Ratlarda periferik sinir kesisi modelinde otolog adiposit kaynaklı kök hücrelerin ve takrolimus kombine kullanımının sinir iyileşmesi üzerine etkileri
The recovery effect of combined use of tacrolimus and autologous adipocyte derived stem cells on peripheral nerve laceration model on rats
Yazar: ONUR OĞAN
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLENEN ÖZKAN
Akdeniz Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Cerrahi-plastik = Surgery-plastic ; Elektromiyografi = Electromyography ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kök hücreler = Stem cells ; Periferik sinir hasarları = Peripheral nerve injuries ; Sinir ezilmesi = Nerve crush ; Sinir rejenerasyonu = Nerve regeneration ; Sıçanlar = Rats ; Takrolimus = Tacrolimus ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries

Özet:
Periferik sinir kesileri sonrası yapılan sinir onarımlarda, fonksiyonel geridönüşün maksimize olmasında rejenerasyon süresi önemli rol almaktadır. Kesi sonrasında oluşan ileti kaybına bağlı olarak son organlarda fonksiyon kaybı oluşmaktadır. Motor sinirlerin kesileri sonrasında iskelet kaslarında motor-son plakta dejenerasyonun gelişmesinden sonra yapılacak ileti getirici yöntemlerin fonksiyonel geri dönüş üzerine etkisi olmadığı bilinmektedir. Periferik sinir kesisi sonrasında iskelet kaslarının nöronal uyarılmasının kısa sürede ve nitelikli olarak sağlanması ile fonksiyonel kayıplar azaltılabilmektedir.
Literatürde sinir onarımları sonrasında rejenerasyonun başarılı ve hızlı olması amacıyla denenmiş çeşitli ajanlar, cerrahi yöntemler ve kök hücre çalışmaları bulunmaktadır. Takrolimus (FK506) isimli immünsupresif ajanın nörorejeneratif etkisini destekleyen çok sayıda çalışma bulunmaktadır. Takrolimusun immünsupresif yan etkilerinden kaçınmak amacıyla kısa dönemli kullanımında  nörorejenerasyonu arttırdığına dair çalışmalar mevcuttur.
	Adiposit kaynaklı kök hücrelerin nörorejeneratif etkisi literatürde incelenmiştir. Farklı diferansiasyon evrelerindeki adiposit kaynaklı kök hücreler ve schwann hücrelerine benzeyen transdiferansiye adiposit kaynaklı kök hücrelerin periferik sinir kesi modellerinde nörorejenerasyona olumlu etki ettiğine yönelik çalışmalar mevcuttur. Ancak kök hücrelerin sinir koaptasyon bölgesine sunum yöntemleri ile ilgili sorunlar bulunmaktadır. Çalışmamızda bu hücrelerin perifasiküler aralığa sunularak verilmesi planlanmıştır.
	Bu çalışmada koaptasyon yapılmış sinir kesisi modellerinde, otolog adiposit kaynaklı kök hücre ve kısa dönem kullanılan takrolimusun (FK506) birlikte kullanımının nörorejenerasyon üzerine etkileri incelenmek istenmektedir. Ayrıca bu ayrı iki rejenerasyon arttırıcı yöntemin birbirlerine olan üstünlükleri ve zayıflıkları ele alınmıştır


Sonuçların incelenmesi aşamasında fonksiyonel geri dönüşümün gösterilmesi için yürüme analizi yapılmıştır. Rejenerasyonun başlangıcını bulmak amacıyla ratlarda ilgili gastrocnemius kasına yönelik EMG uygulanmıştır. Rejenerasyon kalitesini incelemek amacıyla histopatolojik olarak sinir kesitleri incelenmiştir.

Elde edilen sonuçlar neticesinde yürüme analizi verileri izole kök hücre alan grubun sinir kesisi olan diğer gruplara oranla daha iyi fonksiyonel sonuçlar gösterdiğini işaret etmektedir (p<0,05). Elektrofizyolojik çalışmada ise maksimum kas aksiyon potansiyelleri ve latans süreleri değerlendirilmiş ve kök hücre ve takrolimusun beraber uygulandığı deneklerde latans süresinin daha kısa olduğu gözlenmiştir. Her iki kök hücre uygulanan grupta ise kesi yapılan diğer gruplara oranla daha yüksek amplitüdlü aksiyon potansiyelleri ve daha kısa latans süreleri elde edilmiştir (p<0,05). Islak kas ağırlıkları kıyaslandığınında kök hücre kullanılan iki grubun, kesi yapılan gruplara kısmi üstünlüğü gösterilmiştir (p>0.05). Histopatolojik incelemede kesinin proksimali ve distalindeki sinir lif sayıları oranları arasında gruplar arası farklılık saptanmamıştır (p=0,116). Ancak morfolojik bakılarda kök hücre kullanılmayan kesi modellerinde fasikül içi ödem ve lif yoğunluğunda azalma dikkati çekmiştir. Ek olarak perifasiküler alana enjekte edilmiş hücrelerde S100 boyanma izlenmiştir.
Bu sonuçlar ışığında kök hücrelerin sinir kesi modellerinde maksimum kas aksiyon potansiyelini ve fonksiyonel iyileşmeyi arttırdığı görülmektedir. Kök hücrelerin izole olarak nörorejeneratif etkisinin takrolimusla beraber kullanımı arasında kısmi farklılıklar gözlenmiştir. Ancak nörorejenerasyona pozitif etkisi olan bu iki etkenin beraber kullanımının etkilerinin ve mekanizmalarının daha net anlaşılması için ileri çalışmalar gerekmektedir
Anahtar kelimeler: Periferik sinir rejenerasyonu, Takrolimus, Kök Hücre, Yürüme analizi, elektromyografi

Abstract:
Neuroregenerative process has a great role in maximizing functional recovery after repairing peripheral nerve lacerations. Functional loss occurs at the end-organs due to conduction loss. It is well known that repairing the injured nerve can not recover the function after motor-end plates are degenerated. As a result skeletal muscles should be reinnervated as soon as possible to minimize the functional loss. 
Various pharmacological agents, surgical methods, stem cell researchs are tested in altering and accelerating nerve regeneration while increasing regeneration quality. Tacrolimus, an immunosuppressive agent which is investigated in neuroregeneration, is found to impore neuroregeneration. In order to avoid side effects of this immunosuppresive agent some researchers administered this drug temporarily and found that it can still play an effective role in neuroregeneration.
The neuroregenerative effect of adipocyte derived stem cells are investigated. Several differantiaton status of adypocyte derived stem cells and schwann-like transdifferantiated adipocyte derived stem cells are found to improve nerve regeneration process in peripheral nerve injury models Unfortunately there are some problems about delivering stem cells to the injury site in primary repair models. We have planned to deliver these cells to the repair site by injecting these cells to the perifascicular areolar soft tissue proximally and distally.
In this study, we investigated neuroregenerative effects of using tacrolimus and adipocyte derived stem cells together in peripheral nerve laceration model. 
We have evaluated the funcional recovery by intemittent walking track analysis. Electrophysciological evaluation was made to get compuond muscle action potential and latency duration. Histopathological evaluation was made to understand the quality of regenerating nerves. Wet gastrocnemius muscle weight was assessed and recorded.
Walking track analysis showed that subjects that received only stem cells regained walking function better than other subjects (p<0,05). Electrophysological assessments showed that the subjects which receives tacrolimus and stem cells together have shorter latency duration compared to the other nerve injury subjects. In addition Two groups which received stem cells have demonstrated better compuond muscle action potential levels and during the experiment (p<0,05). Groups which treated with stem cells had partially higher wet muscle weight compared to non-stem cell received groups (p>0,05). Histopathological distal to proximal fiber ratio assessment did not demonstrated significant difference between groups (p=0,116). However morphological evaluation showed that non-stem cell received groups had intrafascilular edema and low nerve density. In contrast groups treated with stem cells showed less edema and high density compared to other nerve lacerated groups. In stem cell received groups perifasciular loose tissue contained cells which had S100 dye.  
Stem cells can enhance compound muscle action potentials and improve functional recovery in laceration models. There are some partial differences between subjects which received only stem cells and tacrolimus with stem cells. However further studies are required to investigate neuroregenerative mechanisms of tacrolimus and adipocyte derived stem cells.
Key words: Peripheral nerve regeneration, Tacrolimus, Stem Cells, Walking Track Analysis, Electromyography