PANC-1 insan pankreas kanseri hücre hattında biyolojik ve kimyasal olarak sentezlenen gümüş nanopartiküllerin HIF-1 sinyal yolağı üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of effects of silver nanoparticles synthesized biologically and chemically on HIF-1 signal pathway in PANC-1 human pancreatic cancer cell line
Yazar: ŞEVVAL ÖZKAYA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ EMİNE NEDİME KORUCU
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC), en agresif ve ölümcül katı tümörler arasında yer almaktadır ve kansere bağlı ölümlerin dördüncü önde gelen nedeni olduğu bilinmektedir. Pankreas kanserinde erken belirti olmadığı ve her iki cinsiyette de ileri yaşlarda teşhis edilebildiği için yıllar geçtikçe sağkalım oranı düşmektedir. Pankreas kanseri tedavisinde geçtiğimiz yüzyılda cerrahi tekniklerin iyileştirilmesi, adjuvan ve neoadjuvan tedavilerdeki gelişmeler dahil olmak üzere dikkate değer ilerlemeler kaydedilmiştir. Fakat pankreas kanseri insidansı küresel olarak artmaktadır ve ölümcül bir hastalık olmaya devam etmektedir. Bundan dolayı ilerlemiş pankreas kanseri katı tümörlerini tedavi edebilmek için yeni terapötik ajanların geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Yeşil sentez aracılı gümüş nanopartiküllerin (AgNP), yakında insanlarda pankreas kanserini tedavi etmek için yeni kemoterapötik takviyeler veya ilaçlar olarak kullanılabileceği öngörülmektedir. Nanopartiküller, biyouyumlu oldukları ve geniş bir yüzey alanına sahip oldukları için çeşitli hastalıklar için etkili tekniklerin geliştirilmesinde kritik bir rol oynamaktadır. Özellikle bitki bazlı nanopartiküller, antibakteriyel aktivite, antikanser ve antiviral aktivite sergilediği için terapötik ilaçlar dahil olmak üzere tıpta yaygın olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Nanopartiküllerin biyolojik olarak sentezi, bitki özlerinin ve fizyolojik olarak aktif biyomoleküllerin her yerde bulunabilmesi nedeniyle kimyasal ilaçların kullanımına göre çok daha güvenilir bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Diğer nanopartiküllere oranla daha düşük maliyetli olan gümüş nanopartiküller son yıllarda, pankreas ve çeşitli kanserleri tedavi etmek için modern kemoterapötik ilaçlar olarak kullanılmıştır. Bu çerçevede yapılacak olan çalışmalar pankreas kanseri tedavisine büyük ölçüde katkı sağlayacaktır.
Bu tez çalışmasında konvansiyonel yöntemlerden farklı olarak mikrodalga aracılı yöntem ile Crocus sativus (Safran) stigma kısmının ekstraktı kullanılarak biyolojik olarak gümüş nanopartikül sentezi gerçekleştirilmiştir. Biyolojik olarak sentezlenen AgNP ve ticari olarak satın alınan kimyasal AgNP'ler UV-Vis, TEM, FESEM-EDX, FTIR, XRD, DLS ve Zeta potansiyel yöntemleri ile karakterize edilmiştir. Panc-1 insan pankreas kanseri ve HEK293 hücreleri artan konsantrasyonlarda biyolojik olarak sentezlenen AgNP, ticari olarak satın alınan kimyasal AgNP ve Crocus sativus (Safran) stigma kısmının ekstraktı ile 24 saat boyunca muamele edilmiştir. PANC-1 insan pankreas kanseri ve HEK293 normal hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkileri -4,5-dimetil-tiyazolil-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi ile belirlenmiştir. MTT testi ile IC50 dozu belirlendikten HIF1 transkripsiyon faktörü ve invazyon, metastaz, anjiyogenez, glikoz metabolizması ile ilgili hedef genleri olan VEGFA, FLT-1, GLUT1, Bcl-2 ve pro-apoptotik Bax genlerinde mRNA seviyesindeki değişiklikler qRT-PCR ile incelenmiştir. MTT testi sonucunda hücre proliferasyonunda doza bağlı olarak azalma, qRT-PCR sonucunda HIF-1 ve onun hedef genleri olan VEGFA, FLT-1, GLUT1, Bcl-2 gen ekspresyonlarında anlamlı bir şekilde azalma ve Bax geninde anlamlı bir şekilde artış tespit edilmiştir. 
Bu çalışmada gerçekleştirilen sentez, ucuz, tek adımda gerçekleşen ve çevre dostu bir yöntem olduğundan dolayı bitki aracılı sentez yaklaşımlarının AgNP'leri sentezlemek için daha güvenilir ve ekonomik bir yol olduğu tespit edilmiştir. Çalışma sonucunda tüm veriler değerlendirildiğinde biyolojik olarak sentezlenen AgNP'lerin normal HEK293 hücrelerine kimyasal AgNP'lerden daha az toksik etki göstermeleri nedeniyle daha güvenli oldukları belirlenmiştir. Biyolojik olarak sentezlenen AgNP'ler, tümör ilerlemesinin agresifliğini ve şiddetini artıran hipoksi durumunda aktive olan HIF1 sinyal yolağı üzerinde etkili sonuçlar sergilediği için pankreas kanserinde radyasyon ve kemoterapi tedavilerine direnç gibi mevcut kanser tedavisinin eksikliklerini gideren umut verici bir antikanser ilacı olabileceğini göstermektedir.

Anahtar Kelimeler: Antikanser aktivite, Crocus sativus (Safran), Gümüş nanopartikül (AgNP), Hipoksi, Mikrodalga aracılı biyolojik sentez, Pankreatik duktal adenokarsinom

Abstract:
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most aggressive and lethal solid tumors and is the fourth leading cause of cancer-related deaths. Since pancreatic cancer has no early symptoms and can be diagnosed at an advanced age in both sexes, the survival rate decreases over the years. There have been remarkable advances in the treatment of pancreatic cancer over the past century, including improvements in surgical techniques and advances in adjuvant and neoadjuvant therapies. However, the incidence of pancreatic cancer is increasing globally and remains a fatal disease. Therefore, there is a need to develop new therapeutic agents to treat advanced pancreatic cancer solid tumors. It is envisaged that green synthesis-mediated silver nanoparticles (AgNPs) may soon be used as novel chemotherapeutic supplements or drugs to treat pancreatic cancer in humans. Nanoparticles play a critical role in the development of effective techniques for various diseases, as they are biocompatible and have a large surface area. In particular, plant-based nanoparticles have the potential to be widely used in medicine, including therapeutic drugs, as they exhibit antibacterial activity, anticancer and antiviral activity. The biological synthesis of nanoparticles shows that it is a much more reliable approach than the use of chemical drugs due to the ubiquitous availability of plant extracts and physiologically active biomolecules. Silver nanoparticles, which have lower cost compared to other nanoparticles, have been used as modern chemotherapeutic drugs to treat pancreatic and various cancers in recent years. The studies to be carried out in this framework will greatly contribute to the treatment of pancreatic cancer.
In this thesis study, unlike conventional methods, biological synthesis of silver nanoparticles was carried out using microwave-mediated method extract of Crocus sativus (Saffron) stigma part. Biologically synthesised AgNPs and commercially purchased chemical AgNPs were characterised by UV-Vis, TEM, FESEM-EDX, FTIR, XRD, DLS and Zeta potential methods. PANC-1 human pancreatic cancer and HEK293 cells were treated with increasing concentrations of biologically synthesised AgNP, commercially available chemical AgNP and Crocus sativus (saffron) stigma extract for 24 hours. The cytotoxic effects on Panc-1 human pancreatic cancer and HEK293 normal cell lines were determined by -4,5-dimethyl-thiazolyl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) test. After the IC50 dose was determined by MTT test, changes in mRNA levels of HIF1 transcription factor and VEGFA, FLT-1, GLUT1, Bcl-2 and pro-apoptotic Bax genes, which are target genes related to invasion, metastasis, angiogenesis and glucose metabolism, were analysed by qRT-PCR. As a result of MTT assay, a dose-dependent decrease in cell proliferation, a significant decrease in HIF-1 and its target genes VEGFA, FLT-1, GLUT1, Bcl-2 gene expressions and a significant increase in Bax gene were detected by qRT-PCR. 
Since the synthesis carried out in this study is a cheap, one-step and environmentally friendly method, it was determined that plant-mediated synthesis approaches are a rather reliable and economical way to synthesise AgNPs. The results of the study showed that biologically synthesised AgNPs are safer than chemical AgNPs because they have less toxic effects on normal HEK293 cells. Biologically synthesised AgNPs may be a promising anticancer drug that overcomes the shortcomings of current cancer therapy, such as resistance to radiation and chemotherapy treatments in pancreatic cancer, as it exhibits effective results on the HIF1 signalling pathway, which is activated in the event of hypoxia that increases the aggressiveness and severity of tumour progression.

Keywords: Anticancer activity, Crocus sativus (Saffron), Silver nanoparticle (AgNP), Hypoxia, Microwave-mediated biological synthesis, Pancreatic ductal adenocarcinoma