Sıçanlarda fluoksetin hidroklorürün neden olduğu testis hasarında kafeik asit fenetil esterin değerlendirilmesi
Evaluation of caffeic acid fenethyl ester in testicular damage caused by fluoxetine hydrochloride in rats
Yazar: ZEHRA DEMİRAY ASOĞLU
Danışman: PROF. DR. EBRU BALLI
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Fenetil ester = Phenethyl ester ; Fluoksetin hidroklorür = Fluoxetine hydrochloride ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kafeik asit = Caffeic acid ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Serotonin geri alım inhibitörleri sınıfına ait bir antidepresan olan fluoksetin hidroklorürün (FLX), farklı dozlarda ve sürelerde kullanılmasının testis dokusunda morfolojik ve fonksiyonel değişikliklere neden olduğu bildirilmiştir. Literatürde FLX'in testis dokusunda hasar oluşturduğuna dair çok sayıda çalışma bulunmasına rağmen, oluşan bu hasarın mekanizması hala tam olarak açıklanmamış ve hasarın önlenmesinde etkili bir ajan ortaya konmamıştır. Bu nedenle çalışmamızda FLX kaynaklı testis hasarında, antioksidan etkiye sahip olan kafeik asit fenetil esterin (CAPE) koruyucu etkinliğinin ortaya konulması hedeflenmiştir. Kafeik asit fenetil ester çok geniş spektrumlu etkilere sahip flavonoid grup bileşiğidir. Son yıllarda birçok çalışmanın konusu haline gelen CAPE bileşiğinin, bağışıklık sistemini güçlendirici etkisi olduğu bilinmektedir. Yapılan çalışmalara göre CAPE antioksidatif, antimikrobiyal, antienflamatuar ve antioksidan özelliklere sahiptir.   

Çalışmamızda 9-12 haftalık, 250-300 gr ağırlığında 25 adet erkek Wistar Albino soy sıçan kullanıldı. Denekler eşit sayıda ve rastgele olarak kontrol 1, kontrol 2, FLX, FLX+CAPE ve CAPE olmak üzere 5 gruba ayrıldı. Kontrol 1 grubuna (n=5) %0.9'luk serum fizyolojik, Kontrol 2 grubuna (n=5) dimetil sülfoksit (DMSO), FLX grubuna (n=5) 10 mg/kg/gün FLX, CAPE grubuna (n=5) 10 µmol/kg/gün CAPE ve FLX+CAPE grubuna (n=5) ise 10 mg/kg/gün FLX ve beraberinde 10 µmol/kg/gün CAPE 4 hafta boyunca intraperitoneal olarak enjekte edildi. 4 hafta sonunda derin anestezi uygulanan deneklerin testisleri çıkarıldı ve fiksasyon işlemi için uygun solüsyonlara alındı. Ayrıca biyokimyasal analizler için deneklerden kan örnekleri alındıktan sonra denekler sakrifiye edildi. Işık mikroskobik doku takibi sonrası parafine gömülen dokulardan 5 μm'lik kesitler alınarak, genel morfolojik yapıyı değerlendirmek için Hematoksilen-eozin (HE), Toluidin mavisi (TM) ve Periyodik asit-schiff (PAS) boyamaları yapıldı. HE ile boyanan kesitlerde seminifer tübül çapları ve germinal epitel kalınlığı ölçülürken, Johnsen skorlaması ile spermatogenezis değerlendirildi. İmmünohistokimyasal incelemeler için indirekt immünoperoksidaz tekniği kullanılarak Kaspaz-3, Bcl-2 ve PCNA immün işaretlemesi yapıldı.  

Yapılan morfolojik ve immünohistokimyasal incelemelerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi sonucu; vücut ağırlığı, sağ testis ağırlığı, seminifer tübül çapı, germinal epitel kalınlığı ve Johnsen skorlamasının FLX grubunda diğer bütün gruplara kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı belirlenirken, bu değerlerin FLX+CAPE grubunda FLX grubuna göre anlamlı bir şekilde arttığı saptandı. Leydig hücrelerinde kaspaz-3 ekspresyonu ve seminifer tübüllerde Bcl-2 ekspresyonunun FLX grubunda SF, DMSO ve CAPE gruplarına göre anlamlı bir şekilde arttığı gözlenirken, FLX+CAPE grubunda FLX grubuna göre azaldığı saptandı. PCNA indeksi FLX grubunda SF, DMSO ve CAPE gruplarına göre anlamlı bir şekilde azalırken, FLX+CAPE grubunda FLX grubuna göre anlamlı şekilde arttığı bulundu. Biyokimyasal analizlerde MDA düzeyi FLX grubunda anlamlı olarak artarken, FLX+CAPE grubunda bu değer anlamlı olarak azalmıştı. SOD ve CAT düzeyinde anlamlı bir değişiklik olmadığı gözlendi.   

Bulgularımız FLX'in oksidatif etki ile testiste yapısal bozukluklar oluşturarak apoptozu indüklediğini; CAPE'nin antioksidan etkiyle, bu hasarı düzelttiğini, lipid peroksidasyonunu ve oksidatif stresi azalttığını gösterdi.  

Anahtar Kelimeler: Fluoksetin; CAPE; Testis; İmmünohistokimya; Apoptoz

Abstract:
It has been reported that the use of fluoxetine hydrochloride (FLX), an antidepressant belonging to the class of serotonin reuptake inhibitors, at different doses and times, causes morphological and functional changes in the testicular tissue. Although there are many studies in the literature that FLX causes damage to testicular tissue, the mechanism of this damage and an effective agent in preventing the damage have not been revealed. Therefore, in our study, it was aimed to reveal the protective effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE), which has an antioxidant effect, in FLX-induced testicular damage. Caffeic acid phenethyl ester is a flavonoid group compound with very broad spectrum effects. It has been known for many years that the CAPE compound, which has become the subject of many studies in recent years, has a strengthening effect on the immune system. According to studies, CAPE has antioxidative, antimicrobial, anti-inflammatory antioxidant properties. 

25 male Wistar Albino lineage rats, 9-12 weeks old, weighing 250-300 g, were used in the study. The subjects were randomly divided into 5 groups as control 1, control 2, FLX, FLX+CAPE and CAPE. Control 1 group (n=5) 0.9% saline, Control 2 group (n=5) dimethyl sulfoxide (DMSO), FLX group (n=5) 10 mg/kg/day FLX, CAPE group (n=5) ) 10 µmol/kg/day CAPE and CAPE+FLX group (n=5) were injected intraperitoneally with 10 mg/kg/day FLX and concomitant 10 µmol/kg/day CAPE for 4 weeks. At the end of 4 weeks, the subjects were sacrificed. Testicular tissues taken from the sacrificed subjects were taken into suitable solutions for fixation. After light microscopic tissue follow-up, 5 μm sections were taken from paraffin-embedded tissues. Hematoxylin-eosin (HE), Toluidine blue (TM) and Periodic acid-schiff (PAS) stainings were performed to evaluate the general morphological structure. Seminiferous tubule diameters and germinal epithelial thickness were measured in sections stained with HE, while spermatogenesis was evaluated with Johnsen scoring. Caspase-3, Bcl-2 and PCNA immunolabeling was performed using the indirect immunoperoxidase technique for immunohistochemical examinations. 

As a result of the statistical evaluation of the dyeing and markings; While it was determined that body weight, right testis weight, seminiferous tubule diameter and germinal epithelial thickness decreased statistically in the FLX group compared to the control groups and CAPE group, it was found to increase significantly in the FLX+CAPE group. In Johnsen scoring, it was determined that the FLX group values were significantly decreased compared to the SF and DMSO groups, while the FLX+CAPE group values were significantly increased compared to the FLX group. Caspase-3 expression in Leydig cells and Bcl-2 expression in seminiferous tubules were significantly increased in FLX group compared to SF, DMSO and CAPE groups, but decreased in FLX+CAPE group. It was determined that the PCNA index decreased significantly in the FLX group compared to the SF, DMSO and CAPE groups, and increased significantly in the FLX+CAPE group compared to the FLX group. In biochemical analyzes, it was observed that MDA and SOD levels increased in the FLX group, and there was no significant change in CAT level. 

Our findings indicate that FLX induces apoptosis by forming structural defects in testis with its oxidative effect; It has been shown that CAPE corrects this damage, reduces lipid peroxidation and oxidative stress with its antioxidant effect. 

Keywords: Fluoxetine; Fluoxetine; CAPE; Testes; Immunohistochemistry; Apoptosis