Kentsel katı atık düzenli depolama tesisi sızıntı suyunda Yarrowia lipolytica'nın çoğaltılması
Growth of Yarrowia lipolytica in sanitary landfill leachate
Yazar: SARE KARŞİT
Danışman: DOÇ. DR. MAHMUT ALTINBAŞ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Çevre Bilimleri, Mühendisliği ve Yönetimi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering
Dizin: Katı atıklar = Solid wastes ; Kentsel atıklar = Urban wastes ; Maya hücreleri = Yeast cells ; Sızıntı suyu = Leachate

Özet:
Dünya'da her yıl iki milyar tondan fazla katı atık üretilmektedir. Artan nüfus ve yaşam standartları arasındaki dengenin sürdürülebilir bir seviyede tutulabilmesi, toplulukların refahı ve çevresel sağlığımız için üretilen katı atığın bertaraf, geri dönüşüm ve kazanım süreçleri büyük önem taşıyan konulardan biridir. Kentsel katı atık yönetimi, geri dönüşüm, yakma, atıktan enerjiye dönüştürme, kompostlaştırma veya düzenli depolama yöntemlerini içermektedir. Dünya çapında birçok belediye tarafından katı atık bertarafı için en çok tercih edilen yöntem düzenli depolamadır.  
Katı atık düzenli depolama sahalarında, atıkların sahip olduğu nem oranı ve lokasyon etkisi ile depolama alanına düşen yağış miktarına bağlı olarak sızıntı suyu oluşumu görülmektedir. İçeriğinde çözünmüş organik maddeler, inorganik bileşikler, krom (Cr3+), nikel (Ni2+), bakır (Cu2+), çinko (Zn2+), kadmiyum (Cd2+), cıva (Hg2+) ve kurşun (Pb2+) gibi ağır metaller ve ksenobiyotik organik bileşikleri barındırması sebebi ile çevresel açıdan büyük ölçüde problem oluşturan sızıntı suyunun arıtılması gerekmektedir. 
Günümüzde enerjinin sürdürülebilir yöntemler ile elde edilmesi ihtiyacı her geçen gün artmaktadır. Son on yılda, mevcut enerji talebini karşılamak ve aynı zamanda çevresel bozulmayı azaltmak amacıyla biyokütle bazlı biyoyakıtların üretimine olan ilgide büyük bir artış olmuştur. Daha önceleri, biyodizel üretimi için bitkisel yağlar ve hayvansal yağlar kullanılmasına karşın günümüzde mikroorganizmalardan elde edilen lipid gibi yenilenebilir kaynaklar, gelişen biyodizel endüstrileri için büyük ilgi görmektedir. Hammadde maliyetini en aza düşürmek amacıyla farklı çalışmalar yürütülmektedir. 
Farklı atıksu kaynaklarında yapılan önceki çalışmalara göre, Y. lipolytica lipid depolama özelliğine göre en çok tercih edilen mikroorganizma türüdür. Bu çalışmada, Y. lipolytica'nın sızıntı suyunda yetiştirilerek maksimum büyümesinin sağlanması amacıyla optimum ortam koşullarının belirlenmesi ve aynı zamanda sızıntı suyunun kirlilik gideriminin sağlanması amaçlanmıştır. Genellikle biyolojik arıtma sistemlerinde gözlendiği gibi fosfor limitasyonu biyolojik çoğalmanın kısıtlayıcı olduğu bir konudur. Y. lipolytica'nın mikrobiyal büyümesinde de fosfat limitasyonuna rastlanması sebebiyle bu çalışmada sızıntı suyu ortamına fosfat ilavesinin etkileri incelenmiştir. 
Y. lipolytica, mikrobiyal büyümesi için optimum ortam şartlarının belirlenmesi amacıyla fosfat kaynağı olarak H3PO4 ve K2HPO4 ilaveli/ilavesiz ve maya özütü ilaveli/ilavesiz farklı konsantrasyonlarda sızıntı suyu içeren besi yerlerinde yetiştirilmiştir. Ek olarak, sızıntı suyunda bulunan kirleticilerin giderim verimleri de değerlendirilmiştir. Yapılan çalışmalarda, Y. lipolytica MUCL 28849 kodlu suşu kullanılmıştır. Tüm aklimasyon denemelerinde, Y. lipolytica'nın YPD besi yerinde ve fosfat kaynağı veya maya özütü ilavesiz sızıntı suyu ortamında büyümesi şahit olarak izlenmiştir. Tüm ortamların pH değeri, aklimasyon öncesinde 5,8±0,1'e ayarlanmıştır. Aşılama sırasında, Y. lipolytica'nın mikrobiyal büyümesi, sürekli olarak OY600 ölçümü ile izlenmiştir. Aşılama öncesi ve sonrasında UAKM/AKM, KOİ, TKN, NH3-N, TP ve Orto-P gibi konvansiyonel parametre analizleri yapılmıştır. 
Çalışma üç aşamalı olarak yürütülmüştür. Birinci aşamada, %70 oranında seyreltilmiş sızıntı suyuna belirli konsantrasyonlarda H3PO4 çözeltisi ilave edilmesi ile Y. lipolytica'nın maksimum mikrobiyal büyümesinin kaydedilmesi amacıyla çalışmalar yürütülmüştür. Yapılan önceki çalışmalara göre, sızıntı suyunun %70 seyreltme oranında besi yeri olarak kullanımı, mikrobiyal büyümenin en iyi şekilde gözlemlendiği seyreltme oranı olarak değerlendirilmiştir. Besi yerlerine ilave edilen fosfor konsantrasyonları, Y. lipolytica' nın fosfor konsantrasyonunun katları olacak şekilde ayarlanmıştır. Farklı aklimasyon aşamalarında farklı oranlarda fosfat ilavesi ile hazırlanmış besi yerlerinde çalışılmıştır. Besi yerlerine 105 mg/L (P/2), 210 mg/L (P), 420 mg/L (2*P), 840 mg/L (4*P), 1680 mg/L (8*P) konsantrasyonlarında fosfor çözeltileri ilave edilerek maksimum büyümeyi sağlayan ortam şartları araştırılmıştır. Y. lipolytica çoğalmasını izleyebilmek için çalışma boyunca günlük olarak optik yoğunluk ve pH ölçümü yapılmış olup inkübasyonun başında ve sonunda ise konvansiyonel parametre analizleri yapılmıştır. 
Farklı oranlarda fosfat ilavesi ile hazırlanmış besi yerleri ile yapılan çalışmada ölçülen en yüksek optik yoğunluk değeri 7,18 olarak P/2 no'lu besi yerinde, 2.nesil aklimasyon aşamasında kaydedilmiştir. Şahit olarak izlenen YPD besi yerinde ise ölçülen en yüksek optik yoğunluk değeri 47,2 olarak kaydedilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, fosfor ilavesi ile belirgin ve tekrarlanabilirliği kaydedilmiş, tutarlı bir mikrobiyal büyümeye rastlanılmamıştır, aksine P ilavesiz besi yerlerinde daha iyi büyüme değerleri gözlemlenirken, ilave edilen fosforun biyokütleye olumlu yönde etki sağlamadığı, %70 seyreltilmiş sızıntı suyu içeren besi yerlerindeki erlen diplerinde çökme yaparak kristalleşmeye neden olduğu düşünülmektedir. 
Çalışmanın ikinci aşamasında, %70 oranında seyreltilmiş sızıntı suyuna belirli konsantrasyonlarda K2HPO4 çözeltisi ilave edilmesi ile Y. lipolytica'nın maksimum mikrobiyal büyümesinin sağlanması amaçlanarak çalışmalar yürütülmüştür. İlk aşamada olduğu gibi, farklı aklimasyon aşamalarında farklı oranlarda K2HPO4 çözeltisi ilavesi ile hazırlanmış besi yerlerinde çalışılmıştır. Besi yerlerine 26,25 mg/L (P/8), 52,5 mg/L (P/4), 105 mg/L (P/2), 157,5 mg/L (3*P/4), 210 mg/L (P), 420 mg/L (2*P), 840 mg/L (4*P), 1680 mg/L (8*P) ve 4200 mg/L (20*P) konsantrasyonlarında fosfor çözeltileri ilave edilerek maksimum büyümeyi sağlayan ortam şartları araştırılmıştır. Çalışmanın ilk aşamasındaki gibi, Y. lipolytica'nın çoğalmasını izleyebilmek için çalışma boyunca günlük olarak optik yoğunluk ve pH ölçümü yapılmış olup inkübasyonun başında ve sonunda ise konvansiyonel parametre analizleri yapılmıştır.
Çalışmanın ikinci aşamasında, ölçülen en yüksek optik yoğunluk değeri 8,53 olarak 3*P/4 no'lu besi yerinde, 6.nesil aklimasyon periyodunda yaklaşık 150. saatte kaydedilmiştir. Şahit olarak izlenen YPD besi yerinde ise ölçülen en yüksek optik yoğunluk değeri 48,12 olarak kaydedilmiştir. 
Fosfor kaynağı olarak K2HPO4 ilavesi yapılmış reaktörlerde çalışmanın ilk aşamasına göre daha iyi büyüme ve kuru biyokütle ağırlığında artış gözlemlenmiştir.  Ancak %70 seyreltme oranında sızıntı suyuna sahip besi yerlerine günlük olarak pH şartlandırması yapıldığı halde, pH seviyelerinde yükselme gözlenerek aklimasyon sonunda reaktörlerin pH'ları Y. lipolytica'nın çoğalması için uygun olmayan 8-9 seviyelerine yükselmiştir. 
Çalışmanın üçüncü aşamasında, 3*P/4 oranında K2HPO4 ilavesi ile hazırlanmış %70 seyreltilmiş sızıntı suyuna farklı konsantrasyonlarda maya özütü ilave edilerek besi yerleri hazırlanmıştır. Besi yerlerine 0,01 g/L, 0,1 g/L, 0,5 g/L, 1 g/L, 10 g/L, 20 g/L ve 30 g/L miktarlarında maya özütü ilave edilmiştir. Y. lipolytica'nın mikrobiyal büyümesini izleyebilmek için çalışma boyunca günlük olarak optik yoğunluk ve pH ölçümleri yapılmıştır. Çalışmanın ikinci aşamasında, ölçülen en yüksek optik yoğunluk değeri 1. Nesilde, 10,23 olarak 3*P/4+10 g/L no'lu besi yerinde ölçülürken ilave edilen maya özütü miktarının arttırılması ile 2. nesil aklimasyon periyodunda, 27,94 olarak 3*P/4+30 g/L no'lu besi yerinde kaydedilmiştir. Şahit olarak izlenen YPD besi yerinde ise ölçülen en yüksek optik yoğunluk değeri 58,72 olarak kaydedilmiştir. 
%70 SS + 157,5 mg/L (3*P/4) miktarında P ilavesi ile hazırlanmış besi yerinde 2792,5 mg/L değerinde biyokütle elde edilmiştir. Şahit besi yeri YPD ortamında ise 6443 mg/L değerinde biyokütle eldesi mevcuttur. Maksimum KOİ giderim verimi, %70 SS + 157,5 mg/L (3*P/4) miktarında P ilavesi ile hazırlanmış besi yerinde %48 olarak ölçülmüştür. Buna karşılık YPD besi yerinde KOİ giderim verimi %53 olarak ölçülmüştür. mgUAKM/tüketilen KOİ değerleri ortalaması 0,47'dir. YPD besi yeri için mgUAKM/tüketilen KOİ değeri 0,24'tür. Farklı oranlarda P ilaveli besi yerlerinde orto-P giderim verimleri ortalaması %46 olarak ölçülürken, 3*P/4 no'lu besi yerinde orto-P giderim verimi %51 olarak hesaplanmıştır. Fosfor ilaveli besi yerlerinde TKN ve NH3-N giderim verimleri ortalamaları sırasıyla %9 ve %10 olarak hesaplanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda, elde edilen değerler istenen biyokütle ve giderim verimlerinden uzak olsa da literatürdeki Y. lipolytica ve sızıntı suyu kullanılarak yapılan çalışmalar ile paralellik göstermektedir. 
Bu çalışmanın sonuçlarıyla ilgili olarak yapılan tüm değerlendirmelerden sonra, depolama sahası sızıntı suyunda, bozunmaya/ayrışmaya dirençli olması muhtemel farklı kirleticilere ve makromoleküllere rağmen Y. lipolytica'nın büyümesi gözlenmiştir. Elde edilen biyokütle miktarını artırmak için farklı makro ve mikro elementler eklenerek daha farklı çalışmalar gerçekleştirilebilir.

Abstract:
More than two billion tons of solid wastes are produced in the world every year. Keeping the balance between the increasing population and living standards at a sustainable level, the disposal, recycling and recovery processes of the solid waste produced for the welfare of the communities and our environmental health is one of the issues of great importance. Urban solid waste management includes recycling, incineration, waste-to-energy, composting or landfilling. Landfill is the most preferred method for solid waste disposal by many municipalities around the world.
In solid waste landfills, leachate formation is observed depending on the humidity of the wastes, the effect of location and the amount of precipitation falling on the landfill. It contains dissolved organic substances, inorganic compounds, heavy metals such as chromium (Cr3+), nickel (Ni2+), copper (Cu2+), zinc (Zn2+), cadmium (Cd2+), mercury (Hg2+) and lead (Pb2+) and xenobiotic organic compounds. Because of this, the leachate, which poses a major environmental problem, needs to be treated. While making leachate treatment, it should be aimed to benefit from wastewater at the same time.
Today, the need to obtain energy with sustainable methods is increasing day by day. In the last decade, there has been a huge increase in interest in the production of biomass-based biofuels to meet current energy demand and at the same time reduce environmental degradation. Although vegetable oils and animal fats were used for biodiesel production in the past, today renewable resources such as lipid obtained from microorganisms are of great interest for the developing biodiesel industries. Different studies are carried out in order to minimize the cost of raw materials.
According to previous studies conducted in different wastewater sources, Y. lipolytica is the most preferred microorganism species according to its lipid storage feature. In this study, it was aimed to determine the optimum environmental conditions in order to ensure the maximum growth of Y. lipolytica by growing in leachate and at the same time to ensure the removal of pollution from the leachate. Phosphorus limitation, which is generally observed in biological treatment systems, is an issue that limits biological growth. Since phosphate limitation was also observed in the microbial growth of Y. lipolytica, the effects of phosphate addition to the leachate environment were investigated in this study.
Y. lipolytica was grown in media containing leachate at different concentrations with/without addition of H3PO4 and K2HPO4 as phosphate source and with/without addition of yeast extract as phosphate source in order to determine the optimum environmental conditions for microbial growth. In addition, the removal efficiencies of the pollutants in the leachate were also evaluated. In the studies, Y. lipolytica MUCL 28849 strain was used. In all acclimation trials, growth of Y. lipolytica was observed in YPD medium and in leachate medium without the addition of phosphate source or yeast extract. The pH value of all media was adjusted to 5.8±0.1 prior to acclimation. During inoculation, microbial growth of Y. lipolytica was continuously monitored by measurement of OD600. Conventional parameter analyzes such as UAKM/AKM, COD, TKN, NH3-N, TP and Ortho-P were performed before and after vaccination.
The study was carried out in three stages. In the first stage, studies were carried out to record the maximum microbial growth of Y. lipolytica by adding certain concentrations of H3PO4 solution to 70% diluted leachate. According to previous studies, the use of leachate as a medium at a dilution rate of 70% was evaluated as the dilution rate at which microbial growth was best observed. Phosphorus concentrations added to the media were adjusted to be multiples of the phosphorus concentration of Y. lipolytica. It was studied in media prepared with the addition of phosphate at different rates at different acclimation stages. At concentrations of 105 mg/L (P/2), 210 mg/L (P), 420 mg/L (2*P), 840 mg/L (4*P), 1680 mg/L (8*P) The ambient conditions providing maximum growth by adding phosphorus solutions were investigated. In order to monitor the growth of Y. lipolytica, daily optical density and pH measurements were made throughout the study, and conventional parameter analyzes were performed at the beginning and end of the incubation.
In the study carried out with media prepared with the addition of phosphate at different rates, the highest optical density value measured was 7.18, recorded in the second generation acclimation stage in the medium no. P/2. The highest optical density value measured was recorded as 47.2 in the YPD medium followed as a witness. In the first stage of the study, with the addition of phosphorus, a significant and reproducible microbial growth was not observed thought to cause crystallization.
In the second stage of the study, studies were carried out to ensure maximum microbial growth of Y. lipolytica by adding K2HPO4 solution at certain concentrations to 70% diluted leachate. As in the first stage, it was studied in media prepared with the addition of K2HPO4 solution at different rates at different acclimation stages. Mediums 26.25 mg/L (P/8), 52.5 mg/L (P/4), 105 mg/L (P/2), 157.5 mg/L (3*P/4), Phosphorus solutions at concentrations of 210 mg/L (P), 420 mg/L (2*P), 840 mg/L (4*P), 1680 mg/L (8*P) and 4200 mg/L (20*P) The environmental conditions providing maximum growth were investigated. As in the first phase of the study, optical density and pH measurements were made daily throughout the study in order to monitor the growth of Y. lipolytica, and conventional parameter analyzes were performed at the beginning and end of the incubation.
In the second stage of the study, the highest optical density value measured as 8.53 was recorded in the medium no. 3*P/4 at approximately 150 hours in the 6th generation acclimation period. The highest optical density value measured was 48.12 in the YPD medium followed as a witness.
Better growth and an increase in dry biomass weight were observed in the reactors in which K2HPO4 was added as a phosphorus source compared to the first stage of the study. However, although pH conditioning was applied daily to media with leachate at 70% dilution, an increase in pH levels was observed and the pH of the reactors increased to 8-9 levels, which is not suitable for the growth of Y. lipolytica at the end of acclimation.
In the third stage of the study, the media were prepared by adding different concentrations of yeast extract to the 70% diluted leachate prepared with the addition of 3*P/4 K2HPO4. Yeast extract was added to the medium in amounts of 0.01 g/L, 0.1 g/L, 0.5 g/L, 1 g/L, 10 g/L, 20 g/L and 30 g/L. Optical density and pH measurements were made daily throughout the study to monitor the microbial growth of Y. lipolytica. In the second stage of the study, the highest optical density value measured was 10.23 in the 1st generation, while it was measured in 3*P/4+10 g/L medium no. It was recorded on medium no. 3*P/4+30 g/L. The highest optical density value measured was 58.72 in the YPD medium followed as a witness.
A biomass of 2792 mg/L was obtained in the medium prepared by adding 70% SS + 157.5 mg/L (3*P/4) P. On the other hand, 6443 mg/L biomass was obtained in the witness medium YPD medium. The maximum COD removal efficiency was measured as 48% in the medium prepared with the addition of 70% SS + 157.5 mg/L (3*P/4) P. On the other hand, the COD removal efficiency in YPD medium was measured as 53%. The average of mgVSS/consumed COD values is 0.47. The mgVSS/COD consumed for YPD medium is 0.24. While the average of ortho-P removal efficiency was calculated as 46% in the media supplemented with P at different ratios, the ortho-P removal efficiency was calculated as 51% in the 3*P/4 medium. The average of TKN and NH3-N removal efficiencies in phosphorus added media were calculated as 9% and 10%, respectively. Although the values obtained as a result of the studies are far from the desired biomass and removal efficiencies, they show parallelism with the studies in the literature using Y. lipolytica and leachate.
After all considerations of the results of this study, growth of Y. lipolytica was observed in landfill leachate despite different contaminants and macromolecules likely to be resistant to degradation/decomposition. In order to increase the amount of biomass obtained, different studies can be carried out by adding different macro and micro elements.