Sigara dumanıyla uyarılan nazal epitel hücrelerde oksidatif stres cevabında görev alan SEEP1, NCF2, SFTPD, CC15 ve PTGS1 genlerinin metilasyon profili ve kurkumin uyarımının bu profile etkisi
Methylation profile of the SEEP1, NCF2, SFTPD, CC15 and PTGS1 genes responsible for response to oxidative stress in nasal epithelial cells stimulated with tobacco smoke and the effect of curcumin treatment on this profile
Yazar: AZMİ SERHAT YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM ÇAĞATAY KARAASLAN
Hacettepe Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; DNA metilasyon = DNA methylation ; Epigenetik = Epigenetic ; Epitel hücreleri = Epithelial cells ; Kurkumin = Curcumin ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Sigara = Cigarette

Özet:
Sigara tüketimi, bütün dünyada oldukça yaygın olan alışkanlıklardan biridir. Her ne kadar sigaranın sağlığa zararlı olduğu uzun yıllardır bilinen bir olgu olsa da, dünyada her yıl 7 milyondan fazla insan sigara tüketimi nedeniyle ortaya çıkan hastalıklardan hayatını kaybetmektedir. Sigara dumanı içerisinde bulunan binlerce kimyasal madde kanserojen ve toksik etkiye sahip olup, solunum sistemi başta olmak üzere vücudun birçok doku ve organında tahribata yol açmakta; kanser, kalp ve damar hastalıkları,  üreme sistemi bozuklukları, solunum sistemi sorunları gibi birçok hayatı tehdit eden birçok hastalığın ortaya çıkmasını tetiklemektedir. 
Sigara dumanına maruz kalmanın sonucunda, bu dumanın içerisindeki kimyasal maddelere maruz kalan hücrelerde oksidatif stres durumu ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, moleküler mekanizmalarının bozulması nedeniyle bu hücrelerde epigenetik değişiklikler meydana gelmekte, metilasyon gibi mekanizmalar ile normal gen ifadelerinde değişiklikler ortaya çıkmaktadır. Oksidatif stres mekanizmasında görev alan SEPP1, NCF2, SFTPD, CCL5 ve PTGS1 genlerinin ifadelerinde sağlıklı hücrelerde görülmeyen artış ve azalış gözlemlenmektedir. Oksidatif stres kaynaklı yaşanan epigenetik değişikliklerin kurkumin gibi antioksidan bileşikler ile önlenebileceği ve tersine çevrilebileceğini gösteren literatür çalışmaları sınırlı sayıda olup, hücre ve gen temelli çalışmalara ihtiyaç vardır.  Grubumuzun daha önceki çalışmalarında sigara dumanı ile tetiklenen oksidatif stresle ilişkili olarak antioksidan ve oksidan gen ifadelerinin değiştiğini göstermiştir Bu tez çalışmasında ifadesi değişen genler arasından beş aday gen seçilerek (SEPP1, NCF2, SFTPD, CCL5 ve PTGS1) bu genlerin antioksidan kurkumin tedavisine verdikleri cevap hücresel ve epigenetik düzeyde araştırılmıştır. Tez çalışmasında RPMI-2650 hücre hattının kurkumin ve sigara dumanı ile uyarılması sonucu hücre sitotoksisitenin belirlenmesi için canlılık testleri yapılmıştır. Canlılığın tespiti için EtBr/Kalsein AM boyaması, MTT, LDH ve ROS analizleri yapılmıştır. Hücrelerden mRNA izolasyonu ve cDNA dönüşü ile elde edilen DNA üzerinden qPCR testi yapılarak seçilen beş gene ait ifade analizi yapılmıştır. Hücrelerin toplam metilasyon profilleri ise kurkumin ve CSC uyarımlarında ayrı ayrı incelenerek, kurkuminin toplam metilasyon profili üzerindeki epigenetik etkisi araştırılmıştır. Çalışmalar kapsamında ayrıca bisülfit dönüşümü analizi yapılmış ve CSC uyarımı sonucu ortaya çıkan C-T nükleotit dönüşümünün kurkumin uyarımı ile normal haline getirilip getirilemeyeceği araştırılmıştır. Tez çalışmasında elde edilen sonuçlara göre, hem kurkumin hem de CSC yüksek konsantrasyonlarda öldürücü etki yapmakta olup, kurkumin 5 μM'dan fazla, CSC ile 50-100 μg/μL konsantrasyon aralıklarında kullanılmalıdır. Her iki uyaran için de belirtilen değerlerden yüksek olan konsantrasyonlar öldürücü etki yaratmaktadır. Çalışmada elde edilen bir diğer bulgu ise, nazal epitel hücrelerde sigara dumanı nedeniyle ortaya çıkan oksidan stres ve epigenetik değişikliklerin, kurkumin muamelesi ile tersine döndürülebileceğidir. Toplam metilasyon profilinin incelendiği deneyler sonucunda, sigara dumanına maruz kalmanın sonucu olarak nazal epitel hücrelerin toplan metilasyon profillerinde, kontrol grubuna göre ciddi ölçüde artış görülmekte, ancak bu artış kurkumin muamelesi ile önlenebilmekte ve sağlıklı seviyeye döndürülebilmektedir. Tez çalışmasının bir diğer önemli bulgusu ise, hücre içi oksidan stresin önlenmesinde görev alan SEPP1, SFTPD ve PTGS1 genlerinde, sigara dumanı ile ifade azalması gözlemlenirken, kurkumin muamalesi bu ifade azalmasını önleyici etki göstermektedir. Benzer şekilde, hücre içi oksidan stresin gelişmesinde görev alan NCF2 ve CCL5 genleri ise sigara dumanı ifade artışı yaşarken, kurkumin bu genlerin sigara dumanı nedeniyle artan ifadelerini azaltmaktadır. Dolayısıyla, kurkumin hücre içi oksidan mekanizmasını düzenleyici bir role sahip olup, CSC uyarımı sonucu normal şartlara göre ifadesi artı ya da eksi yönde değişen genlerin ifadelerini normal düzeylere getirebilmek için hem upregüle hem de downregüle etki gösterebilen bir bileşiktir. 

Anahtar kelimeler: sigara, oksidatif stres, epigenetik regülasyon, nazal epitel hücre, antioksidan, kurkumin, DNA metilasyonu

Abstract:
Smoking is one of the most common habits all over the world. Although it has been known for many years that smoking is harmful to health, more than 7 million people in the world die from diseases caused by smoking every year. Thousands of chemicals in cigarette smoke have carcinogenic and toxic effects and cause damage to many tissues and organs of the body, especially the respiratory system. Tobacco smoke triggers the emergence of many life-threatening diseases such as cancer, cardiovascular diseases, reproductive system disorders, respiratory system problems.
As a result of exposure to cigarette smoke, oxidative stress occurs in cells exposed to chemicals in this smoke. In addition, epigenetic changes occur in these cells due to the deterioration of their molecular mechanisms, and alterations in normal gene expressions occur with mechanisms such as methylation. Gene expression alterations in terms of upregulation and downregulation is observed in the expression of SEPP1, NCF2, SFTPD, CCL5 and PTGS1 genes, which are involved in the oxidative stress mechanism. Such alterations are observed in healthy cells. Although there are studies in the literature showing that oxidative stress-induced epigenetic changes can be prevented and reversed with antioxidant compounds such as curcumin, no study has been found showing whether oxidative stress-induced changes in gene expression profiles of the aforementioned five genes can be reversed by curcumin treatment.
In this thesis, changes in the expression of SEPP1, NCF2, SFTPD, CCL5 and PTGS1 genes as a result of oxidative stress in nasal epithelial cells exposed to cigarette smoke are studied to determine to what extent it is possible to reverse these changes with curcumin treatment. In the thesis study, viability tests were performed to determine the cell cytotoxicity as a result of stimulation of the RPMI-2650 cell line with curcumin and cigarette smoke. EtBr/Calcein AM staining, MTT, LDH and ROS analyzes were performed to detect viability. Expression analysis of five selected genes was performed by qPCR test on DNA obtained by mRNA isolation from cells and cDNA conversion. The epigenetic effect of curcumin on the total methylation profile was investigated by examining the total methylation profiles of the cells separately in curcumin and CSC stimulation. Within the scope of the studies, bisulfite conversion analysis was also performed and it was investigated whether the C-T nucleotide conversion resulting from CSC stimulation could be normalized by curcumin stimulation. As a result of exposure to cigarette smoke, there is a significant increase in the total methylation profiles of nasal epithelial cells compared to the control group, but this increase can be prevented and returned to a healthy level with curcumin treatment. According to the results obtained in the thesis study, both curcumin and CSC have a lethal effect at high concentrations, and curcumin should be used in concentration ranges of more than 5 μM and 50-100 μg/μL with CSC. Concentrations that are higher than the specified values for both stimuli create a lethal effect. Another finding obtained in the study is that oxidant stress and epigenetic changes in nasal epithelial cells caused by cigarette smoke can be reversed by curcumin treatment. As a result of the experiments examining the total methylation profile, a significant increase is observed in the total methylation profiles of nasal epithelial cells as a result of exposure to cigarette smoke, compared to the control group, but this increase can be prevented by curcumin treatment and returned to a healthy level. Another important finding of the thesis study is that while the expression of SEPP1, SFTPD and PTGS1 genes, which are involved in the prevention of intracellular oxidant stress, is decreased by cigarette smoke, curcumin treatment has an inhibitory effect. Similarly, while NCF2 and CCL5 genes, which are involved in the development of intracellular oxidant stress, increase in cigarette smoke expression, curcumin decreases the increased expression of these genes due to cigarette smoke. Therefore, curcumin has a regulatory role in the intracellular oxidant mechanism, and it is a compound that can show both upregulating and downregulating effects in order to bring the expressions of genes whose expression changes in the positive or negative direction as a result of CSC stimulation to normal levels.

Keywords: smoking, oxidative stress, epigenetic regulation, nasal epithelial cell, antioxidant, curcumin, DNA methylation