Saanen keçilerinde embriyoların vitrifikasyon yöntemiyle dondurulması
Freezing of embryos by vitrification method in saanen goats
Yazar: AYŞE MERVE KÖSE
Danışman: PROF. TEVFİK TEKELİ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Donma = Freezing ; Embriyo = Embryo ; Keçiler = Goats ; Ovulasyon = Ovulation ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine ; Veterinerlik = Veterinary ; Vitrifikasyon yöntemi = Vitrification method

Özet:
Sunulan tez çalışmasında üreme sezonu içinde bulunan Saanen keçilerinde süperovulasyon sonrası elde edilen ve vitrifikasyon yöntemiyle dondurulup çözdürülen embriyoların viyabilitelerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Çalışmanın hayvan materyalini, sağlıklı ve fertil, 2-3 yaş aralığında 15 baş Saaanen ırkı keçi ve 2 teke oluşturdu. Hayvanlara FGA içeren süngerler intravaginal olarak 11 gün süreyle uygulandı. Sünger uygulamasının 9. gününden itibaren süperovulasyon amacıyla 3 gün süreyle azalan dozlarda (2,5;1,5;1ml) sabah/akşam olmak üzere toplam 200 mg FSH kas içi enjeksiyon şeklinde uygulandı. İlk FSH enjeksiyonu ile birilkte 2,2 ml PGF2α IM olarak uygulandı. Onbirinci gün intravaginal süngerler çıkartıldı ve 12. gün sabah 2 ml GnRH IM olarak uygulandı. Gonadotropin salınım hormonunun uygulamasından 4 saat sonra keçilere günde iki kez doğal aşım yaptırıldı. Embriyoların toplanması için ilk aşımı izleyen 7. günde uterus yıkaması yapıldı. Uterus yıkama işlemi laparotomi yöntemi uygulanarak gerçekleştirildi. Elde edilen embriyolar mikroskop altında incelendikten sonra gelişim aşamalarına ve morfolojik yapılarına göre sınıflandırıldı. Elde edilen Grade 1 ve Grade 2 kalitedeki embriyolar vitrifikasyon yöntemi ile donduruldu. Vitrifikasyon işlemi sırasında ekilibrasyon solüsyonu olarak VS1; %20 EG ve VS2; %20 EG+ %10 G, vitrifikasyon solüsyonu olarak VS3; %25 EG + %25 G kullanıldı. Embriyolar VS1 ve VS2' de 5 dk ve VS3'de 30 sn bekletilip sıvı azotta donduruldu. Embriyolar 0,5 M ve 0,25 M' lık sukroz solüsyonlarında ve ardından m-DPS solüsyonlarında 5' er dk bekletilerek çözdürüldü. Daha sonra kültür medyumuna alınan embriyolar viyabilitelerinin takibi için %5 CO2 inkubatörüne alındı.
Vitrifikasyon yöntemiyle dondurulup çözdürülen 101 adet embriyonun in vitro ortamda 24. 48. ve 72. saatlerindeki viyabiliteleri sırasıyla %59,4; %33,6; %25,7 olarak belirlendi. 24. saatteki viyabilite oranlarının (p<0,05), 48. ve 72. saatteki oranlara göre daha yüksek olduğu tespit edildi. Gelişim aşamalarına göre morula ve blastosist dönemindeki embriyoların 24. 48. ve 72. saatteki viyabilite oranları morula aşamasındaki embriyolar için sırasıyla %51,3; 20,5; 15,4; blastosist aşamasındaki embriyolar içinse %64,5; 41,9; 32,3; olarak belirlendi. Blastosist ve morula aşamasındaki embriyoların 48. saatteki canlılık oranları arasında önemli fark olduğu belirlendi (p<0,05). Grade 1 kalitede olan embriyoların 24. 48. ve 72. saatteki viyabiliteleri sırasıyla %78,6; 46,4; 32,1; Grade 2 kalitede olanların ise %35,5; 17,8; 17,8 olarak belirlendi. Grade 1 ve Grade 2 kalitedeki embriyoların 24. ve 48. saatteki viyabiliteleri arasında istatistiksel önem (p<0,05) olduğu tespit edildi.
Sonuç olarak; Saanen ırkı keçilerde in vivo olarak elde edilen embriyoların dondurulması için vitrifikasyon yönteminin tercih edilmesi halinde, çözdürme sonrası viyabiliteleri esas alınarak, dondurulacak embriyonun gelişim aşamasına ve kalitesine göre seçilmesi ve seçilecek embriyo kalitesinin Grade 1 (çok iyi/iyi) ve gelişim aşamasının da blastosist olması gerektiği önerilmektedir.

Anahtar Sözcükler: Dondurma; Embriyo; Saanen keçisi; Vitrifikasyon.

Abstract:
In this thesis, viability of freeze-thawed embryos by vitrification following superovulation  is aimed in Saanen goats in breeding season.
Material of the study was 2 to 3 years old healthy and fertile 15 Saanen goats and two male. Sponges containing FGA was applied to the animals via intravaginal for 11 days. Total of 200mg FSH injected with decreasing dosages twice in day during three days for superovulation was applied by IM starting 9th day. With first FSH injection, 2,2 ml PGF2α was applied by IM. Intravaginal sponges were removed on 11th day and 2 ml GnRH was applied on 12th day. Four hours after GnRH injection, natural mating was allowed twice a day. For optaining embryos, following first mating uterine flushing was done on 7th day. Uterine washing process was performed by laparotomy. After microscope examined, obtained embryos was classified according to morphological structure and development stage. Grade 1 and 2 embryos were freezed by vitrification method. During vitrification process, as equilibration solution VS1; 20% EG and VS2; 20% EG+ 10% G, as vitrification solution VS3; 25% EG + 25% G were used. Embryos waiting 5 min in VS1 and VS2 and 30 sec in VS3 was freezed in liquid nitrogen. Embryos waiting in 0,5 M and 0,25 M sucrose and then in m-DPS solution 5 minutes was thawed. For the tracking of viability,  embryos were taken in 5% CO2 incubator in culture medium.
Embryos (n=101) freze-thawed by vitrification of viabilities at 24th,48th and 72nd hours in invitro environment respectively was determined as 59,4%; 33,6%; 25,7%. It was detected that viability rates at 24th hour were greater (p<0,05) then at 48th and 72nd hours. According to development stage, viability rates at 24th, 48th and 72nd hours of embryos in morula and blastocyst period was respectively determined as 51,3%; 20,5%; 15,4% for embryos in morula period;  also was determined as 64,5%; 41,9%; 32,3% for embryos in blastosist period. Viability rates at 48th hours in embryos at blastocyst and morula stage was important (p<0.05).
Embryos viability rates at 24th, 48th and 72nd hours of Grade 1 embryos were as 78,6%; 46,4%; 32,1%, and that of Grade 2 were 35,5%; 17,8%; 17,8% respectively. Viability in 24th and 48th hours of embryos at Grade 1 and Grade 2 was statistically significant (p<0,05). 
In conclusion; in case of prefering vitrification method to freze in vivo produced embryos in Saanen goats; based on viability after thawing 1) embryos needs to be selected regarding developmental stages and quality and 2) embryo to be selected should be grade I in quality and blastocyst development.

Key words: Embryos; Freezing; Saanen goats; Vitrification.