Dimetilarginin dimetilaminohidrolaz (DDAH) enziminin saflaştırılması ve kinetik özelliklerinin incelenmesi
Purification and investigation of kinetic properties of dimethylarginine dimethylaminohydrolase enzyme (DDAH)
Yazar: EMEL ÇAĞLAR YILDIZ
Danışman: PROF. DR. M. KEMAL ERBİL
GATA / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Dimetilarginin Dimetilaminohidrolaz (DDAH) Enziminin Saflaştırılması Ve Kinetik Özelliklerinin İncelenmesiBöbrekte çok miktarda bulunan Dimetilarjinin dimetilaminohidrolaz enzimi (DDAH; E.C.3.5.3.18), Asimetrik dimetilarjininin (ADMA)'in, L-sitrüllin ve dimetilamine metabolizmasını katalizleyen bir enzimdir.Bu tez çalışmasında NO metabolizmasında düzenleyici bir enzim olan DDAH enzim aktivitesinin ölçümü için uygulanabilir, hassas ve güvenilir bir spektrofotometrik yöntem optimize edilmiştir. DDAH enzimi, sıçan böbreğinden elde edilmiş, amonyum sülfatla çöktürme, Sephacryl S-200, QAE-Sephadex A-50, Phenyl-Sepharose ve MMA-Sepharose kromatografisi kullanılarak %28 verim ve 260.03x10-3 U/mg protein'lik spesifik aktivite ile saflaştırılmıştır. Enzimin saflık kontrolü sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile yapılmıştır. DDAH enziminin molekül ağırlığı SDS-PAGE ile 33560 dalton, Sephacryl S-200 jel filtrasyonu ile 35870 dalton olarak bulunmuştur. Enzimin optimum pH'sı 6.5 olarak saptanmıştır. DDAH enzim stabilitesi üzerine sıcaklığın (0-80°C) etkisi incelenmiş, enzim aktivitesinin 40°C'ye kadar zamanla arttığı gözlenmiştir. Sıçan böbreği DDAH enziminin optimum sıcaklığı 37°C olarak bulunmuştur. Arrhenius eğrisinden, enzimin aktivasyon enerjisi (Ea) 38,845 kJ/mol, aktivasyon entalpisi (DH) 38,703 kJ/mol ve sıcaklıkla aktivite artma faktörü Q10 ise 1.63 olarak hesaplanmıştır. Enzimin kinetik analizi yapılmış, ADMA için Km değeri 0.21 mM, DDAH'ın maksimum hızı (Vmax) 0.48 U/mg protein olarak bulunmuştur. Hill grafiklemesinden yararlanılarak enzimin ADMA için Hill sabiti (h) 0.74 olarak bulunmuş ve enzimin substratı ile negatif kooperativite gösterdiği saptanmıştır. Sıçan böbreği DDAH enziminin kcat ve V0 değerleri sırayla 0.165 s-1 ve 786 M-1s-1 olarak hesaplanmıştır. Cd+2, Cu+2, Zn+2 gibi çift değerlikli metal iyonlarının enzimi inhibe ettiği gözlenmiştir. Bu çalışma literatürlere göre Türkiye' de DDAH enziminin saflaştırıldığı ilk çalışma özelliğini taşımaktadır.NO-ADMA-Homosistein metabolizmalarının regülasyonunda kilit enzimlerden biri olan DDAH enziminin karakteristik özelliklerinin bilinmesinin özellikle kardiyovasküler, serebrovasküler, renal ve pulmoner hastalıkların tedavisinde yeni görüş ve yaklaşımların olgunlaşmasında ve yeni ilaçların bulunmasında yardımcı olabileceği düşünülmektedir.Anahtar Kelimeler: DDAH, ADMA, sıçan böbreği, saflaştırmaDestekleyen Kurumlar: Gülhane Askeri Tıp AkademisiYazar Adı: Uzm.Bio. Emel ÇAĞLAR YILDIZDanışman: Prof.Dr.Kd.Alb. M. Kemal ERBİL

Abstract:
Purification and Investigation of Kinetic Properties of Dimethylarginine Dimethylaminohydrolase Enzyme (DDAH)Dimethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH; E.C. 3.5.3.18) enzyme which catalyzes asymmetric dimethylarginine (ADMA) thereby forming L-citrulline and dimethylamine presents in large quantities in the kidney.In this project, a pre-existing sensitive spectrophotometric method has been optimized for the measurement of activity of DDAH enzyme that is regulatory enzyme in nitric oxide (NO) metabolism. Rat kidney derived DDAH enzyme purification has been accomplished by using Sephacryl S-200, QAE-Sephadex A-50, Phenyl-Sepharose, MMA-Sepharose chromatographies following ammonium sulfate precipitation, with 28% yield and determined to have a specific activity of 260.03 x 10-3 units per milligram protein. Purity was controlled by Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The molecular weight of DDAH was found to be 33560 daltons by SDS-PAGE and 35870 daltons by Sephacryl S-200 gel filtration. The optimum pH of the enzyme was 6.5. Effect of temperature on DDAH stability was investigated between 0-80 °C. Rat kidney DDAH enzyme activity was shown to increase up to 40 °C and the optimum temperature for the enzyme was 37 °C. From Arrhenius plot, Ea, ? H and Q10 were found to be 38,845 kJ/mole, 38,703 kJ/mole and 1.63, respectively. As the kinetic parameters, Km value for ADMA was 0.21 mM and Vmax value for DDAH was 0.48 U/mg protein. The Hill constant for ADMA was 0.74 (h < 1.00) and the enzyme showed negative cooperativity with its own substrate. kcat and V0 values of the rat kidney DDAH were found as 0.165 s-1 and 786 M-1s-1, respectively. The activity was shown to be inhibited by some divalent metal ions (e.g. Cd2+, Cu2+, Zn2+). According to literature, this is the first study covering DDAH enzyme purification in Turkey.Characterization of DDAH enzyme which was shown to have key role in regulation of NO-ADMA-Homocysteine metabolism may provide new insights into management of cardiovascular, cerebrovascular, renal and pulmonary disorders; moreover, this approach may pose novel treatment models for these pathologies.Key words: DDAH, ADMA, rat kidney, purificationSupported by: Gülhane Military Medical AcademyAuthor: Emel ÇAĞLAR YILDIZ, Uzm.BioCounsellor: M. Kemal ERBİL, Prof.Dr.Kd.Alb.