Beyin kanser hücrelerinden salınan ekstraselüler vezikül içerikleri üzerine temozolomidin etkileri
Effects of temozolomide on extracellular vesicle contents released from brain cancer cells
Yazar: EZGİ KIYGA
Danışman: PROF. DR. EVREN ÖNAY UÇAR ; DOÇ. DR. ZELAL ADIGÜZEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Kanser, dünya genelinde ölüme neden hastalıklar arasında ilk sıralarda rapor edilmektedir ve moleküler mekanizmalarının tam olarak anlaşılması için in vitro deneyler büyük önem taşımaktadır. Tüm kanser türleri arasında beyin tümörleri yaygın olarak gözlemlenmemelerine rağmen glioblastomalar (GBM), yetişkinlerde en kötü huylu ve en hızlı seyreden primer beyin tümörlerindendir. Hastalara uygulanan tüm tedavilere rağmen ortalama yaşam süresi 14.6 aydır. GBM tedavisinde karşılaşılan en büyük zorluklar kan beyin bariyerinin varlığı ve tedavi sonrası gelişen dirençtir. Bir kemoterapi ajanı olan temozolomid yapısı nedeni ile kan beyin bariyerini geçebildiğinden, GBM tedavisinde kullanılan önemli bir terapötiktir.
Son zamanlarda yapılan araştırmalar kanser hücrelerine uygulanan ilaçların, farklı süreçlerde görev alan (apoptoz, DNA hasar yanıtı, hücre döngüsü regülasyonu, stres yanıtı, tömör oluşumu ve baskılanması) genlerin ekspresyon seviyesini değiştirdiğini belirtmektedir. Bu genlerdeki ekspresyonal artış genellikle tedaviye karşı direnç ile ilişkilendirilmektedir. Tedavinin başarı şansını arttırmak amacıyla bu genlerin ekspresyon seviyelerinin, baskılanması kullanılan önemli stratejilerdendir.
Ektrasellüler veziküllerin en alt birimini oluşturan eksozomlar hücreler arası iletişimde, sinyal iletiminde ve kanser dahil birçok hastalığın patolojik sürecinde rol oynamaktadır. Ekzosomlar sahip oldukları çeşitli nükleik asit, miRNA, mRNA, protein (bazı stres proteinleri (Hsp'ler) dahil) içerikleri sayesinde kanser progresyonunda, metastazında, invazyonunda ve direnç oluşumunda görev almaktadır.  Bu nedenle kanser hücrelerinden salınan eksozom içeriklerinin terapötik bir hedef olabileceği düşünülmektedir.
Tez kapsamında kanser ilacı olarak kullanılan temozolomid U87-MG ve LN229 insan glioblastoma hücrelerine uygulanarak, öncelikle hücre içerisindeki farklı stres proteinlerinin ve çeşitli RNA'ların ekspresyon seviyeleri üzerine olan etkileri belirlenmiş, daha sonra belirli hücresel protein ve RNA'ların seviyeleri bu hücre hatlarından besiyerine salınan EV içerikleriyle karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Bu bağlamda öncelikle TMZ'nin U87-MG ve LN229 insan glioma hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkileri değerlendirilmiş ve belirli TMZ konsantrasyonlarında hücrelere uygulanarak hücre içindeki stres proteinlerinin ve 92 gene ait RNA seviyelerinin ne düzeyde etkilendiği yapılan ekspresyon çalışmalarıyla saptanmıştır. Sonraki aşamada GBM hücrelerinden besiyerine salınan eksozomların izolasyonu ve karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiş ve ilaç uygulaması sonrasında seçilen proteinlerin ve RNA'ların anlatım seviyeleri değerlendirilmiştir. Yapılan deneylerde RAD51 gen ekspresyonunun sadece U87-MG hücrelerinde, MDM2 gen ekspresyonunun ise hem LN229 hücrelerinde hem de bu hücrelerden kökenlenen eksozomlarda arttığı saptanmıştır. İmmünolojik analizler TMZ uygulamasının iki glioma hücresinde de Hsp70 ekspresyonunu arttırdığını, Hsp27 ekpresyonunu ise sadece LN229 hücrelerinde arttırdığını göstermiştir. TMZ uygulamasının glioma hücrelerinden kökenlenen eksozomlardaki proteinler üzerine etkileri incelendiğinde, Hsp60 ve Hsp70 ekspresyonlarının arttığı belirlenmiştir.
Bu tez kapsamında elde edilen bulgular, glioblastoma hastalarının tedavisinde yenilikçi yaklaşımların geliştirilmesine katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Cancer, is one of the most prominent member of the diseases that causes deaths worldwide and in vitro experiments are of paramount importance to elucidate its molecular mechanisms. Although brain tumors are not commonly observed among all types of cancer, glioblastomas (GBM) are the most malignant and the fastest-progressing primary brain tumor in adults. Despite all the treatments applied to the patients, the average life expectancy is 14.6 months. The main difficulties encountered in GBM treatment are the presence of the blood brain barrier and resistance that occurs after treatment. Temozolomide, a chemotherapy agent, is an important therapeutic used in the treatment of GBM, as it can cross the blood brain barrier due to its structure.
Recent studies have indicated that drugs applied to cancer cells can change the expression levels of some genes involved in different processes such as apoptosis, DNA damage response, cell cycle regulation, stress response, tumor formation and suppression. Increased expression of these genes is generally associated with resistance to treatment. Suppression of the expression levels of these genes is one of the main strategies used in order to increase the chance of success of the treatment.
Exosomes, which forms the smallest subgroup of extracellular vesicles known so far, play a role in intercellular communication, signal transmission and pathological processes of many diseases, including cancer. Exosomes can involve in cancer progression, metastasis, invasion and resistance formation through their various nucleic acid, miRNA, mRNA, protein (including some stress proteins (Hsp)) contents. Therefore, exosome contents released from cancer cells are considered to be a therapeutical target.
Within the scope of the thesis, by applying temozolomide, which is used as a cancer drug, to human glioblastoma cells (U87-MG and LN229), primarily we determined the expression levels of different stress proteins and various RNAs in the cell and then the levels of certain cellular proteins and RNAs were compared with the EV contents released from these cell lines into the medium. In this context, firstly, the cytotoxic effects of TMZ on U87-MG and LN229 human glioma cell lines were evaluated and by applying certain TMZ concentrations to cells, the level of stress proteins and RNA levels of 92 genes in the cells were detected by expression studies. In the next stage, the isolation and characterization studies of exosomes released from GBM cells into the medium were carried out and expression levels of selected proteins and RNAs after drug administration were evaluated. In the experiments, it was determined that RAD51 gene expression increased only in U87-MG cells, while MDM2 gene expression increased both in LN229 cells and in exosomes originating from these cells. Immunological analysis showed that TMZ administration increased Hsp70 expression in both glioma cells, while Hsp27 expression increased only in LN229 cells. When the effects of TMZ application on proteins in exosomes originating from glioma cells were examined, it was determined that Hsp60 and Hsp70 expressions increased.
The findings obtained within the scope of this thesis will contribute to the development of innovative approaches in the treatment of glioblastoma patients.