Daphne sericea ve daphne gnidioides bitki türlerinde bulunan majör fenolik bileşenin yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile tayini için metot optimizasyonunun ve validasyonunun gerçekleştirilmesi ve bitkilerin farklı gelişim dönemlerinde biyokimyasal içeriklerinin belirlenmesi
Method optimization and validation for the determination of major phenolic compound in daphne sericea and daphne gnidioides species by HIGH performance liquid chromatography and determination of biochemical content of these species in different development stages
Yazar: TUBA SEÇMEN
Danışman: PROF. DR. SİBEL TUNÇ
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Daphne L. = Daphne L. ; Daphne gnidioides = Daphne gnidioides ; Fenolik bileşikler = Phenolic compounds ; Fenoller = Phenols ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Rozmarinik asit = Rosmarinic acid

Özet:
Bu çalışmada, çiçeklenme döneminde toplanan Daphne sericea subsp. sericea Vahl. bitki türünün herba kısmında toplam fenolik madde miktarı analiz sonuçlarına göre optimum ekstraksiyon parametreleri belirlenmiştir. Çiçeklenme öncesi, çiçeklenme ve çiçeklenme sonrası dönemde toplanmış olan D.(Daphne) sericea ve D. gnidioides bitki türlerinin farklı (yaprak, çiçek ve herba) kısımlarının biyokimyasal karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Biyokimyasal içeriklerinin belirlenmesi için her iki bitki türünde de toplam fenolik madde miktarı, toplam flavonoid madde miktarı, DPPH ve FRAP yöntemleri ile antioksidan aktivite miktarı, toplam klorofil miktarı, toplam karotenoid miktarı, toplam antosiyanin miktarı, C vitamini miktarı, fenolik ve flavonoid bileşen miktarı, organik asit bileşen miktarı, şeker bileşen miktarı, toplam yağ verimi ve yağ bileşenleri miktarı analizleri yapılmıştır. Ayrıca, D. sericea ve D. gnidioides bitki türlerinde bulunan rosmarinik asit maddesinin Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) yöntemi ile tayini için metot optimizasyonu ve metot validasyonu gerçekleştirilmiştir.
Optimum ekstraksiyon çözücüsü hacimce % 70'lik metanol çözeltisi, ekstraksiyon sıcaklığı 65 °C ve ekstraksiyon süresi 24 saat olarak tespit edilmiştir. D. sericea ve D. gnidioides bitki türlerinde toplam fenolik madde miktarı sırasıyla 26,89-38,90 mg GAE/g ve 39,33-74,94 mg GAE/g aralığında saptanmıştır. Bu bitki türleri için toplam flavonoid madde miktarı sırasıyla 22,21-30,57 mg CE/g ve 11,10-31,00 mg CE/g aralığında belirlenmiştir. D. sericea ve D. gnidioides bitki türlerinde C vitamini miktarı sırasıyla 21,08-27,50 mg/100 g ve 28,13-50,83 mg/100 g aralığında bulunmuştur. D. sericea bitki türünde kateşin, şiringik asit, sinapik asit, rosmarinik asit, klorojenik asit ve epikateşin fenolik bileşenleri tespit edilmiştir. D. gnidioides bitki türünde başlıca yağ bileşenleri olarak nonakosan, 1-eikosanol, heksakosan, linoleik asit, palmitik asit ve oleik asit saptanmıştır. 
D. sericea ve D. gnidioides bitki türlerinde bulunan rosmarinik asit maddesinin tayini için gerçekleştirilen metot optimizasyon çalışmalarında, farklı mobil faz bileşimleri denenmiş ve asetonitril/metanol/formik asit karışımı  (10/90/0,5, V/V/V) uygun mobil faz olarak belirlenmiştir. Optimum mobil faz akış hızı 0,4 mL/dk olarak tespit edilmiştir. Optimum kolon sıcaklığı 30 °C olarak saptanmış ve optimum enjeksiyon hacmi 10 µL olarak bulunmuştur.
Metot validasyonunun gerçekleştirilmesi için doğrusallık, doğruluk, kesinlik, gözlenebilme sınırı (LOD), tayin sınırı (LOQ) ve seçicilik parametreleri belirlenmiştir. Yüzde geri kazanım miktarı 101,36±7,19 olarak tespit edilmiştir.  LOD ve LOQ değerleri sırası ile 0,37 mg/L ve 0,95 mg/L olarak hesaplanmıştır.

Abstract:
In this study, optimum extraction parameters for herba Daphne sericea subsp sericea Vahl. collected in the flowering period were determined according to the results of total phenolic content analysis. Biochemical characterization of different (leaf, flower and herba) parts of D. sericea and D. gnidioides collected in pre-flowering, flowering and post-flowering stages was carried out. In order to investigate biochemical contents of two species, the total phenolic content, total flavonoid content, amounts of antioxidant activity by DPPH and FRAP methods, total chlorophyll content, total carotenoid content, total anthocyanin content, vitamin C content, amounts of phenolic and flavonoid components, amounts of organic acid components, amounts of sugar components, total oil yield and amounts of fatty components analysis were performed. Additionally, method optimization and method validation were carried out by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method for the determination of rosmarinic acid substance found in D. sericea and D. gnidioides.
The optimum extraction solvent was determined as 70 % (V/V) methanol, the optimum temperature was obtained as 65 °C and the optimum extraction time was found to be 24 hours. Total amounts of phenolic compounds in D. sericea and D. gnidioides species were obtained in the range of 26.89-38.90 mg GAE/g and 39.33-74.94 mg GAE/g, respectively. For these species, total amounts of flavonoid substance were determined to be 22.21-30.57 mg CE/g and 11.10-31.0 mg CE/g, respectively. In D. sericea and D. gnidioides species, the amounts of vitamin C were in the range of 21.08-27.50 mg/100 g and 28.13-50.83 mg/100 g, respectively. Catechin, syringic acid, sinapic acid, rosmarinic acid, chlorogenic acid and epicatechin phenolic components were detected in D. sericea plant specie. Nonacosane, 1-eicosanol, hexacosane, linoleic acid, palmitic acid and oleic acid were determined as the main fatty components in D. gnidioides plant specie. 
The different mobile phase compositions were tested to optimize the method for the determination of rosmarinic acid content in D. sericea and D. gnidioides species and the optimum mobile phase composition was found to be acetonitrile/methanol/formic acid mixture (10/90/0.5, V/V/V). Optimum flow rate was obtained as 0.4 mL/min. Optimum column temperature was detected to be 30 °C and optimum injection volume was found as 10 µL.
In order to perform method validation, linearity, accuracy, precision, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ) and selectivity parameters were obtained. Recovery (%) value was determined as 101.36 ± 7.19. LOD and LOQ values were calculated as 0.37 mg/L and 0.95 mg/L, respectively.