Theileriosis'in tedavisinde kullanılabilecek yeni bir ilaç adayı tespit etmek için kumarin türevlerinin Theileria annulata enolazını inhibisyon potansiyelinin araştırılması
Investigation on Theileria annulata enolase inhibition potential of coumarin derivatives to identify new drug candidates to be used in the treatment of theileriosis
Yazar: SİNEM YAKARSÖNMEZ
Danışman: PROF. DR. DİLEK BALIK ; DOÇ. DR. ÖZKAN DANIŞ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Tropikal theileriosis, bir apikompleksan parazit olan Theileria annulata'nın neden olduğu kene kaynaklı bir hastalıktır. Türkiye'de tüm bölgelerde bu parazitin görülmesi ile birlikte sığırlarda yüksek hastalık ve ölüm oranına sebep olduğu için ekonomik bir öneme sahiptir. Son zamanlarda T. annulata, yaygın olarak kullanılmakta olan antitheilerial ilaç buparvaquone'a karşı direnç geliştirmektedir ve bu nedenle alternatif ilaç adaylarının belirlenmesi gerekmektedir. Enolazın glikolizde 2-fosfogliserik asidin fosfoenolpirüvata dönüşümünü katalizlemesi, çeşitli hücresel fonksiyonlarla ilişkili olabilmesi ve  hücre yüzeyinde bir plazminojen reseptörü şeklinde bulunarak parazitik virülansa aracılık edebilmesi, bu enzimin ilaç bağlanabilen potansiyel bir protein hedefi olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada T. annulata enolazının inhibisyonu için enzim inhibitörü adayı olarak kumarin türevleri seçilmiştir. Bu bileşikler bitkilerde doğal olarak bulunur ve çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptir. Ayrıca, kumarin türevleri genellikle düşük toksisite ile ilişkilendirilmiş olduğundan potansiyel terapötik ilaç adayları olarak kullanılabilmektedir. 
Bu çalışmanın amacı, henüz bilinen bir inhibitörü olmayan T. annulata enolazının (TaENO) aktivitesi üzerine kumarin türevlerinin inhibisyon potansiyelinin literatürde ilk defa değerlendirilmesidir. Deneysel çalışmalar kapsamında ilk olarak ekspresyon gerçekleştirilerek protein afinite kromatografisi ile saflaştırılmış ve enzim stabilizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Daha sonra kumarin türevlerinin inhibitör tarama analizleri, IC50 değerlerinin belirlenmesi, inhibisyon mekanizmasının tespit edilmesi çalışmaları yapılarak, son aşamada protein homoloji modelleme ve inhibitör varlığında ve yokluğunda moleküler yanaştırma ile yapısal olarak analiz edilmiştir. 
İnhibisyon çalışmaları öncesinde ilk olarak, saflaştırılan TaENO'nun protein stabilizasyon analizleri yapılmış ve enzim çözeltisine 6 M etilen glikol eklendiğinde +4 ⁰C'de TaENO'nun stabil kaldığı belirlenmiştir. İnhibitör tarama analizleri yüksek saflıktaki (>% 95) TaENO ile 38 adet kumarin türevi kullanılarak yapılmıştır. Beş kumarin türevinin [3-(3,4-dihidroksifenil)-6,7-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K5); 4-(3,4-dimetoksifenil)-6,7-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K8); 4-(3,4-dihidroksifenil)-7,8-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K9); 4-(3,4-dihidroksifenil)-6,7-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K21) ve 3-(3,4-dihidroksifenil)-7,8-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K23)] bu enzim üzerinde en yüksek (>% 90) inhibitör etkisine sahip olduğu tespit edilmiş ve IC50 değerleri belirlenmiştir. Bu kumarin türevleri içinde en düşük IC50 değeri K21 kumarin türevi için 8,871 μM olarak bulunmuştur. K5, K8, K9 ve K23 için IC50 değerleri sırasıyla 27,910 µM, 10,450 µM, 13,170 µM ve 10,863 µM olarak belirlenmiştir. Belirlenen en düşük (<15 μM) IC50 değerlerine sahip dört kumarin türevinin (K8, K9, K21 ve K23) inhibisyon mekanizmasını tespit etmek için kinetik analizler gerçekleştirilmiş ve bu bileşiklerin TaENO aktivitesini yarışmasız inhibisyon mekanizması ile inhibe ettiği tespit edilmiştir. Ayrıca literatürde tavşan kas enolazı üzerinde çalışmış olan ticari inhibitör ENOblock®'un, TaENO'yu inhibisyon potansiyeli de değerlendirilmiş ve TaENO üzerinde çok düşük bir inhibitor etkisine sahip olduğu belirlenmiştir (100 µM'da % 15,04 inhibisyon). Tüm bu çalışmalarda en yüksek inhibisyon potansiyeline sahip olduğu belirlenen K21 kumarin türevinin TaENO'ya bağlandığı MALDI-TOF kütle spektroskopisi kullanılarak doğrulanmıştır. 
T. annulata enolazının açık ve kapalı konformasyonları homoloji modelleme metodları kullanılarak modellenmiştir. Bu modeller, korunmuş katalitik halka bölgeleri ve aktif bölge rezidüleri ile enolaz süperailesi içerisinde benzer katlanma modelleri göstermiştir. TaENO modelinin aktif bölge ve potansiyel ilaç bağlanma bölgeleri protein dizi analizleri ile karşılaştırılarak öngörülmüştür. Substratın (2-Fosfogliserik asit, 2-PG) ve belirlenen dört kumarin türevinin TaENO üzerinde muhtemel bağlanma pozisyonlarının öngörülmesi için moleküler yanaştırma analizleri gerçekleştirilmiştir. 
Bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde K8, K9, K21 ve K23 kumarin türevlerinin, TaENO'nun güçlü, substrat analogu olmayan ve yarışmasız inhibitörleri olduğunu ortaya koymaktadır. In silico analizler de en yüksek inhibisyon gösteren K8 ve K21 kumarin türevlerinin inhibisyon mekanizmasına paralel olarak, aktif bölge dışında belirlenen bölgelere iyi bir afinite ile bağlandığı göstermiştir. Bu tez çalışması ile yapıya dayalı ilaç geliştirme yaklaşımı kullanılarak literatürde ilk defa TaENO inhibitörleri tanımlanmış ve bu inhibitörler kullanılarak var olan ilaçlara direnç geliştirmiş olan T. annulata enfeksiyonlarının tedavisine yönelik yeni ilaç adayı geliştirme yönünde ileri in vitro ve in vivo analizlerin önü açılmıştır.

Abstract:
Tropical theileriosis is a tick-borne disease caused by an apicomplexan parasite Theileria annulata. The disease has an economic importance due to the high rate of morbidity and mortality accompanied by the appearance of this parasite in all geographical regions of Turkey. Resistance against commonly used antitheilerial drug, buparvaquone, has already been reported and therefore, alternative drug candidates should be identified. In this way, enolase might be a druggable protein target because the enzyme is a multifunctional protein that catalyzes the conversion of 2-phosphoglyceric acid to phosphoenolpyruvate in glycolysis and was observed as a plasminogen receptor could interfere with the virulence of parasites. In this study, coumarin derivatives were selected as potential enzyme inhibitors for inhibition of T. annulata enolase. These compounds are naturally found in plants and have diverse biological activities. In addition, coumarins could be used as potential therapeutic drug candidates due to their low toxicity. 
The aim of this study was to assess inhibition potential of coumarin derivatives on T. annulata enolase (TaENO) activity, for the first time in literature. Firstly, the protein was expressed, and purified by affinity chromatography and then, enzyme stabilization studies were performed. Inhibitor screening analyses, determination of IC50 values and identification of inhibition mechanism were conducted for coumarin derivatives. Finally, protein was structurally analyzed by homology modelling and molecular docking in the presence and absence of inhibitor.
Prior to inhibition studies, protein stabilization analyses of TaENO were performed and it was found that the enzyme remained stable with adding 6 M ethylene glycol at +4 °C. Inhibitor screening analyses were carried out using 38 coumarin derivatives on highly purified TaENO (>95%). Five coumarin derivatives [3-(3,4-dihydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy-2H-chromen-2-one (K5); 4-(3,4-dimethoxyphenyl)-6,7-dihydroxy-2H-chromen-2-one (K8); 4-(3,4-dihydroxyphenyl)-7,8-dihydroxy-2H-chromen-2-one (K9); 4-(3,4-dihydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy-2H-chromen-2-one (K21) and 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-7,8-dihydroxy-2H-chromen-2-one (K23)] showed high inhibitory effects (>90%) among 38 coumarin derivatives and IC50 values of these compunds were calculated. The lowest IC50 value were determined as 8,871 µM for K21 coumarin derivative. IC50 values for K5, K8, K9 and K23 were also found as 27,910 µM, 10,450 µM, 13,170 µM and 10,863 µM, respectively. Kinetic analyses were performed to determine inhibition mechanisms of four coumarin derivatives (K8, K9, K21 and K23) that had IC50 values of <15 μM. Our results indicated that these compounds inhibited the enzyme activity by uncompetitive inhibition. Inhibition potential of a commercial enolase inhibitor, ENOblock®, has been studied on rabbit muscle enolase in the literature was also evaluated, and it was found that the inhibitor possesses very low inhibitory effect on TaENO (15,04% inhibition at 100 µM).  In addition, the binding of K21 coumarin derivative which showed the highest inhibition potential on TaENO was confirmed by using MALDI-TOF mass spectrophotometry.
Open and closed conformations of T. annulata enolase were modelled by homology modelling. These models showed the similar folding patterns within enolase superfamily with conserved catalytic loops and active site residues. Active site and potential drug binding regions of TaENO model were predicted by comparison with protein sequence analysis. Molecular docking analyses of the substrate (2-phosphoglyceric acid, 2-PG) and the four coumarin derivatives were also performed to predict possible binding poses on TaENO. 
Taken together, our results revealed that these coumarin derivatives (K8, K9, K21 and K23) are potent, non-substrate, uncompetitive inhibitors of TaENO. In silico analyses have also predicted that K8 and K21 coumarin derivatives which had high inhibitory effects on TaENO according to the results of inhibition analyses, were interacted with high affinity to the potential regions out of the active site. In this study, potential TaENO inhibitors were described for the first time in the literature by structure-based drug design approach. These inhibitors may be used to facilitate further in vitro and in vivo analysis towards developing new drug candidates for the treatment of drug resistant T. annulata infections.