Meme kanseri tanılı olgularda immun kontrol noktası genlerini regüle eden miRNA'ların ekspresyon profillerinin belirlenmesi
Determination of expression profiles of miRNAs regulating immune checkpoint genes in cases diagnosed with breast cancer
Yazar: MUSTAFA BARIŞ ZEYTUNLU
Danışman: DOÇ. DR. BURÇİN TEZCANLI KAYMAZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı / Kanser Biyolojisi ve İmmünolojisi Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Onkoloji = Oncology

Özet:
Meme Kanseri Tanılı Olgularda İmmun Kontrol Noktası Genlerini Regüle Eden miRNA'ların Ekspresyon Profillerinin Belirlenmesi
Meme kanseri (MK) hücreleri oldukça heterojen bir yapıda olup tedavide genel yaklaşım tümör rezeksiyonu sonrası kemoterapi, radyoterapi, hedefe yönelik tedaviler ve immunoterapidir. İmmunoterapide, immun kontrol noktası inhibitörleri (ICi) ile tümör mikroçevresinde immunosupresif ortama neden olan moleküller hedeflenerek immun mikroçevrenin kanser hücreleri üzerindeki aktivitesinin artırılması ile tümör hücrelerinin eliminasyonu amaçlanmaktadır. MK'de ilk immunoterapi, diğer MK türlerine göre daha immunojenik mikroçevreye sahip olan üçlü negatif meme kanseri (ÜNMK) tedavisinde kullanılmak üzere, FDA tarafından onaylanmış, özellikle PD-L1 ekspresyonu olan hastalarda önemli bir tedavi seçeneği olması ve yapılan klinik çalışmaların bazılarında sağ kalım süresini artırmış olmasına rağmen ÜNMK tedavisinde yetersiz aktivite gösterdiği bildirilmiştir. İmmunoterapi etkinliğini belirleyen en önemli etkenlerden biri, İKN moleküllerinin, kanser immun mikroçevresine göre değişen ekspresyon profilleridir. Bu nedenle İKNi'lerinin duyarlılığını artırmak ve İKN'larında görevli genlerin ekspresyon profillerinin belirlenmesi ve moleküler patogenezinin aydınlatılarak hedefe yönelik tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi önemlidir. miRNA'lar, post-transkripsiyonel seviyede gen ekpresyonunun regülatörleri olarak, hücre proliferasyonu, apoptoz, invazyon, metastaz gibi onkojenik ve birçok hücresel süreçte görev alan kısa kodlanmayan RNAlardır. Terapötik bir hedef olmalarının dışında, diagnostik ve prognostik belirteç olarak da kullanılabilmektedir. Ayrıca miRNA profillemesinin, hastalıkların altında yatan moleküler patogenezin aydınlatılmasında ve yeni hedef tedavi modellerinin geliştirilmesine katkıda bulunabileceği düşünülmektedir. miRNA'lar ile İKN'larında rol alan ko-inhibitör moleküllerin prognostik rolleri veya bu molekülleri hedef alan antikorlarının terapötik etkileri arasındaki korelasyon hakkında çok az şey bilinmektedir.
Bu amaçla çalışmamızda, MK tanılı olgular ile sağlıklı kontrol grubu olgularında, İKN'larında görevli olan PD-1, PDL-1, CTLA-4, LAG- 3 genlerinin mRNA ekspresyon seviyeleri ile, genleri regüle edebileceği in siliko analizle belirlenen 21 adet miRNA'nın ekspresyon profillemesi gerçekleştirildi. Böylece, İKN'larında görev alan genlerin ekspresyonun altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması ile yeni hedef tedavi modellerinin geliştirilmesine katkı sağlanması amaçlanmıştır.
MK tanılı olgular (n=50) ile sağlıklı kontrol grubu olgularından (n=46)  alınan periferik kan örneklerinden total RNA ve miRNA izolasyonu yapılmış ve reverse transkripsiyon ile cDNA sentezlenmiştir. 21 adet miRNA'nın ekpresyonu q-RT-PCR yöntemi ile belirlenmiştir. Hedef genlerin mRNA ve bu genleri regüle ettiği düşünülen miRNAların ekspresyon seviyeleri p<0.05'in önemi referans alınarak değerlendirilmiştir.
Sağlıklı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, olguların PD-1,PD-L1,CTLA4 ve LAG3 mRNA düzeylerinde anlamlı bir fark saptanmamıştır. Bununla birlikte hastalarda 21 miRNA'nın analizi yapılmış ve bunlardan 6 tanesinin kontrol grubuna göre farklı düzeylerde upregüle veya downregüle olduğu belirlenmiştir. miR-195-5p ifadesinin ise kontrol grubuna kıyasla, -3.09 kat daha düşük ifade edildiği (p<0.0001) saptanmışken; miR-6838-5p ekspresyonunun kontrol grubuna göre -6.93 kat daha düşük olduğu belirlenmiştir (p<0.0001). Kontrol grubuna kıyasla, miR-520b ailesinden olan miR-520-5p ifadesinin 2.46 kat (p<0.0001), miR-302d-3p ifadesinin 2.83 kat (p<0.0001), miR-15b-5p nin 3.08 kat (p<0.0001), miR-373-3p nin ise 2.40 kat (p<0.0001) olgu grubunda daha yüksek olduğu saptanmıştır (Tablo 9, Grafik 5, Grafik 6 ve Grafik 7). 
Çalışma örneğimizi oluşturan periferik kan hücrelerinde İKN moleküllerinin sağlıklı kontrollere göre farklı olmamasının nedeni bu bölgede bulunan kanser hücrelerinden oluşturulan kronik immunojenik uyarıların az olmasından dolayı inhibitör sinyallerin oluşmaması olabilir. Ayrıca, hücre proliferasyonu ve invazyonunda rol oynadığı bilinen miRNAların upregüle olması, bunların MK'de diagnostik ve prognostik bir belirteç olarak kullanımına katkı sağlayabilir. Daha ileri çalışmalar için tümör dokusunda da ekspresyon analizlerinin yapılması, immün temelli tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunacak önemli yaklaşımlar olacaktır.

Abstract:
Determination of Expression Profiles of miRNAs Regulating Immune Checkpoint Genes in Breast Cancer Cases
Breast cancer (BC) cells are highly heterogeneous and the general approach to treatment is chemotherapy, radiotherapy, targeted therapies and immunotherapy after tumor resection. In immunotherapy, immune checkpoint inhibitors (ICi) target molecules that cause immunosuppressive environment in the tumor microenvironment and aim to eliminate tumor cells by increasing the activity of the immune microenvironment on cancer cells. The first immunotherapy in BC was approved by the FDA for the treatment of triple negative breast cancer (TNBC), which has a more immunogenic microenvironment compared to other types of BC. Although it is an important treatment option especially in patients with PD-L1 expression and has increased survival in some clinical trials, it has been reported to show insufficient activity in the treatment of TNBC. One of the most important factors determining the efficacy of immunotherapy is the expression profiles of IC molecules, which vary according to the cancer immune microenvironment. Therefore, it is important to increase the sensitivity of ICs and to develop targeted treatment methods by determining the expression profiles of genes involved in ICs and elucidating the molecular pathogenesis. miRNAs are short non-coding RNAs that are involved in oncogenic and many cellular processes such as cell proliferation, apoptosis, invasion and metastasis as regulators of gene expression at the post-transcriptional level. Apart from being a therapeutic target, they can also be used as diagnostic and prognostic markers. In addition, miRNA profiling is thought to contribute to the elucidation of the underlying molecular pathogenesis of diseases and the development of new target therapy models. Little is known about the correlation between microRNAs and the prognostic roles of co-inhibitory molecules involved in ICs or the therapeutic effects of antibodies targeting these molecules.
For this purpose, in our study, we performed mRNA expression profiling of PD-1, PDL-1,CTLA-4,LAG-3 genes, which are involved in ICs, and expression profiling of 21 miRNAs, which were determined by in silico analysis to regulate these genes, in patients with BC and healthy control subjects. Thus, it was aimed to contribute to the development of new target treatment models by elucidating the molecular mechanisms underlying the expression of genes involved in ICs.
Total RNA and miRNA were isolated from peripheral blood samples obtained from patients with CC (n=50) and healthy control subjects (n=46) and cDNA was synthesized by reverse transcription. Expression of 21 miRNAs was determined by q-RT-PCR method. Expression levels of mRNA of target genes and miRNAs thought to regulate these genes were evaluated by taking the significance of p<0.05 as a reference.
There was no significant difference in PD-1, PD-L1, CTLA4 and LAG3 mRNA levels of the patients compared to the healthy control group. However, 21 miRNAs were analyzed in the patients and 6 of them were found to be upregulated or downregulated at different levels compared to the control group. miR-195-5p expression was found to be -3.09-fold lower compared to the control group (p<0.0001), while miR-6838-5p expression was -6.93-fold lower compared to the control group (p<0.0001). Compared to the control group, miR-520-5p expression, miR-302d-3p expression was 2.46-fold (p<0.0001), miR-302d-3p expression was 2.83-fold (p<0.0001), miR-15b-5p expression was 3.08-fold (p<0.0001) and miR-373-3p expression was 2.40-fold (p<0.0001) higher in the case group (Table 9, Graph 5, Graph 6 and Graph 7). 
The reason why IC molecules were not different in peripheral blood cells constituting our study sample compared to healthy controls may be that inhibitory signals do not occur due to the lack of chronic immunogenic stimuli generated from cancer cells in this region. In addition, upregulation of miRNAs known to play a role in cell proliferation and invasion may contribute to their use as a diagnostic and prognostic marker in CC. Expression analysis in tumor tissue for further studies will be important approaches that will contribute to the development of immune-based therapies.