Ege bölgesinden örneklenen Culex pipiens kompleksi sivrisinek populasyonlarıda ace-1 genindeki Gly119Ser ve Phe290Val mutasyonlarının saptanması ve bu populasyonların RAPD belirteçleriyle karakterizasyonları
Determination of the Gly119Ser and Phe290Val mutations in the ace-1 gene of Culex pipiens complex populations sampled from aegean region and characterization through RAPD markers of these populations
Yazar: SERCAN KILIÇ
Danışman: DOÇ. DR. BELGİN GÖÇMEN TAŞKIN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Sivrisinekler, günümüzde zararlılara karşı yapılan kimyasal savaşta insektisitlere en fazla maruz bırakılan, ölümle sonuçlanabilen pek çok hastalığın taşınmasından sorumlu vektörler arasındadır. Ülkemiz, 8 cinse ait toplam 50 sivrisinek türünün üremesi ve yaşaması için gerekli iklimsel ve diğer ekolojik özelliklere sahiptir ve bunlar arasında Culex pipiens kompleksi en baskınlarıdır.
Sivrisineklerle mücadelede insektisitlerin kullanımı diğer pek çok böcek türü ile mücadelede olduğu gibi 1950'lerden bu yana devam etmektedir. Bu durum sivrisinek populasyonlarında hızla direnç gelişimine neden olmaktadır.  Direnç gelişimi ile birlikte insektisitlere karşı daha güçlü hale gelen sivrisinek populasyonlarının kontrol çalışmalarında her geçen yıl birim alanda daha fazla kimyasal kullanımı sonucunda, hem kirlilik hem de insan sağlığı bakımından ortaya çıkan küresel risk durumu giderek artmaktadır.  Mücadele gerektiren böcek türlerinin doğal populasyonlarındaki potansiyel direnç seviyelerinin belirlenmesi, bu türlerle mücadelede daha etkin ve kalıcı stratejilerin geliştirilmesindeki en temel unsurdur. 
Bu çalışmada ülkemizdeki baskın sivrisinek türü olan Culex pipiens'in Ege Denizi'ne kıyısı olan ve Akdeniz İklimini'nin hüküm sürdüğü Muğla, Aydın, İzmir, Balıkesir, Çanakkale illerine ve bunların yanı sıra göreceli olarak daha karasal bir iklimin hüküm sürdüğü geçiş şeridinde bulunan illerden birisi olan Denizli İli'ne ait populasyonlar örneklenmiştir.  Çalışılan populasyonlar üç farklı dönemde örneklenmiştir.  Bu dönemlerin ilki; yıllık sivrisinek mücadele çalışmalarının hemen öncesindeki ilkbaharda, ikincisi; yaz boyunca yapılan ilaçlamaları takiben sonbaharda ve üçüncüsü ise bir sonraki yılın ilkbaharında olmuştur.  Üç farklı dönemde örneklenen C. pipiens kompleksi populasyonlarında organofosfatlı (OP) ve karbamatlı (CB) insektisitlerin hedefi olan asetilkolinesteraz-1 (AChE-1) enzimini kodlayan ace-1 genindeki Gly119Ser direnç mutasyon frekansları PCR-RFLP yöntemi ile ve Phe290Val direnç mutasyon frekansları ise PASA (PCR Amplification of Specific Alleles) yöntemi ile saptanmıştır.
Gerçekleştirilen PCR'a dayalı bu moleküler analizler sonucunda, ace-1 genindeki her iki direnç mutasyonunun da frekanslarının düşük olduğu ve belirgin dönemsel farklılıklar göstermedikleri görülmüştür.
Çalışılan populasyonlarda elde edilen direnç mutasyon frekans benzerlik ya da farklılıklarının populasyona özgü insektisit seleksiyon baskısından mı kaynaklandığı yoksa populasyonlar arası göçün bir sonucu mu olduğu konusuna netlik kazandırabilmek amacıyla, 3 örnek toplama döneminden sadece ikinci toplama dönemine ait örnekler insektisit baskısı altında olmayan RAPD lokusları bakımından da taranarak karakterize edilmişlerdir.
Bu amaç doğrultusunda, oluşturulan alt populasyonda taranan 80 RAPD primerinden 45 tanesinin RAPD bandı oluşturmadığı görülmüştür. Geriye kalan 35 primer, en az 3 polimorfik bant oluşturmuş olup, tüm bireylerde oluşturduğu tüm bantlar bakımından monomorfik olan bir primer saptanmamıştır.
Toplam 375 bireye uygulanan 20 primerin analizi sonucu toplam 252 lokus saptanmıştır. Bu lokuslardan sadece biri monomorfik olup, çalışılan Culex pipiens populasyonlarındaki toplam polimorfik lokus oranı % 99.63'tür. Populasyonlar arası gen akış düzeyi Nm=6.61 olarak hesaplanırken, populasyonlar arası genetik farklılaşmanın (GST=0.07) oldukça düşük olduğu görülmüştür.   Çalışılan C. pipiens kompleksi populasyonlarındaki toplam genetik çeşitliliğin % 96.43'ünü populasyon içi genetik çeşitlilik oluşturmaktadır.
Çalışma kapsamında elde edilen bulgular doğrultusunda uygulamaya yönelik öneriler sunulmuştur.

Abstract:
Mosquitoes are one of the organisms subjected to frequent insecticide application due to their status as vectors which carry a wide range of life threatening diseases.  Our country has climatic and other ecological features required for breeding and living of 50 species from 8 genera and the members of Culex pipiens complex is the dominant mosquitoes among these groups. 
As in combat against many other insect species, the use of insecticide on mosquito control has been going on since the 1950s. This situation causes a rapid insecticide resistance in mosquito populations. However, capacity of these organisms to develop resistance against varying groups of insecticides renders the combat against them challenging. This situation creates a vicious circle that triggers the use of more chemicals per unit area each year which results in a global pollution threat and a great risk against human health. 
The determination of the potential resistance level on natural populations of harmful species is the basic factor to develop more effective and permanent pest control strategies.  In this study Culex pipiens dominant mosquito species of Turkey, populations were sampled from Muğla, Aydın, İzmir, Balıkesir and Çanakkale provinces that have a coastal site on Aegean Sea and have Mediterranean Climatic conditions, and also from Denizli province that has a relatively mild continental climate. Studied populations were sampled in three different periods. First of these periods was the spring preceding the insecticide application carried throughout summer season, second period was the fall after the annual mosquito combat activities; and the third period was the spring of the following year.
Gly119Ser and Phe290Val mutation frequencies in genes coding Acetylcholinesterase-1 (AChE-1) enzyme which is the target of the organophosphate and carbamate insecticides were detected through PCR-RFLP method and PASA (PCR Amplification of Specific Alleles) respectively.
As results of the molecular analysis performed through the PCR method the frequency of the two resistance mutations in ace-1 gene were determined as low and significant seasonal differences were not found.
In order to clarify whether the similarities or differences of resistance mutation frequencies of studied populations are resulting from the insecticide selection pressure peculiar to the population or from migrations between populations, levels of gene flow between populations were detected by screening the samples belonging to the 2. specimen handling periods in terms of RAPD loci which are not subject to insecticide pressure.
For this purpose,  80 RAPD primers were screened on the subpopulations and 45 of them did not created any RAPD band. 35 primers were observed to be producing at least 3 polymorphic bands. 252 loci were detected as a result of 20 primer applications to the 375 sample. Only one of these loci was polimorphic and total polimorphic loci rate is % 99.63. The level of gene flow between populations were evaluated as Nm = 6.61 and genetic differentiation between populations (GST = 0.07) was found to be very low. % 96.43 of total genetic variation of studied Culex pipiens complex populations come from the genetic diversity within populatons. Recommendations for implementation in line with the findings obtained under the study are presented.