Floresan protein temelli fret biyosensörünün üretilmesi ve geliştirilmesi
Production and development of fluorescent protein based fret biosensor
Yazar: İBRAHİM İNCİR
Danışman: PROF. DR. İSA GÖKÇE ; DR. SEMA BİLGİN
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Förster veya Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET), iki florofor arasında meydana gelen radyoaktif olmayan enerji transferi olarak tanımlanmaktadır. FRET biyosensörlerinde, küçük organik boyalar, floresan proteinler ve kuantum noktacıklar olmak üzere üç ana tipte florofor kullanılmaktadır. Floresan proteinler, genetik olarak kodlanabilmesi ve hücrelerle uyumlu olmasından dolayı yaygın şekilde kullanılmaktadır. Floresan Protein temelli FRET (FP-FRET) biyosensörleri, enzim aktivitesi, hücre içi iyon konsantrasyonu, konformasyonel değişimler, protein-protein etkileşimleri gibi biyolojik süreçlerin görüntülenmesinde kullanılmaktadır. Sunulan tez çalışması ile proteaz aktivitesinin FP-FRET biyosensörü yardımıyla tespit edilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, TEV proteaz enzimi model olarak seçilmiştir. mClover3-mRuby3 ve mNeonGreen-mRuby3 floresan çiftlerini içeren FRET biyosensörlerine ait plazmitlerin tasarımı gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan FP-FRET biyosensörüne ait genin ekspresyonu, rekombinant DNA teknikleri kullanılarak E. coli DH5α hücrelerinde gerçekleştirilmiştir. Ekspresyonu gerçekleştirilen füzyon protein, afinite kromatografisiyle saflaştırılmıştır. Sonuç olarak, TEV proteaz enziminin aktivitesi üretilen FP-FRET biyosensörü kullanılarak spektroflorometre cihazında gerçekleştirilen emisyon ölçümleri ile tespit edilmiştir. Daha sonraki çalışmalarda, önemli biyolojik süreçlerde belirteç olarak kullanılan enzimlerin aktivite tayini için yeni FP-FRET biyosensörlerinin üretilmesi hedeflenmektedir.

Abstract:
Förster or Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET) is defined as non-radioactive energy transfer between two fluorophores. Three main types of fluorophores are used in FRET biosensors, small organic dyes, fluorescent proteins and quantum dots. Fluorescent proteins are widely used because they are genetically coding and compatible with cells. Fluorescent Protein-based FRET (FP-FRET) biosensors are used to display biological processes such as enzyme activity, intracellular ion concentration, conformational changes, protein-protein interactions. With the presented thesis study, it was aimed to determine the protease activity with the help of the FP-FRET biosensor. In this context, TEV protease enzyme was chosen as a model. Plasmids of FRET biosensors containing mClover3-mRuby3 and mNeonGreen-mRuby3 fluorescent pairs were designed. Expression of the gene of the designed FP-FRET biosensor was performed in E. coli DH5α cells using recombinant DNA techniques. The expressed fusion protein was purified by affinity chromatography. As a result, the activity of the TEV protease enzyme was determined by emission measurements performed on the spectrofluorometer device using the FP-FRET biosensor produced. In later studies, it is aimed to produce new FP-FRET biosensors for the activity determination of enzymes used in important biological processes.