CUL4B geninin yaşa bağlı katarakt ile ilişkisinin incelenmesi
Investigation of CUL4B in association with age-related cataract
Yazar: CEM KARAOSMANOĞLU
Danışman: PROF. DR. SALİHA HANDAN YILDIZ
Afyonkarahisar Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Genetik = Genetics ; Genler = Genes ; Göz hastalıkları = Eye diseases ; Katarakt = Cataract ; RNA = RNA ; Transfeksiyon = Transfection ; Yaş faktörleri = Age factors ; Yaşlılar = Aged

Özet:
Yaşa Bağlı Katarakt, yaşlı nüfus arasında görüş kaybı ve bozukluğunun en yaygın nedeni olarak bilinmektedir. Lens epitel hücrelerinin apoptoza uğraması hücresel bazda kataraktın oluşumu için temel bir olaydır. CUL4B, cullin-RING E3 ligaz sisteminin temel bir bileşeni olarak hedef proteinlerin übikütinasyon ve proteozomal degredasyonlarını yürüterek birçok hücresel olayda görev yapar. CUL4B geninin Yaşa Bağlı Katarakt ile ilişkisi bilinmemektedir. Bu nedenle, Yaşa Bağlı Katarakt hastalarında ve HLE-B3 hücre hattındaki CUL4B gen ifadesini inceleyerek, apoptoz üzerindeki etkilerini araştırdık.
Anteriör Lens Kapsülü örnekleri, oksidatif stresi taklit etmek için farklı konsantrasyonlarda H2O2 ile muamele edilmiş HLE-B3 hücre hattı örnekleri ile muamele edilmemiş kontrol örneklerinden total RNA izolasyonu gerçekleştirdik. CUL4B gen ifadesini kantitatif Real-Time PCR (RT-qPCR) yöntemi, testlerini WST-1 analizi ile yaptık. CUL4B genine özgü susturucu RNA (siRNA) kullanarak CUL4B gen ifadesini baskıladık. Deney gruplarında Bcl-2, Kaspaz 3, Bax ve Bid apoptotik markırlarının protein düzeyindeki ifadelerini Western blot analizi ile belirledik. 
CUL4B gen ifadesinin hem anteriör lens kapsül örneklerinde (p<0,0001) hem de H2O2 ile muamele edilmiş örneklerde, kontrole göre anlamlı düzeyde (p<0,05) azaldığını belirledik. H2O2 ile muamele edilmiş örneklerde CUL4B protein ifadesi kontrole göre anlamlı düzeyde azalmıştır (p<0,01). HLE-B3 hücre hattında siRNA aracılığıyla, CUL4B ifadesini hem mRNA (p<0,01) hem de protein düzeyinde (p <0,001) yüksek oranda inhibe ettik. CUL4B siRNA kullanılmış örneklerde, Bcl-2 ve Kaspaz 3 proteinlerinin ifadesi azalmıştır (p<0,01). 
Sonuç olarak, elde ettiğimiz bulgular CUL4B gen ifadesinin baskılanmasının lens epitel hücrelerinde apoptoza sebep olabileceğini göstermektedir. Yaşa Bağlı Katarakt gelişiminde ve tedavisinde CUL4B geninin etkilerinin anlaşılması için çalışma verilerimizin yapılacak yeni araştırmalara ışık tutacağını düşünmekteyiz.

Abstract:
Age-related cataract (ARC) is the most common reason for visual impairment and blindness in elderly people. Apoptosis of lens epithelial cells is a well-known cellular event in ARC. Cullin-4B (CUL4B) is a core component of the Cullin-RING E3 ligase complex, which plays an important role in various biological processes by mediating the ubiquitination and proteasomal degradation of target proteins. However, the role of CUL4B in ARC is unclear. Therefore, we analyzed CUL4B expression in patients with ARC and in the HLE-B3 cell line and its effects on apoptosis. 
We extracted total RNA from anterior lens capsules of patients with ARC and from HLE-B3 cells treated with different concentrations of H2O2 to mimic oxidative stress and untreated HLE-B3 cells. We detected CUL4B expression using quantitative real-time PCR (qRT–PCR). We determined cell viability using the WST-1 assay. We performed siRNA transfection to silence CUL4B expression in the cell line. We assessed the protein levels in H2O2-treated and untreated cells, knockdown of CUL4B, and the effect of CUL4B knockdown on protein levels of apoptotic markers Bcl-2, Caspase-3, Bax, and Bid through western blot analysis. 
CUL4B was downregulated in anterior lens capsules (p<0.0001) and H2O2-treated HLE-B3 cells (p<0.05). CUL4B levels were significantly lower in H2O2-treated HLE-B3 cells than in untreated cells (p<0.01). CUL4B was significantly knocked down at the mRNA (p<0.01) and protein levels (p<0.001) in HLE-B3 cells. Bcl-2 and Caspase-3 were significantly downregulated (p<0.01) in the knockdown group. 
Together, these findings show that silencing of CUL4B may promote apoptosis in lens epithelial cells. Our study may help understand the role of CUL4B in ARC pathogenesis and treatment.