Nöroblastom Mycn amplifikasyonunda C-myb protein kümesi ile Cdt1/Geminin, P53, Siklin A/Cdk2, P21 ve P27' nin rolü
The Roles of C-myb protein complex and Cdt1/ Geminin, P53, Cyclin A/Cdk2, P21, P27 for the Mycn amplification in neuroblastoma
Yazar: NEVİM AYGÜN
Danışman: DOÇ. DR. OĞUZ ALTUNGÖZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Nöroblastom, periferal sinir sisteminden köken alan çocukluk çağı solid tümörleri arasında en sık görülen tümördür. MYCN geni amplifikasyonu nöroblastom tümörünün prognozunu kötü yönde etkiler. MYCN amplifikasyonunun nasıl oluştuğu tam olarak bilinmemektedir. Gen amplifikasyonları insan kanserlerinde tümöral bir davranışın sonucu olarak oluşabilmektedir. Diğer organizmalarda da gen kopya sayısı artışı meydana gelebilir. Drosophila melanogaster`in, normal gelişimsel sürecinde chorion genlerinin kopya sayısı, amplifikasyon kontrol elemanı (ACE3) dizisine bağlanan myb protein kümesi ile düzenlenir. Chorion amplifikasyonunu indükleyen kümede myb ve E2F1, baskılayan kümede myb, E2F2 ve l(3)mbt proteinleri yer alır. Drosofila`da genel genomik amplifikasyonda ise DUP ve geminin rol alır. Bu tez çalışmasında da myb benzeri bir protein kümesinin MYCN geni amplifikasyonunu kontrol edebileceği öngörülerek MYCN amplifiye Nöroblastom hücre hatlarında, Drosofila`da tanımlanmış proteinlerin insan ortologları c-myb, b-myb, a-myb, E2F1, HL3MBTL ve hCdt1/gemininin rolleri araştırıldı. Kelly, IMR32, MHH-NB-11 ve SIMA hücre hatlarında; c-myb, HL3MBTL, E2F1, hCdt1, p21, geminin, b-myb ve kontrol olarak EGFP`ye özgül shRNA`ları içeren plazmid vektörlerle RNA susturulması gerçekleştirildi. Susturma öncesinde ve sonrasında MYCN, c-myb, HL3MBTL, E2F1, hCdt1, p21, geminin, b-myb ve referans HPRT1`in mRNA düzeyleri ve MYCN ile referans p53 genleri DNA kopya sayısı oranları gerçek zamanlı PCR deneyleriyle belirlendi. Sonuçta; Kelly ve SIMA`da c-myb geni mRNA`sı baskılandığında; MYCN/p53 genomik DNA kopya sayısı oranında sırasıyla %21,09 ve %104,02 düzeyinde bir artma, IMR32 ve MHH-NB-11`de ise sırasıyla %54,11 ve %78,25 düzeyinde bir azalma görüldü. Ayrıca MYCN mRNA ekspresyon düzeyi MHH-NB-11 (%66,81), SIMA (%44,44) ve IMR32`de (%37,43) azalırken Kelly`de (%27,14) arttı. Bu durumda, c-myb MYCN geni kopya sayısını Kelly ve SIMA`da azaltma yönünde, IMR32 ve MHH-NB-11`de artırma yönünde etkilemiştir. Sonuç olarak; c-myb ile MYCN amplifikasyonunun ilişkili olduğu görülmektedir. Nöroblastom tedavisinde c-myb bir ilaç hedefi olarak seçilebilir.

Abstract:
Neuroblastoma is the most common tumor in pediatric solid tumors which derive from the peripheral nervous system. MYCN gene amplification give rise to the poor prognosis in neuroblastoma tumors. The mechanism of which the MYCN amplification is formed has been clearly unknown yet. Gene amplifications may form due to tumoral behaviour in human cancers. Increased gene copy numbers occur in also other organisms. Chorion gene copy numbers are regulated by the myb protein complex that bind to ACE3 during the normal developmental stage of Drosophila melanogaster. Myb and E2F1 take part in complex that induce chorion amplification and the myb, E2F2 and l(3)mbt proteins participate in the prevention complex. On the other hand, DUP and geminin play role in general genomic amplification of Drosophila. In this thesis study, myb-like protein complex was hypothesized that may control the MYCN gene amplification. And, the roles of human orthologs that are termed as c-myb, b-myb, a-myb, E2F1, HL3MBTL and hCdt1/gemininin related to defined proteins in Drosophila were investigated in neuroblastoma cell lines. RNA interference was performed by using plasmid vectors that include shRNA sequences specific to c-myb, HL3MBTL, E2F1, hCdt1, p21, geminin, b-myb and control EGFP in Kelly, IMR32, MHH-NB-11 and SIMA cell lines. The mRNA levels of MYCN, c-myb, HL3MBTL, E2F1, hCdt1, p21, geminin, b-myb, reference HPRT1 genes and ratios of the DNA copy numbers of MYCN and reference p53 genes were determined by real time PCR assays during pre- and post-RNA interference. In conclusion, when the c-myb expression was interferenced through shRNA vector system in cell lines, the ratios of MYCN/p53 DNA copy number increased in Kelly (21.09%) and SIMA (104.02%) cell lines and decreased in IMR32 (54.11%) and MHH-NB-11 (78.25%) cell lines. In addition, MYCN gene expression decreased in MHH-NB-11 (66.81%), SIMA (44.44%) and IMR32 (37.43%) cell lines and increased in Kelly (27.14%) cell line. According to present findings, while c-myb acts to decrease the MYCN copy number in Kelly and SIMA, it acts to increase in the IMR32 and MHH-NB-11 cell lines. Consequently, it was seen that c-myb and MYCN amplification are related with each other. C-myb may select as a drug target in neuroblastoma therapy.