Zebra balığından (Danio rerio, Cyprinidae, Teleostei) primer hepatosit kültürü eldesi ve bazı zehirsizleştirme enzimleri aktivasyonunda kullanılması
Maintenance of primary hepatocytes culture of zebrafish (Danio rerio, Cyprinidae, Teleostei) its usage for activation of some detoxification enzymes
Yazar: BURAK GÖKÇE
Danışman: PROF. DR. SEMA İŞİSAĞ ÜÇÜNCÜ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmanın amacı zebra balığı,  Danio rerio  (Cyprinidae, Teleostei) hepatositlerinden mekanik izolasyon ve tripsinle enzimatik parçalama olarak iki farklı yöntem kullanılıp primer kültür elde edilmesidir. 24-kuyucuklu kültür plakları alternatif olarak iki tip, jelatinsiz ve jelatinli hazırlanmıştır. Hücre süspansiyonları izolasyondan sonra bu plaklara aktarılmış ve yayılmaları beklenmiştir. Hücreler %10 fetal bovin serumla (FBS) desteklenen L15 besiyeri ile doğrudan doğruya karıştırılmış ve inkubasyon için atmosferik havada, 25°C sıcaklıkta kültür kaplarına ekilmiştir. Hücre canlılığı ve yoğunluğu 7 gün boyunca MTT testi ile değerlendirilmiştir. Hücre yayılımı ve adhezyonu bağlamında en iyi sonucu enzimatik parçalama vermiştir. Jelatinsiz ve jelatinli yapılandırma hepatositlerin yoğunluğu ve canlılığı üzerinde etkili değildir.
Primer hepatosit kültürlerinde ayrıca, biyobelirleyici kapasitelerinin değerlendirilmesi amacıyla katalaz (CAT), glutaton S-transferanz ve 7-etoksirezorufin O-deetilaz (EROD) olarak belirlenen enzimlerinin aktiviteleri spektrofotometrik olarak ölçülmüş ve istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır.
Hepatositler CAT ve GST indüklemesi için iyi bilinen bir oksidatif kimyasal olarak 50, 100 ve 150 µM hidrojen peroksite 18s maruz bırakılmış, EROD ise 12s süreyle 100, 250, 500 nM konsantrasyonlarda 3-metilkolantren (3-MC, bir poliaramatik hidrokarbon=PAH) ile indüklenmiştir. Bütün enzimlerin aktivitesi uygulama süresi ve konsantrasyona bağlı olarak artmakla birlikte, en yüksek düzeyde indüksiyon, PAH grubu ve benzer kimyasalların izlenebilmesi için çok uygun bir biyoişaretleyici gibi görünen EROD'da kaydedilmiştir. Farklı izolasyon yöntemleri ve jelatinsiz-jelatinli yapılandırma, enzim testlerinde de herhangi bir farklılığa yol açmamıştır.
Hayvan örnekleri kullanımına göre daha kısa sürede toplanan veriler,  zebra balığı primer hepatosit kültürünün deney materyali olarak birçok avantaj sunduğunu kuvvetle doğrulamaktadır. Hepatosit kültürleri kimyasal maruziyeti-yanıt bağlantılarını kontrollü koşullarda değerlendirmeyi kolaylaştırmaktadır. Primer hepatosit kültürleri ve hücre hatları bütünsel anlamda, çevresel kirleticilerin insan sağlığıyla bağlantılı olarak araştırılması için mükemmel laboratuvar modelleridir.

Abstract:
The main purpose of this study is to maintain a primary culture of hepatocytes from the zebrafish, Danio rerio  (Cyprinidae, Teleostei) by using two different methodologies; mechanically isolation and enzyme dissociation with trypsin. Two types of 24-well tissue culture plates were constructed as gelationus and non-gelatinous, alternativelly.  After isolation, cell suspensions were poured onto plates and allowed to jellify.  Cells were directly mixed with basal medium, L15 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), and then seeded in flasks for incubation under atmospheric air at 25°C. Cell viability and proliferation were evaluated during 7 days with MTT assay. The best results in terms of cell dissociation and adhesion has been achieved by means of the enzymatic dissociation. Neither gelatinous nor non-gelatinous construction were effective on hepatocyte yields and cellular viabilities. 
In order to assesment of bioindication capacities,  activities of the enzymes determinated as catalase (CAT), glutathyone-S transferanse (GST) and 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) were also measured spectrophotometrically and compared statistically in freshly isolated hepatocytes. Hepatocytes were exposed for 18h to 50, 100 and 150 µM hydrogene peroxide, a well-known oxidative agent, for induction of CAT and GST. EROD was also inducted by 3-methylcholanthrene (3-MC, a polyaromatic hydrocarbon=PAH) for 12h at the concentrations of 100, 250, 500 nM. Although the activities of all of these enzymes were increased in a time-and concentration-dependent manner, maximal induction was recorded for EROD which is seemed to be an ideal biomarker for monitoring contaminants such as PAHs. Different isolation methods and gelatinous or non-gelatinous construction were not caused any differences in enzyme assays, too. 
As expected, the results which are obtained more rapidly than with intact animals, strongly confirm that primary hepatocyte culture of zebrafish offer several advantages as experimental materials. Cultured hepatocytes make it easy to consider the exposition-response relationships for chemicals under controlled conditions. The overall position of primary hepatocyte cultures and cell lines can serve as perfect laboratory models for researching ecotoxicants of concern to human health.