Pan-aurora kinaz inhibitörü olan danusertib'in pankreas kanseri hücrelerinde otofaji, metastaz ve epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) üzerine etkilerinin araştırılması
The investigation of the effect of danusertib, a pan-aurora kinase inhibitor, onto autophagy, metastasis and epithelial mesenchymal transition (EMT) in pancreatic cancer cells
Yazar: ERKAN ALABAŞ
Danışman: DOÇ. DR. AHMET ATA ÖZÇİMEN
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kanser kelime anlamı olarak bir organ veya dokudaki hücrelerin düzensiz olarak bölünüp çoğalması ile beliren ve organizmayı ölüme kadar götüren kötü tümörler olarak tanımlanır. Kanser tek bir organ hastalığı olmadığı için kanser türünün belirtileri ve tedavi yöntemleri de birbirinden farklıdır. Bu çalışmada, CFPAC-1 ve MIA PaCa-2 pankreas kanseri hücre hatlarında daha önce yapılan sitotoksisite deneyinde belirlenen IC50 değeri CFPAC-1 hücreleri için 399 nM, MIA Paca-2 hücreleri için 318 nM saptanmış ve bu dozda ilaç kullanılmıştır. xCELLigence CIM-Plate 16 ve yara açma deneyleri sonucu, iki pankreas kanseri hücre hattında Danusertib ilacının bulunduğu gruplarda migrasyonu durdurduğu görülmüştür. Danusertib'in zamana bağlı IC50 değerleri iki hücre hattında 24. ve 48. saatlerde akım sitometrik olarak ölçülen DAPI-A otofajik analizi sonucunda; CFPAC-1 hücrelerinde 24. saatte %6, 48. saatte %6,6 oranında MIA PaCa-2 hücrelerinde ise 24. saatte  %4,1, 48. saatte %4,7 oranında otofaji görülmüştür. Danusertib'in apoptoz üzerine etkilerini göstermek için, qRT-PCR metodu ile kaspaz -3, -6, -7, kaspaz -8, -9 ve metastaz üzerine etikilerini göstermek için, qRT-PCR metodu ile VEGF, Zeb-1, Slug ve Snail gen ifade düzeyleri araştırılmıştır. Doz/Zaman bağımlı Danusertib uygulanmış CFPAC-1 ve MIA PaCa-2 hücrelerinde kaspaz ifadelerinde artış gözlenmiştir ve bu durum her iki kanser hücresinde de hem iç hem de dış yolaktan apoptozun (programlanmış hücre ölümü) gerçekleştiğini göstermektedir. Metastatik gen ifade düzeyleri analizi sonucu, anjiyogenezde rol oynayan VEGF gen ifadesinde CFPAC-1 hücrelerinde azalma meydana gelirken, MIA PaCa-2 hücrelerinde artış meydana gelmektedir. EMT ile ilişkili olan Zeb1, Slug ve Snail gen ifadelerinde ise azalma meydana gelmektedir. Bu genlerin ifadelerinin azalması metastazın engellendiğini göstermektedir. Sonuç olarak, Pan-Aurora Kinaz inhibitörü Danusertib, pankreatik kanserlerde anti-tümör ve anti-metastatik etkili potansiyel bir ajan olabilir. Ancak, ileri in-vivo araştırmaların gerçekleştirilerek çalışmanın desteklenmesi öngörülmektedir.

Abstract:
The mean of the Cancer is defined as bad tumors, which occur by irregular division and proliferation of cells in an organ or a tissue and lead the organism to death. Since cancer is not a single organ disease, the symptoms and treatment methods of the cancer type are different. In this study, two IC50 values (399nM and 318nM) which previosuly measured by xCELLigence Cytotoxicity test were used in both CFPAC-1 and MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells, respectively. The xCELLigence CIM-Plate 16 Migration and Wound Healing Tests showed no migration in Danusertib treated pancreatic cancer cells. The time-dependent IC50 values of Danusertib were determined by Flow Cytometric DAPI-A autophagic analysis at 24th and 48th hours in two cell lines: The Autophagy was observed that in CFPAC-1 cells at 24 and 48 hours as 6% and 6,6%, respectively and in MIA PaCa-2 cells at 24 and 48 hours as 4,1% and 4,7%, respectively. To demonstrate the effects of Danusertib on apoptosis and on metastasis, caspase -3, -6, -7, caspase -8, -9 and VEGF, Zeb-1, Slug, Snail gene expression levels were quantified by using qRT-PCR method, respectively. An increase in the caspase expressions were observed in both time/dose dependent Danusertib treated CFPAC-1 and MIA PaCa-2 cells that indicates of apoptosis (programmed cell death) as internally or externally. The result of analyses of metatstatic VEGF gene expression levels; plays a role in angiogenesis, were increased in MIA PaCa-2 cells while they were decreased in CFPAC-1 cells.  The expression levels of Zeb1, Slug and Snail genes, associated with EMT, are decreased. Reduction of expression of these genes indicates that metastasis is inhibited. In conclussion, Danusertib, a Pan-Aurora Kinase Inhibitor, may be a potential anti-tumor and anti-metastatic potent agent in pancreatic cancers. However, it is envisaged to support the study by conducting advanced in-vivo studies.