Transplantasyon ve replantasyon sırasındaki uzun ı̇skemi probleminin çözümüne dair ekstrakorporeal dolaşım modeli
Extracorporeal circulation model for solution of the prolongedischemia time during transplantation and replantation
Yazar: SÜLEYMAN YILDIZDAL
Danışman: PROF. DR. SERDAR NAZİF NASIR
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Fizyoloji = Physiology ; Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery

Özet:
Ekstremite nakilleri ve ekstremite amputasyonlarının replantasyonu sırasında klasik kompozit doku saklama ve transport yöntemi soğukta saklamadır. Ancak soğukta saklama yöntemi büyük kas kitlesi olan ekstremitelerin taşınmasında güvenli bir saklama süresi sağladığı düşünülsede, uzamış soğukta saklama süresi, dokularda iskemi-reperfüzyon hasarını engelleyememekte ve bu durumda replante veya transplante edilen ekstremitenin fonksiyonunda ve sağkalımında başarısız sonuçlar oluşabilmektedir. Buna alternatif olarak solid organların naklinde perfüzyon amaçlı kullanılmış olan ex-situ perfüzyon sistemlerinin, vaskülerize kompozit dokuların nakli sırasında da kullanılması halinde; iskemik kalan dokuda hem yeterli oksijenin sağlanacağı hem sıcaklığın istenilen düzeyde tutulacağı hem de oluşan metabolik yan ürünlerin atılacağı varsayılmaktadır. Böylece oluşacak inflamatuvar yanıtın azalacağı ve replante edilen ekstremitenin fonksiyonunun ve sağkalımının artacağı düşünülmektedir.
Replantasyon/transplantasyon cerrahisindeki iskemi problemine bir çözüm oluşturabilmek için bu çalışmada 2 grup sıçanda, soğukta saklama yöntemi ile ex-situ perfüzyon sisteminde saklama yöntemini iskemi-reperfüzyon modeli kullanarak karşılaştırmayı amaçladık. Her iki grupta 6 saat iskeminin ardından 1 saat reperfüzyon yapıldı. Reperfüzyonun ardından alınan gastrokinemius kası doku örneklerinden, cerrahi öncesi ve reperfüzyon sonrası alınan kanlardan elde edilen serum örneklerinden oksidatif hasar düzeyini belirlemek amaçlı Enzim Immun Assay (ELISA) tekniği kullanılarak biyokimyasal olarak Süperoksid Dismutaz (SOD), katalaz, TAS (Total Antioksidan), TOS (Total oksidan) ve Total Thiol parametrelerine bakıldı. Bunların yanı sıra yine aynı örneklerden ELİSA yöntemi ile TNF-α, NF-κB ve IL-10 düzeyleri inflamasyon miktarını belirlemek için bakıldı. Ayrıca kanda iskemi-reperfüzyon hasarının yol açacağı inflamatuvar değişimleri göstermek için biyokimyasal parametreler (Na+, K+, LDH, CK, Myoglobin ve Laktat) değerlendirildi. Ek olarak sıçan arka bacağından alınan gastrokinemius kasından ELİSA yöntemi kullanılarak bax ve bcl-2 proteinlerinin düzeyine bakıp apoptoz değerlendirildi. Mitokondriyal sitokrom oksidaz (cox) boyaması ve hematoksilen/eozin boyama yöntemleri ile kas lifi hasarı değerlendirildi. Ekstremiteden alınan deri örneklerinden iskeminin cilt bulguları gözlemlendi.
Bulgulara bakıldığında, ekstrakorporeal dolaşım sistemi soğukta saklama sistemine göre oksidatif hasarı daha az oluşturmaktadır. Kas homojenatından ve kandan alınan örneklerden TAS, SOD ve Total Thiol değerleri perfüzyon sisteminde anlamlı olarak daha yüksek bulundu. TOS değeri soğukta saklama sisteminde perfüzyon sistemine göre daha yüksek görüldü. Perfüzyon sistemi kullanılarak yapılan amputasyon modelinde soğukta saklama sistemine göre inflamatuvar hasar daha düşüktü. İnflamatuvar hasarı gösteren TNF-α, NF-κB miktarı perfüzyon sisteminde daha düşük görülmüş olup, anti-inflamatuvar özellik gösteren IL-10 miktarı perfüzyon sistemi kullanılan modelde daha yüksektir. Reperfüzyonun geç döneminde oluşan apoptoz ve nekroz bulgularının aksine, bu çalışmada iskemi reperfüzyon hasarının erken dönemi incelendiğinden apoptoz belirteci olan bax ve bcl-2 düzeyleri iki grup arasında farklılık göstermedi. Biyokimyasal parametrelere bakıldığında kas yıkım ürünü olan CK, Myoglobin değerleri ve metabolik yükü gösteren LDH ve laktat değerleri soğukta saklama grubunda perfüzyon grubuna göre daha yüksekti. İskemi reperfüzyon sonrasında ciltte herhangi bir farklılık iki grup arasında yokken; kasta cox boyaması ve hematoksilen/eozin boyaması sonrasında soğukta saklama sisteminde perfüzyon sistemine göre belirgin bir mitokondriyal hasar gözlendi.
Sonuç olarak ekstrakorporeal dolaşım modeli soğukta saklama modeline göre inflamatuvar ve oksidatif hasarı erken dönemden itibaren daha fazla önlemektedir. Bu sebeple kas kitlesi büyük olan ekstremitelerin replantasyonu veya transplantasyonunda ekstrakorporeal dolaşım sistemlerinin kullanılması daha başarılı sonuçlar oluşturabilir.

Abstract:
The standard composite tissue storage and transportation method during limb transplantation and replantation is cold storage. However, although the cold storage method is thought to provide sufficient time for transportation of extremities with large muscle mass, prolonged cold storage cannot prevent ischemia-reperfusion injury. Consequently, function and survival of the replanted or transplanted extremity can be unsuccessful in prolonged cases of cold storage. Alternatively, if vascularized composite tissues are stored in ex-situ perfusion systems, sufficient oxygen is provided to the ischemic tissue, the temperature of the tissue is kept at the desired level, and the metabolic waste products are eliminated. Therefore, it is thought that the inflammatory response will decrease and the function and survival of the replanted extremity will increase.
In order to find a solution to the ischemia problem in replantation/transplantation surgery, in this study we aimed to compare results of the cold storage method and the perfusion system storage method. Following the institutional review board approval, an experimental study on 2 groups of rats using the ischemia-reperfusion model was performed. Both groups underwent 1 hour of reperfusion after 6 hours of ischemia. Superoxide Dismutase (SOD), catalase, Total Antioxidant Status (TAS), Total Oxidant Status (TOS) and total thiol levels in gastrocnemius muscle and blood samples were biochemically analyzed using the Enzyme Immun Assay (ELISA) technique to determine oxidative damage levels. In addition, TNF-α, NF-κB and IL-10 levels were measured using the ELISA method in the same samples to evaluate the degree of inflammation. Additionally, biochemical parameters (Na+, K+, LDH, CK, Myoglobin and Lactate) were analyzed to demonstrate the inflammatory changes caused by ischemia-reperfusion injury in the blood. Apoptosis was evaluated by measuring the levels of Bax and Bcl-2 proteins in gastrocnemius muscle samples, using the ELISA method. Muscle fiber damage was evaluated by mitochondrial cytochrome oxidase (cox) staining and hematoxylin/eosin staining methods. Skin findings of ischemia were observed from skin samples taken from the extremity.
It was found that the extracorporeal circulation system causes less oxidative damage than the cold storage system. TAS, SOD and Total Thiol levels in muscle homogenate and blood samples were found to be significantly higher in the perfusion system. TOS levels were found to be higher in the cold storage system than in the perfusion system. Inflammatory damage was lower in the perfusion system than in the cold storage system. The amount of TNF-α and NF-κB, which indicate inflammatory damage, was lower in the perfusion system, and the amount of IL-10, which an anti-inflammatory cytokine, was higher in the perfusion system. This study was designed to evaluate the early phase of ischemia reperfusion injury therefore it was found that bax and bcl-2 levels, which are markers of apoptosis, did not differ between the two groups. Considering the biochemical parameters, CK, Myoglobin values, which are muscle breakdown products, LDH and lactate values, which show metabolic load, were found to be higher in the cold storage group than in the perfusion group. No difference was found between the skin findings after ischemia reperfusion between the two groups; however, after Cox staining and hematoxylin/eosin staining of the muscle samples, significant mitochondrial damages were observed only in the cold storage system.
In conclusion, the extracorporeal circulation model caused less inflammatory and oxidative damages than the cold storage model in the early phases of ischemia reperfusion injury. Therefore, the use of extracorporeal circulation systems in the replantation or transplantation of extremities with large muscle mass may produce more successful results.