Kromenilyum-siyanin tabanlı seçici ve hassas bisülfit sensörünün geliştirilmesi
Development of chromenylium-cyanine based selective and sensitive bisulfite sensor
Yazar: EMRE ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. İSMAİL YILMAZ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Boyalar = Dyes ; Floresan = Fluorescence ; Rodamin = Rhodamine

Özet:
İlk olarak 1905 yılında m-aminofenol ve ftalik anhidritle bir Lewis asidi varlığında sentezlenmiş olan rodamin bileşiği, ksanten grubunun bir türevi olup kemosensör alanında oldukça yaygın bir şekilde kullanılmıştır. Kendine özgü bir tespit mekanizmasına sahip olmasının yanında yüksek floresans verimi, yüksek absorpsiyon katsayısı ve uzun uyarılma ve emisyon dalgaboyuna sahip olması gibi özelliklerinden ötürü bu bileşiklerile yapılan analizlerin sonuçları hassas ve kesindir. Geniş bir pH aralığında kapalı spirolaktam halkasından ötürü zayıf floresan halde bulunan rodamin türevi bileşikler bir analit varlığında ya da asidik koşullarda bu halkanın açılması sayesinde bütün molekül boyunca π bağı konjugasyonu sağlandığı için kuvvetli floresan hale gelip absorpsiyon ve emisyon sinyallerinin artışı sayesinde kantitatif analizi mümkün kılar.
Yakın kızılötesi kemosensörleri hem yakın kızılötesi bölgesinde biyomoleküllerin oto-floresanından kaynaklı arkaplan gürültüsünün az olmasından hem de hücre içi çalışmalarda analiz yaparken bu bölgedeki ışığın yüksek doku penetrasyonu sayesinde daha derin görüntülemeyi mümkün kılabileceğinden ve bu dalgaboyundaki ışığın hücreye zarar verme olasılığının oldukça azalmasından ötürü biyolojik ve çevresel analizlerde sıklıkla tercih edilir. Siyanin türevi, spesifik olarak rodamin-siyanin (ya da kromenilyum-siyanin) türevi kemosensörler özellikle yakın kızılötesi bölgede çalışmalarından dolayı tercih edildiği gibi rodamin türevi bileşiklerdeki özgün tespit mekanizmasına da sahiptir.
Bisülfit anyonu; enzim inhibitörü, antimikrobiyal ve antioksidan özelliklerinden dolayı özellikle şekerli ve alkollü gıdalarda koruyucu olarak kullanılıp bu gıdalara uzun raf ömrü sağlayabilen bir anyondur. İnsan vücudundaki aşırısı vücutta, özellikle solunum problemleri yaratan astım, akciğer kanseri, solunum sistemine zarar veren alerjik reaksiyonlar gibi hastalıkların yanında kalp rahatsızlıklarına da sebebiyet verebilir. Bu nedenle gıdalardaki denetimi ve kısıtlamaları oldukça önemlidir. Bisülfit anyonunun tespiti için spektroflorometri, spektrofotometri, kemilüminesans, kromatografi gibi halihazırda birçok yöntem bulunmaktadır. Fakat bu yöntemlerin uygulanması, analiz için zaman harcayıcı ön hazırlık prosedürü ve bu yöntemlerde kullanılan cihazları kullanabilen uzmanlar gerektirir. Bu yöntemlerin bahsedilen olumsuz yönlerinden dolayı; hızlı, kesin ve hassas analizi mümkün kılan kemosensörler, bisülfit analizi için oldukça ilgi görmektedir.
UV-Gör ve floresan cihazlarıyla analizin yanısıra, son zamanlarda hızlı ve kolay kantitatif analiz için geliştirilen bir yöntem kolorimetrik kemosensörlerde analiz için gereken tek cihazı sadece akıllı telefona kadar indirgemiştir. Renkler dijital ortamda kırmızı, mavi ve yeşil rengin farklı oranlarda birleşmesiyle tanımlanır. Dolayısıyla hazırlanan sensör bileşiği çözeltisinin-eğer rengi varsa- dijital ortamda (R, G, B) formatında sayısal bir karşılığı vardır. Analit derişiminin değişmesiyle gerçekleşen çözelti rengindeki değişim; dijital ortamdaki bu sayısal değerlerin değişmesi, dolayısıyla değişen analit miktarına karşı bu değişimin doğrusal olabileceği manasına gelir. Bu prensip kullanılarak geliştirilmiş bu yöntem kolorimetrik kemosenörlerlerle yapılan kantitatif analizi oldukça pratik hale getirmiştir.
Bu bağlamda, bu tez çalışması kapsamında, aldehit fonksiyonel grubuna sahip kromenilyum-siyanin tabanlı kemosensör (CyR) UV-Gör, floresan spektrometre cihazları ve akıllı telefonla bisülfit tayinin yapılabilmesi için geliştirilmiştir. Daha önce sentezlenmiş olan bu kemosensörün kristal yapısı X-Işını Kristalografisi ile aydınlatılmıştır. Bisülfit anyonunun aldehit fonksiyonel grubuna nükleofilik katılması sonucu spirolaktam halkasının açılabileceği öngörüsünde bulunduğumuz sensörün, içinde %50 DMF yardımcı çözücüsü bulunan pH 5 tampon ortamındaki çözeltisine bisülfit eklendiğinde başlangıçta sarı olan CyR çözeltisinin rengi bisülfit nükleofilik katılma sonucu spirolaktam halkası açılmasıyla öngörüldüğü gibi yeşile dönmüştür. Moleküldeki bu değişiklik UV-Gör spektrumunda 724 nm ve 480 nm bandındaki absorbansların artarken 385 nm 'deki absorbansın artması şeklinde gözlemlenmiştir. Bu eş zamanlı değişim UV-Gör analizinde oransal yöntemi kullanmayı mümkün kılmaktadır. Floresans spektrumunda ise 745 nm 'de zayıf emisyon veren molekülün bisülfit varlığında bu dalga boyundaki emisyonunun şiddetini arttırdığı gözlenmiştir. Bu sonuçla beraber optimizasyon çalışmaları sonucunda spektrofotometrik çalışma koşulları %50 DMF yardımcı çözücüsüyle pH 5 sulu tampon ortamında CyR'nin 30 μM 'lık çözeltisi olmuştur. Optimizasyonun ardından katılma reaksiyonun ne sürede bittiğini anlayabilmek için sensörün cevap süresi çalışması yapılmış ve reaksiyonun dengeye gelme süresi yaklaşık 300 saniye olarak belirlenmiştir. Bu sonuca göre bütün çalışmalar bu süre dikkate alınarak yapılmıştır. Analiz için uygun pH ortamını belirlemek için pH çalışması yapılmış olup CyR'nin pH 1-10 aralığındaki verdiği absorpsiyon ve emisyon sinyallerinin bisülfit katılmasıyla nasıl değiştiği gözlenmiştir. Bu çalışmaya göre CyR'nin pH 5 ve 7 sulu tampon ortamlarında bisülfite uygun cevap verdiği gözlenmiştir. Fakat bisülfit anyonu sulu ortamda sülfit anyonuyla denge halinde olduğundan ve bazik ortamın bu dengenin yönünü sülfite doğru kaydıracağından çalışma koşulu olarak pH 5 sulu tamponu seçilmiştir. Uygun çalışma ortamı kesinleştirildikten sonra seçicilik ve girişim çalışması yapılmış olup bu çalışmanın sonucuna göre CyR'nin herhangi bir anyon varlığında absorpsiyon ve emisyon sinyallerinde bir değişime uğramadan sadece bisülfite cevap verdiği görülmüş ve bisülfite seçici olduğu gözlenmiştir. Bisülfit derişimine göre absorpsiyon ve emisyon sinyallerinin kalibrasyon eğrisinin çıkarılması için titrasyon çalışması yapılmış ve lineer aralığın UV-Gör ölçümlerine göre 10-160 μM ve floresan ölçümlerine göre 145-270 μM olduğu saptanmıştır. Bu kalibrasyon eğrisine göre yapılan tespit limiti sırasıyla 1.15 μM ve 0.09 μM olarak hesaplanmıştır. Bisülfit bağlanma modunun daha iyi anlaşılması için FT-IR, 1H-NMR ve MALDI-TOF ölçümleri yapılmış olup bisülfitin öngörüldüğü gibi aldehit fonksiyonel grubuna katıldığı doğrulanmıştır. Buna ek olarak; CyR'nin kırmızı şarap, roze şarap ve toz şekerde yüksek geri kazanım oranlarıyla bisülfit tespiti yapabildiği gözlenmiştir. Akıllı telefonla bir numunede bisülfit tayini yapılabildiği ise yine akıllı telefon yardımıyla toz şekerde yapılan bisülfit analizinin yüksek geri kazanım yüzdeleri göstermiştir. Son olarak, bir diğer uyguma alanı olan kağıt testi çalışması yapılmıştır. CyR, hazırlanan derişik DMF'teki çözeltisinden kağıt şeritlerine emdirilip bu şeritlerin üzerine farklı derişimlerde bisülfit sulu çözeltisi damlatıldığında bisülfit derişimine göre başlangıçta sarı olan kağıt şeritlerinin farklı yoğunlukta yeşil renkleri elde edilmiştir. Böylece bir numunede kağıttaki yeşil rengin yoğunluğuna göre bisülfit derişimi yaklaşık olarak belirlenebilmektedir. Bütün bu çalışmalar ışığında UV-Gör, floresan ve akıllı telefon olmak üzere üç kanallı analiz gerçekleştiren, UV-Gör ölçümlerine göre oransal yöntem kullanılabilen, seçici ve hassas bir kolorimetrik bisülfit sensörü geliştirilip literatüre kazandırılmıştır.

Abstract:
Rhodamine compound, which was first synthesized by the reaction of m-aminophenol and phtalic anhydride in the presence of a Lewis acid in 1905, is a derivative of the xanthene group and has been widely used in the field of chemosnesors. In addition to having unique detection mechanism, the result of the analyzes performed with these compounds are sensitive and precise due to their properties such as high fluorescence yield, high absorption coefficient and long excitation and emission wavelengths. Rhodamine derivative compounds, which are weakly fluorescent due to the closed spirolactam ring in a wide pH range, enable quantitative analysis in the presence of an anlyte or in acidic conditions, due to the opening of this ring, because π bond conjugation is provided throughout the molecule, it becomes strongly fluorecent and increases absorption and emission wavelength.
Near-infrared chemosensors are used in both biological and environmental analyzes because the device background noise is low due to absorption and emissions in the near infrared region, and because it enables deeper imaging thanks to the high tissue penetration of the light in this region when analyzing in intracellular studies, and the possibility of damaging the cell at this wavelength is considerably reduced. Cyanine-derived, specifically rhodamine-cyanine (or chromenylium-cyanine) derivative chemosensors are preferred because they work especially in the near infrared region, and they also have a unique detection mechanism in rhodamine-derived compounds.
Bisulfite anion; due to its enzyme inhibitor, antimicrobial and antioxidant properties, it is an anion that can be used as a preservative especially in sugary and alcoholic foods and can provide these foods with a long shelf life. In excess, it can cause heart diseases as well as diseases such as asthma, lung cancer, allergic reactions that damage the respiratory system, which cause respiratory problems in the human body. For this reason, control and restrictions of bisulfite anion in foods are very important. There are currently many methods for the detection of bisulfite anion, such as spectrofluorometry, spectrophotometry, chemiluminescence, chromatography. However, the application of these methods requires time-consuming preparation procedure for analysis and specialists who can use the devices used in these methods. Due to the mentioned negative aspects of these methods; Chemosensors, which enable fast, precise and sensitive analysis, are of great interest for bisulfite analysis.
In addition to analysis with UV-Vis and fluorescent devices, a method recently developed for quick and easy quantitative analysis has reduced the only device required for analysis in colorimetric chemosensors to just a smartphone. Colors are defined by the combination of red, blue and green colors in different proportions in the digital environment. Therefore, the prepared sensor compound solution, if it has color, has a digital equivalent in (R, G, B) format. The change in solution color with the change of analyte concentration; the change of these numerical values in the digital environment means that this change can be linear against the changing amount of analyte. Developed using this principle, this method has made quantitative analysis with colorimetric chemosensors very practical.
In this context, within the scope of this thesis, a chromenylium-cyanine based chemosensor (CyR) with aldehyde functional group has been developed for bisulfite determination with fluorescence and UV-Vis spectrometer devices and smartphone. The crystal structure of this chemosensor, which was synthesized before, was brought to the literature by X-Ray Crystallography. When bisulfite was added to the solution of the sensor in pH 5 buffer medium containing 50% DMF co-solvent, the color of the CyR solution, which was initially yellow, turned green as predicted by the opening of the spirolactam ring as a result of bisulfite nucleophilic addition. The response of this change in UV-Vis measurements was observed as a ratiometric decrease of the band with a maximum absorbance of 385 nm at the beginning, together with the increase in the band with the maximum absorbance of 724 nm. With this result, as a result of optimization studies, spectrophotometric working conditions were found to be a 30 mM solution of CyR in pH 5 aqueous buffer with 50% DMF co-solvent. In order to understand how long the addition reaction takes after the optimization, the response time of the sensor was studied and the time for the reaction to reach equilibrium was determined as approximately 300 seconds. According to this result, all studies were carried out taking this time into account. A pH study was carried out to determine the appropriate pH environment for the analysis, and it was observed how the absorption and emission signals of CyR in the pH range of 1-10 changed with the addition of bisulfite. According to this study, it was observed that CyR responded appropriately to bisulfite in pH 5 and 7 aqueous buffer environments. However, since the bisulfite anion is in equilibrium with the sulfide anion in the aqueous medium and the basic medium will shift the direction of this balance towards the sulfite, the pH 5 aqueous buffer was chosen as the operating condition. After the appropriate working environment was determined, selectivity and interference studies were carried out, and according to the results of this study, it was observed that CyR only responded to bisulfite without any change in the absorption and emission signals in the presence of any anion, and it was selective to bisulfite. Titration study was carried out to calculate the calibration curve of the absorption and emission signals according to the bisulfite concentration and it was determined that the linear range was 10-160 μM according to the UV-Vis measurements and 145-270 μM according to the fluorescence measurements. The detection limit made according to this calibration curve was calculated as 1.15 μM and 0.0868 μM, respectively. In order to better understand the bisulfite binding mode, FT-IR, 1H-NMR and MALDI-TOF measurements were made and it was confirmed that bisulfite joined the aldehyde functional group as predicted. In addition; it has been observed that CyR can detect bisulfite with high recovery rates in red wine, rose wine and granulated sugar. It has been shown that bisulfite determination can be made in a sample with a smartphone, and bisulfite determination with a high recovery rate in granulated sugar according to the calibration curve prepared using a smartphone before. Finally, a paper test study, which is another application area, was carried out. When CyR was absorbed from its solution in concentrated DMF to the paper strips and bisulfite aqueous solution of different concentrations was dripped onto these strips, different intensities of green colors of the paper strips, which were initially yellow, were obtained according to the bisulfite concentration. Thus, the bisulfite concentration can be approximately determined in a sample according to the intensity of the green color in the paper. In the light of all these studies, a selective and sensitive colorimetric bisulfite sensor, which performs three-channel analysis, namely UV-Vis spectrometer with ratiometric method, fluorescence spectrometer and smartphone, has been developed and brought to the literature.