Floresans ömür dağılımı kullanılarak poliakrilik asit-tripsin konjugatı ve serbest tripsinin proteolitik aktivitesindeki değişimlerin incelenmesi
Investigation of changes in proteolytic activity of polyacrylic acid-trypsin conjugated and free trypsin using fluorescence lifetime distribution
Yazar: ÜMMÜGÜLSÜM POLAT
Danışman: PROF. DR. EMİNE KARAKUŞ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Proteinlerin polimer konjugatları, kararlılıklarını arttırmak ve uygulama alanlarını genişletmek için sentezlenir. Amino, hidroksil, karboksil, fenol vb. grupları içeren bir dizi fonksiyonel grup enzimlerin kovalent konjugasyonu için kullanılır. Enzimleri sabitlemek için sentetik organik polimerler, biyopolimerler, hidrojeller, inorganik destekler ve akıllı polimerler de dahil olmak üzere birçok malzeme kullanılır ve bu uygulamalar sonucu iyi aktivite tutma ve gelişmiş termo kararlılık sıklıkla gözlemlenir. Bağlanacak polimerin kimyasal bileşimi ve fiziksel yapısı immobilize edilecek biyomakromolekülün mikro ortamını ve dolayısıyla biyolojik özelliklerini etkiler.
Floresans ömür dağılım profilleri, polimerler ile konjugasyon sonucu enzim aktivitesindeki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir. Proteinlerin farklı bölgelerinde gömülü olan floresan gruplar farklı kimyasal ortamlara sahiptirler ve yapılarında yer aldıkları proteine özgün olarak çeşitlenen floresans ömür dağılım profilleri sergilerler. Bu dağılımların, proteazların serbest halleri ve polimer konjugatları etkisinde göstereceği değişimler arasındaki farklılıklar, protein substratın hidroliz süreci ve sentezlenen "Polimer-Proteaz" konjugatının aktivitesi ve kararlılığı hakkında faydalı bilgiler sağlayabilir. Proteinlerin denatürasyonuna son derece duyarlı olan eksimerlerle modifiye edilmiş protein substratlardan elde edilen floresans ömür dağılım profilleri, proteazların serbest halleri ile polimer konjugatları arasındaki proteolitik farklılıkları çok daha hassas olarak belirlemede kullanılabilir.
Bu çalışmamızda; Tripsin enziminin serbest hali ile Poliakrilik asit konjugatının (PAA-Tripsin) proteolitik aktiviteleri arasındaki farklılıklar, bazik pH'da (pH:9) "N-(1-Pirenil)maleimid; (PM)" ile modifiye edilerek 464 nm civarında maximum eksimer emisyonu sergileme yeteneği kazandırılmış "Sığır Serum Albümin (Bovine Serum Albumin; BSA)"inin floresans ömür dağılımlarındaki değişimlerle incelendi. Konjugasyonun tripsin aktivitesinde önemli derecede azalmaya neden olması sonucu floresans spektrumunda eksimer emisyonunda dikkate değer bir değişim gözlemlenemedi; ancak, floresans ömür dağılımlarında büyük değişimler elde edildi. Bu sonuçlar, floresans ömür dağılımı analizinin; proteazların hidrolitik aktivitelerinin farklılıklarına göre belirlenmesinde ve birbirlerinden ayrıştırılmalarında son derece hassas bir yöntem olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Polymer conjugates of proteins are synthesized to increase their stability and expand their application area. A range of functional groups, which can be used in the covalent conjugation of enzymes, including amino, hydroxyl, carboxyl and phenolic groups. There are many materials, including synthetic organic polymers, biopolymers, hydrogels, inorganic supports, and smart polymers, to be used to immobilize enzymes, and good activity retention, and enhanced thermo-stability are often observed. The physical structure and chemical composition of support can also influence the microenvironment of the immobilized species and consequently their biological properties. Fluorescence lifetime distributions may be useful tool to monitor the changes of enzyme activity by the conjugation with polymers. Fluorescent groups embedded in different regions of proteins have different chemical environments and exhibit varying fluorescence lifetime profiles specific to the protein they are involved in. The differences of the changes of the distributions by free and conjugated protease activity may provide useful information about the hydrolysis process of the protein substrate and the activity and stability of "Polymer-Protase" conjugate.
Fluorescence lifetime distribution profiles obtained from protein substrates modified with excimers that are extremely sensitive to protein denaturation can be used to more precisely determine the proteolytic differences between the free natural states of proteases and polymer conjugates of proteases.
In this study; the differences between the proteolytic activities of free trypsin enzyme and polyacrylic acid conjugated typsin (PAA-Tripsin) were examined with the fluorescence lifetime distribution changes of Bovine Serum Albumin (BSA), which was gained the ability to exhibit excimer emission around the maximum 464 nm, by modifying with N-(1-Pyrenyl) maleimide (PM) at basic pH (pH 9). Because the conjugation reaction caused decreasing in enzyme activity, a significant change in excimer emission could not be observed in the resultant fluorescence spectrum, however, large changes in fluorescence lifetime distributions were obtained. These results showed that the analysis of fluorescence lifetime distribution can be used as an extremely sensitive method for determination and distinguishing of proteases from each other, according to the differences of their hydrolytic activities.