COVİD-19 tanılı hastalarda SARS-COV-2 tam genom analizi ve klinik bulgular ile ilişkisi
Relationship between SARS-COV-2 full genome analysis and clinical findings in patients diagnosed with covid-19
Yazar: FİRUZE SOYAK
Danışman: DOÇ. DR. TUĞBA SARI
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Bakteriyoloji Ana Bilim Dalı / Enfeksiyon Hastalıkları Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases

Özet:
Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin (SARS-CoV-2) neden olduğu koronavirüs hastalığı (COVID-19), Aralık 2019'un sonlarında Wuhan'da ortaya çıkarak kısa sürede tüm dünyada etkisini göstermiştir. Pandemiden kısa süre sonra ortaya çıkan SARS-CoV-2 varyantları, epidemiyolojik ve klinik bulgularda, aşı ve tedavi seçeneklerinde değişikliklere neden olarak pandeminin seyrini değiştirmiştir. SARS-CoV-2 virüsünün genomik dizilimini belirlemek için kullanılan bir teknik olan sekanslama, yeni varyantların ve mutasyonların tespiti ve karakterizasyonu için önemli bir araçtır. RNA dizisindeki değişikliklerin belirlenmesi, virüsün evrimi, yayılımı, bulaşıcılığı, hastalığın klinik bulguları ve aşıların etkililiği gibi faktörlerin anlaşılmasına katkı sağlar ve salgının kontrolünde önemli bir rol oynar.
Bu çalışmada farklı dönemlerde takip edilen belirli özelliklere sahip COVID-19 hastalarından elde edilen SARS-CoV-2 örneklerinde tam genomik sekanslama yapılarak virüsün yapısal değişikliklerinin görülme sıklıkları ve hastalığın klinik bulgularına etkisi analiz edilmiştir.
2022 Ocak ve Kasım ayları arasında Pamukkale Üniversitesi Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği'nde takipli 21 hasta çalışmaya dahil edilmiştir. COVID-19 hastalarının nazofaringeal ve orofaringeal sürüntü örnekleri alınarak viral RNA'ları ekstrakte edilmiş ve tam genomik sekanslama analizi gerçekleştirilmiştir. Hastalar klinik durumlarına göre hafif, orta ve ciddi klinik seyirli olmak üzere gruplandırılmış, klinik durumları, laboratuvar sonuçları, radyolojik bulguları ve PCR pozitiflik süresi ile gen analizi sonuçları arasındaki ilişki araştırılmıştır.
Çalışmaya dahil edilen 21 hastanın 13'ü (%61,9) erkek ve yaş ortalamaları 65,3±20,7 (26-97) idi. Toplamda 18 (%85,7) hastanın hastanede (servis veya yoğun bakım) takip ve tedavisi yapılırken, üç (%14,3) hasta ayaktan takip edildi. Çalışmada 12 hastada Omicron BA.2, dört hastada Omicron BA.1, dört hastada Omicron BA.5 alt varyantları ve bir hastada Delta varyantı saptandı. İncelenen tüm izolatlarda c.1841A>G (D614G), c.425G>A (G142D), c.9764C>T, NSP4 (T492I), c.14144C>T (NSP12 P323L) mutasyonları saptandı. Hastalardan izole edilen örneklerde tespit edilen mutasyonlar ile bu mutasyonların tüm dünyada aynı sekansta görülme sıklıkları Pearson korelasyon testi ile karşılaştırıldığında, bu değişkenler arasında yüksek derecede pozitif bir korelasyon bulundu. (r(163)=0.81, p<0.001). Ek olarak Türkiye'den alınan örneklerde ilk kez bulunan bazı missense mutasyonlar gözlemlendi.
Ağır klinik seyirli hastalarda obezite, hafif ve orta klinik seyirli hastalara göre istatistiksel açıdan anlamlı olarak daha yüksek oranda görüldü (p=0,042). Laboratuvar bulgularına göre incelendiğinde ağır klinik seyirli hastalarda; başvuru anındaki C-reaktif protein (p=0,014), aspartat aminotransferaz (AST) (p=0,001), BUN ve (p=0,018) kreatinin yüksekliği (p=0,003) ve hemoglobin (Hgb) değerlerinde düşüklük (p=0,037) diğer klinik formalara göre istatistiksel olarak anlamlı olarak daha fazla tespit edildi.
Uzamış PCR pozitifliği (dört haftanın üzerinde) immunsuprese hastalarda (malignite (p=0,016), lenfoma (p=0,006)) daha sık saptandı. Aynı zamanda bu hastaların çoğunun orta ve ağır klinik seyir gösterdiği saptandı (p=0,019). 
İmmun yetmezlik kliniği olan hastalarda istatistiksel açıdan anlamlı şekilde daha fazla hastaneye yatış (p=0,026) ve daha ağır hastalık tablosu gözlemlendi (p=0,018).
Çalışmaya alınan hastalarda saptanan mutasyonlar değerlendirildiğinde ise aşılardan herhangi biriyle dört doz ve üzeri aşılanan hastalarda Spike Q493R mutasyonu daha yüksek oranlarda saptandı (p=0,043).
Çalışmada nadir olarak görülen mutasyonlara bakıldığında literatürle uyumlu bir şekilde Omicron BA.1 subvaryantı saptanan olgularda Spike A67V, del211 ve ins214EPE mutasyonları viral infektivitede artış ve bağışıklık yanıtına direnç ile ilişkilendirilmiştir. Spike R346K ve Türkiye'den ilk kez bildirilen Spike A263T mutasyonunun klinik etkisinin infektivite ve bulaştırıcılıktan ziyade sonuncusu son üç ay içinde olan dört doz aşılamaya rağmen hastamızda tespit edilmesi sebebiyle bu varyantın antikor yanıtından kaçış ile ilişkili olabileceğini düşündürmüştür. Omicron BA.2 subvaryantı hastamızda saptanan Spike R21T'nin, literatürle uyumlu olarak, virüsün insan ve bağırsak hücrelerine geçişini artırarak ağır klinik seyir ve gastrointestinal (GİS) bulgulardan sorumlu olabileceği (hastamızda GİS semptomları olması nedeniyle) ve antikor nötralizasyonunda azalmaya (hastamızın dört doz aşılanma öyküsü olması nedeniyle) neden olabileceği sonucuna varılmıştır. 
Omicron BA.2 subvaryantı için Spike L452M değişikliğinin ORF3a'da tespit edilen D155Y ile sinerjik etki göstererek aşırı immün yanıt ve hiperinflamasyonu tetikleyebileceği (hastamızın inflamatuar parametlerinde belirgin artış olması nedeniyle) düşünülmüştür. NSP1 H110Y mutasyonun konakçı gen ifadesini inhibe ederek bu yolla bağışıklık sisteminden kaçma etkisinin hastamızda da görüldüğü gözlemlenmiştir. Spike A222V, T323I ve NS7a A106T değişiklikleri azalmış infektivite, artmış bağışıklık yanıtından kaçış ve konakçı-virüs bağlanması (hastamızda hafif klinik seyir, uzamış PCR pozitifliği saptanması nedeniyle) ile ilişkilendirilmiştir. NSP4 T114I'in literatürle uyumlu olarak hastamızda da viral replikasyonda artış/viral klerenste azalış ile uzamış PCR pozitifliğine neden olduğu görülmüştür. Spike A27S, K417N, N440K, Q493R, T19I, G142D mutasyonlarının saptandığı hastalarımızda da yine literatürle uyumlu olarak, ortak etki oluşturarak aşı ile oluşan antikor yanıtına dirence neden olduğu gözlemlenmiştir. Spike G339D, S373P, S375F, K417N, N440K, S477N, T478K, E484A, Q493R, Q498R, N501Y mutasyonlarının da dört doz aşılı ve yüksek antikor titresine sahip hastamızda olması nedeniyle bağışıklık yanıtından kaçış etkisinin olabileceği düşünülmüştür.
Çalışmamızda Delta (B.1.617.2) varyantı saptanan bir olguda Spike protein NTD spesifik E156G/del157-158 ve L452R kombinasyonunun artan enfektivite, aşı ile ortaya çıkan poliklonal antikorlara direnç ve artmış hücreden hücreye füzyon etkisinin olgumuzda da gözlemlendiği düşünülmüştür. Spike P681R saptanan hastamızda olduğu gibi ağır klinik seyir ve uzamış PCR pozitifliği ile ilişkili olabileceği sonucuna varılmıştır.
Omicron BA.5 varyantı için NSP13 A389V, NSP14 M315I, NSP16 T140I mutasyonlarının hastamızda hiperinflamasyon kliniği olması nedeniyle literatüre benzer şekilde abartılı inflamatuar yanıta ve akciğer immünopatolojisine neden olabileceğini düşündürmüştür. N E136D mutasyonu, hastamızda olduğu gibi daha ağır ve uzun seyreden üst solunum yolu bulgularına neden olabileceğini ve yurt dışı seyahat öyküsü olan kişiyle temas öyküsü olması nedeniyle seyahat öyküsünün epidemiyolojik ve varyantların dağılımındaki önemini olgumuzda göstermiştir.
Türkiye'de ilk kez sekanslama sonuçlarının kliniğe yansıması bu çalışmada değerlendirilmiştir. Ancak sınırlı sayıda hasta grubunda ve tek merkezde yapılan bu çalışma tüm ülke verilerini temsil etmemektedir. Daha büyük bir popülasyonda, daha fazla sayıda merkezde, daha fazla sekanslama çalışmaları ile bu sonuçların klinik yansımasının araştırılmasına gereksinim vardır. Virüsün yayılımının ulusal ve global seviyelerde takibi, viral genomların karşılaştırılması ve moleküler filogenetik ağaçların oluşturulmasıyla izlenebilir. Genetik değişikliklerin tespiti, varyantların ortaya çıkması ve mutasyon oranlarının anlaşılması etkin tedavi ve aşı geliştirilmesinde olumlu bir etki yaratacaktır.

Abstract:
Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Coronavirus Disease-2019 (COVID-19) caused by it, emerged in Wuhan at the end of December 2019 and quickly spread worldwide. SARS-CoV-2 variants that emerged shortly after the pandemic began have changed the course of the pandemic by causing changes in epidemiological and clinical findings, as well as in vaccination and treatment options. Sequencing, a technique used to determine the genomic sequence of the SARS-CoV-2 virus, is an important tool for the detection and characterization of new variants and mutations. Determining changes in the RNA sequence contributes to understanding factors such as the virus's evolution, spread, infectivity, clinical findings of the disease, and effectiveness of vaccines, and plays an important role in controlling the epidemic.
In this study, genomic sequencing was performed on SARS-CoV-2 samples obtained from COVID-19 patients with certain characteristics followed during different periods, and the frequency of structural changes in the virus and their effects on clinical findings of the disease were analyzed.
Between January and November 2022, 21 patients from the Department of Infectious Diseases and Clinical Microbiology at Pamukkale University Hospital were included in the study. Nasopharyngeal and oropharyngeal swab samples were obtained from COVID-19 patients, and their viral RNA was extracted and subjected to whole-genome sequencing analysis. The patients were grouped as having mild, moderate, or severe clinical courses based on their clinical status, and the relationship between their clinical status, laboratory results, radiological findings, PCR positivity duration, and genetic analysis results was investigated.
Of the 21 patients included in the study, 13 (61.9%) were male, and their mean age was 65.3±20.7 (26-97). Eighteen (85.7%) patients were hospitalized, and three (14.3%) patients were followed up as outpatients. In the study, Omicron BA.2 subvariants were detected in 12 patients, Omicron BA.1 subvariants in four patients, Omicron BA.5 subvariants in four patients, and Delta variant in one patient. The mutations c.1841A>G (D614G), c.425G>A (G142D), c.9764C>T, NSP4 (T492I), and c.14144C>T (NSP12 P323L) were detected in all isolates analyzed. When the mutations detected in the samples taken from the patients were compared with the frequencies of these mutations in other sequences worldwide, a high positive correlation was found between these variables (r(163)=0.81, p<0.001). Additionally, some missense mutations observed for the first time in samples from Turkey were identified.
Obesity was statistically significantly more common in patients with severe clinical courses than in those with mild or moderate clinical courses (p=0.042). When the laboratory findings were examined, significantly higher levels of C-reactive protein (p=0.014), aspartate aminotransferase (p=0.001), BUN and (p=0.018), creatinine (p=0.003), and lower hemoglobin levels (p=0.037) were detected in patients with severe clinical courses than in those with other clinical courses.
Prolonged PCR positivity (over four weeks) was detected more frequently in immunosuppressed patients (malignancy (p=0.016), lymphoma (p=0.006)). At the same time, it was found that most patients had a moderate to severe clinical course (p=0.019). In patients with immunodeficiency, statistically significant increased hospitalization rates (p=0.026) and more severe disease course were observed (p=0.018). When the mutations detected in the patients included in the study were evaluated, the Spike Q493R mutation was detected at higher rates in patients vaccinated with any of the vaccines with 4 doses or more (p=0.043). Looking at the rare mutations in our study, Spike A67V, del211, and ins214EPE mutations were found in Omicron BA.1 subvariant cases in a manner consistent with the literature, associated with increased viral infectivity and resistance to immune response. It was suggested that the clinical effect of Spike R346K and the Spike A263T mutation, which was first reported in Turkey and detected in our patient despite four doses of vaccination in the last three months, could be related to escape from the antibody response of this variant.  
It has been concluded that the Spike R21T mutation detected in our patient, consistent with the literature, may be responsible for severe clinical course and gastrointestinal symptoms by increasing the virus's entry into human and intestinal cells, and may cause a decrease in antibody neutralization due to the patient's history of four doses of vaccination. It is thought that the Spike L452M mutation for the Omicron BA.2 subvariant, in synergy with the D155Y detected in ORF3a, may trigger excessive immune response and hyperinflammation, as there was a significant increase in inflammatory parameters in our patient. The NSP1 H110Y mutation was observed to escape the immune system by inhibiting host gene expression. The Spike A222V, T323I, and NS7a A106T mutations were associated with decreased infectivity, increased immune evasion, and host-virus binding, which could explain the mild clinical course and prolonged PCR positivity detected in our patient. The NSP4 T114I mutation was observed to cause prolonged PCR positivity in our patient, consistent with the literature, by increasing viral replication or decreasing viral clearance. The Spike A27S, K417N, N440K, Q493R, T19I, and G142D mutations, detected in our patients, were observed to have a common effect by causing resistance to the antibody response generated by the vaccine, consistent with the literature. It has been suggested that the presence of Spike mutations G339D, S373P, S375F, K417N, N440K, S477N, T478K, E484A, Q493R, Q498R, and N501Y in our patient who has received four doses of vaccine and has high antibody titers may lead to immune escape.
In a case with the Delta (B.1.617.2) variant detected in our study, it was thought that the combination of Spike protein NTD-specific E156G/del157-158 and L452R may have led to increased infectivity, resistance to polyclonal antibodies generated by the vaccine, and increased cell-to-cell fusion effect, which was also observed in our patient. The presence of Spike P681R in our patient was concluded to be associated with severe clinical course and prolonged PCR positivity, as observed in our case.
For the Omicron BA.5 variant, the NSP13 A389V, NSP14 M315I, and NSP16 T140I mutations were considered to be able to cause exaggerated inflammatory response and lung immunopathology, similar to the literature, due to the hyperinflammatory clinical presentation in our patient. The N E136D mutation, as observed in our patient with a travel history and contact history with a person who had a travel history, demonstrated the importance of travel history in our case and its contribution to the epidemiology and distribution of the variants, as it may cause more severe and prolonged upper respiratory tract symptoms.
This study evaluated the clinical impact of sequencing results for the first time in Turkey. However, this study was limited to a small group of patients and a single center, and therefore does not represent all country data. There is a need for further investigation into the clinical impact of these results in a larger population, with more centers and sequencing studies. The tracking of the virus's spread at national and global levels, comparison of viral genomes, and creation of molecular phylogenetic trees can help with this investigation. The detection of genetic changes, emergence of variants, and understanding of mutation rates can have a positive impact on effective treatment and vaccine development.