Bazı antioksidan ajanların ve siRNA-aracılı susturmanın glioma hücrelerinde stres proteinlerinin anlatımına etkileri
Effects of some antioxidant agents and siRNA-mediated silencing on the expression of stress proteins in glioma cells
Yazar: ASLIHAN ŞENGELEN
Danışman: DOÇ. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Glioma = Glioma

Özet:
Beyin tümörleri dünya çapında ölümcül sonuçları olan kanser türlerinden biridir. Merkezi sinir sisteminin en yaygın malign tümörleri gliomalardır ve yüksek dereceli (4.derece) malign gliomaların en yaygın biçimi olan glioblastoma multiforme (GBM) hastaları için ortalama sağkalım süresi 15 aydan azdır ve ölüm oranı %50'nin üzerindedir. Cerrahi, radyolojik ve kemoterapötik müdahalelere rağmen, bu rakamlar çok fazla değişmemektedir. Bu nedenle dünya çapında bilim insanları ve klinisyenler halen malign gliomalar için daha iyi tedaviler aramaktadır.

Son zamanlarda, beyin tümörlerinin tedavisinde Hsp seviyelerini düşürmek önemli bir hedef haline gelmiştir. Bunun nedenleri, beyin tümörleri ile stres proteinleri (diğer adıyla ısı şoku proteinleri "Heat shock proteins", Hsps) arasında bir ilişki olduğunun ortaya konulması, tümör hücrelerinin proliferasyonunda etkili ve bu hücreleri apoptozdan koruyan bazı stres proteinlerinin saptanması ve bu proteinlerin miktarlarındaki artışın kanser hücrelerini tedaviye daha dirençli hale getirdiğinin gösterilmesidir. Bu proteinlerin anlatımının baskılanmasının tedaviye sağlayacağı katkı nedeniyle stres proteinleri yeni ilaç geliştirme çalışmalarında bir odak noktası olmuştur. Literatürde farklı yöntemler kullanılarak bu proteinlerin anlatımlarının baskılanmasını sağlayan birçok çalışma bulunmaktadır. Bu bağlamda gen anlatımının azaltılmasında yüksek özgünlüğe ve yüksek verimliliğe sahip olan siRNA ("small interfering RNA", küçük engelleyici RNA)'lar kansere karşı potansiyel bir tedavi stratejisi olarak araştırmacılar tarafından sıklıkla kullanılmaktadır. Ayrıca, bazı antioksidan ajanların da Hsp anlatımı üzerinde baskılayıcı etki gösterdiği yapılan çalışmalarda ortaya konulmuştur.

Bu çalışmanın ana hedefi, bazı antioksidan ajanların (kersetin, resveratrol, rozmarinik asit) ve siRNA-aracılı susturmanın C6 glioma ve U87MG hücrelerindeki Hsp27 anlatımına etkilerini belirlemektir. 

Çalışmanın ilk aşamasında, Hsp27 siRNA'ları ile kersetin, resveratrol ve rozmarinik asit antioksidan ajanlarının hücre canlılığı üzerindeki etkisi incelenmiştir. Sitotoksisite analizlerinin sonuçlarına göre, hücreler üzerinde herhangi bir toksik ya da proliferatif etki göstermeyen (%100 hücre canlılığı) veya hücre canlılığını %20'den az oranda etkileyen konsantrasyonlarda siRNA ve antioksidan ajan hücrelere uygulanmıştır. Hsp27 siRNA transfeksiyonu, antioksidan ajan ve kombine terapi uygulamalarının çözünebilir protein profilini nasıl etkilediği 1-boyutlu elektroforez tekniği ile ortaya konulmuştur. Bu jellerde ayrıştırılmış proteinler, Western blot tekniği ile membrana aktarılarak, Hsp27'ye özgü antikorla işleme sokulmuştur. 

Bu çalışmanın sonuçlarına göre, glioma hücrelerine uygulanan tüm ajanların (Hsp27 siRNA transfeksiyonu, antioksidan ajan ve kombine terapi) Hsp27 anlatım seviyesini belirgin bir şekilde azalttığı görülmüştür. C6 glioma hücrelerinde Hsp27 anlatımını en çok azaltan (~%35 oranında) antioksidan ajanın 30 µM konsantrasyonundaki kersetin uygulaması olduğu belirlenmiştir. U87MG hücre hattında ~%45 oranında Hsp27 anlatımını inhibe ederek en fazla etkiyi gösteren ajanların 30 µM'lık kersetin, 15 µM'lık resveratrol ve 215 µM'lık rozmarinik asit olduğu saptanmıştır. U87MG hücrelerine uygulanan siRNA ile antioksidan ajan kombine terapisi gruplarında ise 25 nM Hsp27 siRNA'sı ile birlikte uygulanan 15 µM'lık resveratrol veya 215 µM'lık rozmarinik asitin Hsp27 anlatımını ~%92 oranında susturduğu belirlenmiştir. Bu sonuçlar, hücrelere uygulanan Hsp27 siRNA ve antioksidan ajan kombinasyonlarının beyin kanserinin tedavisinde etkin bir terapötik seçenek olabileceğini göstermektedir. 

Bu çalışmadan elde edilen veriler, agresif büyüme, kötü prognoz ve yüksek ölüm oranı gözlenen beyin tümörlerinin tedavisi için, yeni antikanser ilaçların ve bunlara bağlı tedavilerin geliştirilmesine katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Brain tumors are one of the cancer types with fatal consequences worldwide. The most common malignant tumor of the central nervous system is gliomas, and for patients with glioblastoma multiforme (GBM), the most common form of high grade malignant gliomas (grade IV), average survival rates are less than 15 months and the mortality rate is over 50%. Despite surgical, radiological, and chemotherapeutic interventions, these rates have not changed much. Therefore, scientists and clinicians worldwide are still searching for better therapies for malignant gliomas. 

Recently, reducing the levels of Hsp in the treatment of brain tumors has become a significant target. That is because of the assertion that shows a relationship between brain tumors and stress proteins (also known as Heat shock proteins, Hsps), the determination of some stress proteins that is effective in proliferation of tumor cells and protecting these cells from apoptosis, and the indication of increase in the amounts of these proteins make the cancer cells more resistant to the treatment. These proteins have become a focal point in new drug development studies since suppressing the expression of stress proteins contributes to the treatment process. There are many studies which can suppress the expression of these proteins using different methods in the literature. In this context, siRNA (small interfering RNA) which has high specificity and high efficiency in reducing gene expression, is frequently used by researchers as a potential therapeutic strategy against cancer. Also, studies have shown that some antioxidant agents have a suppressive effect on Hsp expression.

The main purpose of this study is to assess the effects of some antioxidant agents (quercetin, resveratrol, rosmarinic acid) and Hsp27 siRNA-mediated silencing on the expression of Hsp27 in C6 glioma and U87MG cells. 

In the first stage of the study, the effect of Hsp27 siRNAs with quercetin, resveratrol and rosmarinic acid antioxidant agents on the cell survival was examined. According to the results of cytotoxicity analyses, the concentrations of siRNA and antioxidant agent that show neither a cytotoxic nor a proliferative effect on the cells (100% cell viability) or doses that affect cell viability less than 20% was applied to the cells. The effect of the Hsp27 siRNA transfection, antioxidant agents and combined therapy applications on the soluble protein profile was exhibited by using 1-dimensional electrophoresis technique. The proteins separated on these gels were transferred to membrane using Western blotting technique and were reacted with the antibody that is specific to the Hsp27.

According to the results of this study, it was observed that all agents (Hsp27 siRNA transfection, antioxidant agents and combined therapy) applied to the glioma cells significantly reduced Hsp27 expression level. It was found that Hsp27 expression is primarily reduced (~35%) by 30 µM concentration of quercetin with the application of on C6 glioma cells. In U87MG cell line, the most effective agents inhibiting Hsp27 expression with ratio of ~45% were found to be 30 μM quercetin, 15 μM resveratrol and 215 μM rosmarinic acid. In the combined therapy of siRNA and antioxidant agents applied to U87MG cells, it was determined that 15 μM resveratrol or 215 μM rosmarinic acid co-administered with 25 nM Hsp27 siRNA silenced the expression of Hsp27 with the ratio of ~92%. These results demonstrate that combinations of Hsp27 siRNA and antioxidant agents applied to the cells may be an effective therapeutic option in the treatment of brain cancer.

The data obtained from this study will contribute to the development of new anticancer drugs and related treatments of brain tumors with observed aggressive growth, poor prognosis and high mortality rate.