Mayada ağır metal stresine bağlı olarak anlatım yapan genlerin karakterizasyonu
Characterization of heavy metal induced genes in yeast
Yazar: ÇAĞATAY TARHAN
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL TOPAL SARIKAYA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Ağır metal iyonları = Heavy metal ions ; Bakır (II) iyonu = Copper (II) ion ; Moleküler analiz = Moleküler analysis ; Moleküler biyoloji = Molecular biology

Özet:
Metaller hücre içinde gerçekleşen birçok biyokimyasal olayda yapısal ve işlevsel olarak rol oynayan elementlerdir. Bir ağır metal olan bakır özgün elektrokimyasal özellikleri nedeniyle canlılar için hayati öneme sahip bir metaldir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bakır metabolizmasının, bazı hastalıkların gelişiminde önemli bir etken olduğu ortaya konmuştur. Gerek bu hastalıklarda gerekse hücre içindeki pek çok metabolik sürecin işleyişinde bakırın rolünü ortaya koyabilmek için bakır metabolizmasının aydınlatılması önemlidir.Bu tez çalışmasında bir maya türü olan ve moleküler biyoloji çalışmalarında önemli bir model organizma olarak değerlendirilen Schizosaccharomyces pombe'nin yabani ırkı kullanılarak bakır stresi altında anlatımları artan bazı genlerin saptanması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda temel olarak Farklılık Gösterim yöntemi kullanılmış ve bu yöntemden elde edilen bilgilerin doğrulaması Gerçek Zamanlı PZR (GZ PZR) yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Bu yöntemlerin uygulanmasından önce bakırın hücrelerin yarısının ölümüne yol açtığı LD50 değerinin belirlenmesi için hücreler farklı konsantrasyonlarda CuSO4 içeren minimal besi yerlerinde üretilmiş ve LD50 değeri 50 µM CuSO4 olarak saptanmıştır. Daha sonra 50 µM CuSO4 içeren ve içermeyen minimal besi yerlerinde üretilen hücrelerden total RNA izolasyonları yapılmış ve bu RNA'lar üç farklı oligo(dt) ve 8 evrensel rastgele primerlein kombinasyonları kullanılarak çift iplkli cDNA'lara çevrilmiştir. Her iki koşuldan elde edilen cDNA'lar primer kombinasyonlarının aynı olması gözetilerek poliakrilamid jellerde yanyana yürütülerek ayrıştırılmış ve kontrol koşulunda görünmeyen/çok az görünen fakat bakır stresi altında ortaya çıkan/miktarı artan bantlar jelden geri alınmıştır. Geri kazanılan bantlar agaroz jelde yürütülerek kontrol edildikten sonra dizilemeye gönderilmiş ve ulaşılan dizi bilgisi NCBI sayfasındaki S.pombe genomuna ait veri tabanında BLAST analizine tabi tutularak bu dizilerin hangi gene ait olduğu belirlenmeye çalışılmıştır. Bu genler, SPCC1682.13 (Laf2, SWIRM domen taşıyan protein), SPBC2F12.05c (sterol bağlayan ankirin tekrarlı protein) , SPAC19G12.16c (adg2, septum oluşumnda rol oynayan protein), SPAC110.01 (ppk1, serin/treonin kinaz) ve SPBC1348.0 (membran bağlı protein) olarak belirlenmiş ve hem kontrol hem bakır stresi koşullarındaki anlatımları SYBR green boyası temelli GZ PZR yöntemiyle kontrol edilmiştir. Gen anlatımlarında kontrol koşuna göre sırasıyla 1,4, 1,6, 1,4 ve 5.8 kat artış saptanırken SPBC1348.01 (membran bağlı protein) geninde bir farklılık yakalanamamış (0,9 kat) sonuç yanlış pozitif olarak değerlendirilmiştir.Daha sonra anlatım artışları doğrulanan genlerin hücre içindeki işlevleri literatür bilgisi ve bazı veri tabanları taranarak belirlenmiştir. Bu genlerin bakır stresi altındaki olası işlevleri bu bilgilerden hareketle değerlendirilmeye çalışılmış ve hücrede ne gibi olayların geliştiği yorumlanmıştır.Buna göre, bu genlerin işlevlerinin özellikle hücre döngüsünün kontrölü ve bu süreçte önemi olan kromozom dinamiği gibi olaylarla ilgili olduğu göz önünde bulundurularak bakır stresiyle ortaya çıkan üremedeki yavaşlamanın bu genlerdeki anlatım artışına bağlı olaylarla açıklanabileceği bir hipotez olarak ileri sürülebilir. Ek olarak, genlerdeki anlatım artışlarının birbirinden tamamen bağımsız olmadığı, tutarlı bir ilişkiler bütünüyle bakır stresine cevap olarak ortaya çıkan bir tabloyu tamamladığı öne sürülebilir. Bu hipotezlerin doğrulanması, elde edilen verilerle birlikte ortaya çıkan sorulara ilişkin yeni deneysel yaklaşımlarla mümkün olabilecektir.

Abstract:
The metals have structural and functional roles in many intracellular biochemical events. Because of its spesific electrochemical properties, copper is an essential heavy metal for living organisms. In recent years, it has been shown that copper is an important factor in the pathogenesis of some diseases. Thus, it is important to understand copper metabolism for determining the role of copper either in pathological conditions and cellular events.In this study, it is aimed to determine the increase in expression of some genes under copper stress using wild type Schizosaccharomyces pombe which is very popular yeast as a model organism in molecular biology studyings. For this purpose differental display was performed as main method. To validate differential display results, Real-Time PCR was used. Before performing these methods, in order to determine the LD50, cells were grown in minimal medium containing increasing concentrations of CuSO4 and 50µM was determined as LD50. After that, total RNAs were isolated from the cells which grown in minimal medium and minimal medium containing 50µM CuSO4. These RNAs converted to double stranded cDNA?s using the combination of three different oligo(dt)s and eight universal random primer. The cDNA?s from both conditions were run in polyacrylamide gels side by side and the bands which was absent or very low in control condition but appeared or increased as a result of copper stress, recovered from gels. Recovered bands were checked in agarose gels and after that sent to sequence analysis. BLAST analysis of these sequences performed in S. pombe genome database and produces significant similarities to SPCC1682.13 (SWIRM domain containing protein), SPBC2F12.05c (sterol binding ankyrin repeated protein) , adg2 (has role in the septum formation), ppk1 (serine/treonine protein kinase) and SPAC110.01 (membran bound protein). The expression levels of these genes quantitatively confirmed. Except of SPBC1348.01 which was assumed as false positive, it was determined that the expression level of other four genes increased 1.6, 1.4, 1.6 and 5.8 fold respectively in copper stress.The possible role of these genes and cellular events under copper stress were evaluated with respect to the literature and some databases. Accordingly, considering the functions of the genes are related to cell cycle, cell division and chromosome dynamics, it can be hypothesised that the retardation of cell cycle progression under copper stress is relevant to the events which depend on the functions of these genes. It will be possible to confirm this hypothesis using new experimental approaches which regard to emerged questions during this study.