PLAGL2'nin CRISPR/Cas9 yöntemiyle susturulduğu hacat keratinosit hücre hattının karakterizasyonu
Characterization of the hacat keratinocyte cell line in which PLAGL2 is silenced by the CRISPR/Cas9 method
Yazar: ÜMİT UZUN
Danışman: DOÇ. DR. TUBA DİNÇER
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Dış çevreye karşı koruyucu bir bariyer görevi gören çok katmanlı epidermisin ana hücresi keratinositlerdir. Epidermisin oluşumu ve yenilenmesi p63 transkripsiyon faktörü tarafından koordine edilen keratinosit farklılaşmasıyla gerçekleşir. Keratinosit farklılaşmasında önemli bir rolü olan RIPK4'ün işleyiş mekanizmasına yönelik çalışmalarımızda, insan keratinosit cDNA kütüphanesi RIPK4'ün yem olarak kullanıldığı büyük ölçek maya-ikili hibrit yöntemiyle taranmış ve RIPK4'ün, bir transkripsiyon faktörü olan PLAGL2 ile etkileştiği bulunmuştur. Bu etkileşim hem küçük ölçek maya-ikili hibritle tekrar mayada hem de farklı protein-protein etkileşim yöntemleriyle insan hücre hatlarında doğrulanmıştır. PLAGL2'nin RIPK4 ile etkileşimi ve RIPK4'e benzer şekilde, ekspresyonunun p63 tarafından düzenlenmesi, RIPK4 gibi PLAGL2'nin de keratinositlerde bir rolü olduğu hipotezini ortaya çıkarmıştır. Bugüne değin yapılan çalışmalar daha ziyade PLAGL2'nin karsinogezdeki rolünü tanımlamaya yönelik olmuştur. Literatürde PLAGL2'nin keratinositlerdeki rolünü gösteren bir çalışma bulunmamaktadır. Bu bağlamda tez çalışmamızla amaçlanan PLAGL2'nin keratinositlerdeki temel hücresel fonksiyonlar üzerinde bir rolü olup olmadığını araştırmaktır. Bu amaca yönelik ilk aşamada PLAGL2'nin ekspresyonu, HaCaT keratinosit hücre hattında CRISPR/Cas9n sistemiyle susturuldu. Sonrasında, oluşturulan PLAGL2 knock-out hücreler morfoloji, büyüme hızı, hücre döngüsü, hücre hareketi ve hücre ölümü gibi temel hücresel fonksiyonlar açısından incelendi. Ayrıca bu hücrelerde, PLAGL2 tarafından düzenlendiği farklı hücrelerde gösterilmiş olan Wnt/β-katenin sinyal yolağı iletimi de araştırıldı. Sonuç olarak, PLAGL2'nin susturulması keratinositlerde hücre döngüsü üzerinde herhangi bir değişime neden olmazken, hücre ölümü ve hareketinde belirgin bir artışa neden olduğu görüldü. Hücreler morfolojik olarak incelendiğinde hücre büyüklüğünün ve hücre hareketiyle ilişkili filopod yapılarının arttığı görüldü. Bunlara ilaveten, Wnt/β-katenin sinyal yolağı etkinliği PLAGL2 knock-out hücrelerde kontrole kıyasla azalma gösterdi. Sonuçlarımız, PLAGL2'nin deri gelişiminde bir rolünün olabileceğine dair ipuçları vermektedir.

Abstract:
Keratinocytes are the main cell of the multilayered epidermis, which acts as a protective barrier against the external environment. The p63 transcription factor coordinates keratinocyte differentiation, which results in the formation and regeneration of the epidermis. RIPK4 is a protein which has an important role in keratinocyte differentiation. In our previous studies in order to identify the mechanism of RIPK4 function in this process, we screened human keratinocyte cDNA library using RIPK4 as a bait with large scale yeast-two hybrid method and found transcription factor PLAGL2 as a RIPK4 interacting partner. This interaction has been confirmed both in yeast with a small-scale yeast-two hybrid assay and in human cell lines with different protein-protein interaction methods. Interaction between RIPK4 and PLAGL2 and transcriptional regulation of PLAGL2 by p63 similar to RIPK4, revealed the hypothesis that PLAGL2, like RIPK4, has a role in keratinocytes. The studies so far have mainly focused on defining the role of PLAGL2 in carcinogenesis. There is no study in the literature showing the role of PLAGL2 in keratinocytes. In this context, our thesis aims to investigate whether PLAGL2 has a role in basic cellular functions in keratinocytes. For this purpose as a first step, PLAGL2 expression was silenced in the HaCaT keratinocyte cell line by using CRISPR/Cas9n gene editing system. Afterwards, PLAGL2 knock-out cells were analyzed in terms of basic cellular functions including morphology, growth rate, cell cycle, migration and cell death. We also investigated the WNT/β-catenin signaling pathway in these cells, which has been demonstrated to be controlled by PLAGL2 in different cell types. In conclusion, silencing of PLAGL2 did not cause any change in the cell cycle in keratinocytes, but increased cell death and cell migration significantly. Morphological examination of knock-out cells revealed increased cell size and cell migration associated filopod structures. In addition, WNT/β-catenin signaling pathway activity was down-regulated in PLAGL2 knock-out cells compared to control. Our results provide clues that PLAGL2 may have a role in skin development.