Bipolar bozukluk tanılı hastaların indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinde (IPS) mikroRNA ekspresyon değişimlerinin incelenmesi
Analyzing mirna expression changes in bipolar disorder patientspecific induced pluripotent stem cells (İPSC).
Yazar: BEGÜM ALURAL
Danışman: PROF. DR. ŞERMİN GENÇ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı / Temel Sinirbilimler Bilim dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Bipolar bozukluk = Bipolar disorder ; Kök hücreler = Stem cells ; Lityum = Lithium ; Mikro RNA = Micro RNA ; Nöronlar = Neurons

Özet:
Bipolar bozukluk (BB), manik ve depresif dönemler arasındaki iyilik dönemleri (ötimi) ile karakterize edilebilen, yineleyici doğada ve .mür boyu süren nöropsikiyatrik bir hastalıktır. Günümüze kadar, BB üzerine yapılan çalışmalarda hayvan modelleri, biyolojik sıvılar, postmortem beyin dokuları kullanılmıştır. Öte yandan, gelişen indüklenmiş pluripotent kök hücre (IPS) teknolojisi ile hastaya .zgü in vitro model oluşturulabilmesi, bahsedilen diğer modelleme yöntemlerinin taşıdığı sınırlılıkların aşılmasına olanak sağlamıştır. Bu nedenle çalışmamızda, BB hastalarına ve sağlıklı kontrollere ait IPS hücrelerinin nöronlara farklılaştırılarak hastaya özgü in vitro bir model oluşturulması ve bu modelde Nanostring global miRNA profillemesi yapılarak BB hasta grubunda farklı ifade düzeyine sahip miRNA'ların belirlenmesi amaçlanmıştır.
Bu çalışmada toplam ü. BB hastasına ve üç sağlıklı kontrole ait fibroblast örnekleri kullanılmıştır. Bu fibroblastlar Cellular Reprogramming firması tarafından, sentetik mRNA transfeksiyon yöntemi kullanılarak IPS hücrelerine çevrilmiştir. IPS hücreleri teslim alındıktan sonra nöral progenitör hücrelere ve nöronlara farklılaştırılmış ve farklılaşmanın 2.-, 4.- ve 6.- haftalarında RNA izolasyonu yapılmıştır. Tüm RNA örneklerinden Nanostring miRNA profillenmesi ve veri analizi New Mexico Üniversitesi'nde, Doç. Dr. Nikolaos Mellios danışmanlığında gerçekleştirilmiştir. Daha sonra RT-qPCR ile miR-34a artışı doğrulandıktan sonra, hastalık tedavisinde sıklıkla kullanılan bir ilaç olan lityumun miR-34a ifade düzeyine ve diğer parametrelere olan etkileri incelenmiştir. Mali yükü ve iş gücü yükünün büyük olması nedeniyle çalışmaya sadece çok az sayıda BB hastası ve sağlıklı kontrol dahil edilebilmesine bağlı olarak, global miRNA profillemesi sonuçları üzerinde istatiksel bir değerlendirme yapılamamıştır. Bu nedenle profilleme sonucunda en az 1,5-kat farklılık gösteren miRNA'lar belirlenmiştir. Çalışmanın ilerleyen aşamalarında ise, hedef genlerin ve tedavi üzerinde etkili olabilecek olası yolakların analizleri için, ifade düzeyinin tüm farklılaştırma zaman noktalarında ortak olarak arttığı saptanmış olan miR-34a üzerine yoğunlaşılmıştır. Lityumun BB hastalarına ait hücrelerde miR-34a ve hedef genlerinin ifade düzeylerine olan etkilerinin incelendiği deneylerde, lityum tedavisi sonrası miR-34a ifade düzeyinin lityum-responder BB hastasına ait hücrelerde azaldığı ve miR-34a hedef genlerinin ifade düzeylerinin istatistiksel olarak anlamlı şekilde arttığı görülmüştür. Ancak lityum non responder BB hastalarına ait hücrelerde böyle bir etki saptanamamıştır. Devam eden deneylerde, lityum ile akut tedavinin de sadece responder BB hastasına ait hücrelerde proliferasyonu arttırdığı ve nörogenezi tetiklediği saptanmıştır. Ancak çalışmaya sadece ü. BB hastasının dahil edilebilmiş olması ve bu üç hastanın sadece bir tanesinin lityum-responder olması önemli bir kısıtlılıktır.
Sonuç olarak, bu tez çalışmasında elde edilen bulgular iki ana başlıkta özetlenebilir: 1) miR- 34a tarafından düzenlenen sinaptogenez ve nörogelişim, BB patogenezinde yer alan yolaklardan biri olabilir ve 2) Hastalığın tedavisinde kullanılan lityum, sahip olduğu terapötik etkisinin bir kısmını miR-34a üzerinden gösteriyor olabilir. Ancak bu bulguların doğru yorumlanabilmesi ve genelleştirilebilmesi için daha büyük hasta kohortlarında doğrulanması gerekmektedir. Ayrıca elde ettiğimiz sonuçların hastalıkla ilişkisinin tam olarak anlaşılabilmesi ve lityumun etki mekanizmasında miR-34a'nın rolü olup olmadığının anlaşılabilmesi için daha fazla hastanın dahil edildiği detaylı çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
Bipolar disorder (BD) is a neuropsychiatric disorder characterized by manic and depressive episodes with intermittent periods of euthymia. Traditionally, the research on BD has relied on the use of animal models, biological fluids, or post-mortem tissues to identify biological changes associated with BD. However, such approaches suffer from various technical and biological limitations. Patient-derived induced pluripotent stem cell (iPSC) technology, on the other hand, offers an opportunity to overcome these limitations. In the present study, we aimed to identify miRNAs associated with BD by Nanostring miRNA profiling. 
In this study, we used fibroblast cells obtained from three BD patients and three healthy controls. These fibroblasts were reprogrammed to IPSCs with messenger RNA-based transfection method by Cellular Reprogramming company. Then we further induced these IPSCs to establish neural progenitor cells (NPC). After characterization, we differentiated NPCs into neurons and collected RNA samples on for two, four, or six weeks of differentiation. Then, we performed Nanostring analysis to identify differentially expressed miRNAs between BD- and control-derived NPCs and neurons. Finally, we evaluated how lithium modulates expression levels of miR-34a and its selected targets, together with NPH viability and neurogenesis parameters. 
Due to time and financial constraints, IPSCs have been established from three BD patients and three healthy controls. Statistical analysis on differentially expressed genes was not possible due to small sample size; therefore, we listed miRNAs with a fold-change of 1.5 or higher between two groups. Among several deregulated miRNAs, we identified miR-34a as one of the most consistently upregulated miRNA during different periods of neuronal differentiation. Building on this observation, we focused on miR-34a for target gene and treatment-related pathway analyses. Lithium treatment caused a marked reduction miR-34a expression in responder cells, which was further reflected in statistically significant elevation of miR-34a target genes' expression levels. Lithium treatment induced proliferation of NPCs and neurogenesis of neurons. On the other hand, lithium treatment failed to produce similar effects on non-responder cells. To our knowledge, this is the first study to investigate the effects of lithium on miRNAs by using BD patient derived neurons. Due to limited sample size, only one of the three patients was lithium responder, and the findings of this study require validation in larger cohorts.
Taken together, the main findings of this study are twofold: 1) The regulatory network modulated by miR-34a may provide clues to the molecular mechanisms underlying BD pathogenesis and 2) Lithium may exerts its effects, at least in part, through miR-34a and its target genes. Further studies on a larger patient cohort are needed to determine the generalizability of these findings around miR-34a, as well as, to obtain a more comprehensive picture of the biological basis of lithium response.