Fipronil ve siflutrin pestisitlerinin zebra balıklarında (Danio rerio,Hamilton, 1822) sanger ve yeni nesil dizi analizi ile DNA metilasyon mekanizmasının araştırılması
İnvestigation of the DNA methylation mechanism of fipronil and cyfluthrin pesticides in zebrafish (Danio rerio, Hamilton, 1822) by sanger and next generation sequence analysis
Yazar: GÜLSÜM KOÇAK
Danışman: PROF. DR. AYLİN SEPİCİ DİNÇEL ; PROF. DR. AYSEL ÇAĞLAN GÜNAL
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Çevre Bilimleri Ana Bilim Dalı / Toksikoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Çevresel kirlilik modern insan yaşamında önemli sorunlardan biri olarak ele alınmaktadır. Artan nüfus ve sanayi ile birlikte tüketim ihtiyacı artmış ve bu doğrultuda ürünlerdeki zararlıların uzaklaştırılması ve ürün verimi açısından kimyasal maddelere yönelim de artış göstermiştir. Dünyada pestisitlerin aşırı kullanımı özellikle sucul canlıları olumsuz etkilemektedir. Bu tez çalışmasının amacı; endokrin bozucu olduğu bilinen sentetik piretroid insektisitlerden siflutrin ve fenilprezol insektisit ailesinden fipronilin sucul bir model organizma olan zebra balıklarında (Danio rerio, Hamilton, 1822) DNA metilasyon mekanizmasının araştırılmasıdır. Araştırma akut toksisite ve DNA metilasyonu deneyleri olmak üzere iki bölümde yürütülmüştür. Akut toksisite deneylerinde ortalama boyları 2,51±0,49 cm ve ağırlıkları 0,14±0,06 g olan zebra balıkları kullanılmıştır. Laboratuvara adaptasyonları sağlanan 100 adet balık, 5 adet akvaryuma eşit şekilde dağıtılmış ve adaptasyon sürecinde ölüm oranının %5'ten az olmasına dikkat edilmiştir. Kontrol grubu, deney gruplarında ise test kimyasallarının LC50 değerinin 1/10 ve 1/100'ü (siflutrin 3,61 µg/L ve fipronil 1,81 µg/L) alınarak dozlama yapılmıştır. Deney grubundaki akaryumlarda 96. saat ve 7. günde metabolik artıkları sucul ortamdan uzaklaştırmak amacıyla akvaryum suları değiştirilerek dozlama tekrarlanmıştır. 7. günün sonunda balıklar baş ve kuyruk kısımları kesilerek, -80oC'de saklanmıştır. Bu çalışmada belirlenen CYP1A, HSP70 genleri ile üç adet ACTB, B2M ve EF1A referans gen çalışılmıştır. Sonuç olarak siflutrin ve fipronil için Sanger dizileme metilasyon yüzdeleri gruplara göre ayrı ayrı hesaplanmış ve Grup 1 (Kontrol) yüzdesi 28,36; Grup 2 (fipronil 7. gün düşük doz)  26,73; Grup 3 (fipronil 7. gün yüksek doz) 27,65 olarak belirlenmiştir. Siflutrin pestisit gruplarında ise Grup 4 (siflutrin 96. saat düşük doz) 27,26; Grup 5 (siflutrin 96. saat yüksek doz) 28,31; Grup 6 (siflutrin 7. gün düşük doz)  28,26 ve Grup 7 (siflutrin 7. gün yüksek doz) 28,22 olarak verilmiştir. Yeni nesil dizi analizi istatistik sonuçlarına göre ise p<0,05 olmak üzere CG, CHG ve CHH bölgelerinde ortalama farklar 0,05 seviyesinde anlamlıdır ve genler arasında anlamlı ilişki bulunduğu belirlenmiştir. Çevre kirleticisi olan iki pestisitin sucul organizmalar üzerine etkilerinin belirlenmesi ve çevresel epigenetik ile literatüre katkı sağlanmıştır.

Abstract:
Environmental pollution is considered one of the important problems in modern human life. With the increasing population and industry, the need for consumption has increased, and accordingly, the tendency towards chemical substances has increased in terms of removing pests from products and product efficiency. Excessive use of pesticides in the world negatively affects especially aquatic organısms. The purpose of this thesis study is to investigate the DNA methylation mechanism of cyfluthrin, a synthetic pyrethroid insecticide known to be an endocrine disruptor, and fipronil, a member of the phenylprezole insecticide family, in zebrafish (Danio rerio, Hamilton, 1822), an aquatic model organism. The research was conducted in two parts: acute toxicity and DNA methylation experiments. Zebrafish with an average length of 2.51±0.49 cm and a weight of 0.14±0.06 g were used in acute toxicity experiments. 100 fish adapted to the laboratory were distributed equally among 5 aquariums, and care was taken to ensure that the mortality rate was less than 5% during the adaptation process. In the control group and experimental groups, dosing was done by taking 1/10 and 1/100 of the LC50 value of the test chemicals (cyfluthrin 3.61 µg/L and fipronil 1.81 µg/L). In the aquariums of the experimental groups, dosing was repeated by changing the aquarium water at the 96th hour and on the 7th day to remove metabolic residues from the aquatic environment. At the end of the 7th day, the head and tail parts of the fish were cut off and stored at -80oC. In this study, the determined CYP1A, HSP70 genes, and reference genes ACTB, B2M, and EF1A were studied. As a result, Sanger sequencing methylation percentages for cyfluthrin and fipronil were calculated separately according to groups and the percentage of Group 1 (Control) was 28.36; Group 2 (fipronil day 7 low dose) 26.73; Group 3 (fipronil high dose on day 7) was determined as 27.65. Among the cyfluthrin pesticide groups, Group 4 (cyfluthrin 96th-hour low dose) was 27.26; Group 5 (cyfluthrin 96th-hour high dose) was 28.31; Group 6 (cyfluthrin day 7 low dose) was 28.26 and Group 7 (cyfluthrin day 7 high dose) was given as 28.22. According to the statistical results of the next-generation sequence analysis, the average differences in the CG, CHG, and CHH regions were significant at the 0.05 level, with p<0.05, and it was determined that there was a significant relationship between the genes. Contributions were made to the literature by determining the effects of two pesticides, which are environmental pollutants, on aquatic organisms and environmental epigenetics.