Köpek oositlerinin vitrifikasyon yöntemiyle dondurulması ve partenogenez aktivasyonu
Cryopreservation of canine oocytes by vitrification method and parthenogenetic activity
Yazar: RABİA GÖZDE ÖZALP
Danışman: PROF. DR. HAKAN SAĞIRKAYA
Bursa Uludağ Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2020
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Köpekler = Dogs ; Oositler = Oocytes ; Partenogenez = Partenogenesis ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Vitrifikasyon yöntemi = Vitrification method

Özet:
Pet hayvanlarında biyoteknolojik çalışmalar son yıllarda hız kazanmaya başlamıştır. Köpeklerde başarısız yardımcı üreme teknikleriyle ilgili oluşan sorular, muhtemelen köpek türlerinin reproduktif fizyolojisine ait yetersiz bilgiden kaynaklanmaktadır. Bu konuda yapılan araştırmaların hız kazanmasında duygusal nedenler önemlidir. Fakat diğer taraftan pet biyolojisindeki uygulamalar, insan hastalıkları için model oluşturmaktadır. Bunun ötesinde gamet kriyopreservasyonunun gelişmesi, nesli tükenmekte olan türlerin korunması ve genetik banka oluşturulması için önemlidir. Köpek oositlerindeki düşük maturasyon oranlarına rağmen, bu tezde, partenogenetik aktivasyonun etkileri, vitrifiye matur oositlerde test edilmiştir.  
Köpek oositleri, Yıldırım Belediyesi Sokak Hayvanları Bakım ve Rehabilitasyon merkezinden alınan, 10 adet sağlıklı köpekten toplanmıştır. Ovaryumların tekrarlı parçalanmasından sonra, seçilen kumulus oosit kompleksleri, 5%CO2 inkübatörde,  mineral yağla kaplanmış 500 µl TCM-199 içeren dört-gözlü petrilerde, 39°C'de,  72  saat boyunca maturasyona bırakılmıştır. Maturasyondan sonra oositler, 0%, 10%, 20% etilen glikol içeren 50 ml PBl içinde sırasıyla, 10, 10 dakika ve 30 saniye muamele edilmiştir. Oositler, 30 µl VS3 içeren kriyoviallere yerleştirilerek sıvı nitrojende dondurulmuştur. Bu grubun oositleri (n=257) vitrfiye oosit 'VO' olarak gruplanmıştır. Çözdürme sonrasında, oositler ionomisinle 5 dakika ve sikloheksimid ile 3 saat muamele ederek partenogenetik aktivasyona bırakılmıştır. Sonrasında oositler 72 saat kültüre edilerek nükleer maturasyon değerlendirilmiştir. Kontrol grubu olarak kullanılan oositler (n=257), 'FO' olarak gruplandırılmıştır. maturasyondan sonra, oositler direkt olarak ionomisin ve sikloheksimid ile muamele edilerek aktivasyona bıkarılmıştır ve 72 saat kültüre edilmiştir. Tüm oositler Hoechst33342 ile 30 dakika boyandıktan sonra nükleer maturasyon oranları faz kontrast mikroskopta değerlendirilmiştir.  
Maturasyon oranları (MI+MII) gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bulunamamıştır (p>0,05). 
Maturasyon sonrasında, vitrifiye köpek oositlerinde partenogenetik aktivasyona bağlı nükleer değerlendirmeye çalışması bulunmamaktadır. Fakat bu uygulamada elde edilen düşük maturasyon oranlarının, ileri moleküler çalışmalarla açıklanması gerektiği kanısındayız. 

Anahtar Kelimeler: Köpek oositleri, vitrifikasyon, in vitro maturasyon, partenogenetik aktivasyon

Abstract:
Biotechnologic researches in pet animals have been run up in recent years. Raised questions about unsuccesful assisted reproductive technologies in canid species are probably related with poor information in reproductive physiology of canid species. The studies about this subject has been thought to be motivated by emotional reasons. But on the other hand  the applications in pet biology is accepted as model for human diseases. Apart from this, development of gamete cryopreservation is an important tool for genetic bank and conservation of endangered species. In spite of low maturation rates of canine oocytes, the results of parthenogenetic activation has been tried to maturated and vitrified-warmed canine oocytes in this thesis.  
Oocytes were collected from 10 healthy bitches at Yıldırım Municipality Stray Animals Sterilization and Rehabilitation Center. After slicing of ovaries, selected cumulus oocyte complexes were maturated for 72 h at 39°C in four-well petri dishes containing 500 µl TCM-199 under mineral oil in a 5%CO2 incubator. After maturation, oocytes were exposed to 50 ml PBl containing 0%, 10%, 20% ethylene glycol for 10, 10 minutes and 30 seconds respectively. They were vitrified in cryovials containing 30 µl VS3 in liquid nitrogen. The oocytes in this group (n=257) were grouped as vitrified oocyted 'VO'. After warming, the oocytes were parthenogenetically activated with ionomycin for 5 minutes and followed by cycloheximide for 3 hr. Oocytes were then cultured for 72 hr and assessed for nuclear maturation. The oocytes (n=257), grouped as fresh oocytes 'FO' were used as control group. After maturation, oocytes were directly incubated with ionomycin and cycloheximide for parthenogenetic activation and cultured for 72 h. All oocytes were stained with Hoechst33342 for 30 min and nuclear maturation rates were assessed using a phase contrast microscope.  
Maturation rates (MI+MII) between groups had not been found statistically different (p>0,05). 
To our knowledge there is no information available about the influence of parthenogenetic activation on nuclear maturation after vitrification of maturated canine oocytes. However, low maturation rates should be clarified by further molecular studies. 

Keywords: Canine oocytes, vitrification, in vitro maturation, parthenogenetic activation