Prunus mahleb ağacının kök florasından izole edilen bacillus subtilis glukoamilazının saflaştırılması, LC-MS/MS analizi, karakterizasyonu ve sitotoksik değerlendirilmesi
Purification, LC-MS/MS analysis, chracterization and cytotoxic evaluati̇on of glycoamylase from bacillus subtilis isolated from the root flora of prunus mahleb tree
Yazar: MUHAMMED SAFA ÇELİK
Danışman: DOÇ. DR. SERAP ÇETİNKAYA ; DR. SERKAN KAPANCIK
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
Bacillus subtilis'ten izole edilen ve amiloglukosidaz olarak da bilinen glukoamilaz enzimi, nişasta işlenmesinde önemli bir rol oynar. Bu enzim, amonyum sülfat çöktürmesi kullanılarak saflaştırıldı ve moleküler kütlesinin, SDS-PAGE yoluyla yaklaşık 65,2 kDa olduğu belirlendi. Saflaştırılmış numunede aktif glukoamilazın varlığı, zimogram analizi kullanılarak doğrulandı. Nano-Sıvı Kromatografi Kütle Spektrometrisi (nLC-MS/MS) analizi, glukoamilaz protein dizisinin %46'sını kapsayan peptidleri tanımladı; bu, enzimin kısmi karakterizasyonunu gösterir. Glukoamilaz aktivitesi için optimum pH ve sıcaklığın sırasıyla 6,0 ve 37°C olduğu bulundu. Substrat olarak çözünür nişasta kullanılarak kinetik parametreler hesaplandı: Km (yarı maksimum hızdaki substrat konsantrasyonu) 30,21 μM ve Vmax (maksimum reaksiyon hızı) 35,59 µmol mg protein⁻¹ min⁻¹ idi. Enzim, çözünebilir nişasta ile optimal aktivite göstererek nişasta hidrolizi konusundaki spesifikliğini vurguladı. Ek olarak, CaCl2 varlığında enzimatik aktivitenin arttığı, bu da kalsiyum iyonlarının olumlu bir etkisine işaret etmektedir. Saflaştırılmış glukoamilaz, nişasta işlemedeki geleneksel rolünün ötesinde potansiyel antikanser aktivitesi sergiledi. Bu, MCF-7 ve A549 hücre hatları üzerinde MTT yöntemi kullanılarak araştırıldı ve oldukça etkili biyoaktivite gösterdi.

Abstract:
The glucoamylase enzyme isolated from Bacillus subtilis, also known as amyloglucosidase, plays a significant role in starch processing. This enzyme was purified using ammonium sulfate precipitation, and its molecular mass was determined to be approximately 65.2 kDa via SDS-PAGE. The presence of active glucoamylase in the purified sample was confirmed using zymogram analysis. Nano-Liquid Chromatography Mass Spectrometry (nLC-MS/MS) analysis identified peptides covering 46% of the glucoamylase protein sequence, indicating partial characterization of the enzyme. The optimum pH and temperature for glucoamylase activity were found to be 6.0 and 37°C, respectively. Using soluble starch as a substrate, the kinetic parameters were calculated: the Km (substrate concentration at half-maximal velocity) was 30.21 μM, and the Vmax (maximum reaction velocity) was 35.59 µmol mg protein⁻¹ min⁻¹. The enzyme demonstrated optimal activity with soluble starch, highlighting its specificity for starch hydrolysis. Additionally, the enzymatic activity was enhanced in the presence of CaCl2, indicating a positive effect of calcium ions. Beyond its traditional role in starch processing, the purified glucoamylase exhibited potential anticancer activity. This was investigated using MTT method on MCF-7 and A549 cell lines and showed highly effective bioactivity.