Kardiyak doku mühendisliği için sığır kalp kasının hücrelerinden arındırılması ve biyolojik iskele olarak etkinliğinin değerlendirilmesi
Decellularization of bovine heart muscle and evaluating their efficacy as a biological scaffold for cardiac tissue engi̇neeri̇ng
Yazar: YUSUF FURKAN GALATA
Danışman: YRD. DOÇ. DR. YAVUZ EMRE ARSLAN
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: DNA analizi = DNA analysis ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Tez çalışmasında, kesimhanelerde ticari amaçlarla kesimi yapılan sığırların, kalbi çıkartılarak daha küçük parçalara ayrılmıştır ve kas dokusu alınmıştır. Kas dokusunu hücrelerinden arındırılması için dört farklı yöntem denenmiştir. Bu dört farklı yöntemden en iyi sonuç 4. yöntem ile elde edilmiştir. Bu yöntem ile kas dokusu sırasıyla Trizma.HCl/Etilendiamin tetraasetik asit çözeltisi, sodium dodecyl sulfate (SDS), DNAz, RNAz ve perasidikasit ile muamele edilerek hücrelerinden arındırılmış, ardından liyofilize edilmiştir. Hücrelerinden arındırılan liyofilize kas dokusuna sırasıyla DNA içerik analizi, agaroz jel elektroforezi, glikozaminoglikan (GAG) miktar tayini, hidroksiprolin içerik analizi ve Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez analizi yapılarak karakterize edilmiştir. Sonuç olarak, DNA içeriği kas dokusu için 886,11 ± 164,85 (n=3) μg/mg ve hücrelerinden arındırılmış kas doku için 47,66 ± 0,09 (n=3) μg/mg, GAG miktarı kas dokusu için 4,52 ± 0,17 (n=3) μg/mg ve hücrelerinden arındırılmış kas doku için 5,83 ± 0,17 (n=3) μg/mg, Hidroksiprolin içeriği kas dokusu için 3,96 ± 0,49 (n=3) μg/mg ve hücrelerinden arındırılmış kas doku için 37,22 ± 4,34 (n=3) μg/mg kuru kütle olarak bulunmuştur. Ardından hücrelerinden arındırılan kas dokusu pepsin enzimi ile sindirilmiştir ve 10X PBS, 0.1 N NaOH kullanılarak film haline getirilmiştir. Elde edilen filmler N-hidroksi süksinimit (NHS)- N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimit (EDC) ile çapraz bağlanarak dayanılıkları artırılmıştır ve hücre kültürü çalışmaları için uygun hale getirilmiştir. Elde edilen filmler Fourier dönüşümlü kızılötesi (FTIR), termal gravimetrik (TGA) ve mikro mekanik test ile karakterize edilmiştir. Ticari olarak satın alınan insan adipoz kaynaklı mezankimal kök hücreler kültüre edilerek çoklu soy farklılaşma (osteojenik, kondrojenik ve adipojenik) çalışmaları yapılmıştır. Daha sonra kök hücreler üretilen filmler üzerine ekilmiştir ve filmler üzerindeki hücre canlılığı 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl) -2,5-difenil tetrazolyum bromür (MTT) testi ile değerlendirilmiştir. 3, 7 ve 14. günlerde yapılan MTT testi sonuçlarına göre filmler hücre canlılığı üzerinde herhangi bir sitotoksik etki göstermemiştir. Filmler üzerindeki hücrelerin tutunduğu ve proliferasyonunun günden güne arttığı taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve invert-faz kontrast mikroskobu ile kanıtlanmıştır. Hücreli ve hücresiz filmlerin histokimyasal ve immünohistokimyasal olarak karakterize edilmiştir. Kök hücrelerin film üzerinde 3 günden itibaren kalp kası hücrelerine farklılaştığı immünhistokimyasal boyamalar ile kanıtlanmıştır. Sonuç olarak kalp kası başarılı bir şekilde hücrelerinden arındırılmış ve kalp kası dokusu kaynaklı filmler üretilmiştir. Üretilen filmlerin kardiyak doku mühendisliği uygulamalarında kullanım potansiyelinin yüksek olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
In this thesis, hearts of bovine commercially slaughtered in slaughterhouses were removed and cut into smaller pieces, and heart muscle tissue was taken. Four different methods were tried to decellularize the heart muscle. Out of these four different methods, the fourth one gave the best result. In this method, the heart muscle was decellularized by being respectively treated with a solution of Trizma HCI/Ethylenediaminetetraacetic acid, sodium dodecyl sulfate (SDS), DNAse, RNAse and peracetic acid it was later lyophilised. The decellularized lyophilised heart muscle was characterised by respectively going through DNA content analysis, agarose-gel electrophoresis, glycosaminoglycan (GAG) quantification, hydroxyproline content analysis and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. According to the results, the dry masses of the DNA content in the heart muscle and the decellularized heart muscle were 886,11 ± 164,85 (n=3) μg/mg and 47,66 ± 0,09 (n=3) μg/mg; the dry masses of the GAG amount in the heart muscle and the decellularized heart muscle were 4,52 ± 0,17 (n=3) μg/mg and 5,83 ± 0,17 (n=3) μg/mg; the dry masses of the hydroxyprolin content in the heart muscle and the decellularized heart muscle were 3,96 ± 0,49 (n=3) μg/mg and 37,22 ± 4,34 (n=3) μg/mg, respectively. The decellularized heart muscle was later digested with pepsin and film was obtained by using 10X PBS and 0,1 N NaOH. The films were later crosslinked with N-Hydroxysuccinimide (NHS)-N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) to gain durability and become suitable for cell culture studies. The films were characterized with Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), thermogravimetric analysis (TGA) and micromechanical testing. Commercially-bought human adipose derived mesenchymal stem cells were cultured and multilineage differentiation (osteogenic, chondrogenic and adipogenic) studies were carried out. Then, the stem cells were seeded on the films and the cell viability on the films were evaluated through the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) test. According to the results of the MTT tests carried out on the 3rd, 7th and 14th days, the films did not have any cytotoxic effect on cell viability. It was proven via a scanning electron microscope (SEM) and an inverted phase-contrast microscope that the cells cling on the films and the proliferation keeps increasing day by day. Cellular and cell free films were characterized histochemically and immunohistochemically. The stem cells have been proven to differentiate into cardiac muscle cells on the film. The result was that the heart muscle was successfully decellularized and heart muscle derived films were produced. The produced films are considered to have a high potential use in cardiac tissue engineering applications.