Çeşitli kaynaklardan izole edilen debaryomyces hansenii strainlerinin moleküler biyolojik tanısı, killer toksin üretimi, saflaştırılması ve biyokontrolde kullanılması
Molecular biological characterization, killer toxin production, purification and use in biocontrol of debaryomyces hansenii strains isolated from different sources
Yazar: CENGİZ ÇORBACI
Danışman: PROF. DR. FÜSUN BAHRİYE UÇAR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
İnsanlar, hayvanlar ve bitkilerde patojenite oluşturan çeşitli maya ve küf türlerinin biyolojik kontrolü günümüzde giderek artan bir şekilde ilgi görmektedir. Bu tür biyolojik kontrollerin ortaya çıkarılması, meydana gelebilecek enfeksiyonların önlenmesinin yanı sıra her yıl rapor edilen hasat sonrası kayıpların azaltılmasına olanak sağlamaktadır. Belirli şartlar altında bazı maya strainleri, duyarlı fungus hücrelerinin büyümesine inhibitör etki gösteren proteinler veya glikoproteinler salgılamaktadırlar. Bu maya strainleri, killer mayalar ve salgıladıklara toksinler ise killer toksinler (proteinler) olarak isimlendirilmektedir.
Killer toksinlerin biyoteknolojik önemlerinden dolayı araştırmamızda, farklı kaynaklardan izole edilmiş ve fenotipik olarak tanılanmış olan D. hansenii strainlerinin moleküler biyolojik tanılarının gerçekleştirilerek killer toksin üretimlerinin araştırılması ve artırılması, elde edilen killer toksinlerin saflaştırılması ve in vivo biyokontrol deneylerinde kullanılması amaçlanmıştır.
Çalışmamızda, fenotipik olarak tanılanmış 56 maya straini, killer toksin üretimi açısından taranmış ve toplam 18 maya straini, bir veya birden fazla test organizmasına karşı toksik aktivite göstermiştir. Toksin aktivitesi gösteren maya türleri, moleküler biyolojik yöntemlerle C. zeylanoides, D. hansenii, M. guilliermondii ve P. kudriavzevii olarak tanılanmıştır. En yüksek toksin aktivitesi gösteren iki D. hansenii straini (TEM 8 ve 17) ile gerçekleştirilen killer toksin artırılması çalışmaları sonrasında en yüksek üretim eldesinin, %6 NaCl ve 1000 ppm DMSO içeren YM broth besiyerinde pH 4.0 ve 20oC?de gerçekleştiği bulunmuştur. Büyük çapta üretim ve iki farklı kromatografi yöntemi ile gerçekleştirilen saflaştırma işlemleri sonrasında saf olarak elde edilen killer proteinlerin 31.5 kDa moleküler ağırlığına sahip olduğu bulunmuştur. Saflaştırılmış killer toksinler, pH 2.5-6.0 ve 5-37oC arasında 1 saat ve proteolitik enzimlere karşı 4 ve 20 saat boyunca yüksek stabilite göstermişlerdir. Gerçekleştirilen in vivo biyokontrol deneyleri sonucunda ise hem maya hücreleri hem de saflaştırılmış killer toksinlerin, meyveler üzerinde bitki patojeni funguslar olan A. brassicicola, A. citri, A. niger ve R. stolonifer türlerine karşı yüksek aktivite gösterdikleri saptanmıştır.
Gerçekleştirilen bu çalışma, D. hansenii ve killer proteinlerinin, çok çeşitli küf türüne karşı günümüzde kullanılan sentetik fungisitlere bir alternatif olabileceklerini göstermiştir.

Abstract:
In today, biological control of several yeast and mould species that constitute pathogenicity in humans, animals and plants is attracting increasingly attention. Introduction of such biological control agents provide to allow the reduction of post-harvested losses reported each year as well as to prevention of infections which may occur. Under certain conditions some yeast strains secrete proteins or glycoproteins which inhibit the growth of sensitive fungal cells. These yeast strains are termed as killer yeasts and their toxins are designated as killer toxins (proteins).
Due to the biotechnological importance of killer toxins, in the research, performing the molecular biological identification of phenotypically identified D. hansenii strains isolated from different sources, investigation and optimization of killer toxin productions, purification of killer toxins and use in in vivo biocontrol experiments were aimed.
In the research, phenotypically identified 56 yeast strains were screened for the production of killer toxin, and a total of 18 yeast strains showed toxin activities against one or more test organisms. The yeast species showing toxin activities were identified with molecular biological methods as C. zeylanoides, D. hansenii, M. guilliermondii and P. kudriavzevii. After the optimization experiments performed with two D. hansenii strains (TEM8 and 17) showing highest toxin activities, the highest production was found in YM broth containing 6% NaCl and 1000 ppm DMSO at pH 4.0 and at 20oC. After the large-scale production and the purification processes performed with two different chromatography methods, molecular weights of purified killer proteins were found to be 31.5 kDa. Purified killer toxins showed highest stabilities at the pH range of 2.5-6.0 and at the temperature range of 5-37oC for 1 h and to proteolytic enzymes for 4 and 20 h. As a results of in vivo biocontrol experiments, it was determined that both yeast cells and killer toxins showed highest activities on fruits against plant pathogenic fungi A. brassicicola, A. citri, A. niger ve R. stolonifer.
The present research showed that D. hansenii strains and its killer toxins would be used as alternatives to synthetic fungisides against a wide variety of mould species.