Çeşitli starter ve probiyotik kültürlerin mikrobiyolojik, immünolojik ve moleküler yöntemlerle karakterizasyonu
Microbiological, immunological and molecular characterization of various starter and probiotic cultures
Yazar: YASEMİN PINARKARA
Danışman: PROF. DR. OSMAN ERGANİŞ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Aglütinasyon = Agglutination ; Aglütinasyon testleri = Agglutination tests ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Laktik asit = Lactic acid ; Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria ; Probiyotikler = Probiotics ; Seroloji = Serology ; Starter kültür = Starter culture ; İmmünoassay = Immunoassay

Özet:
Starter kültürler; çeşitli fermente ürünlere istenilen duyusal, tekstürel ve reolojik özellikleri kazandıran ve son üründe standart kalite özelliklerinin oluşmasını sağlayan seçilmiş tek yada karışık suşları içeren, genellikle laktik asit bakterilerinden oluşan mikroorganizmalardır. Probiyotikler ise; yeterli düzeyde alındıklarında konakçı sağlığı üzerinde olumlu etkileri olan ve bağırsak sisteminin mikrobiyal dengesini geliştirerek, faydalı etki (sindirimi kolaylaştırma, patojenlerle rekabet ederek hastalıklardan koruma vs.) sağlayan mikroorganizmalardır.
Bu çalışmada farklı ticari starter (6 adet) ve probiyotik (4 adet) ürünlerden izole edilen laktik asit bakterilerinin API 50 CHL kiti kullanılarak biyokimyasal tanımlaması gerçekleştirildi. Elde edilen 33 bakteri izolatı tür spesifik primerler yardımıyla Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile doğrulandı. Seçilen 8 farklı laktik asit bakterisi (Streptococcus salivarius ssp. thermophilus,  Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis) ile hazırlanan antijenler kullanılarak tavşanlarda antiserum hazırlandı. LAB'nin serolojik olarak değerlendirilmesinde Lam Aglütinasyon, Mikro Serum Aglütinasyon, İndirekt ELISA, Sandviç ELISA ve Dot-Blot Immuno Assay testleri kullanıldı.
Lam aglütinasyon testi ile laktik asit bakterilerinin cins düzeyinde tanımlaması yapılabildi. Elde edilen antiserumların mikro serum aglütinasyon testi ile titreleri, İndirekt ELISA testi ile de OD değerleri belirlendi. Aynı yöntemle immünizasyonu gerçekleştirilen tavşanlarda en yüksek antikor titresi Bifidobacterium lactis'te belirlenirken, en düşük titreler Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus'ta belirlendi. Her bakteri türü için İndirekt ELISA, Sandviç ELISA, Antijenle kaplanmış Dot-Blot Immunoassay (DIA) ve Antikorla kaplanmış DIA testlerinin standardizasyonu yapıldı. Kullanılan serolojik yöntemler arasında antijen miktarını (bakteri sayısı) belirlemede en duyarlı yöntemin Sandviç ELISA olduğu belirlendi.
Sonuç olarak starter ve probiyotik amaçlı kullanılan laktik asit bakterilerinin identifikasyonu için immünolojik ve serolojik yöntemlerin kullanımına yönelik literatür bilgiye ulaşılamamıştır. Günümüze kadar gıda mikrobiyolojisine yönelik yapılan serolojik çalışmalar sadece patojen bakteri teşhisine yönelik ELISA testleri ile sınırlı iken bu çalışma ile laktik asit bakterilerinin tanımlanmasına yönelik serolojik yöntemlerin de geliştirilebileceği ortaya konmuştur. Antiserum bulunması durumunda laktik asit bakterilerinin daha hızlı tanımlanabileceği, türe özgü geliştirilecek ELISA kitleri ile de mevcut saf ya da karışık kültürdeki laktik asit bakteri miktarlarının tespit edilebileceği gösterilmiştir.  

Anahtar Sözcükler: Aglütinasyon; DIA; ELISA; Laktik Asit Bakterisi (LAB); Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR); Seroloji

Abstract:
Starter cultures; which are provides desirable organoleptic, textural and rheological properties to various fermented products and forming the standard quality in the end product, containing a single or mixed strains of microorganisms are generally composed of lactic acid bacteria. The probiotics are microorganisms that; provides sufficient positive effects on host health and beneficial effects by improving the microbial balance of the intestinal tract (facilitate digestion, protection from disease by competing with pathogens, etc.) when recieved.
In this study, was performed biochemical identification of lactic acid bacteria isolated from different commercial starters (6) and probiotic (4) products using API 50 CHL kit. Thirty three bacterial isolates was confirmed by Polymerase Chain Reaction with the help of species specific primers. Antiserum was prepared in rabbits using antigens prepared with selected 8 different lactic acid bacteria (Streptococcus salivarius ssp. thermophilus,  Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis). For evaluation of LAB as serological, Rapid Agglutination, Micro Serum Agglutination, Indirect ELISA, Sandwich ELISA and Dot-Blot Immunoassay tests were used.
The identification of lactic acid bacteria with Lam Agglutination Test could be made at genus level. Titers of anti-serum was determined with micro-agglutination test and OD values was determined with indirect ELISA. The highest antibody titers in rabbit serum were determined in Bifidobacterium lactis and the lowest titers were determined in Streptococcus salivarius ssp. thermophilus and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. For each type of bacteria Indirect ELISA, sandwich ELISA, antigen-coated dot-blot immunoassay (DIA) and antibody-coated DIA tests were standardized. Among these serological tests sandwich ELISA was determined as the most sensitive method to measure amount of antigen (number of bacteria).
As a result, literature could not be reached for the use of immunological and serological methods for identification of starter and probiotic lactic acid bacteria. Serological studies for food microbiology is limited only ELISA tests for the diagnosis of pathogenic bacteria up to now,  this study demostrated that serological methods for the identification of lactic acid bacteria may be developed by further studies. It was shown that, in the presence of antiserum, lactic acid bacteria could identify more quickly and the amount of bacteria in pure or mixed cultures of lactic acid bacteria could be determine by species-specific ELISA kits.

Keywords: Agglutination; DIA; ELISA; Lactic Acid Bacteria (LAB); Polymerase Chain Reaction (PCR); Serology