Osteokondral hasarlar için peptit amfifil ve bor katkısı içeren gradyan özellikli biyomürekkep formülasyonlarının geliştirilmesi
Development of peptide amphiphiles and boron containing chitosan bioink formulations in gradient property for osteochondral defects
Yazar: SEMA COŞKUN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Osteokondral hasarların tedavisinde kullanılan mevcut yöntemler yetersiz kaldığından yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Bu amaç doğrultusunda, osteokondral dokunun hiyalin kıkırdak ile subkondral kemik arasında dereceli olarak değişen özellikleri dikkate alınarak doku mühendisliği yaklaşımlarıyla alternatif tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi üzerine çalışmalar devam etmektedir. Yapılan çalışmalar arasında üretimde standardizasyon, tekrarlanabilirlik, ölçeklendirme esnekliği ve hastanın kendi hücreleriyle önceden tanımlanmış boyut ve şekilde doku iskelesi üretimine izin veren özellikleri sebebiyle üç boyutlu (3B) biyoyazıcı teknolojisi öne çıkmaktadır. Sunulan doktora tezi kapsamında, gradyan özelliklere sahip osteokondral doku iskelelerinin üretilmesi amacıyla ekstrüzyon tabanlı 3B biyoyazıcıda kullanımı uygun yenilikçi kitosan biyomürekkep formülasyonları geliştirilmiştir. Bu formülasyonlarda kondrojenik farklılaşmayı indükleyecek peptit amfifil (PA) ve osteojenik farklılaşmayı indükleyecek bor katkılı hidroksiapatit (B-nHAp) kullanılmış, ön çalışmalar MC3T3-E1 kemik öncül hücreleri ve göbek kordonu mezenkimal kök hücreleri (MSC) ile yapılmıştır.

Tez çalışması kapsamında, kitosan biyomürekkep formülasyonunda kullanılacak olan 
B-nHAp ve PA'nın karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmaları sonucunda, kütlece %10 B-nHAp ve %2,5 PA içeren kitosan biyomürekkep formülasyonlarının uygun olduğuna karar verilmiştir. Biyomürekkep formülasyonları, 0,628-100 rad/s aralığında kayma incelmesi (shear thinning) davranışı göstermiş ve ~25°C'den sonra jelleşmeye başlamıştır. Kayma incelmesi davranışı, biyomürekkeplerin 3B biyoyazıcıda ekstrüde edilebilirliğinin bir göstergesidir.

Tez çalışması kapsamında Derece 4'teki osteokondral hasarlar amaçlanmış ve 5 mm kalınlığındaki gradyan doku iskelelerinin üretimi üzerine çalışılmıştır. Öncelikle 3B biyoyazıcının yazdırma kafalarına entegre edilebilen akış yönlendirici aparat tasarımı yapılmış, ardından uygun yazdırma parametrelerinin belirlenmesi amacıyla ön çalışmalar yapılmıştır. Ön çalışmaların sonucunda, uygun parametreler küt iğne uçlu 20G nozul, 60-70 kPa yazdırma basıncı ve 4 mm/s yazdırma hızı olarak bulunmuştur. Akış yönlendirici aparat kullanılarak, kütlece %26 Pluronic® F-127 destek çözeltisinin içine yazdırılan kütlece %10 B-nHAp ve %2,5 PA içeren kitosan biyomürekkepler ile gradyan doku iskeleleri desen geometrileri bozulmadan 3B biyoyazıcı ile rahatlıkla üretilebilmiştir. Üretilen gradyan doku iskelelerinin karakterizasyon çalışmaları yapılmış ve doku iskelelerinin katmanlarında kemik ve kıkırdak dokularına uygun farklı yapılar gözlenmiştir.

Tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlar i) kitosan tabanlı biyomürekkep geliştirilmesi ve ii) subkondral kemikten hiyalin kıkırdağa doğru bor katkılı nano hidroksiapatit-peptit amfifil gradyanı içeren osteokondral doku iskelelerinin üretimidir ve bu sonuçlar osteokondral dokuya özgü biyomürekkep çeşitliliği açısından literatüre katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Since the current methods for treating osteochondral damage are insufficient, there is a need to develop new treatment approaches. In this area, research is ongoing to develop alternative treatment methods using tissue engineering approaches, considering the gradient properties of osteochondral tissue that gradually vary between hyaline cartilage and subchondral bone. Among the studies carried out, three-dimensional (3D) bioprinting technology stands out due to its features such as standardization, repeatability, scalability, and the ability to produce tissue scaffolds in predefined sizes and shapes using the patient's own cells. This doctoral thesis focuses on developing innovative chitosan bioink formulations suitable for use in extrusion-based 3D bioprinting for the production of osteochondral tissue scaffolds with gradient properties. In these formulations, peptide amphiphile (PA) to induce chondrogenic differentiation and boron-doped hydroxyapatite (B-nHAp) to induce osteogenic differentiation were used, and preliminary studies were conducted with MC3T3-E1 pre-osteoblastic cells and umbilical cord mesenchymal stem cells (MSC). 

Within the scope of this thesis, characterization studies of B-nHAp and PA, which will be used in the chitosan bioink formulation, were conducted. As a result of the characterization studies, it was concluded that the chitosan bioink formulations containing 10% B-nHAp and 2.5% PA by weight were suitable. The bioink formulations exhibited shear thinning behavior in the range of 0.628-100 rad/s and began to gel at around 25°C. Shear thinning behavior is an indicator of the extrudability of bioinks in 3D bioprinting.

Within the scope of this thesis, osteochondral defects at Grade 4 were targeted, and the production of gradient tissue scaffolds with a thickness of 5 mm was studied. Initially, a flow directing apparatus design was created that can be integrated into the printheads of the 3D bioprinter, and then preliminary studies were conducted to determine the appropriate printing parameters. As a result of the preliminary studies, it was decided to use 20G blunt-end needle nozzle, 60-70 kPa printing pressure, and 4 mm/s printing speed in the experiments. Using the flow directing apparatus, gradient tissue scaffolds with intact pattern geometries were easily produced with a 3D bioprinter using chitosan bioinks containing 10% B-nHAp and 2.5% PA, which were printed into a support solution of 26% Pluronic® F-127 by weight. Characterization studies of the produced gradient tissue scaffolds were conducted, and different structures suitable for bone and cartilage tissues were observed in the layers of the scaffolds.

The results obtained within the scope of this thesis are i) the development of a chitosan-based bioink and ii) the production of osteochondral tissue scaffolds containing a boron-doped nano hydroxyapatite-peptide amphiphile gradient from subchondral bone to hyaline cartilage. These results will contribute to the literature in terms of expanding the variety of bioinks specific to osteochondral tissue.