BldG ve CcaR regülatör proteinlerinin Streptomyces clavuligerus'ta tunikamisin biyosentezi üzerine etkileri
The effects of BldG and CcaR regulatory proteins in tunicamycin biosynthesis in Streptomyces clavuligerus
Yazar: LOKMAN BAŞ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bir nükleozit antibiyotiği olan tunikamisin yapısal olarak diğer antibiyotiklerden oldukça farklı olup urasil, N-asetilglukozamin (GlcNAc), tunikamin adı verilen 11 karbonlu aminoaldoz şeker ve farklı uzunlukta N-açil yan zircirlerden oluşmaktadır. Tunikamisin bakteri hücre duvarı sentezinin peptidoglikan öncülü lipit I' in oluşumunu hedef aldığı bilinen ilk nükleozit tipi antibiyotik olup aynı zamanda ökaryotlarda erken ara ürün olan dolisilpirofosforil-N-asetilglukozaminin oluşumunu bloke eden protein N-glikolizasyon inhibitörüdür. Dolayısı ile protein glikolizasyonunu ve bakteri peptidoglikan biyosentezini inhibe etmesi bakımından oldukça önemli bir antibiyotiktir. Bu çalışmada, Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus)'ta tunikamisin biyosentezinde rol oynayan düzenleyici mekanizmaların belirlenmesi amacı ile pleiotropik bldG ve yolakta konumlanmış ccaR regülatör genlerinin tunikamisin biyosentezi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. bldG ve ccaR genlerinin hücrede yok edilmesinin veya bu genlerin hücrede çoklu ifadeleri/kromozoma entegrasyonlarının tunikamisin biyosentezi ve üretimi üzerindeki muhtemel etkileri bunlara ait vektör kontrolleri ve yabanıl suş ile kıyaslanarak belirlenmiştir. Sadece bldG geninin çoklu kopyasını içeren S. clavuligerus LB1 ve tek kopyasının kromozoma entegre olduğu S. clavuligerus LB2 rekombinant suşları bu çalışmada oluşturulmuştur. Kullanılan diğer manipüle suşlar ise daha önceki çalışmalardan elde edilmiştir. Tunikamisin gen kümesinin ekspresyonunda meydana gelen değişmeler qRT-PCR yöntemi ile tespit edilmiş, kontrol ve manipüle S. clavuligerus suşlarının tunikamisin üretimleri ise biyoassay ve HPLC yöntemleri ile karşılaştırılmıştır. Sonuçlar ışığında, genel anlamda bldG regülatör geninin tunikamisin gen ifadeleri üzerinde negatif bir düzenlenmeyle alakalı bir rol üstleniyor olabileceği, ccaR regülatör geninin ise tunikamisin gen ifadesi üzerinde pozitif bir etkiye sahip olma potansiyeli taşıdığı fikrine varılmıştır.

Abstract:
A nucleoside antibiotic tunicamycin differs structurally from other antibiotics by the presence of uracil, N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), tunicamine, a unique aminoaldose sugar with 11-carbon atoms, and N-acyl side chains. Tunicamycin is the first known nucleoside-type antibiotic targeting the formation of peptidoglycan precursor, Lipid I, in cell wall synthesis. In addition, it is also an N-glycosylation inhibitor that blocks the formation of dolichyl-pyrophosphoryl-N-acetylglucosamine (Dol-PP-GlcNAc), an early intermediate in eukaryotes. Therefore, it is a crucial anitibotic to inhibit protein N-glycosylation in eukaryotes and bacterial peptidoglycan biosynthesis. In this study, the effects of bldG pleiotropic and ccaR cluster-situated regulatory genes in the regulation of tunicamycin biosynthesis in Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus) were investigated with the aim of deciphering regulatory mechanisms acting on this antibiotic biosynthesis. The possible effects of bldG and ccaR gene blockage or their multicopy expressions or integrations to the chromosome on the biosynthesis and production of tunicamycin in S. clavuligerus were determined by comparison with their respective vector controls and wild type strain. S. clavuligerus LB1 carrying multicopy bldG gene and S. clavuligerus LB2 that has an extra copy of bldG integrated into the chromosome have been constructed in this study. The other manipulated strains used were obtained from previous studies. The changes in the expression of tunicamycin gene cluster were determined by qRT-PCR. Tunicamycin production by the wild type and manipulated S. clavuligerus strains were compared by bioassay and HPLC methods. It can be concluded that in general, bldG regulatory gene might play a role in negative regulation of the gene expression of tunicamycin, whereas the ccaR regulatory gene might have the potential to have a positive effect on expression of tunicamycin gene cluster.