Hastanemizde klinik örneklerden izole edilen Campylobacter spp.'lerin antibiyotiklere direnç durumlarının araştırılması
Investigation of antibiotic resistance in Campylobacter spp isolated from clinical samples in our hospital
Yazar: BEYZA ÖNCEL
Danışman: PROF. DR. MÜNEVVER UFUK HASDEMİR
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Kampilobakter = Campylobacter ; Kampilobakter enfeksiyonları = Campylobacter infections ; Kampilobakter jejuni = Campylobacter jejuni ; Kampilobakter koli = Campylobacter coli ; Makrolidler = Macrolides ; Mutasyon = Mutation ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Campylobacter spp.'nin neden olduğu insan enfeksiyonları tüm dünyada yaygın olarak görülmektedir. Özellikle Campylobacter jejuni ve Campylobacter coli, dünya çapında gıda kaynaklı gastroenteritlerin başlıca nedenlerindendir. Enfeksiyonların çoğunda antimikrobiyal tedaviye başvurulmasa da immün sistemi baskılanmış hastalarda, bakteriyemi olgularında, şiddetli ve uzun süren Campylobacter vakalarında antibiyotik tedavisi gereklidir. 
       	Campylobacter spp. enfeksiyonlarının antimikrobiyal tedavisinde öncelikle tercih edilen antibiyotikler makrolidler ve kinolonlardır. Campylobacter spp.'de kinolon grubu antibiyotiklere direnç oranları giderek artmaktadır. Bu durum antibiyotik tedavisi gerektiren olgularda, makrolidlerin önemli hale gelmesine yol açmıştır. Farklı coğrafik bölgelerde yapılan çalışmalar, makrolidlere direncin de giderek arttığını göstermektedir. Campylobacter spp.'de makrolid direncinden esas olarak ribozomal proteinlerde görülen mutasyonlar sorumlu tutulmaktadır. Diğer bakterilerde makrolid direncine yol açan önemli bir mekanizma olan efluks pompasının Campylobacter spp.'nin makrolid direncindeki yeri ise tam olarak bilinmemektedir. Ülkemizde bu konudaki çalışmaların sayısı çok sınırlıdır.
      	 Çalışmamızda, 2017-2018 yılları arasında hastanemizde enfeksiyon etkeni olarak izole edilen Campylobacter spp. suşlarının eritromisin, siprofloksasin, tetrasiklin antibiyotiklerine duyarlılık durumlarını belirlemeyi ayrıca makrolid dirençli izolatlarda, 23S rRNA gen bölgesindeki mutasyonları, L4 ve L22 ribozomal proteinlerindeki aminoasit değişimlerini ve efluks pompasının dirençteki rolünü belirlemeyi amaçladık.  
       	Çalışmamıza klasik yöntemler ve MALDI-TOF MS ile tanımlanması yapılan 184 C. jejuni ve 20 C. coli olmak üzere toplam 204 izolat dahil edilmiştir. Disk difüzyon (DD) yöntemi ile yapılan antibiyotik duyarlılık testi sonuçlarına göre bu izolatların %85,7'si (n=175) siprofloksasine, %60,2'si (n=123) tetrasikline ve %3,4'ü (n=7) eritromisine dirençli bulunmuştur. Eritromisin direnci, C. jejuni'de %2,1; C. coli'de ise %15 olarak saptanmıştır. Bu sonuçlar bölgemizde izole edilen Campylobacter spp.'de makrolid direncinin henüz tehdit edici boyutlara ulaşmadığını göstermektedir. Ek olarak sonuçlarımız, literatürde de vurgulandığı üzere C. coli'de makrolid direncine, C. jejuni'ye kıyasla daha sık görüldüğünü ortaya koymaktadır.
    	   Disk difüzyon yöntemi ile eritromisine dirençli bulunan yedi izolatta eritromisin MİK'leri sıvı mikrodilüsyon (SMD) yöntemi ile belirlenmiştir. Eritromisin MİK değeri SMD testi ile ≥64 mg/L bulunan altı izolatın her birinde, 23S rRNA bölgesinde A2075G mutasyonu saptanmış, MİK değeri 2 mg/L bulunup eritromisine duyarlı olduğu saptanan SSC 97 izolatında ise bu mutasyona rastlanmamıştır. 
       	Yedi izolatta eritromisin SMD testi, resistance-nodulation-cell division (RND) tipi efluks pompalarını inhibe ettiği bilinen bir pompa inhibitörü, Phenyalanin-Arginin β-naphthylamide dihydrochloride (PAβN) ile de çalışılmıştır. SMD testinde kullanılan, bakteri sağkalımı açısından daha güvenilir olan 25 µg/mL PAβN konsantrasyonuna optimizasyon ve SMD çalışmalarıyla karar verilmiştir. PAβN tüm izolatların eritromisin MİK değerlerinde en az 4 katlık düşüşe yol açmıştır. Bu durum, izolatlarımızın eritromisin direncinde efluks pompasının etkin rolü olduğunu açıkça göstermektedir. 
      İzolatlarımızda eritromisin direncindeki başlıca mekanizmanın 23S rRNA gen bölgesinde A2075G mutasyonu olduğu saptanmıştır. L4 ve L22 proteinlerindeki aminoasit değişiklikleri, duyarlı ve dirençli izolatlarda görüldüğünden, dirence katkı sağlayabilceği fakat ana mekanizma olmadığı düşünülmüştür. Efluks pompa inhibitörlerinden PAβN'in eritromisine dirençli tüm izolatlarda MİK değerlerini anlamlı düzeyde düşürmesi, efluks pompası ve 23S rRNA mutasyonlarının dirence katkı sağlamada sinerjistik etkisini ortaya koymuştur.

Abstract:
Infections due to Campylobacter spp. are prevalent throughout the world. Particularly, Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are the most common causes of food-borne gastroenteritis worldwide. There is no need specific antimicrobial therapy in the majority of Campylobacter infections. However, antibiotics should be added to the therapy protocol in particular risk conditions
including bacteremia, immune suprresion or immunocompromisation and/or prolonged cases.
Quinolones and macrolides are primarily preferred antibiotics in the antimicrobial treatment of Campylobacter spp. infections. Since, resistance to quinolones in Campylobacter spp. are increasing worldwide and high resistance rates were recorded from many countries, macrolides became significant in various cases. But recent studies have shown that macrolide resistant Campylobacter spp. are also
increasing in various regions. Mutations in particular ribosomal proteins have been mostly associated with macrolide resistance in Campylobacter spp.. The role of efflux pump which is the prevalent macrolide resistance mechanism in other clinically important bacteria, needs to be clarified in the macrolide resistance of Campylobacter spp. The number of studies in this research area in our country is highly limited.
In our study, we aimed to determine the susceptibility of clinical Campylobacter spp. strains between the years 2017-2018 in our hospital, to erythromycin, ciprofloxacin and tetracycline antibiotics; presence of mutations in the 23S rRNA gene; amino acid substitutions in the L4 and L22 ribosomal proteins and the role of efflux pumps in the resistance in macrolide resistant isolates. 
A total of 204 isolates identified by classical methods and MALDI-TOF MS including 184 C. jejuni and 20 C. coli were included in our study. According to the results of the antibiotic susceptibility test performed by the disk diffusion (DD) method, resistance to ciprofloxacin, tetracycline and erythromycin were 85.7% (n=175), 60.2% (n=123) and 3.4% (n=7), respectively. Erythromycin resistance was determined as 2.1% in C. jejuni and 15% in C. coli. These results show that macrolide resistance in Campylobacter spp. has not reached threatening dimensions in our region. Additionaly our results show that, as emphasized in the literature, macrolide resistance is more prevalent in C.coli.
Erythromycin MICs were determined by broth microdilution method in seven isolates that were found resistant to erythromycin by DD method. A2075G mutations in 23s rRNA gene were detected in each of the six isolates with erythromycin MIC ≥64 mg /L. This mutation was not found in the SSC 97 isolate which has MIC value of 2 mg /L.
Broth microdilution method for erythromycin was also performed with resistance-nodulation-cell division (RND) type efflux pump inhibitör, phenyalaninarginin β-naphthylamide dihydrochloride (PAβN). PAβN concentration reliable for bacterial survival was determined by optimization and broth microdilution method. 25 µg / mL PAβN increased the susceptibility to erythromycin all of isolates. This clearly shows that the efflux pump has an effective role in erythromycin resistance.
The A2075G mutation in the 23S rRNA gene appears to be main mechanism in erythromycin resistance in the Campylobacter isolates studied. Due to the presence in susceptible and resistant isolates, the amino acid substitutions in L4 and L22 proteins may contribute to the resistance but it is not thought to be the main mechanism. Our study has shown that efflux pump and 23S rRNA mutations have
synergistic effect on erythromycin resistance in our Campylobacter isolates.