Sıçanlarda siklofosfamid ile oluşturulan testis hasarında karnozinin etkisi
The effects of carnosine on cyclophosphamide inducedtesticular injury
Yazar: UMUT DEMİRDELEN
Danışman: PROF. DR. BEKİR UĞUR ERGÜR
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Claudin = Claudin ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Histoloji = Histology ; Karnozin = Carnosine ; Kaspazlar = Caspases ; Siklofosfamid = Cyclophosphamide ; Sıçanlar = Rats ; Testiküler hastalıklar = Testicular diseases ; Testis = Testis

Özet:
Amaç: Siklofosfamid romatoid artrit, sistemik lupus eritematozus, multiple sklerozis ve birçok kanser tedavisinde kullanılan bir ilaçtır. Karaciğerde metabolik aktivasyona girdikten sonra vücütta reaktif oksijen radikalleri oluşturan toksik metabolitler oluşturur. Bugüne kadar yapılan çalışmalarda siklofosfamidin testise sitotoksik hasar verdiği; testis ağırlığında azalma, oligospermi, spermatogonyalarda DNA sentezinde azalma yaptığı gösterilmiştir.     
Karnozin insanda kas ve sinir dokusunda sentezlenen, sindirim sisteminden kolayca emilebilen doğal bir antioksidan  dipeptiddir. Deneysel olarak siklofosfamide bağlı oluşturulan testis hasarı modelinde, karnozinin etkilerini içeren bir çalışma literatürde rastlanmamıştır. 
Bu çalışmada amaç, erkek sıçanlarda siklofosfamidin testis yapısında oluşturduğu hasarı incelemek ve bu hasarda karnozinin etkisini, ışık mikroskobik, immunohistokimyasal ve biyokimyasal olarak göstermektir.
Yöntem: Çalışmada Wistar Albino suşu 10-12 haftalık (200-250 gr) toplam 40 denek ile 6 grup oluşturuldu. Kontrol grubunda beş diğer deney gruplarında yedi denek kullanıldı. Deneyde kullanılan ilaçlar karnozin 250 mg/kg, siklofosfamid 150 mg/kg intraperitoneal (i.p) olarak uygulandı. Kontrol grubu; herhangi bir ilaç ve çözgen verilmeyen grup, siklofosfamid (CP) grubu; sadece tek doz siklofosfamid verilen grup, karnozin grubu (K); sadece karnozin verilen grup, (K+CP) grubu; deneklere önce tek doz karnozin, bir saat sonra siklofosfamid verilen grup, (K=CP) grubu; deneklere karnozin ve siklofosfamidin eş zamanlı verildiği grup (CP+K) grubu; deneklere önce siklofosfamid, bir saat sonra karnozin verilen grup. Son doz uygulamadan 48 saat sonra tüm grupların testis doku örnekleri alınarak fiksatife konuldu. Rutin histolojik takip yöntemlerinden sonra testis dokuları parafin bloklara gömüldü. Her bloktan beş µm kalınlığında kesitler alındı. Hematoksilen-eozin ile testis dokusunun morfolojisi, seminifer tübül çap ölçümü, Johnson skorlaması; PAS (Periyodik Asit Schiff) boyaması ile bazal membran kalınlık ölçümü; Masson Trikrom boyaması ile bağ dokusu incelendi. İmmunohistokimyasal olarak anti-klaudin5 ve aktif kaspaz-3 antikorları ile immunhistokimyasal boyamalar yapıldı.
Bulgular: Kontrol ve karnozin gruplarında normal testis histolojik yapısı gözlendi. Hematoksilen-eozin boyamada; siklofosfamid grubunda belirgin germinal epitel hasarı olduğu görüldü. Seminifer tübülün germinal epitelinin bazal membrandan ayrıldığı (bazal membran ondülasyonu) görüldü. Hem karnozin hem siklofosfamid kullanılan diğer üç grupta bazı seminifer tübüllerin arasındaki interstisyel alanda eritrosit görülmekle birlikte birçok seminifer tübülde spermatogenik seri hücrelerinin hasarsız, germinal epitelin düzenli olduğu ve dizilim bozukluğunun azaldığı gözlendi. Masson-Trikrom boyamada; siklofosfamid grubunda diğer gruplara göre intertübüler bağ dokusunda kollajen artışı izlendi. PAS boyamada; siklofosfamid grubunda diğer gruplara göre bazal membranda kalınlaşma saptandı. İmmunohistokimyasal olarak siklofosfamid grubunda diğer gruplara göre artmış aktif kaspaz-3 ve azalmış anti-klaudin5 immunreaktivitesi görüldü. 
Sonuç: Elde ettiğimiz bulgulara göre siklofosfamidin testiste oluşturduğu hasarda karnozinin koruyucu ve tedavi edici etkinliği bulunmaktadır.

Abstract:
Objective: Cyclophosphamide is a drug used in the treatment of rheumatoid arthritis, SLE, multiple sclerosis and many cancers. After the metabolic activation in the liver, it forms toxic metabolites that form reactive oxygen radicals in the body. Recent studies shows that cyclophosphamide has many cytotoxic effects on testis; such as decrease in testicular weight, oligospermia, decrease in DNA synthesis in spermatogonia.
	Carnosine is a natural antioxidant dipeptide synthesized in the human muscle and nervous tissue. It can easily absorbable from the digestive system. A study involving the effects of carnosine in experimental model of testis injury induced by cyclophosphamide has not been found in the literature.
	The aim of this study is to investigate the damage caused by the cyclophosphamide on the testis of male rats and to show the effect of carnosine by light microscopy, immunohistochemistry and biochemistry.
	Method: In the study, 40 Wistar Albino strains 10-12 weeks (200-250gr) were divided into six groups . We used five subjects in the control group and seven subjects in the other experimental groups. Drugs used in the experiment were carnosine 250 mg / kg, cyclophosphamide 150 mg / kg intraperitoneal (i.p.). Control group; any drug and solvent-free group, cyclophosphamide (CP) group; the group which is given only a single dose of cyclophosphamide, carnosine group (K); only carnosine given group, (K + CP) group; first single dose carnosine and one hour later cyclophosphamide were given, (K = CP) group; carnosine and cyclophosphamide were given at the same time, group (CP + K) group; first single dose cyclophosphamide and one hour later carnosine were given. Forty-eight hours after the last dose of all groups, testicular tissue specimens were taken and fixed. After routine histological follow-up, testicular tissues were embedded in paraffin blocks. Sections with a thickness of five μm were taken from each block. Morphology of testis tissue with hematoxylin-eosin, measurement of seminiferous tubule diameter, Johnsen scoring; basal membrane thickness measurement with PAS staining; the connective tissue was examined with Masson's Trichrome staining. Immunohistochemically, immunohistochemical staining with anti-claudin5 and active caspase-3 antibodies was performed.
Result: Normal testicular histologic structure was observed in control and carnosine group. Cyclophosphamide group showed significant germinal epithelial damage with the hematoxyline-eosin stain. The germinal epithelium of the seminiferous tubule detached from the basal membrane (basal membrane ondulation). Although there were erythrocytes in the interstitial space between some seminiferous tubules; it was observed that in many seminiferous tubules, spermatogenic series cells were undamaged, the germinal epithelium was regular and alignment disorder was decreased in the both carnosine and cyclophosphamide used three groups. There was an increase in collagen levels in the intertubular connective tissue in the cyclophosphamide group compared to the other groups with the Masson-trichrom stain. There was an increase in basal membrane thickness at the cyclophosphamide group when compared to the other groups with the PAS stain. Immunohistochemically, active caspase-3 and decreased anti-claudin5 immunoreactivity were observed in the cyclophosphamide group compared to the other groups.
	Conclusion: According to our findings, cyclophosphamide has protective and therapeutic effect of carnosine in testicular damage