NAV-2, Cyclin D2, FABP3 ile TGLN antikorlarının, uterus endometrial stromal sarkomları ve leiomyosarkomlarının ayırıcı tanısında yeterliliğinin ve prognostik özelliklerinin  değerlendirilmesi
Evaluation of NAV-2, Cyclin D2, FABP3 and TGLN antibodies for differantial diagnosis between endometrial stromal sarcoma and leiomyosarcoma and for prognosis prediction.
Yazar: ÖZERK DOĞUŞ GÖRGÜN
Danışman: PROF. DR. EKREM YAVUZ
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology ; Patoloji = Pathology
Dizin: Cerrahi-kadın doğum = Surgery-obs.-gyn. ; Endometrial neoplazmlar = Endometrial neoplasms ; Endometriyum = Endometrium ; Gen ifadesi = Gene expression ; Histopatoloji = Histopathology ; Leiyomiyosarkom = Leiomyosarcoma ; Prognoz = Prognosis ; Teşhis-ayırıcı = Diagnosis-differential ; Uterin servikal neoplazmlar = Uterine cervical neoplasms ; Uterus neoplazmları = Uterine neoplasms

Özet:
Amaç: Leiomyosarkomlar(LMS) tüm uterus malignitelerinin %1-3 kadarını, endometrial stromal sarkomlar(ESS) ise %1'den daha azını oluşturmaktadır. Her iki tümör tipinde de en önemli öngörü belirteci hastalığın evresidir. LMS olgularında 5 yıllık sağkalım ortalama %40'larda, LG-ESS olgularında ise %80'lerdedir. Sağkalım özellikleri arasında belirgin fark olan bu tümörlerin ayrımında genel olarak morfoloji temellidir. Morfolojik olarak ayırıcı tanıda zorluk yaşanılan olgularda immünhistokimyasal çalışmalar bu konuda destek olmaktadır. Günümüz bilgileri ışında, CD10 ve düz kas belirteçleri ayırıcı tanı panelini oluşturmaktadır. Fakat kimi düz kas tümörleri CD10 immünreaktivitesi ve kimi endometrial stromal lezyonlar da düz kas belirteçleri ile immünreaktivite göstermektedir. Bu konuda ek testlere ihtiyaç duyulmaktadır.
Son yıllarda çeşitli tümörlerde moleküler genetik değişimler tanımlanmaya başlanmıştır. Bu tanımlamalar içerisinde uterus sarkomları da payını almıştır. Yapılan araştırmaların sonucunda, LMS olgularında CDK2NA, FABP3, TGLN, JPH2, GEM, NAV-2, RAB23 gibi genlerin; ESS olgularında ise SLC7A10, EFNB3, CCND2, ECEL1, ITM2A, NPW, PLAG-1 ve GCNR gibi genlerin overeksprese oldukları saptanmıştır. Çalışmamızda, uterus sarkomlarında NAV-2, TGLN, FABP3 ve CCND2 genleriyle ilişkili proteinlerin varlığının, uterus sarkomlarında hastalık seyri ile ilişkilerine ve ayırıcı özelliklerine geniş tümör alanı üzerinde bakılması amaçlanmıştır. 
Gereç ve yöntem: 1992-2018 yılları arasında İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı'nda incelenmiş, ESS ve LMS tanıları almış olgular dijital arşivden listelendi ve raporları incelendi. Daha sonra arşivden bu olgulara ait preparatlar çıkarıldı ve morfolojik olarak değerlendirildi. 
	Toplamda 118 uterus sarkomunun örneklerine ulaşıldı. Bunların 71'i LMS, 39'u low grade endometrial stromal sarkom (LG-ESS) ve 6'sı high grade endometrial stromal sarkom olgusudur (HG-ESS). Kalan ikisi ise LMS-ESS ve LMS-Anjiyosarkom şeklinde kombine olgulardır. 

Tümörlerden iç kontrol olarak düz kas ve endometrium dokuları da bulunan parafin bloklar seçildi ve kesitler oluşturuldu. Nav-2, TGLN, FABP3 ve cyclin D2 antikorları ile immünhistokimyasal boyalamalar yapıldı. Aynı zamanda morfolojik özellikler, orjinal raporlardan ve preparatların tekrar gözden geçirilmesiyle sağlandı. İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Kliniği ile İstanbul Üniversitesi Onkoloji Enstitüsü'nün dosya arşivlerinden ve patoloji raporlarında ismi bulunan klinisyenlere telefon ile ulaşılarak çalışmamızdaki olgulara ait sağkalım, takip ve tedavi verileri öğrenildi. Örnekleri olan olguların içinde 49 LMS'un, 22 LG-ESS'un ve 4 HG-ESS'un takip bilgisi öğrenilebildi. Daha sonra immünhistokimyasal ve morfolojik değerlendirme sonuçları, klinik veriler ile karşılaştırıldı. 
Bulgular:  Uterus sarkomlarının büyük kısmı LMS olgularından oluşmaktadır (%60). Takiben 2. sırada LG-ESS olguları görülmektedir (%33). LMS olgularının ortalama 50'li yaşlarda, LG-ESS olgularının ise 40'lı yaşların ortalarında görüldüğü izlendi. Takip süreleri LMS olgularında ortalama 49,57, LG-ESS'larda 128,05 ve HG-ESS'larda 77 aydır. Takip bilgisi olan LMS olgularının 37/49'u, LG-ESS olgularının 0/22'si ve HG-ESS olgularının 1/4'ü ölmüştür. LG-ESS olgularından ölen olmaması, LMS ile aralarında belirgin seyir farklılığı olduğunu gösterdi. 
	Klasik bir bilgi olarak uterus sarkomlarında en önemli öngörü belirteci evredir. Olgu sayısı azlığı nedeniyle Evre 1-2 ve Evre 3-4 şeklinde gruplar oluşturuldu. İleri evre olgular LMS'lar içinde %33, LG-ESS olgularında ise %21 civarındadır. 6 HG-ESS olgusunun 3'ü Evre 1-2, diğer 3'ü ise Evre 3'tür. Evre 4 ESS olgusu görülmedi. Evre 1-2 olgularda ortalama genel sağkalım (GS) süresi 89,21, Evre 3-4 olgularda ise ortalama 23,72 aydır. Değerlendirmemizde, sağkalımı ve evresi aynı anda bilinen 48 LMS olgusu üzerinde Evre 1-2 ile Evre 3-4 olgu grupları arasında GS açısından ileri derecede anlamlı farklılık saptandı (p<0,001). LG-ESS olgularında ölen olmadığından ve HG-ESS olgularının sayı azlığından dolayı bu gruplarda ayrı değerlendirme yapılmadı.
	LMS olgularında sağkalım ile yaşın ilişkisi literatürde çeşitli çalışmalarda mevcuttur. Çalışmamızda 55 yaş üstü olgularda GS daha kısa bulundu (p=0,044). Hastalıksız sağkalım (HS) ise 60 yaş üstü olguları baz aldığımızda daha kısa olarak görüldü (p=0,013).

Evrede önemli olan parametrelerden biri tümör boyutudur. Çalışmamızda 10 cm'den büyük LMS olgularının daha kısa sürede nüks ettiği saptandı (p=0,024). Ayrıca nekroz görülen LMS olgularının daha kötü seyrettiği görüldü (p=0,028). Lenfovasküler invazyon (LVİ) saptanmış olan LMS olgularında GS süresi ortalama 33,16, HS süresi ise ortalama 19,72 ay bulundu. LVİ izlenmeyenlerde bu değerler sırası ile ortalama 75,37 ve 62,8 ay olarak hesaplandı. Aralarında belirgin farklılık izlendi fakat istatistiksel olarak bir anlamlılık görülmedi. Mitoz indeksi ile GS süreleri orta derecede ters korele izlendi (r=-0,353, p=0,013).
Nav-2 antikorunun uterus sarkomlarında hafif, orta ve şiddetli reaksiyonlar verdiği görüldü. Orta ve şiddetli reaksiyonlar, bir adet HG-ESS olgusu hariç sadece 18 adet LMS olgusunda izlendi. Orta ve şiddetli reaksiyonlar dikkate alındığında Nav-2 antikorunun varlığının LMS tanısını desteklediği saptandı. Ekspresyon varlığının ve düzeyinin GS ve HS ile ilişkisi saptanmadı. 
Transgelin proteini, uterus ve yumuşak doku tümörlerinde çalışılmış ve düz kas diferansiasyonunu gösteren bir belirteç olarak tanımlanmıştır. Çalışmamızda 64 LMS olgusunun 18'inde yaygın, 18'inde fokal pozitiflikler izlendi. ESS olgularında reaksiyon gözlenmedi. LMS olguları içinde sağkalımla ilişkisi bulunmadı. LMS ve ESS ayrımında %56,2 sensitivite ve %100 spesifiteye sahip olduğu hesaplandı. 
FABP3 proteini, 33 LMS olgusunun 21'inde, 11 LG-ESS olgusunun 7'sinde ve 3 HG-ESS olgusunun 1'inde kuvvetli reaksiyon göstermiştir. Kalan olgularda zayıf reaksiyonlar izlenmiştir. Uterus sarkomlarının ayrımında etkisiz bulundu ve LMS olgularında sağkalımla ilişkisi görülmedi.      
Cyclin D2, hücre siklusunda önemli bir role sahip, ağırlıklı olarak nükleusta yer alan bir proteindir. Çalışmamızda 68 LMS, 38 LG-ESS ve 6 HG-ESS olgusu üzerinde değerlendirme yapıldı ve LMS olgularının 47'sinde, LG-ESS olgularının 26'sında ve HG-ESS olgularının 4'ünde nükleer boyanma izlendi. Tümör gruplarının ayrımında etkisinin olmadığı görüldü. LMS olgularında nükleer ekspresyon kaybının kısa GS ile ilişkisi saptandı (p=0,034). 
Sonuç: Uterus sarkomlarında en sık LMS olguları görülmektedir. LMS'lar, LG-ESS olgularına göre belirgin derecede kötü seyretmektedirler. Evre hastalığın seyrini belirgin bir şekilde etkilemektedir. LMS olgularının tanı kriterlerinden olan atipinin sağkalımla ilişkisi izlenmemiştir. Nekroz görülen LMS olgularının kötü seyrettiği saptanmıştır. LVİ varlığının istatistiksel olarak kanıtlanamasa da olumsuz seyirle ilişkili olduğu görülmüştür. Artan mitoz değerleri GS süreleri ile ters orantılı bulunmuştur. 
Çalışmamızda yer alan dört belirteçten Nav-2, hastalık seyrini belirlemede yetersiz bulunmuştur. Buna karşın literatürde epitelyal tümörlerde kaybının olumsuz seyirle ilişkisi gösterilmiş olan cyclin D2, LMS olgularında da kaybın kısa GS ile ilişkisi saptanmıştır. Bu bulgumuz literatürde ilktir. Farklı tümör ailelerinde de çalışılmış ve anlamlı sonuçlar alınmış olan bu molekül, tümör seyrini belirlemek açısından umut vaat edicidir. Transgelin molekülünün düz kas diferansiasyonunu saptamada oldukça yararlı olduğu görülmüştür.  FABP3 molekülü ise ayırıcı tanı ve seyir açısından anlamlı bir sonuç göstermemektedir. 
Neticede cyclin D2 ve transgelin moleküllerinin immünhistokimyasal değerlendirme sonuçları umut vericidir. Özellikle bu iki belirtecin uterus sarkomlarında ve diğer organların tümörlerinde daha çok çalışılmasının gerektiği, tümör seyirleri ve ayırıcı tanılar açısından yararlı olabilecekleri ve ileride günlük pratikte faydalı testler haline gelebilecekleri düşünülmüştür.

Abstract:
Aim: Leiomyosarcomas (LMS) constitute 1-3% and endometrial stromal sarcomas (ESS) constitute less than 1% of all uterine malignancies. Currently, stage is the most powerful prognostic indicator for both tumors. Five year survival rate for LMS is about 40%, for low grade endometrial stomal sarcomas, it is approximately 80%. For the two above-mentioned tumors, which have different survival rates, differential diagnosis is mainly made by morphological features. In borderline cases immunohistochemical tests are helpful. Currently, CD10 and smooth muscle markers are main  immunohistochemical markers for differential diagnosis. Some of the smooth muscle tumors show CD10 positivity whereas some endometrial stromal tumors have immunohistochemical and morphological smooth muscle differantiation. So additional tests are needed. 
	Recently, molecular genetic features about uterine mesenchymal tumors have been described. Studies about uterine sarcomas showed that CDK2NA, FABP3, TGLN, JPH2, GEM, NAV-2, RAB23 are overexpressed in LMS's and SLC7A10, EFNB3, CCND2, ECEL1, ITM2A, NPW, PLAG-1 ve GCNR are overexpressed in ESS's. In our study, we aimed to investigate the  NAV-2, TGLN, FABP3 and CCND2 genes products in uterine sarcomas, and its association with disease progression and differential diagnosis characteristics.
Materials and methods: The digital archive was searched for patients with a diagnosis of either LMS or ESS, who were examined in Istanbul University Faculty of Medicine Pathology Department between 1992-2018. Then, the slides of these cases were retrieved from the archive and re-evaluated morphologically.
A total of 118 uterine sarcomas were obtained. Of these, 71 were LMS, 39 were low grade endometrial stromal sarcoma (LG-ESS) and 6 were high grade endometrial stromal sarcoma (HG-ESS). The remaining two are mixed cases of LMS-ESS and LMS-Angiosarcoma.
Paraffin blocks that include smooth muscle and endometrial tissues as internal controls were selected for immunohistochemical examination, using antibodies against to Nav-2, transgelin, FABP3 and cyclin D2. Morphological features were also obtained from the original reports and review of the slides. 
Survival, follow-up and treatment data of the patients in our study were obtained from the file archives of Istanbul University Istanbul Medical Faculty Obstetrics Department of Gynecologic Oncology and Istanbul University Institute of Oncology. The follow-up information of 49 LMS, 22 LG-ESS and 4 HG-ESS was obtained. Immunohistochemical and morphological findings were compared with clinical data.
Results: The majority of uterine sarcomas were LMS cases (60%). LG-ESS cases constituted  33% of the total group. Mean age of cases was 51,17 for LMS's and 45,03 for LG-ESS's. The average follow-up period was 49.6 months for LMS, 128.1 months for LG-ESS and 77 months for HG-ESS. 37 out of 49 patient in LMS group, 0 out of 22 patients in LG-ESS and 1 out of the 4 patients in HG-ESS cases died during follow-up. Mortality rates were significantly different between LMS's and LG-ESS's (p<0,001).
The prognosis largely depended on the stage at the initial diagnosis. Because of the small number of cases, Stage 1-2 and Stage 3-4 groups were formed in our study. Advanced stage cases constituted 33% of LMS and 21% of LG-ESS cases, respectively. Of the 6 HG-ESS cases, 3 were stage 1-2 and the other 3 were stage 3. There was no stage 4 patient in all ESS's. For LMS cases, the mean survival time was 89.2 months in Stage 1-2 cases and 23.7 months in Stage 3-4 cases. A significant difference was found between Stage 1-2 and Stage 3-4 case groups on 48 LMS cases (p <0.001). Because of no deaths were detected in LG-ESS cases and the low number of HG-ESS cases, prognostic evaluations were not performed for these tumors.
In our study, overall survival (OS) was found to be shorter in patients older than 55 years (p = 0.044) and disease-free survival (DFS) was shorter in patients over 60 years of age (p = 0.013) for LMS.
One of the important parameters in the staging is tumor size. We demonstrated that LMS cases larger than 10 cm had recurrence in a shorter period (p = 0.024). From a morphologic view of point, we demonstrated that LMS cases with necrosis had worse prognosis than the others (p = 0.028). In LMS cases with lymphovascular invasion (LVI), mean OS duration was 33.2 months and DFS duration was 19.7 months. These values were calculated as 75.37 and 62.8 months for cases without LVI (for OS: p=0,391, for DFS p=0,331). There was a moderate degree of inverse correlation between mitosis and OS (r =-0.353, p = 0.013).
In our study, Nav-2 antibody showed mild reactions in all types of uterine sarcomas. However, moderate and strong reactions were seen in only 18 cases of LMS and one case of HG-ESS. Nav-2 expression was found to be useful for differential diagnsosis between LMS and LG-ESS when only moderate or strong  expression was taken to account. There was no relationship between Nav-2 reactions with OS or DFS. 
Transgelin has been studied in uterine and soft tissue tumors and has been described as a marker of smooth muscle differentiation. In our study, 18 out of 64 LMS cases were to be widespread positive and 18 out of 64 cases were focally positive. All ESS cases were negative for transgelin. The results showed that it has 56,2% sensitivity and 100% spesifity for differentiating LMS's from ESS's. The presence of transgelin expression was not significant with regard to OS or DFS of LMS cases. 
FABP3 protein reacted strongly in 21 out of 33 LMS cases, 7 out of 11 LG-ESS cases and 1 out of 3 HG-ESS cases. In the remaining cases, weak reactions were observed. We found out that there was no significant difference in FABP3 expression between uterine sarcoma types. Furthermore, there was no association between FABP3 reactions and disease progress in LMS cases.
 	Cyclin D2 is a nuclear-intense protein that plays an important role in the cell cycle. In our study, 68 LMS, 38 LG-ESS and 6 HG-ESS cases were evaluated and nuclear positivity was observed in 47 out of LMS cases, 26 out of LG-ESS cases and 4 out of HG-ESS cases. There was no difference in expressions between tumor groups. But nuclear expression loss was associated with short OS in LMS cases (p = 0.034).
Conclusion: LMS cases are the most common in uterine sarcomas. They have significantly worse prognosis than LG-ESS cases. The stage significantly affects the course of the disease in LMS's. Cellular atypia was not associated with survival times. On the other hand, LMS cases with necrosis were also found to have a poor prognosis. LVI does not affect the survival time, statistically. Increased mitosis values were inversely corralated with OS.
Of the four markers tested in our study, Nav-2 was found to be insufficient to predict the progress of the disease. On the other hand, cyclin D2, which was previously shown to be associated with poor prognosis in epithelial tumors, was associated with short OS in LMS cases. To our knowledge, this finding is the first in the literature. Therefore, Cyclin D2 molecule is promising for prediction of the disease course for LMS. Transgelin molecule was found to be very useful in detecting smooth muscle differentiation. The FABP3 molecule did not show any significant difference in terms of differential diagnosis and clinical course of uterine sarcomas.
In conclusion, the results of immunohistochemical evaluation of cyclin D2 and transgelin molecules are promising. In particular, these two markers need to be studied more in uterine sarcomas and tumors of other regions. They may be useful markers for prediction of prognosis and differential diagnosis and may become useful tests in daily practice.