Biyospesifik enzim immobilizasyon teknikleri ile -galaktozidaz enziminin immobilizasyonu
Immobilization of -galactosidase enzyme with biospesific enzyme immobilization techniques
Yazar: ESİN ÇALCI
Danışman: PROF. DR. SEÇİL ÖNAL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
-D-Galaktozidazlar (?-D-galaktozid galaktohidrolaz, EC 3.2.1.22) doğada oldukça yaygın olarak bulunan hidrolaz sınıfı enzimlerdir. Bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan çok çeşitli teknikler ile izole edilerek saflaştırılan bu enzimler basit ve kompleks galakto-oligosakkaritler ve polisakkaritlerde bulunan ? -1,6-galaktoz birimlerini hidrolizlerler. Şeker endüstrisinde önemli bir potansiyele sahip olan ?-galaktozidazlar, kompleks karbohidratların biyolojik fonksiyonlarının belirlenmesinde, organik sentezlerde, yapı analizlerinde ve medikal alanda ve şeker endüstrisinde oldukça önemli uygulama alanları olan enzimlerdir.Enzim immobilizasyonu teknolojisi enzimlerin tekrar kullanılabilmesini sağlamak ve kararlılığını geliştirmek için etkin bir aracıdır. Enzimlerin immobilizasyonu için bazı protokoller mevcuttur; ancak çok azı basit ve/veya enzim özelliklerini geliştirebilir niteliktedir. Bu nedenle, günümüzde yeni immobilizasyon protokollerine ihtiyaç duyulmaktadır. Enzimlerin immobilizasyonunda yeni trend enzim ve taşıyıcı arasında çeşitli biyoafinite bağlarının oluşturulmasıdır. Biyoafinite immobilizasyonunda, enzim biyospesifik etkileşimler vasıtasıyla taşıyıcıda immobilize edilir.Bu çalışmada, ?-galaktozidaz enzimi domatesten (Lycopersicon esculentum) izole edilerek, biyoafinite protokolü ile kitosanda (doğal bir polimer) üç farklı biyoafinite protokolü (Yöntem I, II ve III) ile immobilize edildi. Yöntem I ile immobilizasyon protokolünde kitosan önce glutaraldehit ile aktive edildi ve ardından konkanavalin A (ConA) ile türevlendirildi. İmmobilizasyon protokolünün optimizasyonu için immobilizasyona ortam pH'sı, iyon şiddeti, protein miktarları ve metallerin etkisi incelendi ve enzim glutaraldehit ile çapraz bağlandı. Yöntem II ile immobilizasyonda, kitosan taşıyıcıda ConA adsorplanarak taşıyıcı türevlendirildi. Ardından adsorpsiyon zamanı, protein miktarı, immobilizasyon ortamın pH' sı ve iyon şiddeti gibi parametrelerin enzim immobilizasyonuna etkisi incelendi ve enzim glutaraldehit ile çapraz bağlandı. Son olarak yöntem III ile enzim immobilizasyonunda, yöntem I için optimize edilen koşullarda enzim afinite tabakaları oluşturularak immobilize edildi. Önce afinite tabaka sayısı ve ardından ortama ilave edilen Con A ve protein miktarları optimize edildi. Her üç yöntemle hazırlanan biyoafinite taşıyıcısında ?-galaktozidaz enziminin immobilizasyonu gerçekleştirildi. Serbest ve immobilize enzimlerin fiziksel ve kimyasal karakterizasyonu gerçekleştirildi. Enzim aktivitesine etki eden bazı parametreler (pH, sıcaklık, substrat konsantrasyonu) incelenerek kararlılık testleri (pH, termal, depo ve operasyonel) yapıldı. İmmobilize enzimlerin tekrar kullanılabilirliği de test edildi. Serbest ve immobilize ?-galaktozidaz enzimleri PNPG ve rafinoz hidroliz prosesinde kullanıldı.

Abstract:
-Galactosidases (-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.22) are a common class of hydrolases which are widely distributed in nature. They have been isolated and purified with different techniques from various sources, such as plants, animals and microorganisms. These enzymes catalyses the hydrolysis of ?-1,6-galactose bonds which found in basic and complex galacto-oligosaccharides and polysaccharides. They have great importance in especially sugar industry, elucidation of the biological functions of complex carbohydrates, for organic synthesis, for structural analysis, for medical purpose and in sugar industry.Enzyme immobilization technology is an effective means to perform enzyme reuse and to improve its stability. There are many protocols for the immobilization of enzymes but very few are also very simple and/or very capable of improving enzyme properties. Therefore, novel immobilization protocols are still needed. A new trend in enzyme immobilization is to create different bioaffinity bonds between the carrier and enzyme. In bioaffinity immobilization, the enzyme is immobilized to a matrix via biospecific interactions.In this study, ?-galactosidase was isolated from tomato fruit (Lycopersicon esculentum) and then immobilized on chitosan (natural polymer) by using three different bioaffinity protocols (protocol I, II and III). In Protocol I, chitosan was activated by glutaraldehyde at first and then derivatized by concanavalin A (ConA). In order to optimize the immobilization protocol the effect of some parameters like; pH, ionic strength, amount of protein and metals to enzyme immobilization were investigated and enzyme was cross-linked by using glutaraldehyde. For Protocol II, chitosan was derivatized with ConA by adsorption. Then, the effect of adsorption time, amount of protein, pH and ionic strength were searched for optimization of immobilization process. At the end of this process, enzyme was cross-linked by using glutaraldehyde. In protocol III, enzyme was immobilized in affinity layers with optimized conditions obtained for protocol I. At first number of affinity layers was determined and then the amounts ConA and protein were optimized. Each of these three bioaffinity supports were used for the immobilization of ?-galactosidase. Physical and chemical characterization of free and immobilized enzymes were made. Some parameters effecting to the enzyme activity (pH, temperature, substrate concentration) were searched and stability tests (thermal, pH, storage and operational stability) were also done. Beside of these, usebility of the immobilized enzymes were tested. Free and immobilized ?-galactosidases were also used in the hydrolysis processes of PNPG and raffinose.