Rozmarinik asitin antioksidan kapasitesinin belirlenmesi ve insan karbonik anhidraz izoenzimleri (HCA-I ve HCA-II) üzerine inhibisyon etkisinin incelenmesi
Determinaton of antioxidant capacity of rosmarinic acid and investigation of its inhibition effects on human carbonic anhydrase izoenzymes (HCA-I and HCA-II)
Yazar: MERYEM NAR
Danışman: DOÇ. DR. İLHAMİ GÜLÇİN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Bölümü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants

Özet:
Rozmarinik asit doğal bir karboksilik asit olup Lamiaceae familyasına ait oğul otu, biberiye, kekik, adaçayı ve nane gibi birçok bitkide bulunur. Yapılan çalışmada rozmarinik asitin muhtemel antioksidan ve radikal giderme aktivitesi değerlendirildi. Ayrıca rozmarinik asitin insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (hCA-II ve hCA-II) üzerine inhibisyon etkisi incelendi.Rozmarinik asitin antioksidan ve radikal giderme aktivitesini değerlendirmek için ferik tiyosiyanat metoduna göre total antioksidan aktivitesi, 2,2´-azino-bis(3-etilbenztiyoazolin-6-sülfonik asit) radikal (ABTS?+) giderme aktivitesi, 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil serbest radikal (DPPH?) giderme aktivitesi, N,N-dimetil-p-fenilendiamin radikal (DMPD?+) giderme aktivitesi, süperoksit anyon radikali (O2?-) giderme aktivitesi, potasyum ferriksiyanit indirgeme metodu ile indirgeme kuvveti, Kuprak metodu ile kuprik iyonları (Cu2+) indirgeme kapasitesi, FRAP metoduna göre indirgeme kapasitesi ve ferrozin ve bipiridil reaktifleri ile ferröz iyonları (Fe2+) şelatlama aktivitesi çalışıldı. Ayrıca BHA, BHT ?-tokoferol ve troloks referans antioksidan olarak kullanıldı. Kullanılan rozmarinik asit bütün metotlarda kuvvetli antioksidan ve radikal giderme aktivitesi sergiledi.Bununla beraber, çalışmanın ikinci kısmında ise rozmarinik asitin insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (hCA-II ve hCA-II) üzerine in vitro inhibitör etkisi araştırıldı. Öncelikle hCA-I ve hCA-II izoenzimleri sırasıyla Sepharose-4B-L-Tirozin Sülfanamit afinite kolon kromatografisi ile %57.9, %67.2 verimle 76.5 ve 509.3 kat saflaştırıldı. Enzim saflığını belirlemek için, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapıldı ve tek bant gözlendi. Daha sonra I50 değerlerini bulmak için, hidrataz aktivitesi kullanılarak rozmarinik asitin karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (hCA-I ve hCA-II) üzerine inhibisyon etkisi araştırıldı. Bu amaçla rozmarinik asitin karbonik anhidraz izoenzimi I ve II (hCA-I ve hCA-II) üzerine inhibisyon etkileri 4-nitrofenil asetat substratı ile esteraz aktivite metodu kullanılarak da araştırıldı. Rozmarinik asit, hCA-I icin 0,086 mM ve hCA-II için de 0,057 mM Ki değerlerine sahip olduğu gözlendi. Rozmarinik asit, (hCA-I, II) için p-nitrofenil asetat substratı ile yarışmasız inhibisyon gösterdi. Rozmarinik asit antioksidan özelliğinden dolayı daha güvenli hCA-I ve hCA-II inhibitörü olarak kullanılabilir.Anahtar Kelimeler: Antioksidan aktivite, enzim inhibitörü, karbonik anhidraz, rozmarinik asit

Abstract:
Rosmarinic acid is a natural polyphenol carboxylic acid and found in many herbs belonging to Lamiaceae family such as such as lemon balm, rosemary, oregano, sage, thyme and peppermint. In the present study, rosmarinic acid was evaluated for possible antioxidant and radical scavenging activity. Also the inhibitory effects of rosmarinic acid were used on human erythrocyte izoenzymes I and II (hCA-I and hCA-II).In order to evaluate antioxidant and radical scavenging activity of rosmarinic acid, different in vitro methods such as total antioxidant activity by ferric thiocyanate method, 2,2´-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) radical (ABTS?+) scavenging activity, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl free radical (DPPH?) scavenging activity, N,N-dimethyl-p-phenylenediamine radical (DMPD?+) scavenging activity, superoxide anion radical (O2?-) scavenging activity, total reducing power by potassium ferricyanide reduction method, cupric ion (Cu2+) reduction capacity by Cuprac method, hydrogen peroxide scavenging activity and ferrous ions (Fe2+) chelating activities using by ferrozine and bipyridyl reagent were performed separately. Also, BHA, BHT, ?-tocopherol and trolox, a water-soluble analogue of ?-tocopherol, were used as the reference antioxidant compounds. Rosmarinic acid exhibited powerful antioxidant and radical scavenging effects in used all methods.In addition, in the second part of this study, the in vitro inhibitory effects of rosmarinic acid on erythrocyte carbonic anhydrase isoenzymes (hCA-I and hCA-II) were investigated. Firstly, hCA-I and hCA-II were purified by Sepharose-4B-L-Tirozin Sülfanamid affinity chromatography column with a yield of 57.86, 67.17% and 76,52 and 509,29 fold purification of each isoenzyme, respectively. For determination of enzyme purity, sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed and single band was observed.Then, for determination of I50 values, the inhibition effects rosmarinic acid on human carbonic anhydrase iso enzymes I and II (hCA and hCA-II) were investigated using by hidratase assay. For this purpose, the inhibition effects of human carbonic anhydrase isozymes I and II were investigated by using the esterase assay, with 4-nitrophenyl acetate as substrate. Rosmarinic acid showed KI value such as 0,086 mM dor hCA-I and 0,057 mM for hCA II. The inhibition type found to be non-competitive. Rosmarinic acid can be used as safer hCA I and hCA II isoenzyme inhibitors due to their antioxidant properties.Keywords: Antioxidant activity, carbonic anhydrase, enzyme inhibition, rosmarinic acid