Ginkgo biloba ekstraktı içeren kitosan nanopartiküllerin sentezi, karakterizasyonu ve in vitro nöroprotektif etkisinin incelenmesi
Synthesis and characterization of ginkgo biloba extract encapsulated chitosan nanoparticles and examination of their in vitro neuroprotective effects
Yazar: ZEYNEP KARAVELİOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. RABİA ÇAKIR KOÇ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Ginkgo biloba (Gb), ana vatanı Çin olan ve tarihi çok eski çağlara kadar ˘
dayanan, şifa verici özellikleri sebebiyle eski uygarlıklardan günümüze kadar ulaşmış,
türünün tek örneği olan bir ağaçtır. Ginkgo biloba ağacının yapraklarından elde ˘
edilen ekstraktlar çok eski zamanlardan bu yana depresyon, kulak çınlaması,
baş ağrısı gibi birçok hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Günümüzde ise ˘
özellikle serebrovasküler hastalıklar, Alzaymır ve makroanjiyopati gibi birçok
dejeneratif hastalığın tedavisinde sıklıkla kullanımı mevcuttur. Bunların yanı sıra ˘
Gb yapraklarından elde edilen ekstraktların; iskemi, felç, periferal sinir hasarı
gibi durumlarda nöroprotektif etki gösterdigi yapılan deneylerce kanıtlanmıştır. ˘
Nanoteknoloji ilerleyen teknolojik gelişmelerle birlikte kullanım alanı gittikçe artan ve
özellikle biyomedikal bilimler üzerinde kendine geniş bir araştırma alanı bulan güncel
bir teknolojidir. Nanoteknolojinin önemli bir parçasını oluşturan nanotaşıyıcılar
ilaç veya etken maddelerin ta¸sınması için oldukça etkin araçlardır. Özellikle dogal ˘
polimerler kullanılarak sentezlenen nanotaşıyıcıların içerdikleri etken maddelerin
olası toksik etkilerini elimine etmek, biyouyumululuklarını arttırmak ve vücut
içerisindeki yarılanma sürelerini arttırmak gibi birçok avantajı olduğu bilinmektedir. ˘
Doğal polimerler hücreler tarafından eksprese edilen spesifik reseptörlerle etkileşime ˘
girebilmek için birtakım biyolojik sinyaller ihtiva ederler. Bu durum doğal polimerlere ˘
yüksek seviyede biyouyumluluk yeteneği kazandırmaktadır. Yüksek lisans tezi ˘
kapsamında yapılan bu çalışmada; boyutları yaklaşık 104 nm olan, Ginkgo biloba ekstraktı enkapsüle edilen kitosan nanopartiküller (Gb-CSNP) sentezlenmiş ve
bunların nöroprotektif potansiyelleri incelenmiştir. Nanopartiküllerin zeta boyut
ve potansiyelleri belirlendikten sonra SEM analizi ile morfolojileri tespit edilmiş,
daha sonra ise FTIR spektroskopisi aracılığı ile nanopartikül içeriğindeki fonksiyonel ˘
gruplar ve bağ yapıları belirlenmiştir. Yükleme ve enkapsülasyon verimleri hesaplanan ˘
nanopartiküllerin salım testi ise PBS içerisinde gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen
Gb-CSNPlerin hücre içerisine alımları FITC boyası aracılığı ile floresan mikroskop ˘
kullanılarak tayin edilmiştir. Yapılan hücre kültürü çalışmaları kapsamında Gb
ekstraktının ve sentezlenen nanopartiküllerin sitotoksisiteleri XTT metodu aracılığı ˘
ile L929 (fare fibroblast hücreleri) hücre hattı üzerinde incelenmiş, nöroproliferatif
etkinlikleri ise SH-SY5Y ve U87 (insan glioblastoma hücreleri) hücreleri üzerinde
gösterilmiştir. Gb-CSNP'lerin, CsNPler ve Gb ekstraktına kıyasla SH-SY5Y ve U87
hücrelerinin nöroproliferasyonu üzerinde daha etkin olduğu gözlemlenirken, hücre ˘
proliferasyonunu artırma yönündeki etkinin L929 hücrelerine göre SH-SY5Y ve U87
hücrelerinde daha yüksek olması incelenen Gb ve NP'lerin nöroproliferatif etkisinin
olduğu şeklinde yorumlanabilmektedir. Gb, CSNP ve Gb-CSNPlerin apoptozis ˘
sürecine olan etkileri DAPI boyaması yapılarak görüntülenirken, hücre migrasyonu
üzerine olan etkileri in vitro yara iyileştirme testi (scratch assay) aracılıgı ile tayin ˘
edilmiştir. In vitro yara iyileştirme testi kapsamında; Gb etkinliğinin SH-SY5Y hücre ˘
hattında L929 hücrelerine göre daha yüksek olması XTT test sonuçları ile de uyumlu
olup, Gb ekstraktının özellikle SH-SY5Y hücrelerinde proliferatif etkinin yüksek
olduğunu göstermiştir. Ayrıca, Gb-CSNPlerin, Gb ve CSNPlere kıyasla SH-SY5Y ˘
hücrelerinin migrasyon süreçlerini hızlandırdıgı gözlemlenmiştir. Nanopartiküllerin ˘
nöroprotektif etkilerini incelemek için nörodejeneratif hastalıklarda hasar gören
dopaminerjik nöronlarla olan benzerlikleri sebebiyle uygun bir model niteliğinde ˘
olan SH-SY5Y insan nöroblastoma hücreleri kullanılmıştır. Bu kapsamda Gb,
CSNp ve Gb-CSNPlerin H2O2 ile uyarılan SH-SY5Y hücreleri üzerinde 0,06 mg/mL
ve 3 mg/mL konsantrasyon aralıklarında meydana getirdikleri nöroprotektif etki
incelenmiş, Gb-CSNPlerin hasar görmüş SH-SY5Y hücreleri üzerinde canlılıgı %45 ˘
oranında arttırdığı belirlenmiştir.

Abstract:
Ginkgo biloba (Gb) is an ancient Chinese tree which has been cultivated for its
healthpromoting properties. Ginkgo biloba leaves extract has been used for thousands
of years. Extracts which are obtained from Gb leaves have been used in the treatment
of various diseases such as depression, tinnitus and headache since ancient times. In
recent decades, basic and clinical studies have established the effects of Gb extract.
It is widely used in various degenerative diseases such as cerebrovascular disease,
Alzheimer's disease, macroangiopathy and more. In addition, there is essential
experimental evidence to support the view that Gb extracts have neuroprotective
properties under conditions such as hypoxia/ischemia, seizure activity and peripheral
nerve damage. Nanotechnology is a popular technology which is widely used
in biomedical field and it's usage area is increasing via advancing technology.
Nanocarriers, which are very substantial part of nanotechnology are quite effective and
popular vehicles for active substances or drug delivery. It is known that nanoparticles,
especially synthesized using natural polymers, have many advantages. They provide
biological signals to interact with specific receptors expressed by cells, in this case
natural polymers have a high level of biocompatibility ability. In this master's thesis,
Gb extract encapsulated chitosan nanoparticles (Gb-CSNP) were synthesized in the
size range of 104 nm and neuroprotective effects of Gb-CSNP were investigated
in vitro. After determination of zeta size and potential of nanoparticles, their
morphology was determined by SEM analysis and then functional groups and bond
structures of nanoparticles were determined by FTIR spectroscopy. Loading and encapsulation yields of Gb-CSNP were calculated and release test were performed in
PBS. Intracellular uptake of synthesized Gb-CSNPs was determined by fluorescence
microscope by means of FITC dye. Cytotoxicity of Gb extract and synthesized
nanoparticles were examined by XTT method on L929 (mouse fibroblast cells) cell
line and neuroproliferative activities were shown on SH-SY5Y and U87 (human
glioblastoma cells) cells. While Gb-CSNPs were observed to be more effective on
neuroproliferation of SH-SY5Y and U87 cells compared to CsNPs and Gb extract, cell
proliferation was higher in SH-SY5Y and U87 cells compared to L929 cells. The effects
of Gb, CSNP and Gb-CSNPs on apoptosis were monitored by DAPI staining and their
effects on cell migration were determined by in vitro wound healing assay (scratch
assay). When the effects of CSNPs and Gb-CSNPs on apoptosis were examined,
it was found that both CSNPs and Gb-CSNPs suppressed apoptotic effect at 0.5
mg/mL concentration, and the number of apoptotic cells was decreased by Gb-CSNP
mostly. According to in vitro wound healing images; the higher Gb activity in the
SH-SY5Y cell line compared to L929 cells was also consistent with the XTT test results,
indicating that the Gb extract had a high proliferative effect, especially in SH-SY5Y
cells. It was also observed that Gb-CSNPs accelerated the migration processes of
SH-SY5Y cells compared to Gb and CSNPs. In order to investigate the neuroprotective
effects of nanoparticles, SH-SY5Y human neuroblastoma cells, which are suitable
models because of their similarity with dopaminergic neurons and damaged in
neurodegenerative diseases, were used. In this context, the neuroprotective effects
of Gb, CSNPs and Gb-CSNPs on H2O2 stimulated SH-SY5Y cells in the concentration
ranges of 0.06 mg/mL and 3 mg/mL was investigated. Gb-CSNPs were found to
increase the cell viability by 45% on H2O2 induced SH-SY5Y cells.