Biçim sonrası kuraklık stresine maruz bırakılan yaygın yonca (Medicago sativa L.) genotiplerinde kuraklık stresine tolerantlığı sağlayan bazı spesifik genlerin ifade seviyelerinin belirlenmesi
Determination of some specific drought related gene expression levels of alfalfa (Medicago sativa L.) applied drought stress rigth after cutting
Yazar: SELÇUK ÇETİN
Danışman: PROF. DR. İSKENDER TİRYAKİ
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Kuraklık stresi = Drought stress ; Medicago sativa = Medicago sativa ; Yonca = Alfalfa

Özet:
Bu çalışma TÜBİTAK-TOVAG 116O417 numaralı proje kapsamında aseptik şartlarda kurağa tolerantlığı tespit edilen ve saksılarda kontrollü koşullarda yetiştirilen 3 farklı mutant (M3) yonca genotipinin birinci biçim sonrasında kuraklık stresine verdikleri tepkilerin kuraklık stresine karşı tolerantlıktan sorumlu lokus spesifik (MsProDH ve MtRD2) genlerin ifade seviyelerinde meydana getirdiği değişimlerin belirlenmesi amacıyla 2017-2020 yılları arasında Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü, Bitki Moleküler Genetik ve Biyoteknoloji Laboratuvarı'nda yürütülmüştür. Çalışmada ayrıca biçim öncesi (0. gün), kuraklık stresinin 18. ve 24. günü bazı agro-morfolojik özelliklerin yanı sıra bitki kanopy sıcaklığı ve total klorofil miktarları da incelenmiştir. Biçim sonrası uygulanan kuraklık stresinin 0, 18 ve 24. günlerinde alınan yaprak örneklerinden total RNA'lar izole edilmiş ve ardından cDNA'lar sentezlenmiştir. Çalışmada Ms18S rRNA geni RT-qPCR analizlerinde referans gen (RG) olarak kullanılmıştır. Her bir genotipe ait örneklerin RT-qPCR analizleri 3 teknik tekrar ile gerçekleştirilmiştir. Kuraklık stresine karşı tolerantlıktan sorumlu lokus spesifik genlerin ifade seviyeleri 2-ΔΔCt metodu kullanılarak hesaplanmıştır. Bitki kanopy sıcaklığı ve total klorofil miktarlarına ait veriler SAS istatistik paket programı kullanılarak varyans analizine tabi tutulmuş, ortalamalar en küçük asgari fark (LSD) %5 önemlilik seviyesinde test edilmiştir. Çalışmada kullanılan X18, X20, X50 mutant bitkiler ile Z1 (sulu) ve Z2 (susuz) kontrol bitkilerinin MsProDH relatif gen ifade seviyeleri kuraklık stresinin 18. gününde sırasıyla 0,81, 4,57, 14,80, 0,19, 20,65 olurken 24. günde sırasıyla 0,19, 0,26, 1,78, 4,20, 49,56 olarak belirlenmiştir. X18, X20, X50, Z1 ve Z2 bitkilerinin MtRD2 relatif gen ifade seviyeleri kuraklık stresinin 18. gününde sırasıyla 0,28, 6,48, 14,84, 0,96, 1,23 olurken 24. günde sırasıyla 0,13, 0,25, 3,63, 5,33, 2,34 olarak belirlenmiştir. X18, X20, X50, Z1 ve Z2 bitkilerinin total klorofil miktarları 0. günde sırasıyla 58,48, 60,27, 65,55, 70,88, 58,08 mg/kg, 18. günde sırasıyla 48,66, 53,98, 56,96, 38,95, 46,05 mg/kg ve 24. günde sırasıyla 53,41, 49,22, 45,67, 46,21, 47,69 mg/kg olarak tespit edilmiştir. Varyans analiz sonuçları birinci biçim sonrası kuraklık stresine maruz kalan mutant ve kontrol yonca bitkilerinde incelenen agro-morfolojik ve fizyolojik özellikler bakımından önemli farklılıkların olduğunu göstermiştir. Sonuçlar birinci biçim sonrası uygulanan kuraklık stresinin, kuraklık stresinin süresi ve bitki genotipine bağlı olarak ilgili lokus spesifik genlerin relatif ifade seviyelerinde büyük değişikliklere neden olduğunu ve mutant bitkilerin kuraklık stresini daha iyi tolere edebildiğini göstermiştir.

Anahtar sözcükler: Yaygın yonca, Kuraklık stresi, Gen ifadesi, Gerçek zamanlı kantitatif PCR

Abstract:
This study was carried out to determine the changes in expression levels of loci-specific genes (MsProDH and MtRD2) responsible for drought stress tolerance on 3 alfalfa mutants (M3) which were determined as drought tolerant in aseptic conditions at germination stage in TUBITAK-TOVAG project (116O417). The experiment was carried out in a growth chamber. The plants grown in pots and application of drought started right after the cutting at first blooming stage in Canakkale Onsekiz Mart University, Faculty of Agriculture, Department of Agricultural Biotechnology, Plant Molecular Genetics and Biotechnology Laboratory between years of 2017-2020. The plant canopy temperatures and total chlorophyll contents of plants were also determined along with some agro-morphological characters on the 0th, the 18th and 24th days of drought stress. The cDNAs were synthesized from total RNAs isolated from leaf samples taken on the days of the 0th, the 18th and 24th of drought stress. The Ms18S rRNA gene was used as a reference and 3 technical replications were used in RT-qPCR analysis for each sample. Relative gene expression levels of drought related loci-specific genes were determined by using the 2-ΔΔCt method. The data of plant canopy temperatures and total chlorophyll contents were analyzed by using the SAS statistical package program and the means were separated based on the least significant difference (LSD) at 5% significance level. The MsProDH relative gene expression levels of X18, X20, X50 mutants, Z1 (aqueous) and Z2 (anhydrous) control plants were determined as 0,81, 4,57, 14,80, 0,19, 20,65 and 0,19, 0,26, 1,78, 4,20, 49,56 on the 18th and 24th days of drought stress, respectively while the MtRD2 relative gene expression levels of the same plants in given order were determined as 0,28, 6,48, 14,84, 0,96, 1,23 and 0,13, 0,25, 3,63, 5,33, 2,34 18th and 24th days of drought, respectively. The total chlorophyll contents of the plants ranged from 58,48 to 70,88 mg/kg, from 38,95 to 56,96 mg/kg, and from 45,67 to 53,41 mg/kg on 0th, 18th and 24th days of drought stress, respectively. The results of variance analysis showed significant differences among the mutants and control plants for the morphological and physiological parameters measured for drought stress which were applied to the mutants grown in pots after cutting at first blooming stage. The results of this study revealed that drought stress greatly changed the relative expression levels of drought related loci-specific genes based on the duration of drought stress and the plant genotype used.

Keywords: Common alfalfa, Drought stress, Gene expression, Real-time quantitative PCR