Termofilik bir küf olan Scytalidium thermophilum'dan proteaz enziminin üretimi, saflaştırılması ve kısmi karakterizasyonu
Production, purification and partial characterization of protease enzyme from thermophilic fungus Scytalidium thermophilum
Yazar: GÜLEN SİNEM İNCİ
Danışman: DOÇ. DR. YONCA YÜZÜGÜLLÜ KARAKUŞ
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Alkali proteaz = Alkaline protease ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Mikrobiyal enzimler = Microbial enzymes ; Scytalidium thermophilum = Scytalidium thermophilum ; İyon kromatografisi = Ion chromatography

Özet:
Protein yapısındaki peptit bağlarının hidrolizinden sorumlu olan proteazlar, oldukça geniş bir grubu temsil etmektedir. Çalışmada, termofilik bir küf olan Scytalidium thermophilum'dan hücre dışı proteaz enziminin optimum fermantasyon koşullarında üretimi, saflaştırılması ve kısmi karakterizasyonu amaçlandı. Buna göre, %4 (a/h) glukoz, %1 (a/h) maya ekstraktı, %0,05 (a/h) MgSO4.7H2O, %0,04 (a/h) KCl ve %0,1 (a/h) K2HPO4 içeren 250 mL YpSS Broth besiyerinde büyütülen mikroorganizmadan üç günlük fermantasyon sonunda hücreler uzaklaştırılarak ham enzim ekstraktı elde edildi. Saflaştırma hem klasik kromatografi hem de sulu ikili faz sistemi (ATPS) uygulanarak gerçekleştirildi ve saflaştırma bulguları karşılaştırıldı. ATPS'ye maruz bırakılan ham ekstrakt örneğinden 5,1-kat ve %78 aktivite geri kazanımla proteaz enzimi saflaştırıldı. HiPrep Q XL (16/10) kolonundan ise proteaz enzimi %22 geri kazanımla yaklaşık 3-kat saflaştırıldı. SDS-PAGE'de her iki yolla saflaştırılan proteaz örneğine ait tek bant gözlendi, protein bandının molekül ağırlığı ⁓80 kDa olarak hesaplandı. Enzimin optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 60 °C ve 8,0 olarak tespit edildi. Kararlı olduğu sıcaklık aralığı 30–60 °C, pH aralığı ise 4,0–9,0 olarak belirlendi. S. thermophilum'dan ilk defa bu çalışmada saflaştırılan proteaz enziminin sıcaklık ve pH değişimlerine gösterdiği kararlılık, enzimin farklı endüstriyel uygulamalarda kullanımına yatkın olduğuna işaret etmektedir

Abstract:
Proteases, which are responsible for the hydrolysis of peptide bonds in the protein structure, represent a very large group of enzymes. In this study, it was aimed to produce, purify and partially characterize extracellular protease enzyme from a thermophilic fungus, Scytalidium thermophilum, under optimum fermentation conditions. For this purpose, S. thermophilum was grown in 250 mL of YpSS Broth medium including 4% (w/v) glucose, 1% (w/v) yeast extract, 0.05% (w/v) MgSO4.7H2O, 0.04% (w/v) KCl and 0.1% (w/v) K2HPO4. After three days of fermentation, the cells were removed and crude enzyme extract was obtained. Purification was carried out using both conventional chromatography and aqueous two-phase partitioning system (ATPS), and purification parameters observed were compared. The protease enzyme was purified with a 5.1-fold and 78% activity recovery from ATPS. With HiPrep Q XL (16/10) column, purification fold and activity recovery values were 3-fold and 22%, respectively. The purity was checked with SDS-PAGE analysis where a single band corresponding to ⁓80 kDa was observed. The optimum temperature and pH values of the purified enzyme were determined as 60 °C and 8.0, respectively. The enzyme was found stable in a temperature range of 30–60 °C, while it was stable in pH values varying from 4.0 to 9.0. The stability of the S. thermophilum protease enzyme, purified here for the first time, against different temperature and pH values, indicates that the enzyme has a potential for its use in different industrial applications.