Laktoperoksidaz enziminin sığır ve koyun sütlerinden afinite kromatografisi tekniği ile saflaştırılması
Purification of lactoperoxidase enzyme from bovine and sheep milk by affinity chromatography technique
Yazar: HANDE USANMAZ
Danışman: PROF. DR. HASAN ÖZDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Sığır sütünden laktoperoksidaz (LPO E.C.1.11.1.7)  enzimi CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B-L-trozin-sülfanilamid afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. LPO  üzerine  2-kloro-4-sülfamoyilanilin, 5-amino-1-naftalin sülfonilamid, 4-amino-6-kloro-1,3-benzendisülfanilamid, 4-amino-3-metil ve 3-amino-4-kloro benzensülfonilamid moleküllerinin  IC50 değeri sırasıyla 346,5 µM, 57,75 µM, 11,36 µM, 86,62 µM ve 49,5 µM olarak hesaplanırken,  Ki değerleri ise sırasıyla 283,32 µM, 6,74 µM, 6,39 µM  55,62 µM  ve 43,67 µM olarak tespit edildi. 4-Amino-3-metil benzensülfonilamid yarışmasız inhibisyon gösterirken diğer moleküller yarışmalı inhibisyon gösterdi. İnhibisyon gösteren moleküllerin her biri için afinite jelleri hazırlanarak sığır sütünden LPO enziminin saflaştırma tabloları hazırlandı. Saflaştırma basamakları sonucunda 2-kloro-4-sülfamoyilanilin kolonundan sığır  sütü LPO enzimi   %12 verimle 453 kat saflaştırılırken koyun sütü LPO enzimi  %13 verimle 869 kat  saflaştırıldı.  Enzimlerin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve tek bant bulundu (80 kDa). 2-kloro-4-sülfamoyilanilin kolonudan saflaştırılan sığır sütü LPO için optimum pH  6,0, optimum sıcaklık 42°C,  KM değeri 0,13 mM ve Vmax değeri 0,55 EÜ/ml.dk iken  koyun sütü LPO için optimum pH 5,5,  optimum sıcaklık 60°C,  KM değeri 0,74,  mM ve Vmax değeri 0,05 EÜ/ml.dk olarak tespid edildi. 2-Kloro-4-sülfamoyilanilin kolunu için LPO'nun bağlanma kapasitesi 15°C'de pH:8,5 ve 0,35 M iyonik şiddet konsantrasyonunda 9,65 mg/g jel olarak belirlendi.

Abstract:
Bovine milk Lactoperoxidase (LPO E.C.1.11.1.7 ) enzyme was purified by Sepharose 4B-L-tyrosine sulfanilamide affinity column choromatoghrophy that activated with CNBr. 2-Chloro-4-sülfamoyilanil, 5-amino-1-naphthalene sulfanilamide, 4-amino-6-chloro-1,3-benzendisülfanilamid and 3-amino-4-chloro benzensülfonilamid showed the competitive inhibition IC50 values were calculated as respectively 346,5 μm, 57,75 μm, 11,36 μm, 86,62 µM and 49,5 μm. On the other hand Ki values determined were respectively 283.32 μm, 6,74 μm, 6,39 μm, 55,62 µm and 43,67 μm. 4-amino-3-methyl benzensülfonilamid inhibitor exhibited noncompetitive inhibition, but the others exhibited competitive inhibition. Affinity gels are prepared for each: inhibitor compound and LPO enzyme purification table were prepared from the bovine and sheep  milk. As a result of purification steps through a column of 2-chloro-4-sülfamoyilanil bovine milk LPO enzyme was purified 453 fold with 12% yield and sheep milk LPO enzyme was purified 869-fold with 13% yield. The purities of the purified enzymes were checked by SDS-PAGE and one band was found (80 kDa). For each enzyme bovine the milk LPO that purified from 2-chloro-4-sülfamoyilanil colon, optimum pH was 6,0, optimum temperature was 42°C, KM values was 0,13 mM and Vmax values was 0,55 EU / ml.dk while for sheep milk LPO optimum  was 5,5, optimum temperature was 60ºC, KM value of 0,74 mM and Vmax values of 0,05 EU / ml.dk were determined. Binding capacity of LPO by 2-chloro-4-sülfamoyilanil column was determined 9,65 mg / g gel at 15°C pH: 8,5 and at a concentration of 0,35 M ionic strength.