Değişik konaklardan elde edilen fasciola hepatica izolatlarında β-tubulin geninin moleküler karakterizasyonu
Molecular characterisation of b-tubulin gene of fasciola hepatica isolates obtained from different hosts
Yazar: SIDDIKA SADET ÇANAKOĞLU
Danışman: PROF. DR. SAMİ ŞİMŞEK
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antihelmintikler = Anthelmintics ; Endoparazitler = Endoparasites ; Fasciola hepatica = Fasciola hepatica ; Genler = Genes ; Koyunlar = Sheep ; Sığırlar = Cattles ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Fasciolosis, çiftlik hayvanlarında et, süt, yapağı, dölverimi ve güç kaybı gibi ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Günümüzde fasciolosisin kontrolünde antelmintik kullanımı en geçerli uygulama yöntemidir. Bunlar içerisinde en sık kullanılanlardan biri de triklabendazol (TCBZ)'dur. Bu ilacın bilinçsiz kullanılması nedeniyle dirençli populasyonlar gelişmektedir. Bu çalışma ile farklı coğrafik alanlardan ve değişik konaklardan (sığır, koyun) elde edilen Fasciolahepatica izolatlarında TCBZ direncine işaret edebilecek β-tubulin gen polimorfizminin olup olmadığı, varsa ne derecede yaygın olduğu ve konak spesifikliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, Erzurum ve Kayseri illerindeki mezbahalardan kesimi takiben her ilden 20 sığır ve 20 koyundan olmak üzere toplam 80 erişkin F.hepatica toplanmış ve %70 ethanol içerisinde laboratuvara ulaştırılıp genomik DNA (gDNA) izolasyonu yapılmıştır. Örnekler, F. hepatica β-tubulin genini çoğaltan spesifik primerler β-tub295f ve β-tub1230r ile çoğaltılıp MboII, HphI ve HindII restriksiyon enzimleri ile RFLP yapılmış, takiben PZR-SSCP analizi uygulanmıştır. Bu çalışma ile işlenen örneklerin hepsinde β-tubulin geni PZR ile başarılı bir şekilde çoğaltılmış ve 935 bp büyüklüğündeki bant elde edilmiştir. Bu PZR ürünlerinin MboII enzimiyle kesim neticesinde bütün örneklerde yaklaşık 350 ve 390 bp'lik iki bant gözlenirken, HphI enzimiyle kesimde bütün örneklerde yaklaşık 210, 340 ve 540 bp büyüklüğünde üç bant elde edilmiştir. Son enzim olan HindII enzimi de bütün örnekleri kesmiş ve yaklaşık 380 ve 450 bp'lik üç bant belirlenmiştir. Takiben bütün örneklerin SSCP analizi yapılmış ve hepsinde benzer bantprofilleri belirlenmiştir. Örnekler içinden rastgele seçilen 6 örneğin DNA dizi analizi yaptırılmıştır. En çok nükleotid değişimi koyun kökenli örneklerde gözlenirken sığırlardan elde edilen numunelerde nispeten daha az nükleotid değişimi belirlenmiştir. Protein kıyaslamalarında dizinin baş ve son kısımlarında farklı oranlarda mutasyonlar olmasına rağmen özellikle TCBZ direnciyle ilişkilendirilebilecek 200. nükleotid ve civarında herhangi bir mutasyon belirlenmemiştir. 
Bu çalışma ile Türkiye'nin iki farklı hayvancılık bölgesinden sığır ve koyunlardan elde edilen F.hepatica izolatlarındaki β-tubulin gen polimorfizmi ilk kez araştırılmıştır. İlaç direncine işaret edebilecek mutasyonlar belirlenememesine rağmen deneysel çalışmalarla moleküler çalışmaların birlikte uygulanması ile daha net verilere ulaşılabileceği düşünülmüştür.

Abstract:
Fasciolosis causes many economical problems in livestock such as loss of meat, milk and wool production. In recent era use of anti-helminthic drugs is common way for controlling Fasciolasis.Triclabendasole (TCBZ) is one of the most frequently used between thoose drugs. Careless and intensive use of that drug cause developing resistance against drug.In this study molecular characterisation of β-tubulin gene from Fasciolahepatica isolates of different hosts and geographic areas have been investigated for possible polyphormism indicating triclabendasole resistance.For this purpose adult Fasciolahepatica isolates from Erzurum and Kayseri have been collected from 20 sheep and 20 herds and they transported to laboratory in %70 ethanol. Then genomic DNA isolation have been done from each parasites separetely and with using spesific primers PCR have been designed for β-tubulin gene. The primers β-tub295f and β-tub1230r have been used for PCR ampilification and SSCP and RFLP analyses have been done for further investigation.β-tubulin gene of all samples succesfully amplified and spesific bant of 935 bp have been observed.Two bants of 350 and 390 bp have been observed with a result of cutting PCR products with MboIIenzyme. Three bants of 210, 340 and 540 bp have been obtained as a result of use of HphI enzyme.HindIIused as last ezyme cut all sampled and spesific bants as 380 and 450 bp have been obtained. Similar bant profiles have been observed of SSCP analyses of samples.Six samples have randomly selected and DNA sequence analysis have been performed. Samples have been obtained from sheep showed more nucleotide polymorphism than the samples from cows. Some nucleotide changes have been observed of first and the last part of protein sequences but the mutation 200th nucloetide which could be associated with triclebendasole resistant couldnt be identified.
With this studyβ-tubulin gene polymorphism of F.hepaticaisolates from sheep and cattles of two distinct geographical ares of Turkey have been researched for first time. Despite of lack of datas which could be indicating drug resistance, using experimental studies with molecular studies can be a way of getting more accurate and clear data.