Orak hücreli anemi hastalarında hemoglobin F oranının artmasında etkili olduğu düşünülen miRNA ekspresyon düzeylerinin araştırılması
Researching expression levels of miRNAs that is considered to increase hemoglobin F rates in sickle cell anemia patients
Yazar: ÜMİT KARAKAŞ
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM İZCİ AY
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Anemi = Anemia ; Anemi-orak hücreli = Anemia-sickle cell ; Eritrositler = Erythrocytes ; Fetal hemoglobin = Fetal hemoglobin ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hemoglobinler = Hemoglobins

Özet:
Orak hücreli anemi (OHA), otozomal resesif bir mutasyon sonucunda ortaya çıkan sistemik bir bozukluktur. Moleküler biyolojideki yeni gelişmelere rağmen, bir hemoglobin molekülünden diğerine geçişin moleküler mekanizması açıklanabilmiş değildir. Bu amaca ulaşmak için, diğer hayati süreçleri aksatmadan fetal hemoglobin (HbF) ekspresyonunu modifiye etmek ve sürdürmek için hemoglobin dönüşümünü yakından anlamak gerekir. Eritrosit hücrelerinin farklılaşması sırasında ve globin gen regülasyonunun transkripsiyonel düzenlenmesinde; transkripsiyon faktörleri, epigenetik mekanizmalar ve kodlamayan RNA değişiklikleri rol oynar. Bu temel doğrultusunda çalışmanın amacı, OHA hastalarında HbF'in HbS'e dönüşümü sırasında etkili olduğu düşünülen miRNA ekspresyon düzeylerinin araştırılmasıdır. 
Eritrosit izolasyonu, OHA'lı hastalardan ve kontrol bireylerinden alınan periferik kan örneklerinden ficoll-hypaque yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen eritrositlerden total RNA izole edilmiştir. hsa-miR-221-5p, hsa-miR-222-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-16-1-3p ve hsa-miR-96-5p miRNA'larına özgü RT primerler ile elde edilen cDNA'lardan, Real time PCR ile miRNA kantitasyonu "Comparative CT (ΔΔCT)" metoduyla değerlendirilmiştir.
miR-221 ve miR-222 eritrosit farklılaşmasını kit reseptörü üzerinden düzenlemektedir. Sağlıklı bireylerde down-regüle olan miR-222'nin ekspresyon düzeyini kontrol grubumuza kıyasla hasta grubunda artmış bulduk (p=0,038). GATA-1'e duyarlı miR-451a ise eritrosit farklılaşmasında up-regüle olan miRNA'lardır. miR451a eritrositlerin anti-stres kapasitesinde önemli roller oynamaktadır. Bu çalışmada hasta grubumuzda kontrole göre hsa-miR-451a'nın ekspresyon düzeyinin azaldığını bulunmuştur (p=0,027).
Sonuçlarımız miRNA'ların HbF modülasyonunda doğrudan ve kritik regülatör rolünü göstermektedir.  HbF'nin transkripsiyon sonrası düzenlemesinin miRNA'lar vasıtasıyla açıklanması hastalığın tedavisi bakımından yeni bakış açıları kazandıracaktır.

Anahtar Kelimeler: Orak hücreli anemi, Eritrosit, Hemoglobin F, miRNA ifadesi,

Abstract:
Sickle cell anemia (SCA) is a systemic disorder and it is caused by an autosomal recessive mutation. Despite new advances in molecular biology, the mechanism of hemoglobin switching has not been elucidated clearly. Therefore, it is necessary to understand the hemoglobin switching to modify and maintain fetal hemoglobin (HbF) expression. Noncoding RNA expression changes, transcription and epigenetic factors are involved in differentiation of erythrocyte cells and transcriptional regulation of globin genes. The aim of this study is to investigate the expression levels of miRNAs which are thought to be effective during the switching of HbF to HbS in patients with SCA. 
Erythrocyte isolation was performed by using ficoll-hypaque method from peripheral blood. Total RNA was isolated from erythrocytes. cDNAs were obtained by specific RT primers for hsa-miR-221-5p, hsa-miR-222-5p, hsa-miR-451a, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-16-1-3p and hsa-miR-96-5p miRNAs. RNA quantitation was assessed by Comparative CT method on qPCR. 
miR-221 and miR-222 regulate erythrocyte differentiation via the kit receptor. We found that the expression level of miR-222 increased in the patient group compared to control group (p=0,038). GATA-1-sensitive miR-451a is one of the upregulate miRNA in erythroid differentiation and plays important roles in the anti-stress capacity of erythrocytes. In this study, we found that the expression level of hsa-miR-451a decreased in patient group (p=0.027). 
Our results show the direct and critical regulatory role of miRNAs in HbF modulation. The disclosure of post-transcriptional regulation of HbF with miRNAs will give new insights in the treatment of SCA.


Keywords: Sickle Cell Anemia, Erythrocyte, Hemoglobin F, miRNA expression