Bazı bitkilerin fenolik madde ekstraksiyonunun Taguchi yöntemiyle optimizasyonu; antioksidan ve antibakteriyel kapasitelerinin incelenmesi
Optimization of phenolic substance extraction of some plants by Taguchi method; examination of their antioxidant and antibacterial capacities
Yazar: MERVE ÇALIŞ
Danışman: PROF. DR. GÜLNUR ARABACI
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Deney tasarımı; bir veya daha fazla sayıda olan değişkenin sistem üzerindeki etkisini 
inceleyen analiz tekniğidir. Bu sayede bir sistem tasarlanırken, sisteme ait faktör ve 
yanıtları arasındaki ilişkiyi açıklamayı sağlar. Sistemi etkileyen faktörlerin artması 
klasik deney tasarımın uygulanmasını zorlaştırır. Bu gibi durumlarda daha fazla bilgi 
edinebilmek ve test sayısını azaltmayı hedefleyen Genichi Taguchi, kendi anıyla 
anılan yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir. Taguchi metodu ürün ya da sistemlerde
kaliteyi arttırma ve maliyet düşürmeyi amaçlayan deney tasarım yöntemlerinden 
biridir. Bu tasarımda esas amaç; değişkenlerin azaltılmasıyla hedef değere en hızlı 
şekilde ulaşmaktır. Bu metot ayrıca tasarımı etkileyen faktörlerin birbirindenbağımsız 
olarak değerlendirebilmesini sağlamaktadır. 
Fenolik bileşikler, sekonder metabolit olarak da bilinen ve tüm bitkilerde bulunan 
doğal maddelerdir. Farklı nitelikte ve miktarda olan fenolik bileşikler bitkiler için 
karakteristiktir. Savunma mekanizması olarak bitkilerde görev alırlar. Bu bileşiklerin, 
koroner kalp, katarakt, diyabet vb. hastalık risklerini azaltan olumlu etkilerinin varlığı 
bilinmektedir. Bu sebeple tıp ve eczacılık alanlarında kullanılmaktadır. Fenolik 
bileşiklerin eldesinde ekstraksiyon teknikleri ve koşulları önemlidir. Çözgen tercihi, 
ekstraksiyon süre ve sıcaklığının kontrolü gibi etkenler fenolik madde kayıplarının 
azaltılması için optimum şekilde düzenlenmelidir. 
Hibiskus (Hibiscus sabdariffa L) bitkisi hem zengin içeriği hem de yoğun çanak 
yaprak renginden dolayı birçok ensüstriyel gıda ürününde kullanılmaktadır. Kerkede
olarak da bilinen hibiskus bitkisi ile yapılan çalışmalarda antioksidan kapasitesinin 
yüksek olduğu, antibakteriyel özelliklere sahip, ateş düşürücü ve tansiyon düşürücü 
gibi etkileri olduğu gözlemlenmiştir. Aspir (Carthamus tinctorius), analjezik ve ateş 
düşürücü etkilerinin yanı sıra kumarinler, tanenler, polifenoller ve flavonoidler gibi 
farklı biyoaktif bileşiklerin potansiyel kaynağı olarak bilinmektedir. Hatmi çiçeği 
olarak bilinen Althaea officinalis iltihap, mide ülseri, öksürük, nezle gibi bazır 
hastalıkların tedavisinde kullanıldığı farmokolojik araştırmalarda rapor edilmiştir. 
Aynısefa (Calendula officinalis L.) bitkisi papatyagiller familyasında bulunan otsu bir 
bitkidir. Tahriş olmuş iltihaplı derilerde, egzamada, ülser tedavisinde uzun zamandır
kullanıldığı bilinmektedir.Çay olarak tüketilebilen ve tıbbi amaç için kullanıldığı 
bilenen bu bitkiler fenolik madde elde etmek için kullanılacaktır. Ekstraksiyon 
işlemini etkileyen birçok faktör bulunmaktadır. Katı-sıvı oranı, katı-çözücü temas 
yüzeyi, sıcaklık, ekstraksiyon işlem süresi, çözücü çeşidi gibi faktörler ekstraksiyon 
işleminin kalitesini ve verimini etkileyebilir. Bu çalışmada ekstraksiyon işlemlerini 
etkileyen parametrelerin optimizasyonu için Taguchi deney tasarımı metodu 
kullanılmıştır. Taguchi modellemesi için ekstraksiyon işlemini etkileyen 
parametrelerden ekstraksiyon yöntemi, çözücü, sıcaklık ve süre olmak üzere 4 farklı 
faktör seçilmiştir. Bu faktörlere ait 3 seviye belirlenmiştir. Ekstraksiyon yöntemi için 
ultrasonik, klasik ve karıştırmalı yöntemler seçilmiştir. Ultrasonik ekstraksiyon için 45 
kHz frekansta ısıtmalı bir ultrases banyosu kullanılmıştır. Klasik ekstraksiyon yöntemi 
olarak su banyosunda belirlenen sıcaklık ve sürede işlem gerçekleştirilmiştir. 
Karıştırılmalı ekstraksiyon yönteminde ise 300 rpm hızda dönen manyetik çubuktan 
yararlanılmıştır. Fenolik maddelerin tıp ve eczacılık gibi insan sağlığını ilgilendiren 
alanlarda kullanılmasından dolayı grass olarak kabul edilen çözücüler seçilmelidir. Bu 
sebeple etanol, metanol ve distile su ekstraksiyon işlemi sırasında çözücü olarak 
kullanılmak üzere seçilmiştir.
Sıcaklık (25°C, 40°C, 55°C) ve süre (30 dk., 60 dk., 90 dk.) fenolik maddelerin artan 
sıcaklık ve ekstraksyion süresine bağlı termal bozunmaya uğradığı bilindiğinden 
yüksek sıcaklık ve uzun süreler tercih edilmemiştir. Seçilen 4 faktör ve faktörlere ait 
3 seviye bulunmakatadır. Belirlenen faktör ve seviyeler için serbestlik derecesi 8'dir. 
Belirlenen faktörler ve serbestlik derecesi Minitab19 paket programı kullanılarak 
deney tasarımı L9 ortogonol dizi seçilerek modellenmiştir. Modelleme sonucunda 
programda belirlenmiş 9 farklı deney seti ve 3 tekrarlı olacak şekilde ekstraksiyon 
işlemi gerçekleştirilmiştir. Toplam fenolik madde miktarı (TFM) analizi en çok tercih 
edilen yöntem olan Folin-Ciocalteau yöntemine göre analiz edilmiştir ve sonuçlar 
gallik asit cinsinden rapor edilmiştir. Hibiskus için en yüksek değer 24,8±1,01 mg 
GAE/g, Aspir için 3,08±0,21 mg GAE/g, hatmi çiçeği ve aynusefa için ise sırayla 
3,50±0,05 mgGAE/g, 39,47±2,06 mgGAE/g olarak hesaplanmıştır. 9 deney seti için 
tüm TFM miktarı değerleri deney tasarımıda sistem çıktısı olarak programa yanıt 
şeklinde işlenir. Programda bu yanıtlara göre Taguchi analizinin gerçekleştirilmesiyle 
tüm faktör ve seviyelere ait sinyal gürültü oranları hesaplanmıştır. Bu oranlara ve 
ortalamaya ait etki grafikleri program çıktısı olarak elde edilmiştir. Bu hesaplamalar 
sonucunda hibiskus, hatmi çiçeği, aynısefa bitkisinin optimum parametreleri 
karıştırmalı ekstrasksiyon, distile su 55°C ve 60 dk. olarak bulunmuştur. Aspir 
bitkisinde ise farklı olarak bu sıcaklık 40°C olarak saptanmıştır. Modellemenin daha 
iyi anlaşılabilmesi ve yorum yapmayı kolaylaştırması amacıyla faktör ve 
parametrelerin fenolik madde miktarını etkileme yüzdeleri araştırılmıştır. Bu sebeple 
varyans analizi kullanılmıştır. Tüm bitkiler için etki yüzeyleri incelendiğinde çözücü 
faktörünün etkisi yüzdesel olarak diğer faktörlere göre daha yüksektir. Hibiskus, aspir, 
hatmi çieçği ve aynısefa bitkileri için çözücü faktörünün ekstraksiyon işlemine 
yüzdesel katkıları sırasıyla; %59,09, %81,82, %60,70 ve %58,50'dir. Varyans analizi 
aynı zamanda sonuçların belirlenen güven aralıklarında anlamlı olup olmadığını test 
etmektedir. Hibiskus ve aynısefa bitkisine ait tüm faktörlerin değişiminin ekstraksiyon 
işlemine katkısı anlamlı iken aspir ve hatmi çiçeği için sıcaklık ve süre faktörlerindeki 
değişim ekstraksiyon işlemi için anlamsız bulunmuştur (p<0.05). Modellemenin 
doğruluğunu araştırmak için optimum koşulları belirlenen bu bitkiler ile üç paralelli 
olacak şekilde ekstraksiyon işlemi gerçekleştirilmiş ve programda beklenen değerler 
ile karşılaştırılmıştır. Aspir ve aynısefa bitkisi için sonuçlar %95 güven aralığında 
anlamsız bulunmuştur. Hibiskus ve hatmi çiçeği için ise sonuçlar anlamlıdır. Optimum 
parametreler ile gerçekleştirilen ekstraksiyon işlemi sonucunda antioksiadan aktivite 
kapasite tayini ve antibakteriyel kapasite tayini geçekleştirilmiştir. 
Antioksidan kapasite tayini, DPPH radikali yakalama yöntemine göre yapılmıştır. 
Hibiskus, aspir, hatmi çieçği ve aynısefa bitkileri % inhibisyon değerleri sırasıyla 
%60,03, %43,85, %53,98, %35,02 oalrak hesaplanmıştır. Sonuçlar BHT (bütillenmiş 
hidroksitoluen) antioksidan standardı ile karşılaştırılmıştır. 
Bitkilerin antibakteriyel özelliklerini incelemek için kuyucuk difüzyon yöntemi 
kullanılmıştır. Analiz aşamasında Escherichia coli (gram negatif), Bacillus cereus
(gram pozitif) ve Staphylococcus aureus kullanılmıştır. 
Aynısefa bitkisi Bacillus cereus (SBT-8) suşu üzerinde en yüksek inhibisyon sağlayan 
bitkidir (Hibiskus;10 mm, aspir; 9 mm Hatmi; etki yok). Staphylococcus aureus 
(29213) bakterisi için ise hibiskus, aspir ve aynısefa bitkilerinin inhibisyon çapları 
sırasıyla; 12 mm, 9 mm, 10 mm olarak ölçülmüştür. Sonuçlar incelendiğinde hatmi 
çiçeğinin hiçbir bakteri suşu üzerinde inhibe edici etkisinin varlığı saptanmamıştır. 
Ayrıca E. coli, bakterisi üzerinde de bitkilere ait bir etki saptanmamıştır

Abstract:
Each step of the process interacts with the others in order to produce a specific result. 
An activity is defined as the activities of a number of factors, including machines, 
tools, processes, and people. By contrast, input variables are parameters that have an 
impact on test results, which can be improved in order to provide measurable or 
unmeasurable results as a result of changes made. Whenever there is a need to improve 
or increase the quality performance of a product or process, the term 'experimental 
design' refers to the process of observing the differences between the selected quality 
characteristics, as a result of adjusting the various factors and levels that influence the 
product/process, and interpreting those differences with a variety of techniques. To 
reach the target value as quickly as possible, experimental design minimizes the 
number of variables while simultaneously allowing factors that affect the design to be 
evaluated independently. It is common for this method to be used when trying to 
analyze the effects of phenolic compounds found naturally in plants, which are 
secondary metabolites which have biological effects. Understanding how these 
compounds interact with the external environment is crucial to understanding how they 
function in plant biology. Reduce the number of variables in the design so that the key 
factors influencing the performance of the phenolic compounds can be identified
Therefore, in addition to solving the above problems in the design, this can also bring 
about more opportunities for increasing the target value in the shortest possible time.
Phenolic compounds of different nature and quantity are characteristic for plants. They 
take part in plants as a defense mechanism.
A number of heart-related conditions can be reduced by using these compounds, such 
as coronary heart disease, cataracts, diabetes and many others. Thus, it is used in many 
areas of medicine and pharmacology, particularly as a treatment for various diseases. 
Extraction techniques and conditions are important in obtaining phenolic compounds. 
To reduce the amount of phenolic substance lost during extraction, factors such as 
solvent preferences, control over extraction time and temperature should be optimally 
regulated as well. 
The Hibiscus (Hibiscus sabdariffa L) plant is used in many industrial food products 
(jam, confectionery, ice cream, chocolate, sweeteners, etc.) due to its rich content and 
intense dish leaf color. A number of antioxidant, antibacterial, antipyretic and blood 
pressure lowering effects have been found in studies conducted with the hibiscus plant.
Safflower petals contain gallic acid, chlorogenic acid, syringic acid, quercetin, and 
epicatechin. It is believed that both phenolic compounds and flavonoids glycosylquinochalcones are colors. This flower's color pigments are largely derived from 
safflower. Safflower flowers Since this substance determines the majority of its 
therapeutic effects, it is included in pharmacological studies. Flowers of safflower 
contain rich amounts of phenols that are antioxidants, and in addition, because they 
contain a number of other substances, they are cardiovascular protective, liver 
cleaners, anticancers, as well as protecting the nervous system and the lungs. It has 
found wide use in the treatment of phenolic found in safflower color pigments in the 
structure; irrigation, fertilization, sowing frequency, sowing time, harvest It is affected 
by many parameters such as time, type, environmental stress and It has been 
determined by studies that it can vary. Harvest from plants secondary metabolites of 
flowers obtained after temperature, UV rays, pH, various It changes depending on 
different factors such as gases, metal ions and chemicals. Reported. Althaea officinalis, 
known as marshmallow flower, has been reported in pharmacological researches to be 
used in the procedure of some diseases like inflammation, stomach ulcers, cough and 
cold. 
Calendula (Calendula officinalis L.) is a herbaceous plant belonging to the Asteraceae
family that can grow as a single or biennial plant. Various fields, such as medicine and 
pharmacy, as well as the food and cosmetic industries, utilize the calendula's rich 
chemical content. Calendula consists of a variety of chemical components that are 
biologically active. These include terpenoids, flavonoids, coumarins, quinine, essential 
oils, carotenoids, and amino acids. In addition, calendula, vanillic acid, chlorogenic 
acid, caffeic acid, oleanolic acid, β-amirin acetate, β-amirin, rutin, narcisssin, 
isoquercitrin, isorhamnetin 3-glucoside, quercetin, protocatechin acid, syringic acid, 
p-coumaric acid; In addition, high levels of antioxidants such as calendoflacid, 
quercetin-3-Orutinoside, isoramnetin, calendoflavosit, isorhamnetin-3-Oneohesperidoside, isoramnetin 3-O-2G-ramnosyl routineosite, quercetin-3-Oglucoside, isoramnetin-3-Orutinoside, and calendoflavobioside detect the presence of 
many components with properties
Due to its rich pharmacological properties, it occupies an important position in the 
group of alternative medicinal aromatic plants. A number of ailments, such as eczema, 
ulcers, and irritated skin have been treated with it since time immemorial. To obtain 
phenolic substances, these plants, which are used as tea and for medicinal purposes, 
will be used. Factors such as temperature, pressure, and humidity affect the extraction 
process. In an extraction process, the quality and yield can be affected by factors such 
as the solid-liquid ratio, the solid-solvent contact surface, the temperature, the 
extraction processing time, or the solvent type.
An experimental design based on Taguchi was used in this study to optimize 
parameters related to extraction processes. For Taguchi modeling, 4 different factors 
were selected from the parameters affecting the extraction process: extraction method, 
solvent, temperature and duration. 3 levels of these factors have been determined. For 
the extraction method, ultrasonic, classical and mixing methods were chosen. For the 
ultrasonic extraction, a heated ultrasound bath at a frequency of 45 kHz was used. As 
a classical extraction method, the process was carried out in the water bath at the 
specified temperature and time. In the mixed extraction method, a magnetic rod 
rotating at a speed of 300 rpm was used. Solvents that are considered grass should be 
selected because of the use of phenolic substances in areas of human health concern, 
such as medicine and pharmacy. For this reason, 3 solvents were used: ethanol, 
methanol and distilled water. Since it is known that temperature (25°C, 40°C, 55°C) 
and duration (30 min., 60 min., 90 min.) phenolic substances undergo thermal 
degradation due to increased temperature and extraction time, high temperatures and 
long periods of time were not preferred. There are 4 factors chosen and 3 levels of 
factors. The degree of freedom for the determined factors and levels is 8. The 
determined factors and the degree of freedom were modeled by selecting the L9 
orthogonol array in the experimental design using the Minitab19 package program. As 
a result of the modeling, 9 different experimental sets and 3 repetitions were extracted 
in the program. 
An analysis of total phenolic matter (TFM) from extraction processes was conducted 
according to Folin-Ciocalteau method, and the results were reported in gallic acid.
The highest value for hibiscus was 24,8±1,01 mg GAE/g, for safflower 3,08±0,21 mg 
GAE/g, for marshmallow flower and aynuprifa, respectively, 3,50±0,05 mgGAE/g and 
39,47±2,06 mgGAE/g. All TFM quantity values for 9 experimental sets are processed 
in the experimental design as a response to the program as a system output. According 
to these responses, Taguchi analysis was performed in the program and signal-to-noise 
ratios for all factors and levels were calculated. Impact graphs of these ratios and the 
average were obtained as program output. As a result of these calculations, the 
optimum parameters of hibiscus, marshmallow flower, calendula plant were found as 
mixed extraction, distilled water 55°C and 60 min. 
The temperature for this plant was determined to be 40°C at sunflower, unlike the other 
plants.The percentages at which factors and parameters affect the amount of phenolic 
substance was investigated so that more knowledge about the modeling could be 
gained and comments would be easier to make. For this reason, analysis of variance 
was used. When the effect surfaces for all plants are examined, the effect of the solvent 
factor is higher than other factors in percentage. For the hibiscus, the safflower, and 
the marshmallow flower, together with the calendula plant, the percentage 
contributions of the solvent factor were as follows: 59,09%, 81,82%, 60,70%, and 
58,50%, respectively.
Analysis of variance also tests whether the results are significant at the specified 
confidence intervals. Research was conducted on hibiscus, calendula, safflower, and 
marshmallow flower extraction processes based on various factors.
The study found that while the changes in all factors of hibiscus and calendula plant 
had a mojor efficacy on the extraction process, the changes in temperature and duration 
factors for safflower and marshmallow flower were found to be insignificant (p<0.05). 
The extraction process was conducted parallel with these plants in order to maintain 
the accuracy of the modeling, and the results were compared with those expected by 
the program. To maintane the correctness of the modeling, the extraction process was 
conducted in three parallels with these plants, and the results were compared with the 
expected values in the program. The accuracy of the model was evaluated by analyzing 
the difference between observed and expected values. Calendula and safflower results 
were meaningless at 95% confidence intervals.
For hibiscus and marshmallow flowers, the results are significant. Following the 
extraction process performed with optimal parameters, the activity capacity and 
antibacterial capacity of the antioxidant were determined as a result of the extraction 
process. 
Antioxidant capacity determination was performed according to DPPH radical capture 
method. The % inhibition values of hibiscus, safflower, marshmallow flower and 
calendula plants were calculated as 60,03%, 43,85%, 53,98% and 35,02%, 
respectively. In order to verify the results, they were compared to the BHT (butylated 
hydroxytoluene) antioxidant standard as a benchmark. 
This study was conducted using the well diffusion method in order to study the 
antibacterial properties of plants.The gram-negative bacteria Escherichia coli 
(grampositive bacteria Bacillus cereus (SBT-8) and Staphylococcus aureus (29213) were 
used for this procedure. Calendula plant provides the highest inhibition on the Bacillus 
cereus (SBT-8) strain (Hibiscus;10 mm, safflower; 9 mm Marshmallow; no effect). 
For the bacterium Staphylococcus aureus (29213), the inhibition diameters of hibiscus, 
safflower and calendula plants were as follows; It measured 12 mm, 9 mm, 10 mm. In 
the examination of the results, marshmallow flower was not found to exhibit an 
inhibitory effect on any strain of bacteria. In addition, no plant effect has been found 
on E. coli bacteria.