Sisplatinle indüklenen testis hasarında melatoninin otofaji yönlendirici etkisinin araştırılması
Investigation of the directing effect of melatonin on autophagy in testicular damage cisplatin-induced
Yazar: MURAT ÜNSAL
Danışman: PROF. DR. BİRKAN YAKAN
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Melatonin = Melatonin ; Otofaji = Autophagy ; Sisplatin = Cisplatin ; Sıçanlar = Rats ; Testiküler hastalıklar = Testicular diseases ; Testis = Testis

Özet:
Sisplatin (Cis) kanser tedavisinde kullanılan kemoterapötik bir ilaçtır. Cis, testislerde  spermatojenik seride, Sertoli  ve  Leydig  hücrelerinde  apopitozu  tetikleyerek  hasar  meydana  getirir. Bu çalışmada, Cis'in testis dokusunda oluşturduğu hasarın ortadan kaldırılmasında güçlü antioksidan özelliğiyle bilinen Melatonin (Mel)' in testis  dokusunda  apopitozu  azaltarak otofajiye yönlendirici  etkisinin  değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
40 adet Wistar albino cinsi sıçan rastgele dört gruba (n=10) ayrıldı. Grup 1 (Kontrol) 7 gün boyunca izotonik salin (SF) (1ml/kg/gün)  solüsyonu intraperitoneal (i.p.) uygulandı. Grup 2 (Cis) deneyin 5. günü tek doz Cis (7 mg/kg) i.p. olarak verildi. Grup 3 (Mel) deneyin başlangıcından itibaren 7 gün boyunca günlük Mel (10 mg/kg/gün) i.p. olarak verildi. Grup 4 (Mel+Cis) deneyin başlangıcından itibaren 7 gün boyunca günlük Mel (10 mg/kg/gün) i.p. olarak verildi, 5. günde Cis (7 mg/kg) tek doz i.p. olarak verildi. Deneyin 8. gününde sıçanlar xylazin ve ketamin anestezisi altında dekapite edilerek testisleri alındı. Testislerden alınan kesitler hematoksilen-eozin ile boyanarak histolojik hasar belirlendi. Tübüllerdeki hasarlanmanın derecesinin değerlendirilmesinde Johnsen Testiküler Biyopsi Skoru (JTBS) kullanıldı. Apopitoz ve otofaji markırları olan Kaspaz-3, LC-3 ve SIRT-1 immünohistokimyasal boyama yöntemiyle boyanarak Image-j programıyla ölçümleri yapıldı. Sıçanların kan serumunda Testosteron, LH, FSH parametrelerine ELISA yöntemiyle bakıldı. Apopitotik hücre görüntüleme ve sayımı için TUNEL yöntemi kullanıldı. Comet Assay tekniğiyle de testis dokusunda ve duktus epididimiste sperm hücre düzeyinde DNA hasarı saptandı ve miktarı belirlendi. Makler kamerasıyla sperm sayımı yapıldı.
Kontrol ve Mel grubu birbirine benzerdi. JTBS skoruna göre Cis grubunda diğer gruplara kıyasla istatistiksel olarak azalma gözlendi. İmmunohistokimya boyama sonuçlarına göre Cis grubunda Kaspaz-3 arttı, LC-3 ve SIRT-1 azaldı. Cis grubunda tüm hormon seviyelerinde azalma gözlendi. Ayrıca apopitotik hücre sayısı arttı. Comet Assay tekniğine göre tail-DNA hasar oranı da Cis grubunda arttı. Cis grubunda sperm sayısı azaldı. Mel+Cis grubunda hem Johnsen Testiküler Biyopsi Skoru (JTBS) hem de immunohistokimya boyamalarında düzelme gözlendi. Kaspaz-3 azaldı, LC-3 ve SIRT-1 arttı. Hormon seviyeleri, TUNEL, Comet Assay ve sperm sayısı parametreleri de Cis grubuna kıyasla düzelmişti.
Sonuç olarak tek doz Cis uygulaması testis dokusunda  hasara yol açmış ve  hücreleri apopitoza yönlendirdiği görülmüştür. Sıçan testis dokusunda oluşan bu hasarın Mel ile düzeltilebileceği, hücresel düzeyde de apopitozu azaltarak otofajiye yönlendirebileceği gözlemlenmiştir.
Anahtar Kelimeler: Sisplatin, Melatonin, Testis, Sıçan

Abstract:
Cisplatin (Cis) is a chemotherapeutic drug used in cancer treatment. Cis causes damage by triggering apoptosis in the spermatogenic series in the testicles, in the Sertoli and Leydig cells. This study, it was aimed to evaluate the directing effect of Melatonin (Mel), known for its powerful antioxidant properties, on autophagy by reducing apoptosis in testicular tissue in eliminating the damage caused by Cis in testicular tissue.
Forty Wistar albino rats were randomly divided into four groups (n=10). Group 1 (Control) isotonic saline (SF) (1ml / kg / day) solution was administered intraperitoneally (i.p.) for 7 days. Group 2 (Cis) was given a single dose of Cis (7 mg/kg) ip on the 5th day of the experiment. Group 3 (Mel) was given daily Mel (10 mg/kg/day) ip for 7 days from the start of the experiment. Group 4 (Mel + Cis) was given as daily Mel (10 mg/kg/day) ip for 7 days from the beginning of the experiment, Cis (7 mg/kg) was given as a single dose ip on day 5. On the 8th day of the experiment, the testes were removed by decapitating the rats under xylazine and ketamine anesthesia. Histological damage was determined by staining the sections taken from the testicles with hematoxylin-eosin. The Johnsen Testicular Biopsy Score (JTBS) was used to evaluate the degree of tubular damage. The markers of apoptosis and autophagy, Caspase-3, LC-3 and SIRT-1 were stained by immunohistochemical staining method and measured with Image-j program. Testosterone, LH, FSH parameters were measured by ELISA method in the blood serum of rats. TUNEL method was used for apoptotic cell imaging and counting. In the Comet Assay technique, DNA damage was detected at the sperm cell level in the testicular tissue and ductus epididymis and its amount was determined. Sperm count was done with spermiogram.
Control and Mel group were similar. According to the JTBS score, a statistically significant decrease was observed in the Cis group compared to the other groups. According to the results of immunohistochemistry staining, Caspase-3 increased, LC-3 and SIRT-1 decreased in the Cis group. A decrease was observed in all hormone levels in the Cis group. In addition, the number of apoptotic cells increased. According to the Comet Assay technique, the tail-DNA damage rate also increased in the Cis group. Sperm count decreased in Cis group. An improvement was observed in both JTBS and immunohistochemistry staining in the Mel + Cis group. Caspase-3 decreased, LC-3 and SIRT-1 increased. Hormone levels, TUNEL, Comet Assay, and sperm counts were also improved compared to the Cis group.
As a result, it was observed that a single dose of Cis application caused damage to the testicular tissue and directed the cells to apoptosis. It has been observed that this damage to the rat testis tissue can be corrected with Mel, and it can be directed to autophagy by reducing apoptosis at the cellular level.
Keywords: Cisplatin, Melatonin, Testis, Rat.