Oksiklozanidin Galleria mellonella L. (lepidoptera: pyralidae)'nın farklı gelişim evreleri üzerine oksidatif etkisi
Oxidative effect of oxyclozanide on different developmental stages of Galleria mellonella L. (lepidoptera: pyralidae)
Yazar: CİHAT ÇELİK
Danışman: PROF. DR. ENDER BÜYÜKGÜZEL ; PROF. DR. DAVID W. STANLEY
Zonguldak Bülent Ecevit Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Fizyoloji = Physiology

Özet:
Antihelmintikler, insan ve hayvanlarda parazitik enfeksiyonları tedavi etmek amacı ile kullanılan ilaçlardır. Son yıllarda birçok antihelmintik maddenin zararlı böcekler ile mücadelede yaygın olarak kullanılan insektisitlere alternatif madde olarak önerildiği görülmektedir.  Oksiklozanid (OKS), parazitler üzerinde etkisi iyi bilinen salisilanilid türevi bir antihelmintik maddedir. Bu çalışmada, pek çok alanda model organizma olarak kullanılan büyük bal mumu güvesi, Galleria mellonella L.'nın birinci evre larvaları 0,003, 0,03, 0,3 ve 1,5 g/100 g OKS içeren yapay besinler ile beslendi. OKS'in böceğin farklı gelişim evrelerinde (yedinci evre larva, pup ve ergin) ve yedinci larval evreden elde edilen ortabağırsak, hemolenf, yağ dokusundaki oksidatif etkilerini belirlemek için malondialdehit (MDA), protein karbonil (PCO) miktarları ve bu oksidatif etkiyi ortadan kaldıran antioksidan enzim sistemlerinden süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve glutatyon-s-transferaz (GST) aktivitelerindeki değişimler incelendi. Ayrıca bu maddenin böceğin larva, pup, ergin ve yedinci evre larvalarının hemolenf dokusunda DNA hasarı üzerine etkilerini belirlemek üzere kuyruk uzunluğu, % kuyruk DNA'sı ve kuyruk momenti verileri elde edildi. Larval evrede kontrol besini ile denenen en yüksek OKS konsantrasyonu karşılaştırıldığında MDA miktarının 0,066 ± 0,005 nmol/mg protein'den 0,224 ± 0,006 nmol/mg protein'e yükseldi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, pup evresindeki MDA içeriğinde önemli bir değişiklik olmadı. Ancak 0,3 ve 1,5 g OKS konsantrasyonlarında erişkin dönemde MDA içeriğinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış kaydedildi. Tüm OKS konsantrasyonlarında ortabağırsak dokusu MDA içeriğinde önemli bir değişiklik olmamasına rağmen, 0,03, 0,3 ve 1,5 g OKS konsantrasyonlarında PCO içeriğinde önemli bir azalma gözlendi. G. mellonella'nın yağ dokusundaki MDA miktarının, OKS'in yüksek konsantrasyonlarında sayısal olarak arttığı ancak bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı tespit edildi.  Aynı dokunun PCO miktarlarına bakıldığında, 0,03 ve 0,3 g'lık OKS konsantrasyonlarında anlamlı bir düşüş görüldü. PCO miktarının larval evrede sadece 0,3 g'lık OKS'de arttığı, pup evresinde ise bu oksidatif stres belirtecinin miktarı 0,003, 0,03 ve 0,3 g'lık OKS'de anlamlı artış olduğu tespit edildi. Bunun yanı sıra 0,3 ve 1,5 g'lık OKS içeren yapay besinlerden elde edilen ergin bireylerde PCO miktarları (sırasıyla 0,18 ± 0,06, 0,16 ± 0,02 nmol/mg protein) kontrol grubuna (0,46 ± 0,05 nmol/mg protein) göre istatiksel olarak da anlamlı azalmanın olduğu belirlendi. Böceğin tüm vücut larva, pup, ergin evrelerinde ve yedinci evre larvalarının hemolenfinde OKS'in genotoksik etkisini belirlemek amacıyla yapılan parametrelerden kuyruk uzunluğu, kuyruk % DNA ve kuyruk momenti verileri artan farklı OKS konsantrasyonlarında kontrol grubuna göre önemli ölçüde DNA hasarı olduğu gözlemlendi. OKS'in böcek üzerindeki oksidatif ve genotoksik etkilerini belirledikten sonra G. mellonella'nın 7. evre larva, pup ve ergin bireylerinde, hemolenf, ortabağırsak ve yağ dokusunda antioksidan enzimlerdeki değişimler araştırıldı. G. mellonella'nın larva, pup ve ergin evrelerinde CAT aktivitesi OKS'in 0,03 g'lık konsantrasyonunda kontrol grubuna göre anlamlı bir yükselmenin olduğu görüldü. Benzer şekilde aynı konsantrasyonda böceğin tüm gelişim evrelerinde SOD aktivitelerinin de arttığı tespit edildi. Ayrıca larval evrede en düşük OKS konsantrasyonunda hem CAT hem de SOD aktiviteleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında oldukça yüksek değerler kayıt edildi. GST aktivitesinin özellikle larval evrede OKS'in denenen yüksek konsantrasyonlarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış gösterdiği tespit edildi. GST aktivitesi kontrol grubunda 10,22 ± 0,99 µmol/mg protein/dk olarak bulundu. Bu değer 0,003, 0,03, 0,3 g OKS konsantrasyonlarında 13,89 ± 1,28, 12,58 ± 1,04, 16,68 ± 0,70 µmol/mg protein/dk olarak ölçüldü. Böceğin 7. evre larvalarında kontrol grubunda GPx enzim aktivitesi 5,49 ± 0,43 mmol/mg protein/dk iken, OKS konsantrasyonlarını içeren (0,003, 0,03, 0,3 ve 1,5 g) yapay besinlerdeki 7. evre larvaların GPx enzim aktiviteleri sırasıyla; 9,60 ± 0,72, 9,39 ± 0,66, 8,51 ± 1,44 ve 9,11 ± 1,35 mmol/mg protein/dk olarak kayıt edildi. G. mellonella'nın ergin evresindeki GPx aktivitesi kontrol besini ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir artışın olduğu tespit edildi. OKS, G. mellonella'nın ortabağırsak dokusundaki SOD, CAT, GPx aktiviteleri üzerinde anlamlı bir değişiklik yapmadı. Ancak OKS'in denenen 0,03 g'lık konsantrasyonunda GST aktivitesinin miktarı kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olduğu tespit edildi. OKS'in G. mellonella'nın yağ dokusundaki SOD aktivitesi denenen yüksek konsantrasyonlarda artış olduğu görülse de istatistiksel olarak önemli bulunmadı. CAT aktivitesinde ise aynı konsantrasyonlarda istatistiksel olarak anlamlı bir artış oldu. Aynı dokunun GPx aktivitesinde denenen tüm OKS konsantrasyonlarında anlamlı bir azalma gözlemlendi. OKS'in denenen 0,03, 0,3 ve 1,5 g konsantrasyonlarında böceğin hemolenf dokusunun SOD aktivitelerinde istatiksel olarak anlamlı artışlar tespit edilmiş olup bu artışlar sırasıyla; 0,0260 ± 0,0053, 0,0227 ± 0,0031 ve 0,0334 ± 0,0067 U/mg protein'dir. Böceğin hemolenf dokusunda 0,03 g'lık OKS miktarında CAT aktivitesinde kontrol grubuna göre anlamlı bir artış olduğu tespit edildi. OKS'in diğer konsantrasyonları (0,03 ve 0,3 g) ile beslenen larvaların hemolenf dokusunda GST enzim aktiviteleri ise sırasıyla; 3,10 ± 0,37 ve 1,70 ± 0,21 µmol/mg protein/dk ölçüldü. Bu çalışmanın sonuçlarına göre denenen OKS konsantrasyonlarının G. mellonella'nın tüm gelişim evreleri, hemolenf, ortabağırsak ve yağ dokusunda anlamlı değişikliklere neden olduğu görülmektedir. Bu kapsamda elde edilen verilerin zararlılar ile mücadele alanındaki çalışmalara katkı sağlayacağı, ayrıca OKS'in yüksek konsantrasyonlarının G. mellonella gibi tarım alanlarında zararlı etkileri olan böcek türleri ile yapılan mücadele yöntemlerinde kullanılan kimyasallara alternatif bir madde olarak önerilebileceği düşünülmektedir. Ancak OKS'in böcekler üzerindeki etkilerinin daha iyi anlaşılması için daha detaylı çalışmalara da ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
Anthelmintics are drugs used to treat parasitic infections in humans and animals. In recent years, many anthelmintic substances have been suggested as an alternative to insecticides, which are widely used in the management against pest insects. Oxyclozanide (OXY) is a salicylanilide derivative anthelmintic agent with a well-known effect on parasites. In this study, first instar larvae of the great wax moth, Galleria mellonella L., which is used as a model organism in many fields, were reared artificial diets containing 0.003, 0.03, 0.3 and 1.5 g/100 g OXY. In order to determine the oxidative effects of OXY different developmental stages of the insect (seventh instar larva, pup and adult) and the midgut, hemolymph, adipose tissue obtained from the seventh larval stage, the amounts of malondialdehyde (MDA), protein carbonyl (PCO) were investigated. And antioxidant enzymes that scavenge this oxidative effect, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-s-transferase (GST) activities were examined. In addition, tail length, % tail DNA and tail moment data were obtained to determine the effects of this substance on DNA damage in the last stage of larva, pup, adult and also hemolymph tissue of insect. When the highest OXY concentration was compared with the control diet in the larval stage, MDA content increased from 0.066 ± 0.005 nmol/mg protein to 0.224 ± 0.006 nmol/mg protein. When compared to the control group, there was no significant change in MDA content in the pup stage. However, a statistically significant increase in MDA content was recorded at the 0.3 and 1.5 g concentrations of OXY in the adult stage.  Although there was no significant change in the midgut tissue MDA content at all OXY concentrations, a significant decrease in the PCO content was observed at 0.03, 0.3 and 1.5 g OXY concentrations. MDA content in the adipose tissue of G. mellonella increased numerically at high concentrations of OXY, but this increase was not statistically significant. Considering to PCO content the same tissue, a significant decrease was observed in the 0.03 and 0.3 g of OXY concentrations. It was determined that the PCO content increased only in 0.3 g OXY in the larval stage, while this oxidative stress marker content increased significantly in 0.003, 0.03 and 0.3 g OXY in the pup stage. In addition, it was determined that there was a statistically significant decrease in PCO contents (0.18 ± 0.06, 0.16 ± 0.02 nmol/mg protein, respectively) in adult obtained from artificial diets containing 0.3 and 1.5 g OXY compared to the control group (0.46 ± 0.05 nmol/mg protein). To determine the genotoxic effect of OXY in the whole body larva, pup, adult stages and hemolymph of the seventh stage larvae of the insect were used tail length, tail % DNA and tail moment data. It was observed that there was significant DNA damage at increasing OXY concentrations compared to the control group. After determining the oxidative and genotoxic effects of OXY on the insect, changes in antioxidant enzymes were investigated in the 7th stage larva, pupa, adult, hemolymph, midgut and adipose tissue of G. mellonella. It was observed that there was a significant increase in CAT activity in the larval, pupa and adult stages of G. mellonella at a 0.03 g of OXY concentration compared to the control group. Similarly, it was determined that SOD activities increased in all developmental stages of the insect at the same concentration. In addition, at the lowest OXY concentration in the larval stage, both CAT and SOD activities were significantly higher when compared to the control group. It was determined that the GST activity showed a statistically significant increase especially in the larval stage at the high concentrations of OXY. GST activity was found to be 10.22 ± 0.99 µmol/mg protein/min in the control group. This value was measured as 13.89 ± 1.28, 12.58 ± 1.04, 16.68 ± 0.70 µmol/mg protein/min at 0.003, 0.03, 0.3 g OXY concentrations. While GPx enzyme activity was 5.49 ± 0.43 mmol/mg protein/min in the control group at 7th larval stage of the insect, GPx enzyme activities of 7th larval stage were recorded respectively 9.60 ± 0.72, 9.39 ± 0.66, 8.51 ± 1.44 and 9.11 ± 1.35 mmol/mg protein/min at 0.003, 0.03, 0.3 and 1.5 g OXY concentrations. It was determined that there was a statistically significant increase in the GPx activity in the adult stage of G. mellonella when compared with the control diet. OXY did not significantly change the SOD, CAT, GPx activities in the midgut tissue of G. mellonella. However, a statistically significant decrease was found in GST activity in the tested 0.03 g concentration of OXY compared to the control group. Although it was observed that the SOD activity of OXY in the adipose tissue of G. mellonella increased at the tested high concentrations, it was not found to be statistically significant. There was a statistically significant increase in CAT activity at the same concentrations. A significant decrease was observed in all tested OXY concentrations in the GPx activity of the same tissue. Statistically significant increases were detected in the SOD activities of the hemolymph tissue of the insect at the tested concentrations of OXY (0.03, 0.3 and 1.5 g). These increases were respectively; 0.0260 ± 0.0053, 0.0227 ± 0.0031 and 0.0334 ± 0.0067 U/mg protein. In the hemolymph tissue of the insect, there was a significant increase in CAT activity in the amount of 0.03 g OXY compared to the control group. GST enzyme activities in the hemolymph tissue of larvae fed with other concentrations of OXY (0.03 and 0.3 g), respectively; 3.10 ± 0.37 and 1.70 ± 0.21 µmol/mg protein/min were measured. According to the results of this study, it is seen that the tested OXY concentrations cause significant changes in all developmental stages, hemolymph, midgut and adipose tissue of G. mellonella. In this context, It is thought that the data obtained will contribute to the studies in the field of pest control, and that high concentrations of OXY can be recommended as an alternative to the chemicals used in the control methods against insect species such as G. mellonella, which have pest effects in agricultural areas. However, more detailed studies are needed to better understand the effects of OXY on insects.