Tip 1 diyabet antijenlerine spesifik T hücre klonlarının izolasyonu ve karakterizasyonu
Isolation and characterization of TYPE 1 diabetes antigen specific T cell clones
Yazar: SÜHEYLA HASGÜR
Danışman: PROF. DR. EMİN ÜMİT BAĞRIAÇIK ; PROF. DR. AYŞEGÜL ATAK YÜCEL
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İmmünoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antijenler = Antigens ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Diabetes mellitus-tip 1 = Diabetes mellitus-type 1 ; İnterferonlar = Interferons

Özet:
Tip 1 diyabet (T1D), T hücre ilişkili otoimmün bir hastalık olup, insülin üreten beta (β) hücrelerinin yıkımı ile karakterizedir. β hücrelerine karşı oluşan T hücre yanıtlarının tespiti, hastalık mekanizmalarının derinlemesine anlaşılabilmesi adına oldukça önemlidir. Bu amaçla, sunulan çalışmada, T1D hastalarında periferik kandan GAD65 reaktif CD4+ T hücre serileri izole ve karakterize edildi. T1D hastalarından izole edilen PKMN hücreleri, GAD65 antijeni ile her 14 günde bir uyarıldı ve antijen reaktif T hücreleri MTT proliferasyon testi ile belirlendi. Makroskobik olarak büyüme gözlemlenen ve MTT testinde en iyi proliferatif yanıt veren kuyucukların antijen ile uyarılmasına devam edildi. Çoğalan hücrelerin hücre yüzey belirteçleri ve aktivasyon fenotipleri akım sitometrisi ile analiz edildi. Elde edilen otoreaktif T hücre serilerinin CD4+ T hücreler oldukları saptandı. T1D hastalarda aktive CD4+CD25+ T ve CD4+CD69+ T hücre oranları sağlıklı kontrole oranla oldukça yüksek bulundu. Otoreaktif T hücre serilerinin sitokin sekresyon profilleri ELİSA testi ile analiz edildi. T hücre serilerinin heterojen fenotip sergiledikleri, ancak T1D hastalarında baskın olarak İFN-γ salgılayan CD4+ Th1 hücrelerin bulunduğu görüldü. Bunun yanında İL-4 salgılayan Th2, İL-17 salgılayan Th-17 ve İL-10 salgılayan T hücre serilerinin varlığı da gözlendi. Sağlıklı kontrol bireyden izole edilen T hücre serilerinin düşük düzeyde İFN-γ, İL-4 ve İL-17, ancak yüksek düzeyde İL-10 salgıladıkları görüldü. Sonuç olarak, T1D hastalarından GAD65 otoantijenine reaktif T hücre serileri izole edildi, bu hücrelerin kontrol bireye oranla yüksek aktivasyon fenotipi sergiledikleri ve daha çok sitokin saldıkları gösterildi. Bu sonuçlar T1D patogenezinde GAD65 spesifik otoreaktif T hücrelerin rollerini ortaya koyması bakımından faydalı olacak, ileride T hücre temelli immünoterapilerin geliştirilmesine ışık tutacaktır.

Abstract:
Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease characterized by the destruction of the insulin producing beta (β) cells. Detection of T cell responses directed against β cells is critical for understanding detailed mechanisms underlying the disease. In this study, with this aim, we isolated and characterized human GAD65 reactive CD4+ T cells from peripheral blood of T1D patients. Isolated PBMN cells from T1D patients were stimulated with GAD65 every 14 days and antigen reactive T cells were determined by MTT proliferation assay. Later, wells with best proliferation index in MTT assay were chosen for other stimulations with the antigen. Cell surface markers and activation phenotypes of proliferating cells were analyzed by flow cytometry. We observed that, isolated autoreactive T cell lines were CD4+ T cell phenotype. Also, the percentages of activated CD4+ CD25+ T cells and CD4+ CD69+ T cells were found to be higher in T1D patients than in healthy control individual. Cytokine profiles of autoreactive T cells were analyzed by ELISA. Although, GAD65 reactive CD4+ T cells were capable of expressing heterogeneous phenotypes, we found that IFN-γ producing cells were dominant among GAD65 specific CD4+ Th1 cells in T1D patients. Additionally, the presence of IL-4 producing Th2 cells, IL-17 secreting Th17 cells and IL-10 producing cells in T cell lines were observed in T1D patients. T cells in healthy individual secreted higher amounts of IL-10 and lower amounts of IFN-γ, IL-4 and IL-17 compared to T1D patients. In conclusion, GAD65 specific T cells in T1D patients served a high activation phenotype and secrete higher amounts of cytokines as compared to healthy donors. These observations will be useful to enhance our understanding of GAD65 specific autoreactive T cell roles in T1D pathogenesis, and may help to generate T cell based immunotherapies against autoimmune diseases.