V2 reseptör fonksiyonu üzerine H80Y, V88L, V215M ve L219P mutasyonlarının etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of H80Y, V88L, V215M and L219P mutations on v2 receptor function
Yazar: DİLARA ULUSAL
Danışman: PROF. DR. HATİCE MERGEN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Diabetes insipidus = Diabetes insipidus

Özet:
Diabetes insipidus (DI), aşırı miktarda idrar oluşumu (poliüri) ve çok fazla miktarda su
içme (polidipsi) ile karakterize edilen nadir bir hastalıktır. Bu hastalık nedeniyle idrar
konsantre edilemez. Susuzluk testi, DI tanısını doğrulamak için kullanılır. Testin amacı,
hastanın idrarı konsantre etme yeteneğini gözlemlemek ve arjinin vazopressine
(vazopressin, antidiüretik hormon, ADH, AVP) olan cevabını değerlendirmektir. Tanı
gecikirse ciddi hipernatremi ve dehidratasyon gibi belirtiler ortaya çıkabilir. Tedavide
desmopressin (DDAVP) kullanılır.
Kalıtsal veya edinilmiş nedenlerle çeşitli tiplerde DI hastalığı oluşmaktadır. Arjinin
vazopressin reseptör 2 (V2 reseptörü, V2R, AVPR2) ve onu kodlayan genlerde oluşan
mutasyonlar ile aquaporin 2 su kanalları (AQP2) ve onu kodlayan genlerde oluşan
mutasyonlar; konjenital (ailesel, kalıtsal) tipteki Nefrojenik Diabetes İnsipidus'a (NDI) neden olmaktadır. Konjenital NDI'da normal şekilde salgılanan ve sentezlenen AVP
varlığına veya yüksek plazma konsantrasyonlarına rağmen idrar konsantre edilemez.
Konjenital NDI'a neden olan V2R genindeki mutasyonlar farklı fenotipte reseptör
oluşumuna neden olabilir. Bu farklı fenotipteki reseptörler, farklı reseptör fonksiyonları
meydana getirirler ve bunun sonucunda hastalığın seyri ve şiddeti değişiklik gösterebilir.
Bu tez çalışmasının amacı, konjenital NDI hastalığına neden olduğu bilinen ve V2R
geninde tanımlanan H80Y, V88L, V215M ve L219P mutasyonlarının, V2 reseptör
fonksiyonu üzerine etkilerinin araştırılmasıdır. Bu araştırmalar sayesinde, hastalığın
seyrinin aydınlatılması ve gelecekteki tedavi çalışmalarında kullanılması için bilgiler
sunulması hedeflenmiştir.
Bu amaç ve hedefler doğrultusunda yapılan deneysel çalışmalarda, ilgili mutasyonlar
yabanıl tip V2R geni içeren memeli ifade vektörleri kullanılarak site-directed mutagenez
yöntemi ile oluşturulmuştur ve COS-7 hücrelerine transfeksiyonları gerçekleştirilmiştir.
Yabanıl tip ve mutant V2 reseptörlerinin hücre içi ve hücre yüzeyindeki ifadeleri, enzimbağlı immünosorbent analiz (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) deneyleri ile
tespit edilmiştir. Mutant V2 reseptör aktivitesi ise transfekte hücrelerin AVP ile
uyarılması sonucunda cevap olarak sentezlenen siklik adenozin monofosfat (siklik AMP,
cAMP) düzeylerine bakılarak değerlendirilmiştir. Ayrıca mutant V2 reseptörlerinin hücre
içindeki yerleşimleri ve endoplazmik retikulumda (ER) takılı kalma durumları floresan
görüntüleme yöntemi ile araştırılmıştır.
Sonuç olarak, tez kapsamında çalışılan tüm mutant tip V2 reseptörlerinin yabanıl tipe
göre farklı düzeylerde fonksiyon kaybına uğradıkları gözlemlenmiştir.

Abstract:
Diabetes insipidus (DI) is a rare disease that is characterized by significantly high urine
production (polyuria) and excessive water consumption (polydypsia). This disease
generally prevents concentration mechanism of urine. Dehydration tests are applied for
confirming the diagnosis of DI. The purpose of dehydration test is to observe the patient's
ability to concentrate urine and to evaluate the patient's reaction to arginine vasopressin
(vasopressin, antidiuretic hormone, ADH, AVP). In case of late diagnosis, DI can result
in serious hypernatremia and dehydration. DI is treated with desmopressin (DDAVP).
Variations of DI can occur either as a hereditary or an acquired disease. Mutations of
arginine vasopressin receptor 2 (V2 receptor, V2R, AVPR2) and its coding genes as well
as mutations of aquaporin 2 channels (AQP2) and its coding genes cause congenital
(hereditary) type Nephrogenic Diabetes Insipidus (NDI). In cases of congenital NDI, urine cannot be concentrated despite normal secreted and synthesized AVP levels or high
plasma concentrations. Mutations on V2R gene that cause congenital NDI, can also result
in the creation of different phenotypes of receptors. The course and the severity of disease
can vary due to incompatible receptor functions caused by different phenotypes of
receptors.
The aim of this thesis is to examine the relation between H80Y, V88L, V215M and L219P
mutations identified in V2R gene, which is known to cause congenital NDI, and V2
receptor functions. The purposes of this examination are to better illuminate the course
of disease and to provide information for further research on the treatment.
In accordance with the purpose of this study following procedure is conducted as an
experimental research. Relevant mutations mentioned above were produced utilizing sitedirected mutagenesis method to mammalian expression vectors containing wild type V2R
gene. These mammalian expression vectors were transfected to COS-7 cells. Intracellular
and cell surface expressions of both wild and mutant types of V2 receptors were
determined with the application of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
experiments. Levels of cyclic adenosine monophosphate (cyclic AMP, cAMP)
synthesized as a response to stimulation of transfected cells with AVP were scanned to
observe mutant V2 receptor activity. Positioning of mutant V2 receptors in the cell, and
their locations in the endoplasmic reticulum (ER) were observed with the fluorescent
imaging method.
As a result, all mutant type V2 receptors studied within the scope of this thesis are
observed to demonstrate varying degrees of function loss compared to wild type V2
receptors.