Yeşil kahvenin A549 ve SPC-212 kanser hücreleri üzerindeki biyolojik etkileri
The biological efeccets of the green coffea on the A549 and the SPC-212 cancer cells
Yazar: TÜLİN KORKMAZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. EMEL ERGENE
Bilecik Şeyh Edebali Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kanserin önlenmesi ve tedavisi için araştırılan etken maddelerin sentetik kimyasallardan ziyade organik bileşenler olması tercih edilmektedir. Bu çalışmada, daha önce farklı yönlerden biyolojik aktiviteleri incelenmiş olan yeşil kahvenin ekstresi ve fraksiyonlarının A549 ve SPC-212 hücreleri üzerinde apoptotik etkileri araştırılmıştır. 
Yeşil kahve ekstre ve fraksiyonlarının sitotoksik etkileri MTT ve Nötral red boya alımı testleriyle belirlenmiş, hücre morfolojisindeki değişimler ise AO/EB çift boyama yöntemiyle floresan mikroskopta incelenmiş ve apoptotoik indeks hesaplanmıştır. Hücre zarında meydana gelen değişim ise Anneksin V/FITC-PI boyaması yapılarak flow sitometride incelenmiştir. Kaspaz enzim aktivasyonu ise kaspaz-3,-8,-9 kolorimetrik kit kullanılarak elizada ölçülmiştür.
A549 hücre hattındaki IC50 değerleri; metanol ekstresinde 3 mg/ml, N-butanol, etil asetat ve sulu fraksiyonlarda, sırasıyla, 1, 0.45 ve 2.75 mg/ml ve demlenmiş yeşil kahvede ise 10 mg/ml dozlarında tespit edilmiştir. SPC-212 hücre hattında ise metanol ekstresinde 0.60 mg/ml, N-butanol, etil asetat ve sulu fraksiyonlarda yine sırasıyla, 0.30, 0.28 ve 0.80 mg/ml ve demlenmiş yeşil kahvede ise 5 mg/ml IC50 değerleri olarak belirlenmiştir. Morfolojik görüntülere göre belirlenen apoptotoik indeksler ise, etil asetat fraksiyonda, SPC-212'de % 25.20 ve A549'de, % 34.53'dir. Demlemede ise SPC-212'de % 19.40 ve A549'da % 36'dır. Anneksin V/FITC-PI boyaması sonucuna göree ise, A549 hücresinde etil asetat fraksiyonu ve demlemede sırasıyla % 28.7 ve % 32.4 oranında apoptotik hücre gözlemlenmiştir. SPC-212 hücrelerinde ise etil asetat fraksiyonunda %24.7, demlemede %31.2 oranında apoptotik hücrede gözlenmiştir. Kaspaz-8'in her iki hücrede de yaklaşık 1.5 katlık artışı dikkat çekmektedir. 
Yeşil kahvenin ekstre ve 3 fraksiyonunun, A549 ve SPC-212 hücrelerinin proliferasyonunda azalmaya ve apoptoza sebep olduğu gözlenmiştir. Her iki hücre hattında da etil asetat fraksiyonunun ve demlenmiş yeşil kahvenin apoptoza etkisinin, diğerlerine göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. İki hücre hattını karşılaştırdığımızda; SPC-212 hücrelerinin A549 hücrelerine göre sitotoksik ve apoptotic etkiler bakımından daha hassas olduğu görülmüştür.  

Anahtar Kelimeler: Sitotoksite, A549, SPC 212, Yeşil Kahve.

Abstract:
It is preferred that the active ingredients investigated for prevention and treatment of cancer should be organic components rather than being synthetic chemicals.  In this study, apoptotic effects of biological activities of green coffee extracts and fractions, previously examined in different aspects, on A549 and SPC-212 cells were investigated. 
The cytotoxic effects of green coffee extracts and fractions were determined by means of MTT and neutral red dye uptake test and the changes in cell morphology were examined in a fluorescent microscope by using Dual AO/EB staining method and apoptotic index was calculated. The changes occurring in the cell membrane were examined in flow cytometry by doing Annexin V/FITC-PI staining. The activation of the caspase enzyme was measured in Eliza by using caspase-3-8-9 colorimetric kit.
IC50 values in A549 cell line were determined as 3 mg/ml in methanol extract; 1, 0.45 and 2.75 mg/ml doses in N-butanol, ethyl acetate and aqueous fractions respectively and 10 mg/ml doses in brewed green coffee. IC50 values in SPC-212 cell line were determined as 0.60 mg/ml in methanol extract; 0.30, 0.28 and 0.80 mg/ml in N-butanol, ethyl acetate and aqueous fractions, respectively and 5 mg/ml IC50 in brewed green coffee. The apoptotic indexes determined according to the morphological images in the ethyl acetate fraction were 25.20 % in SPC-212 and 34.53% in A549. In brewed one, for SPC-212 it was 19.40 % and for A549 it was 36 %. According to the results of Annexin V / FITC-PI staining, in the ethyl acetate fraction and brewing of A549 cells, apoptotic cells were observed in rate of 28.7% and 32.4%, respectively. In SPC-212 cells, apoptotic cells were observed in the rate of 24.7 % in ethyl acetate and 31.2 % in brewing. It is noteworthy that there were approximately 1.5-fold increases in both cells of Caspase-8. 
It was observed that extract and 3 fractions of green coffee caused reduction and apoptosis in proliferation of A549 and SPC-212 cells. It was determined that in both cell lines, the effect of acetate fraction and brewed green coffee to apoptosis was higher than the others. When comparing the two cell lines, it was found that SPC-212 cells were more sensitive than A549 cells in terms of cytotoxic and apoptotic effects.  

Keywords: Cytotoxicity, A549, SPC 212, Green Tea.