Tütün dumanına maruz kalan gebe ratların yavrularında oluşacak akciğer hasarına karşı alfa lipoik asit'in etkilerinin araştırılması
The investigation of effect of alpha lipoic acid against damage on neonatal rat lung to maternal tobacco smoke exposure
Yazar: ELİF ERDEM
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM ENVER OZAN
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Akciğer = Lung ; Gebelik = Pregnancy ; Oksidatif hasar = Oxidative damage ; Sigara dumanı kirliliği = Tobacco smoke pollution ; Sıçanlar = Rats ; Tütün = Tobacco

Özet:
Bu çalışma gebelik döneminde tütün dumanına maruz kalan sıçanların yavrularının akciğerlerinde meydana gelen histolojik ve biyokimyasal değişikliklerin belirlenmesi ve bu değişiklikler üzerine, gebelik süresince uygulanan alfa lipoik asitin koruyucu etkilerinin araştırılması amacıyla yapılmıştır.
Çalışmamızda 6 haftalık ve ortalama 160±10 g ağırlığında 24 adet Spraque-Dawley cinsi dişi sıçanlar kullanıldı. Dişi sıçanlar, erkek sıçanlar ile çiftleştirildi ve vajinal smearda spermin gözlendiği tarih embriyonik 0. gün olarak kabul edildi. Gebe sıçanlar grup I (Kontrol), grup II (Tütün dumanı), grup III (Tütün dumanı + Alfa lipoik asit) ve grup IV (Alfa lipoik asit) olmak üzere rastgele 4 eşit gruba ayrıldı.
Grup II, grup III'deki dişi sıçanlar, çiftleşmeden önce sekiz hafta ve gebelik süresince günde iki defa birer saat tütün dumanına maruz bırakıldı. Grup III' deki sıçanlara tütün dumanına ilaveten 20 mg/kg dozunda alfa lipoik asit gün aşırı oral gavaj yolu ile verildi. Grup IV 'deki sıçanlara ise belirtilen süre boyunca sadece 20 mg/kg dozunda alfa lipoik asit gün aşırı oral gavaj yolu ile uygulandı. Doğum ile birlikte bütün uygulamalar durduruldu. Postnatal 7. ve 21.günlerde her bir gruptan yedişer adet olacak şekilde yavrular alınarak vücut ağırlıkları ölçüldü. Deney süresi sonunda tüm gruplardaki yavru sıçanlar dekapite edildi. Sıçanların akciğerleri alınarak, ağırlıkları tartıldı. Akciğerin bir kısmı alınarak rutin histolojik takip serilerinden geçirildi. Elde edilen preparatlar H&E, PAS ve Masson'un üçlü boyası ile boyandı. Ayrıca surfaktan protein A (SP-A), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), kaspaz-3 immünohistokimyasal boyamaları ve apoptozisin belirlenmesi için de TUNEL metodu uygulandı. Akciğer doku örneklerinin diğer bir kısmı ile de biyokimyasal analizler yapıldı.
Tütün dumanı grubuna ait postnatal 7 günlük sıçan vücut ağırlıklarında kontrol grubuna göre anlamlı bir azalma olduğu gözlendi (p<0.05). Diğer gruplar arasında ise anlamlı bir fark bulunmadı. Rölatif akciğer ağırlıklarında ise tütün dumanı grubunda kontrole göre anlamlı bir artış (p<0.05) , tütün dumanı+ALA grubunda ise tütün grubuna göre anlamlı bir azalma olduğu gözlendi (p<0.05). Tütün dumanı grubuna ait postnatal 21 günlük sıçan vücut ve rölatif akciğer ağırlıklarında kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik gözlenmedi (p>0.05).
Işık mikroskobu altında yapılan histolojik değerlendirmelerde kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tütün dumanı grubuna ait postnatal 7 ve 21 günlük akciğer kesitlerinde inflamatuar hücre artışı, hemorajik alanlar, ödem, interalveoler septal kalınlaşma, bazı bronş ve bronşiyol epitellerinde dejenerasyon, lümene dökülen epitel hücreleri ve hiyalin membran oluşumları izlendi. Tütün dumanı+ALA grubuna ait akciğer kesitlerinde bu histopatolojik bulgularda azalma olduğu gözlendi (p<0.05). Bu grupta hiyalin membran oluşumlarına ise rastlanılmadı.
RAC metodu ile yapılan morfometrik ölçümlerde postnatal 7 ve 21 günlük kontrol ve ALA grubuna ait sıçan akciğer kesitlerindeki alveol sayılarının yakın olduğu gözlendi (p>0.05). Tütün dumanı grubuna ait alveol sayılarında kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olduğu belirlendi (p<0.05). Tütün dumanı + ALA grubunda ise tütün dumanı grubu ile kıyaslandığında alveol sayılarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlendi (p<0.05).
Postnatal 7 ve 21 günlük sıçan akciğer dokularındaki TUNEL pozitif hücre sayıları kontrol grubu ve ALA grubunda benzerdi (p>0.05). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tütün dumanı grubunda anlamlı bir artış saptandı (p<0.05). Tütün dumanı + ALA grubunda ise tütün dumanı grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı bir azalma tespit edildi (p<0.05).
Postnatal 7 ve 21 günlük sıçan akciğer dokularındaki hem SP-A hem de VEGF immünreaktivitesinde tütün dumanı grubunda kontrol grubuna göre anlamlı bir azalma (p<0.05), tütün dumanı +ALA grubunda ise tütün dumanı grubuna göre anlamlı bir artış (p<0.05) gözlendi. Kaspaz-3 immünreaktivitesinde tütün dumanı grubunda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış (p<0.05), tütün dumanı +ALA grubunda ise tütün dumanı grubuna göre anlamlı bir azalma (p<0.05) gözlendi.
Postnatal 7 ve 21 günlük sıçan akciğer doku örneklerindeki malondialdehit (MDA) düzeylerinde tütün dumanı grubunda kontrol grubuna göre anlamlı bir artış (p<0.05), tütün dumanı +ALA grubunda ise tütün dumanı grubuna göre anlamlı bir azalma (p<0.05) belirlendi. Glutatyon (GSH) düzeyi ve superoksit dismutaz (SOD) enzim aktivitelerinde ise kontrol grubuna göre tütün dumanı grubunda anlamlı bir azalma (p<0.05), tütün dumanı + ALA grubunda ise tütün dumanı grubuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir artış tespit edildi (p<0.05).
Sonuç olarak çalışmamızın bulguları birlikte değerlendirildiğinde, gebelik süresince tütün dumanı maruziyetinin yenidoğan sıçan akciğer dokularında oksidatif hasar oluşturarak akciğer gelişimi üzerinde morfolojik, histopatolojik ve fonksiyonel değişikliklere yol açtığı, güçlü antioksidan özelliği bilinen alfa lipoik asidin maternal kullanımının ise tütün dumanı kaynaklı bu oksidatif hasara karşı yenidoğan akciğer gelişimi üzerine koruyucu etki sağlayabileceği kanaatindeyiz.

Abstract:
This study was carried out to determine the histological and biochemical changes in the lungs of the rat pups exposed to tobacco smoke during pregnancy period and to investigate the protective effects of alpha lipoic acid, which is administered during pregnancy, on these changes.
In our study, 24 six-week old Spraque-Dawley female rats weighing 160 ± 10 g were used. Female rats were mated with male rats and the date on which the sperm was observed in the vaginal smear was considered as the embryonic day zero. The pregnant rats were randomly divided into four equal groups: group I (control), group II (tobacco smoke), group III (tobacco smoke + alpha lipoic acid) and group IV (alpha lipoic acid).
The female rats in the group II, group III were exposed to tobacco smoke twice a day for one hour starting from eight weeks before mating and during pregnancy. In addition to tobacco smoke, 20 mg / kg of alpha lipoic acid was administered via oral gavage to the rats in the group III. Only 20 mg / kg of alpha lipoic acid was administered to the rats in the group IV via oral gavage during the stated period of time. Once after the delivery, all administrations were stopped. On postnatal days 7 and 21, seven pups were taken from each group and their body weights were weighed. At the end of the experimental period, the pups in all groups were decapitated. The lungs of the rats were removed and weighed. A portion of the lung was taken and passed through routine histological follow-up series. The obtained preparations were stained with the triple paint of H & E, PAS and Masson. In addition to immunohistochemical staining of surfactant protein A (SP-A), vascular endothelial growth factor (VEGF), caspase-3, TUNEL method was also used to determine apoptosis. Biochemical analyzes were performed with some part of the lung tissue specimens.
A significant decrease was observed in the weights of 7-day old postnatal rats of the tobacco smoke group compared to the control group (p <0.05). No significant difference was found between the other groups. Relative lung weights of the tobacco smoke group were found to be significantly increased compared to the control group (p <0.05) whereas that of the tobacco smoke + ALA group was significantly decreased compared to the tobacco smoke group (p <0.05). No statistically significant difference was observed in the body weights and relative lung weights of 21-day old postnatal rats of the tobacco smoke group compared to the control group (p>0.05).
In the histological evaluations performed under light microscopy, inflammatory cell increase, hemorrhagic areas, edema, interalveolar septal thickening, degeneration of some bronchi and bronchial epithelium, epithelial cells that were fallen into the lumen and hyaline membrane formation were observed in the lung sections from 7- and 21-day old postnatal rats of the tobacco smoke group compared to the control group. These histopathological findings were observed to be decreased in the lung sections of the tobacco smoke + ALA group (p <0.05). Hyaline membrane formation was not detected in this group.
In morphometric measurements performed with the RAC method, the alveolar numbers in the lung sections from 7- and 21-day old postnatal rats of the control and ALA groups were observed to be close to each other (p> 0.05). A statistically significant decrease was found in the alveolar numbers of the tobacco smoke group when compared to the control group (p <0.05). There was a statistically significant increase in the alveolar numbers in the tobacco smoke + ALA group compared to the tobacco smoke group (p <0.05).
The TUNEL positive cell numbers in the lung tissues from 7- and 21-day old postnatal rat groups were similar in the control group and ALA group (p> 0.05). When compared with the control group, a significant increase was detected in the tobacco smoke group (p <0.05). A significant decrease was detected in the tobacco smoke + ALA group when compared with the tobacco smoke group (p <0.05).
In terms of the immunoreactivity of both SP-A and VEGF in the lung tissues from 7 and 21-day old postnatal rats, a significant decrease was observed in the tobacco smoke group compared to the control group (p <0.05) and a significant increase was observed in the tobacco smoke + ALA group compared to the tobacco smoke group(p <0.05). Regarding the immunoreactivity of caspase-3, there was a statistically significant increase in the group of tobacco smoke compared to the control group (p <0.05) and a significant decrease in the group of tobacco smoke + ALA compared to the group of tobacco smoke (p <0.05).
The malondialdehyde (MDA) levels in the lung tissue samples from 7 and 21-day old rats were determined to be significantly increased in the tobacco smoke group compared to the control group (p <0.05)  and they were determined to be significantly decreased in the tobacco smoke + ALA group compared to the tobacco smoke group(p <0.05). Glutathione (GSH) levels and superoxide dismutase (SOD) enzyme activities showed a significant decrease in the group of tobacco smoke compared to the control group (p <0.05)  and a statistically significant increase in the tobacco smoke + ALA group compared to the group of tobacco smoke (p <0.05)
In conclusion, when the results of our study are evaluated together, we suggest that the exposure of tobacco smoke during pregnancy leads to morphological, histopathological and functional changes on lung development by causing oxidative damage in lung tissues of  neonatal rats and the maternal use of alpha lipoic acid, which is known to have strong antioxidant properties, can provide a protective effect on the neonatal lung development against this oxidative stress originating from tobacco smoke.