Davisianoside B ve aristatoside C monodezmozidik saponinlerin akciğer kanser hücreleri üzerinde sitotoksik ve apoptotik aktivitesinin incelenmesi
Investigation of cytotoxic and apoptotic activities of monodesmosidic saponins, davisianoside B and aristatoside C, on lung cancer cells
Yazar: GÖZDE KASAPLIGİL
Danışman: PROF. DR. AYŞE NALBANTSOY ; DOÇ. DR. EMİN İLKER MEDİNE
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Kanser, dünyada ve ülkemizde ölüm sebepleri arasında ikinci sırada yer alan,
fiziksel ve biyokimyasal özelliklerinde meydana gelen farklılaĢmalarla hücrelere
kontrolsüz çoğalma ve ölüm yolaklarından kaçabilme yeteneği kazandıran bir
hastalıktır. Kanserin tedavisi için cerrahi müdahale, kemoterapi, radyoterapi, gen
terapisi, immünoterapi, hedefli terapi gibi birçok yöntem kullanılmaktadır.
Biyoteknolojik basamakların fazla ve maliyetli olması, tümör dokusunun heterojen
olması ve genetik mutasyonlarla kanser hücrelerinin sağkalım yolaklarını aktive
etmesi sebebiyle kanserin hedeflenmesi ve tedavisi zorlaĢmaktadır.
Doğal ürünler, eski yıllardan itibaren insanlar tarafından hastalıkların
tedavisinde kullanılan biyolojik aktif bileĢiklerdir. Genellikle bitki kökenli olup,
bitkinin savunma mekanizmalarının yan ürünüdür. Günümüzde birçok doğal, yarı-
doğal ürün antienflamatuvar, antikanser, antimikrobiyal aktiviteleriyle
bilinmektedir. Farmakolojik özelliklerinden en çok faydalanılan moleküllerden biri
saponinlerdir. Saponinler glikon ve aglikon iki farklı yapıdan oluĢmaktadır.
Triterpen veya stereoid yapılı olmak üzere iki gruba ayrılmaktadırlar.
Kemoterapide karĢılaĢılan ilaç direnci ve yüksek toksisite gibi kısıtlamalara
alternatif çözümler getirme arayıĢında olan bilim insanları, son yıllarda terapötik
doğal kaynaklı ajanlara yönelmiĢlerdir.
Bu tez çalıĢmasında, Cephalaria davisiana ve Cephalaria aristata
bitkilerinden izole edilen davisianoside B ve aristatoside C moleküllerinin akciğer
kanseri hücreleri üzerinde potansiyel sitotoksik ve apoptotik etkileri araĢtırılmıĢtır.
Akciğer karsinom (A549), büyük hücreli karsinom (HTB-177), bronĢiyol alveolar
küçük hücreli olmayan karsinom (CRL-5807), mezotelyoma skuamöz hücrelix
karsinom (CRL-5826) ve sağlıklı akciğer fibroblast (CCD-34Lu) hücreleri hücre
kültürü çalıĢmalarında kullanılmıĢtır.
Moleküllerin hücreler üzerindeki sitotoksik etkileri, MTT testi ile
belirlenmiĢtir. Saponin molekülleri 25, 2.5, 0.25 µg/ml konsantrasyonunda 48 saat
boyunca hücrelerle inkübe edilmiĢtir. Ardından yüzde canlılık grafikleri
oluĢturulmuĢtur, IC50 değerleri Graph Pad Prism 5 programıyla hesaplanmıĢtır.
Apoptotik etkiler ise, FITC konjuge Annexin V ile flow sitometride analiz
edilmiĢtir. Hücreler 48 saat boyunca moleküllerin IC50 ve 2xIC50 dozlarıyla inkübe
edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonunda apoptoz kiti uygulanarak flow sitometride FL-
1A'dan alınan sinyaller ile grafik oluĢturulmuĢtur.
Tez çalıĢmasında elde edilen MTT sonuçlarına göre, davisianoside B
aristatoside C ve doksorubisin moleküllerinin IC50 değerleri sırasıyla A549 hücresi
için, 8.32±0.15 µM, 9.98±0.36 µM, >20 µM olarak hesaplanmıĢtır. Apoptoz
analizi sonuçlarına göre, Davisianoside B molekülünün A549 hücresi üzerinde IC50
dozunda %0.4±0.4, 2xIC50 dozunda %12.4±2.07, Aristatoside C molekülünün IC50
dozunda %14.06±0.97, 2xIC50 dozunda %23.9±1.25 ve doksorubisin için
%95±0.88 apoptotik oranlar belirlenmiĢtir.
HTB-177 hücresi için davisianoside B, aristatoside C ve doksorubisine ait
IC50 değerleri 10.9±0.01 µM, 14.77±3.28 µM, 12.91±4.00 µM olarak
belirlenmiĢtir. Davisianoside B eklenen IC50 dozunda %7.9±1.15 2xIC50 dozunda
%11.9±1.53; Aristatoside C eklenen IC50 dozunda %41.5±2.03, 2xIC50 dozunda
%21.7±1.92 doksorubisin eklenen grupta %77.5±1.03 olarak apoptotik oranlar
tespit edilmiĢtir.
CRL 5826 hücresi için davisianoside B, aristatoside C ve doksorubisine ait
IC50 değerleri 6.43±0.76 µM, 19.87±1.87 µM, 11.11±2.65 µM olarak
belirlenmiĢtir. CRL-5826 hücrelerinde davisianoside B IC50 dozunda %6.0±0.69,
2xIC50 dozunda %16.1±2.07, aristatoside C IC50 dozunda %2.2±0.66, 2xIC50
dozunda %4.4±1.09 ve doksorubisin IC50 dozunda %11.2±1.60 apoptotik oran
tespit edilmiĢtir.
CRL 5807 için davisianoside B, aristatoside C ve doksorubisine ait IC50
değerleri 4.49±0.39 µM, 12.09±1.46 µM, 17.36±3.98 µM, apoptotik oranlar ise
davisianoside B IC50 dozunda %51.47±1.75, 2xIC50 dozunda %62.2±1.35,xi
aristotaside C IC50 dozunda %17.7±0.98, 2xIC50 dozunda %44.5±1.82 ve
doksorubisin için %94.6±0.86 olarak ifade edilmiĢir.
CCD34Lu için davisianoside B, aristatoside C ve doksorubisine ait IC50
değerleri 2.28±0.62 µM, 18.13±2.9 µM, 11.70±5.43 µM olarak hesaplanmıĢtır.
CCD-34Lu hücrelerinde davisianoside B IC50 dozu %10.3±1.25, 2xIC50 dozu
%88.0±1.75 , aristatoside C IC50 dozu %36.8±1.09 , 2xIC50 dozu %79.8±2.16 ve
doksorubisin IC50 dozu %22.1±1.66 oranında apoptotik etki göstermiĢtir.
Bu tez çalıĢmasıyla, davisianoside B ve aristatoside C saponinlerinin 48 saat
inkübasyonu sonucu akciğer kanser hücreleri üzerinde sitotoksik etkisi olduğu ve
kemoterapötik bir ajan olan doksorubusin ile kıyaslandığında daha düĢük dozlarda
sitotoksik aktivite potansiyeline sahip olduğu belirlenmiĢtir. Ayrıca moleküllerin
doza bağlı artan apoptotik aktivite potansiyeline sahip olduğu tespit edilmiĢtir.

Abstract:
Cancer is the second cause of death in the world and in our country. This
disease gains the ability for cells to uncontrollably grow and escape from
mechanisms of cell death with changed features physically and biochemically.
Surgery, chemotherapy, radiotherapy, gene therapy, immunotherapy, targeted
therapies are most commonly used for cancer treatment. But, targeting and
treating cancer have become harder because of the limitations, such as
biotechnological steps are expensive, tumor tissue is heterogenous and survival
pathways are activated by genetic mutations.
Natural products are biologically active substances which have been used
for treatment for many years. Generally they are derived from plants and
secondary products of the defense system. Lots of natural, semi-natural products
are known with anti-inflammatory, anti-cancer and antimicrobial activities. One
of the most benefited molecules of pharmacological properties is saponins.
Saponins consist of glycone and aglycone parts. They are mainly divided into 2
groups: triterpenoid and steroidal. In recent years, scientists search for new agents
isolated from natural sources, because of the limitations such as chemo drug
resistance and high toxicity.
We investigated the cytotoxic and apoptotic effects of davisianoside B and
aristatoside C molecules, which were isolated from respectively Cephalaria
davisiana and Cephalaria aristata, on lung cancer cell lines. A549 (lung
carcinoma), HTB-177 (large cell carcinoma), CRL-5807 (bronchioalveolar nonsmall cell carcinoma), CRL 5826 (squamous cell adenocarcinoma;xiv
mesothelioma), and CCD-34Lu (normal lung fibroblast) were cultured. Cytotoxic
effects on cells, were determined by MTT test. Saponin molecules at 25, 2.5, 0.25
µg/ml concentrations and cells were incubated for 48 hours. After incubation, cell
viability graphs were plotted and IC50 values calculated by Graph pad Prism 5.
For the apoptosis activity, cells were incubated with saponins at concentrations
IC50 and 2xIC50 for 48 hours and analysed with FITC conjugated Annexin V by
flow cytometry. After incubation, Apoptosis kit were applied and plotted a graph
with FL-1A signals.
In this study, according to the MTT results, IC50 values of davisianoside B,
aristatoside C, and doxorubicin on A549, 8.32±0.15 µM, 9.98±0.36 µM, >20 µM
were determined. According to the apoptosis results, on A549 cells, Davisianoside
B at IC50 %0.4±0.4, at 2xIC50 %12.4±2.07, Aristatoside C at IC50 %14.06±0.97, at
2xIC50 %23.9±1.25 and doxorubicin %95±0.88 were measured.
IC50 values of davisianoside B, aristatoside C, and doxorubicin on HTB-
177, 10.9±0.01 µM, 14.77±3.28 µM, 12.91±4.00 µM were determined. According
to the apoptosis results, on HTB-177 cells, Davisianoside B at IC50 %7.9±1.15, at
2xIC50 %11.9±1.53, Aristatoside C at IC50 %41.5±2.03, at 2xIC50 %21.7±1.92 and
doxorubicin %77.5±1.03 were measured.
IC50 values of davisianoside B, aristatoside C, and doxorubicin on CRL-
5826, 6.43±0.76 µM, 19.87±1.87 µM, 11.11±2.65 µM, were determined.
According to the apoptosis results, on CRL-5826 cells, Davisianoside B at IC50
%6.0±0.69, at 2xIC50 %16.1±2.07, Aristatoside C at IC50 %2.2±0.66, at 2xIC50
%4.4±1.09 and doxorubicin %11.2±1.60 were measured.
IC50 values of davisianoside B, aristatoside C, and doxorubicin on CRL-
5807, 4.49±0.39 µM, 12.09±1.46 µM, 17.36±3.98 µM, were determined.
According to the apoptosis results, on CRL-5807 cells, Davisianoside B at IC50
%51.47±1.75, at 2xIC50 %62.2±1.35, Aristatoside C at IC50 %17.7±0.98, at 2xIC50
%44.5±1.82, doxorubicin %77.5±1.03 were measured.
IC50 values of davisianoside B, aristatoside C, and doxorubicin on CCD-
34Lu, 4.49±0.39 µM, 12.09±1.46 µM, 17.36±3.98 µM, were determined.
According to the apoptosis results, on CCD-34Lu cells, Davisianoside B at IC50xv
%10.3±1.25, at 2xIC50 %88.0±1.75, Aristatoside C at IC50 %36.8±1.09, at 2xIC50
%79.8±2.16 and doxorubicin %22.1±1.66 were measured.
In this study, it is shown that saponins of davisianoside B and aristatoside
C have a potential of cytotoxic effect on lung cancer cells, and at low
concentrations have a greater cytotoxic activity than the commercial
chemotherapeutic drug doxorubicin. Additionally, molecules have apoptotic
activity potential dose-dependent manner on lung cancer cells.