Hiyerarşik gözenekli iskelelerin doğal polimerler kullanılarak doku mühendisliği uygulamaları için hazırlanması
Preparation of hierarchical porous scaffolds with using natural polymers for tissue engineering applications
Yazar: TUĞÇE ŞEN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MEHMET MURAT ÖZMEN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Hasarlı doku ya da organların tedavisi için uygun doku iskelelerinin geliştirilmesi doku mühendisliği araştırmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Doku mühendisliği uygulamalarında, hedef doku, doku iskelesinin yapısı içinde büyüyebilmelidir. Bunun için doku iskelelerinin birbiriyle bağlantılı gözenekli bir yapıya sahip olmaları gerekir. Doku iskelesinin gözenek boyutu, hücrelere besin, oksijen difüzyonu, vaskülarizasyon ve doku oluşumu için önemlidir. Literatürde yapılmış olan çalışmalarda genel olarak tek boyutlu gözenek yapısına sahip doku iskeleleri üretimi mevcuttur. Ancak, yapısında büyük ve küçük gözenekleri içeren hiyerarşik gözenekli doku iskelelerinin kullanımı, tek tip gözenek yapısı olan iskelelere göre avantaj sağlamaktadır. Öte yandan, doku iskelelerinin mekanik özellikleri, kullanılacakları doku mühendisliği alanını belirleyen önemli bir faktördür. Bu nedenle, üretim parametrelerine göre mekanik özellikleri ayarlanabilen doku iskelelerini hazırlamak doku mühendisliği uygulamalarının ilerlemesine katkı sağlamaktadır. 
Bu çalışmada, doğal polimerler ile faz ayrılması/buz kalıplama ve kriyojelasyon/faz ayrılması yöntemleri kullanılarak yeni hiyerarşik gözenekli doku iskeleleri üretilmiştir. Bu iki farklı yöntem ile üretilen hiyerarşik gözenekli doku iskelelerinin doku mühendisliği için uygunluğu karşılaştırılarak incelenmiştir. İkincil gözenekliliği sağlamak için her iki yöntemde de sulu reaksiyon çözeltilerine faz ayrılmasını sağlayan n-bütanol eklenmiştir. İki yöntem arasındaki temel farklılık çapraz bağlayıcının reaksiyon sistemine katıldığı aşamadır. Faz ayrılması/buz kalıplama yönteminde çapraz bağlanma reaksiyonu sonradan 60oC'de yapılırken (üretilen polimer matrisi çapraz bağlanma çözeltisinde çapraz bağlanmıştır), kriyojelasyon/faz ayrılması yönteminde ise çapraz bağlayıcı ilk başta polimer karışımına eklenmiş ve çapraz bağlanma reaksiyonu -20oC gibi düşük bir sıcaklıkta yapılmıştır. Çalışmanın ilk kısmında, faz ayrılması/buz kalıplama (phase separation/ice templating) metoduyla ilk önce 3 boyutlu kitosan matris hazırlanmıştır. Bunun için, kitosan, n-bütanol ihtiva eden seyreltik sulu asetik asit çözeltisinde çözünmüştür. Bu polimer çözeltisi çapraz bağlayıcı eklenmeden -20oC'de dondurulmuştur. Çözücünün donma noktası altında oluşan buz kristalleri matriste büyük gözeneklerin oluşmasını sağlarken, polimer çözeltisine eklenen n-bütanol yapıda küçük gözeneklerin oluşmasını sağlamıştır. Ardından, bu hiyerarşik gözenekli 3 boyutlu kitosan matris,  çapraz bağlayıcı olan poli(etilen glikol) diglisidil eter (PEGDGE) çözeltisine alınarak,  60oC'de ileri bir çapraz bağlama reaksiyonu gerçekleştirilerek hibrit kitosan-PEGDGE süngerleri elde edilmiştir. Çapraz bağlayıcı PEGDGE farklı oranlarda kullanılarak  (% 0-100, v/v %), bu oranların süngerlerin mekanik ve şişme özellikleri üzerine etkisi incelenmiştir. Elde edilen süngerlerin %50 gerinimdeki gerilim değerleri 0,1-2 MPa arasında değişmiş olup kullanılan çapraz bağlayıcı miktarının değiştirilmesiyle mekanik özellikleri ayarlanabilen yeni sünger doku iskeleleri elde edilmiştir. SEM fotoğraflarının analizi sonucu, % 50 PEGDGE ile çapraz bağlı hiyerarşik gözenekli 3 boyutlu kitosan süngerlerin yapısındaki büyük gözeneklerin boyutu 50-100 µm iken küçük gözeneklerin boyutu ise 2-7 µm olarak hesaplanmıştır. Böylece ilk defa burada üretimi gerçekleştirilen, kullanılan PEGDGE çapraz bağlayıcı miktarıyla mekanik özellikleri ayarlanabilen, farklı doku mühendisliği uygulamalarında kulanılabilme potansiyelinde olan hiyerarşik gözenekli yeni hibrit doku iskeleleri elde edilmiştir.
Çalışmanın ikinci kısmında ise, yağ ve kalp gibi yumuşak doku mühendisliği alanlarında kullanılabilecek daha yumuşak ve esnek mekanik özelliklerde doku iskeleleri elde edebileceğimizi düşündüğümüz kriyojelasyon/faz ayrılması yöntemi denenmiştir. Bunun için, kriyojelasyon yöntemi kullanılmış olup yukarıda bahsedilen faz ayrılması/buz kalıplama yönteminden farklı olarak, gluteraldehit çapraz bağlayıcısı ilk baştan reaksiyon çözeltisine ilave edilmiş ve çapraz bağlanma reaksiyonları -20oC gibi düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilmiştir.  Hiyerarşik gözenekli kitosan kriyojellerinin büyük gözeneklerin boyutu 35-55 µm, küçük gözeneklerin boyutu ise 7-11 µm arasında hesaplanmıştır. Kitosan kriyojellerinin % 50 gerinimdeki gerilim değerleri 5-22 kPa arasında değişmiştir. Polimer karışımında ovalbumin oranının artmasıyla büyük gözeneklerin boyutları 70-90 µm aralığında değerlere yükselmiştir. Kitosan-PEGDGE hibrit süngerlerinden farklı olarak daha tok (tough) ve esnekliği olan kriyojeller elde edilmiştir. Böylece,  daha kolay, hızlı ve işlem basamakları daha az olan bir yöntemle, doğal polimerler kullanılarak hiyerarşik gözenekli ve yumuşak doku mühendisliği için optimum mekanik özelliklere sahip kriyojel doku iskeleleri üretilmiştir.

Abstract:
In tissue engineering (TE) applications, for treatment of damaged tissues and organs, biocompatible and biodegradable scaffolds are needed. These scaffolds are produced by various methods such as porogen leaching, phase separation, cryogelation, freeze-drying, and electrospinning. The development of proper scaffolds having optimum porosity and elasticity plays an important role in TE research. Target tissue can grow in tissue scaffold structure. Therefore, scaffolds need to have an interconnected porous structure. The pore size of the scaffolds is important for nutrient transfer and oxygen diffusion to cells, vascularization and histogenesis. Generally, the scaffolds in the literature have monomodal (monotype) pore structure. However, the use of hierarchical scaffolds with large and relatively smaller pores (bimodal) is more advantageous compared to monomodal scaffolds. On the other hand, mechanical properties of scaffolds are an important factor for determining the applications of the scaffolds in particular TE field. Thus, to prepare scaffold with tailorable mechanical properties based on the fabrication parameters contributes to improvement of TE applications. 
The aim of this thesis is to produce novel hierarchical structured scaffolds with tailorable elasticity using natural polymers. To achieve this aim, hierarchical porous scaffolds were produced by two different methods; phase separation/ice templating and cryogelation/phase separation. The main difference between two methods is the step in which the crosslinker is added to the reaction system, that is, in phase separation/ice templating method the crosslinking takes place at further steps at 60oC (an already formed polymer matrix is crosslinked within a crooslinker solution) while in cryogelation/phase separation method, the crosslinker is added at the very beginning and the crosslinking reactions occur at low temperatures such as -20oC. Both methods were successfully employed to produce novel scaffolds.
Initially, a 3-dimensional biopolymer network was produced using the phase separation/ice templating technique. N-butanol was used as a porogen to produce small pores whereas large pores were formed by ice templating. N-buthanol was added to o a homogenous solution of the chitosan and the chitosan n-buthanol mixture was frozen at -20oC. Subsequently water and the porogen were removed by leaching in chilled acetone at -20oC. The dried chitosan matrix was subsequently modified by crosslinking with functionalized PEGDGE solutions at 60oC to provide hydrogel sponges with improved stability and mechanical properties. Various concentrations of PEGDGE were used to determine the effect on the mechanical properties of the newly fabricated hydrogel sponges. The prepared sponges were characterized by scanning electron microscopy (SEM), ATR-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FT-IR), compression and swelling tests. It was found that the stress value at 50 % strain of the sponges were significantly varied between 0,1-2 MPa. Thus, sponge scaffolds with tunable mechanical properties were obtained which have potential applications in various TE types. SEM images revealed that the sponges have a bimodal pore structure where the pore sizes of the large and small pores were 50-100 µm and 2-7 µm, respectively. Such a hierarchical internal morphology enhances the performance of scaffolds used in  TE  applications.
Secondly, it occurred to us that cryogelation could be employed to prepare tough and flexible scaffolds for soft TE, i.e., adipose TE. Here, hierarchical porous chitosan and ovalbumin-chitosan cryogels were produced to mimic hierarchical morphologies of tissues by cryogelation/ phase separation. At first, chitosan and ovalbumin-chitosan were dissolved in aqueous acetic acid solutions at predetermined ratios; subsequently n-butanol was added to enable phase separation. Control samples were prepared without n-butanol addition. Then after, glutaraldehyde was added to the initial polymer mixtures as a crosslinker and the polymer solution was transferred to a syringe and stored at -20°C for 24h. The resulting cryogel scaffolds were taken out and immersed in acetone for solvent leaching. The obtained cryogels were characterized by SEM, swelling, FTIR and mechanical measurements. SEM results revealed that while the internal morphology of the n-butanol added cryogels have a hierarchical structure, the control samples possess monotype porosity. The pore sizes of the chitosan cryogels were varied between 35-55 µm for large pores and 7-11 µm for small pores. Moreover, their stress value at 50 % deformation was varied between 5-22 kPa. Increasing the amount of ovalbumin included to the initial polymer solution increased the size of the large pores to 70-90 µm. Compared to the Chitosan-PEGDGE hybrid sponges; all obtained cryogels were softer and tougher.  Characterization and evaluation of the produced hierarchical porous cryogels demonstrate their suitable properties for potential soft tissue engineering applications.