Geç prepubertal dönemdeki dişi köpeklerde deslorelin implant uygulamalarını takiben ovaryum ve uterusta GNRH ve kisspeptin reseptör ekspresyonu
Expression of GNRH and kisspeptin receptors in the ovary and uterus in deslorelin treated late-prepubertal bitches
Yazar: MUHAMMET ALİ KARADAĞ
Danışman: PROF. DR. DUYGU KAYA ; PROF. DR. BÜLENT POLAT
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Deslorelin = Deslorelin ; Ergenlik = Puberty ; GnRH = GnRH ; Kisspeptin = Kisspeptin ; Köpekler = Dogs ; Prepubertal dönem = Prepubertal period ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Günümüze kadar yapılan sınırlı sayıdaki araştırma sonuçları, pubertanın uzun süreli baskılanmasında kullanılan GnRH analoğu Deslorelinin, köpeklerde sonraki üreme aktivitesi ve ovaryumun işlevselliği üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığını göstermektedir. Ancak pubertanın GnRH agonistleri ile uyarılması ve olası yan etkileri üzerine araştırmalar henüz başlangıç aşamasındadır. Bu çalışma ile dişi köpeklerde östrusların yönetimi ve kontrolünde geleceğe yönelik önemli bir alternatif olan Deslorelinin implantın geç pre-pubertal dönemde uygulaması sonrası genital dokulardaki GnRH/R ve KISS1/R ekspresyonu ve lokalizasyonları incelenmiş, GnRH agonisti uygulamaları ile pubertanın engellenmesi/ertelenmesi konularında ileri araştırmalar için tür düzeyinde katkı sunulması amaçlanmıştır.
Bu amaçla sahipleri tarafından kliniklerimize ovaryohisterektomi (OHE) talebi ile getirilen ve pre-pubertal dönemde olduğu anamnez ve klinik/laboratuvar bulgularıyla teyit edilen farklı ırklardan ortalama 7,79±0,17 aylık yaşta toplam 25 adet dişi köpeğe ait ovaryum ve uterus dokuları kullanıldı. Deslorelin asetat (Suprelorin®, 4,7 mg, Virbac, Fransa) içeren implant interskapular bölgeye subkutan olarak uygulandı. Uygulama sonrası klinik östrüs gösteren 6 köpek östrus grubunu (EST), klinik östrüs gözlenmeyen 10 köpek Non-östrus grubunu (N-EST) oluşturdu. Plasebo implant uygulanan 9 köpek kontrol (KONT) grubu olarak kullanıldı. İmplant uygulaması sonrası ortalama 35. günde tüm köpeklerin OHE operasyonları gerçekleştirilerek rutin doku işleme prosedürü uygulandı. PCR analizleri için standart protokoller kullanılarak elde edilen RNA örnekleri cDNA sentezi çalışmalarında kullanılmak üzere -80 °C de saklandı. Hedef genlerin ekspresyon düzeyleri SYBR Green Bazlı Real Time qPCR yöntemi ile belirlendi. İmmünohistokimyasal analizler, Strep-ABC (Streptavidin Biotin Kompleks) immünoperoksidaz yöntemi uygulanarak yapıldı. 
	GnRH1 ekspresyonunun, kontrol grubundaki hayvanlara kıyasla implant yerleştirilen ÖST ve N-ÖST gruplarındaki uterus dokularında azaldığı, bu azalmanın N-ÖST grubunda diğer gruplara göre anlamlı olduğu belirlendi (p = 0,02). GnRH-R, KISS1/R'ünün uterus dokusundaki ekspresyonu bakımından gruplar arasında istatistiksel fark bulunmadı (p>0.05). Ovaryum dokularında KISS1 ve KISS1-R ekspresyon seviyeleri deslorelin implant uygulanmasından etkilendi (p < 0.05). Her iki faktörün ekspresyonu ÖST grubuna kıyasla N-ÖST ve KONT grubundaki hayvanlarda daha yüksekti. Doku kesitlerinde GnRH1/R'nin immünreaktivitesi uterus ve ovaryum dokusunun tüm katmanlarında tüm gruplarda farklı oranda pozitifti, ancak KISS1 hem uterus hem de ovaryum dokularında tüm gruplarda GnRH/R'üne kıyasla daha zayıf immünreaktivite gösterdi. 
Sonuç olarak bu çalışmada Deslorelin asetat uygulanan prepubertal dişi köpeklerde ovaryum ve uterus dokularında farklı düzeylerde olmakla birlikte, KISS1–KISS1R ve GnRH-GnRH-R ekspresyonu belirlenmiştir. Elde edilen bulgulara dayanılarak GnRH agonisti deslorelinin köpeklerde hipofiz seviyesinde olduğu kadar ovaryum düzeyinde de doğrudan etki gösterebileceği ve ovaryum GnRH ve KISS reseptörleri aracılığıyla steroidogenezisi doğrudan etkileyebileceği düşünülmektedir. Bununla birlikte gelecekte ovaryum fizyolojisi ve işlevselliğinde önemli rol oynayan farklı faktörleri içeren çalışmalara ihtiyaç vardır.

Anahtar Kelimeler: Deslorelin, Pre-pubertal dişi köpek, GnRH/GnRH-R, KISS1/KISS-R

Abstract:
The limited number of research results to date indicate that; the GnRH analogue Deslorelin, which is used in the long-term suppression of puberty, has no adverse effects on subsequent reproductive activity and ovarian functionality in dogs. However, studies on the stimulation of puberty and possible side effects with GnRH agonists are still insufficient. In this study, the expression and localization of GnRH/R and KISS1/R in the genital tissues after the application of Deslorelin, which is an important future alternative in the management and control of estrus in female dogs, in the late pre-pubertal period were investigated. 
	For this purpose, ovarian and uterine tissues of 25 female dogs with an average age of 7.79±0.17 months from different breeds, who were brought to our clinics by their owners with a request for ovariohysterectomy (OHE) and confirmed by anamnesis and clinical/laboratory findings in pre-pubertal period, were used. The implant containing Deslorelin acetate (Suprelorin®, 4.7 mg, Virbac, France) was applied subcutaneously to the interscapular region. After the application, 6 dogs were grouped as estrus (EST) and 10 dogs as Non-estrus (N-EST). Nine dogs with placebo implants were served as the control (CONT) group. OHE operations were performed for all dogs on an average of 32-40 days after implantation and routine tissue processing procedure was performed. The RNA samples obtained using standard protocols for PCR analyzes were stored at -80 °C until used in cDNA synthesis. Expression levels of target genes were determined by SYBR Green Based Real Time qPCR method. Immunohistochemical analyzes were performed using the Strep-ABC (Streptavidin Biotin Complex) immunoperoxidase method.
	It was determined that the expression of GnRH1 was decreased in the uterine tissues of the implanted OST and N-OST groups compared to the animals in the control group, and this decrease was significant in the N-OST group compared to the other groups (p = 0.02). There was no statistical difference between the groups in terms of the expression of GnRH-R, KISS1/R in uterine tissue (p>0.05). Expression levels of KISS1 and KISS1-R in ovarian tissues were affected by Deslorelin treatment (p < 0.05). Expression of both factors was higher in animals in the N-OST and KONT groups compared to the OST group.  In tissue sections, immunoreactivity of GnRH1/R in all layers of uterus and ovarian tissue was different in all groups. However, KISS1 showed weaker immunoreactivity in both uterus and ovarian tissues compared to GnRH/R in all groups.
	In conclusion, KISS1–KISS1R and GnRH-GnRH-R expressions were determined, although at different levels, in the ovarian and uterus tissues of prepubertal female dogs treated with Deslorelin acetate. Based on the findings, it is thought that the GnRH agonist deslorelin may act directly at the ovarian level as well as at the pituitary level in dogs, and may directly affect steroidogenesis through ovarian GnRH and KISS receptors. However, there is a need for future studies involving different factors that play an important role in ovarian physiology and functionality.

Keywords: Deslorelin, Prepubertal bitches, GnRH/GnRH-R, KISS1/KISS-R