Çinko oksit nanoparçacıklarının (ZnO-NP) insan dermal fibroblast hücreleri üzerindeki etkisinin proteomiks yaklaşımla değerlendirilmesi
Investigation of the effects of zinc oxide nanoparticles (ZnO-NP) on human dermal fibroblast cells by proteomics approach
Yazar: ÖZAL MUTLU
Danışman: DOÇ. DR. NAGİHAN GÜLSOY
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Çinko oksit nanoparçacıkları (ZnO-NP) günlük hayatta kozmetik ve güneş kremlerinde ayrıca giysi, boya, elektronik, gıda paketleme, biyotıp ve sensörlerde en çok kullanılan nano boyutlardaki parçacıklardandır. Yüzey alanı/hacim oranı, gelişmiş sağlamlık, elektrik ve manyetik özellikleri ve biyolojik aktiviteleri gibi nanoparçacıklara özgü özelliklerinden dolayı yığın (bulk) formlarına göre farklılık gösterirler. Nanoparçacıkların karakteristik özellikleri ve geniş uygulama alanlarının olmasından dolayı, çevre ve insan üzerinde etkileri bulunmakla birlikte, kısa ve uzun vadede toksikolojik etki yaratabilirler. Nanoparçacıklar tarafından ortaya çıkarılan toksisite mekanizmalarını aydınlatmak ve hücresel yolaklar arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak için detaylı mekanistik toksikoloji çalışmalarına gerek vardır. 
Bu tez kapsamında, parçacıklara verilen hücresel cevabın belirlenmesi amacıyla nano boyutlardaki ZnO'nun insan dermal fibroblast hücrelerindeki etkisi proteomiks yaklaşımla değerlendirilmiştir. Proteom profili öncesi ZnO nanoparçacıklarının transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile parçacık boyut dağılımı ve morfolojisi, ZetaSizer ile zeta potansiyeli ve hidrodinamik boyutu ve örnek saflığı, kristal boyutu ve şeklinin belirlenmesi amacıyla da X-ışını difraktometresi (XRD)  analizleri gerçekleştirilmiştir. Uygulama dozu ve parçacıkların sitotoksik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla, Tripan mavisi dışlama testi, MTT, LDH ve ROS analizleri yapılmıştır.  Proteomik profilleme için 15 µg/ml nano-ZnO, 24 saat uygulanmış ve ardından proteomik profil LC-MS/MS ile belirlenmiştir. Elde edilen proteom bilgisi çeşitli biyoinformatik araçlar kullanılarak değerlendirilmiştir. 
Karakterizasyon sonuçlarına göre ZnO nanoparçacıkları yaklaşık olarak 60-70 nm boyutlarında ve genel olarak tane şeklindedirler. Ortalama olarak 105 nm hidrodinamik boyuta ve pozitif zeta potansiyeline sahiptirler.  XRD sonuçlarına göre örnek saf çinko oksit olup hekzagonal wurtzite kristal yapısına sahiptir. Sitotoksisite çalışmaları 10 µg/ml konsantrasyondan sonra hücre canlılığının düşmeye başladığını ve 50 ve 100 µg/ml nano-ZnO konsantrasyonun da ise hücre ölümünün çok yüksek seviyeye ulaştığını göstermektedir. Proteomiks sonuçlarına göre oksidatif stresten dolayı Nrf-2/ARE yolağının tamamen aktive olarak antioksidan/detoksifikatif proteinlerin üretildiği, ısı şoku proteinlerinin (HSP70/40 and 90), mRNA katabolizması ve ubikuitinasyon/proteazomal parçalanma yolaklarının aktivasyonu ile katlanmamış protein tepkisinin ortaya çıktığı, DNA tamiri, pro-inflamasyon, glikoliz ve pro-apoptotik yolaklarda görev alan proteinlerin ifadelerinin arttığı belirlenmiştir. Buna karşı, hücre canlılığı, çoğalması ve anti-apoptotik rolleri olan proteinlerin ifadesi ise azalmıştır.
Tüm sonuçlar değerlendirildiğinde, ZnO nanoparçacıklarına karşı hücresel hasarın giderilmesi ve oksidatif stresten korunma amacıyla dermal fibroblast hücreleri temel olarak antioksidan savunma mekanizmasını, endoplazmik retikulum stres tepkisini ve DNA tamir mekanizmalarını devreye sokarak cevap vermişlerdir. Bu çalışmanın çıktıları nanoparçacıkların yan etkilerinin giderilmesi ve onların daha biyouyumlu hale getirilmeleri hususunda yapılacak olan ileriki çalışmalara kaynak sağlayacaktır.

Abstract:
Zinc oxide nanoparticles (ZnO-NP) are one of the mostly used nanoscale particles in daily life cosmetics and sun screens, also in clothing, paints, electronics, food packaging, biomedicine and sensors.  Unique properties of nanoparticles such as large surface area /volume ratio, enhanced hardness, electro and magnetic properties and biological activity make them different from their bulk forms. Due to their characteristics and widespread applications of nanoparticles, have effects on environment and humans and can have considerable short and long term toxicological effects. Elucidation of the mechanisms of toxicity caused by nanoparticles and to reveal the relationship between cellular pathways requires detailed mechanistic toxicology studies.  
In this thesis, effects of nano scale ZnO on human dermal fibroblast cells was studied by proteomics approach to identify cellular response to particles. Before proteom profiling, ZnO nanoparticles was characterized by transmission electron microscope (TEM) to state particle size distribution and morphology, by ZetaSizer to reveal zeta potential and hydrodynamic particle size and analyzed by X- ray diffraction (XRD) to characterize sample purity, crystalline size and structure.  To assess application dose and cytotoxic feature of particles, Trypan blue exclusion test, MTT, LDH and ROS assays were carried out. For proteome profiling 15 µg/ml nano-ZnO for 24 hours were applied and then proteome profile was determined by LC-MS/MS. Results of proteom were analyzed by different kinds of bioinformatics tools  
According to the characterization results, ZnO nanoparticles were about 60-70 nm size and had mostly grain shape. They had a positive zeta potential with average 105 nm hydrodynamic sizes. XRD result revealed the sample was pure zinc oxide and had hexagonal wurtzite crystal structure. Cytotoxic studies showed decrease in cell viability by 10 µg/ml and cell death become more severe at higher doses which were 50 and 100 µg/ml nano-ZnO concentrations. Proteomics profiling revealed that due to oxidative stress, production of antioxidant/detoxification proteins by completely activation of Nrf-2/ARE pathway, unfolded protein response by activation of heat shock proteins (HSP70/40 and 90), mRNA catabolic process and ubiquitination/proteasomal degradation pathways, up-regulation of  proteins in DNA repair, pro-inflammatory process, glycolysis and pro-apoptotic process. Besides this, proteins responsible from cell proliferation, survival and anti-apoptotic process were found to be down-regulated. 
When all results are evaluated, dermal fibroblasts response to ZnO nanoparticles by activation of antioxidant defence mechanisms, endoplasmic reticulum stress response and DNA repair mechanisms to protect from oxidative stress and recover cellular damage. These outcomes of this work will help to further studies for elimination of side effects of nanoparticles and makes them more biocompatible.