Nükleosit analoğu bazı sitotoksik antineoplastik ilaçların dsDNA ile etkileşim mekanizmaları ve elektrokimyasal analizleri
Interaction mechanisms with dsDNA and electrochemical analysis of some nucleoside analogue cytotoxic antineoplastic drugs
Yazar: PELİN ŞENEL
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL GÖLCÜ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Klinik olarak kullanılan birçok antikanser ilaç antitümör etkisini DNA ile "kovalent ya da kovalent olmayan bağlanma" yolu ile hasar oluşturarak veya DNA sentezini inhibe ederek gerçekleştirmektedir. Ayrıca, birçoğu DNA'yı hedef aldığı zaman sitotoksik etkisinin bir sonucu olarak DNA'nın aktivitesini değiştirerek hücre ölümüne de sebep olmaktadır. DNA'yı direkt ya da dolaylı olarak hedef alan moleküller, klinik kullanım için en etkili antikanser ilaçlardır. Ancak günümüzde klinikte kullanılan antikanser ilaçlarda, seçici olmama ve metastaz kontrol yeteneğinin az olması gibi sorunlar bulunmaktadır. Bu sebeple immünoterapi, hücre döngüsünün modülasyonu gibi yeni yaklaşımlar geliştirilmiştir ve geliştirilmeye de devam etmektedir. Diğer bir taraftan, DNA'ya bağlanabilen ve DNA hasarı oluşturabilen ilaçların bu yeni geliştirilen tedavi yöntemleri ile kombine olarak kullanımlarının pozitif etki gösterdiği de bilinmektedir. DNA'ya bağlanabilen, DNA hasarı oluşturabilen ve sitotoksik özellik gösteren moleküllerin, kanser tedavisindeki olumsuz bazı yan etkilerine rağmen güçlü olan tedavi edici yönleri göz önüne alındığında, daha uzun yıllar bu tür moleküllere ihtiyaç duyulacağı ön görülmektedir. Tüm bunlar düşünüldüğünde klinikte kullanılmakta olan antikanser ilaçların DNA ile olan etkileşim mekanizmalarını tam olarak anlamak, onları daha güvenilir bir şekilde kullanmak ve daha etkili, aynı zamanda seçici ilaçlar geliştirebilmek için son derece önemlidir. 
DNA'nın sarmal yapısı ve içerdiği baz çiftleri onun küçük moleküllere (ilaç etken maddeleri, metal iyonları, metal kompleksleri, proteinler, bazı organik ve anorganik türler) bağlanmasını veya bu türleri çift sarmal yapının içine almasını mümkün kılmaktadır.
DNA ile moleküllerin etkileşimi kovalent bağlanma ve kovalent olmayan bağlanma (moleküller arası zayıf etkileşimler) şeklinde iki yol ile olabilmektedir. DNA ile küçük moleküller arasında meydana gelen kovalent bağlanma, hücre ölümüne sebep olan, geri dönüşümsüz bir süreçtir. Bu süreç, moleküllerin DNA yapısında bulunan major oluklardaki zengin elektron yoğunluğuna sahip guanin(G) ya da adenin(A) bazlarının 7 nolu azot atomuna doğrudan ya da çapraz bağlanmasını içermektedir. DNA ile küçük moleküller arasındaki kovalent olmayan bağlanma ise elektrostatik dış bağlanma, interkalasyon ve oluk(groove) bağlanma şeklinde üçe ayrılmaktadır.
Bu tez kapsamında kanser tedavisinde kullanılan ve ciddi yan etkilere sahip altı farklı kanser ilaç etken maddesinin (Azasitidin, Kladribin, Klofarabin, Eltrombopag, Fludarabin ve Pemetrekset) çift sarmal DNA (dsDNA) ile etkileşim mekanizmaları incelenmiştir. Tüm araştırmalarda, spektrofotometrik teknikler (ultraviyole görünür alan ve floresans), voltametrik yöntemler (dönüşümlü, diferansiyel puls ve kare dalga), ısıl bozunma ve viskozite ölçümleri kullanılmıştır. Her bir yöntemden elde edilen sonuçlar doğrultusunda ilaç etken maddelerinin dsDNA ile etkileşim mekanizmaları belirlenmiştir. Ayrıca, her bir molekülün dsDNA'ya bağlanma gücünü gösteren bağlanma sabiti (Kb) değerleri gün içi ve günler arası tekrar edilebilirlik parametleri ile hesaplanmıştır. 
Farklı sıcaklıklarda yapılan ultraviyole soğurma spektrofotometresi deneylerinden yararlanarak dsDNA-ilaç etkileşimlerine ait Gibbs serbest enerji değişimi (∆G), entalpi değişimi (∆H) ve entropi değişimi (∆S) gibi termodinamik parametreler de hesaplanmıştır. 
Tez kapsamında gerçekleştirilen tüm dsDNA-ilaç etken maddeleri etkileşimi deneysel çalışmaları sonucunda, Azasitidin ve Eltrombopag etken maddelerinin dsDNA'ya "interkalasyon yolu" ile bağlandığı, Kladribin, Klofarabin, Fludarabin ve Pemetrekset etken maddelerinin ise dsDNA yapısındaki minor oluklara yerleşerek dsDNA ile "groove bağlanma" yaptığı kanıtlanmıştır. Ayrıca teorik çalışan farklı bir araştırma grubu tarafından bu ilaç etken maddelerinin "moleküler yerleştirme" ve "moleküler dinamik simülasyon" çalışmaları da gerçekleştirilmiştir. In silico çalışmalar da ilaçların bu bağlanma modlarını doğrulamıştır.
Tez çalışmasının ikinci bölümünde ise dsDNA-ilaç etken maddeleri etkileşimine dayalı miktar tayin yöntemleri geliştirilmeye çalışılmıştır. Sadece, Azasitidin ve Kladribin ilaç etken maddeleri ile dsDNA'nın etkileşimine dayalı iki yöntem geliştirilerek farmasötik dozaj formlarına uygulanmıştır. Yöntem geliştirmede, dönüşümlü, diferansiyel puls ve kare dalga voltametrisi teknikleri  kullanılmıştır. Bu tekniklerde, yükseltgenme akım sinyalinin hangi pH ve tampon ortamında var olduğunu ya da daha yüksek bir değere sahip olduğunu belirlemek amacıyla farklı tampon ortamlarında (H2SO4, asetat, fosfat) pH taraması yapılmıştır. Çalışılacak tampon ortamı ve pH değeri belirlendikten sonra, ilaçların voltametrik davranışı farklı tarama hızlarında (0.005–1 V/s aralığı) incelenmiştir. Yapılan hız taraması deneyleri sonucunda ilaç etken maddeleri oksidasyonunun difüzyon ya da adsorpsiyon kontrollü olup olmadığı ve reaksiyonun geri dönüşümlü mü, geri dönüşümsüz mü olduğu belirlenmiştir. Bu belirlemeden sonra, Azasitidin ve Kladribin ilaçlarının tayini için hızlı, kolay, doğru, duyarlı, kesin, seçici ve herhangi bir ayırma işlemine gerek duyulmayan voltametrik teknikler geliştirilmiş ve bunların etken madde içeren farmasötik dozaj formlarına uygulanabilirliği istatistiksel olarak gösterilmiştir. Geliştirilen yöntemin gerekli tüm validasyon (yöntem geçerliliği) çalışmaları yapılmıştır. Validasyon parametrelerinden elde edilen sonuçlar; Kladribin için algılama limiti (LOD) değerinin 0.30 µM olduğunu göstermiştir. İlaç etken maddelerinin tayini, dsDNA-ilaç etken maddesinin etkileşimi üzerinden geliştirilen ikinci bir yöntem ile de kıyaslanmıştır. Bu yöntemde kalibrasyon eğrisi, farklı ilaç etken maddesi derişimleri ile dsDNA'nın guanin bazının yükseltgenme akım sinyali arasındaki değişimler izlenerek elde edilmiştir. Bu yöntemde Kladribin için algılama limiti 0.92 µM, Azasitidin için ise 0.62 µM olarak bulunmuştur.

Abstract:
Many clinically used anticancer drugs exert their antitumor effect by causing damage to DNA through "covalent or non-covalent binding" or inhibiting DNA synthesis. In addition, many of them cause cell death by changing the activity of DNA as a result of their cytotoxic effect when they target DNA. Molecules that directly or indirectly target DNA are the most effective anticancer drugs for clinical use. However, there are problems with anticancer drugs used in the clinic today, such as non-selectivity and low metastasis control ability. For this reason, new approaches such as immunotherapy and modulation of the cell cycle have been developed and continue to be developed. On the other hand, it is also known that the use of drugs that can bind to DNA and cause DNA damage in combination with these newly developed treatment methods have a positive effect. Considering the strong therapeutic aspects of molecules that can bind to DNA, cause DNA damage and show cytotoxic properties, despite some negative side effects in cancer treatment, it is seen that such molecules will be needed for many years.
Considering all these, it is extremely important to fully understand the interaction mechanisms of anticancer drugs used in the clinic with DNA, to use them more reliably and to develop more effective and selective drugs at the same time. The helical structure of DNA and the base pairs it contains enable it to bind to small molecules (drug active substances, metal ions, metal complexes, proteins, some organic and inorganic species) or to include these species in the double helix structure. The interaction of DNA and molecules can occur in two ways: covalent bonding and non-covalent bonding (weak interactions between molecules). Covalent bonding between DNA and small molecules is an irreversible process that causes cell death. This process involves the direct and/or cross-linking of guanine (G) or adenine (A) bases, which have rich electron density in major grooves in the DNA structure of molecules, to the 7 nitrogen atom. The non-covalent bonding between DNA and small molecule is divided into three as electrostatic external bonding, intercalation and groove bonding.
The electrostatic binding mode of DNA with small molecules has been identified as the external action between coordinated cations and negatively charged sugar-phosphate backbones. It is also known that hydrogen bonds occur between phosphate groups on the polyanionic surface of DNA and compounds. In addition, electrostatic interactions can also occur during intercalation and groove bonding.
A dsDNA intercalator is a molecule that stacks perpendicular to the DNA backbone without forming covalent connections and disrupting hydrogen bonds between dsDNA base pairs. Intercalation type bonding occurs, especially when compounds with planar chromophores are placed between DNA base pairs. During intercalation, strong structural changes occur in the DNA helix, such as expansion and gap formation. The van der Waals, hydrophobic, and electrostatic forces maintain intercalation complex stability. Ethidium bromide (EtBr) is the most well-known examples of intercalating chemical, may easily intercalate with the dsDNA strand due to its unique and distinct structure. Intercalators are strong mutagens. Because their structural alterations can lead to functional changes, such as inhibition of transcription and replication in developing cancer cells and dsDNA repair mechanisms.
There are major and minor grooves in the double helix structure of DNA. These major and minor grooves in the structure provide suitable binding sites to proteins or smaller molecules by van der Waals, hydrophobic and hydrogen bond interactions. Groove linkers are molecules that mostly show adenine-thymine selectivity.
Within the scope of this thesis, the interaction mechanisms with double-stranded DNA (dsDNA) of six different cancer drug active substances (Azacitidine, Cladribine, Clofarabine, Eltrombopag, Fludarabine and Pemetrexed) that are used in cancer treatment and have serious side effects; (constipation, diarrhea, nausea, vomiting, decrease in the number of white blood cells called lymphocytes (lymphopenia), febrile neutropenia, headache, rash, diarrhea, pruritus, pyrexia, palmar-plantar erythrodysaesthesia syndrome, fatigue, anxiety, mucosal inflammation, flushing, nosebleeds, bleeding gums, changes in appetite (increased or decreased), stomach pain/discomfort, stomach swelling, fainting, small red or purple spots caused by bleeding into the skin (petechiae), rash, back pain, muscle pain, bone pain, myelosuppression (neutropenia, thrombocytopenia and anaemia), pneumonia, cough, fever, weakness, hives, difficult breathing, swelling of the face, swelling of the throat, a severe skin reaction, fever, sore throat, burning eyes, skin pain, blistering and peeling, red or purple skin rash) were investigated. In all studies, spectrophotometric techniques (ultraviolet visible and fluorescence), voltammetric methods (cyclic, differential pulse and square wave), thermal denaturation and viscosity measurements were used. In the presence of the results obtained from each method, the interaction mechanisms of drug active ingredients with dsDNA were determined. In addition, the binding constant (Kb) values, which show the binding strength of each molecule to dsDNA, were calculated with intra-day and inter-day repeatability parameters. 
The sign and magnitude of thermodynamic parameters such as ΔH and ΔS are very important to confirm the binding mode. As a result, in order to determine the interaction types of drug active ingredients with dsDNA, thermodynamic parameters should be determined depending on the temperature. Positive ΔS values indicate hydrophobic interactions, and negative ΔH values indicate that van der Waals and hydrogen bonding are effective during bonding. In the case of electrostatic interactions, the ΔH value is negative and the value is very small or even close to zero. Within the scope of the thesis, thermodynamic parameters such as Gibbs free energy change (∆G), enthalpy change (∆H) and entropy change (∆S) of dsDNA-small molecule interactions were also calculated from experiments performed with ultraviolet absorption spectrophotometer at different temperatures.
As a result of all dsDNA-drug interaction experimental studies carried out within the scope of the thesis, it has been shown that Azacitidine and Eltrombopag active substances bind to dsDNA by "intercalation pathway". It has been proven that the active ingredients of Cladribine, Clofarabine, Fludarabine and Pemetrexed settle into minor grooves in the dsDNA structure and make "groove binding" with dsDNA.
In addition, "molecular docking" and "molecular dynamics simulation" studies of these drug active ingredients were also carried out by a different theoretical research group. In silico studies have also confirmed these binding modes.
In the second part of the thesis, quantitative determination methods based on the interaction of dsDNA-drug active substances were tried to be developed. Only two methods based on the interaction of Azacitidine and Cladribine active ingredients and dsDNA have been developed and applied to pharmaceutical dosage forms. In method development; cyclic, differential pulse and square wave voltammetry techniques were used. In these techniques, pH scanning was performed in different buffer media (0.1 M H2SO4, 0.5 M H2SO4, acetate (pH 3.5-5.5), phosphate (pH 2-11)) in order to determine at which pH and buffer medium the oxidation current signal is present or has a higher value. After determining the buffer medium and pH value to be studied, the voltammetric behavior of the drugs was investigated at different scanning rates (0.005–1 V/s). As a result of rate scanning experiments, it was determined whether the oxidation of drugs is diffusion or adsorption controlled and whether the reaction is reversible or irreversible. After this determination, voltammetric techniques that are fast, easy, accurate, sensitive, precise, selective and do not require any separation process for the determination of Azacitidine and Cladribine drugs have been developed and their applicability to pharmaceutical dosage forms containing active substance has been shown statistically. All necessary validation studies of the developed method were carried out. The results obtained from the validation parameters showed that the limit of detection (LOD) value for Cladribine was 0.30 µM. The determination of drug active substances was also compared with a second method developed over the interaction of dsDNA-drug. In this technic, the calibration curve was performed by monitoring the changes between different drug active ingredient concentrations and the oxidation current signal of the dsDNA guanine base. In this method, the detection limit for Cladribine was found to be 0.92 µM and for Azacitidine 0.62 µM.