Meklofenamik asitin küçük hücreli akciğer kanserinin progresyonu ve hücre proteomu üzerine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of meclofenamic acid on the progression and cell proteome of small cell lung cancer
Yazar: SEVİNÇ YANAR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AYLİN KANLI
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Meklofenamik asit = Meclofenamic acid ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Proteomikler = Proteomics

Özet:
Amaç: Tüm akciğer kanseri olgularının yaklaşık %15'ini oluşturan küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK) yüksek metastaz potansiyeli ve düşük sağ kalım oranı ile oldukça saldırgan bir kanser türüdür. KHAK başlangıçta uygulanan kimyasal tedaviye yüksek oranda yanıt verebilmesine rağmen, hastalığın nüksetmesinden sonra uygulanan tedavilerde başarı sağlanamamaktadır. Tedaviye direncin çok yüksek olması bu başarısızlığın en büyük sebebi olarak kabul edilmektedir. Bu sebepten KHAK için yeni tedavi stratejilerine ihtiyaç vardır.  Bu çalışma ile anti-kanserojen etkileri çeşitli kanser türlerinde gösterilmiş olan meklofenamik asitin (MA) KHAK hücre hattı olan DMS114 hücrelerinin proteomunda meydana getireceği değişikliklerin araştırılması ve KHAK patogenezinde ve ilaç direncinde rol alan mekanizmalar/metabolik yolaklar ile ilgili veriler elde edilmesi amaçlanmıştır. MA'nın bir kemoterapi ilacı olan topotekan (TPT) ile kombinasyonun hücre progresyonu üzerine etkilerinin araştırılması bu çalışmanın bir diğer amacıdır.
Yöntem: Çalışmanın ilk kısmında, MA'nın tek başına ve TPT ile kombine kullanımının sitotoksik ve apoptotik etkilerini belirlemek için tripan mavisi testi, Annexin V ve hücre döngüsü analizi yapılmıştır. Çalışmanın ikinci kısmında, ilaç uygulamasının DMS114 hücre proteomunda meydana getirdiği değişiklikler iki ayrı kütle spektometre tekniği (MALDI-TOF/TOF ve LC-MS/MS) ile analiz edilmiştir. Her iki yöntem ile tanımlanan proteinlerden ifade düzeyi anlamlı şekilde değişenler biyoinformatik analiz veritabanı PANTHER ve STRING kullanılarak değerlendirilmiştir. Elde edilen veriler western blotlama yöntemi ile doğrulanmıştır. 
Bulgular: MA ve TPT kombinasyonunun, TPT'nin tek başına kullanımına kıyasla, daha fazla apoptotik hücre ölümüne neden olarak (P < 0.01) güçlü bir sinerjetik etkiye neden olduğu görülmüştür (CI < 1). MA uygulaması sonucu ifade düzeyi değişen proteinlerin biyoinformatik analizi; enerji metabolizması, RNA uçbirleştirme ve işlenmesi, protein düzenlenmesi ve yıkımı süreçlerinde regülasyon olduğunu göstermiştir. Enerji metabolizması ile ilgili proteinler detaylıca incelendiğinde glikolizin baskılandığı, ancak mitokondriyel aktivite, oksidatif fosforilasyon ve glutaminolizin arttığı görülmüştür. Bu veriler, hücrelerin ilaçlı yeni ortama uyum sağlayarak hayatta kalmak için metabolik yeniden programlama sürecine girdiğini göstermiştir. 
Sonuç: MA ve TPT kombinasyonu, KHAK tedavisi için terapötik potansiyeldedir. Proteomik çalışmamız ile bazı kanser türlerinin tedavisinde ilaç direncine neden olduğu bilinen metabolik yeniden programlamanın KHAK ile ilişkisi ilk kez ortaya çıkarılmıştır. Enerji metabolizması ve ilaç direnci ile ilgili tanımlanan proteinler, KHAK tedavisinde ilaç direncinin üstesinden gelmek adına geliştirilecek yenilikçi yaklaşımlar için hedef niteliğindedir. 
Anahtar kelimeler: Küçük Hücreli Akciğer Kanseri (KHAK), Meklofenamik Asit (MA), Proteomik, MALDI-TOF/TOF, nLC-MS/MS

Abstract:
Objective: Small cell lung cancer (SCLC), which accounts for approximately 15% of all lung cancer cases, is a highly aggressive cancer with high metastatic potential and low survival rate. Although SCLC initially respond to chemotherapy at a high rate, the treatments applied after the disease relapses are not successful. Drug resistance is accepted to be one of the main reasons for this failure. Therefore, there is an urgent need for new treatment strategies for SCLC. The aim of this study was to investigate the changes that meclofenamic acid (MA), a drug that has been shown to have anti-tumorigenic effects in various cancer types, would cause on DMS144 cell proteome which is an established SCLC cell line. Therefore, the findings were expected to shed some light onto the molecular mechanisms/metabolic pathways that may have a role in SCLC. The other aim of the study was to investigate the effects of MA and the chemotherapy agent topotecan (TPT) combinations on SCLC cell progression.
Method: During the initial part of the study, trypan blue exclusion assay, Annexin V and cell cycle analysis were performed to determine the cytotoxic and apoptotic effects of MA alone or in combination with TPT. The changes caused by MA on DMS114 cell proteome were then analyzed by two different mass spectrometry techniques (MALDI-TOF/TOF and LC-MS/MS). Among the proteins identified by both methods, those showing significantly altered expression levels were evaluated using bioinformatics approaches databases PANTHER and STRING. The data were verified by western blotting.
Results: The combination of MA and TPT was found to have a strong synergetic effect, causing more apoptotic cell death (P < 0.01) compared to the use of TPT alone (CI < 1). Bioinformatics analysis with the differentially regulated proteins demonstrated regulation of energy metabolism, RNA splicing and processing, protein processing and degradation. When the proteins related to energy metabolism were examined in detail, it was observed that glycolysis was suppressed, whereas mitochondrial activity, oxidative phosphorylation and glutaminolysis were increased. The presented data indicated that cells underwent metabolic reprogramming to adapt their new environment and survive.
Conclusions: The combined application of MA and TPT had therapeutic potential for the treatment of SCLC. In the present study, the relationship between metabolic reprogramming, which is known to cause drug resistance in several cancer types, and SCLC was revealed for the first time. The identified proteins related to energy metabolism and drug resistance could be targets for innovative approaches to overcome drug resistance in SCLC treatment.
Keywords: Small Cell Lung Cancer (SCLC), Meclofenamic Acid (MA), Proteomics, MALDI-TOF/TOF, nLC-MS/MS