Gökkuşağı alabalık (Oncorhynchus mykiss) karaciğerinden glutamat dehidrojenaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of glutamate dehydrogenase from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) liver
Yazar: ONUR ERTİK
Danışman: PROF. DR. REFİYE YANARDAĞ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Enzim aktivasyonu = Enzyme activation ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Enzim inhibitörleri = Enzyme inhibitors ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method ; Enzimler = Enzymes ; Oncorhynchus mykiss = Oncorhynchus mykiss

Özet:
Glutamat dehidrojenaz (GDH) enzimi hem proteinlerin enerji metabolizmasına katılmasında hem de organizma için önemli olan metabolitlerin sentezinde görev almasından dolayı oldukça önemlidir. GDH enziminin katalizlediği reaksiyonun iki yönlü olması enzimin bulunduğu dokunun ihtiyacına ve görevine göre özelleşebilir. Tüm bu nedenlerden dolayı GDH enziminin saflaştırılması hem dokular hem de canlılar arasında bu enzimin fonsiyonel farklılıklarının anlaşılması için oldukça önemlidir. Bu çalışmada gökkuşağı alabalık (Oncorhynchus mykiss) karaciğerinden GDH enzimi 2',5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi ile tek basamakta saflaştırılmıştır. Bu saflaştırma işleminin sonucunda GDH enzimi 5.38 U/mg protein spesifik aktiviteyle 171 kat saflaştırılmıştır. Saflaştırılan GDH enziminin karakterizasyon deneyleri sonucunda depo kararlılığının -80oC; optimum sıcaklığın 40oC; optimum iyonik şiddetin 100 mM fosfat tamponu ve optimum pH'ının 8.0 olduğu tespit edilmiştir. PAGE ve SDS-PAGE çalışmaları sonucunda saflaştırılan GDH her bir alt ünitesinin 53.71 kDa ve mol kütlesinin 346.74 kDa olduğu bulunmuştur. Gökkuşağı alabalık karaciğerinden saflaştırılan GDH enziminin substratları ve koenzimleri olan NAD+, NADP+, NADH+H+, NADPH+H+, L-glutamat, α-ketoglutarat ve NH4+ için Km değerleri sırasıyla 1.86, 2.17, 2.98, 6.25, 15.15, 4.82 mM ve1.73 M ve Vmax değerleri ise sırasıyla 0.11, 0.05, 0.44, 0.43, 0.12, 0.42 and 1.79 U/mL olarak bulunmuştur. Saflaştırılan GDH enziminin aktivitesi üzerine bazı metal iyonları ve vitaminlerin etkisi incelendiğinde, GDH enzimi üzerine metal iyonlarından Ag+, Cu2+, Zn2+, Ni2+, Fe2+, Mn2+, Co2+, Mg2+, Fe3+, Cr3+ iyonlarının inhibitör, Ca2+ ve V4+ iyonlarının aktivatör etkiye sahip olduğu bulunmuştur. Na+ ve Li+ metal iyonlarının ise saflaştırılan GDH enziminin aktivitesi üzerine bir etkisi olmadığı tespit edilmiştir. Bazı vitaminlerin saflaştırılan GDH enziminin aktivitesi üzerine etkileri incelendiğinde B1, B6 ve U vitaminlerinin inhibitör ve B2 vitaminin aktivatör etkisinin, B3 ve C vitaminlerinin ise GDH aktivitesi üzerine etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. İnhibisyon etkisi gösteren metallerin ve vitaminlerin IC50 değerleri, inhibisyon türleri tespit edilmiş ve Ki değerlerinin hesaplanması ile Lineweaver-Burk grafikleri çizilmiştir. Bazı kimyasal çözücülerin saflaştırılan GDH enziminin aktivitesi üzerine olan etkilerine bakılmış, yapılan deneyler sonucunda n-propanol ve siklohekzanon çözücülerinin GDH aktivitesini büyük oranda inhibe ettiği bulunmuştur.

Abstract:
Glutamate dehydrogenase (GDH) enzyme is very important because it participates in the energy metabolism of proteins and the synthesis of metabolites important for the organism. The bidirectional nature of the reaction catalyzed by the GDH enzyme can be customized according to the needs and function of the tissue in which the enzyme is located. For that reason, the purification of the GDH enzyme is very important for understanding the functional differences of this enzyme both between tissues and living things. In this study, GDH enzyme was purified from the liver of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by 2',5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography in one step. As a result of this purification process, GDH enzyme was purified 171-fold with 5.38 U/mg protein-specific activity. As a result of the characterization experiments, the storage stability of the purified GDH enzyme was determined as -80oC; optimum temperature 40oC; it was determined that the optimum ionic strength was 100 mM phosphate buffer and the optimum pH was 8.00. As a result of SDS-PAGE and PAGE studies, it was determined that the natural molar mass of the purified GDH enzyme was 346.74 kDa and the molar mass of its subunits was 53.71 kDa. Km values for substrates and coenzymes of GDH enzyme purified from rainbow trout liver are found that NAD+, NADP+, NADH+H+, NADPH+H+, L-glutamate, α-ketoglutarate and NH4+ are 1.86, 2.17, 2.98, 6.25, 15.15, 4.82 mM and 1.73 M and Vmax values are found that 0.11, 0.05, 0.44, 0.43, 0.12, 0.42 and 1.79 U / mL, respectively. The effects of some metal ions and vitamins on the activity of the purified GDH enzyme were investigated. As a result of these experiments, it was found that metal ions Ag+, Cu2+, Zn2+, Ni2+, Fe2+, Mn2+, Co2+, Mg2+, Fe3+, Cr3+ ions had inhibitory effect and Ca2+ and V4+ ions had an activator effect on the GDH enzyme. It has been determined that Na+ and Li+ metal ions have no effect on the activity of the purified GDH enzyme. Likewise, the effects of some vitamins on the activity of the purified GDH enzyme were examined, and as a result of the experiments, it was determined that B1, B6, and U vitamins had an inhibitory effect and vitamin B2 had an activator effect. B3 and C vitamins were found to have no effect on GDH activity. IC50 values of metals and vitamins showing inhibition effect were determined, Lineweaver-Burk plots were drawn by calculating the inhibition type and Ki values. The effects of some chemical solvents on the activity of the purified GDH enzyme were examined, and as a result of the experiments, it was found that n-propanol and cyclohexanone solvents inhibit GDH activity to a great extent.