Mürdüm eriğinden (Prunus insititia) polifenol oksidaz enziminin saflaştırlması ve karakteriazsyonu
Purification and characterization of polyphenol oxidase enzyme from damson plum (Prunus insititia)
Yazar: SELİNNUR YILDIZ
Danışman: PROF. DR. EMİNE KARAKUŞ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ÇİĞDEM BİLEN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Saflaştırma = Purification

Özet:
Polifenol oksidaz (PFO) enzimi, monofenollerin o-difenollere hidroksilasyonu ve odifenollerin o-kinonlara oksidasyon reaksiyonlarını katalizleyen bir oksidoredüktaz enzimi olup, meyve ve sebzelerde esmerleşme reaksiyonlarını gerçekleştirir. Enzim kaynağı olarak çalışmamızda yüksek oranda fenolik madde ve antioksidan aktiviteye sahip olan Prunus insititia mürdüm eriği kullanılmıştır. Çalışmamızın ilk aşamasında, Prunus insititia mürdüm eriğinden sırasıyla, % 0-80 amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz işlemleri ile kısmi saflaştırılan polifenol oksidaz enzim ekstraktı (KSP) elde edilmiştir. Prunus insititia KSP enzimi kullanılarak, maksimum enzim aktivitesinin gözlendiği optimum reaksiyon koşullarının belirlenmesi amacıyla karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Enzimin katekol, 4-metil katekol, progallol ve kafeik asit substratları için elde edilen optimum koşullar sırasıyla; 0,05M/ pH:7,2/ 25°C; 0,2M/ pH:4,5/ 10°C; 0,01M/ pH:6,8/ 5°C ve 0,2M/ pH:8,5/ 10°C olarak belirlenmiştir. Enzimin her bir substratı için hesaplanan Vmax ve KM kinetik sabitleri ise aynı substratlar için sırasıyla; 17219,97 U/(mL*dk) ve 11,67mM; 7309,73 U/(mL*dk) ve 5mM; 12580,12 U/(mL*dk) ve 3,75mM; 12100,41 U/(mL*dk) ve 6,25mM olarak hesaplanmış ve katekol substratı ile ölçülen PFO enzim aktivitesi diğer substratlarla kıyaslandığında, en yüksek Vmax değerini verdiği belirlenmiştir. İkinci aşamada, KSP enzim ekstraktından Sefaroz 4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit ve Sefaroz 6B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite jelleri kullanılarak, afinite kromatografisi ile saflaştırma işlemi yapılmıştır. Her iki afinite jeli ile saflaştırılan 
Prunus insititia PFO enzim çözeltileri sırasıyla, SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve doğal jel elektroforezine (NATIVE PAGE) uygulanarak yaklaşık 50-55 kDa civarında tek band gözlenmiştir. Sepharose-4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit ve Sepharose-6B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite jelleri kullanılarak saflaştırılan Prunus insititia PFO enzimi için sırasıyla, 90,01 ve 10,18 kat saflaştırma derecesi elde edilmiştir. Sefaroz 6B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite jeli ile yapılan herhangi bir saflaştırma işlemine ve PFO enziminin Prunus insititia mürdüm eriğinden afinite kromatografisi ile saflaştırılmasına literatürde rastlanmadığından, bu çalışma ile literatüre yeni bir jel ve afinite kromatografisinde yeni bir PFO enzim kaynağı kazandırılmıştır.

Abstract:
Polyphenol oxidase (PPO) enzyme performs browning reactions in fruits and vegetables that catalyzes the hydroxylation of monophenols to o-diphenols and the oxidation reactions of o-diphenols to o-quinones as an oxidoreductase enzyme. Prunus insititia damson, which has a high rate of phenolic substances and antioxidant activity, was used as an enzyme source in this study. In the first stage of our study, partially purified polyphenol oxidase enzyme extract (PPE) was obtained from Prunus insititia damson plum by the processes 0-80% ammonium sulfate precipitation and dialysis processes, respectively. Characterization studies were carried out by using Prunus insititia PPE enzyme for 
the aim of the determination the optimum reaction conditions in which maximum enzyme activity was observed. The optimum conditions were obtained by using catechol, 4-methyl catechol, pyrogallol and caffeic acid substrates as 0.05M/ pH:7.2/ 25°C; 0.2M/ pH:4.5/ 10°C; 0.01M/ pH:6.8/ 5°C and 0.2M/ pH:8.5/ 10°C, respectively. The kinetic constants of Vmax and KM calculated for the same 
substrates as 17219.97 U/(mL*min) and 11.67mM; 7309.73 U/(mL*min) and 5mM; 12580.12 U/(mL*min) and 3.75mM; 12100.41 U/(mL*min) and 6.25 mM, respectively. It was determined that PPE enzyme activity was measured by using catechol substrate gave the highest Vmax value when compared to other 
substrates. In the second step, purification was performed in terms of affinity chromatography 
by using Sepharose 4B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid and Sepharose 6B-Ltyrosine-p-amino benzoic acid affinity gels from PPE enzyme extract. Prunus insititia PPO enzyme solutions purified by both affinity gels were applied to SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and native gel electrophoresis (NATIVE PAGE), respectively, and a single band of approximately as 50-55 kDa 
was observed. 90.01 and 10.18 purification degrees were obtained for Prunus insititia PPO enzyme by using Sepharose-4B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid and Sepharose-6B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid affinity gels, respectively. Since no any purification process with Sepharose 6B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid affinity gel and any purification by affinity chromatography of PPO enzyme from 
Prunus insititia damson were found in the literature, an original gel and a new PPO enzyme source in affinity chromatography were gained to the literature in this study.