Akrilamitin C6 sıçan glioma hücreleri üzerindeki toksik etkisine karşı timokinon ve kuersetinin etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of timokinone and quercetin against the toxic effect of acrylamide on c6 rat glioma cells
Yazar: SEDAT KAÇAR
Danışman: PROF. DR. VAROL ŞAHİNTÜRK
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Akrilamitler = Acrylamides ; Akım sitometrisi = Flow cytometry ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Apoptozis = Apoptosis ; Kuersetin = Quercetin ; Otofaji = Autophagy ; Sitotoksik etki = Cytotoxic effect ; Timokinon = Thymoquinone ; İmmünperoksidaz boyama tekniği = Immunoperoxidase staining procedure

Özet:
C3H5NO kimyasal formülüyle bilinen akrilamit beyaz renge sahip suda çok iyi çözünebilen bir monomerdir. Birçok endüstriyel alanda kullanılmasının yanında akrilamit ayrıca yüksek sıcaklığa maruz kalan karbonhidratça zengin yiyeceklerde de oluşmaktadır. Hayvan ve insanlarda yapılan farklı farmakolojik ve epidemiyolojik çalışmalarda akrilamitin nörotoksik etkiler gösterdiği bildirilmiştir. Timokinon çörek otunun aktif maddesidir. Timokinonun anti-inflamatuar, antikonvülsan, antitüsif, anti-tümör ve antioksidan aktiviteleri de içeren birçok faydalı özelliği bulunmaktadır. Kuersetin ise çeşitli yiyeceklerde bulunan bir flavonoittir. Antioksidan, anti-inflamatuar ve antiviral etkilere sahiptir. C6 hücre hattı sıçan glioblastoma hücreleridir. Literatürde akrilamitin C6 hücreleri üzerindeki etkilerini gösteren bir araştırmaya rastlamadık. Ancak, önceki laboratuvar deneyimlerimiz bize akrilamitin C6 hücreleri üzerinde toksik etkilerinin olabileceğini göstermiştir. Bu çalışmamızda, akrilamitin C6 hücreleri üzerindeki etkilerinin belirlenmesi ve timokinon ile kuersetinin akrilamitin etkisini ne yönde etkilediğinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda ilk olarak MTT testi ile akrilamitin 24 saat için C6 glioblastoma hücreleri için toksik dozu bulundu. Sonra timokinon ve kuersetinin 24 saat için C6 hücrelerine toksik olmayan dozları MTT kolorimetrik testi kullanılarak belirlendi. Daha sonra bulunan bu dozlar kullanılarak apoptoz yolağına bakmak için akış sitometrisi ile kaspaz 3/7 ve anneksin V testleri yapıldı. Ayrıca otofajik ölüm ve oksidatif stres de akış sitometrisi analiziyle değerlendirildi. İmmünositokimyasal olarak Nrf2 miktarı incelendi. Morfolojik inceleme TEM ve konfokal mikroskop analizleriyle yapıldı. Bulgularımıza bakıldığında C6 hücrelerinde toksik etki oluşturmak için 4 mM akrilamit değeri belirlendi. Timokinon ve kuersetinin toksik olmayan dozları sırasıyla 3.9 ve 2.0 µM olarak belirlendi. Timokinon ve kuersetinin anneksin V ve kaspaz 3/7 sonuçlarına bakıldığında akrilamitin neden olduğu apoptozu ve mikroskopik incelemelerde de morfolojik deformasyonları azalttığı görüldü. Otofaji incelemesinde ise akrilamitin neden olduğu otofajinin timokinon ve kuersetin verilmesiyle azaldığı ortaya konuldu. Nrf2 ifadesine bakıldığında akrilamitin Nrf2 ifadesini arttırdığı, timokinon ve kuersetinin verilmesinin bu ifadeyi daha da arttırdığı gözlemlendi. Sonuç olarak, akrilamitin C6 glioblastoma hücreleri üzerinde hasar yapıcı etkisinin bulunduğu, timokinon ve kuersetinin önceden verilmesinin bu hücrelerde akrilamit kaynaklı hasara karşı koruyucu etkilerinin olduğu saptanmıştır. Timokinon ve kuersetinin diğer akrilamit ilişkili hücre, doku veya organ hasarlarında da koruyucu etki gösterme potansiyeline sahip olduğuna ve ileriki çalışmalarda denenebileceğine inanıyoruz.

Abstract:
Acrylamide, known as the formula of C3H5NO,  is a white-colored and readily water-soluble monomer. Besides being used in many industrial areas, acrylamide is also formed in carbohydrate-rich foods processed at high temperatures. Acrylamide was reported to exhibit neurotoxic effects in different pharmacological and epidemiological studies conducted on animals and humans. Thymoquinone is the active constituent of Nigella sativa and has many beneficial properties, including anti-inflammatory, anticonvulsant, antitussive, anti-tumor and antioxidant activities. Quercetin is a flavonoid found in various foods. It has antioxidant, anti-viral and anti-inflammatory properties. C6 cells are rat glioblastoma cells. In the literature, to the best of our knowledge, there is not any study showing the effects of acrylamide on C6 cells in literature. However, our previous laboratory experience showed that acrylamide exerts toxic effects in C6 cells. In this study, we aimed at attempting to prevent the toxicity of acrylamide against C6 cells by using thymoquinone and quercetin. In our study, first, the toxic dose of acrylamide against C6 glioblastoma cells for 24 hours was determined by MTT test. Then, non-toxic doses of thymokinone and quercetin against C6 cells for 24 hours were determined by MTT colorimetric test. After that, using these doses, caspase 3/7 and annexin V tests were performed by flow cytometry to evaluate whether apoptosis pathway was inducted. Furthermore, autophagy and oxidative stress were also assessed by flow cytometry. The amount of Nrf2 was immunocytochemically examined. Morphological examination was performed by TEM and confocal microscope analyses. As a result, the 4 mM of acrylamide was determined to be used to induce toxicity in C6 cells. The non-toxic doses of thymokinone and quercetin were respectively determined as 3.9 ve 2.0 µM. Thymokinone and quercetin not only reduced both acrylamide-induced apoptosis in annexin V and caspase 3/7 results and morpholocial deformations in microscopic examinations. In autophagy, it was revealed that acrylamide-induced autophagy was decreased by quercetin and thymokinone pretreatments. As for Nrf2 expression, it was observed that acrylamide increased Nrf2 expression and thymkinone and quercetin pretreatments increased this expression even further. In conclusion, in the study, acrylamide had a damaging effect on C6 glioblastoma cells and thymokinone and quercetin pretreatments exerted a protective effect against acrylamide-induced damage in C6 cells. We believe thymokinone and quercetin might be used in future studies due to their potential to exhibit protective effects against other acrylamide-related cell and organ damages.