Muğla bölgesindeki kolorektal kanser hastalarında PIK3CA genindeki bazı bölgelerin mutasyon analizi
Mutation analysis of some regions of PIK3CA gene of colorectal cancer patients in Mugla region
Yazar: TANER KAYNAR
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Kalın bağırsak, sindirim sisteminin önemli pir parçası olup çekum, kolon ve rektum yapılarından meydana gelmektedir. Kolon ve rektum kısımlarından herhangi birinde meydana gelen kanserleşme, kolorektal kanser (KRK) olarak adlandırılmaktadır. KRK, dünya çapında hem erkek hem de kadınlarda en sık olarak görülen kanser türlerinden bir tanesi olmuştur. Kanserin moleküler temelinin anlaşılması adına üzerinde en çok çalışma yapılan kanser türlerinden biri de kolorektal kanserdir. Fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K) hücre proliferasyon, yayılma ve hayatta kalması için sinyal yollarının başlatılmasında kritik bir lipid kinaz ailesidir. Fosfatidilinositol 4,5- bisfosfat 3-kinaz katalitik alt ünite alfa (PIK3CA), 34 kb' lik bir gen olup 20 exondan oluşmaktadır. Ayrıca 1068 amino asitten oluşan 124kDa'luk p110α proteinini kodlar ve 3.kromozomun  3q26.3 bölgesinde lokalizedir.
Yapılan birçok çalışmada PIK3CA geni üzerindeki bölgeleri, hotspot mutasyon bölgeleri olarak tanımlanmıştır. p110α proteinin helikal domaini exon 9 tarafından kodlanırken kinaz domaini ise exon 20 tarafından kodlanmaktadır. Literatür taramaları sonucunda PIK3CA geninin çeşitli insan kanseri tiplerinde mutasyona uğradığı ve kanser gelişiminde etkili olduğu bulunmuştur. Ayrıca PIK3CA mutasyonlarının yoğun olarak exon 9 ve exon 20 bölgelerinde kümelendiği bildirilmiştir. Bu tez çalışması kapsamında, Muğla bölgesindeki kolorektal kanserli hastalarda PIK3CA geninin exon 9 ve exon 20 onkojenik mutasyonlarının belirlenmesi ve kolorektal kanser gelişimi üzerindeki etkilerinin tartışılması amaçlanmıştır.
Bu çalışmada Muğla Sıtkı Koçman Eğitim ve Araştırma Hastanesi'ne gelerek kolorektal kanser tanısı almış olan 30 adet hastaya ait parafin bloklara gömülü doku örnekleri kullanılmıştır. Ayrıca çalışmada kontrol grubu olarak, bu 30 kolorektal kanserli hastanın 20 tanesine ait sağlıklı kolon dokusu (tümör kontrol grubu) ve 30 adet de kolonunda herhangi bir tümörleşme olmayan hastalara ait parafin bloklara gömülü doku örneği kullanılmıştır. Toplamda 80 adet parafine gömülü doku örneğinden genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. 
Daha sonra her bir DNA örneğinde, PIK3CA geninin exon 9 ve exon 20 bölgeleri, ilgili primerler ile PCR'da çoğaltılmıştır. 80 adet örneğe ait 240 adet PCR ürününün BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit kullanılarak sekans PCR işlemi gerçekleştirilmiştir. Sekans PCR ürünleri, Sanger sekanslama metodu kullanılarak Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer cihazında sekanslama işlemine tabi tutulmuş ve ilgili gen bölgelerine ait DNA dizileri çıkarılmıştır. 240 adet sekans dosyası Sequencing Analysis v.5.3.1 ve SeqScape v.2.6 Software'lerinde analiz edilerek PIK3CA genine ait exon 9 ve exon 20 bölgeleri üzerindeki mutasyon bölgeleri tespit edilmiştir. Daha sonra bu mutasyon bölgelerindeki nükleotid değişimleri ile amino asit değişimleri Ensembl ve NCBI veri tabanlarında biyoinformatik analizler ile tespit edilmiştir.
Bu tez çalışması sonucunda, PIK3CA geninin exon 9 bölgesinde, 1 hastada c.1571 G>A (R524K) heterozigot, 2 hastada c.1624 G>A (E542K) heterozigot, 3 hastada c.1664+105 T>G heterozigot, 9 hastada ise c.1634 A>C (E545A) heterozigot ve c.1658_1659delGTİnsC (S553Thr) heterozigot mutasyon birlikteliği tespit edilmiştir. Toplam 12 kolorektal tümörlü vakada tespit edilen mutasyonların tamamı helikal domain (exon 9) üzerinde kümelenmiştir. Kinaz domaini (exon 20) üzerinde ise herhangi bir mutasyon gözlemlenmemiştir. Ayrıca çalışmaya alınan 20 tümör kontrol ve 30 normal kontrol olmak üzere toplam 50 adet kontrol grubunun exon 9 ve exon 20 bölgelerinde herhangi bir mutasyon gözlemlenmemiştir. Tespit edilen mutasyonlar kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında sadece tümörlü olgularda mutasyonların gözlemlenmesi bu mutasyonların somatik mutasyonlar olduğunu göstermiştir. Çalışma sonucunda PIK3CA mutasyonlarının sıklığı %40 oranında bulunmuştur. Bu durum, literatürdeki oranlara kıyasla Muğla Bölgesindeki kolorektal kanserli hastalarda PIK3CA mutasyonlarının daha sık olduğunu göstermiştir. Tespit edilen mutasyonlardan E545A ve E542K mutasyonlarının, literatür taramaları sonucunda lipid kinaz aktivitesi üzerinde artırıcı bir etkisi olduğu bildirilmiştir. E545A ve S553Thr mutasyon birlikteliği de Cowden Sendromu olarak bildirilirken, R524K ve c.1664+105 T>G mutasyonlarının lipid kinaz aktivitesi ile ilişkisinin bilinmediği rapor edilmiştir.

Abstract:
Large intestines are an important part of digestive system and are composed of cecum, colon and rectum. Cancer formation in any of the colon or rectus is named as colorectal cancer (CRC). CRC is one of the most widely encountered cancer types in the world. Furthermore, CRC is one of the most studied cancer types in order to understand molecular mechanisms of cancer. Phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) is a critical lipid kinase involved in initiating the signal cascades for cell proliferation, invasion and survival. Phosphatidylinositol 4-5 bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha (PIK3CA) of PI3K is a gene of 34kb length and 20 exons. PIK3CA encodes the p110 α protein of 124kDa and is localized on the 3q26.3 region of Chromosome 3.
Exons 9 and 20 of the PIK3CA were determined by numerous studies as one of the hotspot mutation regions. Exon 9 and exon 20 encodes the helical and kinase domains of p110α protein, respectively. As a result of literature searches, PIK3CA gene was found to be mutated in various cancer types and is implicated to be involved in cancer development. Also, it was stated that the mutations were mostly grouped on Exon 9 and 20 regions of PIK3CA gene. This thesis study, therefore, aims to identify oncogenic mutations on the exon 9 and exon 20 regions of PIK3CA gene of the colorectal patients of Muğla region and discuss the effects of such mutations on the development of colorectal cancer within the context of current literature.
In this study, the paraffin-embedded tissue samples (FFPE) of a number of 30 patients diagnosed with colorectal cancer at Muğla Sıtkı Koçman University Training and Research Hospital were used. Additionally, a number of 20 normal colon tissues out of the 30 colorectal patients (tumor control group) as well as a number of 30 normal FFPE tissues taken from the patients without any apparent colon tumor were included in the study as control groups.
Genomic DNAs were isolated from a total of the 80 FFPE tissues and the regions of exon 9 and 20 of PIK3CA gene were amplified with PCR using appropriate primers. A number of 240 PCR products belonging to a total of 80 samples were subject to sequencing PCR using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. The products of sequencing reactions were then subject to Sanger sequencing using Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer and DNA sequences of the gene regions were obtained. The sequencing results were analyzed using the software Sequencing Analysis v.5.3.1 and SeqScape v.2.6 and mutated regions were identified. Then, amino acid changes corresponding to the mutated nucleotides were determined by the use of Ensembl ve NCBI databases and bioinformatics analyzes. As a result of this study, the mutations were detected on the exon 9 of PIK3CA. These are c.1571 G>A (R524K) heterozygote mutation in 1 patient, c.1624 G>A (E542K) heterozygote mutation in 2 patients, c.1664+105 T>G heterozygote mutation in 3 patients and c.1634 A>C (E545A) heterozygote mutation together with c.1658_1659delGTİnsC (S553Thr) heterozygote mutation in 9 patients. All of the mutations detected in a total of 12 patients were only seen on the exon 9. No mutations were evident on the exon 20 as a result of this study. Moreover, no mutations were detected on the exon 9 and 20 in the control groups (n=50) of tumor (n=20) and healthy controls (n=30). Therefore, these mutations were classified as somatic mutations due to their sole existence in the tumor tissues. Consequently, the frequency of PIK3CA mutations was calculated as 40% as a result of this study and out of a number of selected 30 colorectal cancer patients. This ratio shows that PIK3CA mutations were seen relatively higher in the colorectal cancer patients of Muğla region compared to the numbers elsewhere in the literature. Among the mutations detected, E545A and E542K mutations were reported in the literature that they increase lipid kinase activity.  E545A and S553Thr mutations were also seen in the patients with Cowden Syndrome. The effect of R524K and c.1664+105 T>G mutations on lipid kinase activity has not been reported in the literature.