Aspergillus ve Rhizopus suşlarından proteaz enzimi üretimi ve özelliklerinin belirlenmesi
The production and characterization of protease enzyme from strains of Aspergillus and Rhizopus
Yazar: WAEL N.A SHEHADA
Danışman: PROF. DR. GÜVEN URAZ ; PROF. DR. HALUK HAMAMCI
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Araştırmada toprak örneklerinden Aspergillus ve Rhizopus izole edilmiştir. Altı Aspergillus niger, 1 Rhizopus oryzae ve Rhizopus sp 2 adlandırılmıştır. Tür tanımak için ITS gen bölgelerinin dizi analizi yapılmıştır. Fungus örneklerinin proteaz enzimi aktivitesi 2 farklı metodla çalışılmıştır. İlk olarak kalsiyum kazeinat agar ve skim milk agar,da proteaz enzim aktivitesi zon çapları tespit edilmiştir. Daha sonra Aspergillus ve Rhizopus suşlarında fermantasyon çalışılmıştır. Fermantasyon sonucunda ham proteaz enzim aktivitesi belirlenmiştir. Daha sonra Anson metodu ile proteaz enzim aktivitesi tespit edilmiştir. Sonuçta Aspergillus niger 2 örneğin proteaz enzim aktivitesi kalsiyum kazeinat agar,da optimum pH 6,6-8,7 arasında en büyük zon çapı oluşturmuştur (10-20 mm). Rhizopus örneklerinin proteaz enzim aktivitesi optimum pH 6,6-8,7 arasında en büyük zon çapı göstermiştir (30-54mm). Fermantasyonun ortamında tuzlu çözelti ve distile su kullanılarak Aspergillus ve Rhizopus suşlarından hazırlanan ham enzimden 50μL, 100μL farklı pH'larda 5, 6, 7, 8 kalsiyum kazeinat agar'da bulunan kuyucuklara ilave edilerek zon çapları ölçülerek proteoliz belirlenmiştir. Aspergillus niger suşlarının zon büyüklüğü pH 5'de 6-14 mm olarak tespit edilmiştir. Rhizopus suşların zon büyüklüğü pH 8.de 2-8 mm arasında belirlenmiştir. Anson metoduna göre proteaz aktivitesi her bir örnek için hesaplanmıştır. Aspergillus niger suşlarının distile su, tuzlu çözelti ve tam buğday unu kullanılarak yapılan fermantasyon sonucunda proteaz aktivitesi 110-265 U/mL aralığında tespit edilmiştir. Rhizopus suşlarının proteaz aktivitesi 167-325 U/mL dir. Daha sonra proteaz ayrılması için Sephadeks G 100 kolonu kullanılmıştır. Aspergillus niger 2 ve Rhizopus oryzae 1 fermantasyonun sonucu (ham enzimi) gel kolonundan geçirilmiştir ve fraksiyonlar toplanmiştir. Fraksiyonların proteaz aktiviteleri Anson metoduna göre belirlenmiş ve jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapılmıştır. Aspergillus niger 2 suşlarında üretilen proteazın moleküler ağırlığı ≈ 33 kDa tespit edilmiştir. Rhizopus oryzae 1 fraksiyonların jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapılmıştır jel üzerindeki bantlar net olmadığı için üretilen proteazın moleküler ağırlığı tespit edilememiştir. Sonuçta Aspergillus ve Rhizopus suşlarından proteaz enzim aktivitesi farklı metodlarla belirlenmiştir ve enzimler saflaştırılmıştır.

Abstract:
In this study, Aspergillus and Rhizopus are isolated from soil samples. Six Aspergillus niger, 1 Rhizopus oryzae and Rhizopus sp 2 were named. In aim to recognize species, pattern analyzes of gene areas of ITS were made. Protease enzyme activities of fungal strains were studied with 2 different methods; firstly in calcium caseinate agar and skim milk agar protease enzyme activities' zone diameters were established, then fermentation in Aspergillus and Rhizopus strains was studied. As a result of fermentation, crude protease enzyme activity was determined. With Anson method, protease enzyme activity was determined. Ultimately, the protease enzyme activity of Aspergillus niger 2 strain created the biggest zone diameter (10-20 mm) in calcium caseinate agar optimum pH 6.6-8.7. The protease enzyme activity of Rhizopus strains' protease enzyme activity generated the biggest zone cap (30-54 mm) with optimum pH between 6.6-8.7. The proteolysis was determined through measuring the diameter's zone resulted from adding 50 μL, 100μL from the crude enzyme that was prepared from Aspergillus and Rhizopus in various pH 5, 6, 7, 8 on the wells of calcium caseinate agar in a fermentation environment, with the usage of salted solution and distillate water. The zone size of Aspergillus niger strain at pH 5 is determined as 6-14 mm. The zone size of Rhizopus strain at pH 8 is determined as (2-8 mm). According to Anson method, protease activity is calculated for every sample. The protease activity in the end of fermentation of Aspergillus niger strains with distillate water, salted solution and whole wheat flour is detected between 110-265 U/mL. The protease activity of Rhizopus strains is between 167-325 U/mL. Then for the separation of protease, Sephadex G 100 colon was used. Aspergillus niger 2 and Rhizopus oryzae 1 are passed on from gel column at the result of fermentation (crude enzyme) and the fractions are collected. Then protease activity of fractions were determined in respect to Anson method, and gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed. The bands on gel were determined. The protease produced in Aspergillus niger 2 strain; its molecular weight was determined as ≈ 33 kDa. Gel electrophoresis (SDS-PAGE) of Rhizopus oryzae 1 fractions was made. However, since the bands on gel cannot be got out well, the produced protease molecular weight was not determined. Eventually, protease enzyme activity from Aspergillus and Rhizopus strains was determined and purified in different methods.