Anadolu manda rumen metagenom kaynaklı termostabil ksilanaz genlerinin klonlanması
Cloning of thermostable xylanase genes from anatolian water buffalo rumen metagenome
Yazar: EBRU ALBAYRAK
Danışman: PROF. DR. HASAN MURAT VELİOĞLU ; DOÇ. DR. YUSUF SÜRMELİ
Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Enzim ve Mikrobiyal Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Ksilanazlar, ksilanı parçalayan enzim grubudur. Bu enzimler yem ve hayvancılık, küspenin ağartılması ve tarımsal atıkların biyodönüşümü gibi farklı sektörlerdeki kullanımlarına göre incelenir. Şimdiye kadar Anadolu manda rumen kaynaklı ksilanaz enzim çalışması yapılmamıştır. Bu çalışmada Anadolu manda rumen kaynaklı termostabil ksilanaz genlerinin klonlanmasını gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, Anadolu manda rumen kaynaklı metagenomik DNA dizileri kullanılarak iki ayrı muhtemel termostabil ksilanaz enzim geni (M68 ve E65) seçilmiştir ve bu genler, önce klonlama vektörüne (pJET 1.2 blunt), ardından ekspresyon vektörüne (pET28a(+)) klonlanmıştır. BLASTp analiz sonucuna göre, M68 ksilanaz enziminin amino asit dizisi, Bacteroidales takımında yer alan bakterilerde görülen ksilanazın gen dizisine en yakın, E65 ksilanaz enziminin ise, Clostridia türleri tarafından üretilen ksilanaz enzimine en yüksek düzeyde benzerlik gösterdiği görülmüştür. Bu çalışma sonucunda M68 ve E65 ksilanaz enzimlerinin, çeşitli endüstriyel alanlarda kullanım potansiyeline sahip oldukları önerilmiştir. PCR analizleri, tasarlanan primerlerin M68 ve E65 genlerine karşı bağlanma sıcaklıklarının, sırasıyla, 60oC ve 54oC olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bu analizler sonucunda, M68 geninin 1500 bç'den biraz daha büyük olduğu, E65 geninin ise 1000-1500 bç arasında olduğu tespit edilmiştir. Koloni PCR ve restriksiyon enzim kesimi analizleriyle, her iki genin başarılı bir şekilde klonlandığını göstermiştir. Agar aktivite sonucu, rekombinant E65 enzimini taşıyan klonların ksilanı parçaladıklarını ve ksilanaz enzim aktivitesinin varlığını göstermiştir. Termostabilite analizi E65 enziminin 120 dakika boyunca 70oC'de aktivitesini koruduğunu göstermiştir.

Abstract:
Xylanases are a group of enzymes that degrade xylan. These enzymes are examined according to their usage in different sectors such as feed and animal husbandry, pulp bleaching and bioconversion of agricultural wastes. No xylanase enzyme study has been conducted so far from Anatolian buffalo rumen. In this study, the cloning of thermostable xylanase genes from Anatolian buffalo rumen was performed. For this purpose, two different possible thermostable xylanase enzyme genes (M68 and E65) were selected using metagenomic DNA sequences from Anatolian buffalo rumen and these genes were first cloned into the cloning vector (pJET 1.2 blunt) and then into the expression vector (pET28a(+)). According to the BLASTp analysis result, the amino acid sequence of M68 xylanase enzyme was closest to the gene sequence of xylanase seen in bacteria in the Bacteroidales order, while E65 xylanase enzyme showed the highest level of similarity to the xylanase enzyme produced by Clostridia species. As a result of this study, it was suggested that M68 and E65 xylanase enzymes have potential for use in various industrial areas. PCR analyses showed that the annealing temperatures of the designed primers against the M68 and E65 genes were 60oC and 54oC, respectively. In addition, as a result of these analyses, it was determined that the M68 gene was slightly larger than 1500 bp, while the E65 gene was between 1000-1500 bp. Colony PCR and restriction enzyme digest analyses showed that both genes were successfully cloned. Agar activity results showed that clones carrying the recombinant E65 enzyme degraded xylan and had xylanase enzyme activity. Thermostability analysis showed that the E65 enzyme maintained its activity at 70oC for 120 minutes.