İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu sonrası 3 pronukleuslu oositlerde mitokondri aktivitesi ve hücre iskeleti organizasyonunun incelenmesi
Investigation of mitochondrial activity and cytoskeleton organization in 3 pronuclear oocytes after intracytoplasmic sperm injection
Yazar: TUĞBA KOTİL
Danışman: PROF. DR. SEYHUN SOLAKOĞLU
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Tıp Bilimleri Bölümü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Mitokondriler = Mitochondria ; İnce yapı = Ultrastructure

Özet:
Kotil, T. (2012). İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu sonrası 3 pronukleuslu oositlerde mitokondri aktivitesi ve hücre iskeleti organizasyonunun incelenmesi. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Histoloji ve Embriyoloji ABD. Doktora Tezi. İstanbul.Amaç: Dijini, fertilizasyon sonrası ikinci kutup cisminin atılamayıp ooplazma içerisinde kalmasıyla üçüncü bir pronukleus oluşturması durumudur. Oosit olgunlaşmasında, fertilizasyon sırasında ve sonrasındaki gelişim sürecinde baskın organel olan mitokondri enerji üretimi ve Ca+2 metabolizmasını düzenlemesi açısından önemli rollere sahiptir. Oositte hücre iskelet elemanları mitotik iğ ipliğinin oluşması, kromozomların ayrışması, pronukleusların appozisyonu, sitokinezin normal bir şekilde gerçekleşmesinde rol alır. Çalışmamızda 3 pronukleuslu oositlerde mitokondri membran potansiyelinin durumu, hücre iskeleti elemanların düzeni ve bu anormal süreçle olan muhtemel ilişkisi ve 3 pronukleuslu oositlerin ince yapısal özellikleri araştırılmıştır.Gereç ve Yöntem: Yardımcı üreme teknikleri aracılığıyla gebe kalabilmek için IVF ünitelerine başvuran hastalardan bilgilendirme formu ile ICSI sonucu oluşmuş 3 pronukleuslu oositler alındı. %4'lük paraformaldehit ile tespit edilen oositlere anti-gama tübülin ve FITC-falloidin antikorları kullanılarak immünfloresan çalışma uygulandı. %1'lik gluteraldehit ile fikse edilen oositler elektron mikroskobu takibine alındı. Alınan ince kesitler Jeol Jem 1011 transmisyon elektron mikroskobu ile incelendi. Taze oositler mitokondri membran potansiyelinin değerlendirilmesi için JC-1 mitokondri boyası ile boyandı ve floresan mikroskopta değerlendirildi.Bulgular: İncelendiğimiz oositlerde mitokondri membran potansiyeli boyanması iki pronukleuslu normal bir zigotta görülen özelliklere benzer sonuçlar verdi. Gama ? tübülin subplazmalemmal alanda çok sayıda yaygın işaretlenme sergiledi. Mikrofilamanlar kortikal alanda mevcuttu, pronukleusların çevresinde izlenmedi. Bazı vakalarda sitoplazmik hale kısmen oluşurken bazılarında oluşmadığı, ooplazma içerinde lipofuskin granüllerinin olduğu, mitokondride dejenerasyon ve multilamellar cisim oluşumu görüldü.Sonuç: Elde edilen bulgulara göre ikinci kutup cisminin atılamamasında mitokondri membran potansiyelinin etkili olmadığı fikri ortaya çıkmıştır. Oosit kalitesindeki zayıflığa bağlı olarak hücre içi iskelet elemanlarında meydana gelmiş olan düzensizlikler bu anormal süreci tetikliyor olabilir.Anahtar Kelimeler: Oosit, ICSI, mitokondri, hücre iskeleti, ince yapıBu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 3287

Abstract:
Kotil, T. (2012). Investigation of mitochondrial activity and cytoskeleton organization in 3 pronuclear oocytes after intracytoplasmic sperm injection. İstanbul University, Institute of Health Science, Histology and Embryology Department. PhD Thesis. İstanbul.Introduction: Digyny, is the existence of the third pronucleus due to failure of the extrusion of the second polar body. The mitochondria of the oocyte have critical roles such as production of ATP or regulation of Ca+2 homeostasis during oocyte maturation, fertilization and subsequent development. The cytoskeleton of the oocyte has regulatory activity in meiotic spindle formation, chromosome segregation, pronuclear apposition and cytokinesis. In our study mitochondrial membrane potential, distribution of F- actin and gama- tubulin, and ultrastructure of the 3 pronuclear oocytes were investigated.Material and Method: The 3 pronuclear oocytes after ICSI process were taken from patients who were engaged to assisted reproduction programme. Informed consents were taken from all patients. Some oocytes were fixed by %4 paraformaldehyde and treated by anti-gama tubulin and FITC ? phalloidin antibodies for immunoflourescent study. Oocytes for the ultrastructural evaluation fixed with %1 glutaraldehyde. Sections were investigated by transmission electron microscopy. For mitochondrial membrane potential examination, fresh oocytes were stained with JC-1 and evaluated by fluorescent microscope.Results: Mitochondrial membrane potential of three pronuclear oocytes showed similar results like normal zygotes. Gama ? tubulin were stained widely at the subplasmalemmal domain and microfilaments were localized at the cortical area but not perinuclear. Cytoplasmic halo were partly or not detected. Lipofuscin granules, degenerated mitochondria and multilamellar bodies were seen in the ooplasm.Conclusion: These findings suggest that mitochondrial membrane potential has not direct effect on extrusion of the second polar body. This abnormality can be triggered by disturbed cytoskeleton because of poor oocyte quality.Key words: Oocyte, ICSI, mitochondria, cytoskeleton, ultrastructureThe present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project No. 3287