BSA ile kaplanmış h-BN NP'ler: Kanser tedavisinde potansiyel bir taşıyıcı sistem
BSA-coated h-BN NPs: A potential carrier system for cancer therapy
Yazar: KARYA AKBIYIKOĞULLARI
Danışman: PROF. DR. FATMA SENİHA GÜNER ; PROF. DR. MUSTAFA ÇULHA
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kimya Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Kanser, yenilikçi terapötik yaklaşımların geliştirilmesini gerektiren küresel bir sağlık sorunu olmayı sürdürmektedir. Geleneksel tedaviler, spesifik olmayan ilaç dağılımı ve antikanser ajanlarının doğal toksisitesi nedeniyle sıklıkla ciddi yan etkilere neden olmaktadır. Nanoteknoloji, kanser tedavisindeki bu zorlukların üstesinden gelmek için umut verici bir yol olarak ortaya çıkmıştır.  Son yıllarda nanopartikül (NP) bazlı ilaç dağıtım sistemleri, nano ölçekteki benzersiz özellikleriyle kanser tedavisinin etkinliğini artırmak için umut verici bir strateji olarak yeni olanaklar sağlamıştır. Bu NP'lerden biri olan Hegzagonal Bor Nitrür (h-BN) geleneksel tedavilere oranla kanser tedavisinde ilaç taşıyıcı olarak büyük potansiyele sahiptir. h-BN NP'lerinin ilaç dağıtım yeteneklerini geliştirmek için çeşitli yüzey modifikasyonları yapmak ve/veya yüzeyin kaplanması gerekmektedir. Doğal bir protein olan Sığır Serum Albümini (BSA) biyouyumluluğu, uyarlanabilirliği ve ilaç yükleme yeteneklerini geliştirme kapasitesi nedeniyle NP'ler için popüler bir kaplama malzemesi olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada kanser tedavisinde kullanılabilecek yeni bir nanotaşıyıcı sistemin tasarlanması amaçlanmıştır. 
Bu tez çalışması kapsamında, kanser terapisi için bir dağıtım sistemi olarak h-BN NP'lerinin sentezine ve karakterizasyonuna ek olarak, yüzeylerinin kovalent olmayan yöntemlerle BSA ile kaplanması ve elde edilen sistemin taşınımındaki kanser ilacı olarak seçilen Mitoksantron (MTX) dağıtımındaki kullanım potansiyeli incelenmiştir. İlk olarak h-BN NP'ler Kimyasal Buhar Biriktirme (CVD) yöntemiyle sentezlenmiştir. h-BN'lerin sentezinden sonra, BSA ile belirlenen kaplama şartları altında ortamın pH'ı, süre ve BSA:h-BN oranı optimize edilmiştir. Daha sonra, işlevselleştirilmiş NP'ler, antikanser ilacı MTX ile yüklenmiştir. Kaplı NP'lerin ilaç yükleme performansı belirlendikten sonra ardından ilaç yüklü protein kaplı NP'lerden MTX salımı, tümör mikro ortamını (pH=4,5) ve insan sağlıklı hücrelerini (pH=7,4) simüle eden şartlarda incelenmiştir. Bu çalışmada ayrıca, MTX ilacının bu iki farklı ortamda salım kinetiğini açıklamak için çeşitli kinetik modeller kullanılmıştır. Bu amaçla salım verilerine Sıfır derece, Birinci derece, Higuchi, Korsmeyer-Peppas ve Kopcha kinetik modelleri uygulanmıştır.
h-BN NP'leri, Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM), Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), Fourier Dönüşümü Kızılötesi (FT-IR) spektroskopisi, Dinamik Işık Saçılımı (DLS) ve Termogravimetrik Analiz (TGA) gibi yöntemler ile karakterize edilmiştir.Yapılan tüm karakterizasyonlar sonucundaki veriler; 40-80 nm nano boyutlu, trombosit benzeri tekdüze bir yapı sergileyen, yüksek saflıkta ve iyi dağılmış h-BN NP'lerinin sentezlendiğini gösterilmiştir. 
Bu tez çalışmasının ana hedefi, elde edilen h-BN'lerin ilaç taşıma kapasitelerini arttırmak ve suda dispersiyon özelliklerini iyileştirebilmek için BSA ile kimyasal olmayan etkileşimler ile kaplanmasıdır. BSA:h-BN oranı, çözelti ortamının pH'ı,ve etkileşim süresi bu çalışmada deneysel parametreler olarak seçilmiştir. h-BN@BSA kaplama deneylerinde 3 farklı oranda ve 2 farklı pH değeri seçilerek 8 farklı etkileşim süresinde veri alınarak gerçekleştirilmiştir. Kaplama miktarına etki eden parametrelerin etkileşimlerini belirlemek amacıyla, deneysel veriler Minitab kullanılarak üç faktörlü faktöriyel deney tasarımı ile analiz edilmiştir. Bu analiz sonucunda, BSA:h-BN oranı ve BSA:h-BN oranı ile pH etkileşiminin kaplama miktarı üzerinde anlamlı bir etkisi olduğu belirlenmiştir. Ancak, deney süresi ve diğer parametrelerin ikili ve üçlü etkileşimlerinin kaplama miktarı üzerinde etkili olmadığı sonucuna varılmıştır. Deneyler sonrasında gerçekleştirilen karakterizasyon çalışmalarından SEM görüntüleri, FT-IR spektrumları, jel elektroforez ve suda dispersiyon sonuçları h-BN NP'lerin yüzeyinin BSA ile etkileştiğini kanıtlamıştır. 
Kaplama deneylerinin sonuçlarına göre mg BSA/g h-BN için en yüksek kaplama miktarı elde edilen BSA-7,4-3-1 ve BSA-4,7-5-6 kodlu NP'ler, ilaç yükleme ve salım çalışmalarında kullanılmak üzere seçilmiştir. BSA@ h-BN NP'lerinin ilaç yükleme kapasitesini değerlendirmek için MTX kullanılarak yapılan ilaç yükleme deneylerinde daha stabil bir nokta olan 4. saatin sonunda, saf h-BN %18,3 (0,37 mg MTX/1 gr h-BN) yükleme yüzdesine sahip iken, kaplı örneklerin birbirine oldukça yakın; BSA-4,7-6-5 için %32,1 (0,64 mg MTX/1 gr h-BN) ile BSA-7,4-3-1 için %31,8 (0,63 mg MTX/1 gr h-BN) yükleme yüzdesine sahip olduğu bulunmuştur. İlaç yükleme deneylerinin sonucundaki karakterizasyon çalışmaları MTX'in varlığını kanıtlamıştır. Ayrıca, zeta potansiyel değerlerinin incelendiğinde, BSA kaplamasının, MTX ilacının kullanılması ile NP'ler üzerinde kararlılığı artırdığı tespit edilmiştir.
In vitro ilaç salım çalışmaları, yaklaşık 50 saat boyunca NP'lerden MTX'in salım profilini ortaya koymuştur. Deney verilerinde maksimum salım yüzdesi göz önüne alındığında, tümör hücrelerini simüle eden pH=4,5 ortamında BSA kaplı h-BN'ler (%5,18 ve %5,09), kaplanmamış saf h-BN'ye (%0,83) göre 6 kattan daha fazla ilaç salımı gerçekleştirirken, insan sağlıklı hücreleri taklit eden ortam olan pH=7,4'te kaplanmamış saf h-BN (%2,92), BSA kaplı h-BN numunelerine (%0,23 ve %0,20) kıyasla 12 kattan daha fazla kanser ilacı salımı sağlamıştır. Bu salım sonuçları kinetik modellere göre incelendiğinde h-BN'nin Kopcha Modeline uyduğu ve salım mekanizmasının erozyona dayalı olduğunu belirlenmiştir. BSA@h-BN NP'leri ise Korsmeyer-Peppas ve Hixson-Crowell Modellerine uygun ilaç salımı oluşmaktadır.
Farklı sağlıklı insan hücreleri üzerinde gerçekleştirilen hücre kültürü/sitotoksisite testleri incelendiğinde, çeşitli dozajlardaki numunelerin hiçbirinin toksik etki göstermediği belirlenmiştir. Özellikle, BSA@h-BN NP'lerinin hücre çoğalmasını teşvik ettiği gözlemlenmiştir. Ayrıca, kanser ilacı MTX'i taşıyan bu NP'lerin, sağlıklı hücreler üzerinde toksik etki yaratmadığı için, tasarlanan bu ilaç taşıyıcı sistemde güvenle kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Sonuç olarak, bu tez çalışmasından elde edilen veriler, BSA ile kaplanmış h-BN NP'leri, kanser tedavisi için etkili ve hedefe yönelik bir taşıyıcı sistem olarak umut verici olduğunu göstermektedir. Tez kapsamında geliştirilen BSA@h-BN NP'lerin MTX'i yükleme ve salım yeteneği ve düşük toksik özelliği bu sistemi değerli hale getirmektedir. Sonuçlar, nanotıp ve biyomedikal alanda artan araştırmalara katkıda bulunmaktadır; ancak bu bulguların güvenliğini ve etkinliğini doğrulamak için terapötik uygulamalara dönüştürülmesi için daha ileri in vivo çalışmalara ve klinik araştırmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
Cancer remains a global health problem requiring the development of innovative therapeutic approaches. Conventional treatments often cause serious side effects due to nonspecific drug distribution and the inherent toxicity of anticancer agents. Nanotechnology has emerged as a promising way to overcome these challenges in cancer treatment. In recent years, nanoparticle (NP)-based drug delivery systems have opened new possibilities as a promising strategy to increase the effectiveness of cancer treatment with their unique properties at the nanoscale. Hexagonal Boron Nitride (h-BN), one of these NPs, has great potential as a drug carrier in cancer treatment compared to traditional treatments. To improve the drug delivery abilities of h-BN NPs, various surface modifications and/or surface coating are required. Bovine Serum Albumin (BSA), a natural protein, is used as a popular coating material for NPs due to its biocompatibility, adaptability, and capacity to improve drug loading capabilities. This study aimed to design a new nanocarrier system that can be used in cancer treatment.
Within the scope of this thesis study, in addition to the synthesis and characterization of h-BN NPs as a delivery system for cancer therapy, the coating of their surfaces with BSA by non-covalent methods and the potential use of the resulting system in the delivery of Mitoxantrone (MTX), which is selected as a cancer drug, were examined. First, h-BN NPs were synthesized by the Chemical Vapor Deposition (CVD) method. After the synthesis of h-BNs, the pH of the medium, time and BSA:h-BN ratio were optimized under the coating conditions determined by BSA. Then, the functionalized NPs were loaded with the anticancer drug MTX. After determining the drug loading performance of coated NPs, MTX release from drug-loaded protein-coated NPs was examined under conditions simulating the tumor microenvironment (pH = 4.5) and human healthy cells (pH = 7.4). This study also used various kinetic models to describe the release kinetics of MTX drug in these two different environments. For this purpose, Zero order, First order, Higuchi, Korsmeyer-Peppas and Kopcha kinetic models were applied to the release data.
h-BN NPs have been characterized by methods such as Transmission Electron Microscopy (TEM), Scanning Electron Microscopy (SEM), Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopy, Dynamic Light Scattering (DLS) and Thermogravimetric Analysis (TGA). Data as a result of all characterizations; It has been demonstrated that high purity and well-dispersed h-BN NPs with 40-80 nm nano-size, platelet-like uniform structure were synthesized.


The main goal of this thesis study is to coat the obtained h-BNs with BSA with non-chemical interactions in order to increase their drug carrying capacity and improve their water dispersion properties. BSA:h-BN ratio, pH of the solution environment, and interaction time were selected as experimental parameters in this study. h-BN@BSA coating experiments were carried out by selecting 3 different ratios and 2 different pH values and taking data for 8 different interaction times. In order to determine the interactions of the parameters affecting the coating amount, experimental data were analyzed with a three-factor factorial experimental design using Minitab. As a result of this analysis, it was determined that the BSA:h-BN ratio and the interaction of BSA:h-BN ratio and pH had a significant effect on the coating amount. However, it was concluded that the double and triple interactions of the experimental time and other parameters did not affect the coating amount. From the characterization studies carried out after the experiments, SEM images, FT-IR spectra, gel electrophoresis and water dispersion results proved that the surface of h-BN NPs interacts with BSA.
According to the results of the coating experiments, NPs coded BSA-7.4-3-1 and BSA-4.7-5-6, which obtained the highest coating amount for mg BSA/g h-BN, were selected to be used in drug loading and release studies. In drug loading experiments using MTX to evaluate the drug loading capacity of BSA@h-BN NPs, at the end of the 4th hour, which is a more stable point, pure h-BN had a loading percentage of 18.3% (0.37 mg MTX/1 g h-BN). While, the coated samples are quite close to each other; 32.1% (0.64 mg MTX/1 g h-BN) loading for BSA-4.7-5-6 and 31.8% (0.63 mg MTX/1 g h-BN) loading for BSA-7.4-3-1 it was found that the percentage. Characterization studies resulting from drug loading experiments have proven the existence of MTX. Additionally, when zeta potential values were examined, it was determined that BSA coating increased the stability on NPs with the use of MTX drug.
In vitro drug release studies revealed the release profile of MTX from NPs over approximately 50 hours. Considering the maximum release percentage in the experimental data, BSA-coated hBNs (5.18% and 5.09%) were more than 6 times more effective than uncoated pure h-BN (0.83%) in the pH=4.5 environment simulating tumor cells. While releasing more drug, uncoated pure h-BN (2.92%) at pH=7.4, medium that mimics human healthy cells, was more than 12-fold more potent than BSA-coated h-BN samples (0.23% and 0.20%) provided cancer drug release. When these release results were examined according to mathematical kinetic models, it was determined that h-BN conformed to the Kopcha Model and that the release mechanism was primarily based on erosion. BSA@h-BN NPs produce controlled drug release in accordance with the Korsmeyer-Peppas and Hixson-Crowell Models in different pH environments that mimic healthy and tumor cells.
When cell culture/cytotoxicity tests performed on different healthy human cells were examined, it was determined that none of the samples at various dosages showed toxic effects. In particular, BSA@h-BN NPs have been observed to promote cell proliferation. Additionally, it was concluded that these NPs carrying the cancer drug MTX can be used safely in this designed drug carrier system, as they do not have a toxic effect on healthy cells.
In conclusion, the data obtained from this thesis study show that BSA@h-BN NPs are promising as an effective and targeted carrier system for cancer treatment. The ability of the NPs developed within the scope of the thesis to load and release MTX and their low toxicity make this system valuable. The results contribute to growing research in nanomedicine and biomedical fields; however, further in vivo studies and clinical trials are needed to confirm the safety and effectiveness of these findings and translate them into therapeutic applications.