Metisilin dirençli Staphylococcus epidermidis klinik suşlarında sinnamaldehit ve berberin ekstraktlarının antibakteriyel ve antibiyofilm aktivitelerinin araştırılması
Investigation of antibacterial and antibiofilm activities of cinnamaldehyde and berberine extracts in methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis clinical strains
Yazar: BEYZANUR EKEN
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM YILMAZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Kommensal deri mikrobiyotasına ait olan bakteriyel fırsatçı patojen Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), toplum ve hastane kaynaklı enfeksiyonların başlıca etkenidir. Genellikle implante tıbbi cihazlarla ilişki olup yüzeylerinde biyofilm oluşturma yeteneğine sahiptir. Hem Metisilin Dirençli S. epidermidis (MRSE) suşlarının giderek artması hem de biyofilm oluşturma yeteneği, tedaviyi zorlaştırmakla birlikte morbidite ve mortaliteye sebep olmaktadır. 

MRSE biyofilm ilişkili enfeksiyonlarının önlenmesinde sinnamaldehit ve berberinin izole edilen klinik suşlarda antibakteriyel ve antibiyofilm aktivitelerinin araştırılması amaçlandı. 

Çalışmaya Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi'ne Kasım 2022 - Mart 2023 tarihleri arasında polikliniğe başvuran veya yatan ve rutin kültür istenen 117 hasta (%46,2'si erkek; medyan yaşı 57 [IQR 25-68] yıl) dahil edildi. Hastalardan gönderilen farklı klinik örneklerden izole edilen toplam 117 suştan randomize seçilen 40 MRSE suş çalışıldı. Pozitif kontrol Staphylococcus aureus (ATCC 29213 ve ATCC 25923) standart suşları kullanıldı. Sinnamaldehit, berberin, vankomisin ve linezolidin minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile çalışılarak antibakteriyel aktiviteleri belirlendi. Suşlarda biyofilm oluşumu ve planktonik hücrelerde sinnamaldehit ve berberin ekstraktlarının antibiyofilm aktiviteleri 1024-2 µg/mL arası konsantrasyonlarda doku kültürü plakası (TCP) kristal viyole yöntemi ile çalışıldı. Biyofilmle ilişkili gseA, icaA, icaB, icaC, icaD, atlE, fruA, seg, mecA hedef genleri PCR yöntemi ile çalışıldı. Güçlü biyofilm oluşturan MRSE suşun (n=1) morfolojisi ve suşlarda ekstraktların antibiyofilm aktivitesi "scanning electron microscopy" (SEM) ile görüntülendi.

Klinik suşlarda vankomisinin MİK değeri 0,25 ile 2 (medyan 1) µg/mL, linezolidin ise 0,5 ile 2 µg/mL (medyan 1) saptanırken sinnamaldehidin MİK değeri 64 ile 256 µg/mL (medyan 128), berberinin ise 32 ile 512 µg/mL (medyan 256) saptandı. Vankomisin ve linezolide direnç saptanmadı. Sinnamaldehidin MİK değeri Staphylococcus aureus ATCC 29213 standart suşunda 256 µg/mL, Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 standart suşunda ise 128 µg/mL saptanırken berberinin MİK değeri her iki standart suşta da 64 µg/mL olarak saptandı. 

Klinik suşların 31'inde (%77,5) güçlü biyofilm oluşumu ve 9'unda (%22,5) orta biyofilm oluşumu saptandı (OD575), standart suşlardan daha güçlü biyofilm oluşturduğu görüldü. 

Suşların 40'ında (%100) gseA, 37'sinde (%92,5) icaA, 37'sinde (%92,5) icaB, 29'unda (%72,5) icaC, 35'inde (%87,5) icaD, 39'unda (%97,5) atlE, 31'inde (%77,5) fruA, 24'ünde (%60) seg ve 38'inde (%95) mecA saptandı. En fazla saptanan gen, atlE geni idi.

SEM görüntüleme ve analiz çalışmasında 64 µg/mL konsantrasyonda berberinde üç boyutlu kümeleşmiş biyofilm tabakası görülürken aynı konsantrasyondaki sinnamaldehitte biyofilm tabakalarının azaldığı daha düzlemsel bir tabaka görüldü. Ayrıca sinnamaldehidin berberine kıyasla bakteri hücrelerini daha çok birbirinden ayırarak tek tek hücreler haline dönüştürebildiği, biyofilm oluşumunu önlediği ve dolayısıyla daha yüksek antibiyofilm aktivitesi saptandı. 32 µg/mL ve 64 µg/mL konsantrasyonların SEM görüntüsü 4.84KX ve 5KX büyütmelerde berberinin 32 µg/mL konsantrasyonda, 64 µg/mL konsantrasyondakine kıyasla yüzeydeki biyofilm alanında azalma ve hücrelerin biyofilm tabakasından ve birbirlerinden ayrıştığı görüldü. 

Tüm çalışma verileri, hastaların klinik verileriyle de karşılaştırılıp tedavi ile ilişkilendirilerek değerlendirilecektir. Bu çalışmada, MRSE suşları üzerinde her iki ekstraktın da antibakteriyel ve antibiyofilm aktivitesi görülmekle birlikte etki ve mekanizmalarını açıklayacak ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
The bacterial opportunistic pathogen Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), which belongs to the commensal skin microbiota, is the major causative agent of community and nosocomial infections. It is usually associated with implanted medical devices and has the ability to form biofilms on their surfaces. Both the increasing number of Methicillin-Resistant S. epidermidis (MRSE) strains and their ability to form biofilms make treatment difficult and cause morbidity and mortality. 

The aim of the study was to investigate the antibacterial and antibiofilm activities of cinnamaldehyde and berberine, which are alternative antimicrobial agents in the prevention of MRSE biofilm-associated infections, on clinical strains isolated. 

The study included 117 patients (46.2% male; median age 57 [IQR 25-68] years) who were admitted to Dokuz Eylul University Hospital between November 2022 and March 2023. A total of 40 MRSE strains were randomly selected from a total of 117 strains isolated from different clinical specimens sent from patients. Standard strains of Staphylococcus aureus (ATCC 29213 and ATCC 25923) were used as positive controls. Minimum inhibitory concentration (MIC) values of cinnamaldehyde, berberine, vancomycin and linezolid were determined by broth microdilution method. Biofilm formation in strains and antibiofilm activities of cinnamaldehyde and berberine extracts in planktonic cells were studied by tissue culture plate (TCP) method at concentrations between 1024-2 µg/mL. Biofilm-related gseA, icaA, icaB, icaC, icaD, atlE, fruA, seg, mecA target genes were studied by PCR method. The morphology of the strong biofilm-forming MRSE strain (n=1) and the antibiofilm activity of the extracts in the strains were visualized by scanning electron microscopy (SEM).

In clinical strains, the MIC value of vancomycin was 0.25 to 2 (median 1) µg/mL and linezolid was 0.5 to 2 µg/mL (median 1), while the MIC value of cinnamaldehyde was 64 to 256 µg/mL (median 128) and berberine was 32 to 512 µg/mL (median 256). No resistance to vancomycin and linezolid was detected. The MIC value of cinnamaldehyde was 256 µg/mL in Staphylococcus aureus ATCC 29213 standard strain and 128 µg/mL in Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 standard strain, while the MIC value of berberine was 64 µg/mL in both standard strains. 

Strong biofilm formation was detected in 31 (77.5%) and moderate biofilm formation in 9 (22.5%) of the clinical strains (OD575), which were found to form stronger biofilms than the standard strains.

gseA was detected in 40 (100%), icaA in 37 (92.5%), icaB in 37 (92.5%), icaC in 29 (72.5%), icaD in 35 (87.5%), atlE in 39 (97.5%), fruA in 31 (77.5%), seg in 24 (60%) and mecA in 38 (95%) strains. The most detected gene was icaA. SEM imaging and analysis showed a three-dimensional clustered biofilm layer at a concentration of 64 µg/mL, while cinnamaldehyde at the same concentration showed a more planar layer with reduced biofilm layers. It was also found that cinnamaldehyde was able to separate bacterial cells more than berberine and transform them into individual cells, preventing biofilm formation and thus higher antibiofilm activity. SEM image of 32 µg/mL and 64 µg/mL concentrations at 4.84KX and 5KX magnifications showed a decrease in the biofilm area on the surface and separation of cells from the biofilm layer and each other at 32 µg/mL concentration of berberine compared to 64 µg/mL concentration. 

All study data will be analyzed alongside patients' clinical data and assessed in the context of their treatment. 
In this study, both extracts exhibited antibacterial and antibiofilm activity against the same MRSE strains. However, further studies are necessary to elucidate their mechanisms of action.