Iskemiye ikincil damarlanma esnasında çentık sinyal yolagının rolü /
Yazar: OZAN LUAY ABBAS
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN BORMAN
Başkent Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery

Özet:
Embriyonik dönemi takiben yeni damar olusumu, dinamik bir islem olup
organizmanın metabolik, immünolojik ve büyüme gereksinimlerine cevap verecek
biçimde gerçeklesmektedir. Dogum sonrası dönemde, yeni damar olusumu için en
önemli uyaranın hipoksi oldugu düsünülmektedir. Çentik sinyal yolagı hücreler
arası iletisimi saglayarak, hücrelerin büyümesi, farklılasması ve özellesmesi
açısından önemli bir role sahiptir. Islevsel bir Çentik sinyal yolagı, normal damar
gelisimi açısından gereklidir. Embriyonik dönemde damarın arter veya ven
yönünde farklılasmasını sagladıgı gibi, olusan damar agının islevselligi açısından
dallanma isleminde dengeliyici bir rol üstlenmektedir. Bu denge, dallanan
damarın en ucundaki endotel hücrelerinde sentezlenen DLL4 ile saglanmaktadır.
Bu moleküller ana damar endoteli üzerindeki çentik reseptörleri ile etkilesime
girerek vascular endothelial growth factor receptor 2 sentezini baskılamaktadır.
Böylece, vascular endothelial growth factor'un dallandırıcı etkisi
baskılanmaktadır. Postembriyonik dönemde, Iskemiye ikincil gelisen damarlanma
esnasında Çentik sinyal yolagının etkisi halen bilinmemektedir. Bu çalısmada,
sıçanda olusturulan iskemi modelinde Çentik sinyal yolagının etkili olup olmadıgı
sorusuna cevap aramaktayız.
Çalısmada 30 adet erkek "Sprague Dawley" cinsi sıçan kullanıldı. Iskemi
modeli olarak, sırt bölgesinde kaudal bazlı random paternli deri flebi (modifiye
McFarlane flebi) tercih edildi. Sıçanlar 2 gruba ayrıldı. Grup I (kontrol grubu): bu
grupta yer alan 6 sıçana herhangi bir cerrahi islem uygulanmadı. Cerrahi grubunda
kullanılan McFarlane flebinin distal kısmına denk gelen bölgeden doku biopsisi
yapıldı. Kalp içinden kan örneklemesi yapıldıktan sonra sıçanlar sakrifiye edildi.
Grup II (cerrahi grubu): Bu grupta yer alan 24 sıçandan McFarlane dorsal deri
flebi kaldırıldı ve tekrar yerine dikildi. Doku ve kan örneklemeleri ilk 6 sıçandan
55
cerrahi sonrası 1. gün, ikinci 6 sıçandan cerrahi sonrası 3. gün, üçüncü 6 sıçandan
cerrahi sonrası 5. gün ve son 6 sıçandan cerrahi sonrası onuncu gün yapıldı.
Örnekleme islemini takiben sıçanlar sakrifiye edildi. Alınan kan ve doku
örneklerinde incelenen parametreler: ELISA yöntemi ile kanda DLL4 ve VEGF
seviyeleri, GZ - PZR yöntemi ile dokuda DLL4 ve VEGF ifadelenmesi ve
immünohistokimyasal boyama yöntemleri ile dokuda DLL4 proteinin tayini.
Kontrol grubuna ait iskemik olmayan doku ile karsılastırıldıgında, iskemik
dokuda VEGF transkripsiyonunun cerrahi sonrası birinci gün %66 oranında
azaldıgı gözlenmistir. Cerrahi sonrası 3. gün bazal seviyelere tekrar ulastıktan
sonra, en yüksek seviyesine %40'lık artıs ile cerrahi sonrası besinci gün ulastıgını
görmekteyiz. Cerrahi sonrası onuncu gün, ifadelenme bazal seviyeye göre %68
azalmaktadır. Gruplar arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamlıdır (p < 0.01) .
DLL4 ifadelenmesine bakacak olursak, kontrol grubundan elde edilen düzeylere
göre iskemik dokuda DLL4 transkripsiyonunun cerrahi sonrası birinci gün % 63
oranında azaldıgı gözlenmistir. Cerrahi sonrası 3. Gün %147, 5. Gün ise %172
artıs saptanmıstır. Onuncu günde, bazal seviyelere göre %70 azalma saptanmıstır.
Gruplar arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamlıdır (p < 0.01) . Kanda ölçülen
VEGF seviyelerinin ortalamalarına bakıldıgında; kontrol grubu: 0,09 pg/ml,
cerrahi grubu I: 0,37 pg/ml, cerrahi grubu II: 0,63 pg/ml, cerrahi grubu III: 0,25
pg/ml ve cerrahi grubu IV: 0,19 pg/ml olarak bulundu. Gruplar arası fark
istatistiksel açıdan anlamlı bulunmustur ( p < 0.01). Kanda ölçülen DLL4
seviyelerine bakıldıgında; cerrahi grubu I: 0,175 ng/ml ve cerrahi grubu II: 0,28
ng/ml olarak bulundu. Cerrahi grubu III ve IV ile kontrol grubundan alınan
örneklerde düsük seviyeye baglı olarak ölçüm yapılamadı. Gruplar arası farklılık
istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p < 0.01). DLL4 antikoru ile yapılan
immünohistokimyasal boyamada, kontrol grubunda bazı endotelyal hücrelerde
minimal sitoplazmik granüler boyanma gözlendi. Cerrahi uygulanan gruplarda
kapiller proliferasyon alanlarında daha belirgin olmak üzere, endotelyal
hücrelerde degisken siddetlerde yaygın pozitif reaksiyon gözlendi. Cerrahi
grupları arası boyanma siddetinde farklılık gözlenmedi.
Daha önce yapılan çalısmalarda, Çentik sinyal yolagının embriyo ve tümör
damarlarlarında aktive oldugu gösterilmisti. Bu çalısmada, Çentik sinyal yolagının
iskemi ile tetiklenen damarlanma esnasında aktive oldugunu göstermekteyiz.

Abstract:
Postembriyonic neoangiogenesis is a dynamic process which correlates
with tissue's metabolic, immunologic and growth demands. The primary stimulus
for postembriyonic neoangiogenesis is thought to be ischemia. The Notch
signaling pathway is implicated in cell–cell communication, which is important
for the control of cell growth, differentiation, and specification. Functional Notch
signaling is definitely required for normal vascular development, being part of the
genetic program that determines the arterial and venous endothelium identity. In
addition, growing evidence supports the involvement of the Notch ligand Delta
like 4 in the regulation of sprouting angiogenesis in the embriyonic period. This
process is reportedly modulated by Dll4 signals from tip endothelial cells to
neighboring stalk endothelial cells to restrict the emergence of excessive sprouting
through repression of vascular endothelial growth factor receptor 2 transcription
and consequent reduction of responsiveness to vascular endothelial growth factor.
Blockade of Notch signaling reportedly slows down tumor growth despite an
increase of tumor vasculature density because the established vascular network is
functionally inefficient. However, the implication of Dll4 in reparative
neovascularization after ischemia remains unexplored. We investigated the role of
Dll4/Notch signaling in ischemic conditions.
The flap model was, 3X9 cm sized, caudally pedicled, random pattern skin
flap on the back of rat (modified McFarlane flap). Thirty adult male Sprague-
Dawley rats were used in this study. 2 groups were composed. Group I (control
group): 6 rats were included in this group. Dorsal skin biopsies were performed
and blood samples were collected without any surgical procedure. Group II
(surgery group): 24 rats were included in this grup. In all rats, dorsal skin flaps
58
were completely elevated and reinset. Flap biopsies were performed and blood
samples were collected 24 hours, 3 days, 5 days and 10 days postsurgery. Tissue
specimens were assessed for DLL4 and VEGF gene expression by reverse
transcription- polymerase chain reaction analysis (RT-PCR). Plasma levels of
VEGF and DLL4 were measured using ELISA. Immunohistochemical staining
was used for detction of DLL4 in tissue materials.
Compared with nonischemic tissue, there was a %66 decrease in VEGF
tissue expressions in ischemic tissues during the first postoperative day. Normal
levels were reached at third postoperative day. Maximum levels were measured at
the fifth postoperative day with an increase of %40. There was a %68 decrease at
the tenth postoperative day. The differences between groups were statistically
significant (P < 0.01). Compared with nonischemic tissue, there was a %63
decrease in DLL4 tissue expression levels in ischemic tissues during the first
postoperative day. There was a %147 and %172 increase during the third and fifth
days respectively. The differences between groups were statistically significant (P
< 0.01). The mean of plasma levels for VEGF were as follows; control group:
0,09 pg/ml, surgery group I: 0,37 pg/ml, surgery group II: 0,63 pg/ml, surgery
group III: 0,25 pg/ml, surgery group IV: 0,19 pg/ml and control group: 0,09 pg/ml
. The differences between groups were statistically significant (P < 0.01). The
mean of plasma levels for DLL4 were as follows; Surgery group I: 0,175 ng/ml,
surgery group II: 0.28 ng/ml, surgery groups III, IV and control group: not
detectable. The differences between groups were statistically significant (P <
0.01). Imountimmunohistochemical analysis using specific anti-Dll4 antibodies
revealed weak and patchy expression of Dll4 in microvascular ECs of
normoperfused muscles. Conversely, Dll4 expression was upregulated in capillary
endothelial cells after ischemia.
Previous studies reported Dll4 to be expressed in embryonic and tumor
vasculature. In this study, we show the upregulation of the Notch ligand Dll4 in
rat models of ischemia. As a result, we can suggest that the Notch pathway plays
an important role during surgical delay in which ischemia-induced angiogenesis is
stimulated. Therefore, therapeutic anti DLL4 could result in the increase of
adequately functional blood vessels.