Ejder meyvesinin (Hylocereus türleri) biyokimyasal karakterizasyonu ve antikanserojenik özelliklerinin araştırılması
Biochemical characterization and anti-cancerogenic properties of dragon fruit (Hylocereus species)
Yazar: NURAY BAKAL
Danışman: PROF. DR. SERDAR KARAKURT
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Kolon kanseri veya kolorektal kanser dünyada kadınlar ve erkekler arasında en yaygın görülen üçüncü kanser türüdür. 2018 yılı kolorektal kanser verileri incelendiğinde, 1.8 milyon yeni vakanın tespit edildiği ve dünya genelinde 881.000 ölüm vakası ile kanserden ölüm nedenleri arasında üçüncü sırada yer aldığı görülmüştür. Kolon kanseri epidemiyolojik farklılıklar açısından değerlendirildiğinde, yaş gruplarının, cinsiyetin, bölgesel farklılıkların, genetik yatkınlığın, risk faktörüne maruz kalma oranının, demografik özelliklerin, tedavi edilme ve tedaviye verilen yanıtın bu farklılıklar üzerinde etkili olabileceği ile açıklanmıştır. Tüm farklılıklara rağmen kolon kanseri oranında istikrarlı bir artış görülmüştür. Özellikle genç yaştaki bireylerde kolon kanserinde artış görülmektedir. Yeni yapılan çalışmalar ışığında uzmanlar, geç dönemde belirti veren ancak erken dönemde çoğunlukla belirti vermeden seyrine devam eden kolon kanseri için 45 yaş itibariyle tarama yapılmasını önermektedir.
Kolon kanseri için her yıl yeni vaka sayısı artarken, etkili tedavilerin olmaması veya yeterli düzeyde verim alınamaması yeni tedavi yaklaşımlarına olan ihtiyacı vurgulamaktadır. Onkoloji pratiğinde cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi gibi geleneksel tedavi yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tedavi yöntemlerinin terapötik başarılarının az olması nedeniyle yeni tedavi yaklaşımları arayışı devam etmektedir. Son zamanlarda araştırmalar güvenli ve etkili kanser tedavilerinin geliştirilmesine odaklanmıştır. Çalışmaların birçoğu kolorektal kanserin nedenlerini belirlemeye çalışmaktadır.
Bazı çalışmalar ise, diyet kalıplarının kolon karsinogenezinde önemli etkiye sahip olduğunu ancak yüksek oranda kırmızı et ve hayvansal yağ alımının ise kolon kanseri riskini artırdığını belirtmektedir. Tam tahılların, sebzelerin ve meyvelerin ise kolon kanseri riskini azalttığı belirtilmiştir. Ayrıca diyetteki fenolik bileşiklerin ve flavonoidlerin de kolon kanserini önleyici etkiye sahip olduğu yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir. İlaçların ciddi yan etkileri olabilmektedir bu nedenle araştırmacılar kolorektal kanser riski altındaki hastalıkları önleme ve kolorektal kanser hastalarının tedavilerinin en doğru şekilde ilerlemesi için çalışmalar yapmaktadır. Bunun içinde en az yan etki ile doğal ürünlerden yararlanma eğilimi görülmektedir.
Süper meyve olarak tanımlanan Ejder meyvesi de antioksidan, antikanser, antimikrobiyal, antihiperlipidemik, antidiyabetik, hepatoprotektif ve yara iyileştirmesi gibi çeşitli tıbbi özelliklere sahip olduğu belirtilen bitkiler arasında olup tıbbi özellikleri nedeniyle son yıllarda ilgi odağı olmuştur. Betasiyaninler, fenolik bileşikler, polisakkaritler ve terpenoidler gibi biyoaktif maddeler açısından oldukça zengin olan ejder meyvesinin kanser, obezite, tip 2 diyabet ve diğer metabolik bozukluklara karşı koruyucu olarak tüketilebileceği bildirilmiştir. Ayrıca yapılan farklı çalışmalarda ejder meyvesinin hamur ve kabuklarının farklı oranlarda C, B1, B2, B3 gibi vitaminler, kalsiyum, potasyum, fosfor, gibi mineraller, proteinler, yağlar, karbonhidratlar, şekerler ve lif açısından zengin bir kaynak olduğu belirtilmiştir.
Çalışmamızda kullanılan ejder meyveleri (Hylocereus species) Antalya'nın Serik bölgesinde yetiştirilen Hylocereus undates (pembe kabuk, beyaz hamur) ve Hylocereus polyrhizus (pembe kabuk, mor hamur) türleridir. Meyve kabukları pembe renkli, hamur kısımları mor ve beyaz renklerdedir. İçinde kiviye benzer şekilde çekirdekleri bulunmaktadır. Kaktüs ailesinden bir meyve olup, subtropikal bölgelerde yetişmektedir. Çalışmamızda meyvenin hamur ve kabukları birbirinden ayrılmış ve metanol ekstrakları hazırlanmıştır. Metanol ekstraktlarının radikal süpürücü etkisini belirlemek için DPPH, antioksidan gücünü belirleme için hem hidrofilik hemde lipofilik özellikteki antioksidanları belirlemekte ABTS, toplam fenolik içeriği için Toplam Fenolik Bileşikler Tayini, Toplam Flavoid içeriği için Toplam Flavonoidler ve kromojenik bir yükseltgen olan Cu (II)- neokuproin (Nc) reaktifi kullanılarak CUPRAC antioksidan aktiviteleri ve HPLC ile diğer fenolik madde içerikleri test edilmiştir. Elde edilen ekstraktların insan kolon kanseri hücre hatlarından DLD-1 (metastatik), HT-29  (invaziv) ve sağlıklı kolon epitel hücresi olan CCD-18Co'nin hücre canlılığı ve sitotoksisitesi üzerindeki etkileri "Alamar Blue" reaktifi kullanılarak spektrofotometrik yöntemle belirlenmiştir. Hücre görüntüleme ve yara iyileştirme çalışmaları tamamlanmıştır. Daha sonra Apoptoz sürecinde etkin olan BcL-2, Kaspas-12 ve Bax genlerinin mRNA ve Protein ekspresyonları da qRT-PCR ve Western Blot yöntemleri ile belirlenmiştir.
Çalışmamızda tespit edilen DPPH analiz sonuçlarına göre, MH, MHK, BH ve BHK için IC50 değerleri sırasıyla 4.13, 1.28, 9.35 ve 0.96 olarak bulunmuştur. CUPRAC (Bakır II) İyon İndirgeme Kapasitesi analiz sonuçlarına göre, MH, MHK, BH ve BHK örneklerinin 800 µg/mL konsantrasyonda gallik asit eşdeğeri sonuçları sırasıyla 6.15 mg GAE/gr, 12.44 mg GAE/gr, 5.38 mg GAE/gr ve 12.80 mg GAE/gr olarak bulunmuştur. ABTS katyon giderim tayini analiz sonuçlarına göre, MH, MHK, BH ve BHK için IC50 değerleri sırasıyla 23.7, 1106.1, 2252.2 ve 1240.6 olarak bulunmuştur. Toplam flavonoid analiz sonuçlarına göre, MH, MHK, BH, BHK toplam flavonoid içeriği sırasıyla 14.1 mg QEs/gr, 17.3 mg QEs/gr, 13.5 mg QEs/gr, 19.8 mg QEs/gr olarak bulunmuştur. Toplam Fenolik madde analizine göre, MH, MHK, BH ve BHK değerleri sırasıyla 30.3 mg GAE/gr, 26.7 mg GAE/gr, 32.1 mg GAE/gr ve 28.5 mg GAE/gr olarak tespit edilmiştir. HPLC ile fenolik madde tayini sonuçlarına göre MH en fazla t-sinnamik asit içermektedir. BH en fazla t-sinnamik asit, O-kumarik asit, MHK en fazla klorojenik asit ve 4-Hidroksibenzoik asit ve BHK en fazla 4-Hidroksibenzoik asit ve rutin içermektedir. Ejder meyvesi hamur ve kabuklarının metanol ekstraktlarının DLD-1 ve CCD-18Co hücrelerinde sitotoksik etki göstermediği tespit edilmiştir. HT-29 üzerinde ise sitotoksik etkiye sahip olduğu gözlemlenmiştir. Sitotoksisite tayini sonuçlarına göre BH, MH, BHK ve MHK IC50 değerleri sırasıyla 207.4 μg/mL, 188.2 μg/mL, 148.4 μg/mL ve 135.8 μg/mL olarak belirlenmiştir. Ejder meyvesi hamur ve kabuklarının metanol ekstraktları ile yapılan, floresan spektroskopi analizleri, HT-29 hücrelerinde özellikle sitoplazmada lokalize olduğu tespit edilmiştir. Ejder meyvesi hamur ve kabuklarının metanol ekstraktlarının HT-29 hücre hattının göç oranını önemli ölçüde azalttığı görülmüştür. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, Ejder meyvesi hamur ve kabuklarının metanol ekstraktları ile tedavi edilen hücrelerin göç kapasitesinin sırasıyla, BH, BHK, MH ve MHK için HT-29 hücrelerinin migrasyonunu 24. saatte sırasıyla %84.6, %87.7, %88.4 ve %85.3 inhibe ettiği 48 saat sonra ise ingibisyon oranları %94.6, %97.7, %98.4 ve %95.3 şeklinde belirlenmiştir. Ejder meyvesi hamur ve kabuklarının metanol ekstraktlarının HT-29 hücreleri üzerindeki apoptotik etkisi incelendiğinde geç apoptotik evre üzerinde çok fazla etkili olmadığı ancak erken apoptotik evre üzerinde etkili olduğu görülmüştür. Mor hamurun erken apoptozu 5.96-kat attırdığı, Mor hamur kabuklarının erken apoptozu 6.86-kat arttırdığı, beyaz hamurun erken apoptozu 5.26-kat attırdığı ancak beyaz hamur kabuklarının erken apoptozu arttırmadığı görülmüştür. mRNA ekspresyon sonuçlarına göre, BAX geni için MH, BH ve MHK numunelerinin kontrol grubuna göre değerleri sırasıyla %98,7, %75.1 ve %98.4 inhibisyona sebep olduğu ve BHK numunesinin ise kontrol grubuna göre BAX geninde 14.9-kat aşırı ekspresyona sebep olduğu görülmüştür. mRNA ekspresyon sonuçlarına göre, kontrol grubuna göre tüm numunelerde BcL-2 genini inhibe ettiği görülmüştür. MH, BH, MHK ve BHK numunelerinin kontrol grubuna göre inhibisyon yüzdeleri sırasıyla %99.8, %95.7, %28.7 ve %55.0 olarak belirlenmiştir. mRNA Kaspaz-12 geni ekspresyon sonuçlarına göre, MH numunesinin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında Kaspaz-12 genini %75 inhibe ettiği, BH, MHK ve BHK numunelerininin ise kontrol grubuna göre sırasıyla Kaspaz-12 geninde 6.14-kat, 280.7-kat ve 59.2-kat ekspresyona sebep olduğu görülmüştür. Ejder meyvesi hamur ve kabuklarının metanol ekstreleri ile muamele edilen BAX protein ekspresyonunda meydana gelen değişimler sırasıyla MH, MHK, BH, BHK olarak 2.01-kat, 2.11-kat, 2.28-kat ve 1.61-kat arttırmıştır. Ejder meyvesi hamur ve kabuklarının metanol ekstreleri ile muamele edilen BcL-2 protein ekspresyonunda meydana gelen değişimler sırasıyla MH, BH numıuneleri için 1.36-kat, 1.09-kat ekspresyona sebep olduğu, MHK, BHK numuneleri için ise sırasıyla %24.4 ve %31.6 inhisyona sebep olduğu görülmüştür. Ejder meyvesi hamur ve kabuklarının metanol ekstreleri ile muamele edilen Kaspaz-12 protein ekspresyonunda meydana gelen değişimler sırasıyla MH, BH, MHK, BHK olarak 1.33-kat, 1.07-kat, 1.11-kat ve 1.18-kat ekspresyona sebep olduğu görülmüştür. Elde edilen veriler neticesinde Ejder meyvesinin kolorektal karsinoma tedavisinde bir ilaç adayı olabilme potansiyeli bulunduğu belirlenmiştir. Ancak bu verilerin in vivo çalışmalar ile de valide edilmesi ve meyve özütü içerisinde etkinlik gösteren aktif bileşiklerin tespit edilmesi gerekmektedir. 

Anahtar Kelimeler: Antioksidan, Ejder Meyvesi, HPLC, Kolorektal Adenokarsinoma, Sitotoksisite.

Abstract:
Colon cancer or colorectal cancer is the third most common cancer among men and women worldwide. In 2018, colorectal cancer data showed that 1.8 million new cases were detected and it ranked third among the causes of death from cancer with 881,000 deaths worldwide. When colon cancer is evaluated in terms of epidemiologic differences, it is explained that age groups, gender, regional differences, genetic predisposition, exposure to risk factors, demographic characteristics, treatment and response to treatment may be effective on these differences. Despite all the differences, there has been a steady increase in the rate of colon cancer. There is an increase in colon cancer, especially in young people. In the light of new studies, experts recommend screening at the age of 45 for colon cancer, which is symptomatic in the late stages but mostly asymptomatic in the early stages.
While the number of new cases of colon cancer increases every year, the lack of effective treatments or insufficient yield emphasizes the need for new therapeutic approaches. Traditional treatment modalities such as surgery, chemotherapy and radiotherapy are widely used in oncology practice. Due to the low therapeutic success of these treatment modalities, the search for new therapeutic approaches continues. Recently, many efforts have focused on the development of safe and effective cancer therapies. Many studies are trying to identify the causes of colorectal cancer.
Many studies have reported that dietary patterns are important in colon carcinogenesis, but high intake of red meat and animal fat increases the risk of colon cancer. Whole grains, vegetables and fruits have been reported to reduce the risk of colon cancer. In addition, studies have shown that phenolic compounds and flavonoids in the diet have a preventive effect on colon cancer. Drugs can have serious side effects, so researchers are working to prevent diseases at risk of colorectal cancer and to ensure that the treatment of colorectal cancer patients proceeds in the most beneficial way. In this, there is a tendency to utilize natural products with minimal side effects.
Dragon fruit, which is defined as a super fruit, is among the plants reported to have various medicinal properties such as antioxidant, anticancer, antimicrobial, antihyperlipidemic, antidiabetic, hepatoprotective and wound healing and has been the center of attention in recent years due to its medicinal properties. It has been reported that dragon fruit, which is rich in bioactive substances such as betacyanins, phenolic compounds, polysaccharides and terpenoids, can be consumed as a protective against cancer, obesity, type 2 diabetes and other metabolic disorders. In addition, in different studies, it has been reported that the pulp and peels of dragon fruit are a rich source of vitamins such as C, B1, B2, B3, minerals such as calcium, potassium, phosphorus, proteins, fats, carbohydrates, sugars and fiber.
The dragon fruits (Hylocereus species) used in our study are Hylocereus undates (pink skin, white pulp) and Hylocereus polyrhizus (pink skin, purple pulp) species grown in Antalya Serik region. Fruit peels are pink, while the pulp is purple and white. There are seeds inside, similar to kiwi. It is a fruit from the cactus family and grows in subtropical regions. In our study, the pulp and peels of the fruit were separated and methanol extracts were prepared. DPPH was used to determine the radical scavenging effect of the methanol extracts, ABTS to determine both hydrophilic and lipophilic antioxidants to determine the antioxidant power, Total Phenolic Compounds Determination for total phenolic content, Total Flavonoids for total flavoid content and CUPRAC antioxidant activities using Cu (II)- neocuproin (Nc) reagent which is a chromogenic oxidant and other phenolic substance contents were tested by HPLC. The effects of the extracts on the cell viability and cytotoxicity of human colon cancer cell lines DLD-1 (metastatic), HT-29  (invasive) and healthy colon epithelial cell line CCD-18Co were determined spectrophotometrically using "Alamar Blue" reagent. Cell imaging and wound healing studies were completed. Then, mRNA and protein expressions of BcL-2, Kaspas-12 and Bax genes, which are active in the apoptosis process, were determined by qRT-PCR and Western Blot methods.
According to the DPPH analysis results in our study, the IC50 values for MH, MHK, BH, and BHK were found to be 4.13, 1.28, 9.35, and 0.96, respectively. In the CUPRAC (Copper II) Ion Reducing Capacity analysis, the results for the samples MH, MHK, BH, and BHK at a concentration of 800 µg/mL in terms of gallic acid equivalents were found to be 6.15 mg GAE/g, 12.44 mg GAE/g, 5.38 mg GAE/g, and 12.80 mg GAE/g, respectively. According to the ABTS cation radical scavenging assay results, the IC50 values for MH, MHK, BH, and BHK were found to be 23.7, 1106.1, 2252.2, and 1240.6, respectively. Total flavonoid analysis results indicated that the total flavonoid content for MH, MHK, BH, and BHK was found to be 14.1 mg QEs/g, 17.3 mg QEs/g, 13.5 mg QEs/g, and 19.8 mg QEs/g, respectively. Total phenolic compound analysis revealed values of 30.3 mg GAE/g, 26.7 mg GAE/g, 32.1 mg GAE/g, and 28.5 mg GAE/g for MH, MHK, BH, and BHK, respectively. HPLC analysis for phenolic compounds showed that MH contained the highest amount of trans-cinnamic acid. BH contained the highest amounts of trans-cinnamic acid and O-coumaric acid, MHK had the highest chlorogenic acid and 4-hydroxybenzoic acid, and BHK contained the highest amounts of 4-hydroxybenzoic acid and rutin. Methanol extracts of dragon fruit pulp and peel did not show cytotoxic effects on DLD-1 and CCD-18Co cells, but exhibited cytotoxicity on HT-29 cells, with IC50 values for BH, MH, BHK, and MHK determined as 207.4 μg/mL, 188.2 μg/mL, 148.4 μg/mL, and 135.8 μg/mL, respectively. Fluorescence spectroscopy analysis of methanol extracts of dragon fruit pulp and peel revealed localization, especially in the cytoplasm of HT-29 cells. These extracts significantly reduced the migration rate of HT-29 cells, inhibiting migration by 84.6%, 87.7%, 88.4%, and 85.3% for BH, BHK, MH, and MHK, respectively, at 24 hours, and inhibition rates of 94.6%, 97.7%, 98.4%, and 95.3% at 48 hours compared to the control group. Examination of the apoptotic effect of methanol extracts of dragon fruit pulp and peel on HT-29 cells showed a significant effect on early apoptosis but not on the late apoptotic stage. Early apoptosis was increased by 5.96-fold for purple pulp, 6.86-fold for purple peel, and 5.26-fold for white pulp, while white peel did not increase early apoptosis. mRNA expression results revealed that for the BAX gene, MH, BH, and MHK samples caused 98.7%, 75.1%, and 98.4% inhibition, respectively, compared to the control group, and BHK sample caused a 14.9-fold overexpression in the BAX gene compared to the control group. For the BcL-2 gene, all samples inhibited its expression compared to the control group, with inhibition percentages of 99.8%, 95.7%, 28.7%, and 55.0% for MH, BH, MHK, and BHK, respectively. mRNA expression results for the Kaspaz-12 gene showed that MH inhibited the gene by 75% compared to the control group, while BH, MHK, and BHK samples caused 6.14-fold, 280.7-fold, and 59.2-fold overexpression, respectively, compared to the control group. Changes in BAX protein expression, induced by treatment with methanol extracts of dragon fruit pulp and peel, increased by 2.01-fold, 2.11-fold, 2.28-fold, and 1.61-fold for MH, MHK, BH, and BHK, respectively. Changes in BcL-2 protein expression showed increases of 1.36-fold and 1.09-fold for MH and BH samples, and decreases of 24.4% and 31.6% for MHK and BHK samples, respectively. Changes in Kaspaz-12 protein expression showed increases of 1.33-fold, 1.07-fold, 1.11-fold, and 1.18-fold for MH, BH, MHK, and BHK, respectively. The data obtained from this study proved that dragon fruits can be a good candidate for the threatment of the human colorectal carcinoma. On the other hand, further studies including determeination the bioactive compounds and in vivo studies are required to prove this action. 
Keywords: Antioxidant, Dragon Fruit, HPLC, Colorectal Adenocarcinoma, Cytotoxicity