Primer uveal melanom hücre serisinde radyoterapi, bevacizumab, kalsidiol ve kalsitriolün terapotik etkinliğinin karşılaştırmalı olarak incelenmesi
Comparative investigation of the therapeutic effectiveness of radiotherapy, bevacizumab, calcidiol, and calcitriol in primary uveal melanoma cell series
Yazar: ZEYNEP AKGÜN
Danışman: PROF. DR. MELİS PALAMAR ONAY
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases

Özet:
AMAÇ: Primer uveal melanom (UM) hücre serisinde radyoterapi (RT), 25-Hidroksivitamin D3, 1a,25- Dihidroksivitamin D3 ve bevacizumabın terapötik etkilerini karşılaştırmalı olarak incelemektir.
GEREÇ VE YÖNTEM: Çalışma, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı ve Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dalı'nda Göz Hastalıkları Anabilim Dalı'nın katkılarıyla gerçekleştirildi. UM hücre serisi MP41, %1 penisilin-streptomisin ve %10 fetal bovine serum içeren RPMI-1640 besiyeri kullanılarak kültüre edildi, 37°C'de %5 CO2 içeren etüvde çoğaltıldı.  Çalışmada RT, 25-Hidroksivitamin D3, 1a,25- Dihidroksivitamin D3, bevacizumab etken maddeleri ve bu etken maddelerin RT ile kombinasyonlarının MP41 hücreleri üzerindeki etkileri incelendi. Deney süresince canlı kalabilecek hücre sayısını belirlemek amacıyla proliferasyon deneyi ve etken maddelerin sitotoksik etkilerini ve hücrelerin %50'sini öldüren konsantrasyonlarını belirlemek amacı ile sitotoksisite analizlerinin yapılmasının ardından 10 ve 100 nM 25-Hidroksivitamin D3 ve1a,25- Dihidroksivitamin D3, 2,5-7,5mg/ml bevacizumab tek başına ve RT ile kombine şekilde hücrelere uygulandı. Radyasyonun MP41 hücreleri üzerindeki koloni oluşum etkisi, etken maddelerin tek başına ve RT ile kombine uygulandığında hücre döngüsü, apoptoz ve proliferasyonda meydana getirdiği etkiler incelendi.
BULGULAR: 25- Hidroksivitamin D3 ve 1a,25- Dihidroksivitamin D3'ün sitotoksik etki göstermediği, bevacizumabın ise doz ve süre bağımlı olarak sitotoksik olduğu saptanmıştır. Koloni oluşum deneyinde 3 Gy radyasyonun koloni sayısını %50 oranında azaldığı belirlenmiştir. Hücre proliferasyonunu ve ikilenme zamanını 25- Hidroksivitamin D3'ün etkilemediği, 1a,25-Dihidroksivitamin D3'ün ılımlı arttığı görülmüştür. Bevacizumabın konsantrasyon bağımlı olarak hücre prolifeasyonunun azaldığı saptanmıştır.RT ile kombine uygulanan 25-Hidroksivitamin D3'ün radyasyonun antiproliferatif etkinliğini azalttığı saptanmıştır. RT ile kombine 1a-25-Dihidroksivitamin D3 uygulanmasında 100 nM konsantrasyonunda, ikilenme zamanının (26,44±2,12) tedavisiz bırakılan kontrol grubuna kıyasla (27,86±1,75) arttığı saptanmıştır. RT ile kombine bevacizumab uygulanmasında ikilenme zamanının doz bağımlı olarak tek başına RT ve tek başına bevacizumab uygulanan gruplara göre kısaldığı saptanmıştır.
Annexin V/PI boyaması ile yapılan apoptoz analizlerinde 10 nM konsantrasyonunda 25- Hidroksivitamin D3 ve 1a,25- Dihidroksivitamin D3'ün etkisinin olmadığı saptanmıştır.100 nM konsantrasyonunda ise canlı hücre oranında 25- Hidroksivitamin D3'te daha bariz olmak üzere (canlı hücre oranı kontrol grubu/25- Hidroksivitamin D3 1a,25- Dihidroksivitamin D3:%90,2 / %77,9 / %86,9) ılımlı düşüş izlenmiştir. Bevacizumab 2,5 mg/ml ve 7,5 mg/ml konsantrasyonlarında kontrol grubuna (%87,1) kıyasla canlı hücre oranını azaltır iken, 5 mg/ml dozunda uygulandığında canlı hücre oranı %88,0 saptanmıştır. RT ile kombine uygulamada 25- Hidroksivitamin D3 ve 1a,25-Dihidroksivitamin D3'ün radyasyonun apoptotik etkisini (canlı hücre %64,1) azalttığı izlenirken bevacizumabın ise doz bağımlı olmayan katkı sağladığı saptanmıştır. Hücre döngüsü analizlerinde 25- Hidroksivitamin D3 ve 1a,25- Dihidroksivitamin D3'ün dağılımı değiştirmediği saptanmıştır. 
SONUÇ: Bu çalışma, bahsedilen etken maddelerin UM hücre serisi üzerinde araştırıldığı ilk çalışmadır. Bevacizumab UM MP41 hücre serisi üzerinde proliferasyonu inhibe etmede etkilidir, ayrıca klasik tedavi olan RT ile uygulandığında aditif etkisi mevcuttur. Elde edilen bulgular uygulanacak RT dozunu azaltmada bevacizumabın adjuvan kullanılması ile ilgili klinik çalışmalara ışık tutabilir. D vitaminin UM tedavisinde etkinliklerini inceleyen preklinik çalışmalarda ise sonuçlar çelişkili olup daha çok çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır.
ANAHTAR KELİMELER: 25-Hidroksivitamin D3, 1a,25- Dihidroksivitamin D3, Bevacizumab, Radyoterapi, Apoptoz, Hücre döngüsü, Sitotoksisite

Abstract:
PURPOSE: To compare the therapeutic effects of radiotherapy (RT), 25-Hydroxyvitamin D3, 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 and bevacizumab in primary uveal melanoma (UM) cell line.
METHOD: The study was conducted at Ege University Faculty of Medicine, Department of Medical Biology and Radiation Oncology, with the contributions of the Department of Ophthalmology. The UM cell line MP41 was cultured using RPMI-1640 medium containing 1% penicillin-streptomycin and 10% fetal bovine serum and maintained at 37°C in an incubator containing 5% CO 2 . The effects of RT, 25-Hydroxyvitamin D3, 1a,25-Dihydroxyvitamin D3, bevacizumab and their combinations with RT on MP41 cells were investigated. Proliferation assay and cytotoxicity analyzes were performed. After the procedure, 10 and 100 nM 25-Hydroxyvitamin D3 and 1a,25-Dihydroxyvitamin D3, 2.5-7.5mg/ml bevacizumab alone and in combination with RT were treated. Colony formation effect of radiation on MP41 cells, effects of active substances alone or in combination with RT on cell cycle, apoptosis and proliferation were investigated.
RESULTS: 25- Hydroxyvitamin D3 and 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 were found to be non-cytotoxic, while bevacizumab was found to be dose- and time-dependent cytotoxic.
In the colony assay, it was determined that 3 Gy radiation reduced the number of colonies by 50%. It was observed that 25-Hydroxyvitamin D3 did not affect cell proliferation and doubling time, and 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 increased moderately. Bevacizumab has been found to decrease concentration-dependent cell proliferation. It has been obseerved that 25-Hydroxyvitamin D3 combined with RT reduces the antiproliferative effect of radiation. In the application of 1a-25-Dihydroxyvitamin D3 combined with RT, at 100 nM concentration, the doubling time (26.44±2.12) was increased compared to the untreated control group (27.86±1.75). It was determined that bevacizumab combined with RT shortened the doubling time in a dose-dependent manner, compared to the groups treated with RT alone and bevacizumab alone. In apoptosis analyzes performed with Annexin V/PI staining, it was determined that 25-Hydroxyvitamin D3 and 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 had no effect at 10 nM concentration. At 100 nM concentration, a moderate decrease was observed in cell viability, more clearly at 25-Hydroxyvitamin D3. While bevacizumab reduces cell viability at 2.5 mg/ml and 7.5 mg/ml concentrations compared to the control group (87.1%), it does not affect it at 5 mg/ml. In combination with RT, 25-Hydroxyvitamin D3 and 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 were observed to reduce the apoptotic effect of radiation, while bevacizumab provided a dose-independent effect. 25-Hydroxyvitamin D3 and 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 have no effect on cell cycle analyzes.
CONCLUSION: The presented study is the first to investigate the effects of 25-Hydroxyvitamin D3, 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 and bevacizumab in UM cell line in comparison with RT. Bevacizumab is effective in inhibiting proliferation on the UM MP41 cell line, and has an additive effect when combined with RT. The findings may shed light on clinical studies on the adjuvant use of bevacizumab in reducing the dose of RT. In preclinical studies investigating the effects of vitamin D on UM, the results are inconsistent and more studies are needed.
KEYWORDS: 25-Hydroxyvitamin D3, 1a,25-Dihydroxyvitamin D3, Bevacizumab, Radiotherapy, Apoptosis, Cell cycle, Cytotoxicity