Allojenik periferik kan kaynaklı kök hücre vericilerinde rekombinan insan granülosit koloni stimüle edici faktörün (rhg-csf) genotoksisite üzerine etkisi
The effect of recombinant human granulocyte colony stiumlating factor (rhg-csf) on genotoxicity in allogeneic peripheral blood stem cell transplant donors
Yazar: HASAN FATİH ÇAKMAKLI
Danışman: DOÇ. DR. TALİA İLERİ
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Çocuk Hematolojisi Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Hematoloji = Hematology ; Onkoloji = Oncology ; Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Comet tekniği = Comet assay ; Genotoksisite = Genotoxicity ; Granülosit koloni stimülan faktör = Granulocyte colony stimulating factor ; Hücre nakli = Cell transplantation ; Kan = Blood ; Kemik iliği nakli = Bone marrow transplantation ; Kök hücreler = Stem cells ; Mikroçekirdek testleri = Micronucleus tests

Özet:
Dünyada yılda 50.000'den fazla hematopoetik kök hücre nakli (HKHT) yapılmaktadır. Otolog HKHT'lerin % 99'unda, allojenik HKHT'lerin % 72'sinde rhG-CSF, kök hücrelerin periferik kana mobilizasyonunu sağlamak amacıyla kullanılmaktadır. rhG-CSF'in kısa dönem yan etkileri genellikle iyi tolere edilebilir. Uzun dönemli etkileri ile ilgili ise belirsizlikler bulunmaktadır. Uzun yıllardır rhG-CSF'in malinite sıklığını arttırdığı ile ilgili çekinceler vardır. Bu konuda yapılmış birçok klinik ve preklinik çalışmaya rağmen malin dönüşüme neden olup olmadığı günümüzde halen netleştirilememiştir. Bu durumun netleşmesi özellikle sağlıklı ve gönüllü olan allojenik periferik kan kaynaklı kök hücre vericileri (APK-HKHV) için büyük önem taşımaktadır. 
Bu tez çalışmasında, HKHT amacıyla rhG-CSF uygulanan APK-HKHV'lerde Mikronükleus ve Comet testleri kullanılarak ve prospektif olarak genotoksisite incelemeler yapıldı. APK-HKHV olarak 36 kişi, kontrol grubu olarak 16 cinsiyet-yaş uyumlu sağlıklı birey çalışmaya alındı. Vericiden rhG-CSF verilmeden önce, 5 günlük rhG-CSF verildikten sonra ve kök hücre toplanmasından 1 ay sonra kan örnekleri alınarak incelendi. Genotoksisite incelemelerine ek olarak periferik kanda CD34+ sayısı ve tam kan sayımı incelemeleri yapıldı. Genotoksisite testi ve tam kan sayımı sonuçları 26 vericide, CD34 sayımı üzerine etkili faktörler 34 vericide değerlendirildi. 
Mikronükleus ve Comet incelemelerinden Comet uzunluğu, kuyruk uzunluğu, % DNA kuyruk ve kuyruk momenti sonucunda ilaca bağlı genotoksik etki lehine bulgu saptanmadı; Olive?in kuyruk momenti değerlerinde ise 1. ay takibinde bazale ve tedavinin 5. gününe göre istatistiksel anlamlı olarak artış saptandı (p=0,002 ve p=0,017). Nükleer bölünme indeksinin, 5 günlük rhG-CSF uygulaması sonrasında istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı (p<0,001) ve takiben 1. ayda eski değerlerinin üzerine çıktığı görüldü (p=0,004). Comet testi sonuçları kontrol grubunda verici grubunun bazal değerlerine göre istatistiksel anlamlı şekilde daha yüksek bulundu. Total mikronükleus değerlerinin ise çalışma grubunda kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu ancak aradaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı görüldü (p=0,059). Periferik kandaki CD34 sayısının diğer değişkenler arasından sadece 5 günlük rhG-CSF uygulaması sonrasında bakılan beyaz küre sayısıyla istatistiksel olarak anlamlı, orta düzeyde ve pozitif yönde korelasyon gösterdiği izlendi (Pearson R:0,495, p=0,004). Trombosit, nötrofil, monosit, bazofil ve eozinofil sayılarının rhG-CSF uygulamasıyla 5. günde bazale göre istatistiksel anlamlı şekilde arttığı ve 1. ay takibinde eski değerlerine düştüğü görüldü. Lenfosit sayılarının ise ilaç uygulaması sonrası artışı takiben 1. ay takibinde istatistiksel anlamlı şekilde bazal değerlerin de altına düştüğü görüldü.
Genotoksisite değerlendirmesinde kullanmış olduğumuz 3 ana incelemenin ikisinde (NBİ ve Olive'in kuyruk momenti) rhG-CSF'e bağlı genotoksik etki saptandı. Olguların izleminde NBİ değerlendirmesi ile 1. ayda bazal değerlere geri dönme elde edilebilmesine karşın, Olive'nin kuyruk momenti incelemesinde esas etkinin 1. ayda başladığı gözlendi. Mikronukleus testinde ise genotoksisite tespit edilemedi. Sonuç olarak elde edilen verilerde genotoksik etki geliştiğini destekleyici yönde sonuçlara ulaşılmakla birlikte bu çıkarım, uygulanan testler, hasarın gelişme zamanı ve hasarın devam süresi açısından homojenlik göstermemektedir. Bu konuda daha uzun süreyi kapsayan ve CD34 gibi daha homojen hücre gruplarında yapılacak çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
Annually >50.000 hematopoietic stem cell transplantations (HSCT) are performed in the world. In 99 % of autologous HSCTs and 72 % of allogeneic HSCTs, rhG-CSF is used to mobilize stem cells to peripheral blood. Short-term side effects of rhG-CSF are generally well-tolerated but long term effects are not clear. For many years there have been some drawbacks that rhG-CSF may increase the frequency of malignancy. Despite a number of preclinical and clinical studies performed to clarify this subject, there is no exact conclusion either it leads to malignant transformation or not. It is important to reach a precision especially for healthy and volunteer donors of PBSCT.
 	In this study, PBSCT donors who had been receiving rhG-CSF were prospectively evaluated for genotoxicity by using Micronucleus and Comet tests. 36 PBSCT donors and 16 age and sex matched controls were included. Blood samples were collected from donors just before starting rhG-CSF, after using rhG-CSF for 5 days and 1 month after stem cell collection procedure. In addition to genotoxicity research, peripheral blood CD34 cell count and hemograms were performed. Genotoxicity test results and hemograms were analyzed in 26 subjects whose data was complete and CD34 cell count was evaluated in 34 subjects who were available in the beginning of the study. 
	In Micronucleus and Comet tests, Comet length, tail length, % DNA tail and tail moment showed no difference in time, on the other hand Olive tail moment was found to be increased significantly at 1st month evaluation when compared to both basal and 5th day values (p=0.002 and p=0.017). Nuclear division index (NDI) was found to be decreased significantly following 5-day application of rhG-CSF (p<0.001) and at 1st month control it was found to exceed older values (p=0.004). Comet test results (mean) of the control group were significantly higher than the results of the donor group. On the contrary, total micronucleus counts were higher in the donor group than the control group but this difference was not significant statistically (p=0,059). Peripheral blood CD34 cell count showed moderate and statistically significant, positive correlation only with white blood cell count following 5-day rhG-CSF treatment (Pearson R:0,495, p=0,004). Platelet, neutrophil, monocyte, basophil end eosinophil cell counts in the hemograms showed significant increase following 5-day rhG-CSF treatment and dropped back to their original counts at 1st month control. Lymphocyte counts which had increased significantly following rhG-CSF treatment dropped again significantly even under its original count. 
	We have detected genotoxic effect due to rhG-CSF utilisation in two of three tests (NDI and Olive tail moment) we have performed.  Although NDI values dropped back to its normal interval at 1st month control, Olive tail moment test detected actual genotoxic effect at 1st month evaluation. On the other hand, micronucleus test did not show any significant change. In conclusion, however our results supported genotoxic effect due to rhG-CSF, they were not homogeneous in regard to the tests performed and the actual time point and the duration of this effect. Future studies that will select more homogeneous cell groups like CD34 stem cells and in which follow-up time will be longer are needed.