Akalazya etyopatogenezinde rol oynayan epitelyal moleküllerin belirlenmesi ve epitel permeabilitenin incelenmesi
Determination of achalasia etiopathogenesis related epithelial molecules and investigation of epithelial permeability
Yazar: SEZGİ KIPÇAK
Danışman: DOÇ. DR. NUR SELVİ GÜNEL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Epitel = Epithelium ; Etyoloji = Etiology ; Etyopatogenez = Etiopathogenesis ; Geçirgenlik = Permeability ; Moleküller = Molecules ; Özofageal akalazya = Esophageal achalasia

Özet:
İdiyopatik akalazya nadir bir hastalıktır. Özofagusdaki peristaltizmin kaybolması ve alt özofagus sfinkterinin yeteri kadar gevşememesi hastalığın en önemli klinik bulgularıdır. Nadir bir hastalık olması nedeniyle semptomların başlangıcıyla tedavi arasında uzun bir süreç vardır. Ayrıca tanısı, benzer semptomların ortaya çıktığı gastroözofageal reflü hastalığıyla (GÖRH) büyük oranda karıştırılır. Akalazya hastalarının özofagus epitelleri, gıdaların mideye ulaşamaması sebebiyle  uzun süre fermente materyallere maruz kalır ve mekanik travma oluşur. Araştırmanın amacı akalazya hastalarının epitel bariyer fonksiyon özelliklerini elektrofizyolojik ve moleküler düzeyde belirlemektir.
Çalışmamızın araştırma gruplarını akalazya hastaları, tedavi sonrası akalazya hastaları, sağlıklı gönüllüler (SG) ve GÖRH (NERH (non-eroziv reflü hastalığı), ERH (eroziv reflü hastalığı)) hastaları oluşturmuştur. Tüm grupların özofagus epitellerinin elektrofizyolojik özelliklerini belirlemek amacıyla in-vitro Ussing çember sistemi kullanıldı. Permeabilite özellikleri florometrik ölçümler ile gerçekleştirildi.   Epitel doku bütünlüğünde önemli rol oynayan sıkı bağlantı moleküllerinin ve bu moleküller ile ilişkili sinyal yolaklarına ait gen ve protein ekspresyon düzeyleri belirlendi. Gen ekspresyon seviyelerinin belirlenmesinde qRT-PCR yöntemi, protein düzeylerinin belirlenmesinde ise ELISA ve Multiplex ELISA yöntemleri kullanıldı.
Gruplar arası elektrofizyolojik incelemeler sonucunda akalazya gruplarının elektrofizyolojik özelliklerinin SG grubuyla benzer özellik gösterdiği, GÖRH gruplarından ise transepitelyal rezistansın anlamlı olarak daha yüksek, permeabiliteninde rezistans sonucuna uyumlu olarak anlamlı düşük olduğu verisi elde edildi. Tedavi öncesi ve tedavi sonrası grupları arasında ise anlamlı fark yoktu. 
Akalazya gruplarının sıkı bağlantı noktaları ile ilişkili gen ekspresyon seviyeleri,  hem SG'lerden hem de GÖRH gruplarından anlamlı olarak yüksek bulundu. Aynı moleküllerin protein seviyeleri incelendiğinde yalnızca TJP2 protein seviyesinin SG ve GÖRH gruplarından anlamlı yüksek olduğu sonucuna ulaşıldı.  Tedavi sonrası akalazya grubunun CLDN4 seviyesi ise SG ve GÖRH gruplarına kıyasla anlamlı yüksekti. Önemli bir hücre adhezyon molekülü olan CDH1'in protein seviyesi incelendiğinde akalazya gruplarının CDH1 protein seviyelerinin ERH grubundan anlamlı yüksek olduğu belirlendi. Hücre sinyalizasyonunda önemli olduğu bilinen MAPK, PI3K/AKT/mTOR ve JAK/STAT yolakalrının akalazya hastalarında SG ve GÖRH gruplarına kıyasla daha az aktif olduğu belirlendi.
Çalışmamız akalazya özofagus epitelinin  elektrofizyolojik ve moleküler  özelliklerinin detaylı olarak araştırıldığı ilk çalışma olma özelliği taşımaktadır. Bu nedenle akalazya gibi nadir görülen bir hastalığın moleküler düzeydeki araştırmalarına katkı sağlayacağı görüşündeyiz.

Abstract:
Idiopathic Achalasia is a rare disease. Loss of peristalsis in the esophagus and insufficient relaxation of the lower esophageal sphincter are the most important clinical findings of the disease. There is a long process between the onset of symptoms and treatment due to having low incidence. In addition, its diagnosis is highly confused with gastroesophageal reflux disease (GERD) with similar symptoms. The esophageal epithelium of Achalasia patients are exposed to the fermented materials for a long time because of the food not reaching the stomach and mechanical trauma occurs. The aim of the study is to determine the epithelial barrier function characteristics of patients with achalasia.
The research groups of our study consist of the Achalasia patients, post-treatment Achalasia patients, healthy volunteers (HV) and GERD (NERH (non-erosive reflux disease), ERD (erosive reflux disease) patients. In-vitro Ussing chamber system was used to determine the electrophysiological properties of the esophageal epithelium of all groups. Permeability properties were determined by fluorometric measurements.  Gene and protein expression levels of tight junction molecules that play an important role in epithelial tissue integrity and signal pathways associated with these molecules were determined. The qRT-PCR method was used to determine gene expression levels, and protein expression levels were invatigated ELISA and Multiplex ELISA methods.
As a result of the electrophysiological examinations between the groups, it was concluded that the electrophysiological properties of the Achalasia groups were similar to the SG group. On the other hand the Achalasia transepithelial resistance was significantly higher than the GERD groups, and the permeability values were significantly lower. There was no significant difference between the pre-treatment and post-treatment groups.
Tight junction-related gene expression levels of the Achalasia groups were significantly higher than both HV and GERD groups. Additionally, the protein levels of the same molecules were examined, it was concluded that only TJP2 protein level was significantly higher than the HV and GERD groups. 
The CLDN4 level of the Achalasia group after treatment was significantly higher compared to the HV and GERD groups. 
The protein level of CDH1, which is an important cell adhesion molecule, was examined, and CDH1 protein levels of the Achalasia groups were significantly higher than the ERH group. The gene and protein expression levels of inflammation markers in the Achalasia groups were found to be significantly higher than both HV and GERD groups. It was determined that MAPK, PI3K/AKT/mTOR and JAK/STAT pathways, which are known to be important in cell signaling, are less active in achalasia patients compared to SG and GERD groups.
This study is the first to detailed investigate the electrophysiological and molecular properties of the achalasia esophageal epithelium.We believe that our study will contribute the understanding of pathogenesis of Achalasia at molecular level.
Keywords; Achalasia; esophageal epithelium; tight junctions