Renal iskemi-reperfüzyon modelinde taurinin ekstrasellüler matriks bütünlüğü üzerine olası koruyucu etkisinin ve ilişkili sinyal yolaklarının tanımlanması
The investigation of possible protective effect of taurine on extracellular matrix and related signaling pathway in renal ischemia/reperfusion model
Yazar: CEMRE URAL
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ZAHİDE ÇAVDAR
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Nefroloji = Nephrology
Dizin: Böbrek hastalıkları = Kidney diseases ; Ekstrasellüler matriks = Extracellular matrix ; Matriks metalloproteinaz 2 = Matrix metalloproteinase 2 ; Matriks metalloproteinaz 9 = Matrix metalloproteinase 9 ; Matriks metalloproteinazlar = Matrix metalloproteinases ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; Taurin = Taurine ; İskemi = Ischemia

Özet:
Bir organa gelen kan akımının bir pıhtı veya mekanik bir etkenle (özellikle vasküler cerrahi işlemler ve organ transplantasyonu sırasında) yetersiz hale gelmesine veya durmasına iskemi denir. Reperfüzyon ise dokunun kanlanmasının yeniden başlamasıdır. Böbrekte iskemi/reperfüzyon (I/R) hasarı süreçte oluşan serbest oksijen radikallerinden dolayı, vasküler ve doku hasarını oluşturur. Bu hasarın şiddeti iskemi süresi ile ilişkili olarak artmakta ve belirgin doku hasarı olmaksızın gelişen prerenal azotemiden, tübüler veya kortikal nekroza bağlı ciddi akut böbrek yetmezliğine kadar değişen klinik tablolar göstermektedir. Bu çalışmadaki amaç taurinin sıçanlarda renal iskemi/reperfüzyon hasarına karşı olası koruyucu etkilerinin, ekstrasellüler matriks regülasyonunda rol oynayan matriks metalloproteinaz-2 (MMP-2) ve MMP-9 ve ilişkili sinyal ileti yolağı üzerine olan etkisinin araştırılmasıdır. 19 adet Winstar albino sıçan Sham (n=5), I/R hasarı olan (saline i.p) (n=7) ve I/R hasarı + taurin (200mg/kg i.p) (n=7) uygulanan olmak üzere 3 çalışma grubuna ayrıldı. I/R grubunda yer alan sıçanların sol böbrekleri 1 saat iskemi ve 6 saat reperfüzyona maruz bırakıldı. Taurin I/R uygulamasından 45 dakika önce i.p yol ile verildi. Tübüler hasar ve yapısal değişikler ışık mikroskobi ile değerlendirildi. Serum kreatinin ve BUN ölçümü sırasıyla Jaffe ve üreaz yöntemleri kullanılarak Dokuz Eylül Üniversitesi Hasstanesi Merkez Laboratuarında ölçüldü. MDA düzeyi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile, SOD düzeyi ise kolorimetrik enzim aktivite kiti ile değerlendirildi. MMP-2 ve -9 için mRNA ekspresyon düzeyleri gerçek zamanlı PCR ile, aktiviteleri ise florometrik kit ile değerlendirildi. Total p38 ve p-p38 protein düzeyi western blot yöntemi ile saptandı. Sham grubu ile karşılaştırıldığında; I/R grubunda, böbrek tübüler dilatasyon ve fırçamsı kenar kaybı gibi karakteristik morfolojik değişikliklerde (p=0,004) ve
2
renal disfonksiyon belirteçleri olan BUN ve kreatinin düzeylerinde artış (p=0.000, p=0.000, sırasıyla) saptandı. I/R süresince artan MDA düzeyleri, taurin ile anlamlı olarak azaldı (p=0.023, p=0.0147; sırasıyla). I/R süresince azalan SOD düzeyleri ise taurin ile anlamlı olarak arttı (p=0.04, p=0.049; sırasıyla). Real-time PCR bulguları incelendiğinde ise I/R grubunda MMP-2 ve MMP-9 mRNA ekspresyonlarındaki artış taurin ile anlamlı olarak azaldı (p=0.05, p=0.00; p=0.04, p=0.03; sırasıyla). MMP-9 aktivitesinin sham grubuna göre, I/R de anlamlı olarak arttığı (p=0.01), bu artışın taurin ile azaldığı belirlendi (p=0.04). I/R süresince artan MMP-2 aktivitesini (p=0.01) taurinin anlamlı olarak azaltmadığı tespit edildi. Fosforile p38 (p-p38) protein ekspresyonunun ise, hasarlı grupta artarken, taurin uygulanan grupta anlamlı olarak azaldığı belirlendi. Sonuç olarak, taurinin renal I/R süresince oluşan oksidatif strese eşlik eden artmış MMP-2 ve MMP-9 mRNA ve enzim aktivite düzeylerini ve buna paralel olarak artmış p-p38 protein ekspresyon düzeylerini module ettiği gösterilmiştir.

Abstract:
Ischemia is defined as insufficient blood flow to an organ due to a blood clot or a mechanical
cause (especially during vascular surgery or organ transplantation). Reperfusion, on the other hand, is the restoration of blood flow to a tissue or an organ. Renal ischemia/reperfusion injury results from the formation of free oxygen radicals during this process. The severity of this injury increases with increasing duration of ischemia, and can present itself with various clinical conditions including prerenal azotemia (with minute tissue injury), or severe renal failure due to tubular or cortical necrosis. The aim of this study was to investigate the potential protective effect of taurine against renal ischemia/reperfusion injury in rats, and its inhibitory effect on matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MMP-9, which play a role in the regulation of extracellular matrix. Nineteen Winstar albino rats were divided into three experimental groups as follows: Sham (n=5), I/R (saline, intraperitoneally) (n=7) and I/R + taurine (200mg/kg intraperitoneally) (n=7). Left kidneys of rats in the I/R group were exposed to 1 hour of ischemia, followed by 6 hours of reperfusion. Taurine was administered intraperitoneally 45 minutes before I/R. Light microscopy was used to evaluate tubular injury and structural changes. Serum creatinine and BUN were measured using colorimetric techniqe, jaffe and urease method, respectively at Central Laboratory, Dokuz Eylül University. High-performance liquid chromatography (HPLC) was used to analyze MDA levels. A colorimetric enzyme activity kit was used to analyze superoxide dismutase (SOD) levels. Real-time polymerase chain reaction (PCR) was used to analyze MMP-2 and MMP-9 mRNA expression levels. A fluorimetric kit was used to determine MMP-2 and MMP-9 enzyme activities. Total p38 and phospho-p38 (p-p38) levels were analyzed with Western blotting. I/R group had characteristic morphological changes including renal tubular dilation
4
and loss of brush borders (p=0.004), compared to the sham group. Moreover, creatinine and BUN levels were elevated significantly in the I/R group, compared to the sham group (p=0.000 and p=0.000, respectively). MDA levels were higher in the I/R group, but decreased significantly after taurine treatment (p=0.023, and p=0.0147, respectively). SOD levels were lower in the I/R group compared to the sham group, but increased significantly after taurine treatment (p=0.04, and p=0.049, respectively). Real-time PCR analysis showed statistically significant higher MMP-2 and MMP-9 mRNA expression in the I/R group compared to the sham group; however, taurine treatment caused significantly decrease in MMP-2 and MMP-9 mRNA expression levels (p=0.04, p=0.00; and p=0.04, p=0.03, respectively). MMP-9 activity was significantly higher in the I/R group (p=0.01), and decreased significantly after taurine treatment (p=0.04). However, taurine had no significant effect on increased MMP-2 activity in I/R group. Phosphorylated p38 (p-p38) protein levels were significantly higher in the I/R group, whereas taurine treatment caused a significant decrease. In conclusion, taurine modulated increased both mRNA expression and enzyme activities of MMP-2 and MMP-9, and also p-p38 protein expression that accompany increased oxidative stress during renal I/R.