Büyük mum güvesi galleria mellonella nın bazı dokularında ve izole edilmiş mitokondriyumlarında yaşlanma sürecinde gangliyositlerin belirlenmesi
Determination of gangliosides in some tissues and isolated mitochondria of greater wax moth galleria mellonella during aging
Yazar: ATABAK NAGHAVİ
Danışman: PROF. DR. SABİRE KARAÇALI
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada önce CapLC-ESI-MS/MS sisteminde, böcek beyin, kas, ve yağ dokularında gangliosid belirleme yöntemi optimize edilmiştir. Negatif modda kütlesi iki defa parçalanan doku örneklerinde larva beyninde belirlenen m/z 918 iyonunun GD1?e, hareketsiz prepupada m/z 708 iyonunun GT1?e ve ergin dokularda m/z 721 ile m/z 735 değerlerinin de GD3?e ait olduğu tanımlanmıştır. Omurgalı GD3 yapısında, seramide bağlı glukoza bağlanan ikinci şeker galaktozdur. Böcek glikosfingolipidlerinde seramide bağlanan ikinci şekerin mannoz olduğu bildirilmektedir. Kütleleri ve parçalanma iyonları benzer olduğundan, çalışmanın bu düzeyde ikinci şekerin tanımlanması daha sonraya bırakılmıştır. Yöntemin optimizasyonundan sonra Galleria mellonella?nın yaşlanma sürecinde iki sialik asit taşıyan GD3?ün beyin dokularında ve izole edilen mitokondrilerinde (beyin, kas ve yağ dokularından) değişiklikleri belirlenmiştir. 
Homojenize edilen örneklerden gangliosidler kloroform/metanol/su uygulamalarıyla katı faz ekstraksiyonu yapılarak elde edilmiştir. Kurutulmuş ekstraksiyonu metanol içinde çözülmüş ve süzülmüş örneğinden alınan 0.2 µm?lik miktar, CapLC-ESI-MS/MS sisteminde negatif iyon modunda belirlenmiştir. Belirlemelerde N-asetilnöraminik (sialik) asidi tanımlayan m/z 290 parçalanma iyonu aranmıştır. G.mellonella beyin dokusunda GD3?ün ana iyonu m/z 721 dir. Mutlak pik alan değerinin karşılaştırılmasıyla en fazla genç organizma örneği olan  larva beyninde bulunmuştur. Bu değer yaşlı organizma örneği olan hareketsiz prepupa beynine göre yaklaşık bir buçuk, ergin beyine göre ise üç kat daha fazladır. 
İzole edilmiş mitokondri örneklerinde GD3?ün m/z 721 ve m/z 735 olmak üzere iki ana iyonu bulunmuştur. Mitokondrilerde hakim ana iyon m/z 721 dir. Değişiklikleri beyin dokusundan elde edilen değerlere ters bir şekilde genç organizma örneğinde en düşük düzeydedir. Yaşlı organizma örneği hareketsiz prepupa ile ergin mitokondrilerde sırasıyla iki buçuk ve üç buçuk kat artar. m/z 735 ana iyonu en fazla ergin mitokondrilerde bulunmuştur. Birbirine yakın değerlerde olan genç ve yaşlı örneklerden erginde üç buçuk kat daha fazladır. 
Böcek beyin dokusunda GD3?ün varlığı CCA (Cancer antennarius agglutinin) lektininin bir GD3 modifikasyonu olan 9-O-asetil GD3?ün uçtaki ?2,8 bağlı sialik asidine seçici olarak bağlamasından faydalanarak, fluoresan optik yöntemle dolaylı olarak desteklenmiştir. CCA?nın fluoresan optik ışımaları gençten yaşlıya doğru azalmaktadır. 
Yaşlanan böcek beyninde gangliosidlere ek olarak glikoproteinlere bağlanan sialik asit değişikliklerini de belirlemek için fluoresan işaretli MAA (Maackia amurensis agglutinin) ile SNA (Sambucus nigra agglutinin) lektin uygulamaları yapılmıştır. ?2,3 glikosidik bağı tanıyan MAA ışıması en fazla genç organizma beyninde bulunmaktadır. Yaşlı organizmada ışımalar azalır. ?2,6 bağını tanıyan SNA?nın ışıması da yine en fazla genç organizma beyninde fakat MAA?dan daha az olmak üzere bulunmuştur. Benzer şekilde yaşlı organizmada azalır.
Elde edilen bulgulara göre; seramide bağlı iki hekzos ve arkadan iki sialik asit içeren dört monosakkaritli glikosfingolipid, böceklerde ilk defa tanımlanmaktadır. Yaşlanma sürecinde GD3?ün azalmasıyla bağlı sialik asitler de azalır. Ek olarak, fluoresan işaretli lektin uygulamaları glikoproteinlere bağlı sialik asitlerin de azaldığını göstermektedir. Hücre yaşlanması ve ölümü sürecinde mitokondrilerden yaşlanma ve ölüm moleküllerinin salınmasına neden olan GD3?ün, beyin dokusunda ve ayrıca dokulardan izole edilmiş mitkondrilerde belirlenmiş olması, G.mellonella dokularında gangliosidlerin bulunduğunu göstermektedir. 
Anahtar sözcükler: Gangliosid, sialik asit, Sinir sistemi, izole edilmiş mitokondri, CapLC-ESI-MS/MS, floresans işaretleme, Galleria mellonella, böcek

Abstract:
In this study firstly, optimized method of determining ganglioside the insect brain, muscle, and fat tissue with Cap LC-ESI-MS/MS system. MS/MS in negative mode for larval brain tissue samples determined m/z 918 ion of GD1, for still prepupa m/z 708 ion belonging to GT1, for adult tissues, m/z 721 and m/z 735 values are defined to belong to the GD3. In structure of GD3 at vertebrate , the second sugar connected to the ceramide linked glucose is galactose. At insect  glycosphingolipids, mannose is reported to be the second sugar   connected to ceramide. Because of similar mass and ions fragmentation, in this stage the definition of second sugar was left for later. After optimization of the method, during Galleria mellonella aging process disalyl GD3 changes were determined in brain tissue and isolated mitochondria (brain, muscle, and fat body).
Gangliosides was obtained from homogenized samples through solid phase extraction with chloroform/methanol/water treatments. Dried extract was dissolved in methanol and filtered, 0.2 ?m sample determined in negative ion mode  by CapLC-ESI-MS/MS system. At determine, m/z 290 ion which identifies the N-acetylneuraminic (sialic) acid fragmentation was sought. G.mellonella brain tissue m/z 721 is GD3 parent ion. By comparing the absolute value of the peak area maximum level was found at larval brain as young organism. According to this value, at still prepupa brain as example of an old organism approximately one and a half times and at the adult brain is three times higher. GD3 was found in two main m/z 721 and m/z 735 ion in isolated mitochondria from samples. Dominant main  ion is  m/z 721 in mitochondria. Changes obtained lowest level in a reverse way from young organism brain tissue sample values. in mitochondria of Elderly organism samples still prepupa and adult increases respectively two and a half and three and a half times. m/z 735 main ion has most at adult mitochondria. Young and old samples values are close to each  others and in adult it is three and a half times more.
The presence of GD3 in insect brain tissue is supported indirectly by using fluorescent optical method and CCA (Cancer antennarius agglutinin) lectin which selectively bound to ?2,8  sialic acid in 9-O-acetyl GD3 a modification of GD3. CCA fluorescent optical radiation is decreasing from young to old.
In addition to gangliosides in insect aging brain to determine changes of glycoproteins-linked sialic acid, fluorescent-labeled MAA (Maackia amurensis agglutinin) and SNA (Sambucus nigra agglutinin) lectin have been conducted. radiation of MAA which recognize ? 2,3 glycosidic bond is the most in young organism's brain. The radiations reduced in old organism. radiation of SNA which recognize ?2,6 bond  is the most in young organism brain too, but was found to be less than MAA. similarly, is reduced in aged organism.
According to the findings; Glycosphingolipids with four monosaccharide, ceramide linked two hexose with following by two sialic acid are described for the first time in insects. Related to GD3 decrease, during the aging process sialic acids decrease too. In addition, applications of the fluorescent-labeled lectin shows decrease in glycoproteins-linked sialic acid. Determined of GD3 that cause release aging and death molecules from mitochondria in the process of cell aging and death, in brain tissue and isolated mitochondria from tissues, indicate present of ganglioside in G.mellonella tissues.
Key words: Ganglioside, sialic acid, nervous system, isolated mitochondria, CapLC-ESI-MS/MS, fluorescent labeling, Galleria mellonella, insect