Polifenolik bileşiklerden resveratrol ve kurkuminin nörit boyu uzamasına etkisinin PC12 hücre hattında araştırılması
Investigation of the neurite outgrowth effects of resveratrol and curcumin in PC12 cell line
Yazar: GAMZE BORA TATAR
Danışman: PROF. DR. HAYAT YURTER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Atrofi = Atrophy ; Kas atrofisi-spinal = Muscular atrophy-spinal ; Kurkumin = Curcumin ; Nöritler = Neurites ; Resveratrol = Resveratrol ; Sinir büyüme faktörleri = Nerve growth factors ; Spinal hastalıklar = Spinal diseases

Özet:
Spinal müsküler atrofi (SMA) otozomal resesif olarak kalıtılan ve omurilikteki alfa motor nöronların dejenerasyonu sonucu oluşan nörodejeneratif bir hastalıktır. SMA hastalığı SMN1 geni mutasyonları sonucu ortaya çıkmakta, genin özdeş kopyası olan SMN2 geni ise hastalık ciddiyetini etkilemektedir. Bu genlerin ürünü olan SMN proteini tüm hücrelerde sentezlenmesine karşın eksikliğinden en fazla motor nöron hücreleri etkilenmektedir. SMN proteininin fonksiyonunu araştırmak üzere yapılan in vitro ve in vivo deneysel çalışmalarla SMN proteini baskılandığında hücrelerin nörit boyunda kontrole göre kısalma görülmüştür. Bu nedenle, SMA hastalığında ortaya çıkan nörit kısalığının düzeltilerek sağlıklı hücrelerdeki boyutuna erişmesinin SMA tedavisinde önemli bir adım olacağı düşünülmektedir. Bu tez çalışmasında, hasta fibroblast hücrelerinde SMN2 gen ifadesini arttırdğı bilinen resveratrol ve kurkumin adlı polifenolik bileşiklerin nörit boy uzamasını indükleyici etkilerinin ve tedavi potansiyellerinin araştırılması amaçlanmıştır. Yapılan ön çalışmalarda, 5 µM resveratrol ve 500 nM kurkuminin nörit boyu analizleri için uygun olduğu bulunmuş, 3, 5 ve 7 gün süreyle nöron benzeri PC12 hücrelerine uygulanmıştır. Kurkuminin 3 günlük inkübasyon sonunda nörit boyunu 38 µm, 7 günlük inkübasyon sonunda ise 23 µm uzattığı saptanmıştır. Resveratrolün etkisi yalnızca 3. günde gözlenmiş, nörit boyunun 18 µm arttığı saptanmıştır. Aynı bileşikler Smn ifadesi baskılanmış PC12 hücre hattına uygulandığında nörit uzama hatasını düzeltemedikleri görülmüş ve bileşiklerin etki gösterebilmeleri için hücrede Smn proteininin varlığına ihtiyaç duydukları saptanmıştır. PC12 hücrelerinde bileşik uygulaması ile indüklenen nörit uzamasının Smn protein miktar artışı ile ilişkisi olabileceği düşünülerek çekirdekte bulunan Smn proteini Gem sayısı analizi ile araştırılmıştır. İmmunfloresan boyama yöntemi ile gerçekleştirilen analizlerde bileşik uygulamalarının çekirdekteki Gem sayılarını değiştirmediği saptanmıştır. Hücrelerdeki toplam Smn protein miktarı ise Western blot yöntemi ile araştırılmış ve kurkumin uygulanan hücrelerde protein düzeyinin değişmediği belirlenmiştir. Yaptığımız çalışmalarda bileşik uygulaması sonrasında Smn protein miktarı değişmemesine rağmen nörit uzamasının indüklendiği gösterilmiş, bu nedenle kurkuminin Smn proteinine bağlanarak etki edebileceği varsayılmıştır. Bağlantı potansiyeli bilgisayar destekli 3 boyutlu modelleme yöntemi ile araştırılmış, Smn-kurkumin bağlantısının (Kd: 239.79 µM) kontrol olarak kullanılan valproata oranla daha kuvvetli olduğu görülmüştür. Bu tez çalışması sonucunda, kurkumin ve resveratrol uygulamalarının Smn protein miktarını değiştirmeden nörit boyunu uzatabildikleri ve bu uzamanın sağlanabilmesi için hücrelerde Smn proteinin bulunması gerekliliği gösterilmiştir.

Abstract:
Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive neurodegenerative disorder caused by degeneration of alpha motor neurons of the spinal cord. While SMA is caused by SMN1 gene mutations, the identical copy of the gene, SMN2, can affect disease severity. Although SMN protein is found in all cells, lower motor neurons are extremely vulnerable to SMN deficiency. Knock-down of SMN protein results in neurite outgrowth defects in vitro and in vivo, therefore correction of the defect is thought to be an important step for SMA treatment. Previous studies reported that resveratrol and curcumin, which are polyphenolic compounds increased SMN2 gene expression in SMA fibroblast cells. The aim of the thesis is to determine therapeutic potential of resveratrol and curcumin by investigating their effects on neurite outgrowth. In the thesis, neuron like PC12 cells were incubated with 5 µM resveratrol and 500 nM curcumin and neurite lenght was measured after 3, 5 and 7 days. At the end of incubation periods, curcumin promoted neurite length about 38 µm and 23 µm after 3 and 7 days, respectively. Neurite outgrowth due to resveratrol has been only seen on the 3rd day and was about 18 µm. However, compounds were not able to correct neurite outgrowth defects in Smn knock-down PC12 cells. These results showed that the compounds needs the presence of Smn protein to exert their effects on neurite. To investigate whether compound-induced neurite elongation is correlated with Smn protein expression, nuclear Gem numbers were analysed by using immunflorescence staining. No significant changes were obtained in Gem numbers between treated and non-treated samples. Total Smn protein expression level was also analysed by Western blot and it was found that Smn protein level remained unchanged after curcumin treatment. According to our findings, it can be hypothezied that curcumin-induced neurite elongation could be triggered from interactions of Smn and curcumin. To test this hypothesis, Smn-curcumin binding was investigated via computer-aided 3D molecular modeling studies. It was calculated that Smn-curcumin binding affinity (Kd: 239.79 µM) was higher than Smn-valproate, which was used as a control. According to the results of this thesis, resveratrol and curcumin induces neurite elongation without changing Smn protein expression but they require Smn protein to achieve this result.