Termofilik Geobacilyus caldoxylolyticus TK4 suşundan glukoz izomeras geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Clonning, expression and characterization of glucose isomerase gene from thermophilic Geobacillus caldoxylolyticus TK4 strain
Yazar: ÖZLEM FAİZ
Danışman: DOÇ. DR. AHMET ÇOLAK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
TUBİTAK 106T696 nolu proje tarafından desteklenen bu çalışmada, Geobacillus caldoxylolyticus TK4 (G. caldoxylolyticus TK4) suşundan D-glukoz/D-ksiloz izomeraz (GI) geni klonlandı, protein histidin kuyruğu (6xhis tag) ile Escherichia coli'de ekspres edildi ve enzimin bazı biyokimyasal özellikleri incelendi. Genomik DNA kütüphanesi oluşturularak ve invers polimeraz zincir reaksiyonu ile GI geninin 1326 bç'lik tam DNA sırası elde edildi. Bu sıra amino asit sırasına (441 amino asit) çevrildikten sonra BLAST programı kullanılarak diğer organizmalardaki GI'larla karşılaştırılması sonucu yapıldı. Bunun sonucunda, çalışılan enzimin Geobacillus stearothermophilus GI'sı amino asit sırasına % 97 oranında benzerlik gösterdiği belirlendi. Gen, pET28a(+) vektörüne klonlandı ve protein, E.coli BL21(DE3)pLysS suşunda N- ucunda bir histidin kuyruğu ile ekspres edildi. Ekspres edilen protein nikel kolonu ile tek basamakta saflaştırıldı. SDS-PAGE, enzimin ya tek bir alt birim ya da aynı molekül ağırlığına sahip birden fazla alt birim içerdiğini ortaya koydu. Histidin kuyruğu içeren proteinin alt birim ağırlığı 52,64 kDa, histidin kuyruğu içermeyen proteinin alt birim ağırlığı 50,18 kDa olarak hesaplandı. Rekombinant proteinin bazı biyokimyasal özellikleri spektrofotometrik olarak belirlendi. Optimum GI aktivitesi, pH'ın ve sıcaklığın bir fonksiyonu olarak, glukoz substratı kullanılarak belirlendi. Enzimin optimum pH'sı 6,5 olarak bulundu ve enzimin optimum sıcaklığı, 80 ° C olarak belirlendi. pH 4,0-9,0 aralığında, 4 ° C'de 15 gün bekletildikten sonra, rekombinant GI'nın, oldukça kararlı olduğu gözlendi. Isıl kararlılık eğrisi incelendiğinde, enzim, aynı süre 60 °C ve 70 °C'de bekletildiğinde, aktivitesini % 80'nin üzerinde korudu. Glukoz varlığında, rekombinant GI'nın Km ve Vmaks değerleri, Lineweaver-Burk eğrisi yardımıyla, sırasıyla, 20,58 mM ve 0,67 U/mg protein olarak belirlendi. 5 mM'lık son konsatrasyonda, Co2+, Mg2+ ve Mn2+ varlığında enzim aktivitesi kayda değer ölçüde arttı.Bütün bu veriler, G. caldoxylolyticus TK4'ten klonlanan GI'nın diğer GI'lara benzer özelliklere sahip olduğunu desteklemektedir.Anahtar Kelimeler: Geobacillus caldoxylolyticus, Glukoz İzomeraz, Termofilik, His-Tag, Karakterizasyon

Abstract:
In this study, supported by TUBITAK (Project number is 106T696), D-glucose/D-xylose isomerase (GI) gene of Geobacillus caldoxylolyticus TK4 (G. caldoxylolyticus TK4) strain, was cloned, sequenced and expressed with 6x histidine Tag in Escherichia coli and some biochemical properties of the recombinant enzyme were investigated. The whole DNA sequence of GI gene consisting of 1326 bp was determined by constructing genomic DNA library and performing inverse PCR. Sequence aligments were done by using BLAST programme. The results indicated the amino acid sequence of GI gene was similar to Geobacillus stearothermophilus GI in the ratio of 97%. The gene was cloned into pET28a(+) vector and expressed with his-tag in E.coli BL21(DE3)pLysS strain. The enzyme was purified in one step with nickel coloumn. SDS-PAGE showed that the enzyme was composed of either one subunit or more than one subunit that have the same molecular weight. The calculated subunit molecular weight of the protein and his-tagged protein were 50.18 and 52.64 kDa, respectively. Some biochemical properties of the recombinant protein were determined spectrophotometrically. The GI activity as a function of pH and temperature was determined using glucose as substrate. The optimum pH and temperature of the enzyme were found to be 6.5 and 80 ° C, respectively. At the pH range of 4.0-9.0, after 15 days incubation, the enzyme activity was stimulated. When thermostability data were examined, it was seen that the enzyme nearly retained of its original activity after 3 hours incubation at 60 °C and 70 °C. In the presence of glucose as substrate the Km and Vmaks values of the recombinant enzyme were determined by Lineweaver-Burk curve as 20.58 mM and 0.67 U/mg protein, respectively. It was seen that the activity was highly stimulated in the presence of 5 mM Co2+, Mg2+ and Mn2+ .All these data support that GI cloned from Geobacillus caldoxylolyticus TK4 has similar properties to other GIs.Key Words: Geobacillus caldoxylolyticus, Glucose Isomerase, Thermophilic, His-Tag, Characterization