4-T-bütilbenzoik asidin zebra balığı sinir sistemi gelişimi üzerine etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of 4-T-butyl benzoic acid on zebrafish nervous system development
Yazar: TARIK DİNÇ
Danışman: PROF. DR. NAZAN DENİZ YÖN ERTUĞ
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Embriyo gelişimi = Embryonic development ; Sinir dokusu = Nerve tissue

Özet:
Çevre kirliliği günümüzde artan bir sorundur. Endüstri, tarım, kentleşme, ulaşım ve turizm dahil olmak üzere insan faaliyetleri nedeniyle birçok farklı kirletici sınıfı çevreye girer. Kirleticilerin toprak, hava ve su ekosisteminde toksik özellikler göstererek, yaşayan canlılara zararlı etkilerde bulunmaktadır. Bu etkileri gösteren zararlı maddeler arasında önemli olanlar arasında hormon sistemini bozan endokrin bozucular yer almaktadır. Bu endokrin bozucular arasından, plastik katkı maddelerinden, 4-tert bütil benzoik asit (PTBBA) bulunmaktadır. Polimerizasyon durdurucu madde ve PVC ısı stabilizörü olarak sanayide kullanılmaktır. Daha önceki yıllarda yapılan çalışmalarda, PTBBA'nın erkek üreme sisteminde zararlı etkilere sahip olduğu gösterilmiştir. Ancak sucul ekosistemindeki zararları konusunda çalışma çok sınırlıdır. Sucul ekosistemler için zebra balığı, hızlı gelişimi, embriyoların şeffaf olması, bakımı ucuz ve çok sayıda embriyo üretimi, embriyonik gelişim ve sinir sistemi gelişimi ve insanlara genetik olarak benzerliği nedeniyle çok kullanılan bir model organizmadır. PTBBA'nın zebra balığı sinir sistemi gelişimi üzerine etkileri bilinmemektedir. Ayrıca teratolojik etkilerinin olabileceğine dair yeterli çalışma bulunmamaktadır.
PTBBA'in zebra balıkları sinir sistemi üzerine etkilerini araştırmak için balıklar İstanbul Üniversitesi Sucul Omurgalı Canlı Deney Ünitesi'nden temin edildi. 120 saatlik LC50 düzeyini belirlemek için logaritmik dozlarda 100-0,01 mg/l 3 tekrarlı denemeler yapıldı. 24 saatlik LC50 3,900 ± 2,692 mg/l,	120 saatlik LC50 1,775 ± 0,321 mg/l olarak bulundu. Teratolojik etkilerinin araştırılması için 120 saatlik LC50 dozunun %50'si, %20'si ve %10'u olacak şekilde 3 tekrarlı olarak 120 saat boyunca döllenmiş yumurtaların ölüm, koryondan çıkma ve anomali oranları kaydedildi. Histolojik analizler için 15 gün boyunca örnekler alındı, rutin doku takibi işlemlerinden sonra, hematoksilen & eosin ve toludin boyamaları yapıldı ve fotoğraflandı.
PTBBA'in zebra balıkları gelişimi üzerinde olumsuz etkileri arasında gelişim geriliği, pigmentasyonda azalma, omurga bozukları, kranofasiyel anomaliler ve organ eksikleri gibi teratolojik etkileri görülmüştür. Histoloji analizlerde,  artan dozlarda vakuolleşme, atrofi, piknotik hücreler ve bölgesel atrofiler görülmüştür.
PTBBA'nın canlılarda erkek üreme sistemine olan olumsuz etkileri literatürde bilinmektedir.  Ancak bu çalışmada literatürden farklı olarak zebra balıklarında PTBBA'nın teratolojik özellikleri ortaya çıkmış, gelişim aşamasında PTBBA'in nörotoksik etkileri gözlenmiştir.
Plastiklerde kullanılan PTBBA'nın, sularda ve diğer ortamlarda bulunmasından dolayı canlılarda hormonları etkileyerek üreme sistemini bozucu, karaciğer, böbrekler ve sinir sistemine zararlı etkileri mevcuttur. Bunun yanında farklı kimyasal maddeler vücut içerisinde metabolize olarak, yan yada sonuç ürün olarak PTBBA'nın ortaya çıkmasıyla PTBBA maruziyetini artırmaktadırlar. Bu maddelerin ve PTBBA'nın hukuki olarak daha fazla kısıtlanması ve yasaklanması yoluyla düzenlenmesi çevre insan sağlığı açısında faydalı olacaktır.

Abstract:
Environmental pollution is an increasing problem nowadays. Many pollutants enter the environment due to human activities, including industry, agriculture, urbanization, transportation, and tourism. Contaminants show toxic properties in the soil, air, and water ecosystems and harm living creatures. Among the harmful substances that show these effects, endocrine disruptor compounds (EDC) that are averse to a hormone system are among the important ones. Recent studies have determined that EDCs can also function as metabolic disruptors with fetal and pre-adolescent exposure. There are numerous studies on the association of persistent organic pollutants, BPA, and phthalates with adiposity and obesity. Reports also indicate that dioxins and phthalates may be associated with hypertension.
Among the endocrine disruptors, 4-tert butyl benzoic acid (PTBBA) is one of the plastic additives. It is used in industry as a polymerization inhibitor and PVC heat stabilizer. In previous studies, PTBBA has been shown to harm the male reproductive system. Additionally, it has been found to harm the reproductive organs of rats, causing a decrease in sperm count, mobility, and morphological abnormalities. However, the survey of the damage to the aquatic ecosystem is minimal. Zebrafish are a widely used model organism for marine ecosystems. It is used because of its rapid development, the transparency of the embryos, the low maintenance and a transparent and large number of embryos, and its genetic similarity to humans. Zebrafish is a model organism studied extensively in the embryonic and nervous system development literature. The physiology and neuroanatomy of the zebrafish are parallel to that of humans. The zebrafish nervous system becomes functional within days, and all the main components of the brain are present at five dpf. Like other vertebrates, the central nervous system of the zebrafish is formed from the neural plate, an ectoderm epithelial layer on the embryo's dorsal surface. By the end of gastrulation, the neural plate forms a tube. Brain ventricles form 48 hours after fertilization, and the embryo begins to respond to touch stimuli. In some areas of the zebrafish's central nervous system, such as the hypothalamus, optic pathways, olfactory system, spinal cord, and cranial nerves, an apparent structural homology can be found in the corresponding areas of the human brain. The effects of PTBBA on zebrafish nervous system development are unknown. In addition, there are not enough studies showing that it may have teratological effects.
To investigate the effects of PTBBA on the nervous system of zebrafish, fish were obtained from Istanbul University Aquatic Vertebrate Live Experiment Unit. The lethal concentration of PTBBA in zebrafish is not known. To determine the LC50 was performed at logarithmic doses of 100-0.01 mg/l for three repeated trials. The 24-hour LC50 was 3.900±2.692 mg/l, and the 120-hour LC50 was 1.775±0.321 mg/l. To investigate its teratological effects, mortality, hatching, and anomaly rates were recorded for 120 hours with three repetitions of 50%, 20%, and 10% of the 120-hour LC50 dose (0.89, 0,356, and 0,178 mg/l, respectively). Samples were taken for histological analysis for 15 days. Embryo and larvae samples were fixated with Bouine's solution after that, routinely treated with 70-100% alcohol series than xylene. Samples stained with hematoxylin-eosin and toluidine blue and photographed with Leica DM1000 and MC170 HD CCD camera.
Among the adverse effects of PTBBA on zebrafish development, teratological effects such as growth retardation, decreased pigmentation, spinal disorders, craniofacial anomalies, pericardial edema, and organ deficiencies were observed. The control and solvent control groups had no anomalies whatsoever. Lower and middle dose groups had increased anomalies, respectively. In the 0.890 mg/l dose group, anomaly numbers were decreased, but the seriousness of anomalies increased. The primary anomaly was unhatched embryos due to a slower development rate. Histology analysis showed increasing vacuolization, swollen cell bodies, pycnotic cells, and regional atrophies. In high doses, neuronal atrophies were detected in the medulla oblongata area.
The harmful effects of PTBBA on the male reproductive system in living things were known in the literature. However, this study revealed the teratological properties of PTBBA in zebrafish. In addition, the neurotoxic effects of PTBBA were observed at the 15 dpf stage.
PTBBA in plastics harms living things due to its presence in water and other environments. In addition, different chemicals are metabolized in the body, increasing PTBBA exposure. Regulation of these substances and PTBBA will benefit the environment and human health. PTBBA in plastics harms living things due to its presence in water and other environments. In addition, different chemicals are metabolized in the body, increasing PTBBA exposure. Regulation of these substances and PTBBA will benefit the environment and human health.