Radyoaktif işaretli fenitoin'in görüntüleme ve tedavide kullanılabilirliğinin hücre düzeyinde incelenmesi
Investigation of usability of phenytoin in the imaging and therapy at the cell level
Yazar: CANSU UZARAS
Danışman: DOÇ. DR. UĞUR AVCIBAŞI
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Fizikokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Fenitoin (PHT)  Heinrich Biltz tarafından 1908 yılında sentezlenen bir anti-epileptik ajandır. Fenitoinin bu etkisini nöronlardaki voltaja duyarlı sodyum kanallarını bloke ederek sağladığına inanılır. Fenitoin ve fenitoin sodyum tuzu karsinogenler üzerindeki ilk yıllık raporda (FAROC) listlenmişlerdir ve kemirgenler üzerinde bunlarla ilgili bazı çalışmalar vardır. Fenitoin'nin fare ve sıçanlardaki etkileri yetişkin kemirgenlerin ve perinatal gebe kemirgenlerin yiyeceklerine katılarak değerlendirilmiştir. Farelerde gerek yetişkinlere gerekse perinatal gebelere verildikten sonra dişilerde karaciğer tümörüne neden olmuştur. Karaciğer-tümör insidansı erkek farelerde çok fazla artmamıştır.  Erkek sıçanlarda fenitoin karaciğer tümörü insidansını düşük oranda arttırmıştır. 
Yaptığımız bu çalışmanın amacı fenitoini 131I ile işaretlemek ve işaretli bileşiğin terapötik etkinliğini insandan elde edilen U-87 MG insan beyin (glioblastoma), Daoy insan beyin/cerebellum (medulloblastoma) ve, A549 insan akciğer (karsinoma) kanser hücre hatları üzerinde in vitro olarak incelemek ve radyoişaretli bileşiğin kanser hücreleri üzerindeki bağlanma verimlerini hesaplamaktır. Bunun için ilk olarak PHT 131I ile işaretlenerek kalite kontrol çalışmaları ince tabaka radyokromatografi yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiş ve bunun yanında iyot'un yapıya bağlanıp bağlanmadığını kontrol etmek amacıyla fenitoin inaktif 127I ile işaretlenerek sırasıyla HPLC ve yapı analizi (NMR) çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu kapsamda yapılan çalışmalarda işaretli bileşiğin (131I-PHT) bağlanma verimi yaklaşık %95 olarak bulunmuştur. Daha sonraki adımda hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiş, 131I, 131I-PHT'nin kanser hücreleri üzerinde inkorporasyonları incelenerek sırasıyla optimum zaman, substrat konsantrasyonu ve spesifik aktivite parametreleri belirlenmiştir. Belirlenen bu optimum şartlar kullanılarak 131I ve 131I-PHT'nin U-87 MG insan beyin (glioblastoma), Daoy insan beyin/cerebellum (medulloblastoma) ve A549 insan akciğer (karsinoma) kanser hücre hatları üzerindeki bağlanma verimleri incelenmiştir. Bu kapsamda elde edilen deneysel verilerin tamamı GraphPad istatistik programı kullanılarak değerlendirilmiş ve yorumlanmıştır. Ayrıca PHT'nin 3 farklı kanser hücresi üzerindeki sitotoksitetesi ayrı ayrı incelenmiş ve devamında apoptosis çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalarda Tunnel Yöntemi kullanılmıştır.  Yapılan bu çalışmaların sonucunda, PHT'nin U-87 MG, Daoy ve A549 kanser hücreleri üzerindeki sitotoksisite değerleri istatistiksel olarak değerlendirilmiş ve bu değerlendirmeler neticesinde hücre türleri arasında anlamlı bir farklılığın olmadığı tespit edilmiştir.

Abstract:
Phenytoin (PHT) is  an antiepileptic drug which was first synthesized by Heinrich Biltzh in 1908..Phenytoin is believed to protect against seizures by causing voltage-dependent block of voltage-gated sodium channels. Phenytoin and phenytoin sodium were listed in the First Annual Report on Carcinogens and additional studies in rodents have been identified. The effects of phenytoin in mice and rats were eval¬uated following dietary exposure of adults and perinatal exposure (in utero and via lactation). In mice, phenytoin caused liver tumors in females after adult and  perinatal exposure.  Liver-tumor incidence was not significantly increased in male mice after adult-only expo¬sure. In rats, phenytoin marginally increased the incidence of liver tumors in males after adult-only exposure .
The aim of our study carried out by us is to label phenytoin with 131 I and to investigate the the therapeutic effect of this radiolabeled compounds on U-87 MG brain (glioblastoma) , Daoy  (medulloblastoma ) and A549 (lung) cancerous cell lines obtained from human in vitro and to measure the binding yield of radiolabeled compounds on cancerous cell lines. For this, first of all phenytoin (PHT) was labeled with 131I by using thin layer radiochromatography method. In addition to this, to check whether iodine bound to PHT or not PHT was labeled with inactive iodine-127 and then HPLC and NMR structure analysis were done. Labeling yield was found about 95% in these studies. In the next stage, cell culture studies were carried out and incorporations of 131I, 131I-PHT were investigated then the optimum time, the substrate concentration and the spesific activity parameters were determined, respectively.The binding yields of 131I, 131I-PHT were studied on U-87 MG brain (glioblastoma),                                   Daoy  (medulloblastoma ) and A549 (lung) cancerous cell lines. All experimental data obtained by this context were evaluated and interpreted by using GraphPAd statistical program. Also, cytotoxicity of PHT on three diferent cancer cells was investigated seperately then apoptosis studies were done. The Tunnel Method was used in these studies. As a result of these studies, cytotoxicity of PHT on U-87, Daoy, and A549 cancerous cells was statistically evaluated and  as a result of these reviews, it has been found that there is no significant difference between cells