Bacteroides türlerinde antimikrobiyal duyarlılığın akım sitometri yöntemi ile hızlı tespiti
Rapid detection of the antimicrobial susceptibility of bacteroides SPPP. BY flow cytometry
Yazar: SİNEM KAYA
Danışman: DOÇ. DR. ORHAN BEDİR
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Gülhane Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Bacteroides = Bacteroides ; Bacteroides fragilis = Bacteroides fragilis ; Bakteriler-anaerobik = Bacteria-anaerobic ; Mikrobiyal duyarlılık testleri = Microbial sensitivity tests

Özet:
Anaerop bakteriler, yüksek morbidite ve mortaliteye neden olan bakterilerdir. Anaerop bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlar çoğunlukla endojen kaynaklıdır ve miks enfeksiyonlar şeklinde seyretmektedir. Önemli enfeksiyonlara neden olan anaerop bakterilerde direnç sorunu her geçen gün artmaktadır. Artan direnç sorunu ile, bölgesel olarak bu bakterilerin duyarlılık/direnç profillerinin belirli periyotlar halinde belirlenmesi daha da önem kazanmaktadır.  Anaerop bakterilerin duyarlılık test yöntemleri, uygulanması pratik olmayan, zaman alıcı yöntemlerdir ve rutin olarak uygulanamamaktadır. Ancak steril bölgelerden ve tek etken olarak izole edildiğinde, Bacteroides fragilis gibi yüksek virülansa sahip olan dirençli türlerde, ampirik tedaviye rağmen iyileşmeyen olgularda duyarlılık test yöntemlerinin uygulanması gerekmektedir.
Çalışmada; Bacteroides türlerinde antimikrobiyal duyarlılığın tespit edilmesinde, akım sitometri yönteminin uygulanabilir bir yöntem olup olmadığı araştırılmıştır. Bunun için Gülhane Eğitim ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı Bakteriyoloji Laboratuvarı'na rutin anaerop kültür isteğiyle gönderilen örneklerden izole edilen Bacteroides türleri kullanıldı. İzole edilen bakterilerin tanımlanması Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) ile yapıldı. Bakterilerin penisilin G, klindamisin, kloramfenikol, meropenem, metronidazol ve amoksisilin klavulanik asit antibiyotiklerine karşı olan antimikrobiyal duyarlılıkları referans yöntem agar dilüsyon yöntemi ile belirlendi. Çalışmada ayrıca E-Test yöntemi kullanıldı. 
Akım sitometri analizinde, kullanılan antibiyotiklerin EUCAST'de belirtilen klinik sınır değer konsantrasyonları kullanıldı. Bu konsantrasyondaki antibiyotiklerle muamele edilen anaerop bakterilerde canlı/ölü hücre ayrımı yapıldı. Canlı/ölü hücre ayrımı için hücre geçirgen olan thiazole orange (TO) ve hücre geçirgen olmayan propidium iodide (PI) boyası kullanıldı. 
Agar dilüsyon yöntemine göre duyarlı tespit edilen bakteriler 'hücre membran potansiyeli değişen hücreler', dirençli tespit edilen bakteriler ise 'hücre membran potansiyeli değişmeyen hücreler' olarak değerlendirildi. Akım sitometri uygulamalarında antibiyotiksiz hücre süspansiyonlarının, negatif kontrol grubu olarak analizi yapıldı. Membran potansiyeli değişmeyen negatif kontrol grubu istatistiksel analize dahil edildi. 
Bacteroides türlerinde antimikrobiyal duyarlılığa karar vermede 'Klinik Sınır Değer PI Boyanma Oranı (%)' kullanıldı. Klinik sınır değer hesaplanmasında Receiver Operating Characteristic (ROC) analizi yapıldı.
 Çalışmada yer alan 6 antibiyotik için ortak 'Klinik Sınır Değer PI Boyanma Oranı (%)', %95 güven aralığında, %100 duyarlılık ve %100 özgüllükte %30.86 olarak bulundu. %30,86'nın altında kalan PI boyanma oranlarına göre, bakteriler çalışmada yer alan tüm antimikrobiyallere karşı dirençli kabul edilirken, bu oranın üstünde kalan PI boyanmalarına göre duyarlı kabul edildi. Bu klinik sınır değer %95 güven aralığında, %100 duyarlılık ve %100 özgüllükte meropenem için  %26,7, amoksisilin-klavulanik asit için %35,55, klindamisin için %30,24, çalışmada kullanılan bakterisidal etki gösteren tüm antimikrobiyaller için %31,80, bakteriostatik etki gösteren tüm antimikrobiyaller için ise %25,71 olarak bulundu.
Her iki yöntem ile elde edilen sonuçlar arasında kategorik uyum değerlendirmesi yapıldı. Akım sitometri yöntemi ile yapılan duyarlılık çalışmasında 'çok büyük hata' ve 'büyük hata' tespit edilmedi. İzolat sayısının sınırlı olması,  duyarlılık sonucu 'klinik sınır değer'de saptanan suş ve 'orta duyarlı' klinik izolat olmaması nedeni ile  'minör hata' değerlendirilmesi yapılamadı.  Akım sitometri yöntemi ile elde edilen sonuçlar referans yöntem ile uyumlu bulundu.
Sonuç olarak, akım sitometri yönteminde hücre geçirgen ve hücre geçirgen olmayan floresan boyaların bir arada kullanılmasıyla Bacteroides türlerinin antimikrobiyal duyarlılığı 1 saat gibi kısa bir sürede tespit edilebilmiştir. Bu çalışma ile, Bacteroides türlerinin antimikrobiyal duyarlılığın tespitinde, akım sitometri yönteminin oldukça hızlı ve güvenilir sonuçlar verdiği görülmüştür.

Abstract:
The infections caused by anaerobic bacteria have high morbidity and mortality rates. These infections are mostly endogenous and manifest as mixed infections. Antimicrobial resistance issue observed among anaerobic bacteria is steadily increasing. Due to this increase in resistance pattern, it is becoming more important to identify the susceptibility/resistance profiles of these bacteria periodically in certain periods. The methods of susceptibility testing of anaerobic bacteria are non-practical, time-consuming methods, and cannot be routinely applied. However, when isolated from sterile areas and as a single pathogen, for the resistant strains with high virulence like Bacteroides fragilis and in patients who do not recover despite empirical treatment, susceptibility testing methods need to be administered.
In this study, it has been investigated that if flow cytometry method is an applicable method for determination of antimicrobial susceptibility in Bacteroides spp. or not. For this purpose, Bacteroides species isolated from the samples sent for routine anaerobic culture to the Bacteriology Laboratory of Gülhane Training and Research Hospital were used. The isolated bacteria were identified by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). The antimicrobial susceptibilities of the isolated bacteria against penicillin G, clindamycin, chloramphenicol, meropenem, metronidazole, and amoxicillin clavulanic acid were determined by the reference method, agar dilution method. E-Test method was also used in the study.
In flow cytometry analysis, the clinical breakpoint concentrations of the antibiotics were used as defined in EUCAST. Live/dead cell differentiation was performed in anaerobic bacteria exposed to these antibiotics at these concentrations. The cell-permeable thiazole orange and cell impermeable propidium iodide stains were used for the live/dead cell differentiation.
While the anaerobic bacteria which were found to be susceptible by the agar dilution method were evaluated as "cells with changing membrane potentials", the bacteria found to be resistant were evaluated as "cells without changing membrane potentials". In flow cytometry applications, the cell suspension without antibiotics was analyzed as negative control group. The negative control group with unchanged membrane potentials was included in the statistical analysis.
	The clinical breakpoint value of PI staining rate (%) was used to determine the antimicrobial susceptibility in Bacteroides species. The Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis was performed for the calculation of the clinical breakpoint.
	The common clinical breakpoint value of PI staining rate for the six antibiotics included in the study was found to be 30.86%, at the 95% confidence interval, with 100% sensitivity and specificity both. While the bacteria with PI staining rates below 30.86% were considered resistant to all antimicrobials involved in the study, the bacteria with PI staining rates above this threshold were considered as susceptible. In this study, clinical breakpoint was found to be 26.7% for meropenem, 35.55% for amoxicillin-clavulanic acid, 30.24% for clindamycin, 31.80% for all antimicrobials presenting bactericidal activity, and 25.71% for all antimicrobials presenting bacteriostatic effect. All values were at 95% confidence interval with 100% sensitivity and 100% specificity.
	The categorical correlation was applied to the results obtained by both methods. In this study, "very major errors" and "major errors" were not detected by flow cytometry method. The "minor error" evaluation could not be made due to the lack of "intermediate susceptible" and "at the clinical breakpoint susceptible" clinical isolates and limited number of total isolates. The results obtained by flow cytometry were found compatible with those of the reference method.
	In conclusion, the antimicrobial susceptibility of Bacteroides spp. was able to be detected in a relatively short period of time, one hour, by using a combination of cell permeable and non-cell permeable fluorescent dyes by the flow cytometry method. By this study, it was shown that the flow cytometry method provides fast and reliable results in determining the antimicrobial susceptibility of Bacteroides spp.