Gıda maddelerinin toplam antioksidan kapasitelerinin tayini için yeni bir elektrokimyasal yöntem geliştirilmesi
Development of a novel electrochemical method for determining the total antioxidant capacity of foodstuff
Yazar: SEFA BAKİ
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA ÖZYÜREK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Beslenme ve Diyetetik = Nutrition and Dietetics ; Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Diferensiyel puls voltametrisi = Differential pulse voltammetry ; Dönüşümlü voltametri = Cyclic voltammetry ; Polifenol = Polyphenol

Özet:
Gıda maddelerinin ve bitki ekstrelerinin yaşlanmaya ve bazı dejeneratif hastalıklara (ateroskleroz, kanser, Alzheimer ve Parkinson) neden olan reaktif oksijen türleri (ROS) ve reaktif azot türleri (RNS) gibi serbest radikalleri nötralize etmesi özelliği nedeniyle antioksidan kapasitelerinin incelenmesine olan ilgi günümüzde artış göstermektedir. Gıda maddelerinde ve bitki ekstrelerinde bulunan polifenolik antioksidanların aktivite/kapasite tayinine olanak sağlayan pek çok spektrofotometrik yöntem geliştirilmiş olmasına rağmen bu yöntemlerin birçok dezavantajı bulunmaktadır. Alternatif elektroanalitik antioksidan aktivite/kapasite yöntemleri, halen biyoaktif bileşiklerin duyarlı olarak analizinde geliştirilme aşamasında yer almaktadır. Bu tez çalışmasında farklı antioksidan türlerine, karışımlarına ve kompleks matrislere uygulanabilecek, dünyada yaygın kullanım alanına sahip CUPRAC: 'Bakır(II) iyonu indirgeyici antioksidan kapasite' yöntemi esaslı, basit, tekrarlanabilir, ucuz ve duyarlı elektroanalitik yöntem geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Kromojenik yükseltgen reaktifi olan (Cu(Nc)22+) kullanılarak polifenolik bileşiklerin (flavonoidler, basit fenolik asitler ve hidroksisinnamik asitler gibi), askorbik asidin ve gerçek örneklerin (bitki çayları ve meyve suları) antioksidan kapasitelerini tayin etmek için ilk defa, yeni bir diferansiyel puls voltametri (DPV) yöntemi geliştirilmiştir. (Cu(Nc)22+) kompleksinin elektrokimyasal davranışı, camsı karbon elektrotta (GC) döngüsel voltametri ile çalışılmıştır. Elektroanalitik yöntem, (Cu(Nc)22+'nin Cu(Nc)2+'ye antioksidanlar tarafından indirgenmesine ve reaksiyon ortamında kalan Cu(II)-Nc'nin elektrokimyasal tayinine dayanır ve kalan Cu(II)-Nc miktarları arasındaki fark, test edilen bileşiklerin antioksidan kapasiteleriyle orantılıdır. Polifenolik antioksidanların ve C vitamininden oluşan bileşiklerin ayrı ayrı kalibrasyon eğrileri oluşturulmuş ve yanıt duyarlılıkları ile doğrusal konsantrasyon aralıkları belirlenmiştir. GC elektrodundaki reaktif, antioksidanlara karşı onun reaktifliğini sağlarken, farklı antioksidanlarda ölçülen troloks ekivalenti antioksidan kapasite (TEAC) değerleri, Cu(II)–Nc reaktifinin reaktivitesinin çözelti bazlı spektrofotometrik CUPRAC yöntemi ile kıyaslanabileceğini ortaya koymaktadır. Bu elektroanalitik yöntem, bulanık örneklerde doğru sonuçlar elde ederken, spektrofotometrik yönteme göre antioksidan tayininde daha yüksek duyarlık (daha düşük LOD gibi) sağlamıştır. Geliştirilen yöntem, yeşil çay, ada çayı, mercan köşkü, aslan pençesi gibi bitki çaylarının ve meyve sularınının toplam antioksidan kapasite (TAC) ölçümlerine başarılı şekilde uygulanmıştır. Sonuçlar, geliştirilen voltametrik yöntemin duyarlık ve kesinlik bakımından spektrofotometrik CUPRAC yöntemiyle kıyaslanabilir olduğunu göstermiştir.

Bu tez çalışmasının son aşamasında Türkiye'de yetişen üç farklı şifalı bitki türünden (Hypericum scabrum L., Papaver fugax Poiret var. platydiscus cullen ve Achillea vermicularis Trin.) polifenolik bileşiklerin ektstraksiyonu için yeni bir mikrodalga esktraksiyon (MAE) tekniği kullanılmıştır. DPV-CUPRAC yöntemiyle ölçülen antioksidan kapasite değerleri kullanılarak MAE koşulları optimize edilmiştir. Optimal ekstraksiyon koşulları: metanol konsantrasyonu (%80), ekstraksiyon sıcaklığı 800C ve ekstraksiyon süresi 6 dakika şeklinde optimize edilmiştir. DPV-CUPRAC değerleri (TAC), deneysel olarak troloks eşdeğeri antioksidan kapasite (TEAC) cinsinden belirlenmiştir ve diğer referans yöntemlerle (örn. 2,2'-azinobis(3-etil-benzotiazolin-6-sülfonik asid/persülfat (ABTS/persülfat) ve spektrofotometrik CUPRAC yöntemiyle bulunan değerlerle karşılaştırılmıştır.
Sonuç olarak, çok farklı türde polifenolik antioksidanlara ve bu bileşikleri içeren gerçek örneklere uygulanabilen ilk elektroanalitik CUPRAC yöntemi geliştirilmiştir. DPV-esaslı antioksidan kapasite tayin yönteminin antioksidan araştırmalarına bir diğer önemli katkısı, bu yöntemin CUPRAC antioksidan ölçüm zincirine (birçok farklı antioksidan ve antiradikal yöntemleri içeren) entegrasyonudur.

Abstract:
Recently, there is a great interest in studying the antioxidant capacity in food and plant extracts, due to their properties to neutralize free radicals such as reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS), which are involve in aging and some degenerative diseases (i.e., atherosclerosis, cancer, Alzheimer and Parkinson). Although many spectrophotometric methods have been developed for the antioxidant activity/capacity determination of polyphenolic antioxidants (i.e., flavonoids, hydroxycinnamic acids, and hydroxybenzoic acids) present in food and plant extracts, these methods have various disadvantages. Alternative electroanalytical antioxidant activity/capacity methods are still at the development stage in the sensitive analysis of bioactive compounds. Thus the aim of this thesis work is to develop a widely used CUPRAC (CUPric ion Reducing Antioxidant Capacity)-based, simple, reproducible, cost-efficient and sensitive electroanalytical assay, to apply this method to different polyphenolic antioxidant species, mixtures and complex matrices.
A novel differential pulse voltammetric (DPV) method was developed using a chromogenic oxidizing reagent, cupric neocuproine complex (Cu(Nc)22+) for the assessment of antioxidant capacity of polyphenolic compounds (i.e., flavonoids, simple phenolic acids, and hydroxycinnamic acids), ascorbic acid, and real samples (herbal teas and juices) for the first time. The electrochemical behavior of Cu(Nc)22+ complex was studied by cyclic voltammetry at a glassy carbon (GC) electrode. The electroanalytical method was based on the reduction of Cu(Nc)22+ to Cu(Nc)2+ by antioxidants and electrochemical detection of the remaining Cu(II)–Nc (unreacted complex) and the difference being correlated to antioxidant capacity of the tested compounds. The calibration curves of individual compounds comprising polyphenolics and vitamin C were constructed, and their response sensitivities and linear concentration ranges were determined. The reagent on the GC electrode retained its reactivity towards antioxidants, and the measured trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) values of various antioxidants suggested that the reactivity of the Cu(II)–Nc reagent is comparable to that of the solution−based spectrophotometric CUPRAC assay. This electroanalytical method better tolerated sample turbidity and provided higher sensitivity (i.e., lower detection limits) in antioxidant determination than the spectrophotometric assay. The developed method was successfully applied to the measurement of total antioxidant capacity (TAC) in some herbal tea samples such as green tea, sage, marjoram, and alchemilla and fruit juices. Results demonstrated that the developed voltammetric method has comparable precision and accuracy to that of the spectrophotometric CUPRAC assay.
In the final stage of this thesis work, a new microwave-assisted extraction (MAE) process for polyphenols from three herbal plants (Hypericum scabrum L., Papaver fugax Poiret var. platydiscus cullen, and Achillea vermicularis Trin.) grown in Turkey was studied for the first time. MAE conditions were optimized with respect to the recovery in antioxidant capacities measured by DPV-CUPRAC method. The optimal extraction conditions were found to be methanol concentration of 80%, extraction temperature of 800C, and extraction time of 6 min. DPV-CUPRAC values of tested herbal plants were experimentally reported in this work as trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), and compared to those found by reference TAC assays, i.e., 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid/persulphate (ABTS/persulphate) and spectrophotometric CUPRAC methods.
Finally, this is the first electroanalytical CUPRAC method applied to a rich variety of polyphenolic antioxidant compounds, together with their real samples. Another contribution of the DPV-based antioxidant capacity method to antioxidant research is its integration to the main CUPRAC train of antioxidant measurements (comprising many other antioxidant and antiradical assays).