Anaplasma phagocytophilum'un tayinine yönelik elektrokimyasal DNA sensörü geliştirilmesi ve uygulamaları
Development of electrochemical DNA sensor for the determination of anaplasma phagocytophilum and it's applications
Yazar: ÇAĞDAŞ CEYLAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ADİL ELİK
Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Anaplasma = Anaplasma ; DNA probları = DNA probes ; Diferensiyel puls voltametrisi = Differential pulse voltammetry ; Elektroanalitik yöntemler = Electroanalytical methods

Özet:
Bu çalışma, oldukça geniş bir konakçı grubunda enfeksiyona yol açan bir patojen olan A. phagocytophilum dizi seçimli DNA hibridizasyonunun voltametrik yöntemle tayin edildiği tek kullanımlık elektrokimyasal DNA biyosensörü geliştirilmesine yöneliktir.
Herhangi bir etiketlemenin yapılmadığı bu elektrokimyasal çalışmanın esasını DNA hibridizasyonu sonrasında Guanin bazının yükseltgenme sinyalinin ölçülmesi ile bir ikili oluşumunun izlenmesi oluşturur. Söz konusu biyosensör tasarımı inozin modifiye (guanin içermeyen) probun, kalem grafit elektroda (PGE) immobilize edilmesi ve diferansiyel puls voltametrisi (DPV) ile guaninin yükseltgenme sinyalinin ölçülerek, ikili oluşumunun tayinini içerir.
Bu çalışmanın ilk aşamasında, A. phagocytophilum temsil eden prob dizisi, aktive edilmiş, kalem grafit elektrot (PGE) yüzeyine yaş adsorbsiyon (wet adsorbtion) yöntemi ile immobilize edilmiş ve daha sonra prob ve hedefi arasındaki hibridizasyonun varlığı 1000 mV'da gözlenen guanin yükseltgenme sinyali ile tespit edilmiştir.
Yapılan optimizasyon çalışmasında prob derişiminin 25 µg/mL, prob immobilizasyon süresi 6 dakika; hibridizasyon için hedef derişimi 40 µg/mL ve hibridizasyon süresinin 10 dakika olduğu gözlenmiştir. Geliştirilen elektrokimyasal biyosensörün spesifikliği; baz sırasından bir bazının yeri (MM) ve tüm bazlarının yerleri farklı (NC) olan hedef diziler kullanılarak test edilmiştir.
Ferri/Ferro siyanür redoks sistemi altında elektrokimyasal empedans yöntemi kullanılarak yapılan empedimetrik ölçümler ile DNA hibridizasyonunun gerçekleştirildiği ayrıca teyit edilmiştir. Tayin sınırını (DL) belirlemek için hedef derişimi 0,78 - 3,90 µM arasında değişen hedef diziler kullanılmış ve tayin sınırı 0,244 µM olarak bulunmuştur.

Abstract:
This study was intended to enhance the disposable electrochemical DNA biosensor through which A. phagocytophilum, a pathogen causing infection in a considerably wide host group, sequence selective DNA hybridization was detected with a voltametric method. Monitoring the formation of a duplex by measuring the oxidation signal of guanine base after DNA hybridization forms the basis of this study in which no labeling is done. The biosensor design contains immobilizing inosine modified (guanine-free) probe to the pencil graphite electrode (PGE) and detecting duplex formation by measuring guanine oxidation signal with differential pulse voltammetry (DPV).  
In the first stage of this study, probe sequence representing A. phagocytophilum was immobilized to the activated surface of pencil graphite electrode (PGE) by wet adsorption method, and then the hybridization between probe and its target was confirmed with guanine oxidation signal observed at 1000 mV. In the optimization study, it has been observed that probe concentration is 25 µg/mL, immobilization time is 6 minutes; for the hybridization, target concentration was 40 µg/mL and hybridization time is 10 minutes. Respectively of the developed biochemical biosensor was tested by using mismatch and non complementary target sequences. It has been also confirmed that DNA hybridization is carried out with impedimetric measurements by using electrochemical impedance method under the ferri/ferro cyanide redox system. To estimate the detection limit (DL), target sequences whose concentrations varied in range of 0, 78 - 3,90 µM were chosen and it was to be 0,244 µM.