Meme kanseri hücre hatlarında siklin bağımlı kinaz 4 ve 6 inhibisyonunun radyoduyarlılık üzerine etkisi
The effect of cyclin -dependent kinase 4 and 6 inhibition on radiosensitivity in breast cancer lines
Yazar: DÜNYA NAMLISES
Danışman: PROF. DR. AYFER HAYDAROĞLU
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kanser Biyolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Hücre dizisi = Cell line ; Hücre döngüsü = Cell cycle ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Radyoterapi = Radiotherapy ; Siklin = Cyclin ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Meme kanseri, kadınlarda en sık gözlenen ve solunum sistemi ilişkili kanserlerinden sonra kanser nedenli ölümlerin en başında gelmektedir. Günümüzde meme kanseri hastalarında tedavi sonrası sağ kalım oranları her ne kadar artmış olsa da meme kanserinin mortalite oranı değişmemektedir. Bu nedenle yeni tedavi yöntemlerinin araştırılması meme kanseri için oldukça büyük bir önem taşımaktadır. Meme kanserlerinden, terapötik ilerlemelere en çok ihtiyaç duyan alt tip, terapötik direncin yaygın olduğu luminal-B meme kanseridir. Birçok çalışmada luminal-B meme kanserinin diğer meme kanseri tipleri ile karşılaştırıldığında endokrin tedavi, kemoterapi ve radyoterapiye nispeten duyarsız olduğunu ileri belirtilmiştir. Radyoterapi meme kanseri tedavisinde temel taşlardan biridir. Ancak meme tümörleri radyasyon direnci kazanabilir; çünkü düzensiz G1 / S fazı hücre döngüsü mekanizmalarına sahiptirler. Düzensiz hücre döngüsü kanser oluşumuyla sonuçlanan kontrolsüz hücre çoğalmasına katkıda bulunur. G1-S geçişinin anahtar düzenleyicisi siklin D-CDK4 / 6-INK4- Rb yoludur. Hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde CDK4 / 6 aktivitesinin önemi ve kanserde bu yolun aktive edildiği bilinen mekanizmalar nedeniyle, CDK4 / 6 inhibitörlerinin selektif inhibisyonu cazip bir tedavi stratejisi olarak ortaya çıkmıştır. Kanser tedavisinde, hücre döngüsünün G1 evresinin spesifik olarak hedeflenmesi uygun bir yaklaşım olabilir. G1 fazının hedeflenmesi, hücre döngüsünün ilk basamağını bloke edeceğinden hücre bölünmesi de bloke olacaktır. Palbociclib, klinik olarak en ileri CDK4 / 6 inhibitörüdür. Çalışmamızın amacı; radyoterapi ile birlikte palbociclib uygulandığında radyasyon direncini ortadan kaldırarak meme kanseri hücrelerinin radyasyona duyarlı hale dönüştüğünü gösterebilmektir. Çalışmamızda meme kanseri hücre hatları üzerinde deneysel bir in vitro çalışma tasarlanmıştır. Çalışma kapsamında insan meme kanseri hücre modeli olarak MCF-7 kontrol hücresi olarak kullanılan tümörojenik olmayan meme epitel hücresi MCF-10A, meme kanseri kök hücresi (MKKH) kullanılmıştır. MCF-7, MCF-10A ve MKKH' sinde PD-0332991'in sitotoksik etkisi araştırılmıştır. Radyasyon ve ilaçlar gibi ajanların hücrelerin hayatta kalmaları ve çoğalmaları üzerine etkinliğini incelemek klonojenik analizler uygulanmıştır.MCF-7 ve MKKH hücrelerinde PD-0332991, radyasyon ve kombinasyonlarının uygulanması sonrasında koloni oluşumu meydana gelmiştir. PD-0332991, 4 gray radyasyon ve kombinasyon tedavilerine ait klonojenik analiz yapılmış ve plak görüntüleri elde edilmiş olup koloni ortalaması ve kaplama verimliliği, yüzde survi fraksiyonu belirlenmiştir. MCF-10A hücrelerinde PD-0332991, radyasyon ve kombinasyon tedavinin uygulanması sonrasında koloni oluşumu meydana gelmemiştir. Çalışmamızda; MCF-7 hücrelerinin PD-0332991' e karşı daha hassas olduğunu tespit ettik. MKKH'lerinde ve MCF-7 hücrelerinde tek başına palbociclib ve tek başına radyasyon tedavisi kolonilerin oluşumunu önemli ölçüde inhibe etmiştir. Bununla birlikte, iki tedaviyi birleştirdiğimizde canlılık oranı en düşük saptanmıştır. Buda bize MKKH ve MCF-7 hücreleri için kombinasyon tedavinin; tek başına ilaç ve tek başına PD0332991' uygulamasına göre radyoduyarlılığı daha fazla arttırdığını göstermiştir. CCND1, CDKN1A, CDKN2A, CDC25A, WEE1, CHEK1 genlerinin oluşturduğu ekspresyon değişimlerini incelenmiştir. WEE1, CHEK1 genlerinin ifadesi azaltmıştır. WEE1'in inhibisyonu hücreleri radyasyona bağlı hücre ölümüne duyarlı hale getirmiştir. CHEK1'in inhibisyonunun hücreleri Apoptoza yönlendirdiğini öngörebiliriz. Artan CDKN1A ve CDKN2A seviyelerinin tedaviden sonra hücrelerin yaşlanmaya sürükleneceğini düşündürmektedir. Varılan sonuçlar daha sonra planlanacak daha ileri çalışmalar için bir kaynak niteliğinde olup kanser tedavisi için geliştirilecek yeni stratejilerin planlanmasında etken olacaktır.

Abstract:
Cancer is a multi-step process involving metabolic and behavioral changes leading to excessive and untimely proliferation of cells. It is a disease with high incidence and mortality. Although breast cancer is the most common type of cancer in women, it is the leading cause of cancer-related deaths after respiratory-related cancers. Today, although the survival rates of breast cancer patients have increased after treatment, the mortality rate of breast cancer does not change. Therefore, testing of new treatment methods is of great importance for breast cancer. Breast cancer; luminal A, luminal B, HER-2, basal and normal breast are divided into five groups. The subtype that requires the most therapeutic improvements is luminal-B breast cancer, where therapeutic resistance is common. Many studies have suggested that luminal-B breast cancer is relatively insensitive to endocrine therapy, chemotherapy, and radiotherapy compared to other types of breast cancer. Radiotherapy is one of the basic stones in the treatment of breast cancer. But breast tumors can gain radiation resistance; because they have irregular G1 / S phase cell cycle mechanisms.The irregular cell cycle contributes to uncontrolled cell proliferation, resulting in cancer formation. The key regulator of the G1-S transition is the cyclin D-CDK4 / 6-INK4-Rb pathway. Because of the importance of CDK4 / 6 activity in regulating cell proliferation and the mechanisms by which this pathway has been activated in cancer, selective inhibition of CDK4 / 6 inhibitors has emerged as an attractive treatment strategy. In cancer treatment, specific targeting of G1 stage of the cell cycle may be a suitable approach. Targeting the G1 phase will block the first step of the cell cycle, so cell division will also be blocked. Palbociclib is clinically the most advanced CDK4 / 6 inhibitor.

The aim of our study; When palbociclib is applied together with radiotherapy, it is possible to show that the cancer cells become radiation sensitive by eliminating the radiation resistance. In our study we designed an experimental in vitro study on breast cancer cell lines. In this study, human breast cancer cell model MCF-7, non-tumorigenic breast epithelial cell MCF-10A and breast cancer stem cells were used. The cytotoxic effect of PD-0332991 in MCF-7, MCF-10A and MKKH was 
investigated. Clonogenic analyzes were performed to examine the efficacy of agents such as radiation and drugs on the survival and proliferation of cells. In MCF-7 and MKKH cells, colony formation occurred after administration of PD-0332991, radiation and combinations. The clonogenic analysis of PD-0332991, 4 gray radiation and combination therapies was performed and plate images were obtained and colony mean and plating efficiency, percentage survival fraction were determined. In MCF-10A cells, colony formation did not occur after administration of PD-0332991, radiation and combination therapy. In our study; We found that MCF-7 cells were more sensitive to PD-0332991. Palbociclib alone and in MCF-7 cells alone and radiation therapy alone significantly inhibited the formation of colonies. However, when we combined the two treatments, the survival rate was the lowest. These results led us to the combination therapy for MKKH and MCF-7 cells; showed that the drug alone and the radiographic sensitivity of PD0332991 göster alone increased. The expression changes of CCND1, CDKN1A, CDKN2A, CDC25A, WEE1, CHEK1 genes were investigated. The expression of WEE1 and CHEK1 genes decreased. Inhibition of WEE1 has made cells susceptible to radiation-induced cell death. We can predict that inhibition of CHEK1 leads cells to apoptosis. Increased levels of CDKN1A and CDKN2A suggest that cells will be dragged to aging after treatment. The results will be a resource for further studies to be planned, and will be effective in planning new strategies for cancer treatment.