T98 ve U87 kanser hücre hatlarında betulinik asidin otofajik etkilerinin araştırılması
Investigation of the autophagic effects of betulinic acid on T98 and U87 cancer cell lines
Yazar: FATİH ÇÖLLÜ
Danışman: PROF. DR. BEYHAN GÜRCÜ
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Betülinik asit = Betulinic acid ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Hücre kültürü = Cell culture ; Otofaji = Autophagy

Özet:
Beyin tümörlerinin %50'sini oluşturan Glioblastoma multiforme (GBM)'ye karşı tedavi seçenekleri, Kan beyin bariyeri (KBB) nedeniyle sınırlıdır. Beyaz huş ağacından (Betula sp.) izole edilen Betülinik asit (BeA) KBB'yi geçerek beyne ulaşabilen bir pentasiklik triterpenoiddir. BeA, somatik hücrelerde düşük sitotoksik etki ve tümör hücrelerinde yüksek apoptozis ortaya koyar. Bu nedenle, çalışmamızda BeA'nın iki farklı GBM hücre hattında apoptotik etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolium bromid (MTT) ile IC50 ve monodansilkadaverin (MDC) ile rapamycin ve chloroquine dozu belirlenmiş ve dozlar kombinasyon olarak da uygulanarak otofaji inhibisyonu ve aktivasyonunda BeA'nın etkisi incelenmiştir. İmmünfloresan ve western blotting teknikleriyle eNOS, iNOS, LC3-I-II proteinlerinin miktarı ve yerleşimleri, MDC ile veziküllerdeki değişimler, JC-1 ile mitokondriyal zar potansiyelinde (MMP) oluşan değişiklikler ve ANNEXIN-V/PI flow sitometri ile sağlıklı-apoptotik-nekrotik hücre oranları ölçülmüştür. 
BeA uygulamasının apoptozisi iki hücre hattında da arttırdığı, otofaji inhibisyonu ve aktivasyonu ile de iki katına çıkardığı belirlenmiştir. BeA'nın yüksek otofajik etki göstermediği, ancak MMP'yi bozduğu bulunmuştur. Kombinasyonlarda MMP hasarı artmış olup, hasar BeA+rapamycin grubunda daha yüksektir. Bu bulgular BeA'nın otofajik yolu kullanmayarak mitokondriyal yoldan apoptozisi başlattığını göstermektedir. BeA uygulamasında eNOS ve iNOS ekspresyonu iki hücrede de değişmemiş, ancak kombinasyon gruplarında ekspresyon artmıştır. Çalışmamızda BeA'nın GBM hücrelerinde apoptozisi tetiklediği, ancak apoptozisin otofajik inhibitör veya aktivatör kombinasyonlarında daha çok arttığı ve apoptozisin mitokondri kaynaklı olduğu gösterilmiştir. eNOS ve iNOS ekspresyonunun kombinasyon gruplarında yükselmesi mitokondriyal strese bağlı oksidatif stresle ilişkilidir.
Sonuç olarak BeA, GBM hücrelerinde apoptozisi tetiklemekte, ancak otofaji aktivatör ve inhibitörleri ile birlikte uygulanması hücre ölümünü önemli ölçüde arttırmaktadır. Dolayısıyla, BeA'nın kemoterapötik etkisi otofajik mekanizmalar ile arttırılabilir ve GBM üzerinde tedavi amacıyla kullanılabilecek yeni bir kemoterapötik ajan olarak kullanılabilir.

Abstract:
Therapeutic possibilities against Glioblastoma multiforme (GBM), which constitutes 50% of brain tumors, are limited because of blood-brain barrier (BBB). Betulinic acid (BeA), isolated from white birch (Betula sp.), is pentacyclic triterpenoid that can cross BBB and reach the brain. BeA exhibits low cytotoxicity in somatic cells and high apoptosis in tumor cells. Thus, in this study, we aimed to examine the apoptotic effects of BeA on two GBM cell lines. 3-(4,5-dimethyltriazol-2-il)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) for IC50 and monodansylcadaverine (MDC) for finding effective doses of rapamycin and chloroquine were administered and the effects of BeA on autophagy inhibition and activation were investigated by applying doses in combination. Amount and localization of eNOS, iNOS, LC3-I-II proteins by immunofluorescence and western blotting techniques, changes in vesicles with MDC, changes in mitochondrial membrane potential (MMP) with JC-1, and healthy-apoptotic-necrotic cell ratios by ANNEXIN-V/PI flow cytometry were analyzed. 
It was determined that BeA application increased apoptosis in both cell lines and doubled it with autophagy inhibition and activation. It was found that BeA did not show high autophagic activity, but disrupted MMP. MMP damage was increased in the combinations and the damage was higher in BeA+rapamycin group. These findings suggest that BeA initiates apoptosis via the mitochondrial pathway by not using the autophagic pathway. eNOS and iNOS expressions in BeA group was not drastically changed for both cell lines, but changes are more prominent in combinations. 
In this study, it was indicated that BeA causes apoptosis in GBM cells, but apoptosis increased drastically in activator or inhibitor combination groups, and this apoptotic cell death originated from MMP disruption. Changes on eNOS and iNOS in application groups have shown that there is a connection between oxidative and mitochondrial stress.
In conclusion, we report that BeA triggers apoptosis on GBM, however application of BeA with autophagy activator or inhibitor significantly increases cell death. Therefore, it can be suggested that the chemotherapeutic effect of BeA can be enhanced by autophagic mechanisms, and it can be used as a new chemotherapeutic agent on GBM in the future.