DNA'nın arkeozomlarla formülasyonu, in vitro karakterizasyonu ve memeli hücre kültürlerinde taşıyıcı olarak kullanılması
Formulation and in vitro characterization of DNA with archaeosomes and its utilization as DNA carrier to mammalian cell cultures
Yazar: AZADE ATTAR
Danışman: DOÇ. DR. KADİR TURAN ; DOÇ. DR. SEVİL YÜCEL
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada aşırı halofilik özelliğe sahip Haloarcula hispanica suşundan ekstre edilen polar lipidler kullanılarak hazırlanan lipozomların (arkeozomlar) DNA moleküllerinin memeli hücrelerine verilmesinde taşıyıcı olarak potansiyeli araştırılmıştır. H. hispanica pastel portakal izolatı Birbir ve arkadaşları tarafından Tuzköy tuz gölünden izole edilmiştir (2004). Haloarcula hispanica büyük ölçekli steril Brown besiyerine ekilerek 40°C'de 120 dev./dak. çalkalama hızında yaklaşık 30 gün boyunca üretildi. İnkübasyon sonrasında hücreler +4ºC'de, 10 000 dev./dak. hızda, 10 dakika santrifüj edilerek toplandı ve lipid izolasyonunda kullanıldı. Hücreler kloroform/metanol/dH2O (1:2:0.8, v/v) çözeltisi ile 2 saat ekstre edildi. Elde edilen lipidler, rotary evaporatörde buharlaştırılarak evaporasyon balonu cidarında ince bir film haline getirildi. Lipid tabakası hepes tamponu (pH: 7.4) içerisinde 30 dakika vortekslenerek hidrate edildi. Daha sonra örnekler ortalama 100 kez insülin enjektöründen geçirildi ve +4ºC'de saklandı. Plazmitler pEGFP-N1 (Clontech, ABD) ve pSV-ß-Gal (Promega, ABD), Escherichia coli hücrelerinde çoğaltıldı. E.coli hücreleri Luria Bertani besiyerinde (pH = 7.0) hücre yoğunluğu ortalama 4 x 109 h/ml olacak şekilde üretildi. Hücreler santrifüjle toplandı ve plazmit DNA, Peqlab MidiPrep Plazmit Kit kullanılarak saflaştırıldı. DNA'ların yüklemesinde iki farklı yöntem izlendi: a) Hepeste hidrate edilerek hazırlanan boş arkeozomlar belli oranlarda plazmit DNA ile karıştırılarak oda sıcaklığında 20 dakika bekletildi. DNA-lipozom kompleksi oluşumu agaroz jel elektroforezi ile incelendi, b) Arkeal lipidler evaporasyon ile balon cidarında ince bir film haline getirildikten sonra hidrasyon aşamasında plazmit-DNA ortama katıldı. Plazmit DNA'lar ve arkeozom-DNA kompleks oluşumları agaroz jel elektroforezi ile incelendi. Yukarıda belirtildiği şekilde hazırlanan arkeozomların zeta potansiyelleri ve partikül boyutları Zetasizer Nano ZS cihazında ölçüldü. Arkeozomların zeta potansiyellerinin negatif olması nedeniyle arkeozom-DNA komplekslerinin oluşturulmasında Ca2+ iyonları, polibren, DOTAP ve kitosandan yararlanıldı. Transfeksiyonda HEK 293 (human embryonic kidney) hücre hattı kullanıldı. HEK 293 hücre hattı %10 fetal bovin serum içeren D'MEM besiyerinde 37°C %5 CO2 inkübatöründe kültüre edildi. GFP (green fluorescence protein) ekspresyonu floresan mikroskobu ile incelendi. ß-Galaktosidaz ekspresyonu, hücre lizatlarlarında ß-Galaktosidaz aktivitesinin spektrofotometrik yöntemlerle ölçülmesi ile saptandı. Hazırlanan arkeozom örneklerinin morfolojik özelikleri tarayıcı prob mikroskobunun atomik güç modunda (AFM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak incelendi. Sadece arkeal lipidlerden hazırlanan arkeozomlarla gerçekleştirilen çalışmalarda düşük düzeyde transfeksiyon elde edilmiştir. Transfeksiyon etkinliğini artırmak için DOTAP, polibren, kitosan ve Ca2+ iyonlarından yararlanılmıştır. Kalitatif incelemeler sonucunda arkeal lipidlerin DOTAP'ın transfeksiyon etkinliğini artırdığı gözlenmiştir. Ca2+ iyonları ile yapılan çalışmada ise artan konsantrasyonda CaCl2'nin arkeozom ile transfeksiyon etkinliğini belirgin düzeyde artırdığı saptanmıştır.Anahtar kelimeler: Haloarcula hispanica, arkeozom, lipid ekstraksiyonu, plazmit, gen transferi, transfeksiyon.

Abstract:
This study investigates the DNA delivery potential of archaeosomes prepared from Haloarcula hispanica to mammalian cells. The archaeal lipids were extracted from extremely halophilic archaea Haloarcula hispanica isolated from Tuzköy Salt Mine by Birbir et al. (2004). Haloarcula hispanica cells were grown aerobically at 40°C, pH 7.5, for 30 days in Brown medium containing 18% NaCl. All cultures were harvested by centrifugation and stored at ?20°C as cell pastes. Lipids were extracted using methanol/chloroform/water (2:1:0.8, v/v), and total polar lipid fraction collected by cold acetone precipitation. Polar lipids were dried by rotary evaporatory and the dry lipid film obtained was hydrated in 10 mM HEPES buffer, pH 7.0. Two types of plasmid vectors were used: pEGFP-N1 (Clontech, USA) and pSV-ß-Gal (Promega, USA). Archaeosome-DNA complexes were formed by adding plasmid DNA to various concentrations of hydrated archaeal lipid fractions by vortexing and incubating at room temperature for 20 minutes. DNA encapsulated archaeosomes were prepared by the addition of plasmid DNA during the hydration process of archaeal lipid film. Archaeosome-DNA formation and unbound DNA were monitored by agarose gel electrophoresis. The surface charge density of archaeosomes was measured by Zeta-Sizer. The archaeosomes were found to be electronegative by the zeta potential analysis. Human embryonic kidney (HEK 293) cell line was used for the transient transfection experiments. The DNA transfection efficiency was measured by ß-Galactosidase assay (Turan and Nagata, 2006) or monitored with fluorescence microscope. Archaeosome formulations were visualized by atomic force microscope (AFM) and transmission electron microscope (TEM). The pEGFP-N1 transfection studies resulted in higher GFP expression in archaeosome samples than naked DNA. However, the expression level is considerably low when compared to conventional transfection reagents. The results are parallel with samples prepared with pSV-ß-Gal plasmid. As a conclusion, the electronegativity of archaeosomes lowers the DNA binding potential and so the transfection efficiency. To improve the DNA delivery capacity of archaeosomes, electropositive molecules such as DOTAP, polibren, chitosan and Ca2+ ions were used. Observations showed that archaeal lipids improve transfection efficiency of DOTAP. Also, the results indicated that increasing concentrations of CaCl2 improved archaeosomal transfection efficieny in a prominent manner.Keywords: Haloarcula hispanica, archaeosome, lipid extraction, plasmid, gene transfer, transfection.