Kordon kökenli mezenkimal kök hücrelerinin hepatosit hücrelerine farklılaştırılmasının optimizasyonu
Optimisation of the differentiation of cord originated mesenchymal stem cells into hepatocyte cells
Yazar: MELİKE ERSÖZ
Danışman: PROF. DR. ADİL ALLAHVERDİYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Hepatositler = Hepatocytes ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer nakli = Liver transplantation ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Karaciğer hastalıkları dünyanın ve Türkiye'nin ciddi sağlık problemlerinden biridir. Son yıllar da siroz, karaciğer kanseri gibi giderek artan karaciğer hastalıkları oldukça yaygın olup çoğu hepatosit fonksiyon kaybına neden olmaktadır. Günümüzde karaciğer hastalıklarının tedavisinde kullanılan çeşitli yöntemler uygulanmasına rağmen, halen karaciğer tedavisine yönelik etkin bir çözüm bulunamamıştır. Bu nedenle de son yıllar da karaciğer hastalıklarına yönelik kök hücre temelli alternatif tedavi yöntemleri geliştirilmektedir. Günümüzde karaciğer hastalıklarının tedavisine yönelik kök hücre çalışmalarında; kemik iliği, adipoz doku, kordon kanı ve kordon matrisi (Wharton jeli) gibi farklı kök hücre kaynakları kullanılmaktadır.  Çeşitli yöntemler kullanılarak izole edilen kordon kökenli (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerin yüksek çoğalma potansiyeli, düşük immünojeniteleri ve sahip oldukları farklılaşma kapasiteleri karaciğer hastalıklarının tedavisine yönelik uygulamalarda kullanılabilmesi açısından son derece umut vericidir. Karaciğer hastalıkları tedavisi için mezenkimal kök hücrelerden hepatosit hücrelerine farklılaştırmada çeşitli sitokinler, büyüme hormonları ve kimyasal ajanları içeren farklı protokoller kullanılmıştır. Ayrıca farklı kaynaklardan izole edilen mezenkimal kök hücrelerin hepatosit hücrelerine farklılaşma potansiyelleri de aynı değildir. Mezenkimal kök hücrelerin hepatosit hücrelerine farklılaşma potansiyeli bir taraftan izole edildiği kaynak çeşitliliğine bağlı olarak değişirken, diğer taraftan da farklılaşmada kullanılan hepatojenik sitokinler, büyüme hormonları ve diğer kimyasal ajanların uygulanma kombinasyonlarına bağlı olarak değişmektedir. Buna göre de şimdiye kadar mezenkimal kök hücrelerin hepatosit hücrelerine farklılaştırılmasına dayalı çeşitli çalışmalar bulunmasına rağmen, henüz daha etkin bir protokol geliştirilememiştir.
Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; insan kordon kanından, kordon veninden ve kordon matrisinden (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonunun, devamlı kültürünün ve kriyoprezervasyonunun yapılması, aynı zamanda kordon matrisinden (Wharton jeli)  elde edilen mezenkimal kök hücrelerin hepatojenik hücrelere farklılaştırılması için ilk kez olarak daha etkin protokolün geliştirilmesi ve geliştirilen bu protokole dayanarak ülkemizde ilk kez olarak kordon matrisi kökenli (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerden hepatojenik hücrelerin elde edilmesi olmuştur. Ayrıca, doku mühendisliğinde kullanılmak üzere titanyum dioksit, titanyum gümüş, gümüş ve çinko gibi çeşitli nanopartiküllerin ilk kez olarak kordon matrisinden elde edilen mezenkimal kök hücreler üzerindeki etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 
Deneylerde; farklı izolasyon  (Ficoll, enzimatik, eksplant), mikroskobik, kültür, hücre sayımı ve canlılık tayini 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT), histolojik (Periyodik Asit Shift Boyası),  moleküler (Eş Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ve Flow Sitometrik yöntemler kullanılmıştır. Veriler, SPSS version 15.0 for Windows programı ile değerlendirilerek ve p < 0,05 değeri istatistiki olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Elde edilen mikroskobik ve Flow Sitometrik analizler sonucunda; kordon matrisinden (Wharton jeli) eksplant yöntemiyle kısa sürede, fazla miktarda, enzim kullanmadan sağlıklı mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu gerçekleştirildi. Histolojik ve moleküler sonuçlar doğrultusunda; 20 ng/ml bFGF, 50 ng/ml HGF, 10 ng/ml FGF-4, 20 ng/ml EGF, 1 µM/L Deksamethazon, 5 mM Nikotinamid, 50 mg/ml ITS, 20 mM Napiruvat içeren % 10 FBS eklenmiş 1:1 oranında ki DMEM-F12 (Fenol red'siz)-IMDM medyum farklılaştırma kültür ortamı olarak, 10 ng/ml FGF-4, 20 ng/ml HGF, 50 ng/ml OSM, 5 mM Nikotinamid, %  1 DMSO, 50 mg/ml ITS, 1 µM Deksamethazon içeren %10 FBS eklenmiş 1:1 oranında ki DMEM (Düşük Glukozlu Fenol red'siz)- William's E medyum olgunlaşma kültür ortamı olarak kullanılarak  geliştirdiğimiz bu yeni protokol ile en etkin hepatojenik farklılaşma gerçekleştirildi. Diğer protokollerle karşılaştırıldığında, geliştirdiğimiz bu etkin yeni protokol ile elde edilen hepatojenik hücrelerin, kontrol (mezenkimal kök hücre) ve hepatosit (Hep 3B) hücre gruplarına göre; yapılan Eş Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu sonucunda albumin (ALB) ve alfa feto protein (AFP) gen ekspresyon düzeylerinin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde en çok eksprese olduğu belirlendi (PANAVO ***<0,001). Sitokeratin 18 (CK-18) gen ekspresyonunun ise, hepatosit (Hep 3B) hücre grubuna kıyasla yaklaşık 4 kat arttığı, kontrol (mezenkimal kök hücre) grubuna kıyasla yaklaşık 2 kat arttığı görüldü. Sonuçta mevcut protokollerden farklı olarak geliştirilen bu yeni protokol ile, kordon matrisi kökenli mezenkimal kök hücrelerden hepatosit özelliklerine daha çok sahip hepatojenik hücrelerin farklılaştırılması gerçekleştirildi. Ayrıca, MTT sonuçları da; titanyum, titanyum gümüş, gümüş ve çinko nanopartiküllerinin yüksek dozlarının kordon kökenli mezenkimal kök hücreler için toksik etki yaptığı ve hücrelerin proliferasyonunu azalttığı belirlendi. Kordon kökenli mezenkimal kök hücrelerde titanyumun EC50 değeri 20.58, titanyum gümüşün EC50 değeri 33.3, gümüşün EC50 değeri 12.11, çinkonun EC50 değeri 3.1 'dir. EC50 değeri en yüksek olan titanyum gümüş nanopartikülünün toksik etkisinin en az olmasından dolayı kordon matrisinden (Wharton Jeli) elde elde edilen mezenkimal kök hücreler için kullanımın en uygun olduğu tespit edildi.
Yapılan çalışmalar sonucunda karaciğer hastalıklarına yönelik kök hücre çalışmaları alanında ilk kez olarak kordon matrisi kökenli (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerin hepatojenik (hepatosit benzeri) hücrelere dönüştürülmesinde en etkin protokol geliştirilmiş oldu. Geliştirdiğimiz bu yeni protokol ile ülkemizde ilk kez olarak kordon matrisi kökenli (Wharton jeli) mezenkimal kök hücrelerden hepatojenik (hepatosit benzeri) hücreler elde edilmiş oldu. 
Sonuç olarak; kordon matrisi kökenli mezenkimal kök hücrelerin hepatositlere farklılaştırılması için geliştirilen bu yeni protokol diğer kaynaklardan elde edilen mezenkimal kök hücreler içinde uygulanabilir. Bu yöntemle elde edilen hepatojenik hücreler karaciğer hastalıklarında hücre temelli tedavilerde, aynı zamanda da doku mühendisliğinde yeni ilaçların geliştirilmesinde ve toksisite araştırılmalarında, ayrıca toksik olmayan konsantrasyonları belirlenmiş olan titanyum, titanyum gümüş, gümüş ve çinko nanopartiküllerinin de ileri de ilaç, aşı ve doku mühendisliğinin çeşitli alanlarında kullanılabileceği önerilebilir.

Abstract:
Liver diseases are amongst the crucial health problems the world and Turkey face. Liver diseases such as cirrhosis and liver cancer have become common in the recent years and they cause a loss in hepatocyte functions. Despite the number of methods used to treat liver diseases, an effective treatment hasn't yet been found. Therefore, alternative methods based on stem cells are currently being investigated. Some of the commonly used stem cell components are bone marrow, adipose tissue, cord blood and cord matrix (Wharton gel). The isolated mesenchymal stem cells obtained by using numerous methods present give promising results to cure liver diseases with their high reproduction potential, low immünogenecity and capacity to differentiate. In order to treat patients with liver diseases; different protocols containing cytokines, growth hormones and chemical agents   were used to differentiate mesenchymal stem cells into hepatocyte cells. Furthermore, mesencyhmal stem cells isolated by using different origins don't have the same potential to differentiate into hepatocyte cells. The potential for mesencyhmal stem cells to differentiate into hepatocyte cells is a result of not only the type of the source being used to isolate, but also the combination of cytokines, growth hormones and chemical agents involved in the process. As a result of this, until now an effective protocol hasn't been developed to differentiate mesencyhmal stem cells into hepatocyte cells despite the ongoing investigations.   
The purpose of this study is to investigate a relatively effective new protocol to differentiate mesencyhmal stem cells into hepatocyte cells using human cord blood, cord vein and cord matrix (Wharton gel), and continuously culture and cryopreservation which will be the first time for this kind of study to be conducted in Turkey. The additional aim was to investigate the effect of the nanoparticles such as titanium dioxide, titanium silver, silver and zinc on mesencyhmal stem cells obtained from cord matrix in order to be used in tissue engineering.
The methods used in the experiments were; different isolation (Ficoll, enzymatic, explant), microscopic, culture, cell count and viability analysis 3 - (4,5-dimethyltriazole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT),  histologically (Periodic Acid Shift Dye), molecular (Real Time Polymerase Chain Reaction) and Flow cytometric. The data was evaluated using SPSS version 15.0 for Windows and p < 0,05 was taken as the statistically significant.
As a result of the microscopic and flow sytometric analysis, surplus number of healthy mesencyhmal stem cells were isolated from cord matrix using explant method in a short period of time without using enzymes. According to the histological and molecular results, with this new protocol; using 20 ng/ml bFGF, 50 ng/ml HGF, 10 ng/ml FGF-4, 20 ng/ml EGF, 1 µM/L  Dexamethasone, 5 mM Nicotinamide, 50 mg/ml ITS, 20 mM Napyruvate containing 10% FBS added 1:1 ratio DMEM-F12 (Non phenol red)-IMDM as the differentiating culture medium, and 10 ng/ml FGF-4, 20 ng/ml HGF, 50 ng/ml OSM, 5 mM Nicotinamide, 1% DMSO, 50 mg/ml ITS, 1 µM Dexamethasone containing 10% FBS added 1:1 ratio DMEM (Non low glucose phenol red)- William's E as the maturing culture medium, the most effective hepatogenic differentiation was conducted. Comparing with the other protocols, the hepatogenic cells obtained by using this new protocol in comparison to the control (mesenchymal stem cell) and hepatocyte (Hep 3B) cell groups; Real Time Polymerase Chain Reaction made as a result of albumin (ALB) and alpha fetoprotein (AFP) gene expression levels in a statistically significant way to express that most were determined (PANAVO *** <0.001). Cytokeratin 18 (CK-18) gene expression has increased four times more relative to the hepatocyte (Hep 3B) cell group and twice more than the control (mesencyhmal stem cells). Consequently, dissimilar to the previous protocols, this new one enabled the differentiation of a more hepatocyte characterized hepatogenic cells from cord matrix originated mesencyhmal stem cells. Additionally, MMT results revealed that titanium, titanium silver, silver and zinc nanoparticles' overdose has a toxic effect on cord originated mesencyhmal stem cells as well as decreasing the proliferation. In cord originated mesencyhmal stem cells titanium EC50 is 20,58, titanium silver EC50 is 33,3, silver EC50 is 12,11 and  zinc EC50 is 3,1. Due to the lowest nanoparticle toxic effect, titanium silver with the highest EC50 was determined as the most suitable application for the cord matrix (Wharton gel) originated mesencyhmal stem cells. 
In consequence of the experiments conducted, the most effective protocol so far to differentiate the cord matrix originated mesencyhmal stem cells into hepatogenic (hepatocyte like) cells was developed. 
In conclusion, this new protocol differentiating cord matrix originated mesencyhmal stem cells into hepatocyte cells can be applied to the mesencyhmal stem cells obtained from other origins. The acquired hepatogenic cells by using this method can be used in cell based treatment of the liver diseases as well as in tissue engineering to develop new medicine, toxicity research, and also enabling the non-toxic concentrations of titanium, titanium silver, silver and zinc nanoparticles to be used as medicine, vaccine and in different fields of tissue engineering.