Konstitütif aktif vazopressin 2 reseptör mutantlarının, hücre içi ve hücre membranındaki hareketlerinin ß-arrestin1 ve ß-arrestin2 ekspresyonu ile değişiminin incelenmesi
Investigation of cellular trafficking constitutively active vasopressin 2 receptor mutants in the presence or absence of ß-arrestin1 or ß-arrestin2 expression
Yazar: GÖKÇE SÜRAL
Danışman: PROF. DR. HASAN ONGUN ONARAN
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Beta arrestinler = Beta arrestins ; Diabetes insipidus = Diabetes insipidus ; G proteinleri = G proteins ; Nefrojenik uygunsuz antidiürezis sendromu = Nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresisuresis ; Reseptörler = Receptors ; Vazopressinler = Vasopressins

Özet:
Vazopressin-2 reseptöründe (V2R) görülen nokta mutasyonları nefrojenik diabetes insipidus (NDI) ve nefrojenik uygunsuz antidiürezis sendromu (NSIAD) adı verilen iki ayrı klinik tabloya sebep olmaktadır. Reseptörde fonksiyon kaybına sebep olan mutasyonlar, klinik olarak arjinin-vazopressin (AVP)'e duyarsızlık ve hipernatremi ile seyreden NDI'ye sebep olurken, reseptörün spontan aktivite kazanmasına sebep olan mutasyonlar klinik olarak oligüri, hiponatremi ile seyreden NSIAD'ye sebep olmaktadır. NSIAD'ye neden olan V2R mutasyonları, yapısal olarak aktif iki farklı fenotip oluşturmaktadır. Birinci tip, V2R-137 (R137L, R137C gibi) bölgesindeki mutasyonlardan kaynaklanan, agonistlere zayıf yanıt veren ve invers agonistlere dirençli mutasyonlardır. İkinci tip ise reseptör molekülünün çeşitli yerlerinde oluşan (F229V, I130N L312S gibi), agonistlere yanıt verebilen ve invers agonistlere duyarlı, konstitütif aktivite gösteren mutasyonlardır. Çalışmamız kapsamında incelediğimiz R137L R137H ve F229V V2R mutasyonlarından R137H, NDI'ya sebep olurken F229V ve R137L NSIAD'ye sebep olmaktadır. Reseptörün aynı bölgesinde görülen mutasyonların birbirine zıt klinik tablolar oluşturması ve konstitütif aktif mutantlardan sadece bazılarının invers agonistlere yanıt vermesi, söz konusu mutasyonların reseptörün moleküler işleyişi üzerindeki etkilerinin yeterli düzeyde anlaşılmadığını göstermektedir. Bu nedenle, bu mutantların transdüserler, yani Gs ve β-arrestinler ile olan etkileşmelerinin ve hücresel trafiklerinin iyi karakterize edilmesine gereksinim vardır. Bu karakterizasyon, tedavi stratejileri geliştirmek bakımından önemlidir. Çalışmamızın amaçları şu şekilde sıralanabilir: 1) V2R mutasyonlarının, β-arrestin etkileşimlerinde β-arrestin1/2 seçiciliği gösterip göstermediğini incelemek, 2) Reseptörde görülen mutasyonların reseptörün hücresel trafiği üzerindeki etkisini belirlemek, 3) Mutasyonların reseptörün hücre zarındaki lateral mobilitesine olan etkisini incelemek ve 4) NSIAD'ye sebep olan mutant reseptörlerde görülen konstitütif cAMP sinyaline Gs proteini ve β-arrestin1/2'nin katkısını incelemek.
Bu amaçlar doğrultusunda β-arrestinleri kalıcı olarak silinmiş MEF hücrelerine β-arrestin1 veya
β-arrestin2 ayrı ayrı eksprese ettirilmiş ve aynı hücrelere WT V2R veya R137L, R137H, F229V
mutant V2R'ler eksprese ettirilerek mutant reseptörlerin β-arrestin etkileşimlerinde β-arrestin1/2 seçiciliği gösterip göstermediği incelenmiştir. Konfokal mikroskop görüntülerinden reseptör β-arrestin1/2 lokalizasyonlarının birlikteliği hesaplanmıştır. Bu incelemelerde özellikle R137 mutant reseptörlerin β-arrestin2 birlikteliklerinin arttığı, spontan etkileşimlerinde β-arrestin2 seçiciliği gösterdikleri ve β-arrestin2 varlığında hücre içinde büyük veziküler yapılara sekestre oldukları gözlenmiştir. Hücre içi organellerden Golgi, ER ve lizozom selektif markerlar ile işaretlenmiş ve reseptörlerin bu organeller ile olan lokalizasyonları hesaplanmıştır. Bütün mutant reseptörlerin β-arrestin KO (knock-out) hücre serilerinde ER lokalizasyonlarının WT'ye kıyasla arttığı ve β-arrestin ekspresyonunun bu lokalizasyon artışı üzerine bir etkisi olmadığı izlenmiştir. Reseptörlerin Golgi lokalizasyonları incelendiğinde, R137 mutantlarında β-arrestin ekspresyonu ile Golgi lokalizasyonlarının WT'ye kıyasla arttığı gözlenmektedir. Lizozom lokalizasyonları incelendiğinde ise R137 mutantlarında daha bariz olmakla birlikte β-arrestin2 ekspresyonunun bütün mutantlarda, WT'ye kıyasla büyük bir lokalizasyon artışına sebep olduğu gözlenmiştir. Bu artışın
reseptörlerin β-arrestin2 aracılı internalizasyonu sonrası, β-arrestin2'nin R137 mutantlarını lizozoma taşınmasından kaynaklandığı düşünülmektedir.
Gs ve β-arrestin1/2'nin hücre içi cAMP yanıtı üzerine etkisinin araştırıldığı deneylerde cAMP probu Glosensor F22'yi stabil bir şekilde eksprese eden Gs KO 2B2 ve β-arrestin1/2 KO MEF hücreleri kullanılmıştır. Gs yokluğunda bütün reseptörlerde bazal cAMP sinyali birbirlerine benzer olarak gözlenmiş ve AVP, mutant ve WT V2R'lerde gözlenen bazal cAMP sinyalini değiştirmemiştir. NSIAD'ye sebep olan mutant V2R'leri eksprese eden hücrelerde arttığı bilinen bazal cAMP yanıtı β-arrestin1/2 KO MEF hücre serilerinde gözlenmeye devam etmiş olup, bu yanıtın reseptör trafiğinde izlenen farklılıkların sonucu değil, mutant reseptörün moleküler özelliklerinden kaynaklandığını düşündürmüştür.

Abstract:
Point mutations in the vasopressin 2 receptor (V2R) may result in two different clinical conditions called NDI and NSIAD. Loss-of-function V2R mutations cause nephrogenic diabetes insipidus (NDI), which is characterized by hypernatremia and insensitivity to AVP, while gain-of-function mutations cause nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresis (NSIAD), which leads to oliguria and hyponatremia. NSIAD causing V2R mutations can generate two different constitutively active phenotypes. The first type result from mutations in the V2R-137 (such as R137L, R137C) region, which respond poorly to agonists and are resistant to inverse agonists. The second type results from residue substitutions in several V2R domains (such as F229V, I130N L312S), which can respond to agonists, sensitive to inverse agonists and show constitutive activity. Among the R137L, R137H and F229V V2R mutations that we examined within the scope of our study, R137H causes NDI, while F229V and R137L cause NSIAD. The fact that mutations in the same region of the receptor produce opposite clinical pictures and that only some of the constitutively active mutants respond to inverse agonists indicate that the effect of these mutations on the receptor functions is not fully understood. Therefore, the interaction of these mutants with transducers, namely Gs and β-arrestins, and their cellular trafficking need to be well characterized. This characterization is important for developing treatment strategies.
The aims of the present study can be listed as follows: 1) To examine whether V2R mutations show β-arrestin1/2 selectivity in β-arrestin interactions, 2) To determine the effect of mutations in receptor's cellular trafficking, 3) To examine the effect of mutations on the lateral mobility of the receptor in the cell membrane, and 4) To examine the contribution of Gs protein and β-arrestin1/2 to the constitutive cAMP signal seen in mutant receptors causing NSIAD.
For this purpose, β-arrestin1 or β-arrestin2 was expressed separately in MEF cells whose β-arrestins were permanently deleted. Then, each one of the V2R variants, i.e., WT V2R, R137L, R137H or F229V was expressed either in β-arrestin1 or β-arrestin2 expressing cells. These configurations gave us the opportunity to test β-arrestin1/2 selectivity of these receptor variants. The correlation between cellular localizations of receptor and β-arrestin 1/2 was calculated from confocal microscopic images, as an indicator of co-localization of these proteins. We observed that spontaneous co-localization of R137 mutants with β-arrestins was selectively high for β-arrestin2 compared to WT. The latter assemblies were sequestered into large intracellular vesicles. The intracellular organelles, Golgi, ER and lysosome were labeled with selective markers and the localization of the receptors in these organelles was calculated. ER localizations of all mutant receptors were found to be increased in β-arrestin KO cell lines compared to WT. β-Arrestin expression did not change this localization pattern. However, Golgi localizations of the R137 mutants were found to be increased with β-arrestin expression compared to WT. Likewise, lysosome localizations of all the receptor mutants were observed to be increased (more pronounced for R137 mutants) with β-arrestin2 expression. The latter effect suggests that β-arrestin2 drives the R137 mutants to lysosome after β-arrestin2-mediated receptor internalization.
Contribution of Gs and β-arrestin1/2 to the receptor-mediated cAMP production was investigated in Gs KO 2B2 and β-arrestin1/2 KO MEF cells stably expressing the cAMP probe Glosensor F22 and a receptor variant. In the absence of Gs, basal cAMP accumulation was the same for all receptor variants, and AVP did not produce any response. In the presence of Gs, expression of those mutants that are known to cause NSIAD increased basal cAMP accumulation even in the absence of β-arrestin1/2 expression. The latter observation suggests that basal cAMP response is due to the molecular properties of the mutant receptors, but not to the differences in their trafficking.