Hedefli radyonüklid tedavilerde yeni nesil ajanlar
Novel agents in targeted radionuclide therapy
Yazar: BURCU UÇAR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ZEYNEP MUSTAFAEVA AKDESTE ; PROF. DR. MEHMET ONUR DEMİRKOL
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kadherinler, yanyana hücreler arasındaki moleküler bağlantıyı sağlayan, adezyon mekanizmasının başlatılması ve devamı için kritik öneme sahip olan hücre adezyon ve hücre sinyal molekülleridir. Kadherin aile üyelerinden N-kadherinler, tümör hücreleri ve tümörlere ait genişlemiş kan damarlarında yoğun olarak sunulmaktadır. N-kadherin antagonistleri ise, antineoplastik ve antianjiyogenik aktiviteye sahip vasküler hedefleme ajanlarıdır. Bu ajanlar N-kadherin reseptörüne seçici ve yarışmalı bir şekilde bağlanır, böylece tümör vaskülatürü bozulur, tümör hücre büyümesi inhibe olur ve tümör hücresinin endotel hücre apoptozu indüksiyonu meydana gelir. Bu tez çalışması kapsamında, epitelyal mezenkimal dönüşümün meydana geldiği doku ve hücrelerde sunulan N-kadherini hedeflemek üzere, teranostik platformda uygulanabilecek yeni nesil bir peptid radyofarmasötiğinin sentezlenmesi ve bu analoğun in vitro ve in vivo değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla kimerik antijen reseptörü dizisine dayanan seçici bağlayıcı His-Ala-Val (HAV) motifi içeren N-kadherin antagonisti olarak işlev gören ve (ADH-1)c olarak tasarlanan sentetik N-Ac-CHAVC-NH2 siklik peptid dizisi sentezlendi. Peptid sentezinde verimi yükselten ve rasemleşme miktarını düşüren Fmoc kimyası ile çalışan mikrodalga destekli katı fazda peptid sentez sistemi kullanıldı. (ADH-1)c, lineer eşdeğerinin sentezi ve karakterizasyonu sonrası amonyum asetat (% 5 w/v) kullanarak i→i+5 makrosiklizasyonuyla elde edildi. Peptidin saflaştırılması için ters faz-yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC), karakterizasyonu için sıvı kromatografisi-elektrosprey iyonizasyon-kütle spektrometresi (LC-ESI-MS) kullanıldı. Siklik peptidin EDTA şelatörü ile konjugatı (AntiCAD1) suda çözünür karbodiimid yöntemi uygulanarak sentezlendi. AntiCAD1 ajanının karakterizasyonu için floresans spektrofotometre, zetasizer ve LC-ESI-MS sistemlerinden yararlanıldı. Karakterize edilen AntiCAD1, [68Ga]Ga radyonüklidi ile işaretlendi. [68Ga]Ga-AntiCAD1 analoğunun radyokimyasal saflığı TLC metodları ile analiz edildi. Analoğun lipofilisitesini belirlemek için P dağılım katsayısı hesaplanarak 'çalkalama şişesi' yöntemi uygulandı (logP=-2.69±0.54). Analoğun biyodağılımı, Wistar Albino sıçanları üzerinde PET/CT kullanılarak araştırıldı. Karaciğer, böbrekler, dalak, tükürük bezi ve hedeflenen hasarlı bölgede sırasıyla ortalama 1.36, 1.96, 1.38, 1.16 ve 2.14 SUVmax değerleri ile kayda değer oranda tutulum tespit edildi. Ajanın hedeflenen bölge ile diğer vücut dokuları arasında olan ilişkini test etmek ve bu ilişkinin derecesini ölçmek için istatistiksel Pearson Faktörü hesaplama yöntemi kullanıldı. Korelasyon katsayısı 0.73 olarak hesaplandı. 0.70-0.89 arasında yer alan bu değer kuvvetli pozitif korelasyon olarak yorumlandı. 
Bu tez çalışmasında; kanser epitelyal mezenkimal dönüşüm belirteçlerinden olan adezyon molekülü ADH-1 peptidinden türevlenen radyo işaretli konjugat [68Ga]Ga-AntiCAD1, N-kadherin protein sunumu artan hasarlı dokularda ve metastatik solid tümörlerde kadherin aktivitesinin görüntülenmesinde kullanılabilecek potansiyel bir radyofarmasötik olduğu anlaşılmıştır. Çalışma teranostik platformda dizayn edildiğinden konjugatın terapi radyonüklidleri ile işaretlenmesi durumunda analog terapi amaçlı olarak uygulanabilir olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Cadherins are cell adhesion and cell signaling molecules that provide the molecular link  between adjacent cells, and have critical prescription for initiation and continuation of the adhesion mechanism. N-cadherin, which is a member of the cadherin family, is extensively presented in enlarged blood vessels of tumor cells and tumors. N-cadherin antagonists are vascular targeting agents with antineoplastic and antiangiogenic activity. These agents bind to the N-cadherin receptor in a selective and competitive manner and by this way inhibit tumor vasculature and tumor cell growth, also induce endothelial cell apoptosis induction of tumor cells. As part of this thesis, it is aimed to synthesize a new generation of peptide radiopharmaceuticals that can be applied on the theranostic platform to target N-cadherin present in tissues and cells where epithelial-mesenchymal transformation has taken place and evaluate this agent in vitro and in vivo. For this purpose, a synthetic N-Ac-CHAVC-NH2 cyclic peptide sequence, designed as (ADH-1)c, was synthesized which functions as an N-cadherin antagonist containing a selective binding His-Ala-Val (HAV) motif based on the chimeric antigen receptor sequence. A microwave-assisted solid phase peptide synthesis system based on the Fmoc chemistry was used for raising the yield and reducing the amount of racemization in the peptide synthesis. (ADH-1)c was synthesized by i → i + 5 macrocyclization using ammonium acetate (5% w/v) after synthesis and characterization of the linear counterpart (ADH-1). For the characterization and purification, liquid chromatographic-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) and reverse phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) were used respectively. The conjugate of cyclic peptide and EDTA chelator (AntiCAD1) was synthesized by the water-soluble carbodiimide method. For the characterization of the AntiCAD1 agent the fluorescence spectrophotometer, zetasizer and LC-ESI-MS systems were used. The identified AntiCAD1 has been labeled with [68Ga]Ga radionucleotides. The [68Ga]Ga-AntiCAD1 analytical radiochemical purity was analyzed by TLC methods. In order to determine the analytical lipophilicity, the P dispersion coefficient was calculated and the 'shake flask' method was applied (logP=-2.69±0.54). Analytical biodistribution was investigated using PET/CT on Wistar Albino rats. Mean values of SUVmax were 1.36, 1.96, 1.38, 1.16 and 2.14 in the liver, kidney, spleen, salivary gland, and target lesion areas, respectively. The statistical Pearson Factor calculation method was used to test the relationship between the agent's target region and other body tissues and to measure the degree of this association. The correlation coefficient was calculated to be 0.73. This value, which ranged from 0.70 to 0.89, was interpreted as a strong positive correlation.  
In this study; identified that radio-labeled conjugate [68Ga]Ga-AntiCAD1 derived from the ADH-1 peptide - an adhesion molecule which is one of the cancer epithelial mesenchymal transformation markers can be used as a potential radiopharmaceutical in imaging cadherin activity in damaged tissues in which the increase of N-cadherin protein presentation has been identified and metastatic solid tumors with increased expression of the adhesion molecule. Because the study was designed on a terranostatic platform, it was concluded that the conjugate could be used for analogue therapy if it was marked with therapy radionuclides.