Silika nanopartiküllerin sentezi, fonksiyonlandırılması ve insan prostat kanseri hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin incelenmesi
Synthesis and functionalization of silica nanoparticles, and investigation of their cytotoxic effects on human prostate cancer cells
Yazar: İREM MUKADDES DURMUŞ
Danışman: DOÇ. DR. SERDAR KARAKURT
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve İleri Malzemeler Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Nanoteknoloji, nano boyuttan türeyen bir teknoloji olup maddeleri atomik boyutu ile kontrol etmek amacı ile kullanılmaktadır. Nanoonkolojideki ilerlemeler, hedeflenen ilaç dağıtımında önemli yenilikler getirmiştir. Prostat kanseri (PCa) erkeklerde ikinci en yüksek morbidite ve mortalite oranına sahiptir. Günümüzde, geleneksel yöntemlere ek olarak nano boyutlu ilaç verme sistemleri ile prostat kanseri (PCa) tedavisi yapılabilmektedir. Silika nanopartiküller (SiNP'ler) birçok kanser türü üzerinde toksik etkiler göstermektedir. Bu tez çalışmasının amacı kimyasal yöntemler ile SiNP'leri sentezlenmesi ve bunların NH2, SH ve Cl ile fonksiyonlaştırılması ve akabinde elde edilen bu bileşiklerin prostat, akciğer, karaciğer, kolon, rahim ağzı ve böbrek kanser hücreleri ve sağlıklı insan epitel hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin belirlenmesi ve etki değerliliğine göre spesifik kanser türü üzerine antiproliferatif mekanizmasının moleküler düzeyde aydınlatılmasıdır. 
Stöber yöntemine göre SiNP'ler TEOS kullanılarak sentezlendi ve yüzey modifikasyonu APTES, CPTES ve McPTES olarak adlandırılan silan birleştirme maddeleri ile gerçekleştirildi. Nanopartiküllerin karakterizasyonu TEM, DLS, BET ve FTIR analizleri ile gerçekleştirildi. SiNP, SiNP-NH2, SiNP-SH ve SiNP-Cl nanopartiküllerin sitotoksik özellikleri altı(6) farklı kanser hücresi ve insan sağlıklı epitel hücresine karşı araştırıldı. 96-kuyucuklu plakalar içinde büyütülen hücreler, 0-250 µg/mL konsantrasyon aralığında değişen SiNP, SiNP-NH2, SiNP-SH ve SiNP-Cl nanopartikülleri ile muamele edildi. Her bir bileşiğin sitotoksik etkisi ayrı ayrı incelendiğinde çalışılan insan kanser hücreleri arasında en yüksek sitotoksik etki insan prostat kanser hücresi olan metastatik özellikteki PC-3 hücreleri üzerinde belirlenmiş olup moleküler çalışmalar bu hücreler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Hücre ölüm mekanizmasının aydınlatılması amacıyla öncelikle hücre apoptoz çalışmaları yapılmış olup erken/geç apoptoz ve nekroz oranları, Annexin V-APC ve 7-AAD boyaları kullanılarak NovoCyte Flow sitometre sistemi ile belirlenmiştir. SiNP ve fonksiyonlaştırılmış formlarının PC-3 hücrelerinin DNA yapısındaki etkileşimleri comet (DNA kırılması) deneyi ile belirlenmiştir. Hem apoptoz oluşumunda hem de PCa gelişminde önemli role sahip olan anahtar genlerin ve bu genler tarafından eksprese edilen proteinlerin (BCL-2, BAX, Nf-ĸB, P53, SMAD4, KRAS ve BRAF) seviyelerinde meydana gelen değişimler sırasıyla qRT-PCR ve Western-Blot yöntemiyle belirlenmiştir.
Nanopartikül konsantrasyonuna karşı hücre canlılığı grafiğininden elde edilen sigmoidal eğrinin analizi sonucunda sentezlenen SiNP, SiNP-SH, SiNP-NH2 ve SiNP-Cl bileşiklerinin PCa hücre hattı olan PC-3 hücreleri üzerindeki IC50 değerleri sırasıyla 75.91 µg/mL, 72.89 µg/mL, 55.46 µg/mL ve 54.09 µg/mL olarak hesaplanmıştır. Bu bileşiklerin, insan sağlıklı epitel hücre hattı olan PNT1A hücrelerinde ise çok yüksek konsantrayonlarda sitotoksik etki gösterdiği belirlenmiştir (>250 µg/mL). Hücre içi floresans biyogörüntüleme çalışmaları sonucunda SiNP'lerin ve fonksiyonlaştırılmış formlarının yüksek oranda sitoplazmada lokalize oldukları görülmüştür. SiNP'ler, PC-3 hücrelerini kontrol hücresine göre 2.83 kat, SiNP-NH2-4.61 kat, SiNP-SH-7.88 kat ve SiNP-Cl-6.76 kat daha fazla erken apoptoza sürüklemiştir.
SiNP'lerin ve fonksiyonlaştırılmış formlarının PCa hücrelerinin metastatik özelliklerini önemli ölçüde (p<0.001) inhibe ettiği saptanmıştır. Ayrıca koloni oluşturma çalışmaları sonucunda SiNP ve fonksiyonlaştırılmış formlarının PC-3 hücrelerinin koloni oluşturma oranını %75 azalttığı (p<0.001) belirlenmiştir. SiNP ve fonksiyonlaştırılmış formlarının PC-3 hücrelerinde BCL-2, BAX, Nf-ĸB, TP53(p53), SMAD-4, KRAS, BRAF, CASPASE-3, CASPASE-9, CASPASE-12 mRNA ve protein ekspresyonlarını aşağı ve/veya yukarı yönde modifiye ettiği belirlenmiştir.
Sonuç olarak; tez projesi kapsamında SiNP, SiNP-NH2, SiNP-SH ve SiNP-Cl nanopartikülleri başarılı bir şekilde sentezlenmiş olup karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. Bu nanopartiküllerin çeşitli insan kanser hücrelerine karşı seçici olarak etki gösterdikleri saptanmış olup en fazla etkiyi ise insan prostat kanseri hücrelerine karşı göstermiştir. Apoptoz, mRNA ve protein ekspresyonları çalışmaları sonucunda bu nanopartiküllerin PC-3 hücreleri üzerine sitotoksik etilerinin moleküler mekanizması da belirlenmiştir. Elde edilen veriler doğrultusunda özellikle SiNP-NH2 ve SiNP-SH nanopartiküllerinin insan prostat kanseri tedavisinde alternatif ve yeni bir tedavi yönteminde kullanılabilecek bir ilaç adayı olma potansiyellerinin olduğu görülmektedir.

Abstract:
Nanotechnology is a technology derived from nano size and it is used to control the substances with their atomic size. Advances in nanooncology have brought important innovations in targeted drug delivery. Prostate cancer (PCa) has the second highest morbidity and mortality rate in men. Today, in addition to traditional methods, prostate cancer (PCa) can be treated with nano-sized drug delivery systems. Silica nanoparticles (SiNPs) show toxic effects on many types of cancer. The aim of this thesis study is to synthesize SiNPs by chemical methods and functionalize them with NH2, SH and Cl, and then to determine the cytotoxic effects of these compounds on prostate, lung, liver, colon, cervical and kidney cancer cells and healthy human epithelial cells, and it is the illumination of the antiproliferative mechanism on the specific cancer type at the molecular level according to its efficacy.
According to the Stöber Method, SiNPs were synthesized using TEOS and surface modification was carried out with silane coupling agents called APTES, CPTES and McPTES. Characterization of nanoparticles was performed by TEM, DLS, BET and FTIR analysis. The cytotoxic properties of SiNP, SiNP-NH2, SiNP-SH and SiNP-Cl nanoparticles were investigated against six(6) different cancer cells and human healthy epithelial cells. Cells grown in 96-well plates were treated with SiNP, SiNP-NH2, SiNP-SH and SiNP-Cl nanoparticles varying in the concentration range of 0-250 µg/mL. The highest cytotoxic effect among the human cancer cells studied when the cytotoxic effect of each compound was examined separately, is determined on metastatic properties of PC-3 cells, the human prostate cancer cell, and molecular studies were performed on these cells. In order to clarify the mechanism of cell death, primarily cell apoptosis studies were performed, and early/late apoptosis and necrosis rates were determined with the NovoCyte Flow cytometer system using Annexin V-APC and 7-AAD dyes. The interactions of SiNP and its functionalized forms in the DNA structure of PC-3 cells were determined by the Comet Assay. Changes in the levels of key genes that have an important role in both apoptose formation and PCA development and those proteins that are explanted by these genes (BCL-2, BAX, NF-ĸB, p53, SMAD4, KRAS and BRAF) are determined by qRT-PCR and Western-Blot, respectively.
Analysis of the sigmoidal curve from cell viability plot against nanoparticle concentration calculated the IC50 values of the compounds SiNP, SiNP-SH, SiNP-NH2 and SiNP-Cl respectively on the cells of PC-3 as 75.91 µg/mL, 72.89 µg/mL, 55.46 µg/mL and 54.09 µg/mL. These compounds were found to have cytotoxic effects at very high concentrations in PNT1A cells, which are human healthy epithelial cell lines (>250 µg/mL). As a result of intracellular fluorescence bioimaging studies, it was observed that SiNPs and their functional forms were highly localized in the cytoplasm. SiNPs dragged PC-3 cells 2.83-fold, SiNP-NH2-4.61 fold, SiNP-SH-7.88 fold and SiNP-Cl-6.76 fold more early apoptosis than the control cell.
It was found that SiNP's and the functional forms have significantly (p<0.001) invanced the metastatic properties of the PCA cells. It has also been determined that, as a result of colonization, SiNP and the functional forms reduce the rate of colonial formation of the cells PC-3 by 75% (p<0.001). It has been determined that SiNP and its functional forms have modified BCL-2, BAX, NF-ĸB, TP53 (p53), SMAD-4, KRAS, BRAF, CASPASE-3, CASPASE-9, CASPASE-12 mRNA and protein expressions in a down and/or up direction in PC-3 cells.
As a result, SiNP, SiNP-NH2, SiNP-SH and SiNP-Cl nanoparticles were successfully synthesized and characterized as part of the thesis project. These nanoparticles have been found to have a selective effect on various human cancer cells, and the greatest effect has been against human prostate cancer cells. As a result of the studies of apoptosis, mRNA and protein expressions, the molecular mechanism of the cytotoxic effects of these nanoparticles on PC-3 cells was also determined. According to the data obtained, it is seen that especially SiNP-NH2 and SiNP-SH nanoparticles have the potential to be an alternative drug candidate that can be used in an alternative and new treatment method in the treatment of human prostate cancer.