Go proteininin alfa altbiriminin üçüncül yapısının deneysel ve kuramsal olarak incelenmesi
Studies on the tertiary structure of alpha subunit of go protein by experimintal and theoretical methods
Yazar: CEVDET NACAR
Danışman: PROF. DR. BEKİ KAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Ekspresyon = Expression ; Klonlama = Cloning ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Bu çalışmada, merkezi sinir sistemi ve beyinde yaygın bulunan Go proteininin? altbiriminin yapısı deneysel ve teorik yöntemlerle incelendi. Go?'nın üçüncül yapısıve işlevi tam olarak bilinmediğinden, benzeşim modellemisi çalışmalarıyla yapısı veişlevi aydınlatılmaya çalışıldı.Ekspresyon deneylerine pGEX-4T2/BL21(DE3)pLysS sisteminde başlandı.IPTG'ye bağlı yüksek ekspresyon düzeyine ulaşılarak Go protein büyük miktarlardaelde edilmesine karşın, protein çözünür olarak elde edilemedi. Proteinin çözünür kılmakiçin birinci deneysel strateji olarak farklı kültür koşulları denendi. Çözünürlük sorunuaşılamadığından ikinci deneysel stratejisi olarak protein inklüzyon cisimcikleri olaraksaflaştırılıp 1 x PBS'e karşı diyaliz edildi. Çözünürlük sorununun devam etmesi üzerineNDSB ajanı, pET-28a ve pQE-80 vektör sistemleri kullanılarak yeni girişimlerdebulunuldu. NDSB ajanı ve pET-28a sistemi ile çözünürlük sorunu aşılamamasına karşınpQE-80 vektör sistemi ile çözünür protein elde edilmiştir.Teorik çalışmada, yapısı bilinen proteinlerin dizileri kalıp olarak kullanılarakGo?'nın üçüncül yapısı modellendi. Genel G-proteini topolojisi elde edildi. Ancak 115-122. amino asitleri kapsayan bölgedeki halkanın yapısı dizi benzerliğinin yetersizliğinedeniyle son şekline kavuşturulamadı. Modele ilişkin moleküler dinamik çalışmalarısürmektedir.Anahtar Kelimeler: Go? proteini, klonlama, ekspresyon, saflaştırma, NDSB, benzeşimmodellemesi.

Abstract:
In this study, the tertiary structure of ?-subunit of Go (Go?) which is the mostabundant type of G-protein in central nervous system was studied by both experimentaland theoretical methods. Because the tertiary structure of Go? is unknown and thefunction of is not clear yet, in context of the structure-to-function paradigm it was aimedto propose arguments for the function of Go? using homology modelling.Expression experiments were initiated using pGEX-4T2/BL21(DE3)pLysSsystem. Due to IPTG dependent overexpression, large amounts of Go protein wasobtained but the protein was mostly insoluble. To overcome the solubility problem,different incubation temperatures and IPTG concentrations were tried as the firstexperimental strategy. This did not result in increase of soluble protein. As the secondexperimental strategy, the protein was purified as inclusion bodies and then dialysedagainst 1xPBS buffer. The soluble protein could not be obtained by this method, either.Two other attempts, one using NDSB, a mild solubilizing agent, and the other, cloningto the pET-28 vector system, did not work. Finally, Go protein was purified fromcytoplasmic fraction using pQE-80 vector system.In theoretical studies, the tertiary structure of Go? was modelled by usingknown structures that have high sequence similarity to our sequence as a template.Overall G-protein topology was obtained except for a loop encompassing residues 115-122. Molecular dynamical and molecular mechanics studies to refine the modelledstructure are in progress.Keywords: Go? protein, cloning, expression, purification, NDSB, homologymodelling.