Domates bitkisinin metal bazlı nanopartikül uygulamalarına fizyolojik ve proteomik yanıtlarının belirlenmesi
Determination of physiological and proteomic responses of metal based nanoparticle treatments on tomato plants
Yazar: YİĞİT KÜÇÜKÇOBANOĞLU
Danışman: PROF. DR. LALE AKTAŞ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Metal bazlı nanopartikül uygulamaları oldukça yaygın kullanım alanlarıyla birlikte bitki büyüme ve gelişiminde önemli rol oynamaktadır. Demir ve gümüş nanopartikülleri ise spesifik özellikleri sayesinde bu grup içerisinde ön plana çıkmaktadır. Yapılan tez çalışmasında, yeşil sentez yöntemi ile sentezlenen demir ve gümüş nanopartiküllerin domates bitkisine uygulanmasıyla oluşan fizyolojik ve proteomik yanıtlar araştırılmıştır. Demir ve gümüş nanopartikülleri defne (Laurus nobilis) yaprak ekstresi kullanılarak sentezlenmiş ve karakterize edilmiştir.  Ardından sentezlenen nanopartiküllerin karakterizasyonu UV-VIS spektrofotometre, SEM, EDS, FTIR, Zeta boyut ve Zeta potansiyel analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Elde edilen bulgular gümüş nanopartiküllerinin 33 nm, demir nanopartiküllerinin ise 34 nm boyutunda olduğunu göstermiştir. UV-VIS, FTIR, EDS ve Zeta analizleri ise nanopartiküllerin yapısal konformasyonunu doğrulamıştır. Demir ve gümüş nanopartikülleri domates bitkisine foliar olarak uygulandıktan sonra nanopartiküllerin büyüme ve gelişme üzerindeki etkileri ile biyokimyasal/moleküler ve proteomik düzeyde etkileri araştırılmıştır. Bitki büyüme ve gelişmesi üzerinde, 250 mg L-1 konsantrasyon uygulamasında demir nanopartiküllerinin yaş-kuru ağırlık miktarlarını stimüle ettiği belirlenirken kök-gövde uzunluklarını ise 25 mg L-1 ve 50 mg L-1 gümüş uygulamalarının stimüle ettiği belirlenmiştir. Biyokimyasal/moleküler analizler kapsamında yapılan H2O2 içeriği, MDA içeriği, fotosentetik verim analizi ve fotosentetik pigment analizlerinde nanopartikül uygulamalarının bir değişikliğe neden olmadığı belirlenmiştir. Bununla birlikte protein içeriği, CAT aktivitesi ve toplam antioksidan aktivite miktarlarının bütün konsantrasyonlarda yapılan nanopartikül uygulamalarında azaldığı belirlenmiştir. Ayrıca SOD aktivitesi ve prolin içeriklerinin ise uygulama yapılan her iki nanopartikülde ve bütün konsantrasyonlarında arttığı belirlenmiştir. Bu durum nanopartikül uygulamalarının bitki tarafından tolere edilebildiğini sonucunu ortaya koymaktadır Yapılan proteomik analizlerde ilk olarak SDS-PAGE analizi ile bitki proteinleri ayrılmıştır. Elde edilen jel görüntülerinde nanopartikül uygulamalarının tamamında yaklaşık 75, 68, 57, 43, 39, 22, 17 ve 15 kDa olarak hesaplanan toplam 8 bant üzerinde farklılaşmalar olduğu belirlenmiştir. Yaklaşık 39 kDa molekül ağırlığında belirlenen protein bandının gümüş nanopartikül uygulamalarında tamamen kaybolduğu belirlenmiştir. Yaklaşık 22 kDa molekül ağırlığında ise Fe nanopartikül uygulamalarının yeni bir bandı oluşumuna neden olduğu belirlenmiştir. Diğer bantlarda ise bant yoğunluklarında azalmalar gözlemlenmiştir. Son olarak protein bandlarında belirlenen değişimlerin metal bağlayan proteinlerle ilişkisi, belirlenen molekül ağırlığındaki proteinlerin domates proteomundan seçilerek biyoinformatik olarak analiz edilmesiyle ortaya konulmuştur.  In silico sekans analizlerinde belirlenen bantlar üzerinde 3373 protein belirlenirken bunlardan toplam 114 tanesinin metal bağladığı belirlenmiştir. Üç boyutlu yapısal modelleme analizlerinde bu proteinler içerisinden 82 proteinin yapısı Phyre2, ProSA ve MIB araçları kullanılarak doğrulanmıştır. Belirlenen proteinler CELLO ve InterPro araçları kullanılarak lokalizasyon, dahil olduğu biyolojik prosesler, moleküler fonksiyonları ve yapısına katıldığı hücresel bileşenler için analiz edilmiştir. Elde edilen bulgular, uygulanan demir ve gümüş nanopartikül düzeylerinin domates bitkisinde büyüme ve gelişmeyi uyarıcı etkisini ortaya koymaktadır. Fe ve Ag nanopartikül uygulamalarının, bitkide oksidatif stres ve hücre hasarının oluşmasına neden olacak lipid peroksidasyon düzeyine neden olmadığı belirlenmiştir. Ayrıca oksidatif strese yanıtta yer alan enzimlerin biyokimyasal verileri ile farklılaşan proteinlerin biyoinformatik analizleri arasındaki ilişki paralel bulunmuştur.

Abstract:
Metal-based nanoparticle applications have an important role in plant growth and development with their widespread use. Iron and silver nanoparticles come forward because of their specific properties. In this thesis study, iron and silver nanoparticles were produced by green synthesis method. Then, the physiological and proteomic responses of the applied nanoparticles on the tomato plant were investigated. Synthesized nanoparticles were characterized by using UV-VIS spectrophotometer, SEM, EDS, FTIR, Zeta size and Zeta potential. Results showed that size silver nanoparticle were 33 nm and the size of iron nanoparticles were 34 nm. Structural conformation of nanoparticles was performed by UV-VIS, FTIR, EDS and Zeta analyses. After foliar application of iron and silver nanoparticles onto plants, macroscopic, biochemical/molecular, and proteomic observations were done, and their effects were investigated on plants. Within the scope of macroscopic observations, the iron nanoparticles showed positive effects on plant growth and development in 250 mg L-1 dose application, while 25 mg L-1 and 50 mg L-1 silver showed positive effects on root-stem lengths. The nanoparticle applications did not cause any change in H2O2 and MDA content, photosynthetic yield analysis and photosynthetic pigment analyzes made within the scope of biochemical/molecular observations. However, protein content, CAT and total antioxidant activity levels decreased in all doses of nanoparticle applications. In addition, proline and SOD contents increased in all nanoparticle doses applied. This situation revealed that nanoparticle applications can be tolerated by the plant, but at the proteomic level, the plants are exposed to oxidative stress. In the proteomic analysis, plant proteins were first separated by SDS-PAGE analysis. In the obtained gel images, there were variations on a total of 8 bands, which were at around 75, 68, 57, 43, 39, 22, 17 and 15 kDa in all nanoparticle applications. The protein band determined at a molecular weight of around 39 kDa was completely lost in silver nanoparticle applications. Fe nanoparticle applications formed a new band with a molecular weight of around 22 kDa. In other bands, decreases in band intensities were observed. Finally, in order to analyze whether this change is caused by metal binding proteins, the proteins of determined molecular weight were selected from the tomato proteome and analyzed bioinformatically. While 3373 proteins were demonstrated on the bands with in silico sequence analysis, a total of 114 of them were determined to bind metals. In three-dimensional structural modeling analyses, the structures of 82 proteins were verified using Phyre2, ProSA and MIB tools. The identified proteins were analyzed using CELLO and InterPro tools for their localization, biological processes involved, molecular functions, and cellular components that they participate in. Results confirm that plants cause changes in oxidative stress-related proteins at the proteomic level.