Hypoderma bovis hypodermin rekombinant antijenlerinin karakterizasyonu, ekspresyon profilleri ve serolojik teşhisteki etkinliklerinin değerlendirilmesi
Characterization and expression profiles of hypoderma bovis hypodermin recombinant antigens and assesment of their serodiagnostic efficiencies
Yazar: MÜBECCEL OKUR
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH İNCİ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antijenler = Antigens ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Hypoderma bovis = Hypoderma bovis ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Seroloji = Serology ; Stereotip = Stereotyping ; Sığırlar = Cattles ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Bu çalışmada, sığırlarda enfestasyona yol açan Hypoderma bovis larvalarının vücutta göçü sırasında salgıladıkları ve immun modülasyonda aktif görev alan önemli serin proteazları hypodermin A (HA), hypodermin B (HB) ve hypodermin C (HC)'nin moleküler karakterizasyonları sonrası rekombinant olarak elde edilmesi ile hypodermosis'in serolojik teşhisinde önemli antijenler olarak kullanılabilecekleri hipotez edilmiştir. Çalışmada rekombinant antijenler ve ilgili genlerin aminoasit sekanslarından dizayn edilen peptidler ile Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) metodolojisi geliştirilmiş ve etkinlikleri değerlendirilerek saha sığır serum örneklerinde hypodermosis'in seroprevalansı araştırılmıştır.  Araştırma materyalini mezbaha incelemelerinde hypodermosis ile enfeste belirlenen sığırlardan toplanmış üçüncü dönem (L3) Hypoderma larvaları oluşturmuştur. Kesimden önce enfeste hayvanlardan tam kan örnekleri alınarak serumlar elde edilmiştir. Larvalardan genomik Deoksiribo Nükleik Asit (DNA) ve total Ribo Nükleik Asit (RNA) izolasyonları gerçekleştirilmiş ve takiben Komplementer DNA (cDNA) sentezi yapılmıştır. Morfolojik teşhis sonrasında incelenen larvaların mitokondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) DNA barkod bölgesinin sekans karakterizasyonuyla H. bovis'e ait oldukları konfirme edilmiştir. Hypoderma bovis cDNA kütüphanelerinde hypodermin genleri dizayn edilen spesifik primerlerle amplifiye edilmiştir. Nükleotid ve amino asit sekanslarının elde edilmesi amacıyla amplikonlar uygun bakteriyel plazmidlere klonlanarak transformasyon basamaklarından sonra rekombinant plazmid pürifikasyonu yapılmıştır. Rekombinant plazmidler çift yönlü olarak sekanslanmış ve genetik yazılımlarla sekanslar işlenerek her gen bölgesi için konsensus sekanslar elde edilmiştir. HA, HB ve HC genlerine ait Açık Okuma Çerçevesi (ORF) sekanslarının sırasıyla 705 baz çifti (bp), 771 bp, 783 bp uzunluğunda oldukları ve 234 amino asit (aa), 256 aa ve 260 aa uzunluğunda proteinleri kodladıkları belirlenmiştir. Her üç hypodermin geninde intraspesifik nükleotid farklılığı belirlenmezken interspesifik nükleotid farklılıkları HA ve HB arasında %29,5, HA ve HC arasında %57,9, HB ve HC arasında %53,9 olarak tespit edilmiştir. In-silico analizlerde H. bovis HA, HB ve HC genlerinin sırasıyla 25,744 kilodalton (kDa), 27,795 kDa ve 28,516 kDa büyüklüğünde proteini eksprese ettikleri belirlenmiştir. Sonraki basamakta bakteriyel ekspresyon sistemine klonlanan hypodermin genleri üzerinde ekspresyon çalışmaları yürütülmüş ve ekspresyon etkinliği Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) ve Western Blot analizleri ile belirlenmiştir. HA'nın Escherichia coli ekspresyon sisteminde ifade olmadığı belirlenmiş, pürifiye edilmiş rekombinant HB (rHB) ve HC (rHC) antijenlerinin ise pozitif sığır serum dilüsyonları ile yapılan Western Blot analizlerinde immun reaktivite gösterdikleri saptanmış ve protein büyüklükleri in-silico sonuçlara paralellik göstermiştir. Pürifiye rHB, rHC ve peptidler (pHA, pHB, pHC) üzerinde yürütülen standardizasyon çalışmalarında ELISA için rHC antijeni ve pHC peptidinin en etkin ve birbirine benzer sonuçları verdiği belirlenmiştir. rHC ve pHC ile oluşturulan ELISA'da incelemesi yapılan 200 sığırda hypodermosis seroprevalansı %62,0 olarak belirlenmiş ve enfestasyonun dağılımında yaş, cinsiyet ve ırk gibi çeşitli parametrelerin etkisi değerlendirilmiştir. 
Sonuç olarak bu çalışma ile sığırların önemli bir ekto-endoparaziti ve yüksek ekonomik kayıplara yol açan H. bovis için antijenik değeri yüksek ve immun modülasyonda aktif görev alan HA, HB ve HC proteinlerini kodlayan genlerin dünyada ilk kez moleküler karakterizasyon verileri sağlanmış, immun reaktiviteleri üzerine özgün çıktılar elde edilmiş ve hypodermosis'in serolojik teşhisi amacıyla rekombinant teknolojisi ile özgün rekombinant antijenler elde edilmiş ve ELISA metodolojisi geliştirilmiştir.  
Anahtar kelimeler: Ekspresyon, Hypoderma bovis, hypodermin A, hypodermin B, hypodermin C, moleküler karakterizasyon, ELISA, sığır

Abstract:
An ELISA methodology was developed using recombinant antigens and peptides designed from amino acid sequences of the related genes and their efficiencies were evaluated. Afterward, the seroprevalence of hypodermosis in the sera of cattle from the field was investigated. The third stage Hypoderma larvae (L3) collected from infested cattle during abattoir inspections were constituted the material of the study. Whole blood samples were got from the animals prior to slaughter. Genomic DNA and total RNA isolations were performed followed by cDNA synthesis. After morphological identifications, species identification of H. bovis was confirmed by sequence analyses of the barcode mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) DNA region of the larvae. Hypodermin genes were amplified in H. bovis cDNA libraries with originally designed primers. In order to obtain nucleotide and amino acid sequences, recombinant plasmid purifications were utilized after cloning the amplicons into appropriative bacterial plasmids and transformation steps. Recombinant plasmids were bidirectionally sequenced, and consensus sequences were obtained for each gene region by processing the sequences with genetic software. The open reading frame (ORF) sequences of HA, HB and HC gene were determined as in the length of 705 bp, 771 bp, 783 bp, and their coding protein aminoacid lengths were 234 aa, 256 aa, and 260 aa, respectively. There were no intraspecific differences in each Hypodermin gene, while 29.5%, 57.9%, and 53.9% interspecific differences were determined between HA and HB, HA and HC, HB and HC, respectively. Hypoderma bovis HA, HB and HC genes expressed sizes of 25.744 kDa, 27.795 kDa and 28.516 kDa proteins based on in-silico analyses. In the next step, expression studies were conducted on the Hypodermin genes that were cloned to bacterial expression system and expression efficiencies were determined by SDS-PAGE and Western Blot analyses. HA was not expressed in E. coli expression system, while purified recombinant HB (rHB), and HC (rHC) antigens were found as immune reactive in Western Blot analyses using sera dilutions of positive cattle. Protein sizes were also consistent with the result of in-silico analyses. rHC antigen and pHC peptide were found as the most effective with giving similar results to each other for ELISA in the standardization studies on purified rHB, rHC, and peptides (pHA, pHB, pHC). In the ELISA base on rHC and pHC, a seroprevalence of 62.0% of hypodermosis was determined in the examined 200 cattle, and the effects of several parameters such as age, gender, and breed on the distribution of the infection were evaluated.
In conclusion, first molecular characterization data was obtained on the genes encoding HA, HB and HC proteins that are high antigenic importance and have an active role in immunomodulation of H. bovis which is an important endo-ectoparasite of cattle, and cause high economic losses with this study. Unique data were also obtained on the immune reactivities of these proteins and a novel ELISA methodology was developed with recombinant technology in order to the serological diagnosis of hypodermosis.
Key words: Expression, Hypoderma bovis, hypodermin A, hypodermin B, hypodermin C, molecular characterization, ELISA, cattle