Mycobacterium tuberculosis ERP proteininin rekombinant olarak saflaştırılması ve bağışıklık yanıtın preklinik düzeyde incelenmesi
Purpose of Mycobacterium tuberculosis ERP protein as a recombinant and prevalence of an immunity response analysis
Yazar: RUKİYE ÇETİN
Danışman: DOÇ. DR. SEZER OKAY
Çankırı Karatekin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Günümüzde, tüberküloz hastalığına karşı kullanılan tek lisanslı aşı BCG aşısıdır. Bu aşının erişkinlerde koruyuculuğu yetersiz olduğu için etkin yeni tüberküloz aşılarının geliştirilmesi için çalışmalar başlatılmıştır. Bu tez çalışmasında ülkemizdeki bir verem hastasından izole edilmiş olan Mycobacterium tuberculosis suşundan erp geni çoğaltılarak önce pGEM-T sonra pET28-a vektörüne klonlandı. Daha sonra E. coli BL21 suşuna aktarıldı ve E. coli'de ifade edilen his-tag'lı rekombinant Erp proteini nikel kolonlar kullanılarak saflaştırıldı. Saflaştırılan protein yağ bazlı bir adjuvan olan Montanide ISA 720 VG ile 7:3 oranında karıştırılarak aşı formülasyonu hazırlandı. Rekombinant proteinin antijenik özellikleri Western blot deneyi ile kalitatif olarak analiz edildi. Rekombinant proteine ve BCG aşısına özgün serum kullanıldığında beklenen büyüklükte bantlar gözlenirken, sadece adjuvana özgün serum kullanıldığında bant gözlenmedi. Bununla birlikte Erp'nin hümoral ve hücresel bağışıklığı tetikleme kapasiteside değerlendirildi. Aşılama öncesi ve sonrası IgG değerleri karşılaştırıldığında, hazırlanan aşı formülasyonunun hümoral bağışıklık yanıtını anlamlı düzeyde uyardığı belirlendi. Bu formülasyonun hücresel bağışıklığı tetikleme kapasiteleri serum interferon-gama (IFN-γ) ve interlökin-12 (IL-12) düzeyleri ile ölçüldü. Erp formülasyonunun IFN-γ düzeyini artırmada BCG kadar etkin olduğu gözlendi ve 15. ve 30. günlerde BCG'den daha yüksek IL-12 düzeyi sağladığı tespit edildi. Elde edilen bulgular doğrultusunda, rekombinant Erp'nin altünite tüberküloz aşısı geliştirmede kullanılabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
BCG is the only vaccine against tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis bacteria. Effective new tuberculosis vaccines need to be developed because this vaccine is insufficient in adults. In this thesis, erp gene from  Mycobacterium  tuberculosis strain isolated from a tuberculosis patient in Turkey was cloned into pGEM-T, followed by pET28-a vector and transferred to E. coli BL21 strain. His-tagged recombinant Erp protein expressed in E. coli was purified using nickel columns and the vaccine formulations were prepared by mixing 7: 3 with Montanide ISA 720 VG, an oil-based adjuvant. The antigenic properties of the recombinant protein were qualitatively visualized by Western blotting. When using recombinant protein and BCG vaccine-specific serum, the expected large bands were observed, but no band was observed when only adjuvant-specific serum was used. Simultaneously, the humoral and cellular immunity triggering capacity of the recombinant protein was assessed. When comparing pre- and post-immunization IgG values, it was determined that the prepared vaccine formulation significantly increased the humoral immune response. The cellular immunity triggering capacities of this formulation were measured by serum interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-12 (IL-12) levels. Erp formulation was found to be as effective as BCG in increasing IFN-γ levels. Erp formulation was found to provide higher levels of IL-12 than BCG on days 15 and 30. It is thought that recombinant ERP can be used to develop the subtype tuberculosis vaccine in the direction of the obtained findings.