Nükleozidlerin zwitteriyonik monolitik kolonlar ile kapiler elektrokromatografi sisteminde ayrımı
Separation of nucleosides by zwitterionic monolithic columns in capillary electrochromtography systems
Yazar: SİSEM EKTİRİCİ
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ ; DOÇ. DR. FATMA YILMAZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Boronik asitler, nükleozid ve glikoproteinler gibi cis-diol gruplarını içeren bileşiklerin seçici tanınması ve zenginleştirilmesi için kullanılan önemli ligandlardır. Bu özellik boronik asitleri moleküler tanıma, proteomik ve metabolomik çalışmalarında kullanılmak üzere mükemmel ligandlar yapmaktadır. Boronat afinite kovalent bağlanma esasına dayalı olduğu için nonspesifik etkileşimleri baskılayarak yüksek spesifiklik sağlamaktadır. Hidrofobik etkileşim boronat afinitenin seçiciliğini etkileyen en önemli ikincil etkileşimlerden birisidir. Afinite materyalleri olarak kullanılan boronik asit ligandları genellikle aromatik boronik asitlerdir ki bunlar proteinlerin nonspesifik adsorpsiyonunu sebep olan π-π etkileşimlerine sebep olurlar. 
Monolitik silika kolonlar, yüksek kolon etkinliği, hidrofilitesi, yüksek geçirgenliği ve yüksek yüzey alanı gibi üstün avantajları sebebi ile proteomik ve metabolomik çalışmalarında oldukça fazla uygulama alanı bulmuştur. Bununla birlikte organik monolitik kolonlarla kıyaslandığında hazırlama prosesi oldukça zor ve post-modifikasyonları zaman alıcıdır. Alternatif olarak, organik-silika hibrit monolitik kolonlar daha az büzülme, mekanik kararlılık, pH kararlılığı gibi önemli avantajlara sahiptir.  Bu çalışmada nükleozitlerin spesifik izolasyonuna yönelik organik-silika hibrit monolitik kolonlar sentezlendi. Temel prensip, boronik asitler ile cis-diol grupları arasındaki alkali/asidik koşullar altındaki tersinir kovalent kompleks oluşum/ayrılma mekanizmasına dayanmaktadır. Boronat afinite kromatografi (BAC) kovalent bağlanma temeline dayandığı için spesifik olmayan etkileşimler uygun koşullar seçildiğinde baskılanır ve yüksek spesifisiklik elde edilir. Ribozillenmiş metabolitler, özellikle modifiye nükleozidler kanser biyoişaretleyici olarak kullanılmaktadır. Boronat adsorbentler, nükleozidleri kompleks matris ortamlarından ekstrakte etmek için kullanılabilecek umut verici malzemelerdir. Bununla birlikte, düşük miktarlarda bulunan metabolitlerin zenginleştirilmesi mevcut boronat adsorbentlerin sınırlı kapasiteleri ve düşük seçicilikleri nedeni ile halen sorun teşkil etmektedir. Bu amaçla hibrit inorganik-organik metakril polihedral oligomerik silseskuiokzan- metakriloil histidin- fenil boronik asit ([POSS-MAH-PBA]) bazlı BAC adsorbentler, [POSS-MAH] monolitik kolonların önce sentezlenmesi ve PBA ile modifiye edilmesi ile elde edildi. Metakriloil histidin (MAH) monomeri, fenil boronik asidin (PBA) bağlanması için oldukça fazla sayıda bağlanma bölgeleri sağladığından adsorpsiyon kapasitesininin benzer monolitik kolonlara göre arttığı tespit edilmiştir. MAH monomeri hem hidrofiliteyi artırarak spesifik tanımaya yol açmış, hemde mobil fazda organik çözücü kullanılmasını engellemiştir. Sentezlenen hibrit [POSS-MAH] ve [POSS-MAH-PBA] monolitik kolonlar, şişme testi, fourier dönüşümlü kızılötesi spektrometresi (FTIR), elemental analiz, taramalı elektron mikroskobu (SEM), bilgisayarlı mikrotomografi (micro-CT) ve Brunauer–Emmett–Teller analizi (BET) ile karakterize edilmiştir.
[POSS-MAH] ve [POSS-MAH-PBA] monolitik kolonların yüzey alanı analizi ile tespit edilen yüzey alanları sırası ile 110.79 ve 507.60 m2/g olarak ölçülmüştür.  PBA ile fonksiyonlandırıldıktan sonra, geniş yüzey alanına sahip olan [POSS-MAH-PBA] monolitik kolonu, adenozin nükleozid için yüksek bir bağlanma kapasitesi (13.38 mg/g) göstermiştir.
Sentezlenmiş olan [POSS-MAH-PBA] monolitik kolonun, adenozin nükleozid molekülünün adsorplama kapasitesine pH, derişim, sıcaklık, iyonik şiddet, akış hızı ve etkileşim süresi gibi farklı parametrelerin etkisi incelenmiştir. pH 8.0, 0.1 mg/ml adenozin derişimi, 0.01 mg/ml NaCI tuz derişimi, 0.5 ml/dak akış hızı ve 60 dakika etkileşim süresi optimum değerler olarak tespit edilmiştir. Desorpsiyon çözeltisi olarak 25 mM formik asit ve metanol çözeltisi karışımı (1:1, v/v) kullanılmıştır.
[POSS-MAH-PBA] monolitik kolonun cis-diol içeren moleküllere afinitesinin PBA fonksiyonel grubundan kaynaklandığını göstermek için, PBA içermeyen [POSS-MAH] monolitik kolon sentezlenerek adenozin bağlama kapasitesi incelenmiş ve 1.89 mg/g olarak bulunmuştur.
[POSS-MAH-PBA] monolitik kolonun adenozin molekülünü adsorpsiyon davranışı Langmuir ve Freundlich adsorpsiyon modelleri uygulanarak incelenmiştir. Elde edilen deneysel sonuçlar incelendiğinde adenozin molekülünün tek tabakalı olarak bağlanma bölgelerine eşit bir şekilde bağlandığı tespit edillmiştir. 
Tekrar kullanılabilirlik testlerinde, adsorpsiyon kapasitesindeki azalma, arka arkaya 5 tekrarlı adsorpsiyondan sonra sadece %1.6 olarak tespit edilmiştir.
[POSS-MAH-PBA] monolitik kolonun cis-diol içeren nükleozidlere seçici afinitesi, deoksiadenozin trifosfat (dATP) molekülünü içeren örneğin incelenmesiyle gösterildi.
İdrar çözeltisine geçmiş olan nükleozid metabolitlerini incelemek için, yapay idrar çözeltisi önce adenozin (0.25 mg/ml) ile spike edilerek [POSS-MAH-PBA] monolitik kolona adsorbe edildi. Adsorbe olan adenozin molekülünün tespit edilen miktarı kalabalık etkisi yapan iyonların yarışmacı özelliğinden dolayı 10.05 mg/g olarak tespit edilmiştir. Adsorbe olan adenozin yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile doğrulanmıştır.
Hazırlanan [POSS-MAH-PBA] monolitik kolonun cis-diol içeren bileşiklere grup spesifik afinitesini göstermek için, yine aynı şekilde yapay idrar çözeltisine geçmiş olan nükleozid metabolitleri incelendi. Bunun için, yapay idrar çözeltisi nükleozidler (0.25 mg/ml) ile spike edilerek [POSS-MAH-PBA] monolitik kolona adsorbe edildi ve desorbe edilen nükleozidler HPLC yöntemi ile tayin edildi ve [POSS-MAH-PBA] monolitik kolonun nükleozidleri adsorplama özelliği gösterilmiş oldu.
Son olarak hassasiyeti artırmak için, aynı oranlarda hazırlanmış olan kapiler [POSS-MAH-PBA] monolitik kapiler kolonu ile elektrokromatografik analizler gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
Boronic acids are important ligands for selective recognition and enrichment of compounds containing cis-diol groups such as nucleosides and glycoproteins. This feature makes boronic acids excellent ligands for use in molecular recognition, proteomics and metabolomics studies. Since boronate affinity is based on covalent binding, it provides high specificity by suppressing nonspecific interaction. The hydrophobic interaction is one of the most important secondary interactions affecting the selectivity of boronate affinity. Boronic acid ligands used as affinity materials are generally aromatic boronic acids and cause π-π interactions which leads to nonspecific adsorption of proteins. 
Monolithic silica columns have found high application in proteomics and metabolomics studies due to their superior advantages such as high column efficiency, hydrophilicity, high permeability and high surface areas. However, the preparation process is very difficult and post-modifications are time consuming compared to organic monolithic columns. The hybrid organic silica monolithic columns used in the thesis have significant advantages such as less shrinkage, more stable mechanical and pH stability as an alternative. In this study, organic-silica hybrid monolithic columns were synthesized for specific isolation of nucleosides. 
The basis of the mechanism is the reversible covalent complex formation between boronic acids and cis-diol groups which vary depending on the alkali/acidic conditions.
Since boronic acid chromatography (BAC) is based on covalent binding, nonspecific interactions are suppressed when appropriate conditions are selected and high specificity is obtained. Ribozylated metabolites, particularly modified nucleosides, are used as cancer biomarkers. Boronate adsorbents are promising materials that can be used to extract nucleosides from complex matrix media. Despite that due to the limited capacity and low selectivity of boronate affinity materials, the determination of metabolites in low amounts is still a problem. For this aim, before modification by phenyl boronic acid (PBA), methacryl polyhedral oligomeric silsesquioxane- methacryloyl histidine ([POSS-MAH]) monolithic column was synthesized to form methacryl polyhedral oligomeric silsesquioxane- methacryloyl histidine-phenyl boronic acid ([POSS-MAH-PBA]) based BAC adsorbents. PBA, which is bound to [POSS-MAH] monolithic column with its numerous binding sites introduced by methacryloyl histidine (MAH) monomer, has a higher adsorption capacity in the column compared to other materials used for this purpose.
The synthesized hybrid [POSS-MAH] and [POSS-MAH-PBA] monolithic columns were characterized by swelling test, fourier transform infrared spectrometry (FTIR), elemental analysis, scanning electron microscope (SEM), micro computed tomography (Micro-CT) and BET. The surface areas of the [POSS-MAH] and [POSS-MAH-PBA] monolithic columns determined by Brunauer–Emmett–Teller (BET) analysis were 110.79 and 507.60 m2/g, respectively. After functionalization with PBA, the [POSS-MAH-PBA] monolithic column with a large surface area showed a high binding capacity (13.38 mg/g) for adenosine nucleoside.
The effect of different parameters such as pH, concentration, temperature, ionic strength, flow rate and interaction time on the adenosine nucleoside adsorption capacity of the prepared [POSS-MAH-PBA] monolithic column was investigated. pH 8.0, adenosine concentration of 0.1 mg/ml, NaCl salt concentration of 0.01 mg/ml, the flow rate of 0.5 ml/min and the interaction time of 60 min were determined as maximum values for adenosine adsorption. A mixture of 25 mM formic acid and methanol solution (1: 1, v/v) was used as the desorption solution.
In order to show that the affinity of [POSS-MAH-PBA] monolithic column to cis-diol-containing molecules is due to PBA functional group, [POSS-MAH] monolithic column was prepared and the binding capacity of adenosine molecule was examined and estimated to be 1.89 mg/g.
Adenosine nucleoside adsorption behavior of [POSS-MAH-PBA] monolithic column was investigated by applying Langmuir and Freundlich adsorption models. Experimental results showed that adenosine molecule was bound to the binding sites as a monolayered and equally.
In reusability tests, the decrease in adsorption capacity was only 1.6% after 5 consecutive repeated adsorption. The selective affinity of the [POSS-MAH-PBA] monolithic column to cis-diol-containing nucleosides was demonstrated by examining the sample containing the deoxyadenosine triphosphate (dATP) molecule.
In addition, to examine the nucleoside metabolites passed to the urine solution, the artificial urine solution was first spiked with adenosine (0.25 mg/ml) and adsorbed to the [POSS-MAH-PBA] monolithic column. The amount of adsorbed adenosine molecule was determined to be 10.05 mg/g due to the both ions that make up crowd effect and the competing molecules. Adsorbed adenosine was confirmed by HPLC.
To demonstrate the group specific affinity of the prepared [POSS-MAH-PBA] monolithic column to the cis-diol containing compounds, in the same way, the nucleoside metabolites passed to the artificial urine solution was examined. For that, the artificial urine solution was spiked with nucleosides (0.25 mg/ml) and adsorbed to the [POSS-MAH-PBA] monolithic column and the desorbed nucleosides were determined by HPLC method.  The [POSS-MAH-PBA] monolithic column's ability to adsorb nucleosides was demonstrated.
Finally, in order to increase the sensitivity, electrochromatographic analyses were performed with the capillary [POSS-MAH-PBA] monolithic capillary column prepared in the same proportions.