Periferik sinir yaralanması sıçan modelinde ekstraselüler matriks ve büyüme faktörlerinin sinir rejenerasyonuna etkisinin stereolojik ve histolojik olarak incelenmesi
Effect of chondroitinase abc and platelet rich plasma combination on sciatic nerve regeneration
Yazar: EMİNE NAZLI HAYIRLI
Danışman: PROF. DR. OYA EVİRGEN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Büyüme maddeleri = Growth substances ; Ekstrasellüler matriks = Extracellular matrix ; Histolojik teknikler = Histological technics ; Periferik sinir hasarları = Peripheral nerve injuries ; Periferik sinirler = Peripheral nerves ; Sinir büyüme faktörleri = Nerve growth factors ; Sinir rejenerasyonu = Nerve regeneration ; Stereoloji = Stereology ; Sıçanlar = Rats ; Trombositten zengin plazma = Platelet rich plasma

Özet:
Periferik sinirler hasar sonrası rejenere olma kapasitesine sahip olmakla birlikte ortamda bulunan Schwann hücrelerinin, büyüme faktörlerinin ve ekstraselüler matriks elemanlarının birbiriyle etkileşimi iyileşmede önemli bir rol oynamaktadır. Periferik sinir kesi hasarlarının tedavisinde altın standart kesik sinir uçlarının uç uca getirilerek dikilmesidir. Ancak sinir iyileşmesini artırma potansiyeline sahip dikişe ek olarak uygulanabilecek tedavi yöntemleri ile ilgili çalışmalar yoğun olarak devam etmektedir. Biz de çalışmamızda iyi bir fonksiyonel ve morfolojik geri kazanım elde edebilmek amacıyla literatürde daha önce ayrı ayrı kullanılarak sinir iyileşmesine etkileri gösterilen, ekstraselüler matriks elemanlarının sinir iyileşmesini inhibe edici etkisini azaltan kondroitinaz ABC (ChABC) enzimi ile akson büyümesini uyaran çeşitli büyüme faktörlerini içeren plateletten zengin plazma'nın (PRP) tek tek ve literatürde daha önce denenmemiş kombine uygulamalarının etkilerini araştırmayı amaçladık.
Çalışmamızda 5 grup içinde toplam 40 adet 12 haftalık Wistar albino ratlar kullanıldı. Siyatik sinir hasarı bütün gruplarda sol tarafta dallanma bölgesinin 1 cm proksimalinden mikro makasla transvers kesi yapılarak oluşturuldu. Kesi grubu haricindeki gruplarda sinir onarımı aynı cerrah tarafından primer epinöral anastomoz (PEA) yapılarak gerçekleştirildi. Gruplar ve uygulamalar şu şekildeydi; Kesi grubu: PEA ile sinir onarımı yok; Salin grubu: PEA bölgesine 0,125 ml Salin uygulaması; Ch grubu: PEA bölgesine 2U/0,125ml ChABC uygulaması; PRP grubu: PEA bölgesine 0,125 ml PRP uygulaması; Ch+PRP grubu: PEA bölgesine kombine 2U/0,125 ml ChABC+ 0,125 ml PRP uygulaması. PRP uygulanan gruplara ait birer rattan cerrahi işlemden önce intrakardiyak kan alınarak iki aşamalı santrifüj işleminden geçirildi ve PRP elde edildi. Kan alınan ratlar deney dışı bırakıldı. 12 haftanın sonunda siyatik sinir dokuları perfüzyon fiksasyon ile sütur hattının merkezini ve distalini içerecek şekilde çıkarıldı. Her iki bölgeden ışık ve elektron mikroskobik inceleme için alınan örnekler %10 tamponlu formalin ve %2,5 gluteraldehit ile fikse edildikten sonra rutin takip işlemlerinden geçirildi. Sütur hattının merkezinden ve distalinden alınan parafin kesitler hematoksilin-eozin ve Mallory azan ile boyandı. Distal bölgeden alınan kesitler ayrıca Schwann hücreleri için anti-S-100 ve rejenere aksonlar için anti GAP-43 antikorları kullanılarak immünohistokimyasal olarak işaretlendi. Araldit bloklardan alınan yarı ince kesitler ise Toluidin mavisi ile boyandı. Parafin ve yarı ince kesitler Leica DM 500 ışık mikroskobuna bağlı Leica ICC50HD kamera ile inceleme sonrası fotoğraflandı.
Hem distal hem de merkez bölge yarı ince kesitlerinde toplam miyelinli lif sayısı ve dejenere lif sayısı fraksiyonlama probu ile; distal bölge yarı ince kesitlerinde ise lif alanı, akson alanı, miyelin alanı, lif çapı, akson çapı ve miyelin kalınlığı nucleator probu ile stereoloji yazılımı (StereoInvestigator, MBF Bioscience) kullanılarak belirlendi. g-ratio (akson çapı/lif çapı) değerleri de hesaplandı. Fonksiyonel iyileşmeyi değerlendirmek için ratlara pre-op, post-op 6. ve 12. Haftalarda yürüme yolu testi yapıldı ve siyatik fonksiyon indeksi (SFI) belirlendi. Elde edilen SFI değerleri ile stereolojik sayım ve ölçüm verileri istatistiksel olarak IBM SPSS 22 programı kullanılarak değerlendirildi. p<0,05 değeri anlamlı kabul edildi.
Bütün deney gruplarında epinöryum ve perinöryum içinde yanlış yönlenmiş rejeneratif akson filizleri ile endonöryum içinde miyelin debrisi fagosite eden makrofajlar ve Schwann hücreleri, damar komşuluğunda mast hücreleri izlendi. Kontrolle kıyaslandığında dejenere akson sayısı tüm deney gruplarında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksekken (p<0,05), deney grupları kendi aralarında kıyaslandığında anlamlı bir fark bulunmadı. Kontrolle kıyaslandığında toplam miyelinli lif sayısı CH+PRP grubu merkez bölgesinde istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksekti (p<0,05). Deney gruplarının distal bölgelerindeki miyelinli aksonların lif çapı, akson çapı, miyelin kalınlığı ve g-ratio değerleri kontrolle kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde düşük olarak bulundu (p<0,05). SFI sonuçları 6 ve 12. hafta sonunda pre-op döneme göre tüm gruplarda fonksiyon yokluğu veya azlığını ifade edecek şekilde düşüktü ve fark istatististiksel olarak anlamlıydı (p<0,05). Makroskobik olarak kesi hasarı yapılan sol ekstremitede parmak kayıplarının izlenmesi tüm deney gruplarında yarı ince kesitlerde duyu liflerini oluşturan miyelinsiz aksonların gözlenmemesi nedeniyle miyelinli liflere göre duyu liflerindeki hasarın daha yoğun olduğunu düşündürdü.
Sonuç olarak bu çalışmada, cerrahi tedaviye ek olarak uygulanan ChABC ve ChABC+ PRP'nin lokal uygulanmasının kesi bölgesi merkezinde akson filizlenmesini artırarak sinir rejenerasyonuna olumlu katkısı olduğu görüldü. Kesi bölgesinin distalinde ince miyelinli ve küçük çaplı aksonların varlığı ile SFI değerlerinin pre-op döneme göre düşük olmasına bağlı olarak sinir rejenerasyonunun 12. hafta sonunda hala devam ettiği sonucuna varıldı.

Abstract:
The peripheral nerves have an intrinsic capacity for regeneration after injury. For the proper regeneration the cross interactions between Schwann cells, neurotrophic factors and extracellular matrix components play the most important role. Although end-to end anastomosis of injured nerve ends after transection is the gold standard procedure for the treatment of peripheral nerve, there are many studies targeting possible pharmacologic agents that can be applied together with anastomosis to enhance nerve regeneration.
In this study we aimed to investigate the functional and morphological effects of the chondroitinase ABC (ChABC) enzyme that reduces the inhibitory effects of the extracellular matrix components and platelet-rich plasma (PRP) which includes growth factors that applied alone and in combination to the surgical repair site after transection injury
A total of 40 Wistar rats were randomly seperated into 5 groups. The transection injury was formed by transverse incision from the 1 cm proximal of the branching point on the left side in all groups. Right sciatic nerves were used as control. Except that the untreated transection group nerve repair was performed via primary epineural anastomosis (PEA). After PEA 0.125ml saline, 2U/0.125ml ChABC, 0,125 ml PRP and combined 2U/0,125 ml ChABC+0.125ml PRP were applied onto the repair site in treated groups (saline, ChABC, PRP and ChABC+PRP). For the preperation of PRP, blood was collected by cardiac puncture in a tube containing anticoagulant. After two step centrifugation the pellet was activated by 10% CaCl2. Blood collected rats were excluded from the experiment. After 12 weeks the nerves were removed and fixed with 10% formalin and processed as routinely. The paraffin sections from distal stump and center region were stained with hematoxylin- eosin and Mallory's azan. For immunohistochemical examination the sections were stained with anti-S100 and anti-GAP43 antibodies for the visualization of Schwann cells and regenerating axons. Sections were analyzed under Leica DM500 microscope and images were captured with Leica ICC50HD camera. The nerve samples that were processed for araldite embedding and toluidine blue stained semi-thin sections were analyzed using a stereology system (StereoInvestigator, MBF Bioscience).
In both distal stump and center region of all groups the total number of myelinated and degenerated fibers was estimated using fractionator probe. The nerve fiber morphometry including fiber areas, axon areas, myelin areas, fiber diameter, axon diameter and myelin thickness in distal stump of experimental groups were evaluated using nucleator probe. The g-ratio value was calculated using the following formula: g-ratio = axon diameter/ fiber diameter. For the functional evaluation the SFI was measured by walking track analysis preoperatively, post operatively at 6 weeks and 12 weeks. Print length, toe spread and intermediary toe spread were determined. The SFI was calculated using these measurements. The change in SFI and the data achieved by stereologic methods were analyzed using IBM SPSS 22 statistical software and the p values less than 0,05 were considered statistically significant. In all experimental groups we observed misdirected regenerating axon sprouts in the epineurium and perineurium. Endoneurium contained macrophages and Schwann cells that were fagosite myelin debris. Well defined mast cells were seen in close proximity to the endoneurial and perineurial blood vessels. Whereas the total numbers of degenerated fibers in all experimental groups were significantly higher than control group (p<0,05), there were no statistically significant differences between the experimental groups. The total numbers of myelinated fibers in the CH+PRP group central region were significantly higher than control group (p<0,05). In all experimental groups at the distal stump region fiber diameter, axon diameter, myelin thickness and g-ratio values were significantly lower than control group (p<0,05). The SFI in rats of all experimental groups at 6 and 12 weeks after post operation decreased indicating poor or no function and the the difference between pre operative and post operative period was statistically significant (p<0.05) Macroscopically nearly in all groups there were finger loss on the left side where the transection injury performed suggested that unmyelinated sensory axons are more affected than myelinated motor axons. In conclusion the present study revealed that local application of ChABC and ChABC +PRP to the surgical repair site after transection injury increase the axon sprouting at the central region. Due to thinly myelinated and small caliber axon composition seen in distal region of repair site and decreased SFI indicating poor or no function at 12 weeks suggested that nerve regeneration process still going on.