COVİD-19'a karşı prefüzyon yapıda kararlı trimerik spike proteini kodlayan dna aşısının geliştirilmesi
Development of the dna vaccine encoding a prefusion-stabilized trimeric spike protein against COVİD-19
Yazar: AYTÜL GÜL
Danışman: PROF. DR. ELİF ESİN HAMEŞ ; PROF. DR. MERT DÖŞKAYA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Lipozomlar = Liposomes

Özet:
Dünya Sağlık Örgütü tarafından 11 Mart 2020 tarihinde pandemi olarak ilan edilen Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) bu tezin yazıldığı tarih itibari ile dünyayı olumsuz etkilemeye devam etmektedir. İnsanlarda kullanım için onaylanmış elli aşı, bağışıklık tepkisi oluşturmak için yeterli olsa da aşı ile oluşturulan bağışıklık ortalama altı ay sürmekte ve koruyuculuğu devam ettirmek için sık sık aşılanmak gerekmektedir. Bunun yanında yakın zamanda ortaya çıkan şiddetli akut solunum sendromu koronavirüsü 2 (SARS-CoV-2) B.1.617.2 (delta) varyantı gibi endişe uyandırıcı varyantların ilk çıkan Wuhan suşuna göre daha bulaşıcı olması aşıların etkinliğinin artırılması gerektiğini göstermektedir. Bu sebeple bu tezde, SARS-CoV-2 delta varyantına karşı DNA aşısının geliştirilmesi, aşının BALB/c farelerinde immunojenisitesinin belirlenmesi ve nanoteknolojik formülasyonunun geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Trimerik prefüzyon yapıda kararlı bir yapıya sahip aşı antijeni oluşturulması için altı prolin ikamesi, iki alanin ikamesi ve T4 fibritin katlanma bölgesi içeren SARS-CoV-2 delta varyantına ait çözünür spike proteini (STDSpike) in silico olarak tasarlanmıştır. STDSpike geni pVAX1 vektörüne klonlanarak pSTDSpike DNA aşısı oluşturulmuştur. pSTDSpike DNA aşısının protein ekspresyon kapasitesi insan embriyonik böbrek (HEK293T) hücrelerinde Western blot ve immünfloresan antikor boyama testi ile belirlenmiştir. Aşının immunojesitesinin belirlenmesi için BALB/c fareleri intramüsküler (IM) yoldan veya elektroporasyon cihazı kullanılarak intradermal (ID+EP) yoldan pSTDSpike ile üç kez immünize edilmiştir. Humoral immün yanıtın belirlenmesi için Western blot, rekombinant protein kullanılan enzim bağlı immünosorbent analizi (ELISA) ve rekabetçi ELISA testleri gerçekleştirilmiş, hücresel immün yanıt ise splenositlerin stimüle edilmesinin ardından akış sitometrisi, sitokin ELISA ve MTT testleri ile belirlenmiştir. Ayrıca nanoteknolojik formülasyonlar oluşturmak amacı ile L-α-fosfatidilkolin, stearilamin ve kolesterol içeren ticari lipozom kiti kullanılarak pSTDSpike:Lipozom kompleksleri oluşturulmuştur. Geliştirilen komplekslerin DNA koruması, serum stabilitesi, in vitro toksisitesi ve transfeksiyon etkinliği belirlenmiştir.
pSTDSpike DNA aşısı STDSpike proteinini HEK293T hücrelerinde bol miktarda eksprese etmiştir. BALB/c farelerinde pSTDSpike aşısı, antijen spesifik IgG antikorunun yüksek titrelerini indüklemiştir. ID+EP yoluyla uygulanan pSTDSpike titreleri ~52.000'e ulaşırken, IM uygulamada ~21.000'e ulaşmıştır. pSTDSpike hem IM hem de ID+EP yoldan sırasıyla %87,3 (P<0,0001) ve %81,8 (P<0,0001) oranında inhibisyon göstererek güçlü nötralizasyon sağlamıştır. pSTDSpike IM ve pSTDSpike ID+EP ile aşılanmış fareler kontrol grupları ile karşılaştırıldığında IFN-γ salgılayan CD8+ T hücrelerinin yüzdeleri sırasıyla ~10 kat (p=0,0014) ve ~15 kat (p<0,0001) yüksek çıkmıştır. IFN-γ salgılayan CD4+ T hücrelerinin yüzdeleri kontrollere kıyasla 2 kat arttığı saptanmıştır. pSTDSpike ID+EP aşı grubunun IFN-γ seviyesi, pSTDSpike IM grubuna göre 3,5 kat daha yüksek çıkmıştır (p<0,0001). Oluşturulan pSTDSpike:Lipozom kompleksleri arasından ağırlıkça 1:100 ve 1:200 kompleksleri in vitro testler ve hücre kültürü çalışmaları için seçilmiştir. Küresel yapıya sahip olan bu kompleksler sırasıyla 143 nm ve 116 nm boyutlarına, 0,25 ve 0,17 pDI değerlerine ve 45,4 ve 47,2 zeta potansiyellerine sahip olduğu belirlenmiştir. Komplekslerin pSTDSpike aşısını, DNaz I ve serum aracılı bozunmaya karşı koruduğu belirlenmiş ancak HEK293T hücrelerinde %70'in altında canlılık göstermiş ve etkin transfeksiyon gerçekleştirememiştir.
Sonuç olarak pSTDSpike DNA aşısının tek başına IM veya ID+EP yoldan uygulandığında güçlü hücresel ve humoral immün yanıtı uyardığı ve SARS-CoV-2'ye karşı koruma sağlamada umut verici bir aday olabileceği belirlenmiştir.

Abstract:
The coronavirus disease 2019 (COVID-19), declared a pandemic by the World Health Organization on March 11, 2020, continues to affect the world negatively. The fifty vaccines approved for human use are sufficient to induce an immune response. However, immunity only lasts for an average of six months before needing booster doses. In addition, variants of concern, such as the recently emerged severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) B.1.617.2 (delta) variant, are more contagious than the first Wuhan strain shows that the effectiveness of vaccines should be increased. This thesis aimed to develop a DNA vaccine against the SARS-CoV-2 delta variant, determine the immunogenicity of the vaccine in BALB/c mice, and develop its nanotechnological formulation.
The soluble spike protein (STDSpike) of the SARS-CoV-2 delta variant, containing six proline substitutions, two alanine substitutions, and a T4 fibritin folding region, was designed in silico to generate vaccine antigen with a stable structure in the trimeric prefusion state. The STDSpike gene was cloned into the pVAX1 vector to generate the pSTDSpike DNA vaccine. The STDSpike protein was determined by Western blot and immunofluorescent antibody staining test in HEK293T cells. To determine the immunogenicity of the vaccine, BALB/c mice were immunized three times with naked pSTDSpike, either intramuscularly (IM) or intradermally, using an electroporation device (ID+EP). While Western blot, recombinant ELISA, and competitive ELISA tests were performed to determine the humoral immune response, the cellular immune response was determined by flow cytometry, cytokine ELISA, and MTT tests in restimulated splenocytes. In addition, pSTDSpike:Liposome complexes were formed using a commercial liposome kit containing L-α-phosphatidylcholine, stearylamine and cholesterol to prepare nanotechnological formulations. DNA protection, serum stability, in vitro toxicity, and transfection efficiency of the complexes were determined.
The STDSpike protein was produced at high levels in HEK293T cells. The pSTDSpike vaccine induced high titers of antigen-specific IgG antibodies in BALB/c mice. The IgG titers of pSTDSpike administered by ID+EP reached ~52.000, while IM routes reached ~21.000. Both pSTDSpike IM and ID+EP revealed strong neutralizing activity with inhibitions of 87.3% (P<0.0001) and 81.8% (P<0.0001). The percentages of IFN-γ secreting CD8+ T cells were ~10-fold (p=0.0014) and ~15-fold (p<0.0001) higher, respectively, when mice vaccinated with pSTDSpike IM and pSTDSpike ID+EP were compared with control groups. The percentages of CD4+ T cells that secrete IFN-γ were 2-fold higher than control groups. The IFN-γ level of the pSTDSpike ID+EP vaccine group was 3.5 times higher than pSTDSpike IM group (p<0.0001). Among the generated pSTDSpike:Liposome complexes, two successful candidates, 1:100 and 1:200 complexes, were selected for in vitro testing and cell culture studies. These complexes, which have a spherical structure, were determined to have dimensions of 143 nm and 116 nm, pDI values of 0.25 and 0.17, and zeta potentials of 45.4 and 47.2, respectively. The complexes were determined to protect the pSTDSpike vaccine against DNase I and serum-mediated degradation. However, the complexes showed less than 70% viability and failed to perform efficient transfection in HEK293T cells.
In conclusion, the pSTDSpike DNA vaccine induced strong cellular and humoral immune responses when administered by IM or ID+EP. The pSTDSpike vaccine may be a promising candidate for protecting against SARS-CoV-2.