Sıçanlarda ALCL₃ ile oluşturulan alzheımer modelinde evoo, rozmarinik asit ve donepezil'in etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of evoo, rosmarinic acid and donepezil in ALCL₃ rat model of alzheimer's disease
Yazar: SEVİM KANDİŞ
Danışman: DOÇ. DR. LEVENT ALTINTAŞ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Donepezil = Donepezil ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Nörobilişsel hastalıklar = Neurocognitive disorders ; Rozmarinik asit = Rosmarinic acid ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Son yıllarda sağlık ve teknoloji alanındaki gelişmeler ışığında, gerek insan
gerekse hayvanların yaşam kalitesinde ve süresinde olumlu yönde iyileşmeler
olmuştur. Fakat yaşam süresinin uzaması da beraberinde, yaşa bağlı kognitif
bozuklukların yaygınlığında artış meydana getirmiştir. İnsanlarda Alzheimer
hastalığı (AH), hayvanlarda ise Kognitif Disfonksiyon Sendromu (KDS), en yaygın
görülen hastalıklardır. Bu rahatsızlığın artması; özellikle de yaşlı köpeklerin bakımı
yönüyle, günümüz modern veteriner hekimliğinde giderek önem kazanan bir sorun
haline gelmiştir. Metallerin nörotoksik etkilerinin olduğu bilinse de; alüminyumun,
AH'nın önemli nedenlerinden biri ve hastalığın gelişiminde en büyük risk
faktörlerinden biri konumunda olduğu bildirilmiştir. Alüminyum beyinde hafıza ve
kognisyondan sorumlu olan korteks, serebellum ve hippokampusta birikir ve bu
bölgelerde β-amiloid birikimi, oligomerizasyon, hiperfosforile tau yığılması, lipid
peroksidasyonu, bozulmuş kalsiyum iyon değişimi ve apoptozis gibi Alzheimer
patolojisiyle ilişkili patolojik olguları meydana getirir. Bu sebeple de deneysel olarak
Alzheimer modeli oluşturmak için de sıklıkla tercih edilir. Günümüzde henüz AH ya
da KDS'yi tam anlamıyla tedavi edecek bir ilaç ya da yöntem yoktur; ancak,
hastalığa yakalanan insan ve hayvanların refahını artırmaya yönelik diyet ve ilaç
tedavi programları uygulanır. İlaçla tedavide kullanılan gruplardan biri de AchEI
(asetilkolinesteraz enzim inhibitör) grubu ilaçlardır. Asetilkolinesteraz inhibitörleri
enzimatik bozulmayı önleyerek etki göstermekte ve AH için birinci basamak tedavi
seçeneği olarak görülmektedir. AH tedavisi için hala ilk seçenek olarak kullanılan
donepezil, düşük toksisitesi ve iyi tolere edilebilen AchE inhibe edici etkinliği ile
popülerliğini korumaktadır. AH'nın diyetle tedavisinde ise, serbest radikallerin
zararlı etkilerini azaltabilecek antioksidanlar ve mitokondriyal kofaktörlerin
kullanımı esas alınır ve bu yönde yapılan çalışmalarda da ilgi daha ziyade yüksek
oranda antioksidan içeren gıdalara doğru yönelmiştir. Bunların arasında sızma
zeytinyağı, extra-virgin olive oil (EVOO) önemli bir yer tutar. EVOO, sature
olmayan yağ asitleri ve yüksek oranda değerli biyofenolik bileşenleri içermesi
nedeniyle diğer yağlardan ayrılır. Yine antioksidan, anti-inflamatuar, anti-apoptotik
ve nöroprotektif etkileri olduğu bilinen diğer bir madde ise Rosmarinik asit (RA)'tir
ve RA, çeşitli gıdalarda ve şifalı otlarda bulunan doğal bir fenol karboksilik asittir.
Çalışmamızda Sprague Dawley ırkı erişkin erkek sıçanlara 15 gün boyunca 100
ml/kg dozda AlC₃ uygulaması yaptıktan sonra, 3 farklı gruba 21 gün boyunca tedavi
protokolleri uygulanarak donepezil, EVOO ve rozmarinik asit uygulaması
yapılmıştır. AlCl₃ uygulamaları ve tedavilerin bitiminde hayvan ağırlıkları, rölatif
adrenal ve timus ağırlıkları, davranış testleri, motor performans testi, öğrenme bellek
testi, histolojik ve biyokimyasal değerlendirmeler yapılarak istatistiksel anlamlılıklar
değerlendirilmiştir. Stres parametresi olarak değerlendirilen rölatif timus ağırlığında
AlCl₃ grubunda kontrol grubuna göre anlamlı azalma, tedavi gruplarında kontrol
grubuna göre anlamlı artış görülmüştür. Açık alan ve yükseltilmiş artı labirent
76
testinde gruplar arası anlamlı fark görülmemiştir. Motor performans testinde 26 ve
30 rpm hızlarda donepezil grubunda AlCl₃ grubuna göre anlamlı artış görülmüştür.
Öğrenme ve belleğin araştırıldığı Morris Water Maze testinde, 3.ve 4.öğrenme
günlerinde AlCl₃ grubunda kontrol grubuna göre stres parametresi olarak
değerlendirilen yüzme artışı görülmüş, deneyin 5.gününde ise donepezil grubunda
platformun bulunduğu alanda geçirilen sürede AlCl₃ grubuna göre anlamlı artış
görülmüştür. Prefrontal korteks MDA, LDH, pseudokolin esteraz ve beta-amiloid
prekursör protein analizlerinde gruplar arası anlamlı fark görülmemiştir. Hipokampus
LDH seviyesi AlCl₃ grubunda kontrol grubuna göre anlamlı düşük bulunmuştur.
Serum kortikosteron seviyesinde gruplar arası anlamlı fark görülmemiş, serum MDA
ve LDH seviyesi AlCl₃ grubunda kontrol grubuna göre anlamlı yüksek bulunmuştur.
Histopatolojik olarak hematoksilen&eozin boyamada prefrontal kortekste Alzheimer
grubunda kontrol grubuna göre atrofi, nöronal hücre yoğunluğunun azalması ve
gliozis görülmüştür. Benzer şekilde hipokampusta hematoksilen&eozin boyamada
Alzheimer grubunda kontrol grubuna göre nöronal hücre yoğunluğunun azalması ve
gliozis görülmüştür. Aynı zamanda Alzheimer grubunda bazofilik boyamada hücre
sitoplazmasında nörofibriler yumaklara rastlanmıştır. Congo red boyamada
Alzheimer grubunun hipokampus ve prefrontal korteksinde pozitif boyanmış hücre
sitoplazması, bozulmuş hücre bütünlüğü görülmüştür. Kontrol ve tedavi gruplarında
hücrelerde hasara rastlanmamıştır.
Literatürde 15 gün AlCl₃ uygulamasının Alzheimer patolojisi oluşturmak için
yeterli olduğu gösterilmiş olsa da, orta ve şiddetli hastalık patolojisi oluşturmak için
yeterli olmadığı görülmüştür. Bu sonuçlar, alüminyum maruziyetinin ılımlı
Alzheimer patolojisi oluşmasında etkili olduğunu göstermektedir fakat rozmarinik
asit ve EVOO'nun tedavide kullanılabilmesi için daha fazla araştırmaya ihtiyaç
olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
In the last century, the advances in health and technology have resulted in the
expansion of human and animal life span. However, with the lifespan expansion, an
increase is observed in the prevalance of age related cognitive disorders with
cognitive disfunction disorder in dogs and especially Alzheimer's disease in humans
being in the first place. Because of this, the maintenance of old dogs has gained
importance in modern veterinary sciences. When the effect of cognitive disorders on
quality of life and on the society are taken into consideration, the need for
intervention and treatment methods that can stop, reverse or prevent the progressive
cognitive disorder seems urgent. Even though metals cause neurotoxicity, the highest
risk factor for cause and development of AD was reported to be aluminum metal.
Aluminum reaches the brain and accumulate in cortex responsible for memory and
cognition, cerebellum of hippocampus. Aluminum causes pathologies related to
Alzheimer's pathology such as β-amyloid accumulation, oligomerisation, build-up of
hyperphosphoryl tau, lipid peroxidation, change of degenerate calcium ions and
apoptosis in these regions. Yet no medicine can provide permanent treatment of AD,
but drugs that improve symptoms in patients or temporarily slow the progression of
the disease have been developed. One of these medicine groups is AchEI
(acetylcholine esterase enzyme inhibitor). Acetylcholine esterase inhibitors act by
preventing enzymatic degredation anda re seen as a first-line treatment for AD and
CCDS. The AchEI group of medicines is called "symptomatic medicines" and act on
relieving symptoms and increasing quality of life of the patient without altering the
development of the pathology underlying the disease. Donepezil, which is still used
as the first choice for AD therapy, maintains its popularity with its low toxicity and
good tolerable AchE inhibitory activity. The diet treatment of CCDS and AD depend
on the use of mitochondrial cofactors and antioxidants which may decrease the
detrimental effects of free radicals. For this reason, the interest of researchers has
turned to investigation of foods including antioxidants. Among these, extra-virgin
olive oil (EVOO) has an important place. EVOO is separated from other oils due to
its non-sature fatty acids and its highly biodegradable biophenolic components, and
has a more valuable place. Another material researched for Alzheimer's treatment is
Rosmiarinic acid (RA) is a natural phenol carboxylic acid found in different foods
and medicinal herbs. It is known to have antioxidant, anti-enflamatory, anti-apoptotic
and neuroprotective effects. In studies condutcted on mice, positive effects
incognition increase have been shown.
In our study, after administering 100 ml / kg dose of AlC₃ to Sprague Dawley
adult male rats for 15 days, donepezil, EVOO and rozmarinic acid were applied to 3
78
different groups by applying treatment protocols for 21 days. At the end of AlCl₃
treatments; animal weights, relative adrenal and thymus weights, behavioral tests,
motor performance test, learning memory test, histological and biochemical
evaluations were made and statistical significance was evaluated. There was a
significant decrease in the relative thymus weight, which was evaluated as a stress
parameter, in the AlCl₃ group compared to the control group and a significant
increase in the treatment groups compared to the control group. There was no
significant difference between groups in open area and elevated plus maze test. In the
motor performance test, a significant increase was observed in the donepezil group at
26 and 30 rpm compared to the AlCl₃ group. In the Morris Water Maze test, in which
learning and memory were investigated, the increase in swimming, which was
evaluated as a stress parameter in the AlCl₃ group compared to the control group,
was observed on the 3rd and 4th learning days, and a significant increase was
observed in the period in the donepezil group compared to the AlCl₃ group. There
was no significant difference between the groups in the prefrontal cortex MDA,
LDH, pseudocoline esterase and beta-amyloid precursor protein analysis. The
hippocampus LDH level was significantly lower in the AlCl₃ group than in the
control group. There was no significant difference between serum corticosterone
levels, serum MDA and LDH levels were significantly higher in the AlCl₃ group
compared to the control group. Histopathologically, hematoxylin and eosin staining
showed that atrophy, decreased neuronal cell density and gliosis in the prefrontal
cortex compared to the control group in the Alzheimer's group. Similarly, in the
hippocampus, hematoxylin and eosin staining showed that decreased the neuronal
cell density and gliosis in the Alzheimer's group compared to the control group.
Also, in the Alzheimer's group, neurofibrillary tangles were found in the cell
cytoplasm in basophilic staining. Congo red staining showed positively stained cell
cytoplasm and impaired cell integrity in the hippocampus and prefrontal cortex of the
Alzheimer's group. No damage to the cells was observed in the control and treatment
groups.
Although it has been shown in the literature that 15 days of AlCl₃
administration is sufficient to create Alzheimer's pathology, it has not been found to
be sufficient to create moderate and severe disease pathology. These results show
that aluminum exposure is effective in creating a moderate Alzheimer's pathology,
but more research is needed to use rosmarinic acid and EVOO in treatment.