Prolil endopeptidaz (PEP) enziminin Escherichia coli ekspresyon sisteminde çözünür formda eldesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Obtaining, purification and characterization of soluble form of prolyl endopeptidaze (PEP) enzyme in Escherichia coli expression system
Yazar: NEJLA BAKIR
Danışman: PROF. DR. İSA GÖKÇE
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Prolil endopeptidaz serin peptidaz sınıfına ait büyük bir sitosolik enzimdir ve sık olarak kültürlenen bir mikroorganizma olan Aspergillus niger'den izole edilmiştir. Prolil endopeptidaz, prolin bakımından zengin prolaminleri parçalama ve enflamatuar reaksiyonu inhibe etme yeteneklerinden dolayı umut verici bir terapötik ajandır. Günümüzde çölyak hastalığının tedavisinde prolil endopeptidaz enziminin oral yoldan verilmesinin etkili bir strateji olacağı düşünülmektedir. Bu şekilde yapılan tedavinin amacı prolil endopeptidazın mide asitleri tarafından parçalanmasını önlemek ve ince bağırsakta etkili olmasını sağlamaktır. Üretilmesi hedeflenen prolil endopeptidaz enziminin Escherichia coli'de rekombinant üretimi esnasında bazı problemler meydana gelmektedir. İnklüzyon cisimcikleri Escherichia coli'de prolil endopeptidaz enziminin yüksek seviyede ekspresyonu sırasında oluşmaktadır. Rekombinant protein üretimi sırasında meydana gelen inklüzyon cisimciklerinden proteinin yeniden kazanılması için kullanılan stratejiler uzun süre alabilmekte ve uygulamada çeşitli zorluklar içermektedir. Bu tez kapsamında prolil endepeptidaz enziminin ekspresyonu için Escherichia coli BL21 (DE3) hücreleri kullanılmıştır. Beş şaperon plazmid sistemi kullanılarak (pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16) prolil endopeptidaz enziminin inklüzyon cisimcikleri oluşturması engellenip çözünür formda üretimi sağlanmaya çalışılmıştır. Yapılan deneyler sonucunda pKJE7 plazmidinin, prolil endopeptidaz enziminin çözünür formda üretimine bir miktar yardımcı olduğu gözlenmiştir. Prolil endopeptidaz enziminin aktivite çalışmaları spektrofotometrik analiz kullanılarak gerçekleştirilmiş olup prolil endopeptidaz enziminin Km değeri 2,06 mM ve Vm 0,0359 mM/sn olarak bulunmuştur.

Abstract:
Prolyl endopeptidase is a large cytosolic enzyme belonging to the serine peptidase class and has been isolated from Aspergillus niger, a frequently cultured microorganism. Prolyl endopeptidase is a promising therapeutic agent due to its ability to degrade proline-rich prolamines and inhibits their inflammatory reaction. Today, it is thought that oral administration of prolyl endopeptidase enzyme will be an effective strategy in the treatment of celiac disease. The purpose of this treatment is to prevent the breakdown of prolyl endopeptidase by stomach acids and to ensure that it is effective in the small intestine. Problems occur during the recombinant production of the targeted prolyl endopeptidase enzyme in Escherichia coli. Inclusion bodies are formed during high level expression of prolyl endopeptidase in Escherichia coli. Strategies used to recover protein from inclusion bodies that occur during recombinant protein production may take a long time and contain various difficulties in practice. In the scope of this thesis, Escherichia coli BL21 (DE3) cells were used for the expression of prolyl endepeptidase enzyme. By using five chaperone plasmid systems. (pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16), prolyl endopeptidase enzyme was prevented from forming inclusion bodies and its production in soluble form was tested. As a result of the experiments, it was observed that plasmid pKJE7 helped the production of prolyl endopeptidase enzyme in some soluble form. Activity studies of the prolyl endopeptidase were carried out using spectrophotometric analysis and the Km value of prolyl endopeptidase enzyme was found to be 2.06 mM and Vm= 0.0359 mM / sec.