İzatin türevlerinin DNA koruma, etkileşim ve antimikrobiyal aktivitesinin analizleri ve seftriakson-fenilalanin kombinasyonunun sinerjistik etkilerinin değerlendirilmesi
Analysis of DNA protection, interaction and antimicrobial activity of isatin derivatives and evoluation of synergistic effects of ceftriaxone-phenylalanine combination
Yazar: MOHAMED ABDULHAMID GANIM RAMADAN
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET CENGİZ BALOĞLU
Kastamonu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
İzatin, tiyosemikarbazon ve türevleri, antimikrobiyal, antiviral ve antikanser tedavileri gibi biyolojik uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, 5-Floro izatin ve 5-Metoksi ve metal kompleksinden oluşan yirmi yedi izatin ve tiyosemikarbazon türevi bileşiği, yeniden sentezlenmiş ve plazmid DNA (pUC19) kullanılarak yapılan DNA koruma çalışmaları ve buzağı timüs DNA (Buzağı Timus DNA, CT-DNA) kullanılarak DNA etkileşimi deneyleri içeren DNA bağlama analizi için değerlendirilmiştir. Tüm bileşikler ayrıca, yirmi bir farklı patojenik bakteri suşuna karşı bileşiklerin antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için in vitro analizde kullanılmıştır. Sentezlenen tüm bileşikler, % 11,7 ila 59,5 oranında DNA koruma etkinliği göstermiştir. Genelde, I3- (N-2-MP) -TSC en büyük DNA koruyucu etkinliğe sahiptir. DNA bağlanma analizi için izatin, tiyosemikarbazon ve bunların türevleri kullanılmış, ancak 5-Floro izatin ve 5-Metoksi kompleksine sahip bileşikler kullanılmamıştır. DNA bağlanma analizi için kullanılan tüm bileşikler aynı sabit konsantrasyona (40 µM) sahiptir ve CT-DNA ile etkileşime girmişlerdir. Ayrıca DNA etkileşimlerinin yüksek bir içsel bağlanma sabiti sağladığı görülmüştür (Kb = 1,72 ×104 M−1 – 9,73 × 105 M−1). Ayrıca, birçok izatin tiyosemikarbazon türevi, düşük konsantrasyonda önemli ve seçici antibakteriyel etkinlik sergilemiştir. Bu bileşikler öncelikle Gram pozitif bakterileri etkilemiştir. Ancak P. vulgaris ve E. coli'ye karşı etki göstermemişlerdir. Gram pozitif metisiline dirençli S. aureus ATCC 43300 (MRSA) bu bileşiklerden en çok etkilenen tür olmuştur. İzatin' deki metilfenil grubunun, MRSA'nin antibakteriyel etkinliği için gerekli olduğu bulunmuştur. Diğer bileşikler, Floro-izatin ve 5-Metoksi ve metal kompleksi ile birleştirilen izatin tiyosemikarbazon, hafif ila orta derecede inhibisyon zonları ile Gram pozitif ve Gram negatif bakterileri inhibe etmiştir. Bazı bileşiklere nikel ve çinko metalleri eklenmiş, ancak bu antimikrobiyal etkinlikleri veya DNA korumalarını arttırmada önemli bir fark yaratmamıştır.

Seftriakson üçüncü kuşak β-laktam antibiyotiklere aittir ve hem Gram pozitif hem de Gram negatif bakterilerin neden olduğu bir dizi bulaşıcı hastalığın tedavisinde faydalıdır. Fenilalanin, dopamin ve norepinefrin nöro-vericilerinin sentezlendiği bir insan için gerekli bir aromatik amino asididir. Bu çalışmada ayrıca, bunların farklı patojenik bakteri suşlarına karşı kombine etkinlikleri incelenmiştir. Bu çalışmanın amacı, K. pneumonia, S. aureus ATCC 25923, P. vulgaris, E. coli, S.marcrescens, S. epidermis, Alfa hemolitik Streptococcus, E. faecium, P. aeruginosa, L. monocytogenes ATCC 7644, E. durans, S. kentucky, E. aerogenes ATCC 13048 ve C. albicans ATCC 26555 olmak üzere hem Gram pozitif hem de Gram negatif bakteriler için Seftriakson Fenilalanin kombinasyonunun antimikrobiyal maddeler üzerindeki etkisini araştırmak için tasarlanmıştır. Bu etki seftriakson ve fenilanin ile disk-difüzyon yöntemi ve minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) ile belirlenmiştir. Daha sonra, 1mM seftriakson ve 1mM fenilalanin çözeltileri karıştırılmış ve yukarıda belirtilen bakteriyel suşlara karşı tek başına seftriakson veya fenilalaninden daha fazla inhibisyon zonu gözlenmiştir. Bu sonuçlar, fenilalaninin seftriakson ile kombinasyon halinde daha iyi antibakteriyel etkisi açısından MİK seviyesinin düşürülmesi, antibiyotiklerin yan etkilerinin ve antibiyotik dirençli bakterilerin ortaya çıkma tehditlerinin azaltılması için yeni bir yol açabilir. Bu çalışmada, fenilalanin ve seftriaksonun bir arada kullanılması, in vitro seçilmiş bazı Gram pozitif ve Gram bakterilere karşı antimikrobiyal duyarlılığın arttığını göstermiştir.

Abstract:
Isatin, thiosemicarbazone and their derivatives, have been widely used in biological applications such as antimicrobial, antiviral and anticancer therapies. Herein, twenty-seven isatin and thiosemicarbazone derivative compounds with 5-Fluoro-isatin and 5-Methoxy and metal complex were re-synthesized and evaluated for DNA binding analysis including DNA protection studies using plasmid DNA (pUC19) and DNA interaction experiments using Calf-Thymus DNA (CT-DNA). All compounds were also utilized in vitro assay to assess the antimicrobial activity of compounds against twenty-one different pathogenic bacterial strains. All the synthesized compounds exhibited DNA protection activity which ranged from 11,7 to 59,5 % DNA protected. In general, among them, I3-(N-2-MP)-TSC had the greatest DNA protective activity. For DNA binding analysis, it was used for the isatin, thiosemicarbazone and their derivatives but not for the compounds with 5-Fluoro-isatin and 5-Methoxy complex. All compounds used for the DNA binding analysis had the same constant concentration (40 µM), which interacts with CT-DNA. It was also observed that DNA interactions gave a high intrinsic binding constant (Kb = 1,72 ×104 M−1 – 9,73 × 105 M−1). Besides, several derivatives of isatin thiosemicarbazone exhibited significant and selective antibacterial activity with low concentration. These compounds primarily affected Gram positive bacteria but were not effective against P. vulgaris and E. coli. The Gram positive methicillin-resistant S. aureus ATCC 43300 (MRSA) was the most influenced strain by these compounds. It was found that methyphenyl group at isatin was essential for its antibacterial activity for MRSA. The other compounds istain thiosemicarbazone combined with Fluoro-isatin and 5-Methoxy and metal complex inhibited Gram positive and Gram negative bacteria with mild to moderate inhibition zones. Some compounds contain nickel and zinc metals but there were no significant for increasing the antimicrobial activities or DNA protections.   

Ceftriaxone belongs to the third-generation β-lactam antibiotics and it is useful for the treatment of a number of infectious diseases caused by both Gram positive and Gram negative bacteria. Phenylalanine is an essential aromatic amino acid of a human being, from which dopamine and norepinephrine neuro-transmitters are being synthesized. In the present study, we examined their combined efficacy against different types of pathogenic bacterial strains. The aim of this study designed to investigate the affect of Ceftriaxone combination with Phenylalanine on antimicrobial activates for both Gram positive and Gram negative bacteria that were including K. pneumonia, S. aureus ATCC 25923, P. vulgaris, E. coli, S. marcrescens, S. epidermis, Alpha haemolytics Streptococcus, E. faecium, P. aeruginosa, L. monocytogenes ATCC 7644, E. durans, S. kentucky, E. aerogenes ATCC 13048 and C. albicans ATCC 26555  were exposed to ceftriaxone and phenylalanine based on disk-diffusion method. Minimum inhibition concentration (MIC) was determined with ceftriaxone. Then 1mM ceftriaxone and 1mM phenylalanine solutions were mixed and observed greater zone of inhibition than ceftriaxone or phenylalanine alone against above mentioned bacterial strains. These results might open up a new avenue for using phenylalanine in combination with ceftriaxone to lower MIC level for better antibacterial effect, to reduce side effects of antibiotics, and to reduce emerging threats of antibiotic resistance bacteria. In this study, the combined use of phenylalanine and ceftriaxone has revealed increased antimicrobial sensitivity against some selected both Gram positive and Gram bacteria in vitro.