Kara havuç ekstraktının kompleks koaservasyon metoduyla nanoenkapsülasyonu: Tepki yüzey metodu ile optimizasyonu
Nanoencapsulation of the black carrot extraction with complex coacervation method: Optimization with response surface method
Yazar: EDA NUR AYAR
Danışman: PROF. DR. BERAAT ÖZÇELİK
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Gıdalar geleneksel besin maddelerinin yanı sıra birçok bileşik içerir. Bu bileşiklerin birçoğu enzimatik ve kimyasal reaksiyonları değiştirme kapasitesine sahiptir ve bu nedenle insan sağlığını hem olumlu hem de olumsuz etkileyebilir. Polifenoller olarak da adlandırılan fenolik bileşikler, bitki metabolitlerinin en bol ve en yaygın gruplarından biridir. Antioksidan, antiinflamatuar, antibakteriyel ve antiviral fonksiyonlar gibi yüksek biyolojik aktivite yelpazesine sahiptirler. Bu bileşiklerin dengeli bir diyetin parçası olarak tüketildiğinde insan sağladığına faydalarıyla bilinmektedir ve oksidatif stres ile ilgili kanser ve kardiyovasküler hastalık gibi çeşitli kronik hastalıkların üzerine pozitif etkileri vardır.
Fenolik bileşenler ve özellikle de antosiyanin çevre koşullarından etkilenerek çabuk bozulabilmektedir. Alkali ortam, sıcaklık, oksijen vb. pek çok faktör bozunma etkeni olabilir. Ayrıca, fenolik bileşikler sindirim süresince gastrointestinal bölgedeki koş ullarda ortam pH'sından etkilenmekte ve enzim ve diğ er nutrientlerin varlığ ı da bu bileşiklerin potansiyel sağlık etkilerini ve aktivitelerini engellemektedir. Bu kapsamda, sağlık açısından değerli olan bu bileşenlerin korunması hedeflenerek enkapsülasyon teknolojisinden faydalınabilinir. Enkapsülasyon teknolojisinde çeşitli biyoaktif maddeler kapsüller içeresinde haspedilir, böylece çevresel faktörlerden korunmuş olur. Serbest bileşikler yerine kapsüllü polifenollerin kullanımı instabilitelerinin dezavantajlarının üstesinden gelebilir, hoş olmayan tatları telafi eder, ayrıca bileşiğin biyolojik olarak kullanılabilirliğini ve yarı ömrünü in vivo ve in vitro arttırır. Enkapsülasyon metodunda kapsüllerin olabileceği boyutlar çok geniş bir aralığa sahiptir. Nano-, mikro-, makro-enkapsülasyon çalışmaları mevcuttur. Ancak gıdaların biyoyararlılığın ve biyoulaşılabililirliğinin artması yani bağırsaklardaki sindiriminin arttırılması amacıyla nano boyutta yapılan enkapsüllerin daha ve etken olduğu görülmektedir. Halihazırda fenolik bileşenlerin ve antosiyanininlerin enkapsülasyonunda kullanılan pek çok metot vardır: püskürterek kurutma, dondurarak kurutma, emülsyon oluşturma vb. Ancak bununla beraber, yapılan literatür taramasına göre koaservasyon metodu ile fenolik zengini kara havuç ekstraktlarının enkapsülasyonuna dair herhangi bir çalışma yoktur.
Kara havuç geleneksel olarak ılıman bölgelerde yetiştirilmektedir ve doğal gıda renklendiricilerinin en önemlilerinden biri olarak görülmektedir. İçerdiği yüksek oranda fenolik bileşenler ve en önemlisi de antosiyanin miktarı, kara havucun hem sağlık açısından pek çok faydasını hem de renk maddesi olarak kullanılabilirliğini sağlamaktadır. Kara havucun ana antosiyaninin bileşeni asilatlı ve sübstitüe edilmemiş siyanidin türevleridir. Kara havuçta çoğunlukla bulunan antosiyaninler, ferulik, sinapik ve p-kumar asitlerle daha monoasillenmiş siyanürleme-3-ksilosil- galaktoz ve siyanürleme-3-ksilosil-glukosil-galaktoz olarak tanımlanabilir.
Antosiyaninlerin yanında, p-kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit, 3-hidroksibenzoik asit türevleri ve 1quercetin glikozit, klorojenik asit, mono- ve dihidroksisinnamoilkinik asit kara havuçta belirlenen diğer fenoliklerdir.
Koaservasyon metoduyla fenolik zengini kara havuç ekstraktlarının enkapsülasyonun optimum koşullarının belirlenmesi amacıyla tepki yüzey metodu (RSM) kullanılmıştır. RSM son yanıtın optimize edilmesini amaçlayan matematiksel ve istatistiksel tekniklerden oluşan bir kombinasyonu temsil eder. Enkapsülasyon koşulları belirlenirken koaservasyon sağlanabilmesi için gerekli koşullar ve kullanılan hammadde göz önünde tutularak karar verilmiştir. Koaservasyon için ana kriterlerden biri olan pH parametresi asidik koşullarda olmak üzere farklı değerlerde çalışılmıştır. Koaservatlar oluşturulurken farklı kaplama materyali kompozisyonları kullanılarak optimum oran belirlenmiştir.
Deneme deseni merkezi kompozit tasarımı ile 3 faktör ve 3 seviyeli olarak hazırlanmıştır. Çalışmada 3 bağımsız değişkenin 5 farklı özelliğe/yanıta etkisi incelenmiştir. Ph için seçilen değer aralığı 3.0-5.0, % ekstraksiyon oranı için seçilen aralık 0,2-1,0 ve kaplama materyali olaran seçilen farklı formüllerde kullanılan peynir altı suyu proteini oranı % 0-20 olarak belirlenmiştir. Bu amaçla, enkapsülasyon verimliliği, toplam flavanoid miktarı, toplam antioksidan miktarı, partükül boyutu ve zeta potansiyeli analizleri uygulanmıştır. Toplam antioksidan analizleri yapılırken, antioksidan özelliğinin farklı bileşenler tarafından oluşmasından dolayı tek bir analiz yeterli görülmemiş ve iki farklı metodla belirlenmiştir. Antioksidan kapasitesi DPPH (Diphenyl-1pictylhydrazyl) metoduyla serbest radikal yakalam özelliği ve CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity) metodu ile bakır iyonlarının indirgeme özelliği analizlenmiştir.
Bu çalışmada kara havuç kimyasal yöntemler ile ekstraksiyon edildikten sonra dondurucu kurutucuda kurutulmuştur. Enkapsülasyon işlemine hazır olan ekstraktlar, maltodekstrin, gam arabik ve formülasyona uygun whey protein çözeltileri (%10) ile karıştırılmış sonrasında homojinasyon ve partükül boyutu küçültme amaçlı Ultratrox ve Ultrasound cihazlarında muamele görmüştür. pH ayarlamaları HCl ve NaOH çözeltileri ile yapıldıktan sonra partikül boyutları ve zeta potansiyelleri anında ölçülüp sonrasında püskürtmeli kurutucuda kurutulmuştur. RSM desenine göre aynı prosedür 15 farklı formülasyona uygulanmıştır. Sonrasında tüm analizler her örnek için tekrarlı uygulanmıştır. Analiz sonuçlarına göre en düşük enkapsülasyon verimi %60 iken en yüksek enkapsülasyon verimi %89,36 bulunmuştur. Toplam antioksidan aktivitesini belirlemek amaciyla yapılan analizlerden DPPH analizi sonuçları 21,09 mg Trolox/100 mg `dan 68,09 mg Trolox/100 mg`a kadar, CUPRAC analiz sonuçları ise 27,50 mg Trolox/100 mg`dan 141,58 mg Trolox/100 mg`a kadar değişmektedir. Toplam flavanoid miktarı analiz sonuçları ise 2,51 mg Trolox/100 mg`dan 9,54 mg Trolox/100 mg`a kadar değişmektedir.
Enkapsülasyon verimine kaplama materyali ve kaplama materyali*ph interaksiyonunun önemli derecede (p<0,05) etkisi olduğu bulunmuştur. Antioksidan aktivetisinin bellirlenmesi için yapılan analizlerden birincisi olan DPPH analizinde konsantrasyonun etkisi p<0,05 öneminde etkisi olduğu belirlenmiştir, ikinci antioksidan belirlenme analizi olan CUPRAC için ise kaplama materyalinin p<0,01 öneminde etkisi olduğu tespit edilmiştir. Flavanoid miktarının belirlenmesi için yapılan analizde ise ph etkisi p<0,05 derecesinde önemlidir.
Partikül boyutu ve zeta potansiyeli üzerine bağımsız değişkenlerin etkileri incelendiğinde ise p<0,005 derecesinde kaplama materyalinin önemi belirlenmiştir. Peynir altı suyu proteinin kaplama materyali içeresindeki oranı arttıkça zeta potansiyeli küçülmüş, partikül boyutu büyümüştür.
RSM deseni sonucunda istenilirlik derecesinin 0,84 olduğu optimizasyon elde edilmiştir. Bu değer, analizlerin istenilebilir oranda tekrar edilip istenilen optimum koşulların elde edilebileceğini göstermektedir. Tahmin edilen değerler, gerçek değerlerle kıyaslanmıştır ve hata payının %5'den daha küçük olduğu tespit edilmiştir. Optimum koşullarda üretilen koaservatlar farklı gıda matrislerin etkisinin incelenmesi amacıyla çeşitli ürünlerde mide ve bağırsak sindirimleri incelenmiştir. Protein zengini ve karbonhidrat zengini matrislerin etkisini belirlemek amacıyla yağsız süt ve elma suyu numunelerine fenolik zengini kapsüller ilave edilmiştir. Ayrıca, sıcaklığın kapsüllerin stabilitesi üzerine etkisini inceleyebilmek için çikolatalı içecek tozuna kapsüller eklenmiştir ve hazırlama talimatlarına göre yarım yağlı süt ile sıcak (85oC) ve soğuk (4oC) olarak hazırlanmıştır.
Kapsüller ile zenginleştirilen farklı gıdalar daha sonra biyoyararlılık çalışması için in vitro analiz edilmiştir. Çalışmalar mide ve bağırsak ortamında gerçekleştirilip, mide ortamını taklit eden sıvıya (SGF) ve bağırsak ortamını taklit eden sıvıya (SIF) salınan fenolik maddelerin toplam fenolik ve antioksidan aktivitesinin spektrofotometrik yöntemlerle analizleri yapılmıştır. SGF ve SIF salınımlarının örnekte bulunun gerçek toplam fenolik madde miktarına ve örneğin antioksidan aktivitesine kıyaslanabilmesi için biyoyararlılık analizi yapılmadan önce örneklerin bir miktarında kapsüller parçalanarak fenolik ekstraksiyonu yapılmıştır. Ayrıca kapsülsüz ürünlere de in vitro biyoyararlılık analizi yapılmıştır ve böylece kapsül ile zenginleştirilmiş ürünlerin sindirim sonucunda daha fazla antioksidan özellik gösterdiği bulunmuştur.

Abstract:
Foods contains many compounds as well as traditional nutrients. Many of these compounds have the capacity to change enzymatic and chemical reactions and thus can affect human health both positively and negatively. Phenolic compounds, also called polyphenols, are one of the most abundant and most common groups of plant metabolites. They have a high biological activity spectrum such as antioxidant, antiinflammatory, antibacterial and antiviral functions. When these compounds are consumed as part of a balanced diet, they are beneficially beneficial to human beings and have positive effects on various chronic diseases such as cancer and cardiovascular disease related to oxidative stress.
Today, one of the main areas of research in food science and technology is the characterization of new natural additives with biological activity that can contribute to consumer welfare, which is part of new functional additives, as well as extraction. Phenolic compounds can be found in leaves, fruites, flowers, woody parts, and in many plant parts of various plants. Phenolic compounds, phenolic acids and flavonoids are separated into two groups. Flavanoids are polyphenolic antioxidants found in the natural structures of herbal teas, fruits and vegetables. Some of the phenolic compounds are effective in the formation of the flavors of fruits and vegetables, especially in the formation of two important flavors such as bitterness and bitterness in the mouth. Some of them provide the colors of fruits and vegetables in yellow, yellow-brown, red-blue tones. It has been shown that phenolic compounds, secondary metabolites of plants, show antioxidant properties, cleans radicals, extinguishes oxygen atoms and acts as an ion or hydrogen donor.
Phenolic compounds, and especially anthocyanins, can be quickly deteriorated by being affected by environmental conditions. Alkaline environment, temperature, oxygen, etc. Many factors can affect the distortion. In addition, phenolic compounds are affected by ambient pH during gastrointestinal conditions during the digestion period, and the presence of enzymes and other nutrients also inhibits the potential health effects and activities of these compounds. In this context, it is possible to benefit from encapsulation technology by aiming to protect these health-worthy components. In encapsulation technology, various bioactive substances are encapsulated in capsules, thus being protected from environmental factors. The use of encapsulated polyphenols in place of the free compounds can come from overcoming the disadvantages of instabilities, compensating for unpleasant tastes, as well as increasing the bioavailability and half-life of the compound in vivo and in vitro. In the encapsulation method, the size of the capsules can be very wide. Nano-, micro-, macro-encapsulation studies are available. However, nano-sized encapsules seem to be more and more active in order to increase the bioavailability and biocompatibility of foods, ie to increase digestion in the intestines. Currently there are many methods used for the encapsulation of phenolic compounds and anthocyanins: spray drying, freeze drying, emulsification, etc. However, according to the literature review, there is no study on the encapsulation of phenolic rich black carrot extracts by the coevaporation method.
Black carrots are traditionally grown in temperate regions and are regarded as one of the most important of natural food colorants. The high content of phenolic constituents and, most importantly, the amount of anthocyanin provides many benefits for black carrot and health as well as its availability as a coloring agent. The main component of the black carrot is an acylated and unsubstituted cyanide derivative. The anthocyanins commonly found in black carrots can be defined as cyanide-3-xylosyl-galactose and cyanide-3-xylosyl-glucosyl-galactose, which are more monoacylated with ferulic, sinapic and p-gumaric acids. Besides the anthocyanins, p-coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid, 3-hydroxybenzoic acid derivatives and 1quercetin glycoside, chlorogenic acid, mono- and dihydroxycinnamoylquinic acid are other phenolics determined in black carrot.
The reaction surface method (RSM) was used to determine the optimum conditions for the encapsulation of phenolic rich black carrot extracts by coacervation method. RSM represents a combination of mathematical and statistical techniques aimed at optimizing the final response. When the encapsulation conditions are determined, it is decided by taking into consideration the conditions and the raw materials used for coaching. The pH parameter, which is one of the main criteria for coacervation.
The trial design center was prepared with 3 factors and 3 levels with composite design. In study, 5 different features/effects of 3 independent variables were examined. The selected value range for Ph is 3.0-5.0, the selected range for the% extraction ratio is 0.2-1.0, and the ratio of whey protein used in the different formulations selected as coating material is 0-20%. For this purpose, encapsulation efficiency, total flavonoid amount, total antioxidant amount, particle size and zeta potential analysis were applied. In total antioxidant assays, a single assay was not considered sufficient because of the antioxidant properties produced by the different components and was determined by two different methods. Antioxidant capacity The ability to capture free radicals by the DPPH (Diphenyl-1pictylhydrazyl) method and the ability to reduce copper ions by the Cupric Reducing Antioxidant Capacity (CUPRAC) method were analyzed.
In this study, black carrot was extracted with chemical methods and then dried in freezer dryer. Black carrot samples were divided into small pieces in liquid nitrogen and in the grinder to avoid reaching high temperatures. Thus, the efficiency is expected to increase when extractions are applied. Black carrots were extracted with 70% methanol. After extraction, the solution was left in the freeze dryer for one night and the water was removed. Samples taken from the freeze dryer were stored at -20 ° C for subsequent analysis The extracts ready for encapsulation were mixed with maltodextrin, gum arabic and whey protein solutions (10%) suitable for formulation and then treated in Ultratrox and Ultrasound devices for homogenization and particle size reduction. After adjusting the pH with HCl and NaOH solutions, particle sizes and zeta potentials were measured immediately and then dried in spray drier. The same procedure was applied to 15 different formulations according to RSM design. Subsequent analyzes were repeated for each sample. According to the analysis results, the lowest encapsulation yield was 60% while the highest encapsulation yield was 89,36%. The results of DPPH analysis for the total antioxidant activity were 21,09 mg Trolox / 100 mg to 68,09 mg Trolox / 100 mg, CUPRAC analysis results were 27,50 mg Trolox / 100 mg and 141,58 mg Trolox / 100 mg. The total flavanoid amount analysis results ranged from 2.51 mg Trolox / 100 mg to 9.54 mg Trolox / 100 mg.
The encapsulation efficiency was found to be the effect of coating material and coating material * pH interaction (p <0,05). In the DPPH analysis, which is the first analysis to identify antioxidant activity, the effect of concentration was determined to have a significant effect of p <0.05 and for CUPRAC, the second antioxidant determination analysis, it was determined that the effect of coating material was p <0.01. In the analysis to determine the amount of flavanoid, the pH effect is significant at p <0.05.
When the effects of the independent variables on particle size and zeta potential were examined, the importance of coating material in p <0.005 degree was determined. As the ratio of whey protein to coating material increases, the zeta potential shrinks, the particle size grows.
Optimization of the RSM design result of 0.84 is obtained. This value indicates that the analyzes can be repeated at the desired rate and the desired optimum conditions can be achieved. The results from the optimization RSM design were repeated with the same conditions as the previous analyzes. Analyzes of the capsules prepared according to the optimization values were carried out. In this context, analyzes of particle size, zeta potential, encapsulation efficiency, antioxidant activity determination and total flavanoid amount were carried out. The results of each analysis are compared to the values required to reach the optimization endpoint. It is important that this comparison is smaller than 5% when compared. In our study, estimated values are compared to actual values and it is determined that the error margin is less than 5%. Coacervates produced under optimal conditions have been examined for gastric and intestinal digestion in various products for the purpose of examining the effect of different food matrices. Phenolic rich capsules were added to samples of skim milk and apple juice to determine protein richness and the effect of carbohydrate rich matrices. In addition, capsules were added to the chocolate beverage powder to examine the effect of temperature on the stability of the capsules and were prepared warm (85°C) and cold (4°C) with semi-oily milk according to the preparation instructions.
The different foods enriched with capsules were then analyzed in vitro for bioavailability studies. Studies were carried out in stomach and intestinal environment and the total phenolic and antioxidant activities of phenolic substances released in liquid (SGF) mimicing stomach environment and liquid (SIF) mimicking intestinal environment were analyzed by spectrophotometric methods. Phenolic extraction was performed by breaking down the capsules in an amount of the samples before performing bioavailability analysis so that the SGF and SIF emissions can be compared to the actual total amount of phenolic material and the antioxidant activity, for example. In addition, in vitro bioavailability analysis has been carried out on non-capsular products, and thus it has been found that products enriched with capsules have more antioxidant properties as a result of digestion.