Meme kanser hücrelerinde c-MET'in PD-L1 inhibitörü atezolizumab etkinliğindeki rolünün araştırılması
Investigation of the role of c-MET in the activity of PD-L1 inhibitor atezolizumab in breast cancer cells
Yazar: NESLİHAN HAKLIGÜR
Danışman: PROF. DR. MEVLÜDE İNANÇ
Erciyes Üniversitesi / Gevher Nesibe Genom ve Kök Hücre Enstitüsü  / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
MEME KANSER HÜCRELERİNDE C-MET'İN PD-L1 İNHİBİTÖRÜ ATEZOLİZUMAB ETKİNLİĞİNDEKİ ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI
Neslihan HAKLIGÜR
Erciyes Üniversitesi, Gevher Nesibe Genom ve Kök Hücre Enstitüsü
Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı
Doktora Tezi, Eylül 2023
Danısman: Prof. Dr. Mevlüde İNANÇ
ÖZET
Meme kanseri, dünya genelinde kadınlarda en sık teşhis edilen kanserdir ve kanser ilişkili ölüm nedenleri arasında ilk sıralarda yer almaktadır. Bu nedenle meme kanserinin tedavine yönelik daha etkin tedavi şeçeneklerinin ve yaklaşımlarının geliştirilmesi oldukça önemlidir.  PD-1/PD-L1 immün kontrol noktası inhibitörleri meme kanseri tedavisinde umut verici görünmektedir. PD-L1 inhibitörü Atezolizumab ile tedavi umut verici olmakla birlikte monoterapi olarak uygulandığında yanıt oranları sınırlıdır. Ayrıca hastaların çoğu tedaviye direnç göstermektedir. Bir reseptör tirozin kinaz olan c-MET'in çeşitli kanser hücrelerinde immün terapide dahil olmak üzere ilaç direnci ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Ayrıca c-MET ile immünoterapi arasındaki ilişkiyi gösteren çalışmalarda c-MET inhibitörlerinin immünoterapilerin etkinliğini artırdığı rapor edilmiştir. Bu yüzden çalışmamızda meme kanseri hücrelerinde c-MET'in Atezolizumab direncinde bir rolünün olup olmadığının açıklığa kavuşturulması ve Atezolizumab ile c-MET inhibitörü Crizotinib kombine tedavisinin kanser hücreleri üzerindeki olası etkinliğinin araştırılmasını amaçladık.
Bu amaçla sağlıklı donörden elde edilen PMBC hücreleri ile MCF-7 ve BT-20 meme kanser hücrelerini birlikte ko-kültüre ettik ve Atezolizumab ile muamele ettik. Daha sonra hücre canlılığı, koloni oluşumu ve apopitoz oranını ile PD-1, PD-L1, PD-L2 ve c-MET proteinlerinin ekspresyon seviyelerini belirledik. Ayrıca PD-L1 inhibitörü Atezolizumab ile c-MET inhibitörü Crizotinib kombine tedavisinin kanser hücreleri üzerindeki olası etkinliği araştırmak için sağlıklı donörden elde edilen PMBC hücreleri ile MCF-7 ve BT-20 kanser hücrelerini birlikte kültüre ettik ve daha sonra Atezolizumab ve Crizotinibi birlikte kombine olarak uyguladık daha sonra hücre canlılığı, koloni oluşumu ve apopitoz oranları ile PD-L1, PD-L2 ve c-MET proteinlerinin ekspresyon seviyelerini belirledik.
Analiz sonuçlarına göre PD-L1 inhibitörü Atezolizumabın PMBC hücreleri ile ko-kültüre edilen hormon pozitif MCF-7 ve üçlü negatif BT-20 meme kanser hücrelerinde hücre canlılığı, koloni oluşumu ve apopitoz oranı üzerinde bir etkisi bulunamadı. c-MET inhibitörü Crizotinib MCF-7 ve BT-20 hücrelerinde doz bağımlı olarak hücre canlılığı ve koloni oluşumunu azalttı, apopitoz oranını artırdı. Crizotinib BT-20 hücrelerinde PD-L1, PD-L2 ve c-MET ekspresyonlarını baskıladı. MCF-7 hücrelerinde c-MET ekspresyonu bulunamadı. Ancak c-MET inhibitörü Crizotinib MCF-7 hücrelerinde PD-L1, PD-L2 ekspresyonlarını baskıladı. PMBC hücre varlığında Atezolizumab+Crizotinib kombinasyonunun kanser hücreleri üzerindeki hücre canlılığı, koloni oluşumu ve apopitoz oranı açısından etkisi tek başına Crizotinibin etkisi ile benzerdi. Dolayısıyla kombine uygulama Crizotinibin etkisini artırmadı.
Bu bulgular hormon pozitif MCF-7 ve üçlü negatif BT-20 meme kanseri hücrelerinde PD-L1 inhibitörü Atezolizumabın bir etkiye sahip olmadığını ve c-MET inhibitörü Crizotinibin meme kanser hücrelerinde sitotoksik etkiye sahip olduğunu gösterdi. Sonuç olarak Crizotinibin sitotoksik etkisinin hangi hücre içi mekanizmalar yoluyla olduğunun açığa çıkarılması ve meme kanseri tedavisinde monoterapi veya diğer terapi yöntemleri ile kombine olarak uygulanabilmesi konusunda daha ileri araştırmaların yapılmasının faydalı olacağını öngörmekteyiz.
Anahtar Kelimeler: Meme Kanseri, Atezolizumab, PD-L1, c-MET, Crizotinib

Abstract:
INVESTIGATION OF THE ROLE OF C-MET IN THE ACTIVITY OF PD-L1 INHIBITOR ATEZOLIZUMAB IN BREAST CANCER CELLS
Neslihan HAKLIGÜR
Erciyes University, Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute 
Department of Molecular Biology and Genetics
PhD Thesis, September 2023
Supervisor: Prof. Dr. Mevlüde İNANÇ
ABSTRACT
Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer among women worldwide and is one of the leading causes of cancer-related death. Therefore, it is very important to develop more effective treatment options and approaches for the treatment of breast cancer. PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitors appear promising in the treatment of breast cancer. Although treatment with the PD-L1 inhibitor Atezolizumab is promising, response rates are limited when administered as monotherapy. In addition, most of the patients are resistant to treatment. c-MET, a receptor tyrosine kinase, has been reported to be associated with drug resistance, including in immune therapy, in various cancer cells. In addition, studies showing the relationship between c-MET and immunotherapy have reported that c-MET inhibitors increase the effectiveness of immunotherapies. Therefore, in our study, we aimed to clarify whether c-MET has a role in Atezolizumab resistance in breast cancer cells and to investigate the possible efficacy of combination therapy of Atezolizumab and c-MET inhibitor Crizotinib on cancer cells.
For this purpose, we co-cultured PMBC cells obtained from healthy donors with MCF-7 and BT-20 breast cancer cells and treated them with Atezolizumab. Subsequently, we determined cell viability, colony formation and apoptosis rates, as well as the expression levels of PD-L1, PD-L2 and c-MET proteins. Additionally, we co-cultured PMBC cells with MCF-7 and BT-20 cancer cells obtained from healthy donors and applied combined treatment with the PD-L1 inhibitor Atezolizumab and c-MET inhibitor Crizotinib to investigate their potential effectiveness on cancer cells. We then assessed cell viability, colony formation, apoptosis rates, and the expression levels of PD-L1, PD-L2, and c-MET proteins.
According to the analysis results, it was found that the PD-L1 inhibitor Atezolizumab had no effect on cell viability, colony formation and apoptosis rate in hormone positive MCF-7 and triple negative BT-20 breast cancer cells co-cultured with PMBC cells. The c-MET inhibitor Crizotinib dose-dependently reduced cell viability and colony formation while increasing apoptosis rates in MCF-7 and BT-20 cells. Crizotinib suppressed the expression of PD-1, PD-L1, PD-L2, and c-MET in BT-20 cells. c-MET expression was not found in MCF-7 cells, but Crizotinib suppressed the expression of PD-1, PD-L1, and PD-L2 in these cells. In the presence of PMBC cells, the effect of Atezolizumab + Crizotinib combination on cancer cells in terms of cell viability, colony formation and apoptosis rate was similar to the effect of Crizotinib alone. Consequently, the combined administration did not increase the effect of Crizotinib.
These findings showed that the PD-L1 inhibitor Atezolizumab had no effect on hormone positive MCF-7 and triple negative BT-20 breast cancer cells, and the c-MET inhibitor Crizotinib had a cytotoxic effect on breast cancer cells. In conclusion, we anticipate that further research will be beneficial to reveal the intracellular mechanisms through which the cytotoxic effect of crizotinib is, and whether it can be applied as monotherapy or in combination with other therapy methods in the treatment of breast cancer. 
Key Words: Breast Cancer, Atezolizumab, PD-L1, c-MET, Crizotinib