Nörodejeneratif hastalıkların tanısına yönelik elektrokimyasal biyosensörlerin tasarımları
Designs of electrochemical biosensors for the diagnosis of neurodegenerative diseases
Yazar: MARINA SERİN
Danışman: PROF. DR. PINAR KARA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomedikal Teknolojiler Ana Bilim Dalı / Biyomedikal Teknolojiler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Nöroloji = Neurology

Özet:
Bu tez kapsamında; multipl skleroz (MS) hastalığının biyobelirteci olan myelin bazik proteinin (MBP) hızlı, spesifik ve güvenilir tayinine yönelik aptamer ve antikor tabanlı elektrokimyasal nanobiyosensörlerin tasarımı gerçekleştirilmiştir ve elde edilen özelliklerini karşılaştırılmıştır.
Tasarlanmış bu sensörlerde, sensör yüzeyi olarak grafen oksit (GO) nanomateryali ile kaplanmış tek kullanımlık grafit elektrotlar (PGE) kullanılmıştır. GO'nun kullanılması; sensör yüzeylerinin yüzey alanları arttırılarak oldukça hassas ve düşük tayin sınırlı analizler gerçekleştirilmesine olanak sağlamıştır. Nanomodifiye edilmiş sensör yüzeyleri MBP biyobelirtecini tanıyan üç tane farklı aptamer dizi (LJM-5708, LJM-3064, MBPcl3) ve antikor ile kaplanarak MBP ile etkileşime bırakılmıştır. Bu etkileşim, Elektrokimyasal Empedans Spektroskopisi (EIS) tekniği ile görüntülenmiştir. 
Tasarlanan sensörlerin seçiciliği hem beyin omurilik sıvısında (BOS) hem serumda en yüksek oranda bulunan insan serum albümini (HSA) kullanılarak değerlendirilmiştir. Biyoreseptörlerin (aptamerler ve antikor) derişimi, biyobelirteç ile etkileşim süresi ve etkileşim sonrası yıkama süresi gibi koşullarının optimizasyon çalışmalarından sonra tayinin en uygun koşulları saptanarak, MBP, HSA karışımını içeren bir biyolojik matris (yapay BOS) içerisinde analizler gerçekleştirilmiştir. Farklı süre ve saklama koşullarında stabilite analizlerini yapılıp biyosensörlerin uygulanması doğrulanmıştır.
Bu çalışmada kullanılan aptamerler, daha önce terapötik amaçlarla fare modelinde sentezlenmiş olup ilk defa insan MBP tayinine yönelik algılama ajanı olarak uygulanmıştır. Fiziksel çevirici sisteminde elektrokimyasal tekniği uygulanmış üç tane aptasensör ve yanı sıra bir immünosensör geliştirilmiştir. Optimizasyon çalışmalarından sonra aptasensörlerin hedef molekülünü bağlama kapasiteleri değerlendirilip LJM-5708 aptamerin kullanılması en uygun bulunmuştur ve onun tayin limiti 1 ng/ml olarak hesaplanmıştır.
Ayrıca herhangi bir işaretleyici ajan veya indikatör kullanılmaksızın elektrokimyasal ölçümler sayesinde oldukça hızlı, işaretsiz ("label-free") direk analizlere olanak sağlamıştır. Geliştirilmiş bu yeni nesil aptasensör ile; klinikte özellikle nörodejeneratif hastalıkların erken teşhisi ve izlenmesi amacıyla hızlı yanıt veren, güvenilir, ticarileşme potansiyeli olan yerli ürünün geliştirilmesi gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonunda elde edilen minyatür PGE bazlı sensör hem BOS hem de serumda MBP tayini için uygulanabilir.

Abstract:
Within the scope of this thesis; aptamer and antibody-based electrochemical nanobiosensors were designed for rapid, specific, and reliable determination of myelin basic protein (MBP), a biomarker of multiple sclerosis (MS) disease, and their properties were compared.
In these designed sensors, disposable graphite electrodes (PGE) coated with graphene oxide (GO) nanomaterial were used as the sensor surface. Using GO for increasing the surface areas of the sensor enabled very sensitive and analyzes with low detection limit to be performed. Nanomodified sensor surfaces were coated with three different aptamer sequences (LJM-5708, LJM-3064, MBPcl3) and antibodies recognizing MBP biomarker and placed to interact with MBP containing solutions. This interaction was visualized by the Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) technique.
The selectivity of the designed sensors was evaluated using human serum albumin (HSA), which has the highest content in both cerebrospinal fluid (CSF) and serum. After the optimization studies of the bioreceptors (aptamers and antibody) concentration, interaction time with the biomarker and washing time after interaction, the most suitable conditions for the assay were determined and analyzes were performed in a biological matrix (artificial CSF) containing a mixture of MBP and HSA. Stability analyzes were made under different time and storage conditions and the application of biosensors was confirmed.
The aptamers used in this study were previously synthesized in a mouse model for therapeutic purposes and were applied for the first time as detection agents for human MBP determination. In total, three aptasensors and one immunosensor were developed in this study with the electrochemical technique applied in the physical converter unit. After optimization studies, capacities of all sensors to bind the target molecule were evaluated, and LJM-5708 aptamer-based sensor and immunosensor were found to be the most appropriate. The miniature PGE-based sensors obtained at the end of the study was applied for the determination of MBP in both PBS and artificial CSF with same detection limit (1 ng/mL) and range of detection (1…128 ng/mL).
In addition, thanks to electrochemical measurements without the use of any marker or indicator, it allows very fast, label-free direct analysis. With this improved new generation aptasensor; in the clinic, especially for the early diagnosis and monitoring of neurodegenerative diseases, the development of a fast-response, reliable, commercialization potential domestic product has been carried out.