Koyunlarda bağışıklık mekanizması ile ilişkili bazı genlerin periferal tek çekirdekli kan hücrelerinde (PBMC) real-time ekspresyon analizi yöntemi ile incelenmesi
Investigation of some genes related with immune mechanism by real-time expression analysis method in peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
Yazar: ESMA GAMZE AKSEL
Danışman: PROF. DR. BİLAL AKYÜZ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Zootekni (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Akkaraman koyunları = Akkaraman sheep ; Genler = Genes ; Koyunlar = Sheep ; Lipoteikoik asit = Lipoteichoic acid ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; İmmün sistem = Immune system ; İmmünite = Immunity

Özet:
Gelecekte doğal kaynaklarda azalma ve küresel ısınma sebebiyle entansif hayvan yetiştiriciliğinden ekstansif hayvan yetiştiriciliğine doğru yönelim olacağı düşünülmektedir. Dolayısıyla ekstansif hayvancılığın sürdürülmesi için yaşadığı bölgelere adapte, olumsuz çevre koşullarına dayanıklı ve hastalıklara dirençli yerli hayvan ırklarının önemi giderek artacaktır. Bu çalışmada Akkaraman ırkı kuzulara bağışıklık sistemini uyaran Lipoteikoik asit (LTA, 50 μg/kg), Lipopolisakkarit (LPS, 20 μg/kg) ile LTA-LPS karışımı (50 μg/kg + 20 μg/kg) ve PBS (kontrol, 250 μl) intranazal yolla uygulanmıştır. Aynı bakım ve besleme şartlarında bulunan toplam 28 baş Akkaraman ırkı (üç aylık) kuzu LTA (n=7), LPS (n=7), LTA+LPS (n=7) ve kontrol grubu  (n=7) olacak şekilde dört gruba ayrılmıştır.  Uygulama sonrası 24. saat ve 7. günde izole edilen periferal tek çekirdekli kan hücrelerinde (Peripheral blood mononuclear cells, PBMC) immun yanıtın oluşumunda görev alan TLR2, TLR4, MyD88, TRAF6, TNF-α,  IL-1ß, IL-6, IL-10, NF-κß, IFNγ genlerinin ve house-keeping genlerden GAPDH ve ß-actin'e göre ekspresyon farklılıklarının incelenmesi hedeflenmiştir. Yapılan qRT-PCR analizi sonucunda; 24. saatte izole edilen PBMC hücrelerine ait mRNA ekspresyon analizinde tüm gruplarda TLR2 [LPS (P<0.05) ve LTA+LPS (P<0.01)] TLR4 [LTA+LPS (P<0.05)], TNF-α, IL-10 [LTA+LPS (P<0.05)] ve IFNγ genlerine ait ekspresyon verilerinde artış belirlenirken bu genlerin 7. gün ekspresyon seviyelerinde azalış gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre Akkaraman ırkı kuzularda intranazal yolla uygulanan LTA ve LPS dozlarının ayrı ayrı ve bir arada uygulanmasının özellikle TLR2 ve TLR4 gen ekspresyonunda 24. saatte artış sağladığı dolayısıyla planlanan in vivo deneysel uygulamanın koyun PBMC'lerini başarılı bir şekilde etkinleştirdiği belirlenmiştir. Koyun ırkları arasında hastalıklara dirençliliğin belirlenmesi için farklı ırkların çalışıldığı daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır.  Yapılan deneysel uygulama dozları farmakoloji ve mikrobiyoloji alanlarında planlanacak in vivo ve in vitro ilaç ve aşı geliştirilmesi çalışmalarına yardımcı olabilecektir. Ayrıca elde edilen sonuçlara göre hem çiftlik hayvanlarında görülen solunum sistemi enfeksiyöz hastalıkları yönünden hem de koyunun biyomodel hayvan olması bakımından insan ile ilgili planlanacak çalışmalara da katkı sağlayabileceği sonucuna varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: Akkaraman kuzu; lipopolisakkarit; lipoteikoik asit; bağışıklık,  periferal tek çekirdekli kan hücresi.

Abstract:
It is expected that there will be a shift from intensive animal husbandry to extensive animal husbandry due to the decrease in natural resources and global warming in the future. Therefore, in order to maintanence of extensive animal husbandry will be achieved with indigenous breeds that are resistant to disease, adapted to their region and adapted adverse conditions. In this study, a mixture of Lipoteichoic acid (LTA, 50 μg/kg), Lipopolysaccharide (LPS, 20 μg/kg), LTA+LPS mix (50 μg/kg 20 μg/kg) and PBS (control, 250 μl) was intranasally administered to Akkaraman breed lambs. A total of 28 domestic Akkaraman breed lambs (three month years) with the same feeding and raising conditions were divided into four groups as LTA (n=7), LPS (n=7), LTA+LPS (n=7) and control group (n=7). The aim of this study was to investigate the expression levels of TLR2, TLR4, MyD88, TRAF6, TNF-α,  IL-1ß, IL-6, IL-10, NF-κß, IFNγ genes, which were detected on the immune mechanism pathway in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated at 24th hour and 7th day after the administration of the mixture, compared to GAPDH and ß-Actin house-keeping genes. As a result of qRT-PCR analysis, in mRNA expression analysis of PBMC cells isolated at 24th hour, there was an increase in TLR2 (LPS (p<0.05) ve LTA+LPS (p<0.01), TLR4 (LTA+LPS (p<0.05), TNF-α, IL-10 (LTA+LPS (p<0.05) and IFNγ genes in all groups. Also expression values decreased 7th day in this genes. According to the results, intranasal administration of LTA and LPS in Akkaraman lambs were effective especially in TLR2 and TLR4 genes and therefore it was determined that in vivo experimental study activated sheep immune system. More studies with different breeds are needed to determine disease resistance among sheep breeds. Experimental application doses may help in the development of in vivo and in vitro drug and vaccine studies in the fields of pharmacology and microbiology. In addition, according to the results obtained, it was concluded that both the respiratory system diseases seen in farm animals and the sheep being a biomodel animal could contribute to planned human studies.

Keywords: Akkaraman lambs; lipopolysaccaride; lipoteichoic acid; immunity; peripheral mononuclear blood cells.