Bitkisel kaynaklı gıda atıklarından elde edilen ekstraktların antimikrobiyal ve antioksidan özelliklerinin incelenmesi
Investigation of antimicrobial and antioxidant properties of extracts obtained from plantal wastes
Yazar: YAĞMUR KÜÇÜKDUMAN
Danışman: DOÇ. DR. HATİCE FUNDA KARBANCIOĞLU GÜLER
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Son yıllarda, nüfus ve gıda tüketimine paralel olarak artan gıda atıkları tüm dünyada çevresel, ekonomik ve sosyal bir problem haline gelmiştir. Atıkların bertaraf edilmesi, ekonomik ve çevresel açıdan birçok sorun oluşturmaktadır. Zengin besin içeriğine sahip olan gıda atıkları hastalığa neden olan mikroorganizmaların gelişmesine uygun ortamı sağlayarak halk sağlığı için tehlike oluşturmaktadır. Bu atıklar gıda zincirinde üretim, depolama, nakliye sırasında veya tüketiciye sunulduktan sonra ortaya çıkmaktadır. Gıda atıkları, yakma veya düzenli depolama sahasına boşaltılmalarına ek olarak, hayvan yemi veya kompost olarak, sanayide katma değerli ürünlerin (biyopolimer, enzim, etanol vb.) geliştirilmesi amacıyla ve biyoyakıt üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Gıda ürünlerinin raf ömrünün uzatılması tüketicinin sağlığı başta olmak üzere gıda kalitesi, gıda güvenliği, harcanan maliyet ve gıda sürdürülebilirliği açısından gıda endüstrisinin hedefi haline gelmiştir. Patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmların neden olduğu gıda kaynaklı hastalıklar sonucu artan vaka ve ölümlerin dünyada küresel bir halk sağlığı problemi haline gelmesi de bu hedefin ana sebeplerinden biridir. 
Gıdalara doğrudan katılabilen, yüzeye veya ambalaj malzemesine uygulanabilen antimikrobiyaller sentetik veya doğal kaynaklı olarak kullanılabilir. Gıdalarda kullanılan sentetik antimikrobiyallere karşı son yıllarda tüketici eğilimi azalmış olup, güvenli, etkili, ürünün organoleptik özelliklerini beklenen düzeyde sağlayabilecek, doğal kaynaklı antimikrobiyallere olan eğilim artmıştır. Gıda atığı hem yüksek miktarda bitkisel besin (pektin, protein, lipit vb.) ve değerli biyoaktif bileşikler (polifenoller, karoteinod, flavonoid, C vitamini vb.) içermesi, hem de ekonomik ve çevresel açıdan değerlendirildiğinde avantaj sağlaması nedeniyle gıdanın raf ömrünü uzatmak için kullanılabilecek bir doğal antimikrobiyal kaynağı olarak kullanılabilir. 
Tarım atıkları, çok sayıda yüksek değerli ürünün üretimi için ucuz ve doğal bir ikame olabilir. Nar (Punica granatum L.), üzüm (Vitis vinifera L.) ve domates (Lycopersicon esculentum L.), ülkemizde ve dünyada yıllar geçtikçe artan üretim miktarına sahip olan ve değerli biyoaktif bileşenler içeren meyvelerdir. Biyoaktif bileşenler arasında en önemlileri, antimikrobiyal ve antioksidan etki oluşturan fenolik bileşiklerdir. Bu meyve türlerinin, gıda zincirinde çeşitli gıdaların üretiminde rol oynamaları büyük miktarlarda atık (kabuk, çekirdek, sap vb. kısımlar) oluşumuna neden olur. Meyve ve sebze işlemesi sırasında, mahsulün türüne göre değişmekle beraber kütlenin % 35'ine kadar posa şeklinde atıklar ortaya çıkmaktadır. 
Tez çalışması kapsamında, soğuk presleme yöntemiyle yağı alınmış nar, üzüm ve domates çekirdeği atıklarının antimikrobiyal ve antioksidan özellikleri ile gıda ürünlerinde kullanılma potansiyelleri incelenmiştir. Atıklar,  % 70 etanol ile ekstrakte edilerek toplam fenolik madde miktarı Folin Ciocalteu yöntemiyle, toplam antioksidan kapasitesi ise CUPRAC, DPPH ve ABTS analizleri ile spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Sonuçlar incelendiğinde, toplam fenolik madde miktarı en yüksek olan ekstrakt üzüm çekirdeği, en az olan ise domates çekirdeğidir. Toplam antioksidan kapasite sonuçları ise kullanılan yöntemlere bağlı olarak farklılık göstermektedir. DPPH analizi sonuçlarına göre nar ve üzüm çekirdeği ekstraktlarının arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark bulunmazken (p<0,05) , domatesin en düşük antioksidan kapasiteye sahip olduğu bulunmuştur. CUPRAC sonuçlarına göre ise en yüksek antioksidan aktiviteye üzümün en düşük antioksidan aktiviteye ise domatesin sahip olduğu bulunmuştur(p<0,05). ABTS analiz sonuçlarına göre ise, ekstraktların toplam antioksidan kapasiteleri arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır(p<0,05). 
Tez çalışması kapsamında ekstraktların antimikrobiyal etkisi Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium'a karşı incelenmiştir. Çalışılan  bakterilere karşı minimum inhibisyon konsantrasyon (MİK) değerleri agar dilüsyon yöntemi ile belirlenmiştir. Nar çekirdeği ekstraktı, seçilen tüm mikroorganizmalar değerlendirildiğinde, en etkili (en düşük MİK değerine sahip, 3-12 mg/mL) olandır. Domates çekirdeği ekstraktı seçilen mikroorganizmalara karşı en yüksek MİK değerlerine sahip olduğu için, ekstrakte edilmemiş meyve çekirdeği atıklarının  incelenen bakteri türlerine karşı antimikrobiyal etkisi sadece üzüm ve nar çekirdeği atıkları için araştırılmıştır. Sonuçlara göre, bakteri türlerine bağlı olarak 96 mg /mL nar çekirdeği atığı %99,91-%100, 96 mg/mL üzüm çekirdeği atığı ise % 51,77-% 83,96 oranında bakteri inhibisyonu sağlamıştır.
Nar çekirdeği ekstraktı, seçilen mikroorganizmalara karşı en düşük MİK değerine sahip olması sebebiyle, gıda uygulamasında çeşitli ön denemelerde kullanılmıştır.  Ekstrakt, tavuk ve dana köftesi gibi katı gıdalara katılarak gıdaların raf ömrü incelendiğinde, yeterli miktarda antimikrobiyal etki görülmemiştir. Bu sebeple, zengin bir besin içeriğine sahip ve sıvı bir gıda numunesi olan sebze çorbasının sterilizasyonundan sonra %0,6 ve %1,2 oranlarında ekstrakt eklenerek inoküle edilen E. coli' ye karşı antimikrobiyal etkisi incelenmiştir. Çorba numuneleri 8 °C  ve 25 °C sıcaklıkta 1, 3 ve 5 gün boyunca depolanmıştır. Depolama sıcaklığı olarak 8 °C'de depolanan numunelerde E. coli sayısında gün bazında kontrol ve ekstrakt içeren numuneler arası istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (p<0,05). 25 °C sıcaklıkta ise, %1,2 oranında ekstrakt içeren çorba (N2) numunesi tüm depolama günlerinde kontrol numunesine göre E. coli bakterisini %99 - %100 oranında, % 0,6 oranında ekstrakt içeren çorba (N1)  ise % 82,63 - 98,58 oranında inhibisyona neden olmuştur. 
Sebze çorbalarına ekstrakt ilavesinin çorbaların kalite özelliklerine etkisi incelemek amacıyla renk parametreleri, pH, titrasyon asitliği, reolojik özellikler, toplam fenolik madde ve DPPH analizi yoluyla toplam antioksidan kapasite özellikler belirlenmiştir. Renk parametreleri incelendiğinde, L*, 0 siyah ve 100 beyaz olmak üzere açıklığı ifade ederken, tüm numunelerin L* değeri  59,33 ± 1,44 ve 71,22 ± 3,39 arasında değişmektedir. 0. günde, N2 numunesinin L* değeri N1 ve kontrol numunelerinden anlamlı ölçüde farklı ve yüksek bulunmuştur (p<0,05). Numunelerin, a* değerleri, -2,35 ± 0,13 ve -5,71 ± 0,90 arasında değişmektedir ve 0. gün N1 numunesinin yeşilliği, N2 ve K numunesinden az bulunmuştur (p<0,05). Numunelerin, b* değerleri, 30,43±5,58 ve 41,14±0,84 arasında değişmektedir, bu sebeple numuneler sarı renk eğilimindedir. 0. günde numunelerin b* değeri karşılaştırıldığında, numuneler arası istatistiksel olarak anlamlı bir fark çıkmamıştır (p<0,05). ΔE* değeri 0. günde değerlendirildiğinde, N2 numunesinin ΔE* değeri, N1 numunesinden istatistiksel olarak anlamlı derecede fazladır (p<0,05). Sebze çorbasına katılan  ekstrakt miktarı arttıkça kontrol örneğine kıyasla toplam renk değişimi (ΔE* ) artış göstermiştir. pH ve titrasyon asitliği sonuçları değerlendirildiğinde, numuneye katılan ekstrakt miktarı arttıkça pH değerleri azalırken (5,56-4,93), asitlik değerleri (% 0,86-1,25) artmıştır. Tüm numunelerde sıcaklık artışına (8 °C - 25 °C) bağlı olarak 5. gün ölçülen kıvam indeksi (K) değeri azalmıştır. Akış davranış indeksi (n) ise tüm örneklerde 1'den küçük bulunmuştur ve örnekler psödoplastik (kayma ile incelen) akış davranışı göstermekte ve 0, 1, 3 ve 5 gün depolama sonucu, görünür viskozite değerleri (η), 0-100 1/s kayma hızında (˙γ) ölçülmüş olup, kayma hızı arttıkça görünür viskozite tüm örneklerde azalmıştır. Toplam fenolik madde ve toplam antioksidan kapasite sonuçlarına göre, ekstrakt miktarı arttıkça, çorba örneklerinde toplam fenolik madde (mg GAE/100 g KM) ve toplam antioksidan kapasitesi (mg TE/100 g KM) artmıştır. Buna ek olarak, 8 oC ve 25 oC sıcaklıkta numunelerin toplam fenolik madde içeriği ve antioksidan kapasitesi arasında pozitif korelasyon bulunmuştur (sırasıyla r=0,978 ve r=0,716 ; p<0,05). 
Sonuç olarak, meyve çekirdeği atıklarından (nar, üzüm ve domates) elde edilen ekstraktların in vitro çalışmalar sonucu antimikrobiyal ve antioksidan etkisi olduğu saptanmıştır. Soğuk presleme ile yağı alınmış nar çekirdeği  ekstraktının doğal antimikrobiyal olarak sebze çorbasında kullanılması raf ömrünü olumlu yönde etkilemiştir. Katma değeri yüksek bileşenleri doğal olarak barındıran meyve çekirdeği atık ekstraktları hem atık değerlendirmesi hem de düşük maliyetli olmaları açısından sentetik antimikrobiyallere alternatif bir doğal antimikrobiyal olarak gıdalarda kullanılabilir.

Abstract:
In recent years, with the increasing population and consumption amount, food waste has become an environmental, economic and social problem all over the world. While the disposal of wastes creates many economic and environmental problems, wastes with rich nutritional content pose a danger to public health by providing a suitable environment for the development of microorganisms that cause disease. These wastes occur during production, storage, transportation or after being presented to the consumer in the food chain. In addition to incineration or discharging to the landfill, these wastes are widely used as animal feed or compost, during the development of value-added products (biopolymer, enzyme, ethanol, etc.) in the industry, and in the production of biofuels.
Extending the shelf life of food products has become the goal of the food industry in terms of consumer health, food quality, food safety, economic evaluation and food sustainability. The fact that increasing cases and deaths as a result of food-borne diseases caused by pathogens and spoilage microorganisms has become a global public health problem in the world is one of the main reasons for this goal. As an alternative to traditional food preservation methods (which may involve large amounts of physical and chemical processes), one of the areas on which scientific research has been carried out in recent years is the use of antimicrobials in foods. Synthetic and natural antimicrobials can be added directly to foods, applied to the surface or applied to packaging material. Consumers' tendency towards synthetic antimicrobials used in foods has decreased in recent years. In addition to the fact that the use of synthetic antimicrobials poses a great risk to consumer health, their use is limited due to undesirable effects that may lead to environmental pollution. There has been increasing interest in natural antimicrobials that are safe, effective and can provide the expected level of organoleptic properties of the product.
Food waste can be used as a natural antimicrobial that can be used to extend the shelf life of food because it contains high amounts of plant nutrients (pectin, protein, lipid, etc.) and valuable bioactive compounds (polyphenols, caroteinoid, flavonoid, vitamin C etc.), and is advantageous when evaluated from an economic and environmental point of view. Many studies on in vitro and food applications of components extracted from fruit and vegetable wastes have shown that they are effective as an alternative to synthetic antimicrobials.
Pomegranate (Punica granatum L.), grape (Vitis vinifera L.) and tomato (Lycopersicon esculentum L.) are fruit species that have increased production over the years in our country and the world and contain bioactive valuable components. Among the bioactive components, the most important are phenolic compounds that create antimicrobial and antioxidant effects. The fact that these fruit species play a role in the production of various foods in the food chain causes the formation of large amounts of waste (skin, seeds, stems, etc.). During fruit and vegetable processing, wastes in the form of pomace occur up to 35% of the mass, depending on the type of crop. Although there are many food applications in the literature, including the waste parts of pomegranate, grape and tomato, there is no study in which the cold pressed degreased waste of the seeds was extracted and evaluated in terms of antimicrobial and antioxidant activity. 
Within the scope of the thesis, after extracting the degreased waste (by cold pressing method) of pomegranate grapes and tomato seeds with 70% ethanol, the total phenolic content of the extracts was determined spectrophotometrically by total phenolic content method and the total antioxidant capacity of the extracts was determined spectrophotometrically by CUPRAC, DPPH and ABTS methods. When the results are examined, the extract with the highest total phenolic content is grape seed and the lowest is tomato seed. Total antioxidant capacity results differ between analyzes. According to DPPH analysis results, there was no statistically significant difference between pomegranate and grape seed extracts (p<0.05), while tomato had the lowest antioxidant capacity. In the CUPRAC analysis, grape had the greatest antioxidant capacity (722.60±28.50 mg TE/100 g DW), followed by pomegranate (428.75±3.68 mg TE/100 g DW) and tomato (334.70±73.57 mg TE/100 g DW), respectively (p<0.05). As a result of ABTS analysis, no significant difference was found between the total antioxidant capacities of the extracts (p<0.05).
The minimum inhibition concentration (MIC) values of the extracts of Escherichia coli and Enterococcus faecalis, which are gram-negative bacteria, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, which are gram-positive bacteria were determined by agar dilution method. The pomegranate seed extract is the most effective (with the lowest MIC value, 3-12 mg/mL) when all selected microorganisms are evaluated. Since the tomato seed extract has the highest MIC values against the selected microorganisms, the antimicrobial effect of the unextracted fruit seed wastes was observed against the above-mentioned bacterial species, while only grape and pomegranate seed wastes were used. According to the results, 96 mgl /mL pomegranate and grape seed waste provided 99.91%-100% and 51.77%-83.96% bacterial inhibition respectively.
Pomegranate seed extract has been used in various preliminary trials in food applications because it has the lowest MIC value against selected microorganisms. When the total Enterobacteriaceae and total mesophilic aerobic bacteria count results on different storage days were examined after the extract was added to solid foods such as chicken and beef patties and stored at 4°C, the sufficient antimicrobial effect was not observed. For this reason, after sterilization of vegetable soup, which is a liquid food sample with a rich nutrient content, an antimicrobial effect was observed against inoculated E. coli by adding 0.6% and 1.2% extract. Vegetable soup is a suitable food matrix for the growth of pathogenic microorganisms when adequate heat treatment is not applied and proper storage conditions are not provided. Soup samples were stored at 8 °C and 25 °C for 1,3 and 5 days. When the samples stored at 8 °C were examined, there was no statistically significant difference in the number of microorganisms on a daily basis between the samples containing the control and the extract (p<0.05). Considering the results of the 5th day, although the number of microorganisms decreased compared to the previous storage days, there was no significant effect on the extracted samples. At 25 °C, the soup (N2) sample containing 1.2% extract has 99% - 100% E.coli compared to the control sample on all storage days, soup containing 0.6% extract inhibited 82.63 - 98.58%. 
Color parameters, pH, titration acidity, rheological properties, total antioxidant capacity (by DPPH analysis) and total phenolic content were investigated in order to evaluate the effect of adding the extract to the vegetable soups on the quality properties. When the color parameters are examined, L* determines lightness, 0 black and 100 white. L* value of all samples varies between 59.33 ± 1.44 and 71.22 ± 3.39. At day 0, L* value of N2 sample was significantly different and higher than N1 and control samples (p<0.05). The a* values of the samples ranged between -2.35 ± 0.13 and -5.71 ± 0.90, and the greenness of N1 sample at day 0 was less than that of N2 and K samples (p<0.05). The b* values of the samples vary between 30.43 ± 5.58 and 41.14 ± 0.84, therefore the samples tend to be yellow. When the b* value of the samples was compared on day 0, there was no statistically significant difference between the samples (p<0.05). When the ΔE* value was evaluated on day 0, the ΔE* value of the N2 sample was statistically significantly higher than the N1 sample (p<0.05). As the extract added to the vegetable soup increased, the total color change (ΔE*) increased compared to the control sample. When the pH and titration acidity results were evaluated, the pH values decreased (5.56 - 4.93) as the amount of extract added to the sample increased, while the acidity values (0.86-1.25%) increased. Although there is no obvious trend in pH and acidity values of the samples depending on the storage days (day 0-5) at 8 °C and 25 °C, the value ranges are correspond to the day 0 data. When the rheological properties of the soups were evaluated, the consistency index (k) value measured on the 5th day decreased in all samples due to the increase in temperature (8 °C - 25 °C). Flow behavior index (n) was found to be less than 1 in all samples and samples show pseudoplastic (shear thinning) flow behavior. After 0, 1, 3 and 5 days of storage, the apparent viscosity values (η) were measured at shear rate of 0 -100 1/s (˙γ), and the apparent viscosity decreased in all samples as shear rate increased. When the total phenolic content  and total antioxidant capacity results were evaluated, as the  extract amount in the soups increased, the total phenolic content and total antioxidant capacity increased. In addition, a positive correlation was found between the total phenolic content and antioxidant capacity of the samples at 8 oC and 25 oC temperatures (r=0.978 and r=0.716 respectively; p<0.05).
As a result, it has been observed that fruit seed waste (pomegranate, grape and tomato) extracts have antimicrobial and antioxidant effects as a result of in vitro studies. Evaluation of fruit wastes and the use of waste extract of pomegranate seeds, which were degreased by cold pressing method, as a natural antimicrobial in vegetable soup had a positive effect on the shelf life.  Fruit seed waste extracts, which naturally contain high-value components, can be used as a natural antimicrobial alternative to synthetic antimicrobials in terms of both waste recycling and low cost.