B-NGF'ün koyunlarda ovulasyon mekanizması ve sperma kalitesi üzerine etkisi
The effect of B-NGF on ovulation mechanism and semen quality in sheep
Yazar: BESTE ÇİL
Danışman: PROF. DR. ONGUN UYSAL
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2021
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Dölleme-yapay = Insemination-artificial ; Koyunlar = Sheep ; Senkronizasyon = Synchronization ; Sinir büyüme faktörleri = Nerve growth factors ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu araştırmada seminal plazmada halihazırda mevcut olan proteinlerden biri olan β sinir büyüme faktörünün (β-NGF) ekzojen olarak dişilere uygulanması ve spermaya ilavesinin koyunlarda fertilite üzerine etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmaktadır. Araştırma kapsamında 75 baş Akkaraman koyunu ve 3 baş Akkaraman koç kullanılmıştır. Araştırma iki çalışma paketine ayrılarak ilk çalışma paketinde (Senkronizasyon grupları) 30 adet dişiye 12 gün süre ile progesteron hormonu içeren intravaginal süngerler (medroksiprogesteron asetat) uygulanmış ve takibinde 13. gün 20 adet dişiye β-NGF enjeksiyonu 250 µg (n = 10) veya 100 µg (n = 10) dozunda i.m. olarak uygulanmıştır. Kontrol grubundaki (n = 10) dişilere ise β-NGF enjeksiyonu yerine i.m. olarak 1 ml %0,09'luk NaCl enjeksiyonu yapılmıştır. İkinci çalışma paketi (Sperma grupları) için, 45 koyuna 12 gün süre ile vajinal sünger uygulanmış ve 12. süngerler çıkarılırken 350-400 IU i.m. PMSG (gebe kısrak serum gonodotropin) enjeksiyonu yapılmıştır. 3 adet koçtan tohumlama günlerinde alınan spermalar pooling yöntemi ile birleştirilerek payette 250 milyon motil spermatozoa olacak şekilde dozlanmış ve ilk çalışma paketi için β-NGF ilavesi olmadan, ikinci çalışma paketi için üç alt gruba bölünerek, kontrol grubu (n = 15) için sadece sulandırıcı içeren medyum kullanılarak, diğer iki grup olan yüksek doz ve düşük doz grupları (n = 15, n = 15) için; ön çalışma ile belirlenen 10 ng/ml ve 100 ng/ml dozunda β-NGF, 500 × 106 sperm/ml dozunda sulandırılmış spermaya ilave edilmiştir. Her iki çalışma paketi için de hazırlanan payetler soğutularak ilk 3 saat içerisinde kullanmak üzere, toplam 75 baş koyunun tohumlaması, süngerlerin çıkarılmasından itibaren 53-55. saatleri aralığında servikal metot ile gerçekleştirilmiştir. Senkronizasyonun 13. gününde tüm dişilerin ultrasonografik muayeneleri yapılarak ovaryum üzerindeki foliküller belirlenmiş ve ölçümleri yapılmıştır. Ayrıca tohumlamadan sonra 17. günde korpus luteum vaskülarizasyonları ultrasonografi ile görüntülenerek gebelik tespiti yapılmıştır. Tohumlama sonrası 6. ve 10. günlerde serum progesteron düzeyleri Elisa test kiti ile belirlenmiştir. Araştırmada her iki çalışma paketi için de değerlendirilen parametrelerden elde edilen veriler, senkronizasyon gruplarında 5 mm ve üzeri çapa sahip folikül varlığı, ovulasyon, 6. ve 10. gün serum progesteron seviyeleri bakımından en düşük sonuçlar Kontrol grubunda elde edilirken, Yüksek doz grubunda gebelik elde edilmemiş, Düşük Doz grubunda %10, Kontrol grubunda ise %20 oranında kalmıştır. Sperma gruplarında ise ilgili tüm parametreler en yüksek Düşük doz grubunda belirlenirken, en düşük olarak Kontrol grubunda elde edilmiştir. Gruplar arası değerlendirilen parametreler bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık elde edilememiş (p > 0,05) ve veriler klinik olarak önemi açısından değerlendirilmiştir. Sonuç olarak koyunlarda β-NGF'ün spermaya katılmasının olumlu etki yaratabileceği, ancak dişilerin senkronizasyon programında PMSG hormonu yerine uygulanmasının gebelik bakımından yeterli başarıyı sağlamadığı görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlar, β-NGF'ün sperm kriyoprezervasyon ve çeşitli senkronizasyon protokollerine adaptasyonunun araştırılabilmesi yönünde temel sağlamıştır.

Abstract:
The aim of this research was to evaluate the effect of exogen treatment of B nerve growth factor (β-NGF), which is one of the naturally present proteins in seminal plasma, both as administration to females and additive to semen on fertility in sheep. Within the scope of the research, 75 White Karaman sheep and 3 White Karaman rams were used. The research was divided into two study packages and in the first study package (Synchronization groups), 30 females were treated with intravaginal sponges (medroxyprogesterone acetate) for 12 days and β-NGF injection was administered to 20 ewes on the 13th day (n = 10) at a dose of 250 µg (n = 10) or 100 µg (n = 15) intramuscularly. Ewes in the control group (n = 15) received 1 ml of 0.09 %NaCl injection i.m. For the second study package (Semen groups), 45 sheep were treated with a vaginal sponge for 12 days and 350-400 IU i.m. PMSG (pregnant mare serum gonadotropin) injection was administered at the sponge removal. The semen was collected from 3 rams on the insemination days, pooled and dosed to 250 million motile spermatozoa in the straw. For the second study package, following the pooling the semen was divided into three subgroups, containing only diluent for the control group (n = 15) and for the other two subgroups, two different β-NGF doses determined by the preliminary study, at the dose of 10 ng/ml (Low dose) and 100 ng / ml (High dose) groups (n = 15, n = 15) were added to the diluted semen at a dose of 500 × 106 sperm/ml. The straws prepared for both study packages were cooled and used for inseminations within the first 3 hours. The inseminations were carried out transcervically at 53-55 hours following the sponge removal. On the 13th day of synchronization, ultrasonographic examinations of all females were performed and the follicles on the ovaries were determined and measured. In addition, on the 17th day after insemination, the vascularization of the corpus luteum was evaluated by ultrasonography and pregnancy was determined. Serum progesterone levels were determined by Elisa test kit on the 6th and 10th days after insemination. According to the data obtained from the parameters evaluated for both study packages, the lowest results obtained in the presence of follicles with a diameter of 5 mm and above, ovulation and serum progesterone levels on the day 6 and 10 post-insemination were in the Control group, while no pregnancy was obtained in the High dose group and the pregnancies were 10% and 20% in the Low dose and Control group respectively. In the semen groups, the highest parameters were obtained in Low Dose group whereas the lowest were obtained in the Control group. No statistically significant difference was found between the groups (p > 0.05) and the data was evaluated in terms of clinical significance. As a result, it was observed that the addition of β-NGF to semen may have a positive effect in sheep, however, implantation of β-NGF to the synchronization program instead of PMSG hormone did not provide the expected success in terms of pregnancy outcome. These results provided the basis for investigating the adaptation of β-NGF to sperm cryopreservation and synchronization protocols.