Bacillus subtilis (RSKK-11014)'den proteaz enziminin saflaştırılması, aktivitesinin tayini ve karakterizasyonu
For characterization and for determining activity of purification of protease from Bacillus subtilis (RSKK-11014)
Yazar: SEDA ÖZDEN
Danışman: PROF. DR. ELİF LOĞOĞLU
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada topraktan izole edilen Bacillus subtilis (RSKK-11014)'ten proteaz enzimi saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Proteaz enzimi üretimi %1,25 glukoz, %1 pepton, % 0,5 maya ekstraktı içeren besiyerinde 37 oC de  24 saat sürede gerçekleştirilmiştir. Proteaz enzimi; %85 (NH4)2SO4 çöktürmesinden sonra DEAE selüloz anyon değişim kromatografisiyle %5,66 verimle 10,42 kat, Sefaroz 4B-basitrasin afinite kromatografisiyle %7,19 verimle 14,07 kat saflaştırılmıştır. Enzimin molekül kütlesi; Doğal (Native)-PAGE ile yaklaşık 36 kDa olarak bulunmuştur. Enzimin optimum sıcaklığının ve pH'ının sırasıyla 50 oC ve 9,5 olduğu tespit edilmiştir. Enzim 40 oC de 3 saat boyunca aktivitesini korumuştur fakat 60 oC ve 70 oC gibi yüksek sıcaklıklarda aktivitesini çok çabuk kaybettiği görülmüştür. Enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisi incelendiğinde Ca+2, Co+2, Ni+2 iyonları varlığında aktivitesinin arttığı gözlenirken, Al+3, Cu+2, K+ iyonlarının inhibitör etkisi gösterdiği belirlenmiştir. Fe+3, Mg+2 ve Na+2 iyonları varlığında ise enzimin aktivitesini koruduğu gözlenmiştir. Enzimin aktivitesinde etanol ve n-bütanol çözeltileri ile artış gözlenmiştir ancak benzen, toluen, DMSO çözeltilerinde sırasıyla yaklaşık olarak %15, %15 ve %25 şeklinde aktivite kaybı olmuştur. Metanolde ve asetonda ise aktivitesini korumuştur. Enzimin yüzey aktif maddelere ve yükseltgenlere karşı kararlılığını genel olarak koruduğu ancak yüzey aktif bir madde olan SDS varlığında aktivitesinin yaklaşık %48'ini kaybettiği görülmüştür. Enzim; kazein, jelatin, keratin, ovalbumin, soya fasulyesi unu gibi doğal substratlar karşısında en yüksek aktiviteyi kazein substratına karşı göstermiştir. Enzim, karakteristik serin inhibitörü olan PMSF (fenilmetilsülfonilflorür) ile inhibe olmuştur. 2 mM lık EDTA varlığında aktivitede görülen %48'lik kayıp ise enzimin metal bağlama bölgesine sahip olduğunu göstermiştir. Bu inhibisyon profili, bu proteazın serin proteaz sınıfında olduğunu göstermiştir. Enzimin Lineweaver-Burk grafiğinden yararlanılarak tespit edilen Km ve Vmak değerleri sırasıyla 0,37 mg/ml ve 1,13 μmol. ml-1. dk-1 olarak elde edilmiştir.

Abstract:
In this work, the protease which was  produced  by Bacillus subtilis (RSKK-11014) isolated from a soil sample has been purificatied and characterizatied. Protease production was grown in %1,25 glucose, %1 peptone, % 0,5 yeast extract at 37 oC and 24 hour. An alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis (RSKK-11014) was purified by DEAE cellulose anion exchange chromatography with %5,66 yield and 10,42 fold and Sepharose–bacitracin affinity chromatography with %7,19 yield and %14,07 fold followed by %85 ammonium sulfate precipitation. The molecular mass of the purified enzyme determined by using Native-PAGE was approximately 36 kDa. The optimum pH and temperature of protease was 9,5 and 50 oC, respectively. Protease activity was maintained after 3 hours at 40 oC. The purified enzyme was stable temperatures of 40 °C but rapidly deactivated at temperatures of 60 °C and 70 °C.  If  investigation of metal ions effect about to the enzyme activity  while Ca+2, Co+2, Ni+2 was increased enzyme activity but in the presence of Al+3, Cu+2  and K+ activity was inhibited enzyme. Fe+3, Mg+2 and Na+2  showed no effect on protease activity. Ethanol and n-buthanol were stimulatory but benzene, toluene, DMSO had fewer inhibitory effects, bringing about approximately %15, %15 and %25 decreases in activity, respectively. Enzyme maintained activity in the presence of methanol and acetone. The purified protease was found to be stable in the surfactants and oxidizing agent, but more than % 48 inactivation was  observed in the presence of SDS.  The proteases showed highest activity together with  casein relative to other native proteins such as gelatin, ceratin, ovalbumin and soy bean. The protease was almost completely inhibited by the serine protease inhibitor PMSF. The enzyme has metals binding site since 48% of the activity was retained in the presence of 2 mM EDTA. This inhibition profile is consistent with the classification of this protease as serine proteases. The kinetic parameters, Km and Vmax of the purified protease were determined by using Lineweaver-Burk plot 0,37 mg/ml and 1,13 μmol.ml-1.min-1, respectively.