BisBAL'un Escherichia coli  üzerine inhibisyon etkisi ve bisbal'lu membranların Xanthan Gum ile filtrasyonu
Inhibition effect of bisbal on Escherichia coli and Xanthan Gum filtration by membranes which contains BisBAL
Yazar: SELİN OKATAN
Danışman: DOÇ. DR. SÜLEYMAN ÖVEZ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Çevre Bilimleri ve Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering

Özet:
Dünya çapında hızla artan su tüketimi beraberinde doğal su kaynaklarının da aynı hızla hem tüketilmesine hem de kirlenmesine sebep olmaktadır. Oluşan bu tüketim ve kirlilik prosesi ile doğal su kaynaklarının günden güne azaltma etkisi kullanılan suların tekrardan geri kazanılıp kullanılabilir bir duruma getirilmesini gerektirmektedir.
Atıksuların arıtılarak geri kazanılması konusunda membran biyoreaktör sistemler hızla gelişmekte, gerek içme suyuna çok yakın kalitede çıkış suyu eldesi, gerekse az alan ihtiyacı ve koku problemine sebep olmadan arıtma işlemini gerçekleştirmesi bakımından öncelikli tercih seçeneği olma yolunda gitmektedir.
MBR Sistemler her ne kadar diğer arıtma çeşitlerinden daha avantajlı bir arıtma prosesine sahip olsa da ekonomik açıdan yeterince tercih edilebilecek bir seçenek değildir. Yüksek yatırım maliyeti ve hızlı tıkanma MBR sistemlerinin henüz günümüzde seçilme olasılığını arttırmamaktadır.
Bu sebeple günümüzde en verimli arıtma alternatiflerinden biri olan membran proseslerin biyokirlenme problemine yönelik alternatif çözüm yöntemleri sunulması, membranın biyokirlenmeye daha dirençli bir hale getirilip ömrünün uzatılması üzerine çalışmalar yapılmalıdır. Bu tez kapsamında MBR sistemlerin tıkanma problemlerine alternatif metodlar ile çözümler üretilmeye çalışılmıştır. Böylelikle işletime alınmış membran sistemlerin işletim maliyetleri de azaltılarak, yüksek arıtma veriminin yanında, ekonomik yönden de tercih edilebilecek bir arıtma alternatifi haline getirilmesi amaçlanmaktadır. 
Atıksu içerisinde bulunan bakteriler çözünebilir mikrobiyal ürünler (SMP) ve hücre dışı polimerik maddeler (EPS) üretmektedir (Chang ve diğ., 2002). SMP çözünür hücresel madde metabolizması sırasında ortaya çıkan bileşenler ve benzerleri olarak tanımlanmıştır. EPS ise proteinler, karbohidratlar, nükleik nasitler, lipidler ve humik maddelerden oluşur ve çözünebilir makro-moleküller ve kolloidler olarak bilinir (Laspidou ve Rittmann, 2000). EPS bakterilerin membran yüzeyine tutunmasına neden olduğundan membranlarda biyofilm oluşumuna neden olurlar (Codony ve diğ., 2003).Üretilen bu ürünler mukoza yapısına sahip olup MBR sistemler vasıtasıyla yapılan atıksu arıtma sistemlerinde, membran gözeneklerine tutunarak membranın kısa süre içerisinde tıkanmasına sebep olmaktadır. Gözenekleri hızla tıkanan ve hem yatırım hem de bakım maliyetleri yüksek olan membran sistemler ekonomik olmaktan çıkıp tıkanma sorunu ve beraberinde gelen yüksek maliyeti yüzünden atıksu arıtma sistemleri arasında en iyi alternatiflerden birisi olmasına rağmen tercih edilme önceliği ortadan kalkmaktadır. Membranların biyokirlenmesine sebep olan ve membran yüzeyinde birikerek kek tabakası oluşturarak membran gözeneklerini tıkayan,bakterilerin ürettiği, çözünebilir mikrobiyal ürünler (SMP) ve hücre dışı polimerik maddeler (EPS) bu sebeplerden dolayı çözüm üretilmesi gereken bir sorun haline gelmiş bulunmaktadır.
Tez çalışması kapsamında biyotıkanmaya sebep olan EPS ve SMP'nin azaltılabilmesi için tıp ve ilaç sektöründe yaygın olarak kullanılanantibiyotiklerin özelliklerini taşıyan yine antibiyotik özellikte olan Bizmut içerikli membranlar üretilerek etkileri üzerine çalışılmıştır.Bizmut tiyoller en önemli ve bilinen antibiyotiklerdir. EPS üretimini azaltıp, biyofilm oluşumunu engellerler (Dominico ve diğ., 2009). Yapılan çalışmalarda BisBAL (bizmut-2-3-dimerkapto-1-propanol) adı verilen bizmutun dimerkaptopropanol ile yapmış olduğu şelatın Staphylococcus, Klebsiella ve Pseudomonas gibi bakteriler tarafından salgılanan hücredışı polimerik maddelerin yani EPS'lerin hem polisakkarit hem de protein üretimlerini inhibe ettiği böylece membranlarda biyofilm oluşumunu azaltırken, membranların kullanım ömürlerini arttırdığı görülmüştür.  Bu kapsamda Bizmut içerikli antibiyotik özellikte olan BisBAL maddesi farklı üretim koşullarında ve Bis/BAL molar oranlarında üretilerek, atıksu içerisinde bulunan bakterileri temsilen seçilmiş olan gram negatif bir bakteri olan Escherichia coli üzerine inhibisyon çalışmaları yapılarak, membranların üretiminde kullanılacak olan optimum BisBAL çeşidi ve konsantrasyonu belirlenmeye çalışılmıştır. BisBAL, laboratuvarda üretilen bir bizmut tiyol grubu olup, diğer üretilen inorganik bizmut bileşiklerinden 1000 kat daha fazla antibakteriyel aktivitesi olan bir bileşiktir. BisBAL saf bizmut nitrata ve benzer bileşiklere oranla 300 kat daha fazla antibakteriyel özelliğe sahiptir (Domenico ve diğ., 1999).
İnhibisyon çalışmaları sürecinde BisBAL çeşitleri farklı sıcaklık, Bis/BAL molar oran ve pH koşullarında üretildikten sonra yapılan literatür araştırmalarına dayanılarak seçilen farklı BisBAL konsantrasyonları ile gram negatif bir bakteri olan Escherichia coli bakterisinin aşılandığı besiyerlerine ekilerek, bakterilerin inkübe edilmesi sonucu üreme miktarları ve EPS, SMP üretimleri incelenmiştir. Yapılan bu inhibisyon çalışmaları sonucu Escherichia coli bakterileri üzerine minimum inhibisyon konsantrasyonundaki maksimum EPS ve SMP üretimini ve salımını inhibe edici BisBAL çeşitleri seçilmiş ve seçilen BisBAL çeşitleri ile membran üretimleri gerçekleştirilerek filtrasyon deneyleri ile çalışmalara devam edilmiştir.
İnhibisyon çalışmaları sonrasında optimum BisBAL çeşidi ve konsantrasyonu belirlenmiş ve aynı çeşit ve konsantrasyonda BisBAL içeren, %16 ve %20 PES ve PSF içerikli nonmoven membranlar hazırlanarak, Xanthomonas campestris bakterisi tarafından üretilen bir polisakkarit olan, 25mg/L'lik Xanthan Gum çözeltisi ilefiltrasyon deneyleri yapılmıştır. Filtrasyon deneyleri süresince elde edilen değerlerin kıyaslanabilmesi amacıyla BisBAL içermeyen aynı özellikteki membranlar da filtre edilerek verileri kaydedilmiştir. Farklı konsantrasyonda olup aynı BisBAL çeşidini içeren membran türleri sonuçların güvenilir olabilmesi amacıyla eş zamanlı olarak Xanthan Gum ile filtrasyon deneyine tabi tutulmuştur. Xanthan Gum filtrasyonu sonrasında BisBAL içeren membranların ve BisBAL içermeyen membranların yapılarındaki farkları görebilmek ve tıkanıklıkları hakkında fikir sahibi olabilmek için filtrasyon işlemi sonrasında saf su ile hidrolik yıkamaları yapılarak sonuçları kıyaslanmıştır.
Yapılan çalışmalar neticesinde BisBAL'lu membranların BisBAL içermeyen membranlara göre biyotıkanmaya daha dirençli olduğu ve daha yüksek akılarda çalıştığı ölçülerek bulunmuştur.

Abstract:
With rapidly increasing worldwide water consumption at the same rate in both natural water resources as well as pollution is caused to be consumed. This process occurs by the increasing consumption and pollution of natural water sources from day to day.
Wastewater is purified on recycling membrane bioreactor systems developing rapidly, the need of drinking water very close to the quality of output water retrieval, as well as less need for space and odor problems without causing purification performing in terms of first preference option that is well under way .
MBR system which is one of the water and waste water treatment systems, is one of the most advantageous purification process but on the other hand it is not a preferable option because of not meeting the economic standarts enough. High investment costs and rapid clogging of the MBR system is unfortunately reduce the probability of being selected .
Today membrane processes are one of the most efficient treatment alternatives although they do not economically enough,for this reason within this project studies, alternative solutions to the problem of biofouling have been researched tobring the membranesto be more resistant to biofouling and as a result of fact that extending the life.Within the studies in this thesis project, the solutions of biofouling of MBR systems with alternative methods has been aimed to be discovered. Thus, membrane systems operating costs aimed to be reduced with high treatment efficiency and aimed to be aprior preferable alternative treatment method.
Bacterias which existed in the waste water produce soluble microbial products (SMP) and extracellular polymeric substances (EPS) which cause membrane biofoulings. Mucosal structure of this products get biofouling of MBR systems much more easier in wastewater treatment systems, occlude the pores of membranesand decrase the membranes operation life. Pores quickly become blocked so that both investment and maintenance costs get higher which make the membrane systems not to be economical and causes clogging problem as a reasult of the fact that the accompanying high costs. So that because of the being one of the uneconomical choice of the waste water treatment systems, membrane systems are not preferred as a best alternative method and is being eliminated. The most important problem of membrane is biofilms. Biofilms are microbial communities adapted to the conditions of low nutrient and disinfection. In general, biofilms features rarely colonized surfaces, the nested structure of the extracellular polymers, ion channels formed by the microbial cells and the complex layers of thick as large as the depth varies µm (LeChevallier at al, 1987; Stewart at al, 1993). Membranes biofouling which causes the membrane surface deposited cake layer forming the membrane block because of the clogged pores which is a result of the bacterias products which are soluble microbial products (SMP) and extracellular polymeric substances (EPS).
Within the context of this thesis, at the research stage, BisBAL, the Bizmut thiol content that is one of the antibiotics that are widely used in pharmaceutical industry and medicine is studied to reduce  EPS and SMP which causes the biofouling of membranes. Within this scope, Bismuth thiols are selected as an antibiotic and produced BisBAL substance at various Bis/BAL molar ratios, temperatures,pH and concentrations to generate the optimum BisBAL type and minimum inhibition concentration by studying on Escherichia colibacteries which is one of the gram negative bacteries and commonly exist in sewage and waste waters.Concentrations of 0.6 to 1 ppm Bisbal capsule is known to inhibit the formation of biofilm 70-90%. It is safer and less toxic than other antibacterial products like silver (Domenico at al, 2009; Marshall, 1991).
For the optimization of the synthesis conditions of BisBAL; temperature, pH and Bis:BAL molar ratio were chosen as three different parameters. At room temperature (25 ᵒC) and high temperature conditions (45 ᵒC) BisBALs were synthesized. pH 4, 7 and 10 values were selected in order to represent the acidic, neutral and basic conditions respectively for the optimization of the pH. Another parameter which is effective in the inhibition of is ratio of bismuth and BAL. In order to optimize the molar ratio Bis:BAL,  3:1, 2:1 and 1:1 ratios were selected. BisBAL was synthesized by addition of bismuth nitrate pentahydrate (Bi(NO3).5H2O) solved in propylene glycol (C3H8O2) to 2,3-dimercapto-1-propanol. Stock solution was first prepared for the synthesis and then adjustments were made with 1 N NaOH addition and temperature adjustments were provided by using heating stirrer constantly. 18 combinations of BisBAL were synthesized.
Inhibition studies were performed in the process BisBALtypes of different temperatures , Bis / BAL molar ratio and pH conditions after production literature survey based on the selected different BisBAL concentrations and gram negative bacteria, Escherichia coli bacteria was inoculated medium being planted into bacteria, incubating the resulting reproduction quantities and EPS , SMP production was examined. The inhibition studies resulting Escherichia coli bacteria on the minimum inhibitory concentration in the maximum EPS , SMP inhibitory BisBAL varieties selected and the selected BisBAL with other types of membrane production by performing filtration experiments, studies have been continued .
The gram negative bacteria Escherichia coli which is studied on for the inhibition studies, was taken from "Microorganism Culture Collection Research and Application Center (KÜKENS) of Turkey". Pure culture Escherichia colibacterias were incubated at 37 °C in Standard Plate Medium. BisBAL inhibition tests on E. coli had been run with different molar concentrations (5, 12, 15, 20, 30 and 40 µM). Inhibition experiments were carried out in 5 mL liquid media. Autoclaved medium was put in sterile tubes, inoculated with bacteria and various molar concentrations of BisBAL in order to see the effects on bacteria were added with sterile automatic pipettes. After 24 hour and 48 hour incubation ofE.coli bacterias with BisBAL in broth medium by using Heraeus incubator, optical densities of samples were analyzed at 420 and 570 nm wavelengths.
EPS and SMP extractions were done by using ultracentrifugation (15.000 and 9.000 ppm respectively). Protein analyses were run according to Lowry method and carbohydrate analyses were performed by using "the phenol-sulfuric acid method". 
14 different membranes were casted. Polyethersulfone was used as polymer and PVP as solvent. Two different PES ratios were selected: 16% and 20%. PVP ratio was 8%. BisBAL additions were done according to the 15 and 30 µM. Xanthan Gum was filtered by StarliTech Filtration system.
After the inhibition studies and choosing the optimum BisBAL types, the studies has been continued by producing the membranes which contain BisBAL and which did not contain BisBAL to be able to compare the results clearly. At the choosen concentrations, EPS and SMP can be decreased up to 98% for Escherichia coli bacterias. At the filtration stage with the non-woven membranes which is produced with the selected optimum BisBAL types and concentrations and contains %16 and %20 PES and PSF at the same ratio are filtrated with the substance which is made of Xanthomonas campestris bacteria produced by a polysaccharide as called Xanthan Gum solution at the concentration of 25 mg/L. During filtration experiments in order to compare the resultsBisBAL free membranes are filtered at the same conditions too.
As a result of the studies with optimum BisBAL types at the minimum inhibitory concentrarion (MIC) on Escherichia coli bacterias and Xanthan Gum filtrations, it is obvious that BisBAL has a great effect on EPS and SMP decrase and can be easily used without any impact loss, prevent the membrane to biofouling, increase the operation time, membrane life and also prevent the membrane flux loss so that make the membrane systems much more preferable and get a new and useable alternative for the biofouling problems of membrane systems.