Aureobasidium pullulans ile pullulan üretimine etki eden çeşitli parametrelerin incelenmesi
Investigation of various parameters affecting on pullulan production by Aureobasidium pullulans
Yazar: GAMZE NUR MÜJDECİ
Danışman: PROF. DR. ZEKİYE YEŞİM ÖZBAŞ ; PROF. DR. MELEK TİJEN BOZDEMİR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında, çeşitli fermantasyon parametrelerinin Aureobasidium pullulans AZ-6 suşunun, pullulan üretimine etkileri araştırılmıştır. Çalışmadaki fermantasyon deneyleri, kesikli sistemde; sıcaklığı ve çalkalama hızı kontrol edilebilen çalkalamalı su banyolarında gerçekleştirilmiştir. Araştırmada kullanılacak olan suşun belirlenebilmesi amacıyla, yedi A. pullulans suşunun pullulan üretimleri karşılaştırılmış ve daha yüksek derişimde (17.56 g/L) pullulan ürettiği belirlenen; yerel A. pullulans AZ-6 suşu deneyler için seçilmiştir. Fermantasyon ortamında kullanılan farklı karbon kaynaklarının, A. pullulans AZ-6'nın pullulan üretimine etkileri incelendiğinde, denenen glukoz, fruktoz, sakkaroz, galaktoz ve maltoz içerisinden sakkarozun daha yüksek pullulan üretimini (15.66 g/L) sağladığı bulunmuştur. A. pullulans AZ-6 suşunun pullulan üretimini en iyi destekleyen azot kaynağının belirlenebilmesi için gerçekleştirilen deneylerde, fermantasyon ortamında, organik azot kaynakları olarak; üre, maya özütü, pepton, inorganik azot kaynakları olarak ise; (NH4)2SO4, NaNO3 ve NH4Cl kullanıldığında, maksimum pullulan derişimi (18.61 g/L); pepton ve (NH4)2SO4'ın birlikte kullanıldığı ortamda elde edilmiştir. 
Bu çalışmada daha sonra, yanıt yüzey yöntemi kullanılarak A. pullulans AZ-6 suşuyla pullulan üretiminin optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu kapsamda, kullanılan programdaki dönüşümlü merkezi karma tasarım yöntemiyle, merkezde 6 tekrarlı, toplam 30 deneysel noktadan oluşan bir deney tasarım planı oluşturulmuştur. Tasarımda, bağımsız değişkenler olarak; fermantasyon ortamının başlangıç sakkaroz ve pepton derişimleri, fermantasyon ortamının başlangıç pH'ı ve sıcaklık seçilirken, bağımlı değişkenler olarak; maksimum ekzopolisakkarit (EPS) ve pullulan derişimleri, A. pullulans AZ-6'nın özgül üreme hızı, maksimum özgül pullulan üretim hızı ve pullulan verimi seçilmiştir. Tasarım planındaki koşullara göre gerçekleştirilen deneylerden sonra, elde edilen sonuçlara, program yardımıyla çoklu regresyon analizi uygulanarak, bağımsız değişkenlerin, bağımlı değişkenler üzerindeki etkilerini gösteren model eşitlikler türetilmiş ve bu eşitliklerin uygunlukları, varyans (ANOVA) analiziyle değerlendirilmiştir. Optimizasyon, programdaki; istenilen hedefe ulaşma fonksiyonuyla, nümerik olarak gerçekleştirilmiştir. Program tarafından üretilen 100 çözümden, istenilen hedefe ulaşma fonksiyonu değerinin; 0.977, fermantasyon ortamının başlangıç sakkaroz ve pepton derişimleri ile pH'ının sırasıyla; 100 g/L, 11.305 g/L ve 6.481, sıcaklığın ise, 24.2°C olduğu koşullar, optimum olarak belirlenmiştir. Bu koşullarda gerçekleştirilen deneylerde maksimum EPS ve pullulan derişimleri, özgül üreme hızı, maksimum özgül pullulan üretim hızı ve pullulan verimi sırasıyla; 36.95 ve 35.47 g/L, 0.064 sa-1, 0.036 [g pullulan/(g mo.sa)] ve %54.48 olarak elde edilmiş ve optimum koşullar; %95 güven düzeyinde doğrulanmışlardır.

Tez araştırmasında, çeşitli doğal substrat kaynaklarının; ön işlemlerden geçirildikten sonra, doğrudan fermantasyon ortamı veya fermantasyon ortamı temel bileşeni olarak kullanılmalarının, A. pullulans AZ-6 suşunun, pullulan üretimine etkileri de araştırılmıştır. Doğal substrat kaynakları olarak; peyniraltı suyu, melas, üzüm posası, şeker pancarı küspesi, kavun, karpuz, soğan ve havuç kabukları ile tatlı patatesin kullanıldıkları deneylerde, maksimum pullulan üretimleri; tatlı patates özütü (37.62 g/L) ve melas çözeltisi (18.67 g/L) doğrudan fermantasyon ortamı olarak kullanıldığında gerçekleşmiştir. 

Bu tez çalışmasında UV mutasyonu uygulamasının, A. pullulans AZ-6 suşunun pullulan üretimine etkileri de incelenmiştir. Bu deneylerde elde edilen; 13 olası mutant suşun ürettikleri maksimum pullulan derişimlerinin (30.84-35.66 g/L) birbirlerine oldukça yakın oldukları ve bu suşlar tarafından üretilen maksimum pullulan derişimlerinin aynı koşullarda, A. pullulans AZ-6'nın ürettiğine oldukça benzer olduğu saptamıştır.

Tez araştırmasında, EPS örneklerinin, FT-IR spektrometresiyle gerçekleştirilen moleküler yapı analizlerinde, A. pullulans AZ-6 suşu tarafından üretilen EPS'ye ait spektrumların, pullulan için karakteristik pikler içerdiği belirlenmiştir. Çalışmada elde edilen bazı EPS örneklerinin molekül ağırlıkları hesaplandığında ise, bu değerlerin; 0.49x107-3.30x107 aralığında değiştikleri bulunmuştur.

Abstract:
In this thesis, the effects of various fermentation parameters on the pullulan production of Aureobasidium pullulans AZ-6 strain were investigated. Fermentation experiments in the study were carried out in the batch system, in shaking water baths whose temperature and shaking speed could be controlled. In order to determine the strain to be used in the study, pullulan production of seven A. pullulans strains were compared and local A. pullulans AZ-6 strain which produced pullulan at higher concentration (17.56 g/L) was selected for the experiments. When the effects of different carbon sources used in fermentation medium on pullulan production of  A. pullulans AZ-6 strain were examined, it was found that sucrose yielded higher pullulan production (15.66 g/L) among glucose, fructose, sucrose, galactose and maltose. In the experiments conducted for determining the nitrogen source that best supports the pullulan production of A. pullulans AZ-6 strain, in the fermentation medium, when as organic nitrogen sources; urea, yeast extract and pepton, as inorganic nitrogen sources; (NH4)2SO4, NaNO3, and NH4Cl were used, maximum pullulan concentration (18.61 g/L) was obtained in the medium in which pepton and (NH4)2SO4 were used together.
Later in this study, the optimization of pullulan production with A. pullulans AZ-6 was performed using the response surface methodology. In this scope, an experimental design plan consisting of 30 experimental points with six replicates in the center was created by using the central composite rotatable design method in the software. In this design, while the initial sucrose and peptone concentrations of the fermentation medium, the initial pH and temperature of the fermentation medium were selected as independent variables; the maximum exopolysaccharide (EPS) and pullulan concentrations, the specific growth rate of A. pullulans AZ-6, the maximum specific pullulan formation rate and pullulan yield were selected as dependent variables. After the experiments carried out according to the conditions in the design, model equations showing the effects of independent variables on dependent variables were derived by applying multiple regression analysis on obtained results with the help of the software, and the consistency of these equations were evaluated by variance (ANOVA) analysis. Optimization was performed with the desirability function in the software numerically. The conditions where the value of desirability function was 0.977, the initial sucrose and peptone concentrations and the pH of the fermentation medium were 100 g/L, 11.305 g/L and 6.481, respectively and the temperature was 24.2°C were determined as optimum among the 100 solutions computed by the software. In the experiments carried out under these conditions, maximum EPS and pullulan concentrations, specific growth rate, maximum specific pullulan formation rate and pullulan yield were obtained as; 36.95 and 35.47 g/L, 0.064 h-1, 0.036 [g pullulan/(g mo.h)], and 54.48%, respectively and optimum conditions were confirmed at 95% confidence level.

In the thesis research, the effects of using various preprocessed natural substrate sources directly as a fermentation medium or as the main component of fermentation medium on the pullulan production of A. pullulans AZ-6 strain were also investigated. In the experiments where whey, molasses, grape pulp, sugar beet pulp, melon, watermelon, onion and carrot peels and sweet potato were used as natural substrate sources; maximum pullulan production was obtained when sweet potato extract (37.62 g/L) and molasses solution (18.67 g/L) was used as fermentation medium directly.

In this thesis, the effects of UV mutation application on the pullulan production of A. pullulans AZ-6 were also investigated. In these experiments, it was found that the maximum pullulan concentrations (30.84-35.66 g/L) produced by 13 possible mutant strains were very close to each other and the maximum pullulan concentrations produced by these strains were very similar to those of A. pullulans AZ-6's production under the same conditions.

In the thesis research, in molecular structure analyzes performed by FT-IR spectrometer, it was determined that spectra of EPS produced by A. pullulans AZ-6 strain contained characteristic peaks for pullulan. When the molecular weights of some EPS samples obtained in the study were calculated, it was found that; these values vary in the range of 0.49x107-3.30x107.