Çapraz bağlı enzim agregatları formundaki proteaz enziminin taşıyıcısız immobilizasyonu
Carrier free immobilization of protease enzyme in cross-linked enzyme aggregates form
Yazar: ALPER GÖKALP
Danışman: PROF. DR. UĞUR SALGIN
Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Bu çalışmada, Bacillus sp. türü mikroorganizmalardan izole edilmiş bir ticari proteaz enziminin;  önce amonyum sülfatla ile presipitasyonu ve daha sonra glutaraldehitle oluşan agregatların çapraz bağlaması ile  çapraz bağlı enzim  agregatları formunda immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. En uygun immobilizayon ortam bileşimi; 50 mM pH=7 sodyum sülfat tamponunda hazırlanan bileşimlerinde 200 mg/mL başlangıç enzim derişimi, 700 mg/mL amonyum sülfat derişimi ve 60 L/mL glutaraldehit derişimi  olarak saptanmıştır. En yüksek katalitik aktivitenin elde edildiği immobilizasyon bileşiminde sesntezlenen çapraz bağlı proteaz agregatlarının katalitik aktivitesine pH (6 - 10), sıcaklık (25 - 70oC), karıştırma hızı (150 - 750 rpm) ve değişik çözücü sitemlerine karşı toleransı araştırılmıştır. Enzim sistemlerinin geniş bir pH, sıcaklık ve karıştırma hızı aralığında 12 saat süreyle yüksek performans sergilemiş olup optimum pH=7 ve optimum sıcaklık 37oC olarak saptanmıştır.  2 gün süreyle değişik çözücü sistemlerinde maruz bırakılan enzimlerin katalitik aktivileri yüksekten başlayarak; Sodyum fosfat tamponu > Etilasetat > Metanol > Siklohekzan > İzopropanol > Hekzan > İzooktan > Dimetilformamit > Etanol > Kloroform > Su > Dimetilsülfoksit olarak sıralanmaktadır.  Geliştirilen enzim sistemlerinin depolama kararlılığı 6 ay süreyle incelenmiş ve bu süre sonunda yaklaşık %25 aktivite kaybı gözlenmştir. Ayrıca, serbest ve immobilize formadaki enzimler Michaelis-Menten kinetik sabitleri belirlenerek karakterize edilmiştir.

Abstract:
In this study, a commercially available protease enzyme  isolated from  Bacillus sp. type microorganisms was immobilized as cross-linked enzyme aggregates via first precipitation with ammonium sulfate and then formed aggregates were cross-linked with glutaraldehyde. The optimal composition for immobilization media were determined as the initial enzyme concentration of  200 mg/mL, the ammonium sulfate concentration 700 mg/mL and the glutaraldehyde concentration of 60 L/mL at 50 mM pH=7 sodium sulfate buffer composition. It was determined that there is not increased the catalytic activity of enzyme systems developed with addition of protein feeder agent such as bovine serum albumin and lysine before th aggregation process. At the immobilization conditions which were obtained the highest catalytic activity, the effect of pH (6 - 10), temperature (25 - 70°C), stirring speed (150 - 750 rpm) and tolerance to various solvent systems on the catalytic activity of the synthesized cross-linked protease aggregates was investigated. Enzyme systems have exhibited high performances during 12 hours at a wide range of pH, temperature and stirring speed, and also optimum pH and temperature was determined as 7 and 37°C, respectively. Catalytic activity of enzymes exposed in different solvent systems for 2 days was determined as follows: Sodium phosphate buffer > Ethylacetate > methanol > Cyclohexane > Isopropanol > Hexane > Isooctane > Dimethylformamide > ethanol > Chloroform > Water > Dimethylsulfoxide. Storage stability of the improved  enzyme system was examined for 6 months, and approximately 25% activity loss  was observed at the end of the period. Moreover, free and immobilized enzymes were characterized by determining the form of the Michaelis-Menten kinetic constants.