İnsan rekombinant nano-antikor yapılarından kanser tanısı ve tedavisine yönelik etken madde geliştirilmesi
Development of an active substance from human recombinant nano-antibody constructs for the diagnosis and treatment of cancers
Yazar: NURŞAH ERSEZEN
Danışman: PROF. DR. TAMER YAĞCI ; PROF. DR. BERRİN ERDAĞ
Gebze Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Monoklonal antikorlar (MAbs), yaklaşık olarak ~150 kDa büyüklüğünde olan, hedefledikleri yapılara karşı yüksek bağlanma afinitesi gösteren özdeş antikorlardır. Oldukça etkili yapılar olmalarına karşın büyük boyutları tedaviye yönelik yaklaşımlarda kullanımlarını kısıtlayabilmektedir. Nanobodyler (VHH) devegillerden üretilen, antijene bağlanma özelliğine sahip en küçük antikorlardır ve bütün haldeki antikorlara karşı çeşitli avantajlara sahiptirler. Faj gösterim teknolojisi, bakteriyofaj yüzeyinde sunulan (poli) peptid yapılarından hedefe yönelik seçilim yapılmasını sağlayan ve MAb üretiminde sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Bu tez çalışmasında faj gösterim teknolojisi ile yüksek çeşitliliğe sahip naiv insan ağır zincir değişken bölge (VH) antikor kütüphanesi oluşturulmuştur ve birçok kanserde normalden fazla üretildiği bilinen Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü'ne (EGFR) spesifik yapıların seçilimi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, sağlıklı insan periferal kanından izole edilen RNA'dan cDNA sentezi yapılıp, bu kalıp üzerinden insan VH antikor genlerine spesifik primerler kullanılarak VH antikor genleri PZR yöntemiyle çoğaltılmıştır. Antikor kütüphanesi fajmid vektöre klonlandıktan sonra Escherichia coli (E. coli) amber supresör TG1 bakterilerine transforme edilmiştir. Enfektif fajların oluşumu sağlandıktan sonra faj eldesi yapılıp EGFR'ye afinite gösteren yapılar biyopanning döngüleri ile seçilmiştir. 3 döngü sonrasında seçilen klonların antikor geni içerip içermediği PZR ile kontrol edilmiş, EGFR'ye bağlanma afiniteleri faj-ELISA ile değerlendirilmiştir. ELISA ile seçilen klonların DNA dizileri belirlenmiştir. Dizilenen çoğu klonun IGHV3 gen ailesi ile benzerlik gösterdiği ancak klonlanan bölge içerisinde stop kodonu meydana geldiği görülmüştür. 1 klonda ise klonlanan bölgede stop kodon olmadığı belirlenmiştir ancak literatürdeki antikor genleriyle benzerliği tespit edilememiştir. Bu sebeplerle protein yapılarının çözünük üretimleri mümkün olamamıştır ve deneyler bu aşamada durdurulmuştur. İlerleyen çalışmalarda, klonlanan bölgeler içerisinde meydana gelen stop kodonlarının sebeplerinin araştırılması ve klonların EGFR'ye bağlanma potansiyellerinin farklı yollarla doğrulanması öngörülmektedir.

Abstract:
Monoclonal antibodies (MAbs) are identical antibodies approximately ~150 kDa sizes and possess high binding affinity to their targets. Despite their effectiveness, their huge sizes restrict their use in some cases. Nanobodies (VHH) are the smallest antibodies possess antigen-binding ability originated from camelids and have various advantages over whole antibody constructs. Phage display technology is a method provides selection of desired fragments from (poly) peptide structures displayed on the bacteriophage surface and generally used in MAb development. In this study, high diversity naive human heavy chain variable region (VH) antibody library was constructed with phage display technology and then selection of specific structures against Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), which is overexpressed in many cancers, was performed. For this purpose, RNA isolation was done from healthy human peripheral blood and cDNA was synthesized. From this template, VH antibody genes were amplified by PCR using primers specific to human VH antibody genes. Antibody library was cloned into the phagemid vector and transformed into Escherichia coli (E. coli) amber suppressor TG1 strain. After the formation of infective phages, phages were rescued and selection against EGFR was performed with biopanning cycles. After 3 rounds of biopanning, clones were controlled by PCR whether the presence of antibody gene. Binding affinities to EGFR were determined by phage-ELISA. Then DNA sequences were determined. Similarities with IGHV3 gene family was observed in most clones, however stop codon was detected in cloned regions. Also in 1 clone there was not any stop codon in cloned region however the similarity with immunoglobulin genes could not be detected. For these reasons, soluble expressions of proteins were not possible and experiments were stopped. In further studies, the reasons of stop codons in cloned regions must be analyzed and binding potential against EGFR must be verified by different ways.