Kardiyomiyositlerde ksantin/ksantin oksidaz ile indüklenen strese karşı, fenolik bitkisel bileşiklerin antioksidatif, anti-inflamatuvar ve sitoprotektif etkilerinin in vitro yöntemlerle araştırılması
Research on antioxidative and cytoprotective effects of phenolic antioxidants against xhantine/xhanthine oxidase-induced cellular stress and toxicity in cardiomyocyte cultures in vitro
Yazar: NAMIK ÖZBEK
Danışman: PROF. DR. ÇİMEN KARASU
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Bitki özütü = Plant extract ; Ksantin oksidaz = Xanthine oxidase ; Kuersetin = Quercetin ; Polifenol = Polyphenol ; Yapraklar = Leafs ; Zeytin = Olive ; Zeytin ağacı = Olive tree

Özet:
Hipoksi-yeniden oksijenlenme sürecinde kalpte ksantin oksidaz enziminin aktive olması sebebiyle güçlü oksidan süperoksit anyonu üretimininin arttığı gösterilmiştir. Süperoksit anyonu oluşturucu "ksantin/ksantin oksidaz " sistemlerin kardiyomiyosit ölümünü tetiklediği ve iskemik kalp hastalıklarına zemin oluşturduğu bilinmektedir. X/XO'ın kardiyak etkilerini ve polifenolik bileşiklerin koruyucu özelliklerinin mekanizmalarını daha iyi anlayabilmek için, bu tezde X/XO ile indüklenen oksidatif stres modelinde, iki farklı zeytin yaprağı kuru ekstresinin ve zeytin yaprağı polifenolik bileşiklerinin (oleuropein, kersetin ve hidroksitirozol) hücre canlılığı, reaktif oksijen türevi (ROS) oluşumu ve sağkalım-ölüm süreçlerinde rol oynayan hücre içi sinyal proteinleri düzeyindeki etkilerini H9c2 kardiyomiyositlerde araştırdık. H9c2 hücrelerinin X/XO ile uyarılması ROS oluşumunu arttırdı (DCFDA deneyi) ve hücre canlılığını (MTT deneyi) inhibe etti. Her bir ekstrenin ve polifenolik bileşiklerin farklı konsantrasyonları ile ön inkübasyon,  X/XO aracılı ROS oluşumunu ve hücre canlılığını anlamlı olarak inhibe etti. Western blot analizleri, MAPKAPK-2 ve p44/42-MAPK'ın fosforile formlarının ve cl-caspase-3 düzeylerinin X/XO muamelesi ile arttığını ve fosforile c-jun ve Hsp27'in düzeylerinin ise azaldığını gösterdi. Estreler, kersetin ve hidroksitirozol X/XO ile indüklenen p-MAPKAPK-2 ve cl-caspase-3 düzeylerini iyileştirdi. Oleuropein,  X/XO ile indüklenen p-MAPKAPK-2 düzeylerini inhibe ederken, cl-caspase-3 düzeylerini anlamlı olarak etkilemedi. Hidroksitirozol p-c-Jun düzeylerinde X/XO ile oluşan azalmayı arttırırken, Hsp27 ve p44/42-MAPK (ERK1/2)'nin fosforile formlarının indüksiyonuna neden oldu. Bu çalışma sonuç olarak oleuropein, hidroksitirazol ve kersetin içeriği yüksek polifenolik zeytin yaprağı ekstrelerinin, X/XO ile indüklenen oksidatif strese karşı hücre canlılığını iyileştirerek, ROS oluşumunu önleyerek ve sağkalım-ölüm süreçlerinde rol oynayan özgün proteinlerin fosforile formlarının ifadelenme düzeylerini değiştirerek kardiyomiyosit hücrelerini koruduğunu göstermiştir.

Abstract:
The superoxide anion generating xanthine/xanthine oxidase (X/XO) system has been shown to induce cardiomyocyte death, which is a hallmark of ischemic heart disease. To better understand the exact mechanism of the action of X/XO and the effects of polyphenols,  in this thesis we investigated the molecular action mechanism (s) and involved signaling pathways in the treatment of X/XO-induced oxidative stress with two different olive leaf extract mixtures and olive leaf polyphenolic compounds, oleuropein, quercetin and hydroxytyrosol in cardiomyocyte cell line.  The stimulation of H9c2 cells with X/XO evoked ROS generation and inhibited the viability of cells. The preincubation with each extract, oleuropein, quercetin or hydroxytyrosol partially improved the viability and completely inhibited the generation of intracellular ROS in X/XO exposed cells. Western blot analysis showed that X/XO led to an increase in p-MAPKAPK-2, phospho-p44/42-MAPK and cl-caspase-3, but a decrease in the phosphorilation of p-c-Jun and p-Hsp27. Preincubation with each extract, quercetin or hydroxytyrosol partially ameliorated p-MAPKAPK-2 and inhibited cl-caspase-3 induced by X/XO. Oleuropein while inhibited p-MAPKAPK-2, had no effect on cl-caspase-3 in X/XO exposed cells. Hydroxytyrosol also increased down regulation of a transcriptional target p-c-Jun and led to overexpression in a protective stress-sensitive protein phospho-p44/42-MAPK (ERK1/2) and p-Hsp27 in X/XO exposed cells. We concluded from the results of our experiments that olive leaf extracts including high polyphenol content with oleuropein, hydroxytyrosol and quercetin provide cardiomyocyte cell protection activity against X/XO-induced oxidative challenge through recovery and good maintenance of cell viability, inhibiting ROS production and modulation of signaling proteins related with cell survival and death.