Kı̇stı̇k ekı̇nokokkozı̇sli hastalarda dolaşımdaki miRNA (let-7, MİR-71 ve mir-10)'ların kist evrelerine göre araştırılması
Investigating of circulating miRNAs (LET-7, MİR-71, MİR-10) according to cyst stages in patients with cystic echinococcosis
Yazar: MESUT AKIL
Danışman: PROF. DR. NAZMİYE ALTINTAŞ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Echinococcosis = Echinococcosis ; Echinococcus granulosus = Echinococcus granulosus ; Elektroforez-poliakrilamid jel = Electrophoresis-polyacrylamide gel ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Mikro RNA = Micro RNA ; SDS-PAGE =   ; İmmün boyama = Immunoblotting

Özet:
Kistik ekinokokkozis (KE), Echinococcus granulosus' un larval formunun başta
karaciğer olmak üzere çeşitli organlarda kistler oluşturduğu önemli bir paraziter
hastalıktır. Ara konak olan insanlarda çoğunlukla asemptomatik olarak seyretmekte,
yerleştiği organa göre spesifik olmayan klinik semptomlar gösterebilmektedir.
Hastalığın tanısında direkt inceleme, radyolojik görüntüleme, serolojik ve moleküler
yöntemlerden yararlanılmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ), kist tiplerini
ultrasonografik görüntülerin morfolojilerine dayanarak CE1'den CE5'e kadar
sınıflandırmıştır. Bu sınıflandırma kistin aktifliği ve hastanın klinik yönetimi açısından
önemlidir.
MikroRNA'lar (miRNA), translasyonu inhibe ederek veya transkripsiyonu manipüle
ederek hedef genlerin ekspresyonunu düzenleyen 18-22 nükleotid uzunluğunda
RNA'lardır. miRNA'lar metabolik aktiviteler, hücre farklılaşması ve apoptozisi gibi
biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. Yapılan çalışmalarda miRNA'ların
serum ve plazmada stabil olarak bulundukları gösterilmiştir. Bu özellik miRNA'lara
hastalıkların erken tanısında ve hastanın takibinde biyobelirteç olarak kullanılması
açısından önemli rol kazandırmıştır. Çalışmamızda literatür araştırmalarına göre
E.granulosus'da daha önce saptanmış miRNA'lardan 3'ünün (egr-let-7, egr-miR-71
ve egr-mir-10) KE'li hastaların kan örneklerinde araştırılması ve kist tiplerine göre
karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Bu çalışmamıza KE tanısı almış (n:50) ve ultrasonografik muayenede kist
sınıflandırması yapılmış hastalar dahil edilmiştir. Sağlıklı kontrol grubuna (n:20) KE
açısından herhangi bir klinik göstermeyen ve kendini iyi hisseden gönüllü bireyler
dahil edilmiştir. Tüm hastalardan ve gönüllü bireylerden onam formları imzalatılarak
kan örnekleri alınmıştır. Serolojik yöntemlerle hasta ve sağlıklı kontrol grubu serum
örnekleri, ELISA ve Western Blot (WB) ile değerlendirilmiştir. Daha sonra miRNA
analizi için, tüm örneklerin plazmalarından total RNA izolasyonları gerçekleştirilmiş
Reverse Transkriptsiyonla cDNA'ya çevrilmiştir. Kantitatif Real Time PCR (qRTPCR)
yöntemi kullanılarak hedef 3 miRNA'nın amplfikasyonlarına göre Ct (cycling
threshold=eşik döngüsü) değerleri tespit edilmiştir. Normalizasyonu için referans gen
IV
(housekeeping gene) olan U6 snRNA kullanılmıştır (ΔCT). Hasta grubunun
ekspresyon seviyeleri, sağlıklı kontrol grubu ile karşılaştırılarak 2 -ΔΔCT yöntemine göre
hesaplanmıştır. Elde edilen bulguların kist sınıflandırmalarına göre karşılaştırılması
istatistiksel olarak analiz edilmiştir.
KE'li hasta grubu örneklerini, yerleşim yerlerine göre 10 farklı ilden (İzmir, Manisa,
Balıkesir, Muğla, Aydın, Kütahya, Denizli, Isparta, Uşak ve Çanakkale) Ege
Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi'ne başvuran hastalar oluşturmuştur. Bunların 31'i
(%62) kadın, 19'u (%38) erkek olup yaşları 8-73 arasında (ort:40,7 ±18,65)
değişmektedir. ELISA sonuçlarına göre 41 (%82) örnek ELISA ile pozitif tespit
edilmiştir. Ancak 2 (%4) örnek eşik değerde, 7 (%14) örnek negatif olarak
bulunmuştur. WB yöntemiyle hasta grubu örneklerinin doğrulaması
gerçekleştirilmiştir. Sağlıklı kontrol grubu örnekleri ELISA ve WB yöntemiyle KE
açısından negatif tespit edilmiştir. qRT-PCR yöntemi ile hasta örneklerinde egr-let-7,
egr-miR-10 ve egr-miR-71 için sırasıyla 27 (%54), 5 (%10) ve 13 (%26)'ünde
amplifikasyon tespit edilmiştir. Sağlıklı kontrol grubunda herhangi bir amplifikasyon
tespit edilmemiştir. İstatistiksel olarak miRNA ekspresyon seviyelerinde hasta
grubunun, sağlıklı kontrollere göre karşılaştırılmasında egr-let-7, egr-miR-10 ve egrmiR-
71'de anlamlı fark bulunmuştur (p<0,05). Kist sınıflandırmalarına göre
karşılaştırmaları yapılan örneklerde ise CE1'de egr-miR-71 ve CE2'de egr-let-7'de
istatistiksel olarak anlamlı fark tespit edilmiştir (p<0,05).
Sonuç olarak; çalışmamızda KE'li hastaların plazma örneklerinde E.granulosus
kaynaklı egr-let-7, egr-miR-10 ve egr-miR-71 miRNA'larının tespit edilebildiği
gösterilmiştir. Kist sınıflandırmalarına göre, miRNA ekspresyon seviyelerindeki
değişiklikler göz önüne alındığında özellikle CE1 kist tipinde egr-miR-71, CE2'de
egr-let-7 KE'nin erken tanısı ve takibi için biyobelirteç olarak kullanılabilmesi
açısından umut vericidir.
Bu çalışmamız bugüne kadar KE'li hastaların kan örneklerinde miRNA'ların tespitine
yönelik Türkiye'de yapılmış ilk çalışmadır.

Abstract:
Cystic echinococcosis (CE) is an important parasitic disease which the larval form of
Echinococcus granulosus causes cysts in various organs, especially in the liver. It is
usually asymptomatic in human who are intermediate hosts. In the diagnosis of the
disease, direct examination, radiological imaging, serological and molecular methods
are used. World Health Organization (WHO) has classified cyst stages from CE1 to
CE5 based on the morphology of ultrasonographic images. This classification is
important for the cyst's activity and clinical management of the patients.
MicroRNAs (miRNAs) are 18-22 nucleotide length RNAs and they regulate the
expression of target genes by inhibiting translation or manipulating transcription.
miRNAs play an important role in biological processes such as metabolic activities,
cell differentiation and apoptosis. Current studies have shown that miRNAs are stable
both in serum and plasma. This feature has given miRNAs an important role in early
diagnosis of disease and to use as a biomarker for follow-up. In our study, it was aimed
to detect 3 miRNAs (egr-let-7, egr-miR-71 and egr-miR-10), which are previously
discovered according to literature research in E.granulosus, in blood samples of
patients with CE and to compare them according to cyst stages.
In this study, 50 patients who were diagnosed with CE and had cyst classification by
ultrasonographic examination were included. The healthy control group (n: 20)
consists of volunteer individuals who do not show any clinical symptoms and in good
health in terms of CE. Blood sampling were taken after consent forms were signed by
all patients and volunteers. Serum samples of patients and healthy control group were
evaluated serologically by ELISA and Western Blot (WB). Then, total RNA isolations
were performed from the plasma of all samples and converted to cDNA by Reverse
Transcription for miRNA analysis. Ct (cycling threshold) values were determined
according to the amplification of the target 3 miRNAs using quantitative Reverse
Transcription PCR (qRT-PCR) method. U6 snRNA, the housekeeping gene, was used
for normalization (ΔCT). The expression levels of the patient group and the healthy
control group were compared and calculations were performed by using 2 -ΔΔCT
method. The results were compared to cyst classifications and analyzed statistically.
VI
Patients with CE who attended to Ege University Medical School Hospital came from
10 different cities (İzmir, Manisa, Balıkesir, Muğla, Aydın, Kütahya, Denizli, Isparta,
Uşak and Çanakkale) according to their settlements. Thirty-one of them (62%) were
women and 19 (38%) were men and their ages vary between 8-73 (mean: 40.7 ±
18.65). According to ELISA findings, 41 (82%) samples were found to be positive.
However, 2 (4%) samples were detected at threshold and 7 (14%) samples were found
to be negative. Confirmation of patient group samples was carried out with the WB
method. Healthy control group samples were all negative both ELISA and WB in terms
of CE.
Amplification was detected in 27 (54%), 5 (10%) and 13 (26%) for egr-let-7, egr-miR-
10 and egr-miR-71, respectively with qRT-PCR method. No amplification was
detected in the healthy control group. A statistically significant difference was found
in egr-let-7, egr-miR-10 and egr-miR-71 expression levels in comparison of the patient
group and healthy controls (p <0.05). In the samples which were compared according
to cyst classifications, a statistically significant difference was detected in egr-miR-71
in CE1 and egr-let-7 in CE2 (p <0.05).
As a result of our study; it was shown that egr-let-7, egr-miR-10 and egr-miR-71
miRNAs derived from E.granulosus can be detected in the plasma of patients with CE.
According to cyst classifications, considering the changes in miRNA expression
levels, especially egr-miR-71 in CE1 cyst type and egr-let-7 in CE2 cyst type were
promising as a new biomarkers for early diagnosis and follow-up of CE.
Our study is the first study performed in Turkey for the detection of miRNAs in blood
samples of CE patients so far.