Deniz suyundan izole edilen enterokok suşlarının virulans faktörlerinin incelenmesi
Investigation of virulence factors of enterococci strains isolated from sewater
Yazar: İPEK ADA
Danışman: PROF. DR. AYTEN KİMİRAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Laktik Asit Bakterileri grubunda olan Enterokok cinsi bakteriler, insan ve hayvanların bağırsak florasının doğal mikroorganizması olup bağırsak dışı bölgelere yayılarak insanlarda çeşitli enfeksiyonlara sebep olurlar. Çevresel kirliliğin fazla olduğu ve lağım ve kanalizasyon sularının karıştığı deniz sularında, fekal kirlilik indikatörü olarak bilinen Enterokoklar halk sağlığı açısından önemlidir. Kromozomal ya da plazmit ve konjugatif transpozonlarla intrinsik ve ekstrinsik antibiyotik direnç mekanizması ve virulans faktörlerine sahip olan Enterokoklar, patojen mikroorganizmalardandır. Çalışmamızda, turistik, balıkçılık, sulama ve kullanma suyunda önemi olan Marmara Denizi ve Karadeniz (Kilyos, Rumelikavağı, Yeşilyurt ve Üsküdar)'den alınan deniz suyu örnekleri ile ilgili daha önce yapılan bir çalışmadan izole edilen 66 Enterokok suşunun API®20 Strep test kiti ile tür doğrulaması yapılmıştır. Çalışmada kullanılan Enterokok suşlarının antibiyotiklere dirençlilik profili [nalidiksik asit (NA), streptomisin (S), penisilin (P), kloramfenikol (C), vankomisin (VA), tetrasiklin (TE), siprofloksasin (CIP), kanamisin (K), amikasin (AM), eritromisin (E), gentamisin (CN), rifampisin (RIF)], hemoliz üretim aktivitesi, jelatinaz ve kazeinaz aktivitesi, biyofilm oluşturma kapasitesi, serum direnci aktivitesi, hemaglütinasyon ve bakteriyosin aktivitesi, fenotipik olarak incelenmiştir. Aynı zamanda suşların kromozomal DNA izolasyonları yapılmış ve antibiyotik direnç genleri ile virulans faktörleri PZR yöntemi ile incelenmiştir. Hücre dışı matriks proteinlerine bağlanma (ace), jelatinaz aktivitesi (gelE), agregasyon faktörü (agg), konak dokulara tutunma ve biyofilm oluşumu (esp), jelatinaz ve serin proteaz ifadesini düzenleme (fsr), sitolizin üretimi (cylM, cylB ve cylA), Enterokok adezyon proteini varlığı (efaAfs ve efaAfm), seks feromonları (cpd, cob ve ccf) ve antibiyotik direnci [vankomisin (vanA ve vanB), streptomisin (ant(6)-la), gentamisin (acc(6')-aph(2'')), kanamisin (aphA-3), rifampisin (rpoB1 ve rpoB2), ampisilin (bla(Z)), eritromisin (ermB), kloramfenikol (catpIP), tetrasiklin (tetM ve tetL) ile ilgili virulans faktörlerini kodlayan sorumlu olan genler, PZR yöntemi ile incelenmiştir. Diğer yandan, Enterokok suşlarının plazmit profilleri, moleküler büyüklükleri bilinen marker ile kıyaslanarak belirlenmiştir. Çalışmada, API®20 Strep test kiti ile tür doğrulaması yapılan 66 Enterokok izolatının 13 farklı antibiyotiğe karşı dirençlilik profili, Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemine göre incelenmiş ve E. faecalis ve E. faecium suşlarının tür içi antibiyotik direnç oranları sırasıyla, penisilin için %60.8 ve %84.2, kloramfenikol için %10.86 ve %31.57, vankomisin için %41.3 ve %57.9, tetrasiklin için %52.7 ve %63.15, siprofloksasin için %17.4 ve %36.84, kanamisin için %97.82 ve %94.7, ampisilin için %39.13 ve %57.9, eritromisin için %50 ve %84.2, gentamisin için %100 ve %94.7 olarak tespit edilmiştir. Aynı zamanda tüm suşlar nalidiksik asit, amikasin ve rifampisine dirençli, streptomisine ise duyarlı olarak saptanmıştır. Çoklu antibiyotik direnç profilleri fenotipik olarak incelendiğinde, çoklu antibiyotik direncinin 5-11 arasında değiştiği, 3 (%6.52) E. faecalis ve 5 (%26.31) E. faecium suşunun en fazla 11 antibiyotiğe, 3 (%6.52) E. faecalis suşunu ise en az 5 antibiyotiğe çoklu direnç gösterdikleri tespit edilmiştir. Diğer yandan, E. faecalis ve E. faecium suşlarının fenotipik virulans faktörleri kıyaslandığında tür içi oranlarının sırasıyla, jelatinaz aktivitesi için %91.3 ve %94.7, kazeinaz aktivitesi için %67.4 ve %31.57, biyofilm oluşturma kapasitesinde kuvvetli tutunma için %41.3 ve %47.36, serum direnci aktivitesi için %52.7 ve %31.57, hemaglütinasyon aktivitesinde çok kuvvetli reaksiyon için %32.6 ve %0, Staphylococcus aureus ATCC 25923 bakterisine karşı bakteriyosin aktivitesi %32.6 ve %5.26, Escherichia coli ATCC 25922 bakterisine karşı bakteriyosin aktivitesi ise %23.4 ve %0 olarak belirlenmiştir. Çalışmada incelenen E. faecalis ve E. faecium suşlarının antibiyotik direnç genlerinin PZR yöntemi ile genotipik incelenmesi sonucu tür içi antibiyotik direnç gen oranları sırasıyla, vanA ve vanB genleri için %32.6 ve %31.57 ile %21.73 ve %31.57, acc(6')-aph(2'') geni için %100 ve %94.73, aphA-3 geni için %97.82 ve %8947, rpoB2 geni için %97.82 ve %100, bla(Z) geni için %93.47 ve %89.47, ermB için %50 ve %84.2, catpIP için %71.73 ve %63.15, tetM ve tetL genleri için %56.52 ve %21.21 ile %43.47 ve %36.84 olarak tespit edilmiştir. Suşların tamamının ise rpoB1 genine sahip iken, ant(6)-la genine sahip olmadığı belirlenmiştir.  Virulans genlerinin PZR yöntemi ile incelendiğinde ise tür içi virulans gen oranları sırasıyla, ace geni için %86.9 ve %0, gelE geni için %91.3 ve %89.4, efaAfs için %95.6 ve %0, efaAfm için %58.7 ve %63.1, cpd geni için %41.3 ve %26.3, ccf geni için %30.4 ve %63.1, cob geni için %56.5 ve %63.1, agg geni için %84.7 ve %57.9, fsr geni için %60.8 ve %63.1 olarak tespit edilmiştir. Suşların tamamının sitolizin üretiminden sorumlu genler olan cylM, cylB ve cylA genlerine sahip olduğu belirlenmiştir. Çalışmada incelenen 66 Enterokok izolatının çoklu antibiyotik direnç gen profili ve virulans gen profili incelendiğinde, 12 farklı antibiyotik direnç geninden bir (%2.17) E. faecalis ve bir (%100) E. gallinarum suşunun en az 4 direnç genine, bir (%2.17) E. faecalis suşunun ise en fazla 11 direnç genine sahip olduğu belirlenmiştir. Aynı zamanda, 12 farklı virulans geninden 2 (%3.03) E. faecalis suşunun 12 gen bölgesi ile en fazla, 1 (%1.51) E. gallinarum suşunun ise 3 gen bölgesi ile en az virulans profili içerdiği saptanmıştır. Son olarak, çalışmada 66 adet Enterokok izolatının plazmit profilleri belirlenmiş ve 13 (%28.26) E. faecalis ve 3 (%15.78) E. faecium olmak üzere toplam 16 (%24.24) suşun 340 ile 32600 bp arasında değişen 26 farklı moleküler büyüklükte plazmit içerdiği tespit edilmiştir. 
Sonuçlar, deniz suyu örneklerinden izole edilen Enterokok suşlarının antibiyotik direnç ve virulans genlerine sahip olduğunu ve halk sağlığı açısından sorun oluşturabileceğini  göstermektedir. Çalışmadan elde edilen verilerin, deniz suyundaki fekal kirlilik indikatörü olan Enterokok cinsi bakterilerin virulansı hakkında bilinçlenme ve tedavide olası yaklaşımları belirlemede katkı sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Enterococcus bacteria, which classified in the group of Lactic Acid Bacteria, are the natural inhabitants of the intestinal flora of humans and animals and causing various infections in humans by spread to extra-intestinal regions. Enterococci, which is known as fecal pollution indicator in marine waters where environmental pollution is high and where sewage and sewage waters are mixed, are important for public health. Enterococci, which have intrinsic and extrinsic antibiotic resistance mechanisms and virulence factors by chromosomal, plasmid or conjugative transposons, are pathogenic microorganisms. In our study, 66 Enterococcus strains isolated from a previous study on sea water samples taken from Marmara Sea and Black Sea (Kilyos, Rumelikavağı, Yeşilyurt and Üsküdar), which are important in tourism, fishing, irrigation and utility water, were confirmed with API®20 Strep test kit at species level. Antibiotic resistance profile [nalidixic acid (NA), streptomycin (S), penicillin (P), chloramphenicol (C), vancomycin (VA), tetracycline (TE), ciprofloxacin (CIP), canamycin (K), amikacin (AM), erythromycin (E), gentamicin (CN), rifampicin (RIF)], hemolysis production activity, gelatinase and caseinase activity, biofilm formation capacity, serum resistance activity, hemagglutination and bacteriocin activity of the Enterococcus strains used in the study were examined phenotypically. Chromosomal DNA isolations of the strains were made and antibiotic resistance genes and virulence factors were examined by PCR method. Binding to extracellular matrix proteins (ace), gelatinase activity (gelE), aggregation factor (agg), adherence to host tissues and biofilm formation (esp), regulation of gelatinase and serine protease expression (fsr), cytolysin production (cylM, cylB and cylA) The genes responsible for the presence of enterococcal adhesion protein (efaAfs and efaAfm), sex pheromones (cpd, cob and ccf) and virulence factors [vancomycin (vanA and vanB), streptomycin (ant (6)-la), gentamicin (acc(6')-aph (2'')), canamycin (aphA-3), rifampicin (rpoB1 and rpoB2), ampicillin (bla(Z)), erythromycin (ermB), chloramphenicol (catpIP), tetracycline (tetM and tetL)] related to antibiotic resistance were examined by PCR method. On the other hand, plasmid profiles of Enterococcus strains were determined by comparing their molecular size with the known marker. İn this study, the resistance profile of 66 Enterococci isolates against 13 different antibiotics were examined according to Kirby-Bauer disc diffusion method and the intraspecific antibiotic resistance rates of E. faecalis and E. faecium strains were 60.8% and 84.2% for penicillin, 10.86% and 31.57% for chloramphenicol, 41.3% and 57.9% for vancomycin, 52.7% and 63.15% for tetracycline, 17.4% and 36.84% for ciprofloxacin, 97.82% and 94.7% for kanamycin, 39.13% and %57.9 for ampicillin, 50% and 84.2% for erythromycin, 100% and 94.7% for gentamicin, respectively. All strains were also resistant to nalidixic acid, amikacin and rifampicin and susceptible to streptomycin. When multiple antibiotic resistance profiles were examined phenotypically, it was found that multiple antibiotic resistance ranged between 5-11, 3 (6.52%) E. faecalis and 5 (26.31%) E. faecium strains were up to 11 antibiotics and 3 (6.52%) E. faecalis strains multiple resistance to at least 5 antibiotics. On the other hand, when compared the phenotypic virulence factors of E. faecalis and E. faecium strains, 91.3% and 94.7% for gelatinase activity, 67.4% and 31.57% for caseinase activity, 41.3% and 47.36% for strong retention in biofilm formation capacity, 52.7% and 31.57% for serum resistance activity, 32.6% and 0% for very strong reaction in hemagglutination activity, bacteriocin activity against Staphylococcus aureus ATCC 25923 was 32.6% and 5.26%, and bacteriocin activity against Escherichia coli ATCC 25922 bacteria was 23.4% and 0% determined, respectively. Genotypic analysis of the antibiotic resistance genes of E. faecalis and E. faecium strains examined by PCR method in the study resulted in the in vitro antibiotic resistance gene ratios for 32.6% and 31.57% vanA and 21.73% and 31.57% for vanB genes, 100% and 94.73% for the acc(6')-aph (2''), gene, 97.82% and 89.47% for the aphA-3 gene, 97.82% and 100% for the rpoB2 gene, 93.47% and 89.47% for the bla(Z) gene, 50% and 84.2% for ermB, 71.73% and 63.15% for catpIP, 56.52% and 21.21% for tetM and 43.47% and 36.84% for tetL genes were identified. All strains had the rpoB1 gene but not the ant(6)-la gene. When the virulence genes were examined by PCR method, the intra-species virulence gene rates were 86.9% and 0% for the ace gene, 91.3% and 89.4% for gelE gene, 95.6% and 0% for efaAfs, 58.7% and 63.1% for efaAfm and 41.3% and 26.3% for cpd gene, 30.4% and 63.1% for ccf gene, 56.5% and 63.1% for cob gene, 84.7% and 57.9% for agg gene, 60.8% and 63.1% for fsr gene, respectively. All strains were found to have the genes responsible for the production of cytolysin, cylM, cylB, and cylA genes. When the multiple antibiotic resistance gene profile and virulence gene profile of 66 Enterococci isolates examined in the study were analysed, one (2.17%) E. faecalis and one (100%) E. gallinarum strain had at least 4, and 1 (2.17%) E. faecalis strain had up to 11 of 12 different antibiotic resistance genes was determined. At the same time, 2 (3.03%) E. faecalis strains from 12 different virulence genes had the highest virulence profile with 12 gene regions and 1 (1.51%) E. gallinarum strain had the lowest virulence profile with 3 gene regions. Finally, in the study, plasmid profiles of 66 Enterococci isolates were determined and 16 (24.24%) strains, including 13 (28.26%) E. faecalis and 3 (15.78%) E. faecium, contained 26 different sized plasmids ranging from 340 to 32600 bp. The results show that Enterococcus strains isolated from seawater samples have antibiotic resistance and virulence genes and may cause problems for public health. It is thought that the data obtained from this study will contribute to the awareness of virulence of Enterococcus bacteria, which are indicators of faecal pollution in sea water and to determine possible approaches in treatment.