İlaç yeniden konumlandırma yaklaşımıyla SARS-CoV-2 virüsüne karşı ın vitro yöntemlerle ilaç tasarımı
Drug design against SARS-CoV-2 virus via drug repurposing by using in vitro methods
Yazar: BETÜL ORUÇOĞLU
Danışman: PROF. DR. MAHMUT ÇALIŞKAN ; DOÇ. DR. ŞEREF GÜL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: COVID 19 = COVID 19 ; SARS virüsü = SARS virus ; İlaç tasarımı = Drug design ; İlaçlar = Drugs ; İlaçlar-araştırma safhasında = Drugs-investigational

Özet:
SARS-CoV-2 virüsünün neden olduğu COVID-19 hastalığı, Aralık 2019'da Çin'in Wuhan 
şehrinde ilk kez tespit edildikten kısa bir süre sonra dünya genelinde bir pandemi haline geldi.
Güncel verilere göre ~675 milyon kişi enfekte olmuş ve ~7 milyon kişi hayatını kaybetmiştir.
COVID-19 salgını, hemen hemen tüm ülkelerin ekonomik ve sosyal hayatını olumsuz bir 
şekilde etkilemiştir. Dünya çapında alınan çeşitli önlemlerle salgın kontrol altına alınmaya 
çalışılsa da, yeni vaka artışları ve hastalığın olumsuz etkileri devam etmektedir. Salgını kontrol 
altına almak için yaygın aşılama çalışmaları yapılmıştır, fakat aşıların saklama koşulları, 
ekonomik kısıtlamalar ve aşı tereddütleri gibi nedenler dünya genelinde aşılamada zorluklar
oluşturmaktadır. Etkin aşılama yapılıncaya veya SARS-CoV-2'ye karşı etkin bir ilaç 
geliştirilinceye kadar salgının devam edeceği öngörülmektedir.
Belirlenen gen dizilimine göre; yaklaşık 30000 baz olan SARS-CoV-2 genomu, iki poliprotein 
(ORF1a ve ORF1b), dört yapısal protein ve yardımcı proteini kodlayan genlerden oluşmaktadır. 
Viral genom çoğaldığında; ORF'lerinden sentezlenen poliproteinler, yine bu poliproteinlerin 
içerisinde bulunan 3C-benzeri proteaz (3CLpro) ve papain-benzeri proteaz (PLpro) tarafından 
uygun bölgelerden kesilerek yapısal olmayan proteinler açığa çıkarmakta ve virüsün yaşam 
döngüsü devam etmektedir. Bu sebeple, bu iki proteaz virüsün yaşam döngüsü için kritik öneme 
sahiptir ve insanlarda benzeri olmadığı için ilaç tasarım çalışmalarında güvenli ve kritik 
hedefler olarak karşımıza çıkmaktadır. 
Yeni ortaya çıkan hastalıklar için ilaç geliştirme süreleri ve maliyetleri oldukça yüksektir. Bu 
nedenle, FDA tarafından onaylanmış ilaçların, COVID-19 gibi yeni çıkan hastalıklarda, ilaç 
yeniden konumlandırma yaklaşımı, ilaç geliştirme süreçlerinde zaman ve maliyet tasarrufu 
sağlamaktadır.
Bu proje kapsamında, yaygın kullanımda olan FDA onaylı ilaçlardan düşük dozlarda etkinliğe 
sahip SARS-CoV-2 inhibitörü bulunması hedeflenmiştir. Hesaplamalı çalışmalar yardımıyla, 
3CLpro'nun aktif bölgesine yüksek bağlanma enerjisine ve bu proteazın inhibitörü olma 
potansiyeline sahip 27 FDA onaylı ilaç belirlenmiştir. Bu ilaçların sitotoksik aktivitesi 
xCELLigence sistemi kullanılarak analiz edildikten sonra, in vitro 3CLpro enzimatik aktivite ile 
test edilerek IC50 değerleri belirlenmiştir. Sinerjistik etkileri olan ve dolayısıyla daha düşük 
dozlarda yüksek etkinliğe sahip ilaçları belirlemek için ikili kombinasyon denemeleri 
yapılmıştır. Bu aşamada belirlenen ilaç ve ilaç kombinasyonları SARS-CoV-2'nin en çok hasar 
bıraktığı akciğer (Calu-3) ve bağırsak (Caco-2) hücrelerinde SARS-CoV-2'nin kopyalanmasını 
inhibe etmesi üzerine etkisi, enfekte etmeyen ve raportör LUC ve GFP genleri taşıyan SARSCoV-2 genomaltı replikonu kullanılarak belirlenmiştir. 
In vitro ortamda 3CL
pro'nun enzimatik aktivitesi üzerinde amsinonid, eltrombopag, lumakaftor, 
kandesartan ve nelfinavirin ilaç moleküllerinin µM seviyede inhibitör etkinliğine sahip olduğu 
belirlenmiştir. Lumafaktor SARS-CoV-2 replikasyonunu Caco-2 bağırsak ve Calu-3 akciğer 
hücrelerinde, sırasıyla 964 nM ve 458 nM IC50 değeri ile inhibe etmiştir. Kandesartan ilaç 
molekülü de 714 nM (Caco-2 hücrelerinde) ve 1.05 µM (Calu-3 hücrelerinde) IC50 değeri ile 
SARS-CoV-2 replikasyonunu inhibe etmiştir. Amsinonid, pimozide, eltrombopag ve nelfinavir 
tek denemelerinde SARS-CoV-2'nin akciğer ve bağırsak hücrelerinde ~2-5 µM IC50 değerleri 
arasında replikasyonunu engellemiştir. Hücre hatlarında ikili kombin denemelerde kandesertan 
µM seviyesinde kullanıldığında amsinonid, pimozide, lumakaftor ve eltrombopag nM 
seviyesinde SARS-CoV-2 inhibitörü olarak davranmıştır.

Abstract:
COVID-19 disease caused by the SARS-CoV-2 virus, became a worldwide pandemic shortly 
after it was first detected in Wuhan, China in December 2019. According to recent reports, ~675
million people were infected and ~7 million lost their life. COVID-19 pandemic has negatively 
affected the economic and social life of almost all countries. Despite various strict precautions 
around the world to stop the spread of the disease, an increasing number of new cases have 
been reporting and hence the negative effect of the disease persists. Common vaccination efforts 
have been made to control the pandemic, but there are difficulties in vaccination worldwide due 
to reasons such as storage conditions of vaccines, economic constraints and vaccine hesitancy.
It has been predicted that the pandemic will last till either achieving the common vaccination 
or discovering an anti-SARS-CoV-2 drug.
According to the gene sequence, the SARS-CoV-2 genome, which is approximately 30000 
bases, consists of genes encoding two polyproteins (ORF1a and ORF1b), four structural 
proteins and auxiliary proteins. When the viral genome replicates, the polyproteins synthesized 
from ORFs are cut at appropriate sites by 3C-like protease (3CLpro) and papain-like protease 
(PLpro), which are also present in these polyproteins, releasing non-structural proteins and 
continuing the life cycle of the virus. This proteases are very cruical enzymes for the viral life 
cycle and since there is no similar proteases in humans, it is critical and safe target for anti-viral 
drug discovery.
Since the drug discovery process is very time-consuming and expensive, drug repurposing of 
FDA-approved drugs against emergent diseases such as COVID-19 let to save time and money. 
Within the scope of this project, it is aimed to find SARS-CoV-2 inhibitor that is effective at 
low doses from FDA-approved drugs in widespread use. With the help of computational 
studies, 27 FDA-approved drugs with high binding energy to the active site of 3CLpro that have 
potential to be inhibitors of this protease were identified. After analyzing the cytotoxic activity 
of these drugs using the xCELLigence system, their IC50 values were determined by testing 
with in vitro 3CLpro enzymatic activity. Dual combination trials were conducted to identify 
drugs with synergistic effects and thus high activity at lower doses. The effect of the drugs and 
drug combinations identified at this stage on the inhibition of SARS-CoV-2 replication in lung 
(Calu-3) and intestinal (Caco-2) cells most damaged by SARS-CoV-2 was determined using 
non-infectious SARS-CoV-2 sub-genomic replicon containing LUC and GFP reporters. 
It was found that amcinonide, eltrombopag, lumacaftor, candesartan, and nelfinavir exhibited 
inhibitory activity at the µM level against the in vitro enzymatic activity of 3CL
pro. Lumacaftor 
inhibited SARS-CoV-2 replication in Caco-2 intestinal and Calu-3 lung cells with IC50 values 
of 964 nM and 458 nM, respectively. Candesartan also inhibited SARS-CoV-2 replication, with 
IC50 values of 714 nM (in Caco-2 cells) and 1.05 µM (in Calu-3 cells). In individual trials, 
amcinonide, pimozide, eltrombopag, and nelfinavir inhibited SARS-CoV-2 replication in lung 
and intestinal cells at IC50 values of approximately 2-5 µM. When used in dual combination 
experiments in cell lines, amcinonide, pimozide, lumacaftor, and eltrombopag acted as SARSCoV-2 inhibitors at the nM level, when candesartan was used at the µM level.