Akut lenfoblastik lösemi hücre hattında FoxM1 gen ekspresyon seviyesinin belirlenmesi ve FoxM1'in deksametazon ve FoxM1 inhibitörü siomisin A kullanılarak hedeflenmesi
Determination of FoxM1 gene expresssion level in acute lymphoblastic leukemia cell line and targeting FoxM1 by deksametazon and FoxM1 inhibitor Siomycin A
Yazar: ÖZLEM TÜFEKÇİ
Danışman: PROF. DR. GÜLARSU İRKEN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Yan Dal Uzmanlık, 2012
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Deksametazon = Dexamethasone ; Gen ifadesi = Gene expression ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prekürsör hücreli lenfoblastik lösemi-lenfoma = Precursor cell lymphoblastic leukemia-lymphoma

Özet:
Giriş ve Amaç: FoxM1 hücre döngüsünün düzenlenmesinde rol alan ve hücre çoğalmasını arttıran bir transkripsiyon faktörüdür. Son yıllarda yapılan çalışmalarda akciğer kanseri, glioblastom, prostat kanseri, bazal hücre karsinomu, hepatosellüler karsinom, meme kanseri ve pankreas kanserinde FoxM1 sinyal ağının bozulduğu ve gen ekspresyonunun yüksek oranda arttığı gösterilmiştir. Bir tiazol antibiyotiği olan siomisin A, FoxM1 transkripsiyonel aktivasyonunu önleyen önemli bir inhibitördür. Deksametazon, akut lenfoblastik lösemi (ALL) tedavisinde çok önemli yere sahip ve T-hücreli ALL'de diğer steroidlere göre daha etkin olduğu bilinen bir glukokortikoiddir. Bu çalışmamızda, Jurkat hücrelerinde (T-ALLhücre hattı) FoxM1 gen ekspresyon düzeyinin belirlenmesi ve FoxM1'in siomisin A ve deksametazon kullanarak hedeflenmesi ile bu ekspresyondaki değişikliklerin ve hücre çoğalması üzerindeki etkilerin incelenmesi amaçlanmıştır.Gereçler ve Yöntem: FoxM1 geninin ekspresyon düzeyleri Ters Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) ile gösterilmiştir. Siomisin A ve deksametazon'un Jurkat hücreleri üzerindeki hücre çoğalmasını engelleyici etkileri MTT hücre çoğalma testi ile saptanmıştır. Deksametazonun, siomisin A ile kombinasyonlarının olası sinerjistik, additif, nötral veya antagonistik etkilerinin belirlenmesi amacı ile izobologram analizi yapılmıştır. Bu ajanların apoptotik etkileri ise kaspaz-3 aktivitesindeki ve mitokondri zar potansiyelindeki bozulmalar ve fosfatidilserinin hücre zarındaki lokalizasyonu ile belirlenmiştir. Bu amaçla, sırasıyla, kaspaz-3 kolorimetrik kiti, JC-1 mitokondriyal membran potansiyeli kiti ve Anneksin V-FITC apoptoz ölçüm kiti kullanılmıştır. Siomisin A ve deksametazon'un hücre döngüsü üzerindeki etkilerinin araştırılması amacıyla, siomisin A ve deksametazon ile ayrı ayrı ve kombine şekilde muamele edilen hücreler propidyum iyodür ile boyanarak akım sitometrisinde analiz edilmiştir.Bulgular: T-ALL hücre hattında FoxM1 gen ekspresyon seviyesinin belirgin derecede artmış olduğu ve siomisin A ve deksametazon uygulanan Jurkat hücrelerinde FoxM1 gen ekspresyon seviyelerinin her bir ilacın dozuna bağımlı olarak azaldığı gösterilmiştir. Bir ve 10 µM deksametazona 72 saat boyunca maruz bırakılan Jurkat hücrelerinin çoğalması kontrol grubuna göre %8 ve %13 azalırken, aynı dozlarda deksametazonun, siomisin A ile kombine uygulanan hücrelerin çoğalmasını %74 ve %75 oranında baskıladığı izlenmiştir. Yapılan izobologram analizinde deksametazon ve siomisin A'nın çok kuvvetli sinerji gösterdikleri ortaya koyulmuştur. Gerçekleştirilen apoptotik testler, siomisin A ve deksametazon kombinasyonunun Jurkat hücreleri üzerinde apoptotik etkisi olmadığını göstermiştir. Hücre döngüsü analizinde, siomisin A ve deksametazon kombinasyonu ile FoxM1'in belirgin baskılandığı Jurkat hücrelerinin, G1 fazında durdurulduğu ve bölünmelerinin anlamlı derecede azaldığı gösterilmiştir. Sonuç: FoxM1 ekspresyonunun T-ALL hücre hattında belirgin olarak artmış olduğu, bir FoxM1 inhibitörü olan siomisin A'nın ve deksametazonun lösemik hücre çoğalmasını hücre döngüsünü G1 fazında baskılayarak önemli oranda azalttığı gösterilmiştir. Tüm bu bulgular, FoxM1'in T- ALL patogenezinde olası bir rolü olduğunu ve FoxM1'in T-ALL tedavisinde önemli bir hedef olabileceğini göstermektedir.Anahtar kelimeler: FoxM1, akut lenfoblastik lösemi, siomisin ASUMMARY

Abstract:
Introduction-Objective: FoxM1 is a transcriptional factor that takes play in regulation of cell cyle and promotes cell proliferation. Recent studies show that the FoxM1 signaling network is frequently deregulated in human malignancies with up-regulated expression of FoxM1 in lung cancer, glioblastomas, prostate cancer, basal cell carcinomas, hepatocellular carcinoma, and primary breast cancer and pancreatic cancer. Siomycin A, a thiazol antibiotic, is known to inhibit FoxM1 transcriptional activity. Dexamethasone is a glucocorticoid that is very important in treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and is known to be more potent compared to other steroids in the treatment of T-cell ALL. In this study, we aimed to determine the gene expression levels of FoxM1 in Jurkat cells (T-ALL cell line) and to investigate the changes in gene expression levels and the effects on cellular proliferation by targeting FoxM1 with siomycin A and dexamethasone. Materials and methods: The gene expression levels of FoxM1 were studied with reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). The antiproliferative effects of siomycin A and dexamethasone on Jurkat cells were studied with MTT cell proliferation test. The possible synergistic, additive, neutral, and antagonistic effect of combination of dexamethasone and siomycin A was determined with isobologram analysis. The apoptotic effects of these two agents were evaluated by Caspase-3 activity, disturbances in mitochondrial membrane potential and localisation of phospatidilserine in cellular membrane. For this purpose, Caspase-3 calorimetric assay kit, JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit, and Annexin V-FITC apoptosis detection kit were used, respectively. For cell cycle analysis, siomycin A and dexamethasone treated Jurkat cells were stained with propidium iodide and analysed in flow-cytometer. Results: We found that FoxM1 gene is overexpressed in T-ALL cell line and dexamethasone and siomycin A caused a reduction in gene expression levels of FoxM1 in Jurkat cells. Eight to 13 % decrease in proliferation of Jurkat cells were observed when these cells were treated with 1 and 10 µM doses of dexamethasone for 72 hours, respectively. On the other hand, the same doses of dexamethasone combined with siomycin A caused 74% and 75% decrease in proliferation of Jurkat cells. Isobologram analysis revealed very strong synergy between dexamethasone and siomycin A. Apoptotic tests showed no apoptotic activity of dexamethasone and siomycin A on Jurkat cells. Cell cycle analysis showed that, reduction of FOXM1 expression by combination of dexamethasone and siomycin A in Jurkat cells inhibited cell proliferation through induction of G1 phase arrest. Conclusion: It is demonstrated that FoxM1 gene is strongly overexpressed in T-ALL cell line and targeting FoxM1 by siomycin A and dexamethasone caused a significant decrease in TALL cell proliferation through induction of G1 cell cycle arrest. All these findings suggest a possible role for FoxM1 in T-ALL pathogenesis and represent FoxM1 as an attractive target for T-ALL therapy. Key words: FoxM1, acute lymphoblastic leukemia, siomycin A