Döllenmiş zebra balığı (Danio rerio Hamilton-Buchanan, 1822) yumurtalarına gen (GFP) transferi üzerinde bir araştırma
A study on the gene (GFP) transfer in fertilized zebrafish (Danio rerio Hamilton-Buchanan, 1822) eggs
Yazar: AYGÜL EKİCİ
Danışman: PROF. DR. METİN TİMUR ; DOÇ. DR. HAYDAR BAĞIŞ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı / Yetiştiricilik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Genetik = Genetics ; Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Bu çalısma TÜBTAK MAM-Gen Mühendisligi ve Biyoteknoloji Enstitüsü (GMBE),Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuvarında gerçeklestirilmistir. Sunulan çalısmadatransgenik balık eldesi teknolojisinin ülkemizde yerlestirilmesi amaçlanmıs ve gentransferi çalısmamızda güçlendirilmis yesil floresan protein (EGFP) geni markır(isaretleyici) gen olarak kullanılmıstır. Transgenik balık eldesi için, cyto megalo virus(CMV) promotörlü EGFP gen konstraktının halkasal plazmit (pEGFP-N1) ve lineerformları (CMV-EGFP) (transgen konstraktı), döllenmis zebra balıgı yumurtalarınamikroenjeksiyon teknigi ile aktarılmıstır.Mikroenjeksiyonda EGFP gen konstraktı bir hücre safhasındaki zebra balıgıembriyolarının sitoplazmaları içine 2,5?4,5?35-40-65 ng /?l konsantrasyonlarında lineerformu ve 65 ve 100 ng/?l konsantrasyonunda ise halkasal formu aktarılmıstır. Genaktarımı yapılmıs larvaların 3'üncü gününde gen ekspresyonu floresans mikroskoptagözlemlenmis ve larvalar yesil olarak tespit edilmistir. Ayrıca moleküler yöntemler ilefloresans olan ve olmayan transgenik adayı balıklar gen entegrasyonu ve ekpresyonubakımından incelenmistir. Lineer EGFP geninin mikroenjeksiyonu sonucunda 54 adetve halkasal formunun mikroenjeksiyonundan 25 adet F0 balık elde edilmistir. Halkasalformunun 65 ng/?l konsantrasyonundaki aktarımından elde edilen F0 transgenik zebralarvalarındaki gen ekspresyonu seviyesinin aynı konsantrasyonda verilen lineerizeformdan elde edilen transgenik larvalara göre gen ekspresyonun daha fazla oldugugözlemlenmistir. Halkasal EGFP geninin ekspresyonunun larvaların vücudunun çesitlikısımlarında (yumurta kesesi, bas, sırt bölgesi ve gözlerde) yaygın bir dagılımgösterdigi gözlemlenmistir. Lineer EGFP geninin ekspresyonu da larvaların sırtbölgesinde, yumurta sarısında ve gözlerde oldugu gözlemlenmistir. Lineer formunmikroenjeksiyonundan sonra elde edilen 6 adet F0 transgenik balıgın normal balık ileçiftlestirilmesinden toplam 520 adet F1 larva elde edilmistir. Bu F1 larvaların 102tanesinde floresan ısıma görülmüstür (%20). 19 numaralı F0 disi balıktan elde edilenerkek ve disi transgenik bireyler kendi aralarında çiftlestirilmis ve F2 larvaların%20'sinde floresan ısıma gözlemlenmistir. Çalısmamızda stabil transgenik balıkhatlarının elde edilmesinde, lineer gen konstraktının gen ekspresyonu üzerinde etkilioldugu; ancak, sadece F0 transgenik balık eldesinde ise halkasal gen konstraktıformunun kullanılmasının etkili oldugu ortaya konmustur.Bu tez sonucunda ülkemizde ilk defa transgenik balık eldesi teknolojisi kurulmus vekurulan bu teknoloji kullanılarak transgenik zebra balıgı elde edilmistir. Çalısmadanelde edilen sonuçlar gelecekte yapılacak transgenik zebra balıgı ve/veya diger balıktürlerinin eldesi çalısmalarına olanak saglayacak, ayrıca arastırılması istenen genlerinfonksiyonları bu sistemlerde in vivo olarak arastırılabilecektir.

Abstract:
This study was carried out at the TUBITAK-MAM Gene Engineering andBiotechnology Institute, Transgene and Experimental Animals Laboratory. The aim ofthis study is to set up transgenic fish produce technology in Turkey. In this studyenhancer green flourescent protein (EGFP) gene used as a marker gene. To producetransgenic fish circular plasmid (pEGFP-N1) and linear forms of EGFP gene construct,which was containing cyto megalo virus (CMV) promoter has been transferred in tofertilized eggs of zebrafish by microinjection technique.In microinjection, the EGFP gene constructs, 2,5-4,5-35-40-65 ng/?l consantration oflinear form and 65-100 ng/?l consantration of circular form, were transferred intocytoplasm of zebrafish embryos at single-cell stage. At the third days of genetransferred larvae, gene expression was observed at the flourescent microscope andgreen larvae were detected. Also, flourescence and non-flourescence transgeniccandidate larvae were investigated according to gene integration and expression withthe same molecular methods. We obtained 54 F0 zebrafish after linear EGFP genemicroinjection and 25 F0 zebrafish after circular form microinjection. We observed thatthe gene expression efficiency of circular form in 65 ng/?l consantration was higherthan at the same consantration of the linearized form in F0 zebrafish larvae. Theexpression of the circular EGFP gene construct was observed ubiquites distributed atdifferent parts of body (yolk sack, head, dorsal muscle of the belly and eyes) intransgenic zebrafish larvae. The expression of the linearized EGFP gene was observedat the dorsal area, yolk sack and eyes. After the microinjection of linear form weobtained 6 F0 transgenic fish, after the mating of F0 transgenic fish with wild-type fish.We obtained 520 F1 larvae. It is shown flourescent light at 102 larvae (20%). Themating of 19 number F0 female fish with wild-type fish, male and female F1 transgenicfish obtained. These F1 transgenic fish was mating each other to produce F2 transgenicfish which flourescent light observed at 20%. In our study, to produce stable transgenicfish lines, using linear gene constructs were effective on gene expression. However, it isbrought up to produce only F0 transgenic fish used circular gene construct was effective.In the conclusion, to produce transgenic fish technology was established at the first timein Turkey and transgenic zebrafish was obtained by using this technology. The result ofthe study will give an opportunity to produce transgenic zebrafish or other fish.However, investigation of gene functions will be study in vivo in transgenic fishsystems.