Glioblastoma primer beyin tümörlerinde SIRT4'ün glutamat metabolizması ile ilişkisinin incelenmesi ve potansiyel tümör baskılayıcı özelliğinin araştırılması
Investigation of the relationship between SIRT4 and the glutamate metabolism and its tumor suppressing potantial in glioblastoma primary tumor tissues
Yazar: AYŞENUR AKKULAK
Danışman: PROF. DR. GİZEM DÖNMEZ YALÇIN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Beyin hastalıkları = Brain diseases ; Beyin neoplazmları = Brain neoplasms ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Glutamat = Glutamates ; Glütamat dehidrogenaz = Glutamate dehydrogenase ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sirtuin = Sirtuin ; Sitotoksisite = Cytotoxicity

Özet:
Amaç: Eksitotoksisite; glutamatın, fazla salınım veya bozulmuş geri alım nedeniyle nöronlar arası boşlukta birikme durumudur. Eksitotoksisite birçok beyin hastalığında rol oynar. Nöronlar arası boşluğa salınan glutamatı, astrositlerde bulunan GLT-1 (Glutamat Transporter 1) toplar. Glutamatın bir kısmı, astrositlerde glutamat dehidrogenaz (GDH) tarafından α-ketoglutarata çevrilir ve TCA siklusuna girer. İkinci bir yol olarak; glutamat, astrositlerde glutamin sentetaz (GS) tarafından glutamine çevrilir. Glutamin, tekrar glutamaterjik nörona geçerek bu döngüyü sürdürür.
Gereç ve Yöntem: Glioblastoma Multiform (GBM), tüm birincil beyin ve merkezi sinir sistemi neoplazilerinin %16'sını oluşturan, en yaygın birincil kötü huylu beyin tümörüdür. Glioblastomada, nöronların, eksitotoksisite yolu ile öldüğü bilinmektedir. Glutamat alınımından çoğunlukla Glutamat Transporter 1 (GLT-1) diğer adıyla Eksitatör Amino Asit Taşıyıcısı 2 (EAAT2) sorumludur. EAAT2'nin aktivitesinin azalması, glutamat birikimine yol açar. Bu birikim, hücre içi Ca+2 konsantrasyonunda yükselme ve hücresel ATP seviyelerinde azalma yolunu takip ederek glutamat eksitotoksisitesine ve nöronların olası nekrozuna sebep olur.
Bulgular: Sirtuinler, proteinleri deasetilasyon veya ADP-ribosilasyon yoluyla posttranslasyonel olarak modifiye eden; çekirdek, mitokondri veya sitoplazmada ifade edilen enzimlerdir. Sirtuin 4 (SIRT4), beyinde de ifade edilen bir mitokondriyal sirtuindir. Daha önce, SIRT4'ün farede delesyonunun, bir eksitotoksik ajan olan kainik aside karşı hassasiyeti arttırdığı ve GLT-1'e bağlı glutamat alımını azalttığı gösterilmiştir. Yapılan diğer çalışmalarda ise SIRT4'ün, hücre dizilerinde, glutamate metabolizmasını modüle ederek, eksitotoksisiteyi engellediği gösterilmiştir.
Glutamat metabolizması modülatörlerinin glioblastoma tümörlerindeki ifadesinin belirlenmesi; hastalığın tespiti, prognozu, mekanizması ve ilerleyişini anlamak için yol gösterici olacaktır.
Sonuç: Bu çalışmada 84 adet primer tümörlü beyin dokusu (parafinli kesit), 12 adet kontrol beyin dokusu (parafinli kesit) alınmıştır. Parafinli doku kesitlerinden, RNA izolasyon kiti kullanılarak ve protokole uyarak total RNA çıkarılmıştır. Nanodrop ile RNA konsantrasyonları ve kalitesi ölçüldükten sonra cDNA sentez kiti kullanılarak ve verilen protokole uyularak cDNA elde edilmiştir. Elde edilen cDNA, glutamat dehidrojenaza (GDH), glutamin sentetaz (GS) ve Sirtuin4 (SIRT4)'e özgü primerler kullanılarak ve qPCR (quantitative PCR-kuantitatif polimer zincir reaksiyonu) kit protokolüne uyularak mRNA elde etme işlemine tabi tutulmuştur. Elde edilen GDH, GS ve SIRT4 mRNA'ları, beta aktin mRNA'sına oranlanarak normalleştirilmiştir. Daha sonra istatiksel analizde iki örnek grubunun ortalamaları arasındaki fark için Two-Tailed Unpaired, Student's t-test kullanılmıştır. Grup sayısı üç ve üzerinde olan durumlar için ise OneWay ANOVA testi kullanılmıştır.

Abstract:
Objective: Accumulation of excess glutamate in the space between nerve cells is called excitotoxicity. Excitotoxicity plays a role in many brain diseases. Glutamate released into the interneuronal space is collected by GLT-1 (Glutamate Transporter 1) found in astrocytes. Some of the glutamate is converted to α-ketoglutarate by glutamate dehydrogenase (GDH) in astrocytes and enters the TCA cycle. As a second pathway, glutamate is converted to glutamine by glutamine synthetase (GS) in astrocytes. Glutamine completes this cycle by entering into the glutamatergic neuron.
Material and Metedos: Glioblastoma Multiform (GBM) is the most common primary malignant brain tumor, accounting for 16% of all primary brain and central nervous system neoplasms. In glioblastoma, neurons are known to die by excitotoxicity. Glutamate Transporter 1 (GLT-1), also known as Excitatory Amino Acid Transporter 2 (EAAT2), is mostly responsible for glutamate uptake. Decreased activity of EAAT2 leads to accumulation of glutamate. This accumulation leads to glutamate excitotoxicity and possible necrosis of neurons, due to a large increase in intracellular Ca+2 and a decrease in cellular ATP levels.
Results: Sirtuins are enzymes that posttranslationally modify proteins by deacetylation or ADP-ribosylation and are expressed in the nucleus, mitochondria, or cytoplasm. Sirtuin 4 (SIRT4) is a mitochondrial sirtuin that is also expressed in the brain. It has previously been shown that SIRT4 deletion in the mouse increases susceptibility to the excitotoxic agent, kainic acid, and reduces GLT-1-dependent glutamate uptake. In other studies, it has been shown that SIRT4 prevents excitotoxicity by modulating glutamate metabolism in cell lines.
The expression of glutamate metabolism modulators in glioblastoma tumors will be a guide to understand the detection, prognosis, mechanism and progression of the disease.
Conclusion: In this study, 84 primary tumor brain tissues (paraffinic sections) and 12 control brain tissues (paraffinic sections) were used. Total RNA was extracted from paraffin tissue sections using the RNA isolation kit by following the protocol provided. The RNA concentration and the quality were measured using the Nanodrop. Then, cDNAs were obtained using the cDNA synthesis kit by following the given protocol. The mRNA was transcribed from the obtained cDNA using primers specific to glutamate dehydrogenase (GDH), glutamine synthetase (GS) and Sirtuin 4 (SIRT4) by following the qPCR (quantitative PCR-quantitative polymer chain reaction) kit protocol. The GDH, GS and SIRT4 mRNA obtained was normalized to the beta actin mRNA. Then, Two-Tailed Unpaired, Student's t-test was used for the difference between the means of the two sample groups for the statistical analysis, One Way ANOVA test was used for cases with three or more groups.