Tavşanda oluşturulan korneal epitel-stromal defektlerde 3D bioprinter ile basılmış antibiyotik ilaveli deselülerize amniyon membranın yara iyileşmesi üzerine etkisinin araştırılması
The effects of a decellularized amniotic membrane with added antibiotics, printed using a 3D bioprinter, on wound healing i̇n rabbit models with corneal epithelial-stromal defects
Yazar: DİLMERAN ŞİMŞEK PARMAKSIZ
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM EVREN KEMER
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Ankara Bilkent Şehir Hastanesi / Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Göz Hastalıkları = Eye Diseases

Özet:
AMAÇ: 3D (üç boyutlu) bioprinter ile basılmış antibiyotik ilaveli deselülerize amniyon membranın tavşanda oluşturulan korneal epitel-stromal defektlerde yara iyileşmesi üzerine etkisinin araştırılmasıdır.
GEREÇ VE YÖNTEM: Çalışma Ankara Şehir Hastanesi Göz Hastalıkları Kliniği'nde gerçekleştirildi. Elektif sezaryen ile term doğum yapmış̧, serolojik tarama testleri negatif 3 sağlıklı gebeye ait 3 plasenta amniyon membran (AM) eldesi için alındı. AM'ler yıkama solüsyonu ile yıkanarak hem amniyon membran transplantasyonu (AMT) hem de 3D bioprinterda hazırlanacak form için hazırlandı. Transplantasyon için kriyoprezerve AM kullanıldı. 3D bioprinterda basım süreçleri öncesi deselülerizasyon protokolleri uygulandı Çalışmanın deney aşaması Sağlık Bilimleri Üniversitesi Ankara Sağlık Araştırma Uygulama Merkezi'nde (ASAUM) gerçekleştirildi. Yirmi bir adet 'Yeni Zelanda' tavşanı kullanıldı. Tüm tavşanların sağ gözünde 7,5 mm çapında vakum trepan ile epitel ve stroma yaklaşık 120 mikron derinlikte defekt oluşturulup kresent ile debride edildi. Tavşanlar, 7'şer tavşandan oluşan 2 çalışma ve 1 kontrol grubu olacak şekilde gruplandırıldı. Tavşanların hasar oluşturulmayan diğer gözleri ise sağlıklı kontrol grubu olarak kullanıldı. Grup 1'deki(Hasar grubu) tavşanlara herhangi bir tedavi uygulanmadı. Grup 2'teki (3D printer grubu) tavşanlara 3D bioprinterda basılan deselülerize antibiyotik ilaveli amniyon uygulandı. Tavşan gözlerinde sabit durması için özel basılmış biyouyumlu kafesi (polikaprolakton) üzerine dikildi. Grup 3'tekilere (Amniyon grubu) amniyon membran transplantasyonu (AMT) + 4x1vankomisin fortifiye (50 mg/cc) göz damlası uygulandı. Grup 4 olarak da sağlıklı diğer gözleri belirlendi histolojik kesitler için kontrol amaçlı alındı. Grup 2 ve 3'te birer tavşanda cerrahi modelleme sırasında perforasyon görülmesi üzerine amniyon uygulaması yapıldı fakat istatistiksel değerlendirme dışı bırakıldı. Uygulamanın yapıldığı gün 0. gün kabul edildi ve 7. gün sonunda tavşanların yaşamı sonlandırıldı. Öncesinde ön kamara sıvısı örnekleri alındı. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve UV (ultraviyole) dedektörü kullanılarak miktar tayini yapıldı. Kornea çıkarılmadan önce floresein ile kobalt mavisi ışık altında korneal yara iyileşmeleri gözlemlendi. Kornea ve limbus dokusu dahil olarak alınarak ışık mikroskobisi altında yara iyileşmesi açısından histopatolojik olarak incelendi.
BULGULAR: Grup-1 (Hasar grubu) değerlendirildiğinde, yedi tavşanın dördünde (%57.1) '1-2 sıra histolojik epitel oluşumu' görüldü. Yedi tavşanın dördünde (%57.1) keratositler bulundu ve bu keratositlerin tamamı "az yoğunlukta"idi. Kalan üç tavşanda (%42.9) epitel oluşumu ve keratosit oluşumu gözlenmedi. Hiçbir tavşanda enflamasyon görülmedi. Yedinci gün sonunda floresein ile yara iyileşmesi değerlendirildiğinde, dört tavşanda (%57,1) "orta derecede epitel defekti" gözlendi, üç tavşanda ise (%42.9) "büyük epitel defekti" tespit edildi. 
Grup-2 (3D Baskı grubu) değerlendirildiğinde, altı tavşanın beşinde (%83.3) histolojik epitel oluşumu gözlendi. Bu beş tavşandan birinde (%20) "2'den fazla sıra epitel oluşumu", diğer dört tavşanda (%80) ise "1-2 sıra epitel oluşumu" gözlendi. Altı tavşanın beşinde (%83,3) keratosit oluşumu görüldü.  Birinde (%20) "az yoğun", üçünde (%60) "orta yoğun", birinde (%20) ise "yoğun" olarak saptandı. İki tavşanda (%33,3) enflamasyon gözlendi; biri (%50) "hafif ", diğeri (%50) ise "ağır "idi. Yedinci gün sonunda floresein ile yara iyileşmesine göre, dört tavşanda (%66.7) "küçük epitel defekti", bir tavşanda (%16.7) "orta epitel defekti", bir tavşanda ise (%16.7) "büyük epitel defekti" görüldü. 
Grup-3 (Amniyon membran + topikal damla grubu) değerlendirildiğinde, altı tavşanın tamamında (%100) histolojik epitel oluşumu gözlendi. Bu altı tavşanın birinde (%16,7) "2'den fazla sıra epitel oluşumu", diğer beşinde (%83,3) "1-2 sıra epitel oluşumu" vardı. Altı tavşanın tamamında (%100) keratositler gözlendi, dördünde (%66,7) "az yoğun", ikisinde (%33,3)"orta yoğun"du. Hiçbir tavşanda enflamasyon tespit edilmedi. Yedinci gün sonunda floresein ile yara iyileşmesine göre, ikisinde (%33.3) "küçük epitel defekti", üçünde (%50) "orta epitel defekti", birinde ise (%16.7) "büyük epitel defekti" görüldü. Çalışma sonuçlarına göre gruplar arasında, histolojik epitel oluşumu ve keratosit varlığı, enflamasyon ve yara iyileşmesi sonuçları açısından istatistiksel olarak anlamlı fark gösterilmedi. Yapılan validasyon çalışmaları sonucunda doğruluk ve kesinlik parametreleri metodun vankomisin analizine uygun olduğunu gösterdi. Amniyon+topikal vankomisin grubunda 0,7ug/ml±0,52, 3D grubunda da vankomisin miktarı 0,7± 0,58 ug/ml olarak ölçüldü. Tedavi verilen iki grup arasında ölçülen miktar tayin sonuçları benzerdi.
SONUÇ: AM oftalmoloji alanında sık kullanılan ve etkisi kanıtlanmış bir tedavi yöntemidir.  En sık kullanılan formu olan AMT'nin cerrahi bir işlem olması, tekrarlı uygulama ihtiyacının bulunması hastaların uyumunu düşürebilir ve uygulamaya ek tedavi gereksinimleri olabilir. Günümüzde gelişen teknoloji 3D biyobaskı ve doku mühendislikleri ile farklı formların üretim şansını oluşturur. Deselülerizasyon immünolojik yanıtı azalttığı gibi daha uzun süre kullanım avantajı sağlar. Antibiyotik ilaveli 3D biyobaskı ile üretilen amniyon, kriyopreserve AMT ile benzer etkide epitel ve stromal hasar onarımı sağlaması, aynı zamanda antibiyotik miktarlarının benzer sonuçlar vermesi ile sürekli topikal damla yerine tek bir uygulama yapılarak tedaviye alternatif bir biyomateryal kullanımı olmaya adaydır. Deselülerizasyonun olumlu avantajları da düşünüldüğünde başka çalışmalarla desteklenerek biyomedikal ve tıbbi uygulamalarda daha uzun süre dayanıklı ve az tekrarlı tedavi sağlayan alternatif bir uygulama şekli olmaya aday öncül bir çalışma olması sebebiyle önemlidir. 
ANAHTAR KELİMELER: Amniyon membran, doku mühendisliği, korneal yara iyileşmesi, tavşan modeli ,3D biyobaskı

Abstract:
AİM: The aim of this study was to investigate the effects of a decellularized amniotic membrane with added antibiotics, printed using a 3D bioprinter, on wound healing in rabbit models with corneal epithelial-stromal defects.
MATERİALS AND METHODS: This study was conducted at the Ankara City Hospital Ophthalmology Clinic. Placental amniotic membranes (AM) were obtained from three healthy pregnant women who had undergone elective cesarean section, and serological screening tests confirmed their negative status. The AMs were prepared by washing with a cleansing solution and were intended for use in both amniotic membrane transplantation (AMT) and as a formulation for 3D bioprinting. Cryopreserved AM was used for transplantation. Decellularization protocols were applied before the 3D bioprinting processes. The animal experiment phase of the study was carried out at the Ankara Health Research and Application Center of the University of Health Sciences. Twenty "New Zealand" rabbits were used. A 7.5 mm diameter epithelial and stromal defect, approximately 120 microns deep, were created in the right eyes of all rabbits using a vacuum trephine, followed by debridement with a crescent blade. The rabbits were grouped into two experimental groups, each consisting of seven rabbits, and one control group. The undamaged left eyes of the rabbits were used as a healthy control group. No treatment was administered to the rabbits in Group 1 (Damage group). In Group 2 (3D printer group), rabbits received a decellularized amniotic membrane with added antibiotics, printed using a 3D bioprinter. To secure the rabbit's eyes, they were sutured onto a specially printed biocompatible cage made of polycaprolactone. In Group 3 (Amniotic group), amniotic membrane transplantation (AMT) was performed, and fortified vancomycin eye drops (50 mg/cc) were applied. Group 4 consisted of the healthy left eyes. Group 2 and Group 3 each had one rabbit in which amniotic application was performed during surgical modeling due to perforation, and these rabbits were excluded from the statistical analysis. The day of application was considered as day 0 and the rabbits were euthanized at the end of the 7th day. Anterior chamber fluid samples were collected, and the quantity was determined using high-performance liquid chromatography (HPLC) and UV (ultraviolet) detection. Before corneal excision, corneal wound healing was observed under cobalt blue light with fluorescein. The cornea and limbus tissue were excised and histopathologically examined for wound healing.
RESULTS: In Group-1 (Damage group), evaluation revealed that in seven rabbits, four (57.1%) exhibited '1-2 layers of histological epithelial formation.' Keratocytes were found in four out of seven rabbits (57.1%), and all of these keratocytes were "lightly dense." Epithelial formation and keratocyte formation were not observed in the remaining three rabbits. No inflammation was observed in any rabbit. On the seventh day, fluorescein assessment of wound healing indicated that four rabbits (57.1%) exhibited "moderate epithelial defect," while three rabbits (42.9%) had "large epithelial defect" detected.
In Group-2 (3D Printing group), evaluation revealed that in six rabbits, five (83.3%) exhibited histological epithelial formation. Among these five rabbits, one (20%) showed "more than 2 layers of epithelial formation," while the other four (80%) exhibited "1-2 layers of epithelial formation." Keratocyte formation was observed in five out of six rabbits (83.3%). In one rabbit (20%), it was "lightly dense," in three rabbits (60%), it was "moderately dense," and in one rabbit (20%), it was "dense." Inflammation was observed in two rabbits (33.3%), with one (50%) being "mild" and the other (50%) being "severe." On the seventh day, fluorescein assessment of wound healing revealed that four rabbits (66.7%) had "small epithelial defect," one rabbit (16.7%) had "moderate epithelial defect," and one rabbit (16.7%) had "large epithelial defect." 
In Group-3 (Amniotic membrane + topical drop group), evaluation revealed that in six rabbits, all (100%) exhibited histological epithelial formation. Among these six rabbits, one (16.7%) showed "more than 2 layers of epithelial formation," while the other five (83.3%) exhibited "1-2 layers of epithelial formation." Keratocytes were observed in all six rabbits (100%), with four (66.7%) being "lightly dense" and two (33.3%) being "moderately dense." No inflammation was detected in any rabbit. On the seventh day, fluorescein assessment of wound healing revealed that two rabbits (33.3%) had "small epithelial defect," three rabbits (50%) had "moderate epithelial defect," and one rabbit (16.7%) had "large epithelial defect." According to the study results, there was no statistically significant difference between the groups in terms of histological epithelial formation, keratocyte presence, inflammation, and wound healing outcomes. Validation studies indicated that the accuracy and precision parameters of the method were suitable for vancomycin analysis. In the Amnion + topical vancomycin group, the vancomycin concentration was measured at 0.7 μg/ml ± 0.52, while in the 3D group, the vancomycin concentration was 0.7 ± 0.58 μg/ml. The measured quantities between the two treated groups were similar.
CONCLUSİON: Amniotic membrane (AM) is a widely used and proven treatment method in the field of ophthalmology. The most common form, AMT, being a surgical procedure with a need for repeated application, may reduce patient compliance and necessitate additional treatments. Advances in technology today offer the opportunity to create different forms using 3D bioprinting and tissue engineering. Decellularization reduces the immunological response and offers the advantage of long-term use. Amniotic membrane produced by 3D bioprinting with added antibiotics has demonstrated similar effects on epithelial and stromal damage repair as cryopreserved AMT. At the same time, due to the similar results in antibiotic levels, it offers an alternative biomaterial for treatment with a single application instead of continuous topical drops. Considering the positive advantages of decellularization, this pioneering study has the potential to become an alternative application in biomedical and medical practices, providing longer-lasting and less frequent treatments, and should be supported by further research.
KEYWORDS: Amniotic membrane, tissue engineering, corneal wound healing, rabbit model, 3D bioprinting.