Fibriler alfa-sinükleinin hücre içi taşınım ve hücre dışına salınımında şaperonların rolünün nörona farklılaştırılmış hücrelerde araştırılması
Investigation of the roles of chaperones on intracellular transport and extracellular release of fibrillar alpha synuclein in neuron-differentiated cells
Yazar: TUGAY ÇAMOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. DUYGU GEZEN AK
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Nöroloji = Neurology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Alfa sinüklein = Alpha synuclein ; Hücreler = Cells ; Kinezin 1 = Kinesin 1 ; Parkinson hastalığı = Parkinson disease

Özet:
Parkinson Hastalığı, klinik olarak belirli hareket bozukluklarıyla ve patolojik olarak hücre içinde Lewy Cisimleri ile karakterize edilen nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalık, beyinde zamanla daha çok bölgeyi etkiler ve buna bağlı olarak yeni semptomlar ortaya çıkar. Postmortem patolojik incelemeler, sporadik vakalardaki ilerleme sürecinin belirli bir düzenle ve hücreler arası bağlantıları takip edecek şekilde gerçekleştiğini ortaya koymuştur. İlerleyen yıllarda, bu ilerleme sürecinin prion-benzeri özellikler sergileyen fibriler alfa-Sinüklein (f-aSyn)'den kaynaklanabileceği ileri sürülmüş ve takibinde yapılan pek çok çalışma ile bu görüş desteklenmiştir. F-aSyn, nöronal uzantılarda kinezin motor proteini ile aktif olarak taşınarak bir hücreden diğerine ve beyinde bölgeden bölgeye yayılabilmektedir. Kinezin-1, farklı adaptörler kullanarak kargolarına bağlanmaktadır ve f-aSyn'nin de bir adaptör aracılığıyla bağlayarak taşınmasını sağlayabilir. Şaperonlar, kinezin-1 ile sitoplazmik proteinler arasında adaptör olabildikleri ve f-aSyn ile bağlanabildikleri için bu çalışma kapsamında adaptör olabilecekleri değerlendirilmiştir. Ayrıca, f-aSyn'in hücresel stress ve şaperonların ekspresyonu üzerindeki etkileri de çalışmaya alınmıştır. Bu doğrultuda, nörona farklılaştırılan hücrelere 1µM f-aSyn uygulaması gerçekleştirilerek, sırasıyla, konfokal mikroskobuyla f-aSyn'nin hangi zaman aralığında hücre içine girdiği, total protein izolasyonu ardından immün blotlamayla şaperonların ekspresyonlarına etkisi, immün çöktürme ve immün blotlamayla şaperonların f-aSyn'nin taşınımı ve florometrik ölçümlerle hücre dışına salınımındaki rolleri araştırıldı. Elde ettiğimiz bulgulara göre, f-aSyn hücre içine girdiği ilk 12 saatte hücresel stres seviyesini ve şaperonların çoğunun hücre içi seviyelerini düşürmüş veya baskılamıştır. Ayrıca, Hsp40'ın f-aSyn'ye bağlanarak taşınımı sırasında ona refakat ettiğine yönelik bulgular elde edilmiştir. Bu çalışma, f-aSyn'nin şaperonları baskılayarak hücresel müdahalelerden kurtulmak için zaman kazandığını ve şaperonları refakatçı olarak yanına alabildiğini sistemli bir şekilde inceleyen ilk çalışmadır.

Abstract:
Parkinson's Disease is a neurodegenerative disorder characterized with certain movement disorders clinically and Lewy Bodies pathologically. Within time, it effects many region in the brain, and relation to this, new symptoms are seen. Postmortem pathological examinations have revealed that the progression process occurs in a certain order and follows cellular connections in sporadic cases. That the progression may be caused by fibrillar alpha-synuclein (f-aSyn) exhibiting prion-like features has been suggested, and subsequent studies have supported this opinion. F-aSyn spreads cell-to-cell and region-to-region in the brain by being transported on neurites by kinesin motors. Kinesin-1 can use adapters to load its cargos, and may transport f-aSyn in the same way. Because of their roles in cytoplasmic protein transport, we have considered the chaperones as adapter candidates in f-aSyn transport. Moreover, the effects of f-aSyn on cellular stress and the expression of chaperones was also investigated. Accordingly, by applying 1µM f-aSyn to neuron-differentiated cell, the time interval of cellular uptake of f-aSyn was investigated by confocal microscope. The expression levels of chaperones was determined by immunoblots following total cellular protein isolation. Finally, the roles of chaperones on transport and release of f-aSyn were studied by immunoblots following immunoprecipitation and by fluorometric measurements, respectively. According to our findings, within first 12 hours of its uptake, f-aSyn reduced cellular stress level, and reduced or suppressed intracellular level of most of the chaperones. Moreover, for the first time, we have presented the findings indicating that Hsp40 can take role as accompanist in transportation of f-aSyn.