Ebişke (Clitocybe geotropa) mantarından saflaştırılıp karakterize edilen endo-beta 1,4-mannanaz enziminin, magnetik kitosan nanopartiküller üzerine immobilize edilmesi ve meyve sularının durultma işleminde kullanılması
Purification of an endo-beta-1,4-mannanase from (Clitocybe geotropa) and immobilization onto magnetite chitosan nanoparticles and using the clarification of fruit juices
Yazar: ZEYNEP SÖNMEZ
Danışman: PROF. DR. HAYRUNNİSA NADAROĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı / Nanoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Enzimler = Enzymes ; Mantarlar = Fungi ; Meyve suları = Fruit juices

Özet:
Mannanaz (1,4-β-D-mannan mannohidrolaz, EC 3.2.1.78) enzimi çeşitli, bakteri, mantar, bitki ve hayvan türlerinden üretilen, ligninin ve hücre duvarının yapısında bulunan hemiselülozun linear ya da dallı heteropolisakkarit türevi ve doğada yaygın bulunan manno-oligosakkaridleri hidroliz etmektedir. Mannanaz enzimi gıda endüstrisinde lezzet arttırma, kâğıt ve selüloz sanayinde odun selülozunu beyazlatma, hayvan beslenmesinde katkı maddesi olarak, deterjan amaçlı kullanılma ve meyve suyu durultmak olmak üzere pek çok endüstri alanında geniş bir kullanım alanına sahiptir. 
Mannanaz enzimi yüksek bitkiler, hayvanlar, mikroorganizmalar ve funguslar tarafından üretilmektedir. Çalışmamızda kullanılan Tricholomataceae familyasına ait Clitocybe geotropa türü fungus toksik değildir, halk arasında Ebişke mantarı olarak bilinir ve yiyecek olarak tüketilmektedir. 

Bu çalışmanın birinci aşamasında; mannanaz enzimi Clitocybe geotropa mantarından amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sephadex iyon değişim kromatografisi ve Sephakryl S 200 jel filtrasyon kromatografisi teknikleri kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırma işelminin ilk basamağında % 60-80 aralıklarda amonyum sülfat çöktürmesi yapılarak DEAE-Sephadex iyon değişim kromatografisine tatbik edilmiş ve son adımda Sephakril S 200 jel filtrasyon kolonundan elde edilen mannanaz enzimi %21.3 verimle 176.4 kat saflaştırılmıştır. SDS-PAGE jel elektroforez analizi sonucunda β-mannanaz enziminin tek alt birimden oluşturuğu ve jel filtrasyon kromatografisi sonucunda molekül ağırlığının 39.5 kDa olduğu belirlenmiştir.  Clitocybe geotropa mantarından saflaştırılan β-mannanaz enzimi Fe3O4  nanopartiküller ile modifiye edilen kitosan partiküllerine L-glutaraldehit kolu üzerinden kovalent olarak immobilize edilmiştir. Serbest ve immobilize β-mannanaz'ın optimum pH değerleri 5.0, optimum sıcaklık değeri 60°C olarak belirlenmiştir. Sebest enzimin 25-60°C aralığında immobilize enzimin ise 20-60oC'lerde çok daha stabil olduğu tespit edilmiştir. Serbest ve bağlı enzimin substrat spesifikliğini belirlemek amacıyla keçi boynuzu gamı, ksilen, nişasta, selüloz ve jelatin substratları ile ayrı ayrı aktivite ölçümleri yapılmış ve Lineweaver burk grafikleri çizilerek Vmax ve Km değerleri belirlenmiştir. Enzim en yüksek Vmax değerini çalışmada substrat olarak kullanılan locust bean gum substratında göstermiş ve serbest-immobilize -mannanaz enzimlerinin Vmax değerleri sırasıyla 10.2 EU/mg ve 14.35 EU/mg olarak bulunmuştur. Km değerleri ise sırasıyla 0.588 mg/mL ve 0.122 mg/mL olarak hesaplanmıştır. Serbest ve bağlı enzimin 1 mM ve 5 mM konsantrasyonlarında hazırlanan CuCl2, HgCl2, FeCl2, MgCl2, ZnCl2 CaCl2, MnCl2, CdCl2 ve CoCl2 gibi bazı metal iyonlarının etkileri in vitro olarak araştırılmıştır. 5 mM konsantrasyonda Mg2+ iyonunun serbest enzimi %10 oranında inhibe ettiği, her iki konsantrasyonda ki Zn2+ iyonunun serbest ve immobilize haldeki enzim üzerinde %10 oranında inhibisyon etkisi olduğu anlaşılmıştır.  İmmobilize mannanaz enziminin Ca2+ ve Mg2+ iyonlu ortamda tamamen inhibe olduğu diğer metal iyonlarının genel olarak serbest ve immobilize enzimin aktivitesini artırdığı ortaya konmuştur. Çalışmanın son aşamasında ise; serbest ve immobilize -mannanaz enziminin meyve suyunda verim artırma ve durultma işlemlerinde kullanılıp kullanılamayacağı araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, özellikle kuşburnu suyu üretimi üzerinde serbest ve immobilize mannanaz enziminin sırasıyla %146,2 ve %223,1 oranında verimi artırdığı tespit edilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Mannanaz,  Clitocybe geotropa, Saflaştırma, İmmobilizasyon Magnetik kitosan nanopartikül (MG-CTS NPs)

Abstract:
Mannanase (1,4-β-D-manno manno hydrolase, EC 3.2.1.78) enzyme is hydrolyzed manno-oligosaccharides which are produced from various bacteria, fungi plant and animal species, and
It is commonly found in the structure of lignin and cell wall hemicellulose linear or branched heteropolysaccharide derivative and in nature. Mannanase enzyme has a wide range of applications in many industries such as enhancing flavor in the food industry, bleaching the wood pulp in paper and cellulose industry, additives in animal nutrition, detergent and clarification of fruit juice. Mannanase enzyme is produced by higher plants, animals, micro-organisms and fungi. Used Clitocybe geotrop mushroom species in our study are belong to the family Tricholomatacea and they are not toxic fungi. They were popularly known as Ebiske mushrooms and consumed as food. 

In the first step of this study; mannanase enzyme was purified from Clitocybe geotrop using ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sephadex ion exchange chromatography and Sephakryl S 200 gel filtration chromatography techniques. In the first step of purification, it was done ammonium sulfate precipitate in the range of 60-80% then applied to DEAE-Sephadex ion exchange chromatography and in the final step; obtained mannanase enzyme was purified as 176.4 fold and with a yield of 21.3% from Sephacryl S 200 gel filtration column. SDS-PAGE gel electrophoresis analysis was indicated that β-mannanase formed from a single subunit enzyme and the molecular weight was determined to be 39.5 kDa by gel filtration chromatography. Purified β-mannanase enzyme from Clitocybe geotrop fungus was immobilized covalently to chitosan particles which modified with Fe3O4 NPs through L-glutaraldehyde. Then, the characterization of free and immobilized enzymes was completed. Optimum pH and optimum temperature value of free and immobilized β-mannanase was determined as 5.0 and 60°C, respectively. It has been found that free mannanase enzyme was mostly stable between 25 to 60°C and the immobilized enzyme was also stable in the range of 20 and 60°C. 
In order to determine the substrate specificity of free and bound enzyme, activity measurements were done using xylene, starch, cellulose, and locust bean gum and gelatin substrates separately and Vmax and Km values were calculated using Lineweaver Burk plots. Enzyme highest Vmax value was obtained against the locust bean gum substrate and Vmax values of free and immobilized -mannanase enzymes were 10.2 EU / mg and 14.35 EU / mg, respectively. The Km values were calculated as 0.588 mg/mL and 0.122 mg/mL. The effects of CuCl2, HgCl2, FeCl2, MgCl2, CaCl2, ZnCl2, MnCl2, CdCl2 and CoCl2 metal ions at 1 mM and 5 mM concentrations as in vitro.  The free enzyme was inhibited at 10% rate by Mg2+ ions at 5 mM concentration, Zn ion also inhibited at 10% rate both free and immobilized mannanane enzyme at 5 mM concentration. Immobilized mannanase enzyme was inhibited in the medium of Ca2+ and Mg2+ ions but other metal ions activated to them. In the last phase of the study; it was investigated whether free and immobilized -mannanase could be used in the clarification of fruit juice and increasing of juice yield or not. According to the obtained results, it was found that both free and immobilized mannanase enzyme was increased fruit juice production. Especielly, production of rosehip juice was produced by free and immobilized mannanase with the yield of 146.2% 223.1%, respectively.

Key Words: Mannanase, Clitocybe geotropa, purification, immobilization, magnetite chitosan nanoparticles (MG-CTS NPs)