Maackia amurensis lökoaglutininin insan anaplastik tiroit karsinomasında alternatif kırpılma olaylarına etkisi
Effects of Maackia amurensis leukoagglutinin on alternative splicing events in human anaplastic thyroid carcinoma
Yazar: GÖKHAN ŞENER
Danışman: PROF. DR. ENGİN KAPTAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Lektinler = Lectins ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Siyalik asitler = Sialic acids ; Tiroid neoplazmları = Thyroid neoplasms

Özet:
Glikan zincirlerinin terminal kısımlarında bulunan α-2,3 bağlı siyalik asit molekülleri kanser hücrelerinin yüzeyinde bulunan en yaygın motifler arasındadır. Normal hücrelere göre kanser hücrelerinde değişen bu hücre yüzey glikan profili anormal glikozilasyon olarak adlandırılır ve kanser hücrelerinde sıklıkla rastlanan bir olgudur. Kanser hücrelerinin yüzeyinde değişen bu glikan motifleri hücrelerin tümörijenik ve metastatik fenotipini etkilediği bilinmektedir. Bitki lektinleri kullanılarak kanser hücrelerinde değişen hücre yüzey glikan örtüsü spesifik olarak hedeflenebilir. Amur Ağacı bitkisinin tohumlarından elde edilen Maackia amurensis lökoaglutinin (MAL-II), α-2,3 siyalik asit motifine bağlanarak anaplastik tiroit kanserinin poliferatif ve invazif özelliklerini baskıladığı gösterilmiştir. Ancak MAL-II'nin bu etkisinin altında yatan mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır. Alternatif kırpılma, öncü mRNA'lardan kodlama yapmayan dizilerin çıkarılıp çeşitli kombinasyonlarla kodlama yapan dizilerin eklenmesi ile gerçekleşir. Proteinlerin alternatif kırpılmış farklı mRNA varyantlarından translasyonu tümör gelişiminde ve kanseröz fenotipin ortaya çıkmasında rol alabilir. Bu çalışmada, anaplastik tiroit kanser hücrelerine MAL-II uygulamasının alternatif kırpılma olaylarına etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, MAL-II uygulanan anaplastik tiroit kanser hücrelerinde RNA-Seq yöntemi ile hücrelerde gerçekleşen alternatif kırpılma olayları belirlenmiştir. Bunun için 24 saat boyunca 0,25µM MAL-II uygulanmış olan anaplastik tiroit kanser hücrelerinin RNA izolatlarından cDNA kütüphaneleri elde edilmiş ve yeni nesil dizileme teknolojisi ile dizi analizi gerçekleştirilmiştir. Alternatif kırpılmaya uğrayan genlerin fonksiyonlarını anlayabilmek için gen ontolojisi ve yolak zenginleştirme analizi yapılmıştır. Genlerde meydana gelen alternatif kırpılma olaylarının sayısı tespit edilerek, geçirdikleri kırpılma olayına göre genler sınıflandırılmıştır. Alternatif kırpılmaya uğrayan genlerin ekspresyon seviyeleri ise diferansiyel ekspresyon analizi ile gerçekleştirilmiştir. Alternatif kırpılma geçiren tüm genlerin (p-değeri<0,05 ve FDR<0,05) gen ontoloji analizi yapılmıştır ve genlerin mRNA kırpılması, mRNA 3' uç işlenmesi, nükleustan mRNA taşınması ve mRNA işlenmesi gibi biyolojik süreçler kategorisinde kümelendiği belirlenmiştir. Hücresel bileşenler kategorisi incelendiğinde nükleoplazma, sitozol, membran, nükleus ve nükleer beneklerde zenginleşme olduğu görülmüştür. Moleküler fonksiyonlar kategorisinde ise protein bağlama, RNA bağlama, kaderin bağlama gibi fonksiyonlarda kümelendiği tespit edilmiştir. KEGG analizinde genlerin splisozom yolağında zenginleştiği bulunmuştur. Genler kırpılma olayına göre sınıflandırıldığında RPAIN, CCNL1, SNRNP70, EIF4A2, C17orf76-AS1, HNRNPH1, SNGH12, MKNK2, CLK3, KLC1, GIT2, GCOM1 gibi kanserle ilişkili pek çok genin yüksek alternatif kırpılma sıklığına sahip olduğu görülmüştür. Bunun yanı sıra, kırpılmaya uğrayan genler arasında EFNA1, GADD45A, ETS2, UPP1, BHELHE40 gibi kanserle ilişkili genlerin yukarı regüle olduğu, GPR110, SPPL2A, LRP1 gibi genlerin ise aşağı regüle edildiği gösterilmiştir. Bulgularımız, MAL-II uygulaması ile anaplastik tiroit kanser hücrelerinde kanser ile ilişkili bazı genlerin alternatif kırpılmaya uğradığını göstermektedir. Sonuç olarak, MAL-II uygulaması ile bu genlerde ve bu genlerin alternatif varyantlarında meydana gelen nicel değişimler, anaplastik tiroit kanser hücrelerinin tümörijenik ve metastatik aktivitesini etkileyebileceğini ortaya koymaktadır.

Abstract:
The α-2,3-linked sialic acid molecules located at the terminal portions of the glycan chains are the most common motifs found on the surface of cancer cells. This cell surface glycan profile, which changes in cancer cells compared to normal cells, is called abnormal glycosylation and is a frequently encountered phenomenon in cancer cells. It is known that these glycan motifs changing on the surface of cancer cells affect the tumorigenic and metastatic phenotypes of the cells. Altered cell surface glycan coat in cancer cells can be specifically targeted using plant lectins. It has been shown that Maackia amurensis leucoagglutinin (MAL-II), obtained from the seeds of the Amur Tree, binds to the α-2,3 sialic acid motifs and suppresses the proliferative and invasive features of anaplastic thyroid cancer cells. However, the mechanism underlying this effect of MAL-II has not been fully elucidated. Alternative splicing events generate mature mRNAs by removing non-coding sequences from precursor mRNAs and placing coding sequences in various orders. Translation of proteins from different alternative spliced mRNA variants can be involved in tumor development and lead to the emergence of the cancer phenotype. In this study, it was aimed to investigate the effect of MAL-II treatment on alternative splicing events in anaplastic thyroid cancer cells. For this purpose, alternative splicing events in the cells were determined by RNA-Seq method. Hence, cDNA libraries were obtained from RNA isolates of anaplastic thyroid cancer cells treated with 0.25µM MAL-II for 24 hours and sequence analysis was carried out with next-generation sequencing technology. Gene ontology and pathway enrichment analysis were performed to explore the functions and pathways of alternatively spliced genes. The number of alternative splicing events was determined and the genes were classified according to the types of splicing event. Also, differential expression analysis was performed to measure the expression level of alternatively spliced genes. Gene ontology analysis of all genes (p-value <0.05 and FDR <0.05) undergoing alternative splicing was performed and it was determined that the genes clustered in the category of biological processes such as mRNA splicing, mRNA 3' end processing, mRNA transport from the nucleus, and mRNA processing. When the cellular components category was examined, it was observed that there was enrichment in the nucleoplasm, cytosol, membrane, nucleus and nuclear spots. In the molecular functions category, it was determined that it clustered in functions such as protein binding, RNA binding, and cadherin binding. In KEGG analysis, genes were found to be enriched in the splicosome pathway. When the genes were classified according to the splicing event, many cancer-related genes such as RPAIN, CCNL1, SNRNP70, EIF4A2, C17orf76-AS1, HNRNPH1, SNGH12, MKNK2, CLK3, KLC1, GIT2, GCOM1 were found to have high splicing numbers. In addition, it has been shown that among the spliced genes, cancer-related genes such as EFNA1, GADD45A, ETS2, UPP1, BHELHE40 are up-regulated, while genes such as GPR110, SPPL2A, LRP1 are down-regulated. Our findings show that some cancer-associated genes undergo alternative splicing in anaplastic thyroid cancer cells with MAL-II administration. In conclusion, quantitative changes in these genes and alternative variants of these genes with the application of MAL-II reveal that it can affect the tumorigenic and metastatic activity of anaplastic thyroid cancer cells.