Bacıllus thuringiensis subsp. Israelensis'in biyoinsektisid (endotoksin) üretme kapasitesinin arttırılması amacıyla fosfat metabolizmasının değiştirilmesi
Changing the phosphate metabolism of Bacillus thuringiensis Subsp. israelensis in order to increase bioinsectiside (endotoxin) production capacity
Yazar: TUĞRUL DORUK
Danışman: DOÇ. DR. SEDEF TUNCA GEDİK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Bakteri, fungus, bitki ve hayvan olmak üzere her çeşit canlıda bulunan Polifosfat (poliP), yüzlerce fosfat molekülünün yüksek enerjili anhidrid bağlarıyla birleşmesinden meydana gelen düz yapılı bir polimerdir. Polifosfat, ?poliP kinaz? enzimi (PPK) tarafından ATP?nin terminal fosfatının substrat (alttaş) olarak kullanılmasıyla sentezlenir, ekzopolifosfataz (PPX) enzimiyle de inorganik fosfata parçalanır. Çalışılan mikroorganizmalarda çok önemli fonksiyonları olmasına rağmen (enerji deposu, stres faktörlerine karşı dirençlilik, gen ifadesinin düzenlenmesi vb.), literatürde polifosfat polimerinin Bacillus?daki rolüyle ilgili mevcut bilgimize göre tek bir çalışma bulunmaktadır. 2004 yılında Shi ve ark., B. cereus?un poliP metabolizmasından sorumlu genlerini (ppk, ppx, pap) delesyona uğratmışlar ve poliP?nin bu bakterinin hareketliliği, biyofilm oluşturması ve sporulasyonu için gerekli olduğunu göstermişlerdir. ?-endotoxin üreticisi Bacillus thuringiensis, biyolojik böcek kontrol ajanı olarak kullanılmaktadır. Bazı mineral elementlerin özellikle kültür besiyerine eklenen inorganik fosfatın B. thuringiensis toksin biyosentezinde çok önemli bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir [Banerjee-Bhatnagar, 1999; Kurt ve ark., 2005]. Bu çalışmada, hipertoksik rekombinant suş oluşturulması için Bti?in fosfat metabolizmasının değiştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, B. thuringiensis?in ppk ve ppx genleri ayrı ayrı ve birlikte olacak şekilde klonlanmış ve genlerin yüksek ifadelerinin endotoksin üretimi üzerine etkisi araştırılmıştır. SDS-PAGE sonuçlarına göre ppk genini yüksek seviyede ifade eden rekombinant suşun yaban suşa göre daha fazla endotoksin ürettiği gözlenmiş ve bu rekombinant suşta endotoksin üretimi için optimum koşullar (pH, sıcaklık, karbon kaynağı) belirlenmiştir. Ayrıca, aynı rekombinant suşun besiyerindeki fosfatı yaban suşa göre daha hızlı uzaklaştırdığı, vaside daha dayanıklı olduğu ve daha fazla polifosfat biriktirdiği gözlenmiştir. Stres düzenleyici genleri kontrol eden sigB ile ?-endotoksin genlerini düzenleyen sigE?nin ifadelerinin de ppk genini yüksek seviyede ifade eden bu suşta fazla olduğu bulunmuştur. PoliP metabolizması ve biyoinsektisit üretimi arasındaki ilişkiyi aydınlatmak amacıyla, çalışma kapsamında, ppk geninden yoksun Bti suşu da oluşturulmuştur. Rekombinant suşlardan elde edilen proteinlerin larvasidal aktiviteleri 2. evre Culex quinquefasciatus larvaları üzerinde gerçekleştirilmiş ve ppk genini yüksek seviyede ifade ettiği düşünülen rekombinant suşun larvasidal aktivitesinin yaban tipe göre yaklaşık 7.7 kat, ppk geni olmayan rekombinant suşun larvasidal aktivitesinin ise yaban tipe göre yaklaşık 2.4 kat daha fazla olduğu bulunmuştur. Bilgimiz dahilinde,Bti?in poliP metabolizması ile biyoinsektisid biyosentezi arasındaki ilişki ilk kez bu çalışmayla ilişkilendirilmiştir.Anahtar Kelimeler: Polifosfat, ppk, delesyon, Bacillus thuringiensis, biyoinsektisidvi

Abstract:
Polyphosphate (polyP) which is a linear polymer consisting of tens to hundreds of phosphate molecules joined together by high-energy anhydride bonds. PolyP is synthesized by polyP kinase (PPK) using the terminal phosphate of ATP as the substrate. It is degraded to phosphate by exopolyphosphatase (PPX) enzymes. Although polyP polymer has very important functions (energy storage, resistance to stress factors, regulation of gene expression etc.) in the microorganisms studied, to our knowledge there is only one study about the role of this polymer in Bacillus. In 2004 Shi et al., deleted the genes (ppk, ppx, pap) responsible for the polyP metabolism and showed that polyP is necessary for the motility, biofilm formation and sporulation in this microorganism. Bacillus thuringiensis, which produce ?-endotoxin, used for biological control of insects. Some mineral elements, especially phosphate, which were added into the culture media, has been shown to play very important stimulatory effect on toxin production [Banerjee-Bhatnagar, 1999; Kurt et al., 2005]. In this study, it is aimed to obtain hypertoxic recombinant strains by changing the phosphate metabolism of Bacillus thuringiensis. For this purpose; ppk and ppx genes of B. thuringiensis were cloned separately and together and the effect of overexpression of these genes on endotoxin production were determined. According to SDS-PAGE results the ppk overexpressing cells produce more endotoxin than the wild type. Optimum conditions (pH, temperature, carbon source) for toxin production by this recombinantstrain were determined. Furthermore, when compared to wild type, recombinantstrain absorbs phosphates from media faster, more acid tolerant and accumulate more polyphosphate inside the cells. It has also been shown that the expression levels of sigB, which control stress regulating genes, and sigE, which regulates ?-endotoxin genes, were increased in the ppk overexpressing strain. viiIn order to find the relation between polyP metabolism and bioinsecticide production, a Bti strain without ppk gene was also obtained in this study. Larvicidal activity of recombinant strains were determined againts second instar Culex quinquefasciatus larvae. When compared to the wild type strain, larvicidal activities of the recombinant strain which overexpress ppk gene and the recombinant strain in which ppk gene is deleted, were increased about 7.7 and 2.4 fold, respectively. To our knowledge this is the first study which relates polyP metabolism with bioinsecticide biosynthesis.Keywords: Polyphosphate, ppk, deletion, Bacillus thuringiensis, bioinsecticide.