Viral olmayan vektörlerin transgenik koyun embriyosu üretiminde etkinliği
Efficiency of non-viral vectors in transgenic sheep EMBRYO production
Yazar: ANDAÇ KILIÇKAP
Danışman: PROF. DR. KAMBER DEMİR
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
İntrasitoplazmik mikroenjeksiyon (ICI) yöntemi farmasötik, biyomedikal ve tarımsal araştırmalarda önemli yeri olan transgenik hayvanlarının üretiminde kullanılan fiziksel bir gen transfer yöntemidir. Yöntem kapsamında sitoplazmaya enjekte edilen transgenin doğal hücre savunma mekanizmaları tarafından işlevsiz hale getirilmesi veya çekirdeğe ulaşarak eksprese olamaması yöntemin başarı oranlarını düşürmektedir. Çalışmamızda bir katyonik polimer olan Poli (β-aminoester) (PBAE)'in güçlendirilmiş yeşil floresan protein (enhanced green fluorescent protein-pEGFP-N1) plazmidi DNA'sı (pDNA) ile oluşturulan poliplekslerinin koyunlarda embriyonik gelişim ve transgenik embriyo oranlarına etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Elde edilecek yöntemsel gelişmeler ile ülkemizin öncelikli araştırma alanlarından biyoteknolojik ürün geliştirme vizyonuna katkı sunulması hedeflenmektedir. PBAE'in, non-viral vektör olarak somatik hücrelerin transfeksiyonunda başarıyla kullanıldığı bildirilmiştir. Ancak yapılan literatür taramasında PBAE-pDNA kompleksinin transgenik embriyo üretim etkinliğine ve/veya embriyonik gelişime olan etkisinin araştırıldığı bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu bağlamda in vitro ortamda üretilmiş koyun zigotlarına 5, 10 ve 20 ng/μL konsantrasyonlarda intrasitoplazmik pEGFP-N1 ve aynı konsantrasyonlarda pEGFP-N1 ile PBAE polipleks (pDNA+PBAE) haline getirilmiş nanopartiküllerinin mikroenjeksiyonu yapılarak, in vitro kültürde embriyonik gelişimler ve yeşil floresan protein (GFP) ışımaları takip edilmiştir. GFP ışıması gösteren embriyolar transgenik olarak kabul edilmiştir. ICI gruplarında yarıklanma oranları incelendiğinde yalnızca 20 ng/μL pDNA grubu (%55,6) ile kontrol grubunun (%75,3) yarıklanma oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı derecede bir fark tespit edilmiştir (p=0,012). Ancak diğer ICI grupları ile kontrol grubu arasında embriyonik gelişim açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (p>0,05). Enjeksiyon gruplarında farklı konsantrasyon ve PBAE'in embriyo gelişim evrelerine olan etkisi incelendiğinde, kontrol grubu ve deneysel gruplar arasında tüm gelişim evreleri açısından anlamlı bir fark görülmemiştir (p=0,199). Blastosist evresinde deney grupları arasında anlamlı bir fark gözlemlenmemekle beraber sayısal olarak en yüksek GFP(+) blastosist oranı (%12,9) 5 ng/μL pDNA grubunda elde edilmiştir. Morula evresinde ise 10 ng/μL pDNA deney grubu en yüksek GFP(+) oranına (%23,1) sahip olup; 5 ng/μL pDNA, 5 ng/μL pDNA+PBAE ve 10 ng/μL pDNA+PBAE deney gruplarından anlamlı olarak farklıdır (p<0,01). Tüm gelişim evrelerinde sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde kullanılan konsantrasyonlarda PBAE katyonik polimeri ve pDNA'nın koyun zigotlarına ICI yöntemi ile uygulanmasının embriyo gelişimine olumsuz etkilerinin olmadığı ve transgenik embriyo üretiminde yalnızca pDNA enjeksiyonunun görece yüksek transgenik embriyo başarı oranı sağladığı çıkarımı yapılabilir.

Abstract:
Intracytoplasmic microinjection (ICI) is a physical gene transfer method used in the production of transgenic animals, which has a vital importance in pharmaceutical, biomedical and agricultural research. The potential hurdles of transgene injected into the cytoplasm within the scope of the method are being rendered dysfunctional by natural cell defense mechanisms or not being able to reach the nucleus to be expressed, which reduces the success rates of the method. In our study, it was aimed to investigate the effects of poly(β-aminoester) (PBAE), a cationic polymer, and its polyplexes formed with enhanced green fluorescent protein (pEGFP-N1) plasmid DNA (pDNA) on embryonic development and transgenic embryo rates in sheep. With the methodological developments to be obtained, it is aimed to contribute to the vision of biotechnological product development, one of the priority research areas of our country. It has been reported that PBAE has been successfully used as a non-viral vector for transfection of somatic cells. However, no study investigating the effect of PBAE-pDNA complex on transgenic embryo production efficiency and/or embryonic development was reported. In this context, in vitro generated sheep zygotes were microinjected with pEGFP-N1 at concentrations of 5, 10 and 20 ng/μL and nanoparticles of polyplexes of pEGFP-N1 with PBAE (pDNA+PBAE) formed at the same concentrations, subsequently embryonic development and green fluorescent protein (GFP) expressions were monitored during in vitro culture. Embryos expressing GFP were considered as transgenic. Cleavage rate analyzes of the ICI groups revealed a statistically significant difference (p=0.012) only between the 20 ng/μL pDNA group (55.6%) and the control group (75.3%). However, no significant difference between the other ICI groups and the control group in terms of embryonic development was detected (p>0.05). When the effects of PBAE at different concentrations on embryo developmental stages in the injection groups were examined, no significant difference was observed between the control and experimental groups in terms of all developmental stages (p=0.199). Although no significant difference was observed between the experimental groups at the blastocyst stage, the highest GFP(+) blastocyst rate (12.9%) was obtained in 5 ng/μL pDNA group. At the morula stage, 10 ng/μL pDNA experimental group had the highest GFP(+) rate (23.1%) and was found significantly different from 5 ng/μL pDNA, 5 ng/μL pDNA+PBAE and 10 ng/μL pDNA+PBAE experimental groups (p<0.01). When the results of all developmental stages are evaluated together, it can be concluded that the utilization of PBAE cationic polymer and pDNA to sheep zygotes by ICI method at the concentrations used has no negative effects on embryonic development and solo pDNA injection provides a relatively high transgenic embryo success rate in the production of transgenic embryos.