Kreatin ve kreatinin tayinlerine yönelik enzim temelli hibrit biyosensörlerin geliştirilmesi
Enzyme based on hybrid biosensor for the development for determination of creatine and creatinine
Yazar: ÇAĞRI ALTUĞ
Danışman: PROF.DR. ERHAH DİNÇKAYA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tezde kreatinin amidohidrolaz, kreatin amidinohidrolaz vesarkozin oksidaz enzimlerinden yararlanıldı. Bu enzimler , oksijen tayiniamacıyla kullanılan çözünmüş oksijen probu yüzeyinde, glutaraldehidyardımıyla jelatin ile çapraz bağlanarak kreatin ve kreatinin biyosensörühazırlandı. Ölçümler kreatin ve kreatinin derişimi ile doğru orantılıolarak tüketilen oksijen düzeyinin belirlenmesi yoluyla çizilen standartgrafikler yardımıyla gerçekleştirildi.Hazırlanan kreatin biyosensörü için optimum koşullar belirlendi.Kreatin biyosensörünün optimizasyon çalışmaları sonunda kreatinamidinohidrolaz miktarı , sarkozin oksidaz miktarı, jelatin miktarı veglutaraldehid yüzdesi sırayla 0,56mg/cm2 kreatin amidinohidrolaz(16U),0,38mg/cm2 sarkozin oksidaz(25U) , 5,90mg/cm2 jelatin ve %2,5 olarakbulundu. Yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda çalışma tamponupH=8,0 , 50 mM lık fosfat Tamponu olmasına ve ölçümlerin 37 0Cgerçekleşmesine karar verildi. Geliştirilen kreatin biyosensörününkarakterizasyon çalışmaları sonucunda, substrat olarak kreatinVIkullanılması durumunda 25?M-750?M doğrusal sonuçlar alınabildiğibelirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde (n=10) 500?M kreatinderişimi ortalama değer =500,7 ?M standart sapma (S.S)= ± 2,21 ?Mve varyasyon katsayısı VK= %0,44 bulundu.Hazırlanan kreatinin biyosensörü için optimum koşullarbelirlendi. Kreatinin biyosensörünün optimizasyon çalışmaları sonundakreatinin amidohidrolaz, kreatin amidinohidrolaz miktarı , sarkozinoksidaz miktarı, jelatin miktarı ve glutaraldehid yüzdesi sırayla0,016mg/cm2 kreatinin amidohidrolaz(37U), 0,56mg/cm2 kreatinamidinohidrolaz(16U), 0,38mg/cm2 sarkozin oksidaz(25U), 5,90mg/cm2jelatin ve %2,5 olarak bulundu. Yapılan optimizasyon çalışmalarısonucunda çalışma tamponu pH=8,0 , 50 mM lık fosfat Tamponuolmasına ve ölçümlerin 37 0C gerçekleşmesine karar verildi. Geliştirilenkreatinin biyosensörünün karakterizasyon çalışmaları sonucunda,substrat olarak kreatinin kullanılması durumunda 10?M-750?M doğrusalsonuçlar alınabildiği belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde (n=10)500?M kreatin derişimi ortalama değer =499,8 ?M standart sapma(S.S)= ±6,957 ?M ve varyasyon katsayısı VK= %1.4 bulundu.Anahtar kelimeler: Kreatinin biyosensörü, kreatin biyosensörü,kreatinin , kreatin , sarkozin

Abstract:
In this thesis, enzymes were used creatinine amidohydrolase,creatine amidinohydrolase and sarcosine oxidase. These enzymes wascrosslinked with gelatine by using glutaraldehyde and fixed on pretreatedTeflon membrane, served as creatine biosensor and creatinine biosensor.Measurements were carried out by standart curves which were obtainedby the determination of consumed oxygen level, related to creatine andcreatinine concentration in the enzymatic reaction.Firstly, the optimum conditions for the creatine biosensor and thecreatine biosensor were established. In the optimization studies of thecreatine biosensor, creatine amidinohydrolase amount, sarcosine oxidaseamount , gelatine amount and glutaraldehide ratios were determined as0,56mg/cm2 (16U), 0,38mg/cm2 (25U), 5,90mg/cm2 gelatine and 2,5%respectively. Phosphate buffer (50mM. pH= 8 ) and 37 0C wereestablished as providing the potimum working conditions. Thecharacterization studies of developed the creatine biosensor proved aVIIIlineratiriy in the creatine concentration range 25?M-750?M. Thereproducibility experiments (n=10) revealed that for 500 ?M creatine ,the average value =500,7?M , standart deviation (SD) was ± 2,21 ?Mand, variation coefficient (C.V) was 0,44% .The optimum conditions for the creatinine biosensor and thecreatinine biosensor were established. In the optimization studies of thecreatine biosensor, creatinine amidohydrolase amount, creatineamidinohydrolase amount, sarcosine oxidase amount , gelatine amountand glutaraldehide ratios were determined as 0,016mg/cm2 (37U),0,56mg/cm2 (16U), 0,38mg/cm2 (25U), 5,90mg/cm2 gelatine and 2,5%respectively. Phosphate buffer (50mM. pH= 8 ) and 37 0C wereestablished as providing the potimum working conditions. Thecharacterization studies of developed the creatinine biosensor proved alineratiriy in the creatinine concentration range 10?M-750?M. Thereproducibility experiments (n=10) revealed that for 500 ?M creatinine ,the average value =499,8 ?M, standart deviation (SD) was ±6,957 ?Mand, variation coefficient (C.V) was 1,4 %.Keywords: Creatinine biosensor, creatine biosensor, creatinine , creatin,sarcosine