İnsan kanser hücrelerinde in vitro uygulamalarda kullanılabilecek bor nötron yakalama terapisi için nanobiyoparçacıkların sentezlenmesi ve geliştirilmesi
The synthesis and development of nanobioparticles in vitro applications with human cancer cell for boron neutron capture therapy
Yazar: ÖZGE KOZGUŞ GÜLDÜ
Danışman: PROF. DR. PERİHAN ÜNAK ; PROF. DR. SUNA TİMUR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nükleer Bilimler Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Radyoloji ve Nükleer Tıp = Radiology and Nuclear Medicine

Özet:
Tez çalışması ile glioblostoma hücrelerine yüksek sensitivite ve spesifitede bağlanma gösteren Bor Nitrür Nanotüp (BNNT) esaslı nanobiyokonjugat oluşturarak glioblostoma hücrelerini gösterecek ve bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılabilecek bir teranostik ajan geliştirilmesi amaçlanmıştır. Sentezlenen ajanın glioblostoma hücrelerine olan afinitesi in vitro olarak incelenmiştir. Bulunan sonuçlar insanda kullanılan BNCT ajanı olan 4-borono-L-fenilalanin (L-BPA) ile karşılaştırılmıştır.
BNNT'ler lityum katalizörlüğünde NH3 atmosferinde kimyasal buharlaştırma depozisyon (Chemical Vapor Deposition, CVD) yöntemiyle sentezlenmiştir. Sentezlenen BNNT'ler PAMAM ile modifiye edilerek çözünürlüğü arttırılmıştır. L-Phe ile EDC-NHS kimyası ile konjuge edilmiştir. Konjugasyon verimi HPLC ile belirlenmiştir. Elde edilen BNNT/PAMAM/L-Phe optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları XRD, SEM, EDX, TEM, FTIR ile gerçekleştirilmiştir. Nanokonjugatlar 125/131I ile iodojen yöntemine göre radyoiyotlanmıştır. Radyoiyodinasyon kalite kontrolü TLRC ve HPLRC yapılmıştır. Ayrıca radyoiyotlu örneklerin lipofilite tayini ve kağıt elektroforezi gerçekleştirilmiştir. Radyoiyotlu örneklerin oda sıcaklığında stabilite testleri yapılmış ve 24 saate kadar stabilitelerini korudukları görülmüştür.
Nanokonjugatların sitotoksik etkilerini incelemek amacıyla farklı konsantrasyonlarda ve zaman aralıklarında sitotoksisiteleri incelenmiştir. Yapıya giren iyodun hücreler üzerindeki sitotoksisiteye etkisi olup olmadığı incelenmiştir. U87-MG ve C8-D1A hücreleri için 125/131I ile işaretlenen BNNT/PAMAM[G-2]/L-Phe, BNNT/PAMAM[G-2], L-BPA ve L-Phe, örneklerinin hücre tutulumları zamana bağlı olarak incelenmiştir. Nanokonjugatlar fluoresan bir boya olan FITC ile işaretlendikten sonra hücrelerde görüntüleme çalışması gerçekleştirilmiştir. Görüntüleme çalışmasında hücrelerin çekirdekleri DAPİ ile maviye boyanmıştır ve fluoresan işaretli örnekler yeşil görüntü oluşturmuştur. Görüntüler değerlendirildiğinde fluoresan işaretli nanokonjugatın hücre sitoplazmasında bulunduğu tespit edilmiştir. 
U87-MG ve C8-D1A hücrelerinde nanokonjugatların apoptotik etkisi incelenmiş ve herhangi bir apoptotik etkinin olmadığı tespit edilmiştir.
Elde edilen sonuçlar BNNT'lerin biyouyumlu olduğunu göstermektedir. PAMAM'ın BNNT'lerin çözünürlüğünü ve biyoafinitesini arttırıcı etkisi olmuştur. PAMAM ile modifikasyon yapmak sinerjistik etki kazandırmıştır. PAMAM'ın hücre üzerindeki toksik etkisini azaltırken BNNT'lerin çözünürlüğünü ve hücre afinitesini arttırmıştır. Ayrıca L-Phe ile konjugasyon hücre afinitesinde olumlu bir etki sağlamış, U87-MG hücrelerine daha seçici hale getirmiştir. Radyoiyodinasyon da iyi bir taşıyıcı motif sağlamıştır.

Abstract:
In this thesis project, it is aimed to develop a boron neutron capture therapy (BNCT) agent, boron nitride nanotube basis nanobioconjugate which has high sensitivity and specificity to glioblastome multiforme cells for monitoring them. The affinity of the synthesized agent to glioblastoma cells was examined in vitro. The obtained results were compared with the 4-borono-L-phenylalanine, which is used as BNCT agent in human.
BNNTs were synthesized via chemical vapor deposition (CVD) method with the catalysis of lithium in NH3 atmosphere. The synthesized BNNTs were modified with PAMAM for increasing the solubility. L-Phe was conjugated by EDC-NHS chemistry. The conjugation yield was determined with HPLC. The optimization and characterization of obtained BNNT/PAMAM/L-Phe were carried out with XRD, SEM, EDX, TEM and FTIR. The nanoconjugates were radioiodinated with 125/131I via iodogen method. The quality control of radioiodination was carried out with TLRC and HPLRC. Furthermore the lipophilicity and paper electrophoresis of radioiodinated samples were performed. The stability tests of radioiodinated samples were carried out at room temperature and the results showed that they were stable in 24 hours. In order to evaluate the cytotoxic effects of the nanoconjugates different concentrations and time were investigated. Whether the cytotoxicity of iodine, which participated in the structure, or not. The incorporation of radioiodinated BNNT/PAMAM[G-2]/L-Phe, BNNT/PAMAM[G-2], L-BPA and L-Phe with 125/131I were examined by the time dependent on U87-MG and C8-D1A cells.
The fluorescent cell imaging studies were performed with nanoconjugates after FITC conjugation. In the imaging study the cell nucleus was stained blue with DAPI and fluorescent labeled samples were demonstrated green imagine. While the images were evaluated the fluorescent nanoconjugates were migrated to the cytoplasm. 
The apoptotic effects of nanoconjugates were examined in U87-MG and C8-D1A cells. It was detected that there was no apoptotic effect. 
The obtained results were showed that the BNNT was biocompatible. PAMAM increased the solubility and bioaffinity of BNNTs. The modification of PAMAM was supplied synergistic effect to the BNNTs. While PAMAM was reducing the cytotoxic effects on cells, at the same time increase the solubility and cell affinity of BNNTs. In addition, the conjugation of L-Phe also have a positive effect, it has become more selective in U87-MG cells. Radioiodination has provided good carrier motifs.