Antidepresan ilaçlar (Trazodone, Sertraline, Paroxetine ve Amitriptyline)'ın, insan mikroglia hücre serisindeki (HMC3) olası toksik etkilerinin, SIRT1/PGC1α/TFAM sinyal yolağı ve intihar adayı genler ile ilişkileri
Evaluation of the relationship between potential toxic effects of antidepressant drugs (Trazodone, Sertraline, Paroxetine, and Amitriptyline) on human microglia cell line (HMC3) and their impact on SIRT1/PGC1α/TFAM signal transduction pathway and suicide candidate gene expression levels
Yazar: HASAN ÇOBANKAYA
Danışman: DOÇ. DR. ASLI KOÇ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Adli Bilimler Ana Bilim Dalı / Adli Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Farmasötik Toksikoloji = Pharmaceutical Toxicology ; Genetik = Genetics

Özet:
Dünya genelinde 300 milyondan fazla insan depresyonla mücadele etmektedir ve depresyon dünya genelinde iş gücü kayıplarının en büyük nedeni olarak gösterilmektedir. Ülkemizde de depresif hastalıkların görülme sıklığı ve bu hastalıkların sebep olduğu ekonomik yük her geçen yıl artmaktadır. Şiddetli depresyonu olan genç bireyler, intihar olasılığı bakımından, normal popülasyon ile karşılaştırıldığında, 30 kat daha yüksek olasılığa sahiptir. Bu durum, depresyon ve intihar olgularının toplum sağlığı ve ekonomi açısından önemini işaret etmektedir. 2019 yılının sonlarında ortaya çıkan koronavirus pandemisi nedeniyle dünya genelinde depresyon ve intihar olguları hem nitelik hem de nicelik açısından bambaşka bir boyuta evrilmiştir. Antidepresanlar, depresif hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte, bu ilaçların etki mekanizmaları halen tüm yönleriyle aydınlatılabilmiş değildir. Bu nedenle klinik uygulamaların iyileştirilmesi için antidepresanların bilinmeyen etkileriyle ilgili çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca depresyonlu bireylerde kendi kendini zehirleme vakaları genellikle reçeteli antidepresanların kullanımıyla gerçekleştiğinden bu ilaçların toksisitesi ile ilgili bilgiler büyük önem taşımaktadır. Trazodone, sertraline, paroxetine ve amitriptyline, en yüksek intihar vakalarının görüldüğü antidepresanlar olarak bildirilmiştir.
 
Antidepresan tedavisiyle ortaya çıkan intihar düşüncesi aralarında GRIK2 geninin de bulunduğu bazı aday genlerin ifade düzeyi değişimleriyle ilişkilendirilmektedir ve intihar sonucu hayatını kaybeden kişilerde PLSCR4 gen ifadesinin azaldığı gösterilmiştir. Bu nedenle çalışmamızda HMC3 hücrelerinde antidepresan ilaçların, intihar aday genleri olan PLSCR4 ve GRIK2'nin gen ekspresyonu üzerindeki etkileri RT-PCR yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. RT-PCR sonuçları doğrultusunda 200µM trazodone (en yüksek artış) ve belirlenen IC50 konsantrasyonlarında sertraline, amitriptyline maruziyeti (72 saat) HMC3 hücrelerinde GRIK2 ekspresyonunda anlamlı artışlara (sırasıyla p<0,01; p<0,05 ve p<0,05) neden olmuş, ancak paroxetine GRIK2 ekspresyonu üzerinde anlamlı bir etki ortaya çıkarmamıştır. Aynı maruziyet koşulları altında HMC3 hücrelerinde PLSCR4 gen ekspresyonuna ilişkin olarak ise; trazodone (en yüksek artış), amitriptyline ve paroxetine PLSCR4 gen ekspresyonunu anlamlı olarak artırmış (sırasıyla p<0,01; p<0,05 ve p<0,05), ancak sertraline, PLSCR4 gen ekspresyonu üzerinde anlamlı bir etki oluşturmamıştır.

Depresyonun karmaşık patogenezi henüz yeteri kadar anlaşılabilmiş değildir. Ancak konuyla ilgili yapılan çalışmalar, beyin işlevlerinin oksidatif stres ve apoptoz yoluyla düzenlenmesinde mitokondriyal disfonksiyonun önemli bir role sahip olduğunu göstermiştir. Mitokondri biyogenezi ve fonksiyonuyla ilgili proteinlerin büyük bir bölümü çekirdek DNA'sı tarafından kodlanmaktadır. Çekirdek ve mitokondri arasında yer alan bu sıkı ilişki, merkezinde SIRT1/PGC1α /TFAM yolağının yer aldığı güçlü bir sinyalizasyon sistemi ile düzenlenmektedir. Bu nedenle çalışmamızda antidepresan ilaçların sitotoksik etkilerine ek olarak, bu ilaçların mitokondri biyogenezi ve biyoenerjetik aktivite üzerinde ortaya çıkardıkları etkiler de araştırılmıştır. Bu amaçla HMC3 hücrelerinin antidepresanlara maruziyeti sonrasında; hücre canlılığı düzeyleri, ATP düzeyleri, ROS düzeyleri, SIRT1/PGC1α /TFAM protein düzeyleri ve mitokondriyal kütle değişim düzeyleri araştırılmıştır. Hücre canlılık testi sonuçlarına göre; trazodone (72 saat) 200 μM ve 100 μM konsantrasyonlarında, hücre canlılığında anlamlı (p<0,0001) bir azalmaya (tüm antidepresanlar içinde en düşük azalma), sertraline (72 saat) 5μM (p<0,05), 10 μM (p<0,0001), 25μM (p<0,0001) konsantrasyonlarında, hücre canlılığında anlamlı azalmalara (tüm antidepresanlar içinde en yüksek azalma), paroxetine (72 saat) 10 μM ve 25μM konsantrasyonlarında, hücre canlılığında anlamlı (p<0,0001) bir azalmaya, amitriptyline (72 saat) 1μM, 5μM, 10μM 25μM, 50μM, 75μM ve 100μM dozlarında hücre canlılığında doza bağımlı anlamlı azalmalara neden olmuştur. HMC3 hücrelerinin trazodone, sertraline ve amitriptyline antidepresanlarıyla 72 saat maruziyeti sonrasında ATP düzeylerinde anlamlı (p<0,0001) düşüşler ortaya çıkmasına karşın paroxetine maruziyeti ATP düzeylerinde anlamlı bir değişiklik oluşturmamıştır. HMC3 hücrelerinin trazodone için 200µM konsantrasyonunda; sertraline, paroxetine ve amitriptyline antidepresanları için ise belirlenen IC50 konsantrasyonlarında 72 saat maruziyeti sonrasında gerçekleştirilen western blot çalışmalarında; paroxetine dışında tüm antidepresan ilaçların PGC1α protein düzeylerinde anlamlı azalmalara neden olduğu, ancak antidepresan  ilaçların hiçbirinin SIRT1 ve TFAM ekspresyonunda anlamlı bir değişikliğe neden olmadığı görülmüştür. Trazodone, sertraline, paroxetine ve amitriptyline antidepresanlarının hiçbiri mitokondriyal kütle (72 saat maruziyet sonrasında) ve ROS (24 saat maruziyet sonrasında) düzeylerinde kontrol grubuna kıyasla anlamlı bir değişiklik ortaya çıkarmamıştır.

Literatürde trazodone, sertraline, paroxetine ve amitriptyline antidepresanlarının insan mikroglia hücrelerinde mitokondriyal biyonerjetik fonksiyonlar ve GRIK2, PLSCR4 intihar aday genlerinin ifade düzeylerine etkilerinin araştırıldığı bir çalışma yer almamaktadır. Çalışmamızdan elde ettiğimiz veriler bu konularda literatüre önemli katkılar sunacak ve bu konularla ilgili daha ileri çalışmalar için temel teşkil edecektir.

Abstract:
More than 300 million people around the globe suffer from depression, which constitutes the single largest factor contributing to global disability. The prevalence of depressive disorders and the resulting economic burden they brought about are also increasing in Türkiye with each passing year. Adolescents with severe depression have a 30-fold higher probability of committing suicide compared to the general population, indicating the importance of depression and suicide in terms of public health and the economy. Due to the coronavirus pandemic that emerged towards the end of 2019, both quality and quantity of depression and suicide cases have evolved to a completely different dimension globally. Although antidepressants are widely used in the treatment of depressive disorders, all aspects of mechanism of action of these drugs is not fully understood yet. Therefore, studies on the unknown effects of antidepressants are needed in order to improve clinical practice. Besides, the knowledge regarding the toxicity of these drugs is of great importance since self-poisoning in depressed individuals often occur with the use of prescribed antidepressants. Trazodone, sertraline, paroxetine, and amitriptyline have been reported to be the antidepressants with the highest incidence of suicide attempts.

Various suicide candidate genes, including GRIK2 have been related to treatment emergent suicidal ideation and lower PLSCR4 gene expression levels have been shown in suicide deaths.  Therefore, we investigated the effects of antidepressant drugs on gene expression levels of PLSCR4 and GRIK2 suicide candidate genes in HMC3 cells via RT-PCR method. According to RT-PCR results; 200 µM trazodone (highest increase) and IC50 concentrations of sertraline and amitriptyline exposure (72 hours) resulted in significant increases (p<0,01; p<0,05 and p<0,05 respectively) in GRIK2 expression levels of HMC3 cells, while paroxetine exposure caused no significant change. As for the PLSCR4 expression levels under the same exposure conditions; trazodone (highest increase), amitriptyline and paroxetine significantly increased (p<0,01; p<0,05 and p<0,05 respectively) PLSCR4 gene expression levels of HMC3 cells, however sertraline exposure caused no significant change.

The complex pathogenesis of depression remains poorly understood. However, previous studies have shown that mitochondrial dysfunction has an important role in regulating brain function through oxidative stress and apoptosis. The majority of the proteins related to mitochondrial biogenesis and function are encoded by nuclear DNA. This close relationship between nucleus and mitochondria is regulated by a robust signalization system in which SIRT1/PGC1α /TFAM pathway has a central role. Therefore, beyond the cytotoxic effect of antidepressant drugs, we also investigated the effects which these drugs exert on mitochondrial biogenesis and bioenergetic activity. In order to do these investigations; cell viability levels, ATP levels, ROS levels, SIRT1/PGC1α /TFAM protein levels and mitochondrial mass levels were measured. According to cell viability tests carried out after HMC3 cells' exposure to antidepressant drugs; 200 μM and 100 μM trazodone (72 hours) exposure caused a significant (p<0,0001) decrease in cell viability (lowest decrease among all 4 antidepressants); 5μM, 10 μM, 25μM sertraline (72 hours) exposure caused significant decreases (p<0,05, p<0,0001 and p<0.0001, respectively) in cell viability (highest decrease among all 4 antidepressants); 10 μM and 25μM paroxetine (72 hours) exposure caused a significant (p<0,0001) decrease in cell viability; 1μM, 5μM, 10μM 25μM, 50μM, 75μM and 100μM amitriptyline (72 hours) exposure caused dose-dependent significant decreases in cell viability.

Trazodone, sertraline and amitriptyline exposure (72 hours) caused significant (p<0,0001) decreases in ATP levels, while paroxetine exposure (72 hours) caused no significant change in ATP levels of HMC3 cells. After 72 hours of exposure, all antidepressants, except for paroxetine, caused significant decreases in PGC1α protein levels in HMC3 cells. However, none caused significant changes in SIRT1 and TFAM expression levels. Similarly, none of the four antidepressant drugs caused significant changes in mitochondrial mass (after treatment for 72 hours) and ROS (after treatment for 24 hours) levels relative to control group.
 
There is no data in the literature regarding the effects of trazodone, sertraline, paroxetine and amitriptyline antidepressants on mitochondrial bioenergetics and expression levels of GRIK2, PLSCR4 suicide candidate genes in human microglia cells. The results of this study will supply literature with important data on these subjects and lend support for further studies.