Yüzde yetmiş parsiyel hepatektomi yapılan sıçanlarda kalsiyum dobesilatın karaciğer rejenerasyonuna etkisi
Effect of calcium dobesilate on liver regeneration in rats undergoing seventy percent partial hepatectomy
Yazar: GİZEM FIRTINA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ HAMDİ TANER TURGUT
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Kocaeli Derince Eğt. ve Arş. Hast. / Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Genel Cerrahi = General Surgery
Dizin: Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hepatektomi = Hepatectomy ; Kalsiyum dobesilat = Calcium dobesilate ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer rejenerasyonu = Liver regeneration ; Oksidatif hasar = Oxidative damage ; Sıçanlar = Rats

Özet:
GİRİŞ VE AMAÇ: Karaciğer tüm sistemleri ilgilendiren önemli metabolik fonksiyonları olan bir organdır. Parsiyel hepatektomi(PH), karaciğerin primer ve sekonder tümörlerinin tedavisinde ayrıca canlı vericili karaciğer transplantasyonunda yaygın olarak uygulanmaktadır. Rezeksiyon sonrası karaciğer yetmezliği insidansı %0-32 arasında değişmektedir. Prosedüre bağlı mortalitede ana nedenlerden biri, postoperatif karaciğer yetmezliğidir(%18-75). PH sonrası karaciğer rejenerasyonu, inflamatuar sinyal moleküllerinin aktivasyonu ve oksidatif stresin indüklenmesi ile ilişkilidir. Rejenerasyona destek mekanizmalarından biri de antioksidan savunma sistemleridir. Daha önce antioksidan özellikleri olan ajanlarla yapılan çalışmalarda hepatik rezeksiyon sonrası karaciğer rejenerasyonuna olumlu katkılarının olduğu bildirilmiştir. Anjioprotektif ve antioksidan etkili kalsiyum dobesilatın(KD), karaciğer rejenerasyonuna olumlu etkileri olabileceği düşünüldü. Bildiğimiz kadarıyla KD'nin hepatektomi sonrası rejeneratif kapasite üzerine etkileri hakkında yapılmış bir çalışma yoktur. Çalışmamızda, PH sonrası KD'nin karaciğer rejenerasyon kapasitesi ve antioksidan yol üzerine etkilerinin değerlendirilmesi amaçlandı.
GEREÇ VE YÖNTEM: Çalışmada ağırlıkları 250-350 gram arasında değişen, 36 adet Spraque Dawley erkek sıçan kullanıldı. Sıçanlar randomize olarak her biri 9 sıçandan oluşan 4 gruba ayrıldı.
Grup 1: Kontrol grubu: PH + Salin(2 gün)
Grup 2: Kontrol grubu: PH + Salin(7 gün)
Grup 3: Çalışma grubu: PH + KD(100mg/kg/gün) (2gün) 
Grup 4: Çalışma grubu: PH + KD(100mg/kg/gün) (7gün)
Parsiyel hepatektomi sonrası çıkarılan karaciğer ağırlıkları tartılarak kaydedildi. Belirtilen günlerin sonunda relaparotomi uygulandı, abdominal aortadan biyokimyasal inceleme için kan alındıktan sonra sıçanlar sakrifiye edildi. Remnant karaciğer dokuları tartılıp ağırlıkları kaydedildi. Oksidatif hasar ve karaciğer rejenerasyonunu değerlendirmek için biyokimyasal, histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemler kullanıldı. 
BULGULAR: Serum süperoksit dismutaz(SOD) düzeyi kontrol grupları(2. ve 7.gün) arasında istatistiksel anlamlı farklılık yoktu(Sırasıyla 3,69 ± 0,48 vs 4,75 ± 2,75; p:0,13). Tedavi ve çalışma grupları karşılaştırıldığında hem 2 hem de 7 gün KD verilen gruplarda serum SOD düzeyi düşük ölçülmesine rağmen aradaki fark istatistiksel anlamlı değildi(p:0,50). Karaciğer doku SOD düzeyi ölçümünde kontrol grupları(2. ve 7.gün) arasında istatistiksel anlamlı farklılık vardı.(Sırasıyla 2,20 ± 0,59 vs 1,20 ± 0,30; p:0,001). Tedavi verilen(2. ve 7.gün KD) gruplarda kontrol gruplarına göre istatistiksel anlamlı farklılık olacak şekilde doku SOD düzeyi daha yüksekti(p:0,03). Serum glutatyon(GSH) düzeyi açısından kontrol, tedavi grupları ve bu grupların birbirleriyle karşılaştırılmasında istatistiksel anlamlı farklılık saptanmadı(sırasıyla p:0,14 vs 0,66). Karaciğer doku GSH değeri kontrol gruplarında ve bu grupların çalışma gruplarıyla karşılaştırılmasında tüm gruplar arasında istatistiksel anlamlı farklılık saptanmadı. Lipid peroksidasyonunun göstergesi olan malondialdehit(MDA) düzeyinin serumdaki ölçümlerinde kontrol grupları arasında istatistiksel farklılık yoktu(p:0,73). KD verilen gruplarda kontrol gruplarına göre günden bağımsız olarak serum MDA düzeyi daha düşük saptandı. Ancak aradaki fark istatistiksel anlamlı değildi(p:0,22). Doku MDA düzeyinin kontrol gruplarında 2.günden 7.güne azaldığı gösterildi(p:0,001). Hem 2.gün hem de 7.günde çalışma gruplarında kontrol gruplarına göre MDA düzeyi istatistiksel anlamlı olmak üzere yüksekti(p:0,001)
Kontrol grupları arasında 7.günde rejenerasyon oranı(RO) daha yüksek olmasına rağmen fark istatistiksel anlamlı değildi(p:0,66). 2.günde KD verilen grupta kontrol grubuna göre RO yüksek ve istatistiksel olarak da bu farklılık anlamlı saptandı(p<0,001). 7.gündeki çalışma ve kontrol grupları karşılaştırıldığında yine KD tedavisi verilen grupta kontrol grubuna göre yüksek saptanmasına rağmen istatistiksel anlamlı fark saptanmadı(p:0,667). RO, KD verilen 2.gün grubunda 7.gün grubuna göre istatistiksel anlamlı yüksek bulundu(p<0,001).
Histopatolojik değişiklikler Suzuki Skorlama Sistemi'ne göre derecelendirildiğinde; sinüzoidal konjesyon çalışma gruplarında yok(%56,5) veya hafif(%44,4), kontrol gruplarında ise orta(%50) veya şiddetli(%50) düzeyde gözlendi(p<0,001). KD verilen gruplarda vakuolizasyon ve nekroz hiç gözlenmedi(Sırasıyla <0,001 vs 0,034).
Apopitotik indeks(Aİ), kontrol gruplarında çalışma gruplarına göre anlamlı düzeyde yüksekti(p<0,001). Kontrol grupları arasında Aİ için 2. ve 7.günde anlamlı farklılık saptanmazken(p:0,667), çalışma grupları kendi aralarında değerlendirildiğinde 7.günde Aİ istatistiksel anlamlı olmak üzere daha düşük bulundu(p:0,006).
Proliferasyonu değerlendirmek için kullanılan Ki67 ekspresyonu hem 2.günde hem de 7.günde KD tedavisi verilen gruplarda verilmeyen gruplara göre; tedavi alan gruplarda ise 7.günde 2.güne göre istatistiksel anlamlı yüksekti(p:0,006).

SONUÇ: PH'de KD verilmesi ile artan doku SOD düzeyi, bu tedavinin kısmen antioksidan sisteme destek verdiğini göstermektedir. Ancak çalışmamızda oksidatif hasarı değerlendirmede kullanılan diğer parametrelerin(GSH,MDA) doku ve serum düzeyinin, antioksidan maddelerle elde edilen bilinen sonuçlara göre kısmen zıt olduğu görülmüştür. Bu farklı bulguların nedeni çalışmamızda ortaya konulamamıştır. Gruplar arası RO farkının KD'dan kaynaklandığı ve KD'nin karaciğer rejenerasyonuna katkısı olduğunu düşündürmektedir. Işık mikroskobisi altında histopatolojik incelemede sinüzoidal konjesyonun ve vakuolizasyonun KD tedavisi ile azaldığı, KD tedavisinin PH sonrası karaciğerin daha normal histolojiyle rejenerasyonunda faydalı olabileceğini ve karaciğer dokusu üzerinde koruyucu etkisi olabileceğini desteklemektedir. KD'nin, PH sonrası meydana gelen apopitoz eğilimini baskılamada etkin olduğu ve böylece rejenerasyona belirgin katkısı olduğu görülmüştür. KD tedavisi ile Ki67 ekpresyonu artmaktadır. Bu nedenle KD; doku onarımını, hücre proliferasyonunu arttırmakta ve rejenerasyonu desteklemektedir.

Anahtar Kelimeler: Kalsiyum dobesilat, karaciğer rejenerasyonu, oksidatif hasar, parsiyel hepatektomi, deneysel.

Abstract:
INTRODUCTION AND OBJECTIVE: The liver is an organ with important metabolic functions that involve all systems. Partial hepatectomy (PH) is widely used for the treatment of primary and secondary tumors of the liver, as well as living-donor liver transplantations. The incidence of liver failure after resection ranges between 0-32%. One of the main causes of procedural mortality is postoperative liver failure (18-75%). Liver regeneration after PH is associated with activation of inflammatory signaling molecules and induction of oxidative stress. One of the support mechanisms for regeneration is antioxidant defense systems. Studies on agents that previously had antioxidant properties have reported that they positively contribute to liver regeneration after hepatic resection. Angioprotective and antioxidant calcium dobesilate (Cd) have been thought to have positive effects on liver regeneration. To the best of our knowledge, there is no study on the effects of Cd on regenerative capacity after hepatectomy. In our study, we aimed to evaluate the effects of Cd on liver regeneration capacity and antioxidant pathway after PH.
MATERIALS AND METHODS: The study employed 36 Sprague Dawley male rats weighing between 250-350 grams. The rats were randomly divided into 4 groups of 9 rats each.
Group 1: Control group: PH + Saline (2 days)
Group 2: Control group: PH + Saline (7 days)
Group 3: Study group: PH + Cd (100mg/kg/day) (2 days) 
Group 4: Study group: PH + Cd (100mg/kg/day) (7 days)
The liver weights removed after partial hepatectomy were weighed and recorded. Relaparotomy was performed at the end of the specified days and the rats were sacrificed after blood was collected from the abdominal aorta for biochemical analysis. The remnant liver tissues were weighed and recorded. Biochemical, histopathological and immunohistochemical methods were used to evaluate oxidative damage and liver regeneration. 
RESULTS: There was no statistically significant difference between the serum superoxide dismutase (SOD) levels of the control groups (2nd and 7th days) (3.69 ± 0.48 vs 4.75 ± 2.75, p = 0.13, respectively). When the treatment and study groups were compared, the difference was not statistically significant although the serum SOD level was low in the Cd groups on both 2 and 7 days (p = 0.50). There was a statistically significant difference between the control groups (2nd and 7th days) in the measurement of liver tissue SOD levels. (2.20 ± 0.59 vs 1.20 ± 0.30 respectively; p = 0.001). The tissue SOD level was statistically significantly higher in the treatment groups (2nd and 7th day Cd) compared to the control groups (p = 0.03).  In terms of serum glutathione (GSH) level, there was no statistically significant difference between the control groups and the treatment groups, and in the comparison of these groups with each other (p = 0.14 vs. 0.66, respectively). There was no statistically significant difference in liver tissue GSH value between the control groups and in the comparison of these groups with the study groups. There was no statistical difference between the control groups in the measurements of malondialdehyde (MDA) level, which is an indicator of lipid peroxidation (p = 0.73). The serum MDA levels were lower in the Cd groups than in the control groups, regardless of the day. However, the difference was not statistically significant (p = 0.22). The tissue MDA level was shown to decrease in the control groups from the 2nd day to the 7th day (p = 0.001). On both the 2nd and 7th days, the MDA level was statistically significantly higher in the study groups compared to the control groups (p = 0.001).
Although the regeneration rate (RR) was higher on the 7th day among the control groups, the difference was not statistically significant (p = 0.66). On the 2nd day, the RR was higher in the Cd group compared to the control group, and the difference was statistically significant (p < 0.001). When the study and control groups were compared on the 7th day, the RR was higher in the Cd group than in the control group, although the difference was not statistically significant (p = 0.667). The RR was statistically significantly higher in the 2nd day Cd group than in the 7th day group (p < 0.001).
When histopathological changes were graded by the Suzuki Scoring System, the study groups (56.5%) had no sinusoidal congestion or had mild sinusoidal congestion (44.4%), while the control groups had moderate (50%) or severe (50%) sinusoidal congestion (p < 0.001). Vacuolization and necrosis were not observed in the Cd groups (<0.001 vs. 0.034, respectively).
The apoptotic index (AI), was significantly higher in the control groups compared to the study groups (p < 0.001). Although there was no significant difference between the control groups for AI on the 2nd and 7th days (p = 0.667), when the study groups were evaluated among themselves, the AI was statistically significantly lower on the 7th day (p = 0.006). 
The Ki-67 expression, which is used to evaluate proliferation, was statistically significantly higher in both the 2nd and 7th day groups compared to the non-Cd groups, and was also higher on the 7th day compared to the 2nd day in the Cd groups (p = 0.006). 

CONCLUSION: The increased tissue SOD level with the administration of Cd in PH indicates that this treatment partially supports the antioxidant system.  However, in our study, it was observed that the tissue and serum levels of other parameters (GSH, MDA) used for evaluating oxidative stress were partially contrary to the known results obtained with antioxidant substances. The reason for these different results could not be revealed in our study. This suggests that the RR difference between the groups is due to Cd and that Cd contributes to liver regeneration. Decreased sinusoidal congestion and vacuolization with Cd treatment on the histopathological examination under light microscopy supports that Cd treatment may be beneficial for the regeneration of the liver to normal histology after PH and may have a protective effect on liver tissue. It was found that Cd was effective in suppressing the tendency to apoptosis after PH, thus significantly contributing to regeneration. The expression of Ki-67 increases with Cd treatment. Therefore, Cd increases tissue repair, cell proliferation and promotes regeneration.

Keywords: Calcium dobesilate, liver regeneration, oxidative damage, partial hepatectomy, experimental.