Sirkadiyen ritmin beyin felci sonrası gelişen hasar üzerine etkisi
Role of circadian rhythm on focal cerebral ischemia
Yazar: MUSTAFA ÇAĞLAR BEKER
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ZAFER ŞAHİN
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Beyin = Brain ; Beyin hastalıkları = Brain diseases ; Beyin iskemisi = Brain ischemia ; Gen ifadesi = Gene expression ; Proteomikler = Proteomics ; Serebrovasküler bozukluklar = Cerebrovascular disorders ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Sirkadiyen ritim = Circadian rhythm ; İnme = Stroke

Özet:
Sirkadiyen ritim, günlük fizyolojik fonksiyonları ayarlamakla kalmayıp aynı zamanda patofizyolojik süreçleri de etkileyen biyolojik bir saattir. Daha önceki çalışmalara bağlı olarak serebral iskemi ve sirkadiyen ritim arasında kuvvetli bir ilişki olduğu düşünülmektedir. Günümüze kadar sirkadiyen ritim ile ilgili yapılan çalışmaların büyük bir çoğunluğu klinik gözlemlere dayandığından çalışmalar kısıtlı bir alanda kalmıştır. Bununla birlikte, iskemi sonrası patofizyolojik olaylara karşı sirkadiyen ritmin göstereceği hücresel ve moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir.
Bu amaçla 8-12 haftalık erkek Balb/ C farelerine 6 saatlik aralıklarla (ZT0, ZT6, ZT12 ve ZT18) dört farklı zaman noktasında 30 dk orta serebral arter tıkanması takiben 72 saatlik reperfüzyon gerçekleştirildi. Nöronal sağkalım ve apopitotik hücre ölümü immuno-histokimyasal metotlarla incelendi. Biyolojik saat proteinleri; Period-1, Period-2, CLOCK ve Bmal1 protein ifadeleri Western Blot ile değerlendirildi. Ek olarak, PI3K sinyal yolağı Pathscan metoduyla değerlendirildi. Sirkadiyen ritim ile ilişkili proteinler sıvı kromatografi-kütle spektrometresi yöntemleri ile analiz edildi.
Yapılan bu çalışmada zamana bağlı olarak değişen sirkadiyen ritim proteinleri beyin felci sonrası gelişen beyin hasarını doğrudan etkilediğinin kanıtlarını sunulmaktadır. Gece yarısı (ZT18; 24:00) beyin felci geçiren farelerde sabah (ZT0, 06:00) beyin felci geçirenlere göre sirkadiyen ritim proteinleri Bmal1, Per1 ve CLOCK proteinlerinin seviyeleri arttığı ve bunlarla beraber nöronal sağkalımın arttığı, apopitotik hücre sayısının ise azaldığı gösterildi. Ayrıca yapılan protein çalışmaları ile bu etkileri sağkalım kinazlarından p-AKT ve p-Erk-1/2 üzerinden yaptığı gösterildi. Bu bilgilere ek olarak yapılan geniş ölçekli proteomik analizi sonucu sabah ZT0'a kıyasla; ZT18 grubunda GNAZ, NEGR1, IMPCT ve PDE1B seviyesi artarken, CSKP, HBB1, HBB2 ve HBA düzeyleri anlamlı ölçüde düştüğü gözlemlendi. Elde edilen sonuçlar, gece beyin felci geçirenlerde nöronal hasarın daha az olduğu ve bunu sağkalım kinazları ve sirkadiyen ritim ile alakalı proteinlerin ifadesinin artmasıyla sağladığı gösterildi.

Abstract:
Circadian clocks are endogenous timers not only adjusting daily physiological functions but also affect pathophysiological processes. Depends on previous studies, there have been strong relation between cerebral ischemia and circadian rhythm.  In addition, occurance of stroke cases displays a time of day variation. To date, most of the circadian expression studies remained restricted with clinical observations. Nevertheless, the molecular and cellular mechanism linking circadian rhythm to the internal response mechanisms against pathophysiological events after ischemia remained largely unknown.
To this end, 8-12 weeks male Balb/c mice were exposed to min of MCAO following 72 h reperfusion at four different Zeitgeber time (ZT) points with 6-h intervals (ZT0, ZT6, ZT12, and ZT18). Disseminate neuronal injury and DNA fregmantation were examined using immunohistochemistry. Core clock proteins; Period-1, Period-2, CLOCK and Bmal1 protein expressions were evaluated by Western Blot. In addion, PI3K signaling pathway analysed via planar surface immune assay and circadian rhythm related proteins were evaluated by liquid chromatography– mass spectrometry tools.
Here, we present evidence that activational changes of proteins by circadian rhythm regulations directly influence brain injury following cerebral ischemia. Midnight (ZT18; 24:00) I/R injury in mice resulted in significantly improved neuronal survival, and decreased apoptosis compared with ischemia induced at ZT0 (06:00), which were associated with increased expressions of circadian proteins Bmal1, PerI, and Clock proteins and survival kinases p-AKT and p-Erk-1/2. Furthermore, proteomics revealed significantly reduced CSKP, HBB1, HBB2, and HBA levels, while increased GNAZ, NEGR1, IMPCT, and PDE1B at midnight as compared with ZT0. Results showed that nighttime ischemic injury results in less severe neuronal damage, with increased neuronal survival, increased levels of survival kinases and circadian clock proteins, and also alters the circadian-related proteins.