Primer mide adenokarsinomlarının immunohistokimya ve insitu hibridizasyon yöntemleri ile moleküler sınıflaması, TRK yolağının sınıflamadaki olası rolünün belirlenmesi, klinikopatolojik parametreler ile ilişkilerinin değerlendirilmesi
Molecular classification of gastric cancer based on immunohistochemistry and in-situ hybridization, determination of the role of tropomyosin receptor kinase (TRK) signaling pathway in gastric cancer classification and their association with clinicopathological parameters
Yazar: MEDİNE ÖZGÜR GÜNAY
Danışman: PROF. DR. ÇİĞDEM ÇELİKEL
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Herpesvirüs 4-insan = Herpesvirus 4-human ; Mide hastalıkları = Stomach diseases ; Mide neoplazmları = Stomach neoplasms ; Mikrosatelitler = Microsatellites ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prognoz = Prognosis ; Protein-tirozin kinaz = Protein-tyrosine kinases ; Sınıflandırma = Classification

Özet:
Amaç: Çalışmamızda; 1) literatürde tanımlanmış moleküler alt tipler göz önüne alınarak, primer gastrik adenokarsinomu (G-ACa) immünhistokimya (İHK) ve in- situ hibridizasyon (İSH) gibi daha yaygın, ulaşılabilir ve düşük maliyetli teknikler kullanarak sınıflamak, kendi popülasyonumuzdaki dağılımlarını değerlendirmek, morfolojik yansımalarını ve klinik-patolojik parametrelerle olan ilişkilerini belirlemek; 2) İHK (pan-TRK) yöntemi ile G-Ca'larda NTRK gen füzyonlarının oranını belirlemek, moleküler sınıflama alt tipleri ile ilişkisini ve her grup içindeki bağımsız prognostik rolünü araştırmak amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: 2013-2018 yılları arasında, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pendik Eğitim ve Araştırma Hastanesi (MÜTF, Pendik EAH) Tıbbi Patoloji bölümünde, rezeksiyon materyallerinde primer G-ACa tanısı alan 240 olgu çalışma kapsamına alınmıştır. Tissue microarray (TMA) analiz için, her olguya ait farklı morfolojideki tümör alanlarındaki tümörü en iyi temsil ettği düşünülen 4 adet örnek, alıcı bloklardaki 3 mm çaplı yuvacıklara (korlara) yerleştirilmiştir. Çalışmamızda, Setia ve arkadaşlarının, daha önce yayınlanan moleküler sınıflamaları göz önüne alarak önerdikleri sınıflamaya benzer şekilde, EBER-kromojenik İSH (CISH) ile MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, E-kaderin ve p53 İHK analizi uygulanarak, 240 G-ACa olgusu beş gruba ayrılmıştır. 
Çalışmamızda NTRK gen füzyonlarının G-ACa'lardaki görülme sıklığı ve moleküler çalışmaları baz alan G-ACa grupları ile ilişkisi İHK (pan-TRK-EPR17341) yöntemi uygulanarak değerlendirilmiştir. Ekspresyon izlenen olgularda konfirmasyon amaçlı NTRK 1/2/3 floresan-İSH (FİSH) analizi uygulanmıştır. Pan-TRK negatif olan G-ACa'lar arasından kontrol grubu oluşturmak amacıyla, ileri evreli beş olgu seçilerek, NTRK 1/2/3 FİSH analizi gerçekleştirilmiştir.
Çalışmamıza, olgulara ait rutinde uygulanmış HER2 İHK ve İSH (FİSH/SİSH) analizleri dahil edilmiş ve sonuçlarına olguların hastane bilgi yönetim sisteminde kayıtlı patoloji raporlarından ulaşılmıştır.
Bulgular: Çalışmamızda yer alan olguların takip süresi ortalama 19,97 aydır. Genel sağ kalımda; tümör makroskopik tip 1 (polipoid), iyi farklılaşma derecesi, erken evre mide duvar invazyon seviyesi (pT1+pT2) ve lenf nodu tutulumu (pN0+pN1), lenfatik/anjioinvazyon negatifliği ile cerrahi sınır negatifliğinin uzun sağ kalımla istatistiksel anlamlılık gösterdiği belirlenmiştir. Nükssüz sağ kalım analizlerinde ise; ileri evre lenf nodu metastazı (pN3), lenfatik invazyon, anjioinvazyon, perinöral invazyon, cerrahi sınırda tümör pozitifliği ve desmoplastik yanıtın, azalmış nükssüz sağ kalım ile ilişkisi istatistiksel açıdan anlamlı  bulunmuştur. 
Çalışmamızda, İHK ve İSH analizi kullanılarak 240 olgu sırasıyla 5 gruba ayrılmıştır; %3,7'sinin (n=9) EBV (+), %12,1'inin (n=29) dMMR, %12,9'inin (n=31) E-kaderin aberran, %47,9'unun (n=115) P53 aberran ve %23,4'ünün (n=56) P53 normal grupta olduğu saptanmıştır. 
Çalışmamızda, EBV (+) grupta, olgu sayısının sınırlı olması nedeniyle, diğer gruplara göre histomorfolojik ve sağ kalım özellikleri açısından istatiksel anlamlı farklılık elde edilememiştir. Buna karşın, olguların tümünün erkek olması, 6 olgunun (%66) proksimal yerleşim göstermesi ve 7 olguda (%77) lenfositik yanıtın saptanması dikkat çekici özelliktedir. Çalışmamızdaki EBV (+) olan 9 olgunun histolojik tipi incelendiği zaman; 2 olguda (%22) medüller karsinom, 5 olguda (%55) mikst tip karsinom (zayıf koheziv+tubuler), 1 olguda (%11) zayıf koheziv karsinom (taşlı yüzük komponenti içeren), 1 olguda (%11) tubuler karsinom (kötü diferensiye/ solid patern baskın) görülmüştür. EBV (+) olguların tümünde İHK olarak yanlış eşleşme tamir proteinleri (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) korunmuştur (mutually exclusive patern).
dMMR grupta görülen yaş ortalaması, diğer moleküler gruplara göre anlamlı olarak yüksek saptanmıştır (ortalama 71 yaş). Lenfositik yanıt varlığı, p53 aberran grup ile birlikte, diğer moleküler gruplardan daha yüksek oranda izlenmiştir. Histolojik tip olarak, p53 aberran grup ile birlikte Lauren intestinal tip/DSÖ tubuler tip görülme oranı, diğer moleküler gruplara göre anlamlı şekilde yüksek bulunmuştur. Perinöral invazyon, diğer moleküler gruplarla karşılaştırıldığı zaman, istatistiksel olarak anlamlı şekilde az oranda saptanmıştır. Çalışmamızda dMMR grupta yer alan 18 tubuler G-ACa olgusu dışında, 3 olguda medüller karsinom, 3 olguda zayıf koheziv G-ACa, 4 olguda mikst karsinom ve 1 olguda müsinöz karsinom saptanmıştır. Bir olguda ise tubuler morfolojiye %10 oranında mikropapiller paternin eşlik ettiği görülmüştür. dMMR grupta, MLH1 ve PMS2 kaybı dominant patern (%86,2) olarak izlenmiştir.
E-kaderin aberran grupta diğer moleküler gruplara göre daha yüksek oranda Lauren diffüz tip/ DSÖ zayıf koheziv tip saptanmış olmakla birlikte, yaş açısından diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı fark elde edilmemiştir. Kötü farklılaşma gösterme oranının, E-kaderin aberran grupta, diğer gruplara göre anlamlı olarak fazla olduğu görülmüştür.
P53 aberran grubun, istatistiksel olarak anlamlı şekilde, Lauren intestinal tip (%62,6) ve DSÖ tubuler tiple (%54,8) yüksek oranda korelasyon gösterdiği saptanmıştır. P53 aberran gruptaki HER2 pozitiflik oranının (HER2 İHK skor 3), diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde yüksek olduğu görülmüştür.
Tanımlanan 5 moleküler grup arasında, genel ve nükssüz sağ kalım oranları açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmamıştır.
240 olgudan 3'ünde pan-TRK ile az sayıda neoplastik hücrede zayıf immunekspresyon izlenmiştir. Konfirmasyon amaçlı yapılan NTRK 1/2/3 FİSH analizinde, NTRK 1/2/3 genlerindeki split oranı her 3 olguda da %5'den daha az oranda saptanmıştır. Pan-TRK İHK negatif kontrol grubunu oluşturan beş olgunun iki tanesinde NTRK1 gen split oranı %10 (%10 ve %14)'dan fazladır.
Sonuç: Çalışmamızda, İHK ve İSH analizleri yardımıyla, literatürdeki moleküler bazlı çalışmalar esas alınarak oluşturulan G-ACa gruplarının, çalışma kapsamına aldığımız kendi popülasyonumuzdaki dağılımı belirlenmiştir. Histolojik sınıflamalara göre, gruplardaki olguların dağılımı arasında anlamlı fark izlenmekle birlikte, hiçbir grup için özgün histolojik tip saptanmamıştır. Bu doğrultuda, hedef tedavileri yönlendirme açısından etkin olabilecek G-ACa gruplarının belirlenebilmesi için, İHK ve İSH yöntemlerinin rutin uygulanmasının önemli olduğunu bu çalışma göstermiştir. 
Pan-TRK İHK ekspresyonu saptanan olgularımızda uygulanan FİSH analiz sonuçları güncel kriterlere göre negatif kabul edilse de, çalışma ve kontrol gruplarında elde edilen FİSH sonuçlarının, ilerleyen zamanlarda yapılacak kapsamlı moleküler çalışmalarla, prediktif ve/veya prognostik açıdan anlamlılık derecesinin araştırılması gerektiğine inanıyoruz. 
Anahtar Kelimeler: Gastrik adenokarsinom, moleküler sınıflandırma, TCGA, ACRG, mikrosatellit instabilite, EBV, nörotrofik- tropomiyozin reseptör tirozin kinaz (NTRK) gen füzyonu, pan-TRK, prognoz.

Abstract:
Aim: The aims of this study are; 1) to reclassify primary gastric adenocarcinoma (G-ACa), by using more common, accessible and cost-effective techniques such as immunohistochemistry (IHC) and in- situ hybridization (ISH) in accordance with the identified molecular subtypes, to evaluate their distribution in our population, to evaluate their morphological reflections and their relationship with the clinical and pathological parameters; 2) to determine the ratio of NTRK gene fusion in G-ACa by IHC (pan-NTRK) method, to investigate its relationship with our molecular classification subtypes and to investigate its independent prognostic role in individual subtypes.
Material and Metods: A total number of 240 gastrectomy specimens, which had been diagnosed as primary G-ACa in the Pathology Department of Marmara University School of Medicine, between 2013 and 2018 were included in the study. For tissue microarray (TMA) analysis, 4 samples, which are thought to best represent the tumor in tumor areas of different morphology, were placed in 3 mm diameter cores in the recipient blocks. In our study, 240 G-ACa cases were divided into five groups by EBER-chromogenic ISH (CISH) as well as, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, E-cadherin and p53 IHC, similar to the classification proposed by Setia et al., considering the previously published molecular classifications. 
In our study, the prevalence of NTRK gene fusions in G-ACa and its relationship with G-ACa groups based on molecular studies were evaluated by applying the IHK (pan-TRK-EPR17341) method. NTRK 1/2/3 fluorescence-ISH (FISH) analysis was performed for confirmation in cases with pan-TRK expression.  
In order to create a control group among the Pan-TRK negative cases, five cases with advanced stage were selected and NTRK 1/2/3 FISH analysis was applied.
The routine HER2 ISH and ISH (FISH / SISH) analyzes of the cases were also included in our study, and the results were obtained from the pathology reports recorded in the hospital information management system.
Findings: The mean follow-up period of the cases in our study was 19,97 months. In overall survival analysis; tumor macroscopic type 1 (polypoid), well differentiation, early gastric wall invasion level (pT1 + pT2) and lymph node involvement (pN0 + pN1), lymphatic / angioinvasion negativity and surgical margin negativity were associated with long survival. In relapse-free survival analysis; advanced stage lymph node metastasis (pN3), lymphatic invasion, angioinvasion, perineural invasion, tumor positivity at the surgical margin and desmoplastic response were associated with short recurrence-free survival.
In our study, 240 cases were divided into 5 groups by using IHC and ISH analysis; 3,7% (n = 9) EBV (+) group, 12,1% (n = 29) dMMR group, 12,9% (n = 31) E-cadherin aberrant group, 47,9% (n = 115) P53 aberrant group and 23,4% (n = 56) P53 normal group.
In our study, due to the limited number of EBV (+) cases, no statistically significant difference was found in terms of histomorphological and survival characteristics compared to other molecular groups. However, it is remarkable that all of the cases were male, 6 cases (66%) were proximally localized, and lymphocytic response was detected in 7 cases (77%). When the histological type of 9 cases with EBV (+) in our study was examined; 2 cases (22%) medullary carcinoma, 5 cases (55%) mixed type carcinoma (poorly cohesive + tubular), 1 case (11%) poorly cohesive carcinoma (containing signet ring cell component), 1 case (11%) tubular carcinoma (poorly differentiated / solid pattern dominant) was observed. In all EBV (+) cases, mismatch repair proteins (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) were detected as intact (mutually exclusive pattern) as IHC.
The average age seen in the dMMR group was found to be significantly higher than the other molecular groups (mean age 71 years). The presence of lymphocytic response was detected at a higher rate with the p53 aberrant group compared to other molecular groups. As histological type, with p53 aberrant group, Lauren intestinal type / WHO tubular type were found to be significantly higher than other molecular groups. Perineural invasion was found to be statistically significantly less when compared with other molecular groups. In our study, except for 18 tubular G-ACa cases in the dMMR group, 3 cases had medullary carcinoma, 3 cases had weak cohesive G-ACa, 4 cases had mixed carcinoma and 1 case had mucinous carcinoma. In one case, micropapillary pattern was found to accompany tubular morphology at a rate of 10%. In the dMMR group, loss of MLH1 and PMS2 was found to be the dominant pattern (86.2%).
Although there was a higher rate of Lauren diffuse type / WHO weak cohesive type in the E-cadherin aberrant group compared to other molecular groups, no statistically significant difference was found in terms of age compared to the other groups. It was also observed that E-cadherin aberrant group had significantly higher differeantiation grade compared to the other groups.
P53 aberran group was found to be statistically significantly correlated with Lauren intestinal type (62,6%) and WHO tubular type (54.8%). The HER2 positivity rate (HER2 IHC score 3) in the p53 aberrant group was found to be statistically significantly higher than the other groups.
No statistically significant difference was found between the 5 defined molecular groups in terms of overall and recurrence-free survival rates.
In 3 out of 240 cases, weak immunoexpression was observed in a small number of neoplastic cells with pan-TRK. In the NTRK 1/2/3 FISH analysis applied for confirmation, the split ratio in NTRK 1/2/3 genes was found to be less than 5% in all 3 cases. The NTRK1 gene split ratio is more than 10% (10% and 14%) in two of the five Pan-TRK IHC negative cases.
Conclusion: In our study, with IHC and ISH analyzes, groups formed on the basis of molecular-based studies in the literatüre, the distribution of G-ACa's in our own population was determined. Although there was a significant difference between the distribution of cases in the groups according to histological classifications, no specific histological type was detected for any of the groups. In this respect, this study has shown that it is important to routinely apply IHC and ISH methods in order to determine the G-ACa groups that can be effective in directing target therapies.
Although the results of the FISH analysis performed in our cases with pan-TRC IHC expression are considered negative according to current criterias, we believe that the FISH results obtained in the study and control groups should be investigated in terms of predictive and / or prognostic significance with extensive molecular studies in the future.
Keywords: Gastric adenocarcinoma, molecular classification, TCGA, ACRG, microsatellite instability, EBV, neurotrophic- tropomyosin receptor tyrosine kinase (NTRK) gene fusion, pan-TRK, prognosis.