Shogaol'ün antioksidan ve antiproliferatif aktivitelerinin belirlenmesi ve bazı metabolik enzimler üzerinde etkisinin araştırılması
Determination of antioxidant and antiproliferative activities of Shogaol and investigation of its effect on some metabolic enzymes
Yazar: İSMAİL YAPICI
Danışman: PROF. DR. İLHAMİ GÜLÇİN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antioksidan aktivite = Antioxidant activity ; Enzim inhibitörleri = Enzyme inhibitors ; Karbonik anhidraz = Carbonic anhydrases ; Shogaol = Shogaol

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında fenolik bileşikler sınıfında olan Shogaol'ün birçok metotla antioksidan kapasitesi, insan karbonik anhidraz I ve II, asetilkolinesteraz, bütirilkolinesteraz, α-glikozidaz, α-amilaz enzimleri üzerinde inhibisyon etkisi, A-549 akciğer kanseri, HT-29 kolon kanseri, MCF-7 ve MDA-MB-453 göğüs kanseri hücre hatları, 3T3-L1 fare fibroblast normal hücre hattı üzerinde antiproliferatif etkisi araştırıldı.
Yöntem: Shogaol'ün antioksidan kapasitesini belirleme amacıyla DPPH radikali, ABTS radikali ve DMPD radikali giderme ile Cu2+, Fe3+ ve FRAP indirgeme metotları kullanıldı. Standart olarak BHA, BHT ve Troloks kullanıldı. Enzim çalışmalarında hCA I ve hCA II izoenzimleri insan eritrositlerinden, Sepharose-4-B-L-Tirozin-sülfanilamid afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Enzim saflığının kontrolü SDS-PAGE ile yapıldı. Spektrofotometrik olarak 280 nm'de absorbans ölçülerek kalitatif protein tayini ve 595 nm'de absorbans ölçülerek kantitatif protein tayinleri yapıldı. Ek olarak Shogaol'ün hCA I, hCA II, asetilkolinesteraz, bütirilkolinesteraz, α-glikozidaz, α-amilaz enzimlerine karşı inhibisyon etkisine bakıldı. Ayrıca TBE yöntemi ile hücre sayımı yapılarak XTT yöntemi ile hücre canlılığı ölçümü yapıldı ve Shogaol'ün A-549, HT-29, MCF-7, MDA-MB-453 ve 3T3-L1 hücre hatları üzerinde antiproliferatif etkisi araştırıldı.
Bulgular: Shogaol; FRAP metodunda standart olarak kullanılan BHA, BHT ve Troloks'tan (konsantrasyon: 60 µg/mL); DPPH· giderme metodunda BHT'den; ABTS·+ giderme, Cu2+ ve Fe3+ indirgeme metotlarında Troloks'tan daha yüksek antioksidan kapasite gösterdi. hCA I ve hCA II izoenzimleri sırasıyla %40,67 verimle 273 kat ve %81,92 verimle 309 kat saflaştırıldı. hCA I ve hCA II izoenzimleri için tek bant gözlendi ve molekül ağırlıkları yaklaşık 30 kDa olarak bulundu. Shogaol hCAI, hCA II, asetilkolinesteraz, bütirilkolinesteraz, α-glikozidaz enzimlerine karşı sırasıyla 75,91 nM, 47,04 nM, 37,44 nM, 24,11 nM, 35,72 nM'lık IC50 değerleriyle etkili inhibisyon aktivitesi gösterdi. Shogaol en yüksek antiproliferatif etkiyi 8,38 µM'lık IC50 değeriyle HT-29 kolon kanseri hücre hattına karşı gösterdi. Shogaol, A-549 akciğer kanseri ve HT-29 kolon kanseri hücre hattında standart kemoterapötik ilaç Karboplatin'den, MCF-7 göğüs kanseri hücre hücre hattında standart kemoterapötik ilaç Dosetaksel'den daha etkili antiproliferatif aktiviteye sahiptir. Shogaol'ün HT-29, A-549, MCF-7, MDA-MB-453 hücre hatlarına karşı gösterdiği seçicilik endeks değerleri sırasıyla 14,83; 10,82; 2,42; 1,99 olarak; Karboplatin'in ise sırasıyla 0,46; 0,33; 1,30; 0,94 olarak bulundu. 
Sonuç: Shogaol'ün antioksidan kapasitesinin yüksek olduğu; hCA I, hCA II, AChE, BChE, α-glikozidaz enzimlerini etkili bir şekilde inhibe ettiği; çalışılan kanser hücre hatlarında güçlü antiproliferatif etkiye sahip olduğu değerlendirilmektedir.

Abstract:
Purpose: In this thesis, the antioxidant capacity of Shogaol, which is in class the phenolic compounds, by several methods; its inhibition effect on human carbonic anhydrase I and II, acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, α-glycosidase, and α-amylase enzymes; and its antiproliferative effect on A-549 lung cancer, HT-29 colon cancer, MCF-7 and MDA-MB-453 breast cancer cell lines, 3T3-L1 mouse fibroblast normal cell line was investigated.
Method: In order to determining the antioxidant capacity of Shogaol, DPPH radical, ABTS radical and DMPD radical scavenging, Cu2+, Fe3+ and FRAP reduction methods were used. BHA, BHT and Trolox were used as standards. For enzyme studies, hCA I and hCA II isoenzymes were purified from human erythrocytes by Sepharose-4-B-L-Tyrosine-sulfanilamide affinity chromatography. Enzyme purity was checked by SDS-PAGE. Qualitative protein assay was performed by measuring absorbance at 280 nm spectrophotometrically. Also quantitative protein determinations were made by measuring absorbance at 595 nm. In addition, the inhibition effect of Shogaol towards hCA I, hCA II, acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, α-glycosidase, and α-amylase enzymes was examined. Moreover, cell counting was performed with the TBE method and cell viability was measured with the XTT method and the antiproliferative effect of Shogaol on A-549, HT-29, MCF-7, MDA-MB-453 and 3T3-L1 cell lines was investigated.
Findings: Shogaol demonsrated higher antioxidant capacity than BHA, BHT and Trolox used as standards in the FRAP method (concentration: 60 µg/mL), and higher than BHT in DPPH· scavenging method, and higher than Trolox in ABTS·+ scavenging, Cu2+ and Fe3+ reduction methods. hCA I and hCA II isoenzymes were purified 273 and 309 folds, 40.67 and 81.92% yield, respectively. A single band was observed for each isoenzymes and their molecular weights were found to be approximately 30 kDa. Shogaol exhibited effective inhibition effect against hCA I, hCA II, acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, α-glycosidase enzymes with IC50 values of 75.91, 47.04, 37.44, 24.11, 35.72 nM, respectively. Shogaol showed highest antiproliferative effect on HT-29 colon cancer cell line with an IC50 value of 8,38 µM. Shogaol had more effective antiproliferative effect than that of standard chemotherapeutic drug Carboplatin in A-549 lung cancer and HT-29 colon cancer cell line, and than the drug Docetaxel in MCF-7 breast cancer cell line. The selectivity index of Shogaol was found to be 14.83, 10.82, 2.42, 1.99 against HT-29, A-549, MCF-7, MDA-MB-453 cell lines, respectively. On the other hand, Carboplatin exhibited selectivity index of 0.46, 0.33, 1.30 and 0.94 against indicated cancer lines, respectively.
Results: It is considered that Shogaol has a high antioxidant capacity, and it effectively inhibits hCA I, hCA II, AChE, BChE, and α-glycosidase enzymes. Also, it has a strong antiproliferative effect on the studied cancer cell lines.