Kardiyolipin geni olmayan saccharomyces cerevisiae hücrelerinde otofaji sırasında mitokondriyal değişimlerin incelenmesi
Studying mitochondrial changes in saccharomyces cerevisiae without cardiolipin gen
Yazar: GÜLEN KILIÇKAYA
Danışman: DOÇ. DR. HANDAN AKÇAKAYA ; YRD. DOÇ. DR. DEVRİM ÖZ ARSLAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyoloji = Biology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Besi yerleri = Culture media ; Bira mayası = Yeast ; Bira mayası = Yeast ; Genler = Genes ; Kardiyolipinler = Cardiolipins ; Mitokondriler = Mitochondria ; Otofaji = Autophagy ; Saccharomyces cerevisiae = Saccharomyces cerevisiae ; Solunum = Respiration

Özet:
Kılıçkaya G. (2017). Kardiyolipin Geni Olmayan Saccharomyces cerevisiae Hücrelerinde Otofaji Sırasında Mitokondriyal Değişimlerin İncelenmesi. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyofizik ABD. Yüksek Lisans. İstanbul.
Otofaji, hücre içinde birikmiş protein kümelerinin, lipitlerin, karbonhidratların ve ribosomal RNA'ların; mitokondri, endoplazmik retikulum veya golgi gibi organellerin çift tabakalı bir zarla (otofagozom) çevrilmesi ve daha sonra lizozom veya vakuol ile birleşerek sindirilmesi mekanizmasıdır. Hücrenin enerji kaynağı olarak bilinen mitokondriler, birçok hücresel işlevin gerçekleşmesinde rol alırken otofaji sırasında mitokondri işlevlerinde nasıl bir değişim olduğu açık değildir. Önemli bir mitokondriyal lipit olan kardiyolipini olmayan mayalarda mitokondri membran potansiyelinin düştüğü ve solunum hızının azaldığı belirtilmiştir. Bu nedenle kardiyolipini olmayan mayalarda hasarlı mitokondrilerin otofaji ile ortadan kaldırılabileceği ya da otofaji sırasında bu mitokondrilerin işlevlerinde farklılık olabileceği düşünüldü. Bu hipotezi doğrulamak amacıyla kardiyolipini ve kardiyolipini işlevsel hale getiren tafazin enzimini sentezleyen genlerin silindiği Saccharomyces cerevisiae maya hücrelerinde otofajik farklar ve otofaji sırasındaki mitokondriyal değişimler gözlendi. Otofajiyi izleyebilmek için maya hücreleri pRS316-GFP-Atg8 plazmiti ile transforme edildi. Doğal suş, Δcrd1 ve Δtaz1 maya hücreleri sentetik komple (SC), laktatça zengin (Lak) ve gliserol-etanol sentetik komple (SGET) besiyerlerinde üretildi ardından otofaji indüklendi. Bu hücrelerden dört, 24. ve 48. saatlerde alınan hücre özütleri ile western emdirim analizi yapılarak otofaji izlendi, farklı karbon kaynaklarının otafajiye etkisinin değişken olduğu gözlendi. Ayrıca laktatça zengin besiyerinde üretilen maya hücrelerinden mitokondri izolasyonu gerçekleştirildi. İzole edilen mitokondriler, mavi doğal jel elektroforezi ile yürütüldükten sonra kompleks IV ayrışması ve mitokondriyal süperkompleks organizasyonları izlendi. Otofaji indüksiyonunun, respirasyon süperkomplekslerinin ayrılmasında etkili olduğu gözlendi. İzole edilen mitokondrilere NADH, süksinat, ADP ve FCCP eklenerek oksijenmetre yardımıyla oksijen tüketimi ölçüldü ve otofajinin oksijen tüketimini arttırdığı belirlendi. Tüm bu sonuçlar, otofajinin mitokondri yapı ve işlevinde önemli etkileri olduğuna işaret etmektedir.
Anahtar Kelimeler: Saccharomyces cerevisiae, Otofaji, Mitokondri, Elektron taşıma zinciri, Respirasyon

Abstract:
Kılıçkaya, G. (2017).Studying Mitochondrial Changes in Saccharomyces cerevisiae Without Cardiolipin Gene. İstanbul University, Institute of Health Science, Department of Biophysics.Master Thesis. İstanbul.
 Autophagy is an intracellular degradation system and conserved from yeast to mammalian. Proteins, lipids, carbohydrate; damaged organels are sequestered in a double-membrane organelle is called autophagosome. Mitochondria is critical for cellular bioenergetics but the changes of mitochondrial dynamics during autophagy is not known. Cardiolipin is a phospholipid which is localized exclusively to the mitochondrial inner membrane and it interacts with proteins driving oxidative phosphorylation. In the yeast cell without cardiolipin gene, ıt is observed that mitochondrial membrane potential and rate of respiration are reduced. The removal of damaged mitochondria is essential in physiological homeostasis and pathological conditions. In order to investigate the role of CL on the autophagy, we used mutant strains namely Δcrd1 and Δtaz1 strain and compared them to the wild-type S. cerevisiae strain and to observe autophagy, yeast strains were transformed with pRS316-GFP-Atg8 plasmid. Yeast cells were grown in synthetic complete, lactate rich and glycerol-ethanol medias and then shifted to starvation medium to autophagy induction. Cell lysates were taken 4, 24 and 48 hours after autophagy induction. Autophagy induction was monitored by GFP expression using western blot. Different carbon sources affect autophagy inductions. We also isolated mitochondria from yeast cells that were grown lactate rich media. To analyse Complex IV and its supercomplexes, isolated mitochondrias were analysed by Blue-native gel electrophoresis and western blot. Autophagy inductions affect supercomplexes organization. NADH, ADP, succinate and FCCP were added to isolated mitochondria and oxygen consumption was measured by oxygenmeter and oxygen consumption rate increased after autophagy induction. As a result, autophagy effects mitochondrial structure and functions.
Anahtar Kelimeler: Saccharomyces cerevisiae, Autophagy, Mitochondria, Electron Transport Chain, Respiration