Serviks kanserinde allokriptopin ve β-glukan ile geliştirilmiş hibrit sistemin endoplazmik retikulum (ER) stresi ve mTOR sinyal yolağı ile ilişkili olarak hücre ölüm yolaklarına olan etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of the hybrid system developed with allocryptopin and b-glucan on cell death pathways in relation to endoplasmic reticulum (ER) stress and mtor signaling pathway in cervical cancer
Yazar: MERVE SENA KARA
Danışman: PROF. DR. BELMA ASLIM
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Kanser, yüksek ölüm oranına sahip ve insanların yaşam kalitesini düşüren bir hastalık olmakla birlikte, günümüzde mevcut tedavilere rağmen sağkalım oranları hala düşüktür. Doğal bileşikler ve türevleri birçok kanser türünde güçlü antitümör aktivite göstermiş olsa da zayıf farmakokinetik özellikleri, sınırlı biyoyararlanımı ve ilaca dirençli kanser hücrelerine etkinliğinin yeterli olmaması, etkili kanser ilaçlarının üretilmesini sınırlamaktadır. Bu tez çalışmasında, serviks kanser hücresi (HeLa) üzerinde allokriptopin ve β-glukanın farklı konsantrasyonlarında oluşturulmuş kombinasyonları ve tek başına uygulama gruplarının, hücre ölüm yolaklarını hedeflemesi ve HeLa hücresinde etkin bir antikanser ilacın geliştirilmesinde kullanılabilecek çoklu etki mekanizmasına sahip yeni bir ajanın bulunması amaçlanmıştır. Çalışmada allokriptopin, β-glukan ve β-glukan/Allokriptopin kombinasyonlarının antiproliferatif etkileri MTT testi ile belirlenmiştir. Belirlenen etkin doz ve süredeki antikanser ajanlarının HeLa hücresinde ROS , hücre içi Ca+2 seviyesi, apoptoz ve otofaji üzerindeki etkisi flow sitometrik analiz ile ve ayrıca apoptoz (Bax, Bcl-2, Kaspaz-3 ve Kaspaz-9) ve otofaji (Beclin-1, LC3B ve ATG5) ölüm yolakları, ER stresi (PERK ve Grp-78) ve mTOR sinyal yolağına (mTOR ve AMPK) olan etkisi qRT-PCR ile gen düzeyinde tespit edilmiştir. Antiproliferatif etki tek başına doz uygulamasına oranla hibrit sistemde öne çıkmış olup %9 ve %16'lık antiproliferatif etki elde edilmiştir. Bcl-2 geninin ekspresyonunda kontrol grubuna oranla baskılanma gözlemlenirken Kaspaz-3 genin ekspresyonu hibrit sistem de en yüksek düzeyde arttığı (2-4kat) aynı zamanda flow sitometrik analizde bu hibrit sistemin erken apotoz hücre oranlarının diğer uygulamalar göre artış gösterirken nekrotik hücrenin gözlenmediği dikkati çekmiştir. Otofajik genlerde ise hepsinde bir kontrole göre artış gözlemlenirken en etkili LC3-B (2-5kat) elde edilmiştir. Otofajinin flow sitometrik analizinde de hibrit sistem en yüksek düzeyde (2kat) arttığı sonucu elde edilmiştir. Hibrit sistemin flow sitometrik analizlerde, hücre içi ROS seviyesini (MFI: %2,6 kat) ve hücre içi Ca+2 seviyesi (2,7kat) arttığını sonucu elde edilmiştir. ER stres genlerinde ise PERK geninin ekspresyonunda kontrol grubuna oranla baskılanma gözlemlenirken, Grp-78 genin ekspresyonunda öne çıkan β-glukan (5kat) arttığını sonucu elde edilmiştir. AMPK/mTOR sinyal yolağında ise mTOR geninin ekspresyonunda tüm uygulama gruplarında baskılanma gözlemlenirken hibrit sistemde en iyi baskılanma (0,2kat) elde edilmiştir. AMPK genin ekspresyonunda ise öne çıkan β-glukan (2,7kat) arttığını sonucu elde edilmiştir. β-glukan, allokriptopin ve hibrit sistemin, ROS indüklü, ER stresi ve hücre içi Ca+2 artışı, mTOR sinyal yolağı ile ilişkili olarak serviks kanseri hedefli terapötik bir antikanser ajanın geliştirilebileceğini göstermiştir. Ayrıca, geliştirilecek bu hibrit sistem mevcutta kullanılan, ancak bazı yan etkilere sahip kemoterapi ve radyoterapiye alternatif olabilecek güncel tedavilerde de kullanım potansiyeli olabilecektir.

Abstract:
Cancer is a disease with a high mortality rate and reduces the quality of life of people, and despite the treatments currently available, survival rates are still low. Although natural compounds and their derivatives have shown strong antitumor activity in many types of cancer, their weak pharmacokinetic properties, limited bioavailability and insufficient efficacy against drug-resistant cancer cells limit the production of effective cancer drugs. In this thesis study, it was aimed to target cell death pathways with combinations of allocryptopine and β-glucan at different concentrations on cervical cancer cells (HeLa) and single application groups and to find a new agent with multiple mechanisms of action that can be used in the development of an effective anticancer drug in HeLa cells. In the study, the antiproliferative effects of allocryptopine, β-glucan and β-glucan/Allocryptopine combinations were determined by MTT test. The effects of anticancer agents at the determined effective dose and duration on ROS, intracellular Ca+2 level, apoptosis and autophagy in HeLa cells were determined by flow cytometric analysis and also the effects on apoptosis (Bax, Bcl-2, Caspase-3 and Caspase-9) and autophagy (Beclin-1, LC3B and ATG5) death pathways, ER stress (PERK and Grp-78) and mTOR signaling pathway (mTOR and AMPK) were determined at the gene level by qRT-PCR. The antiproliferative effect was prominent in the hybrid system compared to the single dose application and 9% and 16% antiproliferative effect was obtained. While suppression was observed in the expression of the Bcl-2 gene compared to the control group, the expression of the Caspase-3 gene increased to the highest level in the hybrid system (2-4 fold) and at the same time, it was noted that the early apoptosis cell rates of this hybrid system increased compared to other applications in the flow cytometric analysis, while no necrotic cells were observed. In autophagic genes, an increase was observed in all of them compared to the control, while the most effective LC3-B (2-5 fold) was obtained. In the flow cytometric analysis of autophagy, it was obtained that the hybrid system increased the highest level (2 fold). In the flow cytometric analysis of the hybrid system, it was obtained that the intracellular ROS level (MFI: 2.6 fold) and intracellular Ca+2 level (2.7 fold) increased. In ER stress genes, while the expression of the PERK gene was suppressed compared to the control group, it was obtained that the expression of the Grp-78 gene was prominently increased by β-glucan (5 fold). In the AMPK/mTOR signaling pathway, while the expression of the mTOR gene was suppressed in all application groups, the best suppression (0.2 fold) was obtained in the hybrid system. In the expression of the AMPK gene, it was obtained that the expression of the β-glucan (2.7 fold) was prominently increased. β-glucan, allocryptopin and hybrid system have shown that a therapeutic anticancer agent targeting cervical cancer can be developed in relation to ROS-induced, ER stress and intracellular Ca+2 increase, mTOR signaling pathway. In addition, this hybrid system to be developed may have the potential to be used in current treatments as an alternative to chemotherapy and radiotherapy, which are currently used but have some side effects.