Bacillus Subtilis suşu'nun bor'a bağlı proteomik analizi
Boron-dependent proteomic analysis of Bacillus Subtilis strain
Yazar: GÜLŞAH KAPISUZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bor, biyolojik sistemde önemli bir elementtir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda Bor'un bazı canlıların gelişimi için esansiyel olduğu rapor edilmiştir. Bunlar arasında bazı bakteri türleri de mevcuttur. İnsan içinse Borun yararlı etkileri gösterilmiş, ancak esansiyelliği konusunda tatmin edici veriler henüz bulunamamıştır. Bunun için uygun model organizmalar kullanılarak, Bor ile ilgili moleküller veya bu elementin etkilediği hücresel oyuncular ve mekanizmalar araştırılmalıdır. 
Bacillus subtilis gram pozitif bir model bakteridir. Bu suşun gerek genomunun, gerekse proteomik haritasının belirlenmiş olması nedeniyle, kullanılması avantajlıdır. Bu çalışmada, Bor tarafından indüklenen ya da baskılan gen ekspresyonuna ışık tutması amacıyla,  farklı Bor konsantrasyonlarında yetiştirilerek elde edilen bakterinin protein ekstraktlarının proteomik analizi gerçekleştirilmiştir. B. subtilis 168 suşu, bor içermeyen, 25 ve 50 mM borik asit içeren zengin besi yerinde büyütülmüştür. Elde edilen hücre pelletleri uygun prosedürlerle parçalanarak protein ekstraktları elde edilmiştir. Protein ekstraktlarının kalite ve miktar analizleri yapıldıktan sonra, iki boyutlu elektroforez deneyleri (2-DE) yapılmıştır. Ardından, PDQuest (Biorad) programı kullanılarak her bir 2D jeldeki protein spotları eşleştirilmiş ve bazı spotlar spot cutter ile kesilerek, proteinler tripsinizasyon işlemine tabii tutulmuştur. Protein peptitleri AB SCIEX 5800 MALDI-TOF-TOF kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. Proteinler Mascot programı kullanılarak tanımlanmıştır.
Bu çalışma sonucunda, elde edilen 8 protein spotının, Bor'a bağlı regülasyonunda farklılık görülmüştür. 
MALDI TOF-TOF analizi sonucu elde edilen pikler, Mascot ve Swissprot veri tabanlarında araştırılarak protein kimlikleri önerilmiştir. 
Buna göre, belirlenen proteinler; Glisil-tRNA sentetaz alfa alt ünite, karakterize edilmemiş protein YbfQ, karakterize edilmemiş protein YloV, S-adenosilmetiyonin sentetaz, Flagellar motor switch fosfataz FliY, Flagellin, Sükroz-6-fosfat hidrolaz ve ATP-bağımlı Clp proteaz proteolitik alt ünite olarak tespit edilmiştir.
Bu çalışmada ilk kez, bir bakteri türünde Bor miktarına bağlı olarak değişen gen ekspresyonunu araştırmak için proteomik çalışmalar yapılmıştır. Ayrıca, elde edilen 8 farklı protein aktivitesinin, stres ve Borla olan muhtemel ilişkileri açısından, literatüre yeni bilgiler sunduğu düşünülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Bacillus subtilis, Bor, Proteomik, Protein, 2D-PAGE

Abstract:
Boron is an important element in the biological systems. It has been reported in the studies conducted in the recent years that boron is essential for the development of some organisms. Among them are some bacteria species. In terms of human, the beneficial effects of boron are strongly suggested although the evidence showing its essentiality remains insufficient. For that, the molecules pertaining to Boron or the cellular players and mechanisms Boron affects should be investigated using appropriate model organisms.     
Bacillus subtilis is a gram positif model bacterium. Using this organism has its advantageous because its genome and the proteomic map are known. In this study, in order to shed light onto the gene expression induced or repressed by boron, the protein extracts obtained from the bacteria grown with varrying boron amounts were used to perform proteomics analyzes. 
B. subtilis 168 strain was grown in the rich medium containing no boron, 25 mM and 50 mM boric acid. The cells in the pellets were then broken using appropriate procedures to get the cell-free protein extracts. After quality and amount analysis of the protein extracts, two dimensional electrophoresis (2-DE) experiments were performed. Then, the protein spots in each gel were matched using PDQuest (Biorad) and some spots were excised out with the spot cutter followed by the trypsinization of the proteins. Protein peptides were analyzed by AB SCIEX 5800 MALDI-TOF-TOF Mass Spectrometry. 
Proteins were then identified using the Mascot program. As a result of this study, 8 of the protein spots were found to be differentially regulated in response to boron. 
The peptide peaks obtained from MALDI TOF-TOF analysis were further searched in the Mascot and Swissprot databases and the identifications of the proteins were given. These are Glycyl-tRNA synthetase alpha subunite, uncharacterized protein YbfQ, uncharacterized protein YloV, S-adenosylmethionine synhetase, Flagellar motor switch phosphatase FliY, Flagellin, Sucrose -6-phosphate hydrolase and ATP-dependent Clp protease proteolytic subunite.
This study is a first in that proteomics were applied using a bacteria species to investigate gene expression dependent upon different boron amounts. It is thought that the eight protein activities found in this study provide new information to the literature regarding their likely relationship to boron and the stress.  
Keywords: Bacillus subtilis, Boron, Proteomics, Protein, 2D-PAGE