LET-7B-5P ve LET-7B-3P miRNA'larının HL-60 ve NB4 akut myeloid lösemi hücre hatlarında fonksiyonel etkilerinin ve hedef genlerinin araştırılması
Investigation of the functional effects and target genes of LET-7B-5P and LET-7B-3P miRNAs in HL-60 and NB4 acute myeloid leukemia cell lines
Yazar: TUĞÇE NUR GÜMÜŞ
Danışman: PROF. DR. ŞÜKRÜ ÖZTÜRK ; DR. MURAT KAYA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Genler = Genes ; HL60 = HL60 ; Hücre dizisi = Cell line ; Lösemi-miyeloid = Leukemia-myeloid ; Mikro RNA = Micro RNA ; RNA = RNA

Özet:
Akut myeloid lösemi (AML), kemik iliğindeki (Kİ) olgunlaşmamış miyeloid öncül hücrelerinin olgunlaşma ve farklılaşma süreçlerinin durması sonucunda kontrolsüz ve klonal proliferasyonları ile karakterize olan heterojen bir lösemi türüdür. MikroRNA'lar (miRNA), 19-25 nükleotid uzunluğuna sahip tek zincirli, çeşitli genlerin ekspresyonunu regüle eden, kodlanmayan RNA'lardır. MiRNA'lar, çeşitli kanserlerde değişken ifade düzeyleri göstermektedir. Bu çalışmada, çeşitli kanserlerde tümör baskılayıcı role sahip let-7b-5p ve let-7b-3p miRNA'larının, AML'de çeşitli hücresel süreçlere etkisinin ve hedeflediği olası 7 önemli proto-onkogenin ifade seviyelerindeki değişimlerinin araştırılması amaçlanmıştır. Let-7b-5p ve let-7b-3p mimiklerinin, HL-60 ve NB4 AML hücrelerine Lipofektamin aracılığıyla transfeksiyonu yapılmıştır. Transfeksiyon validasyonu için TaqMan primer-problar kullanılmıştır ve qRT-PCR işlemi gerçekleştirilmiştir. Transfeksiyon işleminden sonra AML hücrelerinin canlılık tayini WST-8 yöntemi ile belirlenmiştir. Let-7b-5p ve let-7b-3p'nin apoptoza etkisi kolorometrik Kaspaz 3 kiti ile incelenmiştir. Let-7b-5p'nin, AML hücrelerindeki potansiyel hedef genleri olarak CDC25A, IL-8, CCND1; let-7b-3p'nin ise potansiyel hedef genleri olarak RORA, SYF2, BRF2 ve CREBZF in silico analizler sonucunda belirlenmiştir. Potansiyel olarak hedeflenen genlerin ifade değişimleri karşılaştırmalı olarak qRT-PZR yöntemi ile değerlendirilmiştir. Elde edilen sonuçların kontrol grupları ile kıyaslanarak istatistiki olarak analizi yapılmıştır. Hücre canlılığı oranlarında istatistiksel düzeyde anlamlı bir azalma gözlemlenmiştir (p<0,05). NB4 hücrelerinde, Kaspaz-3 oranı kontrol gruplarına kıyasla istatiksel olarak artış göstermiştir. Let-7b-5p ile transfekte olan grupta, kontrol grubuna göre IL-8 gen ifadesinin; let-7b-3p ile transfekte olan grupta, kontrol grubuna göre RORA  ve SYF2 gen ifadelerinin her iki hücre hattında da anlamlı seviyede azaldığı görülmüştür. Yaptığımız çalışmada ve literatür taramaları sonucunda ulaştığımız veriler, let- 7b-5p ve let-7b-3p ile transfekte edilen NB4 ve HL-60 hücrelerinde, hücre proliferasyonunun baskılanabileceği ve apoptozun indüklenebileceğini işaret etmiştir. Sonuçlar let-7b-5p ve let-7b-3p'nin, AML hücrelerinde IL-8, RORA ve SYF2 gen ekspresyonları üzerinde yönlendirici olabileceğini düşündürmektedir. Doku çalışmaları ve yapılacak diğer genetik analizlerle elde edilen sonuçların doğrulanmasıyla let-7b-5p ve let-7b-3p'nin, AML patogenezinde, teşhisinde, prognozunda ve erken tanısında kullanılma potansiyeli bulunmaktadır.

Abstract:
Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous type of leukemia characterized by uncontrolled and clonal proliferation of immature myeloid precursor cells in the bone marrow (CI) as a result of the arrest of maturation and differentiation processes. MicroRNAs (miRNA) are single-stranded, non-coding RNAs with a length of 19-25 nucleotides that regulate the expression of various genes. MiRNAs show variable expression levels in various cancers. In this study, it was aimed to investigate the effects of let-7b-5p and let-7b-3p miRNAs, which have tumor suppressor roles in various cancers, on various cellular processes in AML and the changes in the expression levels of 7 possible proto-oncogenes they target. Let-7b-5p and let-7b-3p mimics were transfected into HL-60 and NB4 AML cells by Lipofectamine. TaqMan primer-probes were used for transfection validation and qRT-PCR was performed. The viability of AML cells after transfection was determined by the WST-8 method. The effect of let-7b-5p and let-7b-3p on apoptosis was investigated with the colorometric Caspase 3 kit. CDC25A, IL-8, CCND1 as potential target genes of Let-7b-5p in AML cells; RORA, SYF2, BRF2 and CREBZF were identified as potential target genes of let-7b-3p as a result of in silico analysis. Expression changes of potentially targeted genes were evaluated comparatively by qRT-PCR method. The results obtained were compared with the control groups and statistically analyzed. A statistically significant decrease in cell viability rates was observed (p<0.05). Caspase-3 ratio was statistically increased in NB4 cells compared to control groups. In the group transfected with Let-7b-5p, compared to the control group, IL-8 gene expression; In the group transfected with let-7b-3p, RORA and SYF2 gene expressions were found to be significantly decreased in both cell lines compared to the control group. indicated that cell proliferation could be suppressed and apoptosis could be induced in NB4 and HL-60 cells. The results suggest that let-7b-5p and let-7b-3p may be drivers of IL-8, RORA and SYF2 gene expressions in AML cells. Let-7b-5p and let-7b-3p have the potential to be used in the pathogenesis, diagnosis, prognosis and early diagnosis of AML by confirming the results obtained by tissue studies and other genetic analyzes to be performed.