SARS-COV-2 antijenlerinin seçimli izolasyonu ve tanımlanmasına yönelik afinite materyali hazırlanması
Preparation of affinity material for the selective ısolation and ıdentification of SARS-COV-2 antigens
Yazar: KEREM TOK
Danışman: PROF. DR. FİGEN ZİHNİOĞLU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Afinite membran = Affinity membrane ; Antijenler = Antigens ; Antikorlar = Antibodies ; COVID 19 = COVID 19 ; Korona virüsler = Coronaviridae ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; SARS virüsü = SARS virus

Özet:
Fonksiyonel Proteom/peptidom çalışmalarında kullanılan biyolojik örneklerin doğası gereği karmaşık bir matrikse sahip olması zaman zaman istenilen biyomolekülün analizini imkansız hale getirmektedir. Özellikle, belirli bir hastalığın tanısı ve tedavisinde kullanılan veya biyobelirteç olarak görev alan peptid/proteinlerin analizi, düşük konsantrasyon seviyelerinde bulunmaları, çeşitliliğin fazla olması ve matriks kompleksliği sebebiyle çoğu zaman bu biyomolekülleri belirlemek ve/veya proteomik analiz için numune karmaşıklığını azaltmak için zenginleştirme veya ön fraksiyonlama gibi ön işlemlere gereksinim duymaktadır. Bu amaç doğrultusunda hazırlanacak materyalin istenilen biyomolekülü bulunduğu ortamdan seçimli olarak geri kazanması hedeflenmiştir. Bu bağlamda çeşitli biyolojik proseslerde tanı/tedavi amaçlı kullanılabilecek proteinlerin karakteristik özelliklerine göre seçimli zenginleştirmesine ve fraksiyonlanmasına yönelik afinite materyallerinin tasarlanması hedeflendi.
SARS-CoV-2 enfeksiyonu, başlangıç ve pandemi olarak tanımlanmasından günümüze değin gerek tanı gerekse aşı/tedavi mekanizmaları yaygın olarak araştırılmaktadır. Bu bağlamda tez kapsamında SARS-CoV-2 PCR pozitif sürüntü örneklerinden SARS-CoV-2 antijenlerinin saflaştırılmasına yönelik Covid-19 spesifik antikor bağlı manyetik nanopartiküllerin hazırlanması gerçekleştirildi. Bu amaçla öncelikle SARS-CoV-2 PCR pozitif serum örneklerinde anti-COVID-19 IgG, IgA ve IgM varlığı ticari olarak temin edilen ELISA kitleri ile belirlendi. Bunlardan yüksek IgG, IgA ve IgM seviyelerini (çift ve üçlü pozitif) gösteren numuneler, antikor saflaştırma işlemi için seçildi. Birleştirilen serumlar amonyum sülfat (% 45) çöktürülmesi sonrasında immünoglobulinleri saflaştırmak için bir Protein A ve Protein A/G kolonuna uygulandı. %42±5 verimle elde edilen antikor preparatının karakterizasyonu; ELISA titer test, SDS-PAGE ve elektrokimyasal yöntemlerle gerçekleştirildi. Elde edilen poliklonal antikor preparatı EDC-NHS kimyası kullanılarak amino fonksiyonel Fe3O4 manyetik nanopartiküllerin yüzeyine 12.5 µg Ab/mg MNP oranında konjugasyonu sağlandı ve antijen saflaştırılması için test edildi. Hazırlanan MNP-Ab materyalinin optimizasyonu; bağlama tamponu, bağlama kapasitesi, bağlanma zamanı, elüsyon tamponu gibi parametrelerin incelenmesiyle gerçekleştirildi. Ayrıca, tekrar kullanılabilirlik ve depo kararlılığı gibi özellikleri de incelendi. Saflaştırılan antijenlerin karakterizasyonu; SDS-PAGE, elektrokimyasal ve kütle spektrometresi (LC-Q-TOF-MS/MS) ile yapılarak elde edilen preparatta majör olarak SARS-CoV-2 spike ve nükleokapsid proteinlerinin bulunduğu belirlendi. Bu çalışma sonuç olarak virüs enfekte hastaların serumlarından elde edilen poliklonal antikorları kullanarak manyetik nanopartikül tabanlı kolay ve hızlı bir şekilde sürüntüde bulunan antijenik yapıların saflaştırılması ve/veya zenginleştirilmesine yönelik model bir materyal hazırlanmış olup aynı zamanda virüs proteinlerinin belirlenmesinde kütle spektrometresinin potansiyel olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Abstract:
It is sometimes hard to analyze the desired biomolecules in biological samples in Proteomics/Peptidomics applications because of their matrix complexity. Especially, peptides/proteins that play a role in diagnosis or treatment of the disease have some limitations to analyze; found at low concentration levels, wide range diversity, and matrix complexity. To overcome these limitations, and identification of biomolecules or decrease the sample complexity enrichment or pre-fractionation approaches are needed. For this purpose, the target is selective enrichment of desired biomolecule from its enviroment with prepared material. To sum, the aim of this thesis is preparation of affinity materials for selective enrichment of proteins valuable in diagnose/treatment approaches.
Since the SARS-CoV-2 started and is introduced as an pandemic situation, both identification and vaccine/treatment mechanisms are focused until today. First, the presence of COVID-19 IgG, IgA, and IgM in SARS-CoV-2 PCR positive serum is determined by ELISA kits. The serum samples containing high level of immunoglobulins were pooled and pre-fractionated with 45% amonyum sulphate precipitation. After the dialysis, Protein A and Protein A/G immunoaffinity colums were used to obtain purified immunoglobulins. Antibody preparate is obtained with %42±5 yield and characterized by ELISA titer, SDS-PAGE, and electrochemical methods. The obtained antibodies were conjugated to amine functionalized Fe3O4 magnetic nanoparticle surface by using EDC-NHS chemistry linkage with 12.5 µg Ab/mg MNP ratio, and prepared material were tested for COVID-19 antigens purification. The optimization of the prepared MNP-Ab affinity material was carried out by examining the parameters such as binding buffer, binding capacity, binding time, elution buffer. Also, the reusability and storage stability of the material was investigated. Purified antigens were characterized by SDS-PAGE, electrochemical, and mass spectrometric (LC-Q-TOF-MS/MS) techniques. Obtained antigen mix include majorly SARS-CoV-2 spike and nucleocapsid protein. As a result of this study, a model material was prepared by using polyclonal antibodies obtained from the serums of infected patients for an easy and rapid purification and/or enrichment of antigenic structures from swab samples with a magnetic nanoparticle-based manner. it also suggests that mass spectrometry could potentially be used in the determination of virus proteins.