Olgun Antep fıstığı bitkisinin (Pistacia vera L. Atlı) mikroçoğaltımı, in vitro konzervasyonu ve kriyoprezervasyonu için biyoteknolojik yöntemlerin geliştirilmesi
Development of biotechnological methods for micropropagation, in vitro conservation and cryopreservation of mature Pistachio (Pistacia vera L. Atli)
Yazar: HÜLYA AKDEMİR
Danışman: DOÇ. DR. YELDA ÖZDEN ÇİFTÇİ
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Dioik ağaç ve çalıları içeren Pistacia genusu Anacardiaceae ailesine ait olup, en önemli türü ticari olarak yenilebilen değerli meyveye sahip antepfıstığı (Pistacia vera L.)'dır. Genel olarak lüks bir yemiş olarak tüketilen antepfıstığı, tadı ve yeşil rengi nedeniyle pasta ve dondurma endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu özelliklerinin yanı sıra antepfıstığı ağaçları, tanin üretimi, deri endüstrisi, resin içeren sakız maddesi ve uçucu yağ üretiminde de kullanılmaktadır. Antepfıstığını renkli odunu, odun kömürü üretiminde de kullanılır. Antepfıstığı ve diğer Pistacia türlerine ait ıslah çalışmaları, bu türün sert çöl koşullarına adaptasyonu nedeniyle, yalnızca Akdeniz iklimine ait bir kaç türün kültürlenebildiği İran, Türkiye, Suriye ve diğer antepfıstığı üretici ülkelerin kurak ve yarı kurak bölgelerinde yaşayan çoğu düşük gelirli toplulukların beslenmesi ve tarımsal ekonomisi açısından önemlidir.Bu çalışmada, Türkiye'de en önemli ticari antepfıstığı çeşitlerinden olan dişi P. vera L. `Kırmızı' ve `Siirt' ile aynı çiçeklenme zamanına sahip olgun erkek P. vera L. `Atlı' çeşidine ait ağaçlardan başlatılan in vitro kültürler bitki materyali olarak kullanıldı. Pistacia vera L.'nin, klasik yetiştirme yöntemleri ile çoğaltımı, bitki ıslahı ve büyük ölçekli üretim için in vitro çoğaltım yöntemleri kullanılarak güçlendirilmelidir. Ancak, in vitro çoğaltımı, bu türün mikroçoğaltımında görülen gövde ucu nekrozu (STN) gibi kültür koşullarının neden olduğu sorunlar nedeniyle istenilen seviyeye ulaşamamıştır. Bu nedenle, farklı ışık yoğunluklarında (30 or 50 ?mol m-2 s-1), kalsiyum klorür (CaCl2.2H2O) ve borik asit (H3BO3) besiyeri bileşenleri ve gümüş nitrat (AgNO3) ise etilen inhibitörü olarak çeşitli derişimlerde denenerek olgun antepfıstığı bitkiciklerinde STN probleminin giderilmesi için uygulanmıştır. In vitro çoğaltılan gövdelerde STN oluşmasında CaCl2 / H3BO3 ve ışık yoğunlukları arasında belirgin etkileşimler gözlenmiştir. Artırılmış CaCl2 ya da H3BO3 derişimlerini içeren besiyerinde rejenere olan bitkicikler, yüksek ışık yoğunlukları ile karşılaştırıldığında özellikle düşük foton akış yoğunlukları altında daha az oranda STN yanıtı göstermiştir. Besiyerine AgNO3 eklenmesi, her iki ışık yoğunluğunda, STN'yi azaltırken, yüksek AgNO3 derişimlerinin gövdelerin büyüme oranları üzerinde toksik etkisi olduğu görülmüştür. Sonuçta, antepfıstığı bitkiciklerinde STN sorununun, arttırılmış CaCl2 ya da H3BO3 derişimlerinin görece daha düşük ışık yoğunlukları altında uygulanmasıyla giderilebildiği belirlenmiştir.Antepfıstığı ve anaçlarının mikroçoğaltımı için çeşitli çalışmalar mevcut olmasına karşın, biyoreaktör sistemlerinde antepfıstığının çoğaltımı ile ilgili etkin bir çalışma bu zamana kadar rapor edilmemiştir. Bu nedenle, tez kapsamında juvenil antepfıstığı gövde uçları ve nodal tomurcuklarının mikroçoğaltımı hem geleneksel yarı-katı besiyeri hem de geçici daldırma biyoreaktör sisteminde (RITA®) denenmiştir. Denenen daldırma koşulları arasında, her 16 saatte 24 dakikalık daldırma zamanının, antepfıstığında vitrifikasyonu azaltırken, proliferasyonu arttırdığı rapor edilmiştir. Gövde uçları ile karşılaştırıldığında en yüksek gövde oluşumu, RITA® sisteminde 4 mg/L BA ve 0.1 mg/L GA3 içeren MS (M5) besiyerinde (M5), nodal tomurcuklardan elde edilmiştir. Yarı-katı M5 besiyerinde prolifere edilen gövdelerde, gövde ucu nekrozu görülmesine karşın, RITA® sisteminde böyle bir belirti görülmemiştir. Ayrıca, optimize edilmiş bu koşullar olgun erkek antepfıstığı `Atlı' nodal tomurcuk ve gövde uçlarına uygulanmış ve mikroçoğaltım RITA® sisteminde yarı-katı besiyerine görece iyileştirilmiştir. Dahası, düşük oranlarda da (%27.5) olsa, antepfıstığı bitkiciklerinin in vitro köklenmesi RITA® sisteminde gerçekleştirilmiştir. Elde edilen tüm bu veriler, RITA® sisteminin juvenil ve olgun antepfıstığının yanı sıra diğer odunsu türlerde de kitle çoğaltımında kullanılabileceğini göstermiştir.Hem kültür başlatılması hem de altkültürleme sırasında eskplantların hazırlanması oksidatif strese yol açan doku yaralanması ile sonuçlanır. Tez kapsamında, doku kültürü süresince hidroksil radikali oluşumunun belirlenebilmesi için, dokulara zararsız bir deneme olan radikal yakalayıcı olarak DMSO'nun kullanıldığı yöntem kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar, özellikle kültür periyodunun başlangıcında gövde uçlarının oksidatif strese maruz kaldığını göstermiştir. Antepfıstığı genetik kaynaklarında güvenli bir in vitro çoğaltım stratejisinin optimizasyonu için, oksidatif stres ve diğer doku kültürü kaynaklı streslerin antepfıstığının genetik kararlılığı üzerindeki olası etkileri de araştırılmıştır. Apikal tomurcuk proliferasyonunu takiben organogenez yoluyla uzun süre (5-7 yıl) mikroçoğaltılan bitkiciklerin genetik kararlılığı, RAPD, ISSR ve AFLP belirteçleri kullanılarak araştırılmıştır. Her moleküler belirteç sistemi, ana bitki ve klonlar arasında genetik polimorfizm göstermiştir. 15 RAPD primeri ile toplamda 141 bant elde edilmiş ve primerlerin ortalama PIC değeri 0.226 olarak belirlenmiştir. Ana bitki ile klonlar arasında genetik benzerlik oranları, 0.53'ten 0.99'a değişmekte olup, ortalama 0.84 olarak hesaplanmıştır. 7 ISSR primeri ile toplamda 62 bant elde edilmiş ve primerlerin PIC değeri 0.220 olarak hesaplanmıştır. Ana bitki ile klonları arasında genetik benzerlik oranları, 0.56'dan 0.98'e değişmekte olup, ortalama 0.82 olarak hesaplanmıştır. AFLP belirteç sisteminde ise, 10 AFLP primer çiftinden toplamda 789 bant elde edilmiş ve primerlerin PIC değeri 0.241 olarak belirlenmiştir. Ana bitki ile klonları arasında genetik benzerlik oranları, 0.57'den 0.90'a değişmekte olup, ortalama 0.75 olarak hesaplanmıştır. Tüm elde edilen bu veriler, uygulanan belirteç sistemlerinin, doku kültürü temelli özgün genetik değişikliklerin belirlenmesinde kullanılabilir olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, uzun süre altkültürlenen olgun antepfıstıklarında, genetik kararsızlığın (düşük oranda, PIC<0.25) belirlendiği ilk çalışmadır.Akdeniz, Orta ve Batı Avrupa ve Kuzey Afrika'da antepfıstığının genetik erozyona uğramasından dolayı, tez kapsamında olgun antepfıstığı `Atlı' çeşidine ait germplazmanın korunması için hem orta hem de uzun süreli koruma yöntemleri uygulanmıştır. Orta süreli saklama için, yapılan çalışmalarda hem mikrogövdelerin hem de enkapsüle edilmiş gövde uçlarının 4°C'ta 12 aya kadar saklanabileceği gösterilmiştir. Soğuğa alıştırılmış ve ozmotik olarak korunmuş olgun `Atlı' çeşidine ait gövde uçlarının kriyoprezervasyonu için, enkapsülasyon-dehidratasyon ve damlacık-vitrifikasyon yöntemleri denenmiştir. Denenen yöntemler içinde, 150 dk 0°C'ta damlacıklar halindeki vitrifikasyon çözeltisinde inkübe edilip, doğrudan sıvı azota daldırıldıktan sonra hızlıca çözülen, 1 mg/L BA ve 0.5 mg/L GA3 içeren MS besiyerinde kültüre alınan gövde uçlarından %13.6 oranında bitkicik gelişimi gözlenmiştir. Geliştirilen damlacık-vitrifikasyon yöntemi, olgun antepfıstığı gövde uçlarının uzun süreli korunması için umut verici bir yöntem olarak görülmektedir. Dahası, genetik bütünlüğün belirlenebilmesi için kullanılan RAPD analizleri, ana bitki ile en az 3 ay altkültürlenen kriyoprezerve edilmiş bitkiler arasında (benzerlik indeksleri 0.959 ve 0.973 arasındadır), yüksek genetik kararlılık olduğunu kanıtlamıştır. Belirlenen düşük genetik kararsızlığın (makul polimorfizm değeri, 0.5>PIC>0.25), rejenerasyon fazı ve PVS2'nin toksik etkisi nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Bu veriler, optimize edilmiş bu koruma yöntemleri ve özellikle yavaş büyütme yoluyla saklamanın diğer Pistacia türlerine başarıyla uygulanabileceğini göstermiştir.Tez çalışması kapsamında yapılan çalışmalarda elde edilen verilerin bir bölümü, ?Current status and conservation of Pistacia germplasm? adlı araştırma-derleme makalesinde diğer bir bölümü ise ?In vitro conservation and cryopreservation of mature pistachio (Pistacia vera L.) germplasm? adlı araştırma makalesinde, SCI indeks kapsamındaki dergilerde yayınlanmıştır.Bu tez, 209T030 no'lu TUBITAK ve kısmen de 2009-A10 no'lu GYTE-BAP projeleri ile desteklenmiştir.

Abstract:
Pistacia genus belongs to the Anacardiaceae family and consists of dioecious trees and shrubs, among which pistachio (Pistacia vera L.) is the most important species of the genus with its commercially valuable edible nuts. Pistachios are generally consumed as a luxury table nut and it is also widely used in the pastry confectionary industry, confectionery and ice-cream industries for its pleasing flavour and green color. In addition to being a valuable nut tree, the pistachio tree has other uses, including tannin production for the leather industry and resin containing mastic and its volatile oils. The colorful wood of the pistachio is also used in the production of high charcoal. Pistachio and other Pistacia species cultivation play a vital role in the nutrition and agricultural economy of many poor communities living in the arid and semi-arid regions of Iran, Turkey, Syria and other pistachio producing countries due to the tree's adaptation to harsh desert conditions where only a limited number of other Mediterranean species can be cultivated.In this study, in vitro cultures from mature trees of P. vera L. male `Atlı? were used as a plant material since it blooms at same time with female P. vera `Kırmızı? and `Siirt? which are the most important commercial pistachio cultivars in Turkey. Pistacia vera L. propagation via classical breeding methods needs to be strengthened by in vitro propagation techniques for both plant improvement and large scale propagation. However, in vitro propagation can not achieve a maximum rate due to problems which can be observed in the micropropagation of this species such as shoot tip necrosis (STN), which is caused by culture conditions. Thus, trials were carried out to overcome the STN problem in mature pistachio plantlets by assessing various calcium chloride (CaCl2.2H2O) and boric acid (H3BO3) concentrations used as medium components, while silver nitrate (AgNO3) was used as an ethylene inhibitor under different light intensities (30 or 50 ?mol m-2 s-1). Significant interactions were observed between CaCl2 / H3BO3 concentrations and light intensities on STN occurrence in in vitro propagated shoots. Plantlets regenerated in a medium containing increased CaCl2 or H3BO3 concentrations showed fewer STN responses, especially under low photon flux densities in comparison to high light intensities. Although supplementation of AgNO3 under both light intensities decreased STN, higher AgNO3 concentrations had a toxic effect on the growth rate of the shoots. As a consequence, the STN problem in pistachio plantlets can be abrogated with elevated CaCl2 or H3BO3 concentrations under relatively low light intensities.Although there are several reports on micropropagation of pistachio and its rootstocks, to date there is no any effective study on mass production of the plants in bioreactor systems. Thus, micropropagation of juvenile pistachio shoot tips and nodal buds was also investigated in temporary immersion bioreactor system (RITA®) and conventional semi-solid medium in the frame of the Thesis. Among the tested immersion conditions, 24 min immersion every 16h reduced vitrification and improved proliferation in pistachio. Nodal buds were better than shoot tips as the highest multiple shoot formation were scored on MS medium containing 4 mg/L BA and 0.1 mg/L GA3 (M5) in RITA®. Although shoot tip necrosis was observed in shoots proliferated in semi-solid M5 medium, such symptom did not occur in shoots sprouted in RITA® system. Additionally, the optimized conditions were applied to nodal buds of mature male pistachio `Atlı? and micropropagation in the bioreactor system in comparison to semi-solid medium was also improved. Furthermore, in vitro rooting of pistachio plantlets, although with low rates (27.5%), was also achieved in RITA®. The overall results showed that RITA® system could be used in mass propagation of juvenile and mature pistachio as well as other woody plant species.Explant preparation involves wounding of the tissues which is known to cause oxidative stress both in culture initiation and in subculture. In the study, a non-destructive assay for hydroxyl radicals, using DMSO as a radical trap, was used to determine hydroxyl radical formation during tissue culture. The result showed that the shoot tips were subjected to oxidative stress especially in the beginning of culture period. In the frame of the Thesis, possible effects of oxidative stress and other tissue culture induced stresses on the genetic stability of pistachio were also investigated for the optimization of a safe in vitro propagation strategy for pistachio genetic resources. We investigated genetic stability of long-term (5-7 years) micropropagated plantlets, via apical bud proliferation followed by organogenesis using RAPD, ISSR and AFLP markers. Each molecular marker system showed genetic polymorphism between donor plant and its clones. 15 RAPD primers produced 141 scorable fragments and PIC value of the primers was 0.226. Genetic similarity value of the donor plant and its clones varied from 0.53 and 0.99 and the average genetic similarity values were determined as 0.84. 7 ISSR primers produced 62 scorable fragments and PIC value of the primers was 0.220. Genetic similarity value of the donor plant and its clones varied from 0.56 and 0.98 and the average genetic similarity values were determined as 0.82. In case of AFLP marker, totally 789 scorable bands were produced by 10 AFLP primer pairs and PIC value of the primers was 0.241. Genetic similarity value of the donor plant and its clones varied from 0.57 and 0.90 and the average genetic similarity values was determined as 0.75. Our results showed that applied marker systems are useful to reveal out specific genomic alterations associated with tissue culture variation. In conclusion, this is the first study on occurrence of genetic instability, which is slightly informative (PIC<0.25), in long-term micropropagated mature pistachio plantlets.As genetic erosion of pistachio has been occurring in the Mediterranean, Central and West Asia and North Africa, experiments were conducted to conserve mature `Atlı? pistachio germplasm by assessing both medium- and long-term conservation techniques. In medium-term conservation, our results showed that it was feasible to conserve the cultivar in the form of either microshoots or encapsulated shoot apices up to 12 months at 4°C in the dark. As regards long-term conservation, encapsulation-dehydration and droplet-vitrification techniques were assessed for cryopreservation of cold-hardened and osmoprotected shoot apices of mature `Atlı? cultivar. Among the methods tested, 13.6% of regrowth was achieved with incubation of explants in the droplets of vitrification solution for 150 min at 0°C followed by direct immersion in liquid nitrogen (LN), rapidly thawed and then cultured on Murashige and Skoog?s (MS) medium containing 1 mg/L BA and 0.5 mg/ L GA3. The developed droplet-vitrification technique appeared as a promising procedure for long-term preservation of shoot apices of mature pistachio germplasm. Moreover, assesment of genetic fidelity by RAPD revealed out high levels of genetic stability between donor plant and cryopreserved plants (similarity indexes between 0.959 and 0.973) after they were subcultured for at least 3 months. The detected low level of genetic instability, which is reasonably informative (0.5>PIC>0.25) could be due to the toxic effect of PVS2 and regeneration phase. The optimized conservation techniques, especially slow growth storage, could be applied to preserve other Pistacia species.In the frame of thesis, a research-review paper entitled ?Current status and conservation of Pistacia germplasm? and a research paper entitled ?In vitro conservation and cryopreservation of mature pistachio (Pistacia vera L.) germplasm? were published in the SCI indexed journals.The thesis was funded by a grant (209T030), from TUBITAK, the Scientific and Technological Research Council of Turkey. The thesis was also partially funded by a grant (2009-A10) from Gebze Institute of Technology.