Salda gölünden izole edilen alkalifilik bakteri suşlarının siklodekstrin glukoziltransferaz (SGTaz) enzimi üretme yetenekleri ve SGTaz geni üzerine araştırmalar
Studies on the cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) production capacity of alkaliphilic bacteria isolated from Salda lake and on the CGTase gene
Yazar: EDA KABACAOĞLU
Danışman: YRD. DOÇ. BARÇIN KARAKAŞ BUDAK
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Siklodekstrin glikozil transferaz (SGTaz) enzimi siklodekstrinlerin endüstriyel üretimi amacıyla kullanılmaktadır. Ayrıca SGTaz'ın katalitik fonksiyonu bazı gıda katkı maddelerinin modifikasyonunda değerlendirilmektedir. Bu çalışma ile Türkiye'de bulunan sodalı göllerden SGTaz üretebilen suşların izolasyonu, ilgili genin izolasyonu, Pichia pastoris mayasına klonlanmasıyla rekombinant üretimi ve saflaştırılan enzimin karakterize edilmesi hedeflenmiştir. 
Öncelikle Salda ve Van göllerinden SGTaz üretme kapasitesine sahip yeni alkalifik bakteri suşları izole edilmiştir ve bunlar SG2, SG3, V3, SD5 şeklinde kodlanmıştır. İzolatların Gram(+) bakteriler olduğu ve 16S rDNA dizi analizi bakterilerin Bacillus cinsinden ve veri tabanlarında yer alan organizmalardan farklı olduğunu göstermiştir. İzolatlar arasından seçilen SD5 suşundan SGTaz enzimini kodlayan gen izole edilerek P. pastoris mayasına aktarılmıştır. SGTaz enzimini kodlayan gen bölgesini çoğaltmak ve/veya modifiye etmek üzere farklı primer çiftleri ile 3 farklı Polimeraz Zincir Reaksyonu (PZR) gerçekleştirilmiştir. Elde edilen DNA parçalarının gen dizisi belirlenmiş, metanol tetiklemeli protein üretimini ve proteinin hücre dışına salgılanmasını sağlayan pPICZαA vektörü ile Pichia pastoris X33 konukçu suşuna aktarılmıştır. Böylece (doğal gen dizisini içeren) N2, (gene ilave c-myc epitope ve polihistidin kuyruğu kodlayan) S3, ve (gen ve polihistidin kuyruğu kodlayan) M5 şeklinde kodlanan üç farklı rekombinant maya elde edilmiştir. Geliştirilen 3 maya suşuyla fermantasyon gerçekleştirilerek kültür sıvılarında SGTaz aktiviteleri izlenmiştir. Salgılanan rekombinant enzimlerin moleküler ağırlıklarının ~85kDa olduğu belirlenmiştir. M5 suşuyla üretilen polihistidin etiketli SGtaz enzimi afinite kromatografisiyle saflaştırılmış ve optimum aktiviteyi 50 °C'de ve pH 6'da sergilediği ve γ-β-siklodekstrin üreticisi olduğu belirlenmiştir. Enzimin, ısıl ve pH kararlılığı araştırılmış ve aktivitesini 30 dk süreyle 30-50°C, %100, pH 9'da %99,4 oranında koruduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) enzyme is used industially to obtain cyclodextrins. Also, this enzyme has a catalytic function which is utilized in the modification of some food additives. This study aims to isolate potential bacterial strains from the soda lakes in Turkey, amplification of the respective gene, cloning into Pichia pastoris for recombinant production and characterization of the enzyme. 
Four novel CGTase producing alkalophilic bacteria were isolated from lakes Salda and Van and coded SG2, SG3, V3, SD5. The isolates were gram(+) rods and 16S rDNA sequencing revealed these were novel Bacillus strains. The gene encoding for CGTase was amplified using the DNA of the SD5 strain and cloned into the yeast P. pastoris. PCR was conducted seperately with three different sets of primers in order to amplify and/or modify the gene sequence. The fragments obtained were sequenced and cloned into P.pastoris X33 host strain using the pPICZαA vector allowing for methanol induced expression and extracellular secretion of the protein. Thus, three recombinant strains were obtained; N2 (with natural gene sequence), S3 (also encoding the c-myc epitope and polyhistidine tail) and M5 (encoding the polyhistine tail). Extracellular CGTase activity was monitored throughout fermentation for each strain. The molecular weight of the enzymes were ~85 kDa. The CGTase GLYCOSYLTRANSFERASE obtained from the M5 strain was purified and displayed optimum activity at 50 °C and pH 6, producing γ-β-cyclodextrin. Investigation of the thermal and pH stability of showed that the enzyme retained about 100% activity after 30 minutes at 30-50 °C and pH 9.