Cryptosporidium parvum'da transient transformasyon
Transient transformation of Cryptosporidium parvum
Yazar: ZEYNEP KOLÖREN
Danışman: PROF. DR. SADIK DİNÇER
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Parazitoloji = Parasitology

Özet:
Bu çalışmanın amacı Cryptosporidium parvum için genetik transformasyon sistemini (transient transformasyon) kurmaktır. Genetik transformasyon gen fonksiyonlarını analiz etmek için gerekli olup, C. parvum genleri ile henüz böyle bir analiz gerçekleştirilmemiştir. Bu amaç doğrultusunda C. parvum'un ribosomal protein genlerini ( BX538351 segment 2/4 L11 protein genleri üzerinde 84361- 85501 baz dizisi) taşıyan Crypto-construct GFP plazmidinin, C. parvum sporozoitlerine transformasyonu elektroporasyon ve lipofektamin yöntemleri kullanılarak yapılmıştır. Hücre kültürlerinde elde edilen transformantlar invert floresan mikroskop ve revers- transkriptaz PCR ile doğrulanmıştır. Transformasyon ve elektroporasyon koşullarını optimize etmek için Crypto construct GFP vektörün yanı sıra pCMV-DsRed, pEYFP-Mem ekspresyon vektörleri de kullanılmıştır. C. parvum sporozoitlerini açığa çıkarmak için kullanılan eksistasyon koşulları içinde ookistlerin % 80 oranında Taurocholic acid /cytomix:RPMI-1640 (1:1) besi ortamında existe olduğu gözlenmiştir. Bu ortam içerisinde bir elektrik akımı verilerek elektropore edilen sporozoitlerin HCT-8 hücre kültürlerini daha iyi infekte ettiği belirlenmiştir. Hem elektroporasyon hem de lipofektamin yöntemiyle pCMV-DsRed ve pEYFP-Mem vektörlerinin HCT-8 hücre kültürlerine transfeksiyonu sağlanmıştır. Elektroporatörün 180 V, kapasitans 250 ?F, resistans yok şeklinde ayarlandığı koşullar altında pCMV-DsRed ve pEYFP-Mem vektörlerinin HCT-8 hücre kültürlerindeki ekspresyonları floresan mikroskop altında gözlenirken, elektroporatörün 1000 V, 50 ?F, 50 ? şeklinde ayarlandığı koşullarda bu vektörlerin HCT-8 hücre kültürlerindeki ekspresyonları floresan mikroskop altında gözlenememiştir. Her iki elektroporasyon koşulları altında Crypto construct GFP Vektörün transfeksiyonu sonucunda floresan mikroskop altında gözle görülebilir ekspresyon elde edilememiştir. Yapılan RT-PCR ve Nested PCR ile az olan GFP mRNA ekspresyonu gözlenmiştir.Anahtar Kelimeler: Cryptosporidium, Hücre Kültürü, Elektroporasyon, Lipofektamin, Real time PCR

Abstract:
The goal of the present research is to develop a genetic transformation system for Cryptosporidium parvum. Genetic transformation is an essential tool for analyizing gene function and regulation, but it is not avaliable for C. parvum. Establish a transient transformasyon system for C. parvum, electroporetic transformation of sporozoites with plasmids carrying C. parvum intergenic regions flanking a reporter ( Prot L11 on BX538351 segment 2/4, between 84361- 85501 bp ); detection of transformants in cell culture by fluorescent microscopy or reverse transcription PCR. In this study, transformation efficiency was optimized by testing different plasmid constructs (pCMV-DsRed and pEYFP-Mem expression vectors) and electroporation conditions It was showed that all of the using excystation condition, TA/cytomix:RPMI-1640media (1:1) was the best condition and determined 80% of excystation rate. Electroporated sporozoites giving 1 pulse infected HCT-8 cell culture much more efficiently than the other pulse. pCMV-DsRed and pEYFP-Mem Vectors were transfected into HCT-8 cell line by using both electroporation and lipofectamine methods. Transfected pCMV-DsRed and pEYFP-Mem Vectors expressions at 80 voltage, 50 capacitance, none resistance of electroporation condition observed by fluorescent microscopy. However when giving 1000 voltage, 50 capacitance, 50 resistance in electroporator, transfected pCMV-DsRed Vector and pEYFP-Mem Vector and Crypto-construct GFP Vector expressions could not be observed visually by fluorescent microscopy. There was no visually C. parvum (Crypto-construct GFP Vector) expression in both of elektroporation condition by fluorescent microscopy. In order to show incase of avaliable a little GFP mRNA expression of C. parvum vector in transfected HCT-8 cells by two electroporation conditions was used RT-PCR, Nested PCR.Key words: Cryptosporidium, Cell culture, Electroporation, Lipofectamine, Real time PCR