Malacosoma neustria nükleopolihedrovirüs (ManeNPV)'ün malacosoma disstria hücre kültüründe in vitro replikasyonu ve konak spektrumunun araştırılması
Replication of Malacosoma neustria nucleopolyhedrovirus in malacosoma disstria cell line and investigation of the host range
Yazar: NURTEN GÜREL
Danışman: YRD. DOÇ. DR. İSMAİL DEMİR
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Çalışmada, Malacosoma neustria nükleopolihedrovirüs (ManeNPV)'ün Malacosoma disstria Md203 hücre kültüründeki replikasyonu araştırıldı. Enfeksiyon, sitopatik etkiler, ektrasellüler virüs üretimi ve virüs çoğalma eğrisi, polihedral inklüzyon yapı oluşumu, viral DNA replikasyonu ve viral yapısal proteinlerin sentezi ile belirlendi.ManeNPV ile enfekte Md203 hücrelerinde sitopatik etkilerin (CPE) enfeksiyondan 24 saat sonra meydana geldiği görüldü. İlk polihedral inklüzyon yapı (PIB) oluşumu enfeksiyondan 36 saat sonra gözlendi. Enfeksiyondan 4 gün sonra hücrelerin çoğunun kültür kabının tabanından koptuğu tespit edildi. Hücrelerde, granülleşme, yuvarlaklaşma, parçalanma ve nukleusun kararması gibi tipik NPV sitopatik etkileri görüldü. Ekstrasellüler virüs (BV) üretiminde önemli miktarda artış enfeksiyondan 48 saat sonra gözlendi. Enfeksiyondan 96 saat sonra Md203 hücrelerinde 103 kat ekstrasellüler virüs üretildiği belirlendi. Viral DNA replikasyonunun enfeksiyondan 24 saat sonra başladığı slot blot hibridizasyonuyla belirlendi. Viral proteinlerin sentezi poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile belirlendi ve polihedrin proteini enfeksiyondan 36 saat sonra ortaya çıktığı tespit edildi.ManeNPV'nin konak spektrumunu belirlemek amacıyla Tn5, LdElta, Bm-5, Sf21, Se-1 ve Cf-124T hücreleri ManeNPV ile enfekte edildi. Hücrelerin virüse olan duyarlılıkları; CPE'lerin tespiti, ekstrasellüler virüs üretimi ve DNA replikasyonuyla belirlendi. Tn5 ve LdElta hücrelerinin tipik NPV CPE'lerini gösterdikleri ve ManeNPV için üretken hücre kültürleri oldukları tespit edildi. Her iki hücrede de üretilen BV miktarının enfeksiyondan 120 saat sonra 10 kat arttığı belirlendi. Aynı zamanda viral DNA replikasyonunun Tn5 ve Md203 hücrelerine göre LdElta hücrelerinde daha yüksek seviyede olduğu gözlendi.Tüm sonuçlar ManeNPV'nin Md203 hücre kültüründe verimli olarak üretildiğini gösterdi. Üretkenlik seviyesinin tipik üretken bakülovirüs enfeksiyonuna eşdeğer ve ManeNPV-Md203 sisteminin bilimsel ve ticari olarak kullanılma potansiyeline sahip olduğu tespit edildi.Anahtar Kelimeler:Bakülovirüs, ManeNPV, Md203 Hücre Kültürü, Virüs Replikasyonu, Konak Spektrumu

Abstract:
In this study, replicational properties of Malacosoma neustria nucleopolyhedrovirus (ManeNPV) in Md203 cell line derived from Malacosoma disstria were investigated. Infection was determined by cytopathic effects (CPE), budded virus (BV) production and viral growth curve, polyhedral inclusion body (PIB) formation, viral DNA replication, and synthesis of viral structural proteins.CPEs were determined 24 h p.i. in ManeNPV infected Md203 cells. The first PIB formation was detected at 36 h p.i. It was determined that the most cells detached from the bottom of the culture plate four days post infection. Typical NPV cytopathic effects (CPE) like granulated and rounded cells, disruption and darkening were observed. Significent increase in BV production was observed 48 h p.i. 103 times extracellular virus production was determined in Md203 cells at 96 h p.i. The viral DNA replication which was started 24 h p.i. was identified by slot blot hibridization. Viral protein synthesis was determined by SDS-polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) and polyhedrine synthesis was observed at 36 h p.i. in Md203 cells.To determine the host range of ManeNPV Tn5, LdElta, Bm-5, Sf21, Se-1 and Cf-124T cell lines were infected with ManeNPV. The susceptibility of the cells to the virus were determined by CPE?s, extracellular virus production and DNA replication. It was observed that Tn5 and LdElta cells showed typical NPV CPE?s and they were determined as productive cell lines for ManeNPV. Extracellular virus production at both cell lines was increased 10 times 120 h.p.i. Also it was observed that viral DNA replication in LdElta was at high level compared to Tn5 and Md203 cell lines.All these results showed that ManeNPV is produced efficiently at Md203 cell culture. This productivity level is observed as equivalent to typical productive baculovirus infection and it is determined that ManeNPV-Md203 system has scientific and commercial usage potential.Key Words: Baculovirus, ManeNPV, Md203 Cell Line, Virus Replication, Host Range