Osteosarkoma tedavisinde kullanılmak üzere kemik doku oluşumunu destekleyici ilaç yüklü üç boyutlu doku iskelelerinin geliştirilmesi
Development of drug loaded 3-dimensional bone tissue scaffolds for treatment of osteosarcoma and regeneration of defected bone tissue
Yazar: ELİF SARIGÖL ÇALAMAK
Danışman: PROF. DR. CANAN HASÇİÇEK
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Onkoloji = Oncology ; Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology
Dizin: Deksametazon = Dexamethasone ; Doksorubisin = Doxorubicin ; Doku iskeleleri = Tissue scaffolds ; Kemik neoplazmları = Bone neoplasms ; Mikroküreler = Microspheres ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Osteosarkom = Osteosarcoma ; Uzun etkili ilaçlar = Delayed action preparations ; Üç boyutlu yazıcı = Three dimensional printer ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers

Özet:
Kemik doku yenilenmesi özellikle kemik kaybı, bölgesel kemik bozuklukları ve kırıklara neden olan bazı hastalıkların tedavisinin sağlanmasında büyük önem taşımaktadır. Osteosarkoma, en yaygın görülen kemik kanseri türüdür ve çoğunlukla çocuklarda ve adolesanlarda ortaya çıkar. Osteosarkomada, malign mezenkimal kök hücreler tarafından üretilen osteoid yapıları özellikle hızlı büyüyen kemik dokularında yetersiz kemik gelişimine neden olmaktadır. Tedavi, tümörlü bölgenin ameliyat ile tamamen çıkarılıp uzaklaştırılmasını ve bir veya daha fazla antineoplastik ajan ile ameliyat öncesi ve sonrası sistemik tedaviyi gerektirir. Sistemik kemoterapi uygulamaları bazı organlarda geri dönüşümsüz toksisiteye sebep olması ve tümör bölgesinde terapötik doza ulaşılamaması gibi büyük dezavantajlara sahiptir. Bu doktora tez çalışmasında, biri antikanser diğeri de osteojenik aktivitesi olan iki farklı etkin maddeyi iki farklı katmanında içeren kemik doku iskelesi geliştirilmesi, böylece hem tümörün tedavi edilmesinin, hem de çıkarılan kemik bölgesinin yenilenerek eski halini almasının sağlanması amaçlanmıştır. Sistem, en dış katmanında kemik tümörü gelişmiş olan bölgenin tedavisi için antikanser etkili etkin madde olan doksorubisin hidroklorürü aljinat jel içerisinde çözünmüş halde içermektedir. Orta katmanda, aljinat/jelatin jel içerisinde dağıtılmış mezenkimal kök hücrelerin kemik hücrelerine farklılaşmasını sağlayarak kaybedilen kemik dokusunun yerine konmasını destekleyen deksametazon sodyum fosfat etkin maddesi yüklü PCL mikroküreler bulunmaktadır. Sistemin en iç katmanı ise 3D teknolojisi olan FDM yöntemi kullanılarak üretilmiş üç boyutlu poröz PLA iskelelerinden oluşmaktadır. 
Deksametazon sodyum fosfat yüklü mikrokürelerin hazırlanmasında üç farklı molekül ağırlığında PCL polimeri ve iki farklı L:G oranında PLGA polimeri kullanılmıştır. Geliştirilen mikroküre formülasyonları üzerinde, yapısal analizler, morfolojik analizler, partikül boyutu ve dağılımı analizi, üretim verimi, etkin madde yükleme verimi ve in vitro koşullarda etkin madde salımı çalışmaları yürütülerek en başarılı bulunan formülasyon seçilmiş ve ileriki çalışmalarda bu formülasyon ile devam edilmiştir. Hazırlanan deksametazon içeren mikroküreler aljinat/jelatin jel sistemi içerisinde dağıtılarak PLA iskelelere silindirik kalıba gömme yöntemi kullanılarak kaplanmıştır. Daha sonra aynı yöntem kullanılarak doksorubisin içeren aljinat jel sistemleri ile ikinci kaplama yapılmıştır. İskeleler üzerinde yapısal analizler, morfolojik analizler, porozite analizi, mekanik test ölçümü, temas açısı ölçümü, in vitro degredasyon analizi ve in vitro deksametazon sodyum fosfat ve doksorubisin hidroklorür salım çalışmaları yürütülmüştür. In vitro karakterizasyon çalışmaları sonucu seçilen formülasyonlar kullanılarak in vitro hücre kültürü çalışmaları yürütülmüştür. Bu çalışmalarda, L929 hücre hattı ile sitotoksisite değerlendirmesi, Saos-2 hücre hattı ile antikanser aktivite değerlendirmesi, mezenkimal kök hücre hattı ile sitotoksisite ve osteojenik farklılaşma değerlendirmesi yapılmıştır. Çalışmalar sonucu, hem antikanser aktivitesi hem de osteojenik aktivitesi yüksek, kemik doku oluşumunu destekleyecek süre boyunca mekanik olarak dayanıklı, birbirine bağlı ve doku oluşumunu artırıcı poröz yapıda, hücre tutunmasına elverişli hidrofilik yüzeye sahip, biyouyumlu ve biyoparçalanır yapıda, etkin maddeleri kontrollü bir şekilde salabilen ilaç yüklü kemik doku iskelelerinin eldesi sağlanmıştır.

Abstract:
Ensuring the regeneration of bone tissue is the most important challenge for the treatment of some diseases that cause loss of bone mass, such as bone defects and bone fractures. Among the types of bone cancer, osteosarcoma is the most common type and is mostly seen in children and adolescents in developmental age. The osteoid structure produced by malignant mesenchymal cells in osteosarcoma causes immature bone growth, especially in rapidly growing bone tissue. Therapy requires complete surgical removal of the tumor site and systemic treatment with multiple antineoplastic agents before and after surgery. Systemic chemotherapy can lead to inadequate treatment of osteosarcoma and irreversible toxicity in some other organs due to difficulties in reaching therapeutic drug concentration at the tumor site. In this doctoral thesis, it was aimed to develop a bone tissue scaffold containing two different drugs, one of which is anticancer and the other with osteogenic activity, in two different layers, so that both the tumor can be treated and the removed bone area is restored. The system contains doxorubicin, an anticancer active substance, dissolved in alginate gel, for the treatment of the area in which bone tumor has developed in its outermost layer. In the middle layer, there are PCL microspheres loaded with dexamethasone dispersed in alginate/gelatin gel, which supports the replacement of lost bone tissue by allowing mesenchymal stem cells to differentiate into bone cells. The innermost layer of the system consists of a three-dimensional PLA scaffold produced using the FDM method. 
Three different molecular weight of PCL polymers and two different L:G ratios of PLGA polymers were used in the preparation of dexamethasone-loaded microspheres. Structural analysis, morphological analysis, particle size and distribution analysis, production efficiency, active substance loading efficiency, and active substance release studies were carried out on the developed microsphere formulations, and the most successful formulation was selected and continued with this formulation in future studies. The cylindrical mold embedding method is used for the layer-by-layer coating of the PLA scaffold. Structural analysis, morphological analysis, porosity analysis, mechanical resistance measurement, contact angle measurement, in vitro degradation (PLA scaffold) analysis and in vitro dexamethasone and doxorubicin release studies were carried out on the scaffolds. In vitro cell culture studies were conducted using formulations selected as a result of in vitro characterization studies. In these studies, cytotoxicity evaluation with L929 cell line, anticancer activity evaluation with Saos-2 cell line, cytotoxicity and osteogenic differentiation evaluation with mesenchymal stem cell line were performed. 
As a result of the studies, the drug loaded bone tissue scaffold with anticancer and osteogenic activity is determined to be biocompatible and biodegradable, successful at controlled drug release, mechanically durable for the period to support bone tissue formation,  suitable for cell attachment and proliferation by its interconnected porous structure and a hydrophilic surface.