Peroksidaz özelliği gösteren sitrat kaplı altın nanoparçacıkların kataliz mekanizmasının ve kinetiğinin teorik ve deneysel düzlemde incelenmesi
The research of the catalysis mechanism and kinetics for peroxidase-like citrate capped gold nanoparticles on theoretical and experimental bases
Yazar: BUSE ALTIN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSTAFA SALİH HIZIR
Bursa Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Nano parçacık = Nano particles ; Nanomateryaller = Nanomaterials ; Peroksidaz = Peroxidase

Özet:
Nanozim olarak adlandırılan yapay enzimler değişen pH ve sıcaklık koşullarına karşı yüksek dayanıklılıkları, düşük maliyetleri, istenen boyut, şekil ve yüzey özelliğinde hazırlanabilmeleri, yüksek aktiviteleri ve sundukları eşsiz elektrokimyasal özellikler ile çok çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Doğal enzimlere benzer şekilde peroksidaz, oksidaz, katalaz ve süperoksit dismutaz benzeri aktivite göstermektedirler. Nanozimlerin boyutu, şekli, yüzey modifikasyonu, net yükü gibi faktörler enzim benzeri aktivitesinin belirlenmesinde oldukça önemlidir ve bu parametreler değiştirilerek farklı etkinlik düzeyinde nanozimler tasarlanabilmektedir. AuNP, sahip olduğu peroksidaz benzeri aktivite ile araştırmacıların ilgisini çekmektedir. Özellikle sitrat-kaplı AuNP bu anlamda çok geniş bir uygulama alanına sahiptir. AuNP gibi nanozimler doğal enzimlere iyi bir alternatif oluştursa da, yapıları ve kataliz mekanizmaları doğal enzimlerden farklı olabilir. Bu çalışmada, sitrat kaplı AuNP'nin kataliz mekanizmasının, aktif bölgesine substratını bağlayan biyolojik bir enzimden farklı olarak substratların yüzeydeki bağlanma bölgelerine adsorpsiyonuna dayalı olarak gerçekleştiği önerilmiş ve nanozimin çalışma prensibi detaylı olarak incelenmiştir. AuNP'nin substratları H2O2 ve kromojenik bir substrat olan 3,3ʹ,5,5ʹ-tetrametilbenzidin (TMB)' dir. TMB yerine farklı substratlar da kullanılabilmektedir. Önerilen kataliz mekanizmasına göre her iki substrat da AuNP yüzeyinde bulunduğu düşünülen bağlanma bölgelerine adsorplanır. Adsorpsiyon H2O2 molekülü için hidrojen bağları yardımıyla gerçekleşirken, pozitif yüklü TMB molekülü elektrostatik etkileşimler vasıtasıyla negatif yüklü bağlanma bölgelerine adsorplanmaktadır. AuNP yüzeyindeki bir bağlanma bölgesinde adsorplanmış H2O2 molekülü, Fenton benzeri reaksiyon sonucunda hidroksil radikali (•OH) açığa çıkarır ve bu •OH ile komşu bağlanma bölgesine adsorplanmış TMB arasında hız sınırlayıcı basamak olan ve TMB'nin yükseltgendiği reaksiyon gerçekleşir. Açıklanan şekilde gerçekleşen bir yüzey reaksiyonu için yaygın olarak kabul edilen Michaelis-Menten mekanizması yerine bu çalışmada Langmuir-Hinshelwood mekanizması önerilmektedir. Devamında sitrat kaplı AuNP için kataliz mekanizmasının, yüzeyde yer alan bağlanma bölgelerine adsorpsyon üzerinden ilerlediğini desteklemek üzere DNA ile modifiye edilmiş sitrat kaplı AuNP ve sisteamin kaplı AuNP modelleri incelenmiştir. Parçacık yüzeyinde DNA varlığının TMB için mevcut negatif yük miktarını arttırarak H2O2 için de yeni hidrojen bağı olasılıkları oluşturarak adsorpsiyon miktarını arttıracağı öngörülmüştür. Sisteamin kaplı nanoparçacık için ise yüzeyde yer alan amin grupları daha az hidrojen bağı olasılığı ve belirli pH aralığında pozitif yük demektir ki bu da her iki substratın da daha düşük miktarda adsorpsiyonu demek olacaktır. Beklendiği gibi yüzeyde adsorpsiyon için daha fazla bağlanma bölgesi bulunmasının adsorplanan substrat miktarını ve dolayısıyla AuNP için nanozim aktivitesini arttırdığı ortaya konulmuştur. Benzer ilişki daha az bağlanma bölgesi için daha düşük toplam aktivite şeklinde de gözlenmektedir. Böylece literatürde de nanozimler için sıkça önerilen Michaelis-Menten mekanizması dışında sitrat kaplı AuNP için Langmuir-Hinshelwood mekanizmasının önerilebileceği ve kataliz için gerçekleşen yüzey reaksiyonu sebebiyle daha açıklayıcı olacağı düşünülmektedir. Mekanizma incelemesinin ardından Michaelis-Menten kinetiği ile Langmuir-Hinshelwood kinetiğinin kıyaslanması için matematiksel modelleme yapılmış ve her iki kinetik modelin de sitrat kaplı AuNP için deneysel bir veri seti ile uyumluluğu test edilmiştir. Bu çalışma sonucunda her iki modelin de hem birbiri ile hem de deneysel veri ile oldukça uyumlu sonuçlar verdiği görülmüştür. Elde edilen sonuçlara göre nanozimler için bugüne kadar kabul edilenden farklı olarak sitrat kaplı AuNP için Michaelis-Menten yerine Langmuir-Hinshelwood mekanizması ve kinetiğinin kullanılabileceği ve daha açıklayıcı olacağı sonucuna varılmıştır.

Abstract:
The artificial enzymes, known as nanozymes, have wide range of applications by virtue of high stability against varying pH and temperature, low cost, preparation with desired size, shape and surface properties, high activity and unique electrochemical properties. Similar to some natural enzymes, they show activities such as peroxidase, oxidase, catalase and superoxide dismutase. Size, shape, surface modifications and net charge of nanozymes are critical to determine their enzyme-like activity. Those parameters can be tuned in order to design nanozymes with different levels of activity. The peroxidase-like activity of AuNPs make them attractive for researchers. Especially citrate-capped AuNPs have a wide range of applications. Although nanozymes such as AuNPs can be alternatives to natural enzymes, their structure and catalysis mechanisms could be different.  In this study, the working principle of a nanozyme, citrate-capped AuNPs, was researched in detail and the catalysis mechanism was proposed to occur based on the adsorption of the substrates at numerous binding sites on the surface instead of substrates binding to a single active site as it happens with biological enzymes. Substrates of AuNPs are H2O2 and a chromogenic substrate, 3,3ʹ,5,5ʹ-tetramethylbenzidine (TMB). Different substrates can also be used instead of TMB. According to the proposed catalysis mechanism, both substrates adsorbed on the binding sites which are expected to be on AuNP surface. While H2O2 molecules are adsorb through hydrogen bonding, positively charged TMB molecules are adsorbed at negatively charged binding sites via electrostatic interactions. Adsorbed H2O2 molecules reveal hydroxyl radicals (•OH) as a result of a Fenton-like reaction, and the surface reaction in which TMB is oxidized takes place between •OH and adjacently adsorbed TMB as the rate-determining step. According to the explained surface reaction, in this study, Langmuir-Hinshelwood mechanism was proposed rather than commonly accepted Michaelis-Menten mechanism. Later, in order to elaborate the idea that the catalysis occurs for AuNPs through the adsorption at the binding sites all over the surface, DNA-modified citrate-capped AuNP and cysteamine-capped AuNP models were examined. It is hypothesized that the presence of DNA on particle surface improves adsorption by both increasing negative charge for TMB and providing new hydrojen bonding possibilities for H2O2. On the other hand, the amine groups on the surface of the cysteamine-capped particles mean less hydrogen bonding possibilities and positive charge in certain pH range, which results in reduced adsorption of both substrates. Hence, it was revealed that the presence of higher number of binding sites on the surface increases the amount of adsorbed substrates and thus the nanozyme activity for AuNPs. Similar relation can be observed as lowered total activity for smaller number of binding sites. So, the reasoning revealed that for a better explenation for nanozyme catalysis which includes surface reactions, Langmuir-Hinshelwood mechanism can be suggested rather than Michaelis-Menten mechanism which has been generally suggested in the literature for nanozymes. Following the mechanism discussion, mathematical modelling carried out for a comparison between Michaelis-Menten and Langmuir-Hinshelwood kinetics so that the correlation of both kinetic models with an experimental data set for citrate-capped AuNPs can be tested. As a result, a high correspondence both between two models and to the experimental data was observed. According to the results, it was deduced that Langmuir-Hinshelwood mechanism and kinetics can be utilized for citrate-capped AuNPs for a well-explained approach instead of Michaelis-Menten that has been rashly being used so far.