Candida diddensiae format dehidrogenaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu
Recombinant expression and characterization of Candida diddensiae formate dehydrogenase enzyme
Yazar: EDA ARSLAN
Danışman: DOÇ. DR. EMEL ORDU
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Candida albicans = Candida albicans ; DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Enzimler = Enzymes ; Halofilik archaea = Halophilic archaea

Özet:
Organik çözgen içeren ortamlarda enzim aktivitesi klasik reaksiyon ortamı olan sudan daha düşük olmakla birlikte, biyolojik olarak çözülebilen organik çözücüler polar olmayan substratların çözünürlüğünü artırarak reaksiyon hızını artırmakta, istenmeyen yan ürünleri engellemekte, mikrobiyal kontaminasyonu azaltmakta, termostabiliteyi artırmakta ve sulu çözeltilerde gerçekleştirilmesi tercih edilmeyecek reaksiyonların oluşturulmasına imkan sunmaktadır. Halofilik mikroorganizmalardan elde edilen enzimler, tuzun su aktivitesini düşürmesinden dolayı, az sulu ya da susuz reaksiyon ortamlarında stabilitelerini mezofilik homologlarına göre daha iyi koruduğu bilinmektedir.
Son yıllarda NAD+-bağımlı format dehidrogenazlar optikçe saf kiral moleküllerin üretiminde ihtiyaç duyulan, pahalı bir koenzim olan NAD(P)H' ın rejenerasyonunda ve CO2' in hidrojen yakıtının kararlı bir formu olan formata indirgenmesinde önemli hale gelmiştir. Bu sebeple endüstriyel sentezlerin zorlu koşullarında kararlılığını koruyabilecek ve aktivite gösterebilecek yeni FDH'lerin rekombinant olarak üretimeleri önemlidir. Bu çalışmada, % 8-10 NaCl ve pH 3-4 olan zeytin salamura ortamından izole edilerek, 16S RNA yöntemiyle Candida diddensiae olarak tanımlanan halofilik bir mayadan izole edilmiş yeni bir NAD+-bağımlı FDH'in (CdFDH) rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. PQE-2 vektörüne klonlanan CdFDH geni, 1 mM IPTG içeren ortamda ekspresyonun sağlanmasının ardından enzim saf bir şekilde elde edilebilmiştir. Aktivite ve stabilite deneylerinde, CdFDH enziminin geniş bir pH aralığında pH (pH 6 -9) aktive gösterebildiği ölçülmüştür. Yapılan termal aktivite deneylerinde enzimin aktivitesinin yarısını kaybettiği T0.5 değeri 52°C olarak ölçülmüştür. En yüksek enzim aktivitesi 35°C'de tespit edilmiştir. Süreye bağımlı termal aktivite deneylerinde enzim en uzun 47°C'de 1400. dakikaya kadar, en kısa 59°C'de 15. dakikaya kadar aktivite göstermiştir. Enziminin +4 °C'de 25 gün boyunca ölçülebilir bir aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Farklı tuz konsantrasyonlarında (0 - 4 M NaCl, KCl ve MgCl2) inkübe edilen enzim NaCl ve KCl içeren ortamlarda aktivitesini kaybetmezken MgCl2 içeren ortamlarda 2 M üzerindeki konsantrasyonlarda aktivitede düşüş gözlemlenmiştir. En yüksek aktivite 0.8 M KCl içeren ortamda kontrol grubuna oranla 8 kat fazladır. 0.8 M NaCl içeren ortamda kontrol grubuna göre fazla 7 kat 0.8, 0.4 M MgCl2 içeren ortamda ise kontrol grubuna göre 6 kat fazla ölçülmüştür. Organik solvent içeren ortamlardaki aktivite deneyleri aseton, 2-propanol ve n-hekzan (%10-80) içeren ortamlarda gerçekleştirilmiştir. Enzim belirlenen konsantrasyonlarda organik çözücü içeren ortamlarda inkübe edilmiş ve kalan aktiviteleri ölçülmüştür. Enzim aktivitesi %60 v/v konsantrasyona kadar aseton içeren ortamda kontrol grubuna göre en düşük %10.48; %40 v/v konsantrasyona kadar 2-propanol içeren ortamda en düşük %3.5 ve %80 v/v konsantrasyona kadar n-hekzan içeren ortamda %182.47'ye kadar koruyabilmiştir.

Abstract:
However, the activity of enzymes in organic solvents is lower than in conventional reaction medium, water, biodegradable organic solvents enhance reaction rate by increasing solubility of nonpolar substrates, eliminating unfavorable side reactions, minimizing microbial contamination, enhancing thermostability, and allowing reactions usually not favored in aqueous solution to occur. Enzymes obtained from halophiles, due to the effect of salt to reduce the water activity, can maintain their stability better than mesophilic homologs, in the reactions containing low or non-aqueous organic solvents. 
In recent years, NAD+-dependent formate dehydrogenases have become important for the regeneration of NAD(P)H which is an expensive coenzyme used in enzymatic synthesis of chiral molecules that need to be produced optically pure and, for the reduction of CO2 to formate that is a stabilized form of hydrogen fuel. Therefore, the recombinant production of novel FDHs that could be active and stable in the harsh conditions of industrial synthesis is important. In this study recombinant expression and characterization of a novel NAD+-dependent FDH isolated from halophilic and thermophilic yeast, Candida diddensiae, have been performed. C. diddensiae was isolated from an environment with 8-10 % NaCl and pH 3-4. CdFDH gene cloned into the pQE-2 vector was overexpressed in the medium containing 1 mM IPTG. Activity and stability experiments show that the CdFDH enzyme is active in a wide range of pH (pH 6 – 9). In the thermal activity experiments, the T0.5 value, in which the enzyme lost half of its activity, was measured as 52°C. The highest CdFDH activity was determined at 35°C. In time-dependent thermal activity experiments, the protein showed the longest at 47°C for up to 1400 minutes and the shortest at 59°C for 15 minutes. The enzyme has a measurable activity for 25 days at +4 °C. While the protein incubated at different salt concentrations (0 - 4 M NaCl, KCl, and MgCl2) did not lose its activity in media containing NaCl and KCl, a decrease was observed in activity at concentrations above 2 M in media containing MgCl2. The highest activity in the medium containing 0.8 M KCl was 8 times higher than in the control group. It was measured 7 times more in the medium containing 0.8 M NaCl compared to the control group, and 6 times more in the medium containing 0.4 M MgCl2 compared to the control group. Activation experiments in media containing organic solvents were performed in media containing acetone, 2-propanol, and n-hexane (10-80%). The enzyme was incubated in the medium containing organic solvents at the determined concentrations and the residual activities were measured. Enzyme activity is lowest in acetone containing up to 60% v/v concentration, lowest in 2-propanol containing up to 40% v/v concentration, and lowest in the n-containing medium compared to the control group. It managed to protect -hexane up to 182.47% up to 3.5% and 80% v/v concentration.