CHIR99021 ile kombine retinoik asit uygulaması sonrasında nörogenez ve pluripotensi ilişkili genlerin ifadesinin embriyonik karsinoma hücre hattında araştırılması
Investigation of neurogenesis and pluripotency related genes expression in embryonic carcinoma cell line upon treatment with CHIR99021 and retinoic acid
Yazar: DAMLA YÜKSEL BALIM
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM İZCİ AY
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Embriyo = Embryo ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Glikojen sentaz kinazlar = Glycogen synthase kinases ; Karsinoma = Carcinoma ; Kök hücreler = Stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nörogenez = Neurogenesis ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells ; Tretinoin = Tretinoin

Özet:
İnsan embriyonik dönem teratokarsinomundan türetilen NTERA2 hücreleri, kimyasal uyarıcılarla muameleleri sonrasında çeşitli hücre serilerine farklılaşma potansiyeli taşıdıklarından dolayı deneysel model geliştirme araştırmalarında kullanılmaktadır. Çalışmamızda, glikojen sentaz kinaz 3β inhibitörü CHIR99021 (CHIR) ve Retinoik Asit (RA) küçük kimyasal modülatörleri aracılığıyla NTERA2 hücrelerinin farklılaşma kapasiteleri değerlendirilmiştir. 6 gün boyunca, 3 μM/ml CHIR ve 10 μM/ml RA'nın tekli, birinci günden itibaren birlikte ve üçüncü günden itibaren birlikte yapılan uygulamalarının sonrasında, spesifik pluripotensi genleri Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-kit; nöron belirteç genleri Neurog1, Neurog2, Neurod1, Neurod2 ve Wnt sinyal yolağında görevli β-katenin (CTNNB1) ve APC genlerinin ifade düzeylerindeki değişimleri Kantitatif Real Time PCR ile belirlenmiştir. Kimyasal uygulamaların, farklı gruplarda ve değişken seviyelerde Sox-2, CTNNB1 ve c-kit düzeyi üzerinde istatistiksel olarak anlamlı şekilde etkili olduğu belirlenmiştir (p<0,05). RA ve CHIR uygulamaları tüm gruplarda, Sox-2 ve c-kit ifade düzeyinde anlamlı düşüşe sebep olurken; CTNNB1 geninde ilk 3 gün RA, üçüncü günden itibaren RA ve CHIR birlikte yapılan uygulamanın, tek RA uygulamasına göre anlamlı şekilde artışa sebep olduğu belirlenmiştir. RA ve CHIR kombine uygulamasının CTNNB1 ifade düzeyini arttırma yönünde etkili olduğu görülmüştür. Tek başına uygulanan CHIR'ın c-kit ifade düzeyini, ilk üç gün CHIR sonraki günler CHIR ve RA'nın kombine uygulandığı gruba göre istatistiksel olarak anlamlı seviyede daha fazla düşürdüğü belirlenmiş (p<0,05), c-kit ifade düzeyini arttırmak için CHIR ve RA'nın birlikte uygulanmasının etkili olabileceği görülmüştür. CHIR ve RA'nın birlikte kullanıldığı gruplarda toksik etki gözlenmemiştir. RA uygulanan gruplarda nöron hücre benzeri uzantılar gözlenmiş ancak, ifade düzeylerinde anlamlılık elde edilememiştir (p>0,05). Birlikte ele alındığında sonuçlarımız, NTERA2 hücrelerini farklılaşma yoluna yönlendirmek için, kimyasal uygulama sürecinin 6 günden fazla olması gerektiğini, kısa süreli uygulamalar için doz ayarlaması yapılarak bu iki modülatör ile farklılaşma sürecinin daha hızlı ilerlemesinin sağlanabileceğini, ek olarak yeniden programlama verimini arttırmak için kültür içi destekleyici faktör takviyesinin yapılabileceğini göstermektedir.

Abstract:
NTERA2 cells, which are derived from human embryonic teratocarcinoma, are suitable for developing an experimental model due to have the potential to differentiate into various cell lines after treatment with different types of stimulants. In our study, glycogen synthase kinase 3β inhibitor CHIR99021 (CHIR) and Retinoic Acid (RA) small chemical modulators were used to evaluate the differentiation capacity of NTERA2 cells. After a single application of 3 μM/ml CHIR and 10 μM/ml RA for 6 days, together from the first day and from the third day, the changes in the expression levels of specific pluripotency genes Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-kit; neuron marker genes Neurog1, Neurog2, Neurod1, Neurod2 and Wnt signaling pathway β-catenin (CTNNB1) and APC genes were determined by Quantitative Real Time PCR. Chemical applications were statistically significant on Sox-2, CTNNB1 and c-kit levels in different groups and at varying levels (p<0,05). While RA and CHIR applications caused a significant decrease in Sox-2 and c-kit expression levels in all groups; in the CTNNB1 gene, it was determined that RA in the first 3 days, RA and CHIR application from the third day caused a significant increase compared to a single RA application. It was observed that the combined application of RA and CHIR was effective in increasing the expression level of CTNNB1. It was determined that CHIR administered alone decreased the c-kit expression level statistically significantly more than the group in which CHIR was applied in the first three days and CHIR with RA were combined in the following days. (p<0.05). It has been observed that co-administration of CHIR and RA can be effective to increase c-kit expression level. No toxic effects were observed in the groups in which CHIR and RA were treated together. Neuron cell-like extensions were observed in the RA-treated groups, but no significance difference was obtained in the expression levels (p>0,05). Considering the results together, the chemical application period should be longer than 6 days to direct NTERA2 cells to the differentiation pathway. For short-term applications, it has been observed that the differentiation process can be accelerated with these two modulators by adjusting the dose. In addition, in-culture supplementation of promoter factor can be done to increase the reprogramming efficiency.