Hibernasyonda "Pelophylax caralitanus"(amphibia: anura)'da DNA hasarının araştırılması /
Yazar: SELİN GÜLEÇ
Danışman: DOÇ. DR. UĞUR CENGİZ ERİŞMİŞ
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Medikal Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Amphibia = Amphibia ; Comet tekniği = Comet assay ; DNA = DNA ; DNA hasarı = DNA damage ; Hibernasyon = Hibernation ; Kurbağalar = Frogs ; Kuyruksuz kurbağalar = Anura ; Pelophylax caralitanus = Pelophylax caralitanus

Özet:
Bu çalışmada, ülkemizin göller bölgesi için endemik bir tür olan Anadolu Beyşehir Su Kurbağası  (Pelophylax caralitanus)'nda bazı fizyolojik değişimler ve DNA hasarı üzerine hibernasyon döneminin etkileri araştırılmıştır. Hibernasyonun fizyolojik bir davranış olduğu bildirilmiştir. Besin kıtlığında ve mevsimsel sıcaklıkların düşmesi ile gerçekleşir. Canlılar hayatlarını sürdürebilmek için metabolizmalarını minimum seviyeye indirirerek uyku haline geçerler. Jel elektroforez yöntemi olarak bilinen comet assay, DNA hasarını belirlemede kullanılan bir yöntemdir. Kolay,  hızlı ve hassas bir yöntem olması sayesinde sıklıkla kusllanılan bir yöntemdir. Literatürde amfibiler üzerinde yapılan comet assay deneyleri genellikle biyoizlem çalışmaları olarak yapılmıştır. Hibernasyona giren amfibiler üzerinde DNA hasarını comet assay yöntemi ile belirleyen bir çalışmaya rastlanmamıştır. Hibernasyon dönemine giren amfibilerde oluşan DNA hasarının ve fizyolojik değişikliklerin aydınlatılması büyük önem taşımaktadır. Stresli koşullar altında amfibilerde meydana gelebilecek olumsuz etmenleri en aza indirgemede yardımcı olabilir. Eber Gölü'nden toplanan 30 bireyden 20 tanesi çalışmamız için belirlenmiş olup boy uzunlukları ölçülmüş ve ölçülen değerler arasında istatistiksel bir anlam olmadığı saptanmıştır (p=0,12>0,05). Bu bireylerden 10 tanesi aktif dönemde bırakılıp kalanları ise -3°C'da hibernasyon dönemine girmeleri için belirlenmiştir. Aktif dönemde bırakılan bireylerin kanından H2O2 kullanılarak pozitif kontrol grubu oluşturulmuştur.  Her bireyden alınan kan ile P. caralitanus'un hibernasyon döneminde comet assay yöntemi ile DNA hasarının belirlenmesinin yanı sıra glukoz, kolesterol, üre, total antioksidan ve total oksidan miktarlarındaki değişimler de araştırılmıştır. Hibernasyon dönemi, aktif dönem ve pozitif kontrol gruplarında comet uzunluğu (CL), kuyruk uzunluğu (TL), kuyrukta bulunan % DNA miktarı (% DNA) ve olive moment (OM) parametreleri değerlendirilerek her birey için 200 comet hücresi sayılmıştır. Bu parametrelerden alınan sonuçlara göre, hibernasyon döneminde bulunan bireylerde aktif dönemdeki bireylere göre istatiktiksel olarak anlamlı derecede artmış DNA hasarı bulunmuştur (p<0,001).
	Bu çalışmada DNA hasarının yanı sıra belirlenen kan parametrelerindeki değişimler de gözlemlenmiştir. Hibernasyon döneminde, aktif dönemdeki bireylere göre glukoz miktarı 2,25 kat, üre miktarı 2,78 kat artış gösteririrken, total antioksidan miktarında % 65,7 ve total oksidan miktarında % 68,2 artış olduğu saptanmıştır Kolesterol miktarında ise %45,7 oranında bir azalma gözlnmiştir. Anadolu Beyşehir Su kurbağası olan P.caralitanus'un düşük sıcaklıklara maruz kaldığında bile hayatta kalmayı başardığı görülmüştür. Hibernasyona bırakılan bireylerin en fazla -3 °C'a kadar kısmi donma toleransı gösterebildikleri gözlenmiştir. Bu bireylerde donma ve çözülme sırasında glukoz ve üre seviyelerinin artması ile de oluşan stresin olumsuz etkilerinin hafifletildiği görülmüştür.


Anahtar Kelimeler: Amfibi, Comet assay, DNA hasarı, Hibernasyon, P.caralitanus

Abstract:
In this study, some physiological changes in the Anatolian Beysehir Water Frog (Pelophylax caralitanus), which is an endemic species for the lakes region of our country, and the effects of the period of hybridization on DNA damage were investigated. It has been reported that hibernation is a physiological behavior. It occurs in food shortages and in seasonal temperatures. Living things go into sleep by minimizing their metabolism in order to sustain their lives. The comet assay, known as the gel electrophoresis method, is a method used to determine DNA damage. It is an easy, fast and sensitive method and is a frequently used method. In the literature, the comet assay experiments on amphibians were generally carried out as biomass studies. No study has been found to determine DNA damage on the amphibians entering the hybridization by the comet assay method. It is of great importance to clarify the DNA damage and physiological changes that occur in the amphibians entering the hibernation period. Under stressful conditions, it can help to minimize the negative factors that may occur in amphibians. The length of the 20 ones determined for study from the 30 individuals collected from Eber Lake was measured in vitro and it was found that there was no statistical significance between the measured values (p=0.12>0,05). Ten of these individuals were determined to be left in the active period and the rest were allowed to enter the hibernation period at -3 °C. Positive control group was formed by using H2O2 from the blood of the individuals left in the active period. In addition to determination of DNA damage by the comet assay method, changes in glucose, cholesterol, urea, total antioxidant and total oxidant levels were investigated in the hybridization period of P. caralitanus with blood from each individual. Comet length (CL), tail length (TL), % DNA amount (% DNA) and olive moment (OM) parameters in queue were counted and 200 comet cells were counted for each individual. According to the results of these parameters, statistically significant increase in DNA damage was found in the individuals who were in the hibernation period compared to the individuals in the active period (p <0,001).

In this study, changes in blood parameters were observed as well as DNA damage. While the amount of glucose in the active period was 2,25 times and the amount of urea increased 2,78 times compared to the individuals in the active period, the total antioxidant amount increased by % 65,7 and the total oxidant amount increased by % 68,2 . The amount of cholesterol decreased by % 45,7. It was seen that P. caralitanus, a water frog, managed to survive even when exposed to low temperatures. It was observed that individuals left to hibernation could exhibit partial freezing tolerance up to -3 °C. It has been observed that the negative effects of stress caused by the increase of glucose and urea levels during freezing and thawing of these individuals have been alleviated.


Key words: Amphibian, Comet assay, DNA damage, Hibernation, P.caralitanus