Bacillus thuringiensis SY49-1 suşuna ait cry1 ve cry2 genlerinin klonlanması, ifadesi ve böcek öldürücü etkilerinin belirlenmesi
Cloning, expression and insecticidal activity of cry1 and cry2  
genes from bacillus thuringiensis SY49-1 strain
Yazar: UĞUR AZİZOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. ABDURRAHMAN AYVAZ ; DOÇ. DR. SEMİH YILMAZ
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bacillus thuringiensis (Bt) birçok zararlı böcek üzerinde toksik etki gösteren gram pozitif bir bakteridir. Bt'in birçok suşu birden fazla cry gen bulundurur ve farklı konukçu spektrumuna sahiptir. Bu çalışmaya konu olan Bt SY49-1 suşu cry1, cry2, cry4, cry5 ve cry9 olmak üzere beş adet cry gen taşımaktadır. Bu çalışma Ephestia kuehniella ve Culex pipiens larvalarına karşı cry1 ve cry2 gen ürünlerinin toksisite seviyelerini belirlemek için planlanmıştır. Bu nedenle Bt SY49-1 suşunun cry1Ab ve cry2 genleri pET28a(+) ifade vektörüne ligasyon yapılarak pET-cry1Ab ve pET-cry2 rekombinant plazmitleri elde edilmiştir. Bu plazmitler CaCl2 metodu ile kompetan hale getirilmiş E. coli BL21(DE3) suşuna aktarılmıştır. Bu genlerin E. coli BL21(DE3) suşunda ifadesini güçlendirmek amacıyla IPTG indüklemesi yapılmıştır. İndükleme sonucunda sırasıyla ~130 ve ~70 kDa büyüklüğünde rekombinant Cry1Ab ve Cry2 proteinleri elde edilmiştir. Yapılan aktivite denemlerinde E. kuehniella larvalarına karşı Cry1Ab ve Cry2 toksinlerinin 1000 µg\g'lık dozu % 64 oranında ölüme sebep olmuştur. Aynı toksinler eşit hacimde karıştırılıp (Cry1Ab+Cry2) uygulandığında ise % 65 oranında ölüm meydana gelmiştir. Bt SY49-1 suşunun spor-kristal karışımının aynı dozu uygulandığında ise larvaların % 90'ı ölmüştür. Plazmit taşımayan E. coli BL21(DE3) uygulandığında ise aynı dozda önemli bir ölüm oranı (% 10) gözlenmemiştir. Bt SY49-1 spor-kristal karışımının 500 µg\ml'lik dozu C. pipiens larvalarının tamamına yakınını (% 97) öldürmüşken, rekombinant Cry2 proteini ve E. coli BL21 (DE3) suşu aynı zararlı üzerinde sırasıyla % 37 ve % 10 oranında ölüme neden olmuştur. 
Anahtar Kelimeler: Bt SY49-1, Gen klonlama, Rekombinant Cry1Ab ve Cry2 proteini, E. kuehniella, C. pipiens İnsektisidal aktivite

Abstract:
Bacillus thuringiensis (Bt) is a gram positive soil bacteria and has insecticidal activity against many important insect pests. Many strains of the Bt may harbour more than one cry genes and has different host spectrum. Bacilus thuringiensis SY49-1 strain , used in this study, has five cry genes being cry1, cry2, cry4, cry5 and cry9. This study has planned to determine the toxicity levels of cry1Ab and cry2 genes against Ephestia kuehniella and Culex pipiens larvae. For this purpose pET-cry1Ab and pET-cry2 recombinant plasmids were constructed thorugh ligating the cry1Ab and cry2 genes of Bt SY49.1 strain into pET28a(+) expression vector. Consequently, the recombinant plasmids were transfered to E. coli BL21(DE3) strain rendered competent with CaCl2 method. IPTG induction was carried out to improve the expression of the genes in E. coli BL21(DE3). As a result of induction ~130 and ~70 kDa Cry1Ab and Cry2 proteins were obtained, respectively. The bioassay results indicated that recombinant Cry1Ab and Cry2 toxins at dose of 1000 µg\g caused 64 % mortality on E. kuehniella larvae. When the same proteins were mixed (Cry1Ab+Cry2) at the equal amount and applied to the same pest, 65 % mortality rates were obtained. However, the same dose of spor crystal mixture of the Bt SY49-1 strain caused 90 % mortality. Plasmid free E. coli BL21(DE3) strain used as controls did not cause significant mortality (% 10) at the same dose. In the bioassay conducted with C. pipiens, while 500 µg\ml dose of Bt SY49-1 spor-crystal mixture caused nearly complate mortality (97 %), recombinant Cry2 and E. coli BL21 (DE3) strains had only 37 % and 10 % mortality, respectively.
Keywords: Bt SY49-1, Gene clonning, Recombinant Cry1Ab and Cry2 proteins, E. kuehniella, C. pipiens, Insecticidal activity