Tümör nekrozis faktör alfa reseptör-1' in (TNFR 1) klonlanması ve tirozin fosforilasyonunun gösterilmesi
Tümör nekrozi̇s faktör alfa reseptör-1' i̇n (TNFR 1) klonlanmasi ve ti̇rozi̇n fosfori̇lasyonunun gösteri̇lmesi
Yazar: DERYA ÖZEŞ
Danışman: PROF. DR. ÖZGÜL ALPER
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Fosforilasyon = Phosphorylation ; Klonlama = Cloning ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Tirozin = Tyrosine ; Tümör nekroz faktörleri = Tumor necrosis factors ; Ölüm = Death

Özet:
Tümör Nekrosiz Faktör Alfa (TNF-?) bir sitokin olup  kanser gelişimi gibi patolojik durumlar, bakteriyal veya viral enfeksiyon sırasında  ağırlıklı olarak aktive edilen makrofajlar ve T-hücreleri tarafından sentezlenerek vücuda salınan bir proteindir. TNF-?, trimerik yapısı ile yine trimerik olan iki farklı reseptöre bağlanarak biyolojik etkinliğini gösterir. Bu reseptörlerden biri TNFR1 olup (Tümör Necroz Faktör Reseptör-1) 454 amino asitten meydana gelir ve intrasitoplazmik ölüm domeyini (Death Domain-DD) oluşturur.  TNF-? TNFR1'e bağlandığı zaman DD domeynleri aracılığı ile kaspaz-8 aktivasyonu yaparak apoptoz indüksiyonunu sağlar. Apoptozu indüklemesinin yanı sıra TNFR1 aktivasyonu  bu reseptörün  intrasitoplazmik bölgesinde oluşan NIK-IKK kompleksi aracılığı ile NF-kB (Nüklear Faktör Kappa-B) transkripsiyon faktörünü de aktive eder.   DD ihtiva etmeyen TNFR2 ise sadece NF-kB aktivasyonu yapar.
TNF-? bilinen bu fonksiyonlarının yanı sıra JAK1, JAK2, c-SRC, JNK, ERK, p38, AKT, STAT1 ve  STAT3 gibi sinyal iletim enzimlerini ve transkripsiyon faktörlerini de aktive eder. Her ne kadar bunlar bilinmesine rağmen bu aktivasyonların moleküler temelini oluşturan ana mekanizma, halen tam olarak bilinmemektedir. 
Projemizin amacı yukarıda bahsettiğimiz sinyal ileticilerinin ve transkripsiyon faktörlerinin aktivasyon temelini oluşturabilecek TNFR1 modifikasyonların olup olmadığının aydınlatılmasıdır. Bu bağlamda, TNFR1'in intrasitoplazmik bölgesinin amino asit dizilimine baktığımızda bu reseptörün C-terminalinde 359 ve 399 nolu amino asitlerin tirozin fosforilasyon noktaları olabilecek Y359AVV ve Y399SML  dizileri içinde olduğu gösterilmektedir. TNFR1'in bu Tirozinler üzerinden fosforile olması yukarda bahsettiğimiz sinyal ileticilerinin aktivasyonu için  bir başlangıç noktası olabilir. Bu yüzden, TNF- ? muamelesinin ardından TNFR1'in Tirozin fosforilasyonuna uğrayıp uğramadığını araştırılmıştır.
Elde ettiğimiz verilere göre,  TNF-? zamana bağlı olarak TNFR1'in  Tirozin fosforilasyonunu indüklemektedir.  Bu sonuç ile TNFR1 üzerinde gözlenen Tirozin fosforilasyonunun  mekanizması açıklanmamış sinyal ileticilerinin aktivasyonu için başlangıç bölgesi olabileceğini düşünüyoruz.


Anahtar Kelimeler:TNF-?, TNFR1, Apoptosis, Sinyal İletimi, Fosforilasyon, Ölüm Domeyni

Abstract:
Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-?) is a cytokine produced during pathological conditions  like cancer, viral  or bacterial infection mainly by activated macrophages and T-cells and secreted into the body.  TNF-? shows its biological activity by binding to trimeric receptors.  One of these receptors is TNFR1, composed of 454 amino acids and contains intracytoplasmic death domain (DD).  After binding to TNFR1, TNF-? induces apotosis by activating caspase-8 via DD.   In addition to induction of apoptosis, activation of TNFR1 also activates NF-kB pathway via  formation of  intracytoplasmic NIK-IKK complex. TNFR2,  which does not contain DD, can only activate NF-kB  pathway.
In addition to these known functions, TNF- ? also induces the activation of JAK1, JAK2, c-SRC, ERK, JNK, p38, STAT1 and STAT3. Although we know these, we dont know the molecular mechanism behind these activations.
The main purpose of our study was to elucidate  modifications of TNFR1 which would explain the mechanism of activation of the above mentioned signal transducers and transcription factors. In this respect, when we look at the amino acid sequence of the intracytoplasmic domain of TNFR1 we found two possible Tyrosine phosphorylation sites in the sequence of Y359AVV ve Y399SML. Tyrosine phosphorylation of TNFR1 at these sites could be basis of activation of  above mentioned signal transducers. For this reason, we tested the  tyrosine phosphorylation of TNFR1 after TNF-? stimulation. 
According to our results, TNF-? causes Tyrosine  phosphorylation of  TNFR1 in a time dependent manner. With this result, we think that Tyrosine phosphorylation sites of TNFR1 could serve as a point of  initiation  for activation of  above mentioned proteins.  

Key words: TNF- ?, TNFR1, Apoptosis, Signal Transduction, Phosphorylation, Death Domain.