L.)'nın ülkemizde yetiştirilen bazı çeşitlerinde (Tokak157/37, Erginel90, Tarm92 ve Martı) laboratuvar şartlarında tuz stresi uygulanmış ve bitkilerin strese verdikleri yanıtlar fizyolojik ve moleküler yöntemlerle incelenmiştir. Çimlenme arpanın tuza en hassas olduğu gelişimsel aşamadır. Çalışmada çimlenme sırasında arpa tohumlarındaki su absorbsiyonunun %37'ye varan oranda azaldığı, 160 mM tuzun tohum su alımını etkileyen kritik miktar olduğu belirlenmiştir. İlerleyen aşamalarda ise,  arpa fidelerinde 80 mM tuz uygulamasının sürgün boyunda önemli derece azalmaya neden olduğu, kökteki uzamayı kısıtlayacak tuz konsantrasyonlarının ise 120-160 mM NaCl olduğu gözlenmiştir. Altı-sıralı çeşitlerde tuz ortamındaki sürgün büyümesi, iki-sıralı çeşitlere göre daha başarılıdır.  Çimlenme aşamasında dokulardaki ozmolitler ortalama olarak 80 mM'dan sonra anlamlı olarak artmıştır. 
Vejetatif aşamada 160 mM NaCl içeren Hoagland solüsyonlarında tutulan arpa bitkilerinin tuz stresine verdikleri yanıtlara bakıldığında, ozmolit birikiminin tuz stresine ve zamana bağlı olarak arttığı (en yüksek 1072 mOsmol/kg'a kadar) belirlenmiştir. Zar iyon sızıntısı hücrelerin zar hasarını göstermektedir. Çalışmada kök dokularındaki tuzun neden olduğu zar hasarının 160 mM NaCl uygulandıktan 26 saat sonra %90 (Martı çeşidinde) seviyesine çıktığı bulundu. Tuz stresi yaprak dokularındaki hücrelerin zarlarında da anlamlı derecede hasara neden olmuştur (Örn. Tokak157/37 çeşidinde kontrol: %9; stres: %37). Diğer yandan, hidrofonik sistemde 0.5 mM Linolek asit uygulaması zar hasarının azalmasında ve ozmolit birikimin artmasında etkili olmuştur.
Tez çalışmasında bitkilerde stres yanıtıyla ilişkili farklı yolaklarda rol oynayan genlerin ve iki transkripsiyon faktörünün anlatımı RT-PCR ve Gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) yöntemleri ile incelenmiştir.  Antioksidan sistemle ilişkili seçilen dört genden (HvGST6, HvCu/znSOD, HvAPX, HvCAT2), HvGST6, HvCu/znSOD anlatımlarının gerek kök ve gerekse yapraklarda konstitütif olduğu belirlenirken, HvAPX'in tuz stresiyle teşvik edildiği ve HvCAT2'nin yüksek tuz miktarında dahi düşük anlatım yaptığı gözlenmiştir. 
Transkripsiyon faktörlerinden HvDRF2 ve HvWRKY12'nin kök ve yapraktaki anlatımları oldukça düşüktür, ancak stresle transkript miktarının anlamlı seviyede yükseldiği tespit edilmiştir. Antioksidan ilişkili genlerden metallotiyonein kodlayan HvMT2 ve vakuolar bir taşıyıcıyı kodlayan HvNHX1'in tuz stresi ile yüksek oranda anlatım yaptığı belirlendi. Antioksidan sistemle ilişkili peroksiredoksin kodlayan HvBAS1'in ilginç olarak köklerden daha fazla yaprak dokularında anlatım yaptığı bulunmuştur. Dehidrin ailesinin bir üyesi olan ve grup-2 LEA proteinlerinden HvDHN3'ün de düşük transkript seviyesinde olmakla birlikte, tuz stresiyle anlamlı olarak arttığı belirlendi. Çalışmada stresle ilişkili anlatımına dair farklı bilgiler bulunan fotosistem ilişkili, HvLHCB geninin anlatımının tuz stresiyle azaldığı bulunmuştur. Bu bulgu stresin fotosentez üzerindeki olumsuz etkisine dair olarak literatürdeki bazı çalışmalarla paralellik göstermiştir. 
Arpa taşıdığı doğal dayanıklılık nedeniyle, bitkilerde tuza toleransın incelenmesinde önemli bir model organizmadır. Bu tez çalışmasında ülkemizde yetişen çeşitlerde tuz stresine dayanıklılığın laboratuar koşullarında ölçülerek değerlendirilebileceği fizyolojik ve moleküler bir altyapı oluşturulmuştur. Arpanın tuza en hassas olduğu çimlenme aşamasında yapılan çalışmalar 80-160mM tuz miktarının stresin algılanması ve hücresel yanıtta önemli olduğunu göstermiştir. Stresle ilişkili gen anlatımı bitkinin maruz kaldığı tuz konsantrasyonu ve süresinin yanı sıra gelişimsel dönemin önemine işaret etmektedir

Abstract:
Salinity is one of the most serious abiotic stress factors which restricts plant development and crop yield in arid and semi-arid regions. High salinity affects the plant via water stress, ion toxicity, disruption of membrane integrity, alteration metabolic process, reduction of cell expansion and division. All of these effects reduce plant growth and development and even may lead death.
In this thesis study, salt stress was applied in laboratory conditions to some varieties cultivated in our country of naturally-salt tolerant barley (Hordeum vulgare L. cvs. Tokak157/37, Erginel90, Tarm92, and Martı) and response of the plants to the stress was examined with physiological and molecular techniques. Germination is the most sensitive developmental stage to the salt in barley. In the study, it was determined that during germination water absorption in barley seed decreased in 37%, and 160 mM salt concentration is a critical value which effects seed water uptake. In later stages, 80 mM salt treatment caused a significant reduction in shoot length, and 120-160 mM NaCl salt concentrations restricted root length of barley seedlings. Shoot growth in salinity was better in six-row varieties compared with two-row varieties. Osmolytes accumulation were significantly increased during germination stage of tissues after 80 mM of salt concentration. 
At vegetative stage, when barley plants kept in Hoagland solutions including 160 mM NaCl were examined in their response to salt stress, osmolyte accumulation was increased depending on salt stress and time (the highest level was 1072 mOsmol/kg). Membrane ion leakage is an indicator of cell membrane damage. In the study, 26 hours after 160 mM NaCl treatment (in Martı variety), membrane damage in root tissues caused by salt was 90% level. Salt stress also caused a significant damage in cell membranes of the shoot tissues (e.g. in Tokak157/37 variety control: 9%; stress: 37% ). On the other hand, application of 0.5 mM linoleic acid in hydroponic system was effective in decreasing membrane damage and increasing osmolyte accumulation.
In the thesis study, expressions of plant stress responsive genes in different pathways and two transcription factors were analyzed with RT-PCR and real-time PCR (qRT-PCR). Four genes were selected as HvGST6, HvCu/znSOD, HvAPX, HvCAT2. antioxidant related genes and expressions of the HvGST6, HvCu/znSOD were constitutive in both roots and shoots. While HvAPX expression was induced by salinity stess, HvCAT2 had a lower expression, even in high amounts of salt. 
Expressions of HvDRF2 and HvWRKY12 transcription factors were quite low in root and shoots, however, stress leads to significantly higher transcript accumulation. An antioxidant related gene metallothionein coded by HvMT2, and a vacuolar antiporter coded by HvNHX1 had high levels of expressions following salt stress. An antioxidant system related peroxiredoxin coded by HvBAS1, interestingly had higher expression in shoot tissues compared with roots. HvDHN3, which from group-2-LEA proteins belong to the members of dehydrin family had low transcript levels, but significantly increased upon salt-stress. Photosystem related HvLHCB gene which had different informations on stress, was decreased upon salt stress. This result was parallel with some studies about negative effect of stress on photosynthesis in literature.
Barley with its natural resistance, is an important model organism to investigate salt tolerance in plants. In this thesis study, physiological and molecular substructure were established to measure and evaluate varieties cultivated in our country in laboratory conditions regarding to their salinity tolerance. Studies conducted in germination stage which was the most sensitive stage of barley to the salt, show that 80-160 mM salt amount was important in recognition of stress and cellular response. Stress related gene expression indicated to importance of developmental period along with exposure of salt concentration and time of the plant.