Doğal sığır tüberkülozu'nda akciğer ve ilgili lenf düğümlerindeki granülomların patomorfolojik ve immunohistokimyasal yapısı
Pathomorphological and immunohistochemical structure of granulomas in lung and related lymph nodes in natural bovine tuberculosis
Yazar: ÖZGÜR ÖZÖNER
Danışman: PROF. DR. SEVİL VURAL
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Patoloji = Pathology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Hayvan hastalıkları = Animal diseases ; Patoloji = Pathology ; Sığır hastalıkları = Cattle diseases ; Sığırlar = Cattles ; Tüberküloz = Tuberculosis ; Tüberküloz-bovine = Tuberculosis-bovine ; İmmünite = Immunity ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Çalışmada doğal sığır tüberkülozunda oluşan granülomların yapısının, patomorfolojik ve immunohistokimyasal olarak detaylı araştırılması amaçlanmıştır. Özellikle elde edilen immunohistokimyasal yöntemlerin sonuçlarına göre immunite tipi hakkında bilgi edinmek, etkin hücre tiplerini saptamak ve ileri dönük tedavi yöntemlerine yönelik araştırmalara katkı sağlanması hedeflenmiştir. 
Çalışmanın materyali özellikle Ankara ve çevre illerin mezbahalarında, sığır tüberkülozu hastalığı nedeniyle kesime gelen ve lezyon görülen 100 adet sığırın akciğer ve mediastinal lenf düğümleri oluşturdu. Farklı dönemlerde kesilen sağlıklı 5 adet besi sığırının akciğer ve mediastinal lenf düğümleri ise kontrol grubu olarak alındı. Makroskobik incelemeler sonucu 93 adet prodüktif, 7 adet eksudatif tüberküloz tespit edildi. Mikroskobik incelemeler sonucu da prodüktif lezyonlar primer odak (n:16), primer kompleks (n:30) ve tam olmayan primer kompleks (n:47) olarak sınıflandırıldı. Ayrıca görülen granülomlar epiteloid hücre, dev hücre, nekroz ve kapsül kriterleri göz önüne alınarak mikroskobik olarak (I-IV. evre) evrelendirildi. Tüm lezyonlu örneklere histokimyasal olarak Hematoksilen-Eozin, Ziehl-Neelsen; immunohistokimyasal olarak da Myobacterium bovis, CD3, CD68, CD119, TNF-α, IL2, IL4, IL17, Lambda Chain, TLR4 antikorları kullanıldı. Konfokal mikroskobik incelemeler için 10 adet primer kompleks bulunan dokular, Mycobacterium bovis-IL4, Mycobacterium bovis-IL17, TNF-α-IL4, CD3-IL4 antikorları eşleştirilerek boyandı. Yapılan incelemelerde makroskobik olarak saptanamayan I. ve II. evre granülomların tamamı mikroskobik olarak saptandı. Etken varlığı için yapılan Ziehl-Neelsen ve immunohistokimyasal boyamalarda; Ziehl-Neelsen boyama olgularında pozitiflik %11 iken, immunohistokimyasal boyamalarda %100 bulunmuştur. İmmunohistokimyasal olarak aynı zamanda TLR4 pozitifliğinin yüksek olmasının antijenin tanınmasında etkin rol oynadığı düşünüldü. CD119 ve CD3'ün pozitifliği hayvanlardaki hücre aracılı immunite etkinliğini gösterirken; özellikle primer odaklarda saptanan Lambda Chain pozitifliği ise humoral immunitede artışı doğrulamıştır. Yapılan konfokal mikroskobi incelemelerinde de IL4 ve etken antijeni aynı hücrede tespit edilmiş, etken ve IL17 antijenleri farklı hücrelerde görülmüştür. 
Sonuç olarak sığır tüberkülozunda hastalığın kesin teşhisi için makroskobik, mikroskobik bulguların yeterli olabileceği (I ve II. evre granülomlar hariç), etken teşhisi için Ziehl-Neelsen boyamasının yeterli olmayıp, immunohistokimyasal yöntemlere başvurulması gerektiği, hastalığa karşı oluşan reaksiyonun makrofaj ve lenfositlerle oluşan hücresel immuniteyle ilgili olduğu, yapılan sitokin ve/veya kemokin boyamalarında da kazanılmış bağışıklıkta erken enfeksiyon dönemlerinde humoral bağışıklığın etkili olabileceği kabul edilmiştir.

Abstract:
In this study, it was aimed to investigate the structure of granulomas in natural bovine tuberculosis in detail with pathomorphological and immunohistochemical methods. In particular, the aim was to obtain information about the type of immunity according to results of immunohistochemical method, determine active cell types and contribute to researches on advanced treatment methods. 
The materials of this study included lungs and mediastinal lymph nodes with lesions of 100 animals, especially in the slaughterhouses of Ankara and its provinces, presented to slaughtering because of bovine tuberculosis disease. Lungs and mediastinal lymph nodes of 5 healthy beef cattle slaughtered at different times were taken as the control group. As a result of macroscopical examinations, 93 productive and 7 exudative tuberculosis were detected. Also in microscopical examination, productive lesions were classified as primary focus (n:16), primary complex (n:30), and incomplete primary complex (n:47). In addition, granulomas were staged microscopically (stages I-IV) considering presence of epitheloid cells, giant cells, necrosis and capsule. To all samples that have lesions, histochemically Hematoxylin-Eosin, Ziehl Neelsen stains were performed; immunohistochemically, Mycobacterium bovis, CD3, CD68, CD119, TNF-α, IL2, IL4, IL17, Lambda chain and TLR4 antibodies were used. For confocal microscopical examinations, 10 tissues with primary complex were stained with matching Mycobacterium bovis-IL4, Mycobacterium bovis-IL17, TNF-α-IL4, CD3-IL4 antibodies. In examinations, all stages of granulomas were detected microscopically including I. and II. stage granulomas which could not be detected macroscopically. In stainings for causative agent; positivity was 11% in Ziehl-Neelsen staining, but 100% in immunohistochemical staining of all cases. TLR4 positivity was also found to be high and it was thought to play an active role in the recognition of the antigen. While the positivity of CD119 and CD3 shows the efficiency of cell-mediated immunity in animals; Lambda Chain positivity, especially in primary foci, confirmed the increase in humoral immunity. In confocal microscopy examinations, IL4 and causative agent were detected in the same cells, where the agent and IL17 antigens were observed in different cells.

It was concluded that, macroscopical and microscopical findings may be sufficient for the definitive diagnosis of the disease in bovine tuberculosis (except for stage I and II granulomas), where Ziehl-Neelsen staining is not sufficient for diagnosis of causative agent and immunohistochemical methods should be performed, in addition to the results showing that the reaction against the disease is related to cellular immunity formed by macrophages and lymphocytes, and according to cytokine and/or chemokine stainings, humoral immunity may be effective in acquired immunity during the early infection periods.