Antibakteriyel aljinat mikrobaloncuk yapıların mikroakışkan sistemle hazırlanması
Preparation of antibacterial alginate microbubble structures by microfluidic system
Yazar: FATİH EROĞLU
Danışman: PROF. DR. KEZBAN ULUBAYRAM
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Metal nanopartiküller = Metal nanoparticles ; Sodyum aljinat = Sodyum alginate

Özet:
Mikroakışkan sistemler ile üretilen mikrobaloncuklar, kontrast ajanlar olarak ultrason radyografisinde yaklaşık 30 yıldır kullanılmaktadır. Son yıllarda ise basit, hızlı ve tekrarlanabilir üretim imkânı sağlaması nedeniyle farklı biyomedikal uygulamalarda başarıyla kullanılmaya başlanmıştır. Bu uygulamalar arasında ilaç taşıma sistemleri, gen tedavisi, intravenöz oksijen taşıma ajanları, kanser tedavisi, kan-beyin bariyeri hedefli ilaç taşıyıcılar, tromboliz ve odaklanmış ultrason görüntüleme v.b. gelmektedir. Mikrobaloncuklar aynı zamanda homojen gözenek dağılımına sahip 3-boyutlu doku iskelelerin üretiminde de önemli araçlardır. Gözenekli yapıların hazırlanmasında kullanılan geleneksel yöntemler (dondurarak kurutma, faz ayırma, gazla köpürtme, parçacık uzaklaştırma, porojen kullanımı) ile üretilen yapılarda gözenek boyutu, homojenlik ve mimari tam olarak kontrol edilememekte olup üretimden üretime varyasyonlar görülmektedir. Mikroakışkan sistemlerde ise sürekli akışlı bir üretim gerçekleştiğinden dolayı üretilen mikrobaloncuklar kararlı, homojen ve dar gözenek boyut aralığına sahiptirler.  
Bu tez çalışmasında T-bağlantılı mikroakışkan sistemleri kullanılarak aljinat/poli(vinil alkol)/polietilenimin (Alg-PVA-PEI) mikrobaloncukların üretilmesi, bu yapılara gümüş nanopartiküllerin (AgNP) takviyesi ile antibakteriyel özellik gösteren 3-boyutlu gözenekli yapıların hazırlanması amaçlanmıştır. Bu amaçla Alg-PVA-PEI mikrobaloncuklar T-bağlantılı mikroakışkan sistem kullanılarak üretilmiş ve sistem parametreleri optimize edilmiştir. Mikrobaloncuk üretimi sırasında akış hızı 200 µL/dk ve gaz basıncı 9L/dk olarak optimize edilmiş olup, örnek grubuna bağlı olarak 90-175 µm boyut aralığında mikrobaloncuk üretimi gerçekleştirilmiştir. Diğer taraftan bu yapılara antibakteriyel etki kazandırmak için AgNP'ler sentezlenmiştir. AgNP'lerin ortalama hidrodinamik çap dağılımı 31.63±3.7 nm, PDI değeri 0.11 ve yüzey yükü zeta potansiyel değeri -21.7±9.1 mV olarak bulunmuştur. Sentezlenen AgNP'ler Alg-PVA-PEI çözeltisine eklenerek mikroakışkan sistemler ile antibakteriyel mikrobaloncuklar (Alg-PVA-PEI/AgNP) üretilmiştir. Üretilen mikrobaloncuklar kalsiyum klorür (CaCl2) ile çapraz bağlanarak; 3 boyutlu, homojen gözeneklere ve yüksek su tutma kapasitesine sahip, kararlı, uzatılmış gümüş salımı sağlayan, toksik etki göstermeyen ve antibakteriyel etkinliğe sahip mikrobaloncuk yapılar elde edilmiştir. Elde edilen Alg-PVA-PEI/AgNP yapıların su tutma kapasiteleri ~%4000 olarak bulunmuştur. 3 boyutlu-gözenekli aljinat mikrobaloncuk yapılardan AgNP'lerin salım profilleri incelendiğinde ilk 24 saatte patlama etkisi gösterdiği, daha sonra AgNP'lerin 72 saate kadar uzatılmış salım sergilediği izlenmiştir. Alg-PVA-PEI1/AgNP0.05 örnekler %105 hücre canlılığı gösterirken 72 saat sonunda 2605 ppb AgNP salımı tespit edilmiştir.  Bu değerin üzerindeki AgNP miktarının hücre canlılığını olumsuz yönde etkilediği gözlenmiştir. PEI ve AgNP içeren 3 boyutlu-gözenekli yapılar gram negatif Escherichia coli (E. coli–ATCC 25922) ve gram pozitif Staphylococcus aureus (S. aureus-ATCC 29213), Methicillin Resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)) bakteri türlerine karşı yüksek oranda antibakteriyel özellik göstermiştir. Disk difüzyon testi sonuçlarına göre; kontrol gruplarındaki bakteriyel zone inhibisyon çapı en yüksek 3-3.5 mm aralığında gözlenirken, Alg-PVA-PEI1/AgNP0.05 örnek grubunda gram pozitif S. Aureus ve MRSA bakteri türlerine karşı sırasıyla 4 ve 4.7 mm, gram negatif E.coli bakteri türüne karşı ise 3.7 mm zone inhibisyon çapı belirlenmiştir. 3 boyutlu-gözenekli aljinat mikrobaloncuk yapıların özellikle yüksek su tutma kapasitesi, hücresel uyumluluk ve kontrollü gümüş salımı sayesinde uzun dönem antibakteriyel etkinliği göz önünde bulundurularak, enfekte ve eksudalı yaralar için başarılı bir yara örtüsü adayı olabileceği sonucuna varılmıştır.

Anahtar Kelimeler: T-bağlantılı Mikroakışkan Sistem, Mikrobaloncuk, Aljinat, Gözenekli, Antibakteriyel, Gümüş Nanopartikül.

Abstract:
Microbubbles produced with microfluidic systems have been used as contrast agents in ultrasound radiography for approximately 30 years. In recent years, it has been successfully used in different biomedical applications due to its simple, fast and reproducible production possibilities. These applications include drug delivery systems, gene therapy, intravenous oxygen transport agents, cancer therapy, blood-brain barrier targeted drug carriers, thrombolysis and focused ultrasound imaging. Microbubbles are also important structures in the production of 3-dimensional scaffolds with homogeneous pore distribution. Pore size, homogeneity and architecture cannot be fully controlled in structures produced by traditional methods (freeze drying, phase separation, gas foaming, particle removal, use of porogen) used in the preparation of porous structures, and variations are observed from production to production. In microfluidic systems, on the other hand, since a continuous flow production takes place, the microbubbles produced are stable, homogeneous and have a narrow pore size range.
In this thesis, it was aimed to produce alginate/poly(vinyl alcohol)/polyethyleneimine (Alg-PVA-PEI) microbubbles using T-junction microfluidic systems, and to prepare 3-dimensional porous structures with antibacterial properties by adding silver nanoparticles (AgNP) to these structures. For this purpose, Alg-PVA-PEI microbubbles were produced using a T-junction microfluidic system and system parameters were optimized. During the production of microbubbles, the flow rate was optimized as 200 µL/min and the gas pressure as 9L/min, and microbubbles were produced in the size range of 90-175 µm depending on the sample group. On the other hand, AgNPs were synthesized to give antibacterial effect to these structures and the average hydrodynamic diameter distribution of AgNPs was 31.63±3.7nm, PDI value was 0.11 and surface charge zeta potential value was -21.7±9.1 mV. By adding the synthesized AgNPs to the Alg-PVA-PEI solution, antibacterial microbubbles (Alg-PVA-PEI/AgNP) were produced with microfluidic systems. The microbubbles produced are cross-linked with calcium chloride (CaCl2); 3-dimensional porous structures with 3-dimensional, homogeneous pores and high water holding capacity, stable, extended silver release, non-toxic effect and antibacterial activity were obtained. The water retention capacity of the obtained Alg-PVA-PEI/AgNP structures was found to be ~4000%. When the release profiles of AgNPs from 3-dimensional porous alginate microbubble structures were examined, it was observed that AgNPs exhibited burst effect in 24 hours and then prolonged release up to 72 hours. Alg-PVA-PEI1/AgNP0.05 samples showed 105% cell viability, while 2605 ppb AgNP release was detected after 72 hours. It was observed that the amount of AgNP above this value adversely affected cell viability. 3D-porous structures containing PEI and AgNP are highly antibacterial against gram-negative Escherichia coli (E. coli–ATCC 25922) and gram-positive Staphylococcus aureus (S. aureus-ATCC 29213), Methicillin Resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) bacterial strains. According to the results of the disk diffusion test; bacterial zone inhibition diameter in the control groups was observed in the range of 3-3.5 mm, while in the Alg-PVA-PEI1/AgNP0.05 sample group, it was 4 and 4.7 mm against gram-positive S. Aureus and MRSA bacteria, respectively, and against gram-negative E.coli bacteria. 3.7 mm zone inhibition diameter was determined. It has been concluded that 3-dimensional porous alginate microbubble structures can be a successful wound dressing material candidate for infected and exuding wounds, especially considering their long-term antibacterial activity with their high water retention capacity, cellular compatibility and controlled silver release.
Keywords: T-Junction Microfluidic System, Microbubble, Alginate, Porous, Antibacterial, Silver Nanoparticle.