Fasulyede (Phaseolus vulgaris L.) in vitro koşullarda haploid bitki elde etme olanaklarının araştırılması
The research on the possibilities of obtaining haploid plant in common bean (Phaseolus vulgaris L.) under in vitro conditions
Yazar: ASLI KÜÇÜKRECEP
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ DİLEK TEKDAL
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Anterler = Anthers ; Haploitler = Haploids ; Oksinler = Auxins ; Phaseolus vulgaris = Phaseolus vulgaris ; Sitokinin = Cytokinine

Özet:
Fasulyede doku kültürü ile haplod bitki üretiminin uygulanabilir protokollerinin geliştirilmesi özellikle çeşit geliştirme çalışmalarını hızlanıracaktır. Bu amaçla, bu tez kapsamında fasulyede erkek gametten haploid bitki eldesi (androgenesis) yönteminin uygulanabilirliği araştırılmış ve anter kültüründe genotip, besi ortamı ve bitki büyüme düzenleyicilerinin farklı konsantrasyonlarının haploid bitki rejenerasyonuna etkilerinin araştırılması hedeflenmiştir. Bitkisel materyal olarak Akman, Bitlis-76, Bitlis-117, Göksun, Göynük, Hakkari-12, Karacaşehir, Önceler, Tunceli-1, Van-59, Barbunya ve Leklek fasulye genotipleri kullanılmıştır. Anter kültürü çalışmalarında farklı oksin ve sitokinin içeriğine sahip, 24 adet B5 ve 24 adet MS besi ortamı olmak üzere toplamda 48 adet besi ortamı denenmiştir. Kültür ortamında oksin kaynağı olarak 2,4-D, sitokinin kaynağı olarak ise kinetin kullanılmış ve ilave olarak antioksidan özelliğinin etkisini araştırmak amacıyla aktif kömür ilave edilen besi ortamları da test edilmiştir.  Çalışmanın tarla denemeleri Mersin Üniversitesi Peyzaj Planlama Şube Müdürlüğü'ne ait sera alanında, doku kültürü çalışmaları ise Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoteknoloji Bölümü, Bitki Biyoteknolojisi Laboratuvarı'nda, 2019-2021 yılları arasında yürütülmüştür. Anter kültür denemeleri öncesi her genotip için sitolojik ve histolojik analizler yapılarak uygun tomurcuk büyüklüğü ve tek çekirdekli mikrospor evresi tespit edilmiştir. Sera koşullarında yetişen 12 fasulye genotipine ait uygun büyüklükteki tomurcuklara, +4°C de 2 gün süre ile ön soğuk uygulama yapılmış ve bu tomurcuklardan izole edilen anterler, oksin (2,4-D; 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 mg L-1), sitokinin (kinetin; 0, 0.5, 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 mg L-1) ve aktif karbonun (0, 0.5, 1 mg L-1) farklı kombinasyon ve konsantrasyonları ile modifiye edilen MS ve B5 kültür ortamlarında kültüre alınmıştır. Kallus elde edilen genotipler ve besi ortamları kaydedilerek, genotiplerin androgenez yetenekleri ile besi ortamlarının seçilen genotiplerde kallus oluşumunu teşvik etme oranları karşılaştırılmış ve kallus indüksiyon oranı hesaplanmıştır. Çalışma sonucunda seçilen tüm genotiplerde başarı ile embriyogenik kallus elde edilmiştir. En yüksek kallus indüksiyonu 2.5 mg L-1 Kinetin ve 0.5 mg L-1 2,4-D içeren B5 besi ortamından elde edilmiştir. Embriyogenik kallus oluşumu bakımından genotipler arasında istatistiki olarak önemli farklılıklar saptanırken, "Göynük" çeşidinin yüksek kallus indüksiyon oranı ile test edilen diğer genotipler arasında öne çıktığı görülmüştür. Çalışma sonucunda anterlerden gelişen embriyogenik kalluslardan sadece barbunya genotiptinden 1 adet sürgün rejenerasyonu elde edilmiş, elde edilen sürgün ve kallusların ploidi düzeyleri flow sitometri analizi ile belirlenmiştir. Kültürde gelişen örneklerde spontan katlanma olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Developing applicable protocol of haploid plant production through tissue culture will accelerate the cultivar development in common bean. For this purpose, In this research the applicability of anther culture in beans, one of the methods of obtaining haploid plants from male gametes (androgenesis) in beans, was investigated.  In the study, effects of geneotype, basic nutrient medium and its plant growth regulator content on the haploid plant regeneratşion from anthers of common bean were studied. Akman, Bitlis-76, Bitlis-117, Göksun, Göynük, Hakkâri-12, Karacaşehir, Önceler, Tunceli-1, Van-59, Barbunya and Leklek varieties were used as plant material. In anther culture study, a total of 48 nutrient media combinations with different auxin and cytokinin contents of B5 and MS media were tested. In the culture medium, 2,4-D as auxin source and kinetin was used as a cytokinin source, and in order to investigate the effect of its antioxidant properties, nutrient media with activated charcoal were also tested. Donor plants for the anther culture were grown in the greenhouse of Mersin University Landscape Planning Branch Directorate, and tissue culture studies were carried out in the Faculty of Science and Letters, Biotechnology Department, Plant Biotechnology Laboratory between 2019-2021. The buds of 12 bean genotypes grown in greenhouse conditions were treated with 4 °C-cold for four days. Cytological and histological analyzes were performed for each genotype, and appropriate bud size and microspore stage were determined. After the determination of the appropriate microspore stage, the anthers isolated from the buds of the donor plants were culture on the media combinations of Ms and B5 with auxin (2,4-D; 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 mg L-1), cytokinin (kinetin; 0, 0.5, 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 mg L-1) and activated carbon (0, 0.5, 1 mg L-1). As a result of the study, embryogenic callus was successfully obtained in all selected genotypes. Anther samples cultured in MS and B5 nutrient media were comparatively analyzed for each genotype and tested nutrient medium. According to the analysis results, the best callus induction was obtained from the B5 nutrient medium containing 2.5 mg L-1 kinetin and 0.5 mg L-1 2,4-D in the anther culture experiment. While significant differences were detected between genotypes in terms of embryonic callus formation, it was observed that the "Göynük" variety stood out among the other tested genotypes with its high callus induction rate. As a result of the study, shoot regeneration was obtained from embryonic calli developed from anthers, and ploidy levels of shoots and calli were determined.