Deneysel tip 1 diabetes mellitusta kalp kası kalsiyum homeostazisi üzerine aralıklı hipoksinin etkisi
Effect of intermittent hypoxia on calcium homeostasis of experimental type 1 diabetes mellitus heart muscle
Yazar: AYHAN TANYELİ
Danışman: PROF. DR. METİN BAŞTUĞ
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Diabetes mellitus-tip 1 = Diabetes mellitus-type 1 ; Hipoksi = Hypoxia ; Homeostaz = Homeostasis ; Kalp = Heart ; Kardiyomiyopatiler = Cardiomyopathies

Özet:
Dünyadaki önemli sağlık problemlerinden biri olan diabetes mellitusa bağlı morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri diyabetik kardiyomiyopatidir. Streptozotosin ile deneysel olarak Tip 1 diabetes mellitus oluşturulan sıçanlarda, 6. haftada kardiyak disfonksiyonun tamamen gözlemlenebildiği diyabetik kardiyomiyopati geliştiği bilinmektedir. Diyabetik kardiyomiyopati oluşumuna neden olan mekanizmalardan önemli biri olan kalp kası Ca+2 homeostazisindeki bozulmanın SERCA, fosfolamban (PLB) ve CaMKII mRNA ve protein seviyelerinde değişikliklerden kaynaklandığı bildirilmiştir. Bunlardan özellikle PLB ve SERCA mRNA ve protein düzeyleri ile ilgili literatürde farklı ve birbiriyle çelişen sonuçlara rastlanmaktadır. PLB?nin aktifleşmesi yani fosforillenmesini sağlayan temel proteinlerden olan CaMKII aktivitesinin diyabetik kalplerde artmasına karşın; PLB?nin fosforilasyonunda, SERCA mRNA ve protein seviyelerindeki azalmanın Ca+2?nin sitozolde aşırı birikimi ile diyastolik disfonksiyon gelişimine neden olduğu gösterilmiştir.Diğer taraftan deney hayvanları ile yapılan birçok çalışmada aralıklı ve kronik hipoksinin kardiyak fonksiyonlarda iyileşme sağladığı gösterilmiştir. Anabilim Dalımızda yapılan deneysel bir çalışmada streptozotosin ile indüklenen Tip 1 diabetes mellitusa bağlı sol ventrikül fonksiyon bozukluğunda aralıklı hipoksinin diabetes mellitus gruplarında fonksiyonel iyileşme gösterdiği bulunmuştur. Streptozotosin ile indüklenen diyabetik kardiyomiyopatide aralıklı hipoksinin, PLBve CaMKII mRNA düzeylerini arttıracağı hipoteziyle; aralıklı hipoksi uygulamasının diyabetik kardiyomiyopati gelişimindeki moleküler mekanizmaların anlaşılması ve diyabete bağlı kardiyak komplikasyonların engellenmesinde önleyici ve tedavi edici planlamaların oluşturulmasına katkıda bulunması amacıyla bu çalışma gerçekleştirilmiştir.Bu amaçla 34 adet, 10 haftalık, Wistar Albino cinsi, erkek sıçanlar kontrol (K, n=7), aralıklı hipoksi (AH, n=9), diabetes mellitus (DM, n=8) ve diabetes mellitus + aralıklı hipoksi (DM+AH, n=10) olmak üzere 4 gruba ayrıldılar. 11. haftada streptozotosin enjekte edilerek diabetes mellitus oluşturuldu. 12. haftadan itibaren AH ve DM+AH gruplarındaki denekler 6 hafta süresince, günde 6 saat 3.000 m yüksekliğe karşılık gelen hipoksiye maruz bırakıldılar. Deney protokolünün son uygulamasından 24 saat sonra (43. gün) sakrifikasyon işlemi ile kalpleri çıkarılıp sol ventrikül kas dokuları ayrıştırıldı. Homojenize edilen dokudan total RNA eldesi ve 86ardından semi konservatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile cDNA sentezlenip, uygun primerler kullanılarak PLB, CaMKII ve GAPDH PCR amplifikasyonu gerçekleştirildi. Bunların agaroz jel elektroforezi ve UV kamera görüntülerinden bant yoğunluk analizleri yapılarak PLB/GAPDH ve CaMKII/GAPDH mRNA oranları belirlenerek CaMKII ve PLB mRNA olarak değerlendirildi.Kruskal Wallis testi ile yapılan istatistiksel analiz sonucunda CaMKII mRNA düzeylerinin DM ve DM+AH gruplarında azalmış olduğu bulundu (p<0,001). PLB mRNA düzeylerinde ise değişiklik gözlenmedi.Çalışmamızda sadece PLB ve CaMKII mRNA düzeylerinin saptanmış olması DM ve AH etkilerini açıklamayabilir. Translasyonel ve/veya posttranslasyonel düzeydeki etkiler ile protein düzeylerinde ve/veya aktivasyonlarında ortaya çıkabilecek değişimler de önemlidir. İleri çalışmalarda moleküllerin mRNA düzeyleri yanında, protein düzeyleri ve fosforile formları değerlendirilmelidir ve kalp fonksiyonlarıyla ilgili parametrelerin de çalışmaya dahil edilmesi gereklidir. Anabilim dalımızdaki çalışmalar bu yönde devam etmektedir.Anahtar Sözcükler: Aralıklı Hipoksi, Ca+2 Homeostazisi, CaMKII, Diyabetik Kardiyomiyopati, Hipoksi, PLB, Tip 1 Diabetes Mellitus.

Abstract:
Diabetic cardiomyopathy is one of the leading causes of morbidity and mortality of diabetes mellitus which is one of the world?s major health problems. It is known that in rats with type 1 diabetes mellitus induced by streptozotocin, in 6th week, diabetic cardiomyopathy with complete cardiac dysfunction is developed. It is reported that an important mechanism of cardiac myopathy, Ca2+ homeostasis dysfunction, is caused by changes in SERCA, phospholamban (PLB) and CaMKII mRNA and protein levels. However, there are inconsistent results in literature, especially for SERCA and PLB mRNA levels. CaMKII (that is responsible for activation of PLB by phosphorylation) level reduces at diabetic hearths. Although CaMKII activity increases, PLB phosphorylation decreases. By diminishment of SERCA mRNA and protein levels, extreme accumulation of Ca2+ in cytosol causes diastolic dysfunction.On the other hand, by experimental animal studies, it is shown that intermittent and chronic hypoxia can cause improvement in cardiac functions. In an experimental study that took place in our department showed that intermittent hypoxia causes functional improvement in streptozotocin induced diabetes mellitus group, which has left ventricular function disorder. This study is conducted with the hypothesis that intermittent hypoxia will induce PLB and CaMKII mRNA levels in streptozotocininduced cardiomyopathy. The aim of the study is to understand the molecular mechanisms behind diabetic cardiomyopathy and contribute to development of a new treatment plan for diabetic cardiomyopathy malfunction. For this purpose, 34, 10 week-old, Wistar Albino male rats are grouped as control(C, n=7), intermittent hypoxia (IH, n=9), diabetes mellitus (DM, n=8) and diabetes mellitus + intermittent hypoxia (DM+IH, n=10) groups. Diabetes mellitus is induced by streptozotosin injection in the 11th week. Beginning from the 12th week, IH and DM+IH groups are exposed to 6 hours of hypoxia which is equal to hypoxia at 3,000 meters high. 24 hours after the last application of experiment procedure (43rd day) left ventricule muscle tissue is isolated after sacrification. Total RNA is extracted from homojenized tissue and cDNA is synthetised by semi conservative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). With specific primers PLB, CaMKII, and GAPDH PCR amplifications are made. After agarose gel electrophoresis, band density is analyzed on UV camera images, PLB/GAPDH and CaMKII/GAPDH mRNA ratios are determined and CaMKII and PLB is evaluated as mRNA levels.