Sulindak'in farinks ve larinks kanser hücrelerinde hücre canliliği ve hücre siklusu üzerindeki etkileri
The effects of sulindac on cell viability and cell cycle in pharynx and larynx cancer cells
Yazar: FATİH AĞDAŞ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. AYLİN ERYILMAZ
Adnan Menderes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kulak Burun Boğaz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Kulak Burun ve Boğaz = Otorhinolaryngology (Ear-Nose-Throat)
Dizin: Anjiyogenez inhibitörleri = Angiogenesis inhibitors ; Farenks neoplazmları = Pharyngeal neoplasms ; Hücre döngüsü = Cell cycle ; Karsinogenez = Carcinogenesis ; Laringeal neoplazmlar = Laryngeal neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Amaç:Çalışmamızın amacı, sulindak'ın larinks ve farinks kanser hücre hatlarındaki hücre canlılığı, hücre siklusu ve anjiogenez üzerindeki etkilerini araştırmaktır.
Materyal metod:Farinks kanseri hücre hattı (FaDu) ve larinks kanser hücre hattı (Detroit 562) besiyeri ortamında ve 37 oC, %5 CO2'lik inkübatörde inkübe edilerek çoğaltılarak pasajlandı. IC50 deneyleri ile çalışmada kullanılacak sulindak dozu 200 µM bulundu. Hücre canlılığı ve sayımı için her bir tüpe 1x105 hücre aktarıldı. 50 μl'lik hücre süspansiyonuna 450 μl MUSE Count Viability Reagent ilave edilerek dilüe edilmiş boyanma örneği hazırlandı ve MUSE cihazında ölçümler yapıldı. Hücre siklusunu değerlendirmek için her bir tüpe 1x105 hücre aktarıldı. Tüplere %70'lik etanol eklenerek-20 derecede 3 saat inkübe edildi. Santrifüjleme sonrsında 200 μl MUSE Cell Cycle Reagent eklendi ve oda sıcaklığında 30 dk karanlıkta inkübe edilerek MUSE cihazında ölçümleri yapıldı. İmmünhistokimyasal analiz için hücreler 24'lük well plate üzerine ekildi ve sonrasında ilaçlar eklendi.%4'lük paraformaldehit ile 20 dakika oda sıcaklığında fikse edildikten sonra yıkama ve inkubasyon işlemlerinden geçirildi. VEGFR antikorları ekilerek 3,3 diaminobenzidin ile boyanma durumularına bakıldı. Western blot ile de ADAMTS1 antikorlarına bakıldı.
Sonuç:Sulindak kullanımı sonrası hem larinks kanseri hücrelerinde (Detroit 562) hem de farinks kanseri hücrelerinde (Fadu) hücre canlılığında azalma görüldü. Sulindak kullanımı sonrası, larinks kanseri hücrelerinde hücre siklusunun G0/G1 fazında duraksadığı, farinks kanseri hücrelerinde ise hücre siklusunun G2/M fazında duraksadığı görüldü. Bu bulgular sulindakın larinks ve farinks kanserihücrelerinde bölünme öncesi fazlarda hücreyi beklettiği ve hücrelerin mitoza geçişini yavaşlattığını gösterdi. Sulindakın, larinks ve farinks kanser hücrelerinde immunhistokimayada VEGF'yi artırdığını, western blotta ise ADAMTS1 düzeylerini azaltmış olduğu bulunduk. Bu veriler de bize sulindakın anjiogenezi artırdığını göstermektedir. Sulindak kullanımı sonucunda larinks ve farinks kanserlerinin tedavisinde olumlu sonuçlar elde edilebileceği çalışmamızda gösterilmektedir. Sulindak ve/veya diğer NSAII 'leri inceleyen daha ileri çalışmalarla bulgularımız desteklenmelidir. 
Anahtar kelimeler: Sulindak, Hücre siklusu, Hücre canlılığı, Anjiogenez, larinks kanseri, farinks kanseri

Abstract:
Aim: The purpose of this study is to research the effects of sulindac treatment on cell viability, cell cycle and angiogenesis in the pharynx and larynx carcinoma cell lines.
Material and method: In a cell culture media a pharynx carcinoma cell line (FaDu) and larynx carcioma cell line (Detroit 562) has been incubated and reproducted in an incubator that has the settings of 37 oC and 5% CO2, and then has been passaged. The dose of sulindac has been established as 200 µM by using IC50 trials. To count and examine the viability of the cells, 1x105 cells has been transferred to each tube. By adding 450 μL MUSE Count Vability Reagent onto the 50 μL of cell suspension, we prepared a diluated sample to be stained, and then the calculations has been made by using MUSE device. To evaluate the cell cycle, 1x105 cells has been transferred to each tube. 70% ethanol has been added to the tubes and they have been incubated at-20 oC for 3 hours. After the centrifugation of the tubes, 200 μL MUSE Cell Cycle Reagent has been added, and then they have been incubated at room temperature in the dark for 30 minutes before the evaluation in the MUSE device. The cell cultures has been made with the 24-well plate and drugs have been addet to wells afterwards. The fixation with 4% paraformaldehyde at room temperature for 20 minutes has been performed and washing and incubation procedures is followed the fixation. We added VEGFR antibodies and enterprated the solution for occurence of any coloring with 3,3 diaminibenzidine. We analyzed the ADAMTS1 antibodies with Western Blot technique.
Results: We found that the cell viability of both pharynx carcinoma cells (FaDu) and larynx carcioma cells (Detroit 562) is decreased after the sulindac treatment. In larynx carcinoma cells, the cell cycle was paused at the G0/G1 phase and in pharynx carcinoma cells, it paused at the G2/M phase after the sulindac treatment. This findings showed that the sulindac treatment causes the cell cycle in the larynx and pharynx carcinoma cells to pause at the phases that are before cell division and slows the cells down in the way of transition to mitosis. We found that sulindac increase the VEGF in the larynx and pharynx carcinoma cells in the immunohistochemistry analyses and decrease the levels of ADAMTS1 in the Western Blot analyses. This suggests that sulindac increases the angiogenesis. We have showed that beneficial outcomes for the treatment of larynx and pharynx cancer can be obtained by using sulindac. The future studies that examines sulindac and/or other non-steroidal anti-inflamatory drugs are needed to support our findings.
Keywords: Sulindac, cell cycle, cell viability, angiogenesis, larynx cancer, pharynx cancer