Servi polenlerinde tanımlanmış alerjenik pektat liyazın biyoteknolojik üretimi
Biotechnological production of allergenic pectate lyase identified in cypress pollens
Yazar: NARMİN MİZAMAMMADLİ
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Cupressus sempervirens = Cupressus sempervirens ; Polenler = Pollen

Özet:
Polen alerjisi dünyada ve ülkemizde insan sağlığını olumsuz etkileyen, ekonomik kayıplara neden olan ciddi bir sağlık sorunudur. Alerjenik polenler çoğunlukla üst solunum yollarını ve gözleri etkilese de astım gibi daha ciddi hastalıkları tetikleyebilir. Bu nedenle polen alerjisinde erken teşhis ve etkin tedavi büyük önem taşır. Son yıllarda tüm alerjik hastalıklar gibi polen alerjisi de hava kirliliği, küresel ısınma, yoğun kentleşme gibi çevresel faktörler nedeniyle dramatik bir şekilde artmıştır. Alerjik rinit ve konjonktivit gibi polen alerjilerinin tanı ve tedavisinde kullanılacak spesifik ve standardize yeni ürünlere acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Rekombinant alerjenler, polen alerjisinin tanı ve tedavisinde umut vaad etmektedir.  Ağaç polenleri çok sayıda alerjen protein içerir. Galakturonik asit içeren polisakkarit zincirlerini parçalayan bir enzim olan ve servi (Cupressaceae) polenlerinde bulunduğu bilinen pektat liyaz alerjen proteinlerden biridir.  Bu çalışmada, yerel servi (Cupressus sempervirens) poleninde bulunan pektat liyazın (Cup s 1) Escherichia coli'de rekombinant olarak üretimi ile daha sonraki çalışmalarda ve uygulamalarda kullanılacak bir ürün elde edilmesi amaçlanmıştır. Plazmid (pQE-2) üretimi için E. coli DH5α ırkı, rekombinant protein üretimi için ise, E. coli BL21 (DE3) ırkı kullanılmıştır. Servi polenlerinden izole edilen total RNA'dan PZR ile cDNA kütüphanesi oluşturulmuş ve kalıp olarak cDNA'nın kullanıldığı RT-PZR ile histidin etiketli Cup s 1 geni amplifiye edilmiş ve plazmidle ligasyonu sağlanmıştır. pQE-2 plazmidi ve rekombinant plazmid ısı şoku yöntemi ile E.coli'ye aktarılmış ve transformant hücreler koloni PZR ile seçilerek çoğaltılmıştır. 
Transformant hücreler 1 mM IPTG (izopropiltiyo-β-D-galaktopiranozid) içeren besi ortamında çoğaltılmış, ardından çöktürülmüş ve homojenize edilmiştir. Rekombinant protein nikel afinite kromatografisi ile saflaştırılmış ve jel elektroforeziyle analiz edilmiştir. Saf rekombinant proteinin alerjenitesi Western blot analiziyle doğrulanmıştır.  Sonuç olarak tanıda veya immünoterapide kullanılma potansiyeli olan alerjenik servi poleni pektat liyazının biyoteknolojik üretimi başarıyla gerçekleştirilmiştir

Abstract:
Pollen allergy is a serious health problem that has negative effects on people's health and causes economic losses in the world and in our country. Although allergenic pollens mostly affect the upper respiratory tract and eyes, they can trigger more serious diseases such as asthma. Thus early diagnosis and effective treatment are of great importance in pollen allergy. In recent years, pollen allergy, like all allergic diseases, has increased dramatically due to environmental factors such as air pollution, global warming, and intense urbanization. There is an urgent need for specific and standardized new products to be used in the diagnosis and treatment of pollen allergies, such as allergic rhinitis and conjunctivitis. Recombinant allergens show promise in the diagnosis and treatment of pollen allergy.
Tree pollens contain many allergen proteins. Pectate lyase, an enzyme that breaks down polysaccharide chains containing galacturonic acid, found in cypress (Cupressaceae) pollens, is one of the allergenic proteins.
In this study, obtaining a product that will be used in further studies and applications was aimed by recombinant production of the pectate lyase (Cup s 1) found in local cypress (Cupressus sempervirens) pollen in Escherichia coli. DH5α strain was used for plasmid (pQE-2) production, and E. coli BL21 (DE3) strain was used for recombinant protein production. A cDNA library was created by PCR from total RNA isolated from cypress pollen, and histidine-labeled Cup s 1 gene was amplified and ligated with plasmid by RT-PCR using cDNA as a template. Transfer of pQE-2 plasmid and recombinant plasmid to E.coli was performed by heat shock method and transformant cells were grown following their selection by colony PCR. 
Transformant cells were grown in a medium containing 1 mM IPTG ("isopropylthio-β-D-galactopyranoside") followed by precipitated and homogenized. The recombinant protein was purified by nickel affinity chromatography and analyzed by gel electrophoresis. The allergenicity of the pure recombinant protein was confirmed by Western blot analysis.
As a result, biotechnological production of allergenic cypress pollen pectate lyase, which has the potential to be used in diagnosis or immunotherapy, has been successfully achieved.