Batı nil virüsünün tespitine yönelik olarak gerçek zamanlı ters transkripsiyon ı̇lmı̇ğe dayalı izotermal çoğaltma yöntemi tasarımı ve tanısal kapasitesinin sorgulanması
Designing real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for the detection of west nile virus and questioning its diagnostic capacity
Yazar: SAEED SALAH ALSMANI AHMED
Danışman: PROF. DR. AYKUT ÖZKUL
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Batı nil virüsü = West nile virus ; Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) = Reverse transcription polimerase chain reaction ; Protein NS3 = Protein NS3

Özet:
Batı Nil Virüsü (BNV) ensefalit, menenjit veya meningoensefalit gibi yaşamı tehdit eden hastalıklara neden olmaktadır. BNV enfeksiyonunun hayvan sağlığında gözden kaçabilen hastalık seyri, halk sağlığı açısından önemli bir sorun olarak değerlendirilmektedir. Dolayısıyla, enfeksiyon spektrumunda yer alan ve ayrıştırılabilen klinik belirtiler temelli kanatlı ve tek tırnaklı hayvanlarda hızlı ve güvenilir test sistemlerine günümüzde hala ihtiyaç vardır. Bütün bunlar göz önüne alınarak, bu çalışmada, BNV virüsünün tek tüpte ve tek aşamalı olarak, gerçek zamanlı hızlandırılmış bir LAMP testi ile hızlı tespitini amaçlanmıştır. 
Bu yöntemle gen amplifikasyonu, viral RNA'nın, revers transkriptaz (RTaz) ve Bst DNA polimeraz varlığında bir primer seti ile 30 dakika boyunca 65 °C'lik sabit bir sıcaklıkta aynı anda inkübe edilmesiyle elde edilmiştir. Amplifikasyonun tespiti, agaroz jel elektroforezinin yanı sıra floresan görüntüleme ile de gerçekleştirilmiştir. BNV RNA, nanodrop cihazı kullanılarak ölçülmüş ve tespit limitini (LOD) belirlemek için seri olarak seyreltilmiştir (10 pikogram/μL ila 700 nanogram/μL). RT-LAMP, 10 pg'ye kadar BNV RNA tespit ederken, gerçek zamanlı RT-PCR 87,5 pg'ye kadar tespit etmiştir.
Bu sonuçlar, gerçek zamanlı RT-LAMP'ın gerçek zamanlı RT-PCR'den daha duyarlı olduğunu göstermektedir. Gerçek zamanlı RT-LAMP testi, gerçek zamanlı RT-PCR'den daha verimlidir ve 30 dakika gibi oldukça kısa bir zaman içinde sonuç vermektedir. Gerçek zamanlı RT-PCR durumunda, aynı BNV RNA konsantrasyonunda 30 dakika sonra (45 döngüye kadar) sonuçlar alındı.

Anahtar kelimeler: RT-LAMP; Gerçek zamanlı RT-PZR; Batı Nil Virüsü; E geni; NS3 geni; 5' UTR geni.

Abstract:
West Nile Virus (WNV) causes life-threatening diseases such as encephalitis, meningitis or meningoencephalitis. The disease course of WNV infection, which can be overlooked in animal health, is considered as an important public health problem. Therefore, there is still a need today for rapid and reliable testing systems in poultry and equidae animals based on clinical signs that are within the spectrum of infection and can be differentiated. Considering all these, in this study, rapid detection of WNV virus in a single step and tube was aimed with a real-time accelerated LAMP test.
With this method, gene amplification was achieved by simultaneous incubation of viral RNA with a primer set in the presence of reverse transcriptase (RTase) and Bst DNA polymerase at a constant temperature of 65 °C for 30 minutes. Detection of amplification was performed by fluorescence imaging as well as agarose gel electrophoresis. WNV RNA was quantified using the nanodrop device and serially diluted (10 picograms/µL to 700 nanograms/µL) to determine the limit of detection (LOD). RT-LAMP detected up to 10 pg of WNV RNA, while real-time RT-PCR detected up to 87.5 pg.
These results show that real-time RT-LAMP is more sensitive than real-time RT-PCR. Real-time RT-LAMP assay is more efficient than real-time RT-PCR and gives results in a relatively short time of 30 minutes. In the case of real-time RT-PCR, results are given after 30 minutes (up to 45 cycles) at the same concentration of WNV RNA.

Keywords: RT-LAMP; Real-time RT-PCR; West Nile virus; E gene; NS3 gene; 5' UTR gene.