Aort dıseksiyonu olan hastalarda MMP2 ve TIMP2 genlerinin anlatım analizi
Expression analysis of MMP2 and TIMP2 genes in patients with aortic dissection
Yazar: TUĞBA KÖSE
Danışman: PROF. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Aort hastalıkları = Aortic diseases ; Matriks metalloproteinazlar = Matrix metalloproteinases ; Moleküler tanı = Molecular identification ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Torasik Aort Diseksiyonu (TAD) aort damarında meydana gelen son derece ölümcül bir hastalıktır. İnsan vücudunda bulunan en büyük atar damar olan aortun iç tabakasında başlayan bir yırtığın, damar boyunca uzanarak tabakaları birbirinden ayırması ile karakterizedir. Ayrılan tabakalar arasında gerçek damar boşluğuna paralel olarak yalancı bir lümen oluşumu gözlenir. Aort damarının orta tabakası olan medya tabakasında aort damarına dayanıklılığını ve esnekliğini veren hücreler arası matriks (ECM) bulunur. Elastik fiberler ve peptidoglikan yapılar ECM'nin bileşenleridir. TAD vakalarında aort damarında bulunan hücreler arası matriks parçalanmış durumdadır. TAD patogenezinde damarın esnekliğini sağlayan liflerin yapısı ve miktarlarında değişim, hücreler arası matriks proteinlerini parçalayan enzimlerin ve regülatörlerinin arasındaki dengenin bozulması ve bunlara bağlı olarak hücredeki parçalanma faaliyetlerinde artış görülmektedir.

Matriks metalloproteinazlar (MMP) aktif bölgelerinde Zn2+ bulunan geniş bir endopeptidaz ailesidir. Endotel hücre, düz kas hücresi, vasküler düz kas hücresi, fibroblast, enflamatuvar hücreler ve aort damar duvarı gibi birçok hücre çeşidinde üretilebilirler. MMP'lerin hücreler arası matriks proteinlerinin yıkılması, ECM devamlılığının sağlanması, kontrolü ve sinyal iletiminin regülasyonu gibi görevleri vardır. MMP'ler dokuda kendi doğal inhibitörleri ile eşzamanlı olarak bulunurlar. Metalloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP) MMP'lerin hem aktivasyon hem de inhibisyonlarında aktif bir şekilde rol alırlar.

Bu tez çalışmasındaki ilk amacımız 10 adet TAD hastası ve 10 adet sağlıklı bireyden elde edilen aort damar dokusunda TAD patogenezinde önemli rolü olduğu düşünülen  MMP2, MMP9, TIMP2 ve TIMP3 genlerinin mRNA düzeyinde anlatım farklılıklarını belirlemektir. İkinci amacımız, çalışma gruplarından elde edilen periferik kan kökenli monosit hücrelerinde MMP2, MMP9, TIMP2 ve TIMP3'ün gen anlatım analizlerini aort damar dokusundaki gen anlatımı ile karşılaştırmaktır. Üçüncü amacımız ise hedef genlerin promotör bölgelerindeki metilasyon düzenlerinin metilasyon sensitif yüksek çözünürlüklü erime (MS-HRM) yöntemi ile belirlenerek aynı genlerin aort damar dokusundaki gen anlatım miktarları ile olan ilişkisini araştırmaktır.

MMP2, MMP9, TIMP2 ve TIMP3 genlerinin gen anlatımı analizleri damlacıklı dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPZR) yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçların TAD hastası ve kontrol grupları arasındaki değişimlerinin istatistiksel anlamlılık düzeyleri parametrik olmayan "Mann Whitey U" testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Hasta ve kontrol grubu arasında duyarlılık ve özgüllük kontrolü için "Receiver Operating Characteristics" (ROC) eğrisi analizi kullanılmıştır. Gerçekleştirilen analizler sonucunda MMP2'nin gen anlatımının (p=0.85) TAD hastalarının aort damar dokularında kontrol grubuna göre değişmediği, MMP9'un (p=0.043), TIMP2'nin (p=0.0089) ve TIMP3'ün (p=0.028) anlamlı düzeyde azaldığı bulunmuştur. 

Monosit hücrelerde gerçekleştirilen MMP2 (p=0.15), MMP9 (p=0.11), TIMP2 (p=0.25) ve TIMP3 (p=0.37) gen anlatımı analizinde TAD hastalarında, kontrol grubuna göre anlamlı bir değişikliğin gözlenmediği bulunmuştur. Ayrıca aort damar dokusu ve monosit hücrelerde MMP/TIMP oranları da incelenmiştir. Aort damar dokusunda MMP2/TIMP2 oranı (p=0.063) artış göstermiştir ancak istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. MMP2/TIMP3 oranı (p=0.012) TAD örneklerinde kontrollere göre anlamlı düzeyde farklı bulunurken MMP9/TIMP2 (p=0.25) ve MMP9/TIMP3 (p=0.80) oranlarında anlamlı bir artış gözlemlenmemiştir. Monosit hücrelerde ise MMP2/TIMP2 (p=0.45), MMP2/TIMP3 (p=0.68), MMP9/TIMP2 (p=0.80) ve MMP9/TIMP3 (p=0.28) olarak bulunmuştur. 

Hedef genlerin promotör bölgelerindeki metilasyon düzeninin araştırılması için kullanılan MS-HRM yöntemi sonucunda MMP9 geninde hedeflenen bölgede TAD hastalarında ve kontrol grubunda metillenme yüzdesi %0 olarak belirlenmiştir. TIMP3 geninde ise TAD hastalarında promotör bölgesinin ortalama metillenme düzeyi %10 olarak bulunurken kontrol grubunda %12.5 olarak belirlenmiştir. Ek olarak hedef genlerin metilasyon düzenleri ile ilgili TAD hastası ve kontrol grubu arasında anlamlı bir fark olmadığı (p=0.91) bulunmuştur.

Yapılan tez çalışması sonucunda TAD hastalarında kontrol dokulara kıyasla elde edilen istatistiksel olarak anlamlı bir düzeyde anlatımı azalmış MMP9, TIMP2 ve TIMP3 genleri ve istatistiksel anlamlılık düzeyinde artış göstermiş MMP2/TIMP3 ve istatistiksel anlamlılık düzeyine çok yakın olarak artış göstermiş olan MMP2/TIMP2 oranları, seçilen hedef genlerin TAD patogenezinde önemli olduğunu düşündürtmektedir. Ek olarak istatistiksel anlamlılık düzeyine ulaşamasa da monosit hücrelerde azalan MMP9 ve TIMP3 gen anlatımı ve aort damar dokusunda artmış MMP9/TIMP2, MMP9/TIMP3 gen anlatımı oranları da TAD tablosu ile uyumludur. Ayrıca yapılan metilasyon analizinde TAD vakalarında MMP9 ve TIMP3 genlerinin gen anlatımlarının düzenlenmesinde DNA metilasyonunun katkısının olmadığı söylenebilir.

Abstract:
Thoracic aortic dissection (TAD) is an extremely lethal disease that occurs inside the aorta. It is characterized by the separation of the layers from each other by a tear starting in the inner layer of the aorta, the largest artery in the human body, extending along the vessel. Between the separated layers, false lumen formation is observed that is parallel to the true lumen. The media layer, which is the middle layer of the aorta, contains the extracellular matrix (ECM) which provides flexibility and strength to the aorta. Elastic fibers and peptidoglycan structures are the components of ECM. In the TAD cases, the extracellular matrix in the aorta is fragmented. In the TAD pathogenesis, the changes in the structure and amount of fiber that provide the flexibility to the aorta, an imbalance between the enzymes and regulators that break down the ECM proteins, and an increase in cell fragmentation activities are observed accordingly.

Matrix metalloproteinases (MMP) are a large endopeptidase family having the Zn2+ in their active site. They can be synthesized by the cell types such as endothelial cells, smooth muscle cells, vascular smooth muscle cells, fibroblast, inflammatory cells, and the wall of aorta. MMPs have functions such as the degradation of extracellular matrix proteins, the maintenance and control of ECM, and the regulation of signalling. MMPs are found in the tissue with their natural inhibitors. Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) are actively involved in both activation and inhibition of MMPs.

Our first aim in this thesis study is to determine the mRNA level expression differences of the MMP2, MMP9, TIMP2 and TIMP3 genes, which are thought to have an important role in the pathogenesis of TAD, in aortic vascular tissue obtained from 10 TAD patients and 10 control individuals. The second aim of the study is to compare the gene expression levels of MMP2, MMP9, TIMP2 and TIMP3 genes in peripheral blood-derived monocyte cells obtained from the study groups with the gene expression in aortic vascular tissue. Our third aim is to determine the methylation patterns in the promoter regions of target genes by using methylation sensitive high-resolution melting (MS-HRM) method, and to investigate the relation between the target gene expression levels and the methylation pattern in the aortic vascular tissue.

The gene expression analysis of the MMP2, MMP9, TIMP2 and TIMP3 genes are conducted by using the digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) method. The statistical significance levels of the changes in the obtained gene expression results between TAD patients and control groups were evaluated with the non-parametric "Mann Whitey U" test. "Receiver Operating Characteristics" (ROC) curve analysis was used to control the sensitivity and specificity between the patient and control group. As a result of the analyses performed, it is observed that the gene expression of MMP2 (p=0.85) has no change in the aortic tissue of TAD patients compared to the control group, and that MMP9 (p=0.043), TIMP2 (p=0.0089) and TIMP3 (p=0.028) was found to be significantly reduced.

In the gene expression analysis performed in monocyte cells, it was found that MMP2 (p=0.15), MMP9 (p=0.11), TIMP2 (p=0.25) and TIMP3 (p=0.37) did not show a significant change in TAD patients compared to the control group. In addition, MMP/TIMP ratios in aortic vascular tissue and monocyte cells were also investigated. MMP2/TIMP2 ratio (p=0.063) increased in aortic vascular tissue, but it was not statistically significant. While the ratio of MMP2/TIMP3 (p=0.012) was found to be significantly different in TAD samples compared to controls, no significant increase was observed in the ratios of MMP9/TIMP2 (p=0.25) and MMP9/TIMP3 (p=0.80). In monocyte cells, MMP2/TIMP2 (p=0.45), MMP2/TIMP3 (p=0.68), MMP9/TIMP2 (p=0.80) and MMP9/TIMP3 (p=0.28) were found.

As a result of the MS-HRM method used to investigate the methylation pattern in the promoter regions of target genes, the percentage of methylation in the targeted region of the MMP9 gene was determined as 0% in TAD patients and in the control group. In the TIMP3 gene, the mean methylation level of the promoter region was found to be 10% in TAD patients, while it was 12.5% in the control group. Additionally, it was found that there was no significant difference (p=0.91) between the TAD patient and the control group regarding the methylation patterns of target genes.

In the conducted thesis, in TAD patients compared to control tissues the statistically significant decrease in the expression of MMP9, TIMP2 and TIMP3 genes, the statistically significant increase in the ratio of MMP2/TIMP3, and an increase in MMP2/TIMP2 ratio that is very close to the statistical significance level show that selected target genes may have an important role in the pathogenesis of TAD. In addition, decreased MMP9 and TIMP3 gene expression in monocyte cells and increased MMP9/TIMP2, and MMP9/TIMP3 gene expression rates in aortic vascular tissue are also compatible with the TAD scenario although the results could not reach statistical significance. Furthermore, as a result of the methylation analysis, it can be said that DNA methylation has no contribution on the regulation of gene expression of MMP9 and TIMP3 genes in TAD cases.