Kontrollü aktif molekül salımı yapan pektin temelli hidrojellerin geliştirilmesi
Developing pektin-based hydrogels with controlled delivery of active molecules
Yazar: AYŞE BANU KOCAAĞA
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE ÖZGE KÜRKÇÜOĞLU LEVİTAS ; PROF. DR. FATMA SENİHA GÜNER
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kimya Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Kimya mühendisliği = Chemical engineering

Özet:
Yara tedavisi, bir dizi hücresel ve biyokimyasal olayların, dokuyu tamir etme ve yenileme amacıyla, iç içe geçmiş ve düzenli bir sırada gerçekleştiği bir prosestir. Günümüzde, diyabet hastalığı gibi çeşitli hastalıkların neden olduğu kronik yaralar, hızla yaşlanan nüfus, trafik kazaları ve cerrahi prosedürlerin artışı ile daha etkili yara örtülerine olan gereksinim artmaktadır. Gelişmiş bir yara örtüsü, mükemmel biyouyumluluk ile beraber bakterilere karşı bir koruma sağlamalı, fazla eksudayı absorbe edebilmeli, uygun su buharı ve oksijen geçirgenliği oranı ile de iyileşmeyi hızlandırmalıdır. Ayrıca, hasta ve hasta yakınları için konforlu bir kullanıma sahip olması, mekanik dayanıklılık, uzun raf ömrü, uygun maliyet ve biyobozunurluk da bir yara örtüsü malzemesinde aranan önemli özelliklerdendir. Ancak, çoğu mevcut yara örtüleri bu özelliklerden çok azını bir arada içermektedir. Bu nedenle, tüm aranan özellikleri bir arada barındıran, düşük maliyetli, gelişmiş yara örtülerine ihtiyaç bulunmaktadır. Bu motivasyonla, bu tez çalışmasında in silico ve in vitro yöntemlerin beraber kullanıldığı bir yaklaşımla, yara örtüsü olarak kullanılmak üzere antimikrobiyal, kontrollü ilaç/protein salım sistemleri geliştirilmiştir. Yara örtüsünün ana matrisi olarak pektin seçilmiştir. Hidrofilik pektin fazla yara sıvısını absorplayabilir. Gözenekli hidrojel yapısı ile pektin kontrollü ilaç salımı yapabilir. Pektin zincirlerinin üzerindeki fonksiyonel gruplar aracılığıyla oluşan asidik ortam ise bakterilere ve virüslere karşı bir bariyer görevi görebilir.
Tez kapsamında yapılan çalışmalar bölümler halinde sunulmuştur. Öncelikle yara örtüleri için literatürde rapor edilen çalışmalar ve pektinin yara örtüsü olarak kullanımı tartışılmıştır. Bunu, moleküler modelleme ve moleküler dinamik (MD) simülasyonları hakkında kapsamlı bir bölüm takip etmektedir. Tez kapsamında yapılan çalışmalar ise beş ayrı bölümde tartışılmıştır. İlk bölümde, tüm-atom MD simülasyonları kullanılmıştır. Temel olarak galakturonik asit monomerleri içeren pektin zincirleri kimyasal özellikleri farklı karboksil, ester ve amitli grupları barındırmaktadır. Çalışmada, yüksek metoksili ve düşük metoksili olarak 21 monomerli pektin oligomerleri modellenmiştir. Ca2+ iyonlarıyla çapraz bağlanmış zincirlerin düşük enerji seviyelerinde konfigürasyonları taranmış, düşük metoksili pektin zincirlerinin çapraz bağlı yapılarını daha fazla korudukları tespit edilmiştir. Tezin devamında kontrollü ilaç salım sistemlerinde düşük metoksili pektinin kullanılmasına karar verilmiştir. 
Çalışmaların ikinci bölümünde, düşük metoksili pektinden sentezlenen hidrojeller, farklı Ca2+ iyonu ve ilaç yükleme konsantrasyonlarında, ve farklı sayıda hidrojel katmanlarda çalışılmıştır. Sentezlenen hidrojeller karakterize edilmiş ve istenilen ilaç salım hızının katman sayısı ve film kalınlığı ile kontrol edilebileceği sonucuna ulaşılmıştır. Tezin simülasyon odaklı üçüncü çalışmasında ise, pektin hidrojellerinin yüklenen ilacı kontrollü salabileceği ilaç konsantrasyonu aralığının belirlenmesi için hesaplamalı çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, Ca2+ ile çapraz bağlı 21 monomer uzunluğundaki α-D-galakturonik asit oligomerleri, artan prokain konsantrasyonlarında (6, 30, 60, 90 180 mg ilaç.g-1 film), her sistem için üçer bağımsız 200 ns uzunluğunda tüm-atom MD simülasyonları ile incelenmiştir. Sonuçlara göre 30 mg.g-1 prokain yüklemenin çapraz bağlamayı bozmayacağı, bu konsantrasyonun hidrojeli düşük seviyede degredasyona uğratacağı ve kontrollü salım yapabileceği ön görülmüştür. MD çalışmalarında kullanılan konsantrasyonlarda prokain yüklü pektin hidrojeller sentezlenmiş, karakterize edilmiş, analizler ile prokain salımı ve hidrojel degradasyonunun simülasyonlarla tahmin edilebileceği ortaya konmuştur. Bu hesaplamalı yaklaşım kontrollü salım için kullanılacak benzer esnek sistemlerin tasarımında da kullanılabilir. 
Tezdeki diğer bir çalışmada, pektin hidrojelin mekanik özelliklerini arttırmak için kafes yapılı alimünasilikat zeolit-A kullanılmıştır. Bu katkı ile kontrollü ilaç salımı yapabilen, modern yara örtüsü için gerekli özelllikleri taşıyan, uygun maliyetli özgün bir yara örtüsü geliştirilmiştir. Membrana difüzyon ve matrise difüzyon olmak üzere iki farklı hidrojel hazırlama metodu ile hazırlanan hidrojellerde farklı çapraz bağlayıcı, zeolit ve teofilin ilacı konsantrasyonlarında çalışılmıştır. Pektin-zeolit etkileşimlerini kontrol etmek amacıyla iki farklı iyonik formatta (Na+ ve Zn2+) zeolit-A kullanılmıştır. Membrana difüzyon yöntemi ile hazırlanan hidrojellerin teofilini kontrollü bir şekilde salabildiği, zeolit-A partiküllerinin teofilin deposu olarak davranırken hidrojel stabilitesini ve oksijen geçirgenlik hızını arttırdığı tayin edilmiştir. Pektin-zeolit hidrojellerin ilaç salımına etki eden en önemli parametrelerin şişme oranı ve iyon konsantrasyonu olduğu belirlenmiştir. 
Tezin son bölümünde ise hem yüksek kanamalı ve yanık yaralarında önemli bir problem olan, hem de kalp krizi, kanser ve COVID-19 nedeniyle gelişebilen serum albümin eksikliği yaşayan hastaların cerrahi operasyonlarında kullanmak amacıyla serum albümin yüklü pektin-zeolit hidrojeller geliştirilmiştir. pH 6,4 ortamında hazırlanan 100 mg.g-1 film albümin yüklü hidrojelin, yapısında immobilize olmuş albümini kontrollü bir şekilde protein yapısını bozmadan dış ortama salabildiği belirlenmiştir. WST-1 yöntemi ile dermal fibroblast hücrelerine karşı gerçekleştirilen hücre canlılığı analizlerinde, kontrol grubu ile karşılaştırıldıklarında hazırlanan hidrojellerin hücre sayısını düşürmediğini, in vitro yara iyileşmesi analizlerinde ise hücrelerin göçüne etki etmediği, fibroblast hücreleri üzerinde toksik bir etki göstermediği belirlenmiştir. E.coli ve S.aureus'a karşı yapılan antibakteriyel analiz testlerinde ise hidrojellerin antibakteriyel özellikleri gösterilmiştir.
Bu tez kapsamında, atık ürün veya yan ürün olarak değerlendirilen pektini kullanarak geliştirilen antibakteriyel, aktif ajan yüklü yara örtüleri ile kişiye özel tasarım (istendiğinde kontrollü veya hızlı salım, ilaç/protein salımı, istenilen ebatta esnek yara örtüsü) yapılabileceği belirlenmiştir. Katma değeri yüksek olan bu ürünün ithal yara örtülerine olan bağımlılığı azaltacağı ve ülke ekonomisine katkıda bulunacak olması ise tezin bir diğer önemli çıktısıdır.

Abstract:
Wound healing is a dynamic, ordered sequential phenomena that requires numerous chemical, cellular and biochemical processes to perform tissue repair and regeneration. Today, increasing prevalence of chronic injuries such as pressure ulcers, diabetic ulcers, other slow-healing injuries, incidence of accidents such as road accidents, burns, and traumas across the globe, growth of the aged population, and increasing number of surgical procedures highly necessitate advanced wound care products. An ideal advanced wound dressing should exhibit numerous characteristics; these are excellent biocompatibility and non-toxicity, stopping bleeding, relieving local pain, keeping the wound moist enough while absorbing the excess exudate, having optimum water vapor and oxygen permeability, protecting the wound from microorganisms and infections. It should be also easily implemented to the wounded area, become less adhesive before peeling to maintain patient comfort and prevent a second injury. An ideal wound dressing should also have mechanical durability, long shelf life and be cost effective. However, most of the advanced wound dressings available in the market have few of these properties. For this reason, there is a high demand for low-cost, advanced dressings that assemble most of the desired features. The aim of this thesis is thus designing new antimicrobial drug/protein loaded wound dressing materials combining in silico and in vitro methods. 
The main polymeric matrix of the wound dressing is selected as pektin for numerous reasons. Pektin is a non-toxic, natural heterogeneous polysaccharide extracted mostly from citrus peels or apple pomaces. It is a by- or waste product of fruit juice industry, making pektin easily available and cheap. It is mainly composed of linear chains of galacturonic acid monomers accommodating –COOH groups, enabling a unique gel formation in the presence of divalent cations leading to the "egg-box model". This unique hydrogel structure makes pektin an ideal carrier for delivering bio/active agents. Pektin imparts many advantages for wound dressings such as binding bioactive molecules, retaining an acidic environment, which may act as barrier against bacteria, having anti-inflammatory and anti-microbial properties. It has dual-responsiveness to pH, which corresponds to wounded tissue pH. Highly hydrophilic pektin chains can also absorb the excess exudate, therefore controlling the moisture of the wound environment. 
Studies conducted within the scope of this thesis are discussed in five separate chapters. In the first chapter, conformational differences that can occur during the gelation of high-methoxyl (HM) and low-methoxyl (LM) pektin chains are investigated at molecular level using all-atom molecular dynamics (MD) simulations in explicit water. Pektin chains mainly contain galacturonic acid monomers accommodating carboxyl, ester and amide groups. Pektin oligomers of 21 monomers are modeled as HM and LM according to the natural ratios of these functional groups. The conformational rearrangements of the oligomers cross-linked with Ca2+ ions are revealed at low energy configurtaions. LM-pektin chains are noted to maintain their cross-linked structure more when compared to the HM chains, suggesting a more suitable hydrogel for controlled delivery. Consequently, in the remaining of the thesis, LM-pektin is used.
In the second chapter, hydrogels are synthesized from LM-pektin at different Ca2+ concentrations, with different numbers of hydrogel layers and with different drug (theophylline) loading methods. The synthesized hydrogels are characterized, and the most effective drug loading method for drug release is determined. The analyses show that the desired drug release rate can be controlled by the number of layers and film thickness. In the third chapter of the thesis, a total of 3.6 µs long MD simulations in explicit water are employed to predict the optimum drug concentration in pektin-based hydrogels that maintain controlled drug release and delayed hydrogel degradation. The dynamics of the 21 monomer long polygalacturonic acid chains cross-linked with Ca2+ ions is studied at different drug (procaine) concentrations (6, 30, 60, 90, 180 mg/g hydrogel) and compared with the dynamics of the chains without drug. Global motions and local motions of the chains are analyzed. Especially, the deviations of the cross-links from their initial contacts reveal the optimum procaine concentration as 30 mg/g hydrogel to maintain the hydrogel network intact. To assess computational results, LM pektin hydrogels are synthesized, characterized and procaine release experiments are performed. Results from MD simulations and drug release aggree that 30 mg/g procaine loading do not disturb the cross-links, therefore leads to low degradation and controlled release from the hydrogel. On the other hand, 90 mg/g-hydrogel loading leads to increased chain fluctuations causing burst procaine release. In addition, procaine molecules are determined to behave as plasticizer promoting polymer flexibility. 
Next, LM-pektin hydrogels are synthesized with the addition of alumina silicate zeolite-A particles to improve the mechanical properties of the hydrogel. Hydrogel films are prepared based on diffusion into membrane or diffusion into matrix preparation methods with different concentrations of cross-linker, zeolite and drug theophylline. To enlighten the pektin-zeolite interactions, zeolite particles are prepared in two different ionic forms, Na+ and Zn2+. Hydrogels prepared with diffusion into membrane system release theophylline in a controlled manner. In the system, zeolite-A particles also adsorb theophylline, which improves controlled release while enhancing the hydrogel stability and increasing the oxygen permeation rate. Analyses show that swelling of the hydrogel and ion dynamics in the medium dominate the drug release behaviors. As a result, a novel and cost effective wound dressing material is developed with critical features required in a modern wound dressing, 
In the last part of the thesis, bovine serum albumin-loaded LM-pektin – zeolite-A hydrogels are developed to be used in high-bleeding and burn wounds, as well as in surgical operations of patients with albumin deficiency due to heart attack, cancer or COVID-19. Hydrogel samples with 100 mg g-1 film albumin that are immobilized at pH 6.4, display controlled albumin release while preserving secondary and plausibly tertiary structure of albumin.
LM-pektin and LM-pektin – NaA-zeolite hydrogels outperform a similar advanced wound care product, with desirable oxygen permeability, water (moist) permeability, swelling, and absorbing excess exudate. Cell viability analysis performed by WST-1 method reveals that LM-pektin and LM-pektin – NaA-zeolite hydrogels have no cytotoxicity when compared to the control group. In vitro wound healing assays show that all hydrogels have no toxic effects on the fibroblast cells and promote migration of the cells. These hydrogels have antibacterial properties as demonstrated with antibacterial analysis tests against E.coli and S.aureus.
With the wound dressing including pektin and zeolite-A developed during this thesis, two important outcomes can be achieved. First, an effective wound treatment can be provided with tailor made (controlled or rapid release according to the treatment of the disease, drug / protein release, flexible wound dressing in desired size), antibacterial, active agent loaded pektin-based wound dressings. Second, a high added value product can be produced from pektin, which is evaluated as a waste by-product.