Çeşitli gıda ve çevresel örneklerde (Cronobacter spp.) Cronobacter sakazakii izolasyonu, identifikasyonu ve virulans faktörlerin moleküler yöntemle belirlenmesi
Isolation, identification and molecular characterization of (Cronobacter spp.) Cronobacter sakazaki virulence factors from varied foods and environmental samples
Yazar: ÜLKÜ DEMİRCİ
Danışman: PROF. DR. HAYDAR ÖZPINAR
İstanbul Aydın Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Güvenliği Ana Bilim Dalı / Gıda Güvenliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Besin Hijyeni ve Teknolojisi = Food Hygiene and Technology

Özet:
Cronobacter sakazakii, özellikle erken doğmuş ve düşük doğum ağırlıklı bebeklerde hayati risk oluşturan enfeksiyonlara neden olan fırsatçı bir patojendir. Farklı gıdalarda ve diğer çevresel kaynaklarda tespit edilmiş olmasına rağmen, sadece kontamine olmuş toz bebek mamaları (bebek formulü) C. sakazakii'nin neden olduğu bebek enfeksiyonları ile epidemiyolojik olarak ilişkilendirilmiştir. Çevresel ve gıda kaynaklı C. sakazakii türlerine maruz kalmak insan sağlığı açısından ciddi risk taşımaktadır. C. sakazakii türlerinin hızlı ve hassas moleküler yöntemlerle tespiti üzerine yeterli sayıda çalışma ülkemizde bulunmamaktadır. Moleküler tanımlama yöntemleri gelişmekte olan teknolojinin mikrobiyoloji alanında sunduğu en önemli yeniliklerden biridir. Moleküler tanımlama tekniklerine her geçen gün bir yenisinin eklenmesi, farklı amaçlarla yürütülen bilimsel çalışmalara büyük yarar sağlamaktadır. Bu çalışmada çeşitli gıdalar ve çevresel örneklerde öncelikle C. sakazakii'nin varlığının tespiti yapılacak ve bu bakteri üzerindeki OmpA, OmpX, zpx ve Cpa genlerinin varlıkları incelenecektir. Çalışma kapsamında 2015-2016 yılında İstanbul il sınırları içinde temin edilen paketsiz süttozu, paketli nişasta, paketli pirinç unu, paketli irmik, paketli bebek maması ve toz olmak üzere herbirinden 20 adet numune araştırma için toplanmıştır. Toplam 120 adet gıda ve toz örneklerinde biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılarak hızlı test kiti API 20E (BioMérieux, Fransa) ve Real-time Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PZR) analizler gerçekleştirilmiştir. Sonuçta; API 20E ile identifiye edilen 7 adet paketsiz süttozu, 2 adet paketli pirinç unu, 1 adet paketli irmik, 3 adet çevresel toz örneği için RT-PZR gen karakterizasyonu yapılmıştır. Şüpheli olan tüm izolatlarda OmpA, OmpX, zpx ve Cpa virulans genleri saptanmıştır. C. sakazakii varlığı saptanan farklı örnek grupları arasındaki parametreler incelenmiş ve bulgular ışığında parametreler arasındaki verilerin karşılaştırılmasında Fisher Freeman Halton testi ile değerlendirme yapılmıştır.   Paketsiz süt tozunda C. sakazakii görülme oranı (%35), paketli nişasta (%0), paketli irmik (%5), paketli pirinç unu (%10), çevresel (%15) ve paketli bebek mamasında (%0) C. sakazakii görülme oranlarından anlamlı şekilde yüksek bulunmuştur (p<0.05).  Bulgular neticesinde, Türkiye açısından gıda ve çevresel kaynaklı C. sakazakii türlerinin genotipik faktörlerinden virulans özellik gösteren OmpA, OmpX, zpx ve Cpa genlerinin varlığı ortaya konmuştur.
Anahtar kelimeler: Cronobacter sakazakii, virulans genler, Real-Time PZR

Abstract:
Cronobacter sakazakii is an opportunistic pathogen that causes life-threatening infections, especially in preterm and low birth weight infants. Although it has been detected in various nutrients and other environmental sources, only contaminated powder infant formulas have been epidemiologically associated with infections caused by C. sakazakii. Exposure to environmental and foodborne C. sakazakii species pose a serious human health risk. A sufficient number of studies on the detection of C. sakazakii species by rapid and sensitive molecular methods are not available in our country. Molecular identification methods are one of the most important innovations of developing technology in the field of microbiology. The addition of new molecular identification techniques day by day is of great benefit to scientific studies carried out for different purposes. The aim of this study was to genotypically identify C. sakazakii species in various nutrients and environmental samples in a sensitive and reliable way by using fingerprints of OmpA, OmpX, zpx and Cpa genes which enable C. sakazakii to easily reach organs and tissues in all mammals. Within the scope of the study, a total of 120 nutrients and environmental samples, including 20 unpackaged milk powder, 20 packaged starch, 20 packaged rice flour, 20 packaged semolina, 20 packaged baby formulas and 20 environmental samples, collected in the provincial borders of Istanbul in 2015-2016, were analysed using the rapid test kit API 20E (BioMérieux, France) and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) in order to compare the cultural, biochemical and molecular methods. As a result, RT-PCR gene characterization was performed for 7 unpackaged milk powder, 2 packaged rice flour, 1 packaged semolina and 3 environmental samples identified with API 20E. OmpA, OmpX, zpx and Cpa virulence genes were detected in all suspected isolates. The parameters between different sample groups in which C. sakazakii were detected were examined and Fisher Freeman Halton test was used for the comparison of the data between the parameters based on the findings. Incidence rate ratio of C. sakazakii in unpackaged milk powder (35%) was significantly higher than that of starch (0%), semolina (5%), rice flour (%10), environmental (15%), and baby formula (0%)  (p<0.05). Based on the findings, the presence of OmpA, OmpX, zpx and Cpa genes, which display virulent characteristics, and are among the genotypic factors of C. sakazakii species of nutrient and environmental origin were shown.
Keywords: Cronobacter sakazakii, virulence factors, Real-Time PCR