Deve sütü laktoferrin'in kolorektal adenokarsinoma hücre hatti (CACO-2) üzerine antitümöral etkinliği
Antitumoral efficacy of camel milk lactoferrin on colorectal adenocarcinoma (CACO-2) cell line
Yazar: ZEYNEP SEMEN
Danışman: PROF. DR. ARİF ALTINTAŞ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Apoptozis = Apoptosis ; Deve sütü = Camel milk ; Develer = Camelidae ; Hücre dizisi = Cell line ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Laktoferrin = Lactoferrin ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Çalışmada, deve sütü laktoferrin'inin insan kolo-rektal adenokarsinoma hücre hattı (Caco-2) üzerindeki antiproliferatif, antitümöral etkinliğinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, deve sütü laktoferrini izole ve liyofilize edilerek kolo-rektal adenokarsinoma hücrelerine (Caco-2) uygulanmış ve apoptotik ve antiproliferatif etkileri araştırılmıştır. 
Çalışmada kullanılan deve sütü Aydın ve Denizli illerinde yetiştirilen 7 baş deveden elde edilmiş ve soğuk zincir altında laboratuvara ulaştırılmıştır. Deve sütünden laktoferrin iyon değişimi kromatografik yöntemle izole edilmiştir. Laktoferrin tuzlarından ayrılarak saflaştırılmış ve EMEM tamponda hazırlanan çözeltileri Caco-2 hücre hattı üzerine uygulanmıştır. Antitümöral etkinlik hücreler üzerinde MTT canlılık testi, apoptotik belirteçler (fosfo-p53, p53, Cleaved Kaspaz-3, BAD, Fosfo-BAD ve cleaved PARP) ve apoptotik DNA laddering ve apoptotik protein ifade analizleri ile değerlendirilmiştir. Elde edilen veriler uygun istatistik yöntemler kullanılarak önemlilik dereceleri belirlenmiştir.
Laktoferrin'in 10.000 µg/ml ve azalan seri dilüsyonları ile 24 ve 48 saat muamele edilen Caco-2 hücrelerinin sitotoksisiste ve canlılık değişimleri MTT canlılık testi ile analiz edilmiştir. Kontrol olarak 0 µg/ml laktoferrin örneklerinin canlılıkları tüm zaman dilimlerinde %100 olarak kabul edilmiş ve diğer örneklere ait canlılık değerleri ortalama absorbans değerlerinden orantısal olarak hesaplanmıştır. 
Caco-2 hücreleri 24 ve 48 saat deve sütü laktoferrini ile inkübe edildiğinde doza bağlı olarak (10.000 µg/ml; 5.000 µg/ml; 2500 µg/ml; 1250 µg/ml; 625 µg/ml ve 312,5 µg/ml) hücre canlılık oranında düşüş kaydedilmiştir (24 saat için sırasıyla %16,7; %27,84; %35,35; %43,64; %47,89 ve %62,69; 48 saat için sırasıyla %15,56; %27,85; %33,17; %43,54; %51,31 ve %76,34).
Fosfo-p53 değerlerinde, Caco-2 hücrelerinin deve sütü laktoferrini ile 24 saat inkübasyonu sonunda kontrol değerlere göre 1,10 kat artışa (p>0.05), 48 saat inkubasyonda ise kontrol değerlere göre 2,06 kat artışa (p<0.05) neden olmuştur.
Caco-2 hücrelerinin deve sütü laktoferrini ile 24 saat inkübasyonda cleaved kaspaz-3 değerlerinde kontrol değerlere göre 0,68 kat artış, 48 saat inkubasyonda ise 1,17 kat artış gözlenmiştir. Her iki artış da istatistik olarak önemlidir (p<0.05). 
Deve sütü laktoferrini ile Caco-2 hücrelerinin 24 saat inkübasyonu apoptoz ile ilişkili BIM (BCL-2 Interacting Mediator of Cell Death), Kaspaz 3, Kaspaz 6, TNFα ve Kaspaz 10 ekspresyonlarında anlamlı artışlar olmuştur (p<0.05). 
Caco-2 hücrelerinin deve sütü laktoferrini ile inkübasyonunda fosfo-Bad düzeylerinde anlamlı olarak, 24 saatte kontrol değerlere göre 1,5 kat, 48 saatte ise 1,3 kat artış gerçekleşmiştir (p<0.05). 
Caco-2 hücrelerinin deve sütü laktoferrini ile 24 saat inkübasyonunda Bad değerlerinde kontrole göre 1,4 kat artış (p<0.05), 48 saat inkübasyonda ise 1,3 kat (p>0.05) artış gerçekleşmiştir. 
Çalışma sonunda, deve sütü laktoferrin'inin insan kolo-rektal kanser hücre hattı (Caco-2) üzerinde apoptotik ve antikanserojen etkiye sahip olduğu ve tümör hücrelerinin gelişmesini önemli ölçüde engellediği kanısına varılmıştır. Çalışmadan elde edilen sonuçların in vivo çalışmalara temel oluşturacağı kanaatindeyiz.

Abstract:
The aim of this study was to investigate the antiproliferative, antitumoral activity of camel milk lactoferrin on human colorectal adenocarcinoma cell line (Caco-2). For this purpose, camel milk lactoferrin was isolated and lyophilized and applied to colorectal adenocarcinoma cells (Caco-2) and its apoptotic and antiproliferative effects were investigated. The camel milk used in the study was obtained from 7 head camels reared in Aydın and Denizli provinces and delivered to the laboratory under the cold chain. Lactoferrin ion exchange was isolated from camel milk by chromatographic method.  The lactoferrin was separated from the salts and purified and the solutions prepared in EMEM buffer were applied onto the Caco-2 cell line. The antitumor activity was evaluated by MTT viability test on cells, apoptotic markers (phospho-p53, p53, Cleaved Caspase-3, BAD, Phospho-BAD and cleaved PARP) and apoptotic DNA laddering and apoptotic protein expression assays. Obtained data were determined by using appropriate statistical methods. 
The changes in cytotoxicity and viability of Caco-2 cells treated with 10,000 µg/ml and decreasing serial dilutions of lactoferrin for 24 and 48 hours were analyzed by MTT viability test. As a control, the viability of 0 µg/ml lactoferrin samples was accepted as 100% in all time periods and the viability values of the other samples were calculated proportionally from the mean absorbance values.
Caco-2 cells were incubated with camel milk lactoferrine for 24 and 48 hours, depending on the dose (10,000 µg/ml; 5,000 µg/ml; 2500 µg/ml; 1250 µg/ml; 625 µg/ml and 312.5 µg/ml decreased cell viability (for 24 hours respectively 16.7%, 27.84%, 35.35%, 43.64%,47,89% and 62.69% for 48 hours respectively 15.56%, 27.85%, 33.17%, 43.54%, 51,31% and 76.34%)
After 24 hours incubation of Caco-2 cells with camel milk lactoferrine caused 1.10 times increase (p> 0.05) compared to control values and 2.06 times increase (p <0.05) compared to control values in phospho-p53 values.
In 24 hours incubation of camel milk lactoferrine of Caco-2 cells, cleaved caspase-3 values increased by 0.68 times compared to control values and increased by 1.17 times in 48 hours incubation. Both increases were statistically significant (p <0.05).
24 h incubation of Caco-2 cells with camel milk lactoferrine showed significant increases in apoptosis-related BIM (BCL-2 Interacting Mediator of Cell Death), Caspase 3, Caspase 6, TNFα and Caspase 10 expressions (p <0.05).
In the incubation of Caco-2 cells with camel milk lactoferrine, the phospho-Bad levels were increased by 1.5 times compared to the control values in 24 hours and by 1.3 times in 48 hours (p <0.05).
In the 24-hour incubation of Caco-2 cells with camel milk lactoferrine, Bad values increased by 1.4-fold (p <0.05) and by 48-hour incubation by 1.3-fold (p> 0.05).
At the end of the study, it was concluded that camel milk lactoferrin has an apoptotic and anticarcinogenic effect on human colorectal cancer cell line (Caco-2) and significantly inhibits the growth of tumor cells. We believe that the outcomes of the study will be the basis for in vivo studies.