Primer anti-tüberküloz ilaçlara dirençli ve duyarlı mycobacterium tuberculosis kompleksi izolatlarında ethambutol direnci ile ilişkili EMBA, EMBB ve EMBC gen mutasyonlarının araştırılması
Investigation of EMBA, EMBB and EMBC gene mutations related to ethambutol resistance in mycobacterium tuberculosis complex isolates resistant and susceptible to primary anti-tuberculosis drugs
Yazar: NURBANU YAŞAR
Danışman: DOÇ. DR. SEDA TEZCAN ÜLGER ; PROF. DR. GÖNÜL ASLAN
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antitüberküloz ajanlar = Antitubercular agents ; Ethambutol = Ethambutol ; Gen ifadesi = Gene expression ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; Tüberküloz = Tuberculosis ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Tüberküloz (TB), Mycobacterium tuberculosis kompleksi (MTC)'nin neden olduğu akciğerler, omurga, böbrek ve beyin gibi vücudun diğer kısımlarını da etkileyen bulaşıcı bir hastalıktır. Ethambutol (EMB), TB tedavisinde kullanılan birinci seçenek ilaçlardandır ve tedavide anahtar rol oynayan ilaçlara karşı direnç dünya genelinde artmaktadır. EMB, hücre duvarında bulunan arabinogalaktanın biyosentezini inhibe eden mikobakteriyostatik bir ajandır. EMB direncinden embCAB operonundaki mutasyonlar; özellikle 306, 406 veya 497 kodonlarındaki dirençle ilişkisi doğrulanmış mutasyonlar sorumludur. Bu çalışmada primer anti-TB ilaçlara dirençli ve duyarlı olan MTC izolatlarında EMB direnci ile ilişkili embA, embB ve embC gen bölgelerinde meydana gelen mutasyon paternlerinin araştırılması amaçlandı. 
Çalışmaya EMB'ye dirençli 44 ve tüm ilaçlara duyarlı 20 olmak üzere toplamda 64 adet MTC izolatı dahil edildi. EMB direnci ile ilişkili embA, embB ve embC gen bölgeleri embA1, embA2, embB1, embB2, embB3 ve embC gen bölgelerine özgü spesifik primerler kullanılarak in-house PCR yöntemi ile amplifiye edildi. Elde edilen PCR amplifikasyon ürünleri, işaretli dideoksinükleotidleri içeren "Bigdye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit" (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD) kullanılarak, sense ve antisense zincirlerinin her gen bölgesine özgü primerleri ile "Cycle Sequence" PCR'ı yapıldı. Reaksiyon ürünlerinin elektroforez işlemi "ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer" (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD) otomatize DNA dizi analizi cihazında gerçekleştirildi. Kromatografi şeklinde elde edilen dizi analizi verileri CLUSTALX, GENEDOC ve MEGA 7.0 çoklu sekans analiz programları ile analiz edildi. EMB dirençli izolatların %66 (29/44)'unda embB gen bölgesinde [(306. kodonda; ATG→GTG (n=17, %39), ATG→ATA (n=2, %5), ATG→ATC (n=2, %5) ve ATG→ATT (n=1, %2), 334. kodonda; TAC→CAC (n=1, %2), 354. kodonda; GAC→GCC (n=2, %2), 378. kodonda; GAG→GCG (n=1, %2), 406. kodonda; GGC→TGC  (n=1, %2), 423. kodonda; ATG→ATA, (n=1, %2) ve 521. kodonda; GAG→GCG (n=1, %2)), %5 (2/44)'inde embC gen bölgesinde (270. kodonda ACC→ATC ve 270. kodonda ACC→ATC ile 305. kodonda GAG→GAA), %2 (1/44)'sinde embA gen bölgesinde (330. kodonda CTG→TTG (Leu→Leu)] mutasyon taşıdığı saptandı. embB'deki mutasyonların %50 (22/44)'sinin bu bölgede en sık karşılaşılan mutasyon olan embB 306. kodonda olduğu tespit edildi. EMB duyarlı izolatların ise %5 (1/20)'inde sadece embA gen bölgesinde (180. kodonda GGA→GGC (Glu→Gly)) mutasyon saptandı. 
Sonuç olarak mutasyonların, EMB dirençli MTC izolatlarında sıklıkla embB geninde bulunduğu ve embB 306. kodonda meydana gelen mutasyonların EMB direnci ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Sonuçlarımız dünyanın diğer bölgelerinden bildirilen çalışmaları desteklemektedir. Elde ettiğimiz veriler ülkemizde EMB direncine neden olan embCAB mutasyonlarının aydınlatılmasına ışık tutacaktır.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) that also affects other parts of the body such as the lungs, vertebra, kidneys and brain. Ethambutol (EMB) is one of the first-line drugs used in the treatment of TB, and resistance to drugs that play a key role in treatment is increasing worldwide. EMB is a mycobacteriostatic agent that inhibits the biosynthesis of arabinogalactan found in the cell wall. Mutations in the embCAB operon from EMB resistance; in particular, mutations confirmed to be associated with resistance at codons 306, 406 or 497 are responsible. In this study, aimed to investigate the mutation patterns occurring in the embA, embB and embC gene regions associated with EMB resistance in MTC isolates that are resistant and susceptible to primary anti-TB drugs. 
A total of 64 MTC isolates, 44 resistant to EMB and 20 susceptible to all drugs, were included in this study. EmbA, embB and embC gene regions associated with EMB resistance were amplified by in-house PCR method using specific primers to embA1, embA2, embB1, embB2, embB3 and embC gene regions. The collected PCR amplification products were performed by using the "Bigdye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit" (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) containing the labeled dideoxynucleotides, with the "Cycle Sequence" PCR with primers specific to each gene region of the sense and antisense chains. Electrophoresis of the reaction products was performed on the automated DNA sequencing device of the "ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer" (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sequence analysis data obtained as chromatography were analyzed with CLUSTALX, GENEDOC and MEGA 7.0 multiple sequence analysis programs. It was determined that 66% (29/44) of the EMB resistant isolates carried mutations in the embB gene region [at codon 306; ATG→GTG (n=17, 39%), ATG→ATA (n=2, 5%), ATG→ATC (n=2, 5%) and ATG→ATT (n=1, 2%), at codon 334; TAC→CAC (n=1, 2%) at codon 354; GAC→GCC (n=2, 2%) at codon 378; GAG→GCG (n=1, 2%) at codon 406; GGC→TGC (n=1, 2%) at codon 423; ATA→ATA, (n=1, %2) and at codon 521; GAG→GCG (n=1, 2%)), 5% (2/44) in the embC gene region (at codon 270; ACC→ATC and at codon 305; GAG→GAA), and 2% (1/44) in the embA gene region (at codon 330; CTG→TTG (Leu→Leu)]. It was shown that 50% (22/44) of the mutations in embB were in codon 306 of embB, which is the most common mutation in this region. In 5% (1/20) of EMB susceptible isolates, only the embA gene region (at codon180; GGA→GGC (Glu→Gly)] mutation was detected. 
In conclusion, determined that mutations are frequently found in the embB gene in EMB resistant MTC isolates and mutations occurring in embB codon 306 are associated with EMB resistance. Our findings support studies reported from other parts of the world. The data we obtained will shed light on the embCAB mutations that cause EMB resistance in our country.