Preimplantasyonel embriyonik gelişimde ın vivo ve ın vitro asidoz defans mekanizmalarının karşılaştırılması
Comparison of in vivo and in vitro acidosis defense mechanisms in preimplantation embryonic development
Yazar: ÖZLEM IŞIĞIBOL GEZGİN
Danışman: PROF. DR. ŞEREF ERDOĞAN
Çukurova Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Fizyoloji = Physiology

Özet:
Amaç: Hücre içi pH (pHi) düzenlenmesi tüm hücrelerde olduğu gibi preimplantasyon aşamasındaki  embriyolar  için  de  hayati  önem  taşır. Preimplantasyon aşamasındaki embriyolar pHi  düzenlenmesi için temel olarak üç farklı iyon değiştirici mekanizma kullanırlar. Bu mekanizmalardan HCO3⁻/Cl- değiştirici hücreyi alkaloza, Na+/H+ ve Na+, HCO₃⁻/Cl- değiştiricileri ise asidoza karşı korurlar. Bu çalışmada, in vivo elde edilen ve in vitro kültürde geliştirilen farklı aşamalardaki embriyoların (2 hücreli, 4 hücreli, morula ve trofoblast) Na+/H+ değiştirici aktivitesinin tek başına ve Na+, HCO₃⁻/Cl- değiştiricisi ile birlikte sağlanan asidoz defans mekanizmalarının karşılaştırılması amaçlandı.
Gereç yöntem: Çalışmada 5-8 haftalık Balb/c soyu dişi fareler kullanıldı. In vivo ve in vitro elde edilen embriyoların bir grubu pH-sensitif florofor 2,7 Bis Karboksi Etil 5-6  Karboksi Florosin  (BCECF) ile yüklenerek mikrospektrofluorometrik yöntem ile asidozdan iyileşme yanıtları kaydedildi. Na+/H+ değiştirici isoformlarının (NHE1 ve 3) asidozdan iyileşmeye olan katkısını değerlendirebilmek  için spesifik inhibitörler (Kariporid, S3226) kullanıldı. Diğer bir grup embriyoya ise Na+/H+ ve Na+ , HCO₃⁻/Cl- değiştirici proteinlerinin spesifik antikorları ile indirekt immunfloresan boyama yöntemi uygulandı. 
Bulgular:  Asidozdan iyileşmede ana düzenleyici mekanizma olan Na+/H+ değiştirici aktivitesi, in vivo ve in vitro aynı aşama embriyolar arasında anlamlı farklılık göstermezken her iki grupta da en yüksek değiştirici aktivitesi 2-h embriyonik aşamada gözlendi.  Na+/H+ değiştirici 1 ve 3 isoformlarının asidozan iyileşmede etkili olduğu saptandı. Na+ ,HCO₃⁻/Cl⁻ değiştiricisinin asidozdan iyileşmede tamamlayıcı rol oynadığı ve in vitro kültür ortamında gelişen embriyolarda da benzer fonksiyon gösterdiği saptandı. 
Sonuç:  Asidozdan iyileşmede fonksiyonel değiştirici aktivitelerinin 2 hücreli embriyonik aşamada yüksek olması ve embriyonik gelişim sürecinde anlamlı azalmalar görülmemesi, artan metabolik aktivite ve uterusun asidik ortamına uygun olarak etkin bir asidoz defans mekanızmasının bulunduğunu göstermektedir. In vivo elde edilen ve in vitro gelişimi sağlanan tüm preimplantasyonel embriyonik  aşamaların asidoz defans mekanizmalarının etkinliği arasında anlamlı farklılık saptanmamış olması, kültüre edilen ileri aşama embriyoların da IVF uygulamalarındaki embriyo seçiminde düşünebileceğini desteklemektedir.  
  
Anahtar  sözcükler:  Hücre  içi  pH  düzenlenmesi,  Na + /H +  değiştiricisi,  Na + , HCO ₃
⁻ /Cl -  değiştiricisi, preimplantasyonel embriyonik gelişim, immünfloresan boyama

Abstract:
Aim:Intracellular pH (pHi) regulation is crutial for all cell types including preimplantiton embryos. There are three mechanisms that are used for pHi regulation in preimplantation embryos.  HCO3⁻/Cl- exchanger alleviates alkalosis while Na+/H+ and Na+, HCO₃⁻ /Cl- exchangers alleviate acidosis. In this study, we aimed to compare acidosis defence mechanisms provided by Na+/H+  exchanger activity alone and together with Na+,HCO₃⁻/Cl- exchanger activity in in vivo and in vitro embryos.  
Materials and Methods: Embryos were collected from 5-8 week old Balb/c strain female mice. In vivo and in vitro embryos loaded with 2,7 bis carboxyethyl 5-6 carboxy ﬂuorescein  (BCECF)  and  recovery  rates  from  induced  acidosis  were  recorded  by microspectrofluorometric method. Specific inhibitors (Cariporide, S3226) were used to determine the contribution of Na+/H+ exchanger isoforms (NHE1 and 3) to recovery from acidosis. In a group of embryos Na+/H+ and Na+, HCO₃⁻/Cl- exchanger proteins visualised through indirect immunofluorescence protocol.
Results: Na+/H+ exchanger activity was not significantly different between in vivo and in vitro same stage embryos. NHE1 and 3 isoforms contributed to recovery from acidosis. We found that the major mechanism for defence against acidosis is the Na+/H+ exchanger and the Na+, HCO₃-/Cl- exchanger plays a complementary role, and embryos developed in vitro also showed similar results. 
Conclusion: The exchanger activities were high at the 2-cell stage of the embryos and there was no significant decrease during the developmental stages of the embryos. These results suggest that there are effective acidosis defence mechanisms in accordance with  the  increased  metabolic  activity  during  embryonic  development  and  the  acidic environment  of  the  uterus.  The  absence  of  significant  changes  in  acidosis  defence mechanisms  between  in  vivo  and  in  vitro  embryos  at  all  developmental  stages  may indicate that cultured advanced stage embryos can also be used for IVF treatment. 
 
Key  Words:Intracellular pH regulation, Na+/H+ exchanger, Na+ ,HCO₃⁻/Cl- exchanger, preimplantation embryo development, immunofluorescence staining