İnsan göbek kordon veni CD146+ hücrelerin ve bu hücrelerden elde edilen matriks proteinlerinin in vitro biyofilm modellerinde değerlendirilmesi
Evaluation of human umbilical cord vein CD146+ cells and matrix proteins obtained from these cells on in vitro biofilm models
Yazar: NUR KÜBRA ÇANKIRILI
Danışman: DOÇ. DR. BETÜL ÇELEBİ SALTIK ; DR. ÖĞR. ÜYESİ DİDEM KART
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Ekstrasellüler matriks = Extracellular matrix ; Kök hücreler = Stem cells ; Pseudomonas aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ; Staphylococcus aureus = Staphylococcus aureus ; Umbilikal kord = Umbilical cord ; Umbilikal venler = Umbilical veins ; İn vitro = In vitro

Özet:
Yaraların tedavilerinde antimikrobiyal etkileri olan hücrelerin veya hücrelerden arındırılmış deselülerize matrikslerin yara bölgesine uygulanması son yıllarda dikkat çekmektedir. Bu tez çalışmasının amacı, antimikrobiyal etkiye sahip olabileceği düşünülen CD146+ kök hücrelerin ve bu hücrelerden elde edilen ekstraselüler matriks proteinlerinin (deselülerize matriks) in vitro biyofilm modellerinde değerlendirilmesidir. Bu tez çalışması kapsamında, CD146+ kök hücrelerin karakterizasyonu; hücre yüzey belirteçlerinin tayini ve farklılaşma analizleriyle, deselülerize matriksin karakterizasyonu; histolojik/immünfloresan boyamalar ve proteom analizleri ile belirlendi. CD146+ kök hücrelerin, biyofilm oluşumuna katkısını gözlemleyebilmek için, Pseudomonas (P.) aeruginosa ve Staphylococcus (S.) aureus bakterileri ile ko-kültürleri yapılarak hücre canlılık ve proliferasyonları WST-1, Annexin V/PI ve kristal viyole ile değerlendirildi. Aynı zamanda CD146+ kök hücrelerin, olası antimikrobiyal etkilerinin gözlemlenmesi amacıyla disk difüzyon yöntemi kullanıldı. CD146+ kök hücrelerin ve deselülerize matriks proteinlerinin biyofilm oluşumuna etkileri damlamalı akış modelinde test edilerek biyofilm oluşumunda görev alan genlerin ekspresyon seviyeleri kantitatif reverse transkriptaz-PZR yöntemiyle belirlendi. Elde edilen veriler sonucunda; CD146/105+ kök hücrelerin adipojenik yönde farklılaşabildiği ancak osteojenik farklılaşma kapasitelerinin bulunmadığı saptandı. Deselülerize matriks karakterizasyonu, DAPI ve Masson-Trikrom boyamaları ile tayin edildikten sonra proteom analizleriyle matriks bileşenlerinde kollajen, glikoprotein, proteoglikan ve büyüme faktörleri saptandı. Bakteri + hücreli/deselülerize kültürlerde, bakterilerin proliferasyonlarını arttırdıkları gözlemlendi. P. aeruginosa ve S. aureus kullanılarak tasarlanan biyofilm modelinde, deselülerize yapının P. aeruginosa biyofilm oluşumunu anlamlı olarak azalttığı, S. aureus için ise hücreli gruba kıyasla deselülerize grupta anlamlı bir fark bulunmadığı belirlendi. Gen ekspresyon analizi sonuçlarına göre, P.  aeruginosa biyofilm ile ilişkili genlerden rhlR ve LasR için anlamlı azalım saptanmış olup, bu biyofilm hücre sayım sonuçlarını destekler niteliktedir. S. aureus' un tutunma genleri olan icaADBC genlerinin hepsi deselülerize grupta yüksek oranda eksprese edilmiştir. Bu tez çalışması, hedeflenen amaç doğrultusunda insan kaynaklı fetal kök hücrelerin ve onlardan elde edilen matriks proteinlerinin klinik uygulamalarda önemini ortaya koyan ilk çalışmadır.


Anahtar kelimeler : CD146+ hücreler, kök hücreler, biyofilm, ekstraselüler matriks proteinleri,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, göbek kordonu.

Abstract:
In the treatment of wounds, the application of cells or decellularized matrices with antimicrobial effects to the wound area has attracted attention in recent years. The aim of this thesis is to evaluate CD146+ stem cells and extracellular matrix proteins derived from these cells (decellularized matrix) which are thought to have antimicrobial effect in in vitro biofilm models. In this thesis, the characterization of CD146+ stem cells was evaluated by determination of cell surface markers and differentiation analyzes and characterization of decellularized matrix was done with histological/immunofluorescence staining and proteome analysis. To observe the contribution of CD146+ stem cells to biofilm formation, cell viability and proliferation were evaluated by WST-1, Annexin V/PI and crystal violet by co-culture with Pseudomonas (P.) aeruginosa and Staphylococcus (S.) aureus bacteria. Disc diffusion method was also used to observe possible antimicrobial effects of CD146+ stem cells. The effects of CD146+ stem cells and decellularized matrix proteins on biofilm formation were tested in a drip flow model and expression levels of the genes involved in biofilm formation were determined by quantitative reverse transcriptase-PCR method. As a result of the data obtained; it was determined that CD146/105+ stem cells could differentiate in adipogenic direction but they did not have osteogenic differentiation capacity. The characterization of the decellularized matrix was determined by DAPI and Masson' s Trichrome staining, followed by proteome analysis to identify collagen, glycoproteins, proteoglycan and growth factors as matrix components. P. aeruginosa and S. aureus bacteria increased their proliferation capacity when they were cultured in stem cells and decellularized matrices. In the designed biofilm model by using P. aeruginosa and S. aureus, it was determined that the decellularized matrices significantly reduced the formation of P. aeruginosa biofilm, but there were no significant differences with S. aureus in the decellularized group compared to the cellular group. According to the results of gene expression analysis, significant decrease was found for rhlR and LasR among P. aeruginosa biofilm related genes that supports cell counting results. All of the icaADBC genes, which are the attachment genes of S. aureus, were highly expressed in the decellularized group. This thesis is the first study that demonstrates the importance of human stem cells and matrix proteins obtained from them, for clinical applications.


Key words: CD146+ cells, stem cells, biofilms, extracellular matrix proteins, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, umbilical cord.