Bazı helopini (Tenebrionidae, Coleoptera) türlerinde antifriz protein gen dizilerinin belirlenmesi
Determination of antifreeze protein gene sequences in some helopini species (Tenebrionidae, Coleoptera)
Yazar: DUYGU KAN
Danışman: PROF. DR. BEKİR KESKİN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Zooloji = Zoology
Dizin: Amplifikasyon = Amplification ; Antifriz proteinler = Antifreeze proteins ; Biyoinformatik = Bioinformatics

Özet:
Antifriz proteinler (AFP), donma toleransını artırarak organizmayı donmaya karşı korumaktadır (Davies, 2014). Donma toleransının artırılması AFP'lerin
sahip olduğu iki işleve dayanmaktadır. Birincisi, donma sıcaklığını düşüren termal histerez aktivitesi; ikincisi ise, buzun yeniden kristalleşmesinin indirgenmesidir (Białkowska et al., 2020). Sıfırın altındaki sıcaklıkta, membran yüzeyinde bulunan su molekülüne bağlanıp buz kristallerinin büyümesini engelleyerek, membran stabilizasyonunu sağlamaktadırlar (Robles et al., 2019). Ayrıca, erime/donma değerinin altına düştüğü histerik donma noktasında, buz kristallerinin geliştiği sıcaklık noktasını termal histerez aktivitesi ile düşürerek, soğuğa karşı korumada görev almaktadır (Denlinger and Lee, 2010). Sıcaklığın düşük olduğu bölgelerde yaşayan böceklerde, antifriz proteinlerinin soğuktan korumada görev aldığı bildirilmiştir. Sıcaklığın çok daha düşük olduğu bölgelerde yaşayan böceklerde ise antifriz proteinlerin donmadan koruduğu bilinmektedir (Scotter et al., 2006). Tenebrionidae ailesine dahil olan Helopini tribüsü üyeleri, düşük rakımdan yüksek rakıma kadar soğuk ortamlarda yaşayabilmektedirler (Reitter, 1922).
Helopini (Tenebrionidae, Coleoptera) tribüsüne dahil olan; Cylindrinotus charlesi, Turkonalassus petrophilus, Odocnemis anatolica, Euboeus obesus, Raiboscelis coelestinus, Nalassus clavicornis ve Xanthomus ovulus türleri, yılın soğuk dönemlerinde aktif olup kar yakınındaki taş altlarında yada soğuk kumul alanlara gömülü olarak yaşayabilmektedirler. Bu sebeple, bahsedilen bu 7 tür tez çalışması için seçilmiştir.
İlk olarak, AFP gen dizilerini çoğaltabilmek için diziye uygun ileri ve geri yönlü primerler, Geneious, NCBI ve Primer 3 programları kullanılarak
sentezlenmiştir. Daha sonra, genomik DNA izolasyonu yapılan türler, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmıştır. PZR'si yapılan tüm örneklerin, istenilen DNA dizilerinin çoğaltılıp çoğaltılamadığı, agaroz jel elektroforezi yapılarak kontrol edilmiştir. İstenilen uzunlukta bant veren PZR ürünleri, DNA dizileme firmasına gönderilmiştir. Firmadan gelen ab1 formatlı diziler; Geneious, Mesquitte, Clustal W gibi programlar kullanılarak düzenlenip hizalanmıştır. Hizalanan diziler fasta formatında kaydedilmiştir. Sonuçta, Cylindrinotus charlesi, Odocnemis anatolica, Nalassus clavicornis ve Xanthomus ovulus türleri antifriz proteinlerinin kısa DNA dizileri belirlenmiştir. Helopini türleri AFP dizilerinin oluşturduğu hipotetik 3 boyutlu yapılar Swiss-Model platformunda modellenerek tahmin edilmiştir. Helopini AFP dizilerinin korunmuşluk durumu Paraline platformunda; tekrar bölgeleri Motif-Finder platformunda belirlenmiştir. CryoProtect platformunda in silico yaklaşımlarla AFP tahminleri yapılmıştır. Helopini AFP'lerinin homoloji gösterdiği aileler Super-Family ve InterPro platformlarında belirlenmiştir. Ayrıca, bu türlere ait elde edilen antifriz protein dizileri ile veri bankalarında bulunan diğer kınkanatlı türlerindeki antifriz protein dizilerinin arasındaki benzerlik karşılaştırılmıştır.

Abstract:
Antifreeze proteins (AFP) protect the organism against freezing by increasing freezing tolerance (Davies, 2014). Increasing freezing tolerance is based on two functions of AFPs. First, thermal hysteresis activity, which lowers the freezing temperature; the second is the reduction of ice recrystallization (Białkowska et al., 2020). At sub-zero temperatures, AFPs provide membrane stabilization by binding to the water molecule on the membrane surface and preventing the growth of ice crystals (Robles et al., 2019). In addition, AFPs protect against cold by lowering the temperature point at which ice crystals develop through thermal hysteresis activity, when the temperature drops below the melting/freezing value at the hysterical freezing point (Denlinger and Lee, 2010). It has been reported that antifreeze proteins play a role in protecting against cold which are living low temperature. It is known that in insects living in regions where the temperature is much lower, antifreeze proteins protect them from freezing (Scotter et al., 2006). Members of the Tenebrionidae family can live in cold environmenrts distributed in low and high altitude (Reitter, 1922). Included in the tribe Helopini (Tenebrionidae, Coleoptera); Cylindrinotus charlesi, Turkonalassus petrophilus, Odocnemis anatolica, Euboeus obesus, Raiboscelis coelestinus, Nalassus clavicornis and Xanthomus ovulus species are active during the cold periods of the year and they can be found under the stones near snow or buried in cool sand. For this reason, the seven species mentioned were selected for the thesis study.
Firstly, to amplify the AFP gene sequences, forward and reverse primers suitable for the sequence were synthesized using Geneious, NCBI and Primer 3
programs. Then, the species from which genomic DNA was isolated were amplified by polymerase chain reaction (PCR). In all PCR samples, it was checked whether the desired DNA sequences could be amplified by agarose gel electrophoresis. PCR products giving bands of the desired length were sent to the
DNA sequencing company. ab1 format sequences coming from the company; It was edited and aligned using programs such as Geneious, Mesquitte, Clustal W.
Aligned sequences were saved in fasta format. As a result, short DNA sequences of antifreeze proteins of Cylindrinotus charlesi, Odocnemis anatolica, Nalassus clavicornis and Xanthomus ovulus species were determined. Helopini species were predicted by modeling hypothetical 3D structures formed by AFP sequences on the Swiss-Model platform. Conservation status of Helopini AFP sequences on the Paraline platform; Repeat regions were determined on the Motif-Finder platform. AFP predictions were made with in silico approaches on the CryoProtect platform. Families to which Helopini AFPs show homology were identified on Super-Family and InterPro platforms. Additionally, the similarity between the antifreeze protein sequences obtained from these species and the antifreeze protein sequences of other beetle species in the databases was compared.