Meme kanseri hücre hattında 4-Aminopiridin'in etki mekanizmasının belirlenmesi
Investigation of 4-Aminopyridine effect mechanism in breast cancer cell line
Yazar: PINAR İYİOL
Danışman: DOÇ. GÜNSELİ AYŞE GARİP
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Aminopiridinler = Aminopyridines ; Hücre dizisi = Cell line ; Kalsiyum = Calcium ; Meme = Breast ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms

Özet:
Amaç: Bu çalışmada, bir potasyum kanal blokeri olan ve hücre membran potansiyelini değiştirdiği daha önce yapılan çalışmalarla gösterilmiş olan  4-Aminopiridin'in (4-AP) yol açtığı hücre ölümü mekanizmasının araştırılması hedeflenmektedir.
Gereç ve yöntem: Çalışmada, östrojen pozitif MCF-7 (ATCC HTB- 22) ve kontrol olarak fibroblast L-929 (ATCC CCL-1) hücre hatları kullanılmıştır. z-vad-fmk, sikloheksimid (CHX) ve 2-Aminoetoksidifenil borat'ın (2-APB) ayrı ayrı ve 4-AP ile kombine kullanımları sonucu canlılık üzerinde meydana getirdiği değişimler tripan mavisi ile hücreler sayılarak belirlenmiştir. Hücre içi kalsiyum (Ca+2) değişimleri Fura-2 AM floresan boya ile, membran potansiyeli değişimleri DiBAC4(3) ile floresan spektrofotometrede belirlenmiştir. İstatistiksel değerlendirmelerde tek yönlü ANOVA yöntemi kullanılmıştır ve p değeri 0,05'ten küçük değerler anlamlı kabul edilmiştir.
Bulgular: 4-AP uygulamasından sonra hücrelerde vakuol oluşumu gözlendi. 4-AP uygulamasından 1 saat önce ayrı ayrı z-vad-fmk, CHX ve 2-APB ile ön işleme tabi tutulan hücrelerde MCF-7 ve L-929 hücre hatları için sağ kalım artmıştır. Kaspaz inhibitörü ile ön tedavi sonrası canlılık artışı z-vad-fmk apoptotik hücre ölümüne işaret ederken, paraptoz inhibitörü CHX ile ön tedavi sonrası sağkalımda artış ve vakuol oluşumu paraptotik hücre ölümüne işaret etmektedir. 4-AP, beklendiği gibi hücre içi Ca+2 'da artışa neden oldu. IP3 reseptör bloke edici 2-APB ile ön muameleden sonra hücre içi Ca+2 miktarında azalma bulundu ve bu sonuç, sağ kalım artışıyla ilişkilendirildi. 4-AP, her iki hücre hattında da depolarizasyona neden oldu.
Sonuçlar: Meme kanseri hücre hattında 4-AP uygulaması, apoptoz öncesi paraptotik sürecin başlaması ve bu sürecin apoptozu tetiklemesi ile hücre ölümünün gerçekleştiğini düşündürmektedir.

Abstract:
Objective: In this study, it is aimed to investigate the mechanism of cell death caused by 4-Aminopyridine (4-AP), which is a potassium channel blocker and has been shown in previous studies to change cell membrane potential.
Material and method: Estrogen positive MCF-7 (ATCC HTB-22) and fibroblast L-929 (ATCC CCL-1) cell lines were used in the study. The changes caused by z-vad-fmk, cycloheximide (CHX) and 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) separately and in combination with 4-AP were determined by counting cells with trypan blue. Intracellular calcium (Ca+2) changes were determined with Fura-2 AM fluorescent dye, membrane potential changes with DiBAC4(3) in fluorescence spectrophotometer. Statistical evaluations were made using the one-way ANOVA method, and values with a p value less than 0.05 were considered significant.
Results: Vacuole formation was observed in the cells after 4-AP application. Survival was increased for MCF-7 and L-929 cell lines in cells pretreated with z-vad-fmk, CHX and 2-APB separately for 1 hour before 4-AP administration. Viability increase upon pre-treatment with caspase inhibitör z-vad-fmk suggested apoptotic cell death while increased survival after pretreatment with paraptosis inhibitör CHX and vacuole formation suggested paraptotic cell death. 4-AP caused an increase in intracellular Ca+2 as expected. A decrease in the amount of intracellular Ca+2 was found upon pretreatment with IP3 receptor blocker 2-APB which correlated with an increase in survival. 4-AP caused depolarization in both cell lines.
Conclusions: 4-AP application in breast cancer cell line suggests that cell death occurs with the initiation of the paraptotic process before apoptosis and this process triggers apoptosis.