Aptamer bağlı yüzeylerde vegf ve interferon-γ proteinlerinin zenginleştirilmesi ve MALDI-MS ile tayinleri
Enrichment of vegf and interferon-γ proteins on aptamer attached surfaces and their detections by MALDI-MS
Yazar: CANAN HÖÇÜK
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Aptamerler çeşitli sayıda nükleotitlerden oluşan DNA, RNA oligonükleotitleridir. Nükleotitler arasında oluşan hidrojen bağları, van der Waals bağları gibi kovalent olmayan etkileşimler aptamerlerin üç boyutlu halini almasını sağlamaktadır. Bu özel üç boyutlu konformasyonu sayesinde hedef moleküle yüksek seçicilikte bağlanmaktadırlar. Hedef moleküle yüksek seçicilikte bağlanma özelliği bakımından antikorlara benzeyen aptamerler "kimyasal antikor" olarak adlandırılmaktadır. Son yıllarda çalışma koşulları ve özellikleri karşılaştırıldığında, aptamerler antikorlardan daha çok tercih edilmekterdir. En önemli üstünlüğü in vitro olarak laboratuvar ortamında sentezlenebilmesidir. Çalışma koşullarının uygunluğu ve hedef moleküle yüksek özgünlükte bağlanma istendiğinden dolayı saflaştırma, hastalık tanısı, biyoteknoloji ve biyosensör gibi birçok uygulama alanı bulunmaktadır. Bu uygulama alanlarında en yaygın kullanım şekli aptamerin belirli bir yüzeye bağlanması ile hedef molekülle etkileştirilmesidir.
Aptamerler üstün özellikleri sayesinde yanlızca ilaçlar, peptitler gibi küçük yapılara değil proteinler, vitaminler ve bakteri sporları gibi büyük yapılara özgün olarak bağlanabilirler. Aptamerlerin bu çeşitli hedef molekülleri arasında proteinle etkileşimi oldukça dikkat çekicidir. Tez kapsamında çeşitli derişimlerde İnterferon- (IFN-) ve Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) proteinlerinin kendilerine özgü aptamer yapıları kullanılarak zenginleştirme çalışmaları yapılmıştır. Öncelikle proteinler ve aptamerler için uygun MALDI matriksinin bulunması için farklı matrikslerle MALDI-MS analizleri yapılmıştır. Aptamerin çapraz bağlayıcıya bağlanmasının kontrolünün ardından proteinin aptamerle etkileşiminin kontrol çalışmaları yapılmıştır. Proteinlerin çözelti formlarına ait ve zenginleştirme sonrasına ait analizleri yapılarak aptamer etkisi karşılaştırılmıştır. Elde edilen sonuçlardan IFN- proteini için 0.007 pmol/µL, VEGF proteini için 0.002 pmol/µL derişimlerinde zenginleştirme çalışmalarının başarılı olduğu görülmüştür. Polimerik yüzey miktarının etkisi, ortamda kullanılan tampon çözeltinin etkisi, yüzeyde peptit varlığı kontrolü gibi zenginleştirmenin daha iyi olmasını amaçlayan optimizasyon deneyleri de gerçekleştirilmiştir. Daha sonra farklı proteinlerin bulunduğu ortamda aptamer yapılarının özgünlükleri kontrol edilerek aptamerlerin karmaşık ortamda hedef proteinlerin zenginleştirmesinde başarılı olduğu görülmüştür. Aptamerin sadece protein ortamlarında değil büyük-küçük birçok molekülün olduğu ticari olarak satın alınan gerçek kan plazmasında hedef yapıya özgünlüğü incelenmiştir. Ayrıca yapılan çalışmalarda kanda miktarı düşük olan VEGF proteini için ek olarak ziptip işlemi (enzimatik parçalama sonrası ortamdaki DTT, IAA, tuz gibi kimyasalların uzaklaştırılmasını sağlayan işlem )uygulanmış ve bu işlemin peptit sinyal şiddetlerine etkisi incelenmiştir. MALDI-MS ile yapılan analizlerin sonuçlarına göre tez kapsamında kullanılan yöntem sayesinde IFN-γ ve VEGF proteinlerinin düşük derişimlerde zenginleştirilmesi başarılmış ve çözelti ortamında aynı derişimlerde gözlemlenemeyen peptit sinyalleri gözlemlenmiştir.

Abstract:
Aptamers are DNA, RNA oligonucleotides that consist of various numbers of nucleotides. Non-covalent interactions of nucleotides such as hydrogen bond and van der Waals bond enable to consist three dimensional structure of aptamers. Thus, these special three dimensional structure of aptamers interact with target molecules with high specific selectivity.  Aptamers are similar to antibodies in terms of their ability to interact high selectivity with the target molecules so aptamers are called "chemical antibodies". When working conditions and features are compared, aptamers are much prefer than antibodies. The most important superior of aptamers can be synthesis in the laboratory as "in vitro". Bonding their target molecules with high specifity in respect to suitable working conditions, aptamers have many applications fields such as purifications, diagnosis, treatment, biotechnology, and biosensor. The most common method of application is that aptamers are immobilized on a surface for intreaction with target molecule.
Aptamers show specifity not only to small molecules such as drugs, peptides but also to large molecules such as proteins, virus, vitamin, and bacteria spores. Although aptamer interact with many molecules, aptamer and protein interactions are very noteworthy in these interactions. In the scope of this thesis, enrichment of various concentration of IFN-γ and VEGF were studied owing to aptamer structures. Firstly, aptamers and proteins in various matrix were analyzed by MALDI-MS, because suitable matrix choice is most important factor in MALDI-MS for aptamers and proteins. To examine whether aptamer bind on the surface or not, it was checked and then control studies carried out for aptamer-protein interactions. Before enrichment and after enrichment, analyses of proteins in the solutions were done. Analysis results show that lowest concentration of IFN- was succeed to be enriched and detected for 0.007 pmol/µL and this was found to be  0.002 pmol/µL for VEGF. It was noticed that study of enrichment are sucessful in this study for IFN- and VEGF. Optimization studies such as effect of polymeric surface area, effect of buffer solution using in the experiments and peptide presence on the surface were tested for the purpose of the best enrichment. Then specifity of aptamers to target protein was checked in the presence of other proteins and it was noticed that aptamers show high specificty to target protein that aptamers only interacted with target protein even if other proteins were exist in the mixture solutuions. Specifity of aptamers was investigated in the real World sample that have large or small molecule together such as commerical human blood plasma. In addition to these studies, ziptip procedure (this procedure enable to get rid of the chemicals used in protein digestion such as DTT, IAA or salt) was applied to very diluted VEGF solution and the procedure effect on peptide signal intensity was examined. According to MALDI-MS analysis results, using the method proposed in this thesis, enrichments of low concentration of IFN- and VEGF proteins were successfully done. Also undetectable peptide signals in rutin procedure could be observed very clearly compared to the signal of those peptide at the same concentration in the solution without preconcentration using MALDI-MS.