Farklı habitatlardan izole edilen aktinomiset genomlarında yeni ilaç adaylarının taranması
Mining of actinomycete genomes for the discovery of new natural products
Yazar: SÜLEYMAN ÖZAKIN
Danışman: PROF. DR. EBRU İNCE
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Aktinomisetler = Actinomycetes

Özet:
Yeni biyoaktif bileşiklerin keşfi için, biyoteknolojik potansiyele sahip doğal ürünlerin mikroorganizmalardan eldesi son zamanlarda oldukça ilgi uyandıran bir araştırma konusudur. Karasal ve sucul habitatlardan izole edilen aktinomisetler yeni biyoaktif doğal ürünlerin keşfi için önemli kaynaklardan biridir. Bu potansiyellerinden ötürü aktinomiset genomlarında doğal ürün biyosentez genlerinin taranması en güncel yaklaşımlardan biridir. Son yıllarda doğal ürün araştırmalarında farklı yöntemler uygulanmaktadır. Bu yöntemlerden biri dejenere polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) primerleri ile doğal ürünlerin biyosentetik gen kümelerinin taranmasıdır, diğeri ise genom dizilimi bilinen izolatlarda doğal ürün gen kümelerine ait biyoinformatik verilerin, kimyasal verilerle birlikte değerlendirilmesi ilkesine dayalı kütle spektroskopisi (MS) temelli genom taramalarıdır. 
Bu çalışmada karasal (Streptomyces) ve deniz (Salinispora) aktinomisetlerinin doğal ürün gen kümelerinin sırasıyla, PCR ve MS temelli genom tarama yöntemleri ile taranması sonucunda hem genetiksel hem de kimyasal olarak doğal ürün sentezleme potansiyelleri araştırıldı. Çalışmanın ilk kısmında endemik bitki kök çevresi Streptomyces izolatlarının NRPS ve PKS-I genlerinin sırasıyla, adenilasyon (A) ve ketosentaz (KS) domainleri, dejenere primerler kullanılarak PCR ile tarandı. PCR amplifikasyonları, klonlama ve DNA dizi analizleri sonucunda izolatların  tümünün (altmış beş) genomunda A domaini, yaklaşık % 80'inkin de ise KS domaini tespit edildi. A ve KS domaini DNA dizilimlerinin BLASTX analizlerine göre, elde edilen NRPS fragmentlerinin %34'ünün, PKS fragmentlerinin ise %56'sının Genbankasındaki en yakın akrabaları ile %70'in altında benzerlik gösterdiği görüldü. Özellikle, NRPS A domainlerinin büyük bir çeşitliliğe sahip olması bunların, farklı biyosentetik metabolik yolların sentezinde görev aldığını düşündürdü. Ayrıca A domain veri tabanında incelenen klonların büyük bir bölümünde A domain motiflerinin substratları ilgili program tarafından tahmin edilemedi. Bu bulgu ilgili A domainlerinin yeni aminoasitleri substrat olarak tanıyabileceği anlamına gelmektedir. Bununla ilişkili olarak yeni NRPS ürünü olabileceğini düşündürmektedir.
Zorunlu deniz aktinomisetlerinden Salinispora cinsi üyeleri doğal ürün araştırmalarında kullanılan model mikroorganizmalardandır. Genom dizilimi bilinen otuz  Salinispora izolatının genomları, doğal ürün gen kümelerini araştırmak için MS temelli genom tarama yöntemi ile tarandı. Biyoinformatik incelemeler sonucunda izolatların NRPS, PKS, terpen, indol, lantibiyotik, aminoglizokit ve siderefor gibi farklı doğal ürün ailelerine ait bileşikleri sentezleyebilme potansiyeline sahip oldukları tespit edildi. Bununla birlikte; hem dereplikasyon hem de kimyasal network analizleri için, Salinispora izolatı ham ekstraktlarından elde edilen sıvı kromatografisi/kütle spektroskopisi (LC/MS/MS) verileri, GNPS (Global Natural Product Society) veritabanında incelendi. Dereplikasyon analizleri sonucunda lomaiviticin C, 7-OH-staurosporine, staurosporine ve cyanosporaside B doğal ürünlerinin izolatların ekstraktlarında bulunduğu tespit edildi. Ayrıca moleküler network analizleri ile izolatlara ait 1347 MS/MS verisinin spektral benzerliği incelendi. Bu inceleme sonucunda Salinispora tropica CNT250, Salinispora pacifica CNY703, Salinispora arenicola CNY299 ve Salinispora arenicola CNY011 izolatlarına ait spesifik MS/MS spektrumları  biyoinformatik veriler ile birlikte değerlendirildi. Kimyasal ve biyoinformatik değerlendirmeler sonucunda S. pacifica CNY703'ün kültür ortamında glikolize bir bileşiğe ve bu bileşiğin sentezinden sorumlu olduğu düşünülen NRPS-PKS-I gen kümesine ulaşıldı. Bu gen kümesinin sentezlediği bileşiğin yapı aydınlatma çalışmaları devam etmektedir. 
Antimikrobiyal aktivite testleri sonucunda karasal izolatlardan Streptomyces sp. CAH29'un güçlü ve geniş spektrumda biyoaktif doğal ürün sentezleme potansiyeli tespit edilmişti. Bu sebepten dolayı, bu izolatın kültür ortamındaki biyoaktif bileşiklerinin saflaştırması,  kimyasal yapı analizi ve değişik biyolojik aktivite testi çalışmaları gerçekleştirildi. Spektroskopik analizler sonucunda biyoaktif bileşiğin tetrangomycin olduğu tespit edildi. Antrakinon yapısındaki bu bileşiğin Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, methicillin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve Candida albicans mikroorganizmalarına karşı, sırasıyla 14, 10, 12 ve 8 mm'lik inhibisyon zonları ile antimikrobiyal aktivite gösterdiği tespit edildi. Ayrıca tetrangomycin'in insan prostat kanseri (LNCaP) ve alveolar adenokarsinoma (A549)  hücreleri üzerine sitotoksik etkisi yanısıra, düşük oranda DPPH radikalini söndürme etkisi olduğu gözlendi. Staphyloxanthin sentezinin ilk aşamasında dehidrosqualen sentaz (CrtM) enzimi görev almaktadır. Tetrangomycin'in anti-MRSA etkisinin incelenmesi amacıyla CrtM enzimi ile Docking analizleri gerçekleştirildi. Bu analizler sonucunda tetrangomycin ve pozitif kontrol dipotasyum (2-okso-2-{[3-(3-fenoksifenil) propil] amino}etil fosfonat) (830) ligandlarının dehidrosqualen sentaz CrtM enzimine bağlanma enerjilerinin birbirine yakın olduğu belirlendi. Bundan dolayı tetrangomycin'in yeni bir anti-MRSA ajan olarak kullanılma potansiyeli tartışıldı.

Abstract:
Biotechnological potential of natural products from microorganisms are receiving more attention for discovery of novel bioactive compounds. Terrestrial and marine actinomycetes are an important source for the discovery of novel bioactive compounds. Therefore, a new method genome mining is a good strategy for a natural product discovery. There are different strategies for genome mining. One of them is PCR based genome mining. Degenerate primers are used in order to defined biosynthetic gene clusters. The other is MS guided genome mining. The present study was designed to assess the genetic potential of rhizosphere streptomyces strains by amplifying adenylation and ketosynthase domains of NRPS and PKS-I genes, respectively. Using degenerate PCR and sequencing of cloned products, NRPSs were detected in all (sixty-five) isolates. PKS-I genes were successfully amplified from 80% of the isolates. Based on the BLASTX analysis, most of the NRPS (34%) and PKS (56%) fragments showed below 70% identity to their closest relatives. The results reveal that there is a great diversity in NRPS A domains in those habitats and the majority of domains cloned in this study are probably involved in different biosynthetic pathways. According to the bioinformatic analysis of NRPS genes, different A domains were determined in the obtained sequences, but in some cases their substrate specifity failed to be predicted. This means that these domains can recognize novel amino acids as substrate. 
The obligate marine actinomycete genus Salinispora is model microorganism for natural product research. All Salinispora strains selected already had whole genome sequence data available and their natural product gene clusters were evaluated with MS guided genome mining. The draft genome sequences of all Salinispora strains were analyzed by bioinformatic tools for the MS-guided genome mining. These tools were used to determine the presence of biosynthetic gene clusters such as PKS, NPRS, terpene, indole, lantibiotic, siderophore so on.  Molecular networks were generated when extracts of Salinispora strains  were analyzed via LC/MS/MS.  Molecular networking of the data resulted in dereplication of lomaiviticin C, 7-OH-staurosporine, staurosporine and cyanosporaside B. As a result of molecular networking analysis, totally 1347 MS/MS data were compared with one another in the network. Finally, we  determined specific MS/MS and bioinformatic data for S. pacifica CNY703, S. tropica CNT250 and S. arenicola CNY011 and CNY299. Both chemical and bioinformatic data showed that a glycosylated natural product was found in S. pacifica CNY703 culture broth and reached NRPS-PKS-I glycosylated natural product gene clusters in S. pacifica CNY703 genome. Structural elucidation of a compound which is product of NRPS-PKS-I gene clusters is going on.
The major bioactive metabolite produced by Streptomyces sp. CAH29 was extracted, purified and identified as tetrangomycin. This known anthraquinone exhibited antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Candida albicans with inhibition zones of 14, 10, 12 and 8 mm, respectively. Tetrangomycin showed moderate free DPPH radical scavenging activity and potent cytotoxic activity against cell lines LNCaP (human prostate adenocarcinoma cell) and A549 (human alveolar adenocarcinoma cell). Docking results demonstrate that tetrangomycin has a similar mode of action. As a result of this analysis, it was determined that the binding energy of tetrangomycin and positive control dipotassium (2-oxo-2 - {[3- (3-phenoxyphenyl) propyl] amino} ethyl phosphonate (830) to the dehidrosqual synthase CrtM enzyme of MRSA was found to be close to each other.  Therefore, this result suggest that tetrangomycin has the potential to be used as an anti-MRSA agent.