Rekombinant kimozin üretiminde glikozilasyonun etkisinin araştırılması
The effect of glycosylation on recombinant chymosin production
Yazar: FATMA ERSÖZ
Danışman: PROF. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Kimozin enzimi peynir üretim endüstrisinde en kompleks işlem olan sütün pıhtılaştırması amacıyla kullanılan bir aspartik proteazdır. Rennet ya da rennin olarak bilinen kimozin geviş getiren hayvanların dördüncü bölümünden (şirden) elde edilir. Kimozin, sütün yaklaşık %80'ini oluşturan kazein proteininin Phe105 ve Met106 arasında bulunan peptit bağını kırarak, stabil olmayan kazein misellerini oluşturur ve sütün pıhtı oluşturmasını sağlar. Bu kimozin enzimi çeşitli bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan elde edilmektedir. Ancak bu enzimlerin pıhtılaştırma etkileri birbirinden farklı olduğu için ve hayvan kaynaklı kimozin üretiminin düşük olmasından dolayı son yıllarda rekombinant kimozin üretimi artmıştır. Rekombinant DNA teknolojisi ile gerçekleştirilen kimozin üretiminde genel olarak sığır, bufalo, keçi, manda ve deve gibi gen kaynakları kullanılmaktadır. Hayvan, bitki ve mikrobiyal kaynaklı enzimlere göre avantajlarından dolayı  bu çalışmada rekombinant tibet öküzü kimozin üretimi yapılmıştır.

Çalışmada Tibet öküzü (Bos grunniens) kimozin enzimi (glikozile ve glikozile olmayan formları) metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris'te alkol oksidaz I (AOX1) promotoru kontrolü altında üretilmiştir. Kimozin enziminin glikozile (N-glikozilasyon) ve glikozile olmayan formları üretilerek glikozilasyonun rekombinant kimozin üretimine,  enzimin aktivitesine ve stabilitesine etkisi araştırılmıştır. Küçük ölçekli erlenlerde yapılan 120 saatlik metanol beslemesi sonucunda glikozile ve glikozile olmayan kimozin üretiminde önemli farklılık gözlenmemiştir. Glikozile kimozin ve glikozile olmayan kimozin için enzim aktiviteleri sırasıyla 55 IMCU/ml ve 61 IMCU/ml olarak hesaplanmıştır. Fermentör ölçekli üretim (5L) gerçekleştirildiğinde ise glikozile ve glikozile olmayan kimozin için enzim aktiviteleri sırasıyla 214.3 IMCU/ml ve 257.14  IMCU/ml olarak hesaplanmıştır.Enzimin optimum çalışma şartları da pH 6 ve 40C olarak tespit edilmiştir. Ticari maya ile rekombinant kimozin enzimleri verimi arasında önemli bir farklılık olmadığı gözlenmiştir. Bu çalışma sonunda peynir endüstrisinde artan kimozin enzimi ihtiyacının karşılanması için enzimin rekombinant olarak üretimine P. pastoris ekspresyon sisteminin oldukça uygun olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Chymosin, which is used to coagulate milk in the cheese industry, is an aspartic protease. It, generally known rennet or rennin, is isolated from fourth abosuman of ruminant. Chymosin is formed of casein mycellium by cleaved the Phe105-Met106 bond of casein protein, 80% of total milk protein and then milk is coagulated. The enzyme is derived from animal, plant ve microorganism sources. Because of theese enzyme's coagulating properties are different from each other and the animal source chymosin production is low, recombinant chymosin is increased. Bovine, pig, buffalo, goat, cow and camel are generally used gene sources in the production of chymosin by recombinant DNA technologies. Because of theese advantages, compared to animal, plant and microbial sources,  recombinant YAK chymosin was produced in this study.

In the present study YAK chymosin enzymes (in glycosylated and nonglycosylated forms) were produced in metilotrofic yeast Pichia pastoris under the control of AOXI promoter. The effect of glycosylation on the recombinant chymosin production, enzyme activity and stability were investigated by production of glycosylated and nonglycosylated forms of chymosin enzyme.  Glycosylated and nonglycosylated forms of chymosin enzyme's production significant difference is no observed in the shake flasks for 120 hours expression. Enzyme activities of glycosylated and nonglycosylated forms are 55 IMCU/ml ve 61 IMCU/ml, respectively. When chymosin enzymes were produced in 5 L bioreactor, enzyme activities of glycosylated and nonglycosylated forms are 214.3 IMCU/ml ve 257.14 IMCU/ml, respectively The optimum milk clotting activity was obtained at pH of 6 and temperature of 40°C. Low-scale cheese production done with the recombinant enzymes, against commercial chymosin as a control and yields compared between each other. Results showed that there is no important difference between the yield of  cheese produced with recombinant and commercial chymosin.  As a conclusion, this study carried out that P. pastoris is very suitable expression system for recombinant chymosin production to meet the needs in cheese industry.