Yüzeye modifiye edilen aptamer uç gruplarının aptamer-protein etkileşimlerine etkisinin kütle spektrometresi ile incelenmesi
Investigation of the effects of surface modified aptamer end groups on aptamer-protein interactions by mass spectrometer
Yazar: FUNDA YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Aptamerler farklı özelliklerle sentezlenebilen ve hedef moleküllerine (protein, enzim, virüs, hormon vb.) yüksek seçicilikle bağlanabilen deoksiribonükleik asit (DNA) veya ribonükleik asit (RNA) zincirleridir. Aptamerler, antikorların zayıf özeliklerini ortadan kaldırarak, araştırmalarda antikorların yerine kullanılmalarıyla bilinmektedirler. Aptamerler tek zincirli doğal DNA veya RNA moleküllerinden seçilirler. Geniş biyoanalitik uygulamalardaki fonksiyonlarını ve bağlanmalarını arttırmak için aptamerler 3' ve 5' uçlarından çeşitli gruplarla (-NH2, -SH vb.) modifikasyona uğratılırlar. Aptamerler, biyolojik örneklerde düşük miktarlarda bulunan proteinlerin tayinlerinde biyo-işaretleyici (biomarker) olarak kullanılabilirler ve bu sayede karmaşık protein karışımlarından hedef molekülün izole edilmesini sağlarlar. Böylelikle, teşhis ve tedavi edici özelliğe sahip olan hücresel hedefler için seçilen aptamerler sayesinde kanser hücresi ve tümör tayinleri gibi uygulamalarda çok önemli ilerlemeler kaydedilmektedir. Bu tür uygulamaların geliştirilmesi için aptamer-hedef molekül etkileşimlerinin dayandığı bilimsel temellerin belirlenmesi çok önemlidir.
Aptamerlerin yukarıda da bahsedilen eşsiz özelliklerinden dolayı, tez kapsamında yapılan çalışmalarda yüzeye modifiye edilen aptamer uç gruplarının aptamer protein etkileşimlerine etkileri araştırılmıştır. Trombin aptamer çeşidinin etkilerinin gözlenmesi için 24 farklı modifiye aptamer hedef insan trombin proteini ile etkileştirilmiştir. Öncelikle, 5' ve 3' uçlarında farklı sayıda baz birimine sahip trombin aptameri kovalent olarak tiyol (-SH) veya amin ( -NH2) fonksiyonel gruba sahip uçlarından Sülfo-Süksinimidil-4-(N-maleimidomethyl) siklohekzan-1-karboksilat (Sülfo-SMCC) ya da Bis(sülfosüksinimidil süberat) (BS3) uygun çapraz bağlayıcılarından biri kullanılarak amin fonksiyonlu polimerik yüzeye sabitlenmiştir. Yüzeye sabitlenen her bir aptamer 3,5 pmol/ µL insan trombin protein ile muamele edilmiştir. Katı destek yüzeyine kimyasal bağla bağlanan aptamerle etkileştirilip seçimli olarak zenginleştirme işleminin ardından, katı yüzeyde tripsin enzimi ile parçalama uygulanmıştır. Trombinin triptik parçalama ürünlerinin tanımlama ve dizilim analizleri matriks-yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaştırmalı-kütle spektrometrisi (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Mass Spectrometry, MALDI-MS) ile gerçekleştirilmiştir. Her etkileşim için etkin aptamer-protein etkileşimleri karşılaştırılmıştır. Kütle spektrumlarında uç grubunda 6 timin baz birimi bulunan aptamerlerde trombin peptit fragmentleri ile daha fazla karşılaşılmıştır. Bunun yanı sıra, aptamer ile zenginleştirme işlemi gerçekleştirilerek birçok proteinin bulunduğu karmaşık çözelti örneğinden trombin zenginleştirilmesi uygulanmıştır. MALDI-MS analiz sonuçları incelenerek trombinin karmaşık bir örnekten tezde geliştirilmiş yöntem kullanılarak aptameri tarafından seçilebileceği görülmüştür.

Abstract:
Aptamers are deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) chains that can be synthesized with different properties and bind to target molecules (i.e., proteins, enzymes, viruses and hormones) with very high selectivity. Aptamers are widely known as a substitute for antibodies, because they overcome the weaknesses of antibodies. Aptamers are selected from single stranded DNA or RNA molecules made of natural nucleotides. To increase functionality and affinity of aptamers in diverse bioanalytical applications, aptamers have been modified by different functional groups (i.e. -NH2, -SH etc.) from different parts such as 5' and 3'-terminus. Aptamers can be used as a biomarker for the detection of proteins at very low levels in biological samples and provide isolation of targeted molecules from the complex protein mixtures. Thus, very important developments have been carried out for the detection of cancer cells and tumors using the selected aptamers for the cellular targets having diagnostic and therapeutic capabilities. Therefore, it is very important to identify scientific basis of the aptamer-target molecule interactions to improve these diagnostic and therapeutic applications.
Due to the unique properties of the aptamers mentioned above, in the scope of this thesis, the effects of surface modified aptamer end groups on aptamer protein interactions are investigated. To observe the effects of thrombin aptamer type, 24 different modified thrombin aptamer were used to interact with targeted human thrombin. Firslty, each aptamer immobilized surfaces was obtained by covalent attachment of thrombin aptamers via thiol (-SH) or amine ( -NH2) functional groups at 5' or 3' ends which contains different number of base units onto the amine functionalized polystyrene divinyl benzene polymeric surface using appropriate crosslinkers such as Sulfo-succinimdyl-4-(N-maleimidomethyl) cylohexane-1- carboxylate (Sulfo-SMCC) or Bis(sulfosuccinimdyl suberate) (BS3). Surface-immobilized aptamers were incubated with 3.5 pmol/µL human thrombin solution. After the selective enrichment process of thrombin using chemically attached aptamers onto the solid surface, enzymatic digestion process via trypsin was carried out on the surfaces. Analysis were performed for the determination and identification of the peptide sequences in tryptic digests of thrombin protein by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Mass Spectrometry (MALDI-MS). The comparisons for the effective aptamer-protein interactions were made. In the mass spectra highly abundant signals of specific thrombin fragments were observed especially in the case of 6 thymine base units containing aptamer. Also, enrichment of the thrombin process was applied to the complex sample solutions which include a number of proteins were analyzed using MALDI-MS and it was observed that thrombin could be enriched with high selectivity from the very complicated protein matrix solutions via this developed method.