Potansiyel probiyotik Lactobacillus plantarum GD2 tarafından üretilen Ekzopolisakkarit'in (EPS) yara iyileşme özelliklerinin araştırılması
Investigating wound healing properties of Exopolysaccharide (EPS) produced by the potential probiotic  Lactobacillus plantarum GD2
Yazar: ABDULLAH DEMİR
Danışman: PROF. DR. BELMA ASLIM
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyomalzemeler = Biomaterials ; Ekzopolisakkarit = Exopolysaccharide ; Fibroblastlar = Fibroblasts ; Probiyotikler = Probiotics ; Sinbiyotikler = Synbiotics ; Yara iyileşmesi = Wound healing

Özet:
Cilt yaraları, yaşam kalitesini düşüren, ampütasyon ve ölüm ile sonuçlanabilen önemli sağlık problemlerinin başında gelmektedir. Klinikte yara iyileşmesi için kullanılan ürünlerin yetersizliği ve yüksek yan etkileri, araştırmacıları yeni terapötik ajanların ve biyomalzemelerin keşfine yönlendirmiştir. Bu yüksek lisans tez çalışmasında, probiyotik Lactobacillus plantarum GD2 suşunun, bu suştan elde edilen liyofilize ekzopolisakkaritin (L-EPS) ve sinbiyotiğin (canlı bakteri ve L-EPS kombinasyonu) yara iyileşmesinin farklı fazlarına etkisinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Uygulamaların, L929 fare fibroblast hücrelerinde oluşturulan in vitro yara modelinde fibroblast migrasyonu üzerine etkisi belirlenirken, kollajen tip 1 alfa 1 (COL1A1) ve fibronektin (FN) seviyeleri ELISA yöntemi, mRNA ekspresyon düzeyleri qRT-PCR ile tespit edilmiştir. Uygulamaların, dönüştürücü büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1)/Smad sinyal yolağı ile ilişkili 4 gen üzerindeki modülatör etkileri ile tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ile indüklenmiş L929 hücrelerinde yara inflamasyonu ile ilişkili genler üzerindeki etkileri qRT-PCR ile belirlenmiştir. Uygulamaların L929 hücreleri üzerindeki proliferatif etkisi flow sitometri ile tespit edilmiş olup, pro-anjiyojenik etkileri in ovo koryoallantoik membran (CAM) modelinde incelenmiştir. L-EPS, canlı bakteri ve sinbiyotiğin in vitro yara modelinde yara iyileşmesini hızlandırdığı (*p<0,05), L929 hücrelerinde COL1A1 oluşum düzeyini ve gen ekspresyonunu arttırdığı saptanmıştır (*p<0,05). Uygulamalar içerisinde L-EPS ve sinbiyotiğin TGF-β1, Smad2, Smad3 ve Smad4 genlerinin ekspresyonunu arttırarak TGF-β1/Smad sinyal yolağı üzerinde etkili olduğu tespit edilmiştir (*p<0,05). Bununla birlikte, TNF-α ile indüklen L929 hücrelerinde L-EPS, canlı bakteri ve sinbiyotiğin artan interlökin 1 beta (IL-1β), interlökin 6 (IL-6) ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) gen ekspresyonlarını düşürerek, anti-inflamatuar etki gösterdikleri belirlenmiştir (*p<0,05). Ayrıca, L-EPS, canlı bakteri ve sinbiyotiğin hem sağlıklı hem de TNF-α ile indüklenen L929 hücrelerinde proliferatif etkiye sahip olduğu görülmüştür (*p<0,05). İn ovo CAM modelinde ise hem L-EPS hem de sinbiyotiğin pro-anjiyojenik etki gösterdikleri saptanmıştır (*p<0,05). L. plantarum GD2 suşunun, bu suştan elde edilen L-EPS'nin ve sinbiyotiğin yara iyileşme fazlarında farklı mekanizmalar ile çok yönlü iyileştirici etkilerinin olduğu belirlenmiştir. Çalışmalarda, L-EPS ve sinbiyotik uygulamaları birçok mekanizmada öne çıkmıştır. Sonuç olarak, etki mekanizması ortaya konmuş canlı probiyotik bakterinin, probiyotik kaynaklı L-EPS'nin ve sinbiyotiğin yara iyileşmesinde etkili ajan olabilme potansiyelleri bulunurken, buna ilaveten L-EPS'nin yara iyileştirici biyomalzeme geliştirilmesinde kullanılabilme potansiyeli de bulunabilir.

Abstract:
Skin wounds are one of the major health problems that reduce the quality of life and might result in amputation and death. The insufficiency and severe side effects of the products used in the clinic for wound healing have prompted researchers to discover novel therapeutic agents and biomaterials. The purpose of this master's thesis research is to determine the effects of probiotic Lactobacillus plantarum GD2 strain, lyophilized exopolysaccharide (L-EPS) obtained from this strain, and synbiotic (combination of live bacteria and L-EPS) on various phases of wound healing. While determining the effects of the treatments on fibroblast migration with in vitro wound model created in L929 mouse fibroblasts, collagen type 1 alpha 1 (COL1A1) and fibronectin (FN) levels were determined by ELISA method, and mRNA expression levels were determined by qRT-PCR. Modulatory effects of treatments on 4 genes associated with transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1)/Smad signaling pathway and effects on genes related to wound inflammation in tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)-induced L929 cells were determined by qRT-PCR. Flow cytometry was used to determine the proliferative effects of the treatments in L929 cells, and the pro-angiogenic effects were examined using the in ovo chorioallantoic membran (CAM) model. It was found that L-EPS, live bacteria, and synbiotic accelerated wound healing in in vitro wound model (*p<0.05), and increased the production level and mRNA expression of COL1A1 in L929 cells (*p<0.05). It was determined that L-EPS and synbiotic are efficient on TGF-β1/Smad signaling pathway by increasing the expression of TGF-β1, Smad2, Smad3 and Smad4 genes in the conducted treatments (*p<0.05). It was further detected that L-EPS, live bacteria and synbiotic showed anti-inflammatory effects by down-regulating the increased interleukin 1 beta (IL-1β), interleukin 6 (IL-6) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene expressions in TNF-α-induced L929 cells (*p<0.05). In additionally, L-EPS, live bacteria and synbiotic were found to have proliferative effect on both healthy and TNF-α-induced L929 cells (*p<0.05). L-EPS and synbiotic were both shown to exert pro-angiogenic effects in in ovo CAM model (*p<0.05). L. plantarum GD2 strain, as well as both L-EPS and synbiotics produced from this strain, have multifaceted healing effect, including several mechanisms in the wound healing phases. L-EPS and synbiotic applications came to the fore in studies on many wound healing mechanisms. In conclusion, probiotic bacteria, probiotic-obtained L-EPS, and synbiotic have the potential to be an efficient agent in wound healing, and moreover, L-EPS may have the potential to be used in the development of wound-healing biomaterials.