Fesleğen tohumlarından protein izolatı ve biyoaktif peptit üretiminin optimizasyonu, izolat ve biyoaktif peptitlerin karakterizasyonu
Optimization of protein isolate and bioactive peptide production from basil seeds, characterization of isolate and bioactive peptides
Yazar: ŞERİFE MELİKE DALMIŞ
Danışman: DOÇ. DR. HİLAL İŞLEROĞLU
Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında, fesleğen tohumundan proteinlerin ekstraksiyonu amacıyla enzimatik ön işlem uygulanarak klasik alkali ekstraksiyon ve ultrasonik destekli ekstraksiyon (UDE) işlemleri kullanılmıştır. Enzimatik ön işlem için pH (3.0-5.0), sıcaklık (35-50°C), enzim miktarı (0.5-5.0 FBGU/g tohum) ve işlem süresi (1-4 saat) bağımsız değişkenler olarak tanımlanmış, Box-Behnken deneme planı kullanılarak optimizasyon gerçekleştirilmiştir. Enzimatik ön işlem için optimum koşullar, pH 3.01, sıcaklık 52.11°C, enzim miktarı 3.75 FBGU/g tohum ve süre 3.70 saat olarak belirlenmiş, bu koşullarda protein verimi %86.55, indirgen şeker miktarı ise 164.63 mg/g tohum olarak hesaplanmıştır. Çalışmada elde edilen protein izolatlarının koagüle protein yüzdesi, su ve yağ tutma kapasiteleri, köpük özellikleri (kapasite ve stabilite), emülsifikasyon özellikleri (aktivite, stabilite ve kapasite) ve çözünürlük özellikleri kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Ayrıca, fesleğen tohumu proteinlerinin yapısal ve termal özellikleri ile amino asit kompozisyonu da belirlenmiştir. En yüksek koagüle protein yüzdesi (%7.0), su tutma kapasitesi (5.2 g/g) ve köpük kapasitesi (%71) enzimatik ön işlem ve UDE işlemi ile elde edilen örneklerde gözlemlenmiştir. Protein çözünürlüğü pH 4.0'da en düşük seviyede (izoelektrik nokta) bulunurken, pH 12.0'da en yüksek seviyeye ulaşmıştır. 
Tez çalışmasında elde edilen fesleğen tohumu protein izolatından biyoaktif peptit üretimi gerçekleştirilmiştir. Enzimatik hidroliz işlemi ile biyoaktif peptit üretiminin optimizasyonu sağlanmış ve optimum işlem koşulları enzim:substrat oranı %12.26, alkalaz:flavourzyme oranı 0.63 U/U ve hidroliz süresi 157.33 dakika olarak belirlenmiştir. Bu koşullarda hidroliz derecesi %73.73, DPPH serbest radikal inhibisyonu %41.23 olarak hesaplanmıştır. Üretilen biyoaktif peptitlerin IC50 değerleri DPPH için 8.0 µg/mL, ABTS için 15.8 µg/mL, hidroksil serbest radikali için 9.15 µg/mL, şelatlama aktivitesi için 4.9 mg/mL olarak belirlenmiştir. Anti-hipertansif aktivite için IC50 değeri 4.3 mg/mL, anti-diyabetik aktivite göstergesi olarak α-amilaz ve α-glukosidaz için inhibe etme IC50 değerleri sırasıyla 3.9 mg/mL ve 4.8 mg/mL olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, biyoaktif peptitlerin antimikrobiyal aktiviteleri belirlenmiş ve Gram-pozitif bakteriler üzerinde etkinlik gösterdiği saptanmıştır. Biyoaktif peptitlerin gastrointestinal sistem (GİS) stabiliteleri değerlendirildiğinde, ağız safhasında antioksidan aktivitenin ~%68 oranında korunduğu, ancak mide safhasında bu oranın ~%34'e, bağırsak safhasında ise ~%15'e düştüğü tespit edilmiştir. Şelatlama aktivitesi, GİS sindirimi sonrası yaklaşık %80 oranında azalma göstermiştir. Anti-hipertansif aktivite ağız safhasında %80 oranında korunurken, bağırsak safhasında bu aktivitenin %86'sının kaybedildiği belirlenmiştir. Benzer şekilde, anti-diyabetik aktivite bağırsak safhasında ~%84 oranında azalmıştır. Sonuç olarak, fesleğen tohumu protein izolatlarının yüksek besin değeri ve fonksiyonel özelliklere sahip olduğu belirlenmiştir. Enzimatik ön işlem ve ultrasonik destekli ekstraksiyon yöntemlerinin protein verimini ve fonksiyonel özellikleri artırdığı gözlemlenmiştir. Bunun yanı sıra, izolatlardan üretilen biyoaktif peptitlerin güçlü antioksidan, antimikrobiyal, anti-hipertansif ve anti-diyabetik aktiviteler sergilediği ve çeşitli sağlık yararları sunma potansiyeline sahip olduğu tespit edilmiştir. Ancak, GİS sırasında bazı biyolojik aktivitelerde kayıplar olduğu görülmüştür. Elde edilen bulgular, fesleğen tohumu protein izolatları ve biyoaktif peptitlerin fonksiyonel gıda formülasyonlarında ve sağlık destekleyici ürünlerde kullanılabileceğini göstermiştir.

Abstract:
In this thesis, enzymatic pretreatment was applied to extract proteins from basil seeds using conventional alkaline extraction and ultrasonic-assisted extraction (UAE) methods. For enzymatic pretreatment, pH (3.0-5.0), temperature (35-50°C), enzyme concentration (0.5-5.0 FBGU/g seed), and time (1-4 hours) were identified as independent variables, and optimization was carried out using the Box-Behnken experimental design. The optimal conditions for enzymatic pretreatment were determined as pH 3.01, temperature 52.11°C, enzyme concentration 3.75 FBGU/g seed, and time 3.70 hours. Under these conditions, the protein yield was calculated as 86.55%, while the reducing sugar content was 164.63 mg/g seed. The coagulated protein percentage, water and oil holding capacities, foaming properties (capacity and stability), emulsifying properties (activity, stability, and capacity), and solubility characteristics of the protein isolates were comprehensively examined. Additionally, structural and thermal properties and amino acid composition of basil seed proteins were determined. The highest coagulated protein percentage (7.0%), water holding capacity (5.2 g/g), and foaming capacity (71%) were observed in the samples produced using enzymatic pretreatment and UAE. Protein solubility was the lowest at pH 4.0 (isoelectric point) and reached its highest level at pH 12.0.
Bioactive peptides were produced from the basil seed protein isolate obtained in this thesis study. The enzymatic hydrolysis process for bioactive peptide production was optimized, with the optimal process conditions determined as enzyme:substrate ratio 12.26%, alcalase:flavourzyme ratio 0.63 U/U, and hydrolysis time 157.33 minutes. Under these conditions, the degree of hydrolysis was calculated as 73.73%, and DPPH free radical inhibition as 41.23%. The IC50 values of the produced bioactive peptides were determined as 8.0 µg/mL for DPPH, 15.8 µg/mL for ABTS, 9.15 µg/mL for hydroxyl free radical scavenging activity, and 4.9 mg/mL for chelating activity. For anti-hypertensive activity, the IC50 value was determined as 4.3 mg/mL, while the IC50 values for α-amylase and α-glucosidase inhibition, indicative of anti-diabetic activity, were 3.9 mg/mL and 4.8 mg/mL, respectively. Additionally, the antimicrobial activities of the bioactive peptides were determined, showing efficacy against Gram-positive bacteria. When the gastrointestinal system (GIS) stability of the bioactive peptides was evaluated, antioxidant activity was preserved at approximately 68% during the oral phase but decreased to ~34% in the gastric phase and ~15% in the intestinal phase. Chelating activity decreased by approximately 80% after GIS digestion. Anti-hypertensive activity was retained at 80% during the oral phase but showed an 86% reduction in the intestinal phase. Similarly, anti-diabetic activity decreased by ~84% in the intestinal phase. In conclusion, basil seed protein isolates were found to possess high nutritional value and functional properties. Enzymatic treatment and ultrasonic-assisted extraction methods significantly enhanced the protein yield and functional characteristics. Moreover, the bioactive peptides derived from the isolates demonstrated strong antioxidant, antimicrobial, anti-hypertensive, and anti-diabetic activities, highlighting their potential to offer various health benefits. However, it has been observed that some biological activities are lost during GIS. These findings suggest that basil seed protein isolates and bioactive peptides could be utilized in functional food formulations and health-supportive products.