Salubrinalin in vitro ısı stresi oluşturulmuş spermatogenik hücrelerde er stres yolağı üzerine etkisi
The effect of salubrinal on er stress pathway in heat-stressed spermatogonicells al in vitro
Yazar: SUNA KARADENİZ SAYGILI
Danışman: PROF. DR. MAHMUT KEMAL ÖZBİLGİN
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Hücre kültürü = Cell culture ; Salubrinalin = Salubrinalin ; Sperm = Spermatozoa ; Spermatogenez = Spermatogenesis ; İn vitro = In vitro ; İş stresi = Job stress

Özet:
Amaç: Deneysel olarak in vitro ısı stresi modeli (ISM) oluşturulmuş Spermatogenik hücrelerde Salubrinalin (SAL) endoplazmik retikulum (ER) stresi üzerinde etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Çalışmada fare spermatogonyum (GC1) ve fare spermatosit (GC2) hücre hatları kullanıldı.  SAL'ın IC50 dozu MTT yöntemi ile hesaplandı. Her bir hücre kontrol grubu (GC1-K, GC2-K), SAL grubu (GC1-SAL, GC2-SAL), ISM grubu (GC1-ISM, GC2-ISM) ve hem ISM hem SAL grubu (GC1-ISMSAL, GC2-ISMSAL) olmak üzere 4 alt gruba ayrıldı. Kontrol grubu hücreler standart kültür koşullarında inkübe edildi. ISM oluşturulan gruplar 430C sıcaklıkta 60 dk. inkübe edildi. SAL uygulaması yapılan gruplarda 20 µM SAL içeren besiyerinde 24 saat inkübasyon gerçekleştirildi. Deney sonrasında tüm gruplarda p-PERK, ATF6, GRP78, p-IRE1α, p-eIF2α, HSP70 belirteçleri ile immünfloresan boyama analizi yapıldı. Ayrıca tüm deney gruplarında GRP78, PERK ve eIF2α mRNA seviyeleri qRT- PCR yöntemi ile ölçüldü. 
Bulgular: ISM modelinin hücreler üzerinde sitotoksik etkiye sahip olduğu görüldü. ISM oluşturulmuş gruplarda tüm belirteçlerin immünoreaktivitelerinin artmış olduğu, bu hücrelerde ER stresi meydana geldiğinin bir göstergesi olarak kabul edildi. SAL uygulamasının ER stresini azaltmış olduğu tespit edildi. GRP78, PERK ve eIF2α mRNA seviyelerinin ISM uygulanan gruplarda artmış olduğu bulundu. SAL uygulanan gruplarda mRNA seviyelerinde azalma olmasına rağmen istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı.
Sonuçlar: Bu bulgular ışığında, spermatogenik hücrelerde ısı stresinin, ER stresini tetiklediği ve SAL'ın bu stres belirteçleri üzerinde etkin olduğu düşünüldü. Yapılacak ileri moleküler analizlerle spermatogenik hücrelerde ısı stresinde ER kaynaklı stres mekanizmalarının araştırılması teröpatik stratejiler açısından önem kazanacaktır.

Abstract:
Aim: It was aimed to investigate the effect of SAL on endoplasmic reticulum (ER) stress on experimental in vitro heat stress model (HSM) of spermatogenic cells.
Materials and Methods: In the study Mouse spermatogonium (GC1) and spermatocyte (GC2) cell lines were used. IC50 dose of SAL were calculated via MTT assay. Each cell lines were separated into 4 different groups which are; control (GC1-C, GC2-C), SAL treated (GC1-SAL, GC2-SAL), HSM experimental model (GC1-HSM, GC2-HSM) and SAL treated HSM model (GC1-HSMSAL, GC2-HSMSAL). Control cells were incubated under standard culture conditions. IHM model group cells were incubated under 43oC for 60 minutes. In the SAL group, cells were incubated with 20 µM SAL containing culture medium for 24 hours. After the experiments, all groups were stained with immünoflorescence probes of p-PERK, ATF6, GRP78, p-IRE1α, p-eIF2α, HSP70 antibodies. Moreover, mRNA levels of GRP78, PERK, eIF2α were evaluated with qRT-PCR.
Results: It was observed that HSM model has cytotoxicity. In the experimental model of HSM cells, all the markers showed elevated levels of immünoreactivity, that they were agreed upon to have ER stress. With the treatment of SAL, decreased levels of ER stress detected. GRP78, PERK and eIF2α mRNA levels were upregulated in the HSM model group. Even though there was a downregulation following SAL treatment, the difference was not statistically significant.
Conclusions: In the view of such findings, it was thought that heat stress triggered ER stress on spermatogenic cells, and SAL has effect on these markers. Studies of ER-related stress mechanisms on spermatogenic cells will be important for the therapeutical strategies with the forthcoming advanced molecular analyses.