DNA metilasyonunun fare embriyolarının iç hücre kitlesinde pluripotensi üzerindeki etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of dna methylation on pluripotency in the inner cell mass of mice embryos
Yazar: MEHMET DOĞAN
Danışman: PROF. DR. GÖKHAN AKKOYUNLU
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: DNA = DNA ; DNA metilasyon = DNA methylation ; Embriyo = Embryo ; Fareler = Mice ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation

Özet:
Amaç: Kök hücreler başka hücrelere farklanma ve gelişim potansiyeli en yüksek olan hücrelerdir. Embriyonik kök hücrelerin en önemli kaynakları implantasyon öncesi blastosistlerin iç hücre kitleleridir. Bu hücreler kendilerine özgü olan ve diğer hücrelerde olmayan transkripsiyon faktörleri sentezlerler. Bu faktörler, hücrelerin başka hücrelere farklanma ya da kendi kendilerini yenileme özelliklerinin başlıca yönlendiricileridir. Çalışmamızda epigenetik hücre düzenleyicilerinden biri olan DNA metilasyonuna, inhibitör ile müdahale edilerek embriyonik kök hücre belirteci Nanog'un ekspresyonuna etkisini ve böylece hücrelerin pluripotensilerine direkt etkilerini görmek amaçlanmıştır.
Yöntem: Çalışmamızda Balb/c ırkı olgun dişi hamile farelerden embriyonik 3.5. günde uterus diseksiyonu ve boynuz yıkaması ile elde edilen embriyolara 50 mikrolitrelik damlacıklar içerisinde işlemler uygulanmıştır. Total blastosist gruplarına ve immünocerrahi işlemiyle elde edilen iç hücre kitlelerine metilasyon inhibitörü uygulanarak 5-Metilsitozin antikoruyla metilasyon seviyeleri ve Nanog antikoruyla pluripotensi seviyelerindeki değişimler değerlendirilmiştir. Sonuçlar ImageJ ile analiz edilmiştir.
Bulgular: Total blastosist gruplarında 0,1 µM inhibitör uygulanan gruplarda hem 5-Metilsitozin hem de Nanog immünofloresan ekspresyonlarında anlamlı artışlar gözlenmiştir. 1 µM inhibitör uygulanan grupta ise 5-Metilsitozin ekspresyonundaki düşüş kontrol gruplarına göre anlamlı bulunmazken Nanog ekspresyonunda anlamlı azalma olmuştur. İmmünocerrahi gruplarında 0,1 µM inhibitör uygulanan gruplarda hem 5-Metilsitozin hem de Nanog ekspresyonları kontrol gruplarına göre azalmıştır.
Sonuç: Bu çalışmada total blastosistte ve immünocerrahi ile elde edilen iç hücre kitlelerinde metilasyonun pluripotensiye etkisi incelenmiştir. 5-metilsitozin ve Nanog ekspresyon seviyelerindeki değişimler bu iki hücre grubunun inhibitöre olan cevaplarının farklı olduğunu göstermektedir. Nanog ekspresyonunun da hücre içi lokalizasyonunda değişiklikler olduğu görülmüştür. Çalışmamız pluripotent kök hücre kültürleriyle ilgili yapılacak olan çalışmalara katkı sağlayabilir.

Abstract:
Objective: Stem cells are the cells with the highest potential to differentiate and develop into other cells. The most important sources of embryonic stem cells are pre-implantation blastocyst inner cell masses. These cells synthesize some transcription factors unique to them and not found in other cells. These factors are the main controllers of the cell's ability to differentiate into other cells or to renew themselves. In our study, we aimed to see the effect of DNA methylation, one of the epigenetic cell regulators, on the expression of Nanog, which is one of the embryonic stem cell markers, and thus its direct effects on the pluripotency of cells.
Method: In our study, embryos were obtained from Balb/c female mice by uterine dissection and horn washing at embryonic 3.5 days and treated in 50 microliter droplets. Methylation and pluripotency levels determined respectively with 5-Methylcytosine and Nanog immunofluorescence by applying methylation inhibitor to total blastocyst groups and inner cell masses obtained by immunosurgery. Results were analyzed by ImageJ.
Results: Immunofluorescence images were evaluated and significant increases were observed in both 5-Methylcytosine and Nanog expressions in the 0,1 µM inhibitor treated groups in the total blastocyst groups. In the group treated with 1 µM inhibitor, the decrease in 5-Methylcytosine expression was not found to be significant compared to the control groups, while there was a significant decrease in Nanog expression. In the immunosurgery groups, both 5-Methylcytosine and Nanog expressions were decreased in the 0,1 µM inhibitor group compared to the control groups.
Conclusion: In this study, the effect of methylation on pluripotency was investigated in total blastocyst and inner cell masses obtained by immunosurgery. Changes in 5-methylcytosine and Nanog expression levels show that these cell groups have different responses to the inhibitor. It has been observed that there are changes in the intracellular localization of nanog expression. Our study may contribute to studies on pluripotent stem cell cultures.