Aβ (1-42) ile oluşturulan nörodejenerasyonda nikotinamid uygulamasının nad+ metabolizmasında rol oynayan bazı enzimlerin mRNA ekspresyonları üzerine etkisi
Effects of nicotinamide treatment on mRNA expression of various enzymes involved in nad+ metabolism in Aβ(1-42) induced neurodegeneration
Yazar: İREM KILIÇARSLAN
Danışman: PROF. DR. LÜTFİYE KANIT
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Amiloid beta protein = Amyloid beta protein ; Enzimler = Enzymes ; Mikro RNA = Micro RNA ; Nikotinamid = Nicotinamide ; Nörolojik hastalıklar = Neurological diseases ; Sirtuin = Sirtuin

Özet:
Bu çalışmanın amacı, amiloid β-peptid (1-42) ile oluşturulan deneysel 
Alzheimer modelinde, endojen bir PARP-1 inhibitörü ve NAD+ öncülü olan 
nikotinamid uygulamasının NAD+'e bağımlı aktivite gösteren bazı enzimlerin 
(sirtuinler, CD38, ve PARP-2) mRNA ekspresyonu üzerine olan etkilerinin 
araştırılmasıdır.
Alzheimer hastalığının gelişiminde enerji metabolizmasının bozulması 
merkezi bir rol oynamaktadır. Glikoz metabolizmasında görevli sitoplazmik ve 
mitokondriyal enzimlerin aktivitelerindeki değişimler hastalığın seyrini ve şiddetini 
belirler. Hücredeki metabolik olayların koenzimi olan NAD+ aynı zamanda hücrenin 
sağ kalımı ve sağlıklı yaşlanmasında rol oynayan sirtuinlerin aktivite göstermesi için 
gereklidir. Hücre ölüm yolakları ve DNA tamir mekanizmalarında görevli PARP-2 
ile hücre içi Ca+2 düzeylerinin regülasyonunda rol oynayan CD38, aktivite için 
NAD+'e gereklilik gösteren enzimlerdir. NAD+ sentezinde rol oynayan ve NAD+'e 
bağımlı olarak aktivite gösteren enzimler; obezite, diyabet, kanser ve nörodejeneratif 
hastalıklarda önemli birer terapötik hedeflerdir.
Çalışmamızda Sprague-Dawley sıçanlar kullanılmıştır. Deney gruplarındaki 
hayvanlar yapılan uygulamaların yedinci gününde dekapite edilip beyinleri 
çıkarılmış ve kan örnekleri toplanmıştır. Total beyin ağırlıkları alındıktan sonra beyin 
bölgeleri buz üstünde disekte edilmiştir. Beyin dokusu örnekleri deney gününe kadar 
-80C'de saklanmıştır. Çalışmamızda kontrol (n=4), Aβ(1-42) (n=4) ve Aβ(1-42) + 
100 mg/kg NA (n=4) olmak üzere 3 deney grubu oluşturulmuş ve deney 
gruplarındaki hayvanların hipokampüsleri kullanılmıştır. Hedef enzimlerin 
ekspresyon düzeyleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu  (Real-Time PCR) 
öntemi ile saptanmıştır.
Sonuçlar kontrol grubu ile kıyaslandığında Aβ(1-42) uygulaması, SIRT1 
kspresyonunu anlamlı bir biçimde azaltırken, hipokampüste SIRT2, PARP-2, CD38 
ekspresyonlarında herhangi bir değişime neden olmamıştır. Aβ'ya karşı nikotinamid 
uygulaması ise Aβ'nın neden olduğu SIRT1 ekspresyonundaki azalmayı anlamlı bir 
şekilde artırmıştır. SIRT1 ekspresyonundaki bu yükseliş artan NAD+ miktarı ile 
ilişkili olabilir ve hücrenin gen ekspresyonunun, bilişsel ve hücresel fonksiyonlarının 
düzenlenmesinde, Alzheimer hastalığı modelinde oluşabilecek plak miktarının 
azalmasında nöroprotektif etki gösterebilir. Aβ'ya karşı NA uygulaması, aynı 
zamanda CD38 ekspresyonunda kontrol grubuna göre anlamlı bir artışa neden 
olmuştur. İkincil haberci reaksiyonlarında aktif rol alan CD38 enzim miktarının 
artması kalsiyum (Ca+2) iyon salınımı ile hücrenin yaşamsal fonksiyonlarının 
düzenlenmesini sağlayabilir.  Hipokampüsteki PARP-2 ve SIRT2 ekspresyonundan 
elde ettiğimiz sonuçlara göre gruplar arasında anlamlı bir farklılık bulunmamıştır.
Yapılan çalışma sonucunda Aβ(1-42) ile oluşturulan nörodejenerasyonda 
nikotinamid uygulamasının NAD+ metabolizmasında rol oynayan SIRT1 ve CD38 
enzimlerinin ekspresyonuna olan etkisinin nikotinamidin nöroprotektif rolüne katkısı 
olabileceği vurgulanmıştır. Alzheimer hastalığı ve diğer nörodejeneratif hastalıklarda 
SIRT1 ve CD38 üzerindeki düzenleyici etkisi ile nikotinamid umut vaat eden 
nöroterapötik bir ajan olabilir.

Abstract:
The aim of the present study is to research that the effects of nicotinamide
treatment on mRNA expression of various enzymes (sirtuins, PARP-2, CD38) 
involved in NAD+ metabolism in Aβ(1-42) induced neurodegeneration.
Impairment of energy metabolism in the development of Alzheimer's disease 
plays a central role. Changes in the activity of cytoplasmic and mitochondrial 
enzymes involved in glucose metabolism determines the course of the disease and its 
severity. NAD+, a coenzyme of metabolic reactions in cells, is required for cell 
survival, healthy aging and sirtuin activity. PARP-2 and CD38 enzymes exhibit 
requirements to NAD+ for their activity. PARP-2 plays central role in cell death 
pathways and DNA repair mechanisms. CD38 is involved in the regulation of Ca2+ 
levels. NAD+ dependent enzymes and enzymes involved in NAD+ synthesis are 
important therapeutic targets in obesity, diabetes, cancer and neurodegenerative 
diseases.
In our study, Sprague-Dawley rats were used and divided into three groups as 
control (n=4), Aβ(1-42) (n=4) and Aβ(1-42) + 100 mg/kg NA (n=4). At the seventh 
day of treatment animals were decapited and brains were dissected on ice. Brain 
tissue samples were stored in -80˚C until the day of the experiment. Hippocampal 
tissues were used for experiments. The expression profile of SIRT1, SIRT2, PARP-2 
and CD38 genes was determined by Real-Time PCR.
Our results indicate that Aβ(1-42) treatment significantly down-regulated the 
expression of SIRT1 and did not cause any change in SIRT2, PARP-2, CD38 
expressions in hippocampus when compared to control group. The nicotinamide 
treatment against Aβ significantly increased SIRT1 mRNA levels expression which 
were lowered by Aβ. This increase can be related with the elevated levels of NAD+ 
which can be caused by nicotinamide. Nicotinamide has neuroprotective effects 
through the regulation of gene expression, cognitive and cellular functions, and 
reduced plaque formation in Alzheimer disease models. The nicotinamide treatment 
against Aβ, led to a little increase to the expression of CD38 gene compared to the 
control group.  It can effect the cell by regulating calcium channels, second 
messenger activities and cellular functions. According to the results we obtained 
from SIRT2 and PARP-2 expressions in the hippocampus, there were no significant 
differences between the experimental groups.
In this study nicotinamide treatment against Aβ, caused upregulation of 
SIRT1 and CD38 enzymes involved in NAD+ metabolism in the neurodegeneration 
model induced by Aβ(1-42). The regulatory effect of nicotinamide on the 
expressions of SIRT1 and CD38 can be helpful for its neuroprotective role in 
Alzheimer disease and other neurodegenerative diseases.