Psikoaktif maddelerden mefedronun antikolinerjik etkinliğinin in vitro araştırılması
In vitro investigation of anticholinergic efficacy of mephedrone, a psychoactive substance
Yazar: BEGÜM YURDAKÖK DİKMEN
Danışman: PROF. DR. HALİT SİNAN SÜZEN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Adli Bilimler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine
Dizin: Adli toksikoloji = Forensic toxicology ; Adli tıp = Forensic medicine ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Biyoinformatik = Bioinformatics ; Gen ifadesi = Gene expression ; Katinon = Cathinones ; Mefedron = Mephedrone ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Parasempatolitikler = Parasympatholytics ; Toksikoloji = Toxicology

Özet:
Kanser biyolojisinde önemli olan non-nöronal kolinerjik sistem ve otokrin sinyal yolaklarının modülasyonu için uygulama protokollerine klasik antimuskarinik tedavilerin eklenmesi prognozu iyileştirmekte, ancak kronik kullanımda demans gibi istenmeyen etkilere neden olabilmektedir. Kanser kolinerjik sisteminde etkisi olabilecek ancak potansiyel istenmeyen etkili maddeler ise halen araştırılmaktadır. Bu potansiyel maddeler içerisinde yer alan suistimal edilen ilaçların ilaç yeniden konumlandırma çalışmaları ise giderek önem kazanmaktadır. Kuzey Doğu Afrika ve Arap Yarımadası bölgelerinde endemik olarak yetişen ve stimulan etkisi olan khat bitkisinin ana etken maddesi olan katinon bileşiğinin sentetik türevleri; amfetaminlerin yasaklanmasını takiben, 2000'lerin ortalarından bu yana, Avrupa uyuşturucu pazarında ortaya çıkmıştır. 2010'a kadar olan dönemde en yaygın satılan katinonların arasında ise mefedron ve metilon yer almıştır. 2012 yılında kathinon ve metkathinone, Birleşmiş Milletler 1971 Psikotrop Maddeler Sözleşmesinin I Programında listelenmiş ve AB Üye Devletlerinde (2010/759/EU) kontrol kararı alınmıştır. Ülkemizde katinon farmakofor grubunu kapsayan jenerik sınıflandırma metni 06 Şubat 2015 tarihli ve 29259 Sayılı Resmi Gazete'de yayımlanan 26/01/2015 tarihli ve 2015/7238 Sayılı Bakanlar Kurulu Kararı ile 2313 Sayılı Uyuşturucu Maddelerin Murakabesi Hakkında Kanunun 19. Maddesi hükümlerinde yer almaktadır ve yasaklanmıştır. Yasaklanmalarına karşın tasarım ilaçlardan sentetik katinonlar, özellikle belirli alt popülasyonlar tarafından MDMA, kokain ve diğer stimulanlara alternatif olarak hala kullanılmakta, dark web gibi internet sitelerinde "miyav miyav, M-Cat veya dron" gibi isimlerle satılmaktadır.  Mefedron, öfori, artan duyular ve duyusal algı, sosyalliğin teşviki, gelişmiş enerji, zihinsel uyarım, açıklık, empatik bağlantı ve artan libido gibi bazı etkileri nedeniyle uyuşturucu olarak yaygın olarak tüketilmektedir. Bu etkiyi ise; serotonin, dopamin ve norepinefrin için monoamin plazma membran taşıyıcıları ile etkileşime girerek; bu nörotransmitterlerin serbest bırakılmalarını teşvik ederken, geri alımlarını bloke ederek gösterir. Özellikle bağırsak motilitesinde azalma, taşikardi gibi semptomların kolinerjik sistem ile ilişkisi ve dopaminerjik sistemin doğrudan kolinerjik M1 reseptörleriyle ilişki değerlendirildiğinde bu bileşiklerin kolinerjik sistem üzerine olası etkisi bu tezin araştırma konusunu oluşturmuştur. Katinonların ise glioblastoma gibi farklı nöronal hücrelerde kompleks hücresel iletişimin olduğu tümörlerde kullanılabilmesine ilişkin bir araştırma bulunmamaktadır. Sentetik katinonlardan mefedronun kolinerjik etkinliğini değerlendirmek amacıyla tez kapsamında in silico araştırma kapsamında moleküler docking kullanılarak kolinerjik reseptör proteinleri ve mefedron bağlanma afinitesi; biyoinformatik olarak adölesan CD-1 fareye uygulanan 10 mg/kg mefedron uygulanmasına ilişkin veri seti (PubMed, Veri Seti No: GSE58279) kullanılarak DAVID ve Webgestalt ile yapılan gen ifade düzeylerindeki farklılıklar ve yolakların değerlendirmesi; in vitro olarak insan primer glioblastoma hücre hattı U-87'ye IC50 dozu altında uygulanan mefedronun kolinerjik genler (CHRM1, CHRM3, CHRM5, CHRN1a) mRNA ifadesinin rt-PZR ile araştırmaları yapılmıştır. Araştırma in silico bulgularına göre mefedrona en yüksek bağlanma afinitesi Muskarinik asetilkolin reseptörü M1 reseptörü için bulundu; bunu sırasıyla M4, M3, M2 ve M5 takip etti. Nikotinik reseptörlerden ise değerlendirmeye alınan (Alfa9 ve Alfa3Beta4) proteinlerden Alfa9 en yüksek bağlanma afinitesine sahipti. İn vitro deneylerde de U-87 hücrelerine (166,67 µg/ml- 81,38 ng/ml) uygulanan mefedronun IC50 değeri 31,656±1,28 µg/ml olarak tespit edildi. IC50 değerinin altındaki değerlerde uygulanan mefedron ise mRNA ifadesini muskarinik reseptörler içerisinde en yüksek olarak yine M1 için arttırdı (5,22 kat artış), bunu M5 (4,16) ve M3 (2,19) izledi. Bu bulgular, mefedronun literatür bilgilerde sunulan klinik bulguların dopaminerjik etkinliği için M1 uyarımı gerekliliği ve erkek cinsel aktivitesinde artış arasındaki laboratuvar ve klinik çalışmalarını destekler niteliktedir. In vivo kohort bulgularında ise anlamlı (p<0,05) ve belirgin bir değişiklik gözlenmemiştir (Sırasıyla M1, M3 ve M4 için sırasıyla 0,023, 0,003, 0,055 kat azalma ve M2 ile M5'de sırasıyla 0,139 ve 0,025 kat artış). Yine biyoinformatik bulgularına göre 2783 gende mefedron uygulamasına bağlı kontrol grubuna göre farklılık tespit edildi (p<0,05). En anlamlı farklılık (p=0,0000000232; adj p=0,0007) en düşük p değeri ile mitokondride lokalize olan ve demir-kükürt küme biyogenezinde kritik bir rol oynayan bir proteini kodlayan NFU1 (NFU1 iron-sulfur cluster scaffold) geni olarak bulundu. Tez konusu olan kolinerjik reseptörler içerisinde anlamlı farklılık görülen (kontrol grubuna göre ifadesinde 0,123 kat artış ile) tek gen CHRNA10 (Nikotinik kolinerjik reseptör, alfa polipeptid 10) için bulundu (p=0,0234). Bu gen insan protein atlasında da glioma hastalarından alınan örneklerde kontrol grubuna göre daha yüksek ifade edilmiştir. DAVID 2021 analizine göre, zenginleştirme skoru >1,3 bulunan fonksiyonel anotasyon kümeleme yapılmış yolak listesine göre RNA-bağlanma yolağı en fazla etkilenen yolak olarak (20 gen ile p=0,000002) bulunmuştur. Benzer şekilde asetilasyonla ilgili yolaklar da en çok etkilenen yolaklar arasındadır (%31,3). Hem Webgstalt hem de DAVID yolak analizlerinde mefedron uygulanmasına bağlı anlamlı olarak etkilenen yolak olarak nükleer pre-mRNA'dan intronların çıkarılmasını katalize eden büyük bir RNA-protein kompleksi olan splaysozom (spliceosome) mekanizması bulundu. Tez çalışması bulguları, özellikle glioma hücrelerinde muskarinik ve nikotinik reseptör gen ifadesinde anlamlı artış tespit edilmesi; hem zehirlenme vakalarında uygun tedavi yaklaşımı hem de gliomalarda olası ilaç konumlandırma çalışmaları için önemli bir alt yapı sunmuştur.

Abstract:
The addition of classical antimuscarinic therapies to the application protocols for the modulation of the non-neuronal cholinergic system and autocrine signaling pathways, which are important in cancer biology, improves the prognosis, while in chronic use, it may cause undesirable effects such as dementia. These potential substances having an effect on the cancer cholinergic system, are still under investigation. Drug repositioning studies of illicit drugs, which are among these potential substances, are becoming increasingly important. Synthetic derivatives of the cathinone compounds, which is the main active ingredient of the khat plant has appeared on the European drug market since the mid-2000s, following the banning of amphetamines. Traditional khat plant grows in the endemic regions of North East Africa and the Arabian Peninsula and used for its stimulating effect recreationally. Mephedrone and methylone were among the most widely sold cathinones in the period up to 2010. In 2012, cathinone and metcathinone were listed in Schedule I of the United Nations 1971 Convention on Psychotropic Substances and a control decision was taken in the EU Member States (2010/759/EU). In Turkey, the generic classification covering the cathinone pharmacophore group is included in the provisions of the 19th Article of the Law No. 2313 on the Supervision of Narcotic Substances with the Council of Ministers Decision dated 26/01/2015 and numbered 2015/7238 published in the Official Gazette dated 06 February 2015 and numbered 29259 and is prohibited. Despite being banned, synthetic cathinones from designer drugs are still used as an alternative to MDMA, cocaine and other stimulants, especially by certain subpopulations, and are sold on websites such as the dark web as "meow meow, M-Cat or drone". Mephedrone is widely consumed as a narcotic due to some of its effects such as euphoria, heightened senses and sensory perception, promotion of sociability, enhanced energy, mental stimulation, openness, empathetic connection, and increased libido. This pharmacological effect is controlled by interaction with monoamine plasma membrane transporters for serotonin, dopamine and norepinephrine through blocking their reuptake while promoting the release of these neurotransmitters. The clinical symptoms such as decreased intestinal motility, tachycardia indicate a possibility of cholinergic interaction, provides the basis of the thesis research question. There are no research on the use of cathinones in tumors with complex cellular communication in different neuronal cells, such as glioblastoma. In order to evaluate the cholinergic activity of mephedrone three levels of research were conducted: bioinformatics, in silico and in vitro. For the in silico part, cholinergic receptor proteins and mephedrone binding affinity were evaluated used docking, for bioinformatic part, already available dataset (PubMed, Data Set No: GSE58279) including administration of mephedrone at 10 mg/kg to adolescent CD-1 mice were used and evaluated using DAVID and Webgestalt; and last for the in vitro  primary glioblastoma cell line U-87 treated with the tested drug were evaluated for the mRNA expression of the cholinergic genes (CHRM1, CHRM3, CHRM5), using rt-PCR. The highest binding affinity to mephedrone was found for the Muscarinic acetylcholine receptor M1 receptor; followed by M4, M3, M2 and M5 respectively. Among the nicotinic receptors (Alpha9 and Alpha3Beta4) Alpha9, had the highest binding affinity. In in vitro experiments, the IC50 value of mephedrone (with treatment concentratiopns of 166,67 µg/ml- 81,38 ng/ml) was determined as 31,656±1.28 µg/ml. Mephedrone applied at values below the IC50 increased mRNA expression the highest among muscarinic receptors again for M1 (5,22 fold increase), followed by M5 (4,16) and M3 (2,19). These findings support the laboratory and clinical studies of mephedrone between the requirement of M1 stimulation for dopaminergic activity of the clinical findings presented in the literature and the increase in male sexual activity. No significant (p<0,05) or significant change was observed in in vivo cohort findings (0,023, 0,003, 0,055-fold decrease for M1, M3, and M4, respectively, and 0,139 and 0,025-fold increase for M2 and M5, respectively). Again, according to the bioinformatics findings, a difference was found in 2783 genes compared to the control group due to mephedrone application (p<0,05). The most significant difference (p=0,0000000232; adj p=0,0007) was found as NFU1 (NFU1 iron-sulfur cluster scaffold) gene, which encodes a protein localized in mitochondria and plays a critical role in iron-sulfur cluster biogenesis. Among the cholinergic receptors that are the subject of the thesis, the only gene with a significant difference (with 0,123-fold increase in expression compared to the control group) was found for CHRNA10 (Nicotinic cholinergic receptor, alpha polypeptide 10) (p=0,0234). This gene was also expressed higher in the human protein atlas in samples taken from glioma patients compared to the control group. According to the DAVID 2021 analysis, the RNA-binding pathway was found to be the most affected pathway (p=0,000002 with 20 genes) according to the functional annotation clustered pathway list with an enrichment score >1,3. Similarly, acetylation-related pathways are among the most affected (31,3%). Both the Webgstalt and DAVID pathway analyzes found the mechanism of the spliceosome, a large RNA-protein complex that catalyzes the removal of introns from the nuclear pre-mRNA, as the pathway significantly affected by mephedrone administration. The findings of the thesis study, especially in glioma cells U-87 with a significant increase in muscarinic and nicotinic receptor gene expression; provided an important basis for prudent treatment approaches in poisoning cases and possible future drug positioning studies in gliomas.