Alternatif solunumun moleküler düzeyde aktifleştirilmesi ile nohut ve buğday bitkilerinin soğuk stresine karşı dirençlerinin artırılması
Improvement of resistance to cold stress in wheat and chickpea with activation of alternative respiration at the molecular level
Yazar: MUCİP GENİŞEL
Danışman: DOÇ. DR. RAHMİ DUMLUPINAR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Botanik = Botany
Dizin: Kışlık buğday = Bread wheat ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Solunum = Respiration ; Soğuk stresi = Cold stress

Özet:
Bu araştırmada sitokrom yolu inhibitörleri olan azid ve antimisin A, alternatif solunum yolu inhibitörü olan salisilhidroksamik asit (SHAM) ve alternatif solunum yolu aktivatörü olan piruvatın tolerans yetenekleri farklı olan buğday (Tiritucum aestivum cv. Müfitbey) ve nohut (Cicer arietinum cv. Yaşa-05) bitkilerinin soğuğa dirençleri üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla kontrol şartlarında 13 gün süre ile yetiştirilen buğday bitkileri ile 9 gün yetiştirilen nohut bitkileri uygulama yapıldıktan 12 saat sonra sırasıyla 5/2oC ve 10/5oC sıcaklık değerlerine ayarlanan iklim dolaplarına aktarılmışlardır. Bitkiler 48 saatlik soğuk uygulamasından sonra hasat edilerek moleküler ve biyokimyasal parametrelerindeki değişimler incelenmiştir. Her iki bitkide de uygulanan maddelerin optimum konsantrasyonları azid için 2mM, antimisin A için 2µM, piruvat için 5mM ve SHAM için 4mM olarak belirlenmiştir. Soğuk uygulaması kontrol şartlarına göre hem buğday hem de nohut bitkisinin süperoksid dismutaz (SOD), katalaz (CAT), askorbat peroksidaz (APX) ve glutatyon reduktaz (GR) aktivitelerini artırırken peroksidaz (POD) aktivitesini önemli oranda düşürmüştür. Azid, antimisin A ve piruvat uygulamaları soğuk grubuna göre tüm antioksidan enzim aktivitelerini artırırken, en fazla artış piruvat uygulanan bitkilerde kaydedilmiştir. Oysaki SHAM uygulanan bitkilerde SOD dışındaki tüm enzimlerin aktivitelerinde önemli düşüşler meydana gelmiştir. Doğal?PAGE sonucu elde edilen izoenzim sonuçları da antioksidan enzim aktivitelerinin ortaya koyduğu sonuçları doğrulamıştır. Süperoksit (O2 .-) anyonu üretimi ve hidrojen peroksit (H2O2) içeriği  ile lipid peroksidasyon seviyesi soğuk uygulaması ile ciddi derecede artmıştır. Soğuk uygulamasına kıyasla azid, antimisin A ve piruvat bu parametrelerdeki artışları önemli derecede indirgerken, SHAM uygulaması daha da artırmıştır. Diğer yandan oksijen tüketiminin ölçülmesiyle elde edilen sonuçlar, soğuk uygulamasının AOX enzim aktivitesini önemli derecede artırdığını göstermiştir. Soğuk uygulamasına kıyasla azid, antimisin A ve piruvat uygulamaları AOX aktivitesini artırırken SHAM uygulaması ciddi derecede düşürmüştür. Bu sonuçları teyit edebilmek için AOX proteini ifadesi de western blot tekniği ile moleküler düzeyde belirlenmiştir. Elde edilen bulgular soğuk uygulaması sonucunda AOX proteini ifadesinde kaydadeğer oranda ciddi artışların olduğunu göstermiştir. Antimisin A ve piruvat uygulanan bitkilerde AOX ifadesini daha da artırmışken, SHAM uygulanan bitkilerde soğuğa kıyasla önemli bir değişim gözlenmemiştir. Bu sonuçlar bir bütün olarak değerlendirildiğinde azid, antimisin A ve piruvat uygulamalarının antioksidatif mekanizmasının aktivasyonunun yanı sıra, alternatif solunum yolunun aktivitesini de artırarak oksidatif stresin indirgenmesinde etkili olduğu, böylece buğday ve nohut bitkilerinde düşük sıcaklık direncini artırdığı söylenebilir. Soğuğa direncin artırılmasında en etkili maddenin ise AOX aktivatörü olan piruvat olduğu açıkça ortaya konulmuştur.

Abstract:
In this study, it was investigated the effects of inhibitors of respiration pathway, azide and antimycin A, salicylhydroxamic acid (SHAM) which is inhibitor of alternative respiration pathway and pyruvate as activator of alternative respiration pathway on cold resistance of wheat and chickpea which have different tolerance ability. For this purpose, plants grown at control conditions for 9(chickpea)-13(wheat)days were transferred to plant growth chamber  to set for wheat (Tiritucum aestivum cv. Müfitbey) chickpea (Cicer arietinum cv. Yaşa-05) at 5/2°C and  at 10/5°C, respectively after application. The plants were harvested after cold application for 48 hours and examined the changes in molecular and biochemical parameters. For both plants, the optimum concentrations of applied substances were determined as 2mM for azide, 2µM for antimycin A, 5mM for pyruvate and 4mM for SHAM. Compared to control plants, while cold application increased the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and glutathione reductase (GR), it considerably decreased activities of peroxidase of wheat and chickpea. While azide, antimycin A and pyruvate applications increased all antioxidant enzyme activities compared to cold group, the maximum increase was recorded at pyruvate-applied plants.  Whereas all enzymes activities except SOD exhibited importantly decreases in SHAM applied plants. The results of izoenzyme obtained from natural-PAGE approved the results that activities of antioxidants eznymes revealed. The production of superoxide anion  (O2 .-), content of hydrogen peroxide (H2O2) and level of lipid peroxidation enhanced significantly after cold application. When compared to cold application alone, azide, antimicin A and pyruvate pretreatments severely reduced increases in these parameters, whereas SHAM pretreatment more improved the data. On the other hand, the results obtained from oxygen consumption demonstrated that cold application enhanced remarkably AOX activity. In comparision to only cold treatment, azide, antimycin A and pyruvate preatments more enhanced the AOX activitiy, SHAM treatment markedly reduced the activity. To confirm this data, expiression amount of AOX protein was determined by western blot tecnique at the molecular level. The obtained data  exhibitied that cold application caused to remarkable increases in expression in AOX protein. While AOX expression was more enhanced with antimycin A and pyruvate pretreatments, it was not determined significantly changes compared to cold in SHAM-pretreated plants. In view of these results, azide, it may be said that azide, antimycin A and pyruvate pretreatments were effective in reducing of oxidative stress by increasing activity of alternative respiration pathway as well as activation of antioxidative system, thus improved the resistance to cold of wheat and chickpea. The study clearly elucidated that the most effective substance on resistance to cold was pyruvate activator of AOX.