Clostridium difficile'nin laboratuvar tanısında farklı algoritm şemalarının değerlendirilmesi
Evaluation of different algorithm schemes in laboratory diagnosis of Clostridium difficile
Yazar: GÜLAY ŞİMŞEK
Danışman: PROF. DR. BETİGÜL ÖNGEN
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Clostridium difficile = Clostridium difficile

Özet:
Amaç: C. difficile, Gram pozitif, zorunlu anaerop, sporlu bir bakteridir. Toksinleriyle etkili olan bu bakteri, antibiyotikle ilişkili ishalden psödomembranoz enterokolite kadar geniş bir yelpazede hastalıklara yol açabilmektedir. Son yıllarda C. difficile'nin yol açtığı salgınlar ve hastalığın prevalansındaki artışa paralel olarak tanıda kullanılan yöntemler yeniden gözden geçirilmeye başlanmıştır. Uzun yıllardır altın standart olarak kabul edilen laboratuvar yöntemlerinin yerini farklı yöntemler almaya başlamış ve tanıda birkaç aşamalı farklı algoritma şemalarının kullanılması önerilmiştir. Ancak hızlı, düşük maliyetli ve doğru laboratuvar tanısı için en uygun strateji hala tartışmalıdır. Bu çalışmada, toksin araştırılması istenen C. difficile kuşkulu hastalara ait dışkı örneklerinin son yıllarda önerilen algoritmik yaklaşımlar temelinde farklı yöntemlerle incelenmesi ve bu yöntemlerin rutin laboratuvarda uygulanabilirliği, hızı, maliyet etkinliği ve sonuçları açısından değerlendirilerek koşullarımıza en uygun algoritm şemasının belirlenmesi amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntemler: Mart 2013 – Mart 2014 tarihleri arasında İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Bakteriyoloji Laboratuvarı'na C. difficile toksin incelenmesi amacıyla gönderilen 479 hastaya ait dışkı örneği çalışmaya dahil edilmiştir. Örnekler ilk aşamada tarama amacıyla glutamat dehidrogenazı saptayan GDH EIA testi ile çalışılmıştır. Sonraki aşamada GDH EIA ile pozitif sonuç alınan örneklere toksin A ve B'nin saptanmasına yönelik EIA ve toksin genleri varlığının araştırıldığı real time PCR yöntemleri uygulanmış ayrıca toksijenik kültür yapılmıştır. C. difficile pozitifliği saptanan hastalar antibiyotik kullanımı, yaş, altta yatan hastalık gibi farklı predizpozan faktörler açısından değerlendirilmiştir.
Bulgular: Bu çalışmada C. difficile pozitifliği %6 oranında saptanmıştır. İncelenen 479 hastanın 52 (%10.9)'sinde GDH EIA testi pozitif bulunmuştur. GDH pozitif örneklerin toksin A/B EIA testi ile 12 (%23.1)'si, realtime PCR yöntemi ile 29 (%55.8)'u pozitif sonuç vermiştir. Toksijenik kültürü yapılan 52 örneğin 21'inin kültüründe Clostridium cinsi bakteri üretilmiş ve bunların 13 (%25)'ü toksin oluşturan C. difficile olarak identifiye edilmiştir. PCR yöntemi ile alınan pozitif sonuç oranı EIA ve toksijenik kültür yöntemine göre daha yüksek bulunmuştur (p<0.01). C. difficile pozitifliği saptanan hastalarda ribotip 027 geninin varlığına rastlanmamıştır. Toksijenik C. difficile pozitifliği saptanan toplam 29 hastanın 26 (%89.7)'sının antibiyotik tedavisi altında olduğu ve bunların %92.3'ünün beta-laktam ve/veya beta-laktam/beta-laktamaz inhibitörlü bir antibiyotik kullandığı belirlenmiştir. C. difficile pozitif bulunan hastaların %86.2'sinin altta yatan predispozan bir hastalığı mevcut olup hastaların %24.1'inin 65 ve üzeri, %62'sinin 40 yaş ve üzerinde (40-85) olduğu görülmüştür.
Sonuç: Çalışmamızda elde edilen sonuçlara göre, pozitiflik oranları yanında testlerin rutin olarak uygulanabilirliği, rapor çıkarma süresi ve ayrıca yöntemlerin performans özellikleri ve maliyetleri de göz önüne alındığında, ilk aşamada dışkı örneklerinde GDH taramasının yapılması ve ikinci aşama olarak GDH pozitif bulunan örneklerde real time PCR yöntemi ile toksin geni araştırılmasının C. difficile ile ilişkili infeksiyonun rutin laboratuvar tanısında en yüksek poztif sonucu veren, pratik, hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşım olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Objective: C. difficile is a Gram positive, obligate anaerobic, spore-forming bacterium. This bacterium, which is effective through toxins, can lead to a wide range of diseases from antibiotic-associated diarrhea to pseudomembranous enterocolitis. In recent years, the methods used in the diagnosis have begun to be re-examined in parallel with the increase of the outbreaks and in the prevalence of the disease caused by C. difficile. Laboratory methods that have been accepted as gold standard for many years have been replaced with different methods and various algorithm schemes that are consisting of several steps have been proposed. However, the best strategy for rapid, cost effective and accurate laboratory diagnosis is still controversial. The aim of the study is investigation of stool samples from patients with suspected C. difficile infection with different methods, based on the algorithmic approaches proposed in recent years, and to determine the most appropriate algorithm scheme for our condition by evaluating these methods in terms of applicability in routine laboratories, speed, cost effectiveness and results.
Materials and methods: Between March 2013 and March 2014, stool samples of 479 patients submitted for C. difficile toxin detection to İstanbul Faculty of Medicine, Medical Microbiology Department, Bacteriology Laboratory were included in the study. In the first step, samples were run with GDH EIA test for screening, which detects glutamate dehydrogenase enzyme. EIA for the detection of toxin A and B and real-time PCR methods were performed to positive samples with GDH EIA method, and also toxigenic culture was performed. Patients, detected positive for C. difficile, were evaluated for different predisposing factors such as antibiotic usage, age, underlying disease.
Results: C. difficile positivity was detected as 6% in this study. Fifty-two out of 479 (10.9%) patients were detected positive with GDH EIA test. Twelve (23.1%) and 29 (55.8%) of the GDH positive samples were detected positive with toxin A/B EIA and realtime PCR methods, respectively. Clostridium bacteria was detected at the genus level in 21 out of 52 toxigenic cultures and 13 (25%) of them were identified as toxin producing
C. difficile. The positive result rate detected with PCR method was higher than EIA and toxigenic culture methods (p<0.01). Ribotype 027 gene was not detected in the C. difficile positive patients. It is determined that 26 (89.7%) out of 29 toxigenic C. difficile positive patients were under antibiotic therapy and 92.3% of them were treated with beta-lactam antibiotics and/or beta-lactam and beta-lactamase inhibitor combinations. Eighty-six point two%of C. difficile positive patients had an underlying predisposing disease, 24.1% of patients were 65 and older, 62% of them were 40 years or older (40-85).
Conclusion: According to our results, in addition to the positivity rates, when the routine applicability of the tests, the duration of the report and also the performance characteristics and costs of the methods are considered, GDH screening at the first step and investigation of toxin gene with real time PCR to GDH positive samples at the second step is the algorithm approach with the highest positivity rate, practical, fast and cost effective.