Ege bölgesindeki çeşitli sıcak su kaynaklarından thermus genusu bakterilerin izolasyonu, moleküler yöntemlerle identifikasyonu ve ß-galaktosidaz aktivitesinin saptanması
Isolation and identification of the genus thermus from various hot springs in aegean region by molecular biology methods and determination of ß-galactosidase activity
Yazar: NERMİN SARIGÜL
Danışman: PROF. DR. RENGİN ELTEM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Thermus genusu termofilik bakteriler arasında en iyi bilinengenuslardan biridir. T. aquaticus'dan üretilen termostabil DNA polimerazenzimi PCR teknolojisinin ve rekombinant DNA çalımalarınıngerçekletirilmesini salamıtır. Bu nedenle Thermus genusu bakterilerin EgeBölgesinden izolasyonu sadece biyolojik çeitlilik verisinin salanmasıyönünden deil aynı zamanda bu bakterilerin enzimlerinin biyoteknolojikpotansiyelleri nedeniyle de önemlidir.Ege Bölgesi'ndeki sıcaklıkları 55-95 0C ve pH deerleri 6,0-9,5arasında deien 6 ildeki 11 sıcak su kaynaının (9 tanesi kaplıca, 2 tanesijeotermal enerji tesisi) toplam 32 örnekleme noktasından biyofilm ve sukarıımını içeren örnekler toplanmıtır. Ön zenginletirme ileminden sonratoplam 69 bakteri suu izole edilmitir. Gram's boyama, endospor boyama,niastanın hidrolizi, katalaz, üreaz, sitokrom oksidaz, nutrient brothdabüyüme ve peptidoglikan analizi gibi çeitli biyokimyasal test veboyamalarla 40 potansiyel Thermus izolatı seçilmitir.VITanımlama, genetik olarak akrabalık ve biyo-çeitlilik çalımaları içinpotansiyel Thermus izolatlarının 16S rDNA sekansları kullanılmıtır. 16SrDNA amplifikasyonu 8F ve 1492R universal primerleri kullanılarakyapılmıtır. 4 sekanslama primeri seçilmitir; 8F, 1492R, 515F ve 1115R vesekans reaksiyonları Orta Dou Teknik Universitesi Merkez Laboratuvarınayaptırılmıtır ve ham sekans çıktıları eposta aracılıı ile tarafımızagönderilmitir.Her bir izolat için gönderilen 4 adet kısmi 16S rDNA ham sekansverileri Bioedit Sequence Alignment Editor programı ile tek bir sekans dizisihaline getirilmitir. Gen Bankası nukleotid blast ilemi ile en yakın türlerbelirlenmitir. Tüm izolatların sekans benzerlii ise ClustalW1.8 multiplesekans alignment programı kullanılarak gerçekletirilmitir. Mega 3.1programı ile neighboor joining methoda göre filogenetik dendogramoluturulmutur. Oluturulan aacın güvenilirlii bootstrap 500, 1000 ve2000 ile deerlendirilmitir.22 Thermus oshimaii, 9 Thermus scotoductus, 5 Thermusantranikianus, 3 Thermus thermophilus ve 1 Thermus sp. Ege TB 34 suutanımlanmıtır.Termofilik mikroorganizmalardan salanan termostabil -galaktosidaz enzimi, mezofilik olanlar ile kıyaslandıında düük laktozlu sütürünlerinin üretiminde oldukça avantajlıdır. 60 0C'de veya daha yükseksıcaklık derecelerinde aktif olan termostabil enzimler yüksek sıcaklıklardapastörizasyon ilemi yapılırken aynı zamanda laktoz oranınındadüürülmesine olanak salamaktadır. Endüstriyel önemi nedeni iletanımlanan Thermus sularının -galaktosidaz aktiviteleri incelenmitir.Termostabil -galaktosidaz üretiminin indükleme ve sonlandırmazamanları her Thermus suu için büyüme erisinin ve kilenme sürelerininçıkarılması ile belirlenmitir. kilenme süreleri T. oshimai için 50-164 dakika,VIIortalama 81 dakika; T. scotoductus için 59-116 dakika, ortalama 78 dakika;T. thermophilus için 46-68 dakika, ortalama 54 dakika, T. antranikianus için51-86 dakika, ortalama 68 dakika; Thermus sp. Ege TB 34 için 138 dakikaolarak hesaplanmıtır.Tüm Thermus sularında -galaktosidaz enzim aktivitesibelirlenmitir. 70 0C'de en yüksek ve en düük enzim aktiviteleri Thermusoshimai Ege TB 2 ve Thermus oshimai Ege TB 9 sularında sırasıyla 81082Unit/g kuru hücre, 1128 Unit/g kuru hücre eklinde belirlenmitir.Anahtar Kelimeler: Thermus spp., 16S rDNA, filogeni, biyoçeitlilik, -galaktosidaz

Abstract:
The Thermus is one of the most known genus in thermophilic bacteria. ThermostabilDNA polymerases from Thermus aquaticus made PCR feasible and induced a powerfulltechnology that complemented recombinant DNA studies. Isolation and identification of oneof the most important thermophilic bacteria Thermus is not only important for enrichment ofdata on biodiversity of Ege Region but also for their enzymes biotechnological potential.Samples of biofilm and water mixture for Thermus isolation were taken at 32 samplingpoint with temperature ranging from about 55-95 0C and pH ranging from 6.0-9.5 in 11sampling area (9 hot springs and 2 geothermal power plants runoff water) in 6 province, EgeRegion. After enrichment and isolation studies 69 bacterial strains were isolated from all ofthe samples. After some biochemical tests and stains such as Gram?s stain, endospor stain,starch hydrolysis, catalase, urease, cytochrome oxydase, growth on Nutrient Broth andpeptidoglycan analysis, 40 potential Thermus strains were selected.16S rDNA sequences were used for identification and determination of geneticrelationships and diversity of potential Thermus isolates. Amplification of 16S rDNA wascarried out with universal eubacteria primers 8F and 1492 R. Four sequencing primers wereselected; 8F, 1492 R, 515F and 1115 R and 16S rDNA sequencing reactions were carried outby METU Central Laboratory and than raw sequence data were sent by email to us.Partial 16S rDNA raw sequence data were imported into the BioEdit SequenceAlignment Editor and a contiguous consensus sequence generated. Using blastn againstGenBank database, the nearest relatives of these consensus sequence were identified. Themultiple sequence alignments tool in ClustalW 1.8 was used to analyse sequence similarity.The phylogenetic dendogram constructed using the neighboor joining method as implementedin Mega 3.1. Confidence in the tree topology was determined by using 500, 1000 and 2000bootstrapped trees.22 Thermus oshimai, 9 Thermus scotoductus, 5 Thermus antranikianus, 3 Thermusthermophilus and 1 Thermus sp. Ege TB 34 strain were identified out of 40 Thermus strains.Thermostable -galactosidase from thermophiles have significant advantages in theproduction of low lactose dairy products, compared to mesophilic enzymes. The thermostableenzymes, active at or above 60 0C, should enable the hydrolysis process to be conductedduring milk pasteurization at high temperatures. Because of its industrial importance,thermostable -galactosidase activities of Thermus species were detected.For determination of induction and termination time for thermostable -galactosidaseproduction the growth rate and generation time were detected for each Thermus isolates. Therange of doubling times 50-164 minutes, average 81 minutes, for T. oshimai; 59-116 minutes,average 78 minutes, for T. scotoductus; 46-68 minutes, average 54 minutes, for T.thermophilus; 51-86 minutes, average 68 minutes, for T. antranikianus; and 138 minutes forThermus sp. Ege TB 34 were calculated.-galactosidase enzyme activity were detected in all Thermus strains. The highest andthe lowest enzyme activities of two strains, Thermus oshimai Ege TB 2, Thermus oshimai EgeTB 9 were determinated respectively; 81082 Unit/g dried cell, 1128 Unit/g dried cell at 70 0C.Keywords: Thermus spp., 16S rDNA, Phylogeny, Biodiversity, -galactosidase