Sporadik kolorektal kanser vakalarında genom ebadında kopya sayısı değişimlerinin ve transkriptom profilinin belirlenmesi ile kanserin gelişmesinde ve ilerlemesinde etken yeni genlerin tanımlanması
Identification of new gene and gene groups involved in cancer development and progression through genome-wide copy number variation analysis and transcriptome profiling in sporadic colorectal cancer cases
Yazar: NEVİN BELDER
Danışman: PROF. DR. HİLAL ÖZDAĞ
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Kanser, sık görülmesi ve mortalitesinin yüksek olması bakımından dünyanın en önemli halk sağlığı sorunlarının başında gelmektedir. Kolorektal kanser ise maligniteler içinde mortalitede akciğer ve meme kanserinden sonra üçüncü sırada yer almaktadır. Kanser vakalarının büyük çoğunluğunda olduğu gibi kolorektal karsinomlarda da vakaların önemli bir kısmını (%85-90) sporadik olguların oluşturduğu bilinmektedir. Karsinogenez sürecine iyi bir model teşkil eden bu kanser, yaygın görülmesinin de etkisiyle araştırmalara sıklıkla konu olmuştur. Ancak heterojen yapısı, poligenik ve çok basamaklı doğası kanserin başlangıç, ilerleme ve yayılmasının altında yatan moleküler mekanizmalarda karanlıkta kalan pek çok nokta bırakmıştır. Ayrıca yaygın görülen bu kanser türünde prognostik ve terapötik hedeflere olan ihtiyaç her geçen gün artmaktadır. Bu noktadan yola çıkarak planladığımız çalışmada tümör hücrelerindeki bozulmuş gen ekspresyon paterninin ve tümörigenezis boyunca oluşan spesifik genomik değişikliklerin belirlenmesi ve entegre edilmesi kapsamında kanserin  ortaya çıkış ve ilerleyiş mekanizmalarının altında yatan gerçeklerin tespit edilmesi, yeni prognostik ve terapötik hedeflerin tanımlanması amaçlanmıştır.

Bu çalışmada 50 sporadik kolorektal kanser vakasının rezeksiyon materyellerinden alınan kesitlerden manuel mikrodisseksiyon ile ayrılmış tümör ve normal hücrelerinden (tümör/normal toplam 100 örnek) izole edilmiş DNA ve RNA örnekleri ile genom ebadında genom ve transkriptom profili çıkarılmış olup; gen ekspresyon profilleri ile array bazlı komparatif genomik hibridizasyon sonuçları  biyoinformatik analizlerin ardından ortak gen bölgelerinin tespit edilebilmesi için entegre edilmiştir.

Bu tez çalışması, öngörülen metodolojinin kapsamı ve entegre tasarım yaklaşımı ile birlikte sporadik kolorektal kanseri bir bütünlük içinde inceleyen ilk çalışmadır. Genom ebadında gen ifade analizleri sonucunda tümör-kontrol karşılaştırmasında en az 2 kat değişim ile 346 genin ifadesinde artma gözlenirken 576 genin ifadesinde azalma olduğu belirlenmiştir (p<0.001). Bu karşılaştırmada hücre döngüsü, kanser yolağı, fokal adezyon, ekstraselüler matriks reseptör ilişkisi, p53 sinyal yolağı, apoptozis, metabolizma ve MAPK sinyal yolakları ön plana çıkan yolaklar olmuştur. Sol kolon ve sağ kolon arasında gen ifade profiline göre anlamlı bir farklılık tespit edilemezken grade II ve III örnekleri gen ifade profillerine göre 2 gruba ayrılmıştır. Kopya sayısı değişikliklerinde 2±0.35 değişimi ile toplam 20.984 segment tanımlanmış olup yeni ve daha önce tanımlanmış bölgeler tespit edilmiştir. Bu iki kapsamlı verinin entegrasyonu sonucunda %20 sıklıkla görülen kopya sayısı değişikliklerinin toplam 69 bölgede 79 genin ifadesini etkilediği tespit edilmiştir. Özetle belirlenen genlerin arasında kolorektal kanserle daha önceden ilişkilendirilmiş ve ilişkilendirilmemiş olanlar bulunmaktadır. Bu genlerin tümör ve kontrol grupları ile grade II ve grade III gruplarını birbirlerinden net olarak ayırma gücüne sahip olmaları prognostik ve diagnostik önemlerini belirlemektedir.



Anahtar Kelimeler:Sporadik kolorektal kanser, mikrodizin, gen ifade analizi, kopya sayısı değişikliği, entegrasyon.

Abstract:
Cancer being a frequently seen disease with a high mortality rate is one of the most important public health problem. On the other hand colorectal cancer has the third highest mortality rate after lung and breast cancer. Most of the colorectal cancer cases (85-90%) are sporadic cases like most of other cancers. Colorectal cancer constituting a good model for carcinogenesis studies is thus a highly studied area. However its heterogenous, polygenic and multistep nature still leaves many dark spots in the molecular mechanisms underlying the initiation, progression and spreading of cancer. Besides  for this common cancer type the need for novel prognostic and therapeutic targets is ever growing. Thus, in this dissertation, our strategy was to initially determine the gene expression profile and then specific genomic alterations in tumour cells followed by the integration of these two datasets. Our aim was to identify novel prognostic and therapeutic targets to determine the facts explaining the mechanism of cancer initiation and progression.

In this study the genome and transcriptome profile of manually microdissected normal and tumour cells of 50 sporadic colorectal cancer cases was determined. Following bioinformatics analyses gene expression profiles and array CGH analyses results were integrated to identify common gene loci.

This dissertation with its methodological strategy and integrated analysis scheme is the first study analyzing sporadic colorectal cancer as a whole. The gene expression profile analysis of tumour vs control 346 genes were found to be upregulated whereas 576 genes were found to be downregulated (min. 2 fold, p<0.001). The pathways that were highlighted in this comparison were cell cycle, cancer pathways, focal adhesion, extracellular matrix receptor, p53 signal pathway, apoptosis, metabolism, and MAPK signal pathway. Although we could not identify any gene expression difference between left and right colon, grade II and grade III samples were clustered in two separate groups. We identified a total of 20.984 copy number variations (2±0.35) some of which were novel. The integration of the gene expression and aCGH datasets pointed  79 genes in 69 genomic loci in copy number variations seen with a frequency of minimum 20%. In summary some of the genes determined in this study contain genes previously linked to colorectal cancers and some were novel. The clustering between tumour and normal, grade II and grade III based on these genes underlines their prognostic and diagnostic potential. 


Keywords:Sporadic colorectal cancer, microarray, gene expression analysis, copy number variation,  entegration.