Tripsin enziminin immobilizasyonu ve protein fragmantasyonunda kullanım potansiyelinin araştırılması
Immobilization of trypsin and investigation of potential use for protein fragmentation
Yazar: CENK DAĞLIOĞLU
Danışman: PROF. DR. FİGEN ZİHNİOĞLU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Tripsin, peptid bağlarını lizin ve arginin artıklarından sonra spesifik olarak yıkıma uğratan bir pankreatik serin endoproteazdır ve çoğunlukla protein yıkımı ve peptid haritalandırılmasında kullanılmaktadır.Proteazlar arasında en kapsamlı ilgilenilen proteaz olan tripsin endüstriyel ve biyomedikal uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Fakat endüstriyel proseslerde doğal enzim kullanımı, operasyon ve saklama süreci sırasında enzimin biyokatalitik aktivitesini hızlı kaybetmesi ve kararlı olmaması göz önüne alındığında sınırlanmaktadır. Bunun yanı sıra enzimleri substrat çözeltisinden çıkarmak zordur ve bu durum ürün kontaminasyonuna sebep olabilir.Protein analizlerindeki yoğun ilgi göz önüne alındığında, son yıllarda immobilize tripsin konsepti, geniş enzim-substrat oranı, yüksek yıkım verimliliği, tekrar kullanılabilirliğinin mümkün olması ve serbest enzime göre denatürasyon ve inaktivasyon oranının düşük olması gibi çeşitli avantajları nedeni ile çok fazla dikkat çekmiştir.Bu çalışmada, ilk olarak silika tabanlı bir taşıyıcı üzerine tripsin immobilizasyonu gerçekleştirildi. Daha sonra, kovalent baglanma ile immobilize edilen tripsinin karakterizasyonu için, optimum pH, pH kararlılığı, optimum sıcaklık, termal kararlılığı, depo kararlılığı, operasyonel kararlılığı ve tekrar kullanılabilirliği belirlendi. Bunlara ek olarak, immobilize tripsinin organik çözücülerde çalışılabilirliği ve stabilitesi, ve protein fragmantasyonunda kullanım potansiyeli araştırıldı.

Abstract:
Trypsin, which specifically cleaves peptidic bonds on C-terminal group of lysine or arginine, is a pancreatic serine endoprotease and used mostly for protein digestion and peptide mapping.Proteases among which trypsin is the most extensively concerned are widely used in industrial and biomedical applications. However utilisation of native enzyme is limited in industrial processes due to the problem of its instability and rapid loss of biocatalytic activity during the operation and prolonged storage periods. Besides that, it is difficult to remove the enzyme from the substrate solution and might lead to a contamination of the product.In view of the strong interest in protein analysis, the concept of immobilized trypsin has received much attention in recent years because of several advantages, such as: larger enzyme to substrate ratio, high digestion efficiency, the possibility of their repeated use, and the rate of denaturation or inactivation is less than with the free enzyme.In this study immobilization of trypsin was firstly performed on a silica-based carrier. Afterwards, the parameters of: optimum pH, pH stability, optimum temperature, thermal stability, storage stability, operational stability and re-usability were determined for the characterization of the trypsin immobilized by covalent binding. In addition to these, immobilized trypsin was investigated for function and stability in organic solvents, and in potential uses for protein fragmentation.