Ratlarda doxorubicinle oluşturulan böbrek hasarı modelinde, rat mezenkimal kök hücre mitokondrisi transplantasyonu tedavisinin etkinliğinin ortaya konması
Demonstrating the efficacy of treatment of rat mesenchymal stem cell mitochondrial transplantation in A model of renal injury induced by doxorubicin in rats
Yazar: GÖKHAN BURÇİN KUBAT
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET ÖZLER
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Gülhane Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Böbrek = Kidney ; Böbrek yetmezliği-akut = Kidney failure-acute ; Doksorubisin = Doxorubicin ; Kök hücreler = Stem cells ; Mitokondriler = Mitochondria ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Çalışmada ağırlıkları 300-350 gram ağırlığında 42 adet Sprague-Dawley cinsi erkek rat kullanıldı. Ratlar 4 gruba ayrıldı: 1.grup sham grubu, 2.grup Doxorubicin ile nefrotoksisite oluşturacak grup, 3. grup Doxorubicin ile nefrotoksisite oluşturulan mitokondri transplantasyonu yapılan tedavi grubu, 4. grup ise Doxorubicin ve Respiration buffer uygulanan gruptur.
Mitokondri transplantasyonu için Rat mezenkimal kök hücre kültürü yapıldı. Daha sonra mitokondri izolasyonu yapıldı. Mitokondri membran potansiyelini göstermek için Mitotracker RED CMXROS ile immünofloresan yöntem kullanıldı. İzole edilmiş mitokondrinin metabolik aktivitesini belirlemek için ATP Assay ölçümü yapıldı. Mitokondri transplantasyonu için, 2x107 rat mezenkimal kök hücresinden mitokondri izolasyonu yapıldı. Doxorubicin+mitokondri grubunda her iki böbreğe bu transfer işleminde yaklaşık 8 milyon mitokondri 500 µl. içinde uygulandı. Histolojik analizler için hematoksilen-eosin boyaması yapıldı. Biyokimyasal analizler için alınan kan örneklerinden üre, kreatin ve BUN analizleri, idrar örneklerinden proteinüri analizleri yapıldı. Alınan böbrek dokusu örneklerinde oksidan-antioksidan dengeyi ortaya koymak üzere MDA (Malondialdehit), SOD (Superoksit dismutaz), GPx (Glutatyon peroksidaz) analizleri yapıldı.
Mezenkimal kök hücrelerde mitokondrinin membran bütünlüğü için 5x104 hücre sayılması sonucunda %99,39' luk kısmının membran bütünlüğünü koruduğu gözlemlenmiştir. Mezenkimal kök hücreden mitokondri izolasyonu sonrasında %46,30'luk kısımda mitokondrilerin membran bütünlüğünü koruduğu gözlemlenmiştir.
Histolojik analizlerde, sham grubunda hiçbir böbrek hasarı gözlemlenmedi. Doxorubicin grubu, Doxorubicin+respiration buffer grubu ve Doxorubicin+mitokondri gruplarında Doxorubicin enjeksiyonundan sonra tübüler dilatasyon ve tübüllerde protein birikimi gözlemlendi. 5. gunde mitokondri transplantasyonundan sonra Doxorubicin+mitokondri grubunda tübüler protein birikimi anlamlı oranda azaldı. Asıl önemli nokta ise Doxorubicin+mitokondri grubunda transplantasyondan sonra tübüler hücrelerde anlamlı şekilde rejenerasyon bulundu. 
Üre, Kreatin ve BUN ölçümünden elde edilen sonuçlarda Sham grubu, Doxorubicin grubu, Doxorubicin+respiration buffer grubu ve Doxorubicin+mitokondri gruplarındaki değişimler istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar bulunamadı. Proteinüri ölçümünden elde edilen sonuçlara göre Sham grubunda bir değişiklik gözlemlenmedi. Doxorubicin grubu, Doxorubicin+respiration buffer grubu ve Doxorubicin+mitokondri gruplarında doxorubicin enjeksiyonundan sonra ilk beş günde tüm ratlar 3+ proteinüri değerine ulaştı. Doxorubicin+mitokondri grubunda beşinci günde mitokondri transplantasyonundan sonra anlamlı azalma bulundu.
MDA ölçümünden elde edilen sonuçlarda Sham grubu, Doxorubicin grubu, Doxorubicin+respiration grubu ve Doxorubicin+mitokondri gruplarındaki değişimler istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar bulunamadı. SOD enzim seviyesi ölçümlerinde elde edilen sonuçlara göre Sham grubuna göre Doxorubicin+mitokondri grubunda istatistiksel olarak anlamlı derecede artış bulundu. Yine Doxorubicin grubuna göre Doxorubicin+mitokondri grubunda istatistiksel olarak anlamlı derecede artış bulundu. Diğer çalışma gruplarında ölçülen değerler arasında anlamlı bir farklılık bulunamadı. GPx enzim seviyesi ölçümlerinde elde edilen sonuçlara göre Sham grubuna göre Doxorubicin+mitokondri grubunda istatistiksel olarak anlamlı derecede artış bulundu. Yine Doxorubicin grubuna göre Doxorubicin+mitokondri grubunda istatistiksel olarak anlamlı derecede artış bulundu. Diğer Çalışma gruplarında ölçülen değerler arasında anlamlı bir farklılık bulunamadı.
Bu sonuçlara göre mitokondri transplantasyonunun böbrek hasarı hastalıklarında tedavi edici özelliği dikkat çekmiştir. Bu tedavi yönteminin hücresel ya da mitokondriyal hasara neden olan diğer hastalıklarda kullanılabileceği öngörülmektedir.

Anahtar kelimeler: Doxorubicin, böbrek hasarı, rat, mezenkimal kök hücre, mitokondri transplantasyonu

Abstract:
In this study, Forty-two male Sprague-Dawley male rats weighing 300-350 grams were used. The rats were divided into 4 groups: Group 1 sham group, group 2 doxorubicin with nephrotoxicity, group 3 doxorubicin with nephrotoxicity and mitochondria transplantation, group 4 is the doxorubicin and respiration buffer group.
Rat mesenchymal stem cell culture was performed for mitochondrial transplantation. Then, mitochondrial isolation was performed. To demonstrate the mitochondrial membrane potential, an immunofluorescent method was used Mitotracker RED CMXROS. ATP Assay measurement was performed to determine the metabolic activity of isolated mitochondria.For mitochondrial transplantation, isolated mitochondria from 2x107 mesenchymal stem cells were used and approximately 500 μl (8 million) mitochondria were injected into both kidney in the Doxorubicin + mitochondria group. Hematoxylin-eosin staining was performed for histological analysis. Blood samples for biochemical analysis were analyzed for urea, creatinine and BUN, and urine samples were analyzed for proteinuria. MDA (malondialdehyde), SOD (superoxide dismutase), GPx (glutathione peroxidase) analyzes were performed to determine the oxidant-antioxidant balance in the recipient kidney tissue specimens.
In mesenchymal stem cells, it was observed that 99.39% of the mitochondria preserved membrane integrity for 5x104 cell counts for membrane integrity. It has been observed that isolated mitochondria of mesenchymal stem cells maintains membrane integrity in 46.30% for mitochondrial transplantation.
Histologic analysis showed no kidney damage in sham group. Doxorubicin group, doxorubicin + respiratory group and doxorubicin + mitochondria groups showed tubular dilatation and protein accumulation in tubules after dose of doxorubicin. The accumulation of tubular protein in the group of Doxorubicin + Mitochondria group decreased considerably after the 5th day of transplantation of mitochondria. Importantly, there is significant regeneration of tubular cells in the Doxorubicin + Mitochondria group after transplantation.
Differences in the Sham group, Doxorubicin group, Doxorubicin + Respiration buffer group and Doxorubicin + Mitochondria groups were not found to be statistically significant in the results obtained from Urea, Creatine and BUN measurements. No difference was observed in the Sham group according to the results obtained from the measurement of proteinuria. In the Doxorubicin group, Doxorubicin + Respiration buffer group and Doxorubicin + Mitochondria groups, all rats reached 3+ proteinuria in the first five days after doxorubicin injection. Doxorubicin + Mitochondria group showed a significant decrease on day 5 after mitochondrial transplantation.
Differences in the Sham group, Doxorubicin group, Doxorubicin + Respiration buffer group, and Doxorubicin + Mitochondria groups were not found to be statistically significant in MDA measurement results. There was a statistically significant increase in Doxorubicin + Mitochondria group according to Sham group in the results obtained in SOD enzyme level measurements. Moreover,  according to the Doxorubicin group, there was a statistically significant increase in Doxorubicin + Mitochondria group. No significant difference was found between the values measured in the other study groups. There was a statistically significant increase in Doxorubicin + Mitochondria group according to Sham group in the results obtained in GPx enzyme level measurements. Moreover, according to the Doxorubicin group, there was a statistically significant increase in Doxorubicin + Mitochondria group. No significant difference was found between the values measured in the other study groups.
According to these results, mitochondrial transplantation has attracted attention to its therapeutic properties in kidney injury diseases. It is envisaged that this treatment may be used in other diseases that cause cellular or mitochondrial damage.


Key words: Doxorubicin, renal injury, rat, mesenchymal stem cell, mitochondrial transplantation