Bölge yönelimli mutagenez yaklaşımı ile insan bütirilkolinesterazında yapı-aktivite ilişkilerinin incelenmesi
Determination of structure-activity relationships of human butyrylcholinesterase by site-directed mutagenesis.
Yazar: KEVSER BİBEROĞLU
Danışman: DOÇ. DR. ÖZDEN TACAL
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Butirilkolinesteraz = Butyrylcholinesterase ; Enzim inhibitörleri = Enzyme inhibitors ; Enzimler = Enzymes ; Mutajenisite testleri = Mutagenicity tests ; Mutajenler = Mutagens ; İlaçlar-araştırma safhasında = Drugs-investigational

Özet:
İnsan bütirilkolinesterazının (BChE) yapı-aktivite ilişkisini incelemek ve katyonik triarilmetan (TAM+) yapılı boyaların enzim üzerindeki bağlantı noktalarını araştırmak amacıyla; bölge yönelimli mutagenez yöntemi kullanılarak insan BChE'ının aktif merkez oyuğunda veya yakın çevresinde nokta mutasyonları yapıldı. Katyonik triarilmetan yapılı boyaların [malakit yeşili (MG), metil yeşili (MeG), pararozanilin (PR)] rekombinant doğal-tip ve BChE mutantları (A277V, P285L, P382A, H214Q, H77L, F329A) üzerindeki inhibitör etkileri, spektrofotometrik olarak 25 °C'de, 50 mM MOPS (pH 8) ortamında, 0.125 mM 5,5'-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit), 0.05-0.4 mM bütiriltiyokolin (BTC) ve 0-64 µM ligand kullanılarak araştırıldı. Yapılan kinetik değerlendirmeler sonucunda PR'nin rekombinant doğal tip ve tüm mutant enzimler üzerinde çoklu bağlanma ile uyumlu sonuçlar verdiği bulundu. MG ve MeG, F329A mutantı dışında rekombinant doğal tip ve BChE mutantlarında lineer karışık veya kompetitif inhibisyona neden oldu. Ki değerleri açısından karşılaştırıldıklarında rekombinant doğal tip ve BChE mutantlarının (F329A hariç) MG ve MeG'ne benzer afinite gösterdikleri bulundu.. MG ve MeG, F329A BChE mutantı üzerinde ise iki bölgeye bağlanmaya işaret eden nonlineer inhibisyona neden oldu. MG ve MeG ile F329A'nin inhibisyonundaki Ki değerleri sırasıyla; 3.8 µM ve 27 µM olup; rekombinant doğal tip BChE'a göre ? 50 (MG) ve 150 (MeG) kat daha zayıf bağlandığı bulundu. MG ve MeG ile F329A mutantının inhibisyonu sonucunda hem inhibisyon paterninin değişmesi hem de inhibitör etkinin azalması, her iki ligandın F329A mutantı üzerinde bağlandığı bölgelerden birinin (aktif bölge oyuğu ya da periferal anyonik bölge) pi-pi (veya katyon-pi) etkileşimlerinin bozulması nedeniyle devre dışı kaldığı ve ikinci bağlama bölgesi olarak da her iki ligandın farklı bir yere bağlandığını düşündürdü. Bu bulgular göz önüne alındığında, MG ve MeG'in insan BChE'ına bağlanmasında 329. pozisyondaki fenilalaninin çok önemli bir amino asit olduğu sonucuna varıldı.Anahtar sözcükler: Bütirilkolinesteraz, bölge yönelimli mutagenez, malakit yeşili, metil yeşili, pararozanilin, enzim inhibisyonuDestekleyen Kurum: TÜBİTAK [Proje No. 107S183 (SBAG 3677)]

Abstract:
To determine structure-activity relationships of human BChE and to explore binding points of cationic triarylmethane dyes on enzyme, point mutations were created at or near the active site gorge of human butyrylcholinesterase (BChE) by site-directed mutagenesis The inhibitory effects of cationic triarylmethanes [malachite green (MG), methyl gren (MeG), pararosaniline (PR)] on recombinant wild type and mutant BChEs (A277V, P285L, P382A, H214Q, H77L, F329A) were spectrophotometrically studied at 25 °C, in 50 mM MOPS buffer pH 8, using 0.125 mM 5,5?-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), 0.05-0.4 mM butyrylthiocholine and 0-64 µM ligand. Kinetic analyses yielded the following information: With recombinant wild type and mutant BChEs, PR was found to yield results pointing to multiple bindings. MG and MeG caused linear mixed or competitive inhibition of recombinant wild type and BChE mutants except F329A. By comparing the Ki values, it was found that both recombinant wild type and mutant BChEs (except F329A) showed similar affinity against MG and MeG. With F329A, MG and MeG caused complex, nonlinear inhibition pointing to cooperative binding at two sites. The Ki values for inhibition of F329A by MG and MeG were 3.8 µM and 27 µM, respectively and it was found that these ligands bind ? 50-fold (for MG) and 150-fold (for MeG) weaker than recombinant wild type BChE. Change of inhibition pattern and also reduction in inhibitor effect due to inhibition of F329A by MG and MeG, made us assume that because of impairment of pi-pi (or cation- pi) interactions, one of the binding points of both ligands on F329A mutant becomes functionally off and both ligands bind different points as secondary binding sites. Considering these results, it was concluded that phenylalanine at position 329 is a critical amino acid in binding of MG and MeG to human BChE.Key words: Butyrylcholinesterase, site-directed mutagenesis, malachite green, methyl green, pararosaniline, enzyme inhibitionSupported by: TÜBİTAK [Project No. 107S183 (SBAG 3677)]