Tek gen mutasyonu olan hastalıklarda non-ınvaziv prenatal tanı yönteminin başarısı
Success of non-invasive prenatal diagnostic method in diseases with single-gen mutation
Yazar: BETÜL SALİHA ACET ÖZKAYA
Danışman: PROF. DR. FAİK ACAR KOÇ
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology
Dizin: Amniosentez = Amniocentesis ; DNA = DNA ; Gebelik = Pregnancy ; Genetik = Genetics ; Genetik hastalıklar-doğuştan = Genetic diseases-inborn ; Mutasyon = Mutation ; Prenatal teşhis = Prenatal diagnosis

Özet:
Amaç : Çalışmamızda tek gen mutasyonu olan hastalıklar açısından riskli gebeliklerde, invaziv tanı yöntemi ve non invaziv genetik tarama yönteminin sonuçlarını karşılaştırarak, cell free DNA (cfDNA) çalışmalarının başarı oranını değerlendirmeyi amaçladıkYöntem: Çalışma sırasında 5 anne adayından 20 ml periferik kan örneği alımı ve 20 ml amniyosentez veya CVS örneği alındı. Alınan örnekler genetik laboratuvarında aşağıdaki yöntemler ile çalışılmıştır;
DNA eldesi; Anne adaylarından karşılaştırmalı analiz için hem amniyosentez veya CVS hem de periferal kan alındı. Amniyosentez işlemi Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde yapıldı. cfDNA çalışması INTERGEN Genetik ve Nadir Hastalıklar Tanı Araştırma ve Uygulama Merkezi'nde yapıldı. Periferal kandan elde edilen plazma ile cfDNA izolasyonu yapıldı. Amniyosentez materyali hücre kültürüne alındıktan sonra uygun yoğunlukta toplanıp DNA izolasyonu yapılmıştır. Amniyosentezden elde edilen DNA ise polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak hedef bölge çoğaltılıp ve bilinen mutasyonun fetüste varlığına bakılmıştır.
cfDNA'dan fetüs'e ait DNA oranının elde edilmesi: Derin dizilenen cfDNA örneğinden bağımsız SNP (single nucloitide polymorphysm) noktalarında mevcut nadir allellerin tespiti yapıldı. Bu tespit IGV yazılımı yardımı ile SNP bölgelerine ait farklı allellerin sayıları karşılaştırılarak elde edilmiştir .cfDNA dan fetüs genotipi belirlenmesi ve amniyosentez sonuçları ile karşılaştırılması:
Fetal DNA oranı tespit edildikten sonra hastalığa ait bölgedeki değişikliğin oranının değerlendirilmesi yapılmıştır. Mutasyonun bulunduğu bölgede anneden gelecek bir adet allel bulunacağı için bu bölgede %50 mutant allel oranında bir sapma tespit edilmesi gerekmektedir. Fetüsten gelen katkı olmadığı durumda cfDNA'da derin dizilenmiş mutasyon bölgesinde ~%50 oranında anneden gelen mutant allelin tespiti beklenmiştir. Bu oranın daha belirgin bir oranda gerçekleşmesi yüksek düzeyde fetal DNA oranı eldesine bağlıdır.
Sonuç: Çalışmamızın sonucunda gerekli bilgilendirme ve onamın ardından tek gen mutasyonu olan hastalıkların tanısı için 5 hastadan alınan AS ve CVS materyallerinin çalışılması ile ulaşılan sonuç; periferik kan alınarak analiz için çalışılan cell free DNA çalışmalarının sonucu ile uyumlu çıkmıştır. Homozigot ALS mutasyonu olan bir fetüs termine edilmiştir. Heterezigot ve WT genotipi olan diğer 4 fetüsün gebeliği devam etmektedir.Yorum: Bu çalışma sonucunda elde ettiğimiz veriler nadir görülen ve nadir tanı konabilen hastalıkların intrauterin hayatta cell free DNA çalışması ile öngörebileceğimizi göstermektedir. Ancak; çalışmamızda hedef hasta sayısına ulaşılamaması sebebi ile hipotezimizin desteklenmesi için prospektif ve geniş örneklem grubu içeren çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Objective : In our study, we aimed to evaluate the success rate of cell-free DNA studies by comparing the results of invasive diagnostic method and non-invasive genetic screening method in risky pregnancies for diseases with single gene mutationMethod: During the study, 20 ml of peripheral blood samples and 20 ml of amniocentesis or CVS samples were taken from 5 expectant mothers. The samples taken were studied in the genetics laboratory with the following methods;
DNA was obtained; both amniocentesis or CVS and peripheral blood were taken from expectant mothers for comparative analysis. The amniocentesis procedure was performed at Ankara University Faculty of Medicine. cfDNA isolation was performed with plasma obtained from peripheral blood. After the amniocentesis material was taken into the cell culture, it was collected at the appropriate density and DNA isolation was performed (1, 2).
The DNA obtained from amniocentesis was replicated to the target region using polymerase chain reaction (PCR) and the presence of the known mutation in the fetus was examined.
Obtaining the ratio of DNA belonging to the fetus from cfDNA: The detection of rare alleles present at SNP points independent of the deeply sequenced cfDNA sample was performed. This determination was obtained by comparing the numbers of different alleles belonging to SNP regions with the help of IGV software (3).
Determination of fetal genotype from cfDNA and comparison with the results of amniocentesis:After the fetal DNA ratio was determined, the rate of change in the region of the disease was evaluated. Since there will be one allele coming from the mother in the region where the mutation is located, it is necessary to detect a deviation of 50% of the mutant allele in this region. In the absence of contribution from the fetus, it was expected that ~50% of the mutant allele from the mother would be detected at the deep sequenced mutation site in cfDNA. The fact that this rate occurs at a more significant rate depends on the high level of fetal DNA ratio.
Results: As a result of our study, after the necessary information and consent, the result reached by studying the AS and CVS materials taken from 5 patients for the diagnosis of diseases with a single gene mutation; It was found to be compatible with the NIPT result studied for analysis by taking peripheral blood. A fetus with a homozygous ALS mutation was terminated. The other 4 fetuses with heterozygous and WT genotype are still pregnant.
Conclusions: The data we obtained as a result of this study show that we can predict rare and rarely diagnosed diseases in intrauterine life with NIPT. However; Since the target number of patients could not be reached in our study, prospective studies with large sample groups are needed to support our hypothesis.