Aterosklerotik plakların teşhis ve tedavisinde kullanılmak üzere biyokimyasal olarak modifiye edilmiş nanoplatformların hazırlanması ve karakterizasyonu
Preparation and characterization of biochemically modified nanoplatforms used in atherosclerotic plaque diagnosis and therapy
Yazar: DOĞA KAVAZ
Danışman: PROF. DR. EMİR BAKİ DENKBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Kardiyovasküler sistem = Cardiovascular system ; Manyetik rezonans görüntüleme = Magnetic resonance imaging ; Reseptörler = Receptors

Özet:
Kardiyovasküler sistem rahatsızlıkları gerek ülkemizde ve gerekse tüm dünyada ölümle sonuçlanabilen rahatsızlıkların başında gelmektedir. Sözkonusu rahatsızlıkların değişik epidemiyolojik nedenlerden dolayı önümüzdeki yıllarda görülme sıklığının daha da artması beklenmektedir. Ateroskleroz bu rahatsızlıkların en önemlisi olup oluşan aterosklerotik plakların erken teşhisi, tedavi etkinliği ve ölüm riski açısından büyük bir önem taşımaktadır. Son yıllarda konu ile ilgili olarak yapılan çalışmalarda, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) damarlarının anatomik ve fonksiyonel incelemelerinde önemli bir rol oynamaktadır.  Bu çalışmalarda geleneksel MRG kontrast ajanları yerine, toksik olmayan ve biyolojik olarak uyumlu demir oksit nanopartikülleri klinikte kullanılmaya başlanmıştır. Ancak, bu ajanların dokular tarafından tutulumu seçimli olmayıp in vivo olarak görüntülenmek istenen plaklar için uygun değildirler. Bu yüzden biyouyumlu polimerik malzemeler (örneğin; dekstran, kitosan vb gibi) kullanılarak,  demir oksit nanopartiküller modifiye edilmekte ve in vivo uygulamalarda kullanılabilmektedir. Kullanılan biyopolimerlerin değişik fonksiyonel gruplarının olması sayesinde çeşitli ligandlarla donatılarak görüntülenmek istenilen bölgeleri tanıma yeteneğine sahip olan nanopartiküller geliştirebilmektedir.
Sunulan tez kapsamında; kardiyovasküler sistem rahatsızlıklarından, aterosklerozun teşhis ve tedavisinde kullanılmak üzere manyetik özelliklere sahip nanoplatformların geliştirilmesi ve bu platformlarda kullanılmak üzere aterosklerotik plak bölgelerini tanıyan ligand moleküllerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu amaca ulaşmak üzere demir oksit nanopartiküller, manyetik özelliğe sahip poliester yapısındaki polihidroksibütirat (PHB) ile polisakkarit yapısındaki karboksimetil kitosan (CMCs) karışımı ile oluşturulan PHB/CMCs, poliester yapısındaki polihidroksibütirat ile polisakkarit yapısındaki kitosan karışımı ile oluşturulan PHB/Kitosan (PHB/Cs) nanopartiküller ve dekstran nanopartiküller hazırlanmıştır. Hazırlanan nanopartiküllerin boyutları Zeta Sizer sistemi kullanılarak karakterize edilmiş ve boyut dağılımına etki eden parametreler incelenmiştir. Nanopartiküllerin morfolojik özellikleri SEM ve AFM görüntüleme sistemleri yardımıyla manyetik özellikleri ise titreşimli manyetometre (VSM) kullanılarak belirlenmiştir. Hazırlanan nanoplatformların kardiyovasküler sistem rahatsızlıkları teşhiş ve tedavisinde kullanabilmek üzere nanoplatformların yüzeyine model ligand olarak seçilen IgG 1, Anneksin A5 ve A1 liganları biyokimyasal yöntemlerle kovalent olarak takılmıştır. Hem hazırlanan nanopartiküllerin hem de ligand takılı formlarının sitotoksisiteleri incelenmiştir.
Çalışmaların ikinci bölümünde ise hazırlanan ligand takılı nanoplatformlarla in vivo çalışmalar gerçekleştirilmiş ve kullanılan Wistar albino ırkı sıçanların MRG görüntüleri incelenmiştir. MRG işlemlerinden sonra sistemik dolaşım içerisinde dolaşan ligand takılı nanoplatformların vücutta değişik organlara dağılımı ve bu organlarda meydana gelen biyokimyasal etkileşimleri biyokimyasal ve histolojik testlerle değerlendirilmiştir. 
Tez çalışmalarının son bölümünde ise, aterosklerotik plak bölgelerine nanoplatformları seçimli/hedefli olarak ulaştırabilmek üzere ihtiyaç duyulan ve aterosklerozun başlangıcında yer alan köpük hücrelerinin yüzey reseptörlerinin belirlenmesi çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla ticari olarak temin edilen düşük yoğunluklu lipoprotein, bakır sülfat çözeltisi ile oksitlenerek, THP-1 insan monosit hücrelerinin farklılaşması sonucu oluşan makrofaj hücreleri ile etkileştirilerek köpük hücreleri oluşturulmuş daha sonra elde edilen köpük hücrelerinin yüzey reseptörleri/proteinleri MALDI-ToF tekniği yardımıyla belirlenmiştir.
Elde edilen sonuçlara göre söz konusu reseptörlerin belirlenmesiyle bunlara uygun ligandların belirlenmesi ve ardından hazırlanan nanoplatformların bu ligandlarla dekore edilmesiyle kişiye özel teşhis ve tedavi sistemlerinin geliştirilmesi için gerekli alt yapı oluşturulmuştur.

Anahtar Kelimeler: Kardiyovasküler sistem, manyetik nanoplatformlar, manyetik 
resonans görüntüleme (MRG), okside-LDL, köpük hücreler, reseptör, MALDI-ToFMS

Abstract:
Cardiovascular diseases are some of the leading causes of death all over the world, and the prevalence is expected to increase further during the next years. For early detection of atherosclerotic unstable plaques will be a great value in order to reduce the morbidity / mortality level in affected patients. With the developing technology nanomaterials aimed to develop to be used in the early diagnosis of atherosclerosis. In recent studies, magnetic resonance imaging (MRI) plays an important role in the anatomical and functional investigation of large vessels. Instead of conventional MRI contrast agents, non-toxic and biocompatible iron oxide nanoparticles have been started to use in the clinic. However, the uptake of these agents are nonspecific, so the labeling efficiency for plaques in vivo is not ideal. Iron oxide nanoparticles are modified with biocompatible polymeric materials such as dextran, chitosan, etc., and used in vivo applications. Biopolymers with different functional groups featured with a variety of ligands can be used developing nanoparticles that are capable of recognizing the desired areas. 
In the thesis, development of magnetic biopolymeric nanoplatforms were aimed to be used in the diagnosis and treatment of atherosclerosis. To achieve this aim; iron oxide nanoparticles, magnetic poly hydroxybutarate- carboxymethyl chitosan (PHB/CMCs), PHB/Cs (Chitosan) and dextran nanoparticles were prepared. The parameters that affect the size distribution of the prepared nanoparticles were investigated and size analyses were carried out using Zeta Sizer systems. Scanning electron microscope (SEM) and atomic force microscope (AFM) were used for morphological evaluations.  Vibrational scanning microscope was used for the investigation of magnetic properties. Annexin A5, Annexin A1 and IgG 1 werevcovalently attached to the prepared nanoplatforms as model ligands for diagnosis and treatment of cardiovascular system diseases.  Cytotoxicity assays evaluated for both plain nanoparticles and ligand attached forms.
In the second part of the study, annexin A5 and IgG 1 attached PHB/CMCs nanoplatforms have been tested in vivo. Wistar albino type rats were used for MRI imaging.  After MR imaginig, ligand attached nanoplatforms, which were circulated in the systemic circulation, examined biochemically and histologically.
In the final part of thesis, the foam cells in the damaged area of the plaque were investigated to determine the surface reseptors. For this purpose a commercially provided low density protein (LDL) was oxidized by copper sulfate solution. Macrophages which were differentiated from THP-1 Human monocytes, treated with oxidized LDL to form foam cells. Surface proteins derived from foam cells were determined using MALDI -ToF- mass spectroscopy system.

Keywords: Cardiovasculer systems, magnetic nanoplatforms, magnetic resonans 
imaginig (MRI), oxidized- LDL, foam cells, receptor, MALDI -ToF- MS