Şarka hastalığı etmeni olan şarka virüsünün (Plum Pox Virus) bulaşıcı (enfektif) komplementer DNA (cDNA) vektörünün geliştirilmesi
The construction of an infectious complementary DNA (cDNA) vector of sharka virus (Plum Pox Virus) wich is sharka disease agent
Yazar: SERAP DEMİREL
Danışman: DOÇ. DR. MİKAİL AKBULUT ; YRD. DOÇ. DR. KAHRAMAN GÜRCAN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, kayısı, erik ve diğer sert çekirdekli meyveleri etkileyen en tahrip edici hastalık olarak değerlendirilen şarka hastalığına neden olan Plum pox virüsünün cDNA vektörleri Plum pox virüs M, Plum pox virüs D ve sadece Türkiye' ye özgü ırk olan Plum pox virüs T ırkları için elde edilmiştir. Virüs bulaşık doku örnekleri Kayseri, Aksaray ve İstanbul' dan toplanmıştır. Virüs ırkları gerçek zamanlı PZR ile belirlenmiş ve cDNAlar hem tesadüfi (random) hemde oligo dT primerleri kullanılarak RT PZR aracılığıyla oluşturulmuştur. Oluşturulan cDNAlar Plum pox virüs T, M ve D ırklarının tüm genomik DNAsını çoğaltmak için kalıp olarak kullanılmıştır. Her bir virüs genomunu klonlamak için Topo XL klonlama kiti kullanılmış ve ligasyon karışımı elektrokompetent E. coli hücrelerine aktarılımştır. Rekombinant plazmitleri içeren E. coli hücreleri seçici ortamda büyütülerek insörtü taşıdığı varsayılan koloniler alkali lizis metodu ile belirlenmiş ve plazmitler daha ayrıntılı analizler için izole edilmiştir. Plazmitlerde tüm genomik cDNAnın varlığı PZR ve in vitro transkripsiyon aracılığıyla doğrulanmıştır. Bu vektörler konak-virüs etkileşimlerinin çalışılmasında, dizi yönlendirilmiş mutagenez, RNA sessizleştirme, virüs replikasyonu, virüsün kısa ve uzun mesafeli hareketi, hastalığın gelişme mekanizması ve transgenik olmayan tarzda bitkilerde yabancı genlerin ekpresyonu çalışmalarında kullanılma potansiyeline sahiptir.

Anahtar Kelimeler: Şarka hastalığı, Plum Pox virüs, bulaşıcı (enfektif) cDNA vektörü, klonlama, elektrotransformasyon

Abstract:
In this study, a cDNA vector was developed for Plum Pox Virus (PPV), the causal agent of sharka disease which is considered to be the most detrimental virus disease affecting apricots, plums and several other stone fruits. cDNA vectors were developed for the Plum pox virus-M (Marcus), Plum pox virus-D, and Plum pox virus-T strain which is only detected in Turkey so far. The infected tissue samples were collected from Kayseri, Aksaray and Istanbul. Virus strains were determined by Real Time PCR and cDNAs were generated through RT PCR by using either random or oligo dT primers. Those cDNAs were used as templates to amplify full length genomic DNA of Plum PoxVirus T, M and D strains. Topo XL cloning kit was used to clone each virus genome and the ligation mixture were transformed into electrocompetent E. coli cells. Transformant E. coli cells were grown on selective medium. Putative positive clones carrying the recombinant plasmids were determined by alkali lysis method and plasmids were isolated for further analysis. Existence of full length genomic cDNA in plasmids was verified through PCR and in vitro transcription. Those vectors have potential usage in studying the host–virus interactions, site directed mutagenesis, RNA interference, virus replication, short and long distance movement of virus, the mechanism of disease development, and expression of foreign genes in plants in a nontransgenic manner.

Key words: Sharka disease, Plum Pox virus, infective cDNA vector, cloning, electrotransformation.