Deneysel status epileptikus modelinde midazolam ve klonazepam uygulanması sonrası biyomarkır olarak öne çıkan muhtemel miRNA'ların araştırılması
Investigation of possible miRNAs featured as biomarkers after midazolam and clonazepam application in experimental status epilepticus model
Yazar: HAVA YILDIRIM
Danışman: DOÇ. DR. ENDER MEHMET ÇOŞKUNPINAR
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Hamidiye Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antikonvülsanlar = Anticonvulsants ; Epilepsi = Epilepsy ; Klonazepam = Clonazepam ; Midazolam = Midazolam ; Mikro RNA = Micro RNA

Özet:
Amaç: MikroRNA'lar (miRNAs) posttranskripsiyonel seviyede negatif gen düzenleyiciler olarak rol oynayan kısa RNA dizileridir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, ekspresyonu değişen miRNA'ların epileptik nöbetlerin oluşumu ve nöbet kaynaklı nöronal ölümde önemli bir etken olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada deneysel status epileptikus (SE) modelinde politerapi şeklinde kullanılan antiepileptik ilaçların, epilepsi ile ilişkilendirilen 10 miRNA (hsa-miR-22-5p,rno-miR-34a-3p,hsa-miR-124- 5p,rno-miR-128-2-5p,rno-miR-134-3p,mmu-miR-139-5p,hsa-miR-184,hsa-miR-199a- 5p,rnomiR-203a-5p,rno-miR-324-3p)'nın ekspresyon düzeyleri üzerindeki etkilerinin ve biyobelirteç olarak kullanılabilme potansiyellerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Sprague-Dawley sıçanlarda lityum-pilokarpin ile SE modeli oluşturulan gruplara midazolam (MDZ) ve klonazepam (CLZ)'ın ikinci basamak tedavide kullanılan levetirasetam (LEV), lakosamid (LCM), valproik asit (VPA) veya fosfenitoin (fPHT) ile kombinasyonları uygulandı. Tek ve çoklu ilaç uygulaması yapılan, her birinde 7 örnek olan toplam 10 gruptaki 70 örnek ile çalışma tamamlandı. Moleküler genetik deneyler PCR Array yöntemi ile yapıldı.
Bulgular: miRNA ekspresyon seviyeleri 3 tekrar ile belirlendi. rno-miR-324- 3p'nin MDZ grubunda downregüle (p=0,0473); rno-miR-34a-3p'nin CLZ+VPA ve CLZ+fPHT gruplarında upregüle olduğu (p=0,0074, p=0,0228) bulundu. hsa-miR-124- 5p'nin, sırasıyla MDZ+fPHT, CLZ+VPA, CLZ+LCM ve CLZ+fPHT gruplarında upregüle olduğu (p=0,0495, p=0,0215, p=0,0160, p=0,0041) bulundu. rno-miR-128-2- 5p CLZ+fPHT grubunda upregüleyken (p=0,0013), rno-miR-134-3p'nin CLZ+VPA grubunda upregüle olduğu (p=0,0215) bulundu. mmu-miR-139-5p'nin MLZ+fPHT ve CLZ+fPHT gruplarında upregüle (p=0,0181, p=0,0174); hsa-miR-199a-5p'nin MDZ+fPHT grubunda (p=0,0470), rno-miR-324-3p'nin CLZ+LCM grubunda (p=0,0459) upregüle oldukları bulundu.
Sonuç: Ekspresyon değişikliği tespit edilen miRNA'ların SE'ta midazolam ve klonazepam uygulanması ile biyobelirteç olarak kullanılabileceği ortaya konmuştur. MDZ+fPHT, CLZ+VPA, CLZ+LCM ve CLZ+fPHT gruplarında upregüle olduğu tespit edilen miR-124-5p tedaviye yanıtın en iyi göstergesi olarak öne çıkmaktadır. Deregülasyonu ortaya konan genlerin biyobelirteç olarak kullanımı ile bu genlerin çoklu ilaç tedavileri ile SE hastalarında kişiye özgü tedavilerin düzenlenebilmesi mümkün olabilecektir.

Abstract:
Aim: MicroRNAs (miRNAs) are short RNA sequences that act as negative gene regulators at the post-transcriptional level. In recent studies, it has been reported that altered miRNAs are an important factor in the formation of epileptic seizures and in seizure-induced neuronal death. In this study, it was aimed to determine the effects of antiepileptic drugs used as polytherapy in the experimental status epilepticus (SE) model on the expression levels of 10 miRNAs (hsa-miR-22-5p,rno-miR-34a-3p,hsa- miR-124-5p,rno-miR-128-2-5p,rno-miR-134-3p,mmu-miR-139-5p,hsa-miR-184,hsa- miR-199a-5p,rnomiR-203a-5p,rno-miR-324-3p) associated with epilepsy and their potential to be used as a biomarker.
Materials and Methods: Combinations of midazolam (MDZ) and clonazepam (CLZ) with levetiracetam (LEV), lacosamide (LCM), valproic acid (VPA) or fosphenytoin (fPHT) used in second-line therapy in Sprague-Dawley rats in the groups in which the SE model was created with lithium-pilocarpine. The study was completed with 70 samples in 10 groups, 7 samples in each, with single and multiple drug administration. Molecular genetic experiments were performed by PCR Array method.
Results: miRNA expression levels were determined with 3 replicates. Downregulated in group MDZ of rno-miR-324-3p (p=0.0473); rno-miR-34a-3p was found to be upregulated in the CLZ+VPA and CLZ+fPHT groups (p=0.0074, p=0.0228). hsa-miR-124-5p was found to be upregulated in MDZ+fPHT, CLZ+VPA, CLZ+LCM and CLZ+f PHT groups, respectively (p=0.0495, p=0.0215, p=0.0160, p=0.0041). While rno-miR-128-2-5p was upregulated in the CLZ+fPHT group (p=0.0013), rno-miR-134-3p was found to be upregulated in the CLZ+VPA group (p=0.0215). Upregulated in MLZ+fPHT and CLZ+fPHT groups of mmu-miR-139-5p (p=0.0181, 0.0174); it was found that hsa-miR-199a-5p was upregulated in the MLZ+fPHT group (p=0.0470), and rno-miR-324-3p in the CLZ+LCM group (p=0.0459).
Conclusion: It has been demonstrated that miRNAs with expression changes can be used as biomarkers in SE with the administration of midazolam and clonazepam. hsa-miR-124-5p, which was found to be upregulated in MDZ+fPHT CLZ+VPA, CLZ+LCM and CLZ+fPHT groups, stands out as the best indicator of response to treatment. With the use of deregulated genes as biomarkers, it will be possible to organize personalized treatments in SE patients with multi-drug treatments of these genes.