Ratlarda kısa dönem hiperhomosisteineminin yol açtığı endotel disfonksiyonu üzerine nebivololün histopatolojik ve biyokimyasal etkileri
Histopathological and biochemical effects of nebivolol on short term hyperhomocysteinemia induced endothelial dysfunction in rats
Yazar: MUSTAFA AHMET HUYUT
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ AKGÜLLÜ
Adnan Menderes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kardiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Kardiyoloji = Cardiology
Dizin: Antihipertansif ajanlar = Antihypertensive agents ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Biyokimyasal analiz = Biochemical analysis ; Dimetilarginin = Dimethylarginine ; Histopatoloji = Histopathology ; Homosistein = Homocysteine ; Kalp hastalıkları = Heart diseases ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Transforme edici büyüme faktörü-beta = Transforming growth factor-beta ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors

Özet:
Giriş Ve Amaç:  Homosistein vasküler düz kas hücreleri için potent mitojenik etkiye sahiptir. Ayrıca homosistein, endotelyal nitrik oksit sentaz salınımını ve nitrik oksit oluşumunu azaltır. Nitrik oksidin endoteliyal üretiminin bozulması sonucu endotel, oksidatif  hasara maruz kalır ve endotel disfonksiyon oluşur. Ayrıca homosistein lipid peroksidasyonunu artırır.
Üçüncü jenerasyon yüksek selektiviteye sahip β1-boker olan Nebviolol etkisini L-arjinin/NO yolu üzerinden vazodilatasyon yaparak göstermektedir. Yapılan deneysel çalışmalarda endotel kaynaklı NO'in, nebviolol'un uyardığı vazodilatasyonda önemli rol oynadığı ortaya konmuştur. Nebivolol hücre proliferasyonunu azaltır. Nebivolol intima hasarını önler. Endotel hasarı sonrası oluşan intimal hiperplaziyi ve stenozun yeniden oluşumu ihtimalini de azalttığı bildirilmiştir. Bu çalışmada, nebivololün endotel disfonksiyonunu önleyici etkisini, ratlardan alınan kalp ve torakal aortlarındaki patoloji kesitleri ile kan serumlarından yapılan biyokimyasal analizlerinden elde edilecek olan sonuçlar ile ortaya çıkarmayı amaçladık. 

Gereç Ve Yöntem: Erkek wistar albino cinsi ratlar rastgele ve eşit sayıda (n=7) olarak 4 gruba ayrıldı.
1) Kontrol Grubu (n=7): Bu gruptaki hayvanlara 4 hafta süreyle herhangi bir medikasyon uygulanmadı. Aynı orogastrik gavaj stresini yaşamaları amacıyla ratlara orogastrik gavaj ile her gün, günde bir kez 1ml içme suyu verildi.
2) Nebivolol grubu (n=7): Bu gruptaki hayvanlara 4 hafta süreyle orogastrik gavaj ile her gün, günde bir kez 10 mg/kg/gün nebivolol verildi. 
3) Metiyonin grubu (n=7): Bu gruptaki hayvanlara 4 hafta süreyle orogastrik gavaj ile her gün, günde bir kez 1gr/kg/gün metiyonin verildi.
4) Metiyonin+nebivolol grubu (n=7): Bu gruptaki hayvanlara 4 hafta  süreyle orogastrik gavaj ile her gün, günde bir kez 1gr/kg/gün metiyonin, ve aynı gün içinde iki saat arayla 4 hafta süre ile günde bir kez 10 mg/kg/gün nebivolol verildi. 
Çalışma başlamadan önce ratların ağırlıkları ölçüldü. Sıçanların beslenmesinde tüm gruplarda standart rat besini ve şehir içme suyu ratların serbest erişimine açık olarak çalışma boyunca sınırlama olmadan kullanıldı. İlaç doz ayarlaması yapmak için her hafta ratların ağırlıkları ölçülerek her rat için verilecek ilaç miktarları belirlendi. Hiperhomosisteinemi sağlamak için L-metiyonin (M9625 Sigma-Aldrich L-Methionine reagent grade, ≥98% (TLC) )  ph'ı 7,4 olan fosfat tampon (PBS)'da çözünerek ratlara 4 hafta  boyunca her gün 1g/kg doz oral gavaj yoluyla verildi. Nebivolol ise Abdi İbrahim firmasının ürettiği Nexivol 5 mg hazır tabletler ezilerek %10 dimetilsülfoksit ile çözünerek 4 hafta  boyunca her gün 10mg/kg doz oral gavaj yoluyla verildi. Çalışmanın sonunda ratlar eter anestezi altında sakrifiye edilerek kan örnekleri EDTA'lı hemogram ve düz biyokimya tüplerine alındı. Ardından ratların aorta ve kalbi diseke edilerek histokimyasal ve immunohistokimyasal incelemeler için %10 formaldehid solüsyonuna kondu.
Bulgular: Çalışmamızda metiyonin verilen grupta anlamlı düzeyde hiperhomosisteinemi saptandı. Bu bulguya paralel olarak biyokimyasal analizlerde antioksidan moleküller olan katalaz, glutatyon, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz, süperoksit dismütaz sevyelerinde azalma ile oksidan moleküller olan ADMA, homosistein ve MDA seviyelerinde artış gözlendi. Metiyonin ile beraber nebivolol verilen grupta ise antioksidan moleküller olan katalaz, glutatyon, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz, süperoksit dismütaz seviyelerinde azalmanın önlendiği ve oksidan moleküller olan ADMA, homosistein ve MDA seviyelerinde artışın engellendiği gözlendi. Metiyonin ile beraber nebivolol verilen grup ile metiyonin alan grup istatistiksel açıdan karşılaştırıldığında biyokimsal olarak glutayon redüktaz ve SOD sonuçlarının karşılaştırılmalarında, aralarındaki fark istatiksel olarak anlamlı bulunmadı. Diğer tüm biyokimyasal verilerin karşılaştırılmalarında istatiksel olarak anlamlı sonuçlar elde edildi. Histopatolojik bulgulardan sadece kardiyomiyosit dejenerasyonu ve Tgf β-1 aorta boyanma gruplarında, istatistiksel olarak gruplar arası fark saptadı. Fakat metiyonin ile beraber nebivolol verilen grup ile Metiyonin alan grup istatistiksel açıdan karşılaştırıldığında anlamlı fark saptanmadı.
Sonuç: Ratlar üzerinde yaptığımız bu çalışmamızda literatürde ilk defa kısa dönem hiperhomosisteineminin yol açtığı endotel fonksiyon bozukluğunu nebivolol molekülü vererek önleyebileceğimizi biyokimyasal olarak gösterebildik. Ayrıca bildiğimiz kadarıyla ilk kez oral metiyonin ile aynı gün içinde iki saat sonra verilen nebivololün Hcy seviyelerindeki yükselmeyi engelleyebileceğini gösterdik. Literatürde daha önce benzer bir çalışmanın yapılmamış olması çalışmamızı özgün kılmaktadır. Bulduğumuz biyokimyasal bulgular sonucunda kısa dönem hiperhomosisteineminin yol açtığı endotel fonksiyon bozukluğunu eş zamanlı başlanacak nebivolol molekülü ile önleyebileceğimizi düşünüyoruz. Çalışmamızda histopatolojik bulgulara bakıldığında metiyonin verilen gurupta daha fazla kardiyomiyosit dejenerasyonu saptandı. Fakat kısa dönemde nebivolol verilmesinin histopatolojik veriler üzerinde istatiksel olarak anlamlı farka neden olmadığı görüldü. Bu sonuçların genellenebilmesi için ayrıca histopatolojik değişikliklerin daha açık ortaya konabilmesi için daha uzun süreli ve daha fazla sayıda hayvanın kullanılacağı klinik çalışmaların gerekli olduğunu düşünmekteyiz.

Anahtar kelimeler: Hiperhomosisteinemi, nebivolol, asimetrik dimetilarjinin, nitrik oksit, antioksidan, endotel disfonksiyonu, kardiyomyosit dejenerasyonu, histopatoloji, malondialdehit, glutatyon, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz, süperoksit dismutaz, katalaz, transforming büyüme faktör beta-1, vasküler endotelyal büyüme faktörü.

Abstract:
Objective: Homocysteine has a potent mitogenic effect on vascular smooth muscle cells. Additionally homocysteine, decreases endothelial derived nitric oxide synthase and nitric oxide formation. As a result of degradation the endothelial production of nitric oxide, endothel is subjected to oxidative stress and endothelial dysfunction occurs. Also homocysteine increases lipid peroxidation.
Nebviolol which is highly selective third generation β1-boker, shows its effect by vasodilatation, through L-arginine/NO pathway. Endothelial derived NO plays an important role on nebviolol induced vasodilation, has been shown in the experimental studies. Nebivolol reduces cell proliferation. Nebivolol prevents intima against damages. Nebivolol reduces intimal hyperplasia and the possibility of restenosis which occurs after endothelial injury. In this study,  we aimed to uncover the nebivolol's inhibitor effect on endothelial dysfunction, with pathology sections whichs are taken from rats' heart and thoracic aorta, and biochemical analysis results of blood serum.

Materiel And Method: Male wistar albino rats were divided into 4 groups randomly and equally (n=7).
1) Control Group (n=7): The animals in this group,  did not receive any medication for 4 weeks. Every day, once a day we gave 1 ml drinking water by orogastric gavage.
2) Nebivolol Group (n=7): The animals in this group, 10 mg/kg/day nebivolol was given by orogastric gavage every day, once a day, for 4 weeks. 
3) Methionine group (n=7): The animals in this group, 1gr/kg/day methionine was given by orogastric gavage every day, once a day, for 4 weeks.
4) Methionine+nebivolol group (n=7): The animals in this group, 1gr/kg/day methionine and 10 mg/kg/day nebivolol was given at the same day two hours later by orogastric gavage every day, once a day, for 4 weeks.
Before the study begins, weights of rats were measured. Throughout the study, in all groups of rats were fed by standard rat silage and urban drinking water without limitation. For drug dosage adjustment, weights of the rats were measured every week. And then the amount of drug was determined for each rat. L-methionine (M9625 Sigma-Aldrich L-Methionine reagent grade, ≥98% (TLC) ) which dissolved in pH 7.4 phosphate buffer solution, was given 1gr/kg/day dosage by orogastric gavage every day, once a day, for 4 weeks. Nebivolol was obtained from Nexivol ready tablets which was produced by Abdi Ibrahim Company. And then dissolved in 10% dimethylsulfoxide solution. Nebivolol was given 10mg/kg/day dosage by orogastric gavage every day, once a day, for 4 weeks. At the end of the study, rats were sacrificed under ether anesthesia, and then blood samples were taken in EDTA hemogram tubes and flat biochemistry tubes. Then the rat aorta and heart were dissected and placed in 10% formaldehyde solution for histochemical and immunohistochemical examination.
Results: In our study hyperhomocysteinemia was found to be significantly in the group which received methionine. In line with this finding in the biochemical analysis of antioxidants catalase, glutathione, glutathione peroxidase, glutathione reductase, superoxide dismutase levels were decreased and oxidants ADMA, homocysteine and MDA levels were increased. The animals in the group, which was given methionine and nebivolol at the same time, antioxidant catalase, glutathione, glutathione peroxidase, glutathione reductase, superoxide dismutase levels were observed decrease and oxidant ADMA, homocysteine and MDA levels were observed increase. When we make comparison of the animals in the group, which was given methionine and nebivolol at the same time and the animals in the group which was given methionine only, the difference of the Glutathione reductase and SOD results was not statistically significant. All other comparison of biochemical results were obtained statistically significant. From the histopathological findings, only in TGF β-1 aorta staining groups and the cardiomyocyte degeneration groups, were detected statistically significant differences between the groups. But when we make comparison of the animals in the group, which was given methionine and nebivolol at the same time and the animals in the group which was given methionine only, the difference of results was not statistically significant.
Conclusion: In this study which was done on the rats, we were able to shown biochemical results that we could avoid from short-term hyperhomocysteinemia induced endothelial dysfunction by giving nebivolol molecule, for the first time in the literature. 
In addition, for the first time we showed nebivolol may prevent from increase in Hcy levels, if we gave oral methionine with nebivolol in two hours later on the same day. Previously in the literature to the absence of a similar study makes our work unique. We believed that we can avoid from short-term hyperhomocysteinemia induced endothelial dysfunction by giving nebivolol molecule based on our biochemical findings. When we compared histopathological findings in our study, cardiomyocyte degeneration was observed more in the methionine group. But in the short term administration of nebivolol, did not cause a statistically significant difference on histopathological findings. We believe that more clinical trials which will use more rats and long treatment periods are needed in order to generalize these results, also revealed histopathological changes clearly.

Keywords: Hyperhomocysteinemia, nebivolol, asymmetric dimethyl arginine, nitric oxide, antioxidant, endothelial dysfunction, cardiomyocyte degeneration, histopathology, malondialdehyde, glutathione, glutathione peroxidase, glutathione reductase, superoxide dismutase, catalase, transforming growth factor beta-1, vascular endothelial growth factor.

Contact address: Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Kardiyoloji Anabilim Dalı, Merkez/Aydın, Phone:00905352013420