Lipaz enziminin zwitteriyonik fonksiyonlanmış UV ışınlarıyla sertleşebilen polimerik materyale immobilizasyonu
Immobilization of lipase enzyme to zwitterionic functionalized UV-cured polymeric material
Yazar: NUR HÜMAY ÖZDEMİR
Danışman: DOÇ. DR. ÖZKAN DANIŞ
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Lipaz = Lipase ; Polimer malzemeler = Polymer materials ; Sertleşebilirlik = Hardenability ; Ultraviyole ışınlar = Ultraviolet rays ; Zvitteryon = Zwitterion

Özet:
Lipazlar (EC.3.1.1.3, triaçilgliserol açilhidrolaz) hayvansal ve bitkisel yağların ılımlı koşullar altında tersinir hidrolizini katalizleyen enzimlerdir. Geniş bir substrat seçiciliğine sahip olan lipazlar diğer enzimlere göre daha ucuz ve kolay elde edilebilir olmaları nedeniyle endüstride sıklıkla biyokatalizör olarak kullanılmaktadırlar. Lipazlar hayvansal, bitkisel ve mikrobiyal pek çok farklı kaynaktan elde edilebilirler, bununla birlikte kolay üretilmeleri ve pek çok hidrolitik ve sentetik reaksiyonu katalizlemeleri nedeniyle Candida rugosa gibi mikrobiyal kaynaklı lipazlar büyük ölçekli çalışmalarda daha çok tercih edilirler.
Bu çalışmada enzim immobilizasyonu için kullanılacak polimerik destek materyali sitokiyometri dışı tiyol-en (OSTE) reaksiyonu glioksal bis diallil asetal, pentaeritritol tetrakis (3-merkaptopropiyonat) (1:1.5) ve Irgacure 816 (fotobaşlatıcı) eklenerek hazırlandı ve hazırlanan filmlerin yüzeyi 2-(metakriloiloksietil)dimetil-3-sulfopropil amonyum hidroksit monomeri ile modifiye edildi. Daha sonra Candida rugosa lipazı polimerik materyale immobilize edildi. 1 gram polimerik materyale 3,7 mg proteinin nonkovalent olarak bağlandığı bulundu ve immobilizasyon verimi %36,9 olarak hesaplandı.
Serbest ve immobilize enzimin sulu çözeltide p-nitrofenil palmitatın hidrolizi ve hekza içerisinde p-nitrofenil linoleatın sentezi yönündeki aktivitesi ve reaksiyonun optimal şartları incelendi. Hidroliz yönünde serbest enzimin optimum pH'sının 6,5 immobilize enzimin optimum pH'sının ise 6 olduğu belirlendi. Serbest ve immobilize enzimin optimum sıcaklık değerleri hidroliz yönünde sırasıyla 37 °C ve 50 °C olarak belirlendi. Sentez yönünde ise optimum sıcaklık hem serbest hem de immobilize enzim için 37  °C olarak bulundu. Hidroliz yönünde serbest ve immobilize enzimin Km ve Vmaks değerleri sırasıyla 0,6127 mM, 0,2794 mM/dakika ve 0,4838 mM, 1,313 mM/dakika olarak, sentez yönünde ise serbest ve immobilize enzimin Km ve Vmaks değerleri sırasıyla 4,217 mM, 0,9279 µM/dakika ve 1,035 mM, 0,2077 µM/dakika olarak hesaplandı. Çalışmamızda hidroliz yönünde immobilize lipazın yeniden kullanılabilirliği araştırıldı ve 20 kullanım sonrasında aktivitesinin %45.8'ini koruduğu belirlendi. 30 günlük depolama süresi sonunda ise aktivitesinin %71'ini koruduğu hesaplandı. 
Benzer şekilde sentez yönünde de 30 kullanım sonrasında immobilize lipazın başlangıç aktivitesinin %58,2'sini ve 30. günün sonunda başlangıç aktivitesinin %62,8'ini koruduğu gözlemlendi.

Abstract:
Lipases (EC.3.1.1.3, triacylglycerol acylhydrolase) are enzymes that catalyze the reversible hydrolysis of animal and vegetable oils under mild conditions. Lipases, which have a wide substrate selectivity, are often used as biocatalysts in the industry because they are cheaper and easier to obtain than other enzymes. Lipases can be obtained from many different animal, vegetable and microbial sources, however, lipases of microbial origin such as Candida rugosa are more preferred in large-scale studies due to their easy production and catalysis of many hydrolytic and synthetic reactions.
In this study, the polymeric support material to be used for enzyme immobilization was prepared by adding non-stoichiometric thiol-ene (OSTE) reaction glyoxal bis diallyl acetal, pentaerythritol tetrakis (3-mercaptopropionate) (1:1.5) and Irgacure 816 (photo-initiator) and the surface of the prepared films was modified with 2-(methacryloyloxyethyl)dimethyl-3- sulfopropyl ammonium hydroxide monomer. Subsequently, Candida rugosa lipase was immobilized to the polymeric material. It was found that 3.7 mg of protein was non-covalently bound to 1 gram of polymeric material and the immobilization efficiency was calculated as
36.9%.
The activity of the free and immobilized enzyme in the hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate in aqueous solution and the synthesis of p-nitrophenyl linoleate in hexane and the optimal conditions of the reaction were investigated. It was determined that the optimum pH of the free and immobilized enzyme in the hydrolysis direction was found as 6.5 and 6, respectively. The optimum temperature values of the free and immobilized enzyme were determined as 37 °C and 50 °C in the hydrolysis direction, respectively. In the synthesis direction, the optimum temperature was found to be 37 °C for both free and immobilized enzymes. The Km and Vmax values of the free and immobilized enzyme in the hydrolysis direction are 0.6127 mM, 0.2794 mM/min and 0.4838 mM, 1.313 mM/min, respectively, and in the synthesis direction, the Km and Vmax values of the free and immobilized enzyme are 4.217 mM, 0,479 µM/min and 1,035 mM and  0,2077 µM/min, respectively. In our study, the reusability of immobilized lipase in the direction of hydrolysis was investigated and it was determined that it retained 45.8% of its
activity after 20 uses. At the end of the 30-day storage period, it was calculated that it preserved vii 
71% of its activity. Similarly, in the synthesis direction, it was observed that the immobilized lipase retained 58.2% of its initial activity and 62.8% of its initial activity at the end of the 30th day after 30 uses.