İnsan kanı serumunda karvedilol ilaç etken maddesinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile tayini için metot optimizasyonu ve validasyonu
Method optimization and validation for the determination of carvedilol in human blood serum by high-performance liquid chromatography (HPLC)
Yazar: KEMAL KAPLAN
Danışman: PROF. DR. SİBEL TUNÇ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada, hipertansiyon, konjestif kalp yetmezliği ve miyokard enfarktüsünü takip eden sol ventriküler bozukluklarda etkili üçüncü nesil bir beta-bloklayıcı olan karvedilolun insan kanı serumunda izokratik ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) yöntemi ile analizi incelenmiştir. Karvedilol analizi için sabit faz olarak Supelco Discovery C18 (5 μm partikül büyüklüğünde, 4,6 mm iç çapında ve 150 mm uzunluğunda) ters faz kolonu, hareketli faz olarak asetonitril : %1 trietilamin (TEA) sulu çözeltisi (pH = 3,50 ± 0,01 değerine H3PO4 ile ayarlanmış) (30:70 (v/v)) karışımı kullanılmıştır. Karvedilol standart çözeltisi, Diyot Dizi (Array) Dedektörü (DAD) kullanılarak 210 nm, 240 nm ve 254 nm dalga boylarında analiz edilmiş ve karvedilolun 240 nm dalga boyunda maksimum absorbans verdiği gözlenmiştir. Band genişliği (bw) olarak 4, 8 ve 16 değerleri denenmiş ve en iyi sonuçlar bw değerinin 4 olduğu durumda elde edilmiştir. Referans dalga boyu olarak 360 nm belirlenmiştir. Akış hızı olarak 0,1 mL/dk, 0,2 mL/dk, 0,3 mL/dk, 0,5 mL/dk, 1,0 mL/dk ve 1,5 mL/dk denenmiştir. Analiz süresinin en kısa olduğu 1,5 mL/dk'lık akış hızı miktarı, optimum akış hızı olarak belirlenmiştir. Kolon sıcaklığı optimizasyonu için 25 0C, 30 0C, 35 0C, 40 0C, 45 0C ve 50 0C olmak üzere 6 farklı sıcaklık denenmiştir. Optimum kolon sıcaklığı olarak kolonun en verimli olduğu, kuyruklanmanın en az olduğu ve pik alanının en fazla olduğu 25 0C'lik sıcaklık değeri seçilmiştir. Enjeksiyon hacmi olarak 10 μL, 20 μL, 30 μL, 40 μL ve 50 μL'lik hacimler denenmiş ve 50 μL'lik enjeksiyon hacminde pik şekli bozulduğundan enjeksiyon hacmi için optimum olarak 40 μL'lik enjeksiyon hacim değeri belirlenmiştir. İç standart olarak yine bir beta-bloklayıcı olan propranolol kullanılmıştır. Analizler sonucunda karvedilol için tespit limiti (LOD) 45,38 ng/mL ve kantitatif tayin limiti (LOQ) 137,50 ng/mL olarak bulunmuştur. Yüzde geri kazanım miktarı 99,83 ± 0,84 olarak belirlenmiştir. 
   
Metot için doğruluk, doğrusallık, seçicilik, kantitatif tayin limiti (LOQ), gün içi ve günler arası kesinlik, tekrarlanabilirlik ile kısa ve uzun dönem kararlılık parametreleri belirlenerek metot validasyonu gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
In this study, the analysis of carvedilol which is an effective third generation beta-blocker in hypertension, congestive heart failure and left ventricular dysfunction following myocardial infarction was investigated in human blood serum by isocratic reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method. For the analysis of carvedilol, Supelco Discovery C18 (particle size: 5μm, inner diameter: 4.6 mm and length: 150 mm) reversed phase column as stationary phase and the mixture of acetonitrile : 1% triethylamine (TEA) aqueous solution (pH = 3.50 ± 0.01 adjusted with  H3PO4) (30:70 (v/v) mixture) as mobile phase were used. Carvedilol standard solution was analyzed at 210 nm, 240 nm and 254 nm wavelengths by using Diode Array Detector (DAD) and it was observed that carvedilol had a maximum absorbance value at the wavelength of 240 nm. The values of 4, 8 and 16 were tried as bandwidth (bw) and the best results were obtained when bw value was 4. Reference wavelength was determined to be 360 nm. Flow rates of 0.1 mL/min, 0.2 mL/min, 0.3 mL/min, 0.5 mL/min, 1.0 mL/min and 1.5 mL/min were tried as flow rates. The lowest analysis time was obtained at the flow rate of 1.5 mL/min, therefore optimum flow rate was determined to be 1.5 mL/min. Six different temperatures of 25 0C, 30 0C, 35 0C, 40 0C, 45 0C and 50 0C were tried to optimize column temperature. The temperature value of 25 0C was chosen as optimum column temperature because of high column efficiency, reduced peak tailing and high peak area. The volumes of 10 μL, 20 μL, 30 μL, 40 μL and 50 μL were tried as injection volumes and the volume of 40 μL was chosen as optimum injection volume because the injection volume of 50 μL caused a peak fronting. Propranolol, another beta-blocker, was used as internal standard. As a result of analyses, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were found to be 45.38 ng/mL and 137.50 ng/mL, respectively. The amount of % recovery was determined to be 99.83 ± 0.84.

Method was validated by the determination of accuracy, linearity, selectivity, limit of quantification (LOQ), intra-day and inter-day precision, repeatability and short-term and long-term stability parameters.