Lyso-Gb3 (globotriaozilsfingozin) tayini için tuz yardımlı sıvı-sıvı ekstraksiyonu (SALLE) kullanılarak bir LC-MS/MS metodu geliştirilmesi
Development of an LC-MS/MS method for the determination of Lyso-Gb3 (globotriaosylsphingosine) using salt-assisted liquid-liquid extraction (SALLE)
Yazar: ÇETİN UZUN
Danışman: PROF. DR. YASEMİN AKÇAY
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Analitik kimya = Analytical chemistry ; Analitik yöntem = Analytical method ; Biyokimya = Biochemistry ; Biyokimyasal testler = Biochemical tests ; Yeşil kimya = Green chemistry

Özet:
Lizozomal depo hastalıkları genetik bozukluklardır. Çoğu otozomal resesif özelliklerle kalıtılan belirli bir enzimin veya lizozomal bileşenin eksikliğinin sebep olduğu lizozomal disfonksiyon ile karakterize edilen 70'ten fazla hastalığın oluşturduğu bir gruptur. Lizozomal depo hastalıkları geniş bir fenotipe sahiptir. Halihazırda mevcut varyantın tipi, depolanan bileşiğin depolanma yeri ve biyokimyasal özellikleri bu çeşitlilikteki en temel faktörlerdir.  Bu bozukluklar tek tek hastalık bazında nadir olsa da toplu halde 5000 canlı doğumdan 1'ini etkilemektedir. Tüm dünyada Gaucher ve Fabry Hastalığı 1/60000 – 120000 görülme oranıyla en yaygın lizozomal depo hastalıklarındandır. Bu hastalıklarda tanıya ulaşma yolunda enzim ölçümleri ve genetik testler kullanılmaktadır. Güncel yaklaşım olarak enzim replasman tedavileri lizozomal depo hastalıkları için standart protokoldür, bunun yanında da destekleyici tedaviler planlanmaktadır. 
Fabry Hastalığı X'e bağlı kalıtılan α-galaktosidaz A enzim eksikliği nedeniyle ortaya çıkan bir lizozomal depo hastalığıdır. Bu enzimin eksikliği sonucunda lizozomlarda glikosfingolipitler ve golobotiraozilseramid (Gb3) birikmektedir. Cilt, göz, böbrek, kalp, beyin, sinir sistemi gibi birçok sistemde ve çeşitli dokularda Gb3 birikimi olmaktadır. Bu birikimler zaman ilerledikçe renal yetmezliğe, kardiyovasküler hastalıklara, serebrovasküler olaylara ve erken ölümlere neden olmaktadır. 
Hastalık şiddetli olan klasik formdan, klasik olmayan veya geç başlangıçlı form gibi çeşitli tiplerde ortaya çıkabilir. Tanısı konurken lökositlerde azalmış α-galaktosidaz A aktivitesinin gösterilmesi gereklidir. Buna karşın heterozigot kadınlarda enzim düzeyi sağlıklı kontrollerde bulunan seviyelerle örtüşebileceğinden bu enzimin aktivitesinin ölçümü güvenilir olmamaktadır. Kadınlarda hastalığın tanısı açısından genetik test yapılması gereklidir. Cilt veya böbrek biyopsileri de tanıda yardımcı olabilmektedir. Bununla birlikte literatürde globotriaozilseramidin bir bozunma ürünü olan globotriaozilsfingozin (Lyso-Gb3) de hastalığın teşhis ve aktivitesinin izlenmesi için potansiyel bir biyobelirteç olarak önerilmiştir. Bazı çalışmalar Lyso GB3'ün Notch1, TGF-β1, CD74 ve hücre dışı matriks proteinlerinin ekspresyonunda rol oynayarak Fabry Hastalığında inflamatuvar mekanizmada var olduğunu göstermiştir. Çeşitli çalışmalarca Lyso-Gb3'ün teşhis ve prognoz için güvenilir bir biyobelirteç olduğu belirtilmiş, nitekim enzim replasman tedavilerine verilen yanıtı izlemek için de kullanılmıştır. Kadınlarda enzim aktivitesi ölçümünde oluşan bu sınırlılık yine Lyso-Gb3 seviyelerinin analizi ile aşılabilmektedir.
Laboratuvarlarda Lyso-Gb3'ün analizi kuru kan ya da plazma örneklerinde likit kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yöntemleri ile ölçülebilmektedir. İlk çıkan yöntemler plazmada glikolipitlerin saptanması için ince tabaka kromatografisini ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanımını içermekteydi. Zaman ilerleyip yeni kütle spektrometresi analizörleri ve iyonizasyon yöntemleri geliştirildikçe glikosfingolipitlerin daha hızlı ve kapsamlı kantitatif analizi mümkün olabilmiştir. Literatürde bu biyobelirteçlerin analizleri yapılırken ayırma teknikleri olarak sıvı-sıvı ya da sıvı-katı ekstraksiyonları sıklıkla kullanılmıştır. Sıvı-sıvı ekstraksiyonları birbirine karışmayan iki sıvıda çözünürlük farkı bulunan bileşikleri ayırma esasına dayanmaktadır. Bu sıvılardan biri genellikle su iken diğer kısım da organik bir çözgendir. Polar bileşikler su fazda kalırken, polar olmayan bileşikler ise organik fazda kalmakta ve istenilen analit ekstrakte edilebilmektedir. Ek olarak bu tip ekstraksiyonun bir inorganik tuz ile desteklenmesi durumunda ekstraksiyon olasılığı ve kalitesi daha da yükselmektedir. Çeşitli tuzlar ve tuzların farklı konsantrasyonları, farklı seviyelerde ayrım sağlayabilmektedir. Bu hem nötr polar organik maddelerin sudan eldesini hem de analitlerin yüksek geri eldesini sağlamaktadır. Bu ekstraksiyon metodu da tuz yardımlı sıvı-sıvı ekstraksiyonu (salting-out liquid-liquid extraction, SALLE) olarak isimlendirilmektedir. Tezde çalışılacak bu analit için literatürde yöntemlerin hazırlık aşamalarında SALLE yöntemi henüz denenmemiştir. 
Çalışmadaki amacımız yöntemin hazırlık aşamasında kullanılan çözgenleri yeşil kimya konseptine uygun olarak seçmek; insana daha az zarar verecek ve doğaya daha az zararlı atık oluşturacak çözgenlerin kullanımını sağlamaktır. Bununla birlikte ekstraksiyon aşamasında SALLE yöntemi kullanarak daha kaliteli bir ekstraksiyon yapmayı, bu sayede de daha yüksek özgüllük-duyarlılığa sahip test performansı kabul edilebilir bir LC-MS/MS metodu geliştirmeyi amaçlıyoruz.

Abstract:
Lysosomal storage diseases are genetic disorders. They are a group of more than 70 diseases characterized by lysosomal dysfunction caused by the deficiency of a specific enzyme or lysosomal component, most of which are inherited as autosomal recessive traits. Lysosomal storage diseases have a wide phenotype. The type of variant currently present, the storage location of the stored compound and its biochemical properties are the most basic factors in this diversity. Although these disorders are rare on an individual disease basis, they collectively affect 1 in 5000 live births. Gaucher and Fabry Diseases are among the most common lysosomal storage diseases with an incidence rate of 1/60,000 - 120,000 worldwide. Enzyme measurements and genetic tests are used to reach a diagnosis in these diseases. As a current approach, enzyme replacement therapies are the standard protocol for lysosomal storage diseases, and supportive treatments are also planned. 
Fabry disease is a lysosomal storage disease caused by an X-linked inherited deficiency of the enzyme α-galactosidase A. As a result of this enzyme deficiency, glycosphingolipids and golobotiraosylceramide (Gb3) accumulate in lysosomes. Gb3 accumulates in many systems and tissues such as the skin, eye, kidney, heart, brain, and nervous system. Over time, these accumulations cause renal failure, cardiovascular diseases, cerebrovascular events, and premature death. 
The disease can occur in various types, from the severe classical form to the non-classical or late-onset form. When making the diagnosis, it is necessary to demonstrate decreased α-galactosidase A activity in leukocytes. On the other hand, since the enzyme level in heterozygous women may overlap with the levels found in healthy controls, the measurement of the activity of this enzyme is not reliable. Genetic testing is necessary for the diagnosis of the disease in women. Skin or kidney biopsies can also be helpful in the diagnosis. However, globotriaosylsphingosine (Lyso-Gb3), a degradation product of globotriaosylceramide, has also been suggested in the literature as a potential biomarker for the diagnosis and monitoring of disease activity. Some studies have shown that Lyso-Gb3 plays a role in the expression of Notch1, TGF-β1, CD74 and extracellular matrix proteins and is present in the inflammatory mechanism in Fabry Disease. Various studies have indicated that Lyso GB3 is a reliable biomarker for diagnosis and prognosis, and has also been used to monitor the response to enzyme replacement therapies. This limitation in the measurement of enzyme activity in women can again be overcome by the analysis of Lyso-Gb3 levels. 
In laboratories, Lyso-Gb3 analysis can be measured in dry blood or plasma samples by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) methods. The first methods to be developed included the use of thin layer chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC) for the detection of glycolipids in plasma. As time progressed and new mass spectrometry analyzers and ionization methods were developed, more rapid and comprehensive quantitative analysis of glycosphingolipids became possible. In the literature, liquid-liquid or liquid-solid extractions were frequently used as separation techniques when analyzing these biomarkers. Liquid-liquid extractions are based on the principle of separating compounds with solubility differences in two immiscible liquids. One of these liquids is usually water, while the other part is an organic solvent. Polar compounds remain in the water phase, while non-polar compounds remain in the organic phase and the desired analyte can be extracted. In addition, if this type of extraction is supported by an inorganic salt, the probability and quality of extraction increases even more. Various salts and different concentrations of salts can provide different levels of separation. This provides both the recovery of neutral polar organic substances from water and high recovery of analytes. This extraction method is also called salt-assisted liquid-liquid extraction (SALLE). For this analyte to be studied in the thesis, the SALLE method has not yet been tried in the literature in the preparation stages of the methods.
Our aim in the study is to select the solvents used in the preparation stage of the method in accordance with the green chemistry concept; to ensure the use of solvents that will cause less harm to humans and less harmful waste to nature. In addition, we aim to perform a higher quality extraction by using the SALLE method in the extraction stage, and thus to develop an LC-MS/MS method with higher specificity-sensitivity and acceptable test performance.