Metisilin dirençli staphylococcus aureus(MRSA)'dan elde edilen fajın karakterizasyonu ve faj komponenetlerini kullanarak in vitro rekombinant faj elde edilmesi
Characterization of phage obtained from methicilline resistant 
staphylococcus aureus (MRSA) and development of in vitro recombinant phage using phage components
Yazar: ÖZLEM ULUSAN
Danışman: PROF. DR. MEHMET KIYAN
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bakteriyofajlar = Bacteriophages ; Metisilin = Methicillin ; Mitomisin = Mitomycins ; Staphylococcus aureus = Staphylococcus aureus ; Staphylococcus phages = Staphylococcus phages ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Staphylococcus aureus hastane veya toplum kaynaklı enfeksiyonlara neden olabilen ve oldukça ciddi sonuçlar doğurabilen önemli bir patojen mikroorganizmadır. Çoklu ilaç dirençli S.aureus stafilokokal enfeksiyonların tedavisinde büyük zorluklar yaşanmasına neden olmaktadır. Mevcut olan bütün antimikrobiyallere dirençli S.aureus suşlarının ortaya çıkması ancak yeni antibiyotik bulunamaması araştırmacıları antibiyotiklerin keşfi ile popülerliğini kaybetmiş olan faj tedavisine yönlendirmiştir. Bu amaçla 1950 yıllarına kadar kullanılan fajlar temel olarak bakterinin direkt olarak ölmesini sağlayan litik özelliği olan fajlardır. Bu terapi yönteminin bakterilerin ani ölümüne bağlı olarak endotoksik şok gibi istenmeyen etkileri olduğu bilinmektedir. Rekombinant teknolojinin gelişimi içerisinde bakteri ölümünü kontrollü olarak sağlayan gen materyalleri bulunduran lizojenik rekombinant fajların oluşturulması fikrini ortaya çıkarmıştır. Bunun için manüplasyonu kolay küçük boylarda fajlara ihtiyaç duyulmaktadır. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı'nda Şahin ve ark.(2013) tarafından yapılan bir çalışmada MRSA suşlarından elde edilen fajlar incelendiğinde bir MRSA suşundan elde edilen, diğer fajlardan çok daha küçük boyutta lizojenik bir bakteriyofaj tesbit edilmiş ve MRSA φ sml (small) olarak adlandırılmıştır. Bu çalışmada lizojenik bakteriyofajın genom haritasının çıkarılması, fajlara ilişkin bilgi bankasına katkıda bulunulması ve genom haritası kullanılarak faj tedavisinde kullanılabilecek lizojenik rekombinant fajların oluşturulma potansiyelini araştırmak amacıyla elde dilen fajın tanımlanması amaçlanmıştır.
MRSA φ sml bulunduran suşun ekimi yapılmış, mitomisin C ile faj indüklenmesi ve ekstraksiyon işlemi gerçekleştirilmiş, Hind III enzimi ile kesildikten sonra oluşan insertler pBlueScript K plazmidi içerisine klonlanmış ve plazmid ekstraksiyonu yapıldıktan sonra sekans analizine gönderilerek gen ve protein haritası çıkarılmıştır. 
Fajın kuyruk proteinlerini kodlayan genler içermesi nedeniyle kuyruklu faj grubu olan 'Caudovirales'e ait olduğu saptanmıştır. Genom büyüklüğünün 20.000 bp civarında olması sebebi ile de 'Podoviridae' ailesinden olabileceği tahmin edilmektedir. 'Podoviridae' ailesine ait fajların özelliği küçük bir genom ve kısa kasılamayan bir kuyruğa sahip olmalarıdır. Faj genomunun büyüklüğü 20.224 bp olarak hesaplanmıştır. NCBI ORF Finder programıyla bakılmış, genomun sadece 'ATG' kodonu ile başlayan 41 tane ORF içerdiği, bu ORF'lerin 17 tanesinin (%41.4) hangi proteini kodladığı bulunmuştur. 18 tanesinin (%43.9) NCBI BLAST programında karşılığı bulunamazken, geri kalan 6 tanesi (%14.6) hipotetical protein olarak değerlendirilmiştir. Fajın Guanin+Sitozin içeriği %33.96 olarak hesaplanmıştır.
Yapılan son araştırmalara göre bakteriyofaj genomundan olduğu tahmin edilen open reading framelerin %50-75'inin GenBank'ta karşılığı olmadığı görülmüştür. Bakteriyofajları daha iyi anlayabilmek ve faj terapisinde, gıda endüstrisinde, aşılamada, klonlama çalışmaları vs.de fajlardan daha iyi faydalanabilmek için daha fazla fajın dizilenmesi, genomlarının ve karşılık geldiği proteinlerin bulunması, veri bankasına eklenmesi gerekmektedir. Bu nedenle tezimde maniplasyonu kolay küçük bir lizojenik fajın genlerinin ve proteinlerinin tanımlanması nedeniyle oldukça önemli sonuçlar ortaya konmuş, bulgular ayrıntılı olarak değerlendirilmiştir.
Anahtar sözcükler: Bakteriyofaj, Hind III, Mitomisin C, MRSA φ sml, Open Reading Frame

Abstract:
Staphylococcus aureus is an important pathogenic microorganism that can cause hospital or community-acquired infections and can have very serious consequences. Multidrug-resistant S.aureus causes great difficulty in the treatment of staphylococcal infections. Appearance of S.aureus strains that are resistant to all known antibiotics but unavailability of any new antibiotics has led researchers to to phage therapy which has lost its popularity with the discovery of antibiotics. Phages used until 1950 for this purpose are basically phages which are lytic features that allow bacteria to die directly. This therapy is known to have undesirable effects such as endotoxic shock due to sudden death of the bacteria. The development of recombinant technology has led to the idea of creating lysogenic recombinant phage containing gene materials that can control bacterial death. For this, small phages are needed for easy manipulation. In Ankara University Medical Faculty Medical Microbiology Department, Şahin et al. (2013) obtained a lysogenic bacteriophage from an MRSA strain that was much smaller than the other phages and named as MRSA φ sml (small). In this study, it was aimed to identify the lysogenic bacteriophage genome in order to investigate the potential of creating lysogenic recombinant phages that can be used in the phage treatment and to put forth the genome map and contribute knowledge to phages database.
Phage was induced with Mitomycin C and after that DNA extraction was done. After the digestion with Hind III enzyme, the inserts were cloned into plasmid pBluescript K and after plasmid extraction, they were sent to sequence analysis and gene and protein map were plotted.
Because of having genes that coded tail proteins, it has been determined that the phage belongs to Caudovirales. It is estimated that it may be from 'Podoviridae' family because genome size is around 20.000 bp. The characteristics of phages belonging to the 'Podoviridae' family are that they have a small genome and a short contraction-free tail. The size of the phage genome was calculated to be 20.224 bp. Phage genome has 41 ORFs beginning with the 'ATG' codon. Using NCBI Blast ORF Finder programme, it was found which proteins were coded by the 17 (%41.4) of ORFs but 18(%43.9) of them couldn't been determinded. The remaining 6 (14.6%) were considered as hypotetical proteins. Guanine + Cytosine content was calculated as 33.96%.
According to recent studies, 50-75% of the open reading frames estimated to be from the bacteriophage genome were not found in GenBank. To better understand bacteriophages and to better benefit from phages in phage therapy, food industry, vaccination, cloning studies, etc., more phage must be sequenced, genomes and corresponding proteins must be added to the database. For this reason, very important results have been revealed due to the identification of genes and proteins of a small lysogenic phage that are easy to manipulate in the synthesis, and the findings are evaluated in detail.

Key words: Bacteriophage, Mitomycin C, Hind III, MRSA φ sml, Open Reading Frame