Sağlıklı ailelerde bağırsak mikrobiyota parmak izinin kültüromik maldı-TOF MS yaklaşımı ile belirlenmesi
Determination of gut microbiota fingerprints of healthy families using by culturomics maldi-TOF MS approach
Yazar: SELEN GÜÇLÜ DURGUN
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH EKMEKÇİ
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Aile = Family ; Bakteriler-anaerobik = Bacteria-anaerobic ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Gastrointestinal sistem = Gastrointestinal system ; Genom = Genome ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Mikrobiyota = Microbiota

Özet:
İnsan bağırsağı insan vücudunda bakterilerin en yoğun olduğu bölgedir. Doğumdan önce steril olan bebeğin bakteri kolonizasyonu doğum sırasında başlamakta ve takip eden 3 yıl içerisinde yetişkin bir insanın bakteri çeşitliliğine ulaşmaktadır. Patojen ve kommensal bakterilerin benzer mekanizmaları kullandıkları öngörülmesine rağmen, patojenlerin aksine yararlı bakterilerin bireyler arasındaki transferi henüz tam olarak belirlenmemiştir. Bu tez çalışmasında sağlıklı 9 farklı aileden dışkı örnekleri toplanmış, bakteriler üç farklı karbon kaynağı içeren zengin besiyerlerinde anaerobik ortamda çoğaltılmış ve MALDI-TOF MS (Matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi) yöntemi ile bakterilerin 16S ribozomal protein spektrumu belirlenerek bakteri profili çıkarılmıştır. Doğrulama amacıyla ailelerde çoğunlukta bulunan Anaerostipes hadrus ve Bifidobacterium adolescentis bakterilerilerinden DNA izolasyonu yapılmıştır.  Seçilen bakterilerin tüm genomları sekanslanarak aynı türe ait bakterilerin SNP (single nucleotide polymorphism; tek nükleotid polimorfizmi) kıyaslamaları ile tür altı faklılıkları üzerinden birbirlerine yakınlıkları belirtilmiştir. Sonuç olarak kültüromik yöntemi ile toplam 2126 koloni ve 92 farklı tür bakteri izole edilmiştir. Her bir aile için parmak izi kabul edilebilecek, ailenin her bir bireyinde bulunan bakteriler tespit edilmiştir. Anaerostipes hadrus, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacteriım longum, Enterococcus faecalis ve Bacteroides vulgatus en fazla izole edilen bakterilerdir. MALDI-TOF protein spektrumlarına dayanarak oluşturulan filoproteomik dendrogramlara göre bazı çocukların anne ile bazılarında ise baba ile aynı bakterileri paylaştığı gösterilmiştir. Filoproteomik dendrogramlar ile SNP analizleri kıyaslandığında dendrogramların büyük kısmı doğrulanmıştır. Aile içi bakteri geçişini göstermek için kültüromik yönteminin fikir verici olduğu ancak ribozomal protein spektrumlarındaki değişikliklerden dolayı geçiş hakkında bilgi sağlamada tek başına yeterli olmadığı sonucuna varılmıştır.


Anahtar Kelimeler : Mikrobiyota, MALDI-TOF MS, Tüm Genom Sekanslama, Aile-içi
Anaerobik Bakteri Geçişi, Mikrobiyota Parmak izi

Abstract:
The human intestine is a body site which has the largest numbers of bacteria. Bacterial colonization of an infant which was sterile before delivery begins at birth and in the following 3 years of baby bacterial diversity reaches to an adult like. Although pathogens and commensal bacteria are presumed to use similar mechanisms, unlike pathogens, the transfer of beneficial bacteria between individuals has not yet been fully understood. In this thesis, fecal samples were collected from 9 different healthy families and bacteria were grown in anaerobic media containing three different carbon sources. Bacteria profile was determined by MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) by bacterial 16S ribosomal protein spectrum. For validation, DNA was isolated from Anaerostipes hadrus and Bifidobacterium adolescentis which has been the majority of the bacteria in the families. Whole genomes of the selected bacteria were sequenced and inter-family bacterial transmission were investigated by SNP (single nucleotide polymorphism) comparisons of sub-species of the same species. As a result, totaly 2126 colonies which belong to 92 different species were isolated by culturomics approach. For each family, spesific bacteria found in each member of the family were identified which could be considered fingerprints. Anaerostipes hadrus, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacteriım longum, Enterococcus faecalis and Bacteroides vulgatus are most abundant bacteria in families. According to phyloproteomic dendrograms which based on MALDI-TOF protein spectra show that some children share the same bacteria with mother and some are with father. Most of phyloproteomic dendrograms have been confirmed when compared with SNP analysis. It was concluded that the culturomic method is insightful in order to show the intracellular bacterial transmission, but it is not sufficient alone to provide information for the transition due to changes in the ribosomal protein spectra.


Key Words :Microbiota, MALDI-TOF MS, Whole Genome Sequencing,
Intrafamilial anaerobic bacteria transition, microbiota fingerprint