Glioma hücrelerinde indometasinin meydana getirdiği moleküler hasarlar üzerine E vitamininin etkileri
The effects of vitamin E on molecular damages induced by indomethacin in glioma cells
Yazar: MURAT PEKMEZ
Danışman: PROF. DR. NAZLI ARDA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
İndometasin, glioma tümörlerinin tedavisinde kullanılma potansiyeli yüksek non-steroidal anti-inflamatuar ilaçlardan (NSAİİ) biridir. Ancak, etkisini gösterirken reaktif oksijen türlerinin oluşumunu da indükler ve moleküler hasarlara yol açar.E vitamini, ROT'ları süpürücü etkisi nedeniyle kanser tedavisinde destekleyici olarak kullanılan bir vitamindir.Bu tezin ana hedefi, indometasinin sıçan C6 glioma hücrelerinde meydana getirdiği moleküler hasarlara karşı E vitamini türevi ? -tokoferol süksinatın ( ? -TOS) koruyucu etkisini araştırmak ve indometasinin ilişkili olduğu bazı metabolik yolların kilit enzimlerini inceleyerek olası etkileşimlerin moleküler mekanizması hakkında bilgi veren veriler elde etmektir.Çalışmada, öncelikle deney gruplarını oluşturmak için ön sitotoksisite testleri gerçekleştirildi. Kültürdeki hücrelerin yarısını öldüren sitotoksik dozlar (SD50 değerleri) ? -TOS için 50 µM, indometasin için 200 µM olarak belirlendi. Farklı ikili ( ? -TOS+indometasin) kombinasyonların sitotoksik dozları değerlendirilerek, dört deney grubu oluşturuldu ve analizler aşağıda belirtilen bu hücre gruplarında yürütüldü.Kontrol: Sadece besiyerinde üretilen hücreler,TOS: 10 µM ? -TOS içeren besiyerinde üretilen hücreler;İnd: 200 µM indometasin içeren besiyerinde üretilen hücreler,TOS+İnd: 10 µM ? -TOS+200 µM indometasin içeren besiyerinde üretilen hücreler.Deney koşullarında C6 glioma hücrelerinde meydana gelen ROT ile protein karbonilleri, apürinik/apirimidinik DNA bölgeleri ve lipid hidroperoksitleri gibi moleküler hasarlar belirlendi. Reseptör olmayan tirozin kinaz (c-Src) analizleri, hem gen anlatımı ve hem de translasyon düzeyinde gerçekleştirildi; ayrıca siklooksijenaz aktivitesi ölçüldü.Oksidatif stres parametrelerine ilişkin bulgular, tüm deneysel koşulların hücrelerde ROT oluşumunu ve protein hasarlarını indüklediğini ortaya koydu. DNA oksidasyon düzeyleri (apürinik/apirimidinik bölgelerin sayısı) TOS ve İnd gruplarında belirgin şekilde yüksekken, TOS+İnd grubunda kontroldeki düzeye yakındı. Lipid peroksidasyon düzeyleri tüm deney gruplarında kontrolün altında kaldı. RT-PCR bulguları, c-Src gen anlatımının, TOS grubu hariç tüm deney gruplarında kontroldekinden fazla olduğunu ortaya koydu. Western blot analizinin sonuçlarına göre, bu genin ürünü olan proteinin miktarı tüm deney gruplarında kontroldekine göre fazla gibiydi. COX enzim aktivitesi tüm gruplarda kontroldekine göre düşük bulundu.Bu çalışmada elde edilen verilere göre, sıçan C6 glioma kültüründe, hücre çoğalmasını %50 inhibe eden 200 ? M indometasinle birlikte uygulanan 10 ? M E vitamininin, hücre çoğalmasını etkilemeksizin, DNA ve lipid hasarlarını indirgediği ve artan ROT oluşumu ile protein hasarlarını indüklediği sonucuna varıldı. Ayrıca, c-Src indüksiyonu ve COX inhibisyonunun bu süreçlere eşlik ettiği ortaya koyuldu

Abstract:
Indomethacin is one of the non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID), which has a high potential to be used for the treatment of glioma tumors. However, it induces generation of reactive oxygen species (ROS) and causes molecular damages while exhibiting its effects.Vitamin E is a vitamin used as an adjuvant for the cancer treatment due to its ROS scavenging ability.The main purpose of this study is to investigate the protective effect of ? -tocopherol succinate, as a vitamin E derivative against the molecular damages caused by indomethacin in C6 glioma cells and to get informative data on the molecular mechanisms of possible interactions, by investigating the key enzymes of some metabolic pathways related to indomethacin.In principles, preliminary cytotoxicity tests were performed in order to create the experimental groups in the study. The cytotoxic doses that killed the half of the cells in the culture (CD50 values) were determined as 50 µM for ? -TOS and 200 µM for indomethacin. Four experimental groups were created by evaluation of the cytotoxic doses of different binary ( ? -TOS+ indomethacin) combinations and the analyses were carried out on the following groups of cells.Control: The cells grown in the medium alone,TOS: The cells grown in the medium, containing 10 µM ? -TOS,Ind: The cells grown in the medium, containing 200 µM indomethacin,TOS+Ind: The cells grown in the medium, containing 10 µM ? -TOS+200 µM indomethacin.The ROS and the molecular damages, such as protein carbonyls, apurinic/apyrimidinic DNA sites and lipid hydroperoxides generated in C6 glioma cells under the experimental conditions were determined. Non-receptor tyrosine kinase (c-Src) analyses were run on the basis of gen expression, as well as on translation level, and cyclooxygenase activity was also measured.The findings concerning oxidative stress parameters revealed that ROT generation and protein damages were induced in all groups. The significantly high level of DNA oxidation (number of apurinic/aprimidinic sites) detected in TOS and İnd groups, while it was very close to control level in TOS+İnd group. Lipid peroxidation levels were below the control for all experimental groups. RT-PCR findings indicated that Src gene expression level were higher in all groups, except TOS than that of control. According to the results of Western blot analysis, the amount of the protein product of this gene seemed to be over the control in all experimental groups. COX enzyme activity in all groups was lower than that of control.According to data obtained in this study, it was concluded that 10 ? M vitamin E along with 200 ? M indomethacin, which causes 50% inhibition of cell proliferation reduced the DNA and lipid damages and induced protein damages by increased generation of ROS, without no effect on cell proliferation in C6 glioma cultures. It was also deduced that c-Src induction and COX inhibition were attended to these processes