Deneysel sıçan modelinde arteriyel defekt onarımında kullanılan arter ve ven greftlerinde, neointimal hiperplazi gelişimine botulinum toksin A'nın etkisinin araştırılması
The investigation of the effect of botulinum toxin A over the development of neointimal hyperplasia at the arteries and venous grafts used for the reconstruction of arterial defects in an experimental rat model
Yazar: SERHAT ATALAY EVİŞ
Danışman: PROF. DR. UFUK EMEKLİ
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Arterler = Arteries ; Botulinum toksinleri = Botulinum toxins ; Cerrahi-kardiyovasküler = Surgery-cardiovascular ; Cerrahi-plastik = Surgery-plastic ; Sıçanlar = Rats ; Transplantlar = Transplants ; Vasküler greftler = Vascular grafts ; Venler = Veins

Özet:
Amaçlar
Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi klinik  pratiğinde, özellikle rekonstrüktif mikrocerrahi alanında  vasküler mikroanostomozlar  sıklıkla uygulanmaktadır.  Mikrovasküler cerrahi uygulamalarında,  onarılacak damar uçları bazen direkt olarak anastomoz yapılarak onarılabilmekteyken  bazen de  onarım için vasküler greftlerin kullanımı  gerekebilmektedir.  Gerek  damar uçlarının direkt   anastomozuyla yapılan onarımlarda, gerekse  vasküler greftler kullanılarak yapılan mikrovasküler onarımlarda,  kan akımı erken dönemde  anastomoz hatlarında  trombüs oluşumu ve vasküler spazm,  bundan sonra da tromboembolizm gibi  nedenlerle oluşan   mikrosirkülasyon bozuklukları nedeniyle engellenebilmektedir. Neointimal hiperplazi gelişimi sürecinde oluşan protrombotik tablo tromboembolizme zemin hazırlayabilir. Yine neointimal hiperplastik yanıt damar çapını kritik düzeylere kadar azaltabilir.  	
Vasküler greftler kullanılarak yapılan onarımlar direkt yapılan anostomozlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek  neointimal hiperplazi gelişimi oranlarına sahiptir. Çalışmamızda arter ve ven grefti ile yapılan arteriyel defekt onarımlarında  neointimal hiperplazi gelişimini azaltacak bir farmakolojik  ajan olarak botulinum toksin A'nın etkinliğini  göstermeyi amaçladık. 
Gereç ve Yöntemler
Çalışmamızda toplamda 16  Sprague-Dawley türü sıçan kullanılmıştır. Sıçanlar her  grupta 4 sıçan olmak üzere 4 gruba ayrılmıştır. Çalışmada kullanılacak  denek sayısını azaltmak için kullanılan sıçanların, her iki taraf femoral arterleri üzerinde çalışılmıştır. Gruplar; Grup 1- arter grefti ile arteriyel defekt onarımı yapılacak grup, grup 2- ven grefti ile arteriyel defekt onarımı yapılacak grup, grup 3-arter grefti ile arter defekti onarımı sonrasında botulinum toksin uygulanacak grup, grup 4-ven grefti ile arteriyel defekt onarımı sonrasında botulinum toksin uygulanacak grup  olarak belirlenmiştir. Her gruptaki sıçanların ilk operasyonlarının ardından sıçanlar 28. gün ikinci kez opere edilmiştir. İlk operasyonda ve ikinci operasyonda, femoral arter çapları ve  uygulanan vasküler greft çapları ölçülmüş, damar açıklıkları değerlendirilmiş, ikinci operasyonları sonunda  vasküler greft ile onarım yapılan femoral arter, anostomoz hatlarını da içine alacak şekilde  histopatolojik örnek olarak alınmış ve sıçanlar sakrifiye edilmiştir.  Alınan örnekler hematoksilen eozin ile boyanarak, histomorfolojik incelemeye yapılmıştır. Örneklerde intima ve media kalılıkları ölçülmüş,  intima kalınlığının media kalınlığına  oranı ve intima kalınlığının intima ve media kalınlıklarının toplamına oranı hesaplanmıştır.  Elde olunan veriler bağımsız örneklemler T testi, eşleştirilmiş örneklemler  T testi ve  Mann-Whitney U testi  kullanılarak karşılaştırılmıştır. 
Bulgular
Botulinum toksin A uygulanan gruplarda(Grup 3 ve 4), sıçanların 28. gün sonunda ölçülen femoral arter çapılarının, ilk operasyonda ölçülen çaplarına göre anlamlı olarak arttığı görülmüştür(p<0,05).  Bu artış botulinum toksin uygulanmayan gruplarda saptanmamıştır(p>0,05).  Yine safen arter grefti kullanılarak yapılan arteriyel defekt onarımı sonrası botulinum toksin uygulanan grupta (Grup3),  botulinum toksin uygulanmayan gruba(Grup 1) göre safen arter grefti çapının anlamlı olarak arttığı görülmüştür(p<0,05).  Ancak safen ven grefti ile onarım sonrası botulinum toksin uygulanan (Grup 4) ve uygulanmayan(Grup 2)  gruplar karşılaştırıldığında safen ven greft çapında anlamlı bir artış saptanmamıştır. 
Histomorfolojik verilerin değerlendirilmesinde, arter ve ven grefti ile arteriyel defekt rekonstrüksiyonu yapılan gruplar yine arter ve ven grefti uygulaması sonrasında botulinum toksin uygulanan  gruplar ile karşılaştırılmıştır (Grup 1 ile Grup 3 ve Grup 2 ile Grup 4 karşılaştırılmıştır). Arter ve ven grefti ile arteriyel defekt rekonstrüksiyonu sonrası botulinum toksin uygulanan gruplarda (grup 3 ve grup 4), botulinum toksin uygulanmayan gruplara göre (grup 1 ve grup 2) intima kalınlığının, intima/media ve intima/intima+media oranlarının anlamlı olarak daha az olduğu görülmüştür (p<0,05).
Sonuçlar
Çalışmamızda, botulinum toksin uygulanan gruplarda vasküler greft proksimalindeki femoral arter segmentinin çapında 28 gün sonunda anlamlı artış olduğunu, yine arter greftleri ile yapılan arteriyel defekt onarımı sonrası botulinum toksin uygulanmasının greft çapında anlamlı artışa neden olduğunu saptadık. Ancak ven greftleri ile yapılan arteriyel defekt onarımlarında greft çapında 28 gün sonunda artış saptasak da bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. Bu durum ven greftlerinin duvar yapısı nedeniyle dilatasyona yatkın olmalarına bağlanmıştır.
Botulinum toksin A'nın arter ve ven greftlerinde 28. gün , intima kalınğında anlamlı azalma sağladığı ancak media kalınlığına anlamlı bir etkisi olmadığı görülmüştür. Bu durum botulinum toksin A'nın neointimal hiperplastik yanıtı azalttığını göstermektedir. 
Elde ettiğimiz sonuçlar botulinum toksinin neointimal hiperplazi gelişimini sınırlamak için kullanılabilecek bir ajan olduğu hipotezimizi desteklemektedir.

Abstract:
Objectives:
Vascular microanastomoses are performed frequently in the clinical practice of Plastic Reconstructive and Aesthetic Surgery, especially in the field of reconstructive microsurgery.  In the practice of microvascular surgery, the vessel ends may be  coapted by anastomosing directly.  However, in some cases, the utilization of vascular grafts may be required for reconstruction.  Thrombus formation and vascular spasm may be seen at the anastomosis sites at the early stages both in direct anastomoses and in microvascular reconstructions with vascular grafts.  After this period, blood flow may be compromised by microcirculatory disorders that are caused by various reasons such as thromboembolism.  The prothrombotic state that is formed during the development of neointimal hyperplasia may give rise to thromboembolism.  Also, the neointimal hyperplastic response can diminish the diameter of the vessel till critical levels.
The reconstructions that are done with vascular grafts have higher rates of neointimal hyperplasia development in comparison with the direct anastomoses.  In this study, our aim is to show the efficiency of a pharmacologic agent, botulinum toxin A, which  may decrease the development of neointimal hyperplasia in arterial defect reconstructions with arterial and venous grafts.
Materials and Methods
A total of 16 Sprague - Dawley type rats were included in this study.  The rats were classified in four groups with four rats in each group.  Bilateral femoral arteries of the rats were utilized in order to decrease the number of subjects of the study.  The groups were determined in such a manner:  In Group 1, the arterial defects were reconstructed with arterial grafts.  In Group 2, the arterial defects were reconstructed with venous grafts.  In Group 3, the arterial defects were reconstructed with arterial grafts, and then, botulinum toxin was administered.  In Group 4, the arterial defects were reconstructed with venous grafts and then, botulinum toxin was administered.  All the rats of all groups had second operations that were done 28 days after the first operations.  Femoral artery diameters, the diameters of the vascular grafts, and the vascular patencies were measured during both the first and the second operations.  At the end of the second operations, the femoral arteries that were reconstructed with vascular grafts were biopsied as histopathological specimen which included the anastomosis sites.  The rats were sacrificed at the end of the second operations.  The specimen were stained with haematoxylin and eosin dye, and they were examined histomorphologically.    The thicknesses of the intimal and medial layers were measured, and the ratio of the intimal thickness to the medial thickness and the ratio of the intimal thickness to the sum of the intimal and medial thicknesses were calculated.  The obtained data were compared with independent samples T test, paired samples T test and Mann - Whitney U test.
Results
The diameters of the femoral arteries that were measured during the second operations were significantly higher than the diameters that were measured during the first operations in the groups that were treated with Botulinum toxin A (Group 3 and 4) (p<0,05).  This increase was not detected in the groups that were not treated with Botulinum toxin A (p>0,05).  Also, the diameters of the saphenous artery grafts were increased significantly in the group whose  arterial defects were reconstructed with saphenous artery grafts, and which received Botulinum toxin A treatment (Group 3), in comparison with the saphenous artery graft group which did not receive Botulinum toxin A treatment (p<0,05).   However, a significant increase in the diameters of the saphenous vein grafts were not seen in the group that received Botulinum toxin A treatment (Group 4) in comparison with the group that did not receive the Botulinum toxin A treatment (Group 2).
During the histomorphological examination of the specimen that were obtained at the end of the second operations, the mean intimal thickness, the intima / media ratio and the intima / intima + media ratio were significantly lower in Group 3 than Group 1 (p<0,05).  The mean medial thickness was lower in Group 3 than Group 1; however, a statistically significant difference was not found (p>0,05).  The mean intimal thickness, the intima / media ratio and the intima / intima + media ratio were significantly lower in Group 4 than Group 2 (p<0,05).  A significant difference between the mean medial thicknesses of Group 2 and Group 4 was not found (p>0,05).  The mean intimal thickness, the medial thickness, the intima / media ratio and the intima / intima + media ratio were significantly lower in Group 2 than Group 1 (p<0,05).
Conclusions:
In this study, we detected a significant increase in the diameter of the proximal segment of the femoral arteries, 28 days after the application of Botulinum toxin A.  Besides, a significant increase in the graft diameter was detected 28 days after the application of Botulinum toxin A in arterial defect reconstructions with arterial grafts.  However, a significant increase in the graft diameter was not detected 28 days after the application of Botulinum toxin A in anastomoses with venous grafts.  The venous grafts are prone to dilatation due to the structure of their walls, and this may be the reason of this finding.
The Botulinum toxin A causes a significant decrease in the intimal thickness of both arterial and venous grafts 28 days after the application.  However, it does not have a significant effect on the medial thickness.  This finding demonstrates that Botulinum toxin A decreases the neointimal hyperplastic response.
Our results are concordant with our hypothesis, and Botulinum toxin is an agent that may be utilized for limiting the development of neointimal hyperplasia.