Aβ (1-42) ile muamele edilmiş sıçan sinaptozomları üzerinde koruyucu ajan olarak bexaroteneve nikotinamid (NA) fonksiyonunun ex vivo olarak araştırılması
Ex vivo investigation of bexarotene and nicotinamide (NA) function as protective agents on aβ (1-42) treated rat synaptosomes
Yazar: CEYHAN HACIOĞLU
Danışman: PROF. DR. GÜNGÖR KANBAK
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Apoptozis = Apoptosis ; Beksaroten = Bexarotene ; Nikotinamid = Nicotinamide ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Poli (ADP-riboz) polimerazlar = Poly (ADP-ribose) polymerases ; Sinaptozomlar = Synaptosomes ; Sirtuin-1 = Sirtuin-1 ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Nörodejenerasyonla ilişkili nöronal işlev bozukluklarını araştırmak için kullanılan sinaptozomlar, sinaptik fonksiyonların incelenmesine olanak sağlayan bir in vitro model sistemidir. Sirtuin 1 (SIRT1) ve poli(ADP-riboz) polimeraz-1 (PARP1)'in yanı sıra peroksizom proliferatör ile aktive edilmiş reseptör gama (PPARγ), Alzheimer hastalığında (AD) rol oynayan stres yanıtı ve apoptotik yolakları regüle ederek nöroprotektif etkiler göstermektedir. AD etyopatogenezinde henüz etkin bir tedavi şekli bulunmamaktadır. Bu nedenle, potansiyel yeni terapötik ajanların AD'deki rollerini daha iyi anlayabilmek için nöroprotektif sinyal yolakları üzerindeki etkilerinin araştırılması gerekmektedir. Çalışmamızda, nükleer reseptör agonisti olan bexarotene ve hücresel biyoenerjetiğin homeoastazından sorumlu olan nikotinamid, Aβ(1-42) ile inkübe edilmiş sinaptozomlardaki nöroprotektif etkilerinin antioksidan, oksidatif stres, apoptoz ve SIRT1/PARP1/PPARγ sinyal yolakları üzerinden araştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmamız in vivo ve in vitro olmak üzere 2 kısımdan oluşmaktadır. İn vivo kısmında, her grupta altı hayvan olacak şekilde yirmi dört adet Wistar albino erkek sıçan 4 gruba (kontrol, DMSO, nikotinamid ve bexarotene) ayrıldı. Deney gruplarındaki hayvanlara 7 gün boyunca intraperitoneal olarak DMSO (%1), nikotinamid (100mg/kg) ve bexarotene (0.1mg/kg) uygunlandı. Ardından, hayvanlar dekapite edilerek serum ve beyin dokuları alındı. Çalışmamızın in vitro kısmında ise, AD modelinin oluşturulmasında kullanılacak olan sinaptozomların beyin dokusundan elde edilme için 3 farklı izolasyon yöntemi (Whittaker, Percoll gradient ve sükroz gradient) kullanıldı. Elektron mikroskop analiz sonuçlarına göre, en efektif izolasyon yönteminin sükroz gradient prosedürü olduğu belirlendi. 10µM Aβ(1-42) konsantrasyonu ile inkübe edilen sinaptozomlardaki TAS, TOS, CASP3, Cyt c, SIRT1, PPARγ ve PARP-1 seviyeleri ELISA yöntemiyle ölçüldü. 
Serum ve beyin örneklerindeki biyokimyasal analizler ve histopatolojik incelemeler DMSO, nikotinamid ve bexarotene uygulamalarının sıçan beyin dokusunda herhangi bir hasara neden olmadığını gösterdi. İn vitro Aβ(1-42) uygulamasının sinaptozomlarda TAS, SIRT1 ve PPARγ seviyelerini azaltırken, TOS, CASP3, Cyt c, ve PARP1 seviyelerini arttığını bulduk. Nikotinamid tedavisinin antioksidan kapasitesini destekleyerek oksidatif stresi ve apoptozu baskıladığı ve SIRT1 aktivasyonu üzerinden PPARγ artırırken, PARP1 düşüşüne neden olmuştur. Bexarotene ise, PPARγ aktivasyonu ile SIRT1 seviyelerinde ılımlı bir artışa neden olmuştur.
 Sonuç olarak, AD patogenezinde nikotinamid sinaptozomlardaki miktokondriyal fonksiyonları düzenleyerek bexarotene göre daha etkili olabileceğini bulduk.

Abstract:
Synaptosomes used to investigate neuronal dysfunctions associated with neurodegeneration are an in vitro model system that allows examination of synaptic functions. Sirtuin1 (SIRT1) and poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1) as well as peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) have neuroprotective effects by regulating stress response and apoptotic pathways involved in the Alzheimer's disease (AD). There is no effective treatment for AD pathogenesis yet. Therefore, it is necessary to investigate the effects of potential new therapeutics on neuroprotective signaling pathways in order to understand their role in AD. In our study, we were aimed to investigate the neuroprotective effects of bexarotene, nuclear receptor agonist, and nicotinamide, responsible for the homeoastasis of cellular bioenesthetics, in synaptosomes incubated with Aβ(1-42) through antioxidant, oxidative stress, apoptosis and SIRT1/PARP1/PPARγ signal pathways.
Our study consists of 2 parts, in vivo and in vitro. In the in vivo section, twenty four Wistar albino male rats were divided into 4 groups (control, DMSO, nicotinamide and bexarotene) with six animals in each group. DMSO (1%), nicotinamide (100mg/kg) and bexarotene (0.1mg/kg) were administered intraperitoneally to animals in the experimental groups for 7 days. Then, animals were decapitated and serum and brain tissues were removed. In the in vitro part of our study, 3 different isolation methods (Whittaker, Percoll gradient and sucrose gradient) were used to obtain the synaptosomes from the brain tissue that will be used to create the AD model. According to the electron microscope analysis results, the most effective isolation method was determined to be the sucrose gradient procedure. TAS, TOS, CASP3, Cyt c, SIRT1, PPARγ and PARP-1 levels in the synaptosomes incubated with a concentration of 10µM Aβ (1-42) were measured by ELISA method. 
Biochemical analysis and histopathological examinations in serum and brain samples showed that DMSO, nicotinamide and bexarotene treatments did not cause any damage to the rat brain tissue. We found that in vitro Aβ (1-42) administration decreased TAS, SIRT1 and PPARγ levels in synaptosomes while increasing TOS, CASP3, Cyt c, and PARP1 levels. Nicotinamide treatment suppressed oxidative stress and apoptosis by supporting antioxidant capacity and increased PPARγ through SIRT1 activation, causing PARP1 decrease. On the other hand, bexarotene caused a moderate increase in SIRT1 levels with PPARγ activation.
Consequently, we found that nicotinamide can be more effective than bexarotene in AD pathogenesis by regulating mycochondrial functions in synaptosomes.