Kurumuş kan lekesindeki madde konsantrasyonuna bakterilerin etkisinin araştırılması
The investigation of the effect of bacteria on drug concentration in dried blood stain
Yazar: SEHER ÇİFTÇİ KARAOT
Danışman: DOÇ. DR. SELDA MERCAN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine

Özet:
Kurumuş kan lekesi yöntemi, minimal düzeyde olması, toplanması, saklanması ve analiz edilmesi yönünden daha pratik olması sebebiyle geleneksel toksikolojik analiz yöntemlerine bir alternatiftir. Kurumuş kan lekesi yöntemi ile yeni doğan taraması, ağır metal tespiti, terapötik ilaçların izlemesi, psikoaktif madde ve metabolitlerinin tespiti, toksikoloji, mikrobiyoloji ve epidemiyolojik çalışmaların yapılabilmesi mümkündür. Kokain keyif verici madde olarak kullanılan, yasa dışı, bağımlılık yapıcı ve uyarıcı bir maddedir. Kokainin tespiti, kan, idrar, ter gibi çeşitli vücut sıvılarından yapılabilmesinin yanı sıra saç, tırnak gibi çeşitli biyolojik materyallerle ve kurumuş kan lekesinden de yapılabilmektedir. Ancak yapılan literatür taramasında ortam koşullarının ve mikroorganizmaların etkisinin kurumuş kan numunesinde tespit edilen madde konsantrasyonları üzerindeki etkisinin henüz araştırılmadığı görülmüştür. 
Bu tez çalışmasında kokain ve metabolitlerinin kurumuş kan lekesinden tayinine bakterilerin etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. 
Çalışmada, içerisinde kokain, benzoilekgonin ve kokaetilenin bulunduğu sertifikalı referans kan numunesi satın alınmış, kurumuş kan lekesi haline getirilerek farklı bakteri karışımları ile kontamine edilmiş üç farklı ortamda (iç ve dış ortam, poşet), 5 farklı zaman aralığında (1, 7, 14, 21, 28 gün) bekletilerek ardından toksikolojik analizler gerçekleştirilmiştir. Çalışmada sıvı-sıvı çekitleme yöntemi kullanılarak kokain, benzoilekgonin ve kokaetilenin miktar tayini için sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometresi (LC-MS/MS) sisteminden faydalanılmıştır. Mikroorganizmaların madde konsantrasyonu üzerindeki etkisini anlamak için numuneler, bakterisiz, bakteri karışımlı, E. coli ve Enterococcus spp. bakterileri ile ayrı ayrı olacak şekilde çalışılmıştır. Yapılan çalışmalarda kokain, benzoilekgonin ve kokaetilen için metanol çözücüsünde 9 noktalı 0,5-50 ng/mL aralığında kalibrasyon grafiği elde edilmiştir (r>0,99). Kokain, benzoilekgonin ve kokaetilen için metanol içerisinde elde edilen tayin limit (LOQ) değerleri 0,1 ng/mL bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik çalışmalarında yüzde bağıl standart sapma (%RSD) tüm iç ve dış ortam numunelerinde <20 olarak elde edilmiştir. Poşet ortamında saklanan bakteri karışımlı numunelerde 14. gündeki kokaetilenin %RSD değeri 23,20 ve poşet ortamında bekletilen E. coli'nin bulunduğu numunelerde 7. gündeki kokain ve kokaetilen %RSD değerleri sırasıyla 58,16 ve 35,45 olarak elde edilmiş olsa da diğer günlerde elde edilen %RSD değerleri <20'dir. Kokain, benzoilekgonin ve kokaetilene ait yüzde geri kazanım çalışmaları sonuçları iç ortam numunelerinde %66,33-158,32 aralığında, poşette saklanan numunelerde %88,99-249,26 aralığında ve dış ortam numunelerinde %30,27-275,76 aralığında değerler elde edilmiştir.
Kurumuş kan lekesinden yasadışı madde analizinde farklı ortam, farklı zaman ve bakteri maruziyeti gibi etkenlerin madde konsantrasyonu üzerindeki etkisi değerlendirildiğinde, her üç maddenin de zaman içerisinde stabilitelerini kaybettiği gözlemlenmiştir. Bu üç madde içerisinde en yüksek stabiliteye sahip olan madde kokain iken, en hızlı bozunan madde kokaetilendir. İç ortam, poşet ve dış ortam numuneleri karşılaştırıldığında maddelerin en stabil olduğu ortam iç ortam iken, en hızlı bozunduğu ortamın dış ortam olduğu gözlemlenmiştir. Her üç ortamda da içerisinde bakteri karışımının bulunduğu numunelerdeki madde konsantrasyonlarının ve % geri kazanım değerlerinin bakteri içermeyen numunelerden daha düşük olduğu gözlemlenmiştir. Her üç ortamda da içerisinde yalnızca E. coli bakterisinin bulunduğu numunelerdeki madde konsantrasyonlarının ve % geri kazanım değerlerinin yalnızca enterokok bakterisini içeren numunelerden daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. Bu çalışmanın, kurumuş kan lekelerindeki madde konsantrasyonlarının, bakteri türüne, bekleme ortamına ve zamanına bağlı olarak değişebileceğini gösteren ilk çalışma olması bakımından özgün değere sahip olduğu ve ileriki araştırmalara yol gösterici olacağı düşünülmektedir. 
Anahtar kelimeler: kurumuş kan lekesi, bakteri, kokain, benzoilekgonin, kokaetilen, adli toksikoloji, adli mikrobiyoloji

Abstract:
The dried blood spot method is an alternative to traditional toxicological analysis methods because it is minimal and more practical in terms of collection, storage and analysis. With the dried blood spot method, it is possible to conduct newborn screening, heavy metal detection, monitoring of therapeutic drugs, detection of psychoactive substances and their metabolites, toxicology, microbiology and epidemiological studies. Cocaine is an illegal, addictive and stimulant substance used as a recreational drug. Detection of cocaine can be made from various body fluids such as blood, urine and sweat, as well as from various biological materials such as hair, nails and dried blood spots. However, in the literature review, it was seen that the effect of environmental conditions and microorganisms on the substance concentrations detected in dried blood samples has not yet been investigated.
In this thesis study, it was aimed to examine the effect of bacteria on the determination of cocaine and its metabolites from dried blood spots.
In the study, a certified reference blood sample containing cocaine, benzoylecgonine and cocaethylene was purchased, turned into a dried blood spot and contaminated with different bacterial mixtures, in three different environments (indoor and outdoor environment, bags), at 5 different time intervals (1, 7, 14, 21, 28 days) and then toxicological analyzes were performed. In the study, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) system was used for the quantification of cocaine, benzoylecgonine and cocaethylene using the liquid-liquid extraction method. In order to understand the effect of bacteria on the substance concentration, samples were studied separately, without bacteria, with bacterial mixture, and with E. coli and Enterococcus spp.. In the studies conducted, a 9-point calibration graph in the range of 0,5-50 ng/mL was obtained for cocaine, benzoylecgonine and cocaethylene in methanol solvent (r>0,99). The limit of detection (LOQ) values obtained in methanol for cocaine, benzoylecgonine and cocaethylene were found to be 0.1 ng/mL. In repeatability studies, percent relative standard deviation (RSD%) was obtained as <20 in all indoor and outdoor samples. Although the RSD% value of cocaethylene on the 14th day was 23.20 in samples containing bacteria mixtures stored in the bag environment, and the RSD% values of cocaine and cocaethylene on the 7th day were 58,16 and 35,45 respectively, in the samples containing E. coli kept in the bag environment, the other RSD% values obtained on days are <20. The results of percentage recovery studies of cocaine, benzoylecgonine and cocaethylene have values in the range of 66,33-158,32% in indoor samples, 88,99-249,26% in samples stored in bags, and 30,27-275,76% in outdoor samples has been obtained.
When the effects of factors such as different environments, different times and bacterial exposure on the substance concentration were evaluated in the analysis of illegal substances from dried blood spots, it was observed that all three substances lost their stability over time. While the substance with the highest stability among these three substances is cocaine, the substance that degrades most rapidly is cocaethylene. When the indoor, bag and outdoor samples were compared, it was observed that the environment in which the substances were most stable was the indoor environment, while the environment in which they degraded the fastest was the outdoor environment. In all three environments, it was observed that the substance concentrations and % recovery values in the samples containing the bacterial mixture were lower than in the samples containing bacteria. In all three environments, it was observed that the substance concentrations and % recovery values in samples containing only E. coli were higher than in samples containing only Enterococcus spp.. It is thought that this study has unique value as it is the first study showing that the substance concentrations in dried blood spots may vary depending on the bacterial type, storage environment and time, and will guide future research.
Keywords: dried blood spot, bacteria, cocaine, benzoilecgonine, cocaethylene, forensic toxicology, forensic microbiology