Fibrozisli fare akciğerlerinde tirozin kinaz inhibitörlerinin miyofibroblast aktivasyonu üzerine etkileri: Terapötik yaklaşım
The effects of tyrosine kinase inhibitors on myofibroblast activation in mice lung with fibrosis: Therapeutic approach
Yazar: ÖZNUR YILMAZ
Danışman: DOÇ. DR. FÜSÜN ÖZTAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Zooloji = Zoology

Özet:
Pulmoner fibrozis (PF), fibroblast ve miyofibroblast sayısında artış ve ekstrasellular matriks elemanlarının aşırı birikimi ile karakterize edilir. Klinikte bu hastalığın tedavisinde kesin etkili terapötik ajan henüz bulunamamıştır. Sitokin ve büyüme faktörleri, tirozin kinaz reseptörleri aracılığıyla miyofibroblast çoğalmasını ve aşırı ekstrasellular matriks üretimini uyararak pulmoner fibrozise neden olur. Tirozin kinaz inhibitörü olan dasatinib anti-anjiyogenik ve anti-proliferatif özellikleri nedeni ile kanser tedavilerinde kullanılır. Hasarlı akciğerde anjiyogenik ve proliferatif ajanların salınımının pulmoner fibrozisi uyardığı bilinir. Çalışmamızda bleomisin ile pulmoner fibrozisi uyarılan farelerde dasatinibin miyofibroblast aktivasyonu ve kollajen üretimi üzerindeki etkileri ve bu etkilerin PI3K/Akt ve MAPK/ERK sinyal yolakları ile ilişkisi ilk kez araştırıldı. 
Çalışmada ergin farelerden 4 deney grubu oluşturuldu: Deneyin ilk günü tek doz intratrakeal bleomisin uygulaması (0,08 mg/kg) ile fibrozis oluşturulan ve deneyin 21. gününde kesilen fareler (I) ve kontrolleri (II), fibrozis oluşturulduktan sonra deneyin 14. gününden itibaren bir hafta süresince dasatinib verilip (8 mg/kg) deneyin 21. gününde kesilen fareler (III) ve kontrolleri (IV). Akciğerlerde mikroskobik yöntemlerle fibrozis derecesi, fibroblast çoğalması ve miyofibroblast farklılaşması tespit edildi. Ayrıca akciğer homojenatlarında Western emdirimi ile kollajen-I, PTEN (10. kromozomda delesyona uğrayan fosfataz ve tensin homoloğu), Abelson kinaz (c-Abl) ile PI3K/Akt ve MAPK/ERK sinyal yolaklarında görevli olan moleküllerin sentez analizleri yapıldı.
Bleomisin uygulamaları akciğer genelinde yaygın fibrotik odaklar (ortalama fibrozis derecesi: 5), bu odaklarda fibroblast sayısında ve alfa-düz kas aktin sentezinde ve akciğer genelinde kollajen-I, aktive olan platelet kökenli büyüme faktörü reseptör-alfa (PDGFR-α), ERK, Akt ve c-Abl proteinlerinin sentezlerinde  artışa neden olurken, PTEN sentezini azalttı. Dasatinib uygulamaları bleomisin verilen fare akciğerlerindeki bu mikroskobik ve biyokimyasal değişikliklerin gerilemesini ve PTEN (MAPK/ERK ve PI3K/Akt sinyal yolaklarının inhibitör proteini) sentezinin artmasını sağlayarak, akciğerde fibrotik odakların azalmasına ve fibrozis derecesinin 5'ten 3'e gerilemesine neden oldu. Buna göre dasatinib, pulmoner fibrozisde, PDGFR-α ve sitoplazmik c-Abl inhibisyonu, PTEN protein sentezinin ise uyarılması yollarıyla, MAPK/ERK ve PI3K/Akt sinyal yolaklarının fibroblast çoğalması, fibroblast/miyofibroblast farklılaşması ve kollajen-I sentezi üzerindeki etkilerini sınırlar. Böylece bu çalışma, dasatinibin pulmoner fibrozisin geriletilmesinde yaygın anti-fibrotik etkiye sahip yeni bir tirozin kinaz inhibitörü olarak kullanılabilmesinin önünü açmaktadır.

Abstract:
Pulmonary fibrosis (PF) is characterized by an increase in number of fibroblasts/myofibroblasts and excessive accumulation of extracellular matrix components. The precise effective therapeutic agent for this disease has not been discovered yet. Cytokines and growth factors lead to PF, by inducing the proliferation of fibroblasts/myofibroblasts and excessive synthesis of extracellular matrix via tyrosine kinase receptors. Dasatinib, tyrosine kinase inhibitor, is used in cancer treatments due to its anti-angiogenic and anti-proliferative properties. It is known that the release of angiogenic and proliferative agents from injured lung have resulted in PF. In this study, the effects of dasatinib on the myofibroblast activation and the synthesis of collagen-I, as well as  mutual relationship  between these effects and PI3K/Akt and/or MAPK/ERK signalling pathways in mice with bleomycin- induced PF were investigated for the first time.
In the study, PF was induced by intratracheal bleomycin (0.08 mg/kg) instillation into mice lung. Adult mice were divided 4 groups: mice dissected on  the 21st days after the first bleomycin injection (I) and their  controls  (II), mice treated with dasatinib (8 mg/kg) for one week following 14 days after the first bleomycin injection and dissected on the 21st days of experiment (III) and their controls (IV).  Fibrosis score, fibroblast proliferation and myofibroblast differentiation in the lung were determined using microscopic techniques, while the expression of collagen-I, PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on the 10th chromosome), Abelson kinase (c-Abl) and molecules which play a role in PI3K/Akt ve MAPK/ERK signaling pathways were analyzed by Western blotting.
Bleomycin treatments resulted in the formation of numerous fibrotic areas (avarage fibrosis score: 5), increase in the fibroblast proliferation and alpha-smooth muscle actin expressions in these areas, bleomycin-induced expressions of collagen-I,  phospho-platelet derivated growth factor receptor-alpha (PDGFR-α), -ERK, -Akt and –c-Abl proteins in the fibrotic lung, whereas it downregulated the PTEN expressions in mice lung. Dasatinib treatments significantly attenuated these microscopic and biochemical alterations and upregulation of PTEN (inhibitor protein of PI3K/Akt and MAPK/ERK signalling pathways)  expressions in mice lung with bleomycin-induced fibrosis. Thus fibrotic areas decreased and  the fibrosis score decreased from 5 to 3. Dasatinib treatments limited  the effects of PI3K/Akt and MAPK/ERK signaling pathways on fibroblast proliferation, fibroblast/myofibroblast differentiation and collagen-I synthesis, via the PDGFR-α and cytoplasmic c-Abl inhibition and the overexpression of PTEN protein in PF. The current study showed that dasatinib can be used as a novel tyrosine kinase inhibitor with anti-fibrotic effects for  the regression of PF.