Kainik asit ile eksitotoksisite oluşturulmuş nöroblastoma hücrelerinde GLT-1 (Glutamat Transporter 1) yıkım yolağının, SIRT 4 (Sırtuın 4) ile düzenlenmesinin araştırılması
Investigation of the regulation of the GLT-1 (glutamate transporter 1) degradation pathway by SIRT 4 (sirtuin 4) in excitotoxic neuroblastoma cells induced by kainic acid
Yazar: YAREN AKDOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. BAKİYE GÖKER BAĞCA ; PROF. DR. GİZEM DÖNMEZ YALÇIN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Amaç: Çalışmada; SIRT4'ün, nöroblastoma hücrelerinde, GLT-1'in ekspresyonunu ve degradasyonunu nasıl düzenlediği ve GLT-1 promotorundaki transkripsiyon faktörleri üzerine etkisinin aydınlatılması amaçlandı. Bunun yanında özellikle kainik asit kaynaklı eksitotoksisite durumunda bu düzenlemenin nasıl değiştiğinin gözlemlenmesi hedeflendi.
Gereç ve Yöntem: SH-SY5Y insan nöroblastoma hücre hattında, SIRT4 genini susturmak için SIRT4 shRNA içeren lentiviral partiküller kullanıldı ve SIRT4 geni susturulmuş kararlı SH-SY5Y hücre hattı elde edildi. SIRT4'ün susturulduğunu göstermek Western Blot yöntemi kullanıldı. Uygun şartları sağlayan tek bir hücre hattı seçilerek diğer deneylerde kullanılmak üzere çoğaltılmaya devam edildi. Kontrol SH-SY5Y hücreleri ve SIRT4 geni susturulmuş SH-SY5Y hücreleri kainik asit (1mM) ile muamele edilerek eksitotoksisite modeli oluşturuldu. Toplam dört deney grubu meydana getirildi. Bunlar; kontrolgrubu, kainik asit ile eksitotoksisite modeli oluşturulmuş grup, SIRT4 susturulmuş grup ve kainik asit ile eksitotoksisite modeli oluşturulan ve SIRT4 susturulmuş gruptur. Dört deney grubundaki GLT-1 ifadeleri Western Blot yöntemi kullanılarak analiz edildi. Dört deney grubundaki GLT-1 mRNA seviyeleri qPCR yöntemi kullanılarak belirlendi. GLT-1 promotoru ve transkripsiyon faktörlerinin (CREB ve REST) etkileşimi CHIP (Kromatin İmmünopresipitasyon) metodu ile dört deney grubunda gösterildi.
Bulgular: Kontrol grubu, Kainik asit ile eksitotoksisite modeli oluşturulmuş grup, SIRT4 susturulmuş grup ve Kainik asit ile eksitotoksisite modeli oluşturulan ve SIRT4 susturulmuş gruplarındaki GLT-1 ekspresyon düzeyinin belirlenmesi için her gruptan protein izolasyonu yapılarak Western Blot yöntemi uygulandı. Elde edilen sonuçlarda GLT-1'in nöroblastoma hücrelerinde oligomerik yapılar oluşturduğu görüldü. SIRT4 geni susturulmuş iki grup arasında eksitotoksisite oluşturmak toplam GLT-1 ifadesini istatistiksel olarak anlamlı şekilde azaldığı gözlemlendi. Bunun yanında eksitotoksisite oluşturulmuş iki grup arasında SIRT4 genini susturmanın yine toplam GLT-1 ifadesini istatistiksel olarak anlamlı şekilde azalttığı bulundu. Ardından dört deney grubunda GLT-1 mRNA seviyeleri, qPCR yöntemi kullanılarak belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre dört deney grubu arasında, GLT-1 mRNA seviyesinin, istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermediği gözlemlendi.
Sonuç: Elde edilen sonuçlar, nöroblastoma hücrelerinde SIRT4'ün susturulmasının ve eksitotoksisite durumunun GLT-1 ifadesini, mRNA düzeyinden ziyade protein düzeyinde etkilediğini göstermektedir.

Abstract:
Objective: In this study, we aimed to investigate how SIRT4 regulates the expression and degradation of GLT-1 in neuroblastoma cells and to clarify its effect on transcription factors in the GLT-1 promoter. In addition, it was aimed to observe how this regulation changes especially in the case of kainic acid-induced excitotoxicity.
Material and Methods: In SH-SY5Y human neuroblastoma cell line, lentiviral particles containing SIRT4 shRNA were used to silence the SIRT4 gene and a stable SH-SY5Y cell line with silenced SIRT4 gene was obtained. Western blotting was used to demonstrate SIRT4 silencing. A single cell line that met the appropriate conditions was selected and continued to be propagated for further experiments. Control SH-SY5Y cells and SIRT4 gene silenced SH-SY5Y cells were treated with kainic acid (1 mM) and excitotoxicity model was established. A total of four experimental groups were formed. These are; control group, kainic acid-induced excitotoxicity model, SIRT4 silenced group and kainic acid-induced excitotoxicity model and SIRT4 silenced group. GLT-1 expressions in the four groups were analyzed using Western Blot method. GLT-1 mRNA levels in the four groups were determined using qPCR method. The interaction of GLT-1 promoter and transcription factors (CREB and REST) was demonstrated by CHIP (Chromatin Immunoprecipitation) method in four groups.
Results: In order to determine the GLT-1 expression level in the control group, Kainic acid-excitotoxicity induced group, SIRT4 silenced group and Kainic acid-excitotoxicity induced and SIRT4 silenced groups, protein isolation was performed from each group and Western Blot method was applied. The results showed that GLT-1 formed oligomeric structures in neuroblastoma cells. A statistically significant decrease in total GLT-1 expression was observed between the two SIRT4 gene silenced groups to induce excitotoxicity. In addition, silencing the SIRT4 gene between the two excitotoxicity-induced groups was found to statistically significantly reduce total GLT-1 expression. GLT-1 mRNA levels in the four experimental groups were then determined using qPCR method. According to the results obtained, it was observed that GLT-1 mRNA levels did not show a statistically significant difference between the four groups.
Conclusion: Our results suggest that SIRT4 silencing and excitotoxicity in neuroblastoma cells affect GLT-1 expression at the protein level rather than the mRNA level.