Ozmotik membran distilasyon sisteminde galaktooligosakkarit sentezinin optimizasyonu ve kinetik modellenmesi
Optimization and kinetic modelling of galactooligosaccharide synthesis in osmotic membrane distillation system
Yazar: KADİR ÇINAR
Danışman: PROF. DR. GÜRBÜZ GÜNEŞ ; PROF. DR. HACI ALİ GÜLEÇ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Beta galaktosidaz = Beta galactosidase ; Enzimatik sentez = Enzymatic synthesis ; Reaksiyon kinetiği = Reaction kinetics ; Süreç optimizasyonu = Process optimization

Özet:
Prebiyotik etkili gıda bileşenleri, insan sağlığı üzerinde sağladıkları faydalı etkiler nedeniyle gıda endüstrisinde genişleyen bir pazar payına sahiptirler. Prebiyotik karbonhidratlar arasında galaktooligosakkaritler (GOS) en spesifik bifidojenik faktörler olarak tanımlanmışlardır. GOS'ler laktozdan β-galaktosidaz enziminin katalizlediği transgalaktosilasyon reaksiyonları ile sentezlenirler. Fakat GOS üretim sürecinde enzimin transgalaktosilasyon ve hidroliz reaksiyonlarını eş zamanlı katalizlemesi nedeniyle GOS sentez verimi düşük olmaktadır. GOS'nin enzimatik sentezi kinetik kontrollü bir reaksiyon olduğundan enzim kaynağı GOS verimi, laktoz dönüşümü, üretkenlik ve ürün komposizyonu gibi parametreleri etkilemektedir. Aspergillus oryzae kaynaklı β-galaktosidazın GRAS kapsamında olmasının yanında yüksek spesifik aktivite, yüksek sıcaklık dayanımı ve düşük maliyetli olması endüstriyel üretimde bu enzimi ön plana çıkarmaktadır. Fakat bu enzimin GOS sentezinde laktoz dönüşümü düşük olduğundan sürecin optimizasyonunun sağlanarak GOS sentez veriminin arttırılması önemli bir gerekliliktir. Bu kapsamda A.oryzae kaynaklı β-galaktosidaz enziminin katalizlediği GOS sentezinin yanıt yüzey yöntemi ile optimizasyonu ilk defa bu çalışmada ele alınmıştır. 
GOS sentez verimininin arttırılması amacıyla enzimatik GOS sentezi basınç destekli membran sistemleri ile entegre edilmeye çalışılmıştır. Özellikle ultrafiltrasyon ve nanofiltrasyon GOS üretim süreçlerine dahil edilerek enzim üzerinde inhibe edici etkileri olan glukoz ve galaktozun reaksiyon ortamından uzaklaştırılması hedeflenmiştir. Ancak bu sistemlerde hem ürün ve substrat kaybının meydana gelmesi hem de permeat akı değerlerinin hızlı bir şekilde azalması neticesinde GOS üretim süreçleri istenilen etkiyi gösterememiştir. Bu nedenle membran destekli ayırım süreçlerinin GOS sentez sürecine engtegrasyonunda yeni yaklaşımların denenmesine ihtiyaç vardır. 
Literatür incelendiğinde yüksek verimlilikte GOS sentezinin sağlanabilmesi için başlangıç laktoz konsantrasyonunun en önemli parametre olduğu görülmektedir. Buradan hareketle enzimatik reaksiyon ortam laktoz konsantrasyonunun süreç boyunca yüksek seviyede tutulmasının GOS sentez verimini arttıracağı düşünülmüştür. Bu fikir doğrultusunda enzimatik GOS sentez sürecine ozmotik membran distilasyon sisteminin engtegrasyonu sağlanmıştır. Ultrafiltrasyon ve nanofiltrasyonun aksine ozmotik membran distilasyon yönteminde kullanılan yüksek hidrofobisiteye sahip mikro-gözenekli bir membran sayesinde enzimatik reaksiyon ortamından sadece suyun yüksek seçicilikle ayrımı sağlanarak reaksiyon ortamı süreç boyunca laktoz konsantrasyonu açısından daha konsantre bir hale getirilmiştir. Ayrıca, entegre sistemden substrat ve ürün kaybı olmamış ve başlangıç akı değerleri uzun süreler boyunca sabit ilerlemiştir. GOS sentez verimini arttırmaya yönelik sürekli karıştırmalı tip kesikli reaktör sürecinin ozmotik membran distilasyon sistemine entegresi sağlanan bu çalışma, reaktör tasarımı açısından literatürde daha önce çalışılmamıştır. 
Doktora tezi kapsamında ilk önce sürekli karıştırmalı tip kesikli reaktörde (reaktör-1) GOS sentez çalışmaları yapılmış ve süreç çıktıları yanıt yüzey yöntemi ile optimize edilmiştir. İkinci olarak ozmotik membran distilasyon sisteminde (reaktör-2) GOS sentez çalışmaları yapılmış ve süreç çıktıları yanıt yüzey yöntemi ile optimize edilmiştir. Son olarak her iki sistemde yanıt yüzey yöntemi ile elde edilen optimum reaksiyon koşullarında GOS sentezi gerçekleştirilmiş ve elde edilen reaksiyon verilerinin kinetik değerlendirilmesi yapılmıştır. Böylece ozmotik membran distilasyon sisteminin GOS sentezi reaksiyonunun kinetiği üzerine etkileri karşılaştırılmalı olarak incelenmiştir. 
Bu çalışmanın temel hedefi ozmotik membran distilasyon sürecinin entegrasyonu yapılan reaktör-2 sisteminde laktozdan enzimatik yolla elde edilen GOS sentez veriminin incelenmesidir. Tasarımı yapılan reaktör-2 sistemi çalışma mekanizması gereği literatürde GOS sentezi için kullanılan membranlı reaktörlerden farklı olduğundan elde edilen verilerin sağlıklı bir biçimde değerlendirilebilmesi için aynı reaksiyon koşullarında çalıştırılan reaktör-1 sisteminden sağlanan GOS sentez sonuçlarından yararlanılmıştır. 
Reaktör-1'de Box Benhken deney tasarımı ile belirlenmiş deney seti ile başlangıç laktoz konsantrasyonu  (LC),  enzim konsantrasyonu  (EC)  ve sıcaklık  (T)  reaksiyon parametrelerinin toplam GOS'ye (GY=GOS-3+GOS-4) etkisi incelenmiş ve GY değeri en düşük  %8,47 ile en yüksek %26,92 arasında bulunmuştur. Reaktör-2'de aynı reaksiyon parametrelerinin GY'ye etkisi faktöriyel deney tasarımı ile incelenmiş ve elde edilen GY değerleri %18,7 ile %28,63 arasında saptanmıştır. Her iki reaktörde de ayrıca GOS-3 ve GOS-4 değerlerinin reaksiyon parametrelerine bağlı olarak değişimini ifade eden  matematiksel modeller elde edilmiştir. Yanıt yüzey metodolojisi ile elde edilen matematiksel modeller süreç yanıtlarını başarılı bir şekilde tahminleyebilmiştir. Reaksiyon süresinin GOS birim maliyetini etkileyen önemli bir parametre olduğu düşünüldüğünde bu modeller yardımıyla  hedeflenen GOS ürün kompozisyonunu en hızlı sağlayan deney koşulları önceden tahminlenebilecektir.
Reaktör-2'de reaktör-1'e kıyasla reaksiyon verimi üzerine en fazla %20,1 düzeyinde artış elde edilmiştir. Reaktör-2'de yüksek başlangıç laktoz konsantrasyonlarında yüksek laktoz dönüşümlerinde yüksek GOS üretkenliği (GOSP) değerlerinin elde edilmesi enzimin transgalaktosilasyon aktivitesinin hidrolize oranla baskın olduğunu ifade etmektedir. Ayrıca yüksek laktoz dönüşümlerinde yüksek GOSP değerleri için düşük seviyede enzim konsantrasyonunun ve düşük reaksiyon sıcaklığının daha iyi sonuçlar sağladığı tespit edilmiştir.
Kinetik değerlendirmeler sonucunda k5 ve k5/k-5 değerleri reaktör-2'de artmıştır. Bu durum reaktör-2'de transgalaktosilasyonun daha aktif rol oynadığını göstermektedir. Her iki reaktörde elde edilen benzer k3/k-3 oranına karşın reaktör-2'de tespit edilen yüksek k2 ve k5/k-5, reaktör-2'de yüksek seviyede E:Lak ve E:Gal kompleksi oluşumunun GOS sentez/GOS bozunması hızını olumlu yönde etkilediğini belirtmektedir. Bu açıdan ozmotik membran distilasyon sisteminin GOS sentezine önemli etkilerininden birinin enzimin laktoz ile daha fazla etkileşime girmesini sağlayarak reaksiyon ortamındaki E:Gal kompleksi konsantrasyonunu yüksek seviyede tutması olduğu söylenebilir. Ayrıca, reaktör-1 de glukoz inhibisyonu (k6/k-6), reaktör-2'de ise galaktoz inhibisyonu (k7/k-7) ön plana çıkmıştır. 
Reaktör-2'de reaktör-1'e kıyasla aynı laktoz dönüşümü değerlerinde hem daha yüksek GY değerleri elde edilmiş hem de bu süreç daha kısa sürede gerçekleşmiştir. Bu durum enzimin membranlı sistemde daha çok transgalaktosilasyon reaksiyonuna yönelmiş şekilde çalıştığı ifade etmektedir. Aynı zamanda reaksiyon ortamından uzaklaştırılan su enzimin GOS-4 oluşturma performasına olumlu yönde etki etmiştir. 
Sonuç olarak, reaktör-2 sistemi GOS sentezinin yanında sentezlenen reaksiyon ürünlerinin konsantrasyonunu da sağlaması nedeniyle endüstriyel GOS üretiminde rol alma potansiyeline sahiptir. Fakat bu sistemde görülen olumlu etkinin daha da arttırılabilmesi için enzim aktivitesinin de yüksek seviyede tutulması elzemdir. Çünkü ilerleyen reaksiyon sürelerinde enzimde aktivite kaybı yaşandığı tespit edilmiştir. GOS sentez veriminde görülen artışın daha da yükseltilmesi için yeni yaklaşımlar ile enzim aktivitesi üzerinde görülen monosakkarit inhibisyonunun hafifletilmesi gereklidir. Böylece membran destekli sürecin GOS sentez performansının daha da artacağı düşünülmektedir. Bu açıdan reaktör-2 sistemini geliştirmek üzere enzimin immobilizasyonunun sağlanarak nanofiltrasyon sisteminin de reaktör-2 sistemine entegrasyonunun yapılacağı bir bütünleşik süreç tasarımının verim artışına olumlu yönde etki edeceği düşünülmüştür.

Abstract:
Prebiotic food ingredients have an expanding market share in the food industry due to their beneficial effects on human health. Among the prebiotic carbohydrates, galactooligosaccharides (GOS) have been identified as the most specific bifidogenic factors. GOS are synthesized from lactose by transgalactosylation reactions catalyzed by the enzyme β-galactosidase. However, GOS synthesis efficiency is low because the enzyme catalyzes transgalactosylation and hydrolysis reactions simultaneously in the GOS production process. Since the enzymatic synthesis of GOS is a kinetically controlled reaction, the enzyme source affects parameters such as GOS yield, lactose conversion, productivity and product composition. In addition to the fact that β-galactosidase originating from Aspergillus oryzae is within the scope of GRAS, its high specific activity, high temperature resistance and low cost brings this enzyme in the first place in industrial production. However, since the lactose conversion of this enzyme in the GOS synthesis is low, it is an important requirement to increase the GOS synthesis efficiency by optimizing the synthesis process. In this context, the optimization of GOS synthesis catalyzed by β-galactosidase enzyme originating from A.oryzae with the response surface method was discussed for the first time in this study.
In order to increase the efficiency of GOS synthesis, enzymatic GOS synthesis has been tried to be integrated with pressure driven membrane systems. Particularly, ultrafiltration and nanofiltration were included in GOS production processes and it was aimed to remove glucose and galactose, which have inhibitory effects on the enzyme, from the reaction medium. However, as a result of the loss of product and substrate and the rapid decrease in permeate flux values in these systems, GOS production processes did not show the desired effect. Therefore, it is necessary to try new approaches in the integration of membrane-assisted separation processes into the GOS synthesis process.
According to literature nitial lactose concentration is the most important parameter to achieve high efficiency GOS synthesis. From this point of view, it can be expected that keeping the lactose concentration in the enzymatic reaction medium at a high level during the process would increase the yield of GOS synthesis. In line with this idea, the integration of osmotic membrane distillation system into the enzymatic GOS synthesis process was provided. Unlike ultrafiltration and nanofiltration, high hydrophobicity micro-porous membrane used in osmotic membrane distillation ensures that only water can be separated from the enzymatic reaction medium with high selectivity and the reaction medium can be more concentrated in terms of lactose concentration during the process. In addition, there would be no substrate and product loss from the integrated system and the initial flux values can remain steady over long periods. This involved integration of the continuous stirred type batch reactor process with osmotic membrane distillation system to increase the GOS synthesis efficiency, and this approach has not been studien in literature in terms of reactor design.
Within the scope of this doctoral thesis, firstly, GOS synthesis studies were carried out in a continuous stirred type batch reactor (reactor-1) and the process outputs were optimized by the response surface method. Secondly, GOS synthesis studies were carried out in the osmotic membrane distillation system (reactor-2) and the process outputs were optimized by the response surface method. Finally, in both systems, GOS synthesis was performed under optimum reaction conditions obtained by the response surface method and the kinetic evaluation of the obtained reaction data was performed. Thus, the effects of the osmotic membrane distillation system on the kinetics of the GOS synthesis reaction were comparatively investigated.
The main aim of this study was to investigate GOS synthesis efficiency obtained from lactose enzymatically in the reactor-2 system, which is integrated into the osmotic membrane distillation process. Since the designed reactor-2 system is different from the membrane reactors used for GOS synthesis in the literature due to its working mechanism, the GOS synthesis results obtained from the reactor-1 system operated under the same reaction conditions are used to evaluate the obtained data properly.
In reactor-1, the effect of initial lactose concentration (LC), enzyme concentration (EC) and temperature (T) reaction parameters on total GOS (GY = GOS-3 + GOS-4) was investigated with the experiment set, which was determined by the Box Benhken experiment design. The GY value was between 8.47% and 26.92%. The effect of the same reaction parameters on GY in reactor-2 was examined in the factorial experimental design and the GY values obtained were determined between 18.7% and 28.63%. Mathematical models expressing the change of GOS-3 and GOS-4 values depending on the reaction parameters were also obtained in both reactors. Mathematical models obtained with the response surface methodology were able to successfully predict the process responses. Considering that reaction time is an important parameter affecting the GOS unit cost, experimental conditions providing the fastest GOS product composition can be predicted with the help of these models.
In reactor-2, compared to reactor-1, a maximum increase of 20,1% was obtained on the reaction efficiency. Obtaining high GOS productivity (GOSP) values in high lactose conversions at high initial lactose concentrations in reactor-2 indicates that the transgalactosylation activity of the enzyme is dominant compared to hydrolysis. It was also determined that low enzyme concentration and low reaction temperature provide better results for high GOSP values in high lactose conversions.
As a result of the kinetic evaluations, k5 and k5/k-5 values increased in reactor-2. This shows that transgalactosylation plays a more active role in reactor-2. In contrast to the similar k3/k-3 ratio obtained in both reactors, high k2 and k5/k-5 values detected in reactor-2 points out that high level of E: Lac and E: Gal complex formation in reactor-2 affects GOS synthesis/GOS degradation rate positively. In this respect, it can be said that one of the important effects of the osmotic membrane distillation system on GOS synthesis is that the enzyme interacts more with lactose and keeps the E: Gal complex concentration at a high level in the reaction medium. In addition, glucose inhibition (k6/k-6) in reactor-1 and galactose inhibition (k7/k-7) in reactor-2 were dominant.

In Reactor-2, higher GY values were obtained at the same lactose conversion values compared to reactor-1 and this process took place in a shorter time. This indicates that the enzyme worked towards tansgalactosylation reaction to a greater extent in reactor 2 as compared to reactor 1. At the same time, the water removed from the reaction medium positively affected the GOS-4 formation performance of the enzyme.
As a result, the reactor-2 system has the potential to play a role in industrial GOS production, as it provides concentration of synthesized reaction products as well as the GOS synthesis. However, it is essential to keep the enzyme activity at a high level in order to increase the positive effect seen in this system, because it has been determined that there is a loss of activity in the enzyme in the following reaction times. In order to further increase the GOS synthesis efficiency, it is necessary to alleviate the monosaccharide inhibition on the enzyme activity with new approaches. Thus, it is thought that the GOS sythesis performance of the membrane supported process will increase even more. In this respect, an integrated process design in immobilization of the enzyme would provide improvement in the reactor-2 system and integration of the nanofiltration system to the reactor-2 system would positively affect the efficiency.