Poli(3-hidroksibutirat) (P3HB) - poli-β-alanin (PBA) fibröz doku iskelelerinin iskelet kası rejenerasyonundaki etkinliğinin incelenmesi
Investigation of poly(3-hydroxybutyrate) (P3HB) - poly-β-alanine (PBA) fibrous tissue scaffolds in the effectiveness of skeletal muscle regeneration
Yazar: ELVAN KONUK TOKAK
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences

Özet:
İskelet kası dokusundaki hasarların onarılması amacıyla iskelet kası doku mühendisliği yaklaşımları kullanılarak in vitro fonksiyonel bir iskelet kasının elde edilmesi tez çalışmasının amacını oluşturmaktadır. Bu amaçla, çalışmada doğal kas dokusunu taklit edebilen ve piezoelektrik özellikler sergileyen poli-β-alanin (PBA) katkılı poli(3-hidroksibutirat) (P3HB) fibröz matriksler kullanılmıştır. Matrikslerin miyojenik farklılaşmadaki etkinliği C2C12 fare miyoblast hücre hattı ile statik kültür koşullarında ve mekanik, elektrik ve elektromekanik uyarımlı hibrit biyoreaktör ile dinamik kültür koşullarında test edilmiştir.
Tez çalışmasının ilk kısmında, rastgele ve hizalı fiber morfolojisine sahip P3HB/PBA nanofiber matriksler elektroeğirme yöntemi ile üretilmiştir. Matrikslerin kimyasal, termal, morfolojik, mekanik, kristalografik ve piezoelektrik özellikleri karakterize edilmiştir. Rastgele ve hizalı P3HB bazlı matrikslerin d33 piezoelektrik sabiti literatürdeki çalışmalardan farklı olarak artış göstermiş ve sırasıyla 5 pC/N ve 5,3 pC/N olarak tespit edilmiştir. Statik kültür çalışmalarında, hizalı matriksler üzerindeki hücrelerin düzenli miyotübüler yapılar oluşturduğu ve yoğun mikrovilli barındırdığı tespit edilmiştir. Canlılık analizleri, morfolojik analizler, gen ifadesi ve gen belirteçleri analizleri ile hizalı matrikslerin miyojenik olarak uyumlu olduğu ve miyojenik farklılaşmayı iyi bir şekilde desteklediği belirlenmiştir.
İkinci kısımda, hücre kültürü çalışmalarından önce mekanik ve elektriksel uyarımların malzemenin mekanik ve morfolojik özelliklerinde yarattığı değişimler incelenmiştir. Ardından mekanik, elektrik ve elektromekanik uyarımlı hibrit biyoreaktör ile dinamik kültür çalışmaları yürütülmüştür. Canlılık analizleri, morfolojik analizler, mekanik testler, gen ifadesi ve gen belirteci analizleri gerçekleştirilmiştir. Yüzde 5 gerinim, 0,5 Hz frekans ve 20 dk çekme/2 sa dinlenme süresi parametreleri ile mekanik uyarımlı M-D1 grubu ve 2 ms atım periyodu, 0,4 V voltaj, 20 dk atım /2 sa dinlenme süresi parametreleri ile elektrik uyarımlı E-D2 grubu miyojenik farklılaşma ve maturasyon açısından en başarılı sonuçları vermiştir. Uyaranların sinerjik olarak uygulandıklarında miyojenik farklılaşma ve maturasyon üzerine etkilerinin araştırılması amacıyla M-D1 ve E-D2 uyarım parametreleri birleştirilerek elektromekanik uyarımlı biyoreaktör çalışmaları (EM-D) gerçekleştirilmiştir. EM-D grubunda çekme dayanımı %105 artış göstermiştir. Miyojenik maturasyon gen ifadeleri analiz edildiğinde EM-D grubunda, miyozin ağır zincir (MHC) ifadesinin M-D1 grubuna göre ≈ 23 kat, E-D2 grubuna göre ≈ 13 kat; nörofilament (NF-H) ifadesinin M-D1 grubuna göre ≈ 95 kat, E-D2 grubuna göre ≈ 11 kat; asetilkolin reseptörü-α (AChR-α) ifadesinin M-D1 grubuna göre ≈ 13 kat, E-D2 grubuna göre ≈ 1,5 kat artış gösterdiği tespit edilerek miyojenik maturasyonun yüksek oranda desteklendiği belirlenmiştir.
Tez çalışması ile hizalı P3HB/PBA nanofiber matrikslerin morfolojik, mekanik ve piezoelektrik özellikleri ile miyojenik farklılaşmayı başarı ile desteklediği tespit edilmiştir. Ayrıca, bu matriksler kontrollü ön çalışmalarla belirlenen elektromekanik uyarımlar ile simultane olarak desteklendiğinde in vitro fonksiyonel bir iskelet kası dokusu elde edilebildiği gösterilmiştir. Elde edilen doku mühendisliği ürününün gelecekte klinikte kullanılabilmesi için, matriksler satelit hücreler ile etkileştirilmeli ve in vivo hayvan çalışmaları gerçekleştirilmelidir.

Abstract:
The aim of the thesis is to obtain an in vitro functional skeletal muscle using tissue engineering approaches for repairing damage in skeletal muscle tissue. To accomplish this aim, the research utilizes fibrous matrices of poly-β-alanine (PBA) doped poly(3-hydroxybutyrate) (P3HB) which can mimic natural muscle tissue and exhibit piezoelectric characteristics. The effectiveness of the matrices in myogenic differentiation was assessed in static culture conditions with the C2C12 mouse myoblast cell line and dynamic culture conditions using a hybrid bioreactor that provides mechanical, electrical, and electromechanical stimulations.
In the first part of the thesis, random and aligned P3HB/PBA nanofiber matrices were produced using the electrospinning method. The matrices were characterized for their chemical, thermal, morphological, mechanical, crystallographic, and piezoelectric properties. In contrast to the literature, both random and aligned P3HB-based matrices exhibited an increase in the d33 piezoelectric constant, measured as 5 pC/N and 5.3 pC/N, respectively. In static culture studies, cells on aligned matrices formed regular myotubular structures and showed dense microvilli. Viability analyses, morphological examinations, myogenic gene expression and marker analyses determined that aligned matrices were myogenically compatible and well supported myogenic differentiation.
In the second part, the effect of mechanical and electrical stimulations on the mechanical and morphological properties of the matrices was investigated before cell culture studies. Subsequently, dynamic culture studies were conducted using a hybrid bioreactor providing mechanical, electrical, and electromechanical stimulations. Notably, mechanical stimulation with 5% strain, 0.5 Hz frequency, and a 20 min stretching/2 h resting (M-D1 group) and electrical stimulation with a 2 ms pulsing period, 0.4 V voltage, and a 20 min pulsing/2 h resting (E-D2 group) yielded the most successful results in terms of myogenic differentiation and maturation. Electromechanical stimulation studies (EM-D) were carried out by combining M-D1 and E-D2 stimulation parameters to investigate the synergistic effects on myogenic differentiation and maturation. The EM-D group showed a 105% increase in tensile strength. The gene expressions related to myogenic maturation were analyzed in the EM-D group and it was determined that the expression of the myosin heavy chain (MHC) was ≈ 23 times higher compared to the M-D1 group and ≈ 13 times higher compared to the E-D2 group. Similarly, the expression of neurofilament (NF-H) showed a ≈ 95-fold increase compared to the M-D1 group and ≈ 11 times higher compared to the E-D2 group. The expression of acetylcholine receptor-α (AChR-α) was found to increase ≈ 13 times compared to the M-D1 group and ≈ 1.5 times compared to the E-D2 group. These findings indicate that myogenic maturation is highly supported in the EM-D group.
The thesis demonstrates that aligned P3HB/PBA nanofiber matrices successfully support myogenic differentiation through their morphological, mechanical, and piezoelectric properties. Additionally, it has been shown that when these matrices are simultaneously supported with controlled electromechanical stimulations, an in vitro functional skeletal muscle tissue can be obtained. For the future clinical use of this engineered tissue product, the matrices should be interacted with satellite cells, and in vivo animal studies should be conducted.