Enkapsüle edilmiş miR-3670, miR-8078 temelli tedavi yaklaşımının meme kanserinin immünoterapisindeki etkinliğinin araştırılması
Investigation of the efficacy of encapsulated miR-3670, miR-8078 based treatment approach in immunotherapy of breast cancer
Yazar: SEDAT KÖSTEKCİ
Danışman: PROF. DR. YASİN TÜLÜCE
Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Adjuvanlar-immünolojik = Adjuvants-immunologic ; Antikanser = Anticancer ; Hücre kültürü = Cell culture ; Meme kanseri =   ; Reseptörler-immünolojik = Receptors-immunologic ; Sitotoksisite-immünolojik = Cytotoxicity-immunologic ; Tümör hücreleri-kültürü yapılmış = Tumor cells-cultured ; İmmünoterapi = Immunotherapy

Özet:
Bu çalışmada amaç, MCF-7 meme kanseri hücrelerinde aşırı eksprese edilen bir immün kontrol noktası olan PD-L1'in ekspresyonunu mikroRNA-3670 (miR-3670) ve mikroRNA-8078 (miR-8078) kullanarak inhibe etmek ve meme kanserindeki immünoterapötik özelliklerini araştırmaktır. 
Biyoinformatik analizlerimiz sonucunda miR-3670'in PD-L1 mRNA'nın iki farklı bölgesine yüksek bağlanma skorlarıyla (82.15 ve 87.35) bağlanabildiği, PD-L1 ligand sentez yolaklarını ve kanser hücrelerinin temel düzenleyici yolaklarını önemli ölçüde hedef aldığı ve meme kanserinde PD-L1 ekspresyonunu etkili bir şekilde baskıladığı tespit edilmiştir. Sitotoksisite analizi, her iki miRNA'nın 1nM dozunun MCF-7 hücre hattında yüksek toksisite sergilerken, sağlıklı bir meme dokusu hücre hattı olan HME1'de daha az toksik olduğunu tespit edilmiştir. Total RNA analizleri, toplam RNA konsantrasyonları ile sitotoksisite seviyeleri arasında anlamlı bir korelasyon olduğunu belirlemiştir. Yüksek sitotoksik dozlarda toplam RNA miktarında bir azalma gözlenirken, düşük sitotoksik dozlarda bir artış belirlenmiştir. 
RT-PCR ve ELISA analizlerimize dayanarak, miRNA-3670 ve miRNA-8078 mimiklerinin 1 nM dozlarının MCF-7 hücrelerinde hem PD-L1 gen ifadesini hem de sPD-L1 protein seviyelerini azalttığı tespit edilmiştir. Ancak, HME1 hücreleri üzerinde anlamlı bir etki tespit edilememiştir. MCF-7 hücrelerinde, miR-3670 ve miR-8078 hücre sağkalımını azaltıp apoptozu tetiklerken, HME1 hücrelerinde anlamlı bir farka neden olmamıştır. Hücre göçü analizimize göre, miRNA'lar MCF-7 hücrelerinde hücre göçü üzerinde güçlü bir inhibitör etkiye sahipti (sırasıyla %81.47 ve %99.8) ve anti-metastatik özellik sergilemiştir. Tersine, HME1 hücrelerinde hücre göçünü inhibe edemediği (sırasıyla %22.8 ve %6.2) tespit edilmiştir.
Morfoloji ve biyoinformatik analizlere (KEGG ve GO) dayanarak, her iki miRNA da lamellipodia varlığında önemli bir düşüşe yol açarak MCF-7 hücrelerinde EMT'den MET'e geçişe neden olduğu tespit edilmiştir. Ancak, HME1 hücrelerinde görünür morfolojik değişiklikler gözlenmemiştir.
Metastazla ilişkili parametreler üzerinde yapılan ELISA analizlerine göre, MCF-7 ve HME1 hücrelerinde miR-3670 ile miR-8078'in 1nM dozu serbest e-kaderin antijen seviyelerini önemli ölçüde azalttığı tespit edilmiştir. Ayrıca, miR-3670 ve miR-8078'in MCF-7 ve HME1 hücrelerinde sVEGF-A seviyesinde ve sTINAGL-1 antijen seviyesinde azalmaya neden olduğu bulunmuştur.
miR-3670 ve miR-8078'in MCF-7 hücrelerinde koloni oluşumunu sırasıyla %17.7 ve %78.2'lik bir azalma ile önemli ölçüde engellediği belirlenmiştir. MCF-7 hücre hattında 3D sferoid oluşumunu %90 oranında engellediği ve tipik olarak elipsoid şekilli 3D sferoidlerin aksine amorf sferoidlerin (sırasıyla %13 ve %22) gelişmesine neden olduğu tespit edilmiştir. Oluşturulan 3D sferoidlerin boyutunun 100 µm'nin altında kaldığı ve hacimlerinin 1 mm3 ten az olduğu tespit edilmiştir. HME1 hücre hattında 3D sferoid yapı gözlenmemiştir.
Sonuç olarak; miRNA'ların (miR-3670, miR-8078), meme kanseri hücrelerinde bağışıklık tepkilerinin yeniden yönlendirilmesi yoluyla kanser immünoterapisi için potansiyele sahip olabileceğini göstermiştir. Özellikle mevcut kanser tedavisi yaklaşımlarında giderek daha önemli hale gelen kişiselleştirilmiş kanser immünoterapisi de ve hedefe yönelik tedaviye ilişkin gelecekteki araştırmalar için bir temel sağlayabilir.

Abstract:
The aim of this study was to inhibit the expression of PD-L1, an immune checkpoint overexpressed in MCF-7 breast cancer cells, by using microRNA-3670 (miR-3670) and microRNA-8078 (miR-8078) and evaluate its immune therapeutic properties in breast cancer. is to research.
As a result of our bioinformatic analysis, miR-3670 can bind to two different regions of PD-L1 mRNA with high binding scores (82.15 and 87.35), significantly targets PD-L1 ligand synthesis pathways and basic regulatory pathways of cancer cells, and inhibits PD-L1 expression in breast cancer. It has been found to effectively suppress.
Cytotoxicity analysis determined that the 1nM dose of both miRNAs exhibited high toxicity in the MCF-7 cell line, while being less toxic in HME1, a healthy breast tissue cell line. Total RNA analyzes determined that there was a significant correlation between total RNA concentrations and cytotoxicity levels. While a decrease in the amount of total RNA was observed at high cytotoxic doses, an increase was determined at low cytotoxic doses.
Based on our RT-PCR and ELISA analyses, 1 nM doses of miRNA-3670 and miRNA-8078 mimics were found to reduce both PD-L1 gene expression and sPD-L1 protein levels in MCF-7 cells. However, no significant effect on HME1 cells was detected. In MCF-7 cells, miR-3670 and miR-8078 reduced cell survival and triggered apoptosis, while it did not cause a significant difference in HME1 cells. According to our cell migration analysis, miRNAs had a strong inhibitory effect on cell migration in MCF-7 cells (81.47% and 99.8%, respectively) and exhibited anti-metastatic property. Conversely, it was found to be unable to inhibit cell migration in HME1 cells (22.8% and 6.2%, respectively).
Based on morphology and bioinformatics analyzes (KEGG and GO), both miRNAs were identified to cause a significant decrease in the presence of lamellipodia, causing the transition from EMT to MET in MCF-7 cells. However, no visible morphological changes were observed in HME1 cells.
According to ELISA analyzes performed on metastasis-related parameters, it was observed that 1nM doses of miR-3670 and miR-8078 significantly reduced free e-cadherin antigen levels in MCF-7 and HME1 cells. Additionally, miR-3670 and miR-8078 were found to cause a decrease in the sVEGF-A level and sTINAGL-1 antigen level in MCF-7 and HME1 cells.
It was determined that miR-3670 and miR-8078 significantly inhibited colony formation in MCF-7 cells, with a decrease of 17.7% and 78.2%, respectively. It was found to inhibit 3D spheroid formation in the MCF-7 cell line by 90% and cause the development of amorphous spheroids (13% and 22%, respectively), as opposed to the typically ellipsoid-shaped 3D spheroids. It was determined that the size of the 3D spheroids created was below 100 µm and their volume was less than 1 mm3. 3D spheroid structure was not observed in the HME1 cell line.
In conclusion; demonstrated that miRNAs (miR-3670, miR-8078) may have potential for cancer immunotherapy through redirection of immune responses in breast cancer cells. It may also provide a basis for future research into personalized cancer immunotherapy and targeted therapy, which is becoming increasingly important in current cancer treatment approaches in particular.