COX-1 enzimi C50T gen polimorfizminin ve inflamasyon mediyatörlerinin tip 2 diyabet ile koroner arter hastalığı üzerindeki etkisi
Effects of COX-1 enzyme C50T gene polymorphism and inflammation mediators on type 2 diabetes and coronary artery disease
Yazar: ÖZLEM TİMİRCİ KAHRAMAN
Danışman: PROF. DR. TURGAY İSBİR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Diabetes mellitus-tip 2 = Diabetes mellitus-type 2 ; Koroner hastalık = Coronary disease ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Tip 2 diyabet ve koroner arter hastalığında, klinik heterojenite ve genetik faktörlerin önemi uzun zamandan beri dikkat çekmektedir. Son yıllarda yapılan gerek epidemiyolojik gerekse de moleküler düzeydeki araştırmalar bu hastalıkların gelişiminde genetik faktörlerin etkin rol oynayabileceğini gösteren çeşitli kanıtlar sunmaktadır. Son zamanlarda bunlar arasında özellikle inflamasyon ve homeostaz ilişkili siklooksijenaz gibi genetik faktörler çok sayıda araştırmacı tarafından ön planda tutulmaktadır. Siklooksijenaz (COX) enzimleri hücre içerisinde araşidonik asitten prostanoidlerin oluşumunda görev alırlar. Bu enzimlerden COX-1, araşidonik asitten prostaglandin oluşturan konstitütif olarak eksprese edilmiş bir enzimdir. Fizyolojik uyarılarla devamlı olarak aktiftir ve bu aktivasyona bağlı olarak araşidonik asitten TXA2 ve PGI2 metabolitleri üretilmektedir. TXA2 direkt etkisiyle trombositleri aktive ederek onların agregasyonuna ve adezyonuna neden olur. PGI2 ise, TXA2'nin aksine vazodilatör etkiye sahiptir. COX-1 lokusunda çok çeşitli genetik varyasyonlar tanımlanmıştır. Bunlardan biri 2. ekzonda görülen ve Pro17Leu (P17L) aminoasit değişimine sebep olan C50T polimorfizmidir. Yapılan çalışmalarda, tam bağlantı analizi ile belirlenen A-842G ve C50T polimorfizmleri, asetilsalisilik asidin (aspirin) etkisinin artması ile ilişkilendirilmiş ve varyasyon doğal tiple kıyaslandığında çok daha düşük prostaglandin sentez kapasitesine sahip olduğu gösterilmiştir. Bu bilgiler ışığında çalışmamızda, Tip 2 Diyabet ve Koroner Arter Hastalığı üzerinde COX-1 geni C50T polimorfizminin etkilerinin incelenmesi, COX-1, TXA2 ve PGI2 gibi araşidonik asit metabolizması ile ilişkili mediyatörlerin serum düzeylerinin gösterilmesi ve varyasyonun Türk toplumundaki dağılımlarının belirlenmesi hedeflenmiştir. 
Bu amaçla çalışmamız 96 tip 2 diyabet ve 75 koroner arter hasta grubu ve 98 sağlıklı kontrol grubu olmak üzere 3 gruptan oluşturulmuştur. COX-1 geni C50T polimorfizmini (rs3842787) saptayabilmek için; ilgili gen sekansı Nested PCR ile çoğaltılmış, RFLP yöntemi ile varyasyon tespit edilmiş ve validasyon için DNA dizi analiz cihazı ile dizilemesi yapılmıştır. Ayrıca COX-1, TXA2 ve PGI2 düzeyleri ELISA yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. TXA2 ve PGI2 üretiminin göstergesi olarak stabil metabolitleri olan TXB2 ve 6-keto-PGF1?'nın  serum düzeyleri ölçülmüştür.
Deneysel çalışmalarımız sonucunda, COX-1 geni C50T polimorfizmine ait genotip frekansları tip 2 diyabet hasta grubunda; CC % 94,8, CT % 5,2, TT %0 iken, koroner arter hasta grubunda; CC % 96, CT % 4, TT % 0 ve kontrol grubunda; CC % 93,9, CT % 6,1, TT % 0 olarak saptanmıştır. Her üç grubun COX-1 geni C50T polimorfizmi genotip ve allel frekansları açısından karşılaştırıldığında, istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık tespit edilememiştir (p>0,05). Çalışma grupları arasında COX-1, TXB2 ve 6-keto-PGF1? serum düzeyleri açısından karşılaştırıldığında; koroner arter ve tip 2 diyabet hasta grubunda bu serum düzeyleri kontrol grubuna göre düşük oranda gözlemlenmiş olup; aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,05). İki hasta grubu arasındaki karşılaştırmaya göre, koroner arter hasta grubunda COX-1 serum düzeyi tip 2 diyabet hasta grubuna göre, istatistiksel olarak anlamlı seviyede yüksek gözlemlenmiştir (p=0,01). TXB2 ve 6-keto-PGF1? serum düzeyleri ise tip 2 diyabet hasta grubunda daha yüksek tespit edilmiş olup, istatistiksel olarak da anlamlılık bulunmuştur (p<0,001). Çalışma gruplarında COX-1 gen polimorfizmine ait varyantlar ve aspirin kullanımı arasındaki ilişkiye baktığımızda; istatistiksel olarak anlamlılık tespit edilememiştir (p>0,05).
Çalışmamızdan elde ettiğimiz veriler doğrultusunda, haplotipe sahip bu polimorfizmin, aspirine karşı olumlu veya olumsuz reaksiyonlarla ilişkili olup olmadığı ve aynı zamanda farmakolojik olarak fonksiyona etkisi tam olarak belirlenememiştir. Nadir allel -842G/50T için homozigot olan bir bireyde etki ne olurdu henüz bilmiyoruz; çünkü bizim populasyonumuzun yaygın olarak doğal tip homozigotlardan oluştuğunu tespit ettik. Bu haplotipin, aspirin terapisinin terapötik veya olumsuz yanıtları ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için daha büyük katılımcı hasta gruplarının kullanımı ile gelecekte yapılacak araştırmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
The importance of clinic heterogeneity and genetic factors in type 2 diabetes and coronary artery disease has been pointed out for a long time. Recently, epidemiologic and molecular studies have shown evidence on genetic factors playing efficient role on the disease progression. Especially inflammation and homeostasis related genetic factors such as cyclooxygenase efficiency is widely studied. Cyclooxygenase (COX) enzymes catalyze the generation of prostanoids from arachidonic acid. A member of this enzyme family COX-1, catalyses prostaglandin generation from arachidonic acid, is constitutively expressed. It is kept constantly active with physiological stimulations which enable the TXA2 and PGI2 production from arachidonic acid. TXA2 directly activates platelets which lead to their aggregation and adhesion. On the other hand PGI2 has a potent vasodilator effect.  Several genetic variations have been described in COX-1 locus such as the C50T polymorphism causing the Pro17Leu (P17L) substitution in exon 2. The A-842G and C50T polymorphisms, specifically determined with full linkage analysis, are associated with increased acetylsalicylic acid (aspirin) efficiency which was shown to be caused by decreased prostaglandin synthesis capacity compared to the wild type. Taking up from there, in this study it was aimed to determine the effect of COX-1 C50T polymorphism on arachidonic acid metabolism related mediators such as COX-1, TXA2 and PGI2 in type 2 diabetes and coronary artery disease and also the distribution of the variation in Turkish population. 
With this perspective, in this study, 3 groups were included which were comprised of 96 type 2 diabetes and 75 coronary artery disease patients and 98 healthy controls.  In order to determine the COX-1 gene C50T polymorphism (rs3842787), the related gene sequence was multiplied with Nested PCR method; the variation was identified with the RFLP technique and sequenced with a DNA sequence analysis device for validation. Furthermore, COX-1, TXA2 and PGI2 levels were evaluated using ELISA method. Serum levels of PGI2 and TXA2 were measured by their stable metabolites of 6-keto-PGF1? and TXB2. 
As the result of our study, COX-1 C50T polymorphism CC, CT and TT genotype frequencies in type 2 diabetes patient group was determined as 94.8%, 5.2%, 0% where in coronary artery disease patient group 96 %, 4%, 0% and in the control group 93.9%, 6.1%, 0%, respectively. When COX-1 C50T polymorphism genotypes and allele frequencies compared in all three groups, no statistically significant difference was detected (p>0.05). When study groups compared for TXB2 and 6-keto- PGF1? serum levels, coronary artery and type 2 diabetes patient group's serum levels were found to be statistically significantly lower than the control group (p<0.05). According to the comparison of  the two patient groups, in coronary artery disease patient group COX-1 serum levels were found to be statistically significantly higher than type 2 diabetes patient group (p=0.01). However, TXB2 and 6-keto-PGF1? serum levels were found to be statistically significantly higher in type 2 diabetes patient group (p<0.001). When we investigated the association COX-1 gene C50T polymorphism with regular and current use of aspirin in patient groups, there were no statistically significant differences (p>0,05).
The positive or negative association with aspirin related reactions and the effect on the pharmacogenetic function of this polymorphism could have not been determined considering the data gathered from this study. We do not know what kind of an impact it would have to be the rare -842G/50T variants homozygote carrier, since our population was determined to be comprised of wild type carriers generally. In order to detect the effect of this haplotype on therapeutic or adverse effects of aspirin therapy, further studies and greater patients groups are required.