Metastatik meme kanseri hücre hatlarından salınan otokrin faktörlerden C3a, UPa ve TSLP'nin MIP2 ve KC salımı üzerine etkisi.
The effect on MİP2 and KC release of the autocrine factors released by mammary carcinoma cell lines, C3a, UPA AND TSLP.
Yazar: NUR OĞAN
Danışman: PROF. DR. NURAY ERİN
Akdeniz Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Kemokinler = Chemokines ; Kompleman sistem proteinleri = Complement system proteins ; Makrofajlar = Macrophages ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Otokrin motilite faktörü = Autocrine motility factor ; Reseptörler-kemokin = Receptors-chemokine ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-çoklu = Drug resistance-multiple

Özet:
Amaç: Meme kanseri bugün en sık karşılaştığımız ve azımsanmayacak derecede mortalitesi olan bir malignite olup, henüz mortalitesinden büyük ölçüde sorumlu tutulan metastatik yayılımını önleyecek yada geriletecek bir yaklaşım bulunmamaktadır. Diğer yandan "kanser"in ileri düzeyde karmaşık yapısı, moleküler mekanizmaların entegre bir şekilde hedefleneceği yaklaşımlara ihtiyaç doğurmaktadır. CXC kemokinler ve reseptörleri ise kanser gelişim ve progresyonunda önemli rolü olan bir moleküler sistemi temsil etmektedir. Bununla birlikte, özellikle CXCR2'nin, çeşitli kanser hücreleri tarafından eksprese edildiği ve aktivasyonunun metastaz gelişiminde kritik olduğu ortaya konmuştur. Dolayısıyla, CXCR2 antagonistleri anti-kanser tedavide kullanım açısından umut vaad etmektedir ve bu konuda klinik çalışmalar devam etmektedir. Bununla birlikte, farede CXCR2 ligandları olan KC ve MIP2'nin, CXCR2 aktivasyonuna neden olarak tümörogeneziste etkili oldukları saptanmıştır. Bu kemokinlerin, metastatik fare meme kanseri hücre dizilerinden, metastatik olmayanlara kıyasla daha yüksek seviyede ortama salınması ile metastazda da rol aldıkları tespit edilmiştir.
Arkaplan: Önceki çalışmalarımız, CXCR2 antagonisti SB225002 ile anti-tümörojenik etki sağlanırken ortama salınan MIP2 ve KC miktarında artış olduğunu göstermiştir. Bu durum CXCR2'nin bu ligandlar için otoreseptör olduğunu göstermiş ve kronik antagonist tedavi ile direnç gelişebileceğine işaret etmiştir. Dahası, MIP2 salımında görülen bu artış, zamanla artan bir kinetik göstermiştir. Bu durum, metastatik hücreler tarafından salınan çeşitli otokrin faktörlerin CXCR2 ligandlarının salımını arttırarak muhtemel dirençten sorumlu mekanizlardan biri olabilileceğini düşündürmüştür. Bununla birlikte bir ön çalışmamızda, metastatik hücrelerin metastatik olmayanlara kıyasla, kültür ortamına anlamlı düzeyde farklılık gösteren 85 otokrin faktör saldığı tespit edildi. Çalışmamızda, bu proteinlerden, KC ve/veya MIP2 salımını arttırdığı yada bu kemokinlerin salımında kritik rolü olan PI3K/Akt yolağı gibi hücre içi survival yolaklarını aktive ettiği bilinen ancak kanser hücrelerinde daha önce çalışılmamış olan üç tanesini, antagonizmalarının etkilerini değerlendirerek inceledik. Bu proteinler; Plazminojen aktivatör,ürokinaz (uPA), Kompleman komponenti 3a (C3a) ve Timik stromal-lenfopoietin (TSLP)'dir.
Gereç ve Yöntem: Proteinlerin, fare meme karsinomu metastatik 4T1, 4THM, 4TBM ve 4TLM ve metastatik olmayan 67NR hücrelerinden salınma düzeyleri ELISA ile değerlendirildi. MIP2 salımının daha yüksek ve tutarlı olduğunu bildiğimiz 4THM ve 4TBM hücrelerinin spesifik antagonistlerle tedavisinin hücre proliferasyonu üzerine etkileri WST-1 kitiyle değerlendirildi. MIP2 ve KC düzeylerindeki değişiklikler ise ELISA ile ölçüldü. Antagonistlerin sebep olduğu kemokin salımındaki değişikliklerin, PI3K/Akt, Erk1/2 ve p38-MAPK yolakları üzerine etkileri ile tutarlı olup olmadığını değerlendirmek için fosforile Akt, Erk ve p38 düzeyleri immunoblot tekniği ile belirlendi.
Bulgular: uPA, C3a ve TSLP hücre tipine göre değişkenlik gösteren düzeylerde tüm hücrelerde ölçülebildi. uPA antagonisti IPR-803, metastatik hücrelerinin proliferasyonunu inhibe ederken kemokin salımını azalttı ve bu etki Akt, Erk ve p38 fosforilasyondaki inhibisyonu ile paralellik gösterdi. Dahası, CXCR2 antagonisti SB225002 ile kombine edildiğinde, uPA reseptör blokajı ile SB225002'nin anti-proliferatif etkinliği artarken sebep olduğu kemokin artışı kompanse edebildi. C3a antagonisti SB290157 ise hücre çoğalmasını sınırlı düzeyde baskıladı. Bununla birlikte C3a'nın, ilk defa çalışıldığı kanser hücrelerinde MIP2 salımını arttırdığı gösterildi. TSLP ise, tüm metastatik hücrelerde yüksek seviyede saptandı. Diğer yandan TSLPR-Ig Akt, Erk ve p38 fosforilasyonunu baskılarken 4TBM hücrelerin proliferasyonu arttırdı. Kemokin salımı üzerine ise tutarsız etki gösterdi.
Sonuç: uPA-uPAR aksı, antagonizmasının direkt olarak sağlayacağı anti-tümör etkinin yanısıra, kanser tedavisinde adjuvan ajan olarak umut vaad eden CXCR2 antagonistleri ile uzun süreli tedavide otokrin bir mekanizmayla sebep olabileceği "otoresistans"ın engellenebilmesi için meme kanserinde uygun bir hedef olarak gözükmektedir.

Abstract:
Purpose:Today, breast cancer  is the most common malignancy with it's substantial mortality. Neverthless, there is no approach that prevents or reverses the metastatic spread, which is held responsible for its mortality.On the other hand, the advanced complexity of "cancer" causes necessity for the approaches in the field of molecular mechanisms in targeted and  integrated manners.CXC chemokines and their receptors represent a molecular system that has been proven to play an important role in cancer development and progression.In addition, it has been demonstrated that particularly CXCR2 is expressed by various cancer cells and it's activation is crucial for development of metastasis. Therefore, CXCR2 antagonists seem to be promising as anti-cancer therapy and clinical trials are ongoing in that field. It has been demonstrated that KC and MIP2, which are ligands for CXCR2, play substantal roles in tumorigenesis by causing CXCR2 activation.These chemokines have also been found to be involved in metastasis, with released by metastatic mouse breast cancer cell lines in higher levels compared to nonmetastatic ones. 

Background: Our previous studies have shown that the CXCR2 antagonist SB225002 provides anti-tumorigenic effect while increases the levels of MIP2 and KC released into the tumor microenvironment. That condition revealed that CXCR2 is an autoreceptor for these ligands and indicated that long term use of antagonist may be cause chemoristance . Moreover, MIP2 release had an increasing kinetics time dependently.This suggests that various autocrine factors released by metastatic cells may be one of the mechanisms responsible for possible chemoresistance by increasing the release of CXCR2 ligands.Additionally, in our preliminary study, it is found that 85 released autocrine factors into the conditioned medium by metastatic cells, which significantly differ compared to nonmetastatic cells. In our study, we evaluated three of these proteins which is known with increasing the release of KC and/or MIP2 or activate the intracellular survival pathways, such as the PI3K /Akt that have substantial roles in release of that chemokines, but have not been examined in cancer cells before, by evaluating the effects of their antagonists.These proteins are; Plasminogen Activator, Urokinase (uPA), Complement Component 3a (C3a) and Thymic Stromal-Lymphopoietin (TSLP). 

Matherial and Methods:Levels of these proteins released by 4T1, 4THM, 4TBM and 4TLM metastatic murine mammary carcinoma and nonmetastatic 67NR cells were determined by ELISA. The effects of these proteins' spesific antagonists on cell proliferation were evaluated with WST-1 kit, on 4THM and 4TBM cells, whose MIP2 release are known as higher and consistent,.Changes in MIP2 and KC levels were measured by ELISA. To evaluate whether  the changes in the chemokine release caused by antagonists are consistent with their effects on the PI3K/Akt, Erk1/2 and p38-MAPK pathways, phosphorylated Akt, Erk and p38 levels were determined by immunoblot technique. 

Results:uPA, C3a and TSLP were measured in all cells at different levels according to cell type. uPa antagonistIPR-803 decreased chemokine release while suppressing the proliferation of metastatic cells, and this effect was corraleted with the inhibition of Akt, Erk and p38 phosphorylation. Moreover, when it was combinated with CXCR2 antagonist SB225002, uPA receptor blockade increased the antiproliferative effect of  SB225002 and reversed it's increasing effect on chemokine levels. C3a antagonist SB290157 exhibited restricted suppression on cell proliferation.Moreever, it is demostrated that C3a increases MIP2 levels in the cancer cells on that was examined of MIP2 release caused by C3a for the first time. TSLP was determined at a high levels in all metastatic cells. On the other hand, while TSLPR-Ig suppressed Akt, Erk and p38 phosphorylation, increased the proliferation of 4TBM cells. Also it showed an inconsistent effect on chemokine release. 

Conclusion:The uPA-uPAR axis appears to be a suitable target in breast cancer in order to prevent "authoresistance", which can be caused by autocrine mechanism in long-term treatment with CXCR2 antagonists, which are promising as adjuvant agents in cancer treatment, in addition to the antitumor effect directly provided by it's antagonism.