Toxoplasma gondii fraksiyonlarının normal ve apoptotik hücreler üzerine etkileri
Effects of toxoplasma gondii fractions on normal and apoptotic cells
Yazar: KEREM YAMAN
Danışman: PROF. DR. ÇİĞDEM GÜNGÖR
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Toxoplasma gondii = Toxoplasma gondii

Özet:
Toxoplasma gondii dünyada yaygın olarak gözlenen bir intrasellüler protozoon parazittir.Bağısıklık sistemi baskılı bireylerde ve fetuslarda önemli klinik bulgulara yol açabilmektedir. T.gondii'ye karsı olusan bağısıklık yanıtı ağırlıklı olarak hücresel yanıttır. Etkenin virulansını belirleyenantijenik yapılar yüzey yerlesimliler ve ekskretuvar-sekretuvar antijenler olarak ikiye ayrılmaktadır;Parazit bu antijenik yapıları kullanarak, konak hücreler ile etkilesime girmektedir. Apoptoz, memelihücrelerinde doğal bağısıklık yanıtının bir parçası olarak da tetiklenen fizyolojik bir olaydır; farklımekanizmalarla tetiklenmektedir. Organizmada meydana gelen değisiklikler ve dıs etkilerle apoptozaktive olmakta veya engellenmektedir. Enfeksiyon etkenleri apoptozu etkileyen faktörlerden birisidir.Özellikle intrasellüler etkenler ile yapılan çok sayıda çalısma bulunmaktadır. T. gondii de bu etkenlerarasında yer almaktadır. Bu çalısmada T. gondii ile apoptoz arasındaki iliski incelenmistir.T. gondii RH susuna ait takizoitler Vero hücre kültüründe üretildiler. Elde edilen parazitler,hücre artıklarından arındırıldı ve lizat haline getirmek için sonifikasyonla parçalandı. Lizatın proteinkonsantrasyonu saptandı. Fraksiyonlarına ayırmak için HPLC yapıldı. Kromatografi sonrası,moleküler büyüklüklerine göre ayrısan yapılar altı fraksiyon halinde toplandı. Apoptoza yatkın olanJurkat hücreleri kültüre edildi ve dört gruba ayrıldı. ?lk gruba sadece fraksiyonlar uygulandı ve 24 saatbeklendi. ?kinci gruba inkübasyonun 22'inci saatinde apoptoz indüktörü staurosporin eklendi. Pozitifkontrol olan üçüncü gruba sadece staurosporin eklendi, negatif kontrol olan dördüncü gruba ise hiçbirislem yapılmadı. Hücreler TUNEL yöntemiyle isaretlenerek, floresan mikroskobuyla incelendi.Apoptotik hücreler sayıldı ve istatistiki olarak analiz edildi.Çalısma sonucunda, T. gondii lizatlarının normal hücreler üstünde apoptotik etkiye sahipolduğu; apoptoza giden hücreler üstünde ise anti-apoptotik etki gösterdiği anlasılmıstır. Elde edilenfraksiyonlar arasında en belirgin apoptotik etkiye birinci ve ikinci fraksiyonların ulastığı; üçüncü vedördüncü fraksiyonların ise belirgin anti-apoptotik etki gösterdikleri saptanmıstır. Birinci grubaoranla, ikinci grupta apoptoz oranlarında bir artıs görüldü ve istatistiki olarak anlamlı bulundu. T.gondii sağlıklı hücreler üstünde apoptotik etki gösterirken, zaten apoptoza gitmis olan hücrelerde antiapoptotiketkileri vardır. ?leri çalısmalar için, antijenlerin izolasyonu ve farklı suslarla arastırmalaryapılması önerilmistir.Anahtar sözcükler: Apoptoz, HPLC, Toxoplasma gondii, TUNEL Yöntemi

Abstract:
SUMMARYToxoplasma gondii is a worldwide intracellular protozoon parasite. It is clinically important inimmun-compromised individuals and fetuses. Immun response to T. gondii is mostly cellular. Parasiteconsists of two groups of antigens. which determines the virulence: surface antigens and excretorysecretoryantigens; interacts with host cells via these antigens. Apoptosis is a mammalianphysiological process, triggered as a part of immun response. Apoptosis is activated or inhibited inresponse to physiological changes in the organism and to external factors; infectious agents belongs tothe group of external factors. In this study, the relationship between T. gondii and apoptosis issearched.The tachyzoites of T. gondii RH strain were grown in Vero cell culture. Multiplied parasites werecollected, purified from cellular debris and sonifically crushed down for maintaining lysate. Afterdetection of the protein concentration, HPLC was applied to lysate for fraction separation. Afterchromatography, six fractions were seperated according to molecular weights. Apoptosis sensitiveJurkat cells are cultured and divided into four groups. Lysate fractions were added on Jurkat cells .First group without any further supplement incubated for 24 hours. To second group, on the 22nd hourof the incubation apoptosis inductor staurosporin was added . Third group was positive control onlywith staurosporin. Fourth group was designed to be the negative control. Cells were marked withTUNEL assay and counted by using flourescence microscope. Results were analyzed statistically.T. gondii lysates represented an apoptotic effect on normal cells and anti-apoptotic effects onapoptotic cells according to the results of our study. first and second fractions exhibited distinctiveapoptotic features and third and forth fractions exhibited a prominent anti-apoptotic activity. There isa higher levels of apoptosis in group two than group one, and statistically significant. T. gondii?s gotapoptotic effects on healthy cells but anti-apoptotic effects on cells that already gone to apoptosis. Forfurther research, isolation of antigens and experimenting with different strains are recommended.Keywords: Apoptosis, HPLC, Toxoplasma gondii, TUNEL Assay