Tip 2 diyabetik hastalarda mikroRNA'lar
MicroRNAs in patients with type 2 diabetic nephropathy
Yazar: KADRİYE AKPINAR
Danışman: PROF. DR. DİLER ASLAN
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Diabetes mellitus-tip 2 = Diabetes mellitus-type 2 ; Diabetik nefropatiler = Diabetic nephropathies ; Mikro RNA = Micro RNA ; RNA = RNA

Özet:
Çok sayıda dokudan salgılanarak çok sayıda doku ve hücrede etki gösteren mikroribonükleik asitler (mikroRNA/miRNA/miR-) kalp, karaciğer, beyin ve böbrek gibi organlardaki bozukluk ve hastalıklarda, endotel hasarı ve fibrozis başta olmak üzere çeşitli olayların gelişmesinde veya engellenmesinde rol oynamaktadır. Önemli bir halk sağlığı sorunu olan diyabetik nefropatinin (DN) tanı ve takibinde kullanılan mikroalbuminüri ancak renal hasar geliştikten sonra pozitif sonuç vermektedir. miRNA'ların renal hasarın erken tanısında yararlı olabileceği öngörülmektedir. Çalışmamızda, diyabetle ilişkili olduğu saptanan, insanda araştırılmış olan "miRNA-21-3p, miRNA-29a-3p, miRNA-29b-3p, miRNA-29c-3p, miRNA-126-3p, miRNA-192-5p, miRNA-320c" ve farelerde araştırılan  "miRNA-129-1-3p, miRNA-137, miRNA-212-3p" olmak üzere 10 miRNA'yı değerlendirmeyi amaçladık.
Çalışma grubu, 50 sağlıklı kontrol (erkek: n=24; yaş: 55±11; kadın: n=26; yaş: 54±13) ve 100 tip 2 diyabetik hastadan (erkek: n= 46; yaş: 60±11; kadın: n=54; yaş: 56±11)] oluşturuldu.  Diyabetik hastalar 51'i normoalbuminürik (NAlb), 25'i mikroalbuminürik (MikAlb) ve 24'ü makroalbuminürik (MakAlb) olmak üzere alt gruplara ayrıldı. Diyabetik grup (T2DM), 51 NAlb ve 49 diyabetik nefropatili (DN) hastayı kapsadı.   Tüm bireylerin plazmalarında RT-PCR yöntemi ile miRNA'lar analiz edildi. Serumda açlık glukozu, total kolesterol, trigliseritler, LDL-kolesterol, HDL-kolesterol, sistatin C, kreatinin, albumin; tam kanda HbA1c ve 24 saatlik idrarda mikroalbumin ve kreatinin düzeyleri ölçüldü. 24 saatlik idrar toplanarak kreatinin klirensi hesaplandı. Serum kreatinin ve serum sistatin C düzeylerine göre glomerüler filtrasyon hızları hesaplandı (eGFR). Her miRNA'nın ekspresyonu tüm diyabetik grupların kendi arasında ve kontrol grubuyla karşılaştırıldı ve ekspresyonların biyokimyasal ölçüm sonuçlarıyla korelasyonları değerlendirildi.
İnsanlarda araştırılmış olan ilk 7 miRNA'dan yalnız miRNA-21 çalışma grubu bireylerinin yarısında, diğerleri tüm bireylerde saptandı. Farelerde araştırılmış olan miRNA-129-1-3p ve miRNA-137 çalışma gruplarının az bir kısmında saptandı ve yeterli sayıda olmadığı için değerlendirilmedi. miRNA-212 ise tüm bireylerin yaklaşık yarısında saptanabildi. 
Tüm grupların yaklaşık yarısında saptanan, miRNA-21'de gözlenen azalmalar diyabetik, DN ve MakAlb grupta kontrollere göre istatistiksel olarak anlamlı bulundu  (T2DM: 5 kat, p=0,004; DN: 7, p=0,005; NAlb: 4, p=0,519 ve MikAlb: 5, p=0,559; MakAlb: 7, p=0,005). Tüm gruplardaki tüm bireylerde saptanan miRNA'lardan biri olan miRNA-192'de diyabetik hastaların tümünde 2 kat (p=0,029), DN grubunda 2,4 kat (p=0,027) azalma istatiksel olarak anlamlı bulundu. NAlb grubundaki 1,5 kat azalma ise anlamlı bulunmadı.  
miRNA-29 ailesinde, -b'de kontrollere göre MikAlb'de azalma ve diğer gruplarında artma gözlendi. 1 kat olarak gözlenen bu farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. –a ve -c'de MikAlb gruptaki azalmalar istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (sırasıyla, 2,5 ve 3 kat).
 miRNA-126'da,  tüm gruplardaki farklılıklar kontrollere göre istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (T2DM: 1; NAlb: 1 kat artma; DN: 1,5, MikAlb: 1; MakAlb: 1,5 kat azalma).
miRNA-320c'de, gruplarda kontrollere göre gözlenen azalmalar istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (T2DM: 2; DN: 2; NAlb: 2; MikAlb: 2, MakAlb: 1,5 kat). 
miRNA-212'de, tüm gruplarda kontrollere göre gözlenen farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (NAlb: 1; T2DM: 2 kata yakın artma; DN: 3; MikAlb: 5; MakAlb: 2 kat azalma). 
Renal fonksiyon belirteçleriyle korelasyonlar incelendiğinde, sistatin C'ye göre eGFR ile miRNA-21, miRNA-192 ve miRNA-126 pozitif ilişki gösterdi (sırasıyla, r=0,262, p=0,018;  r=0,203, p=0,013 ve r=0,417, p=0,034). 
MDRD eGFR ile miRNA-21 ve miRNA-29c anlamlı korelasyon gösterdi (sırasıyla, r=0,243, p=0,029 ve r=0,188, p=0,021) 
CKD-EPI-Kreatinin ile yalnız miRNA-192'nin ilişkisi anlamlı bulundu (r=0,185, p=0,023). 
GFR değerleri ile miRNA-29a, –b ve miRNA-212 anlamlı korelasyon göstermedi.
Mikroalbuminüri ile miRNA-21, miRNA-192, miRNA-29c ve miRNA-320 anlamlı negatif ilişki gösterdi (sırasıyla, r=-0,323, p=0,003;  r=-0,267, p=0,001; r=-0,173, p=0,034 ve r=-0,172, p=0,032).
HbA1c ile miRNA-21 anlamlı negatif ilişki gösterdi (r=-0,274, p=0,013).
miRNA-21 ve miRNA-192'nin plazma düzeyleri DN'yi sağlıklı kişilerden ayırmadaki tanısal performansları istatistiksel olarak anlamlı bulundu (sırasıyla, AUC=0,726, p=0,0001 ve AUC=0,717, p=0,0001).
miRNA-21 için gruplardaki saptanma oranları düşük olmakla birlikte, GFR ve mikroalbuminüri ile ilişkileri dikkate alındığında, bulgularımız miRNA-21 ve miRNA-192'nin diyabetik nefropatiyle ilişkili miRNA'lardan olduğunu desteklemektedir. Azalmalar istatistiksel olarak anlamlı bulunmasa da miRNA-29c DN tanısı açısından yararlı olabilir. miRNA-29c, miRNA-29b, miRNA-126, miRNA-212 ve miRNA-320c'nin DN ile ilişkilerinin belirlenmesi açısından daha çok araştırma gereklidir. miRNA-29a'nın ise DN ile ilişkisi desteklenmemektedir. 
Posttranskripsiyonel etkili mikroRNA'ların, ilaç keşfi için biyobelirteç olarak terapötik amaçlı kullanılma durumlarına odaklanan araştırmaların yanı sıra plazma ve idrarda tanısal amaçlı da kullanılabilmeleri için daha çok sayıda araştırmaya ihtiyaç vardır

Anahtar Kelimeler: Diyabetik nefropati, mikroRNA, miRNA-21, miRNA-192

Abstract:
Microribonucleic acids (microRNA/miRNA/miR-) are produced by cells of many tissues and impact on the cells of many tissues. They have different roles in the development or prevention of various events, especially endothelial damage and fibrosis, and in disorders and diseases of organs such as the heart, liver, brain, and kidney. Microalbuminuria, used in the diagnosis and follow-up of diabetic nephropathy (DN) which is an important public health issue, gives positive results only after renal damage develops. miRNAs are predicted to be useful in the early diagnosis of renal damage. In our study, we aimed to evaluate 10 miRNAs which were found to be related to diabetes in human (miRNA-21a-3p, miRNA-29a-3p, miRNA-29b-3p, miRNA-29c-3p, miRNA-126-3p, miRNA-192-5p and miRNA-320c), and in animal studies (miRNA-129-1-3p;  miRNA-137, miRNA-212-3p.) 
The study group was composed of 50 healthy controls (male: n=24; age: 55±11; women: n=26; age: 54±13) and 100 type 2 diabetic patients (male: n=46; age: 60 ± 11; female: n=54; age: 56±11). Diabetic patients were divided into three subgroups as normoalbuminuric (NAlb) (n=51), microalbuminuric (MicAlb) (n=25) and macroalbuminuric (MacAlb) (n=24) according to the urinary abumin levels. The diabetic group (T2DM) included 51 patients with NAlb and 49 patients with diabetic nephropathy (DN). Plasma miRNAs were analyzed by RT-PCR method. Serum fasting glucose, total cholesterol, triglycerides, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol, cystatin C, creatinine, albumin; HbA1c, urinary albumin and creatinine in 24-hour urine were measured. Creatinine clearance was determined by collecting 24-hour urine. The glomerular filtration rates (eGFR) were estimated according to serum creatinine and serum cystatin C levels. The expression of each miRNA was compared between all diabetic groups and the control group, and the correlations of the expressions with the biochemical measurement results were evaluated. 
Only miRNA-21 from the first 7 miRNAs investigated in humans were detected in half of the study group, others were detected in all individuals. miRNA-129-1-3p and miRNA-137 studied in mouse were detected in a small number of the individuals, and were not evaluated because of lack of sufficient numbers. miRNA-212 could be detected in approximately half of all individuals.
	The expressions of miRNA-21 which were detected in approximately half of all groups showed statistically significant decreases in the diabetic, DN and MacAlb groups than those in the controls (T2DM: 5-fold, p=0,004; DN: 7, p=0,005; NAlb: 4, p=0,519; MicAlb: 5, p=0,559; MacAlb: 7, p=0,005). The decrease in the expression of miRNA-192, one of the miRNAs detected in all groups, was statistically significant in all diabetic patients (2-fold, p=0,029) and in the DN group (2,4-fold, p=0,027). A 1,5-fold decrease in NAlb group was not statistically significant.
	In the miRNA-29 family, -b decreased in the MicAlb and increased in the other groups compared with the controls. These differences were approximately one fold and were not statistically significant. The decreases in -a and -c in the MicAlb group were not statistically significant (2,5 and 3-fold, respectively).
 The differences of the expressions of miRNA-126 in all groups were not statistically significant (T2DM: 1; NAlb: 1-fold increase; DN: 1,5, MicAlb: 1; MacAlb: 1,5-fold decrease). 
	The decreases in miRNA-320c compared with the controls were not statistically significant. (T2DM: 2; DN: 2; NAlb: 2; MicAlb: 2; MacAlb: 1,5-fold).
	The differences in miRNA-212 expressions that observed in all groups were not statistically significant when compared with the controls ( 1-fold in NAlb, and approximately 2-fold increase in T2DM; DN: 3; MicAlb: 5; MacAlb: 2-fold decreases).
	Correlations of expressions with renal function markers examined. The eGFR based on cys C showed a positive correlation with miRNA-21, miRNA-192 and miRNA-126 (r=0,262, p=0,018; r=0,203, p=0,013 and r=0,417, p=0,034, respectively).
	 miRNA-21 and miRNA-29c were significantly correlated with MDRD eGFR (r=0,243, p=0,029 and r=0,188, p=0,021, respectively).
	The correlation of CKD-EPI-creatinine with miRNA-192 was significant (r=0,185, p=0,023). 
	miRNA-29a, –b and miRNA-212 did not show significant correlation with eGFR values.
	miRNA-21, miRNA-192, miRNA-29c and miRNA-320 were significantly negatively correlated with microalbuminuria (r=-0,323, p=0,003; r=-0,267, p=0,001; r=-0,173, p=0,034 and r=-0,172, p=0,032, respectively).
	HbA1c and miRNA-21 showed significant negative correlations (r= -0,274, p=0,013).
	Plasma levels of miRNA-21 and miRNA-192 were found to be statistically significant in distinguishing the DN from healthy subjects (AUC=0,726, p=0,0001 and AUC=0,717, p=0,0001, respectively).	
	Although we couldn't determined the expressions of miRNA in the whole group, our results supported that miRNA-21 and miRNA-192 could be related to diabetic nephropathy with respect to their correlations with the GFR and microalbuminuria. Our results for the expression of miRNA-29c can be helpful for monitoring the diabetes complications for DN,  show that more research could be performed for prediction of DN. More research is needed to determine the association of miRNA-29c, miRNA-29b, miRNA-126, miRNA-212 and miRNA-320c with DN. The association of miRNA-29a with DN was not supported in our study.
 
Keywords: Diabetic nephropathy, microRNA, miRNA-21, miRNA-192