Ratlarda deneysel bakır zehirlenmesinde patolojik ve immunohistokimyasal çalışmalar
Pathological and immunohistochemical studies in experimental copper toxicity in rats
Yazar: YONCA BETİL KABAK
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA YAVUZ GÜLBAHAR
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Patoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Patoloji = Pathology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Adenozin trifosfat = Adenosine triphosphate ; Apoptozis = Apoptosis ; Bakır = Copper ; Metallothionein = Metallothionein ; Rodanin = Rhodanine ; Süperoksit dismutaz = Superoxide dismutase ; Sıçanlar = Rats ; Zehirlenmeler = Poisonings ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Bakır, pek çok enzimin fonksiyon yapabilmesi için gerekli iz elementlerden biridir. Mitokondrial solunum, demir emilimi, serbest radikallerin tutulumu, elastinle çapraz bağ oluşumu gibi hücre fizyolojisi için önemli olan birçok enzimin yapısında yer almaktadır.Bakır, elektrik ve boya sanayinde, tesisat borularının üretiminde kullanılırken, veteriner hekimlikte bakır tuzları antelmintik, bağ ve meyve ağaçlarında antifungal olarak geniş kullanım alanına sahiptir. Bu nedenle bakır zehirlenmelerine hayvanlarda rastlanılmaktadır. Bu çalışmada bakır zehirlenmesinde Copper transporter 1 (Ctr1), ATP7B, metallotionein (MT) ve bakır/çinko Süperoksit dismutaz (Cu/Zn SOD)'ın ekspresyonları ile farklı dokulardaki apoptozisin incelenmesi amaçlanmıştır.Çalışmada 56 adet erkek, erişkin, Sprague-Dawley ırkı rat (ortalama ağırlıkları 280±50 g) kullanıldı. Her grupta 14 adet rat olmak üzere iki deneme ve deneme grupları için ayrı ayrı iki kontrol grubu oluşturuldu. CuSO4 solüsyonu I. deneme grubundaki ratlara günlük 75 mg/kg dozda ve 14 gün süreyle, II. deneme grubundakilere ise aynı dozda 28 gün süreyle gastrik sonda ile uygulandı. Bu süreler sonunda eter anestezisi altında ötenazileri yapıldı. Nekropside ratlardan karaciğer, böbrek, dalak, mide- bağırsak, kalp, akciğer, beyin ve beyincik dokuları alındı. Dokulardan hazırlanan kesitler hematoksilen- eozin, rodanin, Periodik asit-Schiff teknikleri ile boyanarak değerlendirildi. Bu dokularda Ctr1, ATP7B, MT, Cu/Zn SOD, kaspaz-9, -8, -3 varlığı immunoperoksidaz teknikle incelendi. Dokulardaki apoptozisi belirlemek üzere TUNEL metodu uygulandı.Bu çalışmadan elde edilen bulgulara göre bakır zehirlenmesinin süreye bağlı olarak farklı organ ve dokularda farklı etkiler gösterdiği, bireysel farklılıkların karaciğerde bakır birikimini etkileyebildiği belirlendi. Fazla bakırın akut dönemde karaciğeri, subkronik dönemde böbreği daha fazla etkilediği, akciğer, dalak, beyin ve beyincik dokularını ise uygulanan bu dozlarda ışık mikroskobik olarak etkilemediği tespit edildi. Zehirlenmenin subkronik döneminde ratların karaciğerinde bakıra adaptasyonun geliştiği sonucuna varıldı.Ctr1 proteininin hepatositlerdeki lokalizasyonunun ortamdaki bakır miktarına göre değişiklik gösterebildiği, ancak bu durumun böbrek, dalak, mide- bağırsak, kalp, akciğer, beyin ve beyincik dokuları için geçerli olmadığı görülmüştür. Bu durum, Ctr1'in doku spesifik fonksiyona sahip olabileceğini düşündürmüştür. ATP7B'nin ise farklı dokularda ortamdaki bakır miktarına göre ekspresyonu ve hücredeki lokalizasyonunun değişebildiği görüldü. Bakır metabolizmasında görev alan MT ve Cu/Zn SOD'ın ortamdaki bakır miktarlarına göre yoğunlukları ve hücredeki lokalizasyonlarında değişiklikler olduğu belirlendi. Bunun da hücrenin bakır birikimine karşı geliştirdiği bir adaptasyon mekanizması olabileceği sonucuna varıldı.Bakır zehirlenmesinde dokularda hücrelerin hem apoptozis hem de nekroza gidebildiği ancak akut dönemde apoptotik hücrelerin, subkronik dönemde nekrotik hücrelerin daha fazla olduğu görüldü. Zehirlenmenin akut döneminde karaciğer hem intrinsik hem de ekstrinsik yollarla apoptozise uğrarken, böbrek ve beyin dokularının intrinsik yolu kullandığı, kalbin ise hem akut hem de kronik dönemde her iki yol ile apoptozise gittiği sonucuna varıldı.

Abstract:
Copper is an essential trace element for most of the metabolic processes in living organisms. Enzymes are dependent on copper to sustain their proper functioning. Copper is also a constituent of many important enzymes involved in cell physiology such as mitochondrial respiration, iron absorption, free radical capture and cross-link formation with elastin.Copper is used in electric and paint industry and installation pipes, while copper salts has a wide utilization field in veterinary medicine such as antelmentics and antifungal for fruit trees and vineyards. As a result, copper poisoning is commonly observed in animals. In this study, Copper transporter 1 (Ctr1), ATP7B, metallothionein (MT) and copper/zinc superoxide dismutase (Cu/Zn SOD) which are involved in copper metabolism and apoptosis in different tissue were investigated for expressions during copper toxication.In the study, 56 adult, male, Sprague-Dawley rats (average weights 280±50 g) were used. Two experimental groups with 14 rats in each and two separate control groups for the experimental groups were composed. During the experimental period, 75 mg/kg CuSO4 solution was orally administered daily to the rats in the first and second treatment groups for 14 days and for 28 days, respectively. At the end of the designated periods rats were euthanized under ether anaesthesia. Tissues from liver, kidney, spleen, stomach-intestine, lung, heart, cerebrum and cerebellum were obtained during necropsy. Tissue sections were stained by hematoxylin-eosin, rhodanin and periodic acide-Schiff. The presence of Ctr1, ATP7B, MT, Cu/Zn SOD, caspase-9, -8, -3 were investigated by immunoperoxidase technique. Finally, TUNEL method was used to determine the apoptosis in these tissues.According to the findings obtained in this study, it was determined that copper toxicity leads to different effects in various organs and tissues depending on time. Moreover, individual differences affect copper accumulation in liver. It was also observed that excess copper affects liver in acute period of toxicity while kidney is more affected in the subchronic period. However, microscopic examination on tissues from lungs, spleen, cerebrum and cerebellum did not reveal any significant effect of excess copper. It was concluded that adaptation for copper was developed in the liver of rats at the subcronic period of toxication.The localization of Ctr1 protein at hepatocytes was observed to vary due to the copper level in the medium. However, this situation was not observed in other tissues. This specific variation suggests that Ctr1 may have tissue specific function. Additionally, expression and cell localization of ATP7B was observed to vary in different tissues due to the copper level in the medium. The expressions of MT and Cu/Zn SOD, which are involved in copper metabolism, were observed in different concentration and at different cell localizations due to the copper level in the medium. This observation was interpreted as the cell might have developed an adaptation mechanism against copper accumulation.Tissue cells may undergo to necrosis or apoptosis in copper toxicity. In this study, it was observed that apoptotic cells were predominant at acute period while necrotic cells were predominant at the subchronic period. In addition, it was concluded that, liver undergoes to apoptosis with both intrinsic and extrinsic routes in the acute period of copper toxicity while kidney and cerebral tissues tend only to intrinsic route. Finally, heart tissues were observed to have apoptosis with both intrinsic and extrinsic routes at acute as well as chronic period of copper toxicity.