Mycobacterium tuberculosis LppX proteinin rekombinant tüberküloz aşısı geliştirmede kullanımı
Utilization of LppX protein from Mycobacterium tuberculosis for development of recombinant tuberculosis vaccine
Yazar: CENNET DOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. SEZER OKAY
Çankırı Karatekin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Tüberküloz (TB), Mycobacterium tuberculosis (MTB) bakterisinin neden olduğu bulaşıcı bir hastalıktır. Bu hastalık için kullanılan tek aşı BCG'nin erişkinlerde koruyuculuğu yetersiz kalmaktadır. Bu çalışmanın amacı, rekombinant tüberküloz aşısı geliştirmek için MTB izolatından lppX genini moleküler tekniklerle klonlayıp, LppX proteinini rekombinant olarak saflaştırarak, bu proteinin Montanide ISA 720 adjuvanıyla formülasyonunun hümoral ve hücresel bağışıklığı tetikleme kapasitelerini araştırmaktır. Bu çalışma için ilk olarak ülkemizdeki bir verem hastasından izole edilmiş olan M. tuberculosis suşundan lppX geni pGEM-T, sonrasında pET28a vektörüne klonlanlanarak E. coli BL21 suşuna aktarılmıştır. E. coli'de ifade edilen his-tag'lı rekombinant LppX proteini nikel kolonkullanılarak saflaştırılmış ve Montanide ISA 720 VG adjuvanı ile 7:3 oranında aşı formülasyonu hazırlanmıştır. Aşı formülasyonu, adjuvan ve BCG aşısı, Balb/c farelere enjekte edilmiş ve farelerden belirli aralıklarda serum toplanmıştır. Western blot tekniği rekombinant proteini kalitatif olarak görüntülemek için yapılmıştır. Rekombinant proteine ve BCG aşısına özgün serum kullanıldığında beklenen büyüklükte bantlar gözlenirken, sadece adjuvana özgün serum kullanıldığında bant gözlenmemiştir. Hümoral ve hücresel bağışıklığı tetikleme kapasiteleri değerlendirilmiştir. Bağışıklama öncesinde ve sonrasında IgG değerleri karşılaştırıldığında, hazırlanan aşı formülasyonunun hümoral bağışıklık yanıtını anlamlı düzeyde artırdığı belirlenmiştir. Hücresel bağışıklığı tetikleme kapasitesi serum interferon-gama (IFN-γ) ve interlökin-12 (IL-12) düzeyleri ile ölçülmüştür. LppX formülasyonunun IFN-γ düzeyini artırmada BCG aşısı kadar etkin olduğu, ancak IL-12 tetiklemede yetersiz kaldığı gözlemlenmiştir. Daha sonra yapılacak çalışmalarda, farklı immünojenik proteinlerle oluşturulacak ikili veya üçlü füzyonların daha etkili olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is a contagious disease caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (MTB). Today, BCG is the only vaccine used against TB. However, the protection of this vaccine in adults is insufficient. The purpose of this study was to clone the lppX gene from MTB isolate and to purify recombinant LppX protein for development of recombinant TB vaccine. The lppX gene from MTB strain, isolated from a TB patient in our country, was cloned into first pGEM-T and then pET28a vectors and transferred to E. coli BL21 strain. His-tag recombinant LppX protein expressed in E. coli was purified using nickel columns, and a 7: 3 vaccine formulation was prepared with Montanide ISA 720 VG adjuvant. Vaccine formulation, adjuvant and BCG vaccine, weres. c injected to 5 Balb/c miceand serum samples were collected at regular intervals from mice. The Western blot assay was performed to qualitatively screen the recombinant protein. While bands of the expected size were observed using the recombinant protein and the BCG vaccine-specific serum, the band was not observed only when the adjuvant-specific serum was used. When the IgG values were compared before and after immunization, the vaccine formulationwas significantly increased the humoral immune response. The capacity of these formulations to induce cellular immunity in Balb/c mice was measured by serum interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-12 (IL-12) levels. It was observed that the LppX formulation was as effective as the BCG vaccine in increasing the level of IFN-γ but it was not sufficient to boost IL-12 levels. In future studies, it is thought that double or triple fusions to be formed with different immunogenic proteins may be more effective.