Asetilkolinesteraz (AChE) Enziminin Poliakrilik Asit Esaslı Nanofiber Membran Üzerine Kovalent İmmobilizasyonu
Covalent Immobilization of Acetylcholinesterase on to Polyacrylic Acid-Based Nanofiber Membrane
Yazar: BEKİR ÇAKIROĞLU
Danışman: PROF. DR. AYŞE OGAN ; DOÇ. DR. SERAP DEMİR
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Asetilkolinesteraz (AChE) Enziminin Poliakrilik Asit Esaslı Nanofiber Membran Üzerine Kovalent İmmobilizasyonu 

Asetilkolinesteraz (AChE; EC 3.1.1.7),  nörotrasmitter asetilkolini hidrolizleyerek kolin ve asetat oluşturan hidrolazlar sınıfından bir enzimdir. Asetilkolinesteraz canlının sinaptik boşluklarında bulunarak sinaptik iletimin sonlandırılmasında ve nörotrasmisyonunda rol alır ve bundan dolayı yaşam için büyük bir önem taşır.   Pestisitlerde kullanılan etken maddeler kuvvetli AChE inhibitörleridir ve bu maddelerin eser miktarları bile canlıların sağlığı için tehlike oluşturabilirler. AChE inhibisyonunu ölçülmesi pestisitlerin tarımda çalışanlara ve çevreye verdikleri zararı belirlemek için biyobelirteç olarak kullanılmaktadır. Hızlı ve hassas AChE ölçümü için biyosensör tasarımının ilk ve en kritik basamağını, AChE enziminin bir elektrot yüzeyine immobilizasyonu oluşturmaktadır. Bu amaçla AChE enzimini immobilize etmek için destek materyali olarak poliakrilik asit esaslı nanofiber yapı tasarlanmıştır. Nanofiber materyalin enzime kovalent bağlanabilmesi için materyal sorbitol ile modifiye edilmiştir.  Nanofiber materyalin immobilizasyon öncesi ve sonrası Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) tekniği ile fonksiyonel grupları ve taramalı elektron mikroskopu (SEM)  kullanılarak morfolojik yapısı incelenmiştir. İmmobilizasyon ile enzimin optimum sıcaklığı 30°C'den 34°C'ye çıkmıştır. Serbest ve immobilize enzimin optimum pH değerleri sırasıyla 7.4 ve 8.0 olarak bulunmuştur. 12 deneme sonrasında immobilize enzim ilk aktivitesininin %51'ini korumuştur. 60 günün sonunda serbest enzim aktivitesini tamamen kaybederken, immobilize enzim ilk aktivitesinin %29.1'ini kaybetmiştir.  Serbest enzim için Michaelis-Menten sabiti (Km) ve Vmaks değerleri sırasıyla 0,4733 mM, 2,712 mM/dakika bulunurken immobilize enzim için 0,5008 mM, 1,303 mM/dakika olarak bulunmuştur. 
Gelecekte,  ürettiğimiz bu nanofiber destek materyali sağlam, kullanışlı ve düşük maliyetli bir AChE  biyosensör  tasarımında kullanılabilir.

Abstract:
Covalent Immobilization of Acetylcholinesterase on to Polyacrylic Acid-Based Nanofiber Membrane 

Acetylcholinesterase (AChE; EC 3.1.1.7) is a hydrolase which converts neurotransmitter; acetylcholine to choline and acetate and substantial for living organisms. Acetylcholinesterase is a very important enzyme which is found across the synaptic cleft and participates in termination of  synaptic transmission and continuation of neurotransmission process. Active ingredients found in pecticides are very effective acetylcholinesterase inhibitors and even trace amounts of these agents can represent a considerable hazard to health for living things.Measurement of AChE inhibition has been used as a biomarker for the monitoring of exposure to pesticides in occupational and environmental health.  The initial and most critical step for the fabrication of AChE biosensors with superior accuracy and speed involves the immobilization of AChE enzyme onto an electrode surface. For this purpose a polyacrylic acid-based nanofiber membrane was evaluated to immobilize AChE.   Nanofiber material was modified with sorbitol for the covalent immobilization of AChE. Nanofiber structure was elucidated in terms of its functional groups by fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and the morphology of the nanofiber was characterized by scanning electron microscopy (SEM) before and after the immobilization process. The temperature resistance of the enzyme was enhanced and the optimal temperature increased from 30°C to 34 °C by the immobilization. The optimal pH for free and immobilized enzyme was found  as  7.4 and 8.0, respectively. The immobilized enzyme retained 51% of its original activity after 12 runs. The free enzyme depleted of its activity on the 60th day while the immobilized lost literally 29.1% of its original activity. The Michaelis–Menten constants (Km), and Vmax, for the free and immobilized enzyme were found as 0,4733 mM, 2,712 mM/min and 0,5008 mM.,1.303 mM/min., respectively. 

In future a robust, low-cost and beneficial AChE biosensor may be designed by using this nanofiber supporting material.