Helicobacter pylori enfeksiyonu tanısı almış hastalarda helicobacter pylori varlığının ve klaritromisin direncinin PCR ve multipleks real time PCR ile araştırılması /
Yazar: AHMET MURAT YAVAŞ
Danışman: PROF. DR. ZİYACİBALİ AÇIKGÖZ
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Helicobacter enfeksiyonları = Helicobacter infections ; Helicobacter pylori = Helicobacter pylori ; Klaritromisin = Claritromycin ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis = Diagnosis ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Helicobacter pylori (H.pylori), en yaygın kronik bakteriyel enfeksiyon etkeni olup dünya nüfusunun yaklaşık yarısı bu bakteri ile enfektedir. Midede yerleşerek gastrit, peptik ülser ve gastrik kanser gibi önemli sağlık sorunlarına yol açan bu patojenin,  enfeksiyonun erken döneminde  örneklerden doğru ve hızlı bir şekilde tespit edilmesi, söz konusu hastalıklarla mücadelede en önemli ilk basamaktır. H.pylori enfeksiyonunun tanısında farklı üstünlüklere sahip invaziv ve non-invaziv çeşitli testler kullanılmaktadır. Son zamanlarda konvansiyonel testlere alternatif, hızlı ve güvenli sonuç veren moleküler mikrobiyolojik testler yaygın  kullanım alanı bulmaya başlamıştır. H.pylori ile mücadelede ikinci önemli basamak etkin tedavidir. Ne yazık ki te-davide kilit antibiyotik kabul edilen klaritromisine karşı giderek artan direnç ve buna bağlı düşük eradikasyon başarısı oranları daha sık gözlenir olmuştur. Bu bağlamda standart tedavi kılavuzları, tedavi rejimi belirlenirken bölgedeki klaritromisin direnç prevelansının göz önünde bulundurulmasını şart koşmaktadır. Direnç araştırmasında kullanılan, kültüre dayalı agar dilüsyon ve gradiyent testi gibi fenotipik yöntemlerin zorluğu zaman alıcı olmaları gibi kısıtlılıklar bunlara da alternatif, farklı duyarlılık ve özgüllükte moleküler yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır.

Çalışmamızda öncelikle; 49 taze, 132 parafinize gastrik biyopsi örneğinde polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve multipleks gerçek zamanlı PCR (M.Rt-PCR)  yöntemlerinin H.pylori saptama etkinlikleri, histopatolojik inceleme (HPİ) sonuçlarıyla karşılaştırılmıştır.  Buna ek olarak aynı örnek setinde M.Rt-PCR ve Sanger dizileme yöntemleri ile klaritromisin direnç varlığı ve bundan sorumlu peptidiltransferaz mutasyonları araştırılmıştır. Sonuçların değerlendirilmesinde Cochran Q testi, Bonferroni düzeltmeli McNemar testi ve Cohen'in Kappa uyum katsayısı kullanılmıştır.
HPİ (+) taze örneklerin PCR ile % 86'sı, M.Rt-PCR ile % 89'u pozitif bulunurken; HPİ (+) parafinize örneklerin PCR ile % 63'ü, M.Rt-PCR ile % 74'ü pozitif bulunmuştur. HPİ (-) taze örneklerde PCR ve M.Rt-PCR pozitifliği, sırasıyla % 33 ve % 41 iken HPİ (-) parafinize örneklerde bu oranlar % 0.0 ve % 6 olarak belirlenmiştir.
181 örneğin toplam sonuçlarında HPİ ile PCR ve Rt-PCR uyumu sırasıyla  % 75.14 ve %80.11 olarak belirlenmiştir. Gerçek uyuma ek olarak, tahmin olasılığının dahil edildiği kappa uyum katsayısı ise PCR için 0.485 (0.067), Rt-PCR için ise 0.551 (0.064) olarak hesaplanmış; her iki yöntemde de HPİ sonucu ile orta düzeyde uyum gözlenmiştir. Taze dokularda, karşılaştırılan üç yöntem arasında duyarlılık açısından istatistiki olarak anlamlı fark bulunmazken, parafinize dokularda HPİ, moleküler yöntemlere göre anlamlı derecede daha duyarlı bulunmuştur (p<0.05). Parafinize örneklerde Rt-PCR'nin de PCR'den daha duyarlı olduğu gözlenmiştir (p< 0.05).

Moleküler inceleme sonucu pozitif bulunan toplam 102 örneğin 12'sinde (%11.76) klaritromisin direnci saptanmıştır. M.Rt-PCR kiti ile elde edilen klaritromisin direnç sonuçları Sanger dizileme ile bire bir uyumlu bulunmuştur.  Dirençten sorumlu mutasyonlar 11 örnekte A2143G (% 92), bir örnekte A2142G (% 8) olarak belirlenmiştir.

Sonuç olarak, taze gastrik biyopsi örneklerinde H.pylori araştırılmasında, uygun şekilde optimize ve valide edilmiş PCR ve Rt-PCR'nin HPİ kadar etkin ve doğru sonuçlar ürettiği, dolayısıyla rutin tanıda hızlı, güvenilir bir yöntem olarak kullanılabilecekleri; parafinize örneklerde ise bu iki yöntemin - Rt-PCR diğerinden nispeten üstün olsa da-  HPİ'ye göre daha düşük duyarlılığa sahip oldukları ve sonuçlarının ihtiyatla değerlendirilmesi gerektiği söylenebilir. Rt-PCR ile elde edilen direnç sonuçlarının Sanger dizileme ile bire bir uyum göstermesi de söz konusu yöntemin direnç tayininde -en azından pozitif sonuçları açısından- güvenle kullanılabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızda saptanan klaritromisin direnç oranı, hem kılavuzların antibiyogram şartı için belirlediği sınır olan %15'ten hem de ülkemizden bildirilen oranlardan (>%20) düşüktür. Bu sonucun gerçek durumu yansıtıp yansıtmadığı, kullanılan yön-temlerin saptayamadığı olası heterorezistans profillerine bağlı olup olmadığı daha geniş ölçekli araştırmalarla doğrulanmalıdır.

Abstract:
Helicobacter pylori (H. pylori) is the most common chronic bacterial infection agent, and about half of the world's population is infected with this bacterium. Accurate and rapid detection of this pathogen, which settles in the stomach and causes important health problems such as gastritis, peptic ulcer and gastric cancer, from samples in the early stages of infection is the most important and first step in the fight against these diseases. Various invasive and non-invasive tests with different advantages are used in the diagnosis of H.pylori infection. Recently, molecular microbiological tests, which provide fast and safe results as an alternative to conventional tests, have started to find widespread use. The second important step in the fight against H.pylori is effective treatment. Unfortunately, the increasing resistance to clarithromycin, which is considered a key antibiotic in treatment, and the associated low eradication success rates have become increasingly common. In this context, standard treatment guidelines stipulate that the prevalence of clarithromycin resistance in the region should be considered when determining the treatment regimen. The limitations of phenotypic methods such as culture-based agar dilution and gradient testing used in resistance research have led to the development of alternative molecular methods with different sensitivity and specificity.
In our study, first of all; The efficiencies of H.pylori detection with polymerase chain reaction (PCR) and multiplex real-time PCR (M.Rt-PCR) methods in 49 fresh, 132 paraffinized gastric biopsy samples were compared with the results of histopathological examination (HPI), which is said to be the gold standard in diagnosis. In addition, the presence of clarithromycin resistance and the peptidyl-transferase mutations responsible for it were investigated by M.Rt-PCR and Sanger sequencing methods plus BLAST analysis in the same sample set. Cochran Q test, Bonferroni corrected McNemar test and Cohen's Kappa coefficient of agreement were used to evaluate the results.
While 86% of HPI (+) fresh samples were positive by PCR and 89% by M.Rt-PCR; 63% of HPI (+) paraffinized samples were positive by PCR and 74% by M.Rt-PCR. In HPI (-) fresh samples, PCR and M.Rt-PCR positivity were 33% and 41%, respectively, and these rates were determined as 0.0% and 6% in HPI (-) paraffinized samples.
In the total results of 181 samples, HPI, PCR and Rt-PCR agreement were determined as 75%, 14% and 80.11%, respectively. In addition to the actual fit, the kappa fit coefficient, which included the prediction probability, was calculated as 0.485 (0.067) for PCR and 0.551 (0.064) for Rt-PCR and a moderate agreement was observed with the HPI result in both methods. While there was no statistically significant difference in sensitivity between the three methods compared in fresh tissues, HPI was found to be significantly more sensitive than molecular methods in paraffinized tissues (p<0.05). Rt-PCR was also observed to be more sensitive than PCR in paraffinized samples (p< 0.05).
Clarithromycin resistance was detected in 12 (11.76%) of 102 samples found positive by molecular examination. Clarithromycin resistance results obtained with the M.Rt-PCR kit were found to be perfectly compatible with Sanger sequencing. Mutations responsible for resistance were identified as A2143G (92%) in eleven samples and A2142G (8%) in one sample.
As a result, in the investigation of H.pylori in fresh gastric biopsy samples, appropriately optimized and validated PCR and Rt-PCR produce as effective and accurate results as HPI, so they can be used as a fast and reliable method in routine diagnosis. In paraffinized samples, it can be said that these two methods - although Rt-PCR is relatively superior to the other - have lower sensitivity than HPI and their results should be evaluated cautiously. The fact that the resistance results obtained by Rt-PCR are in perfect agreement with Sanger sequencing suggests that this method can be used safely in the determination of resistance, at least in terms of positive re-sults. The rate of clarithromycin resistance detected in our study is lower than the 15% limit determined by the guidelines for the antibiogram requirement, and the ra-tes reported in our country (>20%). Whether this result reflects the real situation and whether it is due to possible heteroresistance profiles that the methods used cannot detect should be confirmed by larger-scale studies.