Klinik stafilokok izolatlarının transkriptomları ve proteinleri üzerine çeşitli antimikrobiyallerin ve anti-enflamatuvar maddelerin etkilerinin araştırılması
Investigations of the effects of some antimicrobials and anti-inflammatory substances on the transcriptomes and proteins of the clinical staphylococci isolates
Yazar: İSMAİL ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. ŞAFAK ERMERTCAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Antiinflamatuar ajanlar = Anti inflammatory agents ; Gen ifadesi = Gene expression ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Stafilokok enfeksiyonları = Staphylococcal infections ; Staphylococcus = Staphylococcus

Özet:
Bu çalışmada, stafilokok kökenlerinin etken olduğu enfeksiyonların tedavisinde kullanılan antimikrobiyallerin ve anti-enflamatuvar ilaçların tek başlarına ve kombine halde in vitro etkinliklerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, gen ekspresyonu çalışmaları öncesinde, üç klinik metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) izolatı ile S. aureus ATCC kökeninin antimikrobiyallere (moksifloksasin, vankomisin, siprofloksasin, klindamisin ve gentamisin) ve anti-enflamatuvar ilaçlara (diklofenak, naproksen, ibuprofen, asetilsalisilik asit ve asetaminofen) duyarlılıkları disk difüzyon yöntemi ve mikrodilüsyon yöntemi ile belirlendikten sonra, sinerji çalışmaları (dama tahtası yöntemi) ve minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değişimi çalışmaları yapılmıştır. Staphylococcus aureus kökenlerinde virülans faktörlerini kodlayan genler ile düzenleyici genlerdeki (spa, sarA, RNAIII, sigB, mepA, mgrA ve srtA) ekspresyon değişimlerini belirlemek amacıyla, bakteriler etken maddelere maruz bırakıldıktan sonra RNA düzeyinde gen ekspresyon oranları kantitatif gerçek zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) yöntemi ile araştırılmıştır. RNA düzeyinde baskılayıcı veya indükleyici etki saptanan etken madde konsantrasyonları değerlendirilerek, protein miktar tayini, bakteriyel proteinlerin izolasyonu yapılmıştır ve stafilokokal protein A (spa) ekspresyon düzeyleri Western blot yöntemi ile araştırılmıştır.
Disk difüzyon yöntemi sonuçlarına göre, beş anti-enflamatuvar ilaç arasında inhibisyon zon çapı en yüksek olan ilacın diklofenak olduğu saptanmıştır. İbuprofenin inhibisyon zon çapının diklofenaka oranla daha düşük olduğu belirlenmiştir. Mikrodilüsyon yöntemi sonuçları değerlendirildiğinde; diklofenak, 195,31 ve 390,63 µg/ml konsantrasyonlarda ikişer kökene karşı inhibe edici etki göstermiştir. Asetilsalisilik asitin ATCC kökenine karşı MİK değerinin 390,63 µg/ml olduğu saptanmıştır. Dama tahtası yöntemi bulgularına göre; gentamisin+asetaminofen kombinasyonunun üç kökene karşı, gentamisin+diklofenak, gentamisin+ibuprofen, vankomisin+asetilsalisilik asit, siprofloksasin+diklofenak ve vankomisin+naproksen kombinasyonlarının iki kökene karşı sinerjistik etkili oldukları saptanmıştır. MİK değişimi deneyleri bulguları değerlendirildiğinde, tüm klinik izolatlara ve standart kökene karşı en etkili kombinasyonların, gentamisinin diklofenak, ibuprofen ve naproksen ile olan kombinasyonları ve klindamisinin diklofenak ile olan kombinasyonu olduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıca siprofloksasin+diklofenak kombinasyonunun iki klinik izolatta ve ATCC kökeninde siprofloksasin MİK değerini belirgin şekilde düşürdüğü görülmüştür. Klinik izolatlar ve ATCC kökeninde MİK düzeyindeki tüm anti-enflamatuvar ilaçlarla 4 ve 16 saatlik inkübasyon sonucunda bakterilerin üremesi üzerine inhibe edici etki saptanmıştır. Farklı konsantrasyonlarda antibiyotiklerin ve anti-enflamatuvar ilaçların bakterilerin virülans faktörlerinde ve düzenleyici genlerde neden oldukları değişimin antibiyotiklere ve virülans faktörlerine/düzenleyici genlere bağlı olarak farklılık gösterdiği belirlenmiştir. Çalışmamızda, mepA geninin ekspresyonunun artmasına rağmen, siprofloksasin ve gentamisin MİK değerlerinin düştüğü, bu değişimin mepA geninden bağımsız olduğu düşünülmektedir. İmmunoblotlama deneyi bulguları ile spa proteininin ekspresyonunun, MİK düzeylerindeki anti-enflamatuvar ilaçlar ve kombinasyonlar ile azaldığı,  sub-MİK düzeylerindeki gentamisin, vankomisin, asetilsalisilik asit, diklofenak ve naproksen ile indüklenebildiği gösterilmiştir.
Bu çalışma ile anti-enflamatuvar ilaçların tek başlarına veya antibiyotiklerle kombinasyonları sonucunda bakteriyel virülans faktörlerinde neden oldukları değişim ile stafilokokal enfeksiyonlara karşı etkili olabilecekleri düşünülmüştür. Antimikrobiyal direnç ve ilaçlar arasındaki ilişkiyi incelemeyi amaçlayan ve anti-enflamatuvar ilaçların etki mekanizmalarının anlaşılmasına katkı sağlayan daha fazla sayıda fenotipik, transkripsiyonel ve protein analizi çalışmalarının yapılması bu alana önemli katkılar sağlayacaktır.

Abstract:
The aim of our study was to investigate the in vitro effects of antimicrobials, alone or in combination with anti-inflammatory drugs on Staphylococci strains. For this purpose, before gene expression studies, investigations of the susceptibilities of three clinical methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolates and standard S. aureus ATCC strain with antimicrobials (moxifloxacin, vancomycin, ciprofloxacin, clindamycin and gentamicin) and anti-inflammatory agents (diclofenac, naproxen, ibuprofen, acetylsalicylic acid ve acetaminophen) by disc diffusion test and microdilution assay, synergy studies (checkerboard method) and alteration of minimum inhibitory concentration (MIC) studies were performed with antimicrobials and other anti-inflammatory agents. After exposure to the agents, gene espression ratios of virulence factor coding genes and regulator genes (spa, sarA, RNAIII, sigB, mepA, mgrA ve srtA) in Staphylococcus aureus strains were investigated at RNA level by quantitative real time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR) method. Then by evaluating the detected inhibitory/inducing concentrations of agents at RNA expression level, isolation of bacterial protein and quantification of protein assay were performed, and staphylococcal protein A (spa) expression levels were investigated by Western blot analysis. 
According to disc diffusion results, among the five anti-inflammatory drugs, diclofenac was found to be the highest inhibition zone diameters.  Ibuprofen inhibition zone diameters were detected lower than diclofenac. According to the microdilution method results; diclofenac at 195.31 µg/ml and 390.63 µg/ml concentrations showed inhibitory activity against two strains. The MIC value of acetylsalicylic acid against ATCC strain was determined as 390.63 µg/ml.  According to the checkerboard assay results; combination of gentamicin+acetaminophen against three strains, combinations of gentamicin+diclofenac, gentamicin+ibuprofen, vancomycin+ acetylsalicylic acid, ciprofloxacin+diclofenac and vancomycin+naproxen against two strains, were determined synergistic, respectively. According to alteration of MIC studies, the most effective combinations were evaluated as gentamicin with diclofenac, ibuprofen and naproxen and clindamycin with diclofenac. In addition, ciprofloxacin+diclofenac combination significantly reduced the MIC levels of ciprofloxacin against two clinical isolates and ATCC strain. MIC levels of all anti-inflammatory drugs inhibited the growth of clinical isolates and ATCC strain with 4 and 16 hours incubation. The effects of antibiotics and anti-inflammatory drugs with different concentrations on expression of virulence factors and regulator genes depended on the drugs and the virulence factor/regulator gene. According to the transciptional analyses, despite the increase in the gene expression of mepA, the MICs of ciprofloxacin and gentamicin were decreased, and we believed that this alteration was mepA-independent. The results of immunoblotting study has showed that; spa protein expression has been shown to be reduced by MICs of anti-inflammatory drugs and combinations, and induced by sub-MIC levels of gentamicin, vancomycin, acetylsalicylic acid, diclofenac and naproxen. 
Therefore, anti-inflammatory agents may be the therapeutic agents against staphylococcal infections by modulating the virulence factors and regulator genes. Further studies with phenotyphic assays, transcriptional and protein analyses are necessary to research relations between the resistance and the drugs and to understand the mechanisms of the anti-inflammatory and other drugs against bacterial strains.