Ovaryum ve endometriyum kanserlerinde kromozom düzensizlikleri ve sık rastlanan p53 geni 7. ekzon mutasyonlarının taranması
Chromosomal abnormalities and frequent p53 gene mutations seen in exon 7 in endometrial and ovarian carcinomas
Yazar: AYFER PAZARBAŞI
Danışman: PROF.DR. MÜLKİYE KASAP
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2004
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
ÖZET OVARYUM VE ENDOMETRIYUM KANSERLERİNDE KROMOZOM DÜZENSİZLİKLERİ ve SIK RASTLANAN P53 GENİ 7. EKZON MUTASYONLARININ TARANMASI* Organizmada tümör süpresör gen olarak bilinen p53 geni, hücre siklusunun kontrolünden sorumlu olan bir proteini kodlar. İnsan kanserlerinin yaklaşık %50 sinden p53 mutasyonlan sorumlu olduğundan malign insan kanserlerinin çoğunda p53 geni moleküler değişimlerin hedefi olmaktadır. Tüm kanser tipleri gibi, jinekolojik kanserlere de hücrelerin çoğalma, farklılaşma ve ölümlerini düzenleyen genlerde oluşan değişiklikler neden olmaktadır. Dolayısıyla p53'ün fonksiyon kaybı veya inaktivasyonuyla hücre proliferasyonunun kontrolü bozulacak, hücreler DNA hasan olsa bile canlı kalacak ve kontrolsuz çoğalmayı sürdürecektir.Toplam olarak 11 ekzon ve 393 tripletten oluşan p53 geninde nokta mutasy onlarının sıkça görüldüğü sıcak noktalar; 129-146, 171-179, 234-260 ve 270-287. tripletler arasında yoğunlaşmaktadır. Bu tripletler 5 ve 8. ekzonlar arasındaki bölgeyi içermektedir. Ovaryum ve endometriyum kanserlerinde görülen nokta mutasyonlan daha sık olarak 7. ekzonda (%46) ve özellikle 236 (%5.4), 238 (%5.4), 244 (%8.1), 248 (%19) ve 259 (%8.1) tripletlerinde yoğunlaşmaktadır. Tümörlerde moleküler değişiklikler olduğu gibi 3000-5000 kb'dan daha büyük bölgeleri etkileyen sitogenetik değişiklikler de mevcuttur. Birçok tümörde yüksek oranda kromozomal dengesizlik bulunmuştur. Çalışmamızda Ç.Ü. Tıp Fak. Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalına başvuran 23 hastanın ovaryum ve endometriyum karsinomlu dokusundan DNA 1ar izole edilerek, p53 geninin ovaryum ve endometriyal kanserlerde en sık mutasyona uğrayan 7. ekzonu PCR'la çoğaltıldı. p53 mutasyonlannı belirlemek amacıyla BspLUllI, Maeni, Ital, MspI ve Hinfl enzimleri kullanılarak RFLP (Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi) analizi uygulandı. Bunun yamsıra, kanserli ovaryum ve endometriyum dokularına ait örneklerden, primer hücre kültürü yapılarak metafaz alanları elde edildi ve kromozomlardaki değişiklikler sayısal ve yapısal yönden karakterize edildi. 12 endometriyum ve 11 ovaryum kanseri olgusuna ait PCR ürünlerinin BspLUllI enzimiyle kesimi sonucunda kodon 236'da 1; Ital enzimiyle kesimi sonucunda kodon 244'te 5 olguda heterozigotluk görüldü. MaelH, MspI ve Hinfl enzimleriyle kesim sonucunda kodon 238, 248 ve 259'da tüm olgularımızda herhangi bir mutasyon saptanmadı. Ovaryum gurubunda kodon 236'daki mutasyon, 11 olguda 1 (%9) oramnda bulundu. Kodon 244'teki mutasyon ise 11 olguda 5 (%45) oranında görüldü. Ovaryum gurubunda kodon 238, 248 ve 259'da; Endometriyum gurubunda ise çalışılan 5 kodonda da bilinen mutasyonlara rastlanmadı. XIIÇalışmamızda, ovaryum ve endometriyum kanseri sitogenetiğinde 3. kromozomdaki anomaliler birinci, 5. kromozomdaki anomaliler ikinci ve 1. kromozomdaki anomaliler üçüncü sırada yer aldı. Tümörigenez sürecinde ortaya çıkan primer değişimler olan ve o kanser tipi için tanısal öneme sahip marker olarak kullanılabilen klonal değişimler ovaryum kanseri olgularımızda; lq21, lq32, 3p25, 3qll, 5pl3, 5q31, 12pl0, 12ql2 ve 14ql3 bölgelerinde; endometriyum kanseri olgularımızda ise; lp21, lp22, lp32, lp36, lq21, lq31, lq32, 2pl3, 2qll, 2q21, 2q35, 3pl4, 3p21, 3p23, 3q21, 3q25, 4pl5, 4q21, 5pl5, 5q22, 5q31, 6q21, 7q21, 7q22, 9q22, 9q34, 10pl3, llpl5, llq23, llq24, 12pl2, 12pl3, 12ql3, 12q24, 13ql4, I3q22, 16pl3, 17pl2, 17q21, 21pl3, Xq26 ve Xq27 bölgelerinde gözlendi. Ayrıca kanser kırılma noktaları ve frajil bölgelerden lq21, lq32, 3p21, 7q22 ve llq23 bölgeleri ovaryum kanseri ve lp36, lq32, 2pl2, 3p21, 7q22, 9q34, llpl5, llq23, 12ql3, 14qll, 14q32, 16pl3 ve 21q22 bölgeleri de endometriyum kanseri olgularımızda gözlenmiştir. Bu kanser tipleri ile ilişkili aday genler araştırılırken bu bölgelere özel önem verilmesi gerektiği düşünülmektedir. Çalışmamızda ovaryum ve endometriyum kanserlerinde belirlenen kromozomal klonal değişimler, bu kanserlerin gelişiminde rol oynayan major genlerin kromozom lokalizasyonlarının araştırılmasında yol gösterici olabilecektir. Anahtar Sözcükler: Endometriyum kanseri, Kanser sitogenetiği, Mutasyon, Ovaryum kanseri, p53. XU1

Abstract:
ABSTRACT CHROMOSOMAL ABNORMALITIES AND FREQUENT P53 GENE MUTATIONS SEEN IN EXON 7 IN ENDOMETRIAL AND OVARIAN CARCINOMAS In organism p53 known as a tumor suppressor gene encodes a protein that controls the cell cycle. In majority of human malignancies, p53 is the target of molecular alterations as approximately 50% of human cancers are related to mutations of this gene. The causation factors, such as alterations in the genes which regulate the proliferation, differentiation and cell death are the same in all types of the cancers as well as the gynecological neoplasms. So that, loss of function or inactivation of p53 will upset the control of cell proliferation and the cells with DNA damage will survive and proliferate in an uncontrollable manner. The tumor suppressor gene p53 is located at chromosome region 17pl3 and is composed of 11 exon and 393 triplets m total. Majority of hot spots are focused on between triplets of 129-146, 171-179, 234- 260 and 270-287. These triplets include the sites between exon 5 and 8. The mutations in ovarian and endometrial cancers are more frequently seen in exon 7 (46%), especially at the triplets of 236 (5.4%), 238 (5.4%), 244 (8.1%), 248 (19%) and 259 (8.1%). However, along with molecular alterations, the presence of cytogenetic alterations affecting greater regions about 3000 to 5000 kb is a common occurence in tumor tissues. Chromosomal imbalance has also been found at high rate in most of the tumors. In our study, 23 DNA samples isolated from ovarian and endometrial cancer tissues which were obtained from patients who hospitalized at University of Çukurova, Medical Faculty, Department of Obstetrics and Gynecology. Exon 7 of p53 gene which frequently mutated in ovarian and endometrial cancers was amplified from 23 DNA samples. BspLUllI, MaeDT, Ital, Mspl and Hinfl restriction enzymes were used to determine p53 gene mutations at the points 236, 238, 244, 248 and 259 respectively by RFLP (Restriction Fragment Polymorphism) analysis. Metaphases were also obtained from cultured cancer tissues (described above) for characterization of structural and numerical chromosomal alterations. Hetrozygosity was seen in 1 case of 11 ovarian cancer (%9) at triplet 236 by BspLUllI digestion and in 5 case of 11 ovarian cancer (%45) at triplet 244 by Ital digestion. In all cases no mutations were observed at triplets 238, 248 and 259 by MaeDJ, Mspl and Hinfl digestion. No evidence of mutations were seen at triplets 238, 248 and 259 in ovarian cases and at all 5 triplets in endometrial cases analyzed for known mutations. In our cytogenetic studies performed on ovarian and endometrial cancers, abnormalities were seen most frequently on chromosome 3 then on chromosome 5 and then on chromosome 1. Clonal alterations occuring during tumorigenesis are used as a xivmarker having a diagnostic importance. These alterations are observed at lq21, lq32, 3p25, 3qll, 5pl3, 5q31, 12pl0, 12ql2, 14ql3 regions in ovarian cancer cases and at lp21, lp22, lp32, lp36, lq21, lq31, lq32, 2pl3, 2qll, 2q21, 2q35, 3pl4, 3p21, 3p23, 3q21, 3q25, 4pl5, 4q21, 5pl5, 5q22, 5q31, 6q21, 7q21, 7q22, 9q22, 9q34, 10pl3, llpl5, llq23, llq24, 12pl2, 12pl3, 12ql3, 12q24, 13ql4, 13q22, 16pl3, 17pl2, 17q21, 21pl3, Xq26, Xq27 regions in endometrial cancer cases. The cancer breakpoints and fragile sites were also investigated in ovarian (lq21, lq32, 3p21, 7q22, llq23) and endometrial (lp36, lq32, 2pl2, 3p21, 7q22, 9q34, llpl5, llq23, 12ql3, 14qll, 14q32, 16pl3, 21q22) cases. We thought that, the clonal chromosomal alterations observed in the ovarian and endometrial cases may lead to find the chromosomal locations of the major genes that play an important role in progression of these malignancies. Key words: Endometrial cancer, Cytogenetics of cancer, Mutation, Ovarian cancer, p53. XV