İlaç aktif madde yüklü hyaluronik asit nanopartiküllerin sentezi ve eklem dejenerasyonlarında kullanımının değerlendirilmesi
Synthesis of active drug loaded hyaluronic acid nanoparticles and evaluation of their use in joint degeneration
Yazar: SEVAL BİRDANE
Danışman: PROF. DR. SİYAMİ KARAHAN
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Deksametazon = Dexamethasone ; Eklem hastalıkları = Joint diseases ; Eklemler = Joints ; Hyalüronik asit = Hyaluronic acid ; Kondrositler = Chondrocytes ; Kıkırdak = Cartilage ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; İlaç maddeleri = Drug substances

Özet:
Kıkırdak dokunun onarılma yeteneği vücutta bulunan diğer dokulara göre daha sınırlıdır. Kıkırdak doku kan damarlarından yoksun avasküler bir yapıya sahip olduğu için kıkırdak hücreleri düşük oksijen konsantrasyonlarında dahi metabolik aktivite göstermektedir. Son yıllarda kıkırdak doku mühendisliği ve nanoteknoloji alanında çalışmalar hız kazanmış nanoteknolojinin önemli çalışma alanlarından olan biyouyumlu nanopartiküllerden yararlanılarak kıkırdak doku tedavisinde ciddi çalışmalar yapılmıştır. 

       Bu tez çalışmasında; kondrosit hücrelerine bir kortikosteroid türevi olan deksametazon içeren hyaluronik asit nanopartikülleri yüklenerek salınımın, hücre canlılığının, sitotoksisitesinin ve apoptoz-nekroz oranının belirlenmesi amaçlanmıştır.

       İlk olarak hyaluronik asit nanopartikülleri sentezlenmiş daha sonra ise ilaç (deksametazon) yüklenmiş ve salınım çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Deksametazon yüklenmiş ve yüklenmemiş hyaluronik asit nanopartikülleri farklı konsantrasyonlarda kondrosit hücrelerine uygulanarak hücrelerdeki etkisi incelenmiştir. Bu amaçla; ikili boyama yöntemi ile apoptoz/nekroz testi, genotoksisite için mikronükleus testi, sitotoksisite için WST-1 ve Alamar mavisi testi, GAG sentezi için DMMB analizi, proliferasyon için RTCA (Tam Zamanlı Hücre Analizi)  testi yapılmıştır. 

       WST-1 sitotoksisite testinde hyaluronik asit nanopartiküllerinin kondrosit hücrelerine uygulaması ile canlılık oranları 1mg/mL derişiminde % 108,91 ve 0,0312mg/mL derişiminde % 126,88 bulunmuştur. Deksametazon yüklü hyaluronik asit nanopartiküllerinin uygulaması ile ise 1mg/mL derişiminde % 93,42 ve 0,0312mg/mL derişiminde % 134,53 bulunmuştur. Ayrıca sonuçlar Xcelligence hücre proliferasyon testi sonuçları ile uyumludur. Deksametazon yüklenmiş gerekse yüklenmemiş hyaluronik asit nanopartiküller GAG sentezinde kontrole göre önemli bir değişiklik göstermemektedir. Deksametazon yüklenmiş hyaluronik asit nanopartiküller İkili boyama testinde doz azaldıkça apoptotik ve nekrotik indeks azalmaktadır. 

       Sonuç olarak; elde edilen bulgular hyaluronik asit nanopartiküllerden kontrollü salınan deksametazon kondrositlere 0,5mg/mL ve daha düşük dozlarda olumsuz etki göstermemektedir. Bu nedenle dejeneratif eklem tedavilerinde antiinflamatuvar olarak kullanılan deksametazonun hyaluronik asit ile sinerjistik etki yapacağı düşünülmektedir. İlave in vivo çalışmalarla bu sav desteklenmektedir.

Abstract:
Cartilage has a limited capacity of repair compared to other tissues in the body. Because cartilage is avascular tissue, chondrocytes exert their metabolic activities in a low oxygenated environment. In recent years, studies in cartilage tissue engineering and nanotechnology have been gained speed. Serious approaches in cartilage tissue engineering have been conducted using biocompatible nanoparticles.

       In this thesis, it was aimed to load dexamethasone, a corticosteroid derivative, on hyaluronic acid nanoparticles and to evaluate chondrocyte viability, cytotoxic and apoptotic-necrotic effects on chondrocytes upon release.

       First, hyaluronic acid nanoparticles were synthetized and dexamethasone was loaded on hyaluronic acid nanoparticles. The rate of dexamethasone release was determined. Then, dexamethasone loaded hyaluronic acid nanoparticles at various concentrations were applied to chondrocytes and their effects were evaluated. For this purpose, the following tests were conducted: double staining method for apoptosis-necrosis, micronucleus test for genotoxicity, WST-1 and Alamar Blue tests for cytotoxicity, DMMB for GAG synthesis and Real time cell analysis for cell proliferation 
       Cytotoxicity tests indicated that cell viabilities following hyaluronic acid nanoparticle application were 108.91% and% 126.88% at doses of 1 mg/mL and 0.0312 mg/mL, respectively. Cell viabilities following application of dexamethasone loaded hyaluronic acid nanoparticles were 93.42% and % 134.53% at doses of 1 mg/mL and 0.0312mg/mL, respectively.  The results were compatible with Xcelligence cell proliferation test. Compared to control, neither dexamethasone loaded nor hyaluronic acid nanoparticles without dexamethasone did not change GAG synthesis. Apoptotic and necrotic index following application of dexamethasone loaded hyaluronic acid nanoparticles declined in a dose dependent manner.

       As a result, dexamethasone released from hyaluronic acid nanoparticles did not exert a serious negative effect on chondrocytes at a concentration of 0.5mg/mL or below.  Thus, it is thought that dexamethasone, which has been used as an anti-inflammatory agent in degenerative joint diseases, may exert a synergistic effect with hyaluronic acid. This notion should be supported by additional in vivo studies.