Kolorektal tümör spektrumunda müsin ve sitokeratin 20/7 immünprofili
Mucin and cytokeratin 20/7 immune profile in colorectal tumor spectrum
Yazar: FAİK ALEV DERESOY
Danışman: DOÇ. DR. REŞİT DOĞAN KÖSEOĞLU
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Müsinler = Mucins ; Neoplazm evreleri = Neoplasm staging ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Rektal neoplazmlar = Rectal neoplasms ; Sitokeratinler = Cytokeratins

Özet:
Müsinlerin koruyucu ve homeostazı idame etme fonksiyonlarının yanında karsinogenezde de rol aldıkları anlaşılmış olup karsinogenezdeki rolleri hücre proliferasyonu ve diferansiyasyonunu düzenleyici fizyolojik etkinlikleri düşünüldüğünde şaşırtıcı değildir. Sitokeratinlerin de sitoskeletonu meydana getirmek yanında hücre içi/hücreler arası sinyal iletimi, differansiyasyon ve hücre bölünmesinde rolleri artık bilinmektedir. Hem müsin molekülleri hem de sitokeratinlerin son zamanlarda anlaşılan fonksiyonlarından dolayı karsinogenezdeki etkinliklerini araştırmaya yönelik çalışmalar ağırlık kazanmıştır. Müsin ve sitokeratin ekspresyon paternlerindeki değişiklikler kolorektal karsinomaların klinikopatolojik parametreleri ve prognozları üzerinde belirleyici ya da tahmin edici bir takım ipuçları sağlayabilir. Bunun da ötesinde bir takım yeni tedavi modaliteleri için yol gösterici olabilir. Çalışmamızda bu amaçla kolorektal neoplazi spektrumunda özellikle de kolorektal kanserlerde müsin ve sitokeratin 7/20 immünprofillerini analiz etmeyi hedefledik.
Çalışmaya 2007-2012 yılları arasında tanısı konmuş 20 aberran kript odağı (AKO), 20 tubüler adenomatöz polip (AP) ve 48 adenokarsinoma (ACa) olgusu dâhil edildi. Kontrol grubu (KG) olarak 20 normal kolon mukoza örneği kullanıldı. ACa grubu TNM sistemine göre invazyon derinliklerine (T) ve histolojik diferansiyasyon derecelerine (grade) göre sınıflandırıldı. ACa grubunda 27 olguda bölgesel lenf düğümü metastazı mevcut idi. Bu olguların metastatik odakları da ayrı bir grup (Met LAP) olarak analizlere dâhil edildi. İmmünohistokimyasal analiz için MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC6, CK7 ve CK20 primer antikorları kullanıldı. İmmünohistokimyasal boyama manuel yöntemle gerçekleştirildi. İmmün ekspresyonların değerlendirilmesinde boyanma yaygınlığı dikkate alınarak skorlama yapıldı. Buna göre; skor 0: boyanma yok, skor 1+: %1-5, skor 2+: %6-30, skor 3+: %31-60 ve skor 4+: %61-100 olarak tayin edildi. Pozitiflik için eşik değerin %30 ve %5 olarak kabul edildiği iki ayrı düzeyde, ayrı ayrı analizler yapıldı. Uygun istatistiksel yöntemler (Tek Yönlü Varyans Analizi (one-way ANOVA), Mann Whitney U-Testi, Bağımsız Gruplarda t Testi ve Ki-kare Testleri) kullanılarak sonuçlar yorumlandı. İstatistiksel anlam, p?0.05 için kabul edildi.
ACa grubunda, tümör lokalizasyonu ile MUC1 ve MUC2 pozitifliği arasında anlamlı ilişki mevcuttu. Sol kolon lokalizasyonlu tümörlerde MUC1 pozitifliği %15,4 iken, sağ kolon lokalizasyonlu olanlarda bu oran %40,9 idi (x2=3,931, p=0,047). MUC2 için ise sol kolon lokalizasyonlu olguların %11,5? inde, sağ kolon lokalizasyonluların ise %45,5? inde pozitiflik saptandı (x2=6,941, p=0,008). MUC2 pozitifliği tümör invazyon derinliği ile de anlamlı ilişki gösterdi. T4 olguların %53,3? ü, T2 ve T3 olguların ise sırasıyla %23,1 ve %10? u MUC2 pozitif idi (x2=8,296, p=0,016). Gruplar arasında da MUC2 anlamlı farklılığa sahip idi. AP grubunda %50, ACa? da %27,1, AKO, KG ve met LAP gruplarında da sırasıyla %20, %5 ve %16,7 MUC2 pozitifliği saptandı (x2=12,414, p=0,015). MUC1 pozitifliği ise istatistiksel anlam olmamakla beraber AP (%15) ve ACa (%27,1) boyunca yükselmekte idi (p=0,078).  MUC1/MUC2 immünprofilleri içinde tümör invazyon derinliği ve lokalizasyonu ile anlamlı ilişki gösteren profil, MUC1+/MUC2+ immünprofili idi. MUC1+/MUC2+ olguların %83,3? ü T4 olgular iken %16,7? si T3 olgular idi. Bu profildeki olguların hiçbiri T2 kategoride yer almadı (x2=14,144, p=0,028). MUC1+/MUC2+ olguların tamamı, MUC1-/MUC2- olguların ise %67,2? si sağ kolon lokalizasyonlu idi (x2=9,59, p=0,022). ACa grubunda cinsiyet ile CK20 pozitifliği arasında anlamlı ilişki izlendi. Kadınların %71,4? ü, erkeklerin %38,5? inde CK20 pozitifliği mevcut idi (x²=5,071, p=0,024). CK20 pozitifliği gruplar arasında da anlamlı farklılık gösterdi (x2=27,695 p=0,0001). AKO ve AP gruplarında sırasıyla %5,3 ve %27,8 oranlarında CK20 pozitifliği saptanırken KG, ACa ve Met LAP gruplarında sırasıyla %80, %53,2 ve %63,6 oranlarında CK20 pozitifliği saptandı. Gruplar arasında anlamlı fark saptanan bir diğer müsin MUC5AC idi (x2=11,473 p=0,022) AP? de %10 oranında pozitiflik görülürken diğer gruplarda pozitiflik saptanmadı. ACa grubunda lenf düğümü metastazı durumu MUC4 pozitifliği ile ilişkiliydi. Metastatik olguların primer tümörlerinin MUC4 pozitiflik oranı nonmetastatik olgularınkine göre belirgin derecede düşüktü (%3,7? ye karşın %28,6) (p=0,034). Eşik değerin %5? e çekilmesi ile bazı anlamlı sonuçlar ortaya çıkarken bazı ilişkiler de güçlendi. MUC1 ve MUC2 pozitifliğinin gruplar arasındaki farklılığının anlamı daha da kuvvetlenmekte idi (sırasıyla, x2=15,246 p=0,004 ve x2=13,716 p=0,008). MUC5AC pozitifliği AP grubunda (%40) artarak fark daha da belirginleşti (x2=21,844 p=0,0001). MUC6 pozitifliği ile tümör çapı arasında anlamlı ilişki dikkati çekti. MUC6 pozitif olguların ortalama tümör çapı 80 mm iken MUC6 negatif olgularınki 48,8 mm idi (t=2,016,  p=0,05). CK20 pozitifliği ile tümör invazyon derinliği ve tümör derecesi arasında ortaya çıkan ilişki ters yönde idi. T4 olguların %57,1? i CK20 pozitif iken T2 ve T3? de sırasıyla %92,3 ve %90 oranlarında CK20 pozitifliği saptandı (x2=6,732, p=0,035).  Grade III olgularda CK20 pozitifliği %33,3 iken grade I ve grade II olguların sırasıyla %84,6 ve %89,3? ü CK20 için pozitif idi (x2=8,039, p=0,018). Sonuçlarımıza göre müsin ve CK7/20 immünekspresyonlarının kolorektal karsinogenez ve hastalık progresyonu ile ilgili önemli ilişkilere sahip olduğu ortaya çıktı. MUC1 ve MUC2? nin hem izole hem de birlikte ekspresyonlarının sağ kolon tümörleriyle ve daha ileri tümör invazyon derinliği ile ilişkili olduğu saptandı. Ayrıca sağ kolon tümörlerinin de daha ileri evre özelikleri (tümör invazyon derinliği ve bölgesel lenf düğümü metastazı) gösterdiği dikkati çekti. MUC1+/MUC2+ profili gibi MUC1-/MUC2- profili de sağ kolon lokalizasyonuyla ilişkisi mevcuttu. Anca daha ileri evre özellikleriyle bu profilin ilişkisi görülmedi. MUC1/MUC2 ekspresyonları kolorektal karsinogenezin başlarında artmakta ve MUC1 karsinoma süresince yüksek kalmakta, MUC2 ise düşme eğilimi göstermekteydi. Buna karşın MUC4 ekspresyon kaybı metastatik lenf düğümü ile ilişkiliydi. MUC5AC ve MUC6 ekspresyonları adenomatöz polip aşamasında geçici olarak ortaya çıkmaktaydı. CK20 ekspresyonu kaybı da ileri tümör invazyonu ve yüksek tümör derecesi ile ilişkiliydi. Ayrıca primeri araştırılan metastatik adenokarsinomalı erkek hastalarda, CK20 negatifliğinin primer açısından kolorektumu ekarte ettirmemesi gerektiği sonucuna varıldı. Adenoma-karsinoma sekansındaki morfolojik spektrumda izlenen müsin profili karakteristiklerine daha yakın olan sonuçlar, %30 eşik değerine göre elde ettiğimiz sonuçlardı.       
Sonuç olarak kolorektal karsinomalarda MUC1/MUC2 ekspresyon artışı ve MUC4/CK20 ekspresyon kaybı daha ileri evre tümör özellikleri ve progresyonu ile ilişkiliydi.

Abstract:
It has been now understood that mucins might also play a role in carcinogenesis beside mucosal homeostasis. This role should not be supposed to be a surprise when the roles of mucins are been taken into account in cell proliferation and differantiation. Cytokeratins, the basic building block of the cytoskeleton, have similar roles to those of mucins such as intra/intercellular signal transmission, cell differantiation and cell division. The further researches are required about the roles of mucins and cytokeratins in colorectal carcinogenesis and this issue is a popular research topic in the studies of carcinogenesis. The alterations in expressions of mucins and cytokeratins may provide some determinative clues about clinicopathological parameters and prognosis in colorectal carcinomas. Furthermore, these alterations may be guide for new modalities in the treatment of carcinoma. In this study, we aimed to analyse mucins and cytokeratin (CK) 7/20 immunprofiles in colorectal neoplasia spectrum. 
Twenty cases of aberrant crypt focus (ACF), 20 cases of tubular adenomatous polyp (AP) and 48 cases of colorectal adenocarcinoma (ACa) were included in the study. These cases were diagnosed between 2007-2012 years. Colon mucosa samples of 20 cases from colorectal carcinoma specimens were determined as control group (CG). The cases of ACa were classified according to depth of invasion (T) and histological grade of differentiation (grade) on the basis of TNM system. Twenty-seven cases had regional lymph node metastasis. Metastatic foci of these cases were included as a separate group (Met LAP). MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC6, CK7 and CK20 primary antibodies were used for immunohistochemical analyses (IHC). IHC was manually performed. Immune expressions were evaluated according to wideness of immunostaining and scored as; score 0: no expression, score 1+: 1-5% of expression, score 2+: 6-30% of expression, score 3+: 31-60% of expression and score 4+: 61-100% of expression. Two independent cut-off values were determined in the study; 5% and 30%. The analyses according to both cut-off values were separately performed. The results were analyzed by appropriate statistical tests (One-Way Variance Analyses, Mann-Whitney-U test, and chi square tests). P ?0.05 was accepted statistically significance.
MUC1 and MUC2 expressions were related with tumor localization in ACa group. Fifteen per cent of left colon tumors were positive for MUC1 while 40.9% of right colon tumors showed MUC1 positivity (x2=3,931, p=0,047).  MUC2 positivity for left and right colon were 11.5% and 45.55%, respectively (x2=6,941, p=0,008). MUC2 positivity was also related with the depth of tumor invasion. The 53.3% of cases in T4 were positive for MUC2 while the rates of MUC2 positivity in T2 and T3 were 23.1% and 10%, respectively (x2=8,296, p=0,016). There was also a difference between the study groups for MUC2 positivity. MUC2 positivity were 50% in AP while the groups of ACa, ACF, CG and met LAP were 27.1%, 20%, 5% and 16.7%, respectively (x2=12,414, p=0,015). MUC1 positivity was increased in AP (15%) and ACa (27.1%) without statistical significance (p=0,078). The immune profile of MUC1+/MUC2+ was related with tumor localization and depth of tumor invasion. The 83.3% of cases with MUC1+/MUC2+ immune profile were cumulated in T4 while T3 category comprised of 16.7% of the cases with this immune profile.  None of these cases were not included in T2 category (x2=14,144, p=0,028). There was also a relation between gender and CK20 expression in ACa group. Most of CK20 positive cases (71.4%) were female (x²=5,071, p=0,024). The rates of CK20 positivity were different between the groups. The rates of CK20 positivity in groups of ACF, AP, CG, ACa and met LAP  were 5.3%, 27.8%, 80%, 53.2% and 63.6%, respectively (x2=27,695 p=0,0001). Another difference in mucin immune profile was noticed in MUC5AC analysis. Only AP group showed MUC5AC positivity in two cases (10%) (x2=11,473 p=0,022). Loss of MUC4 expression was correlated with lymph node metastasis. MUC4 positivity in primary tumors of metastatic cases were lower than those of non-metastatic cases (3.7% versus 28.6%) (p=0,034). When we accepted the cut-off value as 5%, new correlations were occurred between some parameters. However, some statistical significant correlations became a stronger than the previous their values. The correlations which their statistical significance became stronger than previous status were determined in analyses of MUC1 (x2=15,246 p=0,004), MUC2 (x2=13,716 p=0,008) and MUC5AC (x2=21,844 p=0, 0001) among the groups. MUC5AC positivity was reached to a value of 40% in AP group.  A statistically significant correlation was noticed between MUC6 expression and tumor size. The mean diameter of MUC6 positive tumors was 80 mm while the mean diameter of MUC6 negative tumors was 48,8 mm (t=2,016,  p=0,05). CK20 positivity was inversely correlated with depth of tumor invasion and grade. The 57.1% of cases in T4 were positive for CK20 while the rates of CK20 positive cases in T2 and T3 were 92.3% and 90%, respectively (x2=6,732, p=0,035). The rate of CK20 positivity was 33.3% in grade III while this rate in grade I and II were 84.6% and 84,3%, respectively (x2=8,039, p=0,018). According to results of the present study, the alterations in immune expressions of mucin and CK7/20 may have important roles in colorectal carcinogenesis and progression of disease. The expressions of MUC1 and MUC2, as isolated or co-expression, were related with right colon localization and more advanced depth of tumor invasion. Right colon tumors showed also the features of more advanced stages (more advanced depth of invasion and regional lymph node metastasis). MUC1-/MUC2- immune profile, such as MUC1+/MUC2+ profile, was also related with right colon localization. However, it was not seen that this profile was related with more advanced stages. It was noticed that the levels of MUC1/MUC2 expressions increased at the beginning of the sequence of adenoma-carcinoma. MUC1 expression remained high throughout the sequence, whereas decreased expression of MUC2. Loss of MUC4 expression was related with regional lymph node metastasis while low CK20 expressions were seen in the cases with deeper tumor invasion and higher tumor grade. 
Isolated MUC1 expression or collaboration with MUC2 expression was found to be associated with right colon localization and advanced depth of tumor invasion. Moreover, right colon localized tumors exhibited more advanced stage features (depth of tumor invasion and lymph node metastasis). As seen in MUC1+/MUC2+ immune profile, there was a tendency to be located in right colon in MUC1-/MUC2- immune profile too, but advanced stage features were not detected in this profile. MUC1 and MUC2 expressions showed an increase in the beginning of the carcinogenesis process; MUC1 expressions stayed elevated during the process but MUC2 expressions were prone to decline. Another point, the loss of MUC4 expression was found to be associated to the lymph node metastasis. It was seen that the temporary expression of MUC5AC and MUC6 through the stage of adenomatous polyps. Also the loss of CK20 expression was related to the depth of invasion and higher tumor grade. However, negative CK20 immunostaining in male patients which examined in terms of the origin of metastatic tumor must not rule out colorectum as a probable origin of the tumor. Our result of mucin profile according to 30% of the threshold value were closer the mucin profile of adenoma-carcinoma sequence. 
Finally, we may suggest that the increased expression of MUC1/MUC2 and the decreased expression of MUC4/CK20 were related with the more advanced stages of colorectal carcinomas and progression of the disease.