Çinko ve selenyumun antioksidan özelliklerinin oksidatif stres indüklü DNA radikallerinin immün-spin-yakalama yöntemi kullanılarak incelenmesi
Investigation of antioxidant properties of zinc and selenium on oxidative stress-induced dna radicals by immuno-spin-trapping technique
Yazar: VEDİA DELETİOĞLU
Danışman: PROF. DR. BELMA TURAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; DNA = DNA ; Hidrojen peroksit = Hydrogen peroxide ; Nitro bileşikleri = Nitro compounds ; Oksidatif hasar = Oxidative damage ; Proteinler = Proteins ; Selenyum = Selenium ; Serbest radikaller = Free radicals ; Çinko = Zinc

Özet:
Bir elektronunu kaybetmiş bir oksijen atomu içeren serbest radikaller, kararsız ve reaktif moleküller olarak, özellikle DNA ve proteinler etrafında bulunan elektronlara afinite göstermelerine neden olmakta, bu durum da DNA ve proteinler ile etkileşim sonrası fonksiyon bozukluğu, mutasyon ve hücre ölümlerine neden olabilmektedir. Serbest radikallerin biyomoleküller üzerinde göstermiş olduğu bu etkiye oksidatif stres adı verilir. Oksidatif stres canlılarda belirli bir seviyenin üstünde ise ve/veya antioksidan aktivitenin yetersiz kaldığı durumlarda çeşitli patolojik durumlar oluşturmaktadır. Serbest radikallerin yanında hücrelerde meydana gelen reaktif oksijen ürünleri (ROS) de DNA, protein, karbonhidrat ve lipidler gibi biyolojik açıdan öneme sahip moleküllere zarar verebilmektedir.
Diyabet ile ilgili yapılan çalışmalarda, diyabetli hastalarda ROS'lerinin peroksidasyonunun artmış olduğu ve oluşan oksidatif stresin diyabetin ilerlemesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Redoks biyokimyasında çeşitli modifikasyonların belirlenebilmesi ve sonrasında radikallerin nerede oluşup lokalize olduğunun tespit edilmesi gerekmektedir. Elektron spin rezonans (ESR) biyolojik radikallerin geniş bir bölümünün tespit edilmesi aşamasındaki in vitro çalışmalarda kullanılmasına karşın, DNA ve protein radikallerinin hücre içerisinde tespit edilmesi aşamasında yeterli olamamış ve bu nedenle immüno-spin-yakalama adını verdikleri yeni bir teknik geliştirilerek, DNA ve protein merkezli radikallerin yüksek verimlilik ile tespit edilebilmesini sağlamıştır.
Bu çalışmada immüno-spin yakalama tekniği kullanılarak, DNA ve protein düzeyinde serbest radikal oluşumunun tespiti amaçlanmıştır. Ayrıca immüno-spin-yakalama tekniği kullanılarak in vitro koşullarda DNA üzerinde, selenyum ve çinkonun pro-oksidan/antioksidan  etki gösterdiği konsantrasyonları belirlenmeye çalışılmıştır. Ek olarak normal ve metabolik sendromlu sıçan  kardiyomiyositlerinden izole edilen proteinlerde bu teknik kullanılarak oluşan protein radikallerinin oluşum seviyeleri karşılaştırılmıştır.  Ayrıca, yine protein-oksidan etkileşmesinde çinko ve selenium elementlerinin hangi konsantrasyonda oksidan ve angi konsantrasyonda pro-oksidan etki gösterdikleri Western-blot tekniği ile de doğrulanmıştır. Böylece, bu çalışma sonuçları, bu tekniğin DNA ve protein gibi moleküllerle serbest radikal etkileşimleri oldukça yetkin bir şekilde kullanılabileceğini göstermiştir.

Abstract:
Free radicals are non-stabile and reactive molecules that contain an oxygen molecule, occur ing through initial abstraction of an electron, in particular, having affinity or the electrons around DNA and proteins. Due to the fact that, free radicals that interact with DNA and proteins have been implicated in cellular dysfunction, mutation, cell death and cancer diseases. These effects on biomolecules via free radicals are called oxidative stress. Oxidative stress consists of various pathological conditions when it rises above certain level in cells and/or antioxidants level is insufficient.  At the same time, reactive oxygen species (ROS) that occur in the cells can damage the important biological molecules like DNA, protein, carbohydrates and lipids. In studies related to diabetes it has been shown that, the reactive oxygen species have increased together with the oxidative stress effects in the progression of diabetes.
Understanding the role redox biochemistry has in health and disease, requires the identification of a biomolecule that targets such modifications, specific residue where the radical was first generated and their localization in the whole animal. Electron spin resonance (ESR) technique has been used in in vitro studies of a wide range of biological radicals but lacks the sensitivity to detect DNA and protein radicals in intact cells. Therefore, a new technique, immuno-spin-trapping, has been developed. It is a very useful technique to detect DNA and protein centered radicals with high efficiency.
In this study, we aimed to detect DNA and protein centered radicals by using immuno-spin-trapping technique. Moreover, by using immuno-spin-trapping technique as in vitro, we aimed to determine selenium and zinc's pro-oxidant and antioxidant effects on DNA. In addition, this technique has been used to compare levels of protein centered radicals on isolated proteins in cardiomyocytes from normal and metabolic syndrome rats. Moreover, it is also confirmed by Western-blotting technique that zinc and selenium have a pro-oxidant as well as antioxidant effects on the interaction between protein and oxidant depending on their concentrations. Thus, our results showed that this technique can be used in a highly competent manner on the interactions between free radicals and molecules like DNA and protein.