Farelerde in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferinin yetişkin akciğer dokusunda toll-benzeri reseptör (tlr)-5 ekspresyonu üzerine etkisi
Effect of in vitro embryo culture and embryo transfer on the expression of toll-like receptor (tlr)-5 in adult mouse lung tissue
Yazar: DİDAR TUĞÇE BALGİR
Danışman: PROF. DR. LEVENT KARAGENÇ
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Akciğer = Lung ; Akciğer = Lung ; Embriyo = Embryo ; Embriyo kültür teknikleri = Embryo culture techniques ; Embriyo nakli = Embryo transfer ; Fareler = Mice ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Reseptörler-toll like = Receptors-toll like ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques

Özet:
Üremeye yardımcı tedavi yöntemleri (ÜYTE), infertilite tedavisinde tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır. ÜYTE yöntemleri arasında in vitro fertilizasyon ve embriyo transferi yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak elimizdeki veriler çeşitli ÜYTE yöntemleri sonucu dünyaya gelen çocukların spontan gebeliklerle kıyaslandığında çeşitli sağlık sorunlarına ve astım gibi solunum yolları hastalıklarına karşı daha fazla duyarlı olduklarını göstermektedir. Doğal bağışıklık sistemi, patojenlere ve yabancı antijenlere karşı konakçı vücudunda ilk savunma hattını oluşturmaktadır. Toll-benzeri reseptörler (TLR), doğal bağışıklık sisteminin en önemli unsurlarından birisidir. TLR'ler arasında önemli bir yere sahip olan TLR 5, bakteriyel flagellini tanıyarak immun yanıtın oluşmasında önemli bir rol oynamaktadır. Sunulan tez çalışmasında, in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferi işlemlerinin yetişkin akciğer dokusunda TLR 5 ekspresyonu üzerine herhangi bir etkisinin olup olmadığının incelenmesi amaçlanmıştır. Yapılan çalışmada, bir adet Kontrol grubu ve bir adet Deneme grubu olmak üzere iki gruba yer verilmiştir. Deneme grubu, PMSG+hCG uygulaması yapılan, F1 hibrit dişilerin aynı yaştaki F1 hibrit erkeklerle çiftleştirilmesi sonucu elde edilen döllenmiş yumurta hücrelerinin (zigot) atmosferik oksijen konsantrasyonunda geliştirilmesiyle elde edilen blastosist aşamasındaki embriyoların yalancı gebe dişilere transfer edilmeleri neticesinde büyütülen yavrulardan oluşturulmuştur. Kontrol grubu ise, PMSG+hCG uygulaması yapılmadan, 8-12 haftalık F1 hibrit dişilerin aynı yaştaki F1 hibrit erkeklerle çiftleştirilmeleri sonucu doğan yavrulardan elde edilen yetişkin farelerden oluşturulmuştur. Kontrol ve Deneme gruplarına ait elde edilen yetişkin akciğer dokularında, dokunun genel histolojik yapısını incelemek amacıyla Crossman'ın üçlü boyama yöntemi uygulanmıştır. Dokularda, hangi hücreler tarafından TLR 5'in eksprese edildiğini göstermek amacıyla immunohistokimya ve immunofloresan analizleri gerçekleştirilmiştir. TLR 5 ekspresyonunun mRNA ve protein düzeylerinde ekspresyon düzeyini belirlemek amacıyla, real-time PCR ve western blot tekniklerinden yararlanılmıştır. Elde edilen sonuçlar, Kontrol ve Deneme gruplarında TLR 5 ekspresyon profilinin benzer olduğunu ve TLR 5'in hava yollarında, alveol duvarında, damar çevresinde, damar lümeninde eksprese edildiğini göstermiştir. Ardışık kesitlerin TLR 5 ve hücre-spesifik belirteçler ile boyanması sonucunda, makrofaj, Clara ve Tip 2 hücreleri tarafından eksprese edildiği saptanmıştır. Real-time PCR ve western blot analizlerinden elde edilen sonuçlar, Kontrol grubu ile kıyaslandığında, Deneme grubunda TLR 5 mRNA düzeyinin 1,03 kat arttığını (p>0,05), TLR 5 proteinine ait ekspresyon düzeyinin ise 1,30 kat azaldığını göstermiştir (p>0,05). Elde edilen sonuçlar TLR 5'in yetişkin farelerde akciğer dokusunda Tip II pnömosit, makrofaj ve Clara hücreleri de dahil olmak üzere belirli hücreler tarafından eksprese edildiğini göstermekte ve in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferi işlemlerinin yetişkin akciğer dokusunda TLR 5 ekspresyonunu değiştirerek akciğer immun yanıtını etkileyebileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Assisted reproductive technologies (ART) are widely used all over the world in the treatment of infertility. In vitro fertilization and embryo transfer are commonly used among ART methods. However, there is evidence suggesting that, compared with spontaneous pregnancies, children born through various ART methods are more susceptible to various health problems including respiratory diseases such as asthma. The innate immune system has created the first line of defense in the host body against pathogens and foreign antigens. Toll- like receptors (TLR) constitute one of the most important components of the innate immune system. Among TLRs, TLR 5 plays an important role in the development of the immune response by recognizing bacterial flagellin. The aim of the present thesis was to investigate whether or not there is any effect of in vitro embryo culture and embryo transfer on the expression of TLR 5 in the adult lung tissue. The present study consists of one Control and one Experimental group. The Experimental group consisted of adults generated by transfer of in vitro-developed blastocysts obtained through in vitro culture of zygotes. The control group was obtained from mating natural cycling females with F1 hybrid males of the same age. To examine the general histological structure of the adult lung tissues isolated from Control and Experimental groups, Crossman's trichrome method was used. Immunohistochemistry and immunofluorescence methods were performed to show expression of TLR 5 in the cells of lung tissue. Real-time PCR and western blott techniques were used to to quantify the espression of TLR 5 at the mRNA and protein levels, respectively. Immunohistochemical analyses demonstrated that TLR 5 is expressed by cells located in the airways, alveol's wall, blood with a similar pattern of expression between the two groups. It was further demonstrated that macrophages, Type 2 pneumocytes and Clara cells are among the cells expressing TLR 5. qRT-PCR results indicated that the level of TLR 5 mRNA is increased 1.03-fold (p> 0.05) in the Experimental group compared with the Control group. Results obtained from western blot analysis showed that expression level of TLR 5 protein was decreased in Experimental group by 1.30-fold (p> 0,05) compared with the Control group. Taken together, results obtained from the present study indicate that TLR 5 is expresed by certain cells in the adult mouse lung tissue including Type II pneumocytes, macrophages and Clara cells and in vitro embryo culture and embryo transfer procedures may alter the immune response in adult lung tissue by changing the expression of TLR 5.