YopM-DDX3 etkileşimini hedefleyen dna aptamerlerinin seçilmesi ve floresans rezonans enerji transferi (FRET) yöntemi ile karakterizasyonu
Selection of dna aptamers targeting YopM-DDX3 interaction and characterization by fluorescence resonance energy transfer method
Yazar: OĞUZ GÖK
Danışman: PROF. DR. SERAP EVRAN ; DR. ÖĞR. ÜYESİ CANAN ÖZYURT
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Vebaya neden olan Yersinia pestis, antibiyotik direnci geliştirebilme yeteneği nedeniyle önemli bir tehdit olmaya devam etmektedir. Bağışıklık baskılayıcı rol oynayan ana virülans faktörlerinden biri olan Yersinia dış protein M (YopM), DEAD-kutu helikaz 3 (DDX3) proteininin yardımıyla sitoplazma ve nükleus arasında geçiş yapabilmektedir. Y. pestis için şu anda onaylanmış bir aşı bulunmamaktadır ve bu nedenle yeni tedavi stratejilerine ihtiyaç vardır.
Bu çalışmada, YopM'ye spesifik olarak bağlanabilen ve DDX3 ile etkileşimini inhibe edebilen DNA aptamerlerinin geliştirilmesi amaçlandı. Manyetik boncuk-temelli SELEX yöntemi kullanılarak YopM için DNA aptamerleri seçildi. Yeni nesil sekanslama (NGS) yöntemi ile zenginleşen SELEX turları analizlendi. MEME suite ve mfold programları kullanılarak zenginleşme seviyelerine göre aday aptamerler belirlendi. Bu aptamerlerin bağlanma afiniteleri izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) yöntemiyle belirlendi. YopM16 olarak adlandırılan aptamerin, nM düzeyinde bir bağlanma afinitesine (Kd=271 nM) sahip olduğu gösterildi. YopM-DDX3 etkileşimi üzerindeki inhibisyon etkisi FRET, kolorimetrik test ve pull-down testleri ile belirlendi ve IC50 değeri 105,75 nM olarak bulundu. 
Tez çalışması sonucunda, YopM-DDX3 etkileşimini inhibe edebilen aptamer yapılı bir inhibitör geliştirilmiştir. Çalışması sonucunda, Y. pestis için yeni terapötik ajanların geliştirilmesine yönelik çalışmalara katkı yapacağı öngörülmektedir.

Abstract:
Yersinia pestis, responsible for plague, continues to be a significant threat due to its ability to develop antibiotic resistance. One of its key virulence factors is Yersinia outer protein M (YopM), which plays a crucial role in immune suppression by transitioning between the cytoplasm and nucleus with the help of DEAD-box helicase 3 (DDX3). There are no Yersinia vaccines currently available, emphasizing the need for novel therapeutic strategies.
This study aimed to develop aptamers that can bind to YopM protein with affinity and inhibit the interaction of YopM with DDX3. DNA aptamers were selected for YopM using the magnetic bead-based SELEX method. SELEX rounds enriched by the next-generation sequencing (NGS) method were analyzed. Candidate aptamers were identified according to their enrichment levels using the MEME suite and mfold programs. The isothermal titration calorimetry (ITC) method was utilized to ascertain the binding affinities of these aptamers. The aptamer, YopM16, was shown to have a binding affinity of nM (Kd = 271 nM). The inhibition effect on YopM-DDX3 interaction was determined by FRET, colorimetric test and pull-down tests. The IC50 value was found to be 105.75 nM.
In conclusion, an aptamer inhibitor that can inhibit the YopM-DDX3 interaction was developed. It is anticipated that the result of the thesis study, it will contribute to studies on the development of new therapeutic agents for Y. pestis.