Soğuğa dirençli bitkilerin yaprak apoplastından izole edilen bakterilerin fasulyede (Phaseolus vulgaris L.) soğuk stresi toleransı üzerine etkileri
The effects of bacteria isolated from the leaf apoplast of cold-resistant plants on the cold stress tolerance of bean (Phaseolus vulgaris L.)
Yazar: DENİZ TİRYAKİ
Danışman: PROF. DR. ÖKKEŞ ATICI
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Botanik = Botany ; Fizyoloji = Physiology

Özet:
Bu araştırmada, soğuğa toleranslı bitkilerin yaprak apoplastından izole edilen bakterilerin fasulyenin (Phaseolus vulgaris L.) soğuk stresine fizyolojik ve biyokimyasal cevap mekanizmaları üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu amaç için Erzurum ve yöresinde toplanan soğuğa dayanıklı bazı bitkiler kullanılmıştır. Bu bitkiler, Onosma isauricum, Verbascum cheiranthifolium, Chenopodium botrys, C. foliousum, Myosotis alpestris, Capsella bursa-pastoris, Artemisia austriaca, Draba nemorosa, Raphanus raphanistrum, Trifolium repens, Fragaria vesca, Taraxacum sieheanum, Galanthus gracilis, Colchicum speciousum, Scilla siberica, Erodium cicutarium'dur. Bitkilerin yaprak apoplastından psikrotolerant bakteriler izole edilmiş ve tür teşhisleri 16S rRNA dizi analizi ve Vitek yöntemi ile yapılmıştır. Bitkilerin yaprak apoplastından 10 bakteri türüne ait 20 bitki büyüme düzenleyici bakteri (PGPB) izolatı belirlenmiştir. Bunlar, Sphingobacterium faecium (izolatları; DT-1, DT-2, DT-3, DT-9, DT-15), S. kitahiroshimense (DT-4), Staphylococcus intermedius (DT-5), Bacillus cereus (DT-6, DT-10, DT-11, DT-12), Pseudomonas fragi (DT-7, DT-8), P. chloropaphis (DT-14), P. fluorescens (DT-16, DT-18), P. proteolytica (DT-17, DT-19), Raoultella ornithinolytica (DT-13), Brevibacterium frigoritolerans (DT-20)'dır. Bakterilerin inokule edileceği fasulye fideleri normal şartlarda (25/22 oC) 16 gün büyütülmüş ve bir grubunun yapraklarına 10. gün 50 ml (108 CFU/ml) bakteri uygulanmıştır. Sonra fideler 3 gün daha normal şartlarda tutulmuş ve soğuk şartlara (9/5°C) transfer edilmiştir. Soğuğa 3 gün maruz bırakılan fidelerin yapraklarından apoplastik proteinlerin buz nükleasyon aktivitesi, donma hasarı, apoplastik ve hücresel antioksidan enzimlerin aktivitesi, reaktif oksijen türleri ve lipid peroksidasyon seviyeleri belirlenmiştir. Ayrıca, bakterilerin ACC deaminaz aktivitesi ve ekstrasellüler proteinlerinin SDS-PAGE profilleri belirlenmiştir. Fidelere inokule edilen izolatların çoğu, kök-gövde kuru ağırlığını ve klorofil miktarını artırmıştır. Ayrıca, izolatlar fidelerde donma hasarını düşürmüş ve apoplastik sıvının buz nükleasyon aktivitesini (donma noktasının gecikmesi) artırmıştır. İzolatlardan bazıları H2O2, süperoksit anyonu ve malondialdehid (MDA) içsel seviyelerini düşürmüştür. Düşük sıcaklık, apoplastik katalaz (CAT), askorbat peroksidaz (APX) ve glutatyon redüktaz (GR) aktivitelerini düşürürken, peroksidaz (POX) ve süperoksid dismutaz (SOD) aktivitelerini artırmıştır. Aynı gruptaki bitkilere bakteri uygulamaları ise aktiviteleri genelde artırmıştır. Tek başına düşük sıcaklık, hücresel CAT ve SOD aktivitesini artırırken, POX, APX ve GR aktivitesini düşürmüştür. Soğuk+bakteri uygulamalarında ise aktivitelerde artış ve düşüşler belirlenmiştir. Bakteri izolatlarının hepsinde ACC deaminaz aktivitesi belirlenmiştir. SDS-PAGE verilerine göre izolatların çoğu, ekstrasellüler olarak yeni proteinler salgılamışlardır. İzolatlardan bazılarının, PGPB bakteri grubunda oldukları ve soğuk stresinden önce fasulye fidelerine inokule edildiklerinde bitkinin soğuğa toleransını artırabildikleri ileri sürülmüştür. Tez içinde bütün gruplar kendi kontrolü ile kıyaslanmış ve ayrıntılı olarak tartışılmıştır.

Abstract:
In this study, the effects of bacteria, isolated from the leaf apoplast of psychrotroph plants, on the physiological and biochemical response mechanisms to the cold stress of bean (Phaseolus vulgaris L.) were investigated. For this aim, some plants collected from and nearby Erzurum that are cold-resistant were used. These plants are, Onosma isauricum, Verbascum cheiranthifolim, Chenopodium botrys, C. foliousum, Myosotis alpestris, Capsella bursa-pastoris, Artemisia austricia, Draba memorasa, Raphanus raphanistrum, Trifolium repens, Fragaria vesca, Taraxacum shieheanum, Galanthus gracilis,Colchicum speciousum, Scilla siberica, Erodium cicutarium. The psychrotolerant bacteria were isolated from the leaf apoplast of the plants and the identifications of species was made by 16S rRNA sequencing analysis and Vitek method. 20 Plant Growth Promoting Bacteria (PGPB) isolates belonging to 10 bacteria species were determined. These are, Sphingobacterium faecium (isolates; DT-1, DT-2, DT-3, DT-9, DT-15), S. kitahiroshimense (DT-4), Staphylococcus intermedius (DT-5), Bacillus cereus (DT-6, (DT-10, DT-11, DT-12), Pseudomonas fragi (DT-7, DT-8), P. chloropaphis (DT-14), P. flourescens (DT-16, DT-18), P. proteolytica (DT-17, DT-19), Raoultella ornithinolytica (DT-13), Brevibacterium frigoritolerans (DT-20). The bean seedlings to which the bacteria would be inoculated were grown for 16 days under normal conditions (25/22°C) and on the 10th day, 50 ml (108 CFU/ml) bacteria was applied to the leaves of a group. After that, the seedling were kept under normal circumstances for 3 days and then were transferred to the cold conditions (9/5°C). The ice nucleation activities of apoplastic proteins, frost damage, the activities apoplastic and cellular antioxidant enzyme activity, reactive oxygen types and lipid peroxidation levels were determined from the leaves of seedlings that were exposed to the cold for 3 days. At the same time, the ACC deaminase activities of the bacteria and the SDS-PAGE profiles of the extracellular proteins were determined. Most of the isolates inoculated into the seedlings increased the root-stem dry weight and chlorophyll content. Moreover, the isolates decreased the frost damage and increased the ice nucleation activity (the delay of freezing point) of apoplastic liquid. Some of the isolates decreased H2O2, superoxide anion and malondialdehyde (MDA) levels. As low temperature decreased apoplastic catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and glutathione reductase (GR) activities, it increased peroxidase (POX) and superoxide dismutase (SOD) activities. The bacteria applications to the plants in the same group generally increased the activities. While low temperature, alone, increased the cellular CAT and SOD activities, it decreased POX, APX and GR. In cold+bacteria applications increases and decreases in activities were determined. ACC deaminase activity was determined in all of the bacteria isolates. According to SDS-PAGE data, most of the isolates released new proteins as extracellular. It was suggested that when some of the isolates are in the PGPB bacteria group and when they are inoculated into bean seedlings before cold stress, they can increase the tolerance of the plant to the cold. Within the dissertation, all the groups are compared to their controls and are discussed detailly.