Adipoz kökenli mezenkimal kök hücre dizilerinin geliştirilmesi, immünfenotipik karakterizasyonu ve farklılaşma özelliklerinin incelenmesi
Development of adipose-derived mesenchymal stem cell lines, their immunophenotypical characterization and evaluation of differentiation properties
Yazar: TÜLİN İBŞİRLİOĞLU
Danışman: PROF. DR. YAŞAR MURAT ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışmada, cerrahi operasyonlarla uzaklaştırılan atık insan adipoz dokularından, adipoz mezenkimal kök hücreler (AMKH) izole edildi. Hücrelerin immünfenotipik karakterizasyonu ve koloni oluşturma kapasiteleri belirlendi. Çeşitli büyüme faktörleri kullanılarak farklılaşma özellikleri incelendi. Aynı atık adipoz dokularından ekstraselüler matriks (ECM) fiziksel (homojenizasyon, santrifüjleme, kalıplama) ve kimyasal (çapraz bağlama) basamaklar içeren bir protokol geliştirilerek hücrelerinden arındırıldı, uzun ince lifler ve gözenekler bulunduran bir iskele malzemesi üretildi. Hazırlanan iskelenin su ve tampon tutma kapasitesi belirlendi. AMKH'ler hazırlanan iskelelere tohumlandı. Belli zaman noktalarında toplanan örneklerde hücre canlılığı ile malzemeye tutunma ve çoğalma davranışları MTT testi ve SEM analizleriyle belirlendi. Hücre-iskele yapılarının kıkırdak doku oluşturma kapasitelerinin incelenmesi amacıyla TGFβ-3 ve BMP-6 içeren kondrojenik vasat ortamında 42 gün kültürü sürdürüldü. Belli zaman noktalarında toplanan örneklerde kondrojenik protein ifadesi immüno/histo-kimyasal analizlerle takip edildi. Kondrojenik farklılaşma sonrası hücrelerce sentezlenen toplam sGAG miktarı dimetilmetilen mavisi boya bağlanma testi ile ölçüldü. SEM bulguları iskelenin oldukça gözenekli olduğunu, hücrelerin iskelelere tutunduğunu, MTT testi sonuçları hücrelerin iskelelerde yaşayabilirliğinin yüksek olduğunu, çoğalmaya devam ettiklerini, immüno/histo-kimyasal analizler ise TGFβ-3 ve BMP-6 içeren kondrojenik vasat ortamında kondrogenezin gerçekleştiğini gösterdi. GAG analizi kondrogenezi doğrular şekilde, sGAG miktarının yapılar içinde zamanla arttığını gösterdi. Elde edilen sonuçlar, insan atık adipoz dokusunun hem ECM hem de kök hücrelerin eldesi açısından oldukça zengin ve önemli bir kaynak olduğu, aynı kaynaktan elde edilen matriks iskeleler ve mezenkimal kök hücrelerin uygun kültür şartlarında otolog kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılma potansiyeline sahip olduğu görüşünü destekledi.

Abstract:
In this study, adipose mesenchymal stem cells (AMSCs) were isolated from human waste adipose tissues harvested by surgical operations. Immunophenotypical characterization and colony forming capacity of cells were determined. Differentiation characteristics were examined using a variety of growth factors. Extracellular matrix (ECM) of same waste adipose tissues was decellularized using a protocol composed of physical (homogenization, centrifugation, molding) and chemical (crosslinking) steps, thus a scaffold material containing long thin fibers and pores was produced. Water and buffer uptake capacity of scaffold was determined. ECM scaffold was seeded with AMSCs. Cell viability, adhesion/proliferation behavior of cells were evaluted by MTT assay and SEM analysis. To examine cartilage-forming capacity of cell-laden constructs 42-day culture in chondrogenic medium containing TGFβ-3 ve BMP-6 was maintained. Chondrogenic protein expression were followed by immuno/histo-chemical analysis. Glycosaminoglycans (sGAG) synthesized by cells was measured by dimethylmethylene blue dye binding assay. SEM observations and MTT assay showed that scaffold had a highly porous structure and the cells were well attached to the scaffold with good cellular viability and high proliferation. Immuno/histo-chemical analysis proved that chondrogenesis occurred under the chondrogenic conditions with TGFβ-3 and BMP-6. sGAG analysis pointed out that the amount of GAG increased in constructs by time confirming chondrogenesis. All results supported that human waste adipose tissue is a rich and important source for obtaining ECM, as well as stem cells and matrix scaffolds and mesenchymal stem cells obtained from same adipose tissue have potential in autologous cartilage tissue engineering under proper culture conditions.