Meme kanseri hücrelerinde sitokrom P450 ailesi enzim aktivitelerinde doğal propolis ve polifenolik karışımların etkilerinin karşılaştırmalı analizi
Comparative analysis of the effects of natural propolis and polyphenolic mixtures on cytochrome P450 family enzyme activities in breast cancer cells
Yazar: MURAT ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. OĞUZ ÖZTÜRK ; DR. METE BORA TÜZÜNER
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı / Moleküler Tıp Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Farmasötik Toksikoloji = Pharmaceutical Toxicology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Dünyada en sık teşhis edilen ikinci kanser türü olan meme kanseri kadınlarda hem vaka sayısı olarak hem de ölüm oranı açısından en sık görülen kanser tipidir. Meme dokusunda en etkin östrojen olan östradiole (E2'ye) uzun süre aşırı maruz kalma östrojenik kanser riskini artırmaktadır. E2'nin meme dokusundaki biyotransformasyonu CYP1A1 ile CYP1B1 enzimleriyle sırasıyla 2-(OH)E2 ve 4-(OH)E2 metabolitlerine dönüştürürülür. 4-hidroksilasyon yolu, kimyasal kanserojen yol olup büyük ölçüde 2-(OH)E2 ile 4-(OH)E2 yolları arasındaki dengeyle ilişkilidir.
Çalışmamızda MCF-10A ile MCF-7 hücrelerinin benzo(a)piren (B(a)P) ile indüklenmiş ya da indüklenmemiş hücrelere doğal propolis ile polifenolik karışım (PFK5120) uygulandıktan sonra 48. saatte ki CYP1A1 ile CYP1B1 enzimlerinin mRNA ve protein ekspresyon değişimleri ile mikrozom aktivitesi/inhibisyonu incelendi. CYP1 ailesinin transkripsiyon faktörü olan AhR'nin mRNA ekspresyon seviyesindeki değişimleri de araştırılmıştır. Mikrozomal enzim aktivitesi/inhibisyon deneyleri için E2, 2-(OH)E2 ve 4-(OH)E2 moleküllerinin miktar tayini için UPLC-MS/MS yöntemi EMA yönergelerine göre geliştirilerek validasyonu yapılmıştır. Doğal propolisin GC-MS yöntemiyle yapılan kimyasal madde içerik analizinde 49 tane madde tespit edilmiştir. Propolisin polifenolik madde içeriği; % 5,48 Pinosembrin, % 4,65 Krisin, % 3,75 Galangin, % 3,74 Naringenin, % 3,42 Kafeik asit, % 1,48 Asetil ferulik asit ve %1,54 İzoferulik asit olarak bulunmuştur. Doğal propolis ile PFK5120'nin E2 metabolizması üzerindeki enzim inhibisyon deneylerinde 2-(OH)E2 için IC50 değerleri sırasıyla 6,12 μg/mL ile %2,92'dir. 4-(OH)E2 için IC50 değerleri sırasıyla 8,66 μg/mL ile %6,12'dir. B(a)P'sız MCF-10A ile MCF-7 hücrelerine doğal propolis ve PFK5120' nin uygulanması AhR gen ekspresyonunu artırmıştır. B(a)P'sız MCF-10A ile MCF-7 hücrelerinin 26 μg/mL doğal propolis dozunda AhR gen ekspresyon seviyesinde artış gözlenmiştir (sırasıyla p<0,0031 ve p<0,0073). B(a)P tarafından indüklenen MCF-10A ve MCF-7 hücrelerinde CYP1A1 ile CYP1B1 gen ekspresyon seviyelerinde anlamlı bir artış vardır. Fakat B(a)P ile indüklenen MCF-10A ve MCF-7 hücrelerindeki CYP1A1 ile CYP1B1 genlerinin ekspreseyon seviyelerindeki artış hızı uygulanan iki karışımla da azalmıştır. Gen seviyesindeki bu sonuçlar protein düzeyindeki deney sonuçlarıyla uyumludur. B(a)P'li MCF-7 hücrelerinde 26 μg/mL doğal propolis ile %12 PFK5120 dozlarında CYP1A1 ile CYP1B1 proteinlerinin ekspresyon hızını ve seviyesini azaltmakla kalmayıp bu proteinleri inhibe etmiştir. B(a)P'sız MCF-7 hücrelerine 26 μg/mL doğal propolis uygulandıktan sonra hem CYP1B1'in mRNA ekspresyon seviyesi hem de protein ekspresyon seviyesi azalmıştır. B(a)P'sız MCF-7 hücrelerinde doğal propolis CYP1B1' i gen ve protein düzeyinde inhibe etmiştir.
Doğal propolis ile PFK5120 B(a)P'lı ya da B(a)P'sız MCF-7 hücrelerinin CYP1A1 ve CYP1B1 enzimlerini protein düzeyinde inhibe etmesi iki karışımın CYP1 inhibitörü olabileceğine işaret etmektedir.
Anahtar Kelimeler: MCF-10A, MCF-7, Propolis-Polifenol, CYP1A1, CYP1B1

Abstract:
Breast cancer, the second most commonly diagnosed cancer worldwide, is the most frequently seen cancer type in women both in terms of incidence and mortality rates. Prolonged excessive exposure to estradiol (E2), the most potent estrogen in breast tissue, increases the risk of estrogenic cancer. The biotransformation of E2 in breast tissue is carried out by the enzymes CYP1A1 and CYP1B1, converting it into the metabolites 2-(OH)E2 and 4-(OH)E2, respectively. The 4-hydroxylation pathway is a chemical carcinogenic pathway and is largely related to the balance between the 2-(OH)E2 and 4-(OH)E2 pathways.
In our study, the mRNA and protein expression changes of the CYP1A1 and CYP1B1 enzymes, along with microsomal activity/inhibition, were examined at the 48th hour after the application of natural propolis and polyphenolic mixture (PFK5120) to MCF-10A and MCF-7 cells, either induced or non-induced by benzo(a)pyrene (B(a)P). The changes in the mRNA expression levels of AhR, the transcription factor of the CYP1 family, were also investigated. For the microsomal enzyme activity/inhibition experiments, the quantification of E2, 2-(OH)E2, and 4-(OH)E2 molecules was carried out using the UPLC-MS/MS method, developed and validated according to EMA guidelines. In the chemical content analysis of natural propolis conducted with the GC-MS method, 49 substances were identified. The polyphenolic content of propolis was found to be: 5.48% Pinosembrin, 4.65% Chrysin, 3.75% Galangin, 3.74% Naringenin, 3.42% Caffeic acid, 1.48% Acetyl ferulic acid, and 1.54% Isoferulic acid. In enzyme inhibition experiments on E2 metabolism with natural propolis and PFK5120, the IC50 values for 2-(OH)E2 were 6.12 μg/mL and 2.92%, respectively. For 4-(OH)E2, the IC50 values were 8.66 μg/mL and 6.12%, respectively. The application of natural propolis and PFK5120 to B(a)P-free MCF-10A and MCF-7 cells has increased AhR gene expression. An increase in AhR gene expression levels was observed at a dose of 26 μg/mL of natural propolis in B(a)P-free MCF-10A and MCF-7 cells (p<0.0031 and p<0.0073, respectively). In MCF-10A and MCF-7 cells induced by B(a)P, there is a significant increase in CYP1A1 and CYP1B1 gene expression levels. However, the rate of increase in CYP1A1 and CYP1B1 gene expression levels in B(a)P-induced MCF-10A and MCF-7 cells decreased with the application of both mixtures. These gene-level results are consistent with the protein-level experimental results. In B(a)P-treated MCF-7 cells, the doses of 26 μg/mL natural propolis and 12% PFK5120 not only reduced the rate and level of CYP1A1 and CYP1B1 protein expression but also inhibited these proteins. In B(a)P-free MCF-7 cells, after the application of 26 μg/mL natural propolis, both the mRNA expression level and the protein expression level of CYP1B1 decreased. In B(a)P-free MCF-7 cells, natural propolis inhibited CYP1B1 at the gene and protein levels.
The inhibition of CYP1A1 and CYP1B1 enzymes at the protein level in B(a)P-treated and B(a)P-free MCF-7 cells by natural propolis and PFK5120 indicates that these two mixtures may be CYP1 inhibitors.
Key Words: MCF-10A, MCF-7, Propolis-Polyphenol, CYP1A1, CYP1B1