Trombin saflaştırılması için moleküler baskılanmış mikrokriyojeller
Molecular imprinted microcryogels for thrombin purification
Yazar: MERVE ASENA ÖZBEK
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Protein saflaştırma alanı, proteinlerin yapısal ve işlevsel özelliklerini anlamak ve hücre ve doku içerisindeki rollerini açıklayabilmek için çok gerekli bir yöntem olarak karşımıza çıkmaktadır. Günümüzde yaşam bilimlerindeki gelişmelerle birlikte protein saflaştırılması, biyoteknoloji endüstrisinde temel basamak olan protein üretimi gibi belirli uygulamalarda önemli rol oynamaktadır. Dolayısıyla protein saflaştırma alanında düşük maliyetli, kolay ve verimli saflaştırma yöntemlerine olan ihtiyaç giderek artmaktadır. 

Sunulan tez çalışmasında, sağlık alanında önemli bir yere sahip trombinin yüksek saflıkta, tek basamakta ve düşük maliyetli bir şekilde elde edilmesi için uygun polimerik malzemeler hazırlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda çalışmada, seçiciliği yüksek ve tekrar kullanıma imkan sağlayan, birçok alanda bu üstün özellikleri dolayısıyla tercih edilen moleküler baskılama yöntemi kullanılmıştır. Ayrıca büyük gözenek boyutlarına sahip, esneklik, kısa difüzyon yolu, iyi biyouyumluluk ve yüksek mekanik dayanıklılık gibi eşsiz özellikleri olan mikro ölçeğinde mikrokriyojeller sentezlenmiştir. Tez çalışması kapsamında, hazırlanan bu polimerik malzemelerin söz konusu protein olan trombinin biyoayırma ve saflaştırma işlemlerindeki etkinliği araştırılmıştır.

Tez çalışmasının ilk basamağında, lazer uygulaması ile mikrokriyojellerin sentezleneceği 400-650 µm aralığında farklı boyutlara sahip mikrostensil kalıplar oluşturulmuştur. Aminoasit temelli fonksiyonel monomer olan N-Metakriloil-(L)-glutamik asit sentezlenmiştir. Daha sonraki adımlarda, mikrostensil kalıplar kullanılarak farklı oranda içeriklere sahip trombin baskılanmış ve baskılanmamış mikrokriyojeller sentezlenmiştir. Mikrokriyojellerin karakterizasyon çalışmaları mikro bilgisayarlı tomografi (μCT), taramalı elektron mikroskobu (SEM), optik mikroskop, yüzey alanı ölçümleri (BET analizleri) ve şişme testi ölçümleri ile gerçekleştirilmiştir. Trombin adsorpsiyonuna etki eden pH, sıcaklık, başlangıç derişimi, iyonik şiddet, adsorpsiyon süresi gibi çeşitli parametreler taranarak adsoprsiyon-desorpsiyon ve tekrar kullanılabilirlik çalışmaları gerçekleştirilmiş olup ayrıca belirlenen yarışmacı ajanlar ile mikrokriyojellerin seçiciliği incelenmiştir. Trombinin saflığı hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) yöntemi ile değerlendirilmiştir.

Abstract:
The field of protein purification appears as a very necessary method to understand the structural and functional properties of proteins and to explain their roles in cells and tissues. Nowadays, with the developments in life sciences, protein purification plays an important role in certain applications such as protein production, which is a basic step in the biotechnology industry. Therefore, the need for low-cost, easy and efficient purification methods in the field of protein purification is increasing.

In the presented thesis study, suitable polymeric materials were prepared to obtain high purity, single-step and low-cost thrombin, which has an important place in the field of health. For this purpose, the molecular imprinting method, which is highly selective and allows reuse and is preferred in many areas due to its superior properties, was used in the study. Additionally, micro-scale microcryogels with large pore sizes and unique properties such as flexibility, short diffusion path, good biocompatibility and high mechanical strength have been synthesized. Within the scope of the thesis study, the effectiveness of these prepared polymeric materials in the bioseparation and purification processes of the protein in question, thrombin, was investigated.

In the first step of the thesis, microstencil array chips with different sizes in the range of 400-650 µm were created with laser application, from which microcryogels would be synthesized. N-Methacryloyl-(L)-glutamic acid, an amino acid-based functional monomer, was synthesized. In the next steps, thrombin imprinted and non-imprinted microcryogels with different contents were synthesized using microstencil array chips. Characterization studies of microcryogels were accomplished with micro-computed tomography (μCT), scanning electron microscope (SEM), optical microscope, surface area measurements (BET analyses) and swelling test measurements. Adsorption, desorption and reusability studies were carried out by scanning various parameters affecting thrombin adsorption such as pH, temperature, initial concentration, ionic strength, adsorption time, and the selectivity of microcryogels was also examined with the determined competitive agents. The purity of thrombin was evaluated by fast protein liquid chromatography (FPLC).