Bor içeren yeni bir antibiyotik epetraborole (AN3365)'e karşı duyarlı olan escherichia coli mutantlarının Keıo koleksiyonunun taranması ile belirlenmesi
Determination of escherichia coli mutants sensitive to a novel boron containing antibiotic epetraborole (AN3365) by screening Keio collection
Yazar: ANARA BABAYEVA
Danışman: DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Escherichia coli = Escherichia coli

Özet:
Bor, biyolojik açıdan önemli bir elementtir ve doğada tek başına bulunmayıp, diğer elementlerle bileşikler halinde yer alır. Genellikle oksijen ile bileşik halinde görülür. Bor elementi oksijeni tercih ettiği için özellikle cis-hidroksil grubu içeren moleküllere yüksek afinite ile bağlanır. Bu özelliği sayesinde "moleküler bağlayıcı" olarak rol oynayabilmektedir.  Auto-inducer 2 gibi hücresel haberleşmede görevli olan molekülden, bortezomib gibi anti-kanser ajanı olarak kullanılan moleküle kadar, geniş yelpazede, içerisinde bor bulunan çeşitli biyo- ve sentetik bor içeren bileşikler son derece önemlidir. Bunların yanında son yıllarda, yeni bir antibiyotik sınıfı olarak da tanımlanmaya aday, bor içeren antibiyotikler dikkat çekicidir. Bu bileşikler, özellikle anti-mikrobiyal direncin alarm verici düzeye ulaştığı günümüzde ve yakın gelecekte, insan sağlığı açısından başvurabileceğimiz moleküler silahlardan biri olmaya namzettir.  Bu nedenle, bor birleşikleri ile ilgili hali hazırda çok sayıda araştırma mevcuttur ve bunların sayıları gün geçtikçe artmaktadır.
Bu açıdan en son bulunan bor içeren antibiyotiklerden biri olan Epetraborole (AN3365), ilk çalışmalarda ümit vaat eden sonuçlar sunmuştur. Bazı dirençli bakterilere karşı da etkili olduğu ortaya konulan Epetraborole'nin protein sentezini belli bir basamakta inhibe etmek sureti ile, bakteriyostatik etki gösterdiği bilinmektedir. Epetroborole'nin hücre içerisinde hangi sistem ya da mekanizmaları doğrudan veya dolaylı etkilediğini bulmak, sadece bu spesifik antibiyotik ile bakteri arasındaki etkileşimi tespit etmekle kalmayıp, daha geniş anlamda antibiyotik etki mekanizmasında ve direnç fenotipi ile ilgili moleküler oyuncuları, gen ve protein adaylarını ortaya koyabilecek bir deneysel model hüviyetine sahiptir.
Bor içeren antibiyotiklerin, bakteri hücresi içerisinde hangi gen ürünlerini etkilediği veya etkilendiği, hem global anlamda hücresel yapıların, gen devrelerinin ve metabolik yolakların sistemsel orkestrasını felsefi anlamda çözmek, hem de somut olarak dolaylı veya direkt hedeflerin bulunması açısından, anti-mikrobiyal, anti-biyolojik ve anti-kanser açılımların keşfedilmesi ve irdelenmesi bakımından –şimdi- odaklanılması gereken yaşamsal fenomenlerdendir. İşte bu tez çalışması bir açıdan, genom boyu taramalar yaklaşımıyla ve yaklaşık 4000 genin test edilmesi ile, önemli, etkili ve –bizce- yerinde bir başlangıç olmuştur. Bunun için Escherichia coli'ye (E.coli) ait genlerin tekli mutantlarını içeren, Keio koleksiyonu kullanılmıştır.
Keio mutant koleksiyonu, E. coli bakterisinin tekli mutant hattını içeren bir koleksiyon olup, yaklaşık 50 mikroplakadan oluşmaktadır. Her bir mikroplaka kuyucuğunda yer alan bakteri suşu, bir gen açısından mutanttır. Koleksiyonda onaylanmış 3985 adet mutant bulunmaktadır. Delesyona uğratılan gen içerisine kanamisin direnç kaseti yerleştirilmiş olup, eldeki mutantlar, non-esansiyel genlerin nakavtlarıdır. Bu çalışmada, E. coli'de yaklaşık 300 adet esansiyel gen dışındaki genlerin tümünün, Epetraborole ile ilişkisi test edilmiştir. 
Çalışmanın ilk aşamasında, genom boyunca tarama çalışmaları yapılmıştır. Bu aşamada, 3985 adet mutant suş, farklı Epetraborole konsantrasyonu içeren besi yerlerinde taranmıştır. Bu çalışmadaki hedef, yabanıl tip E. coli suşuna kıyasla, antibiyotiğe karşı daha duyarlı olan mutantların tespit edilmesidir. Yabanıl tipin yaşayabildiği konsantrasyondan daha düşük seviyedeki bir konsantrasyonda yaşayamayan mutant antibiyotiğe duyarlı mutant olup, doğrudan veya dolaylı olarak, antibiyotik toleransı ile ilişkilidir. Genom boyunca tarama çalışmaları sonucunda binlerce mutant arasından duyarlı olanlar belirlenmiştir. Bu mutantlar birkaç farklı teknik ile onayladıktan sonra, mutantların duyarlılık veya direnç seviyeleri teyit edilmiştir. Daha sonra, duyarlılığın, söz konusu mutanttaki nakavt edilen genden kaynaklandığını teyit etmek için, komplementasyon deneyleri yapılmıştır. Bunun için hedef gen plazmit vektör ile transformasyon deneyi ile mutant E. coli hücresine gönderilmiştir.
Yapılan tüm çalışmalar sonucunda, bor içeren antibiyotik olan Epetraborole ile ilgisi olduğu düşünülen genler listelenmiştir. Genom boyunca tarama çalışmalarında, Luria Bertani (LB) zengin katı besi yeri ortamında yapılan tarama sonucu, özellikle göze çarpan, pncA, rnb, yhbY, leuD, trmU, artJ, yddM, ubiG genleri tespit edilmiştir.
Sonuç olarak bu tez çalışması, moleküler mikrobiyoloji, genomik ve kısmen biyoinformatik alanların bazı bilgi birikimlerini kullanmış ve bor içeren antibiyotik-bakteri ilişkisine multidisipliner yaklaşarak, model bakteride yeni, önemli ve yararlı gen bilgileri önermiştir.

Abstract:
Boron is a biologically important element that does not exist in nature by itself, rather is present in the compounds with other elements, especially preferring oxygen-containing molecules. Various bio and synthetic compounds which contain boron are quite important such as auto-inducer 2 which is involved in cellular communication and bortezomib that is used as an anti-cancer agent.
In recent years, boron-containing antibiotics, a new candidate class of antibiotics are notably catching more attention. In terms of human health, these compounds are one of the molecular tools that can be utilized currently and in the near future when the anti-microbial resistance is at alarming stage. The possibility of using such new antibiotics should be and is investigated in all aspects. In this respect, epetraborole (AN3365), one of the most recently discovered boron-containing antibiotics, has presented promising results in the initial studies. This antibiotic, which is found to be effective against some resistant bacteria, exerts its bacteriostatic effect by inhibiting protein synthesis at a certain step as its mechanism of action. 
Finding which systems or mechanisms directly or indirectly affected by epetraborole in the cell is not only useful within the context of detecting the interaction between this specific antibiotic and bacteria. But at the same time, this experimental model is potentially capable of introducing molecular players, gene and protein candidates in the broader sense, in the mechanism of antibiotic action and in relation to the resistance phenotype. In order to decipher the systemic unity of cellular structures, gene circuits and metabolic pathways, it is important to reveal the gene products that are affected directly of indirectly within the bacterial cell by the boron-containing antibiotic.
Boron-containing antibiotics are relatively new phenomena that need to be scrutinized in terms of discovering and investigating direct and indirect targets for anti-microbial, anti-biological and anti-cancer objectives. In a way, this thesis study is an important, effective and appropriate start using genome-wide screen approach by testing about 4000 genes. For this purpose, the Keio collection, which contains single mutants of the non-essential genes of Escherichia coli was used. 
The Keio mutant collection is a collection of the single mutant line of E. coli bacteria and consists of about 50 microplates. Each microplate well contains one mutant strain. There are 3985 mutants validated in the collection. A kanamycin resistance cassette was inserted into the gene to be deleted and the mutants are knock-outs of non-essential genes. In E. coli, the relation of all genes directly or indirectly with epetraborole except for approximately 300 essential genes was tested in the study by the genome-wide screen.
In the first phase of the study, genome wide screening studies were carried out. At this stage, 3985 mutants were screened in the medium containing different antibiotic concentrations. The aim of this study is to identify the mutants that are more susceptible to the antibiotic compared to the wild-type E. coli strain. A mutant is considered as an antibiotic-sensitive mutant if it is unable to live at a concentration lower than that of the wild-type. Then the particular mutant is considered to be directly or indirectly associated with antibiotic tolerance. As a result of genome wide screening studies, the sensitive mutants were identified among the thousands of mutants. After validating the results using these mutants with several different techniques, the sensitivity or resistance levels of the mutants were ensured. Complementation experiments were then performed to demonstrate that the sensitivity was due to the "knock-out" gene, not something else in the mutant. For this purpose, the plasmid vector containing the target gene was sent into the mutant E. coli strain by transformation.
As a result of all the studies, the genes that are thought to be related to epetraborole are listed as pncA, rnb, yhbY, leuD, trmU, artJ, yddM, ubiG following the screening studies throughout the genome using the Luria Bertani (LB)-rich medium.
In conclusion, this thesis study is comprehensive and original in that it has taken advantage of the approaches in the fields of molecular microbiology, genomic and partially bioinformatics using the multidisciplinary approach and in conclusion has presented in the model bacterium, successful results regarding new, important and useful gene information that can be used in the area of boron-containing antibiotics.