Türkiye'de bulunan bazı çam ağaçlarının kabuklarında piknogenol tayini
The determination of pycnogenol in some of the pine barks which is found in Turkey
Yazar: MEHMET EMİN ŞEKER
Danışman: PROF. DR. ALİ ÇELİK
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Çam ağaçlarının kabukları çok eski zamanlardan beri ilaç, şurup, ödem giderici ve  benzer birçok nedenle kaynatılıp içilmekte ya da yaralara sürülmektedir. Eski insanlardan kalma tecrübeye dayanan bu bilgiler çağımızda bilimin gelişmesiyle incelenmeye ve doğrulanmaya başlanmıştır. Bilim insanları çam kabuklarının ekstraksiyonuyla elde edilen bu karışımı piknogenol olaarak adlandırmışlardır. Piknogenol birçok bileşenden oluşan (proantosiyanidinler,flavanoidler vb.) bir karışımdır. E vitaminine göre 50 kat, C vitaminine göre 30 kat daha kuvvetli antioksidan özelliği gösterdiği bilinmektedir. Piknogenol, Frana'da deniz kenarında yetişen kara çam türüne ait ağaçların kabuklarından elde edilmekte ve ticari olarak satılmaktadır. Bu çalışmada Türkiye'de bulunan bazı çam ağacı kabuklarında bir kısım piknogenol bileşenlerinin nitel ve nicel tayini 280 nm dalga boyunda UV dedektör içeren HPLC ile yapılmış ve bileşenlerin  elüsyonunda gradient pompa kullanılmıştır. Önce yöntemi optimize etmek amacıyla ticari olarak satın alınan çam kabuğu ekstraktları kullanılmıştır. Daha sonra standartlar ve toplanan örnekler kullanılarak örneklerin nicel ve nitel analizleri yapılmıştır. 
Çalışmada Manisa, Bilecik ve Adana bölgelerinden toplanan beş farklı tür çam kabuğu kullanılmıştır. Ekstraksiyon işlemi başlangıçta literatürde önerildiği şekilde yapılmıştır. Ancak etilasetat fazın uzaklaştırılması sırasında  piknogenol bileşenlerinde oksitlenme gözlemlenmiştir. Bu nedenle etilasetat giderme adımı argon gazı altında vakumda yapılmıştır. Ekstraksiyon amacıyla toz haline getirilen çam kabuklarından 20 g tartılır, üzerine 150 mL kaynar su ilave edilerek ekstrakte edilir. Oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakılan ekstrakt süzülerek kabuklardan ayrıldıktan sonra doygunluğa kadar üzerine tuz eklenir ve tekrar süzülür. Süzüntü alınarak etil asetat ile  ekstrakte edilir ve ekstrakt etil asetat fazda toplanır. Kalan suyu uzaklaştırmak amacıyla etil asetat faza sodyum sülfat eklenir. Sodyum sülfat süzülerek uzaklaştırıldıktan sonra kalan etil asetat havasız ortamda argon gazı ile vakum  altında uçurulur. Elde edilen bej renkli katı kısım 25 mL  %25 (h/h) metanol içeren suda çözüldükten sonra cihaza enjekte edilmiştir.
Analizi yapılan piknogenol  bileşenlerine ait standartlar için hareketli faz bileşimi ve akış hızı optimize edildikten sonra örnekler analizlenmiştir. Hareketli faz olarak % 0.1 orto fosforik asit içeren su, % 0.1 orto fosforik asit içeren metanol ve  % 0.1 orto fosforik asit içeren asetonitril üçlü elüsyon sistemi kullanılmıştır. Akış hızı 1 mL/dak. olarak ayarlanmış ve gradient elüsyon sistemi kullanılmıştır. Analizlenen çam kabuklarında (karaçam, kızılçam, sarıçam, fıstıkçamı, halepçamı) piknogenol bileşenlerinden kateşin, epikateşin, epikateşingallat, ferrulik asit ve taksifolinin nitel ve nicel tayinleri yapılmıştır. Çam ağaçlarının türlerine göre bulunan piknogenol bileşenleri; karaçamda 0.209 mg/g taksifolin, 0.086 mg/g kateşin, 0.076 mg/g epikateşin, 0.022 mg/g ferrulik asit;  kızılçamda 23.16 mg/g taksifolin, 1.454 mg/g kateşin, 0.027 mg/g epikateşin; fıstık çamında 1.923 mg/g kateşin, 1.801 taksifolin; sarı çamda 0.066 mg/g epikateşin, 0.065 mg/g kateşin, 0.025 epikateşingallat, 0.015 taksifolin, 0.010 ferrulik asit; halepçamda 0.219mg/g taksifolin, 0.093 kateşin, 0.046 epikateşin olarak bulunmuştur.

Abstract:
Pine barks have been used since ancient times as medicine, syrup, edema reliever and etc. and due to these reasons they are drunk after boiling or applied for wounds. Old people knew this based on their experiences and this infromation was known and verified by the development of science in our era. Finally, scientist have named this mixture extracted from pine barks as pycnogenol. Pycnogenol is a mixture composed of many constituents like proanthocyanidins, flavonoids and etc. It has been known to have antioxidant properties of 50 times more potent than Vitamin C and 30 times more potent than Vitamin E when compared. Pycnogenol is obtained from Pinus nigra in France near the seaside and is commercially available.
In this study, pycnogenol components of different types of pine barks collcted from Manisa, Bilecik and Adana regions were analyzed qualitatively and quantitatively after the optimization of gradient HPLC method. At first, the extraction procedure was performed according to the studies in literature. However, oxidation of pycnogenol components were observed during the removal of ethyl acetae phase. For this reason, removal of ethyl acetate step was realized under vacuum using argon gas. The collected pine bark samples were thoroughly grounded, 20 g of pine bark was weighed and then it was extracted in 150 mL of hot water. The sample was filtrated to remove the barks after cooling to room temperature. After, salt was added until saturation and it was re-filtrated. Then, the filtrate was extracted with ethyl acetate and this phase was collected. Sodium sulfate was added to this ethyl acetate phase in order to remove the remaining water. Later, sodium sulphate was also filtered and the ethyl acetate was removed by argon with vacuum. The solid residue which was off-white was dissolved in 25 mL of  25% methanol-water (v/v) mxture. Afterwards, the solution was injected to the instrument.
The samples were analyzed only after the optimization of mobile phase composition. As the mobile phase composition, water, methanol and acetonitrile were used each containing 0.1% ortho-phosphoric acid. The flow rate was adjusetd to 1mL/min. and gradient elution was used. The qualitative and quantitative analyses of pine barks (karaçam, kızılçam, sarıçam, fıstıkçamı, halepçamı) that contain catechin, epicatechin, epicatechingallate, ferulic acid and taxifolin have been performed. According to the types of pine barks analyzed, the pycnogenol components were found to be as: 0.209 mg/g taxifolin, 0.086 mg/g catechin, 0.076 mg/g epicatechin, 0.022 mg/g ferulic acid in karaçam;  23.16 mg/g taxifolin, 1.454 mg/g catechin, 0.027 mg/g epicatechin in kızılçam; 1.923 mg/g catechin, 1.801 mg/g taxifolin in fıstıkçamı; 0.066 mg/g epicatechin, 0.065 mg/g catechin, 0.025 mg/g epicatechingallate, 0.015 mg/g taxifolin, 0.010 ferulic acid in sarıçam; 0.219 mg/g taxifolin, 0.093 mg/g catechin, 0.046 mg/g epicatechin in halepçam.