Hidrojen sülfürün sığır retinal arterini gevşetici etkisinde kalsiyum duyarlılaştırıcı mekanizmaların ve sentezinden sorumlu enzimlerin incelenmesi
Investigation of calcium sensitizing mechanisms and enzymes responsible for synthesis of hydrogen sulfide in the relaxant effect of bovine retinal artery
Yazar: AYÇA TOPRAK
Danışman: PROF. DR. BİRSEL SÖNMEZ UYDEŞ DOĞAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı / Farmakoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Enzimler = Enzymes ; Hidrojen sülfür = Hydrogen sulfide ; Retina = Retina ; Retinal arter = Retinal artery ; Sığırlar = Cattles ; Vazodilatasyon = Vasodilation

Özet:
Hidrojen sülfür (H2S) oküler dokularda eksprese olan ve oküler damarların tonüsünü düzenleyen bir gazotransmitterdir. H2S donörü NaHS sığır retinal arterinde Kv ve Kir kanallarını kısmen aktive ederek vazodilatasyona neden olur. Çalışmamızda NaHS'in sığır retinal arterini gevşetici etkisinde ekstraselüler Ca2+'un, Ca2+ duyarlılaşmasının rolünü ve olası etki mekanizmalarını incelemeyi amaçladık. Ayrıca, H2S'in sentezinden sorumlu enzimlerin (sistatyonin beta sentaz-CBS, sistatyonin gama liyaz-CSE, 3-merkaptopiruvat sülfürtransferaz-3-MST) düzeylerini ve dağılımlarını (CBS, CSE) retina ve retinal arterde belirlemeyi hedefledik. Ekstraselüler Ca2+'un rolü kalsiyumsuz ortamda CaCl2 veya PGF2α ile kastırılan arterlerde, Ca2+ duyarlılaşması sağlayan yolakların rolü ise bu yolakların spesifik inhibitörleri varlığında incelenmiştir. Ca2+ duyarlılaşma mekanizmalarında rol oynayan RhoA/Rho kinaz, myozin fosfataz (MP) enzimlerinin ve protein tip 1 fosfatazın inhibitör proteini (CPI-17)'nin protein düzeyleri Western blot yöntemiyle araştırılmıştır. H2S sentezleyen enzimlerin retinadaki ve retinal arterdeki varlığını, miktarını ve dağılımlarını belirlemek amacıyla ise ELISA ve immünofloresans mikroskobik analizler yapılmıştır. Bulgularımız NaHS'in retinal arter üzerine gevşetici etkisinde ekstraselüler Ca2+, myozin hafif zincir kinaz, protein kinaz C, tirozin kinaz, RhoA/Rho kinaz ve CPI-17'nin rolünün olmadığını göstermiştir. Bununla birlikte NaHS'in gevşetici etkisinin MP inhibitörü calyculin A varlığında kontrole kıyasla anlamlı olarak azaldığı görülmüştür. Damarların PGF2α+NaHS ile inkübasyonu MP'nin MYPT1 subünitesinin fosforilasyon düzeylerinin kontrol ve sadece PGF2α ile inkübe damarlarla kıyaslandığında azaldığını göstermiştir. Bunlara ek olarak CSE başta olmak üzere, her üç enzimin de retina ve retinal arterde varlığı ve retinal arterdeki miktarlarının retinaya göre daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, CBS'nin retinal arterin endotel ve düz kas tabakasında, CSE'nin ise endotelde yerleşim gösterdiği görülmüştür. Retinadaki dağılım açısından ise CBS ile CSE'nin koni-çomak hücreleri ve retinal gangliyon hücrelerinde bulunduğu, ek olarak CSE'nin bipolar hücrelerde de bulunduğu gözlenmiştir. Bulgularımız NaHS'in gevşetici etkisinden sorumlu mekanizmanın temel olarak MP aktivasyonu olduğuna ve H2S'in retina ve retinal arterde endojen olarak sentezlendiğine işaret etmektedir. H2S'in retinal arterdeki varlığını ve vasküler tonüse katkısını ortaya koyduğumuz çalışmamız, H2S'in retinal vasküler hastalıklarda koruyucu veya terapötik etkili olabileceğini düşündürmektedir.

Anahtar Kelimeler: Hidrojen sülfür, Ca2+ duyarlılaşması, retinal arter, retina, vazodilatasyon

Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi ve TÜBİTAK tarafından desteklenmiştir. 
BAP Proje Numarası: TDK-2018-29789 ve TÜBİTAK Proje No: 115S196

Abstract:
Hydrogen sulfide (H2S) is a gasotransmitter expressed in ocular tissues and involved in regulation of ocular vascular tone. NaHS, a H2S donor, induces vasodilation in bovine retinal artery partially via Kv and Kir channel activation. In this study we aimed to investigate the role of extracellular Ca2+, Ca2+ sensitization and the possible mechanisms and also to determine the levels of the enzymes responsible for the synthesis of H2S (cystathionine beta synthase-CBS, cystathionine gamma lyase-CSE, 3-mercapturuvate sulphidetransferase-3-MST) and distributions (CBS, CSE) in retina and retinal artery. The role of extracellular Ca2+ was assessed at CaCl2 or PGF2α precontracted arteries in the absence of Ca2+, the role of Ca2+ sensitization pathways were investigated in the presence of specific inhibitors. The protein levels of RhoA / Rho kinase, myosin phosphatase (MP) enzymes and protein-type 1 phosphatase inhibitor protein CPI-17,which have role in Ca2+ sensitization mechanisms were investigated by Western blot. ELISA and immunofluorescence microscopic analyzes were performed to determine the presence, amount and distrubution of the enzymes that synthesized H2S in the retina and retinal artery. As a result, it is shown that extracellular Ca2+, myosin light chain kinase, protein kinase C, tyrosine kinase, RhoA/Rho kinase and CPI-17 did not play a role in the vasodilator effect of NaHS. Additionally, incubation with MP inhibitor significantly reduced the relaxation effect of NaHS. Incubation of the arteries with PGF2α + NaHS showed that the MYPT1 subunit of MP phosphorylation levels reduced significantly compared to the control and only PGF2α incubated arteries. Besides, the presence of all three enzymes, particularly CSE, were found in retina and retinal artery and they were found to be higher in retinal artery than the retina. Moreover, CBS was shown to be present in the endothelial and smooth muscle layer of the retinal artery whereas, CSE in the endothelium. In terms of distribution, in the retina, CBS and CSE were found in cone-basil cells and retinal ganglion cells, besides, CSE radiating in bipolar cells. Our findings suggest that the mechanism responsible for the relaxation effect of NaHS is mainly MP activation and that H2S is synthesized endogenously in the retina and retinal artery. Our study, showing the presence of H2S in retinal artery and its contribution to vascular tone proposes that H2S may have protective or therapeutic effects in retinal vascular diseases.

Key Words: Hydrogen sulfide, Ca2+ sensitization, retinal artery, retina, vasodilation.

This study was funded by Scientific Research Projects Coordination Unit of Istanbul University and TUBITAK. 
BAP Project Number: TDK-2018-29789 and TUBITAK Project Number: 115S196.