İn vitro hiperglisemik ortamda gözlenen EDCF yanıtlarına rho-kinaz ve AMPK sinyal yolaklarının katkısı /
Yazar: CENNET BALCILAR
Danışman: PROF. DR. VECDİ MELİH ALTAN ; YRD. DOÇ. DR. IŞIL ÖZAKCA
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Adenozin = Adenosine ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Endotelden türeyen gevşetici faktör = Endothelium derived relaxing factor ; Endotelinler = Endothelins ; Fosfotransferazlar = Phosphotransferases ; Hiperglisemi = Hyperglycemia ; Rhokinaz = Rhokinase ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Diabetin neden olduğu mortalite ve morbidite, genellikle mikrovasküler (retinopati, nöropati, nefropati) ve makrovasküler (kardiyovasküler ve serebrovasküler) komplikasyonlardan kaynaklanmaktadır. Hiperglisemi endotel fonksiyonlarını bozarak vasküler tonusu olumsuz olarak etkilemektedir. Vasküler tonus fizyolojik koşullarda EDRF, EDHF ve EDCF tarafından kontrol edilmektedir.


Patolojik durumlarda endotel-kaynaklı gevşemenin azalması, EDRF üretimindeki azalmaya bağlı olabileceği gibi EDCF düzeyinin artmasına da bağlı olabilmektedir. EDCF hipertansiyon, diabet gibi hastalıklarda artmaktadır. Bu çalışmada in vitro hiperglisemik koşullarda EDCF yanıtlarındaki olası değişiklikler değerlendirilmiştir. Ancak seçtiğimiz patolojinin deney protokolü nedeniyle, EDCF yanıtlarının sağlıklı bir şekilde alınamadığı belirlenmiştir. Bu nedenle çalışmaya kısa dönem diabetik sıçanlardaki EDCF yanıt değişiklikleri incelenerek devam edilmiştir. Diabetik sıçanlarda artan EDCF yanıtlarına, birbirine ters etki yapan Rho-kinaz ve AMPK yolaklarının katkısı incelenmiştir. Rho-kinazlar küçük GTP-bağlı proteinlerden biri olan Rho'nun efektörüdür. Rho-kinazlar MLC'i defosforile eden MYPT-1'e etki edip MLC'nin fosforile halde kalmasını sağlayarak sitozolik Ca+2 konsantrasyonu artırır ve vasküler düz kasın kasılmasına neden olurlar. Rho-kinazların aktivitesi EDCF yanıtlarının arttığı hipertansiyon, kalp yetmezliği ve diabet gibi hastalıklarda artmaktadır. AMPK ise hücrenin enerji sensörü olarak düşünülmektedir. Vasküler düz kasta endotel-bağımlı ve bağımsız gevşemeyi sağlayarak vasküloprotektif etki göstermektedir. AMPK' nın aktivitesi Rho-kinaz yolağının aktivitesinin tersine EDCF fonksiyonunun arttığı hipertansiyon ve diabet gibi hastalıklarda azalmaktadır.


Bu çalışmada 30 haftalık kontrol ve kısa dönem (4 hafta) STZ-diabetik Spraque-Dawley erkek sıçanların torasik aort preparatları kullanılmıştır. Kısa dönem STZ-diabette EDCF yanıtlarının arttığı gözlenmiştir. Kısa dönem diabetik koşullarda Rho-kinaz duyarlılığının, ROCK2 protein düzeyinin ve AICAR-aracılı gevşeme yanıtlarının arttığı saptanmıştır. Sonuçlarımız, diabetik aortta artmış EDCF-aracılı kasılma yanıtlarına karşın AMPK-aracılı gevşemelerin arttığını göstermektedir. Ek olarak, AMPK sinyal yolağının relaksasyonun korunması ve iyileştirilmesi açısından oldukça yararlı bir terapötik yaklaşım olabileceği görülmektedir.

Abstract:
Most of the mortalities and morbidities caused by diabetes may be the results of microvascular (retinopathy, neuropathy, nephropathy) and macrovascular (cardiovascular, cerebrovascular) complications. Hyperglycemia badly affects vascular tonus by impairing the functions of endothelium. Vascular tonus is controlled by EDRF, EDHF and EDCF under normal physiological circumstances.
	

In pathological conditions, impairment of endothelium-derived relaxation can be caused by both decrease in EDRF release and increase in EDCF release. The increase in EDCF is observed with diseases such as hypertension and diabetes. In our study, the possible changes that occur in EDCF responses in in vitro hyperglycemic conditions are investigated. Contrary to expectations, EDCF responses found to be diminished due to extension of hyperglycemic incubation time. For this reason, EDCF responses were evaluated in short term STZ-diabetes models. The contribution of two pathways, Rho-kinase and AMPK, which have opposite effects, to the increased EDCF responses in diabetic rat aorta was investigated. Rho-kinases are the effectors of Rho which is one of the small GTP-binding proteins. They increase cytosolic Ca+2 concentration and cause vascular smooth muscle to contract, keeping MLC phosphorylated by affecting MYPT-1 which dephosphorylates the MLC. The activities of Rho-kinases increase in diseases such as hypertension, heart failure and diabetes in which EDCF function increases. AMPK is the energy sensor of the cell. It provides a vasculoprotective effect by causing endothelium-dependent and endothelium-independent relaxation in smooth muscle. In contrast to Rho-kinase pathway activity, AMPK pathway activity decreases with the disease such as hypertension and diabetes in which the EDCF function increases.

 
In the current study, the thoracic aorta preparations of 30-week-old male Sprague-Dawley rats which were grouped as controls and short-term (4-weeks) STZ-induced diabetes. In short-term diabetes, the EDCF-mediated responses were shown to be increased. Also, the increased sensitivity of Rho-kinase pathway, protein level of ROCK2 and improved AICAR-mediated vasorelaxation responses in short-term diabetes were observed. These findings demonstrate AMPK-mediated relaxation is enhanced in diabetic aorta despite the increased EDCF-mediated contraction. Our results, thus, suggest that the activation of AMPK may be a potential therapeutic strategy to improve hyperglycemia-induced endothelial dysfunction.