Deneysel spinal kord travma modelinde rituksimabın nöroprotektif etkisinin immünhistokimyasal ve elektron mikroskobik yöntemlerle incelenmesi
The neuroprotective effects of rituximab in experimental spinal cord injury model: an immunohistochemical and electronmicroscopic study
Yazar: GÜNER MENEKŞE
Danışman: UZMAN ERGÜN DAĞLIOĞLU
Sağlık Bakanlığı / Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery

Özet:
Spinal kord hasarlı (SKH) olguların yaklaşık yarısında sebep trafik kazalarıdır
ve ciddi morbiditeye neden olmaktadır. SKH‟nın tedavisine yönelik çalışmalar
özellikle travma sonrası sekonder mekanizmaları önlemeye yöneliktir ve bugüne
kadar pek çok farmakolojik ajan denenmiştir. Ancak tüm bunlara karşın etkin bir ilaç
klinik kullanıma girememiştir.
Son yıllarda bir sekonder mekanizma olan nöroinflamasyon konusunda
yapılan çalışmalar dikkati çekmektedir ve SKH‟da antiinflamatuar ajanların,
nörolojik iyileşmede anlamlı katkı sağlayabileceği öngörülmüştür. Pek çok
otoimmün nörolojik hastalıkta görülen nöroinflamatuar mekanizmalara benzer
şekilde, SKH sonrası nöral dokuda B-lenfositlerin ilk haftada lezyon bölgesinde
görüldüğü ve müteakip olarak salınan IL-1, IL-6 ve TNF-α gibi sitokinlerin lezyon
bölgesindeki sitotoksik hasarda rol oynadığı gösterilmiştir.
Bu çalışmada klip kompresyonu ile sıçan SKH modelinde, bir monoklonal
antikor ajan olan rituksimabın, antiinflamatuar etkisinin nöroprotektif olup olmadığı
araştırıldı. İnflamatuar sitokinlerden IL-1β, IL-6 ve TNF-α‟ya spesifik antikorların
dışında, B-lenfosit işaretleyicisi olan CD20 antikoru ile immünhistokimyasal ve
elektron mikroskobik inceleme yapıldı.
Materyal ve Metot
Bu çalışmada 24 adet Wistar-albino erkek sıçan kullanıldı. 1. grupta 8 adet
sıçana laminektomi yapıldı. 2. grupta 8 adet sıçana laminektomi sonrası 1 dakika klip
kompresyonu ile SKH oluşturuldu. 3. grupta SKH oluşturu1ması sonrası rituksimab
tedavisi verildi. Bu gruba rituksimab 0. gün (travma ile eş zamanlı), 3. gün ve 5. gün 
55
intraperitoneal olarak toplam 3 doz uygulandı. Sıçanlar 7. günün sonunda sakrifiye
edildi. Perfüzyon sonrası SKH‟lı doku örnekleri alındı. Tespit sonrası ELISA kiti
kullanılarak IL-1β, IL-6, TNF-α ve CD20 antikorları ile immünhistokimyasal ve
elektron mikroskobik olarak incelendi.
Bulgular
Elektron mikroskobik incelemede özellikle otofagozomların yoğun olarak
gözlendiği fagositik süreçte oligodendrositlerden zengin bulgular SKH‟lı doku
örneklerinde hakimdi. SKH‟nın oligodendrositlerde fagositik hücrelere
transformasyonunu hızlandırdığı belirlendi. Rituksimab tedavisi ile SKH sonrası
görülen miyelin dejenerasyonuna ait bulgularda iyileşmeye ek olarak
oligodendrositlerin normal yapıda oldukları gözlendi. Bu bulgu, rituksimab
uygulamasının fagositik süreci baskıladığını, ancak miyelinli sinir rejenerasyonunda
yetersiz kaldığını göstermiştir.
İmmünhistokimyasal incelemede SKH‟lı doku örneklerinde TNF-α
ekspresyonunun arttığı ve rituksimab uygulaması sonrası tamamen baskılandığı
saptandı. Ayrıca rituksimab tedavisi ile SKH‟lı grupta nöral dokuda CD20
ekspresyonunda azalma ilacın nöral dokuda B-lenfosit invazyonuna etkili olduğunu
gösterdi. Ek olarak IL-1β ve IL-6‟nın travma ile glial destek hücrelerinde
ekspresyonunun arttığı ancak rituksimab tedavisiyle herhangi bir değişiklik
oluşmadığı gözlendi.
Sonuç
SKH‟da, özellikle oligodendrositlerde belirgin olmak üzere tüm nöronal ve
glia hücrelerinde TNF-α ekspresyonunun arttığı ve rituksimab uygulaması ile ise
tamamen baskılandığı saptandı. Ayrıca rituksimab tedavisi ile SKH‟lı grupta görülen
CD20 ekspresyonunda azalma, hem nöronal hem de nöronal olmayan destek dokuda
saptanmış olup bu nöral iyileşme ile ilişkili olabilir

Abstract:
Traffic accident is the most frequent reason for spinal cord injury (SCI).
Morbidity of SCI is a major social and medical problem. Studies against treatment of
SCI mainly focus on prevention of secondary mechanisms after SCI and many
pharmacological agents were under trial. Despite all these advancements, a definitive
treatment agent for SCI was not provided yet.
Neuroinflammation is a major secondary mechanism after SCI. Studies
within the last decade focus on antiinflammatory agents and these agents were
accepted to be beneficial for neural healing. B-lymphocytes were noted at the injury
site within the first week after SCI and subsequent secretion of cytokines like IL1,
IL6 and TNF-α play a major role in cytotoxic cell damage. This mechanism was
similar to neuroinflammatory cell damage which is a significant mechanism for
autoimmune neurological diseases.
In this study, we investigate anti-inflammatory and effects of rituximab, a
new generation monoclonal antibody agent, on rat SCI with clip compression.
Rituximab was presumed to be neuroprotective and specific antibodies (ELISA)
against CD20, a marker for B-lymphocytes, were studied with electronmicroscope
and immunohistochemistry. Specific antibodies against cytokines like TNF-α, IL-1β
and IL-6 were also studied.
Material and Methods
24 male Wistar albino rats were used for the study. Rats were divided into 3
groups at random and 8 rats in group 1 (sham) were subjected to thoracic
laminectomy. Clip compression of thoracic spinal cord was performed on 8 rats for 1
minute in group 2. Eight rats in group 3 were subjected to same clip compression and 
57
three separate intraperitoneal rituximab administration on days 0, 3 and 5 in the third
group. Rats in all 3 groups were sacrified on day 7 after perfusion and spinal cord
samples were collected from the injured cord segment. Antibodies against IL-1β, IL-
6, TNF-α and CD20 were studied with ELISA method together with
electronmicroscopic analysis.
Results
Oligodendrocytes at phagocytic stage were noted with characteristic
cytoplasmic autophagosomes on spinal cord sections. This was thought to be due to
increased phagocytic transformation of oligodendrocytes. Degenerative findings of
myelin after SCI were markedly improved and oligodendrocytes were almost normal
in appearance in group 3 under rituximab treatment. This finding showed rituximab
to suppress phagocytic stage but still inefficient for regenerative phase.
TNF-α expression was markedly increased in rats subjected to SCI and
suppressed after rituximab treatment. Decreased CD20 expression was a prominent
finding in rats under rituximab therapy and this finding showed the drug was
effective in suppression of B-lymphocyte invasion. Furthermore, expression of IL-1β
and IL-6 were increased in glial cells without significant change after rituximab
administration.
Discussion and Conclusion
TNF-α expression was augmented at the level of SCI particularly in
oligodendrocytes as well as both neuronal and glial cells. These findings were
suppressed after rituximab administration. Besides, rituximab reduces CD20
expression both in neuronal and supportive glial cells which may be related to neural
healing