Pseudomonas aeruginosa kökenlerinde lipid metabolizması ve antibiyotik direncinde rol alan ACPP ve mMEXA genlerinin antisens oligonükleotitler ile susturulması
Silencing acpp and MEXA genes which take part in lipid metabolism and antibiotic resistance in pseudomonas aeruginosa isolates BY antisense oligonucleotids
Yazar: YAMAÇ TEKİNTAŞ
Danışman: PROF. DR. MİNE HOŞGÖR LİMONCU
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Antisens elementler (genetik) = Antisense elements (genetics) ; Gen susması = Gene silencing ; Genler = Genes ; Lipid metabolizması = Lipid metabolism ; Oligonükleotidler = Oligonucleotides ; Pseudomonas aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-bakteriyel = Drug resistance-bacterial

Özet:
Antisens tedavi stratejisi, çeşitli genlerin protein oluşturmadan susturulması amacıyla, oligodeoksiribonükleotitlerin kullanılmasıdır. Antisens mekanizma, hedef mRNA'ya oligonükleotit dizisinin Watsons-Crick baz eşleşme yoluyla bağlanması sonucu gerçekleşmektedir. Bağlanmadan sonra iki temel yolak, ilgili genin protein oluşumunu engeller. Bunlardan ilki, oligonükleotitin bağlandığı bölgede RNaz H aracılı degredasyon oluşturmasıdır. RNaz enzimi ile parçalanan RNA dizisinden translasyon mümkün olmadığı için protein oluşumu engellenir. İkincisi ise oligonükleotitin bağlanarak ilgili mRNA bölgesini kapatmasıyla oluşur. Böylece translasyon (ribozomun gen dizisini okuması) sterik olarak engellenir, posttranskripsiyonel işlemler inhibe edilir ve gen, ürün oluşturamaz.
Bu tezin amacı, ülkemizde ve dünyada direnç oluşumu nedeniyle tedavisi gittikçe zorlaşmakta olan Pseudomonas aeruginosa kökenlerine karşı uygun antisens dizi ve formülasyonu kullanarak, bakteri için esansiyel olan açil taşıyıcı protein (Acyl carrier protein- acpP) geninin ve bakteriye antimikrobiyallere karşı direnç kazandıran mex grubu dışa atım pompasına (efluks pompası) ait mexA geninin susturulmasıdır. Bakterinin lipid biyosentezi için esansiyel bir protein olan acpP'nin eksikliği, bakterinin ölümüne sebep olacağından bakteri üremesi engellenecek, pompa geninin inhibisyonuyla da direncin önüne geçilmesi mümkün olacaktır. Bu ajanların P. aeruginosa hücresi içine girişlerini sağlamak amacıyla literatür incelendiğinde, lipozom ve peptid konjugasyonu gibi yöntemlerin denendiği gözlenirken, niozom formülasyonlarının kullanımına rastlanılmamıştır. Çalışmamız kapsamında niozomların bu amaçla kullanımı özgün değerlerden birisidir. Görece yeni bir tedavi yaklaşımı sayılabilecek bu yöntemin, mikrobiyoloji alanında bakteri enfeksiyonlarına karşı etkilerini araştıran çalışmalara ülkemizde rastlanılmamıştır. 
Proje kapsamında P. aeruginosa'da bulunan acpP ve mexA genlerinin antisens oligonükleotitler kullanılarak susturulması ve böylece bakteri üremesinin ve direnç mekanizmasının engellenmesi için gerekli çalışmalar yapıldı. Çalışmamızda Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı'nda izole edilen P. aeruginosa kökenlerinin çoklu antibiyotik direnci VITEK MS ile belirlendi ve hedef alınacak genlerin varlığı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi ile saptandı. Bu çalışmalarda P. aeruginosa ATCC 27853 ve ilgili genleri içeren kontrol kökenleri kullanıldı. İstenen özellikteki kökenler, PZR temelli Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PZR (ERIC-PZR) ile genotiplendirildi. Farklı genotipe ait oldukları saptanan 11 adet P. aeruginosa kökeni ile çalışıldı. Antisens oligonükleotitleri belirlemek amacıyla hedef alınan genlerin DNA dizi analizi yapıldı. Elde edilen dizi analizi sonuçları, gen bankaları ve literatür bilgileri beraber değerlendirilerek P. aeruginosa bakterisi için kullanılacak antisens oligonükleotitler belirlendi. Antisens oligonükleotitlerin bakteri hücresi içine geçişini arttırabilmek amacıyla niozom formülasyonları hazırlandı. Elde edilen formülasyonun minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (Clinical and Laboratory Standarts Institute, CLSI) önerileri doğrultusunda sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle belirlendi. Susturulan acpP ve mexA genlerinin ekspresyon düzeyleri gerçek zamanlı nicel RT-PZR ile araştırıldı. 
VITEK MS sonuçlarına göre farklı kliniklerden 41 adet ÇİD izolat çalışmanın ilk aşamaları için seçildi.  Bu izolatlardan 38 tanesinin acpP ve mexA genlerini içerdiği saptandı ve bu izolatların ERIC-PZR sonuçlarına göre, 10 ana klon ve bir alttip olmak üzere 11 farklı ailede yer aldıkları tespit edildi. Her bir aileden seçilen temsilciler için dizi analizleri yapıdı ve acpP geninde mutasyona rastlanmadı. Bununla birlikte mexA geninde sessiz mutasyonlar belirlendi. Tasarlanan ASO dizilerini hedeflemek amacıyla dokuz adet niozom formülasyonu hazırlandı. Sadece F1 ve F5 formülasyonlarının ASO dizileriyle kompleks oluşturduğu saptandı. Bununla birlikte F5 formülasyonunun daha yüksek konsantrasyonda ASO dizisi taşıma kapasitesi olduğu tespit edildi ve sonraki çalışmalarda F5 formülasyonu kullanıldı. Kompleks hale getirilen bu dizilerin RT-PZR sonuçlarına göre ASO-1 ASO-2 ve ASO-6 için sırasıyla altı, dört ve üç izolatta anlamlı gen inhibisyonu saptandı. Diğer dizilerde etkinlik görülmedi.

Anahtar Kelimeler: Antisens, Pseudomonas aerguinosa, RT-PZR

Abstract:
The antisense treatment strategy is to use oligodeoxyribonucleotides for the purpose of silencing various genes before they start producing proteins. The antisense mechanism is established by binding oligonucleotide strands to the target mRNA by way of Watsons-Crick base pairing. After binding, two basic pathways prevent the relevant gene from producing protein. The first of these is the formation of RNase H-mediated degradation by the oligonucleotide at the site of binding. Production of protein is hindered because translation becomes impossible from the gene strand that was broken down by the RNase enzyme. The second occurs when the oligonucleotide binds and closes the relevant gene site. In this way, ribosome is sterically hindered from reading the gene strand, posttranscriptional procedures are hindered and the gene cannot make production. 
The objective of this project is to use appropriate antisense strands and formulation against Pseudomonas aeruginosa strains to silence the Acyl carrier protein (acpP) gene, which is essential for the bacterium, and the mexA gene of the mex group efflux pump, which increases the resistance of bacterium to antimicrobials. Since the lack of acpP, an essential protein for the lipid biosynthesis of the bacterium, will result in the death of the bacterium, proliferation of the bacterium will be prevented and its resistance will be eliminated through the inhibition of the pump gene. It is observed in the literature that methods such as liposome and peptide conjugation have been tried to enable these agents enter P. aeruginosa cells, but we have not encountered any use of niosome formulations. Use of niosomes for this purpose will be unique to our project.
Studies exploring the effects of this method, which can be considered as a relatively new treatment approach, have not been encountered in our country.
In this project, silencing the acpP and mexA genes was made in P. aeruginosa by using antisense oligonucleotides and in this way inhibiting bacterial growth and resistance mechanism. In this study, antibiotic resistance patterns were determined by VITEK MS in P. aeruginosa strains isolated from Ege University Hospital, Medical Microbiology Laboratory and the presence of the targeted genes were revealed through the polymerase chain reaction (PCR) method. In these methods, P. aeruginosa ATCC 27853 and positive controls which harbouring relevant genes were used. The strains that meet the above criteria were genotyped using PCR based Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR). Ten P. aeruginosa strains that were found to belong to different genotypes were used. DNA sequence of targeted genes were determined by DNA sequencing for designing the antisense oligonucleotides. The results of this sequence analysis were assessed in line with gene banks and literature information and the oligonucleotides specific to P. aeruginosa bacterium were identified. Niosome formulations were prepared to enhance penetration of antisense oligonucleotides into bacterial cells. The Minimum Inhibitor Concentration (MIC) values of the formulations were determined using the liquid microdilution method in line with the recommendations of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). The expression levels of the silenced acpP and mexA genes were explored with real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR). The effectiveness of the efflux pump was investigated with the accumulation test and the MIC values were determined again in the presence of the antisense formulation to see the change in resistance level. 
Based on the results of VITEK MS, 41 MDR isolates from different clinics were selected for the first stages of study. 38 of these isolates were found to contain the acpP and mexA genes, and these isolates were found to belong to 11 different families, 10 major clones and one subtype according to ERIC-PCR results. Sequence analyzes were performed for the selected members from each family, and no mutation was found in the acpP gene. However, silent mutations were detected in the mexA gene. Nine niozom formulations were prepared to target the designed ASO sequences. Only F1 and F5 formulations were found to be complexed with ASO sequences. It was, however, found that the combined F5 formulation had a higher concentration of ASO sequence carrying capacity. Thus F5 formulation was used in the next stages of study. Significant gene inhibition was detected at the six, four and three isolates for ASO-1 ASO-2 and ASO-6, respectively, according to the RT-PCR results of these complexed sequences. No activity was seen in other series

Keywords: Antisense, Pseudomonas aerguinosa, qPCR