Preeklamptik gebeliklerde plasenta ve kandan elde edilen mezenkimal kök hücrelerde transkriptom analizi
Transcriptome analysis on mesenchymal stem cells derived from placenta and blood in preeclamptic pregnancies
Yazar: ZEYNEP KUMRAL
Danışman: PROF. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Hipertansif gebelik bozuklukları dünya genelinde gebeliklerin %10'unu etkiler. Maternal, perinatal morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenini oluşturur. Hipertansif bir gebelik hastalığı olan preeklampsi (PE), gebeliğin 20. haftasından sonra yapılan tekrarlı ölçümler neticesinde sistolik kan basıncının 140 mmHg veya üstü olması, diastolik kan basıncının ise 90 mmHg veya üstü olması durumudur. Hipertansiyona ek olarak proteinüri ve maternal organ disfonksiyonu da görülebilmektedir. 
Preeklampsi gelişen gebelerde implantasyon ile birlikte plasenta gelişimi de eksik ve yetersiz kalmaktadır. Plasenta oluşumu sırasında yaşanan spiral arter yeniden modellemesindeki bozukluklar dokunun oksijenden yoksun kalmasına neden olur ve hipoksi oluşumunu tetikler. Oksidatif stres ile de antianjiyogenik faktörlerin maternal salınımı gerçekleşir. Anjiyogenik ve antianjiyogenik faktörler arasındaki dengesizlik anjiyogenez ve plasental vaskülarite de aksamalar yaşanmasına sebep olur.
Mezenkimal kök hücreler (MKH) kendi kendini yenileyebilen ve özel hücre hatlarına farklılaşabilme potansiyeline sahip hücrelerdir. MKH'lerin, plasentasyon sırasında maternal-fetal arayüzün proanjiyogenik, immünomodülatör ve antienflamatuar ortamının düzenlenmesinde rol oynadığı düşünülmektedir. Plasentanın farklı kısımlarından izole edilen MKH araştırmaları bulunmaktadır. Plasentanın vasküler bir organ olması bu dokudan izole edilen MKH'lerde daha baskın bir anjiyogenik profil olabileceğini düşündürmektedir. 
Erişilebilirlik ve yüksek farklılaşma potansiyeli, tıbbi uygulamalar için umut verici bir kaynak olarak kandan türetilen kök hücreler de bir alternatif olmuştur. Periferal kan kökenli MKH'lere ait çalışmalar bulunmaktadır ancak izolasyon sonrasında MKH miktarının yetersiz olması bir kısıtlayıcı faktör olarak çalışmalara yansımaktadır.
Bu tez, PE ve sağlıklı gebelere ait desidua ve periferal kan kökenli MKH'lerin mRNA anlatım analizini kapsamakta ve olası biyobelirteçlerin araştırılması için bir ön çalışma niteliği taşımaktadır. Tez kapsamında yedi preeklapmsi gebeye ve yedi kontrol grubunu oluşturan sağlıklı gebeye ait plasenta dokusu ve periferal kandan toplam 28 örnekten MKH'lerin izolasyonu yapılarak gen anlatım analizi çalışılmıştır. MKH'lerin izolasyonu ve kültürü, hücre yoğunluğu istenilen şekilde arttırıldıktan sonra uygun hücre yüzey belirteçleri aracılığı ile akım sitometrisi yöntemi kullanılarak hücre ayrımı ("cell sorting") yapılmıştır. MKH'lerden total RNA izolasyonu yapılmış ve cDNA'ya çevrilmiştir. Gen anlatım analizi için "Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü A" (VEGF(A)), "Metallopeptidaz İnhibitör 1" (TIMP-1), "Efrin A3" (EFNA3), "Trombospondin Tip 1 7A" (THSD7A) ve normalizasyon için "Gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz" (GAPDH) kullanıldı. Gen anlatım analizi damlacıklı dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPZR) yöntemi ile gerçekleştirildi. Verilerin istatistiksel sonuçları için "Graphpad Prism Version 8.3.0" programı kullanıldı. Sonuçların anlamlılık olarak değerlendirilmesi parametrik olmayan "Mann Whitney Test" ile yapıldı. Özgüllük ve duyarlılık için "Reciever Operating Characteristic" (ROC) analizi yapıldı. 
Analizlerin sonucunda, TIMP-1, EFNA3 ve THSD7A hem desidua hemde periferal kan MKH'lerinde mRNA anlatım seviyesinde kat değişimleri olmasına rağmen istatistiksel olarak anlamlı değerlendirilmemişlerdir. VEGF(A) desiuda MKH'lerinde mRNA anlatım seviyesinde kat değişimi olmasına rağmen istatistiksel olarak p<0,05 koşulunu sağlamadığı için anlamlı olarak değerlendirilmedi fakat PE hastalarının periferal kan kökenli MKH'lerindeki VEGF(A) seviyesinde kontrole kıyasla 4,2 kat artış gözlemlendi (AUC: 0,95 p=0,019) istatistiksel olarak p<0,05 koşulunu sağladığı için anlamlı olarak değerlendirildi.
Bu çalışma, preeklampsinin patogenezi ile paralel olarak anjiyogenez üzerinde etkileri olduğu düşünülen genlerin kök hücre seviyesinde gen anlatımlarında bir değişim olup olmadığını gözlemlemek için yapılmıştır. Bu sonuçlar doğrultusunda özellike periferal kandan elde edilen MKH'lerindeki VEGF(A) seviyesindeki anlamlı artış bu genin potansiyel bir biyobelirteç olarak kullanılabileceğini ve ileride PE'nin  tedavisinde hedef gen olarak terapötiklerin  kullanılabileceği öngörülebilir.

Abstract:
Hypertensive pregnancy disorders affect 10% of pregnancies worldwide. It is an important cause of maternal, perinatal morbidity and mortality. Preeclampsia (PE), which is a hypertensive pregnancy disease, is a condition where systolic blood pressure is 140 mmHg or above, and diastolic blood pressure is 90 mmHg or above as a result of repeated measurements made after the 20th week of pregnancy. In addition to hypertension, proteinuria and maternal organ dysfunction can also be seen. 
Placental development is incomplete and insufficient as well as implantation in pregnant women with preeclampsia. Disturbances in spiral artery remodeling experienced during placenta formation cause tissue to be deprived of oxygen and trigger hypoxia. Maternal release of anti-angiogenic factors occurs with oxidative stress. Imbalance between angiogenic and anti-angiogenic factors causes disruptions in angiogenesis and placental vascularity. 
Mesenchymal stem cells (MSCs) are self-renewable cells with the potential to differentiate into special cell lines. MSCs are thought to play a role in regulating the proangiogenic, immunomodulatory and anti-inflammatory environment of the maternal-fetal interface during placentation. Placenta is widely studied as a source of MSC. There are MSC studies isolated from different parts of the placenta. The fact that the placenta is a vascular organ suggests that there may be a more dominant angiogenic profile in MSCs isolated from this tissue. 
Accessibility and high potential for differentiation have also been an alternative to blood-derived stem cells as a promising resource for medical applications. There are studies of MSCs derived from peripheral blood, but insufficient amount of MSC after isolation is reflected in studies as a limiting factor.
This thesis covers the mRNA expression analysis of decidua and peripheral blood-derived MSCs from PE and healthy pregnant women and is a preliminary study to investigate possible biomarkers.Within the scope of the thesis, gene expression analysis was studied by isolating MSCs from a total of 28 samples from placental tissue and peripheral blood belonging to seven pregnant women with preeclapsia and seven healthy pregnant women. After isolation and culture of MSCs, cell sorting was performed by using flow cytometry method by means of appropriate cell surface markers after increasing cell density as desired. Total RNA was isolated from MSCs and translated into cDNA. For gene expression analysis, "Vascular Endothelial Growth Factor A" (VEGF (A)), "Metallopeptidase Inhibitor 1" (TIMP-1), "Ephrin A3" (EFNA3), "Thrombospondin Type 1 7A" (THSD7A) and for normalization Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used. Gene expression analysis was performed by droplet digital polymerase chain reaction (ddPZR) method. "Graphpad Prism Version 8.3.0" program was used for the statistical results of the data. The significance of the results was evaluated using the nonparametric "Mann Whitney Test". "Reciever Operating Characteristic" (ROC) analysis was performed for specificity and sensitivity. 
As a result of the analyzes, TIMP-1, EFNA3 and THSD7A were not evaluated statistically significant although there were fold changes in the level of mRNA expression in both decidua and peripheral blood MSCs. Although there was a fold change in the mRNA expression level in VEGF (A) decidua MSCs, it was not considered statistically significant because it did not meet the condition of p <0.05, but a 4.2 fold increase in VEGF (A) level in peripheral blood-derived MSCs of PE patients was observed (AUC: 0.95 p = 0.019). It was considered to be statistically significant since it met the condition of p <0.05.
This study was conducted to observe whether there is a change in gene expression at the stem cell level of genes thought to have effects on angiogenesis in parallel with the pathogenesis of preeclampsia. In line with these results, it can be predicted that the significant increase in VEGF (A) level in MSCs obtained from peripheral blood can be used as a potential biomarker and the therapeutics can be used as target gene in the treatment of PE in the future.