Kanda ve dokularda mycobacterium bovis etkeninin moleküler ve sito-histopatolojik yöntemlerle gösterilmesi
Demonstration of mycobacterium bovis in cattle BY molecular and CYTO-histopathological methods
Yazar: EZGİ AKDEŞİR
Danışman: PROF. DR. MÜJDAT MÜFİT KAHRAMAN
Uludağ Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Patoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Histopatoloji = Histopathology ; Kan testleri = Hematologic tests ; Mycobacterium = Mycobacterium ; Mycobacterium bovis = Mycobacterium bovis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Sitoloji = Cytology ; Teşhis = Diagnosis ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Bu çalışmada farklı çiftliklerde tüberkülin deri testinde pozitif bulunan 2 yaş üzeri ineklerden oluşan 30 adet tüberkülozlu sığırda (çalışmanın deney grubu) Mycobacterium bovis  etkeninin varlığının periferik kanda saptanabilmesinde kullanılabilecek, alternatif bir tanı yöntemi denemesi ve rutin histopatoloji, immunohistokimya (İHK),  Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) farklı tanı yöntemlerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır.  Deney ve kontrol grubuna ait hayvanların kesimi sonrası kan ve doku örnekleri alınarak, taze dokularda PZR, formaldehitte tespit edilmiş dokulardan hazırlanan parafin blok kesitlerinde ise Hematoksilen-Eozin (HE), Ziehl-Neelsen (ZN) ve İHK yöntemi ile boyama uygulanmıştır.  Santrifüje edilen kanların 'buffy coat'; lökosit katmanında PZR ve bu katmandan hazırlanan frotilere immunositokimya (İSK) uygulanmıştır.  Deney grubundaki hayvanların 27'sinde öncelikli olarak akciğer ve mediastinal lenf düğümlerinde, ilave olarak plöra ve karaciğerde kazeifiye-kalsifiye olmuş tipik tüberkül yapısı gözlenmiştir.  Organlarında makroskobik lezyon (nodül, tüberkül) gözlenmeyen 4 hayvandan ikisinde spesifik olmayan lenfadenopati gözlenmiştir.  Tipik makroskobik lezyon (tüberkül) gösteren olgularda ve ek olarak lenfadenopati gözlenen 2 olgudan bir tanesinde histopatolojik muayenede tipik tüberkül granulomu yapısı gözlenmiştir.  Histopatolojik incelemeleri takiben yapılan ZN boyamalarda 20 olgu tüberkülozla uyumlu bulunmuştur. Deney grubundaki hayvanların akciğer, mediastinal lenf düğümü ve karaciğer dokularında yapılan İHK boyamalarında 30 hayvanının 25 tanesinde;  lökosit katmanından yapılan İSK boyamalarının ise 3 tanesinde pozitif etken boyanmasına rastlanmıştır.  Tespit edilmeden aynı dokularda gerçekleştirilen PZR'de 18 hayvana ait dokuda; lökosit katmanı PZR'sinde ise 14 tanesinde pozitiviteye rastlanmıştır.  İHK incelemelerinde pozitif boyanmış etkenlere, nekroz alanlarını çevreleyen bağ dokuda serbest şekilde; makrofajların, dev hücrelerinin, nadiren lenfositlerin ve fibrositlerin sitoplazmalarında rastlanmıştır.  İSK incelemelerinde ise pozitif reaksiyon mononükleer lökosit sitoplazmalarında görülmüştür. Kontrol grubunda ise İSK'da 10, ,dokuda PZR'de1, kanda yapılan PZR'da 2 hayvanda pozitif reaksiyon saptanmış diğer yöntemlerde herhangi bir pozitiviteye rastlanmamıştır.
Sonuç olarak çalışmamızda Mycobacterium bovis etkenine ait moleküllerin periferik kandaki varlığı ve bu molekülleri saptamaya yönelik yöntemlerin kanda sığır tüberkülozunun tanısında kullanılabileceği gösterilmiştir.  Klasik olarak ZN boyama ile yapılacak tüberküloz tanısının her zaman hassasiyet göstermediği ve teşhiste diğer yöntemlere ihtiyaç olduğu gözlemlenmiştir.  Bu nedenle destekleyici diğer tanı yöntemi veya yöntemlerinin kullanılmasında fayda olacağı açıktır.  Kullanılan yöntemlerden İHK'nın, etkili sonuç verdiği, kandan yapılan testlerde ise PZR'nin İSK'ya kıyasla daha etkili olduğu gözlenmiştir. Tüberküloz hastalığının kesin teşhisinde kullanılan tekniklerin birinin diğerine üstünlüğünden ziyade birbirini tamamlayıcılığından ve bir arada kullanıldığında teşhisin hem daha hızlı hem de daha güvenilir olduğundan bahsetmek daha yerinde olacaktır. Çalışmanın temel hedefini oluşturan, erken tanıya ve PPD ile ön tanının doğrulanmasına imkan sağlayacak 'etkenin kan-lökosit katmanındaki tesbit edilebilirliği uygulamasının, hangi safhalarda, ne derece tercih edilebileceğini net olarak ortaya koyabilmek, yöntemi rutin kullanıma sunabilmek için ileri çalışmalar gerekmektedir.

Abstract:
In this study it was aimed to provide an alternative method applicable to peripheral blood and compare various methods for diagnosing bovine tuberculosis by sampling from 30 cows older than 2 years, from various farms and found to be positive in intradermal tuberculin test.   Following the slaughter of animals in experiment and control group, blood and tissue samples were collected.   Polymerase chain reaction (PCR) was applied to the fresh tissue samples and Hematoxyline&Eosin (HE), Ziehl-Neelsen (ZN) and immunohistochemistry (IHC) was applied to the formalin fixed, paraffin embedded tissues.  The buffy-coat extracted from the blood by centrifugation was further processed with PCR and the buffy-coat smears with Immunocytochemistry (ICC) method.  In 27 of the experiment group classical tubercle lesion was observed.  In the 4 animals which did not show characteristic macroscopic lesion, nonspecific lymphadenopathy was observed.  In animals showing typical macroscopic lesion and additionally in one of the two lymphadenopathic cows, routine HE examination revealed typical granuloma structure.  In examination of ZN stained slides, 20 animals of the experiment group was found to be consistent with tuberculosis. In the lungs, mediastinal lymphnodes and liver of the experiment group, 25 animals revealed positive staining against M.bovis in IHC and 3 animals in ICC.  Tissues of 18 animals and buffy-coat of 14 animals were found to be PCR positive for mycobacteria.  Positive staining in IHC was observed surrounding the necrosis in the connective tissue and intracytoplasmically in macrophages, giant-cells, rarely in lymphocytes and fibrocytes.  Positive staining in ICC is observed intracytoplasmically in mononuclear leukocytes. Of the control group (n: 30); 10 in ICC and in PCR examination of the buffy coat 2 animals and of the tissue 1 animal were found to be positive. Other tests of the control group revealed negative results.
As a conclusion, this study has shown the possibility of detecting the molecules of the agent in peripheral blood and diagnostic feature of the blood in bovine tuberculosis.  As a usual practice, use of ZN staining for the diagnosis of bovine tuberculosis is found to lack sensitivity and the need for supportive diagnostic tests is considered to be necessary.  It was shown that IHC in tissue and PCR in blood samples was the most effective method to diagnose the disease.  For the quick and accurate diagnosis of bovine tuberculosis, rather than the superiority of diagnostic methods it is more suitable to talk about the complementarity of these methods.  Further studies are urgent to have precise information about the utility of the method based on the theory of detecting agent components in buffy-coat.