Βeta2-adrenerjik reseptör uyarısıyla oluşan adenilat siklaz aktivasyonu ve ERK fosforilasyonu yanıtlarının bronşiyal kökenli hücrelerde "ligand bias" bağlamında incelenmesi
Investigation of beta2-adrenergic receptor induced adenylate cyclase activation and ERK phosphorylation responses in the context of "ligand bias" in bronchial cell lines
Yazar: TUĞBA GÜMÜŞTAŞ
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM UĞUR
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Adenilat kinaz = Adenylate kinase ; Akciğer = Lung ; Antiastmatik ajanlar = Anti asthmatic agents ; Fosforilasyon = Phosphorylation ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre içi sinyal peptidleri ve proteinleri = Intercellular signaling peptides and proteins ; Hücresel yolaklar = Cellular pathways ; Reseptörler-adrenerjik-beta = Receptors-adrenergic-beta ; Reseptörler-adrenerjik-beta = Receptors-adrenergic-beta

Özet:
Bir tip reseptörün uyarılması hücre fonksiyonu üzerine farklı, hatta zıt etkileri olan birden fazla sinyal yolağını aktive edebilir. Bias agonistler, "dengeli" agonistlerin aksine, yolaklardan birini seçici olarak aktive edebilmektedir. HEK-293 hücrelerinde yapılan önceki çalışmada; cAMP yanıtı oluşturan β2-adrenoseptör (β2-AR) agonistlerinin bir kısmının ERK yanıtı ortaya çıkaramadığı yani cAMP yolağına bias gösterdikleri bulunmuştur. Bias'ın sistem-bağımlı olması ve β2-AR-aracılı ERK yanıtlarının hücreye özgü doğası, gözlenen bias agonizmanın fizyolojik hücre tiplerinde incelenmesini gerekli kılmaktadır. Bu çalışmanın amacı akciğer kökenli hücre dizilerinde β2-AR ligandlarının cAMP ve ERK yolakları arasında bias gösterip göstermediğinin incelenmesi, ayrıca β2-AR-aracılı ERK yanıtının henüz tam olarak çözülememiş mekanizmasının araştırılmasıdır. Bu çalışmada akciğer kökenli üç farklı (epitel, fibroblast ve düz kas) hücre dizisinde, 26 farklı β2-AR ligandı ve adenilat siklazın direkt aktivatörü olan forskolin aracılığıyla oluşan hücre içi cAMP artışı ve ERK fosforilasyonu yanıtları incelenmiştir. Hücre içi cAMP artışı yanıtı biolüminesan bir cAMP sensörü olan GloSensor kullanılarak ölçülmüştür. ERK fosforilasyonu yanıtı ise, ERK'in fosforile formunu tanıyan özgül bir antikor kullanılarak Western Blot yöntemiyle incelenmiştir. CCD-16Lu (fibroblast), PCS (bronşial düz kas) ve BEAS-2B (epitel) hücrelerinde; β2-AR ligandlarının oluşturduğu maksimum cAMP yanıtları, bu ligandların önceden bilinen efikasileriyle uyumlu bulunmuştur. β2-AR ligandları hücre tiplerinin hiçbirinde tek başlarına ERK yanıtı oluşturmamıştır. CCD-16Lu ve PCS hücrelerinde; β2-AR agonistleri, EGF'in yaptığı ERK fosforilasyonunu inhibe etmişlerdir. EGF'in yaptığı MEK ve c-Raf aktivasyonunda da paralel bir inhibisyon gözlenmiştir. BEAS-2B hücrelerinde ise β2-AR ligandları EGF'in yaptığı ERK fosforilasyonuna etki etmezken, c-Raf aktivasyonunu inhibe etmişlerdir. Her üç hücre tipinde de forskolin, β2-AR ligandlarına benzer seviyelerde ERK ve c-Raf inhibisyonuna yol açmıştır. Sonuç olarak, BEAS-2B hücrelerinde β2-AR-aracılı ERK yanıtı gözlenemediği için bias değerlendirilememiştir. Forskolin'in CCD-16Lu ve PCS hücrelerinde β2-AR agonistlerine benzer düzeyde ERK inhibisyonuna neden olması, inhibisyon için hücre içi cAMP artışının yeterli olduğunu düşündürmüştür. Karşılaştırılmak istenen iki yanıttan birinin (ERK yanıtı), diğeri (cAMP artışı) aracılığıyla ortaya çıktığını ima eden bu durum; söz konusu yanıtların bu hücrelerde β2-AR ligandlarıyla seçici olarak uyarılmasını, dolayısıyla bias'ın gözlenmesini olanaksız kılmaktadır.

Abstract:
Stimulation of one type of receptor can activate multiple signal pathways with different and even opposite effects on cell function. Bias agonists, unlike "balanced" agonists, can selectively activate one of these pathways. In the previous study on HEK-293 cells, it was shown that some of the β2-adrenoceptor (β2-AR) agonists that produced the cAMP response failed to elicit an ERK response, indicating ligand bias. The system-specific nature of bias and the cell-specific nature of β2-AR-mediated ERK responses require examination of observed bias agonism in physiologically-relevant cell types. The aim of this study is to investigate whether β2-AR ligands were biased to cAMP or ERK pathways in cell lines of lung origin, as well as to investigate the mechanism of β2-AR -mediated ERK response that has not been fully resolved yet. In the present study, intracellular cAMP increase and ERK phosphorylation responses stimulated by β2-AR ligands were investigated in three different cell lines of lung origin. Intracellular cAMP increase response was measured using GloSensor, a bioluminescent cAMP sensor. ERK phosphorylation response was examined by Western Blot method using a specific antibody that recognizes the phosphorylated form of ERK. In CCD-16Lu (fibroblast), PCS (bronchial smooth muscle) and BEAS-2B (epithelium) cells, maximum cAMP responses generated by β2-AR ligands were found to be compatible with their known efficacies. The β2-AR ligands did not generate an ERK response in any of the cell types. However, they inhibited the EGF-induced ERK phosphorylation in CCD-16Lu and PCS cells. A parallel inhibition was also observed in the activation of MEK and c-Raf induced by EGF. In BEAS-2B cells, while β2-AR ligands did not affect ERK phosphorylation by EGF, they inhibited c-Raf activation. Forskolin inhibited the EGF-induced ERK and c-Raf activation in a similar degree to that of β2-AR ligands. In conclusion, since β2-AR-mediated ERK response was not observed in BEAS-2B cells, ligand bias could not be evaluated. The fact that forskolin causes inhibition of ERK in CCD-16Lu and PCS cells similar to β2-AR agonists suggests that intracellular cAMP increase is sufficient for inhibition. This situation implies that one of the two responses (ERK response) is mediated by the other (cAMP increase), making it impossible to selectively stimulate these responses in these cells with β2-AR ligands, thereby observing bias.