Katekolaminlerin tayini için mikro toplam analiz sistemlerinin (µ-TAS) geliştirilmesi
Development of micro total analysis systems (µ-TAS) for the determination of catecholamines
Yazar: CAFER ÇAKAL
Danışman: PROF. DR. PERİHAN ÇAĞLAR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya = Chemistry ; Mühendislik Bilimleri = Engineering Sciences
Dizin: Katekolaminler = Catecholamines ; Katı faz özütlemesi = Solid phase extraction ; Monolit = Monolith

Özet:
Katekolaminler [norepinefrin (NE), epinefrin (E), ve dopamin (DA)] birçok biyolojik proseste yer alan ve parkinson, şizofreni, nöroblastoma, hipertansiyon gibi hastalıkların patolojik incelenmesinde önemli rol oynayan, nörotransmiter veya hormonlardır. Katekolaminlerin biyolojik sıvılardaki miktarları oldukça düşük olduğundan çok hassas analiz yöntemlerine ihtiyaç vardır. Klinik uygulamalarda elektrokimyasal ölçüme veya floresans ölçümüne dayalı HPLC analizi günümüzde sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Analiz genel olarak; ön saflaştırma, ayırma ve tayin olmak üzere üç basamak içermektedir. Ön saflaştırma işlemleri üç şekilde yapılmaktadır, bunlar; boronik asit afinite kolonlarının kullanıldığı, katyon değişim kolonlarının kullanıldığı ve aluminanın kullanıldığı katı faz ekstraksiyon yöntemleridir. Kapiler elektroforez ve HPLC çalışmalarında ön saflaştırma ve deriştirme işlemlerinin sisteme entegre edildiği çalışmalar ve ticari sistemler mevcuttur. Fakat bu işlemlerin mikroakışkan çipler üzerinde entegre edilmesi, mikro toplam analiz sistemlerinin (µ-TAS) oluşturulması açısından daha büyük ilgi görmektedir. Katekolaminlerin tayininde kısıtlı sayıda mikroçip elektroforez çalışması mevcuttur, ancak tüm analiz basamaklarının aynı mikroçip üzerinde gerçekleştirildiği, µ-TAS çalışması mevcut değildir.Bu çalışmada; katekolaminlerin analizi için, ön saflaştırma, deriştirme, ayırma ve tayin işlemlerinin mikroçip üzerinde entegre edildiği µ-TAS geliştirilmiştir. Bu amaçla ilk olarak, monolitik VPBA-EGDMA (4-vinilfenilboronikasit/ Etilenglikoldimetakrilat) polimerleri fotopolimerizasyon ile hazırlanmıştır. Çözücü/gözenek yapıcı olarak n-propanol/1,4-bütandiol karışımı kullanılmıştır. Polimerlerin kimyasal ve yapısal analizleri için, FTIR, SEM, BET ve cıvalı porozimetre yöntemleri kullanılmıştır. 168 ile 417 m2/g arasında değişen yüzey alanlarına sahip, farklı gözenek boyutlarında monolitler sentezlenmiştir. Adsorpsiyon ve elüsyon çalışmaları kesikli sistemde (batch) yapılmıştır. Katekolamin adsorpsiyonu için, tampon derişimi 20 mM ve pH 7.5 olarak belirlenmiştir. Mikroçiplerde kullanmak üzere belirlenen polimer bileşiminde, katekolamin tutma kapasiteleri NE için 11.9, E için 14.4 ve DA için 13.9 mg/g polimer olarak belirlenmiştir. Adsorplanan katekolaminlerin elüsyonu pH 3 ve altında % 90 ve üzerinde bir verimle gerçekleştirilebilmektedir.Mikroçip elektroforez ve µ-TAS çalışmaları için farklı kanal uzunluklarında ve farklı tasarımlarda mikroçipler borofloat camdan üretilmiştir. Mikroçiplerin üretiminde fotolitografi ve yaş aşındırma teknikleri kullanılmış olup, yapıştırma ısı ve basınç ile gerçekleştirilmiştir.Mikroçip elektroforez çalışmalarında, ayırma için etkili parametreler olan enjeksiyon süresi, uygulanan gerilim, tampon bileşimi-derişimi, pH, ayırma gerilimi ve ayırma yolunun uzunluğu konularında deneyler yapılmıştır. En verimli ayırma, 500 mM MES tamponu (pH:6) ve 100 mM fosfat tamponu (pH:3) ile elde edilmiştir.VPBA-EGDMA polimeri, µ-TAS için tasarlanan mikroçiplerde 0.05x2.1 mm boyutlarındaki yuvalarda fotopolimerizasyon ile monolitik diskler şeklinde hazırlanmıştır. µ-TAS de katekolaminlerin adsorpsiyon ve elüsyonu elektrokinetik olarak gerçekleştirilmiştir. Yıkama çözeltisi, elüsyon çözeltisi ve ayırma tamponunda çeşitli formülasyonlar kullanılmıştır. En iyi sonuçlar, elüsyon tamponu olarak 100 mM fosfat (pH:2), ayırma tamponu olarak 100 mM fosfat (pH:3) kullanıldığında elde edilmiştir. µ-TAS de üretilen monolitik diskler ile, NE için 116 kat, E için 178 kat ve DA için 92 kat deriştirme verimi elde edilmiştir.

Abstract:
Catecholamines [norepinephrine (NE), epinephrine (E), and dopamine (DA)] are involved in a number of biological processes as neurotransmitters or hormones and play important roles in the pathological study of several diseases such as hypertension, neuroblastoma, parkinsonizm, and schizophrenia. Due to the very low concentrations of catecholamines and their metabolites in biological fluids, highly sensitive methods of analysis are required for the quantitative determination of catecholamines. Two methods used frequently in clinical studies are HPLC and capillary electrophoresis with electrochemical or fluorescence detection. The analysis generally consists of three steps; pre-purification of catecholamines, separation, and determination procedure. The pre-purification processes are performed in three ways. These are the solid-phase extraction methods, in which boronic acid affinity columns, cation exchange columns and alumina columns are used. Studies integrated with pre-purification and concentration steps are available in HPLC and capillary electrophoresis and commercial systems. However, integration of these steps has become more focused on microfluidic chips in terms of constitution of micro total analysis systems (µ-TAS). Few studies on microchip electrophoresis are presented for analysis of catecholamines, but a µ-TAS study in which all analysis steps have been carried out on the same microchip is not available.In this study, a µ-TAS in which pre-purification, concentration, separation and determination steps were integrated on a microchip was developed for catecholamine analysis. To achieve this, firstly, VPBA-EGDMA polymers were prepared by photopolymerization in which a n-propanol/1,4-butanediol mixture was used as solvent/porogen. For the chemical and structural analysis of polymers, FTIR, SEM, BET and mercury porosimeter methods were used. Monoliths with surface areas that range between 168 and 417 m²/g in a variety of pore sizes were synthesized. Adsorption and elution studies were carried out in a batch system. A buffer concentration of 20 mM and a pH of 7.5 were determined and used for catecholamine adsorption. Catecholamine binding capacities were determined as 11.9 for NE, 14.4 for E and 13.9 for DA for the selected polymer composition that was used in the microchips. The elution of the adsorbed catecholamines at pH 3 and below can be realized with efficiency of 90% and above.Microchips in a variety of channel lengths and in different designs were produced by using borofloat glass for microchip electrophoresis and µ-TAS studies. In microchip production, photolithography and wet etching techniques were employed and the bonding was accomplished with heat and pressure.In microchip electrophoresis studies, several experiments were carried out to investigate some important parameters such as, injection time, applied potential, buffer composition, buffer concentration, pH, separation potential and the length of separation channel. The most efficient separation was obtained with 500 mM of MES buffer (pH:6) and 100 mM of phosphate buffer (pH:3).VPBA-EGDMA polymers were prepared as monolithic disks with photopolymerization in the chambers that were 0.05x2.1 mm sizes in microchips designed for µ-TAS. Adsorption and elution of catecholamines in µ-TAS were realized electrokinetically. Several formulations were used for washing solution, elution solution and separation buffer. The most promising results were obtained when 100 mM of phosphate (pH:2) is used as the elution buffer and 100 mM of phosphate (pH:3) is used as the separation buffer. With the monolithic disks produced in µ-TAS, concentration efficiencies obtained were 116 fold for NE, 178 fold for E and 92 fold for DA.