Antifungal-daptomisin kombinasyonlarının candida albicans-staphylococcus epidermidis biyofilmine, antifungal-meropenem kombinasyonlarının candida albicans-pseudomonas aeruginosa biyofilmine etkisinin araştırılması
"investigation of antifungal-daptomycin combination on candida albicans-staphylococcus epidermidis biofilm and antifungal-meropenem combination on candida albicans-pseudomonas aeruginosa biofilm"
Yazar: AGIM OSMANI
Danışman: PROF. DR. SEMA AŞKIN KEÇELİ
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antifungal duyarlılık testleri = Antifungal sensitivity tests ; Biyofilmler = Biofilms ; Candida albicans = Candida albicans ; Daptomisin = Daptomycin ; Meropenem = Meropenem ; Mikroskopi-elektron taramalı = Microscopy-electron scanning ; Pseudomonas aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ; Staphylococcus = Staphylococcus ; Staphylococcus epidermidis = Staphylococcus epidermidis

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı, antifungal ajanların (amfoterisin B, vorikonazol ve anidulafungin) C. albicans biyofilmine etkisini ve bu antifungallerle birlikte daptomisin antibiyotiğinin birlikte kullanımının C. albicans ve S. epidermidis'in birlikte oluşturduğu biyofilm üzerine; ayrıca bu antifungallerle birlikte meropenem antibiyotiğinin birlikte kullanımının C. albicans ve P. aeruginosa'nın birlikte oluşturduğu biyofilm üzerine etkisini araştırmaktır.
Yöntem: Çalışmada monomikrobiyal (C. albicans) ve polimikrobiyal (C. albicans'ın S. epidermidis veya P. aeruginosa ile birlikte) biyofilm miktarının öncelikle XTT yöntemi kullanarak belirlenmiştir. Biyofilmin mikroskobik olarak incelenmesi inverted mikroskop, floresan mikroskop ve Scanning elektron mikroskobi ile yapılmıştır. C. albicans'ın tek başına oluşturduğu biyofilmin amfoterisin B, vorikonazol ve anidulafungine karşı MİK (Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu) ve SMİK (Sesil MİK) değerleri belirlenmiştir. Daha sonra, C. albicans ve S. epidermidis biyofilmine test edilen antifungaller ile birlikte daptomisin etkinliği ve C. albicans ve P. aeruginosa biyofilmine antifungaller ile birlikte meropenem etkinliği Checkerboard yöntemi ile araştırılmıştır.
Bulgular: Antifungallerin tek başına C. albicans biyofilmine etkinliğinin araştırılmasında, biyofilm oluşturmadan önceki MİK değerleri sırasıyla amfoterisin B için 0,5 µg/ml, vorikonazol için 0,25 µg/ml, anidulafungin için 0,25 µg/ml olarak saptanmıştır. Amfoterisin B ve vorikonazol'un biyofilmdeki MİK değeri (%50 SMİK değeri) karşılaştırıldığınd) planktonik hücrelere göre dört kat fazla bulunmuştur, anidulafungin'de ise bu değerler eşit bulunmuştur. C. albicans'ın tek başına oluşturduğu biyofilme kıyasla polimikrobiyal biyofilmde azalma ve antifungal etkisi inverted ve floresan mikroskop ile gösterilmiştir.  
C. albicans ve S. epidermidis biyofilminde antifungallerle birlikte daptomisin kulanımının test edildiği çalışmalar sonucunda, daptomisinin amfoterisin B ile birlikte kullanıldığında indiferent (yani fark yok); vorikonazol ile birlikte kullanıldığında antagonistik; anidulafungin ile birlikte kullanıldığında da antagonistic etki saptanmıştır.
C. albicans ve P. aeruginosa biyofilminde ise meropenem antibiyotiğinin antifungallerle kombinasyonu test edildiğinde amfoterisin B, vorikonazol ve anidulafunginin tümünün aditif etkisi saptanmıştır. Antifungallerin tek başına veya antibiyotik ile kombinasyonunun biyofilme etkisi taramalı elektron mikroskobu ile de gösterilmiştir.
Sonuç: Çalışma sonuçlarımıza göre, C. albicans ve S. epidermidis biyofilminin varlığında amfoterisin B, daptomisin kullanılacak ise antifungal olarak amfoterisin B tercih edilmesi; C. albicans ve P. aeruginosa biyofilmi varlığında ise antifungal tedavisi sırasında antibiyotik olarak meropenem kullanılması önerilmektedir.

Anahtar Kelimeler: Biyofilm, antifungal duyarlılık, C. albicans, S. epidermidis, P. aeruginosa, Scanning elektron mikroskobu.

Abstract:
Objective: The aim of this study is to research the effect of the antifungal agents (amphotericin B, voriconazole and anidulafungin) on the C. albicans biofilm, and the effect of the combined use of these antifungals with daptomycin, on the polymicrobial biofilm produced by C. albicans and S. epidermidis; and the effect of antifungals combined with meropenem on the polymicrobial biofilm produced by C. albicans and P. aeruginosa.    
Method: In the study, the quantification of monomicrobial (C. albicans) biofilm and polymicrobial (C. albicans with S. epidermidis or with P. aeruginosa) biofilm was determined by XTT method. The microscopic examination of the biofilm was also performed by fluorescence microscope and Scanning electron microscopy. Antifungal susceptibility tests were performed to determine MIC (Minumum Inhibitory Concentration) and SMIC (sessile MIC) values of amphotericin B, voriconazole, anidulafungin against C. albicans mono and polymicrobial biofilm. The effect of daptomycin combination with each antifungals against C. albicans-S. epidermidis biofilm and the effect of meropenem combination against C. albicans-P. aeruginosa biofilm were tested by Checkerboard analysis.
Results: MIC values of C. albicans biofilm alone against amphotericin B, voriconazole and anidulafungin prior to biofilm formation, were 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml and 0,25 μg/ml, respectively. When 50% SMIC values in biofilm were compared, the values of amphotericin B and voriconazole were found to be four times higher than those of planktonic cells, whereas the values of anidulafungin were found to be equal. Compared to the monomicrobial biofilm formed by C. albicans alone, the reduction in polymicrobial biofilm and its antifungal effect has been demonstrated by inverted and fluorescent microscopy.
The effect of daptomycin in C. albicans-S. epidermidis biofilm was determined as indifferent when used with amphotericin B; however, its effect was determined as antagonistic when used in combination with voriconazole or anidulafungin.
When the combination of meropenem with antifungals was tested, in C. albicans and P. aeruginosa biofilm, an additional effect of meropenem with all antifungals was detected. The effects of antifungals and combinations with antibiotics were also visualized by Scanning electron microscopy.
Conclusions: According to the results of all the tests applied in our project, if there is both C. albicans and S. epidermidis infections probably due to polymicrobial biofilm formation and daptomycin was planned to be used in the treatment, amphotericin B might be preferred as a choice in the antifungal treatment. Similarly, if there is C. albicans and P. aeruginosa biofilm formation, meropenem might be preferred as an antibiotic while the patient is under treatment of amphotericin B, voriconazole or anidulafungin treatment.

Keywords: Biofilm, antifungal susceptibility, C. albicans, S. epidermidis, P. aeruginosa, Scanning electron microscope.