Fingolimod tedavisinin multipl skleroz hastalarında periferik kan hücre immünofenotipleri üzerine etkisi
Effects of fingolimod on cytokine and chemokine levels in relapsing remitting multiple sclerosis patients
Yazar: HALİL İBRAHİM AKÇAY
Danışman: DOÇ. DR. MURAT KÜRTÜNCÜ
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Nöroloji = Neurology
Dizin: B lenfositleri = B lymphocytes ; Fingolimod = Fingolimod ; Hücreler = Cells ; Multipl skleroz = Multiple sclerosis ; T lenfositleri = T lymphocytes ; İmmünite = Immunity ; İmmünofenotip tayini = Immunophenotyping

Özet:
Tez Tanıtımı: Akçay Hİ, Fingolimod Tedavisinin Multipl Skleroz Hastalarında Periferik Kan Hücre İmmünofenotipleri Üzerine Etkisi, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalı, Uzmanlık Tezi, İstanbul, 2017. 
Giriş ve Amaç: Multipl Skleroz (MS) merkezi sinir sisteminin inflamasyon ve dejenerasyonla giden kronik seyirli bir hastalığıdır. Etiyolojisinde çevresel faktörler, genetik ve immünite gibi çoklu faktörlerin değişik oranlarda katkıları sonucunda gelişen bir süreçten bahsedilmektedir. MS, ön planda T hücre ilişkili otoimmün bir hastalık görünmekle birlikte son zamanlarda B hücrelerinde katkısının daha önce zannedildiğinden daha fazla olduğu saptanmıştır. MS'in atak tedavisi, semptomatik tedavi ve hastalık düzenleyici tedavi olmak üzere üç alt başlıkta incelenebilecek tedavisi söz konusudur. Hastalık düzenleyici tedavilerdeki son zamanlarda görülen yeni gelişmeler MS'in patofizyolojisine bakış açımızı da değiştirmeye başlamıştır. Bu ilaçlardan biri de fingolimod'dur. Fingolimod etkisini lenfositler üzerindeki sfingozin-1 fosfat reseptörlerini yok ederek göstermenktedir. İlaç immün hücrelerin trafiğini değiştirerek santral hafıza T hücreleri, naif T hücreleri gibi hücreleri lenfoid dokuya hapsederken, efektör hafıza T hücrelerine göreceli olarak daha az etki etmekte ve hücre profilini anti-inflamatuar yönde değiştirmektedir. Bunun yanı sıra fingolimod, B hücrelerinde de benzer etkinlik göstermektedir. Çalışmamızda, MS hastaları sağlıklı gönüllülerle T hücre alt tipleri ile B hücreler açısından karşılaştırılmış ve fingolimodun bu profil üzerine etkisi 6 aylık periyotta araştırılmıştır.
Araç ve Yöntem: Hastalar, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Ana Bilim Dalı Multipl Skleroz ve Miyelin Hastalıkları Birimi, İstanbul Bilim Üniversitesi ve Haydarpaşa Eğitim ve Araştırma Hastanesi Nöroloji Kliniği tarafından takip edilen hastalar arasından seçilmiştir. Hastalar ve sağlıklı gönüllülerden alınan serum örnekleri ile akım sitometri ve ELİSA yöntemleri kullanılarak immün sistem hücreleri yüzde ve sayı açısından sınıflandırılmış ve karşılaştırılmıştır.
Bulgular: Çalışmamızda toplam 80 ataklı yineleyici MS (RRMS) hastası ile 60 sağlıklı kontrol taranmıştır. Hastaların 66'sı çalışmaya dahil edildi. Toplam 66 hastanın 46'sı (%69) kadın, 20'si (%31) erkekti. Sağlıklı gönüllülerin ise 40'ı (%66) kadın, 20'si (%34) erkekti. Hasta ve sağlıklı gönüllü grubu arasında yaş ve cinsiyet açısından istatistiksel anlamlı bir fark saptanmadı. İmmün hücreler açısından değerlendirildiğinde başlangıçta MS hastaları ile sağlıklı gönüllüler arasında T ve B hücre sayısı açısından anlamlı bir fark olmadığı gözlendi. Tedavi sonrasında ise bu hücre gruplarının oranlarında belirgin bir düşüş olduğu saptandı. T hücre alt tipleri açısından incelendiğinde yardımcı T hücrelerinde ve düzenleyici T hücre düzeylerinde anlamlı bir düşüş görülürken, sitotoksik T hücrelerinde artış olduğu izlendi. Sitokin eksprese eden alt tipler açısından bakıldığında ise her üç alt tip T hücrede IFNγ, TNFα ve IL-10 ekspresyonunda artış olduğu belirlendi. IL-9 ekspresyonu sitotoksik T hücrelerde azalırken, yardımcı ve düzenleyici T hücrelerde değişmediği izlendi. IL-4 ekspresyonu yardımcı ve düzenleyici T hücrelerinde artarken, IL-17 ekspresyonu sadece yardımcı T hücrelerde artış gösterdi. NK ve NKT hücrelerinde ise altı ayın sonunda sayısal olarak bir azalma görülürken, oransal anlamda artış olduğu saptandı. 
Tartışma: Saptanan bulgular, tedavi sonrasında IL-4 ve IL-10 gibi anti-inflamatuar etkinlik gösteren sitokinlerin sekresyonunu yapan T hücrelerin artışı ile birlikte IL-17, IFNγ ve TNFα gibi inflamatuar etkinlik gösteren sitokinleri eksprese eden T hücrelerin artışının da olduğunu göstermiştir. Ancak inflamatuar etkinlik gösteren hücre alt tiplerinde artışın toplam T hücre azalması içerisinde göreceli olarak daha az azalmaya bağlı olabileceği düşünülmüştür. Bu çalışmada tedavi sonucunda B hücrelerinin belirgin şekilde azalma göstermesi dikkate değerdir. Buna karşın B hücre alt tiplemesi yapılmadığı için bu azalmanın hangi yönde olduğu değerlendirilememiştir. Sonuç olarak, fingolimodun T ve B hücre düzeylerini azalttığı ve bunu yaparken hücre alt tiplerini seçici olarak etkilediği sonucuna varılmıştır. 

Anahtar Kelimeler: Multipl skleroz, Fingolimod, MS immünitesi, T ve B hücreleri, İmmünfenotipleme.

Abstract:
Presentation of the Thesis: Akcay HI, Effects of Fingolimod on Cytokine and Chemokine Levels in Relapsing Remitting Multiple Sclerosis Patients. Department of Neurology, Istanbul Faculty of Medicine, Istanbul University, Thesis in Neurology, Istanbul, 2017. 
Background and Aim: Multiple Sclerosis (MS) is a chronic, inflammatory, demyelinating and neurodegenerative disorder of the central nervous system (CNS). This chronic pathologic process is caused by mutual impact of environmental, genetic, and immunity-related factors. Despite the previous belief that MS is a T cell-mediated disorder, there is increasing piece of evidence that B cells play an important role during pathogenesis of MS. There are three sub-topics in MS treatment; acute relapse, prophylaxis (disease modification), and symptomatic treatment. New findings on the treatments that modify the disease course (DMTs) start to change our perspective on MS immunopathogenesis. One of them is fingolimod. With its peculiar mechanism of action, fingolimod is an analog of sphingosine-1 phosphate (S1P) and it is rapidly phosphorylated in vivo. Fingolimod-phosphate (fingolimod-P) acts as functionally antagonist of G protein-coupled receptors of sphingosine-1 phosphate (S1P). It seems that its predominant effect is on traffic of naïve and central T cells. This effect on lymphocytes is believed to be caused by the blockage of egressing T lymphocytes from the lymphoid tissue. In this study, we aimed to investigate immunophenotyping profile of T and B cells in MS patients before and after treatment with fingolimod. 
Methods: Our study is a multi-center study, recruiting patients from 3 centers including Departments of Neurology at Istanbul Faculty of Medicine, Istanbul Bilim University, and Haydarpaşa Education and Research Hospital. Blood samples of the patients and healthy controls were immunophenotyped using flow cytometry and ELISA.
Results: We screened 80 RRMS patients in our study. Sixty-six of them (46 female, 20 male) along with age and gender matched 60 healthy controls fulfilled the inclusion and exclusion criteria. We did not observe any difference in B and T cell immunophenotypes of patients and controls at the onset of the treatment. After the initiation of treatment however, the proportion of both cell types decreased gradually. In contrast to this finding, the proportion of the cytotoxic T cells increased, despite decreased ratios of T helper and regulatory T cells. Cytokine profile analysis revealed that anti-inflammatory cytokines such as IL-10 and IL-4 expression increased in all T cell subtypes, Tregs, and T helper cells, respectively. In accordance with this result, we observed decreased levels of IL-9 in cytotoxic T cells which may indicate diminished inflammatory state caused by fingolimod. On the other hand, the proportion of IL9+ Treg and T helper cells did not change after the treatment. Interestingly, the percentage of IL17+, IFNγ+,  and TNFα+ T lymphocytes increased after six months of treatment. The number of natural killer (NK) cells and natural killer T (NKT) cells decreased, despite increased proportions as lymphocyte subsets.
Discussion: Our results suggest that fingolimod has a profound impact of T and B lymphocytes after initiation of treatment. Interestingly, the proportion of T cells expressing proinflammatory cytokines increased despite decreased total number of these cell subtypes. Our study also showed that fingolimod caused a remarkable reduction in the proportion of B lymphocytes. Unfortunately, we cannot interpret this finding any further due to absence of B cell specific cytokines and receptors in our study. In summary, our study reveals differential effects of fingolimod on T and B cell subsets, emphasizing the importance of B cells in the pathogenesis of MS.

Keywords: Multiple Sclerosis, MS, Fingolimod, MS immunogenesis, T and B cells, Immunophenotyping