Β-1,4-glukanaz enzimini üreten toprak bakterisinin izolasyonu ve in vitro mutagenez ile genetik modifikasyonu
Isolation of β-1,4-glucanase producing soil bacterium and genetic modification via in vitro mutagenesis
Yazar: AYCAN SEZAN
Danışman: DOÇ. DR. MAKBULE BAYLAN
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Çalışmada toprak örneklerinden Bacillus sp. suşları pH 5.0-6.0'da ve iki ayrı sıcaklıkta (37℃ ve 50℃) izole edilmiş ve bu izolatlarda β-1,4-glukanaz (CMCaz) enzimi üreten bakteri suşları belirlenmiştir. Bu izolatlardan Bacillus sp. AZH suşu seçilerek (β-1,4-glukanaz +, α-amilaz+, ksilanaz-, proteaz+) α-amilaz, ksilanaz, proteaz gibi istenmeyen enzim genleri Ethidium bromide (EtBr) ve Ultraviole ışını (UV) kullanılarak mutasyon ile köreltilmiş böylece sadece β-1,4-glukanaz üreten mutant suşlar (Bacillus sp. AZH-mEB, Bacillus sp. AZH-mUV) elde edilmiştir. Bacillus sp. AZH (yabani suş) ve mutant varyeterine (Bacillus sp. AZH-mEB, Bacillus sp. AZH-mUV) ait enzim aktiviteleri; miktar, fiziksel ve biyokimyasal özellikleri yönünden karakterize edilmiştir. Optimum sıcaklık değerleri Bacillus sp. AZH ve Bacillus sp. AZH-mEB için 50℃ olarak, Bacillus sp. AZH-mUV için ise 60℃ olarak bulunmuştur. Optimum pH değerleri araştırılmış ve elde edilen verilere göre optimum pH değerleri Bacillus sp. AZH için 9.0; Bacillus sp. AZH-mEB için Bacillus sp. AZH-mUV için ise 7.0 olduğu tespit edilmiştir. Bacillus sp. AZH ve Bacillus sp. AZH-mEB, Bacillus sp. AZH-mUV mutant varyeterine ait β-1,4-glukanaz enziminin üretim seviyeleri karşılaştırılmış ve relatif aktivitelerinin sırasıyla; %100, %100 ve %71,5 olarak bulunmuştur. Sıcaklık direnci ölçümlerinde Bacillus sp. AZH-mUV 30℃, Bacillus sp. AZH-mEB ve yabani suşta 40℃'de ön inkübasyon sonrasında %100 aktivite göztermişlerdir. Bu üç suşta ayrıca metal iyonların etkisi de araştırılmış (CaCl2, MgCl2, KCl2, EDTA, üre); yabani suş ve Bacillus sp. AZH-mUV'de tüm iyonların enzim aktivitesini arttırdığı ancak Bacillus sp. AZH-mEB'de üre ve MgCl2 varlığında enzim aktivitesinin düştüğü gözlemlenmiştir. Son olarak her üç bakteriye ait selülaz enzimlerinin moleküler ağırlıkları SDS-PAGE ve zimogram analizleri ile yaklaşık olarak 40 kDa olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, Bacillus sp. strains were isolated from soil samples at pH 5.0-6.0 and at two different temperatures (37 ℃ and 50℃). Among these strains, β-1,4-glucanase (CMCase) produces were determined. Bacillus sp. AZH strains were selected for further studies unwanted genes such as α-amylase, xylanase, protease were inactivated using Ethidium bromide (EtBr) and Ultraviolet ray (UV).  β-1,4-glucanase enzymes of Bacillus sp. AZH (wild type strain) and it's mutant variants  (Bacillus sp. AZH-mEB and Bacillus sp. AZH-mUV) were partially characterized. Optimum pH values for AZH-mUV, AZH-mEB and wild type strains were 7.0, 6.0 and 9.0, respectively. Optimum temperature values were, 60, 50 and 50°C in the same order. β-1,4-glucanase activities were compared with each other and calculated as 100, 100, and,71,5% relatively for wild type strain, AZH-mEB and AZH-mUV respectively. Bacillus sp. AZH-mUV cellulase maintained its residual activity after incubation at 30℃ for 15 min. while Bacillus sp. AZH-mEB and wild type strain cellulases maintained their rsidual activities after 15 minutes incubation at 40℃. The effects of metal ions on the enzyme activities were also investigated. CaCl2, MgCl2, KCl2, EDTA and urea were increased both wild type strain and Bacillus sp. AZH-mUV cellulase activities. Whereas for Bacillus sp. AZH-mEB urea and MgCl2inhibited cellulase activity in different rations, other metal ions increased its activity. Finally, the molecular weights of the cellulase enzymes of all three bacterial strains were determined by SDS-PAGE and zymogram analysis to be 40 kDa.