Tüberküloz teşhisi için kullanılmak üzere mikro ısıtıcı tasarlanması karakterizasyonu ve üretimi
Microheater design production and characterisation for using in tuberculosis detection
Yazar: MUHAMMED BEKİN
Danışman: PROF. DR. LEVENT TRABZON
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Makine Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Malzeme ve İmalat Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Makine Mühendisliği = Mechanical Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Tüberküloz, Mycobacterium tuberculosis içeren ve havada asılı halde duran, 1-5 μm büyüklüğündeki damlacık çekirdeklerinin solunum yolu ile alınması ve bunların alveollere yerleşmesiyle gerçekleşir. M. tuberculosis' in enfektif dozu düşüktür. Ondan az (1-3) basil enfeksiyon için yeterlidir. Tüberküloz basilini alan sağlıklı kişilerin %5'inde ilk iki yıl içinde aktif tüberküloz, %95'inde ise latent enfeksiyon gelişmektedir. Latent olarak enfekte kişilerin %5-10'unda da aylar veya yıllar sonra tüberküloz hastalığı gelişme riski vardır. Enfeksiyon kaynaklı ölüm sebeplerinde HIV/AIDS'den sonra ikinci sırada yer almaktadır. Tüberkülozda direnç gittikçe artan global bir problemdir. Her yıl yaklaşık olarak 500,000 yeni çok ilaca dirençli (ÇİD) tüberküloz (TB) bildirilmesine rağmen bunların yalnızca 30,000 kadarı tanımlanıp, rapor edilebilmektedir. 2013 yılında dünya genelindeki TB olgularının % 3.5'inin ÇİD-TB olduğu hesaplanmış ve 210,000 kişinin ÇİD-TB nedeniyle öldüğü rapor
edilmiştir. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) raporlarına göre, günümüzde, dünya nüfusunun yaklaşık üçte biri tüberküloz basiliyle enfektedir ve yılda ortalama 9 milyon yeni tüberküloz hastası oluşmakta ve 1,5 milyon kişi tüberküloz nedeniyle ölmektedir. DSÖ'ne göre tüm tüberkülozlu vakaların %10-20'sini çocuklar oluşturmaktadır. Türkiye'de yılda yaklaşık 13-14 bin yeni tüberküloz hastası ortaya çıkmaktadır. Tüberküloz kontrolünde anahtar faktörler; hızlı tanı, etkili tedavi ve temaslı taramasının yapılması ile bulaşın önlenmesidir. Tüberkülozun laboratuar tanısında kültür altın standart yöntemdir, ancak sonuçların elde edilmesi birkaç haftayı bulmaktadır, Ziehl-Neelsen boyama yöntemi ile boyandıktan sonra yapılan mikroskobik incelemenin duyarlılığı ise düşüktür. Tüberküloz bulaşlarını önleyebilmek için, tanının 1-2 gün gibi kısa bir sürede konması ve zaman kaybetmeden tedaviye başlanması büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle tüberkülozun laboratuar tanısı için hızlı, duyarlı, güvenilir ve ekonomik yöntemlere ihtiyaç vardır. In vitro diagnostik (IVD) testler, küresel sağlık sektörü için çok önemli ve değerli bir kesimi oluşturmaktadır. Bu alanda; sürekli teknolojik gelişmelere, yeni ve gelişmiş tedavi izleme tekniklerine, hızlı ve ekonomik tanı/yanıt testlerinin geliştirilmesine hergeçen gün tanık olunmaktadır. IVD'ler, genel refahı arttırmakla birlikte, dünya
çapında sağlık sistemlerinin vazgeçilmez bir parçası haline gelmektedirler. Bugün tüm dünyadaki IVD sektörünün %30'unu hasta başı testler oluşturmaktadır. ABD'de pazardaki payı >13 milyar dolardır ve 20-25 yıl önce 7-8 test iken şimdi sayıları yüzleri bulmaktadır. Moleküler tekniklerdeki gelişmelere paralel olarak tüberküloz tanısı için Polimeraz chain reaction (PCR), real-time PCR, transcription based amplification (TMA) gibi birçok amplifikasyon yöntemini kullanan ticari kitler geliştirilmiştir. Ancak bu kitlerin en önemli dezavantajı çoğunlukla laboratuar ortamı gerektirmeleri ve hasta başında uygulanamamalarıdır. Son zamanlarda geliştirilen GenExpet MTB-RIF testinin hasta başında kullanma potansiyeli bulunmaktadır fakat oldukça pahalı bir sistemdir. Çalışmada PCR yöntemine göre çok daha hızlı ve duyarlı sonuç veren "loop-mediated isothermal amplification" (LAMP) teknolojisi kullanılacaktır. LAMP yönteminin en önemli avantajı; hedef nükleik asit dizilerini izotermal koşullar altında (60-65°C), düşük enerji tüketimli minyatürize ortamda çoğaltma imkânı sunmasıdır. Çoğalma; bulanıklık, DNA'ya bağlanan floresans veya serbest magnezyum miktarını gösteren boyalar ile izlenebilmektedir. Bu nedenle pahalı bir aygıt gerektirmez, sonuçların basit bir optik sistemle veya çıplak gözle değerlendirilebilmesine imkân verir. LAMP yönteminde %96.8 duyarlılık ve %100 özgüllükte sonuçlar elde edilebilmektedir.
Tüberküloz tanısı için geliştirilen yöntemlerinin sadece hızlı ve duyarlı olması yeterli değildir; bu yöntemlerin aynı zamanda kolay uygulanabilir, güvenilir ve ucuz olması da gerekir. Piyasada mevcut bulunan moleküler tanı kitleri ile karşılaştırıldığında projede geliştirilmesi hedeflenen kitlerin yurt dışı bağımlılığı ortadan kaldırması, geleneksel tam donanımlı laboratuvar gerektirmemesi, taşınabilir ve teknik olarak basit bir şekilde yapılabilmesi, hassasiyetinin yüksek olması gibi önemli avantajları vardır. Çalışmanın ana hedefi "M. tuberculosis gibi geç üreyen, erken tanısı ve antibiyotik direncinin belirlenmesi önem arz eden bir mikroorganizmaya yönelik,
kit geliştirilmesi" dir. Bu çalışma içersinde değineceğimiz konu teşhis için gereken 60-65°C aralığını tasarlanacak mikroısıtıcı sisteminin üretilmesinin sağlanmasıdır.

Abstract:
Tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis is spread from person to person via respiratory fluids through the air. Transmission occurs when a person inhales droplet nuclei containing tubercle bacillus(TB) and the droplet nuclei traverse the mouth or nasal passages, upper respiratory tract and bronchi to reach the alveoli of the lungs. M. tuberculosis has a low infective dose; just below the 10 bacillus (1 to 3 bacilli) are enough for infection. Five percent of the people infected with tuberculosis shows active tuberculosis in the first two years while latent tuberculosis develops in 95% of the infected people. It's also important that 10 percent of people with latent tuberculosis carry the risk of developing active tuberculosis in months and even years later. Tuberculosis comes right after HIV for infection caused deaths. According to World Health Organization (WHO) reports, 1/3 of the World population today is already infected with TB. Annualy approximately 9 million new cases have been reported and 1.3 million of these infected people died because of tuberculosis. About 10 to 20 percent of all tuberculosis cases are seen in children. In Turkey 13 to 14 thousands of new tuberculosis patients emerge annualy. Resistant tuberculosis has become an increasing global problem. Altghough about 500.000 new multy-drug resistant TB (MDR-TB) cases have been reported annualy, only 30.000 of these can be identified and reported. In 2013, it was estimated that 3.5% of TB cases over the world are MDR-TB and 210.000 TB cases died due to MDR- TB.
Key factors for the control of tuberculosis are rapid diagnosis, effective treatment and preventing transmission with scanning. Gold standard method for laboratory diagnosis of tuberculosis is culture. However, getting the results takes a few weeks long. Also, sensitivity of the microscopic examination following the Ziehl-Neelsen staining is low. For preventing tuberculosis spread, it's critical to diagnose the disease within 1 or 2 days and thus start the treatment immediately. Therefore, rapid, sensitive, reliable and economical methods for laboratory diagnosis are required. In vitro diagnostics (IVD) is a very important and valuable part of global health care industry. Every passing day, market of this sector witnesses constant technological development, better diagnostic equipment, advancements on follow-up care, shortened times of diagnostic/response tests and growth. Day by day, IVDs become more essential part of the health care systems worldwide and they become more valuable for both the patients and medical specialists. Thirty percent of the IVD industry worldwide consists of point-of-care-testing. In USA market share is above 13 billion dollars. And hundreds of tests are available now while they were limited to 7 or 8 tests 20-25 years ago. In parallel with the developments on molecular techniques, lot of commercial kits using amplification method (like PCR, real-time PCR, transcription based amplification (TMA) etc.) are developed for diagnosis of tuberculosis. However the upmost disadvantage of these kits is that they require laboratory environment and that they are not available for point-of-care-testing. Although lately developed GenExpet MTB-RIF test has the point-of-care potential, it's a highly expensive system. Therefore, there's a need for quick, sensitive, reliable, point-of-care and economical methods for the laboratory diagnosis of tuberculosis. In our project, LAMP technology is going to be used and it gives more quick and sensitive results in comparison with PCR method. The upmost advantage of LAMP method is that it allows the amplification of nucleic acid chains in a miniaturized environment which uses low-energy and under isothermal conditions (60-65°C). Amplification can be screened via blur, with stains that attaches to DNA or with fluorescent stains and stains that shows the free magnesium amount; therefore it does not require an expensive device and it allows the results to be evaluated with a simple optical system or macroscopically. Clinical examples of this method resulted with 96.8% sensitivity (positive predictive value) and with 100% specificity (negative predictive value). Yet, having the feature of quickness and sensitivity is not enough for the diagnosis of tuberculosis; also these methods must have practical use, reliable and low-costs. In comparison with the molecular diagnostic kits for tuberculosis in the market, targeted kits will present a special advantage by its practicality, sensitivity, lower-costs and by not requiring additional equipment thus eliminating dependency to imported products. In our project, development of the new analyzing system will allow the different analyses and tests conducted in fully- equipped laboratories to be performed in quicker, more portable and technically easier way. Main target of our project is "developing an easy-to-use, simple-resulting and quick microfluidic chip based diagnostic kit for Mycobacterium tuberculosis which is a microorganism that divides slowly and its early diagnosis with the detection of antibiotic resistance is critical" and the target product fits with technological outputs. Conduction of this project consists of 4 main stages. 1: preparation of examples that directly effects the analyse results; development and optimization of DNA isolation procedures. 2: Design and production the primers for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) and MDR, and optimization of PCR reactions. 3: production, optimization and performance testing of microfluidic chip. 4: system optimization, performance testing of the prototype, comparison of the results with reference methods (validation studies). By doing all these Works, at the end we planed to develop optimized and validated kits that can be used in diagnostic puposes. The essential part of this project is that it highly focuses on domestic production. With its innovative, multidisciplinary approach, our project will be the basis for new application projects and technological product development studies in health care industry. In conclusion, with this project, diagnosis of tuberculosis will be available within the global health care scope by creating the single use, low-cost MEMS compositions which are also in research at high priority in many countries. An Al thin film is designed and fabricated for Lab on a Chip ( LoC ) application. In this specific design, this microheater will be used in tuberculosis detection in Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) system. For this reason, COMSOL is used for heat and electrical simulation. Microheater is constructed in a glass substrate, this construction is made by lift-off technique. In lift-off method is a technique that one can make patterns by using a sacrificial layer. We made Al paths for microheater by using photo-resist as sacrificial material. PVD and lithography used for patterning and making Al paths. The final pattern coated with SU-8 thin membrane for isothermal dissipation. After thin layer of SU-8, PDMS channel is designed and used for DNA reproduction. Lamp applications needs isothermal heating capability for microheater. In our design one can control heater isothermally as needs in LAMP. This abstract reports an on-chip heating system for using in biotechnology. For produced micro-heater we used four-point probe to find the resistivity of Al path. After resistivity test we designed a closed circuit system to control heating, with 4 pad we can either give power or read the result resistivity which can lead us to control heating capability of the system. To sum up, after using desired voltage, which can be calculated via resistivity curve, we can achieve 65 Celsius and can stay there with 0.4 Celsius oscillations.