Denizkestanesi (Paracentrotus lividus)'un gamet yüzeylerinde sialik asit tiplerinin belirlenmesi ve döllenmedeki rolünün deneysel olarak araştırılması
Determination of the types and investigation of the role of sialic acid in the gamete surface of the sea urchin (Paracentrotus lividus) using experimental method
Yazar: BATUHAN YEŞİLYURT
Danışman: DOÇ. DR. REMZİYE DEVECİ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Deniz Bilimleri = Marine Science
Dizin: Deniz kestanesi = Sea urchins ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Lektinler = Lectins ; Siyalik asitler = Sialic acids ; Sperm = Spermatozoa ; Yumurta bırakma = Spawning

Özet:
Hücresel tanıma olaylarında rol oynayan en önemli moleküllerin başında, bir uç şeker olan dokuz karbonlu modifiye şeker sialik asit (Sia) gelmektedir. Karbohidrat temelli döllenme mekanizması alanında bir çok çalışma yapılmasına karşın, Sia'nın döllenmedeki rolü konusunda hala aydınlanmamış kısımlar vardır. Bu nedenle çalışmanın amacı; farklı tiplerdeki sialik asitlerin döllenmedeki rolünün anlaşılması için, denizkestanesinin (Paracentrotus lividus) yumurta ve sperm yüzeylerinde ayrı ayrı belirlenecek sialik asit tiplerinden hangisi/hangilerinin döllenmede rol aldığının deneysel olarak gösterilmesidir.
Çalışma materyali, denizkestanesi P.lividus'un ergin bireylerinden alınan yumurta ve sperm hücreleridir. Denizkestanelerinin vücut boşluğuna enjekte edilen KCl ile yumurta ve spermler elde edilmiştir. Yumurta yüzeyinde bulunan jel kılıf, asidik yöntem ile izole edilmiştir. Floresan mikroskobu ile gamet yüzeyindeki Sia'ları ve bağlanma özelliklerini belirlemek için FITC işaretli LPA, LFA, MAA, SNA, PSL, ve CCA lektinler kullanılmıştır. İzole jel kılıf örneklerindeki sialik asit tiplerinin Cap-LC-ESI-MS/MS sistemi ile analizi için örnekler hidroliz, reasetilasyon ve türevlendirme işlemlerinden sonra cihaza verilmiştir. Yumurta yüzeyindeki Sia'ların döllenmedeki önemini belirlemek için yumurtaların bulunduğu ortama tüm Sia'lara özgü LPA lektin çözeltisi verildikten sonra normal spermlerle bir araya getirilmiştir. Sperm yüzeyindeki Sia'ların döllenmedeki rolünü belirlemek için yumurtalar iki farklı tipte Sia (Neu5Ac ve Neu5Gc) ile yüzleştirildikten sonra işlem görmemiş normal spermlerle bir araya getirilmiştir. Sperm örneklerinde Sia belirlenmesi için uygulanan FITC işaretli lektinlerden en yoğun ışıma, Neu5Ac ve Neu5Gc Sia'larına özgü olan LFA ve Neu5Ac ye özgü olan LPA lektinlerinde gözlenmiştir. α2-3 bağına özgü MAA ve Neu5Ac α2-6 Gal, α1-4 GlcNAc bağ ve yapısına özgü PSL lektin ışımaları LFA ve LPA lektin ışımalarından daha zayıf, 9-O asetil-4-O asetil bağ ve yapılarına özgü CCA ve α2-6 bağına özgü SNA lektinlerin floresan ışımalarından daha yüksektir. İzole yumurta jel kılıfında Sia belirlenmesi için uygulanan FITC işaretli lektinlerden en yoğun ışıma, sperme benzer şekilde LFA ve LPA lektinlerinde gözlenmiştir. α2-6 bağına özgü SNA ve 9-O asetil-4-O asetil bağ ve yapılarına özgü CCA lektin ışımaları birbiriye hemen hemen aynı olup, LFA ve LPA lektin ışımalarından daha düşüktür. α2-3 bağına özgü MAA lektin ışıması tüm diğer lektin ışımalarından düşük olup, Neu5Ac α2-6 Gal, α1-4 GlcNAc bağ ve yapısına özgü PSL lektin ışıması gözlenmemiştir. İzole jel kılıfta CapLC-ESI-MS/MS sistemi ile analizi sonucu Neu5Gc, Neu5Ac, Neu5Gc7Ac, Neu5Gc8Ac, Neu5Gc9Ac, Neu5,7Ac2, Neu5,8Ac2, Neu5,9Ac2, Neu5Gc8,9Ac2, Neu5Gc7,9Ac2, Neu5AcS, Neu5GcS olmak üzere 12 tip Sia belirlenmiştir. Yumurta yüzeyindeki Sia'ların döllenmedeki rolünü araştırmak için yapılan deney sonucunda döllenme oranı %9,6 olarak hesaplanmıştır. Kontrol grubunda bu oran %99'dur. Sperm yüzeyindeki Sia'ların ve tiplerinin döllenmedeki rolü için yapılan deney sonucunda kontrol gruplarıyla deney grupları arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır. Bu sonuç, Neu5Ac ve Neu5Gc'nin esansiyel olarak döllenme mekanizmasını kontrol etmediğini, diğer sialik asit çeşitlerinin de döllenmede spesifikliği sağlıyor olabileceğini işaret edebilir. 
Denizkestanesi gamet yüzeylerinde döllenmede rol oynayan sialik asit tiplerinin ve bağ özelliklerinin belirlenmesi, henüz tam olarak çözülmemiş karbohidrat temelli sperm yumurta ilişkisinin anlaşılması açısından önemlidir.

Anahtar Kelimeler: Yumurta, Sperm, Sialik Asit, CapLC-ESI-MS/MS, FITC işaretli lektin, Denizkestanesi Paracentrotus lividus

Abstract:
Sialic acid is a terminal sugar of carbohydrate chains that participates in numerous biological events. Recent studies have explored the mechanism of carbohydrate-mediated fertilisation to understand the biochemistry of fertilisation. However, the type and quantity of sialic acid and the role of sialic acid during fertilisation remain unknown. Hence, the aim of this study is to determine the types and quantities of sialic acid in the gamete surface sea urchin, Paracentrotus lividus and investigation of in which type of them essential during fertilisation.
The study materials are sperms and eggs obtained from adult sea urchin P. lividus. The gamets obtained via KCl injection to body cavity of sea urchins. We isolated egg jelly by using acidic method. In order to determine the Sia profile via the fluorescence method, the sperms and eggs are incubated with FITC conjugated LPA, LFA, MAA, SNA, PSL and CCA lectins. Then samples were photographed with a fluoresence microscope. In order to determine the types and quantities of Sia in the egg jelly coat, via using Cap-LC-ESI-MS/MS the samples underwnet hydrolyzation, reacetylation and derivatization steps followed by their flow throuh the device. In order to define the role of Sia on the egg jelly, we blocked the Sia of egg jelly coat with LPA lectins, and then we tested the egg's ability of fertilization with untreated sperms. In order to define the role of Sia on the surface of sperm, we treated eggs with two different Sia solutions (Neu5Ac and Neu5Gc) and tested their ability of fertilization with untreated sperms. Fluorescence analysis, which was performed in order to determine the Sia's on the sperm surface, came out with highest intensity emission signals obtained from FITC conjugated lectins LFA and LPA which specific to all types of Sia. The α2-3 bond specific MAA and Neu5Ac α2-6 Gal, α1-4 GlcNAc specific PSL lectins have a lower emision signals In comparison to the emission obtained from the LFA and LPA. The lowest emission signals obtained from, 9-O acetyl-4-O acetyl specific CCA and α2-6 bond specific SNA. in order to determine the Sia's on the egg jelly coat , came out with highest intensity emission signals obtained from FITC conjugated lectins LFA and LPA which specific to all types of Sia. The α2-6 bond specific SNA and 9-O acetyl-4-O acetyl specific CCA lectins have a lower emision signals In comparison to the emission obtained from the LFA and LPA. The lowest emission signals obtained from α2-3 bond specific MAA. There were no emission signals abtained Neu5Ac α2-6 Gal, α1-4 GlcNAc specific PSL. As a result of the Cap-LC-ESI-MS/MS analysis of egg jelly coat twelve different types of Sialic acid; Neu5Gc, Neu5Ac, Neu5Gc7Ac, Neu5Gc8Ac, Neu5Gc9Ac, Neu5,7Ac2, Neu5,8Ac2, Neu5,9Ac2, Neu5Gc8,9Ac2, Neu5Gc7,9Ac2, Neu5AcS, Neu5GcS were detected. As a result of the experiment which aimed to investigate the role of Sia on the egg jelly coat, the inhibiton with LPA lectins was successful about % 91,4. As a result of the experiment which aimed to investigate the role of Sia on the sperm surface, The inhibiton with two Sia solutions was not successful. The results highlights the importance of not only major types of Sia but also minor types of Sias might be ssential in fertilization process.
Although echinoderm fertilisation has been studied extensively, our understanding of the mechanisms of carbohydrate-mediated fertilisation, and the role of sialic acid remains incomplete. The types and quantities of sialic acid that we detected in the egg jelly coat will aid in the discovery of new sialic acid-specific receptors on the sperm membrane. 

Keywords: Egg, Sperm, Sialic Acid, CapLC-ESI-MS/MS, FITC conjugated lectin, Sea urchin Paracentrotus lividus