Sistein-S-sülfat ile tetiklenen hücre ölümünde korteks ve hipokampal nöronlarda kaspaz 3 bağımlı ve kaspaz bağımsız apopitotik sürecin in-vitro incelenmesi
In vitro investigation of caspase 3-dependent and caspase-independent apopitotic process in cortex and hypocampal neurons in cell death triggered with sistein-S-sulphate
Yazar: AYSEL ALPHAN
Danışman: PROF. DR. ESAT ADIGÜZEL ; PROF. DR. VURAL KÜÇÜKATAY
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Nöroloji = Neurology

Özet:
Sistein-S-Sülfat (SSC) toksisitesinin sülfit oksizdaz enzim eksikliği veya molibden kofaktör eksikliğindeki ağır nöropatolojinin nedeni olabileceğine dair Literatürde çalışmalar mevcuttur. SSC'nin nörotoksik etkisi gösterilmiş olup, apopitotik süreç aydınlatılmamıştır. Bu çalışmada, sekonder hipokampal (HT-22) ve primer kortikal nöron (PKN) dizilerinde SSC'nin tetikleyebileceği muhtemel kaspaz bağımlı ve bağımsız apopitotik mekanizmaların araştırılması amaçlanmıştır.
Bu amaçla HT-22 ve PKN dizilerinde LD50 değerlerini ve apopitotik indükleyici faktör (AIF), kalpain ve sitokrom c inhibitörlerinin güvenli dozlarını belirlemek ve inhibitörlerin SSC'nin toksisitesini baskılamadaki etkisini saptamak için sitotoksisite deneyleri yapıldı. Nöron dizilerine SSC eklenerek zamana bağlı indirgenmiş glutatyon (GSH) miktar analizi ile apopitozun tetiklenme anı saptandı. AIF, sitokrom c, kalpain ve kaspaz düzeyleri kolorimetrik olarak ölçüldü.SSC'nin LD50 değeri HT-22 için 150 µM, PKN için 155 µM olarak bulundu. Kalpain 1, AIF ve sitokrom c inhibitörlerinin, güvenli dozları PKN için sırası ile 10µM, 10nM, 20µM, HT-22 için 10µM, 10nM, 10µM saptandı. Zamana bağlı GSH ölçümlerinde SSC eklenmiş PKN dizilerinde 2-8 saatlik zaman diliminde GSH miktarının arttığı, 8-16 saatlik zaman diliminde azaldığı gözlendi. HT-22 dizilerinde 2. ve 8. saatte SSC eklenmiş gruplarda kontrol grubuna göre GSH miktarının arttığı saptandı. PKN dizilerinde kalpain, AIF, sitokrom c ve kaspaz 3 miktarının, HT-22 dizilerinde ise AIF ve kalpain miktarlarının kontrol gruplarına göre daha fazla olduğu belirlendi. AIF, sitokrom c ve kalpain inhibitörlerininin SSC'nin toksik etkisini azalttığı bulundu.
Bu tezde SSC ile indüklenen apoptozisin HT-22 hücre hattında AIF, kalpain aktivitesini arttırarak kaspaz bağımsız yolak ile indüklendiği gösterildi. PKN hücre hattında ise SSC etkisinin AIF, sitokrom c ve kalpain ve kaspaz 3 aktivitesini arttırarak kaspaz bağımlı (sitokrom c, kaspaz 3 aktivitesi) ve bağımsız (AIF, kalpain aktivitesi) yolakla apoptozisi indüklediği gösterildi. Apoptoz inhibitörlerininin SSC kaynaklı nörotoksisteye karşı tedavi yöntemleri geliştirilmesinde kullanılabileceği sonucuna varıldı.

Abstract:
There are studies in literature that cysteine-S-Sulfate (SSC) toxicity may be the cause of severe neuropathology in sulfite oxysdase enzyme deficiency or molybdenum cofactor deficiency. The neurotoxic effect of SSC has been demonstrated, but the apoptotic process has not been elucidated. In this study, it was aimed to investigate the possible caspase-dependent and independent apoptotic mechanisms that SSC can trigger in the secondary hippocampal (HT-22) and primary cortical neuron (PKN) lines.
For this purpose, cytotoxicity experiments were performed to determine the LD50 and the safe doses of apoptotic inducing factor (AIF), calpain and cytochrome c inhibitors in HT-22 and PKN arrays, and to determine the effect of inhibitors on suppressing the toxicity of SSC.
Triggering time of apoptosis was determined via time-dependent reduced glutathione (GSH) quantification analysis by adding SSC to neuron lines. AIF, cytochrome c, calpain and caspase levels were measured colorimetrically.
The LD50 value of SSC was found to be 150 µM for HT-22 and 155 µM for PKN. Safe doses of Kalpain 1, AIF and cytochrome c inhibitors were found to be 10µM, 10nM, 20µm respectively for PKN cell line, 10µM, 10nm, 10µM for HT-22 cell line. In time-dependent GSH measurements, it was observed that the amount of GSH increased in PKN sequences with SSC added over a 2-8-hour time period and decreased over an 8-16-hour time period. It was found that the amount of GSH increased in the groups with SSC added at the second and eighth hours in the HT-22 cell line compared to the control group. It was determined that the amount of calpain, AIF, cytochrome C and caspase 3 in the PKN cell line and the amounts of AIF and calpain in the HT-22 sequences were higher than those of the control groups. It was found that AIF, cytochrome c and calpain inhibitors reduced the toxic effect of SSC. 
In this thesis, it was demonstrated that SSC-induced apoptosis was induced by a caspase-independent pathway by increasing AIF, calpain activity in the HT-22 cell line. On the other hand, in PKN cell line, it was shown that SSC effect induced apoptosis by increasing AIF, cytochrome c and calpain and caspase 3 activities, by caspase dependent (cytochrome c, caspase 3 activity) and independent (AIF, calpain activity) pathways. It was concluded that apoptosis inhibitors can be used in the development of treatment methods against SSC-induced neurotoxicity.