Isıl işlem görmüş bazı gıdalarda Escherichia coli O157:H7 ve Salmonella Typhimurium'un kantitatif tespitinde kültürel yöntem,  real-time PCR ve PMA-real time PCR yöntemlerinin karşılaştırılması
Comparison of cultural method, real-time PCR and PMA-real time PCR methods for quantitative determination of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella Typhimurium in heat treated some foods
Yazar: HAKİYE ASLAN
Danışman: DOÇ. DR. ZÜLAL KESMEN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Son yıllarda gıda kaynaklı patojenlerin tespitinde real-time PCR tekniği (qPCR), klasik kültürel yöntemlerin yerini alabilecek potansiyel bir yöntem olarak öne çıkmıştır. Ancak, gıdaların hazırlanması sırasında uygulanan bazı teknolojik işlemler, mevcut mikroorganizmaların ölmesini sağlarken bunların DNA'ları üzerinde etkisiz kalabilmektedir. Dolayısıyla hücre canlılığını kaybettikten sonra bile DNA'nın ortamdaki varlığını devam ettirmesi, yanlış pozitif sonuçlara neden olmaktadır. Yanlış pozitif sonuçları minimize etmek amacıyla yapılan araştırmalar, daha çok ortamdaki ölü hücrelere ait DNA'nın ekstraksiyonundan önce elemine edilmesi üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu amaçla yapılan çalışmalarda propidium monoazidenin (PMA) hasarlı hücrelere selektif olarak girdiği ve DNA'ya fotokimyasal olarak bağlanarak qPCR'da amplifikasyonu engellediği bildirilmiştir. 
Tez çalışması kapsamında, gıdalarda yaygın olarak bulunan patojen bakterilerden Escherichia coli O157:H7ve Salmonella Typhimurium'un qPCR yöntemi ile tespiti için PMA yönteminin bir ön işlem olarak kullanılabilirliği araştırılmıştır. Bu amaçla patojen bakteri konsantrasyonu yaklaşık 1.E+07-1.E+02 arasında olacak şekilde 6 farklı inokülasyon seviyesi ile kontamine edilen fizyolojik tuzlu su (FTS), UHT süt ve kıyma örneklerine farklı sıcaklık (60, 65, 70 ve 75 oC) ve sürelerde (15, 60, 300 ve 900 sn) ısıl işlem uygulanmıştır. Isıl işlem sonrası her bir ortamdaki canlı bakteri sayısı, PMA-qPCR, direkt qPCR ve klasik kültüre alma yöntemleriyle karşılaştırmalı olarak belirlenerek PMA işleminin başarısı test edilmiş ve yöntemler arasındaki uyum Bland&Altman metodu ve konkordans korelasyon katsayısına göre istatistiki olarak değerlendirilmiştir. 
Çalışma sonucunda, E.coli O157:H7 ve S.Typhimurium ile kontamine örneklere uygulanan ısıl işlemin derecesi ve süresi arttıkça, PMA uygulamasının etkinliğinin artığı ve direkt qPCR'da tespit edilen sonuçlarla karşılaştırıldığında PMA-qPCR yöntemi ile elde edilen sonuçların klasik kültüre alma yöntemiyle daha yüksek bir uyum gösterdiği tespit edilmiştir. 
Aynı şekilde, kültürel sayım-PMA qPCR yöntemleri arasındaki konkordans korelasyon katsayısının da ısıl işlemin derecesi arttıkça artış gösterdiği, 60 °C'de ısıl işlem uygulanmış örneklerde 0.64-0.86 arasında değişirken, bu katsayının 75 °C'de ısıl işlem uygulanmış örneklerde 0.88-0.97 arasında değiştiği belirlenmiştir. Ayrıca, kültürel sayım-PMA qPCR yönteminin aksine,  uygulanan ısıl işlemin derecesi arttıkça kültürel sayım-direkt qPCR yöntemi arasındaki uyumun azaldığı tespit edilmiştir. 
Ayrıca tez çalışması kapsamında, ortamdaki mikroorganizma sayısı azaldıkça PMA uygulamasının etkinliğinin arttığı belirlenmiştir. E.coli O157:H7  veS.Typhimurium ile 1.E+07 seviyesinde inokule edildikten sonra ısıl işlem uygulanmış FTS, UHT süt ve kıyma örneklerinde, kültürel sayım ve PMA-qPCR yöntemleri arasında Bland&Altman metoduna göre 0.91±1.26-1.93±1.48 arasında değişen bir uyum tespit edilirken, konkordans korelasyon katsayısının da 0.68-0.81 arasında değiştiği saptanmıştır. 1.E+02 inokülasyon seviyesinde ise, iki metot arasındaki uyum Bland&Altman yöntemine göre 0.01±0.13 ile 0.14±0.28 arasında bulunurken, konkordans korelasyon katsayılarının da, 0.86-0.99 arasında değiştiği saptanmıştır. Ayrıca, kültürel sayım ve direkt qPCR yöntemleri ile tespit edilen sonuçlar arasında; E.coli O157:H7 ve S.Typhimurium ile 1.E+07 ve 1.E+02 seviyesinde inokule örneklerde, Bland&Altman yöntemine göre iki metot arasında uyumun olmadığı tespit edilmiştir.
Sonuç olarak,  qPCR oldukça dinamik bir teknik olmakla beraber, canlı ve ölü hücrelerin ayırımında yetersiz kalması bu tekniğin etkinliğini azaltmaktadır. Bu amaçla ısıl işlem uygulanmış gıdalardaki patojen bakterilerin tespitinde PMA'nın bir ön işlem olarak kullanımının, qPCR tekniğinin canlı/ölü hücre ayrımındaki eksikliğinin giderilmesine belirli koşullarda katkı sağladığı sonucuna varılmıştır. Ancak, PMA-qPCR yönteminin gıdalardaki patojen bakterilere ait canlı hücrelerin tespitinde, klasik kültürel yöntemlere alternatif bir yöntem olarak kullanımının henüz uygun olmadığı ve PMA-qPCR yönteminin geliştirilmesine yönelik daha fazla çalışmanın yapılması gerektiği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
In recent years, the detection of foodborne pathogens by real-time PCR technique has emerged as a potential method replacing the conventional method. However, in some  technological processes applied in the preparation of foods, it can have no effect on their DNA, while the death of the microorganisms present. Therefore, the presence of DNA in the media even after losing cell viability, lead to false-positive results. In order to minimize false positive results, researchers are focused on the elimination of DNA of dead cells before the DNA extraction. The most important criteria is to distinguish between live cells and irreversibly damaged cells is membrane integrity. Studies regarding this subject has been reported to, propidium monoazide (PMA) enters selectively damaged cells and binds to the DNA photochemically and decrease the PCR signal from the DNA of the dead cells.
In this thesis, investigated the utilizing as a pretreatment of PMA method  for the detection of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella Typhimurium, which are pathogenic bacteria commonly found in foods, by qPCR method. For this purpose, the concentration of pathogenic bacteria to be between 1.E+07 and 1.E+02 were used for the contamination of  physiological saline (PS), UHT milk and ground beef samples with six different inoculation levels  and heat treated at different temperatures (60, 65,70 and 75 °C) and times (15, 60, 300 and 900s). After heat treatment, the success of PMA process have been tested by determining the number of viable bacteria in each medium by the PMA-qPCR, direct qPCR and conventional culture methods and adjustment between the methods was evaluated statistically by the Bland&Altman method and the concordance correlation coefficient.
As a result, the degree of applied  heat treatment and time increases to the samples contaminated with E.coli O157:H7 and S.Typhimurium, the effectiveness of PMA application increased and comparison with the results detected in direct qPCR, the results obtained PMA-qPCR method have been found to display a higher compliance with conventional culture methods. Similarly, concordance correlation coefficient between cultural count- PMA qPCR methods indicated that increase with increasing the degree of heat treatment, this coefficient varied between 0.64-0.86 range in heat treated samples at 60 °C it  was determined to vary between 0.88-0.97 range in heat treated samples at 75 °C. In addition, unlike the cultural count- PMA qPCR method, the degree of applied heat treatments increases the alignment between cultural count- direct qPCR method was determined reduced. 
Also within the scope of the thesis, it was determined that the effectiveness of PMA application increases when the number of microorganisms in the sample decreases. In heat treated PS, UHT milk and ground meat samples that were inoculated with E.coli O157:H7 and S.Typhimurium at the level 1.E+07, the adjustment between the cultural count-PMA qPCR method was determined according to the Bland&Altman method  as ranging from 0.91±1.26 to 1.93±1.48 and the variation of the concordance correlation coefficient between methods was found in the range of 0.68-0.81. At the 1.E+02 inoculation  level, the adjustment among two methods was detected according to the Bland&Altman method  between 0.01±0.13 to 0.14±0.28, the concordance correlation coefficient between methods was determined as ranging from 0.89 to 0.99. Moreover, among the results that were detected by cultural counting and direct qPCR methods; in the samples inoculated with E.coli O157:H7 and S.Typhimurium at the level 1.E+07 and 1.E+02 according to the Bland&Altman method  no adjustment between two methods. Concordance correlation coefficient between them was determined as ranging between from 0.02-0.21.
Consequently, although qPCR technique is quite dynamic, it is inadequate differentiation of live and dead cells, reducing the effectiveness of this technique. In order to compensate this deficiency, for the more efficient and wide spread use of qPCR technique in the detection of pathogenic bacteria,  PMA can be utilized as a pretreatment in conjunction with qPCR technique was concluded. In addition, the PMA-qPCR method was not yet suitable to be used as an alternative to the conventional cultural methods for the detection of live pathogenic bacteria cells in food samples and it should be concluded that more studies should be done for the development of PMA-qPCR method.