Trombositlerin Candida albicans üzerine antifungal etkinliğinin araştırılması
Investigation of antifungal activity of platelets on Candida albicans
Yazar: BERKSAN ŞİMŞEK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ RIZA AYTAÇ ÇETİNKAYA
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Gülhane Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kan Bankacılığı ve Transfüzyon Tıbbı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Antifungal duyarlılık testleri = Antifungal sensitivity tests ; Candida albicans = Candida albicans ; Kan bileşenleri transfüzyonu = Blood component transfusion ; Kan trombositleri = Blood platelets ; Kandida = Candida ; Trombositten zengin plazma = Platelet rich plasma

Özet:
Mantar enfeksiyonlarında etken olarak en sık Candida türleri, özellikle de
Candida albicans saptanmaktadır. Bu çalışmada gönüllülerden elde edilen
trombositten zengin plazmanın (TZP) C. albicans ATCC 10231 suşuna karşı in vitro
antifungal etkinliği ile bu etkinlikte rol oynayabileceği düşünülen bazı kemokin ve
kinosidinlerin olası etkinliğinin değerlendirilmesi amaçlandı.
Dokuz gönüllüden Magellan PRP™ kiti kullanılarak 3'er ml TZP elde edildi.
Otolog trombin eldesi için %10'luk kalsiyum glukonat kullanıldı. Otolog trombin ile
aktive edilen TZP'nin, son maya konsantrasyonu 1x103 kob/ml ve 1x104 kob/ml olan
C. albicans izolatı üzerindeki antifungal etkinliğinin ortaya konulması amacıyla 1.,
2., 4., 8. ve 16. saatlerde Sabouraud Dekstroz Agar (SDA) yüzeyine ekimleri yapıldı.
30°C'de 18-24 saatlik inkübasyon sonrası koloniler sayıldı. Aynı zamanda her ekim
saatinde kemokin ve kinosidinler [(Trombosit Faktör-4 (Human PF-4), İnterlökin-8
(Human IL-8) ve Timosin-β4 (Human TMSB4)] eş zamanlı olarak ELISA
yöntemiyle ölçüldü.
Trombositten zengin plazmadaki medyan Beyaz Küre (WBC) sayısı;
49,4x103/μl, medyan trombosit sayısı 2165x103/μl olarak saptandı. TZP'deki
trombosit ve WBC verimliliğinde yaklaşık 9 kat artış saptandı. Başlangıç maya
konsantrasyonu 103 olan TZP grubunun (TZP-103) saatlere göre üreyen koloni
medyan değerleri sırasıyla 1., 2., 4., 8., ve 16. saatler için 3, 7, 34, 143 ve 500 iken
başlangıç maya konsantrasyonu 104 olan TZP grubu (TZP-104) için bu değerler 19,
48, 166, 500 ve 500'dü. Aynı saatler için başlangıç maya konsantrasyonu 103 olan
PBS (kontrol) grubunun koloni medyan değerleri ise sırasıyla 242, 280, 500, 500 ve
500'dü.
TZP-103'ün PBS-kontrol grubuyla karşılaştırıldığında antifungal etkinliğinin
8. saatte halen devam ettiği, 16. saatte ise kaybolduğu görüldü. İki grup arası 8.
saatteki koloni üremelerindeki fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,05). TZP-
104'ün antifungal etkinliğinin 4. saatte devam ettiği, 8. saatte bu etkinliğin azaldığı, 16. saatte ise antifungal etkinliğin ortadan kalktığı görüldü. Her iki grupta eşit
miktarda TZP kullanılmış olması ve buna bağlı ortama salınan kemokin ve kinosidin
miktarı aynı olmasına rağmen TZP 103 grubunun daha etkin bulunmasında C.
albicans konsantrasyonunun önemli olabileceği düşünüldü.
ELISA yöntemiyle her iki TZP'li grupta IL-8 seviyelerinde saatlere göre artış
olmakla birlikte C. albicans'a karşı antifungal etki tespit edilmedi. TMSB4 miktarı
yoğun trombosit varlığına bağlı olarak PBS-kontrol grubuna göre TZP'li gruplarda
7-10 kat daha yüksekti. TZP gruplarında ilerleyen saatlerde TMSB4 değerlerinde
antifungal etkinliğine bağlı olarak gerçekleştiği değerlendirilen düşme saptandı. PF-
4, TZP-103 ve TZP-104 üzerinde antifungal etkinlikte değildi.
Trombositten zengin plazmanın C. albicans ve diğer mantar
enfeksiyonlarında etkili olabilmesi için, en yüksek trombosit ve lökosit değerlerinin
elde edilebileceği tam otomatize kapalı sistemlerin kullanılmasının önemli olduğu
düşünülmektedir. En düşük konsantrasyonda en yüksek trombosit değerleri elde
edilen çalışma grubumuzda dahi literatürdeki çalışmalardaki gibi C. albicans
üremeleri tamamen yok edilememiştir. Hastalarda kullanılan ilaçlar gibi tekrarlayan
dozlarda TZP uygulamaları ile antifungal etki daha uzun sürelere erişebilir hatta
üremeleri tamamen baskılayacak değerler elde edilebilir. Ayrıca trombositlerin
antifungal etkinliğinde rol oynayabileceği düşünülen bütün kemokin, kinosidin ve
benzeri diğer molekülleri kapsayan geniş çaplı bir projeye gereksinim
duyulmaktadır.

Anahtar Kelimeler: Candida albicans, Antifungal Direnci, Trombositten Zengin
Plazma.
Destekleyen Kurumlar: Çalışmamız Sağlık Bilimleri Üniversitesi Bilimsel
Araştırma Projeleri Biriminden mali destek alınarak yapıldı.

Abstract:
Candida species, especially Candida albicans, are the most common
pathogen detected in fungal infections. In this study, we aimed to evaluate the in
vitro antifungal activity of volunteer-derived platelet rich plasma (PRP) against C.
albicans ATCC 10231 strain and the possible effect of certain chemokines,
kinocidins that might play a role in this activity.
Three ml of PRP from nine volunteers were derived by using Magellan PRP
™ kit. 10% calcium gluconate was used to obtain autologous thrombin. C. albicans
isolates with a final yeast concentration of 1x103 cfu/ml and 1x104 cfu/ml were
inoculated on Sabouraud Dextrose Agar (SDA) at the 1st, 2nd, 4th, 8th and 16th hours
of incubation in order to reveal the antifungal activity of autologous thrombinactivated
PRP. The colonies were counted after 18-24 hours of incubation at 30°C.
At the same time, chemokines and kinocidins [(Platelet Factor-4 (Human PF-4),
Interleukin-8 (Human IL-8) and Thymosin-β4 (Human TMSB4)] were measured
simultaneously by ELISA method.
The median values of white blood cells (WBC) and platelets in PRP were
detected as 49,4x103/μl and 2165x103/μl, respectively. Approximately 9-fold
increase in platelet and WBC efficacy in PRP was detected. The colony median
values of the PRP groups with an initial yeast concentration of 103 and 104 (PRP-103
and PRP-104) were found to be 3, 7, 34, 143, 500 and 19, 48, 166, 500, 500 for 1st,
2nd, 4th, 8th and 16th hours, respectively. The colony median values of the PBS-
(control) group with an initial yeast concentration of 103 for the same hours were
242, 280, 500, 500 and 500, respectively.
Compared with the PBS-control group, the PRP-103 showed that the
antifungal activity was still going on at the 8th hour and disappeared at the 16th hour.
The difference in colony production between the two groups at 8th hour was
statistically significant (p<0,05). It was observed that the antifungal activity
continued at the 4th hour, decreased at the 8th hour, and disappeared at the 16th hour in the group PRP-104. Although the same amount of PRP was used and the same
amount of chemokine and kinocidins were released in both groups, the concentration
of C. albicans was considered to be important in the detection of more effective
PRP-103 group.
Although there was an increase in IL-8 levels by hours in the two PRP groups
by ELISA method, no antifungal effect was detected against C. albicans. Test results
of TMSB4 were detected 7-10 times higher in the PRP groups than in the PBScontrol
group due to the presence of intense platelet concentration. It was observed
that decrease in TMSB4 values results from the antifungal activity on the advancing
hours in the PRP groups. Whereas PF-4 did not act an antifungal activity on PRP-103
and PRP-104.
It was considered that the use of fully automated systems to obtain highest
platelet and leukocyte counts in PRP is important in order to be effective in C.
albicans and other fungal infections. Even in our study group where the highest
platelet counts were obtained at the lowest concentration, C. albicans reproduction
could not completely eliminated as mentioned in the literature. Repeated doses of
PRP applications, such as drugs used in patients, may have longer duration of action
and even complete repression of reproductive outcomes. In addition, a large-scale
project involving all chemokines, kinocidins, and other molecules thought to play a
role in the antifungal activity of platelets is needed.

Keywords: Candida albicans, Antifungal resistance, Platelet Rich Plasma.
Supporting Institutions: This study is supported by University of Health Sciences,
Scientific Research Projects Unit.