Biyopolimer bazlı biyosorbentlerin sentezi, karakterizasyonu ve biyoafinite uygulamaları
Synthesis, characterization of biopolymer based biosorbents and bioaffinity applications
Yazar: AYDAN GÜLSU
Danışman: PROF. DR. FATMA AYHAN
Muğla Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biyoafinite kromatografisi = Bioaffinity chromotography ; Biyosorbent = Biosorbent

Özet:
Kan plazması hastalıkların teşhisinde kullanılan temel malzemelerden biridir. Yüksek derişimde protein içerir (60-80 mg/mL protein). Örnek içerisinde az miktarda bulunan ama marker olabilecek proteinlerin ayrımı için çok hassas bir çalışma ve iyi bir gözlem gerekmektedir. Bu proteinlerin tanımlanması, hastalığın gelişimi ile ilgisi, bu verilerin bilgi bankalarında toplanarak değerlendirilmesi ile normal biyolojik süreçlerin ve hastalıkların altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasına olanak sağlamaktadır. Proteinlerin proteom analizi ile tanımlanma basamağından önce yüksek derişimde olan proteinlerin uzaklaştırılması marker olabilecek proteinlerin tanımlanabilmesi için avantaj sağlamaktadır.Plazmada bulunan Amiloid Prekürsör Protein'in (APP) parçalanma ürünü olan ve Alzheimer hastalığıyla ilişkisi kanıtlanan Aß-42 (41 pg/ml) proteini plazmada çok düşük derişimlerde bulunmaktadır. Bu protein plazmada yüksek derişimde bulunan albumin (35-50 mg/ml) ve IgG (5-7 mg/ml) tarafından maskelenmektedir. Bu nedenle albumin ve IgG nin uzaklaştırılması Alzheimer hastalığının teşhisinde önemli bir katkı sağlayacaktır.Bu amaçla sunulan çalışmanın ilk bölümünde afinite kromatografisinde destek materyali olarak kullanılacak adsorbentin hazırlanması planlanmıştır. Toksik olmamaları ve biyouyumlu olmaları, istenilen özelliklerde hazırlanabilme gibi özellikleri nedeniyle çalışmada protein (albumin, jelatin) ve polisakkarid (selüloz) esaslı üç biyopolimerik biyosorbent sentezi gerçekleştirilmiştir. Albumin, jelatin ve selüloz emülsiyon polimerizasyonu yöntemi ile mikroküre formuna getirilerek biyosorbentler hazırlanmıştır. Biyosorbentlerin sentezlenmesi sırasında, çeşitli parametreler değiştirilerek optimum koşullar tespit edilmiştir. Protein esaslı albumin ve jelatin biyosorbentlerin sentezinde yağ/su emülsiyon yöntemi ile biyosorbentler sentez edilmiş, bifonksiyonel bir ajan olan glutaraldehid ile biyosorbentler çapraz bağlanarak kararlı hale getirilmiştir. Karbohidrat esaslı selüloz biyosorbentler, su/organik faz emülsiyon sisteminde kitosan ortamında hazırlanarak kararlı formda sentezlenmiştir. Biyosorbent sentezinden sonra karakterizasyon çalışmaları yapılmış, optik mikroskop yardımıyla mikrograf ve daha sonra SEM görüntüleri alınmıştır. Albumin biyosorbent için; 0.1 g/ml albumin derişimi, 1000 rpm karıştırma hızı, % 1 GA derişimi ve 30 dakika çapraz bağlanma süresi optimum koşullar olarak belirlenmiş ve bu koşullarda sentezlenen albumin biyosorbentlere ait boy/boy dağılmı %16; 2-4 µm, %25; 9-11 µm, %10; 11-18 µm, %18; 18-22 µm olarak tespit edilmiştir. Jelatin biyosorbentler için; 0,1 g/ml jelatin konsantrasyonu, %4 tween20 emülsüfiye edici ajan derişimi, 10 dakika emülsüfikasyon süresi, 750 rpm karıştırma hızı optimum koşullar olarak belirlenmiş, bu koşullarda sentezlenen jelatin biyosorbentlere ait boy/boy dağılımının %22; <3 µm, %20; 5-7 µm, %30; 8-9 µm, %8; 10-12, %10; 13-15 µm olduğu görülmüştür. Selüloz biyosorbentler için; %2 kitosan stabilizör oranı, 1400 rpm karıştırma hızı, 40oC organik çözücü uzaklaştırma sıcaklığı optimum koşullar olarak belirlenmiş, bu koşullarda sentezlenen selüloz biyorsorbentlere ait boy/boy dağılımı %5; <2 µm, %80; 3-5 µm, %10; 7-9 µm olarak belirlenmiştir.Çalışmanın ikinci bölümünde optimizasyon çalışmaları tamamlanan biyorsorbentlerin uygulama çalışmalarına gerçekleştirilmiştir. Bu bağlamda kesikli sistemde adsorbsiyon çalışmaları yapılmıştır. Tıp alanında, proteom analizlerinde, iki boyutlu elektroforezden önce, yüksek derişimde bulunan proteinlerin afinite yöntemi ile uzaklaştırılması, hastalıklara özgü proteinlerin tespit edilmesine imkan tanımaktadır. Çalışmada sentezlenen biyosorbentler herhangi bir ligand kullanılmadan oda sıcaklığında, kan pH'ında (pH:7.4), çözelti ortamında albumin (50 mg) ve IgG (17 mg) ile ayrı ayrı muamele edilerek biyosorbentlerin (albumin, jelatin ve selüloz) albumin ve IgG yakalama kapasiteleri tayin edilmiştir. Reaksiyon ortamından alınan örneklerde Lowry yöntemi ile protein tayini yapılarak spektrofotometrik olarak adsorblanmayan albumin ve IgG miktarları tespit edilmiştir. Adsorblanan protein miktarlarını bulmak için başlangıç protein miktarından adsorblanmayan protein miktarları çıkarılarak biyosorbentler tarafından adsorblanan protein miktarları hesaplanmıştır. Adsorblanan mg protein/g polimer ile adsorbsiyon süresi arasında çizilen grafikten sentezlenen biyosorbentlerin maksimum adsorbsiyon kapasiteleri tayin edilmiştir. Buna göre biyosorbentlerin albumin yakalama kapasitesi sırası ile albumin; 609,2 mg/g polimer, jelatin; 877 mg/g polimer, selüloz; 976,6 mg/g polimer olarak belirlenmiştir. Biyosorbentlerin IgG yakalama kapasiteleri ise sırasıyla; albumin; 294,8 mg/g polimer; jelatin; 238,8 mg/g polimer, selüloz; 209 mg/g polimer olarak tespit edilmiştir. Buna göre hazırlanan biyosorbentlerden selülozun en iyi albumin yakalama kapasitesine (%97,6), albumin biyorbentin de en iyi IgG yakalama kapasitesine (%86,7) sahip olduğu belirlenmiştir.Sonuç olarak hazırlanan biyopolimerik biyosorbentlerin, iki boyutlu elektroforez öncesi, önemli ölçüde albümin ve IgG'nin uzaklaştırma yeteneğine sahip olduğu tespit edilmiştir. Hazırlanan biyopolimerik biyosorbentler, Alzheimer hastalığının erken tanısında plazmada tanımlanabilen tek protein olan Aß-42 proteininin, beyin omurilik sıvısı yerine plazmada tayin edilebilme olanağını sağlamaktadır. Literatürde pHEMA, pGMA gibi sentetik polimerlerle albumin ve IgG uzaklaştırma çalışmalarına rastlanmaktadır. Sunulan bu çalışmanın en önemli farkındalığı albumin ve jelatin gibi protein bazlı, selüloz gibi polisakkarid bazlı biyopolimerik biyosorbentler kullanılarak küresel formda biyosorbentlerin hazırlanması ve bu sorbentlerle daha biyouyumlu ve yüksek kapasitede albumin ve IgG uzaklaştırılmasıdır. Biyopolimerik biyosorbentlerle albumin ve IgG uzaklaştırılması literatüre ilk kez kazandırılmaktadır.

Abstract:
The blood plasma is one of the basic material for the diagnosis of diseases. It contains high concentrations of protein (60-80 mg/ml protein). A very sensitive study and good observation should be performed to obtain small amount of proteins in the sample that could be a good marker. Identification of these proteins allow elucidation of mechanisms underlying the disease and normal biological processes with the development and evaluation of the data collected. The removal of high concentration proteins before proteomic analysis obtain advantages to identify marker proteins.The cleavage product of Amyloid Precursor Protein (APP), Aß-42 (41 pg/ml) protein is exist at very low concentration in plasma. Its relationship with Alzheimer disease was proven. This protein is masked by the high concentration plasma proteins, albumin (35-50 mg/ml) and IgG (5-7 mg/ml). The removal of albumin and IgG proteins will provide very important advantage at the diagnosis of Alzheimer disease.In the first section of the present study it was planned to prepare adsorbents that will be used as support material in the affinity chromatography. Protein based (albumin and gelatine) and polysaccharide based (cellulose) three biopolymeric biosorbents were prepared. They are non toxic, biocompatible and can be prepared at desired properties. Albumin, gelatine and cellulose biosorbents have been prepared as microsphere form by the emulsion polymerization method. The optimum conditions were obtained during the synthesis of biosorbents by changing various parameters. Protein based albumin and gelatine biosorbents were synthesized by oil/water emulsion method and stabilized by crosslinking with glutaraldehyde as a bifunctional agent. Polysaccharide based cellulose biosorbents were synthesized and stabilized by water/organic phase emulsion system in chitosan media. The optical micrographes and SEM images of biosorbents were taken for the characterization studies after synthesis. 0,1 g/ml concentration, 1000 rpm stirring rate, 1% GA concentration and 30 min. crosslinking time were determined as optimal conditions for albumin biosorbents. Albumin biosorbents?s size distribution were 16% 2-4 µm, 25% 9-11 µm, 10% 11-18 µm, 18% 18-22 at these conditions. The optimal conditions were found for gelatine biosorbents as 0.1 g/ml, concentration, 4% emulsifier amount, 10 min emulsufication time, 750 rpm stirring rate. Gelatine biosorbents?s size distribution were found as 22% <3 µm, 20% 5-7 µm, 30% 8-9 µm, 8% 10-12 µm, 10% 13-15 µm at these conditions. 2% chitosan amount, 1400 rpm stirring rate, 40oC solvent evaporation temperature were determined as optimal conditions for cellulose biosorbents. The size distribution for cellulose biosorbents were 5% <2 µm, 80% 3-5 µm, 10% 7-9 µm at these conditions.In the second part of the study, application performances of biosorbents were performed after characterization studies. The adsorption studies were carried out at batch wise. In the field of medicine, in proteom analysis, removal of high abundance proteins by affinity chromatography before two dimensional electrophoresis allow the identification of disease-specific proteins. In the present study biosorbents were synthesized at room temparature at blood pH: 7,4 without using any ligand. The biosorbents (albumin, gelatine and cellulose) were treated with albumin (50 mg) and IgG (17 mg) separately. Capturing capacities of biosorbents were determined. Unadsorbed albumin and IgG amounts were determined with samples taken from the reaction media by Lowry method spectrophotometrically. To find the adsorbed amounts of albumin and IgG by biosorbents, unadsorbed protein amounts were subtract from the initial protein amounts. Max adsorption amounts were found by drawing plot between mg protein/g polymer and adsorption time. According to these results albumin biosorbents have 609,2 mg albumin/g polymer and 294,8 mg IgG/g polymer, gelatine biosorbents have 877 mg albumin/g polymer and 238,8 mg IgG/g polymer, cellulose biosorbents have 976,6 mg albumin/g polymer and 209 mg IgG/g polymer capturing capacities. Among them cellulose biosorbents have the best albumin capturing capacity (97,6%) and albumin biosorbents have the best IgG capturing capacity (86,7%).It may be concluded that prepared biopolymeric biosorbents sufficient in terms of efficiency of albumin and IgG depletion prior to two dimensional electrophoresis. Depletion of albumin and IgG proteins from plasma greatly improve the ability to detect Aß-42 in plasma instead of cerebrospinal fluid that very important in the diognosis of Alzheimer disease. There are a number of study to remove albumin and IgG by synthetic polymers like pHEMA, pGMA in the literature. This study was presented as awareness of preparing protein based albumin, gelatin biosorbents and polysaccharide based cellulose in spherical form and removing of albumin and IgG at highly biocompability and capacity. Albumin and IgG removal by biopolymeric biosorbents is obtained for the first time in the literature.