Midye (Mytilus galloprovincialis Lam.) hepatopankreasından tiyoredoksin redüktaz enziminin saflaştırılması ve kinetik özelliklerinin incelenmesi
Purification of thioredoxin reductase from the hepatopancreas of the mollusc (Mytilus galloprovincialis Lam.) and investigation of its kinetic properites
Yazar: ESRA ACAR
Danışman: YRD. DOÇ. DR. NURTEN ÖZSOY
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzimler = Enzymes ; Hepatopankreas = Hepatopancreas ; Kinetik parametreler = Kinetic parameters ; Midyeler = Mussels ; Mytilus galloprovincialis = Mytilus galloprovincialis ; Tiyoredoksin = Thioredoxin ; Tiyoredoksin redüktaz = Thioredoxin reductase

Özet:
Tiyoredoksin redüktaz (TrxR, EC 1.6.4.5), tiyoredoksinin (Trx) indirgenmesini katalizleyen homodimerik bir flavoenzimdir. TrxR?nin DNA sentezi, redoks sinyali, antioksidatif  savunma, selenyum metabolizması ve apoptozun düzenlenmesi gibi birçok hücresel fonksiyonları vardır. 
Tiyoredoksin redüktaz, bakteri, bitki ve memeliler gibi birçok türden saflaştırılmasına rağmen, bugüne kadar  M. galloprovincialis Lam. hepatopankreasından TrxR?nin saflaştırılmasına ilişkin bir bilgi literatürde yer almamaktadır. Bunu göz önünde bulundurarak bu çalışmada Mytilus galloprovincialis L. midye türünün hepatopankreas ham ekstresinden enzimin saf olarak elde edilmesi ve bazı kinetik özelliklerinin incelenmesi amaçlandı. 
Yenikapı deniz kıyısından toplanan midyelerin kabukları çıkartıldıktan sonra hepatopankreas dokusu ayrılarak homojenize edildi. Tiyoredoksin redüktaz aktivitesi gösteren fraksiyon, midye hepatopankreas homojenizatının santrifüje edilmesiyle elde edilen ham ekstreden % 80 amonyum sülfat konsantrasyonunda çöktürülmesi suretiyle ayrıldı, diyaliz edildi ve ilk önce DEAE-Sefaroz CL-6B anyon değiştirici kolonundan  10 mM TE tamponu (pH 7.5) ile daha sonra 2',5'-ADP-agaroz kolonundan 400 mM NaCl içeren 10 mM TE tamponu (pH 7.5) ile elüe edilerek saflaştırıldıktan sonra  bazı kinetik özellikleri incelendi.
Enzimin en yüksek aktivitesini pH 7.0 değerinde gösterdiği, optimum temperatürünü ise 60 oC olduğu belirlendi, NADPH ve DTNB?e karşı gösterdiği en yüksek reaksiyon hızının(Vmax) sırasıyla  4.82 ?mol/dak/mg ve 1.32 ?mol/dak/mg , Km değerinin ise sırasıyla  85 ?mol ve 193 ?mol olduğu bulundu.

Abstract:
Thioredoxin reductase (TrxR, EC 1.6.4.5) is a homodimeric flavoenzyme that catalyzed the reduction of thioredoxin (Trx). TrxR is involved in many cellular functions including DNA synthesis, redox signaling, antioxidative defence, selenium metabolism and regulation of apoptosis. 
Although TrxR has been purified and characterized from different bacteria, plants and mammalian organisms, a survey of the literature revealed that no studies on the purification and characterization of TrxR from mussle (Mytilus galloprovincialis Lam.) have been undertaken. Accordingly, our objective was to isolate and highly purify the enzyme from the hepatopancreas tissue of  Mytilus galloprovincialis Lam. and examine some of its kinetic properties. 
After removing the shells of the mollusc collected from Yenikapi seabord, the hepatopancreas tissue was separated and homogenized. The crude extract of the heparopancreas tissue obtained by centrifugation was precipitated at 80 % ammonium sulphate concentration. The fraction applied on DEAE-Sepharose CL-6B column was eluated with 10 mM TE buffer pH (7.5) and further purified by elution with 400 mM NaCl in 10 mM TE buffer (pH 7.5) on 2',5'-ADP-agarose chromatography column. Kinetic properties of the purified enzyme were investigated.  
Optimum pH and temperature were found to be 7.0 and 60oC, respectively. Km and Vmax for NADPH were found to be 12.5 ?mol and 25 ?mol/min, respectively, Km and Vmax for DTNB were found to be 193 ?mol and 1.32 ?mol/min/mg respectively.