İzole hücrelerin taramalı elektron mikroskobunda incelenmesi için hazırlama yöntemlerinin geliştirilmesi
Development of preparation methods for examing single cells in scanning electron microscope
Yazar: BURCU EMİNE TEFON
Danışman: PROF. DR. ALP CAN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2004
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
İzole Hücrelerin Taramalı Elektron Mikroskobunda İncelenmesi İçin Hazırlama Yöntemlerinin Geliştirilmesi ÖZET Bu çalışmada izole hücrelerin taramalı elektron mikroskobunda incelenebilmesi için hazırlama yöntemlerinin geliştirilmesi amaçlandı. İzole hücreler olarak kan hücreleri kültür hücreleri, ovositler ve spermatozoonlar kullanıldı. Bu hücreler Trump's çözeltisi, Karaowsky çözeltisi ve gluteraldehit+sodyum fosfat tamponu ile değişen zaman uzunluklarında fiske edildi. Ardından hücreler osmiyum tetraoksit+fosfat tamponunda değişen sürelerde ikinci kez fiske edildi. Postfikse edilen hücreler aseton ya da etanol kullanılarak dehidrate edildi. Hücreler, kritik nokta kurutucusunda (CPD) ya da havada kurutma yöntemiyle kurutuldu. Kurutulan hücreler değişik kalınlıklarda altm-paladyum (Au-Pd) ile kaplandı ve SEM'de sekonder elektron dedektörü kullanılarak incelendi. Uygulanan bu kimyasal ve mekanik işlemler sırasında hücrelerin yüzey yapılarının ne kadar korunduğu ve hücre kaybının olup olmadığı araştırıldı. Sonuç olarak Trump's fiksatifinin bütün hücreler için uygun fiksatif olduğuna karar verildi. Fiksasyon süreleri hücrelere göre 30dk ile 24 saat aralığında değişik uzunluklarda tutuldu. Kültür hücreleri ve ovositler postfikse edildiğinde daha iyi sonuç alınırken kan hücrelerinde ve spermatozoonlarda postfiksasyona gerek duyulmadı. Tek hücrelerin hepsinin, kurutma aşamasını kolaylaştıran ve yüzey gerilimini en aza indiren etanolun artan derişimlerinde 10-1 5dk arasında dehidrate edilmesine karar verildi. Kan hücreleri dışında bütün hücreler CPD'de üç kez yıkanarak kurutuldu. Daha sonra hücreler yüzey yapılarına ve büyüklüklerine göre 10-15nm kalınlığında Au-Pd ile kaplandılar. Yukardaki işlemlerin uygulanması halinde yapılan çalışmalarda yüzeye tutunma probleminin ortadan kalktığı, hücre kaybının olmadığı ve yüzey yapılarının iyi korunduğu görüldü. Anahtar Sözcükler: kan hücreleri, kültür hücreleri, ovosit, preparasyon, spermatozoon, taramalı elektron mikroskobu

Abstract:
Development of Preparation Methods For Examing Single Cells In Scanning Electron Microscope ABSTRACT In this study we aimed to develop preparation methods for examining single cells for scanning electron microscopical detection. Blood cells, culture cells, oocytes and spermatozoons were used as single cells. These cells were fixed for different time periods with Trump's solution, Karnowsky solution an glutaraldehyde+sodium phosphate buffer. Then the cells were fixed for different time periods with osmium tetraoxide+ sodium phosphate buffer. The cells which were postfixed were then dehydrated by using acetone or ethanol. The cells were dried using critical point dryer (CPD) or in air. Dried cells were coated with gold- palladium (Au-Pd) using a sputter coater in different thickness and examined in scanning electron microscope using secondary electron detector.During the chemical and mechanical processes implemented, how good the surface structure of the cells were protected and whether there is cell loss or not have been investigated. As a result, were Trump's fixatvie appeared to be the most suitable fixative for all cells. Varying fixation periods tested from 30 minutes to 24 hours. When cultured cells and oocytes were postfixed, better results were taken however post-fixation is not so effective in blood cells and spermatozoa. It is concluded that all of the single cell preparations need have been dehydration using varying concentrations of ethanol, which facilitates the drying process and minimizes surface tension in 10-15 minutes. Furthermore, all cell preparations had to be coated with Au-Pd in 10-15nm thickness in order to preserve the surface ultrastructure. In the condition that the mentioned procedures above have been implemented, it is concluded that the problem of implamantation to surface has been disappeared, there has not been cell loss and the surface structures have been protected in good condition. Conclusively, fixation, dehydration and drying processes used in isolated cell preparations vary due to the all type. Key Words: blood cells, cultured cells, oocyte, preparation, scanning electron microscope, spermatozoon