Understanding Rho GTPase interactions with scaffolding proteins and Ras protein shuttling mechanisms
Rho GTPazlarin iskele proteinlerle etkileşimlerinin ve Ras proteinlerinin nakil mekanizmasinin anlaşilmasi
Yazar: EMİNE SILA ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. ZEHRA ÖZLEM KESKİN ÖZKAYA ; PROF. DR. ATTİLA GÜRSOY
Koç Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya ve Biyoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
Rho GTPaz ailesi ve Ras GTPaz ailesi, Ras GTPaz superailesinin alt aileleridir. GTPazlar yapısal ve işlevsel olarak farklılıklar gösteren efektörlerle seçici olarak etkileşirler. IQ motif-containing GTPase-activating protein (IQGAP) ve phosphodiesterase-δ (PDEδ) bu efektörler arasındadır. Rho GTPazlar diğer GTPazlardan, yüklü amino asitlerce zengin bir heliks motifi olan "insert loop"un varlığıyla ayrılır. Rho GTPazlar, Cdc42 ve Rac1 GTP bağlı aktif formlarındayken üç insan IQGAP proteiniyle de etkileşim kurarlar. IQGAP–Cdc42 etkileşimi aktin polimerizasyonunu arttırarak metaztaza katkıda bulunurlar. Ancak, yüksek sekans benzerliğine ragmen Cdc42 ve Rac'ın IQGAP ile olan etkileşimi farklılık gösterir. Cdc42 ve Rac1'ın IQGAP'e bağlanma mekanizması kesin olarak bilinmemektedir. Moleküler dinamik simulasyonlarını kullanarak Cdc42 ve Rac1'ın IQGAP2 ile olan etkileşimlerinin detaylı mekanizması çalışıldı. Cdc42'nin "insert loop"u ilk Cdc42'nin bağlanmasında önem taşımakta ve ikinci Cdc42'nin bağlanmasına yardımcı olmaktadır. Aksine, Rac1'ın "insert loop" sekansındaki ve yapısındaki farklılılar onun IQGAP2 ile etkileşimini engellemiştir ve sadece bir Rac1 IQGAP2'ye bağlanabilmektedir. Ras GTPaz alailesi proteinlerinde Ras, insan kanserlerinde yüksek oranda mutasyona uğramış halde bulunmaktadır. Ras proteinlerinin plasma membranında (PM) uygun şekilde konumlanması, Ras fonksiyonu için kritik önem taşımaktadır. Ras proteinlerinin konumlandırılmasında PDEδ görev almaktadır. GTP-bağlı Arf-like protein 2 (Arl2), farnesilli proteinlerin PDEδ-aracılı taşınmasında bir regülatör görevi almaktadır, ancak farneillli proteinlerin PDE'dan Arl2-yardımlı salınımının kesin mekanizması bilinmemektedir. MD simülasyonlarını kullanarak Arl2-aracılı en çok rastlanan onkojenik Ras izoformu olan KRas4B'nin PDEδ'dan salınımının detaylı mekanizmasını araştırıldı. Detaylı analizler, PDEδ'nın β6 bölgesi ve bazı amino asitlerini kapsayan alosterik değişikliklerin hidrofobik PDEδ cebini sıkıştırarak KRas4B'yi dışarı ittiğini gösterdi.
Ayrıca, tekli amino asit varyasyonlarının (SAV) protein-protein etkileşim (PPI) ara yüzlerine dağılımını da incelendi. Ara yüzler, hot spot adı verilen ve bağlanma enerjisine önemli katkıda bulunan az sayıda amino asit içerir, bu hot spotlar kümelenerek hot regionları oluşturur. Tekli hot spotlar ise hot regionlar dışında kalan hot spotlara denmektedir. Literatürden toplanmış deneysel thermodinamik dataya sahip SAVlarla, istatistiksel ve yapısal analizler gerçekleştirildi. Bunun sonucunda, PPIı destabilize eden ve hastalığa neden olan SAVların, hot regionlar ya da energy bakımında daha az önemli bölgelerde bulunmaktansa, tekli hot spotlarda bulunmayı tercih ettiğini gösterildi. Bu analizler tekli hot spotlara denk gelen SAVların, proteinin stabilitesine ve fonksiyonuna önemli etkisi olduğunu gösteriyor.
Bu tez çalışması TUBITAK tarafından desteklenmiştir (Araştırma Projesi No: 114M196 ve Burs: 2211-E).

Abstract:
The Rho GTPase family and the Ras GTPase family are subfamilies of the Ras GTPase superfamily. The GTPases selectively interact with structurally and functionally diverse effectors, such as IQ motif–containing GTPase-activating proteins (IQGAP) and phosphodiesterase-δ (PDEδ). Rho GTPases are distinguished from other GTPases by the presence of an "insert loop," which is rich in charged residues in a helical motif. The Rho GTPases, Cdc42 and Rac1, in their GTP-bound active forms, interact with all three human IQGAPs. The IQGAP–Cdc42 interaction promotes metastasis by enhancing actin polymerization. However, despite their high sequence identity, Cdc42 and Rac1 differ in their interactions with IQGAP. The exact mechanism of Cdc42 and Rac1 binding to IQGAP is unclear. Using all atom molecular dynamics (MD) simulations, the detailed mechanisms of Cdc42 and Rac1 interactions with IQGAP2 were studied. It was observed that the Cdc42 "insert loop" is important for the interaction of the first Cdc42 and allows to the binding of the second Cdc42. By contrast, differences in Rac1 insert-loop sequence and structure precluded its interaction with IQGAP and only one Rac1 can bind. Ras GTPase subfamily protein, Ras is highly mutated in human cancers. Proper localization of Ras proteins at the plasma membrane (PM) is crucial for their functions. Their localization is mediated by PDEδ. GTP-bound Arf-like protein 2 (Arl2) is a regulator of PDEδ-mediated transport of farnesylated proteins; however, the exact mechanism of Arl2-assisted release of farnesylated proteins from PDEδ is still unclear. Using MD simulations, detailed mechanisms of Arl2-mediated release of KRas4B, the most abundant oncogenic Ras isoform, from PDEδ were investigated. The detailed analysis showed that allosteric changes (involving β6 of PDEδ and additional PDEδ residues) compress the hydrophobic PDEδ pocket and push the KRas4B out.
Single amino acid variation (SAV) distribution in protein-protein interaction (PPI) interfaces was also investigated. Interfaces have a small subset of residues called hot spots that contribute significantly to the binding energy, and they may form clusters called hot regions. Singlet hot spots are the single amino acid hot spots outside of the hot regions. Statistical and structural analyses of SAVs were performed with literature curated experimental thermodynamics data, and demonstrated that SAVs which destabilize PPIs and cause diseases are more likely to be found in singlet hot spots rather than hot regions and than energetically less important interface residues. This part of the thesis demonstrates that SAVs in singlet hot spot residues have significant effects on protein stability and function.
This thesis study was supported by TUBITAK (Research Grant No: 114M196 and Scholarship: 2211-E).