Rekombinant tümör farklılaşma faktörü üretimi ve meme kanseri hücreleri üzerindeki terapötik etkilerinin araştırılması
Production of recombinant tumor differentiation factor and assessment of its therapeutic effects on breast cancer cells
Yazar: SÜREYYA MERT SELİMOĞLU
Danışman: PROF. MURAT KASAP
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücre kültürü = Cell culture ; Hücre transformasyonu-neoplastik = Cell transformation-neoplastic ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic

Özet:
Amaç: Tümör farklılaşma faktörü (TFF) in vivo ve in vitro ortamlarda uygulandığında, meme kanseri tümör hücrelerini farklılaştırarak invazif niteliklerinin kaybolmasına yol açmaktadır. İlk defa Platica ve diğ. (2004)'nin sıçan hipofiz bezinde TFF'nin kısa formu olan TFF-P1 peptidini kullanarak yapmış oldukları bir çalışma ile böyle bir faktörün varlığı gösterilmiştir. Araştırmacılar bu çalışmada, TFF-P1'in kandaki yarılanma ömrünün oldukça düşük olduğunu gözlemleyerek farelere günde iki kez enjeksiyon yapmak zorunda kalmışlardır. Kandaki kısa yarı ömüründen ötürü TFF-P1'in terapötik amaçlı kullanılması mümkün olmamıştır. Çalışmamızda kısa yarı ömründen dolayı kullanılamayan bu faktörün, renal atılıma daha dirençli ve daha iyi aktivite gösteren bütüncül formdaki TFF proteinin üretilmesi amaçlanmıştır. Ayrıca çalışmamız kapsamında bütüncül TFF proteinine IgG1-Fc uzantısı eklenerek hem kandaki yarılanma ömrü daha uzun, hem de immün sistemi tetikleyebilir nitelikte bir terapötiğin üretilmesi ve in vitro ortamda test edilmesi gerçekleştirilmiştir.
Yöntem: Yapılan çalışmalarda in silico tasarım, modelleme ve sonrasında HEK293F süspanse hücre hattı kullanılarak bütüncül TFF üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretim ve saflaştırma çalışmaları sonrasında elde edilen bütüncül rekombinant TFF proteini'nin (rTFF) doğrulanması amacı ile LC-MS/MS, SDS-PAGE ve western blotlama analizleri yapılmıştır. Hedeflenen şekilde üretildiği kanıtlanan protein, HeLa hücre hattı, MCF-7 hücre hattı ve bir hastanın invazif meme tümör dokusundan elde edilen primer hücre hattı üzerinde hücre canlılığı, proliferasyon ve önemli tümör markırlarına ilişkin in vitro etkinlik testlerine tabi tutulmuştur.
Bulgular: Yapılan testler neticesinde, elde edilen rTFF'nin hedeflenen şekilde eksprese edildiği, başta MCF-7 hücre hattı olmak üzere yeni geliştirilen primer hücre hattı üzerinde yüksek aktivite gösterdiği ve bu şekilde hücrelerin farklılaşarak malignant karakterden, benign bir karaktere farklılaşmalarında başarılı olunduğu gösterilmiştir.
Sonuç: Çalışmamız kapsamında özgün bir tasarım ile geliştirilen rTFF proteininin meme tümörü hücreleri üzerinde terapötik etki gösterme potansiyeline sahip olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Objective: Tumor differentiation factor (TDF) differentiates breast cancer cells in vivo and in vitro, leading to loss of their invasive properties. Platica et al. (2004) showed the presence of TDF in pituitary gland of rats. They used truncated form of TDF called TDF-P1 peptide and performed subcutaneous injections to mice twice a day with high doses of the peptide. Their need of performing such a high dose of injection came from the fact that the half-life of the TDF-P1 is very short in circulation. However, this type of high dosage application has no use in practical and cannot find a place in clinical therapies. Therefore, in this study, we aimed to produce TDF protein in full-length and hoped to achieve higher activity and longer half-life in circulation.
Method: In here, in silico design and modeling studies were performed and the Fc domain of IgG1 was conjugated to the full-length recombinant TDF (rTDF) to increase its half-life in circulation. The subsequent production was achieved in the HEK293F suspended cell line. LC-MS/MS, SDS-PAGE and western blotting analyzes were performed to confirm the production of rTDF. Several trials were performed to purify the recombinant protein in its soluble form. The in vitro efficacy of the produced Fc-TDF fusion protein was monitored by cell viability and proliferation assays using HeLa, MCF-7 and a primary breast-cancer cell line.
Results: In overall, we have shown that the Fc-TDF was displayed higher in vitro tumor suppressor activity on the primary breast cancer and the MCF-7 cell lines in comparison to TDF-P1 peptide. When Fc-TDF was applied to cell cultures of the primary breast cancer and the MCF-7 cell lines, the cells differentiated from a malignant to a more benign character.
Conclusions: The rTDF protein, which was developed with a unique design within the scope of our study, has proven to have the potential to exert a therapeutic effect on breast tumor cells in-vivo.