Kronik hepatit B'li hastaların entekavir tedavisi sırasında HBV polimeraz geninde gelişen ve entekavire karşı direnç oluşumuna sebep olan mutasyonların dizi analizi ile araştırılması
Characterization with sequence analyses of mutation developing within HBV polymerase gene and associated with resistance to entecavir during entecavir treatment of patients with chronic hepatitis B virus
Yazar: SERPİL POLAT
Danışman: DOÇ. DR. MEHMET SAMİ SERİN
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: DNA = DNA ; Direnç = Strength ; Entekavir = Entecavir ; Hepatit = Hepatitis ; Hepatit B = Hepatitis B ; Hepatit B virüsü = Hepatitis B virus ; Mutasyon = Mutation ; Nükleosid = Nucleoside ; İlaç alerjisi = Drug hypersensitivity ; İlaçlara direnç = Drug resistance

Özet:
Son zamanlarda lamivudin (LMV), famsiklovir (FAM), adefovir (ADV) ve entekavir (ETV) gibi nükleosid analoglarının geliştirilmesi ile Kronik hepatit B (KHB) infeksiyonun tedavisinde önemli antiviral etkinlik ve tolerans sağlanmıştır. Ancak buna rağmen bu bileşikler ile uygulanan kısa süreli tedavide bu bileşiklerin hiçbirisinin viral cccDNA'ya karşı etki gösterememesi sebebiyle viral temizlenmenin sağlanabilmesi mümkün olmamaktadır. Tedavinin etkinliğinin arttırılması için uzun süreli (4-5 yıl) tedaviler önerilmektedir. Bu durumda ise viral replikasyonda kullanılan polimeraz enziminin hata düzeltme yeteneğinin mevcut olmamasından dolayı, zamanla ilaca dirençli mutantlar ortaya çıkmaktadır. LMV direnci olan hastalarda ADV iyi bir alternatif olarak önerilmekteyken günümüzde ADV'e dirençli virus izolatlarının da ortaya çıktığını rapor etmektedir. Bu sebeplerle antiviral tedavide, günümüzde daha yüksek bir kalıcı virolojik yanıt oranına sahip olan ETV kullanılmaktadır. Çalışmamızın amacı, KHB infeksiyonlu hastaların, ETV ile tedavileri sırasında virusun polimeraz geninin B, C ve D domainlerinde meydana gelen ETV direnç mutasyonlarının dizi analizi metodu ile araştırılması ve muhtemel direnç gelişimlerinin tespit edilerek yeni tedavi stratejilerinin oluşturulmasına ve daha etkili antiviral tedavi etkinliğinin sağlanmasına katkıda bulunmaktır. Çalışmaya KHB'li ve yaklaşık bir yıldır ETV ile tedavi görmekte olan 56 hasta serumu dahil edildi. Hastaların serum örneklerinden viral DNA ekstrakte edildi. Polimeraz geninin B, C ve D domainlerini kodlayan bölge semi-nested PCR ile amplifiye edilerek saflaştırıldı. Daha sonra ise gümüş boyama-DNA dizi analizi metodu ile analiz edildi. Elde edilen diziler, bir Türkiye HBV izolatının tam genom dizisini içeren AY721609 referans dizisi ile karşılaştırılarak, mutasyonların varlığı yönünden araştırıldı. Çalışmamızda toplam 56 HBV ile infekte hastalarda hiçbirisinde (%0) ETV direnci ile ilişkili mutasyon belirlenememiştir. Bununla birlikte bir hastada (%1.78) rtI233V, bir hastada (%1.78) rtN238R, bir hastada (%1.78) rtP237S ve bir hastada (%1.78) rtY245H dual mutasyonu tesbit edilmiştir. Bu mutasyonların ilaç direnci ile ilişkisi net olarak bilinmemektedir. Ayrıca çalıştığımız bölge LMV ve ADV direnci ile ilişkili mutasyonların da ortaya çıktığı kodonları içerdiğinden, üç hastada (%5.35) rtM204I mutasyonları belirlenmiştir.

Abstract:
Recently, although antiviral activity has been considerably obtained after treatment of chronic hepatitis B (CHB) infection with nucleoside/nucleotide analogues such as lamivudine (LMV), famciclovir (FAM), adefovir (ADV) and entecavir (ETV) in short term therapy with this compounds, viral clearance is still insufficient. Because of its activity is not effective againts to cccDNA, long term therapy (4-5 years) is recommended for increasing of treatment activity. However, in this case antiviral resistance developes due to lack of proofreading activity of viral polymerase. ADV is recommended as a suitable alternative in LMV resistant patients, however, recent studies suggest that came out of resistant strains to ADV. For these reasons, entecavir is used due to its higher antiviral activity nowadays. The aim of our study was to detect mutations developing on B, C and D domains of viral polymerase gene which are related with possible entecavir resistance by DNA sequencing and help to organize new and more effective therapy strategies. Fiftysix patient?s sera was enrolled to this study. Viral DNA was extracted from patient?s sera. The region coding B, C and D domains of polymerase gene was amplified by semi-nested PCR and sequenced by silver staining-DNA sequencing method. All sequences were compared and analyzed for the presence of mutations with a complete genome of Turkey HBV isolate?s reference (AY721609) sequences. We have detected no mutations related with ETV resistance in 56 (0%) patient?s sera. However, rtI233V mutation was detected in 1 of 56 (1.78%), rtN238R mutation was detected in 1 of 56 (1.78%), rtP237S and rtY245H dual mutations were detected in 1 of 56 (1.78%) patient?s sera. The relation of these mutations are not being known. On the other hand, because of our studied region was consisted codons related with LMV and ADV resistance mutations, we have detected 3 rtM204I mutations (5.35%) related with LMV resistance.