Bazı içilebilir fermente süt ürünlerinden identifiye edilen bakterilerin probiyotik özelliklerinin yakult üretiminde kullanılan lactobacillus casei shirota suşu ile karşılaştırılması
Comparison of probiotic properties of bacterias identified from fermented milk beverages and yakult microorganism lactobacillus casei shirota
Yazar: YUSUF BİÇER
Danışman: PROF. GÜRKAN UÇAR
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veteriner Besin Hijyeni ve Teknolojisi Ana Bilim dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Besin Hijyeni ve Teknolojisi = Food Hygiene and Technology
Dizin: Fermentasyon = Fermentation ; Kefir = Kefir ; Kımız = Koumiss ; Lactobacillus casei = Lactobacillus casei ; Probiyotik bakteriler = Probiotic bacteria ; Probiyotikler = Probiotics ; Süt = Milk ; Süt ürünleri = Milk products

Özet:
Bu araştırmada Türkiye'de satışa sunulan kefir ve kımızlar ile ev yapımı kefir numunelerinin mikrobiyal florasının metagenomik yöntemle belirlenmesi ve bu içeceklerden izole edilen laktik asit bakterilerinin bazı probiyotik özelliklerinin yakult üretiminde kullanılan Lactobacillus casei Shirota ile kaşılaştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmada piyasada satışa sunulan ve üretim tarihleri farklı olan 3 adet kımız, 15 adet kefir ile 3 adet ev yapımı kefir ve Japonya'dan farklı tarihlerde temin edilen yakult örnek olarak kullanıldı. Kefir ve kımız örneklerinin mikrobiyal çeşitliliği 16S rRNA geninin V1-V2 bölgesini hedef alan metagenomik analiz yöntemi ile tespit edildi. Direkt kımız içeceklerinden yapılan DNA izolasyonu sonucunda en yüksek düzeyde Lactobacillus kefiranofaciens (%79,2)'in bulunduğu ve bunu Lb. delbrueckii (%10)'nin takip ettiği görüldü. Ancak MRS agarda gelişen kolonilerden elde edilen sonuçlara göre çok büyük oranda Lb. kefiri (%99,8)'nin bulunduğu, M17 agarda ise Streptoccus thermophilus (%47,6)'un ortamda dominant bulunduğu ve bunu Massila alkalitolerans (%30) ile Enterococcus durans (%18,7)'ın takip ettiği görüldü. Kefir içeceklerinden elde edilen sonuçlara bakıldığında tümünde değişen düzeylerde Lactococcus lactis'in bulunduğu görülmektedir. Örneklerin ikisinde Str. thermophilus (%62,10 ve %58) daha yüksek düzeyde tespit edilirken, üç örnekte dominant florayı Lc. lactis (%97,38, %86,87 ve %92,42) oluşturmaktadır. Kefir taneleri kullanılarak üretilen kefir içeceğinin florasını ise en yüksek oranda Lb. kefiranofaciens (%37,6)'in oluşturduğu, bunu sırası ile Str. thermophilus (%18,6), E. durans (%10,3) ve Lb. kefiri (%9,8)'nin takip ettiği görüldü. Mikrobiyolojik ekim sonucunda MRS agarda gelişen kolonilerden elde edilen sonuçlara bakıldığında üç örnekte dominant floranın Lc. lactis (%92,5, %72,9 ve %99,91) tarafından oluşturulduğu görüldü. İki örnekte ise ortamda en fazla bulunan bakterinin Leuconostoc mesenteroides (%72,9 ve %56,7) olduğu tespit edilmiştir. Bunun yanı sıra bir örnekte daha düşük düzeyde Lb. delbrueckii (%6,0)'nin de bulunduğu görülmektedir. Tane kullanılarak üretilen kefir örneğinin ise MRS agar florasında en fazla bulunan bakterinin Lb. kefiri (%66,4) olduğu ve bunu Leu. mesenteroides (%29,3)'in takip ettiği tespit edildi. İçeceklerden M17 agara yapılan mikrobiyolojik ekimlerde örneklerin tümünde baskın olarak tespit edilen tür Lc. lactis (%86,0-%98,10) olmuştur. Bununla birlikte yalnızca bir örnekte Str. thermophilus (%13,37) tespit edildi. Kefir taneleri kullanılarak üretilen kefir içeceğinin M17 agar çeşitliliğine bakıldığında en fazla oranda E. durans (%57,6)'ın bulunduğu bunu sırası ile E. faecium (%27,3) ve Lb. kefiri (%8,9)'nin takip ettiği görülmektedir. M17 agardan izole edilen bakterilerin asit dirençleri incelendiğinde Lc. lactis subsp. lactis'in 0,23 log10 / ml düzeyinde artış gösterdiği diğerlerinin ise azaldığı görülmektedir. Sıfırıncı saatte E. durans ve E. faecium'un en düşük düzeyde oldukları diğerlerinin 0. saatte tespit edilen düzeyleri arasında fark olmadığı tepit edilmiştir (p>0,05). İkinci saatin sonunda ise Lc. lactis subsp. lactis en yüksek düzeyde tespit edilirken Str. thermophilus izolatı 5,34±0,04 log10 / ml ile en düşük düzeye sahip mikroorganizma olarak tespit edildi. Yakult içeceğinden izole edilen Lb. casei ise başlangıçta 7,68±0,02 log10 / ml düzeyinde tespit edilirken 2. saatin sonunda 0,53 log10 / ml'lik bir düşüş gözlendi. MRS agardan izole edilen bakterilerin asit direçlerine bakıldığında tüm izolatlar 0,26-2,49 log10 / ml'lik düşüş göstermiştir. 2. saatin sonunda en fazla düşüş (2,49 log10 / ml) Lb. rhamnosus izolatında tespit edilmiştir. En az düşüş (0,26 log10 / ml) ise Lb. kefiri izolatında tespit edilmiştir. Safra tuzu dirençleri incelendiğinde M17 agardan elde edilen dört izolat 0,11-0,55 log10 / ml arasında düşüş göstermişlerdir. Yakult içeceğinden izole edilen Lb. casei ise 0,42 log10 / ml ile en fazla artış gösteren izolat olmuştur. İçeceklerden MRS agara yapılan ekimler sonucunda izole edilen bakterilerde ise tüm izolatların ilk 90 dakikada artış gösterdikleri tespit edilmiştir. En fazla artışı (0,71 log10/ml) Lb. plantarum izolatı göstermiştir. En düşük artışı (0,01 log10/ml) ise Lb. kefiri'nin gösterdiği tespit edilmiştir. 90-180. dakikalar arasında dört izolat 0,03-0,1 log10/ml arasında düşüş gösterirken diğer tüm izolatların artış gösterdiği tespit edilmiştir. Antibiyotik direnç profilleri araştırılan tüm izolatlar hücre duvarı sentezi inhibitörü olan bacitracine karşı dirençli bulundu. Furazolidone'a karşı dört izolat duyarlı, 1 izolat orta düzeyde duyarlı, geri kalanlar ise dirençli olarak bulundu. Ciprofloxacin'e karşı 1 izolat dirençli, 7 izolat orta düzeyde duyarlı, diğerleri ise duyarlı olarak tespit edildi. Sülfamethoxazole trimetoprime karşı ise 5 izolat dirençli, 1 izolat orta düzeyde duyarlı, diğerleri ise duyarlı olarak bulundu. Protein sentezi inhibitörü grubu antibiyotiklerine karşı 7 izolat iki ve daha fazla antibiyotiğe dirençli bulunurken, 13 izolatın bu gruptan hiçbir antibiyotiğe karşı direnç göstermediği tespit edilmiştir.
Kefir ve kımız içeceklerinin mikrobiyal florasının tespit edilmesinde direkt gıdalardan yapılan DNA izolasyonu ve moleküler yöntemler kolaylık sağlasa da daha geniş çaplı bir profil ortaya koyabilmek için kültürel yöntemlerle kombine şekilde kullanılması gerektiği görülmektedir. Mevcut çalışmanın sonuçları değerlendirildiğinde ev yapımı kefir örneklerinin daha fazla mikrobiyal çeşitliliğe sahip oldukları görülse de ticari olarak satışa sunulan kefir içeceklerinin de yeterli düzeyde canlı mikroorganizma içerdikleri ve bu mikroorganizmaların yakulttan elde edilen bakteri ile benzer şekilde asit, safra ve antibiyotik dirençliliği gibi temel probiyotik özellikleri sergiledikleri tespit edilmiştir.

Abstract:
In this research it was aimed to determine the microbial flora of commercial koumiss and kefir and homemade kefir samples using metagenomic analyses and compared some probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from this beverages and Lactobacillus casei Shirota, used in yakult production. 
In the study, 3 koumiss, 15 kefir sold in the markets, 3 homemade kefir with different production dates, and Yakult, provided from Japan in different dates, were used as samples. Microbial diversity of kefir and koumiss samples was determined by metagenomic analysis method targeting V1-V2 region of 16S rRNA gene. Lactobacillus kefiranofaciens (79,2%) was found the dominant, followed by Lb. delbrueckii (10%) from direct DNA isolation from koumiss beverages. However, results from MRS agar show that Lb. kefiri (99,8%) was found to the dominant bacteria, while Streptoccus thermophilus (47,6%) was found to be dominant in M17 agar followed by Massila alkalitolerans (30%) and, Enterococcus durans (18,7%). Lactococcus lactis determined in all samples at various levels using direct DNA isolation from kefir beverages. In two samples Str. thermophilus (62.10% and 58%) and in three samples Lc. lactis (97,38%, 86,87% and 92,42%) were detected at higher levels. In kefir beverages produced using kefir grains, Lb. kefiranofaciens (37,6%) determined as dominant bacteria followed by Str. thermophilus (18,6%), E. durans (10,3%) and Lb. kefiri (9,8%) respectively. In three samples dominant microflora of MRS agar constituted by Lc. lactis (92,5%, 72,9% and 99,91%). In two samples Leuconostoc mesenteroides (72.9% and 56.7%) were the most common bacteria.  In addition, Lb. delbrueckii (6.0%) was also found in one sample. Dominant MRS agar microflora of homemade kefir is Lb. kefiri (66,4%) followed by Leu. mesenteroides (29,3%). In M17 agar Lc. lactis (86,0% - 98,10%) was found to be predominant lactic acid bacteria in all samples. In addition, Str. thermophilus (13,37%) was detected in one sample. The kefir produced by using kefir grains has the highest rate of E. durans (57,6%) in M17 agar medium followed by E. faecium (27,3%) and Lb. kefiri (8,9%) respectively. Following that, acid, bile salt and antibiotic resistance profiles of the bacteria obtained as a result of microbiological culture were determined. Acid resistance of bacteria isolated from M17 agar displayed an increase of 0,23 log10 / ml in Lc. lactis subsp. lactis and decrease in the others. E. durans and E. faecium were at low level at the 0th hour, and there were no differences between the levels of the others determined at the 0th hour (p>0,05). At the end of the 2nd hour Lc. lactis subsp. lactis was determined at the highest level whereas Str. thermophilus was determined as the lowest level with 5,34 ± 0,04 log10 / ml. While Lb. casei, isolated from the yakult, was detected at the level of 7,68 ± 0,02 log10/ml at the 0th hour, 0,53 log10 / ml of decrease was observed at the end of the 2nd hour. When the acid resistances of bacteria isolated from MRS agar were examined, all isolates showed a decrease between 0,26-2,49 log10 / ml. The maximum decrease (2,49 log10 / ml) at the end of the 2nd hour was determined in Lb. rhamnosus isolate. The minimum decrease (0,26 log10 / ml) was determined in Lb. kefiri isolate. The bile salt resistance of the colonies grown on M17 agar, four isolates showed decrease between 0,11-0,55 log10 / ml. The Lb. casei isolated from the yakult was the most increased isolate with 0,42 log10 / ml. When the bacteria isolated from MRS agar were examined, all isolates increased in the first 90 minutes. The highest increase (0,71 log10 / ml) was found in Lb. plantarum isolate. The lowest increase (0,01 log10 / ml) was found in Lb. kefiri. While four isolates showed a decrease of 0,03-0,1 log10 / ml, all other isolates increased between 90-180 minutes. All isolates investigated for antibiotic resistance were found to be resistant to bacitracine, an inhibitor of cell wall synthesis. Four isolates were susceptible, 1 isolate was moderately sensitive and the rest was found to be resistant against furazolidone. 1 isolate resistant, 7 isolates were moderately sensitive and others were sensitive against to ciprofloxacin, a nucleic acid inhibitor. Five isolates were resistant, 1 isolate was moderately sensitive and others were found to be sensitive against sulfamethoxazole trimethoprime, another nucleic acid inhibitor. While 7 isolates were found to be resistant to two or more antibiotics against protein synthesis inhibitor group antibiotics, it was found that 13 isolates were sensitive against all the antibiotics tested.
Although it is possible to determine the microbial flora of kefir and koumiss beverages by using non-cultural methods via direct DNA isolation from beverages, it should be used in combination with cultural methods in order to present a larger profile. When the results of the present study were evaluated, homemade kefir samples have more microbial diversity. Besides, commercially available kefir beverages contain sufficient live microorganisms, and these microorganisms were found to exhibit basic probiotic properties, such as acid, bile and antibiotic resistance, similar to the lactic acid bacteria isolated from yakult.