Structural dependence of protein binding and vibrational spectra of some odor molecules: Molecular docking and TD-DFT study
Koku moleküllerinin protein etkileşimlerinin ve titreşim spektrumlarının yapıya bağlılığının moleküler kenetlenme ve ZB-YFT ile incelenmesi
Yazar: AYSUN SIRMA
Danışman: PROF. DR. MİNE YURTSEVER
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Koku algısı, Richard Axel ve Linda Buck tarafından 2004 Nobel Ödülü'nü kazanan G protein-bağlı reseptörlerin (GPCR) ve koku alma hücrelerinin işlevlerinin keşfiyle birlikte büyük bir önem kazanmıştır. Bu keşiften bu yana, koku alma mekanizması ve biyokimyasının temel unsurları üzerine birçok bilimsel çalışma gerçekleştirilmiş ve koku algısını anlamamızda büyük ilerlemeler kaydedilmiştir.
Koku algısı, oldukça karmaşık bir süreçtir ve birçok bileşeni içermektedir. Bu süreç, koku reseptörlerinin işleviyle başlar. Koku reseptörleri, koku moleküllerine spesifik olarak bağlanarak elektrik sinyallerini oluştururlar. Bu reseptörler, GPCR adı verilen bir protein ailesine aittir ve koku alma hücrelerinde bulunur. Koku alma hücreleri, burun boşluğunda yer alan özel hücrelerdir ve koku moleküllerinin varlığını tespit ederler.
Koku reseptörleri, koku moleküllerinin tanınması ve kokuya duyarlılığımızın sağlanması açısından hayati öneme sahiptir. Ancak, bu reseptörler aracılığıyla koku moleküllerinin nasıl kokuya dönüştüğü ve moleküler yapılarıyla nasıl etkileşime girdiği hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Birçok faktörün koku moleküllerinin kokuya olan etkisi üzerinde rol oynadığı düşünülmektedir. Örneğin, koku moleküllerinin kimyasal yapısı, kokuya olan etkilerini belirleyebilir. Aynı fonksiyonel gruba sahip olan koku moleküllerinin bazen benzer kokulara sahip olabileceği, bazen ise farklı kokulara sahip olabileceği gözlenmiştir. Bu durum, koku moleküllerinin kokuya olan etkisinde moleküler yapının tek belirleyici olmadığını göstermektedir ve koku moleküllerinin kokuya olan etkisini belirleyen birçok faktör olduğu düşünülmektedir.
Yapısal benzerlik, kiralite, rijitlik, fonksiyonel gruplar, uçuculuk, elektronik özellikler, topoloji, polar olmayan metil gruplarının varlığı ve konumu, sübstitüentlerin van der Waals hacmi, şekli, heteroatomlarının sayısı gibi faktörlerin koku moleküllerinin koku reseptörlerine olan etkisini belirlediği bilinmektedir. Bu faktörler, koku moleküllerinin koku bağlayıcı proteinlere (OBP'ler) olan afinitelerini ve bağlanma davranışlarını etkileyebilir.
Ayrıca, koku moleküllerinin kimyasal yapısı ile UV-VIS titreşim spektrumları arasında da bazı korelasyonlar bulunmuştur. Ancak bu ilişkinin tam olarak nasıl çalıştığı henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, bu konuda daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.
Bu bağlamda, çalışmamızın ilham kaynağı olan bir tez çalışmasında, benzer moleküler yapıya sahip bir dizi koku molekülü ve koku içermeyen molekül üzerinde çalışılmış ve bu moleküllerin OBP14 reseptörüne bağlanma afiniteleri incelenmiştir. Tez çalışmamızı temel amacı, bu moleküllerin serbest halde ve hedef proteine bağlı halde teorik olarak UV-VIS absorpsiyon spektrumları ile floresans emisyon spektrumları gibi spektroskopik verilerini elde etmek ve bunları karşılaştırmaktır. Bu amaçla, Zamana Bağlı Yoğunluk Fonksiyoneli Teorisi (ZB-YFT) metodu kullanılarak M06-2X/6-31G(d,p) seviyesinde spektroskopik çalışmalar gerçekleştirilmiştir.
Arzu edilen çalışmalar yapılmak istenmiştir. Ancak, holo proteinin aktif bölgesi için yapılan hesaplamalarda yakınsama problemlerine atfedilen problemden ötürü floresans emisyon spektrumları elde edilememiştir. Aktif bölgedeki amino asit kalıntılarının birbirleriyle ve ligand molekülüyle olan etkileşimleri, özellikle H-bağı etkileşimleri, optimizasyon sonucunda bozulmakta ve aktif bölgenin doğru bir şekilde modellemesi mümkün olmamaktadır.
Bu nedenle, bu varsayımın doğruluğunu kanıtlamak için teorik br deney tasarlanmıştır. Bu teorik deney; vanilin koku molekülü ile lösin amino asiti arasında 13 farklı H-bağlı kompleksini içermektedir. Bu deneyde, aynı iki molekülün etkileştiği yapılar için hesaplanan elektronik enerjilerin, UV-VIS absorpsiyon ve floresans emisyon maksimum dalga boylarının birbirlerinden oldukça farklı olduğu bulunmuştur. Farklı konformasyonlardaki H-bağları UV-VIS spektrumunu çok fazla etkilemez, dolayısıyla H-bağı UV-VIS spektrumunda önemli bir sonuç ortaya çıkarmaz. Daha sonra her konformasyon için floresan spektrumlarını inceledik. Floresan spektrumlarında farklı aralıklar vardır ve H-bağının floresan spektrumları için etkili olduğu sonucuna vardık. Elde edilen verilere dayanarak vanilin koku molekülü ve lösin aminoasiti arasında oluşan 12 farklı H-bağlı kompleks maviye kayma göstermiştir. Sadece en kararlı H-bağlı kompleks bu durumu ihlal etmiştir. Bu deneyin sonucu olarak yapının floresans emisyon spektrumundaki mavi kaymaların, bağlanma bölgesine bağlı ligand varlığının bir işareti olabileceği söylenebilir. 
Bu tezin bir diğer bölümünde, moleküler kenetlenme çalışmaları Autodock Vina yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Hedef proteinin kristal yapısı protein veri bankasından alınmış ve Apis mellifera OBP14 olarak bilinen bir taşıma proteini, floresan probu 1-N-fenilnaftilamin (NPN) ligandı ile kompleks halinde izole edilmiştir. Fakat, ligandlarla ve ligand olmayanlar arasındaki deneysel bağlanma davranışındaki farklılıklar, kenetlenme bağlanma enerjileriyle tam olarak açıklanamamıştır. Bu nedenle, bu konuda daha fazla araştırma yapılması ve yeni deneylerin tasarlanması gerekmekte olduğu düşünülmektedir.
Kenetlenme çalışmalarında herhangi bir korelasyon elde edilmemesine rağmen, UV-VIS absorpsiyon spektrumlarından elde edilen bilgiler bazı sonuçlar çıkarmamızı imkân tanımıştır. İncelenen 14 koku molekülü, deneysel bağlanma sabitlerine (K_d) göre ligand veya ligand olmayan olarak sınıflandırılmıştır. Tüm moleküllerin sadece UV bölgesinde (200 nm-400 nm) absorpsiyon yaptığı ve ligand moleküllerinin ligand olmayan moleküllere göre daha yüksek osilatör kuvvetine ve daha yüksek λmax değerlerine sahip olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, koku moleküllerinin kimyasal yapıları içerisinde bulunan aromatik halkalar, bu halkalara bağlı grupların büyüklüğü ve konjugasyon uzantıları UV-VIS spektrumlarda belirgin piklerin oluşmasını etkilemektedir. Bilindiği üzere en iyi bağlanan moleküller en yüksek piklere sahiptirler. Tüm bunların sonucunda gerçekleştirdiğimiz ikinci kısımdaki deneylerde UV-VIS spektrumlarını çıplak ve moleküle bağlı karşılaştırdığımızda proteine bağlı moleküllerde kırmızıya kayma gözlenmiştir. 
Bu tez çalışması, koku algısı ve koku moleküllerinin etkileşimleri konusundaki anlayışımızı geliştirmek için önemli bir adımdır. Ancak, henüz birçok sorunun cevabını bulmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Gelecekteki çalışmalar, koku algısının temel mekanizmalarını ve koku moleküllerinin koku alma hücrelerine olan etkilerini daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu alanda yapılan ileri araştırmalar, koku algısının karmaşıklığını ve moleküler etkileşimlerin detaylarını aydınlatabilir.

Abstract:
The perception of odor has become an important scientific problem ever since the discovery of G protein-coupled receptors (GPCRs) and their role in olfactory cells by Axel and Buck, who were awarded the Nobel Prize in 2004. Over the years, numerous biological studies have been dedicated to understanding the mechanism of olfaction and its underlying biochemistry, which is now almost fully understood. In simple terms, olfactory receptors bind to odor molecules and transmit electrical signals to the brain. However, the relationship between the molecular structure of a compound and its odor is not completely known. Odorant compounds with the same functional group may or may not have similar odors, while compounds with different molecular structures may exhibit the same odor.
Studies have revealed that several factors, including chirality, rigidity, functional groups and their steric effects, volatility, electronic properties, topology, presence and position of nonpolar methyl groups, van der Waals volume of substituents, shape, number of heteroatoms, and more, can influence the odor and receptor binding behavior of odorant compounds against odorant-binding proteins (OBPs). Additionally, the literature suggests a correlation between the chemical structure of odor molecules and their UV-VIS vibrational spectra.
This thesis study focuses on a series of odor and non-odor molecules with similar molecular structures, for which their binding affinities against OBP14 are known. Time-dependent density functional theory (TD-DFT) calculations were performed at the M06-2X 6-31G(d,p) level. Initially, the calculations were carried out on the odor molecules in both naked and receptor-bound states to obtain and compare their UV-VIS absorption and fluorescence emission spectra. However, due to convergence problems in the TDDFT calculations arising from incorrect cutting of the active site of the holo protein, only the isolated odor molecules were studied for their fluorescence emission spectra. The failure to accurately represent the hydrogen bonding interactions between amino acid residues and amino acids and ligands may result in the omission of certain non-covalent interactions, thereby preventing the acquisition of correct binding poses. This hypothesis was confirmed through a small theoretical experiment involving the odor molecule vanillin and the amino acid leucine, which formed 12 different hydrogen-bonded complexes. The calculated electronic energies, UV-VIS absorption spectra, and fluorescence emission maximum wavelengths were found to be significantly different from one another.
In the second part of the thesis, molecular docking software Autodock Vina was employed to assess the protein binding behavior of the studied molecules against the transport protein Apis mellifera OBP14. The crystal structure of OBP14, obtained from the 3S0B PDB code in the protein data bank, was isolated as a complex with the fluorescent probe 1-N-phenylnaphthylamine (NPN) ligand. The docking scores were compared with experimentally measured binding constants but were found to be uncorrelated. However, insights gained from the UV-VIS absorption spectra allowed for some conclusions to be drawn. The 14 studied molecules were classified as ligands or nonligands based on their experimental binding constants. It was observed that all molecules absorbed light in the UV region between 200 nm and 400 nm, with ligand molecules exhibiting higher λmax values and oscillator strengths compared to nonligand molecules. The docking score did not differentiate between ligands and nonligands, and the theoretical and experimental binding energies were not correlated. Further investigations are required to determine the underlying reasons for these observations.
This thesis study is an important step in enhancing our understanding of olfaction and the interactions of odor molecules. However, further research is needed to find answers to many questions. Future studies will help us better understand the fundamental mechanisms of olfaction and the effects of odor molecules on olfactory cells. Advanced research in this field can shed light on the complexity of olfaction and the details of molecular interactions.