Nöral krest hücreleri ile birlikte kültüre edilen pankreas organoidlerinde innervasyonun belirlenmesi
Determination of innervation in pancreas organids co-cultured with neural crest cells
Yazar: HÜSEYİN ERDİNÇ BEŞİKCİOĞLU
Danışman: PROF. DR. CANDAN ÖZOĞUL
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Nöral krest hücreleri = Neural crest cells ; Nöropatiler = Neuropathies ; Organoidler = Organoids ; Pankreas = Pancreas ; Pankreas hastalıkları = Pancreatic diseases ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms

Özet:
Pankreas sempatik ve parasempatik sinir lifleri tarafından yoğun olarak innerve edilen bir organ olmasına karşın pankreas organoidleri yalnızca epitelyal hücre türevlerinden oluşmaktadır. Pankreas kanserinde, nöronlar ile nöral olmayan pankreas hücreleri arasında nöral plastisite ile karakterize çift yönlü bir ilişki mevcuttur. Bu tez çalışmasında ilk olarak "inerve pankreas organoidleri" oluşturmak ve bu organoidlerde pankreatik nöropatiyi incelemek amaçlanmıştır. Bu amaçla, normal C57BL/6 ve Kras+/LSLG12D Trp53fl/fl p48+/Cre (KPC) farelerden pankreas organoidleri izole edildi ve bu organoidler ayrı ayrı, insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücreleri (UPKH) farklandırarak elde edilen nöral krest hücreleriyle (NKH) ve C57BL/6 yenidoğan farelerden izole edilen dorsal kök gangliyonuyla (DKG) birlikte kültüre edildi. Brilikte kültürün yaklaşık 3. gününden itibaren, pankreas organoidleriyle birlikte kültüre edilen NKH'lerin nöronal morfoloji sergilediği ve pankreas organoidleriyle birlikte kültüre edilen DKG'ların nöronal uzantılarının ortaya çıkmaya başladığı görüldü. Birlikte kültürler 7. gün sonlandırılarak örnekler Anti-E-cadherin, Anti-β3-Tubulin ve Anti-GFAP antikorları ile wholemoun IF yöntemle işaretlenerek ve konfokal mikroskopi ile görüntülendi. Her iki birlikte kültür modelinde de β3-Tubulin pozitif nöronların gelişerek uzantılarının E-cadherin pozitif organoidlere doğru yöneldiği ve kısmen etkileşime girdiği görüldü. Geliştirilen innerve pankreas organoidleri pankreatik nöropati açısından incelendiğinde, KPC pankreas organoidlerinin hem NKH hem de DKG birlikte kültürü neticesinde oluşan innerve organoid modellerinde nöral plastisiteyi artırdığı belirlendi. Bu çalışmada literatürde ilk kez NKH'den türetilen nöronların veya DKG kökenli olgun nöronların pankreas organoidlerinin innervasyonuna yol açabileceği ve pankreas kanseri mikroçevresinde nöron-ekzokrin hücre etkileşiminin modülasyonu ile sonuçlanabileceği gösterildi.

Abstract:
Although, the pancreas is an organ intensely innervated by sympathetic and parasympathetic nerve fibers, pancreatic organoids consist only of epithelial cell derivatives. In pancreatic cancer, there is a bidirectional relationship between neurons and non-neural pancreatic cells characterized by neural plasticity. In this thesis, it was first aimed to create "innervated pancreatic organoids" and to examine pancreatic neuropathy in these organoids. For this purpose, pancreatic organoids were isolated from normal C57BL/6 and Kras+/LSLG12D Trp53fl/fl p48+/Cre (KPC) mice, and these organoids were respctively co-cultured with human induced pluripotent stem cells (hiPSC) derived neural crest cells (NCCs) and dorsal root ganglion (DRG) isolated from C57BL/6 neonatal mice. It was observed that NCCs co-cultured with pancreatic organoids exhibited neuronal morphology and neuronal extensions of DRGs co-cultured with pancreatic organoids began to emerge on the 3rd day of co-culturing. The co-cultures were terminated on the 7th day and the samples were labeled with Anti-E-cadherin, Anti-β3-Tubulin and Anti-GFAP antibodies with the wholemount IF method and visualized by confocal microscopy. In both co-culture models, it was observed that β3-Tubulin positive neurons developed and their extensions directed towards E-cadherin positive organoids and partially interacted. When the developed innervated pancreatic organoids were examined in terms of pancreatic neuropathy, it was determined that KPC pancreatic organoids increased neural plasticity in innervated organoid models formed as a result of both NCCs and DRG co-culture. In this study, it was shown for the first time in the literature that neurons derived from NCCs or mature neurons from DRG can lead to innervation of pancreatic organoids and result in modulation of neuro-exocrine cell interaction in the pancreatic cancer microenvironment.