Sağlıklı insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden kortikal nöron elde edilmesi
Generation of cortical neurons from healthy human pluripotent stem cells
Yazar: MELİS TEMEL ÖZKILIÇ
Danışman: PROF. DR. FAHRİYE DUYGU ÇETİNKAYA ; DOÇ. DR. AYÇA ARSLAN ERGÜL
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı / Kök Hücre Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Kök hücreler = Stem cells ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Nöronlar = Neurons ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Uyarılmış pluripotent kök hücreler kişiye özel tedavi olanağı sağlaması, hastalık modelleme ve ilaç denemeleri açısından benzersiz bir kaynaktır.  Hastandan alınan kan veya fibroblast hücrelerinden çeşitli transkripsiyon faktörleriyle veya küçük moleküllerle hedef doku ve organ oluşumu sağlanabilir. Böbrek, kalp, karaciğer, beyin vb. doku ve organlara farklılaştırma imkânı bulunmaktadır. Bunların arasında en ilgi çekici olanı şüphesiz beyindir. Diğer doku ve/veya organların aksine biyopsi imkanının olmaması nedeniyle çalışılması zor bir bölgedir. Hastadan alınan kan ve/veya fibroblast örneğine Yamanaka faktörlerinin transferi ile pluripotentlik özellik kazandırılmasının ardından uygun farklılaşma protokolleri ile sinir hücrelerine veya organoide farklılaşma sağlanabilir. Bu tez çalışmasının amacı sağlıklı insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden (uPKH) altı adet küçük molekül kullanarak 12-15 gün içerisinde kortikal nöron eldesini sağlamaktır. Bu kapsamda karakterizasyonu tamamlanmış olan sağlıklı insan uPKH'leri kültürde çoğaltılmıştır. Pluipotentsi belirteçlerini koruduğu kontrol etmek amacıyla qPCR ve immun floresan boyamalar ile teyit edilmiştir. Nöronal yönde farklılaşma deneyleri için hücrelere altı küçük molekülden oluşan kokteyller her gün farklı dozlarda uygulanmıştır. Hücrelerin morfolojik durumu her gün ışık mikroskobu altında izlenmiştir. Protokolün sonunda hücrelerden RNA toplanmış ve immun floresan boyamalar yapılmıştır. Yapılan qPCR deneylerinin sonucunda pozitif kontrole göre elde edilen hücrelerde kortikal nöron belirteçlerinden DCX , FOXG1 ve REELİN ifadelerinde anlamlı bir artış gözlenmiştir. İmmun floresans boyamalarda nöron belirteçleri olan MAP2 ve TUJ1 pozitif hücreler gözlemlenmiştir.

Abstract:
Induced pluripotent stem cells (iPSC) are a unique resource for personalized treatment, disease modeling and drug trials.  Target tissue and organ formation can be achieved with various transcription factors or small molecules from blood and fibroblast cells taken from the patient. Tissues and organs such as kidney, heart, liver, brain, etc. can be differentiated. The most interesting of these is undoubtedly the brain. Unlike other tissues and/or organs, it is a difficult area to study due to the lack of biopsy opportunity. After pluripotency is achieved by transferring Yamanaka factors to the blood and/or fibroblast sample taken from the patient, differentiation into nerve cells or organoids can be achieved with appropriate differentiation protocols. The aim of this thesis is to obtain cortical neuron  from healthy human pluripotent stem cells (uPPCs) within 12-15 days using six small molecules. In this context, characterized healthy human uPPCs were propagated in culture. Pluipotentiation was confirmed by qPCR and immunofluorescence staining to check the preservation of markers. For neuronal differentiation experiments, the cells were treated with cocktails of six small molecules at different doses every day. The morphologic status of the cells was monitored daily by light microscopy. At the end of the protocol, RNA was collected from the cells and immunofluorescent staining was performed. As a result of qPCR experiments, a significant increase in the expression of cortical neuron precursors DCX, FOXG1 and REELIN was observed in the cells obtained compared to the positive control. MAP2 and TUJ1 positive cells were observed in immunofluorescence staining.