Bakteriyel soğuk su hastalığı etkeni Flavobacterıum psychrophılum bakteriyofajının izolasyonu ve karakterizasyonu
Isolation and characterization of bacteriophage of bacterial cold water disease Flavobacterium psychrophilum
Yazar: MUSTAFA ÜSTÜNDAĞ
Danışman: PROF. DR. MUTLU NİSA ÜNALDI CORAL ; PROF. DR. GÖKHAN CORAL
Mersin Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Alabalıklar = Trouts ; Bakteriler = Bacteria ; Bakteriyofajlar = Bacteriophages ; Flavobacterium = Flavobacterium

Özet:
Flavobacterium psychrophilum patojeninin neden olduğu bakteriyel soğuk su hastalığı, bütün dünyada alabalık kuluçkahanelerinde görülen ve ağır kayıplara sebep olan bir hastalıktır. Bu nedenle bakteriyel soğuk su hastalığı alabalık yetiştiriciliğinde çözüm bekleyen konuların başında gelmektedir. Gelişen antibiyotik direnci ile birlikte kültür balıkçılığında daha önce kolaylıkla tedavi edilen hastalıklar ile mücadele zorlaşmıştır. Bakteriyi enfekte eden virüsler olarak tanımlanan bakteriyofajlar (faj) artan antibiyotik direncine alternatif olarak tedavisi zor enfeksiyonlar için yeniden gündeme gelmektedir. Bu çalışmada, kırmızı benekli alabalık yetiştiriciliğinde yüksek ölüm oranlarına sebebiyet veren F. psychrophilum'un izolasyonu, karakterizasyonu; F. psychrophilum'un doğal düşmanları olan bakteriyofajlarının izolasyonu ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. Bu tez kapsamında yeni ölmüş kırmızı benekli alabalıkların; karaciğer, böbrek ve solungaçlarından Anacker Ordal besiyerine ekimler yapılarak 15°C'de 3-5 gün inkübe edilmiştir. Ekimler sonucunda F. psychrophilum'a morfolojik olarak benzeyen sarı renkli koloniler izole edilmiştir. İzole edilen bakterinin identifikasyonu ve karakterizasyonu; API 20E hızlı tanı kiti ve 16S rRNA dizi analizi yapılarak belirlenmiştir. Yapılan testler sonucunda izole deilen bakteri suşu F. psychrophilum olarak tanımlanmıştır. Bakteri suşunun antibiyotik duyarlıkları disk difüzyon ile belirlenmiş, sonuçlar CLSI standartlarına göre değerlendirilmiştir. Antibiyotik duyarlık test sonuçlarına göre F. psychrophilum suşu, Enrofloksasin (ENR, 5 µg) ve Oxolinic acid (OA, 2 µg) karşı duyarlı, Oksitetrasiklin (OT, 30 µg)'e ise orta derecede duyarı olduğu belirlendi. Florfenikol (FFC, 30 µg) Sulphamethoxazole (RL, 25 µg), Erythromycin (E,15 µg), Ampicillin (AMP, 10 µg), Neomisin (N, 10 µg), Trimethoprım (W 5 µg) ve Amoxycillin (AML 10 µg)'e ise dirençli olduğu tespit edilmiştir. Bakteriyofaj süspansiyonu; 5 farklı bölgeden alınan su örneklerinin 0,22 μm por çaplı filtrelerden geçirilmesiyle elde edilmiştir. Çift tabaka agar yöntemi ile 7 faj izole edilmiştir. İzole edilen fajlar FpV1, FpV2, FpV3, FpV4, FpV5, FpV6 ve FpV7 olarak isimlendirilmiştir. Fajların kinetik parametreleri belirlenmiştir. En büyük patlama büyüklüğü ve kısa latent süresinin FpV1 fajında olduğu tespit edilmiştir. Fajların genom büyüklükleri, genomik DNA'larının Hind III restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilmesi sonucunda analiz edilmiştir. İzole deilen fajlar uranil asetat ile negatif boyanak Transmisyon Elektron Mikroskop (TEM) ile görüntülenmiştir. Bu çalışma, alabalık kuluçkahanelerinde görülen bakteriyel soğuk su hastalığının kontrol altına alınmasında faj tedavisinin potansiyelinin daha iyi anlaşılmasına ve gelecek yıllarda alternatif bir tedavi yöntemi olarak kullanılmasına temel sağlamıştır.

Abstract:
Bacterial cold water disease caused by the pathogen Flavobacterium psychrophilum is a disease that is seen in trout hatcheries all over the world and causes heavy losses. For this reason, bacterial cold water disease is one of the leading issues in trout farming. With the developing antibiotic resistance, it has become difficult to fight against diseases that were easily treated in aquaculture. Bacteriophages (phages), defined as viruses that infect bacteria, are on the agenda again as an alternative to increasing antibiotic resistance for infections that are difficult to treat. In this study, isolation and characterization of F. psychrophilum, which causes high mortality rates in red spotted trout farming; Isolation and characterization of bacteriophages, which are natural enemies of F. psychrophilum, are aimed. Within the scope of this thesis, the newly dead red spotted trout; Liver, kidney and gills were inoculated into Anacker Ordal medium and incubated at 15°C for 3-5 days. As a result of cultivation, yellow colored colonies morphologically similar to F. psychrophilum were isolated. Identification and characterization of isolated bacteria; API 20E was determined by rapid diagnostic kit and 16S rRNA sequence analysis. As a result of the tests, the bacterial strain that was not isolated was defined as F. psychrophilum. The antibiotic susceptibility of the bacterial strain was determined by disc diffusion and the results were evaluated according to CLSI standards. According to antibiotic susceptibility test results, F. psychrophilum strain was found to be sensitive to Enrofloxacin (ENR, 5 µg) and Oxolinic acid (OA, 2 µg) and moderately sensitive to Oxytetracycline (OT, 30 µg). Florfenicol (FFC, 30 µg), Sulphamethoxazole (RL, 25 µg), Erythromycin (E, 15 µg), Ampicillin (AMP, 10 µg), Neomycin (N, 10 µg), Trimethoprim (W 5 µg), and Amoxycillin (AML 10) It was found to be resistant to µg). Bacteriophage suspension; It was obtained by passing water samples from 5 different regions through filters with a pore diameter of 0.22 μm. 7 phages were isolated by the double layer agar method. The isolated phages were named as FpV1, FpV2, FpV3, FpV4, FpV5, FpV6 and FpV7. The kinetic parameters of the phages were determined. The largest burst size and short latency period were found in the FpV1 phage. The genome sizes of the phages were analyzed by cutting their genomic DNA with the Hind III restriction endonuclease enzyme. Non-isolated phages were visualized with a negative staining Transmission Electron Microscope (TEM) with uranyl acetate. This study provided the basis for a better understanding of the potential of phage therapy in controlling bacterial cold water disease in trout hatcheries and its use as an alternative treatment method in the coming years.