Yeni bir spektroflorometrik yöntem ile biyotiyollerin hipobromoz asit süpürme aktivitelerinin belirlenmesi
Determination of hypobromous acid scavenging activity for biothiols with a novel spectrofluorometric method
Yazar: GÜLÜZAR ZEYTÜNLÜ
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA ÖZYÜREK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Hipobromoz asit (HOBr), endojen reaktif oksijen türleri arasında bir reaktif brom türü (RBS) olarak kabul edilmektedir. Nötrofil savunma sisteminde önemli bir bileşen olduğu düşünülmektedir.  Makrofajlar ve eosinofiller HOBr oluşumu için eosinofil peroksidaz, hidrojen peroksit(H2O2) ve bromür iyonunu (Br) kullanmaktadırlar. HOBr oluşumu, immun sistemde önemli bir rol oynamasına rağmen aşırı veya yanlış üretimi kanser, kistik fibroz, iltihabik bağırsak hastalıkları, arterit, böbrek hastalıkları, nörodejeneratif koşullar ve astım gibi çok sayıda hastalığa yol açan doku hasarına neden olmaktadır.Hücresel redoks durumunun düzenlenmesinde yer almasından ötürü biyolojik sistemlerde önemli rol oynayan biyotiyoller (glutatyon (GSH), homosistein (Hcy), sistein (Cys) vb.) HOBr için hedef moleküller arasında yeralmaktadır. Bu nedenle, biyotiyollerin HOBr süpürme aktivitelerinin belirlenmesi çok büyük önem arz etmektedir. Buna rağmen literatürde biyotiyollerin HOBr süpürme aktiviteleri ile ilgili kapsamlı bir çalışma bulunmamaktadır. HOBr süpürme aktivite tayini için sıklıkla kullanılan TNB (5-tiyo-2-nitrobenzoik asit)/DTNB (5,5'-ditiyobis (2-nitrobenzoik asit)) yönteminde ise biyotiyollerin DTNB'yi doğrudan TNB'ye indirgemesinden dolayı çeşitli girişim etkileri mevcuttur. Bu kısıtlamayı kaldırıp literatürdeki boşluğu doldurabilecek yeni HOBr süpürme aktivite tayin yöntemlerine ihtiyaç olduğu düşünülmektedir.

Bu tez kapsamında biyotiyollerin HOBr süpürme aktivitelerinin ölçümü için p-kresol 
(4-metil fenol) probu esaslı yeni bir spektroflorometrik yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem gerek p-kresol probunun kullanılması açısından gerekse biyotiyollerin HOBr süpürme aktivitelerin belirlenmesi açısından bir ilktir.p-Kresol probu (λeks= 260 nm,λem=305 nm) floresan özelliğe sahip bir prob olup HOBr ile reaksiyonu sonucunda oluşan bromlu türevleri floresans özelliği göstermemektedir.p-Kresol probunun başlangıçta sahip olduğu floresans şiddeti probu bromlayan HOBr varlığında azalmakta ve ortama HOBr süpürücü antioksidanlar katıldığında bu azalma daha düşük oranda gerçekleşmektedir. Süpürücü varlığında ve yokluğundaki göreceli azalma oranları izlenerek ilgili süpürücü bileşiğin HOBr süpürme aktivitesi IC50(%50 inhibe edici konsantrasyon) değeri cinsinden hesaplanabilir. Bu çalışmada önemli biyotiyollerin (GSH, Cys, Hcy, NAC vb.) ve bu biyotiyolleri içeren kompleks matriksli çeşitli ilaç örneklerinin (mentopin, primene, brunac) HOBr süpürme aktiviteleri, geliştirilen florometrik yöntem ile belirlendi.Çalışılan bazı biyotiyollerin geliştirilen yönteme göre süpürme aktivite sırası;penisilamin>glutatyon > N-asetil sistein >sisteamin>homosistein>glutatyon etilesteri>sistein>1,4-ditiyoeritritol>lipoik asit>metiyonin şeklindedir. Bu çalışmada en etkin HOBr-süpürücü bileşik penisilamin olarak bulunmuştur (IC50=10.12μM). Geliştirilen yöntem ile biyotiyoller ve çeşitli ilaç örnekleri için elde edilen tüm bu veriler referans yöntemler (KI/Taurin ve UPLC yöntemleri) ile elde edilen veriler ile istatiksel olarak karşılaştırılmıştır (ANOVA testi).

Sonuç olarak geliştirilen florometrikbuyöntem literatürde az sayıda bulunan HOBr süpürme aktivite yöntemlerine alternatif olacak ve özellikle biyotiyollerin HOBr süpürme aktivitelerinin belirlenmesindeki boşluğu dolduracaktır. p-Kresol probu esaslı florometrik yöntemin absorptimetrik ve kromatografik yöntemlere göre daha duyarlı olması ve HPLC yöntemlerinden daha az maliyetli ve meşakkatli olması, yöntemin üstünlükleri olarak özetlenebilir. Reaktif türlerin süpürülmesine yönelik tayin yöntemleri, ne kadar ilgili reaktif türe ve onun süpürücülerine özgü (spesifik) olursa bağlantılı oksidatif stres kökenli hastalıkların teşhis ve tedavisinde o kadar yararlı olmaları beklenir.

Abstract:
Hypobromous acid (HOBr) has been regarded as a reactive bromine species (RBS) among endogenous reactive oxygen species (ROS). It is thought to be a key component of the neutrophil defence system. Macrophages and eosinophils can utilize eosinophil peroxidase, hydrogen peroxide (H2O2) and bromide ion (Br) to generate HOBr. Although HOBr formation plays a critical role in immune system, excessive or misplaced generation can cause tissue damage, leading to a wide range of diseases, including, cancers, cystic fibrosis, inflammatory bowel disease, arthritis, kidney disease, neurodegenerative conditions, and asthma. Due to its participation in the maintenance of cellular redox status and alterations in their levels, biothiols (glutathione (GSH), homocysteine (Hcy), cysteine (Cys)etc.) which play a crucial role in biological systems are among the target molecules for HOBr. For this reason, determination of HOBr scavenging activity has attracted great interest. Despite this there are not any comprehensive studies about HOBr scavenging activity measurement of biothiols in literature. The TNB (2-nitro-5-thiobenzoate)/DTNB (5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)) assay which is frequently used for the determination of HOBr scavenging activity is open to interferences due to the fact that biothiols directly reduce DTNB to TNB. It is supposed that there is a requirement for a novel HOBr scavenging activity assay which can suppress this restriction and fill a gap in literature.   
In thisstudy a novel spectrofluorometric assay based on p-cresol (4-methyl phenol) probe developed for the measurement of HOBr scavenging activity.It is a pioneering study for both using p-cresol probe and determination of HOBr scavenging activity of biothiols. While p-cresol probe (λex= 260 nm, λem=305 nm) has fluorescence characteristics, its brominated derivatives emerging at the end of the reaction with HOBr do not show fluorescence. The initial fluorescence intensity of the p-cresol probe is decreased in the presence of the brominating agent, HOBr, and this decrease is less observed in the presence of HOBr scavenging antioxidants. HOBr scavenging activity of related scavengers can be calculated in terms of IC50 (50% inhibitory concentration) value by following the relative diminution of flourescence in the presence and absence of scavengers. The aim of work is to determine HOBr scavenging activity of important biothiols (GSH, Cys, Hcy, NAC etc.) and somepharmaceutical samples (mentopin, primene, brunac), which contain these biothiols, by using the proposed method. The scavenging activities of biyotiyol tested with respect to the developed method decrease in the order: penicilamin> glutathione  > n-acetyl cysteine > cysteamine >homocysteine > glutathione ethyl ester > cysteine > 1,4-dithiothreitol > lipoic acid > methionin. The present study revealed that penicilamin (IC50=10.12 μM) was the most effective HOBr-scavenger agent. The results obtained with the developed method for biothiols and some pharmaceutical samples were statistically compared (using the ANOVA test) to those found by the reference methods (KI/Taurin and UPLC).

In conclusion, the fluorometric method will be an alternative for the rarely existing HOBr scavenging activity assays in literature, and will fill the gap in determining HOBr scavenging activity of biothiols. The advantages of the proposed method can be summarized as higher sensitivity compared to those of absorptimetric and chromatographic methods, less cost and difficulty than the corresponding UPLC methods. The more specific an ROS scavenging activity method is for a given reactive species and its scavengers, the stronger will its benefit be to the diagnosis and treatment of oxidative stress-related diseases in close relation with that reactive species.