-Galaktozidaz enziminin immobilizasyonu, karakterizasyonu ve endüstriyel proseslerde kullanım potansiyelinin araştırılması
Immobilization, characterization and determination of the potential usage of -galactosidase in industrial processes
Yazar: EVRAN BIÇAK ÇELEM
Danışman: PROF. DR. SEÇİL ÖNAL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Enzim immobilizasyonu = Enzyme immobilization ; Enzimatik hidroliz = Enzymatic hydrolysis ; Galaktosidazlar = Galactosidases ; Karpuz = Watermelon ; Soya sütü = Soy milk

Özet:
-Galaktozidazlar (Melibiaz, EC 3.2.1.22), basit ve kompleks oligo- ve polisakkaritlerin (rafinoz, stakiyöz, melibiöz, galaktomannan) ?-1,6-bağlı D-galaktozil artıklarını hidrolizleyen ekzoglikozidazlardır. Çok çeşitli tekniklerle bitkilerden, hayvanlardan ve çeşitli mikrobiyal organizmalardan saflaştırılmışlardır. Özellikle şeker endüstrisinde önemli bir yere sahip olan ?-galaktozidazlar, medikal alanda (Fabry hastalığının tedavisi, doku nakli ve kan grubu dönüşümlerinde), kompleks karbohidratların biyolojik fonksiyonlarının belirlenmesinde, organik sentezlerde ve yapı analizlerinde çeşitli uygulamalara sahiptirler. Bu enzim ile yapılan çok sayıda saflaştırma ve karakterizasyon çalışması olmasına rağmen immobilizasyon çalışmaları oldukça azdır.İmmobilize enzimler, geleneksel kimyasal yöntemlere alternatif olarak yenilikçi biyoteknolojik proseslerin kalpleridirler. ?-Galaktozidazın endüstriyel uygulamalarıserbest enzime kıyasla yüksek aktivite ve kararlılıkta biyokatalist immobilize enzim elde etmek için etkili yöntemlere gereksinim duyar.Bu çalışmada, ?-galaktozidaz enzimi önce karpuzdan (Citrullus vulgaris) izole edilerek kısmi olarak saflaştırıldı ve ardından Sepabead EC- serisi (Sepabead EC-EP, EC-EA ve EC-HA) taşıyıcılarda kovalent bağlama, adsorpsiyon ve çapraz bağlama teknikleri kullanılarak immobilize edildi. Her bir immobilizasyon protokolünün optimizasyonu için immobilizasyona çeşitli parametrelerin etkisi (tampon türü, konsantrasyonu ve pH' ı, protein miktarı, glutaraldehid konsantrasyonu, aktivasyon süresi gibi) incelendi. Hazırlanan immobilize ve serbest enzimlerin fiziksel ve kimyasal karakterizasyonu gerçekleştirildi. Enzim aktivitesine etki eden bazı parametreler (pH, sıcaklık, substrat konsantrasyonu, efektör konsantrasyonları) incelenerek kararlılık testleri (pH, termal, operasyonel ve depo kararlılığı) yapıldı. Bunların yanı sıra immobilize enzimlerin tekrar kullanılabilirliği de test edildi. Serbest ve immobilize ?-galaktozidaz enzimlerinin soya sütündeki rafinoz ve rafinoz tip oligosakkaritlerin hidrolizinde kullanılabilirliği ile ilgili çalışmalar yapıldı.Anahtar sözcükler:Karpuz (Citrullus vulgaris), ?-galaktozidaz, soya sütü, immobilizasyon, Sepabead EC-EP, Sepabead EC-EA, Sepabead EC-HA, rafinoz hidrolizi.

Abstract:
-Galactosidases (Mellibiase, EC 3.2.1.22) are the exoglycosides that catalyses the hydrolysis of ?-1,6- bounded D-galactosyl residues of basic and complex oligo- and polysaccharides (raffinose, stachyose, mellibiose, galactomannans). They have been purifed with different techniques from plants, animals and various microorganisms. They have great importence in especially sugar industry, elucidation of the biological functions of complex carbohydrates, structural analaysis, organic synthesis and medical purpose (cure of Fabry disesase, xenotransplantation). Because of these, there has been many purification and characterization studies with ?-galactosidases but in contrast to this, there are only few immobilization studies.Immobilized enzymes are the hearth of innovative biotechnological processes as alternatives to traditional chemical Technologies. Industrial applications of ?-galactosidase requires efficient methods to immobilize enzyme, yielding a biocatalyst with high activity, stability compared to free enzyme.In this study ?-galactosidase was isolated and partially purified from watermelon (Citrullus vulgaris) and then immobilized on Sepabead EC- carriers (Sepabead EC-EP, EC-EA ve EC-HA) by covalent coupling, adsorption and crosslinking. For optimization of immobilization protocols, effects of some parameters (buffer type, concentration and pH of buffer, protein amount, concentration of glutaraldehyde, activation time, etc?) to immobilization were tested. Physical and chemical characterization of free and immobilized enzymes were made. Some parameters effecting to the enzyme activity (pH, temperature, substrate concentration and effector concentration) were searched and stability tests (thermal, pH, storage and operational stability) were also done. Beside of these, useability of the immobilized enzymes were tested. Finally the usage of free and immobilized enzymes in the hydrolysis of raffinose and raffinose type oligosaccharides present in soymilk were determined.Keywords:Watermelon (Citrullus vulgaris), ?-galactosidase, immobilization, Sepabead EC-EP, Sepabead EC-EA, Sepabead EC-HA, soy milk, hydrolysis of raffinose.