Kronik hepatit C enfeksiyonunda rol oynayan hücreler arası mikroRNA'ların saptanması
Investigation of circulating microRNAs playing role in chronic hepatitis C infection
Yazar: SARA ALTUNTAS
Danışman: PROF. DR. A. MİTHAT BOZDAYİ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Hepatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Hepatit C = Hepatitis C ; Hepatit C virüsü = Hepatitis C virus ; Mikro RNA = Micro RNA ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İnterlökin 28 = Interleukin 28

Özet:
Hepatit C virüsü (HCV) kronik hepatit, siroz ve hepatosellüler karsinomanın önde gelen nedenidir ve dünya nüfusunun% 3 üzerinde etkiler. Pegile-interferon ve ribavirin HCV`nin mevcut standart tedavi yöntemidir. Son çalışmalar, IL28B upstream bölgesinde bulunan rs12979860 ve rs8099917'nin HCV tedavisine yanıt ile ilişkili olduğunu göstermiştir. mikroRNA (miRNA)`lar veya bastırma çeviri gen ekspresyonunu mRNA'yi degrede ederek yada traslasyonu bakılayarak regüle eden endojen, küçük, kodlamayan RNA molekülleridir. miRNA'lar hücrelerin içinde bulunduğu gibi aynı zamanda HCV hastalığının biyobelirteci olarak kullanılmak üzere bir avantaj sağlayabilecek özelliği olan ekstrasellüler sıvılarda da bulunur. Bu çalışmada miRNA'ların IL-28B ekspresyonunda yer alıp almadığı ve HCV enfeksiyonunu atlatmanın bir göstergesi olup olamayacağı soruları ele alındı.IL-28B mRNA'yı tahmini hedef alan miRNA'lar IL28B regülasyonundaki fonksiyonları için reporter analizler ile incelendi. Hepatit C tedavisi sırasında her 80 hastanın serum örneklerinin karakteristik özelliklerini bilmek için IL28B SNP analizi ve miR-122 serum düzeyleri incelendi. Ayrıca, ikisi kronik hepatit geliştirmiş ve diğer ikisi iyileşmiş dört şempanzenin serum örneklerinden miR-122 çalışıldı. KHC geliştiğini gösteren ek miRNA'ları keşfetmek için, aynı şempanze serum örnekleri kullanılarak gerçek zamanlı Array-PZR ile kapsamlı bir ekspresyon çalışması yapıldı. miRNA ekspresyon profillerinin sonuçları doğrulamak için biyoinformatik kullanıldı.Silika analizi ile IL-28B ekspresyonu ile etkileşimdeki potansiyel miRNA'lar olan miR-134 ve miR-877 tespit edildi. Sonrasında, lüsiferaz reporter vektörleri IL28B 3'UTR ve IL28B 877ORF bölgeleri için dizayn edildi ve HuH7 hücrelerine lipozom aracılı transfeksiyon ile aktarıldı. Sensör lüsiferaz ile kontrol edilen lüsiferaz reporter sistemi iyi çalıştı. mir-134 ılımlı bir bağlanma gösterdi. miR-134 reporter aktivitesi ılımlı şekilde baskılamasına rağmen, IL28B-UTR bölgesine bağlanması IL28B sentezi için önemli olmayabilir. Şaşırtıcı bir şekilde, miR-877 reporter ekspresyonunu pozitif olarak etkiledi. HCV ile enfekte hastalarda, yüksek SVR oranları rs12979860 CC ve rs8099917 TT motifi için sırasıyla % 46.2 ve% 75 idi. Hepatit C hastalarının miR-122 serum düzeyleri IFN tedavisine yanıt ile sıkı bir şekilde bağlı değildi. Ancak, 4 haftalık tedaviden sonra komple yanıt verenlerin miR-122 serum düzeylerinde bir düşüş eğilimi vardı. miR-122 ile IL28B genotipleri arasında herhangi bir ilişki tespit edilemedi. Şempanzelerin miR-122 serum düzeylerinde belirgin bir azalma vardı. Array-PZR sonrası, 24 miRNA tüm zaman noktalarında kronik hepatit gelişmiş iki şempanzede son derece artarken iyileşmiş diğer iki şempanzede düşük seviyelerde kaldı. Bu nedenle, daha iyi bir doğrulama için fazla sayıda serum örnekleri gerekli olmasına rağmen, bu çalışmadaki miRNA motifleri hepatit C enfeksiyonun kendiliğinden iyileşme veya terapötik sonucu işaret ediyor olabilirler. Ayrıca, sunulan veriler, ilaç yanıtı tahmin edebilen yeni biyobelirteçleri tanımlamak için daha ileri çalışmalarda ilk adım olarak kullanılabilir ve KHC hastaları için yeni anti-viral tedaviye de uygulanabilir.

Abstract:
Hepatitis C virus (HCV) is the leading cause of chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma and affects over 3% of the world's population. Pegylated interferon and ribavirin is the current standard treatment of HCV. Recent studies have shown that rs12979860 and rs8099917 lying on the upstream region of IL28B have been associated with HCV treatment response. microRNAs (miRNA) are endogenous non-coding small RNA molecules that regulate the gene expression by degrading mRNA or repressing translation. miRNAs are located inside the cells, and as well as in extracellular fluids, a characteristic that might be an advantage to use miRNA as a biomarker of HCV disease. In the present study the questions were addressed, if miRNA are involved in IL-28B expression and if they can serve an indicator of recovery from HCV infection.miRNAs putatively targeting IL-28B mRNA were studied for function in IL28B regulation by reporter assays. Analysis of IL28B SNP and serum levels of miR-122 were examined to know the characteristic features of serum samples of each 80 patients in response to treatment of hepatitis C. Additionally, miR-122 was studied in serum samples of four chimpanzees, two of them developed chronic hepatitis and two recovered. In order to discover additional miRNA indicating development of CHC, a comprehensive expression profiling was performed by Real Time Array-PCR using serum samples of the same chimpanzees. Bioinformatics was used to validate the results of miRNA expression profiles.In silico analysis identified miR-134 and miR-877 as putative miRNAs interacting with IL-28B expression. Luciferase reporter vectors were then constructed for IL28B 3`UTR and IL28B 877 ORF regions and assessed via liposome mediated transfection in HuH7 cells. Luciferase reporter system controlled by sensor luciferase worked well. miR-134 showed moderate binding. Although miR-134 moderately represses the reporter activity, its binding to the IL28B-UTR site may not be crucial for IL28B synthesis. Surprisingly, miR-877 effected reporter expression positively. In patients infected with HCV, high SVR Rates were 46.2% and 75% for rs12979860 CC and rs8099917 TT pattern respectively. Serum levels of miR-122 of patients with hepatitis C were not stringently dependent from the success of IFN therapy. However, there was a decrease trend of miR-122 serum levels in complete responders after 4 weeks of therapy. No association between IL28B genotypes with miR-122 was found. There was a marked decrease in miR-122 serum levels of chimpanzees. After array-PCR, 24 miRNAs were highly increased in both of two chimpanzees which developed chronic hepatitis at all time points, but occurred at low levels in the other two chimpanzees which recovered. Therefore, the miRNA pattern in this study might indicate spontaneous or therapeutical outcome of hepatitis C infection although additional validation on a high number of serum samples is essential. Moreover, the presented data can be used as the primary basic for further studies in order to define novel biomarkers to predict drug response and can also be applied to novel anti-viral therapy for CHC patients.