Salinomisin ve BnHAp yüklü doku iskelelerinin antikanserojen ve antibakteriyel etkinliğinin araştırılması
Investigation of anticancerogen and antibacterial effectiveness of salinomycin and BnHAp loaded tissue scaffolds
Yazar: MELTEM GAMZE ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Tez kapsamında, antikanserojen bir ilaç olan salinomisin yüklü poli (laktik-ko-glikolik asit)
(PLGA 65:35) nanopartiküller ile hidroksiapatite katkılanmış antibakteriyel etkinliğe sahip olan borun sinerjik etkisinin incelenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla salinomisin yüklü PLGA nanopartiküllerin sentezlenmesinin ardından karakterizasyon çalışmaları yapılmış ve in-vitro salım çalışmaları yürütülmüştür. Bor katkılı hidroksiapatit (BnHAp) varlığında salinomisin yüklü PLGA nanopartiküller ile hücre kültür ve bakteri kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
Emülsiyon hazırlama-çözücü buharlaştırma tekniği ile %2.5 (w/v) salinomisin içeriğine
sahip PLGA nanopartiküller üretilmiştir. Üretilen boş ve salinomisin yüklü PLGA
nanopartiküller (PLGA-SAL) sırası ile 185.8 nm ve 187.4 nm ortalama çapa sahiptir.
Sentezlenen PLGA-SAL nanopartiküllerin enkapsülasyon verimleri HPLC cihazı ile yapılan ölçümlere göre ortalama %97.4±1.87 olarak hesaplanmıştır. PLGA-SAL nanopartiküllerden fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ortamında in-vitro salım çalışmaları yürütülmüş olup salinomisin salımı 1. saatte ani patlama etkisi göstererek %43 değerine ulaşmıştır. Kontrollü ve düzenli artış göstererek devam eden PLGA nanopartiküllerden
salinomisin salımı 45. günün sonunda %100'e ulaşmıştır. Daha sonra, üretimleri sırasında yapısına PLGA-SAL nanopartiküller ve bor katkılı hidroksiapatit (BnHAp) katılan kitosan doku iskeleleri ile iskeleden salım çalışması gerçekleştirilmiş olup ilk 24 saatte ani patlama etkisi ile salinomisinin %44'ü salınmıştır. Salımın tamamlanması yaklaşık olarak
59 gün sürmüştür. Hem partikülden hem de iskeleden salinomisin salımının Hixson-
Crowell salım kinetik modeline uyduğu belirlenmiştir.
Çalışmaların ikinci aşamasında, MG-63 osteosarkom hücreleri ile hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla kontrol grubu (MG-63 hücreleri), salinomisin, boş PLGA nanopartiküller, PLGA-SAL nanopartiküller, PLGA-SAL/BnHAp ve PLGASAL/nHAp gruplarına yer verilmiştir. Hücre kültür çalışmaları süresince hücre canlılıkları canlı-ölü boyama analizi ile, hücre iskeleti organizasyonu Alexa Fluor/DAPI boyamayla ve nanopartiküllerin hücre içi alımları kristal viyole boyama yapılarak incelenmiştir. PLGASAL
nanopartiküllerin optimum doz olarak seçilen 0.2 mg miktarında kullanıldığında MG-
63 osteosarkom hücrelerini apoptoza götürdüğü görülmüştür. Bununla birlikte; nHAp'ın
MG-63 hücreleri üzerindeki proliferasyonu destekleyici etkileri sebebiyle BnHAp ve nHAp içeren gruplarda hücre canlılıklarının yüksek olduğu belirlenmiştir.
Son olarak metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA-ATCC 43300), metisiline duyarlı Staphylococcus aureus (MSSA-ATCC 29213) ve kontrol grubu olan Staphylococcus aureus (ATCC 25923) suşları ile bakteri kültür çalışmaları yapılmıştır. Salinomisin yüklü antibiyogram disklerin yanı sıra 19 farklı antibiyogram diskin BnHAp varlığında inhibisyon alanlarındaki değişimler incelenmiştir. Disk difüzyon yöntemi (normal antibiyogram), çift disk sinerji (panç) yöntemi ve agar dilüsyon yöntemi kullanılan kültür çalışmalarında; BnHAp varlığında oluşan sinerjik etki ile SAL yüklenen antibiyogram disklerin inhibisyon alanlarında artış gözlenmiştir.

Abstract:
In the scope of the thesis, it is aimed to investigate the synergistic effect of an anticancer
drug, salinomycin, loaded poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA 65:35) nanoparticles with
the boron doped nanohydroxyapatite (BnHAp) that has antibacterial activity. For this purpose, following the synthesis of salinomycin loaded PLGA nanoparticles, characterization studies and in vitro release studies were carried out. Cell culture and bacterial culture studies were performed with salinomycin loaded PLGA nanoparticles in the presence of BnHAp.
PLGA nanoparticles with salinomycin content of 2.5% (w/v) were produced by emulsion preparation-solvent evaporation technique. The empty and salinomycin loaded PLGA
nanoparticles (PLGA-SAL) produced have an average diameter of 185.8 nm and 187.4 nm, respectively. The encapsulation efficiencies of the PLGA-SAL nanoparticles were calculated to be 97.4 ± 1.87% according to the measurements done with the HPLC. In vitro release studies were carried out on PLGA-SAL nanoparticles in phosphate buffered saline (PBS) and the release of salinomycin reached 43% with a burst effect at the 1st
hour. The sustained release of salinomycin from PLGA nanoparticles with controlled and regular increase reached 100% at the end of the 45th day. Subsequently, a release study was initiated with chitosan tissue scaffolds incorporating PLGA-SAL nanoparticles and BnHAp, and 44% of the salinomycin was released with a burst effect in the first 24 hours. The release lasted approximately 59 days. It was determined that the release of salinomycin from both particles and scaffold was consistent with the Hixson-Crowell release kinetic model.
In the second phase of the studies, cell culture studies with MG-63 osteosarcoma cells were performed. For this purpose, the control group (MG-63 cells), salinomycin, empty PLGA nanoparticles, PLGA-SAL nanoparticles, PLGA-SAL/BnHAp and PLGA-SAL/nHAp groups were included. During the cell culture studies, cell viability was examined by livedead staining analysis, cytoskeletal organization of nanoparticles by Alexa Fluor/DAPI staining and intracellular uptake of nanoparticles by crystal violet staining. When PLGASAL
nanoparticles were used at the optimal dose of 0.2 mg, apoptosis was seen in MG-
63 osteosarcoma cells. However, cell viability was determined to be high in groups which are containing BnHAp and nHAp due to the proliferative effects of nHAP and BnHAp on
the MG-63 cells.
Finally, bacterial culture studies were performed with methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA-ATCC 43300), methicillin sensitive Staphylococcus aureus (MSSA-ATCC 29213) and control group Staphylococcus aureus (ATCC 25923) strains. In addition to salinomycin loaded antibiotic discs; the changes in inhibition areas in the presence of BnHAp were examined for 19 different antibiogram discs. In the culture studies using disc
diffusion method (normal antibiogram), double disc synergy (punch) method and agar
dilution method; the synergistic effect in the presence of BnHAp and the increase of inhibition area of salinomycin loaded antibiogram discs were observed.