Micrococcus luteus Metabolitlerinin Helicobacter pylori'nin Kokoid Formu Üzerindeki Etkisinin İncelenmesi
Investigation of the Effect of Micrococcus luteus Metabolities on Helicobacter pylori Cocoid Form
Yazar: DİDEM AKTAŞ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MELAHAT BAĞIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Dünya nüfusunun %55'inden fazlasını etkileyen Helicobacter pylori, gram-negatif, mikroaerofilik, bir bakteri türüdür ve ciddi hastalıklarla ilişkilendirilmiş olup Dünya Sağlık Örgütü H. pylori'yi 1.sınıf karsinojen olarak belirlemiştir. H. pylori normal koşullarda spiral şekilli olup, ayrıca açlık ve stres gibi olumsuz koşullarda kendini korumak için metabolik aktivitesini azaltıp antibiyotiklere, dezenfektanlara karşı daha dirençli halde bulunduğu kokoid şekilli olmak üzere çeşitli formlarda bulunmaktadır. H. pylori ile enfekte bireylerde, kronik aktif gastrit, peptik ülser, mide karsinomu ve MALT lenfoma (Mucosal Associated Lenfoid Tissue) gibi ciddi hastalıklara sebep olmaktadır. Günümüzde H. pylori enfeksiyonunun eradikasyonu klasik antibiyotik tedavisi olan, bir proton pompa inhibitörü içeren üçlü ve dörtlü tedavidir. Fakat bu tedavi yöntemleri ile %100 eradikasyon sağlanması oldukça zordur. Ayrıca tedavi sonrası enfeksiyon tekrarlanabilmektedir. Eradikasyonların başarısızlığı ve nüks eden enfeksiyonların başlıca temel sebeplerinden biri H. pylori'nin kokoid formlarına dönüşmesi gösterilmekte ve bu form tedavinin etkinliğinin azalmasına neden olmaktadır. H. pylori'ye karşı tedavide başarı şansı H. pylori'nin kokoid formlarının spiral forma dönüşümü ile arttırılabileceği düşünülmektedir. Literatürde konuyla ilgili çalışmalar bulunsada oldukça az sayıda olup yetersizdir. Bu nedenle H. pylori'nin kokoid formlarının spiral forma dönüştürülmesine yönelik yeni yaklaşımların geliştirilmesi oldukça önemlidir. 
Literatürde yapılan çalışmalarda Micrococcus luteus bakterisinden elde edilen metabolitlerde resusitasyon promatör faktörlerin (RPF) varlığı tespit edilmiştir. Bazı çalışmalarda RPF'lerin ''Canlı Fakat Kültüre Edilemeyen Bakteri Sınıfı'' (VBNC)'na  dahil olan bakteriler üzerindeki resusitasyon etkisi incelenmiş olup olumlu sonuçlar elde edilmiştir. H. pylori' de VBNC sınıfa dahil olan bir bakteri olmasına rağmen literatürde M. luteus'dan elde edilen RPF içeren metabolitlerin H. pylori'nin kokoid formu üzerindeki resusitasyon etkisinin incelenmesine yönelik herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu nedenle bu tez çalışmasının amacı M. luteus bakteri kültüründen RPF içeren metabolitlerin elde edilmesi ve bu metabolitlerin farklı koşullarda oluşturulan H. pylori'nin kokoid formlarının aktif/spiral formlara dönüşümü üzerindeki in vitro etkisinin incelenmesi olmuştur. 
Çalışmada; Açlık, antibiyotik (kanamisin) ile muamele, farklı sıcaklıklarda inkübasyon (+4, +22°C) ve uzun süreli kültür gibi beş farklı ortam koşullarında H. pylori'nin kokoid formları oluşturuldu. Bu morfolojik dönüşümler mikroskobik gözlem, gram boyama Flow-sitometrik analiz ve SEM analizi gibi çeşitli yöntemlerle incelendi. M. luteus bakterisinden geç logaritmik fazda elde edilen süpernetant filtrelenerek protein varlığı ve miktarı SDS-PAGE ve Bradford Protein Tayin yöntemleriyle belirlendi. En yüksek düzeyde kokoidleşmenin gözlemlendiği kanamisin ile muamele edilen ve PBS (açlık) ortamında inkübasyona bırakılan H. pylori bakterileri 1, 10, 100 μg/mL RPF içeren metabolitler ile 24 saat inkübe edildi. Bakteri kültüründeki RPF içeren metabolitlerin resusitasyon etkisi mikroskobik, gram boyama, Flow-sitometrik ve SEM analizi ile incelendi. Elde edilen sonuçlara göre beş farklı ortam koşullarına maruz bırakılan bakterilerdeki 192 saat inkübasyona sonundaki kokoidleşme yüzdeleri PBS, +4°C'de inkübasyon, +22°C'de inkübasyon, kanamisin ile muamele ve uzun süreli kültür koşulları için sırasıyla %96, %94, %90, %99,5 ve %70 olduğu Flow-sitometre ile belirlenmiştir. Elde edilen SEM görüntüleride en yüksek kokoidleşmenin kanamisin ile muamele ve PBS ile inkübasyon sonrası oluştuğunu göstermiştir. M. luteus kültüründen 60, 65, ve 72.saatlerde elde edilen RPF içeren metabolitlerin SDS-PAGE analizinde RPF enzimine özgü 17 kDa'luk bant oluşumu gözlendi. Aynı zamanda Bradford yöntemi ile örneklerdeki protein konsantrasyonları sırasıyla 392, 376 ve 300,8 μg/mL olduğu tespit edilmiştir. RPF içeren metabolitlerin 1, 10 ve 100μg/mL konsantrasyonları PBS ve kanamisin ile indüklenen kokoidler üzerinde incelendiğinde kanamisin ile muamele edilen bakterilerin tüm incelenen konsantrasyonlarında %90 üzerinde spiral forma dönüştükleri flow-sitometre, gram boyama ve SEM analizi ile gösterilmiştir. 
Sonuç olarak dünyada ve ülkemizde ilk kez olarak M. luteus bakterisinden elde edilen RPF içeren metabolitlerin H. pylori'nin kokoid formları üzerinde resusitasyon etkisine sahip olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlar RPF içeren metabolitlerin kullanımı ile H. pylori'nin tedavisinde başarasızlığın en önemli etkenlerinden biri olan kokoid formlarının spiral hale dönüştürülmesiyle tedavinin kolaylaştırılmasında önemli rol oynayacaktır. Böylece bu tez kapsamında H. pylori'nin tedavisinde kokoid formlarının aktif-spiral forma dönüşümünü tetikleyen, M. luteus RPF içeren metabolitlerinin gelecekte kullanılması ile enfeksiyonun eradikasyon başarısını arttırabilmesine yönelik yeni bir yaklaşım olabileceği düşünülmektedir.
Bu yüksek lisans tez çalışması Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü tarafından TYL-2018-3326 numaralı projesi kapsamında desteklenmiştir.

Abstract:
Helicobacter pylori is a gram-negative, microaerophilic, bacterial specie, which affects more than 55% of the world's population and has been associated with serious diseases and the World Health Organization has identified H. pylori as first-class carcinogen. H. pylori is spiral-shaped under normal conditions and is also available in a variety of forms, including cocoid-shaped, in which it is more resistant to antibiotics and disinfectants, reducing metabolic activity to protect itself under adverse conditions such as hunger and stress. It causes serious diseases such as chronic active gastritis, peptic ulcer, gastric carcinoma and MALT lymphoma in individuals infected with H. pylori. Today, eradication of H. pylori infection is a classic antibiotic therapy, including a proton pump inhibitor, triple and quadruple therapy. However, it is very difficult to achieve 100% eradication with these treatment methods. In addition, infection may recur after treatment. One of the main causes of eradication failure and recurrent infections is the transformation of H. pylori into cocoid forms, which leads to a decrease in the effectiveness of treatment. The chance of success in the treatment of H. pylori is thought to be possible by the transformation of H. pylori into the spiral form. Although there are studies on the subject in the literature, it is very few and inadequate. Therefore, it is very important to develop new approaches for the transformation of H. pylori cocoids into spiral forms. 
In the studies in the literature, the presence of resuscitation promoter factors (RPF) was found in the metabolites obtained from Micrococcus luteus bacteria. In some studies, the effect of RPFs on the bacteria that belong to the class of ''Viable  But Non-Culturable Bacteria'' was examined and positive results were obtained. Although H. pylori is a bacterium included in the VBNC class, no studies have been found in the literature to investigate the effect of RPF-containing metabolites obtained from M. luteus on cocoid form of H. pylori. Therefore, the aim of this thesis was to obtain RPF-containing metabolites from M. luteus bacterial culture and to investigate the in-vitro effect of these metabolites on the transformation of H. pylori cocoids into active/spiral forms.
Study; Five different conditions such as starvation, antibiotic (kanamycin) treatment, incubation at different temperatures (+4, + 22°C) and prolonged culture were established cocoids of H. pylori. These morphological transformations were examined by various methods such as microscopic observation, gram staining, Flow-cytometric analysis and SEM analysis. Supernetant obtained in late logarithmic phase from M. luteus bacteria was filtered and determined by SDS-PAGE and Bradford Protein Determination methods. H. pylori bacteria, which were treated with kanamycin and incubated in PBS (starvation), where the highest cocoidation was observed, were incubated with metabolites containing 1, 10, 100 μg/mL with RPF-containing metabolities for 24 hours. Resuscitation effects of RPF-containing metabolites in bacterial culture were examined by microscopic, gram staining, Flow-cytometric and SEM analysis. According to the results obtained, the percentages of cocoids at the end of 192 h incubation in bacteria exposed to five different ambient conditions were PBS, incubation at +4°C, incubation at +22°C, treatment with kanamycin and prolonged culture conditions, respectively 96%, 94%. 90%, 99.5% and 70% were determined by Flow-cytometer. The SEM images showed that the highest cocoidization occurred after treatment with kanamycin and incubation with PBS. SDS-PAGE analysis of RPF-containing metabolites obtained from M. luteus culture at 60, 65, and 72h showed a 17 kDa band formation specific to RPF enzyme. At the same time, protein concentrations in the samples were determined as 392, 376 and 300.8 μg/mL by Bradford method. The concentrations of 1, 10 and 100μg/mL of RPF-containing metabolites were examined on PBS and kanamycin-induced cocoids and were demonstrated by flow-cytometry, gram staining and SEM analysis in which all the kanamycin-treated bacteria were transformed into spiral forms over 90% at all examined concentrations.
As a result, it was found that RPF containing metabolites obtained from M. luteus bacteria had the resuscitation effect on the cocoid forms of H. pylori for the first time in the world and in our country. The results obtained will play an important role in facilitating the treatment by transforming cocoids, one of the most important factors of failure in the treatment of H. pylori, with the use of metabolites containing RPF. Thus, in the context of this thesis, it is thought that there may be a new approach to increase the eradication success of infection by using future metabolites containing M. luteus RPF which triggers the conversion of cocoid forms to active-spiral form in the treatment of H. pylori.
This master thesis was supported by the Scientific Research Projects Department of Yıldız Technical University within the scope of TYL-2018-3326 project.