Farklı ağır metallerin Eisenia andrei (toprak solucanı)üzerine gen ekspresyon düzeyinde etkisi
The effect of different heavy metals on the Eisenia andrei (soil worm) on the gene expression level
Yazar: AHMET AŞKIN YILMAZ
Danışman: PROF. DR. EMİNE SÜMER ARAS
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Eisenia andrei türü solucanlar, hem çevresel hem de ekonomik açıdan faydalı olmaları sebebiyle çok önemli ve organik atıkların yönetimi için sıklıkla kullanılan organizmalardır. Ekotoksikoloji, fizyoloji, genetik çalışmalardaki yaygın kullanımları nedeniyle bu tez çalışmasında da biyobelirteç olarak seçilmiştir. Gerçekleştirilen bu tez kapsamında kadmiyum ve bakır ağır metallerinin üç farklı konsantrasyonda (LC50 değerlerinin yarısı, iki katı ve  LC50 değerine yakın olacak şekilde ayarlanmış), 14 gün süreyle Eisenia andrei türüne uygulanması ve etkilerinin gen düzeyinde incelenmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda OECD' nin uygun gördüğü test toprağı hazırlanmış ve 10 adet plastik kutuya bölünerek ardından ağır metaller ortama eklenmiştir. Uzun süreli karıştırıldıktan sonra homojen hale getirilen toprak numuneleri toprak analizine MTA Genel Müdürlüğü' ne gönderilmiş ve ardından solucanlar ortama alınmıştır. Topraktaki ayarlanan ağır metal konsantrasyonları; kontrol, 500, 1000, 2000 ppm Cd, 250, 500, 1000 Cu, 500 ppm Cd +250 ppm Cu, 1000 ppm Cd +500 ppm Cu,  2000ppm Cd+ 1000 ppm Cu şeklindedir. Her düzenekten 24 saat ve 14 günün sonunda örneklem alınmış, ağır metal uygulamasından önce ve sonra solucanlar tartılmıştır. Daha sonra RNA izolasyon basamağına geçilmiş, agaroz jel elektroforezi ile kontrol edilmiştir. İzole edilen RNA' lardan cDNA sentezlenmiş, sentezin sonrasında  Real-Time PCR ile Metallothionein geninin ekspresyon profiline bakılıp, veriler analiz edilmiştir. Bu gen, ağır metal detoksifikasyonunda çok önemli role sahiptir. Yapılan ağırlık ölçümleri analizleri sonucunda, ağır metal uygulaması yapılan topraklardaki solucanlarda genel manada anlamlı azalma görülmüştür. Hayatta kalma oranları ise % 76 ile % 0 sıfır arasında dağılım göstermiştir. Real-Time PCR sonuçlarına bakılacak olursa, Metallothionein geninin ekspresyon seviyesinde, ağır metal oranları sabitken, zaman faktörü ile önemli derecede artış görülmüştür. Zaman sabit tutulduğunda ise, sadece Cd uygulamasında, artan konsantrasyonlarla doğru orantılı olarak anlamlı seviyede azalma görülmüştür. Cu uygulamasında ise 1 gün için, 250 ppm 'den 1000 ppm 'e çıkıldığında yaklaşık 95 kat artış görülürken, 14 günde yaklaşık 2 kat artış görülmüştür. İki metal birlikte uygulandığında ise 1 gün için profil, sadece Cd uygulandığındaki gibidir. 14 gün maruz kalanlar için ise şablon sadece Cu uygulamasındaki gibidir ve anlamlı bir artış söz konusudur. Bu çalışma, Eisenia andrei türü organizmaya, Cd ve Cu' un birlikte, LC₅₀  değerlerinin yaklaşık 2 katı dozun uygulandığı, bu dozlara maruz kalan solucanların gen ekspresyon profilinin gösterildiği ilk çalışmadır.

Abstract:
Eisenia andrei is very important species used for the management of organic wastes because it is both environmentally and economically beneficial. It was chosen as a biomarker in this thesis project because of its widespread use in ecotoxicology, physiology and genetic studies. In this study, it was aimed to apply cadmium and copper heavy metals to Eisenia andrei in three different concentrations (adjusted to be close to half, twice the LC50 value and LC50 value) for 14 days and to examine their effects at the gene level. In this context, the test soil deemed appropriate by the OECD was prepared and divided into 10 plastic boxes and then heavy metals were added to the environment. In this context, the test soil prepared appropriately by the OECD approved standart and divided into 10 plastic boxes and then heavy metals were added to the environment. Soil samples, which were homogenized after long-term mixing, were sent to MTA for the soil analysing and then worms were taken to the test environment. The heavy metal concentrations set in the soil are control, 500, 1000, 2000 ppm Cd, 250, 500, 1000 Cu, 500 ppm Cd  250 ppm Cu, 1000 ppm Cd  500 ppm Cu,  2000ppm Cd  1000 ppm Cu. Samples were taken from each setup at the end of 24 hours and 14 days and worms were weighed before and after heavy metal application. Then, RNA isolation step was fallowed and the integrity and quality was checked by agarose gel electrophoresis. From the isolated RNAs, cDNA was synthesized, the expression profile of the Metallothionein gene was examined by Real-Time PCR and the data were evaluated. This gene has a very important role in heavy metal detoxification. As a result of the weight measurements analysis of the worms, a significant decrease was observed in the worms in the soil which the heavy metals were applied. Also their survival rates ranged from 76% to 0% zero. Considering Real-Time PCR results, Metallothionein gene expression level increased significantly with time factor while heavy metal ratios were constant. When the time was kept constant, a significant decrease was observed in Cd application only in direct proportion with increasing concentration. In Cu application, when it is increased from 250 ppm to 1000 ppm for one day, approximately 95 times increase was observed in expression, while in 14 days it increased approximately two times. When the two metals are applied together, the profile is for one day, revealed the same result with Cd application. For those who are exposed to 14 days, the pattern is just like Cu application and there is a significant increase. This study is the first study in which approximately twice the dose of Cd and Cu is applied to the Eisenia andrei and LC₅₀ values and the metallothionein gene expression profiles are displayed in worms exposed to these doses.