Yeni sentezlenen melatonin analoglarının aromataz aktivitesi üzerine etkilerinin araştırılması
Invastigation of the effects of newly synthesized melatonin analogues on aromatase activity
Yazar: SENEM ÖZCAN SEZER
Danışman: PROF. DR. HANDE GÜRER ORHAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Aromataz = Aromatase ; Endokrin sistem = Endocrine system ; Endokrin sistem hastalıkları = Endocrine system diseases ; Melatonin = Melatonin ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Endokrin bozucu (EB) terimi, sağlıklı organizmada veya gelecek nesillerinde advers sağlık etkilerine, endokrin fonksiyonlarda değişikliklere sebep olan ekzojen maddeleri tanımlar. EB bir kimyasal madde hormon reseptörleri ile etkileşerek agonist ya da antagonist etki gösterebileceği gibi steroid hormonların biyosentez ve metabolizma yolaklarında yer alan enzimlerle etkileşerek fizyolojik hormon düzeylerini değiştirmek yoluyla da etkisini gösterebilmektedir. Dünyada kadınlar arasında insidansının arttığı ve kansere bağlı ölümlerde ilk sırada yer aldığı belirlenen meme kanserinin tedavisinde de bu yaklaşımlardan faydalanılmaktadır. Meme dokusunda yüksek oranda bulunan aromataz enziminin inhibe edilerek östrojenin özellikle postmenopozal dönemde lokal üretiminin engellenmesi hormon bağımlı (östrojen reseptör pozitif; ER+) meme kanserinin tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda yapılan deneysel çalışmalarda indol yapılı bir hormon olan melatoninin aromataz enzimini inhibe ettiği ve ER (+) meme kanseri hücrelerinin proliferasyonunu engellediği saptanmıştır. Bu tez kapsamında yeni sentezlenen indol türevi melatonin analoglarının aromataz aktivitesi üzerine etkileri iki farklı yöntem ile araştırılmıştır. Bunlardan ilki doğrudan aktivite ölçümü olup floresans substrat ve rekombinant insan enziminin kullanıldığı, enzim aktivitesinin spektroflorimetrik olarak ölçülmesine dayanan in vitro bir hızlı tarama testidir. İkinci yöntem ise insan meme kanseri hücresi olan MCF-7 BUS hücrelerinin östrojensiz ortamda testosteron varlığında proliferasyonu değerlendirilerek enzim aktivitesinin dolaylı olarak ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Öncelikle her iki yöntemin duyarlılığı ve ölçüm başarısı bilinen aromataz inhibitörleri kullanılarak değerlendirilmiş, yöntemlerin laboratuvarımızda kısmi validasyonları yapılmıştır. Ardından yeni sentezlenen melatonin analoglarının olası aromataz inhibitör etkinliği hızlı tarama testi ile araştırılmıştır. Bulgular in silico yöntemi ile enzime bağlanmanın özellikleri ortaya konmuştur.  Hızlı tarama testi ile aromataz etkileri belirlenen maddelerin (hit) olası etkileri hücre temelli in vitro test ile de araştırılmıştır. Bulgularımız hücre içermeyen ve hücre temelli her iki yöntemin de aromataz inhibisyonunu değerlendirmede başarılı olduğunu ancak aktivitenin dolaylı ölçümünde testi etkileyen birden fazla faktörün bulunduğunu, bunların da değerlendirilmesi ile sağlıklı yorum yapılabileceğini göstermiştir. Tüm bulgular değerlendirildiğinde yeni sentezlenen analoglar arasından aromataz inhibitörü olduğu belirlenenler yeni etkin madde olarak önerilebileceği için ilaç keşif çalışmalarında erken dönem toksisite göstergesi olarak kullanılan sitotoksik etkileri de araştırılmıştır. İnsan meme kanseri hücreleri (MCF-7 BUS) ve sağlıklı over hücrelerinde (Çin hamster over-CHO-K1) canlılık üzerine etkileri araştırılan tüm analoglar arasından 2-Metil-1-H-indol-3-karboksialdehit (3-klorofenil) hidrazon (M5) ve 2-Metil-1-H-indol-3-karboksialdehit (4-klorofenil) hidrazon (M6)'un sağlıklı hücrelerde sitotoksik etki göstermeksizin aromataz enzim inhibitörü etkileri olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak bu bileşiklerin, özellikle postmenopozal dönemdeki kadınlarda, ER (+) insan meme kanseri hücrelerinin gelişim ve çoğalmasını önlemek suretiyle yeni etkin madde adayı olabilecekleri düşünülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Endokrin bozucular; Aromataz enzimi; ER (+); Meme kanseri; Aromataz inhibitörü, Melatonin

Abstract:
Endocrine disruptors (EDs) are exogenous substances or mixtures that alter function of endocrine system and consequently cause adverse health effects in an intact organism, or subpopulation. An ED can either interact with receptors and act as an estrogen receptor agonist/antagonist or modulate enzymes that involve in biosynthesis and metabolism of steroid hormones and alter physiologic levels of hormones. These mechanisms of ED actions are also used as therapeutical approaches in breast cancer which is the leading cancer site in women and is the leading cause of death among female cancers. Aromatase, a CYP enzyme highly expressed in the breast tissue and responsible for the local estrogen synthesis especially in postmenopausal women, can be inhibited as a treatment strategy in hormone dependent (estrogen receptor positive; ER +) breast cancer therapy. Recent data show that melatonin, an indolic hormone, inhibits aromatase activity and decreases ER (+) breast cancer cell proliferation. In the present study aromatase inhibitory activity of newly synthesized indol derivative melatonin analogues is investigated with two different assays. The first one is a high throughput screening assay where a fluorescence substrate and recombinant human enzyme is used and the enzyme activity is detected directly by spectrophotometer. In the second assay enzyme activity is indirectly evaluated via proliferation of the MCF-7 BUS cells in an estrogen-free medium in the presence of testosterone. First of all the sensitivity and performance of both assays were evaluated by testing known aromatase inhibitors and partial validation of the methods was performed. Potential aromatase inhibitory effect of newly synthesized indole derivatives were investigated by high throughput screening test. The putative ligand-protein binding interactions of the experimentally confirmed hits were investigated with docking studies. The hits that are determined by high throughput screening was further analysed in cell-based indirect measurement assay. Our findings suggest that both assays, cell-free and cell based are successful in evaluating aromatase inhibitory activity but there are many factors affecting the indirect measurement assay and a reliable evaluation can be made after evaluating all these confounding factors. Gathering all data we obtained, some newly synthesized indole derivatives can be suggested as novel active substances and therefore their cytotoxicity potential is also evaluated as an early stage toxicity indicator. Their cytotoxic potential is investigated both in in human breast cancer cells (MCF-7 BUS) and healthy over cells (Chinese hamster ovary-CHO-K1). Among all tested compounds 2-methyl-1-H-indole-3-carboxyaldehyde (3-chlorophenyl) hydrazone (M5) and 2-methyl-1-H-indole-3- carboxyaldehyde (4-chlorophenyl) hydrazone (M6) were found to have no cytotoxic effects in healthy cells but have aromatase inhibitory potential. As a result these two compounds can be suggested as new therapeutic candidates in preventing development and progression of ER (+) human breast cancer, especially in postmenopausal women.  

Key Words: Endocrin distrupters; Aromatase enzyme; ER (+); Breast cancer; Aromatase inhibitor, Melatonin