NAD+ bağımlı mutant Candida methylica format dehidrogenaz enzimine ait katalitik bölgenin protein mühendisliği temelli analizi
Protein engineering based analsis of the catalytic domain of NAD+ dependent mutant Candida methylica formate dehydrogenase
Yazar: UĞUR PALA
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BARIŞ BİNAY
Gebze Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Endüstride, optikçe aktif, değerli, kiral farmasötik ara bileşiklerin ve kimyasalların sentezinde kullanılan enzimler, kofaktör olarak oldukça pahalı olan NAD(P)H' ın kullanımına ihtiyaç duyarlar. Bu nedenle reaksiyonda kullanılan NAD(P)H' ın geri dönüşümünün sağlanması, maliyeti düşürmek için çok önemlidir. Dehidrogenazlar, bu kofaktörlerin yenilenmesini sağlamaları sebebi ile bu tür çalışmalar için çok değerli enzimlerdir. Bu tip enzimlerden olan NAD+- bağımlı format dehidrogenaz (FDH) (EC 1.2.1.2), format iyonunun (HCOO-), karbondiokside (CO2) yükseltgerken, NAD+ iyonunun da NADH' e indirgenmesini katalizler. 
Bu çalışmada, NAD+- bağımlı Candida methylica format dehidrogenaz (CmFDH) enzimine ait katalitik bölgenin protein mühendisliği yöntemlerinden biri olan yarı-rasyonel yaklaşım tekniği ile analizi amaçlanmıştır. Bu amaç ile, enzimin aktif bölgesinde yer aldığı düşünülen 119. pozisyondaki asparajine tekrarlamalı doygunluk mutajenezi uygulamak için dejeneratif kodonlu primerler tasarlanmış, mutant kütüphanesi oluşturulmuş ve 150 koloni taranmıştır. Otoindüksiyon-Studier besiyerinde E.Coli BL21 (DE3) hücrelerinde ifade edilmesi sağlanan, yabanıl tip ve mutant CmFDH' lar, Ni-NTA HisTrap kolonu kullanılarak saflaştırılmıştır. Enzimlerin formata karşı aktivite ölçümleri yapılmıştır. Format ve NAD+ substrat olarak kullanılıp kararlı hal kinetik çalışmaları gerçekleştirilerek, Michaelis-Menten kinetik değerler hesaplanmıştır. Elde edilen mutantlardan N119R, N119D, N119G ve N119C mutant CmFDH' lar formata karşı ölçülebilir bir aktivite göstermemiştir. Yabanıl tip ile kıyaslandığında, N119Y mutant CmFDH' ın katalitik verimliliğinde bir miktar artış ve N119H mutant CmFDH' ın katalitik verimliliğinde ise ciddi bir düşüş görülmüştür.
 Elde edilen bu sonuçlar, 119. pozisyondaki asparajinin katalitik aktivite için fonksiyonel bir amino asit olduğunu göstermiştir. Bu pozisyona atanan yeni amino asitlerin, substrat ile olan etkileşiminin görülmesi ve enzimin aktivitesindeki rolünün daha detaylı anlaşılması için modelleme çalışmaları halen devam etmektedir.

Abstract:
In industrial applications, enzymes are used in the synthesis of optically active, chiral pharmaceutical intermediates and chemicals that require the use of quite expensive NAD(P)H as a cofactor. For this reason, NAD(P)H recycling in the reaction is very important to reduce the cost. Dehydrogenases are valuable enzymes for such studies because they can regenerate these cofactors. One of these enzymes, NAD+- dependent formate dehydrogenase (FDH) (EC 1.2.1.2), oxidizes formate ion to carbon dioxide, while catalyzing the reduction of NAD+ to NADH. 
In this study, it is aimed to analyze the catalytic domain of NAD+ dependent mutant Candida methylica formate dehydrogenase by semi-rational design, one of the protein engineering methods. For this purpose, degenerative codon primers designed to perform iterative saturation mutagenesis for asparagine at position 119, which was assumed to be in the active region of the enzyme. Followed by the construction of a mutant library where 150 colonies were screened. Wild-type and mutant CmFDHs were expressed in E.Coli BL21 (DE3) cells in auto-induction Studier medium. The proteins were purified by using Ni-NTA HisTrap column and activity measurements of CmFDHs towards formate were carried out. Steady-state kinetic studies were performed against both formate and NAD+ where their Michaelis-Menten kinetic parameters were calculated. N119R, N119D, N119G and N119C mutations did not show any measurable activity towards formate. When compared to wild-type CmFDH, N119Y mutant CmFDH showed an increase in catalytic efficiency, while the N119H mutant CmFDH showed a significant decrease in catalytic efficiency.
These results show that asparagine at position 119 is a functional amino acid for catalytic activity. Modeling studies are still in progress in understanding the interaction of encoded amino acids with the substrate in the selected position and the role of this position in the enzyme activity.