Mezenkimal kök hücre ekilmiş üç boyutlu chitosan-heparin doku iskelesinin kıkırdak doku mühendisliğinde kullanımı: İn vitro ve in vivo çalışma
The usage of mesenchymal stem cells seeded chitosan-heparin three-dimensional scaffold in cartilage tissue engineering: in vitro and in vivo study
Yazar: CEMİL IŞIK
Danışman: DOÇ. DR. OSMAN AKDAĞ
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Doku iskeleleri = Tissue scaffolds ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Heparin = Heparin ; Kitosan = Chitosan ; Kök hücreler = Stem cells ; Kıkırdak = Cartilage ; İn vitro = In vitro ; İn vivo = In vivo

Özet:
Plastik cerrahi pratiğinde travmalar, yanıklar, tümörler ve konjenital deformiteler nedeniyle kıkırdak greftlere oldukça sık ihtiyaç duyulmaktadır. Günümüzde kök hücrelerin kullanımı ve doku mühendisliğinin gelişimi, kıkırdak dokunun üretilebilmesinde geniş imkanlar sağlamıştır. Üretilen birçok kıkırdak doku iskelesinde gözlenen yabancı cisim reaksiyonu, fibrozis, antijenite ve inflamasyon bu alandaki en önemli sorunları oluşturmaktadır. 
Bu çalışmada biyouyumlu, emilebilen, düşük immünojeniteye sahip Chitosan-Heparin iskelenin kök hücrelerin kondrojenik diferansiasyonuna etkisi ortaya konmaya çalışılmış ve bu etki invivo şartlarda biyomekanik ve histolojik olarak araştırılmıştır.
İn vitro ortamda; chitosan asetik asitte çözünerek farklı derişimlerde (%4, %5, %6, %7) süspansiyonu oluşturuldu. Anatomik kulak kalıbı ve standart kübik şekilli kalıplarda dondurulduktan sonra TPP ile çapraz bağlama sağlandı. Liyofilizasyon ile  poröz yapı elde edildi. 2500 IU Heparin ile muamele edilerek heparinin iskeleye bağlanması sağlandı. Kıkırdak doku iskelelerine 1x106hücre / µl yoğunlukta kök hücre ekimi yapıldı. İn vitro biyomekanik ve elektron mikroskobik inceleme yapılarak uygun doku iskelesi derişimi tespit edildi. En fazla hücre adezyonu, mitozu sağlayan ve Young katsayısı 3.015 ± 0.53 MPa olan %7'lik Chitosan derişimi in vivo değerlendirmeye uygun bulundu. Elektron mikroskobik incelemede %7 Chitosan iskelesinde por çaplarının 70-200 µm olduğu gözlendi. Aynı zamanda su tutma kapasiteleri de değerlendirildi. %7'lik Chitosan ve %7'lik Chitosan-Heparin doku iskelelerinin PBS tutma kapasitelerinin sırasıyla ortalama %34.13 ve %57.52 olarak belirlendi.
 İn vivo değerlendirme için; C57bl6 Fareler 4 gruba ayrılarak 1. gruba sadece chitosan, 2. gruba chitosan-heparin, 3. gruba kemik iliği kaynaklı kök hücre ekilmiş chitosan, 4. gruba kemik iliği kaynaklı kök hücre ekilmiş chitosan-heparin iskelesi implante edildi. 30. günde kıkırdak doku iskeleler çıkarıldı. Kıkırdak iskelelere histolojik değerlendirmenin yanında, sınırlandırılmamış sıkıştırma testi yapıldı. Histolojik olarak grup 3 ve 4'ün hiyalin kıkırdak yönünde diferansiye olabildiği gözlendi. Kalsifikasyonun grup 3 ve 4'te grup 1 ve 2 ye oranla az olduğu gözlendi. Damarsal yapılar etrafında yoğun olmak üzere grup 3 ve 4'te elastin fibriller belirgin olarak izlendi. Young katsayıları grup 4'te 3.25 MPa, grup 3'te 2.84 MPa olarak ölçüldü. Grup 3 ve 4'ün daha mukavemetli olduğu gözlendi ve bu sonuç istatistiksel olarak anlamlıydı. Ağılığın oransal artışının en fazla grup 4'te olduğu ve bunun istatistiksel olarak anlamlı olduğu tespit edildi.
Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılan doku iskelelerinin biyolojik etkinliklerinin az olması, immünojenite, tepkisel inflamatuar reaksiyonlar ve kontrol edilemeyen hücre biyomateryal etkileşimleri en önemli sorunları oluşturur. Hiyaluronik asit ile chitosan benzer moleküler yapıdayken, heparan sülfat ile de heparin benzer yapısal özellik gösterir. Bu sayede chitosan-heparin iskelelerde inflamasyonun azaldığı bilinmektedir. İn vitro ortamda ~3.015 Mpa Young katsayısı elde edilen %7'lik Chitosan iskelelerin, ~70 µm por çapı ile, biyomoleküllerin difüzyonunu, kök hücrelerin adezyonunu ve migrasyonunu kolaylaştırdığı gösterilmiştir. İn vitro elektron mikroskobik değerlendirmede porlarda yerleşik kök hücrelerin belirlenmesi chitosan-heparin iskelelerin kıkırdak doku mühendisliğinde yaygın kullanımının önünü açabilir.
İn vivo histolojik analizde kök hücre içeren grup 3 ve 4'te hiyalin kıkırdak farklılaşmasının, elastik fibril sentezinin, inflamatuar yanıtın az olmasının ve diğer mezenkimal dokulara farklılaşmanın olmamasının kök hücrelerin etkinliğini göstermektedir. Aynı zamanda grup 4'te ağırlığın %30'a yakın artışı hücresel sentezin histolojik verilerle paralel biçimde en fazla bu grupta olduğunu gösterir. Çalışmamızda grup 4'te (Chitosan-Heparin-Kök hücre) Young katsayısının ortalama 3.25 MPa olarak belirlenmesi fasyal bölgede bu iskelenin kullanımını mümkün kılmaktadır.  
Mezenkimal kaynaklı kök hücre diferansiasyonunda etkin rol oynayan chitosan-heparin iskeleler, biyomekanik yeterliliği olan ve biyolojik aktif kıkırdak doku oluşturarak, geniş rekonstrüksiyon imkânı sağlayacaktır.

Anahtar Sözcükler: Kök hücre, Doku iskelesi, Chitosan, Heparin

Abstract:
The Usage of Mesenchymal Stem Cells Seeded Chitosan-Heparin Three-Dimensional Scaffold in Cartilage Tissue Engineering: In Vitro And In Vivo Study
In plastic surgery practice, cartilage grafts are frequently needed after traumas, burns, tumors and congenital deformities. Today, stem cells and development of tissue engineering have provided extensive options for cartilage tissue fabrication. The most important problems in this field are foreign body reaction, fibrosis, antigenicity and inflammation occurred in many cartilage tissue scaffolds
In this study; the effect of biocompatible, absorbable and low immunogen Chitosan-Heparin scaffold on chondrogenic differentiation of stem cells was investigated and this effect was examined biomechanically and histologically in in vivo conditions.
In in vitro conditions, Chitosan was dissolved in acetic acid and consisted of suspension in different concentrations (4%, 5%, 6%, 7%). After freezing in anatomical ear mold and standard cubic shaped molds, cross-linking was achieved with TPP. Porous structure was obtained by lyophilization. Heparin (2500 IU) was attached to scaffold. Stem cells (1x106 cells/µl) were planted in tissue scaffolds. In vitro biomechanical and electron microscopic examination was performed to determine feasible tissue scaffold concentration. It was thought that the Chitosan provides the cell adhesion, mitosis mostly in 7% concentration. This suspension's Young's modulus was 3.015 ± 0.53 MPa. Under electron microscopy, por diameters was observed as 70-200 µm in 7% Chitosan scaffold. In addition, water binding capacity was evaluated. PBS binding capacities of Chitosan was determined 34.13% and chitosan-heparin tissue scaffolds was 57.52%.
In in vivo evaluation; C57bl6 mice were divided into 4 groups, only chitosan in group 1, chitosan-heparin in group 2, bone marrow-derived stem cells seeded chitosan in group 3 and chitosan-heparin scaffold in which bone marrow-derived stem cells were seeded in group 4. After 30 day, cartilage tissue scaffolds were extracted. In addition to histological evaluation, cartilage scaffolds were also analyzed with unconfined compression test. Histologically, it was observed that groups 3 and 4 could differentiate into to hyaline cartilage. Calcification was less in groups 3 and 4 compared to group 1 and 2. Elastin fibrils were clearly observed in groups 3 and 4, mainly around vascular structures. Young's modulus was measured as 3.25 MPa in group 4 and 2.84 MPa in group 3. Groups 3 and 4 were more durable and this result was statistically significant. The proportional increase of the weight was mostly in group 4 and this was statistically significant.
Low biological activity of tissue scaffolds used in cartilage tissue engineering, immunogenicity, reactive inflammatory reactions and uncontrollable cell biomaterial interactions are the most important problems. While hyaluronic acid and chitosan have a similar molecular structure, heparan sulfate and heparin also show similar structural features. Because of that, it is known as inflammation is reduced in chitosan-heparin scaffolds. In in vitro observation, Young's modulus of 7% Chitosan scaffolds have showed ~3.015 MPa. It has been showed that having Chitosan pore diameter was ~70 µm provides the substance diffusion, adhesion and migration of stem cells more easily.  In electron microscopic investigation, identification of stem cells in pores may lead to widespread use of chitosan-heparin scaffolds for cartilage tissue engineering.
In in vivo, hyaline cartilage differentiation, elastic fibril synthesis, low inflammatory response and no differentiation to other mesenchymal tissues indicate effectiveness of stem cells in groups 3 and 4. At the same time, approximately 30% increase in weight in group 4 indicates that cellular synthesis is mostly in this group in parallel with the histological data. In our study, group 4 (Chitosan-Heparin-Stem cell) that it's Young's modulus was 3.25 MPa makes it possible the usage of this scaffold in the facial region with biomechanical features
Chitosan-heparin scaffolds, which play an active role in mesenchymal stem cell differentiation, will provide a wide reconstruction opportunity by creating biologically active cartilage tissue with biomechanical capability.

Key words: Stem Cells,Tissue scaffold, Heparin,Chitosan