D-sorbitol kullanılarak nadir şekerlerden L-sorbozun fermantasyonla üretim imkanlarının araştırılması
Investigation of the production possibilities of rare sugar L-sorbose by fermentation using D-sorbitol
Yazar: HAZAL ÖZHANLI
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ERBAŞ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
L-sorboz, C6H12O6 kapalı formülüne sahip ketoz bir monosakkarittir. Doğada nadir bir şeker olarak doğal kaynaklarda oldukça düşük miktarda bulunan L-sorboz yaygın olarak Gluconobacter veya Acetobacter türleri kullanılarak D-sorbitolün mikrobiyal oksidasyonu yoluyla üretilmektedir. L-sorbozun gıda endüstrisinde en önemli kullanım alanı C vitamini sentezinde başlangıç veya ara materyal olarak kullanımı olup, dünya genelinde üretilen L-sorbozun çoğunluğu C vitamini üretiminde kullanılmaktadır. 
Bu tez çalışmasında, Gluconobacter oxydans ATCC 621 suşu kullanılarak D-sorbitolden fermantasyon ile L-sorboz üretimi üzerine etkili olan fermantasyon koşullarının optimize edilmesi amaçlanmış ve optimizasyon işlemi çalkalamalı inkübatör ve biyoreaktör ölçeğinde olmak üzere iki aşamalı olarak gerçekleştirilmiştir.
Çalışmanın ilk aşamasında; çalkalamalı inkübatörde L-sorboz üretimi üzerine etkili olan D-sorbitol konsantrasyonu, besiyeri başlangıç pH değeri, sıcaklık ve çalkalama hızı parametrelerinin yanıt yüzey metodu kullanılarak optimize edilmesi amaçlanmıştır. Fermantasyon koşullarının optimizasyonu için bağımsız değişkenlerin sınır değerleri; D-sorbitol konsantrasyonu için 90 ila 170 g/L, başlangıç pH değeri için 6 ila 8, sıcaklık için 25 ila 35°C ve çalkalama hızı için 150 ila 250 rpm olarak belirlenmiştir. Belirlenen parametreler ile merkezi kompozit tasarım istatistik yöntemi ile orta noktanın 3 kere tekrarlandığı toplam 27 üretimlik bir deneme deseni kullanılmıştır. Fermantasyon süresince yapılan örneklemeler ile optik yoğunluk, D-sorbitol ve L-sorboz miktar analizleri yapılmıştır.
Çalkalamalı inkübatörde gerçekleştirilen tüm fermantasyon denemeleri sonunda L-sorboz üretim miktarı üzerine; D-sorbitol konsantrasyonunun, başlangıç pH değerinin, sıcaklığın, D-sorbitol konsantrasyonu-sıcaklık, pH-sıcaklık ve sıcaklık-çalkalama hızı interaksiyonlarının ve D-sorbitol konsantrasyonu, pH değeri ve çalkalama hızı karelerinin önemli (p<0.01; 0.01 0.05) bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Çalkalamalı inkübatör denemeleri sonucunda L-sorboz üretimi için optimum fermantasyon koşulları 127.58 g/L D-sorbitol konsantrasyonu, 7.20 besiyeri başlangıç pH değeri, 35°C sıcaklık ve 224 rpm çalkalama hızı olarak belirlenmiştir. Belirlenen optimum koşullarda gerçekleştirilen 168 saatlik doğrulama fermantasyonuyla %89.95 dönüşüm oranı ile L-sorboz üretimi gerçekleştirilmiştir.
Çalışmanın ikinci aşamasında; çalkalamalı inkübatörde gerçekleştirilen fermantasyon denemeleri sonucu elde edilen optimum koşullar kullanılarak, 1.5 L çalışma hacminde ve 700 rpm karıştırma hızında biyoreaktörde 0.5, 1.0 ve 1.5 vvm hava akım koşullarında 1x3 faktöriyellik yeni bir deneme gerçekleştirilmiş ve 118 saat süren fermantasyonlar boyunca elde edilen örneklemeler ile belirlenen optik yoğunluk, biyokütle, D-sorbitol ve L-sorboz miktar verileri ile fermantasyonlara ait kinetik parametreler hesaplanmıştır.
Farklı hava akım hızlarında gerçekleştirilen denemeler sonucunda, L-sorboz üretim miktarı üzerine hava akım hızının önemli (p<0.01) seviyede etkili olduğu tespit edilmiştir. Biyoreaktör denemeleri sonucunda optimum hava akım hızı %98.33 verim ile en yüksek miktarda L-sorboz üretiminin gerçekleştirildiği 1.5 vvm hava akım hızı olarak belirlenmiştir. Gerçekleştirilen tüm biyoreaktör denemelerinde ortamın pH değeri takip edilmiş ve fermantasyon ortamının pH değeri 5 değerinin altına düşmeden L-sorboz üretiminin başlamadığı ve L-sorboz üretiminin ancak 72 ila 95 saat kadar sonra başladığı tespit edilmiştir.
Fermantasyon süresi üzerine besiyeri başlangıç pH değerinin etkisi göz önünde bulundurularak belirlenen optimum koşullar, besiyeri başlangıç pH değeri 7.2 ve 5.0 olan iki farklı üretim ile doğrulanmıştır. Doğrulama fermantasyonları sonucunda her iki pH değerinde L-sorboz üretim veriminin neredeyse eşit ve ortalama %99.36 olduğu ancak başlangıç pH değeri 7.2 olan üretim 118 saat sürerken, başlangıç pH değeri 5.0 olan üretimin 56 saat gibi kısa bir sürede tamamlandığı belirlenmiştir.
Tüm sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde ise biyoreaktörde 700 rpm karıştırma hızında D-sorbitolden L-sorboz üretimi için optimum koşulların; 127.58 g/L besiyeri başlangıç D-sorbitol konsantrasyonu, 5 başlangıç pH değeri, 35°C fermantasyon sıcaklığı ve 1.5 vvm hava akım hızı olduğu ve bu optimum koşullarda 56 saatte, %99.21 verim ile L-sorboz üretilebildiği tespit edilmiştir. Bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez C vitamini üretim amaçlı L-sorboz üretimi de gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
L-sorbose is a ketose monosaccharide with the formula C6H12O6. The most common method to produce L-sorbose, which is found in very low amounts in natural sources as a rare sugar in nature, is the bio-oxidation of D-sorbitol to L-sorbose using Gluconobacter or Acetobacter species. The most important use of L-sorbose in the food industry is its use as a starting or intermediate material in the synthesis of vitamin C, and L-sorbose is mostly produced worldwide for use in the production of vitamin C. 
In this thesis, it was aimed to optimize the fermentation conditions that are effective on L-sorbose production by fermentation from D-sorbitol by using Gluconobacter oxydans ATCC 621 strain, and the optimization process was carried out in two stages, in a shaking incubator and bioreactor scale.
In the first stage of the study, it was aimed to optimize the D-sorbitol concentration, initial pH value, temperature, and agitation speed parameters, which are effective on L-sorbose production in a shaking incubator, by using the response surface method. The limit values of the independent variables for the optimization of the fermentation conditions were determined as 90 to 170 g/L for the D-sorbitol concentration, 6 to 8 for the initial pH value, 25 to 35°C for the temperature, and 150 to 250 rpm for the agitation speed. A trial design of 27 productions, in which the midpoint was repeated 3 times, was used with the determined parameters and the central composite design statistical method. A trial design consisting of 27 productions, in which the midpoint was repeated 3 times, was used with the determined parameters and the central composite design statistical method. With the samples made during the fermentation, optical density, biomass, D-sorbitol, and L-sorbose amount analyzes were made.
On the amount of L-sorbose production at the end of all fermentation experiments carried out in the shaking incubator; D-sorbitol concentration, initial pH value, temperature, D-sorbitol concentration-temperature, pH-temperature, and temperature-agitation speed interactions, and D-sorbitol concentration, pH value, and agitation speed squares were significant (p<0.01; 0.01 0.05) effect. As a result of shaking incubator experiments, optimum fermentation conditions for L-sorbose production were determined as 127.58 g/L D-sorbitol concentration, initial pH value of 7.20, 35°C temperature, and 224 rpm agitation speed. L-sorbose was produced with %89.95 conversion rate with 168 hours of fermentation carried out under the determined optimum conditions.
In the second stage of the study, a new 1x3 factorial trial was carried out at 0.5, 1.0, and 1.5 vvm airflow conditions in the bioreactor, using the optimum conditions obtained from the fermentation experiments carried out in the shaking incubator. The kinetic parameters of the fermentations were calculated with the optical density, biomass, D-sorbitol, and L-sorbose amount data determined by the samples obtained during the 118 hours of fermentation.
As a result of the experiments carried out at different airflow rates, it was determined that the airflow rate had a significant (p<0.01) effect on the amount of L-sorbose production. At the end of the bioreactor trials, the optimum airflow rate was determined as 1.5 vvm air flow rate, where the highest amount of L-sorbose production was realized with %98.33 yields. In all bioreactor experiments carried out, the pH value of the medium was followed, and it was determined that L-sorbose production did not start before the pH value of the fermentation medium fell below 5 and L-sorbose production started only after 72 to 95 hours.
As a result, it was determined that optimum conditions for L-sorbose production by fermentation from D-sorbitol using G. oxydans ATCC 621 strain were 127.58 g/L D-sorbitol concentration, 7.2 initial pH value, 35°C temperature, 224 rpm agitation speed, and 1.5 vvm airflow rate, and L-sorbose was produced with a yield of %99.51 from the fermentation carried out under optimum conditions.
The optimum conditions determined by considering the effect of the initial pH value of the medium on the fermentation time were confirmed by two different productions with the initial pH value of the medium 7.2 and 5.0. As a result of the fermentations, it was determined that the production yield of L-sorbose at both pH values was almost equal and the average yield was %99.36, but the production with the initial pH value of 7.2 was completed for 118 hours, the production with the initial pH value of 5.0 was completed in a shorter time, such as 56 hours.
When all the results are evaluated, the optimum conditions to produce L-sorbose from D-sorbitol at 700 rpm agitation speed in the bioreactor are 127.58 g/L initial D-sorbitol concentration, 5 initial pH values, 35°C temperature, and 1.5 vvm air flow rate, and under these optimum conditions L-sorbose could be produced with a yield of %99.21 in 56 hours. With this study, L-sorbose production for the purpose of vitamin C production was also carried out for the first time in Turkey.