İnsülin sinyal iletimini düzenleyen potansiyel mikroRNA moleküllerinin belirlenmesi ve bu mikroRNA'ların fonksiyonel analizleri
Determination of potential microRNA molecules regulating insulin signal transduction and functional analysis of these microRNAs
Yazar: AYKUT BOSTANCI
Danışman: PROF. DR. GÖKHAN SADİ
Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: DNA dizileme = DNA sequencing ; Fruktoz = Fructose ; Metabolik sendrom = Metabolic syndrome ; Mikro RNA = Micro RNA ; İnsülin direnci = Insulin resistance

Özet:
Günlük enerji tüketimi içerisinde toplam şeker ve özellikle fruktoz alımındaki artış; obezite, tip 2 diyabet, karaciğer yağlanması ve metabolik sendroma neden olmaktadır. Bu hastalıkların temel nedeni yüksek insülin düzeylerine karşın hedef dokularda meydana gelen biyolojik etkinin azalması olarak bilinen insülin direncidir. Bu tez çalışmasında yüksek doz fruktozun Clone-9 hücreleri üzerine etkilerinin ortaya çıkarılması, insülin direnciyle ilişkili miRNA'ların araştırılması ve fonksiyonlarının belirlenmesi amaçlanmıştır.
Tez çalışmasında yüksek doz fruktozun Clone-9 hücreleri üzerine sitotoksik, apoptotik ve nekrotik etkileri araştırılmış, miRNA ifade profilinin farklı fruktoz oranlarıyla (0, -25, -50, -100, -150 mM) nasıl değiştiği belirlenmiştir. Clone-9 hücrelerinde miRNA'ların dizileri ve ekspresyon düzeyleri yeni nesil sekanslama yöntemiyle belirlenmiştir. İnsülin direnciyle ilişkili miRNA'lar biyoinformatik araçlarla araştırılmış ve insülin sinyal iletimini düzenleyebilecek muhtemel miRNA'lar tanımlanmıştır. İnsülin direnciyle ilişkili olarak IRS/PI3K/AKT sinyal yolağındaki gen ve proteinlerin ekspresyon düzeyleri incelenmiş ve miRNA değişimleriyle ilişkilendirilmiştir. İnsülin sinyal iletimini hedefleyen iki miRNA; miR27a ve miR-186 için ikişer CRISPR/Cas9 sistemi tasarlanmış ve bunların Clone-9 hücrelerinde meydana getirdiği mutasyonlar araştırılmıştır. İlgili miRNA'ların susturulması neticesinde insülin sinyal iletimi elemanlarında meydana gelen değişimler moleküler düzeyde araştırılarak miRNA-fonksiyon ilişkisi kısmi olarak ortaya çıkarılmıştır.
Elde edilen veriler, insülin sinyal iletiminden sorumlu proteinlerin yüksek fruktozla belirgin şekilde baskılanmasının insülin direnci gelişimine doğrudan etkisi olabileceğini göstermektedir. Ayrıca bu süreçte miR-27a ve miR-186'nın yolak elemanlarını doğrudan etkileyerek insülin direncini düzenleyebileceğine dair kanıtlar elde edilmiştir. Yüksek fruktoz diyetinin düzenlediği miRNA ağlarının insülin sinyal iletimindeki anahtar genlerle etkileşimleri tanımlanarak, fruktoz kaynaklı insülin direncinin moleküler mekanizmalarının daha iyi anlaşılması sağlamıştır.

Anahtar Kelimeler: Yüksek fruktoz, metabolik sendrom, insülin direnci, yeni nesil dizileme, miRNA, CRISPR/Cas9

Abstract:
Increase in total sugar and especially fructose intake in daily energy consumption; causes obesity, type 2 diabetes, fatty liver and metabolic syndrome. The main cause of these diseases is insulin resistance, which is known as the decrease in the biological effect that occurs in the target tissues despite high insulin levels. In this thesis, it was aimed to reveal the effects of high-dose fructose on Clone-9 cells, to investigate insulin resistance-related miRNAs and to determine their functions.
In the thesis study, the cytotoxic, apoptotic and necrotic effects of high-dose fructose on Clone-9 cells were investigated, and the changes in miRNA expression profile with different fructose amount (0, -25, -50, -100, -150 mM) were revealed. Sequences and expression levels of miRNAs in Clone-9 cells were determined by next generation sequencing method. MiRNAs associated with insulin resistance have been investigated with bioinformatics tools and possible miRNAs that may regulate insulin signaling have been identified. Expression levels of IRS/PI3K/AKT signaling pathway elements associated with insulin resistance were examined and correlated with miRNA changes. For two of the miRNAs targeting insulin signaling; miR27a and miR-186 two different CRISPR/Cas9 systems were designed and their effects on mutations in Clone-9 cells were investigated. The changes in insulin signal transduction elements as a result of silencing of the relevant miRNAs were investigated at the molecular level, and the miRNA-function relationship was partially revealed.
The obtained data show that the significant suppression of the proteins responsible for insulin signal transduction by high fructose may have a direct effect on the development of insulin resistance. In addition, in this process, evidence has been obtained that miR-27a and miR-186 can regulate insulin resistance by directly affecting pathway elements. By identifying the interactions of miRNA networks regulated by the high-fructose diet with key genes in insulin signaling, a better understanding of the molecular mechanisms of fructose-induced insulin resistance has been provided.

Keywords: High fructose, metabolic syndrome, insulin resistance, next generation sequencing, miRNA, CRISPR/Cas9