Kolorektal kanserlerde sirküle lncRNA'ların prognoza etkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of the effect of circulated lncRNAs on prognosis in colorectal cancers
Yazar: SERAP ARSLAN
Danışman: DOÇ. DR. OĞUZ ÇİLİNGİR ; PROF. DR. MURAT DİNCER
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı / Tıbbi Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen ifadesi profili = Gene expression profiling ; Genetik belirteçler = Genetic markers ; Genetik-medikal = Genetics-medical ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Plazma = Plasma ; Prognoz = Prognosis ; RNA = RNA ; ROC eğrisi = ROC curves

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı, ARHGAP5- AS1, LOC152578, SNHG16, ZNRF3-IT1, CCAT1, CRNDE ve XLOC_000303 sirküle lncRNA genlerinin kolorektal kanserde non-invaziv bir biyobelirteç olarak kullanılma olasılıklarını tartışmaktır. Bir diğer amacı ise ileri evre olgularında aday sirküle lncRNA'lar ile KRAS, NRAS ve BRAF genlerindeki sık gözlenen somatik varyantlar arasındaki ilişkinin incelenmesidir.
Kapsam: Çalışmada 50 evre III/IV ve 15 evre I/II olmak üzere 65 KRK hastası ile kontrol grubunu oluşturan 31 bireyin plazma örneği incelenmiştir. Ayrıca ileri evre grubundaki 50 hastanın FFPE doku örneklerinde KRAS, NRAS ve BRAF somatik varyantları ve CEA ve CA 19-9 tümör belirteçleri incelenmiştir. 
Yöntem: Total RNA izolasyonu ve cDNA eldesinden sonra, 7 aday  sirküle lncRNA geninin (ARHGAP5-AS1, LOC152578, SNHG16, ZNRF3-IT1, CCAT1, CRNDE ve XLOC_000303) ekspresyon analizi yapılmıştır. Referans gen olarak β-actin kullanılmıştır. Ayrıca ileri evre grubunda FFPE örneğinden DNA eldesi yapılarak Real-Time PCR yöntemi ile KRAS, NRAS ve BRAF somatik varyantları incelenmiştir.
Bulgular: Çalışmaya kolorektal kanser tanısıyla tedavi gören 65 hasta ve 31 kontrol dâhil edilmiştir. Hastaların % 61,53'ü kolon % 38,46'sı rektum kanseri tanısı almış ve olguların % 93,8'i adenokarsinom olarak tespit edilmiştir. Hastaların %6,15'i evre I, %16,92'si evre II, %9,23'ü evre III ve %67,69'u evre IV olarak tanı almıştır. Elde edilen verilerin analizi IBM SPSS 21 paket programı ile yapılmış olup, p<0,05 olan durumlar anlamlı kabul edilmiştir. 
Hasta ve kontrol grubu karşılaştırıldığında, ZNRF3-IT1(p=0,012; AUC:0,660), CCAT1 (p=0,007; AUC:0,672), CRNDE (p=0,002; AUC:0,700), XLOC_000303 p=0,001; AUC:0,706) sirküle lncRNA genleri arasında anlamlı farklılık saptanmıştır. Evrelere göre ise sadece XLOC_000303'de anlamlı farklılık saptanmıştır (p=0,001). Ayrıca, XLOC_000303'ün metastaz oluşumuna karşı koruyucu bir faktör (p=0,045, HR:0,90, 1,111 kat) olduğu bulunmuştur.  
İleri evre olgularda en sık KRAS somatik varyantları (%34) gözlenmiştir. KRAS geninde sık gözlenen somatik varyantlar ile CRNDE geni (p=0,031) arasında anlamlı bir farklılık saptanmıştır. 
ARHGAP5-AS1 geni ile CA 19-9 tümör belirtecinin tanı (p=0,014) ve prognozdaki (p=0,036) serum seviyeleri arasında anlamlı farklılık saptanmıştır.
Klinik parametreler değerlendirildiğinde, CRNDE ile tümör farklılaşması (p=0,023), primer tümör yerleşim yeri (p=0,009) ve tümör boyutu (p=0,010) arasında ilişki olduğu belirlenmiştir. CCAT1 (p=0,021) ve SNHG16 (p=0,023) ile tümör boyutu arasında ve metastaz oluşumu ile XLOC_000303 (p=0,016) arasında ilişki olduğu saptanmıştır. 
Sonuç: Bulgularımız, ZNRF3-IT1,CCAT1, CRNDE ve XLOC_000303 sirküle lncRNA genlerinin kolorektal kanser prognozunda potansiyel bir non invaziv  biyobelirteç olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Aynı zamanda XLOC_000303 ekspresyon artışı metastaz oluşumuna karşı koruyucu bir faktör olabilir.  Ayrıca bu veriler,  sirküle lncRNA'ların KRAS somatik varyantları üzerine etkili olabileceğini düşündürmektedir. Bunun yanı sıra verilerimizin CEA ve CA 19-9 ile aday sirküle lncRNA'lar arasında ilişki olabileceğini göstermesi açısından önemli olduğunu düşünüyoruz.
Anahtar kelimeler: KRK, sirküle lncRNA, Real-Time PCR, ARHGAP5-AS1, CCAT1, CRNDE, LOC152578, XLOC_000303, SNHG16 ZNRF3-IT1, CEA, CA 19-9, KRAS, NRAS ve BRAF

Abstract:
Objective: The aim of this study is to discuss the possibilities of using the ARHGAP5-AS1, LOC152578, SNHG16, ZNRF3-IT1, CCAT1, CRNDE, and XLOC_000303 circulating lncRNA genes as a non-invasive biomarker in colorectal cancer. Another aim is to examine the relationship between candidate circulating lncRNA and frequently observed somatic variants in KRAS, NRAS, and BRAF genes in advanced stage cases.
Content: In this study, plasma samples of 65 CRC patients (50 stages III / IV and 15 stages I / II) and plasma samples of 31 individuals in the control group were examined. In addition, KRAS, NRAS, and BRAF somatic variants were investigated in FFPE tissue samples of 50 patients in the advanced stage group and CEA and CA 19-9 tumor markers in their serum were studied.
Methods: After total RNA isolation and cDNA were obtained, expression analysis was performed in terms of 7 candidate circulating lncRNA genes (ARHGAP5-AS1, LOC152578, SNHG16, ZNRF3-IT1, CCAT1, CRNDE, and XLOC_000303). β-actin was used as the housekeeping gene. In addition, somatic variants of KRAS, NRAS, and BRAF were examined by the Real-Time PCR method by obtaining DNA from FFPE tissue samples in the advanced stage group.
Results: Sixty-five patients treated with the diagnosis of colorectal cancer and thirty-one controls were included in this study. 61.53% of the patients were diagnosed with colon cancer, 38.46% with rectal cancer, and 93.8% of the patients were diagnosed as adenocarcinoma. Of the patients, 6.15% were diagnosed as stage I, 16.92% as stage II, 9.23% as stage III, and 67.69% as stage IV. The analysis of the obtained data was made with the IBM SPSS 21 package program, and the cases with p<0.05 were considered significant.
Comparing the patient and control groups, ZNRF3-IT1(p=0.012, AUC:0.660), CCAT1 (p=0.007, AUC:0.672), CRNDE (p=0.002, AUC:0.700), XLOC_000303 p=0.001, AUC: 0.706) circulating lncRNA genes between were detected a statistically significant difference. According to the stages, a significant difference was found only in XLOC_000303 lncRNA (p = 0.001). Moreover, XLOC_000303 was found to be a protective factor against metastasis formation (p=0.045, HR:0.90, 1.111 fold).
The most common KRAS somatic variants (34%) were observed in the advanced cases. A significant difference was found between the frequently observed somatic variants in the KRAS gene and the lncRNA CRNDE gene (p = 0.031) in this study. 
A significant difference was found between the serum values of the CA 19-9 tumor marker of the lncRNA ARHGAP5-AS1 gene in diagnosis (p= 0.014) and prognosis (p= 0.036).
When clinical parameters were evaluated, there was a relationship between the CRNDE and tumor differentiation (p=0.023), primary tumor location (p=0.009) and tumor size (p=0.010). A correlation was found between the CCAT1 (p=0.021) and the SNHG16 (p=0.023) and tumor size and between metastasis formation and the XLOC_000303 (p=0.016).
Conclusions: Our findings suggest that ZNRF3-IT1, CCAT1, CRNDE, and XLOC_000303 circulating lncRNA genes can be used as a potential non-invasive biomarker in colorectal cancer prognosis. Also, increased expression of XLOC_000303 may be a protective factor against metastasis formation. In addition, these data suggest that circulating lncRNAs may act on KRAS somatic variants. Besides, we think that our data is important in terms of showing that there may be a relationship between CEA and CA 19-9 and candidate circulating lncRNAs.

Keywords: KRK, circulating lncRNA, Real-Time PCR, ARHGAP5-AS1, CCAT1, CRNDE, LOC152578, XLOC_000303, SNHG16, ZNRF3-IT1, CEA, CA 19-9, KRAS, NRAS, and BRAF