Tavuklarda dermanyssus gallınae'nin moleküler karakterizasyonu ve salmonella SPP. yönünden vektörlük potansiyellerinin moleküler olarak araştırılması
Molecular characterization of dermanyssus gallinae in chickens and molecular investigation of their potential as vectors of salmonella SPP
Yazar: ZEKİYE KOÇER
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Dermanyssus gallinae = Dermanyssus gallinae ; Hastalık vektörleri = Disease vectors ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Salmonella = Salmonella ; Tavuklar = Chickens ; Tavukçuluk = Chicken farming ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu çalışmada, Kayseri yöresinde bir yumurta tavukçuluğu işletmesinde enfestasyona yol açan Dermanyssus gallinae popülasyonuna ait nesillerin filogenetik yapılanmaları ve Salmonella spp. enfeksiyonlarının nakli açısından risk potansiyelleri moleküler olarak araştırılmıştır. Araştırma materyalini 2014 yılının Temmuz ayında ilgili işletmeden laboratuvara getirilmiş 8 adet ölü tavuk üzerindeki akar örnekleri oluşturmuştur. Tavukların üzerinden ve konuldukları poşetler içerisinden toplam 2750 adet akar örneği toplanmıştır. Toplanan akarlar morfolojik olarak D. gallinae olarak identifiye edilmiş ve gelişim dönemlerine göre 1920 adet ergin (%69,81), 785 adet nimf (%28,45) ve 45 adet larva (%1,63) olmak üzere kategorize edilmiştir. Moleküler ve filogenetik analizler için mithocondrial cytochrome oxidase subunit I (mt-COI) ve ribozomal internal transcribed spacer (ITS+) hedef gen bölgeleri olarak belirlenmiştir. Her gelişim dönemini kapsayacak şekilde örneklerden genomik DNA izolasyonu gerçekleştirilmiş ve akabinde genomik DNA izolatlarının ilgili gen bölgeleri yönünden primer çiftleriyle PCR analizleri gerçekleştirilmiştir. Her iki gen bölgesi için ergin, nimf ve larva dönemlerine ait toplam 7'şer izolata ait amplikon sekans ve filogenetik analizler için klonlanmış ve plazmid pürifikasyonları gerçekleştirilmiştir. Plazmidler vektör spesifik primerlerle sekans analizine tabii tutulmuş ve hedef gen bölgesi dizilimleri elde edilmiştir. Mt-COI sekans analizleri 6 yeni haplotipin varlığını ortaya koymuş olup bu haplotiplerin E, F ve A haplogruplarında yer aldıkları ve aralarında ortalama %11,3 genetik farklılık bulunduğu saptanmıştır. ITS+ filogenisine göre izolatlar arasındaki genetik farklılık %0,3 belirlenmiş olup filogenetik çözünürlük düşük olmakla birlikte izolatların 3 filogenetik grup (Tip 1-3) içerisinde kümelendikleri tespit edilmiştir. Çalışmada ayrıca ITS+ gen bölgesi analizleriyle D. gallinae olduğu konfirme edilen bir izolatın mt-COI sekans analizleriyle sığır DNA'sına ait olduğu saptanmış ve barınak ortamında D. gallinae'nin sığırlardan kan emerek beslenebildiğine dair özgün veri sağlanmıştır. Diğer yandan çalışmada D. gallinae gelişim dönemleri bazında oluşturulmuş toplam 38 genomik DNA havuzunun 9 (5 ergin, 3 nimf ve 1 larva havuzu)  'unda (%23,7) Salmonella spp. 16S rRNA gen bölgesini parsiyel olarak amplifiye eden primerlerle PCR analizleri sonucu pozitiflik belirlenmiştir.  Pozitif belirlenen ergin havuzlarına ait iki izolat 16S rRNA sekans ve blastn analizleri sonucu S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis olarak karakterize edilmiştir.
Sonuç olarak bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez D. gallinae nesillerinin moleküler karakterizasyonları sağlanmış ve filogenetik yapılanmaları ortaya konmuş ve Salmonella enfeksiyonlarında vektörlük potansiyelleri açısından oluşturdukları risk faktörleri üzerine özgün bilimsel veriler sağlanmıştır.

Abstract:
Phylogenetic constructions and risk potentials for the transmission of Salmonella spp.of the lineages belong to Dermanyssus gallinae population which caused infestation on a private poultry farm where located in Kayseri region were molecularly investigated in this study.  The mite specimens found on the 8 died hens which were brought to the laboratory in August 2016 from the related enterprise were constituted the research material. Totally 2750 mite specimens were collected from the hens and the nylon bags in which the hens' individullay placed in. The collected mites were morphologically identified as D. gallinae and cathegorized by their development stages as 1920 adult (69.81%), 785 nympf (28.45%) and 45 larvae (1.63%).Mithocondrial cytochrome oxidase subunit I (mt-COI) and ribozomal internal transcribed spacer (ITS+) were determined as the target gene regions for molecular and phylogenetic analyses. Genomik DNA isolations were performed on the specimens which include every development stages and PCR analyses of the obtained isolates were done with the primer pairs specific to the target gene regions. Amplicons from 7 isolates belong to the adult, nympf and larvae stages for both gene regions were cloned and plasmids purifications were performed. The obtained plasmids were sequenced with the vector specific primer pairs and the sequences of the target gene regions were obtained. The mt-COI sequence analyses revealed 6 new haplotypes and these haplotypes were designated in the haplogroups E, F and A. The mean genetic diversity among the obtained haplotypes were determined as 11.3%. The mean genetic diversity among the isolates was designated as 0.3% based on ITS+ phylogeny and the isolates were clustered in 3 phylogenetic group (Type 1-3) with a low phylogenetic resolution. In addition one isolate that was confirmed as D. gallinae was determined as belong to cattle DNA with the sequence analyses of mt-COI in this study and this result proved an unique data for blood feed of D. gallinae from cattle in natural conditions. On the other hand 9 (23.7%) (5 adults, 3 nympf and 1 larvae) out of totally 38 genomic DNA pools which were consitituted from the development stages of D. gallinae were found to be positive for Salmonella spp. in PCR with the primers that amplify the partial 16S rRNA gen region. Two positive isolates belong to the adult pools were characterized as S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis with the sequence and blastn analyses of the 16S rRNA.  
In conclussion, molecular characterization and phylogenetic construction of D. gallinae linages were provided for the first time in Turkey with this study. Furthermore unique scientific data were obtained on the risk factors for vector potential of D. gallinae in the Salmonella infections.