Pamuk yaprak kurdu Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae)'te insektisitlere karşı oluşan direncin biyokimyasal ve moleküler karakterizasyonu
Biochemical and molecular characterization of insecticide resistance in the cotton leafworm Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae)
Yazar: NECVA HADİM
Danışman: PROF. DR. M. OKTAY GÜRKAN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Pyrethroid insektisidler = Pyrethroid insecticides ; Sodyum kanalları = Sodium channels ; Spodoptera littoralis = Spodoptera littoralis

Özet:
Bu çalışma, Adana, Mersin, Mısır ve İsrail'den toplanan ve laboratuvarda yetiştirilmekte olan pamuk yaprak kurdu S. littoralis (Boisd.) popülasyonlarının organik fosforlu (chlorpyrifos), karbamatlı (carbamate) ve sentetik piretroitli (deltamethrin) insektisitlere karşı ilaç tepkilerini belirlemek ve gelişen direnç mekanizmalarının biyokimyasal ve moleküler yöntemlerle belirlenmesi amacı ile yapılmıştır.Adana, Mersin, Mısır ve İsrail Spodoptera littoralis popülasyonlarının carbamate, chlorpyrifos ve deltamethrin etken maddeli insektisitlere karşı tepkileri belirlenmiş ve carbamate etken maddesinin en yüksek dozuna dahi duyarsız oldukları görülmüştür. Chlorpyrifos hassasiyeti en düşük ve en yüksek olan popülasyonların sırasıyla Adana ve İsrail popülasyonları oldukları; deltamethrin hassasiyeti en düşük ve en yüksek popülasyonların ise sırasıyla Mısır ve Mersin popülasyonları oldukları belirlenmiştir. Spodoptera littoralis'in sentetik piretroitli insektisitlere karşı geliştirdiği direnç mekanizmalarının yeterince aydınlatılmamış olması ve özellikle bu mekanizmaların moleküler karakterizasyonu ilgili çalışmaların olmaması, çalışmanın bu yöne kaymasına neden olmuştur. Deltamethrine dirençli ırk elde etmek amacıyla İsrail popülasyonunun bir kısmına 6 jenerasyon boyunca her dölde bir defa olmak üzere, bir önceki jenerasyonun yaklaşık % 90'nını öldüren dozlarla seleksiyon baskısı uygulanmış ve F6'da LC50 değerlerine göre 17,10 kat direnç oranı elde edilmiştir. Biyokimyasal analizler sonucunda artan direnç oranıyla doğru orantılı olarak carboxylesterase (karboksilesteraz), cytochrome P450 monooxygenase (sitokrom P450 monooksigenaz) ve glutathione-S.transferase (glutatyon S-transferaz) enzim aktivitelerinin de arttığı tespit edilmiştir. Native-PAGE jel elektroforezi sonucunda da dirençli bireylerde daha kalın ve koyu boyanmış esteraz bantları gözlemlenmiştir. Sinerjistlerle yapılan çalışmalar sonucunda da Piperonyl butoxide (PBO) ile 8,5 kat, Diethyl Maleate (DEM) ile 6,3 kat sinerjizim oranı tespit edilmiştir. Direncin kalıtımını belirlemek amacıyla dirençli ve hassas ırklar arasında resiprokal çaprazlamalar yapılmış ve F1 ve F2 dölleri elde edilerek ilaç tepkileri belirlenmiş ve deltamethrin direncinin otozomal eşbaskın özellikte olduğu tespit edilmiştir.Moleküler çalışmalarda hassas ve deltamethrin ile selekte edilmiş dirençli (F6) S. littoralis bireylerine ait sodyum kanalı IIS4-IIS6 bölümünün cDNA'ları klonlanlanarak, sekansları elde edilmiş ve karşılaştırılmıştır. Dirençli bireylerde 927 amino asit pozisyonunda asparagin yerine serine substitüsyonunu sağlayan nokta mutasyon dışında, dirençle ilişkilendirilebilecek bir nükleotit ve / veya amino asit varyasyonu tespit edilememiştir. S. littoralis'te gözlemlenen deltamethrin direncinin metabolik detoksifikasyon mekanizması sonucu olduğu ve bu mekanizmada monooksigenazlar, esterazlar ve glutatyon S-transferazların etkili olduğu düşünülmektedir.Farklı etki mekanizmasına sahip ilaçların kullanılması ve böylece piretroit seleksiyon baskısına belli dönemlerde ara verilmesi, tarla koşullarında gen akışına izin verilerek direnç alellerinin seyreltilmesi, temel önemli ürünler dışındaki ürünlerde piretroit kullanımından kaçınılması S. littoralis'e karşı etkili direnç yönetim stratejileri için sıralanabilecek öneriler arasındadır.Bu çalışma ile S. littoralis sodyum kanalının bir bölümüne ait sekans ilk defa elde edilmiştir.

Abstract:
This study was performed in the aim of identifying the biochemical and molecular mechanisms of resistance to organophosphates (chlorpyrifos), carbamates (carbamate) and synthetic pyrethroids (deltamethrin) observed in S. littoralis populations collected from Adana, Mersin, Egypt and Israel and have been maintained in the laboratory.The response of Adana, Mersin, Egypt and Israel populations to chlorpyrifos, carbamate and deltamethrin was identified. The populations were all insensitive to even the highest dose of carbamate. The most susceptible and the most resistant populations to chlorpyrifos are Adana and İsrail, respectively. The most susceptible and the most resistant populations to deltamethrin are Mersin and Egypt populations, respectively. Since the resistance mechanisms developed by S. littoralis to pyrethroids have not been identified clearly yet and especially since there are not any studies concerning molecular characterization of those mechanisms, this study have continued in this direction. Part of the Israel population was subjected once a generation to deltamethrin dose that kills about 90 % of the former generation in order to increase deltamethrin resistance. This has done for 6 generations, and the resistance ratio was 17,10 at generation F6. The activities of esterase, cytochrome P450 monooxygenase and glutathione S-transferase were found to increase as the resistance increases. The esterase bands on native-PAGE were observed as darker and thicker for resistant individuals. The synergistic ratios were found to be 8,5 by PBO and 6,3 by DEM when the populations were exposed to deltamethrin. Reciprocal crosses have been carried out and the inheritance of deltamethrin resistance was found to be controlled by an autosomal and codominant trait.The cDNAs of IIS4-IIS6 region of voltage-gated sodium channel gene of both deltamethrin susceptible and resistant (F6) populations were cloned, sequenced and aligned with each other as well as other related species. Any mutation related to resistance could be detected, except for a point mutation that gives rise to substitution of serine instead of asparagine at position 927. The deltamethrin resistance observed in S. littoralis, is thought to be the result of metabolic detoxification where the induced activities of monooxygenases, esterases and GSTs observed.The use of insecticides with different modes of action and thus relaxation pyrethroid selection pressure for some periods, allowing gene flow to dilute the resistance allels in field conditions, avoidance of pyrethroid use on crops other than major cash crops are some of the recommendations for efficient resistance management strategies for S. littoralis.On the other hand, the sequence of a region of sodium channel of Spodoptera littoralis has been identified for the first time in this study.