Tatlısu balıklarında hemorajik septisemiye neden olan Aeromonas hydrophila'nın 16S rDNA RFLP ve RAPD analizleri ile identifikasyonu
The identification of Aeromonas hydrophila associated with hemorraghic septicemia in freshwater fish by 16S rDNA RFLP and RAPD analysis
Yazar: ESRA FATMA DENİZCİ
Danışman: PROF.DR. GÜLŞEN TİMUR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products
Dizin: Aeromonas hydrophila = Aeromonas hydrophila ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RAPD = RAPD ; Restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi = Restriction fragment length polymorphisms

Özet:
Bu çalısma, tatlısu balıklarında hemorajik septisemiye neden olan Aeromonashydrophila'nın teshisinde kullanılan ve fazla zaman alıcı klasik bakteriyolojik teshisyöntemleri yerine, hızlı ve duyarlı olan moleküler teshis metotlarından 16S rDNArestriksiyon fragment uzunluk polimorfizm (RFLP) ve rastgele çogaltılmıs polimorfikDNA (RAPD) analizlerinin kullanılması ve bu suretle hastalıgın çok daha kısa birsürede teshis edilebilmesi amacı ile yürütülmüstür.Bu amaçla, gökkusagı alabalıgından ve çesitli akvaryum balıklarından izole edilen 12adet Aeromonas hydrophila susunun önce konvensiyonel bakteriyolojik yöntemler ileidentifikasyonu yapılmıstır. ncelenen balıklarda vücudun yan yüzeylerinde, agız içinde,yüzgeç diplerinde hemoraji, vücut üzerinde ülseratif hemorajik lezyonlar, solungaçlardasolgunluk, viseral organlarda hemoraji ve dalakta hipertrofi gibi hareketli aeromonadseptisemiye özgü klinik ve otopsi bulguları gözlenmistir.Daha sonra, yurt dısından getirilen referans sus ve izole edilen Aeromonas hydrophilasuslarından Roche DNA izolasyon kiti kullanılarak DNA izole edilmistir. 16S rDNARFLP (Restriksiyon Fragment Uzunluk Polimorfizm) analizi için özgün primerlerkullanılarak öncelikle PCR reaksiyonu gerçeklestirilmistir. DNA'nın restriksiyonendonükleazları ile kesimi için; elde edilen amplifikasyon ürünleri üzerine AluI ve MboIrestriksiyon endonükleazları eklenerek 37°C`de 3 saat inkübe edilmistir. Aeromonashydrophila suslarının RAPD (Rastgele Çogaltılmıs Polimorfik DNA) analizi 3 farklıprimer kullanılarak gerçeklestirilmistir. Restriksiyon enzim reaksiyon karısımı ve RAPDçogaltım ürünleri %2,5'lük agaroz jel elektroforezinde yürütülmüstür. Elektroforezsonrasında, agaroz jel etidyum bromür ile boyanarak UV transilluminator altındaincelenmistir.Bütün susların aynı RFLP profilleri gösterdigi tespit edilerek, suslar Aeromonashydrophila olarak identifiye edilmistir. Aeromonas hydrophila suslarının RAPDprofilleri ise suslar arasında farklılık göstermistir. Bu bulgular Aeromonas hydrophilasusları arasındaki genetik çesitliligi ortaya çıkarmıstır.

Abstract:
The aim of this study was to identify Aeromonas hydrophila associated withhemorraghic septicemia in freshwater fish by rapid and sensitive 16S rDNA RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) and RAPD (Randomly AmplifiedPolymorphic DNA) analysis instead of time-consuming conventional bacteriologicalmethods.For this purpose, 12 Aeromonas hydrophila strains isolated from diseased culturedrainbow trout and various aquarium fish were identified by conventional bacteriologicmethods. The majority of the fish that examined had haemorrhages on the body surface,in the mouth and at the base of fins, pale gills, enlarged spleen and haemorrhages in thevisceral organs.DNA of isolated Aeromonas hydrophila strains and referance strain was extracted byusing DNA Purification Kit (Roche Inc.) according to the manufacturer?s protocol. PCRfor 16S rDNA RFLP analysis was performed by using specific primers. Enzymaticdigestion were performed by incubating the amplication products with MboI and AluI at37ºC for 3 hours. The RAPD analysis of Aeromonas hydrophila strains were performedusing three primers. Aliquot of restriction reaction mixture and amplified RAPD DNAfragments were electrophoresed on a 2,5% agarose gel. After electrophoresis, gels werestained with ethidium bromide, examined and photographed under a UVtransilluminator.All strains showed the same RFLP pattern and identified as Aeromonas hydrophila. Onthe other hand, the RAPD profiles of Aeromonas hydrophila differed between isolates.This findings reveal genetic variety in Aeromonas hydrophila strains