Topikal nanoemülsiyon formülasyonlarının geliştirilmesi ve in vitro değerlendirilmesi
The development and in vitro evaulation of topical nanoemulsion formulation
Yazar: AFİFE BÜŞRA UĞUR
Danışman: PROF. DR. MELTEM ÇETİN ; PROF. DR. SÜEDA HEKİMOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Daidzein = Daidzein ; Deri neoplazmları = Skin neoplasms ; Emülsiyonlar = Emulsions ; Fibroblastlar = Fibroblasts ; Hücre dizisi = Cell line ; Melanom = Melanoma ; Neoplazmlar = Neoplasms ; İlaç formülleri = Formularies ; İn vitro = In vitro

Özet:
Amaç: Cilt kanseri (melanoma) tedavisine yönelik daidzein (DZ) içeren topikal nanoemülsiyon (NE) ve nanoemulsiyon bazlı jel (NEJ) formülasyonları hazırlanmış ve in vitro karakterizasyon çalışmaları (morfolojik inceleme, damlacık boyutu, zeta potansiyel, salım çalışması, stabilite çalışması, viskozite ve pH ölçümleri) gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, formülasyonların melanoma (SK-MEL 30/An1) ve normal dermal fibroblast (PCS-201-012) hücre hatlarında sitotoksik etkilerinin değerlendirilmesi amacıyla hücre kültürü çalışması gerçekleştirilmiştir.
Materyal ve Metot: DZ'nin miktar tayini için HPLC tayin yöntemi geliştirilmiş ve validasyonu gerçekleştirilmiştir. Yağ fazı olarak etil oleat (%10), DMSO (%5), sürfaktan olarak Tween 80 (%10) ve Lipoid S100 (%5) ve ultra saf su kullanılarak kaba emülsiyon hazırlanmış ve daha sonra bu kaba emülsiyon yüksek basınçlı homojenizatörden geçirilerek (2 devir) boş ve DZ içeren nanoemülsiyon formülasyonları (B-NE ve DZ-NE) hazırlanmıştır. Bunun dışında, jelleştirme ajanı olarak %1 Protasan™ UP G 213 kullanılarak nanoemülsiyon bazlı jel formülasyonları (B-NEJ ve DZ-NEJ) geliştirilmiştir. Ayrıca, boş ve daidzein içeren klasik emülsiyon formülasyonları (B-KE, D-KE) da hazırlanmıştır. Tüm formülasyonların damlacık büyüklüğü, büyüklük dağılımı, zeta potansiyel, viskozite ve pH değerleri belirlenmiştir. Stabilite (4 C ve 25 C'de) ve in vitro salım (%5 SDS içeren PBS pH 7.4'de) çalışmaları gerçekleştirilmiştir. MTT yöntemi kullanılarak formülasyonların insan melanoma ve normal fibroblast hücre hatlarında sitotoksik etkileri incelenmiştir.
Bulgular: Damlacık büyüklüğü ve zeta potansiyel değerleri, B-NE ve DZ-NE için sırasıyla 151.12±2.70 ve 149.80±3.52 nm (p>0.05) ve -22.57±0.78 ve -19.32±1.06 mV (p<0.05); B-NEJ ve DZ-NEJ için 191.48±5.26 ve 200.25±11.09 (p>0.05) ve 18.67±0.59 ve 19.35±0.66 mV (p>0.05); B-KE ve DZ-KE için 2.830±0.011 ve 4.420±0.017 μm (p<0.05) ve -15.50±0.75 ve -14.67±0.43 mV (p<0.05) olarak tespit edilmiştir. Protasan™ UP G 213 varlığında B-NEJ ve DZ-NEJ için pozitif zeta potansiyel değerleri elde edilmiş ve NE formülasyonları ile karşılaştırıldığında önemli bir viskozite artışı sağlanmıştır. Hazırlanan formülasyonların cilt ile uyumlu pH değerlerine (pH 4.53-5.54) sahip olduğu saptanmıştır. En küçük damlacık büyüklüğüne sahip DZ-NE formülasyonundan daha yüksek miktarda DZ salımı gerçekleşmiştir. Stabilite çalışması süresince (90 gün) NE ve NEJ formülasyonlarının damlacık büyüklüklerinin nano-aralıkta kaldığı ve mutlak zeta potansiyel değerlerinin ise yaklaşık 20-40 mV olduğu tespit edilmiştir. Tüm formülasyonlar, melanoma hücre hattına karşı saf DZ'nin sitotoksik etkisini korumuştur. Diğer taraftan, saf DZ'nin ve tüm formülasyonların normal fibroblast hücreleri üzerinde sitotoksik etki göstermediği de tespit edilmiştir.
DZ içeren NE ve NEJ formülasyonları başarılı bir şekilde hazırlanmıştır. DZ'nin topikal olarak uygulanması ve cilt kanseri tedavisi için hazırlanan NE ve NEJ formülasyonları faydalı taşıyıcı sistemler olabilir.
Anahtar Kelimeler: Cilt kanseri, daidzein, fibroblast hücre hattı, melanoma hücre hattı, nanoemülsiyon, nanoemülsiyon-bazlı jel, stabilite

Abstract:
Aim: Topical nanoemulsion (NE) and nanoemulsion-based gel (NEG) formulations containing daidzein (DZ) for the treatment of skin cancer (melanoma) were prepared and in vitro characterization studies (morphological analysis, droplet size, zeta potential, release study, stability study, viscosity and pH measurements) were performed. In addition, cell culture studies were performed to evaluate the cytotoxic effects of the formulations on melanoma (SK-MEL 30/An1) and normal dermal fibroblast (PCS-201-012) cell lines.
Materials and Methods: HPLC method for quantification of DZ was developed and validated. The coarse emulsion was prepared using ethyl oleate (10%), DMSO (5%) as the oil phase, Tween 80 (10%) and Lipoid S100 (5%) as surfactant and ultrapure water and then blank nanoemulsion and nanoemulsion containing DZ formulations (B-NE and DZ-NE) were prepared by passing the coarse emulsion through high-pressure homogenizer (2 cycles). Furthermore, nanoemulsion-based gel formulations (B-NEG and DZ-NEG) were developed using 1% Protasan ™ UP G 213 as the gelling agent. And also, blank conventional emulsion and conventional emulsion containing DZ formulations (B-CE, DZ-CE) were also prepared. The droplet size, size distribution, zeta potential, viscosity and pH values of all formulations were determined. Stability (at 4 C and 25C) and in vitro release (in PBS pH 7.4 with %5 SDS) studies have were performed. Using MTT method, the cytotoxic effects of formulations was evaluated against human melanoma and normal fibroblast cell lines.
Results: Droplet size and zeta potential values were 151.12±2.70 and 149.80±3.52 nm (p>0.05) and -22.57±0.78 and -19.32±1.06 mV (p<0.05) for B-NE and DZ-NE, 191.48±5.26 and 200.25 ±11.09 nm (p>0.05) and 18.67±0.59 and 19.35±0.66 mV (p>0.05) for B-NEG and DZ-NEG, 2.830±0.011 and 4.420±0.017 μm (p<0.05) and -15.50±0.75 and -14.67±0.43 mV (p<0.05) for B-CE and DZ-CE, respectively. Positive zeta potential values for B-NEG and DZ-NEG were obtained and a significant viscosity increase was achieved in the presence of Protasan ™ UP G 213 compared to the NE formulations. It was determined that the prepared formulations had pH values (pH 4.53-5.54) compatible with the skin. Higher amount of DZ was released from the DZ-NE with the smallest droplet size. During the stability study (90 days), it was determined that the NE and NEG formulations have droplet sizes in the nano-range and their absolute zeta potential values were about 20-40 mV. All formulations maintained the cytotoxic effect of DZ against the melanoma cell line. Moreover, it was also found that pure DZ and all formulations had no cytotoxic effect on normal fibroblast cells.
Conclusion: DZ-containing NE and NEG formulations were successfully prepared. The prepared NE and NEG formulations might be useful delivery systems for the topical application of DZ and treatment of skin cancer.
Key Words: Daidzein, fibroblast cell line, melanoma cell line, nanoemulsion, nanoemulsion-based gel, skin cancer, stability