Pyrin proteininin hücre göçü üzerine etkisinin incelenmesi
Investigating the effect of pyrin protein on cell migration
Yazar: ARDA ÇETİNKAYA
Danışman: PROF. DR. ENGİN YILMAZ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Ailesel akdeniz ateşi = Familial mediterranean fever ; Hücre hareketleri = Cell movement ; Kolşisin = Colchicine ; Pirin = Pyrin ; Proteinler = Proteins

Özet:
Ailesel Akdeniz Ateşi inflamatuar epizotlarla belirgin otoinflamatuar otozomal resesif olarak kalıtılan bir hastalıktır. Hastalığın ülkemizdeki prevelansı 1:1000'dir. Hastalık için ilk tercih ilaç, hem epizotlara iyi gelen hem hastalığın amiloidoz gibi uzun dönem komplikasyonlarını engelleyen kolşisindir. Hastalıktan sorumlu olan ve yanlış çalışan protein, inflamasyon kontrolünde, apoptozda ve sitokin salınımında pek çok rolü olduğu gösterilmiş pyrindir. Bunun yanında pyrinin iyi bilinen hücre göçü düzenleyicileri olan PSTPIP1 ve aktin ile etkileşime girerek hücre göçünün kontrolünde de bazı rolleri olduğu ileri sürülmüştür. Bugüne kadar pyrinin hücre göçü üzerindeki doğrudan etkileri gösterilmemiştir. Mikrotübül iskeletinin genel yapısını bozmayan en yüksek kolşisin derişimi, hücre ölümünün ölçülmesi ve hücre iskeleti ile organel boyamaları yapılarak saptanmıştır. Bu çalışmada kullanılan uygun kolşisin derişimleri, COS-7 ve HeLa hücreleri için sırasıyla 10ng/ml ve 7,5ng/ml olarak bulunmuştur. Yara iyileşmesi deneylerinde, yara sınırında kontrol grubu ile karşılaştırıldığında artmış sayıda aşırı pyrin ifade eden hücre saptanmıştır (p<0.01). Doğal pyrin, mutant pyrin (M694V, M680I ve V726A mutasyonlarını taşıyan) ve kolşisinin geçici transfekte insüline karşı göç eden COS-7 hücrelerindeki rolünü belirlemek için filtre deneyleri kullanılmıştır. Filtre deneylerinde, kontrol grubunda veya pyrin mutantlarında görülmemesine karşın, doğal pyrin ile artmış hücre göçü arasında anlamlı bir ilişki kurulmuştur (p<0,01). Buna ek olarak, kolşisin uygulaması pyrin veya mutant pyrin ifade eden hücrelerde hücre göçünü negatif yönde etkilerken (p<0,05) kontrol grubunda anlamlı bir diapedez artışına neden olmuştur (p<0,05). Burada sunulan veriler, pyrinin hücre göçünün kontrolünde doğrudan görevleri olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, pyrin proteininin PSTPIP1, aktin veya henüz bilinmeyen; ancak büyük olasılıkla MAPK sinyal yolağındaki proteinlerle etkileşimleri aracılığıyla olabilir. Kolşisinin hücre göçünü baskılayan etkilerinin sadece doğal veya mutant pyrin varlığında ortaya çıkması da dikkat çekilmesi gereken önemli bir noktadır. Bu konudaki ilerleyen araştırmalar inflamatuar hücrelerde hücre göçünün yeni kontrol mekanizmalarının keşfine yol açıp genel olarak tüm inflamatuar hastalıklar için yeni tedavi olasılıklarının kapılarını açabilir.

Abstract:
Familial Mediterranean Fever is an autosomal recesively inherited, autoinflammatory disease characterized by inflammatory episodes. The prevalance of disease is 1:1000 in Turkey. The drug of choice for the disease is colchicine which both relieves the patient from episodes and prevents late complications like amyloidosis. The abberantly acting protein responsible for the disease is pyrin, shown to have several roles in inflamation control, apoptosis and cytokine secretion. Furthermore, pyrin was suggested to have several roles in the control of cell migration through its interaction with well-known regulators of cell migration, PSTPIP1 and actin. Until today direct effects of pyrin on cell migration have not been shown. Appropriate concentration of colchicine that would not disturb general microtubule skeleton was determined through cell death measurement, cytoskeleton and organelle staining. The appropriate concentration that was used in this study for COS-7 cells and HeLa cells were determined respectively as 10ng/ml and 7.5ng/ml. In wound healing assays, we noted an increased number of pyrin overexpressing HeLa cells neighboring the wound border compared to control group (p<0.01). Boyden chamber assays were used to determine the role of pyrin, its mutants, namely M694V, M680I, V726A, and colchicine in transiently transfected COS-7 cells migrating against an insulin gradient. In Boyden chamber assays, a positive significant relationship between wild type pyrin overexpression and increased cell migration was shown (p<0.01), which was not observed in either control group or mutants of pyrin. In addition, colchicine treatment would negatively affect cell migration in either wild or mutant pyrin overexpressing COS-7 cells (p<0.05) while colchicine caused a significant increase in diapedesis in control group (p<0.05). The data presented here shows direct involvement of pyrin in control of cell migration. This maybe either through pyrin protein?s interaction with PSTPIP1 or actin, or a different yet unknown mechanism possibly involving MAPK signaling pathway. Colchicine?s cell migration abolorating effects appearing only in the presence of wild type or mutant pyrin is also another interesting point to note. Further research in this subject may lead to discovery of novel mechanisms controlling cell migration in inflammatory cells and would result in novel treatment options for inflammatory diseases in general.