Toxocara canıs inorganik pirofosfatazının (TC-PYP) moleküler karakterizasyonu, rekombinant TC-PYP'nin immunojenitesi ve koruyucu etkinliğinin araştırılması
Molecular characterization of toxocara canis inorganic pyrophosphatase (TC-PYP) and investigation of the immunogenicity and protective efficacy of recombinant TC-PYP
Yazar: GAMZE YETİŞMİŞ
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Toxocara canis dünya çapında yaygınlık gösteren ihmal edilmiş zoonotik bir nematod olup, parazitin son konağı köpekler, paratenik konakları ise insan dahil birçok omurgalı hayvanlardır. Toxocara canis hem köpek yavrularında oluşturduğu hastalık tablosu hem de insanlarda iç organ larva göçüne sebebiyet vermesinden dolayı veteriner ve medikal önemi yüksek olan paraziter enfeksiyonlar arasında yer almaktadır. Özellikle enfeksiyonun etkin kontrolü noktasında yüksek katkı sağlayacak potansiyel aşıların geliştirilmesi oldukça önem arz etmektedir. Günümüze kadar her ne kadar bazı deneysel araştırmalar bulunsa da toxocariasis'e karşı ticari bir aşı geliştirilmemiştir. Bu noktadan hareketle çalışmamızda nematod parazitlerin özellikle larval gelişiminde önemli fonksiyonları olan ve potansiyel bir aşı adayı olarak nitelenen inorganik pirofosfatazların (PPaz) bir homoloğu (Tc-PYP) Toxocara canis nesillerinde tanımlanmış ve bu enzimi kodlayan gen bölgesi nükleotid ve amino asit sekansları yönünden karakterize edilmiştir. Tc-PYP geninin kodlama bölgesi sekansının 1080 bp uzunluğunda olduğu, 360 amino asit zinciri içeren 40,5 kDa büyüklüğünde bir proteini kodladığı belirlenmiştir. Tc-PYP amino asit dizisinin filogenetik analizleri, T. canis PPaz'ının Baylisascaris schroederi, Ascaris suum ve Anisakis simplex PPaz'ları ile yakın ilişkili olduğunu göstermiştir. Tc-PYP proteinin nonsitoplazmik tek bir domaine ve toplam 18 antijenik bölgeye sahip olduğu, izoelektronik noktasının da 6.62 olduğu belirlenmiştir. Çalışmamızda F(I)CA ile adjuvanize rTc-PYP'nin fare modelinde immunizasyon çalışmaları ile aşı etkinliği ve antikor ile sitokin yanıtları üzerine etkisi değerlendirilmiştir. rTc-PYP immunizasyonunun yüksek düzeyde antijen spesifik total IgG, IgG1, IgG2a ve IgG2b yanıtlarını indüklediği, IgE antikor yanıtını ise uyarmadığı saptanmıştır. Sitokin yanıtları ile ilgili olarak rTc-PYP'nin Th1 sitokinleri interferon-gama ve interleukin IL-2 ifade düzeylerine etki göstermediği ancak Th2 sitokinlerinden IL-10 ifade düzeyini istatistik olarak önemli düzeyde yükselttiği, IL-4 ifade düzeyinde de artışa yol açtığı tespit edilmiştir. rTc-PYP immunizasyonunun akciğer ve karaciğerde göç geçiren T. canis L3 sayısında önemli ölçüde azalmaya yol açtığı ve aşı etkinliğinin %72,8 olduğu belirlenmiştir. 
Sonuç olarak bu tez çalışması ile, rTc-PYP ile aşılanan farelerde Th2-aracılı bağışıklığın uyarılarak T. canis'e karşı iyi düzeyde bir koruma sağlandığı gösterilmiş olup özellikle enfeksiyonun kontrolü noktasında rTc-PYP'nin son konak köpeklerde kullanılabilir potansiyel bir aşı adayı olabileceği düşünülmüştür. Bu çerçevede yeni araştırmalara ihtiyaç bulunmaktadır. 
Anahtar kelimeler: Toxocara canis, İnorganik Pirofosfataz, Gen Ekspresyonu, Rekombinant antijen, biyoteknolojik aşı

Abstract:
Toxocara canis is a neglected zoonotic nematode that is widely prevalent worldwide. The parasite's definitive host is dogs, and its paratenic hosts include various vertebrate animals, including humans. Toxocara canis is of high veterinary and medical importance due to the disease it causes in dog puppies and its ability to cause larval migration in humans, affecting internal organs. The development of potential vaccines that would contribute to effective control of the infection is considered crucial. While some experimental research has been conducted, no commercial vaccine has been developed against toxocariasis to date. In the current study, a homolog (Tc-PYP) of inorganic pyrophosphatases (PPases) was identified in T. canis lineages. The region encoding the Tc-PYP gene was characterized in terms of nucleotide and amino acid sequences. The coding region of the Tc-PYP gene was found to be 1080 bp long, encoding a protein with a chain of 360 amino acids and a size of 40.5 kDa. Phylogenetic analysis of the Tc-PYP amino acid sequence showed its close relationship with PPases of Baylisascaris schroederi, Ascaris suum, and Anisakis simplex. The Tc-PYP protein was found to have a single non-cytoplasmic domain and a total of 18 antigenic regions. Its isoelectric point was determined to be 6.62. In our study, the efficacy of rTc-PYP, an adjuvanted form of the protein, was evaluated through immunization studies in a mouse model. It was observed that rTc-PYP immunization induced high levels of antigen-specific total IgG, IgG1, IgG2a, and IgG2b responses, while not stimulating IgE antibody response. Regarding cytokine responses, rTc-PYP did not affect the expression levels of Th1 cytokines interferon-gamma and interleukin IL-2, but it significantly elevated IL-10 expression, a Th2 cytokine, and led to an increase in IL-4 expression. Immunization with rTc-PYP resulted in a significant decrease in the number of T. canis L3 larvae migrating to the lungs and liver, with an efficacy of 72.8%.
In conclusion, this study demonstrated that immunization with rTc-PYP induced a Th2-mediated immune response and provided a good level of protection against T. canis in mice. It suggests that rTc-PYP could be a potential vaccine candidate for controlling T. canis infection, particularly in the definitive host, dogs. Further research is needed within this framework.

Key words: Toxocara canis, Inorganic Pyrophosphatase, Gene Expression, Recombinant antigen, biotechnological vaccine.