Yara yerinden izole edilen staphylococcus aureus suşlarının biyofilm oluşumunun konvansiyonel ve moleküler yöntemlerle incelenmesi
Examination of biofilm formation of staphylococcus aureus strains isolated from wound with conventional and molecular methods
Yazar: TÜRKAN ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. AYŞE MELTEM ÇIRAK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Genler = Genes ; Membran proteinleri = Membrane proteins ; Staphylococcus aureus = Staphylococcus aureus ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries

Özet:
Bu çalışmada ile Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi
Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvar'ında yara yerinden izole
S.aureus suşlarının biyofilm yapma yetenekleri, biyofilm oluşumu ile ilişkili
genlerin ve yüzey proteinleri ile ilişkili genlerin varlığının araştırılması,
biyofilm pozitif ve negatif suşların fenotipik ve genotipik karakterlerinin
karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmaya yara yerinden izole edilen 50 S.aureus bakterisi
dahil edilmiştir. Çalışmada biyofilm oluşumu konvansiyonel yöntem olarak
kongo kırmızılı agar besiyeri ve mikrotitrasyon plak yöntemi kullanılarak
karşılaştırılmıştır. Kongo kırmızılı agar besiyerine ekilen 50 S.aureus
suşunun 37oC'de bir gece ve sonrasında oda ısısnda 48 saat inkübasyon
sonucunda yapılan koloni morfolojisine dayanan fenotipik
değerlendirmede 16 (%32) örneğin biyofilm oluşumunu negatif bulunurken
34 (%68) örneğin biyofilm oluşumu pozitif olarak bulunmuştur.
Mikrotitrasyon plağı yönteminde; 37oC'de 24 saatlik inkibasyonun ardından
kristal viyole ile boyama sonrasında absorbans ölçümleri yapılarak tüm
suşların biyofilm oluşumu değerlendirilmiştir. Kristal viyole kullanılarak
yapılan absorbans ölçümlerine göre yara yeri örneklerinin 17'sinde (%34)
zayıf biyofilm oluşumu (negatif), 21'inde (%42) orta derece biyofilm
oluşumu ve 12'sinde (%24) güçlü biyofilm oluşumu olduğu belirlenmiştir.
Kongo kırmızılı agar besiyeri ve mikrotitrasyon plak yöntemi biyofilm
oluşumu yönünden karşılaştırıldığında istatiksel olarak uyumluluk
bulunmamıştır (p0.05) .
77
S.aureus bakterisinin biyofilm oluşumunun moleküler olarak
değerlendirmesinde; biyofilm oluşumunun ilk basamağında görev yapan
yüzey proteinleri genlerinin varlığı (fnbA, clfA ve ebpS) ve ikinci
basamakta hücre-hücre adezyonu ve çok tabakalı biyofilm oluşumunun
şekillenmesinde görev alan icaA ve icaD genleri araştırılmıştır.
Çalışmamızda yara yerinden izole edilen 50 S.aureus
bakterisinin 44'ünde (%88) fnbA ve clfA geni saptanırken 6 (%12) suşta
fnbA ve clfA geninin varlığı saptanılamamıştır. ebpS geni 23 (%46) suşta
saptanırken 17(%34) suşta saptanılamamıştır. Kongo kırmızılı agar
besiyerinde değerlendirilen biyofilm üretimi ile fnbA, clfA genleri arasında
normal-orta derecede ilişki bulunurken (r=0.274, p<0.001). ebpS geni
arasında zayıf bir ilişki bulundu (r=0.031, p>0.001). Mikrotitrasyon plağı
yönteminde değerlendirilen biyofilm üretimi ile fnbA geni arasında zayıf
derecede (r=0.039 p>0.001), clfA geni arasında zayıf derecede (r=0.028
p>0.001) ve ebpS geni arasında negatif yönlü zayıf (r=-0.148 p>0.001) bir
ilişki bulunmuştur.
Çalışmamızda yara yerinden izole edilen 50 S.aureus
bakterisinin 42'sinde (%84) ve pozitif kontrol olarak kullanılan S.aureus
ATCC 43300 suşunda icaA ve icaD genlerinin her ikiside saptanmıştır.
Çalışmaya alınan 50 suşun 7'sinde (%14) ve negatif kontrol olarak
kullanılan S.aureus ATCC 29213 icaA ve icaD genleri saptanamadı.
Çalışmaya katılan 1 (%2) suşda icaA pozitif, icaD geni ise negatif olarak
saptanmıştır. Kongo kırmızlı agar besiyerinde değerlendirilen biyofilm
oluşumu ile icaA ve icaD genleri arasında normal-orta derecede ilişkili
bulunmuştur (r=0.285, p=0.001). Mikrotitrasyon plağı yönteminde
değerlendirilen biyofilm oluşumu ile icaA ve icaD genleri arasında zayıf bir
korelasyon saptanmıştır (r=0.088 p>0.001).
Sonuç olarak; S.aureus biyofilm oluşumunda
değerlendirilmesinde kullanılan konvansiyonel yöntemler arasında
standardizasyon saptanılamamıştır. Yapılan moleküler değerlendirme
sonucunda S.aureus'un biyofilm oluşumu ile sorumlu tutulan (fnbA, clfA,
icaA ve icaD) genlerin biyofilm ile ilişkisi olduğu ve ebpS ile negatif yönlü
bir ilişkinin bulunduğu ancak biyofilm oluşumunun tek başına genotipik
özelliklere bağlı olmadığı, çevresel ve suşa ait özelliklerin de biyofilm
oluşum mekanizmalarını etkilediği düşünülmektedir.

Anahtar kelimeler; Staphylococcus aureus, biyofilm, yüzey protein genleri, ica genleri

Abstract:
This study is intended to analyze the ability of the S.aureus
strains isolated from wounds to make biofilm, to assess the presence of
the genes related to the biofilm formation and the genes related to surface
proteins, and to compare the phenotypic and genotypic characters of the
biofilm positive and negative strains at the Microbiology and Clinical
Microbiology Laboratory of Gazi University Faculty of Medicine.
A total of 50 S.aureus bacteria isolated from wounds were
included to the study. In the study, Congo Red Agar and microplate assay
method were used to compare the biofilm formation. According to the
phenotypic assessment of colony morphology of 50 strains at Congo Red
Agar, which was conducted after they were incubated at 37 oC for one
night and then at room temperature for 48 hours, the biofilm production of
16 (32%) of the strains was found negative, while that of 34 (68%) strains
was found positive. In microplate method, after the 24-hour incubation at
37 oC, absorbance measurements were evaluated after they were painted
by using crystal violet, and then the biofilm production of all the strains
was assessed. According to the absorbance measurements related to
using crystal violet, 17 (34%) strains were negative, 21 (42%) were
moderate and 12 (24%) were strong in terms of biofilm production. There
was found no statistical relationship between microplate method and
Congo Red Agar in terms of biofilm formation, upon their comparison.
In the molecular evaluation of the biofilm formation of
S.aureus bacteria, the existence of surface proteins genes (fnbA, clfA ve
ebpS) that has role in the first step of biofilm formation was analyzed as
well as the icaA and icaD genes that has role in the cell-cell adhesion and
multi-layered biofilm formation.
In our study, fnbA and clfA genes were detected in 44 (88%)
of 50 S.aureus bacteria isolated from wounds while fnbA and clfA genes
were not detected in 6 (12%) strains. Also ebpS genes were detected in
23 (46%) strains and were not detected in 17 (34%) strains. There was a
normal-to-moderate relation between fnbA and clfA genes and the biofilm
formation examined on Congo Red Agar (r=0.274, p<0.001). There was a
poor relationship between the biofilm formation and ebpS gene (r=0.031
p>0.001). Moreover, there was a poor relation between fnbA gene and
biofilm formation examined with the microplate method (r=0.039, p>0.001).
There was a poor relation between the biofilm formation and clfA gene
(r=0.028, p>0.001) and a negative relation between the biofilm formation
and ebpS gene (r=0.148, p>0.001).
In our study, both icaA and icaD genes were determined in
42 (84%) strains of 50 S.aureus bacteria isolated from wounds and in
S.aureus ATCC 43300 used positively. Neither icaA nor icaD genes were
determined in 7 (14%) strains of 50 S.aureus bacteria included in the
study and in S.aureus ATCC 43300 used negatively. In one strain (2%)
included in the study, icaA gene was found as positive and icaD gene was
found as negative. There was a normal-to-moderate relationship between
icaA and icaD genes and the biofilm formation examined on Congo Red
Agar (r=0.285, p=0.001). However, a poor correlation was determined
between biofilm formation with the microplate method and icaA and icaD
genes existence (r=0.088, p>0.001).
81
As a result, no standardization was determined among the
conventional methods used in the evaluation of S. aureus biofilm
formation. The result of molecular evaluations showed that the genes
(fnbA, clfA, icaA ve icaD) was found to be responsible for the biofilm
formation of S.aureus have something to do with the biofilm and have a
negative relationship with ebpS gene. These results also indicate that
biofilm formation does not depend only on genotypic features, but its
mechanisms are also affected by the environmental features.

Key Words: Staphylococcus aureus, biofilm, surface protein genes, ica genes