Hidroksinitril liyaz'ın çeşitli meyve çekirdeklerinden saflaştırılması ve immobilizasyonu
Purification and immobilization of hydroxynitrile lyase from different fruits seeds
Yazar: DİLEK ALAGÖZ
Danışman: PROF. DR. S.SEYHAN TÜKEL
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzim immobilizasyonu = Enzyme immobilization ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification

Özet:
Bu çalışmada, şimdiye kadar hidroksinitril liyaz (HNL) kaynağı olarak kullanılmamış üçü yabani ve üçü kültür formu altı çeşit Prunus türü meyvenin çekirdeklerinden HNL'ın saflaştırılması, karakterizasyonu ve Eupergit CM desteğe kovalent olarak veya çapraz bağlı enzim agregatları (CLEA) oluşturma yöntemiyle immobilizasyonları (HNL-CLEA) ile (R/S)-mandelonitrilin kinetik rezolüsyonu ve (R)-mandelonitril, (R)-2-kloromandelonitril, (R)-3,4-dihidroksimandelonitril ve (R)-2-hidroksi-4-fenilbütironitril sentezlerinde kullanımları araştırılmıştır. Ayrıca serbest ve immobilize HNL'ların termal ve depolama kararlılıkları ve immobilize HNL'ların kesikli reaktördeki tekrar kullanım kararlılıkları araştırılmıştır. Farklı türlerden saflaştırılan HNL'ın herbiri yaklaşık 25 kDa olan 4 alt üniteden oluştuğu belirlenmiştir. Serbest HNL'lar arasında en yüksek Vmax değeri 197,2 U/mg prot. olup acıbadem HNL için ve immobilize HNL'lar arasında en yüksek Vmax değeri 126,2 U/g Eup CM ve 48 U/g CLEA olup sırasıyla kayısı HNL-Eupergit CM ve kayısı HNL-CLEA için hesaplanmıştır. Tüm immobilize HNL'ların 50°C'deki termal kararlılıkları ve 5°C'deki depolama kararlılıkları serbest karşıtlarına göre daha yüksek bulunmuştur. İmmobilize HNL'lar arasında, tekrar kullanım kararlılığı en yüksek olan kültür formu erik HNL-Eupergit CM'nin 20 mg'ının kesikli reaktörde başlangıç aktivitesinin %50'si kalıncaya kadarki tekrar kullanımı sonucundaki aktivite toplamı (prodüktivite) yaklaşık 4x103 U/g Eup CM olarak belirlenmiştir. Farklı türlerin serbest HNL'ları kullanılarak sentezlenen (R)-mandelonitril, (R)-2-kloromandelonitril, (R)-3,4-dihidroksimandelonitril, (R)-2-hidroksi-4-fenilbütironitril için en yüksek %verim değerleri sırasıyla %91, %66, %95, %88 ve en yüksek enantiyomerik aşırılık ( %ee) değerleri sırasıyla %94, %47, %99, %94 olarak belirlenmiştir. İmmobilize HNL'lar için, özellikle de HNL-CLEA'lar kullanılarak yapılan sentezler olmak üzere daha yüksek % verim ve ee değerine sahip enantiyosaf siyanohidrinler elde edilmiştir.

Abstract:
In this study, we aimed to purify and characterize hydroxynitrile lyase (HNL) from the seeds of three wild type and three cultivated type of Prunus fruits which have not been used as HNL sources up to now, to immobilize onto Eupergit CM by covalently or cross-linked to obtain cross-linked HNL aggregates (HNL-CLEA), and to investigate the application of free and immobilized HNLs for the kinetic resolution of (R/S)-mandelonitrile and the synthesis of (R)-mandelonitrile, (R)-2-chloromandelonitrile, (R)-3,4-dihydroxy mandelonitrile and (R)-2-hydroxy-4-phenylbutyronitrile. Thermal and storage stabilities of all HNL preparations were also determined and the reusabilities of immobilized HNLs in batch type reactor were investigated. Purified HNLs were consist of four identical subunits and the molecular weight of each one is 25 kDa. Of free HNLs the highest Vmax value was determined as 197.2 U/mg prot. for wild type almond and the highest Vmax values were determined as 126.2 U/g Eup CM and 48 U/g CLEA for cultivated apricot HNL-Eupergit CM and cultivated apricot HNL-CLEA, respectively. Immobilized HNL preparations showed better thermal stabilities at 50°C and storage stabilities at 5°C than those of corresponding free HNLs. The highest reusability was obtained with the cultivated plum HNL-Eupergit CM and the productivity of 20 mg sample was determined as 4x103 U/g Eup CM when the remaining activity was 50% of its initial activity. Using free HNLs of different types, the highest (R)-mandelonitrile, (R)-2-chloromandelonitrile, (R)-3,4-dihydroxy mandelonitrile, R)-2-hydroxy-4-phenylbutyronitrile yields were determined as 91, 66, 95, 88% , respectively and the highest enantiomeric excess (ee%) values were obtained as 94, 47, 99, 94%, respectively. Better results were obtained with immobilized HNLs, especially in the case of HNL-CLEAs for the synthesis of above mentioned enantiopure cyanohydrins.