Arpa doku kültürlerinde genetik ve epigenetik varyasyonlar
Genetic and epigenetic variations in barley tissue culture
Yazar: ASLIHAN TEMEL
Danışman: PROF. DR. NERMİN GÖZÜKIRMIZI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Botanik = Botany
Dizin: Arpa = Barley ; Bitki büyüme düzenleyicileri = Plant growth regulators ; Doku kültürü = Tissue culture ; Kallus kültürü = Callus culture ; Somaklonal varyasyon = Somaclonal variation

Özet:
Bu çalışmada, 15- ve 30-günlük arpa (Hordeum vulgare L. cv. Zafer-160) kallusları arasındaki genetik ve epigenetik varyasyonlar sırasıyla IRAP ?Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism? ve MSRF ?Methylation Sensitive Restriction Fingerprinting? teknikleri ile araştırıldı. Dört-günlük arpa fideleri kontrol olarak seçildi. Olgun embriyolar, 4 mg l-1 Dicamba içeren Murashige ve Skoog (MS) besiyerinde 30 gün boyunca kültüre alındı. Embriyogenik kalluslar, rejenerasyon için 0.5 mg l-1 trans-zeatin riboside içeren MS besiyerine aktarıldı. Dokular, BARE-1 ve Sukkula gibi arpa retroelementlerinden geliştirilen dört IRAP kombinasyonu ile analiz edildi. BARE-1 polimorfizmi gözlenmesine rağmen; Sukkula elementinin hareketsiz kaldığı gözlendi. Olgun embriyolardan kallus gelişimi sırasında, epigenetik varyasyonların en önemlilerinden biri kabul edilen metillenme değişimlerinin meydana geldiği anlaşıldı. MSRF verilerine göre, 30-günlük kallus DNA'sı, fide DNA'sına göre daha fazla metillenmiştir.Çalışmanın ikinci kısmında, Homobrassinolide (HBL)'in, kallus gelişimine ve rejenerasyona etkileri araştırıldı. Otuz-günlük kalluslar, bir ay boyunca, iki farklı konsantrasyonda (0.5 µM and 1 µM) 22(S),23(S)-Homobrassinolide (HBL) uygulamasına maruz bırakıldı. Hem kontrol (hormon içermeyen) hem de HBL grupları, taze ağırlık miktarında ve SOD aktivitesinde azalmaya; total çözünebilir protein ve DNA içeriğinde artışa yol açtı. 0.5 µM grubu en yüksek değerleri oluştururken; en düşük SOD aktivitesi, 1 µM HBL grubunda gözlendi. HBL uygulamasının 14-15. gününde, HBL-uygulanmış ve uygulanmamış kalluslar, yeşil hücre kümeleri ve sürgün şeklinde rejenerasyon belirtileri gösterdi. Kontrol ve özellikle 0.5 µM hormon gruplarındaki kallusların, daha büyük, sert ve ufalanabilir oldukları gözlendi. En uzun sürgünlerin, 0.5 µM grubundaki kalluslarda geliştiği görüldü. Kontrol ve 0.5 µM hormon gruplarındaki metillenme değişimleri, MSRF tekniği ve iki primer kombinasyonu ile araştırıldı. HBL uygulamasının, genomda metillenme artışına yol açtığı görüldü.Çalışmada elde edilen sonuçlara göre, kallus gelişimi sırasında genetik ve epigenetik varyasyonlar meydana gelmektedir. HBL metillenmede artışa yol açmakta ve rejenerasyonu olumlu etkilemektedir. Bu çalışmanın, doku kültürü kaynaklı varyasyonların anlaşılmasında ve HBL'nin, doku kültürlerinde kullanılmasında yararlı olması beklenmektedir.

Abstract:
In this study, genetic and epigenetic variations between 15- and 30-days-old barley (Hordeum vulgare L.) calli were investigated with IRAP ?Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism? and MSRF ?Methylation Sensitive Restriction Fingerprinting? techniques, respectively. Four-days-old seedling was used as control. Mature embryos were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 4 mg l-1 dicamba for 30 days. Embryogenic calli were transferred to regeneration medium, MS containing 0.5 mg l-1 trans-zeatin riboside. Tissues were analyzed with four IRAP primer combinations, which were designed according to barley retroelements BARE-1 and Sukkula. BARE-1 polymorphisms were detected however, Sukkula elements remained inactive. Methylation alterations, which is one of the most prominent epigenetic variations, occurred during callus formation from mature embryos. According to MSRF data, 30-days-old callus DNA was much more methylated than seedling DNA.In the second part of the study, effects of Homobrassinolide (HBL) on callus growth and regeneration were investigated. Thirty-days-old calli were treated with two different concentrations (0.5 µM and 1 µM) of 22(S),23(S)-Homobrassinolide for one month. Both control (hormone-free) and HBL media caused decrease in fresh weight and SOD (EC 1.15.1.1) activity and increase in total soluble protein and DNA content. 0.5 µM group exhibited the highest protein and DNA levels and the least decrease in fresh weight. However, minimum SOD activity was measured in 1 µM HBL group. At the 14-15th day of the HBL treatment, HBL-treated and non-treated calli started to regenerate. Green cell clusters and as well as shoots were observed. Control and especially 0.5 µM group calli were bigger, harder and more friable than 1 µM group calli. Longest shoots developed in 0.5 µM group. Methylation alterations between control and 0.5 µM group were investigated with MSRF with two primer combinations. HBL treatment caused increase in genome-wide methylation.Data indicate that genetic and epigenetic variations occurred during callus formation. HBL treatment caused increase in methylation and favoured regeneration. These results may be useful for exploration of tissue culture-induced variation and use of HBL in tissue cultures.