Deneysel fare modelinde subkutan endometriotik implantlar üzerinde metformin ve genireliksin etkisi
The effect of metformin and genirelix on subcutaneous endometriotic implants in an experimental mouse model
Yazar: GAMZE ÜNAL
Danışman: PROF. DR. ALİ ÇETİN
Cumhuriyet Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology
Dizin: Endometriyoz = Endometriosis ; Fareler = Mice ; Genireliks = Genirelix ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Metformin = Metformin ; Otofaji = Autophagy

Özet:
Endometriozis, endometrium dokusunun uterin kavite dışında olduğu, östrojen bağımlı, sıklıkla ağrı, pelvik ağrı, disparoni,dismenore ve infertiliye neden olabilen, üreme çağındaki kadınların %10 'unda görülen patolojisi net olarak açıklanamayan bir hastalıktır. Otofaji  uzun ömürlü proteinlerin, fonksiyonu bozulmuş organellerin, sitozolik parçaların, hasarlı makromoleküllerin ve patojenlerin yok edilmesinden sorumlu fizyolojik bir olaydır. Hücresel içeriğe bağlı olarak apoptozisin yetersiz kaldığı koşullarda otofaji ile hücre ölümü olmaktadır. Endometiozis hastalarının tedavisinde ilk amaç ise hastalığa bağlı ağrıyı ortadan kaldırmak ve hastaların hayat kalitesini artırmaktır. Endometriozis  tedavisinde yeni ilaç çalışmaları hala devam etmektedir. Hastalığın geriletilmesi, ortaya çıkmadan yok edilmesi hala araştırmaya açık konulardır. Bu çalışma ile PCOS, diyabetes mellitus gibi hastalıklarda sık kullanılan bir ilaç olan metforminin  deneysel fare modelinde oluşturulan subkutan endometriotik dokulardaki etkinliğini araştırmaktır. Bu çalışma ağırlıkları 20-30 gram arasında değişen 10 adet mice kullanılarak Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları laboratuvarında yapılmıştır. 40 adet  mice otolog endomiyometriyal dokuları mice cilt altına  oldukça vasküler olan yüzeye transplante edilerek endometriyotik lezyonlar oluşturulmuştur.  Her grupta 8 hayvan olmak üzere 5 grup oluşturulmuştur. Gruplardan biri kontrol grubu olarak ayarlanmıştır. Metformin  tedavisi bir gruba operasyondan 24 saat sonra hayvanların içme sularına katılarak uygulanmaya başlandı  ve çalışma sonuna kadar devam ettirilmiştir. Genireliks uygulaması bir gruba operasyondan 24 saat sonra başlanmak üzere 10 mgr/kg olmak üzere çalışma sonuna kadar devam ettirilmiştir. Bir gruba metformin operasyondan 7 gün sonra içme sularına katılmak üzere başlanmış ve çalışma sonuna kadar devam ettirilmiştir. Genireliks bir gruba 10mgr/kg  operasyondan 7 gün sonra başlandı ve çalışma sonuna  kadar devam ettirilmiştir. Operasyonundan 2 hafta sonra ikinci operasyon yapılıp endometriyotik lezyonlar değerlendirilmiştir. Tedavi gruplarındaki lezyon regresyon oranları kontrol grubuna göre kıyaslanmıştır.
Elde edilen dokular, daha önceden steril edilmiş ve etiketlenmiş 1.5 mL'lik eppendorf tüpe alındı ve üzerlerine 1 mL Ribo Saver (Gene All, Seoul, Korea) çözeltisi eklendi. Total RNA izolasyonu yapılıncaya kadar -80 0C de saklandı. Her bir gen bölgesi için mesajcı RNA (haberci, mRNA) expresyonu miktarlarının belirlenmesinde,  Aktin Beta (ACTB) referans geni  expresyonu referans olarak kullanıldı. Projede belirlenen genlerin analizleri yapıldı.
Metformin 1. gün, metformin 7. gün, genireliks 1. gün, genireliks 7. gün gruplarının Beclin2 gen ifadelenme katsayıları kontrol grubu katsayısı ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak azalmış bulundu.
Metformin 1. gün, metformin 7. gün, genireliks 1. gün, genireliks 7. gün gruplarının Beclin1 gen ifadelenme katsayıları kontrol grubu katsayısı ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak azalmış bulundu.
Metformin 1. gün, metformin 7. gün  gruplarının  LC3BII gen ifadelenme katsayıları kontrol, genireliks 1. gün ve genireliks 7. gün gruplarının LC3BII gen ifadelenme katsayıları ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak azalmış bulundu.
Metformin 1. gün, metformin 7. gün, genireliks 1. gün ve genireliks 7. gün  gruplarının katenin-beta CateninB gen ifadelenme katsayıları kontrol grubunun gen ifadelenme katsayısı ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak azalmış bulundu.
Genireliks 24. saat grubunun TCF gen ifadelenme katsayısı kontrol, metformin 1. gün, metformin 7. gün ve genireliks 7. gün  gruplarının gen ifadelenme katsayısıları ile karşılaştırıldığında azalmış olduğu bulundu.
Metformin 7. gün grubunun WNT2 gen ifadelenme katsayısı kontrol, metformin 1. gün , genireliks 1. gün  ve genireliks 7. gün  gruplarının gen ifadelenme katsayıları ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak yüksek bulundu.
Otofaji, tüm ökaryotik hücrelerde homeostazı koruyan bir olaydır. Son çalışmalar, endometrioziste anormal bir otofajik aktivite olduğunu göstermektedir, ancak otofajinin rolü hala tartışılmaktadır.
         Otofajik biyobelirteçler olan Beclin1, Beclin2, LC3BII genlerine bakıldığında yaptığımız analiz sonucunda istatistiksel olarak anlamlı ifadeler bulduk. Bu genler otofaji yolağında aktif olarak görev alan genler olduğu için, endometrioziste metformin kullanımının otofaji temelli bir baskılama mekanizması oluşturabileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
An estrogen dependent disease in which the endometrial tissue is outside the uterine cavity, endometriosis often causes pain, pelvic pain, dyspareunia, dysmenorrhea and infertility, and is seen in 10% of women of reproductive age and its pathology has not been able to be clearly explained yet. Autophagy is a physiological event responsible for the destruction of long-lived proteins, dysfunctional organelles, cytosolic parts, damaged macromolecules and pathogens. Depending on the cellular content, autophagy leads cell death in conditions where apoptosis is insufficient. The first goal in the treatment of endometriosis patients is to eliminate the pain associated with the disease and to increase the patients' quality of life. New drug studies are still ongoing in the treatment of endometriosis. The regression of the disease and its eradication before it emerges are still open to research. The aim of this study is to investigate the efficacy of metformin, a drug commonly used in diseases such as pcos and diabetes mellitus, in subcutaneous endometriotic tissues created in an experimental mouse model. This study was conducted in Cumhuriyet University Faculty of Medicine Experimental Animals Laboratory using 10 mice whose weights range between 20-30 grams. Endometriotic lesions were formed by transplanting 40 autologous endomiometrial mice tissues under the skin to a highly vascular surface. 5 groups, in each of which there were 8 animals, were formed. One of the groups was set as the control group. Metformin treatment was applied in one group 24 hours after the operation by adding it to the drinking water of the animals and continued until the end of the study. Genirelix was applied 24 hours after the operation in one group and continued until the end of the study at an amount of 10 mg/kg. Metformin was applied in one group by adding it to drinking water 7 days after the operation and continued until the end of the study. Genirelix was applied 7 days after the operation at an amount of 10mgr/kg in one group and continued until the end of the study. Two weeks after the operation, a second operation was performed and endometriotic lesions were evaluated. Lesion regression rates in the treatment groups were compared to the control group.
The tissues obtained were taken into a 1.5 mL pre-sterilized and labelled eppendorf tube and 1 mL of Ribo Saver (Gene All, Seoul, Korea) solution was added to them. They were kept at -80 ° C until Total RNA isolation was made. Actin Beta (ACTB) reference gene expression was used as a reference in determining the amount of messenger RNA (messenger, mRNA) expression for each gene region. The genes determined in the project were analyzed.
Beclin2 gene expression coefficients of metformin 1st  day, metformin 7th  day, genirelix 1st  day and general 7th  day groups were found to have significantly decreased compared to the control group coefficient.
Beclin1 gene expression coefficients of metformin 1st  day, metformin 7th  day, genirelix 1st  day, genirelix 7th  day groups were found to have significantly decreased compared to the control group coefficient.
LC3BII gene expression coefficients of metformin 1st  day and metformin 7th day groups were found to have significantly decreased compared to LC3BII gene expression coefficients of control, genirelix 1st day, and genirelix 7th day groups.
The catenin-beta CateninB gene expression coefficients of metformin 1st  day, metformin 7th  day, genirelix 1st  day and genirelix  7th  day groups were found to have significantly decreased compared to the gene expression coefficient of the control group.
The TCF gene expression coefficient of the Genireliks 24th  hour group was found to have decreased compared to the control, metformin 1st  day, metformin 7th  day and genirelix  7th  day groups.
The WNT2 gene expression coefficient of the metformin 7th  day group was found to be significantly higher compared to the control, metformin 1st day, genirelix 1st  day and genirelix 7th  day groups.
Autophagy is a survival process that maintains homeostasis in all eukaryotic cells. Recent studies have shown an abnormal autophagic activity in endometriosis, but the role of autophagy is controversial.
When the autophagic biomarkers Beclin1, Beclin2, LC3BII genes were looked into, we found statistically significant expressions as a result of our analysis. Since these genes are actively involved in the autophagy pathway, we think that the use of metformin in endometriosis might create an autophagy-based suppression mechanism.