Klinik Enterobacteriaceae izolatlarında fosfomisin direncinin moleküler epidemiyolojisi ve biyolojik özelliklere etkisi
Molecular epidemiology of fosfomycin resistance and effect on biological properties in clinical Enterobacteriaceae isolates
Yazar: MUSTAFA ÖKEER
Danışman: PROF. DR. BAYRI ERAÇ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Biyofilmler = Biofilms ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Fosfomisin = Fosfomycin ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae ; Virülans faktörleri = Virulence factors

Özet:
Diğer antibiyotiklerden farklı bir etki mekanizmasına sahip olması dolayısı ile çapraz dirence
yol açmaması, gram pozitif ve GSBL-pozitif birçok gram negatif bakteriye karşı etkili olması
fosfomisini yeniden gündeme getirmiştir. Çeşitli virülans faktörleri ve artan antibiyotik direnç
oranları nedeniyle oluşturdukları enfeksiyonların tedavisi zorlaşan Escherichia coli ve
Klebsiella pneumoniae izolatlarına karşı fosfomisin kullanımının artacağı düşünülmektedir.
Fosfomisinin kullanım alanının genişlemesinin olası etkilerinin öngörülmesi önem
taşımaktadır. Çalışmamızda fosfomisine dirençli ve duyarlı E. coli ile K. pneumoniae
kökenlerinin virülans faktörleri arasındaki olası farklılıkların fenotipik ve moleküler açıdan
incelenmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi'nde farklı
klinik örneklerden izole edilen 78 E. coli ve 34 K. pneumoniae olmak üzere toplam 112 köken
çalışmaya dahil edilmiştir. Öncelikle kökenlerin fosfomisin minimum inhibitör
konsantrasyonları agar dilüsyon yöntemiyle belirlenmiştir. 78 E. coli kökeninin 13 tanesi
(%16,66), 34 K. pneumoniae kökeninin ise 8 tanesi (%23,5) fosfomisine dirençli bulunmuştur.
Fosfomisine dirençli bulunan E. coli (13) ve K. pneumoniae (8) kökenlerinde dirençle ilgili
olan genlerin (murA, glpT, uhpT, fos) yanısıra, adezyon (fimH, papC, mrkD), kapsül yapısında
yer alan polisakkaritler (uge, ycfM, wabG), üropatojenitede rol alan protein (usp) ve siderofor
sentezi (entb) gibi çeşitli virülans faktörleriyle ilişkili genler de araştırılmıştır. Ardından seçilen
fosfomisine duyarlı 2 E. coli ve 2 K. pneumoniae kökeni artan konsantrasyonlarda fosfomisin
içeren besiyerlerine pasajlanarak dirençli hale getirilmiştir. Ardından dirençli ve duyarlı
izogenik varyatların virülans genlerini eksprese etme düzeyleri, biyofilm oluşturma
kapasiteleri ve üreme hızları karşılaştırılmıştır. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir
reaksiyonu (RT-qPCR) sonucunda fosfomisin dirençli varyantlar ile duyarlı eşleri
karşılaştırıldığında, incelenen virülans genlerinden birçoğunda ekspresyon düzeyi açısından
anlamlı bir değişim saptanmamıştır. Spektrofotometrik kristal viyole yöntemiyle dirençli ve
duyarlı kökenlerin biyofilm oluşturma kapasiteleri karşılaştırılmış olup aralarında anlamlı bir
fark bulunmamıştır. Fosfomisine dirençli ve duyarlı kökenler sıvı besiyeri içinde 10 saat
boyunca inkübe edilmiş ve 2 saatte bir tüplerden örnek alınıp 600nm dalga boyunda absorbans
ölçülerek üreme hızları karşılaştırılmıştır. İncelenen dört bakteri çiftinden üçünde duyarlı
varyantların dirençlilere göre anlamlı bir şekilde hızlı ürediği ancak 1 kökenin duyarlı veIV
dirençli varyantları arasında anlamlı bir farklılık olmadığı görülmüştür. Çalışmamızın verileri,
fosfomisine dirençli E. coli ve K. pneumoniae kökenlerinin üreme hızlarında azalma olmakla
birlikte, virülans faktörleri açısından önemli bir dezavantajları olmadığına işaret etmekte,
fosfomisin kullanımının dikkatle izlenmesi gerektiğini ortaya koymaktadır.

Abstract:
Fosfomycin has a different mechanism of action from other antibiotics and does not cause
cross-resistance. Also its activity against many gram-positive and ESBL-positive gramnegative bacteria makes fosfomycin a point of interest. It is thought that the use of fosfomycin
against Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates, will incresae because infections
of these microorganisms are difficult to treat due to various virulence factors and increasing
antibiotic resistance rates. Therefore it is important to foresee the possible effects of expanding
the use of fosfomycin. In our study, we aimed to examine the possible differences between the
virulence factors of fosfomycin-resistant and susceptible E. coli and K. pneumoniae strains
from a phenotypic and molecular point of view. A total of 112 strains, constitute of 78 E. coli
and 34 K. pneumoniae isolated from different clinical specimens at Ege University Medical
Faculty Hospital, were included in the study. The minimum inhibitory concentrations of
fosfomycin of the strains were determined by agar dilution method. 13 (16.66%) of 78 E. coli
strains and 8 (23.5%) of 34 K. pneumoniae strains were found to be resistant to fosfomycin. In
the fosfomycin resistant E. coli (13) and K. pneumoniae (8) strains, genes related to resistance
(murA, glpT, uhpT, fos), adhesion (fimH, papC, mrkD), polysaccharides in the capsule structure
(uge, ycfM, wabG), gene involved in uropathogenicity (usp) and siderophore synthesis (entb)
gene have been investigated. Then, fosfomycin-sensitive 2 E. coli and 2 K. pneumoniae strains
were made resistant by passaging into media containing increasing concentrations of
fosfomycin. Then, expression levels of virulence genes, biofilm forming capacities and growth
rates of these resistant and susceptible isogenic variants were compared. There weren't any
significant changes between the expression levels of the most of the virulence genes examined
when fosfomycin resistant and susceptible isogenic variants were compared by quantitative
real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). Biofilm forming capacities of the resistant
and susceptible variants were compared with the spectrophotometric crystal violet method and
no significant difference was found between them. Fosfomycin resistant and susceptible
variants were incubated in broth media for 10 hours, and the growth rates were compared by
measuring the absorbance at 600nm wavelength by taking samples from the tubes every 2
hours. In three of the four bacterial variant pairs examined, we observed that the susceptible
variants grew significantly faster than the resistant ones but there was no significant difference
between the susceptible and resistant variants of one strain. The data of our study indicate thatVI
although the growth rates of fosfomycin-resistant E. coli and K. pneumoniae strains are
reduced, fosfomycin resistance didn't pose any significant disadvantage in terms of virulence
factors. Therefore the use of fosfomycin should be carefully monitored.