Periferal hipotoni tanılı çocuk hastalarda genetik etiyolojinin yeni nesil dizi analizi yöntemi ile araştırılarak, fenotip-genotip ilişkisinin belirlenmesi
The determination of phenotype-genotype relationships by investigating of genetic etiology with next-generation sequencing method in pediatric patients with peripheral hypotonia
Yazar: DAMLA EKER
Danışman: DOÇ. DR. HAKAN GÜRKAN
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Genetik = Genetics ; Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases

Özet:
Hipotoni, beyin, beyin sapı, spinal kord, motor nöronlar, ön boynuz hücreleri, periferik sinirler ve kaslarda nörolojik fonksiyon bozukluğu sonucu ortaya çıkan nörolojik bir bulgudur. Üst ve alt ekstremitelerde, gövdede ya da kraniyofasiyal iskelet kaslarında azalan tonusu ifade etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Hipotonik olguların %60 kadarını genetik-metabolik etiyolojilerin oluşturduğu ve bunların önemli bir bölümünün genetik hastalıklardan kaynaklandığı bildirilmiştir. Tüm hipotonik olguların %15-30'unu oluşturan periferal hipotoni olgularında genetik sonuçlar ile klinik bulgular desteklenebilse de tüm olgularda fenotip-genotip ilişkisi kurulamamaktadır.
Çalışmamızın amacı, konvansiyonel sitogenetik, moleküler sitogenetik ve Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification yöntemleri uygulanarak tanı konulamayan periferal hipotoni olgularında, periferal hipotoni ile ilişkili olduğu düşünülen genleri içeren, özgün tasarlanmış çoklu gen paneli (ACTA1, CCDC78, DYNC1H1, GARS, RYR1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, FKRP, FKTN, IGHMBP2, LMNA, LAMA2, LARGE1, MTM1, NEM, POMGnT1, POMT1, POMT2, SEPN1) kullanılarak yeni nesil dizi analizi (NGS) teknolojisiyle genetik etiyolojinin araştırılmasıdır.
Çalışmaya Trakya Üniversitesi Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezi Çocuk Nöroloji Bilim Dalı Polikliniğinden hipotoni ön tanısı ile Tıbbi Genetik Anabilim Dalı Genetik Hastalıklar Tanı Merkezine yönlendirilen, klasik sitogenetik ve moleküler yöntemler ile nedeni açıklanamayan, periferal hipotoniye sahip 18 hasta (6 ay ile 7 yaş arasında) dahil edildi.
Çalışmamızda 18 hastanın 11'inde (%61) on üç varyant saptandı. Bu varyantlardan ikisi LAMA2, biri COL6A2, üçü COL6A3, üçü RYR1, biri POMT1 ve üçü POMGnT1 genlerinde yer almaktadır. ACMG-2015 kriterlerine göre on üç varyantın ikisi patojenik, üçü muhtemel patojenik, sekizi klinik önemi belirsiz varyant olarak değerlendirildi.
Nedeni açıklanamayan periferal hipotoniye sahip bir hastamızda POMGnT1 geninde homozigot, c.1649G>A, p.(Ser550Asn) varyasyonu saptandı. Bu varyasyon literatürde Kas-Göz-Beyin (MEB) Hastalıkları fenotipi ile ilişkilendirilmiştir. Hastamıza ait fizik muayene bulguları ve görüntüleme sonuçları incelendiğinde, hastanın kliniğinin MEB fenotipi ile uyumlu olduğu görüldü. Diğer bir hastamızda ise RYR1 geninde daha önce literatürde ve açık erişimli veri tabanlarında rapor edilmeyen, "klinik önemi belirsiz" olarak sınıflandırılan yeni bir varyasyon saptandı.
Ülkemizde hipotonik olguların belirli algoritmalar kullanılarak tanımlanmasına yönelik farklı çalışmalar olmakla birlikte, nedeni açıklanamayan periferal hipotoni olgularının NGS yöntemiyle genetik etiyolojisinin araştırılmasına yönelik bir başka çalışma literatürde bildirilmemiştir. Özgün tasarlanmış gen paneli ile nedeni açıklanamayan periferal hipotoniye sahip on sekiz hastamızın birinde tespit edilen varyasyon, hastanın fenotipi ile uyumlu olarak saptandı. Bu sonuçlara göre, periferal hipotoni etiyolojisinde özgün tasarlanmış gen panelinin klinik tanıya katkı oranı % 5,5'tir. 
Sonuç olarak, hedefe yönelik tasarlanmış çoklu gen panelinin daha uzun zaman dilimi içerisinde, örneklem büyüklüğünün arttırılarak NGS yöntemi ile çalışılması durumunda, klinik tanıya önemli katkılar sağlayacağı öngörüsündeyiz.

Abstract:
Hypotonia is a neurological finding that occurs as a result of neurological dysfunction in the brain, brainstem, spinal cord, motor neurons, anterior horn cells, peripheral nerves, and muscles. It is widely used to express reduced mucle tone in the upper and lower extremities, in the body, or in the craniofacial muscles. It has been reported that up to 60% of hypotonic cases have genetic-metabolic etiologies and a significant proportion of these cases are caused by genetic diseases. Even the genotype-phenotype correlation may be established in some patients with peripheral hypotonia constituting the 15-30 % of all hypotonia patients, it is difficult to correlate in most of the cases.
The aim of our study is to investigate genetic etiology using Next Generation Sequencing Analysis (NGS) technology with in-house designed multi-gene panels (ACTA1, CCDC78, DYNC1H1, GARS, RYR1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, FKRP, FKTN, IGHMBP2, LMNA, LAMA2, LARGE1, MTM1, NEB, POMGnT1, POMT1, POMT2, SEPN1), containing genes thought to be associated with peripheral hypotonia in cases of peripheral hypotonia that cannot be diagnosed using conventional cytogenetics, molecular cytogenetics and Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification.
Eighteen cytogenetically and molecularly unexplained pediatric peripheral hypotonia patients (between 6 months and 7 years), referred with the pre-diagnosis of hypotonia from Trakya University Health Research and Training Center, Division of Pediatric Neurology to the Department of Medical Genetics Diagnosis Center were included in our study.
In our study, we found thirteen variants in 11 (61%) out of 18 patients. Two of these variants were in the LAMA2, one in COL6A2, three in COL6A3, one in POMT1 and three in the POMGnT1 genes. According to ACMG-2015 criteria, two of the thirteen variants were evaluated as pathogenic, three as likely pathogenic, and eight as variants of uncertain clinical significance.
A homozygous, c.1649G>A, p.(Ser550Asn) variation was detected in the POMGnT1 gene in a patient with unexplained peripheral hypotonia. This variation has been associated with the Muscle-Eye-Brain (MEB) Diseases phenotype in the literature. The physical examination findings and screening results of our patient was consistent with the MEB phenotype reported in the literature. We detected a novel variation in another patient, classified as "uncertain significance" in the RYR1 gene, which was not previously reported in the literature and open access databases.
Although there are different studies aimed to identify hypotonic cases using certain algorithms in our country, there are no studies in the literature investigating the genetic etiology of unexplained peripheral hypotonia cases with the use of NGS method. With the in-house designed gene panel, a phenotype-genotype relationship was revealed in one of our eighteen patients with unexplained peripheral hypotonia. According to these results, the contribution of in-house designed gene panel in the etiology of peripheral hypotonia to clinical diagnosis is 5.5%.
As a result, we suggest that if the targeted multi-gene panels are studied by increasing the sample size in a longer period of time with NGS method, it will make significant contributions to the clinical diagnosis.