Kolorektal kanser olgularında preoperatif, postoperatif ve kemoradyoterapi sonrası dönemde kan dokusunda moleküler prognostik ve prediktif biyobelirteçlerin araştırılması
Investigation of molecular prognostic and predictive biomarkers in blood tissue during preoperative, postoperative and post-chemoradiotherapy period with colorectal cancer patients
Yazar: AYTEN DOĞAN
Danışman: PROF. DR. OĞUZHAN DOĞANLAR
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers

Özet:
Kolorektal kanser dünyada ve Türkiye'de en yaygın kanser tiplerinden biridir ve kansere bağlı ölümler arasında dünyada 3. sırada yer almaktadır. Güncel olarak kolerektal kanserlerin tiplendirilmesinde ve immun terapi etkinliğin belirlenmesinde kullanılan genetik mutasyon temelli testler vardır. Ancak bunlar tedavinin başlangıç aşamasında kullanılabilirdir ve hastalık prognozu ve tedavi arasındaki ilişkiyi göstermezler. Bu sebeple, kolorektal kanserlerinde kan bazlı diagnostik ve prognostik biyomarkerların belirlenmesi günümüzde en çok çalışılan konulardan birisidir.
Bu tezin amacı, kolorektal kanserinin patofizyolojisinde önemli olan moleküler sinyal yolaklarındaki gen ekspresyon profilini belirlemek, bu gen ekspresyonları ile farklı tedavi uygulamalarının etkinliğini analiz etmek, son olarak tedavilerin etkinliğini ortaya koyabilecek biyomarkerları belirlemektir. Bu amaçla, tez kapsamında Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi'ne başvuran kolorektal kanser tanılı hastalardan, sırasıyla kemoradyoterapi öncesi, kemoradyoterapi sonrası, cerrahi operasyon öncesi ve cerrahi operasyon sonrası kan ve serum örnekleri alınmıştır. Çalışmada ayrıca verilerin normalize edilmesi için 10 adet sağlıklı kontrol kullanılmıştır. Alınan bu kanlarda, rutin biyokimya testleri oto-analizörlerde yapılmıştır. Tam kan dokularında, antioksidan savunma, DNA tamir, ısı şok cevabı, endoplasmik retikulum stres (ER stres), hipoksi, JAK/STAT, mitokondrial disfonksiyon, otofaji ve apoptoz yolaklarında önemli görevleri olan 87 adet gen ekspresyonu, aynı zamanda miR-21-5p ve miR-16-5p seviyeleri, kontrol numunelerine kıyasla qRT-PCR yöntemi ile belirlenmiştir. Serum örneğinde, survivin ve IRE1α seviyelerinin belirlenmesinde ELISA kullanılmıştır.
Çalışma sonucunda rutin kan parametrelerinde, tedavi grupları arasında anlamlı düzeyde değişim gösteren tüm parametrelerin, hastalığa spesifik markerlar olmadığı belirlenmiştir. Yapılan tam kan gen ekspresyon analizinde, uygulanan tedavi rejiminin, hastalarda güçlü bir oksidatif stres, buna bağlı DNA hasarı aynı zamanda yanlış-hatalı katlanmış protein cevabı oluşturduğu görülmüştür. Bu durum kan dokusunda, güçlü bir mitokondrial disfonksiyon ve özellikle içsel apoptoz yolağı aktivasyonu ile kendini göstermiştir. Proje kapsamında tüm genler kullanılarak yapılan başlıca bileşen analizi sonucunda (PCA), hasta kanlarında kansere bağlı gen ekspresyon profilinin, kontrole kıyasla önemli düzeyde farklı olduğunu, kemoradyoterapi sonrası oksidatif hasar, DNA hasarı, hücre siklus tutuklanması ve ölüm sinyalinin hızla arttığını, ancak özellikle cerrahi operasyon sonrası tedavi alan hastaların kontrol ile istatistik olarak aynı gruba girdiği belirlenmiştir. PCA analizi aynı zamanda kullanılan moleküler yolakların hastalık prognozunu anlamlı düzeyde yansıttığını ortaya koymuştur. FDR ve SAM analizleri bu yolaklarda 22 adet gen ekspresyonunun tedaviye bağlı hastalık prognozu ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Yapılan AUROC analizi, antioksidan savunma yolağından CuZn-SOD (AUC=0.964), DNA tamir yolağından CHOP (AUC=0.865), EXO1 (AUC=1) ve XRCC1 (AUC=0.859), ER stres yolağından XBP1 (AUC=0.960) ve IRE1α (AUC=0.77), ısı şok ailesinden HSP70 (AUC=0.931) ve HSP90 (AUC=0.942), çoklu ilaç direnci proteinlerinden, Pgp (AUC=0.816) ve LRP (AUC=0.875), anjiyogenez yolağından, IGFR (AUC=884), apoptoz yolağından TRAIL (AUC=1), TNFα (AUC=0.933), BID (AUC=0.925), PUMA (AUC=0.749), Survivin (AUC=0.983) ve JAK/STAT yolağından IFNG (AUC=0.833), STAT3 (AUC=0.938), STAT4 (AUC=0.894) ve SOCs3 (AUC=0.895) ve PI3K (AUC=0.804) genlerinin istatistik olarak anlamlı düzeyde seçicilik ve duyarlılık gösterdiğini ortaya koymuştur.
Sonuç olarak, tez bulgularımız, kolorektal kanser hastalarının tam kan dokularında belirlediğimiz 22 genlik biyomarker panelinin, öncelikle sağlıklı bireyleri ve kanser hastalarını başarılı bir şekilde ayırdığını, sonrasında uygulanan farklı tedaviler sonrasında hastalık prognozunu da monitörize edebildiği göstermiştir. Bununla birlikte tek merkezli ve az sayıda hasta ile yapmış olduğumuz çalışma bulgularımızın, çok merkezli, farklı yaş aralıklarında ve fazla sayıda hasta ile doğrulanmasının gerekli olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
Colorectal cancer is one of the most common cancer types in Turkey and it is ranks in the third place cancer-related deaths in worldwide. Currently, several tests exist based on genetic mutations in order to determine immune-therapy efficacy and to classify colorectal cancer types. However, these tests can only be used at the initial stage of treatment and can not show the relationship between the therapy and the prognosis. Therefore, determination of blood-based diagnostic and prognostic biomarkers in colorectal cancer is one of the most studied subjects.
The aim of this thesis is to determine the gene expression profile in molecular signaling pathways that are important in the pathophysiology of colorectal cancer, to analyze the effectiveness of these gene expressions and different treatment applications, and finally to determine the biomarkers that can demonstrate the efficacy of treatments.
For this purpose, blood and serum samples were collected respectively before and after chemotherapy, preoperative and postoperative period from the patients diagnosed with colorectal cancer who applied to Trakya University Faculty of Medicine. In the study, additionally 10 healthy controls were used to normalize of the obtained data. In these blood samples, routine biochemical tests were performed by autoanalyser. Expression profiles of 87 genes that have important roles in antioxidant defense, DNA repair, heat-shock response, ER stress, hypoxy, JAK/STAT, mitochondrial disfunction, autophagy and apoptosis pathways and also miR-21-5p ve miR-16-5p levels were determined by using qRT-PCR in whole blood samples,  ELISA method was used for the determination of survivin and IRE1α levels in serum tissue.
Our result determined that biochemical blood parameters that shows significant changes between treatment groups were not disease-specific markers. Whole blood gene expression analysis showed that the treatment regimen caused a strong oxidative stress and/or related DNA damage as well as unfolded/misfolded protein response. This situation had manifested by strong mitochondrial dysfunction and especially activation of the intrinsic apoptosis pathway in blood tissue. The PCA analysis determined that there are significant differences between control and cancer groups in whole blood gene expression profiles, oxidative damage, DNA damage, cell cycle arrest and death signal increased rapidly after chemoradiotherapy, however, the resulting cellular signal regressed to the same level as the control group after surgery.  PCA analysis, also showed that the molecular pathways used in the study significantly reflect disease prognosis. FDR and SAM analysis showed that 22 gene expression in these pathways was associated with treatment-related disease prognosis. AUROC analysis showed that CuZn-SOD (AUC=0.964) from antioxidant defense pathway, CHOP (AUC=0.865), EXO1 (AUC=1) and XRCC1 (AUC=0.859) from DNA repair pathway, XBP1 (AUC=0.960) ve IRE1α (AUC=0.77) from ER stress pathway, HSP70 (AUC=0.931) and HSP90 (AUC=0.942) from the heat shock family, Pgp (AUC=0.816) and LRP (AUC=0.875) from multiple drug resistance proteins, IGFR (AUC=0.884) from the angiogenesis pathway, TRAIL (AUC=1), TNFα (AUC=0.933), BID (AUC=0.925), PUMA (AUC = 0.749), Survivin (AUC=0.983) from the apoptosis pathway and IFNG (AUC=0.833) STAT3 (AUC=0.938), STAT4 (AUC=0.894) and SOCs3 (AUC=0.895) and PI3K (AUC=0.804) JAK/STAT pathway genes have statistically significant selectivity and sensitivity.
In conclusion, our thesis findings showed that the biomarker panel, which contains 22 genes identified in whole blood tissues of colorectal cancer patients, successfully separates healthy individuals and cancer patients primarily and can monitor the prognosis of the disease after different treatments. However, it is thought that, results of our single-centered study with a small number of patients should be confirm by future studies on multicentre, different age ranges and a large number of patients.