Toplam protein tayin yöntemleri ve enzimlerle hidrolizlenmiş protein çözeltilerinde toplam amino asit tayin yöntemlerinin karşılaştırılması
The comparison of the methods for the analysis of total protein and the analysis of total amino acid values in enzymatically hydrolyzed protein solutions
Yazar: ÖZLEM GÜMRAH
Danışman: PROF. DR. PERİHAN ÇAĞLAR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Bölümü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Amino asitler = Amino acids ; Amino asitler-esansiyel = Amino acids-essantial ; Enzimatik hidroliz = Enzymatic hydrolysis ; Peptid hidrolazlar = Peptide hydrolases ; Protein analizleri = Protein analysis ; Protein ekstraksiyonu = Protein extraction ; Stafilokok protein A = Stafilokok protein A

Özet:
Bu çalışmada, protein için iyi bir kaynak olan ?süt tozu ? ve son zamanlarda yüksek protein içeriği ve insan sağlığı üzerindeki olumlu etkileriyle ön plana çıkan ?soya küspesi? ele alınarak protein özütlenmesi, tayin yöntemleri, protein hidrolizi ve hidroliz sonucunda açığa çıkan amino asitlerin tayini incelenmiştir. Çalışma dört ayrı kısım halinde yürütülmüştür.Çalışmanın ilk bölümünde, yağı giderilmiş soya unundan protein eldesi için özütleme yönteminin süt tozu ve soya unu üzerinde denenmesi ve uygun pH, sıcaklık ve sürenin belirlenmesi ile ilgili deneyler yapılmıştır. Proteinlerin çözünürlüklerinin izoelektrik pH'da minimum olmasından faydalanarak, protein saflaştırılmıştır. Sonuç olarak, özütleme deneylerinde optimum koşullar 60 oC, pH:11 ve 1 saat olarak belirlenmiştir.İkinci bölümde, literatürdeki başlıca toplam protein analiz yöntemlerinin incelenmesi sonucu seçilen beş yöntem süt proteini ve soya proteini tayini için denenmiştir. Gıda analizlerinde en çok kullanılan Kjeldahl yöntemine alternatif olarak Biüret 340-nm, Biüret-550 nm ve UV-280 nm, UV-220 nm gibi spektrofotometrik yöntemler seçilmiştir. Bu yöntemlerin seçilme nedeni, uygulanabilirliklerinin kolay olması ve farklı reaksiyonlar üzerinden gerçekleşmesidir. Sığır serum albumini (BSA) ve kazein standart proteinleri kullanılarak bütün yöntemler için ayrı ?kalibrasyon grafikleri? ve daha sonra da ?doğrusal çalışma grafikleri? elde edilmiştir. Bu sayede yöntemlerin, proteinlerin amino asit bileşimi ile olan ilgisi de incelenebilmiştir. Standart protein örnekleri ile yapılan çalışmalarda yöntemlerin çalışma aralıkları belirlenerek, duyarlılıkları karşılaştırılmıştır. Çalışma aralıkları, UV-280 nm, UV-220 nm, Biüret-340 nm, Biüret-550 nm için sırasıyla ; 0.03-2 mg/mL, 0.001-0.06 mg/mL, 1-10 mg/mL,1-10 mg/mL olarak bulunmuştur. Seçilen yöntemler doğal örneklere de uygulanmıştır. Bunun için soya protein izolatı, yağı giderilmiş soya unu, ekstrakte edilmiş soya unu ve yağsız süt tozu kullanılmıştır.Spektrofotometrik yöntemler genel olarak, Kjeldahl yöntemine göre protein derişimi açısından yüksek sonuçlar vermiştir. Deney sonuçlarına göre UV-220 nm, Kjeldahl yöntemine en yakın sonuçları veren ve en hassas olan yöntemdir. Biüret-550 nm ise en düşük duyarlılığa sahiptir.Çalışmanın üçüncü kısmında ise, elde edilen protein çözeltisinde enzim hidrolizi gerçekleştirilerek, hidroliz parametreleri belirlenmiştir. Hidrolizi gerçekleştirmek için Novozyme firmasından temin edilen 3 farklı endüstriyel proteaz enzimi (Flavourzyme 1000 L, Alcalase 2.5 L Type DX, Neutrase 1.5 mg) kullanılmıştır. Hidroliz sonrasında oluşan toplam amino asit değeri ve hidroliz derecesi (HD) belirlenmiştir.Hidroliz tepkimesi 9 saat süreyle izlenmiştir. Enzim kombinasyonu şeklinde uygulanan yöntem en yüksek HD (%36.8) vermiştir. Daha sonra üçlü enzim karışımı ile %30.2 HD değerine ulaşılmıştır. En düşük hidroliz derecesi (%4.84) Neutrase enzimi ile elde edilirken, Flavourzyme (%15.7) ve Alcalase (%15.2) enzimleri ile gerçekleştirilen hidrolizlerde HD değerlerinin yaklaşık aynı olduğu gözlenmiştirHidroliz deneylerinden sonra elde edilen amino asitler ninhidrin yöntemiyle belirlenmiştir. % 40 oranında amino asit içeren doğal örmekte yapılan tayin sonucunda amino asit miktarı %27.8 olarak bulunmuştur. Literatürde de belirtildiği gibi ninhidrin belirtecinin bulunması gerekenden daha düşük sonuçlar verdiği gözlenmiştir.Anahtar Kelimeler : Protein tayini, protein özütlenmesi, enzimatik hidroliz, amino asit tayini.

Abstract:
In this study, two good sources of protein, powdered milk and defatted soy flour were considered and the extraction of proteins, the methods of protein determination, the hydrolysis of proteins and the determination of amino acids obtained from protein hydrolysis were investigated. The study was carried out in four parts.In the first part of this study, the extraction method for obtaining proteins from defatted soy flour was tried on both milk powder and defatted soy flour and the experiments for the determination of optimum values for pH, temperature and time were carried out. Proteins were purified by using the fact that the solubility of proteins is a minimum at isoelectrical pH values. Consequently, the optimum result was observed at 60 oC and pH 11 in the protein extraction experiments. The optimum time observed was one hour.In the second part, five methods for total protein determination were chosen from the literature and were tried on samples of milk powder and defatted soy flour. The spectrophotometric methods such as Biuret-340 nm, Biuret-550 nm and UV-280 nm, UV-220 nm were chosen as the alternative for Kjeldahl method which is mostly used in food analysis. The rationale for choosing these methods includes the easiness of implementation and the applicability to different reactions. Two separate calibration curves were obtained using laboratory grade bovine serum albumin (BSA) and casein as the standard proteins. Therefore, the relationship between the proteins and their amino acid composition was examined in each case. When working with the samples of the standard proteins, the detection limits and the sensitivities of the methods were compared. The detection limits of these methods were found for UV-280 nm, UV-220 nm, Biuret-340 nm, Biuret-550 nm; 0.03-2 mg/mL, 0.001-0.06 mg/mL, 1-10 mg/mL, 1-10 mg/mL, respectively. The chosen methods were also applied to the natural samples. For this aim, soy protein isolate, defatted soy flour, extracted soy flour and milk powder were used.Generally, spectrophotometric methods give higher values for protein concentrations in comparison to the Kjeldahl method. UV-220 nm was the method which gives the nearest results to the Kjeldahl method and is the most sensitive one based on our experiments. Also, the Biuret- 550 nm has the lowest sensitivity.In the third part of this study, enzymatic hydrolysis was performed to obtain soy protein hydrolyzates by using three different industrial protease enzymes (Flavourzyme 1000 L, Alcalase 2.5 L Type DX, Neutrase 1.5 mg) produced by Novozyme and the parameters of hydrolysis were determined. After hydrolysis, the total amino acid concentrations and the degree of hydrolysis (DH) were determined.The hydrolysis was observed up to 9 hours. A combination of three enzymes showed the highest DH (%36.8). It was observed that the mixture of three enzymes results in considerably higher DH values (%30.2). The lowest DH was obtained in the presence of Neutrase (%4.84) and DH values were almost the same for Flavourzyme (%15.7) and Alcalase (%15.2).After hydrolysis, the released amino acids in the protein hydrolyzates were determined using the ninhydrin method. When applied to the natural sample which has an amino acid content of 40 % the result was found as %27.8. However, as indicated in literature, the ninhydrin reagent gives lower results.Keywords: Protein determination, protein isolation, enzymatic hydrolysis, amino acid determination.