Escherichia coli'de aska klon koleksiyonu ve fonksiyonel genomik yaklaşımıyla propolisin antibakteriyel etkisine karşı direnç sağlayan genlerin araştırılması
Investiagation of genes conferring resistance to the antibacterial effect of propolis in Escherichia coli using aska clone collection and functional genomic approach
Yazar: TELLI MAHMUDOVA
Danışman: DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Genomik yaklaşım ve genom boyu plazmid kütüphaneleri, son yıllarda binlerce genin hızlıca taranarak, antimikrobiyal hedeflerin bulunmasında ve onaylanmasında kullanılmaktadır. Bilindiği gibi günümüzde patojen bakterilerin antibiyotiklere karşı direnç kazanması sonucu, yeni ilaç adayı moleküller için bilimsel arayış devam etmektedir. Zararlı bakterileri veya diğer hastalık kaynağı hücreleri öldürebilecek veya gelişmesini inhibe edebilecek sentetik ve doğal bileşiklerin keşfedilip onaylanması yanında, bu bileşiklerin hücresel hedeflerinin ve etki mekanizmalarının araştırılması gerekmektedir. 
Laboratuvarımız bünyesinde bulunan Escherichia coli ASKA genom boyu plazmid kütüphanesi koleksiyonu (ASKA klon koleksiyonu), rekombinant plazmidlere klonlanmış 4123 farklı geni içeren 4123 suştan oluşmaktadır ve bu koleksiyon, literatürde bazı antimikrobiyal bileşiklerin hücresel hedeflerini ve aynı zamanda hücresel cevap sürecinde görev olabilecek genleri tespit etmede kullanılmıştır. ASKA klon koleksiyonu genomik çalışmalarda kullanılan eşsiz ve güçlü bir deneysel kaynaktır. 
Bu tez projesinde, bölgemizde de çok bulunan doğal ürün propolisin su ekstraktının antibakteriyel hedefleri ve hücresel cevapta rol alabilecek aday genleri araştırılmıştır. Propolis, arılar tarafından üretilen ve bitki kaynaklı bileşiklerden oluşan doğal ve reçineli bir karışımdır. Propolis ekstraktlarının antimikrobiyal ve antikanser etkileri bilinmektedir. Ancak propolisin hücrede hangi gen veya ilgili ürünleri ve süreçleri hedeflediği bilinmemektedir. Aynı zamanda hücrenin propolise maruz bırakıldığında hangi genlerin kullanıldığına dair veriler yetersizdir. 
Bu tez çalışmasında, 4123 adet klonlanan geni içeren "ASKA klon havuzu" ile, artan propolis konsantrasyonlarda seleksiyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Rekombinant plazmidlerde (pCA24N::genX), klonlanan genler T5 promotoru ve lac operatörü tarafından transkripsiyonel kontrol altındadır ve gen ekspresyonu IPTG kullanılması ile kontrol edilebilmektedir. ASKA klon havuzundaki 4123 suş yetiştirilerek, artan konsantrasyonlarda propolis su eksktraktı içeren gradient besi yerine ekilmiştir. Propolis konsantrasyonu arttırıldıkça, belli konsantrasyonlarda tüm bakteri suşları ölmüş, ancak bazı suşlar ölmemiş ve yaşayabilmiştir. 28 adet göreceli olarak yüksek tolerans seviyesine sahip suş belirlenmiştir. Bu suşların içindeki rekombinant plazmidlerde bulunan genler, propolisin antibakteriyel etkisine karşı doğrudan veya dolaylı yolla direnç sağlayan genler olarak değerlendirilmiş ve onaylama çalışmaları yapılmıştır. Onaylama çalışmalarında kontrol suşuna göre, göreceli olarak daha yüksek konsantrasyonda üreme gösteren 7 adet koloni seçilmiştir. Seçilen kolonilerden plazmid izolasyonu yapılmış ve restriksiyon enzimle kesim işlemi uygulanmıştır. Kesim sonucu seçilen tolerant kolonilerin insert büyüklükleri belirlenmiştir. Hedef genlerin dizilerini belirlemek için Sanger sekans analizi yapılmış ve biyoinformatik analizler sonucu aaeR, cmtB, prpE gen bilgilerine ulaşılmıştır. Bulunan genlerin propolise karşı antimikrobiyal direnci sağlamasının nedenini araştırmak için, suşlarla biyofilm çalışmaları yapılmasına karar verilmiş ve biyofilm oluşturma kapasiteleri değerlendirilmiştir. Ayrıca, Escherichia coli yabanıl tip bakteri suşunda propolis ekstraktının belirlenen genlerin ekspresyonu üzerindeki etkisini belirlemek için, Real-Time PCR analizleri ile propolis stresine bağlı mRNA seviyelerine bakılmıştır. Bu tez çalışması, fonksiyonel genomik, moleküler mikrobiyoloji ve moleküler genetik disiplinlerinin bazı deneysel yaklaşımlarını kullanan özgün, kapsamlı bir çalışma olarak sonuçlandırılmış ve alanında yeni bilimsel veriler üretmiştir.

Anahtar kelimeler: Propolis, ASKA, Escherichia coli, hedef gen, antibakteriyel

Abstract:
The genomic approach and genome-wide plasmid libraries have been utilized in recent years to relatively rapidly screen thousands of genes in order to find and validate antimicrobial targets. As known, the need for scientific search for new drug candidate molecules still continues as a result of emerging resistance of pathogenic bacteria to current antibiotics. In addition to the discovery and approval of synthetic and natural compounds that can kill or inhibit the growth of harmful bacteria or other disease-causing cells, the cellular targets and mechanisms of action of these compounds need to be investigated. 
Escherichia coli ASKA genome-wide plasmid library collection (ASKA clone collection) consists of 4123 strains containing 4123 different genes cloned into recombinant plasmids, and this collection has been used in the literature to determine cellular targets of some antimicrobial compounds as well as genes that may be involved in the cellular response. The ASKA clone collection is a unique and powerful experimental resource for genomic studies. 
In this thesis, the antibacterial targets of the water extract of the natural product propolis, which is also abundant in our region, and the candidate genes that may play a role in the cellular response were investigated. Propolis is a natural resinous mixture of plant-derived compounds produced by bees. Antimicrobial and anticancer effects of propolis extracts are known. However, it is not known which genes or related products and processes propolis targets in the cell. At the same time, data on which genes are used when the cell is exposed to propolis are insufficient. 
In this thesis, the "ASKA clone pool" containing 4123 cloned genes was used in selection studies where increasing concentrations of propolis water extract was used. Cloned genes in the recombinant plasmids (pCA24N::genX) are under transcriptional control by the T5 promoter and lac operator, and levels of gene expression can be controlled using varying concentrations of IPTG. A number of 4123 strains in the ASKA clone pool were grown and inoculated on a gradient petri having LB medium with increasing concentrations of propolis water extract. As the concentration of propolis was increased, all bacterial strains died at certain concentrations, but some strains survived and grew. A number 28 strains with relatively high tolerance levels against propolis were obtained. The genes present in the recombinant plasmids in these strains were evaluated as genes providing direct or indirect resistance to the antibacterial effect of propolis and validation studies were carried out. In the following studies, 7 colonies were selected that showed a relatively better growth under higher concentrations compared to the control strain. Plasmid isolation was performed from the strains and restriction enzyme digestion was applied to the recombinant plasmids. The insert sizes of the plasmids within the tolerant colonies were determined. Sanger sequence analysis was performed to determine the sequences of target genes, and the information of aaeR, cmtB, prpE genes was obtained as a result of bioinformatics analyzes. Biofilm formations of the selected strains based on the gene information were evaluated. In order to determine the effect of propolis on target gene expression in wild-type bacterial strains with these genes, Real-Time PCR analyzes were carried out and mRNA levels related to propolis stress were examined. This thesis has been an original and relatively comprehensive study that used some of the experimental approaches from the disciplines of functional genomics, molecular microbiology and molecular genetics and produced novel scientific results to the field.

Keywords: Propolis, ASKA, Escherichia coli, target gene, antibacterial