T-2 toksininin kan-testis bariyeri üzerine etkisinin SerW3 hücre hattında araştırılması
Investigation of the effects of T-2 toxin on blood-testis barrier in SerW3 cell line
Yazar: ELİF KARACAOĞLU
Danışman: PROF. DR. GÜLDENİZ SELMANOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Sitotoksisite = Cytotoxicity ; İmmün boyama = Immunoblotting ; İmmünofloresan = Immunofluorescence

Özet:
Temel besin kaynağı olarak tüketilen tahıllarda çoğalan funguslar tarafından üretilen mikotoksinler insan sağlığını tehdit etmektedirler. Fusarium türü funguslar tarafından tahıl ve tahıl ürünlerinde oluşan bir mikotoksin olan T-2 toksini de insan sağlığı için potansiyel tehlike oluşturmaktadır. T-2 toksininin erkek üreme sistemini olumsuz etkilediği ve sperm sayısında azalmaya neden olduğu bilinmekle birlikte toksisite mekanizması bilinmemektedir. Bu çalışmada testiste sperm hücrelerinin gelişimi sırasında germ hücrelerine mekanik olarak destek sağlayan, aynı zamanda kan-testis bariyerinin oluşmasında önemli işlevlere sahip Sertoli hücrelerinde T-2 toksininin potansiyel etkilerinin araştırılması hedeflenmiştir.
Bu tez çalışması kapsamında, sıçan Sertoli hücre hattı olan SerW3 hücreleri 12, 120 ve 1200 ng/ml dozlarında T-2 toksini ile 24 ve 48 saat boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonrasında, SerW3 hücreleri hücre canlılığı testi (MTT), laktat dehidrogenaz (LDH) sitotoksisite testi ve tripan mavisi hücre canlılığı testi ile sitotoksisite açısından değerlendirilmiştir. Sitotoksisite testlerinin yanı sıra, SerW3 hücrelerinde Sertoli hücre bariyerinde yer alan proteinlerden okludin, ZO-1, N-kaderin ve β-katenin proteinleri hücresel lokalizasyonlarının belirlenmesi amacıyla immünfloresan olarak boyanmış, okludin ve N-kaderin proteinlerinin ifadesinde meydana gelebilecek değişiklikler Western blotlama yöntemi ile gösterilmiştir. Ayrıca Sertoli hücre bariyerinin bütünlüğünün toksin maruziyeti sonrasında değerlendirilmesi için transepiteliyal elektrisel direnç (TEER) ölçümü yapılmıştır.
Sitotoksisite testlerinden MTT, LDH ve tripan mavisi sonuçlarına göre, T-2 toksini doz ve inkübasyon süresine bağlı olarak SerW3 hücrelerinde sitotoksisite artışına neden olmuştur. 120 ve 1200 ng/ml dozlarında hücreler LDH ve tripan mavisi testine daha çok hassasiyet göstermişlerdir. İmmünfloresan boyama sonuçları T-2 toksininin artan doz ve inkübasyon süresine bağlı olarak okludin, ZO-1, N-kaderin ve β-katenin ifadelerinde azalmaya neden olduğunu göstermiştir. Ayrıca toksin ile inkübasyon sonucunda N-kaderinin SerW3 hücrelerinde sitoplazmada konumlandığı gösterilmiştir. Western blotlama sonuçları, okludin ve N-kaderin protein ifadelerinde doza ve inkübasyon süresine bağlı olarak azalma olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda, toksin uygulanan gruplarda TEER değerlerinde meydana gelen azalma immünfloresan boyama ve Western blotlamadan elde edilen sonuçları desteklemektedir.
Bu sonuçlar, T-2 toksininin SerW3 hücrelerinde yüksek dozlarda sitotoksisiteye neden olduğunu, ayrıca Sertoli hücreleri arasında bulunan hücreler arası bağlantı proteinlerinin ifadelerinde değişikliklere neden olarak kan-testis bariyeri geçirgenliğinin olumsuz olarak etkilediğini göstermiştir.

Abstract:
Mycotoxins which are produced in grains by fungi and consumed as main food source threaten human health. T-2 toxin, which is one of the mycotoxins produced in grain and grain products as a secondary metabolite by Fusarium species, has also potential danger for human health. It was known that T-2 toxin caused decreases in sperm count, however toxicity mechanism of it remained unclear. Our aim is to reveal potential effects of T-2 toxin on Sertoli cells which mechanically support germ cells in testis and have also crucial functions in constitution of blood-testis barrier.
Within the scope of this dissertation, SerW3 cells which are Sertoli cell line were exposed to T-2 toxin at 12, 120 and 1200 ng/ml doses for 24 and 48 hours. At the end of the incubation time, several cytotoxicity tests including cell viability (MTT), lactate dehydrogenase (LDH) cytotoxixity test and trypan blue dye exclusion assay were performed for evaluating cytotoxicity. In addition to cytotoxicity test, immunostaining of essential proteins for constitution of blood-testis barrier such as occludin, ZO-1, N-cadherin and β-catenin were performed for detecting immunlocalization in SerW3 cells. Expressions of occludin and N-cadherin were also shown by Western blotting as a result of T-2 toxin exposure. Furthermore, integrity of blood-testis barrier in response to T-2 toxin exposure were interpretted for SerW3 cells by TEER measurement.
According to the Cytotoxicity test results T-2 toxin caused increases in cytotoxicity in a dose and incubation time dependent. SerW3 cells were more sensitive to T-2 toxin according to LDH and trypan blue exclusion tests at the doses of 120 and 1200 ng/ml. Immunofluorescence staining results revealed that T-2 toxin decreased in expression of occludin, ZO-1, N-cadherin and β-catenin in SerW3 cells in a dose and incubation time dependent manner. In response to T-2 toxin, occludin and N-cadherin expression by western blotting were also decreased in SerW3 cells. Additionally, results of TEER measurement decreased in dose and time dependent manner after T-2 toxin exposure and also these results were consistent with immunofluorescence and Western blotting results.
These results pointed out that T-2 toxin caused cytotoxicity at higher doses in SerW3 cells, caused alterations in expression of junctional proteins in Sertoli cell and had adverse affects on blood-testis barrier integrity.