Tirozin kinaz inhibitörlerine duyarlı ve dirençli hücre dizilerinde sentetik kannabinoid ajanı JWH-073'ün antiproliferatif etkinliğininaraştırılması
Investigation of antiproli ferative effects of synthetic cannabinoid agent JWH073 in cell lines sensitive and resistant to tyrosine kinase inhibitors
Yazar: HÜLYA ÇİNAR
Danışman: DOÇ. DR. BURÇİN KAYMAZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Kemoterapi-kanser-bölgesel perfüzyon = Chemotherapy-Cancer-Regional Perfusion ; Myeloblastik lösemi =

Özet:
Kronik miyeloid lösemi (KML), dünya çapında yıllık insidansı 100.000 kişide 0,87 olan ve multipotent hematopoetik kök hücrelerden köken alarak oluşan malign bir kanser türüdür. 
KML, Kromozom 9 üzerinde lokalize Abelson 1 (ABL1) onkogeni ile kromozom 22 üzerinde lokalize kesme noktası küme bölgesi (BCR) genleri arasındaki karşılıklı translokasyon sonucu oluşan pheledelpia kromozomu ile karakterizedir. Kimerik BCR-ABL1 onkogeni tarafından kodlanan BCR-ABL1 füzyon onkoproteini, hücre döngüsünü aktive eden ve DNA onarımını inhibe eden yapısal olarak aktif protein kinazı kodlamaktadır. 
KML tedavisinde BCR-ABL1 füzyon onkoproteini, tirozin kinaz inhibitörleri (TKİ) ile spesifik olarak hedeflenebilmektedir. TKİ, BCR-ABL1 füzyon onkoproteininin aktif bölgesindeki ATP bağlanma bölgesine rekabetçi bir şekilde bağlanarak protein kinaz aktivitesini inhibe etmektedir fakat KML hücrelerinin onkojenik sinyal yolakları ve mekanizmaları ile tirozin kinaz inhibitörlerine karşı direnç geliştirmeleri tedaviyi yanıtsız bırakabilmektedir. KML tedavisindeki bu sınırlama KML için yeni terapötik ajanların keşfedilmesinin önünü açmaktadır. 
Kannabinoid reseptörlerinin ligandı olan kannabinoidler lösemi dahil çeşitli kanser türlerinde antitümör etki gösterdikleri bilinmektedir fakat sentetik kannabinoid ajanı JWH-073'ün KML K562 hücreleri üzerindeki antitümör etkisi bilinmemektedir. Bu doğrultuda tez çalışmamızda sentetik kannabinoid ajanı JWH-073'ün mono ve TKİ olan İmatinib ve Ponatinib ile kombinasyonunun TKI'ne duyarlı KML K562 ve dirençli K562/Pon3 ve K562/İMA1.2 hücre dizileri üzerinde oluşturacağı olası terapötik etkinliğinin araştırılması amaçlanmaktadır.
İn vitro koşullarda kültüre edilen KML hücre dizileri ile sitotoksisite analizleri sonucunda JWH-073 ajanının mono, İmatinib ve Ponatinib ile kombine uygulanmasının  K562, K562/Pon3 ve K562/İMA1.2 hücreleri üzerindeki IC50 ve ED50 dozu XTT metodu ile saptanmıştır. JWH-073'ün K562, K562/Pon3 ve K562/İMA1.2 hücreleri üzerindeki IC50 dozu 48. saatte sırasıyla 6.14 μM, 5.87 μM ve 0.735 μM saptanmıştır. 
JWH-073'ün Ponatinib ile kombinasyonu K562 hücrelerinin canlılığını inhibe ederek sinerjistik bir etki yaratırken İmatinib ile kombinasyonu ılımlı sinerjistik bir etki göstermiştir. JWH-073'ün Ponatinib ile kombinasyonu K562/Pon3 hücrelerinin canlılığını inhibe ederek güçlü sinerjistik bir etki gösterirken İmatinib ile kombinasyonu K562/İMA1.2 hücrelerinde ılımlı antagonist bir etki göstermiştir.
Annexin V ile yapılan apoptotik analizler sonucunda; JWH-073'ün IC50 dozu K562 hücrelerinde apoptoz oranını 7,65, K562/Pon3 hücrelerinde 4,59 ve K562/İMA1.2 hücrelerinde 1,63 katlık bir artış meydana getirmiştir. JWH-073'ün Ponatinib ile kombinasyonu K562 hücrelerinin apoptoz oranınında 7,72; K562/Pon3 hücrelerinde 5,92 katlık apoptotik artış meydana getirirken JWH-073'ün  İmatinib ile  kombinasyonu K562 hücrelerinin apoptoz oranında 1,5 kat K562/İMA1.2 hücrelerinde 1,15 katlık bir artış meydana getirmiştir.
JWH-073'ün mono, Ponatinib ve İmatinib ile kombine kullanımı K562 hücrelerinde endokannabinoid sistemde ve karsinogenetik süreçte görevli seçtiğimiz kilit genlerin ekspresyon seviyelerinde değişiklik göstermiştir.
Bu bulgular, JWH-073'ün düşük dozda TKI'ne dirençli ve duyarlı K562 hücrelerinin canlılıklarını inhibe ederek antitümör etki gösterdiğini ortaya koymaktadır.  Sentetik kannabinoid ajanı JWH-073'ün mono ve TKI olan İmatinib ve Ponatinib ile kombine kullanımı sensitif K562 hücrelerinde ve dirençli alt klonlarında canlılık düzeylerini azaltarak ve apoptozu indükleyerek antitümör etki göstermiştir. Dirençli K562 hücrelerinin tedavisindeki antitümör etkileri göz önüne alındığında JWH-073 ajanı potansiyel yeni ajan olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Chronic myeloid leukemia (CML) is a malignant cancer that originates from multipotent hematopoietic stem cells, with a worldwide annual incidence of 0.87 per 100,000 people. 
CML is characterized by pheledelpia chromosome resulting from a reciprocal translocation between the Abelson 1 (ABL1) oncogene localized on chromosome 9 and the breakpoint cluster region (BCR) genes localized on chromosome 22. The BCR-ABL1 fusion oncoprotein encoded by the chimeric BCR-ABL1 oncogene encodes a constitutively active protein kinase that activates the cell cycle and inhibits DNA repair.
In the treatment of CML, the BCR-ABL1 fusion oncoprotein can be specifically targeted with tyrosine kinase inhibitors (TKI). TKIs inhibit protein kinase activity by competitively binding to the ATP binding site in the active site of the BCR-ABL1 fusion oncoprotein, but CML cells develop resistance to tyrosine kinase inhibitors through oncogenic signaling pathways and mechanisms, which may render treatment unresponsive. This limitation in CML treatment paves the way for the discovery of new therapeutic agents for CML.
Cannabinoids, which are ligands of cannabinoid receptors, are known to show antitumor effects in various cancer types including leukemia, but the antitumor effect of the synthetic cannabinoid agent JWH-073 on CML K562 cells is unknown. In this regard, our thesis aims to investigate the possible therapeutic efficacy of the synthetic cannabinoid agent JWH-073 in combination with Imatinib and Ponatinib, which are mono- and TKIs, on TKI-sensitive CML K562 and resistant K562/Pon3 and K562/IMA1.2 cell lines.
As a result of cytotoxicity assays with CML cell lines cultured in vitro, IC50 and ED50 doses of JWH-073 mono, combined with Imatinib and Ponatinib on K562, K562/Pon3 and K562/IMA1.2 cells were determined by XTT method. The IC50 dose of JWH-073 on K562, K562/Pon3 and K562/IMA1.2 cells was 6.14 μM, 5.87 μM and 0.735 μM at 48 hours, respectively.
The combination of JWH-073 with Ponatinib showed a synergistic effect by inhibiting the viability of K562 cells, while the combination with Imatinib showed a moderate synergistic effect. The combination of JWH-073 with Ponatinib showed a strong synergistic effect by inhibiting the viability of K562/Pon3 cells, while the combination with Imatinib showed a moderate antagonistic effect in K562/IMA1.2 cells.
As a result of apoptotic analysis with Annexin V; IC50 dose of JWH-073 caused a 7.65-fold increase in apoptosis rate in K562 cells, 4.59-fold increase in K562/Pon3 cells and 1.63-fold increase in K562/IMA1.2 cells. The combination of JWH-073 with Ponatinib caused a 7.72-fold apoptotic increase in the apoptosis rate of K562 cells and a 5.92-fold apoptotic increase in K562/Pon3 cells, while the combination of JWH-073 with Imatinib caused a 1.5-fold increase in the apoptosis rate of K562 cells and a 1.15-fold increase in K562/IMA1.2 cells.
JWH-073 mono, in combination with Ponatinib and Imatinib altered the expression levels of selected key genes involved in the endocannabinoid system and carcinogenetic process in K562 cells.
These results reveal that JWH-073 shows antitumor effect by inhibiting the viability of TKI-resistant and sensitive K562 cells at low doses.  The use of the synthetic cannabinoid agent JWH-073 mono and in combination with TKIs Imatinib and Ponatinib showed antitumor effect by reducing the viability levels and inducing apoptosis in sensitive K562 cells and resistant subclones. Considering its antitumor effects in the treatment of resistant K562 cells, JWH-073 is considered to be a potential new agent.