Dekstransukraz üreten bakteriyel soyların yerel bitkilerden izolasyonu ve dekstransukraz' ın mutasyona uğratılan soylardan saflaştırılarak nitelendirilmesi
Isolation of the dextransucrase producer bacteria from local plants and caracterization of purified dextransucrase from mutated strains
Yazar: ÇİĞDEM YAMANER
Danışman: PROF. DR. AZİZ TANRISEVEN ; PROF. DR. İ. YAVUZ SEZEN
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Dekstranlar = Dextrans ; Etil metan sulfonat = Ethyl methane sulphonate ; Leuconostoc = Leuconostoc ; Meyveler = Fruits ; Mutagenez = Mutagenesis ; Polietilen glikoller = Polyethylene glycols ; Ultraviyole ışınlar = Ultraviolet rays

Özet:
Türkiye' nin farklı illerinden toplanan on beş yerel meyveden ve ev yapımı lahana turşusundan toplam 531 adet izolat elde edildi. Bu izolatların çeşitli mikrobiyolojik ve biyokimyasal testler kullanılarak tanımlaması yapıldı. Bu tanımlama sonunda toplam 531 adet izolatın içinden, 235 tanesinin laktik asit bakterisi olduğu tespit edildi. Sukroz medyuma ekilen saf izolatlar içinden dekstransukraz üretenler (111 izolat) seçildi. Bu izolatların enzim üretim yetenekleri İTK metodu kullanılarak doğrulandı. Dekstransukraz üretebilen izolatların mikrobiyolojik, fizyolojik ve biyokimyasal tanımlama testleri yapıldı.Yüksek dekstransukraz aktivitesine (0.68-1.63 IU/mL) sahip olan sekiz izolat (C2MM, YKY3G2M, Mu11, AN 39-1, OR2P-2, MU3, K13-2 ve MU10) 16S rDNA dizi analizi yöntemi ve BLASTN programı kullanılarak NCBI veri bankasında kayıtlı türlerin 16S rDNA dizileri ile karşılaştırıldı ve bu izolatların Leuconostoc mesenteroides olduğu belirlendi.Moleküler düzeyde tanılanan bu sekiz izolatın ürettikleri dekstransukrazın molekül ağırlığı belirlendi ve maltoz kullanılarak akseptör reaksiyonları çalışıldı. Sentezledikleri dekstranın dekstranaz ile hidrolizi sonucu elde edilen ürünlerin endüstride kullanılan ticari dekstranının yapısı ile benzer olduğu görüldü. Bu izolatlardan yedi tanesi (C2MM, YKY3G2M, Mu11, AN 39-1, OR2P-2, MU3 ve MU10) nin +4 °C'ta, mutant bir suş olan Leuconostoc mesenteroides B512FMC-13Glc' den daha hızlı üreyip, daha erken dekstransukraz ürettikleri belirlendi.İzolatların dekstransukraz üretim kapasitesini arttırabilmek için 3 izolat önce UV radyasyonuna ve sonra EMS ve NTG gibi kimyasallara maruz bırakıldı. Bu çalışmalar sonunda ana soydan aktivitesi yüksek (1,2-8 kat) mutantlar elde edildi. Ana soyun ürettiği enzimin aktivitesi 1,60 IU iken mutasyon çalışmaları sonunda elde edilen mutantın ürettiği enzimin aktivitesinin 12, 98 IU olduğu görüldü. Ana soy sadece sukroz varlığında dekstransukraz sentezlerken elde edilen konstitütif mutantların hem sukroz hem de glukoz varlığında enzim sentezleyebildiği tespit edildi.Mutant soyun sentezlediği enzim ile ana soyun sentezlediği enzim, saflaştırmadan önce ve sonra yapılan karakterizasyon çalışmaları ile karşılaştırıldı. Her iki suşun sentezlediği enzimleri saflaştırmak amacı ile farklı yöntemler kullanıldı. Ana soyun ve mutant türün sukroz broth'da ürettikleri enzimlerin saflaştırılmasında PEG 400 [ % 25 (w/v)] kullanıldığında sırası ile 50 ve 29 kat saflaştırma oranları elde edildi. PEG 6000 [%5 (w/v)] kullanıldığında ise saflaştırma oranları sırası ile 10 ve 16 olduğu tespit edildi . Mutant suşun glukoz medyumda ürettiği enzimin saflaştırılmasında sefadeks G-100 kolon dolgu maddesi kullanıldı. Afinite kromatografisi sonunda A26-2/11G' nin sentezlediği enzimin 62 kat saflaştığı belirlendi. Mutant suşun sentezlediği enzimin düşük pH (4,0) ve düşük sıcaklık (10 °C) gibi uç koşullarda ana soyun sentezlediği enzime oranla daha iyi aktivite gösterebildiği belirlendi.

Abstract:
531 colonies were isolated from homemade sauerkraut and fifteen different native fruits collected from different cities in Turkey. This isolates were identified by using of physiological-biochemical tests. 531 isolates obtained, 235 of the isolates were lactic acid bacteria which streaked on sucrose agar plaka and then dextransucrases producing strains were selected. Ability of enzyme syntesis of isolates were confirmed with İTK method. 111 colonies of lactic acid bacteria producing dextransucrase were characterized by microbiological, physiological-biochemical methods.Molecular characterization of eight isolates (C2MM, YKY3G2M, Mu11, AN 39-1, OR2P-2, MU3, K13-2 ve MU10) with high dextransucrase activities (0.68-1.63 IU/mL) was carried out by using 16S rDNA analysis and the obtained sequences compared with the existing data in the database of NCBI by using BLAST program. According to the results, selected strain were Leuconostoc mesenteroides.Molecular weights of the dextransucrases produced by 8 isolates were determined and acceptor reactions achieved in the presence of maltose. Dextranase hydrolysis products of dextrans produced by new enzymes were similar to industrial utility dextran. It was found that seven strain (C2MM, YKY3G2M, Mu11, AN 39-1, OR2P-2, MU3 and MU10) between these isolates grew faster at 4°C and produced dextransucrase earlier than Leuconostoc mesenteroides B512FMC-13Glc, a mutant form of the commercial strain.Three isolates (K13-2, AN 39-1 and C2MM) were irradiated with UV light (254 nm) in order to increase dextransukrase synthesis ability. Then the UV mutants were treated with EMS and NTG. It was obtained that the dextransucrase activities of these mutants were more higher (1,2-8 fold) than that of the wild type. Dekstransucrase activity of wild type was 1,60 IU in sucrose medium, whereas enzyme activity of mutant strain (A26-2) was 12, 98 IU at the same medium. The wild type require sucrose in the culture medium as an inducer for the elaboration of dekstransucrase, whereas the mutant strains dextransucrases are produced constitutively by growing on glucose medium. Mutant strains dextransucrases and wild type enzyme were characterized and compared before and then the prufication.These enzymes were purified using 2 different methods; affinity chromatography and polyethylene glycol fractionation (PEG). Wild type and mutant enzyme produced in sucrose medium were subjected to fractionation by PEG-400, 2000 and 6000, whereas mutant enzyme produced in glucose medium were purified using affinity chromatography. The 10% (w/v) PEG-1500 gave dextransucrase with maximum specific activity of 29,77 IU/mg with 50 fold purification in a single step.. Dextransucrases of mutant strains are more active than wild type enzyme at low temperature ( 10 °C ) and low pH ( pH: 4,0 )