Bazı alabalık işletmelerindeki yavru gökkuşağı alabalığında (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) Flavobacterum psychrophilum bakterisinin belirlenmesi, fenotipik ve genotipik özelliklerinin araştırılması
Identification and investigation of phenotypic and genotypic characteristics of Flavobacterium psychrophilum in fry rainbow trouts (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) in some trout farms
Yazar: MİKAİL ÖZCAN
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA SARIEYYÜPOĞLU
Fırat Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Bu çalışma ile Elazığ ili Keban ilçesinde bulunan dört ayrı Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) işletmesindeki yavrularda Flavobacterium psychrophilum bakterisinin varlığı ile fenotipik ve genotipik özelliklerinin araştırılması hedeflendi. Bu amaçla, Aralık 2008 ve Temmuz 2009 tarihleri arasında alabalık işletmelerinden yumurta, döllenmiş yumurta, ovaryum sıvısı, sperm, gözlenmiş yumurta, keseli yavru, 5 gramdan küçük yavru, 5 gramdan büyük yavru, su ve yem örnekleri alındı.F. pyschrophilum izolasyonu için; Cytophaga Agar (CA), Cytophaga Broth (CB), Modified Anacker ve Ordal Agar (MAOA), Modified Anacker ve Ordal Broth (MAOB), Tryptone Yeast Extract Salt Agar (TYES-A), Tryptone Yeast Extract Salt Broth (TYES-B), Enriched Anacker ve Ordal + Fetal Bovine Serum+ Agar (EAO+FBS+A), Enriched Anacker ve Ordal + Fetal Bovine Serum + Broth (EAO+FBS+ B), Tryptone Yeast Salt Agar + Tobramycin (TYESA+ T) Tryptone Yeast Extract Fetal Bovine Serum (TYFBS) agarlar kullanıldı. Bu besiyerleri 15 oC'de 5?7 gün süreyle etüvde inkübe edildi. Üreyen saf sarı renkteki kolonilerin fenotipik özellikleri belirlendi. Ayrıca antibiyoğram duyarlılık testi disk difüzyon yöntemine göre yapıldı.İşletmelerden alınan 175 adet yumurta, 185 adet ovaryum sıvısı (2 ml'lik), 200 adet sperm (2 ml'lik) 185 adet povidin/iodin solüsyonuyla yıkanmış yumurta, 205 adet döllenmiş yumurta, 240 adet gözlenmiş yumurta, 510 adet keseli yavru, 400 adet 5 gramdan küçük yavru, 200 adet 5 gramdan büyük sağlıklı yavru alabalık dalağı, 200 adet 5 gramdan büyük sağlıklı yavru alabalık karaciğeri, 200 adet 5 gramdan büyük sağlıklı yavru alabalık böbreği, 200 adet 5 gramdan büyük sağlıklı yavru alabalık bağırsağı, 200 adet hastalıktan şüpheli ve yeni ölmüş yavru alabalık dalağı, 200 adet hastalıktan şüpheli ve yeni ölmüş yavru alabalık karaciğeri, 200 adet hastalıktan şüpheli ve yeni ölmüş yavru alabalık böbreği, 200 adet hastalıktan şüpheli ve yeni ölmüş yavru alabalık bağırsağı 120 adet yem ve 204 adet su örneği olmak üzere toplam 4024 adet örnek bakteriyolojik olarak incelendi. Bu örneklerde 160 adet (% 3,97) F. psychrophilum izole edildi. Bu suşların 18'i (% 10,28) yumurtadan, 13'ü (% 7,02) ovaryum sıvısından, 6'ı (% 3,24) povidin/iodin solüsyonuyla yıkanmış yumurtadan, 14'ü (% 6,82) döllenmiş yumurtadan, 14'ü (% 7,77) gözlenmiş yumurtadan, 13'ü (% 2,54) keseli yavrudan ve 15'i ise (% 3,75) 5 gramdan küçük yavrulardan izole edildi. Beş gramdan büyük sağlıklı yavruların dalağından 8 adet (% 4), karaciğerinden 5 adet (% 2,5), böbreğinden 4 adet (% 2) ve bağırsağından 1 adet (% 0,5) F. psychrophilum'un izolasyonu yapıldı. Yine 5 gramdan büyük hastalıktan şüpheli veya yeni ölmüş alabalık dalağından 17 adet (% 8,5), karaciğerinden 10 adet (% 5), böbreğinden 10 adet (% 5), bağırsağından 6 adet (% 3) ve işletmedeki sudan da 6 adet (% 2,94) F. psychrophilum izolasyon ve identifikasyonu yapıldı.Fenotipik ve biyokimyasal özellikler göre belirlenen 160 adet F. pyschrophilum suşunun Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) tekniğiyle doğrulanmasında iki farklı primer kullanıldı. Akabinde bu suşların tamamının moleküler olarak F.pyschrophilum olduğu teyit edildi.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile doğrulanan suşların Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) tekniği ile gen tiplendirmesi yapıldı. Bunun sonucunda dört ayrı yavru alabalık işletmesinden izole edilen suşların referans F. psychrophilum NCIMB 1947T ile yakın akraba olduğu tespit edildi.Antibiyotik disk sonuçlarına göre, F. psychrophilum suşları; Amoksisilin, Amoksisilin/Klavulanik asit, Amikasin, Ampisilin, Kloramfenikol, Sefazolin, Enoksasin, Optokin, Neomisin, Vankomisin, Sefoksitin, Nalidiksik Asit, Aztreonam, Linkomisin ve Trimetoprim (% 100); Penisilin ve Klindamisin (% 78,12); Ofloksasin ve Gentamisin (% 78,75); Eritromisin ve Sulfametoksazol (% 55,62) ile Furazolidone (% 15,62) gibi antibiyotiklere karşı direnç gösterdiği görüldü. F. psychrophilum; Eritromisin ve Sulfametoksazol (% 28,12); İmipenem (% 21,87); Nitrofurantin, Tobramisin ve Netilmisin (% 21,25); Seftriakson, Sefoperazon, Klaritromisin, Piperasillin, Basitrasin ve Trimetoprim + Sulfametoksazol (% 16,25); Penisilin ve Klindamisin (% 12,50) gibi antibiyotiklere de orta derecede duyarlı olduğu tespit edildi. Yine F. psychrophilum; Oksitetrasiklin, Florfenikol, Enrofloksasin ve Siprofloksasin (% 100) ile Furazolidone (% 84,37); Trimetoprim + Sulfametoksazol, Seftriakson, Sefoperazon, Klaritromisin ve Piperasilin (% 83,75); Tobramisin, Nitrofurantoin ve Netilmisin (% 78,75); İmipenem % 78,12; Streptomisin (% 77,5); Ofloksasin (% 21,25); Eritromisin ve Sulfametoksazol (% 16,25); Penisilin ve Klindamisin (% 9,37) antibiyotiklerine ise duyarlı olduğu belirlendi.Sonuç olarak bu çalışmada, Elazığ ili Keban ilçesindeki dört farklı işletmede F. psychrophilum etkenini taşıdığı tespit edildi. F. psychrophilum kültür yöntemiyle identifikasyonu 3 hafta sürerken, Polimeraz Zincir Reaksiyon tekniği ile 24 saat içerisinde yapıldı. Pulsed Field Gel Electrophoresis tekniği ile F. psychrophilum'un alt tiplendirilmesi başarılı bir şekilde gerçekleştirildi. Ancak F. psychrophilum'a bağlı enfeksiyon ve salgınların epidemiyolojisi daha iyi anlaşılması için Türkiye'nin farklı bölgelerinde izole edilen suşlar kullanılarak daha detaylı bilgi sağlanacağı düşünülmektedir.

Abstract:
In this study, it was aimed to identify and investigate phenotypic and genotypic charecteristics of Flavobacterium psychrophilum in four rainbow trout farms in Keban district of Elazığ province. For this purpose, eggs, fertilized eggs, ovarian liquid, sperm, eyed eggs, larvae with egg sac, fry under 5 g, fry over 5 g, water and food samples were collected.For isolation of Flavobacterium psychrophilum; Cytophaga Agar (CA), Cytophaga Broth (CB), Modified Anacker and Ordal agar (MAOA), Modified Anacker and Ordal Broth (MAOB), Tryptone Yeast Extract Salt Agar (TYES-A), Tryptone Yeast Extract Salt Broth (TYES-B), Enriched Anacker and Ordal + Fetal Bovine Serum+ Agar (EAO+FBS+A), Enriched Anacker And Ordal + Fetal Bovine Serum + Broth (EAO+FBS+ B), Tryptone Yeast Salt Agar + Tobramycin (TYESA+ T) Tryptone Yeast Extract Fetal Bovine Serum (TYFBS) agars were used. These media were incubated for 5-7 days at 15 oC and phenotypic characteristics of colonies pure yellow colour were identified. Antibiogram sensitivity test was also applied according to disk diffusion method.A total of 4024 samples; 175 eggs, 205 fertilized eggs, 185 eggs washed with povidin/iodin solution, 185 ovarian liquid (2 ml), 200 sperm (2 ml), 240 eyed eggs, 510 larvae with egg sac, 400 fry under 5 g, 200 spleen of healthy fry over 5 g, 200 liver of healthy fry over 5 g, 200 kidney of healthy fr fry over 5 g, 200 intestine of healthy fry over 5 g, 200 spleen of newly dead and suspicious from disease fry over 5g, 200 liver of newly dead and suspicious from disease fry over 5 g, 200 kidney healthy of newly dead and suspicious from disease fry over 5 g, 200 intestine of newly dead fry over 5 g and suspicious from disease, 120 food and 204 water samples obtained from fish farms were examined as bacteriologically. From these samples; 160 (3.97 %) Flavobacterium psychrophilum were isolated. 18 (10.28 %), 13 (7.02 %), 6 (3.24 %), 14 (6.82 %), 14 (7.77 %), 13 (2.54 %) and 15 (3.75 %) of these strains was isolated in eggs, ovarium liquid, eggs washed with povidin/iodin solution, fertilized eggs, eyed eggs, larvae with egg sac, and fry under 5 g respectively. 8 (4 %), 5 (2.5 %), 4 (2 %) and 1 (0.5 %) of Flavobacterium psychrophilum were isolated from spleen, liver, kidney and intestine of heallty fry over 5 g respectively. Again 10 (5 %), 10 (5 %), 6 (3 %) and 6 (2.94 %) of Flavobacterium psychrophilum were isolated from spleen, liver, kidney and intestine of healthy fry over 5 g and suspicious from disease and water of fish farms respectively.Two different primers were used to confirm 160 Flavobacterium psychrophilum with PCR after determined according to the phenotype and genotype characteristics. Subsequently, these strains were confirmed as Flavobacterium psychrophilum with DNA.Gene typing was performed with PFGE technique on strains confirmed with PCR. As a result of this, it was decided that strains obtained from four different fish farms wasclose relative with reference Flavobacterium psychrophilum NCIMB 1947T.According to the results of antibiotic disc, Flavobacterium psychrophilum strains showed strength against antibiotics; (78.75 %) Amoxicillin, Amoxicillin / Clavulanic Acid, Amikacin, Ampicilin, Chloramphenicol, Cefazolin, Enoxacin, Optochin, Neomicin, Vankomisin, Cefoxitin, Nalidixic Acid, Aztreonam, Linkomicin and Trimetoprim (100 %); Penicillin and clindamycin (78.12 %); Ofloxacin and gentamicin; (55.62 %) Erythromycin and Sülphamethoxazole (15.62 %) Furazolidone. It was detremined that Flavobacterium psychrophilum was moderately sensitive to antibiotics; (28.12 %) Erythromycin and Sulphamethoxazole; (21.87 %) Imipenem; (21.25 %) Nitrofurantoin, Tobramicin and Netilmicin; (16.25 %) Ceftriaxone, Cefoperazone, Clarithromycin, Piperacillin, Bacitracin and Trimethoprim+Sülphamethoxazole; (12.50 %) Penicillin and Clindamycin. Again, Flavobacterium psychrophilum was found sensitive to antibiotics; (100 %) Oxytetracycline, Florfenikol, Enrofloxacin and Ciprofloxacin; (84.37 %) Furazolidone; % (83.75 %) Trimethoprim+Sülphamethoxazole, Ceftriaxone, Cefoperazone, Clarithromycin and Piperacillin; (78.75 %) Tobramycin, Nitrofurantoin and Netilmicin; (78.12 %) Imipenem; (77.5 %) Streptomisin; (21.25 %) Ofloksasin; (16.25 %) Eritromisin and Sulphamethoxazole; (9.37 %) Penisilin and Klindamisin.Consequently, F. psychrophilum was determined in four fish farms in Keban district of Elazığ province. While the identification period of F. psychrophilum with culture method was taken three weeks, it was performed in 24 hours. Sub-typing of F. psychrophilum with Pulsed Field Gel Electrophoresis technique was performed successfully. However, it was thought that to well understand infection and epidemiology of F. psychrophilum, detailed information will be obtained by using strains isolated from different region of Turkey.