Bir probiyotik olan saccharomyces cerevisiae'nın candida parapsilosis biyofilmine veantifungal duyarlılık paternine etkisinin in-vitro testlerle araştırılması ve antifungaltedaviye etkinliğinin deneysel fare modelinde incelenmesi
Investigating the effects of the probiotic saccharomyces cerevisiae on candida parapsilosis biofilm and antifungal susceptibility patterns with in-vitro tests and examining its efficacy in antifungal treatment in an experimental mouse model
Yazar: GAMZE ALÇİ
Danışman: PROF. DR. SEMA AŞKIN KEÇELİ
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Biyofilmler = Biofilms ; Candida parapsilosis = Candida parapsilosis ; Probiyotikler = Probiotics ; Saccharomyces cerevisiae = Saccharomyces cerevisiae ; Sinerji = Synergy

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı, Saccharomyces cerevisiae probiyotiğinin Candida
parapsilosis biyofilmine ve antifungal duyarlılık paternine olan etkilerini in-vitro testlerle
araştırmak, ayrıca probiyotiğin antifungal tedaviye olan etkinliğini deneysel fare modelinde
incelemektir
Yöntem: Bu çalışmada, C. parapsilosis ATCC 22019 ve probiyotik olarak S. cerevisiae
ATAFM2021 suşları; antifungal olarak, flukonazol (FLU), kaspofungin (CAS), amfoterisin-
B (AMB) kullanılmıştır. İn vitro testlerde biyofilm miktarları, kristal viyole yöntemiyle
absorbans değerleri şu gruplarda ölçülmüştür; tek başına C. parapsilosis'in oluşturduğu
biyofilm; tek başına S. cerevisiae'nın oluşturduğu biyofilm; S. cerevisiae ve C.
parapsilosis'nin aynı anda uygulandıktan sonraki biyofilm (grup-1); S. cerevisiae
inokülasyonundan 60 dak. sonra C. parapsilosis 'in uygulandığı biyofilm (grup-2); C.
parapsilosis inokülasyonundan 60 dak. sonra S.cerevisiae 'nin uygulandığı biyofilm (grup-
3). Antifungal duyarlılık testleri mikrobroth dilüsyon yöntemi ile CLSI M27-A3 rehberine
göre yapılmıştır ve minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerlerindeki değişimler
incelenmiştir. C.parapsilosis biyofilminde antifungallerle birlikte probiyotiğin etkinliği
Checkerboard yöntemi ile araştırılmış ve fraksiyonel inhibitör konsantrasyon (FIC) indeksi
hesaplanmıştır. In vivo deneylerde, BALB/C erkek farelerde kuyruk veninden C.
parapsilosis verilerek kandidiyazis modeli oluşturulmuştur. Enfeksiyondan 24 saat sonra, 5
gün boyunca intraperitoneal yolla antifungal tedavi uygulanmıştır. Probiyotik içme sularına
eklenmiştir. Probiyotik uygulaması, iki farklı ana grupta, enfeksiyondan 5 gün sonra ve
enfeksiyondan 14 gün önce başlayarak enfeksiyon sonrası 5 gün boyunca verilmiştir.
Tedavinin 5. gününde sakrifikasyon yapılarak fare böbreklerinden izole edilen C.
parapsilosis'in koloni sayıları kob/ml/g cinsinden hesaplanmıştır.
Bulgular: İn vitro testlerde, absorbans değerleri karşılaştırıldığında, S. cerevisiae'nin C. parapsilosis üremesi üzerine etkisi olmadığı gözlenmiştir. C.parapsilosis'nin oluşturduğu biyofilme kıyasla gruplardaki biyofilm miktarları karşılaştırıldığında, grup1 'de %11, grup2'de %15, grup3'te %28 oranında daha az biyofilm miktarı saptanmıştır. C.parapsilosis'in tek başına oluşturduğu biyofilmin antifungal SMİK50 değerleri deney gruplarına göre karşılaştırıldığında, AMB'de grup1'de 2 kat, grup 2 ve grup 3'te ise 4 kat düştüğü; CAS'ta tüm gruplarda 2 kat; FLU'da ise grup1 ve grup2'de 4 kat, grup 3'te ise 16 kat düştüğü belirlenmiştir.C. parapsilosis biyofilminin probiyotik ile birlikte antifungallere etkinliği test edildiğinde FICi değerlerine göre; AMB ve CAS kullanıldığında tüm deney gruplarında probiyotik ile sinerjik etki gözlenmiştir. FLU kullanıldığında ise grup2 ve grup3'te sinerjik etki gözlenmiştir.
İn vivo deneylerde, böbrek C. parapsilosis koloni sayıları, probiyotiğin enfeksiyondan 14 gün önce verildiği ve enfeksiyondan sonra antifungal tedavilerle birlikte probiyotik verildiği gruplarda en yüksekten en düşüğe doğru FLU, AMB, CAS grupları şeklinde sıralanmıştır. Enfekte edilip tedavi uygulanmayan kontrol grubunda ortalama 133,3 kob/ml/g C. parapsilosis tespit edilmiştir. Koloni sayıları, enfeksiyon sonrası sadece probiyotik verilen grupta ortalama 110,8, probiyotikle birlikte CAS verilen grupta 32, AMB grubunda 66, FLU grubunda 80 kob/ml/g olarak saptanmıştır. Enfeksiyondan 14 gün önce ve sonrasında probiyotik ile antifungal tedavi uygulanan gruplardaki koloni sayısı; sadece probiyotik verilen grupta ortalama 115, CAS grubunda 48,5; AMB grubunda 46,5; FLU grubunda ise 91,5 kob/ml/g'dır.
Sonuç: İn vitro test sonuçlarına göre, S. cerevisiae probiyotiğinin önceden uygulanması C. parapsilosis biyofilmini inhibe etmiştir. Ayrıca, S. cerevicae, C. parapsilosis'in antifungal MİK değerlerinin azalmasına neden olmuştur. S. cerevicae'nın CAS ve AMP ile uygulanması ile sinerjik etki saptanmış olup, FLU'de ise bir fark saptanamamıştır. Deneysel kandidiyazis modelinde tüm gruplarda, en etkili antifungalin CAS olduğu gözlenmiştir. Enfeksiyondan 14 gün önce probiyotik verilmesi sadece AMB grubunda tedavi sonucunu olumlu etkilemiş olup, CAS ve FLU etkinliğinde ise anlamlı bir değişikliğe neden olmamıştır. Sonuç olarak, S. cerevisiae, C. parapsilosis enfeksiyonlarının tedavisinde potansiyel bir yardımcı ajan olarak değerlendirilebilir.

Abstract:
Objective: The aim of this study is to investigate the effects of the probiotic Saccharomyces cerevisiae on Candida parapsilosis biofilm formation and antifungal susceptibility patterns with in-vitro tests. Additionally, the study aims to examine the efficacy of the probiotic in enhancing antifungal treatment in an experimental mouse model.

Methods: In this study, the strains C. parapsilosis ATCC 22019 and S. cerevisiae ATAFM2021 (used as a probiotic) were utilized, along with the antifungals fluconazole (FLU), caspofungin (CAS), and amphotericin-B (AMB). In-vitro tests measured biofilm quantities by absorbance values using the crystal violet method in the following groups: biofilm formed by C. parapsilosis alone; biofilm formed by S. cerevisiae alone; biofilm formed after the simultaneous application of S. cerevisiae and C. parapsilosis (group-1); biofilm formed after the application of C. parapsilosis 60 minutes post S. cerevisiae inoculation (group-2); and biofilm formed after the application of S. cerevisiae 60 minutes post C. parapsilosis inoculation (group-3). Antifungal susceptibility tests were conducted using the microbroth dilution method according to CLSI M27-A3 guidelines, and changes in minimum inhibitory concentration (MIC) values were examined. The efficacy of the probiotic in conjunction with antifungals against C. parapsilosis biofilm was investigated using the Checkerboard method, and the fractional inhibitory concentration index (FICi) was calculated. In vivo experiments involved creating a candidiasis model in BALB/C male mice by administering C. parapsilosis through the tail vein. Antifungal treatment was administered intraperitoneally for 5 days, starting 24 hours after infection. The probiotic was added to their drinking water. Probiotic administration was given in two main groups: starting 5 days post-infection and starting 14 days before infection, continuing for 5 days post-infection. On the 5th day of treatment, mice were sacrificed, and the colony counts of C. parapsilosis isolated from their kidneys were calculated in CFU/ml/gr.
Results: In the in-vitro tests, comparing absorbance values, it was observed that S. cerevisiae had no effect on the growth of C. parapsilosis. When comparing the biofilm amounts in the groups to the biofilm formed by C. parapsilosis alone, there was 11% less biofilm in group 1, 15% less in group 2, and 28% less in group 3. When comparing the SMIC50 values of antifungals for the biofilm formed by C. parapsilosis alone to the experimental groups, it was found that the values for AMB decreased by 2-fold in group 1 and by 4-fold in groups 2 and 3; for CAS, the values decreased by 2-fold in all groups; and for FLU, the values decreased by 4-fold in groups 1 and 2, and by 16-fold in group 3. When testing the efficacy of antifungals in combination with the probiotic against C. parapsilosis biofilm, based on FICi values, a synergistic effect was observed in all experimental groups with AMB and CAS. With FLU, a synergistic effect was observed in groups 2 and 3. In the in vivo experiments, the C. parapsilosis colony counts in the kidneys were ranked from highest to lowest as follows: FLU, AMB, and CAS in the groups where the probiotic was administered 14 days before infection and continued post-infection along with antifungal treatments. In the infected control group that received no treatment, an average of 133.3 CFU/ml/gr of C. parapsilosis was detected. The colony counts were as follows: in the group given only the probiotic post-infection, an average of 110.8 CFU/ml/gr; in the group given CAS with the probiotic, 32 CFU/ml/gr; in the AMB group, 66 CFU/ml/gr; and in the FLU group, 80 CFU/ml/gr. In the groups where the probiotic and antifungal treatment were administered both 14 days before and post-infection, the colony counts were: in the group given only the probiotic, an average of 115 CFU/ml/gr; in the CAS group, 48.5 CFU/ml/gr; in the AMB group, 46.5 CFU/ml/gr; and in the FLU group, 91.5 CFU/ml/gr.
Conclusion: According to the in-vitro test results, the pre-application of the S. cerevisiae probiotic inhibited the biofilm of C. parapsilosis. Additionally, S. cerevisiae caused a reduction in the antifungal MIC values of C. parapsilosis. A synergistic effect was detected with the application of S. cerevisiae in combination with CAS and AMP, while no difference was observed with FLU. In the experimental candidiasis model, CAS was found to be the most effective antifungal across all groups. Administering the probiotic 14 days before infection positively affected the treatment outcome only in the AMB group, with no significant change in the efficacy of CAS and FLU. In conclusion, S. cerevisiae can be considered a potential adjunctive agent in the treatment of C. parapsilosis infections.