Mitojenik (MAPK) ve hayatta kalim (AKT) sinyal yolaklarinin Speedy/RINGO proteini ile ilişkisinin SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinde aydinlatilmasi
Identifying the role of Speedy/RINGO on mitogenic (MAPK) and survival AKT pathways intersection in SH-SY5Y neuroblastoma cells
Yazar: YEŞİM KAYA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AYŞEGÜL YILDIZ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Genetik = Genetics ; Nöroloji = Neurology ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Nöroblastoma, nöral krest kökenli malign bir tümör çeşididir. Klinik olarak heterojen ve kemoterapiye direnç gösteren bir karakter sergilemektedir. Kemoterapiye direnç oluşumunun asıl sebeplerinden biri olarak, MAPK (mitojenik) ve AKT (survival/ sağkalım) sinyal yolaklarının tetiklenmesi ve aşırı-aktivasyonu gösterilmektedir. Bu iki sinyal yolağının aşırı aktivasyonu, hastalıkta zayıf prognoza sebep olmaktadır. Bu durum, bu iki sinyal yolağının birbirleriyle iletişim ve etkileşim halinde hareket ettiklerini göstermektedir. Fakat bu etkileşimin odak noktaları henüz aydınlatılabilmiş değildir. Direkt olarak bu iki sinyal yolağının üyeleriyle bağlantısı olmayan fakat bir aracı vasıtasıyla MAPK ve AKT sinyal yolağının kesişiminde bulunan hücre siklus regülatörlerinin varlığına dair çalışmalar mevcuttur. Bu hücre siklus regülatörlerinden biri olan, Speedy/RINGO'nun aşırı aktivasyonu veya aşırı ekspresyonu, hücrelerin kanserleşmesine ve agresifleşerek apoptozdan kaçırılmasına sebep olmaktadır. Speedy/RINGO, siklin benzeri bir protein olup CDK'lara bağlanarak aktivasyonunu sağlamakta ve hücre siklusunda G1/S fazı geçişinde etkin role sahiptir.                  Yapılan tez çalışması kapsamında, öncelikle kültür ortamındaki nöroblastoma hücrelerinde MAPK sinyal yolağı inhibitör ajanlar vasıtasıyla (U0126) inhibe edilmiştir. Bu inhibisyon sonucunda, Speedy/RINGO'nun protein düzeyinde ekspresyonu analiz edilmiş ve ekspresyon seviyesinde beklenen düşüşün gerçekleştiği gözlemlenmiştir. Sonrasında ise CDK2 ekspresyonu ve aktivasyonu ve buna bağlı olarak da AKT fosforlanma seviyeleri incelenmiştir. Ayrıca bu inhibisyon uygulamasının hücrelerin yaşamsal durumlarına etkisi de canlılık analiziyle belirlenmiştir. Tüm bu veriler AKT ve MAPK sinyal yollarını birbiriyle ilişkilendiren ve aşırı aktivasyonlarına neden olan asıl sebebin ne olduğuna ve bu konuda en kuvvetli aday protein olan Speedy/RINGO'nun muhtemel fonksiyonuna dair ilk kez aydınlatıcı bilgiler elde edilmiştir.  Böylece başta nöroblastoma olmak üzere birçok kanserin hem tanı ve tedavisi için hücresel mekanizmaların, hücre içi proteinler arasındaki ilişkilerin doğru şekilde anlaşılabilmesi ve bu sayede doğru moleküler hedeflerin seçilebilmesi mümkün olacak ve bu sayede belirlenen doğru hedefler üzerinden hastalığın tanı ya da tedavisinde kullanılabilecek etkili yöntemlerin geliştirilmesi mümkün olabilecektir.

Anahtar Kelimeler: Nöroblastoma, MAPK, AKT, Speedy/RINGO, CDK2, CyclinA

Abstract:
Neuroblastoma is a neural crest derived malignant pediatric tumor. It is characterized by clinical heterogeneity and resistant to chemotherapy. The main reason of this resistance is the over-activation of mitogenic MAPK pathway and AKT survival pathways. Over-activation of these signaling pathways also indicates poor prognosis. This state indicates that there is a cross talk between these two signaling cascades and they act together by one triggering the other, during cancer progression. However, yet it is unknown what is there at the heart of this interaction. Not only direct interaction between the members of these two pathways, but also mediator-dependent interactions, independent from both pathways' members, should be considered, since there are studies giving insights about certain cell cycle regulators which may be involved in the intersection of these signaling pathways. It has been shown that over-activity or over-expression of some cell cycle regulators such as Speedy/RINGO, a novel cell cycle regulator, cause cells to become cancerous and become aggressive by escaping them from apoptosis. Speedy/RINGO, is a cyclin like cell cycle regulator protein which binds and activates CDKs and has a functional role in G1/S transition
In this thesis, MAPK pathway was firstly inhibited with a specific chemical, U0126. Afterwards, the expression of Speedy/RINGO was analyzed and a corresponding decrease in the expression of Speedy/RINGO was shown. Then, CDK2 expression and AKT phosphorylation levels were analyzed, accordingly. In addition, the effect of this inhibition study on the vitality of the cells were analyzed by cell viability test. All data was obtained at the end of this study provide crucial information for the first time about the connecting and hence over-activating function of Speedy/RINGO in between AKT and MAPK pathways. This study gives information about the interactions between different intracellular mechanisms and to choose the appropriate molecular targets for diagnosis and treatment of many cancer types. Hence, in the light of these data, commercial cancer diagnosis or treatment-based techniques can be designed in the near future.

Keywords: Neuroblastoma, MAPK, AKT, Speedy/RINGO, CDK2, Cyclin A