Farklı klinik numunelerden izole edilen e. coli ve klebsiella pneumoniae suşlarında karbapenem, kinolon, kolistin direncinin araştırılması ve karbapenem dirençli suşlarda multipleks pcr yöntemi ile kpc, ndm, vım, oxa-48, ımp-1 genlerin tespiti
An investigation of carbapenem, quinolone and colistin resistance in e. coli and klebsiella pneumoniae strains isolated from different clinical samples and detection of kpc, ndm, vim, oxa-48, imp-1 genes by multiplex pcr in carbapenem-resistant strains.
Yazar: ÖZGE ALKAN BİLİK
Danışman: PROF. DR. MEHMET BAYRAKTAR
Harran Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: Karbapenem dirençli Enterobacteriaceae (KDE) sınırlı tedavi seçenekleri ile ciddi ve hayatı tehdit eden enfeksiyonlara neden olur. Karbapenem direncinin en sık nedeni karbapenem hidrolizi yapan karbapenemazlardır. A sınıfı (KPC), B sınıfı (IMP, VIM, NDM) ve D sınıfı (OXA-48) karbapenemazlar en sık saptananlardır. Bu çalışma ile Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesinde çeşitli klinik örneklerden izole edilen E. coli ve K. pneumoniae suşlarında bazı antibiyotik direnç oranlarını belirlemek, fenotipik ve moleküler yöntemlerle karbapenem direnç mekanizmalarını göstermek amaçlandı.

Gereç ve Yöntem: Çalışma, retrospektif veri analizi ve karbapenem direnç mekanizmalarının gösterilmesi olmak üzere iki aşamada planlandı. Çalışmanın retrospektif ayağında; Temmuz 2016- Temmuz 2017 tarihleri arasında Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi klinik ve yoğun bakımlardan bakteriyoloji laboratuvarına gönderilen çeşitli klinik örneklerden izole edilen 922 E. coli ve 564 K. pneumoniae izolatı olmak üzere toplam 1486 izolatın antibiyotik duyarlılık profilleri incelendi. İkinci aşamada, PhoenixTM 100 (Becton-Dickinson, ABD) otomatize sistemi ile karbapenemlerden biri veya birkaçına orta dirençli veya dirençli bulunan izolatlardan 15 E. coli, 74 K. pneumoniae olmak üzere toplam 89 KDE izolatı çalışmaya dahil edildi. İzolatların antibiyotik duyarlılıkları Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile de değerlendirildi. Karbapenemazların fenotipik yolla saptanması için Modifiye Hodge testi, kombinasyon disk testi (KDT) ve çift disk sinerji testi çalışıldı. KPC, NDM, VIM, OXA-48 ve IMP-1 karbapenemaz genlerini saptamak için Xpert Carba-R (Cepheid, ABD) multiplex PCR sistemi kullanıldı.
Bulgular: Ertapenem, imipenem, meropenem, siprofloksasin ve kolistin direnci E. coli suşlarında sırasıyla %20,9, %7,4, %6,7, %52,4 ve %2,7 olarak; K. pneumoniae suşlarında ise sırasıyla %52,8, %38,4, %32,8, %63,3 ve %23,2 olarak saptandı. Toplam 193 (% 20,9) E. coli ve 298 (% 52,8) K. pneumoniae izolatı karbapenemlerden en az birine dirençliydi. KDE görülme oranı erkek hastalarda kadınlara göre; yoğun bakım hastalarında da klinik hastalarına göre ve K. pneumoniae izolatlarında E. coli izolatlarına göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p<0,05). KDE'lerin 65'inde (%73) tek başına OXA-48 geni, 4'ünde (%4,5) tek başına NDM geni,  6'sında (%6,7) OXA-48 ve NDM geni, 1'inde (%1,2) ise OXA-48, VIM ve IMP-1 genleri birlikteliği saptandı. On üç (%14,6) KDE izolatında ise OXA-48, NDM, VIM, IMP-1 ve KPC genlerinden hiçbiri saptanmadı. Karbapenemaz üreticilerini saptamada MHT duyarlılığı %93, özgüllüğü %100 olarak bulundu. OXA-48 üreticilerini saptamada MHT duyarlılığı %94 ve özgüllüğü  %82 iken NDM geni için sırasıyla %90, %22 olarak tespit edildi. KDT'nin duyarlılığı %80, özgüllüğü %85 olarak bulundu. İzolatların 74'ünde (% 83,1) KDT'de gözlemlenen sinerji, saptanan direnç mekanizması ile uyumluydu. BD Phoenix sistemi, karbapenemaz üreticilerini tanımlamada Xpert Carba-R PCR ile % 86 uyumlu bulundu. 

Sonuç: Moleküler yöntemlerin çalışılamadığı durumlarda karbapenemaz varlığını öngörmede MHT; karbapenemaz tipini öngörmede kombinasyon disk testi, otomatize sistem ve antibiyotik direnç profilleri kullanılabilir.

Anahtar kelimeler: E. coli, Klebsiella pneumoniae, Karbepenem dirençli Enterobacteriaceae, Multiplex PCR, OXA-48, NDM, VIM, IMP-1, MHT, KDT

Abstract:
Aim: Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) cause serious and life-threatening infections with limited treatment options. The most common causes of carbapenem resistance are carbapenemases, which hydrolyze carbapenems. Class A (KPC), class B (IMP, VIM, NDM), and class D (OXA-48) carbapenemases are the leading ones. We aimed to determine some antibiotic resistance rates and to show carbapenem resistance mechanisms by phenotypic and molecular methods in E. coli and K. pneumoniae strains isolated from various clinical specimens in Dicle University Hospital.

Material and Method: The study was conducted at Dicle University Hospital and scheduled in two stages: retrospective data analysis and demonstration of carbapenem resistance mechanisms. Antibiotic susceptibility profiles of a total of 1486 (922 E. coli and 564 K. pneumoniae) strains were retrospectively studied during July 2016 and July 2017. The isolates sent to the bacteriology laboratory were from inpatients of various clinical specimens including clinicals and intensive care units.   In the second stage,  89 CRE isolates (15 E. coli, 74 K. pneumoniae) which were resistant or moderately resistant to one or more of the carbapenems with the Phoenix ™ 100 (Becton-Dickinson, USA) automated system were included. Antibiotic susceptibilities of isolates were also assessed by Kirby-Bauer Disc Diffusion Method. Modified hodge test (MHT), combination disc test (CDT) and double disc synergy tests were performed to detect carbapenemase as phenotypically. Xpert Carba-R (Cepheid, USA) multiplex PCR system was used to detect carbapenemase genes, KPC, NDM, VIM, OXA-48 and IMP-1.
Findings: Ertapenem, imipenem, meropenem, ciprofloxacin and colistin resistance were found to be 20.9%, 7.4%, 6.7%, 52.4% and 2.7% respectively in E. coli strains, whereas in K. pneumoniae strains, 52.8%, 38.4%, 32.8%, 63.3% and 23.2%, respectively. A total of 193 (20.9%) E. coli and 298 (52.8%) K. pneumoniae were resistant to at least one of the carbapenems. The incidence of CRE was significantly higher in male patients than in women; in the intensive care patients than other inpatients. CRE rates were higher in K. pneumoniae isolates compared to E. coli isolates (p<0.05). OXA-48 gene alone was found in 65 (73%) isolates, NDM gene alone in 4 (4.5%), OXA-48 and NDM genes altogether in 6 (6.7%), OXA-48, VIM and IMP-1genes were found together only in one (1.2%) CRE isolate. None of the OXA-48, NDM, VIM, IMP-1 and KPC genes were detected in the rest thirteen (14.6%) CRE isolates. The sensitivity and specificity were calculated for the modified Hodge test. They were found to be respectively 93% and 100% for carbapenemase producing isolates; 94% and 82% for OXA-48 producers; 90% and 22% for NDM producers. The sensitivity and specificity of CDT were determined. They were 80% and 85% respectively. 74 of the isolates (83,1 %), the synergy observed in combination disc tests was compatible with the resistance mechanism detected. BD Phoenix system was found as 86% compatible with Xpert Carba-R PCR to identify carbapenemase producers.

Conclusion: MHT can be used to predict the presence of carbapenemase whereas combination disc testing, automated systems and antibiotic resistance profile for carbapenemase typing when molecular methods are not available.

Key words: E.coli, Klebsiella pneumoniae, Carbepenem resistance Enterobacteriaceae, Multiplex PCR, OXA-48, NDM, VIM, IMP-1, MHT, CDT