Akut lenfoblastik lösemi ve kronik lenfositik lösemi hücre serilerinde kemoterapötik ajan "rituximab" kullanımının jak-stat ve nf-κb sinyal yolakları üzerindeki etkilerinin belirlenmesi
Determination of the effects of rituximab treatment on jak-stat and nf-κb signaling pathways in acute lymphoblastic leukemia and chronic lymphocytic leukemia cell lines
Yazar: AYŞEGÜL DALMIZRAK
Danışman: DOÇ. DR. BUKET KOSOVA CAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Lösemi-lenfositik-kronik-B hücreli = Leukemia-lymphocytic-chronic-B-Cell ; Lösemi-miyeloid-akut = Leukemia-myeloid-acute ; Nükleer faktör-kappa B = Nuclear factor-kappa B

Özet:
Kronik lenfositik lösemi (KLL) daha çok yetişkinlerde ve akut lenfoblastik lösemi (ALL) de çoğunlukla çocuklarda görülen önemli iki lösemi tipidir. Her iki hastalığın gelişiminde JAK-STAT ve NF-κB gibi sinyal yolaklarındaki düzensizliklerin etkili olabileceği bilinmektedir. Günümüzde lösemi tedavisi ağırlıklı olarak kemoterapi ile sağlanmaktadır. Ancak, son yıllarda tedavi rejimlerine monoklonal antikorların eklenmesi ile yeni tedavi seçenekleri oluşturulabilmiştir. Şimerik bir anti-CD20 antikoru olan Rituximab kanser tedavisinde kullanılmak üzere lisans alan ilk monoklonal antikordur ve günümüzde B-KLL gibi B-hücre malignite tedavilerinde kullanılmaktadır. Ancak, B-ALL hastalığının tedavisinde henüz aktif olarak kullanılmaya başlanılmamıştır. Çalışmadaki amacımız, Rituximab' ın özellikle çocukluk çağı B-ALL' deki etkisini; aynı zamanda, JAK-STAT ve NF-κB sinyal yolakları üzerinden B-ALL ve B-KLL' deki etki mekanizmalarını araştırmaktı.	Çalışmamızda, Rituximab' ın KLL' ye model oluşturan EHEB ve ALL' ye model oluşturan TANOUE hücre serilerindeki sitotoksik etkisi MTT testi ile, apoptotik etkisi de Annexin V metodu ile değerlendirilmiştir. Ayrıca, Rituximab' ın ilgili hücre serilerindeki STAT3 ve RelA ile hedef genlerinin mRNA ekspresyonlarına etkisi kantitatif RT-PCR ile rölatif olarak belirlenmiştir.  Rituximab ile muamele sonrası STAT3 ve RelA protein ekspresyonlarındaki değişimler ise Western Blot' un ardından alkalen fosfataz yöntemiyle kromojenik olarak saptanmıştır. 
Rituximab' ın EHEB ve TANOUE hücre serileri üzerinde sitotoksik bir etkisi olmadığı belirlenmiş ve kompleman aracılı sitotoksisitenin de sadece EHEB hücre serisinde oluştuğu saptanmıştır. Bununla birlikte, Rituximab' ın her iki hücre serisinde apoptotik bir etkisinin bulunmadığı da görülmüştür.  Rituximab ile muamele sonrasında her iki hücre serisinde STAT3 ve RelA' nın değişik saatlerde mRNA ve protein ekspresyon düzeylerinde bir azalmaya neden olduğu saptanmıştır. STAT3 gen ekspresyonunun EHEB hücre serisinde 6. saatte 4.2, TANOUE hücre serisinde de 3. saatte 2.7- kat azaldığı belirlenmiştir (p = 0.00). RelA gen ekspresyonunun ise EHEB hücre serisinde 6. saatte 4.5, TANOUE hücre serisinde de 12. saatte 3.34 - kat azaldığı saptanmıştır (p = 0.00). Ayrıca, JAK-STAT ve NF-κB sinyal yolaklarının hedef genleri arasında yer alan PTGS2, MYC, ICAM1, CCND1 ve BIRC5 ekspresyonlarının EHEB hücre serisinde sırasıyla 1.5 (p = 0.0076), 1.61 (p = 0.00022), 9.3 (p = 0.028), 1.67 (p = 0.046), 1.54 (p = 0.028) - kat; yine ICAM1 ve BIRC5 ekspresyonlarının TANOUE hücre serisinde sırasıyla 2.29 (p = 0.000012), 1.76 (p = 0.017) - kat azaldıkları belirlenmiştir. 
Sonuç olarak, Rituximab kullanımının KLL' nin yanında pediatrik B-ALL' de de etkin olabileceği ve farklı kemoterapötik ajanlarla kombinasyonlarının B-ALL tedavisindeki rolünü daha iyi ortaya çıkaracağı kanısındayız.

Abstract:
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) which is more common in adults and acute lymphoblastic leukemia (ALL) mostly seen in children are two important types of leukemia. It is known that irregularities in the JAK-STAT and NF-κB signaling pathways have an effect on the development of both diseases. Leukemia is mainly treated by chemotherapy. But, by addition of monoclonal antibodies to the treatment regimes new treatment approaches could be developed in recent years. Rituximab, which is a chimeric anti-CD20 antibody, is the first licenced monoclonal antibody for the use in cancer therapy and is currently being used in the treatment of B-cell malignancies like B-CLL. However, it is not active utilized in the treatment of B-ALL disease. The aim of our study was to identify the effect of Rituximab particularly on childhood B-ALL; and also, to study its mechanism of action in B-ALL and B-CLL over the JAK-STAT and NF-κB signaling pathways.
In our study, cytotoxic and apoptotic effects of Rituximab in the cell lines EHEB model for CLL and TANOUE model for ALL were evaluated by the MTT test and Annexin V method, respectively. Besides, the effect of Rituximab on STAT3 and RelA and their target genes mRNA expressions were relatively determined by quantitative RT-PCR. Following Rituximab treatment alterations in STAT3 and RelA proteins expressions were measured by using the chromogenic alkaline phosphatase assay after Western Blotting.
Rituximab had no cytotoxic effect on the EHEB and TANOUE cell lines and complement mediated cytotoxicty was only detected in EHEB cell line. At the same time Rituximab had also no apoptotic effects on both cell lines. It was found that after treatment with Rituximab mRNA and protein expressions of STAT3 and RelA were decreased at different time points. STAT3 gene expression decreased 4.2- fold after 6 hours and 2.7- fold after 3 hours in the EHEB and TANOUE cell lines, respectively (p = 0.00). RelA gene expression decreased 4.5- fold after 6 hours and 3.34- fold after 12 hours in EHEB and TANOUE cell lines, respectively (p = 0.00). In the EHEB cell line expression levels of PTGS2, MYC, ICAM1, CCND1 and BIRC5, target genes of JAK-STAT and NF-κB signaling pathways were decreased 1.5 (p = 0.0076), 1.61 (p = 0.00022), 9.3 (p = 0.028), 1.67 (p = 0.046), 1.54 (p = 0.0028)- fold respectively; again ICAM1 and BIRC5 expressions in the TANOUE cell line were decreased 2.28 (p = 0.000012) and 1.76 (p = 0.017)- fold, respectively. 
ln conclusion, we strongly believe that the use of Rituximab in pediatric B-ALL besides CLL will be effective and in combinations with different chemotherapeutic agents will better reveal the role of Rituximab in B-ALL treatment.