Identification of transcription factors that interact with ARID4B protein in mouse embryonic stem cells
Fare embriyonik kök hücrelerde ARID4B proteiniyle etkileşen transkripsiyon faktörlerinin bulunması
Yazar: EZGİ GÜL KESKİN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ NİHAL TERZİ ÇİZMECİOĞLU
Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Embriyonik gelişim, gen ifadesinin kontrolü seviyesinde, son derece planlı ve düzenli işleyen bir süreçtir. Bu süreç boyunca, zigot bölünür ve erişkin vücudundaki bütün hücre tiplerini oluşturacak şekilde farklılaşır. Gelişimin erken safhalarında pluripotent özellik gösteren embriyonik kök hücreler (EKH) izole edilip laboratuvar ortamında gelişim sırasındaki hücre kader mekanizmaları üzerinde çalışmak için kullanılabilir. EKH'lerin pluripotent karakteri belli transkripsiyon faktörleri (TF) (Oct4, Sox2 vb.) tarafından yönetilir. EKH'lere özgü bir transkripsiyon ağı kuran bu TF'ler pluripotentlik için gerekli genlerin yüksek ve dengeli bir miktarda ifade edilmesini sağlar. TF'lerin bu görevlerinde kromatin faktörleri de görev alır.
Daha önceki çalışmalarımızda EKH'lerin mezoderm ve endoderm tabakalarına farklılaşmasını sağlayan kromatin faktörlerini belirledik. Bu faktörlerden biri, Sin3a korepresör kompleksinin içinde bulunan Arid4b proteinidir. Arid4b proteininin histon modifikasyon ve DNA bağlanma bölgeleri yardımıyla Sin3a kompleksini, EKH farklılaşması için gerekli olan genlere yönlendirdiğini düşünüyoruz. Kompleks içerisinde olan histon deasetilazlar sayesinde bu kompleks, gen ifadesini baskılayıcı bir görev üstlenebilmektedir. Arid4b proteininin EKH farklılaşmasındaki görevini daha detaylı anlayabilmek için, normal ve arid4bΔ EKH'leri mezoderme ve endoderme farklılaştırıp genomdaki histon 3 lizin 27 asetilasyon (H3K27Ac) dağılımını inceledik. H3K27Ac aktif arttırıcı bölgelerinde; aktif promotor bölgelerinde görülür. arid4bΔ hücrelerindeki H3K27Ac seviyesinin normal hücrelere oranla daha yüksek olduğunu belirledik. 
Arid4b ve içinde bulunduğu Sin3a kompleksi, bu genlerin EKH farklılaşması sırasında baskılanması görevinde bulunuyor olabilir. Bu görevi yerine getirirken, Arid4b'nin transkripsiyon faktörleri ile çalıştığını düşünüyoruz. H3K27Ac seviyesinde artış görünen bölgelerde konsensüs bağlanma sekansı sık bulunan bir TF olan Tfap2c proteinin normal ve arid4bΔ EKH'lerde mRNA ve protein seviyesinde ifade edildiğini teyit ettik. Yaptığımız eşimmünoçökeltme deneylerine göre, Arid4b ve Sin3a proteinin Tfap2c ile fiziksel etkileşimi olduğunu gösterdik. Sonuç olarak, Arid4b'nin Tfap2c proteini ile fiziksel etkileşim sayesinde genlerin baskılanmasını sağladığını düşünüyoruz. Bu projede, EKH'lerin mezoderm ve endoderme farklılaşma süreçlerini kontrol eden Sin3a korepresör kompleksi ve Arid4b proteinin bir transkripsiyon faktörü olan Tfap2c ile fiziksel etkileşimini belirledik.

Abstract:
Embryonic development is a process that is highly regulated at the level of gene expression. Throughout this process, the zygote divides and differentiates to form all cell types in the adult body. In the early stages of development, pluripotent embryonic stem cells (ESC) can be isolated and used to study cell fate mechanisms during development in vitro. The pluripotency of ESCs is governed by certain transcription factors (TF) (Oct4, Nanog, etc.). These TFs construct a transcription network specific to ESC and enable the high and stable expression of pluripotency genes. Chromatin factors work alongside TFs to maintain pluripotency.
In our previous studies, we have identified Arid4b protein in the Sin3a corepressor complex is critical for proper ESC differentiation into mesoderm and endoderm lineages. Arid4b might direct the Sin3a complex to the ESC differentiation related genes with the aid of its histone modification and DNA binding domains. Histone deacetylases in the complex is critical for the suppression of gene expression.
To better understand the role of Arid4b protein in ESC differentiation, we examined the histone 3 lysine 27 acetylation (H3K27Ac) genome-wide distribution in wildtype and arid4bΔ mesoderm or endoderm differentiated cells. H3K27Ac is a marker of active enhancer regions as well as active promotor regions. We found that the higher level of H3K27Ac in the arid4bΔ cells when compared to wildtype cells. Therefore, Sin3a complex may be required for the suppression of these genes during ESC differentiation.
Upon bioinformatics analyses, we identified TF consensus binding sequences enriched in the regions with increased H3K27Ac levels in arid4bΔ cells. We analyzed the mRNA expression level of 10 such TFs in WT and arid4bΔ ESCs. We further validated the protein expression of selected TFs. Of these, we showed that Tfap2c physically interacts with Arid4b and Sin3a in ESCs through endogenous coimmunoprecipitation experiments.