Serviks kanser tedavisi için aptamer hedefli eksozom aracılı lizozomotropik etkili biyoteknolojik ilaç geliştirilmesi
Development of biotechnological drugs with aptamer targeted exosome-mediated and lysosomotropic effective for the treatment of cervical cancer
Yazar: ÖMER ERDOĞAN
Danışman: PROF. DR. ÖZGE ÇEVİK
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Tıp) Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Aptamerler = Aptamers ; Eksozomlar = Exosomes ; Lizozomlar = Lysosomes ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Uterin servikal neoplazmlar = Uterine cervical neoplasms

Özet:
Amaç: Eksozomlar biyolojik sıvılarda bulunan ve yapılarında biyolojik moleküllerden ilaçlara kadar pek çok şeti taşıyan doğal ekstrasellüler veziküllerdir. Son yıllarda ilaç taşıma sistemlerini hedeflendirmede DNA veya RNA dizilerinden oluşan aptamerler önemli yer tutar. Cisplatin (cis), Klorokin (klor) ve Raloksifen (ral) lizozomotropik yapıda olup bu ilaçların biyolojik aktivitelerinin arttırılması için yeni taşıyıcı sistemlere ve moleküler hedeflendirmelere ihtiyaç duyulmaktadır.  Bu çalışmada eksozomlara klorokin, raloksifen ve cisplatin yüklenmesi ve aptamerler ile taşıyıcı sistemin hedeflendirilmesi amaçlanmıştır. Geliştirilen formülasyonların HeLa serviks kanser hücrelerinde sitotoksik, lizozomotropik, apoptotik ve otofajik etkileri araştırılmıştır.
Gereç ve Yöntem: HeLa hücrelerinden salınan eksozomlar ultrasantrifüj metodu ile izole edilmiş ve western blot, SEM ve zeta analizi ile karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. Eksozomlara ayrı ayrı klorokin, raloksifen ve cisplatin elektroporasyon ile yüklenmiş ve HeLa hücrelerine spesifik aptamerler eksozomlara bağlanmıştır. Exo-apt-ilaç formülasyonları (Exo-apt-cis, Exo-apt-klor ve Exo-apt-ral) HeLa hücreleri ile 24 saat inkübe edildikten sonra sitotoksisiteleri MTT ile, lizozomotropik aktiviteleri Lysotracker floresan boyama ile, apoptotik (Bax, BCL-2) ve otofajik etkileri (LC3AB, Beclin-1) western Blot ve qPCR ile incelenmiştir.
Bulgular: HeLa hücrelerinden izole edilen eksozomların CD9, CD63 ve CD81 gibi spesifik belirteçleri içerdiği ve boyutlarının 66±12 nm olduğu bulunmuştur. HeLa hücrelerinde Exo-apt-cis, Exo-apt-klor ve Exo-apt-ral'in hücre prolifreasyonunu Cisplatin Klorokin ve Raloksifen'e daha düşük konsantrasyonda azalttığı görülmüştür. Exo-apt-cis, Exo-apt-klor ve Exo-apt-ral formülasyonları HeLa hücrelerine spesifik olarak bağlanmış ve ilaçların lizozomlara taşınmasını kolaylaştırmıştır. Exo-apt-cis, Exo-apt-klor ve Exo-apt-ral formülasyonları Bax, LC3AB ve Beclin-1'in protein ve gen ekspresyonlarını artırmış, BCL-2'nin protein ve gen ekspresyonlarını azaltmıştır. 
Sonuç: Aptamer ile hedeflendirilmiş eksozom içerisinde cisplatin, klorokin ve raloksifen yüklü geliştirilen taşıyıcı sistemde lizozomotropik ilaçların hücre içerisine kolay girişi sağlanmış ve biyolojik olarak aktivitesi arttırılmıştır. Bu çalışmanın bulguları serviks kanser tedavisine yönelik yeni biyoteknolojik ilaç geliştirme çalışmalarına ışık tutacaktır.

Abstract:
Objective: Exosomes are natural extracellular vesicles found in biological fluids that carry many cheques from biological molecules to drugs. In recent years, aptamers consisting of DNA or RNA sequences have been essential in targeting drug delivery systems. Cisplatin (cis), Chloroquine (klor), and Raloxifene (ral) are in lysosomotropic structure, and new carrier systems and molecular targeting are needed to increase the biological activities of these drugs. This study aimed to load chloroquine, raloxifene, and cisplatin into exosomes and target the carrier system with aptamers. The developed formulations investigated the cytotoxic, lysosomotropic, apoptotic, and autophagic effects in HeLa cervical cancer cells.
Material and Methods: Exosomes released from HeLa cells were isolated by ultracentrifugation and characterized by western blot, SEM, and zeta analysis. Chloroquine, raloxifene, and cisplatin were individually loaded into exosomes by electroporation, and aptamers specific to HeLa cells were bound to exosomes. Exo-apt-drug formulations (Exo-apt-cis, Exo-apt-klor, and Exo-apt-ral) were incubated with HeLa cells for 24 hours, MTT determined their cytotoxicity, and their lysosomotropic activity was determined by Lysotracker fluorescent staining, apoptotic (Bax, BCL- 2) and its autophagic effects (LC3AB, Beclin-1) were examined by western blot and qPCR.
Results: The exosomes isolated from HeLa cells contained specific surface markers such as CD9, CD63, and CD81 and were 66±12 nm in size. In HeLa cells, Exo-apt-cis, Exo-apt-klor, and Exo-apt-ral have been shown to reduce cell proliferation at a lower concentration than Cisplatin, Chloroquine and Raloxifene. Exo-apt-cis, Exo-apt-klor, and Exo-apt-ral formulations bound explicitly to HeLa cells and facilitated the transport of drugs to lysosomes. Exo-apt-cis, Exo-apt-klor, and Exo-apt-ral formulations increased protein and gene expressions of Bax, LC3AB, and Beclin-1 and decreased protein and gene expressions of BCL-2.
Conclusion: In the developed delivery system loaded with cisplatin, kloroquine, and raloxifene in the targeted exosome with aptamer, easy entry of lysosomotropic drugs into the cell was ensured, and their biological activity was increased. The findings of this study will shed light on new biotechnological drug development studies for cervical cancer treatment.