İn-vitro hepatik organoid modelinin geliştirilmesi
Development of in-vitro hepatic organoid model
Yazar: SOHEIL AKBARI
Danışman: PROF. DR. ŞERİFE ESRA ERDAL BAĞRIYANIK ; PROF. DR. NUR ARSLAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases ; Genetik = Genetics ; Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Hepatit = Hepatitis ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer hastalıkları = Liver diseases ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells ; Sitrulinemi = Citrullinemia ; İn vitro = In vitro

Özet:
Kanserden metabolizma hastalıklarına kadar karaciğer ilintili hastalıkların modellenmesi ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesi önündeki en büyük engel hepatositlerin hücre kültürü ortamında verimli bir şekilde çoğaltılamamasıdır. Son yıllarda gelişim biyolojisi araştırmalarından öğrenilen bilgiler, embriyonik kök hücre (EKH) yada uyarılmış kök hücre gibi pluripotent hücrelerden (UPKH) in vitro koşullarda karaciğer hücrelerine farklılaştırma protokollerinin temelini oluşturmuştur. Ancak halen önemli sorun 2 boyutlu (2D) üretilebilen hepatositlerin yeterince işlevsel matür hepatosite benzememesidir. Bu noktada, hücre-hücre ve/veya hücre-matriks bağlantıları gibi çevresel faktörleri gerçeğine daha yakın olduğu, 3 boyutlu (3D) hücre kültürü modelleri önem kazanmıştır.
Bu tez kapsamında, epizomal yeniden programlama ile elde edilen sağlıklı insan UPKH'lerden ilk olarak 2D ve sonrasında 3D organoid kültürü yapılarak hepatositler elde edildi ve her aşamada hücrelerin in vitro ve in vivo koşullarda karakterizasyonu yapıldı. 3D hepatosit organoidleri elde etmek için, UPKH'ler önce endoderme farklılaştırıldı ve akım sitometri aracılığıyla ayrımlanan EpCAM+ endoderm hücrelerinden, Huch's protokolünde kullanılan çeşitli büyüme faktörleri içeren expansiyon ortamı kullanılarak matrijel içerisinde organoid yapıları oluşturulması sağlandı. Son olarak organoidler yine uygun koşullarda hepatosite farklılaştırıldı. Endoderm kaynaklı hepatik organoidler (eHEPO)'in üretimi için ilk kez bu çalışma kapsamında geliştirilen yöntem, sonrasında bir üre döngüsü kalıtsal hastalığı olan ve argininosüksinat sentaz (ASS1) enzim eksikliğinden kaynaklanan Sitrulinemi Tip I'in modellemesi için kullanıldı. Sitrülinemi hastalarından elde edilen organoidler sağlıklı insanlardan elde edilen organoidlere göre, hastalığın patofizyolojisindekinin aynı şekilde amonyak eliminasyonunu gerçekleştiremediler ve mutasyon içermeyen ASS1 geni hasta kaynaklı organoidlerde aşırı eksprese edildiğinde  fenotipin geriye döndüğü tespit edildi. Sonuç olarak bu çalışma ile ilk kez sitrüllinemi hastalığı için hastaya özgü UPKH'lerden karaciğer organoidlerinin oluşumu ortaya konulmuştur. Bu kişiselleştirilmiş UPKH-türevli organoid kültürleri, hastalık modelleme, ilaç taraması, rejeneratif tıpta kullanılma potansiyeline sahiptir.

Anahtar Sözcükler: Organoid, UPKH, Sitrulinemi

Abstract:
The biggest obstacle to modeling and the development of treatment strategies for liver-related diseases from cancer to metabolic diseases is that hepatocytes can not replicate efficiently in the cell culture. In recent years, knowledge learned from developmental biology research has been the basis of in-vitro differentiation protocols to produce liver cells from pluripotent cells such as embryonic stem cell (ESC) or induced  pluripotent stem cells (iPSC). However, the current problem is that two dimension (2D) hepatocytes are not functionally equivalent to primary hepatocytes. At this point, three-dimensional (3D) cell culture models have become more important because environmental factors such as cell-cell and/or cell-matrix interaction are similar to tissue.
In this thesis, healthy human iPSCs obtained by episomal reprogramming and hepatocytes were generated  by using 2D and  3D organoid culture systems. The cells were characterized in vitro and in vivo conditions at each step. To acheive 3D hepatic organoids, iPSCs were first differentiated into endoderme and FACS purified EpCAM+ cells of endoderm step were used to establish organoid  by using an expansion medium containing various growth factors used in the Huch's protocol. Finally, the organoids were differentiated toward mature hepatocytes under appropriate conditions. 
Organoids from citrullinemia-derived iPSCs exhibited phenotypes such as increased ammonia and citrulline accumulation, similar to the disease pathology observed in patients. These phenotypes could be rescued by ectopic expression of the wild-type ASS1 gene in patient derived organoids. 
Thus, in this study, we report for the the first time the generation of liver organoids from patient-specific human iPSCs for citrullinemia disease. These personalized iPSC derived-organoid cultures have the potential to be utilized in disease modeling, drug screening, personalized and regenerative medicine.

Key Words: Organoid, İPSC, Citrullinemia