Spirulina platensis'ten tiyoredoksin redüktazın saflaştırılması ve bazı kinetik özelliklerinin incelenmesi
Purification of thioredoxin reductase from Spirulina platensis and investigation of some kinetic properties
Yazar: EDA DAĞSUYU
Danışman: PROF. DR. REFİYE YANARDAĞ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Enzim aktivasyonu = Enzyme activation ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Enzim inhibitörleri = Enzyme inhibitors ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method ; Enzimler = Enzymes ; Spirulina platensis = Spirulina platensis ; Tiyoredoksin redüktaz = Thioredoxin reductase

Özet:
Tiyoredoksin sistemi, tiyoredoksin redüktaz (E.C 1.6.4.5; TrxR), tiyoredoksin (Trx) ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfattan (NADPH) oluşur. Mavi-yeşil alglerden olan spirulina, spiral halka şeklinde siyanobakter sınıfına ait olup protein, lipit, polisakkarit, pigment, karotenoid, enzim, vitamin ve daha birçok kimyasal madde bakımından zengin bir mikroalgdir. Bu tez kapsamında tiyoredoksin redüktaz, Spirulina platensis'ten saflaştırıldı. Saflaştırma işlemi; ham ekstrenin hazırlanması ve 2',5'-ADP Sefaroz 4B afinite kromatografisi olmak üzere 2 aşamada gerçekleştirildi. Enzim 5.77 U/mg protein spesifik aktiviteyle, % 9.7 verimle ve 1059.51 kat saflaştırıldı. Enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edilerek alt biriminin molekül ağırlığı yaklaşık 45 kDa olarak hesaplandı. Tiyoredoksin redüktaz için optimum pH, fosfat tamponunda pH 7.0; optimum sıcaklık, 40°C ve optimum iyonik şiddet, pH 7.0 fosfat tamponunda 750 mM olarak belirlendi. Spirulinadan saflaştırılan enzimin -80°C, -20°C, +4°C ve oda sıcaklığındaki depo kararlılığı tayin edildi. Ayrıca NADPH substratı için Km sabiti 5 µM ve Vmax değeri 0.0033 U/mL; DTNB substratı için Km sabiti 2.2 mM ve Vmax değeri 0.0044 U/mL olarak belirlendi. Spirulina platensis'ten saflaştırılan tiyoredoksin redüktaz aktivitesi üzerine Ag+, Cu2+, Al3+ ve Se4+ metal iyonlarının inhibisyon etkisi in vitro olarak araştırıldı. Se4+ iyonu enzim aktivitesini arttırırken metal iyonlarının tamamı inhibisyon etkisi gösterdi. İnhibisyon etkisi gösteren metal iyonlarının Lineweaver–Burk grafikleri yardımıyla inhibisyon türleri belirlendi.

Abstract:
The thioredoxin system consists of thioredoxin reductase (E.C 1.6.4.5; TrxR), thioredoxine (Trx) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH). Spirulina, which is one of the blue-green algae, belongs to the cyanobacteria class in the form of spiral rings. The microalgae rich in protein, lipid, polysaccharide, pigment, carotenoid, enzyme, vitamin and many other chemicals. Within the scope of this thesis, the thioredoxin reductase was purified from Spirulina platensis. Purification processes were performed in two steps: preparation of the homogenate and 2',5'-ADP Sepharose 4B affinity chromatography. The enzyme was purified approximately 1059.51 fold over the crude extract and a 9.7 % yield was obtained. The specific activity of the purified enzyme was 5.77 U/mg protein. The purity of the enzyme was checked by SDS-PAGE and the molecular mass of its subunit was calculated to be about 45 kDa. The purified enzyme had an optimum pH of 7.0 in phosphate buffer and showed optimal activity at 40°C. Optimum ionic strength was determined as pH 7.0 in 750 mM phosphate buffer. Storage stability of the purified enzyme was determined at -80°C, -20°C, +4°C and room temperature. In addition, Km constant for NADPH substrate is 5 µM and Vmax value is 0.0033 U / mL. More so, the Km constant for the DTNB substrate was 2.2 mM and the Vmax value was 0.0044 U/mL. The inhibition effects of Ag+, Cu2+, Al3+ and Se4+ metal ions on thioredoxin reductase activity purified from Spirulina platensis were investigated in vitro. While the Se4+ ion increased the enzyme activity, all of the metal ions showed an inhibition effect. The inhibition types of metal ions were determined with the help of Lineweaver–Burk graphs.