İyon kanallarını inhibe etme özelliğine sahip ilaçların sperm kalitesi üzerine moleküler genetik etkileri
Molecular genetic effects of drugs having the feature of ion channel inhibition on sperm quality
Yazar: AHMET TEKTEMUR
Danışman: DOÇ. DR. EBRU ÖNALAN
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Diltiazem = Diltiazem ; Karbamazepin = Carbamazepine ; Klomipramin = Clomipramine ; Kısırlık-erkek = Infertility-male ; Mikro RNA = Micro RNA ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Sperm = Spermatozoa ; Verapamil = Verapamil ; İnhibitör = Inhibitor ; İyon kanalları = Ion channels

Özet:
Hücre zarında yer alan Ca+2, K+, Cl-, Na+ vb. geçirgen iyon kanalları; sperm hareketliliği, flagella lokalizasyonu, sperm-oosit penetrasyonu, akrozom reaksiyonu gibi birçok mekanizmada görev almaktadır. Yapılan çalışmalar anksiyete, epilepsi, ağrı ve hipertansiyon gibi hastalıkların tedavisinde kullanılan iyon kanal inhibitör etkili ilaçların fertilizasyonu ve sperm işlevini engellediğini göstermektedir. Mevcut çalışmada, iyon kanal inhibitörü olan Klomipramin, Karbamazepin, Verapamil ve Diltiazem adlı ilaçların sıçanlarda spermiyogram, hormon profili, testis dokusu ve sperm hücrelerindeki miRNA, iyon kanal ve sperm kalitesini belirleyen gen ifadeleri üzerine etkilerinin moleküler/genetik düzeyde araştırılması amaçlandı.       
Çalışmada toplam 90 adet erkek Wistar albino cinsi sıçan her grupta 15 hayvan olacak şekilde kontrol, sham (distile su 1 ml / gün), Karbamazepin (25 mg / kg / gün), Klomipramin (10 mg / kg / gün), Verapamil (3.4 mg / kg / gün) ve Diltiazem (2.57 mg / kg/ gün) olmak üzere 6 ana gruba ayrıldı. Uygulamalar oral gavaj ile toplam 60 gün yapıldı. Kullanılan ilaçların sperm motilite, morfoloji, sayı ve akrozom bütünlüğü üzerine etkilerinin belirlenmesi için spermiyogram analizi, hormon profillerinin belirlenmesi için ELISA, doku düzeyinde hasar tespiti için hematoksilen – eozin boyaması ve gen ifadelerinin belirlenmesi için qRT-PCR yöntemi kullanıldı. qRT-PCR'da anlamlı mRNA kat değişimi tespit edilen gen ifadelerinin protein düzeyinde doğrulanması için immünreaktivite analizi uygulandı. 
İyon kanal inhibitörlerinin folikül stimüle edici hormon, prolaktin, östradiol ve testosteron düzeylerinde artışa yol açtığı belirlendi. Özellikle Karbamazepin ve Diltiazem'in sperm parametrelerini olumsuz etkilediği gözlendi. Buna karşın tüm veriler açısından değerlendirildiğinde fertilite üzerine Klomipramin'in daha çok olumlu etkiler gösterdiği ortaya kondu. Testis örneklerinde iyon kanal inhibitör uygulamalarının KCNJ11 ve TRPV5 gen ifade düzeylerinde azalmaya, CATSPER1 ve rno-let-7a gen ifade seviyelerinde ise artışa neden oldukları gözlendi (p < 0.05). Bu ilaçların sperm örneklerinde ise TRPM3 mRNA ve rno-miR-92a gen ifade seviyelerinde azalmaya, CFTR mRNA ve rno-mir-27a gen ifade seviyelerinde ise artışa yol açtığı belirlendi (p < 0.05).
İyon kanal inhibitörlerinin fertilite üzerindeki etkilerinin moleküler mekanizmaları hala tam olarak ortaya konmamış olsa da literatürde yer alan veriler ve mevcut çalışmadan elde edilen bulgular iyon kanalları ve miRNA'ların bu süreçte önemli bir rolü olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Ca+2, K+, Cl-, Na+, etc. permeable ion channels, located in the cell membrane, are involved in many mechanisms such as sperm motility, flagella localization, sperm-oocyte penetration, acrosome reaction. Studies have shown that ion channel inhibitor drugs used in the treatment of diseases such as anxiety, epilepsy, pain and hypertension inhibit fertilization and sperm function. The aim of this study was to investigate the effects of ion channel inhibitors such as clomipramine, carbamazepine, Verapamil and Diltiazem drugs, on spermiogram, hormone profile and gene expressions determining miRNA, ion channel and sperm quality in testicular tissue and sperm cells at molecular / genetic level.
A total of 90 male Wistar albino rats were divided into 6 main groups, 15 animals in each group, control, sham (distilled water 1 ml / day), carbamazepine (25 mg / kg / day), clomipramine (10 mg / kg / day), Verapamil (3.4 mg / kg / day) and Diltiazem (2.57 mg / kg / day). The treatments were performed by oral gavage for a total of 60 days. Effects of ion channel inhibitors on spermatologic parameters were evaluated by spermiogram analysis, on hormone profiles by ELISA, at tissue level by hematoxylin-eosin staining and gene expression by quantitative qRT-PCR. Immunoreactivity analysis was performed to confirm gene expression at the protein level where significant mRNA fold change was detected in qRT-PCR.
It was determined that ion channel inhibitors increased follicle stimulating hormone, prolactin, estradiol and testosterone levels. It was observed that carbamazepine and Diltiazem negatively affect sperm parameters. However, when evaluated in terms of all data, it was found that clomipramine had more positive effects on fertility. It was determined that ion channel inhibitor treatments caused a decrease in KCNJ11 and TRPV5 gene expression levels and an increase in CATSPER1 and rno-let-7a gene expression levels in testis samples (p < 0.05). It was also detected that TRPM3 mRNA and rno-miR-92a gene expression levels decreased in sperm samples and CFTR mRNA and rno-mir-27a levels increased (p < 0.05).
Although the molecular mechanisms of the effects of ion channel inhibitors on fertility have not yet been fully elucidated, data from the literature and findings from the present study suggest that ion channels and miRNAs play an important role in this process.