SiRNA iletimi için lazer ablasyon yöntemi kullanılarak polietilenimin ile kaplanmış altın nanopartikül üretimi
Production of gold nanoparticles capped with polyethyleneimine using laser ablation method for siRNA delivery
Yazar: DURUKAN ŞAHİNGÖZ
Danışman: PROF. DR. AYTEN ÇELEBİ KESKİN
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Hücrelere gen aktarımı son zamanlarda sıklıkla artan çalışmaların temelini oluşturmaktadır. Özellikle siRNA' nın aktarımı bu olaylarda başı çekmektedir. DNA- temelli terapötikler, plazmid içerisinde, antisens oligonukleotidler ve küçük RNA parçaları (siRNA) olarak uygulanmaktadır. Gen terapisi, genetik temeli bulunan hastalıkların tedavisinde stratejiler geliştirmek için kullanılan ve günümüzde tedavisi olmayan hastalıklar için umut vaat eden bir yöntemdir. Başarılı bir gen terapisi, ilgili transgenlerin hedeflenmiş hücrelere transfeksiyonunu gerektirir. Dolayısıyla gen terapisinin iyileştirici etkisi büyük ölçüde uygun gen sağlama vektörlerinin mevcudiyetine bağlıdır. Viral gen sağlama vektörleri yüksek verimlidir fakat hem immünojeniteye hem de sitotoksisiteye sahiptir. Nonviral gen dağıtım vektörleri, hem düşük toksisite hem de düşük immünojenite gösterdikleri için giderek daha fazla ilgi görmektedir. Geniş nanopartikül türleri arasında soy metal nanopartiküller son yıllarda özellikle yüzeyel plasmon rezonansı (SPR) da dahil olmak üzere biyouyumluluk ve eşsiz fiziksel ve kimyasal özelliklerinden ötürü altın nanopartikül (AuNP)' lere önem vermişlerdir. Son zamanlarda, sıvı fazda bir altın hedefin darbeli lazer ablasyonu, çoğunlukla kimyasal indirgeme yöntemi ile üretilirken AuNP' leri sentezlemek için çekici bir alternatif olarak benimsenmiştir.
Bu çalışmanın amacı hastalıkların tedavisinde kullanılan ve gen susturma işlemleri için gerekli olan siRNA' yı Polietilenimin (PEI) ile modifiye edilmiş AuNP'ler ile birleştirerek, siRNA iletimi için bir yaklaşım oluşturmaktır. Bu tez kapsamında yapılan işlemler başlıca dört aşamadan oluşmaktadır; İlk bölümde farklı konsantrasyonlarda (%1, %2, %5) PEI çözeltisi hazırlanmış, ikinci kısımda hazırlanan PEI çözeltisi içerisinde lazer ablasyon yöntemi ile altın nanopartiküller üretilmiştir. Üçüncü kısımda üretilen altın nanopartiküllerin Zeta-Sizer cihazıyla boyutlarına ve zeta potansiyellerine bakılmıştır. Ayrıca FTIR spektroskopisi yapılmış ve nanopartiküller karakterize edilmiştir. Dördüncü ve son kısımda farklı oranlardaki AuNP/PEI/İF kompleksleri ile farklı oranlardaki (100 nM, 200 nM) siRNA bağlanmaya çalışılmıştır. Bağlanıp bağlanmadıklarını anlamak için agaroz jel elektroforezi yapılmıştır ve ultraviyole (UV) ışınları altında gözlemlenmiştir.
Elde edilen sonuçlara göre AuNP'lerimizin katyonik özellikte olduğu gösterilmiştir. Ayrıca boyut analizlerinin de 100 nm'nin altında olduğu belirlenmiştir. FTIR testi ile PEI/AuNP kompleksinin birbirine bağlandıkları, agaroz jel elektroforezi ile de siRNA ile birleşmenin sağlandığı ve hücreye aktarılma aşamasına hazır hale getirilen bir taşıyıcı sistem olduğu gösterilmiştir.
siRNA'nın kanser tedavisinde PEI/AuNP/İF kompleksleri ile birlikte kullanılabileceği ilk kez yapılan bu tez çalışması ile gösterilmiştir.

Abstract:
The gene transfer to the cells is the basis for the studies that have been increasing in recent times. Especially the transfer of siRNA is leading to these events. DNA-based therapeutics are carried out in the plasmid as antisense oligonucleotides and small RNA fragments (siRNA). Gene therapy is a promising method for developing strategies in the treatment of genetically-based diseases and is currently a non-therapeutic disease. Successful gene therapy requires transfection of the relevant transgenes into targeted cells. Thus, the therapeutic effect of gene therapy depends on the availability of large quantities of appropriate gene delivery vectors. Viral gene delivery vectors are highly efficient but have both immunogenicity and cytotoxicity. Nonviral gene distribution vectors are increasingly attracted to both low toxicity and low immunogenicity. Among the broad types of nanoparticles, noble metal nanoparticles have recently gained attention for gold nanoparticles (AuNP) due to their biocompatibility and unique physical and chemical properties, especially including superficial plasmon resonance (SPR). Recently, pulsed laser ablation of a gold target in the liquid phase has been adopted as an attractive alternative to synthesizing AuNPs, often produced by chemical reduction.
The aim of this study is to create an approach for siRNA delivery by combining the siRNA, which is used in the treatment of disease and for gene silencing, with AuNPs modified with Polyethyleneimine (PEI). The processes carried out within the scope of this thesis mainly consist of four phases; In the first section, PEI solution was prepared at different concentrations (1%, 2%, 5%) and gold nanoparticles were produced by the laser ablation method in the PEI solution prepared in the second part. The gold nanoparticles produced in the third part were examined with their Zeta-Sizer device for their size and zeta potential. In addition, FTIR spectroscopy was performed and the nanoparticles were characterized. In the fourth and last section, different ratios of (100 nM, 200 nM) siRNAs were tried to bind with different proportions of AuNP / PEI / IF complexes. Agarose gel electrophoresis was performed to observe whether they were connected and observed under ultraviolet (UV) light.
According to the results obtained, our AuNPs have been shown to be cationic. It was also determined that size analyzes were below 100 nm. It has been shown that the FTIR assay binds PEI/AuNP complexes, is coupled with siRNA by agarose gel electrophoresis and is a carrier system ready for transfection.
This is the first time that siRNA can be used in combination with PEI / AuNP / IF complexes in the treatment of cancer.