Nöral hastalıklarda alternatif bir ilaç adayı olabilecek Glaucium corniculatum ekstraktlarının apoptoz, inflamasyon ve asetilkolinesteraz (AChE)'ı baskılama potansiyellerine göre etkilerinin araştırılması
The investigation of the effects of Glaucium corniculatum  extracts, which may be candidates for an alternative drug in neural diseases, according to their suppression potential of apoptosis, inflammation and acetylcholinesterase (AChE)
Yazar: FATMA GONCA KOÇANCI
Danışman: PROF. DR. BELMA ASLIM
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Alzheimer, Parkinson, Huntington ve amiyotrofik lateral skleroz gibi nörodejeneratif hastalıklar, kolinerjik iletim kaybı (AChE enzim artışı), apoptoz ve inflamasyonun neden olabileceği nöronal hasar ile karakterizedir. Nörodejeneratif hastalıklar için geliştirilen mevcut ilaçlar, hastalığın tam anlamıyla tedavisini sağlayamamaktadır. Bu tez çalışmasında, nörodejeneratif hastalıkların ortak mekanizmaları üzerinde etkisi ortaya konmuş, doğal ve yeni bir bitkisel ajanın bulunması amaçlanmıştır. Glaucium corniculatum bitkisinin kloroform, metanol ve su ekstraktlarında toplam alkaloid, flavonoid ve fenolik bileşik miktarı spektrofotometre ile, biyoaktif bileşen içeriği ise GC-MS ve HPLC ile belirlenmiştir. Ekstraktların in vitro ve hücresel asetilkolinesteraz inhibitör (AChE-i) özellikleri Ellman yöntemi ile belirlenmiş, hidrojen peroksit (H2O2) ile AChE aktivitesi indüklenmiş farklılaştırılmış PC12 (fPC12) hücre modelinde AChE gen ve protein düzeyinde etkileri qRT-PCR ve western blot hibridizasyon yöntemleriyle incelenmiştir. Aynı hücre modeli ile apoptoza indüklenen fPC12 hücrelerinde, ekstraktların apoptozu inhibe edici etkileri qRT-PCR ve western blot hibridizasyon yöntemleriyle belirlenmiştir. Ayrıca, BV-2 hücrelerinde lipopolisakkarit (LPS) ile oluşturulan inflamatuar hücre modelinde ekstrelerin TNF-α ve IL-6 üzerindeki etkileri ELISA kitleri ile tespit edilmiştir.  Her üç ekstrede de alkaloid (93-112 mg/g ekstre), flavonoid (0,71-1,55 mg/g ekstre) ve fenolik bileşen (1,45-1,70 mg/g ekstre) belirlenmiştir. Ellman yöntemiyle gerçekleştirilen analizlerde tüm ekstrelerin in vitro ve hücresel AChE-i etkilerinin olduğu saptanmış, gen (% 29-90 AChE inhibisyonu) ve protein düzeyinde (% 16-21 AChE inhibisyonu)  elde edilen veriler de bu sonuçları doğrulamıştır. Test edilen tüm yöntemlerde metanol ekstraktı, AChE-i özellik bakımından diğer ekstrelere göre öne çıkmış olup, ekstrenin allokriptopin alkaloidini, rutin ve kuersetin flavonoidini yüksek oranda içerdiği dikkati çekmiştir. Ekstrelerin nöral apoptoza indüklenmiş hücre modelinde Bax, Kaspaz 3, 9 ve Bcl-2 gen ve proteinlerini baskılayarak, nöral apoptozu giderici etki gösterdiği tespit edilmiştir. G. corniculatum'un üç ekstresinin de LPS kaynaklı TNF-α (% 12-70 oranında) ve IL-6 (% 23-96 oranında) indüksiyonunu önemli ölçüde engellediği ve BV-2 hücrelerinde anti-inflamatuar etki gösterdiği saptanmıştır. Apoptoz ve inflamasyon yolaklarında su ekstresinin 1000 µg/mL'lik konsantrasyonu, diğer uygulamalara göre öne çıkmıştır. Bunun ekstredeki tetrahidroberberin ve oleamid miktarıyla ilişkili olabileceği düşünülmüştür. Sonuçlar, G. corniculatum ekstrelerinin nörodejeneratif hastalıklar üzerinde üç farklı mekanizma ile etkili olabileceğini göstermiştir.

Abstract:
Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's diseases, and Amyotrophic lateral sclerosis are characterized by neuronal damage which may be caused by loss of cholinergic transmission (AChE enzyme increase), apoptosis and inflammation. Existing drugs against these neurodegenerative diseases can not provide a complete cure. In this thesis, a natural and new herbal agent, the effect of which has been revealed on the common mechanisms of neurodegenerative diseases, has been aimed to be discovered. The amount of alkaloid, flavonoid and phenolic compounds in the chloroform, methanol and water extracts of Glaucium corniculatum have been determined by spectrophotometer and their bioactive component contents determined by GC-MS and HPLC. The in vitro and cellular acetylcholinesterase inhibitor (AChE-i) properties of the extracts have been determined by ELISA, their effects of AChE mRNA and protein expression determined by qRT-PCR and western-blot hybridization methods in differentiated PC12 (fPC12) cell model which AChE activity induced with hydrogen peroxide (H2O2). Apoptosis inhibitory effects of extracts have been determined by qRT-PCR and western blot hybridization methods in the apoptosis-induced fPC12 cells with the same cell model. Furthermore, the effects of extracts on TNF-α and IL-6 in the lipopolysaccharide (LPS)-induced microglial BV-2 cell model have been determined by ELISA kits. In all three extracts, alkaloid (93-112 mg/g extract), flavonoid (0.71-1.55 mg/g extract) and phenolic component (1.45-1.70 mg/g extract) were determined. In the analysis carried out by the Ellman method, it was determined that all extracts had in vitro and cellular AChE-i effects and these data obtained at the gene (29-90%  inhibition of AChE) and protein (16-21% inhibition of AChE) level also confirmed these results. In all of the methods tested, the methanol extract came out with respect to AChE-i properties, and it was noted that the extract contains a high proportion of allocriptopine alkaloid, rutin and quercetin flavonoids. In the neural apoptosis induced cell model, the extracts were found to suppress the Bax, Caspase 3, 9 and Bcl-2 genes and proteins and showed a neural apoptosis inhibiting effect. It was determined that three extracts of G. corniculatum significantly inhibited LPS-induced TNF-α (ratio of 12 to 70%) and IL-6 (ratio of 23 to 96%) induction and showed anti-inflammatory effects in BV-2 cells. The 1000 μg/mL concentration of water extract was more prominent than other applications in the pathways of apoptosis and inflammation. This was thought to be related to the amount of tetrahydroberberin and oleamide in the extract. The results demonstrated that G. corniculatum extracts may be effective in the neurodegenerative diseases through three different mechanisms.