Quorum sensing inhibisyonunun Pseudomonas aeruginosa'da floresan ışıma ve kRT-PZR yöntemleri kullanılarak kantitatif olarak karşılaştırılması
Quantitative comparison of quorum sensing inhibition on Pseudomonas aeruginosa by fluorescence and qRT-PCR methods
Yazar: BARIŞ GÖKALSIN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. NÜZHET CENK SESAL
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoloji Eğitimi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Mikroorganizmaların geliştirdikleri antibiyotik dirençleri son yıllarda sağlık açısından önemli bir tehdit oluşturmaktadır. Bağışıklık yetersizliği olan kişilerde yaralı dokuları kolayca enfekte edebilen fırsatçı patojenlerden Pseudomonas aeruginosa, bu mikroorganizmalar arasında yer almaktadır. P. aeruginosa, ürettiği ekzopolisakkaritler ile biyofilm oluşturarak ilaç ve dezenfektanlara karşı koyabilmektedir. Biyofilm oluşumundaki en önemli etkenlerden birinin Quorum Sensing (QS) mekanizması olduğu bilinmektedir. Sinyal molekülleri ile çalışan QS mekanizmasının bloke edilmesi ile bakterilerin iletişimi sekteye uğratılabilmekte ve biyofilm oluşturmaları engellenerek daha savunmasız kalmaları sağlanabilmektedir.
Bu çalışmada bir liken sekonder metaboliti olan evernik asitin, antibiyotik maddelere alternatif veya yardımcı olabilecek, P. aeruginosa üzerinde etkili Quorum Sensing İnhibitörü (QSI) özelliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu bağlamda, sekonder metabolitlerin moleküler düzeyde QS bağlantılı gen ekspresyonuna etkisinin floresan protein ışıma yöntemi ile incelenmesi ve elde edilen verilerin kRT-PZR sonuçları ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Ekspresyon ve QSI analizleri için kRT-PZR metoduyla birlikte canlı biyosensör hücreler aracılığıyla in vivo ölçüme izin veren, GFP temelli floresan ışıma yöntemi kullanılmıştır. Böylece gen anlatımının ve bağlantılı olarak QS mekanizmasının inhibisyonunun gerçek zamanlı izlenmesi ve yöntemlerin karşılaştırılması ayrıca hedeflenmiştir.
QSI taramaları sonucunda evernik asitin belirli konsantrasyonlarında QS bağlı lasB ve rhlA genlerinin ekspresyonlarını inhibe ettiği gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlar ile P. aeruginosa üzerinde QSI özellikli doğal maddelerin belirlenmesi açısından kantitatif iki yöntem karşılaştırılmıştır. QSI ve ilgili gen ekspresyonları üzerinde etkili olabilecek koşul veya maddeler ile ilgili çalışmalarda floresan biyosensör suşların kullanılmasının kolaylık sağlayabileceği anlaşılmıştır. Ayrıca elde edilen evernik asit inhibisyon değerleri ile antibiyotiklere yardımcı ilaç geliştirme çalışmaları için ön araştırmalar ortaya çıkarılmıştır.

Abstract:
The antibiotic resistance of microorganisms is becoming a major problem for health in recent years. One of these microorganisms is Pseudomonas aeruginosa: an opportunistic pathogen that can easily infect wounded tissues in immunocompromised people. P. aeruginosa can resist against drugs and disinfectants by producing exopolysaccharides that form biofilm. It is known that Quorum Sensing (QS) is one of the most important factors in biofilm formation. Inhibiting QS signals can block bacterial communication and prevent biofilm formation, leaving them more vulnerable.
A lichen secondary metabolite evernic acid was chosen to screen for Quorum Sensing Inhibitor (QSI) activity that may replace or assist antibiotic treatments on P. aeruginosa. Accordingly, it was aimed to analyze effects of secondary metabolites on specific QS regulated gene expressions via fluorescent protein method and compare the results with qRT-PCR method. Together with PCR method, GFP based fluorescence method, which enables in vivo measurements of live biosensor cells, was employed for QSI and expression analyses. Therefore, real time observations of QS inhibition and relevant gene expressions were conducted and a comparison of two methods was also aimed.
QSI screens have shown that evernic Acid inhibits expressions of QS related lasB and rhlA genes at certain concentrations. Two quantitative methods were compared for determining natural products with QSI properties on P. aeruginosa. It was concluded that fluorescent strains can easily be used in future research and assist in studies on conditions or substances that may affect QS and related gene expressions. Moreover, with the inhibition data, preliminary studies were revealed for drug research to supplement antibiotics.