Mezenkimal kök hücre-kanser hücresi ko-kültürü sonrası TGF-βeta ve CxCL12 sinyal yolaklarındaki değişimin araştırılması
Determination of TGF-beta and CxCL12 signaling pathway changes after mesenchymal stem cell-cancer cell co-culture
Yazar: ŞEFİKA ÖZCAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ ONUR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Fizyoloji = Physiology

Özet:
Kanser, insan hastalıkları arasında iskemik kalp hastalığından sonra dünya çapında ikinci ölüm nedenidir. Karsinogenez, sağlıklı hücrelerin kötü huylu hücre tipine dönmesi şeklinde tanımlanır. Karsinogenez, genetik/epigenetik ve tümör mikro çevresinin karşılıklı etkileşimi ile kanser oluşmaktadır. Üçlü meme kanseri ve glioblastoma agresif ilerleyen ve yaygın kanser türleri arasındadır. Mezenkimal kök hücreler (MKH) rejeneratif tedavi ve hücresel tedaviye yönelik yapılan araştırmaların temelini oluşturan en önemli hücresel kaynaklar olarak dikkat çekmektedir. MKH'lerin, tümör mikro çevresi (TMÇ) ile etkileşimi tam olarak açıklığa kavuşmamıştır ve bu etkileşimin mekanizmaları oldukça karmaşık aynı zamanda değişkendir. 
Bu tez çalışması kapsamında üçlü meme kanseri ve glioblastoma kanseri ile insan kemik iliği MKH'lerin ko-kültürü sonrasında hücrelerin canlılık analizi yapılmıştır. Hücre canlılığına ek olarak dönüştürücü büyüme faktörü beta (TGF-β) ve kemokin bağımlı ligand 12 (CXCL12) sinyal yolaklarındaki moleküllerin ifadesindeki değişim hem kanser hücreleri hem de MHK'ler açısından incelenmesi hedeflenmiştir.
Deneysel çalışmalarda insan kemik iliği kökenli MKH'ler ile kanser hücreleri (T98G ve MDA-MB-231) transwell sistemleri kullanılarak ko-kültüre edilmiştir. Ko-kültür sonrası 24., 48. ve 72. saatler; 4., 7. ve 10. günlerde hücre canlılığı MTT yöntemi ile analiz edilmiştir. TGF–β sinyal yolağındaki değişimin değerlendirilmesi için pTGFβRI ve pSMAD3 molekülleri; CXCL12 sinyal yolağı için ise pCXCR4 ve pERK1/2 molekülleri seçilmiştir. pTGFβRI molekülünün ifadesi immonofloresans, pCXCR4 molekülünün ifadesi immünohistokimyasal analiz yöntemiyle incelenmiştir. pSMAD3 ve pERK1/2 ifadesi ELISA yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir. 
Tez çalışmasında gerçekleştirilen analizler sonucunda, ko-kültür sonrası kanser hücreleri kontrol grubuyla kıyaslandığında kanser hücrelerinin canlılığında azalma olduğu görülmüştür. Kanser hücreleri/MKH ko-kültürü sonrası MKH hücre canlılığının kontrol MKH hücrelerinin canlılığına oranla azaldığı görülmüştür. TGF-β sinyal yolağı incelendiğinde, kanser hücrelerinde ve MKH'lerde, pTGFβRI molekülünün ifadesi kontrol gruplarıyla kıyaslandığında çok fazla değişmediği görülmüştür. Hücre içi sinyal molekülü olan pSMAD3 molekülüne bakıldığında pSMAD3 ifadesinin ko-kültür sonrası gruplarda kontrol gruplarına kıyasla azaldığı görülmüştür. CXCL12 sinyal yolağı incelendiğinde, kanser hücresi-MKH ko-kültürü sonrası iki grupta da pCXCR4 ifadesinin zayıf ve orta düzeyde arttığı gözlenmiştir. Kanser hücrelerindeki bu pCXCR4 ifadesindeki artış hücre içi sinyal molekülü pERK1/2 molekülünün aktivitesini arttırırken MKH'lerdeki pCXCR4 ifadesinin artması hücre içi pERK1/2 ifadesini etkilemediği görülmüştür.
Tez çalışması sonucunda elde edilen veriler kanser hücreleri ile ko-kültüre edilen MKH'lerin kanser hücrelerinin canlılığını her iki kanser tipi için de baskıladığını göstermiştir. MKH'lerde ise canlılığın ko-kültür sonrası azaldığı görülmüştür.  TGF-β sinyal yolağının ko-kültür sonrası reseptör aktivitesinin artması sinyal yolağının MKH'lerle etkileşim sonucu arttığını ancak pSMAD3 ifadesinin azalması MKH'lerden salgılanan aktif moleküllerin bu sinyal yolağını baskıladığını göstermektedir. CXCL12 sinyal yolağı reseptör aktivitesinin zayıf/orta düzeyde artması, pERK1/2 ifadesinin de artması ile sonuçlanmıştır. Bu durum kanser hücreleri canlılığının MKH'ler tarafından baskılanmasını engellememektedir. Aksine CXCL sinyal yolu aktivitesinin MKH'lerin kanserli bölgede kalmasına ve MKH'lerden salgılanan biyoaktif moleküller aracılığı ile kanser hücreleri canlılığının baskılanmasına katkı sağladığı düşünülmektedir.

Abstract:
Cancer is the second leading cause of death worldwide, following ischemic heart disease, among human diseases. During carcinogenesis, healthy cells exhibit similar protective characteristics to malignant cell types. Cancer develops as a result of intricate interactions between genetics/epigenetics and the tumor microenvironment. Breast cancer and glioblastoma are well-known as aggressive and prevalent types of cancer. Mesenchymal stem cells (MSCs) play a critical role in regenerative therapy and are considered a significant cell therapy candidate for cancer research. A variety of studies have been conducted on the interaction between MSCs and the tumor microenvironment, revealing a highly complex and variable relationship.
This thesis focuses on the analysis of cell viability after co-culturing triple-negative breast cancer, glioblastoma cancer, and human bone marrow MSCs. Additionally, the study aims to investigate changes in the expression changes for the Transforming Growth Factor Beta (TGF-β) and Chemokine-dependent Ligand 12 (CXCL12) signaling pathways in both cancer cells and MSCs.
The experimental setup consists of co-culturing human bone marrow-derived MSCs with cancer cells (T98G and MDA-MB-231) using transwell systems. Cell viability was analyzed at the 24th, 48th, and 72nd hours and the 4th, 7th, and 10th days after co-culture using the MTT method. Expression changes for the TGF-β signaling pathway, pTGFβRI, and pSMAD3 molecules were selected, while for the CXCL12 signaling pathway, pCXCR4 and pERK1/2 molecules were chosen. The expression of pTGFβRI was measured through immunofluorescence, while the expression of pCXCR4 was observed immunohistochemically. The ELISA method was used to analyze the expression of pSMAD3 and pERK1/2.
The results showed that the viability of cancer cells decreased when compared with the control group after co-culture. After cancer cells/MSC co-culture, MSC cell viability was found to be decreased compared to control MSC cells. The expression of pTGFβRI in cancer cells and MSCs did not change significantly compared to the control groups. However, the intracellular signaling molecule pSMAD3 showed a more pronounced expression than in the control group. In the CXCL12 signaling pathway, the expression of pCXCR4 was observed to be weak to moderate in both cancer cells and MSCs. The expression of pCXCR4 in cancer cells and the activity of the intracellular molecule pERK1/2 increased. It was observed that increased pCXCR4 expression in MSCs did not affect intracellular pERK1/2 expression.
This thesis study determined that MSCs can suppress the viability of cancer cells for both cancer types when co-cultured with MSCs. Additionally, the viability of MSCs was maintained after co-culture. The increase in the receptor activity of the TGF-β signaling pathway after co-culture indicates that the signaling pathway increases as a result of interaction with MSCs, but the decrease in pSMAD3 expression indicates that active molecules secreted from MSCs suppress this signaling pathway. Weak and moderate levels of CXCL12 signaling pathway receptors activity resulted in increased expression of pERK1/2. This does not prevent cancer cell viability from being suppressed by MSCs. On the contrary, it is thought that CXCL signaling pathway activity contributes to the retention of MSCs in the cancerous region and suppression of cancer cell viability through bioactive molecules secreted from MSCs.