Topraktan izole edilen Bacillus sp. suşlarından fitaz enziminin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu
Partial purification and characterization of phytase enzyme from Bacillus sp. strains isolated from soil
Yazar: DİLARA AKÇAKOCA
Danışman: PROF. DR. ELİF DEMİRKAN
Uludağ Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Bacillus = Bacillus ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Fitaz = Phytase

Özet:
Bu çalışmada Türkiye' nin 30 farklı ilinden temin edilen toprak örneklerinden 300 adet bakteri izole edilmiştir. Bakterilerin morfolojik ve fizyolojik özellikleri incelenmiş ve 236 bakteri Bacillus cinsi olarak tanımlanmıştır. Bütün suşların fitaz aktiviteleri fitaz tarama ortamı (PSM) kullanılarak tespit edilmiş ve açık zonların çapı mm olarak gösterilmiştir. Toplam 19 Bacillus sp. suşu ekstraselüler fitaz üreticisi olarak bulunmuştur. Bu suşlar arasında, en geniş zona sahip Bacillus sp.'nin 2 suşu seçilmiştir. Bunlar Bacillus sp. EBD 9-1 (zon çapı:11 mm) ve EBD 19-9 (zon çapı:9 mm) olarak isimlendirilmiştir. Bakteriler sıvı ortam içinde enzim üretim kapasitesi için test edilmiştir. En yüksek fitaz aktivitesini (600 U/mL) Bacillus sp. EBD 9-1 suşu göstermiştir. Bacillus sp. EBD 9-1 'den elde edilen fitaz kısmen saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Amonyum sülfat çökeltmesi (%70), diyalizasyon ve ultrafiltrasyon saflaştırma aşamasından sonra, enzim 2.06 kez saflaştırılmıştır. Saf enzim üzerine sıcaklık ve stabilitesinin, pH ve stabilitesinin, farklı potansiyel bileşiklerin etkileri araştırılmıştır. Enzimin Km ve Vmax değerleri saptanmış, moleküler ağırlığı belirlenerek enzim karakterize edilmiştir. Saflaştırılan enzimin optimum sıcaklık 60°C olarak bulunmuştur. 60°C'de ham enzim aktivitesi ile karşılaştırıldığında saflaştırılmış enzim % 20 oranında artmıştır. Termostabilite çalışmaları saf enzimin 60° C'de 50 dakika boyunca % 69 oranında muhafaza edildiğini göstermiştir, bu nedenle termostabil enzim olabilir. Optimum pH değeri 7.0 olarak belirlenmiştir. Saf enzimin aktivitesi asidik tarafa göre alkalin tarafta daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Diğer yandan, fitaz aktivitesi bazı farklı potansiyel bileşikler tarafından etkilenmektedir. Bu çalışmada, 1 mM konsantrasyondaki potansiyel bileşiklerin 5 mM'den daha etkili olduğu saptanmıştır. Ca++ and Mg++ gibi metal iyonlarının saf enzim aktivitesi üzerinde stimulatör rol oynadığı belirlenmiştir. Fakat SDS daha güçlü bir inhibitör etki göstermiştir. Saflaştırılmış enzim için Vmax ve Km kinetik değerleri sırasıyla 333 U / ml ve 2 mM olarak bulunmuştur. Enzimin moleküler ağırlığı yaklaşık 45 kDa belirlenmiştir. Burada, yeni fitaz enziminin geniş bir endüstriyel uygulamaya sahip olabileceği ve hayvan yemi katkı maddesi olarak kullanılabileceği rapor edilmiştir.

Abstract:
In this study, 300 bacteria were isolated from soil samples are provided from 30 different cities of Turkey. Morphological and physiological features of bacteria were investigated, and 236 bacteria were defined as Bacillus genus. The phytase activities of all strains were assayed using phytase screening medium (PSM), and exhibited as diameter of clear zone in mm. Total 19 Bacillus sp. strains were found as extracellular phytase producer. Among of these strains, two strains of Bacillus sp. that had the largest zones were selected. They were named as Bacillus sp. EBD 9-1 (zone diameter:11 mm) and EBD 19-9 (zone diameter:9 mm). Bacteria were tested for enzyme production capacity in the liquid medium Bacillus sp. EBD 9-1 strain showed the highest phytase activity (600 U/mL).The phytase obtained from Bacillus sp. EBD 9-1 was partial purified and characterized. After the purification steps of ammonium sulphate precipitation (70%), dialization and ultrafiltration, the enzyme was purified 2.06 fold. The effects of temperature and stability, pH and stability, different potential compounds on partial pure enzyme were investigated. Km and Vmax values of the enzyme were calculated, molecular weight was determined and, enzyme was characterized. The optimum temperature of purified enzyme was found as 60°C. The purified enzyme activity compared with crude enzyme activity at 60°C was increased by 20%. Thermostability studies showed that pure enzyme was retained as 69% for 50 min at 60°C, therefore it might be a thermostable enzyme.
The optiumum pH was determined as 7.0 It was observed that the activity of pure enzyme is higher at the alkaline side than the acidic side. On the other hand, the phytase activity is influenced by several different potential compounds. In this study,  1 mM concentrations of potential compounds was found to be more effective than 5 mM. Metal ions such as Ca++ and Mg++ were stimulated on the purified enzyme activity but, SDS showed stronger inhibitory effect. Kinetic values of Vmax and Km for the purified enzyme were 333 U/mL and 2 mM, respectively. The molecular weight of enzyme was determined about 45 kDa. Here, we reported that novel phytase enzyme may have wide industrial application, and can be as an animal feed additive.