Pseudomonas aeruginosa pao1 suşunda sıcaklık, pH ve klor streslerine karşı biyofilm oluşumunu tetikleyen genlerin etkinliğinin real-time PCR yöntemi ile belirlenmesi
Determining the biofilm formation inducing genes activity against heat, pH and chlorine stress via real-time PCR in pseudomonas aeruginosa pao1 strain
Yazar: ÖZGE KEKEÇ
Danışman: DOÇ. DR. FİGEN ESİN KAYHAN ; YRD. DOÇ. DR. NÜZHET CENK SESAL
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Pseudomonas aeruginosa, sporsuz, kapsülsüz, basil morfolojisinde ve bağışıklık yetersizliği olan hastalarda ciddi enfeksiyonlara neden olabilen önemli bir fırsatçı patojendir. Antibiyotiklere karşı direncindeki artış sebebiyle, mortalite ve morbiditesi yüksek, tedavisi güç enfeksiyonların etkeni olan bir bakteridir. Çoğunlukla toprak ve suda bulunan P. aeruginosa, yaşamını sürdürebilmek için, farklı çevresel etkenlere karşı kendini korumak zorunda kalmaktadır. Ortam koşullarından korunmak, ortama adapte olmak ve strese cevap oluşturmak için iletişim mekanizmaları geliştirmiştir. Quorum Sensing (QS), bakterinin salgıladığı sinyalleri, sayıları belirli bir seviyenin üzerine çıktığında algılaması ve sinyallere cevap oluşturarak iletişim kurması sistemidir. Ekstrasellüler polimerik madde içine gömülü halde, yüzeye yapışarak yaşayan biyofilm formu, QS ilgili genlerin ekspresyonu ile meydana getirilmektedir. Meydana gelen bu biyofilm, antibiyotik ve dezenfektanlara direncin başlıca sebebidir. 
P. aeruginosa'nın yaşadığı ortamlarda maruz kaldığı çeşitli stres durumlarının, QS sistemi tarafından gen ekspresyonu ile kontrol edilen biyofilm oluşumunu, moleküler düzeyde nasıl etkilediğini araştırmayı amaçladığımız çalışmamızda; klor, pH ve sıcaklık streslerine karşı P. aeruginosa PAO1 suşunun oluşturduğu yanıt incelenmiştir. Sıcaklık, klor ve pH streslerine maruz bırakılan bakteriler, üç günlük inkübasyonun ardından, biyofilm miktarının ölçülmesi için boyanmıştır. Stres dozları, boyama bulgularına göre belirlenmiştir. 
Gerçek zamanlı PZR'nin, bakteriyel gen ekspresyonunu analiz etmek için uygun bir yöntem olduğu bilinmektedir.  P. aeruginosa PAO1 suşunda biyofilm ve stres oluşumunda etkili olduğu literatürde belirtilen yedi gen bölgesi (rpoS, bifA, migA, dnaK, katB, soxR, algC) belirlenmiştir. Bu gen bölgeleri, gerçek zamanlı PZR metodu ile çoğaltılmış, stres durumlarının ve dozlarının genlerin anlatımı üzerine etkisi belirlenmiştir. Ayrıca, kapiller ve LightCycler Nano gerçek zamanlı PZR sisteminin kullanıldığı gerçek zamanlı PZR cihazları, bulguların güvenilirliğini test etmek için karşılaştırılmıştır.
Elde edilen bulgular, klor stresinin rpoS, bifA, migA, katB, soxR ve algC genlerinin anlatımını arttırdığını; düşük pH stresinin rpoS, bifA, migA, soxR ve algC genlerinin anlatımını arttırdığını aksine yüksek pH stresinin aynı genlerin anlatımını azalttığını ve sıcaklık streslerinin ise rpoS, bifA, migA, katB, soxR, algC ve dnaK genlerinin anlatımını etkilemediğini göstermiştir. Sonuç olarak, özellikle yüksek asit ve klorun, biyofilm oluşumunda etkili genlerin anlatımını arttırdığı, yüksek pH'ın ve sıcaklık stresinin ise anlatımda anlamlı değişiklikler yapmadığı ya da doza bağlı olarak anlatımı baskıladığı görülmüştür. Kapiller ve LightCycler Nano gerçek zamanlı PCR sistemlerinin karşılaştırılması sonucu da bulguların birbirlerini desteklediklerini göstermiştir.
Bakterilerin ortadan kaldırılmasında sıklıkla tercih edilen, klorlama, yüksek sıcaklık ve ekstrem pH değerleri yöntemleri dezenfeksiyon için yetersiz kalmakta hatta bakterilerin daha da çoğalmasına sebep olmaktadır. Bu sebeple, bakterilerin ortadan kaldırılması için yeni dezenfeksiyon yöntemlerinin geliştirilmesine ve var olan tekniklerin ise bakteriyi strese sokmadan, ek dezenfeksiyon yöntemleriyle beraber uygulanmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Biyofilm gibi tehlikeli bir form ile mücadele ediliyorsa, bütün dezenfeksiyon yöntemlerinin, bakteride yarattığı etki de ayrıntılı olarak incelenmelidir. Etkin bir mücadele için, bu konudaki çalışmaların sayılarının arttırılması gerektiği düşünülmektedir.

Abstract:
Pseudomonas aeruginosa is an important opportunistic pathogen which is a bacillus without capsule, has no spores, and may cause serious infections in patients with immunodeficiency. P. aeruginosa is responsible for frequently encountered infections with high morbidity and mortality and hard to treat. P. aeruginosa is mostly found in soil and water, and protects itself from various enviromental conditions to survive. It creates communication mechanisms to ensure its survival, to resist from environmental conditions and to response to stress. Quorum Sensing (QS) mechanism is the system of communication that bacteria using signals when number of signals reached a certain level and responding them.  With the expression of genes related to QS, a biofilm form which lives in adherence to the o surface inside extracellular polymeric matter is generated. This generated biofilm is the main reason of the resistance against antibiotics and disinfectants.
This study aims to find out how the several stress conditions that P. aeruginosa PAO1 strain exposed in it's habitats effects the biofilm formation that is controlled with gene expression by QS system in molecular level additionally, response against heat, chlorine and pH stres is also investigated. Stress severity was designed according to viability results in response to heat, chlorine and pH stres.
Real-time PCR has been used to analyze bacterial gene expression. Seven genes (rpoS, bifA, migA, dnaK, katB, soxR, algC) indicated in literature that play role on biofilm formation and stress response determined in P. aeruginosa PAO1 strain.  These genes were amplified using real-time PCR and effect of stress conditions and severity on gene expression is determined. Tubular and capillar real-time PCR systems were compared in order to test the reliability of the results.
 The results obtained showed that chlorine stress increases the gene expressions of rpoS, bifA, migA, katB, soxR and algC; low pH stress increases the gene expressions of rpoS, bifA, migA, soxR and algC, on the other hand high pH stress reduces the gene expressions of the same genes, and finally heat stress did not induce any changes for expressions of the genes rpoS, bifA, migA, katB, soxR, algC and dnaK. In conclusion, it is observed that high levels of acid and chlorine increased gene expression related to biofilm formation particularly while high pH levels and heat stress did not have a significant effect or repress based on severity on gene expression. It is observed that the results of capillary and tubulary PCR are in accordance with each other when compared.
Methods commonly used for exterminating bacteria such as chlorination, high temperature and extreme pH levels are inefficient and they even cause bacterial growth. Therefore, new disinfection methods should be developed and current methods should be used without stressing out bacteria with additional techniques. If controversy against dangerous form such as biofilm exists, all the effects of disinfection techniques must be investigated in the bacteria. For an effective contention, research in this field should be increased.