Laktik asit bakterilerinin kültür filtratları ve ekzopolisakkaritlerinin (EPS)bifidobakterilerin gelişimini düzenleyici (BGD)ve antibiyofilm etkilerinin belirlenmesi
Determination of lactic acid bacterias filtrates and their exopolisaccaharides bifidogenic growth stimulator (BGD) and antibiofilm activities
Yazar: HALİME SARIKAYA
Danışman: PROF. DR. BELMA ASLIM
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada, gıda ve gaita kaynaklı bakteri suşlarından, daha önce yapılan çalışmalarda probiyotik özellikleriyle öne çıkmış 6 adet laktik asit bakterisi suşu (L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3, L. delbrueckii ssp. bulgaricus A12, L. fermentum LB69, L. paracasei  LB8, L. plantarum GD2, L. rhamnosus GD11) kullanılmıştır. Bu suşların ekzopolisakkarit (EPS) üretimleri, EPS'lerinin monosakkarit kompozisyonları, bifidobakterilerin (B. breve A28 ve BASO1) gelişimini düzenleyici (BGD) etkileri ve antibiyofilm yetenekleri araştırılmıştır. Kültür ortamında, en yüksek EPS üretim kapasitesi GD11, LB69 ve B3 suşlarında tespit edilmiştir. Kültür ortamından saflaştırılıp, liyofilize edilen EPS'lerin monosakkarit kompozisyonları HPLC analizi ile araştırılmış ve tüm suşlarda baskın monomerin mannoz olduğu görülmüştür. En yüksek mannoz oranına sahip suşlar ise LB69  ve GD11 olarak belirlenmiştir. Laktik asit bakterilerinin kültür filtratları ve liyofilize EPS'lerinin bifidobakterilerin gelişimini düzenleyici (BGD) etkisi, ticari bir prebiyotik olan inulin ile mukayese edilerek araştırılmıştır. Filtratların ve EPS'lerin inulin ile benzer bir şekilde BGD etkisinin olduğu görülmüştür. En yüksek BGD aktivitesi GD11 suşunun kültür filtratında görülmüştür. Elde edilen verilerle yapılan istatistiksel analizlerde, suşların EPS üretim miktarı ile süpernatantlarının gösterdiği BGD aktivitesi arasında (p<0,05) ve EPS'lerin içerdiği mannoz miktarı ile EPS'lerin gösterdiği BGD aktivitesi arasında (p<0,05) pozitif bir korelasyon bulunmuştur Bu çalışmada, 13 patojen bakterinin biyofilm oluşturma yetenekleri belirlenmiş ve en yüksek biyofilm yapma yeteneğine sahip olan 4 suş (B. cereus RSKK-863, L. monocytogenes ATCC-7644, E. fecalis ATCC 25175, P. aeruginosa ATCC-72853) antibiyofilm çalışmaları için test bakterisi olarak seçilmiştir. 3 adet laktik asit bakterisinin  kültür filtratları ve liyofilize EPS'lerinin farklı konsatrasyonları antibiyofilm etkisi bakımından test edilmiştir. En yüksek antibiyofilm etkiyi, LB69 suşunun kültür filtratı B. cereus RSKK-863 suşu üzerinde % 93 biyofilm inhibisyonuyla, liyofilize EPS'si de aynı suş üzerinde biyofilmi % 90 inhibe ederek göstermiştir. Elde edilen verilerle yapılan istatistiksel analizlerde, EPS'lerin içerdiği mannoz miktarı ile kültür filtratlarının gösterdiği antibiyofilm aktivitesi arasında ve EPS'lerin içerdiği mannoz miktarı ile EPS'lerin gösterdiği antibiyofilm aktivite arasında güçlü bir korelasyon (p<0,01) bulunmuştur. Bu çalışmada, LB69 ve GD11 suşlarının kültür filtratları ve EPS'lerinin hem BGD etkili hem de antibiyofilm etkili ajanlar olarak kullanılabileceği tespit edilmiştir. Bu ajanların oral yolla alınması durumunda, gastrointestinal alanda bulunan bifidobakterilerin gelişimi arttırılarak, konağa yararlı etkilerin sağlanmasının yanı sıra, zararlı bakterilerin biyofilm oluşturmaları engellenerek, hastalıkların önlenmesi ve tedavisi mümkün olabilecektir.

Abstract:
In this study, we used 6 lactic acid bacterial strains (L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3, L. delbrueckii ssp. bulgaricus A12, L. fermentum LB69, L. paracasei  LB8, L. plantarum GD2, L. rhamnosus GD11) that became prominent in the previous studies due to their probiotic properties, among food-borne and feces derived bacterial strains. This study investigated the exopolysaccharide (EPS) production of these strains, monosaccharide composition of the EPSs, regulatory effects of the EPSs on bifidobacteria development (B. breve A28 and BASO1) and their antibiofilm abilities. In the culture broth, highest EPS production capacity was detected in GD11, LB69 and B3 strains. Monosaccharide compositions of the EPSs that were purified and lyophilized in the culture medium were investigated and dominant monomer was found to be mannose in all strains. Strains with highest mannose concentrations were LB69 and GD11. Culture filtrate of the lactic acid bacteria and regulatory effect of lyophilized EPSs on bifidobacteria development (RBD, regulation of bifidobacteria development) were studied by comparing with a commercially available prebiotic, named inulin.  It was seen that filtrates and EPSs showed a similar RBD effect. Highest RBD activity was seen in the culture filtrate of GD11 strain. In the statistical analyses based on the data obtained, positive correlations were detected between the amount of EPS produced by the strains and RBD activity exhibited by the supernatants (p<0,05) and between the amount of mannose contained in EPSs and RBD activity shown by EPSs (p<0,05). In this study, the biofilm-forming capacity of 13 pathogen bacteria was determined and four strains with the highest biofilm-forming capacity (B. cereus RSKK-863, L. monocytogenes ATCC-7644, E. fecalis ATCC 25175, P. aeruginosa ATCC-72853) were selected as test bacteria for antibiofilm studies. Different concentrations of culture filtrates and lyophilized EPSs of three lactic acid bacteria were tested for antibiofilm effect. Highest antibiofilm effects were exhibited by the culture filtrate B. cereus RSKK-863 strain of the LB69 strain with a biofilm inhibition of 93% and by lyophilized EPSs that inhibited the biofilm by 90% on the same strain. In the statistical analyses performed using the available data, a strong correlation was found between the amount of mannose present in EPSs and the antibiofilm activity exhibited by the culture filtrates and between the amount of mannose present in EPSs and the antibiofilm activity exhibited by EPSs (p<0,01). In this study, it was concluded that the culture filtrates and EPSs of the LB69 and GD11 strains could be used as efficient agents with both RBD effect and antibiofilm effect. If these agents are taken via oral route, it would be possible to provide beneficial effects for the host by increasing the development of bifidobacteria present in the gastrointestinal tract as well as to prevent and treat the diseases by hindering the biofilm formation by harmful bacteria.