Sinir hücreleri ile kalp kası hücreleri arasındaki etkileşimin moleküler ve elektrofizyolojik düzeyde araştırılması
Investigation of the neuron and cardiac muscle cell interaction at the molecular and electrophysiological level
Yazar: TÜBA AKGÜL ÇAĞLAR
Danışman: DOÇ. DR. ESRA ÇAĞAVİ ; PROF. DR. GÜRKAN ÖZTÜRK
İstanbul Medipol Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı / Sinirbilim Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Kardiyoloji = Cardiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Dizi analizi = Sequence analysis ; Dizi analizi-RNA = Sequence analysis-RNA ; Ganglion = Ganglia ; Nöronlar = Neurons ; Optogenetik = Optogenetics ; RNA = RNA

Özet:
Kalbe dallanan otonom sinir sistemi ve duyu nöronları kalp kası hücreleri (kardiyomiyosit) ve kalbin çalışmasını düzenler. Kalpte oluşan ağrı, basınç ve gerilme gibi duyusal bilgilerin bağlantılı olduğu arka kök gangliyon (AKG) ve nodoz gangliyonda (NG) bulunan nöronlar tarafından beyne iletildiği bilinmektedir. Ancak, kalbe ait bu duyusal veriyi taşıyan duyu nöronlarının karakteri, moleküler ve elektrofizyolojik özellikleri tam olarak bilinmemektedir. Bu tez çalışmasında, literatürde ilk olarak kalbe özgü AKG ve NG duyu nöronları işaretlenerek saflaştırıldı, karakterize edildi ve kardiyomiyositler ile arasındaki elektriksel iletişim in vitro ortamda incelendi. Kardiyak aferentleri işaretlemek için değerlendirilen dört farklı retrograd boya içerisinden, Di-8-ANEPPQ'nun en yüksek işaretleme kapasitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Üç boyutlu görüntüleme ve hücre çap analizleri sonucunda, kalbe özgü duyu nöronlarının AKG ve NG'da bilateral olarak homojen dağıldığı ve hücre boyutlarının 20 m'den küçük olduğu tespit edilmiştir. Genel transkriptom profili değerlendirdiğinde, saflaştırılan kalbe özgü duyu nöronlarının total duyu nöron popülasyonuna göre Scn10a, Scn11a, Mrgpa3, Mrgpd gibi iyon kanallarını yüksek ifade ettikleri tespit edilmiştir (p<0.05). İmmünboyama, RNA dizi analizi ve hücre çap analizi kardiyak aferentlerin nosiseptif nöronlar olduğunu göstermektedir. Kalsiyum (Ca+2) işaretleyici GCaMP6s kullanılarak yapılan analizlerde, kokültürlerdeki kalbe-özgü duyu nöronlarının elektrofizyolojik aktivite gösterdiği ve hücreler arasında Ca+2'a bağlı sinyal korelasyonu (>0.5) olduğu bulunmuştur. Kokültürdeki kardiyomiyositlerin ışık ile optogenetik uyarımı sonucunda, duyu nöronlarının Ca+2 değişiminde artış gözlemlenmiş ve bu veriler bu iki hücre grubu arasındaki elektriksel bağlantıyı in vitro olarak literatürde ilk kez göstermiştir. Bu tez çalışması ile kalbe özgü duyu nöronlarının gen ifade profili, kardiyomiyositlerle olan elektriksel etkileşiminin ve moleküler mekanizması değerlendirilmiştir. Sonuç olarak, kalp ve duyu sinir sistemi arasındaki iletişiminin daha detaylı incelenmesine ve gelecekte ilişkili hastalıkların patolojisinin anlaşılmasına yönelik çalışmalarda etkin veriler sunacağı öngörülmektedir.

Abstract:
Heart muscle contraction is controlled by cardiac muscle cells (cardiomyocytes) and neurons. It is known that sensorial information such as pain, pressure, and stretch is transmitted into the brain via the neurons located in the dorsal root ganglion (DRG) and nodose ganglion (NG). However, the molecular and electrophysiological mechanism at how sensorial input from the heart is conveyed is unclear. In this thesis, cardiac afferents in DRG and NG were labeled, purified, and characterized at the molecular level and their electrical interaction between cardiomyocytes was analyzed. From four retrograde tracers evaluated, Di-8-ANEPPQ yielded the highest labeling efficiency of cardiac afferents. 3D imaging of the whole tissues and cell diameter measurement from tissue sections revealed the homogeneous and bilateral distribution of cardiac afferents having a cell diameter smaller than 20 m. Based on the global transcriptome profile and immunohistochemical analysis, purified cardiac sensory cells expressed at high levels highly ion channels such as Scn10a, Scn11a; G-coupled proteins such as Mrgpa3, Mrgpd compared to total sensory neuron population (p<0.05). RNA sequencing and cell diameter and immunolabeling with TRPV1 analyzes revealed that cardiac afferents showed the molecular character of nociceptive neurons. In the co-culture system, neurons became active when interacting with the cardiomyocytes and a correlation in electrical interaction between cells was found (>0.5 or <-0.5). After optogenetic stimulation of cardiomyocytes, an increase in calcium exchange in the neurons was observed confirming the electrical interaction between cells.  Through this study, for the first time in the literature gene expression profile of cardiac sensory neurons was revealed, and sensory neuron cardiomyocyte interaction was examined. This information will shed light on the mechanism of how sensory input is relayed to the brain at the cellular and molecular level of normal and disease conditions.