Vardenafil kullanımının sıçan femuru kırık modelinde kemik iyileşmesine etkileri
Effects of vardenafil on bone healing in the rat femur fracture model
Yazar: TOLGAHAN ATCI
Danışman: UZMAN ENDER ALAGÖZ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Bağcılar Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology
Dizin: Femoral kırıklar = Femoral fractures ; Femur = Femur ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kırık iyileşmesi = Fracture healing ; Kırıklar-kemik = Fractures-bone ; Sıçanlar = Rats ; Vardenafil = Vardenafil ; Yara iyileşmesi = Wound healing

Özet:
Amaç: Kırık iyileşmesi sürecinde rol alan biyolojik faktörler ve bunlara ait etkilerin anlaşılır hale gelmesiyle, iyileşme süresini kısaltmak ve kaynama oranlarını artırmak için kırık tedavisinde yenilikler gündeme gelmiştir. Bu çalışmada, sıçan femuru kırık modelinde kemik iyileşmesi sürecine bir fosfodiesteraz tip 5 enzim (PDE5) inhibitörü olan vardenafilin farklı dozlarda yapılan uygulamaları ile radyolojik, biyomekanik, histopatolojik, histomorfometrik ve immunohistokimyasal etkilerini göstermeyi amaçladık.
Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda 51 adet Sprague-Dawley cinsi sıçan kontrol (K), vardenafil 5mg (V5), vardenafil 10mg (V10) grupları olmak üzere üç gruba ayrıldı. Sağ femurlara osteotomi sonrası Kirschner teli ile tespit uygulanarak standart kırık modeli oluşturuldu. Cerrahi sonrası V5 grubuna 5mg/kg/gün (düşük doz), V10 grubuna 10mg/kg/gün (yüksek doz) dozunda vardenafil ve K grubuna aynı hacimde serum fizyolojik oral gavaj ile uygulandı. 14. günde (erken dönem) her gruptan rastgele 6 adet sıçan, 42. günde (geç dönem) ise geriye kalan sıçanlar sakrifiye edilerek sağ femurları ampute edildi. Mikro bilgisayarlı tomografi (mBT) ile kallus/femur hacmi ve kemik mineral yoğunluğu (BMD) ölçüldü. 42. güne ait her gruptan rastgele alınan 5'er adet femur, mekanik dayanıklılık açısından biyomekanik testler ile incelendi. Hücresel düzeyde inceleme için histolojik boyamalar yapıldı ve alınan kesitlerde histopatolojik, histomorfometrik değerlendirmeler yapıldı. Aynı blokların farklı kesitlerine de indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS), transforme edici büyüme faktörü-β3 (TGF-β3) ve nuklear faktör kappa B (NF-κB) proteinlerinin düzeylerini incelemek için immunohistokimyasal analizler yapıldı.
Bulgular: mBT değerlendirmemize göre vardenafilin her iki dozu geç dönemde primer kemik hacmini kontrol grubuna kıyasla arttırdı (P<0,05) ancak kemik yoğunluğunu etkilemedi. Biyomekanik analiz sonucunda 6. haftada vardenafilin her iki dozu kemik kırılma kuvvetinin maksimum düzeyini kontrol grubuna göre anlamlı derecede arttırmış (P<0,05), ancak iki doz arasında istatistiksel farka rastlanmamıştır. Histopatolojik bulgulara göre 2. haftanın vardenafil gruplarında skorlar anlamlı derecede arttı (P<0,01) ancak farklı doz grupları arasında istatistiksel olarak fark bulunamadı. 6. hafta gruplarında ise sadece V10 grubundaki artış kontrol ve V5 gruplarına kıyasla anlamlı derecede yüksekti (P<0,05) ancak kontrol ve V5 grupları arasında fark yoktu. Histomorfometrik değerlendirmede erken dönemde kıkırdaksı kallus/total kallus oranı vardenafil uygulanan gruplarda kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek iken (P<0,001) geç dönemde kallus çapı/femoral çap oranı vardenafil gruplarında anlamlı düzeyde düşüktür (P<0,01). İmmunohistokimyasal analizler erken dönemde V10 grubunda NF-κB immunopozitifliğinin kontrol grubuna göre anlamlı düzeyde azaldığını (P<0,001) fakat geç dönemde kontrol grubuyla aynı düzeyde olduğunu gösterdi. Yine erken dönemde TGF-β3'ün immunopozitifliğinin V5 ve V10 gruplarında anlamlı derecede arttığı (P<0,001) ancak geç dönemde normale döndüğü görüldü. iNOS analizinde erken dönemde her iki dozun immunopozitifliği arttırdığı (P<0,01) ancak geç dönemde etkisini yitirdiği görüldü.
Sonuç: Oluşturduğumuz kırık modelinde vardenafilin kemik kaynamasına radyolojik, biyomekanik, histopatolojik, histomorfometrik ve immunohistokimyasal olarak olumlu etkiler gösterdiğini ve kırık iyileşmesini desteklediğini kaydettik. Sonuçlarımız kırık iyileşmesi sürecinde inflamasyonla birlikte vazodilatasyona en çok ihtiyaç duyulan ilk aşamada vardenafilin etkili olduğunu ancak daha sonra primer kemik oluşumuyla birlikte bu etkinin ortadan kalktığını akla getirdi. Yakın zamanda PDE5 inhibitörlerin kemiksi kırık köprüsü oluşmasını destekleyerek kırık defektinin iyileşmesini hızlandırdığı ve bu yararlı etkiyi nitrik oksit sentaz enzimlerini arttırarak gösterdiği ortaya konmuştur. Deneysel çalışmamızın bir ön çalışma olarak değerlendirilmesi gerektiğini düşünüyoruz. Kırık iyileşmesinde PDE5 inhibitörlerinin etkilerini daha ayrıntılı ortaya koyabilmek adına ilerleyen zamanlarda daha çok sayıda denekle, daha farklı dozlarda ve daha fazla parametrenin ayrı ayrı değerlendirilebileceği geniş çaplı yapılabilecek çalışmalara örnek teşkil edebileceği kanaatindeyiz.
Anahtar kelimeler: Femur, kırık iyileşmesi, sıçan, vardenafil

Abstract:
Aim: Understanding the biological factors which take part in bone healing and their effects has become a current issue in the treatment of fracture which allows the healing period to shorten and increases the ratio of union. In this study, we aimed to show radiological, biomechanical, histopathological, histomorphometric and immunohistochemical effects of treatment with different doses of a phosphodiesterase type 5 enzyme (PDE5) inhibitor called vardenafil on bone healing in a rat femur fracture model.
Material and Methods: In our study, fifty-one Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: control (C), vardenafil 5 mg (V5) and vardenafil 10 mg (V10). Standard fracture models were established by the osteotomy of right femurs and applying  Kirschner wire fixation. After surgery, a dosage of vardenafil through oral gavage was applied; 5 mg/kg/day (low dose) to group V5, 10 mg/kg/day (high dose) to group V10 and the same amount of physiological saline was applied to the control group. Six rats randomly chosen from all groups were sacrificied at 14th day (early phase), the remaining rats were sacrificied at 42nd day (late phase) and all their right femurs were amputated. Callus/femur volume ratio and bone mineral density (BMD) were calculated by the help of micro computed tomography (µCT). Five femurs randomly chosen from all groups at 42nd day were evaluated with biomechanical tests for their mechanical resistance. As for cellular investigations, histological stainings were performed and the sections were evaluated histopathologically and histomorphometrically. Different sections from the same paraffin blocks were evaluated by immunohistochemical analysis for the protein levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS), transforming growth factor- β3 (TGF-β3) and nuclear factor kappa B (NF-κB).
Results: According to µCT findings, both doses of vardenafil compared to the control group increased primary bone volume in the late phase significantly (P<0.05), but did not affect BMD. Biomechanical analysis at the end of 6th week, indicated that both doses of vardenafil elevated the maximum level of bone fracture force significantly compared to the control group (P<0.05) whereas there was no statistical difference between the doses. Based on histopathological findings, histological scores of vardenafil groups at 2nd week increased significantly (P<0.01) while no statistical difference was found between vardenafil groups. Moreover, at 6th week increase in histological scores for group V10 was significantly higher than control and V5 groups (P<0.05) but no significant difference between the V5 and control groups. Histomorphometric evaluations revealed that cartilagenous callus/total callus ratio of vardenafil treated groups was significantly higher than the control group in early phase (P<0.001), while in the late phase total callus diameter/femoral diameter ratio of vardenafil groups was significantly lower (P<0.01). Immunohistochemical analysis showed that, NF-κB immunopositivity of group V10 was significantly low in comparison with the control group at early phase (P<0.001) but was similar to the control group at late phase. Yet, TGF-β3 immunopositivity of V5 and V10 groups increased significantly at early phase (P<0.001) whereas during the late phase they returned to the control levels. iNOS analysis showed elevation in immunopositivity for both doses of vardenafil at early phase while lost their this effect at late phase.
Conclusion: In this fracture model established, we reported that vardenafil have positive effects on fracture union radiologically, biomechanically, histopathologically, histomorphometrically and immunohistochemically, by supporting bone healing. Our results have suggested that, vardenafil is more effective in early phase, in which vasodilatation with inflammation are needed in the bone healing process, but this effect disappears at late phase due to the formation of primary bone. Recently, PDE5 inhibitors have been shown to accelerate fracture healing through supporting the formation of osteoid fracture bridge, resulted in this beneficial effect by increasing nitric oxide synthase enzymes. Our experimental study can be considered as a pre-study; hence we consider that this study may be an example for future large-scaled studies evaluating more parameters with more different doses on a large number of subjects to elucidate the detailed effects of PDE5 inhibitors in bone healing.
Key words: Femur, bone healing, rat, vardenafil