Glutensiz diyete uyan çölyaklı gebelerde gliadine karşı plasental immün yanıtın sağlıklı gebelerle karşılaştırılması
Placental immune response to gliadin in diet compliant celiac patients
Yazar: BURCU VOLKAN
Danışman: PROF. DR. DENİZ ERTEM
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Gastroenteroloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Yan Dal Uzmanlık, 2014
Konu: Gastroenteroloji = Gastroenterology
Dizin: Diyet = Diet ; Gebelik = Pregnancy ; Gliadin = Gliadin ; Glutenler = Glutens ; Plasenta = Placenta ; Çölyak hastalığı = Celiac disease ; İmmünite = Immunity

Özet:
Giriş ve amaç: Çölyak hastalığında diet tedavisine uyulmadığı durumlarda geçikmiş menarş, amenore, erken menapoz, tekrarlayan düşükler, infertilite ve hamilelikle ilgili problemler gibi reprodüktif sistemle ilgili olumsuz etkiler görülmektedir. Son bilgilerin ışığında reprodüktif sistemle ilgili problemlerin mekanizması net değildir. Besin ve vitamin eksikliğine bağlı malabsorbsiyonun katkısının yanında gliadinin indüklediği inflamasyon ve plasental hücrelerin apoptozu da fetal büyümeyi etkileyebilir. Çalışmanın amacı, glutensiz diyet tedavisine uyumlu çölyak hastalarından elde edilen desidual mononükleer hücrelerin, gliadin antijenine immün yanıtının değerlendirilmesidir. 

Yöntem: Diyetine uyumlu çölyak hasta plasentalarının desidual lökosit popülasyonu (CD3+ T lenfosit, CD4+ T lenfosit, CD8+ T lenfosit, CD3+CD16+CD56+ NK-T hücre, CD16+CD56+ NK hücre) akım sitometrisi ile sayıldı. İmmünhistokimyasal boyama ile desiduada bulunan CD3+, CD4+, CD8+, CD16+ ve CD56+ lenfositler değerlendirildi. Ekstravillöz trofoblastlarda, fetüsün implantasyonu için önemli olan HLA-G molekülünün ekspresyonu immünhistokimyasal boyama ile değerlendirildi. Desidual mononükleer hücreler pt-gliadin (enzimatik olarak parçalanmış gliadin), fitohemaglütinin (PHA) yada pt-gliadin+PHA ile uyarılarak 72 saat kültüre alındı ve lenfositlerin aktivasyonunu gösteren CD69 molekülü ekspresyonu akım sitometrisi ile ölçüldü. Kültür süpernetanlarında salgılanan Th1 (IFN-γ IL-15, IL-17), Th2 (IL-4, IL-10) sitokinleri ve sHLA-G ELISA yöntemi ile ölçüldü. Kontrol grubuna alınan plasentalar, yaş ve gebelik haftası ile uyumlu sağlıklı hamilelerden elde edildi.

Bulgular: Onaltı gebe (8 çölyak hastası, 8 sağlıklı kontrol) çalışmaya dahil edildi. Doğum yapılan gestasyon haftası ve doğan bebeklerin tartısı açısından hasta ve kontrol grubu arasında fark saptanmadı. Akım sitometrisi ile değerlendirildiğinde CD3+, CD4+, CD8+ T lenfosit, NK-T hücre ve NK hücre yüzdeleri açısından iki grup arasında anlamlı bir fark saptanmadı. Desidual lökositlerin immünhistokimyasal boyama sonucunda CD16+ NK hücre sayısı hasta grubunda anlamlı derecede yüksek saptandı (p=0.007), CD3+, CD4+, CD8+ T lenfosit ve CD56+ NK hücre sayıları açısından ise fark saptanmadı. Kontrol grubunda CD3+ T hücrelerinin  pt-gliadin + PHA uyarımı sonrasında, CD69 ekspresyonu hasta grubuna göre anlamlı derecede arttığı izlendi (p=0.038), NK ve NK-T hücrelerinin uyarımı sonrasında ise iki grup arasında anlamlı bir fark saptanmadı. Hasta grubunda pt-gliadin ile uyarım sonrasında NK hücrelerin CD69 ekspresyonu, NK-T hücrelerine göre anlamlı derecede fazla olduğu görüldü (p=0.03). Desidual mononükleer hücrelerden pt-gliadin ile uyarımı sonrası salgılanan IL-10, IFN-γ, IL-15 seviyeleri çölyak hastalarında kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek saptandı (p=0.028, p=0.01 ve p=0.01). IL-4, IL-17 ve sHLA-G salgılanması açısından iki grup arasında anlamlı bir fark saptanmadı. Ektravillöz trofoblastların HLA-G ekspresyonunun immünhistokimyasal değerlendirilmesi sonucunda iki grup arasında fark saptanmadı.

Sonuç: Çölyak hasta plasentasından izole edilen desidual lökosit kompozisyonunun sağlıklı kontrollerden farklı olduğunu ve hasta grubunda CD16+ NK hücrelerinin anlamlı olarak arttığı saptandı. Desidual lökositler gliadinle uyarıldığında kontrol grubunda CD3+ T lenfositler, NK ve NK-T hücreleri aktive olurken, çölyak plasentasında ise sadece NK hücreleri aktive oldu. İzole edilen desidual lökositlerin gliadinle uyarılması sonucunda çölyaklı hastalara ait plasentada IFN-γ, IL-15 ve IL-10'nun daha fazla salgılandığı, gebeliğin devamı için zararlı ortam oluşturan CD16+ NK hücrelerin sayısının ve aktivitesinin artmış olduğu görüldü. IFN-γ ve IL-15 gibi inflamatuar sitokinlerin fazla salgılandığı çölyak plasentasında artan Th1 yanıtın kaynağının NK hücreleri olduğu  düşünüldü.

Anahtar kelimeler : Çölyak hastalığı, gebelik, plasenta, gliadin, immün yanıt

Abstract:
Objectives and study: Celiac disease is associated with reproductive disorders such as delayed menarche, amenorrhea, early menopause, recurrent abortions, infertility and adverse pregnancy outcome in patients who are not compliant to gluten free diyet (GFD). The current knowledge regarding the pathogenesis of reproductive problems is still obscure. Nutrient and vitamin deficiency secondary to malabsorption may impair fetal growth as well as gliadin induced inflammation and apoptosis of the placenta. The aim this study was to evaluate immune response of the decidual mononuclear cells, isolated from GFD compliant celiac patients to gliadin. 

Methods: Decidual leucocyte population (CD3+ T lymphocytes, CD4+ lymphocytes, CD8+ lymphocytes, CD3+CD16+ CD56+ NK-T cells, CD56+CD16+ NK cells) isolated from placenta of GFD compliant celiac patients, was assessed by flow cytometry. Desidual mononuclear cells (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD56+) were assessed by immunohistochemistry staining. Expression of HLA-G (which is important for the implantion of the fetus was determined) on the extravillous cytotrophoblasts was determined by immunohistochemistry. Decidual mononuclear cells were cultured with pt-gliadin (digested gliadin), phytohemaglutinine (PHA) or pt-gliadin+PHA for 72 hours, and expression of CD69, which shows the activation of lymphocyte, was assessed by flow cytometry. Subsequently, secretion of Th1 (IFN-γ IL-15, IL-17), Th2 (IL-4, IL-10) cytokines and, sHLA-G were measured by ELISA. Control placentas were obtained from healthy pregnant women who were matched for age and parity. 

Results: Sixteen pregnant women (8 celiac patients, 8 healthy controls) have participated in this study. There was no difference between the patients and controls regarding gestational age and birth weight of the newborns. Flow cytometric analysis of CD3+, CD4+, CD8+ lymphocytes, NK-T and  NK cells did not vary significantly between celiac patients and controls. Immunohistochemistrical analysis of desidual leucocyte population, the number of CD16+ NK cells were significantly higher in celiac plasentas than control (p=0.007) but CD3+, CD4+, CD8+ T lymphocytes and CD56+  NK cells did not vary significantly between two groups. In control placenta, the percentage of CD3+ T cells expressing CD69 activation molecule was significantly increased after exposure to pt-gliadin+PHA (p=0.03), however expression of CD69 activation molecule on NK and NK-T cells did not vary between two groups. In celiac placenta, NK cells were activated more than NK-T cells after exposure to pt-gliadin (p=0.03). Pt-gliadin stimulated IL-10, IFN-γ and IL-15 secretion from cultured decidual mononuclear cells of celiac women were significantly higher than control group (p=0.028, p=0.01, p=0.01 respectively).  Secretion of IL-4, IL-17 and sHLA-G did not vary significantly between celiac patients and controls. There was no difference in pattern of HLA-G expression on extravillous trophoblast with immunohistochemistry analysis between two groups. 

Conclusion:  Decidual leucocyte composition, isolated from celiac placeta was different from control placenta and CD16+ NK cells were were significantly higher in celiac plasentFas than control. The CD3+ T lymphocytes, NK cells and NK-T cells, isolated from the decidua were activated after antigenic stimulation in both patients and controls, however decidual NK cells were activated more than NK-T and CD3+ cells after gliadin stimulation in celiac patients. In celiac placentas, pt-gliadin stimulated IL-10, IFN-γ and IL-15 secretion from cultured decidual mononuclear cells were significantly higher than controls. It is thought that NK cells are responsible for the increased Th1  response in celiac placenta in which inflammatory citokines like IFN- and  IL-5 are secreted in high amounts.

Key words: Celiac disease, pregnancy, placenta, gliadin, immune response