Benzoksazol, benzamit ve benzenasetamit türevlerinin sitotoksik, genotoksik, epigenetik ve topoizomeraz I enzim inhibisyon etkilerinin araştırılması
Investigation of cytotoxic, genotoxic, epigenetic and topoisomerase I enzyme inhibitory effects of benzoxazole, benzamide and benzeneacetamide
Yazar: FATMA ZİLİFDAR
Danışman: PROF. DR. NURAN DİRİL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kanser, kardiyovasküler hastalıklar ile birlikte dünyada ölümcül hastalıkların başında yer almaktadır. Hastalığın çok faktörlü olması ve çok sayıda alt tipe sahip olması her geçen gün tedavisi ile ilgili yeni yaklaşımları gündeme getirmektedir. Tedavide kemoterapötik ajanların kullanımı tüm kanser tipleri için vazgeçilmez olsa da bu ilaçlara karşı hücrelerin geliştirmiş olduğu direnç tedavideki başarının düşüşündeki en önemli faktördür. Bu nedenle yeni ve daha etkili ilaçların keşfi ile ilgili çalışmalar devam etmektedir. Bu çalışmada heterosiklik yapısından dolayı antikanser aktiviteye neden olabileceği düşünülerek sentezlenmiş bir dizi bileşiğin biyolojik aktiviteleri değerlendirilmiştir. Çalışma kapsamında 9 adet 2-fenil/benzil benzoksazol türevi ile benzoksazollerin olası metabolitleri olarak sentezlenmiş 7 adet N-fenilbenzamit ve 5 adet N-fenilbenzenasetamit türevi bileşiğin sitotoksik, genotoksik, epigenetik aktiviteleri ve insan DNA topoizomeraz I (hTopo I) enzimi üzerindeki inhibisyon etkileri araştırılmıştır.
Bileşiklerin kanser hücreleri üzerindeki etkileri insan serviks adenokarsinom HeLa hücre hattı üzerinde, normal hücrelere olan etkileri ise fare fibroblast L929 hücre hattı üzerinde araştırılmış ve birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Bileşiklerin sitotoksik etkileri sülforodamin B (SRB) yöntemiyle, genotoksik etkileri alkali komet yöntemiyle ve epigenetik etkileri metilasyon özgül komet yöntemiyle değerlendirilmiştir. Topoizomeraz inhibitörleri antikanser ajanlar içerisinde önemli bir grubu oluşturmaktadır. Bu bağlamda test bileşiklerinin hTopo I enzimi üzerindeki inhibisyon aktiviteleri relaksasyon yöntemi ile araştırılmıştır. Bileşiklerdeki sitotoksik potansiyelden sorumlu ortak yapılar farmakofor modelleme analizi ile, genotoksik aktiviteden ve Topo I enzim inhibisyonundan sorumlu ortak yapılar ise SAR çalışmaları ile belirlenmiştir. 
Sitotoksik aktivite verileri değerlendirildiğinde, test edilen 21 bileşikten 17 tanesinin HeLa hücrelerinde sitotoksik aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur. Ayrıca test bileşiklerinden 18 tanesinin HeLa hücrelerini L929 hücrelerine oranla daha fazla etkilediği, hatta XT3B (Sİ:693) başta olmak üzere XT8B, XT9B, X17B, X23B ve XT4B bileşiklerinin HeLa hücrelerindeki seçiciliklerinin 15-693 kat fazla olduğu belirlenmiştir. Farmakofor analizine göre bileşiklerin 2. konumdaki fenil halkası ve 5. ya da 6. konumdaki nitro grubunun HeLa hücrelerindeki sitotoksik aktivite için mutlaka gerekli olduğu sonucuna varılmıştır.
Test bileşiklerinin genotoksik aktiviteleri komet yöntemi ile değerlendirildiğinde, HeLa hücrelerinde düşük dozda güçlü genotoksik etkili olup, L929 hücrelerinde ise etkisiz olduğu görülen X17, XT11, XT12 ve X17B bileşikleri, kanser hücre DNA'sında seçici olarak kırık yarattıkları için antikanser etkili olabilecek aday türevler olarak belirlenmiştir. 
Bileşiklerin Topo I enzimi üzerindeki inhibisyon etkileri değerlendirildiğinde, 7 bileşiğin (X8B, X17, XT4B, XT6, X23, X23B, XT12) diğerlerinden daha düşük konsantasyonlarda enzimin katalitik inhibisyonuna neden olduğu ancak pozitif kontrollerle karşılaştırıldığında etkilerinin oldukça düşük olduğu tespit edilmiştir.
Metilasyon özgül komet yöntemi kullanılarak test edilen 10 bileşikten X17, XT4B ve XT6 bileşiklerinin L929 ve HeLa hücrelerinde, X23 bileşiğinin ise yalnızca L929 hücrelerinde metilasyon düzeyini istatistiksel olarak anlamlı oranda (p<0.05) azalttıkları belirlenmiştir.

Anahtar kelimeler: Benzoksazol, benzamit, benzenasetamit, sitotoksik, genotoksik, epigenetik

Abstract:
Cancer, along with cardiovascular diseases, occupies the first place among the causes of deadly diseases worldwide. Due to the fact that cancer is a multifactorial disease and having a plurality of subtypes, new approaches were thrown into sharp relief for its treatment with every passing day. Even though usage of chemotherapeutic agents in the treatment is indispensable for all types of cancer, drug resistance developed by cancer cells is the most important factor which decreased the success of the treatment. In this study, biological activites of a series of compounds, sythesized on account of their heterocylic structure which might have anticancer activity, were evaluated. As a part of the study, cytotoxic, genotoxic, epigenetics activities of nine 2-phenyl/benzylbenzoxazole derivatives and their probable metabolites, seven phenylbenzamide and five phenylbenzeneacetamide derivative compounds, and their inhibitory effects on human DNA topoisomerase I enzyme were investigated.
The effects of the compounds on cancer cells were investigated with human cervical adenocarcinoma HeLa cell line, whereas their effects on normal cells were investigated with mouse fibroblast L929 cell line. These effects were then compared with each other. Compounds were evaluated for their cytotoxic effects with sulphorhodamine B (SRB) assay, for their genotoxic effects with alkaline comet assay and for their epigenetics effects with methylation specific comet assay. Topoisomerase inhibitors are an important group among anticancer agents. Therefore, inhibitory activities of the test compounds on human DNA topoisomerase I enyzme were investigated with relaxation assay. Common structures of the compounds, responsible for cytotoxic potential, were identified with pharmacophore modelling analysis, whereas common structures which were responsible for genotoxic activity and topoisomerase I enyzme inhibition were identified with studies of SAR.
As a result of cytotoxic activity data determination, it was found that 17 of 21 tested compounds had cytotoxic activity on HeLa cells. Moreover, it was determined that 18 of the test compounds affected HeLa cells more than L929 cells. Selectivities of the compounds XT8B, XT9B, X17B, X23B, XT4B and in particular XT3B (SI:693) were 15-993 times higher on HeLa cells. According to the pharmacophore analysis, it was concluded that phenyl ring at the position 2- and nitro groups at positions 5- or 6- on the compounds were strictly necessary for cytotoxic activity.
Evaluation of the genotoxic activities of the tested compounds with comet assay revealed that compounds X17, XT11, XT12 and X17B showed strong genotoxic effects against HeLa cells at low concentrations, whereas they had no genotoxic effect on L929 cells. Due to the selective DNA strand breaks formation induced by these compounds only in cancer cells, they were identified as effective derivatives for anticancer candidates.
As a result of inhibitory effects determination of the compounds on topoisomerase I, it was revealed that 7 of compounds (X8B, X17, XT4B, XT6, X23, X23B, XT12) catalytically inhibited enyzme activity at lower concentrations than the others, whereas their effecets were considerably low as compared with positive controls.
It was determined that among 10 of the compounds tested using with methylation specific comet assay, compounds X17, XT4B and XT6 decreased methylation level in a statistically significant manner (p<0.05) in L929 and HeLa cells, whereas compound X23 decreased it only in L929.

Keywords: Benzoxazole, benzamide, benzeneacetamide, cytotoxic, genotoxic, epigenetics