Blastocystis türlerinde pirosekans yöntemiyle alttür belirlenmesi
Determination of Blastocystis subtypes with pyrosequencing
Yazar: TUĞÇE NİL YANTIRA
Danışman: DOÇ. DR. FUNDA DOĞRUMAN AL
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Blastocystis = Blastocystis ; Blastocystis enfeksiyonları = Blastocystis infections ; Blastocystis hominis = Blastocystis hominis ; Diziler = Sequences ; Genotip = Genotype ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic

Özet:
Blastocystis uzun yıllar sınıflandırılamamış, kimi yazarlarca mantar, kimi yazarlarca protozoon sınıflamasına dahil edilmiş olan bir mikroorganizmadır. Brump tarafından 1912 yılında  Blastocystis hominis olarak olarak isimlendirilmiştir. Günümüzde Blastocystis alttürleri insan ve hayvanlarda da enfeksiyona neden olduğu bilinmektedir.
Blastocystis enfeksiyon, fekal-oral yolla bulaşmaktadır; genellikle asemptomatiktir. Blastocystis gelişmekte olan ülkelerde yaşayanlarda gelişmiş ülkelere oranla daha sık görülmektedir. Özellikle tropikal ve subtropikal ülkelerde daha sık olarak rastlanılan tüm dünyada yaygın olarak bulunmaktadır.
Çalışmamızın  amacı,  Blastocystis izolatlarının alt tiplerinin spesifik polimorfizimlerine dayalı genotipleme için kullanılan PZR ile pirosekans  yöntemlerini  karşılaştırmaktır. 
Çalışmada, Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuarı ve Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi mikrobiyoloji Laboratuvarına  Eylül 2011- Kasım 2012 dönemleri arasında   farklı parazitolojik inceleme amacıyla gönderilen dışkı örneklerinden izole edilen Blastocystis konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemleriyle  ile  genotiplendirilmiştir.
Çalışmamızda konvansiyonel PZR yöntemiyle 60 örneğin  yedisi  subtip 1, dokuzu subtip 2, kırkbiri  subtip 3 olarak tanımlanmıştır. Pirosekans yöntemiyle 60 örneğin  altısı  subtip 1, onbiri subtip 2, kırkı  subtip 3 olarak tanımlanmıştır.
Pirosekans ile konvansiyonel PZR sonuçları kıyaslandığında, pirosekans  ile subtip 2 olarak tiplendirilen 2 örnekten bir tanesi konvansiyonel PZR ile subtip 1, diğeri de subtip 3 olarak genotiplendirilmiştir. Ayrıca pirosekans  ile subtip 3 olarak genotiplendirilen bir örnek de konvansiyonel PZR ile subtip1 olarak genotiplendirilmiştir.
Konvansiyonel metodlar ile bir Blastocystis örneği subtip1-2, 2 örnek de subtip 2-3 mix enfeksiyon şeklinde tiplendirilmiş ve bu örneklerden pirosekans ile subtip1-2? nin  subtip 2, subtip 2-3 olanların da subtip 3 olarak belirlediği   saptanmıştır.
Konvansiyonel PZR ve pirosekans yönteminin uyumluluğuna bakıldığında sadece 3 örnekte farklı genotiplendirme yaptıkları görülmüştür. İki yöntemin %94,7 oranında aynı sonucu verdiğini saptanmıştır. İstatistiksel analizi yapılmış kappa testi ile uyumluluğa bakılmış ve % 88 oranında uyumlu çalıştıkları  gösterilmiştir.
Pirosekans yöntemi altın standart olarak kabul edilip ve konvansiyonel PZR yönteminin özgüllük ve duyarlılığı hesaplandığında Pirosekans yöntemine göre % 95 duyarlılığa ve %95,2 özgülüğe sahip olduğu tespit edilmiştir.
Konvansiyonel PZR ve ülkemizde ilk defa Blastocystis alttür tayininde kullanılan pirosekans yönteminin karşılaştırılmasında iki yöntemin Blastocystis saptanmasında uyumlu olduğu, Blastocystis alttür tayininde pirosekans yöntemi konvansiyonel  PZR yöntemine göre daha hızlı ve doğru sonuçlar elde edilebileceği sonucuna varılmıştır.

Anahtar Sözcükler: Blastocystis, PZR, Pirosekans

Abstract:
Blastocystis is not classified for many years. Some authors are included in the classification of fungi and some authors are included in the classification of protozoa. In 1912, it has been named by Brumpt as Blastocystis hominis.Today; it is known that Blastocystis subtypes caused infections both humans and animals.
Blastocystis infections generally  transmitted by fecal-oral route and it is usually asemptomatic. Blastocystis infections are more frequent in developing countries than the developed countries. Especially it is more comman in tropic and subtropic areas and widely available all over the word.
The aim of our study is that comparision of the conventional PCR and the pyrosequencing technique for genotyping the Blastocystis.
In the study, stool specimens were sent in different periods to Gazi University, Faculty of Medicine, Medical Microbiology Department?s Parasitology Laboratory and Ankara Numune Training and Researche Hospital Routin Microbiology laboratory between September 2011 - November 2012 for parasitological examination and Blastocystis isolates genotyping by conventional PCR and pyrosequencing technique.
In our study with conventional  PCR seven of 60 samples genotyped as subtype 1, nine of them genotyped as subtype 2, fourty one of them genotyped as subtype 3 and with pyrosequencing six of 60 samples genotyped as subtype 1, eleven of them genotyped as subtype 2, fourty of them genotyped as subtype 3.
When the conventional PCR and pyrosequencing results were compared; with pyrosequencing two samples genotyped as subtype 2 and with conventional PCR one of two samples genotyped as subtype 1, and the other was genotyped as subtype 3. In addition one of the sample was  genotyped as subtype 3 by pyrosequencing and with conventional PCR it was genotyped as subtype 1.
Blastocystis samples were identified as mix infection by using conventional PCR. One of sample was genotyped  as subtype 1,2 and the other two sample was genotyped as subtype 2-3. With using pyrosequencing method, samples were identified and subtype 1,2 genotyped as subtype 2 and subtype 2-3 genotyped as subtype 3, respectively.
Looking at the compatibility of conventional PCR and pyrosequencing only three of the sample was genotyped different and 94.7 % the same result was found by two methods. 
Statistical analysis was performed with the kappa test was 88% compliance was evaluated and shown to work compatible pyrosequencing method can be regarded as the gold standard conventional PCR method?s specificity was 95%, and sensitivity was 95.2%. 
Conventional PCR method and pyrosequencing method which is used for the first time in our country for Blastocystis genotyping are compatible fort the genotyping of Blastocystis. And it is conclude that pyrosequencing is more faster and accurate method than the conventional PCR.

Key Words: Blastocystis, PCR, Pyrosequencing