SH-SY5Y hücre hattında SNCA, PARK2, DJ-1, PINK1 ve LRRK2 gen ürünlerinin nörojenik farklılaşma sırasında transkripsiyonel ve translasyonel düzeyde gösterdikleri değişimlerin incelenmesi
Investigation of the changes occurring at transcriptional and translational levels in a SNCA, PARK2, DJ-1, PINK1 and LRRK2  gene products during neuronal differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cell line
Yazar: EYLÜL ECE İŞLEK CAMADAN
Danışman: PROF. DR. MURAT KASAP
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Proteomikler = Proteomics

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasının amacı nörojenik faklılaşmaya tabi tutulmuş SH-SY5Y hücrelerinde SNCA, PARK2, DJ-1, PINK1 ve LRRK2 genlerinin ifade seviyelerindeki değişiklikleri farkılaşma süreci boyunca mRNA ve protein düzeyinde takip etmekti. Bu amaçla, literatürde yayınlanmış olan bilgiler doğrultusunda kısa fakat oldukça etkili bir nörojenik farklılaşma protokolü geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Ayrıca, global bir bakış açısı ile protein düzeyinde meydana gelen değişiklikleri izlemek için 2-D jel elektroforezi ve nLC-MS/MS proteom analizleri yapıldı. Genel olarak, bu tez çalışmasında, farklılaşan SH-SY5Y hücrelerinin Parkinson hastalığı (PH) ile ilişkili çalışmalar için model olarak kullanılmasının etkinliğini anlamayı ve PH ile ilişkili olarak seçilen bazı genlerin mRNA ve protein seviyelerinde meydana gelen değişiklikler hakkında ayrıntılı bilgi sağlamayı amaçladık. 
Yöntem: Nispeten kısa ancak etkili bir nöronal farklılaşma protokolü geliştirilmiş ve SH-SY5Y hücrelerini farklılaştırmak için kullanılmıştır. Nöronal farklılaşmanın başarısı, İmmünofloresan mikroskopisi (IF) yöntemi kullanılarak seçilen bazı nöron markörlerindeki (Nestin, Nurr1, NeuroD1, NeuN ve TH) artışların gösterilmesiyle doğrulanmıştır. Belirlenen zaman aralıklarında nöronal farklılaşma markörlerinin (Nestin, Nurr1, NeuroD1, NeuN), dopaminerjik nöron markörlerinin (TH, DAT, DRD1 ve DRD2) ve PH ile ilişkili genlerin (SNCA, PARK2, DJ1, LRRK2 ve PINK1) ekspresyon seviyeleri mRNA (qRT-PCR) ve protein (WB) düzeylerinde izlendi. Farklılaşma sırasında meydana gelen proteom farklılıklarına küresel bir bakış açısı sağlamak için 2-D jel elektroforezi ve nLC-MS/MS çalışmaları da gerçekleştirildi.
Bulgular: Nörojenik farklılaşma sürecinde hücreler nöron benzeri yapılar oluşturdu, akson ve dendrit benzeri uzantılar geliştirdi. IF mikroskopisi ile gösterildiği gibi farklılaşma işleminin başlangıcı ve sonu sırasında alınan numuneler arasında karşılaştırma yapıldığında, NeuN, Nurr1 ve TH markörlerinin ekspresyon seviyelerinde artışlar gözlemlenmiştir. Farklılaşma sürecinde nörojenik farklılaşma ve dopaminerjik nöron markörlerinin (Nestin, Nurr1, NeuroD1, NeuN, TH, DAT, DDC, DRD1 ve DRD2) ve PH ile ilgili genlerin (SNCA, PARK2, DJ1, LRRK2, VPS35 ve PINK1) ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler de WB deneyleri ile belirlendi. Sonuçlar SH-SY5Y hücrelerinin dopaminerjik nöron benzeri hücrelere farklılaştığını imâ etti. Ek olarak, nörojenik farklılaşma sürecini proteom düzeyinde takip edebilmek için yapılan 2-D jel elektroforez bazlı proteom analizi örnekler arası regülasyona uğrayan 13 adet proteininin varlığını gösterdi. nLC-MS/MS bazlı proteom analizi yapıldığında, MAP2 proteini sadece farklılaşmış hücrelerde tespit edildi. Farklı şekilde düzenlenmiş olan proteinlerin biyoinformatik analizleri enerji metabolizmasındaki ve katekolaminerjik yolaktaki değişikliklere işaret etti.
Sonuç: Nörojenik farklılaşmaya maruz kalan SH-SY5Y hücreleri dopaminerjik nöron benzeri bir fenotipe farklılaşmıştır. Bu nedenle, bu hücreler in vitro PH ile ilişkili çalışmalarda kolaylıkla model olarak kullanılabilirler.
Anahtar Kelimeler: SH-SY5Y hücreleri, Nörojenik farklılaşma, SNCA, PARK2, DJ-1, LRRK2, PINK1, 2-DE, nLC-MS/MS ve Proteomik.

Abstract:
Objective: The aim of this thesis study was to investigate the changes at the expression levels of SNCA, PARK2, DJ-1, PINK1 and LRRK2 genes at both mRNA and protein levels during neurogenic differentiation of SH-SY5Y cells. For this purpose, a short yet highly effective neurogenic differentiation protocol was developed and optimized using the published information available in the literature.  In addition, 2-D gel electrophoresis and nLC-MS/MS proteome analysis were performed to monitor the changes taking place at the protein level on a global scale. In overall, in this thesis study, we aimed at understanding the efficacy of using differentiated SH-SY5Y cells as a model for Parkinson's disease (PD)- associated studies and provide detailed information as to the changes occurring at the mRNA and protein levels of some of the selected PD-assocaited genes.
Method: A relatively short but efficient neuronal differentiation protocol was developed and used to differentiate SH-SY5Y cells. The success of neuronal differentiation was verified by demonstrating the increases in some selected neuronal markers (Nestin, Nurr1, NeuroD1, NeuN and TH) using immunofluorescence microscopy (IF). The expression levels of neuronal differentiation markers (Nestin, Nurr1, NeuroD1, NeuN), dopaminergic neuron markers (TH, DAT, DRD1 and DRD2) and PD related genes (SNCA, PARK2, DJ1, LRRK2 and PINK1) were monitored at the mRNA (qRT-PCR) and protein (WB) levels at determined time intervals. The 2-D gel electrophoresis and nLC-MS/MS studies were also carried out to provide a global perspective to the proteome differences occurring during the differentiation.
Results: During neurogenic differentiation process, the cells formed neuron like structures and developed axon and dendrite like extensions. As demonstrated by IF microscopy, there were increases in the expression levels of NeuN, Nurr1 and TH when comparisons were made between the samples taken during the onset and end of the differentiation process. During the differentiation process, changes in the expression levels of neurogenic differentiation and dopaminergic neuron markers (Nestin, Nurr1, NeuroD1, NeuN, TH, DAT, DDC, DRD1 and DRD2) and PD related genes (SNCA, PARK2, DJ1, LRRK2, VPS35 and PINK1) were also determined by WB experiments. The results implicated that SH-SY5Y cells differentiated into dopaminergic neuron like cells. In addition, monitoring of the changes during neurogenic differentiation process at the proteome level indicated the presence of 13 differentially regulated proteins when 2-D gel electrophoresis-based proteome analysis was performed. When nLC-MS/MS based proteome analysis was performed, MAP2 unique proteins were detected only in the differentiated cells. Bioinformatics analysis of the differentially regulated proteins pointed to the changes in energy metabolism and catecholaminergic pathway.
Conclusions: SH-SY5Y cells subjected to neurogenic differentiation have differentiated into a dopaminergic neuron like phenotype. Therefore, these cells can be readily used as a model for in vitro PD-associated studies.
Keywords: SH-SY5Y cells, Neurogenic differentiation, SNCA, PARK2, DJ-1, LRRK2, PINK1, 2-DE, nLC-MS/MS and Proteomics.