Kalbe özgü "subtractive" hibridizasyon kütüphanesinden seçilen yeni genlerin analizleri
Analysis of the novel genes selected from heart specific subtractive hybridization library
Yazar: AYŞE EVRİM BAYRAK
Danışman: PROF. DR. NİHAN ERGİNEL-ÜNALTUNA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Ekspresyon = Expression ; Fareler = Mice ; Genler = Genes ; Kalp = Heart ; RNA = RNA

Özet:
Çıkartılmış (?subtractive?) cDNA kütüphaneleri, araştırılan dokularda farklı anlatıma uğrayan genlerin belirlenmesinde güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Daha önceki çalışmalarda, fare (BALB/c) kalp ve iskelet kası arasında çıkartılmış hibridizasyon tekniğini uygulayarak kalbe özgü genlerin cDNA'larını içeren kütüphane oluşturulmuştu. Bu çalışmada, dizileri daha önce belirlenmiş cDNA parçalarının bioinformatik incelenmesi ve seçilen transkriptlerin kalpteki anlatımlarının belirlenmesi amaçlandı. İlk aşamada, kütüphanedeki toplam 292 adet cDNA parçasının GenBankasındaki veriler ile homoloji araştırmaları yapıldı. Daha sonra kütüphaneden seçilen 42 farklı transkriptin, genel olarak kalp ile iskelet kası arasındaki gen anlatım düzeylerinin kıyaslaması yapıldı. Bunun için uygulanan Dot blot hibridizasyonu sonucunda 42 farklı transkriptten 26'sının kalpte daha fazla eksprese olduğu belirlendi. Bunlar arasından seçilen K3 (pdlim4), K21 (tspyl1), K44 (tsc22d1), K55 (tpm1) ve K80 (My12) klonlarının ayrıntılı biyoinformatik analizleri yapıldı. Northern Blot analizi ile kalpteki gen anlatım düzeyleri doğrulandı. Kalpte iskelet kasından daha fazla eksprese olduğu belirlenen iki genin (pdlim4 ve tsc22d1) İn Situ Hibridizasyon (İSH) tekniği ile yetişkin kalp ve iskelet kasında bölgesel olarak gen anlatımları araştırıldı. Kontraktil protein olduğu bilinen K55 (tpm1) ve K80 (My12) klonları İSH'da kontrol olarak kullanıldı. Transkripsiyonel düzenleyici olarak kanser ve apoptoz gibi önemli olaylarda rol alan pdlim4 ve tsc22d1 mRNA'ları İSH analizi ile kalbin her bölgesinde belirlendi. Ayrıca, tsc22d1 geninin atriyumlarda daha fazla eksprese olduğu saptandı. Bu çalışma sonucunda, İSH tekniği ile çıkartılmış hibridizasyon kütüphanesinde yer alan 2 adet klonun kalp dokusundaki ekpresyon profilleri belirlendi. Böylece, önceki çalışmaların sonuçları ile bütünlük sağlanmış oldu. Kalbe özgü çıkartılmış genlerin daha ileri çalışmaları, kalpteki ve hatta kardiyovasküler hastalıkların etyolojisindeki işlevlerinin anlaşılması yönünde devam edecektir.

Abstract:
Subtractive cDNA libraries provide a powerful approach for identifying and isolating genes that are differentially expressed in defined tissues. By using subtractive hybridization technique between heart and skeletal muscle of mice (BALB/c), a heart specific cDNA library was created in our previously studies. This study was aimed to analyse the cDNA fragments within library using bioinformatics and determined the expression profile of selected transcripts. The homology search of the 292 cDNA fragments in the library was performed with the data available through the GenBank. The cDNA fragments in the library were selected the 42 different transcripts. Dot blotting is performed generally for the comparison between heart and skeletal muscle expression levels of these transcripts. The 26 of the 42 different transcripts are determined to express high levels in heart. We selected the K3 (pdlim4), K21 (tspyl1), K44 (tsc22d1), K55 (tpm1) and K80 (myl2) clones considering dot blot hybridization results. These clones were analyzed with detailed bioinformatics analysis and their expression levels were confirmed by Northern blotting. Northern blotting results showed that the heart expression levels of pdlim4 and tsc22d1 genes were greater than those in skeletal muscle. These genes are analyzed locally in heart and skeletal muscle by using In Situ Hybridization (ISH) technique. The K55 (tpm1) and K80 (myl2) clones are used as controls in ISH. In all parts of the heart, we determined the pdlim4 and tsc22d1 mRNAs that have been described to have roles as transcriptional regulators in important mechanisms such as cancer and apoptosis. In addition, we found that tsc22d1 is expressed in atrium at high levels. In this study, the heart tissue expression profiles of two clones present in subtractive hybridization library were determined. Thus, we obtained integrity with the results of previous studies. Further studies of heart specific subtracted genes will provide insights into their functional roles in heart, even in the etiology of the cardiovascular diseases.