Fisetin ve mirisetin flavonoidlerinin Caernorhabditis elegans' ta yaşam uzunluğu ve stres direncine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of fisetin and myricetin flavonoids on lifespan and stress resistance in Caernorhabditis elegans
Yazar: SEREN ÇELİKEL
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET AKİF KILIÇ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Caenorhabditis elegans = Caenorhabditis elegans ; Fisetin = Fisetin ; Flavonoidler = Flavonoids ; Mirisetin = Myricetin ; Reaktif oksijen türleri = Reactive oxygen species ; Yaşlanma = Aging

Özet:
Organizmalar yaşlanırken hücrelerin fonksiyonları azalır ve yaşlanma işaretleri biriktirir. Yaşlanma hemen hemen bütün organizmalarda zamanla oluşan hücre ve doku fonksiyonlarındaki azalmadır, bu süreç içerisinde strese cevap verme yeteneğinde azalma da gözlenir. Yaşlanma biyolojide senesenstir, biyolojik nedenleri hücrelerde DNA hasarı, telomer kısalması, epigenetik faktörler, proteostatik fonksiyon bozukluğu, besin sinyali bozukluğu, kök hücrelerde azalma, vücutta kronik inflamasyon olarak tanımlanmıştır. Hedefli şekilde endojen ve istenilmeyen yan ürün olarak üretilen, ya da dışarıdan maruz kalınan serbest reaktif oksijen ya da nitrojen türlerinin çeşitli tipleri gibi bazı potansiyel tehlikeli moleküller yaşlanma ve hastalığın bilinen sebepleridir. Bu moleküller hem antioksidan enzimler hem de vücutta üretilen küçük moleküller ve dışarıdan alınan vitaminler ve polifenolik bileşikler tarafından nötralize edilmeye çalışılır. Yine de hücrelerde/vücutta oksidatif stres artar, antioksidan kapasite azalır ya da her ikisi birlikte oksidatif stresi arttırır. Vücudun kendi antioksidanlarına ek olarak, dışarıdan alınan vitaminler ya da polifenolik bileşikler yaşlanma ve yaşlanmayla ilişkili hastalıkları önleyen oksidatif stresteki artışı azaltır. Fenolik bileşiklerin flavonoidler grubunda yer alan mirisetin ve fisetin antioksidan etkilere sahip bileşiklerdir. Yaşlanmanın etkilerini azaltan mirisetin ve fisetin gibi doğal antioksidanlar bu alandaki araştırmalarda dikkat çekmektedir. Caenorhabditis elgans en çok tercih edilen in vivo model organizmadır. Çünkü genleri insan genleri aşağı yukarı %44 homoloji gösterir. Yaşam döngüsü kısadır, insanlara benzer yaşlanma işaretleri gösterir ve hızlı deneysel sonuçlar elde edilebilir. 
Bu çalışmanın amacı fisetin ve mirisetinin (polifenollerin flavonoid grubundaki doğal antioksidan etkileri bulunan iki ayrı bileşik), C. elegans in vivo model organizmasında ayrı ayrı ve/veya kombinasyon halinde uygulamak, yaşam beklentisi, sıcaklık stresine cevap, oksidatif strese cevap ve organizmadaki reaktif oksijen türleri seviyesini etkileyip etkilemediğini belirlemektir. Bu kapsamda beş farklı grup oluşturuldu: kontrol grubu, %1 DMSO kontrol grubu ve 100 μM fisetin, 100 μM mirisetin ve 100 μM mirisetin + 100 μM fisetin içeren deney grupları. Her çalışma her deney grubunda üç set halinde çalışıldı. Normal sıcaklık yaşam uzunluğu deneyi C. elegans'ları 20 ºC'de tutarak yapıldı. Sıcaklık stresine cevap deneyinde nematodlar 37 ºC'lik sıcaklığa maruz bırakıldı ve stres indüksiyonu uygulandı. Oksidatif strese cevap deneyinde oksidatif stres oksidan madde paraquat ile indüklendi. Vücuttaki toplam reaktif oksijen türleri seviyesinin belirlenmesi deneyinde foleresans boya kullanıldı. Reaktif oksijen türlerinin zamana karşı artışı flavonoid uygulamasından 24 saat sonra 37 ºC'de ölçüldü.
20 ºC'de gerçekleştirilen yaşam uzunluğu deneyinde yalnızca mirisetin nematodların yaşam uzunluğunu arttırdı. Oksidatif strese tolerans deneyine göre mirisetin + fisetin kombinasyonunun nematodların oksidatif strese toleransını ve yaşam uzunluğunu arttırdığı gözlendi. 37 ºC'de yapılan sıcaklık stresine tolerans deneyinde fisetin ve mirisetin + fisetin gruplarında nematodların ömür uzunluğu arttığı ve mirisetin grubunda ise yaşam uzunluğunun azaldığı bulundu. ROT seviyesi ölçümüne göre bileşiklerin tek başına (mirisetin ve fisetin) uygulanması ya da birlikte (mirisetin + fisetin) uygulanmasının nematodların ROT seviyesini azaltmadığı bulundu.
Mirisetin ve fisetin bileşiklerinin antioksidan özelliklere sahip olduğu bilinmesine rağmen, bu iki flavonoidin birlikte uygulanmasının ve/veya birlikte kullanılmasının antioksidan özelliklerini arttırarak ve/veya yaşlanma süreci ve işaretlerini geciktirme yeteneğine sahiptir. Bu bağlamda mirisetin + fisetin kombinasyonunun mirisetin ve fisetinin ayrı ayrı kullanımından daha çok yaşlanma etkilerini azaltmada daha etkili olduğunu göstermektedir. Bu çalışma beslenmedeki antioksidanların önemini bir kez daha açığa çıkarmıştır. Açıktır ki antoksidanlar sağlıklı yaşam uzunluğunu destekler. Yine de bir antiaging ajan ve insan sağlığı için tedavi edici olarak kullanabilmek için daha yüksek dozlara ihtiyaç duyulabilir. Bu anlamda yaşlanma ve yaşlılıkla ilişkili problemleri azaltmak üzere bu antioksidanları içeren besin destekleri ya da ilaçlar geliştirmek mümkündür.

Abstract:
As organisms age, the function of cells decrease and they accumulate signs of aging. Aging is the gradual decrease in cell and tissue functions that occurs over time in almost all organisms, and a decrease in the ability to respond to stress is also observed in this process. Aging is senescence in biology, its biological causes such as DNA damage in cells, telomere shortening, epigenetic factors, mitochondrial dysfunction, proteostatic dysfunction, nutrient signal dysfunction, decrease in stem cells and increase in chronic inflammation in the body have been defined. Some potentially dangerous molecules, such as various types of free reactive oxygen or nitrogen species that are either produced endogenously by targeted or as undesired by-products, or exposed exogenously, are known causes of aging and disease. These molecules are tried to be neutralized both by antioxidant enzymes and other small molecules which are produced in the body, and by vitamins and polyphenolic compounds are taken from the outside. However, increase in oxidative stress in cells/body, decrease in antioxidant capacity or both increase oxidative stress. In addition to the body's own antioxidants, vitamins or polyphenolic compounds taken from outside help to delay or prevent aging and diseases related to aging by reducing the increase in oxidative stress. Myricetin and fisetin, which are in the flavonoids group of polyphenolic compounds, are compounds with antioxidant effects. As natural antioxidants such as myricetin and fisetin reduce the effects of aging, interest in studies in this area is increasing. Caenorhabditis elegans is the most preferred in vivo model organism because its genes show approximately 44% homology with human genes, its life cycle is short, it shows signs of aging similar to humans, and rapid experimental results can be obtained. 
The aim of this study is to investigate whether fisetin and myricetin (which are two separate compounds with natural antioxidant effects in the flavonoids group of polyphenols), applied separately and/or in combination, increases life expectancy, thermal stress response and oxidative stress response in C. elegans in vivo model organism and whether they also affect the reactive oxygen species levels. In this context, 5 different groups were formed: a control group, a 1% DMSO control group, and 100 μM fisetin, 100 μM myricetin and 100 μM myricetin + 100 μM fisetin containing experimental groups. Each experimental group was studied in three sets in each study. The normal temperature longevity experiment was carried out by keeping the C. elegans culture at 20 °C. In the temperature stress response experiment, the nematodes were placed in 37 °C environment and thus stress induction was achieved. In the oxidative stress response experiment, oxidative stress was induced by the oxidant substance paraquat. In the experiment of determining the level of total reactive oxygen species in the body by fluorescent dye, the increase in reactive oxygen species against time was measured at 37 °C after 24 hours of flavonoid administration.
In the lifespan experiment performed at 20 °C, it was found that only myricetin increased the longevity of the nematodes. According to the oxidative stress tolerance experiment, it was observed that the combination of myricetin + fisetin increased the tolerance of nematodes to oxidative stress and therefore, the lifespan of the nematodes. According to the temperature stress tolerance tested at 37 ºC, it was observed that the lifespan of nematodes in the fisetin and myricetin + fisetin groups increased, while the lifespan decreased in the myricetin group. According to the ROT level measurement, it was found that the application of the compounds alone (myricetin and fisetin) or together (myricetin + fisetin) did not contribute to the reduction of nematodes' ROT levels.
Although it is known that myricetin and fisetin compounds have antioxidant properties, it is not known whether the co-administration and/or use of these two flavonoids has the ability to increase their antioxidant properties and/or delay the aging process and its signs. In this regard, this is the first study shows that combined use of myricetin + fisetin is more effective in reducing the effects of aging than the use of myricetin and fisetin separately. This study reveals the importance of antioxidants in nutrition once again. It is clear that antioxidants support healthy life span. However, to be able to use as an antiaging agent and therapeutic for human health, higher amounts may be needed. In this context, it is possible to develop nutritional supplements or drugs containing these antioxidants in order to reduce aging and aging-related problems.