Deneysel parkinson modeline glutatyon izopropil esterin etkisi ve mekanizması
The effect and the mechanism of glutathione isopropyl ester on experimental parkinson's model
Yazar: ÖZLEM ÖZSOY
Danışman: PROF. DR. AYSEL AĞAR
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Glütatyon = Glutathione ; Glütatyon transferaz = Glutathione transferase ; Hidroksidopaminler = Hydroxydopamines ; Parkinson hastalığı = Parkinson disease

Özet:
Parkinson hastalığı (PH), beynin substansia nigra (SN) bölgesindeki dopaminerjik nöronların seçici kaybı ve ilerleyici motor yetmezlik ile karakterize bir hastalıktır. PH'da en erken görülen biyokimyasal değişikliklerden biri, hücre için önemli bir antioksidan olan total glutatyon (GSH)'un azalışıdır. GSH sentezinin artışıyla ya da yıkımının inhibisyonuyla sonuçlanacak uygulamaların PH'nın ilerlemesini yavaşlatabileceği öne sürülmüştür. Bu çalışmanın amacı, kan beyin bariyerini geçtiği bilinen ve sıçanlarda lipid peroksidasyonunu inhibe ederek beyin iskemisine karşı koruyucu etkisi gösterilen GSH analoğu N-(N-r-L-glutamil-L-sisteinil) glisin l-izopropil ester sülfat monohidrat (YM737)'ın deneysel PH üzerine olası koruyucu etkisini ve etki mekanizmasını ortaya koymaktır.3 aylık erkek Wistar sıçanlar rasgele olarak 4 gruba ayrılmıştır: Kontrol (K) grubu, YM737 verilen grup (Y), deneysel Parkinson oluşturulan grup (P), deneysel Parkinson oluşturulan + YM737 verilen grup (PY). Deneysel Parkinson modeli, 6-hidroksidopamin (6-OHDA) nörotoksininin medial ön beyin demeti (MFB)'ne, tek taraflı infüzyonu (3x4?g/?l dozda, 1?l/d hızla) ile oluşturulmuştur. YM737, stereotaksik cerrahiden hemen sonra, 0,1ml/100g hacimde, tek dozda (300mg/kg), intraperitonel yolla uygulanmıştır. Motor aktivite, katalepsi, lokomotor aktivite ve rotasyon testleri ile değerlendirilmiştir. SN'deki dopaminerjik hücre sayısı Tirozin Hidroksilaz (TH) immünreaktif (IR) hücrelerin stereotaksik analizi ile tespit edilmiştir. SN'deki apoptoz, DNA kırıklarının enzimatik olarak işaretlendiği Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling (TUNEL) yöntemiyle belirlenmiştir. B-hücre lenfoma-2 (Bcl-2) ve apoptoz sinyal regüle edici kinaz 1 (ASK1) proteinlerinin ekspresyon düzeyleri immünohistokimyasal analiz ile değerlendirilmiştir. Nigral GSH, 4-hidroksinoneal (4-HNE) ve sitokrom-c (sit-c) düzeyleri spektrofotometrik yöntemlerle ölçülmüştür.P grubunda belirgin katalepsi cevabı, lokomotor aktivite azalışı ve rotasyon gözlenmiştir. Bu grupta nigral TH-pozitif nöronların ve Bcl-2 protein yoğunluğunun kontrol grubuna göre azaldığı tespit edilmiştir. Bununla birlikte SN'de TUNEL-pozitif hücreler belirlenmiş, ASK-1 ekspresyonunda ise bir fark gözlenememiştir. Ayrıca bu grupta kontrol grubuna göre nigral GSH düzeyinin azaldığı, 4-HNE düzeyinin arttığı, sit-c düzeyinin ise değişmediği saptanmıştır. PY grubunda tüm bu parametreler açısından P grubundan bir fark tespit edilemezken Y grubunda kontrol grubuna göre nigral GSH miktarında azalış ve 4-HNE düzeyinde artış gözlenmiştir. Ayrıca Y grubunda nigral TUNEL-pozitif hücrelere rastlanmıştır.Sonuç olarak 6-OHDA ile oluşturduğumuz deneysel Parkinson modelinde gözlenen davranışsal, histolojik ve biyokimyasal değişikliklerde GSH analoğu YM737'nin düzeltici etkisi gözlenmezken, sağlıklı hayvanlarda bazı toksik etkileri belirlenmiştir.

Abstract:
Pakinson?s disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive motor decline and loss of dopaminergic neurons from the substantia nigra (SN). One of the earliest biochemical changes seen in PD is a reduction in the levels of total glutathione (GSH), a key cellular antioxidant. Treatments that lead to enhanced synthesis of GSH or that inhibit its degredation may result in a slowing of disease progression. The aim of this study was to investigate the protective effect and the metabolism of N-(N-r-L-glutamyl-L-cysteinyl) glycine l-isopropyl ester sulfate monohydrate (YM737), a GSH analog which penetrates blood-brain barrier and provides protection againts cerebral ischemia in rats by inhibiting lipid peroxidation.Three month old Wistar male rats were randomly divided into 4 groups as follows; control (C), YM737-treated (Y), experimental Parkinson induced (P), experimental Parkinson induced + YM737-treated (PY). Experimental model of PD was created by unilateral infusion of a neurotoxin, 6-hydroxydopamine (6-OHDA) (3x4?g/?l, 1?l/min), into the medial forebrain bundle (MFB). YM737 was administered i.p. (300mg/kg), in a volume of 0,1ml/100g. Motor activity of rats was evaluated via catalepsy, locomotor activity, and rotation tests. Apoptosis in SN was detected by enzymatic labeling of DNA strand breaks using Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling (TUNEL) method. B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and apoptosis signal regulating kinase 1 (ASK1) protein expression were evaluated by immunohistochemistry. Nigral GSH, 4-hydroxynoneal (4-HNE) and cytochrome-c (cyt-c) levels were determined by spectrophotometric assays.Animals in P group exhibited catalepsy, decreased locomotor activity and rotation. Decreased nigral TH-positive neuron number and decreased Bcl-2 protein density were detected in this group compared to control group. TUNEL-positive cells were detected in experimental Parkinson group. No change was observed between groups in ASK1 immunoreactivity. Additionally, P group exhibited lower concentration of GSH, higher levels of 4-HNE and unchanged levels of cyt-c compared to conrol. However there was no difference in PY group versus P group with respect to the all these parameters. Y group exhibited decreased GSH and increased 4-HNE levels compared to control group. Moreover, nigral TUNEL-positive cells were detected in Y group.In conclusion, we did not observe any protective effect of YM737, a GSH analogue, on behavioral, histological and biochemical alterations which were detect in 6-OHDA Parkinson model. However YM737 exerts some toxic effect on non-lesioned animals.