Pentilentetrazolindüklü epileptik nöbetlerde eritropoetinin proinflamatuar sitokin seviyelerindeki değişimler ve nitrik oksit ile ilişkisi
The relationship of erythropoietin with proinflammatory cytokines and nitric oxide in pentilentetrazole induced epi̇leptic seizures
Yazar: NESRİN BAHÇEKAPILI
Danışman: UZMAN ARİFE ÇİMEN ATALAR
Sağlık Bakanlığı / Tıp Fakültesi / Nöroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Nöroloji = Neurology

Özet:
Epilepsi patogenezinden sorumlu olabilecek birçok mekanizma ileri sürülmektedir. Ancak son yıllarda inflaınatuar mekanizma üzerinde çalışmalar yoğunlaşmıştır ve eldeki kanıtlar oldukça önemli rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Epileptik nöbetlerin patogenezinden sorumlu olabileceği kabul edilen kan beyin bariyeri (KBB) yıkımına mikroglial aktivasyon neden olabilmektedir. KBB yıkımı sonucu periferden beyne geçen immun hücrelerin inflamatuar süreci artırabileceği, sekonder beyin hasarı, nöron hasarına neden olabileceği ileri sürülmektedir. Epilepsi hastaları ve deneysel epilepsi modellerinde beyin ve serumda proinflamatuar moleküllerin artışı rapor edilmiştir. Aynca epilepsi patogenezinde nitrik oksitin rolü de bilinmektedir. NOS türlerinden indüklenebilir nitrik oksitin sitokinler tarafından uyarılabileceği ve inflamatuar sürece katkıda bulunabileceği ileri sürülmektedir. Eritropoietin (EPO)'nun serebral iskemi, travma gibi merkezi sinir sistemi hastalıklarında antiapoptotik, antioksidatif, antinflamatuar, nitrik oksid modülasyonu ve C+a 2 modülasyonu gibi birçok faktör aracılığı ile koruyucu olabileceği rapor edilmiştir. EPO'nun epilepside koruyucu olabileceğine dair hipotezleri  içeren raporlar ve sınırlı sayıda deneysel çalışma vardır. Bu çalışmalarda EPO'nun eksojen verilmesinin anti konvulzif etkisi rapor edilmiş ancak mekanizma halen açık değildir.
Çalışmamız her grupta 8 sıçan olmak üzere 6 grupta planlandı. Kontrol grubu: %0.9 serum fizyolojik verilen grup, Pentilentetrazol grubu: Tek doz 80 mg/kg intraperitonal Pentilentetrazol (PTZ; SIGMA, USA) verilerek akut epileptik nöbet oluşturuldu. 4 saat öncesinde EPO (Eprex, 4000 IU/ml) verilen grup: 3000 IU/kg eritropoetin i.p SF enjeksiyonundan 4 saat önce verildi. 4 saat öncesinde EPO verilen +PTZ grubu: PTZ enjeksiyonundan 4 saat önce 3000 IU/kg eritropoetin i.p olarak verildi. 24 saat önce EPO verilen grup: 3000 IU/kg eritropoetin i.p SF enjeksiyonundan 24 saat önce verilmiştir. 24 saat önce EPO verilen +PTZ grubu: PTZ enjeksiyonundan 24 saat önce 3000 IU/kg eritropoetin i.p olarak verildi. PTZ enjeksiyonundan sonra 2 saat süre ile nöbetler izlendi. Nöbetler; nöbet latansı, nöbet şiddeti ve nöbet süresi olarak skorlandı. Çalışmamızda Wistar türü erkek sıçanlara PTZ (80 mg/kg i.p) verilmesi ile indüklenen nöbetlerde beyin ve serum pro/anti inflaınatuar sitokin, nitrit-nitrat seviyeleri ve hipokaınpusda hücre yapısındaki değişikler ve nitrikoksit sentaz türlerinin ekspresyonu üzerine PTZ'den 4 ve 24
 
saat önce uygulanan 3000IU/kg i.p EPO ön tedavisinin etkilerini araştırdık. Çalışmamızda kullandığımız doz antikonvulzif etkisini rapor eden çalışmalarda kullanılan dozlardan düşüktür. Aynca nöbetlerden önce verilmesi ile EPO'nun profilaktik etkisini inflamatuar medyatörler açısından araştıran benzer çalışma olmaması nedeniyle özgündür.

Çalışmamızda PTZ verilmesi ortalama 2 dk da tonik klonik nöbetlerin oluşumuna neden oldu. 2 saat süreyle izlenen nöbetler şiddet, latans ve süre açısından skorlandıktan sonra 2. saat sonunda dekapite edilen sıçanlardan alınan kan örneklerinde ve çıkarılan beyinlerinde proinflamatuar sitokinler (iL-1 beta, TNF alfa, IL-6) ve antiinflamatuar sitokin, IL-1O seviyelerinin serumda tümünün arttığı beyinde ise IL-6 hariç diğerlerinin anlamlı olarak arttığını saptadık (p<0.01). Kan beyin bariyeri hasarının periferal göstergesi serumda S100B proteini ve nöron hasarının göstergesi olan nöron spesifik enolaz (NSE) serum seviyesi anlamlı olarak arttı (p<0.001). Nöbetler hipokampusta iNOS ekspresyonunun ve hasar göstergesi miyeleperoksidaz reaksiyonun artmasına neden oldu. PTZ verilmeden 4 ve 24 saat önce EPO verilmesinin nöbetlere etkisine baktığımızda ilginç olarak 4 saat önce verilmesi nöbetlerin latansını uzattı (p<0.001) ancak şiddetini etkilemedi. 24 sat önce EPO tedavisi nöbet şiddetini anlamlı olarak azalttı (p<0.001) ancak ilginç olarak 1-2 şiddetinde ortaya çıkan nöbetlerin latansını etkilemedi. Bu bulgu EPO'nun anti konvulzif etkisinin süreye bağlı olduğunu göstermesi açısından özgündür. 4 saat önce EPO tedavisi sitokin seviyelerini, Sl00B proteini ve NSE seviyesini azalttı ancak 24 saat önce tedavi sadece nöbetleri baskılamadı aynı zamanda tüm parametreleri kontrol seviyesine düşürdü. S100B proteinin azalması KBB geçirgenliğinin korunduğunu, NSE'nın azalması hasarın engellendiğini göstermektedir. Bulgularımız ışığında EPO'nun antikonvulzif etkisinin EPO'nun verilme süresine bağlı olduğunu, inflamatuar sitokin ve molekülleri azaltarak antiepileptik etki gösterebileceğini ve EPO'nun epilepside potansiyel terapötik role sahip olabileceğini söyleyebiliriz.

Abstract:
There are many etiological factors proposed in epilepsy pathogenesis but in recent years studies are focused on irıflammatory mechanisms. BBB (blood brain barrier) breakdown is possible etiology of epileptic seizure pathogerıesis which can be caused by microglial activation. it is proposed that after BBB breakdown immune cell migratiorı from periphery to brain induces inflammatory process and causes secorıdary brain arıd rıeuron damage. in the literature increased proinflammatory molecule count is reported in serum and brain of epilepsy patients arıd experimental models. Alsa the role of NOS is well known in epilepsy pathogenesis. it is also proposed that a kind ofNOS known as inducible NOS can be stimulated by cytokines arıd carı contribute to inflammatory process. The protective role of EPO in central nervous system diseases like trauma and cerebral ischemia by arıtiapopitotic, arıtioxidative, anti-inflammatory NO arıd Ca+ı modulation is reported. There are limited experimental studies regarding protective role of EPO in epilepsy. in these studies exogenous administrations of EPO reported to cause arıticonvulsive effect but mechanism of this effect is stili not clear.

in our study we examined the therapeutic effect of EPO on PTZ induced  seizures with brain and serum proinflammatory cytokines, nitrite-nitrate levels and hippocampus cell damage arıd nitric oxide cytokine types expression. EPO is administered 4 arıd 24 hours before PTZ intraperitonealy 3000 IU/kg. We used lower doses than other studies.  Our study is unique because EPO is administered before seizures. in our study  PTZ induced torıic clonic seizures at a mean time of 1 minute. We scored seizures regarding time, latency and severity. After 2 hours blood and brain samples were obtained from decapitated rats. Proinflammatory cytokines (IL-1-B, TBF alpha, IL-6) arıd anti­ inflammatory cytokines, IL-1O levels were found to be increased in blood samples but other than IL-6 were mearıingfully increased in brain samples (p<0.01). S100B protein which is an indicator of BBB damage arıd NSE which is arı indicator of neuron damage serum levels were mearıingfully increased (p<0.001). Seizures increased NOS expression arıd damage indicator myeloperoxidase reaction in hippocampus. When we compared the administration of EPO 4 arıd 24 hours before PTZ induced seizures we observed that interestingly 4 hours before administration caused increased latency of seizures (p<0.001)

X
 



but have no effect on severity. 24 hours before EPO administration decreased severity of seizures meaningfully (p<0.001) and did not effect the latency of grade 1-2 severe seizures. This finding is original for showing that the effect of EPO is time dependent. 4 hours before EPO treatment decreased cytokine levels, S100B protein and NSE levels. 24 hours before treatment not only depressed seizures but also decreased all parameters to control levels. S100B protein decline shows BBB permeability is protected; NSE decline shows that the damage is prevented. In the light of our findings we can say that anticonvulsive effect of EPO depends on administration time, can induce antiepileptic effect by decreasing inflammatory cytokines and molecules and EPO may have a therapeutic role in epilepsy disorder.