Halofilik mikroorganizmalar olan Pseudomonas halophila DSM 3050 ve Haloarcula hispanica ATCC 33960'da glutatyon S-transferaz (GST) enziminin optimizasyonu ve spesifik aktivitesinin belirlenmesi
Determination of glutathione S-transferase (GST) specific activity and optimization of enzyme in halophilic microorganisms Pseudomonas halophila DSM 3050 and Haloarcula hispanica ATCC 33960
Yazar: AYŞE ÇAKIR
Danışman: PROF. DR. KIYMET GÜVEN ; YRD. DOÇ. DR. ELİF ÖZTETİK
Anadolu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada halofilik bakteri Pseudomonas halophila DSM 3050 ve halofilik arke Haloarcula hispanica ATCC 33960'da GST aktivitesinin karakterizasyonu yapılmıştır. GST enzim aktivitesinin belirlenmesi, substrat olarak 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) varlığında spektrofotometrik olarak gerçekleştirilmiştir. %25 tuz konsantrasyonuna sahip besiyerinde gelişen P. halophila için pH'sı 6.5 olan 50 mM Tris-HCl tamponu, 50 ?g protein, 1.0 mM CDNB, 4.0 mM kofaktör glutatyon (GSH) ve 25°C enzimin maksimum aktivite gösterdiği optimum koşullar olarak belirlenmiştir. H. hispanica için ise maksimum aktivite alınan koşullar %25 tuz konsantrasyonu, pH'sı 9.0 olan 50 mM Tris-HCl tamponu, 50 ?g protein, 1.0 mM CDNB, 1.0 mM GSH ve 25°C olarak gözlenmiştir. Optimize koşullar altında mikroorganizmaların GST aktiviteleri ölçülmüştür. P. halophila GST spesifik aktivitesinin ortalama 53.48 nmol/dk/mg ve H. hispanica GST spesifik aktivitesinin ortalama 19.68 nmol/dk/mg olduğu belirlenmiştir. Sonuçlar ANOVA, Duncan ve student-t testleri yardımıyla istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Lineweaver-Burk grafiği çizilerek enzimin CDNB ve GSH'a karşı kinetik özellikleri belirlenmiştir. P. halophila GST aktivitesinin CDNB'ye karşı Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0.52 mM, 80.65 nmol/dk/mg ve GSH'a karşı Km ve Vmax değerleri sırasıyla 1.89 mM, 81.30 nmol/dk/mg olarak bulunmuştur. H. hispanica'da CDNB'ye karşı GST aktivitesinin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0.46 mM ve 27.93 nmol/dk/mg; GSH'a karşı Km ve Vmax değerleri ise sırasıyla 0.13 mM ve 22.03 nmol/dk/mg olarak hesaplanmıştır. Hanes-Woolf ve Eadie-Hofstee grafikleri de çizilmiş ve bu grafiklerden elde edilen sonuçların Lineweaver-Burk grafiğinden alınan sonuçlar ile uyumlu oldukları görülmüştür.Anahtar Kelimeler: Pseudomonas halophila, Haloarcula hispanica, GST, CDNB, GSH, optimizasyon

Abstract:
In this study, characterizations of GST activities in halophilic bacterium Pseudomonas halophila DSM 3050 and halophilic archaeon Haloarcula hispanica ATCC 33960 were carried out. Determination of GST enzyme activity was conducted spectrophotometrically in presence of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) as a substrate. Optimum conditions for maximum activity were determined as 50 mM Tris-HCl buffer (pH 6.5), 50 ?g protein, 1.0 mM CDNB, 4.0 mM cofactor glutathione (GSH) and 25°C for P. halophila growing at medium with a salt concentration of 25%. Optimum conditions obtained for maximum activity of H. hispanica were observed as 25% salt concentration, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), 50 ?g protein, 1.0 mM CDNB, 1.0 mM GSH and 25°C. Cytosolic GST activities of both microorganisms were measured under optimized conditions. The average activity of P. halophila and H. hispanica was determined as 53.48 nmol/dk/mg and 19.68 nmol/dk/mg, respectively. The results were analyzed statistically by ANOVA, Duncan and student-t tests. Kinetic properties of the enzyme against CNDB and GSH were determined by drawing Lineweaver-Burk plot. Km and Vmax values of P. halophila GST activity against CDNB were calculated as 0.52 mM, 80.65 nmol/dk/mg and against GSH they were found as 1.89 mM, 81.30 nmol/dk/mg, respectively. Km and Vmax values of H. hispanica GST activity towards CDNB were determined as 0.46 mM and 27.93 nmol/dk/mg and towards GSH they were calculated as 0.13 mM ve 22.03 nmol/dk/mg, respectively. Hanes-Woolf and Eadie-Hofstee plots were also drawn and it was seen that the results from these plots were in co-relation with the results acquired from Lineweaver-Burk plot.Keywords: Pseudomonas halophila, Haloarcula hispanica, GST, CDNB, GSH, optimization