Çin hamster overi hücre hattında doksorubisin ile birlikte epigallokateşin gallat, rosmarinik asit uygulanmasıyla rapamisin memeli hedefi protein düzeylerinin araştırılması
Investigation of rapamicine mammalian target protein levels in the chinese hamster ovary cell line with application of epigallocatechin gallat, rosmarinic acid and doxorubicin
Yazar: SİNEM HELVACIOĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞENAY VURAL KORKUT
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Doksorubisin en yaygın kullanılan kemoterapötik ajanlardan biridir. Sitotoksik özelliğinden dolayı kanser hücrelerinde etkilidir. Fakat sadece kanser hücrelerini etkilemeyip normal sağlıklı hücreler üzerinde de istenmeyen etkilere sahiptir. Rosmarinik asit, fenolik bir bileşiktir. Kaffeik asit ve 3,4-dihidroksifennillaktik asidin esteridir. Rosmarinik asit, antioksidan ve antienflamatuar etkilere sahiptir. Rosmarinik asit tek başına veya diğer antioksidanlarla, esansiyel yağ asidi takviyeleri ve diğer bitki türevi ürünlerle birlikte kullanılmaktadır. Bir başka fenolik bileşik olan epigallokateşin gallat, çay yapraklarında en bol bulunan kateşin ve güçlü antioksidandır. Epigallokateşin gallat birçok diyet takviyesinde kullanılır. Hem Epigallokateşin gallat hem de Rosmarinik asit fenolik bileşikler olsalar da, farklı kimyasal sınıflara aittirler. Epigallokateşin gallat, gallik asit ile esterleştirilmiş flavan-3-ol yapısında olan tanindir. Rosmarinik asit bir fenolik asittir. Rapamisin memeli hedefi, büyüme faktörleri, besin mevcudiyeti ve immün-düzenleyici sinyaller gibi çeşitli çevresel faktörlere cevaben hücresel büyüme ve proliferasyonu indükleyip, değiştirir.
Bu çalışmanın amacı, öncelikle Çin Hamsteri Yumurtalık hücre hattında Doksorubisin'in, Epigallokateşin gallat'ın ve Rosmarinik asit'in sitotoksisitesini hücre canlılığı için etkin olarak kullanılan WST-1 testiyle değerlendirmek ve daha sonra Western blotlama yöntemiyle Rapamisin memeli hedefi protein düzeylerinin araştırılmasıdır. 24 saat, 48 saat ve 72 saat süre ile inkübe edilen CHO hücrelerinde Rosmarinik asit, Epigallokateşin gallat ve Doksorubisin için IC50 değerleri hesaplandı. Epigallokateşin'in IC50 değerleri 24 saat için 299.512 uM, 48 saat için 276.694 uM ve 72 saat için 267,511 uM olarak bulunmuştur. Rosmarinik asit 0.0625-1 mM konsantrasyonlarında 24, 48 ve 72 saat boyunca hücrelere uygulanmıştır. Rosmarinik asit, uygulanan yüksek dozlara rağmen hücre canlılığında azalmaya neden olmamıştır. Bu yüzden IC50 hesaplanamamıştır. Doksorubisin'in IC50 değeri 24 saat için 696.817 nM, 48 saat için 467 nM ve 72 saat maruz bırakılınca 131.008 nM olarak bulunmuştur.Doksorubisin'in neden olduğu sitotoksisiteye karşı Rosmarinik asit'in koruyucu etkisinin daha fazla olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlara göre seçilen dozlar ile Western blot yapıldığında Doksorubisin uygulanan grupta 250 nM'dan 2000 nM doza kadar Rapamisin memeli hedefi protein seviyesi azalmıştır. Rosmarinik asit ve Epigallokateşin gallat uygulanan gruplarda da protein seviyesi kontrol grubuna kıyasla azalma göstermiştir. Bu azalmanın nedeninin oksidatif strese bağlı olduğu düşünülmektedir.
Mekanizmanın tam olarak aydınlatılması için farklı yöntemlerle in vitro ve in vivo çalışmalar yapılmalıdır.
Anahtar Kelimeler: Doksorubisin, Rosmarinik asit, Epigallokateşin gallat, western blot, sitotoksisite

Abstract:
Investigation of Rapamicine Mammalian Target Protein Levels in the Chinese Hamster Ovary Cell Line with Application of 

Doxorubicin is commonly used chemotherapeutic agents. It is effective in cancer cells due to its cytotoxic properties. However, it not only affects cancer cells but also has undesirable effects on normal healthy cells. Rosmarinic acid is a member of many Lamiaceae families including caffeic acid ester and Rosmarinus officinalis. Rosmarinic acid has antioxidant and anti-inflammatory effects. Rosmarinic acid can be used alone or in combination with other antioxidants and other plant-derived products. Epigallocatechin gallate, another phenolic compound, is the most abundant catechin and strong antioxidant in tea leaves. Epigallocatechin gallate is used in many dietary supplements. Although both Epigallocatechin gallate and Rosmarinic acid are phenolic compounds, they belong to different chemical classes. Epigallocatechin gallate is a tannin of flavan-3-ol esterified with gallic acid. Rosmarinic acid is a phenolic acid. Rapamycin mammalian target induces and alters cellular growth and proliferation in response to a variety of environmental factors such as, growth factors, nutrient availability, and immunoregulatory signals.
The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity of Doxorubicin, Epigallocatechin gallate and Rosmarinic acid in the Chinese Hamster Ovary cell line with the WST-1 assay, which is effectively used for cell viability, and the second aim is to investigate the mammalian target protein levels by Western blotting. IC50 values for Rosmarinic acid, Epigallocatechin gallate and Doxorubicin were calculated in CHO cells incubated for 24 hours, 48 hours and 72 hours. IC50 values of epigallocatechin were 299.512 uM for 24 hours, 276.694 uM for 48 hours and 267,511 uM for 72 hours. Rosmarinic acid was applied to the cells at concentrations of 0.0625-1 mM for 24, 48 and 72 hours. Rosmarinic acid did not cause a decrease in cell viability despite high doses. Therefore, IC50 could not be calculated. The IC50 value of Doxorubicin was found to be 696.817 nM for 24 hours, 467 nM for 48 hours and 131.008 nM when exposed to 72 hours. It has been found that Rosmarinic acid has a higher protective effect against cytotoxicity caused by Doxorubicin. According to these results, Western blot was performed with selected doses, Rapamycin mammalian target protein level decreased from 250 nM to 2000 nM doses in Doxorubicin treated group. In the groups treated with Rosmarinic acid and Epigallocatechin gallate, the protein level decreased compared to the control group. This reduction is thought to be due to oxidative stress.
In vitro and in vivo studies with different methods should be performed to fully clarify the mechanism.
Keywords: Doxorubicin, Rosmarinic acid, Epigallocatechin gallate, western blot, cytotoxicity