İnsan göbek kordonu stroması kaynaklı kök hücrelerin 
in vitro koşullarda gerçekleştirdiği hücresel dönüşümün 
epitel mezenkim geçişi çerçevesinde değerlendirilmesi
The assessment of cellular transformation in view of epithelial-mesenchymal transition of human umbilical cord-derived stromal stem cells upon in vitro culture conditions
Yazar: HAKAN COŞKUN
Danışman: PROF. DR. ALP CAN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Laboratuvar koşullarında kültürü yapılan insan göbek kordonu stroması mezenkimal kök hücreleri (iGKS-MKH) iki farklı fenotip ile karşımıza çıkmaktadır. Tip 1 ve Tip 2 olarak adlandırılan bu hücreler kültür ortamında heterojen bir yapıda olup, ilk pasajlardaki kültür ortamı Tip 1 hücrelerce zengin iken ilerleyen pasajlarda yerini Tip 2 hücrelere bırakmaktadır. Tip 1 hücreler geniş sitoplazmalı, son derece yassı ve stres liflerince zengin bir fenotip sergilerken; Tip 2 hücreler fibroblastoid olup uzun sitoplazmik uzantılara sahiptir. Bu bulgular ve deneyimler doğrultusunda göbek kordonu stromasından izole edilen hücreler arasında in vitro koşullarda bir geçişin olduğunu ön görmekteyiz. Bu olay EMG süreci ile ilişkilendirildiğinde Tip 1 hücrelerin ilerleyen pasajlarda yerini Tip 2 hücrelere bıraktığı düşünülebilir. Bu geçişin epitel mezenkim geçişinden ziyade bir miyofibroblast fibroblast geçişi olabileceğini düşündük ve bu tez çalışması ile bunu kanıtlamayı planladık.

Epitel mezenkim geçişi (EMG) bazal membran üzerinde polarize olmuş epitel hücresinin bir dizi hücresel değişim sonucunda mezenkim hücresi karakteri kazanmasıdır. Bu geçiş, biçimsel (fenotipik) ve hücre-hücre yapışma moleküllerinde meydana gelen bir dizi değişimle başlar ve bazal membranın tamamen yıkılmasıyla sona erer. EMG süreci ile hücrenin göç ve invazyon kapasitesi artar. Bu süreç içerisinde birçok moleküler değişim gerçekleşmektedir. 
 
Doğum sonrasında alınan göbek kordonu steril ve uygun taşıma koşulları içerisinde laboratuvara getirilerek gerekli mekanik ve enzimatik izolasyon teknikleri kullanılarak hücrelerin izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Ardından 7. pasaja kadar kültürleri yapılan bu hücreler çalışmanın amacına göre farklı denemelere tabi tutulmuştur. 

Araştırmada temel olarak immünhistokimyasal ve immünsitokimyasal incelemeler ile belirli hücre iskeleti ve hücre yüzey proteinlerinin hücredeki varlığı, dağılımı ve yarı sayısal yöntemle miktarı belirlenmiştir. Yapılan in situ ve in vitro çalışmalarda hücrelerin E-kaderin ifade etmedikleri fakat N-kaderin ifade ettikleri belirlenmiştir. Bunun yanında hücrelerin farklı düzeylerde pansitokeratin, sitokerain 18, sitokeratin 19 ile ?-SMA (alfa-düz kas aktini) ve vimentin ifade ettikleri gözlenmiştir. 

Bu çalışmada in vitro ortamda Tip 1 ve Tip 2 olarak adlandırılan farklı fenotipe sahip iki hücre tipi ile yapılacak olan moleküler düzeydeki deneylerden elde edilen veriler doğrultusunda miyofibroblast fibroblast geçiş sürecini ve bu iki hücrenin deneysel olarak birbirine geçişini kontrol eden mekanizmaların gösterilmesi amaçlanmıştır. Bu moleküler mekanizmalar temelinde iGKS-MKH?lerinin moleküler ve fenotipik özelliklerinin belirlenmesi kök hücre tedavisinde başarı oranına ve hücre biyolojisi alanına önemli katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Human umbilical cord-derived stromal stem cells (HUCSCs) in culture revealed two distinct cell populations, designated as type-1 and type-2 cells. Type-1 cells dominate in the early passages, whereas later passages become rich in type 2 cells. Type-1 cells exhibit flat, wide cytoplasmic phenotype like myofibroblastic cells. In contrast, type 2-cells appear to have fibroblast-like cell phenotype. We hypothesized that an in vitro transition is concerned between those cell types, type-1 cells are replaced by type-2 cells in late passages. It appears that this phenomen is a myofibroblast fibroblast transition rather than an epithelial-mesenchymal transition. In this thesis, our aim was to prove this hypothesis.  

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a biologic process that allows a polarized epithelial cell, which normally interacts with basement membrane via its basal surface, to undergo multiple biochemical changes enabling it to assume a mesenchymal cell phenotype. EMT starts to undergo a series of multiple biochemical changes by which and greatly an increased production of extra cellular matrix (ECM) components exist. The completion of EMT is signaled by the degradation of underlying basement membrane and the formation of a mesenchymal cell, which includes enhanced migratory capacity, invasiveness.

Briefly, umbilical cords from newborn babies were immersed in sterile transfer solution and immediately transferred to the laboratory. Stromal cells were isolated using mechanical and enzymatic cell isolation techniques and then primary cultures were carried out until 7 passages. 

We used to immunohistochemical and immunocytochemical methods. to observe the changes and semi-quantitative amount in specific cell-surface and cytoskeletal proteins. When in situ and in vitro surveys was observed that E-cadherin was not expressed but N-cadherin was expressed by the cells. Furthermore, it was determined that the cells were expressing pancytokeratin, cytokeratin 18, cytokeratin 19 and vimentin, ?-SMA (alpha-smooth musle actin). 

In this study, we aimed to assess the cellular transformation of Type-1 and Type-2 cells in view of EMT in vitro culture conditions.  The ultimate goal was to achieve the molecular and phenotypic characterization of the HUCSCs, which will importantly contribute to the stem cell therapies and biology of the cell.