NMRAL1 proteininin HTATIP2 üzerine etkisi ve baş-boyun kanserinde biyobelirteç olarak incelenmesi
The effect of NMRAL1 protein on HTATIP2 and investigation as A biomarker in head and neck cancer
Yazar: ASUMAN ÇELEBİ
Danışman: PROF. DR. AYŞE NUR BUYRU
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Biyobelirteçler-tümör = Biomarkers-tumor ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Kafa ve boyun neoplazmları = Head and neck neoplasms ; Karsinoma-yassı hücreli = Carcinoma-squamous cell ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Baş-boyun kanserlerinden en sık görülen skuamöz hücreli baş-boyun kanseridir. Kanser hücreleri artmış oksidatif stresi azaltmak, redoks dengesini korumak için NADPH'a ihtiyaç duyar. NADPH, Htatıp2 ve Nmral1 gibi proteinlerle etkileşime girerek işlev gösterir. Çalışmanın amacı; Nmral1'in yokluğunda Htatıp2'nin ifade düzeyinin ve hücresel yerleşiminin değişip değişmediğini belirlemektir. Htatıp2 ile etkileşimi gösterilmiş olan c-Myc ve siklin D1 genlerinin Nmral1 yokluğunda ifade düzeylerini incelemektir.
Kanserli ve normal hücre hatlarında Nmral1 geni siRNA ile susturularak HTATIP2, c-MYC ve CCND1 gen ifade düzeylerine bakılmıştır. İmmunsitokimya ile Nmral1 ve Htatıp2'nin hücresel yerleşimi belirlenmiştir. Ayrıca larenks kanserli 50 hastanın tümör ve normal dokularında mRNA ve protein ifadelerine bakılmıştır.
NMRAL1 geni normal baş-boyun hücre hattında %62, kanser hücre hattında %74 susturuldu. Susturma sonrası; kanser hücre hattında HTATIP2 ve CCND1 mRNA ifadesi değişmezken, c-MYC ifadesi azalmıştır. Normal hücre hattında HTATIP2 mRNA ifadesi azalırken, c-MYC ve CCND1 ifadesi değişmedi. NMRAL1 susturması sonrası; Htatıp2 protein miktarı ve yerleşimi kanserli hücre hattında değişmezken, normal hücre hattında sitoplazmada yoğunlaşmıştır. NMRAL1 ifade düşüklüğü her iki hücre hattında hücre canlılığını ortalama %60 oranında azaltmıştır. Larenks tümör dokularında NMRAL1(p=0,001) ve c-MYC (p<0,001) mRNA ifadesi azalmıştır. HTATIP2 ifadesi artan hastaların %85,2'sinde c-MYC ifadesi, %65,9'unda CCND1 ifadesi azalmaktadır. NMRAL1 mRNA ifadesi azalan hastaların %85,7'sinde c-MYC ifadesi azalmaktadır.
Sonuç olarak; Normal baş-boyun hücre hattında NMRAL1 geni yokluğunda Htatıp2 proteininin sitoplazmada daha yoğun olması sitoplazmik görevlerinin arttığını düşündürmektedir. HTATIP2 larenks kanserinde c-MYC ve CCND1gen ifadesi üzerine baskılayıcı etkisi söz konusudur. Ancak NMRAL1 genininc-MYC ile aynı yönlü, CCND1 ile ters yönlü korelasyon göstermektedir. Öngörülen bu ilişkileri belirlemek için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Anahtar Kelimeler: Baş-Boyun kanseri, NMRAL1, HTATIP2, siRNA, Western Blot

Abstract:
Head and neck squamous cell carcinoma is the most common head and neck cancer type. Cancer cells need NADPH to reduce increased oxidative stress and preserve redox balance. NADPH performs by interacting with proteins such as Htatip2 and Nmral1. Purpose of the study is to determine altering expression level and cellular location of Htatip2 in absence of Nmral1. Furthermore, to explore the expression levels of c-MYC and cyclin D1, which have been shown to interact with Htatip2, in absence of Nmral1. 
HTATIP2, c-MYC and CCND1 gene expression levels were examined by silencing the NMRAL1 gene with siRNA in cancerous and normal cell lines. The cellular localization of Nmral1 and Htatip2 was determined by immunocytochemistry assay. Also, mRNA and protein expressions in tumor and normal tissues of 50 patients with larynx cancer were examined.
The NMRAL1 gene was silenced 62% in head and neck normal cell line and %74 in cancer cell line. In normal cell line, HTATIP2 mRNA expression was decreased while c-MYC and CCND1 did not change after silencing. After NMRAL1 silencing, the amount and location of Htatip2 protein did not change in the cancer cell line but it was concentrated in the cytoplasm in the normal cell line. Low expression of NMRAL1 was decreased cell viability by approximately 60% in both cell lines. NMRAL1 (p=0.001) and c-MYC (p<0.001) mRNA expression was decreased in laryngeal tumor tissues. c-MYC and CCND1 expression was decreased in 85.2% and 65.9% of patients with increased HTATIP2 expression, respectively. c-MYC expression was also decreased in 85.7% of patients with decreased NMRAL1 mRNA expression.
As a result, absence of the NMRAL1 gene in normal head and neck cell line, the Htatip2 protein is more concentrated in the cytoplasm. This suggests that cytoplasmic functions of Htatip2 might be increased. HTATIP2 has a suppressive effect on c-MYC and CCND1 gene expression in laryngeal cancer. NMRAL1 gene has a positive correlation with c-MYC but contrarily with CCND1. Further studies are needed to determine this predicted association.
Key Words: Head and neck cancer, NMRAL1, HTATIP2, siRNA, Western blot