Oosit maturasyonu ve arrestinde tubal sıvı kültür ortamının yeri
The role of tubal fluid culture conditiion during oocyte maturation and arrest
Yazar: HAYRUNNİSA YEŞİL
Danışman: PROF. DR. HAFİZE SEDA VATANSEVER
Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Oosit matürasyonu embriyonik dönemde başlayıp, mayoz I'in profaz safhasında duraksar ve puberte ile birlikte gelişmeye başlayan foliküllerden fertilizasyon için uygun oositin atılımı gerçekleşir. Oosit gelişimi sırasında mayoz I ve Mayoz II evrelerini kontrol eden birçok moleküler mekanizma bulunmaktadır. Bu mekanizmalar sayesinde oositin bir fazdan diğer faza geçişi sağlanmakta ve fertilizasyon için olgun oosit gelişimi tamamlanmaktadır. Kadın infertilite sebeplerinden oosit matürasyonundaki aksaklıklar ve/veya oositin mayozun herhangi bir aşamasında duraksaması (arrestte kalması) sonucu fertilizasyonun gelişememesi görülebilmektedir. Bu nedenle in vitro şartlarda oosit kültür ortamlarının geliştirilmesi gereklidir. Uygun kültür ortamlarının sağlayabilmesi ve kültür ortamındaki embriyo canlılığının korunabilmesi için, in vivo şartları mümkün olduğunca taklit edebilen kültür sistemlerine ihtiyaç vardır. Bu amaçlara yönelik IVF kültür vasatlarına ek olarak ko-kültür sistemleri de tercih edilebilmektedir. Bu veriler doğrultusunda çalışmamızda oosit kültür ortamında matürasyonu ve arresti üzerine tubal sıvı kültür ortamının etkisi ve bu ortamda kültüre edilmiş oositlerin embriyo geliştirebilme potansiyelleri de öngörülmesi amaçlanmıştır. 

Bu amaç doğrultusunda superovulasyon işleminden sonra elde edilen mayoz 1 ve mayoz II evresindeki oositler, oosit kültür vasatı içerisinde kültüre edildi. İlk grupta mayoz 1 aşamasında Metafaz I oosit kültürü ve Metafaz I oosit kültürü + tubal sıvı ilaveli olan oositler, 2. gruptaki oositler ise mayoz 2 aşamasında olup Metafaz II oosit kültürü ve Metafaz II oosit kültürü + tubal sıvı ilaveli olan oositler kültüre edildi. Böylelikle toplam 4 grup incelendi.  
Gruplar: 
Grup 1: Metafaz I Oosit kültürü 
Grup 2: Metafaz I Oosit kültürü + tubal sıvı ilaveli
Grup 1: Metafaz II Oosit kültürü 
Grup 2: Metafaz II Oosit kültürü + tubal sıvı ilaveli

Kültürün 48. saatinde oositler whole mount immunohistokimyasal analiz yöntemi ile anti-siklin B, anti-MPF, ve anti-MOS dağılımları immunofleurosans boyama tekniği ile incelendi. Eş zamanlı olarak apoptotik hücrelerde TUNEL yöntemi ile incelendi. Bununla beraber ovariyan döngü sırasında salgılanan anti-siklin B,  anti-MOS ve anti-MPF birincil antikorlarının dağılımları için yukarıda tarif edilen oosit eldesi ile eş zamanlı olarak ovaryum örnekleri alındı (5 adet fareden) ve rutin parafin takibi sonrasında elde edilen kesitlerde anti-siklin B,  anti-MOS ve anti-MPF dağılımları indirekt immunoperoksidaz yöntemi ile incelendi. Ovarian doku kesit örneklerinde TUNEL yöntemi uygulanarak apoptotik hücre tanımı yapıldı.   
   Mayoz I döneminde alınan oositlerin tubal sıvı ile kültür sonrasında Mayoz II aşamasına geçtikleri gözlenirken, Mayoz II dönemindeki oositlerin tubal sıvı kültürü içinde canlılıklarını korudukları ve özellikle Emi salınımı ile her iki dönemdeki oositlerin canlılıklarının korundukları saptandı. Ovaryum dokusunda da Emi salgısı erken dönemde pozitif iken, MOS and Siklin-B salgılarının follikül gelişimi ile birlikte arttıkları saptandı. 
Sonuç olarak oosit matürasyonunda Emi salgısı önemli iken, gelişen folliküllerde MOS ve Siklin-B salgılarının önemli olduğu ve oosit canlılığı ile ilişkili oldukları sonucuna varıldı.

Abstract:
Maturation of oocyte started at embryonic stage, it hesitated during prohase I of meiosis, started to develop in puberty with developing follicules. During the development stages of oocyte at meiosis I and meiosis II, many molecular mechanisms controls. These mechanisms also provided to transition from one phase to another phase of oocyte and was complemented by the development of mature oocytes for fertilization. Oocyte maturation problems and/or pauses of development of oocyte during meiotic stage (remain in arrest) could not be seen fertilization. Therefore, the culture condition for oocyte had to be develop. Provided appropriate culture media and to protect the viability of embryos cultured in vivo culture system that could mimic conditions were needed as much as possible. For these purpose, in addition to IVF culture medium, co-culture systems might be preferred. According to these data, in our study, we investigated to analyze the effect of tubal fluid culture system on oocyte maturation and embryo development potentials. For this purpose, after superovulation of mouse, meiosis I and meiosis II stage of oocytes would be cultured in culture condition. In the first group, oocytes with cumulus cells would be at stage of meiosis I, in the second group oocytes without cumulus cells would be at stage of meiosis II would be culture in medium with tubal fluid. A total of 6 groups would be examined.
Groups:
Group 1 : Metaphase I oocyte culture
Group 2 : Metaphase I oocyte culture + tubal fluid
Group 3 : Metaphase II oocyte culture 
Group 4 : Metaphase II oocyte culture + tubal fluid

 	After 48 hour of culture, oocytes would be evaluated anti-cyclin B, anti-MPF and anti-MOS distribution using whole mount immunofleurosans staining technique.  Apoptotic cells by TUNEL assay would be evamined with the same time. In addition, to analyze secreted anti-cyclin B, anti-MPF and anti-MOS distribution during ovarian cycle, ovarian tissue would also be collected (form 5 mouse) and after routine paraffin embedding protocols, the sections would be stained to with  anti-cyclin B, anti-MPF and anti-MOS using immunoperoxidase technique. In ovarian tissue sections, the apoptotic cells would be analyze using TUNEL assay.
While the oocytes taken during meisis I were  observed to pass to phase of meiosis II following the culturing in the tubal fluid  ,the oocytes in meiosis  II were noted to preserve their vitality in the tubal fluid culture and   especially during both phases  with the secretion of Emi.