Aşı adayı toxoplasma gondii GRA8 proteininin oluşturduğu immun yanıt ve korunmanın araştırılması
Evaluating the immune response and protection conferred by vaccine candidate toxoplasma gondii GRA8 protein
Yazar: MUHAMMET KARAKAVUK
Danışman: DOÇ. DR. MERT DÖŞKAYA
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Aşılama = Vaccination ; Aşılar = Vaccines ; DNA = DNA ; Genetik = Genetics ; Genler = Genes ; Protozoa = Protozoa ; Toxoplasma gondii = Toxoplasma gondii ; Toxoplasma gondii = Toxoplasma gondii ; İmmün sistem = Immune system ; İmmünite = Immunity

Özet:
Toxoplasma gondii insan dâhil tüm sıcakkanlı hayvanları enfekte edebilen, insan ve hayvanlarda ciddi klinik tablolara yol açan zoonotik bir protozoondur. Dünya nüfusunun ortalama %30'u T. gondii ile enfektedir. Toksoplazmozis çiftlik hayvanlarında da büyük ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu yüzden T. gondii'ye karşı aşı geliştirmek oldukça önemlidir.
Bu amaçla daha önceki çalışmamızda kuvvetli immun yanıt uyaran GRA8 geni öncelikle biyoinformatik olarak incelenmiş, proteinin hücre içi ve transmembran kısımları atılıp, sinyal peptidi eklenmiştir. Protein pcDNA.3.3 vektörü içine klonlanarak sadece GRA8 plazmid içeren ve CpG+Escort ile takviye edilmiş GRA8 plazmid DNA aşıları geliştirilmiştir. Daha sonra Swiss Webster fareler üç hafta ara ile iki kez SC olarak aşılanmış ve uyarılan sıvısal immun yanıt Western Blot ve ELISA ile hücresel immun ise flow sitometri ve MTT testleri ile belirlenmiştir. DNA aşılarının koruyuculuğu, 7-8 tane T. gondii PRU suşuna ait doku kistlerinin oral yoldan uygulanması ile tespit edilmiştir. Dokularda oluşan kistler faz kontrast mikroskobu ile sayılmıştır. 
Elde edilen sonuçlara göre, aşılama sonrası sadece GRA8 plazmid ve Cpg+Escort+GRA8 plazmid içeren aşı grupları kontrollere göre kuvvetli IgG yanıtı uyarmıştır (P<0,001). IgG1 ve IgG2a yanıtı incelendiğinde Th1-Th2 kutuplaşmasının dengeli olduğu tespit edilmiştir. Aşı gruplarında, IFN-γ salgılayan CD4 T lenfositleri ile CD8 T lenfosit oranlarının kontrollere göre sırasıyla 1,31-1,75 ve 1,17-1,70 kat arasında arttığı saptanmıştır. Stimülasyon indeksleri aşı gruplarında kontrol gruplarına göre %7-%34 arasında yüksek olduğu tespit edilmiştir. GRA8 plazmid aşısı uygulanan farelerde doku kisti sayısı 440,74±343,35 olup PBS ve Cpg+Escort+Boş plazmid uygulanan farelere göre belirgin olarak azalmıştır (P<0,0001, ****). Cpg+Escort+GRA8 plazmid aşısı uygulanan farelerde ise doku kisti sayısı ise 804,76±715,87 olup PBS (P=0,0086, **) ve Cpg+Escort+Boş plazmid (P=0,0007, ***) uygulanan farelere göre belirgin şekilde düşmüştür. GRA8 plazmid aşı grubunda oluşan doku kisti sayısı Cpg+Escort+GRA8 plazmid grubuna göre belirgin bir şekilde azalmıştır (P<0,05, *).
Sonuç olarak bu çalışmada protein mikroarray taraması ile seçilen aşı adayı GRA8 antijeninden geliştirilen DNA aşılarının kuvvetli sıvısal ve hücresel immun yanıtı uyarabildiği ve toksoplazmozise karşı kısmi korunma sağladığı tespit edilmiştir. Ayrıca ileride yapılacak çalışmalarda GRA8 antijeni ve diğer T. gondii antijenlerinin kullanıldığı multi-antijenik DNA aşılarının geliştirilmesiyle toksoplazmozise karşı tam bir korunmanın olasılığı öngörülmektedir. 
Anahtar Kelimeler: Toxoplasma gondii; GRA8 proteini; DNA aşısı; Nano-adjuvant; CpG

Abstract:
Toxoplasma gondii is a zoonotic protozoan that can infect all warm-blooded animals including humans and may lead to serious clinical manifestations especially in immunocompromised and pregnant humans and animals. Almost 30% of the world population is infected with T. gondii. Along with the treatment cost of the disease, the agent may cause large economic losses in farm animals. Therefore, it is very important to develop a vaccine against T. gondii.
For this purpose, GRA8 protein that showed high immunogenicity in our previous study was firstly examined by bioinformatics. After removing intracellular and transmembrane fragments of the protein, a signal peptide was added. The naked GRA plasmid and the CpG+Escort+GRA8 plasmid DNA vaccines were developed by cloning the gene fragment into the pcDNA.3.3 vector. Swiss Webster mice were vaccinated twice, at three weeks intervals. The sıvısal immune response was determined both Western Blot and ELISA, and the cellular immunity was determined both flow cytometer and MTT assay. Protection efficacy of DNA vaccines was determined by challenging each mice orally with 7-8 cysts of T. gondii PRU strain.
According to the results, GRA8 plasmid and CpG+Escort+GRA8 plasmid vaccine groups induced strong IgG response compared to controls (P<0.001). As we examined the IgG1 and IgG2a responses, a balanced Th1-Th2 polarization was seen. IFN-γ secreting CD4 T lymphocyte ratios increased 1.45 to 2 and 1.6 to 2 times compared to the controls. In the vaccine groups, IFN-γ secreting CD4 T and CD8 T lymphocyte ratios increased 1.31 to 1.75 and 1.17 to 1.70 times compared to the controls, respectively. Stimulation index were found to be high in the vaccine groups which was between 7% and 34% compared to the control groups. The number of tissue cysts in the GRA8 plasmid group was 440.74±343.35 that decreased significantly compared to PBS and CpG+Escort+Empty plasmid groups (P<0.0001, ****). In CpG+Escort+GRA8 plasmid group, the number of tissue cysts found to be 804.76±715.87, which decreased significantly compared to PBS (P=0.0086, **)  and CpG+Escort+Empty plasmid groups (P=0.0007, ***). The amount of tissue cysts in the GRA8 plasmid vaccine group was significantly lower than the CpG+Escort+GRA8 plasmid group (P<0.05, *).
Overall, DNA vaccines developed from vaccine candidate GRA8 antigen which was selected by protein microarray screening showed strong sıvısal and sıvısal immune response and provide partial protection against toxoplasmosis mice model. Furthermore, development of multi-antigenic DNA vaccines using GRA8 antigen and other T. gondii antigens future studies may provide complete protection against toxoplasmosis.
Keywords: Toxoplasma gondii; GRA8 protein; DNA vaccine; Nano-adjuvant; CpG