Akut promyelositik lösemi hücre hattı (HL-60) ve normal insan lenfosit hücre kültüründe idarubisin sitotoksisitesine karşı bromelainin etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of bromelain versus cytotoxicity of idarubicin to on acute promyelocytic leukemia cell line (HL-60) and normal human lymphocyte cell culture
Yazar: ABDULLAH TAŞKIN
Danışman: PROF. DR. MEHMET TARAKÇIOĞLU
Gaziantep Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Hematoloji = Hematology ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Bromelin = Bromelain ; Comet tekniği = Comet assay ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre kültürü = Cell culture ; Lösemi = Leukemia ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; İdarubisin = Idarubicin

Özet:
İdarubisin (İDA), akut lösemiler ve birçok kanserin tedavisinde yaygın bir şekilde kullanılan sentetik antrasiklin antikanser bir ilaçtır. İdarubisinin primer sitotoksik etkisi, hücresel membranlardan kolayca geçip, hücre membranı ve organellerde oksidatif hasar oluşturarak, özellikle çoğalan hücrelerde DNA topoizomeraz II enzimini inhibe ederek ve DNA interkalasyonuyla nükleik asit sentezini bozarak ölümcül DNA zincir kırıklarına yol açmasından ileri gelmektedir. Bromelain, (BRO) ananas bitkisinden elde edilen, antiinflamatuvar, antikanser ve immünmodülatör etkileri gibi birçok terapötik özelliklere sahip proteolitik enzimleri içerir. Araştırmalar antikanserojenik maddelerin kemoterapi ajanlarıyla birlikte kullanımının genellikle additif ve sinerjik etkiler oluşturduğunu göstermektedir. Çalışmamızda, HL-60 akut promyelositik lösemi hücre hattı ve insan lenfosit hücre kültüründe idarubisin sitotoksisitesine karşı bromelainin muhtemel etkileri araştırıldı. İDA ve BRO'nun optimal konsantrasyonları kombine edilerek HL-60 hücre hattı ve lenfosit hücre kültüründe 24, 48 ve 72 saat süreyle inkübe edildi. Her bir inkübasyon süresi sonunda İDA-BRO kombinasyonunun HL-60 ve lenfosit hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerini tespit etmek için luminesans ATP hücre canlılık testi, genotoksik etkilerinin tespiti için Comet assay yöntemiyle DNA hasarı, ELISA yöntemiyle kaspaz-3 düzeyi ve akridin orange/ethidium bromid (AO/EB) ve DAPI floresan boyalarıyla morfolojik incelemeler yapılmıştır. Sonuçlar SPSS istatistik analiz programında nonparametrik analiz metodlarıyla değerlendirildi. İDA-BRO kombinasyonlarının sitotoksik etkisi ve DNA hasarı düzeyleri HL-60 hücre hattında, lenfosit hücre kültürüne göre hemen hemen tüm inkübasyon sürelerinde daha yüksek ve istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.05). Lenfosit hücre kültüründeki kaspaz-3 düzeyleri, 24 saatlik inkübasyon periyodu sonunda HL-60 hücre hattına göre daha yüksek iken, 48 ve 72 saatlik inkübasyon süreleri sonunda daha düşük bulundu (p<0.05). AO/EB ve DAPI floresan boyama metodlarıyla elde edilen sonuçların hücre canlılığı, DNA hasarı ve kaspaz-3 düzeyleri ile ilişkili olduğu bulundu. Sitotoksik etkili İDA'nın, BRO ile birlikte kombine edildiğinde, tek başına kullanıldığından daha fazla sitotoksik etkiyi, kombinasyonla daha düşük konsantrasyonlarda gerçekleştirdiği tespit edildi. Bulgularımız, bundan sonra yapılacak in vitro ve in vivo çalışmalar için yol gösterici olacak, lösemi tedavisinde yeni yaklaşımların geliştirilmesine, yeni moleküllerin tasarlanması ve bromelain preparatlarının kullanımı için aydınlatıcı olacaktır.

Abstract:
Idarubicin (IDA) is a synthetic anthracycline anticancer drug that is widely used in the treatment of acute leukemias and many cancers. The primary cytotoxic effect of the idarubicin is that it leads to lethal DNA chain breaks by diffusing easily from cellular membranes and by causing oxidative damage to cell membranes and organelles, particularly by inhibiting DNA topoisomerase II enzyme in proliferating cells and by disrupting nucleic acid synthesis with DNA intercalation. Bromelain (BRO) includes proteolytic enzymes that have many therapeutic properties such as anti-inflammatory, anticancer and immunomodulatory effects, originating from the pineapple plant. Studies have shown that the use of anticarcinogenic substances with chemotherapeutic agents generally has additive and synergistic effects. In our study, the possible effects of bromelain against idarubicin cytotoxicity in HL-60 acute promyelocytic leukemia cell line and human lymphocyte cell culture were investigated. Optimal concentrations of idarubicin and bromelain were combined and incubated for 24, 48 and 72 hours in HL-60 cell line and lymphocyte cell culture. At the end of each incubation period, luminescent ATP cell viability test, DNA damage by comet assay method for detection of genotoxicity, caspase-3 level by ELISA method and morphological examinations by using acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) and DAPI fluorescence staining methods were made in the detection of cytotoxicity of IDA-BRO combination in HL-60 and lymphocyte cells. The results were evaluated by nonparametric analysis methods in SPSS statistical analysis program. The cytotoxic effect of the IDA-BRO combinations on the HL-60 cell line was higher and statistically significant in all incubation times than in the lymphocyte cell culture (p<0.05). The DNA damage level of the combinations in the HL-60 cell line was also higher and statistically significant compared to the lymphocyte cell culture at almost all incubation times (p<0.05). Caspase-3 levels were higher in the lymphocyte cell culture than in the HL-60 cell line at the end of the 24 hour incubation period, but lower at the end of the 48 and 72 hour incubation periods (p<0.05). The results obtained with AO/EB and DAPI fluorescent staining methods were found to be related to cell viability, DNA damage and caspase-3 levels. We found that when combined with BRO, cytotoxic IDA was achieved at lower concentrations with combination more cytotoxic effect than when used alone. Our findings will be a guide for future study in vitro and in vivo, for the development of new approaches in the treatment of leukemia, for the design of new molecules and for the use of bromelain preparations.