Bakteriyel kanser teşhisine yönelik hızlı tanı kiti tasarlanması
Rapid diagnostic kit design for bacterial cancer diagnosis
Yazar: BURAK ŞENER
Danışman: PROF. DR. ÖMÜR BAYSAL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bakteriyel patojen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis'in neden olduğu bakteriyel kanser, önemli bir hastalıktır ve enfekte domates tohumlarının yayılması şeklinde görülen bulaşma kabiliyeti nedeniyle mahsul kaybına neden olur. Bu nedenle, hastalık teşhisi, patojen içermeyen bitki yetiştirme ve verim kaybını azaltmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem gereklidir.
Bu çalışmada, domateste bulunan Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) için DNA bazlı, hızlı bir teşhis kitinin prototipini geliştirdik. Teşhis kitinin ana prensibi, kemosensör-DNA hibridizasyonuna dayanmaktadır. Bu amaçla, DNA'ya bağlanabilen ve hibridizasyon oluşturabilen BSP-3 (Burak Sentez Ürünü) ve karbazol kemosensörleri sentezlenmiştir. Cmm izolatından ekstrakte edilen DNA denatüre edilmiş ve tek zincirli DNA elde edilmiştir. Tek zincirli DNA'daki timine bağlanmaları için kemosensörlere adenin bazı eklenmiştir, ancak bu adenin ve timin bazlarının oluşturduğu bağlanma zayıf bir bağlanma olacaktır. Bağlanmanın gerçekleşeceği sabit yüzey olarak nitroselüloz membran seçilmiştir. Membran üzerinde oluşturulan DNA- kemosensör hibritine başka bir tek zincirli Cmm DNA'sı eklendiğinde, birbirine tamamen komplementer olan DNA'ların güçlü bağlanma isteği nedeniyle zayıf olan kemosensör-DNA bağlantısı kesilecektir. Farklı bakteri suşunun DNA'sının ortamda olduğu durumda ise kemosensör-DNA bağlantısı kesilmeyecek ve tek zincirli DNA'ya bağlanmayacaktır. Teşhisler, ortamdaki kemosensör varlığına bağlı olarak gerçekleştirilecektir. Kemosensörler sinyal yayan moleküllerdir ve FTIR spektroskopisi sinyallerin tespiti için kullanılmıştır. Tespit edilen sinyaller, IR analiz yazılımları kullanılarak analiz edilmiştir.
Sonuçlar, iki farklı kemosensörün DNA'ya bağlanabildiğini göstermiş ve testler, ortamda Cmm DNA'sı bulunduğunda kemosensör sinyalinin olmadığını kanıtlamıştır. Farklı bakteri türlerinin DNA'ları ortamdayken BSP-3 kemosensörü sinyal vermeye devam etmiştir. Karbazolde ise bu durum görülememiştir. Bu nedenle BSP-3 karbazole göre daha zayıf sinyaller verse de, doğru teşhis oranı daha yüksektir. Her iki kemosensörün de yüksek tanı oranı vardır ancak veriler, hibridizasyon sıcaklığı ve kemosensör konsantrasyonu üzerinde daha fazla optimizasyon yapılmasının önemli olduğunu göstermektedir.
Ayrıca, kemosensöre adenin yerine üçlü hidrojen bağı yapan sitozin veya guanin eklenmesi ile sekans bazında spesifite seviyesi, teşhis sürecinde daha yüksek doğruluk oranı elde etmede faydalı olacaktır.

Anahtar Kelimeler: DNA, Kemosensör, Cmm, Karbazol, BSP-3

Abstract:
As known bacterial canker caused by bacterial pathogen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis is an important disease and results in crop loses due to its transmission ability through infected tomato seeds and propagation materials. Therefore, a rapid and confident tool is necessary for the disease diagnosis, pathogen-free cultivation and to cut down of yield loses. 
In this study, we have developed the prototype of a rapid diagnosis kit based on DNA for Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) on tomato. The main principle of the diagnosis kit relies on chemosensor-DNA hybridization. For this purpose, chemosensors BSP-3 (Burak Synthesis Product) and carbazol, which can bind and forming hybridization, has been synthesized. DNA extracted from Cmm isolate was denatured and single-strand DNA was provided. Adenine bases were added to chemosensors for binding with thymine of single strand of DNA, However, this binding would be weak binding within adenine and thymine bases. Nitro-cellulose membran selected for stabile surface of binding has provided splitting up of chemosensor-DNA binding due to willingness of binding strength within complementary DNAs with each other against to DNA chemosensor hybridization on the formed membrane when a single strand DNA is added. In the case of existence the different bacterial strain of DNA, chemosensor-DNA binding will not split up and will not bind to single-strand DNA. Diagnoses will be realized depending on the existence of chemosensor in medium. Chemosensors are molecules emitting signals, and FTIR spectroscopy were used for detection of the signals and analysed using IR analysis software. 
The results showed that two different chemosensors can bind to DNA and the assays proved there is no signal of chemosensors when DNA of Cmm is present in the medium. In the case of existence, the different bacterial species BSP-3 chemosensor continued emitting the signal, but there was no signal of carbazol. That reason BSP-3 has higher accuracy ratio for diagnosis capability though it emits less signal compared to carbazol. Both chemosensors have high diagnosis ratio, but the data shows that further optimisation on hybridization temperature and adjustments of chemosensors concentration is of importance.  
Furthermore, the specificity based on sequence level instead of adenine, cytosine and guanine bases with three hydrogen bonds added to chemosensor will be beneficial for obtaining much higher accuracy ratios in the diagnosis process. 

Keywords: DNA, Chemosensor, Cmm, Carbazole, BSP-3