Dondurma öncesi ve sonrası oosit ve embriyolarda UPR (Unfolding protein response ) sinyal yolunun araştırılması ve preimplantasyon embriyo gelişimine etkisinin araştırılması
The investigation of UPR (Unfolding protein response) signaling cascade in oocyte and embryos before and after cryopreservation and its impact on preimplantation embryo development
Yazar: İDİL BOZKURT
Danışman: DOÇ. DR. IŞIL TEKMEN ; DOÇ. DR. ÜMİT A. KAYIŞLI
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Donma = Freezing ; Embriyo = Embryo ; Embriyo nakli = Embryo transfer ; Embriyoloji = Embryology ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Histoloji = Histology ; Histolojik teknikler = Histological technics ; Oositler = Oocytes ; Üreme biyolojisi = Reproductive biology ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques

Özet:
AMAÇ Bu çalışmamızda, ER stresinin preimplantasyon embriyo gelişimine olan etkisini ve dondurma (kriyoprezervasyon) çözme tekniğinin oosit ve embriyolarda yaratabileceği olası ER stresine bağlı olumsuz etkiyi Immünofloresan, Western Blot ve RT-PCR yöntemleri ile incelemeyi amaçladık.YÖNTEM Deneysel modelimiz C57BL/6 dişi farelerden superovulasyonu ve in vivo fertilizasyonu takiben iki hücreli embriyolar toplandı .Embriyolar üç gruba ayrıldı: I. Kontrol n=6, II. Tunikamisin (0.5 µg/ml; n=6), III. Sikloheximid (10 µg/ml; n=6), bu gruplar preimplantasyon süreci boyunca inkübe edildiler (2.günden 4. güne kadar) ve gün gün gruplar arasında karşılaştırmalı gelişim analizi yapıldı. İkinci set deneyimiz, kontrol (n=12), kısa dönem tunikamisin (n=12) ve uzun dönem tunikamisin (n=12) ile inkübe edilen deney gruplarından oluşturularak, kısa süreli yada uzun süreli UPR aktivasyonunun etkisi preimplantasyon embriyo gelişiminde araştırıldı. Benzeri olarak üçüncü set deney gruplarımızda elde edilen iki hücreli embriyolar ve olgun oositler 3 gruba ayrıldı; I. grup kontrol, II. grup vitrifikasyon grubu, III. grup yavaş dondurma grubu. Oosit ve embriyolar morfolojik değerlendirmeyi takiben ER stress molekülleri olan BiP ile protein düzeyinde ve BiP, XBP-1 ve sXBP-1 ile de mRNA seviyesinde analiz edildi.BULGULAR Sikloheksimid grubundaki embriyoların preimplantasyon embriyo gelişim süreci boyunca iki hücreli aşamada kaldıkları gözlenirken, kontrol ve tunikamisin gruplarındaki embriyoların preimplantasyon üçüncü günde 8 hücreli aşamayı takiben morfolojik bir fark olmaksızın kompaksiyon düzeyine geldikleri gözlendi. Dördüncü günde ise kontrol grup embriyoların hepsi blastosist aşamasında iken tunikamisinli medyum ile inkübe edilen embriyoların hiçbirinin blastosist aşamasına gelemediğini gözlemledik. Dahası kontrol, kısa dönem ve uzun dönem tunikamisinle inkübe edilen embriyolarda blastosist formasyon oranı sırasıyla; %100, %33, ve %0 idi. Vitrifikasyon ve yavaş dondurma ile dondurulup çözülen oosit/embriyolarda kontrol gruplarına oranla daha yüksek BiP immüno reaktivitesi saptandı. Western blot analizi sonucunda dondurulup çözülen oosit/embriyolar da dondurulmamış gruplardaki oosit/embriyolara oranla daha yüksek BiP protein seviyesi gözlendi ve buna ek olarak RT-PCR analizlerinde dondurulup çözülen oositler/embriyolarda daha yüksek BiP ve sXBP-1 seviyesi saptandı. Ayrıca, yavaş dondurulup çözülen embriyolarda Immünofloresan, Western blot ve RT-PCR analizlerinde vitrikiasyon ile dondurulup çözülen embriyolara oranla daha yüksek BiP seviyesi saptandı.SONUÇ Sonuçta bulgularımız, gelişim sürecindeki embriyoların UPR sinyal yolağını aktive edebilen ER stresinin, preimplantasyon embriyo gelişim sürecine olan etkisinin çok büyük olduğunu göstermiştir. Kısa veya uzun dönem UPR sinyal moleküllerinin aktivasyonu embriyoların kompaksiyon aşamasından sonra gelişimlerini duraklatmaktadır. Dondurma çözme deneylerimiz sonrasında oosit ve blastosistlerin ER stresi aracılı UPR sinyal yolaklarının aktive olmasınun preimplantasyon gelişimide etkisi olduğunu göstermiştir.

Abstract:
PURPOSE In this thesis, we aimed to investigate the comparative impact of endoplasmic reticulum (ER) stress in normal mature oocyte and preimplantation embryo development and in differently cryopreserved oocytes and preimplantation embryos using Immunofluorescence staining and Western blot techniques at the protein level and RT-PCR technique at the RNA level.MATERIAL-METHOD We used C57BL/6 female mice for our experimental animal model. Following standard superovulation protocol and in vivo fertilization in C57BL/6 mice embryos at two cell stage were collected. Embryos were then divided into 3 groups; I. Control (n=6), II. Tunicamycin (0.5 µg/ml; n=6) and III. Cycloheximide (10 µg/ml; n=6) and incubated in vitro conditions during the preimplantation period ( from day 2 to day 4) to achieve the comparative development analysis among the groups in a day to day basis. In the second set of the experiments embryos in two cell stage were divided into three groups; I. control (n=12), II. short time exposure (4 h) of tunicamycin and III. long time exposure (72 h) of tunicamycin to investigate the role of short- and long-term effects of UPR stressors on preimplantation embryo development. Similarly, in the third set of our experiments embryos and mature oocytes (MII) from obtained in vivo conditions as described above were analyzed in three groups as I. Control (no freezing-thawing procedure), II. Vitrification and III. Slow freezing-thawing groups. Following morphological evaluation embryos and oocytes in all groups were analyzed for ER stress molecules BiP at the protein and mRNA level and XBP-1 and sXBP-1 at the mRNA level.RESULTS Embryos treated with cycloheximide were arrested at two cells stage during the preimplantation development while control and tunicamycin groups were first divided to 8-cell stage and then followed with compaction stage without significant morphological differences between these two groups. However, there was a significant difference in the number of blastocyst formed between two groups on the day of blastocyst formation (on day 4). None of tunicamycin-treated embryos could achieve blastocyst formation with a clear inner cell mass and outer cell mass while almost all embryos in the control group could reach to the blastocyst stage. Moreover, blastocyst formation rate in control, short-term and long-term tunicamycin treated groups was 100%, 33% and 0%, respectively. In RT-PCR analysis, sXBP-1 mRNA level was significantly increased with long-term tunicamycin treatment compared to short-term and control groups. Embryos and oocytes cryopreserved with both slow freezing and vitrification techniques showed higher BiP immunofluorescence staining compared to that of control embryos and oocytes. Moreover, BiP expression was increased in both protein and RNA level in slow frozen and vitrified oocytes and embryos compared to that in control oocytes and embryos as determined by Western blot and RT-PCR. Compared to XBP-1 form, sXBP1 was predominant with significantly higher level in frozen-thawed oocytes and embryos compared to that in control oocytes and embryos. Moreover, embryos from slow freezing group showed higher BiP expression compared to embryos from vitrification group.CONCLUSION In conclusion, these results suggest that activation of ER mediated UPR signaling in developing preimplantation embryos is extremely important to complete preimplantation development. Either long-term or short-term activation of UPR mediated signaling molecules prevents the embryos to progress from compacting stage to blastocyst stages suggesting that even a shot time activation of ER stress molecules could inhibit embryonic cell differentiations. Our freeze-thaw experiments also suggest that these processes could activate ER-mediated UPR signaling and in turn could have a negative impact on later stage of preimplantation embryo development.