Blastosist sıvısı aspirasyonunun in vitro sığır embriyolarında dondurma sonrası viyabiliteye etkisi
Effect of artificial collapse method on freezed-post thawed bovine blastocysts viability
Yazar: GÖKÇE ONUR ÜNAL
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA KAYMAZ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Blastosist = Blastocyst ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Embriyo = Embryo ; Sığırlar = Cattles ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques ; İnekler = Cows

Özet:
Bu çalışmada in vitro koşullarda üretilen sığır embriyolarından blastosist sıvısının aspirasyonu yapıldıktan sonra, embriyoların vitrifikasyon ve yavaş dondurma metotlarıyla dondurulup çözdürülmesini takiben viyabilitelerinin incelenmesi amaçlanmıştır.
Çalışmada lokal mezbahalardan toplanan ovaryumlardan elde edilen oositlerde maturasyon, fertilizasyon ve embriyo kültürü yapılmasını takiben zigotların cleavage kontrolü IVF sonrası 27-31. saatlerde ve 51-55. saatler olmak üzere iki kez inverted mikroskop altında kayıt alındı. Embriyonik kültürün 7-8-9. günlerinde oluşan toplamda 597 adet 5 hücreli ve 5 hücreden büyük aşamadaki zigotlardan 271 adet BL ve Exp-Bl elde edildi (%45,39). Bunların 141 adeti (%52,02) iyi kaliteli (good) olarak değerlendirilerek çalışmada kullanıldı. Embriyolar; aspire ve vitrifiye edilen embriyolar (Grup I), vitrifikasyon kontrol (Grup II), aspire ve yavaş dondurma ile dondurulan embriyolar (Grup III) ve yavaş dondurma kontrol (Grup IV) olmak üzere dört gruba ayrıldı. Aspirasyon gruplarında yer alan Bl/Exp Bl'nin blastosöl sıvısı, özel olarak hazırlanan kağillar cam pipet ile mikromanipülatör ve inverted mikroskop kullanılarak yapıldı. Embriyonun iç hücre kümesine dokunulmadan trofoblast hücreleri arasından mikroenjeksiyon pipetiyle girilerek blastosist sıvısının tümü blastosist kavitesi tamamen kollabe olana kadar aspire edildi. Bütün gruplarda çözdürme sonrası embriyoların canlılık oranları, 24-48-72. saatlerde ve 7 gün süre ile takip edildi. Yapılan istatistik değerlendirmeler sonucunda, her iki yöntem ile dondurulan embriyoların 3 gün ve 7 gün takiplerinde toplam hatched oranı ekspanded blastosistlerde blastosistlere göre daha başarılı bulundu (p=0,004 ve p=0,006). Çözdürme sonrasında embriyoların 24-48 ve 72. saatlerdeki toplam hatching-hatched oranı incelendiğinde; Grup I (%28,57), Grup II (%39,39) ve Grup IV (%41,18) arasında önemli bir farklılık bulunmazken, Grup III (%71,88) diğer gruplardan önemli bir şekilde yüksek bulundu (p=0,002). Çözdürme sonrası 7 gün süre ile incelenen embriyoların hatching-hatched oranı Grup III (%78,10)'te diğer gruplardan önemli bir şekilde yüksek bulundu (Grup I-%31; Grup II-%48,50; Grup IV-%55,90) ve Grup I,II ve IV arasındaki farklılığın ise önemsiz olduğu tespit edildi (p<0,001). Yapılan çalışmada, blastosist sıvısı aspirasyonunun yavaş dondurmada rahatlıkla kullanılabileceği ve başarılı sonuçlar elde edilebileceği sonucuna varıldı. Aspirasyon için embriyo seçiminde embriyonun ekspanded blastosist aşamasında olması, çözdürme sonrası viyabiliteyi olumlu etkilediği kanısına varıldı.

Abstract:
The aim of this study is to investigate the viability of in vitro produced embryos, which will be frozen and thawed by using slow freezing and vitrification methods after blastocyst fluid aspiration.
In this study, oocytes were obtained from slaughter house ovaries using standard techniques. Cleavage checked was done 27-31 hours and 51-55. hours after IVF under the inverted microscope. Blastocysts or expanded blastocysts were obtained from 5- cell ≤ zygotes at 7-8-9 days post fertilization (45,39%). Good embryos were used in the study and four groups were formed; Group I-vitrification aspirated, Group II- vitrification control, Group III-slow freeze aspirated and Group IV-slow freeze control. Embryos at 7-8-9th days were aspirated using micromanuplator attached to the inverted microscope. For aspiration, capillary glass pipettes prepared with micropipette puller. Microinjection pipette was entered the blastocyst cavity through trophoblast cells without damaging inner cell mass and blastocoel fluid were aspirated until the collapse of blastocyst cavity. After thawing, embryo viability was checked for 24-48-72nd hours and 7 days. As a result of the statistical evaluations, the total hatched ratio of frozen embryos in both methods that follwing 3 days and 7 days after thawing was found to expanded blastocysts were more successful than blastocysts (p = 0,004 and p = 0,006). When embryo viability was examined for 3 days, there was no significant difference was found between Group I (28,57%), Group II (39,39%), Group IV (41,18%) but Group III (71,88%) was found significant difference from other groups (p=0,002). While embryo viability was examined for 7 days, the rates of hatched embryos of slow freeze aspirated group (Group III) (78,10%) was significantly higher (p<0,001) than vitrification aspirated groups (Group I) (31%), vitrification control (Group II) (48,50%) and slow freeze control (Group IV) (55,90%). There was no difference between vitrification control, vitrification aspirated and slow freeze control groups. In the current study, it has been concluded that blastocyst fluid aspiration can be easily used in slow freezing method and successful results can be obtained. Viability is positively effected after thawing when embryo is in expanded blastocyt stage at the selection of the embryo for aspiration.