Morchella esculenta'dan elde edilen ekstraktın DLF1 ve COLO205 kolon kanseri hücre hatlarında anti-kanser özelliklerinin araştırılması
Investigation of anti-cancer properties of extract from morchella esculenta in DLD1 and COLO205 colon cancer cell lines
Yazar: AYŞE AYDOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. SEYİT ALİ BİNGÖL
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Bitki özütü = Plant extract ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre dizisi = Cell line ; Kolon hastalıkları = Colonic diseases ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Kuzugöbeği = Morel mushroom ; Mantarlar = Fungi ; Morchella esculenta = Morchella esculenta ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Çalışmamızda M. esculenta'dan elde edilen MeOH ekstraktı uygun dozlarda COLO205 ile DLD1 kolon kanseri hücre serilerine ve HUVEC sağlıklı hücre hattına uygulandı. Hücre hatlarında MeOH mantar ekstraktının apoptotik etkisi ve hücre sağkalım testi ile sitotoksik etkisi belirlendi. Hücre hatları ekiminde DMEM ve RPMI 1640 medyumu kullanıldı. Ekim yapılan petri kapları 37°C'de ve %5 CO2 içeren serbest nemli inkübatörde geliştirildi. Hücreler %70-80 yoğunluğa ulaştıklarında, belirlenen metadolojik gruplara belirtilen konsantrasyonlarda uygulama yapıldı ve hücreler 48 saat boyunca inkübasyona bırakıldı. DMSO içerisinde çözdürülen MeOH mantar ekstraktı konsantrasyonları 400 µg/mL, 600 µg/mL, 800 µg/mL, 1000 µg/mL ve 1200 µg/mL olarak belirlendi ve kontrol grubuyla birlikte her hücre hattı için 6 grup oluşturularak hücre sağkalım testi ile hücrelerin IC50 değerleri belirlendi. Mantar ekstraktının hücrelerde neden olduğu morfolojik değişiklikler ve apoptozisi gösteren yapısal farklılıklar invert mikroskopta belirlendi. IC50 değerlerine göre protein ölçümleri için gruplar revize edildi. Son konsantrasyonlar 400 µg/mL, 600 µg/mL, 800 µg/mL olarak belirlendi. DMSO ve kontrol grupları ile birlikte her hücre hattı için totalde 5 grupla çalışmaya devam edildi. Hücre sağkalım testi bulgularına göre; kolon kanseri hücre hatlarında uygulanan mantar dozuna paralel olarak sitotoksik etkinin arttığı, sağlıklı hücrelerde ise sitotoksik etkinin tam aksine dozla paralel olarak proliferasyon indüksiyonunun arttığı belirlendi. Kolon kanseri hücrelerinde gözlemlenen hücre ölümlerinin apoptozis regülasyonuyla ilişkisinin anlaşılması amacıyla Western Blot yöntemiyle PARP ve ELISA yöntemiyle BAX proteini ekspresyon seviyeleri belirlendi. Kanser hücrelerinde PARP ekspresyonunun doza paralel olarak arttığı BAX'ın ise DLD1'de arttığı COLO205'de değişmediği gözlemlendi. Ayrıca ekstraktın mutant ve mutant olmayan KRAS ekspresyonuna etkisi ELISA yöntemiyle belirlendi. Mutant KRAS ekspresyonunun azaldığı, mutant olmayan KRAS'ın ise arttığı gözlemlendi.
Anahtar kelimeler: Apoptozis, BAX, COLO205, DLD1, HUVEC, Kolon kanseri, KRAS, M. esculenta, PARP.

Abstract:
In our study, MeOH extract that derived from M. esculenta in proper doses distributed over HUVEC the healthy cell line and DLD1 colon cancer cell line and COLO205 colon cancer cell. In cell lines, apoptotic effect of MeOH mushroom extract, cell viabilty test and cytotoxic effect were identified. DMEM and RPMI 1640 medium were used in cell lines planting. The planted petri plates were developed in a free-humidity incubator at 37°C and 5% CO2. When the cells reached 70-80% density, the implementation was practiced on the determined methodological groups at the specified concentrations and the cells were incubated for 48 hours. The concentrations of MeOH mushroom extract dissolved in DMSO were determined as 400 µg/mL, 600 µg/mL, 800 µg/mL 1000 µg/mL and 1200 µg/mL. The IC50 values of the cells were determined by cell viabilty test by creating 6 groups for each cell line and. The morphological changes caused by the mushroom extract in the cells and the structural differences showing apoptosis were determined under an invert microscope. Groups were revised for protein measurements according to IC50 values. Final concentrations were determined as 400 µg/mL, 600 µg/mL, 800 µg/mL. The study was continued with a total of 5 groups for each cell line, with the DMSO and control groups. According to the cell viabilty test findings; It was determined that the cytotoxic effect increased in parallel with the dose of fungi applied in colon cancer cell lines, and on the contrary to the cytotoxic effect in healthy cells, the induction of proliferation increased in parallel with the dose. PARP and BAX protein expression levels were determined respectively by Western Blot and ELISA method in order to understand the relationship between cell death observed in colon cancer cells and the regulation of apoptosis. It was observed that PARP expression in cancer cells increased in parallel with the dose, while BAX increased in DLD1 and stayed the same in COLO205. Besides, the effect of the extract on the expression of mutant and non-mutant KRAS was determined by ELISA method. It was observed that the expression of mutant KRAS decreased, while non-mutant KRAS increased. 
Keywords: Apoptozis, BAX, COLO205, DLD1, HUVEC, Colon cancer, KRAS, M. esculenta, PARP.