Pankreatik beta hücre farklılaşmasında moleküler enerji algılayıcıları ve metabolik değişimlerin rolü
The role of molecular energy sensors and metabolic changes in pancreatic beta cell differentiation
Yazar: ERTAN ÇELİK
Danışman: PROF. DR. SELDA OKTAYOĞLU
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases

Özet:
Bu tez çalışmasının amacı, klinikte insülin direnci tedavisinde sıklıkla kullanılan metformin'in doğal bir şeker olan glukoz veya yapay bir tatlandırıcı olan aspartam ile birlikte pankreatik adacık kaynaklı progenitör hücre (PAK-PH)'lere uygulanarak, bu maddelerin in vitro ortamda beta hücre farklılaşması üzerine etkisinin olup olmadığının araştırılması ve olası moleküler mekanizmanın ortaya konmasıdır. Glukoz ve/veya aspartam ve/veya metformin varlığında meydana gelen PAK-PH'lerin beta hücrelerine farklılaşması ile ilgili sinyal yolağının tatlı tat reseptörü ile uyarılan, moleküler enerji algılayıcıları ile etkileşen ve aynı zamanda kök hücre karakterlerinin korunmasında önemli olduğu bilinen Warburg etkisini ortadan kaldıran bir yolak olabileceğini düşünerek çalışmamızı mitokondri merkezli metabolik değişimler üzerine odakladık.
Beta hücre farklılaşmasının tespiti için insülin ve reaktif oksijen türleri (ROS) üreten hücreler akım sitometri yöntemi ile belirlendi. Ayrıca, insülin üreten hücreler immuohistokimyasal olarak işaretlendi. Bu farklılaşma mekanizmasında GLUT1'in rolünü göstermek amacıyla hücrelere özgün GLUT1 inhibitörü olan WZB117 uygulandı. NGN3, PAX4, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, INS2, GLUT2, Hekzokinaz ve laktat dehidrojenaz A genlerinin ekspresyon seviyeleri ters çevrim-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) metoduyla gösterildi. Hücre metabolizması ile ilgili fikir sahibi olabilmek için laktat, NAD+/NADH, NADP+/NADPH ve hücre içine glukoz alımı seviyeleri kolorimetrik yöntemle ölçüldü. Mitokondriyal kütle mitotracker green işaretlemesi ile fluorometrik olarak belirlendi. Ayrıca, GLUT1, MDH2, UCP2, Sitrat Sentaz,T1R2, T1R3, PLCβ2, CAMKK2, LKB1, p-AMPK(Thr172), p-Akt(Th308)/(S473), Akt, p-mTOR(Ser2448) ve FOXO1 seviyelerindeki değişimler western emdirimi tekniği ile ölçüldü. Hücre içi Ca+2 seviyelerindeki değişiklikler fluorometrik yöntemle belirlendi ve hücreler fluoresanss mikroskop ile görüntülendi. Tüm bu işlemler sonucunda elde ettliğimiz bulgular ve ulaştığımız sonuçlar aşağıda listelenmiştir:
Aspartam ve aspartam+glukoz uygulanmasının istatistiksel olarak anlamlı oranlarda beta hücre farklılaşmasına neden olduğu, metformin'in tek başına veya diğer uyaranlarla birlikte uygulanmasının ise daha yüksek oranda beta hücre farklılaşmasını sağladığı tespit edilmiştir.
GLUT1 inhibisyonunun metformin+aspartam ve metformin+aspartam+glukoz gruplarında beta hücre farklılaşmasını baskıladığının tespit edilmiş olması aspartam ve metformin varlığında GLUT1'in beta hücre farklılaşmasında önemli bir rol oynadığını göstermektedir.
Beta hücre farklılaşması sırasında anaerobik glikolizden oksidatif fosforilasyona geçiş şeklinde gerçekleşen bir metabolik yeniden programlanma söz konusudur. Özellikle glukoz ile aspartam ve aspartam+glukoz gruplarında kontrol grubuna daha yakın bir metabolik profilin gözlenmesi bu gruplarda farklılaşan hücrelerin yanı sıra PAK-PH'lerin sayıca fazla olabileceğini düşündürmektedir.
Metformin uygulanan tüm gruplarda uygulanmayan gruplara göre mitokondriyal kütlede artış gözlense de bu artış yalnızca glukoz+metformin ve aspartam+glukoz+metformin gruplarında istatistiksel olarak anlamlıydı, en belirgin artışın aspartam+glukoz+metformin grubunda meydana geldiği ve UCP2'nin mitokondriyal kütle ile paralel değişim gösterdiği belirlendi.
Metformin+aspartam+glukoz grubu hariç T1R2 alt ünitesinin seviyelerinin korunuyor olması sinyalin baskın olarak bu alt ünite aracılığıyla algılandığını düşündürmektedir.
Aspartam grubunda sitoplazmik Ca+2 seviyeleri kontrol grubuna kıyasla düşük olsa da Ca+2 ile aktive olan CAMKK2'nin belirgin olarak artmış olması sitoplazmada tatlı tat sinyalini iletmeye yetecek kadar Ca+2'nin bulunduğunu düşündürmektedir. Bu grupta PLCβ2 seviyesinin korunması da tatlı tat sinyalinin tamamen baskılanmadığının diğer bir göstergesidir.
Metformin uygulanan gruplarda en belirgin değişiklik sitoplazmik PLCβ2 ve Ca+2 seviyelerinin belirgin olarak azalmasıdır. Buna karşın, yalnızca metformin uygulanan grupta CAMKK2 aracılığı ile artan AMPK aktivasyonu dikkat çekmektedir.
Glukoz+metformin grubunda aktif AMPK seviyelerinin değişmemesi ve aktif AKT seviyelerindeki azalmaya karşın artan mTOR aktivasyonun yüksek seviyede bulunan glukoz aracılığıyla meydana gelmesi olasıdır.
Metformin ve metformin+glukoz gruplarında FOXO1 seviyeleri artmakta ve bu antioksidan savunmaya işaret etmektedir.

Abstract:
The aim of this thesis study is to evaluate the effects of metformin, which is commonly used in the treatment of insulin resistance in clinical practice, with natural sugar glucose or artificial sweetener aspartame on beta cell differentiation from pancreatic islet-derived progenitor cells (PID-PC) in vitro and to determine the possible molecular mechanisms. The signaling pathway associated with the differentiation of PID-PCs into beta cells in the presence of glucose and/or aspartame and/or metformin might be sweet taste receptor-stimulated, molecular energy sensors interacted and also eliminates the Warburg effect, which is known to be important in maintaining stem cell characters. We have focused our study on mitochondrial metabolic changes based on this idea.
For the determination of beta cell differentiation, insulin and reactive oxygen species (ROS) producing cells were determined by flow cytometry. Insulin-producing cells were also immunohistochemically labeled. In order to demonstrate the role of GLUT1 in this differentiation mechanism, a spesific GLUT1 inhibitor WZB117 was applied to the PID-PCs. Expression levels of NGN3, PAX4, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, INS2, GLUT2, Hexokinase and lactate dehydrogenase A genes were demonstrated by the reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Lactate, NAD+/NADH, NADP+/NADPH and glucose uptake levels were measured by colorimetric methods. Mitochondrial mass was determined fluorometrically with mitotracker green staining. Furthermore, GLUT1, MDH2, UCP2, Citrate synthase, T1R2, T1R3, PLCβ2, CAMKK2, LKB1, p-AMPK (Thr172), p-Akt (Th308)/(S473), Akt, p-mTOR (Ser2448) and FOXO1 levels were measured by western blotting technique. Changes in intracellular Ca2+ levels were determined by fluorometric method and the cells were visualized by a fluorescence microscope. The findings and results we have obtained as a result of all these procedures and findings are listed below:
Aspartame and aspartame + glucose administration causes statistically significant beta cell differentiation, and metformin alone or in combination with other stimuli provides a higher rate of beta cell differentiation.
The fact that GLUT1 inhibition supress beta cell differentiation in the groups metformin+aspartame and metformin+aspartame+glucose indicates that GLUT1 plays an important role in beta cell differentiation in the presence of aspartame and metformin.
During beta cell differentiation, there is a metabolic reprogramming that takes place from anaerobic glycolysis to oxidative phosphorylation. The observation of a metabolic profile closer to the control in the groups especially glucose, aspartame and aspartame+glucose suggests that PID-PCs may be more numerous in these groups besides differentiated cells.
Although the increase in mitochondrial mass was observed in all metformin treated groups, this increase was statistically significant only in the groups glucose+metformin and aspartame+glucose+metformin. The most significant increase occurred in the group aspartame+glucose+metformin and UCP2 levels were in parallel with the mitochondrial mass.
Preservation of the levels of T1R2 subunit in the groups except of metformin+aspartame+glucose suggests that the signal is predominantly detected by this subunit.
Although the cytoplasmic Ca+2 level in the group aspartame was lower compared to the control group, the Ca2+-induced CAMKK2 increased significantly. This finding suggested that cytoplasmic Ca2+ concentration was enough to improve the sweet taste signal. In this group, maintaining the PLCβ2 level is another indication that the sweet taste signal is not completely suppressed.
The most significant change in metformin-treated groups is the marked decrease in cytoplasmic PLCβ2 and Ca2+ levels. However, increasing AMPK activation through CAMKK2 is noteworthy in only metformin-treated group.
It is possible that the preserved actived AMPK levels and increased mTOR activation may occur through high glucose in the group glucose+metformin.
FOXO1 levels increase in the groups metformin and metformin+glucose this indicates antioxidant defense.