Süperkrtik CO2 ile ön işlem görmüş Candida rugosa ve Candida antarctica lipaz enzimlerinin çapraz bağlı enzim agregatları
Cross linked enzyme aggregates of Candida rugosa and Candida antarctica pretreatment with supercritical CO2
Yazar: DERYA DİNÇYÜREK
Danışman: DOÇ. DR. UĞUR SALGIN
Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Çapraz bağlı enzim agregatları (cross-linked enzyme aggregates, CLEA), enzimatik üretim proseslerinde serbest ya da immobilize enzim kullanımındaki darboğazların çözümü için son yıllarda geliştirilen yeni bir immobilizasyon yöntemidir. CLEA'ları diğer taşıyıcısız enzim immobilizasyon yöntemlerine göre alternatif ve yeni ortaya çıkmış bir yöntem olasına karşın; enzim agregatlarının boyutunun herhangi bir difüzyon kısıtlamasına gitmeden nasıl kontrol edilebileceği, enzim konformasyonunun nasıl daha esnek hale getirilebileceği ve enzim aktivitesi ve seçiciliğinin agregasyon koşullarının farklılaştırılması ile nasıl ayarlanabileceği gibi darboğazların aydınlatılması gerekmektedir. Enzimatik sentezlerde çözücü ortamlarına alternatif olarak süperkritik CO2 (scCO2)'in kullanılması enzimlerin bölgesel ve stereo seçimli özeliklerini artırılabilmektedir. Sıcaklık ve basınç gibi biyoproses parametrelerindeki küçük değişimler süperkritik akışkanların fizikokimyasal özelliklerini önemli ölçüde etkilemektedir. Enzimlerin mikro çevresindeki bu değişimler biyokatalizörlerin katalitik aktivite ve yapısal kararlılığını da etkiler. Yüksek lisans tez projesinin temel amacı yaygın uygulamalar için katalitik açıdan oldukça aktif ve yeniden kullanılabilir CLEA'larının tasarımına yönelik esnek bir teknoloji platformu oluşturmaktır. Bu amaç doğrultusunda scCO2 ortamında ön işlem gören enzimlerin CLEA işlemleri öncesi katalitik performansının geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu çalışmada, model enzim olarak Candida rugosa lipazı (CRL) ve Candida antarctica lipazı B (CALB) kullanılmıştır. scCO2 'in sıcaklık ve basınç koşulları sırasıyla 31-60 oC ve 7.38-40 MPa aralığında değiştirilmiştir. CLEA'ların katalitik performanslarını geliştirmek ve en yüksek immobilizasyon etkinliğine ulaşmak için ön işlem koşulları 40 oC ve 10 MPa olarak seçilmiştir. CLEA işlemlerinde scCO2 ortamında 15 min süreyle ön işlem görmüş ve görmemiş CRL ve CALB enzimleri kullanılmıştır. CLEA aktivitelerine başlangıç enzim derişimi (CEo=50-200 mg/mL), gluteraldehit derişimi (CGA=26.7-100 µL/mL) ve amonyum sülfat derişiminin (C(NH4)2SO4=500-800 mg/mL) etkisi araştırılmıştır. Bunun yanı sıra CLEA aktiviteleri üzerine proteik feeder olarak bovin serum albümin (BSA) ve lizin, ve Triton X-100 katkısı da incelenmiştir. BSA derişimi (CBSA) ve lizin derişimi (CLizin) 0.88-16.67 mg/mL aralığında ve Triton X-100 derişimi ise (CTriton X100) 1.67-4 µL/mL aralığında değiştirilmiştir. CLEA hazırlama sürecinden önce scCO2 ile ön işlem görmüş CRL enzimleri kullanılarak; CEo=150 mg/mL, CGA=40 µL/mL, C(NH4)2SO4=600 mg/mL, CLysine=1.67 mg/mL and CTriton X100= µL/mL koşullarında gerçekleştirilen immobilizasyon süreçlerinde 2278.9 U/g CLEA olarak belirlenen maksimum CLEA aktivitesine ulaşılmıştır. Ticari olarak üretilen CRL enziminin CLEA aktivitesine göre elde edilen bu aktivite değeri yaklaşık 2.2 kat daha fazladır. Konvansiyonel CLEA hazırlama yöntemi kullanılarak; CEo=150 mg/mL, CGA=40 µL/mL, C(NH4)2SO4=600 mg/mL, CLysine=1.67 mg/mL ve CTriton X100=3.33 µL/mL koşullarında elde edilen maksimum CLEA aktivitesi ise 1718.2 U/g CLEA değerine ulaşmıştır. Ancak 40 oC ve 40 MPa koşullarındaki scCO2 ortamında ön işlem gömüş CALB enzimleri ile hazırlanan CLEA'ların katalitik aktivitesinde önemli bir artış olmamıştır.

Abstract:
Cross-linked enzyme aggregates (CLEA) has been development to solve drawbacks for used free enzyme or carrier-bound enzyme is a new immobilization method in enzymatic production process, recently. Though CLEA is an alternative and a new immobilization method to others carrier-free immobilization methods, many critical questions still remain to be explored, including how to control the particle size of enzyme aggregates without causing significant diffusion constraints, how to make the enzyme conformation flexible, and how to modulate the enzyme activity and selectivity by altering aggregation conditions. Supercritical CO2 (scCO2) as an alternative enzymatic synthesis medium to organic solvents is increased the regional and stereo selectivity properties of enzymes. The alteration of physicochemical characteristics of scCO2 by process parameters remark influence around the micro environment of enzymes and this also affect catalytic activity and stability of enzyme. This master project is to construct a flexible technology platform for designing highly active and reusable CLEAs for broad applications. For this purpose, we are aim to enhance the catalytic performance of enzyme which treated with scCO2 medium before the preparation of CLEA of enzyme. Candida rugosa lipase (CRL) and Candida antarctica lipase B (CALB) are be used as model enzymes in this study. The pressure and temperature conditions of scCO2 were varied 31-60 oC and 7.38-40 MPa, respectively. To enhance the catalytic performance of CLEAs and reach highest immobilization efficiency, the pretreatment conditions were selected as 40 oC and 10 MPa. CRL and CALB were exposed in neither in scCO2 medium for 15 min or not before the CLEA preparation process. The effect of initial enzyme concentration (CEo=50-200 mg/mL), glutaraldehyde concentration (CGA=26.7-100 µL/mL), ammonium sulphate concentration (C(NH4)2SO4=500-800 mg/mL) on CLEAs activities were investigated. Addition of the bovine serum albumin (BSA) and lysine as a proteic feeder and also Triton X-100 on CLEAs activities were also investigated. BSA concentration (CBSA) and lysine concentration (CLysine) varied from 0.88-16.67 mg/mL, and also Triton X-100 concentration (CTriton X100) varied from 1.67-4 µL/mL. The maximum CLEA activity for CRL enzyme reached to 2278.9 U/g CLEA at CEo=150 mg/mL, CGA=40 µL/mL, C(NH4)2SO4=600 mg/mL, CLysine=1.67 mg/mL and CTriton X100= µL/mL when CRL enzyme exposed to scCO2 medium before CLEA preparation procedure. This CLEA activity value for CRL enzyme is more than about 2.2-fold increased according to a commercially produced CLEA. The maximum CLEA activity obtained using conventional CLEA preparation procedure reached to 1718.2 U/g CLEA at CEo=150 mg/mL, CGA=40 µL/mL, C(NH4)2SO4=600 mg/mL, CLysine=1.67 mg/mL and CTriton X100=3.33 µL/mL. However, CLEA activities for CALB enzyme did not show a significant increase when the enzyme exposed to scCO2 medium at 40 oC and 10 MPa.