Yumurtalık kanseri hücre kültürlerinde hydroxytyrosol'ün sitotoksik, apoptotik, Pi3K/Akt ve ERK 1/2 yolakları üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of hydroxytyrosol on cytotoxicity, apoptosis, Pi3K/Akt and ERK 1/2 pathways in ovarian cancer cell cultures
Yazar: LATİFE MERVE OKTAY
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BERRİN TUĞRUL
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Hydroxytyrosol'ün çeşitli kanser hücre hatları üzerinde antitümöral, çoğalmayı inhibe etme ve apoptozisi destekleme etkileri olduğu gösterilmiştir. Birkaç tümör hücre hattında çeşitli mekanizmalar üzerindeki etkisi bakımından da çalışılmıştır. Bu çalışmada hydroxytyrosol'ün insan yumurtalık kanser hücre hatlarındaki (MDAH-2774 ve OVCAR-3) sitotoksik, apoptotik etkileri ile sitotoksik etkisinin fosfatidilinositol 3-kinaz /Akt (PI3K/Akt) ve hücre dışı sinyalle düzenlenen kinaz (ERK1/2) sinyal ileti yolakları ile bağlantılı olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. 

MDAH-2774 ve OVCAR-3 hücre hatlarında, 24., 48., 72.  ve 96. saatlerde hydroxytyrosol'ün artan konsantrasyonlarının (50-400 µM)  hücreler üzerindeki sitotoksik etkisini belirlemek için XTT testi ve tripan mavisi boyama yöntemi, apoptotik etkiyi belirlemek için DNA fragmentasyon testi ve protein antikor array yöntemi, PI3K/Akt ve ERK1/2 sinyal ileti yolakları üzerinden etkisinin olup olmadığını ortaya koymak için yolaklarla ilgili spesifik inhibitörleri kullanılarak araştırıldı. Elde edilen bulgular ANOVA ve ardından Dunnett's istatistiksel analizleriyle değerlendirildi. 

Hydroxytyrosol'ün MDAH-2774 hücre kültürlerinde 72. saatteki IC50 değeri 102.3 µM, OVCAR-3 hücre kültürlerinde 96. saatteki IC50 değeri 51.5 µM olarak hesaplandı. 

Hydroxytyrosol'ün MDAH-2774 hücre kültürlerinde 72. saatteki apoptotik etkisi en yüksek 100 µM konsantrasyonda görülürken, 150 µM'da azaldığı, 200 µM ve üzerindeki konsantrasyonlarda ise apoptozisin görülmediği tespit edildi. OVCAR-3 hücre kültürlerinde ise 96. saatte en yüksek apoptotik etkisi 100 µM konsantrasyonda görülürken, 100 µM'ın üzerindeki konsantrasyonlarda giderek azalan apoptotik etkisi olduğu belirlendi. 

Hydroxytyrosol'ün MDAH-2774 hücre kültürlerinde pro-apoptotik moleküllerden Bad, Bax, aktif kaspaz-3, Htra2/Omi ve SMAC/DIABLO proteinleri ile yine pro-apoptototik ölüm reseptörleri olan TRAIL R1/DR4, TRAIL R2/DR5 ve FAS/TNFRSF6 moleküllerinin seviyesinde artışa, apoptozis inhibitör proteinleri (AIP) ailesinden Survivin'in miktarında ise azalmaya sebep olduğu; OVCAR-3 hücre kültürlerinde ise anti-apoptotik moleküllerden Bcl-2 ve Pro-kaspaz-3 ile AIP ailesinden CIAP-1, CIAP-2, XIAP, Livin ve Survivin'in miktarlarında azalmaya, pro-apoptotik olan sitokrom-c miktarında ise artışa sebep olduğu tespit edildi.

HT'nin hücre canlılığı üzerindeki etkisinin MDAH-2774 ve OVCAR-3 hücre kültürlerinde PI3K/Akt sinyal yolağı üzerinden olmadığı, ancak ERK 1/2 sinyal yolağı üzerinden olabileceği bulundu.

 Bu bulgular HT'nin yumurtalık kanseri hücre hatlarında sitotoksik, apoptotik etkilerinin olduğunu ve sitotoksik etkisinin ERK 1/2 sinyal yolağı üzerinden etkisi olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
It has been shown that hydroxytyrosol (HT) has antitumoral, anti-proliferative and apoptotic effects on various cancer cell types. It was also studied in several tumor cell lines in terms of its action mechanisms. In this study, we aimed to evaluate the cytotoxic, apoptotic effects of hydroxytyrosol and whether its cytotoxic effect on through phosphatidylinositol 3- kinase / Akt (PI3K/Akt) and extracellular signal-regulated kinase 1/2  (ERK 1/2) signal transduction pathways in human ovarian cancer cell cultures OVCAR-3 and MDAH-2774. 

To investigate the cytotoxic effect of increasing concentrations of HT (50-400 µM) XTT assay was used in OVCAR-3 and MDAH-2774 cell lines at 24., 48.,72. and 96. hours. To determine the apoptotic effect of HT, DNA fragmentation assay and protein antibody array methods were used. XTT assay was used to determine whether hydroxytyrosol is effective on PI3K/Akt and ERK 1/2 signal tranduction pathways, specific inhibitors of these pathways were used. The findings were evaluated by ANOVA followed by Dunnett's statistical analyzes. 

IC50 value of HT in MDAH-2774 cell cultures was calculated as 102.3 µM at 72 h and 51.5 µM in OVCAR-3 cell cultures at 96 h. 

Apoptotic effect of HT in MDAH-2774 cells at 72 h was the highest at 100 µM, and kept lowering at 150 µM concentrations and was not seen at 200 µM and higher concentrations. Highest apoptotic effect was seen at 100 µM concentration in OVCAR-3 cells at 96 h, however apoptotic effect was decreased over 100 µM concentrations. 

In our study, HT increased the levels of pro-apoptotic molecules Bad, Bax, active caspase-3, Htra2/Omi and SMAC/DIABLO and also increased the levels of pro-apoptotic death receptors TRAIL R1/DR4, TRAIL R2/DR5 and FAS/TNFRSF6, however, it decreased the levels of Survivin which is one of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family in MDAH-2774 cells. In OVCAR-3 cells, HT decreased the levels of anti-apoptotic proteins Bcl-, pro-caspase 3 and IAP family proteins CIAP-1, CIAP-2, XIAP, Livin and Survivin and increased the levels of cytochrome c.

 We have shown that cytotoxic effect of HT is not through PI3K/Akt signaling pathway however, it may effect through ERK1/2 signaling pathway in both OVCAR-3 and MDAH-2774 cells.

These findings show that HT has cytotoxic and apoptotic effects on ovarian cancer cell lines and it may show its cytotoxic effect through ERK 1/2 signalling pathway.