Bos taurus enolaz enzimini kodlayan genin yapıya dayalı ilaç tasarımı yönünde moleküler ve enzimatik analizlerinin yapılması
Structural, molecular and enzymatic analysis of Bos taurus enolase towards structure-based drug design
Yazar: EMRAH SARIYER
Danışman: PROF. DR. DİLEK TURGUT  BALIK ; DOÇ. DR. ÖZKAN DANIŞ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Gen klonlama = Gene cloning

Özet:
Tropikal theileriosis, Theileria annulata parazitinin neden olduğu vektör kaynaklı vakalar arasında en yaygın görülen hastalıklardan biridir ve küresel ölçekte hayvancılık üretiminde ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Theileria annulata, Hyalomma cinsi kene vektörleri tarafından aktarılan ve özellikle Bos taurus ve Bos indicus olmak üzere ruminant hayvanlarda hastalığa neden olan bir zorunlu hücre içi protozoon parazitidir. Son yıllarda tropikal theileriosis tedavisinde başarı oranları düşüktür ve buparvaquona'a karşı direnç rapor edilmiştir. Son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalarda Theileria annulata'nın Buparvaquona'a karşı direnç gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bu sebeple Tropikal theileriosis ile mücadele alanında yeni tedavi yöntemi ve ilaç çalışmalarının artırılması gerekmektedir. Bu kapsamda 2017 yılında grubumuzda gerçekleştirilen bir tez çalışmasında bu hastalığa sebep olan Theileria annulata enolazına karşı yapıya dayalı ilaç tasarım çalışmaları gerçekleştirilmiştir ve Theileria annulata'nın temel enerji metabolizmasındaki glikoliz yolağında önemli bir enzim olan enolaz hedef alınarak bu enzimi inhibe eden kumarin türevleri taranmıştır. Bu tez çalışmasında 38 kumarin türevi arasında yüksek T. annulata enolazın inhibisyon aktivitesine sahip (IC50<15 μM) kumarin türevleri; K8 (6,7-dihidroksi-4-(3,4-dimetoksifenil)-kumarin), K9 (7,8-dihidroksi-4-(3,4-dihidroksifenil)-kumarin), K21 (6,7-dihidroksi-4-(3,4-dihidroksifenil)-kumarin) ve K23 (7,8-dihidroksi-3-(3,4-dihidroksifenil)-kumarin) olarak belirlenmiştir. Bir etken maddenin ilaç olarak kullanılabilmesi için söz konusu bileşiğin parazit hedef molekülünü inhibe etmesi ama konak organizmadaki eşdeğer molekülü inhibe etmemesi gerekmektedir. Bu amaçla gerçekleştirilen  bu tez çalışmasında parazitin konağı Bos taurus'ta eşdeğer enzim olan enolazın yapıya dayalı ilaç tasarımı yönünde yapısal, moleküler ve enzimatik analizleri yapılmıştır.
Bu tez çalışmasında Bos taurus enolazını (BtEno3) ifade eden gen klonlanmış, eksprese edilmiş ve protein % 95 saflıkta afinite kromatografisi ile başarıyla saflaştırılmıştır. Sıcaklığın ve pH değişimlerinin enzim aktivitesine etkisi analiz edilmiş ve optimum koşullar 40 °C, pH 6.5 olarak belirlenmiştir. BtEno3'ın biyokimyasal özellikleri karakterize edilmiştir ve literatürde ilk defa enzimin kinetik parametreleri Vmax ve Km sırasıyla 0,01305 μmol/dk ve 0.514 mM olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, in siliko analizlerde kullanılmak üzere Bos taurus enolazının 3 boyutlu yapısı homoloji modellemesi ile oluşturulup kumarinler ve substrat moleküler yanaştırma metodları ile enolaza yanaştırılmıştır. Enzim-substrat, enzim-kumarin ve enzim-kumarin-substrat komplekslerindeki etkileşimler 100 ns boyunca moleküler dinamik yöntemler ile simule edilerek analiz edilmiştir. Enzim-substrat arasındaki etkileşimlerin, mayada deneysel olarak belirlenen etkileşimler ile aynı olduğu belirlenmiştir. Substratın ve kumarin türevlerinin enzime tahmini serbest bağlanma enerjileri MM-GB(PB)SA metodları ile hesaplanmıştır.
T. annulata parazitinin enolazını yüksek etkili olarak inhibe eden K8, K9, K21 ve K23 kumarin türevlerinin Bos taurus enolazının aktivitesine etkisi in vitro olarak çalışılmıştır ve bu kumarin türevlerinin Bos taurus enolazını T. annulata enolazına kıyasla daha düşük konsantrasyonlarda inhibe ettiği belirlenmiştir (K8 100 μM konsantrasyonda %36,87, K9 100 μM konsantrasyonunda %8,13 inhibisyon, K21 IC50: 77,69 μM ve K23 IC50:84,42 μM).
In vitro ve in siliko çalışmalar birlikte değerlendirildiğinde parazit enolazını inhibe eden K8, K9, K21 ve K23 türevlerinin parazit konağındaki eşdeğer enolazını daha yüksek kumarin türevi konsantrasyonlarda inhibe ettiği görülmüştür.  Bu kumarin türevlerinin inhibisyon oranları K21>K23>K8>K9 olarak sıralanmıştır. Kumarin türevleri BtEno3'a bağlandıktan sonraki enzimin aktif bölgesindeki konformasyon değişikleri, enzim-substrat ve enzim-kumarin etkileşimleri in siliko analiz edilmiştir. Kumarinlerin enzimin aktif bölgesine bağlanmadığı, bağlandığı oyuklarda sıkı bağlar oluşturmadağı ve aktif bölgede herhangi bir konformasyon değişikliğine sebep olmadığı belirlenmiştir. Enzim-substrat etkileşiminde koordinasyon eksikliğine sebep olmadığı in siliko çalışmalar sonucunda ortaya konmuştur. 
Bu tez çalışmasında gerçekleştirilen in vitro ve in siliko çalışmaların sonucunda K8 ve K9 kumarin türevlerinin parazit enolazını konak enolazına kıyasla çok daha etkili olarak inhibe ettiği belirlenmiştir. Belirlenen bu türevler ile Theilerisosis tedavisine yönelik yeni ilaç adayı geliştirme yönünde hücre kültürü ve pre-klinik çalışmaların önünü açacaktır.

Abstract:
Tropical theileriosis is one of the among most common vector-born diseases caused by Theileria annulata parasites and causes serious economic losses in livestock production on a global scale. Theileria annulata is an obligate intracellular protozoan parasite that is transmitted by Hyalomma tick vectors and causes disease in ruminant animals, especially Bos taurus and Bos indicus. The success rates of tropical theileriosis treatment are low and resistance to buparvaquona has increased in the last decades. Recent studies have shown that Theileria annulata reveals resistance to Buparvaquona. For this reason, new treatment methods and drug studies should be increased in the combat against tropical theileriosis. Structrue-based drug design studies were studied for the first time against Theileria annulata enolase in a thesis study performed at research group in 2017 and coumarin derivatives were screened for their inhibitory activity on T. annulata enolase is an crucial enzyme in the glycolysis pathway of T. annulata essential energy metabolism. Of the 38 coumarin derivatives studied those who have potent inhibitory activity (IC50<15 μM) were reported as K8 (4-(3,4-dimethoxyphenyl)-6,7-dihydroxy-2H-chromen-2-one), K9 (4-(3,4-dihydroxyphenyl)-7,8-dihydroxy-2H-chromen-2-one), K21 (4-(3,4-dihydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy-2H-chromen-2-one) and K23 (3-(3,4-dihydroxyphenyl)-7,8-dihydroxy-2H-chromen-2-one). In order for an active substance to be used as a drug, the compound must inhibit the parasite target molecule but not the equivalent molecule in the host organism. In the direction of the structure-based drug design studies; structural, molecular and enzymatic analyzes of the enolase, which is the counterpart of Bos taurus, were performed in this thesis study.	
The gene encoding Bos taurus enolase (BtEno3) was cloned, expressed and the protein was successfully purified by affinity chromatography with 95% purity. The effect of temperature and pH changes on enzyme activity was analyzed and optimum conditions were determined as 40 °C, pH 6,5. Biochemical properties of enolase have been characterized for the first time in the literature, the kinetic parameters of the enzyme, Vmax and Km values, were calculated as 0,01305 μmol/min and 0.514 mM, respectively. In addition, in order to be used in silico analysis, 3D structure of Bos taurus enolase was built by homology modeling and coumarins and substrate were docked into enolase by molecular docking methods. Interactions in the enzyme-substrate, enzyme-coumarin and enzyme-coumarin-substrate complexes were analyzed by simulating molecular dynamics for 100 ns. Interactions between enolase-substrate have been reported to be the same as experimentally determined interactions in yeast. Estimated free binding energies of the substrate and coumarin derivatives to the enzyme were calculated by MM-GB(PB)SA methods.
The effects of K8, K9, K21 and K23 coumarin derivatives, which highly inhibit enolase of T. annulata parasite, on the activity of Bos taurus enolase were studied in vitro and it was determined that these coumarin derivatives inhibited Bos taurus enolase at lower concentrations compared to T. annulata enolase (at 100 μM concentration of K8 %36,87,   at 100 μM concentration of K9 %8,13 inhibition, K21 IC50: 77,69 μM and K23 IC50:84,42 μM).	
When the in vitro and in silico studies were evaluated together, K8, K9, K21 and K23 derivatives were reported to inhibit the parasite host Bos  taurus enolase at higher coumarin derivative concentrations than the parasite enolase. The inhibition rates of these coumarin derivatives can be sorted as K21> K23> K8> K9. The conformational changes in the active site of the enzyme, the enzyme-substrate and enzyme-coumarin interactions were analyzed in silico after coumarin derivatives were docked to BtEno3. It has been determined that coumarins do not bind to the active site of the enzyme, not form tight bonds in the pockets and did not cause any conformation changes in the active site. It was revealed in silico studies that there is no lack of coordination in enzyme-substrate interaction.	
In the thesis study, in vitro and in silico studies showed that K8 and K9 coumarin derivatives inhibit parasite enolase much more effectively than host Bos taurus enolase. The proposed ligand will enlight the cell culture and pre-clinical studies to develop new drug candidates for the theileriosis treatment.