Sıçanlarda steroidin indüklediği femur başı osteonekrozu üzerine timokinon'un etkisi
Protective effects of thymoquinone on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rats
Yazar: MUSTAFA FATİH DAŞCI
Danışman: UZMAN ENDER ALAGÖZ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Bağcılar Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology
Dizin: Femur = Femur ; Femur başı = Femur head ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Metilprednizolon = Methylprednisolone ; Osteonekroz = Osteonecrosis ; Steroidler = Steroids ; Sıçanlar = Rats ; Timokinon = Thymoquinone ; Timokinon = Thymoquinone

Özet:
Amaç: Timokinon (TQ), Nigella Sativa (Çörek otu) bitkisinden izole edilmiş aktif bir bileşendir. Bu tez çalışmasında sıçanlarda steroid ile indüklenmiş femur başı osteonekroz (FBON) modelinde, TQ tedavisinin antioksidan, anti-apoptotik, osteoblastik ve hipolipidemik etkilerinin radyolojik, biyokimyasal, histopatolojik, histomorfometrik ve immunohistokimyasal açıdan değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Toplam 24 adet Sprague-Dawley cinsi genç-erişkin erkek sıçan randomize olarak dört gruba ayrıldı. Kontrol grubuna dört hafta süresince oral yoldan salin solüsyonu verildi. TQ grubuna dört hafta oral TQ (10 mg/kg/gün) uygulandı. LPS/MPS ve LPS/MPS+TQ grubunda FBON modeli için Lipopolisakkarit (LPS) (20 µg/kg) ve Metilprednizolon (MPS) (40 mg/kg) enjeksiyonları uygulandı. LPS/MPS+TQ grubunda FBON indüklenmesi ile beraber her gün ve günde bir kez oral TQ (10 mg/kg/gün) uygulandı. Tüm sıçanlara dördüncü haftanın sonunda genel anestezi altında intrakardiyak kan alma ve sakrifikasyon işlemi uygulandı ve sağ femurları cerrahi olarak çıkartıldı. Ayrılan serumlarda biyokimyasal inceleme için ELISA yöntemi ile ölçüm yapıldı. Çıkarılan tüm kemik dokularına mikro-BT görüntülemesi yapıldı. Ardından femur başı kemik dokularına histopatolojik, histomorfometrik ve immunohistokimyasal incelemeler yapıldı. 
Bulgular: Mikro-BT değerlendirmesinde LPS/MPS+TQ grubunda; LPS/MPS grubuna göre daha yüksek BMD, daha düşük porozite, Tr. Sp ve Tr. Sep verileri elde edildi. Histopatolojik incelemede osteonekroz; LPS/MPS grubunda diğer gruplara kıyasla anlamlı derecede artarken, LPS/MPS+TQ grubunda anlamlı derecede düştüğü tespit edildi (P = 0,0077). LPS/MPS grubunda kemik iliğinin normal morfolojisini kaybettiği, hematopoetik hücrelerin sayısının azaldığı görüldü. Bunlara nekroz ve hemorajinin eşlik ettiği ve bazılarında trombus varlığı belirlendi. LPS/MPS+TQ grubunda kemik iliğinin normal morfolojisini koruduğu, hematopoetik hücre sayısının arttığı görüldü. Histomorfometrik incelemede LPS/MPS grubunda BV/TV yüzdesi, kontrol ve diğer gruplara kıyasla anlamlı derecede düşük olduğu (sırasıyla P<0,01 ve P<0,05), LPS/MPS+TQ grubunda ise normal oranlara ulaştığı tespit edildi. İmmünohistokimyasal incelemede LPS/MPS grubunda 8-OHdG immünoreaktivitesinin arttığını ve TQ' nun bu hasarı dokunun tüm bölümlerinde neredeyse tamamen iyileştirdiğini tespit edildi. Dokuda MDA düzeylerinin LPS/MPS grubunda arttığı ve LPS/MPS+TQ grubunda anlamlı olarak gerilediği fakat kontrol grubu düzeylerine ulaşamadığı tespit edildi. Bcl-2 immunoreaktiviteleri LPS/MPS uygulanan sıçanların dokularında düşük olduğu buna karşın TQ tedavisiyle arttırdığı belirlendi. LPS/MPS grubunun caspase-3 immunoreaktivitelerinin anlamlı düzeyde arttığı ve LPS/MPS+TQ grubunda kontrol seviyelerine gerilediği görüldü. VEGF immunoreaktivitelerinin LPS/MPS grubunda düşerken tedavi grubunda neredeyse normal düzeylerine ulaştığı belirlendi. Serum biyokimyasal incelemesinde MDA düzeyleri LPS/MPS+TQ grubunda, LPS/MPS grubunun serum düzeylerine kıyasla anlamlı derecede (P<0,01) düştüğü tespit edildi. Serum GSH düzeyleri FBON modelinde anlamlı derecede düştüğü ve TQ tedavisiyle bu düzeylerin anlamlı olarak arttığı görüldü(P<0,01). LPS/MPS grubunun kemik rezorpsiyon belirteci olan serum CTX seviyesi anlamlı derecede yüksek bulunurken; tedavi gruplarında kontrol seviyesine geriledi. TQ uygulamasının LPS/MPS ile indüklenen HDL kolesterol düşüşü ve LDL kolesterol yükselişini anlamlı derecede düzelterek normal seviyelere yaklaştırdığı belirlendi.
Sonuç: Tüm verilerimiz sıçanlarda oluşturulan FBON modelinde LPS ve steroid kaynaklı DNA oksidatif ve lipit peroksidatif hasarın bir sonucu olarak ortaya çıkan vasküler ve hematopoetik hücre hasarlarının TQ uygulanmasıyla başarılı bir şekilde azaltılabileceği gösterildi. Bu antioksidan ve apoptoz önleyici etki; erken evre osteonekroz için umut verici bir tedavi olabilir.

Anahtar kelimeler: Timokinon, femur başı osteonekroz, metilprednizolon, lipopolisakkarit

Abstract:
Aim: Thymoquinone (TQ) is an active ingredient isolated from the Nigella Sativa (Nigella) plant. In this thesis study, it was aimed to evaluate the antioxidant, anti-apoptotic, osteoblastic and hypolipidemic effects of TQ therapy on the steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (ONFH) model in rats in terms of radiological, biochemical, histopathological, histomorphometric and immunohistochemical aspects.
Materials and Methods: A total of 24 Sprague-Dawley young-adult male rats were randomly divided into four groups. Saline solution was administered orally to the control group for four weeks. TQ group was administered TQ (10 mg / kg / day) orally for four weeks. Lipopolysaccharide (LPS) (20 µg / kg) and Methylprednisolone (MPS) (40 mg / kg) injections were applied to establish ONFH model in LPS / MPS and LPS / MPS + TQ groups. After the establishment of ONFH in LPS / MPS + TQ group, oral TQ (10 mg / kg / day) was administered once daily. All rats underwent an intracardiac blood collection and sacrificed under general anesthesia at the end of fourth week, and right femurs were surgically removed. Analysis was carried out by ELISA method for biochemical examination in the serum. Micro-CT imaging was performed on all bone tissues removed. Then, histopathological, histomorphometric and immunohistochemical examinations were performed on the paraffin sections of femoral head.
Results: In micro-CT evaluation, a higher BMD and lower porosity, Tr. Sp and Tr. Sep data were detected in LPS / MPS + TQ group compared to LPS / MPS group. In histopathological examination, it was found that osteonecrosis increased significantly in LPS / MPS group compared to other groups but decreased in LPS / MPS + TQ group (P = 0.0077). The bone marrow was observed to lose its normal morphology, and the number of hematopoietic cells decreased in LPS / MPS group. These were accompanied by necrosis and hemorrhage, and the thrombus was determined in some of rats. In LPS / MPS + TQ group, it was observed that the bone marrow preserved its normal morphology and the number of hematopoietic cells increased. Histomorphometric examination revealed that the percentage of BV / TV in LPS / MPS group was significantly lower compared to the control and other groups (P <0.01 and P <0.05, respectively), while reached normal rates in LPS / MPS + TQ group. Immunohistochemical examination revealed that 8-OHdG immunoreactivity increased in LPS / MPS group and TQ almost completely healed this damage in all parts of tissue. It was determined that MDA levels in tissue increased in LPS / MPS group and decreased significantly in LPS / MPS + TQ group but could not reach the control levels. Bcl-2 immunoreactivity was low in the tissues of LPS / MPS treated rats but increased by TQ treatment. Caspase-3 immunoreactivity of LPS / MPS group increased significantly while decreased to control levels in LPS / MPS + TQ group. It was determined that VEGF immunoreactivity decreased in LPS / MPS group but reached almost to normal levels in the treatment group. In serum biochemical examination, MDA levels was found to reduce significantly (P <0.01) in LPS / MPS + TQ group compared to the serum levels of LPS / MPS group. Serum GSH levels was observed to reduce significantly in the ONFH model and these levels elevated significantly with TQ treatment (P <0.01). While the serum CTX level, which is the bone resorption marker, was found significantly higher in LPS / MPS group but decreased to the control level in treatment groups. It was determined that TQ application significantly improved the LPS / MPS-induced HDL cholesterol decrease and LDL cholesterol elevation by approximating to the normal levels.
Conclusion: All of our data showed that the vascular and hematopoietic cell damages that occur as a result of steroid-induced DNA oxidative and lipid peroxidative damages in the ONFH model established in rats can be successfully ameliorated by TQ administration. This antioxidant and anti-apoptosis effects of TQ may be a promising treatment option for early stage of osteonecrosis.

Key words: Thymoquinone, osteonecrosis of femoral head, methylprednisolone, lipopolysaccharide