In vitro koşullarda oral anti-diyabetiklerin glikoz metabolizması ve genetiği üzerine etkilerinin incelenmesi
Evaluation of the effects of oral anti-diabetics on 
glucose metabolism and genetics
Yazar: MELİHA KOLDEMİR GÜNDÜZ
Danışman: PROF. DR. BELGİN SÜSLEYİCİ DUMAN
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Antidiyabetikler =   ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
3T3-L1 adiposit, AML12 hepatosit ve adiposit-hepatosit ko-kültürlerinde oral
anti diyabetik ilaç etken maddelerinin (glipizid, akarboz, metformin) insülin
sinyalizasyonunda değişikliğe neden olabilecek, adipogenik süreçte etkili olan ve
fonksiyonları henüz bilinmeyen ve şişmanlıkla ilişkili olan FTO, CD68, NIBAN ve
RAN genlerinin anlatımlarını ne yönde değiştirdiğini ve hücrelerin çoğalma
aktivitelerini nasıl etkilediğinin detaylı olarak araştırılması ve kullanılan oral
antidiyabetik ilaç etken maddelerinin hücrelerde oluşturduğu oksidatif stres ve gen
anlatımı arasındaki ilişkinin belirlenmesi amaçlandı.
Hücre çoğalması, iCELLigence sistemi tarafından gerçek zamanlı olarak
incelendi ve 15 dk'lık periyotlarda 96 saat boyunca ölçüm alındı. Hücrelere uygulanan
oral antidiyabetik ilaç etken maddelerinin süreleri ve uygulama dozları IC50 değerine
göre gerçek zamanlı olarak tespit edildi. FTO, CD68 NIBAN ve RAN gen anlatımları
qPCR ile belirlendi. Oral antidiyabetik ilaç etken maddelerinin hücrelerdeki toplam
protein miktarları, malondialdehit düzeyleri, glutatyon seviyeleri ve katalaz enzim
aktivitesi spektrofotometrik yöntemler kullanılarak belirlendi. Protein anlatımının
kantitatif olarak belirlenmesi western blot yöntemi ile yapıldı.
Glipizid ve akarboz uygulanan ko-kültür dozları ile tekli kültür dozları
karşılaştırıldığında 24. saatteki IC50 değeri sırasıyla, adipositlerde 180μM, 17 mg/ml;
hepatositlerde 72 μM, 23 mg/ml ve ko-kültür hücrelerinde 41.5 μM, 5 mg/ml olarak
belirlendi. Tekli kültürlerde metformin uygulamada 24. saatteki IC50 değeri
adipositlerde 175 mM ve hepatositlerde 2.3 mM olarak saptandı.
Glipizid uygulanan hücrelerde FTO gen anlatımı ko-kültür hepatosit hücreleri
dışında diğer gruplarda azaldı. Glipizid uygulanan hücrelerde CD68 anlatımı ko-kültür
hepatosit hücreleri dışında diğer gruplarda azaldı. Glipizid uygulaması sonucunda
adiposit hücrelerindeki NIBAN gen anlatımı artarken ko-kültür adiposit hücrelerinde
NIBAN gen anlatımı azaldı. Glipizid uygulaması sonucunda RAN gen anlatımı kokültür
hepatositlerde susturulurken diğer gruplarda arttı. Metformin uygulanan
hücrelerde FTO, CD68, NIBAN ve RAN gen anlatımı tüm gruplarda azaldı. Akarboz
uygulanan hücrelerde FTO ve CD68 gen anlatımları tüm gruplarda azaldı. Akarboz
uygulanan hücrelerde adipositlerde NIBAN gen anlatımı azalırken ko-kültür
adipositlerde NIBAN gen anlatımı arttı. Akarboz uygulanan hücrelerde RAN gen
anlatımı tüm gruplarda arttı.
Ko-kültürde ilaç dozları tekli kültürlere göre daha düşük tespit edilmesi, söz
konusu dozların kişiye özel olarak belirlenmesi ile yüksek dozla tedavi etmek yerine
uygun dozda kişiye daha fazla zarar vermeden tedavi edilebileceğini göstermektedir.
Hücrelerde glipizid, metformin ve akarbozun CD68 ve FTO gen anlatımları üzerine
düşürücü etkisi, inflamasyon ve obezitede koruyucu etkiye sahip olabileceğini
gösterebilir. Glipizid ve akarboz uygulanmış insülin dirençli olgun adipositlerde
NIBAN geninin anlatımının yüksek olması antiapoptotik etkiye ve RAN gen
anlatımının yüksek olması ise glikoz homeostazında düzenleyici etkiyi sahip olduğunu
gösterebilir. Metformin uygulaması sonucunda adiposit, hepatosit ve karaciğer
yağlanmasının modellendiği hücrelerde RAN geninin anlatımının azalması metfrominin
azalmış glikoz homeostazının düzenleyici faaliyetlerini yansıtabilir.

Abstract:
In 3T3-L1 adipocytes, AML12 hepatocytes and adipocyte-hepatocyte cocultures,
the active substances of oral anti-diabetic drugs (glipizide, acarbose,
metformin), how they effect the cells reproduction activities and how they change the
expressions of FTO, CD68, NIBAN, and RAN genes which could change insulin
signalization, also be effective in the adipogenetic process, have unknown functions and
related to obesity - and to determine the effects of anti-diabetic drugs in a detailed
research on the relation between oxidative stress and gene expression is aimed.
Cell proliferation was examined real time with iCELLigence system and
measured for 96 hours each 15 min period. The time and amount of active substances of
the oral anti-diabetic drugs which were applied to cells were determined real time
according to IC50 value. FTO, CD68 NIBAN and RAN gene expressions were
determined with qPCR. The amounts of total protein, malondialdehyde levels,
glutathione levels and catalase enzyme activities as a response to oral anti-diabetic
drugs were determined by using spectrophotometric methods. The quantitative
determination of protein expression were performed by western blot method.
When single and multiple doses of glipizide and acarbose in co-culture's were
compared respectively, the 24 hour IC50 values were determined as 180 μM and 17
mg/ml in adipocytes; 72 μM and 23 mg/ml in hepatocytes, 41.5 μM and 5 mg/ml in coculture
cells. The application of metformin for 24 hour IC50 value in single culture was
determined as 175 mM in adipocytes and 2.3 mM in hepatocytes.
FTO gene expression was found to be decreased in the glipizide administered
cells, except for co-cultured hepatocyte cells. CD68 gene expression was found to be
decreased in the glipizide administered cells, except for co-cultured hepatocyte cells. As
a response to glipizide application, NIBAN gene expression was found to increase in
adipocytes cells, whereas decreased in the co-cultured adipocytes. As a result of
glipizide application, while the RAN gene expression in co-cultured hepatocyte was
silenced in other study groups it was increased. In the Metformin administered cells
FTO, CD68 and NIBAN gene expressions were decreased in all groups. In the acarbose
applied cells FTO and CD68 gene expressions were decreased in all groups. In the
acarbose applied cells while NIBAN gene expression was decreased in adipocytes, it
was fund to increase in co-cultured adipocytes. In the acarbose applied cells RAN gene
expression was found to increase in all groups.
When compared to single cultures, the low drug doses in co-cultures shows that
the doses that are determined, as proper doses less harmful, by determining specially
personalized dose can be used in treatment instead of using high doses. The decreasing
effects of glipizide, metformin and acarbose on CD68 and FTO gene expressions may
show the protective effect of drug on inflammation and obesity. In glipizide and
acarbose applied insulin resistant mature adipocytes, the NIBAN gene expression's high
levels may show antiapoptotic effect and as to RAN gene expression's high levels may
show it's regulatory effect in glucose homeostasis. In the result of apply, in the
adipocyte, hepatocyte and liver fat modelled cells as a response to metformin, the
decrease of RAN gene expression may reflect the decrease in regulatory effect of
metformin over glucose homeostasis.