Glioblastoma multiforme kanser kök hücrelerinde PI3K/AKT/mTOR dual inhibisyonu ve düşük yoğunluklu darbeli ultrason uygulamasının F-aktin ve otofaji özelinde araştırılması
An investigation of PI3K/AKT/mTOR dual inhibition and low intensity pulsed ultrasound application on F-actin and autophagy in glioblastoma multiforme cancer stem cells
Yazar: IRMAK TUTAK
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL UYSAL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyoloji = Biology
Dizin: Fosfoinositid 3-kinaz = Phosphoinositide 3-kinase ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Kök hücreler = Stem cells ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Otofaji = Autophagy ; Ultrasonik dalgalar = Ultrasonic waves ; Ultrasonik tedavi = Ultrasonic therapy ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Glioblastoma Multiforme (GBM), erken tanısı yapıldığı takdirde dahi agresif etkisini
gösteren biyolojik olarak heterojen bir tümördür ve bu heterojen kitlenin içerisinde,
kendini yenileme ve farklılaşma özelliğine sahip, CD133, CD44 gibi tipik kök hücre
yüzey belirteçlerini ifade edebilen, kanser progresyonunu uyaran ve kanser
hücrelerinin tedavi direnci kazanmasına sebep olan kanser kök hücreleri de yer
almaktadır.
Hücre büyümesi, hayatta kalma, migrasyon ve karsinogenez gibi hücresel olayların
gelişiminden sorumlu PI3K/AKT/mTOR sinyal yolunun GBM ve Glioblastoma
multiforme kanser kök hücrelerinde (GBMKH/CD133+ kanser kök hücreleri) aktif
olduğu, tümörojeniteye katkı sağladığı bildirilmiştir. Hücre sağ kalım mekanizması
otofaji ile epitelyal mezenşimal geçiş (EMT) esnasında kanser hücrelerinin
hareketlilik kazanarak metastazına neden olan hücre iskelet elemanı F-aktin,
PI3K/AKT/mTOR sinyal yolu üzerinden düzenlenmektedir. Bu sinyal yolunun dual
inhibitörü olan Voxtalisib (XL765, SAR245409)'in GBM'li hastalarda sitotoksisiteyi
artırarak tümör gelişimini azalttığı ve buna bağlı sağ kalım oranını artırdığı
görülmüştür.
Mekanik enerjinin non-invaziv bir formu olan düşük yoğunluklu darbeli ultrason
(low intensity pulsed ultrasound, LIPUS), diğer mekanik uyarıcılara kıyasla derin
yerleşimli dokulara etki edebilme yeteneğine sahip bir ultrason tipidir. LIPUS'un
düşük toksisitesi, derin penetrasyonu ve yüksek etkinliği nedeniyle anti-tümör
tedavisi için kullanılabileceğini gösteren güncel çalışmalar bulunmaktadır. İlaçla
kombine edilen LIPUS tedavisinin mekano-akustik etkisi ile karsinogenezi uyaran
sinyal proteinlerinin down-regülasyonunu sağladığı, kanser hücrelerinde apoptoz ve
otofajiyi indüklediği bildirilmiştir. Ancak LIPUS'un, Voxtalisib ile meydana gelen
kemodinamik etkisi henüz incelenmemiş olup, GBMKH'de Voxtalisib/LIPUS
inhibisyonu sonucu F-aktin ve hücre sağ kalım mekanizmalarının ortaya konduğu
yeterli bir çalışma bulunmamaktadır.

IV
Bu çalışmada, dual inhibitör Voxtalisib ile PI3K/AKT/mTOR inhibisyonu ve LIPUS
kombine uygulamasının, F-aktin hücre iskeleti ve hücre ölüm mekanizması olan
otofaji üzerindeki olası etkilerinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu amaçlar
doğrultusunda floresanla aktive hücre ayırma (FACS) metodu kullanılarak
glioblastoma multiforme kanser kök hücrelerinin izolasyonu gerçekleştirilmiştir.
GBM ve GBM kanser kök hücrelerine Voxtalisib, LIPUS ve ikili kombinasyonları
uygulanarak otofaji ve F-aktin üzerinde meydana gelen değişimler incelenmiştir. Bu
değişimlerin incelenmesi sırasında uygun ilaç dozu belirlenmiş, hücre sayımları
yapılmıştır. İmmünofloresan yöntemleri kullanılarak F-aktin ve sinyal yolu
inhibisyonunun yorumlanması gerçekleştirilmiştir. Hücre migrasyonları standart
wound healing deneyi ile gösterilmiş, deney ve kontrol gruplarında sırasıyla
incelenen tüm parametreler ImageJ programı ile skorlanmış ve değerlendirilmiştir.
Sonuçta, Voxtalisib'in artan dozlara bağlara bağlı LIPUS uygulamasının mTOR'u
inhibe ederek, her iki hücrede de canlılığı azalttığı gösterilmiştir. Yanı sıra, mTOR
inhibisyonuna bağlı olarak otofaji aktive olmuştur ve bunun sonucunda LIPUS'un
GBM hücrelerinde otofajiyi artırdığı, GBMKH'lerde ise hücrelerin 5 ve 10 μM ilaç
dozlarında otofajiye direnç geliştirdikleri gözlenmiştir. Hücre invazyonu, phalloidin
boyaması ve migrasyon deneyleri ile gösterilmiş, sonuçta LIPUS'un artan dozlara
bağlı olarak hücre invazyonunu negatif yönde etkilediği sonucuna varılmıştır.
Yapılan çalışmalar, LIPUS ve Voxtalisib birlikte uygulamasının, kanser ve kanser
kök hücrelerini hedef almada etkili olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, yeni tedavi
yöntemlerinin geliştirilmesine, LIPUS'un klinik kullanımının yaygınlaşmasına
yardımcı olabilir.

Abstract:
Glioblastoma Multiforme (GBM) is a biologically heterogeneous tumor that shows
its aggressive effect despite early diagnosis. In this heterogeneous tumor, there are
also cancer stem cells which has capability of self-reneweal and differantiation, can
express typical stem cell surface markers such as CD133, CD44, stimulate cancer
progression and cause cancer cells to gain treatment resistance.
PI3K/AKT/mTOR signaling pathway what is responsible for the development of
cellular events such as cell growth, survival, migration and carcinogenesis has been
reported to be active in GBM and Glioblastoma Multiforme cancer stem cells
(GBMKH/CD133 + cancer stem cells) and contribute to tumorigenicity. The cell
survival mechanism autophagy and the cellular skeleton element F-actin which
causes metastasis of cancer cells by mobilizing during epithelial mesenchymal
transition (EMT) are regulated on PI3K/AKT/mTOR pathway. Voxtalisib (XL765,
SAR245409), the dual inhibitor of this signaling pathway has been shown to
reducing tumor development by increasing tumor cytotoxicity in patients with GBM,
consequently, increased the survival rate associated with it.
Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS), a non-invasive form of mechanical
energy, is an ultrasound type that capable of affecting deep-lying tissues when
compared to other mechanical stimulants. Due to low toxicity, deep penetration and
high efficacy of LIPUS, there have been current studies that show LIPUS can be
used for anti-tumor treatments. It has been reported that LIPUS therapy combined
with the drug provides down-regulation of signal proteins that stimulate
carcinogenesis and induces apoptosis and autophagy in cancer cells with its
mechano-acoustic effect. However, the chemodynamic effect of LIPUS with

Voxtalisib has not yet been studied, and there is no adequate study demonstrating F-
actin and cell survival mechanisms in GBMKH as a result of Voxtalisib/LIPUS

inhibition.

VI
In this study, it is aimed to reveal the possible effects of PI3K/AKT/mTOR inhibition
with dual inhibitor Voxtalisib and LIPUS combination on F-actin cytoskeleton and
cell survival mechanism autophagy. For these purposes, it is realized to isolation of
glioblastoma multiforme cancer stem cells using fluorescent activated cell sorting
(FACS) method. It has been examined the changes that were occured on F-actin and
autophagy in GBM and GBMKH applying Voxtalisib, LIPUS and their dual effects.
During the examination of these changes, the appropriate drug dose was determined
and cell counts were made. Interpretation of F-actin and signal path inhibition was
performed using immunofluorescence methods. Cell migrations were demonstrated
with the standard wound healing assay, all parameters that examined in the
experimental and control groups were scored and evaluated with the ImageJ
programme.
As a result, the application of Voxtalisib's increased doses of ligated LIPUS has been
shown to inhibit mTOR and decrease viability in both cells. In addition, autophagy
has been activated with mTOR inhibition, and in the event of this, it has been
observed that LIPUS increases autophagy in GBM cells and GBM cancer stem cells
advanced resistance for autophagy at 5 and 10 μM drug doses. Cell invasion has
been demonstrated by phalloidin staining and wound healing stratching experiments,
eventually it has been resulted that LIPUS negatively affects cell invasion depend on
increasing doses.

Our studies have shown that co-administration of LIPUS and Voxtalisib co-
administration is effective in targeting cancer and cancer stem cells. This study can

help development for new methods of treatment and expand the clinical use of
LIPUS.