Şarbon aşı adayı olarak PA83'ün yeni mutant formunun N. benthamiana bitkisinde tasarlanması, ekspsresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Engineering, expression, purification and characterization of new mutant form of PA83 in N. benthamiana plants as antrax vaccine candida
Yazar: RIFAT ÜNGÖR
Danışman: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Bacillus anthracis potansiyel biyolojik savaş ajanı olarak bilindiğinden beri, güvenli, düşük maliyetli, etkinliği yüksek ve uzun süreli stabiliteye sahip şarbon aşısını geliştirebilmek oldukça yüksek önem taşımaktadır. Son yıllardaki çalışmalar yüksek ekspresyon kapasitesi ve değerli rekombinant proteinlerin güvenli, hızlı ve ucuz üretimine olanak sağlaması nedeniyle bitki temelli transient ekspresyon sisteminin umut vaad edici teknoloji olduğunu göstermektedir. B. Anthracis'in bitkide üretilen koruyucu antijeni  (PA) şarbona karşı güvenli, etkili ve düşük maliyetli aşı geliştirmede büyük potansiyele sahiptir. B. Anthracis'in koruyucu antijeni glikoprotein değildir. Buna rağmen, dizisi 9 tane olası potansiyel glikolizasyon bölgesine sahiptir ve Nicotiana benthamiana bitkilerinde eksprese edildikleri zaman aşırı derecede glikozillenme gösteriyorlar. Son zamanlarda PA83 antijeninin glikozillenmemiş versiyonları, ya in vivo deglikolizasyon stratejisi (PNGase F veya Endo H temelli), (Mamedov vd. 2012; Mamedov vd. 2016; Mamedov vd. 2017) ya da mutasyon (6 tane N-glikolizasyon bölgesine yönlendirilmiş mutagenez), (Mamedov vd. 2016) yaklaşımı vasıtasıyla üretilebilmiştir. PA83'ün bu mutant formunu analiz ettiğimizde, bir önceki çalışmada mutasyon yapılmamış bölge olan fakat glikozillenme düzeyine sahip olan bir bölge olan Asn-39'u bulduk. Bu çalışmada, koruyucu antijeninin Asn-39 dahil 7 tane N-glikolizasyon bölgesinin mutasyonu ile oluşturulmuş yeni mutant formu tasarlandı, kodon optimize edildi, eksprese edildi ve N.benthamiana bitkisinde üretildi. Kıyaslama yapabilmek amacıyla PA83'ün 6 olası N-glikolizasyon bölgesinde nokta mutasyonu taşıyan versiyonu N.benthamiana bitkisinde üretildi. PA83'ün her iki mutant formu IMAC afinite kolon kromatografisi yöntemi kullanılarak saflaştırıldı ve saflaştırılmış protein stabilite analizi için değerlendirildi.


ANAHTAR KELİMELER:  Geçici gen anlatımı, in vivo deglikolizasyon, Koruyucu Antijen, Şarbon aşı adayı.

Abstract:
Bacillus anthracis has long been considered a potential biological warfare agent, and therefore, developing safe, low-cost and highly efficient anthrax vaccine with long-term stability is important. Numerous studies in recent years demonstrated that plant based transient expression system is a promising technology with high expression capacity and provides safe, fast, inexpensive production of valuable recombinant proteins.  Plant produced PA of B. anthracis has great potential as a target for a safe, effective, and low-cost vaccine against anthrax. Protective antigen of B. anthracis is not a glycoprotein, however, its sequence has nine potential glycosylation sites and it has been shown to be aberrantly glycosylated when expressed in Nicotiana benthamiana plants. Recently,  a non-glycosylated versions of PA83 antigen was produced  by in vivo deglycosylation strategy (PNGase F or Endo H based) (Mamedov et al 2012; Mamedov et al 2016; Mamedov et al 2017)  or by site-directed mutagenesis-based approach, by mutation of six N-Glycosylations sites (Mamedov et al 2016). When we analyzed this mutant form of PA83, we found that Asn-39 site, which was not mutated in the previous studies has some level of glycosylation. In this study, a new mutant form by mutation of seven N-glycosylation sites  (including Asn-39) of protective antigen was engineered, codon optimized, expressed and produced in N. benthamiana plant. For comparison, version of PA83 containing point mutations in six potential N-glycosylation sites was also produced  in N. benthamiana. Both PA83 mutants were purified using IMAC affinity column and purified protein were subjected for stability analysis.


KEYWORDS: Anthrax vaccine candidate, in vivo deglycosylation, Protective Antigen,    Transient gene expression.