Reaktif oksijen türleri süpürücü antioksidan aktivitenin ölçümünde modifiye CUPRAC yöntemlerinin geliştirilmesi
Development of modified CUPRAC methods for reactive oxygen species scavenging antioxidant activity measurement
Yazar: MUSTAFA ÖZYÜREK
Danışman: PROF. DR. REŞAT APAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Polifenol = Polyphenol ; Serbest radikaller = Free radicals

Özet:
Süperoksit anyon radikali (O2.-), hidroksil radikali (?OH) ve hidrojen peroksit (H2O2) gibi reaktif oksijen türlerinin canlı organizmalardan uzaklaştırılması ve bu türleri süpürebilen antioksidanların araştırılmasına olan ilgi günümüzde giderek artmaktadır. Bu nedenle bu reaktif oksijen türlerinin (ROS) saptanması ve antioksidanların bu radikalleri süpürme aktivitesinin belirlenebilmesi için basit, duyarlı ve hızlı yöntemler gereklidir. Tez çalışmasında geliştirilen spektrofotometrik yöntemlerde amaç; çalışma grubumuzca daha önce literatüre kazandırılan ve hem ülkemizde hem de dünyada yaygın kullanım alanına sahip CUPRAC `Bakır(II) iyonu indirgeyici antioksidan kapasite' yönteminin esasına bağlı kalınarak çeşitli modifikasyonlarla ilgili reaktif oksijen türlerinin süpürülmesine dayalı antioksidan aktivite analiz yöntemleri geliştirerek CUPRAC yönteminin uygulama alanını genişletmektir.İnsan vücudunda üretilen hidroksil radikali, oksidatif stres kaynaklı hastalıklarla sonuçlanan doku hasarının oluşumunda önemli bir rol oynamaktadır. HPLC/elektrokimyasal dedeksiyon teknikleri ve spesifik olmayan, düşük verimli deoksiriboz yöntemleri (TBARS) gibi mevcut tekniklere alternatif olarak geliştirilen Modifiye CUPRAC yöntemi-I daha uygun, yüksek verimli ve daha düşük maliyetli bir yöntemdir. Bu çalışmada, Fe(II)-EDTA kompleksi ve H2O2 karışımından oluşan Fenton reaksiyonu ile üretilen hidroksil radikallerinin belirlenmesinde salisilat probu kullanılmıştır. İnkübasyon ortamına ilave edilen hidroksil radikal süpürücüler salisilatla yarışmakta ve Cu(I)-Nc kromoforu oluşumu azalmaktadır. İnkübasyon periyodunun sonunda reaksiyon katalaz ilavesiyle durdurulmuştur. Bu çalışmada, bazı polifenolik bileşikler, askorbik asit ve diğer bazı antioksidanların ikinci mertebeden hidroksil radikali süpürme hızları yarışmalı kinetik yöntemiyle belirlenmiştir. Yeni geliştirilen bu yöntemle bazı şifalı bitkilerin (mercanköşk, aslanpençesi, ada çayı vb.) % süpürme etkileri belirlenerek sonuçlar referans yöntem olarak seçilen deoksiriboz yöntemiyle karşılaştırılmıştır. Deoksiriboz yönteminde hidroksil radikali süpürme aktiviteleri ölçülemeyen askorbik asit, gallik asit ve klorojenik asit modifiye CUPRAC yöntemiyle ölçülebilmiştir.Birçok polifenolik bileşiğin ksantin oksidaz (XO) enzimini inhibe etme özelliği bulunmaktadır. XO enzimi, O2.- ve H2O2 gibi ROS türlerinin oluşumunda rol oynayarak oksidatif stres kaynaklı hastalıklara neden olmaktadır. XO aktivite testi süperoksit anyon radikallerinin süpürülmesine dayalı yöntemler içerisinde yeralmaktadır. Ksantin oksidaz aktivite yönteminde (UV-yöntem) ksantin-ksantin oksidaz (X-XO) sisteminden oluşan ürik asit UV bölgede 295 nm'de ölçülmektedir. Bazı polifenolik bileşiklerin bu dalgaboyunda yüksek absorbans göstermesi nedeniyle Modifiye CUPRAC (Modifiye CUPRAC yöntemi-II) yöntemiyle bu interferans etkisi giderilerek oluşan ürik asid ve H2O2'in 450 nm'deki absorbans ölçümlerinden yararlanarak doğrudan polifenolik bileşiklerin (flavonoidler, basit fenolik ve hidroksisinnamik asitler) ve diğer bazı antioksidanların (askorbik asit) XO inhibisyon aktiviteleri tayin edilmiştir. Geliştirilen yöntemle katalaz varlığında QR ve CAT için elde edilen sonuçlar HPLC yöntemiyle uyumlu olarak bulunmuştur. Yeni geliştirilen bu yöntem aynı zamanda bazı şifalı bitki ekstraktlarına uygulanıp bu bitki ekstraktlarının XO inhibisyon etkileri ölçülmüştür. Modifiye CUPRAC yöntemi-II ile bulunan sonuçlar referans yöntem olarak seçilen Ksantin oksidaz aktivite (UV-yöntem) yöntemiyle karşılaştırılmıştır.Hidrojen peroksit biyolojik açıdan oldukça önemli, radikalik olmayan bir reaktif oksijen türü olmakla birlikte oksidatif süreç içerisinde dokularda bulunabilmektedir. Polifenolik bileşiklerin hidrojen peroksiti süpürme (HPS) aktiviteleri ile ilgili olarak literatürde kısıtlı bilgi bulunmaktadır. Bu çalışmada, polifenolik bileşiklerin HPS aktiviteleri yeni bir modifiye CUPRAC yöntemi (Modifiye CUPRAC yöntemi-III) geliştirilerek reaksiyon ortamındaki hidrojen peroksit miktarındaki değişim bakır(II) katalizliğinde spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. HPS aktivite tayini, yaygın olarak inkübasyon sisteminde (H2O2+süpürücü) süpürücü bileşik tarafından tüketilen H2O2'in klasik UV-yöntemle 230 nm'de dedeksiyonuyla yapılmaktadır. Bazı polifenolik bileşiklerin bu dalgaboyunda yüksek absorbans göstermesi nedeniyle Modifiye CUPRAC yöntemi-III ile bu interferans etkisi giderilerek Cu(II) varlığında (H2O2 oldukça kararlı bir bileşiktir ve ancak geçiş metalleri katalizörlüğünde süpürülmesi gerçekleşmektedir) H2O2'in 450 nm'deki absorbans ölçümlerinden yararlanarak doğrudan polifenolik bileşiklerin HPS aktiviteleri tayin edilmiştir. Benzoik asit türevleri içerisinde en yüksek HPS aktivite değeri gallik asid (GA) için bulunmuştur (%HPS=62.8±0.9). Sinnamik asit türevleri içerisinde rosmarinik asid %HPS=26.0±0.5 değeriyle en güçlü antioksidan bileşiktir. Modifiye CUPRAC yöntemiyle bulunan sonuçlar referans yöntem olarak seçilen GSH-Px-DTNB yöntemiyle karşılaştırılmış ve her iki yöntemle uyumlu sonuçlar elde edilmiştir. Yeni geliştirilen bu yöntem aynı zamanda bazı meyve suları ve yeşil çay ekstraktına uygulanıp bu örneklerin % HPS etkinlikleri ölçülmüştür.

Abstract:
Recently the importance of removing excessive active oxygen species from living organisms is becoming increasingly recognized, together with a growing interest in finding antioxidants that can scavenge superoxide anion (O2.-), hydroxyl radical (?OH) and hydrogen peroxide (H2O2). So a simple and sensitive method for the determination of related ROS species and the scavenging activity of the antioxidants is necessary. The aim of spectrophotometric procedures that will be developed in this regard is to use, and modify the widely used CUPRAC (CUPric ion Reducing Antioxidant Capacity) method developed and introduced to world literature by our research group. The purposes of development of such modified CUPRAC methods are to establish novel antioxidant activity analysis methods based on scavenging hydrogen peroxide, hydroxyl, and superoxide anion radicals for individual compounds, synthetic and real mixtures, and to expand the field of application of CUPRAC method.Hydroxyl radicals (?OH) generated in the human body may play an important role in tissue injury at sites of inflammation in oxidative stress-originated diseases. As a more convenient, efficient, and less costly alternative to HPLC/electrochemical detection techniques and to the nonspecific, low-yield deoxyribose (TBARS) test, we used a salicylate probe for detecting ?OH generated by the reaction of iron(II)-EDTA complex with H2O2 (Fenton reaction). Added radical scavengers to the incubation medium compete with salicylate for the ?OH produced, and diminish chromophore formation from Cu(II)-neocuproine (Nc). At the end of the incubation period, the reaction was stopped by adding catalase. With the aid of competitive kinetic reaction, the second-order rate constant of polyphenolics, ascorbic acid, and other compounds were determined. In addition to phenolics and flavonoids, five kinds of herbs were evaluated for their ?OH scavenging activity using the developed method and compared with the reference TBARS test. The modified CUPRAC assay-I proved to be efficient for ascorbic acid, gallic acid and chlorogenic acid, for which the deoxyribose assay test is basically nonresponsive.Various dietary polyphenolics have been found to show an inhibitory effect on xanthine oxidase (XO) which mediates oxidative stress-originated diseases because of its ability to generate reactive oxygen species (ROS), including O2.- and H2O2. Superoxide anion radical scavenging assays include XO test. XO activity has usually been determined by following the rate of uric acid formation from xanthine-xanthine oxidase (X-XO) system using the classical XO activity assay (UV-method) at 295 nm. Since some polyphenolics have strong absorption from the UV to visible region, XO inhibitory activity of polyphenolics (i.e., flavonoids, simple phenolic and hydroxycinnamic acids) and other antioxidants (e.g., ascorbic acid) was alternatively determined without interference by directly measuring the formation of uric acid and hydrogen peroxide using the modified CUPRAC method-II at 450 nm. The findings of the developed method for quercetin and catechin in the presence of catalase were statistically alike with those of HPLC. In addition to polyphenolics, ? ve kinds of herbs were evaluated for their XO inhibitory activity using the developed method and compared with reference classical XO activity assay (UV- method).Hydrogen peroxide is a biologically relevant, non-radical, oxidizing species, and may be formed in tissues through oxidative processes, but there has been limited information regarding its scavenging by polyphenolic antioxidants. The present study was undertaken to determine the hydrogen peroxide scavenging (HPS) activity of several polyphenolic compounds, and other antioxidants (e.g., ascorbic acid) in the presence of CuCl2 using a modified CUPRAC method (Modified CUPRAC method-III). HPS activity has usually been determined by following the rate of H2O2 consumption in an incubation system (H2O2 + scavenger) using the classical UV-method at 230 nm. Since some polyphenolics have strong absorption in the UV-to-visible region, HPS activity of polyphenolics was alternatively determined without interference by directly measuring the concentration of H2O2 using the modi ? ed CUPRAC method-III at 450 nm in the presence of a Cu(II) salt (since H2O2 is a relatively stable compound, not scavenged unless transition metal compounds are present as catalysts). Among benzoic acid derivatives, gallic acid (GA) was found to be the most efficient H2O2 scavenger with its HPS activity being 62.8±0.9 %. Rosmarinic acid (RA) was the strongest antioxidant amongst cinnamate derivatives with a HPS of 26.0±0.5 %. The ? ndings of the developed method for polyphenolics were statistically alike with those of reference GSH-Px-DTNB method. In addition to polyphenolics, some fruit juices and green tea extract were evaluated for their HPS activity using the developed method.