Tümör görüntüleme ve tedavi amaçlı fonksiyonel mezopor karbon/silika nanomalzemenin hazırlanması
Preparation of functional mesoporous carbon/silica nanomaterials for tumor imaging and therapy
Yazar: AYÇA TUNÇEL ORAL
Danışman: PROF. DR. FATMA YURT ONARAN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nükleer Bilimler Ana Bilim Dalı / Nükleer Uygulamalar Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry ; Radyasyon Onkolojisi = Radiation Oncology
Dizin: Farmasötik nanoteknoloji = Pharmaceutical nanotechnology ; Fotokemoterapi = Photochemotherapy

Özet:
Kanser tedavisinde monoterapiye göre kombinasyon terapisi (kemoterapi/fototermal ya da kemoterapi/fotodinamik terapi konusunda tercih edilmektedir. Fototermal terapide (FTT), yakın kızıl ötesi (NIR) ışığın kullanımıyla kanser hücrelerinin termal ablasyonu sağlanmaktadır. Diğer yandan kemoterapi ise kanserin tedavisi için geliştirilmiş özel ilaçların kullanımıyla yapılan bir tedavi yöntemidir. Mezoporlu karbon nanomalzemeler (MKNp), kemoterapötik ilaçları taşıyabilen nanosistemler olup aynı zamanda FTT için uygun malzemelerdir. Aynı zamanda bu nanomalzemelerin radyonüklid işaretlenmesiyle nükleer görüntüleme ajanı olarak da kullanılabilirler. Bu özellikleri sayesinde MKNp'ler hem tanı hem de tedaviyi gerçekleştirebilen teranostik ajanlar olarak dizayn edilebilmektedirler.
Bu tez çalışmasında, kemo/FTT ve nükleer görüntülemede kullanılması planlanan yeni ve çok fonksiyonlu nano ilaç taşıyıcı bir ajanın sentezlenmesi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla karbon@silika nanokompoziti (MK@Si) hazırlanmış ardından yüzeyi polietilenimin (PEI) ile kaplandıktan sonra Trastuzumab (TRA) monoklonal antikorunun PEI-MK@Si nanokompozitin yüzeyine entegre edilmiştir. Bu nanokompozitin (TRA/PEI-MK@Si) HER-2 pozitif meme tümörü hücre yüzeylerindeki HER-2 reseptörüne aktif olarak hedeflendirilmesi sağlanmıştır. Yüzey modifikasyonları tamamlanan TRA/PEI-MK@Si nanokompozitinin ortalama boyut dağılımı, taramalı elektron mikroskopi (SEM) verilerine göre 130,5±2,7 nm olarak saptanmıştır. DLS ölçümlerinde ise aynı nanokompozitin belirlenen hidrodinamik çapı 197±12,3 nm olarak saptanmıştır. Daha sonra kemoterapi ilacı Gemcitabine (GEM)'in bu nanokompozite yüklenmesiyle kemo/FTT'nin aynı anda uygulanmasına olanak verecek ilaç yüklü nanokompozit (GEM/TRA-MK@Si) hazırlanmıştır. GEM'in TRA/PEI-MK@Si nanokompozite % 57,2±5,9 verimle yüklendiği tespit edilmiştir. Salım deneylerinde ilacın pH 5,5'te ve lazer etkisi altında salım oranı % 55±2,6 olarak saptanmıştır. Ayrıca GEM/TRA-MK@Si nanokompozitin fototermal özellikleri incelenmiş ve fototermal dönüşüm verimliliği % 43 olarak belirlenmiştir. In vitro çalışmalarda, 25 µg/mL GEM/TRA-MK@Si nanokompozitinin SK-BR-3 hücrelerinde % 48,9±3,9 sitotoksik etki göstermiş ve FTT gerçekleştirildiğinde ise hücre canlılığının % 35,5±4,5 olduğu tespit edilmiştir. Kontrol hücre gurubunda kayda değer bir sitotoksik etki gözlemlenmemiştir. Bunun yanı sıra SK-BR-3 hücre hattında nanokompozitin GEM yüklü (GEM/TRA-MK@Si) ve yüklü olmayan (TRA/PEI-MK@Si) versiyonlarıyla NIR ışığı etkisi altında apoptoz deneyleri gerçekleştirilmiştir. Her iki GEM/TRA-MK@Si ve TRA/PEI-MK@Si nanokompozitin apoptoz indüksiyonunda etkili olduğu ve apoptoz oranlarının sırasıyla % 63,3±8,6 ile % 86,1±11,7 arasında değiştiği belirlenmiştir. Sonuçlar, GEM/TRA-MK@Si nanokompozitinin kemo/FTT kombinasyonunun apoptoz indüksiyonunda etkili olduğunu göstermiştir.
Nanokompozitin nükleer görüntüleme potansiyelinin ortaya konulması için ise TRA/PEI-MK@Si nanokompozitine DOTA-NHS-şelatlayıcı ajanın bağlanması ardından 177-Lutesyum (177Lu) radyoizotopu ile işaretlenmiştir. Radyoişaretlenme verimi gerekli saflaştırma işlemlerinin tamamlanmasının ardından % 93,0±2,4 olarak belirlenmiştir. Ayrıca, SK-BR-3 hücrelerinde 177Lu-DOTA@TRA/MK@Si nanokompozitin tutulumu ilk 24 saatte % 44,0±4,6 olarak tespit edilmiştir. MDA-MB-231 hücrelerinde ise ilk 24 saatteki tutulum oranı % 21,0±2,3 olarak belirlenmiş ve SK-BR-3 hücrelerine kıyasla daha düşük bulunmuştur. Ek olarak,177Lu-DOTA@TRA/MK@Si nanokompozitin TRA ile rekabet edebilme potansiyeli için kompetitif bağlanma deneyleri gerçekleştirilmiştir. SK-BR-3 ve MDA-MB-231 hücre hatları için tespit edilen IC50 değerleri sırasıyla 0,17 nM ve 0,09 M olarak saptanmıştır. Sonuçlar, 177Lu-DOTA@TRA/MK@Si nanokompozitin HER-2 reseptörü taşıyan SK-BR-3 hücrelerine daha yüksek bir afinitesi olduğunu göstermiştir. Ayrıca radyoişaretlenen 177Lu-DOTA@TRA/MK@Si ve 177Lu-DOTA@PEI-MK@Si nanokompozitlerin lipofilite dağılım katsayıları (logD7,4) sırasıyla 1,7±0,3 ve 1,5±0,2 olarak tespit edilmiştir. Radyoişaretli nanokompozitlerin lipofilik olması, hücre membranlarını daha kolay geçebilme ve hedef dokuda birikimin artmasına ve böylelikle radyonüklid hedeflenen dokuda daha etkili bir şekilde tanı ve/veya terapötik etki sağlayacaktır. Sonuç olarak sentezlenen nanokompozitin meme kanseri HER2+ için sitotoksik etki, apoptoz indüksiyonu ve radyoişaretlenme üzerinde yapılan in vitro çalışmalardan umut vadeden sonuçlar elde edilmiştir. Bir başka değişle, TRA ile hedeflendirilen GEM/TRA-MK@Si nanokompozitin meme kanserinin kemo/FTT kombine terapisi ve Lu-177 ile işaretlendiğinde nükleer görüntüleme ve/veya nükleer terapinin tek bir nanoplatformda gerçekleştirilebilecek bir teranostik ajan olabilme potansiyeli gösterilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Gözenekli silika ve karbon nanomalzeme, kombinasyon terapisi, fototermal terapi, kemoterapi, Lutesyum-177, HER-2+ meme kanseri

Abstract:
In cancer treatment, combining chemotherapy/photothermal or chemotherapy/photodynamic therapy is preferred over monotherapy. In photothermal therapy (PTT) thermal ablation of cancer cells is provided using near-infrared (NIR) light. On the other hand, chemotherapy is a treatment method that involves the use of drugs specifically developed for cancer treatment. Mesoporous carbon nanomaterials (MCNp) are nanosystems that have the ability to carry chemotherapeutic drugs and are also suitable materials for PTT. At the same time, these nanomaterials can be used as nuclear imaging agents by radiolabeling them. Thanks to these features, MCNps can be designed as theranostic agents that can diagnose and treat. 
In this thesis study, a new and multifunctional nano-drug carrier agent planned to be used in chemo/PTT and nuclear imaging was synthesized. For this purpose, a carbon@silica nanocomposite (MC@Si) was prepared, and then, after its surface was coated with polyethyleneimine (PEI), the Trastuzumab (TRA) monoclonal antibody was integrated onto the surface of the PEI-MC@Si nanocomposite. This nanocomposite (TRA/PEI-MC@Si) was actively targeted to the HER-2 receptor on the surface of HER-2-positive breast tumor cells. The average size distribution of the TRA/PEI-MC@Si nanocomposite, whose surface modifications have been completed, was determined as 130.5±2.7 nm according to scanning electron microscopy (SEM) data. In DLS measurements, the determined hydrodynamic diameter of the same nanocomposite was found to be 197±12.3 nm. Later, by loading the chemotherapeutic drug Gemcitabine (GEM) onto this nanocomposite, a drug-loaded nanocomposite (GEM/TRA-MC@Si) that would allow the simultaneous application of chemo/PTT was prepared. It was determined that the chemotherapy drug GEM was loaded onto the TRA/PEI-MC@Si nanocomposite with a yield of 57.2±5.9%. In release experiments, the release rate of the drug under the effect of laser and at pH 5.5 was determined as 55±2.6%. Additionally, the photothermal properties of the GEM/TRA-MC@Si nanocomposite were investigated and the photothermal conversion efficiency was determined to be 43%. In in vitro studies, the GEM/TRA-MC@Si nanocomposite at 25 µg/mL showed a cytotoxic effect of 48.9±3.9% in SK-BR-3 cells, and when PTT was performed, cell viability was found to be 35.5±4.5%. No significant cytotoxic effect was observed in the control cell group. Furthermore, apoptosis experiments were performed under the effect of NIR light in the SK-BR-3 cell line with both the GEM-loaded (GEM/TRA-MC@Si) and non-loaded (TRA/PEI-MC@Si) versions of the nanocomposite. It was determined that both the GEM/TRA-MC@Si and TRA/PEI-MC@Si nanocomposites were effective in apoptosis induction, and the apoptosis rates varied between 63.3±8.6% and 86.1±11.7% respectively. The results showed that the GEM/TRA-MC@Si nanocomposite effectively induced apoptosis in the chemo/PTT combination.
For the demonstration of the nuclear imaging potential of the nanocomposite, the DOTA-NHS-chelating agent was attached to the TRA/PEI-MC@Si nanocomposite and then labeled with the 177-Luthetium (177Lu) radioisotope. After completing the necessary purification processes, the radio-labeling yield was determined to be 93.0±2.4%. In addition, the uptake of 177Lu-DOTA@TRA/MC@Si nanocomposite in SK-BR-3 cells was determined to be 44.0±4.6% in the first 24 hours. The uptake rate in the first 24 hours in MDA-MB-231 cells was determined to be 21.0±2.3%, which was lower than SK-BR-3 cells. In addition, competitive binding experiments were performed for the potential of 177Lu-DOTA@TRA/MC@Si nanocomposite to compete with TRA. The IC50 values determined for SK-BR-3 and MDA-MB-231 cell lines were found to be 0.17 nM and 0.09 M respectively. The results showed that the 177Lu-DOTA@TRA/MC@Si nanocomposite had a higher affinity to SK-BR-3 cells carrying the HER-2 receptor. Also, the lipophilic distribution coefficients (logD7.4) of the radiolabeled 177Lu-DOTA@TRA/MC@Si and 177Lu-DOTA@PEI-MC@Si nanocomposites were determined to be 1.7±0.3 and 1.5±0.2 respectively. The lipophilic of the radiolabeled nanocomposites facilitates their passage through cell membranes and increases their accumulation in the target tissue and thus radionuclide provides a more effective diagnostic and/or therapeutic effect in the targeted tissue. In conclusion, promising results have been obtained from in vitro studies on the cytotoxic effect, apoptosis induction, and radiolabeling of the synthesized nanocomposite for HER2+ breast cancer. In other words, it has been shown that the GEM/TRA-MC@Si nanocomposite targeted with TRA has the potential to be a theranostic agent that can perform combined chemo/PTT therapy and nuclear imaging and/or nuclear therapy for breast cancer in a single nanoplatform when labeled with Lu-177.

Keywords: Mesoporous silica and carbon nanomaterial, combination therapy, photothermal therapy, chemotherapy, Lutetium-177, HER-2+ breast cancer