Bazı peptit yapılı analitlerin (Adrenokortikotropik hormon-Acth, İnsülin, C-peptit ve İnsülin benzeri büyüme faktörü-1-İGF-1) ölçümünde hemoliz interferansının ve N-fenil maleimidin olası koruyucu etkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of hemolysis interference and possible protective effect n-phenyl maleimide on the measurement of some peptide structured analytes (ACTH, insulin, C-peptide and IGF-1)
Yazar: MUSTAFA DURMAZ
Danışman: PROF. DR. BERRİN İMGE ERGÜDER
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Adrenokortikotropik hormon = Adrenocorticotropic hormone ; C peptid = C peptide ; Hemoliz = Hemolysis ; Maleimidler = Maleimides ; Proteaz inhibitörleri = Proteases inhibitors ; İnsülin = Insulin ; İnsülin benzeri büyüme faktörü I = Insulin like growth factor I ; İnterferometri = Interferometry

Özet:
BAZI PEPTİT YAPILI ANALİTLERİN (ACTH, İNSÜLİN, C-PEPTİT VE IGF-1) ÖLÇÜMÜNDE HEMOLİZ İNTERFERANSININ VE N-FENİL MALEİMİDİN OLASI KORUYUCU ETKİSİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ

Amaç: Bu çalışmada hemoliz sonucunda salınan proteolitik enzimlere bağlı olarak peptit yapılı parametrelerde azalmayı göstermek ve NPM ekleyip proteaz enzimlerinin inhibisyonunu sağlayarak azalmayı önlemek amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem: Laboratuvara gelen hasta kanlarının istenilen parametreleri çalışıldıktan sonra artan hasta serum ve plazmalarından havuz oluşturularak bu çalışma gerçekleştirildi. Seçilen numunelerin konsantrasyonlarının klinik karar noktalarına yakın olmasına özen gösterildi. Her parametreden iki farklı seviye serum/plazma havuzu oluşturuldu. Her bir havuz iki eşit hacme bölünüp birine NPM eklenerek NPM'li ve NPM'siz gruplar elde edildi. Her grup 5 tekrarla çalışıldı. Numune olarak her tekrarda 400 μL serum/plazma kullanıldı. Hemolizat oluşturmak için EDTA'lı tam kan tüpleri santrifüj edilerek plazmaları uzaklaştırıldı. Plazmaya eşit hacimde % 0,9'lık SF koyulup 5 kez yıkama gerçekleştirildi. Her yıkamadan sonra santrifüj edildi. Distile su eklenerek ozmotik şok metoduyla hemoliz indüklendi. 1 gece -20 oC'de bekledikten sonra hemoglobin konsantrasyonu ölçülerek uygun dilüsyonlarla 1000 mg/dL, 500 mg/dL ve 250 mg/dL hemolizatlar elde edildi. 400 μL serum/plazma üzerine 100 μL hemolizat eklenerek 200 mg/dL, 100 mg/dL ve 50 mg/dL Hİ'ler oluşturuldu. 0 mg/dL hemolizat seviyesi için SF kullanıldı. ACTH ve C- peptit elektrokemilüminesans, insülin ve IGF-1 ise IRMA yöntemiyle ölçüldü.

Bulgular: ACTH'nın düşük seviyesinde 200 mg/dL, yüksek seviyesinde ise 100 mg/dL hemolizden itibaren interferans görüldü. Ayrıca ACTH düşük seviyesinde (200 Hİ p=0,043) ve yüksek seviyesinde (100 Hİ p=0,043, 200 Hİ p=0,043) NPM eklenmesi ACTH değerlerinde yükselmeye neden oldu. İnsülin yüksek seviyesinde 100 Hİ'den itibaren hemolize bağlı anlamlı düşüş tespit edildi. NPM'nin koruyucu etkisi ise insülin yüksek seviyesinde 200 Hİ'de (p=0,043) görüldü. C-peptit ve IGF-1 ise her iki seviyede de 200 Hİ'ye kadar hemolize bağlı herhangi bir interferans görülmedi.

Sonuçlar: ACTH ve insülinde belli bir noktadan itibaren hemolizat seviyesi arttıkça proteaz enzimleri peptit yapılı hormonları parçalayarak negatif interferansa neden olmaktadır. NPM eklenmesi ise proteaz enzim inbisyonu yaparak bu kaybı azalttı. Bu veriler laboratuvara gelen kanları reddetmede veya kabul etmede yol gösterici olabilir. Böylece laboratuvar hataları azaltılarak daha doğru sonuçlar verilebilir.

Anahtar Sözcükler: Hemoliz, interferans, NPM, peptit yapılı analitler, proteaz inhibitörleri

Abstract:
EVALUATION OF HEMOLYSIS INTERFERENCE AND POSSIBLE PROTECTIVE EFFECT N-PHENYL MALEIMIDE ON THE MEASUREMENT OF SOME PEPTIDE STRUCTURED ANALYTES (ACTH, INSULIN, C-PEPTIDE AND IGF-1)

Aim: In this study, it was aimed to show the decrease in the peptide structure parameters due to proteolytic enzymes released as a result of hemolysis and to prevent decrease by adding NPM and inhibiting protease enzymes.

Material and Methods: After the study of the desired parameters of the patient blood coming to the laboratory, a pool was created from the remaining serum and plasma. Care was taken to ensure that the concentrations of the selected samples were close to the clinical decision points. Two different levels of serum/plasma pool were generated for each parameter. When each pool was divided into two equal volumes and NPM was added to one, NPM and without NPM groups were obtained. Each group was studied in 5 replicates. 400 μL serum/plasma was used as a sample. Whole blood tubes with EDTA were centrifuged to form hemolysate and their plasmas were removed. Instead of plasma, an equal volume of 0.9 % SF was added and 5 washings were performed. Centrifuged after each wash. Hemolysis was induced by osmotic shock method by adding distilled water. After waiting at -20 °C for a night, the hemoglobin concentration was measured and 1000 mg/dL, 500 mg/dL and 250 mg/dL hemolysates were obtained with appropriate dilutions. 100 μL of hemolysate was added to 400 μL
of serum/plasma to form 200 mg/dL, 100 mg/dL and 50 mg/dL HI. SF was used for the hemolysate level of 0 mg/dL. ACTH and C-peptide were measured by electrochemiluminescence, insulin and IGF-1 by IRMA method.

Results: Interference was observed from the hemolysis of 200 mg/dL at the low level of ACTH and from the 100 mg/dL hemolysis at the high level of ACTH. Furthermore, the addition of NPM at the ACTH low level (200 HI p = 0.043) and at the high level of ACTH (100 HI p = 0.043, 200 HI p = 0.043) caused an increase in ACTH values. Significant decreases due to hemolysis in high level insulin were detected from 100 mg/dL HI. The protective effect of NPM was determined at the high level of insulin at 200 mg/dL HI (p = 0.043). No interference from hemolysis was observed at C-peptide and IGF-1 at both levels until 200 mg/dL HI.

Conclusion: As the hemolysate level increases from a certain point, protease enzymes break down the peptide-structured hormones and cause negative interference on ACTH and insulin. The addition of NPM reduced the loss of these enzymes by inactivating the protease enzyme. These data may be a guide in rejecting or accepting blood from the laboratory. Thus, more accurate results can be given by reducing laboratory errors.

Keywords: Hemolysis, interference, NPM, peptide structured analytes, protease inhibitors