Aureobasidium pullulans ile liamocin (ağır yağ) üretiminin incelenmesi
Investigation of liamocin (heavy oil) production by aureobasidium pullulans
Yazar: ASLI DENİZ PEHLİVAN
Danışman: PROF. DR. ZEKİYE YEŞİM ÖZBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında, çeşitli fermantasyon parametrelerinin A. pullulans NBRC 100716 suşunun liamocin üretimi üzerine olan etkileri incelenmiştir. Çalışmada, tüm fermantasyon denemeleri kesikli sistemde, çalkalama hızı ve sıcaklığı kontrol edilebilen bir su banyosu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Araştırmada ilk olarak, altı A. pullulans suşunun liamocin üretimleri, bileşiminde üç farklı şekerin ayrı ayrı denendikleri agarlı bir besiyerinin kullanıldığı bir ön tarama testiyle makroskopik olarak incelenmiş ve tüm suşların agarlı besiyerinde gelişebildikleri ve liamocin üretiminin belirteci olarak koloni etrafında yağ tabakası üretebildikleri belirlenmiştir. Daha sonra, yüksek derişimde liamocin üreten bir suşun belirlenebilmesi amacıyla, altı A. pullulans suşunun liamocin üretimleri karşılaştırmalı olarak incelenmiş ve A. pullulans NBRC 100716 suşunun, çalışılan diğer suşlardan daha yüksek derişimde (4.20 g/L) liamocin ürettiği belirlenmiştir. Sonraki aşamada ise, seçilen bu suşun farklı karbon kaynakları içeren fermantasyon ortamlarında liamocin üretimleri araştırılmıştır. Bu amaçla gerçekleştirilen deneylerde, fermantasyon ortamında karbon kaynağı olarak glukoz, fruktoz, maltoz ve sakkaroz kullanıldığında en yüksek liamocin derişimi (5.50 g/L) fruktozun kullanıldığı denemelerde elde edilmiş ve bu nedenle çalışmaya, karbon kaynağı olarak fruktoz içeren fermantasyon ortamıyla devam edilmesine karar verilmiştir. Fermantasyon ortamında
kullanılan farklı azot kaynaklarının, incelenen suşun liamocin üretimi üzerine etkilerinin araştırıldığı denemelerde, organik azot kaynakları olarak; pepton ve maya özütü, inorganik azot kaynağı olarak ise; (NH4)2SO4 kullanılmıştır. Azot kaynakları olarak pepton ve maya özütünün bir arada kullanıldığı deneylerde liamocin üretiminin, diğer azot kaynaklarının kullanıldığı fermantasyon ortamındakilerden daha yüksek derişimde olduğu (4.26 g/L) belirlenmiştir.
Bu çalışmada daha sonra, A. pullulans NBRC 100716 suşunun liamocin üretiminin yanıt yüzey yöntemi ile optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, Design Expert®12 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, ABD) programında yer alan; dönüşümlü merkezi karma tasarım yöntemi kullanılmıştır. Program yardımıyla oluşturulan deney tasarım planı kapsamında, merkez noktada 6 paralel olmak üzere 20 deney gerçekleştirilmiştir. Tasarımda seçilen bağımsız değişkenler; fermantasyon ortamının fruktoz başlangıç derişimi, başlangıç pH'ı ve sıcaklık, bağımlı değişkenler ise; maksimum liamocin derişimi, mikroorganizma özgül üreme hızı ve maksimum özgül liamocin üretim hızıdır. Tasarım planında verilen koşullarda gerçekleştirilen deneyler sonucunda elde edilen verilere, program yardımıyla çoklu regresyon analizi uygulanmış ve bağımsız değişkenlerin bağımlı değişkenler üzerindeki etkilerini gösteren model eşitlikler türetilmiştir. Oluşturulan model eşitliklerin uygunluğu varyans analizi (ANOVA) ile değerlendirilmiştir. Optimizasyon aşamasında, program tarafından oluşturulan 58 çözümden; istenilen hedefe ulaşma fonksiyonu 0.825, fermantasyon ortamı fruktoz başlangıç derişimi 93.47 g/L, başlangıç pH'ı 4.92 ve sıcaklığın ise 27.2°C olduğu bir çözüm seçilerek, bu koşullarda bir deney gerçekleştirilmiştir. Seçilen koşullarda gerçekleştirilen deneyde, maksimum liamocin derişimi; 3.56 g/L, A. pullulans NBRC 100716 suşunun özgül üreme hızı; 0.0670 sa-1 ve maksimum özgül liamocin üretim hızı ise; 0.00450 [g liamocin/(g mo.sa)] olarak bulunmuştur. Elde edilen sonuçların, %95 güven aralığında oldukları doğrulanmıştır.
Bu tez çalışmasında, incelenen suş tarafından üretilen bazı liamocin örneklerinin moleküler olarak doğrulanmaları; MALDI-TOF-MS ile gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, GC-FID analizi ile incelenen suş tarafından üretilen liamocinin yağ asidi profili de belirlenmiştir.
Bu araştırmada, incelenen suş tarafından üretilen liamocin örneklerinin biyosürfektan aktivitesini belirlemeye yönelik bazı testler de gerçekleştirilmiştir.
1.08 mg/mL derişimindeki liamocin örneğinin yağ yayma çapı; 8.10 cm olarak ölçülmüştür. Liamocin örneğinin yüzey gerilimi değeri ise, asılı damla yöntemiyle, 31.6 mN/m olarak olarak belirlenmiştir.

Abstract:
In this thesis, the effects of various fermentation parameters on liamocin production of Aureobasidium pullulans NBRC 100716 were investigated. In the study, all fermentation experiments were carried out in batch system, using a water bath with controllable shaking speed and temperature. Primarily, the liamocin production of six A. pullulans strains was macroscopically examined with a pre-screening test using an agar medium in which three different sugars were tested separately and it was determined that all strains could grow on agar medium and produce an oil layer around the colony as an indicator of liamocin production. Afterwards, liamocin production of six A. pullulans strains was compared with the aim of identifying a strain that produced high concentrations of liamocin, and it was determined that A. pullulans NBRC 100716 produced higher concentrations of liamocin (4.20 g/L) than the other strains studied. Then, liamocin production of this selected strain was investigated in fermentation media containing different carbon sources. In the experiments carried out for this purpose, when glucose, fructose, maltose and sucrose were used as carbon sources in the fermentation medium, it was observed that the highest liamocin concentration (5.50 g/L) was obtained in the experiments using fructose. For this reason, it was decided to continue the study with a fermentation medium containing fructose as a carbon source. In the trials where the effects of different nitrogen sources used in the fermentation medium on the liamocin production of the tested strain were investigated; peptone and yeast extract were used as organic nitrogen sources and (NH4)2SO4 was used as inorganic nitrogen source. In experiments where peptone and yeast extract were used together as nitrogen sources, it was determined that the production of liamocin was at a higher concentration (4.26 g/L) than in the fermentation medium where other nitrogen sources were used.
In the next part of this study, optimization of liamocin production of A. pullulans NBRC 100716 strain was performed by response surface method. For this purpose, in the Design Expert®12 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, ABD) software; rotatable central composite design method was used. Within the scope of the experimental design plan created by the program, 20 experiments, 6 parallel at the central point, were carried out. While the independent variables selected in the design were the initial fructose concentration of the fermentation medium, initial pH and temperature, the dependent variables were the maximum liamocin concentration, the microorganism specific growth rate and the maximum specific liamocin formation rate. Multiple regression analysis was applied to the data obtained as a result of the experiments carried out under the conditions given in the design plan, with the help of the program, and model equations showing the effects of independent variables on dependent variables were derived. The convenience of the created model equations was evaluated by analysis of variance (ANOVA). An experiment was carried out under these conditions by choosing a solution with a desirability function was 0.825, initial fructose concentration of fermentation medium was 93.47 g/L, initial pH was 4.92 and temperature of 27.2°C from 58 solutions created by the program during the optimization. In the experiment performed under the selected conditions, the maximum liamocin concentration, the specific growth rate of A. pullulans NBRC 100716 strain and the maximum specific liamocin formation rate were found as; 3.56 g/L, 0.0670 h-1 and 0.00450 [g liamocin/(g mo.sa)], respectively. It has been verified that the obtained results are within 95% confidence intervals.

In this thesis, molecular confirmations of some liamocin samples produced by the tested strain were performed by MALDI-TOF-MS. In addition, the fatty acid profile of liamocin produced by the tested strain was also determined by GC-FID analysis. In this study, some tests were also performed to determine the biosurfactant activity of liamocin samples produced by the tested strain. The oil spreading diameter of the 1.08 mg/mL liamocin sample was measured as 8.10 cm. The surface tension value of the liamocin sample was determined as 31.6 mN/m using the pendant drop method.