Periost grefti plateletten zengin plazma ile beraber kullanıldığında kemik defekt iyileşmesini artırır mı? Tavşan zigomatik arkta deneysel çalışma
Periosteal graft improves healing of bone defects when used together with  platelet-rich plasma? Experimental study in rabbits zygomatic arch
Yazar: ARZU TÜRKSEVEN TOPAÇOĞLU
Danışman: PROF. DR. DERYA ÖZÇELİK
Düzce Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Cerrahi Tıp Bilimleri Bölümü / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Kemik defektleri = Bone defects ; Kemik ve kemikler = Bone and bones ; Kırık iyileşmesi = Fracture healing ; Periost = Periosteum ; Tavşanlar = Rabbits ; Transplantlar = Transplants ; Trombositten zengin plazma = Platelet rich plasma

Özet:
Kemik defekti içeren yüz kırıkları klinikte karşımıza sık çıkan sorunlardandır
(1,2). Kemik defektlerinin tedavisinde halen en geçerli yöntem kemik greft ve flepleri
ile onarım olmasına rağmen, hücre bazlı yöntemlerin önemi gün geçtikçe artmaktadır
(1,2). Periost hücreleri multipotent mezenkimal ve osteoprogenitör hücreler içerir.
Yüksek proliferasyon ve farklılaşma oranı ile mezenkimal kök hücrelere (MKH),
osteogenik progenitör hücrelere ve osteoblastlara farklılaşarak kemik iyileşmesine
önemli katkı sağlarlar (3). Son yıllarda doku mühendisliğinin gelişmesiyle periost
hücreleri, kolay elde edilebilir olması, osteojenik aktivitesi ve büyüme faktörlerine
(TGF beta-1, PRP, BMP-2) gösterdiği gelişmiş yanıt ile ilgi odağı olmuştur (3).
Trombositten zengin plazma (TZP) kanın farklı iki frekansta sanrifüj
edilmesiyle oluşan bir maddedir. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF),
trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), transforming büyüme faktörü α ve β
(TGF α ve β), epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF),
insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) gibi büyüme faktörlerini içerir. TZP içindeki
trombosit miktarı normal plazmadakinin 3-5 katıdır. Bu ürüne trombin ilavesiyle
trombositlerin α-granüllerinden çok sayıda mediatör salınır. Bunların hemen hepsi
kemik iyileşmesinde görev alan mediatörlerdir. Otolog doku olması nedeniyle son on
yılda özellikle kemik iyileşmesinde klinikte sık kullanılmasına sebep olmuştur.
Yapılan klinik çalışmalarda yara ve kemik iyileşmesini hızlandırdığı; şişliği, ağrıyı,
enfeksiyonu ve skarı azalttığı, kanama kontrolü sağladığı ortaya konulmuştur (4-10).
Ayrıca kemik greftleri ve periostal hücreler ile birlikte, büyüme faktörlerinin otolog
kaynağı olan TZP'nin kemik döngüsü ve periost hücrelerinin biyolojik davranışı
üzerinde olumlu etkisi olduğu gösterilmiştir (3).
Biz kemik iyileşmesine pozitif katkıları bilinen periost grefti ve trombositten
zengin plazma kombinasyonunun, defekt oluşturulmuş membranöz kemikte yeni
kemik oluşumunu artırıp artırmadığını radyolojik ve histolojik olarak inceledik,
konrol grupları ile karşılaştırdık ve istatistiksel olarak fark olup olmadığını araştırdık.
iii
Çalışmada toplam 12 adet New Zealand erişkin tavşan kullandık. Lateral
insizyonlar ile sağ ve sol zigomatik arkları ortaya koyduk. Tavşanların bilateral
zigomatik arklarında (24 adet zigoma) standart olarak 5 mm kemik defekt oluşturduk.
Denekleri 3 gruba ayırdık:
1.Grup (Deney Grubu): Periost grefti+TZP uygulama grubu olan bu grupta
yer alan toplam 12 adet tavşanın sağ zigomatik arkları lateral insizyonlar ile ortaya
konuldu ve sağ zigomatik ark orta hatta 5 mm'lik kemik defekti oluşturuldu.
Deneklerin kraniyumundan 4x1,5 cm ebatlı kranial periost grefti alındı. Ardından
deneklerden 12 cc kan alındı. Alınan kanın 8,5 cc'si TZP elde etmek için özel kitler
ile işlendi, geriye kalan 3,5 cc kan ise otolog trombin elde etmek için kullanıldı. TZP
ve trombin steril petri kabında karıştırılarak aktive TZP elde edildi. Jel kıvamına
gelmiş aktive plateletten zengin plazma, periost greftinin içine konuldu. Periost
grefti 6-0 poliglekapron sütür ile tüp haline getirildi ve uç kısımları sağlam kalan
zigoma uçlarındaki periosta sütüre edildi (n: 12 zigoma). Periost grefti zigomayı kılıf
şeklinde sarmış oldu. Deri 4-0 ipek sütürlerle kapatıldı. TZP elde etmek için alınan
kan sadece o tavşan için kullanıldı.
2.Grup (1. Kontrol Grubu: 6 zigoma): Sadece periost grefti uygulanan grupta
toplam 6 adet tavşanın sol zigomatik arkları lateral insizyonlar ile ortaya konuldu ve
sol zigomatik ark orta hatta 5 mm'lik kemik defekti oluşturuldu, deneklerin
kraniyumları orta hat insizyonları ile ortaya konularak 4x1,5 cm ebatlı kranial periost
grefti alındı, 6-0 polyglekapron sütür ile tüp haline getirilerek zigomatik ark defekt
etrafına sütür ile sabitlendi. Bu grupta TZP kullanılmadı (n:6 zigoma). Deri 4-0 ipek
sütürlerle kapatıldı.
3.Grup (2. Kontrol Grubu: 6 zigoma): Sadece silikon sonda uygulanan bu
grupta toplam 6 adet tavşanın sol zigomatik arkları lateral insizyonlar ile ortaya
konuldu ve sol zigomatik ark orta hatta 5 mm'lik kemik defekti oluşturuldu.
Osteokonduktif etki sağlaması için silikon tüp defekti çevreleyecek biçimde zigoma
uçlarına geçirildi (n:6 zigoma). Deri 4-0 ipek sütürlerle kapatıldı.
Postoperatif takip süresi 8 ve 16 hafta idi. Sekizinci haftada 3 deney grubu, 2
periost greft grubu, 1 de silikon tüp grubundan zigoma görüntülenecek şekilde 3
tavşana üç boyotlu tomografi (3D-BT) çekildi. Sekizinci haftada 1 tavşanın bilateral
zigomaları histolojik inceleme için alındı.
iv
16 hafta sonunda ise geriye kalan 11 tavşana anestezi altında üç boyutlu
tomografi çekildi ve sonrasında zigomatik arkları çıkarıldı. Zigomatik ark üzerinde
oluşturulmuş kemik defekt alanları yeni kemik oluşumu açısından bir de mikrotomografi
(mikro-BT) çekilerek değerlendirildi. Son olarak histolojik verileri
incelendi. Histolojik inceleme sonuçları ''Modifiye Heiple'' ve ''Bosch''
sınıflamalarına göre derecelendirildi ve sonuçlar istatistiksel olarak karşılaştırıldı.
3D-BT değerlendirme ile 16. haftada hesaplanan yeni oluşan kemik miktarları
gruplar arasında karşılaştırıldı. 1. Grup, periost+TZP grubunda (Deney grubu)
2,5±1,51 mm, 2. Grup, periost greft grubunda (1. Kontrol grubu) 1,9±1,53 mm, 3.
Grup, Silikon tüp grubunda (2. Kontrol grubu) 3,7±2,02 mm olarak tespit edildi.
Gruplar arasında yeni oluşan kemik miktarları açısından istatistiksel olarak anlamlı
bir fark olmadığı saptandı (p=0.232).
Grupların 16. hafta sonunda Mikro-BT ölçümlerinden elde edilen Kemik
Volümleri (BV) (mm3) ortalamaları açısından karşılaştırılmasında gruplar arasında
anlamlı fark saptandı (P=0.029):
1. Grup, periost+TZP (Deney grubu) ile 2. Grup, periost grefti (1. Kontrol grubu)
arasında anlamlı bir fark bulunamadı (P=0.137).
1. Grup, periost+TZP (Deney grubu) ile 3. Grup, silikon tüp (2. Kontrol grubu)
arasında anlamlı bir fark bulundu (P=0.028).
2. Grup, periost grefti (2. Kontrol grubu) ile 3. Grup, silikon tüp (2. Kontrol grubu)
arasında anlamlı bir fark bulunamadı (P=0.967).
Grupların 16. hafta sonunda Mikro-BT ölçümlerinden elde edilen Kemik
Mineral Yoğunluğu (BMD) (mm2) ortalamaları açısından karşılaştırılmasında gruplar
arasında anlamlı fark saptandı (P=0.047):
1. Grup, periost+TZP (Deney grubu) ile 2. Grup, periost grefti (1. Kontrol grubu)
arasında anlamlı bir fark bulunamadı (P=0.953).
1. Grup, periost+TZP (Deney grubu) ile 3. Grup, silikon tüp (2. Kontrol grubu)
arasında anlamlı bir fark bulundu (P=0.001).
v
2. Grup, periost grefti (1. Kontrol grubu) ile 3. Grup, silikon tüp (2. Kontrol grubu)
arasında anlamlı bir fark bulunamadı (P=0.166).
Histolojik değerlendirme sonunda gruplar 16. haftada histolojik skorlama
sistemine göre karşılaştırıldı. Modifiye Heiple Sınıflamasına göre gruplar arasında
istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı (P=0.015). Bosch Kemik Rejenerasyon
Sınıflamasına göre gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı
(P=0.015). 1. Grup, periost+TZP (Deney grubu)'da grade 2 (%45.5), grade 1 (%54.5),
grade 0 (%0) histolojik olarak yüzde cinsinden iyileşme oranları diğer gruplara göre
daha fazla idi. Bunu sırası ile 2. Grup, periost grefti (1. Kontrol grubu)'da grade 2 (%
0), grade 1 (%40 ), grade 0 (%60) ve 3. Grup, silikon tüp (2. Kontrol grubu)'da grade
2 (%0), grade 1 (%33.3), grade 0 (%66.7) izledi.
Bu çalışma sonucunda, TZP ve periost greft kombinasyonunun kemik iyileşme
üzerine olumlu etkileri saptanmasına rağmen, periost grefti+TZP (Deney grubu)
grubunda daha fazla kemik rejenerasyonu görülse de periost greftinin tek başına
kullanıldığı grup ile karşılaştırıldığında fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı.
Peirost grefti+TZP grubunun, silikon tüp (2. Kontrol grubu) grubu ile
karşılaştırıldığında, farkın anlamlı olması ise hem periost grefti hem TZP'nin kemik
iyileşmesi üzerine pozitif katkı sağladığını düşündürdü.
Ayrıca histolojik olarak her 3 grupta da osteokondüktif etki sağlayacak biçimde
konulmuş olan periost greftleri ve silikon tüplerin karşılaştırılması yapıldığında
periost greftli olan grupların kemik iyileşmesi silikon tüplü gruba göre belirgin fazla
olması bize periost greftlerinin tek başına osteokondüktif etki ile değil aynı zamanda
osteoindüktif etki ile de kemik iyileşmesini artırdığını düşündürdü. Tüp biçiminde
periost greftine bir de TZP eklendiğinde kemik iyileşmesinde daha fazla artış olması
TZP'nin pozitif yönde osteoindüksiyonu artırdığını düşündürmektedir. Kemik
iyileşmesi üzerine sağladığı yararların saptanabilmesi ve istatistiksel olarak anlamlı
bir fark ortaya konabilmesi için, TZP'nin daha yüksek trombosit konsantrasyonlarıyla
hazırlandığı ve tekrarlayan dozlarda uygulanabildiği benzer çalışmalara ihtiyaç vardır.
Hücre bazlı yöntemlerin otolog dokulardan hazırlanması, kolay hazırlanması ve
uygun maliyetli olması bizim çalışmamızda sadece periost grefti kullanılan gruba
göre istatistiksel olarak çok anlamlı çıkmamış olsa da kullanılabileceğini bu konuda
yapılacak ileri çalışmaların konuyu daha çok aydınlatacağını düşünüyoruz.
vi
Hücre bazlı yöntemlerden biri olan TZP'nin kemik defektlerinin iyileşmesinde
sınırlı olsa da pozitif yönde katkı sağladığını düşünmekteyiz. Özellikle erken
dönemde (8. hafta) hızlı kemik iyileşmesi sağladığını düşündük. Tekrarlayan dozlarda
uygulanması deney modelimizde mümkün olmadı. Deneklerin hayati tehlikesi nedeni
ile benzer çalışmalarda da tek doz uygulanmıştır. Klinik uygulamalarından da
bilindiği üzere 3-4 aşamalı tekrarlayan dozlarda uygulandığı takdirde daha pozitif
sonuçlar elde edilebileceğini düşünmekteyiz.
Kemik iyileşmesini artırabilecek her türlü girişim rekonstrüktif cerrahi için bir
anlam teşgil etmektedir. Kemik iyileşmesini artıran hücre bazlı tedavilerin gelecekte
de ön planda olacağına inanıyoruz.
ANAHTAR SÖZCÜKLER; Kemik iyileşmesi, trombositten zengin plazma
(TZP), tavşan, zigomatik ark, periost, kırık, greft

Abstract:
Facial fractures with bony defects are common problems faced in the clinic 
(1,2). The importance of cell-based methods is increase progressively, despite the fact 
that restoration with bone grafts and flaps is still the most valid method for the 
treatment of bone defects (1,2). Periosteum cells include multipotent mesenchymal 
and osteoprogenitor cells. They contribute significantly to bone healing by 
differentiating into mesenchymal stem cells, osteogenic progenitor cells and 
osteoblasts with their high proliferation and differentiation rates (3). While tissue 
engineering has progressed in recent years, periosteum cells have become the focus of 
interest by being easy to acquire, due to their osteogenic activity and improved 
response to growth factors (TGF beta-1, PRP, BMP-2) (3).
Platelet-rich plasma (PRP) is a material acquired with the centrifugation of 
blood in two different frequencies. It includes growth factors such as vascular 
endothelial growth factor (VEGF), platelet derived growth factor (PDGF), 
'transforming' growth factor α and β (TGF α and β), epidermal growth factor (EGF), 
fibroblast growth factor (FGF), and insulin-like growth factor (IGF). The platelet 
amount included in the PRP is 3-5-folds of the amount of platelets in normal plasma. 
A high number of mediators are secreted from α-granules of platelets with addition of 
thrombin. Almost all of these mediators play a role in bone healing. It has frequently 
been used clinically in the last ten years, especially for bone healing, because it is 
autologous tissue. In the clinical studies conducted, it has been proven to accelerate 
wound and bone healing, reduce swelling, pain, infection and scarring, and facilitate 
bleeding control (4,5,6,7,8,9,10). It has also been demonstrated that PRP, the 
autologus source of growth factors, has a positive effect on bone cycle and the 
biological behavior of the periosteum cells with bone grafts and periostial cells (3).
We have investigated histologically and radiologically whether or not new 
bone formation of defected membranous bone is enhanced with periostial graft and 
platelet-rich plasma combination, which is known to have positive effects on bone 
healing, compared with the control groups, and evaluated the presence of statistical 
significance. viii
We used 12 New Zealand rabbits. The right and left zygomatic arches were 
exposed through lateral incisions. We created standard 5 mm bone defects on the 
bilateral zygomatic arches (24 zygomatic bones) of rabbits. We then divided the 
subjects into 3 groups:
Group 1 (Experiment Group): Right zygomatic arches of 12 rabbits in this 
group, the periosteum graft+PRP application group, were exposed with lateral 
incisions and 5mm bone defects were formed at the right zygomatic arch midline. 
4x1,5cm cranial periosteum grafts were extracted from the craniums of the subjects. 
Then, 12 cc of blood samples were obtained from the subjects. 8,5cc of the blood 
were processed with special kits to obtain PRP and the remaining 3,5cc were used to 
obtain autologous thrombin. PRP and thrombin were mixed in sterile petri dish and 
activated PRP was obtained. Jelly-activated platelet-rich plasma was placed into the 
periosteum graft. The periosteum graft was sutured with 6-0 polyglecapron in the 
form of a tube and sutured to the periosteum at the ends of the zygomatic bones (n:12 
zygoma). The periosteum graft was covering the zygomatic bone like a case. It was 
then closed with 4-0 silk sutures.
The blood sample that had been obtained in order to be processed for PRP, 
was used only for the rabbit from which the sample was obtained. 
Group 2 (1st control group: 6 zygomatic bones): The left zygomatic arches 
of 6 rabbits in this group, and the periosteum graft of only the application group, were 
exposed with lateral incisions, and 5 mm bone defects were created at the midline of 
the left zygomatic arch, and 4x1,5 cm cranial periosteum grafts were extracted from 
the craniums of the subjects that had been exposed through midline cranial incisions, 
and the periosteum graft was sutured with 6-0 polyglecapron in the shape of a tube 
and fixed around the zygomatic arch defects. PRP was not used in this group (n:6 
zygoma). It was then closed with 4-0 silk sutures.
Group 3 (2nd control group: 6 zygomatic bones): The left zygomatic arches 
of 6 rabbits in this group, the silicon drain-only application group, were exposed with 
lateral incisions and 5mm bone defects were created at the midline of the left 
zygomatic arch. A silicone tube was placed so as to cover the defect in order to obtain 
osteoconductive effect (n:6 zygoma). The skin was then closed with 4-0 silk suture. ix
The postoperative follow-up period was at the 8th and the 16th weeks.
In week 8, three-dimensional computed tomography (3D-CT) was performed 
on 3 rabbits with imaging of the zygomatic bones for 3 in the experimental group, 2 in 
the periosteum graft group, and 1 in the silicone tube. The bilateral zygomatic bones 
of 1 rabbit were removed for histological examination.
The remaining 11 rabbits underwent 3D-CT under anesthesia and their 
zygomatic bones were removed at the end of 16 weeks. Bone defect areas on the 
zygomatic bones were examined with microtomography (micro-CT) to evaluate new 
bone formation. The histological data were evaluated as the last step. The histological 
examination results were classified as "Modified Heiple" and "Bosch" classifications, 
and the results were compared statistically.
The quantities of newly formed bone at the end of 16 weeks were compared 
among the groups with 3D-CT evaluation. This was determined as 2,5±1,51 mm in 
Group 1 (periosteum+PRP group (experiment group)), 1,9±1,53 mm in Group 2 
(periosteum graft group (1st Control group)), and 3,7±2,02 mm in Group 3 (Silicone 
tube group (2nd Control group)). No statistically significant difference was 
determined among the groups with regard to the quantity of newly formed bone 
(p=0.232).
A significant difference was determined among the groups when the mean 
Bone Volumes (BV)( mm3
) were compared (P=0.029):
No significant difference was determined between Group 1, the periosteum+PRP 
(experiment group) and Group 2, the periosteum graft group (1st Control group)
(P=0.137).
A significant difference was determined between Group 1, the periost+PRP group 
(experiment group), Group 3, and the Silicone tube group (2nd Control group) 
(P=0.028).
No significant difference was determined between Group 2, the periosteum graft 
group (1st Control group) and Group 3, the Silicone tube group (2nd Control group) 
(P=0.967).x
A significant difference was found among the groups when the mean Bone 
Mineral Density (BMD)(mm
2
) obtained from micro-CT results were compared
No significant difference was detected between Group 1, the periosteum+PRP 
(experiment group) and Group 2, the periosteum graft group (1st Control group) 
(P=0.953).
A Significant difference was detected between Group 1, the periosteum +TRP group 
(experiment group), and Group 3, the Silicone tube group (2nd Control group) 
(P=0.001).
No significant difference was found between Group 2, the periosteum graft group (1st
Control group) and Group 3, the Silicone tube group (2nd Control group) (P=0.166).
The groups were compared according to the histological scoring system at the 
end of 16 weeks for the histological evaluation. A statistically significant difference 
was determined among the groups according to the Modified Heiple Classification 
(P=0.015). A statistically significant difference was determined among the groups 
according to the Bosch Bone Regeneration Classification (P=0.015). Grade 2 
(%45.5), grade 1 (%54.5), grade 0 (%0) histological healing percentages were higher 
in Group 1 (the periosteum+PRP (experiment group)) than in the other groups. And it 
was grade 2 (% 0), grade 1 (%40), grade 0 (%60) in Group 2 (periosteum graft group 
(1st Control group)), and grade 2 (%0), grade 1 (%33.3), grade 0 (%66.7) in Group 3 
(Silicone tube group (2nd Control group)), respectively.
Although the positive effects of PRP and periosteum graft combination on 
bone healing have been determined as a result of this study, despite bone regeneration 
being observed to be higher in the periost graft+PRP (experiment group), no 
statistically significant difference was determined when compared to the periosteum 
graft only. A significant difference between the silicone tube (2nd control group) and 
the periosteum graft+PRP groups has rendered the consideration that both PRP and 
periosteum graft contribute to bone healing.
We have concluded that periosteum grafts enhance bone healing with 
osteoconductive, in addition to osteoinductive effects, as histological bone healing 
was observed to be significantly higher in groups with periosteum graft than the 
silicone tube group, and at the same time, the periosteum grafts and silicone tubes xi
were placed as they could exhibit osteoconductive activity. It is thought that PRP 
increases the osteoinduction in a positive direction due to further enhancement of
bone healing with addition of PRP to the periosteum graft formed as a tube. Similar 
studies in which PRP is prepared in higher concentrations and applied repeatedly are 
required to determine the benefits on bone healing and to put forth the statistical 
significance. 
We think that cell-based methods may be used, as they are prepared from 
autologous tissues, easy to obtain and cheap, in spite of the fact that the results were 
not so statistically significant in our study, compared to the periosteum graft-only 
group, and further studies in this matter will enlighten the subject further.
We think that PRP, one of the cellular-based methods, positively contributes 
to healing of bony defects. We observed that it provided quick healing, especially in 
the early period (8th week). Repeated doses were not possible in our experimental 
model. In other studies, too, a single dose was applied, due to the vital risk of the 
subjects. We think that 3-4 stepped repeated doses, as known from clinical 
applications, may provide more favorable results.
Any method that may improve bone healing is meaningful for reconstructive 
surgery. We believe that cell-based methods enhancing bone healing will be 
important in the future, too.