Hayvan, gıda ve çevre örneklerinden lısterıaların izolasyonu ve moleküler karakterizasyonu
Listeria isolation ann molecular characterization from animal, food and environmental samples
Yazar: ERAY ATIL
Danışman: PROF. DR. HASAN BASRİ ERTAŞ
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışma, Şubat 2007-Ocak 2008 tarihleri arasında Elazığ ve çevresinde yapıldı. Sığır ve koyunlardan, süt ve peynirlerden ve bu hayvanların yetiştirildiği çevrelerden 12 ay boyunca örnekler toplanarak listeriaların varlığı araştırıldı. Bölgedeki listeriaların varlığının mevsimsel dağılımı ortaya konuldu. İzole edilen L. monocytogenes suşlarının moleküler tiplendirilmesi yapılarak, profil dağılımı ortaya konuldu. Ayrıca L. monocytogenes suşları ile hayvan, gıda ve çevre olguları arasındaki ilişkiler araştırıldı.Elazığ ve çevresinden seçilen 6 sığır ve 5 koyun işletmesinden süt, peynir, su, yem, süt tankı, fekal ve çevresel örnekler toplandı. Bu çalışmada sığır çiftliklerinden 415, koyun çiftliklerinden de 304 adet olmak üzere toplam 719 adet örnek incelendi. Bu örneklerin dağılımı 132 adet (72 adet sığır, 60 adet koyun) gaita, su, yem, çevre, 106 adet süt (75 adet sığır, 35 adet koyun), 57 adet peynir (28 adet sığır, 29 adet koyun), 28 adet sığır süt tankı svabı şeklinde oldu.Süt ve süt ürünlerinde listeria izolasyonu Association of Official Agricultural Chemists/International Dairy Federation (AOAC/IDF), diğer örneklerde ise United States Department of Agriculture/Food Safety and Inspection Service (USDA/FSIS)'in önerdiği yöntem kullanılarak yapıldı. İzole edilen Listeria spp. suşları biyokimyasal testler ile isimlendirildi. İzolatlar Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile cins düzeyinde ve L. monocytogenes izolatları ise tür düzeyinde PCR ile doğrulandı. Hem PCR hem de biyokimyasal testler ile identifiye edilen L. monocytogenes izolatları Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ve Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) moleküler analiz yöntemleri ile tiplendirildi.Toplam 719 örneğin 46 adedinden (% 6.40) Listeria spp. izolasyonu yapıldı. Bu izolatların moleküler ve biyokimyasal yöntemler ile 8'i (% 17.4) L. monocytogenes, 18'i (% 39.0) L. innocua, 8'i (% 17.4) L. seeligeri, 7'si (% 15.2) L. grayi ve 5'i (% 10.8) L. welshimeri olarak saptandı. Listeriaların 39 adedi (% 9.4) sığır, 7 adedi (% 2.4) koyun orijinli örneklerden izole edildi.İzole edilen L. monocytogenes suşlarının RAPD analizleri iki farklı primerle birlikte (HLWL74 ve HLWL85) yapıldı. HLWL74 primeri ile 4 farklı profil 1-4 arası sayıda bantlar, HLWL85 primeri ile 6 farklı profil ve 1 ile 3 arası bantlar elde edildi. RFLP analizi ile tiplendirmede inlA genine spesifik PCR'dan sonra AluI ve Tsp509I restriksiyon enzimleri kullanıldı. AluI restriksiyon enzimiyle 2 farklı profil ve 2-3 arasında bantlar elde edildi. AluI ve Tsp509I restriksiyon enzimleriyle toplam 4 farklı profil elde edildi. Çalışmada, RAPD analizinin RFLP analizine göre daha ayırt edici bir test olduğu saptandı.Sonuç olarak; listeriaların, o bölgedeki insan ve hayvanlar için risk faktörü olduğu tespit edildi. Ayrıca sığır çiftliklerinin koyun çiftliklerine oranla daha yüksek bir riske sahip olduğu belirlendi. Elde edilen bulgular, süt ve süt ürünlerinin listeria kontaminasyonunun, bakterilerin hayvanlardan süte geçmesinden daha çok, gıdaların işlenmesi esnasında çevreden kaynaklandığını göstermektedir. Ayrıca bu çalışmada listeriaların görülme sıklığı ve bulundukları yerler açısından sonbahar ve ilkbahar mevsimlerinde, diğer mevsimlere göre daha fazla oranda izolasyon ve identifikasyonu yapıldı.

Abstract:
In this study, listeria prevalence in sheep and cattle feeding Elazığ and it?s around investigated in February 2007- January 2008. Raw milk, cheese, water, animal food, feces, bulk milk swabs and environmental samples was collected from both farmhouses. Moreover, seasonal variation in listeria species was researched in those animals. To determinate genetic relationships between L. monocytogenes isolates was planned by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) and Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).Six cattle and 5 sheep farmhouses was used. Totally 719 samples as 415 bovine samples and as 304 sheep samples were cultured in this study. Total 106 milk (75 bovine, 35 sheep), 57 cheese samples (28 bovine, 29 sheep), 28 samples bulk milk swabs were performed. Furthermore, 72 fecal, 72 animal food, 72 water and 72 environment bovine samples and 60 fecal, 60 animal food, 60 water and 60 environment sheep samples were examined.Association of Official Agricultural Chemists/International Dairy Federation (AOAC/IDF) method in milk and cheese samples and United States Department of Agriculture/Food Safety and Inspection Service (USDA/FSIS) method in environmental and other samples were followed in this study. Isolated L. monocytogenes and other listeria strains were confirmed by Polymerase Chain Reaction (PCR) and biochemical reactions. Then, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) and Random Amplified Polymorhic DNA (RAPD) methods were performed amongst L. monocytogenes isolates. Furthermore, seasonal variations in listeria isolates were found out with some differency.Prevalence of Listeria spp. was found 6,4 % in whole samples. Eight of 46 isolates (17,4 %) L. monocytogenes, 18 of 46 (39,0 %) L. innocua, 5 of 46 (% 10,8) L. welshimeri, 8 of 46 (17,4 %) L. seeligeri and 7 of 46 (15,2 %) L. grayi were identified. L. ivanovii was not isolated in this study. listeria prevalence were found in cattle 9,4% and in sheep 2,4%.RAPD analyses were performed by two different primers (HLWL74 and HLWL85) and obtained 10 different profiles with 1-4 band patterns. In RFLP analysis by AluI and Tsp509I restriction endonucleases was obtained 4 different profiles and 2-3 bands patterns. According to obtained results in this study, RAPD analysis was found more discriminative than RFLP.Consequently, listeria existence in Elazığ and it?s around, the people of that region and animals were found to be as a risk factor. Moreover, higher proportion of cattle farms than sheep farms have been identified at risk. Results obtained that listeria that more transmitting to milk and milk products from animals than food during the preparation of environmental exposure is caused by listeria contaminations. Furthermore, seasonal variations indicate that autumn and spring more important than other seasons.