Fetal foku interfaz nükleuslarında 13, 18, 21, X ve Y kromozom anöploidilerinin fluoresan in situ hibridizasyon yöntemi ile araştırılması
Detection of numerical aberrations of chromosomes 13, 18, 21, X and Y in interphase nucleus of fetal tissues by fluorescence in situ hybridization
Yazar: GÜLLEYLA KILIÇ
Danışman: PROF. DR. SEHER BAŞARAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 1998
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: FISH = FISH ; Kromozom düzensizlikleri = Chromosome aberrations

Özet:
VI. ÖZET Canlı doğumlarda en sık rastlanan sayısal kromozom anomalileri, konjenital anomalili canlı doğumların %95'inden sorumlu olan, dengeli translokasyonları da kapsayan tüm kromozomal anomalilerin ise %65'ini oluşturan 13, 18, 21, X ve Y anöploidileridir. Anöploidilerin tanısı, klasik sitogenetik yöntemlerle son derece güvenilir biçimde yapılabilmektedir. Ancak, prenatal tanı uygulamalarında tüm teknolojik gelişmelere karşın, kesin kromozom analizi sonuçlarının en erken yedi gün içinde alınabilmesi ya da üremenin yetersiz olduğu durumlarda metafaz elde edilememesi araştırmacıları, anöploidilerin daha kolay ve daha hızlı belirlenebileceği, özellikle de hem mitotik hem de interfazdaki hücre popülasyonuna uygulanabilecek bir yöntem arayışına itmiş ve "interfaz sitogenetiği" adı verilen yeni bir alan doğmuştur. Kromozomların çeşitli bölgelerinden elde edilen ve fluoresan maddelerle işaretlenen DNA problarının, interfaz nükleusları ile hibridizasyona sokulması esasına dayanan "interfaz sitogenetiği", sık rastlanan anöploidilerin 8 ila 24 saat gibi kısa bir sürede belirlenmesini sağlamıştır. Ancak interfaz sitogenetiğinde, FISH ile yapılan analizlerin doğruluğu, tekrarlanabilirliği ve güvenirliği, kullanılan probların duyarlılığına, spesifisitesine ve hibridizasyonun verimlilik derecesine bağlıdır. Bu nedenlerle, interfazda FISH'in rutin bir tanı yöntemi olarak kullanılmasından önce, standardize Sayfa 178edilmesi, probların öploidi / anöploidi ve cinsiyeti doğru olarak saptadığı optimum "sınır değer" lerin belirlenmesi şarttır. Bu amaçla, Türkiye'de Oncor ve Cytocell firmalarının satışa sunduğu, indirekt ve direkt yöntemle işaretli D13Z1/D21Z1, D18Z1, DXZ1 ve DYZ1 alfoid probları, kültür edilmemiş koriyon villus, amniyon ve lenfosit hücreleriyle hibridize edilmiş, alınan sinyal sayılarının, her olgu için değerlendirilen tüm nükleuslardaki yüzde oranları hesaplanarak sinyallerin dağılım ortalamaları bulunmuştur. Ayrıca, karyotip analizine göre, "opioid", "anöploid" ve sinyal dağılımına göre "sonuç verilemeyenler" olarak sınıflandırılan olgulardan elde edilen sonuçların birbirinden anlamlı olarak farklı olup olmadığı, "diskriminant analizi" yöntemiyle araştırılmış, duyarlılık ve spesifisiteleri belirlenen probların, prospektif çalışmalarda kullanılmak üzere dokulara özgü "diskriminant fonksiyonlarının elde edilmesiyle interfazda FISH yöntemi, laboratuvarımızda belli bir güvenlik sınırı içinde uygulanabilir duruma getirilmiştir. İnterfaz sitogenetiğinin, prenatal tanıda uygulanma koşullarına uygun olarak, ancak klasik sitogenetik yöntemlerle birlikte uyguladığımız bu hızlı tanı yönteminin laboratuvarımıza yerleştirilmesiyle, önümüzdeki yıllarda planladığımız preimplantasyon tanısına ve maternal kandan izole edilen fetal hücrelerde anöploidilerin araştırılmasına temel oluşturacak alt yapı da hazırlanmıştır. Sayfa 179

Abstract:
SUMMARY Aneuploidies in newborns involving chromosomes 13, 18, 21, X and Y can account for up to 95% of livebom chromosomal abnormalities which are accompanied by birth defects and 67% of chromosomal abnormalities if balanced translocations are included. Classical cytogenetic techniques have been extremely valuable in the identification of these chromosomal aberrations. For prenatal diagnostic applications, advances in culture methods and staining techniques have decreased the time required to carry out a full karyotype analysis to approximately seven days under the best circumstances, although turn around time of greater than two weeks are common. Thus, the perceived need for rapid methods for detecting the major aneuploidies has lead to the the development of a new technology called "interphase cytogenetics". FISH to interphase nuclei with chromosome-specific probes can now detect in 8-24 hours the most common autosomal trisomies and aneuploidies of the sex-chromosomes. However, the accuracy, reproducibility, and the reliability of analysis by FISH depends mostly on both the specificity and the sensitivity of the probes, and the hybridization detection efficiency. Therefore every laboratory must have its own standard material and generates its own "cutoff values" to evaluate the probes. The purpose of the present study was to compare the results of FISH on uncultred amniocytes, trophoblasts and fetal lymphocytes Sayfa 180with the results of conventional cytogenetics. Further to evaluate on this basis the sensitivity and specificity of the four commercially available alfa-satellite DNA probes (D13Z1 /D21Z1, D18Z1, DXZ1, DYZ1) from two different companies, Cytocell and Oncor. The evaluation of the probes was performed by calculating both the percent of total nuclei counted that displayed different numbers of hybridization signals as appropriate for each sample and, the mean domain distributions. Samples were then categorized as normal or abnormal as determined by the karyotype analysis and discriminant analysis was used to determine whether the hybridization results obtained from euploid and aneuploid samples were significantly different and whether they could be used to define parameters for prospective identification of samples. This study demonstrated that interphase FISH provides quite efficient and accurate prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidies in uncultured fetal cells but, for the time being, it is only used as an adjunct rapid test, with standard chromosomal analysis serving as the primary diagnostic and confirmatory evaluation. Moreover, the standardization of this technology has great impact on the development of new technologies such as, preimplantation diagnosis and detection of aneuploidies using fetal cells from the blood of pregnant women, which will be used in our laboratory. Sayfa 1 8 1