Uzun kodlamayan RNA (lncRNA) linc00968 'in alzheimer hücre kültürü modellerinde apoptoz üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of long non-coding RNA (lncRNA) linc00968 on apoptosis in alzheimer cell culture models
Yazar: SERAP KURT
Danışman: PROF. DR. SEFA KIZILDAĞ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Alzheimer hastalığı, kognitif bozukluk ile karakterize nörodejeneratif ve heterojen bir hastalıktır. Hastalığın patogenezinde rol oynayan amiloid beta plakları beyinde hücre dışı amiloid birikintileri oluştururken, nörofibriler yumaklar hiperfosforile tau proteininin anormal filamentlerinin birikmesiyle karakterizedir. Bu çalışmanın amacı, Amiloid beta 25-35 nörotoksisitesi oluşturulmuş SH-SY5Y hücrelerinde uzun kodlamayan RNA (lncRNA) linc00968'in apoptotik rolünü araştırmaktır. Alzheimer hastalığı nörotoksisitesini taklit etmek için SH-SY5Y hücrelerinde Amiloid beta 25-35 fragmanı kullanıldı. Hücre canlılığı MTT assay ile belirlendi ve uygun Amiloid beta 25-35 inhibisyon konsantrasyonu değeri hesaplandı. 40 µM Amiloid beta 25-35 uygulanmış ve uygulanmamış (kontrol) hücrelerinde linc00968 ifadesi qRT-PCR ile incelendi. Daha sonra linc00968 ifadesi susturulmak amacıyla Amiloid beta 25-35 uygulanmış SH-SY5Y hücrelerine siRNA ile transfekte edildi ve qRT-PCR ile doğrulandı. Apoptotik yolaklardaki etkisinin incelenmesi amacıyla BCL-2, BAX, CYT-C ve internal kontrol GAPDH gen ifadeleri qRT-PCR ile incelendi. Post transkripsiyonel etkileri değerlendirmek amacı ile western blot ile Bcl-2, Bax, Cyt-c ve Beta aktin düzeyleri incelendi. Sonuçlar, linc00968'in A toksisitesi oluşturulmuş SH-SY5Y hücrelerinde ifadesinin artmış olduğu saptandı. SH-SY5Y hücrelerinde, Amiloid beta 25-35 kaynaklı toksisitenin antiapoptotik BCL-2 gen ifadesini azalttığı, proapoptotic BAX ve CYT-C gen ifadesini arttırdığı saptandı. A toksisitesi oluşturulmuş SH-SY5Y hücrelerinde, Linc00968'in baskılanmasının apoptozu tersine çevirdiği belirlendi. Protein düzeyinde bakıldığında siRNA ile linc00968'in baskılanması anti-apoptotik Bcl-2 düzeyini azalttı, proapoptotic Bax ve Cyt-c düzeyinde azalışa neden oldu. Bulgularımız, linc00968'in Amiloid beta 25-35 ile indüklenen SH-SY5Y hücrelerinde yüksek oranda ifade edildiğini göstermektedir. Linc00968'nin baskılanmasının, apoptoz ile ilişkili bazı belirteçleri düzenleyerek SH-SY5Y hücrelerini Amiloid beta 25-35 kaynaklı nörotoksisiteye karşı koruyabildiği gösterilmiştir. Linc00968'in ifadesinin düzenlenmesi Amiloid beta 25-35 fragmanları ile AH nörotoksisitesini taklit eden hücrelerde nöronal apoptozun önlenmesinde yeni belirteç olarak önerilebilir.

Abstract:
Alzheimer's disease is a neurodegenerative and heterogeneous disease characterized by cognitive impairment. In the brain, aberrant filaments of hyperphosphorylated tau protein accumulate to create neurofibrillary tangles, whereas extracellular amyloid deposits are formed by amyloid beta plaques. Here we aimed that to examine the involvement of long non-coding RNA (lncRNA) linc00968 in apoptosis in SH-SY5Y cells that exhibit neurotoxicity from amyloid beta 25–35. In SH-SY5Y cells, the amyloid beta 25–35 fragment was employed to simulate the neurotoxicity of AD.Cell viability was determined by cytotoxicity assay and the appropriate Amyloid beta 25-35 inhibition concentration value was calculated. Quantitative simultaneous polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to assess linc00968 expression in treated and untreated (control) cells with 40 µM Amyloid beta 25-35. Subsequently, linc00968 expression was transfected with siRNA into Amyloid beta 25-35-treated SH-SY5Y cells to silence expression and confirmed by qRT-PCR. BCL-2, BAX, CYT-C and internal control GAPDH gene expressions were analyzed by qRT-PCR in order to examine their effects on apoptotic pathways. To evaluate the post-transcriptional effects on the levels of beta actin, Bcl-2, Bax, and Cyt-c, Western blot analysis was employed. Results showed that the expression of linc00968 was increased in SH-SY5Y cells with A toxicity. Amyloid beta 25–35 toxicity reduced antiapoptotic BCL-2 gene expression and elevated proapoptotic BAX and CYT-C gene expression in SH-SY5Y cells. It has been found that inhibiting Linc00968 can stop apoptosis in SH-SY5Y cells that have been stimulated by amyloid beta 25–35. Proapoptotic Bax and Cyt-c as well as anti-apoptotic Bcl-2 were also reduced in the protein level upon linc00968 knockdown using siRNA. According to our research, SH-SY5Y cells generated by amyloid beta 25–35 exhibit high levels of linc00968 expression. It has been demonstrated that by controlling a few apoptosis-related indicators, inhibition of Linc00968 can shield SH-SY5Y cells from the neurotoxicity caused by amyloid beta 25–35. In cells that imitate the neurotoxicity of AD, Linc00968 expression regulation in combination with Amyloid beta 25–35 fragments may be a novel marker for the prevention of neuronal death.