Rhodobacter sphaeroides'e özgü indüklenebilir özellikte bir ekspresyon vektörünün geliştirilmesi ve yeşil floresan protein geninin ifade edilmesi
Construction of a new inducible expression vector for Rhodobacter sphaeroides and expression of the green flourescent protein gene
Yazar: VAHİDE COŞKUN
Danışman: PROF. DR. HASAN HÜSEYİN DOĞAN
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Fotosentetik bakteri grubundan olan mor kükürtsüz (PNS) bakteriler, değişen çevre koşullarında zengin metabolik aktiviteler gösterebilen bakterilerdendir. Aerobik, anaerobik, fotosentetik veya fermentatif üreme biçimleri gösterebilirler. Bu özelliklerinden dolayı azot ve karbon fiksasyonu, oksijensiz fotosentez ve membran biyoenerjisi gibi birçok temel metabolik olayın araştırılmasında model organizmalar olarak kullanılmışlardır. Bu bakterilerin bazıları 5-aminolevulinik asit (5-ALA), biyohidrojen, B12 vitamini, koenzim Q10, poli-β-hidroksibütirat (PHB) ve karotenoid gibi birçok yüksek katma değerli ürünü tek bir biyoproseste aynı anda üretebilmektedirler. Gerek birçok biyolojik olayın aydınlatılmasında model bakteriler olarak kullanılmaları gerekse çok önemli birçok yüksek katma değerli ürünler üretebilmeleri, PNS bakterileri son derece önemli kılmaktadır.
Diğer bakteri gruplarında olduğu gibi PNS bakterilerle de yüksek katma değerli ürünler üretmek için özel tasarlanan ekspresyon vektörlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Mevcut vektörlere yeni ve akılcı özellikler eklenerek yeni klonlama ve ekspresyon vektörleri geliştirilmektedir. Bu tez kapsamında, PNS bakterilerden biri olan Rhodobacter sphaeroides'e özgü rekabetçi, yerli ve indüklenebilir bir ekspresyon sistemi geliştirilmesi hedeflenmiştir. Böylece yüksek katma değerli ürünlerin üretimine olanak sağlanmış olacaktır. Bu çalışmada son derece özenle seçilen vektör parçaları kullanılmış ve birçok konakla uyumlu vektör iskeleti olan PBBR1MCS2 (5144 bp) ile birleştirilerek özgün bir ekspresyon vektörü geliştirilmiştir. Geliştirilen ekspresyon vektöründe indüklenebilir bir promotor olan fruBKA operonunun promotoru kullanılmıştır. Ekspresyon vektörüne protein pürifikasyonlarında kullanılmak üzere altı Histidin aminoasiti içeren bir bölge eklenmiştir. Böylece geliştirilen ekspresyon vektörü ile indüklenebilir gen ekspresyonları yapılabilmiştir. Sadece ribozom bağlanma bölgesini kapsayan bir NruI (TCG / CGA) tanıma bölgesi eklenmiş, ilgili gen klonlanabilir ve çıkarılabilir bir hale getirilmiştir. Kavram ispatı çalışması olarak geliştirilen bu vektöre yeşil floresan protein geni klonlanmış ve Rhodobacter sphaeroides te ifade edilmiştir. Sonuç olarak, sağlam ve sürdürülebilir bir hücre fabrikası olarak Rhodobacter sphaeroides'in geliştirilmesi için fru ile indüklenebilir bir ekspresyon vektör olarak tasarlanan moleküler araç sentetik biyoloji bağlamında kurulmuştur.Böylece uluslararası düzeyde rekabetçi bir düzenin kurulması sağlanmış olup yüksek katma değerli ürünlerin üretimi ile ülke ekonomisine katkıda bulunulacaktır.

Abstract:
Purple sulfur (PNS) bacteria belonging to the group of photosynthetic bacteria have versatile metabolic activities at different environmental conditions. They can show aerobic, anaerobic, photosynthetic, and fermentative growth modes. Due to these characteristics, they have been used as model organisms for research in nitrogen and carbon fixations, anoxygenic photosynthesis and membrane bioenergetics. Some of these bacteria can produce a large number of high value added products like 5-amionolevulinic acid (5-ALA), biohydrogen, vitamin B12, Coenzyme Q10, poly-β-butyric acid and carotenoids in a single bioprocess at once. The usage of PNS bacteria in elucidation of many biological processes as model bacteria and their capability to produce many important high value-added products make PNS bacteria extremely important.
Like other bacteria, specifically designed expression vectors are needed to produce high value added products with PNS bacteria. Newly designed vectors are developed by adding new and logical features to the existing ones. In the context of this thesis, a local, inducible, superior and competitive expression vector unique for a PNS bacterium Rhodobacter sphaeroides will be developed. In this way, it will be possible to produce high value added products. In this study, highly elaborately selected vector fragments were used and a unique expression vector was developed by combining with the host vector frame, PBBR1MCS2 (5144 bp), which is compatible with several hosts. The promoter of the fruBKA operon, which is an inducible promoter in the expressed expression vector, is used. A region containing six histidine amino acids was added to the expression vector for use in protein purification. Thus, inducible gene expressions could be made with the developed expression vector. An NruI (TCG / CGA) recognition region encompassing only the ribosome binding site was added and the gene was cloned and made removable. Green fluorescent protein gene was cloned into this vector, developed as a concept-based study, and expressed in R. sphaeroides. As a result, a molecular instrument designed as a fru inducible expression vector for the development of Rhodobacter sphaeroides as a robust and sustainable cell factory was established in the context of synthetic biology. Thus, establishment of a competitive order at an international level has been ensured and the production of high added value products will contribute to the country's economy.