Atomik kuvvet mikroskobu ile biyomoleküllerin doğal ortamlarında tayini ve karakterizasyonu
Detection and characterization of biomolecules with atomic force microscope in their native environments
Yazar: DEMET ÇATÇAT KAYIM
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MEMED DUMAN ; PROF. DR. EMİR BAKİ DENKBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Diğer yüksek çözünürlük teknikleri ile karşılaştırıldıklarında, AKM'lerin en önemli özelliklerinden birisi sıvı içerisinde görüntü alabilme yeteneğidir. Ancak sıvı içerisinde görüntü alabilme ambiyant koşullara göre çok daha zordur, çünkü sıvı yüzeyi lazer ışını yansımasına neden olmaktadır ve kantileveri akustik olarak titreştirmek sıvı içerisinde zordur. Ayrıca örnek alttaş yüzeyine sıkıca tutturulmalıdır ve sıvı hücre içerisindeki hava kabarcıkları ve sıvı kaybı iyi bir yalıtım ile minimize edilmelidir. Bu tarz engellerin üstesinden gelebilmek için bu tez kapsamında ilk olarak Nanomanyetik Bilimsel Cihazlar tarafından üretilmiş olan AKM cihazında mekanik, optik ve elektronik olarak optimizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiş ve bu kapsamda iki prototip geliştirilmiştir. İlk prototip geliştirilirken mekanik engeller ortadan kaldırılmış ve sıvı hücre içerisinde mikron ve submikron skalada çeşitli biyolojik örneklerin görüntüleri kaydedilebilmiştir. Bu çalışmalarda varolan sıvı hücre, kantilever tutucu tasarımı ve kullanılan malzemeler literatür verileri ışığında değiştirilmiştir. Daha sonra sıvı içerisinde gerçek atomik çözürlük elde edilebilen AKM geliştirilmesi için optik yolakta ve AKM elektronik düzeneğinde iyileştirme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar neticesinde kantilever sıvı içerisinde, istenmeyen frekans eğrilerinden kaçınılarak doğru merkez frekans eğrisinde titreştirilebilmiş ve aynı zaman da düzgün bir rezonans eğrisi kaydedilebilmiştir. Bu şekilde geliştirilen AKM ile kantileverin rezonanstaki termal olarak titreşiminin gürültü tabanları sırası ile havada 19.24 fm/√Hz, sıvıda ise 28.43 fm/√Hz olarak ölçülmüştür ve atomik skalada yüksek çözünürlük görüntüleri kaydedilmiştir.
Tez çalışmasının ikinci ve son kısımlarında AKM'yi çok kuvvetli bir karakterizasyon cihazı haline getiren kuvvet spektroskopi çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Hücrelerin yüzeyinde bulunan farklı reseptör ve proteinlerin ilgili ligandları ile etkileşimleri, hücresel yapılanmayı ve hücrelerin birbirleri ile olan ilişkilerini önemli ölçüde etkilemektedir. Bu etkileşimlerin çok daha detaylı ve tek molekül düzeyinde anlaşılması, günümüzde moleküler biyoloji ve biyofizik çalışma alanlarının en önemli sorularındandır. Kuvvet spektroskopisi, reseptör-ligand etkileşimlerini, uygun fizyolojik koşullarda pikonewton düzeyinde ölçebilen oldukça hassas bir karakterizasyon tekniğidir. Yalnız bu etkileşimlerin ölçülebilmesi ve AKM iğne ucunun hassas bir sensör gibi davranabilmesi için, ucun çeşitli kimyasal çapraz bağlayıcılar ile modifiye edilmesi gerekmektedir. Tez kapsamında AKM ucu modifikasyon çalışmaları gerçekleştirilmiş ve çeşitli yöntemler denenerek kalibrasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Validasyon çalışması olarak streptavidin-biyotin spesifik bağlanma çalışmaları model olarak kullanılmıştır. Bu çalışmalar lizozim baskılanmış polimer ile lizozim arasındaki bağlanmalar kaydedilerek sonuçlandırılmıştır. Tezin son aşaması olarak AKM'nin biyomedikal uygulamalarına örnek teşkil edecek ostesarkoma benzeri hücrelerin  substrat ve inkübasyon günlerine bağlı olarak elastisite tayinleri yapılmıştır. Örneklerin elastik modülü ve sertlikleri AKM'lerin nanoindentasyon özelliği ile tayin edilebilmektedir. Bu özellik sayesinde bu çalışma kapsamında SaOS-II hücrelerinin mekaniği hakkında kantitatif bilgi edinilmiş ve çeşitli parametrelere bağlı olarak hücre elastisite ve mekaniği üzerindeki değişim karşılaştırmaları yapılabilmiştir.
Sonuç olarak tez çalışmasında gürültü kaynakları minimize edilerek, akustik titreştirme ve optik ışık saçılması yöntemi ile çalışan kapalı sıvı hücre AKM geliştirilmiştir. Geliştirilen sistemin hassasiyeti, tek molekül kuvvet spektroskopisi ve nanoindentasyon çalışmaları ile gerçekleştirilmiştir.  Elde edilen veriler ışığında tez çalışması boyunca tasarlanan kapalı sıvı hücre AKM'sinin, biyolojik moleküllerin biribileri ile olan etkileşimlerini fizyolojik ortamlarda nano ölçeklerde incelenebilmesinden dolayı temel bilimler ve tıp alanında kullanılabileceği öngörülmektedir.

Abstract:
One of the most prominent features of AFM is its ability to operate under aqueous solutions compared to other high resolution microscopes. However, imaging in aqueous solutions is a more difficult process than imaging in ambient conditions, because liquid surface causes refraction of laser beam and vibrating the cantilever becomes more difficult due to acoustical resonances. In addition, sample should be immobilized, air bubbles should be prevented and sealing is essential to avoid liquid loss. In order to avoid these type of obstacles, in the scope of this thesis at first mechanical, optical and electronic optimization studies of AKM, manufactured by Nanomagnetics Scientific Instruments Ltd. Şti., were carried out and two prototypes have been developed in this content . During the development of the first prototype mechanical obstacles were eliminated and micron and submicron scale images of the various biological samples could be recorded in the liquid cell. In these studies, the existing liquid cell , kantilever holder design and materials used were changed in view of the literature. As the second phase of this study, true atomic resolution were obtained in liquid with new developments through optical pathways and improvements in electronics assembly. As a result of this study, kantilever could vibrated and also a resonance curve could be recorded properly in the liquid, avoiding unwanted frequency curves towards the center frequency of the curve. Thus with the developed AKM kantilever was thermally vibrated at its center resonance frequency and noise floors were recorded as 19.24 fm / √Hz, 28.43 fm / √Hz was measured in air and liquid respectively, and high-resolution images were recorded at the atomic scale. 
In the second and final part of the thesis force spectroscopy studies, that makes AFM a most powerful tool for characterization, were carried out . The interactions between membrane proteins/receptors and their cognate ligands initiate most of the cellular response and structural organization. The understanding of these interactions in single molecule level is one of the most important challenges in molecular biology and biophysics studies. Force spectroscopy is extremely accurate characterization technique that is capable of measuring receptor-ligand interactions at pikonewton levels in appropriate physiological conditions. However measuring those interactions and using AFM tip as a sensor, tip should be modified with various crosslinkers with the help of chemical bonds. In the scope of this thesis AFM tip modification was carried out and calibration tests was carried out by using various methods. Validation studies as streptavidin-biotin specific binding studies were used as templates. These studies with lysozyme imprinted polymer binding between lysozyme have been recorded. As the final stage of the thesis, as an example of AFM biomedical applications, determination of  osteosarcoma-like cells elasticity was carried depending on the substrate and incubation days. The elastic modulus and hardness of samples can be assessed by the nano-indentation feature of AFM. With this feature, quantitative information  about the mechanics of Saos - II cells was obtained and  cell mechanics and elasticity changes based on various parameters could be compared in the scope of this study.
To conclude, closed liquid cell AKM was improved with using acoustic osilation and optic light scattering with minimizing noise effects in this study. Single cell force spectroscopy and cell elasticity measurements with nanoindentation were completed with using sensitivity of this system. To be capable of detecting interaction between each other biological molecules in physiological environment with designed closed liquid cell high resolution AFM at nano scale, it can be provided that AFM is usable for fundamental sciences and  medicine.