Rhizopus oryzae mantarı üzerine farmakognozik araştırmalar
Pharmacognostical investigations on rhizopus oryzae fungi
Yazar: AMİNE DİLARA PİLEVNELİ AYIK
Danışman: PROF. DR. BELMA KONUKLUGİL
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakognozi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Deniz Bilimleri = Marine Science ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Deniz ürünleri = Seafoods ; Doğal besin = Natural food ; Farmakognozi = Pharmacognosy ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Mantarlar = Fungi ; Metabolitler = Metabolites ; Rhızopus oryzae = Rhızopus oryzae ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Denizler ve okyanuslar, yeni terapötik ajanların geliştirilmesi için büyük potansiyele sahip
değerli bir kaynağı temsil eden biyolojik olarak aktif sekonder metabolitlere sahip çok çeşitli
türleri içerir. Deniz kaynaklı mantarlar, kimyasal yapılarındaki ve biyolojik aktivitelerindeki
çeşitliliklerinden dolayı, biyolojik olarak aktif ürünlerin yeni umut verici kaynakları olarak
büyük ilgi görmektedir.
Bu tezin amacı, deniz süngerinden (Dendrectilla tremitensis) izole edilen Rhizopus oryzae
Went & Prins.Geerl. mantarı tarafından üretilen sekonder metabolitlerin araştırılması ve
mantar ekstresinin antioksidan, sitotoksik ve antimikrobiyal aktivitelerinin
değerlendirilmesidir. Bu deniz mantarı, ekstresinin YPSK-UV analizi ve daha önce bu
konuda yapılan bir çalışma olmadığı için seçilmiştir.
Silika jel tatbik edilen vakum likit kromatografisinde (VSK) hekzan, etil asetat,
dikolorometan ve metanol solvan sistemleri kullanılarak ham ekstreden 13 fraksiyon elde
edilmiştir.
Seçilen fraksiyonlar sefadeks kolona uygulanmış ve sonrasında İTK analizleriyle alt
fraksiyonlara ayrılmıştır. Fraksiyonlardan sekonder metabolitlerin saflaştırılması için yüksek
basınçlı sıvı kromatografisinde semipreparatif kolon kullanılmıştır.
Sonuç olarak, deniz kaynaklı Rhizopus oryzae mantarından nafto γ-piron, disakkarit,
aromatik poliketid türevleri gibi farklı etken madde gruplarına ait 8 maddenin yapısı
aydınlatılmıştır. Yaptığımız araştırmalar sonucunda elde ettiğimiz bilgiye göre dört madde
ilk kez izole edilen yeni maddelerdir. Yapı tayininde LCMS-TOF ve 1H, 13C ve iki boyutlu
NMR teknikleri kullanılmıştır.
Mantarın ham ekstresinin antimikrobiyal, antioksidan ve sitotoksik akvitelerine bakılmıştır.
Minimum İnhibitör Konsantrasyonu ölçülerek yapılan antimikrobiyal aktivite testleri
sonucunda S. aureus'a karşı MIC: 31,25 μg/mL değerinde orta derecede antimikrobiyal
aktivite tespit edilmiştir.
DPPH, SO, NO, ABTS yöntemleri kullanılarak yapılan antioksidan aktivite tayininde
Rhizopus oryzae'nın yapılan dört metoda göre antioksidan aktivite göstermediği
bulunmuştur. Rhizopus oryzae'nın MTT yöntemi kullanılarak yapılan sitotoksik aktivite 
139
tayininde, HCT -116 kolon kanserine karşı kayda değer (16,7 μg/ml IC50) bir sitotoksik etki
gösterdiği tespit edilmiştir.
Deniz kaynaklı mantarlardan yeni biyolojik olarak aktif metabolitlerin izolasyonu ve
tanımlanması amacıyla, bir deniz süngeri (Dendrectilla tremitensis) örneğinden izole edilen,
Rhizopus oryzae mantarında bulunan biyoaktif bileşenleri inceledik. Ham ekstrenin
kromatografik yöntemlerle analizi sonucu bu mantardan 8 madde izole edilmiştir. Yapılan
analizler sonucu dördünün yeni etken maddeler olduğu doğrulanmıştır. Bunlar 3-metoksi
mikofenolik asit 7-O-glukopiranozid metil ester türevi trivial adıyla penicacid H, 3 -metoksi
mikofenolik asit-7-O-glukopiranozid türevi trivial adıyla penicacid I, 3-metoksi-mikofenolik
asit 7-O glukopiranozid metil ester türevi trivial adıyla penicacid J ve 3-metoksimikofenolik
asit 7-O glukopiranozid metil ester türevi trivial adıyla penicacid K'dir. Bu maddeler daha
önce herhangi bir kaynaktan izole edilmemiştir.
Bu çalışmada sunulan sonuçlara ve literatür kayıtlarına göre, deniz kaynaklı mantarları
içeren deniz ortamının mükemmel bir doğal ürün ve ilaç endüstrisinin gelişimi için son
derece önemli olan benzersiz biyoaktif metabolitlerin kaynağı olduğu sonucuna varabiliriz.

Abstract:
Seas and oceans contain a wide diversity of species with biologically active secondary
metabolites that represent a valuable source with great potential for the development of novel
therapeutic agents. Marine-derived fungi are of great interest as new promising sources of
biologically active products due to their diversity in chemical structures and biological
activities.
The objective of this thesis was the investigation of the secondary metabolites
produced by Rhizopus oryzae Went & Prins.Geerl. isolated from the marine sponge
(Dendrectilla tremitensis) and the assessment of antioxidant, cytotoxic and antimicrobial
activities of fungi extract. This marine fungi was chosen, based on its HPLC-UV analysis
and no previous studies on this subject.
The crude extract was subjected to vacuum liquid chromatography (VLC) on silica gel
employing a step gradient of n-hexane-EtOAc, dichloromethane and methanole to give13
fractions. Selected fractions was subjected sephadex column chromatography than thin layer
chromatography. Semipreparative HPLC was used to purify secondary metabolites.
In conclusion, a total of 8 were successfully identified comprising diverse structural
groups including naphtho-γ-pyrons, disaccharides and aromatic polyketide derivatives from
the sponge-associated fungus Rhizopus oryzae in this study, to the best of our knowledge,
four of which were confirmed as new natural products. The structures of the compounds
were elucidated by performing mass spectrometry as well as one and two-dimensional
nuclear magnetic resonance (NMR) experiments. The fungal extract was examined for
antimicrobial, antioxidant, and cytotoxic activities. For antimicrobial activity determination
minimum inhibitory concentration was calculated and as a result, it was found that the crude
extract has antimicrobial activity against S. aureus with MIC: 31.25 μg/mL value.
141
Antioxidant activity of the crude extract was determined by DPPH, SO, NO, ABTS
methods. According to the obtained results, Rhizopus oryzae didn't show any antioxidant
activity by all methods. The cytotoxic activity of Rhizopus oryzae extract against HCT -116
colon cancer cells was evaluated by using MTT assay. The results show that crude extract
shows significant (16,7 μg/ml IC50) cytotoxic activity.
With the goal of isolation and identification of novel biologically active metabolites
from marine-derived fungi, we have investigated the bioactive constituents from a spongederived fungal Rhizopus oryzae. Chromatographic separation of the crude extract obtained
from this fungal strain, yielded 8 compounds, in this study, to the best of our knowledge,
four of which were confirmed as new natural products. These compounds are: 5-methoxy
mycophenolic acid-7-O-glucopyranoside that was trivially named as penicacid H, of 5-
methoxy mycophenolic acid-7-O-glucopyranoside that was trivially named as penicacid I, 3-
methoxy mycophenolic acid derivative-7-O-glucopyranoside methyl ester that was given a
trivial name penicacid J,and 3-methoxy mycophenolic acid derivative-7-O-glucopyranoside
methyl ester that was given a trivial name penicacid K.
According to the results presented in this study and literature backgrounds, we can
conclude that the marine environment including marine-derived fungi are an excellent source
of natural products and a source of unique bioactive metabolites, which are extremely
important for the development of the drug industry