Crıspr prıme edıtıng gen düzenleme yaklaşımları kullanılarak Survıval Motor Nöron-2 (SMN2) geni üzerindeki nokta mutasyonların onarım etkinliğinin araştırılması
Investigation of the repair efficiency of point mutations on the Survival Motor Neuron-2 (SMN2) gene using crispr prime editing gene editing approaches
Yazar: ENES BAL
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHAN TAŞTAN
Üsküdar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Nöroloji = Neurology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Genetik hastalıklar-doğuştan = Genetic diseases-inborn ; Kalıtsal hastalıklar =   ; Kas atrofisi-spinal = Muscular atrophy-spinal

Özet:
Spinal Müsküler Atrofi (SMA), SMN1 (Survival Motor Neuron-1) genine bağlı delesyonlar ve mutasyonlar ile fonksiyonel SMN protein ekspresyonunun azalmasıyla ortaya çıkmaktadır. SMA, motor nöron hücre kaybı ve ileri derecede kas güçsüzlüğü ile karakterize, ölümcül bir nöromüsküler hastalıktır. Otozomal resesif bir hastalık olan SMA'nın dünyada görülme sıklığı 1/10.000'dir. SMN proteini, pre-mRNA'nın eklenmesini katalize eden, mRNA'ların ve kodlamayan RNA'ların olgunlaşmasını sağlayan spliceosome kompleksinin oluşumunda moleküler bir şaperon görevi görmektedir. Mevcut SMN1 kodlayan Adeno-ilişkili virüs (AAV) veya SMN2 geni hedefli antisens oligonükleotid (ASO) bazlı tedavi stratejileri, nöron hücrelerinde uzun vadeli stabil SMN ekspresyonu sağlayamadığından, daha etkili yöntemlerin geliştirilmesi gerekmektedir. SMA açısından, literatürdeki önceki çalışmalar, SMA'yı CRISPR stratejisi ile tedavi etmenin mümkün olduğunu göstermektedir. CRISPR-Prime editing (PE) teknolojisi, çift sarmal kırılmasına veya donör DNA dizilerine ihtiyaç duymadan çeşitli genomik modifikasyonları kesin olarak sağlayan yeni nesil bir gen düzenleme yaklaşımıdır. SMA için CRISPR Prime Editing aracılı gen düzenlemesi henüz detaylı olarak araştırılmamıştır.  Söz konusu tezdeki amaç ise CRISPR Prime Editing yaklaşımı kullanarak SMN2 geni üzerinde nokta mutasyonlarının tamiriyle SMN protein ekspresyonunun yüksek seviyelere çıkarılmasını ve uzun dönemde stabil tutulmasını sağlamaktır. SMN2 genindeki c.840 C>T dönüşümünün Jurkat hücrelerinde tek bir pegRNA ile sağlanması ilk kez bu çalışmada incelenmiştir. Sonuç olarak CRISPR-PE sisteminin c.840 C>T modifikasyonu ile ekzon 7 katılımının sağlanmasıyla SMN2 gen aktivitesinin ve SMN protein ekspresyonunun kalıcı olarak artırabileceği gösterilmiştir. Bu tez çalışması, CRISPR-Prime Editing yaklaşımının, SMA hastalarından alınan birincil hücre hatlarında ve SMN-düşük nöronal hücrelerde test edilmesine öncü olabilecektir.

Abstract:
Spinal Muscular Atrophy (SMA) occurs with deletions and mutations related to the SMN1 (Survival Motor Neuron-1) gene and decreased functional SMN protein expression. SMA is a fatal neuromuscular disease characterized by motor neuron cell loss and severe muscle weakness. The incidence of SMA, which is an autosomal recessive disease, is 1/10,000 in the world. The SMN protein acts as a molecular chaperone in the formation of the spliceosome complex, which catalyzes the splicing of pre-mRNA, enabling maturation of mRNAs and non-coding RNAs. Since current SMN1-encoding Adeno-associated virus (AAV) or SMN2 gene-targeted antisense oligonucleotide (ASO)-based treatment strategies cannot provide long-term stable SMN expression in neuronal cells, more effective methods need to be developed. In terms of SMA, previous studies in the literature show that it is possible to treat SMA with the CRISPR strategy. CRISPR-Prime editing (PE) technology is a next-generation gene editing approach that precisely enables a variety of genomic modifications without the need for double-strand breaks or donor DNA sequences. CRISPR Prime Editing-mediated gene editing for SMA has not yet been studied in detail. The aim of the thesis is to increase the SMN protein expression to high levels and to keep it stable in the long term by repairing point mutations on the SMN2 gene by using the CRISPR Prime Editing approach. The c.840 C>T transformation in the SMN2 gene was investigated for the first time in Jurkat cells with a single pegRNA. As a result, it has been shown that SMN2 gene activity and SMN protein expression can be permanently increased by providing exon 7 participation with c.840 C>T modification of the CRISPR-PE system. This thesis may lead to testing of the CRISPR-Prime Editing approach in primary cell lines and SMN-low neuronal cells from SMA patients.