Kanola (Brassica napus L.) fidelerinde krom(VI) toleransı ve proteom değişimleri üzerine krom(VI) ve sülfatın rolünün araştırılması
Investigation of the chromium(VI) tolerance and the roles of chromium(VI) and sulfate on the proteome changes in canola (Brassica napus L.) seedlings
Yazar: HAKAN TERZİ
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA YILDIZ
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Brassica napus = Brassica napus ; Krom = Chromium ; Kükürt = Sulfur ; Tolerans = Tolerance

Özet:
Bu çalışmanın birinci aşamasında, 8 kanola (Brassica napus L.) çeşidinin (Champlain, Dante, Heros, Nelson, NK Petrol, Sary, Süzer ve Vectra) hekzavalent krom [Cr(VI)] için fitoremediasyon potansiyelleri hidroponik kültür ortamında değerlendirilmiştir. Bu amaçla, 7 gün süreyle Cr(VI) stresine (0, 10, 50 ve 100 µM potasyum dikromat) maruz bırakılan 14 günlük kanola fidelerinde büyüme, Cr birikimi, malondialdehit (MDA) içeriği, klorofil içeriği, protein olmayan tiyol (NPT) içeriği ve bazı antioksidan enzimlerin [süperoksit dismutaz (SOD), guaiakol peroksidaz (POD) ve katalaz (CAT)] aktivitesindeki değişimler incelenmiştir. Cr(VI) stresi kuru ağırlık (KA), klorofil içeriği ve CAT aktivitesinde azalmaya, MDA içeriği, NPT içeriği, SOD ve POD aktivitelerinde artışa neden olmuştur. Kuru ağırlık temelinde belirlenen tolerans indeksi NK Petrol çeşidinde maksimum (%82.5-74.1), Sary çeşidinde ise minimum (%65.7-40.8) olarak bulunmuştur. Sary çeşidi, düşük klorofil seviyeleri ve yüksek MDA içeriği ile ilişkili olarak en yüksek oranda (705.8 μg g1 KA) Cr biriktirmiştir. Bununla birlikte, en düşük Cr birikimi (255.0 μg g1 KA) NK Petrol çeşidinde bulunmuştur. Ayrıca, NK Petrol çeşidi Cr(VI) stresi altında yüksek klorofil içeriğini ve CAT aktivitesini sürdürmüştür. Sary çeşidinde göre NK Petrol çeşidi nispeten Cr'u dokuları dışında tutabilen bir çeşit olmasına rağmen, daha yüksek oranda biyokütle üreterek Cr(VI) stresini tolere edebildiği için Cr ile kirlenmiş alanların fitoremediasyonu için potansiyele sahip olabilir.  

Bu çalışmanın ikinci aşamasında, Cr(VI) toleransında farklılık gösteren nispeten Cr-toleranslı (NK Petrol) ve Cr-hassas (Sary) kanola çeşitlerinde kükürt (S) beslemesi ve Cr(VI) stresi arasındaki etkileşimler değerlendirilmiştir. Kanola fideleri 7 gün süreyle S-yeterli (1 mM S) besin çözeltisinde büyütülmüştür. Sonrasında fideler farklı S konsantrasyonlarında [0 mM S (–S), 1 mM S (+S) ve 2 mM S (+HS)] 7 gün daha büyütülmüştür. On dört günlük fideler 3 gün süreyle 6 farklı uygulamaya maruz bırakılmıştır: (1) +S/−Cr; 1 mM sülfat, 0 μM Cr(VI) (kontrol), (2) +S/+Cr; 1 mM sülfat, 100 μM Cr(VI), (3) −S/−Cr; 0 mM sülfat, 0 μM Cr(VI) (kükürt eksikliği), (4) −S/+Cr; 0 mM sülfat, 100 μM Cr(VI) (kombine stres), (5) +HS/−Cr; 2 mM sülfat, 0 μM Cr(VI) (aşırı S uygulaması) ve (6) +HS/+Cr; 2 mM sülfat, 100 μM Cr(VI). Bu süre sonunda fideler büyüme, Cr birikimi, MDA içeriği, klorofil içeriği, tiyol içeriği, sistein içeriği, askorbik asit (AsA) ve glutatyon (GSH) içerikleri, bazı antioksidan enzimlerin [SOD, POD, CAT, askorbat peroksidaz (APX), glutatyon S-transferaz (GST) ve glutatyon redüktaz (GR)] aktivitesi, metallotiyonein protein 1 geninin (BnMP1) ifade seviyesi ve yaprak proteomundaki değişimleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Sary çeşidinin büyüme parametrelerinde, –S/–Cr ve –S/+Cr uygulamaları belirgin bir azalmaya neden olmuştur. Maksimum Cr birikimi –S/+Cr bitkilerinde ve özellikle de Sary çeşidinde belirlenmiştir. Sary çeşidindeki yüksek seviyedeki Cr, MDA içeriğini arttırmış ve klorofil içeriğini azaltmıştır. Antioksidan enzimlerin aktivitesi ve sistein içeriği –S/+Cr koşulları altındaki NK Petrol çeşidinde daha yüksek bulunmuştur. Antioksidan metabolitlerin (AsA ve GSH) içerikleri her iki çeşitte –S/–Cr uygulaması tarafından azaltılmıştır. BnMP1 geninin ifade seviyesi NK Petrol çeşidinde –S/+Cr uygulaması, Sary çeşidinde ise +S/+Cr ve +HS/+Cr uygulamaları tarafından arttırılmıştır. Bu sonuç, metallotiyonein proteininin S kullanılabilirliği sırasında değil, S-eksikliği altında Cr toleransında fonksiyon görebileceğini ileri sürmektedir. Sonuç olarak, kükürt beslemesinin Cr alınımını engellenmesinin yanı sıra savunma sistemleri ve gen ifadesi üzerindeki pozitif etkileri ile de toleransı arttırmıştır.        

Mevcut araştırmada, nispeten Cr-toleranslı NK Petrol ve Cr-hassas Sary kanola çeşitlerinde kükürt beslemesi ve Cr(VI) stresi ile ilişkili proteom değişimleri belirlenmiştir. İki-yönlü jel elektroforezi ile analiz edilen yaprak protein profilleri, farklı S konsantrasyonları ve Cr(VI) stresine cevap olarak farklı şekilde ifade olan 65 proteini ortaya koymuştur. Farklı şekilde ifade olan bu proteinlerden 46 protein beneği MALDI-TOF/TOF kütle spektrometrisi ve veri tabanı taraması ile başarılı bir şekilde tanımlanmıştır. Farklı şekilde ifade olan proteinlerin büyük çoğunluğunun fotosentez, enerji metabolizması ve stres savunmada fonksiyon gördüğü belirlenmiştir. Stres savunma ile ilişkili olarak 2-Cys peroksiredoksin BAS1,  glutatyon S-transferaz, ferritin-1, L-askorbat peroksidaz 1, tiazol biyosentetik enzim ve mirosinaz-bağlayıcı protein-benzeri proteinin nispeten Cr-hassas Sary çeşidine göre Cr-toleranslı NK Petrol çeşidinde kükürt eksikliği ve Cr(VI) stresine cevap olarak daha fazla artış göstermiştir. NK Petrol çeşidinde enerji metabolizmasında fonksiyon gören proteinlerin bolluğundaki daha fazla artışın muhtemelen yüksek enerji talebini karşılamak için Cr(VI) stresi altındaki hücrelere yardım edebileceği ileri sürülebilir. Diğer taraftan, NK Petrol çeşidinde moleküler şaperonun (20 kDa şaperonin) artan ifadesi, yanlış katlanmış proteinlerin tekrar katlanması ve protein fonksiyonlarının stabilizasyonu için ilave savunma mekanizması olabileceği ileri sürülebilir. Mevcut proteomik çalışmanın bulguları, kanola çeşitlerinde kükürt eksikliği ve Cr(VI) toleransının moleküler mekanizmaları ile ilgili birincil verileri sağlamıştır.

Abstract:
In the first stage of this study, the phytoremediation potential of 8 canola (Brassica napus L.) cultivars (Champlain, Dante, Heros, Nelson, NK Petrol, Sary, Süzer and Vectra) for hexavalent chromium [Cr(VI)] were evaluated in hydroponic culture. For this purpose, the alterations in seedling growth, Cr accumulation, malondialdehyde (MDA) content, chlorophyll content, non-protein thiol content (NPT) and activities of some antioxidant enzymes [superoxide dismutase (SOD), guaiacol peroxidase (POD) and catalase (CAT)] were investigated in canola seedlings exposed to Cr(VI) stress (0, 10, 50 and 100 µM potassium dichromate) for 7 days. Chromium stress caused a reduction in dry weights (DW), chlorophyll content and CAT activity, and increase in lipid peroxidation, NPT content and activities of SOD and POD. Based on the dry weight, the tolerance index was found maximum in cultivar NK Petrol (%82.5-74.1) and minimum in cultivar Sary (%65.7-40.8). The cultivar Sary accumulated the maximum amount of Cr (705.8 μg g1 DW), which was correlated with the lowest levels of chlorophyll content and highest levels of lipid peroxidation. However, Cr accumulation was found lowest (255.0 μg g1 DW) in NK Petrol. Moreover, the cultivar NK Petrol maintained high content of chlorohyll and CAT activity under Cr(VI) stress. Although NK Petrol may be a Cr(VI) excluder cultivar relative to Sary, it may have the potential for the phytoremediation of Cr-contaminated sites as it tolerates Cr(VI) stress by producing higher biomasses.

In the second stage of this study, the interactions between sulfur (S) nutrition and Cr(VI) stress were evaluated in relatively Cr-tolerant (NK Petrol) and Cr-sensitive (Sary) canola cultivars differing in Cr(VI) tolerance. The canola seedlings were grown S-sufficient (1 mM S) nutrient solution for 7 days. The seedlings were then grown in variable S concentrations [0 mM S (–S), 1 mM S (+S) and 2 mM S (+HS)] for another 7 days. The fourteen-day-old seddlings were exposed to 6 different treatments for 3 days: (1) +S/−Cr; 1 mM sulfate, 0 μM Cr(VI) (control), (2) +S/+Cr; 1 mM sulfate, 100 μM Cr(VI), (3) −S/−Cr; 0 mM sulfate, 0 μM Cr(VI) (sulfur deficiency), (4) −S/+Cr; 0 mM sulfate, 100 μM Cr(VI) (combined stress), (5) +HS/−Cr; 2 mM sulfate, 0 μM Cr(VI) (excess S treatment) and (6) +HS/+Cr; 2 mM sulfate, 100 μM Cr(VI). After this period, the seedlings were used to evaluate the alterations in  growth, Cr accumulation, lipid peroxidation, chlorophyll content, thiol content, cysteine content, ascorbic acid (AsA) and glutathione (GSH) contents, activities of some antioxidant enzymes [SOD, POD, CAT, ascorbate peroxidase (APX), glutathione S-transferase (GST) and glutathione reductase (GR)], expression level of metallothionein protein 1 gene (BnMP1) and leaf proteome. The –S/–Cr and –S/+Cr treatments caused a marked decrease in growth parameters of cultivar Sary. The maximum Cr accumulation was measured in –S/+Cr plants, especially in cultivar Sary. The higher level of Cr in cultivar Sary increased lipid peroxidation and decreased chlorophyll content. The activities of antioxidant enzymes and cysteine content were found higher in NK Petrol under –S/+Cr condition. The levels of antioxidant metabolites (AsA and GSH) in both cultivars were decreased by –S/–Cr treatment. The expression level of BnMP1 gene was increased by –S/+Cr treatment in NK Petrol, while incrased +S/+Cr and +HS/+Cr treatments in Sary. This result suggests metallothionein protein may be involved in Cr(VI) tolerance but only under S-deficiency not during availability of S. In conclusion, the tolerace was increased by the positive effects of sulfur nutrition on defense systems and gene expression as well as by the preventing Cr uptake. 

In the present study, the proteome changes related to sulfur nutrition and Cr(VI) stress were determined in a relatively Cr-tolerant NK Petrol and a Cr-sensitive Sary cultivars of canola. Leaf protein profiles analyzed by two-dimensional gel electrophoresis revealed that 65 protein spots were differentially expressed in response to variable S concentrations and Cr(VI) stress. Of these, differentially expressed 46 protein spots were identified successfully by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry and database search. Majority of the differentially expressed proteins were involved in photosynthesis, energy metabolism and stress defense. In relation to stress defense, 2-Cys peroxiredoxin BAS1, glutathione S-transferase, ferritin-1, L-ascorbate peroxidase 1, thiazole biosynthetic enzyme and myrosinase-binding protein-like exhibited a greater increase in response to sulfur deficiency and Cr(VI) stress in the relatively Cr-tolerant NK Petrol compared to Cr-sensitive Sary. It is suggested that the greater increase in the abundance of proteins involved in energy metabolism in cultivar NK Petrol might help to Cr(VI) stressed cells to meet the high energy demand. On the other hand, it is suggested that the enhanced expression of molecular chaperone (20 kDa chaperonin) in NK Petrol might be another additional defense mechanism for refolding of misfolded proteins and to stabilize protein structure and function. The findings of the present proteomics study provide the primary information regarding the molecular basis of sulfur deficiency and Cr(VI) tolerance in canola plants.