Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile plazma ksantin oksidaz aktivitesi ölçümü ve hipogonadizmli hastalarda ksantin oksidaz düzeylerinin belirlenmesi /
Yazar: GÜRKAN METİNYURT
Danışman: DOÇ. DR. ŞERİF AKMAN
GATA / Tıp Fakültesi / Biyokimya ve Klinik Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2003
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
VI. ÖZET Molibden hidroksilaz flavoprotein ailesinin üyesi olan XOR enziminin ksantin oksidaz (XO) ve ksantin dehidrojenaz (XDH) şeklinde iki farklı formu mevcuttur. Plazmada bulunan enzim esas olarak XO formundadır. İskemi-reperfüzyon injürisi, karaciğer hastalıkları, inflamatuvar ve otoimmün hastalıklar, ateroskleroz, hipertansiyon ve tip II diyabette plazma XOR aktivitelerinin arttığı gösterilmiştir. Rutin çalışma ve araştırmalar için daha sensitif ve spesifik olan HPLC ile XO ölçümünün optimizasyonu için yaptığımız çalışmalarda yöntem 1000 nM isoksantopterin konsantrasyonlarına kadar lineerdi (r=0,9999). Deteksiyon limiti 0,79 nM, CV değeri gün-içi tekrarlanabildik için % 0.99 ve günler-arası tekrarlanabildik için % 2.95, ortalama verim % 103 olarak bulundu. Bu hali ile metod hem düşük düzeydeki plazma XOR aktivitelerini hem de daha yüksek aktivite içeren örnekleri kolayca ölçebilecek kadar duyarlı, örnek körü çalışması gerektirmediği için iş gücü kaybını azaltan, maliyeti düşük, reaktifleri kolaylıkla hazırlanabilen, diğer metodlara göre nisbeten daha iyi irdelenerek plazma XO aktivitesini ölçmek için dizayn edilmiş, kliniğimizde diğer çalışmalar için rutin uygulanabilir bir yöntem olarak kabul edildi. Yaşa ve cinsiyete bağlı normal değerlerin belirlenmesi için çalışmada 108 sağlıklı denek (67 erkek, 41 kadın) kullanıldı ve plazma XO aktivitesinin normal değerleri 1,12 ± 0,23 mU/L olarak belirlendi. Erkekler için normal değerler 1,11 ± 0,25 mll/L, kadınlar için ise 1,14 ± 0,20 mU/L idi. Plazma XO aktivitesi açısından erkek ve kadınlar arasında anlamlı farklılık bulunmadı (p=0,496). Sağlıklı bireyler bütün olarak ele alındığında, yaş ile plazma XO aktivitesi arasında bir korelasyon görülmedi (r=0,075, p=0,438). Bireyler yaşlarına göre dekatlara ayırılarak incelendiği zaman dekatlar arası enzim aktivitesi açısından anlamlı farklılık saptanmadı (p=0,721). Erkeklerde yaş ile enzim aktivitelerinde anlamlı bir değişim görülmez iken (r=-0,058, p=0,641) kadınlarda artan yaş ile birlikte plazma XO aktivitesinin anlamlı olarak arttığı görüldü (r=0,368, p= 0,018). Hipogonadotropik hipogonadizmli 24 erkek hasta, 25 sağlıklı erkek kontrol deneği ile karşılaştırıldığında; hipogonadizmli hastaların total testosteron düzeyleri ve ürik asit seviyeleri kontrol grubuna göre belirgin olarak düşük (sırasıyla p<0,001 ve p=0,001) iken plazma ksantin oksidaz aktiviteleri açısından iki grup arasında anlamlı bir farklılık yoktu (p=0,398). Sonuç olarak, çalışmamızda XO enziminin plazmada ve diğer birçok örnekte ölçümüne olanak sağlayacak performansa sahip bir floresans deteksiyonlu HPLC yöntemi kurulmuş, normal değerler cinsiyete ve yaş dekatlarına göre belirlenmiştir. Plazma XO aktiviteleri açısından erkek ve dişi cinsiyetler arasında farklılık bulunmadığı gösterilmiştir. Artan yaşla birlikte erkeklerde plazma XO aktiviteleri değişmezken kadınlarda anlamlı bir artış olduğu da ilk kez ortaya konulmuştur. Ayrıca, testosteron hormonunun plazma XO aktivitesi üzerine etkisi olmadığı ve olasılıkla karaciğer XO aktivitesi üzerine artırıcı bir etkinlik gösterebileceğine de dikkat çekilmiştir. Uyguladığımız yöntemde yapılacak başka modifikasyonlar rutin uygulama etkinliğini artırarak bu enzimin ilişkili olduğu klinik durumların ayrıntılı olarak araştırılmasına olanak sağlayacaktır. 48

Abstract:
VII. SUMMARY Xanthine oxidoreductase (XOR), one of the enzymes in the molybdenum hydroxylase flavoprotein family, has two different forms: xanthine oxidase (XO) and xanthine dehydrogenase (XDH). XO is the essential form found in plasma. It was shown that XOR activity in plasma was increased in patients with diabetes mellitus type II, atherosclerosis, hypertension, inflammatory and autoimmune rheumatic diseases, liver diseases, ischemia-reperfusion injury. A linearity up to 1000 nM isoxanthopterine concentration was obtained in the method used in our study aimed the optimization of XO determination by HPLC which is more spesific and sensitive for routine and research purposes (r=0,9999). In addition, detection limit was 0.79 nM, intra-day precision and between-day precision were 0,99 % and 2,95 %, respectively. Mean recovery was found 103 %. According to these data, this mentioned method was accepted as practicable method due to its high sensitivity that can measure both low and high activity of plasma XOR. Since this method minimizes the work load by not using the sample blank and uses the easily prepared reagents and is cost-effective, it is supposed that this method could be used for other research purposes in our department. In this study, 108 healthy subjects (67 male, 41 female) were included and normal value of plasma XO activity was found 1,12 ± 0,23 mU/L (1,11 ± 0,25 mU/L for male, 1,14 + 0,20 mU/L for female). No statistically significiancy was found between the values of plasma XO activity in both genders (p=0,496). No correlation was also observed between age and plasma XO activity (r=0,075, p=0,438). In terms of age groups in decade, enzyme activity showed no difference in different age groups (p=0,721). In male subjects, there was no significant change in enzyme activity with age (r=-0,058, p=0,641). However, female subjects were shown to have increased plasma XO activity correlated with age increase (r=0,368, p=0,018). When 24 male patients with hypogonadotropic hypogonadism were compared with 25 healthy male individuals, plasma XO activity levels showed no statistically difference (p=0,398), while total testosterone levels and uric acid levels were found significantly decreased when compared with those of controls (p<0,001 and p=0,001, respectively). As a consequence, in our study, a method providing the measurement of XO enzyme in plasma and other biological samples by using HPLC with fluorescence detection was set up and normal values were determined with respect to genders and age groups. Plasma XO activities in female subjects were firstly reported to be increased by the increase at age in female subjects. In addition, it was pointed out that testosterone had no effect on plasma XO activity, but could have an increasin effect on hepatic XO activity. So, further researchs to develope this method can lead highlightning of other clinical conditions associated with this enzyme in routine applications. 49