Lipaz enziminin UV ışınlarıyla sertleşebilen sol-jel hibrit kaplama filmlerine kovalent immobilizasyonu
Covalent immobilization of lipase enzyme onto UV curable sol-gel hybrid coating films
Yazar: DİLEK DÖNGEZ
Danışman: DOÇ. DR. SERAP DEMİR ; PROF. DR. AYŞE OGAN
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Lipaz Enziminin UV Işınlarıyla Sertleşebilen Sol-Jel Hibrit Kaplama Filmlerine Kovalent İmmobilizasyonu
Lipazlar lipitlerin metabolizmasında önemli enzimlerdir. EC 3.1.1.3. şeklinde hidrolazlar altında sınıflandırılırlar. Hidrolitik ve sentetik aktiviteye sahiptirler. Çeşitli kaynaklardan elde edilen lipazlar arasında Candida rugosa'dan elde edilen lipazlar yüksek aktiviteleri ve geniş bir spesifiklik göstermeleri nedeniyle daha fazla dikkat çekmektedir.
Bu çalışmada UV-sertleşebilen hibrit epoksi-silika film sol-jel metodu kullanılarak yapıldı. Candida rugosa'dan elde edilen Lipaz (E.C. 3.1.1.3) hibrit epoksi-silika film üzerine kovalent olarak immobilize edildi. 1 g polimere 7.22 mg enzim bağlandığı bulundu. Polimerik desteğin morfolojisi Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) ve Fourier Dönüşümlü Infrared (FT-IR) karakterize edildi. 
İmmobilize ve serbest enzimler sulu ortamda p-nitrofenil palmitatın hidrolizi ve hekzan içinde para nitrofenil linoleatın (para nitrofenol ve linoleik asitten) sentezi şeklinde iki farklı reaksiyon sisteminde analiz edildi. Hidrolitik aktivite ve sentetik aktivite yöntemleri kullanılarak serbest ve immobilize enzim üzerine depolama süresi, kinetik özellikleri, sıcaklık ve tekrar kullanılabilirlik gibi özellikleri incelenerek sonuçlar karşılaştırıldı.
Hidrolitik aktivite üzerine pH etkisi incelendiğinde serbest enzim pH 6.5'ta maksimum aktivite gösterirken, immobilize enzimin pH 6.0'ta maksimum aktivite gösterdiği bulundu. İmmobilizasyon sonucunda enzimin sıcaklığa olan dayanıklılığı gelişti ve 50°C'de maksimum aktivite gösterdi. Michaelis sabiti (Km) serbest ve immobilize enzim için sırayla 0.71 ve 0.91 mM olarak hesaplandı. Serbest ve immobilize enzim için Vmax değerleri sırayla 0.83 ve 0.23 mM/dakika olarak hesaplandı. 20 deneme sonrasında immobilize enzim ilk aktivitesininin %56'sını korumuştur. Serbest enzim 15 gün içinde tamamen aktivitesini kaybetmiştir. İmmobilize enzim 30 günde aktivitesinin sadece %22'sini kaybetmiştir.
Sentetik aktivite üzerine sıcaklık etkisi incelendiğinde serbest enzim 37°C'de maksimum aktivite gösterirken, immobilize enzim 45°C'de maksimum aktivite gösterdiği bulundu. Serbest ve immobilize enzim için Michaelis-Menten sabiti (Km) ve Vmaks değerleri sırasıyla 5 mM, 0.0026 mM/dakika bulunurken immobilize enzim için 1.1 mM, 0.004 mM/dakika olarak bulunmuştur. 20 deneme sonrasında immobilize enzim ilk aktivitesininin %34'ünü kaybetmiştir. İmmobilize enim 30 gün sonunda aktivitesinin %67'sini korumuştur.

Abstract:
Covalent Immobilization of Lipase Enzyme onto UV Curable Sol-Gel Hybrid Coating Films
Lipases are important enzymes in nature which are responsible for the metabolism of lipids. They are classified under hydrolases EC 3.1.1.3. They have both hydrolytic as well as synthetic activity. Among the lipases from various sources, Candida rugosa lipase received much attention due to its high activity and broad specificity.
In this study UV-curable hybrid epoxy-silica polymer films were prepared via sol–gel method. Lipase (E.C. 3.1.1.3) from Candida rugosa was covalently immobilized onto hybrid epoxy-silica polymer films. Immobilization yield was found as 7.22 mg/g of polymer films. The morphology of the polymeric support was characterized by scanning electron microscopy (SEM) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). 
Immobilized and free enzymes were used in two different reaction systems: hydrolysis of para nitrophenyl palmitate in aqueous medium and synthesis of para nitrophenyl linoleate (from p-nitrophenol and linoleic acid) in hexane medium. The effect of several parameters was investigated such as activity retention, as well as kinetic properties, thermal and operational stability aspects were investigated for hydrolytic activity and synthetic activity and compared with free enzyme. 
The effects of pH on hydrolytic activities was found that the pH of maximum activity for the free enzyme was 6.5, while for the optimal pH of the immobilized enzyme was 6.0. By immobilization, the temperature resistance of the enzyme was improved and showed maximum activity at 50°C. The estimated Michaelis-Menten constants (Km) for the free and immobilized lipase were 0.71 and 0.91 mM, respectively. The Vmax values of free and immobilized enzymes were calculated as 0.83 and 0.23 mM/min enzymes, respectively. The immobilized enzyme retained 56% of its original activity after 20 runs. Free enzyme lost its activity completely within 15 days. Immobilized enzyme lost only 22% of its activity in 30 days.
The effects of temperature on synthetic activities was found that the temperature of maximum activity for the free enzyme was 37°C, while for the optimal temperature of the immobilized enzyme was 45°C. The Michaelis–Menten constants (Km), and Vmax, for the free and immobilized enzyme were found as 5 mM, 0.0026 mM/min and 1.1 mM., 0.0004 mM/min., respectively. The immobilized enzyme lost 34% of its activity after 20 runs. Immobilized enzyme retained 67% of its activity in 30 days.