Kronik hepatit C hastalarında pyrosekanslama yöntemi ile hepatit C virusu (HCV) genotiplerinin belirlenmesi
Detection of hepatitis c virus (HCV) genotypes by pyrosequencing in chronic HCV patients
Yazar: OĞUZHAN HANCI
Danışman: DOÇ. DR. YASEMİN BULUT
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Genotip = Genotype ; Hepatit C = Hepatitis C ; Hepatit C virüsü = Hepatitis C virus ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer hastalıkları = Liver diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Kronik viral hepatitler, günümüzde en önemli halk sağlığı problemlerindendir. Dünyada yaklaşık olarak 170-210 milyon kişinin Hepatit C Virusu (HCV) ile enfekte olduğu düşünülmektedir. Akut ve kronik hepatit, siroz ve hepatosellüler karsinoma gibi hastalıklar için en önemli risk faktörlerinden biri olan HCV, karaciğer hastalıklarının    % 25-40 kadarından sorumludur. HCV, nükleotit dizileri birbirlerinden % 30'a kadar farklı olabilen 6 ana genotipe ve 80'den fazla subtipe ayrılmaktadır. Genotipler, HCV enfeksiyonunun nasıl seyredeceğinin öngörüsünü sağlayamaz ancak virusun genotipleri tedaviye yanıt kriteri olarak ve tedavi süresinin belirlenmesinde yol göstericidir.  HCV genotiplerinin belirlenmesinde doğrudan dizi analizi, Ters Hibridizasyon, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), tipe özgü Polymerase Chain Reaction (PCR), Pyrosekanslama ve Serotiplendirme gibi yöntemler uygulanmaktadır. Bunlardan Pyrosekanslama, DNA sentezi esnasında açığa çıkan pirofosfatların saptanması esasına dayanan yeni gerçek zamanlı kantitatif dizi analizi tekniğidir. Bu tezde, Pyrosekanslama yöntemi ile Elazığ ilindeki kronik hepatit C öntanısı/tanı olan hastaların HCV genotiplerinin belirlenmesi amaçlandı. Bu çalışmaya, Kronik Hepatit C ön tanısı / tanı ile takip edilen Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Merkez Laboratuvarına gönderilen 50 hastanın serum örnekleri dahil edildi. Anti-HCV yönünden pozitif olan bütün örneklerin HCV-RNA düzeyleri gerçek zamanlı PCR yöntemi (Taqman 48, Roche) ile araştırıldı. Örneklerden RNA izolasyonu üretici firmanın önerileri doğrultusunda otomatik izolasyon sistemi (EZ1, Qiagen) ile yapıldı. Örneklerde HCV genotip analizi Pyrosekanslama yöntemi ile belirlendi. HCV genotiplerinin 46 (% 92,0)'si genotip 1; 1 (% 2,0)'si genotip 3 olarak bulundu. Genotip 1 olarak bulunan 46 örneğin 41'i genotip 1b; 5'inin genotip 1a olduğu belirlenirken, 3'ünün alt tipi belirlenemedi. Sonuç olarak, hepatit C ile enfekte kronik hastalarda en yaygın genotipin 1b olduğu saptandı. Pyrosekanslama yöntemi ile HCV genotiplerinin belirlenmesi diğer DNA dizi analizi yöntemlerine kıyasla oldukça kısa sürmektedir. Bu durum ise rutin laboratuvarlarda uygulama kolaylığı sağlamaktadır. Pyrosekanslama yönteminin test birim fiyatı DNA dizi analizi yöntemlerinin test birim fiyatına yakın olup, ters hibridizasyon testlerine kıyasla ucuzdur. Fiyat ve süre açısından bakıldığında, tedaviye yanıt kriteri olarak ve tedavi süresinin belirlenmesinde önemli bir kriter olan HCV genotipleme için Pyrosekanslama yönteminin uygulanabileceği kanaatine varıldı.

Anahtar kelimeler: Hepatit C virusu, kronik hepatit C, genotip, Pyrosekans

Abstract:
Chronic viral hepatits are one of the most important public health problems. It has been predicted that 170-210 million people have been infected with Hepatitis C virus (HCV) in the world. HCV, which is one of the most important risk factors for diseases including acute and chronic hepatitis, chirose, and hepatocellular carcinoma is responsible for 25-40% of the liver diseases. HCV is divided into 6 main genotypes, nucleotide sequences of which can be different up to 30%, and into more than 80 subtypes. Genotypes can not be used for predicting how the HCV infection will progress but can be an indicator of response to the treatment and can be used for determining the treatment period. HCV genotypes are determined using various methods such as Direct sequence analysis, Reverse Hybridization, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), type-specific Polymerase Chain Reaction (PCR), Pirosequencing, and serotyping. Among those, pyrosequencing is a real time quantitative sequencing technique based on the detection of pyrophospates released during the synthesis of DNA. In this thesis, it was aimed to determine HCV genotypes of the patients with prediagnosis or diagnosis of chronic hepatitis C in Elazığ by using pyrosequencing method. Serum samples of 50 patients with prediagnosis/diagnosis of chronic hepatitis C were used in this study.  HCV-RNA levels of all samples that were positive for anti-HCV were determined using real time PCR (Taqman 48, Roche). RNA isolation from the samples were carried out using an automated isolation system (EZ1, Qiagen) as described by the manufacturer. HCV genotype analysis of the samples were determined by using pyrosequencing method. 46 (92%) and 1(2%) of the samples were determined as genotype 1 and genotype 3, respectively. Of 46 samples that were genotype 1, 41 were found as genotype 1b and 5 as genotype 1a whereas 3 of those were not be able to subtyped. As a result, genotype 1 was found as the most common genotype in patients infected with HCV. Genotyping HCV by pyrosequencing takes quiete shorter time compared to other DNA sequencing methods. In this case, pyrosequencing can be a method of choice in routine analysis laboratories due to ease of use. Unit cost of pyrosequencing is comparable to that of DNA sequencing based methods. In fact, it is cheaper than the cost of reverse hybridization method.  It is concluded that, due to the cost and required-time advantages, pyrosequencing can be used for genotyping HCV, which is an important criteria for determining the treatment response and the treatment period.

Key Words: Hepatitis C Virus, Chronic hepatitis C, genotype, pyrosequence