Farklı şaperon plazmitleri kullanılarak Escherichia coli' de rekombinant omp25 proteinin ekspresyonunun optimizasyonu
Optimization of rekombinant omp25 protein expression in Escherichia coli by using different chaperone plazmids
Yazar: KÜBRA TRABZONLU
Danışman: DOÇ. DR. TÜLİN ARASOĞLU
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
E.coli, kısa sürede hızlı bir şekilde kültüre alınabilmesi ve yüksek verimli protein üretimi gibi sahip olduğu avantajlar nedeniyle rekombinant protein üretimi için en yaygın kullanılan konakçı organizmadır. E.coli sitoplazma, birçok avantajı nedeniyle yüksek düzeyde protein üretimi için en çok tercih edilen hücresel bölmedir. Ancak bu kompartmanda protein üretimi sıklıkla inklüzyon cisimcikleri oluşumu ile sonuçlanır. E.coli' de inklüzyon cisimcikleri olarak üretilen rekombinant proteinler; inaktif, agregat oluşturan, çözünmeyen, genellikle doğal olmayan moleküler disülfit bağlara ve olağandışı serbest sisteinlere sahip yapılardır. Aktif proteinin inklüzyon cisimlerinden in vitro olarak geri kazanımı büyük ölçekli üretim için çok pahalı olabildiğinden bu proteinlerin doğal üç boyutlu yapı oluşumunu sağlamaya yönelik stratejiler günümüzde önemi korumaktadır. 
Sunulan çalışmada sitoplazmada inklüzyon cisimciği oluşturduğu bilinen ve bruselloza hastalığına karşı majör antijenlerden olan rekombinant Omp25 proteininin; farklı moleküler şaperonlar kullanılarak sıcaklık ve indükleyici konsantrasyonu açısından ekpresyonun indüklenmesi stratejileri ile protein çözünürlüğü ve doğru katlanmanın arttırılması hedeflenmektedir.  Çalışmada DnaK/DnaJ/GrpE/GroES/GroEL ve trigger faktör sitoplazmik şaperonlarını farklı kombinasyonlarda içeren pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16 şaperon plazmitleri kullanılmış, iki ayrı sıcaklık ve iki ayrı IPTG konsantrasyonu çözünürlüğün artırılması için optimizasyon parametreleri olarak değerlendirilmiştir. Sonuçlar, 25 °C'de indüklenen ekspresyonun 30°C'de ekspresyona kıyasla supernatanttaki toplam protein miktarını artırdığı ancak Omp25 proteininin çözünürlüğüne etkisinin olmadığını göstermiştir. Aynı şekilde indükleyici konsantrasyonu yarıya düşürülerek yapılan çalışmada, rekombinant Omp25 proteininin çözünürlüğüne anlamlı bir etkisi gözlemlenmemiştir. Yapılan çalışmalar SDS-PAGE ve Western Blot analizleriyle doğrulanmıştır.

Abstract:
E.coli is the most commonly used host organism for recombinant protein production because of the advantages such as rapid culture and high yield protein production in a short time. E.coli cytoplasm is the most preferred cellular compartment for high level protein production due to many advantages. However, protein production frequently results in the formation of inclusion bodies. Recombinant proteins, produced as the inclusion bodies in E. coli, are inactive, aggregate-forming, insoluble structures which have generally unnatural intra and molecular disulfide bonds and extraordinary free cysteines. In-vitro recovery of the active protein from inclusion bodies can be very expensive for large scale productions. Therefore, in order to provide the formation of natural 3-dimensional structure of proteins, increasing the protein solubility and correct folding is aimed by using different strategies.
The main purpose of this study was to increase soluble expression by changing parameters such as the temperature and inducer concentrations of recombinant Omp25 outer membrane protein, one of the major antigens against brucellosis disease, which are also known to form inclusion bodies in the cytoplasm, with the help of chaperone plasmids (pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16) containing different cytoplasmic chaperones (DnaK/DnaJ/GrpE/GroES/GroEL and Trigger factor). Two separate temperatures (25 °C and 30°C) and two separate IPTG concentrations (1 mM and 0.5mM) were evaluated as optimization parameters to increase solubility. The results of this study claimed that the expression induced at 25 °C increased the total amount of protein of the supernatant compared to the expression at 30 °C while had no effect on the solubility of Omp25 protein. In the same context, any significant effect on the solubility of recombinant Omp25 protein was not observed although the inducer concentration was reduced by half. The studies were verified by SDS-PAGE and Western Blot analyzes.