Amniyositlerin, histon ve hücre sinyal yolakları modifikasyonu ile kimyasal olarak yeniden programlanma kapasitelerinin incelenmesi
Investigation of chemically-induced reprogramming potential of amniocytes with modification of histone and cell signaling patways
Yazar: MURAT ÇOKAKLI
Danışman: PROF. DR. MEHMET EMİN ERDAL
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Amniyosit = Amniocyte ; Histonlar = Histones ; Hücre programlama = Cell programming ; Kimyasal yöntemler = Chemical methods ; Kök hücreler = Stem cells ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Rejeneratif tıp uygulamaları için somatik hücrelerin yeniden programlanarak iPSC'lerin (indüklenmiş-Pluripotent Kök Hücre) oluşturulması amacıyla kimyasal programlama stratejilerinin kullanımı son yıllarda büyük bir ivmeyle artmaktadır. Ancak hem kullanılan hücre tipi, hem de uygulanacak kimyasal kombinasyonu hücre yeniden programlama etkinlik ve güvenilirliğini değiştirmekte, bu nedenle de uygun hücre tipi ve kimyasal kombinasyonunun belirlenmesi için çalışmalar sürmektedir. Farklılaşma aşamalarını tam olarak tamamlamamış ve primitif formda olan amniyositler ise iPSC oluşturmada elverişli bir aday olarak durmaktadır. Bu çalışmada amniyositlerin yeniden programlanma kapasiteleri, histon ve hücre sinyal yolaklarının modifikasyonuna neden olan inhibitör kimyasal maddeler uygulanarak ve pluripotensi belirteçlerinin ekspresyon değişimleri incelenerek araştırılmıştır. Amniyositlerin yeniden programlaması için, 5 farklı kimyasal molekülün (histon deasetilaz inhibitörü "Valproik Asit", MEK/Erk inhibitörü "PD0325901", TGF-β reseptör inhibitörü "SB431542", GSK-3β inhibitörü "CHIR99021" ve Rock inhibitörü "Thiazovivin") farklı kombinasyonları kullanılmıştır. Kimyasal uygulamaları sonrası pluripotensi genlerinin ekspresyon değişimleri kantitatif olarak Real-Time PCR ile incelenmiştir. Amniyositlerin yeniden programlanması için literatürde daha önce kullanılan Valproik Asit koşuluna göre, "Valproik Asit-SB431542-CHIR99021 (VSC)" kombinasyonu uygulanan hücrelerde, pluripotensi genlerinin ekspresyon düzeylerinde anlamlı düzeyde artışlar gözlenmiştir (p<0,05). SOX2,  SALL4, KLF4, DDPPA3, DPPA5, FUT4, NANOG, OCT4, MYC ve KIT ekspresyonlarındaki değişimler analiz edilerek, VSC kimyasal kombinasyonunun amniyositlerin yeniden programlanmasında en etkin kombinasyon olduğu belirlenmiştir. Programlama sırasında mezenşimal-epitelyal hücre morfolojisi dönüşümü olduğu, ayrıca CHIR99021 içeren tüm kombinasyonların etkin olduğu gözlenmiş, bununla uyumlu şekilde      TGF-β ve GSK3β sinyal yolaklarının amniyositlerin pluripotensi düzenleyici gen ağında ve yeniden programlanmasında kilit konumda olduğu değerlendirilmiştir. Sonuç olarak bu çalışmada, allogenik hücresel tedaviler için son derece uygun bir hücre tipi olan amniyositlerin VSC kombinasyonu kullanılarak etkin şekilde yeniden programlanabileceği gösterilmiştir. Elde edilen bulguların, amniyositlerden iPSC oluşturulması ve rejeneratif tıp uygulamalarında kullanımına, ayrıca hüresel düzeyde pluripotensi dinamiklerinin anlaşılmasına katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
The use of small chemicals to reprogram somatic cells into iPSCs (induced-Pluripotent Stem Cells) for regenerative medicine applications are increasing in recent years. However, both the cell type and the introduced chemical combinations alter the cellular re-programming efficiency and reliability; so, the studies are focused on appropriate cell types and combinations. Amniocytes which are not fully differentiated and relatively primitive, attract attention as an effective candidate to obtain iPSCs. In this study, re-programming capacity of amniocytes was investigated by examination of expression changes of pluripotency markers under modification of histone and cell signaling pathways with chemicals (HDAC inhibitor "Valproic-Acid", MEK/Erk inhibitor "PD0325901", TGF-β inhibitor "SB431542", GSK-3β inhibitor "CHIR99021", Rock inhibitor "Thiazovivin"). The expressions of pluripotency markers were quantitatively analysed by Real-Time PCR after chemical exposures. Significant increases were found in expression levels of pluripotency markers when "Valproic Acid-SB431542-CHIR99021 (VSC)" combination is used, according to Valproic acid only group which is defined previosuly in literature for reprogramming of amniocytes (p<0,05). Significant increases in expressions of SOX2, SALL4, KLF4, DDPPA3, DPPA5, FUT4, NANOG, OCT4, MYC and KIT were observed as being the VSC chemical combination was most efficient one for reprogramming. During reprogramming with these chemicals, a mesenchymal-epithelial transition in cell morphology was observed, additionally all combinations containing CHIR99021 were efficient on expression increases of pluriotency markers. In line with these observations, it can be interpreted that TGF-β ve GSK3β signaling pathways are key regulators for pluripotency gene regulatory network and reprogramming of amniocytes. As a result,  it was shown in this study that amniocytes which remains as an appropriate cell type for allogenic cellular therapies, can be reprogrammed efficiently by using VSC chemical cocktail. Obtained results in this study may contribute to understanding of stem cell dynamics and generate a basis for iPSC construction from amniocytes and their potential therapotic applications.