HCV genotipinin belirlenmesinde 5'ncr Ve Ns5b bölgelerinin yeni Nesil Dizileme (YND-NGS) İle Araştırılması
HCV Genotyping with 5'NCR and NS5B regions with next generation sequencing (YND-NGS)
Yazar: SENİHA AKTAKKA
Danışman: PROF. DR. MEMNUNE SELDA ERENSOY
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
ÖZET
Giriş ve Amaç: Hepatit C virüsü (HCV) çok yüksek derecede genetik çeşitliliğe sahiptir. HCV suşları, viral genomların filogenetik ve sekans analizleri temelinde yedi tanınmış genotipe ayrılır. HCV'de genotip belirlenmesi hastaya uygun tedavinin seçilmesinde önemlidir. Özellikle doğrudan etkili antivirallerin tedavide kullanıma girmesiyle genotiplerin ve alt tiplerin doğru belirlenmesi daha da önemli hale gelmiştir. HCV genotiplemesi için altın standart tam genomun nükleik asit dizi analizidir. Pratikte 5'NCR, kor ve NS5B gen bölgeleri genotiplemede analiz edilmektedir. Nükleik asit dizi analizi için günümüzde en sık kullanılan yöntem olan Sanger Dizi Analiz Yöntemi zincir sonlandırma reaksiyonu olarak bilinir. Yeni nesil dizileme (YND) sistemleri ile ise bir çalışmada tüm genom, transkriptom veya daha küçük hedef bölgelerdeki milyonlarca DNA parçası dizilenebilmektedir. YND teknolojisinin Sanger dizileme yöntemine göre daha hızlı ve yüksek verimli sonuçlar verdiği görülmektedir. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Moleküler Viroloji Laboratuvarı'nda 2000 yılından beri HCV genotip testi farklı yöntemlerle rutin olarak yapılmaktadır. Laboratuvarımızda rutinde son olarak genotipe özgü gerçek zamanlı PCR ve/veya NS5B ve/veya 5'NCR bölgelerinin Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu dizilemesi ile HCV genotipi belirlenmektedir. Bu çalışmada daha hızlı ve yüksek verimli olan YND ile HCV 5'NCR ve NS5B bölgeleri kullanılarak genotipleme yapılması ve laboratuvarımıza uygun HCV genotipleme yönteminin belirlenmesi amaçlanmaktadır.
Gereç ve yöntem: Laboratuvarımıza HCV genotip testi için gönderilmiş ve -80˚C'de arşivlenmiş olan 60 HCV pozitif hastanın plazma örneği çalışmamıza dahil edilmiştir. RNA ekstraksiyonu, tersine (revers) transkripsiyon basamaklarından sonra, 5'NCR bölgesi ve NS5B bölgesi için ayrı ayrı dış PCR, nested (ikinci tur) PCR ve analiz basamakları uygulanmıştır. HCV genomunun 5'NCR ve NS5B bölgelerinin PCR ürünlerinin ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Foster City, CA, ABD) cihazı ve MiSeq (Illumina, San Diego, CA, ABD) (YND) ile analizi yapılmış, nükleik asit dizileri NCBI gen bankasındaki genotipleme bölümü (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi) kullanılarak genotipleme yapılmıştır.
Bulgular: Ellibeş örnekte NS5B bölgesinin hem YND ve Sanger ile, hem de 5'NCR bölgesinin YND ve Sanger ile genotip sonuçları benzer bulundu. (%91,67). YND ile elde edilen verilerin analizine göre; NS5B bölgesi dizi analizi ile 60 örneğin 43'ü (%71,67) genotip 1b, yedisi (%11,67) genotip 4, dördü (%6,67) genotip 3, üçü (%5) genotip 1a, ikisi (%3,33) genotip 5, biri (%1,67) genotip 2 olarak saptandı. 5'NCR bölgesi dizi analizi ile ise, 60 örneğin 36'sı (%60) genotip 1b, yedisi (%11,67) genotip 4, dördü (%6,67) genotip 3, beşi (%8,33) genotip 1a, ikisi (%3,33) genotip 5, ikisi (%3,33) genotip 6, biri (%1,67) genotip 2 olarak saptandı. 5'NCR bölgesi dizi analizi ile üç örnek (%5) alt tip ayrımı yapılamadan genotip 1 olarak belirlendi. 
Her iki bölgenin analizine göre en çok saptanan genotip, genotip 1b oldu. Çalışmada genotip 7 olarak tanımlanan örnek olmadı. 
Sanger dizi analizi ve YND ile elde edilen diziler örnek bazında hizalandığında; YND ile 38-40 baz daha uzun temiz dizi elde edildiği görüldü. 5'NCR bölgesine ait dizilerde 60 örnekten 53'ünün (%88,3) %100 uyumlu, beşinin (%8,3) %99 uyumlu, birinin (%1,6) %98 uyumlu, birinin (%1,6) %97 uyumlu olduğu görüldü. NS5B bölgesine ait dizilerde ise 60 örnekten; 45'i (%73,3) %100 uyumlu, beşi (%8,3) %99 uyumlu, biri (%1,6) %98 uyumlu, dördü (%6,6) %95-97 uyumlu, dördü (%6,6) %92-94 uyumlu, biri (%1,6) %83 uyumlu idi.
Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu ve YND ile elde edilen verilerden her iki grupta da genotip 1 olarak tanımlanan üç örnekte 5'NCR bölgesi dizi analizi ile alt tip ayrımı yapılamazken, bu örnekler NS5B bölgesi dizi analizi ile genotip 1b olarak saptandı. İki örnek, iki yöntemle de 5'NCR bölgesi dizi analizinde genotip 1a, NS5B bölgesi dizi analizinde genotip 1b; iki örnek 5'NCR bölgesi dizi analizi ile genotip 6, NS5B bölgesi dizi analizi ile genotip 1b olarak saptandı. Bu durum; bilindiği gibi genotip 1 alt tiplerinin belirlenmesinde ve 1 ile 6 ayrımında NS5B bölgesinin daha güvenilir olmasına bağlandı.
Sanger YND dizilerinin hizalamasında NS5B dizisi %83 uyumlu olan örnek Sanger ile yapılan NS5B bölgesi dizi analizinde genotip 1b, Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu 5'NCR, YND NS5B ve YND 5'NCR bölgeleri dizi analizlerinde genotip 1a olarak saptandı. Bu durum Sanger ile elde edilen NS5B dizisinin temiz okunan kısmının kısa olmasına bağlandı.
Sonuç: Altmış örneğin 59'unda hem NS5B, hem de 5'NCR dizileri YND ve Sanger analizleriyle aynı sonuçları vermiştir (%98,33 uyum). YND ile örneklerin havuzlanması ve çoklu çalışılması ("multipleks") ile maliyet düşmektedir. Klinik açıdan önemli olan genotip belirlenmesi, NS5B bölgesinin YND gibi güvenilir bir yöntemle analiziyle etkin olarak yapılabilmektedir. Değerlendirmelerin sonucuna göre; 60 örneğin 43'ü genotip 1b (%71,67), üçü 1a (%5), yedisi 4 (%11,67), dördü 3 (%6,67), ikisi 5 (%3,33), biri 2 (%1,67) bulunmuştur.
Anahtar Kelimeler: HCV genotipleme, Yeni Nesil Dizileme, NS5B, 5'NCR

Abstract:
ABSTRACT
Introduction and AIM: Hepatitis C virus (HCV) has very high genetic diversity. HCV strains are divided into seven known genotypes based on phylogenetic and sequence analysis of viral genomes. Genotype identification of HCV is important in determining the appropriate treatment of the patient and the duration of the treatment. In particular, direct identification of genotypes and subtypes have become even more important as direct-acting antivirals become available for treatment. Nucleic acid sequence analysis of the whole genome is the gold standard for HCV genotyping. In practice, NS5B, core, and 5'NCR regions are analysed for genotyping. HCV genotype test has been routinely performed since 2000 in the Molecular Virology Laboratory of the Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Ege University. HCV genotyping with Sanger chain termination reaction is currently routinely being performed from HCV positive patient samples. In this study it is aimed to evaluate the eficiency of genotyping by using HCV 5'NCR and NS5B regions with next generation sequencing (NGS) and to determine the appropriate HCV genotyping method in our laboratory.
Materials and methods: Sixty archived (at -80°C) HCV positive plasma samples which were sent for HCV genotyping to the laboratory were included in the study. RNA extraction, reverse transcription steps followed by external PCR, nested (second round) PCR and analysis steps for the 5'NCR region and NS5B region separately. PCR products of the 5'NCR and NS5B regions of the HCV genome were analyzed with the ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Foster City, CA, USA) and the MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA) (NGS), and the nucleic acid sequences were genotyped at the NCBI gene bank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi) genotyping tool. 
Results: According to the analysis of data obtained with NGS; by NS5B region sequence analysis 43 (72%) of the 60 samples were genotype 1b, seven (11%) genotype 4, four (7%) genotype 3, three (5%) genotype 1a, two (3%) genotype 5, one (2%) was genotype 2. With the 5'NCR region sequence analysis; 36 (60%) of the 60 samples were genotype 1b, seven (12%) genotype 4, four (7%) genotype 3, five (8%) genotype 1a, two (3%) genotype 5, two (3%) genotype 6, one (2%) was genotype 2. With 5'NCR region sequence analysis, three samples (5%) were identified as genotype 1 without subtype discrimination. According to analysis of both regions, genotype 1b was the most detected genotype. There was no sample defined as genotype 7. 
With NGS, 38-40 base longer clean sequences could be obtained compared to the Sanger sequences. When Sanger and NGS sequences were aligned on sample basis; among the 5'NCR region sequences, 53 (88,3%) of the 60 samples had 100% identity, five of them (8,3%) had 99% identity, one of them (1,6%) had 98% identity, one of them (1.6%) had 97% identity. Among the NS5B region sequences, 45 (73.3%) of the 60 samples had 100% identity, five (8.3%) had 99% identity, one (1.6%) had 98% identity, four (6.6%) had 95-97% identity, 4 (6.6%) had 92-94% identity, one (1.6%) had 83% identity. The 83% identical sample was determined as genotype 1a with Sanger and as genotype 1b with NGS.  This sample was identified as genotype 1a by 5 'NCR sequence analysis both with NGS and Sanger. 
Sanger chain termination reaction and NGS data in both groups showed that; three samples identified as genotype 1, while subtype discrimination could not be done with 5'NCR region sequence analysis, these samples were identified as genotype 1b with NS5B region sequence analysis. Two samples were identified as genotype 1a with 5'NCR region sequence analysis, but identified as genotype 1b with NS5B region sequence analysis. Two samples were identified as genotype 6 with 5'NCR region sequence analysis but identified as genotype 1b with NS5B region sequence analysis. It was thought to be associated to the insufficiency of 5'NCR seuence for subtype determination and discrimination of genotype 6 from some genotype 1 strains as it has been known.
One sample was identified as genotype 1b by NS5B region sequence analysis with the Sanger chain termination reaction, but identified as genotype 1a by 5'NCR region sequence analysis with Sanger, NS5B region sequence analysis and 5'NCR region sequence analysis with NGS. The NS5B sequence which could be obtained by Sanger method was short; it was thought to be the reason of incompatibility.
Conclusion: Next generation sequencing and Sanger chain termination results were the same both with NS5B and 5'NCR regions in 59 of 60 samples (98.33). Cost was reduced with NGS by pooling and "multiplexing" the samples. Analysing NS5B region with a reliable method such as NGS is efficient in determining the genotypes which is clinically important to guide the treatment. According to overall evaluation of the data; 43 of 60 samples (71.67%) were genotyped as genotype 1b, three were genotype 1a (5%), seven were genotype 4 (11.67%), four were genotype 3 (6.67%), two were genotype 5 (3.33%), an done was genotype 2 (1.67%). 
Key words: HCV genotyping, Next Generation Sequencing, NS5B, 5'NCR