Farklı hayvan gözleri, retina çubuklarında bulunan rodopsin yapılarının ve nano disk oluşumlarının x-ışını saçılma yöntemleri (SAXS/WAXS) ile incelenmesi
Structural investigation of rhodopsin molecules and nano disks located inside retina rods of different animal eyes by using x-ray scattering (SAXS/WAXS) methods
Yazar: ILGHAR ORUJALIPOOR KALKHORAN
Danışman: PROF. DR. SEMRA İDE
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Saçılma = Scattering ; X ışını = X ray

Özet:
Hayvanlarda görme fonksiyonunun gerçekleşmesinde etkin olan, en önemli karmaşık dokulardan biri retinadır. Retinanın fotosensör bölümlerinden biri olan ve dış segment (ROS) olarak tanımlanan çubuksu yapılar siyah-gri-beyaz tonlarda görmeden sorumlu olup, temelde membran disklerden ve rodopsin adlı makromoleküler yapılardan oluşurlar. Görme duyusu ile ilgili teşhis ve tedavi uygulamalarında, bu yapıların moleküler-nano ve mikro ölçekte takibi ile uğradıkları fiziko-kimyasal yapı değişimlerinin incelenmesi, nanotıp ve nanoteknolojiye önemli kazanımlar sağlayacaktır.  Günümüzde bu tür yapısal değişimler, özellikle makromoleküler yapıların ayrıştırılması ve saflaştırılması yolu ile incelenebilmektedir. Bu çalışmalarda elde edilen yapısal bulgular, biyolojik yapılarda gerçekleşen fiziko-kimyasal reaksiyonları anlamamızı sağlamakla birlikte, doğal yapıyı tam olarak yansıtamamaktadırlar. Bu tez kapsamında, ROS doku ortamını fazla bozmadan, doğal durumu en iyi yansıtan yapısal bulgulara ulaşmak adına yapılan analizlerde , farklı X-ışını donanımlarına sahip SAXS-WAXS deney sistemleri kullanılmıştır. Bu analizlerde, retina örnekler doğrudan kullanılarak, ROS kısmı ile ilgili membran ve makromoleküler rodopsin yapıları inceleyebilme olanakları araştırılmıştır. Fiziko-kimyasal yöntemlerle ROS çubuk yapılar izole edilmiş, doğrudan retina kulanılarak elde edilen yapısal bulgular ile bu örneklere ait bulgular karşılaştırılmıştır. Doğrudan retina kullanılarak elde edilen SAXS-WAXS yapısal bulgularının, izole edilmiş ROS ve rhodopsin yapı bilgilerini de  doğrudan yansıtabildiği sonucuna ulaşılmıştır.  Ayrıca, TEM analizleri sonucunda, ROS izolasyonları ile ilgili, mikro ölçekte tamamlayıcı ve izolasyonun başarılı olduğunu destekleyici yapısal bulgulara da ulaşılmıştır.
X-Işını saçılma deneylerinde üç farklı optik sisteme sahip, üç farklı ışın kaynağının ve dedektör donanımının bulunduğu deney sistemleri ile çalışma olanağı oluşturulmuştur. Ülkemizde bulunmayan ve tüm dünyada aktif sayıları 60 civarında olan son nesil Sinkrotron Işın merkezlerinden birinde (NSRRC-Tayvan) çalışma olanağı, bu tez çalışmasının en önemli bölümlerinden birine zemin oluşturmuştur. 
Üç farklı hayvan [inek: Holstein (siyah alaca), keçi: Saanen, fare: Mice-664 C57BL/6J] gözünden elde edilen retina yapılar üzerine incelemeler yapılarak, yapısal farklılıklar araştırılmış ve ilerleyen çalışmalarda hangi retina örnekleri ile daha iyi çalışılabileceği de belirlenmiştir. 
Yapılan çalışmalar sonucunda,
•	Disiplinler arası çalışma ortamı oluşturularak, farklı üniversitelerde görev yapan fizikçi, kimyacı, biyolog ve veteriner hekim bilim insanları ile iş birliğine gidilebilmiştir.

•	Ulusal ve uluslararası (Avusturya ve Tayvan da bulunan) deneysel olanaklar kullanılarak, ilk kez X-ışını saçılma yöntemleri ile biyolojik dokular üzerine, geniş ölçekte ve ayrıntılı yapısal incelemeler yapılabilmiştir. Farklı deneysel olanakların, retinalar ile ilgili analizler için, olumlu ve olumsuz yönleri de belirlenmiştir.

•	ROS membran yapıya ve 3D rodopsin makromoleküler yapıya ait elektron yoğunluğu bilgilerine ve parakristalin düzenlenim bilgisine kadar inilebilecek ayrıntılı analizler yapılabilmiştir.

•	Ayrca, veri işleme aşamasında kullanılan gerçek uzaya ait uzaklık dağılım fonksiyonlarının belirlenebileceği bir yazılım da, yine araştırma grubumuzda geliştirilerek ilk kez retina ile ilgili analizlerde kullanılmıştır.

•	Rodopsin SAXS yapı modeli olarak, 3D elipsoid form faktörü tanımlanmış ve önerilen yapı ile ilgili eksen boyutları, farklı hayvanlarda bulunan rodopsin yapılar için ayrı ayrı ölçülmüştür. Yine bu analizler ile rodopsin yapı içeriğinde bulunan 7 adet alfa heliks yapı için tanımlanan Kuhn Modeli kullanılarak, uzunluk ve çap bilgilerine ulaşılmıştır. Lazer ışın etkisi ile trans/cis konformasyonunda değişim gösterebilen retinal molekülünün 3D elipsoid zarf yapıda oluşturduğu değişiklik bile yapılan analizler ile algılanabilmiştir.

•	WAXS analizleri ile rodopsin içeriğinde bulunan, alfa heliks yapıların periyodik atım mesafeleri ve kenar zincir yapıya ait kristalin düzlem uzaklıkları gibi (bir kaç Angström'lük mesafeler) bile ölçülebilmiştir.

•	Elde edilen bulguların doğruluğu, güncel literatürde yer alan, farklı deneysel yöntemlerle elde edilen bulgularla karşılaştırılarak sınanmıştır.

Anahtar Kelimeler: Retina, Rodopsin, ROS, SAXS, WAXS, TEM

Abstract:
Retina is one of the most complex tissues which enable the realization of visual function in animals. Striped structures defined as outer segment ROS are one of the photosensor sections of retina and responsible of detection of black, gray, and white tones. They are composed of membrane discs and macromolecular structures called rodopsin. The monitoring of these structures in nano and micro scale and   the examination of physico-chemical structure changes will provide significant benefits to nanomedicine and nanotechnology regarding eyesight diagnosis and treatment applications. Today such structural changes, in particular macromolecular structures can be examined by separation and purification techniques. Structural findings obtained in this study, let us understand the actual physico-chemical reactions in biological structures, but they can not fully reflect the natural structure. In this thesis, without any large deterioration in the ROS tissue environment, different X-ray configurations, SAXS-WAXS experimental systems are used to reach structural results which explain the natural state in the best way. In this analysis, the retina samples are used to examine the possibilities of investigation on membranes and macromolecular rhodopsin structures. Physico-chemical methods are used to isolate ROS structures and the obtained results compared with the findings obtained by using the direct retina. The SAXS-WAXS structural findings is obtained by investigation of isolated and normal retina and rhodopsin are reflect each other.  In addition, TEM analysis about ROS isolation show that isolation of the complementary micro scale has achieved successful results in the supporting structure.
The X-ray scattering experiments have been conducted with three different optical systems, light sources and detectors. One of the most important parts of this thesis is the opportunity to work in the Taiwan synchrotron radiation research center (NSRRC-Taiwan).
The experiments were carried out on three different animal's eyes retina [cows: "Holstein", goat "Saanen", mice: "Mice-664 C57BL / 6J"] and the differences between structures were obtained. As a result the best retina sample to work with is determined.

As a result of studies,
•	By creation of a multi-disciplinary working environment, it was made physicists, chemists, biologists and veterinary scientists from different universities able to collaborate together.

•	For the first time a detailed structural investigations on biological tissues in a large scale by X-ray scattering methods could be made using national and international (located in Austria and Taiwan) experimental facilities. The positive and negative aspects of different experimental facilities for analysis related to the retina were identified.

•	The detailed analysis could be able to get knowledge about the electron density and paracrystalline arrangement profile related with the ROS membrane structure and macromolecular 3D rhodopsin structure.

•	Additionally, the software that can determine the distribution functions related to actual space from data used in the processing stage was developed in our research group and used in the analysis of the retina.

•	The 3D ellipsoid form factor is defined as the rhodopsin SAXS structure model and the axis dimensions of proposed model are measured separately for rhodopsin structures in different animals.

•	However, by these analyses for 7 alpha helix structures in the rhodopsin, using the Kuhn Model, length and diameter information were obtained. By Laser beam effect, the change of 3D ellipsoidal structure in retinal molecule that can vary in trans/cis conformation could be detected.

•	Using the WAXS analysis side chains distances of alpha-helix structures and the crystalline plane spaces of the side chain structure (a few Angstrom distances) in the rhodopsin content could be measured.

•	The accuracy of the data obtained has been tested and compared with data obtained by different experimental methods in literature.

Keywords: Retina, Rhodopsin, ROS, SAXS, WAXS, TEM