Cerulenin uygulanmış U87 glioblastoma hücre hattında endoplazmik retikulum stresinin araştırılması
Investigation of endoplasmic reticulum stress in cerulenin treated U87 glioblastoma cell line
Yazar: ŞEFİKA BEYZA METE
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MURAT PEKMEZ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology
Dizin: Beyin hastalıkları = Brain diseases ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Glioma = Glioma ; Serulein = Cerulein

Özet:
Glioblastoma, yüksek malignansi özelliği, tıbbi yöntemlerle saptanmasının zor ve tedavi başarısının düşük oranda olması nedeniyle en ölümcül kanser türlerinden biri olarak kabul edilmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, glioblastomadaki moleküllerin ve/veya hücresel yolakların karsinojenez sürecindeki değişimleri ve bunların anlatımlarındaki değişimler, glioblastomanın hem tanı hem tedavisi için çeşitli hedeflerin belirlenmesine olanak sağlayabilmektedir. Buna örnek olarak, kanser hücrelerinde yüksek oranda anlatımı yapılan yağ asit sentaz ve onun inhibitörü Cerulenin verilebilir. Cerulenin maddesi bir antifungal ajan olup lipit biyosentez yolağında yağ asit sentaz enzimini inhibe ederek malonil koenzim A'nın palmitik aside dolayısıyla yağ asitlerine dönüşümünü engeller. Yağ asitlerinin oluşamadığı bir hücrede stres durumu gelişir ve stresin önlememesi durumunda ölüm mekanizmaları aktifleşerek hücre ölebilir. 
Yapılan tez çalışmasında; Cerulenin'in U87MG hücre hattına çeşitli dozlarda uygulanmasıyla hücre canlılığındaki değişim, MTT testiyle belirlenip sonraki deneyler için iki doz grubu seçilmiştir. MTT testinden elde edilen verilerden sonucunda seçilen ilk grubun (IC20) konsantrasyonu 3.6 μg/mL; ikinci grubun (IC50) konsantrasyonu ise 5.55 μg/mL olarak belirlendi. Sitotoksik dozları belirlenmiş hücrelerde Cerulenin'in neden olabileceği stres koşulunda endoplazmik retikulumun (ER) ne düzeyde etkilendiği, ER'nin hücresel strese ve/veya ölüm mekanizmalarının işlemesinde nasıl katkı sağladığı ve Cerulenin'in veya ER stresinin gen düzeyindeki etkileri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve Western blot teknikleri ile incelenmiştir. RT-PCR sonucunda; TMED4 geninin anlatımı, madde uygulanmamş kontrol grubuna kıyasla IC20 ve IC50 grubunda sırasıyla 0.31 ve 0.48 kat azalmıştır. Protein ekspresyonunda ise TMED4 proteininde kontrole göre 1.26 ve 1.38 kat artış saptanmıştır. Endoplazmik retikulum proteinlerinde ise, ER şaperonu olarak bilinen Grp78 proteininde kontrole kıyasla IC20 grubunda 1.5 kat; IC50 grubunda ise 1.12 kat artış; IRE1α'nın IC20 ve IC50 gruplarında sırasıyla 1.04 ve 1.22 kat artış; ATF6'nın doz gruplarında sırasıyla 0.91 ve 0.84 kat azalış ve fosforile PERK proteininde ise kontrole oranla 1.32 ve 1.16 kat artış gözlenmiştir. ER proteinlerinin yanı sıra, hücre ölümünde görev alan proteinlerden biri olan Bax'ın ekspresyonu, kontrole göre sırasıyla 1.09 ve 1.35 kat artmıştır. ER stresini görüntülemek için Tiyoflavin T adlı floresan boya ile boyanan U87MG hücrelerinde, dozun öldürücülüğü ile floresan ışımanın pozitif korelasyon gösterdiği saptanmıştır.
Çalışmadan elde edilen verilerin, glioblastoma ile ilgili tanı ve tedaviye yönelik strateji geliştirilmesinde veri bakımından katkı sağlaması hedeflenmektedir.

Abstract:
Glioblastoma remains as one of the most fatal cancer types due to its high malignancy, insufficient diagnostic methods and poor rate of overall survival. Recent studies indicate that alterations in molecules and/or metabolic pathways during carcinogenesis may come forward as potential targets in regards to prognosis and cure of glioblastoma. Fatty acid synthase, the enzyme which is responsible for converting malonyl coenzyme A to palmitate, and its inhibitor, Cerulenin are one of the most prominent examples of such targets. Cerulenin, an antifungal agent, blocks lipid synthesis pathway via blocking fatty acid synthase and induces cellular stress due to lack of fatty acids. In addition to that, fatty acid deficiency-related stress may cause cells undergo death via activation of death pathways.
In this study, MTT assay results revealed that Cerulenin treatment in various concentrations significantly alters U87MG cell viability. Based on the 48 hours of incubation results, one untreated control group and two treated groups were selected for following experiments. One of the two groups was IC20 which represented 20% cytotoxicity, was found as 3.6 μg/mL. The latter group was IC50 that represented 50% cytotoxicity, was determined as 5.55 μg/mL. Western blotting and qPCR were used to analyze changes in protein and gene expressions as a result of Cerulenin-induced ER stress. qPCR data displayed that tmed4 gene expression significantly reduced, with being 0.31 times for IC20 group and 0.48 times for IC50 cells. However, TMED4 protein expression increased 1.26 times and 1.38 times, respectively. In endoplasmic reticulum proteins; IRE1α expression increased 1.04 and 1.22 times, ATF6 expression slightly decreased 0.91 times and 0.84 times, respectively. Phosphorylated PERK, another ER protein, has increased 1.32 and 1.16 times compared to untreated cells. ER stress was visually assessed by using fluoroscent microscopy. A fluoroscent dye named Thioflavin T was used to stain Cerulenin-treated U87MG cells. Microscopy results indicated that dose-dependent inhibtion and fluoroscent signal were positively correlated.
Data obtained from the study are expected to contribute in terms of developing novel strategies related to diagnosis and cure of glioblastoma.