Kiwano (Cucumis metuliferus) bitkisinde peroksidaz enzimlerinin kinetik özelliklerinin incelenmesi
Kinetic properties of some peroxidases from kiwano (Cucumis metuliferus)
Yazar: ZEYNEP DENLİ
Danışman: YRD. DOÇ. GÜLNUR ARABACI
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada, Cucumis metuliferus (kiwano) bitkisinden elde edilen Peroksidaz (POD) ve Askorbat peroksidaz (APX) enzimlerinin kinetik özellikleri incelenmiştir. POD üçlü-faz ayırma tekniği (TPP) ve diyaliz işlemleri ile kısmen saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ve Native PAGE yöntemleriyle saflık kontrolü yapılmıştır. Ham enzim kullanılan karakterizasyon çalışmalarında 4-metil katekol, ABTS, guaiakol, kafeik asit, o-dianisidin, o-fenilen diamin, progallol, katekol, gallik asit ve H?O?  substratları kullanılmıştır. Her bir substrat için Michaelis-Menten sabiti (KM) ve maksimum reaksiyon hızı (Vmax) hesaplanmıştır. Kafeik asit en yüksek substrat spesifikliğine sahiptir. Enziminin optimum pH?sı 4,0?7,5 arasında ve optimum sıcaklığı ise 30 ? 40 ? arasında bulunmuştur. Kiwano POD enzimini NaN3, tiyoüre, KCN, L-Sistein, EDTA, SDS, Triton X-100 ve L-Glutatyon, Zn+2, Mg+2, Fe+2, Pb+2, Sn+2 metalleri, metanol, DMSO, aseton, etanol, 1-bütanol, 2-propanol, kloroform ve etil asetat organik çözücüleri inhibe etmektedir. Pek çok POD enzimini 2- merkapto etanol inhibe ederken kiwano POD enzimini inhibe etmemiştir. Bazı aminoasitlerin POD enzimi üzerine etkisi incelendiğinde L-histidin en yüksek aktivasyona, L-prolin en yüksek inhibisyona sebep olmuştur. POD optimum iyonik şiddeti NaCl? ün 4 mM konsantrasyonunda çıkmıştır. Yapılan POD depolama kararlılığı sonucuna göre; oda sıcaklığında dört yüz saat sonrasında enzim aktivitesi %84, +4 oC? de altmış günün sonrasında 83%, -20 oC? de yüz otuz beş gün sonrasında % 73 oranında azalmıştır.

Kiwano askorbat peroksidaz (APX) enziminin maksimum aktivite gösterdiği optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 6,2 ve 30 oC olarak bulunmuştur. Kiwano APX enzim kinetiğinden elde edilen sonuçlara göre; KM ve Vmax değerleri sırasıyla askorbik asit için 284.80 µM, 0.0035 EÜ/dk. H2O2 için 64.90 µM, 0,0077 EÜ/dk. olarak bulunmuştur. Kiwano APX üzerine NaN3, KCN, 2-merkapto etanol, L-sistein, EDTA, iyodoacetamid, 2-nitrobenzoik asit ve L-glutatyon?nun inhibisyon etkisi incelendiğinde L-Glutatyon ve EDTA hariç hepsinin inhibisyon etkiye sahip olduğu bulunmuştur. Metal iyonlarının APX aktivitesi üzerine etkisi sonucuna göre Fe+2, Cu+2, Ba+2 metallerinin bazı konsantrasyonlarında aktivasyona sebep olurken, diğer metaller inhibisyona sebep olmuştur. APX enzimi üzerine amino asit etkisi çalışmasında; L-prolin en iyi aktivatör olarak, L-glutamik asit ise en etkili inhibitör olarak görev yapmaktadır.
Anahtar kelimeler: Peroksidaz /askorbat peroksidaz, kiwano, Cucumis metuliferus, NATİVE / SDS-PAGE, üçlü-faz ayırma tekniği (TPP).

Abstract:
In this work, it is investigated the kinetic properties of peroxidase (POD) and ascobate peroxidase (APX) obtained from Cucumis metuliferus (kiwano). POD was partially purified by using Three Phases Partitioning (TPP) and dialysis. The purification of POD was detected by SDS-PAGE and Native PAGE. 4-methylcatechol, ABTS, guaiacol, caffeic acid, o-dianisidine, o-phenylenediamine, pyrogallol, catechol, gallic acid and H?O? substrates were used in the characterization studies of crude enzyme extract. Michaelis-Menten constant (KM) and maximum reaction velocity (Vmax) were calculated for each substrate. Cafeic acid has the maximum substrate specifity. POD?s optimum pH and temperature were found between 4,0-7,5 and 30-40 ?, respectively. POD activity was inhibited from NaN3, thiourea, KCN, L-cysteine, EDTA, SDS, Triton X-100 and L-glutathione, Zn+2, Mg+2, Fe+2, Pb+2, Sn+2 metal ions, methanol, DMSO, acetone, ethanol, 1-butanol, 2-propanol, chloroform and ethyl acetate. 2-mercaptoethanol acts as an inhibitor for many PODs, but not for kiwano POD. When the effect of some amino acids on the POD was investigated, L-histidine led to maximum activation and L-Proline maximum inhibition. Optimum ionic strength of POD was found in 4 mM of NaCl. As a result of enzyme storage stability, the POD activity decreased %84 at the room temperature after 400 hours, 83% at +4 oC after 60 days and % 73 at -20 oC after 135 days. 

The optimum pH and temperature that ascorbate peroxidase (APX) has maximum activity were obtained as 6,2 and 30 oC, respectively. In the results of APX kinetics, the KM and Vmax values were found as for ascorbic acid 284.80 µM, 0.0035 EU/min. and for H2O2 64.90 µM, 0,0077 EU/min., respectively. When it is searched the inhibitory effect of NaN3, KCN, 2-mercaptoethanol, L-cysteine, EDTA, iodoacetamide, 2-nitrobenzoic acid and L-glutathione on the APX, all of them except L-glutathione and EDTA caused to inhibition.  As a result of some metal ions effect on APX activity, whereas Fe+2, Cu+2 and Ba+2 metal ions lead to activation in the some concentrations of them, other metals lead to inhibition. In the study of the amino acid effect on the APX; while L-proline acts as the best activator, L-glutamic acid acts as the most effective inhibitor.
Key Words: Peroxidase/Ascorbate peroxidase, kiwano, Cucumis metuliferus, Native / SDS-PAGE, three phase partitioning (TPP).