Akciğer kanser hücre modelinde mitokondrialmutant gen ekspresyonlarının susturulmasınınkarsinogenez üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of silencing mitochondrial mutant geneexpressions on carcinogenesis in a lung cancer cell model
Yazar: ROYA GASIMLI
Danışman: PROF. DR. CUMHUR GÜNDÜZ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ BESRA ÖZMEN YELKEN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Çalışmamızda, insan küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücre hattı A549'da bulunan MT-ND2 m.4587T>C (Phe40Leu) varyantının siRNA transfeksiyonu ile mRNA düzeyinde susturulmasının mitokondriyal fonksiyonlar ve karsinogenez üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladık. Ayrıca, akciğer kanseri gibi ölümcül hastalıklarda mtDNA mutasyonlarının RNA tabanlı terapötik ajanlarla nasıl hedeflenebileceğini anlamayı hedefledik. Bu bağlamda, siRNA transfeksiyonu ile mitokondriyal süreçler deregüle edilerek, hücre proliferasyonu, apoptoz, klonojenik sağkalım ve yara iyileşmesi üzerindeki etkileri çeşitli deneylerle değerlendirildi
Akım sitometri analiz bulgularına göre, A549 hücre hattında apoptoz analizlerinde (Annexin V, Kaspaz-3 ve JC-1) zamana bağlı istatistiksel anlamlı değişiklikler gözlemlendi. T2A hücre hattında ise, mitokondriyal membran değişimi üzerinde zamana bağlı etkiler gözlenmemiş, ancak Annexin V ve Kaspaz-3 bulgularına göre özellikle 72. saatte zamana bağlı istatistiksel değişiklikler gözlemlendi
Bulgularımız, apoptozla ilgili genler CASP3, CASP7, CASP9 ve BAX genlerinin ekspresyonunda siRNA transfeksiyonunun 72 saatte artışlar gözlemlendi. Diğer taraftan TP53 geninin ekspresyonunda da 72. saatte artışlar gözlendi ve bu artışın MT-ND2 m.4587T>C varyantının hücrelerde tümör supresör etkilerini artırabileceği ve apoptoz yolaklarını etkileyebileceği tahmin edilmektedir.
A549 hücre hattında yara iyileşmesi deneyi bulguları analizlerimiz, 0-120 saatlik zaman periyodunda uygulama ve kontrol grupları arasında zamana bağlı istatistiksel anlamlı farklar olduğunu gösterdi. T2A hücrelerinde ise uygulama ve kontrol grupları arasında zamana bağlı istatistiksel anlamlı farklar olduğunu ancak 96 saat sonunda bu etkinin azaldığı gözlemlendi
A549 hücre hattında 72 saatlik zaman periyodunda uygulama ve kontrol grupları arasında mitokondriyal fonksiyonlar üzerindeki etkiler ROS üretim analizi ile değerlendirildi ve zamana bağlı belirgin bir değişiklik olmadığı gözlemlendi. Diğer taraftan bulgularımız T2A hücre hattında ise 72 saatlik zaman periyodunda uygulama ve kontrol grupları arasında zamana bağlı istatistiksel anlamlı farklar olduğunu gösterdi. Hücre proliferasyonu ve klonojenik sağkalım üzerinde susturmanın anlamlı bir etkisi saptanmadı 
Bu çalışma, MT-ND2 m.4587T>C varyantının siRNA ile hedeflenmesinin A549 hücrelerinde etkiler yarattığını, ancak bu tür terapötik yaklaşımların karsinogenez üzerindeki potansiyelini anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerektiğini gösterdi. Gelecekte, farklı siRNA formülasyonları ve stratejileriyle bu sonuçların doğrulanması ve mtDNA mutasyonlarının kanser terapilerindeki rolünün daha iyi anlaşılması için kapsamlı çalışmalar yapılması gerekmektedir.

Abstract:
In our study, we aimed to investigate the effects of silencing the MT-ND2 m.4587T>C (Phe40Leu) variant at the mRNA level using siRNA in the human non-small cell lung cancer cell line A549 on mitochondrial functions and carcinogenesis. Additionally, we sought to understand how mtDNA mutations in deadly diseases like lung cancer can be targeted with RNA-based therapeutic agents. In this context, the effects of siRNA transfection on mitochondrial processes were evaluated through various experiments, assessing cell proliferation, apoptosis, clonogenic survival, and wound healing.
According to flow cytometry analysis results, statistical significant changes were observed over time in apoptosis analyses (Annexin V, Caspase-3, and JC-1) in the A549 cell line. In the T2A cell line, although no time-dependent effects were observed on mitochondrial membrane changes, statistical changes were notably observed at 72 hours according to Annexin V and Caspase-3 results.
Our findings indicate that siRNA transfection led to increases in the expression of apoptosis-related genes CASP3, CASP7, CASP9, and BAX at 72 hours. Additionally, an increase in the expression of the TP53 gene was observed at 72 hours, suggesting that the MT-ND2 m.4587T>C variant might enhance tumor suppressor effects and affect apoptosis pathways in the cells.
Wound healing assay results for the A549 cell line showed statistically significant time-dependent differences between the treatment and control groups over the 0-120 hour period. In the T2A cells, time-dependent statistically significant differences were observed between the treatment and control groups, but this effect decreased at 96 hours.
In the A549 cell line, mitochondrial functions were evaluated through ROS production analysis over a 72-hour period, and no significant time-dependent changes were observed. Conversely, our findings in the T2A cell line showed time-dependent statistically significant differences between the treatment and control groups. No significant effects of silencing on cell proliferation or clonogenic survival were detected.
This study demonstrates that targeting the MT-ND2 m.4587T>C variant with siRNA has effects in A549 cells; however, further research is needed to understand the potential of such therapeutic approaches in carcinogenesis. Future work should include validation of these results with different siRNA formulations and strategies, and comprehensive studies to better understand the role of mtDNA mutations in cancer therapies.