MK2 geninin hipoksik koşullarda mezenkimal ve nöral kök hücrelerin çoğalım ve farklılaşması üzerine etkisinin incelenmesi
Effects of MK2 gene silencing on proliferation and differentiation of mesenchymal and neural stem cells under hypoxic culture conditions
Yazar: ZEHRA SEDA HALBUTOĞULLARI
Danışman: PROF. DR. MÜJGAN CENGİZ ; PROF. DR. ERDAL KARAÖZ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Tıp Bilimleri Bölümü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Gen analizi = Gene analysis ; Gen ifadesi = Gene expression ; Gen teknolojisi = Gene technology ; Genetik transformasyon = Genetic transformation ; Genler = Genes ; Hipoksi = Hypoxia ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Ünal ZS. MK2 geninin hipoksik koşullarda mezenkimal ve nöral kök hücrelerin çoğalım ve farklılaşması üzerine etkisinin incelenmesi. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi. Tıbbi Biyoloji ABD. Doktora Tezi. İstanbul. 2014 
Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 18843 
Çalışmamızda %20 oksijen konsantrasyonu (normoksik) ve %3 oksijen konsantrasyonu (hipoksik) ile kültüre edilen, sıçan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre(sKİ-MKH) ve nöral kök hücre(sNKH)'lerinde hücre bölünmesi, apoptoz, hücre farklılaşması ve inflamatuvar yanıt ile ilişkilendirilen p38MAPK yolağı substratlarından MK2 (Mitogen Activated Protein Kinase Activated Protein Kinase 2)'nin çoğalma ve farklılaşmadaki rolü araştırılmıştır
MK2 proteini az oksijenli kültür koşullarında fosforile olup aktive olmaktaydı. Her iki kök hücre hattında MK2 geni lentiviral shRNA ile susturulmuş inaktif formda kalması sağlanmıştır. Gen susturma etkinliği Western blotlama ve gerçek-zamanlı PZR ile test edilmiştir. Normoksi ve hipokside kültüre edilen hücrelerde WST-1, annexin V-7ADD boyaması ve hücre siklüsü analizleri gerçekleştirilmiştir. Hücre hatları iki kültür koşulunda farklılaştırmaya alınmış değişimler immuno-histokimyasal ve gen düzeyinde karşılaştırılmıştır. MK2 susturulmuş sKİ-MKH'leri ve kontrollerin serum yoksunluğunda apoptoza dirençleri karşılaştırılmış ve hücre analiz cihazı (xCELLigence) ile hipokside hücrelerin çoğalma kapasiteleri incelenmiştir. 
MK2 geni susturulması sonrasında kök hücrelerin çoğalma kapasitesinin ve apoptoza dirençlerinin arttığı saptanmıştır. MK2 geninin susturulduğunda, farklılaşma öncesi ve sonrasında osteojenik belirteçlerin azaldığı ve bu etkilerin %3 oksijen konsantrasyonunda daha anlamlı bir düşüş gösterdiği tespit edilmiştir. Serum yoksunluğunda MK2 geni susturulan hücre grubunda apoptoza direncin daha fazla olduğu saptanmıştır.
 Sonuç olarak, çalışmamızda farklı oksijen konsantrasyonlarında MK2 geninin susturulmasının mezenkimal kök hücre ve nöral kök hücrelerin çoğalım ve farklılaşması üzerindeki etkilerinin tespit edilmesiyle, ilk kez bu gen ve ilişkili olduğu yolağın az oksijenli ve normal oksijenli kültür koşullarında olası yeni bir mekanizma olduğu ve gelecekte iskemik koşullara bağlı patolojik süreçlerin kök hücrelerle tedavisine oksijen kısıtlamasının da dahil edilebileceğine ilişkin önemli bulgulara ulaşılmıştır. 
Anahtar Kelimeler: Farklılaşma, gen susturma, hipoksi, kök hücreler, MK2.

Abstract:
Ünal ZS. Effects of MK2 gene silencing on proliferation and differentiation of mesenchymal and neural stem cells under hypoxic culture conditions. İstanbul University, Institute of Health Science, Cerrahpaşa Medical Faculty. İstanbul. 2014
The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project No. 18843 
In our study,we analyze the effects of MK2(mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase2),which belongs to MAP-kinase family member related with proliferation,cell cycle,apoptosis,differentiation and inflamatory response in long-term cultured rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells(rBM-MSCs) and adult neural stem cells(rNSCs) both in 20%(normoxic) and 3%(hypoxic) oxygen levels.
In both stem cell line MK2 gene silenced by lentiviral shRNA was expected to left MK2 in the inactive form.Gene silencing efficiency was analyzed with western blotting and RT-PCR. WST-1,AnnexinV-7AAD and cell cycle analysis were performed with cells cultured in normoxia and hypoxia.Immunohistochemical and RT-PCR analyzes were performed before and after differentiation.Resistance to apoptosis in MK2 silenced rBM-MSCs and controls were analysed with cell death detection ELISA and cell index was measured with xCELLigence cell-analyze device. 
After silencing the MK2 gene the cell proliferation capacity and anti-apoptotic effects were observed to be improved. Furthermore, the expression of osteogenic markers decreased in the silenced cells before and after osteogenic differentiation compared to normal cells, but the decline is more significant in 3%hypoxic oxygen concentration.Increased resistance to apoptosis was measured in MK2 silenced cells with serum starvation. 
By revealing the crucial role of MK2 gene in the proliferation and differentiation of silenced rBM-MSCs and rNSCs cultured under different oxygen concentrations,the importance of this gene and related pathways were demonstrated with their possible mechanisms.This study provides an evidence for the importance of hypoxic conditions in the cell cultures.In future aspects, possible new mechanisms,like as MK2 pathway, might be used in pathological processes for cell therapies in ischemic conditions.
Key words: differentiation, gene silencing, hypoxia, MK2, stem cells.