Dimetil fumarat'ın mikroglial hücrelerde nlrp3 inflamazom aktivasyonu üzerine etkisi
The effects of dimethyl fumarate on nlrp3 inflammasome activation in microglial cells
Yazar: BORA TAŞTAN
Danışman: PROF. DR. ŞERMİN GENÇ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Bilimler Ana Bilim Dalı / Temel Sinirbilimler Bilim dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Adenozin trifosfat = Adenosine triphosphate ; Dimetil fumarat = Dimethyl fumarate ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Nöroglia = Neuroglia ; Polisakkaritler = Polysaccharides ; İnflamazom = Inflammasome

Özet:
İnflamazom aktivasyonu klasik inflamatuar yanıtlardan farklı olarak başlayan ve gelişen bir süreçtir. Mikrobiyal ajanların yanı sıra Adenozin Trifosfat(ATP) gibi metabolik stres ürünleri veya asbestos , silika gibi dış uyaranların etkisiyle de oluştuğu bilinmektedir. İnflamazom aktivasyonu hücrelerden Kaspaz-1 aracılığı ile interlökin-1beta (IL-1beta), interlökin-18 (IL-18) sitokinlerinin salınımı ile sonlanmaktadır. Bu süreçte inflamazom aktivasyonu hücrenin piroptotik yolla ölümüne de neden olabilir. Dolayısıyla inflamazom aktivasyonun baskılanması gereklidir. Dimetil Fumarat (DMF) anti-inflamatuar ve pro-metabolik etkileri olan bir moleküldür. Fumarik asidin metil esteri olarak da bilinen DMF'nin Multipl skleroz'da klinik parametrelerde iyileşme sağladığı ve atak sıklığını azalttığı gösterilmiştir.  Ayrıca mikroglial hücrelerle aynı kökenden gelen THP-1 monosit hücre hattında inflamazom aktivasyonunu baskıladığı saptanmıştır. Çalışmamızda DMF'nin N9 mikroglial hücre hattında inflamazom aktivasyonuna etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır.

Çalışmamızda, N9 mikroglial hücrelerine Lipopolisakkarit (LPS) ve ATP uygulaması ile NOD benzeri reseptör ailesi pyrin domain içeren protein 3 (NLRP3) inflamazom aktivasyonu oluşturuldu. İlk önce DMF'nin toksik olmayan, inflamazom aktivasyonunda etkili dozu belirlendi. Sonrasında inflamazom aktivasyonu göstergeleri mRNA düzeyinde real-time PCR, protein düzeyinde ELISA ve immünoblot yöntemleri ile incelendi. Ayrıca mitokondriyal Reaktif Oksijen Türleri (ROS) ve mitokondriyal membran potansiyeli akış sitometrisi, İmmünflorasan boyama (IF) ve florometrik yöntemlerle incelendi. Sonuçlarımıza göre DMF, LPS + ATP modeli ile NLRP3 inflamazom aktivasyonu gerçekleştirilen N9 mikroglial hücrelerinde, Kaspaz-1 aktivitesini ve IL-1beta ve IL-18 sitokinlerinin salınımı baskıladı. Ayrıca, inflamazom ilişkili proteinlerin ekspresyonunu ve inflamazom aktivasyonu sonucunda görülen piroptotik hücre ölümünü azalttı. Bunların yanı sıra, mitokondriyal ROS miktarını baskılayıp ve mitokondriyal membran potansiyelinin bozulmasını önledi.
Bu çalışma DMF'nin mikroglial hücrelerde inflamazom aktivasyonunu baskıladığını gösteren ilk çalışmadır.

Abstract:
Inflammasome activation is a developing process differently from classical inflammatory responses. It has been known that inflammasome activation occurs by both microbial agents and the effects of some metabolic stress products (Adenosine triphosphate (ATP) and external agents like asbestos, Inflammasome activation is a process that is initiated by Interleukin-1beta (IL-1beta), Interleukin-18 (IL-18) cytokines production from activated cells and terminated by caspase-1 activation. In this process, inflammasome activation may cause cell death via pyroptotic pathway. Therefore, inflammasome activation is needed to be inhibited. Dimethyl fumarate (DMF) is anti-inflammatory molecule that has pro-metabolic effects. DMF, known as also methyl ester of fumaric acid, has been shown that it provided improvement for multiple sclerosis in clinical parameters and decreased frequency of attacks. And also, it has been established that DMF inhibited inflammasome activation in THP-1 monocyte cells which came from same ancestor of microglial cells. In our work, observing effects of DMF to inflammasome activation in N9 microglial cells has been aimed. In this regard, NOD-like receptor family, pyrin domain containing protein 3 (NLRP3) inflammasome activation in N9 microglial cells was initiated with lipopolysaccharide (LPS) and ATP model. Firstly, the effective and non-toxic dose of DMF was determined. After that, inflammasome activation parameters were observed with real-time PCR for mRNA level, ELISA and Western-blotting for protein level. Additionally, mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS) production and mitochondrial membrane integrity were analyzed via flow cytometry, immunofluorescence (IF) and fluorometric analyses. Consequently, DMF significantly suppressed LPS + ATP induced NLRP3 inflammation, decreased Caspase-1 activity, secretion of IL-1beta and IL-18 cytokines, and reduced the rate of pyroptotic cell death resulting from inflammasome activation. Furthermore, the level of mitochondrial ROS was declined and mitochondrial membrane integrity was restored. This study is the first to demonstrate that DMF is effective to suppress the NLRP3 inflammasome activation in microglial cells.