Preeklampsi hastalarında, desidual mezenkimal stromal hücrelerde farklı şekilde anlatılan mRNA'ların validasyonu
Validation of differentially expressed mRNAs in decidual mesenchymal stromal cells on preeclampsia patients
Yazar: MÜRÜVVET AKBUDAK
Danışman: PROF. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Preeklampsi, dünya genelinde tüm gebeliklerin yaklaşık %10'unu etkileyerek maternal ve perinatal morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenini oluşturan hipertansif bir gebelik bozukluğudur. Maternal-fetal arayüzden kaynaklanan ve genellikle üçüncü trimesterde yeni başlangıçlı hipertansiyon ve sıklıkla proteinürinin eşlik ettiği preeklampsi hem anne hem de fetüsün ölümü de dahil olmak üzere maternal çoklu organ sistemlerini etkileyen komplikasyonlar oluşturabilir. Doğum hastalığın tek tedavisidir; ancak hastalık doğumdan sonra da devam edebilir ve bazı durumlarda, doğum sonrası dönemde yeniden gelişebilir.
Preeklampsi patofizyolojisinin plasentadan kaynaklandığı düşünülmektedir. Anormal plasentasyon sonucu spiral arterlerin yeniden şekillenmesindeki bozukluk, plasentanın oksijensiz kalmasına ve oksidatif stresi beraberinde getiren hipoksi oluşumuna neden olur. Oksidatif stres, anti-anjiyojenik faktörlerin salınımına ve dolayısıyla anjiyojenik ile anti-anjiyojenik faktörler arasında dengesizliğe yol açar. Bu dengesizlik anjiyogenez ve plasental vaskülaritede aksamalar yaşanmasına sebep olur.
Mezenkimal stromal hücreler (MSH) kendi kendini yenileyebilen ve birçok farklı hücre tipine farklılaşabilme potansiyeli bulunan hücrelerdir. MSH'ler salgıladıkları maddeler aracılığıyla anjiyogenezi teşvik eder, immün modülatör, anti-inflamatuar ve onarıcı özellikleriyle plasental ortamın düzenlenmesinde rol oynar. 
Bu tez, preeklampsi ve sağlıklı gebelere ait desidua ve periferal kan kökenli MSH'lerin mRNA anlatım analizini kapsamakta ve olası biyobelirteçlerin araştırılması için bir ön çalışma niteliği taşımaktadır. Tez kapsamında deney grubunu oluşturan 6 preeklampsi gebeye ve kontrol grubunu oluşturan 3 sağlıklı gebeye ait plasenta dokusu ve periferal kandan alınan toplam 13 örnekten MSH izolasyonu yapılmış ve gen anlatım analizi çalışılmıştır. Öncelikle MSH'lerin izolasyonu, ardından hücre kültürü ve hücre sayısı yeterli yoğunluğa ulaştıktan sonra uygun hücre yüzey belirteçleri kullanılarak akım sitometrisi yöntemiyle hücre ayrımı ("cell sorting") yapılmıştır. MSH'lerden total RNA izolasyonu gerçekleştirilmiş ve cDNA'ya çevrilmiştir. Gen anlatım analizi için "İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü 2" (IGF2), "İnterlökin 16" (IL-16), "Netrin-4" (NTN4), "Toll Benzeri Reseptör 4" (TLR4) genleri ve normalizasyon için "Gliseraldehit- 3-fosfat dehidrojenaz" geni (GAPDH) kullanılmıştır. Gen anlatım analizi damlacıklı dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPZR) ile gerçekleştirilmiştir. Verilerin istatistiksel sonuçları için "Graphpad Prism Version 9.5.1" programı kullanılmış, sonuçların anlamlılık değerlendirilmesi parametrik olmayan "Mann Whitney Test" , özgüllük ve duyarlılık değerlendirilmesi "Reciever Operating Characteristic" (ROC) analizi ile yapılmıştır.
Analizler sonucunda NTN4 ve TLR4 genlerinin hem desidua hem de periferal kan MSH'lerinde mRNA anlatım seviyesi açısından kat değişimleri olmasına rağmen istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmemiştir. 
Bu çalışma; preeklampsi patogenezinde MSH değişimlerinin hastalıkla ilişkilendirilmek üzere IGF2, IL16, NTN4 ve TLR4 genlerinin ekspresyonları değerlendirilerek yapılan ilk çalışmalardan biridir. Saptanan bulguların istatistiksel olarak anlamlı çıkmaması daha geniş sayıda hasta örnekleri ile doğrulanmasını gerektirir. Özellikle NTN4 ve TLR4 genlerindeki artış, preeklampsinin erken tanısında rol oynayabileceklerini düşündürmektedir.

Abstract:
Preeclampsia is a hypertensive pregnancy disorder that affects approximately 10% of all pregnancies worldwide, making up an important cause of maternal and perinatal morbidity and mortality. Preeclampsia, which is caused by the maternal-fetal interface and is often accompanied by new-onset hypertension and often proteinuria in the third trimester, can create complications that affect maternal multi-organ systems, including the death of mother and fetus. Birth is the only treatment of the disease; however, it can continue after birth and in some cases, it may redevelop in the postpartum period.
Preeclampsia pathophysiology is thought to originate from the placenta. The disorder in remodelling of spiral arteries as a result of abnormal placentation causes the placenta to remain oxygen-free and hypoxia formation that brings oxidative stress. Oxidative stress leads to the release of anti-angiogenic factors and thus an imbalance between angiogenic and anti-angiogenic factors. This imbalance causes disruptions in angiogenesis and placental vascularity.
Mesenchymal stromal cells (MSC) are cells that can be self-renewable and have the potential to differentiate into many different cell types. MSCs promote angiogenesis through the substances they secrete and play a role in regulating the placental environment with its immune modulator, anti-inflammatory and restorative properties.
This thesis covers the mRNA expression analysis of decidua and peripheral blood derived MSCs from preeclampsia and healthy pregnant women and is a preliminary study for the investigation of possible biomarkers. Within the scope of the thesis, gene expression analysis was studied by isolating MSC from a total of 13 samples taken from placental tissue and peripheral blood belonging to 6 pregnant women with preeclampsia that form the experimental group and 3 healthy pregnant women that form the control group. After the isolation and culture of MSCs reached sufficient density, cell sorting was made using the appropriate cell surface markers using the flow cytometry method. Total RNA isolation from MSCs and synthesized into cDNA. For gene expression analysis, "Insulin-Like Growth Factor 2" (IGF2), "Interleukin 16" (IL-16), "Netrin-4" (NTN4) and "Toll -Like Receptor 4" (TLR4) and for normalization "Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase" (GAPDH) were used. Gene expression analysis was performed by droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR). "Graphpad Prism Version 9.5.1" was used for the statistical results of the data. Evaluation of the results as significance was done with nonparametric "Mann Whitney Test". "Receiver Operating Characteristic" (ROC) analysis was performed for specificity and sensitivity.
As the result of analysis, NTN4 and TLR4 genes were not considered statistically significant, although there were fold changes in the mRNA expression level in both decidua and peripheral blood MSHs. 
This study is one of the first researches to evaluate the expression of IGF2, IL16, NTN4 and TLR4 genes to be associated with preeclampsia pathogenesis in terms of MSH changes. Failing to observe statistically significant findings requires verification with larger number of samples taken from pregnant women with the disease. Especially the increased expression of NTN4 and TLR4 genes suggests that they can play a role in the early diagnosis of preeclampsia.