Enfeksiyon tanısında cihaz bağımsız amplifikasyon yöntemi geliştirme ve değerlendirilmesi
Development and evaluation of a device-independent amplification method for infection diagnosis
Yazar: HASAN SAĞCAN
Danışman: PROF. DR. AHMET ZEKİ ŞENGİL
İstanbul Medipol Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Enfeksiyon hastalıkları =

Özet:
Enfeksiyonların tanısı kişi ve toplum sağlığı açısından oldukça kritiktir. Enfeksiyon etkenlerinin keşfiyle beraber geliştirilen tanı yöntemleri de günümüze kadar sürekli gelişmiş ve farklı ihtiyaçlara göre değişiklikler geçirmiştir. Moleküler yöntemlerdeki ilerlemelerle beraber patojen mikroorganizmaların tanısı yüksek doğrulukta ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilmektedir. Son yıllarda özellikle izotermal amplifikasyon yöntemleri enfeksiyon etkenlerinin tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca kullanılan bu yöntemlerde sürekli iyileştirmeler yapılmaktadır. Bu çalışmada enfeksiyon etkenlerinin tanısı için kullanılan izotermal amplifikasyon yönteminin cihazdan bağımsız olarak gerçekleştirilmesi ve hasta örnekleriyle değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda ilmiğe dayalı izotermal amplifikasyon yönteminde kullanılan Bst polimeraz enziminin aktif bölgesinde bulunan 312. glisin, daha hidrofobik karakterdeki izolösin ile değiştirilerek termal çalışma aralığı 30-70 ºC aralığına genişletilmiştir. Saflaştırma çalışmasında elde edilen toplam 3250 µg/mL protein içerisinden 786,18 µg/mL rekombinant enzim elde edilmiştir. Yöntem değerlendirilmesi Sars-Cov-2 'nin tespiti ile gerçekleştirilmiştir. Bu doğrultuda ORF1ab, N ve E genleri için primer setleri tasarlanmıştır. Yöntemin tanı limiti 10 kopya/reaksiyon olarak belirlenmiştir. Ayrıca 100 hasta örneğiyle yapılan çalışmada yöntemin spesifikliği %97,37, hassasiyeti %79,17 ve doğruluğu %93 olarak tespit edilmiştir. Bu çalışma TÜBİTAK 1512, 2210751 numaralı 'Cihaz Bağımsız Amplifikasyon Yöntemi Geliştirilmesi ve Uygun Enzim Üretimi' projesi desteğiyle gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
Diagnosis of infections is critically important for individual and public health. With the discovery of infectious agents, the diagnostic methods developed alongside them have continuously evolved and adapted to meet different needs over time. As a result of developments in molecular methods, the diagnosis of pathogenic microorganisms can be performed quickly and with high accuracy. In recent years, isothermal amplification methods have become widely used for diagnosis of infectious agents. Moreover, the essential improvements are constantly being made in the methods. This study aims to develop and evaluate a device-independent isothermal amplification method for diagnosis of infectious agents using patient samples. In this context, the Bst polymerase enzyme used in the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method was modified by substituting glycine at position 312 in the active site with isoleucine, a more hydrophobic amino acid, thereby expanding the thermal working range to 30-70°C. From the purification process, 786.18 µg/mL of purified recombinant enzyme was obtained from a total of 3250 µg/mL of protein. The method was evaluated for the detection of SARS-CoV-2. Primer sets were designed for the ORF1ab, N, and E genes. The detection limit of the method was determined to be 10 copies/reaction. Additionally, in a study involving 100 patient samples, the method's specificity was found to be 97.37%, sensitivity 79.17%, and accuracy 93%. This study was supported by the TÜBİTAK 1512, project number 2210751, "Development of a Device-Independent Amplification Method and Production of Suitable Enzyme."