Tunceli ilindeki alabalıklarda plazmit kaynaklı kolistin direnç genlerinin multipleks polimeraz zincir reaksiyonu ile saptanması
Determination of plasmit-delivered colistine resistance genes in trout in Tunceli by multiplex polymeraze chain reaction
Yazar: ESRA TOPRAK
Danışman: PROF. DR. ÜLKÜ ÖZBEY ; PROF. DR. GÖKBEN ÖZBEY
Munzur Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Antimikrobiyal etki = Antimicrobial effect ; Dirençlilik = Resistance ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Kolistin = Colistin ; Tunceli = Tunceli

Özet:
Antimikrobiyal direnç (AMR) küresel bir sağlık sorunudur. Su ekosistemleri AMR`nin yayılmasında ideal bir ortam sağlayabilir. Balık çiftliklerinde terapötik ajanlar olarak yeme ilave edilen antimikrobiyaller su içerisine eklenmektedir. Antibiyotik kalıntıları aquatik ortamlarda kalmakta ve bu atık sular akarsulara karışarak üretim tesislerine taşınabilmekte ve direnç genleri o ortamda bulunan bakterilere aktarılabilmektedir. Yapılan araştırmalara göre Türkiye'de su ürünlerinin antimikrobiyal dirençliliğinin belirlenmesi konusunda yeterli bir çalışma olmamakla birlikte yapılan çalışmalarda sınırlıdır.
Bu çalışmada; Tunceli ili Pertek, Çemişgezek, Ovacık, Mazgirt ilçelerindeki ağ kafes ve beton havuzlarda Gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliği yapılan 16 tesisden Haziran, Temmuz, Aralık ayları süresince temin edilen 200 adet yavru veya ergin Gökkuşağı alabalıklarının bağırsak, deri ve solungaç kısımlarından alınan 600 adet numune ve 64 adet su örneğinden konvansiyonel yöntemlerle bakteri izolasyonu ve bakterilerin Matriks Aracılı Lazer Desorbsiyon İyonizasyon-Uçuş Zamanlı-Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF MS) analiziyle identifikasyonunu gerçekleştirilmesi, identifiye edilen enterobacteria familyasına ait bakterileri türlerinden ekstrakte edilmiş DNA kullanılarak multipleks PZR yöntemiyle mcr gen varlığınının ortaya konulması, bu familyaya ait bakteri izolatlarının kolistin minimum inhibitör (MİK) konsantrasyonununun sıvı mikrodilüsyon ve antimikrobiyal duyarlılıklarının Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemleriyle tespit edilmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmada; MALDI-TOF MS analiziyle Moraxellaceae, Enterococcaceae, Vibrionaceae, Comamonadaceae, Pseudomonas, Staphylococcaceae, Pseudomonadaceae ve Enterobacteriaceae olmak üzere 8 bakteri familyasına ait ağ kafeslerden 290 (% 59,67), beton havuzlardan ise 196 (% 40,33) olmak üzere toplamda 486 adet bakteri identifikasyonu gerçekleştirildi. 114 adet numunede ise bakteri üremesi görülmedi. Multipleks PZR metoduyla enterobacteria familyasına ait bakterilerde mcr geni tespit edilemedi. MİK konsantrasyonu sıvı mikrodilüsyon testi sonucunda MİK değerinin 2'den küçük olarak bulunmasıyla kolistin duyarlılığı ortaya konuldu. Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemiyle belirlenen antimikrobiyal duyarlıklar sonucunda enterobacteria familyasına ait izolatların kinolon grubu antibiyotiklere karşı direnç geliştirdikleri saptandı. Ülkemizde ve Doğu Anadolu havzasında E. coli, Enterobacter ve Salmonella türlerini içeren enterobacterales'lerde kolistin direnç gen varlığının ilk olarak belirlenmeye çalışılacak olması projenin özgün yönünü ortaya koymaktadır. Konvansiyonel ve moleküler tanımlama yöntemleri ile kıyaslanacak olursa MALDI-TOF MS örnek başı maliyeti ve tanımlama için geçen süre yönünden çok daha etkin görülmektedir. Özellikle enterobacteria familyasına ait bakterilerin tiplendirilmesinde % 100 sonuç alınabilen MALDI-TOF MS analizi moleküler çalışmalarda öne çıkmıştır. Tunceli ilinin Mazgirt, Çemişgezek, Ovacık ve Pertek ilçelerindeki gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliği yapılan işletmeleri kapsayan çalışmamızda plazmid aracılı kolistin direnç potansiyelini ve tehlikesini ortaya koyarak ülkemizin antimikrobiyal direnç önleme stratejilerine katkı sağlanacaktır.

Anahtar kelimeler:  Antimikrobiyal dirençlilik, Escherichia coli, Kolistin, Multipleks PZR, MALDI-TOF MS Analizi

Abstract:
Determination of Plasmit-Delivered Colistine Resistance Genes in Trout in Tunceli by Multiplex Polymeraze Chain Reaction
Antimicrobial resistance (AMR) is a global health problem. Aquatic ecosystems can provide an ideal environment for the spread of AMR. Antimicrobials added to the feed as therapeutic agents in fish farms are added into the water. Antibiotic residues remain in aquatic environments, and these wastewaters can be mixed with rivers and transported to production facilities, and resistance genes can be transferred to bacteria in that environment. According to the researches, there is not enough study on the determination of the antimicrobial resistance of fishery products in Turkey, but the studies are limited. 
In this study, bacteria isolation is it was aimed to determine by conventional methods from 64 water samples and 600 samples taken from the intestine, skin and gill parts of 200 juvenile or adult rainbow trout obtained from 16 facilities where rainbow trout breeding in net cages and concrete ponds in Pertek, Çemişgezek, Ovacık, Mazgirt districts of Tunceli province during the months of June, July, and December. isolation from 600 samples taken from the intestine, skin and gill parts of 200 juvenile or adult rainbow trout and 64 water samples obtained from 16 facilities where rainbow trout are raised in net cages and concrete ponds in Pertek, Çemişgezek, Ovacık, Mazgirt districts of Tunceli province during the months of June, July and December, to identification of bacteria by Matrix Mediated Laser Desorption Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometer (MALDI-TOF MS) analysis, To reveal the presence of mcr gene by multiplex PCR method using DNA extracted from bacteria species belonging to the identified enterobacteria family, to determine the colistin minimum inhibitory (MIC) concentration, liquid microdilution and antimicrobial susceptibility of bacterial isolates belonging to this family by Kirby-Bauer disk diffusion methods. In this study; 290 (59.67%) of the mesh cages belonging to 8 bacterial families, including Moraxellaceae, Enterococcaceae, Vibrionaceae, Comamonadaceae, Pseudomonas, Staphylococcaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae and 96 (40.33%) of concrete pools, a total of 486 bacterial identification was performed by MALDI-TOF MS analysis.  Bacterial growth was not observed in 114 samples. The mcr gene could not be detected in bacteria belonging to the enterobacteria family by multiplex PCR method. Colistin susceptibility was revealed by the MIC concentration being less than 2 as a result of the liquid microdilution test. As a result of the antimicrobial sensitivities determined by the Kirby-Bauer disc diffusion method, it was determined that the isolates belonging to the enterobacteria family developed resistance to the quinolone group antibiotics.The first attempt to determine the presence of colistin-resistance genes in enterobacterales containing E.coli, Enterobacter and Salmonella species in our country and in the Eastern Anatolia basin is to reveal the original aspect of the project. When it compared with conventional and molecular identification methods, it is more effective on per sample costs and elapsed time on working. In particular, MALDI-TOF MS analysis, which can achieve 100% results in typing bacteria belonging to the Enterobacteria family, has come to the fore in molecular studies. In our study, which covers rainbow trout farms in Mazgirt, Çemişgezek, Ovacık and Pertek districts of Tunceli province, we will contribute to our country's antimicrobial resistance prevention strategies by revealing the resistance potential and danger of plasmid-mediated colistin.

Keywords: Antimicrobial resistance, Escherichia coli, Colistin, Multiplex PCR, MALDI-TOF MS Analysis.