Şap virusu üretiminin dolgulu reaktörlerde araştırılması
Investigation of fmd virus production in packed-bed reactors
Yazar: GENCAY ERGİN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, dolgulu yataklı biyoreaktörde mikrotaşıyıcılı hücre kültürü teknolojisi kullanılarak Şap virusu üretimi incelenmiştir. Çalışmada, dokunmamış poliester fabrik (NWPF) yapı üzerinde üretilen BHK-21 hücreleri ve O tipi Şap virusu kullanılmıştır.Çalışmanın ilk aşaması durgun ortamda, NWPF diskli ve disksiz 24 gözlü TCPS kaplarında gerçekleştirilmiştir. Toplam hücre sayısı ve özgül üreme hızının (?) belirlenmesi için MTT analizi kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan BHK-21 hücrelerinin özgül üreme hızları diskli ve disksiz kültürlerde sırasıyla, 0,038 sa-1 ve 0,046 sa-1 olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, ortalama özgül glikoz tüketim hızı (qglu) ve ortalama özgül laktat üretim hızları (qlac) diskli kültürler için (0-96 saat aralığı) sırasıyla, 3,22x10-10 mmol glikoz hücre-1 sa-1 ve 5,21x10-10 mmol laktat hücre-1 sa-1; disksiz kültürler için (0-48 saat aralığı) ise 3,42x10-10 mmol glikoz hücre-1 sa-1 ve 5,08x10-10 mmol laktat hücre-1 sa-1 olarak hesaplanmıştır. Üretilen virusların 146 S miktarlarının, 96 saat inkübe edilen diskli kültürlerde 48 saatte doygunluğa ulaşan disksiz kültüre göre 2 kat daha fazla olduğu belirlenmiştir.Çalışmanın ikinci aşaması 0,5 L çalışma hacimli dolgulu yataklı biyoreaktörde gerçekleştirilmiştir. Çalışmalarda başlangıç hücre sayısı, taşıyıcı konsantrasyonu ve kültür süresinin hücre ve virus verimi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Hemositometrik yöntemle hücre sayımı pratik olarak mümkün olmadığı için hücre sayıları indirek yöntemler kullanılarak tahmin edilmiştir. Bu amaçla besiyerinin kimyasal analizleriyle glikoz ve laktata ait özgül hızlardan yararlanılmış ve ayrıca dinamik yöntemle oksijen tüketim hızının belirlenmesi ile tahmini hücre sayıları belirlenmiştir. Sonuçlar dolgulu yataklı reaktörde virus titrelerini etkileyen en önemli faktörün başlangıç hücre sayısı olduğunu göstermiştir. Maksimum 146 S miktarı (4,20 ?g/mL), 5x105 hücre/mL ile başlanan ve virus inokulasyonundan önce 48 saat inkübe edilen kültürlerden elde edilmiştir. Bu değer monolayer kültüre göre 2,5 kat ve süspanse kültürlere göre ise 5 kat daha yüksek olarak bulunmuştur.Çalışma sonunda elde edilen bulgulardan dolgulu yataklı biyoreaktörlerin çalışma hacminin 5-20 L kapasiteye çıkartılması ve biyoreaktör işletim sisteminin kesikli kültür yerine perfüzyon sistemine çevrilmesiyle BHK-21 hücresi ve Şap virusu üretimi için optimum koşulların sağlanacağı düşünülmektedir. Böylece Şap virusu üretimi, daha az işçilik ve malzeme maliyeti olan, kolay çalıştırılabilir, kontaminasyon riski düşük ve daha az enerji tüketen avantajlı bir sistemle, yüksek verimde gerçekleştirilebilecektir.

Abstract:
In this study, the production of Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) was investigated by the microcarrier cell technology in a packed bed bioreactor. For this purpose, cell culture studies were carried out by using BHK-21 cells on non wowen polyester fabric (NWPF) discs. The FMD virus serotype O was used to infect the cells growing on discs.The first part of the study was conducted in stationary cultures using 24-well TCPS plates in the presence and absence of NWPF discs. MTT staining was used for the quantitative estimation of total cell number and the specific growth rate (?). The specific growth rates of BHK-21 cells in the presence and absence of NWPF discs were found 0,038 h-1 and 0,046 h-1 respectively. Also, the average specific glucose consumption (qglu) and the average specific lactate production (qlac) rates were calculated as 3,22x10-10 mmol glucose cell-1 h-1 and 5,21x10-10 mmol lactate cell-1 h-1 in NWPF discs cultures and 3,42x10-10 mmol glucose cell-1 h-1 and 5,08x10-10 mmol lactate cell-1 h-1 in disc-free cultures, respectively. 146 S yields showed quantity of produced virus were about 2 times higher in the NWPF discs containing cultures at the 96 hours than the disk free culture at the 48th hours that BHK cell reached confluency.The second part of the study, were carried out in the packed bed bioreactor which has 0,5 L working volume. The effects of initial cell density, microcarrier concentration and incubation time on cell and virus yields were investigated. Since determination of the cell yield by hemocytometric counting was inapplicable it was estimated by indirect methods. Indirect methods of cell estimation involve the chemical analysis of a culture media for glucose and lactate concentrations and a measurement of oxygen consumption rate via the dynamic method. Results shown that, initial cell density was the most important factor on virus titers in packed bed reactors; The maximum 146 S yields of FMDV (4,20 ?g/mL) was obtained when cells were seeded at 5x105 cells/mL and incubated for 48 hours before infection with the virus and this value 2,5 and 5-fold higher than that of monolayer and suspension cultures of FMDV, respectively.Hopefully, the improvement of the packed bed bioreactor in pilot scale (5-20 L working volume) and changing the operation mode from the batch culture to perfusion culture will provide an optimal growth condition for both of the BHK-21 cells and FMD viruses. Furthermore, this method also provide high-yield production of FMDV with advantages of reduction in the cost of labor and materials, easy-to-operate, low contamination risk and low energy consumption.