Laboratuvar ölçekli bir biyobenzerin biyofarmasötik sürecinin geliştirilmesi
Development of the biopharmaceutical process of a lab-scale biosimilar
Yazar: TUĞÇE ANAKÖK
Danışman: PROF. DR. ERCÜMENT KARASULU
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Antikorlar = Antibodies ; Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Biyobenzer ilaçlar = Biosimilar drugs ; Hamsterler = Hamsters ; Karakterizasyon = Characterization ; Ölçek büyütme = Scale up ; Ölçekler = Scales

Özet:
Hibridoma Teknolojisinin 1975 yılında Kohler ve Milstein tarafından geliştirilmesinden sonra, terapötik monoklonal antikorların (mAb) ticari gelişimi 1980'lerin başında başlamıştır. 1986'da ilk mAb ürünü olan muromonab-CD3'ün Amerika Birleşik Devletleri'nde onaylanmasından bu zamana terapötik mAb'lar özgünlükleri, seçicililikleri, düşük immünojenisitelerinden dolayı küresel biyofarmasötik pazarında en baskın ve talep gören ilaç sınıfı haline gelerek büyümüştür. Küresel ilaç pazarında bu ilaçlara artan talep, piyasada oluşan rekabet ve ojinal ürünlerin patent sürelerinin dolmasından dolayı bu ürünlerin biyobenzerleri de piyasaya çıkmaya başlamıştır. Biyobenzer ürün, referans ürün ile ürünün güvenliği, etkinliği, saflığı ve potensi arasında klinik anlamda hiçbir farklılığı bulunmayan üründür. Ürünlerin canlı organizmalardan elde edilmesinden dolayı her üretimde birebir aynı ürünün elde edilememesi, üretimlerinin zaman alması, hassas ürünler olmaları ve üretimdeki verimliliğin yüksek olmaması dezavantajlarıdır. Memeli hücre hatları, doğru katlanma, birleştirme ve translasyon sonrası modifikasyon (PTM) kapasiteleri nedeniyle farmasötik proteinlerin endüstriyel üretimi için en önemli konak hücrelerdir. Özellikle Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri, terapötik proteinlerin endüstriyel üretimi için en güvenilir konak hücrelerdir. Terapötik proteinlere yönelik artan talep, hem orjinal ürünlerin hemde biyobenzerlerinin üretim verimliliğinin arttırılmasını gerekli kılmaktadır. Bu amaç için hücre hattı geliştirme, hücre mühendisliği, besiyerinin kompozisyonu ile besleme stratejileri, biyoreaktör ve üretim parametrelerini iyileştirme çalışmaları yapılmaktadır. Bu yollarla arttırılmaya çalışılan verimliliğin yanında hem orjinal hem de biyobenzer ürün çalışmalarında elde edilen ürünlerin fizikokimyasal karakterizasyonlarının, biyolojik etkinliklerinin, stabilitelerinin ve immünojenisite özelliklerinin benzer olması gerekmektedir. 
IgG1 eksprese eden CHO-HcD6 hücrelerinin (CHO-K) özgül verimliliğini arttırmak için Doç. Dr. Noriko Yamano tarafından CHO-K hücreleri polietilenglikol ile kaynaştırılarak füzyona uğramış (CHO-F) hücre hattı elde edilmiştir. Elde edilen bu CHO-F hücre hatlarının kesikli hücre kültürü çalışmalarında CHO-K hücre hattına göre daha fazla IgG1 ürettiği gözlenmiştir. Buradan yola çıkarak CHO-K ve CHO-F hücre hatlarının masa üstü karıştırmalı tank biyoreaktörde kesikli beslemeli kültür ile ölçek büyütme çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalar ile iki hücre hattının özgül IgG1 üretime hızı, özgül hücre büyüme hızları, ürettikleri IgG1 miktarları, glukoz, glutamin gibi metabolit tüketimleri ile laktat glutamat ve amonyum yan ürünlerini oluşturma profilleri değerlendirilmiştir. Bu çalışmalarda özgül üretim verimliliğinin yanında CHO-K hücre hattının ürettiği IgG1 molekülleri orijinal ürün olarak kabul edilmiş, CHO-F hücre hattının ürettiği IgG1 molekülleri ise orijinal ürünün biyobenzeri olarak değerlendirilmiştir. İki hücre hattından elde edilen orijinal ve biyobenzer IgG1'ler fizikokimyasal olarak karakterize edilerek karşılaştırma çalışmaları yapılmıştır.

Abstract:
After the development of Hybridoma Technology by Kohler and Milstein in 1975, commercial development of therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) began in the early 1980s. Since the first mAb product, muromonab-CD3, was approved in the United States in 1986, therapeutic mAbs have grown to become the most dominant and in-demand drug class in the global biopharmaceutical market due to their specificity, selectivity, and low immunogenicity. Due to the increasing demand for these drugs in the global pharmaceutical market, the competition and the expiration of the patent of the original products, biosimilars of these products have also started to appear on the market. A biosimilar product is a product in which there is no clinical difference between the reference product and the product's safety, efficacy, purity and potency. The disadvantages are that the same product cannot be obtained in every production since they are obtained from living organisms, their production is time consuming, they are sensitive products and the efficiency in production is not high. Mammalian cell lines are the most important host cells for the industrial production of pharmaceutical proteins because of their capacity for accurate folding, splicing and post-translational modification. Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most reliable host cells for the industrial production of therapeutic proteins. Increasing demand for therapeutic proteins makes it necessary to increase the production efficiency of both original products and biosimilars. For this purpose, cell line development, cell engineering, media composition and feeding strategies, bioreactor and improvement of production parameters are carried out. In addition to the productivity studies, the physicochemical characterization, biological activities, stability, and immunogenicity properties of the products obtained in both original and biosimilar product studies should be similar.
To increase the specific productivity of IgG1-expressing CHO-HcD6 cells (CHO-K), the fused cell line (CHO-F) was obtained by fusing CHO-K cells with polyethyleneglycol by Assoc. Prof. Dr. Noriko Yamano. It was observed that these obtained CHO-F cell lines produced more IgG1 than the CHO-K cell line in batch cell culture studies. Based on this, scale-up studies of CHO-K and CHO-F cell lines were carried out with fed-batch culture in a benchtop stirred tank bioreactor. With these studies, the specific IgG1 production rate, specific cell growth rate, the amount of IgG1 they produce, the consumption of metabolites such as glucose and glutamine, and the formation of lactate glutamate and ammonium by-products of the two cell lines were evaluated. Also in these studies, besides the specific production rates, the IgG1 molecules produced by the CHO-K cell line were accepted as the original product, and the IgG1 molecules produced by the CHO-F cell line were evaluated as biosimilars of the original product. Physicochemical characterization and comparison studies were carried out with the original and biosimilar IgG1's obtained from the two cell lines.