Astenozoospermik hastalarda sperm proteomik yapısı ve bu olgularda antioksidan gıda desteğinin spermin proteomik yapısına ve semen parametrelerine etkisi: plasebo kontrollü çift kör randomize çalışma
Sperm proteomic profile in asthenozoospermic patients and the effect of antioxidant dietary support on sperm proteomic profile and semen parameters: a placebo-controlled double-blind randomized study
Yazar: NACİ BURAK ÇINAR
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA MELİH ÇULHA
Kocaeli Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Üroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Üroloji = Urology
Dizin: Oligoastenozoospermi = Oligoasthenozoospermia

Özet:
Giriş ve Amaç:  
Erkek infertilitesinin yaygın nedenlerinden biri olan astenozoospermide, sperm hareketinin bozulmasına yol açan moleküler mekanizmalar bugüne kadar ayrıntılı olarak ortaya konulamamıştır. Gerçekleştirilen bu klinik çalışmanın amacı, astenozoospermik infertil erkek hastaların sperm proteomik profilini incelemek ve tedavide sıklıkla kullanılan antioksidanların sperm proteomu üzerindeki etkilerini moleküler düzeyde incelemektir. Ayrıca, antioksidan tedaviye yanıt veren ve yanıt vermeyen hastaların moleküler karakterlerini ortaya koyarak, tedavi stratejilerinin belirlenmesinde antioksidan tedaviye uygun bireyleri ayırt edebilecek hedef biyobelirteçlerin saptanması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntemler:
Kliniğimize Mayıs 2023 ve Ağustos 2023 tarihleri arasında başvuran 30 astenozoospermik infertil ve 10 normozoospermik fertil olgu çalışmaya dahil edilmiştir. Ardından astenozoospermik hastalar bilgisayar destekli randomizasyon ile antioksidan (A Grubu) ve plasebo (B Grubu) gruplarına ayrılmıştır. Her iki gruba üç ay boyunca sabah ve akşam olmak üzere tedavi uygulanmıştır. Hastalardan tedavi öncesi ve sonrası alınan semen örneklerinden gradyan tamponlar yardımıyla yapılan santrifüj sonrası elde edilen sperm hücreleri -80ºC'de bekletilip kullanım zamanında protein özütleri hazırlanmıştır. Elde edilen protein örneklerinden eşit miktarda alınarak örneklem havuzu oluşturulmuş ve bu özütlerden peptit örnekleri hazırlanarak LC-MS/MS analizleri gerçekleştirlmiştir. Analizler sonucunda elde edilen ve aralarında anlamlı farklılık gözlenen proteinlerin biyoinformatik analizleri STRING aracı kullanılarak gerçekleşirilmiştir.
Bulgular:
Antioksidan tedavi sonrası semen analizinde toplam motilite ve progresif motilitede istatistiksel olarak anlamlı artış gözlenirken (p=0,005), plasebo verilen olgularda ise anlamlı bir değişiklik izlenmemiştir. Her iki grupta semen hacmi ve sperm sayısı parametrelerinde anlamlı değişiklik olmamıştır (p>0,05). LC-MS/MS analizleri sonucunda toplamda 1068 insan spermatozoa proteini tanımlanıp değerlendirilmiştir. Antioksidan tedavi uygulanan olgularda sperm kapasitasyonu, flagellum ve silyum yapısı, spermatid gelişimi ve spermatogenez ilişkili proteinlerin aşırı eksprese olduğunu ortaya çıkarırken gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz, asil-fosfataz aktivitesi, desmozom yapısı, hidrojen peroksit katabolik süreci, oksijen taşıma ve bağlama aktivitesi yolaklarına ilişkin proteinlerin ekspresyonunda azalma olduğu gösterilmiştir. Antioksidan grubunda tedaviden fayda gören 10 hasta ile fayda görmeyen 5 hastanın proteomik profilleri karşılaştırıldığında ara filament organizasyonu, doku gelişimi, epitel hücre farklılaşması ve oksidatif strese yanıt yolakları ile ilişkili proteinlerin tedaviden fayda gören hastalarda aşırı eksprese olurken hücresel makromolekül metabolik süreci, nükleik asit bağlanması, aerobik elektron taşıma zinciri, mitokondri ATP sentezi, NADH dehidrogenaz aktivitesi, yağ asidi beta oksidasyonu, çekirdeğe protein alımı, aksonem yapısı, protein katlanması, aerobik solunum, hücresel solunum, öncü metabolitlerin ve enerjinin üretilmesi ile ilişkili proteinlerin tedaviden fayda görmeyen hastalarda aşırı eksprese olduğu gösterilmiştir. Grupların toplam protein profil verilerine göre elde edilen PCA plot analizinde ve proteomik ısı haritası analizinde verilen antioksidan tedavi sonucu astenozoospermik bireylerde protein profilinin sağlıklı fertil kontrol grubuna benzerliğinin arttığı gözlemlenmiştir.
Sonuç:
Bu çalışmada, astenozoospermik infertil erkeklerde antioksidan tedavinin sperm motilitesi üzerindeki iyileştirici etkileri, karşılaştırmalı semen ve proteomik analizlerle gösterilmiştir. Mevcut çalışmanın devamında, antioksidan tedaviye yanıt veren ve vermeyen gruplar arasında anlamsal farklılık gösteren proteinlerin olduğu görülmüştür. Bu proteinlerin hastalığın tedavi stratejilerinin ve yaklaşımlarının geliştirilmesinde önemli biyobelirteç potansiyelleri olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle aday biyobelirteçlerin western blot analizleri ile doğrulanması planlanmaktadır. Yapılması planlanan doğrulama testleri ve sonrasında çalışmanın genişletilmesiyle elde edilecek çıktılar ile hastalığın daha iyi anlaşılması, biyobelirteç panellerinin geliştirilmesi ve astenozoospermik infertil erkek hastaların klinik açıdan daha doğru anlaşılması ve değerlendirilmesi konularında literatüre önemli katkılar sağlayacağımızı düşünmekteyiz.

Abstract:
Introduction:
In asthenozoospermia, a common cause of male infertility, the molecular mechanisms leading to impaired sperm motility have not been elucidated in detail to date. The aim of this clinical study is to examine the sperm proteomic profile of asthenozoospermic infertile male patients and to investigate the effects of commonly used antioxidants on the sperm proteome at the molecular level. Additionally, by elucidating the molecular characteristics of patients who respond to antioxidant therapy and those who do not, this study aims to identify target biomarkers that can distinguish individuals suitable for antioxidant therapy in the determination of treatment strategies.
Materials and Methods: 
Thirty asthenozoospermic infertile and ten normozoospermic fertile cases, who presented to our clinic between May 2023 and August 2023, were included in the study. Subsequently, the asthenozoospermic patients were divided into antioxidant (Group A) and placebo (Group B) groups through computer-assisted randomization. Both groups received treatment twice daily, in the morning and evening, for three months. Semen samples were collected from the patients before and after treatment. After centrifugation using gradient buffers, sperm cells obtained from these samples were stored at -80ºC until protein extraction was performed. Equal amounts of protein from each sample were pooled to create a sample pool, and peptide samples were prepared from these extracts for LC-MS/MS analyses. Bioinformatics analyses of the proteins showing significant differences were performed using the STRING tool.
Results:
Following antioxidant treatment, a statistically significant increase in total motility and progressive motility was observed in the semen analysis (p = 0.005), whereas no significant changes were noted in the placebo group. Additionally, no significant changes were observed in semen volume and sperm count parameters in either group (p > 0.05). LC-MS/MS analyses identified and evaluated a total of 1068 human spermatozoa proteins. The analyses revealed that proteins associated with sperm capacitation, flagellum and cilium structure, spermatid development, and spermatogenesis were overexpressed in cases receiving antioxidant treatment. Conversely, there was a decrease in the expression of proteins related to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, acyl-phosphatase activity, desmosome structure, hydrogen peroxide catabolic process, and oxygen transport and binding activity pathways.
When comparing the proteomic profiles of 10 patients in the antioxidant group who benefited from treatment with those of 5 patients who did not benefit, proteins associated with intermediate filament organization, tissue development, epithelial cell differentiation, and oxidative stress response pathways were overexpressed in patients who benefited from treatment. On the other hand, proteins related to cellular macromolecule metabolic processes, nucleic acid binding, aerobic electron transport chain, mitochondrial ATP synthesis, NADH dehydrogenase activity, fatty acid beta-oxidation, protein uptake into the nucleus, axoneme structure, protein folding, aerobic respiration, cellular respiration, and production of precursor metabolites and energy were overexpressed in patients who did not benefit from treatment.
In the PCA plot analysis and proteomic heat map analysis based on the total protein profile data of the groups, it was observed that the protein profile similarity of asthenozoospermic individuals to the healthy fertile control group increased as a result of the antioxidant treatment administered.
Conclusions: 
In this study, the beneficial effects of antioxidant therapy on sperm motility in asthenozoospermic infertile men were demonstrated through comparative semen and proteomic analyses. Further analysis revealed significant differences in proteins between groups that responded to antioxidant therapy and those that did not. These proteins are considered to have significant biomarker potential for the development of treatment strategies and approaches for the disease. Therefore, the validation of candidate biomarkers through western blot analyses is planned. We believe that the planned validation tests and the subsequent expansion of the study will significantly contribute to the literature by providing a better understanding of the disease, developing biomarker panels, and enabling a more accurate clinical understanding and assessment of asthenozoospermic infertile male patients.