Gen amplifikasyonu içeren tümör hücrelerinde CRISPR-Cas ile amplikon hedeflenmesi
Amplicon targeting with CRISPR-Cas in tumor cells with gene amplification
Yazar: SEDA NUR HOMURLU
Danışman: PROF. DR. OĞUZ ALTUNGÖZ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Meme kanseri =

Özet:
HER2 gen amplifikasyonu meme kanserinde malign transformasyona yol açar
ve agresif fenotiple ilişkilendirilir. Bu çalışmanın amacı HER2 amplifikasyonu içeren
SK-BR-3 ve BT-474 hücreleri ile amplifikasyon içermeyen MCF-7 hücrelerine
yönelik CRISPR Cas9 teknolojisi kullanılarak oluşturulmuş DNA kırıklarının hücre
apoptozu ve nekrozu üzerindeki etkilerini incelemektir. Çalışmada Cas9 içeren PX458
plazmitine özel olarak kılavuz RNA'lar tasarlanmış, tasarlanan kılavuz RNA'lar
plazmite klonlanmıştır. Daha sonra plazmit BT-474, SK-BR-3 ve MCF-7 hücrelerine
transfekte edilmiştir. MCF-7 hücreleri, gRNA'ların özgüllüğünü test etmek amacıyla
aynı prosedüre tabi tutulmuştur. Hücrelerde apoptoz ve nekroz düzeyleri Annexin V
boyaması ile akım sitometri cihazında ölçülmüştür.
Çalışma sonuçları, MCF-7 hücrelerinin gRNA transfeksiyonuna anlamlı bir
apoptoz tepkisi göstermediğini ancak HER2 amplifikasyonu taşıyan SK-BR-3 ve BT-
474 hücrelerinin anlamlı düzeyde apoptoza girdiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, BT-
474 hücrelerinin daha fazla kopya sayısına sahip olmasının, SK-BR-3 hücrelerine
kıyasla daha yüksek apoptoz oranlarına yol açtığı gözlemlenmiştir. Bu bulgular,
hipotezimizi desteklemekte ve HER2 amplifikasyonu taşıyan tümör hücrelerinin
CRISPR Cas9 ile hedeflenmesi durumunda, çoklu DNA iplik kırıklarına bağlı olarak
apoptozun indüklendiğini göstermektedir. Elde edilen bu sonuç CRISPR Cas9
sisteminin HER2 pozitif meme kanseri hücreleri için potansiyel bir tedavi stratejisi
olarak kullanılabileceğini ortaya koymaktadır.

Abstract:
HER2 gene amplification in breast cancer leads to malignant transformation and
is associated with an aggressive phenotype. The aim of this study is to investigate the
effects of targeted DNA cleavage using CRISPR Cas9 technology on apoptosis and
necrosis in HER2-amplified SK-BR-3 and BT-474 cells compared to non-amplified
MCF-7 cells. In this study, guide RNAs were specifically designed for PX458 plasmid
that have Cas9 protein and the guide RNAs were cloned into the plasmid. Then the
plasmid was transfected into the BT-474, SK-BR-3 and MCF-7 cells. MCF-7 cells
were subjected to the same procedure to test the specificity of the gRNAs. Apoptotic
and necrotic levels of these cells were measured with flow cytometry using Annexin
V staining.
The results demonstrated that MCF-7 cells did not exhibit a significant apoptotic
response to gRNA transfection, whereas HER2-amplified SK-BR-3 and BT-474 cells
showed significant levels of apoptosis. Moreover, it was observed that BT-474 cells,
having a higher copy number of HER2, exhibited higher rates of apoptosis compared
to SK-BR-3 cells. These findings support our hypothesis and show that targeting
HER2-amplified tumor cells with CRISPR Cas9 induces apoptosis through multiple
DNA strand breaks. This indicates that CRISPR Cas9 system could be a potential
therapeutic strategy for HER2-positive breast cancer cells.