Deneysel parkinson modelinde dokosaheksaenoik asitin (DHA) nnos yolağına etkisi /
Yazar: HANDE PARLAK
Danışman: PROF. DR. AYSEL AĞAR
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Dokosahekzaenoik asitler = Docosahexaenoic acids ; Lipid peroksidasyonu = Lipid peroxidation ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Parkinson hastalığı = Parkinson disease

Özet:
Parkinson hastalığı (PH), substansiya nigra'nın pars kompakta (SNpc) bölgesinde dopaminerjik nöronların kaybı ile karakterize olan ve Alzheimer hastalığından sonra en yaygın görülen nörodejeneratif hastalıktır. Dokosaheksaenoik asit (DHA), beynin fosfolipid tabakasında bulunan ve hücresel fonksiyonların devamı için gerekli temel çoklu doymamış yağ asidi (PUFA)'dir. Nitrik oksit (NO), nitrik oksit sentaz (NOS) enzimi ile L-arjininden sentezlenen bir nörotransmitterdir. Oksidasyonu ile hücrede nitrozatif stresi meydana getiren reaktif oksijen türleri (ROS) üretilir. Oluşan radikaller hücrede lipid peroksidasyonuna neden olmaktadır. 1-metil-4-fenil 1,2,3,6 tetrahidropiridin (MPTP) ile deneysel parkinson modeli oluşturulan farelerde nNOS aktivitesinin arttığı bilinmektedir. Çalışmamız, deneysel parkinson modelinde DHA uygulaması ile dopaminerjik nöron apoptozunu önlemede, nNOS fosforilasyonunun rolünü araştırmak üzere planlanmıştır. 
3 aylık erkek C57BL/6 fareler rastgele 4 gruba ayrılmıştır. Kontrol (K) grubu, DHA verilen grup (DHA), deneysel parkinson modeli oluşturulan grup (MPTP), DHA verilen ve deneysel parkinson modeli oluşturulan grup (DHA + MPTP). DHA (36 mg/kg/gün), 4 hafta boyunca DHA ve DHA+MPTP gruplarına gavaj yoluyla uygulanmıştır. Deneysel parkinson modeli  23.günde intraperitonel (i.p.) yolla uygulanan MPTP nörotoksini (4x20 mg/kg, 2 saat aralıklarla) ile oluşturulmuştur. Motor aktivite tayini; çubuk testi ile bradikinezi şiddetinin belirlenmesi, lokomotor aktivite testi ve rotarod testi ile değerlendirilmiştir. Substansiya nigra (SN) dokusu apoptoz belirteci kaspaz-3 aktivitesi, nitrozatif stres göstergesi  nitrit/nitrat düzeyi  ve lipid peroksidasyon 4-hidroksi nonenal (4-HNE) düzeyleri ticari kitler yardımıyla ölçülmüştür. SN'deki dopaminerjik hücre sayısı tirozin hidroksilaz (TH) enzimi  ile, nNOS ve fosfo-nNOS enzim ekspresyonları spesifik NOS immünreaktif hücrelerin immünohistokimyasal analizi ile tespit edilmiştir. 
Deneysel parkinson modeli oluşturulan farelerde bradikinezi şiddetini gösteren çubuk testinde geri dönüş ve total iniş sürelerinin uzadığı, DHA verilmesinin ise sürelerde kısalmaya neden olduğu görülmüştür. Lokomotor aktivite testinde deneysel parkinson modeli oluşturulan grupta ambulatuvar aktivite, mesafe ve toplam lokomotor aktivitelerde azalma görülmüştür. DHA+MPTP grubu ile MPTP grubu karşılaştırıldığında, aktivitenin artmış olduğu izlenmiştir. Motor koordinasyonun ve dengenin göstergesi olan rotarod testinde 40 rpm düzeyinde MPTP grubunda dönen çubuk üzerinde kalma süreleri kısalırken DHA+MPTP grubunda sürenin uzadığı görülmüştür. Kaspaz-3 aktivite sonuçlarının MPTP grubunda kontrol grubuna kıyasla arttığı, DHA+MPTP grubunda ise MPTP grubuna göre önemli bir fark yaratmadığı bulunmuştur. Nitrit-nitrat ve 4-HNE düzeyleri MPTP grubunda artış göstermiştir. MPTP grubuyla karşılaştırıldığında, DHA+MPTP grubunda nitrit/nitrat ve 4-HNE düzeylerinin önemli ölçüde azaldığı saptanmıştır. SN'de TH içeren nöron sayıları incelendiğinde birim alandaki TH+ hücre sayısı MPTP grubunda anlamlı şekilde azalmış, DHA verilen MPTP grubunda ise MPTP grubuna kıyasla artış göstermiştir. nNOS enzim ekspresyonları MPTP grubunda kontrole oranla artmış, DHA uygulanan MPTP grubunda ise belirgin şekilde azalmıştır. nNOS enzim fosforilasyonu değerlendirildiğinde, MPTP grubuna kıyasla DHA+ MPTP grubunda nNOS Serin 847 fosforilasyonunun arttığı görülmüştür. Bu durum, Serin 847 fosforilasyonu ile nNOS aktivitesinin azalarak dopaminerjik hücrelerin ölümünün engellendiğini göstermektedir.

Anahtar kelimeler: Parkinson, DHA, MPTP, nNOS, lipid peroksidasyon

Abstract:
Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by the loss of dopaminergic neurons from the substantia nigra pars compacta (SNpc). PD is recognized as the second most common neurodegenerative disease after Alzheimer's disease. Docosahexaenoic acid (DHA), which is the major polyunsaturated fatty acid (PUFA) found in the phospholipid fractions of the brain, is essential for normal cellular functions. Nitric oxide (NO) is a neurotransmitter synthesized from L-arginine by the enzyme nitric oxide synthase (NOS). Oxidation of NO yields reactive oxygen species (ROS) causing nitrosative stress in cells by triggering lipid peroxidation. An increased neuronal NOS (nNOS) activity was reported in the experimental model of PD elicited by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) in mice. The present study is designed to investigate the role of nNOS phosphorylation in the prevention of apoptosis by administration of DHA to the experimental PD model.
Three months old male C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups as: Control (C), DHA-treated (DHA), MPTP-induced (MPTP), DHA-treated and MPTP-induced (DHA+MPTP). DHA was administered daily by oral gavage for four weeks (as 36mg/kg/day) to DHA and DHA+MPTP groups. Experimental PD model was utilized by consecutive intraperitoneal (ip) injections of the neurotoxin MPTP (4x20 mg/kg-1 at 2-hr intervals) on the day 23. Motor activity of mice was evaluated by "pole test" (as a marker for the intensity of bradykinesia) as well as the tests of locomotor activity and rotarod. Using commercial kits, caspase-3 activity was measured as an apoptosis marker. Additionally, measurements of nitrite/nitrate and 4-HNE levels were performed as markers of nitrosative stress and lipid peroxidation, respectively. The number of the dopaminergic cells in substantia nigra (SN) was determined by immunohistochemical analysis of tyrosine hydroxylase (TH)-immunopositive cells. Expression of the nNOS and phospho-nNOS enzymes was also determined in all tissue sections via immunohistochemical staining.
Pole test results showed an increased return and total down time in the MPTP-treated group, while DHA treatment decreased both parameters in the DHA+MPTP group. In MPTP-treated group, decreased ambulatory activity, distance and total locomotor activity were detected. These were restored by DHA treatment. As an indicator of motor coordination and balance, the rotarod test at 40 rpm showed that MPTP-treated animals exhibited shorter time on the rotating rod mill compared to the DHA+MPTP group. An increased caspase 3 activity was detected in the MPTP group compared to the control. However, it was not altered by DHA treatment. Nitrite/nitrate and 4-HNE levels were also significantly increased in SN of the MPTP-treated mice compared to the control. DHA treatment significantly attenuated these MPTP-induced alterations. Dopaminergic cell death in SNpc was significantly increased in the MPTP-treated group compared to the control. DHA treatment significantly diminished cell death in the DHA+MPTP group as compared to the MPTP-treated group. The expression of nNOS enzyme was significantly increased in the MPTP-treated group compared to the control. In addition, DHA treatment caused a significant decrease in nNOS expression in the DHA+MPTP group. Our immunohistochemistry results showed an elevated phosphorylation of nNOS on the serine 847 residue upon DHA treatment in the experimental PD model. Taken together, these results indicate that the phosphorylation at serine 847 may decrease the activation of nNOS which in turn protects dopaminergic neurons from death.

Key words: Parkinson, DHA, MPTP, nNOS, lipid peroxidation