İnsan makrofajlarında nitrik oksit sentaz 2 (NOS2) ifade ve aktivitesinin bazal benzeri meme kanseri hücrelerinden üretilen faktörler varlığında incelenmesi
Investigation of nitric oxide synthase 2 (NOS2) expression and activity in human macrophages in the presence of factors produced from basal-like breast cancer cells
Yazar: GÖZDE BİLİR
Danışman: PROF. DR. GÜNEŞ ESENDAĞLI ; DR. ÖĞR. ÜYESİ NEŞE ÜNVER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı / Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Hücre dizisi = Cell line ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Makrofajlar = Macrophages ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Nitrik oksit sentazlar = Nitric oxide synthases

Özet:
Makrofajlar patojenlere karşı immün cevapta doğal immünitenin 
önde gelen hücreleridir ve kazanılmış bağışıklık cevaplarının düzenlenmesinde rol alırlar. 
Mikrobisidal özelliğe sahip makrofajlar LPS gibi bakteriyel ürünler, IFN-γ veya TNF-α gibi 
sitokinlerle uyarılarak proinflamatuvar cevabı ilerletirler. Nitrik oksit (NO) ve reaktif oksijen 
türleri (ROT) üretimi anti-mikrobiyal yanıtların biyokimyasal mekanizmasında elzemdir. NO 
üretimi nitrik oksit sentaz (NOS) enzimleri tarafından sağlanır. Uyarılabilir NOS izoformu 
(NOS2)'nin fare makrofajlarındaki varlığı pek çok çalışma ile kanıtlanmışken, insanlarda 
NOS2 ifadesine ve NO üretim düzeyine dair pek çok çelişkili yayın bulunmaktadır. Bu tez 
çalışması, monosit-makrofaj dönüşümü sırasında bazal-benzeri meme kanseri 
hücrelerinden üretilen faktörlerin miyeloid hücrelerin geçirdiği aktivasyon ve farklılaşma 
süreçleri sırasında NOS2 ifadesini ve NO değiştirebilmesi hipotezine dayanmaktadır. Bu 
amaçla, THP-1 monositik hücre hattı, bazal-benzeri meme kanseri hücre hattı 
süpernatanları varlığında makrofaj yönünde farklılaştırıldı ve lipopolisakarit (LPS) ve 
interferon (IFN)-γ ile uyarıldı. Hücrelerde fenotipik (CD14, TLR4, MD2, CD40, CD11c ve 
IFNγR), fonksiyonel (ROT ve NO üretimi) ve morfolojik (May-Grünwald Giemsa, aktin hücre 
iskeleti boyaması) farklılaşma parametreleri incelendi. Ayrıca, THP-1 hücrelerinin bu 
koşullarda farklılaştırılması sırasında fibronektin ve Matrijel kaplı yüzeyler ile de deneyler 
gerçekleştirildi. Bu koşullar altında NOS2 ifade düzeyi mRNA ve protein düzeyinde 
araştırıldı. Fare kökenli makrofaj ve meme kanseri hücreleri varlığında ve ek olarak 
kullanılan insan hücre hatları süparnatanları varlığında doğrulama deneyleri gerçekleştirildi. 
İnsan bazal-benzeri meme kanseri hücre hattı prototipi olarak kullanılan MDA-MB-231 
hücrelerinden salgılanan faktörler varlığında farklılaştırılan THP-1 hücrelerinde ROS ve NO 
üretiminin moldüle olduğu belirlendi. Kanser süpernatanları varlığında LPS'nin etkisinin 
sınırlanabildiği ancak IFN-γ'nın daha belirgin etkisi olduğu izlendi. İnsan NOS2 düzeylerinin 
meme kanseri süpernatanları varlığında olumsuz etkilendiği ve bunun NO üretimine de 
yansıdığı belirlendi. Elde edilen bulgular, özellikle kanser hücresinden salgılanan faktörler 
varlığında insan NOS2 ifadesinin ve dolayısı ile NO üretiminin monosit-makrofaj faklılaşma 
derecesine bağlı olarak transkripsiyon-translasyonel düzeylerde düzenlenebileceğine işaret 
etmektedir.

Abstract:
Macrophages are the leading cells of innate immunity in the 
immune response against pathogens and are involved in the regulation of adaptive immune 
responses. Macrophages with microbicidal properties promote the proinflammatory response by 
stimulating bacterial products such as LPS, cytokines such as IFN-γ or TNF-α. Production of nitric 
oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) is essential in the biochemical mechanism of 
antimicrobial responses. NO production is provided by nitric oxide synthase (NOS) enzymes. 
While the existence of the inducible NOS isoform (NOS2) in mouse macrophages has been 
proven by many studies, there are many conflicting publications on NOS2 expression and NO 
production level in humans. This thesis is based on the hypothesis that factors produced from 
basal-like breast cancer cells during monocyte-macrophage transformation can change NOS2 
expression and NO during the activation and differentiation processes of myeloid cells. To this 
end, the THP-1 monocytic cell line was differentiated into macrophage in the presence of basallike breast cancer cell line supernatants and stimulated with lipopolysaccharide (LPS) and 
interferon (IFN)-γ. The phenotypic (CD14, TLR4, MD2, CD40, CD11c and IFNγR), functional (ROT 
and NO production) and morphological (May-Grünwald Giemsa, actin cytoskeleton staining) 
differentiation parameters in cells were examined. In addition, experiments were performed 
with fibronectin and Matrigel coated surfaces during differentiation of THP-1 cells under these 
conditions. Under these conditions, NOS2 expression level was investigated at the mRNA and 
protein levels. Confirmation experiments were performed in the presence of mouse macrophage 
and breast cancer cells and in the presence of supplemental human cell lines supernatants. It 
was determined that ROS and NO production were modulated in THP-1 cells differentiated in the 
presence of factors secreted from MDA-MB-231 cells used as a human basal-like breast cancer 
cell line prototype. It was observed that the effect of LPS could be limited in the presence of 
cancer supernatants, but IFN-γ had a more pronounced effect. It was determined that human 
NOS2 levels were negatively affected in the presence of breast cancer supernatants and this was 
also reflected in NO production. The findings indicate that human NOS2 expression and thus NO 
production can be regulated at transcriptional-translational levels depending on the degree of 
monocyte-macrophage differentiation, especially in the presence of factors secreted from cancer 
cells.