Pankreas kanseri gelişiminde etkili olan TP53 genindeki R273H mutasyonunun CRISPR/CAS9 tekniği ile düzeltilmesi
Editing of the R273H mutation in TP53 gene, which is effective in the development of pancreatic cancer, by using the CRİSPR/CAS9 tecnique
Yazar: ŞEYMA HAZAL ÇETİN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ DUDU ERKOÇ KAYA
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: CRISPR = CRISPR ; Genetik = Genetics ; Genler = Genes ; Genler-P53 = Genes-P53 ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; PANC-1 = PANC-1 ; Pankreas hastalıkları = Pancreatic diseases ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms

Özet:
Günümüzde yaygın olarak kullanılan genom düzenleme teknolojileri ZFN (Zinc Finger Nucleases), TALEN (Transc ription Activator-Like Effector Nucleases) ve CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)'dir. Çeşitli endonükleazlar aracılığıyla oluşturulan çift zincir DNA kırıklarının homolog rekombinasyon (HR) veya homolog olmayan uç birleştirmeleri (NHEJ) yoluyla tamir edilmesi temeline dayanan bu teknolojiler, hedef genom bölgelerinin düzeltilmesinde hücrenin normal DNA tamir mekanizmalarını kullanmakta ve değişik genetik hastalıklarda genomun manipüle etmek amacıyla uygulanmaktadır. Yakın zamanda keşfedilen ve doğada bakteriyel bir savunma sistemi olarak işlev gören RNA aracılı kümelenmiş düzenli aralıklı palindromik tekrar dizileri (CRISPR) ve CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) sistemi (CRISPR/Cas9), günümüzde en güncel gen modifikasyon yöntemlerinden biri olarak birçok alanda etkin bir şekilde kullanılmaktadır. Pankreastik Duktal Adenokarsinom (PDAC) pankreas kanserleri içinde en agresif tip olarak bilinmektedir. PDAC da tek bir genden ziyade birden fazla genetik mutasyona rastlanılabilir. Bunlardan en sık karşılaşılan mutasyonlar sırayla KRAS, TP53, CDKN2A ve SMAD4 genlerinde meydana gelen mutasyonlardır. TP53 geni bir tümor supresör gendir. Tümör supresör genler hücre çoğalmasında negatif yönde rol oynayan genlerdir. Hücre siklusunu denetlerler. Tamir edilemeyen DNA hasarı tespit edilen hücrelerde hücreyi apoptoza yönlendirme ve anormal hücre çoğalmasını engelleme gibi birçok önemli noktada görev alır. Bu gende en sık meydana gelen mutasyon türü ise yanlış anlamlı mutasyon türüdür ve hücre siklusundaki kilit görevi nedeniyle TP53 geni mutasyonları birçok kanserde en yaygın değişiklik olarak öne çıkar. Yumurtalık kanseri, meme kanseri, akciğer kanseri ve pankreas kanseri gibi birçok kanser türlerinde TP53 genindeki mutasyonlar yaygın görülmektedir. PDAC'da, TP53 geninde görülen mutasyonlardan özellikle R273H (Arg273His) mutasyonunun tümörigenezi başlatma potansiyelini düşünülmektedir. Bu çalışmada, PANC-1 insan pankreas kanseri hücrelerinde, TP53 geninde meydana gelen R273H mutasyonunun CRISPR/Cas9 tekniği kullanılarak düzeltilmesi amaçlandı. Bunun için gerekli R273H mutasyon bölgesine spesifik ssODN ve gRNA tasarımları yapılarak, sentezlettirildi. Hazır gRNA'lar seçilen plazmid vektöre başarıyla aktarılarak klonlandı. Klonlanan plazmidler ve hedef için donör ssODN ler uygun besiyeri ortamında çoğaltılan PANC-1 hücrelerine elektroporasyon yöntemi ile başarıyla transfekte edildi. Transfeksiyon sonrası 24 saat kültüre dilenPANC-1 hücrelerinden DNA izolasyonları yapıldı. Düzeltme işleminin kontrolü için melting curve analizi ve ayrıca PCR/sanger dizileme yapıldı. Analiz sonuçlarımıza göre; CRISPR yapılarının tasarımı, vektöre klomlanması ve sonrasında bu yapıların hücreye aktarılması adımlarının başarılı bir şekilde tamamlanmasına rağmen PANC-1 pankreas hücrelerinde R273H mutasyonu düzeltilemedi.

Abstract:
Today, commonly used genome editing technologies are ZFN (Zinc Finger Nucleases), TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) and CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) technologies. These technologies, which are based on the repair of double-stranded DNA breaks created by various endonucleases by homologous recombination (HR) or non-homologous end joining (NHEJ), use the normal DNA repair mechanisms of the cell to edit target genome regions and are applied for the manipulation of the genome in various genetic diseases. RNA-mediated clustered regularly spaced palindromic repeat sequences (CRISPR) and CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system (CRISPR/Cas9), which have been discovered recently and function as a bacterial defense system in nature, are used as an effective method in many fields as one of the most up-to-date gene modification methods. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is known as the most aggressive type of pancreatic cancer. More than one genetic mutation can be found in pancreatic ductal adenocarcinoma rather than a single gene. The most common mutations among these are the mutations occurring in KRAS, TP53, CDKN2A and SMAD4 genes, respectively. The TP53 gene is a tumor suppressor gene. Tumor suppressor genes are genes that play a negative role in cell proliferation. They control the cell cycle. It plays an important role in many important points such as directing the cell to apoptosis and preventing abnormal cell proliferation in cells with unrepairable DNA damage. The most common type of mutation in this gene is missense mutations and TP53 gene mutations stand out as the most common change in many cancers due to its key role in the cell cycle. Mutations in the TP53 gene are common in many cancer types such as ovarian cancer, breast cancer, lung cancer and pancreatic cancer. In PDAC, mutations in the TP53 gene, especially the R273H (Arg273His) mutation, are thought to increase the potential to initiate tumorigenesis. In this study, it was aimed to correct the R273H mutation in the TP53 gene in PANC-1 human pancreatic cancer cells by using the CRISPR/Cas9 technique. For this, specific ssODN and gRNA for R273H mutation region were designed and synthesized. Ready gRNAs were successfully transferred into the selected plasmid vector and cloned. The cloned plasmids and donor ssODNs were successfully transfected into PANC-1 cells grown in the appropriate medium by electroporation method. DNA isolations were made from PANC-1 cells cultured for 24 hours after transfection. Melting curve analysis and also PCR/sanger sequencing were performed to confirm the correction process. According to our analysis results; despite the successful completion of the designing and cloning of CRISPR constructs and subsequently transfer of these constructs to the cells, the R273H mutation could not be corrected in PANC-1 pancreatic cells.