Türk fındık (corylus avellana l.) çeşitlerinde mikropropagasyon ve agrobacterium spp. ile infeksiyon çalışmaları
The studies on micropropagation and agrobacterium spp.infection of turkish hazelnut (Corylus avellana L.) cultivars
Yazar: BAKİ YAMAN
Danışman: PROF. DR. ŞULE ARI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Corylus avellena L. dünyadaki en yaygın fındık türüdür. Meyvesi için yetiştirilen fındık, yaprak, çotanak ve sert kabuk gibi kısımlarında içerdiği etken maddeler nedeniyle farmasötik, gıda ve kozmetik endüstrileri için de önemli hale gelmiştir. Türkiye küresel ihtiyacın %60'ını karşılayarak dünya fındık üretiminde lider konumda bulunmaktadır. İklim değişikliği, fındık ağaçlarının yaşlanması ve bitki patojenleri gibi olumsuz etkenler, Türkiye'nin mevcut fındık üretim verimini düşürmektedir. Fındık üretiminde sürdürülebilirliğin sağlanması için istenilen karakteristiklere sahip bitki genotiplerinin geliştirilmesi ve çoğaltımının yapılması gerekmektedir. Geleneksel çoğaltım yöntemlerinin yetersizliği fındık üretimi için mikropropagasyon yöntemini öne çıkartmaktadır. Ülkemizde sürdürülebilir bir üretim için oldukça az sayıdaki in vitro mikropropagasyon çalışmalarının Türk fındık çeşitleri için optimize edilmesi büyük önem taşımaktadır.

Bu tez çalışmasında Türk fındık çeşitleri için etkili gövde gelişimi ve kök indüksiyonunu sağlayan iki aşamalı bir in vitro mikroçoğaltım prosedürünün optimizasyonu ve sekonder metabolit üretiminde yüksek potansiyele sahip saçak kök kültürlerinin kurulması amacıyla yetiştirilen steril bitkiciklerin Agrobacterium rhizogenes K599 suşu ile infeksiyonu hedeflenmiştir. Bu hedef doğrultusunda Kalınkara çeşidinin embriyo dokuları, başlangıç bitki materyali olarak kullanılmıştır. İlk aşamada aynı bitki büyüme düzenleyici içeriğine sahip (1,5 mg/L BAP + 0,01 mg/L IBA + 0,5 mg/L GA3), besiyeri konsantrasyonu ve çeşidi açısından farklılaşan 6 besin ortamının (MS, ½ MS, ¼ MS, WPM, ½ WPM, ¼ WPM) gövde gelişimi üzerindeki etkileri analiz edilmiştir. Bu besiyeri tipleri arasından fındık gelişiminde en etkili olan ½ MS, fındık köklendirme aşamasında temel besin ortamı olarak kullanılmıştır. Yetiştirilen gövdeler, farklı IBA (2 ve 3 mg/L) ve FeEDDHA (0, 100, 200 mg/L) içeriğine sahip 6 adet besin ortamına (K1, K2, K3, K4, K5, K6) aktarılarak kök indüksiyonları başarıyla sağlanmıştır. Daha sonra optimize besin ortamlarında yetiştirilen fındık bitkileri A. rhizogenes K599 ile inoküle edilmiştir. 

Gövde gelişimi için MS temelli besin ortamlarının WPM'e göre daha iyi sonuç verdiği gözlemlenmiştir. Besin ortamları arasında çimlenme frekansı (%72), eksplant başına yaprak sayısı (4,5 adet) ve gövde/yaprak kalitesi (%66 iyi kalite) açısından ½ MS + 1,5 mg/L BAP + 0,01 mg/L IBA + 0,5 mg/L GA3 kombinasyonu en etkili besiyeri olarak belirlenmiştir. Yetiştirilen gövdelerin köklendirici besin ortamlarına aktarımını takiben 45. gündeki gelişimleri analiz edildiğinde 200 mg/L FeeDDHA içeren besin ortamlarının kök gelişimini oldukça olumsuz etkilerken, 100 mg/L FeEDDHA'nın bitki canlılığı (%72), kök indüksiyonu (%60-65), eksplant başına kök sayısı (9-10 adet) ve ortalama kök uzunluğu (2,8-4,4 cm) bakımından pozitif etkilemiştir. Bitkilerin IBA konsantrasyonlarına verdiği yanıtlar arasında büyük farklılık olmamasına ve FeEDDHA konsantrasyonuna bağlı olarak değişmesine karşın, 2 mg/L IBA kök gelişiminde daha etkili bulunmuştur. Sonuç olarak, Kalınkara fındığın kök gelişiminde, besiyerlerinin etkinlikleri K2 (½ MS + 2 mg/L IBA + 100 mg/L FeEDDHA) > K5 (½ MS + 3 mg/L IBA + 100 mg/L FeEDDHA) > K1 (½ MS + 2 mg/L IBA)  > K4 (½ MS + 3 mg/L IBA)  > K3 (½ MS + 2 mg/L IBA + 200 mg/L FeEDDHA)  > K6 (½ MS + 3 mg/L IBA + 200 mg/L FeEDDHA) şeklinde sıralanabilmektedir. Optimize besin ortamlarında yetiştirilen fındıkların A. rhizogenes K599 ile infeksiyonu sonucunda ise herhangi bir saçak kök oluşumu gözlemlenememiştir.

Bu Yüksek Lisans tez çalışması sonucunda, dünyanın en büyük fındık üreticisi olan Türk fındık çeşitlerinden Kalınkara'da ilk kez iki aşamalı bir in vitro mikropropagasyon prosedürü geliştirilmiştir. Diğer çeşitlere de uygulanabilecek bu yöntemin, moleküler ıslah, genom dizilenmesi, doku kültürü platformlarının kurulması ve ticari amaçlarla fındık bitkisi üretimi gibi süreçlerde hızlı ve steril bitki materyali elde edilmesi için kullanılabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Corylus avellena L. the most common hazelnut in the world. Hazelnut which primarily cultivated for its fruit, has also become important for pharmaceutical, cosmetic and food industries due to the active components contained in its by-products such as leaves, husk and hard shell. Turkey has a leading position in the world hazelnut production by meeting 70% of the global demand. Negative factors such as climate change, hazelnut tree ageing and plant pathogens reduces the current hazelnut production yield of Turkey. In order to ensure sustainability for hazelnut production, it is necessary to develop and propagate plant genotypes with the desired characteristics. The inadequacy of traditional propagation methods highlights the micropropagation method for hazelnut propagation. For sustainable production in our country, optimisation of limited number of in vitro micropropagation studies for Turkish hazelnut cultivars is of crucial importance. 

The aim of this thesis was to optimise a two-step in vitro micropropagation procedure that provides effective shoot development and root induction for Turkish hazelnut cultivars and to infect the grown sterile hazelnuts with Agrobacterium rhizogenes K599 strain in order to establish a hairy root culture which has high potential in the production of secondary metabolites. For this purpose, embryo tissues of Kalınkara hazelnut were used as starting plant material. In the first stage, the effects of 6 nutrient media (MS, ½ MS, ¼ MS, WPM, ½ WPM, ¼ WPM) with the same plant growth regulator content (1.5 mg/L BAP + 0.01 mg/L IBA + 0.5 mg/L GA3), which differed in terms of medium concentration and type, on shoot growth were examined. Among these medium types, ½ MS, which is the most effective in hazelnut growth, was used as the basic nutrient medium in hazelnut rooting stage. The grown shoots were transferred to 6 nutrient media (K1, K2, K3, K4, K5, K6) with different IBA (2 and 3 mg/L) and FeEDDHA (0, 100, 200 mg/L) contents and root induction was successfully achieved. Then, hazelnut plants grown on optimised nutrient media were inoculated with A. rhizogenes K599.

For shoot development, it was observed that MS-based nutrient media gave better results than WPM. The combination of ½ MS + 1.5 mg/L BAP + 0.01 mg/L IBA + 0.5 mg/L GA3 was determined as the most effective medium in terms of germination frequency (72%), number of leaves per explant (4.5 pieces) and shoot/leaf quality (66% good quality). When the development of the grown shoots on the 45th day after transfer to the rooting medium was analysed, it was found that the medium containing 200 mg/L FeEDDHA had a quite negative effect on root development, whereas 100 mg/L FeEDDHA had a positive effect on plant vitality (72%), root induction (60-65%), number of roots per explant (9-10 pieces) and average root length (2.8-4.4 cm). Although there was no significant difference between the responses of plants to IBA concentrations and it varied depending on FeEDDHA concentration, 2 mg/L IBA was found to be more effective in root development. In conclusion, the effectiveness of the media on root growth of Kalınkara hazelnut can be ranked as K2 (½ MS + 2 mg/L IBA + 100 mg/L FeEDDHA) > K5 (½ MS + 3 mg/L IBA + 100 mg/L FeEDDHA) > K1 (½ MS + 2 mg/L IBA) > K4 (½ MS + 3 mg/L IBA) > K3 (½ MS + 2 mg/L IBA + 200 mg/L FeEDDHA) > K6 (½ MS + 3 mg/L IBA + 200 mg/L FeEDDHA). No hairy root formation was observed as a result of infection of A. rhizogenes K599 with hazelnuts which grown in optimised nutrient media.

As a result of this master thesis, a two-stage and sensitive in vitro micropropagation procedure was developed for the first time for hazelnut varieties of Turkey, the world's largest hazelnut producer. It is thought that this method can be used to obtain fast and sterile plant material in processes such as molecular breeding, genome sequencing, establishment of tissue culture platforms and hazelnut plant production for commercial purposes.