Nişasta içeren atıklardan mikrobiyal amilazın elde edilmesi
Isolation of microbial amylase from starch-containing wastes
Yazar: İREM ÇELEBİER
Danışman: PROF. DR. NEVİN KESKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Enzimler, bilimsel araştırmalardan endüstriyel uygulamalara kadar pek çok alanda kullanılmaktadır. Genişleyen enzim pazarındaki ürünlerin miktarca artışı ve yeni biyokatalizörlere olan talepten dolayı ticari enzim üretimi son 10 yıldır hızlı bir büyüme göstermiştir. Dünya enzim ticaretinde büyük bir paya sahip olan amilazlar gıda, içecek, tekstil, deterjan ve tıp gibi pek çok alanda kullanılmaktadır. Özellikle nişasta endüstrisinde kullanılan termostabil amilazlar, endüstriyel enzimlerin %25' ini oluşturmaktadır. Bu tez çalışmasında, ekonomik değeri olmayan çeşitli atıklardan katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile Bacillus subtilis ATCC 6633 ve Aspergillus niger ATCC 16404 suşları kullanılarak bakteriyel ve fungal kaynaklı α-amilaz enzimi çalışılmıştır. Enzim üretimi için uygun atık çeşidi, sıcaklık, süre, pH, nem miktarı, inokülüm hacmi, atık boyutu ve nemlendirici ajan belirlenmiştir. Ayrıca farklı karbon ve azot kaynaklarının, metal tuzlarının, deterjan çözeltilerinin enzim üretimi ve aktivitesi üzerindeki etkisi incelenmiştir. Fungal ve bakteriyel α-amilaz enzimi kısmi olarak saflaştırılmıştır. 
Katı faz fermantasyon (SSF) ortamlarının hazırlanması için on farklı atık kullanılmıştır. Çalışmalar sonunda bakteriyel amilaz için en iyi üretim ortamının muz kabuğu, fungal amilaz için ise pirinç kabuğu olduğu belirlenmiştir. Bakteriyel amilaz için en iyi inkübasyon süresi 72 saat, inkübasyon sıcaklığı 37 °C,  ortam pH' sı ise pH 7.0 olarak tespit edilmiştir. Fungal amilaz için ise, en iyi inkübasyon süresi 48 saat, inkübasyon sıcaklığı 30 °C,  ortam pH' sı ise pH 5.0 olarak belirlenmiştir. Bakteriyel amilaz üretimi için optimum inokülüm hacmi 3 ml, nem miktarı %10, atık boyutu 1500 µm, nemlendirici ajan çeşme suyu olarak belirlenmiştir. Fungal amilaz üretimi için ise, optimum inokülüm hacmi 2 ml, nem miktarı %60, atık boyutu 1000 µm, nemlendirici ajan tuz solüsyonu olarak saptanmıştır. %1 oranında ortama eklenen karbon kaynaklarından mannoz ve galaktozun bakteriyel amilaz üretimini, arabinozun ise fungal amilaz üretimini arttığı, diğer karbon kaynaklarının ise her iki amilazında üretimini azalttığı görülmüştür. %1 oranında ortama eklenen azot kaynaklarının hepsinin hem bakteriyel hem de fungal amilaz üretimini inhibe ettiği belirlenmiştir. %0,1 oranında ortama eklenen metal tuzlarından MnSO4.H2O' nun az miktarda bakteriyel amilaz üretimini arttırdığı, diğer metallerin ise azalttığı tespit edilmiştir. Ortama eklenen metal tuzlarının tamamı fungal amilaz üretimini inhibe etmiştir. Kullanılan deterjan çözeltileri ise hem bakteriyel hem de fungal amilazın aktivitesini önemli miktarda azaltmıştır. Enzimin maksimum aktivite gösterdiği sıcaklık ve pH ile ilgili yapılan deneyler göre, bakteriyel amilaz 60 °C ve pH 6.5' te maksimum aktivite göstermiştir. Fungal amilazın ise 40 °C ve pH 6.5' te maksimum aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. Yapılan SDS-PAGE analizi ile Bacillus subtilis ATCC 6633 amilazının molekül ağırlığı ~70 kDa, Aspergillus niger ATCC 16404 amilazının ise molekül ağırlığı ~60 kDa olarak tespit edilmiştir. 
Bu tez çalışmasının, ekonomik değeri olmayan atıklardan amilaz üretimi ve bu enzimin endüstriyel olarak pek çok alanda kullanımına fayda sağlanacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Enzymes are used in various areas from scientific research to industrial application. Production of commercial enzymes has shown a rapid progression over the last 10 years due to demand for novel biocatalysts and increasing product amounts of expanding enzyme markets. Amylases which have large margin in the world enzyme trade have been used in various industrial areas such as food, beverage, textile, detergent and medicine. Especially, thermostable amylases which are used in starch industry constitute 25% of industrial enzymes. 
In this study, bacterial and fungal amylase enzymes were produced from various valueless wastes  by solid state fermentation (SSF) using Bacillus subtilis ATCC 6633 and Aspergillus niger ATCC 16404. The waste type, temperature, time, pH, moisture content, volume of inoculum, waste size and wetting agents suitable for enzyme production were determined. The effects of carbon and nitrogen sources, metal ions, and detergent solutions were examined on enzyme production and activity. Fungal and bacterial amylases were partially purified.
Various 10 wastes were used as substrate for preparing SSF medium. Results of this study, the best production medium were determined as banana husk for bacterial amylase, whereas the best production medium for fungal amylase was determined as rice husk. Best incubation time, incubation temperature and the medium pH of bacterial amylase was determined as 72 hours, 37°C and pH 7.0 respectively. Best incubation time, incubation temperature and the medium pH of fungal amylase was determined as 72 hours, 37°C, and pH 7.0, respectively. Optimum inoculum volume as 3 ml, moisture content 10%, waste size 1500 µm and tap water as moisturiser agent were determined for production of bacterial amylase. Furthermore, optimum inoculum volume 2 ml, moisture content 60%, waste size 1000 µm and saline solution as moisturiser agent were determined for production of fungal amylase. Bacterial amylases production increased when 1% mannose and 1% galactose were added as carbon source in the medium. Besides, fungal amylases production increased when 1% arabinose was added as carbon source in the medium. Both bacterial and fungal amylases demonstrated decreasing activity for other carbon sources. Both bacterial and fungal amylases lost their activities when 1% nitrogen source was added to the medium. When MnSO4.H2O was added to the medium bacterial amylase production slightly increased whereas other metal salts did not change the production of bacterial amylase. All of the metal sources which were added to medium showed inhibition for the production of fungal amylase. The activities of detergent solutions which were used both for fungal and bacterial amylases decreased significantly. According to the experiments related to temperature and pH which enzyme shows the maximum activity, bacterial amylase showed maximum enzyme activity at 60°C and pH 6.5. Besides, fungal amylase was also determined to show maximum enzyme activity. Molecular weights of Bacillus subtilis ATCC 6633 and Aspergillus niger ATCC 16404 amylases were detected by SDS-PAGE analyses as ~ 70 kDa, ~60 kDa, respectively. 
The results of this study revealed that it will enable the amylase production using wastes carrying no economic value and provide industrial benefits in many areas.