Periferik hematopoietik kök hücre nakil ürününde canlılık değerlendiren yöntemlerin kıyaslanması
Comparison of viability assesment methods in peripheral hematopoietic stem cell transplantation product
Yazar: HACER DOĞAN VARAN
Danışman: PROF. DR. OSMAN İLHAN
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Hematopoetik kök hücreler = Hematopoietic stem cells ; Hematopoietik sistem = Hematopoietic system ; Hücre nakli = Cell transplantation ; Kök hücreler = Stem cells ; Sağkalım = Survival

Özet:
GİRİŞ VE AMAÇ: Günümüzde hematopoietik kök hücre nakli çoğunlukla PHKH kullanılarak yapılmaktadır. Dondurularak saklanan PHKH'lerin nakil öncesi canlılığının hızlı ve doğru bir şekilde belirlenmesi için güvenilir yöntemler gereklidir. Çalışmamızda, canlılık değerlendirmesinde sık kullanılan yöntemler (Tripan mavisi(TP) ve Eosin Y(EO) ile Akridin oranj- etidium bromid (AO/EB)) ile daha objektif bir yöntem olan akım sitometri- 7AAD yöntemi ile kıyaslandı. PHKH nakil öncesinde canlılığın hangi yöntemle daha güvenilir ve hızlı bir şekilde tespit edildiğinin belirlenmesi amaçlandı. Ayrıca bu çalışmada, PHKH'lerin dondurularak saklanmasında kriyoprotektan olarak kullanılan ve oda ısısında toksik olduğunu bilinen DMSO maruziyetinin canlılık değerlendirmesi sonuçları üzerine etkisi değerlendirildi. 
HASTALAR VE YÖNTEM: Ankara Üniversitesi Tıp fakültesi Hematoloji Bilim Dalı Kök Hücre Nakil Ünitesi'nde PHKH nakli yapılan 12 hastaya ait %10 DMSO+ otolog plazma ile kriyoprezerve edilmiş toplam 20 adet üründen naklin hemen öncesinde 1 ml örnek alındı. Örneğin 0.5 ml kadarı DMSO oranını seyreltmek üzre RPMI solusyonu ile 1:2 oranında sulandırıldı ve geri kalan 0.5 ml (%10 DMSO içeren ) örnek hiçbir işlem yapılmadan ETDA'lı tüpe alındı. Her iki örnekte nakil sonrası iki saat içerisinde iki kişi tarafından, eş zamanlı dört farklı yöntemle canlılık yüzdesi değerlendirildi. AO/EB, TP, EO yöntemleri ile elde edilen sonuçlar, akım sitometri-7AAD ile uyumluluk açısından değerlendirildi. RPMI'lı ürün ve direk ürüne ait canlılık yüzdeleri arasındaki fark her yöntem için kendi içlerinde kıyaslandı. 
BULGULAR: PHKH nakil ürününde, canlılığı akım sitometri- 7AAD yöntemi ile en iyi uyum gösteren yöntemin AO/EB olduğu saptandı. TP yöntemi ile akım sitometri- 7AAD yöntemi canlılık sonuçları arasında istatistiksel olarak anlamlı uyum gözlenmedi. 
RPMI?lı üründe EO yöntemi, akım sitometri- 7AAD ile istatistiksel olarak uyumlu saptandı. Direk üründe EO ve akım sitometri- 7AAD arasında anlamlı uyum saptanmadı. 
TP, EO ve AO/EB yöntemleri ile direk üründe RPMI'lı ürüne göre canlılık yüzdeleri anlamlı olarak daha düşük bulundu. Ancak akım sitometri- 7AAD yöntemi ile direk ürün ve RPMI'lı ürün canlılık yüzdeleri karşılaşirıldığında istatistiksel olarak anlamlı fark gözlenmedi. 
SONUÇ: Dondurularak saklanan PHKH nakil ürününde nakil öncesinde canlılığı akım sitometri- 7AAD ile en iyi uyum içerisinde gösteren yöntemin AO/EB olduğu saptandı. TP ve EO yöntemlerinin nakil öncesi PHKH canlılık değerlendirmesinde yanıltıcı olabileceği saptandı. İki saat süresince DMSO maruziyetinin TP, EO ve AO/EB ile canlılık değerlendirmesi sonuçlarını olumsuz etkilediği saptandı. PHKH nakil ürününde canlılık değerlendiren yöntemlerinin hücre kültürü ve engraftman kinetikleri ile kıyaslayan daha geniş örneklemli yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
BACKGROUND: Today, the peripheral hematopoietic stem cells (PHSC) are commonly used in hematopoietic stem cell transplantation. Reliable methods for rapid and accurate determination of the postthawing PHSC viability is required. In this study, commonly used viability assesment methods are compared with a more objective viability assesment method (flow cytometry-7AAD). So we aimed to determine which method is the most reliable and practical for determination of peripheral hematopoietic stem cell viability shows product quality. Also we evaluated the effect of DMSO (used as a cryoprotectant in PHSC cryopreservation and has toxic effects at room temperature on PHSC viability) exposure on the results of PHSC viability assesment.
MATERIALS AND METHODS: In this study, total of 20 peripheral blood stem cell transplantation products cryopreserved in 10% DMSO + autologous plasma, collected from 12 patients, examined just before transplantation .Total 1cc sample had received just prior to infusion. Two different sample was created for each sample.0.5 cc of sample was diluted with RPMI solution, diluting ratio was 1:2 and the remaining 0.5 cc (10% DMSO) was included in a tube with EDTA without any operations. First sample was called