Sıçan ince bağırsak glutatyon S-transferaz enziminin saflaştırılması ve izozimlerinin hiperisin bileşiği ile bağlanma özelliklerinin incelenmesi.
Purification of glutathione S-transferase from rat small intestine and examining the binding properties of defined isozymes with the hypericin.
Yazar: GAMZE TUNA
Danışman: PROF. DR. İZZET HAMDİ ÖĞÜŞ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada, Glutatyon S-transferaz (GST, E.C. 2.5.1.18) sıçan ince bağırsağından, Sephadex G-25 jel filtrasyonu, S-Hekzilglutatyon Sefaroz 6B affinite kolunu kullanılarak %76 verim ve 16.13 U/mg-protein'lik özgül aktivite ile saflaştırıldı. Enzim daha sonra PBE-118 kromatofokuslama kolonuna yüklenerek izozimler Pharmalyte/HCl (pH:8) ile ayrıldı. PBE-118 kolonundan ? izozimi pH 9,58'de, pi izozimi pH: 8,97'de elde edildi. Alt birimlerin molekül ağırlığı 25 kDa (? izozimi) 24 kDa (pi izozimi) olarak hesaplandı. GST-? CDNB ve GSH ile negatif kooperatif özellik gösterdi. İzozimin düşük ve yüksek [CDNB]'de farklı Km ve Vm değerlerine sahip olduğu gözlendi. Km ve Vm düşük derişimlerde sırasıyla 0.366 mM, 4.237 U/mg protein, yüksek derişimlerde ise 0.590 mM, 5.675 U/mg protein olarak bulundu. Aynı şekilde [GSH] değişken substrat olduğunda da farklı kinetik parametreler hesaplandı. Düşük derişimlerde Km: 0.043 mM, Vm: 2.079 U/mg protein ve yüksek derişimlerde Km: 0.426 mM, Vm: 6.262 U/mg protein olarak saptandı. GST pi, değişen CDNB ve GSH derişimlerine karşı negatif kooperatif özellik gösterdi. Km ve Vm değerleri düşük CDNB derişimleri için sırasıyla 0.118 mM, 0.672 U/mg protein ve yüksek CDNB derişimleri için 2.967 mM, 8.306 U/mg protein olarak hesaplandı. Düşük GSH derişimlerinde Km ve Vm 0.038 mM, 1.4 U/mg protein iken yüksek GSH derişimlerinde bu değerler 0.167 mM, 2.431 U/mg protein olarak hesaplandı.Hiperisin, sabit [GSH] değişken [CDNB]'de GST-?'yı non-kompetitif olarak inhibe etti. Ki : 0.1, 0.4, 2.0 ?M sabit [hiperisin]'de sırasıyla 0.239, 0.350, 1.038 ?M olarak bulundu. [GSH] değişken subsrat olduğunda ise hiperisinin unkompetitif inhibisyon yaptığı saptandı. (0.1, 0.4, 2.0 ?M sabit [hiperisin]'de sırasıyla Ki : 0.131, 0.119, 0.231 ?M). Hiperisinin GST-Pi izoziminin inhibitörü olduğu saptandı. [CDNB] sabit, [GSH] değişken substrat olduğunda non-kompetitif inhibisyon özellikleri gözlenirken (0.1, 0.4, 2 ?M sabit hiperisin derişiminde Ki sırasıyla; 0.366, 0.872, 2.863 ?M); değişken [CDNB] olduğunda aynı şekilde GST-Pi izozimi üzerinde non-kompetitif inhibisyon gösterdi (0.1, 0.4, 2 ?M sabit hiperisin derişiminde sırasıyla Ki : 0.715, 0.865, 2.297 ?M).

Abstract:
In this study, Glutathione S-transferase (GST, E.C. 2.5.1.18) was purified from small intestine of the rat using Sephadex G-25 gel filtration, S-Hexylglutathione Sepharose 6B affinity column chromatography with 76% yield and a specific activity of 16.13 units per milligram proteine. The enzyme was then loaded to PBE-118 chromatofocusing column and isozymes were separated with Pharmalyte/HCl (pH: 8). The ? isozyme was separated by PBE-118 column chromatography at the pH 9.58 with a molecular weight of 25 kDa. The ? isozyme was separated by PBE-118 column chromatography at the pH 8.97 with a molecular weight of 24 kDa.GST-? showed a negative cooperativity pattern both with CDNB and GSH. The enzyme had different Km and Vm values for low (0.366 mM, 4.237 U/mg protein) and high [CDNB] (0.590 mM, 5.675 U/mg protein), respectively. Different kinetic parameters were also calculated for low (Km: 0.043 mM, Vm: 2.079 U/mg protein) and high (Km: 0.426 mM, Vm: 6.262 U/mg protein) [GSH]. GST- ? showed a negative cooperativity for its substrates, CDNB and GSH. The Km and Vm values were calculated as 0.118 mM, 0.672 U/mg protein in low concentrations, and 2.967 mM, 8.306 U/mg protein in high concentration of CDNB, respectively. In the low GSH concentrations Km and Vm values were found to be 0.038 mM, 1.4 U/mg protein, whereas in the high GSH concentrations these values were calculated as 0.167 mM, 2.431 U/mg protein.Hypericin showed a non-competitive inhibition pattern on GST-?, using [GSH] fix and [CDNB] as a varied substrate (Ki: 0.239, 0.350, 1.038 ?M at 0.1, 0.4, 2.0 ?M hypericin concentrations, respectively), whereas uncompetitive inhibition was found when [GSH] was a varied substrate (Ki: 0.131, 0.119, 0.231 ?M at 0.1, 0.4, 2.0 ?M hypericin concentrations, respectively). Hypericin was found to be an inhibitor for GST-Pi. Non-competitive inhibition pattern was found at fix [CDNB] and varied [GSH]. Ki values obtained were; 0.366, 0.872, 2.863 ?M for 0.1, 0.4, 2 ?M of constant [hypericin], respectively. While using CDNB as a varied substrate, non-competitive inhibition was also found with a Ki; 0.715, 0.865, 2.297 ?M, for 0.1, 0.4, 2 ?M of [hypericin], respectively).