Farmasötik preparatlarda N-nitrozaminlerin LC-MS/MS ile tayini için yöntem geliştirme ve validasyon: Extractables ve leachables çalışmalarına uygulama
Method development and validation for determination of N-nitrosamines in pharmaceutical preparations by  LC-MS/MS: Application to extractables and leachables studies
Yazar: OĞUZHAN DALKILIÇ
Danışman: PROF. DR. ALPTUĞ ATİLA
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Amaç: İlaç endüstrisinde bir ilacın üretim aşamasından başlayıp, raf ömrünün sonuna kadar izlenmesi gereken süreçte ilaca kontamine olabilecek N-nitrozaminlerin analizi için LC-MS/MS yöntemini geliştirip, geliştirilen bu yöntemi valide etmektir. Valide edilmiş olan LC-MS/MS metodu ile Extractables ve Leachables çalışmalarında N-nitrozaminlerin analizlerini yapmaktır.
Yöntem: İlaç endüstrisinde sıkça karşılaşılan, literatürde bilinen ve Avrupa Farmakopesi'nde belirlenen toplam 15 adet N-nitrozamin LC-MS/MS sisteminde çalışıldı. Bu çalışmada iç standart olarak N-nitrozo-dimetilamin-d6 (N-DMA-d6) kullanıldı. LC-MS/MS sisteminde iyonlaştırma kaynağı olarak Atmosferik Basınçlı Kimyasal İyonizasyon (APCI) kullanılmıştır. Kromatografik ayrımda sabit faz olarak ters faz C18 kolon, hareketli faz olarak %0.1 formik asit içeren ultra saf su ve %0.1 formik asit içeren metanol karışımı kullanılarak gradient ayrım gerçekleştirildi. Gerçek numunelerde Extractables ve Leachables çalışmaları için çeşitli ekstraksiyon teknikleri kullanılarak LC-MS/MS sisteminde analizleri yapıldı.
Bulgular: İç standart yardımıyla 15 adet N-nitrozaminin analizi için LC-MS/MS metot geliştirilip ICH (Validation of Analytical Procedures: Q2(R1))'e göre metot validasyonu yapıldı. Optimize edilen kromatografik ve spektroskopik şartlarda her bir N-nitrozamin ve iç standartın moleküler iyon ve parçalanma iyon pikleri belirlendi. 15 adet N-nitrozaminin sinyal/gürültü (S/N) oranlarına göre gözlenebilme limiti (LOD) ve tayin alt limiti (LOQ) belirlendi. Her bir N-nitrozaminin doğrusal olduğu aralık belirlenerek kalibrasyon eğrileri çizildi. Çalışılan 15 adet N-nitrozamin için gün içi ve günler arası kesinlik, doğruluk, tekrarlanabilirlik, sistem uygunluk ve stabilite analizleri yapılarak geliştirilen LC-MS/MS metodunun uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. 
Sonuç: Farmasötik preparatların ambalaj malzemelerinden ekstrakte olabilecek, yapısında N-nitrozamin oluşumunu tetikleyebilecek amin grupları ihtiva eden, üretim ve ambalajlama esnasında veya sonrasında sızabilecek N-nitrozamin safsızlıkları için uygun ekstraksiyon metotları ile E&L profili belirlendi. Elde edilen ekstraktların analizi için literatürde bilinen ve Avrupa Farmakopesi'nde tanımlanan toplam 15 adet N-nitrozaminin tek enjeksiyonda analizinin LC-MS/MS sistemi ile yapılabilmesi için hassas, hızlı, hassas, tekrarlanabilir ve güvenilir olan yeni ve özgün bir metot geliştirildi. Geliştirilen metot ICH (Validation of Analytical Procedures: Q2(R1))'e uygun olarak valide edildi. Bu yeni metot ile ilaç endüstrisinde son yıllarda büyük önem kazanan Extractables ve Leachables çalışmaları için ihtiyaç duyulan N-nitrozaminlerin analizi güvenilir bir şekilde yapılacaktır.

Anahtar Kelimeler: N-nitrozamin, Extractables, Leachables, LC-MS/MS, Farmasötik Preparat, Validasyon

Abstract:
Purpose: Our aim is to develop and validate the LC-MS/MS method for the analysis of N-nitrosamines that may contaminate the drug in the pharmaceutical industry, starting from the production phase of a drug until the end of its shelf life. To analyze N-nitrosamines in Extractables and Leachables studies with the validated LC-MS/MS method.
Method: A total of 15 N-nitrosamine LC-MS/MS systems, which are frequently encountered in the pharmaceutical industry, known in the literature and identified in European Pharmacopoeia, were studied. N-nitroso-dimethylamine-d6 (N-DMA-d6) was used as the internal standard in this study. Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) was used as the ionization source in the LC-MS/MS system. In chromatographic separation, gradient separation was performed using a reverse phase C18 column as the stationary phase, and a mixture of ultrapure water containing 0.1% formic acid and methanol containing 0.1% formic acid as the mobile phase. Real samples were analyzed in the LC-MS/MS system using various extraction techniques for Extractables and Leachables studies.
Findings: LC-MS/MS method was developed for the analysis of 15 N-nitrosamines with the help of internal standard and validated according to ICH (Validation of Analytical Procedures: Q2(R1)) method validation was performed. The molecular ion and fragmentation ion peaks of each N-nitrosamine and internal standard were determined under optimised chromatographic and spectroscopic conditions. For 15 N-nitrosamines, the limit of detection (LOD) and lower limit of quantification (LOQ) were determined according to their signal-to-noise (S/N) ratios. The linear range of each N-nitrosamine was determined and calibration curves were drawn. Intraday and inter-day precision, accuracy, reproducibility, system suitability and stability analyses were performed for 15 N-nitrosamines and the developed LC-MS/MS method was shown to be applicable.
Results: The E&L profile was determined by suitable extraction methods for N-nitrosamine impurities that may be extracted from the packaging materials of pharmaceutical preparations, contain amine groups that may trigger the formation of N-nitrosamine, and may leak during or after production and packaging. For the analysis of the extracts obtained, a new and unique method that is sensitive, fast, precise, reproducible and reliable was developed for the analysis of a total of 15 N-nitrosamines known in the literature and defined in the European Pharmacopoeia in a single injection with LC-MS/MS system. The developed method was submitted to ICH (Validation of Analytical Procedures: Q2(R1)) was validated in accordance. With this new method, the analysis of N-nitrosamines needed for Extractables and Leachables studies, which have gained great importance in the pharmaceutical industry in recent years, will be performed reliably.

Keywords: N-nitrosamine, Extractables, Leachables, LC-MS/MS, Pharmaceutical Preparation, Validation