Mikrorna'ların hashimoto tiroiditi'ndeki rolü
The role of mikrornas in hashimoto thyroiditis
Yazar: HALE ÖNDER YILMAZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ALPER HAN ÇEBİ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Hashimoto hastalığı = Hashimoto disease ; Mikro RNA = Micro RNA ; Otoimmünite = Autoimmunity ; RNA = RNA ; Tiroid bezi = Thyroid gland ; Tiroid hastalıkları = Thyroid diseases ; Tiroidit = Thyroiditis ; İmmünogenetik = Immunogenetics

Özet:
MikroRNA (miRNA) 'lar son yıllarda ortaya çıkan, 18-24 nükleotid uzunluğunda küçük kodlama yapmayan (noncoding) ve büyük bir çoğunluğu hücre içinde bulunmakla birlikte ekstrasellüler alanda, vücut sıvılarında ve kanda bulunabilen RNA molekülleridir. miRNA'lar hücre proliferasyonu, farklılaşması, metabolik süreçler, apopitoz, inflamasyon ve immünolojik süreçlerin düzenlenmesi gibi yolaklarda düzenleyicidirler. Çeşitli çalışmalarda yapılan gözlemler, insan plazmasında bulunan miRNA'ların yüksek bir stabiliteye sahip olduğunu ve bu örneklerde yapılan miRNA ekspresyon kalıbı analizinin çeşitli hastalıkların durumları hakkında yararlı bilgiler sunabileceğini ortaya koymuştur. miRNA'ların solid dokulardan elde edilen örneklere ek olarak hasta serum/plazmasında da belirlenebilmesi, tanısında mutlaka girişimsel tekniklerin  kullanılmasını gerektiren hastalıklarda oldukça kolay bir örnek eldesini  sağlar. Potansiyonel olarak gen veya protein sentez bozukluğu aracılı her hastalık, hücre tipi veya doku tipi miRNA tabanlı hedefleri oluşturabilirler. miRNA'lar gelişimsel açıdan mesajcı RNA'ların protein üretmesini düzenleyici rol üstlendiğinden, terapötik açıdan önemli olmalarını sağlamaktadır. 
          Hashimoto Tiroiditi (HT), T ve B lenfositlerin tiroid dokusunu istila ederek parçalaması sonucu Anti-TPO ve Anti-TG antikorlarının üretimi ile karakterize bir hastalıktır. En yaygın görülen otoimmun ve endokrin hastalıklardan birisidir. 
         miRNA'ların immün sistemi kontrol etmede önemli bir yeri olduğunu son yıllarda yapılan bilimsel çalışmalar açıkça göstermektedir. HT'de bunu tiroid dokusuna infiltre olan lenfositleri aktive ederek yaptıkları düşünülmektedir. Bu sebeple sirkülatuar miRNA'nın tanımlanması hastalığın kliniği ve patogenezinde önemli ve yeni bilgiler sağlayabilir. 
          Hashimoto Tiroiditi'nde yeni tanı anında ve aynı hastaların ötroid dönemdeki miRNA profili bu güne kadar henüz çalışılmamış bir konudur. Biz de bunu göz önünde bulundurarak TSH'ın yüksek olduğu tanı anında ve aynı hastaların ötroid oldukları kontrol dönemindeki miRNA ekspresyon düzeylerini belirleyip sağlıklı kontrol grubu ile aralarında ekspresyon düzeyi açısından bir fark olup olmadığını tespit etmeyi amaçladık. Çalışmamız ile HT'nin şimdiye dek tam olarak aydınlığa kavuşamamış olan patogenezine yeni bir bakış açısı sunarak hem literatüre katkı yapmayı planlıyoruz; hem de bu yeni bakış açısının HT güncel tedavisine yeni ufuklar açmasını bekliyoruz.
         Çalışmamızda Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı'na bağlı Endokrinoloji Polikliniği'ne gelen ve yeni tanı Hashimoto Tiroiditi olup TSH değerleri yüksek olan 34 hastadan tanı anında ve 3 ay sonra ötroid oldukları dönemdeki halleri ile endokrinoloji polikliniği'nde yapılan muayene ve tetkikler sonucu herhangi bir sağlık problemi tespit edilmeyen, hasta grubu cinsiyet ve yaşı ile uyumlu 33 gönüllü birey çalışmaya dahil edilmiştir. Hasta ve sağlıklı bireylerden EDTA'lı kan örnekleri alınmıştır. Plazmada eksprese olduğu bilinen ve otoimmunite ile ilişkisi daha önceki çalışmalar ile ortaya konmuş 5 farklı miRNA'nın (mir-22, miR-141, miR-155, miR-375, miR-451) ekspresyon düzeyleri hasta ve kontrol grubunda çalışılmıştır.
Hasta ve kontrol grupları arasındaki miRNA ekspresyon düzeylerinin kantitatif olarak belirlenmesi amacıyla RT-PCR verileri Qiagene Gene Globe Veri Analizi Merkezi portalı ΔΔCt modülü kullanılarak analiz edilmiştir. (http://www.qiagen.com/us/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page/). Veri normalleştirmek için yine aynı analiz merkezinde bulunan "Global CT Mean Of expressed miRNAs" kullanıldı. Gruplar arasındaki miRNA ekspresyon düzeyleri arasındaki ilişkisi Student T testi ile analiz edildi (p<0.05 anlamlı olarak kabul edildi). Hasta grubun ilk tanı anı ve üç ay sonraki kontrol dönemi arasındaki TSH ve miRNA ekspresyon düzeyi arasındaki ilişki Spearman korelasyon analizi ile hesaplanmıştır. Veriler IBM SPSS Statistics for Windows 23.0 istatistik paket programında analiz edilmiştir.
          Yapmış olduğumuz bu çalışma plazmadaki sirkülatuvar miRNA'ların otoimmun bir hastalık olan HT'de hastalık aktivitesi ile ilişkili olabileceğini ortaya koymaktadır. Özellikle miR-451'in gen ekspresyonunda yeni tanı anındaki TSH'ı normal sınırın üzerinde olan hasta grubunda, sağlıklı kontrol grubuna göre 1,495 kat artış (p=0,434) saptanması; bununla birlikte hastaların tedavi sonrası TSH değerlerinin normale döndüğü kontrol döneminde sağlıklı kontrollere göre aynı genlerin ekspresyonunda 0,545 kat azalma (p=0,042) gözlenmesi ve hasta grubunun kendi arasındaki karşılaştırmasında da TSH'ın yüksek olduğu dönemde normal olduğu döneme göre miR-451 gen ekspresyonları arasında  2,74 katlık artış (p= 0,00262) tespit edilmesi miR-451'in hastalık aktivitesi ile yakından ilişkili olduğunu düşündürmektedir. 
          Otoimmun bir hastalık olan HT, patogenezi hala aydınlatılamamış bir hastalıktır. miRNA'ların son yıllardaki hastalık patogenezlerindeki önemli etkilerinin ortaya konması ile birçok hastalık patogenezi aydınlatılmış, tedavi alternatifleri sunulmuştur. Bizim çalışmamız ile ortaya konulan sonuçlar ışığında HT patogenezini aydınlatmada ve yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesinde öncülük edecektir.

Abstract:
microRNAs (miRNAs) are small noncoding 18 to 24 nucleotides long RNA molecules, that have emerged in recent years. Most of miRNAs are found in the cells but they can be found extracellular area, body fluids and blood. miRNAs are regulatory in processes such as cell proliferation, differentiation, metabolic processes, apoptosis, inflammation and regulation of immunological processes. Observations made in various studies have shown that miRNAs found in human plasma have high stability and miRNA expression pattern analysis performed in these samples may provide useful information on the status of various diseases. In addition to the samples which are obtained from solid tissues, miRNAs can also be determined in patient serum / plasma, providing a fairly easy sampling of diseases that require the use of invasive techniques. Any disease, cell type or tissue type mediated by gene or protein synthesis deficiency may constitute miRNA-based targets. miRNAs are developmentally important because they have a regulatory role in the production of protein by messenger RNAs, which is therapeutically important. 
          HT is one of the most common autoimmune and endocrine disease which characterized by the production of Anti-TPO and Anti-TG antibodies, which result in the breakdown of T and B lymphocytes by invading thyroid tissue. Scientific studies in recent years show that miRNAs have an important role in controlling the immune system. It is thought that HT activates lymphocytes that infiltrate the thyroid tissue. Thus, identification of the circulatory miRNA may provide important and novel information in clinical situations and disease pathogenesis.
         At the time of new diagnosis in Hashimoto thyroiditis and euthyroid period of the same patients' miRNA profile has not been studied yet. We therefore aimed to determine the miRNA expression levels at the time of new diagnosis and control period when the same patients were euthyroidized and to determine whether there is a difference in expression level between healthy control group and the patients' expression level. We are planning to make a contribution to the literature by presenting a new perspective on the pathogenesis of HT  that has not yet fully attained enlightenment; And we expect that this new perspective will open new horizons to current HT treatment.
          We took blood from 34 patient who were diagnosed as Hashimoto thyroiditis newly who came to the Endocrinology Polyclinic in Karadeniz Technical University Medicine Faculty, and were taken blood again 3 months after when they were euthyroid. And blood samples were taken in tube with EDTA from 33 voluntary individuals who were in agreement with the gender and age group of the patients who did not have any health problems after the examinations performed at the endocrinology polyclinic. Expression levels of 5 different miRNAs (mir-22, miR-141, miR-155, miR-375, miR-451) which were known to be connected autoimmunity were revealed by previous publications were studied in the patient and control group. 
          To quantitatively determine miRNA expression levels between patient and control groups, RT-PCR data were analyzed using the Qiagene Gene Globe Data Analysis Center portal ΔΔCt module (http://www.qiagen.com/us/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page/). In order to normalize the data, "Global CT Mean of expressed miRNAs" was used in the same analysis center. Relation of expression levels between groups was also determined by the system by the Student T test and p <0.05 was considered significant. Qualitative data are number and percentage; Measured data are presented with mean standard deviation and minimum maximum values. The relationship between TSH and miRNA expression level between the first diagnostic moment of the patient group and the control period after 3 months was calculated by Spearman correlation analysis. The data were analyzed in IBM SPSS Statistics for Windows 23.0 statistical package program. 
         The conclusion of our study is that circulating miRNAs in different levels of plasma may be associated with disease activity in HT. Specifically, the gene expression of miR-451 was found to be 1,495 fold increase (p = 0.423) in group H compared to group S; In the N group, there was a 0.545 fold decrease (p=0,042) in the expression of the same genes according to the S group and we found 2,74 fold increase (p= 0,00262) between expression levels of mir-451 in H group compared to N group. These findings suggest that  miR-451 is closely related to disease activity.
         HT is an autoimmune disease and its pathogenesis is still unknown. Many of the pathogenesis of the disease has been clarified and treatment alternatives are presented by introducing the important effects of miRNAs on the disease pathogenesis in recent years. The results of our study will lead to clarify HT pathogenesis in light and to develop new therapeutic approaches.