Torasik aortik anevrizmalarında oksidatif stres ve apoptozla ilişkili gen anlatımlarının incelenmesi
Investigation of gene expressions related to oxidative stress and apoptosis in human thoracic aortic aneurysms
Yazar: ZELAL ADIGÜZEL
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA ; DR. CEYDA AÇILAN AYHAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Torasik aortik anevrizma (TAA), nispeten nadir görülen, ölüm riski çok yüksek bir hastalıktır. Reaktif oksijen türlerinin (ROT) bu hastalığın patogenezinde önemli bir rolü olduğu gösterilmiştir. Artmış oksidatif stres, aorttaki düz kas hücrelerinde apoptoza yol açar. Bu hücrelerin kaybı TAA gelişimine yol açan en önemli faktörlerden biridir. 
Bu çalışmanın amacı, torasik aortik anevrizmalı (deney grubu) ve anevrizmasız (kontrol grubu) dokulardan çıkan hücrelerde oksidatif stres ve apoptoz ile ilgili bazı genlerin anlatım düzeylerini karşılaştırarak TAA'da ölüm yolaklarına ilişkin mevcut bilgilere katkıda bulunmaktır.
Anevrizmalı ve anevrizmasız dokular, Kartal Koşuyolu Eğitim ve Araştırma Hastanesindeki uzman hekimler tarafından, etik kurul onayı ile cerrahi operasyon sırasında toplandı. Doku örnekler kullanılarak primer hücre kültürleri kuruldu. Düz kas hücrelerinde oksidatif stresi indüklemek için oksisteroller (7-ketokolesterol ve 25-hidroksikolesterol) kullanıldı. Bu ajanlar uygulandıktan sonra hücre içi ROT düzeyleri belirlendi. ROT'a bağlı ölüm yanıtı, antioksidan (resveratrol ve N-asetilsistein) uygulamaları ile doğrulandı. Oksidatif strese karşı bu hücrelerin apoptoz mekanizmasıyla öldüğü, canlı hücre mikroskopisi, DNA kondensasyonu/ fragmentasyonu analizleri ve kaspaz 3 aktivitesi ölçümleriyle belirlendi. 
Seçilen bir dizi genin (Bax, p53, kaspaz 3, Akt1 ve Akt2), TAA hücrelerinin apoptozundaki rolü gen susturma teknolojisiyle araştırıldı. Gen susturma etkinliği, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) ile doğrulandı. Ek olarak, oksidatif stres yanıtı ile ilişkili SOD ve Nox4 genlerinin anlatım düzeyleri incelendi.
Oksisterollerin hem deney hem de kontrol hücrelerinde oksidatif stresi indükleyerek apoptoza yol açtığı ve kaspaz 3 aktivitesini artığı belirlendi. Bununla beraber bu hücrelerde apoptotik genlerden Bax, p53 ve kaspaz 3'ün ve oksidatif stres yanıtı genlerinden SOD ve Nox4'ün anlatım düzeyi anlamlı bir değişim göstermedi.
Bu bulgularla, 1) TAA'larda oksisterollerle indüklenen oksidatif stresin apoptoz ile sonuçlanarak hücrelerin ölümüne yol açtığı; 2) SOD ve Nox4 anlatımını değiştirmediği; 3) hücre ölümünün Bax, p53 ve kaspaz 3 moleküllerinden bağımsız meydana geldiği; 4) anti-apoptotik Akt1 ve Akt2 gen anlatımlarının azaltılması ile hücre ölümünün artmadığı ve 5) tüm bu süreçlerin anevrizmasız dokulardan çıkan hücrelerdekine benzer bir şekilde gerçekleştiği sonucuna varıldı.
TAA'nın tüm mekanizmasını daha iyi anlamak için ilgili tüm genleri protein düzeyinde de çalışmak ve diğer ölüm yolaklarını araştırmak gereklidir.

Abstract:
Thoracic aortic aneurysm (TAA) is a relatively rare disease with a high risk of mortality. It has been shown that reactive oxygen species (ROS) play an important role in the pathogenesis of this disease. Increased oxidative stress induces apoptosis in smooth muscle cells within the aorta. Loss of these cells is one of the prominent factors lead to development of TAA. 
The aim of this study is to contribute to current knowledge on death pathways in TAA by comparing the expression levels of some genes related to oxidative stress and apoptosis in smooth muscle cells from aneurysmal (experimental group) and non-aneurysmal (control group) tissues.
Both aneurysmal and non-aneurysmal tissues were collected during the surgical operation by expert medical doctors at Kartal Kosuyolu Training and Research Hospital with the approval of ethics council. Primary cell cultures were established using the tissue samples. Oxysterols (7-ketocholesterol and 25-hydroxycholesterol) were used to induce oxidative stress in smooth muscle cells. Intracellular ROS levels were determined after the treatment with these agents. The cell death in response to ROS was confirmed via treatment with antioxidant agents, resveratrol and N-acetylcysteine. The mean of cell death via apoptosis was determined by live cell imaging microscopy, DNA condensation/fragmentation analyses and caspase 3 activity measurements.
The role of a selected set of genes (Bax, p53, caspase 3, Akt1 and Akt2) in the apoptosis of TAA cells was investigated using gene silencing technology. The silencing efficiency was verified using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). In addition, expression levels of SOD and Nox4 genes involving oxidative stress response were analyzed.
It was observed that oxysterols caused apoptosis through inducing oxidative stress, and increased caspase 3 activity in both experimental and control cells. However, expression level of apoptotic genes, Bax, p53 and caspase 3, and oxidative stress response genes, SOD and Nox4 did not change significantly in these cells.
With these findings, it was concluded that 1) the oxidative stress response has triggered cell death via apoptotic pathways in TAAs; 2) SOD and Nox4 expression levels have not changed; 3) cells could undergo apoptosis independent of Bax, p53 and caspase 3; 4) cell death has not been enhanced by silencing anti-apoptotic genes, Akt1 or Akt2; and 5) all these processes in TAAs have occurred similar to non-aneurysmal tissues.
For a better understanding of whole mechanism of TAA all related genes might be studied on protein level and other death pathways should also be investigated.