Çeşitli kaynaklardan izole  edilen metisilin dirençli staphylococcus aureus suşlarının virülans faktörleri üzerine daptomisin ve linezolidin  sub minimal inhibitör konsantrasyonlarının etkisi
Effect of sub minimal inhibitory concentrations of daptomycin and linezolid on virulence factors of methicillin resistant staphylococcus aureus strains isolated from various sources
Yazar: HALİL BAL
Danışman: PROF. DR. NURTEN ALTANLAR ; PROF. DR. SULHİYE YILDIZ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Biyofilmler = Biofilms ; Daptomisin = Daptomycin ; Linezolid = Linezolide ; Metisilin = Methicillin ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Staphylococcus aureus = Staphylococcus aureus ; Virülans faktörleri = Virulence factors ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Antibiyotikler çevresel ortamlarda veya tedavinin iki dozu arasında vücudun çeşitli bölmelerinde sub-MİK konsantrasyonlarda bulunabilirler. Sub-MİK konsantrasyonlar bakterileri öldürmemesine rağmen bakterinin morfolojisi, enzim ve toksin üretimi, biyofilm oluşumu gibi çeşitli virülans faktörlerine etki edebilir.
Çalışmamız Ankara Üniversitesi Hastanelerinden elde ettiğimiz 32 MRSA suşu ile yürütülmüştür. Bu suşların daptomisin ve linezolid antibiyotiklerinin ½ sub-MİK konsantrasyonlarına seri pasajlar ile maruziyeti sonrasında suşlardaki direnç oluşumu, biyofilm oluşturma özelliğindeki değişim incelenmiş ve metisilin direnç geni (mecA), biyofilm ilişkili genler (icaA, icaD), enterotoksin genleri (sea,sed), toksik şok sendromu toksini-1 geni (tst)'nin varlığı konvansiyonel PZR ile araştırılmıştır. Suşlar fenotipik ve genotipik yöntemler ile MRSA olarak doğrulanmıştır. Sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle gerçekleştirilen antibiyotik duyarlılık deneyleri ile suşların daptomisin ve linezolid için 1. MİK değerleri tespit edilmiştir. Seri pasaj deneyleri sonrasında 2. MİK ve 3.MİK değerleri belirlenmiştir. Suşların, daptomisin ve linezolid 1. MİK ve 3. MİK değerleri kar-şılaştırıldığında linezolidde 2-8 kat, daptomisinde 4-32 kat artış olduğu, bu artışların istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu belirlenmiştir (p<0,05). Mikrotitrasyon plak yöntemi ile gerçekleştirilen biyofilm oluşturma deneyleri sonucunda; suşların 20'sinin (%62,5) çeşitli düzeylerde biyofilm oluşturduğu, 12'sinin (%37,5) ise biyofilm oluşturmadığı görülmüştür. Biyofilm oluşturmayan 12 (%37,5) ana suşun, 2. seri pasajlar sonrasındaki suşlarının, 2'sinin (%6,25) linezolid,  4'ünün (%12,5) daptomisine maruziyeti ile biyofilm oluşturma düzeyinde artış olduğu gözlenmiştir. Güçlü biyofilm üreten 7 (%21,9) ana suşun, 2. seri pasajlar sonrasındaki suşlarının 4'ünün (%12,5) linezolide, 2'sinin (%6,25) daptomisine maruziyeti ile biyofilm oluşturma özelliğinin kaybolduğu ve 1 (%3,1) suşun ise daptomisin maruziyeti ile biyofilm oluşturma özelliğinin değişmediği, linezolid maruziyeti ile biyofilm oluşturma özelliğinin kaybolduğu gözlenmiştir. 3. MİK sonuçlarına göre 10 (%31,25) suşun daptomisine direnç oluşturduğu gözlenmiştir. Bu suşları ana suşlar ile karşılaştırdığımızda, biyofilm oluşturan 4 (%12,5) ana suşun 2'sinde (%6,25) biyofilm oluşturma özelliğinde artış, 2'sinde (%6,25)  azalış olduğu, biyofilm oluşturmayan 1 (%3,1) ana suşun ise güçlü düzeyde biyofilm oluşturduğu görülmüştür. 2. seri pasaj deneyleri sonrasındaki suşların biyofilm oluşumu üzerine daptomisin ve linezolidin etkisi incelendiğinde iki antibiyotik arasında anlamlı bir fark olmadığı görülmüştür (p>0,05). Konvansiyonel PZR yöntemiyle, metisilin direnç geni mecA, suşların %100'ünde, biyofilm ilişkili  icaA ve icaD genleri %96,9'unda, enterotoksin genleri sea %100'ünde, sed %6,25'inde, toksik şok sendromu toksini-1 geni  tst  %6,25'inde tespit edilmiştir.

Çalışmamızda suşların daptomisin ve linezolid antibiyotiklerinin ½ sub-MİK konsantrasyonlarına seri pasajlar ile maruziyeti sonrasında MİK değerlerinde artış olduğu belirlenmiştir. 2. seri pasajlar sonrasındaki suşların  biyofilm oluşturma özelliğinin suşun ve antibiyotiğin türüne göre değiştiği görülmüştür. Suşlardaki enterotoksin  genleri ve toksik şok sendromu toksini-1 geninin çeşitli oranlarda tespit edilmesi, mutlaka toksin üretimini göstermemekle birlikte enterotoksin genlerinin  stafilokokal gıda zehirlenmeleri, toksik şok sendromu toksini-1 geninin ise toksik şok sendromu için potansiyel risk oluşturabileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Antibiotics may be present in sub-MIC concentrations between two doses of therapy, in various parts of the body or in environmental settings. Although sub-MIC con-centrations do not kill bacteria, they can affect various virulence factors such as bacterial morphology, enzyme and toxin production, biofilm formation.
Our study was carried out with 32 MRSA strains obtained from Ankara University Hospitals. After the exposure of these strains to ½ sub-MIC concentrations of daptomycin and linezolid antibiotics with serial passages, the formation of resistance in the strains and the change in biofilm formation properties were investigated and the presence of methicillin resistance gene (mecA), biofilm-related genes (icaA, icaD), enterotoxin genes (sea,sed), toxic shock syndrome toxin-1 gene (tst) were investigated by conventional PCR. The strains were confirmed as MRSA by phenotypic and genotypic methods. The 1. MIC values for daptomycin and linezolid of the strains were determined by antibiotic susceptibility experiments performed by broth microdilution method. After serial passage experiments, 2. MIC and 3. MIC values were determined. When the daptomycin and linezolid 1. MIC and 3. MIC values of the strains were compared, it was determined that there was a 2-8 fold increase in linezolid and 4-32 fold increase in daptomycin, and these increases were statistically significant (p<0,05). As a result of the biofilm formation experiments performed with the microtitration plate method; It was observed that 20 (62,5%) of the strains formed various levels of biofilm, while 12 (37,5%) did not form biofilm. Of the 12 (37.5%) parent strains that do not form biofilms,  it was observed that the level of biofilm formation increased with the exposure of 2 (6.25%) strains to linezolid and 4 (12.5%) to daptomycin after 2.serial passages. Of the 7 (21.9%) parent strains that produced strong biofilms, after the 2. series of passages, 4 (12.5%) of the strains were exposed to linezolide and 2 (6.25%) to daptomycin, which lost their biofilm forming feature and It was observed that the biofilm forming feature of 1 (3.1%) strain did not change with daptomycin exposure and the biofilm forming feature was lost with linezolid exposure. It was ob-served that 10 (31.25%) strains formed resistance to daptomycin after the 2.series of passages. When we compare these strains with parent strains, It was found that 2 (6.25%) of these strains had an increased biofilm forming property, 2 (6.25%) had an decrease and 1 (3.1%) strain that did not form a biofilm formed a strong level of biofilm. When the effects of daptomycin and linezolid on the biofilm formation of the strains after the 2. series of passage experiments were examined, it was seen that there was no significant difference between the two antibiotics. (p>0,05). By conventional PCR method, methicillin resistance gene mecA was detected in 100% of strains, biofilm-related icaA and icaD genes in 96.9%, enterotoxin genes sea in 100%, sed in 6.25%, toxic shock syndrome toxin-1 gene tst in 6.25%. In our study, it was determi-ned that there was an increase in MIC values after exposure of strains to ½ sub-MIC concentrations of daptomycin and linezolid antibiotics with serial passages. It was ob-served that the biofilm forming properties of the strains after the 2. series of passages varied according to the strain and the type of antibiotic. Although the detection of ente-rotoxin genes and toxic shock syndrome toxin-1 gene at various rates in strains does not necessarily indicate toxin production, we think that enterotoxin genes may pose a potential risk for staphylococcal food poisoning and toxic shock syndrome toxin-1 gene for toxic shock syndrome.