Apoptozis belirtecinin belirlenmesinde biyosensör geliştirilmesi
Development of biosensors for the determination of apoptosis marker
Yazar: KEZBAN KARTLAŞMIŞ
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH TULİ
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Apoptozis = Apoptosis

Özet:
Apoptoz gelişim ve doku homeostazında kritik rol oynayan temel bir fizyolojik süreçtir. Bu süreç, belirli koşullar altında bir dizi sinyal dizisi tarafından düzenlenir. Kaspaz kaskat sistemi, hücre içi apoptotik sinyallerin indüksiyonunda, transdüksiyonunda ve amplifikasyonunda hayati rol oynar. Bir sistein-aspartik asit proteazı olan kaspaz-3 küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde, hepatoselüler karsinomda, intraserebral kanamalarda, akciğer adenokarsinomunda, şiddetli seyreden endometriyozis vakalarında, mesane karsinomunda kötü prognozla ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, Kaspaz-3'ün saptanması, apoptoz görüntüleme, erken tümör tedavisi ve diğer hastalıkların izlem etkisinin değerlendirilmesi için büyük önem taşımaktadır.
Elektrokimyasal immünosensörler aktif tabaka yüzeyinde immobilize edilmiş antikor ve özgün antijen arasındaki etkileşimlere dayanan bir tür afinite biyosensörüdür. Bu tez çalışmasında kaspaz-3'ün nicel ölçümü için elektrokimyasal immünosensör tasarımı ve bu biyosensöre ait karakterizasyon ile optimizasyon çalışmaları yapılarak elde edilen sonuçların ELISA yöntemiyle karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Tez çalışmasının ilk aşamasında altın elektrot yüzeyi antikaspaz-3 ile kaplandı ve tepkime ortamındaki kaspaz-3 ile etkileşimi sonucu oluşturduğu akım farkından yararlanıldı. Biyoaktif tabakanın optimizasyonunda kitosan, aljinat, jelatin ve BSA'nın farklı kombinasyonları kullanılarak immobilizasyon jelleri hazırlandı. SEM mikrograflarında ve FTIR spektrumlarında optimum immobilizasyon polimerkombinasyonu Aljinat-Jelatin'de elde edilmiştir. AFM analizinden elde edilen yüzey görüntüleri SEM ve FTIR sonuçlarını desteklemektedir. Optimum çapraz bağlayıcı EDC/NHS (0,3 M:0,1 M) olup çalışma ortamı pH'si 6,5, 0,1 M asetat tamponunda optimum sonuçlar elde edilmiştir.  Tasarladığımız kaspaz-3 biyosensörünün doğrusal saptama aralığı 1.5 100 ng/mL,  tekrarlanabilirlik çalışmasında elde edilen ortalama değer (x̄)=10,02, standart sapma değeri (SD)=0,18 varyasyon katsayısı (CV)= %1,8'dir. Günler arası tekrarlanabilirlik çalışmasından elde edilen standart sapma değeri 2,5'dir. Elektrodun raf ömrü ise %40 aktivite kaybının görüldüğü 30. güne kadar kullanılabilir olduğu belirlendi. ELISA yöntemi ve tasarlanan biyosensör verilerinin karşılaştırılması sonucu elde edilen korelasyon katsayısı 0,9927 olup bu değer tasarlanan kaspaz-3 biyosensörünün pratikte kullanımı için uygun olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Apoptosis is an essential physiological process that plays a critical role in development and tissue homeostasis. This process is regulated by a series of signals under certain conditions. The caspase cascade system plays a vital role in the induction, transduction, and amplification of intracellular apoptotic signals. Caspase-3, a cysteine-aspartic acid protease, has been associated with poor prognosis in non-small cell lung cancer, hepatocellular carcinoma, intracerebral hemorrhages, lung adenocarcinoma, severe endometriosis cases, and bladder carcinoma. Therefore, detection of caspase-3 is of great importance for apoptosis imaging, early tumor therapy, and evaluation of the surveillance effect of other diseases.
Electrochemical immunosensors are a type of affinity biosensor based on interactions between antibodies and specific antigens immobilized on the active layer surface. In this thesis, it is aimed to compare the results obtained by performing the electrochemical immunosensor design for the quantitative measurement of caspase-3 and the characterization and optimization studies of this biosensor with the ELISA method.
In the first stage of the thesis work, the gold electrode surface was coated with anticaspase-3, and in the next stage, the current difference created by interacting with caspase-3 in the reaction medium was used. In the optimization of the bioactive layer, immobilization gels were prepared using different combinations of chitosan, alginate, gelatin, and BSA. In SEM micrographs and FTIR spectra, the optimal immobilization gel combination of Alginate-Gelatin was obtained. The surface images obtained from the AFM analysis support the SEM and FTIR results. The optimal crosslinker is EDC/NHS (0,3M/0,1M), and optimal results were obtained in a 0.1 M acetic acid/acetate buffer with a working pH of 6.5. The linear detection range of the caspase-3 biosensor we designed is 1.5 100 ng/mL, the mean value (x̄)=10.02 obtained in the intraday repeatability study, the standard deviation value (SD)=0.18, the coefficient of variation (CV)= 1.8%. The standard deviation value obtained from the interday repeatability study is 2.52. The shelf life of the electrode was determined to be usable until the 30th day, when 40% activity loss was observed. The correlation coefficient obtained as a result of the comparison of the ELISA method and the designed biosensor data is 0.9927, which shows that the designed caspase-3 biosensor is suitable for practical use.