Sütte escherichia coli O157:H7 canlı hücrelerinin belirlenmesinde kültür yöntemi ile REAL-TİME PCR yöntemlerinin karşılaştırılması
Comparison of culture and real-time PCR methods for the determination of escherichia coli O157: H7 live cells in milk
Yazar: İSMAİL HAKKI EKİN
Danışman: PROF. DR. EMRULLAH SAĞUN
Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Besin Hijyeni ve Teknolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Besin Hijyeni ve Teknolojisi = Food Hygiene and Technology
Dizin: Bakteriyolojik teknikler = Bacteriological technics ; Besin kirlenmesi = Food contamination ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Ethidium = Ethidium ; Gıda kalitesi = Food quality ; Gıda mikrobiyolojisi = Food microbiology ; Gıda ürünleri = Food products ; Gıdalar = Foods ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Süt = Milk

Özet:
Bu çalışmada, canlı E. coli O157:H7 hücrelerinin konvansiyonel kültür yöntemi ve qPCR tekniği ile belirlenmesi ve karşılaştırılması amaçlandı. Bunun için PBS ve süt ortamlarında canlı E. coli O157:H7 süspansiyonlarına 55C'de 10, 20 ve 30 dk. süreyle ısıl işlem uygulandı. PBS ve süt ortamlarındaki canlı hücre sayıları konvansiyonel kültür yöntemiyle elde edilen sonuçlar ile direkt qPCR, EMA+qPCR ve PMA+qPCR yöntemlerinden elde edilen sonuçlar ayrı ayrı karşılaştırıldı. Hazırlanan test süspansiyonunun kültürel sayım sonucu ile direkt qPCR sayım sonucu arasındaki fark istatistiki açıdan önemsiz (p<0.05) bulundu. Tüm uygulamalarda farklı sürelerde yapılan ısıl işlem sonrası kültürel sayım ile direk qPCR sayımları arasındaki fark önemli (p<0.05) bulundu. Farklı konsantrasyonlarda EMA ve PMA uygulanan örneklerde kültür ve qPCR sayımlarının ortalama değerleri arasındaki fark önemsiz bulunurken kültür sayımına en yakın EMA konsantrasyonunun 7 g/ml, PMA konsantrasyonunun ise 30 M/ml olduğu belirlendi. PBS ve süt ortamlarında farklı konsantrasyonlarda EMA ve PMA uygulamaları sonrası yapılan qPCR sayımlarında elde edilen değerler, kültürel sayımlarda elde edilen değerlerle karşılaştırıldığında aralarındaki fark istatistiksel olarak önemli olmamakla birlikte qPCR sayımları daha yüksek çıktı. Isıl işlem sonrası PBS ortamındaki canlı E coli O157:H7 sayısı, süt ortamındaki uygulama ile karşılaştırıldığında daha düşük bulundu. Sonuç olarak bu çalışmada EMA ve PMA uygulamaları sonrası elde edilen qPCR sonuçlarının kültür yöntemi ile elde edilen sonuçlara direkt qPCR'dan daha yakın olduğu tespit edildi. Konvansiyonel kültür yöntemleri ile tespit edilemeyen canlı fakat kültüre edilemeyen hücrelerin (VBNC) tespiti ve miktar tayini bakımından EMA + qPCR veya PMA + qPCR gibi yeni tekniklerin uygulanmasının önemli olduğu, halk sağlığı açısından önemli risk oluşturan E coli O157:H7'nin EMA + qPCR veya PMA + qPCR teknikleri ile kantitatif analizlerinde daha güvenilir sonuçların alınması ve optimizasyonu için yeni alternatif kimyasalların geliştirilmesi ve ileri düzey çalışmaların devam etmesi gerektiği kanaatine varıldı.

Abstract:
In this study, it was aimed to determine and compare live E. coli O157:H7 cells with conventional culture method and qPCR technique. For this purpose, heat treatment was applied to live E. coli O157:H7 suspensions in PBS and milk at 55 °C for 10, 20 and 30 minutes. The viable cell counts obtained by conventional culture method in PBS and milk were separately compared with the results obtained from direct qPCR, EMA+qPCR and PMA+qPCR methods. The difference between the cultural count result and the direct qPCR count result of the prepared test suspension was found to be statistically insignificant (p<0.05). After the heat treatment at different times in all applications, the difference between cultural and direct qPCR counts was significant (p<0.05). While the difference between the mean values of culture and qPCR counts in the samples treated with different EMA and PMA concentrations was insignificant, it was determined that 7 mg/ml of EMA concentration and 30 mM/ml of PMA concentration that used for qPCR were found closest results to the culture counts. Although the difference between the results obtained with EMA and PMA applications at different concentrations in PBS and milk is not statistically significant, the qPCR counts was found to be higher. After heat treatment, the number of viable E coli O157:H7 in PBS was found to be lower compared to the application in milk. As a result, in this study, it was determined that the qPCR results obtained after EMA and PMA applications were closer to the culture method than direct qPCR. It has been observed that the application of new techniques such as EMA + qPCR or PMA + qPCR is important for the detection and quantification of viable but non-culturable cells (VBNC) that cannot be detected by conventional culture methods. It was concluded that new alternative chemicals should be developed and advanced studies should be continued in order to obtain more reliable results and optimization with EMA + qPCR or PMA + qPCR techniques in the quantitative analysis of E coli O157:H7, which poses a significant risk to public health.