Metiyonin biyomolekülü ile modifiye edilmiş kromenilyum -siyanin floresan probun sentezi, çevrede ve canlı hücrelerde cıva(II) analizi uygulamaları
Synthesis of a methionine biomolecule-modified chromenylium-cyanine fluorescent probe and its application of mercury(II) analysis in the environment and living cells
Yazar: YUSUF ALÇAY
Danışman: PROF. DR. İSMAİL YILMAZ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Analitik kimya = Analytical chemistry ; Anorganik kimya = Inorganic chemistry ; Kimyasal sensör = Chemical sensor ; Organik kimya = Organic chemistry

Özet:
Standart koşullarda sıvı halde bulunan cıva, nanometre, termometreler, barometre, kozmetik ve amalgam yapımı gibi birçok alanda kullanılan bir metaldir. Cıva elementel, inorganik ve organik formlarında bulunmakta olup, her biri farklı özelliklere sahiptir. Elementel hali, sıvı halde ve düşük emilim riskine sahip formudur ancak buhar basıncına sahip olduğundan cıva buharı, akciğerde emilim riski gösterebilir. İnorganik cıva, geçmişte ilaç olarak da kullanılmış, çözünürlükleri ile orantılı olarak zehirli türlerdir. Canlılar için en zehirli formu olan organik cıva türevleri ise, insan vücudunda tümöre sebebiyet verebilir.
Ağır metal türleri arasında canlılığı en çok tehdit eden türlerden bir tanesi olan cıva, biyoparçalanırlığının düşük olması ve besin zincirinde birikiyor olması sebebiyle, canlılar için olumsuz etkiler meydana getirebilmektedir. Cıva birikimi, bağışıklık sistemi bozukluğu, organ iflası, biliş ve hareket kaybı, DNA hasarı, kanser ve sakat doğumlar gibi anomalilere neden olabilir. Dünyanın çeşitli bölgelerinde cıva kaynaklı vakaların ortaya çıkmasıyla birlikte cıvanın sağlığa zararlı bir tür olduğu ortaya konmuş ve bu konuda çalışmalar dünya çapında ilgi görmeye başlamıştır. Günümüzde iş yerlerinin daha sıkı denetlenmesiyle birlikte, insanlara çeşitli cıva formlarının maruziyetinin azaltılması mümkün olmuşsa da, hala cıva zehirlenmesi kaynaklı hastalıklar görüldüğünden, bu tür durumlar için müdahaleler önemli bir yer tutmaktadır. 
Düşük konsantrasyon değerlerinde bile zehirli olabilen cıvanın, etkin olarak tayini için günümüzde atomik absorpsiyon spektroskopisi, indüktif eşleşmiş plazma/atomik emisyon spektrometresi gibi cihazların yanı sıra florometrik ve kolorimetrik sensörler de kullanılmaktadır. Cıvanın hassas olarak tayini için, rodamin, siyanin, BODIPY, kromenilyum-siyanin gibi platformlar prob tasarımında kullanılmıştır. 
Kromenilyum-siyanin boyaları yakın kızılötesi bölgede absorpsiyon ve emisyon yapan, ksanten halkasına sahip bir boya tipidir. Rodamin bileşiklerinde olduğu gibi yüksek kuantum verimi ve molar absorpsiyon katsayısı gibi üstün fotofiziksel özelliklere sahip olmasının yanı sıra, siyanin boyalarındaki gibi yakın kızılötesi bölgesinde çalışılabilme imkanı sunmaktadır. Kromenilyum-siyanin boyaları rodamin boyalarında olduğu gibi uygun analit varlığında spirohalka açma kapama mekanizmasıyla birlikte analiz yapmaya uygundur. Rodamin boyalarındaki yakın kızılötesinde çalışılamama problemi ile siyanin boyalarındaki düşük kuantum verimi problemleri kromenilyum-siyanin boyaları ile önemli ölçüde aşılmıştır. 
Kromenilyum-siyanin boyaları, karboksilik asit formunda iken, geniş bir pH aralığında yüksek absorpsiyon ve emisyon şiddetine sahipken, yüksek pH değerlerinde (>11) sprilakton oluşumu sebebiyle düşük absorpsiyon ve emisyon şiddetine sahiptir. Amid formu göz önüne alındığında ise, asidik pH değerlerinde spirohalka açık formda ve yüksek emisyona sahipken, bazik koşullarda ise spirolaktam formunda ve düşük emisyona sahip bir formda yer almaktadır. Bu yüzden fizyolojik koşullarda halka kapalı-açık geçişleri üzerinden çalışmaya uygun bileşikler olarak görülmektedir.
Kromenilyum-siyanin boyaları farklı bileşiklerin bağlanması ile farklı fotofiziksel özelliklere sahip olarak, florofor dizaynı için kullanıma uygundur. 
Bu çalışmada seçici, hassas, hızlı ve geniş bir doğrusal aralıkta Hg2+ analizi yapabilmek maksadıyla, yeni tip kromenilyum-siyanin tabanlı bir prob olan CSME ile çalışılmıştır. 
CSME (Metil (2S)-2-(((1Z,2E)-2-(((E)-6'-(dietilamino)-3-okso-4'-(2-((E)-1,3,3-trimetilindolin-2-iliden)etiliden)-1',2',3',4'-tetrahidrospiro[isoindolin-1,9'-ksanten]-2-il)imino)etiliden)amino)-4-(metiltiyo)butanoat) probu 6 kademelik bir reaksiyon üzerinden sentezlenmiştir. 3-Dietilaminofenol ve ftalik anhidritten başlanarak ilk kademede bir benzofenon türevi olan 1 numaralı bileşik toluen varlığında 3-dietilaminofenol ve ftalik anhidritin kaynatılmasıyla sentezlenmiştir. Bir sonraki kademede kromenilyum türevi olan 2, 1 numaralı bileşiğin sülfürik asit ve siklohekzanon varlığında kaynatılmasının ardından perklorik asit varlığında çöktürülmesiyle elde edilmiştir. 2 numaralı bileşiğin asetik anhidrit içerisinde Fischer aldehit ile tepkimesi sonucunda çalışmadaki ana iskelet yapısı olan CS2 elde edilmiştir. BOP ve hidrazin hidrat ile tepkimeye sokulan CS2, spirolaktam yapısındaki CS2H yapısını meydana getirmiştir. Devamında CyR bileşiğini oluşturmak için CS2H, THF içerisinde, glioksal ile tepkimeye sokulmuştur. Nihai ürün olan biyokarakter taşıyan CSME ise metiyonin metil esterinin nikel(II) nitrat varlığında CyR ile tepkimesi sonucunda sentezlenmiştir. Sentezi gerçekleştirilen tüm ürünler, 1H-NMR, 13C-NMR, kütle spektroskopisi, FTIR gibi çok bilinen spektral yöntemlerle karakterize edilmiştir. 
CSME probu çeşitli metal iyonlarının (Li+, Na+, K+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Cd2+ ve Pb2+) ve anyonların (SO42-, CN-, CO32-, S2-, Cl-, NO3-, EDTA2-, AcO-, SCN-, Br- ve I-) varlığında yanıt vermezken, Hg2+ varlığında sulu asetonitril ortamında UV-görünür bölge spektroskopisinde 711 nm dalga boyunda bir absorpsiyon artışı gözlenirken, floresan spektroskopisinde 740 nm dalga boyunda bir emisyon artışı görülmüştür. Bu değişimlerle birlikte uçuk sarı renkli çözelti, yeşil renge dönüşmüştür. Yakın kızılötesi bölgede UV–görünür bölge spektroskopisinde 6,29 × 10−8 – 1,86 × 10−4 M ve floresan spektroskopisinde 9,49 × 10−9 – 1,13 × 10−5 M aralıklarında çalışabilen CSME, 4,93 × 10−9 M (0,99 ng/mL) LOD değerine sahiptir. Hg2+ analizini, floresan ve UV-görünür spektroskopilerinin yanında cep telefonu uygulaması yardımı ile içme ve musluk suyu örneklerinde de yüksek geri kazanım değerleriyle birlikte gerçekleştirilmiştir. CSME probu ve Hg2+ arasındaki etkileşim DFT kullanılarak Gaussian programı vasıtasıyla kuantum mekaniksel olarak incelenmiştir. 3T3 hücrelerinde görüntüleme yapılarak biyolojik uygulamalarda kullanılması mümkün olmuştur.

Abstract:
Mercury, a metal that is liquid under standard circumstances, is utilized in various products, including nanometers, thermometers, barometers, cosmetics, and amalgam manufacturing. There are three different types of mercury: organic, inorganic, and elemental. Although liquid elemental form of mercury that has a minimal absorption risk, due to its vapor pressure, mercury vapor may increase the risk of lung absorption. Inorganic mercury is dangerous in proportion to its solubility and has previously been employed in medicine. The most hazardous type of mercury for living things is organic mercury compounds, which can result in cancers in humans. 
Due to its low biodegradability and accumulation in the food chain, mercury, one of the heavy metal species that poses the greatest hazard to life, can have a severe impact on living organisms. The buildup of mercury can result in anomalies such weakened immunity, organ failure, memory and mobility loss, DNA damage, cancer, and birth deformities. Studies on this topic have started to draw attention from all over the world since incidences of mercury-related illness have been reported in many different places of the world. While it has been able to lower human exposure to different types of mercury through tougher occupational inspections, interventions for such patients are nevertheless crucial because diseases brought on by mercury poisoning still happen. 
Mercury, which can be harmful even at low concentrations, can now be determined effectively using tools like atomic absorption spectroscopy, inductively coupled plasma/atomic emission spectrometry, as well as fluorometric and colorimetric sensors. Sensors including rhodamine, cyanine, BODIPY, and chromenylium-cyanine platforms were designed as probes for the sensitive measurement of mercury. 
Rhodamine dyes are a fluorophore belonging to the xanthene family of the compounds. Rhodamine dye, is a dye used in areas such as textile paper, plastic, leather and laser dyes. Rhodamine dyes have unique photophysical properties such as high absorption coefficient and high quantum yield. Rhodamines may exhibit different photophysical properties depending on the substituents and counterions they contain. Solutions of rhodamines derivatized from different positions show different absorption and emission, while changes in fluorescence lifetime and quantum yields can be observed. In rhodamine compounds, there is a state of equilibrium between the closed(non-fluorescent)  form and the open form under neutral conditions. Fluorescent active solutions can be obtained in acidic solutions, while fluorescent inactive solutions can be obtained in high pH conditions. 

Cyanine dyes are one of the most studied compounds among synthetic dyes. Cyanine dyes are used in lasers and solar cells in photography. Cyanine dyes are formed by conjugating two nitrogen-containing heterocyclic structures. Cyanine dyes are compounds that can absorb and emit in the visible and near infrared regions, used in a very wide wavelength range. Absorption and emission maxima in cyanine dyes vary depending on the length of the polymethine bridge between the heterocyclic structures. Although cyanine dyes have been studied in the near infrared region, their low quantum yield is a handicap for this dye type. 
Chromenylium-cyanine dyes are a type of dye with a xanthene ring that absorbs and emits in the near infrared region. In addition to having superior photophysical properties such as high quantum yield and molar absorption coefficient, as in rhodamine compounds, it offers the opportunity to be studied in the near infrared region, as in cyanine dyes. Chromenylium-cyanine dyes are suitable for analysis with the spiroring opening and closing mechanism in the presence of the appropriate analytes, as in rhodamine dyes. The problem of inability to work in the near infrared in rhodamine dyes and the low quantum yield problems in cyanine dyes have been significantly overcome by chromenylium-cyanine dyes. 
Chromenylium-cyanine dyes, when in the carboxylic acid form, have high absorption and emission intensity in a wide pH range, but at high pH values (>11) they have low absorption and emission intensity due to the formation of sprilactone. Considering the amide form, at acidic pH values, chromenylium-cyanine dyes are in the spiroring-open form and have high emission, while in basic conditions, dyes are in closed spirolactam form and with low emission and absorption values. They therefore seem to be appropriate chemicals to research ring-closed-open transitions in physiological pH levels. With derivation with various species, photophysical characteristics of chromenylium-cyanine dyes can alter to create miscellaneous fluorophores. 
In this study, CSME (methyl (2S)-2-(((1Z,2E)-2-(((E)-6'-(diethylamino)-3-oxo-4'-(2-((E)-1,3,3-trimethylindolin-2-ylidene)ethylidene)-1',2',3',4'-tetrahydrospiro [isoindoline-1,9'-xanthen]-2-yl)imino)ethylidene)amino)-4-(methylthio)butanoate) a new type of chromenylium-cyanine-based probe, was used to analyze Hg2+ in a selective, sensitive, rapid and wide linear range. 
The CSME probe was synthesized through a 6-step reaction. Starting from 3-diethylaminophenol and phthalic anhydride, compound number 1, which is a benzophenone derivative, was synthesized in the first step by boiling 3-diethylaminophenol and phthalic anhydride in the presence of toluene. In the next step, 2, which is a chromenylium derivative, was obtained by boiling compound 1 in the presence of sulfuric acid and cyclohexanone and then precipitated with perchloric acid. As a result of the reaction of the compound number 2 with Fischer aldehyde in acetic anhydride, CS2, the main skeleton structure in the study, was obtained. CS2 was reacted with BOP and hydrazine hydrate to form the CS2H structure in the spirolactam structure. Subsequently, CS2H was reacted with glyoxal in THF to form the CyR compound. The final product, CSME, which carries biocharacter, was synthesized as a result of the reaction of methionine methyl ester with CyR in the presence of nickel(II) nitrate. All synthesized products were characterized by well-known spectral methods such as 1H-NMR, 13C-NMR, mass spectroscopy and FTIR. 
While the CSME probe did not respond in the presence of miscellaneous metal cations Li+, Na+, K+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Cd2+ and Pb2+) and anions (SO42-, CN-, CO32-, S2-, Cl-, NO3-, EDTA2-, AcO-, SCN-, Br- and I-) an absorption increase was observed at 711 nm in UV-visible spectroscopy in aqueous acetonitrile environment in the presence of Hg2+, while an emission increase was observed at 740 nm in fluorescence spectroscopy. With these changes, the pale yellow solution turned into green. CSME, which can operate in the near infrared region between 6.29 × 10−8 – 1.86 × 10−4 M in UV–visible spectroscopy and 9.49 × 10−9 – 1.13 × 10−5 M in fluorescence spectroscopy. CSME has limit of detection (LOD) value (4.93 × 10−9 M (0.99 ng/mL)) lower than EPA values. In addition to fluorescence and UV-visible spectroscopy, Hg2+ analysis was carried out with high recovery values in drinking and tap water samples with the help of a mobile phone application. The interaction between the CSME probe and Hg2+ was studied quantum mechanically through the Gaussian program using DFT. By imaging 3T3 cells, it has become possible to use them in biological applications.