Tetrahymena thermophila'da nöroprotektif potansiyeli olan bir insan proteininin rekombinant üretimi
Tetrahymena thermophila'da nöroprotektif potansiyeli olan bir insan proteininin rekombinant üretimi
Yazar: YELİZ DÜNDAR
Danışman: DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
Eskişehir Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Merkez sinir sistemi hastalıkları = Central nervous system diseases

Özet:
Moleküler biyoteknoloji çağının başlamasıyla birlikte rekombinant DNA yöntemleri ile geliştirilen organizmal platformlarda terapötik ilaçların üretiminde artış gözlenmiştir. Bu tez kapsamında alternatif protein üretim konakçısı ökaryotik tek hücreli, silli Tetrahymena thermophila'da insan terapötik proteinlerinden nöroprotektif etki potansiyeli olan bir rekombinant proteinin üretimi amaçlanmıştır. Glikozile bir protein olan bu proteinin birincil görevi hematokrit (alyuvar üretimini arttırıcı) etki olsa da özellikle glikozil çatallarındaki sialik asit kalıntılarının uzaklaştırılması ile ikincil görevi olan koruyucu-yenileyici etkisi (sinir, kalp ve böbrek dokularında) ortaya çıkmaktadır. Bu tez çalışması ile Tetrahymena thermophila'da O-glikozilasyon, sialik asit, galaktoz ve fukoz içermeyen iki çatallı N-glikozilasyonlu özgün yapıda bir rekombinant protein üretiminin organizma biyolojisi ile gerçekleşebileceği hipotezlenmiştir. TtAC2.1 vektöründeki HSP70.2 promotörünün ısı şoku ile indüklenmesiyle, Tetrahymena thermophila hücrelerinde proteinin glikozile formda hücre dışına salgılatılarak üretilebildiği sırasıyla; Ni-NTA afinitik saflaştırma, PNGase F enzimiyle N-glikozilasyon çatalı kesimi ve Western blot analizleri ile gösterilmiştir. Hücre koruyucu-yenileyici etkisi tanımlanabilmesi durumunda üretilen proteinin sinir sistemi hastalıklarının (ALS, parkinson, alzheimer vb.) tedavisinde terapötik ajan olarak kullanımı hedeflenmektedir.

Abstract:
The production of therapeutic drugs has been accelerated drastically in the organismal platforms developed by recombinant DNA methodswith the beginning of the molecular biotechnology era. In this thesis, a human protein with neuroprotective potential, which is one of the human therapeutic proteins, is aimed to be produced in an alternative protein production host, eukaryotic unicellular ciliate Tetrahymena thermophila. Although the hematocrit effect (increasing red blood cell production) of this glycosylated protein is considered as the main function, it also shows protective-regenerative effect on the nerve, heart, and kidney tissues, especially with the lack of sialic acid residues in the glycan structure. It was hyphothesised that the production of the novel recombinant protein in Tetrehymena thermophila consisted of a bi-positional N-glycosylation structure without sialic acid, galactose and fucose residues depending on the organism's biology in this thesis. Ni-NTA affinity purification, cleavage of N-glycoside bond by PNGase F enzyme, and Western blot analyzes shown that the protein could be produced by Tetrahymena thermophila cells and secreted externally in glycosylated form by means of the heat shock induction of the HSP70.2 promoter in the TtAC2.1 vector. If its cell-protective-regenerative effect can be defined undoubtedly, Tt-EPO can be used as a therapeutic agent in the treatment of nervous system related diseases (e.g. ALS, Parkinson's, Alzheimer's).