Organotipik modellere uygulanan farklı irrigasyon protokollerinin apikal papillaya ait kök hücrelerin canlılığına etkisi
Effect of different irrigation protocols on the survival of human stem cells of the apical papilla in organotype models
Yazar: MERVE ÖZGÜVEN AKBULUT
Danışman: PROF. DR. ALİ ERDEMİR
Kırıkkale Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Endodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2016
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Endodonti = Endodontics ; Kök hücreler = Stem cells ; Kök kanal tedavisi = Root canal therapy ; Kök kanalı irrigantları = Root canal irrigants ; İrrigasyon = Irrigation ; İrrigasyon-yara = Irrigation-wound

Özet:
Rejeneratif endodontik prosedürler pulpa nekrozlu immatür daimi dişlerin tedavisi için uygulanabilir bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Birçok rejeneratif endodontik tedavi minimal enstrümentasyonla ya da hiç enstrümentasyon yapılmaksızın gerçekleştirilmektedir. Bu nedenle kök kanal dezenfeksiyonunun sağlanması rejeneratif endodontik uygulamalar içinde önemli bir yere sahiptir. Fakat rejeneratif endodontide kullanılan kimyasal ajanların bakteriyostatik/bakterisidal özellikte olması yeterli değildir; aynı zamanda hastaya ait kök hücrelerin hayatta kalma, çoğalma ve farklılaşma kapasitesini de artırabilmelidir. Bu çalışmanın amacı farklı irrigasyon protokollerinin insana ait SCAP'nin canlılığı üzerindeki etkisini değerlendirmektir. Bu çalışmada insana ait immatür üçüncü molar dişlerden elde edilen SCAP akan hücre ölçer kullanılarak karakterize edildi. CD73, CD90 ve CD105 markırlarını aynı anda eksprese hücrelerin yüzdesi %90'ın üzerindeydi. Karakterize edilen SCAP tüm deneylerde kullanıldı.
Çalışmada WST-1 yöntemi için 43 adet yeni çekilmiş tek köklü insan dişi kullanıldı. Dişler çekilir çekilmez steril ve soğuk HBSS içerisine yerleştirildi. Bütün dişlerin kron kısmı, dişin uzun aksına dik olarak kesilerek uzaklaştırıldı. 5 mm uzunluğa sahip standart kök segmentleri oluşturmak için steril edilmiş yüksek hızda frezler kullanıldı. 1,3 mm çapında paralel duvarlı kanal yapısı hazırlamak için konik olmayan LSX eğeler kullanıldı ve böylelikle rejeneratif vakaların çoğunda karşılaşılan açık/immatür apeks taklit edilmiş oldu. Bütün organotipik kök kanal modelleri hava ile kurutulup, hidrojen peroksit gazıyla steril edildi ve 1 kontrol grubu (n=3) ve 8 deney grubu (n=5) olmak üzere rastgele 9 farklı gruba ayrıldı. Her grupta farklı bir irrigasyon protokolü uygulandı: (Grup 1) irrigasyon yapılmadı, (Grup 2) %5 EDTA, (Grup 3) %17 EDTA, (Grup 4) %1 NaOCl+%5 EDTA, (Grup 5) %2,5 NaOCl+%5 EDTA, (Grup 6) %5 NaOCl+%5 EDTA, (Grup 7) %1 NaOCl+%17 EDTA, (Grup 8) %2,5 NaOCl+%17 EDTA, (Grup 9) %5 NaOCl+%17 EDTA ile irrigasyon yapıldı. Tüm deney gruplarında irrigasyon ajanı artıklarını uzaklaştırmak amacıyla steril salin kullanılarak final irrigasyon yapıldı. Tüm bu prosedürlerin ardından izole SCAP, PRP ile karıştırılarak organotipik modeller içerisine ekildi. Bu modeller dik bir şekilde 0,4 µm boyutunda porlara sahip transwell insertler (Corning, Tewksbury, MA) içerisine yerleştirildi, 3 ve 7 gün boyunca inkübe edildi. Besiyeri ise her 2 günde bir kez tazelendi. İrrigasyon protokollerinin SCAP canlılığı üzerine etkisi WST-1 yöntemi ile değerlendirildi. İki farklı değerlendirme zamanı için absorbans değerlerini belirlemek amacıyla mikroplaka spektrofotometri cihazı (BioTek, PowerWave XS2) kullanıldı. İstatistiksel analizlerde Bonferroni düzeltmeli Kruskall-Wallis H testi kullanıldı (α=0,05). Grup içi değerlendirmeler ise Wilcoxon işaret testi ile yapıldı.
SCAP'nin proliferasyonu, xCELLigence RTCA sistemi ve 96 kuyucuklu E-plate (Roche, Basel, Switzerland) kullanılarak belirlendi. Bu sistemde irrigasyon protokolleri E-plate kuyucuklarına uygulandı ve ardından PRP/SCAP süspansiyonu steril otomatik bir pipet yardımıyla yine E-plate kuyucuklarına ekildi. Tüm deneyler 3 tekrarlı olarak çalışıldı. 116 saat boyunca her kuyucuğun empedans değeri xCELLigence sistemi ile takip edildi ve CI değeri olarak sunuldu. Verilerin analizi için Bonferroni düzeltmeli Kruskall-Wallis H testi kullanıldı (α=0,05).
Apoptotik/nekrotik hücreler ikili boyama yöntemi ile değerlendirildi. Bu sistemde irrigasyon protokolleri kuyucuklara uygulandı ve ardından PRP/SCAP süspansiyonu steril otomatik bir pipet yardımıyla yine kuyucuklara ekildi. Tüm deneyler 3 tekrarlı olarak çalışıldı. 24 saat inkübasyonun ardından, floresan ataçmanlı inverted mikroskop (DMI6000B, Leica, Germany) yardımıyla her kuyudan bir görüntü alındı. Tüm hücre ve apoptotik hücre sayısı DAPI filtresi altında belirlenirken, nekrotik hücrelerin sayısı FITC filtresi altında belirlendi. Elde edilen değerlerle apoptoz/nekroz oranı hesaplandı. İstatistiksel analizlerde Bonferroni düzeltmeli Kruskall-Wallis H testi kullanıldı (α=0,05).
SEM analizi için 9 adet yeni çekilmiş tek köklü insan dişi kullanıldı. Bütün dişlerin kron kısımları dişin uzun aksına dik olarak kesilerek uzaklaştırıldı. Kök kanalları çalışma boyutunda hazırlandıktan sonra, bütün kökler longitudinal olarak ikiye ayrıldı. Örnekler hava ile kurutuldu, hidrojen peroksit gazı ile steril edildi ve rastgele 9 gruba ayrıldı. İrrigasyon protokolleri uygulandıktan sonra, izole edilen SCAP, PRP ile karıştırıldıktan sonra kök kanalları içerisine ekildi. Örnekler yatay bir şekilde 12 kuyucuklu mikroplakalara yerleştirildi ve 7gün boyunca inkübe edildi. Besiyeri ise her 2 günde bir kez tazelendi. Ardından örnekler SEM analizi için hazırlandı. 1 000× ve 10 000× büyütmede görüntüler alındı.
WST-1 yönteminde, 3. günde yapılan ölçümlerde Grup 8 en yüksek absorbans değerine sahipken, 7. günde Grup 3'ün en yüksek absorbans değerine sahip olduğu görüldü. Her iki zaman ölçümünde de en düşük SCAP canlılık oranı Grup 6'da görüldü.
xCELLigence RTCA sisteminde, 116 saat sonunda en yüksek değerler EDTA'in tek başına kullanıldığı gruplarda (Grup 2 ve Grup 3) görülürken, en düşük değerler %5'lik NaOCl'in kullanıldığı gruplarda (Grup 6 ve Grup 9) görüldü. En yüksek proliferasyon oranına sahip bu gruplar (Grup 2 ve Grup 3) ile Grup 5, 6 ve 9 arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,01).
İkili boyama yönteminde 24 saat sonunda elde edilen verilere göre en yüksek nekroz oranı %5 NaOCl+%5 EDTA (Grup 6) ile irrigasyon yapılan grupta gözlenirken, en düşük nekroz oranı %17'lik EDTA (Grup 3) ile irrigasyon yapılan grupta gözlendi. Hiçbir grupta apoptotik hücreye rastlanmadı.
SEM analizi sonuçlarına göre, sadece EDTA'in kullanıldığı (Grup 2 ve Grup 3) ve %2,5 NaOCl+%17 EDTA ile irrigasyon yapılan grupta (Grup 8), SCAP'nin küçük topluluklar halinde ve diğer gruplara göre daha yoğun olarak dentin yüzeyine tutunduğu görüldü. %5'lik NaOCl ile irrigasyon yapılan gruplardan (Grup 6 ve Grup 9) 1 000× büyütmede alınan SEM görüntülerinde ise, fibrin ağ yoğunluğunun azaldığı tespit edildi.
Sonuç olarak, %5'lik NaOCl'in dâhil edildiği irrigasyon protokollerinin SCAP üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğu görüldü. NaOCl ile yapılan irrigasyonun SCAP üzerindeki olumsuz etkilerini geri çevirmede ise, %17'lik EDTA'in %5'lik EDTA'e göre daha başarılı olduğu tespit edildi.

Abstract:
Regenerative endodontic procedures have emerged as viable "alternatives for the treatment of immature permanent teeth with pulpal necrosis. Most regenerative endodontic procedures include minimal to no mechanical instrumentation. Therefore, root canal disinfection is an important part in regenerative endodontic procedures. However, chemical agents used in regenerative endodontics must be selected not only based on their bactericidal/bacteriostatic characteristics but also on their ability to promote the survival, proliferation and differentiation capacity of the patient's stem cells. The aim of this study was to evaluate the effect of different irrigation protocols on the survival of human SCAP in organotype models. SCAP were isolated from immature human third molars and characterized by flow cytometry. The percentage of cells that coexpressed CD73, CD90, and CD105 was >90%. The characterized SCAP were used in all experiments.
In the study 43 recently extracted with single canal human teeth were used for WST-1 method. Extracted teeth were immediately placed in sterile ice-cold HBSS. All teeth were decoronated perpendicular to the long axis. Sterilized high-speed burs were used to section roots to achieve standardized segment lengths of 5 mm. Nontapered LSX instruments were used to prepare a parallel-walled canal space with a constant 1,3 mm diameter. Thus, an open/immature apex was simulated often observed in regenerative cases. All organotype root canal models were air dried, gas sterilized with hydrogen peroxide, and randomly divided into 1 control group (n=3) and 8 experiment groups (n=5). Different irrigation protocols were performed on each group: (Group 1) no irrigation, (Group 2) 5% EDTA, (Group 3) 17% EDTA, (Group 4) 1% NaOCl+5% EDTA, (Group 5) 2,5% NaOCl+5% EDTA, (Group 6) 5% NaOCl+5% EDTA, (Group 7) 1% NaOCl+17% EDTA, (Group 8) 2,5% NaOCl+17% EDTA, (Group 9) 5% NaOCl+17% EDTA. The final irrigation was done with sterile saline in all experiment groups to remove residual irrigant. Following this procedures, isolated SCAP were mixed with PRP and seeded into the organotype models. The models containing PRP and cells were placed vertically into the transwell inserts (Corning, Tewksbury, MA) with 0,4 µm pore size and incubated for 3 and 7 days and the medium was refreshed once every 2 days. After all of these procedures, the effect of irrigation protocols on SCAP survival was evaluated with WST-1 method. To determine the absorbans value the microplate spectrophotometer was used (BioTek, PowerWave XS2) for two different evaluation time. Kruskall-Wallis H and post hoc Bonferroni test were used in statistical analysis (α=0,05). Wilcoxon signed-rank test used for intra-group comparison.
The proliferation of SCAP was determined using the xCELLigence RTCA and E-plate 96 system (Roche, Basel, Switzerland). In this system, the irrigation protocols were applied on the E-plate and then PRP/SCAP suspension was seeded onto the E-plate via a sterile automatic pipette. These experiments were done in triplicates. The impedance value of each well was monitored by the xCELLigence system for 116 hours and expressed as a CI value. Kruskall-Wallis H and post hoc Bonferroni test were used for analysing the data (α=0,05).
Apoptotic/necrotic cells was evaluated with double-staining method. In this method, the irrigation protocols were applied on the plate and then PRP/SCAP suspension was seeded onto the plate via a sterile automatic pipette. These experiments were done in triplicates. After 24 hour incubation, an image was taken from each well by the inverted fluorescence microscope (DMI6000B, Leica, Germany). While the number of all and apoptotic cells determining under the DAPI filter, the number of necrotic cells were determined under the FITC filter. After that apoptosis/necrosis rate was calculated. Kruskall-Wallis H and post hoc Bonferroni test were used in statistical analysis (α=0,05). 
9 recently extracted with single canal human teeth were used in this study for SEM analysis. All teeth were decoronated perpendicular to the long axis. After the root canals were prepared at working length, all roots were split longitudinally. All samples were air dried, gas sterilized with hydrogen peroxide, and randomly divided in into 9 groups. After irrigation protocols were applied, isolated SCAP were mixed with PRP and seeded into the root canals. The samples containing PRP and cells were placed horizontally into the 12 well plate and incubated for 7 days and the medium was refreshed once every 2 days. Then the samples were prepared for SEM analysis. The images were taken at 1 000× and 10 000× magnifications.  
In WST-1 method, while the measurements which took place at 3rd day showed that Group 8 has the highest absorbance value, at 7th day it was seen that Group 3 had the highest absorbance value. The measurements which made 3rd and 7th days showed that in both time period group 6 had the lowest absorbance value. 
In xCELLigence RTCA system, after 116 hours of incubation, the highest proliferation rates were seen in Group 2 and Group 3 where only EDTA used, in the meanwhile the proliferation rates were seen in Group 6 and Group 9 where 5% NaOCl used. There were statistically significant differences between the groups which had the highest proliferation rates (Group 2 and Group 3) and Group 5,6 and 9 (p<0,01).
According to the datas which obtained by double staining method after 24 hours, the highest necrosis rate observed in Group 6 which was irrigated with 5% NaOCl+5%EDTA, the lowest necrosis rate observed in Group 3 which was irrigated with 17% EDTA. There was no apoptotic cell in any group. 
According to SEM analysis results it has been seen that, in Group 2 and Group 3 which only EDTA used and Group 8 which irrigated with 2,5% NaOCl+17% EDTA, SCAP in small communities attached on dentine surface more consistent than the other groups. On the other hand, in SEM images which were taken at 1 000× magnification from Group 6 ve Group 9 which irrigated with 5% NaOCl, it has been detected that fibre web consistenty has decreased.
As a result, it has been seen that, the irrigation protocols which 5% NaOCl included have negative effects on SCAP. It has been detected to reverse the negative effects of NaOCl irrigation on SCAP, 17% EDTA is more successful than %5 EDTA.