Türkiye Batı bölgelerinde hantavirus araştırılması: Trakya bölgesi kemiricilerinde hantavirus varlığının polimeraz zincir tepkimesi ile araştırılması
Investigation of hantavirus in western regions of Turkey: Investigation of the presence of hanta virus in rodents in Thrace region by using polymerase chain reaction
Yazar: ALİHAN BULĞURCU
Danışman: DOÇ. DR. İBRAHİM MEHMET ALİ ÖKTEM
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Hantavirüs = Hantavirus ; Kemiriciler = Rodentia ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Türkiye = Türkiye

Özet:
Hantaviruslar, üç segmentli genomları negatif iplikli olan RNA viruslarıdır. İnsanlarda iki önemli sendroma sebep olurlar. Birincisi Asya ve Avrupa? da görülen renal sendromlu kanamalı ateş (HFRS), diğeri ise Amerika? da hantavirus pulmoner sendromudur (HPS). Hantaviruslar, kemirici türleri tarafından taşınırlar ve her bir kemirici türü bir hantavirus türüne spesifiktir. Hantavirus tanısı için serolojik ve moleküler yöntemler kullanılır. Serolojik yöntemlerde en çok; IFAT, ELISA, Fokus Redüksiyon Nötralizasyon Testi ve Strip İmmunoblot yöntemi kullanılırken epidemiyolojik çalışmalarda ise IFAT ve ELISA özellikle yüksek aviditedeki IgG antikorlarını tespit etmeye yönelik kullanılır. Moleküler yöntemler ise hantavirus enfeksiyonlarının 12 ile 24 saat içinde ölüme gidebilen tablosundan ötürü hızlı tanıda önem kazanmaktadır. İnsan ve rodent doku örneklerindeki viral RNA? nın düşük seviyelerde bulunmasından ötürü, yüksek homolojiye sahip bölgeler için seçilmiş primerler kullanılarak gerçekleştirilen yuvalanmış ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesine (nested-RT-PCR) gerek duyulmaktadır. Bu çalışmada, Trakya Bölgesi? nden toplanan kemiriciler optimize ettiğimiz yuvalanmış-RT-PCR yöntemi kullanılarak Dobrava, Saarema ve Puumala virüs varlığı açısından taranmıştır.
Optimizasyon çalışması öncesi her üç türe özgü öncüller tasarlanmış ve sentezlettirilmiştir. Rodent dokuları ekstraksiyon kiti üreticisinin talimatlarına göre RNA ekstraksiyon işlemine tabi tutulmuş ve RNA? lardan cDNA sentezlettirilerek, sentezlenen cDNA?lar PZT ile taranmasına kadar -80 0C? de saklanmışlardır. PZT tepkimesinin yuvalı olmasına literatürler ışığında karar verilmiş ve Dobrava virüs için sırasıyla MgCl2 konsantrasyonu, cDNA konsantrasyonu, DMSO konsantrasyonu, öncül konsantrasyonu, ürün konsantrasyonu ve Tm optimizasyonu yapılmış ve bu koşullar Saaremaa ve Puumala için de denenerek üç virüs için de yöntem optimizasyonu oturtulmuştur. Daha sonra ise dokulardan ekstrakte edilen RNA? lardan elde edilen cDNA?lar üç virusun varlığı açısından ayrı ayrı taranmıştır. Tarama sonucunda üç serotip için de pozitif sonuç bulunamamıştır. Bu çalışmada optimize edilen PZT yöntemi, tanısal ve immünolojik ileriki çalışmalarda da kullanılabilir.

Anahtar Kelimeler: Hantavirus, nested RT-PCR, optimizasyon

Abstract:
Hantavirus is the RNA virus which has three-segmented and negative-strand genomes. It causes two major syndrome in humans. The first is hemorrhagic fever with renalyndrome (HFRS) in Asia and Europe, the other is hantaviruspulmoner syndrome (HPS) in USA. Hantavirus is carried by rodent species and each rodent species is unique to only one Hantavirus species. Serological and molecular methods are used for the diagnosis of hantavirus. Immun Fluorescence Antibody Test (IFAT), Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), Focus Reduction Neutralization Test and Stripİmmunoblot method are generally used as serological methods, also IFAT and ELISA are used to detect high avidity IgG antibodies in epidemiological studies. Molecular methods are highly important for rapid diagnosis because hantavirus infections can cause death within 12 to 24 hours. Since viral RNA presences in low-levels in tissue samples of human and rodents, the nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested-RT-PCR) which is performed by specific primers to regions with high homology is necessary. In this study, the rodents collected from Thrace Region have been screened for the presence of Dobrava, Saarema and Puumala viruses by using optimized nested-RT-PCR.
Specific primers for each three species were designed and synthesized prior to the optimization study. RNA extraction from rodent tissues have been performed according to extraction kit manufacturer's instructions. It has been decided in the light of the literature that PCR method is performed as nested PCR and concentration of MgCl2, cDNA, DMSO, primers, product and Tm were optimized respectively for Dobrova virus. These conditions also have been tested for each Saaremaa and Puumala viruses to the end that method optimization was finalized for three viruses, too. Then, cDNAs obtained from the RNA extracted from tissues have been screened for the presence of these three viruses. The positive results were not found for three serotypes in result of molecular screening. PCR method which is optimized in this study may also be used for further diagnostic and immunological studies.

Keywords: Hantavirus, nested-RT-PCR, optimization