Terapötik bir monoklonal antikorun ortogonal kromatografik metotlarla karakterizasyonunun yapılması
Characterization of a therapeutic monoclonal antibody by orthogonal chromatographic techniques
Yazar: CİHAT ALTAS
Danışman: PROF. DR. GAYE ÖNGEN ÖZGEN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; Hidrofobik kromatografi = Hydrophobic chromatography ; Ters faz kromatografisi = Reverse phase chromatography ; Yüksek basınç sıvı kromatografisi =   ; İyon kromatografisi = Ion chromatography

Özet:
Biyoteknolojik ilaç sınıfının en büyük kolu monoklonal antikorlardır. Terapötik monoklonal antikorlar  farmasötik alanda 1986 yılından beri kullanılmaktadır. Son 5 yılda 40'ın üzerinde terapötik monoklonal antikor FDA tarafından onaylanmıştır. Son 10 yılda biyoteknolojik ilaçların pazar payı hızla yükselmektedir.
Patentli orijinal biyoteknolojik ilaçların patent sürelerinin bitmesi biyobenzer pazarını doğurmuştur. Biyobenzer monoklanal antikor adayları regulasyonlara uygun olarak çok iyi karakterize edilmesi gerekmektedir. Orijinal moleküle fizikokimyasal benzerlik klinik olarak biyobenzerin güvenlik ve etkinlik başarısını arttırmaktadır.
Kromatografik yöntemler, monoklonal antikorun fizikokimyasal özellikleri ve karakterizasyonun belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Protein A, Ters faz kromatografisi, Hidrofobik etkileşim kromatografisi, Hidrofilik etkileşim kromatografisi, Boyut eleme kromatografisi ve Katyon değişim kromatografisi kullanılarak ortogonal yöntemler ile Belimumab terapötik monoklonal antikoru karakterizasyonu yapılmıştır.  
Belimumab monoklonal antikoru Hc bölgesi amino asit sekansı sonucunda  Gln-Asp-Glu-Leu-Thr-Gln-Asp-Pro-Ala-Val peptidine sahip olduğu bulunmuştur. Amino asit kompozisyonu analizi ile Triptofan ve Sistein elde edilememiştir. Belimumab amino asit kompozisyonunda en az metiyonin amino asitine, en fazla serin amino asitine sahiptir. Protein A kromatografisi ile miktar tayini metotu geliştirilmiştir. Doğrusallık grafiği R2=0,9994 bulunmuştur. Ters faz kromatografi miktar tayini ve impürite metotları geliştirilmiştir. Ters Faz doğrusallık grafiği R2=0.9998 bulunmuştur. İmpurite metotunda yaklaşık %8 impurite bulunmuştur. Hidrofobik etkileşim kromatografisi ile okside örnekler ayrılmıştır. Hidrofilik etkileşim kromatografisi ile Glikan profili ve %35 ile en fazla G1Fa glikanı olduğu bulunmuştur. Katyon değişim kromatografisi ile yük varyantlarının %8-12 arasında değiştiği ve asidik varyantların bazik varyantlardan fazla olduğu bulunmuştur. Molekül ağırlığı Sec-malls sistemi ile 142-145 kDa arasında olduğu, kütle spektroskopisine göre 147.016 kDa olduğu bulunmuştur.
Bu tez çalışması ile Belimumab orijinal monoklonal antikorun fizikokimyasal özellikleri ve karakterizasyon profili belirlenmiştir.

Abstract:
Monoclonal antibodies are the largest class of biotechnological drugs. Therapeutic monoclonal antibodies have been used since 1986. FDA has approved more than fourty therapeuetic monoclonal antibodies in last five years. Market share of biopharmaceuticals has been increasing in pharma industry for ten years. 
Expiration of the original patents of biotechnological drugs has resulted in the emergence of biosimilars. Biosimilar candidate monoclonal antibodies should be characterized according to regulatory compliance. The more physicochemically biosimilar a candidate biosimilar is to the original molecule, the higher are the clinical safety, efficacy and success.
Chromatographic techniques have widely been used for assessment of physicochemical properties and characterization of monoclonal antibodies. Belimumab, which is a therapeutic monoclonal antibody, was characterized with orthogonal methods by using protein A, reverse phase, hydrophobic interaction, hydrophilic interaction, size exclusion and cation exchange chromatography techniques. 
It was found that constant region in heavy chain (Hc) domain of monoclonal antibody Belimumab has the peptide sequence Gln-Asp-Glu-Leu-Thr-Gln-Asp-Pro-Ala-Val. Trp and Cys could not be obtained by amino acid composition analysis. The most abundant amino acids in Belimumab are methionine and cysteine is the least abundant ones. Antibody titer determination method was developed by Protein A chromatography and R2 was found 0.9994. Protein titer quantification and impurity testing methods were developed by reverse phase chromatography. According to impurity assay, percentage impurity value was found 8%. Oxidized groups were separated by hydrophobic interaction chromatography. Glycan profile was determined by hydrophilic interaction chromatography and it was found that amount of G1Fa 35%, which is the most abundant. According to the results of cation-exchange chromatography analysis, charge variants are within the range of 8-12% and there are more acidic variants than basic variants. Molecular weight was measured by SEC-MALS and mass spectrometry. Molecular weight was found between 142 kDa and 145 kDa by SEC-MALS and 147.016 kDa by mass spectrometry.
In this thesis, physicochemical features and characterization profile of Belimumab monoclonal antibody were determined.