Anoxybacillus gonensis G2T ksiloz izomeraz geninin klonlanması, gen ürününün saflaştırılması ve karakterizasyonu
Cloning of anoxybacillus gonensis G2T xylose isomerase gene and purification and characterization of gene product
Yazar: DERYA YANMIŞ
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
D-ksiloz izomeraz (D-ksiloz ketol-izomeraz, E.C. 5.3.1.5) yaygın olarak D-glukoz izomeraz olarak da adlandırılır. Ksiloz izomeraz (KI) hücre içinde D-ksilozun D-ksiluloza izomerizasyonunu, hücre dışında D-glukozun D-fruktoza izomerizasyonunu katalizler. KI, endüstriyel olarak oldukça önemli bir enzimdir. Çünkü enzim hem D-glukozu D-fruktoza izomerize ederek HFCS üretiminde kullanılır hem de D-ksilozu alkole fermente olabilen D-ksiluloza izomerize etmesi nedeniyle önemlidir. Sahip olduğu yüksek ticari önem nedeniyle enzimin mikroorganizma kaynakları, özellikleri, çalışma mekanizması, özelliklerinin iyileştirilmesi ve immobilizasyonu gibi konular yoğun bir şekilde çalışılmaktadır.Gönen Kaplıca'sından izole edilmiş termofilik bir mikroorganizma olan Anoxybacillus gonensis G2T KI aktivitesine sahiptir.Bu çalışma; Anoxybacillus gonensis G2T KI pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmasını, gen ürününün ekspres edilmesini, saflaştırılmasını ve saf enzimin biyokimyasal özellikleri belirlenmesini içermektedir.Bu çalışmada, KI gen ürünü E. coli BL21(DE) suşunda ekspres edildikten sonra ışı şoku, iyon değişimi kolon kromatografisi ve hidrofobik etkileşim kolon kromatografisi uygulamalarıyla saflaştırıldı ve elde edilen saf enzim karakterize edildi. Enzimin optimum çalışma sıcaklığı 85°C, optimum pH değeri 6,5 olarak bulundu. Km değeri 25 ±2 mM olarak, Vmax değeri 0,12958±0,002 µmol/dk olarak bulundu. Enzimin aktivite göstermek için Co2+, Mg2+ ve Mn2+ metal iyonlarından en az birine ihtiyaç duyduğu, ancak en yüksek aktiviteyi Mn2+ varlığında gösterdiği bulundu. Ca+2, Hg+2, Ni+2, Zn+2, Fe+2 ve Cu+2 bivalent metal iyonlarının inhibitör etki gösterdiği belirlenmiştir. Enzimin optimum çalışma sıcaklığı olan 85°C'de (pH 6,5), 50 saat sonunda enzim aktivitesinin yarıya düştüğü, pH 6 ve 6,5'da (4°C) enzimin aktivitesini kaybetmediği belirlendi. Enzimin moleküler ağırlığı HPLC ile 180 kDa olarak belirlendi.

Abstract:
D-xylose isomerase (D-xylose ketol isomerase; E.C. 5.3.1.5) is commonly referred to as D-glucose isomerase. It catalyzes intracellular isomerization of D-xylose to D-xylulose and extracellular isomerization of D-glucose to D-fructose. XI is an industrially important enzyme since it has capacity to produce a high-fructose corn-enriched syrup (HFCS) by the isomerization of D-glucose to D-fructose. KI has also being examined for the isomerization of D-xylose to D-xylulose, which can be fermented to ethanol. Because of the industrial value of this enzyme, microbial sources of the enzyme, biochemical properties, mechanism of action, improvement of properties, and immobilization have being extensively examined.Anoxybacillus gonensis G2T, a thermophilic microorganism isolated from Gönen Thermal Springs, ownes activity of XI.In the present work, Anoxybacillus gonensis G2T xylA gene was cloned into pET-28a(+) expression vector. Gene product was expressed and purified. The biochemical properties of the enzyme was determined.In the present work; after the gene product was expressed in E.coli BL21(DE), XI was purified by classical purification methods such as heat treatment, ion-exchange chromatography and hydrophobic-interaction chromatography. The pure enzyme was characterized. The optimum temperature for enzyme activity was 85 °C, the optimum pH for enzyme activity 6,5. Km and Vmax values for xylose were 25±2 mM and 0,12958±0,002 µmol/dk respectively. It was found that at least one of the divalent metallic cations Co2+, Mg2+, and Mn2+ was essential for activity of xylose isomerase. In addition to these results, the maximum activity of the enzyme was observed in the presence of Mn2+. Ca+2, Hg+2, Ni+2, Zn+2, Fe+2, and Cu+2 were determined as inhibitors for activity of XI. It was found that at the end of 50 hours at 85 °C (pH 6,5) XI lost half of its activity and the enzyme was stable at pH 6 and 6,5 at 4 °C. Molecular weight of enzyme was determined by HPLC as 180 kDa.