Diffüz büyük B-hücreli lenfomada eksozomal ve nükleer DNA metilasyon paternlerinin karşılaştırılması
Comparison of exosomal and nuclear dna methylation paterns in diffuse large B-cell lymphoma
Yazar: İKBAL CANSU BARIŞ
Danışman: PROF. DR. GÜLSEREN BAĞCI
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: DNA = DNA ; Dizi analizi-DNA = Sequence analysis-DNA ; Eksozomlar = Exosomes ; Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Genler = Genes

Özet:
Diffüz Büyük B-Hücreli Lenfoma (DBBHL) agresif lenfomaların en yaygın tipidir ve Hodgkin-dışı lenfomaların yaklaşık %30-40'ını oluşturmaktadır. DBBHL'nin moleküler patogenezi kompleks ve çok basamaklı mekanizmaları içermektedir. Bu mekanizmalardan bir bölümü aydınlatılmış olsa da, henüz hastalığın tam olarak patogenezi bilinmemektedir.     
Kanser hücrelerinden köken alan eksozomların tümör oluşumu, progresyonu ve yayılımına neden olacak önemli modülatörleri içerdikleri iyi bilinmektedir. Bu çerçevede, bu çalışma DBBHL'de primer tümörde EZH2-hedef genlerinde gözlenen epigenetik değişimlerin sirkülasyondaki eksozomlarda da belirlenebilirliğini değerlendirmek amacı ile dizayn edildi. 
Çalışmada 21 DBBHL hastası ve 21 sağlıklı gönüllü bireyin plazma eksozomları izole edildi. Eksozomlardan ve primer tümör dokularından DNA izolasyonu yapılarak, metilasyon-spesifik PCR ile hedef genlerdeki metilasyon durumları belirlendi. Aynı zamanda izole edilen RNA örnekleri kullanılarak, eksozomların ve primer tümör doku örneklerinin hedef genlere ait transkriptleri içerip içermedikleri belirlendi. EZH2'de mutasyonun varlığı DNA dizi analizi ile incelendi. 
Primer tümörlerle uyumlu olarak DBBHL eksozom örneklerinin CDKN1A ve CDKN1B unmetile DNA'sını ve CDKN2A ve CDKN2B metile DNA'sını içerdikleri belirlendi. DBBHL FFPE doku örneklerinin tümünde EZH2 mRNA'sının varlığı gözlenmişken karşılıkları olan eksozom örneklerinde söz konusu transkriptin varlığına rastlanmadı. FFPE doku örneklerinin 12'sinde (%57) CDKN1A; 9'unda (%43) CDKN2A mRNA'sının varlığı belirlenirken, aynı örneklerin eksozom karşılıklarında CDKN1A ve CDKN2A mRNA'larına rastlanmadı. FFPE doku örneklerinin tümünde CDKN1B; 3'ünde (%14) CDKN2B transkriptinin varlığı belirlenmişken karşılıkları olan eksozom örneklerinin %38'inin CDKN1B transkriptini içerdikleri ve hiçbirinin CDKN2B transkripti içermediği belirlendi. Ayrıca, primer tümörle uyumlu olarak eksozom örneklerinin EZH2 Y641 mutasyonunu taşımadığı saptandı.  
Bu çalışma, DBBHL-kökenli eksozomlarda DNA'nın varlığını gösteren ilk çalışmadır. Bu çalışma DBBHL'de plazma eksozomlarının primer tümörle uyumlu DNA fragmanlarını içerdiklerini gösteren ilk çalışmadır. DBBHL'de plazma eksozomlarının primer tümörden tercihli olarak özgün hedef moleküllerini paketlediklerini ve CDKN1B ile CDKN2A ve CDKN2B'nin rol oynadığı yolaklar üzerinden lenfomageneze katıldıklarını düşünmekteyiz.

Anahtar Kelimeler: Diffüz Büyük B-Hücreli Lenfoma, eksozom, epigenetik, EZH2,
EZH2-hedef genleri

Abstract:
Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) is the most common type of aggressive lymphoma, and accounts for approximately 30-40% of non-Hodgkin's lymphomas. The molecular pathogenesis of DLBCL is a complex, multistep process. Although recent advances in our understanding of the process have been significant, the pathogenesis still remains to be elucidated.  
It is well known that exosomes derived from cancer cells are able to transfer important modulators for tumor formation, progression and spread. In this respect, this study was designed to evaluate if epigenetic changes in EZH2-targeted genes in primary tumor are also observed in circulating exosomes.  
This study included 21 healthy volunteers and 21 DLBCL patients and then plasma exosomes were isolated. After DNA isolation from the exosomes and primary tumor tissue samples, methylation-specific PCR was used to determine methylation status of the target genes. It was also determined whether exosomes and primary tumor tissue samples contained transcripts of the target genes using isolated RNA samples. DNA sequencing was used to determine the presence of mutation in EZH2.
In concordance with the primary tumors, CDKN1A and CDKN1B unmetile DNAs and CDKN2A and CDKN2B methylated DNAs were determined in the exosomes isolated from DLBCL patients. EZH2 transcript was found in all primary tumor samples of DLBCL patients but no in the exosome counterpart. CDKN1A and CDKN2A transcrits were determined in 12 (57%) and 9 (43%) of the FFPE tumor samples, respectively whereas these transcripts were not  found in  the exosomes. CDKN1B transcript was determined in all FFPE tumor samples while CDKN2B transcript was determined in 3(14%) of the tumor samples. In the exosome counterpart, the presence of CDKN1B transcript was observed in 38% of the samples while there was no transcript for CDKN2B. In addition to, EZH2 Y641 mutation was not detected in both exosome samples and primary tumor samples counterparts. 
This study is the first to show that exosomes included DNA fragments which is in concordance with primary tumors. We thought that specific target molecules were preferentially sorted into exosomes and plasma exosomes may contibute to lymphomagenesis, at least in part, by pathogenic pathways including CDKN1B, CDKN2A and CDKN2B.



Keywords: Diffuse Large B-Cell Lymphoma, exosome, epigenetic, EZH2, EZH2-
targeted genes