Meme kanseri tedavisinde manyetik hipertermi ve gen terapisi ile dual terapi yaklaşımı
Dual therapy approach with magnetic hyperthermia and  gene therapy in breast cancer treatment
Yazar: FATMA TURHAN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ YAĞMUR ÜNVER ; PROF. DR. AHMET MAVİ
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Gen Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Gen tedavisi = Gene therapy ; Hipertermi = Hyperthermia ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms

Özet:
Amaç: Bu çalışmada meme kanseri için kullanılmaya aday hedeflenebilir, etkili ve özgün bir yaklaşım olan manyetik hipertermi indüksiyonlu gen terapisi (dual terapi) yönteminin geliştirilmesi amaçlandı.
Yöntem: Öncelikle ısı ile indüklenebilir promotöre (HSP promotörü; PHSP) sahip rekombinant pHSP-GFP elde edildi. Daha sonra durdurma kodonu içeren kodon optimize azurin geninin, pHSP-GFP'ye klonlanmasıyla pHSP-Azu elde edildi. Elde edilen rekombinant DNA'lar Sanger veya yeni nesil dizileme (Next Generation Sequencing) ile doğrulandı. Çalışmada gen aktarım ve hipertermi aracı olarak kullanılacak olan manyetik ve biyo-uyumlu nanopartiküllerin (MSNP-NH2) TEM, DLS ve VSM analizleriyle karakterizasyonları yapılıp, AC manyetik alan altında ısıtma kapasitesi belirlendi. MSNP-NH2'lerin plazmit DNA'ları bağlama ve salma yetenekleri DLS ölçümü ve jel elektroforezi ile tespit edildi. Manyetofektinler (MSNP-NH2+DNA+PEI) mıknatıs yardımı ile hücrelere gönderildi (manyetofeksiyon). Transfeksiyon etkinliği konfokal mikroskop, akış sitometrisi ve spektrofotometrik ölçüm ile belirlendi. Ayrıca manyetik hiperterminin tümörijenik (MCF-7) ve tümörijenik olmayan (MCF-10A) hücre hatları üzerindeki etkisi hücre canlılığı testi (MTS) ile ortaya konuldu. Son olarak, hipertermi ve gen terapisinin uygulandığı hücrelerde ikili terapinin etkinliği, apoptoz testi ve Real-Time PCR (qRT-PCR) ile gösterildi.
Bulgular: Çalışma sonucunda elde edilen verilere göre MSNP-NH2'lerin plazmit DNA'ları tutabildiği ve hücre içinde bırakabildiği görüldü. PHSP'nin inkübatör veya AC manyetik alan aracılığıyla indüklenebildiği ve hedef proteinlerin hücre içerisinde üretilebildiği belirlendi. Dual terapi uygulanan hücrelerde hem apoptoz testi hem de qRT-PCR ile belirlenen BAX/BCL2 oranlarına göre MCF-7 hücrelerinin apoptotik olmayan yolla öldüğü tespit edildi. 
Sonuç: Bu çalışmada, dual terapinin MCF-10A üzerindeki etkisinin sınırlı olduğu, MCF-7 üzerindeki etkisinin ise daha fazla olduğu gösterildi. Ayrıca hücrelerin apoptotik yola kıyasla nekrotik yolu daha çok tercih ettiği gözlendi.

Abstract:
Purpose: In this study, it was aimed to develop magnetic hyperthermia induction gene therapy (dual therapy), which is a targetable, effective and unique approach for breast cancer.
Method: First, recombinant pHSP-GFP with a heat-inducible promoter (HSP promoter; PHSP) was obtained. Then, pHSP-Azu was obtained by cloning the codon-optimized azurin gene containing the stop codon into pHSP-GFP. The resulting recombinant DNAs were confirmed by Sanger or Next Generation Sequencing. In the study, magnetic and biocompatible nanoparticles (MSNP-NH2), which will be used as a gene transfer and hyperthermia tool, were characterized by TEM, DLS and VSM analyses and their heating capacity under AC magnetic field was determined. The ability of MSNP-NH2s to bind and release plasmid DNA was determined by DLS measurement and gel electrophoresis. Magnetofectins (MSNP-NH2+DNA+PEI) was sent to the cells with the help of magnet (magnetofection). Transfection efficiency was determined by confocal microscopy, flow cytometry and spectrophotometric measurement. In addition, the effect of magnetic hyperthermia on tumorigenic (MCF-7) and non-tumorigenic (MCF-10A) cell lines was revealed by cell viability test (MTS). Finally, the efficacy of dual therapy in cells with hyperthermia and gene therapy was demonstrated by apoptosis test and Real-Time PCR (qRT-PCR).
Findings: According to the data obtained from the study, it was seen that MSNP-NH2s could hold plasmid DNAs and leave them in the cell. It was determined that PHSP could be induced by incubator or AC magnetic field and target proteins could be produced inside the cell. According to the BAX/BCL2 ratios determined by both apoptosis test and qRT-PCR in the dual therapy cells, it was determined that MCF-7 cells died in a non-apoptotic way.
Results: This study showed that the effect of dual therapy on MCF-10A was limited, while the effect on MCF-7 was greater. In addition, it was observed that the cells preferred the necrotic pathway more than the apoptotic pathway.