Yeni sentezlenen DNA nanotaşıyıcılarının gen salım amacıyla hücre transfeksiyonu ve toksisitelerinin incelenmesi
Cell transfection and cytotoxicity studies of newly synthesized DNA nanocarriers for gene delivery
Yazar: ZELİHA GÜLER
Danışman: DOÇ. DR. ŞEBNEM ERÇELEN ; PROF. DR. ŞEHNAZ BOLKENT
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Flüoresan tekniği = Fluorescent technique ; Gen aktarımı = Gene transfer ; Hücre görüntüleme = Cell imaging ; Transfeksiyon = Transfection

Özet:
Gen terapisi, genetik ya da edinilmiş hastalıkların tedavisi amacıyla, hedef hücrelere terapötik genlerin vektör adı verilen bir DNA taşıyıcısı aracılığıyla aktarımı ve aktarılan genlerin ekspresyonu temeline dayanır. Bu aşamaların gerçekleşmesi sırasında vektör, transfeksiyon verimini etkileyen çeşitli hücresel bariyerler ile karşılaşır. Gen terapisinde kullanılacak vektörün hücresel bariyerleri aşarak; hücreleri en düşük toksisite ile en etkili şekilde transfekte etmesi arzu edilir. Bu nedenle uygun vektörün seçimi oldukça önemlidir. Gen terapisinde viral ve viral olmayan olmak üzere iki temel vektör sınıfı olmasına rağmen, viral olmayan vektörlerin birçok üstünlüğe sahip olmalarından dolayı bu çalışmada viral olmayan, yeni sentezlenmiş ve BG-2 olarak adlandırılmış oligoelektrolit temelli kopolimer tercih edilmiştir.Bu tez çalışmasında yeni sentezlenmiş BG-2 oligoelektrolitinin transfeksiyon aşamalarında karşılaşılan bariyerleri aşabilme yeteneği, insan serviks epiteloid karsinoma HeLa, insan nöroblastoma SH-SY5Y ve sıçan C6 glioma olmak üzere üç farklı hücre soyu üzerindeki transfeksiyon verimi ve toksik etkisi incelenerek başta kanser olmak üzere birçok genetik ya da edinilmiş hastalıkların tedavisi için gen terapisinin başarısının arttırılması amaçlanmıştır. Ayrıca transfeksiyon aşamalarının aydınlatılması ve bu konuda literatürde mevcut olan eksikliklerin giderilmesine katkıda bulunulması hedeflenmiştir.BG-2 oligoelektrolitinin 9-(dietilamino)-5H-benzo[R]fenoksazin-5-on (Nil kırmızısı) floresans probu aracılığıyla kiritik misel konsantrasyonu (CMC), DNA molekülü ile oluşturduğu kompleks yapısı ise 1,1'-(4,4,8,8-tetrametil-4,8-diazaundekametilen)bis-4-[[3-metilbenz-1,3-okzazol-2-il]metilidin]-1,4-dihidroquinolinyum] tetraiodid (YOYO-1) probunun floresansından yararlanılarak floresans spektrometrede belirlendi. DNA/BG-2 kompleksinin boyutu Nanosizer boyut ölçüm cihazı aracılığıyla tespit edildi. DNA/BG-2 kompleksinin anyonik 1,2-dimiristoil L-?-fosfatidil-DL-gliserol (DMPG) ve nötral 1,2-dimiristoil-sn?glisero-3-fosfokolin (DMPC) model mebranları ile etkileşimleri etidyum bromür floresansında (EtBr) meydana gelen değişimlerin floresans spektrometrede izlenmesi ile incelendi. BG-2 molekülü ile kompleks halinde bulunan DNA molekülünün, Deoksiribonukleaz I (DNaz I) ve serumda bulunan nukleazların aktivitesine karşı direnci agaroz jel elektroforezinde belirlendi. HeLa, SH-SY5Y ve C6 glioma hücre soyları yeşil floresans protein (GFP) kodlayan pEGFP plazmidi ve lusiferaz enzimini kodlayan pGL4.51 plazmidi ile transfekte edildi. BG-2 oligoelektrolitinin transfeksiyon verimi; GFP ekspresyonunun floresans invert mikroskopta görüntülenmesi ve lusiferaz gen ekspresyonunun luminometrede ölçülmesi ile belirlendi. BG-2'nin transfeksiyon veriminin yanısıra 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) ve Bikinkoninik asit (BCA) yöntemi ile hücreler üzerindeki toksik etkisi de incelendi.BG-2 oligoelektrolitinin üç farklı hücre soyu üzerindeki transfeksiyon verimi incelendiğinde, en etkili HeLa hücrelerini transfekte ettiği, C6 glioma hücrelerini ise transfekste edemediği görüldü. BG-2'nin hücreler üzerinde toksik etki gösterdiği görülmesine rağmen; DNA ile BG-2 arasında kararlı ve küçük boyutlu komplekslerin oluşumu, oluşan komplekslerin model membranlar ile etkileşim profillerinin arzu edilen düzeyde olması, ayrıca BG-2'nin DNA'yı nukleaz aktivitesine karşı koruması BG-2 oligoelektrolitinin hücresel bariyerleri aşabildiğini göstermektedir. Bu sebeple, BG-2 oligoelektrolit yapısında uygulanacak küçük değişiklikler ile BG-2'nin gen terapisinde kullanıma uygun olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Gene therapy is based on transferring therapeutic genes into the targeted cells via DNA carriers called as vector and expression of these genes to cure genetic and acquired diseases. During this process vector encounters cellular barriers which effects transfection efficiency. Vector planned to use for gene delivery is desired to overcome cellular barriers and to achieve transfection of cells with high efficiency and low cytotoxicity. As a result, selection of appropriate vector is highly important. Although there are two major class of vectors such as viral and non viral vectors in gene delivery; non-viral, newly synthesized oligoelectrolyte based copolymer which is called as BG-2 was chosen since non-viral vectors have many advantages over viral-vectors.In this thesis study it was aimed to improve potency of gene therapy to cure especially cancer and other genetic or acquired diseases by studying the ability of newly synthesized BG-2 oligoelectrolyte to overcome cellular barriers, and to determine efficiency of transfection and cytotoxic effects of oligoelectrolyte on three different cell lines, human cervix epiteloid carcinoma (HeLa), human neuroblastoma SH-SY5Y and rat C6 glioma. Moreover, it was objected to enlighten the transfection steps and to fulfill the missing parts in literature dealing with this subject.Critical micellar concentration (CMC) of BG-2 oligoelectrolyte was determined by 9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one, (nile red) fluorescence characteristics and complex formation of DNA with BG-2 was determined by monitoring the changes on 1,1'-(4,4,8,8-tetramethyl-,8-diazaundecamethylene)bis-4-[(3-methylbenz-1,3-oxazol-2-yl)methylidine]-1,4-dihydroquinolinium] tetraiodide (YOYO-1) fluorescence characteristics with the help of flourescence spectrometer. Size of DNA/BG-2 complex was measured by Nanosizer. Interaction between anionic 1,2- dimyristoyl L- ?-phosphatidyl-DL-glycerol (DMPG) or neutral 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DMPC) model membranes and DNA/BG-2 complex was studied by monitoring the changes on ethidium bromide (EtBr) fluorescence characteristics by using flourescence spectrometer. Sensitivity of DNA molecule, complexed with BG-2, against deoxyribonuclease I (DNase I) and serum nucleases was determined by agarose gel electrophoresis. HeLa, SH-SY5Y and C6 glioma cells were transfected with green fluorescent protein (GFP) encoding pEGFP plasmid and luciferase enzyme encoding pGL4.51 plasmid. Transfection efficiency of BG-2 oligoelectrolyte was determined by monitoring GFP expression by fluorescence invert microscope and measuring the luciferase gene expression by luminometer. Besides the transfection efficiency of BG-2, the toxicity of oligoelectrolyte on cells was also examined. Cytotoxicity was assessed by 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide MTT ve Bicinchoninic acid (BCA) method.Transfection efficiency of BG-2 oligoelectrolyte on three different cell lines was analysed and it was observed that BG-2 transfected HeLa cells with highest rate, transfection of C6 glioma cells was not achieved with BG-2 oligoelectrolyte. Although BG-2 showed some toxic effect on the cells, it was also observed that BG-2 oligoelectrolyte was successful to overcome cellular barriers by forming stable and small sized complexes with DNA, interacting with model membranes in a desirable manner and protecting DNA from nuclease activity. As a result, with small modifications on BG-2 oligoelectrolyte structure, it can be suitable for gene delivery applications in the future.