Hepatosellüler kanserde önemli bir LncRNA olan MIR100HG'nin transkripsiyonel regülasyonu
Transcriptional regulation of MIR100HG, an important LncRNA, in hepatocellular cancer
Yazar: AYLİN TÜRKOĞLU
Danışman: PROF. DR. FERAY KÖÇKAR
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Hipoksi = Hypoxia ; Moleküler biyoloji = Molecular biology ; Moleküler genetik = Molecular genetic

Özet:
Son çalışmalar, uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) çeşitli hastalıklarda önemli rol oynadığını ortaya çıkarmıştır. MIR100HG ilk olarak bir insan transkriptom analizinde nöronal hücrelerde aşırı ekspresyon yoluyla tanımlanmıştır. Biyoinformatik ve ekspresyon çalışmaları, MIR100HG'nin nöroblastoma, lösemi, meme kanseri dahil olmak üzere insan kanserlerinde bir tümör promoteri olarak rolünü ortaya çıkarmıştır. Ancak literatürde MIR100HG geninin hepatoselüler karsinomdaki (HCC) rolüne ilişkin sınırlı bilgi bulunmaktadır. Bu tez çalışması normoksik ve hipoksik koşullar altında, farklı hepatosellüler kanser hücre hatlarında MIR100HG'nin ekspresyon seviyelerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla epitel hücre hatları (Hep3B ve HUH-7), mezenşimal hücre hatları (SNU-398 ve SNU-475) ve sağlıklı bir karaciğer modeli (Clone-9) seçilmiştir. Hipoksik bir ortam oluşturmak için kobalt klorür kullanılmıştır. Gerçek Zamanlı PCR analizleri, spesifik MIR100HG primerleri kullanılarak yapılmıştır.  Tez çalışmasının sonucunda, normoksik ve hipoksik koşullar altında MIR100HG'nin en yüksek Hep3B hücre hattında eksprese edildiği, bu sonucu SNU-398 hücre hattının takip ettiğini gösterilmiştir. Hipoksi oluşumu, HIF-1a ifadesinin mRNA ve protein seviyelerine bakılarak doğrulanmıştır. MIR100HG promotorunun transkripsiyonel regülasyonu beş farklı uzunlukta promotor parçasının Hep3B hücrelerine geçici transfeksiyonu ile hipoksik ve normoksik koşullar altında araştırılmıştır. Transfeksiyon sonucunda, en aktif promotor parçalarının -397/+231, -815/+231 ve -1031/+231 olduğu ve hipoksik koşullarda aktivitelerinin arttığı tespit edilmiştir. Hep3B hücrelerinde hipoksik şartlar altında HIF-1α'nın MIR100HG promotorunda bulunan HRE bölgelerine fonksiyonel olarak bağlandığı kromatin immunopresipitasyonu (ChIP) analiziyle doğrulanmıştır. MIR100HG geninin hücrelerin karakterizasyonu için önemli ve gerekli olduğu, Clone-9 hücrelerinde MIR100HG ifadesinin susturulması ve overekspresyonunun neden olduğu sonuçlar ilk kez bu tez çalışmasında belirlenmiştir. Overekpresyon ve susturma deneyleri sonrasında gerçekleştirilen Real Time analizi, MTT, Koloni Formasyon, Çizik Testi ve Matrijel deneyleri ile Clone-9 hücrelerinde MIR100HG'nin hücre sağkalımı, proliferasyonu, göçü gibi hücresel süreçlerde rol oynadığı kanıtlanmıştır. Bu tez kapsamında elde edilen verilerin, daha ileri kanser araştırmalarında, araştırmacılara yol göstereceği öngörülmektedir.

Abstract:
Recent studies have revealed the significant role of long non-coding RNAs (lncRNAs) in various diseases. MIR100HG was initially identified through its over-expression in neuronal cells in a human transcriptome analysis. Bioinformatics and expression studies have elucidated the role of MIR100HG as a tumor promoter in human cancers including neuroblastoma, leukemia, and breast cancer. However, limited information exists in the literature regarding the role of the MIR100HG gene in hepatocellular carcinoma (HCC). This thesis aims to investigate the expression levels of MIR100HG in different hepatocellular cancer cell lines under normoxic and hypoxic conditions. Epithelial cell lines (Hep3B and HUH-7), mesenchymal cell lines (SNU-398 and SNU-475), and a healthy liver model (Clone-9) were selected for this purpose. Cobalt chloride was used to induce a hypoxic environment. Real-time PCR analyses were performed using specific MIR100HG primers. The results of the thesis study showed that MIR100HG was most highly expressed in the Hep3B cell line under both normoxic and hypoxic conditions, followed by the SNU-398 cell line. Hypoxia induction was confirmed by examining the mRNA and protein levels of HIF-1α. The transcriptional regulation of the MIR100HG promoter was investigated under hypoxic and normoxic conditions through the transient transfection of five different lengths of promoter fragments into Hep3B cells. The most active promoter fragments were found to be -397/+231, -815/+231, and -1031/+231, with increased activity observed under hypoxic conditions. The functional binding of HIF-1α to the HRE regions of the MIR100HG promoter in Hep3B cells under hypoxic conditions was confirmed by chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis. The importance and necessity of MIR100HG in cell characterization were determined for the first time in this thesis study through the silencing and over-expression of MIR100HG in Clone-9 cells. Real-time analysis, MTT assay, colony formation assay, scratch assay, and Matrigel assay performed after over-expression and silencing experiments demonstrated the role of MIR100HG in cellular processes such as cell survival, proliferation, and migration in Clone-9 cells. It is anticipated that the data obtained in this thesis will guide researchers in further cancer research.