İnsan ADAMTS-3 geninin transkripsiyonel regülasyonu
Transcriptional regulation of human ADAMTS-3  gene
Yazar: AYŞE TUĞŞEN AYDEMİR
Danışman: PROF. DR. FERAY KÖÇKAR
Balıkesir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Bağ dokunun temel bileşeni olan kollajenlerin olgunlaşma süreci oldukça karmaşık ve önemli bir süreçtir. Prokollojen moleküllerinin N-terminal ve C-terminal uçlarındaki peptitlerin doğru şekilde uzaklaştırılmaması halinde kollajen fibril organizasyonu aksamakta ve kollajenlerle bağlantılı çeşitli hastalıklar ortaya çıkmaktadır. İnsan ADAMTS-3 (bir disintegrin ve metalloproteaz trombospondin motif 3) geni kemik ve kıkırdağın temel kollajen tipi olan tip II kollajenin olgunlaşmasında görevli bir N-propeptidazdır. ADAMTS-3 ekspresyonuyla ilgili birçok çalışma yapılmış fakat gen ekspresyonu için en önemli basamak olan transkripsiyonel regülasyonu henüz aydınlatılmamıştır.
Çalışmada ilk olarak çeşitli hücre hatlarında ADAMTS-3 genine ait ekspresyon çalışmaları yapıldı. En fazla ekspresyon PC3 hücrelerinde gözlenirken tez çalışma modeli olan Saos-2 ve MG63 hücrelerinde de ADAMTS-3 ekspresyonu belirlendi. Gen regülasyon çalışmaları için ADAMTS-3 promotor bölgesine ait 1340 bç'lik bölgenin klonlaması gerçekleştirilerek, dört farklı promotor parçası TS3[-131/+40], TS3[-576/+40], TS3[-899/+40], TS3[-1340/+40] lusiferaz vektörüne klonlandı. Saos-2 ve MG63 hücrelerinde geçici transfeksiyonları yapılan promotor parçalarından en yüksek aktiviteyi TS3[-576/+40]'nın gösterdiği belirlendi. Biyoinformatik analizleri yapılan ADAMTS-3 promotorunun TATA kutusu içermediği, GC bazları açısından oldukça zengin olduğu ve başta SP1, C/EBPα ve USF transkripsiyon faktörleri için birçok bağlanma motifi içerdiği tespit edildi. SP1, C/EBPα ve USF için kotransfeksiyonları yapılan ADAMTS-3 geninin transkripsiyonel aktivitesinin azaldığı tespit edildi. Saos-2 hücrelerinde DNA-protein bağlanma analizleri ile SP1, C/EBPα ve USF'nin promotora bağlandığı belirlendi. Söz konusu transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi neticesinde ADAMTS-3'ün mRNA ve protein düzeyinde ifadesinin azaldığı Saos-2 ve MG63 hücrelerinde belirlendi. 
Tip I, II ve III kollajen ekspresyonlarının SP1, C/EBPα ve USF aşırı ifadesi yapılmış MG63 hücrelerinde azaldığı belirlendi. Saos-2 hücrelerinde SP1'in tip I kollajen ekspresyonunu azaltırken, tip II ve III ekspresyonunu arttırdığı belirlendi.  C/EBPα'nın tip I ve II kollajen ekspresyonunu arttırırken tip III kollajeni azalttığı, USF'nin ise tip I, II ve III kollajen ekspresyonlarını azalttığı yapılan ekspresyon çalışmalarıyla belirlendi. 
Sonuç olarak ADAMTS-3 promotorunun ve ADAMTS-3'ün işlediği temel kollajen tipi olan tip II kollajenin bu üç TF etkisi ile azaldığı osteosarkoma hücre modelinde tespit edildi.

ANAHTAR KELİMELER:ADAMTS-3, kollajen, osteosarkoma, transkripsiyonel düzenlenme, SP1, C/EBPα, USF.

Abstract:
ADAMTS-3 is an N-pro peptidase that takes an important role in collagen maturation. Removal of the N- and C-terminus propeptides by specific enzymes, the N- and C-pro peptidases, is essential for the correct organization of collagen fibrils. Otherwise, collagen fibrils will assembly in a weaken and unorganized formation that causes several disorders in the collagenous tissues. ADAMTS-3 (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 3) is mainly responsible for the maturation of type II collagen molecule which is the main component of the bone and cartilage. There are several expression studies about ADAMTS-3 gene however its transcriptional regulation has not been lighten up, yet.
In this study, we first determined the expression profile of the ADAMTS-3 gene in several cancer cell lines. ADAMTS-3 is mostly expressed in PC3 (prostate cancer) cells. ADAMTS-3 is also expressed in Saos-2 and MG63 cell lines which are the model cell lines of this project. For gene regulation studies, 1340 bp upstream of the promoter region of the ADAMTS-3 was cloned for the first time and four different promoter fragments TS3[-131/+40], TS3[-576/+40], TS3[-899/+40], TS3[-1340/+40] were cloned into luciferase vector. Basal activity studies showed that all the promoter fragments were active and TS3[-576/+40] showed the maximal activity for Saos-2 and MG63 cell lines. Bioinformatic analysis revealed that the promoter is GC-rich, includes several transcription binding motifs especially for SP1, C/EBPα, and USF and is lack of TATA box. By the cotransfection of SP1, C/EBPα, and USF, the transcriptional activity of ADAMTS-3 promoter decreased for both cell lines. The DNA-protein binding experiments confirmed the binding of SP1, C/EBPα and USF in Saos-2 cells. The overexpression of the transcription factors decreased the ADAMTS-3 mRNA and protein expression levels for Saos-2 and MG63 cells.
In MG63 cells, the expression levels of type I, II and III collagens were decreased by the presence of SP1, C/EBPα, and USF. In Saos-2 cells, while the type I collagen expression was decreased, the type II and III collagen expressions were increased by SP1. The overexpression of C/EBPα increased the expression of type I and II collagens, on the other hand, decreased the type III collagen expression. And the results for the effect of USF in MG63 cells showed that USF decreased the type I, II and III expression levels. 

KEYWORDS: ADAMTS-3, collagens, osteosarcoma, transcriptional regulation,  SP1, C/EBPα, USF.