Poliglisidil metakrilat mikrokürelere anti C-reaktif protein immobilizasyonu ve tanı amaçlı kullanımı
Anti c-reactive protein immobilization onto polyglysidil methacrylate microspheres and it's use for diagnosis
Yazar: ERİNÇ OZAN
Danışman: DOÇ.DR. HAKAN AYHAN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2005
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
POLİGLİSİDİL METAKRİLAT MİKROKÜRELERE ANTİ C-REAKTİF PROTEİNİMMOBİLİZASYONU VE TANI AMAÇLI KULLANIMIErinç OZANÖZSunulan bu çalışmanın amacı; ticari örneklerine alternatif olmak üzere c-reaktifproteinin tanısında kullanılacak, polimerik taşıyıcı bazlı bir diagnostik test kitiningeliştirilmesidir. Çalışmanın ilk bölümünde monodispers PGMA(poliglisidilmetakrilat) partikülleri; GMA (glisidilmetakrilat) monomerinin etanoldağıtma ortamında başlatıcı olarak AIBN (azobisizobutironitril) ve stabilizör olarakPAA (poliakrilikasit) varlığında dispersiyon polimerizasyonuyla sentezlenmiştir.Sentezlenen PGMA mikrokürelerin boy ve boy dağılımlarının saptanması içintaramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılmış, elde edilen fotoğraflardanmikroküreler sayılarak sayıca ortalama çap (Dn) 1,166 Âµm, ağırlıkça ortalama çap(Dw) 1,166 Âµm, ve polidispersite indeksi (PDI) 1.000 olarak hesaplanmıştır.Gravimetrik yöntemle tayin edilen %88,67 (%ağırlık) değeri ise toplam monomerdönüşüm oranının yeterince yüksek olduğunu göstermektedir. Karakterizasyonsonuçlarına göre polimerizasyon reçetesinin başarıyla kullanılabileceğiöngörülmüştür. Çalışmanın ikinci bölümünde, karakterizasyonu yapılanmikroküreler, C-reaktif protein tanısında, anti-human C-reaktif proteinimmobilizasyonunda taşıyıcı partikül olarak kullanılmıştır. İmmobilizasyonda,taşıyıcıya bağlama yönteminin adsorpsiyon ve kovalent bağlama metotlarıdenenmiştir. Kovalent bağlanma metodunda uzatma kolu (spacer-arm) olarak çiftfonksiyonel bir reaktif olan glutaraldehit kullanılmıştır. Modifiye Lowry toplamprotein tayini ile elde edilen ?immobilize antijen miktarları? ve hasta serumu ileyapılan çökelme testleri sonuçlarına göre adsorbsiyon yönteminin tamamıylakullanışsız, bunun yanında kovalent bağlama metodunun glutaraldehit varlığındadaha uygun olduğu saptanmıştır. Mikrokürelere bağlanacak antijeninimmobilizasyon çalışmaları sonucunda optimum koşullar; başlangıç glutaraldehitderişimi %2, immobilizasyon pH'ı 7.4, immobilizasyon sıcaklığı 25oC,immobilizasyon süresi 90 dak. ve başlangıç antijen derişimi 1Âµg/ml olarakbulunmuştur. Çalışmanın son aşamasında ise, hazırlanan anti-human C-reaktifprotein immobilize mikroküreler, hasta serumlarından alınan örneklerle in-vitroortamda etkileştirilerek çökelme deneyleri yapılmıştır. Bu çalışmalar sonundaçökelme şiddetlerine göre en yüksek skorlara sahip kitler belirlenerek seçilmiştir.Bu seçilen kitler ve ticari CRP tanı kitleri, seri olarak seyreltilerek hazırlanan hastaserumları ile etkileştirilerek kıyaslanmıştır. Bu kıyaslama sonuçlarına görehazırlanan kitlerin performansları saptanmıştır.Anahtar Kelimeler: CRP, polimerik mikroküreler, antijen immobilizasyonu, tanıkitleri.Danışman: Doç.Dr. Hakan AYHAN, Hacettepe Üniversitesi, Kimya MühendisliğiBölümü, Kimyasal Teknolojiler ABD.

Abstract:
ANTI C-REACTIVE PROTEIN IMMOBILIZATION ONTO POLYGLYSIDILMETHACRYLATE MICROSPHERES AND IT?S USE FOR DIAGNOSISErinç OZANABSTRACTThe aim of this study is to develop a test kit for diagnose of C-reactive protein(CRP) as an alternative to commercial kits. The diagnostic test kit to be developedis propsed as an polymeric carrier based test kit. In the first step of the submittedstudy, PGMA (polyglysidilmetacrylate) particles were synthesized by dispertionpolymerization method from the GMA (glysidilmethacrylate) monomer, dissolved inan ethanol medium, by using AIBN (asobisisobutyronitrile) as initiator and PAA(polyacrylicacid) as stabilizer. Size and size distribution of the synthesizedmicrospheres were determined by SEM (scanning electron microscope). Bycounting the particles from the obtained photographs the following results werecalculated: average diameter by number (Dn); 1,166Âµm, average diameter byweight (Dw); 1,166Âµm, polydispersity index (PDI); 1,000. The calculated monomertransformation value (%88,67 by weight), which was determined by gravimetricmethods, indicates that the total monomer transformation rate is satisfactory. Theobtained characterization results supported that the formulation could be usedsuccesfully. In the second step of the study, the characterized particles were usedas micro-carriers for the immobilization of the anti-human CRP aiming thediagnosis of CRP. For the immobilization process, adsorption and the covalentbinding methods of the binding onto a carrier technique has been applied.Glutaraldehyde, a bifunctional reactive, has been used as the spacer arm in thecovalent binding method. The ?immobilized antigen amount? results obtained fromThe Modified Lowry total protein analysis and the agglutination results obtainedfrom the patient serums stated that the adsorption method is totally uselesshowever with the presence of glutaraldehyde, the covalent binding method seemsto be favorable. The optimum conditions found at the end of the experiments forthe antigen to be immobilized onto the surface-modified microspheres are: initalglutaraldehyde concentration; %2, immobilization pH; 7.4, temperature ofimmobilization medium; 25oC, immobilization time 90 min. And initial antigenconcentration; 1Âµg/ml. For the last step of this study, agglutination tests have beendone under in-vitro conditions with the anti-human CRP immobilized microspheresand the samples from patient serums. By referring to the agglutination intensityscores, the kits resulting the most intense agglutination have been chosen. Thesechosen kits were compared with the commercial CRP diagnostic kits usedwidespreadly by reacting with patient serums preparde by serial dilution. Theperformances of the synthesized kits were determined by these comparison tests.Keywords: CRP, polymeric microspheres, antigen immobilization, diagnostic kits.Advisor: Assoc. Prof. Dr. Hakan AYHAN, Hacettepe University, Chemical Eng.Dept., Chemical Technology Division.