Farklı kaynaklardan izole edilen üreaz enziminin immobilizasyonu ve üre tayininde ve hidrolizinde uygulanabilirliğinin araştırılması
Immobilization of urease enzyme from different sources and investigation of usability in determination and hydrolysis of urea
Yazar: AYLİN TÜRKSEVER TETİKER
Danışman: PROF. DR. FİGEN ERTAN
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu tez çalışmasında üç farklı kaynaktan izole edilen üreaz enzimi aljinata immobilize edilerek hayvan yemlerinde üre tayininde kullanıldı. Kaynak olarak yüksek üreaz aktivitesinde sahip bitki, fungus ve bakteri türleri kullanıldı. Üreaz aktivitesi Nessler metoduna göre ölçüldü. Bitki kaynağı, bir nohut çeşidi olan Cicer arietinum, fungus kaynağı Aspergillus fumigatus, bakteri kaynağı ise Proteus mirabilis olarak belirlendi.
Bitki, fungus ve bakteri kaynaklarının her üçü için de süre, sıcaklık, termal kararlılık, optimum pH, pH kararlılığı, substrat konsantrasyonu, yüklenen enzim miktarı, aljinat konsantrasyonu, tekrar kullanılabilirlik, depo kararlılığı gibi çeşitli parametreler araştırılarak bu bulgular serbest enzim ile karşılaştırıldı. Protein tayinleri Bradford yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. İmmobilize üreaz enzimleri içeriği farklı olan hayvan yemlerinde üre tayininde kullanıldı. 
Cicer arietinum üreazı ile yapılan çalışmalarda immobilizasyon verimi % 88.5 olarak belirlendi. Optimum süre 40 dakika, optimum sıcaklık ve pH değerlerinin  her iki enzim formu için de benzer olduğu, immobilizasyonun enzimin  sıcaklık ve pH istemini değiştirmediği gözlendi. Optimum sıcaklık ve pH sırasıyla 50 °C ve 7.0 olarak bulundu. İmmobilizasyonun enzimin termal ve pH kararlılığını iyi yönde etkilediği saptandı.   Optimum immobilizasyon koşullarında hazırlanan boncuklar 5 tekrar kullanım sonunda ilk aktivitelerinin yaklaşık % 60'ını korudu. Depolama kararlılığı çalışması sonucunda serbest enzim 4. günde aktivitesinin tamamına yakınını kaybederken immobilize enzimin aktivitesinin % 88'ini korudu. Serbest ve immobilize üreazın Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0.42 mM ile 5 U mL-1 dk-1 ve 1.33 mM ile 10 U mL-1 dk-1 olarak bulundu.
Aspergillus fumigatus ile yapılan optimizasyon çalışmalarının sonucunda immobilizasyon veriminin % 82.5 olduğu bulundu. Optimum süre 30 dakika, optimum sıcaklık 40 °C, optimum pH 7.0 olarak bulundu. Fungus üreazı immobilizasyon sonrasında termal ve pH kararlılığını serbest enzime göre daha iyi korudu. Tekrar kullanılabilirlik çalışmasında immobilize üreazın 5 döngü sonunda aktivitesinin % 44'ünü koruduğu gözlendi. Depo kararlılığı çalışmasında serbest enzim 7. günün sonunda aktivitesinin sadece % 18'ini korurken immobilize enzim % 66'sını korudu. Serbest üreaz ve aljinat boncuklarda tutuklanan üreazın Km ve Vmax kinetik sabitleri sırasıyla 1 mM ile 8.33 U/ mL-1 dk-1  ve  0.44 mM ile 4.16 U/ mL-1 dk-1  dak olarak bulundu.
Proteus mirabilis ile gerçekleştirilen optimizasyon çalışmalarının sonucunda immobilizasyon verimi % 85 olarak hesaplandı. Optimum pH her iki enzim formu için 7.0 olarak bulundu. pH 7.0 ve 8.0'de serbest ve immobilize üreaz benzer şekilde kararlılıklarını korudular. Optimum sıcaklık serbest ve immobilize üreazlar için 40 °C olarak belirlendi. İmmobilize enzimin termal stabilitesi serbest enzime göre daha iyi bulundu. Tekrar kullanılabilirlik çalışmasında, immobilize enzimin 12 kullanım sonunda aktivitesinin % 55'ini hala koruduğu bulundu. Serbest enzimin depolama kararlılığı çalışmasında 10. günde aktivitesinin tamamına yakınını kaybederken immobilize üreaz ise % 53'ünü koruduğu gözlendi. Serbest ve immobilize enzimlerin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 2 mM,  40 U/ mL-1 dk-1 ve  0.4 mM,  35 U/ mL-1 dk-1 olarak hesaplandı.
Hayvan yemlerinde üre miktarını belirlemek amacıyla içeriği bilinen yemlerde immobilize bitki, fungus ve bakteri üreazları ile üre tayini yapılarak bulgular karşılaştırıldı. Çalışmanın sonucunda immobilize üreazlar ile hayvan yemlerinde üre tayin edilebileceği sonucuna varıldı. Son olarak immobilize üreazların üre hidrolizinde kullanılabilirliği araştırıldı.

Anahtar Kelimeler	: İmmobilizasyon, üreaz, aljinat, üre tayini, Cicer arietinum, Aspergillus fumigatus, Proteus mirabilis.

Abstract:
In this study, urease enzyme was isolated from three different sources and immobilized in calcium alginate beads for determination of urea amounts in animal feeds. As a source, plants, fungal, and bacterial species with high urease activity were used. Urease activity was measured by the Nessler's method. Cicer arietinum was determined as a source of plant, Aspergillus fumigatus was determined as a source of fungi and Proteus mirabilis was determined as a  source of bacteria.
Plant, fungi and bacteria sources for various parameters, such as effect of thermal stability, temperature, optimum pH and pH stability, substrate concentration, reuse and storage stability were investigated  and the results of the investigation were compared with the soluble enzyme. Protein determination was performed using the Bradford method. Immobilized urease enzyme was tested for the determination of urea amounts in various animal feeds.
In studies with Cicer arietinum urease; the activity yield of immobilization was calculated as 88.5 %. Optimum temperature and pH were found to be similar for both soluble and immobilized enzymes. It was observed that immobilization did not change pH and temperature prompt of the enzyme. pH and optimum temperature were found to be 7.0 and 50°C respectively. Improved thermal and pH stability of urease were achieved by immobilization. The Km value for immobilized urease was found to be higher than that of the free enzyme. Immobilization of beads at optimum conditions enabled up to 5 repeated use of enzyme and maintained 58 % of their initial activity. In storage stability assays, almost all of the activity of the free enzyme lost at fourth day. It is observed that the immobilized enzyme retained 88 % of its activity after fourth days. The Km and Vmax values were calculated from Lineweaver-Burk plot as 0.42 mM ile 5 U mL-1 dk-1 and 1.33 mM ile 10 U mL-1 dk-1 for free and immobilized enzyme, respectively.
According to results of the optimization study with Aspergillus fumigatus. The immobilization efficiency was calculated as 82.5 %. Optimum incubation time, optimum temperature and optimum pH were determined 30 min, 40°C and pH 7.0 for both enzymes. It was found that thermal stability and pH stability of immobilized enzyme was better than that of the free enzyme. In reusability study, immobilized enzyme maintained 44 % of its initial activity after 5  repeated use of enzyme. In storage stability study, free enzyme retained 18 % of its initial activity within 7 days. Immobilized enzyme conserved 66 % of its initial activity for 7 days. Free and immobilized enzyme Km and Vmax values were calculated to be 1.0 mM , 8.33 U/ mL-1 dk-1  and  0.44 mM ile 4.16 U/ mL-1 dk-1, respectively.
According to results of the optimization study with Proteus mirabilis. Immobilization yield was calculated as 85 %. Optimum pH for free and immobilized urease was found to be 7.0. Immobilized and free urease enzymes protected their stability at pH 7.0 and 8.0 in a similar way. Optimum temperature was found to be 40 °C for free and immobilized urease. Thermal stability of the immobilized urease enzyme was significantly better than the free enzyme.  In reusability assays, immobilized enzyme maintained 55 % of its initial activity after 12  repeated use of enzyme. In storage stability study, almost all of the activity of the free enzyme lost at tenth day . It is observed that the immobilized enzyme retained 53 % of its activity after tenth days. Free and immobilized enzyme Km and Vmax values were calculted to be 2 mM, 40 U/ mL-1 dk-1 and 0.4 mM, 35 U/mL-1 dk-1, respectively.
In order to determine of the amount of  urea in different animal feed known of the content urea determination assays were carried out using immobilized ureases and results were compared. In this study showed that immobilized urease allowed measurement of the urea levels in the animal feeds. Finally, the availability of immobilized urease for hydrolyzes urea were evaluated.

Keywords		: Immobilization, urease, alginate, entrapment, urea assay, Cicer arietinum, Aspergillus fumigatus, Proteus mirabilis.