Rhizopus stolonifer HA13 ile kitosan üretimi
Chitosan production by Rhizoupus stolonifer HA13
Yazar: ÖZLEM FİRDEVS AÇAR
Danışman: PROF. DR. HAKAN ÖZKAN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Gen Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Amaç: Karbon kaynağı olarak melasın kullanıldığı mevcut tez çalışmasında, Rhizopus stolonifer HA13 'ten mikrobiyal yolla kitosan üretimi ve üretilen fungal kitosanın antimikrobiyal ve antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
Yöntem: Fungus topraktan izole edildi ve üretim deneyleri melas-temelli besiyerinin 100 ml' sini içeren 250 mL' lik erlenler içerisinde gerçekleştirildi. Fungal biyomass ve kitosanın maksimum üretimi için çeşitli kültür parametreleri (melas konsantrasyonu, başlangıç pH' sı, çalkalama hızı, sıcaklık ve inkübasyon süresi) optimize edildi.  Fungal biyokütle alkalin çözünmeyen materyali (AISM) hazırlamak için alkali ekstraksiyona (1 M NaOH) tabi tutuldu. Daha sonra AISM' ye sırasıyla H2SO4 (fosfat gruplarını  uzaklaştırmak) ve asetik asit (kitosanı kitinden ayırmak için) işlemleri uygulanmıştır. Elde edilen asetik asit fraksiyonu daha sonra sırasıyla alkali işleme (2M NaOH), santrifüjleme, nötralizasyon (distile su ile), yıkama (etanol ve aseton ile) ve kurutma prosedürlerine tabi tutuldu. Elde edilen nihai malzeme, Rhizopus kitosanı (RC) olarak adlandırıldı.
Bulgular: Yapılan optimizasyon çalışmalarında 200 mL/L melas, pH 5, 7 günlük inkübasyon süresi, 150 rpm çalkalama hızı ve 25°C sıcaklıkta maksimum biyokütle ve kitosan üretimi gerçekleşmiştir. Optimizasyon sonrası elde edilen biyokütle miktarı 9,8 g/l, kitosan miktarı 1,47 g/L ve AISM miktarı 4,20 g/L dir. Araştırma sonuçlarına göre R. stolonifer HA13 ile batık fermentasyon koşullarında, biyokütle bakımından % 15 ve AISM bakımından % 35'lik bir verimle kitosan üretimi yapılmıştır. Ayrıca üretimi sağlanan fungal kitosanın güçlü antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Ancak TK'nın aksine RK, DPPH· giderme aktivitesi göstermediği tespit edilmiştir. RK ve TK' nın deasetilasyon dereceleri sırasıyla %77,17 ve %76,9 olarak belirlendi.
Sonuç: Bu tez çalışması, melasın substrat olarak kullanıldığı çalkalamalı balon kültüründe yerel izolat R. stolonifer HA13'ten yüksek verimle doğal kitosan üretiminin başarıldığını ve üretilen kitosanın ticari kitosandan daha güçlü antimikrobiyal etkinliğe sahip olduğunu ortaya çıkardı.

Abstract:
Purpose: The aim of the current thesis study, where molasses was used as a carbon source, was to investigate the microbial production of chitosan from Rhizopus stolonifer HA13 and determine the antimicrobial and antioxidant activities of the produced fungal chitosan.
Method: The fungus was isolated from soil and the production experiments were performed in 250 mL shaking flasks containing 100 mL of molasses-based medium. Various culture parameters (molasses concentration, pH, agitation rate, temperature and incubation time) were optimized for the maximum production of fungal biomass and chitosan.. The fungal biomass was subjected to alkaline extraction (1M NaOH) to prepare alkaline insoluble material (AISM). Later to AISM, H2SO4 (to remove phosphate groups) and acetic acid (to separate chitosan from chitin) treatments were applied, respectively. The resulting acetic acid fraction was then subjected to alkali treatment (2M NaOH), centrifugation, neutralization (with distilled water), washing (with ethanol and acetone) and drying, respectively. The resulting final material was named Rhizopus chitosan (RC). The antimicrobial potential of RC was determined using the Agar Disk Diffusion Test. Its antioxidant activity was evaluated using the DPPH radical scavenging method.
Findings: In the conducted optimization studies, maximum biomass and chitosan production were achieved at 200 mL/L molasses, pH 5, 7 days of incubation period, 150 rpm agitation rate, and 25°C temperature. After optimization, the obtained biomass quantity was 9,8 g/L, chitosan quantity was 1.47 g/L, and AISM quantity was 4.20 g/L. According to the results, chitosan production was achieved with a biomass yield of 15% and AISM yield of 35% under submerged fermentation conditions with R. stolonifer HA13. Additionally, the produced fungal chitosan (RC) was found to possess stronger antimicrobial activity than commercial chitosan (CC). However, unlike CC, RC was determined to not have DPPH· scavenging activity. Deacetylation degrees of RC and CC were found to be 77.17 and 76.9%, respectively.
Results: This thesis study revealed that natural chitosan production was achieved with high yield from the local isolate R. stolonifer HA13 in shaking-flask culture using molasses as substrate, and that the produced chitosan had stronger antimicrobial activity than commercial chitosan.