Anjiyogenik mikroiğnelerin geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterization of angiogenic microneedles
Yazar: SOGHRAT SALAMATI
Danışman: PROF. DR. KEZBAN ULUBAYRAM
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Anjiyogenez doku onarımı sürecinde başta kök hücrelerin farklılaşması, hücre çoğalması ve migrasyonu gibi önemli hücresel süreçlerin devam ettirilebilmesi için dokuya oksijen taşınmasını sağlarken ayrıca doku hasarından dolayı meydana gelen hipoksi koşullarının doku üzerindeki etkisinin azaltılmasında önemli bir rol oynamaktadır. Östrojen hormonlarının ise memelilerde özellikle yumurtlama döneminde anjiyogenez sürecinde etkili olduğu bilinmektedir. Diğer taraftan son yıllarda penetrasyon arttırıcı özellikleri nedeniyle mikroiğneli (MN) yamalar, çeşitli terapötiklerin transdermal uygulama için ideal platformlar olarak düşünülmektedir. 
Bu tez kapsamında östrojen (estron (E1), ß-estradiol (E2), estriol (E3)) içeren anjiyogenik mikroiğnelerin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla kitosan (CH) ve poli(vinil alkol) (PVA) polimeleri harmanlanarak farklı çapraz bağlayıcılar (gluteraldehit, Glu),  tetraetil ortosilikat (TEOS)) ile mikroiğneler hazırlanmış ve mekanik özellikleri karşılaştırılmıştır. Aynı zamanda farklı östrojen türevleri içeren mikroiğnelerin anjigenik etkileri ve in vivo cevapları incelenmiştir.
Üretilen mikroiğnelerin morfolojileri ışık ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir. E1 ve E2 içeren mikroiğnelerin yaklaşık 650 m iğne yüksekliğine sahip kare tabanlı pyramidal, düzgün iğne yapısına sahip olduğu ancak E3 içeren mikroiğnelerin morfolojisinin bozulduğu ve düzgün iğne sayısının azaldığı görülmüştür. Diğer taraftan TEOS ve Glu ile çapraz bağlanmış E1 ve E2 yüklü MN'lerin morfolojik görünümlerinin benzer olduğu ve oluşan iğnelerin pürüzsüz ve düzenli bir şekilde sıralandığı gözlenmiştir. TEOS ve Glu kullanılarak çapraz bağlanan E1 veya E2 içeren MN'lerin mekanik karakterizasyonları tekstür cihazı ile incelenmiş olup TEOS konsantrasyonu ve glutaraldehit buharına maruz kalma süresinin, MN'lerin mekanik özelliklerini önemli ölçüde etkilediği görülmüştür. TEOS içeren MN-T gruplarının TEOS içermeyen MN gruplarına göre daha esnek ve daha yüksek bir kuvvette kırılma gösterdiği, E1 veya E2'nin mekanik özellikler üzerinde anlamlı bir değişim meydana getirmediği görülmüştür. Diğer taraftan Glu maruz bırakılan E1 veya E2 içeren mikroiğnelerin Glu buharı uygulama süresinin artmasıyla daha kırılgan bir yapı haline geldiği görülmüştür. Mikroiğnelerin su tutma kapasiteleri incelendiğinde ise TEOS ile çapraz bağlı mikroiğnelerin yeterli çapraz bağa sahip olmadığı, su içinde çözündüğü ve kararlı bir yapı sergilemedikleri izlenmiştir. Glu buharın maruz kalan mikroiğnelerin ise kararlı oldukları 8. günde maksimu %1 kütle kaybına sahip olduğu izlenmiştir. Glu çapraz bağlı mikroiğnelerin ise gluteraldehit buhar süresinin artışıyla birlikte su tutma kapasitesinin azaldığı tespit edilmiştir. E2 içeren ve 15, 30 ve 60 dakika süreyle Glu buharına maruz bırakılan mikroiğnelerin % su tutma kapasitesi %88, 49 ve 31 olarak ölçülmüştür. 
Östrojen yüklü MN'lerin anjiyogenez üzerindeki etkileri in ovo CAM deneyi ile incelenmiştir. Östrojen yüklü mikroiğnelerin tümünde, içermeyen gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek damarlanma tespit edilmiştir (p<0.05). Östrojen yüklü mikroiğne grupları kendi aralarında karşılaştırıldığında ise en yüksek damarlanma E3 yüklü mikroiğne grubunda gözlemlenmiş ve bu artışı sırasıyla E2 ve E1 grupları takip etmiştir. Bununla birlikte E3, E2 ve E1 grupları arasında damarlanma seviyelerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmemiştir (p>0.05). Bu sonuç, farklı östrojen türevlerinin anjiyogenez üzerinde benzer etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak mikroiğnelerin güvenli dozda anjiyogenezi teşvik edici bir etkiye sahip olduğu görülmüştür. 
Geliştirilen mikroiğnelerin in vivo yanıtının değerlendirilmesine yönelik olarak E2 içeren ve glutaraldehit buharına maruz bırakılan mikroiğneler seçilerek, sıçanların deri altına implante edilmiştir. MN yamalarının in vivo implantasyonundan 14 gün sonra abdomen bölgesinden alınan örneklerin makroskobik incelemelerinde MN yamaların bağ dokusu içinde dokuyla bütünleşerek dokuya entegre olduğu gözlenmiştir.

Abstract:
Angiogenesis plays a crucial role in tissue repair processes, ensuring the continuation of important cellular processes such as stem cell differentiation, cell proliferation, and migration during tissue repair. It also plays a significant role in reducing the impact of hypoxia conditions caused by tissue damage by facilitating oxygen transport to the tissue. Estrogen hormones are known to be particularly effective in angiogenesis during mammalian ovulation. In recent years, microneedle (MN) patches, due to their penetration-enhancing properties, are considered ideal platforms for transdermal application of various therapeutics.
This thesis aims to develop angiogenic microneedles containing estrogen (estrone (E1), ß-estradiol (E2), estriol (E3)). For this purpose, microneedles were prepared by blending chitosan (CH) and poly(vinyl alcohol) (PVA) polymers with different crosslinkers (glutaraldehyde, Glu, tetraethyl orthosilicate (TEOS)), and their mechanical properties were compared. Additionally, the angiogenic effects and in vivo responses of microneedles containing different estrogen derivatives were investigated.
The morphologies of the produced microneedles were examined using light and scanning electron microscopy (SEM). Microneedles containing E1 and E2 exhibited square-based pyramidal structures with approximately 650 μm needle height and a smooth needle structure, while the morphology of E3-containing microneedles was disrupted, and the number of smooth needles decreased. On the other hand, microneedles crosslinked with TEOS and Glu containing E1 and E2 showed similar morphological appearances, with smooth and regularly arranged needles. The mechanical characterization of microneedles crosslinked with TEOS was examined using a texture analyzer, revealing that the TEOS concentration and exposure time to glutaraldehyde vapor significantly affect the mechanical properties of the microneedles. TEOS-containing MN-T groups exhibited more flexibility and higher fracture strength compared to MN groups without TEOS, while E1 or E2 did not cause significant changes in mechanical properties. Furthermore, microneedles exposed to Glu vapor containing E1 or E2 became more fragile as the duration of Glu vapor application increased. When the water retention capacities of microneedles were examined, it was observed that TEOS-crosslinked microneedles did not have sufficient crosslinking, dissolved in water, and did not exhibit a stable structure. Microneedles exposed to Glu vapor were stable on the 8th day with a maximum mass loss of 1%. The water retention capacity of Glu-crosslinked microneedles decreased with increasing glutaraldehyde vapor exposure time. The water retention capacity of microneedles containing E2 and exposed to Glu vapor for 15, 30, and 60 minutes was measured as 88%, 49%, and 31%, respectively.
The effects of estrogen-loaded MNs on angiogenesis were examined using in ovo CAM experiments. In all estrogen-loaded microneedles, statistically significantly higher vascularization was observed compared to non-loaded groups (p<0.05). When compared among themselves, the highest vascularization was observed in the E3-loaded microneedle group, followed by the E2 and E1 groups, respectively. However, no statistically significant difference in vascularization levels was observed among the E3, E2, and E1 groups (p>0.05). This result indicates that different estrogen derivatives have similar effects on angiogenesis. Ultimately, it was observed that microneedles had a safe dose of angiogenic effect.
For the evaluation of the in vivo response of the developed microneedles, microneedles containing E2 and exposed to glutaraldehyde vapor were selected and implanted subcutaneously into rats. Macroscopic examination of the samples taken from the abdominal region 14 days after the in vivo implantation of MN patches revealed that the MN patches integrated with the tissue by being incorporated into the connective tissue. It was observed that both the control group and estrogen-loaded microneedles showed foreign body granulomatous reaction after implantation, which was considered an expected response. On the other hand, increased presence of inflammatory cells and vascularization were observed in estrogen-loaded microneedles compared to the control group. This finding indicates that estrogen can trigger angiogenic and inflammatory responses. Additionally, it was observed that estrogen-containing microneedles stimulated fibroblast activity and increased collagen fibril accumulation.