Sıçan nöropatik ağrı modelinde siyanokobalamin ve siyanokobalamin+morfin etkilerinin trombospondin 4 doku düzeyi ile ilişkisi
The relationship of cyanocobalamin and cyanocobalamin+morphin effects with thrombospondin 4 tissue levels in rat neuropathic pain model
Yazar: NESLİHAN DÜZENLİ
Danışman: PROF. DR. AYTÜL ÖNAL
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Ağrı = Ağrı ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Morfin = Morphine ; Nöropatiler = Neuropathies ; Siyanokobalamin = Cyanocobalamin ; Sıçanlar = Rats ; Trombospondin-1 = Thrombospondin-1 ; Trombospondin-4 = Thrombospondin-4

Özet:
Nöropatik ağrı, sinir sistemi hasarı ile oluşan kronik bir ağrı şeklidir. Tedavide kullanılan ilaçların yan etkilerinin fazla olması ve yeterli etkinliğin sağlanamaması, tedaviyi zorlaştırmaktadır. Nöropatik ağrı mekanizmalarının daha iyi anlaşılması, hem hedefe spesifik tedavi yaklaşımlarının hem de kullanılan ilaçların yan etkilerini azaltmak adına yapılacak kombinasyon şekillerinin geliştirilmesine olanak sağlayabilir. 
Periferik sinir hasarını takiben spinal astrositlerde upregüle olan TSP4, omurilik arka boynuzunda eksitatör sinaptik iletim artışına neden olarak nöropatik ağrı gelişimine katkıda bulunan bir ekstrasellüler matriks proteinidir. TSP4 sinyal ağının kontrolü ile daha etkili ve hedefe yönelik tedavi stratejilerinin geliştirilebileceği düşünülmektedir. Yeni bir çalışma alanı olan TSP4'ün, nöropatik ağrı tedavisinde kullanılan ilaçlarla ilişkisi konusunda bilgiler çok azdır. Biz bu çalışmada, nöropatik ağrılı sıçanlarda siyanokobalamin ve morfinin, hem tek başlarına hem de birlikte kullanımlarının ağrı eşik değerleri ve spinal TSP4 ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırdık. 
Nöropatik ağrı modeli, Wistar sıçanlarında ketamin-ksilazin anestezisi altında, sağ siyatik sinirin ligasyonu (4.0 ipek ile 3 adet) ile oluşturuldu. Preoperatif 15 gün boyunca siyanokobalamin (5 ve 10 mg/kg/gün) veya 5 ml/kg/gün serum fizyolojik (SF) verilmesini takiben postoperatif 4 ve 14 gün süresince kontrol, sham, nöropatik ağrı gruplarına SF, morfin gruplarına 2.5 ve 5 mg/kg/gün morfin, siyanokobalamin gruplarına 5 ve 10 mg/kg/gün siyanokobalamin, kombinasyon grubuna 5 mg/kg/gün morfin+10 mg/kg/gün siyanokobalamin intraperitoneal (ip) uygulandı. Fonksiyonel ağrı testleri (dinamik plantar esteziometre, plantar test ve analjezimetre) enjeksiyonlara başlanmadan önce, cerrahi öncesi ve postoperatif 4. ve 14. günlerde uygulandı. Postoperatif 4. ve 14. günlerde çıkarılan lumbar omurilik dokusunda TSP4 protein ekspresyonları Western blotting yöntemiyle değerlendirildi. GFAP ve TSP4 immunreaktiviteleri, sadece postoperatif 14. günde ve ilaçların yüksek dozları ile oluşturulan grupların lumbar omurilik dokularında immunboyama yapılarak değerlendirildi. 
Postoperatif 4. günde ilaç verilmeyen nöropatik ağrılı grupta her üç testte de ağrı eşikleri düşerken, spinal TSP4 ekspresyonu arttı. Postoperatif 14. günde, dinamik plantar esteziometre ve analjezimetrede düşüş devam ederken spinal TSP4 ekspresyonu ise sham grubu değerlerine geri döndü. Hem 4. hem de 14. günde nöropatik hayvanların ağrı eşiklerinde siyanokobalamin ve düşük doz morfin iyileştirici etki yapmazken, yüksek doz morfin sadece esteziometre ile ölçülen ve kombinasyon tedavisi ise tüm testlerde ağrı eşiklerini iyileştirdi. Postoperatif hem 4. hem de 14. günde bakılan TSP4 protein ekspresyonu ile sadece postoperatif 14. günde saptanan TSP4 ve GFAP immunreaktivitesi, siyanokobalamin ve morfinin ayrı ayrı uygulandığı gruplarda önemli derecede artarken, bu artış kombinasyonda daha az idi. 
Bulgularımız, nöropatik ağrı modelinde ağrı eşiklerindeki azalmaya eş zamanlı spinal TSP4 ekspresyon artışının postoperatif erken dönemde olduğunu göstermektedir. Siyanokobalamin ile görülen spinal TSP4 artışı, TSP4 proteininin B12 vitaminlerinin rejeneratif potansiyellerine aracılık edebileceğini düşündürmektedir. Morfin ile etkin bir antinosiseptif etki edilememesi, tolerans gelişimine bağlanabilir. Siyanokobalamin ve morfin gruplarıyla karşılaştırıldığında, kombinasyon grubunda düşen ağrı eşiklerinin artması ve TSP4 ekspresyon ve reaktivite artışının daha az olması, siyanokobalaminin morfine tolerans gelişimini engellemesi nedeniyle olabilir. 
Sonuç olarak, siyanokobalamin ve morfin kombinasyonu ile tedavide, uzun vadede rejenerasyon dengesinin kurulması ve tolerans gelişiminin azalması ile daha etkin bir analjezi elde edilebilir.

Abstract:
Neuropathic pain is a chronic form of pain caused by nervous system damage. The medications used in neuropathic pain management do not provide the desired effect and excessive adverse effects challenge the treatment. A better understanding of neuropathic pain mechanisms can allow target-specific treatments, as well as the development of combination forms to reduce the adverse effects of the drugs used. 
TSP4, which is upregulated in spinal astrocytes following peripheral nerve injury, is an extracellular matrix glycoprotein that contributes to the development of neuropathic pain by triggering an increase in excitatory synaptic currents in the dorsal horn of the spinal cord. It is thought that more effective and target spesific treatment strategies can be developed with the control of the TSP4 signal network. There is very little information about the relationship of TSP4, a new study area, with the drugs used in neuropathic pain treatment. In this study, we investigated the effects of cyanocobalamin and morphine both alone and in combination on pain threshold measures and spinal TSP4 expression in neuropathic rats. 
Neuropathic pain model was induced by ligation (4.0 silk, 3 ligatures) of right sciatic nerve of Wistar rats under the ketamine-xylazine anesthesia. After administration of cyanocobalamin (5 and 10 mg/kg/day) or 5 ml/kg/day saline (SF) for 15 days preoperatively, SF to control, sham and neuropathic pain groups, 2.5 and 5 mg/kg/day morphine to morphine groups, 5 and 10 mg/kg/day cyanocobalamine to cyanocobalamin groups, 5 mg/kg/day morphine + 10 mg/kg/day cyanocobalamine to combination group intraperitoneally (ip) was injected for postoperative days 4 and 14. Pain threshold measures were recorded by using functional pain tests (dynamic plantar aesthesiometer, plantar test and analgesimeter) before the injections, before surgery and on the 4th and 14th postoperative days. TSP4 protein expressions in lumbar spinal cord tissue removed on postoperative days 4 and 14 were assessed by Western blotting method. GFAP and TSP4 immunoreactivities were evaluated by performing immunostaining on the lumbar spinal cord tissues of experimental groups produced with high doses of drugs and only on the 14th postoperative day. 
In the neuropathic pain group that did not receive any medication on the postoperative 4th day, spinal TSP4 expression increased while pain thresholds decreased in all three tests. On the 14th postoperative day, the decrease in dynamic plantar aesthesiometer and analgesimeter persisted, while spinal TSP4 expression returned to the sham group measures. Cyanocobalamin and low dose morphine did not improve the pain thresholds of neuropathic animals in both the 4th and 14th postoperative days, however high dose morphine improved pain thresholds only at esthesiometer test while the combination group ameliorated pain thresholds at all tests. In groups where cyanocobalamin and morphine were administered separately, TSP4 protein expression in spinal cord increased on the 4th and 14th postoperative days and the TSP4 and GFAP immunoreactivity increased only on the 14th postoperative day significantly. The amount of increase was less in the combination group. 
Our findings show that the decrease in pain thresholds is accompanied by an increase in spinal TSP4 expression simultaneously at the early postoperative period of neuropathic pain model in rats. The increase of spinal TSP4 by cyanocobalamin administration suggests that TSP4 protein may mediate the regenerative potentials of B12 vitamins. The absence of a prominent antinociceptive effect with morphine therapy can be attributed to the development of tolerance. Compared to the cyanocobalamin and morphine groups, the increase in spinal TSP4 expression and reactivity and the improvement in the decreased pain thresholds detected in the combination group reminds that cyanocobalamin treatment is likely to prevent the development of morphine tolerance. 
In conclusion, a more effective analgesia can be achieved by combining cyanocobalamin to the morphine treatment through setting up a regeneration balance and preventing the development of tolerance in long term.