Akdeniz, Ege ve Marmara denizleri'nden toplanan bazı makroalg türlerinin biyoaktif metabolit içeriklerinin ve etkilerinin belirlenmesi
Determination of bioactive metabolite contents and effects of some macroalgae species collected from Mediterrenian, Aegean and Marmara seas
Yazar: HATİCE BANU KESKİNKAYA
Danışman: PROF. DR. CENGİZ AKKÖZ
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Akdeniz = Mediterranean ; Antibakteriyel aktivite = Antibacterial activity ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Ege Denizi = Aegean Sea ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Makroalgler = Macroalgae ; Marmara = Marmara ; Metabolitler = Metabolites

Özet:
Denizel organizmalar arasında algler, yüksek kimyasal yapı çeşitliliği ve sahip olduğu aktif doğal ürün potansiyeli ile en verimli organizmaların başında gelir. Alglerin zengin fitokimyasal özelliklerinin araştırılarak farklı biyolojik aktivitelerini açığa çıkarmak ve alternatif tedavi ve ilaç uygulamaları konusunda ön hazırlık diyebileceğimiz bu tez çalışmasında ülkemiz denizlerinde yayılış gösteren makroalg türlerinden seçtiğimiz örneklerimiz üzerinde değerlendirme yapılmıştır. 
Bu tez çalışmasında ülkemiz Akdeniz, Ege ve Marmara Denizleri'nden toplanan; Rhodophyta, Chlorophyta ve Phaeophyta divisiolarına ait çalışma materyalimiz olan (Ellisolandia elongata (J.Ellis & Solander) K.R.Hind & G.W.Saunders) 2013 ve Amphiroa rigida (J.V.Lamouroux) (Rhodophyta) 1816, Codium fragile (Suringar) Hariot 1889 ve Codium bursa (Olivi) C.Agardh 1817 (Chlorophyta),  Padina pavonica (Linnaeus) Thivy 1960 ve Zanardinia typus (Nardo) P.C.Silva 2000 (Phaeophyta)) 6 farklı  makroalg türünün 4 farklı çözücüyle hazırlanan ekstrelerinin Folin-Ciocalteu yöntemi ile toplam fenolik ve flavonoid miktarının tayin edilmesi, toplam antioksidan kapasite tayin yöntemleri ile antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi, MİK yöntemi ile antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesi, HPLC yöntemi ile β-karoten içeriklerinin kantitatif olarak analiz edilmesi, LC-ESI-MS/MS metodu ile fitokimyasal içerik analizinin gerçekleştirilmesi ve ayrıca makroalglerin biyoaktif metabolit içerikleriyle etkinliklerinin arasındaki ilişkinin belirlenmesi  amaçlanmıştır. Bu çalışma kahverengi alg Z.typus'un biyoaktif metabolit içeriklerinin, antioksidan ve antimikrobiyal aktivitelerinin geniş bir spektrumda değerlendirilmesi ilgili yapılan ilk çalışmadır.
Elde ettiğimiz bulgulara göre, en yüksek fenolik miktarları, kahverengi alg  Z.typus etanol ekstresinde (76.78±0,54 µg GAEs /mg), en yüksek flavonoid miktarları, Z. typus'un aseton ekstresinde (96.91±1,11 µg QEs/mg) tespit edilmiştir. Alg ekstrelerine uyguladığımız toplam antioksidan aktivite tayin yöntemlerinden en iyi DPPH süpürücü aktivite değerleri, Z. typus'un etanol ekstresinde (IC50: 24.72±0.21 µg/ml), en iyi ABTS radikali giderici aktivite değerleri, Z.typus'un etanol ekstresinde (IC50: 9.43±0.16 µg/ml), en iyi CUPRAC aktivite değerleri yine Z.typus'un etanol ekstresinde (A0.50: 15.20±0.14 µg/ml) tespit edilmiştir. Dolayısıyla bütün antioksidan aktivite belirleme testleri bakımından en yüksek değerler Phaeophyta (kahverengi alg) divisiosu üyelerinde saptanmıştır (p<0.05). Toplam fenolik miktarları ile DPPH, ABTS ve CUPRAC aktiviteleri aralarındaki ilişki Spearman Korelasyon analiziyle değerlendirilmiş ve iki değişken arasında ilişki hiçbirinde anlamlı bulunamamıştır (sırasıyla p=0,305, r=0,274; p=0,064, r=0,479; p=0,144, r=0,382). Toplam flavonoid miktarları ile DPPH, ABTS ve CUPRAC aktiviteleri aralarındaki ilişki Spearman Korelasyon analiziyle değerlendirilmiş ve iki değişken arasında ilişki hiçbirinde anlamlı bulunmamıştır (sırasıyla p=0,812, r=0,065 ;  p=0,762, r=;-0,082    p=0,983, r=0,006).
Çalışılan test patojenlerine karşı en yüksek antimikrobiyal etki kahverengi alg olan Z.typus'un metanol  etanol ve aseton ekstresinde görülmüş olup en etkili olduğu suş  gram (+) bakteri suşu Sarcina lutea (ATTC 9341) (MİK: 0.390 mg/ml) olarak belirlenmiştir. Yine aynı türün aseton ekstresi gram (+) bakteri Staphylococcus aureus (ATTC 43300) suşuna karşı benzer konsantrasyonda büyümeyi inhibe edici etki göstermiştir (MİK: 0.390 mg/ml). LC-ESI-MS/MS metodu ile analizini gerçekleştirdiğimiz tüm makroalg ekstrelerinde total majör fitokimyasal metabolitler, gallik asit, klorojenik asit, 4-hidroksibenzaldehit, p-kumarik asit, biokanin A, diosgenin, 4-hidroksibenzoik asit, polidatin, hiperozid, kersetin 3-glukozid, izokersitrin, salisilik asit olarak tespit edilmiştir. Bu metabolitlerden en yüksek miktarda olanı Biokanin A (456.39 µg/g)  E.elongata metanol ekstresinde gözlenmiştir. HPLC-PDA analiz sonuçlarında elde ettiğimiz bulgulara göre, β-karoten maddesi farklı konsatrasyonlarda (ppm düzeyinde) kırmızı alg E. elongata'nın etanol ekstresi hariç tüm alg ekstrelerinde kantitatif olarak varlığı tespit edilmiştir ve en yüksek β-karoten miktarı kırmızı alg C. bursa'nın aseton ekstresinde (136.2 ppm=0.136 mg/g) gözlenmiştir.
Sonuç olarak, alglerde fenol, flavonoid gibi fenolik yapıdaki bileşenler, streoid yapılar ve karotenoidler gibi pigmentlerin bulunmasının antioksidan aktivitenin ve serbest radikal kovucu etkinin, ayrıca antimikrobiyal etkinliğinin bulunduğunun bir göstergesi olduğu düşünülmektedir. Tanımlanan fenolik antioksidan bileşikler, β-karoten ve diosgenin gibi alglerde yüksek miktarda bulunan streoidler bu alglerin sağlık yararlarının anlaşılmasında yeni bir adım oluşturabilir ve türler, gıda ve tıbbi preparatlardaki fonksiyonel bileşenler için önemli bir alternatif olarak kabul edilebilir. Türkiye Denizleri'nin sahip olduğu hem karasal hem de denizel kaynaklar düşünüldüğünde araştırılmak üzere büyük bir hazine karşımıza çıkmaktadır. 

Anahtar Kelimeler: Akdeniz, antibakteriyel, antioksidan, bioaktif metabolit, Ege, HPLC-PDA, LC-MS/MS, makroalg, Marmara

Abstract:
Among marine organisms, algae is one of the most productive organisms with its high chemical structure diversity and active natural product potential In this thesis study, which can be called as a preliminary study on alternative treatment and drug applications, by investigating the rich phytochemical properties of algae and revealing their different biological activities, an evaluation was made on the samples we selected from the macroalgae species that spread in the seas of our country.
In this thesis study, aimed to determine total phenolic content with the Folin-Ciocalteu method and the total flavonoid amounts with the aluminum chloride method, to determine antioxidant activities with total antioxidant capacity determination methods and antimicrobial activities with MIC method, to quantitatively analyze the β-carotene contents by HPLC-PDA method, to perform phytochemical content analysis by LC-ESI-MS/MS method, and also to determine the relationship between the bioactive metabolite contents of macroalgae and their activities collected from the Mediterranean, Aegean and Marmara Seas of our country; material of our study belonging to Rhodophyta, Chlorophyta and Phaeophyta divisions (Ellisolandia elongata (J.Ellis & Solander) K.R.Hind & G.W.Saunders 2013, Amphiroa rigida (J.V.Lamouroux) 1816,Codium fragile (Suringar) Hariot 1889, Codium bursa (Olivi) C.Agardh 1817, Padina pavonica (Linnaeus) Thivy 1960 and  Zanardinia typus (Nardo) P.C.Silva 2000 extracts of macroalgae species prepared with 4 different solvents. Our study is the first study to evaluate the bioactive metabolite contents, antioxidant and antimicrobial activities of the brown alga Z. typus in a wide spectrum.
According to our findings, the highest phenolic contents were detected in the brown algae Z.typus ethanol extract (76.78±0.54 µg GAEs /mg), the highest flavonoid amounts has been detected in the acetone extract of Z. typus (96.91±1.11 µg QEs /mg). Among the total antioxidant activity determination methods we applied to algae extracts were detected the best DPPH scavenging activity values were in the ethanol extract of Z. typus (IC50: 24.72±0.21 µg/ml), the best ABTS radical scavenging activity values were in the ethanol extract of Z.typus (IC50 : 9.43±0.16 µg/ml), the best CUPRAC activity values in the ethanol extract of Z.typus (A0.50: 15.20±0.14 µg/ml). Therefore, the highest values in terms of all antioxidant activity determination tests were found in Phaeophyta (brown alga) divisio members (p<0.05). The relationship between total phenolic amounts and DPPH, ABTS and CUPRAC activities was evaluated by Spearman Correlation analysis and the relationship between the two variables was not significant in any of them (p=0.305, r=0.274; p=0.064, r=0.479; p=0.144, r=0.382). The relationship between total flavonoid amounts and DPPH, ABTS and CUPRAC activities was evaluated by Spearman Correlation analysis and the relationship between the two variables was not significant in any of them (p=0.812, r=0.065 ; p=0.762, r=;-0.082 p=0.983, r=0.006, respectively).
The highest antimicrobial effect against the tested pathogens was observed in the methanol, ethanol and acetone extract of the brown alga Z. typus, and the strain that was most effective was determined as the gram (+) bacterial strain Sarcina lutea (ATTC 9341) (MIK: 0.390 mg/ml). Also, the acetone extract of the same species showed a similar concentration growth inhibitory effect against gram (+) bacteria Staphylococcus aureus (ATTC 43300) strain (MIK: 0.390 mg/ml). Total major phytochemical metabolites was detected as gallic acid, chlorogenic acid, 4-hydroxybenzaldehyde, p-coumaric acid, biochanin A, diosgenin, 4-hydroxybenzoic acid, polydatine, hyperocide, quercetin 3-glucoside, isoquercitrin and salicylic acid in all macroalgae extracts we analyzed by LC-ESI-MS/MS method. The highest amount of these metabolites, Biochanin A (456.39 µg/g) was observed in E. elongata methanol extract. According to the results of HPLC-PDA analysis, the presence of β-carotene at different concentrations (ppm level) was quantitatively detected in all algae extracts, except for the water extract of the red alga E. elongata and the highest amount of β-carotene was observed in the acetone extract of the red alga C. bursa (136.2 ppm).
As a result, it is thought that the presence of phenolic components such as phenol, flavonoids, steroid structures and pigments such as carotenoids in algae is an indicator of antioxidant activity and free radical repellent effect, as well as antimicrobial activity. The identified phenolic antioxidant compounds, β- karoten and streoid such as diosgenin which can be found in high concentration in these macroalgae can constitute a new move in the understanding of the health benefits of these algae seaweed and the species can be considered as substantial alternate for functional ingredients in food and medicinal preparations. Considering both the terrestrial and marine resources of the Turkish Seas, we come across a great treasure to be explored. 

Keywords: Aegean, antibacterial, antioxidant, bioactive metabolite, HPLC-PDA, LC-MS/MS, macroalgae, Marmara, Mediterranean