Kayseri'nin mahzemin yöresindeki sığırlarda coccıdıosıs'e yol açan patojenik eımerıa türlerinin moleküler prevalansı ve filogenetik karakterizasyonu
Molecular prevalence and phylogenetic characterization of pathogenic eimeria species, which cause bovine coccidiosis in mahzemi̇n area of Kayseri̇
Yazar: MUZAFFER HATIRNAZ
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Eimeria = Eimeria ; Filogenetik = Phylogenetic ; Kayseri = Kayseri ; Koksidiyozis = Coccidiosis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Prevalans = Prevalence ; Sığırlar = Cattles

Özet:
Bu çalışma, Kayseri'nin mahzemin yöresinde sığırlarda coccidiosis'e yol açan Eimeriatürlerinin moleküler prevalansı ve filogenetik karakterizasyonunu ortaya koymak amacıylaplanlanmıştır. Bu amaçla 2014 yılında araştırma yöresinde halk elinde süt ve besi sığırcılığı yapılan 23 ahırdan farklı yaş, cinsiyet ve ırklara ait toplam 150 sığır incelenmiştir.Sığırlardan tekniğine uygun şekilde alınan dışkı örnekleri laboratuvarda Eimeria ookistleri yönünden incelenmiş ve pozitif örneklerde gram dışkıdaki ookist sayısı (OPG) belirlenmiştir. Pozitif belirlenen sığırlara ait dışkı örnekleri sporlandırma prosedürüne tabii tutulup ookist morfolojisine göre Eimeria türlerinin teşhisleri yapılmıştır. Eimeriaookistleri ile pozitif belirlenen örneklere ait genomik DNA izolatları patojenik Eimeria türlerinin kantitatif identifikasyonu için Real Time PCR analizlerine tabii tutulmuştur. Morfolojik identifikasyon ve Real Time PCR analizleri temelinde belirlenen patojenik Eimeria türlerine ait izolatların 18S rRNA gen bölgeleri amplifiye edilmiş ve sonrasında klonlama, plazmid pürifikasyonu ve sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. Nükleotid dizileri saptanan izolatların moleküler karakterizasyonları belirlendikten sonra GenBank aksesyonları (KU052223-37) sağlanmış ve filogenetik yapılanmaları belirlenmiştir. İncelemesi yapılan sığırlardan 98'i (%65,3) Eimeria ookistleri yönünden pozitif bulunmuştur.Eimeria pozitifliğinin sığırların yaş, cinsiyet, ırk ve dışkı karakterlerine göre dağılımında istatistiksel bir farklılık belirlenmemiştir (p>0,05). Pozitif belirlenen sığırlarda ortalama OPG değeri 883,8±1166,2 belirlenmiştir. OPG değerleri <3ay ve 4-12 ay yaş grupları ile kanlı ishalli ve ishalli dışkı karakteri gruplarında istatistiksel anlamda daha yüksek düzeyde saptanmıştır. Pozitif örneklerde morfolojik identifikasyon sonucunda en yaygın tür %76,5 ile E. bovis bulunmuş bunu sırasıyla %64,3 ile E. zuernii, %51,0 ile E. auburnensis, %44,9 ile E. alabamensis, %16,3 ile E. cylindrica, %6,1 ile E. bukidnonensis ve %4,1 ile E. subspherica izlemiştir. Patojenik türler için Real Time PCR analizleri sonucunda DNA kopya sayısı düzeyinde en yüksek pozitiflik E. bovis için belirlenmiş bunu sırasıyla E. zuernii, E. auburnensis ve E. alabamensis izlemiştir.<3 ay grubu ve ishalli dışkı karakterinde olan örneklerde E. bovis ve E. zuernii pozitifliği de DNA kopya sayısı düzeyinde E. auburnensis ve E. alabamensis pozitifliklerine oranla daha yüksek belirlenmiştir (p<0,05).18S rRNA gen bölgesi filogenetik analiz sonuçlarına göre araştırma yöresinde belirlenen E. zuernii, E. bovis, E. auburnensis, E. alabamensis, E. cylindrica ve E. bukidnonensis türlerine ait izolatların Japonya'dan bildirilen izolatlarla birlikte 3 monofiletik grupta tür bazlı olarak kümelendikleri saptanmıştır.Belirlenen izolatlar ve aynı türe ait Japonya izolatları arasında farklı oranlarda (%0,0-0,7) intraspesifik sekans heterojenitesi belirlenmiştir. 
Sonuç olarak bu çalışma ile Kayseri'nin Mahzemin yöresindeki sığırlarda coccidiosis'e yol açan Eimeria türlerinin moleküler prevalansı ve enfeksiyon yükleri kantitatif düzeyde ortaya konmuş ve patojenik türlerin filogenetik karakterizasyonları sağlanmıştır.
Anahtar kelimeler: Sığır, Coccidiosis, Real Time PCR, Moleküler prevalans, Filogenetik Karakterizasyon

Abstract:
This study was conducted to determine the molecular prevalence and phylogenetic characterization of Eimeria species that cause bovine coccidiosis in Mahzemin district of Kayseri. For this aim in year 2014, 150 cattle belong to different ages, gender and breed were sampled from 23 barns in which the cattle were raised for milk and food production by local folk. Techniqually collected fecal samples from cattle were investigated in terms of Eimeria ookists at the laboratory and ookists per gram of feces (OPG) were calculated in the positive samples. Species identifications of Eimeria ookists were performed after the sporulation of the ookists in fecal samples from positive cattle. Real Time PCR analyses were carried out on the genomic DNA isolates from the samples positive with Eimeria ookists in order to quantitative identification of pathogenic Eimeria species. 18S rRNA gene regions of the isolates belong to the Eimeria species, which were determined on the base of morphological identification, and Real Time PCR analyses were amplified. Afterwards cloning, plasmid purification and sequence analyses were performed. After the the molecular characterization of the isolates in which the nucleotide sequences were determined, GenBank accessions were provided (KU052223-37) and phylogenetic constructions were obtained.98 (65.3%) out of examined cattle were found to be positive with Eimeria ookists. No statistically importance was determined (p>0.05) in the distribution of Eimeria positivity over the age, gender, breed and feces structure of the infected cattle. The mean OPG was determined as 883.8±1166.2 in the positive cattle. The OPG values were found to be statistically higher in the <3 month and 4-12 month age groups and also in bloody diarrheaoic and diarrheaoic groups. According to the morphological identification results of the positive samples, E. bovis was found to be the most prevalent species with the ratio of 76.5% and this was followed by E. zuernii, E. auburnensis, E. alabamensis,E. cylindrica, E. bukidnonensisandE. subspherica with the ratios of64.3%, 51.0%, 44.9%, 16.3%, 6.1% and 4.1%, respectively. The Real Time PCR assay results for pathogenic species revealed that E. boviswas the species with the maximum positivity and this was followed byE. zuernii, E. auburnensisandE. alabamensison the base of DNA copy number.The E. bovisandE. zuernii positivities in the 3 month and diarrheaoic groups were determined higher than the positivities for E. auburnensisandE. alabamensisbased DNA copy number level and this difference was found statistically important (p<0.05). According to the 18S rRNA phylogenetic analyses results, the isolates determined in the research area and belong to E. zuernii, E. bovis, E. auburnensis, E. alabamensis, E. cylindricaandE. bukidnonensisspecies along with the Japanese isolates were placed in 3 monophyletic groups and clustered on the basis of species. Intraspecific sequence heterogenicy with different rates (0.0-0.7%) among the determined isolatates and the Japanese isolates were determined. 
In conclusion, the molecular prevalence and quantitative infection loads of Eimeria species that cause bovine coccidiosis in the Mahzemin district of Kayseri were revealed and phylogenetic characterizations of pathogenic species were provided with this study. 
Key words: Cattle, Coccidiosis, Real Time PCR, Molecular prevalence, Phylogenetic Characterization