Proteomik yaklaşımlarla nörodejeneratif mekanizmaların araştırılması ve tedaviye yönelik potansiyel hedeflerin belirlenmesi
The investigation of neurodegenerative mechanisms by using proteomic approaches and determining potential therapeutic targets
Yazar: ÇİĞDEM ACIOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. HAKAN SAVLI ; YRD. DOÇ. DR. AHMET TARIK BAYKAL
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Nöronlar = Neurons ; Proteomikler = Proteomics ; Reseptörler-toll like = Receptors-toll like ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Spinal kord yaralanmaları = Spinal cord injuries ; Spinal yaralanmalar = Spinal injuries

Özet:
AMAÇ: Toll-like reseptör (TLR9) antagonizminin omurilik nöronlarında direkt ve astrosit aracılı etkisinin araştırılması ve TLR9 antagonizminin omurilik nöronlarında meydana getirdiği etkilerin altında yatan moleküler mekanizmaların belirlenmesi amaçlanmıştır. 
YÖNTEM: Nöronal kültürler on üç günlük fare embriyolarının, astroglial kültürler ise üç günlük farelerin omuriliklerinden elde edilmiştir. Etiketsiz karşılaştırmalı proteom analizi nLC-MS/MS kullanılarak yapılmıştır. Nöronal canlılık B-III tubulin pozitif hücreler sayılarak belirlenmiştir. Sitokin/kemokin konsantrasyonları ELISA yöntemi ile ölçülmüştür. Yetişkin farelere T8 kontüzyon hasarı uygulanmıştır.
BULGULAR: nLC-MS/MS analizi ile omurilik nöronlarında TLR9 antagonisti cytidine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotide (CpG ODN) 2088 uygulamasının ardından ekspresyonu değişen (2-kat≤) 201 protein tanımlanmıştır. CpG ODN 2088 Parkin ve gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 1 (GABA(B)R1) protein seviyelerinde artışa neden olmuştur. Omurilik hasarlı farelere CpG ODN 2088 muamelesi Parkin protein seviyesinde hasara bağlı meydana gelen azalmayı baskılamıştır. CpG ODN 2088 ayrıca omurilik nöronlarını kainik asidin (KA) indüklediği eksitotoksik ölümden in vitro korumuş ve KA'nın yol açtığı endoplazmik retikulum (ER) stresini azaltmıştır. CpG ODN 2088 astrositlerden interlökin 6 (IL-6), Chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (CXCL1) ve monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) salgısını in vitro azaltmıştır. CpG ODN 2088 uygulanan astroglial besiyeri nöronal canlılığı ve nöronal TrkB protein miktarını azaltmıştır. Astrosit-nöron ko-kültürlerinin CpG ODN 2088 ile muamelesi de nöronal canlılığı azaltmıştır. 
SONUÇ: TLR9, omurilik nöronlarının ve astrositlerinin işlevlerinin düzenlenmesinde rol oynayabilir. Direkt TLR9 antagonizmi omurilik nöronlarında ER stres cevabını kısmen baskılayarak nöronları eksitotoksisiteden korur. Buna karşın, astroglial TLR9'un inhibisyonu nöronal hayatta kalımı azaltır. 

ANAHTAR KELİMELER: Omurilik yaralanmaları, Toll-like reseptörler, proteomiks, nörodejenerasyon, nöronal koruma, eksitotoksisite, endoplazmik retikulum stresi

Abstract:
OBJECTIVE: The aim of the current study is to investigate the effect of toll-like receptor (TLR9) antagonism on spinal cord (SC) neurons through direct and astrocyte-mediated actions and to elucidate the underlying mechanisms. 
METHODS: Neuronal cultures were established from the SC of 13-day-old mouse embryos. Astroglial cultures were obtained from the SC of 3-day-old pups. Label-free differential proteome analysis were performed by nLC-MS/MS. Neuronal viability was assessed by counting B-III tubulin positive cells. Chemokine/Cytokine concentrations were measured by ELISA. A SC contusion injury was induced in adult mice at the T8 level.
RESULTS: nLC-MS/MS analysis identified 201 differentially modulated proteins in SC neurons (2-fold≤) in response to the TLR9 antagonist cytidine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotide (CpG ODN) 2088, in vitro. Parkin and gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 1 (GABA(B)R1) were among proteins which were up regulated by CpG ODN 2088. Intrathecal administration of CpG ODN 2088 to mice sustaining spinal cord injury prevented the injury-induced decrease in Parkin at the epicenter. CpG ODN 2088 protected SC neurons from kainic acid (KA)-induced excitotoxic death in vitro and attenuated the KA-elicited endoplasmic reticulum (ER) stress response via direct effects. CpG ODN 2088 reduced interleukin 6 (IL-6), chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (CXCL1) and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) release by astrocytes, in vitro. Conditioned medium of CpG ODN 2088-treated astrocytes also reduced the viability of neurons and decreased neuronal Trk receptor B (TrkB) protein levels. Treatment of astrocyte-neuron co-cultures with CpG ODN 2088 reduced neuronal viability.
CONCLUSIONS: TLR9 plays role in the regulation of SC neuronal and astroglial function. Direct TLR9 antagonism protects neurons against excitotoxicity partly through the attenuation of the ER stress response. In contrast, astroglia adversely affect neuronal survival following blockade of TLR9. 

KEYWORDS: Spinal cord injury, Toll-like receptors, proteomics, neurodegeneration, neuroprotection, excitotoxicity, endoplasmic reticulum stress