Kardiyak glikozit aracılıklı sitotoksisite ile rho/rho kinaz yolağının olası bağlantısının kanser hücre dizilerinde incelenmesi
Investigation of the possible link between cardiac glycosides mediated cytotoxicity and RHO/RHO kinase pathway on cancer cell lines
Yazar: AYSUN ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ARK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Glikozitler = Glycosides ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre ölümü = Cell death ; Kalp = Heart ; Kardiyak glikozitler = Cardiac glycosides ; Neoplazm hücreleri-dolaşan = Neoplastic cells-circulating ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Rhokinaz = Rhokinase ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Son yıllarda yapılan araştırmalar ile kardiyak glikozitlerin çeşitli kanser hücrelerinde apoptotik ve antiproliferatif etkiye sahip oldukları belirlenmiştir. Rho kinazlar'ın (ROCK I ve ROCK II) ise kanser hücre gelişimi ve metaztazında da önemli rol oynadıkları gösterilmiştir. Bu tez kapsamındaki çalışmalarla kardiyak glikozitlerin indükledikleri sitotoksik etkilerde Rho/Rho kinaz yolağının kanser hücrelerinde işlevsel olup olmadığı araştırılmıştır.
Kardiyak glikozit olan ouabain, digoksin ve bufalin konsantrasyon-bağımlı olarak HeLa, MCF-7 ve HepG2 kanser hücrelerinde hücre ölümüne neden olmuştur. ROCK inhibitörü olan Y27632 ise bu hücre ölümünü etkilememiştir. Ayrıca kardiyak glikozitler HeLa hücrelerinde membran tomurcuk oluşumunu artırmıştır. Fakat Y27632 kardiyak glikozitlerin neden olduğu membran tomurcuk oluşumunu engellememiştir. Uvabain uygulaması her üç hücre tipinde de ROCK I'in kesilmesine aracılık etmiştir. Diğer taraftan uvabainin neden olduğu ROCK II kesilmesi sadece HeLa ve HepG2 hücrelerinde gözlenmiştir. ROCK II'nin kesilmesi Y27632 tarafından engellenmez iken tüm kaspazları inhibe eden z-VAD-fmk, kaspaz 2 inhibitörü olan z-VDVAD-fmk ve kaspaz 3 inhibitörü olan z-DEVD-fmk bu kesilmeyi önlemiştir. Uvabain uygulaması hem HeLa hem HepG2 hücrelerinde kaspaz 2 aktivasyonunu artırırken, HeLa hücrelerinde ROCK aktivasyonunu da artırmıştır. Ayrıca uvabain ERM proteinlerininin fosforilasyonunun membran tomurcuklarında lokalize olmasına neden olmuştur.
Sonuç olarak bulgularımız daha önce endotel hücrelerinde yapmış olduğumuz çalışmamız ile uyumlu olarak kanser hücrelerinde kardiyak glikozitlerle indüklenen hücre ölümünde ROCK kinazın işlevi olduğunu göstermiştir. Fakat bu çalışmamızda normal hücrelerden farklı olarak kanser hücrelerinde kardiyak glikozit aracılıklı hücre ölümlerinin ROCK inhibisyonundan etkilenmediği görülmüştür. Bu durum kanser tedavisinde kardiyak glikozitlerle oluşturulacak sitotoksisite ve ROCK inhibisyonu ile sağlanacak antimigratuar etkinin kombine kullanımı ile elde dilecek yeni tedavi yaklaşımlarına katkı sağlayacaktır.

Abstract:
In recent studies it has been demonstrated that cardiac glycosides have apoptotic and antiproliferative activities in several cancer cell lines. ROCK I and ROCK II have pivotal roles in the development and metastasis of cancer cells. In this thesis we investigated whether Rho/Rho kinase pathway is functional in the cardiac glycosides-induced cytotoxic effects in cancer cell lines.
All three cardiac glycosides, ouabain, digoxin and bufalin, induced cell death in HeLa, MCF-7 and HepG2 cancer cell lines and increased the formation of blebbing in HeLa cells. ROCK inhibitor Y27632 did not prevent the cell death and the blebbing. Ouabain mediates cleavage of ROCK I in three cancer cells. However ouabain-induced ROCK II cleavage was only observed in HeLa and HepG2. Although Y27632 did not prevent the cleavage of ROCK II, z-VAD-fmk, z-VDVAD-fmk and z-DEVD-fmk inhibited this cleavage. Ouabain treatment stimulated the activation of caspase-2 in both HeLa and HepG2 cells and induced the activation of ROCK in HeLa cells. Besides uvabain treatment resulted in the localization of ERM phosphorlylation in blebs.
In conclusion, in accordance with our previous work which is performed in endothelial cells our findings showed that ROCK is involved in the mechanism of cell death induced by cardiac glycosides in cancer cells. However in contrast to normal cells Y27632 did not prevent the cardiac glycosides-induced cell death in cancer cells. These findings suggest that combination of cytotoxic effect of cardiac gylcosides and antimigratory effect of ROCK inhibitor may contribute to develop new therapeutic strategies in the cancer treatment .