Kolon kanserinde probiyotik bakterilerin etkisinin immün sistem açısından araştırılması
Investigation the effect of probiotic bacteria in colon cancer in terms of immune system
Yazar: SAFAA ALTVEŞ
Danışman: PROF. DR. HASİBE VURAL
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Kolon hastalıkları = Colonic diseases ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Probiyotik bakteriler = Probiotic bacteria ; Probiyotikler = Probiotics ; İmmün sistem = Immune system

Özet:
Kolorektal kanser (KRK), dünya çapında en yaygın üçüncü kanser ve kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. KRK multifaktöriyel bir hastalıktır ve normal kolon epitelinin adenomatöz polipe dönüşmesi sonucu gelişir. Kemoterapi, radyasyon ve cerrahi prosedürler geleneksel olarak kolon kanserini tedavi etmek için kullanılmaktadır. Son zamanlarda, bu tedaviler immünoterapötik stratejilerle birleştirilmiş ve tedavi sonuçlarını büyük ölçüde iyileştirmiştir. PD-L1'in antikor-aracılı blokajı, kanser hücrelerine saldıran sitotoksik T hücrelerinin aktivitesini ve inhibisyonunu engelleyerek ve güçlendirerek PD-L1 kontrol noktası reseptörlerini bloke etmeyi amaçlayan immünoterapi yaklaşımlarından biridir. Son yıllarda, özellikle immün kontrol noktası inhibitörleri üzerinde yapılan birçok çalışma, probiyotiklerin immünoterapi yanıtındaki temel rolüne atıfta bulunmuştur. Probiyotik türlerin immün kontrol noktası inhibitörleri üzerindeki rolünü araştıran birkaç çalışma, immünoterapi sırasında adjuvan ajanların bulunmasına veya tedavi üzerinde kötü bir etkisi varsa hastanın diyetinden çıkarılmasına ışık tutmaktadır.
Bu tezde, dört probiyotik bakteri izole edilmiş ve bakteriler Lactobacillus rhamnosus, Enterococcus faecium, Leuconostoc mesenteroides ve Streptococcus sp. olarak morfolojik ve biyokimyasal testlerin yanı sıra 16S rRNA tüm gen dizilimi kullanılarak tanımlanmıştır. Daha sonra izole edilen bakterilerin hücre sitotoksisitesi XTT kullanılarak incelenmiştir. L. mesenteroides, hem süt fermente ürünleri hazırlamak için starter olarak kullanılması ve önemli fonksiyonel özelliklere sahip olması hem de diğer laktik asit bakterilerine göre daha az çalışılmış olması nedeniyle sonraki deneyler için seçilmiştir. 
Çalışmada L. mesenteroides'in Caco-2 ve HT-29 kolon kanseri hücre hatları üzerine etkisinin immün kontrol noktası PD-L1 ve PD-L1 tarafından düzenlenen yolaklar açısından araştırılması amaçlanmıştır.  L. mesenteroides'in PD-L1 geni ve protein ekspresyon seviyesi üzerindeki etkisi, IFN-γ uyarımına bağlı olarak qPCR ve western blot yöntemleri ile incelenmiştir. Kolon kanserinde PD-L1'in fonksiyonel analizini belirlemek için T hücrelerinin aktive sitokin markörleri ölçülmüştür. Bakteri-aracılı PD-L1 tarafından düzenlenen yolaklar qPCR yöntemi ile incelenmiştir.
Sonuçlarımıza göre, canlı L. mesenteroides ile muameleden sonra her iki hücre hattında PD-L1 gen ekspresyonu önemli ölçüde artmıştır. Ayrıca, L. mesenteroides IFN-γ üretimini indüklemiştir. IFN-γ, PD-L1 geni ve protein ekspresyonunda önemli rol oynadığı için deney protokollerine dahil edilmiştir. L. mesenteroides ile IFN- γ'nin PD-L1 ifadelerini on kattan fazla arttırdığı bulunmuştur. Öte yandan, L. mesenteroides ve IFN-γ tarafından indüklenen PD-L1, Jurkat T-hücrelerinin canlılığı ile IFN-γ ve IL-2 sitokinlerinin seviyesini önemli ölçüde artırmıştır. Ek olarak, L. mesenteroides ve IFN-γ tarafından kolon kanserinde indüklenen PD-L1'in, bakteri ile ilişkili PD-L1 tarafından düzenlenen yolaklarda çoklu değişikliklerle ilişkili olduğu belirlenmiştir. Buna göre Hippo yolağı markörleri YAP-1 ve TAZ aktivasyonuna bağlı olarak TLR'ler, NOD ve bakteri ilişkili G-protein ilişkili reseptörler aktive edilirken otofaji markör genleri BECN-1, ATG-5 ve SQSTM önemli ölçüde azalmıştır.  
Sonuç olarak, L. mesenteroides kolon kanseri hücrelerinde PD-L1 ekspresyonunu arttırmıştır. Bu artış, PD-L1'nın antikor aracılı blokajı varlığında Jurkat T hücrelerini aktive etmiştir. Elde edilen sonuçlar, mevcut bakterinin PD-L1 blokajını hedefleyen immün terapisi sırasında bir adjuvan ajan olarak (koruyucu tedavi) kullanılabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer and the third leading cause of cancer-related death worldwide. CRC is a multifactorial disease and develops as a result of the change in normal colonic epithelium to an adenomatous polyp. Chemotherapy, radiation, and surgical procedures are traditionally being used to treat colon cancer. Recently, these therapies have been combined with immunotherapeutic strategies, greatly improving therapy outcomes. The blockade of PD-L1 antibody is one of the immunotherapy approaches aims to block PD-L1 checkpoint receptors by increasing and enhancing cytotoxic T cells activity in attacking cancer cells. In recent years, many studies have also referred to probiotics' essential role in immune therapy response, particularly on immune checkpoint inhibitors. Several studies investigating the role of probiotic species on immune checkpoint inhibitors shed the light to find adjuvant agents during immunotherapy or remove it from the patient's diet if it has a bad impact on the treatment. 
In this thesis, we isolate four probiotic bacteria. The bacteria have been confirmed as Lactobacillus rhamnosus, Enterococcus faecium, Leuconostoc mesenteroides and Streptococcus sp. using morphological and biochemical tests as well as 16S rRNA whole gene sequencing. Then cell cytotoxicity of the isolated bacteria has been studied using XTT. L. mesenteroides has been chosen for the following experiments since it is used as a starter to prepare milk fermented products and owned important functional properties, in the same time, inferior studies had been conducted compared to the other lactic acid bacteria.
We aimed to investigate the role of L. mesenteroides on colon cancer cell lines; Caco-2 and HT-29 in terms of immune checkpoint PD-L1 and bacterial-related PD-L1 regulated pathways. The effect of L. mesenteroides on PD-L1 gene and protein expression level was investigated using qPCR and western blot analyses in the presence of an external supplement of IFN-γ. To determine the functional analysis of PD-L1 in colon cancer in the presence of blockade of PD-L1 antibody T cells activated cytokines markers has been measured. Regarding to bacterial-related PD-L1 regulated pathways the investigation has been done using qPCR.
According to our results, PD-L1 gene expression has been significantly increased in both cell lines after treatment with live L. mesenteroides. It has been found that L. mesenteroides induce IFN-γ production. Since IFN- γ plays important role in PD-L1 gene and protein expression we added it to the experiments. And found that L. mesenteroides plus IFN-γ increases PD-L1 expressions more than ten folds. On the other hand, presence of blockade PD-L1 antibody with per-induced PD-L1 colon cancer by L. mesenteroides plus IFN-γ increased Jurkat T-cells viability and significantly increased activated T cells marker cytokines IFN- γ and IL-2. Additionally, it has been found that induced PD-L1 in colon cancer by L. mesenteroides plus IFN-γ has been associated with multiple changes in bacterial-related PD-L1 regulated pathways. Although TLRs, NOD, and bacterial related G-protein coupled receptors have been activated leading to activate hippo pathway markers YAP-1 and TAZ, autophagy marker genes BECN-1, ATG-5 and SQSTM, have been significantly reduced.
In conclusion, L. mesenteroides has increased PD-L1 expression in colon cancer cells. This increase was significant in the presence of blockade PD-L1 antibody to activate Jurkat T cells. This indicates a possible use of this bacterium as an adjuvant agent during blockade PD-L1 antibody immunotherapy.