TGF-B1 gen terapisi yapılmış insan adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden elde edilen koşullu besiyerinin meme kanser hücrelerinde cd44 inhibitör ve tümör baskılayıcı etkisinin araştırılması: In vitro çalışma
Investigation of CD44 inhibitory and tumor suppressive effect in breast cancer cells of conditioned medium obtained from TGF-B1 transfected human adipose-derived mesenchymal stem cells: In vitro study
Yazar: HASAN SALKIN
Danışman: PROF. DR. BİRKAN YAKAN ; PROF. DR. SAİM ÖZDAMAR
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Gen tedavisi = Gene therapy ; Genler-tümör baskılayıcı = Genes-suppressor-tumor ; Kök hücreler = Stem cells ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Transforme edici büyüme faktörleri = Transforming growth factors

Özet:
Bu çalışmanın amacı, TGF-B1 transfekte adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücre (AD-MKH)'lerden elde edilen sekretom kullanılarak hem AD-MKH'lerden salınan anti-tümörojenik faktörlerle hem de TGF-B1/SMAD sinyal yolağının aktifleştirilmesiyle meme kanser hücrelerinde CD44'ü ve tümör hücrelerine ait biyolojik özellikleri baskılamaktır.
AD-MKH'lere TGF-B1 gen terapisi yapılarak bu hücrelerin ortama saldıkları faktörler koşullu besiyeri olarak toplanmış olup (TGF-B1-CM) elde edilen koşullu besiyerleri meme kanser hücre hatları ve fibroblast hücrelerine uygulanmıştır. Uygulamalar sonrası CD44 ifadeleri western blot ve immünfloresan boyamalarla değerlendirilmiştir. TGF-B1/SMAD sinyal yolağına ait proteinlerin analizi western blot ile gerçekleştirilmiştir. Meme kanser hücreleri ve fibroblastlar üzerinde proliferasyon MTT testi ile çalışılmıştır. Apoptoz, hücre döngüsü, mitokondri membran depolarizasyonu ve DNA hasarı testleri Muse Cell Analyzer cihazında uygun kitlerle gerçekleştirilmiştir. Hücresel senesens beta-galaktozidaz enzim aktivitesi ile ölçülmüştür ve migrasyon testleri yara iyileşmesi deneyleriyle gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel analizler GraphPad Prism 6 yazılımıyla gerçekleştirilmiştir. p<0.05 olan veriler anlamlı kabul edilmiştir. 
Bulgularımız, TGF-B1 transfeksiyonunun AD-MKH'lere başarılı şekilde gerçekleştirildiğini ve koşullu besiyerlerinin başarılı şekilde elde edildiğini göstermiştir. TGF-B1-CM meme kanser hücrelerine uygulandığında fenotiplerini bozduğu görülmüştür. Meme kanser hücrelerinde TGF-B1-CM uygulaması apoptozu kaydadeğer şekilde artırmıştır, proliferasyonlarını baskılamıştır ve hücre döngüsünün G0/G1 evresinde tutuklamıştır. TGF-B1-CM uygulaması meme kanser hücrelerinde mitokondri depolarizasyonunu indüklemiştir. Hücresel senesenste gruplar arasında anlamlı fark bulunmamıştır. DNA hasarı TGF-B1-CM uygulaması ile meme kanser hücrelerinde indüklenmiştir. Meme kanser hücre migrasyonları TGF-B1-CM uygulaması ile baskılanmıştır. Fibroblast hücrelerinde ise; TGF-B1-CM uygulaması bu hücrelerin daha fazla iyileşmesine neden olmuştur. TGF-B1-CM uygulanan meme kanser hücrelerinde TGF-B1/SMAD sinyal yolağı aktifleşmiştir. MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde pSMAD2/3 protein ifadeleri artmış, SMAD4 ifadesi ise baskılanmıştır. Bununla birlikte CD44 protein ifadeleri SMAD sinyal yolağında meydana gelen bu değişimlere göre baskılanmıştır.
Bu çalışma ile hedefe yönelik, meme kanser hücrelerini baskılayıcı, fibroblast hücrelerini aktifleştirici teröpatik biyolojik bir ürün elde edilmiştir. TGF-B1-SMAD-CD44 yolağının tam olarak aydınlatılması adına gerçekleştirmiş olduğumuz çalışma literatüre ciddi katkılar sağlayacaktır. Çalışmamızın sonuçları ile in vivo deneyler gerçekleştirilebilir.

Abstract:
The aim of this study was to suppress CD44 and the biological properties of tumor cells in breast cancer cells with both anti-tumorigenic factors released from AD-MSCs and activation of TGF-B1 / SMAD signaling pathway using secretome obtained from TGF-B1 transfected adipose derived mesenchymal stem cells (AD-MSCs).
By applying TGF-B1 gene therapy to AD-MSCs, the factors that these cells release into the environment were collected as conditional media (TGF-B1-CM), and the conditional media obtained were applied to breast cancer cell lines and fibroblast cells. CD44 expressions after applications were evaluated by western blot and immunofluorescent staining. Analysis of proteins belonging to the TGF-B1 / SMAD signaling pathway was performed by western blot. Proliferation was studied with the MTT test on breast cancer cells and fibroblasts. Apoptosis, cell cycle, mitochondrial membrane depolarization and DNA damage tests were performed in Muse Cell Analyzer device with appropriate kits. Cellular senescence was measured by beta-galactosidase enzyme activity and migration tests were performed by wound healing experiments. Statistical analyzes were performed with GraphPad Prism 6 software. Data with p <0.05 were considered significant.
Our findings showed that TGF-B1 transfection was successfully performed into AD-MSCs and conditioned media were obtained successfully. When TGF-B1-CM is administered to breast cancer cells, it has been found to impair their phenotype. TGF-B1-CM administration in breast cancer cells significantly increased apoptosis, suppressed their proliferation, and arrested them in the G0 / G1 phase of the cell cycle. TGF-B1-CM administration induced mitochondrial depolarization in breast cancer cells. There was no significant difference between the groups in cellular senescence. DNA damage was induced in breast cancer cells by the application of TGF-B1-CM. Breast cancer cell migrations were suppressed by the application of TGF-B1-CM. In fibroblast cells; The application of TGF-B1-CM caused these cells to heal more. TGF-B1 / SMAD signaling pathway was activated in breast cancer cells treated with TGF-B1-CM. Expressions of pSMAD2 / 3 protein were increased in MCF-7 and MDA-MB-231 cells, while SMAD4 expression was suppressed. However, CD44 protein expressions were suppressed according to these changes in the SMAD signaling pathway.
With this study, a targeted therapeutic biological product that suppresses breast cancer cells and activates fibroblast cells has been obtained. Our study to fully elucidate the TGF-B1-SMAD-CD44 pathway will provide serious contributions to the literature. In vivo experiments can be performed with the results of our study.