Clostridium tetani toksoidine karşı tavuk yumurtasından ımmunoglobulin-y (IgY) üretimi, saflaştırılması ve serolojik olarak spesifikliğinin belirlenmesi
Production, purification and serological determination of immunoglobulin-y (IgY) from chicken eggs against Clostridium tetani toxoid
Yazar: KÜRŞAT TETİK
Danışman: PROF. DR. BARIŞ SAREYYÜPOĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Tetanoz, Clostridium tetani tarafından üretilen tetanospazmin (TeNT) nörotoksininin neden olduğu, insanlar ve birçok hayvan türü için yaşamı tehdit eden bakteriyel bir hastalıktır. Hastalığın teşhisi ve tedavisinde farede üretilen, kullanımının homojenlik ve özgüllük gibi çeşitli avantajları olan monoklonal antikorlar kullanır. Buna karşılık, poliklonal antikorların, özellikle kümes hayvanlarından ekstrakte edilen IgY'nin dikkate değer bir özelliği, memeli (IgG) antikorlarından daha fazla miktarda elde edilmesidir. Bu tez çalışmasında, Geçit Kuşağı Tarımsal Araştırma Enstitüsü bünyesinde 2015 yılından beri ıslah çalışmaları yürütülen ve 2020 yılında T.C. Tarım ve Orman Bakanlığı tarafından ırk tescili yapılan 'Anadolu-T' ırkı etçi tavukların saf hatları kullanılmıştır. Tesadüfi olarak seçilen 22 haftalık yaştaki tavuklar, C. tetani toksoidi + adjuvant (FCA/FIA) ile göğüs kasından enjeksiyon yolu ile immunize edildi ve 4 hafta aralıklarla iki hatırlatma enjeksiyonu yapılarak immunizasyon işlemi tamamlandı. Aşılama öncesinde ve 14 gün sonrasında aşılanan hayvanların kanat venlerinden kan alındı ve total antikor titreleri ELISA yöntemi ile ölçüldü. Son bağışıklamadan 14 gün sonra alınan kan örneklerinin serumlarında total antikor titreleri en yüksek seviyeye ulaştığı görüldü. İmmunize edilen ve edilmeyen tavukların yumurtalarından non-invaziv şekilde PEG (6000) ekstraksiyon protokolü kullanılarak IgY antikorları izole edildi. Saflaştırılmış anti-C. tetani IgY antikorlarının moleküler ağırlığı SDS-PAGE analizi ile belirlenerek jel üzerinde uygun ve beklenen konumda görüntülendi. Ardından western blot analizi sonucunda elde edilen görüntüler, izole edilen IgY antikorlarının varlığını doğruladı. Varlığı doğrulanan IgY antikorların anti-C. tetani IgY olduklarını ispatlayabilmek için agar jel immunodifüzyon (AGID) ve çabuk lam aglütinasyon testi yapıldı. AGID test sonucunda izole edilen C. tetani spesifik IgY'ler ile tetanoz toksoidi arasında oluşan presipitat görüntüsü ve çabuk lam aglütinasyon testinde tipik kümeleşmelerin oluşumu, elde edilen yumurta sarısı antikorlarının C. tetani toksoidine spesifik olarak üretildiğini serolojik olarak belirlemiş oldu.

Abstract:
Tetanus is a bacterial disease caused by the tetanospasmin (TeNT) neurotoxin produced by Clostridium tetani, which is life-threatening for humans and many animal species. It uses monoclonal antibodies produced in the mouse for the diagnosis and treatment of the disease, the use of which has several advantages, such as homogeneity and specificity. In contrast, a remarkable feature of polyclonal antibodies, especially IgY extracted from poultry, is that they are obtained in greater quantities than mammalian (IgG) antibodies. In this thesis study, breeding studies have been carried out within the Transitional Zone Agricultural Research Institute since 2015 and in 2020, pure lines of 'Anatolian-T' breed broiler chickens, breed registered by the Republic of Türkiye Ministry of Agriculture and Forestry, were used. Randomly selected chickens at the age of 22 weeks, C. tetani toxoid + adjuvant (FCA/FIA) was immunized by injection from the chest muscle and two reminder injections were given at intervals of 4 weeks and the immunization process was completed. Blood was taken from the wing veins of vaccinated animals before and 14 days after vaccination, and total antibody titers were measured by the ELISA method. It was observed that total antibody titers in the serum of blood samples taken 14 days after the last vaccination reached the highest level. IgY antibodies were isolated from the eggs of immunized and nonimmunized chickens non-invasively using the PEG (6000) extraction protocol. Purified anti-C. tetani molecular weight was determined by SDS-PAGE analysis and displayed in the appropriate and expected position on the gel. Then, the images obtained as a result of western blot analysis of confirmed the presence of IgY antibodies. Agar gel immunodiffusion (AGID) and rapid slide agglutination test were performed to prove that the confirmed IgY antibodies were anti-C. tetani IgY. The precipitation lines were formed between isolated C. tetani-specific IgYs and tetanus toxoid as a result of the AGID test, and the formation of typical aggregation in the quick slide agglutination test, serologically determined that the egg yolk antibodies obtained were produced specifically for C. tetani toxoid.