Kolistin dirençli Acinetobacter baumannii sepsis modelinde Mezenkimal Kök Hücre kaynaklı eksozom tedavi etkinliğinin araştırılması
Investigation of the effectiveness of Mesenchymal Stem Cell-derived exosome treatment in the colistin-resistant Acinetobacter baumannii sepsis model.
Yazar: IŞIL ERANIL
Danışman: PROF. DR. GÖKÇEN DİNÇ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı / Kök Hücre Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Enfeksiyondan kaynaklanan ve organ fonksiyon bozukluğu ile sonuçlanan sepsis; insidans, sağlık hizmeti yükü, maliyeti ve ölüm göz önünde bulundurulduğunda dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Günümüzde sepsis için hücresel tedavide en çok ilgi duyulan hücre tipi mezenkimal kök hücrelerdir (MKH). Bu hücrelerin, yetişkin dokularından uygun izolasyonları ve nispeten kolay kültüre edilmeleri gibi birçok potansiyel avantajı bulunmaktadır. Çeşitli hücre türleri, özellikle MKH'ler tarafından salgılanan eksozomlar 40-160 nm çapında biyoaktif veziküllerdir. Eksozomlar, MKH'lerin parakrin etkisi için yeni bir mekanizma aracı olarak kabul edilmektedir. Bu çalışmanın amacı, kolistin dirençli Acinetobacter baumannii'nin etken olduğu deneysel sepsis modeli oluşturularak sepsis tedavisinde kemik iliği kaynaklı MKH'lerin ve eksozomların bakteriyel eradikasyon ve inflamasyon üzerine etkisini belirlemektir. 
Çalışmada 8-10 haftalık dişi Balb-c fareler 6 deney grubuna ayrıldı. Çalışma grupları; kontrol grubu (negatif kontrol [sadece serum fizyolojik alan] ve pozitif kontrol grubu [sadece bakteri uygulanan] ve tedavi grupları; kolistin-linezolid uygulanan antibiyotik tedavi grubu [ANT], mezenkimal kök hücre uygulanan tedavi grubu [MKH], eksozom uygulanan tedavi grubu [EKS], antibiyotik ve eksozom uygulanan tedavi grubu [EKS+ANT]. Tüm farelerde kolistin dirençli A. baumannii ile intraperitoneal (ip) sepsis modeli geliştirildi. Tedavi gruplarında sepsis geliştirildikten 3 saat sonra MKH grubuna 2x106 hücre/kg MKH, ortalama 100x106 ekzozom/ml, eksozom serum fizyolojik (100µl) içinde ip olarak verildi. 24 saatte uygulama tekrarlandı. İlk antibiyotik dozu bakteriyel inokülasyondan 3 saat sonra başlandı, kolistin 12 sa ve linezolid 5 sa arayla ip uygulandı. Tüm gruplardaki farelerin ilk yarısı sepsisin 24. saatinde, diğer yarısı ise 48. saatinde yüksek doz anestezik enjeksiyonu ile sakrifiye edildi.  Sakrifikasyon sonrası kalpten kan alınarak IL-6, IL-10, IFN -ɣ, CRP ölçümü ile gruplardaki inflamatuar değişiklikler incelendi. Akciğer, karaciğer ve böbrekten hazırlanan örneklerde histopatolojik inceleme yapıldı. Bakteri yükünün hesaplanması için akciğer ve karaciğerden kültür yapılarak kantitatif bakteri sayımı yapıldı. Tüm gruplara ait sonuçlar karşılaştırılarak istatistiki olarak analiz edildi.
Bu çalışmada akciğerdeki kantitatif bakteri yüklerini incelendiğinde 24. ve 48. saatteki ANT ve MKH tedavi gruplarındaki üremelerin pozitif kontrol grubuna göre azaldığı istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Karaciğerde ise hem 24 hem de 48. saatte gruplar arası anlamlı bir farklılık saptanmadı. Grupların serum IL-6 düzeyleri 48. saatte MKH grubunda EKS ve EKS+ANT alt gruplarından istatistiki olarak anlamlı düşük belirlendi. IL-10 sonuçları incelendiğinde 24. saatte EKS+ANT alt grubunun serum IL-10 düzeylerinin MKH grubundan istatistiksel anlamlı olarak yüksek (p<0,05) olduğu belirlendi. 24. saat alt gruplarının serum IFN-ɣ sonuçları incelendiğinde MKH alt grubunun serum IFN-ɣ düzeylerinin diğer gruplara göre anlamlı derecede düşük olduğu, EKS alt tedavi grubunun ise diğer gruplara göre istatistiksel anlamlı yüksek olduğu görülmüştür (p<0,05). 48. saat alt gruplarının serum IFN-ɣ sonuçları incelendiğinde ise istatistiksel anlamlı bir fark izlenmemiştir (p>0,05). CRP düzeyleri karşılaştırıldığında 24. saatte ANT, MKH ve EKS gruplarının serum CRP düzeylerinin pozitif kontrollerden istatistiksel anlamlı olarak düşük olduğu (p<0,05), 48. saatte ise ANT ve MKH gruplarının serum CRP düzeylerinin pozitif kontrollerden düşük olduğu belirlendi (p<0,05). Histopatolojik değerlendirmede ise akciğer, karaciğer ve böbrek skorları negatif kontrol grubunda diğer gruplara göre istatistiki olarak anlamlı düşüktü. 24. saatte akciğerde skor EKS+ANT grubunda, 48. saatte ise EKS grubunda pozitif kontrole göre anlamlı düşük; karaciğerde ise 48. saatte MKH ve EKS gruplarında pozitif kontrole göre anlamlı düşük; böbrekte 24. saatte EKS ve EKS+ANT gruplarında pozitif kontrole göre anlamlı düşük bulundu (p<0,05), ayrıca eksozom alan gruplarda 48. saatteki histopatolojik skordaki düşüş 24. saate göre anlamlı bulundu. Kaspaz 3 düzeyleri 24. saatte EKS grubunda; 48 satte ise MKH, EKS ve EKS+ANT gruplarında pozitif kontrole göre anlamlı düşük bulundu (p<0,05). 
Sonuç olarak, MKH ve ANT gruplarında ilk 24 satte bakteriyel yükteki azalma istatistiki olarak anlamlı bulunurken, özellikle eksozom alan gruplarda akciğer, karaciğer ve böbrek dokularındaki histopatolojik değişimler diğer gruplara kıyasla daha olumlu olarak belirlendi. Dirençli A. baumanni sepsisinde tedaviye eksozom takviyesinin doku hasarını azaltmada rol oynayabileceği kanısına varıldı.

Abstract:
Sepsis, which is caused by infection and results in organ dysfunction, is a major health problem worldwide, considering the incidence, healthcare burden, cost and mortality. Currently, mesenchymal stem cells (MSCs) are the cell type of greatest interest in cellular therapy for sepsis. These cells have many potential advantages, including their convenient isolation from adult tissues and relatively easy cultivation. Exosomes secreted by various cell types, in particular by MSCs, are bioactive vesicles with a diameter of 40-160 nm. Exosomes are recognized as a novel mechanistic mediator for the paracrine action of MSCs. The aim of this study was to establish an experimental sepsis model caused by colistin-resistant Acinetobacter baumannii and to determine the effect of bone marrow-derived MSCs and exosomes on bacterial eradication and inflammation in the treatment of sepsis. 
In the study, 8-10 weeks old female Balb-c mice were divided into 6 experimental groups. Study groups; control group (negative control group [receiving only saline] and positive control group [receiving only bacteria] and treatment groups; colistin-linezolid antibiotic treatment group [ANT], mesenchymal stem cell treatment group [MSC], exosome treatment group [ECS], antibiotic and exosome treatment group [CKS+ANT]. Intraperitoneal (ip) sepsis model was developed in all mice with colistin-resistant A. baumannii. 3 hours after the development of sepsis in the treatment groups, 2x106 cells/kg MSC group, average 100x106 exosomes/ml, exosomes were administered in saline (100µl). At 24 hours, the application was repeated. The first antibiotic dose was started 3 hours after bacterial inoculation, colistin and linezolid were administered ip at 12 h intervals. The first half of the mice in all groups were sacrificed at the 24th hour of sepsis and the other half at the 48th hour with high dose anesthetic injection.  After sacrifice, blood was collected from the heart and inflammatory changes in the groups were analyzed by measuring IL-6, IL-10, IFN-ɣ, CRP. Histopathologic examination was performed on samples prepared from lung, liver and kidney. Quantitative bacterial count was performed by culture from lung and liver to calculate the bacterial load. The results of all groups were compared and statistically analyzed.
In this study, when the quantitative bacterial loads in the lung were analyzed, it was found statistically significant that the growths in the ANT and MSC treatment groups at 24 and 48 hours decreased compared to the positive control group. In the liver, no significant difference was found between the groups at both 24 and 48 hours. The serum IL-6 levels of the groups were statistically significantly lower at 48 hours in the MSC group than in the ECS and ECS+ANT subgroups. When IL-10 results were analyzed, it was determined that serum IL-10 levels of the ECS+ANT subgroup were statistically significantly higher (p<0.05) than the MSC group at 24 hours. When the 24th hour serum IFN-ɣ results of the subgroups were analyzed, it was observed that the serum IFN-ɣ levels of the MSC subgroup were significantly lower than the other groups, whereas those of the ECS subgroup were significantly higher than the other groups (p<0.05). When the 48th hour serum IFN-ɣ results of the subgroups were analyzed, no statistically significant difference was observed (p>0.05). When CRP levels were compared, it was determined that serum CRP levels of ANT, MSC and ECS groups were significantly lower than positive controls at 24 hours (p<0.05), and serum CRP levels of ANT and MSC groups were lower than positive controls at 48 hours (p<0.05). In histopathologic evaluation, lung, liver and kidney scores were significantly lower in the negative control group compared to the other groups. At 24 hours, the score in the lung was significantly lower in the ECS+ANT group and at 48 hours in the ECS group compared to the positive control; at 48 hours in the liver, it was significantly lower in the MSC and ECS groups compared to the positive control; at 24 hours in the kidney, it was significantly lower in the ECS and ECS+ANT groups compared to the positive control (p<0.05), and the decrease in the histopathological score at 48 hours in the groups receiving exosomes was significant compared to 24 hours. Caspase 3 levels were found to be significantly lower in the ECS group at 24 hours, and in the MSC, ECS and ECS+ANT groups at 48 hours compared to the positive control (p<0.05). 
In conclusion, while the decrease in bacterial load in the first 24 h was statistically significant in the MSC and ANT groups, histopathologic changes in the lung, liver and kidney tissues were more favorable in the exosome groups compared to the other groups. It was concluded that exosome supplementation may play a role in reducing tissue damage in resistant A. baumanni sepsis.