Börülce bitkisinden (Vigna unguiculata) afinite tekniği kullanılarak peroksidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification of peroxidase enzyme from cowpea (Vigna unguiculata) using affinity technique and, characterization study
Yazar: ŞEYMA TAŞBAŞI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AYKUT ÖZTEKİN
Ağrı İbrahim Çeçen Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tez kapsamında amino benzohidrazid türevi moleküller tabanlı afinite kromatografisi tekniği kullanılarak börülce (Vigna unguiculata) peroksidaz enziminin ilk defa tek kademede saflaştırılması gerçekleştirildi ve enzimin biyokimyasal karakterizasyonu yapıldı. Sefaroz 4B-L-tirozin-4-amino-3-bromo-2-metilbenzohidrazid afinite jelinin kullanıldığı tek kromatografik adımda, %53,6 verime ve 91,6 kat saflaştırma katsayısına ulaşıldı. Elde edilen enzimin saflığını ve molekül ağırlığını belirlemek için yapılan SDS-PAGE'de 39 kDa'da tek bant gözlendi. Saflaştırmada ligand olarak kullanılan 4-amino-3-bromo-2-metilbenzohidrazid, 4-amino-3-bromo-5-florobenzohidrazid, 4-amino-3-bromo-5-klorobenzohidrazid ve 5-aminoizoftalohidrazid'in enzim ile etkileşimlerini analiz etmek için, her bir molekülün börülce POD üzerine inhibisyon etkisi incelendi ve saflaştırmada en etkili ligand olan 4-amino-3-bromo-2-metilbenzohidrazid için Ki değeri 970±130 µM olarak hesaplandı. Enzimin karakterizasyon çalışmaları kapsamında, enzim için optimum şartların; pH 6,0, iyonik şiddet 0,3 M ve 40 ºC olduğu bulundu. Ayrıca börülce POD'nin guaiakol,  H2O2, 4-metilkatekol ve ABTS substratlarına olan ilgisini belirlemek amacıyla kinetik çalışmalar yapıldı ve bu substratlara ait KM değerleri sırasıyla 7,21 mM, 17,03 mM, 7,28 mM ve 49,21 mM olarak hesaplandı.

Abstract:
In this thesis, a single step purification of cowpea (Vigna unguiculata) peroxidase enzyme was carried out for the first time by using amino benzohydrazide derivative molecules-based affinity chromatography technique and biochemical characterization of the purified enzyme was performed. 53,6% yield and 91,6 purification fold were achieved in a single chromatographic step using Sefaroz 4B-L-tyrosine-4-amino-3-bromo-2-methylbenzohydrazide affinity gel. A single band at 39 kDa was observed in SDS-PAGE performed to determine the purity and molecular weight of the obtained enzyme. To analyze the interactions of 4-amino-3-bromo-2-methylbenzohydrazide, 4-amino-3-bromo-5-fluorobenzohydrazide, 4-amino-3-bromo-5-chlorobenzohydrazide and 5-aminoisophthalohydrazide used as ligands in purification with the enzyme, the inhibition effect of each molecule on cowpea POD was assayedand the Ki value for 4-amino-3-bromo-2-methylbenzohydrazide, the most effective ligand in purification, was calculated as 970±130 µM. Within the scope of enzyme characterization studies, optimum conditions for enzyme; It was found that the pH was 6,0, the ionic strength was 0,3 M and the temperature was 40 ºC. Additionally, kinetic studies were carried out to determine the affinity of cowpea POD with guaiacol, H2O2, 4-methylcatechol and ABTS substrates, and the KM values of these substrates were calculated as 7,21 mM, 17,03 mM, 7.28 mM and 49,21 mM, respectively.