Farklı nanomalzemeler ile glukoz biyosensörlerinin hazırlanması ve uygulama potansiyellerinin araştırılması
Design of glucose biosensors using different nanoparticles and their applications in glucose sensing
Yazar: ÇAĞLAR ÖZDEMİR
Danışman: DOÇ. DR. SUNA TİMUR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyosensörler = Biosensors ; Glükoz oksidaz = Glucose oxidase ; Nanokompozitler = Nanocomposites ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Polianilin = Polyanilines

Özet:
Bu tez projesi kapsamında, üç farklı glukoz biyosensörü tasarlandı. Piranoz oksidaz (POx) ve glukoz oksidaz (GOx) enzimleri farklı immobilizasyon metodlarıyla elektrot yüzeyine immobilize edildi. Bu sistemlere yönelik optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları yapıldı.Poliamidoamin (PAMAM) temelli piranoz oksidaz biyosensörüne yönelik yapılan optimizasyon çalışmalarına göre optimum enzim miktarı ve pH; 9,4 U ve 6 olarak bulundu. Bu koşullarda, glukoz için doğrusal tayin aralığı 0,025 mM-0,5 mM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde 0,3 mM glukoz için tekrarlı 7 ölçüm alındı. Standard sapma (S.D) ve varyasyon katsayısı (c.v) ± 0,011 mM ve % 3,57 olarak bulundu. Operasyonel kararlılığın belirlenmesi amacıyla belirli aralıklarla 9 gün boyunca ölçüm alındı. İlk 2 günde alınan 30 ölçüm sonunda aktivite kaybı gözlenmedi. 9 günde alınan 80 ölçüm sonunda biyosensör cevabının % 50 azaldığı gözlendi. Tekrar üretilebilirlik ve substrat spesifikliği belirlendi. Ayrıca bu sistem FIA sistemiyle kombine edildi. Bu sistemde aynı koşullar altında, glukoz için doğrusal tayin aralığı 0,025 mM-1 mM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde 0,5 mM glukoz için tekrarlı 10 ölçüm alındı. Standard sapma (S.D) ve varyasyon katsayısı (c.v) ± 0,019 mM ve % 3,69 olarak bulundu. Operasyonel kararlılığın belirlenmesi amacıyla 6 saat boyunca 15 ölçüm alındı ve biyosensör cevabının % 9,3 oranında azaldığı gözlendi. Tekrar üretilebilirlik ve substrat spesifikliği belirlendi.Altın nanopartikül (AuNP)-polianilin (PANI)/AgCl/jelatin nanokompozit temelli piranoz oksidaz biyosensörü ikinci sistem olarak geliştirildi. Yapılan optimizasyon çalışmalarına göre optimum enzim miktarı ve pH; 0,75 U ve 6,5 olarak bulundu. Bu koşullarda, glukoz için doğrusal tayin aralığı 0,05 mM-0,75 mM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde 0,25 mM glukoz için tekrarlı 6 ölçüm alındı. Standard sapma (S.D) ve varyasyon katsayısı (c.v) ± 0,005 mM ve % 2,16 olarak bulundu. Operasyonel kararlılığın belirlenmesi amacıyla 6 saat boyunca 8 ölçüm alındı ve biyosensör cevabının % 12 oranında azaldığı gözlendi. AuNP'nin biyosensör cevabına etkisi ve substrat spesifikliği belirlendi. Son olarak biyosensör, doğal örneklerdeki glukoz miktarının analizi için kulanıldı. Biyosensörden elde edilen veriler referans metod olarak spektrofotometrik Trinder reaksiyonuna dayanan ticari glukoz deney kitlerinden elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı.Manyetik Fe3O4 nanopartikül temelli glukoz oksidaz biyosensörü üçüncü sistem olarak geliştirildi. Yapılan optimizasyon çalışmalarına göre optimum biyonanopartikül miktarı ve pH; 10 µL ve 6 olarak bulundu. Bu koşullarda, glukoz için doğrusal tayin aralığı 0,25 mM-2 mM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde 2 mM glukoz için tekrarlı 10 ölçüm alındı. Standard sapma (S.D) ve varyasyon katsayısı (c.v) ± 0,051 mM ve % 2,51 olarak bulundu. Operasyonel kararlılığın belirlenmesi amacıyla 6 saat boyunca 15 ölçüm alındı ve biyosensör cevabının % 17 oranında azaldığı gözlendi. Son olarak biyosensör, doğal örneklerdeki glukoz miktarının analizi için kulanıldı. Biyosensörden elde edilen veriler referans metod olarak spektrofotometrik Trinder reaksiyonuna dayanan ticari glukoz deney kitlerinden elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı.Anahtar Kelimeler: Glukoz biyosensörü, piranoz oksidaz (POx), glukoz oksidaz (GOx), poliamidoamin (PAMAM), altın nanopartikül (AuNP), polianilin (PANI), nanokompozit, Fe3O4 manyetik nanopartikül.

Abstract:
In this project, tree different glucose biosensors were designed. Pyranose oxidase (POx) and glucose oxidase (GOx) enzymes were immobilized on to electrode surfaces via different immobilization methods. Optimization and characterization studies were carried out by glucose substrate.According to the optimization studies, for the polyamidoamine (PAMAM) based pyranose oxidase biosensor, optimum enzyme amount and pH were found to be as 9.4 U and 6.0. Under these conditions, linearity for the glucose was in the range of 0.025 mM and 0.5 mM. As for the repeatability, 7 subsequent measurements were taken for 0.3 mM glucose. Standard deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) were calculated as ± 0.011 mM and 3.57 %. For the operational stability, sensor responses were followed during 9 days. First 2 days 30 measurement were carried out and any drop wasn?t observed. At the end of this period 80 measurement were carried out and 50 % drop was observed. Reproducibility and substrate specifity of the proposed system was investigated. Also this system was combined FIA. Under same conditions, linearity for the glucose was range of 0.025 mM and 1 mM. As for the repeatability, 10 subsequent measurements were taken for 0.5 mM glucose. Standard deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) were calculated as ± 0.0189 mM and 3.69 %. For the operational stability, sensor responses were followed during 6 hours, 15 measurements were carried out and only 9.3 % drop was observed at the end of this period.Pyranose oxidase biosensor based on gold nanoparticles (AuNP)- polyaniline(PANI)/AgCl/gelatin nanocomposite has been developed for the second biosensor system. According to the optimization studies, optimum enzyme amount and pH were found to be as 0.75 U and 6.5. Under these conditions, linearity for the glucose was in the range of 0.05 mM and 0.75 mM. As for the repeatability, 6 subsequent measurements were taken for 0.25 mM glucose. Standard deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) were calculated as ± 0.005 mM and 2.16 %. For the operational stability, sensor responses were followed during 6 hours 8 measurements were carried out and 12 % drop was observed at the end of this period. Substrate specifity of the proposed system and effect of AuNP to biosensor response was investigated. Finally, proposed biosensor was used to analyze glucose content in real samples. Obtained data from the biosensing system was compared with a commercial enzyme assay kit based on spectrophotometric Trinder rection as a reference method.Glucose oxidase biosensor based on magnetic Fe3O4 nanoparticles (Nano- Fe3O4) has been developed for the third biosensor system. According to the optimization studies, optimum bionanoparticle amount and pH were found to be as 10 µL and 6.0. Under these conditions, linearity for the glucose was in the range of 0.25 mM and 2 mM. As for the repeatability, 10 subsequent measurements were taken for 2 mM glucose. Standard deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) were calculated as ± 0.051 mM and 2.51 %. For the operational stability, sensor responses were followed during 6 hours 15 measurements were carried out and 17 % drop was observed at the end of this period. Finally, proposed biosensor was used to analyze glucose content in real samples. Obtained data from the biosensing system was compared with a commercial enzyme assay kit based on spectrophotometric Trinder rection as a reference method.Keywords: Glucose biosensor, pyranose oxidase (POx), glucose oxidase (GOx), polyamidoamine (PAMAM), gold nanoparticle (AuNP), polianiline (PANI), nanocomposite, Fe3O4 magnetic nanoparticle.