Geobacillus kaustophilus alfa-glukuronidaz enziminin in-siliko yaklaşımlar ile protein mühendisliğinin gerçekleştirilmesi
Protein engineering of Geobacillus kaustophilus alfa-glucuronidase enzyme by in-silico approaches
Yazar: ELİF ALTUNKÜLAH
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ YUNUS ENSARİ
Kafkas Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Enzimler; yeniden kullanılabilir, ekonomik ve etkili fonksiyonel proteinler olarak endüstrinin pek çok alanında biyolojik katalizör görevinde kullanılmaktadır. Enzimlerin endüstriyel koşullarda en yüksek stabilite ve aktivite ile çalışabilmelerini sağlamak amacıyla yabani tipler üzerinde genetik iyileştirme çalışmaları yapılmaktadır. Moleküler biyoloji ve genetik bilimindeki gelişmeler, protein mühendisliğinin enzim optimizasyonunda kullanılabilmesinin yolunu açmıştır. Protein mühendisliği teknikleri ile mevcut enzimlerin aktivite, verimlilik, stabilite, substrat seçiciliği gibi özellikleri geliştirilebilmekte ve yeni proteinler tasarlanabilmektedir. Alfa-glukuronidazlar; lignoselülozik biyomateryallerin, suda çözünmeyen polimerlere hidrolizini sağlayan ve bu sayede oldukça kararlı olan selüloz gruplarının endüstriyel kullanımda daha kolay işlenebilen bir forma dönüşmesine olanak verme potansiyeli taşıyan enzimlerdir. Protein mühendisliği teknikleriyle bu enzimin stabilitesinin ve aktivitesinin iyileştirilmesi, kullanım alanını ve yaygınlığını da artıracaktır. 
Bu tez çalışmasında Geobacillus kaustophilus'tan izole edilen ksilan alfa-1,2-glukuronidaz enziminin (A0A0D8BWB2) biyoinformatik araçlar kullanılarak stabilitesinin artırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla enzimin dizi bilgisinden yola çıkılarak farklı yaklaşımlara sahip yapı tahmin araçlarıyla modeller oluşturulmuştur. Elde edilen modeller, yapı tahmini doğrulama araçları ile değerlendirilip YASARA Structure ile oluşturulan homoloji modelin en uygun model olduğu belirlenmiştir. Sonrasında HotSpot Wizard v3.1 kullanılarak enzimin stabilitesine etki edebilecek olası amino asit pozisyonları ve olası ikameler belirlenmiştir. HotSpot Wizard ile elde edilen mutasyonlar enzim üzerine YASARA içinde bulunan FoldX uzantısı ile yerleştirilmiştir. Mutasyon bölgeleri arasından aktivite ve stabilite üzerinde olumlu etki gösterenleri seçmek amacıyla stabilite değişimleri (ΔΔG) ölçülmüş ve moleküler doking yapılarak substrata olan ilgisi üzerindeki değişim tespit edilmiştir. FoldX ile yapılan stabilite değişim ve moleküler doking analizleri, T227A, T227R, I210L/Y238F ve E299L/C319A mutantlarının enzim aktivitesinde olumsuz bir değişim olmadan enzimin stabilitesinin artacağını göstermiştir.

Abstract:
Enzymes are used as biological catalysts in many areas of industry as reusable, economical and effective functional proteins. Genetic improvement studies are carried out on wild types in order to ensure enzymes can work with the highest stability and activity in industrial conditions. Advances in molecular biology and genetics have paved the way for protein engineering to be used in enzyme optimization. The features of current enzymes, such as activity, efficiency, stability, and substrate selectivity, can be enhanced via protein engineering techniques, and novel proteins can also be created. Alpha-glucuronidases provide hydrolysis of lignocellulosic biomaterials to water-insoluble polymers and thus have the potential to transform highly stable cellulose groups into a form that can be processed more easily in industrial use. Improving the stability and activity of this enzyme through protein engineering techniques will also increase its usage area and prevalence.
In this thesis study, it is aimed to increase the stability of the xylan alpha-1,2-glucuronidase enzyme (A0A0D8BWB2) isolated from Geobacillus kaustophilus by using bioinformatics tools. For this purpose, models were created using structure prediction tools with different approaches based on the sequence information of the enzyme. The obtained models were evaluated with the structure prediction validation tools, and it was determined that the homology model created with YASARA Structure was the most suitable. Then, possible amino acid positions and possible substitutions that may affect the stability of the enzyme were determined using HotSpot Wizard v3.1. In order to choose the mutation sites that have a beneficial impact on activity and stability, stability changes (ΔΔG) were assessed, and the change in the affinity of mutants to the substrate was determined by molecular docking.  In this way, possibly more stable T227A, T227R, I210L/Y238F, and E299L/C319A mutants of the enzyme were obtained.