Alfa- fetoprotein analizine ilişkin ELISA test sistemi geliştirilmesi
Development of ELISA test system for alpha-fetoprotein analysis
Yazar: DEMET TÜRK TUNCER
Danışman: DOÇ. DR. CANAN GÜLMEZ SAMSA ; DOÇ. DR. CEVAHİR ALTINKAYNAK
Iğdır Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kanser biyobelirteçlerinin arasında önemli bir yere sahip olan alfa-fetoprotein (AFP) karaciğer kanseri başta olmak üzere endoderm kanser, teratoma, yumurtalık kanseri, vitellus kesesi tümörleri, mide kanserinden ve diğer kötü huylu tümörlerde serumda görülmektedir. Hepatosellüler kanser hastalarının kanında % 75-80 oranında AFP bulunduğu bilinmektedir. Gebelik döneminde yaşanan düşük, down sendromu ve nöral tüp defekti vakalarında AFP miktarının değişiklik gösterdiği tespit edilmiştir. AFP' nin erken tespiti ve izlenmesi, hastaların zamanında tedavi edilebilmesi ve hayatta kalım için büyük önem taşımaktadır. ELISA test sistemlerinde enzimle işaretli antikor (konjugat) tekniğin en önemli ve kolaylıkla bozunabilen reaktifidir ve hedef antijen tespitine yönelik hassasiyetin artırılması, stabilite, maliyet ve reaksiyon süresi gibi parametrelerde yeni ve farklı yaklaşım tekniklerine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tez çalışmasında kanser ve patolojik gebelikle ilişkili hastalıkların tespitinde kullanılan α-fetoprotein (AFP) tanısına yönelik fonksiyonel organik-inorganik hibrit nano çiçek konjugat sisteminin kullanıldığı ELISA testinin geliştirilmesi hedeflenmiştir.
Hibrit nano çiçek sentezinde AFP'ye özgü antikorlar, horseradish peroksidaz enzimi ve inorganik bileşen olarak bakır iyonu (Cu+2) kullanılarak hibrit konjugat yapı sentezlenmiştir. Yüksek enkapsülasyon verimi (%97) ile sentezlenen konjugat SEM, EDX, FTIR ve XRD analizleri ile karakterize edilmiştir. Hibrit konjugatın direkt ve sandviç ELISA test sisteminde analizleri gerçekleştirilmiş ve direkt yöntemde testin çalışmadığı tespit edilmiştir. Sandviç ELISA test sisteminde ise optimum çalışma koşulları belirlenmiştir. Bu yöntemde, AFP'ye spesifik poliklonal antikor havuzu kullanılarak hazırlanan hibrit konjugat yapılar 15,6-500 ng/mL aralığındaki konsantrasyonlarda kullanılarak ELISA sistemindeki performansı ölçülmüştür. Bu test için cut off değeri 0.465 olarak hesaplanmıştır. Konjugatın tespit referans aralığı ticari ELISA test kitlerine yakın bulunmuştur. Bulgular işlevselleştirilmiş hibrit konjugat sistemlerin antijen bağlama kapasitesinin diagnostik alanda daha ekonomik bir uygulama alanı sunma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. Hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve stabilite ile ilgili ileri çalışmalara ihtiyaç duymakla birlikte protein-inorganik hibrit malzeme teknolojisi diyagnostik endüstrisine yönelik ELISA kit geliştirilmesine imkan sağlayabilecek niteliktedir. Sunulan biyomühendislik yaklaşımı, isteğe bağlı hibrit sistem geliştirme konusunda umut vaat edicidir.

Abstract:
Alpha-fetoprotein (AFP), which holds a significant position among cancer biomarkers, is observed in the serum of various malignancies, including liver cancer, endoderm tumors, teratomas, ovarian cancer, yolk sac tumors, gastric cancer, and other malignant tumors. It is known that AFP is present in the blood of hepatocellular cancer patients in 75-80% of cases. Changes in the amount of AFP have been detected in cases of miscarriage, Down syndrome, and neural tube defects during pregnancy. Early detection and monitoring of AFP are crucial for timely treatment and survival of patients. In ELISA test systems, the enzyme-labeled antibody (conjugate) technique is the most important and easily degradable reagent, and there is a need for new and different approach techniques to increase sensitivity for target antigen detection, stability, cost, and reaction time parameters. This thesis aims to develop an ELISA test using the functional organic-inorganic hybrid nano-flower conjugate system for the diagnosis of α-fetoprotein (AFP) used in the detection of cancer and pathologic pregnancy-related diseases.
In synthesizing hybrid nano-flowers, specific antibodies to AFP, horseradish peroxidase enzyme, and copper ion (Cu+2) as an inorganic component were used to synthesize hybrid conjugate structures. The conjugate synthesized with high encapsulation efficiency (97%) was characterized by SEM, EDX, FTIR, and XRD analyses. The analyses of the hybrid conjugate were conducted in direct and sandwich ELISA test systems, and it was found that the direct method did not work. Optimum working conditions were determined in the sandwich ELISA test system. In this method, hybrid conjugate structures prepared using a pool of AFP-specific polyclonal antibodies were used in concentrations ranging from 15,6 to 500 ng/mL to measure the performance in the ELISA system. The cut-off value for this test was calculated as 0.465. The detection range of the conjugate was found to be close to commercial ELISA test kits. The findings indicate that functionalized hybrid conjugate systems have the potential to offer a more economical application in the diagnostic field. Although further studies are needed regarding sensitivity, repeatability, and stability, protein-inorganic hybrid material technology is promising for the development of ELISA kits for the diagnostic industry. The presented biomolecular engineering approach is promising for the development of optional hybrid systems.