İnsan SNX2 proteini ile influenza virüsü RNA polimeraz enzimi arasındaki ilişkinin memeli hücrelerinde araştırılması
Investigation of the relationship between human SNX2 protein and influenza virus RNA polymerase enzyme in mammalian cells
Yazar: TUĞBA KOÇMAR
Danışman: PROF. DR. KADİR TURAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Enzimler = Enzymes ; RNA = RNA ; Virüsler = Viruses ; İnfluenza = Influenza ; İnfluenza A virüsü = Influenza A virus ; İnfluenza virüs = Influenza virus

Özet:
İnfluenza A virüsleri sekiz adet tek iplikli negatif polarite gösteren RNA
molekülünden oluşan genoma sahiptirler. Geniş bir konak yelpazesine sahip olan bu
virüslerde replilasyon ve transkripsiyon işlevleri; PB2, PB1 ve PA alt birimlerinden
oluşan RNA polimeraz enzimi tarafından gerçekleştirilir. Viral RNA polimeraz enzimi
konak hücrede viral patogenezi etkileyen önemli bir faktördür. Bu çalışmada, maya
ikili-hibrit metodu kullanılarak viral PA proteini ile ilişkisi gösterilen insan sorting
nexin 2 (SNX2) proteinin influenza A virüsü replikasyonuna etkilerinin belirlenmesi
amaçlanmıştır.
   Çalışmada maya ikili-hibrit testlerinde Saccharomyces cerevisiae
hücreleri kullanıldı. Memeli hücrelerinde PA ve SNX2 proteinleri arasındaki
etkileşimi saptamak için yapılan çalışmalarda HEK293 ve HeLa hücrelerinden
yararlanıldı. Enfeksiyon deneylerinde influenza A/WSN/33-H1N1 ve
A/duck/Pennsylvania-H5N2 virüs ırkları kullanıldı. Protein etkileşimlerinin
saptanmasında, birlikte immünçöktürme ve immünfloresan teknikler uygulandı.
Memeli hücrelerinde SNX2 ya da PA protein düzeylerinin geçici olarak arttırılması,
bu proteinleri kodlayan plazmitlerin hücrelere transfeksiyonu ile sağlandı. Hücrelerde
SNX2 transkript düzeyini düşürmek (knock down) için siRNA teknolojisinden
yararlanıldı. SNX2 protein düzeyi değiştirilen hücrelerde virüs replikasyonunun seyri
viral proteinlerin analizi ile saptandı. SNX2 proteinin viral RNA polimeraz enzimine
etkileri minireplikon modelleri ile araştırıldı.
   İmmünçöktürme, immünfloresan boyama ve PL testleri HEK293 ve/veya
HeLa hücrelerinde plazmit vektörler üzerinden kodlanan SNX2 ve PA proteinlerinin
etkileşim halinde olduğunu gösterdi. SNX2 proteinine bağlanmada PA proteininin
özellikle amino-terminal bölgesinin (PAdC) önemli olduğu saptandı. İnsan SNX2
proteinin influenza A virüsü replikasyonuna negatif yönde etki ettiği, bu etkinin kuş
tipi influenza A/duck/Pennsylvania-H5N2 virüslerinde çok daha belirgin olduğu
ortaya kondu. Bu veriler PA ve SNX proteinlerinin influenza A virüsü patogenezini
etkileyen faktörler arasında olduğu sonucunu verdi.

Abstract:
Influenza A viruses have a genome consisting of eight single-stranded negative
sense RNA molecules. Replication and transcription of these viruses having a wide
host range are performed by the RNA polymerase enzyme, which composed of PB2,
PB1 and PA subunits. The influenza RNA polymerase is one of the important factor
affecting the viral pathogenesis in host cell. In this study, it was aimed to determine
the effects of human sorting nexin 2 (SNX2) protein, which is shown to be associated
with viral PA protein by yeast two-hybrid assay on influenza A virus replication.
   Yeast two-hybrid assays were carried out with Saccharomyces
cerevisiae. HEK293 and HeLa cells were used for revealing the interaction between
PA and SNX2 proteins in mammalian cells. Influenza A/WSN/33-H1N1 and
A/duck/Pennsylvania-H5N2 virus strains were used to infect the cells.
Immunoprecipitation and immunofluorescence techniques were applied for detection
of protein interactions. Transient increase of SNX2 and/or PA protein levels in the
mammalian cells was achieved by transfection of the plasmid DNAs encoding the
proteins. siRNA interference technology was applied for knock down of SNX2
transcript in the cells. The course of virus replication in the cells, over-expressing of
SNX2 protein or down regulated with gene specific siRNA was determined by analysis
of the viral proteins. Effects of SNX2 protein on viral RNA polymerase were
investigated with minireplicon models.
   Immunoprecipitation, immunofluorescence staining and PL assay showed
that the SNX2 and PA proteins encoded from plasmid DNAs have interaction in
HEK293 and HeLa cells. The amino-terminal region of the viral PA protein (PAdC)
was found to be particularly important for binding to human SNX2. The results showed
that human SNX2 protein had a negative regulatory effect on influenza A virus
replication and this effect was much more pronounced for avian influenza A/DkPen
viruses. It was concluded that PA and SNX proteins are important factors that
determine the pathogenesis of influenza A viruses in mammalian cells.