Pseudomonas aeruginosa'da piyoverdin üretimini engelleyen bir inhibitörün moleküler hedefinin belirlenmesi
Determination of the molecular target of an inhibitor which inhibits the production of pyoverdin in Pseudomonas aeruginosa
Yazar: ESRA UYANIK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞRUL DORUK
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Piyoverdin = Pyoverdine ; Pseudomonas aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ; Virülans = Virulence ; İlaç hedefleme = Drug targeting ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Bakterilerin birçok antibiyotiğe karşı direnç kazanmış olmaları, meydana
getirdikleri enfeksiyonlar ile mücadelede önemli bir sorun olarak karşımıza
çıkmaktadır. Bu nedenle günümüzde kullanılan geleneksel antibiyotikler yerine, etki
mekanizmaları farklı yeni nesil ilaçların keşfi büyük önem taşımaktadır.
Virülans, patojen mikroorganizmaların bulunduğu konağa zarar verebilme
kapasitesi olarak tanımlanır. Toksin üretimi, çoğunluk algılanması (quorum sensing)
ve biyofilm mikroorganizmaların virülans mekanizmaları arasında sayılabilir. Bu
mekanizmalara karşı üretilen ilaçlar ise antivirülans ilaçlar olarak adlandırılır.
Geleneksel antibiyotikler ile kıyaslandığında antivirülans ilaçlar, bakteri üzerinde
evrimsel baskı oluşturmamakta ve direnç meydana getirmemektedir. Antivirülans
ilaçlar ile terapi bakterileri öldürmeden veya gelişimlerini durdurmadan, sadece
onların virülans özelliklerini inhibe etmeyi amaçlayan bir yöntemdir. Aynı zamanda
yararlı mikrobiyotayı korumak ve antibiyotik kullanımı azaltmak bu terapinin temel
amaçları arasındadır. Bu avantajlarından dolayı virülans mekanizmaların inhibe
edilerek hastalıklar ile mücadele edilmesi; yeni ve güvenli bir yol olarak karşımıza
çıkmaktadır.
Bu bilgilere dayanarak bu tezde, fırsatçı patojen Pseudomonas aeruginosa'nın
patojen özelliğini oluşturan en önemli virülans faktörlerden piyoverdin üretimini
engellediği tespit edilen piperidinkarboksiamid türevi bir molekülün, moleküler
hedefi belirlenmiştir. Piperidinkarboksiamid türevi inhibitör maddenin moleküler
hedefi çoğu laboratuvar tarafından kolayca benimsenen, inhibitör madde üzerinde
herhangi bir modifikasyona ihtiyaç duymadan doğal hali ile çalışılmasına imkan
veren, Pai ve ark. tarafından açıklanmış DARTS yöntemi ile belirlenmiştir. Bu
yöntem temel olarak inhibitör madde ile etkileşime giren proteinlerin proteazlardan
korunacağına prensibine dayanmaktadır.Yapılan çalışmalar sonucunda, kontrol
grubu ile karşılaştırılan inhibitör madde uygulanmış protein örneklerinde 0,25 mg/ml
Termolizin enzimi uygulamasının 2. dakikasında proteazdan korunmuş bir bant
gözlemlenmiştir. QTOF-MS sisteminde analiz edilen korunmuş bant içinde
kontrolden farklı 7 adet protein varlığı tespit edilmiştir. Analiz sonucunda virülansa
etkili olduğu düşünülen proteinlerin yüksek değer verdiği görülmüştür. Piyoverdin
üretiminde görevli Aspartat aminotransferaz proteinin ise en yüksek değere sahip
olduğu bulunmuş ve böylece piperidinkarboksiamid türevi inhibitör molekülümüzün
moleküler hedefi Aspartat aminotransferaz proteini olabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
The fact that bacteria have gained resistance to many antibiotics is a significant
problem in the fight against the infections they cause. For this reason, instead of the
traditional antibiotics the discovery of new generation drugs with different
mechanisms of action is of great importance.
Virulence is defined as the capacity of pathogenic microorganisms to harm the
host. Toxin production, quorum sensing and biofilm targeting the host can be
counted among the virulence mechanisms of microorganisms. Drugs produced
against these mechanisms are called antivirulence drugs. Compared with traditional
antibiotics, antivirulence drugs do not directlycause resistance and selective pressure
on bacteria. Antivirulence therapy is a method that just aims to inhibit the virulence
properties of bacteria without killing them or effecting their growth. At the same
time, protecting the beneficial microbiota and reducing the use of antibiotics are
among the main goals of this therapy. Because of these advantages, fighting diseases
by inhibiting virulence mechanisms emerges as a new and safe way.
Based on this information, in this thesis, the molecular target on the virulence
mechanism of Pseudomonas aeruginosa of a piperidinecarboxyamide-derived
molecule, which was found to inhibit the production of pyoverdin, one of the most
important virulence factors forming the pathogenic feature of the opportunistic
pathogen P. aeruginosa, has been determined. The molecular target of the
piperidinecarboxyamide derivative inhibitor material is determined by the DARTS
method explained by Pai et al., which is easily adopted by most laboratories and
allows working in its natural state without the need for any modification on the
inhibitory substance. This method is based on the principle that proteins interacting
with the inhibitory substance would be protected from proteases. As a result of the
studies conducted, a band protected from protease was observed in the second minute
of 0.25 mg/ml Thermolysin enzyme test in inhibitory substance treated protein
samples compared with the control group. The presence of 7 different proteins from
the control were detected on the conserved band analyzed in the QTOF-MS system.
As a result of the analysis, it was seen that the proteins thought to be effective on
virulence gave high scores. Aspartate aminotransferase protein, which is involved in
the production of pyoverdin, was found to have the highest score, and thus, it was
concluded that the molecular target of our piperidinecarboxyamide derivative
inhibitor molecule could be Aspartate aminotransferase protein.