Sıçan koroner mikrovasküler endotel hücre kültüründe rho/rho-kinaz yolağı ve nitrik oksid ilişkisi
The relation of rho/rhokinase pathway and nitric oxide in rat coronary microvascular endothelium cell culture
Yazar: RUKİYE NALAN TİFTİK
Danışman: DOÇ. DR. KANSU BÜYÜKAFŞAR
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2005
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Bu çalışmada sıçan koroner mikrovasküler endotel hücrelerinde Rho/Rho-kinaz yolağı ve nitrik oksit ilişkisi araştırıldı. Bu amaçla sıçan koroner mikrovasküler endotel hücreleri kültüre edildi.
Kültüre edilen sıçan koroner mikrovasküler endotel hücrelerinde nitrik oksit (NO) vericileri, gliseril trinitrat (GTN, 10-7 M-10-8 M), sodyum nitroprussiyat (SNP, 10-7 M-10 -8 M), DETA-NO (10-5 M-10-6 M) ve NaNO2 (10-3 M-10-4 M) ile intrasellüler kalsiyum düzeyini yükselterek endotelyal hücrelerde NO sentezini ve salıverilmesini artıran kalsiyum iyonofor, A-23187'nin (10-7 M ve 10-6 M) bazal şartlarda ve trombin varlığında Rho-kinaz (ROCK) enziminin (ROCK-1 ve ROCK-2 izoformlarının) ekspresyonları üzerindeki etkisi araştırıldı.
Çalışmada Wistar türü sıçanlar kullanıldı. Kalpler Langendorff kalp perfüzyon sistemine asılarak koroner mikrovasküler endotel hücreleri elde edildi. Hücreler kültür flasklarına ekilerek 37ºC'de %5 CO2'li ortamda inkübe edildi. Konfluent olan flasklar pasajlanarak çoğaltıldı.
3. pasaj koroner mikrovasküler endotel hücreleri, deneylerden 24 saat önce bölünmeleri durdurulup NO donörleri, NO sentezi ve salıverilmesini artıran ilaçlar ve Rho-kinaz enzim inhibitörü Y-27632 ile inkübe edildi.
	İnkübasyon sonrası Y-27632 ile inkübe edilen flaskların mediumları alınarak nitrit-nitrat düzeyleri Griess yöntemiyle ölçüldü. Diğer ilaçlarla inkübe edilen flasklardaki hücreler ise homojenize edilerek Western-Blot yöntemi ile ROCK (ROCK-1 ve ROCK-2) enzim ekspresyon düzeyleri ölçüldü.
Sonuç olarak, NO donörleri ve NO sentezini artıran A-23187, koroner mikrovasküler endotel hücrelerinde kontraktil bir protein olan Rho-kinaz enziminin ekspresyonunu azalttı. Bu bulgu, NO donörleri ve sentezini artıran ajanların yeni bir etki mekanizmasına işaret etmektedir.

Abstract:
In this study, we aimed to investigate possible relationship between Rho/Rho-kinase pathway and nitric oxide in rat coronary microvascular endothelial cells. Therefore, we cultured rat coronary microvascular endothelial cells.   
The effect of nitric oxide (NO) donors, glyceryl trinitrate (GTN, 10-7 M-10-8 M), sodium nitroprusside (SNP, 10-7 M-10-8 M), DETA-NO (10-5 M-10-6 M) and NaNO2 (10-3 M-10-4 M) and calcium ionophore A-23187 that induces NO synthesis and expression via increasing the intracellular calcium concentration, on the expression of ROCK enzyme (ROCK-1, ROCK-2) was investigated on basal as well as thrombin-stimulated conditions.
Wistar rats were used in the study. Coronary microvascular endothelial cells were obtained by the mounted rat hearts on a constant-flow Langendorff system. The cell suspensions were plated and incubated at 37 oC under 5 % CO2. 
The third passage coronary microvascular endothelial cells was made quiscent 24 hours before experimentation and than NO donors, A-23187 or the Rho-kinase inhibitor, Y-27632 was incubated.
After the incubation, the medium of flasks incubated with Y-27632 was taken and their nitrit-nitrate levels were measured by Griess method. The cells incubated with the other drugs was homogenized for measuring ROCK (ROCK-1, ROCK-2) enzyme expression levels by Western-Blotting technique.
As a result, NO donors and A-23187 increasing NO synthesis, downregulated the expression of contractile protein Rho-kinase in the coronary microvascular endothelial cells. This finding indicates a new mechanism of action of NO donors and A-23187 that induces NO synthesis.