Köpeklerde endotoksik pyometra olgularında colicillin (Polimiksin e-ampisilin)'in antiendotoksik etkisinin araştırılması
Investigation of the Antiendotoxic effect of Colicillin (polimyxin E-ampicillin) in dogs with endotoxic pyometra
Yazar: MÜRŞİDE AYŞE DEMİREL
Danışman: PROF. DR. ŞÜKRÜ KÜPLÜLÜ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Sunulan tez çalışmasının amacı, köpeklerde endotoksemi kriterlerine uyan pyometra olgularında gram negatif bakteriyel endotoksin insidensinin ve düzeyinin belirlenmesi; operasyon-polimiksin E+ampisilin kombinasyonu ile operasyon-ampisilin uygulamalarının olguların yaşam gücüne etkisinin; klinik, hematolojik ve serum biyokimyasal parametrelerin izlenmesi ile kıyaslamalı olarak araştırılmasıdır. Ayrıca, uygulamanın klinik öneminin yanı sıra pyometranın etiyopatogezinde etkili olan bazı faktörlerin (yaş, ırk, reprodüktif statü, sebep olan mikroorganizmalar) de ortaya konması amaçlanmıştır.Bu amaçla, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı Kliniği'ne sahipleri tarafından getirilen, anamnez, ultrasonografik (6-8 mHz, B mode real time), vaginal muayene ve vaginal sitoloji ile laboratuar parametre bulguları sonucu pyometra tanısı konulan ve endotoksemi kriterlerine uygun semptomlar gösteren 2-18 yaş arası ve Terrier, Doberman, Rotweiler, Kangal, Collie, Pekingese, Labrador, Poodle, Cocker ırkı toplam 30 dişi köpek Grup I (n=15) ve Grup II (n=15) olmak üzere rastgele iki gruba ayrıldı. Operasyon öncesi kan biyokimyasal (AST, ALT, ALP, üre, kreatinin) parametreler ile serum toksin düzeyinin belirlenmesi için antikoagulansız tüplere, hematolojik parametreler için (alyuvar, akyuvar, hematokrit, band ve segmentli nötrofil, lenfosit, monosit, eozinofil, bazofil) ise antikoagulanlı tüplere 3'er ml vena sefalika antebrahi'den kan alındı. Gram negatif bakteriyel endotoksin düzeyini belirlemek amacıyla jelasyon yöntemine göre çalışan E-toxate® test kiti (Sigma-Aldrich, Germany) kullanıldı. Uterus, vagina ve idrar kesesinden mikrobiyolojik örnekler alındı. Ovaryohisterektomi sonrası, Grup I'e ait olgulara serum toksin düzeyini azaltmayı amaçlayan antiendotoksemik sağaltım (polimiksin E-ampisilin) 4 gün süre ile 1 ml/10 kg/i.m. dozda (Collicilin®, Egevet, İzmir), Grup II'de bulunan olgulara ise 4 gün süre ile ampisilin (Ampisina® 250-500 mg, Mustafa Nevzat, İstanbul) intramusküler yoldan verildi. Ovariohisterektomiden 7 gün sonra tekrar kan alınarak biyokimyasal ve hematolojik parametreler ile toksin düzeyi değerlendirilerek operasyonu izleyen süreçte olguların iyileşme ve ölüm nedenleri yorumlandı.Grup I (n=15)'de 10 köpekte, E-toxate testine göre gram negatif bakteri toksini belirlendi ve toksin düzeyinin 0,24-3,84 EU/ml arası, ortalama 1,2±0,4 EU/ml olduğu saptandı. Toksin düzeyi yüksek (0,96-3,84 EU/ml arası) bulunan olgularda BUN (80,5±21,9 mg/dl), kreatinin (3,7±1,4 mg/dl), ALP (172,2±58,4 U/L), akyuvar (42,02±11,8x103µl) ve band nötrofil (%21,5±2,06) değerinde; düşük (0,24-0,48 EU/ml) olan olgularda ise ALP (221,86±86,07 U/L), akyuvar (32,03±10,0x103µl) ve band nötrofil (%16,5±5,0) sayılarında artış görülürken diğer parametreler normal seviyede bulundu. Grup I'de 2 olguda bakteri izolasyonu yapılamazken, 3 olguda gram pozitif bakteri ürediği görüldü. Bu olgularda ALP (270,4±156,5 U/L) ve band nötrofil (%20,8±6,2) referans değerlerin üzerinde iken diğer parametreler referans aralıkta saptandı. Grup II (n=15)'de ise 12 köpekte belirlenen toksin düzeyinin 0,48-3,84 EU/ml arası, ortalama 0,9±0,2 EU/ml olduğu görüldü. Toksin düzeyi yüksek (0,96-3,84 EU/ml) olan olgularda ALP (157,7±18,7 U/L), BUN (44,9±16,3 mg/dl), kreatinin (1,5±0,3 mg/dl), akyuvar (52,5±10,6 x103µl) ve band nötrofil (%11,0±2,1) sayısının; düşük (0,48 EU/ml) bulunan olgularda ise AST (81,1±8,1 U/L), ALP (211,6±66,4 U/L), akyuvar (43,4±15,4x103µl) ve band nötrofil (%22,6±5,3) sayısının arttığı, diğer parametrelerin referans aralıkta olduğu görüldü. Bu grupta 1 olguda bakteri izolasyonu yapılamazken, 2 olguda gram pozitif bakteri ürediği belirlendi. Gram negatif bakteriyel endotoksin düzeyi belirlenen olgulara benzer olarak AST (84,8±13,5 U/L), ALP (261,6±77,7 U/L), BUN (72,4±30,8 mg/dl), kreatinin (1,8±0,5 mg/dl), akyuvar (56,6±15,7x103µl) ve band nötrofil (%25,3±7,8) değerinin arttığı dikkati çekti.Grup I'de 5/15 (%62,5) olgunun, Grup II'de 3/15 (%37,5) olgunun operasyonu izleyen 48-72. saatlerde öldüğü belirlendi. Grup I'de gram negatif bakteriyel endotoksin düzeyi belirlenen ve operasyon sonrası ölen köpeklerde (n=4) toksin seviyesinin yüksek (0,96-3,84 EU/ml) olduğu, ALP, BUN ve kreatinin değerlerinin önemli düzeyde arttığı; Grup II'de toksin düzeyi yüksek (3,84 EU/ml) belirlenen ve ölen 1 olguda ALP (212 U/L) hariç diğer biyokimyasal parametreler Grup I'den farklı olarak referans aralıkta bulundu. Gram pozitif bakteri izole edilen ve ölen olgularda (Grup II; n=2) BUN (72,4±30,8 mg/dl) ve kreatinin (1,9±0,5 mg/dl) düzeylerindeki artış, gram negatif bakteriyel endotoksin belirlenen olgulara benzerlik gösterdi. Çalışmaya ait yaşayan ve ölen köpeklerin operasyon öncesi toksin düzeyi (r=0,727; p<0,01) ile BUN (r=0,539; p<0,01) ve kreatinin seviyesi arasında (r=0,504; p<0,05) pozitif yönlü bir korelasyon belirlendi.Operasyon sonrası 7. günde her iki gruba ait yaşayan ve gram negatif bakteriyel endotoksin belirlenen olgularda toksin seviyesinin (0,12-0,24 EU/ml arası) düştüğü (p<0,05), serum biyokimyasal parametrelerin referans değerlerde seyrettiği görüldü. Grup I'de akyuvar (28,0±3,5x103µl) sayısı ile Grup II'de band nötrofil (%4,4±0,2) sayısı dışındaki hematolojik parametrelerin referans değerlerde olduğu görüldü. Ayrıca Grup I ve Grup II'ye ait bakteri izolasyonu yapılamayan ve gram pozitif bakteri izole edilen yaşayan olgularda da biyokimyasal ve hematolojik parametrelerin referans aralıkta olduğu belirlendi. Operasyon öncesinde ve sonrası 7. günde ölçülen kan biyokimyasal ve hematolojik parametrelerinin kıyaslamasından polimiksin E+ampisilin kombinasyonunun band nötrofil (p<0,05) hariç diğer parametrelerde olumlu gelişme olmadığı, bunun aksine ampisilin uygulanan Grup II'de ALT, ALP, BUN, kreatinin gibi kan biyokimyasal, alyuvar, akyuvar, yüzde hematokrit, band nötrofil ve lenfosit sayıları gibi hematolojik parametrelerin olumlu değiştiği ve bu sonuçların istatistiki açıdan önemli (p<0,05) olduğu bulundu.Grup I ve Gup II'ye ait köpeklerin uterus (27/30), vagina (20/30) ve idrar örneğinden (16/30) elde edilen 90 svaptan 63 (%70)'ünde bakteri izolasyonu yapıldı. Pozitif örneklerden E coli (%56,6), Ps aeruginosa (%10), Klebsiella spp. (%6,6), koagulaz pozitif Stafilokok (%6,6), Enterekok (%3,3), B hemolitik Streptokok (%3,3), mikst bakteri (%3,3) izole edildi. Grup I'de izole edilen bu bakterilerin %76,9'u gram negatif, %15,3'ü gram pozitif, %7,6'sı mikst enfeksiyon; Grup II'de ise bu izolatların %85,7'sinin gram negatif, %14,2'sinin gram pozitif bakteri olduğu belirlendi. Escherichia coli (n=17), Klebsiella spp. (n=2), Ps aeruginosa (n=3) izole edilen tüm olgularda cefuroksim ve amikasin'e, ß-Hemolitik Streptokok (n=1), Koagulaz pozitif Stafilokok (n=2) ve Enterekok (n=1) izole edilen tüm olgularda ise ampisilin-amoksisilin'e ileri düzeyde hassasiyet belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre, herhangi bir antibiyotiğe karşı bazı olgularda hassasiyet görülürken, bazı olgularda direnç geliştiği saptandı.Sonuç olarak; endotoksemi kriterlerine uyan pyometra olgularının %81,4'ünün gram negatif bakterilerden ileri gelebileceği, toksin seviyesi ile BUN ve kreatinin düzeyleri arasında ilişki olduğu ve bu değerleri yüksek bulunan olguların viabilitesinin düşük olduğu, operasyonla birlikte ampisilin uygulamasının polimiksin E+ampisilin kombinasyonuna göre hipotezin aksine köpeklerde pyometra olgularında daha etkili sonuç doğurduğu, 7 yaş ve üzeri köpeklerin pyometra için predispozisyon oluşturduğu, yaygın mikroorganizmanın E coli olduğu ve gram pozitif bakteri toksinleri de gözetilerek bilimsel çalışmaların devam edilmesinin klinik öneminin olacağı kanaatine varıldı.

Abstract:
The aim of this dissertation study was to determine the incidence and levels of the gram negative bacterial entoxin; to investigate comparatively whether the operation ?the enjection of polymyxin E + ampicillin combination and the operation- ampicillin application had the prognostic significance on the postoperative survival rate as well as the evaluation of clinical signs, haematological and serum biochemical parameters in bitches with endotoxic pyometra. In addition to, the introduction of some triggered factors in ethiopathogenesis of pyometra (age, breed, reproductive status, microorganisms) were also targed as well as the clinical importance of the present implementation.The client?owned 30 bitches brought to Gynecology Clinic, Faculty of Veterinary Medicine, Ankara University were used as material. The age ranges of the animals were from 2 to 18 years and the breed distribution was identified as Terrier, Doberman, Rotweiler, Kangal, Collie, Pekingese, Labrador, Poodle, Cocker. The presumptive diagnosis of pyometra cases, which were had clinical signs in accordance with endotoxemia criteria, was based on case history, clinical-gynaecological examination including ultrasonography, vaginal cytology along with laboratory profiles. The bitches were randomly allocated into two groups as Group I (n=15; polymyxin E-ampicillin) and Group II (n=15; ampicllin). Blood samples were collected for biochemical ( AST, ALT, ALP, urea, creatinin), haematological tests (erythrocyte, leucocyte, haemotocrit, band and segmented neutrophil, lymphocyte, monocyte, eosinophile, basophile) and serum toxine levels during clinical examination of all bitches. Blood samples for testing biochemical parameters and toxine levels were taken to blood tubes without anticoagulants, while for hematological parameters to ethylendiaminetetra-acetic acide (EDTA) tubes by venopuncture of the cephalica antebrachii. E-toxate test kit operating in accordance with gelation (Sigma-Aldrich, Germany) was used to determine the gram negative bacterial endotoxin level. Samples for bacteriological examination were taken from vagina, vesica urinaria and uterus. After ovariohysterectomy, in order to decrease serum toxin level in cases of Group I, antiendotoxemic treatment (polymyxin E-ampicilin) during four days, 1 ml/10 kg/i.m. (Collicilin®, Egevet, Izmir), for Group II, during four day ampicillin (Ampisina® 250-500 mg, Mustafa Nevzat, İstanbul) was given via intramuscular. Seven days after ovariohysterectomy, blood was taken again and survival rate after surgery was interpreted by biochemical, hematological parameters and toxin level.Gram negative bacteria toxin with E-toxate® test kit was determined in 10 dogs in Group I (n=15). Toxin levels were ranged between 0,24 and 3,84 EU/ml, with avarage of 1,2±0,4EU/ml. The increased means levels of BUN (80,5±21,9 mg/dl), creatinin (3,7±1,4 mg/dl), ALP (172,2±58,4 U/L), WBC (42,02±11,8x103µl) and band neutrophil (21,5%±2,06) were observed in cases with high toxin level (0,96-3,84 EU/ml), whereas the increased means of ALP (221,86±86,07 U/L), WBC (32,03±10,0x103µl) and band neutrophil (%16,5±5,0) in cases with low toxin level (< 0,96 EU/ml ) were identified. The remaining biochemical and haematological parameters were in the normal range. In Group I, bacterial isolation was not obtained in 2 cases, while gram positive bacteria was isolated in 3 cases. In these 5 cases, ALP (270,4±156,5 U/L) and band neutrophil (20,8%±6,2) were found above the reference range, although the other parameters were determined in the reference range. In Group II, toxin levels could be determined in 12 animals as ranged between 0,48-3,84 EU/ml with avarage of 0,9±0,2 EU/ml. It was observed a significant trend toward the increase of means ALP (157,7±18,7 U/L), BUN (44,9±16,3 mg/dl), creatinin (1,5±0,3 mg/dl), WBC (52,5±10,6 x103µl) and band neutrophil (11,0%±2,1) in animals with high toxin level (0,96-3,84 EU/ml range), and means AST (81,1±8,1 U/L), ALP (211,6±66,4 U/L), WBC (43,4±15,4x103µl) and band neutrophil (22,6%±5,3) profiles in bitches with low toxin levels. In this group, while bacteria was not isolated in 1 case, gram positive bacterial multiplication was obtained in 2 cases. As similar to the cases isolated gram negative bacterial endotoxin from uterus, AST (84,8±13,5 U/L), ALP (261,6±77,7 U/L), BUN (72,4±30,8 mg/dl), creatinin (1,8±0,5 mg/dl), WBC (56,6±15,7x103µl) and band neutrophil (25,3%±7,8) means were featured by their increases in the bitches isolated gram positive bacteria.Five bitches in Group I and 3 bitches in Group II were died within 72 hours after surgery. Endotoxin levels in dead bitches that had gram negative bacterial agents were found above 0,96 EU/ml and the increase levels of ALP, BUN and creatinin in these animals were signified. In Group II, biochemical parameters were identified in reference range except ALP (212 U/L) as contrary to Group I. The increase of BUN (72,4±30,8 mg/dl) and creatinin (1,9±0,5 mg/dl) levels in 2 dead cases which caused gram positive bacterial agents showed similarity with the cases that had gram negative bacterial endotoxin. There was a positive correlation between toxin levels (r=0,727; p<0,01) and BUN-creatinin (r=0,539; p<0,01) profiles before surgery in recovered and nonsurvival dogs.In all of dogs survived and had gram negative bacterial agents, toxin levels (0,12-0,24 EU/ml range) were observed to decrease (p<0,05) and serum biochemical parameters were determined to be in the reference range on the 7th day after the operation. Hematological parameters were seen in the reference range except leukocyte number (28,0±3,5x103µl) in Group I and band neutrophil (%4,4±0,2) number in Group II. In addition, biochemical and haematological parameters were in normal limits in both the cases did not isolate bacteria and isolated gram positive bacteria from uteri. When comparing biochemical and haematological parameters obtained before surgery with day 7 after operation, no positive development except band neutrophil recorded in Group I that the combination of polymyxin E+ampicillin were used. Contrarily, in Group II that ampicilin were used, blood biochemical values such as ALT, ALP, BUN, creatinin and hematological parameters such as number of RBC, WBC, Hct, band neutrophil, lymphosyte were developed positively and this was found to be statistically significant (p<0,05).Bacteria were isolated from the uteri (27/30), vagina (20/30) and urine (16/30) samples of dogs (63/90; 70%) in Group I-Group II. From positive samples, E coli (56,6%), Ps aeruginosa (10%), Klebsiella spp. (6,6%), coagulase positive Staphylococ (6,6%), Enterecoc (3,3%), B hemolytic Streptococ (3,3%), mixed bacteria (3,3%) were isolated. Out of these bacteria that isolated in Group 1, 76,9% found to be gram negative, 15,3% gram positive, 7,6% mixed infection and in Group II; 85,7% gram negative, 14,2% gram positive bacteria. All of cases that isolated from Escherichia coli (n=17), Klebsiella spp. (n=2), Ps aeruginosa (n=3) were showed to have susceptibility to cefurokcim and amikacin. In addition, in cases that isolated ß-Haemolytic Streptococ (n=1), coagulase positive Staphylococ (n=2) and Enterecoc (n=1) were determined have high sensitivity to ampicillin-amoksicillin. According to this results, it was determined that some sensitivity on some cases while resistance on some cases againt any antibiotic was also present.As a result, of 81,4% of dogs with pyometra suitable to endotoxemia criteria can be infected due to gram negative bacteria. There was a correlation between toxin levels and BUN-creatinin values and also the cases that have the increased BUN and creatinin levels together with high toxin levels were trended toward low viability rate. After surgery, on cases that performed ampicillin were acquired more effect results in opposition to the hipothesis according to polimiksin E+ampicillin combination in dogs with pyometra. Seven years and older dogs generated predisposition factor for pyometra.