CRISPR/CAS9 kullanılarak sığır preimplantasyon embriyolarının trofektoderm farklılaşmasında CDX2 rolünün araştırılması
Investigation of CDX2 role in trophectoderm differentiation of bovine preimplantation embryos by using CRİSPR/CASs9
Yazar: EMEL TÜTEN SEVİM
Danışman: PROF. DR. KEMAL KARABAĞ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Model memeli hayvan olarak farelerde zigottan blastosiste dönüşüm sürecinde hücre soyu farklılaşması hakkında detaylı çalışmalar yürütülmüş olmasına rağmen sığırlarda bu süreç belirsizliğini korumaktadır. Bununla beraber, yardımcı üreme teknikleri kullanılarak üretilen sığır embriyolarında sıklıkla yaşanan erken gebelik kayıpları çözülmesi gereken bir sorun olarak güncelliğini korumaktadır. Preimplantasyon gelişim sırasında meydana gelen trofektoderm (TE) ve iç hücre kitlesi (ICM) farklılaşmasında etkili olan faktörlerin doğru bir şekilde anlaşılmasıyla erken gebelik kayıpların önlenebileceği öngörülmektedir. Bu kapsamda, sığırların preimplantasyon gelişim sürecinde yer aldığı ve fare embriyolarında TE/ICM soylarının farklılaşması için gerekli olduğu bilinen kaudal tip homeobox transkripsiyon faktörü-2 (CDX2) geninin sığırlardaki rolünün araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, CRISPR/Cas9 teknolojisi ile CDX2 geni susturulmuş (Knock-out) olan embriyolar in vitro üretilerek, CDX2 geninin susturulmasının sığır preimplantasyon gelişimine etkisi takip edilmiştir. Çalışma materyalini mezbahalardan alınan ovaryumlardan elde edilen oositler oluşturmuştur. Sığır oositlerine sadece Cas9'u kodlayan mRNA enjekte edilerek kontrol grubu ve CDX2 hedefli sgRNA+Cas9 mRNA enjekte edilerek deney grubu oluşturulmuştur. Preimplantasyon gelişiminin 8. günündeki sığır blastosistleri fikse edilerek TE/ICM hücrelerinin belirlenmesi için sırasıyla CDX2, GATA3 ve SOX2 immünositokimyasal boyama ile görüntü analizi yapılarak embriyo morfolojisi incelenmiştir. Hangi embriyoların CDX2 geni bakımından başarıyla susturulduğunu belirlemek için DNA izolasyonu yapılmış ve miSeq teknolojisi ile genotiplenmiştir.
Tüm analizler sonucunda, CDX2 geni bakımından kontrol ve deney gruplarında embriyo gelişimi bakımından istatistiksel bir fark olmadığı tespit edilmiştir. Bu tez çalışmasında ulaşılan bilgiler fare embriyoları ile kıyaslandığında sığır embriyolarının trofektoderm farklılaşmasında blastosist oluşumunda CDX2'nin hayati bir rol oynamadığını göstermiştir. Ayrıca memeli türleri arasında embriyo gelişimi sırasında ilk hücre soyu farklılaşmasının aynı olmadığı belirlenmiştir. Bu sonuçlara dayanarak, yardımcı üreme teknikleri kullanılarak üretilen sığır embriyolarında meydana gelen kayıpların sebeplerinin belirlenmesi için sürece dahil olduğu öngörülen bütün genlerin araştırılması gerektiği söylenebilir.

Abstract:
While detailed studies have been conducted on cell lineage differentiation during the zygote-to-blastoscsyt formation process in mice as a model mammalian species, this process remains uncertain in bovine. Moreover, early pregnancy losses frequently occur in bovine embryos produced using assisted reproductive techniques, making it an ongoing issue that needs to be addressed. It is anticipated that a better understanding of the factors that effective on the differentiation of trophectoderm (TE) and inner cell mass (ICM) during preimplantation development could help prevent early pregnancy losses. In this context, it was aimed to investigate the role of the caudal type homeobox transcription factor-2 (CDX2) gene in bovine, which is known to be involved in the preimplantation development process of bovine and is required for the differentiation of TE/ICM lineages in mouse embryos. For this purpose, embryos with CDX2 gene silenced (knock-out) using CRISPR/Cas9 technology were produced in vitro and the effect of silencing the CDX2 gene on bovine preimplantation development was monitored. The study material consisted of oocytes obtained from ovaries collected from slaughterhouses. Bovine oocytes were injected with mRNA encoding only Cas9 to create a control group, and with CDX2-targeted sgRNA+Cas9 mRNA to form the experimental group. Bovine blastocysts on the 8th day of preimplantation development were fixed and embryo morphology was examined by image analysis for CDX2, GATA3 and SOX2 immunohistochemical staining to identify TE/ICM cells, respectively. DNA isolation was conducted to identify which embryos had successfully silenced the CDX2 gene, and genotyping was performed using the MiSeq technology.
As a result of all the analyses, it has been determined that there is no statistically significant difference in embryo development with respect to the CDX2 gene between the control and experimental groups. The information obtained in this thesis study, when compared to mouse embryos, indicates that CDX2 does not play a vital role in trophectoderm differentiation and blastocyst formation in bovine embryos. Furthermore, it has been found that the first cell lineage differentiation during embryo development differs among mammalian species. Based on these results, it can be suggested that the investigation of all genes presumed to be involved in the losses observed in bovine embryos produced using assisted reproductive techniques is necessary to determine the causes.