Fare spermatogonyal kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 ile hedefli genom düzenleme
Genom editing in mouse  spermatogonial stem cell using crispr-cas9
Yazar: SÜHEYLA YEŞİLBOSTAN
Danışman: DOÇ. DR. BENGİ ÇINAR KUL
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Fareler = Mice ; Genom = Genome ; Kök hücreler = Stem cells ; Sperm = Spermatozoa ; Testis = Testis

Özet:
CRISPR-Cas9 rehber DNA endonükleaz teknolojisi, çeşitli hücre tipleri ve organizmalarda biyolojik süreçlerin incelenmesi için, hedeflenmiş genomik mutasyonların üretilmesinde yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Yapılan çalışmalarda CRISPR/Cas9'un SKH'lere uygulanmaları, spermatogenez ve spermatogenetik başarısızlığın genetik mekanizmasının ortaya çıkarılmasında etkili birer yöntem olduklarını göstermiştir. Testis-expressed 15 (Tex15) genindeki fonksiyon kaybı erkeklerde infertilite ile ilişkilendirilmiştir. Sunulan çalışmada, spermatogonyal kök hücre kültür hattında CRISPR-Cas9 yöntemiyle lentiviral plasmid vektörün transfeksiyonu sonrası Tex15 geninin susturulmasına yönelik deneyler gerçekleştirilmiştir. Çalışmada; Tex15 geninin 1.ekzonunu 3 farklı bölgeden hedefleyen CRISPR-Cas9 uygulama grubu, CRISPR-Cas9 kimyasallarının kontrolü amacıyla, herhangi bir gene komplementer olmayan sgRNA klonlanmış vektörün aktarıldığı sham grubu ve sadece pasajlama yapılan kontrol grubu olmak üzere üç grup tasarlanmıştır. Deney aşamasında; spermatogonyal kök hücrelere invitro ortamda farklı DNA:  DNAfectin oranlarında lipit temelli aktarım ile CRISPR-Cas9 uygulaması gerçekleştirilip, Tex15 geninde c.959C2den itibaren çerçeve kaymasına neden olan indel mutasyonlar elde edilmiştir. Başarının etkinliği mutasyon bölgesi enzim kesim analizi, DNA dizi analizi ve in-silico analizler ile ortaya konulmuştur. En yüksek transfeksiyon etkinliği in-silico analizde 1:5 DNA:DNAfectin oranı için % 98 olarak hesaplanmış ve bu oranın SKH'ler için en uygun oran olduğu tespit edilmiştir. Sunulan çalışma ile CRISPR/Cas9 uygulamasının SKH'lerde farklı genlerde de yapılabilmesi ve dolayısıyla SKH aracılı genom düzenleme ile transgenik hayvan oluşturma, çiftlik hayvanlarında verimi artırma ve hayvan hastalıklarının tedavisinde kullanılma potansiyeli olan gen/genom düzenleme çalışmaları için literatüre katkı sağlanmıştır.

Abstract:
CRISPR-Cas9 guide DNA endonuclease technology has been widely used in the production of targeted genomic mutations for the study of biological processes in various cell types and organisms. In the studies conducted, the application of CRISPR-Cas9 to the SSCs has shown that they are effective methods in revealing the genetic mechanism of spermatogenesis and spermatogenetic failure. Dysfunction in the testis-expressed 15 (Tex15) gene has been associated with infertility in men. In the present study, experiments were performed to silence the Tex15 gene after transfection of the lentiviral plasmid vector in the spermatogonial stem cell culture line by CRISPR-Cas9 method. Study; Three groups are designed as CRISPR-Cas9 application group, targeting the first exon of the Tex15 gene from 3 different regions, the sham group to which CRISPR-Cas9 chemicals are controlled, and the passaged control group to which only noncomplementary sgRNA cloned vector is transferred. At the experimental stage; CRISPR-Cas9 was applied to spermatogonial stem cells in vitro with lipid-based transfer in different DNA:DNAfectin ratios, and indel mutations causing frame shift in the Tex15 gene from c.959C were obtained. The effectiveness of success has been demonstrated by mutation site enzyme cut analysis, DNA sequence analysis and in-silico analysis. The highest transfection efficiency was calculated as 98% for the ratio of 1:5 DNA:DNAfectin in in-silico analysis and this ratio was found to be the most suitable rate for SSCs. With the present study, CRISPR-Cas9 has been contributed to the literature for gene / genome editing studies that have the potential to be performed in different genes in SSCs, and thus have the potential to be used in SSC-mediated genome editing, creating transgenic animals, increasing yield in farm animals, and in the treatment of animal diseases.