Tetrahymena thermophila'ya kodon uyumu yapılmış superfolder GFP (sfGFP)'nin T. thermophila'da rekombinant protein üretimi ve flüoresan özelliğinin karakterizasyonu
Recombinant protein production of codon adapted superfolder GFP (sfGFP) in Tetrahymena thermophila and its fluorescence characterization
Yazar: GÜRKAN YILMAZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
Anadolu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Tetrahymena thermophila'da kullanılan, Aequorea victoria Yeşil Flüoresan Proteininin (Wild Type GFP) EGFP gibi değişik mutantları genellikle kodon uyumu yapılmaksızın gen lokalizasyonunda kullanıla gelmiştir. Bu tez çalışmasının amacı; GFP'nin güçlü ışıyan, hızlı katlanan, çözünürlüğü yüksek diğer bir mutant versiyonu olan Super Folder GFP (sfGFP) geninin Tetrahymena'ya kodon uyumu ve afinitik saflaştırmaya uygun hale getirilmesi, rekombinant protein üretimi ve EGFP ile deneysel kullanım açısından karşılaştırmalı karakterizasyonudur. sfGFP geninde % 21.3 sessiz mutasyon ile Tetrahymena'ya kodon uyumu sağlanmış ve N-Terminaline 6XHis takısı (6XHis-TtsfGFP) eklenmiştir. Tetrahymena ifade vektörü olan pVGF'nin PmeI-ApaI kısmına 6XHis-TtsfGFP geni klonlanarak, EGFP yerine yerleştirilmiş ve MTT1-6XHis-TtsfGFP-rpl29Ter kaseti oluşturulmuştur. Kontrol grubu olarak Tetrahymena'ya kodon uyumu yapılmamış sfGFP aynı şekilde yapılandırılmıştır. Vektörler elektroporasyon ile konjugatif hücrelere transform edilmiştir. Elde edilen TtsfGFP, sfGFP ve EGFP klonlarının CdCI2 ile indüksiyonundan sonra ki 3. saatte yapılan in vivo spektroskopik flüoresan ölçümü, TtsfGFP'nin kontrollore göre ~2.2-4 kat fazla ışıma verdiğini göstermiştir. Flüoresan mikroskop analiz bulguları; TtsfGFP'li hücrelerin maksimum görsel ışımaya 100 dk gibi kısa bir sürede ulaşmasına rağmen EGFP ve sfGFP'li hücrelerin ~240 dk'da ulaştığını göstermiştir. pVTtsfGFP vektöründe yer alan 6XHis-TtsfGFP'nin C-terminaline Tetrahymena'nın bir hipotetik geni (H) XhoI-ApaI klonlaması ile yerleştirilmiş ve Tetrahymena thermophila hücresi içinde füzyon proteinin makronükleus ile mikronükleusta lokalize olduğu görülmüştür. TtsfGFP ile TtsfGFP-H'nin Ni-NTA ile afinitik saflaştırılabilirliği SDS PAGE ve Western blot analizi yapılarak teyit edilmiştir. Araştırma bulguları, 6XHis-TtsfGFP takısının, Tetrahymena proteinlerinin lokalizasyonu ve saflaştırılmasında affinitik flüoresan takı olarak kullanılabileceğini ortaya koymuştur.

Abstract:
Different mutants of Aequorea victoria Green Fluorescent Protein (Wild Type GFP) such as EGFP have been used without a codon adaptation as a tag for gene localization in Tetrahymena thermophila. The aim of this study is to create a codon adaptive mutant version of Super Folder GFP (sfGFP) gene for Tetrahymena with an affinity purification feature, its recombinant protein production in T.thermophila and comparative characterization with EGFP for experimental use. sfGFP protein coding region was codon-adapted with 21.3 % silent mutations to Tetrahymena and 6XHis tag coding sequence was also added to its 5? end for affinity purification (6XHis-TtsfGFP).  The EGFP gene in Tetrahymena pVGF expression vector was replaced into PmeI-ApaI restriction site with 6XHis-TtsfGFP gene to construct MTT1-6XHis-TtsfGFP-rpl29Term protein expression cassette. Non-codon adapted sfGFP was similarly cloned as a control group. All vectors were transformed to conjugant Tetrahymena cells with electroporation. Results of in vivo fluorescence analyses at 3rd hours after the CdCl2 induction of TtsfGFP, sfGFP and EGFP carrying clones showed that TtsfGFP clones have ~2.2-4 fold more fluorescence emission against control groups. Fluorescent microscopic results also showed that TtsfGFP reach to max emission at 100 min, which is much earlier than EGFP and sfGFP clones at ~240 min. A Tetrahymena hypothetical gene (H) was cloned with XhoI-ApaI site to be in the C-Terminal of 6XHis-TtsfGFP of pVTtsfGFP vector and microscopic analysis revealed the fusion protein localizes in macronucleus and micronucleus in Tetrahymena thermophila. Affinitic purifiability of TtsfGFP and TtsfGFP-H with Ni-NTA was confirmed by SDS PAGE and Western blotting experiments. Findings of this study suggest that 6XHis-TtsfGFP tag can be use as a protein localization and affinity purification tag for recombinant protein expression in Tetrahymena thermophila.