Linalool'ün Fusarium graminearum'daki etkilerinin hücresel gösterimi
Cellular display of the effects of linalool on Fusarium graminearum
Yazar: BÜŞRA NUR ÇETİN
Danışman: PROF. GÜLRUH ALBAYRAK ; DOÇ. DR. EMRE YÖRÜK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Patoloji = Pathology
Dizin: Antifungal aktivite = Antifungal activity ; Antioksidan enzimler = Antioxidant enzymes ; Esansiyel yağlar =   ; Fusarium = Fusarium ; Oksidatif stres = Oxidative stress

Özet:
Yüksek lisans tezi kapsamında uçucu esansiyel yağ (EY) bileşenlerinin terpen alkolü bir fitokimyasalı olan linaloolün Fusarium graminearum PH-1 referans suşu üzerine etkileri hücresel düzeyde (oksidatif stres, apoptoz süreçleri ile hücre canlılığı ve mikotoksin üretimi ile ilişkili olarak) araştırıldı.
Linaloolün F. graminearum PH-1 referans suşu üzerindeki minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) 52,2 mg/L olarak bulundu. Deneylerde linalool içermeyen patates dekstroz agar (PDA) besi ortamında yetiştirilen kültürler kontrol grubu olarak ifade edildi. Linaloolün radyal üremeyi maksimum inhibe eden konsantrasyonun %25, %50 ve %75'ine karşılık gelen IC25, IC50 ve IC75 dozları sırasıyla 13,05 mg/L; 26,1 mg/L ve 37,15 mg/L olarak hesaplandı. Bu dozların radyal büyüme oranını azalttığı, azalmanın istatistiksel olarak anlamlı olduğu (p<0,0001) belirlendi. Linaloolün hücre canlılığı üzerine etkisi WST-1 testi ile belirlendi. IC25, IC50 ve IC75 dozları canlı hücre sayısını kontrole göre sırasıyla %33,09; %76,44 ve %86,03 oranında azalttı (p<0,0001). Linaloolün lipid peroksidasyonu üzerine etkisi TBARS testi ile incelendi. Lipid peroksidasyonun IC25, IC50 ve IC75 dozlarında kontrol grubuna göre sırasıyla %64,68; %145,16 ve %392,47 oranında arttığı belirlendi (p<0,0001). Linaloolün IC25, IC50 ve IC75 dozlarının hücre içi oksidasyonu kontrol grubuna göre sırasıyla %467, %1477 ve %3523 oranında arttığı spektrofotometrik yöntemle ortaya kondu (p<0,0001). Linalool dozundaki artışa bağlı olarak peroksidaz (POD) enzim aktivitesinde IC25 için %83,6; IC50 için %213,7 ve IC75 için %407,7 artış olduğu gösterildi. Katalaz (KAT) enzim aktivite değer artışları sırasıyla %180 (IC25), %409 (IC50) ve %1180 (IC75) olarak hesaplandı. Süperoksit dismutaz (SOD) aktivite artışları da %847 (IC25), %1840 (IC50) ve %2340 (IC75) olarak belirlendi (p<0,0001). SOD aktivitesindeki şiddetli artışın, linaloolün oksidatif stresi arttırmasına bağlı olarak hücre içindeki H2O2 konsantrasyonunu arttırmasından kaynaklandığı düşünüldü. POD ve KAT aktitivetisinin SOD'a göre düşük olması ve KAT aktivitesinin IC75'teki artışı ise POD'un H2O2 açısından doyma noktasına ulaştığını düşündürdü. Işık mikroskobu incelemesinde, linaloolle muamele edilmiş PH-1 referans suşunda hücresel düzeyde farklılıklar izlendi. Linalool konsantrasyon artışı deney gruplarının hücre ve organellerinde kontrole göre şişmeye, miselyum yapısında kalınlaşmaya neden oldu. Ek olarak klamidospor-benzeri yapı oluşumları gözlendi. Stres etkisi spor oluşumunu baskıladı. Linalool tarafından tetiklenenen oksidatif stres ve apoptotik etkiler sırasıyla 2′,7′-diklorodihidrofloresein diasetat (H2DCF-DA) boyaması ve akridin turuncusu/etidyum bromür (At/EtBr) ikili boyaması kullanılarak floresan mikroskobunda hücresel düzeyde görüntülendi. Linalool konsantrasyonu artışına bağlı olarak oksidatif stresteki artış H2DCF-DA boyaması sonucu artan yeşil ışık şiddeti ile ortaya kondu.  Ayrıca, linaloolün neden olduğu deoksinivalenol (DON) mikotoksini üretim miktarı üzerindeki etkisi ince tabaka kromatografisi (ing., thin layer chromatography-TLC) ile gösterildi. DON mikotoksininin incelendiği 0,28 Rf değerinde spot gözlemlenmedi.
Yüksek lisans tezi kapsamında, aromatik bitki türlerinde çiçek aromasına sahip ve doğal olarak bulunan, monoterpen bir EY bileşeni olan linalool fitokimyasalının çok düşük konsantrasyonda fungal büyümeyi inhibe ettiği F. graminearum PH-1 referans suşu üzerinde gösterildi. Linaloolün hücrelerde oksidatif strese bağlı olarak meydana getirdiği etkiler gerçek zamanlı olarak incelenerek hidrofobik yapıdaki EY'ların patojenik mantar türleri ile mücadelede güçlü bir antifungal ajan olarak kullanılma potansiyelini ortaya kondu.

Abstract:
In this master thesis, the effects of linalool, which is a terpene alcohol phytochemical of volatile essential oil (EO) components on Fusarium graminearum PH-1 reference strain at the cellular level (associated with oxidative stress, apoptosis processes, cell viability and mycotoxin production).
The minimum inhibitory concentration (MIC) of linalool on the F. graminearum PH-1 reference strain was found as 52,2 mg/L. In the experiments, cultures without linalool addittion was grown on potato dextrose agar (PDA) medium called as a control group. The IC25, IC50 and IC75 doses of linalool corresponding to 25%, 50% and 75% of the concentration that maximally inhibits radial growth were calculated as 13,05 mg/L; 26,1 mg/L; and 37,15 mg/L. It was shown that these doses decreased the radial growth rate and the decrease was statistically significant (p<0,0001). Effect of linalool on cell viability was determined via WST-1 test. IC25, IC50 and IC75 doses reduced number of viable cells in the ratio of 33,09%; 76,44% and 86.03% (respectively) compared to the control group (p<0,0001). The effect of linalool on lipid peroxidation was studied via TBARS test. It was measured that IC25, IC50 and IC75 doses increased lipid peroxidation 64,68%; 145,16% and 392,47% (respectively) compared to the control group (p<0,0001). Intracellular oxidation of linalool at IC25, IC50 and IC75 doses was demonstrated by spectrophotometric method, which increased by 467%, 1477% and 3523%, respectively, compared to the control group (p<0,0001). It was shown that peroxidase (POD) enzyme activity increased by 83,6% for IC25; 213,7% for IC50 and 407,7% for IC75 depending on the increase in linalool dose. Catalase (KAT) enzyme activity value increases were calculated as 180% (IC25), 409% (IC50) and 1180% (IC75), respectively. Superoxide dismutase (SOD) activity increases were also determined as 847% (IC25), 1840% (IC50) and 2340% (IC75) (p<0,0001). It was thought that the severe increase in SOD activity was due to the fact that linalool increased the H2O2 concentration in the cell due to increasing oxidative stress. The fact that POD and CAT activity were lower than SOD and the increase in CAT activity at IC75 suggested that POD had reached the saturation point in terms of H2O2. In the light microscopy examination, differences at the cellular level were observed in the reference strain PH-1 treated with linalool. The increase in linalool concentration caused swelling in the cells and organelles of the experimental groups compared to the control, and thickened the mycelium structure. In addition, chlamidospore-like structure formations were observed. The stress effect suppressed spore formation. Oxidative stress and apoptotic effects induced by linalool were visualized at the cellular level in fluorescence microscopy using 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) staining and acridine orange/ethidium bromide (At/EtBr) dual staining, respectively. The increase in oxidative stress due to the increase in linalool concentration was revealed by increasing green light intensity as a result of H2DCF-DA staining. In addition, the effect of linalool on the amount of deoxynivalenol (DON) mycotoxin production was demonstrated via thin layer chromatography (TLC). No spot was observed at an Rf value of 0,28; where DON mycotoxin was examined.
In the context of the master thesis, it was demostrated that linalool; which have flower aroma, and naturally exist in aromatic plant species, is a compound of monoterpene EOs, inhibates fungal growth at very low concentrations on F. graminearum PH-1 reference strain. By simultaneously examined that the effects of linalool on cells due to oxidative stress, it was revealed thet the potential of using hydrophobic EOs as a potent antifungal agent in the fight against pathogenic fungal species.