Kestanelerde (Castanea sativa Mill.) kuraklık ilişkili SSR ve EST-SSR belirteçlerle toleranslılık değerlendirme ve iPBS belirteçlerle genetik varyasyon analizi
An evaluation of tolerance with drought-associated SSR and EST-SSR markers in chestnuts (Castanea sativa Mill.) and analysis of genetic variation with iPBS markers
Yazar: DİDEM KARA
Danışman: PROF. DR. EMİNE ORHAN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Bitkisel Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Basit dizi tekrarları (SSR) = Simple sequence repeats (SSR) ; Genetik ilişki = Genetic relationship ; Kestane = Chestnut ; Kuraklık = Drought

Özet:
Amaç: Bu çalışmada, kuraklık ilişkili genomik SSR belirteçler ile genik EST-SSR belirteçler kullanılarak ülkemiz için önemli bazı kestane çeşitleri arasındaki kuraklığa toleranslılık/duyarlılık değerlendirmesinin yapılması ve genetik ilişki analizlerinin yapılması amaçlanmıştır. İlave olarak, ülkemizde yetiştirilen kestane çeşitleri için ilk olmak üzere, retrotranspozon esaslı iPBS belirteçler kullanılarak alternatif bir moleküler analiz değerlendirmesinin yapılması dahil edilmiştir.
Yöntem: Çalışmada, Türkiye'de en fazla tanınan ticari kestane çeşitleri arasında yer alan Hacıömer, Osmanoğlu, Sarıaşlama, Erfelek, Kemer, Işıklar, Şekerci, Siyah Bursa, Bouche De Betizac, Marigoule ve Tülü çeşitleri kullanılmıştır. Çalışmada; kuraklık ilişkili geliştirilmiş olan 5 adet SSR ve 8 adet EST-SSR belirteçlerine ilave olarak genetik ilişki tespiti için 19 adet iPBS belirteç kullanılmıştır.
Bulgular: Kuraklık ilişkili belirteçler ile elde edilen kapiller elektroforez görüntüleri yardımıyla kestane çeşitleri arasında bir toleranslılık/duyarlılık değerlendirmesi yapılmıştır. Kuraklığa duyarlı olarak bilinen Marigoule çeşidi üzerinden diğer kestane çeşitlerinin kuraklığa toleranslılık durumları değerlendirilmiştir. SSR, EST-SSR ve iPBS belirteçler ile yapılan PCR işlemlerinden elde edilen bant profilleri değerlendirilmiştir ve bu primerlere ait allel boyutu, toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı, polimorfizm oranı, gözlenen heterozigotluk,  polimorfizm bilgi içeriği,  markır indeksi ve ayırt etme gücü gibi değerler belirlenmiştir. Çalışmada kullanılan tüm mikrosatellit ve retrotranspozon belirteçler, kestane çeşitleri arasında %100 polimorfiklik göstermiştir. SSR, EST-SSR belirteçler ile elde edilen toplam bant sayısı sırasıyla 507 (ort. 101,4) ve 728 (ort. 91,0) olarak kaydedilmiştir. SSR primerler için gözlenen heterozigotluk (Havp), 0,351 (CsCAT6)-0,464 (CsCAT1)  arasında belirlenirken (ort. 0,395), EST-SSR primerler için heterozigotluk (Havp) 0,240 (FIR08)-0,377 (FIR059) olarak kaydedilmiştir (ort. 0,309). Ayrıca, iPBS belirteçler ile elde edilen toplam bant sayısı 2887 (ort. 151,95) olarak kaydedilmiş olup heterozigotluk (Havp) değerleri 0,184 (iPBS 2295)-0,275 (iPBS 2256) arasında tespit edilmiştir (ort. 0,204). Hem SSR hem de EST-SSR belirteçlerle elde edilen UPGMA dendogramlarda Erfelek ve Hacıömer kestane çeşitleri birbirine en benzer çeşitler olarak belirlenmiştir. iPBS belirteçlerle elde edilen UPGMA dendogramda ise Hacıömer ve Şekerci kestane çeşitleri 0,924 benzerlik katsayısı değeri ile birbirine en benzer çeşitler olarak belirlenmiş olup bu iki çeşitle yakın benzerlik ilişkisi gösteren Osmanoğlu ve Erfelek kestane çeşitleri ile birlikte bir alt grup oluşturmuştur.
Sonuç: Çalışma sonucunda, genetik akrabalık ilişkisinin belirlenmesi amacıyla kestane ıslahında yardımcı olacak yüksek doğrulukla moleküler analizler gerçekleştirilmiştir ve kullanılan mikrosatellit ve retrotranspozon esaslı belirteçlerin markır destekli seleksiyon çalışmaları için yararlı olacağı bilgisi ortaya çıkmıştır.

Abstract:
Aim: In this study, it was aimed to evaluate drought tolerance/susceptibility and genetic relationship analyzes between some important chestnut cultivars for our country by using drought-related genomic SSR markers and genic EST-SSR markers. In addition, an alternative molecular analysis evaluation using retrotransposon-based iPBS markers was included, the first for chestnut cultivars grown in our country.
Method: In the study, Hacıömer, Osmanoğlu, Sarıaşlama, Erfelek, Kemer, Işıklar, Şekerci, Siyah Bursa, Bouche De Betizac, Marigoule and Tülü varieties, which are among the most well-known commercial chestnut varieties in Turkey, were used. In the study, in addition to 5 SSR and 8 EST-SSR microsatellite markers, 19 iPBS markers were used for genetic association detection
Results: A tolerance/susceptibility assessment was made among chestnut cultivars with the help of capillary electrophoresis images obtained with drought-related markers. Drought tolerance status of other chestnut cultivars were evaluated on Marigoule cultivar, which is known to be drought sensitive. Band profiles obtained from PCR processes with SSR, EST-SSR and iPBS markers were evaluated and values such as allele size, total number of bands, number of polymorphic bands, polymorphism ratio, observed heterozygosity, polymorphism information content, marker index and discrimination power of these primers were determined. All microsatellite and retrotransposon markers used in the study showed 100% polymorphism among chestnut cultivars. The total number of bands obtained with SSR, EST-SSR markers were recorded as 507 (avg.101,4) and 728 (avg.91,0), respectively. Observed average heterozygosity (Havp) for SSR primers was determined in the range of 0,351 (CsCAT6)-0,464 (CsCAT1) (avg.0,395), while heterozygosity (Havp) for EST-SSR primers was recorded as 0,240 (FIR08)-0.377 (FIR059) (avg.0,309). In addition, the total number of bands obtained with iPBS markers was recorded as 2887 (avg.151,95), and the heterozygosity (Havp) values were found in the range of 0,184 (2295)-0,275 (2256) (avg. 0,204). In UPGMA dendograms obtained with both SSR and EST-SSR markers, Erfelek and Hacıömer chestnut cultivars were determined as the most similar cultivars. In the UPGMA dendogram obtained with iPBS markers, Hacıömer and Şekerci chestnut cultivars were determined as the most similar cultivars with a similarity coefficient value of 0.924, and they formed a subgroup together with Osmanoğlu and Erfelek chestnut cultivars, which showed close similarity with these two cultivars.
Conclusion: As a result, high-accuracy molecular analyzes were carried out to help in chestnut breeding in order to determine the genetic relationship, and it was revealed that the microsatellite and retrotransposon-based markers used would be useful for marker-assisted selection studies.