Kemik doku implant malzemeleri: Osseointegrasyon ve antibakteriyel etkinlik
Bone tissue implant materials: Osseointegration and antibacterial effect
Yazar: DERYA KALELİOĞLU
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışma 2210-C TÜBİTAK Öncelikli Alanlara Yönelik Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı Desteği ile hazırlanmıştır. Sunulan tez çalışması kapsamında osseointegrasyonu destekleyecek antibakteriyel özelliğe sahip titanyum (Ti) kaplamaların geliştirilmesi amaçlanmıştır. Ti plakalar, osseointegrasyonu sağlayacak hidroksiapatit (HA) partiküllerle işlevselleştirilmiş, antibakteriyel özellikte polietilen oksit fiberler ile kaplanarak, malzeme karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca üretilen plakaların osteojenik ve antibakteriyel etkinlikleri, in-vitro hücre kültür çalışmalarıyla incelenmiştir. 
Tez çalışmasının ilk aşamasında kaplama kararlılığının arttırmak ve fiber kaplamalar için geniş yüzey alanı oluşturmak amacıyla, saf ticari Ti plaka (CP Ti) (1x1 cm2) yüzeylerine mekanik ve kimyasal uygulamalar yapılmıştır.  İlk olarak Ti plakalar, P280/400 numara zımpara kağıdı ile iki yönlü zımparalanmış, ardından farklı sürelerde %4' lük nitrik asit (HNO3) uygulaması yapılarak yüzeyde nano boyutta pürüzler oluşturulmuştur. Zımparalanmış ve kimyasal olarak aşındırılmış Ti  plakalar, NaOH ve HCl çözeltilerine batırılarak yüzeylerinde titanyum oksit tabakası oluşumu sağlanmıştır. Malzemelerin yüzey özellikleri ve topografisi, profilometre, su temas açısı ve AFM analizleriyle incelenmiştir. Yüzey uygulamaları ile hem mikron, hem de nano boyutta yapılar oluşturulmuştur. Yüzey uygulamaları sonrasında su temas açısı 84°'den 69°'ye düşmüş ve ıslatılabilirliği daha yüksek bir yüzey oluşumu sağlanmıştır. 
Çalışmanın sonraki aşamasında, osseointegrasyonu desteklemek amacıyla biyomimetik yöntemle, yapay vücut sıvısı içerisinde, farklı tip HA partikül üretimi gerçekleştirilmiştir. M-HA ve B-HA partiküller (bor katkılı HA) mikrodalga enerjisi uygulanarak biyomimetik yöntemle, O-HA partiküller ise oda sıcaklığında biyomimetik yöntemle üretilmiştir. Ti plakaların yüzeyleri, elektroeğirme ile farklı oranlarda HA partikül içeren, polietilen oksit fiberlerle kaplanmış ve en uygun HA miktarı belirlenmiştir. Nanofiberlerin morfolojileri, HA yerleşim ve dağılımları, TEM ve SEM analizleri ile incelenmiş, fiber çapları, Image J programı kullanılarak hesaplanmıştır. Analizler, HA partiküllerin fiber yapısını bozmadan fiber içi ve üzerine dağıldığını göstermiştir. Ayrıca HA katkısı sonucunda fiber çaplarında (210±41nm) büyük değişimler gözlenmemiştir.
Ti plakaların osteojenik aktiviteleri, 28 günlük MC3T3-E1 preosteoblast hücre kültür çalışmaları ile incelenmiştir. Mitokondriyal aktivie test (MTT) sonuçları, HA katkısının hücre yapışmasını desteklediğini ve hücre üremesini PEO fiber kaplı örneklere göre 2 kat fazla olacak şekilde, logaritmik olarak arttırdığını göstermiştir. HA/PEO fiberlerle kaplanmış Ti plakaların osteojenik farklılaşma kapasiteleri, ALP aktiviteleri ile belirlenmiş ve HA içeren örneklerin ALP aktivitesinin 28. güne kadar arttığı gözlenmiştir. Osteoblastlara özgü gen ifade seviyeleri (runx2, kollajen tip1, osteokalsin, osteopontin), RT-PCR çalışmaları ile incelenmiştir. Tüm HA içeren örnekler arasında, bor katkılı HA içeren grubun en yüksek gen ifade seviyelerini gösterdiği belirlenmiştir. Hücre kültür çalışmaları ile, HA katkısının, yüzeyde hücre yapışma, çoğalma ve farklılaşma kapasitelerini arttırdığı sonucuna varılmıştır. 
Ti plakaların antibakteriyel etkileri, standart S. epidermidis (ATCC12228 ve 35984)  bakteri suşları kullanılarak belirlenmiştir. Yapılan analizler, PEO fiber kaplamaların bakteri yapışmasını belirgin bir şekilde azatlığını, ayrıca O-HA içeren grubun  diğer gruplara göre en yüksek antibakteriyel etkiye sahip olduğunu göstermiştir.
Sonuç olarak, Ti malzemelerin yüzeylerine yapılan kaplamalarla osseointegrasyonu başarılı bir şekilde destekleyen, öte yandan hücre yapışmasını belirli oranlarda engelleyen implant kaplaması üretilmiştir.

Abstract:
This study was prepared with the support of TÜBİTAK, 2210-C National scholarship programme for MSc students. This study aims to improve antibacterial titanium coating which enhanced osseointegration at the same time. Titanium (Ti) substrates covered with antibacterial polyethylene oxide (PEO) fibers which have functionalized with hydroxyapatite (HA) particles to improve osseointegration and their characterization studies were performed. Osteogenic and antibacterial activities of coated Ti plates were examined with in-vitro cell culture analysis.
At the first step of the study, mechanic and chemical treatments were applied to the commercially pure titanium plates (cpTi) (1x1 cm2) to improve coating stability and to form extensive surface area for further fiber coating. First, Ti substrates were grinded with 280/400 grit sandpapers in two directions. Then, they were chemically etched by using 4% HNO3 which formed nanoscale roughness on Ti surfaces. The polished and etched Ti substrates were immersed into NaOH and HCl solutions to form titanium oxide layer. Material surface properties and topographies were examined with profilometer, AFM and water contact angle measurements. Surface characterizations showed that mechanical and chemical treatments formed micro- and nanoscale features on titanium surfaces. Surface treatments resulted in contact angle decrease from 84° to 69° which shows that surface hydrophilicity increased.
In the next step, different types of HA particles were used to promote osseointegration which were produced by biomimetic precipitation of concentrated simulated body fluid (SBF). M-HA particles and B-HA particles (boron substituted HA) were produced with biomimetic method supported by microwave irradiation and O-HA particles were produced with biomimetic procedure at room temperature. PEO fibers including different ratios of HA particles were coated on Ti substrates by electrospinning and the most appropriate HA amount was determined. The nanofibers morphology, the HA location and distrubition were characterized via using SEM and TEM analysis. Fiber diameters were calculated by using Image J software. The analysis shows that HA nanoparticles were successfully entrapped in PEO nanofibers. Besides, PEO fiber (210±41nm) diameters were approximately same after HA addition.
Osteogenic activities of Ti plates were examined by preosteoblastic MC3T3-E1 cell culture studies.  Mitochondrial activity (MTT) assay results showed that HA addition promoted cell adhesion and cell population increased exponentially which was two times more than that of PEO fibers. Osteogenic differentiation capacity of Ti substrates were evaluated by ALP activity and all HA coating fiber's values increased till 28th days. Expression rate of osteoblast specific genes (Runx2, Col1, OCN, OPN) were evaluated by using RT-PCR. Among HA containing fibers, boron substituted HA fibers showed highest gene expressions level. Cell culture studies showed that addition of HA nanoparticles improved cell adhesion, proliferation and differentiation.
The antibacterial effects of coated Ti plates were observed by using Stapylococcus epidermidis (ATCC12228 and 35984) bacterial strains. Bacterial adhesion rates showed that, PEO fiber coatings decrease the number of adherent bacteria on Ti plates. The most successful antibacterial effect was provided on O-HA/PEO fiber coated samples.
This study shows that protein and cell adhesion resistant PEO polymer coatings are functionalized efficiently with hydroxyapatite nanoparticles and this coating supporting osseointegration.