Di-N-bütil fitalat'ın sazan balıklarında (Cyprinus carpio) HSP70, GPX, SOD, CYP1A ve vitellogenin üzerine toksik etkilerinin moleküler düzeyde araştırılması
Molecular studies on toxic effects of Dİ-N-butyl phthalate on HSP70, GPX, SOD, CYP1A and vitellogenin in common carp (Cyprinus carpio)
Yazar: HIZLAN HINCAL AĞUŞ
Danışman: PROF. DR. SİBEL SÜMER
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Bölümü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
Çevre kirliliği doğayı gittikçe daha fazla tehdit etmektedir. Sanayiide plastikleştirici ajan olarak kullanılan fitalatlar özellikle sucul ortamları kirletmektedirler. Bu çalışmada, kozmetikte, boya üretiminde, parfümde katkı maddesi olarak, oyuncakların yapımında ve günlük hayatta kullandığımız birçok araç-gereçte polimerleşme ajanı olarak kullanılan ve maruz kalınan "di-n-bütil filatat" (DBP) maddesinin sucul ortamdaki canlılarda oluşturduğu toksik etkiler moleküler düzeyde incelenmiştir. Deney hayvanı olarak OECD'nin belirlediği model sucul test organizması sazan balığı (Cyprinus carpio) kullanılmıştır. Deney düzeneği, di-n-bütil fitalatla (1 mg/l) dozlanan sazan balıklarından oluşan deney grubu (D) ve kontrol grubu (K) olarak planlanmıştır. Deney grubu balıklar asetonda çözünen DBP'ye maruz bırakılmışlardır. Dozlamadan sonra 4. saatte, 24. saatte ve 96. saatte örnek olarak alınan sazan balıklarının solungaç ve karaciğerlerinde Hsp70, CYP1A, Vtg, SOD ve GPx proteinlerinin gerçek-zamanlı ters transkriptaz-PCR ile gen ekspresyonu düzeyinde ve western blotlama ile protein seviyesi düzeyinde yarı-kantitatif analizleri yapılmıştır.

Analizler sonucunda, ısı şoku stresinde ve kimyasallara maruziyette organizmanın yanıt olarak sentezlediği Hsp70'in, solungaç dokusunda mRNA seviyelerinin 4. saatte ve 24. saatte sırasıyla 5,17 ve 5,4 kat azaldığı, 96. saatte ise 3,86 kat arttığı; karaciğer dokusunda ise mRNA seviyelerinin 4. saatte 1,16 kat, 24. saatte 2,35 kat ve 96. saatte 1,85 kat arttığı bulunmuştur. Hsp70 protein seviyeleri de mRNA seviyeleriyle korelasyon göstermiştir. CYP1A mRNA seviyeleri solungaç dokusunda 4. saatte 7 kat, 24. saatte 1,22 kat ve 96. saatte 2,15 kat artmış, karaciğerde ise bunun tersine, sırasıyla 1,76 kat, 8,46 kat ve 1,08 kat azalmıştır. Protein seviyeleri mRNA seviyeleri ile yarı yarıya değişim göstermiş, ancak korelasyon bulunmuştur. Karaciğerde sentezlenen Vtg'nin mRNA seviyeleri 24. saatte 2,27 kat azalırken, 96. saatte 1,49 kat artmıştır. Protein seviyelerinde ise değişim gözlenmemiştir. SOD mRNA seviyelerinde solungaçlarda anlamlı değişim gözlenmemiştir. Karaciğerde ise mRNA seviyeleri 4. ve 24. saatlerde sırasıyla 2,58 ve 2,67 kat, 96. saatte 10,82 kat artmıştır. Solungaçlarda GPx mRNA seviyeleri değişmezken, karaciğerde saate göre sırasıyla 1,18, 2,45 ve 1,6 kat artmıştır.

DBP, karaciğer dokusunda SOD ve GPx seviyelerinin katlı artışına sebep olmuştur. Oksidatif strese bağlı olarak Hsp70 seviyelerinin organ spesifik değişimler gösterebileceği bilinmektedir. Solungaçlar su ortamında DBP ile doğrudan ve geniş bir yüzeyle maruz kaldığından, ksenobiyotiklerin karsinojenik metabolitlere dönüşümünü sağlayan CYP1A seviyeleri katlı artış göstermiş olabilir. Temel metabolizma organı karaciğer ise daha korunaklı olup, ksenobiyotiklerin vücut tarafından daha seyreltilmiş miktarlarına maruz kaldığından CYP1A'da artış gözlenmemiş, hatta azalma gözlenmiştir. Bu azalış ve buna zıt olarak, karaciğer Hsp70 seviyelerindeki artış, hücresel koruma mekanizmalarının stresi yenmeye çalıştığına ve CYP1A metabolizmasıyla üretilen, hücreye zararlı radikallerin oluşmasının engellendiğine işârettir. Solungaçta oksidatif strese dair bulgu olmasa da, DBP ve sazan balığı ile yapılan çalışmalarda gözlenen nekroz ve diğer bozukluklar göz önünde tutularak, solungaç Hsp70 seviyelerinin ilk 24 saatteki azalması, hücrelerin savunma mekanizmasında yetersiz kalmış olabileceği ve enerjinin korunmaya çalışıldığı düşünülebilir.

Ayrıca, bu çalışma ile çevre kirleticisi fitalatların sucul canlılar üzerine etkilerinin anlaşılması ve kirlilik biyobelirteci olarak yöntem geliştirilmesi için literatüre katkı sağlanmıştır. Gerçek-zamanlı ters transkriptaz-PCR, moleküler ekotoksikolojik çalışmalarda kullanılabilecek hassas, doğruluğu yüksek, tekrarlanabilir ve hızlı bir yöntem olarak belirlenmiştir.

Abstract:
Environmental pollution increasingly threatens nature. Phthalates used as plasticizers contaminate aquatic habitats principally. In this study, toxic effects of "di-n-butyl phthalate" (DBP), which is used in the manufacture of children toys, as excipients in perfumes, in manufacture of paints and cosmetics and as polymerization agent within a great deal of instruments used in daily life, were studied in the living organisms of the aquatic habitat at the molecular level. Common carp (Cyprinus carpio), a model aquatic organism by OECD, was used as experimental animal. Experimental setup was planned as an experimental group (E), which was comprised of fish dosed with di-n-butyl phthalate (1 mg/l), and control group (C). Fish in the experimental group were exposed to DBP in acetone. Samples representing 4, 24 and 96 hours after dosing were taken. Hsp70, CYP1A, Vtg, SOD and GPx proteins in gills and livers of fish were analysed semi-quantitatively in the level of gen expression by real-time reverse transcriptase-PCR and in the level of protein by western blotting.

As the result of analyses, it was shown that mRNA levels of Hsp70 in gills, which is synthesized by the organism in response to heat shock and chemical exposure, decreased 5.17 fold and 5.4 fold in 4 and 24 hours respectively, but increased 3.86 fold in 96 hour; but mRNA levels of Hsp70 in liver increased 1.16 fold in 4 hour, 2.35 fold 24 hour and 1.85 fold in 96 hour. Protein levels of Hsp70 correlated with mRNA levels. CYP1A mRNA levels in gills increased 7 fold in 4 hour, 1.22 fold in 24 hour and 2.15 fold in 96 hour, however decreased 1.76 fold, 8.46 fold and 1.08 fold respectively in liver. Protein levels were observed half and half according to mRNA levels, but correlated with each other. mRNA levels of Vtg, a protein synthesized in the liver, decreased 2.27 fold in 24 hour, whereas mRNA levels decreased 1.49 fold in 96 hour. No alterations were observed in protein levels. Significant alterations were not observed in SOD mRNA levels. Besides, SOD mRNA levels in gills increased 2.58 fold, 2.67 fold and 10.82 fold in 4, 24 and 96 hours respectively. GPx mRNA levels in the liver increased 1.18 fold, 2.45 fold and 1.6 fold in a time dependent manner, whereas no change was recorded in gills in any time group.

DBP caused fold increase of SOD and GPx levels in liver. It is known that Hsp70 levels may represent organ specific alterations dependent on oxidative stress. It is possible that levels of CYP1A which provides transformation of xenobiotics to carcinogenic metabolites may represent fold increase in gills, where gills are exposed with their wide exposure surface directly to DBP. Any increment in liver CYP1A levels was not observed, as a matter of fact a reduction was observed, in which liver, essential organ of the metabolism, is well protected and exposed to more diluted amounts of xenobiotics by organism according to gills. With this reduction, an increase in Hsp70 levels indicate that cellular defense mechanisms responsible for defending against stress and preventing formation of reactive radicals formed by CYP1A metabolism. Although there is no evidence for oxidative stress in gills, by keeping in mind that necrosis and other disorders observed in other studies with DBP and common carp, it is conceivable that cells failed in the mechanism of cellular protection and in charge of energy conservation by taking into consideration a decrease of Hsp70 levels in gills during the first 24 hour.

Furthermore, contribution to literature was provided with this study in understanding the effects of phthalates as environmental pollutants on aquatic organisms and for method development for contamination biomarker. Real-time reverse transcriptase-PCR was determined as a sensitive, accurate, reproducible and rapid method for use in molecular ecotoxicological studies.