İnülinaz enziminin üretimi, kısmi saflaştırılması, karakterizasyonu ve fermentasyonlarının matematiksel modellenmesi üzerine bir araştırma
An investigation on the production, partial purification, characterization of inulinase enzyme and mathematical modeling of its fermentations
Yazar: MUSTAFA GERMEÇ
Danışman: DOÇ. DR. İRFAN TURHAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmanın amacı, enzim üretimi için en iyi karbon kaynağını belirlemek, enzim üretiminde kullanılan besiyeri formülasyonunu otimize etmek, üretilen enzimi kısmi saflaştırmak, enzimin özelliklerini belirlemek ve fermentasyonları ve substrat spesifikliğini matematiksel modellemektir.

Elde edilen sonuçlara göre, Aspergillus niger A42 (ATCC 204447) ile inülinaz (Iase)  enziminin üretiminde kullanılan on farklı karbon kaynağı arasından en iyisi melas olmuştur (383.73 U/mL). Üretilen enzimin optimum çalışma koşulları pH 4.8, 60ºC sıcaklık ve 10 dk inkübasyon süresi olarak belirlenmiştir. Plackett-Burman Dizayn (PBD) ile besiyeri kompozisyonunun optimizasyonunda, optimum besiyeri %1 maya ekstraktı ve %1 peptondan oluşmuştur (Iase=1011.02 U/mL, sukraz (Sase)=834.28 U/mL ve I/S oranı=1.22). Besiyerinde kullanılan maya ekstraktı ve peptonun konsantrasyonu, Merkezi Kompozit Dizayn (MKD) ile optimize edilmiş ve optimum besiyeri kompozisyonu %4.2 maya ekstraktından oluşmuştur (Iase=1294.50 U/mL, Sase=1076.85 U/mL, I/S oranı=1.20). Kinetik modelleme neticesinde, PBD ile optimize edilen besiyerinde enzim üretimi fungal gelişimden bağımsızdır (α≤0 ve β≠0). MKD ile optimize edilen besiyerinde ise enzim üretimi karışık gelişimle ilgilidir (a≠0 and β≠0). Küçük ölçekli biyoreakördeki (5-L) fermentasyonlar, pH kontrolsüz ve havalandırmalı ortamda gerçekleştirilmelidir (Iase=1810.76 U/mL, Sase=1537.88 U/mL ve I/S oranı=1.18). Büyük ölçekli biyoreaktörde (30-L) gerçekleştirilen fermentasyonun sonucunda Iase, Sase ve I/S oranı sırasıyla 791.35 U/mL, 616.90 U/mL ve 1.28 olarak belirlenmiştir.

Elde edilen enzim solüsyonu, santrifüj-süre kombinasyonu (16873 g-5 dakika, Iase=1181.18 U/mL, saflaştırma katsayısı (SK)=1.39) ve UF membranı (10 kDa, Iase=12065.20 U/mL, SK=5.33) ile kısmi olarak saflaştırılmıştır. Diğer yandan, enzimin substrat spesifikliğinde, aktivitesi düşük olan enzimin inüline olan afinitesinin sukrozdan daha yüksek olduğu belirlenmiştir (Km inülin=17.79 g/L < Km sukroz=49.43 g/L). Tam tersine, aktivitesi yüksek olan enzimin sukroza olan ilgisinin inülinden daha yüksek olduğu tespit edilmiştir (Km inülin=28.77 g/L > Km sukroz=25.95 g/L).

Substrat üzerine eklenen enzim miktarının artması ile birlikte aktivitenin arttığı belirlenmiştir. Mn2+, enzimin aktivatörü, Cu2+ ve Ag+ ise enzimin inhibitörü olmuştur. Üretilen enzimin 30ºC, 40ºC ve 50ºC sıcaklıklarda termostabil olduğu belirlenmiştir. Ek olarak, enzimatik reaksiyonun termal inaktivasyon ve termodinamik parametreleri de hesaplanmıştır. Buna göre Ea, Eia ve Z değerleri sırasıyla 37.3 kJ/mol.K, 112.86 kJ/mol ve 12.80ºC olarak hesaplanmıştır. Sıcaklık 60ºC'den 80ºC'ye artırıldığında, enzimin inaktivasyon hız sabiti ve entropisi artarken yarılanma ömrü, D-değeri, entalpi ve serbest enerjisi azalmıştır. Bunun yanısıra, enzimin moleküler ağırlığının 60-70 kDa arasında olduğu belirlenmiştir.

PBD ve MKD ile optimize edilen besiyeri kompozisyonunda gerçekleştirilen fermentasyonların deneysel verileri matematiksel modeller kullanılarak tahmin edilmiştir. Öte yandan, deneysel kinetik parametre değerleri de modellerden tahmin edilen değerler kullanılarak hesaplanmış ve karşılaştırılmıştır. Son olarak, enzimin substrat spesifikliğinin deneysel verileri de matematiksel modeller kullanılarak tahmin edilmiştir. Deneysel Vmax ve Km değerleri, modellerden tahmin edilen Vmax ve Km değerleri ile karşılaştırılmıştır. En iyi model(ler), model kıyaslama verilerine (ortalama karesel hata (RMSE), ortalama mutlak hata (MAE), ortalama standart sapma (MSD), belirleme katsayısı (R2), eğim (m), Akaike bilgi ölçütü (AIC), ön yargı faktörü (BF) ve kesinlik faktörüne (AF)) göre tespit edilmiştir.

Sonuç olarak, inülinaz enziminin üretimi, fermentasyonların kinetik modellemesi, üretilen enzimin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu ve fermentasyonlar ve substrat spesifikliğinin modellenmesi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Çalışma, hem fermentasyon öncesi (upstream processing) hem de fermentasyon sonrası (downstream processing) prosesleri içermektedir.

Abstract:
The objectives of this study were to determine the best carbon source for enzyme production, to optimize the medium formulation used in enzyme production, to make the kinetic modeling of the fermentations, to purify partially the produced enzyme, to determine the properties of the enzyme, and to model mathematically the fermentations and substrate specificity. 

According to the results obtained; among the ten different carbon sources used in the production of Aspergillus niger A42 (ATCC 204447) inulinase (Iase), molasses was the best (383.73 U / mL). The optimum working conditions of the enzyme were pH 4.8, 60ºC and 10 min incubation time. In the optimization of the medium composition with Plackett-Burman Design (PBD), the optimum medium consisted of 1% yeast extract and 1% peptone (Iase=1011.02 U/mL, sucrase (Sase)=834.28 U/mL and I/S ratio=1.22). The concentration of yeast extract and peptone used in the medium was optimized by Central Composite Design (CCD) and the optimum medium composition consisted of 4.2% yeast extract (Iase=1294.50 U/mL, Sase=1076.85 U/mL, I/S ratio=1.20). As a result of kinetic modeling, the enzyme production in PBD-optimized medium is non-growth-associated (α≤0 and β≠0). In CCD-optimized medium, the enzyme production is mixed-growth-associated (a≠0 and β≠0). Fermentations in the small-scale bioreactor (5-L) should be carried out in a pH-uncontrolled and aerated environment (Iase=1810.76 U/mL, Sase=1537.88 U/mL and I/S ratio=1.18). As a result of fermentation in large scale bioreactor (30-L), Iase, Sase and I/S ratio were determined as 791.35 U/mL, 616.90 U/mL and 1.28, respectively.

The enzyme solution obtained was partially purified by centrifuge-time combination (16873 g-5 min, Iase=1181.18 U/mL, purification coefficient (PC)=1.39) and UF membrane (10 kDa, Iase=12065.20 U/mL, PC=5.33). On the other hand, in the substrate specificity of the enzyme, the inulin affinity of the low-activity enzyme was found to be higher than sucrose (Km inulin=17.79 g/L < Km sucrose=49.43 g/L). In contrast, the sucrose affinity of the high-activity enzyme was found to be higher than inulin (Km inulin=28.77 g/L > Km sucrose=25.95 g/L).

It was determined that activity increased with the increasing amount of enzyme added on substrate. Mn2+ was the activator of the enzyme whereas Cu2+ and Ag+ were inhibitors of the enzyme. It was determined that the enzyme produced was thermostable at 30ºC, 40ºC and 50ºC. In addition, thermal inactivation and thermodynamic parameters of the enzymatic reaction were also calculated. Hereunder, the Ea, Eia, and Z values were computed as 37.3 kJ/mol.K, 112.86 kJ/mol, and 12.80ºC, respectively. When the temperature was increased from 60ºC to 80ºC, the inactivation rate constant and entropy of the enzyme increased while half-life, D-value, enthalpy and free energy decreased. Besides, it was determined that the molecular weight of the enzyme was between 60 kDa and 70 kDa.

The experimental data of fermentations performed in the medium composition optimized by PBD and CCD were estimated using mathematical models. On the other hand, the experimental kinetic parameters were also calculated and compared using the predicted values from the models. Finally, the experimental data of the substrate specificity of the enzyme were also predicted using mathematical models. Experimental Vmax and Km values were compared with Vmax and Km values estimated from the models. The best model(s) was/were determined according to the model comparison data (root-mean-square-error (RMSE), mean-absolute-error (MAE), mean standard deviation (MSD), regression coefficient (R2), slope (m), Akaike's information criterion (AIC), bias factor (BF), and accuracy factor (AF)).

Consequently, the production of inulinase enzyme, kinetic modeling of the fermentations, partial purification and characterization of the produced enzyme and mathematical modeling of the fermentations and the substrate specificity have been performed successfully. The study includes both upstream processing and downstream processing.