Halofitik bitkilerin rizosferinden izole edilen halotolerant bakteriler kullanılarak mısırda (Zea mays L.) tuz stresi toleransının artırılması
Enhancing salt stress tolerance in maize (Zea mays L.) by using halotolerant bacteria isolated from rhizosphere of halophytic plants
Yazar: İHSAN AYDIN
Danışman: PROF. DR. ÖKKEŞ ATICI
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Botanik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu araştırmada, halofitik bitkilerin rizosferinden izole edilen halotolerant bakterilerin  tuz (NaCl) stresine maruz kalmış mısırda (Zea mays L.) fizyolojik ve biyokimyasal cevap mekanizmalar üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu amaç için Tuz Gölü havzasında 6 farklı istasyondan toplanan 17 halofit bitkinin rizosferinden bakteri izole edilmiştir. Bitkilerden toplamda 7 bakteri türüne ait 22 izolat elde edilmiştir Bakteri izolatlarının tür teşhisleri 16S rRNA dizi analizi yöntemi ile yapılmıştır. Bu izolatlarla yapılan ön denemelerden elde edilen bulgulara göre, çalışmalarda 4 izolat kullanılmıştır. Bu bakteriler Halomonas arcis (izolatı; TG-4), Marinococcus tarijensis (DT-8), Halobacillus dabanensis (TG-12) ve Kushneria indalinina (TG-20)'dır. Sıvı besi yerinde çoğaltılan bakteriler, 108/109 CFU/ml oranında olacak şekilde mısır tohumlarına inoküle edilmiştir. On beş gün boyunca farklı seviyelerde (75, 150 ve 250 mM) tuz stresine maruz kalan mısır yapraklarında membran hasarı (%EC), lipid peroksidasyon seviyesi, reaktif oksijen türleri (O2•-, H2O2) ve prolin miktarları incelenmiştir. Ayrıca enzimatik (katalaz-CAT, süperoksid dismutaz-SOD, guaiakol peroksidaz-POX, askorbat peroksidaz-APX ve glutatyon redüktaz-GR) ve enzimatik olmayan (askorbik asit-AsA ve glutatyon-GSH) antioksidanların seviyeleri ve kök-gövde uzunluğu, kuru madde ağırlığı, mineral (Na+, K+ ve Ca+2) ve klorofil miktarları belirlenmiştir. Bunlara ilave olarak çözünebilir proteinlerin SDS-PAGE profilleri ve kök ile yaprakta nitrat redüktaz (NR) aktivitesi de değerlendirilmiştir. Bulguların değerlendirilmesine katkı olması amacıyla, izole edilen bakterilerin Gram özellikleri, ACC deaminaz aktiviteleri ve azot fiksasyon yetenekleri de araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, ACC deaminaz aktivitesi TG-4 izolatında belirlenmezken, diğer izolatlar pozitif aktivite göstermiştir. Ayrıca TG-4, TG-12 ve TG-20 izolatlarının azot fiksasyonu yapabilen bakteriler olduğu belirlenirken, TG-8 izolatının azot fiksasyonu için negatif olduğu görülmüştür. Tohumlara inoküle edilen izolatlar kök-gövde uzunluk ve kuru ağırlıklarını genellikle artırmıştır. Tuz konsantrasyonunun artmasıyla meydana gelen membran hasarı (MH), bakteri uygulamaları ile önemli ölçüde azalmıştır. İzolatlar, 150 ve 250 mM tuz uygulaması başta olmak üzere, genellikle H2O2, O2•- ve malondialdehid (MDA) seviyelerini düşürmüştür. Bakteri inokülasyonu tuzlu şartlarda klorofil miktarını artırmıştır. Artan tuz seviyesi, CAT, SOD, APX ve POX aktivitelerini düşürürken, GR aktivitesini ise artırmıştır. Aynı gruptaki bitkilere bakteri uygulamaları ise aktiviteleri genelde artırmıştır. Ayrıca tuzlu şartlarda artan AsA ve total GSH miktarları bakteri uygulamalarıyla daha fazla artış göstermiştir. Tek başına tuz uygulaması NR aktivitesini ve prolin miktarını artırmıştır. Bakteri+tuz uygulamasında NR aktivitesinde artış gözlenirken, prolin miktarı ise düşmüştür. Genel olarak çalışılan halotolerant izolatlar mısır bitkisinin tuz stresi toleransını artırmıştır ve bu yüzden bitki büyümesini teşvik eden bakteriler (PGPR) grubunda oldukları ileri sürülmüştür. Tez içinde bütün gruplar kendi kontrolü ile kıyaslanmış ve ayrıntılı olarak tartışılmıştır.

Abstract:
In this study, the effects of halotolerant bacteria isolated from rhizosphere of halophytic plants were investigated on the physiological and biochemical response mechanisms to the salt stress (NaCl) of maize (Zea mays L.). For this aim, 17 halophytic plants were collected from 6 different stations in the basin of Salt Lake (Turkey) and bacteria were isolated from rhizosphere of the plants. It was obtained 22 isolates belonging to 7 bacterium species from the plants. Identifications of the isolated bacteria were made according to the 16S rRNA sequencing method. After preliminary experiments, 4 of isolates were selected in order to use in the later stages of the present study. These isolates were Halomonas arcis (isolate; TG-4), Marinococcus tarijensis (DT-8), Halobacillus dabanensis (TG-12) and Kushneria indalinina (TG-20). The bacteria developed in Tryptic Soy Broth (TSB) was washed by using 100 mM MgSO4 solution and then was inoculated (108/109 CFU/ml) to maize seeds. Membrane damage, level of lipid peroxidation, contents of reactive oxygen species (ROS) and proline were determined in the leaves of maize exposed to different levels of salt stress (75, 150 and 250 mM) for 15 days. Furthermore, the levels of enzymatic (catalase-CAT, superoxide dismutase-SOD, guaiacol peroxidase-POX, ascorbate peroxidase-APX and glutathione reductase-GR) and non-enzymatic (ascorbic acid-ASA and glutathione-GSH) antioxidants, root-stem length, dry matter weight, and the contents of minerals (Na+, K+ and Ca+2) and chlorophyll were determined. Additionally, SDS-PAGE profiles of soluble proteins in the leaves, and nitrate reductase (NR) activity in both leaves and roots were evaluated. As with bacteria, Gram properties, ACC deaminase activities and nitrogen fixation abilities of the isolated bacteria were also investigated. Most of the isolates inoculated to the seeds generally increased the root-stem length and dry weight in the maize seedlings. Membrane damage (MD) increased by the salt concentrations was decreased significantly with the bacterial applications. Application of the isolates decreased the levels of H2O2, superoxide anion and malondialdehyde (MDA) in especially 150 and 250 mM salt conditions, and increased the chlorophyll content in the salty conditions. The salt concentrations decreased the activities of CAT, SOD, APX and POX and increased that of GR but the bacteria applications in the same conditions generally increased their activities. In addition, the increased ASA and total GSH levels by the salt applications showed more increasing with the bacteria applications. The salt applications alone increased NR activity and the content of proline. Salt+bacteria applications, however, increased NR activity while decreased proline content. Isolate TG-4 was negative for ACC deaminase activity while others were positive. Isolates TG 4, 12 and 20 were in capable of nitrogen fixation except TG-8. The present study showed that the halotolerant isolates could increase the salt stress tolerance of the maize seedlings, and therefore it is suggested that they have potential to be used as plant growth promoting rizobacteria (PGPR). All groups are compared to their controls and are discussed in the thesis in detail.