G proteinlerine kenetli reseptörlerde, reseptör-G proteini kenetinin sinyal transdüksiyon verimi bakımından incelenmesi
Investigation of receptor-G protein coupting in terms of signal transduction efficiency in G protein coupled receptors
Yazar: KEMAL SAYAR
Danışman: DOÇ.DR. ONGUN ONARIM
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Farmakoloji ve Klinik Farmokoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 1999
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Adenil siklaz = Adenyl cyclase ; Reseptörler-adrenerjik-beta = Receptors-adrenergic-beta ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
53 ÖZET Burada sunulan çalışma, G-proteini aracılı sinyal iletiminde, özellikle de p- adrenerjik reseptör-Gs-adenilat siklaz sistemininde sinyal ileti veriminin düzenlenmesine katkıda bulunabilecek üç noktayı araştırmak üzere tasarlanmıştır: 1. G proteinine kenetli sinyal ileti sisteminde aynı G proteini ve efektörû kullanan reseptörler arasında fonksiyonel ve bağlanma düzeyinde çapraz etkileşim olup olmadığı: Sinyal ileti sisteminin alt birimlerinin membranda sınırlanmaksızın hareket edebileceğini varsayan aktivasyon modelleri, en azından bazı koşullarda, aynı G proteini ve efektörû kullanan reseptörlerden birinin aktivasyonunun diğerinin aktivasyon verimini etkileyeceğini öngörmektedir. Bu olasılığı test etmek için yapılan deneylerin verileri şu şekilde yorumlandı: Kalp membranlarında, Gi aracılı adenilat siklaz inhibisyonunda, muskarinik ve alfa2 reseptörlerinin etkinliği birbirlerinden bağımsız değildir. Yani bu reseptörler, ortak bir doyurulabilir G proteini ve/veya adenilat siklaz havuzu kullanmaktadır. Buna karşın, bağlanma düzeyinde ortak bir G proteini havuzu kullanılıp kullanılmadığını test etmek amacıyla Gs proteinine kenetli reseptör sistemlerinde (p-AR, PGE2 ve histamin) yapılan deneylerde ortak bir havuz düşündürecek bir sonuç gözlenmedi. 2. CHO hücrelerindeki j3-adrenerjik reseptör-Gs-Adenilat siklaz sisteminindeki aktivasyon mekanizmasının incelenmesi: Reseptör sayısının tersinmez bir antagonists azaltılmasının adenilat siklazın reseptör aracılı aktivasyonuna etkisini incelemek için yapılan deneylerin sonuçları, bir katalitik model olan "encounter coupling" model ve bir termodinamik denge modeli olan "quaternary complex" model çerçevesinde değerlendirildi. Her iki model de gözlenen EC50 kaymasını öngörebildiğinden, sadece bu sonuca dayanarak sistemde geçerli olan modeli saptamak mümkün olmadı. Ancak, "encounter coupling" modeli p-AR-Gs-adenilat siklaz sistemini açıkladığı iddia edilen parametre değerlerinde, gözlemlerimize ters düşen, monotonik olmayan bir konsantrasyon-yanıt eğrisi öngörmektedir. Bu durum "encounter coupling" modelinin, en azından burada konu edilen sistem için, geçerliliğine gölge düşürdüğü sonucuna varıldı. Yine bu konuda diğer bir yaklaşım olarak farklı miktarlarda p-adrenerjik reseptör taşıyan CHO hücreleri kullanıldı ve agonistle uyarılabilir adenilat siklaz aktivasyonu yukarıda belirtilen deneylerden elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı, içsel olarak farklı miktarda reseptör içeren hücrelerde, yukarıdaki durumdan farklı olarak, EC50 değerinde farklılık gözlenmedi. Bu gözlem, sistemi oluşturan birimlerin membranda serbest olarak hareket edebildiğine dayanan aktivasyon modelleri ile açıklanamadığı için, CHO hücrelerindeki p-adrenerjik reseptör-Gs-Adenilat siklaz sisteminin fonksiyonel yanıtın bir parametresini (EC50) koruyabilecek şekilde hücre membranında organize olabileceğini düşündürmektedir.54 3. Adenilat siklazın aktivasyon durumu ile termal inaktivasyonu arasındaki ilişkinin incelenmesi: Çalışmanın bu bölümünde bazal aktivitesi yüksek fakat reseptörle aktivasyonu çok az olan kobay akciğer membranları ve bazal aktivitesi düşük fakat reseptörler aracılığı ile iyi uyarılabilen, yüksek konsantrasyonda insan p-adrenerjik reseptörü taşıyan CHO WT4 hücre membranları kullanıldı. Bu deneyler kobay akciğerlerinde yapıldığında reseptör ve G proteini üzerinden etki eden maddeler adenilat siklazın inaktivasyon yarı ömrünü etkilemezken, bir siklaz aktivatörü olan forskolin inaktivasyon yarı ömrünü belirgin olarak arttırdı. Bu deneyler, CHO WT4 membranlarında yapıldığında, forskolin, kobay akciğerinde olduğu gibi, adenilat siklaz inaktivasyonunu yavaşlattı. Fakat bu sistemde reseptör ve G proteini aracılı aktivasyon yapan isoproterenol ve GTPyS de siklaz inaktivasyon hızını (görünüşte) yavaşlattı. Ancak bu görünüş isoproterenol ve GTPyS'in inkübasyon ortamına konmayıp sadece eşey ortamına konduğu paralel deneylerde de gözlendi. Bu sonuç CHO WT4 sisteminde adenilat siklaz düzeyinde bir rezerv bulunduğu şeklinde yorumlandı. Böyle bir rezervin varlığında agonist potensinin adenilat siklaz konsantrasyonundaki küçük oynamalara duyarlı olmayacağı düşünüldü. Bu durumu değerlendirmek için yapılan çalışmada bazal aktiviteyi yan yarıya azaltacak bir inkübasyondan sonra gerçekten de agonistle uyarılan maksimum yanıtta çok az bir azalma oldu ve agonistin potensi değişmedi.

Abstract:
55 SUMMARY The present study was undertaken to investigate three points that may contribute to the regulation of signaling efficiency of G protein-mediated signal transduction, with particular reference to p-adrenoceptor-Gs-adenylate cyclase system: 1) The existence of "cross-talks" between receptor systems that use a common G protein and/or a common effector. The activation models, which are based on the assumption that the components of the signal transduction system can freely diffuse in the plasma membrane, conditionally predict that the stimulation of one receptor system may affect the signaling properties of another receptor system that uses the same G protein and effector. This prediction was tested for muscarinic and a2-adrenergic receptors in rat ventricular membranes, and for p-adrenergic, histamine and PGE2 receptors in guinea-pig lung parenchymal membranes. The results showed that inhibition of adenylate cyclase by the stimulation of muscarinic and a- adrenergic receptors was not independent from each other, suggesting that these receptor systems use apparently the same physical pool of Gi and/or adenylate cyclase. On the other hand, no results, that may suggest such a dependence between receptor systems, were obtained in lung parenchymal membranes when the interaction of p-adrenergic, PGE2 and histamine receptors were evaluated at the ligand binding level. 2 Mode of coupling between fi-AR, Gs and adenylate cyclase in J3-AR- transfected CHO cell membranes. The effect of variation of receptor number on the receptor-mediated adenylate cyclase stimulation was evaluated in the framework of encounter coupling or quaternary complex model. In the first place, variation of receptor number was achieved by using an irreversible antagonist (bromoacetylalprenolol) in high-receptor expressing CHO clones. EC50 value of isoproterenol in stimulating adenylate cyclase was found to be a function of receptor number. However, this observation alone was not discriminative between the models, for they both predict such a dependence. Nevertheless, the encounter coupling model, with the parameter values that have been claimed to explain the p-AR system, predicted nonmonotone concentration-response curves, which was not the case experimentally and thus threaten the validity of the model in this experimental system. In the second place, concentration-cyclase activity curves were evaluated in cell clones that express different amount of p-AR. Unlike in the case of irreversible antagonist, no difference was observed in the EC50 values for isoproterenol in these cells. Considering that such observations all together can not be explained by the theoretical models that assumes free diffusion of signaling components in the cell membrane, we postulated that there must be a mechanism in the cell that adjust the signaling system to keep the agonist potency constant when the expression of the relevant receptor varies.56 3) Activity states of adenylate cyclase: Possible activity states of adenylate cyclase were evaluated by means of analyzing thermal inactivation rate of the enzyme at different activating conditions. Two preparations were used as a source of adenylate cyclase: guinea-pig lung parenchymal membranes where the basal cyclase activity was high compared to p-AR-stimulated activity, and high-receptor-CHO cell membranes where p-AR-stimulated cyclase activity was high compared to the basal activity. In lung membranes, stimuli via p-AR-Gs (isoproterenol and/or GTPyS) did not change the inactivation rate of adenylate cyclase, whereas the presence of forskolin (a cyclase ligand) in the incubation medium slowed the inactivation rate. In CHO membranes, on the other hand, both isoproterenol and GTPyS, along with forskolin, (apparently) slowed the rate of cyclase inactivation. However, addition of isoproterenol or GTPyS to the assay medium (instead of the incubation medium) gave the same apparent results, which suggest the presence of an adenylate cyclase reserve, rather than a protection against thermal inactivation of the enzyme, in the CHO cell system. In the presence of such a cyclase reserve, one can postulate that the potency of agonist should be insensitive to the small variations in the adenylate cyclase concentration in the membrane. This was indeed the case when the potency of isoproterenol was experimentally evaluated in membranes where the basal activity of adenylate cyclase was halved due to incubation at 37 °C.