Trehaloz ve iodiksanol içeren Tris bazlı sulandırıcılarla dondurulan köpek epididimal spermatozoalarının eritme sonrası spermatolojik özellikleri
Post-thaw spermatological characteristics of canine epididymal spermatozoa frozen with Tris based extenders containing trehalose and iodixanol
Yazar: MAMET ÇEŞMECİ
Danışman: PROF. DR. ALPER BARAN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​ / Dölerme ve Suni Tohumlama Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
: Bu çalışmada köpek epididimal spermatozoonlarının dondurulmasında Tris temel sperma sulandırıcısına farklı dozlarda trehaloz ve iodiksanol ilavesinin spermatolojik özellikler üzerine etkisini ve bu maddelerin optimal dozlarını saptayarak her ikisinin birlikte kullanımında olası sinerjik etkisini ortaya koymak amaçlanmıştır. 
Çalışmada kısırlaştırma amacıyla barınağa getirilen 2-4 yaş arasında, 15-30 kg vücut ağırlığına sahip, karışık ırk sokak köpeklerinin bilateral orşiektomi operasyonu sonrası testislerinden elde edilen epididimal spermatozoon örnekleri kullanıldı. Çalışma iki aşamada gerçekleştirildi. Birinci aşamada Tris bazlı sulandırıcıya katılan trehaloz (Tr50- 50 mM, Tr75- 75 mM ve Tr100- 100 mM) ve iodiksanol'ün (İo%1- %1, İo%1,5- %1,5 ve İo%2- %2) optimal dozları belirlendi (kontrol grubuna hiçbir ekleme yapılmadı), ikinci aşamada ise optimal dozlarda trehaloz (Tr100) ve iodiksanol (İo%2) ve optimal dozların kombine kullanımının (Tr100 ve İo%2) spermatolojik özelliklere etkileri değerlendirildi (kontrol grubuna hiçbir ekleme yapılmadı).
Üç-dört adet erkek köpeğin testislerinden her bir epididimis 0,5 ml'lik bir enjektör yardımıyla Tris bazlı sulandırıcı ile petri kabına yıkanarak epididimal spermatozoonlar toplandı. Kazanılan epididimal spermatozoonların toplam motilite, progresif motilite ve yoğunluğu belirlendi. Bu değerlendirmeler köpek spermasına ait standart parametrelere göre ayarlanmış SCA® (Sperm Class Analyzer) CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer) cihazı kullanılarak yapıldı. Toplanan spermatozoonlar oda sıcaklığında (23-25C) 5 dakika bekletildikten sonra tüplere aktarıldı ve bir araya (pooling) getirildi. Elde edilen örneklerin, hacim açısından en az 0,5 ml olması, motilitenin ≥%70 ve yoğunluğun ≥200-300×106 spermatozoon/ml düzeyinde olması sağlandı. Spermatozoon yoğunluğu belirlendikten sonra sperma 1:3 oranında kademeli bir şekilde sulandırıldı. Soğutma, gliserolizasyon (final gliserol oranı %4) ve ekilibrasyon aşamalarından sonra 0,25 ml'lik payetlerde önce 110C'de donduruldu ve 196C'de saklandı. Dondurulmuş iki adet payet 37°C'lik su banyosunda, 30 saniyede eritildi. Ekilibrasyon, eritme, dayanıklılık ve termal stres sonrası spermatozoon toplam motilite, progresif motilite, kinematik hareket parametreleri CASA cihazında, HOS testi faz-kontrast mikroskobunda ve akrozom ve membran bütünlüğü ise flow sitometri cihazında incelendi. 
Farklı miktarlarda trehaloz'un ilave edildiği sulandırıcı gruplarının ekilibrasyon ve eritme sonrasına ait spermatolojik bulgular kontrol grubuyla karşılaştırıldığında incelenen spermatolojik özellikler yönünden herhangi bir fark saptanmadı (P>0,05), eritme sonrası aşamada 50 mM trehaloz kullanılan gruba ait LIN değerinin diğer gruplara göre önemli düzeyde yüksek olduğu belirlendi (P<0,05). Eritme sonrası flow sitometrik analizlerde 100 mM trehaloz ilave edilen grupta membran sağlam spermatozoon, akrozom sağlam canlı spermatozoon oranları, akrozomu hasarlı ölü spermatozoon oranları açısından en üstün olduğu kontrol grubuna göre istatistiksel açıdan önemli düzeyde farklı olduğu saptandı (P<0,05). Farklı oranlarda iodiksanol içeren gruplarda ise ekilibrasyon ve eritme sonrası spermatolojik özellikler yönünden gruplar arası herhangi bir fark saptanamadı (P>0,05). Eritme sonrası flow sitometrik analizlerde %2 iodiksanol ilave edilen grupta (İo%2) akrozomu sağlam canlı hücre oranı kontrol grubuna göre önemli derecede yüksek bulundu (P<0,05). 
Optimal dozların kombine kullanımı ile oluşturulan gruplarda (Kontrol, OpTr100, Opİo%2 ve OpTr100+Opİo%2) ekilibrasyon ve eritme sonrası aşamalarda incelenen tüm spermatolojik özellikler bakımından gruplar arası fark saptanamadı (P>0,05). Eritme sonrası yapılan dayanıklılık testleri bakımından 2 saat inkübasyon sonrası kontrol grubuna ait LIN ve STR değerleri hariç incelenen diğer spermatolojik özelliklerin birbirine benzer olduğu belirlendi. Kontrol grubuna ait LIN değerinin diğer gruplara göre daha yüksek olduğu, ancak istatistiksel açıdan OpTr100 (P<0,05) hariç diğer gruplarla benzer olduğu belirlendi (P>0,05). STR değeri bakımından kontrol grubunun OptTr100 ve Opİo%2 gruplarından istatistiksel olarak daha üstün olduğu belirlendi (P<0,05). Eritme sonrası yapılan termal stres testleri sonrası incelenen spermatolojik özellikler bakımından gruplar arası istatistiksel fark saptanamadı (P>0,05).
Sonuç olarak, köpek epididimal spermatozoonlarının 100 mM trehaloz ilave edilen Tris temel sperma sulandırıcısı ile dondurulup eritilmesi sonrasında daha yüksek oranda sağlam akrozom ve plazma membran bütünlüğü ile sonuçlandığını gösterdi. Aynı zamanda sperma sulandırıcısına %2 oranında iodiksanol ilavesinin ise eritme sonrası akrozomu sağlam hücre oranı açısından daha başarılı bulundu. İodiksanol ve trehaloz eklenen Tris sulandırıcısı ile kriyoprezerve edilen köpek epididimal spermatozoasının fertilizasyon kabiliyetini tam olarak ortaya koyabilmek için in vitro fertilizayon (İVF) ve suni tohumlama çalışmalarına ihtiyaç bulunmaktadır.

Abstract:
In this study, it was aimed to determine the effect of different doses of trehalose and iodixanol addition to Tris basic semen diluent on spermatological properties in freezing of canine epididymal spermatozoa and to determine the optimal doses of these substances and to reveal the possible synergistic effect of using both together. 
In the study, epididymal spermatozoon samples obtained from the testes of 2-4 years old, 15-30 kg body weight, mixed breed street dogs brought to the shelter for sterilisation after bilateral orchiectomy operation were used. The study was carried out in two stages. In the first stage, the optimal doses of trehalose (Tr50 - 50 mM, Tr75 - 75 mM and Tr100 - 100 mM) and iodixanol (Io1% - 1%, Io1.5% - 1.5% and Io2% - 2%) added to the Tris-based diluent were determined (no addition was made to the control group), In the second stage, the effects of optimal doses of trehalose (Tr100) and iodixanol (Io2%) and the combined use of optimal doses (Tr100 and Io2%) on spermatological properties were evaluated (no addition was made to the control group).
Epidididymal spermatozoa were collected from the testes of three to four male dogs by washing each epididymis with Tris-based diluent using a 0.5 ml syringe into a petri dish. Total motility, progressive motility and density of the recovered epididymal spermatozoa were determined. These evaluations were performed using the SCA® (Sperm Class Analyser) CASA (Computer Assisted Sperm Analyser) device adjusted according to the standard parameters of canine semen. The collected spermatozoa were kept at room temperature (23-25°C) for 5 minutes, then transferred to tubes and pooled. The samples obtained were ensured to be at least 0.5 ml in volume, motility ≥70% and density ≥200-300×106 spermatozoa/mL. After the spermatozoon density was determined, the semen was diluted gradually at a ratio of 1:3. After cooling, glycerolisation (final glycerol ratio 4%) and equilibration, 0.25 ml straws were first frozen at 110°C and stored at 196°C. Two frozen aliquots were thawed in a 37°C water bath in 30 seconds. After equilibration, thawing, endurance and thermal stress, spermatozoon total motility, progressive motility, kinematic motion parameters were analysed by CASA device, HOS test by phase-contrast microscopy and acrosome and membrane integrity by flow cytometry device.
When the spermatological findings of the diluent groups to which different amounts of trehalose were added were compared with the control group, no difference was found in terms of the spermatological properties examined (P>0.05), the LIN value of the group using 50 mM trehalose at the post-thawing stage was significantly higher than the other groups (P<0.05). In the post-thawing flow cytometric analyses, it was determined that the group in which 100 mM trehalose was added was the most superior in terms of the ratios of spermatozoon with intact membrane, live spermatozoon with intact acrosome and dead spermatozoon with damaged acrosome compared to the control group (P<0.05). In the groups containing different ratios of iodixanol, there was no difference between the groups in terms of spermatological properties after equilibration and thawing (P>0.05). In post-thawing flow cytometric analyses, the proportion of viable cells with intact acrosome was significantly higher in the group containing 2% iodixanol (Io2%) compared to the control group (P<0.05).
In the groups (Control, OpTr100, Opİo2% and OpTr100+Opİo2%) formed with the combined use of optimal doses, no difference was found between the groups in terms of all spermatological properties examined in the equilibration and post-thawing stages (P>0.05). In terms of post-thawing endurance tests, except for LIN and STR values of the control group after 2 hours of incubation, the other spermatological properties examined were similar to each other. It was determined that the LIN value of the control group was higher than the other groups (P<0.05), but statistically similar to the other groups except OpTr100 (P>0.05). In terms of STR value, it was determined that the control group was statistically superior to OptTr100 and Opİo2% groups (P<0.05). There was no statistical difference between the groups in terms of spermatological properties examined after thermal stress tests performed after thawing (P>0.05).
The results showed that freezing and thawing of canine epididymal spermatozoa with Tris basic semen diluent to which 100 mM trehalose was added resulted in a higher proportion of intact acrosomes and plasma membrane integrity. At the same time, the addition of 2% iodixanol to the semen diluent was found to be more successful in terms of acrosome intact cell ratio post-thawing. In vitro fertilization (IVF) and artificial insemination studies are needed to fully demonstrate the fertilisation ability of canine epididymal spermatozoa cryopreserved with Tris base diluent to which iodixanol and trehalose were added.