Sisplatinle oluşturulan in vivo ve in vitro nörotoksisitede klorojenik asitin rolü
The role of chlorogenic acid in cisplatin induced peripheral neuropathy in vivo and neurotoxicity in vitro
Yazar: ÇİĞDEM ÇENGELLİ ÜNEL
Danışman: PROF. DR. KEVSER EROL
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Klorojenik asit = Chlorogenic acid ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Nöropatiler = Neuropathies ; Nörotoksinler = Neurotoxins ; Sisplatin = Cisplatin ; Toksisite = Toxicity ; İn vitro = In vitro ; İn vivo = In vivo

Özet:
Amaç: Çalışmada klorojenik asitin (CGA) primer sıçan dorsal kök gangliyon (DRG) hücre kültüründe sisplatinin (CIS) sebep olduğu nörotoksisitede ve yetişkin sıçanlarda sisplatinle oluşturulan periferik nöropatide (PN) potansiyel nöroprotektif ve antihiperaljezik etkilerinin ve bu etkilerde nitrik oksitin (NO) rolünün araştırılması amaçlanmıştır. 
Kapsam: CIS birçok tümörün tedavisinde yaygın olarak kullanılan antikanser ajandır. PN, CIS kullanımında en önemli doz-kısıtlayıcı yan etkidir. CGA antioksidan, antiinflamatuvar, nöroprotektif etkileri gösterilmiş, besinlerde bulunan fenolik bir bileşiktir. Çeşitli nöropatik ağrı çalışmalarında antihiperaljezik etkileri de olduğu bulunmuştur.
Yöntem: İlk olarak, CIS (200 µM) in vitro nörotoksisitesinde CGA'nın (250-1000 µM) etkileri 1 günlük yavru sıçanlardan elde edilen DRG hücre kültüründe MTT testiyle değerlendirilmiştir. In vivo deneylerde ise CIS 3 mg/kg dozunda 5 hafta boyunca haftada 1, Sprague Dawley sıçanlara (250-350 kg, n=8) ip uygulanarak PN gelişmesi sağlanmıştır. Tek doz CGA (50, 100, 200 mg/kg) ip uygulanmasıyla akut etkileri değerlendirilmiş olup, CGA (100 mg/kg) CIS ile beraber uygulanarak kronik etkileri de değerlendirilmiştir. L-arginin (LARG) ve L-nitro-arginin-metil-ester (LNAME) 10 mg/kg ip uygulanmıştır. Nöropati mekanik allodini, termal hiperaljezi, kuyruk sıkıştırma, soğuk plaka testleriyle değerlendirilmiştir. Motor koordinasyon testleri olarak rotarod ve ayak izi analizi, motor aktivite için de aktivitemetre uygulanmıştır. DRG, siyatik sinir, karaciğer ve böbreklerde histolojik değerlendirme toluidin mavisi, hemotoksilen eozin ve Masson trikrom boyamasıyla yapılmıştır. TNF-α, GSH, IL-19 ve NGF sıçanlardan alınan serum örneklerinde çalışılmıştır. Verilerin değerlendirmesinde iki yönlü varyans analizi ve Kruskal Wallis uygulanmıştır.
Bulgular: Yüksek konsantrasyonlardaki (1000 µM) CGA'nın primer DRG hücre kültüründe sisplatin nörotoksisitesine karşı koruyucu potansiyeli olduğu görülmüştür. CIS mekanik allodini ve soğuk allodiniye neden olmuştur. Termal hiperaljezi ve kuyruk sıkıştırma testinde anlamlı bir değişme saptanmamıştır Aynı zamanda CIS'ın motor koordinasyonu bozduğu ve motor aktiviteyi azalttığı görülmüştür. CGA, CIS'in allodinik etkilerini anlamlı olarak düzeltmiştir. Bozulan motor aktivite ve motor koordinasyonu da iyileştirmiştir. LARG ve LNAME CGA'nın iyileştirici etkilerini mekanik allodinide değiştirmezken, soğuk allodini testinde, motor aktivite ve motor koordinasyon testlerindeki iyileştirici etkilerini azalttıkları görülmüştür. CIS'ın neden olduğu periferik dokulardaki yapısal toksisiteyi de CGA'nın azalttığı gözlenmiştir. Ayrıca CIS uygulaması sonucu artan TNF-α düzeylerini CGA'nın azalttığı bulunmuştur. TNF-α düzeylerinin diğer bütün gruplarda kontrole göre yüksek olduğu da görülmüştür.
Sonuç: CGA, CIS'in neden olduğu PN ve nörotoksisitede antihiperaljezik ve sitoprotektif etkiler göstermiştir. Bu yararlı etkileri, incelenen periferik dokuların histolojisi ve önemli inflamatuvar belirteç olan TNF-α düzeylerini azalttığı gösterilerek desteklenmiştir. Sisplatine bağlı gelişen PN'nin mekanizma tabanlı tedavisinde kullanılabilecek aday bir ajan olabilir. NO'nun bu etkide modülatör rolü olabileceği düşünülmüştür.

Abstract:
Aim: The aim of study was to investigate potential neuroprotective and antihyperalgesic effects of chlorogenic acid (CGA) against cisplatin (CIS) neurotoxicity in primary dorsal root ganglion (DRG) in vitro and CIS-induced peripheral neuropathy (PN) in vivo and the role of NO in these effects.
Content: CIS is an anticancer agent widely used in the treatment of many tumors. PN is the most important dose-limiting side effect of CIS. CGA is a phenolic compound with antioxidant, antiinflammatory, neuroprotective effects and abundant in foods. Anti-hyperalgesic effects of CGA were proposed in different neuropathic pain studies.
Method: The effects of CGA (250-1000 µM) were evaluated by MTT test against CIS (200 µM) neurotoxicity in primary DRG culture. CIS was administered to Sprague Dawley rats (250-350 kg, n = 8) at a dose of 3 mg/kg once a week for 5 weeks to develop PN. The acute effects were evaluated by single dose CGA (50, 100, 200 mg/kg) against CIS neuropathy. CGA (100 mg/kg) was concurrently administered with CIS to evaluate chronic effects. L-arginine (LARG) and L-nitro-arginine-methyl-ester (LNAME) 10 mg/kg i.p. were administered to evaluate the contribution of NO. Neuropathy was tested by mechanical allodynia, thermal hyperalgesia, tail clip and cold plate tests. Rotarod/footprint analysis and activitymeter were used to evaluate motor coordination and motor performance respectively. Histological evaluations of DRG, sciatic nerves, liver, kidney were performed by using toluidine blue, hemotoxylin eosin and Masson trichrome. TNF-α, GSH, IL-19 and NGF were studied in serum samples from rats. Two-way analysis of variance and Kruskal Wallis were used as statistical analysis. 
Results: Higher concentrations of CGA (1000 µM) were found to be protective against CIS-induced neurotoxicity. CIS caused mechanical allodynia and cold allodynia. There was no significant change in thermal hyperalgesia and tail clip tests. CIS also impaired motor coordination and reduced motor activity. CGA significantly improved allodynic effects of CIS. Impaired motor activity and motor coordination were ameliorated by CGA. Ameliorative effects of CGA were not changed in mechanical allodynia, but reduced in cold allodynia, motor activity and motor coordination tests by LARG and LNAME. CGA also attenuated CIS toxicity in peripheral tissues. CGA decreased levels of TNF-α which was increased in CIS group. TNF-α levels were higher in other groups with respect to control. 
Conclusions: CGA was shown to have protective and antihyperalgesic effects in CIS-induced neurotoxicity and PN. The histology of the peripheral tissues and reduced levels of TNF-α were supported the beneficial effects of CGA. CGA may be a candidate agent for mechanism-based treatment of CIS-induced PN. NO seems to have a modulatory role in this effect.