Tetrazin fonksiyonlu polimerlerin doğrudan hazırlanması ve bu polimerlerin yüksek hızlı biyoortogonal reaksiyonlarda etkinliğinin incelenmesi
Direct synthesis of tetrazine functional polymers and investigation of efficiency of these polymers in super fast bioorthogonal reaction
Yazar: SİNEM SİPAHİOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. MUHAMMET ÜBEYDULLAH KAHVECİ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Biyoortogonal reaksiyonlar, moleküler düzeyde canlı sistemlerdeki uygulamalarıyla son yıllarda oldukça dikkat çekmektedir.  Ters elektron gereksinimli Diels-Alder reaksiyonu (iEDDA), özellikle tetrazin biyoortogonal bağlanma reaksiyonu (ligasyonu), son derece hızlı kinetiği, biyoortogonalliği ve yüksek özgünlüğünden dolayı görüntüleme, teşhis ve tedavi alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Tetrazin iEDDA ilk olarak 1957'de Carboni ve Lindsey tarafından rapor edilmiştir. Günümüzde ise, tetrazin iEDDA tekrardan popüler hale gelmiştir ve malzeme bilimine ve kimyasal biyolojiye yeni bir bakış açısı getirmiştir. Tetrazin siklokatılma, diğer konjugasyon türlerine göre daha avantajlı özellikleri ile yeni bir biyoortogonal reaksiyon olarak ortaya çıkmıştır. Klasik biyoortogonal reaksiyonları katalizöre ihtiyaç duyup ve genellikle düşük verimle sonuçlanırken, tetrazin reaksiyonları ise süper hızlı kinetiği ve seçiciliği nedeniyle oldukça etkili bir reaksiyon olarak bilinirler.
Bu tezde, polimer zincirleri üzerinde tetrazin gruplarının direkt sentezlenmesi için özgün bir yaklaşım geliştirilmiştir. Tezin amacı, bir polimerin yan zincirlerinde ya da uç grubunda tetrazin gruplarını direkt olarak sentezlemektir. Bu amaçla, herhangi bir polimer zincirindeki nitril grupları, bir katalizör ve hidrazin varlığında iki nitril grubunun birbirleriyle reaksiyona girmesini ve ardından oksidasyonunu içeren klasik tetrazin sentezi ile, direkt tetrazin halkalarına dönüşebileceği hipotezi kurulmuştur. Bu çalışmada, yan zincir veya uç grup olarak polimer üzerindeki nitril grupları birinci nitril ve küçük molekül ağırlıklı bir nitril türevi ise ikinci nitril olarak kullanılmıştır. Bildiğimiz kadarıyla, bu yaklaşım polimer zincirleri üzerinde tetrazin işlevsel gruplarının direkt sentezi için ilk örnektir.
Bu yeni yaklaşım, tetrazin fonksiyonlu polimerleri sentezlemek için önemli ölçüde katkı sağlayabilir. Bu tezdeki yaklaşım, poli(N-isopropilakrilamid) (PNIPAAm), poli(poli(etilen glikol) metil eter metakrilat) (PPEGMA) ve poli(metil metakrilat) (PMMA) içeren biyouyumlu polimerler üzerinden örneklenmiştir. Yan zincir olarak nitril grupları akrilonitrilin (AN'nin) uygun monomerler (NIPAAm, PEGMA veya MMA) ile kopolimerizasyonuyla bu polimer yapısına dahil edilmiştir. P(PEGMA-co-AN) ve P(MMA-co-AN) öncül polimerleri atom transfer radikal polimerizasyonu (ATRP) ile sentezlenmiştir. Diğer öncül polimer P(NIPAAm-co-AN) ise serbest radikal polimerizasyonu (FRP) ile sentezlenmiştir. Nitril uç grup fonksiyonlu polimerler için siyano fonksiyonlu ATRP başlatıcısı sentezlenmiş ve PEGMA'nin ATRP'sinde kullanılmıştır. Polimerlerin yan zincirleri olarak tetrazin fonksiyonları metal katalizörlü tek-kap (one-pot) sentez yöntemi izlenerek elde edilmiştir. Polimer üzerindeki nitril yan grupları, direkt tetrazin halkasının oluşumunda kullanılmıştır. Tetrazin halkalarının oluşumu ile tetrazine has olan pembe renkli polimerler gözlemlenmiştir. Diğer yandan, nitril uç gruplarının tetrazine dönüştürülmesi ile yapılan reaksiyon sonucunda hedeflenen tetrazin uç fonksiyonlu polimer elde edilememiştir. Elde edilen bu sonuç için literatür taraması yapıldığında katalizörün (Ni(OTf)2), uç grup ile polimer omurgası arasındaki amid bağını kırabileceği anlaşılmaktadır. Yapılan NMR spektroskopisi analizleri sonucunda belirtilen amit bağının kırıldığı ve bulgunun önceki raporlar ile uyumluluk gösterdiği anlaşılmaktadır. Bu nedenle, tetrazin fonksiyonlu polimerlerin sentezi için önerilen bu yaklaşım sadece yan zincir fonksiyonları için kullanışlıdır. 
Tetrazin ligasyonu için substratlar arasından hızlı kinetiğe sahip olan trans-siklookten (TCO) ve norbornen (NB) seçilmiştir. Tetrazin fonksiyonlu polimerler ile TCO yada NB türevleri arasındaki iEDDA reaksiyonu kısa bir sürede (özellikle TCO için bir dakikadan kısa bir sürede) gerçekleşmiştir ve kolaylıkla çıplak gözle ve UV-Vis spektroskopisi ile izlenmiştir. Çünkü tetrazin halkasının karakteristik pembe rengi reaksiyon gerçekleşince bir anda kaybolmuştur. TCO türevi ile tetrazin fonkisyonlu polimerin konjugasyonu NMR ve UV-Vis spektroskopisi ile de iyi bir şekilde karakterize edilmiştir.
Bu tez kapsamında, polimer omurgası üzerinde tetrazin grubunun direkt sentezinin geliştirilmesi çaba, zaman ve maliyet açısından büyük bir potansiyele sahiptir. Araştırmalar, gelecekte tetrazin siklokatılmalar ile ilgili çalışmaların, ilaç salımı, çeşitli polimer mimarilerinin üretilmesi, protein-polimer konjugasyonu, sensör ve biyogörüntüleme sistemi gibi biyomedikal uygulamalarda birçok gelişmeye yol açabileceğini göstermiştir. Bu tezde geliştirilen yaklaşım da, benzer uygulamalarda potansiyele sahip olacaktır.

Abstract:
Bioorthogonal reactions get great attention in the application of living system at the molecular level during recent years. Especially, tetrazine bioorthogonal ligation, which is known as Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction (iEDDA), is widely employed in imaging, diagnostics, and therapy fields due to bioorthogonality, extremely rapid kinetics and high specificity. Tetrazine iEDDA bioorthogonal reaction. While the classic bioorthogonal reactions require a catalyst and usually result in low yield, tetrazine reaction does not. Therefore, this approach is known as a highly efficient reaction due to its super fast kinetics and selectivity.
In this thesis, an orginal approach was developed for synthesis of tetrazine moieties directly on polymer chains. The aim of this thesis is to synthesize directly tetrazine functionalities as side chains or an end group of a polymer. For this purpose, we hypothesized that nitrile groups on polymer can be directly transformed into tetrazine rings by applying one of the usual synthetic route, in which two nitrile groups are reacted to each other in the presence of a catalyst and hydrazine followed by oxidation. In this work, nitrile groups on polymers as side chain or end group were utilized as the first nitrile and a small nitrile derivative was utilized as the second one. To the best of our knowledge, this approach is the first example for direct synthesis of tetrazin moiteis on polymer chains. 
This new approach may contribute significantly to synthesis of tetrazine functional polymers. In the thesis, the approach was exemplified on biocompatible polymers including poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), poly(poly(ethylene glycol methacrylate) (PPEGMA), and poly(methyl methacrylate) (PMMA). The nitrile groups as side chains were incorporated into these polymers by copolymerization of acrylonitrile (AN) with corresponding monomers (NIPAAm, PEGMA or MMA). P(PEGMA-co-AN) and P(MMA-co-AN) precursor polymers were synthesized by atom transfer radical polymerization (ATRP). The other precursor polymer P(NIPAAm-co-AN) was synthesized by free radical polymerization (FRP). For end group nitrile functional polymers, a cyano functional ATRP initiator was synthesized and utilized in ATRP of PEGMA. Tetrazine functionalities as side chains of polymers were obtained by following metal catalyzed one-pot synthesis route. The nitrile group on the polymer was utilized to the formation of the tetrazine rings directly on the polymer backbone. The characteristic color of tetrazine rings was observed as pink. On the other hand, transformation of end nitrile groups into tetrazine was not achieved, since the catalyst (Ni(OTf)2) cleaved off the amide bond between the end group and the polymer backbone. 
The NMR spectrum of the resultant polymer and early reports prove this finding. Therefore, the proposed approach for synthesis of tetrazine functional polymers is useful for only side chain functionalities.
Among the substrates for tetrazine ligation are chosen trans-cyclooctene (TCO) and norbornene (NB) derivatives due to their fast kinetics. The iEDDA reaction between tetrazine functional polymers with TCO or NB derivates achieved in a short period (especially for TCO less than a minute), and monitored easily by naked eye and UV-Vis spectroscopy. Because the characteristic pink color of tetrazine ring vanishes at once. Conjugation of a TCO derivative to the tetrazine functional polymer was well characterized by NMR and UV-Vis spectroscopy. 
Within the scope of the thesis, development of the direct synthesis of tetrazine group on polymer backbone have big potential with respect to effort, time and cost. Research has shown that future work with tetrazine cycloadditions will certainly lead to improvement in biomedical applications like drug delivery, fabrication of various polymer architecture, protein-polymer conjugate, sensor or bioimaging system. The developed approach in the thesis will have potential in similar applications.