Bilirubin uzaklaştırması için PHEMA kriyojellerin hazırlanması
Preparation of hsa-bound phema cryogels for bilirubin removal
Yazar: MAHDİ KAVOSHCHİAN
Danışman: PROF. DR. SERAP ŞENEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tez çalışması kapsamında hiperbilirubinemili insan plazmasından bilirubinin şeçimli olarak uzaklaştırılması için HSA immobilize PHEMA kriyojelleri hazırlanmıştır. PHEMA kriyojeller serbest radikal polimerizasyonu yöntemi ile sentezlenmiştir. PHEMA kriyojeller şişme testleri, BET ve SEM analizleri ve kan uyumluluk testleri ile karakterize edilmiştir.  PHEMA kriyojellerin denge şişme değeri 7.86 g H2O/g kriyojel ve sahip olduğu gözeneklilik oranı %69.6 olarak saptanmıştır. PHEMA kriyojellerin BET yöntemi ile saptanan spesifik yüzey alanı ortalama 27.2 m2/g ve ortalama gözenek çapı 68.2 Å'dur. Kriyojellerin aktivasyonu için optimum CNBr derişimi 60 mg/mL olarak saptanmıştır. Aktivasyonun ardından pH, akış hızı, etkileşim süresi ve HSA derişimi parametrelerinin HSA immobilizasyonuna etkisi incelenmiştir. CNBr aktive edilmiş PHEMA kriyojellere maksimum HSA immobilizasyonu 12.40 mg/g olarak pH:7'de, 1.0 mg/mL HSA derişiminde, 0.75 mL/dk akış hızında 30 dk etkileşim süresiyle elde edilmiştir. Kan uyumluluğu çalışmaları yapılmış ve protrombin zamanı (PT), aktive edilmiş kısmi tromboplastin zamanı (APTT), fibrinojen testi ve trombosit pıhtılaşma zamanı (TCT) belirlenmiştir. HSA immobilize PHEMA kriyojeller kullanılarak elde edilen platelet kaybı % 2.32, lökosit kaybı %5.17'dir. 
PHEMA-HSA kriyojellerinin bilirubin uzaklaştırılma etkinliğine plazmadaki bilirubin derişiminin, etkileşim süresinin ve sıcaklığının etkisi sürekli sistemde incelenmiştir. Plazma örneklerine bilirubin yüklemesi yapılarak plazmadaki toplam bilirubin seviyesi 3.0 mg/dL seviyesine çıkarılmış ve farklı oranlarda HSA içeren PHEMA kriyojellerle etkileştirilerek zamanla plazmadaki bilirubin seviyesindeki azalma incelenmiştir. 2 saat sonunda plazmadaki bilirubin 1.23 mg/dL (hiperbilirubinemi için minimum toplam bilirubin seviyesi) seviyesinin altına indirilmiştir. Maksimum adsorpsiyon 3.0 mg/dL bilirubin içeren plazmadan 37.5 oC'de 25.35 mg/g olarak bulunmuştur. 1.0 M NaCl ve 0.1 M NaOH desorpsiyon ajanı olarak kullanılmıştır. Tüm çalışmalarda desorpsiyon yüzdesi %97'nin üstündedir. Freundlich ve Langmuir adsorpsiyon modelleri adsorplanan moleküllerin adsorbentle etkileşimini belirlemek için kullanılmış ve adsorpsiyonun Langmuir modeline uyduğu sonucuna varılmıştır. Adsorpsiyon işlemini kontrol eden mekanizmaların belirlenmesinde yalancı-birinci ve yalancı ikinci dereceden kinetik modeller incelenmiştir. Yalancı-ikinci dereden kinetik modelin HSA immobilize PHEMA kriyojellerle bilirubin adsorpsiyonu için daha uygun olduğu bulunmuştur. HSA immobilize PHEMA kriyojellerin tekrar kullanılabilirlikleri incelenmiş ve 10 adsorpsiyon-desorpsiyon döngüsü sonunda kriyojellerin adsorpsiyon kapasitesinde kayda değer bir azalma gözlenmemiştir.

Abstract:
In this study, HSA-immobilized PHEMA cryogels were prepared to remove bilirubin from human hyperbilirubinemi plasma. PHEMA cryogels were synthesized by free radical polymerization method. Cryogels were characterized by swelling tests, BET and SEM analysis and blood compatibility tests. The equilibrium swelling value and porosity were determined as 7.86 g H2O/ g cryogel and 69.6%, respectively. The specific surface area determined by BET was 27.2 m2/g and the avarage pore diameter was 68.2 Å. The optimum CNBr concentration for activation of cryogels was determined as 60 mg/mL. The effect of pH, flow rate, incubation time, and HSA concentration on HSA immobilization was examined. The maximum HSA immobilization was achieved at pH 7 for 1.0 mg/mL HSA concentration when the flow rate and incubation time were 0.75 mL/min and 30 min. Prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), fibrinogen time (FT) and thrombocyte clotting time (TCT) were determined in compatibility tests for blood. Platelet and leucocyte losses were 2.32 % and 5.17 %. 
The effect of bilirubin concentration in plasma, incubation time and temperature on bilirubin removal efficiency of PHEMA-HSA cryogels was examined in continuous mode. The plasma samples were over loaded with bilirubin up to 3.0 mg/dL and were interacted with PHEMA cryogels having different amounts of HSA and the decrease of bilirubin level in time was followed. Following an incubation period of 2 h, the bilirubin level in plasma was lowered to 1.23 mg/dL (minimum total bilirubin level for hyperbilirubinemi). The maximum bilirubin adsorption capacity was 25.35 mg/g from a plasma sample containing 3.0 mg/dL bilirubin at 37.5 oC. The desorption agent was 1.0 M NaCl and 0.1 M NaOH. The desorption ratio was over 97 % in all runs. Freundlich and Langmuir adsorption models were treated to examine the interaction between adsorbate and adsorbent and Langmuir model was better fitted. The pseudo-first order and pseudo-second order kinetic models were examined to determine the mechanism in adsorption process. The pseudo-second kinetic model was found suitable to describe the adsorption of bilirubin by HSA immobilized PHEMA cryogels. The reusability of HSA immobilized PHEMA cryogels was examined and no significant decrease in adsorption capacity was recorded following 10 consecutive adsorption-desorption cycles