hTOPO IIα enzim inhibitörü olabilecek bazı benzazol türevi bileşiklerin ın silico tasarımı, sentezi ve antikanser etki çalışmaları
In silico design, synthesis and anticancer activity studies of some benzazole derivatives as potential hTOPO IIα enzyme inhibitors
Yazar: GÖZDE YENİCE ÇAKMAK
Danışman: PROF. DR. İLKAY YILDIZ ; DR. ÖĞR. ÜYESİ SERAP YILMAZ ÖZGÜVEN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
hTopo IIα enzimi, kanser tedavisinde önemli bir hedef olup, bu enzimin inhibisyonu çeşitli kanser türlerinde etkili bir tedavi yaklaşımı sunmaktadır. Bu doktora tez çalışmasında, hTopo IIα enzimi inhibitörü olabilecek yeni 13 adet ve toplamda 30 adet metil (2-sübstitüefenil)-1H-benzimidazol-5(6)-karboksilat (2a-2p) ve metil (2-sübstitüefenil)benzoksazol-5-karboksilat (3a-3p) türevleri tasarlanmış, sentezlenmiş ve sitotoksisite ve hTopo IIα enzim inhbisiyonu çalışmaları ile biyolojik aktiviteleri kapsamlı bir şekilde değerlendirilmiştir.
Benzimidazol türevlerinin sentezinde, 3,4-diaminobenzoik asidin tiyonil klorür varlığında metanol ile esterleşmesiyle metil 3,4-diaminobenzoat (1a) ara ürünü hazırlanmıştır. Bu ara ürün, çeşitli benzaldehit türevleriyle reaksiyona sokularak metil (2-sübstitüefenil)-1H-benzimidazol-5(6)-karboksilat (2a-2p) türevlerine dönüştürülmüştür. Benzoksazol türevlerinin sentezinde ise 3-amino-4-hidroksibenzoik asit, asetil klorür varlığında metanol ile esterleştirilerek metil ester türevi olan metil 3-amino-4-hidroksibenzoat (1b) elde edilmiştir. Bu ara ürün, farklı sübstitüe benzaldehit türevleriyle reaksiyona sokularak metil (2-sübstitüefenil)benzoksazol-5-karboksilat (3a-3p) türevleri sentezlenmiştir. Sentezlenen bileşiklerin saflık ve yapısal karakterizasyonu, erime noktası, ince tabaka kromatografisi (İTK), ¹H NMR, ¹³C NMR, LC, Mass (ESI+) ve IR analizleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Bileşiklerin in vitro antikanser aktiviteleri, prostat (LNCaP), karaciğer (HepG2) ve akciğer (A549) kanseri hücre hatlarında ve sağlıklı insan embriyonik böbrek hücre hattı (293T) üzerinde WST-1 testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Referans inhibitör olarak etoposid kullanılmış ve bileşiklerin antikanser etkinlikleri IC₅₀ değerleri üzerinden karşılaştırılmıştır. Ayrıca, 13'ü orijinal toplamda 30 adet sentezlenen bileşiklerin hTopo IIα enzimi üzerindeki bağlanma potansiyelleri in vitro enzim çalışmaları üzerinden incelenmiştir.
Bileşiklerin moleküler düzeyde bağlanma özelliklerini ve enzim-DNA kompleksindeki etkileşimlerini analiz etmek ve bağlanma mekanizmalarını değerlendirmek için hTopo IIα enziminin (PDB: 5GWK) kristal yapısı kullanılarak moleküler kenetlenme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, bileşiklerin in silico ADMET özellikleri değerlendirilerek farmakokinetik profilleri, biyoyararlanımları ve toksisite tahminleri kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir.
Elde edilen sonuçlara göre, benzimidazol türevlerinin benzoksazol türevlerine kıyasla daha yüksek antikanser aktivite sergilediği gözlemlenmiştir. Özellikle 2n bileşiği, HepG2 ve A549 hücre hatlarında etoposide kıyasla sırasıyla (33,58 (±5,31) ve 35,29 (±3,35) µM değerleri ile daha güçlü antikanser aktivite ve hTopo IIα enzimine karşı yüksek bağlanma potansiyelleri (1,10 µg/L) göstermiştir. Bunun yanında 2h ve 2l bileşikleri de LNCaP, HepG2 ve A549 hücrelerine karşı (sırasıyla, 11,84 (±3,48); 19,59 (±2,15) µM ve 20,22 (±3,05) ve 10,83 (±4,74); 15,58 (±5,25); 14,48 (±4,28) µM olmak üzere) güçlü antikanser aktiviteleriyle dikkat çekmiştir. 
Moleküler kenetlenme çalışmaları, bileşiklerin DNA stabilizasyonunda önemli π-π ve π-katyon etkileşimleri sergilediğini ortaya koymuştur. ADMET analizleri, bileşiklerin büyük çoğunluğunun iyi farmakokinetik profile sahip olduğunu ve Lipinski ve Veber kurallarına uygunluk gösterdiğini ortaya koymuştur. Düşük toksisite profiliyle 3m ve 3i türevleri öne çıkarken, 2d bileşiği yüksek kardiyotoksisite potansiyeli nedeniyle dikkatle değerlendirilmesi gereken bir aday olarak belirlenmiştir.

Abstract:
hTopo IIα enzyme is a significant target in cancer therapy, and its inhibition offers an effective treatment approach for various types of cancer. In this doctoral thesis study, 13 novel and a total of 30 derivatives of methyl (2-substituted phenyl)-1H-benzimidazole-5(6)-carboxylate (2a-2p) and methyl (2-substituted phenyl)benzoxazole-5-carboxylate (3a-3p) were designed, synthesized, and comprehensively evaluated for their biological activities through cytotoxicity and hTopo IIα enzyme inhibition studies.
In the synthesis of benzimidazole derivatives, methyl 3,4-diaminobenzoate (1a) was prepared as an intermediate by esterification of 3,4-diaminobenzoic acid with methanol in the presence of thionyl chloride. This intermediate was reacted with various benzaldehyde derivatives to yield methyl (2-substituted phenyl)-1H-benzimidazole-5(6)-carboxylate (2a-2p) derivatives. For the synthesis of benzoxazole derivatives, 3-amino-4-hydroxybenzoic acid was esterified with methanol in the presence of acetyl chloride to obtain the methyl ester derivative, methyl 3-amino-4-hydroxybenzoate (1b). This intermediate was reacted with different substituted benzaldehyde derivatives to synthesize methyl (2-substituted phenyl)benzoxazole-5-carboxylate (3a-3p) derivatives. The purity and structural characterization of the synthesized compounds were performed using melting point, thin-layer chromatography (TLC), ¹H NMR, ¹³C NMR, LC-MS, Mass (ESI+), and IR analyses.
The in vitro anticancer activities of the compounds were evaluated using the WST-1 assay on prostate (LNCaP), liver (HepG2), and lung (A549) cancer cell lines, as well as the healthy embryonic kidney cell line (293T). Etoposide was used as a reference inhibitor, and the anticancer activities of the compounds were compared based on their IC₅₀ values. Additionally, the binding potentials of the 13 novel and 30 as total synthesized compounds on hTopo IIα were analyzed through in vitro enzymatic assays.
To analyze the molecular-level binding properties and interactions of the compounds within the enzyme-DNA complex, molecular docking studies were conducted using the crystal structure of the hTopo IIα enzyme (PDB: 5GWK). Furthermore, the in silico ADMET properties of the compounds were assessed to comprehensively analyze their pharmacokinetic profiles, bioavailability, and toxicity predictions.
The results showed that benzimidazole derivatives exhibited higher anticancer activity compared to benzoxazole derivatives. Notably, compound 2n demonstrated stronger anticancer activity against HepG2 and A549 cell lines compared to etoposide, with values of 33.58 (±5.31) and 35.29 (±3.35), respectively, as well as high activity against hTopo IIα enzyme (1.10 µg/L). Additionally, compounds 2h and 2l showed remarkable anticancer activities against LNCaP, HepG2, and A549 cells (11.84 (±3.48), 19.59 (±2.15), and 20.22 (±3.05) µM for 2h; 10.83 (±4.74), 15.58 (±5.25), and 14.48 (±4.28) µM for 2l. 
Molecular docking studies revealed significant π-π and π-cation interactions of the compounds in DNA stabilization. ADMET analyses indicated that the majority of the compounds had favorable pharmacokinetic profiles and complied with Lipinski's and Veber's rules. While compounds 3m and 3i stood out with low toxicity profiles, compound 2d was identified as a candidate requiring careful evaluation due to its high cardiotoxicity potential.