Doğal kaynaklardan dao (diamin oksidaz) pürifikasyonu ve enzimle zenginleştirilmiş gıda üretimi
Dao (diamin oxidase) purification and enzyme enriched food production from natural sources
Yazar: BURAK DURMAZ
Danışman: PROF. DR. ESER YILDIRIM SÖZMEN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Beslenme ve Diyetetik = Nutrition and Dietetics ; Biyokimya = Biochemistry ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Anti alerjik ajanlar = Anti allergic agents ; Besin alerjisi = Food hypersensitivity ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Fermente gıdalar = Fermented foods ; Reseptörler-histamin = Receptors-histamine

Özet:
Histamin intoleransı, nüfusun yaklaşık %1-3'ünde görülmektedir. DAO, Histamin gibi diaminleri, bazı primer monoaminleri oksitleyen enzim grubudur. Histamin, yüksek seviyelerde alınırsa, alerjik reaksiyona benzer semptomlar ortaya çıkarabilir. Bakteriyel enzimlerin Histamin oluşumu üzerindeki etkisi nedeniyle, mikrobiyal üretim veya fermantasyon içeren diyetlerde ve ayrıca çok fazla protein içeren gıdalarda yüksek seviyelerde histamin bulunmaktadır. DAO aktivitesi düşük ise, yüksek miktarda histamin bulunduran yiyeceklerin tüketilmesi intolerans reaksiyonlarına sebep olabilmektedir. Amacımız, ülkemizde yüksek yetişme alanlarına sahip ve ucuz elde edilebilen doğal kaynaklarımızdan olan buğdaylardan piyasada bulunan DAO takviyelerine kıyasla daha yüksek spesifik aktiviteye sahip bir DAO enzimi saflaştırmak olarak belirlenmiştir. Araştırmanın ikinci amacı ise Türk mutfağında her mevsimde yaygın olarak tüketilen turşuların üretim sürecinde DAO enzimi ile zenginleştirme yapmaktı. 
Buğday çimi Ege Tarımsal Araştırma Müdürlüğünden tescil edilmiş buğdaylardan elde edildi. DAO enzim aktivitesi spektrofotometrik yöntem ve LC/MS-MS yöntemi ile belirlendi. DAO enzimi eldesi için amonyum sülfat protein çöktürmesi, diyaliz, kolon kromatografisi aşamaları ile saflaştırma işlemleri uygulandı. İlk deney planında 12.5 U/10ml, 25 U/10ml,50 U/10ml konsantrasyonlarda ticari Diamin oksidaz enzimi ve kromatografi sonrası elde ettiğimiz DAO enzimi fermantasyon aşamasının başında 6 farklı örnek elde edecek şekilde lahana turşularına eklendi. 2. Deney için ise 12.5 mU/10 ml, 25 mU/10ml ve 50 mU/10ml konsantrasyonlarda ticari Diamin oksidaz enzimi ve diyaliz sonrası elde ettiğimiz DAO enzimi fermantasyon aşamasının başında 6 farklı örnek elde edecek şekilde eklendi. DAO eklenmeyen örnekler kontrol olarak kullanıldı. Lahana turşularının histamin düzeyleri 3 hafta sonunda spektrofotometrik yöntem ve LC MS/MS yöntemi ile belirlendi.
Elde ettiğimiz DAO'nun optimum pH 6.5 olduğunu, uyguladığımız yöntemde enzim optimum çalışma süresini 10 dk olduğunu belirledik. Spektrofotometrik yöntem ile analiz edilen buğday çimi homojenatının spesifik enzim aktivitesi 21,37 U/mg iken ekstraksiyon basamaklarından diyaliz sonrası 206,46 U/mg'a, basamakların en sonuncusu olan kolon kromotografisinden sonra 4138,07 U/mg a yükselmiştir. LC/MS-MS analizlerine göre buğday çimi homojenatının spesifik enzim aktivitesi 10,18 U/mg iken ekstraksiyon basamaklarından diyalizden sonra 207,6 U/mg a yükselmiştir.
DAO eklenmemiş turşu örneklerinin %6'lık tuzluluk oranında en yüksek histamin miktarına sahip olduğunu tespit ettik. 1. deney planında DAO enzimi eklenmemiş kontrole göre diyaliz örneğinin %28 oranında kromotografi örneğinin %34 oranında, kromotografi örneğinin ½ sinin %26 oranında yine bu öreneğin ¼ ünün %20 oranında anlamlı olarak histamin içeriğini düşürdüğü görüldü. 2. deney planında ise 25 U ticari DAO enziminin 3 hafta sonra turşu suyundaki histamin miktarını kontrole göre % 92 oranında, 50 U DAO enzimi %43 oranında, 100 U DAO enzimi %45 oranında azaltırken, Diyaliz sonucu elde ettiğimiz DAO enziminin 25 U'lik %87, 50 U'lik %96, 100 U'lik %93 oranında anlamlı bir azalma gösterdi. Buna ek olarak 25 U ticari DAO enzimi, 3 hafta sonra turşudaki histamin miktarını kontrole göre %89 oranında, 50 U DAO enzimi %43 oranında, 100 U DAO enzimi %50 oranında azaltırken, Diyaliz sonucu elde ettiğimiz DAO enzimi 25 U konsantrasyonda %85,2, 50 U konsantrasyonda %85,9, 100 U konsantrasyonda %83,4 oranında anlamlı bir azalma sağladı.
Tarafımızdan ilk kez uygulanan bu yöntem ile (Patent başvuru no:P-20 1710) bitkisel DAO enzimi ile turşu ve turşu suyunun histamin seviyesi önemli ölçüde azaltıldı. Bu uygulamanın yaygınlaştırılması ile histamin intorelansı olan kişilerin intorelansa sebep olan besinleri güvenli kullanabilmelerinin sağlanacağını ve yaşam kalitelerinin artacağını ön görüyoruz.

Abstract:
Histamine intolerance affects about 1-3% of the population. DAO is a family of enzymes that convert diamines like histamine into main monoamines. When histamine levels are high, it might cause symptoms comparable to an allergic reaction. Because of the action of bacterial enzymes on histamine creation, large levels of histamine are found in diets containing microbial production or fermentation, as well as those high in protein. Consumption of foods high in histamine may produce intolerance responses if DAO activity is low. 
Our goal is to purify a DAO enzyme with better specific activity than currently available DAO supplements from wheat, which is one of our natural resources with high growth regions in our nation and can be obtained cheaply. The second goal of the research is to include DAO enzyme in the production process of pickles, which are popular in Turkish cuisine throughout the year. Wheat grass was obtained from wheat registered in the Aegean Agricultural Research Directorate. 
DAO enzyme activity was determined by spectrophotometric method and LC/MS-MS method. DAO enzyme was prepitated by ammonium sulphate protein precipitation, dialysis, column chromoatography steps. In the first experimental plan, commercial diamine oxidase enzyme at concentrations of 12.5 U/10ml, 25 U/10ml, 50 U/10ml and DAO enzyme obtained after chromatography were added at the beginning of the fermentation stage to obtain 6 different samples. For experiment 2, commercial Diamine oxidase enzyme at concentrations of 12.5 mU/10ml, 25 mU/10ml and 50 mU/10ml and DAO enzyme obtained after dialysis were added at the beginning of the fermentation stage to obtain 6 different samples. DAO enzyme was added at the beginning of the fermentation stage of sauerkraut. Samples without DAO were used as control. Histamine levels of sauerkraut were determined by spectrophotometric method and LC/MS-MS method at the end of 3 weeks. 
We determined that the optimum pH 6.5 of the DAO we obtained was the optimum pH 6.5 and the optimum enzyme working time was 10 min. The specific enzyme activity of wheatgrass homogenate analysed by spectrophotometric method was 21.37 U/mg, increased to 206.46 U/mg after dialysis from the extraction steps and increased to 4138.07 U/mg after column chromatography, the last of the steps. According to LC/MS-MS analyses, the specific enzyme activity of wheatgrass homogenate was 10.18 U/mg and increased to 207.6 U/mg after dialysis from extraction steps. We found that the pickle samples without DAO added had the highest amount of histamine at 6% salinity. In the 1st experimental plan, it is seen that the dialysis sample 28%, the chromatography sample 34%, ½ of the chromatography sample 26%, ¼ of the chromatography sample 20% significantly reduced the histamine content compared to the control without DAO enzyme added. 2. In the experimental plan, 25 U commercial DAO enzyme decreased the histamine content in pickle juice by 92%, 50 U DAO enzyme decreased by 43%, 100 U DAO enzyme decreased by 45% after 3 weeks compared to the control, while 25 U of DAO enzyme obtained by dialysis decreased by 87%, 50 U by 96%, 100 U of DAO enzyme showed a significant reduction of 93% and in addition, 25 U of commercial DAO enzyme reduced the histamine level in pickles by 89%, 50 U of DAO enzyme by 43% and 100 U of DAO enzyme by 50% after 3 weeks compared to the control, while 25 U of DAO enzyme showed a significant reduction of 85.2%, 50 U 85.9%, 100 U 83.4%.
The histamine level in pickles and pickle juice was dramatically lowered with herbal DAO enzyme, which we used for the first time (Patent application no: P-20 1710). With the spread of this application, persons with histamine intolerance will be able to safely consume foods that trigger intolerance, improving their quality of life.