Türkiye'de halk arasında yara iyileştirici olarak kullanılan bazı Euphorbia L. türleri üzerinde farmakognozik araştırmalar
Pharmacognostical investigations on some Euphorbia L. species used traditionally as wound healer in turkey
Yazar: SERKAN ÖZBİLGİN
Danışman: PROF. DR. HAYRİYE GÜLÇİN SALTAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakognozi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antiinflamatuar ajanlar = Anti inflammatory agents ; Euphorbia = Euphorbia ; Farmakognozi = Pharmacognosy ; Kuersetin = Quercetin ; Türkiye = Turkey ; Yara iyileşmesi = Wound healing

Özet:
Bu çalışmada, ülkemizde bazı türleri halk arasında yara iyileştirici olarak kullanılan Euphrobia cinsine ait beş tür seçilmiş ve aktif bileşikleri izole etmek için biyoaktivite yönlendirmeli fraksiyonlama metodu kullanılmıştır.
Bu amaç doğrultusunda, E. macroclada, E. seguieriana subsp. seguieriana, E. characias subsp. wulfenii, E. virgata ve E. helioscopia türlerinin toprak üstü kısımlarından sıralı olarak hazırlanan n-hekzan, etil asetat ve metanol ekstrelerinin yara iyileştirici ve antienflamatuvar etkileri test edildi. Yara iyileştirici aktivite tayini için çizgisel insizyon ve dairesel eksizyon yara modelleri ile hidroksiprolin tayin metodu kullanıldı. Antienflamatuvar aktivite tayini için akut enflamasyon modellerinden olan asetik asit nedenli kapiller permeabilitenin artışının inhibisyonu (Whittle yöntemi) metodu kullanıldı. Hazırlanan ekstreler arasında, yara iyileştirici aktivitesi en yüksek olan E. characias subsp. wulfenii metanol ekstresi, etkili bileşiklerin izolasyonu için kolon kromatografisi ile fraksiyonlarına ayrıldı. Elde edilen fraksiyonların biyolojik aktivite tayin sonuçları değerlendirildi ve aktif olduğu tespit edilen fraksiyonda izolasyon ve saflaştırma işlemlerine devam edildi.
Kolon kromatografisi, ince tabaka kromatografisi ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi kromatografik yöntemlerden yararlanılarak, aktif bileşikler aktif fraksiyondan izole edildi. İzole edilen üç bileşiğin, çeşitli spektroskopik yöntemler yardımıyla yapı tayinleri gerçekleştirildi. İzole edilen bileşiklerin, kersetin-3-O-ramnozit (kersitrin), kersetin-3-O-galaktozit (hiperozit) ve kersetin-3-O-arabinozit olduğu tespit edildi. Bu bileşiklerin yara iyileşmesini geciktiren enzimler olan hyaluronidaz, kolajenaz ve elastaz enzimleri üzerindeki inhibisiyonları test edildi, üç bileşiğin de kolajenaz ve elastaz enzimlerini anlamlı ölçüde inhibe ettiği tespit edildi.
Aktif fraksiyondan izole edilen üç bileşiğin bitkideki miktarları, yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak ölçüldü. Saf maddelerden hazırlanan dilüsyonlar ile kalibrasyon denklemi oluşturuldu ve E. characias subsp. wulfenii'den hazırlanan total ekstrede miktar tayini gerçekleştirildi. Bitkinin %1.22 kersitrin, %0,35 hiperozit ve %0,11 oranında kersetin-3-O-arabinozit taşıdığı tespit edildi. Analitik yöntemin validasyonu doğrusallık, kesinlik, teşhis sınırı ve tayin sınırı parametreleriyle gerçekleştirildi.

Abstract:
In this study, five species have been selected from Euphrobia species, of which some species are used traditionally as wound healer in our country, and bioactivity-guided fractionation method has been used to isolate the active compounds. 

In line with this purpose, wound healing and anti-inflammatory effects of n-hexane, ethyl acetate, and methanol extracts, which were successively prepared from aerial parts of E. macroclada, E. seguieriana subsp. seguieriana, E. characias subsp. wulfenii, E. virgata and E. helioscopia species were tested. For wound healing activity assay, linear incision and circular excision wound models, and hydroxyproline assay method were used. For anti-inflammatory activity assay, an acute inflammation model, namely acetic acid induced capillary permeability increase inhibition method (Whittle method) was used. E. characias subsp. wulfenii methanol extract, which was the extract with highest wound healing activity among extracts prepared, were separated into its fractions by column chromatography for isolation of efficient compounds. Biological activity of the fractions were assessed and further isolation and purification processes have been carried out in the active fraction. 
Active compounds were isolated from active fraction by utilizing chromatographic methods such as column chromatography, thin layer chromatography, and high performance liquid chromatography. Structure elucidations of the isolated three compounds were performed by various spectroscopic methods. The isolated compounds were detected as quercetin-3-O-rhamnoside (quercitrin), quercetin-3-O-galactoside (hyperoside), and quercetin-3-O-arabinoside. The inhibition effects of these compounds on hyaluronidase, collagenase, and elastase enzymes which delay wound healing, were tested and, it was detected that all three compounds significantly inhibited collagenase and elastase enzymes.
The amounts of three compounds, isolated from the active fraction, in the plant were determined by using high performance liquid chromatography. Calibration equation was calculated with dilutions, prepared from pure substances, and assay was performed in total extract, prepared from E. characias subsp. wulfenii. It was detected that the plant had 1.22% quercitrin, 0.35% hyperoside, and 0.11% quercetin-3-O-arabinoside. The validation of the analytical method was performed by linearity, precision, limit of detection, and limit of quantification parameters.