Bazı mikrobiyolojik metabolitlerin çipura (Sparus aurata)'daki bozucu mikroorganizmalar üzerine etkisi ve soğukta depolama aşamasında kullanılma potansiyeli
Effect of some microbiological metabolites on specific spoilage microorganisms in gilthead sea bream (Sparus aurata), and their usage potential in cold storage
Yazar: HATİCE HASANHOCAOĞLU YAPICI
Danışman: PROF. DR. LATİF TAŞKAYA ; DOÇ. DR. ÖZGÜR CEYLAN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: Gıda kalitesi = Food quality ; Gıda katkı maddeleri = Food additives ; Gıda mikrobiyolojisi = Food microbiology ; Mikrobiyolojik bozulma = Microbiological spoilage ; Pseudomonas = Pseudomonas ; Su ürünleri = Aquatic products ; Çipura balığı = Seabream

Özet:
Su ürünleri, son yılların en fazla büyüyen gıda sektörlerindendir. Ancak özellikle mikroorganizma aktiviteleri yüzünden çabuk bozulan gıdalar arasında yer almaktadır. Bu da su ürünleri endüstrisinin karşı karşıya olduğu en büyük problemdir. Tüm canlılarda olduğu gibi balıkların da yaşam süreçleri boyunca doğal bir mikroflorası vardır. Mevcut mikroflora hasattan sonra pek çok değişime uğrayarak sonunda yalnızca belirli bazı mikroorganizma türleri ortamda baskın hale geçerek bozulmaya neden olurlar. Bir gıdanın kalitesini korumak ve raf ömrünü uzatmak için öncelikli olarak bu bozulmaya neden olan dominant mikroorganizmaların belirlenmesi ve bunlar üzerine inhibe edici çalışmaların yapılması gerekmektedir.
Bu amaçla tez çalışmasında öncelikle ülkemiz için değerli bir balık olan çipura balığı (Sparus aurata) materyal olarak seçilmiş ve bozulmaya neden olan dominant mikroorganizmaları belirlenmiştir. Temin edilen balıklar buzlanarak aerobik koşullarda 16 günlük soğuk muhafazaya (+4±2°C) alınmıştır. Depolama süresince analiz günlerinde toplam bakteri, maya&küf, psikrotrofik ve lipolitik bakteri için ekimler yapılmıştır. PCA'ya yapılan ekimlerden farklı morfolojideki koloniler izole edilmiştir. İzolatlara gram boyama ve oksidaz testleri yapılarak, aynı sonuçları veren izolatlar gruplandırılmıştır. Farklı gruplardan izolatlar seçilerek önce API kitleri, daha sonra 16S rDNA yöntemi kullanılarak PZR ile tanımlanmış ve bozulmaya neden olan dominant bakteriler Pseudomonas fragi ve Pseudomonas fluorescens grup olarak belirlenmiştir. 
Mikroorganizmalar biyolojik faaliyetleri sonucu metabolit adı verilen küçük moleküller sentezlemektedir. Mikroorganizmaların ürettikleri bu metabolitler gıdalarda doğal koruyucu olarak kullanabilmektedir. Bu tez çalışmasında birer mikrobiyolojik metabolit olan mevinolin, nisin ve oksitetrasiklin satın alınarak, çipuranın dominant bozulma bakterileri üzerindeki etkilerinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Bunun için öncelikle metabolitlerin minimum inhibisyon konsantrasyonları (MİK) belirlenmiştir. Mevinolinin her iki bakteri üzerindeki MİK değeri 32 µg/ml olarak tespit edilmiştir. Çalışmada nisinin, gram negatif olan P. fragi ve P. fluorescens bakteriler üzerinde, 0.125 – 128 µg/ml aralığında gerçekleştirilen analizlerde MİK değeri belirlenememiştir. Oksitetrasiklin metabolitinin ise P. fragi ve P. fluorescens üzerinde sırasıyla 1 ve 8 µg/ml MİK değerine sahip olduğu tespit edilmiştir. 
Kullanılan miktarın ve maliyetin oldukça düşük olması sebebi ile solüsyon çalışmaları oksitetrasiklin ile gerçekleştirilmiştir. Öncelikle oksitetrasiklin metabolitinden konsantrasyonu 8 µg/ml olacak şekilde 200 ml solüsyon hazırlanarak disk düfizyon yöntemi ile belirlenen dominant bakteriler üzerindeki antimikrobiyal etkisi değerlendirilmiştir. Hazırlanan oksitetrasiklin solüsyonun P. fragi ve P. fluorescens üzerindeki en büyük inhibisyon zonunun sırasıyla 22.6 ve 13.1 mm olduğu tespit edilmiştir. 
Son olarak farklı bir parti çipura balığı temin edilerek yine konsantrasyonu 8 µg/ml olan oksitetrasiklin solüyonu 3 farklı yöntem (daldırma, sprey, buz) ile balıklara uygulanmıştır. Kontrol (K), daldırma (D), sprey (S) ve buz (B) grupları yine aerobik şartlarda soğuk havada (+4±2°C) 16 gün boyunca depolanmış ve raf ömrünü belirlemek için aralıklarla duyusal, mikrobiyolojik ve kimyasal analizler yapılmıştır.
Analiz sonuçlarına göre buz şeklinde uygulanan oksistetrasiklinin çipuranın duyusal ve mikrobiyolojik açıdan raf ömrünü kontrol grubuna göre 5 gün kadar uzattığı belirlenmiştir. Ayrıca kontrol grubuna göre Pseudomonas spp.'de en az 2 log, proteolitik bakterilerde de en az 1 log düşüş sağladığı ortaya konmuştur. Kimyasal olarak toplam uçucu bazik azot (TVB-N) (31.36 mg/100g) ve trimetilamin azot (TMA-N) (1.03 mg malonaldehit/kg) değerlerinin diğer gruplara göre çok daha az seviyelerde kaldığı belirlenmiştir. Tiyobarbütirik asit (TBA) değerleri incelendiğinde 17. günde kontrol, daldırma ve sprey grupları sırasıyla 5.30, 4.71 ve 4.94 mg malonaldehit/kg iken; oksitetrasiklinli buz uygulaması 2.46 mg malonaldehit/kg'dır. TBA sonuçlarına göre oksistetrasklinin ayrıca antioksidan özelliğinin de güçlü olduğu görülmektedir. Çipura örneklerinin başlangıçtaki ham protein ve ham yağ değerleri sırasıyla %18.56 ve %10.55'tir. Depolamanın 17. gününde bu değerler kontrol (%17.57 ve %9), daldırma (%16.97 ve %6.74) ve sprey (%16.53 ve %8.55) grubunda kayıba uğradığı görülmüştür. Buz uyglunan grupta ise ham protein ve ham yağ değerleri %18.23 ve %10.45 ile tazeye en yakın besin içeriğine sahip grup olarak tespit edilmiştir.
Oksitetrasiklinin; soğuk depolama süresince çipura balığının bozulma etmeni mikroorganizmaları üzerindeki inhibe edici etkisi ortaya konulmuştur. Yapılan denemeler sonucunda oksitetrasiklinin buz olarak uygulanmasının raf ömrünü uzatmak için çok daha etkili bir yöntem olabileceği belirlenmiştir. Ayrıca su ürünleri işleme tesislerinde kullanılma potansiyeli ve önemi tartışılmıştır.

Abstract:
Seafood is one of the fastest growing food markets in recent years. However, it is among quickly spoiling food especially due to microorganism activity. This is one of the biggest challenge facing seafood industry. Fish, as all living, have a natural microflora during their lifetime. Current microflora undergoes many changes after harvesting, only some specific microorganisms become dominant in environment resulting in spoilage. In order to quarentee quality and expand shelf life of any food product; it is mandatory to determine this spoilage causing dominant microorganisms and perform prohibitive precautions on them. 
Therefore; first of all, gilthead sea bream (Sparus aurata) which is a valuable species in our country, was selected as main material in this thesis and dominant microorganisms causing its spoilage was determined. Procured fish were placed in ice and stored in cold (+4±2°C) for 16 days in aerobic conditions. Total bacteria, lipolytic bacteria, yeast&mould and psychrotrophic bacteria were performed during storage. Colonies with varying morphologies were isolated from PCA plantings. Isolates producing similar results in gram staining and oxidase test were grouped as one. Isolates obtained from different groups were identified first by API kits then 16S rDNA sequencing by PCR and Pseudomonas fragi and Pseudomonas fluorescens groups were detected as dominant spoilage bacteria.
Microorganisms synthesize small molecules called metabolites as result of their biological activities. These metabolites can be used as natural preservatives for food. Thus; mevinolin, nisin and oxytetracycline, which are microbiological metabolites, were purchased and their effects on mentioned dominant spoilage bacteria for gilthead sea bream was studied in this thesis. To do so; first of all, Minimum Inhibatory Concentration (MIC) of metabolites were identified. MIC value of mevinolin on both bacteria was identified to be 32 µg/ml. MIC value of nisin on P. fragi and P. fluorescens, which are gram-negative bacteria, could not be detected in series of analysis performed in 0.125 – 128 µg/ml range. Oxytetracycline metabolite's MIC values on P. fragi ve P. fluorescens were detected as 1 and 8 µg/ml respectively.
Solution applications were performed with oxytetracycline due to low amount and hence cost of required usage. First; 200 ml solution with 8 µg/ml oxytetracycline concentration was prepared and its antimicrobial effect using disc diffusion method on dominant spoilage bacteria was researched. Maximum inhibitoin zone of prepared oxytetracycline solution on P. fragi and P. fluorescens were identified as 22.6 and 13.1 mm respectively.
Finally, oxytetracycline solution, again with 8 µg/ml concentration, using 3 different methods (dipping, spraying and ice) was applied to another party of gilthead sea bream. Control (K), dipping (D), spraying (S) and ice (B) groups were, again, stored in cold (+4±2°C) and aoreobic conditions for 16 days. Sensory, microbioligical and chemical analysis were performed periodically on these groups in order to identify shelf life.
Analysis results unveiled that oxytetracycline applied as ice (B) increases sensory and microbioligical shelf life of gilthead sea bream about 5 days compared to control (K) group. It was also found out that; application of oxytetracycline applied as ice (B) causes a decrease at least 2 log in Pseudomonas spp. and 1 log in proteolytic bacteria compared to control (K) group. Chemically it was detected that total volatile base nitrogen (TVB-N) (31.36 mg/100g) and trimethylamine nitrogen (TMA-N) (1.03 mg malonaldehit/kg) values are much lower compared to other groups. Thiobarbituric acid (TBA) values at day 17 for control (K), dipping (D) and spray (S) groups were 5.30, 4.71 and 4.94 mg malonaldehit/kg respectively whereas it was close to half at 2.46 mg malonaldehit/kg for oxytetracycline ice (B) application. TBA values also shows that; oxytetracycline, in addition, has stronger antioxidant feature. Initial raw protein and raw lipid values of gilthead seabream samples were 18.56 %and 10.55 %. At day 17; those values were observed to drop in control (17.57 %and 9 %), dipping (16.97 %and 6.74 %) and spray (16.53 %and 8.55 %) groups. Oxytetracycline ice group was detected to be closest group to the fresh food content with raw protein and raw lipid values at 18.23 %and 10.45 %respectively.
It is manisfested that oxytetracycline has an inhibiting effect on dominant spoilage microorganisms of gilthead sea bream during cold storage. Its application in the form of ice is a much better method for increasing shelf life as a result of assays has been done in this study. In addition, the potential of using in seafood processing and importance of oxytetracycline were discussed.