Kitinolitik Bacillus suşları kullanılarak kitooligosakkaritlerin enzimatik üretimi
Enzymatic synthesis of chitooligosaccharides by using chitinolytic Bacillus strains
Yazar: FAKHRA LIAQAT
Danışman: PROF. DR. RENGİN ELTEM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bacillus = Bacillus ; HPLC =   ; Kitin = Chitin

Özet:
Kitin ve kitosanın enzimatik veya kimyasal depolimerizasyonu ile kitooligosakkaritler (COS) elde edilmektedir. Suda çözünen ve düşük molekül ağırlıklı kitooligosakkarit türevleri, birçok açıdan ana polimerden üstündür. COS'ler çok geniş alanda biyolojik aktiviteye ve çeşitli endüstrilerde dikkat çekici potansiyel uygulama alanına sahiptir. Bu proje daha önce izole edilen ve moleküler olarak tanımlanmış yerli Bacillus suşları tarafından üretilen farklı kitosanaz enzimleri kullanılarak kitosanın enzimatik hidrolizi ile COS üretmek amacı ile planlanmıştır. Bu amaçla, maksimum kitinaz ve kitosanaz aktivitelerinin belirlenmesi için 16 farklı kitinolitik Bacillus suşu taranmıştır. İstatistiksel yöntemler kullanılarak kitosanaz üretiminin optimizasyonu için Bacillus mojavensis EGE-B-5.2i (GenBank aksesyon numara KC119405) seçilmiştir. 7,5 g L⁻¹ çözünür nişasta, 6,5 g L⁻¹ kolloidal kitosan, 7,5 g L⁻¹ pepton ve 3,5 g L⁻¹ NaCI içeren bir ortam keşfedilmiş ve optimize edilmiş ortam kullanılarak kitosanaz aktivitesi 9,5 kata kadar artmıştır.
Daha sonra 37 kDa'lık bir kitosanaz iyon değişim kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılmış kitosanazın optimum sıcaklığı ve pH'sı sırasıyla 55°C ve 5,5 olarak belirlenmiştir. Enzim aktivitesinin %66'sının bir saat boyunca 55°C'de stabil olarak kaldığı ayrıca geniş bir pH (3,0-11,00) aralığında stabil olduğu saptanmıştır. Kitosanaz için optimum substrat çözünür kitosan olmuş ve çözünür kitosan ile enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 2,1 mg mL⁻¹ ve 244,5 µmol min⁻¹ mg⁻¹ olarak belirlenmiştir.
Ayrıca, COS analizi için HPLC yöntemini optimize etmek için farklı kolonlar ve detektörler test edilmiştir. Daha sonra DAD detektörü ve Hypersil APS-2 kolonu kullanılarak bir gradiyent elüsyon yöntemi optimize edilmiştir. Bacillus suşlarının ham kitosanaz ekstraktları, kitosanı COS'lere hidrolize etmek için kullanılmış ve hidrolizatlar, optimize edilmiş yöntem kullanılarak HPLC ile kantitatif olarak analiz edilmiştir. 14 Bacillus suşunun ham kitosanaz ekstraktları, kitosanı COS'lere başarılı bir şekilde hidrolize edebilmiş ve polimerizasyon derecesi (DP) 2-6 arasında olan farklı oligomerler tespit edilmiştir. COS ürünlerinin relatif verimleri %11-31 aralığında belirlenmiş ve Bacillus thuringiensis EGE-B-3.5m suşunun ham  kitosanaz ekstraktı ile en yüksek relatif verim (%31) elde edilmiştir. Ham kitosanaz ekstraktlarının çoğukitosanın hidroliz ürünü olarak kitobiyoz oluşturmuştur. HPLC metodu, COS karışımının etkili bir şekilde ayrılmasını sağlayabilmesine rağmen, sonuçların doğrulanması ve oligomerlerin doğru karakterizasyonu için LC-MS, MALDI-TOF-MS ve NMR analizinin yapılması gerekli olmuştur.

Abstract:
The enzymatic or chemical depolymerisation of chitin and chitosan delivers chitooligosaccharides (COS). Water soluble, low molecular weight and biologically active COS derivatives are superior to the parent polymers in multiple aspects. This project was designed to produce COS by enzymatic hydrolysis of chitosan using crude chitosanase extracts of previously isolated and identified indigenous chitinolytic Bacillus strains. For this purpose, 16 different chitinolytic Bacillus strains were tested for their chitinase and chitosanase activities. Bacillus mojavensis EGE-B-5.2i (GenBank accession number KC119405) was selected for chitosanase production optimization using statistical methods. A medium containing 7.5 g L⁻¹ soluble starch, 6.5 g L⁻¹ colloidal chitosan, 7.5 g L⁻¹ peptone and 3.5 g L⁻¹ NaCl was discovered and chitosanase activity was enhance up to 9.5 folds using the optimized medium. 
A chitosanase of 37 kDa was then purified by using ion exchange chromatography. The optimum temperature and pH of purified chitosanase were 55°C and 5.5, respectively. The enzyme was stable at 55°C for 1 h with 66% of its activity and also stable in a wide range of pH (3.0-11.0). The optimum substrate for the chitosanase was soluble chitosan and the Km and Vmax values of enzyme with soluble chitosan were 2.1 mg mL⁻¹ and 244.5 µmol min⁻¹ mg⁻¹, respectively. 
Furthermore, different columns and detectors were tested to optimize the HPLC method for COS analysis. A gradient elution method was then optimized using DAD detector and Hypersil APS-2 column. The crude chitosanase extracts of Bacillus strains were used to hydrolyse chitosan into COS and the hydrolysates were quantitatively analysed by HPLC using optimized method. Chitosanases of 14 Bacillus strains were able to successfully hydrolyse chitosan to COS and different oligomer from DP 2-6 were detected. Relative yields of the COS products were in a range of 11-31% and chitosanase of Bacillus thuringiensis EGE-B-3.5m has presented maximum relative yield (31%). For most of the chitosanases the major chitosan hydrolysis product was chitobiose. Although the HPLC method was capable to provide efficient separation of COS mixture but for the validation of results and proper characterization of oligomers LC-MS, MALDI-TOF-MS and NMR analysis of the products is necessary.