Farklı karbon kaynağı ve besiyeri pH değerinin Pichia pastoris mayasının rekombinant protein üretimine olan etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of different carbon sources and media pH values on recombinant protein production of Pichia pastoris yeast
Yazar: MERVE GÜLTEN AKBABA
Danışman: PROF. DR. MEHMET KARAASLAN
Harran Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Meyveler hoşa giden tat, aroma ve renklerinden dolayı özelliği tarafından rağbet ekonomik görünen değeri yüksek ürünlerdir. Ancak meyvelerin hasadının ardından solunumunun devam etmesi ve ortaya çıkan biyokimyasal değişimlerin bozulması ve parçalanma sürecinin hızlandırılması dolayısıyla hızlı bir şekilde katma değerli ürünlerin uygulanması gerekmektedir. Bu en başında da meyve suyu ve konsantresinin üretimi yapılmaktadır. Meyve suyu üretimi presleme aşamasında meyve suyu randımanı boyutu için ve berrak meyve suyu üretimi amacıyla çeşitli hücreli parçalayıcı enzimler kullanılmaktadır. Parçalanmış duvar kağıdı parçalayan enzimlere parçaları olan proteinlerden birisi de ekspanzin proteinidir. Ekspanzin proteini bitkilerde bulunan bir proteindir. Ekspanzin proteini bitkileri ekstradan az miktarda kaybederek klasik olarak elde edilirken maliyet artışına ve zaman kaybına neden olmaktadır. Ekspanzin proteinin modern biyoteknolojik dayanıklılığı için domates ( Solanum lycopersicum ) LeExp1 genini içeren Pichia pastoris konakçı hücresi çalışma kapsamı içinde kullanılmıştır. Bu olabilir P. pastoris metilotropik mayasının optimum fermentasyon koşullarının belirlenmesinin devamı. Bu amaçlanan, karbon kaynağı metanole ikamesi olarak gliserol, sorbitol ve mannitol besiyeri pH değeri olarak da 4.0-5.0-6.0-7.0 ve tüm deneme desenleri için fermentör sıcaklığı 30 ºC olacak şekilde 16 adet deneme deseni belirlendi. Sonuçlar karbon kaynağının metanol ve besiyeri pH 6.0 olduğu fermentasyon koşulları ile karşılaştırılmıştır. Araştırma kapsamında rekombinant mayaların biyokütle miktarı, fermentasyon ortamındaki toplam protein miktarı, RNA transkripsiyonu ve Western Blot analizleri gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonucunda pH değeri 7.0 ve karbon kaynağının metanol ile birlikte sorbitol veya gliserol fabrikası çalışır durumda P. pastoris'in biyokütle kapasitesi 21,3 ve 34,7 mg/mL ve fermantasyon ortamındaki toplam protein kapasitesi ise 30,35 ve 30,00 mg/mL'dir. olarak ölçülmüştür. Yapılan RNA Transkripsiyon analizi ile agaroz jel üzerinde LeExp1 geninin varlığı inkübasyonun tüm aşamalarında (24-48-72-96.sa.) gözlenmiştir. RNA Transripsiyon analizi ile LeExp1 geninin başarılı bir şekilde konakçı organizma olan P. pastoris'e aktarıldığı ve transkribe edildiği doğrulanmıştır. P. pastoris'in salgıladığı proteinler SDS Sayfa analizi ile jel üzerinde parçalanmış ve 30 kDa boyutunda ekspanzin proteinin varlığı tespit edilmiştir. SDS Sayfası jeli Western Blot analizi ile PVDF membrana blotlanarak ekspanzin proteininin varlığı spesifik antikor ile tespit edilmiştir.

Abstract:
Fruits are high-value products that are favored by consumers due to their pleasant taste, aroma, and color. Fruits continue to respire and undergo biochemical reactions during post-harvest period wich lead to rapid spoilage and decay. Therefore frits should be processed into value-added products quickly. Among these products, fruit juice and concentrate production are the most prominent. Various cell wall- degrading enzymes are used in fruit juice production to increase juice yield during the pressing stage and to produce clear fruit juice. One of the proteins accompanying cell wall-degrading enzymes is the expansin protein. Expansin is a protein found in plants. As the expansin protein present in small amounts in plants, its extraction through classical methods requires increased cost and time. To produce expansin protein using modern biotechnological methods recombinant Pichia pastoris harboring the tomato LeExp1 gene was used in this investigation. This study aimed to determine the optimal fermentation conditions of the methylotrophic yeast P. pastoris. For this purpose, 16 experimental designs were established with glycerol, sorbitol, and mannitol as substitutes for methanol as the carbon source, and with medium pH values of 4.0, 5.0, 6.0, and 7.0, while maintaining a fermentation temperature of 30ºC for all designs. The results were compared to the fermentation conditions where methanol was used as the carbon source and the medium pH value was 6.0. To ensure the traceability and verifiability of the research results, biomass quantity, total protein concentration, RNA transcription, and Western Blot analyses were performed. As a result of the study, the biomass concentration was measured at 21,3 mg/mL and 34,7 mg/mL, and the total protein concentration was measured at 30,35 mg/mL and 30,00 mg/mL, respectively, when using sorbitol or glycerol with methanol as the carbon source and a medium pH value of 7.0 for recombinant expansin protein production by P. pastoris. RNA Transcription analysis revealed the presence of the LeExp1 gene on agarose gel at all incubation stages (24-48-72-96 hours). The RNA Transcription analysis confirmed the successful transcription of the LeExp1 gene into the host organism P. pastoris. The proteins secreted by P. pastoris were separated on a gel using SDS Page analysis, and the presence of the expansin protein with a size of 30 kDa was detected. The SDS Page gel was blotted onto a PVDF membrane using Western Blot analysis, and the presence of the expansin protein was detected with a specific antibody.