Periferik iskemi/reperfüzyona bağlı hedef ve uzak organ zedelenmesinde RHO-kinaz etkinliğindeki değişimlerin mekanizmasının araştırılması /
Yazar: PELİN ÇEÇEN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. AYŞE NİHAL SARI
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Eczacılık Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Böbrek = Kidney ; Kas-iskelet = Muscle-skeletal ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; Rhokinaz = Rhokinase ; İskemi = Ischemia

Özet:
Bu çalışmada, sıçanlarda oluşturulan periferik iskemi/reperfüzyon (İ/R) sonrasında uzak organ olarak seçilen böbrekte ve hedef organ olarak seçilen gastroknemius kasında gelişen zedelenmede Rho-kinaz (Rho-kinase; ROCK) etkinliğindeki değişikliklerin mekanizması sistemik yoldan uygulanan seçici ROCK inhibitörü Y-27632 kullanılarak araştırıldı. Deneylerde kontrol  ve İ/R gruplarında serum fizyolojik (4 ml/kg, IP), Y-27632 ve İ/R+Y-27632 gruplarında Y-27632 100 g/kg (4 ml/kg, IP) uygulanan sıçanlar kullanıldı. İ/R ve İ/R+Y-27632 gruplarındaki sıçanların  her iki bacağına trochanter major düzeyinde 4 saat iskemi ve ardından 4 saat reperfüzyon uygulandı. Kontrol ve Y-27632 grubundaki sıçanlara herhangi bir işlem uygulanmadı. Deneyler sonunda öldürülen sıçanlardan böbrek ve gastroknemius kas dokuları izole edildi. İzole edilen dokulardan doku homojenatları hazırlanarak, bu homojenatlarda fosforile miyozin hafif zincir kinaz fosfataz (myosin light chain kinase phosphatase; MYPT) 1, MYPT1, RhoE ve Rad protein ekspresyonları, malondialdehit (MDA) düzeyleri ile miyeloperoksidaz (MPO) etkinliği araştırıldı. İ/R uygulamasının ardından fosforile MYPT1/MYPT1 oranının böbrekte arttığı, kasta azaldığı gözlendi. İ/R ile RhoE ve Rad protein ekspresyonu böbrekte azalırken, kasta arttı. İ/R MPO etkinliği ile MDA düzeylerinde böbrek ve kasta artmaya neden oldu. İ/R'nin neden olduğu Rad protein ekspresyonu, MPO etkinliği ile MDA düzeylerindeki değişiklikleri Y-27632 her iki dokuda, fosforile MYPT1/MYPT1 oranındaki artmayı yalnızca böbrekte geri çevirdi. Y-27632 kastaki fosforile MYPT1/MYPT1 oranı ile böbrekte RhoE protein ekspresyonundaki azalmayı geri çevirmezken, kastaki RhoE protein ekspresyonundaki artmayı önledi. Daha önce yaptığımız çalışmaların sonuçlarıyla birlikte değerlendirildiğinde bulgularımız, oksidatif/nitrozatif stres ve enflamasyon ile birlikte RhoE ve Rad proteinlerindeki azalmanın eşlik ettiği RhoA/ROCK/MEK1/ERK1/2/iNOS yolunun etkinliğindeki artışın İ/R'nin neden olduğu uzak organ zedelenmesine katkıda bulunabileceğini gösterdi. Bulgularımız, ayrıca, İ/R'nin neden olduğu hedef organ zedelenmesinde ise, RhoE ve Rad proteinlerindeki artmanın eşlik ettiği ROCK etkinliğindeki azalmayla birlikte RhoA/MEK1/ERK1/2/iNOS yolunun up-regülasyonunun rol oynadığını düşündürdü.


Anahtar kelimeler: Y-27632, iskemi/reperfüzyon, RhoE, Rad, gastroknemius kası, böbrek

Abstract:
In this study, it was investigated the mechanism of the changes in Rho-kinase (ROCK) activity following peripheral ischemia/reperfusion (I/R)-induced injury in kidney as an end organ and gastrocnemius muscle as a distant organ by using selective ROCK inhibitor, Y-27632. Rats in the control and I/R groups received saline (4 ml/kg, IP). In the Y-27632 and I/R+Y-27632 groups, Y-27632 was injected to the animals intraperitoneally at 100 µg/kg dose (4 ml/kg). In the I/R and I/R+Y-27632 groups, a tourniquet was placed on right hindlimbs, proximal to trochanter major in all animals. After 4 h ischemia, tourniquets were removed and the animals were released for reperfusion for 4 h thereafter. In the control and Y-27632 groups, similar procedure was not applied. At the end of the experiments, the animals were sacrificed and kidney and gastrocnemius muscle tissues were isolated from all animals. Homogenates prepared from the tissues were used for measurement of phosphorylated myosin light chain kinase phosphatase (MYPT) 1, MYPT1, RhoE, and Rad protein expression in addition to malondialdehyde (MDA) levels and myeloperoxidase (MPO) activity. Although phosphorylated MYPT1/MYPT1 protein ratio was increased in the kidney following I/R, the ratio was found to be decreased in the muscle. RhoE and Rad protein expression was decreased in the kidney while their expression was increased in the muscle. I/R caused an increase in MPO activity and MDA levels in both tissues in I/R. The changes in Rad protein expression, MPO activity, and MDA levels induced by I/R were reversed by Y-27632 in both tissues. However, Y-27632 decreased phosphorylated MYPT1/MYPT1 ratio only in the kidney. Y-27632 did not reverse the decrease in RhoE protein expression in the kidney and phosphorylated MYPT1 /MYPT1 ratio in the muscle, however, it prevented the increase in RhoE protein expression in the muscle. The results of the present study together with our previous observations provided an evidence that activation of RhoA/ROCK/MEK1/ERK1/2/iNOS pathway associated with oxidative/nitrosative stress and inflammation accompanied by a decrease in RhoE and Rad proteins contributes to hindlimb I/R-induced distant organ injury in rats. Our findings also suggested that hindlimb I/R induces distant organ injury via upregulation of RhoA/MEK1/ERK1/2/iNOS pathway associated with decreased ROCK activity accompanied increased in RhoE and Rad protein expression.


Keywords: Y-27632, ischemia/reperfusion, RhoE, Rad, gastrocnemius muscle, kidney