İnsan göbek kordonu multipotent stroma hücreleri kaynaklı ekzozomların in vitro hipoksik ve normoksik koşullarda endotel hücreleri üzerinde damar oluşturma etkinliği
Vascularization efficacy of human umbilical cord multipotent stroma cell-derived exosomes on human cardiac microvascular endothelial cells in vitro normoxic/hypoxic condition
Yazar: BİLGE SERDAROĞLU
Danışman: DOÇ. DR. FERDA TOPAL ÇELİKKAN
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Giriş: Dünya çapında mortalitesi ve morbiditesi en yüksek hastalıklar olan iskemik hastalıklara yönelik medikal ve cerrahi tedavilerin yanı sıra anjiyogenezi destekleyici rejeneratif tedaviler araştırılmaktadır. İnsan göbek kordonu multipotent stroma hücreleri (iGK-MSH), mezenkimal kök hücre özelliği gösterirler. Elde edilme kolaylığı ve allojeneik kullanıma uygun olmaları gibi nedenlerle araştırmalarda sıklıkla kullanılırlar. Multipotent stroma hücrelerinin (MSH) kök hücre özelliklerine hücre dışına salgıladıkları ekzozom adı verilen veziküllerdeki parakrin faktörlerin aracılık ettiği yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Ekzozomlar, farklı hücre tiplerinden salgılanabilen, alıcı hücrelere biyoaktif molekülleri taşıyan lipid çift zarla çevrili hücre dışı keseciklerdir. iGK-MSH'den elde edilen ekzozomların proanjiyogenik etkilere sahip olduğu daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Hipoksi, iskemik hastalıklarda doku düzeyinde ortaya çıkan temel sorundur; in vitro ortamda hipoksi modeli oluşturularak anjiyogenez değerlendirilebilir. Farklı kaynaklardan hipoksi koşullarında elde edilen MSH ekzozomlarının anjiyogenez üzerinde olumlu etkilerine yönelik çalışmalar literatürde bulunmaktadır.

Amaç: Bu çalışmada, iGK-MSH ekzozomları normoksi (%21 O2) ve hipoksi koşullarında (%1 O2) elde edilerek, iki farklı dozda (50 μg/mL ve 200 μg/mL) normoksi koşullarındaki endotel hücrelerinin in-vitro damar oluşturma kapasiteleri üzerine etkisi eş zamanlı değerlendirilerek, iskemik hasarların tedavisinde klinik çalışmalara katkı yapılması amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem: İnsan göbek kordonundan (n=5) eksplant kültürle elde edilen İGK-MSH kendine özgü belirteçler kullanılarak akım sitometri yöntemiyle karakterize edildi. P4 ve P5 hücrelerin ekzozomları diferansiyel ultrasantrifüj yöntemiyle ayrıştırıldı. Ekzozomların karakterizasyonu için SEM, Western Blot, ayarlanabilir dirençli darbe algılama sistemi, MicroBCA® analizleri yapıldı. İnsan umbilikal ven endotel hücre (HUVEC) hattı tüp oluşumu deneyi yapılarak anjiyogenezin gösterilmesi amacıyla kullanıldı ve gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak değelendirildi.

Bulgular ve Sonuç: Uygulanan dozdan bağımsız olarak normoksi koşullarında elde edilen ekzozomlar, hipoksi koşullarında elde edilen ekzozomlara göre anjiyogenezi artırmaktadır. Hipoksi koşullarında elde edilen 50 μg/mL ekzozomun anjiyogenez üzerindeki etkisi literatürün aksine normoksi gruplarından daha azdı. Kullanılan ekzozom dozu arttığında (200 μg/mL) ise normoksi gruplarıyla istatistiksel olarak benzer sonuçlar elde edildi. Bu bulgular hipoksi ortamında elde edilen ekzozomların anjiyogenez uyarıcı etkisinin doza bağımlı olabileceğini göstermektedir. Daha büyük örneklem ile doz ve proteom çalışmaları yapılması literatürü güçlendirecektir.

Abstract:
Introduction: In addition to medical and surgical treatments for ischemic diseases, which are the diseases with the highest mortality and morbidity worldwide, regenerative treatments that support angiogenesis are being investigated. Human umbilical cord multipotent stroma cells (hUC-MSC) show mesenchymal stem cell characteristics and are frequently used in research due to their ease of obtaining and suitability for allogeneic use. Studies have shown that the stem cell properties of MSC are mediated by paracrine factors in the vesicles called exosomes that they secrete outside the cell. Exosomes are extracellular vesicles surrounded by a lipid double membrane that can be secreted from different cell types and carry bioactive molecules to recipient cells. It has been shown in previous studies that exoosomes obtained from hUC-MSC have proangiogenic effects. Hypoxia is the main problem that occurs at the tissue level in ischemic diseases. Angiogenesis can be evaluated by creating a hypoxia model in vitro. There are studies in the literature on the positive effects of multipotent stroma cell (MSC) exosomes obtained from different sources under hypoxic conditions on angiogenesis.

Aim of the Study: In this study, hUC-MSC exosomes were obtained under normoxia (21% O2) and hypoxia (1% O2) conditions, and their effects on the in vitro vessel formation capacity of endothelial cells under normoxia conditions were examined at two different doses (50 μg/mL and 200 μg/mL). It was aimed to contribute to clinical studies in the treatment of ischemic injuries by evaluating them simultaneously.

Materials and Methods: hUC-MSC obtained by explant culture from human umbilical cord (n=5) was characterized by flow cytometry using unique markers. exosomes of P3 cells were separated by the differential ultracentrifuge method. SEM, Western Blot, tunable resistive pulse detection system, MicroBCA® analyzes were performed for the characterization of exosomes. The human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) line was used to evaluate tube formation in-vitro.

Findings and Conclusion: Regardless of the applied dose, exosomes obtained under normoxia conditions increase angiogenesis compared to exosomes obtained under hypoxia conditions. Contrary to the literature, the effect of 50 μg/mL exosome obtained under hypoxia conditions on angiogenesis was less than in normoxia groups. When the exosome dose used increased (200 μg/mL), statistically similar results were obtained with the normoxia groups. These findings indicate that the angiogenesis-stimulating effect of exosomes obtained in the hypoxia environment may be dose dependent. Conducting dose and proteome studies with larger samples will strengthen the literature.