Vezikovajinal fistül onarımı için pro-anjiogenik/antibakteriyel doku interpozisyon flep eşleniğinin tasarımı ve geliştirilmesi
Designing and fabrication of pro-angiogenic/antibacterial tissue interposition flap substitute for use in vesicovaginal fistula repair
Yazar: HALİME SERİNÇAY
Danışman: PROF. DR. KEZBAN ULUBAYRAM ; DOÇ. DR. NAŞİDE MANGIR BOLAT
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Vezikovajinal fistül (VVF), mesane ve vajina arasında sürekli idrar kaçırmaya neden olan olağan dışı bir açıklıktır. VVF' nin tedavisi fistülün boyutu, yeri ve cerrahın deneyimi gibi etmenlere bağlı olarak konservatif veya girişimseldir. VVF'nin cerrahi onarımında başarılı bir sonuç elde etmek için çoğunlukla mesane ile vajina arasına iyi damarlanmış bir doku interpozisyon flebi yerleştirilmektedir. Doku interpozisyon flepleri, mesane ile vajina arasında bir bariyer görevi görerek ve doku oluşumunu ve damarlanmayı artırarak tedavinin başarı şansını yükseltmektedir. VVF'nin cerrahi tedavisinde otolog doku interpozisyon flepleri yaygın olarak tercih edilmektedir. Ancak otolog fleplerin kullanımı hastanın genel sağlık durumu, fistülün özellikleri ve cerrahi teknik ile ilgili nedenlerle her zaman mümkün olmamaktadır. Otolog dokuların kullanımının mümkün olmadığı durumlarda, sentetik interpozisyon fleplerinin kullanılması önerilmiş ve bazı çalışmalarda denenmiştir. Bu fleplerin hiçbiri VVF tedavisi için özel olarak tasarlanmamış olup yaygın klinik kullanıma girememiştir. Bu tez çalışmasının birinci aşamasında VVF onarımında kullanılan doku interpozisyon fleplerinin klinikte başarı oranları değerlendirilmiş ve klinik ihtiyaçlar göz önüne alınarak tedaviye özel, pro-anjiyojenik ve antibakteriyel fiber yapıda bir doku interpozisyon flepi tasarlanmıştır. Tez çalışmasının ikinci bölümünde ise tasarlanan flepler elektro-eğirme yöntemi ile üretilerek in vitro ve in vivo olarak incelenmiştir. Bu amaçla ipek fibroin (Fib) ve polikaprolakton (PCL) polimerleri kullanılarak elektro-eğirme yöntemi ile 2 katmanlı fiberler (Fib/PCL) üretilmiştir. Fib/PCL fiberlerin birinci katmanına pro-anjiogenik özellik gösteren 17-β-estradiol (E2) ve ikinci katmanına ise antibakteriyel etki gösteren AgNO3 eklenerek gümüş nanopartiküllere indirgenmesi sağlanmıştır. E2 ve AgNP içeren fiberlerin (E2Fib/PCL-Ag) anjiyogenik ve antibakteriyel etkileri incelenmiştir. Çapları 0,28-0,55 µm arasında değişen düzgün ve homojen morfolojideki fiberler, L929 hücre hattında toksik etki göstermemiştir. E2'nin fiberlerden salım profilleri incelendiğinde; ilk 7 günde ani bir salım gözlenmiş olup 14. günden sonra ise sürekli bir salım profili izlenmiştir. AgNP ise benzer bir salım profili göstermiştir. E2 içeren fiberlerin anjiyogenik etkisi koryoallantoik membran (CAM) deneyi ile incelenmiştir. Bu fiberlerin normalize damar yoğunluklarını kontrol grubuna göre %10 ile 36 arasında artırdığı tespit edilmiştir. Bu sonuçlar fiber yapısından salınan E2'nin anjiyojenik etki gösterdiğini ispatlamıştır. Aynı zamanda AgNP içeren fiberler mesane ve vajina florasında yaygın olarak bulunan Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 ve Candida albicans ATCC 90028 suşlarına karşı antibakteriyel etki gösterdiği tespit edilmiştir. E2 ve AgNP içeren fiberler sıçanların abdomen ve mesane–vajina bölgesine ayrı ayrı implante edilerek erken dönem doku yanıtı karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Bu amaçla, bu bölgelerden alınan doku kesitleri, polimorfonükleer lökositler (PMN), mononükleer hücreler (MN), bağ dokusu organizasyonu ve damarlanma açısından değerlendirilerek skorlanmıştır. E2 içeren iki katmanlı fiberlerin damarlanmayı ve bağ dokusu oluşumunu kontrole göre artırdığı gözlenmiştir. Diğer taraftan, fiberler enfeksiyon açısından değerlendirildiğinde, AgNP içeren fiberler diğer gruplara göre daha az yabancı cisim reaksiyon kaynaklı enfeksiyon göstermiştir. Mesane-vajina ve abdomen bölgelerinden alınan doku örnekleri PMN, MN, bağ dokusu organizasyonu ve dev hücre sayısı açısından incelendiğinde, bölgeler arasında anlamlı bir farkın olmadığı görülmüştür. Sonuç olarak doku interpozisyon flep eşleniği olarak geliştirilen iki katmanlı fiberlerin klinik kullanım potansiyeli olduğu ve ileriye dönük çalışmalar ile kliniğe translasyonunun mümkün olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
A vesicovaginal fistula (VVF) is an anbormal opening between the bladder and vagina that causes continous leakage of urine and urinary incontinence. Definitive treatment of VVF is surgery and the type of surgical intervention is chosen depending on factors such as the size and location of the fistula, and the surgeon's experience. In order to achieve successful surgical repair of VVF, a well-vascularized tissue interposition flap is usually placed between the bladder and the vagina. Tissue interposition flaps increase the chances of success of treatment by acting as a barrier between the bladder and the vagina and increasing tissue formation and vascularization. Autologous tissue interposition flaps are widely preferred in the surgical treatment of VVF. However, the use of autologous flaps is not always possible due to the general health status of the patient, the characteristics of the fistula, and the surgical technique. In cases where the use of autologous tissues is not possible, the use of synthetic interposition flaps has been suggested and tried in several studies. None of these flaps were designed specifically for the treatment of VVF and have not ever gained widespread clinical acceptance. In the first part of this thesis, the clinical success rates of tissue interposition flaps used in VVF repair were evaluated, and a treatment-specific, pro-angiogenic, and antibacterial tissue interposition flap in fiber form was designed considering clinical needs. In the second part of the thesis, the designed flaps were produced by electro-spinning method and examined in vitro and in vivo. For this purpose, bilayered fibers (Fib/PCL) were produced by an electro-spinning method using silk fibroin (Fib) and polycaprolactone (PCL) polymers. 17-β-estradiol (E2), which has pro-angiogenic properties, was added to the first layer of Fib/PCL fibers, and AgNO3, which has an antibacterial effect, was added to the second layer to reduce it to silver nanoparticles (AgNPs). The angiogenic and antibacterial effects of fibers containing E2 and AgNPs (E2Fib/PCL-Ag) were investigated. Fibers with smooth and homogeneous morphology varying between 0,28-0,55 µm in diameter did not show any toxic effects in the L929 cell line. When the release of E2 from fibers are examined; initial burst effect was observed in the first 7 days and then a continuous release profile was observed after the 14th day. AgNPs release from the fibers showed a similar release profile. The angiogenic effect of E2 containing fibers was investigated by chorioallantoic membrane (CAM) assay. It was observed that these fibers increased the normalized vascular densities between 10 and 36% compared to the control group. These results proved that E2 released from the fiber structure showed an angiogenic effect. It has been determined that fibers containing AgNPs have antibacterial effects against Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 and Candida albicans ATCC 90028 strains that are commonly found in the bladder and vaginal flora. Fibers containing E2 and AgNP were implanted separately in the abdomen and paravaginal regions of rats and the early tissue response was comparatively examined. For this purpose, tissue sections taken from these regions were evaluated and scored in terms of polymorphonuclear leukocytes (PMN), mononuclear cells (MN), connective tissue organization and vascularization. It was observed that E2 containing bilayered fibers were observed to increase vascularization and connective tissue formation as compared to the control. On the other hand, when the fibers were evaluated in terms of infection, AgNP containing fibers showed less foreign body reaction-induced infection than the other groups. When the tissue samples taken from the paravaginal and abdomen regions were examined in terms of PMN, MN, connective tissue organization, and the number of giant cells, it was observed that there was no significant difference between the regions. As a result, it is thought that bilayer fibers developed as tissue interposition flap equivalents have the potential for clinical use and their translation to the clinic may be possible with prospective studies.