Meme kanserinde foliküler yardımcı T lenfositlerin fonksiyonel ve moleküler analizi
Functional and molecular analysis of follicular helper T lymphocytes in breast cancer patients
Yazar: İZEL YILMAZ
Danışman: PROF. DR. HALUK BARBAROS ORAL ; PROF. DR. GÜNEŞ ESENDAĞLI
Bursa Uludağ Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İmmünoloji Ana Bilim Dalı / İmmünoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Alerji ve immünoloji = Allergy and immunology ; Lenf nodları = Lymph nodes ; Lenfosit aktivasyonu = Lymphocyte activation ; Lenfositler = Lymphocytes ; Lenfositler-tümör enfiltre edici = Lymphocytes-tumor infiltrating ; Meme hastalıkları = Breast diseases ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; T lenfositleri = T lymphocytes ; İmmünite-hücresel = Immunity-cellular ; İmmünofenotip tayini = Immunophenotyping

Özet:
T foliküler yardımcı (Tfh) hücreler, lenf nodu (LN)'nda antijene özgü antikor üreten B hücrelerinin olgunlaşmasında görev alır. Kanser hastalarının LN ve periferik kanlarında bulunan Tfh hücrelerinin moleküler ve fonksiyonel karakterizasyonu net bir şekilde tanımlanmamıştır. 

Bu çalışmada fenotipik karakterizasyon için meme kanseri hastaların LN ve periferik kanından izole edilen lenfositler kullanıldı ve CD4, CD8, PD-1, CXCR5, CCR7, CD45RO, CD127, CD25, TIM-3, LAG-3, CTLA-4 ve ICOS ifadeleri, akım sitometresi aracılı analiz edildi ve klinik veriler ışığında incelendi. LN kesitlerinden CD4, CD19 ve BCL-6 immünofloresan boyamalar yapıldı. Fonksiyonel analizlerde, CD4+ T hücreleri izole edildi ve anti-CD3/CD28 uyarımı sonrası zamana bağlı; PD-1 ve CXCR5 ilişkili, erken aktivasyon ve inhibitör belirteçlerinin ifadelerindeki değişimler ve proliferasyonları incelendi. Uyarım sonrası CD4+ T hücreler PD-1 ve CXCR5 bağımlı olarak izole edildi ve bu hücrelerdeki BCL-6, ICOS ve TIM-3 ifadeleri immünfloresan boyama ile ve bu popülasyonlardaki diğer T hücre alt grupları ile ilişkili moleküllerinin mRNA düzeyi RT-PZR tekniği ile araştırıldı.

Sonuç olarak, LN'de dolaşıma kıyasla daha yüksek Tfh ilişkili CD4+PD-1+CXCR5+ hücreler tespit edildi, bu hücrelerin CCR7+CD45RO+ merkezi bellek fenotipik özelliği taşıdığı ve yüksek oranda CD127, TIM-3 ve ICOS ifadesine sahip olduğu saptandı. Ayrıca, CD4+PD-1+CXCR5+ hücrelerinin yüksek oranda çoğalma kapasitesine sahip olduğu ve uyarım ile erken aktivasyon ve inhibitör reseptör ifadelerini arttırdığı tespit edildi. Uyarım sonrası CD4+PD-1+CXCR5+ hücrelerinde yüksek oranda BCL-6 mRNA düzeyi, ICOS ve TIM-3 ifadesi de görüldü. Böylelikle çalışmamız, Tfh hücrelerinin esas olarak LN'de yüksek çoğalma kapasitesindeki CD4+PD-1+CXCR5+BCL-6+ICOS+TIM-3+ hücreler olarak karakterize edilebileceğine ışık tutmaktadır ve bu hücrelerinin aktivasyonunun hedeflenmesi ile anti-kanser hümoral bağışıklık yanıtını indüklenebileceğini düşünülmektedir.

Abstract:
T follicular helper (Tfh) cells are involved in the maturation of antigen-specific antibody-producing B cells in the lymph node (LN). The molecular and functional characterization of Tfh cells found in the LN and peripheral blood of cancer patients has not been clearly defined.

In this study, lymphocytes isolated from the breast cancer patients' LN and peripheral blood were used in phenotypical characterization; CD4, CD8, PD-1, CXCR5, CCR7, CD45RO, CD127, CD25, TIM-3, LAG-3, CTLA-4 and ICOS expression were analyzed with flow cytometer and evaluated in the light of clinical data. Immunofluorescence staining was conducted for CD4, CD19 and BCL-6 on LN sections. In functional analysis, CD4+ T cells were isolated from samples, stimulated with anti-CD3/CD28 microbeads and time dependent expression of PD-1 and CXCR5 related early activation and inhibitory markers and their proliferation were examined. After stimulation, CD4+ T cells were isolated as PD-1 and CXCR5 dependent and in these cells BCL-6, ICOS and TIM-3 expressions were investigated by immunofluorescence staining and the mRNA level of molecules which are associated with other T cell subgroups were analysed with RT-PZR technique.

As a result, higher Tfh related CD4+PD-1+CXCR5+ cells were detected in the LN compared to the circulation, these cells were found to have CCR7+CD45RO+ central memory phenotypic features and have high levels of CD127, TIM-3 and ICOS expression. In addition, it was determined that CD4+PD-1+CXCR5+ cells have a higher proliferation capacity and increase early activation and inhibitory receptor expressions with stimulation. High levels of BCL-6 mRNA, ICOS and TIM-3 expression were also observed in CD4+PD-1+CXCR5+ cells after stimulation. Thus, our study highlights that Tfh cells can be characterized mainly as CD4+PD-1+CXCR5+BCL-6+ICOS+TIM-3+ cells with high proliferative capacity in LN, and it is suggested that targeting the activation of these cells can induce anti-cancer humoral immune response.