Hidroksiapatit katkılı poli(gliserol-sebakat)/poli(laktik asit) karışımından üç boyutlu basım ile kemik doku iskelesi üretimi ve ın vıtro karakterizasyonu
Construction and in vitro characterisation of hydroxyapatite/poly(glycerol-sebacate)/poly(lactic acid) based bone tissue scaffolds via three-dimensional printing
Yazar: KÜBRA KIRATLI
Danışman: PROF. DR. ÖZCAN GÜNDOĞDU ; PROF. DR. HALİME KENAR
Kocaeli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyomalzemeler = Biomaterials ; Kemik dokusu = Bone tissue ; Kök hücreler = Stem cells ; Polilaktik asit = Polylactic acid

Özet:
Kemik doku mühendisliği, kemik hasarının mekanik stabilite içinde ve doğal doku oluşumu yolu ile yenilenmesini amaçlayan, üzerine çalışmaların gün geçtikçe arttığı bir tedavi yaklaşımıdır. Biyobenzer ve biyobozunur bir kemik doku iskelesi üretmeyi hedeflediğimiz bu çalışmada polilaktik asit (PLA) tabanlı üç boyutlu kompozit iskeleler üç boyutlu basım yötemi ile basılan kalıplar yardımıyla üretilerek iskelelerin hücre canlılığına ve osteojenik farklılaşmasına etkisi incelenmiştir. PLA tabanlı polimer karışımında kullanılmak üzere poli(gliserol sebakat) metakrilat (PGS-MA) sentezlenmiş ve kimyasal olarak karakterizasyonu yapılmıştır. İskelelere osteoindüktif özellik kazandırmak amacıyla hidroksiapatit (HAP) katkılanmıştır. PLA, PLA/PGS-MA ve PLA/PGS-MA/HAP iskelelerin biyouyumluluğu ve osteojenik farklılaşmaya etkisinin incelenmesinde kullanılmak üzere ATADEK-2020/12 sayılı etik kurul izni ile insan adipoz doku kökenli mezenkimal kök hücreler (AD MKH) izole edilmiş ve hücre karakterizasyon testleri gerçekleştirilerek hücrelerin mezenkimal kök hücre olduğu kanıtlanmıştır. İskelelerin fiziksel ve mekanik özellikleri sırası ile taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve mekanik test ile belirlenmiştir. PGS-MA katkısının PLA iskelenin mekanik dayanımını arttırdığı gösterilmiştir. 
PLA/PGS-MA iskelelerin hücre tutunmasına olumlu etkisinin saf PLA iskeleye göre daha iyi olduğu, hücre çoğalma hızına olumlu etkisinin ise PLA/PGS-MA/HAP katkılı kompozit iskeleye göre daha iyi olduğu hücre çoğalma testi ile belirlenmiştir. Canlı-ölü hücre boyaması hiçbir iskele türünün hücre canlılığına olumsuz etkisinin olmadığını göstermiştir; hücre ölümü genel olarak PLA/PGS-MA/HAP iskelelerde gözlemlenen hücre kümelerinin iç kısmında tespit edilmiştir. PLA/PGS-MA iskele yüzeyinde hücre uzanması (yayılması) diğer iki iskele yüzeyine kıyasla daha başarılı gerçekleşmiştir. Osteojenik farklılaşmanın erken belirteci olan alkalin fosfataz enzim aktivitesi PLA/PGS-MA/HAP iskelesinde en düşük seviyede belirlenmesine rağmen kemik minerali oluşumu en yüksek seviyede yine bu iskele üzerinde tespit edilmiştir. PLA'nın %1 oranında PGS-MA ile katkılanmasının mekanik dayanımını, yüzeyinde hücre tutunması ve çoğalmasını arttırdığı ve kemik oluşumuna olumlu etkisi olduğu belirlenmiştir. Bu iki bileşene HAP eklenmesi ile de doku iskelesi üzerinde kemik dokusu oluşumu hızlandırılmıştır.

Abstract:
Bone tissue engineering is a treatment approach that aims to regenerate bone damage in mechanical stability and through natural tissue formation, on which studies are increasing day by day. In this study, where we aimed to produce a biosimilar and biodegradable bone tissue scaffold, three-dimensional composite scaffolds based on polylactic acid (PLA) were produced with the help of molds printed with the three-dimensional printing method and the effect of the scaffolds on cell viability and osteogenic differentiation was investigated. Poly(glycerol sebacate) methacrylate (PGS-MA), to be used in PLA-based polymer mixture, was synthesized and chemically characterized. Hydroxyapatite (HAP) was added to the scaffolds to give osteoinductive properties. With the permission of the ethics committee numbered ATADEK-2020/12; human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (AT MSCs) , to be used in the biocompatibility studies of PLA, PLA/PGS-MA and PLA/PGS-MA/HAP scaffolds and their effect on osteogenic differentiation, were isolated and cell characterization tests were performed to prove that these cells are mesenchymal stem cells. The physical and mechanical properties of the scaffolds were determined by scanning electron microscopy (SEM) and mechanical testing, respectively. It has been shown that PGS-MA addition increases the mechanical strength of the PLA scaffolds.
It was determined by the cell proliferation test that the positive effect of PLA/PGS-MA scaffolds on cell adhesion was better than the pure PLA scaffold, and the positive effect on cell proliferation rate was better than PLA/PGS-MA/HAP composite scaffolds. Live-dead cell staining showed that neither of the scaffolds had an adverse effect on cell viability; cell death was detected in the interior of the cell clusters generally observed on the PLA/PGS-MA/HAP scaffolds. Cell spreading on the PLA/PGS-MA scaffold surface was more successful than on the other two scaffold surfaces. Although alkaline phosphatase enzyme activity, which is an early marker of osteogenic differentiation, was determined at the lowest level in PLA/PGS-MA/HAP scaffolds, bone mineral formation on this scaffold was determined at the highest level. It was determined that the addition of 1% PGS-MA to PLA increased its mechanical strength, cell adhesion and proliferation on its surface, and had a positive effect on bone formation. With the addition of HAP to these two components, bone tissue formation on the tissue scaffold was accelerated.