Everolimus ile immunsuprese edilen sıçanlarda yapılan kolon anastomozlarında kök hücrenin anastomoz üzerine etkileri: 
Deneysel çalışma
Effects of stem cell on anastomosis in the colon anastomosis done in everolimus-immunsupressed rats: Experimental study
Yazar: EMRE KARAKAYA
Danışman: PROF. DR. SEDAT YILDIRIM
Başkent Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Genel Cerrahi = General Surgery
Dizin: Anastomoz = Anastomosis ; Anastomoz-cerrahi = Anastomosis-surgical ; Everolimus = Everolimus ; Kolon = Colon ; Kök hücreler = Stem cells ; İmmünosupresif ajanlar = Immunosuppressive agents ; İmmünosüpresyon = Immunosuppression

Özet:
Gastrointestinal sistem cerrahisi, bening veya malign nedenlerden dolayı yoğun olarak yapılan ameliyatlardır. Gastrointestinal sistem ameliyatları sonrası görülen anastomoz kaçakları önemli mortalite ve mobiditeye neden olmaktadır. Anastomoz kaçaklarının azaltılması ve yönetimi konusunda uzun yıllardan beri yapılan birçok çalışma vardır.
Solid organ nakli yapılan hastalara, nakledilen organa karşı gelişen immun reaksiyonu önlemek ve greftin uzun süreli sağ kalımını sağlamak amacıyla immunsupresif tedaviler verilmektedir. İmmunsupresif tedavi alan bu hastalara, organ nakli cerrahisi sırasında veya sonrasında, gastrointestinal sistem ameliyatları yapılabilmektedir. İmmunsüpresif tedaviler sıklıkla; kalsinörin inhibitörleri, kortikosteroid ve antiproliferatif ajanların tekli veya kombine şeklinde kullanılması şeklindedir. Kalsinörin inhibitörlerinin kullanılamadığı durumlarda genellikle mTOR inhibitörlerinin yer aldığı tedavi protokolleri tercih edilmektedir. mTOR inhibitörleri, kalsinörin inhibitörlerine göre daha az nefrotoksik olmasına ve daha güçlü immunsupresyon sağlamasına rağmen yara iyileşmesinde gecikme, infertilite, pnömonitis ve trombositopeni gibi yan etkileri vardır. mTOR inhibitörlerinin, kalsinörin inhibitörlerine göre yara iyileştirmesini belirgin oranda geciktirdiği birçok çalışmada gösterilmiş ve mTOR inhibitörlerinin yara iyileşmesindeki olumsuz etkilerini azaltan çeşitli tedaviler denenmiştir. Mezenkimal kök hücre tedavisinin, çoklu dokulara farklılaşma özelliklerinden ve yeni damar oluşumunu arttırdığından ötürü yara iyileşmesine pozitif etkileri olduğu ve anastomoz kaçaklarını azalttığı gösterilmiştir. Bu çalışmada; mTOR inhibitörü ile immunsüpresyon sağlanan sıçanlarda, kolon anastomuzunda adipoz dokudan elde edilen kök hücrenin yara iyilişmesi üzerine olan etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmada 60 adet Sprague-Dawley cinsi erkek sıçan kullanıldı. Her biri 14 adet sıçan bulunduran 4 grup oluşturuldu. Grup 1: Kontrol, Grup 2: Kök hücre, Grup 3: Everolimus, Grup 4: Everolimus + Kök hücre. 4 adet sıçan ise kök hücre eldesi için kullanıldı. 4 ana gruptan 3. ve 4. gruplar laparotomiden 7 gün öncesinden itibaren mTOR inhibitörü(everolimus) ile immunsuprese edildi.  Tüm gruplardaki sıçanların inen kolonu tam kat kesildikten sonra anastomoz yapıldı. İkinci ve dördüncü gruplarda anastomoz bölgesine subserozal kök hücre enjeksiyonu yapıldı. Tüm gruplar eşit şekilde iki alt gruba ayrıldı. Alt gruplardan bir tanesi 4. gün, diğeri ise 7. gün sakrifiye edildi. Tüm gruplarda vücut kitle kaybı, anastomoz patlama basıncı, doku hidroksiprolin düzeyi ölçümü ve histopatolojik değerlendirme yapıldı. İmmünohistokimyasal olarak; çalışma grubunda DiI ile işaretli adipoz kökenli kök hücrelerin takibi için floresan mikroskopta inceleme yapıldı.
Deney sonucunda dördüncü günde sakrifiye edilen hayvanlar dikkate alındığında uygulama grupları arasında kilo kaybı dağılımı açısından istatistiksel olarak önemli bir farklılık saptanmadı (p>0,05).  Ancak, Grup 3 de ortanca kilo kaybı yaklaşık %13,5 olarak gözlenirken grup 1 yaklaşık %5,4 oldu. Bununla birlikte 7.günde Grup 3'te ortanca kilo kaybı %13,4 olarak gözlenirken Grup 1 de yaklaşık %1,3 olmuştur (p<0,001). Karın içi yapışıklığı açısından gruplar değerlendirildiğinde dördüncü günde daha fazla yapışıklık görüldü. Grup 2, 3 ve 4, Grup 1 ile ayrı ayrı karşılaştırıldığında hafif dereceli yapışıklıklarda azalma gözlenirken, orta ve ileri dereceli yapışıklıkların arttığı görüldü. Ancak Grup 3 ile 4 karşılaştırıldığında yapışıklık skoru ve oranın kök hücre verilmesi ile Grup 4'de daha az olduğu gözlendi. Yedinci günde gruplar arasında yapışıklık olarak bir fark görülmedi. Yedinci günde sakrifiye edilen sıçanlarda hidroksiprolin düzeyinin dördüncü günde sakrifiye edilen hayvanlara göre daha yüksek olduğu görüldü. Bununla beraber 4 ve 7. günde kök hücre uygulaması Grup 2'de Grup 1'e göre doku hidroksiprolin seviyesinde artmaya neden olurken, immunsuprese edilen Grup 3'te aynı etkiye neden olmadı. Everolimus verilmesi sıçanlarda dördüncü günde doku hidroksiprolin seviyesinde azalmaya neden oldu. Dördüncü günde, kök hücre uygulaması Grup 2 ve Grup 4'te patlama basıncında artışa neden oldu (p <0.05). Yedinci günde bu farklılık gözlenmedi. Histopatolojik inceleme sonucunda reepitelizasyon, iskemik nekroz, fibrozis ve muskuler tabakada bozulma açısından farklılık saptanmadı. Vasküler proliferasyon açısından yapılan değerlendirmede 4. gün sakrifiye edeilen sıçanlar arasında anlamlı farkılık saptanmazken (p=0,226), 7. günde kök hücre verilen Grup 2 ve Grup 4'te daha fazla vasküler proliferasyon saptandı (p=0,003).
Everolimus ile immunsuprese edilen ve edilmeyen sıçanlarda yapılan kolon anastomozuna subserozal kök hücre enjeksiyonunun yapılması anastomoz dayanıklılığını artırmakta, kilo kaybını azaltmakta, vasküler proliferasyonu arttırmaktadır. Riskli gastrointestinal anastomozlarda, adipoz doku kaynaklı kök hücre uygulaması uygun bir yöntem olabilir.

Abstract:
Gastrointestinal system surgery operations have been applied intensively due to the malignant or benign causes. Anastomosis leakages that are seen after the gastrointestinal system operations cause important mortality and morbidity. There have been a lot of studies on the reduction and management of anastomosis leakage for many years. 
After the solid organ transplantation, to prevet the formation of the immune reaction against to transferred organ and to provide long-term survival of the graft, immunosuppressive treatment protocols are applied to the patients. Gastrointestinal system operations can be performed during or after the organ transplant surgery in these patients receiving immunosuppressive treatment. Commonly applied immunosuppressive treatment protocols are, calcineurin inhibitors, corticosteroids and the single or multiple combinations of the antiproliferative agents. When the calcineurin inhibitors can not be used, treatment protocols with m- TOR inhibitors have been preferred. Although m- TOR inhibitors are less nephrotoxic than the calcineurin inhibitors and they provide stronger immunosuppression, they have adeverse effects like delay in wound healing, infertility, pneumonitis and thrombocytopenia. However, several treatments have been tried to reduce the adverse effects of mTOR inhibitors in wound healing. Mesenchymal stem cell therapy has positive effects on wound healing and it decreases the anastomosis leakages  due to the differentiation characteritics to multiple tissues and the increased formation of new blood vessels. In this study, it is aimed to investigate the effect of the stem cells that are derived from adipose tissue on wound healing in rats that are immunosuppressed with m-TOR inhibitors.
In this study, 60 Sprague- Dawley male rats were used. Four groups of 14 rats each were formed. Also 4 rats were used to obtain the stem cells. We immunsupressed the third and the fourth groups of four main groups with everolimus everyday from 7 days prior to laparatomy. Anastomosis was performed, after the descending colon of all the rats in all groups was completely cut. In the second and forth groups we performed subserosal stem cell injection into the anastomotic region. All of the groups were randomly divided into two equal subgroups . One of the subgroups of each main groups were sacrified on the 4th day, and the other ones were sacrificed on the 7th day. In each groups, the bursting pressure of the colonic anastomosis, tissue hydroxyproline level measurement and histopathological evaluation were done. Immunohistochemicaly, florescent microscopic examination was done for the following of the DiI marked adipose derived stem cells in the study group. 
As a result of the analysis, there is no statistically siginificant difference in the weight loss distribution between the experimental groups when considering the animals that are sacrified on the 4th day (p= 0,013). When all the groups are evaluated in terms of adhesion parameters, minimal adhesion was observed in the 85,7 % of the animals that are sacrified on the 7. day and that are in the groups of everolimus+ stem cell while indermediate adhesion was observed in the 14,3 % of them. Adhesion rate on the 4th day is significantly higher than the adhesion rate on the 7th day. The effect of the sacrifice day on the level of the hydroxyproline is statistically siginficant at 95 % confidence level. (p< 0,001). When we look, it is observed that the average hydroxyproline levels of the animals that are sacrified on the 7th day are higher than the average hydroxyproline levels of the animals sacrified on the 4th day. When the animals sacrified on the 4th day are considered, there is a statistically significant difference in terms of the average of the bursting pressures between the Control and Stem Cell groups ( p= 0,002) and between the Stem Cell and Everolimus groups ( p<0,001). When evaluating the results of the analysis of reepithelization, ischemic necrosis, fibrosis and the deterioration of the muscular layer, no significant difference was determined. When evaluating the vascular proliferation results, there was no significant difference between the groups that were sacrified on the 4th day (p= 0,226) , whereas there was a significant difference among the groups that were sacrified on the 7th day ( p= 0,003). 
Subserosal stem cell injections to colon anastomosis in immunosupressed rats with everolimus and in non- immunosuppressed rats increase the anastomotic resistance,  decrease the weight loss and increase the vascular proliferation. In the risky gastrointestinal system anastomosis, adipose tissue derived stem cell application may be an appropriate method.