Mikro RNA'ların prostat kanseri ile ilişkisi
The effect of micro RNA in prostate cancer
Yazar: ABDULLAH KARADAĞ
Danışman: PROF. DR. SELDA KABADERE
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Fizyoloji = Physiology ; Üroloji = Urology
Dizin: Hücre kültürü = Cell culture ; Mikro RNA = Micro RNA ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Prostat = Prostate ; Prostat hastalıkları = Prostatic diseases ; Prostat neoplazmları = Prostatic neoplasms ; RNA = RNA

Özet:
Amaç: Benign prostat hiperplazili (BPH, 18) ve radikal prostatektomi ameliyatı öncesi/sonrası prostat kanserli (PK, 19+19) toplam 56 hasta plazmasında, seçtiğimiz 9 tane miRNA'nın ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi, ardından bu miRNA'ların hücre kültüründe etkilerinin incelenmesi ve hastalardan elde ettiğimiz veriler ile kültür ortamında elde ettiğimiz veriler arasındaki ilişkinin araştırılması amaçlanmıştır.
Kapsam: PK erkeklerde kanserden ölümlerin en sık ikinci nedenidir.  Erken teşhis durumunda, tedavi radikal prostatektomi gibi lokal uygulamalardır ve yaşam süresi uzundur.  Ancak teşhiste kullanılan prostata özgü antijen seviyeleri (PSA), birçok nedenden dolayı yüksek çıkabilmekte ve yanlış sonuç verebilmektedir. Bunun sonucu olarak birçok hastada gereksiz girişimsel işlemler yapılmaktadır. Dolayısıyla PK'nin teşhisinde yeni belirteçlere ihtiyaç duyulmaktadır. Mikro RNA'lar (miRNA) 18-25 nükleotit uzunluğunda protein kodlamayan RNA parçacıklarıdır.  Protein sentezinin düzenlenmesinde görev alırlar. Birçok kanser türünde ekspresyon düzeylerinde meydana gelen farklılıklar nedeniyle, tümör baskılayıcı veya onkogen olarak kanser gelişiminde rol oynadıkları bilinmektedir. miRNA'ların prostat kanserindeki düzeylerinin belirlenmesi ve etki mekanizmalarının açığa çıkarılmasının kanser tanı ve tedavisi açısından yararlı olabileceği düşünülmektedir.
Yöntem: Çalışmamızda, nicel eş zamanlı polimer zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yöntemi ile PK'li ve BPH'li hasta plazmalarında dokuz adet miRNA'nın ekspresyon düzeyleri ölçüldü. PK'li hastalarda, radikal prostatektomi ameliyatından önce ve sonra olmak üzere iki kez ölçüm yapıldı. Böylelikle miRNA'ların tedaviden sonra ekspresyon düzeylerinde bir değişim olup olmadığı da karşılaştırılabildi. Deneylerimizin hücre kültürü aşamasında, DU 145 hücrelerine, anlamlı farklılık bulunan üç miRNA (miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-221-3p) agonistinin (mimik) transfeksiyon işlemi gerçekleştirildi. Transfekte hücrelerin 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) yöntemiyle canlılık oranları ölçüldü. Ayrıca ELISA yöntemiyle apoptoz (kaspaz 3-8-9) ile migrasyon ve anjiogenez için gösterge olan matriks metalloproteinaz (MMP) 2-9 düzeyleri ölçüldü. Daha sonra hücreler Hematoksilen Eosin boyama, Bax/ Bcl-2 immünositokimya boyama ve migrasyon testi (yara iyileşme testi) yapılarak incelendi. Böylelikle bu miRNA'ların tedavi edici etkinliği de araştırıldı
Bulgular: Elde ettiğimiz bulgulara göre, PK hastalarında miRNA'lardan dört tanesinin (miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-221-3p, miR-130b-3p) ekspresyon düzeyleri BPH'li hastalara göre anlamlı düzeyde düşük bulundu. miR-125b-5p, miR-145-5p ve miR-221-3p'nin DU 145 insan PK hücrelerinin çoğalmasını üçüncü günde sırasıyla % 37, % 28 ve % 18 (p=0,0001, p=0,0051, p=0,276) oranında baskıladığı gözlendi. Mimiklerin tamamının kaspaz 3 düzeyini arttırdığı gözlendi. Kaspaz 8 düzeyini ise miR-125b-5p ve miR-221-3p'nin arttırdığı bulundu. Bax/Bcl-2 boyama yapılan hücrelerde mimiklerimizin hepsinin apoptozu arttırdığı sonucu elde edildi. Migrasyon testinde mimik uygulanan üç grupta da yara alanının daha yavaş kapandığı gözlendi. Ayrıca, sadece miR-221-3p'nin MMP-9 düzeyini anlamlı düzeyde düşürdüğü tespit edildi.
Sonuç: miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-221-3p ve miR-130b-3p'nin PK'li hastalarda düzeyleri düşük bulundu. Belirlenen miRNA'lar hücrelere transfekte edildiğinde hücre çoğalmasını baskıladıkları, apoptozu artırdıkları, migrasyon ve metastazı azalttıkları görüldü. Bu veriler ışığında bu miRNA'ların PK'nin tanı ve tedavisine katkı sağlayabilecekleri düşünülmektedir. Özellikle daha geniş hasta popülasyonlarında bu miRNA'ların araştırılması sonucu, hazırlanacak biyobelirteç panellerinde kendilerine yer bulabileceklerine inanılmaktadır.
Anahtar Kelimeler: mikroRNA, Prostat Kanseri, PCR, Hücre Kültürü

Abstract:
Aim:  We aimed to determine the expression levels of 9 selected miRNAs in plasmas of 56 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH, 18) and with prostate cancer (PK, 19 + 19) before / after radical prostatectomy surgery. Then, it was aimed to investigate the effects of these miRNAs on cell culture and to investigate the relationship between the data obtained from the patients and the data obtained from the culture media.
Content: PK is the second leading cause of cancer death in men. In the case of early diagnosis, treatment of PK includes local applications such as radical prostatectomy and the survivals of the patients are quite long.  However, The prostate-specific antigen levels used in the diagnosis could be high and false for many reasons. As a result, unnecessary invasive procedures are applied in many patients. Thus, new markers are needed in the diagnosis of PK. Micro RNAs (miRNAs) are 18-25 nucleotides long, non-coding RNA fragments. Due to differences in expression levels of miRNAs in many cancer types, they are known to play a role in cancer development as a tumor suppressor or oncogen. It is thought that determining the levels of miRNAs in prostate cancer and revealing the mechanisms of their affects, could be useful for cancer diagnosis and treatment.
Material method: In our study, the expression levels of nine miRNAs were measured by quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) method in plasmas of PK and BPH patients. Two measurements were performed before and after radical prostatectomy in patients with PK. Thus, expression levels of miRNAs were compared before and after surgery. Then, three of the miRNAs (miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-221-3p) agonists (mimics), which found to be different,  were transfected to DU 145 cells. The viability of the transfected cells was measured by 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) method. Matrix metalloproteinase 2-9 levels which are an indicator for migration and angiogenesis and the levels of apoptosis (caspase 3-8-9) was also measured by ELISA. Then cells were examined by Hematoxylin Eosin staining, Bax / Bcl-2 immunocytochemistry staining and wound healing test. Thus, the therapeutic efficacy of these miRNAs was also investigated.
Result: According to our findings, expression levels of four miRNAs (miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-221-3p, miR-130b-3p) were significantly lower in patients with PK compared to patients with BPH. It was observed that miR-125b-5p, miR-145-5p and miR-221-3p repressed growth of DU 145 human PK cells respectively at 37 %, 28% and 18% rate on the third day (p = 0.0001, p = 0.0051, p = 0.276). It was observed that all mimics increased the caspase 3 levels. Caspase 8 levels were found to increase by miR-125b-5p and miR-221-3p. It was found that all mimics increased apoptosis in Bax / Bcl-2 staining cells. The wound healing test showed that the wound area closed more slowly in all three mimics groups. In addition, miR-221-3p was found to significantly reduce MMP-9 levels. 
Conclusion: The expression levels of miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-221-3p and miR-130b-3p were found to be low in patients with PK. It was seen that when miRNA mimics were transfected to the cells, they suppressed cell proliferation, increased apoptosis, and reduced migration and metastasis. In the light of these data, these miRNAs are thought to contribute to the diagnosis and treatment of PC. It is believed that these miRNAs can be found in biomarker panels to be prepared. Investigation of these miRNAs, especially in larger patient populations are needed for further studies.
Key Words: microRNA, Prostate cancer, PCR, Cell Culture