Gebeliğin farklı dönemlerinde insan plasentasında ubikütin proteazom sistemi proteinlerinin ekspresyonlarının ve fonksiyonlarının incelenmesi
Investigation of expressions and functions of ubiquitin proteasome system proteins in human placenta in different periods of pregnancy
Yazar: CANSU ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. SEVİL ÇAYLI
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Gebelik = Pregnancy ; Gen ifadesi = Gene expression ; Mikroskopi-elektron taramalı = Microscopy-electron scanning ; Plasenta = Placenta ; Proteozom = Proteasome ; Trofoblastlar = Trophoblasts ; Ubikuitinler = Ubiquitins

Özet:
İmplantasyon ve plasenta gelişimi sürecinde trofoblastların invazyon ve migrasyonlarına etki eden çeşitli moleküler mekanizmalar bulunmaktadır. Son çalışmalarla, p97/VCP (Valosin-İçeren Protein) ve SVIP (Küçük VCP ile Etkileşen Protein)'in kanser hücrelerinin invazyonlarında ve Ubikütin Proteazom Sistemi (UPS)'ndeki önemleri bildirilmesine rağmen, bu proteinlerin insan plasenta gelişimindeki rolleri ve fonksiyonları bilinmemektedir. Bu nedenle çalışmanın ilk amacı bu proteinlerin farklı trimester insan plasentalarında ekspresyonlarını belirlemek ve karşılaştırmak, ikinci amacı ise bu proteinlerin ekstravillöz trofoblast hücreleri invazyon ve migrasyonlarına olası etkilerini belirlemektir. 
Bu amaçlar doğrultusunda, üç trimestere ait insan plasenta dokularında histokimyasal değerlendirmeler ve Taramalı Elektron Mikroskobisi kullanılmıştır. Protein ve gen analizleri immünohistokimya, immünofloresan, Western Blot ve qRT-PCR ile değerlendirilmiştir. Fonksiyonel çalışmalar için ekstravillöz trofoblast hücrelerinde (HTR-8/SVneo) p97/VCP inhibitörü (DBeQ) uygulaması ve p97/VCP-SVIP siRNA transfeksiyonlarıyla proteinlerin ekspresyonları baskılanmıştır. Bu baskılanmanın hücrelerin invazyon ve migrasyonlarına olan etkileri, gerçek zamanlı analiz sistemiyle (xCELLigence) belirlenmiştir. 
p97/VCP ve SVIP ekspresyonlarının 1. trimestere ait sitotrofoblastlarda ve sinsisyotrofoblastlarda yoğun olduğu gözlenmiştir. Western Blot ve qRT-PCR bulgularıyla 1. trimesterdeki ekspresyonların 2. trimesterde anlamlı düzeyde azaldığı ve 3. trimesterde tekrar arttığı belirlenmiştir. Otofaji proteinlerinden LC3II ve p62 ekspresyonları ise gebelik boyunca artmıştır. HTR-8/SVneo üzerinde DBeQ uygulamasının ve siRNA ile p97/VCP ekspresyonunun baskılanmasının, SVIP ekspresyonunu azalttığı ve otofajik proteinlerin (LC3II ve p62) ekspresyonlarını ise anlamlı derecede arttırdığı belirlenmiştir. DBeQ uygulaması ve p97/VCP siRNA transfeksiyonu hücrelerin invazyon ve migrasyonlarını anlamlı derecede azaltırken, SVIP siRNA transfeksiyonları hücrelerin invazyon ve migrasyonlarında artış sağlamıştır.
Sonuç olarak UPS'de rol oynayan p97/VCP ve SVIP'in üç trimesterde farklı düzeylerde eksprese edildiklerinin belirlenmesi bu proteinlerin insan plasenta gelişimindeki önemini ortaya çıkarmıştır. Aynı zamanda ekstravillöz trofoblastların invazyon ve migrasyonlarını etkiledikleri belirlenerek gebeliğin sürdürülebilirliği ve preeklampsi gibi patolojilerde etkin olabilecekleri ortaya konulmuştur.

Abstract:
During implantation and placental development, there are molecular mechanisms in the invasion and migration of trophoblasts. Recent studies have reported the importance of p97/VCP (Valosin-Containing Protein) and SVIP (Small VCP-Interacting Protein) in invasion of cancer cells and Ubiquitin-Proteasome System (UPS). Although many studies have been conducted during pregnancy, the roles of p97/VCP and SVIP are unknown. In the first stage, the aim of the study was to compare the expressions of these proteins in different trimester human placentas. In the second stage, it was aimed to examine the possible effects of these proteins on invasion and migration in functional studies with extravillous trophoblast cells.
Histochemical evaluations and Scanning Electron Microscopy were used in placentas. Protein and gene analyses were performed by immunohistochemistry, immunofluorescence, Western Blot and qRT-PCR. Expressions were suppressed through extravillous trophoblast cell line HTR-8/SVneo by p97/VCP inhibitor (DBeQ) administration and p97/VCP-SVIP siRNA transfections. Changes in invasion and migration were determined by real-time analysis system (xCELLigence). 
In the 1st trimester, p97/VCP and SVIP expressions were found to be intense in cytotrophoblasts and syncyiotrophoblasts. In the Western Blot and qRT-PCR findings, the expressions in the 1st trimester decreased in the 2nd trimester and then increased again. Expressions of LC3II and p62 increased throughout pregnancy. It was determined that SVIP expressions decreased, LC3II and p62 increased significantly after DBeQ. DBeQ and p97/VCP siRNA transfection reduced invasion and migration of the cells. In addition, there was an increase in the SVIP siRNA groups in invasion and migration.   
As a result, the determination that p97/VCP and SVIP, which play a role in UPS, were expressed at different levels in trimesters revealed the importance of these proteins in human placental development. Also, it was revealed that extravillous trophoblasts affected invasion and migration, and that they might be effective in pathologies such as pregnancy sustainability and preeclampsia.