İzole memeli ventriküler miyositlerinde sodyum-hidrojen değiş-tokuşcusunun hipoksik duyarlılığı ATP'nin rolü
Hypoxic sensitivity of the sodium-hydrogen exchanger in isolated mammalian ventricular myocytes. The role of ATP
Yazar: HİLMİ BURAK KANDİLCİ
Danışman: PROF. DR. BELMA TURAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Fizyopatoloji = Physiopathology ; Kardiyoloji = Cardiology
Dizin: Anoksi = Anoxia ; Hidrojen = Hydrogen ; Hidrojen iyon konsantrasyonu = Hydrogen-ion concentration ; Hipoksi = Hypoxia ; Hücreler = Cells ; Sodyum = Sodium

Özet:
Hücre içi pH (pHi) hücre fizyolojisinde rol oynayan temel mekanizmalardandır. Sodyum/hidrojen değiş-tokuşu (NHE) pHi dengesinden sorumlu hücre dışına asit atımı yapan ana proteinlerdendir.Bu çalışmada izole sıçan ventriküler miyositlerinde NHE aktivitesi ölçüldü. NHE-1'i aktive etmek için hücreler CO2/HCO3- içermeyen koşullarda amonyum ön işlemi ile (20mM NH4Cl, 4-5 dk) asit yüklendi. Akut anoksi (1mM Na-diatonit, 100% N2) ihmal edilebilir miktarda geri plan asit yüklemesi oluşturmuştur (0.5mM/min) ve asitten kurtulmayı yavaşlatmıştır. Reoksijenasyon ise hızlı bir şekilde anoksik inhibisyonu tersine çevirmiştir. Anoksi hücre içi doğal tamponlamayı ya da Cl--bağımlı asit yüklemesini değiştirmediği gözlenmiştir.Gerçek hipoksik koşullar ise (%100 N2, ~1 mmHg PO2), hücrenin asitten kurtulmasınında yavaşlamaya neden olmuştur. Anoksi ile indüklenen NHE-1 aktivitesindeki yavaşlama oksidatif inhibitörler (miksotiazol, rotenon; 1 M/antimisin A; 5 µg/mL) ve glikoliz ve oksidatif fosforilasyon ortak inhibitörü iyodoasetat (0,5 mM) ile taklit edilmiştir. Ancak, 2--deoxy-D-glucose bir inhibisyon oluşturmamıştır. Buna karşın anoksi mitokondri membran potansiyelini keneti bozan maddelere (FCCP, 5 M) göre daha yavaş şekilde depolarize ettiği gözlenmiştir. Hücre içi ATP (ATPi) ölçümleri anokside ATPi seviyesi ve NHE-1 aktivitesi arasında ilişki olduğunu göstermiştir. Diğer yandan, reaktif oksijen türleri NHE-1'nin bazal kontrolü ve anoksik inhibisyonunda herhangi bir rol üstlenmediği görülmüştür.
Diatonit ile indüklenen veya gerçek hipoksi NHE-1 aktivitesini hızlı ve geri dönüşlü biçimde azaltmıştır. Kan akışının bozulması kalpte birçok patofizyolojik durumda (ör.: miyokard iskemisi, koroner by-pass cerrahisi) karşılaşılan iskemi ile sonuçlanmaktadır. Bu koşullarda NHE-1'in hücreye aşırı Na+ yüklemesinden sorumlu olabileceği için, aktivitesi büyük önem kazanmaktadır. Genel olarak iskemi/reperfüzyondan sonra kalbin fonksiyonunun geriye dönüşü iskemide hücreye yüklenen Na+ miktarı ile ters orantılı olduğu kabul edilmektedir.
Bu gözlem ana komponenti azalmış parsiyel oksijen basıncı olan miyokard iskemisinin moleküler mekanizmalarını kavramada önemlidir. Sonuç olarak mitokondri aktivitesi, ATPi seviyesi ve NHE-1'in hipoksi/anoksi yanıtı arasında bağlantı bulunmaktadır.

Anahtar sözcükler: Aktivite, anoksi, hipoksi, hücre içi pH dengesi, sodyum-hidrojen değiş-tokuşcusu.

Abstract:
Intracellular pH (pHi) is a major regulator of cell physiology. Sodium/hydrogen exchange (NHE) is one of the principal acid-extruders, implicated in pHi regulation. NHE activity was measured in isolated rat ventricular myocytes. To stimulate NHE-1, cells were acid-loaded by means of an ammonium prepulse (20mM NH4Cl, 4-5 min) under nominally CO2/HCO3--free conditions. Acute anoxia (1mM Na-dithionite, 100% N2) induced background acid loading (0.5mM/min) but it was negligible and slowed the pHi recovery rate. Reoxygenation immediately reversed anoxic inhibition. Anoxia did not alter intrinsic buffering capacity or Cl--dependent intracellular acid-loading. Real hypoxia (%100 N2, ~1 mmHg PO2) also reduced pHi recovery rate. Anoxia-induced slowing of NHE-1 was mimicked by oxidative inhibitors (myxothiazol, rotenone; 1 M/antimycin A; 5 µg/mL) and also by the glycolytic and oxidative phosphorylation inhibitor iodoacetate (0.5 mM) but not with 2--deoxy-D-glucose. Anoxia slowly depolarized mitochondrial membrane potential, relative to mitochondrial uncouplers (FCCP, 5 M). Intracellular ATP (ATPi) measurements revealed that there is a correlation between ATPi levels and NHE-1 activity. In contrast reactive oxygen species does not seem to have role neither in basal regulation in normoxia nor in anoxic NHE-1 inhibition.
Both dithionite-induced anoxia and real hypoxia attenuated NHE-1 activity rapidly and reversibly. Cessation of blood flow in the heart results in ischemia that can be observed in many pathophysiological situations (e.g.: Myocardial ischemia, coronary artery by-pass surgery). Under those circumstances, NHE-1 has great importance since its activity can lead to intracellular Na+ overload. It is widely accepted that the level of Na+ is inversely related to the recovery function after the period of ischemia/reperfusion.
This observation is important while understanding the molecular mechanisms that take place during myocardial ischemia since the major consequence of ischemia is low ambient partial oxygen pressure. In conclusion, there seems to be a correlation between mitochondrial activity, ATPi levels and hypoxia/anoxia-response of NHE-1.

Key words: Activity, anoxia hypoxia, intracellular pH regulation, sodium-hydrogen exchange