Bruselloza karşı aşı geliştirilmesinde antijen yüklü polimerik nanopartiküllerin immünostimülan etkinliklerinin incelenmesi
Investigation of immunostimulating activities of antigen-loaded polymeric nanoparticles in vaccine development against brucellosis
Yazar: SEDANUR ÖZTAV
Danışman: DOÇ. DR. EMRAH ŞEFİK ABAMOR ; DOÇ. DR. TÜLİN ÖZBEK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Ülkemizde Bruselloz, hayvancılıkta ciddi kayıplara sebep olan zoonotik bir hastalıktır. Mevcut Bruselloz aşıları istenmeyen durumlara sebebiyet verdiğinden Bruselloz'a karşı güçlü ve güvenli aşı adaylarının geliştirilmesi gerekmektedir. Bu ihtiyaç doğrultusunda bu tez çalışmasının amacı, Bruselloz'a karşı Brucella abortus'a ait Omp25 ve EipB rekombinant proteinlerinin PLGA nanopartiküllerine enkapsüle edilmesiyle oluşturulmuş formülasyonların aşı adayı olarak etkinliklerinin in vitro ve in vivo incelenmesidir. Bu proteinlerden EipB literatürde ilk kez rekombinant DNA teknolojisi ile elde edilmiş ve bu iki protein ilk kez PLGA polimerlerine yüklenerek nanoformülasyonları hazırlanmıştır. Üretilen nanopartiküllerin RAW-264.7 makrofaj hücreleri üzerinde in vitro sitotoksisiteleri, immünostimülan etkinlikleri incelenmiş ve uygun konsantrasyonlar seçilerek in vivo çalışmalara geçiş yapılmıştır. Serbest halde bulunan proteinler ve protein yüklü nanopartiküller BALB/c farelere enjekte edilmiştir. ELISA metodu ile fare kan serum örneklerindeki antikor seviyeleri belirlenmiş ve anlamlı düzeyde artış gözlemlendiğinde farelerin sakrifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Hücresel immün yanıtın ise Th1 yönünde ilerlemesi beklendiğinden, ELISA kitleri kullanılarak farelerin dalaklarından elde edilmiş splenositlerde IL-12, TNF-α ve IFN-γ ile IL-4 sitokin miktarlarının tayini gerçekleştirilmiştir. Eş zamanlı olarak fare dalaklarından kanlı agara ekim yapılmıştır. Kanlı agardaki koloniler üzerinde yapılan gram boyama ve biyokimyasal analiz sonuçlarıyla mevcut kolonilerin Brucella bakterisine ait olduğu doğrulanmıştır. Formülasyonların enjekte edildiği gruplardaki koloni sayılarında kontrol grubuna göre 60 kata varan düşüşler tespit edilmiştir. Sitokin miktarları değerlendirildiğindeyse hücresel bağışıklık yanıtının Th1 yönünde indüklendiği görülmüştür. Protein yüklü PLGA nanoformülasyonlarının diğer formülasyonlara göre bağışıklık sistemini nispeten daha az indüklediği belirlenmiştir. Bu durumun kontrollü salım sisteminden kaynaklandığı öngörülmektedir. Mevcut sonuçlar incelendiğinde, ilk kez üretilmiş olan EipB rekombinant proteininin immünostimülan etkinliğinin var olduğu, Omp25 proteini ile kullanıldığında da kontrol grubuna göre anlamlı düzeyde hümoral ve hücresel bağışıklık sistemini indüklediği görülmüştür. Hem nanoformülasyonlar hem de serbest haldeki proteinlerden oluşan formülasyonların Th1 yanıtını indüklediği, hümoral ve hücresel yanıtlar göz önüne alındığındaysa EipB proteininin Omp25 gibi Brucella abortus bakterisine karşı yürütülen aşı çalışmalarında PLGA ile kontrollü salım sistemlerinde kullanılabileceği gösterilmiştir.

Abstract:
Brucellosis is a zoonotic disease that causes serious losses in livestock in our country. Since the existing Brucellosis vaccines cause undesirable situations, new vaccine candidates are needed. With this need, the aim of this thesis is to examine the in vitro and in vivo efficacy of formulations formed by encapsulating Omp25 and EipB recombinant proteins of Brucella abortus into PLGA nanoparticles as vaccine candidates. EipB was obtained for the first time by recombinant DNA technology, and Omp25 were loaded into PLGA polymers for the first time. Cytotoxicity and immunostimulatory activities of formulations on RAW-264.7 macrophage cells were examined for appropriate concentrations and in vivo studies were performed. Free proteins and protein-loaded nanoparticles were injected into BALB/c mice. When a significant increase of antibody levels was observed via the ELISA method, mice were sacrificed. IL-12, TNF-α, IFN-γ, and IL-4 cytokine amounts were determined in the splenocytes of mice using ELISA kits. Simultaneously, mouse spleens were seeded on blood agar. The analysis results on the colonies confirmed that the existing colonies belonged to Brucella bacteria. In all groups, a decrease of up to 60 times was observed in the number of colonies compared to the control group. With cytokine amounts, it was observed that the cellular immune response was induced in the direction of Th1. It has been determined that protein-loaded PLGA nanoformulations have lower efficiency because of the controlled release system. It was observed with current results, the EipB recombinant protein had immunostimulant activity. When used with the Omp25 protein, it induced the humoral and cellular immune system at a significant level. It has been shown that all formulations induce the Th1 response, and considering the humoral and cellular responses, EipB protein can be used in controlled release systems with PLGA in vaccine studies against Brucella abortus bacteria such as Omp25.