Crıspr-prime editing yaklaşımının Spinal Musküler Atrofi in vitro modelinde off-target kapasitesinin, sitotoksisitesinin ve SMN protein ekspresyonunun stabilitesinin araştırılması
Investigation of off-target capacity, cytotoxicity, andstability of SMN protein expression of crispr-pe approach inSspinal Muscular Atrophy in vitro model
Yazar: SİBEL PINAR ODABAŞ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHAN TAŞTAN
Üsküdar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Spinal Musküler Atrofi nöromusküler bir hastalık olup, alfa motor nöron kaybı ve kas atrofisi ile karakterizedir. Bu kompleks genetik bozukluk, SMA hastalarının yaşam süresini ve kalitesini önemli ölçüde etkilemektedir. SMA'nın patolojisi, motor nöron kaybının yanı sıra sinapslarda ve nöromüsküler kavşakta meydana gelen ek kusurları içermektedir. SMA hastalığında en sık görülen kalıtım otozomal resesif olmakla beraber proksimal SMA olarak adlandırılmaktır. Hastalığın temelinde SMN1 geni ekzon 7/8 homozigot delesyonu yer almaktadır. SMN proteininde meydana gelen bu düşüş hastalığın temelini oluşturmaktadır. SMN1 ve SMN2 %99 benzer genlerdir. SMN2 geninde 840. sitozin yerinde timin bulunması ile alternatif splicing meydana gelmekte ve eksprese edilen SMN proteini ~%90 kararsız ve kesikli yapıda olmaktadır. SMN2 kopya sayısı ile hastalığın fenotipik şiddeti ilişkilidir. Kopya sayısının azalması, daha ciddi seyreden SMA tiplerinin ortaya çıkmasına sebep olmaktadır. 859 G-C SMN2 varyantı bulunan kişilerde doğal tip SMN2 genine kıyasla SMN protein ekspresyonun daha fazla olduğu gösterilmiştir. SMA tedavisi için; küçük moleküller ile splicing düzenleyicileri, ASO teknolojisi ve gen terapisi gibi terapötik stratejiler üzerine çalışılmıştır. Mevcut tedavilerin faydalarının yanı sıra ciddi yan etkileri ve sınırlamaları, daha etkili ve güvenli tedavilere olan ihtiyacı göstermektedir. Bu bağlamda, CRISPR Prime Editing gibi hassas genom düzenleme yöntemleri, SMA gibi monogenik hastalıkların tedavisi açısından ümit vadetmektedir. Bu tez kapsamında ise CRISPR-PE yöntemi aracılığıyla SMN2 geni ekzon 7'de 840 T-C ve 859 G-C baz dönüşümleri ile SMN protein ekspresyonun artırılması hedeflenmiştir. İki baz değişiminin tek pegRNA ile hedeflenerek SMN protein ifadesinin arttığı ve stabil kalabildiği de gösterilmiştir. Bu yöntemin off-target etkisi ve toksisitesinin düşük olduğu da tekrar gösterilmiştir. Ek olarak, SMA hastalığı için in vitro araştırmalarda kullanılabilecek CRISPR-Cas9 aracılı SMN1 geni silinen hücre hatları bu tez kapsamında oluşturulmuştur. CRISPR-PE yöntemini içeren in vivo çalışmalar yapılarak immünojenite gibi faktörlerin araştırılmasına ihtiyaç bulunmaktadır. Güvenlik ve klinik uygulanabilirlik ile ilgili kaygıların giderilmesi için de ek çalışmalar gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: CRISPR-PE, GEN DÜZENLEME, OFF-TARGET, SMA, SMN PROTEİNİ

Abstract:
Spinal Muscular Atrophy is a neuromuscular disease and is characterized by alpha motor neuron loss and muscle atrophy. This complex genetic disorder significantly affects the life expectancy and quality of SMA patients. The pathology of SMA involves motor neuron loss as well as additional defects at synapses and the neuromuscular junction. The most common inheritance in SMA disease is autosomal recessive and is called proximal SMA. The basis of the disease is the exon 7/8 homozygous deletion of the SMN1 gene. This decrease in SMN protein forms the basis of the disease. SMN1 and SMN2 are 99% similar genes. With the presence of thymine at the 840th cytosine site in the SMN2 gene, alternative splicing occurs, and the expressed SMN protein is ~90% unstable and discontinuous. SMN2 copy number is related to the phenotypic severity of the disease. The decrease in the copy number causes the emergence of more serious types of SMA. It has been shown that individuals with the 859 G-C SMN2 variant have higher SMN protein expression compared to the wild-type SMN2 gene. For SMA treatment; Therapeutic strategies such as small molecules and splicing regulators, ASO technology, and gene therapy have been studied. The benefits, as well as the serious side effects and limitations of current treatments, indicate the need for more effective and safe treatments. In this context, precise genome editing methods such as CRISPR Prime Editing are promising for treating monogenic diseases such as SMA. Within the scope of this thesis, it is aimed to increase SMN protein expression by base conversions of 840 T-C and 859 G-C in exon 7 of the SMN2 gene through the CRISPR-PE method. It has also been shown that by targeting two base changes with a single pegRNA, SMN protein expression can increase and remain stable. It has also been shown again that this method has low off-target effect and toxicity. In addition, cell lines with CRISPR-Cas9-mediated SMN1 gene deletion that can be used in in vitro research for SMA disease were created within the scope of this thesis. There is a need to investigate factors such as immunogenicity by conducting in vivo studies involving the CRISPR-PE method. Additional studies are also required to address concerns regarding safety and clinical applicability.
Keywords: CRISPR-PE, GENE EDITING, OFF-TARGET, SMA, SMN PROTEIN