Süs bitkilerinden elde edilen flavonoid 3'-hidroksilaz (F3'H) ve flavonoid 3'5'-hidroksilaz (F3'5'H) enzimlerinin klonlanmaları, karakterizasyonları ve substrat spesifitelerinin çalışılması
Cloning and characterization of flavonoid 3'-hydroxylase and flavonoid3'5'-hydroxlase from ornemantal plants and studies on their substrate specifities
Yazar: FUAT TOPUZ
Danışman: DOÇ. DR. MURAT KÜÇÜK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmanın öncelikli amacı, çeşitli süs bitkilerinden flavonoid 3'-hidroksilaz (F3'H) ve flavonoid 3'5'-hidroksilaz (F3'5'H) enzimlerini izole etmek ve onları, pYes2.1 vektörü yardımıyla tamamlayıcı DNA (cDNA)'larını oluşturmak ve onları maya içinde hetorolojik olarak ifade etmekti.Çeşitli süs bitki kültürlerinin yaprak kısmındaki mRNA'lar, µMACS mRNA izolasyon kiti kullanılarak izole edilmişlerdir. Ters transkripsiyon, SuperScript II ters transkriptaz ve oligo(-dT) öncü primer kullanılarak gerçekleştirildi. RT-PCR için, primerler bitkilerin mevcut olan F3'H gen dizilerinden, henüz tercümeleri yapılmamış 5' ve 3' bölgeleri için satın alındı. Çeşitli F3 'H genler, birçok primerler kullanılarak test edildi ve çoğaltma için ileri ve ters olmak üzere uygun diziler seçildi. Çoğaltma üretici tarafından belirtilen uygun koşullarda, Taq/Pwo-polimeraz kullanılarak yapıldı.E nzim ifadeleri heterolojik olarak gerçekleştirilen F3'H ve F3'5'H enzimlerinin naringenin (flavonon), kaemferol (flavonol), dihidrokaemferol (dihidroflavonol) ve apigenin (flavon) olmak üzere 4 farklı flavonoid türü ve bir adet fizyolojik önem taşıyan isolikuiritigenin (ISL) adlı kalkon ile reaksiyona sokarak substrat sipesifiteleri belirlendi. Ayrıca, bu substratların çeşitli bitkilerden klonlanan F3'H ve F3'5'H enzimleri için optimum pH'ları bulundu. Bu optimım pH'ların incelenmesiyle apigeninin diğer substratlara göre daha bazik ortamı sevdiği bulundu.Enzimlerin substrat ilgileri bulunduktan sonra, gen dizi karşılaştırmaları gerçekleştirildi. Bilindiği gibi aktif bölgede bulunan sadece 1 amino asit değişikliği bile enzimin aktivitesini değiştirebilmektedir. Gen dizi karşılaştırılmasıyla bulunan benzer ve farklılıklar belirlenerek, aktivitenin gen dizisinin aktif bölgesinde hangi amino asitten kaynaklandığı bulundu. Ger. Hyb. (8) enzimin apigeninle reaksiyon vermemesinin ve bazı enzimlerin ISL ile reaksiyon vermelerinin nedenleri gen dizi karşılaştırılmasıyla bulundu.Anahtar Kelimeler: Flavonoid 3'-hidroksilaz, Flavonoid 3'5'-hidroksilaz, RT-PCR Taq/Pwo-polimeraz, Oligo(-dT), SuperScript II ters transkriptaz, Transkripsiyon.

Abstract:
The primary aim of this work is to isolate flavonoid 3?-hydroxylase (F3?H) andflavonoid 3?5?-hydroxylase (F3?5?H) and to compose cDNA of them with the aid ofpYes2.1 vector and ultimately to express them in yeast heterogeneously.The mRNAs which are found at the leaf part of cultures from various ornemantalplants were isolated by means of ?MACS mRNA kit. Inverse transcription was actualizedusing Supersript II inverse transcriptase and oligo(-dT) primer. Primers that are present inplants from F3?H gene sequences for 5? and 3? zones in RT-PCR were composed. DistinctF3?H genes were tested using numbers of primers and convenient sequences as a reverseand inverse, selected for amplification. Amplification was carried out using Taq/Pwopolimeraseunder right convenient conditions that were described by producer firm.These enzymes which were expressed heterogeously were tested with four differentflavonoids pertaining to each various class as naringenin (flavonone), kaempferol(flavonol), dihydrokaempferol (dihydroflavonol), apigenin (flavone) and physiologicalchalcone named isoliquiritigenin and substrate specifities of them were found.Subsequently, optimum pHs for these enzmes with same substrates were determined, andsubstrates specifities were determined. According to outcomes of opt. pH determinations,It was defined that apigenin is basic-lover substrate.After having reached substrate affinities, gene sequences of enzymes were comparedwith each others. As it is known, one amino acid can bring out changes in enzyme activity.By comparing gene sequences, similarities and differences were determined and the aminoacid responsible for enzyme activity in gene sequence has been found. Reason of inactivityof Ger. hyb. (8) enzyme was determined with comparing gene sequences. It was alsodetermined th reason of why the some enzymes that reacted with ISL with same tecnique.Keywords: Flavonoid 3?-hydroxylase, Flavonoid 3?5?-hydroxylase, RT-PCR,Taq/Pwo-polymerase, Oligo(-dT), SuperScript II reverse transcriptase,Transcription.