Yüksek bor toleransına sahip pseudomonas cinsine ait bazı izolatların genomik kütüphanelerinin oluşturulması ve bor ile ilgili genlerin bulunması
Construction of genomic libraries of some highly boron tolerant isolates of pseudomonas genus and determination of boron related genes
Yazar: ESRA DİBEK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bor, birçok açıdan ekonomik ve bilimsel önemi olan bir elementtir. Ülkemizde Balıkesir-Bigadiç, Bursa-Kestelek, Kütahya-Emet-Hisarcık ve Eskişehir-Kırka bölgelerinde yoğun olarak bulunan Bor madenleri vardır. Türkiye, dünya Bor rezervlerinin %72'sine sahiptir ve bu yüzden bilimsel, teknolojik ve ticari alanlarda öncelikli bir alandır. Birçok endüstri alanında kullanılan Bor, aynı zamanda biyolojik açıdan da önemli bir yarı metaldir. Bitkiler ve diğer bazı canlı grupları için essansiyel bir mikronütrienttir. Az miktarda vazgeçilmez iken, belli bir seviyenin üzerinde toksik etkilere sahiptir. Bor'un insan hücreleri için de önemli olabileceği düşünülmektedir. Ancak tam olarak essansiyel olup olmadığı, bir takım deneysel limitasyonlar yüzünden kanıtlanamamıştır. Geniş bir canlı yelpazesinde, biyolojik fenotip açısından role sahip olan bu elementin, detaylı biyokimyasal rolü tam olarak bilinmemektedir. Bundan dolayı, uygun model organizmalar kullanılarak, Bor ile ilgili biyomoleküller ve özellikle genler ve proteinler bulunmalıdır. Bu tez, felsefi olarak bu hedefe yönelik, pratik aksiyonları amaçlamıştır.
Bu tez çalışması kapsamında, daha önceden Türkiye'deki Bor madenlerinden izole edilen Pseudomonas cinsine ait bakteri izolatları model organizmalar olarak kullanılmıştır. Bu bakteriler yüksek Bor toleransına sahip olup, 200 mM borik asit içeren ortamda üreyebilmektedir. Diğer bakteriler (test edilen 50 üzerinde tür) ise en çok, 25?75 mM borik asit direncine sahiptir. Madenlerde binlerce ppm'lik Bor ortamında bulunan bu bakterilerin, yaşayabilmek için içerdikleri genleri, kullandıkları protein aksiyonlarını ve işlettikleri mekanizmaları tespit etmek mümkündür. Elimizde bulunan yüksek Bor toleransına sahip izolatlardan Pseudomonas cinsine ait olan farklı türlerden genomik kütüphaneler oluşturulmuştur. Önce, bakteri DNA'ları izole edilmiş, uygun restriksiyon endonükleaz ile kısmi kesime uğratılan genom parçalara ayrılmış, bir plazmid içine klonlanarak Escherichia coli içerisinde genomik kütüphaneler oluşturulmuştur. Binlerce koloninin içinde temsil edilen Bor bakterisinin genomu, kütüphane olarak stoklanmış ve bu dahil birçok diğer çalışmalar için kaynak olarak saklanmıştır. Elde edilen genomik kütüphane kolonileri Bor seleksiyonuna tabii tutulmuş, yani Bor konsantrasyonu arttırılarak, gerekli kontrol deneylerinden sonra, sadece Bor direnci sağlayan plazmidler tespit edilmiştir. Bu plazmidlerin insertlerinde yer alan genler, DNA dizi analizi ile belirlenmiştir. Bu dizilerin içerdikleri gen bilgileri biyoinformatik programları ile araştırılarak, Bor tolerans aday genleri önerilmiştir.
Bu çalışmada sonuç olarak, dört adet Bor toleransı yüksek Pseudomonas izolatının genomik kütüphanesi hazırlanıp, göreceli olarak yüksek düzeyde Bor konsantrasyonlarında seleksiyonlara uğratılması sonucu, 46 adet Bor toleransına sahip bakteri kolonisindeki rekombinant plazmidler elde edilmiştir. Bunlardan seçilen en iyi 36 tanesinin insert bölgelerindeki genlerin isimleri tespit edilerek liste halinde verilmiştir. Bu genlerin, transport (n=4), DNA, RNA veya gen ekspresyonu (n=6), hücre membranı ve/veya duvarı (n=6) ile ilgili aktiviteler, metabolik yolaklarda görev alan aktiviteler veya enzimler (n=13) ve diğer veya bilinmeyen aktiviteler (n=7) ile ilgili olduğu görülmüştür. Bu çalışmada ilk kez, bir gram negatif bakteride rol alabilecek Bor tolerans aday genleri bulunmuş ve bakterideki olası rolleri tartışılarak, bilim dünyasına orijinal ve önemli bilgiler sunulmuştur.   

Anahtar Kelimeler: Bor, Pseudomonas, genomik kütüphane, bakteri, tolerans, gen

Abstract:
Boron is an important element of economical and scientific value in many ways. Boron mines are present in our country mostly located in Balıkesir-Bigadiç, Bursa-Kestelek, Kütahya-Emet-Hisarcık and Eskişehir-Kırka. Turkey possesses 72% of world Boron reserves and hence is a priority in scientific, technological and trading areas. Boron, currently used in many industrial applications, is also a biologically important semi-metal.  It is an essential micronutrient for the plant and some other group of living organisms. While required and beneficial in low amounts, this element causes toxic effects above a certain level. It is also thought that Boron is significant for human cells. However, it has not yet been fully possible to prove its essentiality due to some experimental limitations. Possessing a role in biological phenotypes within a broad spectrum of living systems, the biochemical function of this element is not completely known. Therefore, the biomolecules, especially genes and proteins related to Boron should be investigated using appropriate model organisms.  Thus, this thesis philosophically aims to take the practical actions towards reaching such a goal.
The bacteria, which were previously isolated from the Boron mines in Turkey and belonging to Pseudomonas genus, were used as model organisms in this thesis project. These bacteria are highly Boron tolerant and can grow in the medium containing 200 mM boric acid. Other bacteria (more than 50 tested) have boric acid resistance of 25-75 mM at most. 
It is possible to find out the genes, protein actions and mechanisms in order for the bacteria present in the mines with Boron levels of thousands of ppm to survive. The genomic libraries of the different species of Pseudomonas isolates our lab has were constructed.  First, the bacteria DNAs were isolated, the genome was partially fragmented using an appropriate restriction endonuclease and cloned into a plasmid to have the genomic libraries in Escherichia coli. The bacteria genome represented in thousands of colonies was stocked as genomic library and saved as a source for numerous other studies including this one. The genomic colonies obtained were then subject to Boron selection. In other words, Boron concentration was increased and following necessary control experiments, the plasmids that potentially provide Boron tolerance were determined. The genes in the inserts of the plasmids were identified using DNA sequence analysis. Using bioinformatics programmes to search for gene information contained in the sequences, Boron tolerance candidate genes are proposed.In conclusion, the genomic libraries of four highly Boron tolerant Pseudomonas isolates were prepared in this study. Following the selection using relatively high levels of Boron concentration, 46 plasmids were obtained from the bacteria colonies. The names of the genes in the inserts of thirty six of the selected recombinant plasmids were determined and are given as a list. It was seen that the genes comprise the activities related to transport (n=4), DNA, RNA or gene expression (n=6), cell membrane and/or wall (n=6), the proteins in metabolic pathways (n=13) and other or unknown functions (n=7). Boron tolerance candidate genes potentially employed in gram negative bacteria were found for the first time by this study, their possible roles were discussed and original and important information are presented to the scientific community and beyond.

Keywords: Boron, Pseudomonas, genomic library, bacteria, tolerance, gene