Astragalus chrysochlorus'da doku kültürü ve transformasyon çalışmaları
Studies on tissue culture and transformation of Astragalus chrysochlorus
Yazar: SEMRA HASANÇEBİ
Danışman: PROF. DR. ŞULE ARI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2003
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Astragalus chrysochlorus = Astragalus chrysochlorus ; Doku kültürü = Tissue culture ; Dönüşüm = Transformation ; Vejetatif çoğaltmak = Vegetative propagation

Özet:
Astragalus chrysochlorus' da Doku Kültürü ve Transformasyon Çalışmaları Bitkisel sekonder metabolitler başta tıp olmak üzere gıda, kozmetik, ziraat gibi çeşitli sektörlerde yaygın biçimde kullanılmaktadırlar. Sekonder metabolitlerin doku kültürü yöntemleri ile üretimi, doğal ortamlarda yetişen bitkilerden elde edilmeleri sırasında karşılaşılan zorluklara ve aşırı toplama nedeniyle türlerin kaybolması tehlikesine karşı önemli bir alternatiftir. Doku kültürü yöntemlerinden yüksek biyokimyasal ve genetik stabilite göstermeleri, bitki büyüme düzenleyicileri içermeyen besiyerlerinde hızlı büyümeleri nedeniyle saçak kök kültürleri sekonder metabolit üretimi için en uygun ve tercih edilen sistemlerdir. Bu tez çalışmasında halk arasında geleneksel ilaç olarak kullanılan ve kitre zamkı üretimi nedeniyle de ekonomik değere sahip Astragalus türlerinden endemik Astragalus chrysochlorus' 'da doku kültürü ve sekonder metabolit içeriğinin araştırılmasına yönelik transformasyon çalışmaları, kimyasal analizler ve ayrıca biyolojik aktivite testleri yapıldı. Doku kültürü çalışmaları kapsamında in vitro geliştirilen bitki gövdelerinin MS- 0+0.5 mg/1 ZR besiyerinde çoğaltılmasını takiben, MS-1 besiyerinde köklendirilmeleriyle, bitki vegetatif yolla çoğaltıldı ve ayrıca sıvı MS-0+0.5 mg/1 NAA ile MS-0+0.5 mg/1 BA besiyerlerinde de kök kültürleri kuruldu. Transformasyon çalışmalarında beş farklı Agrobacterium rhizogenes (A4, ATCC- 15834, R1000, 8196 ve 9402) ırkı için, iki ayrı transformasyon yöntemi ve transformasyon aktivatörü olarak da asetosiringon denendi. Bütünlüğü bozulmamış bitkilerin transformasyonu yöntemiyle A4, 9402 ve 8196 ırklarında transformasyon başarıldı ve saçak kök kültürleri kuruldu. Bu kültürlerin kurulması için yapılan besiyeri optimizasyonu çalışmalarında, besiyerinde NH4NO3 bulunmamasının, kök gelişimi için esas olduğu belirlendi. Altkültürleme süresi uzatılan kök ve saçak kök kültürlerinde, bordo renk oluşumu gözlendi ve bu kültürlerde sekonder metabolit içeriğinin saptanmasına yönelik ekstraksiyon, ayırma, saflaştırma ve spektral analizler yapıldı. Mevcut spekral veriler sonucunda bordo renkten sorumlu olan sekonder metabolitin moleküler yapısı henüz aydınlatılamadı. Ayrıca saçak köklerden elde edilen ham ekstrenin, sitotoksik, antioksidan ve PNL hücrelerinde fagositik aktiviteyi artırıcı etkiye sahip olduğu belirlendi. Tez çalışmasından elde edilen bulgular, endemik Astragalus chrysochlorus' 'un doku kültürü koşullarında hızlı bir biçimde çoğaltılabileceğini, kültürleme ve sekonder metabolit üretim koşullarının optimizasyonu ile de saçak kök kültürlerinin sekonder metabolit analizleri ve üretimi için kullanılabileceğini gösterir niteliktedir.

Abstract:
Studies on Tissue Culture and Transformation of Astragalus chrysochlorus Plant secondary metabolites have been widely used in various sectors especially in medicine, food, cosmetic and agriculture. Production of secondary metabolites by tissue culture is an important alternative way to the problems for being come crossed in the course of obtaining plants from nature and this technique also prevents the danger of these plants' extinction. Hairy root culture is the most suitable and preferred tissue culture technique because of its biochemical and genetic stability, fast growing ability in mediums that not containing plant growth regulators. In this thesis, tissue culture and transformation studies, chemical analysis and biological activity tests were carried out in order to investigate secondary metabolite content of Astragalus chyrsochlorus, an endemic Astragalus species, which has been used as traditional medicine and has economical value for the production of tragacanth gum. Following the cultivation of the shoots that grew in vitro in MS-Û+0.5 mg/1 ZR medium, the roots were regenerated in MS-1 medium, afterwards they were reproduced vegatatively and besides root cultures were established in MS-0+0.5 mg/1 NAA with MS-0+0.5 mg/1 IBA liquid media. In transformation studies, two transformation procedures were applied for five different Agrobacterium rhizogenes strains (A4, ATCC-15834, R1000, 8196 and 9402). Acetocyringone was tested as a transformation activator. Transformation was succeeded and hairy root cultures were established by transforming the whole plant with A4, 9402 and 8196 strains. During media optimization studies, it was determined that lack of NH4NO3 in medium was essential for root development. Claret red colour formation was observed in root and hairy root cultures which were prolonged period subculturing. In order to investigate secondary metabolite content in this culture, extraction, separation, purification and spectral analyses were carried out. Molecular structure of this secondary metabolite which is responsible for the formation of claret red colour has been yet unidentified by the spectral data. Furthermore it was determined that, the crude extract of hairy roots had cytotoxic, antioxidant and enhancement effect of fagocytic activity. The results that were gained from this thesis showed that Astragalus chyrsochlorus could be reproduced fastly in tissue culture conditions, hairy root cultures could be used for analysis and production secondary metabolite in the optimized condition for culturing and production.