RNA işleme ve dönüşümünde IF5A translasyon faktörünün rolünün karakterizasyonu
Characterization of the role of the translation IF5a factor in RNA processing and turnover
Yazar: YEŞİM ÖZAY
Danışman: DOÇ. DR. SAVAŞ İZZETOĞLU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Translasyondaki önemi bilinen Ökaryotik başlangıç faktörü eIF5A, Archaea'da homoloğu olan aIF5A ve bakterilerde EF-P, uzama aşamasında tekrarlayan prolin sekanslarına geldiğinde duraklayan ribozomların kurtarılması ve translasyonun devam etmesi işlevini üstlenirler. Bu işlevlerini yerine getirebilmeleri için translasyon sonrası Hipuzinasyon adında bir modifikasyonla fonksiyonel hale gelmeleri gerekir. Aday onkogen olarak belirlenen eIF5A'nın yüksek ifadesi, çeşitli kanser tipinde olumsuz prognostik etkiler göstermesi kanser biyobelirteçleri olarak bu protein faktörlere önem kazandırmıştır. Evrimsel olarak korunmuş bu önemli rollerinin yanı sıra RNA metabolizmasında rollerinin olduğu önerilmiştir.
Bu çalışmada Crenaarchaeal model organizma olan Sulfolobus solfataricus'tan izole ettiğimiz Arkeal translasyon faktörü aIF5A'nın karakterizasyonu, RNA metabolizmasında rol oynayıp oynamadığı ve aIF5A'nın önerilen RNA bağlanma ile RNA yıkımı görevleri için translasyonda olduğu gibi modifikasyona ihtiyaç duyup duymadığının belirlenmesi amaçlanmıştır.
Bu amaç doğrultusunda aIF5A genini içeren plasmid pETM11, Escherichia coli Rosetta suşu kompetent hücrelerinde rekombinant  Sulfolobus solfataricus translasyon faktörü aIF5A ifade edilip daha sonra Afinite Kromatografisi ile saflaştırılmıştır. 
S.solfataricus genomik DNA'sı kalıp olarak kullanılarak cDNA dizileri hedef  RNA moleküllerine spesifik primerler dizayn edilerek Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile çoğaltılmış ve cDNA dizilerinin İn Vitro Transkripsiyon ile hedef RNA moleküllerine çevirimi yapılmış. Rekombinant proteinler ile RNA'lar arasında çeşitli İn Vitro deneyler gerçekleştirilmiş ve daha sonra rekombinant protein ve RNA'lar ile  Dinamik Işık Saçılımı (Dynamic light Scattering-DLS) deneyleri gerçekleştirilmiş solüsyon içerisindeki davranışları çeşitli sıcaklık değişimlerine tabi tutularak analiz edilmiştir. 
In vitro Degredasyon Assay deneyleri sonucunda  translasyon faktörü aIF5A proteininin hipuzin modifikasyonu olmaksızın mRNA bağlanma ve yıkım kapasitesine sahip olduğu , kodlanmayan RNA'ları ise yıkımdan koruduğu verileri elde edilmiştir. DLS deneylerinde aIF5A solüsyon içerisinde sıcaklık arttırıldıkça kümelenmeye başladığı gözlemlenmiş fakat kodlanmayan RNA ile birlikte yapılan ölçümlerde kümelenmenin azaldığı bulgusu elde edilmiştir.
Elde edilen bu bulgular aIF5A faktörünün RNA bağlanma ve yıkım aktivitelerine sahip olduğunu ve bunun için herhangi bir modifikasyona ihtiyaç duymadığını kanıtlamaktadır. Arkeal faktörün daha iyi anlaşılmasını sağlayan bu çalışma ökaryotik proteinin de anlaşılmasına katkı sağlayarak, ökaryotik protein eIF5A'nın gelecekte kanserde erken tanı ve tedaviye yönelik hedef moleküller olarak kullanılabilmesinin yolunu açmaktadır.

Abstract:
Eukaryotic initiation factor eIF5A, which is known to be important in translation. eIF5A with it's homolog aIF5A in Archaea and EF-P in Bacteria. These factors are translation elongation factors which perform the essential task to rescue ribosomes from stalling during the synthesis of proteins bearing particular sequences such as polyproline stretches. Indispensable for this action is the characteristic and unique post-translation modification: hypusination.
High expression of eIF5A which is determined as a candidate oncogene, and it's negative prognostic effects in various cancer types have given importance to these protein factors as cancer biomarkers. In addition to this evolutionary conserved roles, it has been suggested to have function in RNA metabolism.
In this study, it was aimed to characterize the Archaeal translation factor aIF5A, isolated from Crenaarchaeal model organism Sulfolobus solfataricus to analyse its function in RNA metabolism. And whether aIF5A needs modification or not for this suggested function like it has in translation elongation.
In accordance with this aim, plasmid pETM11 containing  aIF5A gene was expressed in Escherichia coli Rosetta strain competent cells and purified by Affinity Chromatography method. Using S.solfataricus genomic DNA as template, spesific primers were designed for target RNA molecules and cDNA sequences amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR). The cDNA sequences were translated into target RNA molecules by In Vıtro Transcription. In Vitro Degradation Assay experiments were performed between recombinant protein aIF5A and RNAs. Dynamic Light scattering (DLS) experiments were performed with recombinant protein aIF5A and RNAs subjecting them various temperatures and analyse their behiviour in solution.
As a conclusion of In Vitro Degradation Assay experiments, according to the data have been obtained that translation factor aIF5A has the capacity of binding ve degrading mRNA molecules while it has binding and protection activity on ncRNAs without needing hypusine modification. In DLS experiments it was observed that aIF5A when its in the solution, it has clustering behaviour. When together with RNA molecule in the solution, a decrease in aggregation has been observed.
These findings clearly shows that factor aIF5A has RNA-binding and RNA-degrading activities and does not need any modification for this function. This study provides better understanding of archaeal factor as well as it contributes to understand the eukaryotic factor eIF5A to be used as a target molecules for early diagnosis and treatment of cancer in future studies.