Fitoremediasyon çalışmaları için fitoşelatin sentaz (PCS1) geninin izolasyonu ve klonlanması
Isolation and cloning of phytochelatin synthase (PCS1) gene used  for phytoremediation studies
Yazar: CANAN SEVİNÇ
Danışman: DOÇ. DR. MUHAMMAD ASIM
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bitkilerde ağır metal toleransında rol aldığı bilinen genlerden biri Fitoşelatinler (PC) ailesine ait PCS1 genleridir. PC'ler indirgenmiş glutatyondan (GSH) enzimatik olarak sentezlenir. Ɣ-glutamilsistein dipeptidil transpeptidaz enzimi (EC 2.3.2.15, yaygın olarak fitoşelatin sentaz (PCS) olarak adlandırılır) ile katalize edilen reaksiyon, metal iyonları ile aktive edilir. Bitkiler, ağır metallere karşı bir savunma mekanizması olarak, ağır metal varlığında PC sentezlerler ve bu metal-şelatlayıcılar, ağır metal iyonlarının bazılarıyla kompleksler oluştururlar, daha sonra sitosoldan, vakuole aktarılırlar. Tezin amacı doğrultusunda, bu metal-şelatlayıcı peptidleri sentezleyen PCS1 genleri bitki kaynaklarından izole edilip klonlanması sağlanmıştır. Bu amaçla, Arabidopsis thaliana ve Ceratophyllum demersum bitkileri kullanılmıştır. C. demersum bitkisinde PCS1 geni bulunmazken, A. thaliana bitkisinden PCS1 geni izole edilip Pfu DNA Polimeraz ile yüksek doğrulukta amplifiye edilmiştir. Amplifikasyonu gerçekleştirilen PCS1 genlerinin, pBIN61 (bitki ekspresyon vektörü) plazmidi ile T4 DNA Ligaz enzimi aracılığıyla ligasyonu sağlanmıştır. Ligasyon sonrası PCS1 genlerini içeren pBIN61 plazmidleri ısı şoku transformasyon yoluyla Escherichia coli bakterisinin JM109 ırkına aktarılmıştır. Transformasyonu yapılan E. coli bakterileri kanamisin (50 mg/L) içeren LB agar besi ortamına ekilerek kanamisin antibiyotiğine dayanıklılık yoluyla, PCS1 genlerini içeren plazmidleri taşıyan bakteri kolonilerinin seleksiyonu yapılmıştır ve koloni PCR, restriksiyon analizi yöntemleri ile doğrulamaya tabi tutulmuştur. Koloni PCR' da pozitif sonuç vererek, PCS1 genini içeren pBIN61 plazmidini taşıdığı belirlenen koloniler seçilerek plazmid izolasyonu gerçekleştirilmiştir ve ayrıca gliserol stokları -80 °C' de saklanmıştır. Pozitif klonlar, elektroporasyon cihazı kullanılarak Agrobacterium suşu LBA4404' e transforme edilmiştir. Sonraki çalışmalarda PCSI genini içeren Agrobacterium ile farklı bitkilerin transformasyonu gerçekleştirilerek transgenik bitkiler oluşturulabileceği ve bu tür transgenik bitkilerin, ağır metallerle kirlenmiş ortamların fitoremediyasyonunda kullanılabileceği düşünülmüştür.

Abstract:
PCS1 genes of the Phytochelatin (PC) family are one of the known genes involved in heavy metal tolerance in plants. PCs are enzymatically synthesized from reduced glutathione (GSH). The reaction is catalyzed by Ɣ-glutamylcysteine dipeptidyl transpeptidase enzyme and activated by metal ions. Plants syntheize PC in the presence of heavy metal as a defense mechanism against heavy metals and these metal chelators form complexes with heavy metal ions. The aim of this thesis was to isolate and clone PCS1 genes from plant sources. For this purpose, Ceratophyllum demersum ve Arabidopsis thaliana plants were used. PCS1 gene could not be isolated from C. demersum plant but was found in A. thaliana plant and amplified with Pfu Polymerase with high accuracy rate. The amplified PCS1 gene was ligated in plasmid pBIN61 (plant expression vector) by T4 DNA Ligase enzyme. After ligation, plasmids pBIN61 containing PCS1 genes were transferred to the JM109 strain of Escherichia coli by heat shock transformation. Transformed E. coli bacteria were inoculated to LB agar medium containing kanamycin (50 mg/L) and the colonies carrying plasmids containing PCS1 genes were selected by colony PCR and restriction analysis methods. By using positive results in colony PCR, pBIN61 plasmid carrying PCS1 gene were selected and plasmid isolation was performed. Positive clones were transformed into Agrobacterium strain LBA4404 using the electroporation device. Agrobacterium containing PCSI gene will be used for genetic transformation studies in future studies and such transgenic plants can be used in phytoremediation of heavy metals contaminated environments.