Thermus aquaticus DNA polimeraz ı enziminin rekombinant                                        DNA teknolojisi ile üretilmesi, saflaştırılması ve analizi
Purification and analysis of thermus aquaticus DNA polymerase i                                           produced by recombinant DNA technologies
Yazar: BURAK EKEN
Danışman: PROF. DR. KADİR TURAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: DNA = DNA ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Rekombinant DNA teknolojisi = Recombinant DNA technology ; Thermus aquaticus = Thermus aquaticus

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında Thermus aquaticus DNA Polimeraz I enziminin Escherichia coli hücrelerinde düşük maliyette rekombinant olarak üretilmesi, saflaştırılması ve analizi amaçlandı. 
Gereç ve Yöntem: Taq DNA Polimeraz I enzimini kodlayan gen, pAKTaq plazmit vektörü üzerinden polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile hazırlandı. Elde edilen DNA fragmenti E. coli lac promotörü ve T7 RNA polimeraz promotörü kontrolünde klonlanarak bakteri ekspresyon vektörleri oluşturuldu. Oluşturulan plazmit vektörlerin kontrolleri ilk aşamada restriksiyon enzdonükleaz enzimleri ile kesilerek yapıldı. Sonrasında DNA dizi nalizleri ile Taq DNA polimeraz geni dizilendi. Elde edilen plazmiter farklı E. coli suşlarına transforme edildi. Hücrlerde Taq DNA polimeraz enziminin sentezi PAGE/Western melezleme tekniği ile belirlendi. Daha sonra E. coli hücrelerinden ekstre edilen ve/veya kolon kromatografisi ile saflaştırılan Taq DNA polimeraz enziminin farklı koşullarda aktivitesi standart PZR deneylerinde enzim kaynağı olarak kullanılarak analiz edildi. 
Bulgular ve Sonuç: PAGE/Western melezleme tekniği ile yapılan analizler sonucunda lac promötörü kontrolünde klonlanan Taq DNA polimeraz geninin E. coli BL21 (DE3), Mach1 ve TOP110 hücrelerinde IPTG ile uyarılma (indüksiyon) gerekmeksizin ekspresyon yaptığı saptandı. T7 RNA polimeraz promotör taşıyan vektörlerin, beklendiği gibi sadece E. coli BL21 (DE3) hücrlerinde Taq polimeraz enzimini ekspresse ettiği görüldü. Transforme edilen hücrelerden hazırlanan ham ekstrelerden ya da kolon kromatografisi fraksiyonlarından aseton ile çöktürülerek elde edilen enzim örneklerinin referans olarak kullanılan ticari bir Taq enzimi kadar aktif bir şekilde DNA sentezini kataliz ettiği satpandı. Sonuç olarak, bu çalışmada izlenen ektraksiyon yöntemi ile kısa sürede ve düşük maliyette aktif Taq DNA polimeraz ekstraksiyonu ve saflaştırılması gerçekleştirildi. 
Anahtar Kelimeler:  Thermus aquaticus, DNA polimeraz, Taq Polimeraz, Rekombinant DNA

Abstract:
Aim: In this thesis,it is aimed to recombinantly produce,purify  and analyze of Thermus aquaticus DNA Polymerase I at low cost in Escherichia coli cells. 
Material and Methods: The gene encoding Taq DNA Polymerase I was amplified with polymerase chain reaction (PCR) by using - of pAKTaq plasmid as template. Bacterial  expression vectors were constructed  by  cloning of  resulting DNA fragments under the control of  E. coli  lac promoter and T7 RNA polymerase promoter. The generated plasmid vectors were checked by with restriction endonuclease enzymes in first stage. After, Taq DNA polymerase gene was sequenced by DNA sequencing. The resulting plasmids were  transformed into  different E.coli strains. Synthesis of Taq DNA polymerase enzyme in the cells was determined by SDS-PAGE / Western blotting techniques. Then, the  activity of Taq DNA polymerase enzyme, extracted from E.coli cells and/or  purified  by column chromotography  in different conditions was  analyzed  by using this  enzyme as a enzyme resource  in standard   PCR  experiments. 
Results and Discussion: After  the result of analyses  made by  SDS-PAGE/Western  blotting  techniques, it is determined   that  Taq DNA polymerase gene cloned under the control of lac promoter  was expressed  in  E. coli BL21 (DE3), Mach1 ve TOP10  cells without the IPTG induction. It  was seen that  the vectors carrying the T7 RNA polymerase promoter  expressed   Taq DNA Polymerase enzyme in only BL21 (DE3) cells as expected. It was observed  that  the enzymes obtained from the crude extracts prepared from transformed cells or from column chromatography fractions by precipitation with acetone catalyze DNA synthesis as active as a commercially available Taq enzyme. As  a result, active  Taq DNA polymerase extraction and purification was achieved in a short time and  at  low cost.  
Key Words: Thermus aquaticus, DNA polymerase, Taq Polymerase, Recombinant DNA