LncRNA part1 SNP (RS8176070) polimorfizminin Türkiye'deki diz osteoartritli hasta popülasyonunda DNA sekans analizi ile araştırılması
Investigation of LncRNA part1 SNP (RS8176070) polymorphism in Turkey knee osteoartritis patient population by DNA sequence analysis
Yazar: İLKAY PİŞKİN
Danışman: PROF. DR. AHMET ÇEVİK TUFAN
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Androjenler = Androgens ; DNA = DNA ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Osteoartrit = Osteoarthritis ; Osteoartrit-diz = Osteoarthritis-knee ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; RNA = RNA

Özet:
Osteoartrit (OA); kıkırdak degredasyonu, sinoviyal inflamasyon, subkondral kemik yeniden modellenmesi ve osteofitlerin oluşumuna yol açan kronik bir hastalıktır. Hastanın yaşam kalitesini önemli ölçüde bozan ağrı ve eklem fonksiyon kaybına yol açan, subkondral kemik ve eklem kıkırdağının ilerleyici degredasyonu ile ilişkili dejeneratif bir hastalıktır. Diz OA; diz ekleminin 3 kompartmanını (medial, lateral ve patellofemoral eklem) etkilemektedir ve genellikle 10-15 yıl içinde yavaş ilerleyerek günlük yaşam aktivitelerini bozmaktadır.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda, kıkırdak dokusunda ve kondrositlerde kodlanmayan RNA (lncRNA) PART1 ifadesi tespit edilmiştir. PART1'in miR-373-3p/SOX4 aksisini düzenleyerek OA gelişimini uyardığı belirtilmiştir. LncRNA PART1'in insana ait 5. kromozomun q12 kolunda lokalize olduğu gösterilmiştir. OA ile ilişkisi olduğu düşünülen çok sayıda tek nükleotid polimorfizm (SNP) tanımlanmıştır. LncRNA PART1'de görülen SNP'nin (rs8176070), Türkiye'deki diz OA popülasyonunda oluşturduğu riski test etmek için DNA sekans dizileme yöntemi kullanılarak analiz edilmesi çalışmamızın amacını oluşturmaktadır. 
Çalışmamız için etik kurul izni alınarak, 102 primer OA hastasından oluşan çalışma grubu ve 81 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubu çalışmamıza dahil edilmiştir. Tüm katılımcıların gönüllü onamları alınarak, fiziksel ve radyolojik muayeneleri yapılmıştır. Diz OA'i belirlenen bireylerin Kellgren-Lawrence ölçeğine göre dereceleri (grade 1-4) belirlenip Western Ontario and McMaster Universities Index (WOMAC) anketleri yapılmıştır. Her katılımcıdan 5 ml periferal venöz kan alınmış ve genomik DNA izolasyonları ticari kitler ile yapılmıştır. Saflaştırılan genomik DNA'nın spektrofotometrik absorbansları ölçülerek konsantrasyonları hesaplanmış ve 1 mikrogram (µg) olacak şekilde standart polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için kullanılmıştır. PART1 DNA dizisi için primerler dizayn edilmiştir ve PCR koşulları optimize edilmiştir. PCR reaksiyonu sonucu 508 baz çift (bç)'lik ürün elde edilmiştir. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) yöntemi ile BseYI restriksiyon enzimi SNP (rs8176070) polimorfizminin olduğu bölgede tanıma dizisine (5'-C▼CCAGC-3') göre enzim kesim işlemini gerçekleştirmiştir. DNA sekans analizi polimorfizm çalışmalarında için altın standart durumunda olduğu için çalışmamızdaki tüm bireylerin DNA sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. 
Çalışmaya alınan bireylerin yaş ortancası (ÇAG) OA grubunda 60.5 yıl (ÇAG: 53.8-67.0), kontrol grubunda 46.0 yıl (ÇAG: 40.5-51.0) olarak elde edilmiştir. OA grubunun %75.5'inin (n=77), kontrol grubunun %55.6'sının (n=45) kadın olduğu görülmüştür. İki grup karşılaştırıldığında, OA grubu hastaların yaş ortalaması ve cinsiyetinin kadın olma oranının kontrol grubuna göre anlamlı düzeyde daha yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Benzer şekilde hasta grubunda Beden Kitle İndeksi (BKİ) ve WOMAC puanı kontrol grubuna göre daha yüksek elde edilmiştir (p≤0.001). Hasta grubunun Kellgren-Lawrence derecesine göre dağılımı demografik veri tablosunda (Tablo 4.1) verilmiştir. Yabanıl tip genotip (CC) "bb", heterozigot polimorfik genotip (CN) "Bb" ve homozigot polimorfik genotip (NN) "BB" olarak kodlanmıştır. OA ve kontrol grubunda genotip dağılımı incelendiğinde,  OA grubunun %13.8'i (n=14) ile kontrol grubunun %13.6'sında (n=11) homozigot polimorfik (NN) "BB" genotip, OA grubunun %43.1'i (n=44) ile kontrol grubunun %45.7'sinde (n=37) heterozigot polimorfik (CN) "Bb"  genotipi ve OA grubunun %43.1'i (n=44) ile kontrol grubunun %40.7'sinde (n=33) yabanıl tip (CC) "bb" genotip tespit edilmiştir (Tablo 4.2). Sonuç olarak BB veya Bb genotipleri için odds oranları istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0.05). Gruplarda allel dağılımları benzerdir(p=0.875).

Literatürde, SNP (rs8176070) ile OA arasındaki olası ilişkiyi analiz etmiş mevcut popülasyon çalışmalarından bir kısmı pozitif ilişki tarif ederken, bir kısmı ise negatif yönde sonuç bulmuştur. Bizim çalışmamızda da, Türk diz OA'li olgularda lncRNA PART1 SNP (rs8176070) ile diz OA'i arasında anlamlı bir ilişki olmadığı gösterilmiştir. SNP(rs8176070) ile OA ilişkisini analiz eden ileri popülasyon çalışmalarına ihtiyaç vardır.

Abstract:
Osteoarthritis (OA); is a chronic disease that causes cartilage degradation, synovial inflammation, subchondral bone remodeling, and osteophyte formation. It is a degenerative disease associated with the progressive degradation of the subchondral bone and joint cartilage, leading to pain and loss of joint function that significantly impairs the patient's quality of life. Knee OA affects the 3 compartments of the knee joint (medial, lateral and patellofemoral joint) and usually progresses slowly within 10-15 years and disrupts daily life activities.
In recent studies, non-coding RNA (lncRNA) PART1 expression has been detected in cartilage tissue and chondrocytes. It is indicated that PART1 stimulates OA development by regulating the miR-373-3p / SOX4 axis. LncRNA PART1 has been shown to be localized in the q12 arm of human chromosome 5. Numerous single nucleotide polymorphisms (SNPs) thought to be associated with OA have been identified. The aim of our study is to analyze SNP (rs8176070) seen in lncRNA PART1 using DNA sequencing method to test the risk it creates for the Turkey knee OA population.
By obtaining the permission of the ethics committee for our study, the study group consisting of 102 primary OA patients and the control group consisting of 81 healthy individuals were included in our study. Physical and radiological examinations were performed by obtaining the voluntary consent of all participants. Individuals with knee OA were determined according to the Kellgren-Lawrence scale (grade 1-4) and Western Ontario and McMaster Universities Index (WOMAC) surveys were conducted. 5 ml of peripheral venous blood was taken from each participant and genomic DNA isolations were made with commercial kits. Spectrophotometric absorbance of purified genomic DNA was measured and concentrations were calculated and used for standard polymerase chain reaction (PCR) as 1 microgram (µg). Primers for the PART1 DNA sequence have been designed and the PCR conditions have been optimized. As a result of the PCR reaction, the product of 508 base pairs (bp) was obtained. By the Restriction fragment length polymorphism (RFLP) method, BseYI performed the enzyme cut process according to the recognition sequence (5'-C▼CCAGC-3 ') in the region of the restriction enzyme SNP (rs8176070) polymorphism. For DNA sequence analysis is the gold standard for polymorphism studies, DNA sequence analyzes of all individuals in our study has been carried out.

The median age of the subjects included in the study was 60.5 years (MP: 53.8-67.0) in the OA group, and 46.0 years (MP: 40.5-51.0) in the control group. It was observed that 75.5% (n = 77) of the OA group and 55.6% (n = 45) of the control group were women. When the two groups were compared, it was determined that the mean age and women gender of the OA group patients were significantly higher than the control group (p <0.05). Similarly, Body Mass Index (BMI) and WOMAC score were higher in the patient group compared to the control group (p≤0.001). The distribution of the patient group according to the Kellgren-Lawrence degree is given in the demographic data table (Table 4.1). The wild type genotype (CC) is encoded as "bb", heterozygous polymorphic genotype (CN) "Bb" and homozygous polymorphic genotype (NN) "BB". When the genotype distribution in the OA and control groups was examined, 13.8% (n = 14) of the OA group and 13.6% (n = 11) of the control group were homozygous polymorphic genotype (NN) "BB", 43.1% (n = 44) of the OA group and the control group, 45.7% (n = 37) of the heterozygous polymorphic genotype (CN) "Bb" and 43.1% (n = 44) of the OA group and 40.7% (n = 33) of the control group, wild type genotype (CC) "bb" was detected (Table 4.2). As a result, odds ratios were not found to be statistically significant for BB or Bb genotypes (p> 0.05). Allele distributions in the groups are similar (p = 0.875).

In the literature, some of the existing population studies that analyzed the possible relationship between SNP (rs8176070) and OA described a positive relationship, while some found a negative result. In our study, it was shown that there was no significant relationship between the lncRNA PART1 SNP (rs8176070) and knee OA in cases with Turkish knee OA. Further population studies analyzing the relationship between SNP (rs8176070) and OA are needed.