Tümör hücrelerindeki PD-L1 ekspresyonunun anjiyogenez ve invazyon üzerine etkisi
Effect of PD-L1 expression on tumor cells on angiogenesis and invasion
Yazar: CANSU BABAHAN
Danışman: PROF. DR. HAKAN AKBULUT
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Anjiyogenez inhibitörleri = Angiogenesis inhibitors ; Antikorlar = Antibodies ; Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Gen ifadesi = Gene expression ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İmmünoterapi = Immunotherapy

Özet:
CTLA-4 ve PD-1 gibi immün denetim noktalarını bloke eden anti-CTLA-4, anti-PD1 ve anti-PDL1 monoklonal antikorlar, klinik çalışmalarda başta melanoma olmak üzere pek çok solid tümörün tedavisinde başarılı olarak rutin tedavide kullanılmaya başlanmıştır. Ancak bu ilaçlar kullanılan hastaların yaklaşık %20 kadarında etkili olmaktadır. Klinik çalışmalarda tümör dokusunda immunohistokimyasal olarak PD-L1 ekspresyonu olduğu gösterilen hastalarda PD-L1'e karşı geliştirilen monoklonal antikorlar ile elde edilen yanıt oranının daha yüksek olabildiği gösterilmiştir. Bugün için tümör hücreleri ve tümör mikroçevresindeki immün hücrelerdeki PD-L1 ifadesi dışında bu hastalarda genel kabul gören bir biyomarker bulunmamaktadır.  Anti-PDL1 antikorlarının tümör anjiyogenezi ve tümör hücre biyolojisi üzerindeki etkileri iyi bilinmemektedir. Bu çalışmamızda anti-PDL1 monoklonal antikoru olan avelumabın PD-L1 ifade eden ve etmeyen tümör hücrelerinde anjiyogenez ve metastaz sürecinde önemli rol oynayan genlerin ifadesi üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmamızda 11 adet insan tümör hücresi (HT-29, MDA-MB-231, LNCAP, DU145, A-375, A549, MCF-7, WM115, MDA-MB-435, MDA-MB-468, G361) akım sitometrisi ile PD-L1 ifadesi yönünden taranmış ve PD-L1 ifadesi en düşük ve en yüksek olan ikişer tanesi gen ifade çalışmalarında kullanılmıştır. Tümör hücrelerine 40 µg/ml, 20µg/ml ve 2 µg/ml olmak üzere 3 farklı dozda avelumab uygulanmış ve 24 ile 72 saatlik inkübasyon sonrası hücreler toplanarak eş zamanlı PZR yöntemi ile VEGFA, bFGF, EGFR, MMP-9, E-kaderin ve TGF-β genlerinin mRNA düzeyinde ekspresyonları incelenmiştir.
Çalışmaya, PDL-1 ifadesi açısından taradığımız 11 hücreden PD-L1 ifadesi % 2'nin altında olan DU-145 ve MDA-MB-435 hücreleri ile %50'nin üzerinde olan LNCAP ve MDA-MB-231 hücreleri ile devam edildi. Avelumab PD-L1 ifadesi yüksek olan LNCAP ve MDA-MB-231 hücrelerinde VEGFA ve bFGF ifadesini 72 saatlik inkübasyonda belirgin olarak arttırırken PD-L1 ifadesi düşük olan hücrelerde doza bağımlı değişken bir cevap izlenmiştir. Avelumabın PD-L1 ifadesi yüksek olan tümör hücrelerinde CDH1 ifadesini arttırdığı, TGFb ifadesini azalttığı bulundu. PD-L1 düşük düzeyde ifade eden hücrelerde ise doza bağımlı değişken cevap izlendi. Avelumabın EGFR ve MMP-9 gen ifadesi üzerindeki etkileri hücrelerdeki PD-L1 ifadesinden bağımsız ve doza bağlı değişkenlik göstermiştir.
Sonuç olarak anti-PDL1 antikoru olan avelumab PD-L1 ifadesi yüksek olan tümör hücrelerinde bFGF ve VEGFA genlerini uyararak anjiyogenezi uyarma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. Bunun yanı sıra yine aynı hücrelerde CDH1 ve TGFb üzerindeki etkileri ile epitelyal mezenkimal geçişi baskılayabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Anti-CTLA-4, anti-PD-1 and anti-PD-L1 monoclonal antibodies blocking immune check points such as CTLA-4, PD-1 and PD-L1 have been successfully used in routine treatment of many solid tumors, especially melanoma in clinic trials. However, these drugs are effective in about %20 of patients. Clinical trials have shown that the response rate to monoclonal antibodies developed against PD-L1 may be higher in patients who are shown to have PD-L1 expression immunohistochemically in tumor tissue. There are no biomarkers that are generally accepted in these patients except for expression of PD-L1 in tumor cells and immune cells in the tumor microenvironment. The effects of ant-PD-L1 antibodies on tumor angiogenesis and tumor cell biology are not well known.
In this study, we aimed to investigate the effects of avelumab, an anti-PD-L1 monoclonal antibody, on the expression of genes that play an important role in the angiogenesis and metastasis process in the PD-L1 expressing and non-PD-L1 tumor cells.
In our study eleven human tumors (HT-29, MDA-MB-231, LNCAP, DU145, A-375, A549, MCF-7, WM115, MDA-MB-435, MDA-MB-468, G361) were screened for PD-L1 expression by flow cytometry and two cells with the lowest and two cells with highest expression of PD-L1 were used in gene expression study.
Three different doses of avelumab (40 ug/ml, 20ug/ml ve 2 ug/ml) were administered to the tumor cells and after 24 and 72 hours of incubation, the cells were collected and their expression at the mRNA levels of VEGFA, bFGF, EGFR, MMP-9, E-cadherin and TGF-Beta genes were examined by the quantitative PCR method. The study continued with LNCAP and MDA-MB-231 cells with a PD-L1 expression of over %50 and DU145 and MDA-MB-435 with a PD-L1 expression of less than %2.
Avelumab significantly increased VEGFA and bFGF expression in LNCAP and MDA-MB-231 cells with high expression of PD-L1in the 72 hour incubation, whereas a dose dependent variable response was observed in cells with low PD-L1 expression. 
Avelumab was found to increase CDH1 expression and decrease TGF-Beta expression in tumor cells with high expression of PD-L1. Whereas in cells expressing low levels of PD-L1 the variable responses were observed.
The effects of avelumab on EGFR and MMP-9 gene expression was independent of the PD-L1 expression in the cells and showed dose dependent variability. 
In conclusion, the anti-PD-L1 antibody avelumab has the potential to stimulate angiogenesis by stimulating bFGF and VEGFA genes in tumor cells with high expression of PD-L1. Besides, it shows that avelumab can suppress epithelial mesenchymal transition with its effects on CDH1 and TGF-beta.