Glikoprotein ayrılması için monolitik sıvı kromatografisi kolonlarının hazırlanması
Preparation of monolithic liquid chromatography columns for glycoprotein separation
Yazar: CANAN ARMUTCU
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Monolitik kolonlar tek parçalı gözenekli yapılar olarak, yerinde polimerizasyonlayani kolon bir tüp içerisine yerleştirilerek hazırlanmaktadırlar. Gerekli durumlarda,matriks yüzeyi modifiye edilerek istenilen bağlama özelliğine sahip adsorbentüretimi yapılmaktadır. Kolay hazırlanabilmesi, eşsiz özellikleri ve mükemmelperformansından dolayı Yüksek Performans Sıvı Kromatografisinde (HPLC)monolitik kolonlar son dönemlerde dikkatleri üzerine çekmektedirler. Sunulan tezçalışmasında insan plazmasından etkin bir şekilde insan-IgG ayrılması için etkinve kolay hazırlanabilir monolitik bir kolon geliştirilmiştir. Pseudospesifik ligand Nmetakriloil-L-aspartik asit (MAAsp), L-aspartik asit ve metakriloil klorür kullanılaraksentezlenmiştir. Monolitik kolonlar, MAAsp monomeri ile 2-hidroksietil metakrilat(HEMA)'ın yığın polimerizasyonu ile çelik kolonların içinde üretilmiştir. Elde edilenpoli(HEMA) ve Asp-30 monolitik kolonların spesifik yüzey alanları sırasıyla 173.6m2/g ve 213.4 m2/g'dır. Sentezlenen MAAsp monomeri, Fourier Transform InfraredSpektroskopisi (FTIR) ve Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) ile karakterizeedilmiştir. Poli(HEMA-MAAsp) monolitik kolonlar, şişme testi, FTIR, TaramalıElektron Mikroskopisi (SEM) ve elementel analiz ile karakterize edilmiştir.Monomer çözeltisine 30 mg MAAsp eklenerek hazırlanan Asp-30 monolitikkolonun denge şişme oranı % 62.5'dir. Sulu çözeltilerden ve insan plazmasındanIgG adsorpsiyonu ve desorpsiyonunda farklı miktarlarda MAAsp içeren monolitikkolonlar kullanılmıştır. IgG adsorpsiyonunun kullanılan tampon sistemine bağlıolduğu gözlenmiştir ve sulu çözeltilerden IgG maksimum adsorpsiyon miktarı pH6.0 fosfat tamponunda 0.087 mg/g'dır. Ayrıca bu afinite kolonlarının insanplazmasından tek basamakta insan-IgG'si ayrılmasında kullanılabileceğibelirlenmiştir. Poli(HEMA-MAAsp) monolitik kolonların tekrarlanan adsorpsiyondesorpsiyon döngülerinde adsorpsiyon kapasitesinde belirgin bir azalma olmadantekrar kullanılabileceği de gösterilmiştir.Anahtar Kelimeler: Monolitik kolon, IgG ayrılması, pseudospesifik ligandlar,Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC).

Abstract:
A monolithic column is the continuous unitary porous structure prepared by in situpolymerization or consolidation inside the column tubing and, if necessary, thesurface is modified to convert it into a adsorbent with the desired chromatographicbinding properties. Monolithic columns have attracted considerable attention inliquid chromatography in recent years due to their simple preparation procedure,unique properties and excellent performance, especially for separation ofbiopolymers. In the present thesis, a novel and new approach was developed toobtain an efficient separation of IgG from human plasma. N-methacryloyl-Lasparticacid (MAAsp) was chosen as a pseudospecific ligand and synthesized byusing methacryloyl chloride and L-aspartic acid. Monolithic columns were obtainedby the bulk polymerization of MAAsp and 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA)conducted in a steel columns. Poly(HEMA) and Asp-30 monolithic columns hadspecific surface areas of 173.6 m2/g and 213.4 m2/g respectively. SynthesizedMAAsp monomer was characterized by Fourier Transform Infrared Spectroscopy(FTIR) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Poly(HEMA-MAAsp) monolithiccolumns were characterized by swelling studies, FTIR, Scaning ElectronMicroscopy (SEM) and elemental analysis. The Asp-30 monolithic columns haveprepared by adding 30 mg MAAsp monomer into monomer solution, a swellingratio of 62.5%, and monolithic columns that containing different amount MAAspwere used in the adsorption/desorption of human-IgG from aqueous solutions andhuman plasma. IgG adsorption depend on the buffer system and the maximumamount of IgG adsorption from aqueous solution in phosphate buffer was 0.086mg/g at pH 6.0. The affinity columns allowed the one-step separation of human-IgG. It was observed that human- IgG could be repeatedly adsorbed and desorbedwith poly(HEMA-MAAsp) monolithic columns without significant loss in theadsorption capacity.Key words: Monolithic columns, IgG separation, Pseudospesific ligands, HighPerformance Liquid Chromatography.