İlaç yeniden konumlandırmanın in silico ve in vitro uygulaması
In silico and in vitro applications of drug repositioning
Yazar: SENA KARAOSMANOĞLU
Danışman: PROF. DR. DİLEK BALIK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Meme kanseri dünya çapında kadınlar arasında en sık rastlanan kanser türüdür. Yapılan son kanser istatistiklerine göre; meme kanseri 2017 yılında kadınlarda tanısı koyulan kanserlerin %30'unu oluşturarak, en yüksek görülme sıklığına sahiptir. Bu hastalık, nüfus üzerindeki büyük etkisi nedeniyle, kritik bir sağlık sorununu temsil etmekte ve erken tanı ve tedavisi için moleküler seviyede daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Meme kanseri hastalarının sağ kalım oranını etkileyen en önemli faktörlerden biri metastazdır. Yakın zamanda yayınlanan bir makale ile normal şartlarda sadece beyinde ifade edildiği düşünülen GABAA reseptör alfa3 (Gabra3)'ün meme kanseri hücrelerinin metastazında kritik bir rol aldığı kanıtlanmıştır. Ayrıca Gabra3'ün normal meme epitelyal hücrelerinde ifade edilmediği yapılan birçok çalışma sayesinde bilinmektedir.
Bu tez çalışmasında; MCF-7 ve MDA-MB-436 kanser hücre hatlarındaki Gabra3 ifadesinin incelenmesi ve bir GABA antagonisti olan flumazenil molekülünün MDA-MB-436 meme kanseri hücrelerine karşı etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, Gabra3/Gabrg2 dimeri modellenmiş ve bilgimiz dahilinde, literatürde ilk kez flumazenil ve Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme çalışması yapılmıştır. Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme analizlerinde uygulanan bütün programlar için altyapı olarak Maestro Molecular Modeling Interface 11.3 (Schrödinger Release 2017-3: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2017) kullanılmıştır. Yapılan SP (Standart precision) ve XP (Extra precision) Glide moleküler kenetlenme çalışmaları sonucunda flumazenilin Gabra3/Gabrg2 dimerine XP metotunda -6.229, SP metotu ile ise -7.167 skoru ile bağlandığı belirlenmiştir. Ardından bu bağlanmanın in vitro etkisini gözlemlemek için MCF-7 ve MDA-MB-436 hücrelerinin kültürü yapılmıştır. MDA-MB-436 hücrelerine 0,01 µM, 1 µM, 10 µM ve 100 µM kosantrasyonlarındaki flumazenil, 24 saat boyunca uygulanmış ve bir grup hücreye DMSO (dimetil sülfoksit) uygulanmıştır. Tüm örneklerden sırasıyla yapılan total RNA izolasyonu ve cDNA sentezinin ardından elde eldilen genomik materyal ile kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirilmiş ve hücrelere ait Gabra3 ifadesi ve değişimleri karşılaştırılmıştır. In vitro deneylerin sonucunda; MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ifadesinin MCF-7 hücrelerinin Gabra3 ifadesine göre 20 kat fazla olduğu görülmüştür. Flumazenil uygulamasının tüm konsantrasyonlarında ise MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ekspresyonunun arttığı belirlenmiştir. Yapılan 0,01 μM ve 1 μM flumazenil uygulaması Gabra3 ifadesini MDA-MB-436 kontrol hücrelerine göre sırasıyla 8 ve 10 kat arttırırken, yüksek konsantrasyondaki 10 μM ve 100 μM flumazenil uygulaması ise kontrole kıyasla Gabra3 geninin ifadesini sırasıyla 0,5 ve 1 kat  oranında arttırmıştır. Flumazenilin Gabra3 üzerindeki etkisine bağlı olarak meme kanserinde kullanımının daha ileri çalışmalarla belirlenmesi gerekmektedir.

Abstract:
Breast cancer is the most common cancer type among women worldwide. According to the latest cancer statistics; breast cancer has the highest incidence of cancer in women, 30% of which is diagnosed in 2017. Due to its large impact on the population, this disease represents a critical health problem and requires further research at the molecular level for early diagnosis and treatment of breast cancer. Metastasis is one of the most important factors affecting the survival rate of breast cancer patients. Recently, GABAA receptor alpha3 (Gabra3), which is thought to be expressed only in the brain under normal conditions, has been proven to play a critical role in the metastasis of breast cancer cells and it is also known from many studies that Gabra3 is not expressed in normal breast epithelial cells.
In this thesis; examination of the Gabra3 expression in MCF-7 and MDA-MB-436 breast cancer cell lines and the effect of flumazenil, a GABA antagonist, against these cancerous cells was aimed. For this purpose, Gabra3/Gabrg2 dimer, which is believed to contain the binding site of flumazenil, was modeled and a molecular docking study with the flumazenil compound was performed for the first time in the literature. Maestro Molecular Modeling Interface 11.3 (Schrödinger Release 2017-3: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2017) was used as the background for all programs applied in the molecular docking analysis of the Gabra3/Gabrg2 dimer. The molecular docking scores of Flumazenil and Gabra3/Gabrg2 dimer was confirmed by SP and XP glide docking methods as -7.167 and -6.299 respectively. In addition, MCF-7 and MDA-MB-436 cells were cultured to observe this effect with in vitro studies. Then, MDA-MB-436 cells were treated with 0.01 μM, 1 μM, 10 μM and 100 μM flumazenil and DMSO (dimethyl sulfoxide). Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) with genomic DNA was carried out after total RNA isolation and cDNA synthesis in all samples respectively and the change of Gabra3 expression was compared. As a result of in vitro experiments; It was determined that the Gabra 3 expression of MDA-MB-436 cells was 20 times more than the Gabra3 expression of MCF-7 cells. 0.01 μM and 1 μM flumazenil administration increased the expression of Gabra3 by about 8 and 10-fold respectively compared to MDA-MB-436 control cells. High concentrations of 10 μM and 100 μM Flumazenil increased the expression of the Gabra3 gene by 0.5 and 1.5, respectively. Depending on the effect of Flumazenil on Gabra3, its use in breast cancer metastasis should be further studied.