Üç boyutlu biyobaskı teknolojisinin yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler üzerindeki oksidatif strese etkisi
The effect of three dimensional bioprinting technology on oxidative stress of adipose-derived mesenchymal stem cells
Yazar: DAMLA ALKAYA
Danışman: DOÇ. DR. AÇELYA YILMAZER AKTUNA
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Kök Hücre ve Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Baskı = Print ; Biyobaskı = Bioprinting ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Kök hücreler = Stem cells ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Sodyum aljinat = Sodyum alginate

Özet:
Doku mühendisliği ve yenileyici tıp, hasarlı veya yaralı dokuların iyileştirilebilmesi için umut vadetmektedir. Üç boyutlu biyobaskı, biyouyumlu malzemelere, hücrelere ve destekleyici bileşenlere uygulanmasına izin vererek doğal organları ve dokuları taklit etmek için karmaşık doku yapıları geliştirmek için oldukça kullanılan en yeni teknolojilerden biridir. Kök hücreler, kendi kendine çoğalma ve özelleşmiş hücrelere farklılaşma gibi yeteneklere sahip olduklarından, biyobaskı sırasında kullanılan diğer hücre türlerine kıyasla daha önemli faydalar sunarlar. Biyouyumlu malzemeler olarak hidrojeller, 3B biyobaskı teknolojisinde hücreyi yüklemede biyomürekkep olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Aljinat, biyouyumlu olması, doğal yapısının yumuşak olması, yüksek su içeriği, kütle taşıma özelliği, hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını teşfik edebilmesi nedeniyle kök hücre kültürlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, doku mühendisliği yapılacak olan yapı iskeleleri hazırlamak için aljinat hidrojellerin yapısı, mekanik özellikleri ve şekil uygunluğunun kontrol edilmesi oldukça zordur. Oksidatif stres, reaktif oksijen ve azot türlerinin düzenli olmayan üretimi veya düzensiz atılması ile karakterize edilmektedir. Üç boyutlu biyobaskıda, serbest radikallerin üretimi ve birikmesi, DNA, protein ve lipidler başta olmak üzere tüm biyomoleküllere zarar verebilmektedir. Bu yüzden, 3B biyobaskıda kullanılacak olan MKH'lerin oksidatif stresinin incelenmesi, MKH'lerin genişlemesi, engraftmanı, işlevi ve uzun ömürlü olabilmeleri için gelişimi zorunlu kılmaktadır.
Bu tez çalışmasında, 3B biyobaskı ile aljinat biyomürekkep konsantrasyon farkı ve biyobaskı desen farkının mezenkimal kök hücreler üzerindeki oksidatif strese etkisi incelenmiştir. Ticari olarak satın alınan ve in vitro koşullarda iki boyutlu kültür ortamında yetiştirilen insan yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler ile birlikte %8 ve %10 SA olmak üzere iki farklı konsantrasyonda sodyum aljinat ile biyomürekkepler hazırlanarak 3B biyobaskı için kullanılmıştır. Üç boyutlu biyoyazıcılardan ızgara ve dalgalı desen projeleri kullanılarak beş katmanlı iskeleler basılmıştır. İskele üzerindeki hücrelerin 1. ve 7. günlerde oksidatif stres ve floresan boyama yöntemleri kullanılarak oksidatif stres ve canlılık analizi yapılmıştır. Basım sonrası hücreli iskeleler 7 gün kültürde bekletildikten sonra iskelelerden sodyum sitrat ile hücre izolasyonu yapılmış ve izole edilen hücrelerden eş zamanlı PCR kullanılarak HIF-1α ve antioksidan genlerin (SOD1, SOD2, CAT1, GPX1) ifadelerinin analizi yapılmıştır. Sonuç olarak, 3B biyobaskı teknolojisinin iAKH'ler üzerindeki oksidatif strese ve hücre canlılığı üzerine etkisi olmuştur. Izgara ve dalgalı desen basımının yanı sıra biyomürekkepteki SA konsantrasyonu iAKH'lerdeki antioksidan genlerin ifadesinde farklılığa sebep olmuştur. Aynı zamanda SA konsantrasyon farkı hipoksiye sebep olmuştur. Yapılan bu tez çalışması, doku mühendisliği ve yenileyici tıp alanında kullanılmak üzere hücreli 3B doku iskelelerinin etkili basımı ve uygulanabilmesi için daha fazla bilgi edinmemizi ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirilmesi bakımından önem taşımaktadır.

Abstract:
Tissue engineering and regenerative medicine show promise for healing damaged or injured tissues. Three-dimensional bioprinting is one of the newest technologies highly used to develop complex tissue structures to mimic natural organs and tissues, allowing it to be applied to biocompatible materials, cells and supporting components. Because stem cells have the ability to self-replicate and differentiate into specialized cells, they offer more significant benefits compared to other cell types used during bioprinting. As biocompatible materials, hydrogels are widely used as bioinks to load the cell in 3D bioprinting technology. Alginate is widely used in stem cell cultures due to its biocompatibility, soft nature, high water content, mass transport feature, and ability to promote cell proliferation and differentiationHowever, it is very difficult to control the structure, mechanical properties and shape conformity of alginate hydrogels to prepare scaffolds to be tissue engineered. Oxidative stress is characterized by the irregular production or irregular removal of reactive oxygen and nitrogen species. In three-dimensional bioprinting, the production and accumulation of free radicals can damage all biomolecules, especially DNA, protein and lipids. Therefore, examining the oxidative stress of MSCs to be used in 3D bioprinting necessitates the development of MSCs for their expansion, engraftment, function and longevity.
In this thesis, the effect of 3D bioprinting and alginate bioink concentration difference and bioprinting pattern difference on oxidative stress on mesenchymal stem cells was investigated. For 3D bioprinting, bioinks are prepared with two different concentrations of sodium alginate, 8% and 10% SA, together with commercially purchased human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells grown in two-dimensional culture medium in vitro. used. 5-layer scaffolds were printed using grid and wavy pattern projects from 3D bioprinters. Oxidative stress and viability analyzes of the cells on the scaffold were performed on the 1st and 7th days using oxidative stress and fluorescent staining methods. After the cell scaffolds were kept in culture for 7 days after printing, cell isolation was made from the scaffolds with sodium citrate and the expressions of HIF-1α and antioxidant genes (SOD1, SOD2, CAT1, GPX1) were analyzed using simultaneous PCR from the isolated cells. In conclusion, 3D bioprinting technology had an effect on oxidative stress and cell viability on iAKHs. Besides the printing of grid and wavy patterns, the SA concentration in the bioink caused differences in the expression of antioxidant genes in iAKHs. At the same time, SA concentration difference caused hypoxia. This thesis study is important in terms of obtaining more information and developing new treatment approaches for the effective printing and application of cellular 3D tissue scaffolds for use in tissue engineering and regenerative medicine.