Antimikrobiyallerin subinhibitör konsantrasyonlarının Pseudomonas aeruginosa virülansı üzerine etkilerinin moleküler düzeyde incelenmesi
Molecular analysis of the effect of antimicrobial subinhibitory concentrations on Pseudomonas aeruginosa virulence
Yazar: BERNA ERDAL YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. AYŞE MELTEM YALINAY ÇIRAK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Biyofilmler = Biofilms ; Pseudomonas aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ; Siprofloksasin = Ciprofloxacin ; Virülans = Virulence

Özet:
Pseudomonas aeruginosa hastane enfeksiyonlarına yol açan fırsatçı patojenlerin başında yer almaktadır. P. aeruginosa'ya ait bazı virülans faktörlerinin salınımı Quorum Sensing (QS) olarak adlandırılan hücre yoğunluğuna bağımlı bir mekanizma ile kontrol edilmektedir. Bakterinin önemli virülans faktörlerinden biri olan biyofilm oluşturması ve antimikrobiyalerin biyofilme penetrasyonundaki zorluklar P. aeruginosa enfeksiyonlarının tedavisini güçleştirmektedir.Bu çalışma ile Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda çeşitli klinik örneklerden izole edilen P. aeruginosa suşlarının biyofilm yapma yeteneklerinin antimikrobiyallerin subinhibitör konsantrasyonları varlığındaki değişimin ortaya konması, biyofilm oluşumu ile ilişkili QS genlerinin varlığının araştırılması ve biyofilm yapım şiddeti ile QS genleri arasında ilişki olup olmadığının gösterilmesi amaçlanmıştır.Çalışmaya dahil edilen 24 P. aeruginosa suşunun 2 tanesi balgam örneklerinden (%8.3), 2 tanesi trakeal aspirat örneklerinden (%8.3), 5 tanesi idrar örneklerinden (%20.9), 6 tanesi yara örneklerinden (%25) ve kalan 9 tanesi de (%37.5) çeşitli klinik örneklerden (kan, biyopsi, gaita v.b.) izole edildi. Kontrol olarak P. aeruginosa ATCC 27853 suşu kullanıldı.P. aeruginosa ATCC 27853'ün biyofilm absorbans değerlerine göre, suşlardan 5 tanesinin (%20.8) %50 ve altında (zayıf), 6 tanesinin (%25) %50-%100 arasında (orta kuvvetli), 13 tanesinin (%54.2) %100'ün üzerinde (kuvvetli) biyofilm yaptıkları saptandı.Çalışmaya alınan 24 suşun MİK değerleri, mikrodilüsyon yöntemiyle, siprofloksasin için 0.125-32 ?g/ml, piperasilin/tazobaktam için ise 2-256 ?g/ml aralığında saptandı. Her iki antibiyotiğin de, sub-MİK konsantrasyonlarında, (MİK/2, MİK/4, MİK/8) antibiyotiksiz durum ile karşılaştırıldığında, biyofilm yapımını doz bağımlı olarak azalttığı saptandı. Sub-MİK dozlarda antibiyotik uygulamaları sonrasında her iki antibiyotik için en fazla biyofilm oluşumunun azaldığı konsantrasyon MİK/2 olarak tespit edildi. Bu sonuç taramalı elektron mikroskobu kullanılarak da doğrulandı.Quorum sensing'de rol alan lasI, lasR, rhlI ve rhlR genlerinin varlıklarını göstermek amacıyla kullanılan polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile P. aeruginosa ATCC 27853'e göre kuvvetli ve orta kuvvetli biyofilm yaptığı saptanan suşların hepsinde (%100) lasI/lasR genlerine rastlanırken zayıf biyofilm yapan 5 suşun 4'ünde (%80) lasI/lasR genleri saptandı. Çalışmaya dahil edilen tüm suşlarda (%100) rhlI gen varlığı tespit edildi. Kuvvetli biyofilm yapan suşların 6 tanesinde (%46.2) rhlR geni saptanırken orta kuvvetli biyofilm yapan suşların 4 tanesinde (%66.7), zayıf biyofilm yapan suşların 3 tanesinde (%60) rhlR geni tespit edildi. RhlR geninin bazı suşlarda gösterilememesi; bu gende meydana gelen mutasyonlara bağlanmıştır. Bu suşlardaki mutasyon varlığının ileri moleküler incelemelerle aydınlatılmasının yararlı olacağı düşünülmektedir.Sonuç olarak; antimikrobiyallerin subinhibitör konsantrasyonlarının yeni tedavi stratejileri açısından dikkate alınması ile P. aeruginosa enfeksiyonlarının iyileşme sürecinde olumlu sonuçlar alınacağı düşünülmektedir. Ayrıca P. aeruginosa'da QS sisteminin biyofilm oluşumu ile önemli ilişkisi olduğu ancak biyofilm yapımının tek başına QS gen varlığına bağlı olmadığı, çevresel ve suşa ait özelliklerin de biyofilm oluşum mekanizmalarını etkilediği düşünülmektedir.

Abstract:
Pseudomonas aeruginosa is the leading opportunistic pathogen which causes nosocomial infections. Release of some virulence factors of P. aeruginosa is controlled via a mechanism called Quorum Sensing (QS) which is dependent on cell density. Biofilm formation, which is an important virulence factor of bacteria, cause difficulties in treatment of P. aeruginosa infections.The aim of this study is to determine the the change in the ability of P. aeruginosa strains isolated from various clinic samples at Gazi University Medical Faculty Hospital, Microbiology and Clinic Microbiology Laboratory, to produce biofilm in the presence of antimicrobial subinhibitory concentrations. In addition, we aim to investigate the presence of QS genes related with biofilm formation and to determine whether there is a relationship between biofilm formation intensity and QS genes.24 P. aeruginosa strains used in the study were isolated from: 2 sputum samples (8.3%), 2 tracheal aspirate samples (8.3%), 5 urine samples (20.9%), 6 wound samples (25%) and 9 (37.5%) various clinic samples (blood, biopsy, feces etc.). P. aeruginosa ATCC 27853 strain was used as control.According to biofilm absorbance values of P. aeruginosa ATCC 27853, 5 strains (20.8%) formed a biofilm at a rate of %50 and below (weak), 6 strains (25%) at a rate of 50%-100% (intermediate), 13 strains (54.2%) at a rate over 100% (strong).MIC values of 24 strains studied was determined via microdulition method to be in the range of 0.125-32 ?g/ml for ciprofloxacin and 2-256 ?g/ml for piperacillin/tazobactam. For both antibiotics, at sub-MIC concentrations (MIC/2, MIC/4, MIC/8) biofilm formation was reduced in a dose-dependent manner when compared to the case without antibiotics. At sub-MIC doses, after treating with antibiotics, the concentration which provided the highest reduction in the biofilm formation for both antibiotics was determined to be MIC/2. This was validated using scanning electron microscope.Polimerase chain reaction was used to show the presence of genes lasI, lasR, rhlI ve rhlR which play a role in Quorum sensing. All of the strains (100%) which form strong and intermediate biofilm compared to P. aeruginosa ATCC 27853, were found to have lasI/lasR gene, 4 in 5 strains (80%) which form weak biofilm had lasI/lasR genes. rhlI gene was determined in all (100%) strains studied. rhlR gene was determined in 6 strains (46.2%) which produce strong biofilm, in 4 strains which produce intermediate biofilm (66.7%) and in 3 strains (60%) which produce weak biofilm. Absence of RhlR gene in some of the strains is attributed to mutations in this gene. Further investigation should be performed for the identification of these mutations.As a result, considering subinhibitory concentrations of antimicrobials as new treatment strategies is thought to provide positive outcomes during the recovery period of P. aeruginosa infections. In addition, QS system in P. aeruginosa has important relationship with biofilm formation however biofilm formation is not only dependent on the presence of QS genes, and environmental and strain characteristics also effect biofilm formation mechanisms.