Hücrelerinden arındırılmış miyokardiyal doku ile hücre tabakası destekli kalp yaması geliştirilmesi
Development of cell sheet supported cardiac patch with decellularized myocardial tissue
Yazar: GÖKÇE KAYNAK BAYRAK
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: L-askorbik asit = L-ascorbic acid

Özet:
Sunulan tez çalışmasında kardiyovasküler hücre tabakası ve hücrelerinden arındırılmış miyokardiyal hücre dışı matrisin (ECM) birleştirilmesi ile kalp yaması üretilmesi hedeflenmiştir. Çalışmada doku mühendisliğinin yenilikçi yaklaşımları arasında yer alan ''hücre tabaka teknolojisi'' ve ''hücresizleştirme yaklaşımı'' birleştirilmiştir. Böylece, kalp hastalıklarının tedavisi için kullanılabilecek in vitro kalp doku modeli geliştirilmiştir. 

Tez çalışmasının ilk aşamasında, kardiyovasküler hücre tabakalarının üretiminde kullanılan, H9C2 sıçan kardiyomiyoblast hücre hattı ve primer sıçan kardiyak mikrovasküler endotel hücreleri (KMEH)'nin karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Ardından, yalnızca H9C2 hücre hattı kullanılarak hücre tabakası üretmek için 3 farklı yöntem, sıcaklık duyarlı kültür kapları, yüksek hücre ekim yoğunluğu ve serum konsantrasyonu ve askorbik asit (AA) uygulaması, kullanılmıştır. Genel olarak tüm hücre tabakalarında canlılığın yüksek oranda korunduğu ve hücre tabakalarının sırası ile kültürün 7., 9. ve 5. günlerinde başarılı şekilde yüzeyden kaldırıldığı belirlenmiştir. Ayrıca hücrelerin gen ekspresyon seviyelerinin hücre kültür kabı yüzeyinden, hücre ekim yoğunluğundan ve kültür ortamındaki AA ve serum konsantrasyonundan etkilendiği gözlenmiştir. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) analiz sonuçları, poli(izopropil akrilamid) (PIPAAm) kaplı kültür yüzeyinin iskelet kası spesifik L-tipi voltaj bağımlı Ca+ kanalı (Alfa 1s, Cacna1s) gen ifadesini arttırdığını, düşük hücre ekim yoğunluğunun ise Cacna1s ve kardiyak troponin T (Tnnt2) ekspresyonunu azalttığını ve kollajen I (Col1a1) gen ekspresyonunu arttırdığını göstermiştir. Kültür ortamında yüksek serum konsantrasyonu ve AA kullanılması ile hücrelerin Col1a1 gen ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir. Askorbik asitin etkisi değerlendirildiğinde, normal serum içeren ortamda H9C2 hücrelerinin miyojenik  karakterinde artış meydana geldiği, ancak, yüksek serum ile birlikte 100 µg/mL AA kullanıldığında kardiyomiyojenik karakteri yüksek hücre tabakalarının üretildiği belirlenmiştir. 

Kardiyovasküler hücre tabakalarının üretilmesi için, öncelikle H9C2 hücreleri retinoik asit (RA; 10 nM, 50 nM ve 100 nM) içeren ortamda farklı sürelerde (5 ve 7 gün) kültüre edilmişler ve kardiyomiyosit hücrelerine farklılaştırılmışlardır. İmmünofloresan boyama ve RT-PCR analizleri sonucunda 5 gün süresince 100 nM konsantrasyonda RA uygulamasının farklılaşma için en uygun koşul olduğu belirlenmiştir. Ardından farklılaştırılmış H9C2 hücreleri ve KMEH'leri ko-kültür şeklinde (6:1) farklı konsantrasyonlarda AA (20, 50, 100 µg/mL) ve serum (%10.5 ve %15.0 v/v) içeren ortamlarda kültüre edilmişlerdir. Tüm gruplarda yüksek oranda canlılık gösteren hücre tabakası elde edilmesine rağmen, %10.5 (v/v) FBS ve 100 µg/mL AA konsantrasyonda kardiyomiyojenik özelliklerin en yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu nedenle kalp yaması üretimi için bu koşullarda elde edilen hücre tabakaları kullanılmıştır. 

Tez çalışmasının ikinci aşamasında, kalp yamasının ikinci bileşeni olarak, hücresizleştirilmiş miyokardiyal ECM iskele üretimi için 2 farklı yöntem (SDS ve OGP) kullanılmıştır. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), immünofloresan boyama, histolojik boyama ve DNA analizi sonuçları hücresizleştirmenin SDS yönteminde başarılı şekilde gerçekleştirildiğini ve doğal doku ile karşılaştırıldığında DNA içeriğinde ~%89 oranında azalma olduğunu göstermiştir. Ayrıca gerçekleştirilen hidroksipirolin, GAG analizi ve sitotoksisite testi ile yöntemin ECM yapısına zarar vermediği ve hücrelere toksik kimyasal kalıntı bulundurmadığı belirlenmiştir. 

Adipoz kökenli mezenkimal kök hücreler (AKMKH) ve KMEH'ler kullanılarak, hücresizleştirilmiş ECM iskele üzerinde 2 haftalık in vitro ko-kültür çalışması gerçekleştirilmiştir. Kardiyomiyojenik farklılaşmayı uyarmak için 24 sa süresince 5-Azasitidin (5-Aza) uygulaması yapılmıştır. Hücrelerin, kültür süresince, canlılıklarını yüksek oranda korudukları ve iskele içerisinde damar benzeri lümen yapıları oluşturdukları belirlenmiştir. Ancak, yapılan analizler (immünofloresan boyama ve RT-PCR) 5-Aza'nın, kalp ECM nişi üzerindeki AKMKH'lerin kardiyomiyojenik farklılaşmasında tek başına yeterli olmadığını göstermiştir. 

Kardiyovasküler hücre tabakası destekli miyokardiyal yamanın üretilmesi için AKMKH ve KMEH ekimi gerçekleştirilmiş ECM iskele yapısı, elde edilen kardiyovasküler hücre tabakası ile birleştirilmiştir. Kardiyomiyojenik farklılaşmanın desteklenmesi için 24 sa 5-Aza uygulaması yapılmıştır. 5-Aza'nın, kardiyomiyositler ile doğrudan ko-kültür etkisi yardımıyla, ECM nişi üzerindeki AKMKH'lerin kardiyomiyojenik farklılaşmasını desteklediği gözlenmiştir. RT-PCR sonuçları hücrelerin Tnnt2 ve Gata4 gen ekspresyonlarında artış olduğunu göstermiştir.  Ayrıca, kimyasal uyarıcı ajan bulunmadığı durumda, kalp ECM nişi ve kardiyomiyositler ile doğrudan ko-kültürün de AKMKH'lerin kardiyomiyojenik farklılaşmasını desteklediği belirlenmiştir. 

Çalışma kapsamındaki tüm sonuçlar değerlendirildiğinde sıcaklık duyarlı kültür kaplarının kullanımına gerek duyulmadan hücre tabakalarının başarılı şekilde elde edilebildiği belirlenmiştir. Ayrıca, AKMKH'lerin kalp ECM nişi, kardiyomiyositler ile doğrudan ko-kültür ve 5-Aza'nın üçlü sinerjik etkisi ile kardiyomiyojenik farklılaştırılabildiği gözlenmiştir. Sonuç olarak, damarlanma potansiyeli yüksek bir in vitro kalp doku modeli ortaya konmuştur. Üretilen kalp yamasının, sıçanlar üzerinde gerçekleştirilecek in vivo deneylerde kullanıma uygun olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmalarda başarılı sonuçlar alındığı takdirde, yamanın klinik çalışmalara uyarlanarak, kalp hasarlarında alternatif bir tedavi yaklaşımı olarak değerlendirilebileceği belirlenmiştir.

Abstract:
The aim of this thesis is to produce a heart patch by combining cardiovascular cell sheet and decellularized myocardial extracellular matrix (ECM). In the study, two innovative approaches of tissue engineering, ''cell sheet technology'' and ''decellularization approach'' were combined. Thus, in vitro heart tissue model, which can be used for the treatment of heart diseases, has been developed.

In the first step of the thesis study, characterization studies of H9C2 rat cardiomyoblast cell line and primary rat cardiac microvascular endothelial cells (CMEC), used in the production of cardiovascular cell sheets, were performed. Then, 3 different methods, temperature responsive culture plates, high cell seeding density and serum concentration and ascorbic acid (AA) treatment, were used to produce cell sheet using only H9C2 cell line. In general, it has been determined that the viability of all cell sheets is highly conserved and the cell sheets were successfully removed from the culture surface on days 7, 9 and 5 of the culture, respectively. In addition, it was observed that the gene expression levels of the cells were influenced by the nature of the cell culture dish surface, cell seeding density and AA and serum concentration in the culture medium. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis results demonstrated the poly(isopropylacrylamide) (PIPAAm)-coated culture surface enhanced gene expression of skeletal muscle specific L-type voltage-dependent Ca+ channel (Alpha 1s, Cacna1s), while low cell seeding density decreased the expression of Cacna1s and cardiac troponin T (Tnnt2), but increased collagen I (Col1a1) gene expression. It has been shown that Col1a1 gene expression of the cells increased with the use of high serum concentration and AA in culture medium. When the overall effect of ascorbic acid was evaluated, it was determined that myogenic character of H9C2 cells increased in normal serum containing medium, but, cell sheets having high cardiomyogenic character were produced in case of high serum with 100 µg/mL AA.

In order to produce cardiovascular cell sheets, at first H9C2 cells were cultured in retinoic acid (RA; 10 nM, 50 nM and 100 nM) containing medium at different time periods (5 and 7 days) and differentiated into cardiomyocyte cells. As a result of the analyzes (immunofluorescence staining and RT-PCR), it was determined that 100 nM RA treatment for 5 days was the most appropriate condition for differentiation. Subsequently, differentiated H9C2 cells and CMECs (6:1) were co-cultured in media containing different AA (20, 50, 100 µg/mL) and serum (10.5% and 15.0% v/v) contents. Although high levels of viable cell sheets were obtained in all groups, it was determined that cardiomyogenic properties were highest in 10.5% (v/v) FBS and 100 µg/mL AA concentration. Therefore, cell sheets obtained in these conditions were used for the production of heart patches.

Two different methods (SDS and OGP) were used for the production of decellularized myocardial ECM scaffolds, which is the second component of the heart patch. Scanning electron microscope (SEM), immunofluorescence staining, histological staining and DNA analysis showed that decellularization was performed successfully with SDS method and compared to native tissue there was ~89% reduction in DNA content. Otherwise, hydroxyproline assay, GAG analysis and cytotoxicity test showed that the SDS method did not damage the ECM structure and did not contain toxic chemical residues to the cells.

A 2-week in vitro co-culture study was performed on the decellularized ECM scaffold using adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) and CMECs. 5-Azacitidine (5-Aza) was applied for 24 h to stimulate cardiomyogenic differentiation. It has been determined that the cells maintain high viability during culture and form vascular-like lumen structures in the scaffold. However, the analyzes (immunofluorescence staining and RT-PCR) showed that 5-Aza alone was not sufficient for the cardiomyogenic differentiation of ADMSCs on the heart ECM niche.

ECM scaffold seeded with ADMSCs and CMECs was combined with cardiovascular cell sheet to produce the cardiovascular cell sheet supported myocardial patch. To support cardiomyogenic differentiation, 5-Aza treatment for 24 h was applied. It has been observed that, 5-Aza supports the cardiomyogenic differentiation of ADMSCs on the ECM niche with the help of direct co-culture with cardiomyocytes. RT-PCR results showed an increase in Tnnt2 and Gata4 gene expression of the cells. Furthermore, in the absence of a chemical stimulant agent, heart ECM niche and direct co-culture with cardiomyocytes were also found to support the cardiomyogenic differentiation of ADMSCs.

It was determined that cell sheets could be produced successfully without the use of temperature responsive culture plates. Besides, it has been observed that ADMSCs could be differentiated cardiomyogenic with the triple synergistic effect of cardiac ECM niche, direct co-culture with cardiomyocytes and 5-Aza. In conclusion, an in vitro heart tissue model with high vascularization potential has been demonstrated. It has been shown that the produced heart patch is suitable for use in in vivo experiments on rats. If successful results were obtained in these studies, it was determined that the patch could be considered as an alternative approach in heart damage by adapting the clinical studies.