Eski ve bozulmuş örneklerde mitokondriyal dna dizinlenmesi
Mitochondrial dna sequencing of old and degraded samples
Yazar: SELÇUK ERDEM
Danışman: YRD. DOÇ. DR. HAVVA ALTUNÇUL
İstanbul Üniversitesi / Adli Tıp Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Genetik = Genetics
Dizin: Adli tıp = Forensic medicine ; DNA = DNA ; DNA-mitokondrial = DNA-mitochondrial ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Adli bilimler olay yerinde başlar. Günümüzde en karmaşık ve ardında iz bırakılmadığı düşünülen suçların bile çözümü, adli bilimler sayesinde mümkün olmaktadır. Tüm bu gelişmelere rağmen bazı özel durumlarda, özellikle eser miktarda elde edilen biyolojik materyal söz konusu olduğunda genomik DNA üzerinden bir olguyu aydınlatmak mümkün olmayabilir. Bu durumda hücrenin DNA taşıyan bir diğer organeli olan mitokondriler içinde yer alan mitokondriyal DNA (mtDNA) kullanılabilir. Mitokondriler hücre içinde çok sayıda bulundukları için (~1000) çekirdek DNA'ya oranla hasar görmemiş halde mtDNA elde edilme olasılığı oldukça yüksektir. Adli bilimlerde mtDNA'nın polimorfik bölgeleri kullanılmaktadır. MtDNA baz dizisinde en yüksek polimorfizm, kodlama yapmayan kontrol bölgesi dizilerinde (1120 baz çifti boyunda) görülür. Bu kontrol bölgesi 3 adet polimorfik yüksek değişken bölge içerir: HV1 (16024?16383), HV2 (73?354), HV3 (438?574). Yaygın olarak HV1 ve HV2 bölgelerinin dizin analizi yapılmaktadır. Bu çalışmanın amacı kan, saç, tırnak, küpe, diş fırçası, kulak pamuğu, bardak kenarı svabı, sakız, jilet, sigara izmariti, gibi örneklerden DNA izolasyonu ve mitokondriyal DNA'nın ileri değişken HV1 ve HV2 bölgelerinin dizin analizinin optimizasyonunun yapılmasıdır. Optimizasyon aşamasında yöntemde bazı modifikasyonlar yapıldı. Araştırmada birbirleriyle akrabalık ilişkisi bulunmayan 5 kişiden kan, saç, tırnak, küpe, diş fırçası, kulak pamuğu, bardak kenarı svabı, sakız, jilet, sigara izmariti gibi materyaller ve farklı 12 kişiden alınan kan örnekleri çalışıldı. Birinci PCR aşamasında, hedef bölgelere özgü primerler ile HV1 ve HV2 bölgeleri ayrı reaksiyonlar halinde çoğaltıldı, ikinci PCR aşamasında ise Applied Biosystem BigDye v3.1 Cycle Sequencing Kit kullanıldı. Dizin analizi bilgisayar kontrollü kapiler elektroforez cihazında yapıldı. Sonuçlar Sequence Scanner, SeqScape (Applied Biosystems) ve Sequencher 4.10.1 yazılımları ile analiz edildi. Aynı kişilere ait farklı örneklerden aynı sonuçlar elde edildi. İncelenilen genotiplerde en sık rastlanan polimorfik nokta 263, A-G nokta mutasyonu ve 315.1 C insersiyonudur. Örneklerin ait olduğu kişilerin profilleri kendi aralarında karşılaştırıldıklarında iki kişinin HV1bölgelerinin referans dizi ile farklılık göstermediği, ?152, T-C 263, A-G 309.1 C 309.2 C 315.1 C? HV2 profiline ise iki kişide rastlandığı belirlenmiştir. Yöntemin Türkiye'deki kriminal laboratuarlarda rutin olarak kullanıma başlayabilmesi için Türk toplumunda HV1 ve HV2 bölgelerinin popülasyon verilerinin araştırılması gerekmektedir.

Abstract:
Forensic sciences begin at the crime scene. Nowadays, even the most complex crimes can be solved with the help of forensic sciences branches. Despite all these developments, some cases are even harder to solve, especially when there is not sufficient, or degraded biological evidence. Most of these degraded biological samples can?t be genotyped with the routine STR analyzes. At these cases, mitochondrial DNA analyzes can be done to correctly genotype the degraded samples. The most diversity between two random mtDNA molecules is in the control region of mtDNA. The control region of mtDNA consists of 3 hyper variable regions: HV1 (16024?16383), HV2 (73?354), and HV3 (438?574). In routine, HV1 and HV2 regions are used for forensic analysis. The aim of this work were optimizing the sequencing of mtDNA?s HV1 and HV2 regions from samples like hair, nails, earrings, toothbrushes, q-tips, glass edge swabs, gums, razors and cigarette butts. At this work 5 unrelated individuals? samples mentioned above were sequenced and other 13 individuals blood samples were sequenced for the reliability of the procedure. In the first PCR reaction, the target regions were amplified separately with their specific primer pairs and in the second PCR reaction Applied Biosystem BigDye v3.1 Cycle Sequencing Kit was used. The electroforetic separation of the products was carried out on capillary electrophoresis, and results were analyzed with Sequence Scanner, SeqScape (Applied Biosystems) and Sequencher 4.10.1 software?s. The most common polymorphic positions are 263, A>G point mutation, and 315.1 C insertion. The HV2 profile ?263, A-G 315.1C? has been observed on 2 individuals and ?152, T-C 263, A-G 309.1 C 309.2 C 315.1 C? profile has been observed on 2 individuals. 2 individual also shared a profile same as rCRS on their HV1 regions. Every analyzed person has unique HV1 + HV2 profiles together. Although it was possible to distinguish every analyzed individual according to their HV1 and HV2 profiles together, a more comprehensive population study should be done at Turkey to calculate the population frequencies, for HV1 and HV2 sequencing to take its place in forensic laboratories.