Malatya yöresinde sığırlarda anaplasma türlerinin  reverse line blotting (RLB) yöntemi ile araştırılması
Investigation of anaplasma species in cattle in Malatya province by reverse line blotting (RLB)
Yazar: SERDAR ÇOLAK
Danışman: PROF. DR. MÜNİR AKTAŞ
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Anaplasma = Anaplasma ; Malatya = Malatya ; Moleküler yapı = Molecular structure ; RNA = RNA ; Sığırlar = Cattles

Özet:
Anaplasma türleri, hayvanların ve insanların sağlığını etkileyen zorunlu hücre içi riketsiyal patojenlerdir. Anaplasma soyu içinde çoğu hayvanlar için bazıları aynı zamanda insanlarda da patojen olan 6 bakteri tanımlanmıştır. Son zamanlarda, Japonya, Çin ve Tunus'ta A. phagocytophilum ile genetik olarak yakın benzerlik gösteren iki yeni tür tanımlanmıştır.
Bu çalışmada sığırlarda Anaplasma türlerinin varlığı ve dağılımının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun için Malatya'nın Akçadağ, Arguvan ve Yazıhan ilçelerine bağlı 27 farklı işletmede klinik enfeksiyon göstermeyen 200 sağlıklı sığırdan 2019 yılında (Mart ve Ekim aylarında) EDTA'lı kan örnekleri toplanmıştır. Kanlardan ekstrakte edilen DNA'lar, reverse line blot (RLB) yöntemiyle Anaplasma/Ehrlichia türlerinin 16S rRNA geninin V1 değişken bölgesi yönünden taranmıştır. RLB ile %38.5 (77/200) oranında Anaplasma enfeksiyonları yönünden pozitiflik saptanmıştır. En yaygın türün A. marginale (%32.5) olduğu, bunu A. centrale (%5.5), Anaplasma/Ehrlichia catch-all (%5.5) ve Anaplasma sp. Omatjanne (%2.5)'nin izlediği belirlenmiştir.
Test edilen hayvanların hiçbirinde A. phagocytophilum ve A. bovis saptanmamıştır. PZR pozitif 77 amplikondan 11'i sadece Anaplasma/Ehrlichia catch-all proba sinyal verirken, membrandaki tür spesifik probların hiçbirine sinyal vermemiştir. Bu amplikonların PZR-RFLP yöntemi ile A. phagocytophilum-like 1 ve A. phagocytophilum-like 2 oldukları belirlenmiştir. 
DNA dizileme ve filogenetik analizler RFLP verilerini doğrulamış ve Türkiye'de sığırlarda A. phagocytophilum ile yakından ilişkili potansiyel olarak yeni iki türün bulunduğunu göstermiştir.
Türkiye'de A. phagocytophilum-like 1 ve A. phagocytophilum-like 2'nin bulunduğu ilk defa bu çalışmada ortaya konmuştur. Bu çalışma sonucunda elde edilen veriler Anaplasma cinsindeki genetik çeşitliliğin beklenenden çok daha fazla olduğunu ve A. phagocytophilum benzeri suşların sığır anaplasmosisinin ayırıcı tanısında dikkate alınması gerektiğini göstermiştir.

Anahtar Kelimeler: Anaplasma phagocytophilum-like 1 ve 2; Molecular epidemiology; 16S rRNA PCR-RFLP; reverse line blot; sığır

Abstract:
Anaplasma species are obligate intracellular rickettsial pathogens that affect the health of humans and other animals. The genus Anaplasma currently comprises 6 bacterial species mostly pathogenic to animals and/or human. Recently, two potentially novel species genetically related to A. phagocytophilum have been identified in Japan, China, and Tunisia.
The aim of this study was to determine the presence and distribution of Anaplasma spp.in cattle. For this purpose, EDTA blood samples were collected in 2019 (in March and October) from 200 apparently healthy cattle farmed in 27 different willages belonging to Arguvan, Yazihan, Akçadağ district in Malatya province. DNA was screened by reverse line blot assay for the presence of the hypervariable V1 region of the 16S rRNA gene of Anaplasma/Ehrlichia species. Anaplasma spp. overall infection rates were 38.5% (77/200) by RLB. The most frequently found species was A. marginale (32.5%), followed by A. centrale (5.5%), Anaplasma/Ehrlichia catc-all (5.5%) and Anaplasma sp. Omatjanne (2.5%). A. phagocytophilum and A. bovis were not detected in any of tested animals. Eleven of 77 PCR-positive amplicons gave positive signals to the catch-all probes, but did not show any response to the species-specific probes tested. PCR-RFLP based on 16S rRNA of these amplicons provided evidence for the presence of A. phagocytophilum-like 1 and A. phagocytophilum-like 2 strains. Sequencing and phylogenetic analyses based on 16S rRNA gene validated RFLP findings, and provided evidence for circulation of two potentially novel species closely related to A. phagocytophilum in Turkish cattle.
This is the first report of the presence of A. phagocytophilumlike-like strains in the country. These findings suggest that genetic diversity within the genus Anaplasma is much greater than expected, and A. phagocytophilum-like strains should be taken into account as differential diagnosis in bovine anaplasmosis. 

Keywords: Anaplasma phagocytophilum-like 1 and 2; Molecular epidemiology; 16S rRNA PCR-RFLP; reverse line blot; cattle