Coiled coil domain containing protein 124'ün post-translasyonel modifikasyonlarının hücresel moleküler etkileşimler üzerine etkileri
The effects of post-translational modifications of coiled coil domain containing protein 124 on cellular molecular interactions
Yazar: GAMZE ÇAKIRCA
Danışman: PROF. DR. UYGAR HALİS TAZEBAY
Gebze Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Tüm ökaryotlarda korunmuş, ribozomla ilişkili RNA bağlayıcı protein olan Coiled-coil domain-containing 124 (Ccdc124) proteini, stresin neden olduğu translasyonel 
kapanmanın ardından ribozom aktivitesinin devam etmesine yardımcı olmaktadır.
Translasyondan bağımsız hücresel işlevi hala bilinmemekle birlikte, Ccdc124 
proteini, ribozom dışında; hücre döngüsünün interfaz evresinde sentrozom veya 
sitokinetik bölünme sırasında orta cisimcik gibi hücresel konumlarda da bulunur.
Daha önce HEK293 (insan embriyonik böbrek) hücrelerinde yapılan LC-MS/MS 
tabanlı proteomik analizler sonucu birçok yeni Ccdc124 protein partnerleri 
keşfedilmiştir. Haritalanan etkileşim partnerlerinin bir kısmının çekirdekçik 
biyosentezi ve işleyişinde yer aldığı görülmüştür. Yapılan bu tez çalışmasının ilk
kısmında, HEK 293T ve U2OS (osteosarkom) hücre tiplerinde kanserle bağlantılı
nükleolus belirteci olan Nükleofosmin (Npm1) ve Nükleolin (Ncl) ile Ccdc124 
proteini arasındaki etkileşimin aydınlatılmasına yönelik çalışmalar 
gerçekleştirilmiştir. Bu etkileşim immün boyama ve birlikte çöktürme deneyleri ile 
teyit edilmiştir. Çalışmanın ikinci kısmı, Ccdc124'ün fosforilasyonunun partner 
etkileşimi üzerine etkisinin araştırılmasını kapsamaktadır. Ccdc124 proteininin 
mutasyona uğratılmış translasyon sonrası modifikasyon (PTM) bölgeleri ve mutant 
proteinlerin Npm1 etkileşimi üzerindeki rolü analiz edilmiştir. Yapılan immün
boyama çalışmalarında mutant proteinlerin, Npm1 ile etkileşiminde yabanıl tipe 
oranla düşüş olduğu görülmüştür. Npm1, çeşitli DNA onarım yollarına aracılık 
ederek genomik stabilitenin korunmasında yer alan kritik bir proteindir [Scott ve
Oeffinger, 2016]. Nükleolar stres algılama, DNA hasarı tepkisini içeren moleküler 
mekanizmalarda Ccdc124'ün davranışının aydınlatılması amacıyla, çalışmanın son 
kısmında, Ccdc124 proteininin bir DNA interkalatörü olan Dox (doksorubisin)
uygulamasına verdiği yanıtın araştırılması ve Dox yanıtı olarak DNA hasar 
durumunda nükleolar lokalizasyonu değiştiği bilinen Npm1 ile etkileşim dinamiği
analiz edilmiştir. Yapılan in vitro deneyler sonucunda hem yabanıl tip hem de mutant 
Ccdc124 proteinlerinin Dox yanıtı olarak Npm1 proteini ile benzer yol izleyerek 
lokasyonunun çekirdekçikten çekirdek içine yayıldığına yönelik veriler elde 
edilmiştir.

Abstract:
Coiled-coil domain containing 124 (Ccdc124), a conserved ribosome-associated 
RNA-binding protein in all eukaryotes, helps maintain ribosome activity following 
stress-induced translational shutdown. Although its translation-independent cellular 
function is still unknown, the Ccdc124 protein is located not only the ribosome but
also found in cellular locations such as the centrosome during the interphase of the 
cell cycle or the midbody during cytokinetic division. Previous LC-MS/MS-based 
proteome analyses carried out in HEK293 (human embryonic kidney) cells have led 
to the identification of a large number of novel Ccdc124 protein partners. Some of 
the mapped interaction partners were found to be involved in nucleolus biosynthesis 
and functioning. In the first part of this thesis, studies were carried out to elucidate 
the interaction between Nucleophosmin (Npm1), which is a cancer-associated 
nucleolar stress marker, and Ccdc124 protein in HEK 293T and U2OS 
(osteosarcoma) cell types. This interaction has been confirmed by immunostaining 
and co-precipitation experiments. In the second part of the study, it covers the 
investigation of the effect of phosphorylation of Ccdc124 on partner interaction. The 
role of the proteins mutated from the post-translational modification regions of the 
Ccdc124 on the interaction of Npm1 has been analyzed. In the immunostaining 
experiments, it was shown that the mutant proteins' interactions with Npm1 
decreased compared to the wild-type protein. Npm1 is a critical protein involved in 
maintaining genomic stability by mediating various DNA repair pathways. In order 
to elucidate the behavior of Ccdc124 in molecular mechanisms including nucleolar 
stress sensing and DNA damage response, in the last part of the study, the response 
of Ccdc124 protein to Dox (doxorubicin) treatment, a DNA intercalator, and its 
interaction dynamics with Npm1, which is known to change its nucleolar localization 
as Dox response, were analyzed. Based on the results of the in vitro experiments, it 
was demonstrated that the wild-type and mutant forms of the Ccdc124 protein 
translocate from the nucleolus to the nucleus with a similar path as the Npm1 protein 
in response to Dox