Tavşan karaciğer paraoksonaz enziminin saflaştırılarak kinetik özellikleri, endojen substratları ve antioksidan özelliklerinin araştırılması.
Purification of rabbit liver paraoxonase enzyme and investigation of its kinetic properties, endogenous substrates and antioxidant properties.
Yazar: TÜLİN BAYRAK
Danışman: PROF. DR. EDİZ DEMİRPENÇE
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada, tavşan karaciğer paraoksonaz enzimi (PON1), karaciğer dokusundan mikrozomal fraksiyonun hazırlanması, Sefakril S300 HR jel eleme kromatografisi, DEAE Trisakril M iyon değiştirici kromatografi, hidroksiapatit kromatografisi ve ikinci DEAE Trisakril M iyon değiştirici kromatografi aşamalarıyla saflaştırılmıştır. Bu yöntem ile tavşan karaciğer PON1 enzimi 668 kez saflaştırılmış ve saf enzimin spesifik aktivitesi 3160 U/mg protein olarak bulunmuştur. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile saflık kontrolü yapılmış ve yaklaşık 40 kDa büyüklüğünde tek bir bant elde edilmiştir. Saflaştırdığımız enzimin kinetik özellikleri fenilasetat ve homosistein tiyolakton substratları kullanılarak incelenmiştir. 25ºC'de 1 mM Ca+2 içeren 50 mM Tris-HCl tamponunda (pH:8) fenilasetat substratı için Km 0,55 mM olarak saptanmıştır. 37ºC'de 50 mM Hepes tamponunda (pH:7,4) homosistein tiyolakton substratı için Km 17,31 mM olarak saptanmıştır. Tavşan karaciğerinden saflaştırdığımız PON1'in lipid peroksidasyonu üzerine olan etkisi, in vitro koşullarda oksidasyona maruz bırakılan karaciğer mikrozomları ve fosfatidil kolin süspansiyonu kullanılarak incelenmiştir. Lipid substratların oksidasyonu demir-askorbat-H2O2 sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ortama eklenen PON1'in doz bağımlı olarak peroksidasyonu inhibe ettiği gözlenmiştir. Lipid peroksidasyonunun, 80 U enzim kullanıldığında mikrozomlarda %75,9; fosfatidil kolin süspansiyonunda ise %65,2 oranında azaldığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada tavşan karaciğer PON1 enzimi literatürden farklı bir yaklaşım kullanılarak saflaştırılmış ve ilk kez fenilasetat ve homosistein tiyolakton substratlarına karşı kinetik davranışı incelenmiştir. Ayrıca, tavşan PON1'inin özellikle intakt biyolojik zarlar üzerinde etkili bir antioksidan enzim olduğu da ilk olarak bu çalışmada gösterilmiştir.Anahtar Kelimeler: Tavşan karaciğeri, paraoksonaz 1, enzim saflaştırma, fenilasetat, homosistein tiyolakton, antioksidan.

Abstract:
Rabbit liver paraoxonase enzyme (PON1) was purified through the preparation of liver microsomal fraction, Sephacryl S300 HR gel filtration chromatography, DEAE Trisacryll M ion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography and a second DEAE Trisacryll M ion exchange chromatography steps. Using this method, rabbit liver PON1 was purified 668,08 times with a specific activity of 3160 U/mg protein. Sodium dodecyl sulphate poliacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) revealed the purified enzyme as a single protein band close to 40 kDa. Kinetic properties of the puried enzyme were studied using phenylacetate and homocysteine thiolactone as substrates. At 25ºC, in 50 mM Tris-HCl buffer (pH:8) containing 1 mM Ca+2 , the Km was found as 0,55 mM for phenylacetate. At 37ºC, in 50 mM Hepes buffer (pH:7,4) the Km was found as 17,31 mM for homocysteine thiolactone. The effect of the purified enzyme on lipid peroxidation was studied using liver microsomes and phosphatidyl choline suspension oxidized in vitro. Iron-ascorbate-H2O2 system was used for the oxidation of lipid substrates. Purified PON1 inhibited lipid peroxidation in a dose-dependent manner. At 80 U enzyme concentration, 75,9% inhibition was observed in liver microsomes, while 65,2% inhibition was found for phosphatidyl choline suspension. In conclusion, rabbit liver PON1 enzyme was purified using a new purification approach different from the literature, and for the first time the kinetic properties of the purified enzyme were investigated using phenylacetate and homocysteine thiolactone as substrates. In addition, it has been shown for the first time that rabbit liver PON1 enzyme has an antioxidant effect, particularly on intact biological membranes.Keywords: Rabbit liver, paraoxonase 1, enzyme purification, phenylacetate, homocysteine thiolactone, antioxidant.