N-açil homoserin lakton (AHL) degrede eden bakterilerin izolasyonu ve identifikasyonu
N-acyl homoserine lactone (AHL) degrading bacteria isolation and identification
Yazar: GÜLPERİ BULUT
Danışman: PROF. DR. İHSAN YAŞA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bacillus = Bacillus

Özet:
Mikroorganizmalarda hücre-hücre etkileşimi ile popülasyon yoğunluğuna bağlı iletişim mekanizması Çevreyi Algılama Sistemi (Quorum Sensing) olarak adlandırılmaktadır. Quorum Sensing (QS) regülasyonu, bakterilerin popülasyon yoğunluklarına yanıt olarak gen ekspresyonlarını kontrol etmelerini sağlar. Hücreler sayıca belirli bir eşik konsantrasyonuna ulaştığında (genellikle 10 11 kob/ml) hedef genleri indükleyebilen veya baskılayabilen bir regülatörü aktive eden sinyal molekülleri üretirler. Bakterilerde birden fazla sinyal molekülü tanımlanmış olup (otoindükleyici I, otoindükleyici II, acyl homoserine lakton) Gram negatif bakterilerde yaygın olarak açil homoserin lakton (AHL) adı verilen sinyal molekülleri kullanılmaktadır. Bakteriler virülans faktörlerini (çeşitli enzimler, toksinler, antimikrobiyal direnç, biyofilm) bu sistem aracılığı ile regüle etmektedir. Örneğin, bir popülasyon yoğunluğuna ulaşan mikroorganizmalar antimikrobiyallere karşı planktonik bakterilere göre daha yüksek direnç gücüne sahiptir. QS sisteminin virülans faktörlerinin regülâsyonundan sorumlu olmasının keşfinden sonra bu sistemin inhibisyonunu sağlamak, antimikrobiyal direnç ile mücadelede yeni tedavi stratejileri olarak onları potansiyel hedef haline getirmiştir. QS inhibisyonu için Gram negatif bakterilerin kullandığı sinyal molekülü olan N-açil homoserin lakton'un degredasyonu alternatif bir stratejidir. Böyle bir strateji bakterilerin arasındaki haberleşmeyi keseceğinden onları antimikrobiyallere karşı daha duyarlı hale getirecek, birçok virulans faktörünün ifadesini engelleyecektir.
Bu çalışmada akuakültür ortamından, Penisilin G ile indüklenmiş besiyeri ortamı kullanılarak AHL laktonaz enzimi üreten bakteriler izole edilmiştir. 16S rRNA PZR analizi ile identifiye edilen 26 izolatın 20 tanesi Bacillus sp.'ye ait olduğu bulunmuştur. Ardından AHL laktonaz ürettiği bilinen aiiA gen bölgesi, iki farklı primer çifti kullanılarak PZR ile çoğaltılmıştır. Agaroz jel elektroforezinde amplikon veren izolatların PZR ürünleri sekans analizi için bir dizileme firmasına gönderilmiştir. Sekans analizinden gelen nükleotid dizilerinin sonuçları proteine transle edilmiştir ve NCBI veri tabanındaki mevcut aiiA protein dizileri ile benzerlik oranları karşılaştırılmıştır. Tüm izolatlar AHL degrede eden enzim ailesi grubuna ~ %98 benzerlik oranı göstermiştir. Ahl laktonaz aktivitesini gözlemlemek amacıyla Chromobacterium violaceum CV026 biyosensör suşu kullanılarak agar difüzyon yöntemiyle viyolasein inhibisyonu test edilmiştir. aiiA gen bölgesine sahip tüm izolatlar viyolasein üretimini inhibe etmiştir. Ardından izolatların viyolasein inhibisyon aktivitelerini kantitatif olarak ölçmek için mikroplaka analizi gerçekleştirilmiştir. Analiz sonucunda %50'nin üzerinde inhibisyona neden olan izolatların protein dizileri NCBI veri tabanındaki mevcut aiiA dizileri ile hizalanmıştır. Hizalama sonucunda tüm izolatların AHL laktonaz aktivitesi için gerekli korunmuş bölge olan ~HXHXDH~ motifine sahip olduğu belirlenmiştir. Bulgularımız AHL laktonazların bir biyokontrol maddesi veya antibiyotiklere alternatif yeni anti-virulans madde adayı olabileceklerini ortaya çıkarmıştır.

Abstract:
It is called the Quorum Sensing in communication environments that depend on cell-cell interaction and expansion density in microorganisms. Quorum Sensing (QS) regulation allows bacteria to control their gene expression in response to their population density. When cells reach a certain threshold concentration (usually 10 11 cfu/ml), they produce signaling molecules that activate a regulator that can induce or suppress target genes. More than one signaling molecule has been defined in bacteria (autoinducer I, autoinducer II, acyl homoserine lactone), and signal molecules called acyl homoserine lactone (AHL) are commonly used in Gram-negative bacteria. Bacteria regulate virulence factors (various enzymes, toxins, antimicrobial resistance, biofilm) through this system. For example, microorganisms that reach a population density have higher resistance to antimicrobials than planktonic bacteria. After the discovery that the QS system is responsible for the regulation of virulence factors, inhibiting this system has made them potential targets as new therapeutic strategies in the fight against antimicrobial resistance. The degradation of N-acyl homoserine lactone, the signal molecule used by Gram-negative bacteria for QS inhibition, is an alternative strategy. Such a strategy will cut off communication between bacteria, make them more susceptible to antimicrobials, and inhibit the expression of many virulence factors.
In this study, bacteria producing AHL lactonase enzyme were isolated from aquaculture medium by using Penicillin G induced nutrient medium. 20 of the 26 isolates identified by 16S rRNA PCR analysis were found to belong to Bacillus sp. The aiiA gene region known to coding AHL lactonase was then amplified by PCR using two different primer pairs. The PCR products of the isolates that gave amplicon in agarose gel electrophoresis were sent to a sequencing company for sequence analysis. The results of the nucleotide sequences from the sequence analysis were translated into protein and the similarity ratios were compared with the aiiA protein sequences available in the NCBI database. All isolates showed ~98% similarity to the AHL-degrading enzyme family group. Violacein inhibition was tested by agar diffusion method using Chromobacterium violaceum CV026 biosensor strain to observe Ahl lactonase activity. All isolates with the aiiA gene region inhibited violacein production. Then, microplate analysis was performed to quantitatively measure the violacein inhibition activities of the isolates. As a result of the analysis, the protein sequences of the isolates that caused more than 50% inhibition were aligned with the available aiiA sequences in the NCBI database. As a result of the alignment, it was determined that all isolates had the ~HXHXDH~ motif, which is the conserved region required for AHL lactonase activity. Our findings revealed that AHL lactonases could be candidates for a biocontrol agent or a new anti-virulence agent alternative to antibiotics.