Hematopoetik kök hücre nakli yapılmış hastalarda anjiyogenik faktör düzeylerinin aGvHH ile ilişkisi
The relationship between aGvHH and angiogenetic factor levels in hematopoietic stem cell transport Child health and diseases
Yazar: ÖZLEM ŞATIRER
Danışman: DOÇ. FATMA VİSAL OKUR
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Çocuk Hematolojisi Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Anjiyogenez = Angiogenesis ; Greft versus host hastalığı = Graft versus host disease ; Hematopoetik kök hücre transplantasyonu = Hematopoietic stem cell transplantation ; Hematopoetik kök hücreler = Hematopoietic stem cells ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HKHN) özellikle hematolojik kanserlerde, hastalık eradikasyonu için çok önemli bir tedavi seklidir. Ancak akut gelişen bir alloreaktif immünolojik  reaksiyon olan graft versus  lösemi  etkisi hematopoetik sistem dışına yayıldığında en önemli transplant komplikasyonlarından biri olan akut graft versus host  hastaligi (GvHH) gelişmesine neden  olmaktadır. Devam eden laboratuvar ve klinik çalışmalar ile aGvHH etyopatogenezi daha iyi anlaşılmaya başlanmıştır. Ancak belirlenen farklı biyobelirteç panellerinden (sistemik inflamasyon, immün aktivasyon, endotel hasari/aktivasyonu ile ilişkili) hiçbirinin aGvHH gelişme riskinin veya  steroid tedavi yanıtının erken tespiti sağlayacak etkinliği/güvenilirliği kanıtlanamamıştır. Son yıllarda elde edilen bilimsel veriler aGvHH gelişiminde vasküler endotel hücre hasarı, disfonksiyonu ve/veya aktivasyonunun da immün aktivasyon kadar kritik önem taşıdığını göstermiştir.
Transplantasyon öncesi verilen kemoterapi ve radyoterapi içeren yoğun hazırlama rejimleri, proflaktik immünsupresif tedaviler, engraftmanı desteklemek için kullanılan büyüme faktörleri ve gelişen enfeksiyonlar endotel hasarına neden olabilmektedir. Endotel hasarı endotel hücre aktivasyonuna ve anjiyogenezin uyarılmasına yol açar. Anjiyogenezin aGvHH gelişimindeki önemli rolü farklı araştırma sonuçları ile gösterilmiş olmasına rağmen anjiyogenez ile inflamasyon arasındaki ilişkinin aGvHH patogenezindeki rolü (neden veya sonuç iliskisi)  hala araştırılmaktadır.
Çalışmamıza Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı, Kemik İliği Transplantasyonu Ünitesi'nde, Haziran 2008 ile Ekim 2018 tarihleri arasındaki allojeneik HKHN yapılmış 37 tane hasta dahil edilmiştir. Hasta grubu, malign ya da malignite dışı nedenler ile HKHN yapılmış olan tüm hastaları kapsamaktadır [18 kız, 19 erkek; ortalama yaş: 8,5 (1-22 ) ].  Ayrıca  10 sağlıklı kök hücre vericisi kontrol grubu olarak çalışmaya dahil edilmiştir. Kontrol grubu ortalama yaşları 22,4 (2-39) olan 7 kadın ve 3 erkekten oluşmaktadır.
Hastaların hazırlık rejimi öncesinde (-9.günde) ve hazırlık rejimi tamamlandıktan hemen sonra, transplantasyon öncesi (0.günde)  toplanan plazma örneklerinden endotel hücre kaynaklı anjiogenik faktörlerlerden (Epidermal büyüme faktörü (EGF), Anjiopoetin-2 (Ang2), Endoglin, Follistatin (FS), Heparin bağlayıcı epidermal büyüme faktörü (HB-EGF), Plasental büyüme faktörü (PLGF) ve Vasküler endotelial büyüme faktör A (VEGF-A) düzeyleri multiplex immunoassay yöntemi ile çalışmıştır. Doku rejenerasyonu ile ilişkili trofik faktörler olan VEGF-A, HB-EGF, EGF ve inflamasyon/doku hasarı ile ilişkili olan Ang2, Folistatin ve Endoglin düzeylerine bakılarak aGvHH gelişme riskini belirlemede kullanılabilecek anjiyogenik bir profil elde edilmesi hedeflenmiştir. Ayrıca sistemik inflamasyon belirteçleri olarak serum ürik asit ve albümin değerleri, mutlak lenfosit ve monosit sayıları da rejim öncesi  (-9.günde) ve sonrası (0.günde) olmak üzere iki kez bakılarak kaydedilmiştir.
Calismaya dahil edilen tüm hastalarda ,Ang2, Endoglin, EGF, HB-EGF, VEGF-A plazma düzeyleri incelendiginde hazirlama rejimi öncesi (-9.gün) bakılan değerlerin rejim aldıktan sonra (0.gün) ciddi bir düşme gösterdiği ancak sadece Ang2 ve Endoglin icin kontrol grubu ile karsilastirildiginda bu degisimin istatiksel olarak anlamli olduğu tespit edilmiştir (p<0.05). Rejim sonrasi bakilan bu angiogenik faktör düzeyleri ile  kontrol grubundan elde edilen değerler karsilastirildiginda anlamli bir farklılık olmadigi bulunmuştur (p>0.05).
Plazma Folistatin düzeyleri incelendiğinde ise ise; hem rejim öncesinde (-9.gün) hemde rejim sonrasinda (0.gün) plazma değerinin kontrol grubu ile hem karsilastirildiginda anlamli olarak yüksek kaldigi gorulmustur. 
Aynı zamanda hastalardan hazirlama rejimi öncesinde ve sonrasında bakılmış olan sistemik inflamasyon belirteçleri olan ürik asit, albümin, absolü lenfosit, absolü monosit değerleri de karsilastirilmistir. Eksi dokuzuncu gün ve sıfırıncı gün absolü lenfosit ve monosit değerlerindeki değişim hem sayısal hem de istatistiksel açıdan anlamlı bulunmuştur. Diğer parametrelerde ise sayısal açıdan fark olmakla birlikte istatistiksel açıdan fark tespit edilememiştir.
aGvHH gelişen grup ile gelişmeyen hasta gruplari arasında rejim öncesi ve sonrasi plazma Ang2, VEGF-A, Endoglin, Follistatin, HB-EGF düzeyleri ve  diğer parametreler (ürik asit, albümin, absolü lenfosit, absolü monosit sayilari) ) acisindan farklılık olup olmadigi arastirildiginda gruplar arasinda hic bir farklılık olmadigi tespit edilmiştir.  
Daha sonra pre-transplant angiyogenik profil belirleme acisindan daha anlamli olabileceği düşünülerek rejim öncesi ve sonrasi değerlerin oranlanmasi ile indeks değerleri hesaplanmis ve aGvHH olan ve olmayan hastalar arasinda indeks değerleri acisindan farklılık olup olmadigi irdelenmiştir. aGvHH gelişen grupta Ang2 indeks ortalama değeri 3,59±2,98 bulunurken; GvHH geliştirmeyen grupta bu değer 1,99 ±1,11'dir (p=0.043). Endoglin, VEGF-A, Folistatin, HB-EGF, ürik asit, albümin, lenfosit, monosit parametrelerine ait indeks değerlerinde ise; iki grup arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark bulunamamıştır. 
Akut GvHH olan ve olmayan hasta grubunda ortalama sağ kalım süresi kıyaslandığı zaman aGvHH geliştirmeyen hastaların geliştiren hastalara göre daha uzun süre yaşadığı tespit edilmekle birlikte bu fark istatistiksel açıdan anlamlı bulunmamıştır (p>0.05). 
Lojistik Regresyon Analizi sonucuna göre aGVHH gelişme riski acisindan yapilan analizlerde primer hastalik sınıflamasi (malign vs. nonmalign), Ang2 ve albümin indeks değişkenleri önemli bulunmuştur  (p<0.05). Malign hastaliklar nedenle nakil yapılmış olan hastaların malign olmayan nedenle nakil yapılmış olan hastalara oranla akut GvHH görülme riski 9,72 kat fazladır. Ang2 indeks değerindeki bir birim artisin aGvHH hastalığı görülme riski 2,25 kat arttırdığı ve tedavi sonrası albümin değerindeki düşme yani  indeks değerindeki bir birimlik artışın ise aGvHH riskini 62 (1/0,016) kat arttırdığı bulunmuştur. 
Sonuç olarak allogeneik HKHN yapilan hastalarda nakil öncesi endotel ilişkili angiyogenik faktör düzeyleri prognostik bilgi edinebilmek amacıyla incelendiğinde  sadece vaskuler endotel hasari ve inflamasyon ile ilişkili olan Ang2 indeksi acisindan farklılık saptanmistir. Ang2 degeri yüksek olup,hazırlık rejimi sonrasi  yeterli düzeyde düşüş elde edilemeyen dolayısı ile Ang2 indeksi yüksek olan hastalarin aGvHH gelisimi acisindan riskli olduklari tespit edilmiştir.. Diger angioyogenik faktörler ile aGvHH gelişimi arasinda ilişki tespit edilememiştir. Bu durum calismadaki hasta sayimizin sinirli olmasindan kaynakli olabilir. Ancak hem aGvHH olan hemde olmayan hastalarda rejim sonrasi benzer degisim paternlerinin izlenmiş olmasi, aGvHH henüz gelişmediği erken donemdeki inflamasyon baslangicindaki endotel hücre değişim mekanizmalarinin, aGvHH geliştikten sonra görülen endotel hücre activasyon/hasar mekanizmalarindan farkli olabileceğini düşündürtmektedir. Dolayisi ile transplant öncesi aGvHH gelişme riskini tespit edebilmek için bu mekanizmalarin aydinlatilmasi ve daha geniş kapsamli klinik arastirmalar ile bu sonuclarin dogrulanmasi gerekmektedir. Bu calisma sonunda elde edilen ve aGvHH gelişme riski acisndan anlamli bulunan Ang2 ve Albumin indeksleri ayni zamanda immun regulatuvar rolleride olan angiogenik faktörler ile inflamasyon baslangici arasindaki bu iliskinin daha detayli arastirilmasi gerekliliğini göstermektedir.

Abstract:
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a very important treatment for disease eradication, especially in hematological cancers. However, when the effect of graft versus leukemia spreading out of the hematopoietic system, an acute alloreactive immunological reaction, causes acute graft versus host disease (GvHD) which is one of the most important transplant complications. The ongoing laboratory and clinical studies have begun to better understand the etiopathogenesis of aGvHH. However, the efficacy / safety of none of the different biomarker panels (systemic inflammation, immune activation, associated with endothelial injury / activation) to provide early detection of aGvHH development or steroid treatment response could not be established. Recent scientific data have shown that vascular endothelial cell damage, dysfunction and / or activation are as critical as immune activation in the development of aGvHH.
Intensive preparation regimens including chemotherapy and radiotherapy given before transplantation, prophylactic immunosuppressive therapies, growth factors used to support engraftment and developing infections may cause endothelial damage. Endothelial damage leads to endothelial cell activation and stimulation of angiogenesis. Although the role of angiogenesis in aGvHH development has been demonstrated by different research results, the role of the relationship between angiogenesis and inflammation in the pathogenesis of aGvHH is still being investigated.
In our study, 37 patients with allogeneic HSCT between June 2008 and October 2018 were included in the study of the Bone Marrow Transplantation Unit, Department of Pediatrics, Hacettepe University, Faculty of Medicine. The patient group consisted of all patients who underwent HSCT for malignant or non-malignant reasons [18 girls, 19 men; Mean age: 8.5 (1-22)]. In addition, 10 healthy stem cell donors were included in the study as a control group. The control group consisted of 7 women and 3 men with a mean age of 22.4 (2-39).
Before the preparation regimen of the patients (day -9) and immediately after completion of the preparation regimen, plasma samples collected before transplantation (day 0) from endothelial cell-derived angiogenic factors (Epidermal Growth Factor (EGF), Angiopoietin-2 (Ang2), Endoglin, Follistatin (FS), Heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF), Placental growth factor (PLGF) and Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) levels were studied by multiplex immunoassay method VEGF-A, the trophic factors associated with tissue regeneration. The aim of this study is to obtain an angiogenic profile which can be used to determine the risk of aGvHH development by looking at the levels of HBV-EGF, EGF and inflammation / tissue damage in terms of Ang2, Folistatin and Endoglin levels. pre-regime (-9th day) and later (on day 0) were recorded twice.
In all patients included in the study, Ang2, Endoglin, EGF, HB-EGF, VEGF-A plasma levels were examined when the pre-treatment regimen (-9th day) values after the regime (day 0) showed a significant decrease but only Ang2 and Endoglin It was determined that this change was statistically significant when compared with the control group (p <0.05). There was no significant difference between these angiogenic factor levels and the control group (p> 0.05).
Plasma Folistatin levels are examined; It was observed that the plasma values were significantly higher when compared with the control group both before the regimen (-9th day) and after the regime (day 0).
At the same time, uric acid, albumin, abscess lymphocyte and absolute monocyte values, which are the markers of systemic inflammation, were compared before and after the preparation period. The change in abscess lymphocyte and monocyte values on day minus ninth day and zero day were found to be both statistically significant and statistically significant. In other parameters, although there is a difference in terms of numerical difference, no statistically significant difference was found.
The groups that did not develop with aGvHH group were evaluated before and after the administration of the groups. There was no difference between them.
Afterwards, it was thought that pre-transplant angiogenic profile could be more meaningful and the index values were calculated with the ratio of the values before and after the regime and whether there was any difference between the patients with and without aGvHD. The mean value of Ang2 index was 3.59 ± 2.98 in the developing group. In the group who did not develop GvHH, this value was 1.99 ± 1.11 (p = 0.043). In the index values of Endoglin, VEGF-A, Folistatin, HB-EGF, uric acid, albumin, lymphocyte and monocyte parameters; There was no statistically significant difference between the two groups.
Although the mean survival time of the patients with and without acute GvHH was compared with the patients who did not develop aGvHH compared to the patients who developed it, this difference was not found statistically significant (p> 0.05).
According to the results of logistic regression analysis, primary disease classification (malignant vs. nonmalign), Ang2 and albumin index variables were found to be significant in the analyzes made for the risk of developing aGVHD (p <0.05). The risk of acute GvHH is 9.72 times higher than the patients who underwent transplantation because of malignant diseases. It was found that a unit increase in Ang2 index increased the risk of aGvHH disease by 2.24 times and a decrease in albumin value after treatment, ie a one-unit increase in the index value increased the risk of aGvHH by 62 (1 / 0.016).
In conclusion, endothelium-related angiogenic factor levels before transplantation in patients undergoing allogeneic HSCT were statistically different from Ang2 index, which was associated with vascular endothelial injury and inflammation. Ang2 value is high and it is determined that patients with high Ang2 index are at risk of developing aGvHH after the preparation regimen. Therefore, there was no relationship between the other angioyogenic factors and aGvHH development. This may be due to the limited number of patients in our study. However, the similar patterns of change in patients with and without aGvHH have been shown to be different from the endothelial cell activation / damage mechanisms seen in the onset of inflammation at the beginning of inflammation in the early period when aGvHH has not been developed. Therefore, in order to determine the risk of aGVHH before transplantation, these mechanisms should be illuminated and these results should be verified with a wider clinical research. The Ang2 and Albumin indices obtained at the end of this study and which are significant in terms of the risk of developing aGvHH also indicate the necessity to investigate this relationship between the onset of angiogenic factors in the immune regulated roles and the onset of inflammation.

Keywords: Hematopoietic Stem Cell Transplantation, Graft versus Host Disease, Angiogenetic Factors