Deneysel periodontitis modelinde (6)-shogaol uygulamasının antienflamatuvar ve antioksidan etkilerinin değerlendirilmesi
Evaluation of anti-inflammatory and antioxidant effects of (6)-shogaol administration in experimental periodontitis model
Yazar: DİDEM BEZİRCİ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MELTEM HENDEK ; PROF. DR. GÖNEN ÖZCAN
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Periodontoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Antiinflamatuar ajanlar = Anti inflammatory agents ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Periodontal hastalıklar = Periodontal diseases ; Periodontitis = Periodontitis ; Shogaol = Shogaol ; Zencefil = Ginger

Özet:
Periodontitis, diş çevresinde biriken mikrobiyal dental plak ve buna karşı konak immün yanıt arasındaki kompleks etkileşim sonucu gelişen bir hastalıktır. Konak-bakteri etkileşimiyle tetiklenen immün yanıt belirteçlerinin çok miktarda salınımına yol açarak, doku yıkımını başlatmaktadır. Özellikle immün sistem ve kemik metabolizması arasındaki yakın ilişkinin anahtar düzenleyicileri olarak görev yapan nükleer faktör-kappa B (NF-κB)'nin reseptör aktivatörü (RANK) ve onun ligandı (RANKL) ve RANKL'ı inhibe eden osteoprotegerin (OPG) sıkça değerlendirilen belirteçlerdendir. 
Serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma mekanizması arasındaki dengesizliği ifade eden oksidatif stresin, oksidatif hasara duyarlı hücresel makromoleküllere zarar vererek doku hasarına yol açtığı ve periodontal hastalık gibi birçok kronik dejeneratif hastalığın patogenezinde rol oynadığı bilinmektedir. Oksidatif stres, genelde lipit peroksidasyon (LPO) son ürünü olan malondialdehit (MDA) ve süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon peroksidaz (GP) gibi antioksidan enzimlerin ölçümü ile belirlenmektedir.
Geleneksel periodontal tedavi yaklaşımlarına ek olarak kullanılan ajanların uzun dönem kullanımları ve istenmeyen birtakım yan etkileri farklı alternatif tedavi seçeneklerine yol açmıştır. Zencefil bitkisi, güçlü antienflamatuvar, antioksidan, antibakteriyel özellikleriyle bilinmektedir. Literatürde zencefil ve/veya etkili metabolitlerinin kontrollü deneysel bir çalışma ile sistemik uygulanmasının, periodontitisin hem önlenmesi hem de tedavisi üzerine olan etkilerini değerlendiren herhangi bir çalışma bulunmamaktadır.
Çalışmanın amacı, deneysel periodontitis oluşturulan sıçanlarda zencefilin etkili metabolitlerinden biri olan (6)-shogaol'ün uygulanmasının hem profilaktik hem de terapötik olarak periodontal dokular üzerine olan antienflamatuvar ve antioksidan etkinliğini incelemektir.
Deney grupları 35 adet erkek Wistar Albino sıçan rastgele 4 gruba ayrılarak şu şekilde oluşturuldu. Sağlıklı grup (n=5): 1-14 gün süresince herhangi bir işlem uygulanmadı. Periodontitis grubu (n=10): 1-14 gün boyunca sadece ligatür ile periodontitis oluşturuldu. Profilaksi grubu (n=10): 1-14 gün süresince ligatür ile periodontitis oluşturuldu ve bu süre boyunca 20 mg/kg/gün (6)-shogaol oral gavaj yoluyla verildi. Terapötik grup (n=10): 1-14 gün ligatür ile periodontitis oluşturuldu ve ligatür çıkarılmasını takiben 14 gün boyunca 20 mg/kg/gün (6)-shogaol oral gavaj yoluyla verildi. Grup periyodu sonuna göre sakrifiye edilen sıçanlardan elde edilen örneklerde histopatolojik ve histomorfometrik olarak bağ dokusu ve interdental septum ve enflamatuvar hücre infiltrasyonu, alveoler kemik kaybı; immünohistokimyasal olarak ise MDA, SOD, GP, NF-κB, RANKL ve OPG  incelendi.
Ölçümü alınan değişkenlerin gruplar arası karşılaştırması normallik ve varyans homojenliğinin sağlandığı yerlerde tek yönlü varyans analizi (ANOVA), sadece normallik varsayımının sağlandığı yerlerde Welch-ANOVA testi, aksi durumda Kruskal Wallis testi ile test edildi. Farklılığın belirlendiği ölçümlerde farkı belirlemek için Bonferroni düzeltmeli Mann Whitney U testi, Games-howell veya Bonferroni düzeltmeli bağımsız örneklem t testinden uygun olan post hoc testi ile karşılaştırmalar yapıldı.
Çalışmamızda histopatolojik analizlerde; enflamatuvar hücre infiltrasyonu semikantitatif olarak skorlandı ve gruplar karşılaştırıldığında sıfır değerini alan sıçanların %60'ı sağlıklı grupta bulundu. Periodontitis grubunda bu değeri alan sıçan yoktu. Histomorfometrik analizlerde; mine sement sınırı – alveoler kret tepesi (MSS-AKT) arası mesafe, sağlıklı grupta periodontitis, profilaksi ve terapötik gruba göre anlamlı derecede düşük (tüm karşılaştırmalar için p<0.001); periodontitis grubunda terapötik gruba göre anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0.001). İmmünohistokimyasal analizlerde; RANKL seviyesi periodontitis grubunda sağlıklı ve terapötik gruba göre anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0.001; p<0.001, sırasıyla). OPG seviyesi, periodontitis grubunda profilaksi ve terapötik gruba göre; sağlıklı grupta ise terapötik gruba göre  anlamlı derecede düşük bulundu ( p=0.002; p<0.001; p=0.049, sırasıyla). RANKL/OPG oranı, periodontitis grubunda sağlıklı, profilaksi ve terapötik gruba göre, profilaksi grubunda ise terapötik gruba göre anlamlı derecede yüksek bulundu (p=0.005; p=0.006; p=0.005; p=0.011, sırasıyla). NF-κB seviyesi, periodontitis grubunda sağlıklı, profilaksi ve terapötik gruba göre anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0.001; p=0.017; p=0.023, sırasıyla). MDA seviyesi, sağlıklı grupta periodontitis, profilaksi ve terapötik gruba göre anlamlı derecede düşük bulundu (p=0.004; p=0.012; p=0.017, sırasıyla). SOD seviyesi, periodontitis grubunda profilaksi ve terapötik gruba göre anlamlı derecede düşük bulundu (p=0.039; p=0.042, sırasıyla). GP seviyesi, sağlık grupta profilaksi ve terapötik gruba göre anlamlı derecede yüksek  bulundu (p=0.031; p=0.002, sırasıyla).
Sonuç olarak, (6)-shogaol, sıçanlarda deneysel periodontitis modelinde antienflamatuvar ve antioksidan etki göstermiştir.

Abstract:
Periodontitis is a disease formed as a result of the complex interaction between the microbial dental plaque accumulating around the tooth and the host immune response developing against it. The immune response triggered by host-bacteria interaction causes secretion of mediators in large quantities, and consequently starts tissue destruction. As the key regulators of especially the close relationship between the immune system and bone metabolism, receptor activator (RANK) of nuclear factor-kappa B (NF-κB) and its ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) inhibiting RANKL are frequently utilized mediators. 
It is known that oxidative stress, which means the imbalance between the free radical formation and antioxidant defense mechanism, damages the cellular macromolecules sensitive to oxidative damage and causes tissue damage, and plays a role in the pathogenesis of many chronic degenerative diseases such as periodontal disease. Oxidative stress is generally determined by the measurement of malondialdehyde (MDA) which is the final product of lipid peroxidation and antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GP).
Long term use and unwanted side effects of the agents which are used as supplementary tools to the conventional periodontal treatment have caused the requirement of different alternatives. Ginger plant is well known for its strong anti-inflammatory, antioxidant, antibacterial properties. There are no studies in the literature evaluating the effects of systemic application of ginger and/or its effective metabolites on both prevention and treatment of periodontitis with a controlled experimental study.
       The purpose of the study is to examine the anti-inflammatory and antioxidant efficiency of (6)-shogaol application which is one of the most effective metabolites of ginger both prophylactically and therapeutically, on periodontal tissues of rats with experimentally formed periodontitis. 
Experimental groups was formed with randomised separation of 35 male Wistar Albino rats into 4 groups, as follows: Healthy group (n=5), not had any operation conducted for 1-14 days. Periodontitis group (n=10), periodontitis was formed only with ligature for 1-14 days. Prophylaxy group (n=10), periodontitis was formed with ligature for 1-14 days and during this time 20 mg/kg/day (6)-shogaol was given via oral gavage. Therapeutic group (n=10), periodontitis was formed with ligature for 1-14 days and 20 mg/kg/day (6)-shogaol was given via oral gavage for 20 days following the removal of the ligature. Connective tissue and interdental septum, inflammatory cell infiltration, alveolar bone loss via histopathology and histomorphometry, and MDA, SOD, GP, CAT, NF-κB, RANKL and OPG was examined via immunohistochemistry in the samples taken from the rats sacrificed according to the end of the group period
One way analysis of variance (ANOVA) was used for group comparisons where the normal distribution and homogenity of the values are reached while the normality of the variables were tested with Welch-ANOVA test. In the analysis of non-normal distribution of the data, all group comparisons were made with Kruskal-Wallis test, and the statistical significance was compared with Bonferroni corrected Mann-Whitney U test, Games-howell test or Bonferroni corrected t-test.
       During the histopathology analysis of the study, inflammatory cell infltration was scored semiquantitatively and the comparison of the rat groups showed that if a rat is assaigned with the score zero, this rat is in the healthy group. In the periodontitis group, none of the rats were assigned in score zero. Histomorphometry analysis of the test groups were showed that MSS-AKT levels were significantly lower in the healty group compared to periodontitis, prophylaxy and therapeutic groups (p<0.001) while the distance between the cemento-enamel junction and the alveolar bone crest (CEJ-AC) were significantly higher in the periodontitis group compared to therapeutic group (p=0.001). Immunohistochemistry analysis showed that, RANKL levels were significantly higher in the periodontitis group compared to prophylaxy and therapeutic groups (p=0.002; p<0.001; p=0.049). OPG levels were significantly lower in the periodontitis group compared to prophylaxy and therapeutic groups ( p=0.002; p<0.001). The same pattern was detected between the comparison of healty and  therapeutic groups (p=0.049). RANKL/OPG levels were significantly higher in the periodontitis group compared to healthy, prophylaxy and therapeutic groups (p=0.005; p=0.006; p=0.005). Moreover the comparison between prophylaxy and therapeutic groups revealed that RANKL/OPG levels were significantly higher in prophylacy group (p=0.011). NF-κB levels were significantly higher in the periodontitis group compared to healty, prophylaxy and therapeutic groups (p<0.001; p=0.017; p=0.023). The MDA levels were significantly lower in the periodontitis group compared to healthy, prophylaxy and therapeutic groups (p=0.004; p=0.012; p=0.017). Additionally, the SOD levels were significantly lower in the periodontitis group compared to prophylaxy and therapeutic groups (p=0.039; p=0.042) and the GP levels were significantly higher in the healthy group compared to prophylaxy and therapeutic groups (p=0.031; p=0.002).
As a result, our study confirmed the anti-inflammatory and antioxidant effects of (6)-shogaol in experimental periodontitis on rats.