İn vitro fabry hastalığı modelinde ferulik asitinolası etkilerinin araştırılması
İnvestigation of possible effects of ferulic acid an in vitro fabry disease model
Yazar: LEYLA ASADOVA
Danışman: PROF. DR. ERCAN KURAR
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Fabry hastalığı, galaktosidaz A'nın (α-GAL A) eksik aktivitesinin ve globotriaosilseramid (GL-3)
birikiminin neden olduğu X'e bağlı resesif lizozomal depo bozukluğudur. GL-3'ün birikimi özellikle böbrek,
kalp ve beyinde iskemi ve enfarktüse yol açmaktadır. Fabry hastalığının kesin bir tedavisi yoktur. GL-3 birikimi
otofajik membran yapısını bozmaktadır. Endoplazmik retikulum (ER), ökaryotik hücrelerde protein sentezinin
düzenlenmesi ve modifikasyonu gibi kritik görevleri bulunan bir organeldir. Hücresel stres durumlarında ER
işlev bozukluğu ile sonuçlanır ve yanlış katlamış proteinleri birikimine neden olur. Ferulik asitin antioksidan ve
antienflamatuar potansiyelinin bulunduğunu gösterilmiştir. Bu çalışma kapsamında, shRNA teknolojisi
kullanılarak GLA gen ifadesinin baskılanması ve in vitro Fabry hastalığı modelinin oluşturulması
amaçlanmaktadır. Fabry modelinde ve ferulik asit uygulamasının apoptoz ve ER stres yolağında bulunan
genlerin ifadesi üzerine etkileri değerlendirilmiştir.
İnsan podosit hücrelerinde GLA geni ORF ve kodlanmayan dizisini hedefleyen shRNA-lentiviral
vektörü ile transfekte edilmiştir. GLA ifadesinin baskılanma durumu qPZR ve western blot analizleri ile
değerlendirilmiştir. Farklı konsantrasyonlarda ferulik asidin (5-4000 µM) podosit hücreleri üzerine sitotoksik
etkisi tespit edilmiştir. Düşük (5 µM) ve yüksek (1500 µM) ferulik asit dozu GLA (+) ve GLA (-) podosit
hücrelerine uygulanmıştır. Kontrol ve doz gruplarında apoptoz ve ER stres yolağında bulunan önemli genlerin
mRNA düzeyinde ifadesi qPZR analizi ile belirlenmiştir.
İnsan podosit hücrelerinde GLA geni ifadesi shRNA transdüksiyonu sonrası kontrol grubuna göre
mRNA düzeyinde 16,9 kat, protein düzeyinde ise 7,7 kat baskılanmıştır. Düşük (5 µM) ve yüksek (1500 µM)
ferulik asit uygulaması sonucunda GLA (+) podosit hücrelerinde apoptoz ve ER stress yolağında bulunan
genlerin ifadesinde artış gözlenmiştir. Yüksek doz ferulik asit uygulanan GLA (+) podosit hücrelerinde kontrol
grubuna göre CYCS ve CHOP hariç çalışmaya konu olan tüm genlerin ifadesi artmıştır. GLA (-) podosit
hücrelerinde, GLA (+) hücrelerine göre CASP3, ATF4, CALR4 ve XBP1 ifadesi artmış, CHOP ve GRP78
ifadesi baskılanmıştır. Aşağı yönde gen ifadesinde benzer regülasyon yüksek doz (1500 µM) ferulik asit
uygulamasında gözlenmiştir. TAS analizinde kontrole göre 1500 μM ferulik asit uygulanmış grup, düşük ve
yüksek doz ferulik asit uygulanmış grup ve GLA (-) gruplarda anlamlı artış tespit edilmiştir. TOS analizinde ise
kontrole göre tüm gruplarda artış gözlenmiştir.
Bulgular, shRNA teknolojisi ile GLA gen ifadesinin podosit hücrelerinde baskılandığını ve in vitro
Fabry modelinin başarıyla oluşturulduğunu göstermiştir. GLA ifadesinin baskılanması ile oluşan hücresel stresin
ATF4, CALR4, GRP78 ve XBP1 üzerinden tolere ettiğini göstermiştir. Apoptoz kaskadının ise içsel yolak
üzerinden başlama sürecinde olduğu değerlendirilmiştir. Antioksidan ve antienflamatuar potansiyeli bulunan
ferulik asitin GLA ifadesinin eksikliği ile podosit hücrelerinde gelişen hücresel stresi ER ve bazı apoptoz
genlerin regülasyonu ile kısmen tolere ettiği anlaşılmaktadır.
Anahtar Kelimeler: ER stres, Fabry hastalığı, Ferulik asit, Galaktosidaz A, shRNA

Abstract:
Fabry disease is an X-linked recessive lysosomal storage disorder caused by the deficient activity of
galactosidase A (α-GAL A) and the resulting accumulation of globotriaosylceramide (GL-3). The accumulation
of GL-3 leads to ischemia and infarction, especially in the kidney, heart and brain. The autophagic pathway is
damaged because the accumulation of GL-3 disrupts the membrane structure. The endoplasmic reticulum (ER) is
an organelle with critical functions such as regulation and modification of protein synthesis in eukaryotic cells.
Cellular stress results in ER dysfunction and causes accumulation of misfolded proteins. Ferulic acid has been
shown to have strong antioxidant and anti-inflammatory potential. In this study, it is aimed to downregulate
GLA gene expression and to create an in vitro Fabry disease model using shRNA technology. Therefore, effects
of ferulic acid application in fabry model was investigated on expression of genes in the apoptosis and ER stress
pathway.
GLA gene expression in human podocyte cells was downregulated by transfection with a shRNA-
lentiviral vector targeting the ORF and non-coding sequence and thereby evaluated by qPCR and western blot
analysis. The cytotoxic effect of ferulic acid at different concentrations (5-4000 µM) on human podocyte cells
was determined. According to the results of viability assays, low (5 µM) and high (1500 µM) ferulic acid doses
were applied to GLA (+) and GLA (-) podocyte cells. The expression of important genes in the apoptosis and ER
pathways in the control and dose groups was determined by qPCR analysis.
After shRNA transduction and compared to the control group, GLA gene expression in human podocyte
cells was downregulated as 16.9 and 7.7 folds at mRNA and protein levels, respectivelly. Low (5 µM) and high
(1500 µM) dose ferulic acid increased the expression of genes in the apoptosis and ER stress pathway except
CYCS and CHOP in GLA (+) podocyte cells. In GLA (-) podocyte cells, the expression of CASP3, ATF4,
CALR4 ve XBP1 were upregulated but CHOP ve GRP78 were downregulated compared to the GLA (+) group.
Similar regulation of downstream gene expression was observed in high dose (1500 µM) ferulic acid treatment.
In TOS analysis, an increase was observed in all groups compared to the control. In TAS analysis, a significant
increase was detected in 1500 μM ferulic acid treated group, low and high dose ferulic acid treated group and
GLA (-) groups compared to the control. In TOS analysis, an increase was observed in all groups compared to
the control.
These findings showed that GLA gene expression was suppressed using shRNA technology and an in
vitro Fabry model was successfully established. Cellular stress induced by suppression of GLA expression was
shown to be tolerated via ATF4, CALR4, GRP78 and XBP1. The apoptosis cascade was assessed to be in the
process of initiation through the intrinsic pathway. Ferulic acid, which has antioxidant and anti-inflammatory
potential, appears to somehow tolerate the cellular stress that develops in podocyte cells with lack of GLA
expression through regulation of ER and some apoptosis genes.
Keywords: ER stress, Fabry disease, Ferulic acid, Galactosidase A, shRNA