Enterobacteriaceae ailesinde genişlemiş spektrumlu beta laktamaz enziminin clsı ve eucast kriterlerine göre tespiti ve moleküler tiplendirilmesi
Detection of expanded spectrum beta lactamase enzymes according to clsi and eucast criteria in enterobacteriaceae family and their molecular characterization
Yazar: HANDE TOPTAN
Danışman: DOÇ. DR. SEBAHAT AKSARAY
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Haydarpaşa Numune Eğt. ve Arş. Hastanesi / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Antibiyotikler-laktam = Antibiotics-lactam ; Beta laktamazlar = Beta lactamases ; Enterobacteriaceae = Enterobacteriaceae ; Enterobacteriaceae enfeksiyonları = Enterobacteriaceae infections ; Mikrobiyal duyarlılık testleri = Microbial sensitivity tests ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Genişlemiş spektrumlu beta laktamazlar sayı ve yaygınlıkları giderek artan, beta laktam antibiyotikleri hidrolize ederek bu antibiyotiklerin kullanım alanlarını sınırlayan önemli bir direnç kaynağıdır. GSBL üretiminin doğru bir şekilde saptanmasında, kullanılacak yöntem ve değerlendirme kriterleri son derece önemlidir. Antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesinde en yaygın olarak kullanılan iki standart CLSI ve EUCAST'tir. Bu çalışmada bu iki standartın GSBL tespitine yönelik duyarlılık ve özgüllüklerinin araştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmamıza Nisan 2014-Temmuz 2014 tarihleri arasında Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarına gönderilen idrar örneklerinden moleküler olarak GSBL ürettiği belirlenen 76 ve kontrol olarak GSBL negatif 74 izolat dahil edilmiştir. Çalışmaya alınan bütün izolatların disk difüzyon yöntemiyle tarama ve fenotipik doğrulama testleri (çift disk sinerji ve kombinasyon diski yöntemi) ile moleküler doğrulama testleri çalışılmıştır. Tarama testleri için seftazidim (10µg ve 30µg), sefotaksim (5µg ve 30µg), seftriakson (30µg), sefpodoksim (10µg), sefepim (30µg) ve aztreonam (30µg) diskleri kullanılmıştır. Çift disk sinerji testi için tarama diskleri amoksisilin-klavulonat (20+10µg) diski ile merkezden merkeze 20mm olacak şekilde yerleştirilmiştir. Kombinasyon disk yöntemi için seftazidim-klavulonat (30+10µg) ve sefotaksim-klavulonat (30+10µg) diskleri kullanılmıştır. Moleküler doğrulama testi için CTX-M, TEM ve SHV gen bölgelerinin varlığı konvansiyonel PZR ile saptanmıştır. 
 Çalışmamızda GSBL üreten izolatların %86.8'i CTX-M, %47.4'ü TEM ve %9.2'si SHV olarak bulunmuştur. Bazı izolatlarda birden fazla direnç geni saptanmıştır. GSBL üreten izolatların beta laktam duyarlılıkları CLSI ve EUCAST kriterleri kullanılarak sırasıyla seftazidim için %29.2 ve %19.7, sefepim için %14.5 ve %15.8, aztreonam için %2.6 ve %13.2 olarak bulunmuştur. GSBL tarama testi için duyarlılık ve özgüllük dengesi en iyi disk EUCAST kriterlerine göre yorumlanan sefpodoksim diski olarak saptanmıştır. Bunu CLSI kriterleriyle yorumlanan sefpodoksim, ve her iki kriterin de benzer duyarlılık ve özgüllük gösterdiği sefotaksim ve seftriakson diskleri izlemiştir.
GSBL üretiminin tespitinde CLSI ve EUCAST kriterlerinin birbirine anlamlı bir üstünlüğü saptanmamıştır. EUCAST'in seftazidim ve sefotaksim için tarama ve doğrulama disk difüzyon testlerinde farklı içeriklerde diskler önermesinin özellikle seftazidimde duyarlılık artışını sağlamakla birlikte pratikte kullanım zorluğuna sebep olacağını düşünmekteyiz. Her iki standart için de tarama testlerinde sefpodoksim, sefotaksim veya seftriakson; doğrulama testlerinde ise sefotaksim ve sefotaksim-klavulonat disklerinin  kullanılması daha doğru sonuç verilmesini sağlayacaktır.

Abstract:
Expanded spectrum beta-lactamases are an important source of resistance with an increasing number and prevalance, and limit the using areas of beta-lactam antibiotics by hidrolising them. The method to be used and evaluation criteria for accurate detection of ESBL production is extremely important. The two most widely used standards for determining antibiotic susceptibility are CLSI and EUCAST. This study aimed to investigate the sensitivity and specificity of these standards for detection of ESBL.
From April 2014 to July 2014, 76 moleculary characterised ESBL producer strains and 74 ESBL negative control strains which were isolated from urine specimens that sent to Medical Microbiology Laboratory of Haydarpasa Numune Training and Research Hospital were included in this study. Screening and phenotypic confirmation tests (Double disk synergy and combination disk method) by disk diffusion method and molecular confirmation tests were conducted for all strains taken into study. For screening tests ceftazidime (10µg ve 30µg), cefotaxime (5µg ve 30µg), ceftriaxone (30µg), cefpodoxime (10µg), cefepime (30µg) ve aztreonam (30µg) disks were used. For double disk synergy test, screening disks were placed at a distance of 20 mm from the center of amoxicillin-clavulanate (20+10µg) disk. For combination disk method ceftazidime-clavulonate (30+10µg) and cefotaxime-clavulonate (30+10µg) disks are used. For molecular confirmation tests CTX-M, TEM and SHV resistance genes were investigated by conventional PCR.
In our study ESBL producing isolates were found 86.8% as CTX-M, 47.4% as TEM and 9.2% as SHV. More than one resistance gene was detected in some isolates. Beta-lactam susceptibilities of ESBL producers with CLSI criteria and EUCAST criteria were 29.2% and 19.7% for ceftazidime, 14.5% and 15.8% for cefepime, 2.6% and 13.2% for aztreonam respectively. Among the screening disks, cefpodoxime disk (interpreted by the EUCAST criteria), showed the highest sensitivity and specificity. This was followed by cefpodoxime disk interpreted by CLSI criteria and by cefotaxime and ceftriaxone disks with similar sensitivity and specificity for both criteria.
There was no significant difference between CLSI and EUCAST criteria in determinin ESBL production. The suggestion of EUCAST that using different disks for screening and confirmation tests increase the sensitivity of detecting ESBL, especially in  ceftazidime, however we believe it might cause practical difficulties. For both standarts the use of cefpodoksime, cefotaxime or ceftriaxone disks in screening tests and the use of cefotaxime and cefotaxime-clavulonate disks in confirmation tests will provide more accurate results.