Türkiye kaynaklı Bacillus spp.'lerin alkalen proteaz üretim kapasiteleri ve enzimlerin kısmen karakterizasyonu
Alkaline protease production capacity of Bacillus spp. isolated from Turkey and partial characterization of enzymes
Yazar: NİLGÜN TEKİN
Danışman: PROF. DR. CUMHUR ÇÖKMÜŞ
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Türkiye'nin çeşitli bölgelerinden izole edilen toplam 57 adet izolat içerisinden Skim Milk Agar besiyerinde proteolitik zon oluşturabilen 32 izolat içerisinden pH 9.0 veya 10.0'luk Skim Milk Agar besiyerinde gelişme göstererek zon oluşturabilen toplam 14 adet izolat ve standart olarak Bacillus licheniformis DSM13 seçilerek alkalen proteaz üretim yetenekleri yönünden incelenmiştir. 1 ünite alkalen proteaz aktivitesi, 30°C'de dakikada 1 ml tirozin açığa çıkması için gerekli enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. Enzim üretim miktarlarına göre yapılan sıralama sonucunda alkalifilik basil olduğu belirlenen Gram (+), hareketli, spor oluşturabilen, katalaz aktivitesine sahip APT5 izolatının (1555 U/ml/g), standart B. licheniformis DSM 13'den (1197 U/ml/g) 48 saat sonunda pH 10.0'luk glisin-NaOH tamponunda daha yüksek kapasitede alkalen proteaz aktivitesi görülmüş ve bundan sonraki enzim saflaştırması çalışmalarında alkalifilik Bacillus sp. APT5 izolatı kullanılmıştır. Alkalen proteaz enzimi, besiyeri üst sıvısından aseton presipitasyonu ve iyon değişim kromotografisi uygulanarak 500,1 U/mg spesifik aktivitede, 1,6 kat ve %29,5 verimle saflaştırılmıştır. SDS- ve Native-PAGE ile enzimin elektroforetik davranışı belirlenmiştir. APT5 enziminin pH 11 ve 50°C'de optimum aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Enzimin 50°C'deki 4 saatlik stabilitesi ve pH11.0'deki 3 günlük stabilitesi %100 olarak bulunmuştur. Mn+2 divalent katyonunun enzimin aktif merkezine bağlandığı düşünülerek aktiviteyi %153 oranında arttırdığı görülmüştür. Serin proteazların bir inhibitörü olan PMSF varlığında APT5 alkalen proteazı ile subtilisin Carlsberg üreticisi Bacillus licheniformis'e ait standart enzimin benzer aktivite göstermesi enzimin serin proteazların subtilisinler alt grubuna dahil olabileceğini göstermiştir. Bu çalışma ile alkalifilik APT5 izolatından yeni bir alkalen proteaz enzimi saflaştırılarak karakterize edilmiş, optimum sıcaklık ve pH değerleri ile inhibitör ve metal iyonlarına karşı gösterdiği direnç nedeniyle enzimin yüksek bir yapısal stabiliteye sahip olduğu görülmüştür. Bu özellikleri ile APT5 alkalen proteazının deterjan endüstrisinde yüksek bir kullanım potansiyeline sahip olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Thirty two bacterial strains of 57, which produce clear proteolytic zone on Skim Milk Agar, were selected from distinct regions of Turkey. 14 out of 32 isolates could grow and showed clear zone on Skim Milk Agar with pH 9.0 and 10.0 and, thus their alkaline protease production capacities were determined by comparing with alkaline protease producer Bacillus licheniformis DSM13 standard strain. One unit of alkaline protease activity is defined as the amount of the enzyme needed for producing 1 mg of tyrosine per minute at 30°C. According to the alkaline protease production levels after cultivation for 48 hours, it was found that Gram (+), rod-shaped, motile, catalase (+), spor forming, alkalophilic bacterium APT5 produced higher amount of alkaline protease (1555 U/ml/g) than standart DSM 13 strain (1197 U/ml/g) when pH 10.0 Glycine-NaOH buffer was used, it is there for further purification experiments were carried on APT5 isolate. Alkaline protease enzyme was purified 1.6 fold from culture supernatant by acetone precipitation and ione-exchange chromotography with 500 U/mg specific activity and 29,5% yield. Electrophoretic mobility of enzyme was determined using SDS- and Native-PAGE. The pH and temperature optima for APT5 alkaline protease were measured as pH 11 and 50°C, respectively. Enzyme showed 100% stability at 50°C for 4 hours and at pH11.0 for 3 days. It was found that Mn divalent cation stimulated the enzyme activity with 153% ratio probably by binding the active site of the enzyme. PMSF which is a specific inhibitor for serine-proteases did not show inhibitory effect on the enzyme activity. On the other hand PMSF showed simillar effect on a standart subtilisine Carlsberg producer bacterium Bacillus licheniformis?s enzyme and APT5?s alkaline protease. Thus this result showed that APT5 alkaline protease could be a subtilisin protease which is a subgroup of serine proteases. In this study, a new alkaline protease was purified and characterized from the alkalophilic isolate APT5, and it was demonstrated APT5 alkaline protease has a high conformational stability not only because of its optimal pH and temperature, but also its high resistance to inhibitors and metal ions tested. In conclusion, it is thought that APT5 alkaline protease has a potential for being used in detergent industry with its extreme properties.