Nerium oleander ekstrelerinden elde edilen karbon nanodotların meme kanseri hücreleri üzerindeki in vitro sitotoksik ve genotoksik etkilerinin incelenmesi
Investigation of in vitro cytotoxic and genotoxic effects of carbon nanodots synthesized from Nerium oleander extracts on breast cancer cells
Yazar: SİNEM ŞİMŞEK KEKEVİ
Danışman: PROF. DR. BELMA ÖZBEK ; DOÇ. DR. RÜKAN GENÇ ALTÜRK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kimya Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Nanoparçacıklar, üstün fiziksel ve kimyasal özellikleri ve umut vaadeden uygulama potansiyellerine rağmen, özellikle biyomedikal uygulamalarda kullanılmadan önce nanotoksikolojilerinin sistematik, hassas ve güvenilir olarak belirlenmesi geremektedir. Geleneksel sitotoksiste testleri bu aşamada yetersiz kalabilmekte ve nanopaçacıkların testlerde kullanılan kimyasal ajanlarla etkileşimlerine ve/veya insan faktörüne bağlı olarak hatalı sonuçlar verebilmektedir. Bu nedenle nanotoksikoloji araştırmalarında, söz konusu etkileşimlere mahal vermeyen, insan faktörünü ortadan kaldıran ve yüksek hassasiyette sonuç veren yenilikçi, güvenilir yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır.
Bu kapsamda, Nerium oleander ekstrelerinden, farklı sentez yöntemleri ile farklı fiziksel koşullarda sentezlenen karbon nanodotların (CD) karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiş ve elde edilen bulgular doğrultusunda, incelenen parametrelerin sentezlenen nanoparçacıklar üzerindeki etkileri açığa çıkartılmıştır. Yeni nesil in vitro sitotoksik aktivite tayini yöntemi, empedans ölçümü temelli gerçek zamanlı hücre analiz cihazı xCELLigence kullanılarak; CD'lerin MCF-7 insan meme kanseri ve HDFa insan primer dermal fibroblast hücreleri üzerindeki in vitro sitotoksik aktiviteleri belirlenmiştir.
In vitro sitotoksik aktivite bulguları göz önünde bulundurularak seçilen karbon nanodotların MCF-7 hücre hattı üzerindeki in vitro genotoksisiteleri tek hücre jel elektroforezi (comet yöntemi) kullanılarak araştırılmıştır. Ardından sitokinezi bloklanmış mikronükleus (CBMN) testi ile CD'lerin, hücrelerin DNA'ları üzerindeki hasar seviyeleri belirlenerek klastojenik etkileri irdelenmiştir. Nanoparçacıkların neden olduğu hasarın mekanizmasının açığa çıkarılması, amaca yönelik olarak verdikleri hasar seviyesinin güçlendirilmesi veya engellenmesi bakımından önem taşımaktadır. Bu nedenle, akış sitometrisi yöntemi kullanılarak parçacıkların hücre döngüsü ilerleyişi üzerindeki etkileri belirlenerek hücre hasarının mekanizması açıklanmaya çalışılmıştır.
Elde edilen bulgular neticesinde, CD sentezinde, karbon kaynağı olarak kullanılan ekstre tipinin, sentez yönteminin, yüzey modifikasyonunun ve sentez koşullarındaki değişimin; parçacıkların boyutu, fotolüminesansı ve yüzey özellikleri üzerinde önemli etkileri olduğu belirlenmiştir. Sentezlenen CD'lerin in vitro sitotoksik aktivitelerinin araştırılması neticesinde, parçacıkların kanser hücre hattı üzerinde doza (50 ppm) ve zamana bağlı sitotoksite gösterirken, sağlıklı HDFa hücreleri üzerinde en yüksek konsantrasyonda bile herhangi bir sitotoksik aktiviteye neden olmadıkları belirlenmiştir. Aynı zamanda, parçacıkların MCF-7 hücre hattı üzerinde 0.25 ppm gibi düşük konsantrasyonlarda bile genotoksik ve klastojenik etkiye neden olduğu saptanmıştır.
Biyolojik aktiviteleri incelenen CD'lerin memeli hücrlerindeki mutajenite ve karsinojenite potansiyellerininin desteklenmesi için daha fazla araştırmaya gerek duyulsa da, bu çalışma neticesinde, son derece küçük boyutlu CD'lerin, hücre çekirdeğine girerek tümör hücrelerinin hücresel fonksiyonlarını etkileyebileceği görülmüştür. Böylelikle CD'lerin tek başlarına bile, yüksek konsantrasyonlarda, MCF-7 meme kanseri hücrelerine seçici sitotoksisite gösterirken, HDFa insan primer dermal fibroblast hücrelerinde aynı konsantrasyonlarda büyümeyi indüklediği gözlenmiştir. CD'lerin genotoksiste ve hücre döngüsü üzerindeki etkisi incelendiğinde, DNA hasarına bağlı kanser tedavisinde kullanılma potansiyellerinin olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Despite their superior physical and chemical properties and promising application potentials, nanoparticles require the systematic, precise and reliable determination of their nanotoxicology, especially before they are used in biomedical applications. Tests in traditional cytotoxicity may be inadequate at this stage and may give deceptive results, depending on the interaction of the nanoparticles with the chemical agents used in the tests and/or the human factor. For this reason, in nanotoxicology studies, innovative, reliable methods that do not place these interactions, eliminating the human factor and giving high precision results are needed. In this context, the characterizaton studies of carbon nanodots synthesized from two different Nerium oleander extracts via different synthesis methods under various physical conditions were performed and the effects of the investigated parameters on carbon nanodots (CD) were revealed.
In this study, in vitro cytotoxic activities of carbon nanodots on human primary dermal fibroblast cells (HDFa) and human breast cancer cells (MCF-7) were determined by using the new generation in vitro cytotoxic activity determination method, impedance measurement based real time cell analyzer xCELLigence. The in vitro genotoxicity of the selected CDs on the MCF-7 cell line was determined using single cell gel electrophoresis (comet assay). The cytoplasm blocked micronucleus (CBMN) test was used to determine the level of damage of carbon nanodots on the DNA of the cells and their clastogenic effects were examined. Revealing the mechanism of damage caused by the particles is important for strengthening or preventing the damage level they cause. Therefore, by using flow cytometry method, the mechanism of cell damage is tried to be explained by determining the effects of particles on cell cycle progression.
As a result of the outcomes, the significiant effects of the extract type used as carbon source, synthesis method, surface modification and changes in synthesis conditions on the particle size, photoluminescence and surface properties of synthesized CDs were determined. The results obtained from the in vitro cytototoxicy assessment of CDs synthesized concluded that CDs have concentration and time-dependent cytotoxic potentials (at 50 ppm) over MCF-7 cells while they comforted the proliferation of healthy HFDa cells even at highest CD concentrations. Meanwhile, in vitro genotoxicity studies have shown that the particles cause genotoxic and clastogenic effects even at concentrations as low as 0.25 ppm on the MCF-7 cell line.
Although further studies are warranted to investigate the mutagenicity or carcinogenicity potency of CD in mammalian cells, this work shows evidence that CDs with super tiny size can specifically affect cellular function of tumour cells by entering the cell nucleus. Thus, at high concentrations, CDs showed selective cytotoxicity to MCF-7 breast cancer cells, while they induces growth at the same concentrations in HDFa human primary dermal fibroblast cells. When the effect of CDs on genotoxicity and cell cycle was examined, it was found that they have potential to be used in cancer treatment due to DNA damage.