Farelerde monokrotalin ile indüklenen hepatik hasarda apoptotik belirteçlerin ekspresyon seviyelerindeki değişikliklerin incelenmesi
Examination of changes in the  expression levels of apoptotic markers in monocrotaline induced hepatic damage in mice
Yazar: ALİ ŞENOL
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN KADİR DEVRİM ; PROF. DR. MİYASE ÇINAR
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Biyokimyası Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu çalışmanın amacı, canlılarda hepatotoksisiteye neden olduğu bilinen pirolizidin alkaloidlerinden monokrotalin (MCT) kaynaklı hepatik hasarın biyokimyasal ve moleküler düzeyde meydana getirdiği değişikliklerin incelenmesidir. Bu amaçla 30 adet erkek BALB/c faresi; kontrol, akut toksisite ve subakut toksisite olmak üzere üç gruba ayrıldı. Kontrol grubuna %0,9 salin, akut toksisite grubuna 120 mg/kg tek doz MCT, subakut toksisite grubuna 5 gün arayla toplam 3 kez 120 mg/kg MCT uygulandı. Tüm uygulamalar intragastrik olarak gerçekleştirildi. Deneme sonunda plazma AST, ALT ve GGT aktiviteleri ile TBIL, TCHO ve TP düzeyleri belirlendi. Ayrıca deney sonlandırılmasında toplanan karaciğer dokuları, oksidatif stres belirteçlerinden TAK, TOK ve OSİ düzeylerinin belirlenmesi, histopatolojik incelemeler ve moleküler tekniklerde kullanılmak üzere total RNA'nın izole edilmesi amacıyla kullanıldı. Yapılan incelemelerde kontrol grubuna göre deneme gruplarında ALT (P≤0,05) ve GGT (P<0,001) aktiviteleri ile TBIL  (P<0,001) düzeylerinin istatistiksel açıdan önemli düzeyde, AST aktiviteleri ve TCHO düzeylerinin  sayısal olarak arttığı (P>0,05), TP düzeylerinin ise önemli düzeyde azaldığı (P<0,001) belirlendi. Karaciğer doku homojenatlarında oksidatif stres parametrelerinden TOK (P<0,001) ve OSİ (P>0,05) düzeylerinin kontrol grubuna kıyasla deneme gruplarında artış gösterdiği tespit edildi. Total antioksidan kapasite düzeylerinin ise kontrol grubuna göre akut toksikasyon grubunda sayısal olarak azaldığı (P>0,05), subakut toksikasyon grubunda ise önemli düzeyde arttığı (P<0,05) belirlendi. Ayrıca doku homojenatlarında Bcl-2, Bax ve Kaspaz-3 protein düzeyleri ELISA tekniği ile belirlendi. Deneme gruplarında pro-apoptotik markır Bax (P>0,05) ile Kaspaz-3 (P<0,05) protein düzeylerinde artma, anti-apoptotik markır Bcl-2 (P<0,001) düzeylerinde ise azalmaların olduğu görüldü. Aynı markırların qPCR ile gen ekspresyon düzeylerindeki değişikliklerin ELISA sonuçları ile uyumlu olduğu ancak istatistiksel açıdan önemli düzeyde olmadığı belirlendi (P>0,05). Moleküler düzeyde yapılan qPCR analizinin yanında aynı prensibe dayanan PCR array analizi ile de apoptotik belirteçler, JAK/STAT proteinleri, STAT etkileşimli transkripsiyon faktörler, hücre döngüsü, proliferasyonu, büyümesi ve/veya onarımı, akut faz tepkisi ile inflamatuar yanıttan sorumlu çok sayıda gen ekspresyonu, eş zamanlı olarak taranarak kontrol grubuna göre artan ya da azalan genlerin eksresyon profili tespit edildi. Monokrotalinin sebep olduğu karaciğer hasarının hücresel boyutta incelenmesi için yapılan mikroskobik incelemelerde, deneme gruplarında hasar belirteçlerinde değişikliklerin olduğu ve akut toksikasyon grubundaki değişikliklerin daha şiddetli düzeyde olduğu görüldü. Sonuç olarak MCT'nin sebep olduğu hepatik hasar sürecinde karaciğer enzim aktivitelerinin ve oksidatif stres mekanizmasının olumsuz yönde etkilendiği, ayrıca gerçekleştirilen ELISA ve qPCR analizleri ile de hem protein hem de gen düzeylerinde elde edilen Bcl-2, Bax ve Kaspaz-3 ekspresyonlarının önemli değişiklikler sergilediği anlaşıldı. Ayrıca, PCR array tekniği ile de incelenen hepatik hasar süreci ile ilişkili moleküler yolaklarda ekspresyon değişiklikleri gen panelleri seviyesinde belirlenerek potansiyel biyokimyasal ve patolojik belirteçler ortaya konuldu. Elde edilen verilerin yeni çalışmaların planlanması için önemli veriler sunduğu kanaatine varıldı.

Abstract:
This study aims to examine the changes caused by hepatic damage at the biochemical and molecular levels caused by monocrotaline (MCT), one of the pyrrolizidine alkaloids known to cause hepatotoxicity in living things. For this purpose, 30 male BALB/c mice were divided into control, acute toxicity, and subacute toxicity groups. 0.9% saline was administered to the control group, a single dose of 120 mg/kg MCT was administered to the acute toxicity group, and 120 mg/kg MCT was administered to the subacute toxicity group for a total of 3 times with an interval of 5 days. All applications were performed intragastricly. At the end of the experiment, plasma AST, ALT and GGT activities and TBIL, TCHO and TP levels were determined. In addition, liver tissues collected at the end of the experiment were used to determine TAC, TOC and OSI levels, which are oxidative stress markers, and to isolate total RNA for use in histopathological examinations and molecular techniques. According to the examinations, ALT (P≤0.05) and GGT (P<0.001) activities and TBIL (P<0.001) levels increased at a statistically significant level in the experimental groups compared to the control group, while AST activities and TCHO levels increased numerically (P>0.05). ), and TP levels were found to decrease significantly (P<0.001). It was determined that TOC (P<0.001) and OSI (P>0.05) levels, which are oxidative stress parameters in liver tissue homogenates, increased in the experimental groups compared to the control group. It was determined that total antioxidant capacity levels decreased numerically in the acute toxicity group compared to the control group (P>0.05), and increased significantly in the subacute toxicity group (P<0.05). Additionally, Bcl-2, Bax and Caspase-3 protein levels in tissue homogenates were determined by ELISA. In the experimental groups, there was an increase in the pro-apoptotic marker Bax (P>0.05) and Caspase-3 (P<0.05) protein levels, and a decrease in the anti-apoptotic marker Bcl-2 (P<0.001) levels. It was determined that the changes in gene expression levels of the same markers by qPCR were compatible with the ELISA results, but were not statistically significant (P>0.05). In addition to the qPCR analysis performed at the molecular level, PCR array analysis based on the same principle reveals the expression of apoptotic markers, JAK/STAT proteins, STAT interacting transcription factors, cell cycle, proliferation, growth and/or repair, acute phase response and many genes responsible for the inflammatory response, The expression profile of genes that increased or decreased compared to the control group was determined by scanning simultaneously. Microscopic examinations performed to examine the liver damage caused by monocrotaline at the cellular level showed that there were changes in damage markers in the trial groups and that the changes were more severe in the acute toxicity group. As a result, liver enzyme activities and oxidative stress mechanism were negatively affected during the hepatic damage process caused by MCT, and Bcl-2, Bax and Caspase-3 expressions obtained at both protein and gene levels showed significant changes in ELISA and qPCR analyses. understood. In addition, expression changes in molecular pathways related to the hepatic damage process, which were examined with the PCR array technique, were determined at the level of gene panels and potential biochemical and pathological markers were revealed. It was concluded that the data obtained provided important data for planning new studies.