Sıçanlarda mcfarlane flep modelinde ripasudil'in flep yaşayabilirliğine etkisi
The effect of ripasudil on flap viability in the mcfarlane FLAP model in rats
Yazar: HALİL İBRAHİM KANLIKAMA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ RAMAZAN HAKAN ÖZCAN
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı / Tıp Eğitimi Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Cerrahi flepler = Surgical flaps ; Doku yaşaması = Tissue survival ; Gref yaşaması = Graft survival ; Rhokinaz = Rhokinase ; Ripasudil = Ripasudil ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Flepler, kendi kan damarları bulunan ve doku defektlerinin onarımında kullanılan, rekonstrüktif plastik cerrahinin en temel yöntemlerinden biridir. Vücudun hemen her bölgesinde kullanılabilen fleplerin beslenmesi uzun yıllardır üzerinde çalışılan ve hala gelişime ihtiyaç duyan bir konudur. Flep yaşayabilirliğinin artırılması ve nekrozun önlenebilmesi için yüzlerce yöntem ve molekül üzerinde çalışmalar yapılmış ve ciddi başarılar elde edilmiştir. Kısmi ya da tam flep nekrozu, flep başarısızlığının hala en önemli sorunu olup ilgi konusu olmaya devam etmektedir. Rho kinazlar(ROCK), serin-treonin kinaz ailesine ait proteinlerdir. Esas olarak hücrenin şeklini ve hareketini belirlerler. Rho kinaz inhibitörlerinin ise koroner vazospazm, serebral vazospazm, anjina, pulmoner hipertansiyon, erektil disfonksiyon, glokom, insülin direnci gibi durumlarda potansiyel faydalı etkileri gösterilmiş, günümüze kadar iki ROCK inhibitörü, Fasudil 1995 yılında serebral vazospazm, Ripasudil 2014 yılında glokom tedavisi için Japonya'da onaylanmıştır. Ripasudil(K-115), yeni bir rho kinaz inhibitörü olup, göz içi basıncı azalttığı, retinal mikrosirkülasyonu ve oküler kan akımını artırdığı yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Ayrıca akut akciğer hasarında(ARDS), lipopolisakkaritlerle indüklenen apoptozisi ve endotel hasarını, inflamasyonu, koagülasyonu, kontraksiyonu ve ödemi azalttığı gösterilmiştir. Literatür taramasında Ripasudil'in flep yaşayabilirliği üzerine etkilerine dair herhangi bir çalışma bulunmamaktadır.
Çalışmamızda 28 adet rat randomize olarak dört eşit gruba ayrıldı(n=7). Grup 1 kontrol grubu olup herhangi bir cerrahi işlem uygulanmadı. Grup 2 plasebo grubu olup postoperatif 0, 1 ve 2. günlerde 12 saatlik aralıklarla günde iki doz olacak şekilde 2ml/kg serum fizyolojik uygulandı.  Grup 3 düşük doz Ripasudil grubu olup postoperatif 0, 1 ve 2. günlerde 12 saatlik aralıklarla günde iki doz olacak şekilde toplam 2mg/kg Ripasudil uygulandı. Grup 4 yüksek doz Ripasudil grubu olup, postoperatif 0, 1 ve 2. günlerde 12 saatlik aralıklarla günde iki doz olacak şekilde toplam 8mg/kg Ripasudil uygulandı. Tüm flepler postoperatif 7. gün total olarak eksize edildi. Makroskopik olarak flep yaşayan alanları hesaplandı. Yaşayan ortalama flep alanlarının Grup 2'de %50, Grup 3'te %62, Grup 4'te %70 olduğu gözlendi. Gruplar arasında yaşayan flep alanı açısından istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı(p<0.05). Histopatolojik olarak hematoksilen eozin, masson trikrom, immünohistokimyasal olarak ise VEGF ve eNOS antikorları ile boyamalar yapıldı. Alınan biyopsi örnekleri histopatolojik incelemede neovaskülarizasyon, inflamatuar hücre infiltrasyonu, fibroblast proliferasyonu ve kollajen depolanması değerlendirilerek skorlama yapıldı. VEGF, eNOS, Bax ve Bcl-2 gen ekspresyonları PCR yardımıyla değerlendirildi. Yaşayan flep alanı, neovaskülarizasyon, nötrofil sayıları, total inflamatuar hücre sayıları, fibroblast proliferasyonu ve kollajen depolanmalarından elde edilen değerler istatistiksel olarak analiz edildi. Yaşayan flep alanları, neovaskülarizasyon, nötrofil sayıları, total inflamatuar hücre sayıları, PCR ile VEGF, eNOS, Bax ve Bcl-2 değerlendirmelerinde istatistiksel olarak anlamı fark saptandı(p<0.05). Fibroblast proliferasyonu ve kollajen depolanmasında ise klinik farklılık olsa da istatistiksel anlamlı fark saptanmadı. 
Morfolojik ve histopatolojik değerlendirmeler sonucunda Ripasudil'in flep yaşayabilirliğine anlamlı katkı sağladığı görülmüştür. Artan dozlarda uygulama ile anlamlı sonuç elde edilmiştir. Bu sonuçlar hipotezimizi desteklemekte ve Ripasudil'in flep yaşayabilirliğini artırmada kullanımı mümkün, potansiyel faydalı bir molekül olduğu sonucunu ortaya koymaktadır. 

Anahtar kelimeler: Flep yaşayabilirliği, Mcfarlane Flep, Ripasudil, Rho kinaz inhibitörü.

Abstract:
Flaps are one of the most basic methods of reconstructive plastic surgery, which have their own blood vessels and are used to repair tissue defects. Nutrition of flaps, which can be used in almost every part of the body, is a subject that has been studied for many years and still needs improvement. In order to increase flap viability and prevent necrosis, studies have been carried out on hundreds of methods and molecules and serious successes have been achieved. Partial or complete flap necrosis is still the most important problem of flap failure and continues to be of interest. Rho kinases (ROCK) are proteins belonging to the serine-threonine kinase family. They mainly determine the shape and movement of the cell. On the other hand, the potential beneficial effects of Rho kinase inhibitors in conditions such as coronary vasospasm, cerebral vasospasm, angina, pulmonary hypertension, erectile dysfunction, glaucoma, insulin resistance have been demonstrated. Two ROCK inhibitors, Fasudil in 1995 for the treatment of cerebral vasospasm, Ripasudil in 2014 for the treatment of glaucoma, have been approved in Japan. Ripasudil (K-115) is a new rho kinase inhibitor and it has been shown in studies to decrease intraocular pressure, increase retinal microcirculation and ocular blood flow. It has also been shown to reduce lipopolysaccharide-induced apoptosis and endothelial damage, inflammation, coagulation, contraction and edema in acute lung injury (ARDS). In the literature review, there are no studies on the effects of Ripasudil on flap viability.
In our study, 28 rats were randomly divided into four equal groups(n=7). Group 1 was the control group and no surgical procedure was applied. Group 2 was the placebo group, and 2 ml/kg saline was administered twice a day at 12-hour intervals on postoperative days 0, 1 and 2. Group 3 was the low-dose Ripasudil group, and a total of 2mg/kg Ripasudil was administered twice a day at 12-hour intervals on postoperative days 0, 1 and 2. Group 4 was the high-dose Ripasudil group, and a total of 8mg/kg Ripasudil was administered twice a day at 12-hour intervals on postoperative days 0, 1 and 2. All flaps were completely excised on the 7th postoperative day. The areas of flap living were calculated macroscopically. It was observed that the average living flap area was 50% in Group 2, 62% in Group 3, and 70% in Group 4. A statistically significant difference was found between the groups in terms of living flap area (p<0.05). Staining was done with Hematoxylin eosin, Masson trichrome histopathologically, and VEGF and eNOS antibodies immunohistochemically. Biopsy specimens were scored by evaluating neovascularization, inflammatory cell infiltration, fibroblast proliferation and collagen deposition in histopathological examination. VEGF, eNOS, Bax and Bcl-2 gene expressions were evaluated by PCR. Values obtained from living flap area, neovascularization, neutrophil counts, total inflammatory cell counts, fibroblast proliferation and collagen deposition were statistically analyzed. A statistically significant difference was found in the evaluations of living flap areas, neovascularization, neutrophil counts, total inflammatory cell counts, VEGF, eNOS, Bax and Bcl-2 by PCR (p<0.05). Although there were clinical differences in fibroblast proliferation and collagen deposition, no statistically significant difference was found.
As a result of morphological and histopathological evaluations, it was seen that Ripasudil contributed significantly to flap viability. Significant results were obtained with increasing doses. These results support our hypothesis and suggest that Ripasudil is a potentially useful molecule that can be used to increase flap viability.

Keywords: Flap viability, Mcfarlane Flap, Ripasudil, Rho kinase inhibitor.