Penisilin açilaz (PA) saflaştırılması için süpermakrogözenekli hidrofobik afinite sorbentler
Supermacroporous hydrophobic affinity sorbents for penicilline acylase (PA) purification
Yazar: AHMET HAMDİ DEMİRÇELİK
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Penisilin açilaz (PA, EC 3.5.1.11), ilaç endüstrisi için önemli bir enzimdir. PA yarı sentetik penisilinlerin üretiminde hammadde olarak kullanılan 6-aminopenisillanik asitin (6-APA) üretiminde kullanılır. PA'nın saflaştırılması için pek çok yöntem  bulunmasına rağmen, afinite kromatografisi tek basamakta etkili bir ayırım sağladığı için avantajlıdır. Bu çalışmada hidrofobik özellikteki N-metakriloil-L-triptofan (MATrp) fonksiyonel monomerini ligand olarak içeren poli(2-hidroksietil metakrilat) bazlı kriyojel kolon (PHEMATrp) hazırlanmıştır. PA'ın yapısında yer alan hidrofobik özellikteki aminoasitlerin MATrp ile etkileşimi bu çalışmadaki hidrofobik etkileşim kromatografisinin temelini oluşturmaktadır. PHEMA ve PHEMATrp kriyojel kolonlar yüzey alanı ölçümü, infrared spektroskopisi, şişme testleri, elemental analiz ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterize edilmiştir. Başlangıç PA derişiminin, pH'ın, sıcaklığın, ligand miktarının, akış hızının, iyonik şiddetin ve zamanın PHEMATrp kriyojel kolona PA adsorpsiyonuna etkisi araştırılmıştır. PA adsorpsiyonu için optimum pH 5.0 olarak belirlenmiş ve maksimum adsorpsiyon kapasitesi 6.40 mg/g olarak bulunmuştur. Sıcaklığın artması ile birlikte adsorpsiyon kapasitesinin arttığı görülmüştür. Ayrıca 0.25 M tuz derişimine kadar PA adsorpsiyonu artmış, daha yüksek tuz derişimlerinde ise adsorpsiyon kapasitesi düşmüştür. Elde edilen veriler bu afinite sisteminde hidrofobik etkileşimlerin baskın olduğunu göstermektedir. Çalışmanın son aşamasında mantarsı bir kaynak olan Penicillium chrysogenum'dan PA saflaştırılması amaçlanmıştır. Fenilasetik asit varlığında inkübe edilen hücrelerin homojenizasyonundan sonra ham özüt elde edilmiştir. Bu özüt doğrudan PHEMATrp kriyojel kolona verilmiştir. 1.0 M etilen glikol ile desorpsiyon sonrası PA %76.3 verimle ve 332.3 saflaştırma faktörü ile elde edilmiştir. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDSPAGE) sonuçları saflaştırılan PA'ın 23 kDa ve 63 kDa olmak üzere 2 alt birimden oluştuğunu ve toplam moleküler ağırlığının 86 kDa olduğunu göstermektedir.

Abstract:
PA (PA, EC 3.5.1.11) is an important enzyme in drug industry. PA is used in the production of 6-aminopenicillanic acid (6-APA) which is used as a raw material in the production of semi synthetic penicillins. Although there are many methods for PA purification, affinity chromatography is advantageous as it provides efficient one step purification. In this study, poly(2-hydroxyethyl methacrylate) based cryogel column containing hydrophobic N-methacryloyl-L-tryptophan (MATrp) functional monomer as a ligand was prepared. Interaction of MATrp with amino acids in PA structure is the basis of hydrophobic interaction chromatography in this study. PHEMA and PHEMATrp cryogel columns are characterized by surface area measurements, infrared spectroscopy, swelling tests, elemental analysis and scanning electron microscopy (SEM). Initial PA concentration, pH, effect of temperature, amount of ligand, flow rate, ionic strength and time on PA adsorption on PHEMATrp cryogel were investigated. Optimum pH was determined as 5.0 for PA adsorption and maximum adsorption capacity was obtained as 6.40 mg/g. It was observed that adsorption capacity increased with the increasing of temperature.  Also, PA adsorption increased up to 0.25 M salt concentration and decreased in higher salt concentrations. Data obtained in this affinity system suggests that hydrophobic interactions are dominant. In the last stage of the study, purification of PA from a fungal source that is Penicillium chrysogenum is aimed. After homogenisation of cells incubated in the presence of phenylacetic acid, raw extract is obtained. This extract is directly given to the PHEMATrp cryogel column. After desorption with 1.0 M ethyleneglycol, PA was obtained with 76.3% yield and 332.3 purification factor. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) results show that purified PA consists of two subunits with the molecular weights of 23 kDa and 63 kDa and the total molecular weight is 86 kDa.