Kutanöz mantar enfeksiyonu şüphesi olan hastalardan alınan deri kazıntı örneklerinde dermatofit ve diğer mantar etkenlerinin konvansiyonel ve PCR yöntemleriyle saptanması
Determination of dermatophyte and other fungus agents in conventional and PCR methods in skin scraping samples taken from patients with suspected cutanus fungi infection
Yazar: FATMA GÜNBEY
Danışman: PROF. DR. ZÜLAL AŞÇI TORAMAN
Fırat Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Deri hastalıkları = Skin diseases ; Deri testleri = Skin tests ; Dermatofitler = Dermatophytes ; Epidermofiton = Epidermophyton ; Mantar hastalıkları = Mycoses ; Mikrosporum = Microsporum ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Trichophyton = Trichophyton

Özet:
Dermatofitoz, dermatofit adı verilen patojenik keratinolitik mantarların neden olduğu küresel öneme sahip bir hastalıktır. Dermatofitler morfolojik özellikleri temel alınarak; Microsporum, Epidermophyton ve Trichophyton olmak üzere üç cinse; doğal kaynaklarına göre de; antropofilik (insan kökenli), zoofilik (hayvan kökenli) ve geofilik (toprak kökenli) olmak üzere üç gruba ayrılırlar. Keratinize dokuların mantar enfeksiyonlarında en kolay, en hızlı ve en pratik inceleme yöntemi örneklerin direkt mikroskobik incelemesidir. Direk mikroskobik inceleme örnekleme kalitesine, mikrobiyoloğun tecrübe ve becerisine bağlı olduğu için duyarlılığı değişkenlik gösterir. Kültür direk mikroskobiye yardımcıdır ve tüm yüzeyel mantar enfeksiyonları ile herhangi bir sistemik tedavi gerektiren dermatofit enfeksiyonlarının tanısında kullanılmalıdır. Ancak dermatofitoz tanısında kullanılan mikolojik kültür ve ileri tür düzeyi identifikasyon yöntemlerinin kullanılması tanıyı geciktirir. Bu çalışmada dermatoloji polikliniğine kutanöz mantar enfeksiyonu şüphesi ile başvuran hastalardan alınan deri kazıntı örneklerinde dermatofit ve diğer mantar etkenlerinin konvansiyonel ve PCR yöntemleriyle saptanması amaçlanmıştır. 
Çalışmaya Mayıs 2020-Temmuz 2020 tarihleri arasında Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Dermatoloji Polikliniğine dermatofit ön tanısıyla başvuran 130 hastaya ait alınan saç, saçlı deri, deri kazıntısı ve tırnak örnekleri dahil edilmiştir. Her klinik örnek, öncelikle direk mikroskobik inceleme için %20'lik KOH ile preparatları hazırlanıp ışık mikroskobunda önce küçük (10x) sonra büyük büyütmeli (40x) objektiflerle incelenmiştir. Yapılan incelemede mantar hif/miçel ve sporları aranmıştır. Klinik örneklerin mikolojik kültürü için steril petri kutusuna alınan örneklerin SDA, antibiyotikli SDA, PDA besiyerlerine ekimleri yapılmıştır. Ekimi yapılan besiyerleri 4 haftalık süre sonunda makroskobik olarak SDA ve/veya PDA besiyerinde üreyen kültürdeki koloniler; koloni örgüsü, koloni yüzeyi, yüzey ve taban pigmentasyonu açısından değerlendirilmiştir. PDA besiyeri, koloninin taban ve yüzeyde pigmentasyon oluşturma özelliği için değerlendirilmiştir. Kültürde üreme gözlenen kolonilerden DNA izolasyonu için CTAB metodu uygulanmıştır. Çalışmada ITS (ITS1/ITS4) gen bölgelerini hedefleyen primerlerle PCR uygulanmıştır. Konvansiyonel yöntemlerle küf ya da maya olarak tanımlanan kültürlere PCR analizi sonrası dizi analizi uygulanmıştır. Elde edilen dizilere göre tanımlama nükleotid BLAST programı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) ile gen bankasındaki nükleotid dizilerinin karşılaştırılması ile yapılmıştır.
Dermatofit ön tanılı hastalardan alınan 130 klinik örneğin 102 (%78,4)'sinin direk mikroskobik incelenmesinde mantar hif ve/veya sporlarına rastlanmıştır. Direk mikroskobide pozitif olarak değerlendirilen 99 (%76) ve negatif olarak değerlendirilen 7 (%25) örnek olmak üzere toplam 106 (%81,5) örneğin mikolojik kültürlerinde üreme gözlenmiştir. Üreme olan kültürlerden yapılan ileri identifikasyon değerlendirmelerinde tanımlanan dermatofitlerin dağılımında en sık T. rubrum (%49) türünün ürediği saptanmıştır. Kültürde üreyen suşların konvansiyonel yöntemler ile tanımlanan türlerinin ITS gen bölgelerinin hedefleyen primerlerle yapılan PCR ile identifikasyon sonuçları aynı (sadece konvansiyonel yöntemle T. mentagrophytes olarak tanımlanan 36 nolu suş PCR ile T. rubrum olarak tanımlanmıştır) tanımlanmıştır.
Çalışmamızda kültürden izole edilen dermatofitoz etkenleri ileri identifikasyon yöntemleri uygulanmadan önce moleküler tanı yöntemleri kullanılarak hızlı bir şekilde tür düzeyinde tanımlanabilmiştir. Alt yapısı uygun olan laboratuvarlarda dermatofitozların rutin tanısında moleküler yöntemlerin uygun bir tanı aracı olabileceği sonucuna varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: dermatifoz, Trichophyton,  Epidermophyton, Microsporum, PCR

Abstract:
Dermatophytosis is a disease of global importance caused by pathogenic keratinolytic fungi called dermatophytes. Based on the their morphological features, dermatophytes are divided into three genera as Microsporum, Epidermophyton and Trichophyton, while according to their natural resources as anthropophilic (human origin), zoophilic (animal origin) and geophilic (soil origin) dermatophytes. The easiest, fastest and the most practical examination method in fungal infections of keratinized tissues is the direct microscopic examination of the samples. 
	Since direct microscopic examination depends on the sampling quality, the experience and skill of the microbiologist, its sensitivity varies. Culture aids direct microscopy and should be used in the diagnosis of all superficial fungal infections and dermatophyte infections requiring any systemic treatment. However, mycological cultures and advanced species-level identification methods used in the diagnosis of dermatophytosis delay the diagnosis.
	 In this study, we aimed to detect dermatophytes and other fungal agents by conventional and PCR methods in skin scraping samples taken from patients who applied to the dermatology outpatient clinic with the suspicion of cutaneous fungal infection. 
	Hair, scalp, skin scraping and nail samples taken from 130 patients who applied to the Dermatology Outpatient Clinic of Fırat University Medical Faculty Hospital between May 2020 and July 2020 with a preliminary diagnosis of dermatophytosis were included in the study. Each clinical sample was first prepared with 20% KOH for direct microscopic examination and examined under the light microscope using eyepieces with 10x) and then 40x magnification. In the examination, fungal hyphae/micelle and spores were searched. For mycological culture of clinical samples, the samples taken in sterile Petri dishes were inoculated into SDA, antibiotic SDA and PDA media. 
	Colonies in cultures grown macroscopically in SDA and/or PDA medium at the end of a 4-week period were evaluated in terms of texture, surface appearance, surface and base pigmentation of colonies. PDA medium was evaluated for its ability to produce pigmentation on the base and surface of the colony. The CTAB method was used for DNA isolation from colonies grown in culture. 
	In the study, PCR was applied with primers targeting ITS (ITS1/ITS4) gene regions. Sequence analysis was applied to cultures defined as mold or yeast by conventional methods after PCR analysis. Identification according to the sequences obtained was made by comparing the nucleotide sequences in the gene bank with the nucleotide BLAST program.
	Fungal hyphae and/or spores were found in direct microscopic examination of 102 (78.4%) of 130 clinical samples taken from patients with prediagnosis of dermatophytosis. Fungal growth was observed in mycological cultures of a total of 106 (81.5%) samples, including samples that had been evaluated as culture -positive (n: 99 ;76%) , and culture-negative (n:7 :25%) under direct microscopic examination. In the distribution of dermatophytes identified using the further identification methods of the cultures, most frequently T. rubrum (49%) species was detected.
	Results of the identification of the strains grown in cultures by PCR method using primers targeting ITS gene regions were not different from those identified by conventional methods excepting only strain no. 36 defined as T. mentagrophytes by the conventional method was revealed as T. rubrum by PCR. 
	In our study, agents of dermatophytosis isolated from culture could be identified at the species level quickly by using molecular diagnostic methods before applying advanced identification methods. We have concluded that molecular methods can be an appropriate diagnostic tool in the routine diagnosis of dermatophytoses in laboratories with suitable infrastructure.
Key words: dermatophytosis, Trichophyton,  Epidermophyton, Microsporum, PCR