Metagenomik yaklaşımla elde edilen endoglukanaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu
Recombinant expression and characterization of a novel endoglucanase enzyme obtained by metagenomics approach
Yazar: FURKAN ABDULLAH ÇALIŞ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU ; DR. GÜNSELİ KURT GÜR
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyoetanol = Bioethanol ; Endoglukanaz = Endoglucanase ; Metagenomik = Metagenomics ; Rekombinant ekspresyonu = Recombinant expression

Özet:
Selülazlar, O-bağlantılı glikozitleri hidrolize eden glikozid hidrolazlardır. Bunlar esas olarak endoglukanaz (EC 3.2.1.4), ekzoglukanaz / sellobidrohidrolaz (EC 3.2.1.176/EC 3.2.1.91) ve beta-glukozidazdan (EC 3.2.1.11) oluşan sinerjistik olarak işleyen bir enzim sistemi oluşturmaktalardır. Endo-β-1,4-glukanazlar, selüloz polimerlerinde iç amorf bölgelere rastgele saldırarak yeni zincir uçları oluşturmakta ve rastgele uzunlukta daha küçük selüloz parçalarını serbest bırakabilmektedir. Selülazlar genellikle mantarlardan elde edilmekle birlikte bakterilerin yüksek büyüme hızları, etkili kompleks enzimleri üretebilmeleri ve enzim üretimini arttırmak için genetik mühendisliğinin kolay uygulanabilir olması nedenleriyle önemli olduğu düşünülmektedir. Son araştırmalar, bakteri çeşitliliğinin bitki polimer bozulmasında önemli olduğunu ve bu mikroorganizmalardan ilgili genlerin ve enzimlerin izole edilmesinde geleneksel kültüre alma yöntemlerinden bağımsız metagenomik yaklaşımın giderek arttığını göstermektedir. Metagenomik, çevredeki mikroorganizma topluluklarını kültüre almadan doğrudan tüm topluluğun genomik DNA'larının izole edilmesidir. Bu sayede, kültür koşullarının optimizasyonuna gerek kalmadan ya da kültüre alınamayan mikroorganizmaları gözden kaçırmadan mikrobiyal genetik çeşitlilik ve biyoteknolojik potansiyelin araştırılması sağlanmaktadır.
xiii
Çalışmamızda önceki başka bir çalışmada kompost topraktan kurulan fozmit-metagenomik kütüphanenin aktivite temelli taranması sonucu tespit edilen yeni bir endo-β-1,4-D-glukanaz enzimini kodlayan gen, öncelikle pJET1.2/blunt vektörüne klonlanmıştır. 1134 nükleotitten oluşan tam uzunluktaki rekombinant β-1,4-D endoglukanaz geni, amplifiye edilen ürünün dizi analizi yoluyla tanımlanmıştır. Daha sonra pQE-2 ekspresyon vektörüne aktarılan genin heterolog ekspresyonu Escherichia coli BL21 (DE3) 'de yapılmıştır. ORF, tahmini moleküler ağırlığı 42.82 kDa olan 378 amino asitlik bir proteini kodlamaktadır. N-terminal ucundaki sinyal dizisinin kesilmesinin ardından saflaştırması optimize edilerek endüstriyel uygulamalarda biyoteknolojik potansiyele sahip bu yeni enzimin aktivitesi değerlendirilmiştir.
N-terminal sinyal dizisi kesilmiş genle karşılaştırıldığında, tam uzunluktaki rekombinant β-1,4-D endoglukanaz geni taşıyan E. coli'de selülaz üretiminde dört kat daha az ekspresyon sergilemiştir. Ayrıca sinyal dizisi uzaklaştırılmış geni bulunduran hücreden elde edilen süpernatanda, hücre peletinden daha yüksek enzim aktivitesi gözlenmiş olup sinyal dizisi uzaklaştırılmasının daha fazla hücre içi çözünebilir β-1,4-D endoglukanaz üretimini sağladığı gözlemlenmiştir.
Enzim aktivite sonuçları metagenomik kütüphane kaynaklı elde edilen bu yeni selülazın biyoetanol üretiminde selülozik madde parçalanmasında kullanılmak üzere endüstriyel uygulamalar için potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
Cellulases are glycoside hydrolases that hydrolyze O-linked glycosides. They form a synergistically functioning enzyme system consisting mainly of endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase / cellobidrohydrolase (EC 3.2.1.176/EC 3.2.1.91) and beta-glucosidase (EC 3.2.1.11). Endo-β-1,4-glucanases can randomly attack the inner amorphous regions in cellulose polymers, forming new chain ends and releasing smaller pieces of cellulose of random length. Although cellulases are generally obtained from fungi, they are thought to be important because of the high growth rate of bacteria, their ability to produce effective complex enzymes, and the easy application of genetic engineering to increase enzyme production.
Recent studies show that bacterial diversity is important in plant polymer degradation and that the metagenomic approach independent of traditional culturing methods is increasingly used to isolate relevant genes and enzymes from these microorganisms. Metagenomics is the isolation of genomic DNA of the entire community without culturing the surrounding microorganism communities. In this way, it is possible to investigate microbial genetic diversity and biotechnological potential without the need for optimization of culture conditions or missing microorganisms that cannot be cultured.
In our study, the gene encoding a new endo-β-1,4-D-glucanase enzyme, which was detected as a result of activity-based screening of the fosmid-metagenomic library
xv
established from compost soil in another previous study, was first cloned into the pJET1.2/blunt vector. The full-length recombinant β-1,4-D endoglucanase gene, consisting of 1134 nucleotides, was identified by sequence analysis of the amplified product. Heterologous expression of the gene, which was then transferred to the pQE-2 expression vector, was performed in Escherichia coli BL21 (DE3). The ORF encodes a 378 amino acid protein with an estimated molecular weight of 42.82 kDa. The activity of this new enzyme, which has biotechnological potential in industrial applications, was evaluated by optimizing its purification after cutting the signal sequence at the N-terminal end. E. coli carrying the full-length recombinant β-1,4-D endoglucanase gene showed four-fold less expression in cellulase production compared to the gene with truncated N-terminal signal sequence. In addition, higher enzyme activity was observed in the supernatant obtained from the cell containing the gene with the signal sequence removed, and it was observed that the removal of the signal sequence provided more intracellular soluble β-1,4-D endoglucanase production.
It is thought that this new cellulase, whose enzyme activity results were obtained from the metagenomic library, has the potential for industrial applications to be used in bioethanol production for the degradation of cellulosic material.