Shigella kökenlerinin antibiyotik direnç modelleri, plazmid profil analizi ve pulsed-fıeld jel elektroforezi ile incelenmesi
Investigation of Shigella strains by antibiotic resistance models, plasmid profile analysis and pulsed-field gel electrophoresis
Yazar: NACİYE BEGÜM SARAN
Danışman: PROF. DR. BİRSEL ERDEM
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2010
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Dizanteri-basilli = Dysentery-bacillary ; Elektroforez-agar jel = Electrophoresis-agar gel ; Shigellalar = Shigella ; İlaç alerjisi = Drug hypersensitivity ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Bu çalışmada Ankara ilinde görülen Shigella türlerinin dağılımının belirlenmesi; Shigella türlerinde antibiyotiklere direnç oranlarının belirlenmesi; antibiyotik direnç modelleri, plazmid profil analizleri ve PFGE yöntemleriyle incelenmesi; Shigella türlerinin incelenmesinde tiplendirme yöntemi olarak antibiyotik direnç modeli, plazmid profil analizi ve PFGE'nin karşılaştırılması amaçlanmıştır.Çalışmaya Ankara'da Ağustos 2001?Ekim 2001, Ağustos 2008?Ekim 2008 ve Temmuz 2009?Ekim 2009 tarihleri arasında standart yöntemlerle klinik örneklerden izole edilen 60 Shigella kökeni alınmıştır. İzolatların 49'u (%81,6) S. sonnei, 10'u (%16,6) S. flexneri, 1'i S. dysenteriae (%1,6) olarak tanımlanmıştır.Shigella kökenlerinin CLSI önerileri doğrultusunda disk diffüzyon yöntemi ile antibiyotiklere in-vitro duyarlılıkları incelenmiştir. Ampisiline 16 (%26,6), amoksisilin/klavulonik asite 10 (%16,6), kloramfenikole 9 (%15), nalidiksik asite 6 (%10), sefalotine 14 (%23,3), sefotaksime 4 (%6,6), tetrasikline 4 (%68,3), trimetoprim/sülfametoksazole 55 (%91,6) köken dirençli bulunmuştur. Shigella türlerinin antibiyotik direnci karşılaştırılmış S. flexneri'nin ampisilin, kloramfenikol, amoksisilin/klavulonik asit direnci S. sonnei'ye göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde yüksek bulunmuştur (p<0.001).Shigella kökenlerinin incelenmesinde fenotipik tiplendirme yöntemi olarak antibiyotik direnç tiplendirimi kullanılmıştır. S. sonnei izolatlarında 12 farklı antibiyotik direnç modeli izlenmiş, en sık görülen tetrasiklin ve trimetoprim/sülfametoksazol direnç modelini (T Sxt) 23 (%46,9) köken göstermiştir. S. flexneri izolatlarında 4 farklı antibiyotik direnç modeli izlenmiş, en sık izlenen ampisilin, amoksisilin/klavulonik asit, kloramfenikol, tetrasiklin ve trimetoprim/ sülfametoksazol direnç modelini (A A/K C T Sxt) 7 köken (%70) göstermiştir. Simpson'un farklılık indeksine dayalı formülü ile antibiyotik direnç tipleme yönteminin ayırım gücü S. sonnei kökenleri için 0,75; S. flexneri kökenleri için 0,54 bulunmuştur.Shigella kökenlerinden Kado ve Liu yöntemi kullanılarak plazmid DNA'sı elde edilmiş ve plazmid profilleri araştırılmıştır. Plazmid taşımayan kökene rastlanmamıştır. Shigella kökenlerinin plazmid profil analizi sonucunda 1 ile 7 arasında değişik sayılarda ve 200 ile 3 kb arasında değişen büyüklüklerde plazmid taşıdıkları görülmüştür.S. sonnei kökenlerinde 27, S. flexneri kökenlerinde 9 plazmid profili izlenmiştir. Plazmid profil analizinin ayırım gücü S. sonnei kökenlerinde 0,97; S. flexneri kökenlerinde 0,98 bulunmuştur.Shigella kökenleri WHO ve CDC protokolleri doğrultusunda XbaI enzimi kullanılarak PFGE yöntemi ile incelenmiştir. S. sonnei kökenleri 4, S. flexneri kökenleri 5 PFGE paterni göstermiştir. S. sonnei izolatlarında en sık sa paterni (%85,7); S. flexneri izolatlarında en sık fa paterni görülmüştür (%50). PFGE yönteminin ayırım gücü S. sonnei kökenleri için 0,26; S. flexneri kökenleri için 0,76 bulunmuştur.Üç yöntem beraber değerlendirildiğinde ayırım gücünün 0,98'e yükseldiği gösterilmiştir. Epidemiyolojik amaçlarla Shigella kökenlerinin incelenmesinde PFGE'nin klonal ilişkileri değerlendirmede uygun olduğu; ancak Ankara'da aynı klonun uzun zamandır dolaşımda olması nedeniyle antibiyotik direnç modeli ve/veya plazmid profil analizi ile birlikte kullanılmasının ayırım gücünün yükseltilmesi için yararlı olacağı kanısına varılmıştır.

Abstract:
In this study we aimed to determine the distribution of Shigella species isolated in Ankara city, determine antibiotic resistance among Shigella strains; investigate by antibiotic resistance models, plasmid profile analysis and PFGE methods, compare antibiotic resistance models, plasmid profile analysis and PFGE as typing methods in Shigella species.Totally 60 Shigella strains isolated by standart methods from clinical samples between August 2001- October 2001, August 2008- October 2008 and July 2009- October 2009 were included in this study. Of the isolates 49 (%81,6) were S. sonnei, 10 (%16,6) S. flexneri and 1 (%1,6) S. dysenteriae.Shigella strains were invesigated for in-vitro antibiotic susceptibilities by disc diffusion method according to the directions of CLSI. The number of isolates resistant to antibiotics and resistance rates were as follows; 6 (%26,6) for ampicillin, 10 (%16,6) for amoxicillin/clavulanic acid, 9 (%15) for chloramphenicol, 6 (%10) for nalidixic acid, 14 (%23,3) for cephalothin, 4 (%6,6) for cephotaxim, 4 (%68,3) for tetracycline and 55 (%91,6) for trimethoprim/sulfamethoxazole. Antibiotic resistance among Shigella species were compared and ampicillin, chloramphenicol, amoxicillin/clavulanic acid, resistance in S. flexneri were higher then S. sonnei which is found to be statistically significant (p<0.001).Antibiotic resistance typing is performed as a phenotypic typing method in investigation of Shigella strains. S. sonnei isolates demonstrated 12 antibiotic resistance models, the most common tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole resistance model (T Sxt) was observed in 23 (%46,9) of the isolates. S. flexneri demonstrated 4 antibiotic resistance models, the most common ampisilin, amoxicillin/clavulanic acid, chloramphenicol, tetracycline, and trimethoprim/ sulfamethoxazole resistance model (A A/K C T Sxt) was observed in 7 (%70) of the isolates. Discriminatory power of the antibiotic resistance typing method was calculated according to the Simpson?s discriminatory index formula and found as 0,75 for S. sonnei and 0,54 for S. flexneri.Plasmid DNA of Shigella strains were extracted by the method of Kado and Liu and plasmid profiles were analysed. All strains were found to have plasmids. Plasmid profile analysis revealed that Shigella strains have different number of plasmids between 1-7 and different sizes of plasmids ranging from 200-3 kb.Totally 27 plasmid profiles in S. sonnei and 9 profiles in S. flexneri was observed. The discriminatory power of plasmid profile analysis is calculated as 0,97 for S. sonnei and 0,98 for S. flexneri.Shigella strains were examined by PFGE method using XbaI enzyme performed by following directions of WHO and CDC protocols. Four PFGE patterns were obtained in S. sonnei, 5 in S. flexneri. Sa patern in S. sonnei (%85,7) and fa pattern in S. flexneri (%50) were the most frequently found patterns. Discriminatory power of PFGE method is calculated as 0,26 for S. sonnei and 0,76 for S. flexneri.When the three method were evaluated together, the discriminatory power increases to 0,98. In investigation of Shigella strains for epidemiological purposes, PFGE is found to be convenient for evaluating clonal relations but because of the same clone is in circulation for a long time of period in Ankara, performing antibiotic typing method and/or plasmid profile analysis in addition to PFGE will be usefull in increasing discriminatory power of the method.