Glial tümörlerde ARHI tümör süpresör geninde loh ve metilasyon profillerinin araştırılması
Investigation of loh and methylation profiles of the ARHI tumour supressor gene in glial tumours
Yazar: SEZİN YAKUT
Danışman: DOÇ. SİBEL BERKER KARAÜZÜM
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Metilasyon = Methylation

Özet:
1p31 bölgesinde lokalize olan ARHI geni, Ras protoonkogenine % 60 homolojigöstermesine karşın Ras ailesine ait tanımlanmış ilk tümör süpresör gendir. Maternalolarak susturulmuş ve sadece paternal allelden eksprese olan ARHI geninin, başta memeve over olmak üzere kalp, karaciğer, pankreas ve beyin normal dokularında süreklisentezlendiği bilinmektedir. Yapılan çalışmalarla meme ve over kanserlerinin % 70-80'inde ARHI geninin ekspresyonunda azalma olduğu gösterilmiştir. ARHI geninin glialbeyin tümörlerinin gelişimde etkili olup olmadığı ise bilinmemektedir. Bu çalışmadanormal beyin dokusunda ekspresyon gösteren ARHI geninin, glial beyin tümörügelişiminde rolünün belirlenmesi hedeflenmiştir. Çalışmamızda, 21 glial tümörlü olgununtümör ve periferik kan örnekleri ile 7 otopsiden elde edilen normal beyin doku örnekleriincelenmiştir. ARHI gen ekspresyon düzeyleri gerçek zamanlı RT-PCR tekniği iledeğerlendirildiğinde, 21 glial tümör örneğinin 7'sinde (% 33.3) ARHI genekspresyonunda azalma gözlenmiştir. Ekspresyon azalmasına neden olabilecekmekanizmalardan biri olan heterozigosite kaybı, 1p31 bölgesinde yer alan D1S207,D1S226, D1S430, D1S488 ve D1S2638 olmak üzere 5 işaretli polimorfik markırkullanılarak fragment analizi uygulanarak gerçekleştirilmiştir. 21 olgunun 2'sinde (%9.5) LOH tespit edilmiş olup bu olgular gerçek zamanlı RT-PCR tekniği ile ARHI genekspresyonunda azalma gösteren 7 olgunun içerisinde yer almaktadır. Kalan 5 olgununtümör DNA örneklerinde, ekspresyon azalmasına neden olabilecek bir başka mekanizmaolan metilasyon araştırılmıştır. Yapılan çalışmalarla ARHI geninin promotor bölgesinde 3farklı CpG adacığı tanımlanmış olup, gen ekspresyon kaybı ile en çok CpG II bölgesiarasında ilişki bulunmuştur. Buradan yola çıkarak CpG II bölgesinin metilasyon profili,5 olguda COBRA tekniği ve restriksiyon enzim kesimi teknikleri uygulanarakçalışılmıştır. Değerlendirme sonucunda 5 olgunun hiçbirinde ARHI genininpromotorundaki CpG adacığı II bölgesinde metilasyon belirlenmemiştir. Bulgularımız,ARHI tümör süpresör geninin ekspresyonundaki azalmanın glial beyin tümörügelişiminde rol oynayabileceğini ve heterozigosite kaybının bu ekspresyon azalmasındansorumlu mekanizmalardan birisi olabileceğini göstermiştir.Anahtar kelimeler: Glial beyin tümörleri, ARHI, LOH, metilasyon

Abstract:
Although the ARHI gene, which is localized in the 1p31 chromosomal region,shows 60% homology to the Ras protooncogene, it is the first tumor supressor genedefined in the Ras family. The maternally silenced ARHI gene that is expressed onlyfrom the paternal allele, is known to be constitutively expressed in primarily the normalbreast and ovarian tissues, and in normal heart, liver, pancreas, and brain tissues also.Studies have revealed reduction in the ARHI gene expression in 70 to 80% of the breastand ovarian cancers. It is not known yet whether the ARHI gene plays a role in thedevelopment of the glial brain tumors or not. This study aimed detection of the role ofARHI gene, which is expressed in the normal brain tissue, in development of the glialbrain tumors. In the study, tumor and peripheral blood samples of 21 cases with glialtumor, and normal brain tissue samples obtained from 7 autopsies were investigated.Evaluation of the ARHI gene expression levels by Real time RT-PCR revealed decreasein 7 (33.3%) of the 21 glial tumor samples. Analysis of loss of heterozygosity, which isone of the mechanisms that can lead to decrease in expression, was performed byfragment analysis using 5 labeled polymorphic markers localized in the 1p31 region,namely D1S207, D1S226, D1S430, D1S488, and D1S2638. LOH was detected in 2(9.5%) of the 21 cases, who were included in the 7 cases who were found to reveal adecrease in the ARHI gene expression by real time RT-PCR. Methylation status, which isanother mechanism that can lead to decrease in the ARHI expression, was investigated inthe tumor DNA samples of the remaining 5 cases. Studies performed revealed 3 differentCpG islands in the promotor region of the ARHI gene, where the CpG region II had thehighest relation with the gene expression loss. Thus, the methylation profiles of the CpGregion II in these 5 cases were investigated by COBRA technique and restriction enzymeanalysis. Evaluation of the results revealed no methylation in the CpG island region IIlocated in the promotor of the ARHI gene in any of the 5 cases studied. Our resultsrevealed that decrease in the ARHI tumor supressor gene expression may play a role inthe glial brain tumor development, and that loss of heterozygosity can be one of themechanisms responsible for this reduction in the ARHI gene expression.Key Words: Glial brain tumors ARHI, LOH, methylation