Mikozis fungoides tanılı hastalarda toll benzeri reseptörler ile ilişkili sinyal iletim yolağı ve mirna'ların ekspresyon profillerinin ve T hücre klonalitesinin belirlenmesi
Determination of T-cell clonality and expression profiles of toll-like receptors related signal transduction pathway and mirnas in patients with mycosis fungoides
Yazar: MÜCAHİT SEÇME
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM AÇIKBAŞ
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Lenfoma = Lymphoma ; Lenfoma-T hücreli = Lymphoma-T cell ; Mikro RNA = Micro RNA ; Mycosis fungoides = Mycosis fungoides ; RNA = RNA ; Reseptörler-toll like = Receptors-toll like ; T lenfositleri = T lymphocytes

Özet:
Kutanöz T hücreli lenfomalar (KTHL) deride bulunan malign klonal CD4+ T lenfositlerle karakterize bir hastalık grubudur. Mikozis fungoides (MF) KTHL'lerin en sık görülen tipi olup, kutanöz T hücreli lenfomaların %60'ını, tüm primer kutanöz lenfomalarında %50'sini kapsamaktadır.  MF'nin patogenezi henüz tam anlamıyla tespit edilememiştir. Toll-benzeri reseptörler (TLR)'ler spesifik olarak ilgili ekzojen ve endojen ligandlarını tanımakta ve böylece hücredeki çeşitli genlerin ekspresyon seviyelerini uyarmakta ve bunun sonucunda da doğal immunitenin aktive olmasını sağlamaktadır. miRNA'lar, TLR'ler de dahil olmak üzere inflamasyon ilişkili genleri hedefleyerek immun hücre fonksiyonlarının çeşitli yönleriyle düzenlenmesinde rol alırlar. Çalışmamızda, tüm TLR'lerin ve bu sinyal iletiminde rol alan genlerin ve miRNA'lar ile downstreamindeki hedef genlerin ekspresyon profillerinin değişimini belirleyerek hastalığın mekanizmasındaki olası rollerini hem hasta dokuları hem de hücre kültürü üzerinden anlamaya çalışmaktır. Ayrıca T hücre klonalite çalışması ile olgulardaki klonal durumun tespiti ve klinikopatolojik veriler ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda 52 MF ve 50 kontrol parafin blok materyalinde ve MF hücre hattı olan MJ'de Real-time PCR ile TLR 1-10,  MyD88, TIRAP, IRAK4, TRAF6, IRF7, TRAF3, TRIF(TICAM-1), MEK1, MEK2, ERK1, ERK2 (p38), Elk1, NFkB (REL-A), IRAK1 ve TAB2 ile hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR—224-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-214-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR- 210-3p ve hsa-miR—204-5p'nın ekspresyon değişimleri araştırılmıştır. KEGG veri tabanı kullanılarak yolak analizi ve çalışılan miRNA'ların görev aldığı veya ilişkili olduğu sinyal iletim yolakları belirlendi ve String analizi yapılarak protein-protein ilişkisi ve etkileşimi teyit edildi. T hücre reseptörü (THR) gama klonalite değişimi İnvivoscribe IdentiClone™ T Cell Receptor Gamma Gene Rearrangement Assay 2.0 ile mültipleks PCR kullanılarak gerçekleştirildi. Yalancı pozitifliği önlemek için heterodupleks analizi yapıldı ve dikey jel elektroforezi ile görüntüleme işlemleri gerçekleştirildi. Çalışma sonucunda hem hasta grubu hem de hücre hattı değerlendirildiğinde TLR -1,-4,-8, IRF7, TRAF3, MEK1, MEK2, Elk1 ve NFkB mRNA ekspresyonlarında ve hsa-miR-21-5p, hsa-miR-155-5p miRNA ekspresyonlarındaki artışlar ve hsa-miR-130a-3p, hsa-miR- 210-3p ve hsa-let-7e-5p ekspresyonlarında anlamlı azalma tespit edildi. THR gama klonal değişim sonuçlarına göre olgularımıza ait çalışılan DNA'ların %55,5 monoklonal ve biallelik sergilediği ve %45,5 oranında poliklonalite saptandı. Tüm bu sonuçlar ile TLR sinyal yolağının MF patogenezindeki olası rolü ve tedavi açısından potansiyelini ortaya koymaktadır.

Abstract:
Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are a group of diseases characterized by malignant clonal CD4 + T lymphocytes in the skin. Mycosis fungoides (MF) is the most common type of CTCL and includes 60% of cutaneous T cell lymphomas and 50% of all primary cutaneous lymphomas. The pathogenesis of MF has not yet been fully determined. Toll-like receptors (TLRs) specifically recognize their respective exogenous and endogenous ligands, thereby stimulating the expression levels of various genes and activates the natural immunity in the cell. miRNAs play role in the regulation of various aspects of immune cell function by targeting inflammation-related genes, including TLRs. In our study, we aimed to understand the possible roles of all Toll-like receptors and the genes involved in this signal transduction and the expression profiles of miRNAs and downstream target genes in the mechanism of the disease through both patient tissues and cell culture. In addition, clonal status and compare it with the clinicopathological data were determined by T cell clonality assay. In this context, expression status of TLR 1-10,  MyD88, TIRAP, IRAK4, TRAF6, IRF7, TRAF3, TRIF(TICAM-1), MEK1, MEK2, ERK1, ERK2 (p38), Elk1, NFkB (REL-A), IRAK1 ve TAB2, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-375, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR—224-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-214-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR- 210-3p and hsa-miR—204-5p were detrmined by RT-PCR in 52 MF and 50 control paraffin block material and MF cell line MJ. Pathway analysis and signal transduction pathways involved or associated with miRNAs were investigated via KEGG database and the protein-protein relationship and interaction was confirmed by string analysis. The T cell receptor (TCR) gamma clonality change was performed using multiplex PCR with Invivoscribe IdentiCon ™ T Cell Receptor Gamma Gene Rearrangement Assay 2.0. Heteroduplex analysis was performed to avoid false positivity, and imaging was performed with the PAGE system. According to the result of the study,  when both the patient group and cell line were evaluated, increased expressions in TLR -1, -4, -8, IRF7, TRAF3, MEK1, MEK2, Elk1, NFkB hsa-miR-21-5p, hsa-miR-155-5p and decreased expressions in hsa-miR-130a-3p, hsa-miR- 210-3p ve hsa-let-7e-5p were determined. According to the results of TCR gamma clonal change, the DNAs studied in our cases exhibited 55.5% monoclonal and biallicity and 45.5% polyclonality was determined. All these results show the potential role and treatment potential of Toll-like receptor signaling pathway in MF pathogenesis.