Demir nanopartiküllerin yeşil sentezi, karakterizasyonu ve biyoremediasyonda kullanımı
Green synthesis, characterization of iron nanoparticles and their use in bioremediation
Yazar: NAZLICAN TOPTAŞ
Danışman: PROF. DR. BİLGE HİLAL ÇADIRCI EFELİ
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Ağır metal giderimi = Heavy metal removal ; Ferro demir = Ferrous iron ; Gram negatif bakteriler = Gram negative bacteria ; Metal nanopartiküller = Metal nanoparticles ; Nanobiyoteknoloji = Nanobiotechnology ; Su kirliliği = Water pollution ; Toprak bakterileri = Soil bacteria ; Toz karakterizasyonu = Powder characterization

Özet:
Bu tez çalışmasında topraktan izole edilen mikroorganizmaların siderofor üretim kapasiteleri araştırılmış ve CAS sıvı deneyinde pozitif sonuç veren, gram boyamada gram (-) basil olduğu anlaşılan mikroorganizmanın, 16S rRNA geni dizi analizi ile Cronobacter turicensis olduğu tespit edilmiştir. C. turicensis BHC04 olarak adlandılan suşun optimizasyon öncesinde siderofor üretim yüzdesi % 65 olduğu belirlenmiştir. Optimum siderofor üretim saatinin belirlenmesi çalışmasında, farklı saatlerde CAS sıvı besiyerindeki renk değişimleri (turuncu ve mor), organizmanın iki farklı siderofor sentezlediğini işaret etmesi üzerine bu sideroforlar araştırılmıştır. Ortam koşulları optimize edildiğinde, 1. sideroforun OD400'de, 37 ˚C sıcaklıkta, 18. saatte, pH 8.5'te, karbon kaynağı olarak gliserol, azot kaynağı olarak amonyum klorür kullanılarak ve FeCl3 ilave edilmeden hazırlanmış CDLIM besiyerindeki üretiminin % 70'e yükseldiği görülmüştür.  2. sideroforun ise OD580'de, 37 ˚C sıcaklıkta, 28. saatte, pH 6.5'te, karbon kaynağı olarak gliserol, azot kaynağı olarak amonyum klorür kullanılarak ve FeCl3 ilavesi olmadan hazırlanmış CDLIM besiyerindeki üretiminin % 94'e yükseldiği belirlenmiştir. C. truicensis BHC04'ün pH 8.5'ta az ürediğinin belirlenmesi ve yapılan optimizasyonlar sonucunda pH 6.5'ta belirlenen sideroforun daha yüksek miktarlarda üretildiğinin ölçülmesi üzerine, çalışmaya 2. siderofor ile devam edilmiştir. Büyük ölçekli üretimi gerçekleştirilen sideroforun liyofilizasyon ile konsantre hale getirilmesi sonrasında Sephadex LH-20 dolgulu kolon kullanılarak saflaştırılmıştır. Renk ve absorbans miktarları değerlendirilerek 5-20. Fraksiyonlar birleştirilmiştir. Saflaştırılmış fraksiyonlar ile siderofor tipini belirlenmek üzere Arnow ve Cśaky testi gerçekleştrilmiş yüksek oranda katekolat tipi siderofor içerdiği anlaşılmıştır. Saflaştırılmış sideroforun karakterizasyonu amacıyla, sırasıyla HPLC, FTIR ve 1H-NMR analizleri gerçekleştirilmiş ancak HPLC analizinde elde edilen piklerin, standart olarak kullanılan desferal ve 2,3-dihidroksibenzoik asit (DHBA) larla eşleşmediği görülmüştür. Yapılan FTIR ve 1H-NMR analizlerinde ise, CDLIM besiyerinde karbon kaynağı olarak kullanılan gliserolün girişim yapması sebebiyle, yeterli veri elde edilememiştir. Bunun üzerine tezin asıl hedefi olan siderefor nanopartikül sentezi ve sudaki arseniğin temizlenmesi çalışmalarının gerçekleştirilmesi amacıyla, çalışmaya, BAP 2020/108 nolu çalışmada çeşitli analizlerle katekolat tipi siderofor olduğu kanıtlanmış olan Lactobacillus plantarum BHC03 suşu ile devam edilmiştir. Optimum siderofor üretim koşullarında üretilen suş süpernatantı ile Fe2O3'ün karıştırılması ile hücre dışı biyolojik demir nanopartikül sentezlenmiştir. Sentezlenen FeNP'lerin optimizasyonu gerçekleştirilmiş ve optimum koşulların OD350'de, 36 ˚C sıcaklıkta, 60. ve 80. saatte, pH 8.5'te absorbans verdiği gözlemlenmiştir. 60. saat ve 80. saatte üretilen FeNP'lerin karakterizasyonu için sırasıyla SEM, EDX, FTIR, XRD ve Zeta potansiyel ölçüm analizleri gerçekleştirilmiştir. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucunda, SEM analiziyle 80-200 nm çaplarında agromelere küresel forma sahip, EDX ile demir, oksijen ve karbon varlığı kanıtlanmış, FTIR analizi ile biyolojik demir nanopartikül spektrumlarına sahip olan, XRD analizi ile ortalama çapının 86 nm belirlenmiş kristal yapıdaki, Zeta potansiyeli -43.9 mV olan biyolojik demir nanopartiküllerin üretildiği belirlenmiştir. 60. saat biyolojik FeNP ile sudaki arsenik giderimi araştırılmıştır. ICP analizi ile biyolojik FeNP miktarının artışına bağlı olarak arsenik miktarının azaldığı görülmüştür. Bu tez çalışması ile sudaki ağır metallerden biri olan arseniğin, çevre kirliliğine sebep olabilecek kimyasal yöntemler yerine daha ucuz ve çevre dostu olan biyolojik demir nanopartikül ile giderimi sağlanabileceği kanıtlanmıştır.

Abstract:
In this study, the siderophore production capacity of microorganisms isolated from the soil was investigated. The best siderophore-producing microorganism in CAS liquid test was gram (-) bacil and identified as Cronobacter turicensis by 16S rRNA gene sequence analysis. It was observed that the isolated strain called C. turicensis BHC04 has a siderophore with percentage of 65% before optimizing the production conditions. Two different siderophores were investigated since the color changes (orange and purple) at different production hours point to two different siderophores. It was observed that the production of the optimized 1st siderophore increased to 70% in CDLIM medium prepared at OD400, 37 ˚C, 18th hour, pH 8.5, 0 µl FeCl3 concentration, using glycerol as carbon source and ammonium chloride as nitrogen source. On the other hand, the production of the optimized 2nd siderophore increased to 94% in CDLIM medium prepared at 37 ˚C, 28 hours, pH 6.5, 0 µl FeCl3 concentration, using glycerol as carbon source and ammonium chloride as nitrogen source. The study was continued with the second siderophore. After the large-scale production of the siderophore was concentrated by lyophilization, it was purified using Sephadex LH-20 packed column. By evaluating the color and absorbance amounts, 5-20. fractions have been merged. Arnow and Cśaky tests were performed to determine the siderophore type with the purified fractions, and it was found that it contained a high percentage of catecholate type siderophores. For the characterization of the purified siderophore, HPLC, FTIR and 1H-NMR analyzes were performed, respectively, but sufficient data could not be obtained due to the incompatibility with the standards in HPLC analysis and the inability to purify and remove the glycerol used as a carbon source in CDLIM medium in FTIR and 1H-NMR analyzes. Due to the lack of characterization, the study was continued with the Lactobacillus Plantarum BHC03 strain, which was proven to be a catecholate type siderophore by various analyzes in the BAP 2020/108 study. Extracellular biological iron nanoparticle of Fe2O3 was synthesized with the strain supernatant produced under optimum siderophore production conditions. Optimization of the synthesized FeNPs was carried out and it was observed that the optimum conditions were absorbance at OD350, 36 ˚C, 60. and 80. hours, pH 8.5. SEM, EDX, FTIR, XRD and Zeta potential measurement analyzes were performed for the characterization of FeNPs produced at 60th and 80th Hours, respectively. As a result of the characterization, the arsenic removal in water with the 60. hour biological FeNP was investigated, SEM analysis showed that it had a spherical shape with agromes of 80-200 nm in diameter, the presence of iron, oxygen and carbon was proven by EDX, it was observed that it had biological iron nanoparticle spectra with FTIR analysis, and its mean diameter was 86 nm by XRD analysis determined crystal structure, -43.9 mV by Zeta potential measurement analysis. With the ICP analysis, it was observed that the amount of arsenic decreased due to the increase in the amount of biological FeNP. With this thesis, it has been proven that heavy metal (arsenic) in water can be removed with cheaper and environmentally friendly biological iron nanoparticles instead of chemical methods that may cause environmental pollution.