siRNA kullanılarak insan meme kanseri hücre dizilerinde (MCF-7) ERK geninin sessizleştirilmesi,bu sessizleştirmenin ERK proteini aktivasyonu ve hücre çoğalması üzerine etkilerinin belirlenmesi
The silencing of ERK by using siRNA in human breast cancer cell lines (MCF-7), the effects of this silencing on ERK protein activation and cell proliferation
Yazar: FULYA DOĞANER
Danışman: PROF. DR. HASAN VEYSİ GÜNEŞ
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Fibroblastlar = Fibroblasts ; Genler = Genes ; Hücre dizisi = Cell line ; Meme = Breast ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazm hücreleri-dolaşan = Neoplastic cells-circulating ; Neoplazmlar = Neoplasms ; RNA = RNA

Özet:
MAP (Mitogen-activated protein) kinazlar hücre dışı sinyalleri, transkripsiyon faktörlerine ileten protein ailesidir. Hücre içi sinyal yolunda görev yapan bu protein ailesinin üyelerinden ERK (extracellular signal-regulated protein kinase) büyüme faktörleri ile uyarılarak hücre büyümesi, farklılaşması ve çoğalmasını etkilerken, JNK (c-jun amino-terminal kinase) ve p38 (high osmolarity glycerol response kinase) strese bağlı uyaranlarca uyarılarak apoptotik sinyallere aracılık eder.Meme kanseri kadınlarda çok sık görülen ve ölümle sonuçlanabilen bir kanser tipidir. ERK, p38 ve JNK proteinleri meme kanserinde incelenmiş ve normal dokulara oranla aktivasyonlarında artış olduğu belirlenmiştir. ERK proteininin aktivasyonundaki 5-20 kat artışın insan meme kanserinin metastatik formunun başlangıcının belirlenmesinde önemli bir belirteç olabileceği ileri sürülmüştür. RNAi (RNA interference), gen ekspresyonunun post-transkripsiyonel olarak baskılanmasına yol açan bir sistemdir. Bu baskılama, siRNAlar (small interference RNA) (21-23 nükleotid) aracılığı ile mRNA'nın yıkımının uyarılması ile gerçekleşir.Bu çalışmada; MCF-7 insan meme kanseri hücre dizisi ve NIH 3T3 sıçan normal fibroblast hücre dizisi, erk genine özgü siRNA ile transfekte edilerek erk geninin ne kadar sessizleştirildiği ve gen ekspresyon düzeyi total RNA kullanılarak qRT-PCR'da belirlenmiştir. Ayrıca ERK, p38 ve JNK proteinlerinin aktiviteleri de ELISA yöntemi ile belirlenirken, bu sessizleştirmenin hücre çoğalmasını nasıl etkilediği XTT kiti ile ortaya konmuştur.Elde edilen sonuçlar incelendiğinde, MCF-7 insan meme kanseri hücre dizisinde ERK siRNA kullanımı sonucu en etkili sessizleştirmenin 48. saatte 100 nM konsantrasyonda (% 99,85) olduğu belirlendi. Bunların yanında bu sessizleştirmeninhücre çoğalması ve protein ekspresyonunun azalması üzerine hemen hemen tüm konsantrasyonlarda etkili olduğu gözlendi. Sonuçta siRNA uygulamasının kanser tedavisinde oldukça faydalı yardımcı bir araç olabileceği belirlendi.Anahtar Sözcükler : ERK, MCF-7, NIH 3T3, RNAi, siRNA

Abstract:
MAP (Mitogen-activated protein) kinases, protein family, act as transducers of extracellular signaling to elements regulating transcription. The members of this intracellular signaling pathway protein family; ERK (extracellular signal-regulated protein kinase) is activated by growth factor signals and induces cell growth, differentiation and proliferation, JNK (c-jun amino-terminal kinase) and P38 (high osmolarity glycerol response kinase) are activated by stress-related stimuli and mediate apoptotic signals.Breast cancer is seen frequently in women and can result in death. ERK, p38 and JNK proteins were investigated in breast carcinoma and elevated activation was found compared with normal tissue. It has been proposed that 5-20 fold elevation in ERK activation is an important marker in initiation of metastatic form of human breast cancer. RNAi is a system in which leads to posttranscriptional suppression of gene expression. This suppression is mediated by siRNAs (21-23 nucleotide) which induce degradation of mRNA.In this study, MCF-7 human breast cancer cell line and NIH 3T3 mouse normal fibroblast cell line were cultured. Afterwards, erk gene of MCF-7 and NIH 3T3 cells was silenced by using siRNA. After siRNA transfection, erk gene silencing was measured by qRT-PCR method on mRNA level with total RNA isolated from cells by using total RNA isolation kit. In addition to activations of ERK, p38 and JNK proteins were measured by ELISA and it has been determined how this silencing effects cell proliferation by XTT kit.When the obtained results are analyzed, it is determined that the most effective silencing occurs at the 48th hour of 100 nM concentrated (% 99,85) ERK siRNA utilization. Besides, it was observed that erk gene silencing was effective for cellproliferation reducing and protein expression reducing at almost all concentrations. As a resullt, it was determined that siRNA application might be aidful in cancer treatment.Key words : ERK, MCF-7, NIH 3T3, RNAi, siRNA