Kronik myeloid lösemi kök hücre hattı üretimi
Chronic myeloid leukemia stem cell line production
Yazar: SİBEL AZİZENUR ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ ÖZCAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Hücre dizisi = Cell line ; Kök hücreler = Stem cells ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
BCR/ABL füzyon proteiniyle karakterize Kronik myeloid lösemi (KML), pluripotent hematopoetik kök hücrelerin malign transformasyonu sonucu gelişen klonal bir lösemi kök hücre (LKH) hastalığıdır. Bu projenin amacı, KML LKH'lerinin kültür ortamında birçok tümör serilerine farklılaşma mekanizmalarına karşı kuvvetli  bir protokol geliştirerek gelecekteki çalışmalar için uygun kalite ve standartlarda in-vitro KML LKH hattı üretimidir.Bu çalışmada, K562 ve K562/IMA-3 (imatinibe dirençli) insan KML hücrelerinde, FACS ve MACS yöntemleriyle CD34+/CD38-/CD123+ and CD34+/CD38- LKH altpopülasyonlarının izolasyonu sonrasında LKH'lerin davranışları, farklı kültür şartlarına maruz bırakılarak gözlemlendi. LKH'leri, akış sitometriyle hücre siklusu; tümörojeniteyle tümör oluşturma potansiyeli; kantitatif gerçek-zamanlı PCR'la telomeraz aktivitesinin ve BCR/ABL'ın ekspresyon düzeyleri; alkalen fosfataz (AF) boyamayla farklılaşma; ve mikoplazma testiyle kontaminasyon varlığı incelenmiştir. Ayrıca, CD paneli (CD34+, CD38+, CD34+/CD38-, CD34+/CD38/CD123+ altpopülasyonları), KML hücrelerinde, LKH'lerinde ve farklılaşmış LKH'lerinde akış sitometriyle incelenmiştir.K562 ve K562/IMA-3 lösemi hücrelerinin, sırasıyla % 0,4 ve % 5,3 oranlarında LKH'leri içerdiklerini bulduk. Diferansiye etmeyen ortamda LKH'lerin çoğalmaksızın fenotipini koruduğu ve LKH ekspanse edici ortamda LKH'lerin çoğunluğunun LKH olarak çoğaldığı gözlemlendi. Bununla beraber, diferansiye edici ve RPMI-1640 ortamlarında LKH'lerinin, lösemi hücrelerine dönüşerek çoğaldığı gözlemlendi. K562/IMA-3 LKH'lerinin daha hızlı tümör oluşumuna neden olmasının yanı sıra, her iki hücre hattının LKH'leri, atimik nude farelerde tümör oluşturdu. Her iki hücre hattının LKH'lerinde AF pozitif bulundu. Telomeraz aktivitesi ekspresyon düzeyi, K562/IMA-3 LKH'lerinde artmış bulunurken, K562 LKH'lerinde azalmış bulundu. BCR-ABL ekspresyon düzeyi her iki hücre hattının LKH'lerinde azalmış olmakla birlikte korunmuştur. LKH'lerde mikoplazma kontaminasyonu görülmedi. CD panelinde tüm popülasyonların en yüksek seviyeleri, LKH'lerinde görüldü.Bu çalışma sonucunda KML LKH hattı üretiminin zor, ama olası olduğu saptandı.

Abstract:
Chronic myeloid leukemia (CML), characterized with BCR/ABL fusion protein is a clonal leukemia stem cell (LSC) disorder developing as a result of malignant transformation of pluripotent hematopoietic stem cells. The aim of this project is to produce in vitro CML LSC line in appropriate quality and standards for  future work by developing a strong protocol against the differentiation mechanism to many tumors series of its in culture medium of CML LSC.In this study, behaviors of LSCs were  observed by exposure to different culture conditions after isolation of LSC subpopulations of CD34+/CD38-/CD123+ and CD34+/CD38- by FACS and MACS methods in K562  and K562/IMA-3 (imatinib-resistant) human CML cells. LSCs were analyzed cell cycle by flow cytometry; potential of formating tumor by tumorigenicity; expression levels of telomerase activity and BCR/ABL by quantitative real-time PCR; differentiation by alkaline phosphatase (AF) staining; and presence of contamination by mycoplasma test. Also, CD panel (subpopulations of CD34+, CD38+, CD34+/CD38- and CD34+/CD38-/CD123+) were analyzed by flow cytometry in CML cells, LSCs and differentiated LSCs.We found that K562 and K562/IMA-3 cells contained LSCs in 0,4% and 5,3% ratios, respectively. It was observed that LSCs maintained the phenotype without proliferation in dedifferentiated medium, and that the majority of LSCs proliferated as LSCs in LSC expanded medium. However, it was observed that LSCs proliferated by transforming into leukemia cells in mediums of differentiated and RPMI-1640. In athymic nude mice, LSCs of both cell lines generated tumor as well as causing to faster tumorigenicity of K562/IMA-3 LSCs. It  was found AP positive in LSCs of both cell lines. Expression level of telomerase activity was found to increased in K562/IMA-3 LSCs, while to decreased in K562 LSCs. BCR/ABL expression level was maintained although decreased in LSCs of both cell lines. Mycoplasma contamination was not seen in LSCs.  The highest levels of all populations in CD panel were seen in LSCs. In result of this study, the production of CML LSC line was found to be possible, but to be difficult.