Genetik olarak değiştirilmiş soyada omik analizler
Omic analyses on genetically modified soybean
Yazar: SİNAN MERİÇ
Danışman: PROF. DR. ŞULE ARI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: GDO = GDO ; Mutasyon ıslahı = Mutation breeding ; Proteomikler = Proteomics ; Soya = Soybean ; Transgenik bitkiler = Transgenic plants

Özet:
Mutasyon ıslahı ve genetik mühendisliğinden yararlanan moleküler ıslah, klasik bitki ıslahına destek olarak istenilen karakterleri taşıyan bitkilerin daha kısa süre içerisinde geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Özellikle genetik mühendisliği ile geliştirilen genetiği değiştirilmiş (GD) transgenik bitkiler biyogüvenlik, etik, çevresel değerlendirme ve risk yönetimi ile ilgili tartışmaları da beraberinde getirmiş, GD bitkiler için beklenen ve olası beklenmeyen değişikliklerin belirlenmesi biçimindeki risk değerlendirmeleri önem kazanmıştır. GD ürünlerinin güvenlik testleri için genel kabul görmüş 'temel eşdeğerlik' kavramı kullanılmakta olup son yıllarda bu kapsamda profil tabanlı genomik ve proteomik yaklaşımlar, güvenlik değerlendirmesindeki gücü ve doğruluğu nedeniyle sıklıkla tercih edilmektedir. 
Bu tez çalışmasında temel eşdeğerlilik kapsamında, transgenik, transgenik olmayan, mutant, mutantın kökenlendiği Ataem-07 soya bitkileri ve bu çeşitten elde edilmiş transgenik saçak köklerde transgenesiz ve mutagenesizin neden olduğu beklenmeyen etkilerin karşılaştırmalı olarak incelenmesi amacıyla genomik, gen anlatımı ve proteomik çalışmaları yürütülmüştür. Bu karşılaştırmalar sonucunda deney grupları arasında genom, gen anlatımı ve proteom düzeyindeki farklılıklar belirlenmiştir. Transgenik, mutant, mutantın kökenlendiği Ataem-07 soya bitkilerinin kökleri ve transgenik saçak kökler kullanılarak gerçekleştirilen genomik kapsamlı IRAP analizlerinde, hem Bagy2 hem de Nikita retrotranspozonunun deney grupları arasında polimorfizm gösterdiği saptanmıştır. Ataem-07 ile karşılaştırıldığında Bagy2 için polimorfizm oranı, deney grupları arasında en yüksekten en düşüğe olacak şekilde saçak kök, %0-69; transgenik, %20-42; mutant, %0-25 olarak belirlenmiştir. Nikita için ise bu değerler sırasıyla %0-71, %18-42, %0-36 olarak tespit edilmiştir. Bagy2 ve Nikita retrotranspozları için en yüksek polimorfizm  oranları sırasıyla  transgenik saçak örneklerinde %56-69 (kök-5) ve %62-71 (kök-5)  olarak saptanmıştır. Ataem-07 ile yapılan bu  karşılaştırmalar, transgenesizin Bagy2 ve Nikita ile ilişkili genom değişimleri bakımından mutasyona ıslahına göre daha fazla etki yarattığını düşündürmüştür.
Transgenik, transgenik olmayan, mutant ve Ataem-07 soya çeşidi bitkilerinin hem gelişim ile ilişkili genlerinin anlatım profilleri belirlenmiş hem de proteomik analizleri gerçekleştirilmiştir. Gen anlatım analizleri için, deney grupları arasında fide boyu ve çiçeklenme zamanı bakımından belirgin farklılıklar gözlendiğinden (beşinci üçlü yaprak evresinde Transgenik, 43 cm ve çiçeklenme yok; Transgenik olmayan, 61 cm ve çiçeklenme var; mutant, 18 cm ve çiçeklenme yok, Ataem-07, 22 cm ve çiçeklenme yok) gelişim ile ilişkili dt1, e1, elf3, luxb, luxc ve sız1a genleri seçilmiştir. Ataem-07 bitkilerinde, mutantlara göre sız ve elf3 genlerinin, transgenik olmayan bitkilerde ise transgeniklere göre dt1, e1, luxb ve luxc genlerinin anlatımlarının istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı belirlenmiştir. Bu durum, transgenesizin, gelişim ile ilişkili incelenen 6 gen bakımından gen anlatım profillerindeki farklılığa daha fazla  neden olabileceğini düşündürmüştür. 
Deney gruplarında protein profillerindeki farklılıkları değerlendirmek için yapılan 2-D elektroforez analizi sonuçları, protein spot sayılarının 533 ile 674 arasında değiştiğini ortaya koymuştur. Mutant bitkilerdeki toplam protein spotlarının %25,7'sinin kökenlendiği bitkilerde bulunmadığı, transgenik bitkilerdeki toplam protein spotlarının ise %11'inin transgenik olmayan bitkilerde yer almadığı saptanmıştır. Mutant ve transgenik bitki gruplarının sırasıyla Ataem-07 ve transgenik olmayan bitkilere göre anlatım düzeyi farklılık gösteren protein spotlarında yapılan dağılım grafiği analizleri sonucunda, anlatım düzeyi 2, 3, 4 ve 5 kat artan ve azalan proteinlerin dağılımının mutant bitkilerde transgenik bitkilere göre daha geniş bir yayılım gösterdiği belirlenmiştir. Mutant bitkilerde anlatımı artan proteinlerin gelişim, stres tepkisi, fotorespirasyon ve ribozomal alt birim, mRNA işlenmesi, karbonhidrat metabolizması, homeostaz, kromozomal kararlılık ve transkripsiyon regülasyonu gibi biyolojik süreçlerle ilişkili oldukları saptanırken, transgenik bitkilerde anlatımı artan proteinlerin ribozomal alt birim, elektron taşınması, amino asit-nükleik asit ve karbonhidrat metabolizması, sinyal yolakları ve hücre duvarı biyogenezi ile ilgili sınıflarda yer aldığı belirlenmiştir. Proteomik analiz sonuçları, hem anlatımı yapılmayan hem de anlatımları değişen protein sayısının, mutantlarda transgeniklere göre daha fazla olduğunu göstermiştir. Bu durum, gama radyasyonunun genomda rastgele biçimde neden olduğu değişimlerin, transgen insersiyonu etkisine göre proteoma yansımasının daha fazla olduğunu düşündürmüştür. Anlatım artışı gösteren proteinlerin her iki grupta da temel biyolojik yollarla ilişkili oldukları belirlendiğinden, mutasyonun proteomda yaratmış olduğu etkilerin transgenesize göre, incelenen protein çeşitleri bakımından önemli farklara neden olmadığı sonucuna varılmıştır.
Sonuç olarak, bu çalışmada Bagy2 ve Nikita bakımından retrotranspozon hareketliliği, dt1, e1, elf3, luxb, luxc, sız1a gelişim genleri ve 674 adet proteinin anlatım analizleri kapsamında elde edilen bulgular ile, transgenesizin genomdan proteoma giden yoldaki değişimleri mutagenesize göre, mutagenesizin ise gen anlatımının son kademesi olan proteomdaki değişimleri transgenesize göre daha fazla etkilediği gösterilmiştir. Farklı ıslah yöntemlerinin bitkilerde beklenmeyen değişiklilikleri meydana getirme potansiyeli ve buna bağlı olarak risk oluşturmaları üzerindeki tartışmalar GD organizmalara odaklanma eğilimindedir. Ancak, yapılageldiği gibi yeni özellikler kazandırılan bitkilerin herbirinin ayrı ayrı karakterize edilmesinin yanında, risk değerlendirmesi kapsamında bitki ıslahı için kullanılan mutasyondan, yeni nesil ıslah yöntemlerine kadar farklı yaklaşımların tümünün bu etkiler bakımından değerlendirilmesinin yararlı olacağı düşünülmektedir. Bitki ıslah yöntemleri ile meydana gelebilecek varyasyonların omik teknolojilerle karakterizasyonu bitki ve gıdaların bileşimi hakkında daha derin bilgi sağlayacak, üreticileri, tüketicileri, biyogüvenlik ve risk değerlendirmesine yönelik olarak yasa düzenleyicilerini ve diğer paydaşları bilgilendirmeye yardımcı olacaktır.

Abstract:
Mutation breeding and molecular breeding which utilizes genetic engineering, has enabled the development of plants with desired characteristics in a shorter time as an supportive to conventional plant breeding. Genetically modified plants that have been developed by genetic engineering approaches brought along debates on biosafety, ethics, environmental assessment and risk management. Therefore, evaluation of intended and potentially unintended changes contribute to the GM risk assessments. The commonly-held concept of 'substantial equivalence' has been used for many years for the safety assessments of GM products. In this context, profile-based genomic and proteomic approaches are often preferred due to their power and accuracy in safety assessment.
In this thesis, within the scope of substantial equivalence, it was aimed to conduct comparative genomic, proteomic and gene expression studies in transgenic (GM), non-transgenic, mutant, Ataem-07 soybean plants and Agrobacterium-mediated transgenic hairy roots of Ataem-07. Alterations in genome, gene expression and proteome level were detected by comparative analyzes of transgenic and mutant plants with their counterparts. Genomic comparison through Bagy2 and Nikita retrotransposon mediated IRAP analysis revealed polymorphism between roots of transgenic, mutant, Ataem-07 soybean plants and transgenic hairy roots. According to Bagy2, polymorphism rates were determined as 0-69% for hairy root, 20-42% for transgenic; 0-25% for mutant compared to Ataem-07 among experimental groups from the highest to the lowest. Likewise, these values were determined as 0-71%, 18-42% and 0-36%, respectively for Nikita. The highest polymorphism rates for Bagy2 and Nikita retrotransposes were detected as 56-69% and 62-71% in transgenic hairy samples, respectively. These results suggested that transgenesis exerts a greater effect on Bagy2 and Nikita-related genome changes than mutation breeding in comparison to Ataem-07.
In transgenic, mutant, non-transgenic and Ataem-07 soybean cultivars, expression profiles of development related genes were determined and proteomic analyzes were performed. Development-related dt1, e1, elf3, luxb, luxc and siz1a genes were selected for gene expression analyses due to distinct differences in height and flowering time of experimental groups (in fifth trifoliolate stage, transgenic, 43 cm and no flowering; non-transgenic, 61 cm and with flowering; mutant, 18 cm and no flowering, Ataem-07, 22 cm and no flowering). It was determined that the expression of sız1a and elf3 genes in Ataem-07 plants compared to mutants and dt1, e1, luxb and luxc genes in non-transgenic plants compared to transgenic plants were significantly decreased. For these 6 development related genes, transgenesis caused more differences in gene expression profiles.
The results of 2-D electrophoresis analysis in the experimental groups revealed that the protein spots varied between 533 and 674. It was determined that 25,7% of the total protein spots in mutant plants were not found in Ataem-07, and 11% of the total protein spots in transgenic plants were not found in non-transgenic plants. In addition, this study showed that many protein spots detected in mutant and transgenic plant groups have differences in expression levels compared to conventional counterpart soybean plants. Scatter plot analyzes revealed that the distribution of 2, 3, 4 and 5 times up- and down-regulated proteins showed a wider distribution in mutant plants than in transgenic plants. It has been determined that up-regulated proteins in mutant plants have various biological roles in processes such as development, stress response, photorespiration and ribosomal subunit assembly, mRNA processing, carbohydrate metabolism, homeostasis, chromosomal stability and transcription regulation. On the other hand, it has been determined that the up-regulated proteins in transgenic plants have biological roles related to ribosomal subunit assembly, electron transport, amino acid and nucleic acid metabolism, carbohydrate metabolism, signaling pathways and cell wall biogenesis. The proteomic analysis results showed that the number of both unexpressed and altered proteins were higher in mutants than transgenics. This suggested that the random changes in the genome induced by gamma radiation were more expressed in the proteome than the effect of transgene insertion. Since it was determined that the proteins presenting increased expression were related to basic biological processes in both groups, it was concluded that the effects of the mutation on the proteome did not cause significant differences in terms of the examined protein compared to transgenesis.
In conclusion, the findings of this study within the scope of retrotransposon mobility in terms of Bagy2 and Nikita, expression analyzes of dt1, e1, elf3, luxb, luxc, sız1a development genes and 674 proteins showed that transgenesis affected changes more than mutagenesis in the genome and transcript level, and mutagenesis affected the changes more than transgenesis in the proteome which is the last stage of gene expression. Discussions on the potential of unintended changes induced by different breeding methods in plants and their associated risks are biased focusing on GM organisms. However, we suggest that it would be beneficial to characterize each of the plants with new features individually, and all of the different approaches from mutations to new generation breeding methods used for plant breeding in terms of these effects should be evaluated within the scope of risk assessment. Characterization of the variations that may occur due to plant breeding methods by omic technologies will provide deeper insight into the composition of plants and foods, which will aid to inform producers, consumers, regulators and other stakeholders for biosafety and risk assessment.