Farklı toxocara vitulorum antijenlerinin elde edilmesi ve enfeksiyona spesifik antikorların saptanması
Recovery of different toxocara vitulorum antigens and detection of specific antibodies
Yazar: ABDALLA FADLALLA AZRUG
Danışman: PROF. DR. AYŞE BURGU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antijenler = Antigens ; Antikorlar = Antibodies ; Buzağılar = Calves ; Enfeksiyonlar = Infections ; Toxocara = Toxocara ; Toxocara vitulorum = Toxocara vitulorum

Özet:
Bu çalışmada, Türkiye'de şimdiye kadar dışkı, kolostrum/süt ve otopsi bakıları ile bildirilen ve hala bazı yörelerde buzağılarda sorun olabilen T. vitulorum'un serodiagnozu amaçlandı. Toxocara vitulorum'la doğal enfekte buzağı serumlarında, hazırlanan biri larva (Ex) diğeri olgun (Pe) antijenle humoral immun yanıt araştırıldı.Araştırmanın laboratuar çalışmalarında için gerekli materyallerin (dışkı, kan, parazit) sağlanması için önce saha çalışmalarına yoğunlaşıldı ve T. vitulorum ile enfekte hayvanlar arandı. Değişik 22 ilden; yaşları 0-6 aylık; halk elinden, özel ve resmi kurumlardan; yerli, kültür ırkı ve melez; her iki cinsiyetten 2393 buzağıya ait dışkı Fulleborn doymuş tuzlu su flotasyon yöntemi ile kontrol edildi. Yirmi sekiz örnekte (% 1,17) T. vitulorum yumurtalarına rastlandı. Ankara, Düzce ve Erzurum illerine ait dışkılarda enfeksiyona rastlandı, resmi kurumlara ait dışkıların hiç birinde yumurta görülmedi. McMaster tekniği ile gram dışkı yumurta sayısı en fazla 10 250 olarak belirlendi.Toxocara vitulorum larva (Ex) antijeni hazırlanmasında; dışkıdan ve olgun parazitlerden elde edilen yumurtalar oda sıcaklığında gelişmeye bırakıldı. Larva gelişimi 17-40 günde tamamlandı. Yumurta kabuğu soyularak, dışarı çıkması sağlanan larvalar 448,4 (452,6-516,6) µm boyda 20,1 (14,7-24,6) µm ende ölçüldü. Toxocara vitulorum olgun (Pe) antijeni hazırlanmasında; kendiliğinden veya ilaç verilerek düşürülen erkek ve dişi parazitler kullanılarak, perienterik sıvı çekildi. Elde edilen larvalardan (Ex), perienterik sıvıdan (Pe) antijenleri seçilen yönteme uygun olarak hazırlandı. Spektrofotometre ile (Ex) antijeni için protein konsantrasyonu 7,5 mg/ml, (Pe) antijen için 20,56 mg/ml olarak belirlendi.SDS-PAGE'le elektroforetik separasyonda (Ex) antijeninde moleküler ağırlıkları 14-150 kDa, (Pe) antijeninde ise 12-141 kDa arasında değişen protein bantları elde edildi.Toxocara vitulorum (Ex) antijenlerinin negatif serumlarla (4 saha, 3 fötal) immunoblotting analizinde hiçbir örnekle reaktif bant saptanmazken, pozitif 6 serumda 14, 35, 56, 63, 68 ve 94 kDa molekül ağırlığındaki protein bantlarının immunoreaktif oldukları tespit edildi. 14 kDa'luk bant bazı örneklerde daha belirgin izlendi. (Pe) antijen ile yapılan immunoblotting çalışmasında negatif serumların (2 saha, 4 fötal) söz konusu antijenlere reaktif olmadıkları, pozitif 6 serumun ise tüm örneklerde 96 ve 110 kDa'luk 2 proteine benzer yoğunlukta reaktif oldukları tespit edildi.Anahtar Kelimeler : Antijen, Buzağı, SDS-PAGE, Toxocara vitulorum, Western Blot.

Abstract:
Toxocara vitulorum causes serious problems among calves in many parts of Turkey. All previous diagnostic approaches for T. vitulorum infections performed based on faeces, colostrum / milk and post-mortem examinations. The aim of this study is to prepare two kinds of antigens, larva extract (Ex) and perienteric (Pe) for serodiagnosis, besides the advantages of clinical and epidemiological aspects of the disease in its diagnosis.This study was initiated by an intensive field work that involved the collection of materials needed for laboratory examinations (faeces, blood and parasites). Faecal samples were collected from a total of 2393 calves of both sexes aged 0-6 months, settled in 22 provinces at public/private and state farms of different breeds. Then the faecal samples examined in the laboratory by Fulleborn Flotation Technique using saturated sodium chloride solution. Twenty eight calves were found positive with T. vitulorum (1,17%) by the presence of the eggs in their faeces. The infected calves were belonged to public/private farms at Ankara, Düzce and Erzurum provinces, while no infection was found in calves at the State farms. McMaster technique was performed to determine the parasite egg count per gram of faeces and the maximum (epg) was found as 10250.Toxocara vitulorum eggs were recovered from both infected faeces and the mature parasites for the purpose of larval (Ex) antigen preparation. The eggs were incubated at room temperature when the larval deveopment was completed within 17-40 days. The egg shells decorticated and the length and width of the obtained larvae was measured as 448,4 (452,6-516,6)µm and 20,1 (14,7-24,6)µm respectively.Toxocara vitulorum perienteric fluid was recovered from both male and female parasites that obtained by either the spontaneous explusion of the parasites or the parasites collected after adminstration of drug.Proper procedures used for preparation of (Ex) antigen from the recovered larvae and (Pe) antigen from the obtained perienteric fluid. Protein concentration of both antigens was measured by spectrophometer where it estimated as 7,5 mg/ml for (Ex) and 20,56 mg/ml for (Pe) antigen.Different protein bands of variable molecular weights which was estimated as 14-150 kDa for (Ex) and 12-141 kDa for (Pe) antigen recovered by SDS-PAGE electrophoretic separation.The negatif serum samples (4 field, 3 fetal) did not show any reaction bands with (Ex) antigen in the immunoblotting analysis, while the 6 positive serum samples showed protein bands within the range of 14, 35, 56, 63, 68 and 94 kDa molecular weights. 14kDa moleculer weight band was more prominent in some samples.Negative serum samples ( 2 field, 4 fetal) did not react with (Pe) antigen in the immunoblotting analysis, while all positive 6 serum samples showed protein bands to 96 and 110 kDa molecular weights with same reactivity.Key words: Antigen, Calf, SDS-PAGE, Toxocara vitulorum, Western Blot.