Deneysel tasarım uygulanarak yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile hidrokortizon tayini ve geçerli kılınması
Determination and validation of hydrocortison by high performance liquid chromatography using experimental design
Yazar: GÜLAY ÇETİN TARLA
Danışman: PROF. DR. ÖZCAN YALÇINKAYA
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu tezde kortikosteroid tedavisinde kullanılan ilaçlarda bulunan Hidrokortizon etkin maddesinin analizi için deneysel tasarım yöntemi ile HPLC sistemde analitik yöntem geliştirilerek validasyon süreçleri tamamlandı. Etkin maddelerin kromatografik şartlarda ayrılması için çeşitli çözücü sistemlerinde analiz denemeleri gerçekleştirildi. Devamında deneysel tasarım yöntemi ile analiz şartları optimize edildi. Deneysel tasarım ile optimizasyonda faktör olarak; akış hızı, hareketli faz pH değeri, hareketli faz organik oranı ve kolon sıcaklığı kullanıldı. Bu faktörlerin ve birbirleri ile olan etkileşimlerin, HPLC kromatogramında elde edilen hidrokortizon pikinin alan değeri ve teorik plaka sayısı üzerine etkileri incelendi. İncelemede 4 faktör için Merkezi Kompozit Tasarımı kullanıldı. Her faktör için 5 seviye belirlendi. Bu seviyeler akış hızı için 0,7-0,8-0,9-1,0-1,1 mL/min hareketli faz pH değeri için 2,0-2,5-3,0-3,5-4,0 hareketli faz organik oranı yüzdesi için 60-65-70-75-80 % (h:h) kolon sıcaklığı için 20-25-30-35-40°C olarak belirlendi. Faktörlerin en düşük seviyeleri için - α, düşük seviyeleri için –1 orta seviyeleri için 0 ve yüksek seviyeleri için +1 en yüksek seviyeleri için α işareti kullanıldı. Toplamda 31 deney gerçekleştirildi. Elde edilen deney sonuçlarının değerlendirilmesi için regresyon analizi yapıldı. Sonuçların güvenilirliğini kontrol etmek için ANOVA yapıldı. Elde edilen verilere göre bir model oluşturuldu. Oluşturulan model kullanılarak pik alan değerleri kaydedildi. Bu değerlerle deneysel olarak bulunan değerler arasındaki ilişki incelendi. İncelemede regresyon katsayısı 0,9998 olarak bulundu. Ve modelin uygun olduğuna karar verildi. Geliştirilen model kullanıldığında, hidrokortizonun HPLC ile analizi için optimum koşullar; akış hızı 0,7 mL/min, kolon sıcaklığı 37,5°C, hareketli faz pH değeri 4,0 ve hareketli faz bileşimi metanol/su 80/20 olarak bulundu. Hidrokortizon pik kromatogramları, deneysel tasarım ile tespit edilen optimum koşullarda, 254 nm de UV ve PDA dedektör ile elde edildi. Geliştirilen yöntemin, seçicilik, sistem uygunluk, doğrusallık, çalışma aralığı doğruluk (geri kazanım), kesinlik (tekrarlanabilirlik, laboratuvar içi kesinlik), sağlamlık ve çözelti stabilitesi parametreleri incelenerek analitik yöntem validasyonu yapıldı.

Abstract:
In this thesis, an analytical method was developed and validated using an experimental design approach for the determination of Hydrocortisone in drugs utilized in corticosteroid therapy via High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). Various solvent systems were evaluated to achieve optimal chromatographic separation of the active ingredient. Subsequently, experimental design methodologies were employed to optimize the analysis conditions. The factors considered for optimization included flow rate, mobile phase pH, organic ratio of the mobile phase, and column temperature. The effects of these factors and their interactions on the peak area and theoretical plate number of the hydrocortisone peak in the HPLC chromatogram were examined using a Central Composite Design. Five levels were established for each factor: flow rate (0.7-0.8-0.9-1.0-1.1 mL/min), mobile phase pH (2,0-2.5-3,0-3.5-4,0), organic ratio of the mobile phase (60-65-70-75-80% v/v), and column temperature (20-25-30-35-40°C). The factor levels were denoted as -α for the lowest, -1 for low, 0 for medium, +1 for high, and α for the highest levels. A total of 31 experiments were conducted. Regression analysis was performed to evaluate the experimental results, and ANOVA was utilized to assess the reliability of the findings. Based on the collected data, a model was constructed. Using this model, peak area values were recorded and compared with experimentally obtained values. The regression coefficient was determined to be 0.9998, indicating the model's suitability. The optimal HPLC conditions for hydrocortisone analysis were identified as a flow rate of 0.7 mL/min, column temperature of 37.5°C, mobile phase pH of 4.0, and a mobile phase composition of methanol/water at 80/20. Chromatograms of hydrocortisone peaks were obtained at 254 nm using UV and PDA detectors under these optimized conditions. The developed method was subjected to validation by examining parameters such as selectivity, system suitability, linearity, operating range, accuracy (recovery), precision (repeatability, in-laboratory precision), robustness and solution stability.