Hidrojen sülfit (H2S) kullanımının insan adiposit kültürlerinde oluşturulan iskemik koşullarda adiposit sağkalımı üzerine etkilerinin in vitro araştırılması
In vitro hydrogen sulphide effects on adipocyte viability in human adipocyte culture under ischemic conditions
Yazar: ANDAÇ AYKAN
Danışman: DOÇ. DR. SERDAR ÖZTÜRK
GATA / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Hidrojen sülfür = Hydrogen sulfide ; Sağkalım = Survival ; Transplantlar = Transplants ; İskemi = Ischemia

Özet:
Yağ greftleri, vücutta başka bir yere aktarıldıktan sonra adipositler iskemik birortamla karşı karşıya kalmaktadırlar. Yetersiz perfüzyon sonucu oluşaniskemi, apoptozis ve nekroz sonucu hücresel ölüme ve yağ grefti kaybınaneden olmaktadır. Bu sorunun çözümüne yönelik olarak geliştirilen farklıuygulama şekillerine karşı kullanılan yağ greftlerinin sağkalımları ile ilgiliproblemlere çözüm arayışı halen devam etmektedir.Hidrojen Sülfit, Karbonmonoksit ve Nitrik oksit ile beraber gaz yapıda olan 3gazotransmitterden biri olarak kabul edilmektedir. Hidrojen Sülfitin, bazıdokularda iskemiye direnci arttırdığı ve mekanizması tam olarak ortayakonulamamışsa da apotozisi azalttığı bilinmektedir. Ancak yağ dokusuüzerine etkileri ile ilgili yapılmış çalışma mevcut değildir.Bu çalışmada, Hidrojen Sülfit'in iskemik koşullar altında adiposit sağkalımıüzerindeki etkilerini araştırmak ve apoptotik süreç üzerindeki olası etkimekanizmasını daha ayrıntılı olarak açıklamak amaçlandı.Bu amaçla, canlı bir donörden alınan cilt altı yağ dokusu örneğinden insanyağ dokusu kaynaklı Mezenkimal Kök Hücre kültürü elde edildi. Kullanılanfarklılaştırma medyumu ile kök hücreler adipojenik yönde farklılaştırıldı vematür adiposit kültürü elde edildi. Daha sonra Yağ dokusu kaynaklımezenkimal kök hücre ve matür adiposit kültürleri kendi içinde 6'şar grubaayrıldı. Hidrojen Sülfit vericisi olarak Sodyum Hidrojen Sülfit kullanıldı. Her birgruba sırasıyla 0, 0,1, 1, 10, 100 ve 1000 ?M konsantrasyonlarda SodyumHidrojen Sülfit uygulandıktan sonra hücre kültürleri çok gazlı inkübatörde %1Oksijen, %5 karbondioksitli ortamda 37°C' de 24 saat inkübe edildi. İskemisonrası her iki hücre kültüründeki gruplar, proliferasyon/sitotoksisite testi ileproliferasyon, akım sitometrisi ile apoptoz ve nekroz oranları, polimeraz zincirreaksiyonu ile apoptotik ve antiapoptotik gen ifade düzeylerine bakılarakdeğerlendirildi.Düşük doz (0, 0,1 ?M) Sodyum Hidrojen Sülfit uygulanan yağ doku kaynaklımezenkimal kök hücre gruplarında belirgin proliferasyon artışı saptandı (p<0,05). Matür adiposit kültürlerinde tüm farklı doz uygulamalarında apoptozoranlarının anlamlı ölçüde azaldığı bulundu (p <0,05). Her iki hücre kültürgruplarında, antiapoptotik gen (bcl-2) ifadelerinin arttığı, apoptotik gen(caspase-3) ifadelerinin azaldığı tespit edildi.Sonuç olarak, planlanacak in vivo çalışmalarda ve klinik kullanımda yağgreftleri alındıktan sonra Hidrojen Sülfit uygulanarak alıcı sahaya aktarımgerçekleştirilebilir. Böylece iskemik ortamla karşılaşan yağ grefti içerisindekimezenkimal kök hücreler daha hızlı prolifere olup, sağkalan matür adipositmiktarı artarak, yaşayabilen yağ dokusu miktarının daha fazla olacağıöngörülmektedir.

Abstract:
After the fat graft is transplanted to another area of body, adipocytes face withan ischemic environment. Ischemia which is a result of poor perfusion causescellular death and loss of fat graft by apoptozis and necrosis. Although therehave been many experimental and clinical attempts to increase survival rates,many of these manuplations have failed to produce satisfactory results.Hydrogen Sulfide is accepted as a gasotransmitter, which has a gaseousstructure like the other two gasotransmitters; carbon monoxide and nitric oxide.It is known that Hydrogen Sulfide increases the resistance to ischemia in sometissues and it decreases apoptosis whereas the exact mechanism cant beexplained. However there is no research about its effects on adipose tissue inthe literature.In this study, we aimed to evaluate the effects of Hydrogen Sulfide onAdipocyte survival under ischemic conditions and to explain the possiblemechanism of its apoptotic process in details.For this purpose mesenchymal stem cell culture was prepared fromsubcutaneous adipose tissue sample of an human donor. Byuse of adipogenicdifferentiating medium, adipose derived mesenchymal stem cells weredifferentiated into adipogenic direction and mature adipocyte culture wasobtained. Adipose derived mesenchymal stem cell culture and mature adipocyteculture were divided in to six groups separately. Sodium Hydrogen Sulfide wasused as a Hydrogen Sulfide donor. After applying Sodium Hydrogen Sulfite toall groups with a concentration of 0, 0,1, 1, 10, 100 and 1000 ?M, cell cultureswere incubated in special gas incubator with %1 oxygen and %5 carbondioxide,at 37°C for 24 hours. After ischemia period, cell culture groups were examinedby the rates of proliferation/cytotoxicity within MTT test, apoptosis and necrosisrates with Flow cytometry, apoptotic and antiapoptotic genes expression levelswithin polymerase chain reaction.Statistically significant increase in proliferation rates were found in adiposederived mesenchymal stem cells groups which was applied low dose (0,1 and 1?M) Sodium Hydrogen Sulfide. For every different dose applications, statisticallysignificant decrease was found in apoptosis levels on the mature adipocytecultures (p <0, 05). In both cell culture groups significant increase was found inantiapoptotic gene (bcl-2) expressions and significant decrease was found inapoptotic genes (caspase-3) expressions.As a conclusion, Hydrogen Sulphide has protective effect on adipocytes andthis effect is mediated by elevation of antiapoptotic gene expression.Furthermore, this study suggest that, administration of Hydrogen Sulphide to fatgraft before fat graft injection may be therapeutic benefit in the fat graft viability.