Clostridium botulinum toksininin kantitatif olarak saptanmasında kullanılacak kanatlı immunoglobulinlerine (IGY) dayalı bir immuno real-time pcr testinin geliştirilmesi
Development an immuno real-time pcr assay for the quantitative determination of clostridium botulinum toxin by using poultry immunoglobulins (IGY)
Yazar: ALİ ABDELKAREEM
Danışman: PROF. DR. KENAN MİDİLLİ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Botulinum toksinleri = Botulinum toxins ; Clostridium = Clostridium ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Tavuklar = Chickens ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; İmmünoglobülin Y = Immunoglobulin Y

Özet:
Sporlu, anaerob, gram pozitif çomak şeklinde bir bakteri olan Clostridium botulinum  tarafından üretilen botulinum toksini (BoNT),  bilinen en güçlü nörotoksindir ve organofosfatlardan "VX"'e (S-[2-(Diisopropylamino)ethyl] O-ethyl methylphosphonothioate)  göre 15,000, sarin gazına göre ise 100,000 kat daha güçlüdür. Botulinum toksini, yaklaşık 150 KD ağırlığında, çift zincirli polipeptid yapıda bir toksindir. C. botulinum'un sporları, toprak ve su birikintilerinde yaygın olarak bulunmaktadır. Bu sporlar gıda ve gıda ürünlerini kontamine ederek ciddi intoksikasyonlara neden olurlar. BoNT'nin A'dan H'ye kadar olmak üzere sekiz serotipi bulunmaktadır. İnsanlarda meydana gelen botulizmlerin çoğundan C. botulinum'un A, B, E ve F toksin serotipleri sorumludur. 
Beşeri tıp dışında veterinerlik, gıda ve farmasötik endüstrisi, biyogüvenlik gibi pekçok alanda botulinum toksinlerinin hızlı ve duyarlı bir şekilde saptanmasını sağlayacak, kolay uygulanabilir test formatlarına gereksinim duyulmaktadır.
Bu çalışmada BoNT A'yi hasas ve hızlı bir şekilde saptayabilecek bir yöntem geliştirilmesi amaçlandı. Deneyin duyarlılık ve özgüllüğünü artırmak, toksini büyük hacimlerden konsantre edebilmek amacı ile kanatlı immun globulini (IgY) kaplı manyetik boncukların kullanıldığı bir yakalama sistemi geliştirildi. Saptamada protein ya da antijenlerin saptanmasında bilinen en duyarlı yöntemlerden biri olan immuno realtime PCR'a dayalı bir test formatı tasarlanarak optimize edildi. Yapılan ön değerlendirmeler ile alt saptama sınırının 100 femtogram/ml olarak bulunan bu ultrasensitif test formatı ile 100 femtogram – 0,1 ng aralığında güvenilir kantitatif sonuçlar elde edilebildiği gözlendi. Farklı matrik yapılarına sahip örneklerde (bal, süt, yoğurt, yoğurt suyu, sucuk ve dışkı) deneyin alt saptama sınırı değişmemekle birlikte bal örneklerindeki kantitatif performansının örnek matriksinden etkinlendiği gözlendi. 
Sonuç olarak geliştirilen sistemin BoNT'u farklı örneklerde ELISA yöntemi ve fare deneylerine göre 103-106 kat, daha düşük bir alt saptama sınırına sahip olduğu, fakat kantitatif ölçümler için matrikse özgü standart kullanımı ve optimizasyon işlemlerinin gerektiği sonucuna varıldı.

Abstract:
The botulinum toxin (BoNT) produced by the Clostridium botulinum, which is an anaerobic, spore-forming, Gram positive rod-shaped bacterium, is the known most potent neurotoxin and is 15 000 and 1000 000 times more toxic than organophosphate "VX"'e (S-[2-(Diisopropylamino)ethyl] O-ethyl methylphosphonothioate)  and sarine, respectively. BoNT is consisted of two peptide chains with a molecular weight 150 kDa. The spores of C. botulinum is ubiquitous in soil and water. These spores contaminate foods especially canned food products and cause intoxications. There are 8 serotypes (A-H) of BoNT and serotypes A, B, E and F are responsible for the human cases. 
In addition to the human medicine, easy to use test formats enabling rapid and reliable detection of BoNTs are needed also in other practices like veterinary medicine, food safety, pharamaceutical and enviromental biosafety.
The aim of this study was to develop a rapid and highly sensitive assay for detection and quantification of BoNT. A toxin capture system consisting of avian IgY coated magnetic beads is designed to increase the sensitivity and specificity of the assay and to concentratate the toxin from samples of large volumes. For detection, an assay relying on immuno real-time PCR which is one of the known most sensitive methods is designed and optimised. The results of the preliminary evaluations revealed that the lower limit of detection of the assay was 100 femtogram/ml and toxin amounts ranging between 100 femtogram – 0.1 ng could be quantified reliably.  Although the lower limit of detection of the assay didn't vary between spiked samples (eg. milk, yoghurt, honey, supernatant of yoghurt, sausages and feces), the quantitative performance of the assay in honey samples was affected by the sample matrix  
In conclusion, the results of the study revealed that with the new developed assay BoNT could be detected in different sample types with sensitivity which was lower in order of 103-106 compared to mouse assays and ELISA. However, for the quantitative anlysis, use of standards specific to the sample matrix and additional optimisation procedures may be required.