Fibronektin saflaştırılması için kriyojel monolitik kolonların hazırlanması
Preparation of cryogel monolithic columns for fibronectin purification
Yazar: IŞIK PERÇİN DEMİRÇELİK
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ ; PROF. DR. EROL AKSÖZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology
Dizin: Afinite kromatografisi = Affinity chromatography ; Fibronektinler = Fibronectins ; Jelatin = Gelatin

Özet:
Fibronektin, birçok hücrenin yüzeyinde ve plazma dahil hücrelerarası sıvılarda bulunan yüksek molekül ağırlıklı bir glikoproteindir. Fibronektin, embriyonik gelişim, yara iyileşmesi ve hemostaz gibi birçok önemli fizyolojik süreçte rol alır. Bu nedenle fibronektinin saflaştırılması hem tedavide kullanılması açısından hem de biyolojik açıdan önemlidir. Bu çalışmada fibronektinin afinite kromatografisi yöntemi ile saflaştırılması amaçlanmıştır. Yeni nesil polimerik sistemlerden biri olan poli(hidroksietilmetakrilat) (PHEMA) kriyojel polimer destek olarak hazırlanmış ve ligand olarak fibronektine yüksek afinite gösteren jelatin seçilmiştir. PHEMA kriyojel şişme testleri, infrared spektroskopisi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve yüzey alanı ölçümü ile karakterize edilmiştir. PHEMA kriyojelin kan uyuşabilirliği pıhtılaşma testleri ile araştırılmıştır. Jelatin immobilize PHEMA kriyojele fibronektin adsorbsiyonu sıcaklık, başlangıç fibronektin derişimi, ligand yükleme miktarı, iyonik şiddet, akış hızı ve zaman parametreleri açısından incelenmiştir. Elde edilen verilere adsorbsiyon modelleri ve kinetikleri uygulanmıştır. Jelatin immobilize PHEMA kriyojelin fibronektini ayırmadaki etkinliği albumin, lizozim ve IgG ile karşılaştırılarak FPLC sisteminde gösterilmiştir. Jelatin immobilize PHEMA kriyojel kullanılarak insan plazmasından %64 verimle fibronektin elde edilmiştir. Son olarak, desorbe fibronektindeki konformasyonel değişim florimetre ile araştırılmış, saflığı SDSPAGE ile kontrol edilmiştir.

Abstract:
Fibronectin is a high molecular weight glycoprotein found on the surface of many cells and in extracellular fluids including plasma. It plays a major role in many important physiological processes such as embryogenesis, wound healing and hemostasis. Fibronectin purification is, therefore, important from both a therapeutic and a biological point of view. Purification of fibronectin with affinity chromatography was aimed in this study. Poly(hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) cryogel which is one of the new generation polymeric systems was prepared as the polymer support and gelatin which has a high affinity for fibronectin was chosen as the ligand. PHEMA cryogel characterized by means of swelling tests, infrared spectroscopy, scanning electron microscope (SEM) and surface area measurement. Blood compatibility of PHEMA cryogel was investigated by coagulation tests. Fibronectin adsorption on gelatin immobilized PHEMA cryogel was investigated in terms of temperature, initial fibronectin concentration, ligand loading, ionic strength, flow rate and time parameters. Adsorption models and kinetics were applied to obtained data. Efficieny of gelatin immobilized PHEMA cryogel in fibronectin separation was showed in FPLC system comparing with albumin, lysozyme and IgG. Fibronectin was obtained from human plasma with a yield of 64% by using the gelatin immobilized PHEMA cryogel. Finally, conformational changes in desorbed fibronectin was investigated by fluorometer and purity of it was checked with SDSPAGE.