Bortezomib ve BAPTA kombinasyonun 4T1 fare meme kanseri hücrelerinde çeşitli sinyal iletim yolları üzerindeki etkisi
Effect of Bortezomib and BAPTA combination on several signal transduction pathways in mouse 4T1 breast cancer cells
Yazar: ŞERİFE YERLİKAYA
Danışman: PROF. DR. AZMİ YERLİKAYA
Dumlupınar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Kanser hücreleri, tümörleşme sürecinde değişen sinyal yolaklarından dolayı kemoterapiye karşı direnç gösterebilirler (Yardley, 2013). Isı-şok proteini olan GRP78'in aşırı miktarda ekspresyonu da ilaç direncine sebep olabilir (Visioli, vd., 2014). Bu çalışmada, GRP78 inhibitörü BAPTA ve bortezomib kombinasyonun sinyal iletim yolları üzerindeki etkisi 4T1 meme kanseri hücrelerinde araştırılmıştır. 4T1 meme kanseri hücreleri logaritmik fazdayken bortezomib, BAPTA ve kombine dozları ile 24 saat muamele edildi (10 nM bortezomib, 1 µM BAPTA, 5 µM BAPTA, 10 nM bortezomib + 5 µM BAPTA ve 10 nM bortezomib + 1 µM BAPTA). İlaç muamelesi sonrasında hücrelerin apoptoza uğrayıp-uğramadığını belirlemek için ilk önce DNA izole edildi ve DNA fragmentasyonu analiz edildi. Analiz sonuçları, 10 nM bortezomib + 5 µM BAPTA kombinasyonuyla DNA kırılmasında (smearing) belirgin bir artış tespit edildiği görüldü. Daha sonra akış sitometrisi yardımıyla MAPK/PI3K hücre içi sinyal iletim yolları aktivitesi incelenmiş ve ilaç kombinasyonun MAPK aktivitesini düşürdüğü ve beklenmedik bir şekilde PI3K aktivitesini ise arttırdığı anlaşılmıştır. Bortezomib ve GRP78 inhibitörü BAPTA'nın tek başına ve kombine olarak diğer sinyal iletim yollarındaki bazı enzimlerin ve proteinlerin aktivasyon/inaktivasyonlarını incelemek ve muhtemelen hangi protein/enzim üzerinden apoptozise yol açtığını araştırmak için Pathscan intraselüler sinyal iletim array sistemi kullanıldı. Sonuç olarak 100 nM bortezomib tek başına SAPK/JNK (stress-activated protein kinase) fosforilasyonunu artırdığı görülmektedir. En fazla artış 100 nM bortezomib + 5 μM BAPTA kombinasyonu ile yapılan muamele sonucu görülmüştür. Ayrıca SAPK proteinin, biyoinformatik yöntemler kullanılarak insan SAPK ve fare SAPK dizi analizi ve benzerlik araştırması yapılmıştır.  
Anahtar Kelimeler: MAPK, BAPTA, bortezomib, GRP78, apoptozis

Abstract:
Cancer cells can exhibit resistance to drugs in tumorogenesis process due to alterations of signal transduction pathways (Yardley, 2013). Excessive expression of heat-shock protein GRP78 may also cause resistance to chemotherapy (Visioli, et al., 2014). In this study, the effect of GRP78 inhibitor BAPTA and bortezomib combination on signal transduction pathway is investigated on 4T1 breast cancer cells. 4T1 cells were treated with bortezomib, BAPTA and the combination doses for 24 hour in the logarithmic phase of the growth (10 nM bortezomib, 1 µM BAPTA, 5 µM BAPTA, 10 nM bortezomib + 5 µM BAPTA and 10 nM bortezomib + 1 µM BAPTA). After drug treatment, DNA was isolated and DNA fragmentation was analyzed. According to the results, bortezomib and BAPTA combination caused an increase in DNA smearing. By the aid of flow cytometry, MAPK/PI3K intracellular signal transduction pathway activation was investigated and a significant decrease in MAPK activity was detected in cells treated with bortezomib and BAPTA combination. However, contrary to our expectations, PI3K activity was increased significantly. To observe some enzymes and proteins activation/inactivation of signal transduction pathways of combination BAPTA and bortezomib, and to investigate the probability to which protein/enzyme caused apoptosis, Pathscan intracellular signal transduction pathway array system was carried out. As a result, 100 nM bortezomib increased the  phosphorylation of SAPK/JNK protein. The maximum increase was observed after treatment with a combination of 100 nM bortezomib + 5 µM BAPTA. In addition, by using bioinformatic methods, human SAPK and mouse SAPK genome analysis was investigated and with sequence alignment, protein sequences were compared with each other. 
Keywords: MAPK, BAPTA, bortezomib, GRP78, apoptosis