Deneysel olarak oluşturulan fibrosarkomalarda programlanmış hücre ölümünün çekirdekteki dna parçalanması tayini ve immunohistokimyasal olarak gösterilmesi
Detection of apoptosis in experimentaly induced fibrosarcomas using dna fragmentation and immunohystochemical methods
Yazar: HASAN AKŞİT
Danışman: PROF.DR. AYŞEGÜL BİLDİK
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Fibrosarkom mezenkimal dokudan köken alan bag dokunun kötü huylu tümörü olupdaha çok kedi ve köpeklerde görülmekle birlikte tüm hayvan türlerinde ortaya çıkabilir. Hızlıve infiltratif büyüyen bir tümördür. Rodentlerde en yaygın görülen mezenkimaltümörlerdendir ve ratlarda spontan olarak sekillenme olasılıgı % 1-3, farelerde görülmeolasılıgı ise % 1-6 düzeyindedir. Apoptozis ise; gelismis organizmalarda hücreler arasıiliskilerin geregi olarak gereksinim duyulmayan ve fonksiyonları bozulan hücrelerin, çevreyezarar vermeden programlı ölümüdür. Kanserlerde erken teshis yanında prognozun tayini,hastanın yasamını uzatmada ve daha uygun tedavi sekillerinin tespit edilmesinde büyük önemtasımaktadır. Özellikle kedilerde ası yerlerinde gelisen fibrosarkomlar önemli bir problemolusturmakta ve bunun en basta gelen sebebi olarak ise ası yerlerinde olusan kronik yangılarileri sürülmektedir. Son dönemlerde kanser üzerine yapılan çalısmalarda programlı hücreölümünün önemli rol oynadıgı bilinmektedir. Çalısmada ratlarda deneysel olarak 3-metilkolantren ile olusturulan fibrosarkomlarda programlı hücre ölümü iki ayrı metotlagösterilmistir. Böylece fibrosarkom ile programlı hücre ölümü arasındaki iliski incelenmistir.Aynı zamanda ELISA yöntemiyle DNA hasarı tespiti ve programlanmıs hücre ölümününimmunohistokimyasal olarak saptanması karsılastırılmıstır.Arastırmanın materyalini 16 adet 8 haftalık agırlıkları 150-200 gram olan erkekSpraque Dawley türü rat olusturdu. Ratlar her grupta 8 adet olmak üzere iki gruba ayrıldı.Birinci grup kontrol, ikinci grup deneme grubunu olusturdu. Hayvanlara tüm deney boyuncakuru pelet yem ve içme suyu ad libitium olarak verildi. Deneme süresi 150-210 gün sürdü.Deneme süresinin basında deneme grubundaki ratların boyun bölgelerinin dorsaline 0,25 mlsusam yagında çözdürülen 0,2 mg 3-metilcholantren fibrosarkoma olusturmak üzere deri altıyolla tek doz enjekte edildi. Kontrol grubuna ise tek doz 0,25 ml susam yagı deri altı yollaenjekte edildi. Deney süresi boyunca hayvanlar periyodik olarak kontrol edilip tümoralolusum yönünden palpe edildi. Deney süresinin sonunda ratlara eter anestezisi altında ötenaziuygulanarak nekropsileri yapıldı. Olusan tümör kitlelerinde DNA kırılmaları, ELISAyöntemiyle Roche firmasının kitleriyle bakıldı. Alınan dokulardan Bcl-2 ve Bax içinimmunohistokimyasal boyama yapıldı.Deneme ve kontrol grubundan alınan dokular homojenize edilip santrifüj islemindensonra süpernatant ELISA' da kullanıldı. ELISA sonuçlarına göre deney grubunda DNAfragmentasyonu ortalama 0,262 U (=absorbans), kontrol grubundaki ratlarda ise 0,069 Uolarak tespit edildi. Yani deney grubunda DNA fragmentasyonu kontrol grubuna göreyaklasık 4 katı artmıs olarak tespit edildi.Deneme ve kontrol grubundan alınan dokuların Bcl-2 ve Bax içinimmunohistokimyasal boyaması sonucunda, deney grubunda yogun olarak bcl-2 ve baxpozitif hücreler tespit edilmis olup tümörlerde apoptozis uyarısı alan hücrelerin bazılarınınapoptozise bir süre daha gitmesi engellenirken bazılarının da artık apoptotik ölümeyönlendikleri tespit edilmistir.Elde edilen bulgular sonucunda, fibrosarkomalarda apoptozis sık görülen bir olayolup, DNA fragmentasyonu apoptozisin en önemli belirtisidir. Kanser tedavisi ile ugrasanlarınapoptozis, Bcl-2 ve Bax' ı göz önünde bulundurması gerektigi, literatür bilgileridogrultusunda tümörün baslangıç evresinde apoptozisin azaldıgı, tümörün prolifiye olmasıylabirlikte apoptozisin de arttıgı kanısına varılmıstır.

Abstract:
Fibrosarcoma is driving from mesenchimal tissue. It is one of the malign tumors andusually seen in cats and dogs, however, itcan be encountered in all animals. It is growing quitefast and invade in other tissue rapidly. It is one of mesenchimal tumor in rodents varyingbetween 1-3 %, and in rat 1-6 %. Apoptosis used for eliminating of cells which arefunctioning not properly. Early diagnosis of tumors and follow up prognosis are of greatimpotance for extention of live of cancer patients. Especially, fibrosarcoms in cats occur invaccation areas due to the chronic inflamatio. Recent studies on tumors showed that there is aconnetion between cancers and apoptosis. In this study apoptosis in fibrosarcomas induced by3- methylcholantrene with two different methods. Thus relationship between apoptosis andfibrosarcomas is investigated. On the other hand programmed cell death investigated usingimmunhystochemical and ELISA methods and differences in results are compared.Sixteen male Spraque Dawley rats used in this study. They were 8 weeks old and thebody weights of the rats were between 150-200 grams. Rats were allocated into two groupseach containing 8 rats. During the experiment which took between 150-210 days dependingon the appearance of tumor tissue. They were allowed free access to water and feed. In orderto induce fibrosarcoma in rats, at the beginning of the experiment animals were injectedsubcutaneusly on the neck with 0,2 mg 3-methylcholanthrene solved in 0,25 ml sesame oil.To find out weather any tumoral tissue occured animals were palpated daily. At the end of theexperiment animals were killed under the ether anesthesia and necropsy is permormed. DNAfragments of tumor tissue cell were analized using ELISA (Roche), localisation of Bcl-2 andBax was determine by immunohystochemically method.Tissues obtained from the control and the experimental animals homogenizated,centrifugated and the supernatant was used for ELISA procedure. In experimental groupabsorbance of the DNA fragmentation was 0,262 U but in control group it was 0,069 U. Inother words absorbance of DNA fragmentation of experimental animals was 4 times higherthan that of controls.Immunohystochemically there was a lot of Bcl-2 and Bax positive cells. Contrary tothis in control animals there was hardly Bcl-2 and bax positive cells. This data indicates thatin the tumor tissue it is observed some cells programmed to death by apoptosis but the othersnot.In the light of this findings we got in the present study apoptosis is encounteredfrequently in fibrosarcoma and fragmentation of the DNA indicates apoptosis. Researcherswho are engageg in curing of cacer patients should take into concideration of levels of Bcl-2and Bax proteins. Furthermore, smilar to the results of previous studies the rate of apoptosisseems to be very low at the beginning of the cancer however in the course of the timeconcomitantly the increase in proliferation of the tumor cells the rate of apoptosis increaseddramatically.