Hücre membranı yamayıcı molekülleri ile Panneksin1 megakanalı arasındaki olası ilişkinin araştırılması
Investigation of the relationship between membrane sealing agents and Pannexin1 megachannel
Yazar: SEVDA LÜLE
Danışman: DOÇ. DR. HÜLYA KARATAŞ KURŞUN ; PROF. DR. YASEMİN ÖZDEMİR
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Nörolojik ve Psikiyatrik Temel Bilimler Ana Bilim Dalı / Temel Nörolojik Bilimler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Hücre zarı = Cell membrane ; Moleküller = Molecules ; Pannexin = Pannexin ; Poloksalen = Poloxalene ; Sitidin difosfat kolin = Cytidine diphosphate choline

Özet:
Nörolojik hastalıkların çoğu için yeni ve etkin tedavi yöntemlerine ihtiyaç vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalar Panneksin (Panx) büyük gözenekli iyon kanallarının özellikle santral sinir sistemi hastalıklarında önemli rolü olabileceğini vurgulamaktadır. Panx1 kanalları membran yerleşimli büyük kanal proteinleri olup özellikle P2X pürinoseptör 7 (P2X7R) ile fonksiyonel olarak ilişkilidirler. Bu tezin amacı membran yamayıcı moleküller olarak tanımlanmış ve nöroprotektif etkileri çeşitli çalışmalar ile gösterilmiş olan sitikolin ve Poloksamer 188 (P-­‐188)'in, Panx1 büyük gözenekli iyon kanalı üzerindeki olası etkilerinin araştırılmasıdır. Bu amaca yönelik olarak in vivo gibi karmaşık bir test sistemi yerine, in vitro gibi kontrolü daha kolay ve basit bir test sisteminin oluşturulmasına çalışılmıştır. HEK hücrelerinde fare Panx1 (mPanx1) ve fare Panx1-­‐P2X7 (mPanx1-­‐P2X7) ikili yoğun ifade sistemi oluşturulup sırasıyla yüksek konsantrasyonda potasyum klorür (KCl) ve adenozin tri-­‐fosfat (ATP) uyarıları ile bu hücrelerin fizyolojik koşullarda floresan boya alımları konfokal mikroskop ve florometrik ölçümlerle test edilmeye çalışılmıştır. Ayrıca Panx1'i endojen olarak yoğun ifade ettiği bilinen J774A.1 ve RAW264.7 fare makrofaj hücre hatlarının da, lipopolisakkarit (LPS) ve ATP veya serumsuz hücre kültürü ortamı ve ATP ile uyarılmasıyla da benzer deneyler yapılmıştır. mPanx1'i yoğun ifade eden HEK hücrelerinde yüksek konsantrasyonda KCl ile boya girişi tespit edilememiş, J774A.1 ve RAW264.7 hücrelerinin her ikisinde de LPS ve serumsuz ortam uyaranları boya girişine neden olmamıştır. mP2X7 yoğun ifade eden HEK hücreleri ile J774.A1 ve RAW264.7 hücre hatlarında ATP uyarısı sonrasında boya girişi tespit edilmiştir. Bu boya girişleri Panx1 inhibitörleri ile bloke edilemediği için başka bir mekanizma ile hücreye boya girişi olduğu düşünülmüştür. mPanx1 ile mP2X7'yi beraber fazla ifade eden hücreler ise yaşam devamlılığı gösteremediği için boya girişi çalışmalarında kullanılamamıştır. mPanx1 yoğun ifade sistemlerinde boya girişi olmadığından, membran yamayıcı ajanların etkileri yalnızca mP2X7 yoğun ifadesi yapan HEK hücre sisteminde denenmiş ve bu kanal aracılı etkilerinin olmadığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak bu tez çalışmasında, in vitro test edilen koşullar ile Panx1 kanalları açılamamıştır. Membran yamayıcı ajanlar etkilerini P2X7 kanalı üzerinden göstermemektedir. Panx1 için in vitro deney sistemlerinden elde edilen bulguların birbiriyle varolan çelişkileri göz önüne alındığı zaman, in vivo sistemlerde Panx1 kanalını çalışmak bu şartlar altında daha uygun gözükmektedir. Panx1 kanalının uyarılma koşulları ile ilgili olarak aydınlatılması gereken çok fazla bilinmeyen nokta bulunmaktadır. Bu noktaların açığa çıkarılması ile in vitro sistemlerdeki varolan çelişkiler de azalacaktır.

Abstract:
For most of the neurological diseases, new theurapeutic targets and drugs are needed. During the last several years one of the large pore channels, Pannexin (Panx) channels have emerged as an important target for neurological diseases. They are membrane bound megachannels that have high homology with connexin channels and are functionally related to purinergic receptors especially with P2X purinoceptor 7 (P2X7R). The main aim of this thesis is to demonstrate if the mechanisms of two membrane sealing agents (Citicoline and Poloxamer 188 (P-­‐ 188)) are related to blockage of pannexin channels. These membrane sealing agents are neuroprotective and their neuroprotective effects were demonstrated via several experimental studies. For this purpose, in vitro systems were developed which are easy to control and simple instead of complicated in vivo systems. To do so HEK cells overexpressing mouse Panx1 (mPanx1) and mouse Panx1 together with mouse P2X7 (mPanx1-­‐P2X7) were created. These cells were stimulated with either high concentration of potasium chloride (KCl) or adenosine three phosphate (ATP) and flourescent dye uptake was measured with confocal microscope or fluorometry in physiological conditions. In addition to these cells, mouse J774A.1 and RAW264.7 cells which endogenously overexpress Panx1 were stimulated with either lypopolysaccharite (LPS) and ATP or serum free media and ATP. There were no dye intake to HEK cells overexpressing Panx1 with KCl stimulation and to J774A.1 and RAW264.7 cells with either serum free media or LPS application. On the other hand, there was significant dye intake to HEK cells overexpressing mP2X7 as well as J774.A1 and RAW264.7 cells after ATP application. These dye intake were not blocked by pannexin inhibitors suggesting that there may be other mechanisms. Cells with double overexpression of mPanx1 and mP2X7 were not used for dye intake studies because they were not viable. HEK cells overexpressing mP2X7 were used for testing the mechanism of membrane sealing agents but no blocking effects was observed. As a result it was not possible to open Panx1 channels with the stimulation parameters used in this study. Regarding the controversies in the previous studies about in vitro experimental models, it can be concluded that in vivo systems might be more suitable to study Panx1 channels.