İnsan eritrosit glutatyon s-transferaz pi izoziminin saflaştırılması ve hiperisin ile etkileşiminin incelenmesi
Purification of human erythrocyte glutathione s-transferase pi isozyme and analysis of the interaction with hypericin
Yazar: SEYHAN TÜRK
Danışman: PROF. DR. NACİYE LEYLA AÇAN ; ÖĞR. GÖR. GÜLNİHAL KULAKSIZ ERKMEN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Eritrositler = Erythrocytes ; İnhibisyon = Inhibition ; İnsan = Human

Özet:
Bu çalışmada, Glutatyon S-Transferaz (EC 2.5.1.18, GST) enzimi insan eritrositlerinden Q-Sepharose iyon değiştirici, Sephadex G25 jel filtrasyonu ve S-Hexylglutathione Sepharose 6B afinite kolonları kullanılarak %71 verimle 2550 kez ve 51 Ünite / mg protein özgül aktivite ile saflaştırıldı. Elde edilen GST PBE-94 kolonu kullanılarak kromatofokuslandı ve izoelektrik noktası 4.8 olan asidik GST-pi elde edildi. GST-pi izozimi % 12'lik SDS-PAGE' de tek bir bant olarak gözlemlendi ve alt birim molekül ağırlığı 23,3 kDa olarak hesaplandı.GST-pi için substrat ve inhibitör kinetiği çalışmalarının tamamı 37°C'de ve pH 6.5'de yapıldı. Substrat kinetiği çalışmalarında sabit CDNB (1 mM) - değişken GSH (0.035-1.6 mM), ve sabit GSH (1 mM) - değişken CDNB (0.035-1.6 mM) derişimleri kullanılarak aktivite ölçümleri yapıldı. Elde edilen sonuçlar kullanılarak Michaelis - Menten, Lineweaver ? Burk, Dixon, Eğim ve Kesim noktalarına karşı 1 / [substrat] grafikleri çizildi ve istatiksel hesaplamalar yapılarak GST-pi için Vm, Km değerleri bulundu. Sabit [CDNB] - değişken [GSH]: Vm = 111 ± 7 Ünite / mg protein, Km ise 0.64 ± 0.08 mM; Sabit [GSH] - değişken [CDNB]: Vm = 85 ± 6 Ünite / mg protein, Km = 0.74 ± 0.10 mM olarak hesaplandı.Antidepresan, antiviral ve fotosensitizör bir molekül olan hiperisinin GST-pi'yi doz bağımlı ve iki fazlı olarak inhibe ettiği saptandı. Birinci faz 1.6 ? M hiperisinle %40 inhibe olurken ikinci fazın tümüyle inhibe edilebilmesi için 30 ? M hiperisin derişimine çıkılması gerekti. Kinetik çalışmalar birinci faz inhibisyonun gözlendiği 0.1, 0.2, 0.4 µM hiperisin derişimlerinde yapıldı ve insan eritrosit GST-pi'sinin, hem GSH hem de CDNB ile nonkompetitif inhibisyona girdiği saptandı. Lineweaver - Burk, Dixon, Eğim ve Kesme noktalarına karşı 1 / [substrat] grafiklerinden ve nonlineer regresyon analizlerinden elde edilen değerler birbirleri ile çok uyumlu idi: Ki(GSH) 0.19 ± 0.01 µM ve Ki(CDNB) 0.26 ± 0.03 µM olarak bulundu.

Abstract:
In this study, glutathione S-transferase (EC 2.5.1.18, GST) was purified from human erythrocytes using Q-Sepharose ion exchange, Sephadex G25 gel filtration, and S-hexylglutathione Sepharose 6B affinity column chromatographies with a yield of 71 % and a purification fold of 2550. The specific activity of the enzyme was 51 units per milligram of protein. GST was chromatofocused on PBE-94 and a single asidic isozyme peak (GST-pi) was obtained at pH 4.8. GST-pi displayed a single band on 12 % SDS / PAGE with a subunit Mr of 23.3 kDa.All substrate and inhibitory kinetic experiments were established at 37°C and at pH 6.5. Substrate kinetics experiments were performed at fixed CDNB (1 mM) - varied GSH (0.035-1.6 mM) concentrations, and vice versa. The data obtained were used for performing the Michaelis - Menten, Linewaver ? Burk, Dixon and Slope - intercepts versus 1 / substrates plots, and for statistical analysis. When the varied substrate was GSH, Vm and Km were calculated as 111 ± 7 units / mg protein and 0.64 ± 0.08 mM, respectively. On the other hand, when the varied substrate was CDNB a value of 85 ± 6 units / mg protein for Vm and a value of 0.74 ± 0.10 mM for Km were obtained.Hypericin, an antidepressant, antiviral and photosensitizer molecule, inhibited GST-pi in a dose dependent manner. İnhibition was biphasic. The first phase resulted in 40% inhibition with 1.6 ? M hypericin but the second phase required higher concentrations, 30 ? M of hypericin for total inhibition. All kinetic studies were performed with phase I concentrations (0.1, 0.2, 0.4 µM) of hypericin. It was observed that human erythrocyte GST-pi shows noncompetitive type of inhibition with both subtrates (GSH and CDNB). The Ki values obtained from Lineweaver ? Burk, Dixon, secondary plots (Slope vs 1 / S or y-intercept vs 1 / substrate) and from non-lineer regression analysis were in good correlaton: Ki(GSH) 0.19 ± 0.01 µM and Ki(CDNB) 0.26 ± 0.03 µM were found.