Muşmula (Mespilus germanica) polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of medlar (Mespilus germanica) polyphenol oxidase enzyme
Yazar: AYŞİN ÇAVDAR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ÇİĞDEM BİLEN ; PROF. DR. EMİNE KARAKUŞ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Mespilus germanica = Mespilus germanica ; Polifenol oksidaz = Polyphenol oxidase

Özet:
Enzimatik esmerleşme reaksiyonlarını gerçekleştiren polifenol oksidaz (PFO) enzimleri, oksidasyon tepkimelerini katalizlemektedir. Enzimatik esmerleşme reaksiyonları, meyve ve sebzelerin içeriğinde bulunan fenolik maddelerin PFO enzimi katalizörlüğünde o-kinonlara hidroksilasyon ve oksidasyon reaksiyonları ile sağlanmaktadır. Hidroksilasyon ve oksidasyon reaksiyonlarından sonra o-kinonların enzimatik olmayan oksidasyonu ve polimerizasyonu sonucunda melanoidinler oluşur. Gerçekleşen bu reaksiyonlar sebebi ile ürünlerde esmerleşme meydana gelmektedir. Mespilus germanica muşmula, sağlık yararları sebebi ile ticari pazar değeri kazanmış bir meyvedir. İçeriğinde bulunan antioksidan ve mineral özellikleri sebebi ile enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Yapılan tez çalışmasında Mespilus germanica muşmulanın saflaştırılması amacıyla ilk olarak, %0-80 amonyum sülfat ile çöktürme işlemi yapılmıştır, ardından diyaliz işlemi ile kısmen safsızlıklardan uzaklaştırılan polifenol oksidaz enzim ekstraktı (KSP enzimi) elde edilmiştir. Elde edilen KSP enziminin en yüksek enzim aktivitesine sahip olduğu optimum reaksiyon koşullarının tespit edilebilmesi amacıyla karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Enzimin kafeik asit, katekol, progallol ve 4-metil katekol substratları ile ilk olarak optimum substratı tespit edilmiş ve bu substrat üzerinde çalışılarak, optimum konsantrasyon, optimum pH ve optimum sıcaklık çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Yapılan bu çalışmalar için elde edilen optimum koşullar katekol substratı için sırasıyla 0.1M/ pH:6.8/ 15°C; olarak belirlenmiştir. Enzimin optimum substratı için Vmax ve KM kinetik sabitleri ise sırasıyla; 12542.46 EU ve 2.5 mM olarak hesaplanmıştır. Çalışmanın devamında ise, kısmen safsızlık içeren KSP enzim özütü Sefaroz 4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit ve Sefaroz 6B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite jelleri ile saflaştırılmıştır. Elde edilen PFO enziminin saflık kontrolü ve molekül kütlesinin tespit edilebilmesi amacıyla doğal jel elektroforezi (NATIVE PAGE) ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi uygulanmıştır. Muşmula PFO diyaliz numunesinde SDS-PAGE ile yaklaşık olarak 40 kDa ve 35 kDa'da iki bant gözlenirken, Native-PAGE ile 40 kDa ve 70 kDa'da iki bant elde edilmiştir. Dolayısıyla muşmulada molekül agırlıkları 40 kDa ve 35 kDa'luk özdeş iki alt birim içeren 70 kDa olan iki PFO izoenzim olabileceği şeklinde yorum yapılmıştır. Afinite kromatografisi ile saflaştırılan örnekler için ise Native-PAGE 'de yaklaşık 40 kDa civarında tek bant gözlendiğinden, muşmula PFO izoformlarından birinin afinite kromatografisi ile saflaştırıldığı yorumu yapılmıştır. Sefaroz-4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit ve Sefaroz-6B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite jelleri kullanılarak saflaştırılan Mespilus germanica PFO enzimi için sırasıyla 53,96 ve 7,26 saflaştırma katsayısına ulaşılmıştır.

Abstract:
Polyphenol oxidase (PPO) enzymes, which perform enzymatic browning reactions, catalyze oxidation reactions. Enzymatic browning reactions are provided by hydroxylation and oxidation reactions of phenolic substances to o-quinones catalyzed by PFO enzyme in fruits and vegetables. As a result of non-enzymatic oxidation and polymerization of o-quinones, melanoidins are formed in dark colorful products. Mespilus germanica medlar was used as a source of enzymes due to the benefits it provides for human consumption, its commercial value and rich antioxidant and antiradical properties in this study. In the first part of the study, the PPO enzyme extract of Mespilus germanica medlar, which was partially purified by precipitation with (0-80) % ammonium sulfate and dialysis, respectively, was obtained. Following, characterization studies were carried out in order to determine the optimum reaction conditions in which maximum enzyme activity was observed. Optimum substrate was determined by using catechol, 4-methyl catechol, progallol and caffeic acid substrates. Optimum concentration, optimum pH and optimum temperature studies were performed in the presence of optimum substrate. The optimum conditions were determined for catechol as 0.1M/ pH:6.8/ 15°C, respectively. Vmax and KM kinetic constants of the enzyme for catechol were calculated as 12542.46 EU and 2.5 mM, respectively. In the following step, Mespilus germanica PPO extract was purified with Sepharose 4B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid and Sepharose 6B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid affinity gels, respectively. While bands of medlar PPO dialysis samples were observed at approximately 40 kDa and 35 kDa in SDS-PAGE, two bands were obtained at 40 kDa and 70 kDa which is a homodimer that each one is 35 kDa in Native-PAGE. Therefore, it was interpreted that it could be two PPO isoenzymes with molecular weights of 40 and 70 kDa in medlar. Since a single band of approximately 40 kDa was observed in Native-PAGE for the samples purified by affinity chromatography, it was interpreted that one of the medlar PPO isoforms was purified by affinity chromatography. For Mespilus germanica PPO enzyme purified by using Sepharose-4B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid and Sepharose-6B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid affinity gels, 53.96 and 7.26-fold purification degrees were achieved, respectively.