Bazı yeni benzotiyofen türevlerinin anti-kolinesteraz aktivitelerinin belirlenmesi
Determination of anti-cholinesterase activities of some new benzothiophene derivatives
Yazar: ÖZNUR YALMAÇ
Danışman: DOÇ. DR. CAN YILMAZ
Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method ; Kolinesterazlar = Cholinesterases

Özet:
Heteroaromatik bileşikler biyolojik olarak önemli özelliklere sahiptir ve bu nedenle ilaç keşfi ve geliştirilmesi için birçok çalışmanın konusu olmaktadırlar. Klinik olarak anti-mikrobiyal, anti-kanser, anti-oksidan ve anti-kolinesteraz ajan olarak kullanım potansiyelleri ile dikkat çeken kükürt bazlı heteroaromatik yapılar içerisinde özellikle tiyofen türevleri üzerinde durulmaktadır. Bu tez çalışmasında yedi farklı benzotiyofen türevinin, Alzheimer Hastalığı'nın semptomatik tedavisinde kullanılabilecek yeni ilaç etken maddeleri olabilme kapasiteleri araştırılmıştır. Alzheimer Hastalığı'nın tedavi stratejilerinden biri asetilkolinesteraz (AChE) ve bütirilkolinesteraz (BChE) enzimlerinin aktivitelerinin geri dönüşümlü olarak inhibisyonunu içermektedir. Bu noktadan hareketle, bu yeni yedi benzotiyofen türevlerinin AChE ve BChE enzimleri üzerindeki inhibisyon etkileri hem in vitro hem de hesaplamalı olarak araştırılmıştır. İlk olarak SwissADME ve OSIRIS Property Explorer yazılımları ile ilaç olma potansiyelleri tespit edilmiş, sonrasında aktivite testlerine geçilmiştir. Bu amaçla farklı konsantrasyonlardaki maddelerin eklendiği reaksiyon ortamlarında Ellman ve arkadaşlarının metodu ile enzim aktivitelerindeki değişimler üç ayrı substrat konsantrasyonu için ölçülmüştür. SigmaPlot 13.0 Enzyme Kinetics modülü ile inhibisyon modelleri bulunmuştur. AutoDockTools-1.5.6 ve CB-Dock2 yazılımları ile moleküler kenetlenme analizleri yapılarak maddelerin enzimler üzerinde yerleştiği bölgeler belirlenmiştir. Tüm ölçümler standart olarak kullanılan inhibitörler rivastigmin ve galantamin için de gerçekleştirilmiştir. ADME/T analizleri tüm türevlerin ilaç etken maddesi olma potansiyeli taşıdığını göstermekle birlikte Q35 ve Q37 diğerlerine oranla daha yüksek ve önemli ilaç skorlarına sahiptir; sırasıyla 0.37 ve 0.41. Yalnızca Q45 (Ki: 630.63 µM) ve Q48 (Ki: 344.50 µM) kodlu türevler elektrikli yılanbalığı saf AChE enzimi üzerinde zayıf derecede, sırasıyla tam yarışmalı ve tam yarışmasız, inhibisyon gerçekleştirmişlerdir. Buna karşılık türevlerin tümü at serumu saf BChE enzimini inhibe etmişlerdir. Özellikle Q37 (kısmi yarışmasız, Ki: 2.171e-7 µM), Q44 (kısmi karışık, Ki: 1.063e-6 µM), Q45 (kısmi karışık, Ki: 0.19 µM), Q48 (kısmi karışık, Ki: 8.15 µM) ve Q40 (kısmi yarışmasız, Ki: 9.17µM) türevleri rivastigmin (tam yarışmasız, Ki: 21.32 µM) ve galantamin (tam yarışmalı, Ki: 0.41 µM) ile kıyaslanabilecek derecede etkili inhibisyon gerçekleştirmişlerdir. İnhibisyon etkisine sahip tüm türevler, her iki enzimde de mevcut olan ve yüksek homoloji paylaşan dar kanalı oluşturan veya etrafında lokalize durumdaki amino asitlerle çoğunlukla hidrofobik etkileşimler içerisindedirler. Her iki enzime de inhibisyon uygulayan türevlerden Q45 hidrofobik etkileşim kurduğu TRP286 ile PAS, PHE338 ve PHE297 ile de ABS bölgesine yerleşerek AChE'yi inhibe ederken, TRP82 ve ASP70 ile PAS bölgesine yerleşerek BChE'ı inhibe etmiştir. Q48 ise, hidrofobik etkileşimler kurarak Q45 gibi, TRP286 ile PAS, PHE338 ve PHE297 ile de ABS bölgesine yerleşerek AChE'yi inhibe ederken, TYR128 ve PHE329 ile PAS, ve LEU286 üzerinden ABS bölgelerine bağlanarak BChE enzimini inhibe etmiştir. Sonuç olarak her iki enzim üzerinde de etkili olan Q45 ve Q48 ve ayrıca son derece düşük Ki değeriyle BChE inhibisyonu gerçekleştiren Q37 Alzheimer Hastalığı'na karşı kullanılabilecek etken maddeler olarak tespit edilmiş, ancak daha ileri çalışmalar ile testlerin ve türevlendirmelerin devam etmesi gerektiğinin önemi belirtilmiştir.

Abstract:
Heteroaromatic compounds have biologically important properties and therefore they are the subject of many studies for drug discovery and development. Among the sulfur-based heteroaromatic structures, which attract attention with their potential to be used clinically as anti-microbial, anti-cancer, anti-oxidant and anti-cholinesterase agents, especially thiophene derivatives are emphasized. In this thesis study, the capacity of seven different benzothiophene derivatives to be new drug active ingredients that can be used in the symptomatic treatment of Alzheimer's Disease was investigated. One of the treatment strategies of Alzheimer's Disease includes reversible inhibition of the activities of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) enzymes. From this point of view, the inhibitory effects of these seven new benzothiophene derivatives on AChE and BChE enzymes were investigated both in vitro and computationally. First, their potential to be a drug was determined with SwissADME and OSIRIS Property Explorer software, and then activity tests were started. For this purpose, the changes in enzyme activities were measured for three different substrate concentrations with the method of Ellman et al. Inhibition patterns were found with the SigmaPlot 13.0 Enzyme Kinetics module. Molecular docking analyzes were performed with AutoDockTools-1.5.6 and CB-Dock2 software to determine the regions where the substances interacted on the enzymes. All measurements were also performed for the standard inhibitors rivastigmine and galantamine. Although ADME/T analyzes show that all derivatives have the potential to be drug active components, Q35 and Q37 have higher and significant drug scores compared to others; 0.37 and 0.41 respectively. Only derivatives coded Q45 (Ki: 630.63 µM) and Q48 (Ki: 344.50 µM) performed weak inhibition of pure AChE enzyme from electric eel, with full competitive and full noncompetitive modes, respectively. In contrast, all derivatives inhibited equine serum pure BChE enzyme. Specifically, Q37 (partial noncompetitive, Ki: 2.171e-7 µM), Q44 (partial mixed, Ki: 1.063e-6 µM), Q45 (partial mixed, Ki: 0.19 µM), Q48 (partial mixed, Ki: 8.15 µM) and Q40 (partial noncompetitive, Ki: 9.17µM) derivatives exerted comparable potent inhibition with rivastigmine (full noncompetitive, Ki: 21.32 µM) and galantamine (full competitive, Ki: 0.41 µM). All derivatives with inhibitory effect are in mostly hydrophobic interactions with amino acids present in the narrow channel, for which both enzyme share high homology, or localized around it. Q45, one of the derivatives that inhibits both enzymes, inhibited AChE by establishing hydrophobic interaction with TRP286 of PAS with PHE338 and PHE297 of ABS, and inhibited BChE by hydrophobic interaction with TRP82 and ASP70 localized in the PAS region. Q48, on the other hand, inhibited AChE by establishing hydrophobic interactions with TRP286 of PAS, and PHE338 and PHE297 of ABS, like Q45; and inhibiting the BChE enzyme by binding to the PAS region with hydrophobic interaction with TYR128 and PHE329, and ABS regions via LEU286. As a result, Q45 and Q48, which are effective on both enzymes, and Q37, which inhibits BChE with its extremely low Ki value, were determined as potential drug active components that can be used against Alzheimer's Disease, but it was emphasized that further studies and derivatization should continue.