Gökkuşağı alabalık ( oncorhynchus mykiss) dokularından karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve kinetik özelliklerinin incelenmesi
Purification and characterization of carbonic anhydrase from rainbow trout (oncorhynchus mykiss) tissues and inhibition effects of some antibiotics on enzyme activity
Yazar: HAKAN SÖYÜT
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ŞÜKRÜ BEYDEMİR ; DOÇ. DR. OLCAY HİSAR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada gökkuşağı alabalığı karaciğer, böbrek, kas ve beyin dokuları CA enzimlerisırasıyla 4318, 17285, 2300 ve 2275 EU x mg-1 spesifik aktiviteleriyle ve %38, %31,7, %19 ve%22,5 verimlerle Sepharose-4B-L-tirozin-sülfanilamid afinite kromatografisi kullanılaraksaflaştırıldı. Gökkuşağı alabalığı karaciğer, böbrek, kas ve beyin için tüm saflaştırma işlemleriboyunca saflaştırma kat sayıları sırasıyla 2260, 1800, 1080 ve 1283 olarak bulundu.Saflaştırılan enzimlerin saflığını kontrol etmek ve alt birim molekül kütlelerini tespit etmekamacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve tek bant gözlendi. Alt birim molekülkütleleri karaciğer için yaklaşık 29,4 kDa, böbrek için yaklaşık 28,7 kDa, kas için yaklaşık 30,3kDa ve beyin için yaklaşık 29 kDa olarak belirlendi. Karaciğer, böbrek, kas ve beyindokularındaki enzimlerin doğal hallerinin molekül kütleleri Sephadex-G 200 jel filtrasyonkolonu kullanılarak sırasıyla 31 kDa, 26,9 kDa, 31,5 kDa ve 27,3 kDa olarak belirlendi. Tümdokulardan saflaştırılan CA'lar için optimum iyonik şiddetler 1M Tris-SO4 tamponu olarakbelirlendi. Optimum ve stabil pH'lar 4oC'de 1 M Tris-SO4 ve fosfat tamponlarında hesaplandıGökkuşağı alabalığı karaciğer, böbrek, kas ve beyin dokuları için optimum sıcaklık, aktivasyonenerjisi (Ea), aktivasyon entalpisi ( ÎH ) ve Q10 değerleri Arrhenius grafiğinden elde edildi. Safenzimlerin KM ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk grafiklerinden hesaplandı. Gökkuşağıalabalığı karaciğer, böbrek, kas ve beyin dokuları CA'larının kcat değerleri sırasıyla 32,8 15,25,28,83 and 43,67 s-1 olarak bulundu. Bunun yanısıra, gökkuşağı alabalığı CA aktiviteleri üzerinebazı ağır metallerin (kobalt, bakır, çinko, gümüş ve kadmiyum) inhibitör etkileri esteraz metodukullanılarak in vitro şartlarda incelendi. Doku CA enzimleri aktivitelerinin %50'sinin inhibeedildiği ağır metal konsantrasyonları tüm dokulardan saflaştırılan CA enzimleri için elde edildi.Daha sonra, bu maddeler için Ki değerleri Lineweaver-Burk grafiklerinden hesaplandı.2006, 174 sayfaAnahtar Kelimeler: Karbonik anhidraz, karakterizasyon, gökkuşağı alabalığı, ağır metali

Abstract:
In the present study, CA enzymes were purified from rainbow trout (RT) liver, kidney, muscleand brain with a specific activity of 4318, 17285, 2300 and 2275 EU x mg-1 and a yield of 38%,31.7%, 19% and 22.5% using Sepharose-4B-L tyrosine-sulfanilamide affinity gelchromatography, respectively. The overall purifications from RT liver, kidney, muscle and brainwere approximately 2260, 1800, 1080 and 1283-fold respectively. To check the purity anddetermine subunit molecular weights of enzymes, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis wasperformed, which showed a single band and Mw of approx. 29.4 kDa for liver, 28.7 kDa forkidney, 30.3 kDa for muscle and 29 kDa for brain. The molecular weight of native enzyme inliver, kidney, muscle and brain was estimated to be approx. 31 kDa, 26.9 kDa, 31.5 kDa and27.3 kDa by Sephadex-G 200 gel filtration chromatography, respectively. Optimum ionicstrengths for the CAs from all tissues were obtained as 1M Tris-SO4 buffer. Optimum and stablepHs were determined in 1 M Tris-SO4 and phosphate buffers at 4oC. The optimum temperature,activation energy (Ea ), activation enthalpy ( ÎH ) and Q10 values from Arrhenius plot for theRT liver, kidney, muscle and brain CA were obtained. An apparent KM and Vmax for p-nitrophenylacetate of the purified enzymes were calculated from Lineweaver-Burk graphs. kcatvalues of the RT liver, kidney, muscle and brain CAs were found as 32.8, 15.25, 28.83 and43.67 s-1, respectively. Besides, the inhibitory effects of different heavy metals (cobalt, copper,zinc, silver and cadmium) on RT CA activities were investigated using the esterase methodunder in vitro conditions. The heavy metal concentrations, inhibited in vitro 50% of tissue CAenzymes activity, were obtained for CA enzymes from all tissues. Then, Ki values for thesesubstances were also calculated from Lineviewer-Burk graphs.2006, 174 pagesKey words: Carbonic anhydrase; characterization; rainbow trout; heavy metalii