Yara enfeksiyonlarından korunma ve iyileştirmeye yönelik "akıllı" kumaş geliştirilmesi ve medikal aplikasyonu
Development of "intelligent" fabric for the curingand prevention from microbial infections of openwounds and medicinal application of the "intelligent" fabric
Yazar: NOUHAN DOUMBOUYA
Danışman: DOÇ. DR. ALPER AKKAYA
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antimikrobiyal ajanlar = Antimicrobial agents ; Enfeksiyonlar = Infections ; Hidrojeller = Hydrogels ; Hyalüronik asit = Hyaluronic acid ; Kumaşlar = Fabrics ; Poliakrilonitril = Polyacrylonitrile ; Sargı bezi = Bandage cloth ; Yara enfeksiyonu = Wound infection ; Yara iyileşmesi = Wound healing ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries

Özet:
Bu çalışmada, tekstil sanayinde kullanılan sentetik poliakrilonitril (PAN) kumaşların mikrobiyal olarak modifikasyonu ile özelliklerinin iyileştirilmesi ve fonksiyonelleştirilmesi gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma kapsamında Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Pseudomonas putida (ATCC 17514), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas fluorescens (DSM 6521) ve Micrococcus luteus (DSM 20030) mikroorganizmaları kullanılarak nitrilaz enziminin üretimi, üretimin optimizasyonu ve optimum koşullarda PAN kumaşın modifikasyonu yapılmıştır. PAN kumaşlarda karboksil gruplarının oluştuğu ATR-FTIR yöntemiyle belirlenmiştir. Modifikasyon işlemleriyle fonksiyonel grup eklenerek reaksiyona yatkın hale getirilen sentetik kumaşlara, biyoaktif bileşik olarak antimikrobiyal peptid (AMP) PAN kumaşa immobilize edilmiştir. İmmobilizasyonda kullanılan AMP, Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Pseudomonas putida (ATCC 17514), Bacillus subtilis (ATCC 6653), Lactobacillus pentosus (DSM 16366) ve Bacillus subtilis (DSM 347) mikroorganizmaları kullanılarak üretimi, üretimin optimizasyonu çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca, kromatografik yöntemler ile üretilen AMP'nin saflaştırılması yapılmıştır. 
Yaranın enfeksiyonlardan korunması ve iyileşmesine yönelik kullanmak üzere rekombinant Bacillus subtilis 1A752 ile hyaluronik asit (HA) üretiminin gerçekleştirildi, kromatografik yöntemler ile HA saflaştırıldı, viskozimetrik yöntem kullanılarak üretilen HA'nın molekül ağırlığı belirlendi, NMR ile HA'nın moleküler yapısı ve saflık derecesi incelendi, HA kitosan (CS) ile hidrojel hazırlandı ve ardından AMP immobilize kumaşa hidrojelin yüzey aplikasyonu yapılmıştır. 
Bu çalışmada, ilaç dağıtımının sürekliliğine yönelik HA'nın biyouyumluluğunun belirlenmesinde in vitro toksisite testleri (sitotoksisite, hemoliz ve irritasyon) başarıyla gerçekleştirilmiştir. Gerçekleştirdiğimiz in vitro sitotoksisite çalışması sonucunda 72 saat sonunda 0,25-1,00 mg/mL dozlarda dahi CCD34Lu hücrelerinin canlılık oranı yaklaşık %100 iken, 1,5 mg/mL dozda dahi CCD34Lu hücrelerinin canlılık oranı yaklaşık %80'di. HA'nın yüksek dozda dahi CCD34Lu hücreleri üzerine sitotoksik etki göstermediği belirlenmiştir. Bu çalışmada gerçekleştirilen hemoliz testi sonucunda HA'nın ve HA/CS'nın kan uyumlu olduğu belirlenmiştir. Tüm veriler istatistiksel olarak değerlendirildi ve sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Sonuç olarak B. subtilis 1A752'den elde edilen HA'nın güvenilir bir ürün olarak kullanılabileceğini ortaya konulmuştur.
Projenin son aşamasında, üretilmiş AMP üzerinde antimikrobiyal testler yapılmıştır. Kumaşlar üzerinde ise su tutma kapasitesi ve temas açısı ölçümü, SEM görüntüsü, ATR-FTIR (ham kumaş, modifiye kumaş, AMP immobilize kumaş, hidrojel ürün) gibi karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. 
Sonuç olarak; çalışmada geliştirilen "Akıllı" kumaşın medikal alanlarda kullanılmak üzere endüstriyel ölçekte üretime hazırlık olması açısından önemli bir yol kat edilmiştir. HA, ürünün üzerinden kontrolü bir şekilde salınacaktır; ancak AMP kumaşın üzerinde kalacağı için yara iyileşmesini hızlandırmasının yanısıra, yaranın enfekte olmasını önlenecektir. Çalışma sonunda, yanık veya ameliyat sonrasında oluşan yara iyileşmesini hızlandırıcı nitelikte antibakteriyel bir ürün elde edilmiştir.
Anahtar Kelimeler: Poliakrilonitril kumaş, kumaş modifikasyonu, antimikrobiyal peptid, immobilizasyon, hyaluronik asit, hidrojel, yara iyileşmesi.

Abstract:
In this study, properties of synthetic polyacrylonitrile (PAN) fabrics used in textile industry were improved and functionalized by microbial modifications. Therefore, the production and optimization of nitrilase enzyme and the PAN fabrics modification were performed under optimum conditions using Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Pseudomonas putida (ATCC 17514), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas fluorescens (DSM 6521) and Micrococcus luteus (DSM 20030). The formation of carboxyl groups in PAN fabrics was determined by the ATR-FTIR method. The antimicrobial peptide (AMP) was also immobilized on the PAN fabric as a bioactive compound on the functional groups of the synthetic fabric. Microorganisms namely Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Pseudomonas putida (ATCC 17514), Bacillus subtilis (ATCC 6653), Lactobacillus pentosus (DSM 16366) and Bacillus subtilis (DSM 347) were used for the production, optimization of AMP immobilized on the fabric. In addition, the produced AMP was purified using chromatographic methods. 
The production of hyaluronic acid (HA) was carried out with recombinant Bacillus subtilis 1A752. The produced HA was employed in the protection against microbial infections and wound healing. HA was purified by chromatographic methods, the molecular weight was determined by a viscometric method and the molecular structure and purity of HA were examined by NMR. The HA hydrogel was prepared with chitosan (CS) and then an application of the hidrogel to the PAN fabric  surface containing AMP was performed.
In this study, in vitro toxicity tests (cytotoxicity, hemolysis and irritation) were successfully conducted to determine the biocompatibility of HA for continuous drug delivery. As a result of our in vitro cytotoxicity study, the survival rate of CCD34Lu cells is approximately 100% at a dose of 0.25 to 1.0 mg/mL after 72 hours, while the survival rate of cells CCD34Lu is approximately 80% at a dose of 1.5 mg/mL. HA did not show cytotoxic activity on CCD34Lu cells even at high doses. As a result of the hemolysis test performed in this study, it was determined that the blood was compatible with produced HA and HA/CS. All data were statistically evaluated and the results were statistically significant and it was demonstrated that HA obtained from B. subtilis 1A752 could be used as a reliable product. 
In the final phase of the project, antimicrobial assays were performed on the produced MPA, characterization studies were performed on fibers such as water retention capacity and contact angle measurement, and then SEM image, ATR-FTIR spectoscopy (for raw fabric, modified fabric, immobilized AMP fabric, hydrogel product) were performed.
As a result, the "smart" fabric developed in this study can be a pathway in terms of preparation for industrial scale production and for use in the medical field. HA will somehow be released under control; however, since the AMP will remain on the fabric, it will accelerate the healing of wounds and prevent infection of the wound. At the end of the study, an antibacterial product was obtained that accelerates the healing of wounds after a burn or surgery.
Keywords: Polyacrylonitrile fabric, fabric modification, antimicrobial peptide, immobilization, hyaluronic acid, hydrogel, wound healing.