Suistimali artan pregabalinin idrarda analizine yönelik bir yöntem geliştirilmesi
Development of analytical method for analysis of pregabalin increasing abuse in urine
Yazar: EZGİ BENGİ
Danışman: PROF. DR. SERAP ANNETTE AKGÜR
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Bağımlılık Toksikolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Adli bilimler = Forensic sciences ; Adli toksikoloji = Forensic toxicology ; Adli tıp = Forensic medicine ; Kromatografi = Chromatography ; Kötüye kullanma = Abuse ; Pregabalin = Pregabaline ; Toksikoloji = Toxicology ; İdrar = Urine

Özet:
Bir gabapentinoid olan pregabalin; epilepsi, fibromiyalji, nöropatik ağrı, yaygın anksiyete bozukluğu gibi terapötik endikasyonlarında, 150-600 mg/gün dozunda kullanımı onaylanmış ilaç etken maddesidir. Ülkemizde ve dünyada pregabalinin suistimal, zehirlenme, yoksunluk vaka raporları giderek artmaktadır. Suistimal amaçlı kullanım terapötik dozlardan daha yüksek olup yayınlanmış vaka raporlarında dozajlar 800-7500 mg/gün arasında değişmektedir. Pregabalin içeren ilaçlardan en çok ticari ismi bilinen Lyrica ve eşdeğerleri, ülkemizde 01.04.2019 tarihiyle "Yeşil Reçete ile Verilmesi Gereken İlaçlar" listesine alınmıştır.
Pregabalin suistimalinin saptanabilmesi için biyolojik materyallerden doğru, güvenilir, hassas olarak analizi yapılmalıdır. Literatür araştırıldığında kromatografik analizinde kullanılan yöntemlerin sınırlı sayıda, mevcut olanların da verimliliğinin düşük olduğu saptanmıştır. Bu nedenle, suistimali artan pregabalinin analizine yönelik literature katkı sağlayacak bir yöntem geliştirmek önemlidir. Tez çalışmasının amacı; pregabalinin idrarda kromatografik analizine yönelik hızlı, güvenilir, hassas, maliyeti düşük, adli toksikolojide faydalanılabilecek bir yöntem geliştirmektir.
Çalışmada, etik kurul onayıyla beraber gönüllülerden alınarak oluşturulan idrar havuzuyla pregabalin kapsülleri kullanıldı. Sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometresi cihazında üç farklı  ekstraksiyon yöntemi denenip analite ait alan değeri en yüksek olan yöntem seçildi.  Bu yöntemde; 100 μl idrar örneği eppendorfa konuldu, 500 μl soğuk asetonitril eklenip 30 saniye vortekslendi. 10 dk -18 °C'de inkübe edildi. 10 dk 4100 rpm'de santrifüjlendi. Üst fazdan 500 μl başka  cam tübe alındı. Üzerine 50 μl 0.2 M HCL (MeOH'da) eklenip 30 saniye vortekslendi. 550 μl örnek, azot altında uçuruldu. 550 μl mobil fazda çözüldü, vialler içerisine alınarak kromatografik ölçümlere uygun hale getirildi. Geliştirilen yöntem  seçimlilik, doğrusallık, kesinlik, tekrarlanabilirlik, LOD, LOQ, matriks etkisi, stabilite, taşınma validasyon parametrelerince incelendi. 
Elde edilen verilerle yöntem pregabalin için oldukça seçimli bir yöntemdir. Cihazda yapılan ölçümler sonucunda 6 noktalı, 3 tekrarlı bir kalibrasyon eğrisi oluşturuldu. Kalibrasyon eğrisi doğrusal olup korelasyon katsayısı  R2=0.9984'tür. Gün-içi tekrarlanabilirlik 500 ng/ml, 2500 ng/ml, 5000 ng/ml olmak üzere üç farklı derişimde 3 tekrarlı; günler-arası tekrarlanabilirlikte 500 ng/ml, 2500 ng/ml, 5000 ng/ml derişimlerindeki 3 derişim 3 tekrarlı 5 gün boyunca çalışıldı. Çalışmada elde edilen bağıl standart sapma değerleri %1.15-8.99 aralığındadır. Yöntemin 500 ng/ml, 2500 ng/ml, 5000 ng/ml derişimlerde yapılan pregabalin geri kazanım değerleri %53.17 ve %113.47 arasındadır. Yöntemde stabilite etkisi 1000 ng/ml derişimde pregabalinin olduğu idrar örnekleri -18°C'de bekletilerek 0. 1. ve 10. gün çalışılarak analizleri yapıldı, pregabalinin stabil olduğu belirlendi. Yöntemin LOD ve LOQ'sunda 500 ng/ml derişimde elde edilen kromatogramdan pik yüksekliği ve gürültü ölçülerek S/N oranı elde edildi, formüle göre yöntemin LOD'si 4.77 ve LOQ'su 15.92 olarak hesaplandı. Yöntemde matriks etkisi, 1000 ng/ml derişimde pregabalinin idrarda ve metanoldeki analizinden elde edilen alanları karşılaştırılarak matriks etkisi olmadığı saptandı. Yöntemde taşınma etkisi, 1000 ng/ml derişimdeki enjeksiyon sonrasında çözgen enjeksiyonu yapılarak sonraki enjeksiyona taşınma olup olmadığı bakıldı, taşınma olmadığı saptandı. Valide edilen yöntem pregabalin pozitif gerçek örneklere başarı ile uygulandı.
Pregabalin reçetesi ve temininde, özellikle doktor ve eczacılar olmak üzere sağlık çalışanlarına yönelik, suistimal eden kişiler tarafından fiziksel ve psikolojik şiddet uygulandığı göz önüne alındığında gerekli yeni düzenlemelerin yapılmasının önemi artmaktadır. Pregabalin Türkiye'de ve dünyada suistimali artan bir madde olup hukuki olaylarda pregabalin analizine yönelik geçerli bir yöntemin olması önemlidir. Çalışma ile idrardan pregabalin analizi başarıyla gerçekleşmiştir. Geliştirilen yöntem etkili bir şekilde toksikoloji laboratuvarlarında rutin hizmette kullanılabilecek niteliktedir.
Anahtar Kelimeler; Adli toksikoloji; gabapentinoidler; pregabalin; Lyrica; idrar; sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometresi

Abstract:
Pregabalin, a gabapentinoid; It is an active drug substance approved for use at a dose of 150-600 mg/day in therapeutic indications such as epilepsy, fibromyalgia, neuropathic pain, generalized anxiety disorder. Case reports of abuse, poisoning and withdrawal of pregabalin are increasing in our country and in the world. Abusive use is higher than therapeutic doses, with dosages ranging from 800-7500 mg/day in published case reports. Among the drugs containing pregabalin, Lyrica and its equivalents, whose trade name is known the most, were included in the list of "Green Drugs to be Given by Prescription" on 01.04.2019 in our country.
In order to detect pregabalin abuse, an accurate, reliable and sensitive analysis of biological materials should be made. When the literature was searched, it was determined that the methods used in chromatographic analysis were limited in number and the efficiency of the existing ones was low. Therefore, it is important to develop a method that will contribute to the literature for the analysis of increased abuse of pregabalin. The aim of the thesis study; Our aim is to develop a fast, reliable, sensitive, cost-effective method for the chromatographic analysis of pregabalin in urine that can be used in forensic toxicology.
In the study, pregabalin capsules were used with the urine pool created from the volunteers with the approval of the ethics committee. Three different extraction methods were tried in a liquid chromatography-sequential mass spectrometry device and the method with the highest area value of the analyte was selected. In this method; 100 μl of urine sample was placed in eppendorf, 500 μl of cold acetonitrile was added and vortexed for 30 seconds. It was incubated for 10 min at -18 °C. It was centrifuged at 4100 rpm for 10 min. 500 μl of the supernatant was taken into another glass tube. 50 μl of 0.2 M HCL (in MeOH) was added and vortexed for 30 seconds. 550 μl of sample was evaporated under nitrogen. 550 μl was dissolved in the mobile phase, taken into vials and made suitable for chromatographic measurements. The developed method was examined in terms of selectivity, linearity, precision, reproducibility, LOD, LOQ, matrix effect, stability, transport validation parameters.
With the data obtained, the method is a highly selective method for pregabalin. As a result of the measurements made on the device, a calibration curve with 6 points and 3 repetitions was created. The calibration curve is linear and the correlation coefficient is R2=0.9984. Intra-day reproducibility 500 ng/ml, 2500 ng/ml, 5000 ng/ml in 3 different concentrations; 3 concentrations of 500 ng/ml, 2500 ng/ml, 5000 ng/ml concentrations were studied in 3 repetitions for 5 days with inter-day reproducibility. The relative standard deviation values obtained in the study are in the range of 1.15%-8.99%. Pregabalin recovery values of the method made at 500 ng/ml, 2500 ng/ml and 5000 ng/ml concentrations are between 53.17% and 113.47%. Stability effect in the method: Urine samples containing pregabalin at a concentration of 1000 ng/ml were kept at -18°C and analyzed on the 0, 1 and 10 days, and it was determined that pregabalin was stable. The S/N ratio was obtained by measuring the peak height and noise from the chromatogram obtained at 500 ng/ml concentration in the LOD and LOQ of the method, and the LOD of the method was calculated as 4.77 and the LOQ of 15.92 according to the formula. In the method, it was determined that there was no matrix effect by comparing the areas obtained from the analysis of pregabalin in urine and methanol at a concentration of 1000 ng/ml. In the method, the effect of transport, after the injection at a concentration of 1000 ng/ml, the solvent injection was performed to see if there was any transport to the next injection, and it was determined that there was no transport. The validated method was successfully applied to pregabalin positive real samples.
Considering that physical and psychological violence is practiced by abusers, especially doctors and pharmacists, in the prescription and supply of pregabalin, the importance of making the necessary new regulations increases. Pregabalin is a substance with increasing abuse in Turkey and in the world, and it is important to have a valid method for pregabalin analysis in legal cases. The analysis of pregabalin from the urine was successfully performed with the study. The developed method can be effectively used in routine service in toxicology laboratories.
Keywords; Forensic toxicology; gabapentinoids; pregabalin; urine; Lyrica; liquid chromatography-tandem mass spectrometry