Bacillus izolatlarının fibrinolitik enzim aktivitesi yönünden taranması ve enzimin kısmi karakterizasyonu
Screening of the Bacillus isolates for fibrinolytic enzyme activity and partial characterization of the enzyme
Yazar: BİRKAN SLEM
Danışman: PROF. DR. RENGİN ELTEM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Bacillus = Bacillus ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Fibrin = Fibrin ; Fibrinolitik ajanlar = Fibrinolytic agents ; Mezofilik = Mesophilic

Özet:
Çalışmamızda çeşitli kaynaklardan yapılan izolasyon çalışmaları sonunda oluşturulan ?Biyomühendislik Bölümü Kültür Koleksiyonunda? yer alan 150 adet mezofilik Bacillus izolatında, 60 adet endospor içeren termofilik bakteri izolatında ve Geobacillus stearothermophilus NRRL B-1102 türünde fibrinolitik enzim aktivitesi taranmıştır. Tarama prosesi, içerisinde fibrin oluşturulan katı besiyerinde berrak zon oluşumuna dayandırılarak yapılmıştır. Daha sonra, substrat olarak dekstrin ve soya unu içeren sıvı kültür ortamında 300C'de 72 saat inkubasyonun ardından aktivite tayini 300C'de gerçekleştirilmiştir. Buna göre, petri plağında taranan 150 adet mezofilik suş ve izolatın % 14' ünde fibrinolitik enzim aktivitesi belirlenmiş, 61 adet termofilik suş ve izolatın hiçbirisinde fibrinolitik enzim aktivitesi saptanamamıştır. Bu veriler ışığında suşlardan en yüksek aktivite ve termostabil enzime sahip olan mezofilik Bacillus sp. Ege B.2d.1 izolatından 5 L'lik karıştırmalı tank reaktörde kesikli kültür yöntemiyle enzim üretimi yapılmıştır. Üretimden sonra, fermentasyon sıvısındaki fibrinolitik enzimin saflaştırılması; santrifügasyon, ultrafiltrasyon, amonyum sülfat ile çöktürme, diyaliz, jel filtrasyon kromatografi yöntemleri ile yapılmış ve saflık ölçümü her adımda enzim aktivitesi, total aktivite, protein miktarı, spesifik aktivite ve verim hesaplanmasıyla belirlenmiştir. Kısmi olarak saflaştırılan enzimin moleküler ağırlığı SDS-PAGE ile gösterilmiştir. Ardından, enzimin farklı sıcaklık ve pH'lardaki stabiliteleri ve plazminojen aktivatörü özelliğinin belirlenmesi ile kısmi karakterizasyonu yapılmıştır.

Abstract:
In our study, in 150 mesophilic and 60 endospor containing thermophilic isolates supplied by the ?Bio-engineering Culture Collection? and in Geobacillus stearothermophilus NRRL B-1102 type culture, fibrinolytic enzyme activity was screened. Screening process was carried out basing on clear zone formation in a solid medium containing fibrin. Later, in the liquid culture medium containing dextrin and soybean meal as substrate, after 72 hours of incubation at 300C, activity of the enzym was determined at 300C. Accordingly, 14% of the 150 mesophilic strains screened in the petri plate were found to have fibrinolytic enzyme activity. None of the 61 thermophilic isolates and strain showed fibrinolytic enzyme avtivity. On the basis of these data, fibrinolytic enzyme production was performed in a 5-L stirred tank bioreactor in a batch culture from mesophilic Bacillus Ege B.2d.1 which showed the highest activity being the most termostabile enzyme. After production, partial purification of the fibrinolytic enzyme in fermentation broth was achieved using centrifugation, ultrafiltration, dialysis, gel filtration chromatography and degree of the purification was determined by calculation of the enzyme activity, total activity, protein content, spesific activity and yield for each step. The molecular weight of the partially purified enzyme was determined using SDS-PAGE. Partial characterization of the fibrinolytic enzyme was done by determination its plasminogen activator property and also stabilities at different temperature and pH ranges.