Cryptosporidium spp. türlerinin real time PZR yöntemi ile tanımlanması
Identification of Cryptosporidium species by real time PCR method
Yazar: GÜLLÜ EVCİL
Danışman: PROF. DR. FATİH KÖKSAL
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Cryptosporidium = Cryptosporidium ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA ; Teşhis = Diagnosis ; rRNA = rRNA

Özet:
Cryptosporidium spp. immun sistemi baskılanmış veya sağlam bireylerde ve çocuklarda öldürücü diyareye neden olabilen zorunlu hücre içi yerleşim gösteren bir protozoondur. Kriptosporidiyozun tanısında genellikle aside dirençli boyama tekniği kullanılmaktadır. Günümüzde geliştirilen moleküler yöntemler sayesinde, epidemiyolojik verilerin elde edilmesine yönelik olarak asemptomatik taşıyıcılarda Cryptosporidium saptanması ve tür düzeyinde tanımlanması mümkün olmuştur. Bu çalışmanın amacı, küçük alt ünite (SSU) rRNA genine dayalı sekanslama ve gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (real time PZR) sonrası erime eğrisi (melting curve) analizi kullanılarak Adana'daki insanlardaki Cryptosporidium türlerini saptamaktır. Bunun için 2011 Nisan ve 2014 Şubat ayları arasında Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji bölümüne başvuran ishalli kişilerden toplam 320 dışkı örneği toplanmıştır. Bu dışkı örnekleri, doğrudan preparat inceleme, yoğunlaştırma, modifiye asit fast boyama, ELİSA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay), standart PZR ve SSU rRNA genini temel alan uygun primer ve hibridizasyon problardan Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) kullanılarak real-time PZR yöntemleri ile incelenmiştir. Cryptosporidium spp. saptanan pozitif örneklere real time PZR yöntemi sonrası melting curve analizi uygulayarak tiplendirme yapılmıştır. Çalışma sonucunda, boyama yöntemiyle 22, ELİSA ile 26, standart PZR ile 27 ve real-time PZR ile 31 örnekte Cryptosporidium varlığı saptanmıştır. Tür olarak Cryptosporidium hominis (12), Cryptosporidium parvum (7) Cryptosporidium meleagridis (7) ve Cryptosporidium andersoni (5) türleri tanımlanmıştır. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, Adana'daki enfeksiyonlardan Cryptosporidium hominis'in Cryptosporidium parvum'dan daha yaygın olduğunu ve real time PZR yönteminin Cryptosporidium türlerinin ayrımında ve tanımlanmasında kolay, hızlı ve güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir.

Abstract:
Cryptosporidium spp. are protozoa which only live in a host cell and may cause an infection that may result in the death of people with immune deficiency, in healthy individuals and children. Resistant to acid staining technique is often used in the diagnosis of cryptosporidiosis. Today, thanks to the development of molecular methods , in order to obtain epidemiological data in asymptomatic carrier detection and identification of Cryptosporidium species level was possible. The aim of the present study was to determine Cryptosporidium species/genotypes in humans in Adana, Turkey using melting curve analysis after real-time PCR and sequencing based on the small subunit rRNA gene. A total of 320 faecal samples were collected from humans with diarrhea applying to Parasitology Department of Medicine Fakulty in Cukurova University between April 2011 and Fabruary 2014. This stool samples were examined with direct smears, concentration, modified acid- fast staining, ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay), conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) and based on the SSU rRNA genes by real time PCR method. Moreover, genomic DNA of each fecal sample was screened for the presence of Cryptosporidium with real-time PCR using primers and hibridization probes, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET),  which was genotyped by analyzing the DNA sequences of small subunit rRNA (SSU rRNA). In the results of working, 22 positive with staining method, 26 positive with ELISA, 27 positive with standart PCR and 31 positive with real time PCR were found Cryptosporidium spp. Molecular and genotype characterization found the following protozoan species; Cryptosporidium hominis (12), Cryptosporidium parvum (7), Cryptosporidium meleagridis (7) and Cryptodporidium andersoni (5). The results obtained in this study support previous findings showing that Cryptosporidium hominis infections are more prevalent than Cryptosporidium parvum infections in Adana and they demonstrate that real time PCR procedure is a simple, fast and voluable tool for the detection and differention of Cryptosporidium species.