Sularda fekal kirlilik tayinine yönelik biyosensör geliştirilmesi
Biosensor development for the detection of faecal pollution in water
Yazar: ÖZGECAN ERDEM
Danışman: PROF. DR. NİLÜFER CİHANGİR ; PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
İçme ve yüzey sularının mikroorganizmalar ile kontaminasyonu insan sağlığını tehdit ettiğinden dolayı dikkat çeken bir problemdir. Sularda fekal bir kirlilik olduğunu belirleyen mikroorganizmalardan birisi de koliform bakterileri enfekte eden bakteriyofajlardır. Mikroorganizma tespiti için hali hazırda kullanılan yöntemler, zaman alıcı olmalarının yanı sıra fazla emek isterler. Bu yüzden bir alternatif olarak hızlı, hassas ve düşük maliyetli yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu noktada biyosensörler, mikroorganizma tespiti için yararlı araçlardır. Bunlardan birisi de optik biyosensörler sınıfında yer alan yüzey plazmon rezonans biyosensörlerdir. Biyosensör yüzeyinde moleküler baskılanmış polimerlerin kullanılması yüksek seçiciliğe ve hassaslığa sahip olduğundan dolayı tercih edilen bir yöntemdir. Sunulan tez çalışmasının amacı, fekal indikatör mikroorganizmalardan biri olan T4 bakteriyofajını tespit etmeye yönelik  bakteriyofaj baskılanmış yüzey plazmon rezonans biyosensörler hazırlamaktır. Nanopartikül ve nanofilm temelli polimer ile iki farklı yüzey plazmon rezonans biyosensör hazırlanmış ve sularda fekal kirlilik tayinindeki etkinlikleri karşılaştırılmıştır.  Bu bağlamda öncelikle fonksiyonel monomer olan N-metakroil-(L)-histidin metil ester sentezlenmiş ve karakterizasyonu Fourier dönüşümlü kızıl ötesi spektroskopisi ve nükleer manyetik rezonans analizleri ile yapılmıştır. Uygun fonksiyonel monomer ve T4 bakteriyofajı kalıp molekülü ile hazırlanmış ön-kompleks varlığında T4 bakteriyofajı baskılanmış ve baskılanmamış nanopartiküller mini-emülsiyon polimerizasyon yöntemi ile sentezlenmiştir. Zeta boyut, fourier dönüşümlü kızıl ötesi spektroskopisi, taramalı elektron mikroskobu,  geçirimli elektron mikroskobu ve atomik kuvvet mikroskobu analizleri ile karakterize edildikten sonra yüzey plazmon rezonans çip yüzeyine immobilize edilmiştir. Biyosensör yüzeyi, elipsometri ve temas açısı ile karakterize edildikten sonra kinetik, seçicilik, tekrar kullanılabilirlik ve gerçek örnek analizleri için kullanılmıştır. Seçicilik çalışmaları için T2 ve MS2 bakteriyofajları kullanılırken, gerçek örnek analizlerinde çeşme suyu ve deniz suyu kullanılmıştır. Mikro-temas baskılama yöntemi kullanılarak, T4 bakteriyofajı baskılanmış ve baskılanmamış nanofilmler hazırlanmıştır. Yine hazırlanan biyosensör yüzeyi, temas açısı, elipsometri ve atomik kuvvet mikroskobu ile analiz edildikten sonra aynı koşullarda kinetik, seçicilik, tekrar kullanılabilirlik ve gerçek örnek analizleri için kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre nanopartiküller ve nanofilm polimerleri kullanılarak hazırlanan yüzey plazmon rezonans biyosensörlerin 1x104-4x106 pfu (plaque forming unit)/mL derişim aralığında sırasıyla %99 ve %92 doğrulukta ölçüm yapabildiği görülmüştür. Tayin limiti nanopartikül temelli yüzey plazmon rezonans biyosensör için 6x103 pfu/mL iken nanofilm temelli yüzey plazmon rezonans biyosensör için 8x103 pfu/mL olarak hesaplanmıştır. Ayrıca nanopartikül temelli yüzey plazmon rezonans biyosensörün geri kazanım değerleri çeşme ve deniz suyu örneklerinde %91-96 iken nanofilm temelli yüzey plazmon rezonans biyosensörün geri kazanım değerleri %85-90 olarak hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlar her iki yüzey plazmon rezonans biyosensörün de yüksek seçicilikte ölçüm yapabildiğini ancak nanopartikül polimer temelli yüzey plazmon rezonans biyosensörün daha yüksek duyarlılığa ve seçiciliğe sahip olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Contamination of drinking and surface waters with microorganisms is a threatening health problem that attracts attention. One of the microorganisms that determine fecal contamination in water is bacteriophages which infect coliform bacteria. The methods currently used for microoganism detection are time consuming and require more labor. Therefore, there is a need for fast, precise and low-cost methods as an alternative. At this point, biosensors are useful tools for microorganism detection. One of these is surface plasmon resonance (SPR) sensors which are in the class of optical biosensors. The use of molecularly imprinted polymers on the sensor surface is a preferred method because of its high selectivity and sensitivity. The aim of this thesis is to prepare bacteriophage imprinted biosensors to detect T4 bacteriophage which is one of the fecal indicator microorganisms. Two different biosensors were prepared with nanoparticle and nanofilm based polymers and compared. In this context, the functional monomer N-methacroyl- (L) -histidine methyl ester was synthesized and its characterization was made by fourier transformed infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance. T4 bacteriophage imprinted and non-imprinted nanoparticles were synthesized by mini-emulsion polymerization method and immobilized on SPR biosensor surface after zeta size, fourier transform infrared spectroscopy, scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and atomic force microscopy analysis. After the biosensor surface was characterized by ellipsometry and contact angle, the prepared biosensor was used for kinetic, selectivity, reusability and real sample analysis. While T2 and MS2 bacteriophages were used for selectivity studies, tap water and sea water were used in real sample analyzes. T4 bacteriophage imprinted and non-imprinted nanofilms were prepared using the micro-contact imprinting method. The prepared biosensor surface was analyzed by contact angle, ellipsometry and atomic force microscopy and used for kinetic, selectivity, reusability and real sample analysis under the same conditions. According to the results obtained, SPR biosensors prepared using nanoparticles and nanofilm polymers were able to measure 99% and 92% accuracy in 1x104-4x106 pfu/mL concentration range, respectively. The limit of detection was 6x103 pfu/mL for the nanoparticle based biosensor and 8x103 pfu/mL for the nanofilm based biosensor. In addition, recovery values of nanoparticle based surface plasmon resonance biosensor were calculated as 91-96% in tap and sea water samples while recovery values of nanofilm based surface plasmon resonance biosensor were calculated as 85-90%. The results show that both surface plasmon resonance biosensors can measure with high selectivity, but nanoparticle polymer based surface plasmon resonance biosensor has higher sensitivity and selectivity.