Türkiye' de kültür deniz balıklarında streptokok enfeksiyonlarının farklı diyagnostik tekniklerle tespiti
Determination of streptococcal infections in cultured marine fish by different diagnostic tecniques in Turkey
Yazar: ÇİĞDEM ÜRKÜ
Danışman: PROF. DR. GÜLŞEN TİMUR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: Beta hemolitik streptokok = Beta hemolitic streptococcus

Özet:
Bu doktora tez çalışmasının amacı yurdumuzun Ege ve Karadeniz kıyılarında yetiştirilen kültür deniz balıklarındaki streptokok enfeksiyonlarının bakteriyolojik, serolojik, moleküler ve histopatolojik diyagnostik metotlarla tespiti olup ayrıca izole edilen streptokok bakterilere patojenite testi uygulanarak patojenik özelliklerinin tespitidir.
Bu amaçla Ekim 2013- Nisan 2015 tarihleri arasında Karadeniz kıyıları ve Ege Bölgesinde bulunan kafes, toprak havuz ve kuluçkahane olmak üzere 30 adet kültür deniz balığı işletmesine gidilmiş, 181 adet hasta kültür deniz balığı bakteriyolojik ve histopatolojik olarak incelenmiştir. Septisemi tablosu gösteren kültür deniz balıklarında hastalık etkeni olarak çoğunlukla Vibrio spp., Aeromonas spp ve Pasteurella sp. gibi Gram negatif bakterilerin yanı sıra nadiren Mycobacterium spp. ve Staphylococcus spp. gibi Gram pozitif bakteriler izole edilmiştir. Sadece Ege Bölgesindeki bir adet deniz balığı işletmesinde ağırlıkları 5- 10 gram olan hasta sinarit (Dentex dentex) ve granyöz balıklarında (Argyrosomus regius) streptokok türü bakteri izole edilmiştir.
Streptokok türü bakteri izole edilen hasta sinarit balıklarında eksternal olarak ülseratif deri lezyonları, pul kaybı, yüzgeçlerde erime ve karın kısmında şişkinlik;  internal olarak bağırsak duvarında incelme, bağırsak lümeninin sarı renkli sıvı ile dolu olduğu, abdomende sıvı birikimi, dalakta büyüme, karaciğer ve sindirim kanalında congestion ve hemoraji, böbrek dokusunda erime, tespit edilmiştir. Aynı işletmeden temin edilen granyöz balıklarında, eksternal olarak gözlerde tek veya çift taraflı ekzoftalmus, veya göz kaybı, göz çevresinde nekrotik lezyonlar, vücut yüzeyinde hemorajik ülseratif deri lezyonları, pul kaybı, internal olarak; karın boşluğunda şeffaf sıvı birikimi, dalakta büyüme ve renginde açılma, karaciğerde solgunluk, şişkin olan bağırsak içinde şeffaf sıvı birikimi ve ön böbrekte erime gözlenmiştir.
Hasta sinarit ve granyöz balıklarının viseral organlarından ve kanından %1,5 NaCl içeren TSA (Tripticase Soy Agar) ve BHIA (Brain Heart Infusion Agar) besiyerlerine yapılan bakteriyolojik ekimlerin 22-24°C'de 48 saatlik inkübasyon süresi sonunda, hasta granyöz balıklarından yapılan ekimlerde besiyerinde küçük yuvarlak sarı pigmentli kolonilerin oluştuğu; hasta sinarit balıklarından yapılan ekimlerde ise beyaz küçük yuvarlak kolonilerin ürediği gözlenmiştir.
Hasta sinarit ve granyöz balıklarından izole edilen bakteri izolatlarının kok hücre morfolojisine sahip ikili veya kısa zincirler oluşturan, hareketsiz, Gram pozitif bakteriler olduğu, sitokrom oksidaz ve katalaz testine negatif reaksiyon verdiği, fermentatif olduğu, vancomycine duyarlı, kanlı agarda alfa hemolitik aktivite gösterdiği, PYRaz enzimine sahip olduğu için Enterococcus sp. olarak identifiye edilmiş, ayrıca bu bulgu Enterococcus-genus spesifik primerler kullanılarak konfirme edilmiştir. Ancak tür bazında identifiye edilememiştir. Benzer şekilde izole edilen bakterilerin API profilleri (Rapid ID 32 Strep, API 20 Strep) yanı sıra Vitek 2 profili ile de izole edilen bakterilerin identifikasyonu yapılamamıştır.
Genus spesifik primerlerle elde edilen PCR ürünlerinin dizi analizi sonucunda hasta sinarit balıklarından izole edilen bakteri izolatları Enterococcus aquimarinus olarak identifiye edilirken; tür spesifik primerler ile yapılan PCR sonuçlarına göre hasta granyöz balıklarından izole edilen bakteri izolatları Enterococcus casseliflavus olarak identifiye edilmiştir. Hasta sinarit ve granyöz balıklarından izole edilen bu bakterilerin identifikasyonu Indirek Floresan Antikor (IFAT) ve lam aglütinasyon yöntemi ile konfirme edilmiştir.
Histopatolojik olarak; hasta sinarit ve granyöz balıklarında genellikle karaciğer, dalak, iskelet ve kalp kaslarında multifocal liquefactive nekroz; hepatopankreas hücrelerinde nekroz; böbrekte hemorajiler, tübüler dejenerasyon ve periglomerular ödem; solungaç filamentlerinde hiperplazi, hemoraji ve solungaç epitel hücrelerinde dökülme; dalağın hemapoietik dokusunda boşalma ve geri kalan hücrelerde nekroz; bağırsak duvarındaki longitudinal ve sirküler kaslar ve propria mukoza ve kolumnar mukoza epitelinde nekroz ve bağırsak lümenine dökülme; beyin dokusunda hemoraji gibi benzer histopatolojik bulgular gözlenmiştir. Bu benzer bulgulara ek olarak hasta sinarit balıklarının solungaç filamentlerinde telanjiektazis; hasta granyöz balıklarının renal tübüllerinde kan hücrelerinin infiltrasyonu gibi farklı histopatolojik bulgular gözlenmiştir.
Ayrıca hasta sinarit ve granyöz balıklarından izole edilen bu bakterilerin deniz balıklarında patojen olup olmadığını belirlemek için kültür levrek balıklarında patojenite testi yapılmıştır. Hem hasta sinarit balıklarından izole edilen E. aquimarinus'un hemde granyöz balıklarından izole edilen E. casseliflavus'un levrek balıklarında mortaliteye neden olduğu tespit edilmiştir. Ölen balıkların histopatolojik doku kesitleri saha örneklemesi sırasında hasta balıklardan alınan doku örnekleri ile karşılaştırılmış, benzerlik taşıdığı tespit edilmiştir.
Sonuç olarak, yurdumuzda kültürü yapılan deniz balıklarında hastalığa neden olan katalaz negatif reaksiyon veren, zincir oluşturan Gram pozitif kok şekilli bakteriler ilk kez bu tez çalışmasında biyokimyasal, hızlı tanı kiti, histopatolojik, serolojik ve moleküler yöntemler ile kapsamlı olarak çalışılmıştır. Ülkemizde kültürü yapılan sinarit ve granyöz balıklarında streptokok enfeksiyonuna neden olan etken olarak E. aquimarinus ve E. casseliflavus olarak izole ve identifiye edilmiştir. Bu tür bakterilerin identifikasyonunda biyokimyasal ve hızlı tanı kitlerinin yetersiz kaldığı bu bakterilerin tür bazında identifikasyonun yapılabilmesi için moleküler ve serolojik testlerin kullanılması gerektiği tespit edilmiş olup bu tez çalışmasının daha sonraki yıllarda özellikle deniz kültür balıkçılığında yapılacak çalışmalara katkı sağlayacağını düşünülmektedir.

Abstract:
This Ph.D. thesis was carried out for the determination of the streptococcal infections of marine fish cultured in Black Sea and Aegean Sea coast of Turkey by using bacteriological, serologic, molecular and histopathological diagnostic methods. Also, designation of a challenge study was aimed for the confirmation of the pathogenicity of the isolated streptococci species.
For this purpose; marine cage, inland pool and hatchery units of 30 fish farms were visited between October 2013 and April 2015 and 181 moribound cultured marine fish species sampled and examinated bacteriological and histopathological methods. Generally, Gram-negative bacteria such as Vibrio spp., Aeromonas spp. and Pasteurella sp. and rarely Gram-positive bacteria such as Mycobacterium spp. and Staphylococcus spp. were recovered from the moribund cultured marine fish samples showing clinical symptoms of septicemia. Streptococci were only recovered from 5-10 g moribund common common dentex (Dentex dentex) and meagre (Argyrosomus regius) fish samples obtained from a marine fish farm located in the Aegean Sea coast region.

In the moribund common dentex samples isolated streptococci were observed externally, ulcerative skin lesions, loss of scales, eroded fins and swelling of the abdomen; internally, thinnig of the intestine wall, accumulation of a yellowish fluid in the intestine lumen, accumulation of a fluid in the abdominal cavity, splenomegaly, congestion and hemorrhages on the liver and the digestive tract, liquefaction of the kidney. In the moribund meagre samples obtained from same fish farm was observed externally, uni or bilateral exophthalmia or loss of eyes and necrotic lesions around the eyes, hemorrhagic ulcerative skin lesions on the body surface, loss of scales; internally, accumulation of a clear liquid in the abdominal cavity, splenomegaly and discoloration spleen, pale liver and accumulation of a clear liquid in the swelled intestine and liquefaction of the head kidney.
After the incubation of the bacteriological inoculations that were made from the visceral organs and blood of moribund common dentex and meagre onto TSA (Trypticase Soy Agar) and BHIA (Brain Heart Infusion Agar) both containing 1,5% NaCl, at 22-24 °C for 48 hours, while small, round, yellow pigmented colonies were recovered from moribund meagre samples; small, white, round, colonies were recovered from moribund common dentex samples.
These two bacteria isolates recovered from moribund common dentex and meagre samples were identified as Enterococcus sp. These cocci shaped, nonmotie Gram positive bacteria are formed pairs or short chains, fermentative, sensitive to vancomycin, alpha-haemolytic on blood agar and produce PYRase enzyme. This result was confirmed with Enterococcus-genus specific primers. However, they could not be identified in the species level. Similarly, identification of these bacteria could not be made with the API (Rapid ID 32 Strep and Apı 20 Strep) profiles and Vitek 2 profiles.
As a result of the sequence analyses of PCR products obtained with genus-specific primers, bacterial isolates recovered from moribund common dentex samples were identified as Enterococcus aquimarinus, while the isolates recovered from moribund meagre samples were identified as Enterococcus casseliflavus depending on the species-specific PCR results. Identification of these two bacteria that were recovered from moribund common dentex and meagre samples were confirmed with Indirect Fluorescent Antibody (IFAT) and slide agglutination tests.
Histopathologically; similar histopathologic findings were observed in the diseased common dentex and meagre were observed such as  multifocal liquefactive necrosis in the liver, in the spleen, in the skeletal and heart muscle; necrosis of hepatopancreatic tissue cells; haemorrhages, tubular degeneration and periglomerular oedema in the kidney; haemorrhages in the gill filaments and hyperplasia of the seconder lamella and sloughed of the necrotic gill epithelium cells; depletion of haemopoietic tissue and necrosis of the remaning cell necrosis in the spleen; sloughed of the necrotic longitudinal and circular muscles of the gastric and intestinal wall, propria mucosa  and columnar mucosal epithelium into the intestinal lumen; haemorrhages in the brain. In addition to these findings telangiectasis in the gill filaments of the diseased common dentex and blood cells infiltration in the renal tubules of the diseased meagre were observed as different findings.

A pathogenicity assay was designed for the confirmation of pathogenicity of the two isolates that were recovered moribund common dentex and meagre samples, in the cultured European sea bass. E. aquaimarinus recovered from moribund common dentex and E. casseliflavus recovered from meagre caused mortalities in European sea bass. Histopathological tissue sections of these fish samples were similar finding with the naturally infected fish samples.
In conclusion, Gram-positive cocci shaped bacteria that are catalase negative and forming chains, which caused diseases in the cultured marine fishes in Turkey, were studied comprehensively by using biochemical tests, rapid identification kits, histopathologic, serologic and molecular methods. The pathogens causing streptococcosis in common dentex and meagre cultured in Turkey were identified as E. aquimarinus and E. casseliflavus. It was determined that biochemical tests and rapid identification kits are incapable for the identification of these bacteria in the species-level and molecular and serologic tests should be used for identification, it is thought that this thesis will make a contribution to the further marine fish culture studies.