Dihidrotestosteronun kolesteatom kaynaklı kemik destrüksiyonu üzerine etkisinin fare modeli üzerinde incelenmesi
Investigation of the effect of dihydrotesthosterone on cholesteatom induced bone destruction on the mouse model
Yazar: ESRA MİSİR
Danışman: PROF. DR. ÖZGÜR YİĞİT
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Kulak Burun Boğaz ve Baş-Boyun Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Kulak Burun ve Boğaz = Otorhinolaryngology (Ear-Nose-Throat)
Dizin: Dihidrotestosteron =   ; Fareler = Mice ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kemik rezorpsiyonu = Bone resorption ; Kemik ve kemikler = Bone and bones ; Kolestatoma = Cholesteatoma ; Temporal kemik = Temporal bone ; Testosteron = Testosterone

Özet:
Kolesteatom, temporal kemiğin yıkıcı bir lezyonudur ve ilerleyerek komşu kemik yapıların destrüksiyonu ile işitme kaybı, vestibüler disfonksiyon, fasial paralizi, labirent fistülü ve diğer kafa içi komplikasyonlara neden olabilir. Kemik rezorpsiyonu için daha önce osteoklast aktivasyon teorisi, basınç nekroz teorisi, asit lizis teorisi, enzim-aracılı rezorpsiyon teorisi, inflamatuar aracılı rezorpsiyon teorisi düşünülmüştür. Testosteron androjen grubundan steroid yapıda bir hormondur. Dididrotestosteron ise testosteronun 5-alfa redüktaz enzimi aracılığı ile çevre dokularda dönüşümünden meydana gelen aktif metabolitidir. 5-alfa redüktaz enziminin subtipleri bulunmakla beraber vücutta genitoüriner sistem organlarında, karaciğerde, saçlı deride, sebase glandlarda ve düz kaslarda gösterilmiştir. Sekonder seks karakterlerinin oluşumu, anabolizmanın ve eritropoezin indüklenmesi gibi etkileri oldukça bilinen DHT, kemik metabolizmasında da düzenleyici etkiye sahiptir.  Önceki çalışmalarda dihidritestosteronun RANKL ve M-CSF kaynaklı osteoklast oluşumunu baskıladığını gösterilmiştir. 
Otolog dermal greftleme tekniği ile oluşturulan kolesteatom modeli, kolesteatomuda kemik rezorpsiyonun gösterilmesinde en uygun model olduğundan çalışmamızda bu teknikle oluşturulan kolesteatom modelinde bir grup deneğe dihidrotestosteron uygulayıp uygulanmayan denek grubu ile kolesteatom oluşum sıklığını ve kemik rezorpsiyonunun değerlendirilmesini amaçladık. Bu çalışmanın hipotezi dihidrotestesteronun kolesteatoma bağlı kemik rezorpsiyonunu engelleyeceği yönündedir.
GEREÇ VE YÖNTEM
Çalışmada 24 adet genç erişkin (5–7 hafta arası)  30±10 gr erkek BALB/c fare kullanıldı. Denekler random 3 gruba ayrıldı. Tüm denek gruplarına genel anestezi altında cerrahi bölge tıraş edilip sterilize edildi.
 Başın dorsumu üzerinden horizontal yaklaşık yarım cmlik bir cilt kesisi yapılmasının ardından cilt laterale ekarte edilip periost parietal kemikten eleve edildi. 
1. gruptaki deneklerin parietal kemiğinin üzerine farenin kendisinden alınan tırnak (keratin) yerleştirildikten sonra periost tırnağın üzerine yatırılıp cilt sütüre edildi. 2. gruptaki deneklere aynı prosedüre ek parietal kemik üzerine 500 µg testosteron jel (Testogel 50 mg transdermal jel içeren saşe-Liba) uygulandı. 3.gruptaki deneklerde (sham grubu) ise insizyon sonrası periost parietal kemikten eleve edildikten sonra periost parietal kemiğe yatırılıp cilt sütüre edildi. 
            İşlem sonrası tüm denekler sakrifiye edilerek başın dorsumu üzerinde horizontal cilt kesisi sonrası periostun kaldırılıp işlemin yapıldığı sahayı içine alacak şekilde parietal kemikler toplandı. 
Alınan kalvaryum kemikleri dekalsifiye edildi. Örnekler hemotoksilen eozin (H&E) ile boyandıktan sonra ışık mikroskobunda bir histopatolog tarafından değerlendirildi. Örneklerde kolesteatom oluşumu, inflamasyon gelişimi ve mm2 başına düşen osteoklast sayıları karşılaştırıldı.

BULGULAR

İnflamasyon sham grubunda izlenmedi. Keratin grubunda 2 örnekte (%25), keratin+testosteron grubunda 4 örnekte (%50)  saptandı. Sham grubunda epitelizasyon görülmezken keratin grubunda 3 örnekte (%37,5), keratin+testosteron grubunda 2 örnekte (%25)  epitelizasyon görüldü. Gruplar arasında epitelizasyon ve inflamasyon bakımından anlamlı ilişki görülmedi (p>0.05).
Ortalama osteoklast sayısı sham grubunda 3,50 ± 1,41, keratin grubunda 22,38 ± 11,65, keratin+testosteron grubunda 24,88 ± 13,14 olarak izlendi. Mm2 başına hesaplanan ortalama osteoklast sayısı sham grubunda 0,49 ± 0,13, keratin grubunda 3,22 ± 1,99, keratin+testosteron grubunda 3,16 ± 1,59 olarak hesaplandı. Gruplar arasında osteoklast sayısı ve osteoklast oranı karşılaştırıldığında sham grubunun osteoklast sayısı ve osteoklast oranı keratin ve keratin+testosteron gruplarına göre daha düşük olarak bulunmuştur (p<0.05). Keratin ve keratin+testosteron grupları arasında osteoklast sayısı ve osteoklast oranı bakımından anlamlı fark görülmemiştir (p>0.05)


SONUÇ
Çalışmamızda kolestatom kaynaklı kemik destrüksiyonunu engellemede ve inflamasyon ile kolestatom oluşumunu azaltmada dihidrotestosteronun etkili olmadığı saptanmıştır. Kolestatomdaki kemik lizisinin mekanizmasının ve birçok fizyolojik yolakta etkili olan dihidrotestosteronunun kemik metabolizması üzerindeki etkilerinin anlaşılabilmesi için gelecekte daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Abstract:
Cholesteatoma is a devastating lesion of the temporal bone and may progress to destruction of adjacent bone structures, causing hearing loss, vestibular dysfunction, facial paralysis, labyrinth fistula, and other intracranial complications. For bone resorption, osteoclast activation theory, pressure necrosis theory, acid lysis theory, enzyme-mediated resorption theory, inflammatory mediated resorption theory have been considered before. Testosterone is a steroid hormone from the androgen group. Dididrotestosterone, on the other hand, is the active metabolite of testosterone resulting from the conversion of testosterone in the surrounding tissues via the enzyme 5-alpha reductase. Although there are subtypes of 5-alpha reductase enzyme, it has been shown in the genitourinary system organs, liver, scalp, sebaceous glands and smooth muscles in the body. DHT, which is well known for its effects such as formation of secondary sex characters, induction of anabolism and erythropoiesis, also has a regulatory effect on bone metabolism. Previous studies have shown that dihydritestosterone suppresses RANKL and M-CSF-induced osteoclast formation.
Since the cholesteatoma model created by autologous dermal grafting technique is the most suitable model for demonstrating bone resorption in cholesteatoma, we aimed to evaluate the frequency of cholesteatoma formation and bone resorption in a group of subjects in a cholesteatoma model created with this technique, with a group of subjects who did not receive dihydrotestosterone. The hypothesis of this study is that dihydrotestosterone will inhibit bone resorption due to cholesteatoma.
MATERIALS AND METHODS
In the study, 24 young adult (5–7 weeks old) 30±10 g male BALB/c mice were used. The subjects were randomly divided into 3 groups. The surgical area was shaved and sterilized under general anesthesia for all subject groups.



After making a horizontal skin incision of approximately half a cm over the dorsum of the head, the skin was retracted laterally and the periosteum was elevated from the parietal bone.
After placing the nail (keratin) taken from the mouse itself on the parietal bone of the subjects in the 1st group, the periosteum was laid on the nail and the skin was sutured. Subjects in group 2 underwent the same procedure with 500 µg testosterone gel (sachet-Liba containing Testogel 50 mg transdermal gel) on the additional parietal bone. In the subjects in the third group (sham group), after the incision, the periosteum was elevated from the parietal bone, and the skin was sutured by placing it on the periosteal parietal bone.
 After the procedure, all subjects were sacrificed, and after a horizontal skin incision on the dorsum of the head, the periosteum was removed and the parietal bones were collected to cover the area where the procedure was performed.
The removed calvarium bones were decalcified. The samples were stained with hematoxylin-eosin (H&E) and evaluated by a histopathologist under light microscope. The development of cholesteatoma and inflammation and the number of osteoclasts per mm2 were compared in the samples.

RESULTS
Inflammation was not observed in the sham group. It was detected in 2 samples (25%) in the keratin group and in 4 samples (50%) in the keratin+testosterone group. While epithelialization was not observed in the sham group, epithelialization was observed in 3 samples (37.5%) in the keratin group and in 2 samples (25%) in the keratin+testosterone group. There was no significant relationship between the groups in terms of epithelization and inflammation (p>0.05).
The mean number of osteoclasts was 3.50 ± 1.41 in the sham group, 22.38 ± 11.65 in the keratin group, and 24.88 ± 13.14 in the keratin+testosterone group. The mean osteoclast count per mm2 was 0.49 ± 0.13 in the sham group, 3.22 ± 1.99 in the keratin group, and 3.16 ± 1.59 in the keratin+testosterone group. 
When the osteoclast number and osteoclast ratio were compared between the groups, the osteoclast number and osteoclast ratio of the sham group were found to be lower than the keratin and keratin+testosterone groups (p<0.05). There was no significant difference in osteoclast number and osteoclast ratio between keratin and keratin+testosterone groups (p>0.05)

CONCLUSION

In our study, it was determined that dihydrotestosterone was not effective in preventing cholestatoma-induced bone destruction and reducing inflammation and cholestatoma formation. More studies are needed in the future to understand the mechanism of bone lysis in cholesteatoma and the effects of dihydrotestosterone, which is effective in many physiological pathways, on bone metabolism.