Tavuk etlerinde Salmonella spp. ve Campylobacter spp.'nin standart kültürel yöntem, ilmiğe dayalı izotermal amplifikasyon (LAMP) ve real-time PCR ile belirlenmesi ve doğrulanması
Determination and identification of Salmonella spp. and Campylobacter spp. by standard culture method, loop-mediated isothermal amplification and real-time PCR in chicken meats
Yazar: MEHMET YÜKSEL
Danışman: PROF. DR. SELAHATTİN SERT
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Genetik = Genetics ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmanın amacı standart kültürel method, ilmiğe dayalı izotermal amplifikasyon (LAMP) ve Real-Time PCR (qPCR) kullanarak Salmonella spp. ve Campylobacter spp. varlığının tavuk etlerinde belirlenmesi ve izolatların bu moleküler yöntemlerle doğrulanmasıdır. Temel amaç, özellikle LAMP metodunun spesifiklik ve hızlılık açısından tavuk etlerinde hedef patojenlerin tespitinde kullanılabilirliğinin araştırılmasıdır. Bu amaçla eşit sayıda baget, kanat ve göğüs etinden oluşan toplam 126 adet örneğin ön zenginleştirme kültürleri LAMP, qPCR ve geleneksel kültürel metot kullanılarak analiz edilmiştir. Çalışma boyunca klasik kültürel yöntemlerle elde edilen Salmonella ve Campylobacter izolatları biyokimyasal testler, LAMP ve qPCR ile doğrulanmıştır. Ayrıca tavuk etleri mezofilik ve psikrotrofik bakteri, koliform ve fekal koliform, maya-küf, Listeria spp., Staphylococcus aureus gibi mikrobiyolojik özellikleri açısından da incelenmiştir. Bununla birlikte; izolatların 12 farklı antibiyotiğe karşı duyarlılıkları disk difüzyon metodu ile belirlenmiştir. Çalışmada Salmonella spp. ve Campylobacter spp. klasik kültürel yöntem, LAMP ve qPCR ile tespit edilmiş ve her üç metodla da aynı hassasiyet ve spesifiklik sonucuna ulaşılmıştır. Salmonella ve Campylobacter için pozitif örnek dağılımı üç yöntemle de sırasıyla 44/126 (%35) ve 32/126 (%25) olarak bulunmuştur. Analizi gerçekleştirilen örneklerde mezofilik ve psikrotrofik bakteri, koliform, maya-küf, Staphylococcus aureus sayısı sırası ile 5-6, 5-7, 2-4, 3-4, 1-3 Log kob/g arasında bulunmuştur. Örneklerin 24'ünde (%19) Listeria spp. tespit edilmiştir. Elde edilen tüm izolatların çoklu antibiyotik direncine sahip olduğu belirlenmiştir. Tüm izolatlar üzerinde Meropenem ve ertapenem en yüksek duyarlılık etkisine sahipken; ampisilin, kanamisin ve nalidiksik asid'in ise en fazla direnç gösterilen antibiyotikler olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak; LAMP'ın, klasik ve moleküler metodlarla gösterdiği uyum nedeni ile tavuk etlerinde Salmonella ve Campylobacter'in hızlı tespitinde kullanılabileceği görülmüştür. Özellikle LAMP metodu hızlı, spesifik, hassas ve düşük maliyet gibi özellikleriyle kısıtlı imkanlara sahip laboratuvarlarda uyugulanabileceği gösterilmiştir.

Abstract:
The aim of this study is to determine using the standard culture method, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and Real-Time PCR (qPCR) methods for detection the presence of Salmonella spp. and Campylobacter spp. in chicken meats,  identificate of the obtained isolates with the molecular methods. The main objective of our study was to assess availability of LAMP in terms of rapidity and specificity, for detection of the target pathogens in chicken meats. For this purpose, pre-enrichment broth cultures a total of 126 consisting of equal number of baguettes, wings and chests of were analysed by using the LAMP, PCR and conventional culture methods. The isolates of Salmonella spp. and Campylobacter spp. obtained using conventional cultural methods were confirmed by both assays (LAMP, qPCR) and biochemical tests. Also, the samples were examined for microbiological properties in terms of mesophiles, psychrotrophs, coliforms and fecal coliforms, yeast-moulds, Listeria spp., Staphylococcus aureus. Moreover, susceptibility of the isolates against to the twelve different antibitoics were determined by the disk diffusion method. In the study, compared to isolation of targets by conventional culture testing, the LAMP and PCR assays showed 100% sensitivity and specificity. The positive sample ratios for the two targets were respectively found 44/126 (35%) and 32/126 (25%) by three methods. In examined samples, the counts of mesophiles, psychrotrophs, coliforms, yeast-moulds, S. aureus were found in the range of 5-6, 5-7, 2-4, 3-4, 1-3 Log CFU/g,   respectively. Listeria spp. were determined in 19% (24/126) of the samples. All isolates were found to be multiply antibiotic resistant. The carried out antibiotic susceptibility test results indicated that all isolates showed susceptibility to meropenem, ertapenem at the highest level, while their resistance to ampicilin, kanamycine ve nalidixic acid were at the highly level. In conclusion, LAMP can be used for the rapid diagnosis of Salmonella and Campylobacter in the chicken meats, due to its compatible with standard culture method and qPCR. Especially, this study has shown that LAMP assay can be utilized with features, such as rapid, specific, sensitive and cost-effective in resource-limited laboratories.