Kemik doku mühendisliğinde melatonin-β siklodekstrin inklüzyon komplekslerinin etkinliğinin araştırılması
Investigation of effectiveness of melatonin-β cyclodextrin inclusion complexes in bone tissue engineering
Yazar: BEDRİYE TOPAL
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Bu çalışma, TÜBİTAK 2210-C Öncelikli Alanlara Yönelik Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı ve Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Birimi, FBA-2015-5315 numaralı proje kapsamında desteklenerek hazırlanmıştır. Sunulan tez çalışmasının amacı, antikanserojen ve antiproliferatif etkilere sahip melatoninin az olan sudaki çözünürlüğünün hidroksipropil-β-siklodekstrin (HPβCD) molekülleri ile inklüzyon kompleksi oluşturarak arttırılması ve üretilen inklüzyon komplekslerinin kitosan doku iskelelerine yüklenmesinin ardından melatoninin in-vitro salım etkinliğinin insan kemik kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisinin incelenmesidir.
Tez çalışmasının ilk aşamasında, melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksleri oda sıcaklığında fiziksel karıştırma yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur. İnklüzyon kompleksi oluşumunun dengeye ulaşıp ulaşmadığının anlaşılması için farklı sürelerde denemeler yapılmıştır. Higuchi-Connor faz çözünürlük çalışması yapılarak, oluşturulan inklüzyon kompleksinin içerdiği melatonin miktarı ve kararlılık sabitleri belirlenmiştir. Sonuç olarak, oda sıcaklığında fiziksel karıştırma yöntemi ile inklüzyon kompleksi oluşumunun 72 saatte tamamlandığı ve 0.034 M melatonin içerdiği bulunmuştur. 
Tez çalışmasının sonraki aşamasında, melatonin/HPβCD inklüzyon komplekslerinin mikrodalga yöntemiyle oluşturulması hedeflenmiştir. Bu yöntemle üretilebilecek en yüksek melatonin içeriğine sahip inklüzyon kompleksinin belirlenmesi için farklı mikrodalga güçleri ve alıkonma süreleri ile çeşitli denemeler yapılmıştır. Higuchi-Connor faz çözünürlük çalışması sonucunda, 0.043 M melatonin içeriğine sahip inklüzyon kompleksinin elde edildiği 900 W, 60˚C ve 90s mikrodalga koşulu, optimum mikrodalga koşulu olarak belirlenmiştir. Oda sıcaklığında fiziksel karıştırma ile mikrodalga yöntemleri karşılaştırıldığında, oda koşullarında 3 günde üretilen inklüzyon kompleksinin, mikrodalga koşullarında 90 saniyede oluşturulduğu görülmüştür. 
Çalışmanın bir sonraki aşamasında, mikrodalga yöntemiyle üretilen melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksi vakum altında kurutularak katı hale getirilmiştir. Bu katı inklüzyon kompleksinin fizikokimyasal özelliklerinin belirlenmesi amacıyla, Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR), diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC), termogravimetrik analiz (TGA), 1H ve 13C nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (1H ve 13C NMR) ve X ışını kırınımı (XRD) analizleri ile karakterizasyon çalışmaları yürütülmüştür. Sonuç olarak, melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksinin varlığı kanıtlanmıştır. Ayrıca, melatoninin siklodekstrin boşluğuna yapının geniş kısmından girdiği ve hidrofobik etkileşimlerin komplekste etkili olduğu görülmüştür. 
İnklüzyon kompleksinin yükleneceği doku iskelesi, ağırlıkça %2'lik kitosan çözeltilerinden dondurarak-kurutma yöntemiyle hazırlanmıştır. Melatonin ve melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksleri emdirme yoluyla kitosan doku iskelelerine yüklenmiş ve fosfat tampon çözeltilerinde in vitro salım gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak, melatonin ve melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksleri iskelelere sırasıyla 1.53±0.21 ve 2.58±0.01 mg yüklendiği ve ortama ilk 5 saatte sırasıyla 1.08 ve 2.16 mg melatoninin salındığı hesaplanmıştır. İnklüzyon kompleksi kullanıldığında, salınan melatonin miktarının daha yüksek olduğu sonucuna varılmıştır.   
Çalışmanın son aşamasında, melatonin ve melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksinin insan osteosarkom kemik kanser hücreleri (MG-63) üzerindeki sitotoksik etkisi incelenmiştir. Hücrelerin canlılığı ve çoğalması MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür) analiziyle ve hücre morfolojileri optik mikroskop görüntüleriyle değerlendirilmiştir. Melatonin ve melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksinin hücre döngüsü üzerindeki etkileri akış sitometrisi ile belirlenmiştir. Sonuç olarak; inklüzyon kompleksinin ilk günden itibaren 3 gün boyunca hücreler üzerinde apoptotik etkilere neden olduğu görülmüştür. Akış sitometrisi ile yapılan 24 saatlik çalışma sonucunda, melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksinin MG-63 hücrelerinin çoğalmasını G0/G1 hücre döngü fazında inhibe ettiği belirlenmiştir. 
Sonuç olarak, melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksi yüklü kitosan doku iskelelerinin insan osteosarkom hastalığının uzun süreli tedavisinde kullanılabilecek bir sistem olduğu düşünülmüştür.
Anahtar kelimeler: Osteosarkom, melatonin, HPβCD, inklüzyon kompleksi, kitosan doku iskelesi, ilaç salımı.

Abstract:
This thesis was supported financially within the scope of TÜBİTAK 2210-C Primary Subject Scholarship for National Master Program and FBA-2015-5315 project of Hacettepe University Scientific Research Fund. The aim of the present study is to increase the low aqueous solubility of melatonin which has antiproliferative and anticancerogenic effects by forming inclusion complexes with hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) molecules and to investigate the cytotoxic effects of melatonin releasing from the chitosan scaffold on human bone cancer cells. 
In the first part of the study, the melatonin/HPβCD inclusion complexes were formed by using physical mixture method at room temperature. Experiments were carried out in different exposure times in order to understand whether the inclusion complex formation reached the equilibrium. The melatonin amount within obtained inclusion complex and stability constants were determined by performing Higuchi-Connor's phase solubility study. The inclusion complexes obtained via physical mixture at room temperature were reached the chemical equilibrium at 72 hours and contained 0.034 M of melatonin content.
It was aimed to form melatonin/HPβCD inclusion complexes via microwave treatment. The experiments were made out in different microwave powers and exposure times to produce inclusion complex which has maximum melatonin content. According to the results of Higuchi-Connor's phase solubility diagrams, optimum microwave conditions were specified as 900 W, 60˚C and 90 s with 0.043 M melatonin content in inclusion complex. The production of inclusion complexes via physical mixture method was lasted as three days meanwhile it was lasted 90 seconds for microwave method. 
In the next part of the study, the melatonin/HPβCD inclusion complex produced at optimum microwave conditions via microwave method was solidified by vacuum drying. In order to prove the physicochemical properties of the solid melatonin/HPβCD inclusion complexes, the Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (TGA), 1H and 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H and 13C NMR) and X-ray diffraction (XRD) were performed as characterization studies. Consequently, melatonin/HPβCD inclusion complex was proved with the help of these analysis. Also, melatonin was gone into the cyclodextrin's cavity from its wide side and the hydrophobic interactions applied in the inclusion complex. 
Scaffold loading with inclusion complex was prepared from the %2 (w/v) chitosan solutions via freeze-drying technique. Melatonin and melatonin/HPβCD inclusion complexes were loaded into the chitosan scaffold via embedding technique and in vitro release was performed to the phosphate buffer solution (PBS). Melatonin and melatonin/HPβCD inclusion complexes were loaded respectively 1.53±0.211 and 2.58±0.0064 mg into the scaffolds and for first 5 hours 1.08 and 2.16 mg melatonin were diffused into the PBS medium, respectively. In comparison with melatonin loaded scaffold, inclusion complex loaded scaffold was released more melatonin to the medium.
In the last part of the study, cytotoxic effects of melatonin and melatonin/HPβCD inclusion complexes were investigated on the human osteosarcoma bone cancer cells (MG-63). The cell viability and proliferation were evaluated by MTT (3-[4,5-dimethylthiazoyl-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay and the morphological examination was evaluated with optical microscope images. The effects of melatonin and melatonin/HPβCD inclusion complexes on cell cycle were determined by flow cytometer analysis. Consequently, the inclusion complexes had apoptotic effect on tumor cells during 3 days. Besides, melatonin/HPβCD inclusion complexes were inhibited the MG-63 cell proliferation at G0/G1 cell cycle phase. 
In conclusion, melatonin/HPβCD inclusion complex loaded chitosan scaffolds could be considered as an alternative system for the human osteosarcoma therapy.
Keywords: Osteosarcoma, melatonin, HPβCD, inclusion complexes, chitosan scaffold, drug release.