18F-FDG-grayanotoksin-gadolinyum-nanoparçacıkların sentezi ve in vitro biyoetkinliklerin incelenmesi
In vitro bioactivity evaluation of synthesized 18F-FDG grayanotoxin-gadolinium-nanoparticles
Yazar: TALHA SIDDIK AKKAYA
Danışman: PROF. DR. PERİHAN ÜNAK ; ÖĞR. GÖR. İSKENDER İNCE
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nükleer Bilimler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry ; Radyoloji ve Nükleer Tıp = Radiology and Nuclear Medicine

Özet:
Bu çalışmada, Ericaceae familyasına ait Rhododendron ponticum L. (mor çiçekli orman gülü) cinsi otlar ve deli bal içerisinde doğal olarak bulunan grayanotoksin III (GTX-III) bileşiği mor çiçekli orman gülü yaprağı, çiçeği ve deli baldan ekstrakte edildikten sonra Gadolinyum Naoparçacıklar (GdO@Si-NP) ile konjuge edilmiş daha sonra sentezlenen Gadolinyum Naoparçacıklar 2deoksi-2-(F-18) floro-D-glukoz (18F-FDG) ile konjuge edilerek radyoişaretlenmiştir. İnsan Meme Adenokarsinom (MCF7) ve Prohormone Konvertaz 3 (PC3) hücrelerinde in vitro olarak biyoetkinlikleri biyoetkinlikleri Gd MR kontrastından yararlanarak incelenmiştir. 

Grayanotoksin-III bileşikleri, orman gülü yaprağı ve çiçeği kurutulduktan sonra metanol ile ekstraksiyon, etil asetat ile kristallendirme işlemi ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) cihazı ile saflaştırılmıştır. Grayanotoksin III bileşiğinin  deli baldan eldesi ise metanol ile ekstrakte edilip katı faz ekstraksiyonu (SPE) kartuşundan geçirilerek HPLC cihazı ile saflaştırılmıştır. Grayanotoksin-III (GTX-III) bileşiği Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi (LC-MS) ve Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) spektroskopisi ile tanımlanmıştır. Gadolinyum Nanoparçacıklar (Gd-NP) birlikte çöktürme yöntemi ile sentezlenmiş ve silikalama işlemi gerçekleştirildikten sonra Dynamic Light Sccattering (DLS) ile boyut ölçümü gerçekleştirilmiştir. Gd-NP' ın yapı tayini Tarayıcı Elektron Mikroskobu (SEM) cihazı ile gerçekleştirilmiştir.  Sentezlenen silikalı Gadolinyum nanoparçacıkları (GdO@Si-NP)  1,1'Karbonildiimizadol/N-Hidroksi Süksinimid (CDI/NHS) metodu kullanılarak orman gülü yaprağı, çiçeği ve deli baldan elde edilen GTX-III-Yaprak (GTX-III-Y) GTX-III-Çiçek (GTX-III-Ç) ve GTX-III-Bal (GTX-III-B) bileşikleri ile konjuge edilmiştir.  GTX-III bileşiklerinin GdO@Si-NP ile konjugasyon verimi HPLC analizi ile % 100 olarak saptanmıştır. Konjugasyon ürünü olan GTX-III-Y-GdO@Si-NP, GTX-III-Ç-GdO@Si-NP ve GTX-III-B-GdO@Si-NP'ın, PC3 ve MCF7 hücrelerine sitotoksik etkisi ve inkorporasyonu incelenmiştir. Sitotoksisite çalışmalarında, PC3 ve MCF7 hücreleri 0,25-0,5-1-5-10-25 μg/mL konsantrasyonlarında konjugasyon ürünü ile muamele edilip 24 saat inkübe edildikten sonra IC50 oranları belirlenmiştir. İnkorporasyon  çalışmalarında PC3 ve MCF7 hücrelerine 96'lık kuyular içerisinde 10 μg/mL konsantrasyonda, 0,2 mL madde ile muamele edilmiş ve 1, 4, 8 ve 24 saatlerde inkorporasyon değerleri hücrelerin MR görüntülemesinden elde edilen kontrast değerleri ile belirlenmiştir. GTX-III-Y-GdO@Si-NP, GTX-III-Ç-GdO@Si-NP ve GTX-III-B-GdO@Si-NP'ın 18F-FDG ile konjugasyonu CDI/NHS metodu kullanılarak gerçekleştirilmiş ve ve bağlanma verimi ince tabaka radyokromatografisi (Thin Layer Radiochromatography) (TLRC) ve HPLC analizleri ile belirlenmiştir.

Yapılan çalışmalar sonucunda, orman gülü ve deli baldan izole edilen GTX-III bileşiklerinin MCF7 ve PC3 hücrelerine sitotoksik etkisi olduğu gösterilmiştir. GdO@Si-NP' ın MCF7 hücreleri için bu sitotoksik etkiyi düşürdüğü PC3 hücreleri için sitotoksik etkiyi arttırdığı gösterilmiştir. Sentezlenen GTX-III-Y-GdO@Si-NP, GTX-III-Ç-GdO@Si-NP ve GTX-III-B-GdO@Si-NP ile MCF7 ve PC3 hücrelerinin MR görüntüleri alınarak inkorporasyon veriminin hesaplanabileceği gösterilmiştir. CDI/NHS metodunun GTX-III, GdO@Si-NP ve 18F-FDG bileşiklerinin konjugasyonu için uygun olduğu gösterilmiştir. Sentezlenen GXT-III-GdO@Si- NP' ların PC3 ve MCF7 hücre hatlarında MR kontrastı verdiği gösterilmiş ve 18F-FDG ile işaretlenmiştir. Elde edilen sonuçlar sentezlenen bileşiklerin teranostik ajan olarak kullanımında umut vaadetmektedir.

Abstract:
In this study, Grayanotoxin III (GTX-III) compounds which can be found naturally in Rhododendron ponticum L. (purple coloured forest rose plant, which belongs to Ericaceae family) and ''mad honey'', were extracted from the leaves and flowers of the forest rose and mad honey. The extracted compound then conjugated with Gadolinium nanoparticles (GdO@Si-NP). Synthesized Gadolinium nanoparticles were conjugated and radiolabelled with 2deoksi-2-(F-18) floro-D-glukoz (18F-FDG). Afterwards, bioactivity of the conjugation product was investigated by applying to Breast Adenokarsinom (MCF7)  and Prohormone Konvertaz 3 (PC3) cell lines and evaluated together with the MR image contrasts.

Grayanotoxin-III compounds were romeved from dried leaves and flowers of the forest rose extracted with methanol and crystalized with etil acetate and then purified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). However, mad honey was mixed with methanol and, the extract was passed through solide phase extraction (SPE) cartridge for seperation of the compounds and then the extract was purified by HPLC. Grayanotoxin-III (GTX-III) compound was identified with Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (LC-MS) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy method. Gadolinium nanoparticles (Gd-NP) were synthesized by co-precipitation method and silicated. Size of the nanoparticles was measured by using Dynamic Light Scattering (DLS) and characterization of the nanoparticles was defined by using Scanning Electron Microscopy (SEM). By using 1,1'carbonyldiimidazole/N-Hydroxysuccinimide (CDI/NHS) conjugation method, synthesized gadolinium nanoparticles (GdO@Si-NP) were conjugated with GTX-III-Yaprak (GTX-III-Y) GTX-III-Çiçek (GTX-III-Ç) ve GTX-III-Bal (GTX-III-B)  compounds. The yield of the conjugation process was determined with HPLC analysis and found to be100 %. 

Bioactivity of the conjugated nanoparticles (GTX-III-Y-GdO@Si-NP, GTX-III-Ç-GdO@Si-NP ve GTX-III-B-GdO@Si-NP) was investigated by carrying out cytotoxicity and incorporation tests on PC3 and MCF7 cell lines. Cytotoxicity tests were done with 0.25-0.5-1-5-10-25 μg/mL substance concentrations, after 24 for hours of observation in the incubation process, IC50 values were determined. In the incorporation studies, 0.2 mL of the substance concentrated with 10 μg/mL were added into the 96 well plate which was having PC3 and MCF7 cells. The cells were observed for the 1st, 4th, 8th and 24th hours and incorporation values were evaluated by using contrast values from MR image of the PC3 and MCF-7 cell cultures.

Conjugation of 18F-FDG with GTX-III-Y-GdO@Si-NP, GTX-III-Ç-GdO@Si-NP and GTX-III-B-GdO@Si-NP, were caryyied out with CDI/NHS method and yield of the conjugation process  was determined by Thin Layer Radiochromatography (TLRC) and HPLC analysis. 

In conclusion, GTX-III compounds extracted from forest rose and mad honey, were  found to be cytotoxic to MCF7 and PC3 cell lines. However, GdO@Si-NP decreased the  cytotoxicity to MCF7 while increasing PC3 cells. It was shown that incorporation studies can be carried out by using Gadolinium NP contrasts of MCF7 and PC3 cell lines, that was determined MR image technique. CDI/NHS method may be used for conjugation of GTX-III-GdO@Si-NP with 18F-FDG .  As a result of the study, the synthesized 18F-FDG-GTX-III-GdO@Si-NP compounds have the potential of being used as theranostic agents.