Sarıağız balığı, Argyrosomus regius (Asso, 1801) larvalarının proteaz aktiviteleri üzerine farklı besin maddelerinin inhibisyon değerlerinin in vitro yöntemle belirlenmesi ve türe özgü mikroyem üretimi
Determination using in vitro assay of inhibition values of different feed ingredients on the protease activities of meagre, Argyrosomus regius (Asso, 1801) larvae and production of species-specific microdiet
Yazar: GÜRKAN DİKEN
Danışman: DOÇ. DR. ORHAN DEMİR ; YRD. DOÇ. DR. MEHMET NAZ
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Bu çalışma, sarıağız balığı (Argyrosomus regius) larvalarının ontogenetik gelişimlerine bağlı olarak larvaların proteaz aktiviteleri üzerine besin inhibisyon etkilerinin belirlendiği türe özgü mikroyem üretimi için yapılmıştır. Çalışmada,     0.–32. gün yaş (gy) sarıağız balığı larvalarının yem formülasyonu in vitro yöntemle belirlenerek Na alginatla kapsüle edilen 75–100, 100–200, 200–300, 300–500 µm deneysel mikroyemler (DMY)'i üretilmiştir. Sarıağız balığı larvalarının proteaz aktiviteleri üzerine DMY'in inhibisyen dereceleri, hidroliz dereceleri ve moleküler ağırlık profilleri, DMY'in besin madde analizleri (kuru madde, ham protein, ham yağ, ham kül) ve yağ asitleri profilleri belirlenmiştir. 
İn vitro analizlerde kullanılan Menderes Deltası, Karina Dalyanı–TÜRKİYE anaç orjinli larvalar Egemar (Aydın–TURKEY) ticari yetiştiricilik protokolünden örneklenmiştir. Anaç balıklardan 20 µg/kg♀ & 10 µg/kg♂ tek doz GnRH hormon enjeksiyonuyla yumurta alınmıştır. Larva yetiştiriciliğinde açık sistem yeşil su tekniği kullanılmıştır. Ticari larva yetiştiriciliğinde, 3.–26. gy'de toz alg veya canlı alg (Nannochloropsis occulata), 3.–8./9. gy'de 10–15 adet/mL rotifer (Brachionus plicatilis), 6./7.–11. gy'de 2–6 naupli/mL Artemia nauplii, 10.–15. gy'de 2–6 metanauplii/mL Artemia metanuplii (zenginleştirilmiş Artemia), 16./17.–32. gy'de ilk günlerde 1,5 metanauplii/mL 6 kez, son günlerde 6 metanauplii/mL 1 kez ve tank biomasının %3,5–8'si oranında ticari mikroyemle besleme protokolü uygulanmıştır. 
Sarıağız balığı larvalarının, yumurta ve yağ damlasının çapları (ortalama±SH mm) sırasıyla 0,90±0,01 ve 0,24±0,01 (2013 yılı), 0,86±0,01 ve 0,23±0,01 (2014 yılı) olarak tespit edilmiştir. 2013 ve 2014 yıllarının 0.–32. gy tam boy–TB (ortalama±SH mm), yaş ağırlık (ortalama±SH mg), spesifik büyüme oranları–SBO (ortalama±SH %) sırasıyla 21,61±0,22 ve 20,95±0,30, 118,00±1,09 ve 89,21±0,36, 18,39±0,21 ve 17,94±0,10 olarak belirlenmiştir. 2013 ve 2014 yıllarında günlük TB sırasıyla TB=2,6725e0,0682gy (R2=0,9959) ve 2,5388e0,0667gy (R2=0,9923) olarak hesaplanmıştır.
Sarıağız balığının, yumurta ve prelarval dönem proteaz aktivitleri hesaplanarak anaç kaynaklı proteolitik etkiler belirlenmiştir. Yumurta, prelarva (0.–2. gy), 3., 15. ve 32. gy  proteaz aktiviteleri (ortalama±SH U/mg protein) 2013 ve 2014 yılında sırasıyla 2,83±0,37–2,89±0,45, 4,69±0,58–4,71±0,56, 106,43±9,74–345,66±1,45, 5,95±0,60–32,81±1,76 ve 28,12±0,49–68,66±2,52 olarak hesaplanmıştır (p<0,05). Larva üretiminde larva, canlı yem ve ticari mikroyemlerin moleküler ağırlık (bovine albümin/67000 Da, ribonuclease A/13700 Da, insulin chain A/2532 Da, tyr–tyr–tyr/508 Da, tryptophan/204 Da, tyrosine/181 Da, p–aminobenzoic acid/137 Da) dağılımları belirlenmiştir. Larvaların proteaz aktiviteleri üzerine ticari canlı yem ve mikroyemlerin inhibisyon etkileri in vitro yöntemle analiz edilerek, canlı yem ve mikroyemlerin durumları tespit edilmiştir. 2013 yılı sarıağız balığı larvalarının proteaz aktiviteleri üzerine Orange Grow–S, Orange Grow–L ticari yemlerinin inhibisyon dereceleri Orange Nurse–XS, Orange Start–S, Orange Start–L mikroyemlerinden daha yüksek hesaplanmıştır. 2014 yılında %50'den daha yüksek inhibisyon oranları haricinde Caviar 200–300, Caviar 300–500 ve Perla Larva Proactive 4.0 inhibisyon dereceleri, Gemma Micro 150'e göre düşük tespit edilmiştir. Larva proteazlarına rotifer ve Artemia nauplii katkıları çok düşük, Artemia metanauplii katkıları ise oldukça yüksek düzeyde tespit edilmiştir (p<0,05). 
DMY'in formülasyonlarının oluşturulmasında sarıağız balığı larvalarının proteaz aktiviteleri üzerine inhibisyon etkileri in vitro olarak belirlenmiştir. Hayvansal (balık unu, balık hidrolizatı, kalamar unu, karides unu, krill unu,  tavuk unu ve tüy unu), bitkisel (buğday glüteni, mısır glüteni, soya unu, ayçiçeği tohumu unu¬, soya protein konsantresi–SPC, bitkisel protein konsantresi–VPC, kurutulmuş damıtık tahıl (mısır)+çözünür maddeleri–DDGS, maya) ve mikro/makro alg (Chlorella sp. unu, Schizothyrium sp.  unu, Spriluna sp. unu, Sargassum sp. unu, ve Ulva sp. unu) yem ham maddelerinin inhibisyon derecelerine bağlı olarak formülasyonunda balık unu, balık hidrolizatı, kalamar unu, krill unu,  tavuk unu, tüy unu, buğday glüteni, mısır glüteni, ATU, maya, Schizothyrium sp.  unu, Spriluna sp. unu ve Ulva sp. unu kullanılmıştır. Rasyon oluşturulmasından önce yem formülasyonunda kullanılması uygun yem ham maddelerinin balık unu ikame durumları %25, 50, 75 ve olarak belirlenmiştir. Ayrıca DMY'in formülasyonlarının oluşturulmasında kullanılan ham maddelerinin moleküler ağırlık dağılımları da göz önünde bulundurulmuştur. DMY'in formülasyonunda kullanılan ham maddelerin pH–stat hidroliz dereceleri balık unu, balık hidrolizatı, mısır glüteni, maya, kalamar unu ve ATU'da diğerlerinden daha yüksek düzeyde tespit edilmiştir (p<0,05). İnhibisyon dereceleri yüksekken hidroliz oranlarının düşük, inhibisyon dereceleri düşükken hidroliz oranlarının yüksek olduğu belirlenmiştir. DMY'in kaplanmasında Na alginatın bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir (p>0,05). DMY'in inhbisyon derecelerinin ticari mikroyemlerden çok daha düşük olduğu tespit edilmiştir. DMY'in 2.532 Da≥ (serbest amino asit+di/tri/oligopeptit) dağılımlarının ticari mikroyemlerle benzer olduğu belirlenmiştir.  DMY'de  n–3/n–6 1, DHA/EPA 2 ve DHA/EPA/ARA 7/4/1 olarak hesaplanmıştır. DMY'in 19,27–18,83 TL/kg (4,90–4,79 €/kg, 5,32–5,20 $/kg) üretim maliyetleriyle ticari mikroyemlerden daha ekonomik olduğu tespit edilmiştir.
Sonuç olarak, deniz balığı larvaları için türe özgü mikroyemlerin üretilmesinin gerektiği bu amaç için larvaların proteaz aktiviteleri üzerine yem ham maddelerinin inhbisyon derecelerinin belirlenmesinin yeterli olacağı tespit edilmiştir. Larvaların ontogenetik gelişimine bağlı olarak türe özgü/besin–inhibisyon in vitro yönteminin bir değerlendirme kriteri olacağı belirlenmiş ve deniz balıkları için tavsiye edilmiştir. Ayrıca mikroyem üretiminde moleküler ağırlık dağılımlarının belirlenmesi de tavsiye edilmiştir. Menderes Deltası–TÜRKİYE orjinli ticari sarıağız balığı larva gelişimlerinin tanımlandığı bu çalışma ile birlikte sonraki çalışmalar Türk Karasularına ait sarıağız balığı ifadesinin tanımlanmasına katkı sağlayacaktır 

Anahtar Kelimeler: Sarıağız, Argyrosomus regius, mikroyem, yem ham maddesi, proteaz, inhibisyon, protein kaynakları, moleküler ağırlık, hidroliz, in vitro, ontogeni, türe özgü, besin–inhibisyon, Menderes Deltası

Abstract:
This study, was established to produce species–spesific microdiets identifying the nutritional inhibition effects on the protease activities of larvae depending on the ontogenetic developments of meagre (Argyrosomus regius) larvae. In this study,    0.–32. days after hatching (DAH) feed formulation of meagre larvae was identified according to in vitro assay results and 75–100 µm, 100–200 μm, 200–300 μm,     300–500 μm of the experimental microdiets (EMD) encapsulated with Na alginate according to produced were produced. EMD's inhibition degrees, hydrolysis degrees, moleculer weight profiles on meagre larvae's protease activities and EMD's nutritional composition analysis (dry matter, crude protein, crude fat, crude ash) and fatty acids profiles were determined
Larvae which are originated meagre broodstocks of Menderes Delta, Karina Fishgarth–TURKEY used in vitro assay were sampled from Egemar (Aydın–TURKEY) commercial culture protocol. With a single dose of 20 mg/kg♀ & 10 mg/kg♂ GnRH hormone injection, they were spawned. In larvae culture, open sytem green water technique was used. In the commercial larval production feeding protocol was applied at 3.–26. DAH powder algae or live algae (Nannochloropsis occulata), at  3.–8./9. DAH 10–15 prey/mL rotifera (Brachionus plicatilis), at 6./7.–11. DAH 2–6 nauplii/mL Artemia nauplii, at 10.–15. DAH  2–6 metanauplii/mL Artemia metanuplii (enriched Artemia), at 16./17.–32. DAH in the beginning 1.5 metanauplii/mL 6 time, recently 6 metanauplii/mL once and 3.5–8% of tank biomass with commercial microdiets.
The diameters of the egg and oil drop diameter (mean±SE mm) were determined as 0,90±0,01 and 0,24±0,01 (2013 year), 0,86±0,01 and 0,23±0,01 (2014 year). The total length–TL (mean±SE mm), wet weight (mean±SE mg), specific growth ratio–SGR (mean±SE %) at 0.–32. DAH of 2013 and 2014 were determined as 21.61±0.22 and 20.95±0.30, 118.00±1.09 and 89.21±0.36, 18.39±0.21 and 17.94±0.10, respectively. Daily TL of 2013 year and 2014 year were calculated as TL=2.6725e0.0682DAH (R2=0,9959) and 2.5388e0,0667DAH (R2=0,9923), respectively.

Meagre's egg and prelarva phase protease activities were calculated and maternal affected proteolytic effects were identified. The egg, prelarvae (0.–2. DAH), 3., 15. and 32. DAH's  protease activities (mean±SE U/mg protein) values were obtained as 2.83±0.37–2.89±0.45, 4.69±0.58–4.71±0.56, 106.43±9.74–345.66±1.45, 5.95±0.60–32.81±1.76 and 28.12±0.49–68.66±2.52 2013 and 2014 years, respectivily (p<0.05).  Besides, the molecular weight (bovine albümin/67000 Da, ribonuclease A/13700 Da, insulin chain A/2532 Da, tyr–tyr–tyr/508 Da, tryptophan/204 Da, tyrosine/181 Da, p–aminobenzoic acid/137 Da) distributions of larvae, live food and commercial microdiet were also determined in larval production. The inhibition effects of commercial live food and microdiet on larvae protease activity were analysed in vitro assay and conditions of live food and microdiet were identified. On the 2013 year's meagre larvae's protease activities Orange Grow–S, Orange Grow–L commercial microdiets' inhibition degrees were calculated higher than Orange Nurse–XS, Orange Start–S, Orange Start–L. In case of 2014 year, Caviar 200–300, Caviar 300–500 and Perla Larva Proactive 4.0 inhibition degrees were found lower than Gemma Micro 150 except for more than 50%. The contributions of rotifera and Artemia nauplii to larval proteases was very low and, Artemia metanauplii contributions were detected at a very high level (p<0.05).
Inhibition effects on the protease activities of larvae of meagre in the formation of EMD formulations were determined in vitro. Depending on the inhibition of feed ingredients of animal (fish meal, fish hydrolysate, squid meal, shrimp meal, krill meal, chicken meal and feather meal), vegetable (wheat gluten, corn gluten, soybean meal, sunflower meal–sunflower, soy protein concentrate–SPC, vegetable protein concentrate–VPC, dried distilled grain (maize)+soluble substances DDGS, yeast) and micro/macro algae (Chlorella sp. meal, Schizothyrium sp.  meal, Spriluna sp. meal, Sargassum sp. meal and Ulva sp. meal) in the formulation, fish meal, fish hydrolyzate, squid meal, krill meal, chicken meal, feather meal, wheat gluten, corn gluten, sunflower, yeast, Schizothyrium sp.  meal, Spriluna sp. meal, and Ulva sp. meal were used. The fish meal substitution status of suitable feed ingredients for use in the feed formulation prior to formation of the ration was determined to be 25, 50, and 75%. Besides, molecular weight distributions of the feed ingredients used to formulate the formulations of EMD in the study were also taken into account. The pH–stat hydrolysis ratios of the feed ingredients used in the formulation of the EMD were found to be higher in fish meal, fish hydrolysate, corn gluten, yeast, squid meal and sunflower than the others (p<0.05). When the inhibition grades were high, the hydrolysis rates were found to be low and when the inhibition grades were low, the hydrolysis rates were found to be high. It was identified that there was no effect of Na alginate on the coating of EMD (p>0.05). The degree of inhibition of EMD was found to be much lower than commercial microdiet. It was determined that the distributions of 2.532 Da≥ (free amino acid+di/tri/oligopeptide) of the EMD were similar to those of the commercial microdiets. In EMD n–3/n–6 1, DHA/EPA 2 and DHA/EPA/ARA 7/4/1 were calculated. EMD's were found to be more economical than commercial microdiets with production costs of 19,27–18,83  TL/kg (4,90–4,79 €/kg, 5,32–5,20 $/kg).
As a result, it is recommended that species–specific microdiets should be produced for marine fish larvae, for this purpose it was established that identification of inhibition degrees of feed ingredients on the larvae protease activities can be sufficient. Depending on the larvae ontogenetic development, species–specific/nutrional–inhibition in vitro assay was identified to be on evalvation criteria and advised for marine fish larvae. And determination of molecular weight distributions in the production of EMD are recommended. With this study in which Menderes Delta–TURKEY originated commercial meagre larvae developments are identified the further studies will contribute to the definition of meagre belonging to Turkish Territorial waters.  

Keywords: Meagre, Argyrosomus regius, microdiet, feed ingredents, protease, protein sources, inhibition, molecular weight, hydrolysis, in vitro, ontogeny,             species–specific, nutrional–inhibition, Menderes Delta