Yüzeyde güçlendirilmiş raman spektroskopisi (YGRS) tekniği ile proteaz aktivitesi tayini
Determination of protease activity with surface enhanced raman spectroscopy (SERS)
Yazar: NAZİFE NUR YAZĞAN
Danışman: PROF. DR. İSMAİL HAKKI BOYACI ; YRD. DOÇ. DR. ALİ TOPCU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmada proteaz aktivitesi tayini için yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopisi (YGRS)'ne dayalı yeni, hassas ve hızlı analiz sistemi geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla; iki farklı şekilde nanopartikül (altın nanoküre ve altın nanoçubuk) ve iki farklı analiz yüzeyi (altın kaplı cam yüzey ve polistren mikrotiter plaka) kullanılmıştır. Bu çalışmadaki nanopartiküller YGRS aktif hale getirilmek için YGRS işareti olan 5,5'-Ditiobis (2-Nitrobenzoik asit) (DTNB) ile işaretlenmiştir. Enzim konsantrasyonuna karşı, DTNB'nin 1326 cm-1 deki simetrik NO2 gerilmesine ait bandın grafiğe geçirilmesi ile kalibrasyon grafikleri elde edilmiştir. Bu çalışma için dört farklı analiz düzeneği tasarlanmıştır. Birincisi altın kaplı cam yüzey üzerine altın nanoküre (Platform 1a), ikincisi altın kaplı cam yüzey üzerine altın nanoçubuk (Platform 1b), üçüncüsü polistren mikrotiter plaka üzerine altın nanoküre (Platform 2a) ve dördüncüsü ise polistren mikrotiter plaka üzerine altın nanoçubuk (Platform 2b) şeklinde hazırlanmış yüzeydir. Nanopartikül geometrisinin ve hazırlanan yüzeylerin analiz sistemine etkileri incelenerek, en iyi çalışma kombinasyonu olarak altın nanoçubuklar ile altın kaplı cam yüzeylerin beraber kullanımı olan platform 1b seçilmiştir. Ayrıca, proteaz enziminin aktivitesinin tespit edilmesinde yüzeylere substrat olarak kazein ve sığır serum albumini (SSA) ayrı ayrı bağlanarak enzimin substrata olan spesifikliği incelenmiştir. Seçilen platform 1b düzeneğine ait çizilen kalibrasyon eğrisinde, proteaz aktivitesi ve YGRS sinyalleri arasındaki korelasyon 0.1 - 2.0 mU/mL konsantrasyon değerleri arasında doğrusal olarak bulunmuştur (R2= 0.979). Metodun doğrulanması için yöntem validasyonu yapılmış ve gözlenebilme sınırı (LOD) ve tayin alt sınırı (LOQ) değerleri sırasıyla 0.43 ve 1.30 bulunmuştur. Gün içi ve günler arası kesinlik için yapılan deneylerde yüzde bağıl standart sapma (RSD) değerleri sırasıyla % 2.5 ve % 3.6 olarak bulunmuştur. Proteaz aktivitesi için geliştirilen metodun gerçek gıda örneklerinde kullanılabilirliği de test edilmiştir. Bu amaçla, seçilen platform düzeneğindeki kalibrasyon eğrisinde gözlenen doğrusal ve doğrusal olmayan bölgelerde ayrı ayrı çalışılmıştır. Geri kazanım değerleri % 94 ile % 106 arasında değişmekte olup sonuçlar tatmin edici düzeydedir. Metot, ayrıca peynir yapımında kullanılan ticari enzim preparatı ve süt örnekleri üzerinde başarıyla uygulanmıştır.

Abstract:
In this study, a new, sensitive and rapid assay was aimed to be developed to measure the protease activity based on surface-enhanced Raman scattering (SERS). For this purpose, two different shapes of gold nanoparticles (gold nanosphere and nanorod particles), and two different analysis surfaces (gold coated glass and polystyrene microtiter plate) were used. Nanoparticles were labeled with Raman reporter 5, 5?-Ditiobis (2-Nitrobenzoik asit) (DTNB). The calibration curves were obtained by plotting the intensity of the SERS signals of symmetric NO2 stretching of DTNB at 1326 cm-1 versus protease concentration. Four different analysis platforms were designed for this study. First was gold nanosphere on the gold coated glass surface (Platform 1a), second was gold nanorod on the gold coated glass surface (Platform 1b), third was gold nanosphere on the polystyrene microtiter plate (Platform 2a), and the fourth was gold nanorod on the polystyrene microtiter plate (Platform 2b). The effects of nanoparticle geometry and assay platform on the protease determination were investigated. The best working combination of the parameters, rod shaped gold nanoparticles on the gold-coated glass slide expressed as platform 1b was selected. It was also used for investigation of substrate specificity of protease enzyme towards the casein and bovine serum albumin. The correlation between the protease activity and SERS signal was found to be linear within the range of 0.1 ? 2.0 mU/mL (R2 = 0.979) for the selected platform. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) values of the validated method were found as 0.43 and 1.30 mU/mL, respectively. The intra-day and inter-day precisions of the method, as relative standard deviation (RSD), were determined as 2.5 % and 3.6 %, respectively. The usability of the developed method in real food samples was also exhibited. For this purpose, linear and non-linear regions of the calibration curve of the selected platform were studied individually. The recovery results varied between 94 % - 106 %. The developed method was also successfully applied for quantitative analysis of the commercial enzyme preparate that is used in cheese making process and milk samples.