Photobacterium damselae subsp. damselae'ye özgü bakteriyofajların izolasyonu ve genomik karakterizasyonu ile faj terapi potansiyellerinin araştırılması
Isolation, genomic characterization and  phage therapy potential of bacteriophages specific to  Photobacterium damsela subsp. damselae
Yazar: ASİYE ESRA EREN EROĞLU
Danışman: PROF. DR. İHSAN YAŞA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Photobacterium damselae subsp. damselae (PDD), hem deniz hayvanlarını hem de insanları etkileyen patojenik bir bakteridir. Bu bakteri, su ürünleri yetiştiriciliği için ciddi bir sorun oluşturmakta ve halk sağlığı açısından da önemli bir tehdit teşkil etmektedir. Klasik antibiyotiklerle kontrol edilemeyen dirençli suşların tedavisinde, fajlar yüksek özgüllükleri ve çevre dostu olmaları nedeniyle potansiyel terapötik ajanlar olarak öne çıkmaktadır. Özellikle akuakültür denemelerinde hayvanlar arasında fajların otonom transferlerinin gerçekleşmesi, kuluçkahaneler ve adaptasyon tesisleri gibi hassas ortamlarda mikrobiyal kontrolün ideal bir yolu olarak dikkat çekmektedir. Bu çalışmada, Aydın ilindeki bir akuakültür tesisinden izole edilen iki yeni faj (TEMp-D1 ve TEMp-D2) detaylı olarak incelenmiştir. Her iki faj da geniş bir pH ve sıcaklık aralığında stabil kalabilmiş, TEMp-D1 dar bir konak aralığında yalnızca PDD hücrelerini enfekte ederken, TEMp-D2 daha geniş bir konak yelpazesinde Vibrio anguillarum ve Pseudomonas aeruginosa üzerinde de litik aktivite göstermiştir. Tek adımlı büyüme eğrisi analizleri, TEMp-D1'in latent süresinin 20 dakika, TEMp-D2'nin ise 25 dakika olduğunu ortaya koymuştur. Fajların bakteriyolitik aktiviteleri farklı enfeksiyon çokluğu (MOI) aralıklarında test edilmiş ve optimum MOI değerlerinin sırasıyla TEMp-D1 için 0.01, TEMp-D2 için ise 0.001 olduğu belirlenmiştir. In vitro denemeler sırasında, fajlar yüksek litik aktiviteleriyle PDD'nin büyümesini engellemiş ve biyofilm üretimi gibi önemli bir virülans faktörünü de önemli ölçüde azaltabilmiştir. Uluslararası Virüs Taksonomisi Komitesi'nin (ICTV) yönergelerine göre gerçekleştirilen filogenetik analizler, her iki fajın da Schitoviridae ailesi N4-benzeri fajlar ile birlikte gruplandığını göstermiştir. Tüm genom nükleotit ve amino asit dizilerinin karşılaştırmalı analizleri, TEMp-D1'de 97, TEMp-D2'de ise 93 kodlama bölgesi (CDS) olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu CDS'lerin tahmini fonksiyonları farklı veritabanlarında karşılaştırmalı olarak incelenmiş ve sonuçlar, çeşitli işlevsel proteinleri kodlayan gen bölgelerini ortaya koymuştur. Her iki fajda da yapısal, replikasyon ve DNA onarımı ile ilişkili proteinler ile holin ve endolizin gibi konak hücrenin yapısal bütünlüğünü bozmada görevli bölgeler belirlenmiştir. Faj genom haritaları oluşturulmuş ve tüm genom dizileri NCBI-GenBank veritabanına PP852687 ve PP852688-90 erişim numaraları ile yüklenmiştir. Bu çalışma, PDD'yi enfekte eden fajlar ve faj genomlarının ülkemizdeki ilk raporunu sunmaktadır. TEMp-D1 ve TEMp-D2 fajlarının N4-benzeri özellikleri, yüksek litik ve anti-biyofilm aktiviteleri, bu fajların PDD'nin biyokontrolünde kullanım potansiyelini vurgulamaktadır. Ayrıca, biyoinformatik yöntemlerle tespit edilen önemli enzimleri kodlayan gen bölgelerinin faj mühendisliği teknikleriyle terapötik amaçlı kullanımına yönelik yeni olanaklar sunmaktadır.

Abstract:
Photobacterium damselae subsp. damselae (PDD) is a pathogenic bacterium that affects both marine animals and humans. This bacterium poses a significant problem for aquaculture and constitutes a serious public health threat. Phages, due to their high specificity and environmental friendliness, have emerged as potential therapeutic agents for treating resistant strains that cannot be controlled with conventional antibiotics. Notably, the autonomous transfer of phages among animals during aquaculture trials has drawn attention as an ideal method for microbial control in sensitive environments such as hatcheries and adaptation facilities. In this study, two novel phages (TEMp-D1 and TEMp-D2) isolated from an aquaculture facility in Aydın province were thoroughly examined. Both phages remained stable across a broad range of pH and temperature conditions. While TEMp-D1 exhibited a narrow host range, infecting only PDD cells, TEMp-D2 demonstrated broader lytic activity, also affecting Vibrio anguillarum and Pseudomonas aeruginosa. One-step growth curve analyses revealed latent periods of 20 minutes for TEMp-D1 and 25 minutes for TEMp-D2. The bacteriolytic activities of the phages were tested across various multiplicities of infection (MOI), with optimal MOI values determined to be 0.01 for TEMp-D1 and 0.001 for TEMp-D2, respectively. During in vitro experiments, the phages effectively inhibited the growth of PDD and significantly reduced biofilm production, an important virulence factor. Phylogenetic analyses conducted in accordance with the guidelines of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) grouped both phages with N4-like phages in the Schitoviridae family. Comparative analyses of the complete genome nucleotide and amino acid sequences revealed 97 coding sequences (CDS) in TEMp-D1 and 93 CDS in TEMp-D2. The predicted functions of these CDS were comparatively analyzed across various databases, highlighting gene regions encoding a variety of functional proteins. In both phages, regions related to structural proteins, replication, and DNA repair, as well as those involved in compromising host cell structural integrity, such as holins and endolysins, were identified. Phage genome maps were constructed, and the complete genome sequences were deposited in the NCBI-GenBank database under accession numbers PP852687 and PP852688-90. This study presents the first report of phages infecting PDD and their genomes in Turkey. The N4-like characteristics, high lytic, and anti-biofilm activities of TEMp-D1 and TEMp-D2 underscore their potential use in the biocontrol of PDD. Moreover, the gene regions encoding key enzymes identified through bioinformatics methods offer new possibilities for therapeutic applications through phage engineering techniques.