İnsan pulmoner fibrozisinde etkili uzun kodlanmayan RNA'ların in vitro modelde belirlenmesi
The determination of effective long non-coding RNA on human pulmonary fibrosis in an in vitro model
Yazar: MERVE YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. FÜSUN ÖZTAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kanonikal Wnt sinyal aracılı epitelyal mezenşimal geçiş (EMT), alveolar epiteliyal hücrelerde pulmoner fibrozise katkıda bulunur. Uzun kodlanmayan RNA'lar (LncRNA'lar) hücre çoğalmasını, hücre göçünü ve EMT'yi düzenler. Bu çalışmanın amaçları, transforme edici büyüme faktörü-β (TGF-β) ile EMT aracılı miyofibroblast farklılaşmasının uyarıldığı ve Wnt inhibitörü (FH535) ile durdurulduğu durumlarda, HOTAIR, CARLo-5 ve CD99P1 LncRNA'larının, Wnt sinyali, EMT ve miyofibroblast farklılaşması ile ilişkili gen ve proteinlerin ekspresyon profillerini belirlemek ve LncRNA'ların bu süreçteki muhtemel rollerini açıklamaktır. İnsan A549 hücrelerinin bir kısmı, EMT'nin uyarımı için TGF-β (5ng/ml) ile muamele edildi. Diğer hücre grubu, TGF-β ilavesinden 24 saat sonra 20 μM FH535 ile inkübe edildi. Tüm hücreler, deneylerin 0, 24, 36 ve 48. saatlerinde toplandı. LncRNA'lar ile ACTA2, VIM, COL1A1, SNAIL, CTNNB1, TCF4, LEF1, ESRP1 ve ESRP2 genlerinin ekspresyon profili, QRT-PCR ile alfa-düz kas aktin (α-SMA), E-kaderin ve aktif β-katenin protein düzeyleri ise Western emdirimi ile belirlendi. Ayrıca, HOTAIR, CARLo-5, CD99P1 LncRNA'ların, Wnt sinyali, EMT ve idiopatik pulmoner fibrozis ile ilişkili kodlanan ve kodlanmayan genler ve ürünleri ile olan ilişkileri LncTar ve Pathway stüdyo mammalplus analiz programları ile analiz edildi.
TGF-β ile muamele edilen hücrelerde, LncRNA'lar, ACTA2, VIM, COL1A1, SNAIL, CTNNB1, TCF4, LEF1, ESRP1 ve ESRP2 gen ekspresyonu yanı sıra α-SMA ve aktif β-katenin proteinleri artarken, E-kaderin protein miktarı deneyin 24, 36 ve 48. saatlerinde azaldı. TGF-β tarafından uyarılan hücreler üzerindeki FH535 uygulamaları, deneyin 36.saatinde HOTAIR ekspresyonunu arttırırken, CARLo-5 ve geri kalan gen ve proteinlerin ekspresyonunu azalttı (E-kaderin proteini hariç). Bununla birlikte, TGF-β ile uyarılan hücreler üzerindeki FH535 uygulamaları, deneyin 48.saatinde α-SMA ve aktif β-katenin proteinleri ile LncRNA'lar, ACTA2, VIM, COL1A1, SNAIL, CTNNB1, TCF4, LEF1, ESRP1 ve ESRP2 genlerinin ekspresyonunu azalttı, ancak E-kaderin protein düzeyini arttırmadı. Biyoinformatik analizler, HOTAIR, CARLo-5 ve CD99P1'in, Wnt sinyali ve EMT ile ilgili transkripsiyon faktörleri, koaktivatörler, diğer etkili gen/protein ve en az 13 adet miRNA ile etkileşerek EMT aracılı miyofibroblast farklılaşmasını ve fibrotik cevabı düzenlediğini göstermiştir. LncRNA'lann ekspresyonları, EMT ve Wnt sinyali varlığında artarken, A549 hücrelerinde azaltılmış Wnt sinyal aktivasyonu ve EMT'nin gerilemesine paralel olarak her üç LncRNA'nın da ekspresyonu azalmıştır. Buna göre, bu LncRNA'lar, TGF-β aracılı miyofibroblast farklılaşması, Wnt sinyali ve EMT'nin uyarılması üzerinde etkilidirler. HOTAIR, CARLo-5 ve CD99P1 LncRNA'ları idiyopatik pulmoner fibroziste EMT'nin geriletilmesi için potansiyel moleküller olarak önerilebilir.

Abstract:
Canonical Wnt signaling-mediated epithelial-mesenchymal transition (EMT) in alveolar epithelial cells contributes to pulmonary fibrosis. Long non-coding RNAs (LncRNAs) regulate cell proliferation, cell migration and EMT. The present study aims to determine the expression profile of HOTAIR, CARLo-5 and CD99P1 LncRNAs, when EMT mediated-myofibroblast differentiation was induced by transforming growth factor-β (TGF-β) and reduced by a Wnt inhibitor (FH535) to investigate the expressions of genes and proteins associated with the Wnt signaling, EMT and myofibroblast differentiation, and to explain the role of LncRNAs in this process. A group of human A549 cells was treated with TGF-β (5ng/ml) to stimulate of EMT. The other group of cells was incubated with 20 μM FH535 after 24 hours following TGF-β treatment. All of cells were collected at the 0th, 24th, 36th and 48th hours of the experiments. Expression profile of LncRNAs ACTA2, VIM, COL1A1, SNAIL, CTNNB1, TCF4, LEF1, ESRP1 and ESRP2, and the levels of alpha smooth muscle actin (α-SMA), E-cadherin and active β-catenin were performed by QRT-PCR and Western blotting, respectively. In addition, the relationships between of HOTAIR, CARLo-5, CD99P1 LncRNAs and coding/noncoding genes and their product related to Wnt signaling, EMT and idiopathic pulmonary fibrosis were analysed by LncTar and Pathway studio mammalplus analysis programs.
TGF-β treated cells exhibited the increased expressions of LncRNAs, ACTA2, VIM, COL1A1, SNAIL, CTNNB1, TCF4, LEF1, ESRP1 and ESRP2 genes as well as α-SMA and active β-catenin proteins and the decreased E-cadherin protein at the 24th, 36th and 48th hours. While FH535 treatments on TGF-β induced cells resulted in the increased HOTAIR expression, decreased expression of CARLo-5 and the other tested genes 36th hours (except for E-cadherin protein). However, FH535 treatments on the cells induced by TGF-β resulted in decreased levels of α-SMA and active β-catenin proteins, and LncRNAs, ACTA2, VIM, COL1A1, SNAIL, CTNNB1, TCF4, LEF1, ESRP1 and ESRP2 genes at the 48thhours, but it did not increase E-cadherin protein levels. Bioinformatic analysis showed that HOTAIR, CARLo-5 and CD99P1 regulate EMT-mediated myofibroblast differentiation and fibrotic response by interacting with transcription factors, coactivators, other effective genes/proteins and at least 13 miRNAs related to Wnt signaling and EMT.
The expressions of LncRNAs increased in the presence of EMT and Wnt signaling, whereas their expressions decreased in parallel with decreasing activity of EMT through reduced Wnt signaling in A549 cells. Accordingly, these LncRNAs can be effective on TGF-βmediated-myofibroblast differentiation, and induction of Wnt signaling and EMT. HOTAIR, CARLo-5 and CD99P1 LncRNAs can be thought as the potential molecules for decreasing of EMT activity in pulmonary fibrosis.