Kolajen/beta-trikalsiyum fosfat bazlı sentetik kemik greftlerinin geliştirilmesi
Development of collagen/ beta-tricalcium phosphate based synthetic bone grafts
Yazar: BURCU SARIKAYA
Danışman: DOÇ. DR. HALİL MURAT AYDIN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Dünya'da milyonlarca insan trafik kazası, spor yaralanması, günlük yaralanma veya genetik hastalıklar yüzünden kemik yaralanması tedavilerine ihtiyaç duymaktadır. Oluşan travmalar uygun implantlar ile fikse edilirken doğal/sentetik kemik greftleri ile de desteklenmektedir. Tez çalışmasının amacı biyouyumlu, biyobozunur, gözenekliliği yüksek ve kemik oluşumunu artıracak sentetik kemik greftlerinin hazırlanmasıdır. Çalışmada oluşturulması hedeflenen doku iskelelerinin kanla ıslandığında esneyebilme, hemostatik olma, hücre ya da büyüme faktörü ile desteklenebilme, osteokondüktif ve osteoindüktif olma gibi önemli özelliklere sahip olması hedeflenmiştir. Bu amaç ve hedefler doğrultusunda tezin ilk aşamasında öncelikle sığır kaynaklı kolajen tip-I ve beta trikalsiyum fosfat (β-TCP) karışımı oluşturulmuş ve dondurulduktan sonra liyofilizasyon ile gözenekli yapılar oluşturulmuştur. Hazırlanan yapılar vakum altında ve 100°C üzerinde sıcaklıkta dehidrotermal (DHT) yöntem kullanılarak değişik sürelerde çapraz bağlanmış ve örneklerin bir kısmı gama radyasyonu ile steril edilmiştir. 
Tezin ikinci aşamasında nihai formuna kavuşan doku iskelelerinin karakterizasyon testleri tamamlanmıştır. Seramik fazın belirlenmesi için X-ray difraksiyonu (XRD), oluşturulan doku iskelesindeki fonksiyonel grupların tespit edilmesi için Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR), termal davranışların karakterize edilmesi amacıyla da diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) analizleri yapılmıştır. Hazırlanan kolajen/β-TCP doku iskelelerinin aynı zamanda üç nokta eğme ve basma analizleri yapılarak, mekanik davranışları belirlenmiştir. Mekanik analiz sonuçlarına göre doku iskelelerinin basma mukavemeti oldukça fazla olup, kemik dokusuna oldukça yakın olduğu tespit edilmiştir. Gözenekli doku iskeleleri taramalı elektron mikroskop (SEM) ve mikro-bilgisayarlı tomografi (µ-CT) ile görüntülenmişlerdir. Analiz sonucunda doku iskelelerinin %65 gözeneklilik ve gözeneklerin birbiriyle ilişkili olduğu belirlenmiştir. Malzemenin su alım kapasitesi de ölçülerek şişme davranışı irdelenmiştir. 
Mekanik, termal ve kimyasal olarak karakterizasyonu yapılan doku iskelelerinin in vitro ortamda hücre kültürü analizleri ile biyolojik olarak da karakterizasyonu yapılmış ve kolajen/β-TCP doku iskelelerine MG63 insan osteosarkoma hücre hattı ekilmiştir. Hücre ekimi sonrasında doku iskelelerinin sitotoksisite ve dağılma davranışları gözlemlenmiştir. Hücre kültürü sonuçlarında doku iskeleleri herhangi bir sitotoksik etki göstermemiştir. Hayvan çalışmalarında BMP-2 ve TGF-β1 büyüme faktörü kullanıldığından dolayı, çalışma öncesi doku iskelelerinden büyüme faktörlerinin salım kinetiklerine bakmak amacıyla, model protein olan serum albümin doku iskelelerine yüklenmiş ve bir haftalık salımı incelenmiştir. 
Tez çalışmasının son aşamasında ise hazırlanan kolajen/β-TCP doku iskeleleri 120 adet Sprague Dawley cinsi sıçana implante edilmiş ve sıçanların kranyum ve femur kemiklerinde iki farklı defekt modeli oluşturulmuştur. Kontrol, doku iskelesi, doku iskelesi+BMP-2, doku iskelesi+TGF-β1, doku iskelesi+BMP-2+ TGF-β1 ve otogreft grupları oluşturulmuştur. Kranyum defekti oluşturulan hayvanlar 4 ay, femur defekti oluşturulanlar ise 6 ay sonra sakrifiye edilmiştir. Spesimenler saklanarak µ-CT analizi ile kemik rejenerasyon oranları bulunmuş ve en iyi gelişme otogreft uygulamasında görülmüştür. Doku iskelesi grubu ile büyüme faktörü içeren gruplar arasında anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir.

Abstract:
Millions of patients worldwide need bone injury treatments due to traffic accidents, sports injuries, daily injuries or genetic diseases. While originating traumas are fixated with appropriate implants, they are also supported by natural and synthetic bone grafts. The aim of this thesis is to prepare synthetic bone grafts that have high porosity and are also biocompatible and biodegradable which will improve bone growth. It was intended in this study for the prepared tissue scaffolds to become osteoconductive and osteoinductive, that can be supported with cells or growth factors, that are able to bend and twist when wetted with blood, and that are also hemostatic. According to these aims, in the first stage of the thesis, firstly, bovine collagen type-I and beta tricalcium phosphate (β-TCP) mixture was prepared and porous structures were obtained via freeze drying. The structures prepared were cross-linked by dehydrothermal method above temperatures over 100°C for varying periods of time, and some of the samples were sterilised via gamma radiation.
In the second stage of the thesis, characterisation of the scaffolds that have assumed their final form were completed. X-Ray Diffraction (XRD) was used to determine the ceramic phase, while Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) was used to determine the functional groups in the prepared tissue scaffold, and to characterise thermal behaviour, differential scanning calorimetry (DSC) analysis was performed. Mechanical behaviour of the prepared collagen/β-TCP scaffolds was determined via three point bending and compression analyses. According to mechanical analysis results, strength values of the scaffolds were found to be significantly high and were close to that of bone tissue. Morphology was observed by using scanning electron microscopy (SEM) and micro-computed tomography (µ-CT). With the results of these analyses, it was found that the scaffolds have over 65% porosity and that these pores are interconnected. Swelling capacity of the material was also investigated.
In order to investigate in vitro performance of the collagen/β-TCP scaffolds, a MG63 human osteosarcoma cell line was seeded onto constructs. The scaffolds were tested for cytotoxicity and degradation/disintegration behaviour. Cell culture results have indicated that scaffolds have not shown any cytotoxic effects. To investigate the release kinetics of the growth factors, model protein of serum albumin was loaded into the scaffolds and its release was observed for a week before the study.
In the last stage of the thesis, prepared collagen/β-TCP scaffolds were implanted into 120 Sprague Dawley rats and two types of defect models were created in the cranium and femur of these animals. Six groups were formed, which were: control, scaffold, scaffold+BMP-2, scaffold+TGF- β1, scaffold+BMP-2+TGF- β1 and autograft. Animals with cranium defects and femur defects were sacrificed after, 4 months and 6 months, respectively. Specimens were preserved and bone regeneration ratios were determined with  µ-CT analysis, and the the highest bone formation was observed in autograft group with no significant difference between bare and growth factor containin groups.