Patojen Clostridium perfringens nöraminidaz enzimi monoklonal antikor ve tanı kiti geliştirme çalışmaları
Monoclonal antibody and diagnostic kit development studies for pathogen Clostridium perfringens neuraminidase enzyme
Yazar: YASİN KIZILYER
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ DİLARA AKÇORA YILDIZ
Burdur Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Blotting-western = Blotting-western ; Clostridium perfringens = Clostridium perfringens ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Hibridomalar = Hybridomas ; Nöraminidaz = Neuraminidases ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
Clostridium perfringens insan ve hayvanların enterik sisteminin doğal bir parçası olan, belirli koşullar altında hızla çoğalan ve çok sayıda toksin üreten önemli bir patojendir. Ortaya çıkacak olan patojenitenin tipi ve şiddeti, bakteri tarafından üretilen toksinlerle yakından ilişkilidir. Patolojilerinin hızlı seyretmesi, ciddi ekonomik kayıplara yol açması ve ölümle sonuçlanabilmesi ise etmenin hızlı tanısını önemli kılmaktadır. 
Nöraminidazlar, bütün C. perfringens suşları tarafından üretilen, hem bakteri metabolizmasında hem de virülansında işlev gören, patojeniteye elverişli koşullarda ise üretimi arttırılan bir toksin grubudur. Bu doktora tez çalışmasında, C. perfringens nöraminidazlarını tanıyabilecek monoklonal antikorların hibridoma tekniği kullanılarak geliştirilmeye çalışılması ve üretilebilecek antikorlar ile nöraminidaz aracılı C. perfringens tanısının incelenmesi amaçlanmıştır. Ayrıca, başarılı monoklonal antikor üretimi halinde, C. perfringens için ELISA tanı kiti prototiplerinin oluşturulması da hedeflenmiştir. 
Çalışmalar sonucunda 26 hibrit hücresi elde edilmiş, bunlardan seçilen prototip adaylarının antikorları ise, geniş ölçekte üretilmiş, saflaştırılmış ve tiplendirilmiştir. Bu antikorların kullanıldığı, sandviç ELISA tekniğine dayanan sahada C. perfringens tanısı denemeleri ve C. perfringens tanı kiti prototiplerinde ise başarı elde edilememiştir. Western blot tekniği kullanılarak yapılan ek incelemeler üretilen 1C7, 3C5 ve 5A9 monoklonal antikorlarının NanI'ya özgün olduğunu, çalışmalar sırasında kullanılan ticari nöraminidaz ürününün safsızlıklar taşıdığını ve bu safsızlıklara karşı da antikor yanıtı geliştiğini göstermiştir. Ek olarak, çalışmalar sırasında tesadüfen sığır serum albüminine yüksek afinite gösteren, IgM tipindeki 4F3 monoklonal antikoru da elde edilmiştir. Sonuçlar, çok yönlü doğrulama yapmanın antikor geliştirme çalışmaları için önemini de ortaya koymaktadır.

Abstract:
Clostridium perfringens is an important pathogen that is a natural part of the enteric system of humans and animals, which can divide rapidly and produces a large array of toxins under permissive conditions. The type and severity of its emerging pathogenicity are closely related to these toxins produced by the bacteria. The rapid progression of their pathologies, which may cause serious economic loss and mortality makes rapid diagnosis of C. perfringens crucial.
Neuraminidases are a group of toxins produced by all C. perfringens strains, involved in both bacterial metabolism and virulence, and whose production in pathogenic conditions increases. The aim of this doctoral thesis is to try to develop monoclonal antibodies, through hybridoma technique, that can recognize C. perfringens neuraminidases, and to examine the neuraminidase-mediated diagnosis of C. perfringens with these antibodies. In addition, in case of successful production of monoclonal antibodies, it is aimed to create ELISA diagnostic kit prototypes for C. perfringens.
As a result of this study, 26 hybrid cells were obtained, of which prototype candidates were selected, antibodies produced in large-scale, purified, and isotyped. However, attempts to diagnose C. perfringens from diseased-animal specimens using these antibodies, and production of a C. perfringens diagnostic kit prototype based on sandwich ELISA technique have not been successful. Further investigations using western blot showed that the 1C7, 3C5 and 5A9 monoclonal antibodies obtained were specific to NanI, the commercial neuraminidase product used during the studies contained impurities and antibody responses developed against these impurities. In addition, an IgM type monoclonal antibody, 4F3, with high affinity for bovine serum albumin was incidentally obtained. These results also demonstrate the importance of multi-faceted validations for antibody development studies.