Pediatrik akut Myeloid Lösemi tedavisinde kullanılan Metilprednizolon'un DNA metilasyonu üzerine etkisi
Effects of Methylprednisolone on DNA Methylation used for pediatric acute Myeloid leukemia patients
Yazar: IŞIL YÜKSELEN
Danışman: PROF. DR. ASUMAN SUNGUROĞLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: DNA = DNA ; Genler-Bcl-2 = Genes-Bcl-2 ; Genler-CDX2 = Genes-CDX2 ; Lösemi-miyeloid = Leukemia-myeloid ; Lösemi-miyeloid-akut = Leukemia-myeloid-acute ; Metilasyon = Methylation ; Metilprednizolon = Methylprednisolone ; Reseptörler-östrojen = Receptors-estrogen ; Çocuk hastalıkları = Child diseases

Özet:
Akut Myeloid Lösemi, erken hematopoetik kök hücrelerde bir dizi genetik değişiklik sonucunda normal büyüme ve farklılaşmanın bozulması, kemik iliği ve periferik kanda çok sayıda anormal olgunlaşmamış myeloid hücrenin birikimi ile karakterize olan bir hastalıktır. DNA metilasyonu, histon proteinlerinin translasyon sonrası modifikasyonu ve nükleozomların yeniden modellenmesi gibi epigenetik mekanizmalar, kromatin yapısını etkiler ve gen ifadesinde kalıtsal değişikliklere neden olur. Bu değişiklikler löseminin çeşitli alt tipleri dahil birçok kanserin gelişimine yol açabilir. DNA'daki geri dönüşümsüz yapısal değişikliklerin aksine, epigenetik değişiklikler DNA'nın kodlayan dizisinde değişikliğe neden olmadan genin fonksiyon kaybına yol açar. Akut lösemi tedavisinde kullanılan glukokortikoidler antiproliferatif etkileri sayesinde, immün baskılama, inflamasyon tedavisi ve sitotoksitenin indüklenmesi için kullanılmaktadırlar. Sentetik bir glukokortikoid olan metilprednizolonun yüksek dozda, myeloid lösemi hücrelerinin granülositlere ve makrofajlara farklılaşmasını ve myeloid lösemi hücrelerde apoptozisi indüklediği gösterilmiştir. Dexametazon ve metilprednizolon gibi glukokortikoidlerin normal ve tümörlü hücrelerde antiproliferatif etkisi de gösterilmiştir. Çocukluk çağı AML hastalarında metilprednizolonun epigenetik mekanizma üzerine etkisi bilinmemektedir.ER-? promotorünün anormal olarak metilasyonu, epigenetik olarak bu genin susturulmasıyla bağlantılıdır ve lösemilerin tanı, prognoz ve tedavisinde epigenetik belirteç olarak kullanılmaktadır. %50-90 sıklıkla akut ve kronik lösemide metile olduğu analiz edilmiştir.CDX2 embriyonik gelişimde önemli rol oynar ve yetişkinlerde intestinal epitel hücrelerin farklılaşması ve proliferasyonunu düzenler. AML'li hastaların %90'ında CDX2'nin eksprese olduğunu ama normal bireylerdeki hematopoetik ve kök hücrelerde ekspresyonun olmadığı saptanmıştır..AML'de P15, ER genlerinin sıklıkla metile olduğu bildirilmektedir ve Metilprednizolon'un bu genler üzerinde metilasyon düzeyinde etkileri konusunda herhangi bir bilgiye rastlanmamıştır.Bu projenin amacı, AML'de sıklıkla metile olduğu bildirilen p15, ER ve anormal ekspresyonu görülen Bcl-2 ve CDX2 genlerinin HL-60 hücre serisinde ve AML hastalarında steroid tedavisi öncesi ve sonrası metilasyonuna bakılarak, metilprednizolonun etkisini, epigenetik yolaktan gösterip göstermediğini araştırmaktı. Bu çalışmada, akut myeloid lösemi hücre serisi HL-60, hücre serisine metilprednizolon uygulanarak etken doz saptandı ve 24. ve 48.saatlerdeki kadar apoptotik ve farklılaşma etkisine bakıldı. Yüksek ve etken dozun hücreleri farklılaşmaya götürdüğü ancak bunu epigenetik yolak mekanizmalarından biri olan DNA metilasyonu üzerinden yapmadığı saptandı. 6 yeni tanı AML hastasının tedavi öncesi ve sonrası kemik iliği örneklerinden yapılan analizler sonucu da ilacın etkisini DNA metilasyonu üzerinden göstermediğini doğruladı.

Abstract:
Acute Myeloblastic Leukemia (AML) is a disease characterized with disruption of normal hematopoietic growth and differentiation and accumulation of numerous abnormal unmatured myeloid cells. Epigenetic mechanisms such as DNA methylation, posttranslational modifications of histone proteins and remodeling of nucleosomes affect chromatin structure and cause heritable changes in gene expression. Epigenetic mechanisms, in particular DNA methylation, plays a major role in the modulation of gene activity in cancer and silence a large number of tumor supressor genes in acute leukemias. In contrast to irreversible structural alterations in DNA, epigenetic alterations don?t cause changes in coding DNA sequence and result in loss of gene function which can be reversed pharmacologically. But epiegenetic changes can reverse pharmacologically with demethylating agents which are in use therapy of hematological malignancies. Methylprednisolone is a synthetic glucocorticoid drug which has been used with short course and high dose for treating newly diagnosed children with AML, different AML subtypes and relapsing patients. Methylprednisolone induces differentiation of myeloid leukemia cells to granulocytes and macrophages and induce apoptosis of myleoid leukemia cells with or without differentiation. It has been shown that glucocorticoids such as dexamethasone and methylprednisolone exert anti-proliferative effects on normal and tumor cells. It?s still unknown if methylprednisolone has any effect on gene expression or it performs its effects through an epigenetic mechanism. CDX2 gene expression is abnormally seen in acute leukemias. In this study, methylation p15, CDX2, ER and Bcl-2 are investigated before and after methylprednisolone treatment in HL-60 cell line and in 6 AML patient and it is demonstrated if methylprednisolone shows its effect with epigenetic pathway. It?s known that P15, ER genes are aberrantly methylated in AML and their methylation can be reversed with demethylating agents. Methylation analysis is done two times before and after methylprednisolone treatment. First, apoptosis determination is done with Annexin V. HL-60 specific surface antigens and mature myeloid cell surface antigens analyzed with flow cytometry analysis. Following this step, the high and effective dose for HL-60 cells established as 5x10-3. For this dose, DNA isolation is done. After isolation, methylation pattern studied for p15, ER, CDX2 and Bcl-2 genes. 6 AML patients bone marrow samples before and after MP treatment are done metylation spesific pcr for p15, ER, CDX2 and Bcl-2 genes. In conclusion both patient samples and HL-60 cell line shows that MP doesn?t effect DNA methylation.