Nanopartiküler taşıyıcı sistem aracılığıyla indometasinin insan glioblastoma u87mg hücreleri üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of indomethacin on human glioblastoma U87MG cells by nanoparticular delivery system
Yazar: FERHAT BOSTANCI
Danışman: DOÇ. DR. MURAT PEKMEZ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
İndometasin kan-beyin bariyerinden geçebilen bu nedenle daha önce glioblastoma hücre hatlarında çalışılmış ümit vaat eden bir non-steroidal anti-inflamatuar ilaçtır. Prostaglandinlerin oluşmasını engelleyerek inflamasyonu azaltmaktadır. Fakat kanda %90 oranında kan proteinleriyle beraber bulunduğundan kandaki serbest indometasin miktarı azdır. Poli(laktik-ko-glikolik asit)(PLGA) ise FDA tarafından onaylı normal koşullarda insanlarda ciddi bir yan etki oluşturmayan nanopartiküllerdir. Daha önce birçok farklı ilacın farklı amaçlarla taşınmasını sağlamıştır. Bu çalışmada indometasin yüklü PLGA'nın U-87 MG insan glioblastoma üzerindeki etkisi araştırılmıştır. 
Bu çalışmada üretilen indometasin yüklü PLGA nanopartiküllerinin boyutu 160,6 nm olarak hesaplanmıştır. Ayrıca yapılan zeta potansiyeli testlerinde nanopartikülün zeta potansiyeli -23,9 mV olarak tespit edilmiştir. Nanopartikülün kimyasal yapısını tespit etmeye yönelik olan araştırmada ise üretilen nanopartikülün indometasin taşıdığı sonucuna varılmıştır. Spektral yöntemler kullanılarak üretilen nanopartikülün kütlece %9 oranında indometasin içerdiği tespit edilmiştir. Ayrıca yapılan salınım testlerinde 4 saat içerisinde yapısındaki indometasinin %72,5'lik miktarını ortama saldığı gösterilmiştir.
Nanopartikülün özellikleri göz önünde bulundurularak hücreler üzerindeki sitotoksik etkisi MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2,5-difeniltetrazolyum] ile tespit edilmiştir. Bunun için hücreler nanopartiküle 4 saat maruz bırakılmış ve medyası değiştirilerek 24, 48 ve 72 saatlik sonuçları analiz edilmiştir. Nanopartikülle taşınan indometasinin etkisi saf indometasinin etkisiyle kıyaslanmıştır. Sonuç olarak indometasin yüklü nanopartiküllerin saf indometasine göre çok daha öldürücü olduğu belirlenmiştir. Sitotoksisite analizleri neticesinde uygun görülen 200µM ve 100µM indometasin içeren nanopartiküller ile saf haldeki 200µM ve 100µM indometasinin hücre ölüm yolaklarındaki etkisi araştırılmıştır. Bunun için Bax, Bcl2 ve Cas3 genlerinin RNA ve protein düzeyindeki değişimleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ve western blotlama yöntemleriyle tespit edilmiştir. Bu yöntemlerin sonucunda indometasin yüklü nanopartikülün saf indometasine göre apoptoza yol açan genlerin ifadesini ciddi derece artırdığı saptanmıştır. Ayrıca apoptozu engelleyen genlerin ifadesinde azalma tespit edilmiştir.  
Nanopartikülün hücre içerisine girişi nanopartikülün Rhodamine B ile işaretlenmesi ve floresan mikroskop altında gözlemlenmesi ile tespit edilmişrtir. Hücrelerin yerlerini doğrulamak için hücrelerin çekirdekleri Hoechst 33342 ile boyanmış ve floresan mikroskop altında gözlemlenmişrtir.
Sonuç olarak indometasin yüklü PLGA'nın saf indometasinden çok daha etkili olduğu ve üzerine daha fazla araştırma yapılmaya uygun bir aday tedavi sistemi olduğu belirtilmiştir.

Abstract:
Indomethacin is a promising non-steroidal anti-inflammatory drug that can cross the blood-brain barrier and has therefore been previously investigated in glioblastoma cell lines.It reduces inflammation by preventing the formation of prostaglandins. However, the amount of free indomethacin in the blood is low, as 90% of  it is found with blood proteins in the blood. Poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) is FDA-approved nanoparticles that do not cause serious side effects in humans under normal conditions.It has previously enabled many different drugs to be transported for different purposes. In this study, the effect of indomethacin loaded PLGA on U-87 MG human glioblastoma was investigated.
The size of indomethacin loaded PLGA nanoparticles produced in this study was calculated as 160.6 nm. In addition, the zeta potential of the nanoparticle was determined as -23.9 mV in the zeta potential tests. In the research to determine the chemical structure of the nanoparticle, it was concluded that the produced nanoparticle contained indomethacin. By using spectral methods, it was determined that the nanoparticle produced contains 9% mass of indomethacin.In addition, it was shown in the release tests that it released 72.5% of indomethacin in its structure within 4 hours.
Considering the properties of the nanoparticle, its cytotoxic effect on cells was determined by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetrazolium]. For this, the cells were exposed to the nanoparticle for 4 hours and the media was changed and the results were analyzed at 24, 48 and 72 hours. The effect of nanoparticle contained indomethacin was compared with the effect of pure indomethacin. As a result, it was determined that indomethacin loaded nanoparticles were much more lethal than pure indomethacin. The effects of 200µM and 100µM indomethacin containing nanoparticles and 200µM and 100µM pure indomethacin on cell death pathways were investigated according to results of cytotoxicity analyses. For this purpose, changes in the RNA and protein levels of Bax, Bcl2 and Cas3 genes were determined by real-time polymerase chain reaction and western blotting methods. As a result of these methods, it was determined that the indomethacin loaded nanoparticle significantly increased the expression of genes that cause apoptosis compared to pure indomethacin. In addition, a decrease in the expression of genes that prevent apoptosis was detected.
The entry of the nanoparticle into the cell was determined by labeling the nanoparticle with Rhodamine B and observing it under a fluorescent microscope. To confirm the location of the cells, the nuclei of the cells were stained with Hoechst 33342 and observed under a fluorescent microscope.
As a result, it was stated that indomethacin loaded PLGA is much more effective than pure indomethacin and is a candidate treatment system suitable for further research.