Wilson hastalığına yol açan ATP7B genindeki mutasyonların bakır taşınmasındaki etkilerinin saccharomyces cerevisiae model sisteminde araştırılması
Searching the effect of mutations on ATP7B gene that caused wilson disease to the copper transport on saccharomyces cerevisiae model system
Yazar: ÖZLENEN ŞİMŞEK PAPUR
Danışman: PROF. DR. ORHAN TERZİOĞLU
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Bakır = Copper ; Hepatolentiküler dejenerasyon = Hepatolenticular degeneration ; Mayalar = Yeasts ; Mutasyon = Mutation

Özet:
Amaç : Klinik bulguları farklı Wilson Hastalarında saptanan ATP7B genindeki T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutasyonları ve yaban tip ATP7B geni, yaban tip BY4741 (MAT? his3?1 leu2?0 met15?0 ura3?0) suşundan elde edilmiş CCC2 geni mutant olan (BY4741 ?CCC2) Saccharomyces cerevisiae suşuna transformasyonuyla bakır miktarındaki değişimin saptanması amaçlandı.Yöntem : Hepatoselüler karsinoma hücre dizisi HepG2?den total RNA izolasyonu yapılıp cDNA elde edildi. Yaban tip ATP7B genine özgül primerler kullanılarak ATP7B geni PCR ile çoğaltıldı, plazmid DNA?sına klonlandı.Yaban tip ATP7B?yi içeren plazmid DNA?sında bölge yönlendirilmiş mutagenez `site directed mutagenesis? yöntemi ile T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutasyonları elde edildi. DNA dizi analizi ile yaban tip ATP7B, T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutant hücrelerden elde edilen plazmid DNA?larının dizileri doğrulandı. Yaban tip ATP7B, T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutantları Saccharomyces cerevisiae (BY4741?CCC2) transforme edildi.Konvansiyonel PCR ve real time PCR yapıldı. Komplementasyon deneyi yapılarak ICP MS analizi ile farklı ortam şartlarında, ortamdaki ve hücre pelletlerindeki bakır ve demir miktarı ölçüldü.Bulgular : BY4741 ?CCC2 suşunda , ATP7B geninin mayadaki CCC2 genini komplemente ettiğive işlevsel olduğu gösterildi. Demir sınırlı ortamda, yaban tip ATP7B?ye göre T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutantlarında hücre kültür ortamındaki bakır miktarının azaldığı ve hücre pelletlerindeki bakırın arttığı gösterildi. Kontrol ortamlarında hem ortam hem de hücre pelletlerinde bakır miktarında fark saptanmadı. Aynı deney şartlarında, yaban tip ATP7B?ye göre mutantlarda hem ortam hem de pelletlerde ölçülen demir miktarında fark saptanmadı. Sonuç : Demir sınırlı ortamda yaban tip ATP7B?ye göre T788I, V1036I ve R1038G-fsX83mutasyonlarında hücre kültür ortamındaki bakırın azaldığı, hücre pelletlerindeki bakırın arttığı gösterildi. ICP-MS ile yapılan ölçümlerde yaban tip ATP7B ile üç mutant arasında bakır taşınımında fark saptandı, hipotezimiz doğrulandı. BY4741?CCC2 genetik özelliğindeki mutant maya suşuna ilk kez insan bakır taşıyıcı geni ATP7B transforme edildi ve komplemantasyon gösterildi. Farklı klinik özelliklere sahip Wilson hastalarındaki mutasyonlara ait model sistem kurulmuş oldu.Anahtar Sözcükler : Wilson hastalığı, bakır, ATP7B , mutasyon, CCC2 , maya

Abstract:
Objective : It was aimed to detect the change amount of copper by transforming wild type ATP7B gene and T788I, V1036I and R1038G-fsX83 mutations in ATP7B gene which detected on Wilson Disease patients that has different clinical findings to Saccharomyces cerevisiae that has mutant CCC2gene (BY4741?CCC2) which obtained from wild type BY4741 (MAT? his3?1 leu2?0 met15?0 ura3?0) strain.Method : Total RNA was isolated from HepG2 cell line that belongs to hepotecellular carcinoma and cDNA synthesis reaction was performed. ATP7B gene was amplified with specific primers by PCR and it was cloned into plasmid DNA. T788I, V1036I and R1038G-fsX83 mutations were obtained by site directed mutagenesis on wild type ATP7B plasmid DNA. Plasmid DNAs that have wild type ATP7B; T788I, V1036I and R1038G-fsX83 mutations were verified by DNA sequencing. Wild type ATP7B, T788I, V1036I and R1038G-fsX83 mutants were transformed to Saccharomyces cerevisiae (BY4741?CCC2). Conventional and real time PCR was performed. Complementation assay was performed. In different medium condition copper and iron were measured in supernatant and pellet by ICM MS analysis.Results : In BY4741?CCC2 strain, ATP7B gene complemented CCC2 gene in yeast and it has been demonstrated that it is functional. On iron limited medium it has been demonstrated that T788I, V1036I and R1038G-fsX83 mutants have decreased copper in supernatant and increased copper in cell pellet comparing with wilde type ATP7B. In control media, no difference was detected on amount of copper both in supernatants and pellets. On the same experiement conditions, comparing with wild type ATP7B and mutants, no difference was found on amount of iron that has been measured in both supernatants and pellets.Conclusion: In iron limited medium it has been demonstrated that T788I, V1036I and R1038GfsX83 mutants have decreased copper in supernatant and increased copper in cell pellet comparing with wilde type ATP7B. The difference of copper transport between wild type ATP7B and three mutants were detected by ICP-MS and the hypothesis was confirmed. ATP7B gene was transformed to BY4741?CCC2 background yeast strain for the first time and complementation was shown. A model system was established for the mutations that belong to Wilson Disease patients that have different clinical findings.Key Words : Wilson disease, copper, ATP7B , mutation, CCC2, yeast