Hassas buğday (Triticum aestivum L.) seri82 çeşidinde sarı pas (Puccinia striiformis f. sp. tritici) enfeksiyonu gelişiminde rol alan proteinlerin proteomik yaklaşımla incelenmesi
Proteomic analysis of proteins in susceptible wheat cultivar (Triticum aestivum L.) seri82 upon  development of yellow rust (Puccinia striiformis f. sp. tritici) infection
Yazar: YAHYA EMİN DEMİRCİ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SENAY VURAL KORKUT
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Bitki hastalıkları = Plant diseases ; Bitki patojenleri = Plant pathogens ; Bitki proteinleri = Plant proteins ; Buğday = Wheat

Özet:
Buğdayda (Triticum aestivum L.) Puccinia striiformis f. sp. tritici (Pst)?nin etmeni olduğu sarı pas hastalığı, dünya çapında en tahripkar hastalıklardan birisidir. Pst oldukça kısa zamanda yeni ırklar geliştirme, rüzgar etkisiyle de kolaylıkla ve hızlıca yayılım gösterebilme konusunda yüksek bir potansiyele sahiptir. Dayanıklı buğday çeşidi kullanımı ve fungusit uygulamaları ile sarı pas hastalığı kontrol edilmeye çalışılmaktadır. Bununla birlikte yeni virülent ırklar ve çevresel koşulların etkisiyle dünyanın farklı yerlerinde son derece tahripkar epidemiler meydana gelebilmektedir. Bu yüzden hastalıkla mücadelede daha etkin ve hızlı yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu bağlamda buğday/Pst etkileşiminin moleküler mekanizmalarını ve bu süreçlerde işlevsel olan gen ve gen ürünlerinin aydınlatılması önem taşımaktadır. Tez kapsamında proteomik yaklaşım kullanılanılarak virülent fungal saldırıya karşı bitki incelenmiştir. Çalışma, buğday-Pst etkileşiminde hastalık cevabının incelendiği ilk proteomik çalışmalardan biridir. Elde edilen veriler, bu konuda yapılmış genomik ve işlevsel genomik çalışmaları da tamamlayıcı niteliktedir.
Tez çalışması kapsamında sarı pasa hassas buğday çeşidi Seri82 kullanıldı. Patojenle inokule edilmiş (enfekte) ve boş inokulasyon yapılmış (kontrol) bitkilerin 24, 48, 72 ve 96. saat yaprak örneklerinden hazırlanan total protein ekstraktları, PF2D (İki boyutlu protein fraksiyonlama) sisteminde iki boyutlu ayrılarak fraksiyonlandı. Her bir zaman dilimine ait enfekte/kontrol örneklerin protein profilleri bire bir karşılaştırıldı. Pst ile inoküle edilen örneklerde kontrole göre farklı eksprese olan proteinler seçildi ve nanoLC-ESI-MS/MS sistemi kullanılarak tanımlandı. 
Tüm zaman dilimlerinde, farklı eksprese olan toplam 193 protein tanımlandı. Tanımlanan proteinlerin %30?u fungal kaynaklı, %70?inin ise konukçu kaynaklı olduğu bulundu. Hem fungal hem de bitkisel proteinler temel biyolojik fonksiyonlarına göre farklı gruplar altında sınıflandırıldı. Bu gruplar patojen saldırısı, bitki savunması, stres cevabı, sinyal iletimi, transport, transkripsiyon, metabolizma, enerji metabolizması (fotosentez ve elektron transportu), protein metabolizması ve yapısalı içermektedir. Ayrıca fungal proteinlerin %70?i bilinen proteinlerden hiç birisi ile homoloji göstermedi ve hipotetik grup olarak sınıflandırıldı. Her bir fonksiyonel grup ve içerdiği protein oranları farklı zaman dilimlerinde çeşitlilik gösterdi.
İnokulasyon sonrası 24. saatte tanımlanan fungal proteinlerden biri konukçu hücre yüzeyine tutunmada rol aldığı bilinen Metil alımı kemotaksis proteini (Methyl-accepting chemotaxis protein-MCP) ile homoloji göstermiştir. Diğer bir fungal protein ise bitki hücresine giriş için Pst sporlarından gelişen flagella biyosentezinde rol alan FliO/FliZ ile homoloji göstemiştir. İki bitkisel protein ise bitki savunmasının ilk aşamalarında önemli rollere sahip süperoksit dismutazlar (Superoxide dismutases-SOD) ve Flavanon 3 hidroksilaz (Flavanone 3 hydroxylase-F3H) ile homoloji göstermiştir.
48. saat örneklerde ekspresyon artışı gözlenen fungal Endoksilanaz (Endoxylanase Precursor) proteini ise bitki hücresine giriş için patojen saldırısının devam ettiğini göstermektedir. Aynı zaman diliminde tanımlanan Metakaspaz 4 (Metacaspase 4-MCA4), pas dayanıklı kinaz Lr10 (Rust resistance kinase Lr10-LRK10),  Agmatin kumaril transferaz (Agmatine Coumaroyl Transferase-ACT) ve Lipid transfer proteini (Lipid Transfer Protein-LTP) ise bitki savunmasının önemli proteinlerindendir.
72 ve 96. saatlerde gözlenen fungal İzokorismataz hidrolaz (Isochorismatase hydrolase)?ın ekspresyonunun arttığı görüldü. İzokorismataz hidrolaz, salisilik asit üretiminin inhibitörü ve en önemli bitki savunma baskılayıcılardan biridir. Aynı zaman diliminde bitkisel Kitinaz (Citinase) ve Endokitinaz (Endocitinase) enzimlerinin de anlatımı artmıştır. Bunlar patojen hücre duvarını yıkma ve diğer antifungal özelliklerinden dolayı bitki savunmasında önemli proteinlerdir.
Sonuç olarak; sunulan tez çalışması literatürde karşılaştığımız, buğday-Pst etkileşiminde hassasiyet cevabının incelendiği en kapsamlı proteomik çalışmadır ve son derece özgün bulgular içermektedir. Bu sonuçların hastalığın kontrolü için daha hızlı ve etkin mücadele yöntemlerinin geliştirilmesine katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Wheat (Triticum aestivum L.) yellow rust, caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici (Pst), is one of the most destructive diseases of wheat worldwide. Pst has high potential to develop new pathotypes in very short time intervals and spreading easily and rapidly by the effect of wind. There has been attempts to control yellow rust disease by the usage of resistant wheat cultivars and the application of fungicides. However devastating outbreaks of epidemies occur in different parts of world by the effect of environmental conditions and new pathotypes. Therefore development of more effective and rapid disease control strategies are required. It is important to elucidate the molecular mechanisms of wheat-Pst interaction and genes and gene products which are functional in this processes. In the thesis, plant defence responses against virulent yellow rust attack were invastigated by using proteomic approach. This study is one of the first proteomic studies about disease responses in wheat-Pst interaction. Obtained data will be supplementary for the similar genomic and funtional genomic studies.
In the scope of this study, yellow rust-susceptible wheat cultivar Seri82 was used. Total protein extracts from pathogen-inoculated (infected) and mock-inoculated (control) plant leaves at 24, 48, 72 and 96th following infection were fractionated with PF2D (Protein Fractionation 2 Dimensional) system. Protein profiles of infected and control samples were compared for each time point. Differentially expressed proteins were selected and identified in Pst-inoculated samples as compared with mock-inoculated controls by nanoLC-ESI-MS/MS system.
Totally 193 differentially expressed proteins were identified for all the time point samples. Thirty percent of identified proteins were found to have fungal origin, meanwhile, 70% of proteins were found to have host origin. Both fungal and plant proteins were categorized into different groups based on their basic biological functions. These groups include pathogen attack, plant defence, stress responses, signal transduction, transport, transcription, metabolism, energy metabolism (photosynthesis and electron transport), protein metabolism and structure. In addition, 70% of fungal proteins do not show homology with any known proteins and they were classified as hypotetical group. Relative representation of each group and percentages of proteins showed variations between different time points.
One of the fungal proteins identified at 24th hour post inoculation that showed homology to ?Methyl-accepting chemotaxis protein? (MCP) that were found to be functional in adsorption of pathogen to the host cell surfaces. Another fungal protein showed homology to ?FliO/FliZ? that is found to be expressed for biosynthesis of flagella which germinate from Pst spores for penetration to the plant cell. Two wheat proteins showed homology to ?Superoxide dismutases? (SODs) and ?Flavanone 3 hydroxylase? (F3H) proteins which have significant roles in early stages of plant defence responses.
There was increased expression of ?Endoxylanase Precursor? fungal protein at 48th hour and this may indicate that pathogenicity is going on for the penetration to the plant cell. Important plant defensive proteins such as ?Metacaspase 4?  (MCA4), ?Rust resistance kinase Lr10? (LRK10),  ?Agmatine Coumaroyl Transferase? (ACT) and ?Lipid Transfer Protein? (LTP) proteins were also identified at the same time point.
Up-regulation of fungal ?Isochorismatase hydrolase? protein were observed at 72 and 96th hours. Isochorismatase hydrolase is inhibitor of salicylic acid production and one of the most important plant defence suppressor. In the same time points, plant ?Citinase? and ?Endocitinase? enzymes were found to be up-regulated. These are important for plant defence due to their effect on pathogen cell wall degradation and other antifungal features.
As a result; presented thesis is the most extensive proteomic study that can be find in the screened literatures about wheat-Pst interaction and results contain unique findings. We expect that our findings will contribute to development of more rapid and effective disease control methods.