Deneysel olarak oluşturulan beyin iskemi/ reperfüzyon hasarında panneksin-1 proteininin apoptoz ve nekroptoz ile ilişkisi
The relationship of pannexin-1 protein with apoptosis and necroptosis in experimentally induced brain ischemia / reperfusion injury
Yazar: EMİNE ÇOLAK
Danışman: PROF. DR. HASAN VEYSİ GÜNEŞ
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Beyin = Brain ; Beyin hastalıkları = Brain diseases ; Nekroz = Necrosis ; Pannexin = Pannexin ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; İskemi = Ischemia

Özet:
Bireylerde ölüme ya da kalıcı hasara sebep olabilen inme olgularının %85'i arteriyel tıkanma ya da yetersiz perfüzyon sonucunda oluşan iskemi kaynaklıdır.  Beyinde iskemi ve bunu takip eden reperfüzyon süreçleri eksitoksisite, periinfarkt depolarizasyon, inflamasyon, nitrik oksit üretimi, serbest radikal hasarı ve hücre ölümü olmak üzere çeşitli patofizyolojik süreçlerin tetiklenmesine sebep olur. Beyinde iskemi reperfüzyon (İ/R) süreçleri ekstrinsik yolak ve intrinsik olmak üzere iki apoptoz yolağını tetikler. Son yıllarda yapılan çalışmalarda iskemi reperfüzyon hasarında nekroptozun da bu süreçte işlevsel olduğu ortaya konulmuştur. 
Panneksin 1 (Pan1) proteinleri tarafından oluşturulan Pan1 kanalları katyonlar, anyonlar ikincil mesajcılar ve metabolitler de dahil olmak üzere geniş bir geçirgenlik özgüllüğüne sahiptir. Hücre farklılaşması, doku gelişimi ve rejenerasyonu, inflamasyon ve hücre ölümü gibi çeşitli patolojik süreçlerde görev alır. Beyin iskemi ve reperfüzyon sürecinde Pan1 kanallarının açılması oksijen- glikoz yoksunluğu, hücreler arası alanda yüksek K+ konsantrasyonu gibi çeşitli faktörler tarafından düzenlenir. Pan1 kanallarının açılması hücrelerin ölümü ile sonuçlanabilecek hipoksik depolarizasyona neden olur.
Çalışmamızda, sıçanlarda sağ arteria carotis communis'e klemp takılarak oluşturulan iki saat iskemi ve sonrasında kan akımının sağlandığı 24 saatlik reperfüzyon süreçlerinde pan kaspaz inhibitörü Z-VAD-fmk ve Pan1 protein/kanal inhibitörü probenecid kullanarak, oluşan beyin İ/R hasarında Pan1 proteinin apoptoz ve nekroptoz süreçlerindeki rolü araştırıldı. Yapılan uygulamalar sonucunda elde edilen beyin dokusu örnekleri kullanılarak Paneksin1 kanallarının apoptoz ile ilişkisinin belirlenmesi için kaspaz 3, kaspaz 8, nekroptoz ile ilişkisinin belirlenmesi için RIP1, RIP3, MLKL gen ifadeleri ve protein düzeyleri belirlendi.  Ayrıca bu yolaklarla ilişkili olan inflamasyon belirteci olan TNF-α ve DNA hasarı ve apoptoz belirleyicisi olan PARP protein düzeyleri belirlendi. Kaspaz 3, kaspaz 8, RIPK3 ve MLKL antikorları kullanılarak immünohistokimyasal çalışmalar yapılarak protein düzeylerinin dokularda birikimi belirlendi. TTC boyama yapılarak İ/R hasarı makroskobik olarak değerlendirilirken, TUNEL yöntemi ile dokularda apoptoz oranları belirlendi.
Yapılan çalışmalar sonucunda, Pan1 kanal/protein inhibitörü olan probenecidin iskemi reperfüzyon sürecinde apoptoz ile ilişkili olarak kaspaz 3 ve kaspaz 8 nekroptozla ilişkili olan RIP1, RIP3 ve MLKL gen ifadelerini ve protein düzeylerinin düşürdüğü belirlendi. Beyin İ/R hasarında Z-VAD-fmk, TNF-α düzeyinde önemli bir etki oluşturmadığı fakat probenecidin intraperitoneal uygulaması İ/R sürecinde artan TNF-α protein düzeyini azalttığı belirlendi. Ayrıca çalışmamızda beyin dokularında TNF-α protein düzeyini en etkili şekilde azaltarak İ/R hasarında oluşan inflamasyonu inhibe eden uygulamanın hem apoptoz inhibitörü hem de Pan1 inhibitörünün birlikte uygulanması olduğu belirlendi. Yaptığımız çalışmada beyinde oluşturulan İ/R hasarında PARP protein düzeyini en etkili şekilde azaltan uygulamanın pan kaspaz inhibitörü Z-VAD-fmk ve Pan1 protein/ kanal inhibitörü olan probenecidin birlikte uygulaması olduğu belirlenmiştir. TUNEL çalışmaları sonucunda Pan1 kanalarını bloke eden probenecid uygulamasının beyin dokularında iskemi ve reperfüzyon sürecinde artan apoptoz yüzdesini azalttığı fakat bu azaltışın Z-VAD-fmk uygulaması kadar etkili olmadığı belirlendi.
	Sonuç olarak, gerçekleştirilen beyin iskemi ve reperfüzyon sürecinde hem apoptotik hem nekroptotik hücrelerin görüldüğü, İ/R sürecinde oluşan hücre hasarlarını uygulanan pan kaspaz inhibitörü Z-VAD-fmk'nın bir dereceye kadar azaltırken Pan1 protein/kanal inhibitörü olan probenecidin önemli düzeyde azaltarak reperfüzyon hasarında etkili bir terapötik ajan olduğu ve Pan1 proteinlerinin İ/R hasarında önemli rol aldığı belirlendi. 
Anahtar Kelimeler: Beyin iskemi reperfüzyon, apoptoz, nekroptoz, panneksin 1

Abstract:
85% of stroke cases that can cause death or permanent damage in individuals are caused by ischemia due to arterial occlusion or insufficient perfusion. In the brain, ischemia and subsequent reperfusion processes trigger various pathophysiological processes including excitotoxicity, periinfarct depolarization, inflammation, nitric oxide production, free radical damage and cell death. Ischemia reperfusion (I/R) processes in the brain trigger two apoptosis pathways, the extrinsic pathway and the intrinsic pathway. Recent studies have shown that necroptosis is also functional in ischemia reperfusion injury.
Pannexin 1 (Pan1) channels formed by Pan1 proteins have a wide permeability specificity including cations, anions, secondary messengers and metabolites. It is involved in various pathological processes such as cell differentiation, tissue development and regeneration, inflammation and cell death. Opening of Pan1  channels in brain ischemia and reperfusion process is regulated by various factors such as oxygen-glucose deprivation, high K + concentration in the intercellular space. Opening of the Pan1  channels leads to hypoxic depolarization, which can result in cell death.
In our study, two hours of ischemia with clamp insertion to the right arteria carotis communis and 24-hour reperfusion processes after blood flow were provided. Using pan caspase inhibitor Z-VAD-fmk and Pan1  protein/channel inhibitor probenecid, the role of Pan1  protein in brain I / R injury in apoptosis and necroptosis processes was investigated.  To investigate the relationship between Pan1  channels and apoptosis caspase 3, caspase 8  gene expressions and protein levels and  the relationship between Pan1  channels and necroptosis was evaluated by  RIP1, RIP3, MLKL gene expressions and protein levels. In addition, TNF-α, as an inflammation marker and PARP for predictors of DNA damage and apoptosis were determined. The accumulation of protein levels in tissues was determined by immunohistochemical studies using caspase 3, caspase 8, RIPK3 and MLKL antibodies. I/R damage was evaluated macroscopically by TTC staining and apoptosis rates were determined by TUNEL method.
As a result of the studies, it was determined that probenecid, which is a pan1 channel/protein inhibitor, decreases RIP1, RIP3, and MLKL gene expressions and protein levels associated with necroptosis and caspase 3 and caspase 8 gene expressions and protein levels associated with apoptosis in the ischemia-reperfusion process It was also determined that Z-VAD-fmk did not have a significant effect on TNF-α in brain I/R injury but intraperitoneal administration of probenecid decreased TNF-α during I/R process. In addition, in our study, it was determined that the most effectively application that inhibited inflammation in I/R damage by decreasing TNF-α in brain tissues was the co-administration of apoptosis inhibitor and Pan1 inhibitor. It was demonstrated that the application that most effective administration for reducing the level of PARP protein in the brain I/R damage is co-administration of pan-caspase inhibitor Z-VAD-fmk and Pan1 protein/channel inhibitor probenecid. As a result of TUNEL studies, it was determined that probenecid administration blocking Pan1  channels decreased the percentage of increased apoptosis in I/R process in brain tissues but this reduction was not as effective as Z-VAD-fmk administration.
In conclusion, we found that both apoptotic and necroptotic cells are seen in brain ischemia and reperfusion process, and while the pan caspase inhibitor Z-VAD-fmk was reduced to cell damage some degree; probenecid, a Pan1  protein/channel inhibitor, is an effective therapeutic agent in reperfusion injury by significantly reducing cell damage. Our results demonstrated that Pan1  proteins play an important role in I/R damage.
Keywords: Brain ischemia reperfusion, apoptosis, necroptosis, pannexin 1