Fare in vitro alzheimer modelinde hipokampus trpa1, TRPM2 ve TRPV1 katyon kanalları üzerinde homosistein ile memantin'in etkilerinin araştırılması
Effects of homocysteine and memantine on TRPA1, TRPM and TRPV1cation channels in mouse hippocampus of in vitro alzheimer's disease model
Yazar: İSHAK SUAT ÖVEY
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA NAZIROĞLU
Süleyman Demirel Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Nöroloji = Neurology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Apoptozis = Apoptosis ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hipokampus = Hippocampus ; Homosistein = Homocysteine ; Katyonlar = Cations ; Memantine = Memantine ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; İyon kanalları = Ion channels

Özet:
NMDA reseptörleri ve TRP kanal aktivasyonuna bağlı aşırı hücre içi Ca+2 artışı sinir hücresi ölümü ve Alzheimer hastalığı (AH)'na neden olduğu iyi bilinirken, AH tedavisinde kullanılan memantinin TRP kanalları üzerindeki etkisi henüz bilinmemektedir. Hcy Alzheimer hastalığı oluşumunda oksidatif stresi artırarak rol oynadığı iyi bilinmektedir. Memantin, A ve Hcy neden olduğu oksidatif stres TRPA1, TRPM2 ve TRPV kanalarını aktivasyonunu önleyerek aşırı apoptozis ve mitokondrial oksidatif stres oluşumuna neden olabilir. A ile oluşturulan in vitro AH modelinde TRPA1, TRPM2 ve TRPV1 katyon kanalları aktivasyonu yolu ile Hcy'nin tetiklediği mitokondriyal oksidatif stresle indüklenen hücresel hasar üzerinde memantinin koruyucu etkisi araştırıldı.
İzole edilen fare hipokampus hücreleri kontrol, A, Hcy, MEM, A+Hcy, A+Hcy+MEM, A+MEM, Hcy+MEM olacak şekilde toplamda sekiz gruba ayrıldı. İzole edilen hipokampus hücreleri kendi gruplarına özgü A (20 µM ve 24 saat), Hcy (250 µM ve 30 dakika) ve memantin (10 µM ve 24 saat) ile inkübe edildiler. 
Kalsiyum sinyali analizlerinde TRPA1, TRPM2 ve TRPV1 kanal inhibisyonu sırası ile AP-18 (0.020 mM), N-(p-Amylcinnamoyl) antranilik asit (0.025 mM) ve kapsazepin (0.1 mM) yapılırken, kanal aktivasyonları sırası ile sinamaldehid (0.1 mM), cumene hidroperoksit (0.1 mM) ve kapsaisin (0.01 mM)  ile yapıldı. TRPA1, TRPM2 and TRPV1 kanal uyarımları ile yapılan analizlerde, hücre içi serbest Ca+2, mitokondriyal depolarizasyon, hücre içi oksidatif stres düzeyleri, apoptozis, aktif kaspaz 3 ve 9 düzeyleri kontrole kıyasla A ve Hcy gruplarında yüksek iken, MEM grubunda A ve Hcy kıyasla daha düşük gözlendi.  ve Hcy gruplarında azalan hücre canlılığı değerleri, memantin tedavisi ile arttığı gözlemlendi. Benzer şekilde, aktif kaspaz 3, kaspaz 9 ve PARP1, TRPA1, TRPM2 ve TRPV1 kanal ekspresyon düzeyleri kontrole kıyasla, A ve Hcy gruplarında yüksek iken, MEM grubunda A ve Hcy gruplarına kıyasla daha düşük gözlendi. Araştırılan bu değerlerin MEM ile birlikte TRPA1, TRPM2 ve TRPV1 kanal blokelerinin kullanılması durumunda sadece MEM grubuna kıyasla daha da azaldığı gözlendi. 
Sonuç olarak, TRPA1, TRPM2 ve TRPV1 kanalları aracılı A ve Hcy ile indüklenen hipokampal nöron ölümlerinde MEM'in bu kanalların aşırı aktivasyonunu önlediği gözlemlendi. A ve Hcy'in neden olduğu hipokampus aşırı mitokondriyal oksidatif stres üretimi, stozole aşırı Ca+2 girişi ve apoptozise karşı memantinin TRPA1, TRPM2 ve TRPV1 kanal aktivasyonunu düzenleyerek koruyucu etkisinin olduğu gözlemlendi.

Abstract:
It is well known that overload calcium ion entry (Ca2+) and excessive reactive oxygen species (ROS) production have important role in etiology of Alzheimer' disease (AD). Memantine (MEM) has been used to treat patients with AD though inhibition of Ca2+ entry and glutamate receptor. The Ca2+ permeable TRPA1, TRPM2 and TRPV1 channels are activated in the hippocampus by oxidative stress, and antioxidant MEM as a potent TRPA1, TRPM2 and TRPV1 channel antagonist may reduce A-induced oxidative stress and apoptosis in the neurons. In the current study, we investigated the neuroprotective properties of MEM in A-induced primary mice hippocampal neuron cultures.
 	Freshly isolated hippocampal neurons divided into eight groups as control, A, Hcy, MEM, A+Hcy, A+Hcy+MEM, A+MEM, Hcy+MEM. The neurons were incubated with A (20 µM for 24 h), Hcy (250 µM for 30 min) and MEM (10 µM for 24 h). The eight groups, TRPA1, TRPM2 and TRPV1 were further activated by cinnamaldehyde (0.1 mM),  cumene hydyroperoxide (0.1 mM) and capsaicin (0.01 mM), respectively although they were further inhibited by AP-18 (0.020 mM), N-(p-Amylcinnamoyl) anthranilic acid (ACA and 0.025 mM) and capsazepine (CPZ and 0.1 mM). The [Ca2+] concentration, apoptosis, caspase 3, caspase 9 activations, mitochondrial membrane depolarization and intracellular ROS production values in the neurons were higher in A and Hcy groups than in control although they were lower in the MEM group than in A and Hcy groups. The values were further decreased by MEM+AP-18, MEM+CPZ and MEM+ACA treatments as compared to MEM only. A and Hcy-induced decrease of cell viability level was increased by MEM treatment although A and Hcy-induced increase of caspase 3, caspase 9, PARP1, TRPA1, TRPM2 and TRPV1 channels expression levels were decreased by MEM treatments. 
In conclusion, TRPA1, TRPM2 and TRPV1 channels are involved in A and Hcy-induced neuronal death, and modulation of the activity of these channels by MEM treatment may account for their neuroprotective activity against apoptosis, excessive ROS production, and Ca2+ entry.