Doku kültüründe yetiştirilen Alyssum corsicum (Brassicaceae) bitkisinde nikel birikiminin belirlenmesi ve moleküler analizi
Determination and molecular analysis of nickel accumulation at Alyssum corsicum (Brassicaceae) grown in tissue culture conditions
Yazar: SENİHA SELCEN BABAOĞLU AYDAŞ
Danışman: PROF. DR. LEYLA AÇIK
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Alyssum = Alyssum ; Antioksidan enzimler = Antioxidant enzymes ; Nikel = Nickel ; RAPD-PCR = RAPD-PCR

Özet:
A. corsicum, yeni bir teknoloji olan bitkisel arıtım çalışmalarında ağır metallerden özellikle nikelin çevreden temizliği ve geri kazanılmasında kullanılmaya aday bir bitki olarak önem kazanmaktadır. Bu araştırmada A. corsicum bitkisi doku kültürü şartlarında 0.01 mM, 0.04 mM, 0.2 mM nikel derişimleri varlığında yetiştirilmiştir. Bitkinin nikel biriktirme potansiyeli ve metal içeriğindeki değişim X ışını floresans spektroskopisi (XRF) ile belirlenmiştir. Ayrıca bitkinin gövde alt ve üst yaprak yüzeylerinde Fe, Mg, Ca, Ni metallerinin oranları ve oluşan morfolojik değişimler taramalı elektron mikroskobu-enerji dağılımlı X ışını analizi (SEM-EDX) ile belirlenmiştir. Bitkinin nikel metalini köklerden (499.7 µg/g) çok gövdesinde (932,5 µg/g) biriktirdiği ve nikel metalinin artan derişimleri ile birlikte yaprak tüyü yoğunluğu ve yapısında değişiklikler olduğu gözlenmiştir. Değişiklikler yaprak tüy uçlarında kıvrılmalar, yer yer yaprak tüylerinin dinamik ve çıkıntılı yapısını kaybetmesi olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca yaprak tüy merkezlerinin değişik şekiller oluşturduğu ve bunların üzerlerinde düzensiz çıkıntıların oluştuğu gözlenmiştir. Bitki gövde ve köklerinde yapılan antioksidant enzim analizinde gövde ve köklerdeki katalaz ve glutatyon reduktaz enzim aktivitesinin 0.01 mM nikel derişiminde belirgin bir artış gösterdiği daha sonra düştüğü, askorbat peroksidazın ise gövde ve kökteki aktivitesinin sadece 0.04 mM nikel derişiminde belirgin bir artış gösterdiği diğer derişimlerde ise aktivitenin değişken olduğu gözlenmiştir. Bitkinin toplam yaprak proteinlerinin sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile incelenmesi sonucu RuBisCo proteinine ait 49 kDa ve 14 kDa ağırlığında iki temel bant ve 45 kDa ve 18.4 kDa arasında dağılan çok sayıda küçük bantlar tespit edilmiştir. Bitkilere ait protein bant desenlerinin tüm nikel derişimleri için aynı olduğu ve bantların yoğunluk ya da hareket bakımından kontrolden fark göstermediği görülmüştür. Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA-Polimeraz zincir reaksiyonu (RAPD-PZR) işleminde denenen primerlerle 1000 bp-300bp arasında değişen bantlar elde edilmiştir. OPW10, OPB10, OPA17 primerleri ile yapılan çoğaltmalarda bant farklılıkları görülmezken, OPO04 ve B7 primerleri ile elde edilen RAPD profillerinde bazı farklılıklar ortaya çıkmıştır. 0.2 mM nikel derişimi uygulaması ile bitkide farklı ifade edilen genler bulunmuş ve bunların dizi analizleri yapılmıştır. 0,2 mM nikel uygulanan bitkide bulunmadığı gözlenen, farklı ifade edilen gen dizisilerinden birisi Arabidopsis thaliana 1. kromozom dizisinin BAC T24P13 kısmına ait genomik dizisi ile %93 benzerdir. Nikel uygulanan bitkide ortaya çıkan farklı ifade olmuş bir gen dizisi ise Arabidopsis thaliana Lhca2 protein (Lhca2) mRNA' sı ile %99 benzedir. Nikel uygulanan bitkide ifadesi azalan bir gen dizisinin Lobularia maritima kloroplast DNA' sı, tamamlanmış dizisi ile %99 benzer olduğu görülmüştür.

Abstract:
A. corsicum is a candidate plant to be used in remediation and recovery of heavy metals especially nickel from the environment by a new technology phytoremediation. In this study A. corsicum plants were grown in tissue culture conditions supplied with 0.01 mM, 0.04 mM, 0.2 mM nickel concentrations. The nickel hyperaccumulation potential and the changes in plant?s metal content were detected by X-ray floresence spectrometer (XRF). The density of the metals Fe, Mg, Ca, Ni and morphological changes were detected at upper and lower stem leaves by scanning electron microscope energy dispersive X-ray anaysis (SEM-EDX). The shoots (932.5 µg/g) of the plant hyperaccumulated significantly more nickel than the roots (499.7 µg/g). The density of the trichomes was reduced with the increasing concentrations of nickel and some changes at the structure of the trichomes were observed. The changes are the curved trichome tips and the loss of the dynamic and denticulated structure. At 0.04 mM and 0.2 mM concentrations the centre of the trichomes had some different structures and denticulates. The analysis of antioxidant enzyme activities were performed at root and shoot samples. Catalase and glutathione reductase enzyme activity increased at 0.01 mM at both shoot and roots and decreased with the 0.2 mM nickel concentration. Ascorbate peroxidase activity increased at just 0.04 mM nickel concentration and showed variable values at other concentrations. The total leaf proteins of the plant were examined by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Two major bands were determined with 49 and 14 kDa molecular weight. Other minor bants dispersed between 45 and 18.4 kDa. The protein banding patterns of all plants grown at different concentrations of nickel were the same with each other in the aspect of density and mobility. In random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction experiments (RAPD-PCR) bands took place between 1000 bp and 300 bp. The bands showed no difference at the amplifications performed with OPW10, OPB10, OPA17 while they showed differences at some aspects with the primers OPO04, B7 primers. Differentially expressed genes (DEG) at 0.2 mM nickel treated plants were detected by special primers. One of the genes absent at 0.2 mM nickel treated plants is %93 similar with Arabidopsis thaliana 1. chromosome BAC T24P13 part genomic sequence. A differantially expressed gene appearing at 0.2 mM nickel treated plants is %99 similar with Arabidopsis thaliana Lhca2 protein (Lhca2) mRNA sequence and another less expressed gene at 0.2 mM nickel treated plant is %99 similar with Lobularia maritima chloroplast DNA completed sequence.