In vıtro sığır blastosist üretimi üzerine tanımlanmış medyumların etkisi ve blastosistlerin farklı kriyoprezervasyon teknikleri ile dondurulması
In vıtro sığır blastosist üretimi üzerine tanımlanmış medyumların etkisi ve blastosistlerin farklı kriyoprezervasyon teknikleri ile dondurulması
Yazar: TOLGA AKKOÇ
Danışman: PROF. DR. M. İHSAN SOYSAL ; PROF. DR. HAYDAR BAĞIŞ
Namık Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Blastosist = Blastocyst ; Döllenme = Fertilization ; Klonlama = Cloning ; Sığırlar = Cattles ; Üreme = Reproduction ; Üretim = Production ; İn vitro = In vitro

Özet:
Blastosist safhasındaki sığır embriyolarının eldesi ve soğuğun zararlı etkilerinden korunması, hayvansal üretimde, klonlamada, transgenik teknolojide, tıbbi biyoteknolojide ve gen bankacılığında oldukça önem taşımaktadır.Bu çalışmanın amacı, farklı in vitro döllenme (IVF) yöntemlerinin ve solüsyonlarının in vitro sığır blastosist üretimi üzerine etkilerini ve blastosistlerin katı yüzey camsı yapı dondurma ve klasik camsı yapı dondurma yöntemleri kullanılarak dondurulup çözündürülmesi ve çözündürme sonrası canlılık oranları ve toplam çekirdek sayılarının yani blastosistlerin iç hücre sayılarının araştırılmasıdır.Çalışmada, yumurtaların in vitro olgunlaştırma ve döllenme sürelerinin, farklı (QACM, QABM, KSOM ve SOF) kültür solüsyonlarının, solüsyona katılan betamerkaptoethanolün blastosist oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu çalışmaları takiben elde edilen blastosistlerin katı yüzey camsı yapı dondurma ve klasik camsı yapı dondurma yöntemlerinin blastosist canlılık ve hücre sayılarına etkisi araştırılmıştır.Elde edilen veriler doğrultusunda QACM, QABM, KSOM ve SOF kültür solüsyonlarının blastosist gelişimi üzerine etkisinin araştırıldığı çalışmada, QACM (Quinn'in Avantaj Yarıklanma Solüsyonu) ve QABM'de (Quinn'in Avantaj Blastosist Solüsyonu) 72 saat ara ile yapılan kültür sonucunda %15.9 oranında blastosist eldesi gerçekleşirken, KSOM (Potasyumu optimize edilmiş Solsyonu)-SOF (Koyun Oviduk Solüsyonu) solüsyonlarında 48 saat ara ile yapılan kültür sonucunda %1.7 oranında blastosist elde edilmiştir (P<0.05). Katı yüzey camsı yapı dondurma ve klasik camsı yapı dondurma yöntemleri ile dondurulan blastosistlerin çözüldükten sonraki canlılık oranları sırasıyla %82.6 ve %34.8 olmakla birlikte dondurulup çözündürülme işlemi uygulanmayan blastosistlerin bulunduğu kontrol grubunda %100 olmaktadır. Katı yüzey camsı yapı dondurma yönteminin uygulandığı blastosistlerin ortalama çekirdek sayısı (124) klasik camsı yapı dondurma yönteminin uygulandığı blastosistlerden (104) yüksek bulunmuştur. Kontrol grubu yani herhangi bir dondurma ve çözündürme işlemine tabi tutulmamış blastosistlerin toplam iç hücre (çekirdek) sayıları ise 213 olarak tespit edilmiştir (p<0.05).Sonuç olarak, IVF yöntemi kullanılarak elde edilen embriyoların QACM ve QABM solüsyonlarında 72 saat ara ile yapılan kültür sonucunda elde edilen blastosist oranın, KSOM-SOF solüsyonlarında 48 saat ara ile yapılan kültür sonucuna göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Ayrıca canlılığını sürdüren yani düzgün zona pelisudaya sahip, parlak görünümlü blastosist oranı ve ortalama iç hücre sayısı, katı yüzey camsı yapı dondurma yönteminin kullanıldığı grupta, klasik camsı yapı dondurma yönteminden yüksek olmuştur. İki dondurma grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmaktadır. Çalışmanın sonuçları elde edilen IVF ve embriyo dondurma protokollerinin hayvan üreme biyoteknolojisinde ve transgenik hayvan üretimin de efektif olarak kullanılabileceğini göstermektedir.Anahtar Kelimeler: Blastosist, Klonlama, Transgenik Teknoloji.

Abstract:
In vitro production and cryopreservation of bovine blastocysts are important for animal breeding, cloning, transgenic technology, medical technology and gene banking.The aim of this study is to investigate the effect of different in vitro fertilization (IVF) methods and solutions on producing bovine blastocysts, and vitrification and warming of blastocysts both solid surface vitrification (SSV) and classic vitrification techniques. And finally to research the viability rate and total nuclei number of warmed blastocysts.In this study, the effect of maturation period and betamercaptoethanol on oocyte maturation and blastocysts development, the effect of QACM, QABM, KSOM and SOF embryo culture mediums and fertilization period and finally the effect of different culture mediums on blastocysts development were investigated. As a continuation of this study blastocysts were vitrifed with SSV and classic vitrificaiton techniques. The effect of these vitrification techniques on survivability and total nuclei number of blastocysts investigated.In comparison of different culture mediums on blastocysts development, in in vitro culture with QACM (Quinn?s Advantage Cleavage Medium) and QABM (Quinn?s Advantage Blastocyst Medium) at 72 hour produced higher blastocysts stage embryo rate (15.9 %), while KSOM-SOF solution showed 1.7% of blastosist stage after 48 hours (p<0.05). The viability rate of blastocysts that vitrified with SSV and Classic vitrification techniques were 82.6% and 34.8% respectively. Viability rate of Non-vitrified blastocyst as a control group were found 100%. Total nuclei number of vitrified-warmed, non vitrified group and control were 124,104 and 213 respectively (p<0.05).As a result, the blastocysts rate of in vitro produced IVF embryos by culture with QACM and QABM for 72 hours found to be higher than cultured embryos with KSOM (Potassium Simolex Optimised Medim) and SOF (Sheep Oviduct Fluid) for 48 hours. However, in SSV group, both blastocysts viability rate and total nuclei or inner cell mass number was higher than Classic vitrification group blastocysts. In conclusion, used protocols showed both IVF and vitrification techniques can be used in animal reproduction biotechnology and transgenic animal production effectively.Key Words: Blastocyst, Cryopreservation, Cloning, Transgenic Technology.