Schizosaccharomyces pombe'de ikili moleküler floresans komplemantasyon yöntemiyle bazı replikasyon proteinlerinin etkileşimlerinin in vivo analizi
In vivo analysis of certain replication proteins interactions by using bimolecular fluorescence complementation method in Schizosaccharomyces pombe
Yazar: GÖKHAN AKMAN
Danışman: DOÇ. DR. STUART A. MACNEİLL ; PROF. DR. AYŞEGÜL TOPAL SARIKAYA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Ökaryotik hücrelerde kromozom replikasyonu, genomun nesilden nesile doğru bir şekilde aktarımı için oldukça karmaşık bir şekilde düzenlenmektedir. Son yıllarda, ökaryotlarda DNA replikasyonunun moleküler mekanizmasının anlaşılması konusunda büyük ilerlemeler kaydedilmiş olmakla beraber, replikasyonun en önemli aşamalarından biri olan DNA çift sarmalının açılmasının nasıl gerçekleştiği tam olarak aydınlığa kavuşmamıştır. Yapılan çalışmalar, MCM kompleksinin, Cdc45 ve GINS kompleksiyle beraber S fazında DNA çift sarmalının açılmasında görev aldığını göstermektedir.Bu çalışmada, Schizosaccharomyces pombe'de replikasyonda yer alan proteinlerin birbirleriyle ilişkilerini incelemek amacıyla floresan ışıma temeline dayanan ?İkili Moleküler Komplementasyon? (Bimolecular Fluorescence Complemantation, BiFC) yönteminden faydalanılarak, replikasyon proteinlerinin birbirleriyle olan ilişkilerinin in vivo olarak incelenmesi amaçlandı. Bu yöntem ile birbirleriyle etkileşime giren proteinlerin hücre içi yerleşiminin incelenebilmesi mümkün olabilmektedir. BiFC yöntemini uygulamak amacıyla, bir rekombinant sarı floresan protein olan Venüs proteininin, floresan özelliğe sahip olmayan N ve C terminal parçaları kullanıldı. Bu parçaların birbirleriyle etkileşime giren proteinlere eklendi. Bu proteinlerin etkileşimi, eklenen parçaların bir araya gelip, yeniden katlanmaları ve floresan ışımanın meydana gelmesiyle gözlemlendi.BiFC yönteminin uygulanabilirliğini kolaylaştırmak ve S. pombe'de hedef proteinlerin C ucu bölgelerine füzyonu gerçekleştirmek amacıyla bir dizi vektör tasarlandı. GINS kompleksinin dört alt ünitesinden ikisini kodlayan: psf1, psf2 ve MCM kompleksinin altı alt ünitesinden ikisin kodlayan: mcm2, mcm4 ve cdc45 geninin yapısı, kendi genomik bölgelerinde genlerin anlatım düzeyi yabani ırk ile aynı kalacak şekilde değiştirilmeden PCR aracılı gen hedefleme yöntemi ile değişime uğratıldı.BiFC yöntemiyle elde edilen verilere göre Psf1 ve Mcm4 proteinlerinin nukleusta tüm hücre çevrimi boyunca etkileşime girmektedir ve sadece S fazında kromatin materyaline bağlanmaktadır. Ayrıca diploid hücreler kullanılarak Mcm4 proteininin bir başka Mcm4 proteini ile etkileşimi incelendiğinde, Mcm4-Mcm4 proteinlerinin, Psf1-Mcm4 poteinlerine benzer şekilde, nukleusta ışıma gösterirken sadece S evresinde kromatin materyaline bağlandığı gösterilmiştir

Abstract:
Chromosome replication in eukaryotic cells is regulated in a highly complex fashion in order to stable transmission of the genom from one generation to the next. Although, there has been significant progress to be understood the molecular mechanisms of eukaryotic DNA replication in recent years, the identity of the primary activity that unwinding of the parental DNA duplex has remained unclear. Several recent reports confirm that the MCM complex associated with two partners, Cdc45 and GINS complex, is responsible for the unwinding of DNA during S phase.In this study, we describe flourescence-based method, ?Bimolecular Fluorescence Complementation? (BiFC) in fission yeast S. pombe to investigate protein dynamics and interactions between replication proteins in vivo by using. This method allows to visualization of subcellular localization of protein interactions. To apply BiFC method, N? and C- terminal fragments of non-fluorescent fragments of a recombinant yellow fluorescence protein, Venus, are fused to the interacting partners. The interaction brings the fragments together, which then fold, reassemble and fluoresce.To facilitate the applicaton of BiFC, we designed series of vectors for easy construction of C-terminal fussion of the target protein in S. pombe. The modifications are carried out by PCR-mediated gene targeting of five genes encoding psf1 and psf2 (encoding two of the four subunit of GINS), mcm2 and mcm4 (two of the six subunits of the MCM complex) and cdc45 at the genomic level, thus resulting in the tagged yeast proteins being expressed at wild-type levels.BiFC data indicated that Psf1 and Mcm4 interacted in the nucleus throughout the cell cycle and chromatin association occurs only during S-phase. We also analysed self-association of Mcm4 in diploid cells. As with the Psf1-Mcm4 interaction, Mcm4-Mcm4 displayed nuclear flourescence and chromatin association occurs only during S-phase.