Anne sütü yağına benzer yapılandırılmış yağ üretimi
Production of structured lipids resembling human milk fat triaclyglycerols
Yazar: NEŞE ŞAHİN YEŞİLÇUBUK
Danışman: PROF.DR. F. ARTEMİS KARAALİ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Anne sütü yagı, bebek beslenmesi ve gelisimi açısından anne sütünün önemli birbilesenidir. Anne sütü yagında bulunan triaçilgliserol'ler (TAG), palmitik asidi(C16:0) %60-70 oranında gliserol molekülünün sn-2 pozisyonunda, uzun zincirlidoymamıs yag asitlerini (YA) ise çogu bitkisel ve hayvansal kaynaklı yaglardanfarklı olarak sn-1,3 pozisyonlarında bulundurmaktadırlar.Bebek için anne sütü yagındaki bu özgün pozisyonun, bebeklerin sindirim veabsorpsiyon metabolizmalarını olumlu etkileyen etmenlerden biri oldugudüsünülmektedir. Anne sütü yagına benzer yapılandırılmıs yag (YY)'ların bitkiselkaynaklı yaglardan spesifik lipaz enzimlerinin katalizledigi interesterifikasyontepkimeleri ile üretilmeleri ve bu YY'ların bebek maması formülasyonlarındakullanımı artık endüstriyel ölçekte mümkün olmaktadır.Bu çalısma dört farklı kısımdan olusmaktadır. Çalısmanın birinci kısmında, annesütü yagında bulunan baslıca uzun zincirli yag asitlerini içeren ve anne sütü yagınabenzer YY'ların enzimatik interesterifikasyon (asidoliz) tepkimesi ile elde edilmesiamaçlanmıs ve asidoliz tepkimeleri ekonomik açıdan ülkemiz için önemli bir bitkiselyag olan fındık yagı SYA, tripalmitin ve stearik asit arasında, Rhizomucor mieheiorjinli Lipozyme® RM IM immobilize sn-1,3 spesifik lipaz enzimi katalizörlügündegerçeklestirilmistir. Bu asamada asidoliz tepkimelerine substrat mol oranı, reaksiyonsıcaklıgı ve reaksiyon süresi gibi faktörlerin etkisi incelenmistir.Çalısmanın ikinci asamasında ise, fındık yagı serbest yag asitleri (SYA) vetripalmitin kullanılarak, Lipozyme® RM IM lipaz enzimi katalizörlügündegerçeklesen enzimatik interesterifikasyon (asidoliz) reaksiyonları ile anne sütüyagına benzer YY'lar eldesi ve tepki-yüzey yöntemi ile reaksiyon kosullarınınoptimizasyonu amaçlanmıstır. Ayrıca elde edilen optimum kosullar kullanılarak tanktipi kesikli biyoreaktörde laboratuar ölçekli üretim gerçeklestirilmistir.Çalısmanın üçüncü bölümünde ise, gamma-linolenik asit (GLA) ile zenginlestirilmisanne sütü yagına benzer YY'ların üretiminin tripalmitin, fındık yagı SYA ve hodan(boraj) yagından konsantre edilen GLA arasında enzimatik asidoliz tepkimeleri ilegerçeklestirilmesi ve tepki-yüzey metodu ile reaksiyon kosullarının optimizasyonuamaçlanmıstır. Lipozyme® RM IM ve Thermomyces lanuginosus orijinli Lipozyme®TL IM sn-1,3 spesifik lipaz enzimleri enzimatik asidoliz reaksiyonlarındabiyokatalizör olarak kullanılmıstır.Çalısmanın dördüncü bölümünde ise, iki önemli omega-3 yag asidi olaneikosapentaenoik asit (EPA) ve dokosahekzaenoik asit (DHA) ile zenginlestirilmisanne sütü yagına benzer YY'ların üretimi, tripalmitin, fındık yagı SYA ve omega-3YA konsantresi arasında enzimatik asidoliz reaksiyonları ile gerçeklestirilmesi vetepki-yüzey metodu ile reaksiyon kosullarının optimizasyonu amaçlanmıstır.Enzimatik asidoliz tepkimelerinde Lipozyme® RM IM enzimi kullanılmıstır.Çalısmanın ikinci, üçüncü ve dördüncü asamalarında gerçeklestirilen reaksiyonlarınüzerinde seçilmis farklı faktörlerin etkilerinin incelenmesi ve optimum kosullarınbelirlenmesi amacıyla, 5 seviyeli Merkezil Bilesik Deney Tasarımı (CCD)kullanılmıs ve faktörler olarak da "substrat mol oranı (Toplam YA/TAG, Sr)","reaksiyon sıcaklıgı (T, ºC)" ve "reaksiyon süresi (t, saat)" seçilmistir. Faktörlerin vearalıkların seçiminde hem birinci çalısmada elde edilen sonuçlardan hem de öndeneme sonuçlarından yararlanılmıstır.Uzun zincirli yag asitlerini içeren ve anne sütü yagına benzer YY'ların eldesinde,tripalmitine katılan (inkorpore olan) stearik ve oleik asit miktarlarının reaksiyonsüresi ile birlikte arttıgı, ayrıca oleik asidin tripalmitine katılma oranının "substratmol oranı" ile arttıgı gözlenmistir. Stearik asitin en fazla katılımı [1:3:0,75] substratmol oranında gerçeklesmistir. Reaksiyon ürünlerinin oleik/palmitik asit oranının"substrat mol oranı" ve "süre" ile birlikte arttıgı ve "substrat mol oranı" [1:12:1,5],65ºC sıcaklık ve 24 saat reaksiyon süresi kosullarında elde edilen ürünün en yüksek(1,2) oleik/palmitik asit oranına sahip olmustur.kinci kısımda yapılan çalısmada, ?çoklu regresyon? ve ?geriye dönük eleme?yöntemleri kullanılarak tepki (oleik/palmitik asit oranı) için basarılı kuadratikmodeller elde edilmistir. Üründeki oleik/palmitik asit oranının 1,25 olmasıhedeflenmis ve bu ürünü elde etmek için gerekli optimum kosullar [Sr: 12,2, T:64,5ºC ve t: 24 saat] olarak bulunmustur. Bu kosullar kullanılarak hem modelindogrulugunu tespit amacıyla reaksiyonlar test tüplerinde gerçeklestirilmis hem deaynı kosullar kullanılarak laboratuar ölçekli karıstırmalı tank tipi biyoreaktörde YYüretimi gerçeklestirilmistir.Üçüncü asama olan GLA ile zenginlestirilmis anne sütü yagına benzer YY eldesiçalısmasında, iki farklı enzim (Lipozyme® RM IM ve Lipozyme® TL IM) kullanımıile gerçeklestirilen reaksiyonlar sonucunda seçilen tepkiler [oleik asit miktarı (%) veGLA miktarı (%)] için, ?çoklu regresyon? ve ?geriye dönük eleme? yöntemleriuygulanarak basarılı kuadratik modeller elde edilmistir. Bu asamada üründe GLAmiktarının %10, oleik asit miktarının ise %45 olması hedeflenmistir. Lipozyme® RMIM enzimi ile bu özelliklerde ürün elde etmek için optimum kosullar [Sr: 14,8, T:55ºC ve t: 24 saat] olarak bulunurken Lipozyme® TL IM enzimi ile ise [Sr: 14,0, T:55ºC ve t: 24 saat] olarak bulunmustur. Bu kosullarda modelin dogrulugu tespitedilmis ve bebek beslenmesi ve saglıgı açısından önemli etkileri olan GLA ilezenginlestirilmis ve anne sütü yagı ile benzer absorpsiyon özelliklerine ve yag asidikompozisyonuna sahip YY üretimi mümkün olmustur.Dördüncü asama olan omega-3 YA (EPA ve DHA) ile zenginlestirilmis anne sütüyagına benzer YY eldesi çalısmasında ise seçilen tepkiler [EPA+DHA miktarı (%) veoleik asit miktarı (%)] için, ?çoklu regresyon? ve ?geriye dönük eleme? yöntemleriuygulanarak basarılı kuadratik modeller elde edilmistir. Bu asamada üründekiEPA+DHA miktarının %5, oleik asit miktarının ise %40 olması hedeflenmistir.Lipozyme® RM IM enzimi ile bu özelliklerde ürün elde etmek için gerekli olanoptimum kosullar [Sr: 12,4 T: 55ºC ve t: 24 saat] olarak bulunmus ve bu kosullardamodelin dogrulugu tespit edilmistir. Elde edilen YY hem bebek beslenmesi vesaglıgı açısından önemli etkileri olan omega-3 YA (EPA ve DHA) ilezenginlestirilmis hem de absorpsiyon özellikleri/yag asidi bilesimi bakımından annesütü yagı ile benzer ürün üretimi mümkün olmustur. Bu yeni ürünün ticari ölçektebebek mamalarında kullanımıyla bebek beslenmesi ve gelisimine önemli katkılarınınolacagı düsünülmektedir.

Abstract:
Human milk fat is one of the most significant components of human milk. Humanmilk fat is characterized by the dominance of triacylglycerols where 60-70% ofpalmitic acid (C16:0) is located at the sn-2 position of the glycerol backbone,whereas unsaturated fatty acids are located mainly at the sn-1 and sn-3 positions; thisunique structure is different from most vegetable oils and animal fats. Previousreports provided convincing information that the higher fatty acid (FA) and calciumabsorption and efficient use of dietary energy was the result of this specific positionof these fatty acids in triacylglycerol (TAG) moiety. Structured lipids (SL)resembling human milk fat can now be produced at industrial scale by lipasecatalyzedinteresterification reactions from vegetable oils, for including in term andpreterm infant formula.This study consists of four different parts. In the first part, it was aimed to producestructured lipids resembling human milk fat containing long-chain fatty acids byenzymatic interesterification (acidolysis) reactions between free fatty acids ofTurkish hazelnut oil, tripalmitin, and stearic acid using sn-1,3 specific lipase,Lipozyme® RM IM obtained from Rhizomucor miehei. The effects of substrate molarratio, reaction temperature and reaction time on the progress of acidolysis reactionswere investigated.In the second part of the study, it was aimed to produce human milk fat substitutesfrom hazelnut oil free FA and tripalmitin by enzymatic interesterification (acidolysis)reactions catalyzed by Lipozyme® RM IM lipase enzyme. The reaction conditionswere modeled and optimised by response-surface methodology (RSM). Optimumconditions were used to synthesize SLs using laboratory scale stirred tank batchbioreactor.In the third part of the study, it was aimed to produce human milk fat substitutesenriched with gamma-linolenic acid (GLA) by enyzmatic interesterification(acidolysis) reactions with tripalmitin, hazelnut oil FA and GLA obtained fromborage oil as well as to optimize reaction conditions by response surfacemethodology. Lipozyme® RM IM and Lipozyme® TL IM obtained fromThermomyces lanuginosus were used as the biocatalyst for the enzymatic acidolysisreactions.In the fourth part of the study, it was aimed to produce human milk fat substituteenriched with omega-3 FA (EPA and DHA) by enzymatic acidolysis reactionsbetween tripalmitin, hazelnut oil FA and omega-3 FA concentrate as well as tooptimize reaction conditions by RSM. Lipozyme® RM IM was used in the acidolysisreactions.In the studies (two, three and four), circumscribed central composite (CCC) designwith five levels and three factors chosen as "substrate molar ratio (Total FA/TAG,Sr)", "reaction temperature (T, ºC)" and "reaction time (t, h)" were used to model andoptimize the reaction conditions via RSM. The independent variables and their levelswere chosen based on the results of the first study and the reaction trials.For the production of human milk fat substitutes containing long-chain fatty acids, itwas found that incorporation of oleic and stearic acids into tripalmitin increased withthe reaction time. Incorporation of oleic acid increased with the substrate molar ratio.The highest incorporation of stearic acid was achieved at "substrate molar ratio" of[1:3:0,75]. The oleic/palmitic acid ratio of the reaction products was increased withsubstrate molar ratio and reaction time and the product obtained at substrate molarratio of [1:12:1,5], 65ºC reaction temperature and 24 h reaction time had the highestoleic/palmitic acid ratio (1,2).In the second part of the study, good quadratic models were obtained for [oleic acid:palmitic acid] ratio by multiple regression and backward elimination for theproduction of human milk fat substitutes. The optimum conditions generated fromthe model for the targeted [oleic acid: palmitic acid] ratio (1,25) were [Sr: 12,2mol/mol, T: 64,5°C and t: 22,8 h]. Using these optimal conditions, reactions weredone in test tubes in order to verify the model, and also structured lipid productionwas done at laboratuary scale stirred-tank batch bioreactor using the same conditions.For the production of human milk fat substitutes enriched with GLA, which is thethird part of the study, good quadratic models were obtained for the incorporation ofGLA (response 1) and oleic acid (response 2) by multiple regression and backwardelimination. The optimal conditions generated from the models for the targeted GLA(10%) and oleic acid (45%) incorporation were [Sr: 14,8 mol/mol, T: 55°C and t: 24h] and [Sr: 14 mol/mol, T: 55°C and t: 24 h] for the reactions catalyzed byLipozyme® RM IM and by Lipozyme® TL IM, respectively. A human milk fatsubstitute product containing GLA was successfully produced having both theassociated health benefits of GLA and similar fatty acid composition as well assimilar absorption characteristics with human milk fat.For the production of human milk fat substitutes enriched with omega-3 FA (EPAand DHA), which is the fourth part of the study, good quadratic models wereobtained for the responses [EPA+DHA (%) and oleic acid content (%)] by multipleregression and backward elimination. The targeted TAG product was aimed tocontain omega-3 FA (EPA+DHA) and oleic acid at 5% and 40%, respectively. Theoptimal conditions generated from the models for the targeted product were [Sr: 12,4mol/mol, T: 55°C and t: 24 h]. The model was further verified with the optimumconditions. The product was enriched with omega-3 FAs (EPA and DHA) with thepotential to deliver both the health benefits associated with omega-3 FAs and theabsorption characteristics/fatty acid composition similar to human milk fat. This SLmay be an important ingredient for commercial use in infant formula and contributeto the infant nutrition and development.