Mezenkimal kök hücre kaynaklı osteoblastların spongioz allogreftle inkübasyonunun osteojenik aktiviteye etkisi
The effect of incubation of mesenchymal stem cell derived osteoblants with spongious allografts on osteogenic activity
Yazar: KORCAN YÜKSEL
Danışman: DOÇ. DR. TAHSİN BEYZA BEYZADEOĞLU
Yeditepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Kemik defektleri = Bone defects ; Kemik dokusu = Bone tissue ; Kemik iliği = Bone marrow ; Kemik nakli = Bone transplantation ; Osteoblastlar = Osteoblasts

Özet:
Amaç: Allogreftler ve mezenkimal kök hücreleri temel alan hücre kaynaklı tedaviler Ortopedi ve Travmatoloji'de sık olarak kullanılmaktadır. Mezenkimal kök hücrelerin genel ortopedik uygulamalarda kullanılmasına ek olarak, kemik greftleme gereksinimi olan hastalarda, mezenkimal kök hücre ve greftleme kombinasyonları da giderek artan sıklıkla uygulanan işlemlerdir. Ancak bu kombine uygulamalarda mezenkimal kök hücre davranışları ile ilgili bilgi birikimi hala kısıtlıdır. Bu çalışmada, kemik iliği ve yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücreleri, osteoblastik aktivite açısından birbirleriyle karşılaştırmayı ve bunların taze allogreftlerle inkübasyonu sonrası osteoblastik aktivitelerindeki değişiklikleri bulmayı amaçladık.Materyal ve Metod: Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler 23 yaşında femur psödoartroz cerrahisi geçiren hastanın iliak kanat aspirasyon materyalinden, adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler 32 yaşında abdominal liposuction cerrahisi geçiren hastanın aspirasyon materyalinden izole edildi. Hücreler izolasyon sonrası ilk 10 gün büyütme besiyerinde çoğaltıldı. Daha sonra kaynağına göre her bir grup kendi içinde 2 gruba ayrıldı. Bir grup sadece osteojenik besiyerinde, diğer grup kemik grefti eklenmiş osteojenik besiyerinde 21 gün inkübe edildi. Elde edilen dört kültür grubunun; 1,7,14,21. günlerde MTS kullanılarak hücre proliferasyonları, 7,14 ve 21. günlerde alkalen fosfataz düzeyleri ölçülerek osteojenik potansiyelleri, 14 ve 21. günlerde uygulanan Von Kossa ve Alizarin Red boyamalarıyla mineralizasyon açısından değerlendirildi.Sonuç: Kemik grefti eklenmeyen kemik iliği ve adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücreleri, proliferasyon düzeyi açısından her bir grubun kendi içinde gün bazında hücre proliferasyon değişiminde istatistiksel anlamlılık bulunmadı ancak iki grubun karşılaştırılmasında 7 ve 21. günlerde hücre proliferasyonunda kemik iliği kaynaklı hücreler lehine istatistiksel anlamlı sonuç bulundu (p<0.05). Bu sonuç kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler doğal gelişim çizgisi kemik olduğu için, daha iyi osteoblastik proliferasyon gösterebileceklerini düşündürmüştür. İki grup arasında alkalen fostaz aktivitesinde 7,14,21. günlerde istatistiksel fark görülmemiştir. Von Kossa ve Alizarin Red boyamalarında her ne kadar kantitatif bir ölçüm yapılmamış olsa da mikroskop ile incelemede belirgin fark saptanmamıştır. Kemik iliği ve adipoz doku kaynaklı kök hücrelerin kemik grefti eklenmeyen ve eklenen grupları karşılaştırıldığında, greft eklenmeyen grupta özelleşmenin görüldüğü 14. gün dışında 21 gün boyunca hücre sayılarında artış görülmüştür, greft eklenen grupta hücre sayısı iki kaynak grubunda da 14. günden sonra azalmıştır. Bu azalma 21. günde istatistiksel olarak da anlamlı bulunmuştur (p<0.05). Alkalen fosfataz düzeyleri arasında greft eklenen ve eklenmeyen gruplarda 7,14,21. günlerde istatistiksel fark bulunmamıştır. Von Kossa ve Alizarin Red boyamalarında greft eklenen gruplarda mineralizasyonda belirgin azalma tespit edilmiştir.Çıkarımlar: Taze spongioz allogreftler kemik iliği ve adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin osteojenik aktivitesini inhibe etmektedir.İleri Perspektifler: Mezenkimal kök hücrelerin özelleşmesinin geç döneminde MTS analizi ile görülen hücre sayısındaki azalma, ayrı bir çalışmada hücre DNA analizi veya protein analiziyle de tekrarlanarak daha güvenilir sonuçlara ulaşılabilir. Von Kossa ve Alizarin Red boyamalarında greft eklenen mezenkimal kök hücre gruplarında görülen mineralizasyondaki azalma mineralizasyonun kantitatif olarak gösterilebileceği kalsiyum ölçümü ile desteklenebilir. Ayrıca özelleşmenin geç dönemindeki bu inhibisyon osteojenik aktivitenin geç dönem belirteçleri olan Osteonektin, Osteopontin, Osteokalsin gibi geç dönem belirteçlerinin ölçümüyle desteklenebilir. Tüm bunlara ek olarak bu inhibisyonda rol oynayabilecek Sclerostin ve DKK1 gibi muhtemel moleküller ve bu moleküllerin etkin olduğu yolaklar ayrı bir çalışmayla araştırılabilir.

Abstract:
Purpose: Allografts are widely used in Orthopedics. The use of mesenchymal stem cells and combined grafting are increased with the increase use of mesenchymal stem cells in orthopedic surgery. But, there is limited knowledge about behavior of mesenchymal stem cells in combined grafting. Our object was to compare osteoblastic activities of bone marrow and fat derived stem cells and to find the differences of osteoblastic activities after incubation with fresh allografts.Material and Method: Bone marrow derived stem cells were isolated from a 23 years-old patients iliac crest aspiration materials who undergone pseudoarthrosis surgery of femur, and fat derived stem cells were isolated from a 32 years-old patients aspiration material who undergone abdominal liposuction surgery. After isolation, cells were multiplied in a growing medium for 10 days. After that, each group in respect to their origin were divided into two groups. One group was incubated in an osteogenic medium and the other in an osteogenic medium with bone graft for 21 days. These four culture groups? cell proliferations were evaluated with MTS at 1,7,14 and 21st days, osteogenic potentials were evaluated with the measurement of alkaline phosphatase levels at 7,14 and 21st days, and mineralization were evaluated with Von Kossa and Alizarin Red staining at 14 and 21st days.Results: There were no statistically significant difference in proliferation levels between days in each group without bone graft, but at 7th and 21st days, there were statistically significant difference in favour of bone marrow derived stem cells (p<0.05). This result preoccupy that, bone marrow derived stem cells have better osteoblastic proliferation due to their natural line. There were no statistically significant difference in alkaline phosphatase levels between each group at 7,14 and 21st days. There were no significant difference in Von Kossa and Alizarin Red stainings with microscopic evaluation even no quantitative measurement made. When groups with and without bone graft were compared, in the group without bone graft, an increase in cell count was observed except 14th day that specification occurs, but in the group with bone graft, cell count was decreased after 14th day at both two groups. At the 21st day the previously described decrease reached to a statistically significant level (p<0.05). There were no statistically significant difference in alkaline phosphatase levels between groups with and without bone graft at 7, 14 and 21st days. There were statistically significant decrease of mineralization with Von Kossa and Alizarin Red stainings at group with bone graft.Conclusions: Fresh spongios allografts inhibits the osteogenic activity of bone marrow and fat derived mesenchymal stem cellsFurther Perspectives: The decrease of cell count seen with MTS analysis at the late specification phase of mesenchymal stem cells could be evaluated with another study with DNA or protein analysis for more reliable results. The decrease of mineraliation at the groups with bone graft seen at Von Kossa and Alizarin Red stainigs could be also supported with calcium measurement for quantitative evaluation of mineralization. Furthermore, the inhibition at the late phases of specification could be supported with late phase markers of osteogenic activity like; Osteonectine, Osteopontine, Osteocalcine. Some molecules that possibly have role in inhibition like Sclerostin and DKK1 and pathways of these molecules could also been evaluated.