Şeker pancarı (Beta vulgaris L.) rizosferindeki bakteriyel mikrobiyatanın belirlenerek metagenomun değerlendirilmesi ve yumuşak çürüklük etmenlerine karşı biyolojik mücadele olanaklarının araştırılması
Evaluation of the metagenome by determining the bacterial microbiota in the rhizosphere of sugar beet (Beta vulgaris L.) and investigation of biological control possibilities against soft rot agents
Yazar: MUSTAFA ALPARSLAN UMARUSMAN
Danışman: PROF. DR. KUBİLAY KURTULUŞ BAŞTAŞ
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Yürütülen tez çalışmasında, ülkemizde ekim alanı ve üretim miktarı açısından en fazla şeker pancarı tarımı yapılan Konya ilinin, ekolojik olarak birbirinden farklı olan üç ilçesinden (Altınekin, Çumra ve Seydişehir) ve şeker pancarının üç farklı büyüme döneminde (intaş sonrası, yumru başlangıcı ve hasat öncesi) yumuşak çürüklük hastalık etmenlerine (Pectobacterium betavasculorum (Pb) ve Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc))  karşı rizosferik mikrobiyotadan faydalı bakteriyel mikroorganizmaların elde edilmesi planlanmıştır. Arazi koşullarında yumuşak çürüklük belirtisi gösteren şeker pancarı bitkilerinden 33 patojenik bakteri (8 adet Pb, 10 adet Pcc ve 9 adet Dickeya chrysanthemi) izolatı morfolojik, biyokimyasal, fizyolojik ve moleküler yöntemlerle tanılanmıştır. Çalışmada elde edilen 3064 faydalı bakteriyel izolatından 143 tanesinin Pb'a, 119 tanesinin Pcc'a ve 39 tanesinin her iki patojene karşı antagonistik etkiye sahip oldukları belirlenmiştir. In vitro etkililik testlerinde patojenlerin %29-100 oranında baskılandığı tespit edilmiştir. Her iki patojene karşı etkili olan ve en yüksek etkililiğe sahip 15 antagonist izolat ile yumuşak çürüklüğe karşı duyarlı olan Mohican ve dayanıklı olan Rodeo şeker pancarı çeşitleri üzerinde sera denemeleri kurulmuştur. Saksı denemelerinde antagonistlerin Pb ve Pcc'u sırasıyla %49,33-90,00 ve %58,13-88,00 aralığında değişen oranlarda baskıladığı belirlenmiş ve bu antagonistler MALDITOF-MS biyotiplemesi ile tanılanmıştır. Saksı denemelerinde hastalık şiddetini en yüksek oranda baskılayan ve her iki patojen için ortak antagonistik etki gösteren 3 adet izolat 16s rRNA ile sekans edilmiş ve etmenler Pseudomonas donghuensis, Pseudomonas silesiensis ve Bacillus subtilis olarak teşhis edilmiştir. Altınekin, Çumra ve Seydişehir ilçelerinde kurulan tarla denemelerinde, tekli ve üçlü uygulamaların Pb ve Pcc'a karşı etkililiklerinin sırasıyla %27,08-83,38 ve %62,28-88,93 oranlarında hastalığı baskıladıkları belirlenmiştir. Ayrıca bu üç antagonist izolatın şeker pancarı köklerinde 4 haftalık süre içinde yüksek oranda hayatta kalabildikleri belirlenmiştir. Biyopriming uygulamalarında tohumların çimlenme ve kök gelişimine etkilerini incelemek amacıyla tohum çimlenme ve vigority oranları tespit edilmiştir. Yüksek antagonistik etki gösteren 15 antagonistin yumuşak çürüklük patojenlerinin biyofilm oluşumu baskılama potansiyelleri değerlendirilmiştir. Buna göre swarming, swimming ve twitching motility testlerinde antagonistlerin Pb ve Pcc'u karşı %13,2-81,5 aralığında, sınırladıkları saptanmıştır. QS mekanizması ile ilişkili AHL biyodegredasyon testleri sonucunda değerlendirilen 15 antagonist bakteriden 7 tanesinin kontrol grubu ile kıyaslandığında %2,01-92,83 oranlar arasında AHL miktarını azalttığı tespit edilmiştir. Yapılan in vitro test sonuçlarına göre, 2 antagonistin IAA sentezlediği, 6 antagonistin amonyak ürettiği, 5 antagonistin siderefor ürettiği, 3 antagonistin azot fiksasyonu yapabildiği, 1 antagonistin fosforu çözdüğü, 4 antagonistin ACC demainaz enzim aktivitesi gösterdiği ortaya konmuştur. Mikrobiyota tespit çalışmaları sonucunda tüm ilçelerden ve tüm gelişme dönem örneklerinde toplamda 8552 adet bakteri saptanmıştır. Belirlenen tüm bakteriler içerinde 2928 farklı bakteri türünün olduğu tespit edilmiştir. 2928 farklı bakteri tür içerisinde 87 türün tüm ilçe ve gelişme dönemlerinde ortak olarak bulunan türler olduğu metagenomik yorumlama ile ortaya konmuştur. Bölgeye ait mikrobiyota yapısı Pectobacterium genusu açısından incelendiğinde, P. parmentieri tüm mikrobiyota gruplarında en fazla rastlanan yumuşak çürüklük patojeni olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma kapsamında, şeker pancarında yumuşak çürüklük patojenlerine karşı koruma sağlayan antagonist bakterilerin sera ve tarla koşullarında, sahip oldukları bakteriostatik ve enzimatik özelliklerinin yanı sıra bitki gelişimini teşvik etme nitelikleri dolayısıyla hem biyopestisit hem biyogübre özelliği taşıyan formülasyonlar geliştirilmesinde önemli aşamaya gelinmiştir. Bitkinin patojene karşı savunma enzimlerinden sorumlu gen bölgelerinin veya patojene karşı dayanıklılık gen/genlerin etkileşim öncesi ve sonrasında ekspresyon seviyelerinin incelenmesinin, patojen-konukçu-antagonist etkileşimlerinde bitkide meydana gelen oksidatif enzimlerin ve reaktif oksijen türevlerinin değişkenliği fizyolojik ve biyokimyasal açıdan belirlenmesinin daha kapsamlı bir şekilde araştırılması önemli görülmüştür.

Abstract:
In the conducted thesis study, it was planned to obtain beneficial bacterial microorganisms from the rhizosphere microbiota against soft rot pathogens (Pectobacterium betavasculorum (Pb) and Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc)) from three districts of Konya province, where sugar beet farming is most prevalent in terms of cultivation area and production amount in our country, and at three different growth stages of sugar beet (post-sowing, initial tuber formation, and pre-harvest). In field conditions, 33 pathogenic bacterial isolates (8 Pb, 10 Pcc, and 9 Dickeya chrysanthemi) showing soft rot symptoms were identified by morphologic, biochemical, physiological, and molecular teqniques. Among the 3064 beneficial bacterial isolates obtained in the study, 143 were found to have antagonistic effects against Pb, 119 against Pcc, and 39 against both pathogens. In vitro efficacy tests showed that the pathogens were suppressed at rates ranging from 29% to 100%. Greenhouse trials were established with 15 antagonist isolates that were most effective against both pathogens, using the soft rot-susceptible Mohican and resistant Rodeo sugar beet varieties. In pot trials, the antagonists were found to suppress Pb and Pcc at rates ranging from 49.33% to 90.00% and 58.13% to 88.00%, respectively, and these antagonists were identified by MALDITOF-MS biotyping. Three isolates that most effectively suppressed disease severity in pot trials and showed common antagonistic effects against both pathogens were sequenced with 16s rRNA and identified as Pseudomonas donghuensis, Pseudomonas silesiensis, and Bacillus subtilis. In field trials conducted in Altınekin, Çumra, and Seydişehir districts, single and triple applications were found to suppress Pb and Pcc at rates ranging from 27.08% to 83.38% and 62.28% to 88.93%, respectively. It was also determined that these three antagonist isolates could survive at high rates in sugar beet roots for up to 4 weeks. In biopriming applications, seed germination and vigor rates were determined to examine the effects on seed germination and root development. The biofilm formation inhibition potentials of the 15 antagonists showing high antagonistic effects against soft rot pathogens were evaluated. Accordingly, in swarming, swimming, and twitching motility tests, it was found that the antagonists limited Pb and Pcc by 13.2% to 81.5%. In AHL biodegradation tests related to the QS mechanism, 7 of the 15 antagonist bacteria were found to reduce AHL amounts by 2.01% to 92.83% compared to the control group. According to the in vitro test results, it was revealed that 2 antagonists synthesized IAA, 6 produced ammonia, 5 produced siderophores, 3 could fix nitrogen, 1 solubilized phosphorus, and 4 showed ACC deaminase enzyme activity. Microbiota determination studies identified a total of 8552 bacteria from all districts and growth stage samples. It was found that there were 2928 different bacterial species among all identified bacteria. Metagenomic interpretation revealed that 87 of the 2928 different bacterial species were common to all districts and growth stages. When the microbiota structure of the region was examined in terms of the genus Pectobacterium, P. parmentieri was found to be the most common soft rot pathogen in all microbiota groups. This study has reached an important stage in developing formulations with both biopesticide and biofertilizer properties, given the bacteriostatic and enzymatic characteristics and plant growth-promoting qualities of antagonist bacteria that provide protection against soft rot pathogens in sugar beet under greenhouse and field conditions. It was considered important to comprehensively investigate the expression levels of gene regions responsible for plant defense enzymes against pathogens or resistance genes/genes before and after interaction, and to determine the variability of oxidative enzymes and reactive oxygen species in plants in pathogen-host-antagonist interactions physiologically and biochemically.