İmmün yetmezlikli hastalardan elde edilen sitomegalovirüs (cmv) suşlarının genotiplerinin belirlenmesi ve gansiklovir direncinin araştırılması
Determination of genotypes and investigation of ganciclovir resistance in cytomegalovi̇rüs (cmv) strains isolated in i̇mmünocompromised patients.
Yazar: AYŞENUR COŞKUN
Danışman: PROF. DR. SELMA GÖKAHMETOĞLU
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: Sitomegalovirüs  (CMV) sağlıklı immün sistemi normal kişilerde genellikle asemptomatik hastalık oluştururken, immün yetmezliği olanlarda ve fetusta çok ciddi komplikasyonlara neden olmaktadır.
CMV'de gB; genotipleme açısından en çok üstünde çalışılan proteindir.  Doğada bulunmakta olan CMV suşlarında bugüne kadar dört farklı gB genotipi (gBl-4) tarif edilmiştir.  CMV enfeksiyonların tedavisinde viral DNA polimeraz inhibitörü olan gansiklovir (GCV) foskarnet ve sidofovir kullanılmaktadır. 
Bu çalışmada immün yetmezlikli hastalardan elde edilen CMV suşlarının genotiplerinin belirlenmesi ve CMV suşlarında antiviral direncin belirlenmesi amaçlanmıştır.
Yöntem: Erciyes Üniversitesi Sağlık Uygulama ve Araştırma Merkezi Erişkin Hematoloji ve Pediatrik Hematoloji bölümlerinde takip edilen 49 hastaya ait kan  örnekleri çalışmaya dahil edildi.  Hastaların CMV DNA viral yükü 1000 kopya/ml ve üzerinde idi.
CMV pozitif örneklerinden DNA izolasyonu otomatik izolasyon cihazında kit prospektüsüne uygun olarak yapıldı. CMV gB gen bölgesinde 474 bp'lik bölge; CMV suşlarında gansiklovir direncinin belirlenmesi için, UL97 gen bölgesinde 732 bp'lik bölge çoğaltıldı.
 CMV genotiplerinin ve CMV direncinin belirlenmesi için çoğaltılan bölgelerde Abi Prism 3500 cihazında Sanger yöntemi ile dizi analizi yapıldı. CMV genotiplendirme ve antiviral direnç analizinde sanger metoduyla sonuç alınamayan 2 örneğe yeni nesil dizileme yöntemi uygulandı.
Bulgular: Hastaların 35 (% 71,4)'üne allojenik kemik iliği transplantasyonu (AKİT); 6 (%12,3)'sine otolog kemik iliği transplantasyonu (OKİT);8 (%16,3)'i transplantasyon yapılmamıştır.
Çalışmaya dahil edilen 49 hastanın CMV genotipleri dağılımı;  18/49'unda tip1(%36,7 );  5/49'unda tip 2 (%10.2 ); 5/49'unda tip 3 (%10,2 );1/49'unda tip 4 (%2 ); 14/49 (%28.6)'unda miks genotip verecek şekilde belirlenmiştir. Hastaların 6/49 (%12.3)'unda genotip tiplendirilememiş, toplamda hastaların 20/49 (%40.9) 'unda miks genotip ve tiplendirilemeyen genotip bulunduğu belirlenmiştir.
Çalışmaya dahil edilen 49 hastadan elde edilen 53 örneğin 37 (%69.8)'sinde gansiklovir direnci saptanmamış olup bir hasta örneğinde direnç analizi sonucunda gansiklovir direnç mutasyonu  (C592G) bulunduğu görülmüştür. 15 hasta örneğinde diziler karışık olduğu için direnç analiz değerlendirmesi yapılamamıştır.
Sonuç: Hastalarda en çok miks genotip ve tiplendirilemeyen genotip olması dikkat çekmektedir. Gansiklovir direnci örneklerin tümünde değerlendirilemedi, hasta örneklerinden birindeki direnç analizi sonucunda gansiklovir direnç mutasyonu (C592G) bulunduğu gözlenmiştir. Genotipleme ve direnç analiz işlemlerinin kesinleştirilmesi için yeni nesil dizileme işlemlerinin uygulanması gerektiği kanaati oluşmuştur.
Anahtar kelimeler: Cytomegalovirüs, genotipleme, gansiklovir, antiviral direnç, dizi analizi.

Abstract:
Aim: Cytomegalovirüs (CMV) cause asymptomatic infection in healty people that have normal immünity system, it may cause serious complications in immünocompromised patients and in fetus.
GB protein in CMV is the most studied protein in genotyping. Four genotypes (gBI-4) have been foumd in different CMV strains present in the nature. Viral DNA polymerase inhibitors such as ganciclovir, foscarnet and cidofovir are used in the treatment of CMV infections.
In this study it is aimed to determine genotypes of CMV strains and antiviral resistance of CMV strains obtained from immünocompromised patients.
Method: Blood samples from 49 patients   that have been monitored in  Department of Adult Hematology  and Pediatric Hematology in Erciyes University Health Practice and Research Center  were included in this study. CMV DNA viral load of these patients were  1000 copies/mL or above.  
DNA isolation from CMV positive samples was done in the automatic isolation device according to the kit insertion. To determine CMV genotype 474 bp region in CMV gB gene regionand to determine the ganciclovir resistance 732 bp region in UL97 gene,  were amplified.
Sequence analysis was performed on the Abi Prism 3500 instrument using the Sanger method in the amplified regions to identify CMV genotypes and CMV resistance. New generation was applied in to 2 samples that genotypes of CMV and antiviral resistance of CMV could not be determined by Sanger method.
Results: Allogeneic bone marrow transplantation (ACT) was performed in 35 (71.4%) patients; autologous bone marrow transplantation (OCD) was performed in 6 (12.3%) and transplantation was  not appliced in  8 (16.3%) patients.
Distribution of CMV genotypes of 49 patients included in the study; type 1in 18/49 (36.7%); type 2 in 5/49 (10.2%) ; type 3 in 5/49 (10.2%), type 4 in 1/49 (2%); mix genotype in 14/49 (28.6%) were found. CMV genotypes 6/49 (12.3%)  patients could not be determined. Totally mix genotypes and nontypeable genotypes were found in  20/49 (40.9%) patients.
Ganciclovir resistance was not detected in 37 (69.8%) of the 53 samples obtained from the 49 patients included in the study. Ganciclovir resistance (C592G) was found in 1 sample of patients. Ganciclovir resistance could not be evaluated in 15 samples of patients as sequences of these samples were complicated.
Conclusion: It attracted attention that mixed genotypes and nontypable genotypes were the most common ones. Ganciclovir resistance was not evaluated in all cases and resistance analysis of 1 patient sample revealed ganciclovir resistance mutation (C592G). It has been concluded that new generation sequencing must be applied to ensure genotyping and resistance analysis processes
Key words: Cytomegalovirüs, genotyping, gansiclovir, antiviral resistance, sequence analysis.