Sıradışı çok karpelli çiçek yapısına sahip endemik legüm türü thermopsis turcica'da bazı çiçek organ genlerinin kısmi klonlanması ve sekanslanması
Partial cloning and sequencing of some floral organ genes in thermopsis turcica, an endemic legume species with an unusual structure of multi-carpellated flower
Yazar: EZGİ MELİS KOLUKISA
Danışman: DOÇ. DR. SÜLEYMAN CENKCİ
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Botanik = Botany
Dizin: Gen klonlama = Gene cloning

Özet:
Yabani legüm Thermopsis turcica'da sıra dışı çiçek morfolojisi, yani tek çiçekten 3-4 serbest karpel üretimini kontrol eden moleküler mekanizmaların belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu ana hedefe ulaşabilmek amacı ile bu çalışmada sepal, petal, stamen, karpel ve meyve gibi çiçek organlarının oluşumu ve gelişimini kontrol eden A-[APETALA1 (AP1), APETALA2 (AP2)], B-[ APETALA3 (AP3), PISTILLATA (PI)], C-[AGAMOUS (AG)], D-[SEEDSTICK (STK), SHATTERPROOF (SHP)] ve E-[SEPALLATA (SEP)] fonksiyonlu genlerin T. turcica'da kısmi klonlanması ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. 

T. turcica çiçek tomurcuklarından izole edilen total RNA özütü ilk iplik cDNA üretiminde kullanılmıştır. Özellikle legümler için bilinen hedef genlere ait nükleotid ve protein dizilerinden dejenere primerler tasarlanmıştır. PCR reaksiyonları cDNA kalıbı, gene özgü dejenere primer çifti ve PhusionTM polimeraz ile kurulmuştur. PCR ürünleri agaroz jelde yürütüldükten sonra, hedef DNA parçaları agaroz jelden kesilmiş, çıkarılmış ve saflaştırılmıştır. Hedef DNA parçaları pJET1.2 klonlama vektörüne yüklendikten sonra ligasyon ürünleri yetenekli DH5α E. coli hattına transforme edilmiştir. Koloni PCR tekniği transformantların doğru PCR ürünü içerip içermediğini belirlemede kullanılmıştır. Rastgele seçilmiş transformantlardan PCR ürününü bulunduran rekombinanat plazmid DNA'lar izole edilmiş ve dizilim analizi yapılmıştır.
Nükleotid ve çıkarılmış protein dizi sonuçları hedefimizdeki tüm çiçek organ meristem kimlik genlerinin T. turcica'dan kısmi olarak başarılı bir şekilde elde edildiğini göstermiştir. AP1 için 667 nükleotid (nt), AP2 için 447 nt, AP3 için 480 nt, PI için 249 nt, AG için 402 nt, SHP için 296 nt, STK için 350 nt ve SEP için 441 nt dizileri en az üç bağımsız dizilemeyle belirlenmiştir. Bu dizilemelere ilaveten, qPCR gibi daha sonraki fonksiyonel analizlerde içsel kontrol genleri olarak kullanmak üzere 18S rRNA için 451nt ve β-ACTIN için 276 nt de dizilenmiştir. BLASTn, BLASTp ve CLUSTALw analizleri, T. turcica çiçek meristem kimlik genlerinin nükleotid ve çıkarılmış protein dizilerinin diğer legüm türlerinde belirlenmiş homologlarına çok benzediğini (%70-100 oranlarında) göstermiştir. 

Sonuç olarak, T. turcica'da sekiz farklı çiçek organ meristemi kimlik geni mevcut araştırmada kısmen klonlanmış ve dizisel olarak karakterize edilmiştir. Bu dizi bilgileri hedef genlerin tam uzunluk cDNA dizileri ve fonksiyonel analizlerinin belirlenmesinde kullanılabilecektir.

Abstract:
The molecular mechanisms controlling unusual floral morphology that is producing 3-4 free carpels from a single flower in the wild legume Thermopsis turcica were aimed to be evaluated. The partial cloning and characterization of A-[APETALA1 (AP1), APETALA2 (AP2)], B-[ APETALA3 (AP3), PISTILLATA (PI)], C-[AGAMOUS (AG)], D-[SEEDSTICK (STK), SHATTERPROOF (SHP)] and E-[SEPALLATA (SEP)] function genes that controlling the initiation and development of floral organs such as sepals, petals, stamens, carpels and seed pods  in T. turcica was aimed in this study to reach our major objective. 

The total RNA extracted from the floral buds of T. turcica was used to produce first strands cDNAs. The degenerate primers were designed from the nucleotide and protein sequences of target genes especially known for the legume species. PCR reactions were set up with cDNA template, gene specific degenerate primer pairs and PhusionTM Polymerase. After separating PCR products on agarose gel, target DNA fragments were cut, removed and then purified from the agarose. After ligating the target DNA fragments into the pJET1.2TM cloning vectors, ligation products were transformed in to competent DH5 E. coli strains. The colony PCR technique was used to identify whether transformants have the right PCR fragment or not. The recombinant plasmid DNA holding the PCR product was isolated from randomly selected transformants and was sequenced. 

The results of nucleotide and deduced protein sequence clearly indicated that all floral meristem identity genes of our target were partially obtained from T. turcica. 667 bp for AP1, 447 bp for AP2, 480 bp for AP3, 249 bp for PI, 402 bp for AG, 296 bp for SHP, 350 bp for STK and 441 bp for SEP were identified with at least three independent sequencing. In addition to these sequencings, 451 bp for 18S rRNA and 276 bp for -ACTIN were also sequenced to be used as internal control genes in further functional analysis, such as qPCR. BLASTn, BLASTp and CLUSTALw analyses obviously indicated that nucleotide/deduced protein sequences of T. turcica floral meristem identity genes obtained in this study were very similar (100%-70%) to their homologues determined for the other legume species.

Consequently, eight different floral meristem identity genes for T turcica were partially cloned and sequentially characterized in the present study. These sequence information would be used to determine the full length cDNA sequences and their functional analyses of the target genes.