Flavoenzimlerdeki flavin oksidasyonu mekanizmasının hesapsal modellenmesi
Computational modelling of the flavin oxidation mechanism in flavoenzymes
Yazar: İLKE DEMİR
Danışman: PROF. DR. SAFİYE ERDEM
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Organik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Flavoproteinler vücutta indirgenme ve yükseltgenme reaksiyonları, moleküler oksijenin
aktivasyonu, ışık emisyonu, fotosentez, bitki fototropizması, DNA tamiri ve biyolojik
saatin ayarlanması gibi birçok önemli kimyasal reaksiyonu katalizleyen, aktif
bölgelerinde riboflavin bulunduran enzimlerdir. Riboflavin enzimin aktif bölgesinde
flavin adenin dinükleotit (FAD) ve flavin mononükleotit (FMN) olarak bulunabilir.
Flavoproteinlerde çeşitli enzim mekanizmaları sonucu kataliz sırasında FAD
indirgenmektedir. İndirgenmiş flavin aşagıdaki reaksiyona göre moleküler oksijenle
reaksiyona girerek tekrar oksitlenir ve enzim tekrar aktif hale gelir.
E-FADH2 + O2 → E-FAD + H2O2
Reaksiyon sonunda oluşan hidrojenperoksit bir reaktif oksijen türüdür ve oksidatif
strese neden olmaktadır. Oksidatif stres, hücre yaşlanmasına hatta hücre ölümüne sebep
olabilecek önemli bir sorundur. Bu nedenle reaksiyonun aydınlatılması büyük önem
taşımaktadır. Literatürde flavinin reaksidasyon mekanizması bazı enzimlerle
çalışılmıştır ve son yıllarda söz konusu reaksiyon ile ilgili çalışmalar hızla artmaktadır.
Bu tez çalışmasında herhangi bir enzime bağlı kalmadan flavinin tam indirgenmiş
formu (FADH2) ve moleküler oksijen arasındaki reaksiyon modellenmiştir. Önerilen
mekanizmalardaki tüm yapılar gaz fazında, yoğunluk fonksiyoneli teorisi (YFT) M06-
2X/6-31+G(d,p) ve UM06-2X/6-31+G(d,p) yöntemi ile optimize edilmiştir ve Gibbs
serbest enerjileri hesaplanmıştır. Relatif enerjiler ve optimize yapılar potansiyel enerji
yüzeyinde gösterilmiştir. Flavinin si ve re-yüzünden triplet, singlet ve açık kabuk
singlet olmak üzere yedi mekanizma modellenmiştir. Daha sonra re-yüzünden
modellenen üç mekanizma spin dönüşüm noktası olup olmadığı araştırılmak üzere aynı
potansiyel enerji yüzeyinde çakıştırılmıştır. Önerdiğimiz mekanizmaya göre açık kabuk
enerji yüzeyinde FADH….OOH biradikal araürünü oluştuktan sonra triplet-singlet spin
dönüşüm noktası gözlenmiştir. Reaksiyon triplet FAD….O2 kompleksiyle başlayarak
triplet FADH….OOH radikal ara ürününü oluşturur ve bu ara ürün açık kabuk singlet
biradikal hale geçer. Daha sonra açık kabuk singlet biradikal enerji yüzeyi ile kapalıv
kabuk singlet enerji yüzeyi çakışarak kovalent bağlı, kararlı FADH-OOH ara ürünü
oluşur. Reaksiyon 25.2 kkal/mol aktivasyon enerjili hız belirleme adımında OOH'ın
FADH'tan hidrojeni almasıyla biter. Sonuç olarak bizim önerdiğimiz mekanizma bu
reaksiyonun herhangi bir enzim olmadan da gerçekleşebileceğini kanıtlamaktadır. Bu
mekanizmanın detaylarının anlaşılması oksidatif stres ve nörodejenerasyon hakkında
gelecekteki terapötik yaklaşımların tasarımına yardımcı olabilir.

Abstract:
Flavoproteins are enzymes that contain riboflavin in their active sites and catalyze very
important reactions in the living systems such as oxidation-reduction reactions,
activation of molecular oxygen, light emission, photosynthesis, phototrophism, DNA
repair and circadian rhythm regulation. Riboflavin can be found in the active sites of
flavoproteins as flavin adenin dinucleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN).
As a result of various enzyme mechanisms in the flavoproteins, FAD is reduced during
the catalysis. Reduced flavin is reoxidized by reacting with molecular oxygen according
to the following reaction and the enzyme becomes active again.
E-FADH2 + O2 → E-FAD + H2O2
Hydrogen peroxide formed at the end of the reaction is a reactive oxygen species which
causes oxidative stress. Oxidative stress is an important problem that can lead to cell
damage and even cell death. For this reason, elucidating the mechanism of this reaction
is very important. The mechanism of flavin reoxidation in several enzymes has been
studied in the literatüre and studies about this reaction are increasing rapidly in recent
years.
In this study, the reaction between fully reduced form of flavin (FADH2) and molecular
oxygen is modeled in gas phase regardless of any enzyme. All the structures in
proposed mechanisms were optimized with the density fuctional theory (DFT) M06-
2X/6-31+G(d,p) and UM06-2X/6-31+G(d,p) method and Gibbs free energies were
calculated. Relative energies and optimized structures were shown on the potential
energy surfaces. Seven mechanisms have been modeled on flavin si and re-faces as
triplet, singlet and singlet biradical. Since this reaction involves a spin-forbidden change
from triplet to singlet, three of the mechanisms modelled on re-face were superposed on
the same potential energy surface to search for the possibility of any spin-crossing
point. We propose that a triplet-singlet spin crossing point has been observed in the
open shell potential energy surface after the formation of FADH….OOH biradical
intermediate. Reaction starts with triplet FAD….O2 complex which is converted tovii
triplet FADH….OOH intermediate and then it crosses with open shell singlet state
somewhere near the singlet FADH….OOH biradical intermediate. Afterwards, the open
shell singlet surface crosses with the closed shell surface and the stable FADH-OOH
covalent intermediate forms. The reaction is finalized at the rate-determining step with
25.2 kcal/mol activation energy while OOH abstracts the second hydrogen from FADH.
As a result, our proposed mechanism confirms that this reaction can even occur
nonenzymatically. Understanding the details of the mechanism may help to design
future therapeutic approaches about oxidative stress and neurodegeneration.