Yeni tanı multipl miyelom hastalarında kemik iliğinde cd4+cd25+ foxp3+ pd-1+ regülatör t hücrelerin düzeyinin ve pd-1, pd-l1 mrna ifadesinin araştırılması
Investigation of the level of cd4 + cd25 + foxp3 + pd-1 + regulator t cells and pd-1, pd-l1 mrna expression in bone marrow in new diagnosis multiple myeloma
Yazar: DENİZ EKİNCİ
Danışman: PROF. DR. AYSUN ÖZKAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Multipl miyelom (MM) habis bir plazma hücre kanseridir. Yeni tedavi seçenekleri ve kök hücre nakline rağmen hemen hemen her zaman hastalarda nüks gelişir. Gerek yeni tanı MM gerekse tedavi almış MM hastalarında regülatör T hücre (Treg) artışı kötü klinik seyir ile ilişkilendirilir. Tregler immün yanıtı baskılayan bir T hücre alt popülasyonudur. Programlanmış hücre ölümü proteini 1 (PD-1) sinyal yolağı Treg gelişimi ve fonksiyonunda önemli rol oynar. PD-1 bir immün kontrol noktası olarak kabul edilir ve hem antijene spesifik T hücrelerinde apoptoz indüklenmesi hem de Treg hücrelerinde apoptozu inhibe etme yoluyla otoimmün tepkilere karşı korur. MM'da PD-1 ve ligandı PD-L1'e yönelik inhibitör ilaçların kullanıldığı klinik çalışmaların sayısı hızla artmaktadır. MM'da bu klinik çalışmaların varlığına karşın kemik iliği mikroçevresinde Treg hücrelerinin dağılımı konusunda bilgiler yetersizdir. Çalışmada MM hastalarında kemik iliğindeki PD1+ Treg hücre dağılımları ve PD1/PD-L1 genleri ifade seviyelerinin incelenmesi amaçlanmıştır.
Çalışmada yeni tanılı 20 MM olgusu ve kontrol grubu olarak idyopatik trombositopenik purpura (İTP) ile takip edilen 9 olgu değerlendirilmiştir. Kemik iliği örneklerinden fikol ayrıştırma yöntemiyle elde edilen mononükleer hücrelerde CD4, CD25, Foxp3 ve PD1(CD279) proteinlerinin ifadesi akış sitometri yöntemiyle incelenmiştir. PD1 (PDCD1) ve PD-L1 (CD274) genleri mRNA ifadelerinin belirlenmesi amacıyla kemik iliği örneklerinden silika kolon yöntemi ile total RNA elde edilmiştir. Reverse transkriptaz PCR ile mRNA'dan cDNA sentezlenmiş ve kantitatif PCR yöntemi kullanılarak hedef genlerin göreli ifade seviyeleri belirlenmiştir.
Çalışmada MM hastalarında PD-1 ve PD-L1 mRNA ifade seviyeleri daha yüksek düzeyde bulunmuştur. MM hastalarında CD4+CD25+FoxP3+PD-1+ Treg hücreleri (%) ölçümleri daha yüksek düzeyde tespit edilmiştir. Hastaların evrelerine göre CD4+CD25+FoxP3+PD-1+ Treg hücreleri (%) ve PD-1 mRNA ölçümlerinin farklı düzeylerde olmadığı görülmektedir. Hastaların evrelerine göre PD-L1 mRNA ölçümlerinin farklı düzeylerde olduğu ve farkın evre I olan hastaların PD-L1 mRNA ölçümlerinin Evre II ve III hastalarına göre daha yüksek düzeylerde olmasından kaynaklandığı görülmüştür.
Bu çalışma yalnızca hasta tedavisinde terapötik seçeneklere kılavuzluk ettiği için değil aynı zamanda da bu ilaçlarla tedavi edilen hastalarda alınan yanıtı güçlendirme stratejilerini bulmak açısından da önemlidir.
ANAHTAR KELİMELER: Multipl miyelom, PD-1, PD-L1, Treg

Abstract:
Multiple myeloma (MM) is a cancer that plasma cells. In almost all patients may be develop relaps although new treatment options and stem cell transplantation. Increased regulatory T cell (Treg) has been associated with poor clinical outcome in which both newly diagnosed and treated MM patients. Treg cells are a T cell subgroup that suppressing immune response. Programmed cell death protein 1 (PD-1) signalling pathway play essential role in Treg function and development. PD-1 is accepted as an immune check point which protects against autoimmune responses by both inducing apoptosis in antigen-specific T cells and inhibiting apoptosis in Treg cells. In literature knowledge is insufficient about Treg cell distribution in the bone marrow microenvironment despite the presence of these clinical studies in MM. In this study, we aimed to investigate PD1+ Treg cell distribution and PD1/PD-L1 gene expression levels in MM patients bone marrow.
In the study, twenty patients newly diagnosed MM cases and as control group nine patients with Idiopathic thrombocytopenic purpura (İTP) were included. Mononuclear cells were isolated from bone marrow by using density gradient centrifugation method. CD4, CD25, Foxp3 and PD1(CD279) protein expressions were evaluated flow cytometry on mononuclear cells. In order to determine mRNA expression of PD1 (PDCD1) and PD-L1 (CD274) genes, total RNA was obtained from bone marrow samples by silica column method. cDNA has been synthesized from mRNA through reverse transcriptase PCR. The relative expression levels of target genes were determined using the quantitative PCR method. 
The study, PD-1 and PD-L1 mRNA expressions were higher in MM patients. CD4+CD25+FoxP3+PD-1+Treg cells (%) measurements were found to be higher in MM patients. CD4+CD25+FoxP3+PD-1+ Treg cell (%) and PD-1 mRNA levels were not being show difference according to stage of patients. PD-L1 mRNA expressions were different according to the stage of the patients and the difference was due to the higher levels of PD-L1 mRNA expression of the stage I patients compared to Stage II and III patients.
This study is important not only because it guides therapeutic options in patient treatment, but also in finding strategies to enhance response in patients treated with these drugs.

KEYWORDS	: Multiple myeloma, PD-1, PD-L1, Treg