Kitlesel ölüm gözlenen bal arıları ve ballarında modifiye edilmiş QuEChERS ekstraksiyon yöntemi kullanılarak LCMS/MS ve GC-MS/MS kütle spektrometresi ile pestisit kalıntılarının belirlenmesi
Determination of pesticide residues by LCMS/MS and GC-MS/MS spectrometry using the modified QuEChERS extraction method in mass mortalities observed honey bees and honey
Yazar: ORHAN DİNÇAY
Danışman: PROF. DR. HASAN SUNGUR CİVELEK
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Ziraat = Agriculture ; Zooloji = Zoology
Dizin: Bal = Honey ; Bal arısı = Honey bee ; Kalıntılar = Residues ; Pestisit artıkları = Pesticide residues

Özet:
Dünya'nın birçok bölgesinde son yıllarda gözlenen toplu arı ölümlerinin artması ve bu ölümlerin sebeplerinin araştırılması dikkat çeken konuların başında gelmektedir. Bu konuda yapılan çalışmalar, ölümlerin arılarda pestisit maruziyetinden kaynaklı olabileceğini göstermektedir. Arılarda yüksek toksisite gösteren pestisitlerin, yapılan risk değerlendirmeleri sonucunda bazılarının Dünya'da kullanımının yasaklanması zorunluluğu doğmuştur. Dünya ile birlikte ülkemizde de toplu arı ölümleri görülmesi ile yaşanan koloni kayıpları hem ekosistem açışından hem de ekonomi açısından ciddi zararlar doğurabilmektedir. Bu sebeple kitlesel ölüm gözlenen kolonilerde pestisit kalıntı analizlerinin yapılarak risk değerlendirmelerinin sunulması büyük önem arz etmektedir. 
Gerçekleştirilen bu tez ile de Dünya'da örnekleri olmasına karşın, Türkiye'de yapılan çalışmalar incelendiğinde örneği bulunmayan, pestisit analizlerinde evrensel bir metot olan QuEChERS ekstraksiyon metodu modifiye edilerek, Türkiye'de ilk kez arılarda pestisit kalıntılarının saptanabilmesi için metot validasyon çalışmaları yapılması amaçlanmıştır. Böylece arılarda yapılacak çoklu pestisit kalıntı analizlerinde bu metodun kullanılması hedeflenmiştir. Yine balda da çoklu pestisit kalıntılarının analizi için metot validasyon çalışmaları yapılarak, balda da pestisit kalıntıların tespiti amaçlanmıştır. Bu amaçlarla yoğun tarımsal uygulamaların olduğu ve Türkiye bal üretiminin yarısından fazlasının yapıldığı Marmara, Ege ve Akdeniz Bölgeleri'ndeki kitlesel arı ölümleri takip edilerek, ölmüş arı ve onlara ait kovanlardan bal örnekleri toplanmıştır. Yine toplu ölüm söz konusu olmadığında da belirlenen lokasyonlarda kovan önlerinden ölü arılar toplanarak örneklemeler yapılmış ve metodun kullanılabilirliği test edilmiştir. 
Öncelikle arı analizleri için QuEChERS yöntemi baz alınarak farklı modifikasyonlar denenmiş ve en iyi metot performans kriterlerini sağlayan metot seçilerek ve bu metodun validasyonu gerçekleştirilmiştir. Valide edilen modifiye QuEChERS yöntemi ile ekstrakte edilen arı ve bal örnekleri LC-MS/MS ve GC-MS/MS kütle spektrometresi cihazları ile toplamda 600 adet pestisit etken maddesi yönünden analiz edilmiş ve pestisit kalıntıları belirlenmiştir. 2020 ve 2021 yıllarında toplamda 42 adet arı ve 56 adet bal örneği analiz edilmiştir. Analiz edilen arı numunelerinin 29 tanesinde en az bir tane pestisit etken maddesi saptanmıştır ve bu numunelerde 0,002 ile 3,66 mg/kg arasında değişen değerlerde, 56 farklı pestisit etken maddesi tespit edilmiştir. Analiz edilen bal numunelerinin ise 22 tanesinde en az bir tane pestisit etken maddesi saptanmıştır. Bu numunelerde 0,002 ile 0,052 mg/kg arasında değişen değerlerde 16 farklı etken maddeye rastlanmıştır.
Arılarda pestisit maruziyetinin görülebilmesi için tehlike katsayıları (HQ-Hazard Quotient) hesaplanmış ve pozitif sonuçlanan 29 arı numunesinin HQ puanlarının %34'ü HQ<50, %7'si HQ>50 ve %59'u HQ>1000 olduğu belirlenmiştir. Pestisit maruziyeti risklerin HQ>50 parametresi yani belirgin pestisit yüküne göre kıyaslandığı zaman pozitif numunelerin %66'sında kendini göstermektedir. Tespit edilen pestisitlerin HQ puanları 0 ile 1.016.667 arasındaki değişirken numunelerin HQ puanları 0,02 ile 1.016.670 arasında değişim göstermektedir. HQ puanının 1000'in üzerinde olması sebebi ile numuneleri tek başlarına yüksek pestisit yükü altına sokan pestisitlerin tamamı insektisitlerden meydana gelmektedir.
Yapılan bu çalışmanın sonucunda valide edilen, pestisit gruplarında ayrım yapmaksızın, arılarda çoklu kalıntı analizlerine kantitatif olarak olanak sağlayan modifiye QuEChERS metodu ile hızlı ve güvenilir sonuçlar alınması mümkündür. Homojenizasyon işleminden sonra iki saatten daha kısa bir sürede analizlerin tamamlanabilmesi, tüm kontrol laboratuvarlarında bulunabilecek altyapıyla rahatlıkla çalışılabilmesi, analiz maliyetlerinin düşük olması, kolay ve güvenilir olması gibi kendini ön plana çıkaran özellikleri ile bu modifiye QuEChERS metodunun arılarda pestisit kalıntı analizlerinde kullanılması önerilmektedir. Ayrıca bu çalışmada sunulan pestisit maruziyetine karşılık yapılan risk değerlendirme hesaplamalarının da ülkemizde arılarda kalıntı analizlerinin gerçekleştirilmesinin ardından pestisit maruziyetini yorumlamak için rehber olarak kullanılması tavsiye edilmektedir.

Abstract:
The increase in mass mortalities of bee observed in almost every region of the world in recent years and the investigation of the causes of these deaths are among the most remarkable issues. As a result of studies on increasing bee deaths, it shows that these deaths may be caused by pesticide exposure in bees. As a result of the risk assessments of pesticides with high toxicity in bees, the necessity of prohibiting the use of some of them in the world has arisen. Colony losses due to mass bee deaths in our country as well as in the world can cause serious damage both in terms of ecosystem and economy. For this reason, it has a great importance to present risk assessments by performing pesticide residue analyzes in colonies where mass mortalities are observed.
With this thesis, it is aimed to carry out method validation studies for the first time in Turkey to detect pesticide residues in bees by modifying the QuEChERS extraction method, which is a universal method in pesticide analysis, although there are some examples that using for also bee analysis in the world. Thus, it is aimed to use this method in multiple residue method analyzes on bees. Also, method validation studies were carried out for the analysis of multiple residue method in honey, and it was aimed to detect pesticide residues in honey. For these purposes, mass bee deaths in the Marmara, Aegean and Mediterranean regions, where there are intensive agricultural practices and have more than half of Turkey's honey production, were followed and collected honeybees and honey samples from their hives. In addition, if there is no mass death, dead bees' sample also were collected from the front of the hive in the designated locations to check the usability of method.
First of all, different modifications were tried based on the QuEChERS method for bee analysis, and the method that met the best method performance criteria was selected and the validation of this method was carried out. Bee and honey samples extracted with the validated modified QuEChERS method were analyzed with LC-MS/MS and GC-MS/MS devices for a total of 600 pesticide active substances. In 2020 and 2021 total of 42 bee and 56 honey samples were analyzed. At least one pesticide active ingredient was detected in 29 of the analyzed bee samples, and, with values varying between 0.002 and 3.66 mg/kg. 56 different pesticide active ingredients were detected in these samples. At least one pesticide active ingredient was detected in 22 of the analyzed honey samples. In these samples, 16 different active substances were found with values varying between 0.002 and 0.052 mg/kg.
Hazard coefficients (HQ-Hazard Quotient) were calculated in order to see pesticide exposure in bees and it was determined that the HQ scores of 29 positive bee samples 34% were HQ<50, 7%, HQ>50 and 59% were HQ>1000. Pesticide exposure shows itself in 66% of positive samples when the risks are compared according to the parameter HQ>50, that is, the relevant pesticide load. While the HQ scores of the detected pesticides vary between 0 and 1.016.667, the HQ scores of the samples vary between 0.02 and 1.016.670. All detected pesticides that alone put the samples under a elevated pesticide load due to the HQ score above 1000 were insecticides.
It is possible to obtain fast and reliable results of quantitative analysis of multiple residues in bees without discrimination in pesticide groups with the modified QuEChERS method, which has been validated as a result of this study. It is recommended that this modified QuEChERS method be used in pesticide residue analysis in bees, with its outstanding features such as completing the analyzes in less than two hours after the homogenization process, being able to work easily with the infrastructure available in all control laboratories, low analysis costs, and being easy and reliable. In addition, it is recommended that the risk assessment calculations made in response to pesticide exposure presented in this study should be used as a guide for interpreting pesticide exposure after residue analysis in bees in our country.