Alzheimer hastalığında oluşan beta-amiloid fibrillerin yeni sentezlenen kolinesteraz inhibitörleri ile destabilizasyonu
Destabilization of beta-amyloid fibriles in alzheimer?s disease with newly synthesized cholinesterase inhibitors
Yazar: HURİYE EDA ÖZTURAN ÖZER
Danışman: PROF. DR. GÜLBERK UÇAR
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Amiloid beta protein = Amyloid beta protein ; Amiloid protein SAA = Amyloid protein SAA ; Asetilkolinesteraz = Acetylcholinesterase ; Butirilkolinesteraz = Butyrylcholinesterase ; Kolinesteraz inhibitörleri = Cholinesterase inhibitors

Özet:
Alzheimer hastalığı (AH), nörodejeneratif bir hastalıktır. AH patogenezinde beyinde amiloid ß-peptid (Aß) agregasyonunun ve nörofibriller ağ oluşumunu önemli rolü olduğu gösterilmiştir. Kolinesterazlar farklı genler tarafında kodlanan substrat seçicilikleri ve kinetik mekanizmaları değişiklik gösteren yaygın dağılımlı enzimlerdir. Bu çalışmada donepezil türevi yeni bir grup kolinesteraz inhibitörlerinin sentezlenmesi, inhibitör etkilerinin araştırılması; bu inhibitörlerin Aß-fibrilin oluşumunu bozucu etkilerinin incelenmesi amaçlanmaktadır. Yeni sentezlenen bileşiklerin insan rekombinant asetilkolinesteraz (AChE) ve at plazma bütirilkolinesteraz (BChE) aktivitesi üzerindeki inhibitör etkileri, 25° C' de, 50 mM MOPS (pH 8), 0.125 mM 5,5'-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit), 0.05?0.4 mM asetiltiyokolin/bütiriltiyokolin ve 0?140 ? M inhibitör içeren ortamda spektrofotometrik olarak araştırılmıştır. İnhibitörlerin amiloid fibril oluşumu üzerine destabilize edici etkisi fluorimetrik ve kütle spektrometresi yöntemleriyle gösterilmiş ve tüm inhibitörlerin fibril oluşumu üzerinde destabilize edici etki gösterdiği bulunmuştur. IC50 değerlerine göre en etkin inhibitör olarak 5a (IC50= 48.8 ± 4.99 ? M ) ve 5c (IC50= 53.1 ± 4.56 ? M) bileşikleri seçilmiştir. 5a bileşiği at plazma BChE aktivitesi üzerinde lineer karışık tipte (Ki= 30.5 ± 0.08 ? M, ? = 12.5 ± 0.18); insan rekombinant AChE aktivitesi üzerinde ise unkompetetif tipte inhibitör etki göstermiştir (Ki=19.5 ± 0.06 ? M). 5c bileşiği ise at plazma BChE aktivitesi üzerinde kompetetif tipte etki gösterirken (Ki= 31.5 ± 0.05 ? M); insan rekombinant AChE aktivitesini 20?40 ? M inhibitör derişimlerinde unkompetetif (Ki= 50.8 ± 0.04 ? M); 60?100 ? M inhibitör derişimlerinde ise nonkompetetif (Ki= 83.8 ± 0.04 ? M) olarak etkilemiştir. Bulgular göz önüne alındığına inhibitörlerin enzimlere farklı ilgilerinin aktif bölge, periferal anyonik bölge ve inhibitör bağımlı çoklu bağlanma nedeniyle olabileceği düşünülmüş ve tüm bileşiklerin etkin kolinesteraz inhibitörleri olarak Alzheimer tedavisinde iki yönlü etkili olarak kullanılabileceği düşünülmüştür.

Abstract:
Alzheimer?s disease (AD) is a progressive neurodegenerative brain disorder. It is shown that the abundance of neurofibrillary tangles ve the aggregation of the amyloid ? -peptide (A ? ) are important in the pathogenesis of AD. Cholinesterases are ubiquitus enzymes encoded by distinct genes differing in substrat specifity, mechanisms. The following study aimed to investigate the effect of novel synthesized derivatives of cholinesterase inhibitor donepezil in the destabilization of ? -amyloid fibril formation ve kinetic mechanisms. The inhibitory effects of novel inhibitors on acetylcholinesterase(AChE) ve butyrylcholinesterase(BChE) were spectrophotometrically studied at 25 ? C in 50 mM MOPS (pH 8.0), 0.125 mM 5,5?-dithiobis-(2-nitrobenzoicacid) (DTNB), 0.05-0.4 mM acetylthiocoline/butyrylthiocholine, 0-140 ? M inhibitor containing medium. Destabilization effect of inhibitors on fibril formation were shown by fluorimetric and mass spectrometric methods. All of the compounds have destabilized ?? amyloid formation and 5a (IC50= 48.8 ± 4.99 ? M) ve 5c (IC50= 53.1 ± 4.56 ? M) were chosen for kinetic analysis depending on IC50 values. 5a showed a linear mixed-type inhibition on equine serum BChE activity (Ki= 30.5 ± 0.08 ? M, ? = 12.5 ± 0.18) and a uncompetitive effect on human recombinant AChE activity ( Ki=19.5 ± 0.06 ? M). 5c showed a competitive inhibition on equine serum BChE activity (Ki =31.5 ± 0.05 ? M); whereas it showed an uncompetitive effect on 20?40 mM inhibitor concentration (Ki= 50.8 ± 0.04 ? M) and noncompetitive effect on 60?100 mM inhibitor concentration (Ki= 83.8 ± 0.04 ? M ) on human recombinant AChE activity. It was concluded that differences on inhibition mechanisms with compounds were caused from differences of active site, peripheral anionic side and multi-binding sites of enzymes and all compounds were considered as new hopefull dual-mechanism anti AD drug targets with effective cholinesterase properties.