Juvenil aksenik sakız ağacı eksplantlarından (Pistacia lentiscus L.)süspansiyon kültürlerinin başlatılması ve optimizasyonu
JUVENİL AKSENİK SAKIZ AĞACI EKSPLANTLARINDAN (Pistacia lentiscus L.)SÜSPANSİYON KÜLTÜRLERİNİN BAŞLATILMASI VE OPTİMİZASYONU
Yazar: AYŞE HOŞER
Danışman: PROF. DR. ENGİN TİLKAT
Batman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, Pistacia lentiscus L. (Sakız ağacı)'nın in vitro çimlendirilmiş tohumlarından hücre süspansiyon kültürlerinin başlatılması ve optimizasyonu için bir protokol geliştirilmiştir. İn vitro çimlendirilen sakız fidelerine ait aksenik yaprak ve kök eksplantlarından öncelikle kallus dokusu elde edilmiş, bu kallus hatlarından ise hücre süspansiyon kültürleri başlatılmıştır. Süspansiyon kültürlerinin başlatılması için, ilk olarak P. lentiscus L. tohumları 1 mg/l IBA içeren Murashige ve Skoog (MS) besi ortamında çimlendirildi. Kallus üretmek için kök ve yaprak eksplantları, BAP, Kin ve 2,4-D (her biri 1 mg/l) kombinasyonlarını içeren MS besi ortamında kültüre alındı. Kallus oluşumu için en iyi bitki büyüme düzenleyicisi (BBD) kombinasyonu sarı renkli ve yumuşak tekstürde kallusların elde edildiği 1 mg/l Kin ve 1 mg/l 2,4-D içeren yarı katı  MS besi ortamı olarak tespit edildi ve yine aynı BBD kombinasyonu içeren ancak agar içermeyen MS besi ortamında süspansiyon kültürleri başlatıldı. Süspansiyon kültür koşullarının optimize edilebilmesi amacıyla farklı BBD [BAP, Kin (1.0 ve 0.5 mg/l) ile 2,4-D (1 mg/l)] kombinasyonları içeren, farklı çalkalama hızları (90, 95, 100 ve 110 rpm), farklı ışık yoğunlukları (karanlık ve ışık), farklı sıcaklık dereceleri (4, 25, 37 °C), farklı pH ortamları (4,5, 5, 5.8, 6,5 ve 7.0), farklı şeker tipleri (sukroz ve glukoz) ile bunların farklı kombinasyonlarına (15, 30, 50 mg/l) tabi tutulan MS besi ortamında kültüre alınarak ayrı ayrı test edildi. Test edilen farklı BBD kombinasyonları arasındaki en etkili ortamın, paketlenmiş hücre hacmi (PHH, ml/l), taze ve kuru ağırlık (g/l) değerleri açısından 1 mg/l BAP ve 1 mg/l 2,4-D ile desteklenen MS besi ortamı olduğu tespit edildi. Ancak kültürlerin sürdürülebilirliği ve somaklonal varyasyonlara sebebiyet vermemek adına optimizasyon çalışmalarına test edilen parametreler bakımından aralarında istatistikel olarak fark bulunmayan 1 mg/l Kin ve 1 mg/l 2,4-D BBD kombinasyonu ile devam edilmiştir. Kök ve yaprak süspansiyon kültürlerinin optimizasyonu üzerine denenen söz konusu parametreler bakımından en yüksek PHH, taze ve kuru ağırlık sonuçları 25 °C sıcaklık, 95 rpm çalkalama hızı, pH 5 ile 15g/l (kök) ya da 30 g/l sukroz (yaprak) destekli MS besi ortamından elde edilmiştir. Elde edilen bu veriler ışığında sakız hücre süspansiyon kültürüne ait büyüme fazlarının her birine (lag fazı, eksponansiyel veya log fazı, lineer faz, yavaşlama fazı ve durağan faz) ilişkin zamana bağlı olarak PHH'yi gösteren bir büyüme eğrisi oluşturulmuştur. Hücre süspansiyon kültürleri her 28 günde bir alt kültüre alınarak % 3 sukroz, 1 mg /l 2,4-D ve 1 mg/l Kin destekli MS besi ortamında düzenli olarak muhafaza edilmiştir. Tez çalışmamızdan elde ettiğimiz bu bulgular, sakız hücre süspansiyon kültürlerinin, biyoreaktörlerde değerli kimyasalların büyük ölçekli üretimi için uygun olabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
In this study, a protocol was developed for the initiation and optimization of cell suspension cultures from in vitro germinated seeds of Pistacia lentiscus L. (mastic tree). Callus tissue was first obtained from axenic leaves and root explants of mastic seedlings germinated in vitro and then cell suspension cultures were initiated from these callus lines. To initiate suspension cultures, P. lentiscus L. seeds were first germinated in Murashige and Skoog (MS) medium containing 1 mg / l IBA. Root and leaf explants were cultured in MS medium containing BAP, Kin and 2,4-D (1 mg/l each) to produce callus. The best plant growth regulator (BBD) combination for callus formation was determined as an agar-free liquid MS medium containing 1 mg/l Kin and 1 mg/l 2,4-D and suspension cultures were initiated. In order that the suspension culture conditions can be optimized, the combinations of different BBD (BAP, Kin (1.0 and 0.5 mg/l) and 2,4-D (1 mg/l)), different shaking speeds (90, 95, 100 and 110 rpm), different light intensities (dark and light), different temperature grades (4, 25, 37 ° C), different pH media (4,5, 5 and 7.0), different types of sugar (sucrose and glucose) and their different combinations (15, 30, 50 mg / l) were separately tested by cultured on a MS medium. The most effective medium among the different BBD combinations tested was determined as MS medium supplemented with 1 mg/l BAP and 1 mg/l 2,4-D in terms of packed cell volume (PCV, ml/l) and fresh and dry weight (g/l). However, in order not to cause somaclonal variations at the same time in terms of sustainability of cultures, optimization studies were continued with the combination of 1 mg/l Kin and 1 mg/l 2,4-D, which is no statistical difference between the combination of 1 mg/l BAP and 1 mg/l 2,4-D. In terms of the parameters tested on the optimization of root and leaf derived suspension cultures; the highest PCV, fresh and dry weight results were obtained from MS medium applied 25 °C temperature, 95 rpm agitation speed, pH 5 and supplemented with 15g/l or 30 g/l sucrose (for root and leaf derived cultures, respectively). In the light of the data obtained, a growth curve showing PCV depending on the time for each of the growth phases (lag phase, exponential or log phase, linear phase, deceleration phase and stationary phase) of the mastic cell suspension cultured was created. Cell suspension cultures were maintained regularly by subcultured every 28 days in MS medium supplemented with 3% sucrose, 1 mg/l 2,4-D and 1 mg/l Kin. These findings from our studies suggest that cell suspension cultures of mastic tree may be suitable for large-scale production of fine chemicals in bioreactors.