Kalıtsal  metabolik hastalıklarda otofaji, oksidatif stres ve inflamasyon ilişkisi
The relationship between autophagy, oxidative stress and inflammation in inherited metabolic diseases
Yazar: EDA ÖZAYDIN
Danışman: PROF. DR. ALİ DURSUN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Pediatrik Temel Bilimler Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases

Özet:
Kalıtsal metabolik hastalıklarda, hastaların klinik izlemi sırasında epilepsi, katarakt, hepatik yetmezlik, kronik böbrek hastalığı gibi komplikasyonlar gelişebilir. Bu çalışmanın amacı bu komplikasyonların gelişmesinde otofajik disfonksiyon, inflamasyon ve oksidatif stresin rolünü araştırmaktır.  Klasik galaktozemi, akça ağaç şurubu hastalığı (MSUD), herediter tirozinemi tip 1, lizinürik protein intoleransı (LPI) tanılı 48 hasta ve 10 sağlıklı çocuk çalışmaya dahil edildi. Hasta ve sağlıklı kontrol gruplarında otofaji (Beclin 1, LC3B-II, p62) ve inflamazom (NLRP3, ASC, Kaspaz 1, NF-Ƙβ) yolağında yer alan gen ve protein ekspresyonlarının analizi, oksidatif stres biyobelirteçlerinin (total tiyol, nativ tiyol, disülfit, tiyol/disülfit denge, total antioksidan kapasite ve total oksidatif stres) ve sitokin düzeylerinin ölçümü, lenfosit alt grupları ve lenfosit aktivasyon belirteçleriyle immun fenotiplendirme, hedefsiz metabolomik analizle metabolomik profilleme çalışmaları gerçekleştirildi. En yüksek total tiyol, nativ tiyol, TAS ve TOS değerleri MSUD grubunda gözlendi. En yüksek disülfit ve en düşük TAS değerleri LPİ grubunda saptandı. Hasta ve kontrol grupları arasında sitokin düzeyleri belirgin farklılık göstermedi. Bütün gruplarda NLRP3/p62 gen ekspresyonları yükselmişti. En yüksek kat değişimleri galaktozemi ve LPI gruplarında gözlendi. Otofaji disfonksiyonu tüm gruplarda mevcuttu. p62, molekülü, antioksidan, otofaji ve inflamasyon yolaklarını birbirine bağlayan önemli bir oyuncu olarak görünmektedir. Çalışmamızda NLRP3 gen ekspresyonları, katarakt geliştiren galaktozemi, akciğer tutulumu olan LPI grubunda ve hepatik fibrozis geliştiren tirozinemi hastalarında daha yüksek bulundu. İmmün fonksiyonlar açısından yapılan incelemede T ve B lenfositlerle, DNT, NKT, CD3HLADR, klasik ve klasik olmayan monosit düzeyleri açısından hasta gruplarında göre istatistiksel olarak belirgin farklılık gözlendi. Yolak analizlerinin PLS-DA istatistik yöntemi ile değerlendirilmesinde hasta gruplarında sağlıklı kontrol gruplara göre belirgin farklılaşmış metabolitler tespit edildi.  Özellikle steroid biyosentezi, lipid, pürin-pirimidin metabolizması, enerji metabolizması gibi genel metabolik yolaklarda yer alan metabolitlerin hasta grubunda normal gruba göre değişkenlik gösterdiği saptandı. LPI hastalarının metabolomik profillemesi kronik inflamatuvar hastalıklarda etkilenen yolaklara benzerlik göstermekteydi. Çalışmamız intoksikasyon tip kalıtsal metabolik hastalıklarda, aynı anda inflamazom ve otofaji gen ve protein ekspresyonlarını, oksidatif stres, otofaji ve inflamasyon ilişkisini, immun fonksiyonları ve metabolomik profillemeyi araştıran ilk çalışmadır. Çalışmanın sonuçları metabolik hastalıkların patogenezinde otofajik disfonksiyon oksidatif stres, inflamasyon ve immun disregülasyonun önemli rol oynayabileceğini gösterdi. 

Anahtar Kelimeler: İnflamazom, otofaji, oksidatif stres, hedefsiz metabolomik analiz, kalıtsal metabolik hastalıklar

Abstract:
The complications such as epilepsy, cataract, hepatic failure, chronic renal disease may develop during the clinical follow-up of the patients with inherited metabolic diseases. The aim of this study is to investigate the role of autophagic dysfunction, inflammation and oxidative stress in the development of these complications. Forty-eight patients with the diagnosis of classic galactosemia, maple syrup urine disease, hereditary tyrosinemia type 1, lysinuric protein intolerance and ten healthy children  were included in the study. Laboratory investigations  were performed such as analysis of autophagy ( Beclin 1, LC3B-II, p62) and inflammasome (NLRP3, ASC, Caspase 1, NF-Ƙβ) gene and protein expressions, measurement of oxidative stress biomarkers  (total thiol, native thiol, disulphid, thiol/disulphide homeostasis, total antioxidant capacity and total oxidative stress), cytokine levels, immune phenotyping with lymphocyte subgroup and lymphocyte activation markers, metabolomic analysis with untargeted metabolomic profiling in the patient and healthy control group. The highest levels of total thiol, native thiol, TOS and TAS were observed in MSUD group. The highest disulphide, the lowest TAC levels were detected in LPI groups. The cytokine levels showed no significant difference between patient and control group. In all groups, NLRP3/p62 gene expressions increased. The highest fold changes were observed in the patients of galactosemia and LPI groups.   Autophagy dysfunction was detected in all groups. NLRP3/p62 gene expressions were positively correlated. p62 seems to be a key player  which links the antioxidant (Nrf2),  autophagy and inflammation pathways in the patient groups. NLRP3 gene expressions were found to be higher with specific clinical phenotypes such as cataract in galactosemia patients,  lung involvement in LPI group or hepatic fibrosis in tyrosinemi patients.  Significant statistical differences were observed with respect to T and B lymphocyte, DNT, NKT, CD3HLADR, classic and non-classic monocyte  levels  in the patient groups. PLS-DA analysis revealed statistically significant different metabolites in the patient group compared with healthy control group. The metabolites enriched in general metabolic pathways such as steroid hormone and aminoacid biosynthesis,  lipid, purine-pyrimidine metabolism, energy metabolism were principally detected by metabolomic analysis in the patient group. The metabolomic profiling of LPI patients were resembling with the pathways affected in chronic inflammatory diseases. This is the first study which investigates the  inflammasome and autophagy gene and protein expressions, the relationship between oxidative stress, autophagy and inflammation, immun functions and metabolomic profiling simultaneously in intoxication type inherited metabolic diseases. The results of the study revealed that autophagic dysfunction, oxidative stress, inflammation, immun dysregulation might play an important role under the pathogenesis of metabolic diseases. 

Key words: Inflammasome, autophagy, oxidative stress, untargeted metabolomic profiling, inherited metabolic diseases