Tavuk etinde antibiyotik kalıntılarının HPLC yöntemiyle belirlenmesi
Determination of antibiotic residues in chicken meat by HPLC method
Yazar: TUĞBA YILDIZ
Danışman: PROF. DR. BİRSEN  DEMİRATA  ÖZTÜRK
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Tavuk (Gallus gallus domesticus), sülüngüler (Phasianidae) familyasından evcilleştirilebilir bir kuş türüdür ve genelde çiftliklerde eti ve yumurtası için yetiştirilir. Tavuk üretimi, 2. Dünya savaşından sonra endüstrileşmiş olup, daha hızlı büyüyen ve daha fazla beyaz et verecek şekilde "kar" arttırıcı seçici üretim yöntemleri ile yapılmaktadır. Bu tesisler, tavukların dar alanlarda hareket edemeyecek sıkışıklıkta yetiştirilmesi (minimum enerji harcayacak şekilde) prensibiyle kurulmuşlardır. Bu üretim yönteminde yemden maksimum verim elde etmek  (bakterilerin yem tüketimini önlemek için) ve hastalıklara karşı direnç arttırmak ve tedavi etmek için yemlere antibiyotik katılması uygulamaları yer almaktadır. 
Antibiyotik, bir mikroorganizma tarafından (bakteri, mantar, virüs, vb.) yapılan ve başka mikroorganizmaları öldüren veya üremelerine mani olan maddelerdir. Antibiyotikler ilk olarak 1928 yılında bulunmuş ancak rutin olarak kullanılmaya 1940'lı yıllarda, ikinci dünya savaşı döneminde başlanmış ve insan sağlığının düzeltilmesinde hayati bir öneme sahip olmuştur. Antibiyotikler, yaygın bir şekilde hayvanlara hem tedavi edici olarak hem de yardımcı olarak kullanılır. Antibiyotikler enfeksiyöz hastalıkların sağaltımında ve gıda değeri olan çiftlik hayvanlarının büyümelerini ve verimlerini teşvik edici olarak geniş çapta kullanılmaktadırlar. β-laktam, tetrasiklinler, kloramfenikol, makrolidler, spektinomisin, linkozamid, sulfonamid, nitrofuran, nitroimidazol, trimethoprim, polimiksin, kinolon ve makrosiklik grubu ilaçlar belirtilen amaçlar için sahada en fazla kullanılan ilaçlardır. Ancak bu ilaçların sahada uygun olmayan şekillerde ve yasal olmayan kullanımları sonucu et, süt, yumurta, bal ve hayvanların yenilebilir diğer dokularında kalıntılar oluşmaktadır. 
Son yıllarda yem katkı maddesi adı altında çok değişik ürünlerin kullanıldığı ülkemizde, yem katkı maddelerinin ithalatında ciddi kontroller yapılmamaktadır. Ülkemizde karma yem fabrikalarının ürettiği yemlerin denetimini etkin ve iyi bir şekilde yapıldığını söylemek imkânsızdır. Üretici tarafından beyan edilen ham besin maddeleri ve enerji düzeyi tutulamadığından üretici firmaya uygulanan yaptırımlar son derece yetersizdir.
Beta-laktam antibiyotikler yan etkilerinin azlığı ve bakterisid olmaları nedeniyle günümüzde en sık kullanılan antibiyotik grubudur. En önemli üyesi penisilindir. Penisilin ilk bulunan en önemli antibiyotiklerdendir. Etki spektrumu dar bir madde olan penisilin ana molekülü üzerinde yapılan çalısmalar sonucu ampisilin, amoksisilin, azlosilin, karbenisilin gibi spektrumu genis ve çok sayıda yarı sentetik penisilin türevi bulunmus ve sagaltımda kullanılmaya başlanılmıştır. Penisilin veterinerlikte kullanılan ß-laktam antibiyotiklerindendir. Penisilin, günlük ortalama kilo artışında, beslenme etkinliğini artırmada, kronik solunum yolları ve nonspesifik enfeksiyöz enterit tedavisinde kullanılır. Kullanım dozu 2,4-100 g/ton'dur. Tavuk dokularında penisilinin maksimum kalıntı limiti 50μg-1'dir. Tetrasiklin için MRL değeri kasta 100 μg kg_1, ciğerde 300 μg kg_1, yağda ve böbrekte 600 μg kg_1'dir. Tetrasiklin grubu antibiyotikler, geniş spektrumlu olmaları ve toksik etkilerinin düşük olması dolayısıyla kanatlı yetiştiriciliğinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ucuz olmaları ve yan etkilerinin az olması en önemli avantajlarıdır. Yan etki spektrumları nedeniyle gebelerde ve sekiz yaşın altındaki çocuklarda kullanımları uygun değildir. Kullanıma girişlerinden itibaren hayvan yemlerinde kullanılmaları direnç sorununu da birlikte getirmiştir. 
Bu çalışmanın amacı, tetrasiklin, oksitetrasiklin ve penisilin G antibiyotiklerinin tavuklar üzerindeki etkisinin Yüksek Performanslı Sıvı Kromotografiyle (HPLC) analiz etmek, uyguladığımız metodun doğruluğunu kanıtlamak ve kullanılan antibiyotik miktarlarını MRL değerleriyle karşılaştırmaktır. Çalışmada tetrasiklin, oksiterasiklin ve penisilin G antibiyotiğinin seçilmesinin nedeni; tetrasiklinin hayvanlarda aşırı kullanımının sakıncalı olması, penisilinin analizinin bu gibi örneklerde uzun ve zor olmasından dolayıdır. Bu nedenle penisilinle ilgili çok fazla çalışmaya literatürde rastlanılmamıştır. Yapılan önceki çalışmalarda antibiyotik kalıntı analizlerinde kromatografik, spektrofotometrik, v.b. birçok yöntem kullanılmıştır. 
Bu tez kapsamında hızlı, duyarlı ve sonuçlarının doğruluğu nedeniyle HPLC yöntemi kullanılmıştır. İlk olarak her bir antibiyotik bileşiğinin stok çözeltileri hazırlanmıştır. HPLC ile yapılan analizlerde örnek hazırlama önemli bir aşamadır. Örnekler katı faz ekstraksiyonu, rotary, mikrofiltrasyon işlemleri kullanılarak analize hazır hale getirilmiştir. Katı faz ekstraksiyonu, günümüzde etkili bir örnek hazırlama yöntemi olarak birçok laboratuvarda kullanılmaktadır. Katı faz ekstraksiyon metodu, klasik sıvı-sıvı ekstraksiyon ile karşılaştırıldığında daha hızlı, az çözücüye ihtiyaç duyan, emülsiyon oluşumun şekillenmediği, çok daha ucuz bir tekniktir. Bunun yanında katı faz ekstraksiyonu ile daha temiz ekstrakt ve yüksek geri kazanım (recovery) oranları elde edilebilmektedir.
Çalışmada antibiyotik kalıntılarının belirlenebilmesi için çeşitli tampon ve mobil faz bileşimleri değiştirilerek kromatogramlar alındı ve hangi tamponun ve mobil fazın uygun olduğuna karar verildi. Penisilin ve tetrasiklin antibiyotik kalıntısında farklı tampon ve mobil faz kullanıldı. Literatürde yapılan çalışmalarda tetrasiklin antibiyotiğinin penisilin grubu antibiyotiklerin kromatogramda görünmesine engel olduğu rapor edilmiştir. Denemelerimizde belirlediğimiz bu durumdan dolayı her iki antibiyoik grubuna farklı yöntem uygulandı. İlk olarak antibiyotiklerin belirli derişimlerde çözeltileri hazırlanarak kalibrasyon grafikleri çizildi. Daha sonra tavuk örneklerine belirlediğimiz yöntemler uygulandı. Aynı tavuk örneklerine antibiyotik standartlarından spike yapılarak analizler tekrarlandı. Bu şekilde tavuklardaki kalıntı miktarı saptandı.
Çoğu ülkede antibiyotiklerin büyütme faktörü olarak kullanımı yasaklanmıştır. Üretici firmalar kısa sürede hızlı üretim için yemlerde/sularda yüksek miktarlarda antibiyotikler kullanarak insan hayatını ve çevreyi tehlikeye atmaktadır. Bunun sonucunda hastalıkların çoğalmasına, hastalıklarla mücadele edilememesine neden olmaktadır. Yapılan bu tez kapsamında bazı tavuk örneklerinde bulunan kalıntı miktarı maksimum kalıntı limitlerinin (MRL) üzerinde çıkmıştır. 
 
Bu tez çalışmasının sonuçları, ülkemizde hangi antibiyotik türlerinin ve izinli miktarlarının üzerinde kullanıldığına dikkat çekerek üretici firmaların yüksek kuruluşlar tarafından daha sıkı kontrolünün gerektiğini ortya koymuştur. Ayrıca tüketicilerin hayvansal gıdalar konusunda daha bilinçli ve seçici olmaları gerektiğini ortaya koymuştur. Çünkü hayvanlarda antibiyotik kullanımı ile ilgili ana sorun, bunları besin olarak tüketen canlılarda antibiyotik direncinin artması tehlikesidir. Gıdalardaki veteriner ilaç kalıntılarına bağlı olarak, bakteriler arasında çoklu direnç özelliğinin gelişmesi ve bu direncin patojen bakterilere aktarılması sonucu, insanlarda çoğu kez antibiyotik tedavisine cevap alınamamaktadır. Bu durum, daha fazla antibiyotik kullanımına yol açarak, hem toplum sağlığını hem de ülke ekonomisini olumsuz yönde etkilemektedir.

Abstract:
The chicken (Gallus gallus domesticus) is a a kind of bird family which can reclaim from Phasianidaes. In general, it is raised for meat and eggs in farms. Chicken production is industrialised after World War II. It is done as a incresing "profit" with selective breeding methods for giving faster growing and more white meat. These facilities were established for the growth of chickens (way to spend minimum energy) without moving in tight area. This manufacturing process is preconditioned the application which is added antibiotic in feed in order to achieve maximum efficiency from feed (in order to prevent feed consumption of bacteria) and for treating disease and increasing resistance against diseases. Animals are treated routinely with antibiotics to prevent, treat, or control disease. Even under the best conditions of agricultural management, crowding and stress can lead to disease. While historically there have also been nontherapeutic uses of antibiotics, typically as production tools to improve endpoints such as feed efficiency and weight gain. Antibiotic is a substance that occurs by a microorganism and also destroys or prevent the growth of the other microorganism. First antibiotics are discovered in 1928, but start to use them in 1940s routinely during the second world war. They have been an important role interms or medical treatment of human health. Antibiotics are commonly administered to food animals both therapeutically and subtherapeutically. Several classes of antibiotics are used in livestock veterinary medicine.  Antibiotics have been widely used for treating infectious diseases and for promoting food-producing animals growth and yields too. β-lactam, tetracyclines, chloramphenicol, the macrolides, spectinomycin, lincosamides, sulfonamide, nitrofurans, nitroimidazole, trimethoprim, polymyxine, quinolones and macrocyclics groups are the most commonly used drugs for these purposes. However, their improper and illegal use may produce residues in meat, milk, eggs, honey and the other edible tissues of animals. Up to now about 40 000 antibiotics have been found and about 80 of them are in therapeutic use. They are isolated primarily from metabolic products of living cells. Beta-lactam antibiotics are the most widely used group of antibiotics due to low side effect and being bactericidal. Penicillin is the most important member. Penicillin is one example of a ß-lactam antibiotic historically used in veterinary medicine. Penicillin used for the avarage daily weight gain, increases the effectiveness of nutrition, treating chronic respiratory and nonspesific infectious enteritis infectious enteritis. Dose of usage is 2,4-100 g / ton. Penicillin was the first microbial metabolite to distinguish between toxicity to the bacterial cell and toxicity to the mammalian host to permit its use in the systemic treatment of infections caused by gram-positive and -negative organisms in humans and animals. Despite their generally non-toxic nature, β-lactams appear to be responsible for most of the reported human allergic reactions to antimicrobials. The maximum residue limit (MRL) for benzylpenicillin(penicilin G) is 50 mgkg-1 in chicken tissue.  Tetracycline antibiotics produced by from gram-positive to negative bacterias. Tetracycline group of antibiotics are used widely in poultry breeding due to the fact that they are broad-spectrum and low toxic effects. They are antibiotics with a broad antibacterial spectrumand bacteriostatic activity, and have a good activity against acute disease caused by Gram-positive and Gram-negative bacteria, including the species Spirochete, Actinomyces, Ricketsia and Mycoplasma. These characteristics, together with the low cost and the paucity of major side effects (except in children and pregnant wome) have made the tetracyclines a widely used class of antibiotics. Moreover, the discovery that tetracyclines can be used as growth promoters has resulted in their use in animal feeds. Because of this, tetracycline-resistant pathogens has limited their usefulness in clinical practice. The use of tetracyclines is increasing, as they are used not only in treatment but also prevention of illnesses. Besides TCs are given to animals destined for human consumption to promote growth and may potentially result in the presence of residues in edible animal tissues, which can be toxic and hazardous for human health and potentially cause allergic reactions. The determination of residual TCs in animal products is consecutively very important. The maximum residue limit for tetracycline is 100 μg kg_1 in muscle, 300 μg kg_1 in liver, 600 μg kg_1 in fat and kidney.
The aim of this project is to analyse the effect of tetracycline, oxytetracycline and penicillin G antibiotics on chicken by HPLC method, to prove the accuracy of method and compare the used antibiotic amounts with MRL values. In this study the reasons of selection penicillin G and tetracycline, oxytetracycline are their common objectionable usage in animals and In such a study, anaylsis of penicilline is difucult and time is very important. Many methods have been used to determine the antibiotic residue. For example, High performance liquid cgromotography (HPLC), liquid chromatography( LC), thin layer chromatography, spectrophotometer, quadruple plate test, agar diffusion method, the disk diffusion method. HPLC will be used because of accuracy of analysis results in previous studies and analysis speed of equipment. The moment that the equipment being used is chosen, the antibiotic amount which give to chicken will determine. First of all, stock standard solution of each antibiotic compound will be prepared. When samples with these solution is passed from some steps(e.g extraction, rotary) , they will be ready to give in HPLC. Sample preparation is a considerable step before modern instrumental analysis (High Performance Liquid Chromatography, Gas Chromatography etc). Today, solid phase extraction is a powerful method for sample preparation and is used by most laboratories. Compared to classical liquid-liquid extraction, SPE is faster, uses less solvent, eliminates emulsions, and saves money. In addition, solid phase extraction provides clean extracts and high recoveries. In study, various buffers and mobile phases were tried for determining antibiotic residues and which buffer and mobile phase were judged to be appropriate. Different buffer and mobile phase were used for determining tetracycline and penicillin residues. Because ıt was proved that tetracycline antibiotic prevent the penicillin antibiotic to appear the chromatogram. Because of that the different method was applied for these antibiotics. Although tetracyclines form complexes with metal ions which adsorb on the silanol groups in the reversed-phase causing peaks tailing, symmetrical non-tailed peaks could be obtained when introducing 0.03 M oxalic acid into the mobile phase. As a extraction, solid phase extraction may be the chosen technique for the clean up of TCs extracted from biological matrixes. Nevertheless, the elution of TCs from reversed-phase sorbent is difficult since these compounds are amphoteric drugs and they contain more than one nitrogen atom. To overcome this difficulty, large elution volume, i.e. 10 ml of 0.01 M methanolic oxalic acid, was used for complete eluting TCs. The use of antibiotics to bring about improved performance in growth and feed efficiency, to synchronize or control of reproductive cycle and breeding performance also often lead to harmful residual effects. Concern over antibiotic residues in food of animal origin occurs in two times; one which produces potential threat to direct toxicity in human, second is whether the low levels of antibiotic exposure would result in alteration of microflora, cause disease and the possible development of resistant strains which cause failure of antibiotic therapy in clinical situations. A withdrawal period is established to safeguard human from exposure of antibiotic added food. Antibiotics are prohibited to use as a growth factor due to the fact that in studies, amounts of residue are high in most countries. Most of the manufacturing companies endanger the creature life by using high antibiotic at food in a short time. As a result, this event is caused the proliferation of diseases, not to fight with diseases. tetracycline and penicillin antibiotics which are two of the most commonly used varieties in chicken can be compare in residues of chicken body. Thus we can learn both which one is more used in industry and relevant instutions will be controlled to producing company. In adittion to this, Human will be conscious during consuming the animal product. Because one of the main issues associated with the use of antibiotics in food animals is the concern of developing antibiotic resistance. Human may be exposed to these resistant bacterial populations during the preparation or consumption of food. In humans often can not be taken respond to antibiotic treatment due to use antibiotic very much in animal. Investigations on the development of antibiotic resistance have reported that enteric pathogen bacteria commonly emerged from poultry meat have a crossresistance to the antibiotics used in human medicine because of prophylactic and growth promoter usage of antibiotics in low concentrations for a long time in poultry production. Whenever antibiotics are used in animal feed, consumers could be exposed to their residues via food chain. It is considered within food safety, some risks can appear for human health. The systematic intake of antibiotics by human beings results in various allergic reactions, metabolic diseases, and dysbiosis; it inhibits the activity of some enzymes, adversely affects gut organisms, contributes to the appearance of resistant microorganisms, etc. The presence of antibiotics in food raw materials can change the course of a process and, finally, impair the quality of finished products (for example, in the manufacture of fermented milk and meat products). In many cases the long-term effects of antibiotics on human health are not known, but they can, for example, provoke strong allergic reactions in sensitive people. An allergic reaction may be triggered by antimicrobial residues in a previously sensitized individual.