Antibiyotik dirençli Escherichia coli izolatlarının bakteriyofaj uygulaması ile belirli antibiyotiklere karşı duyarlı hale getirilmesinin araştırılması
Investigation of sensitizing of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates to spesific antibiotics by bacteriophage application
Yazar: AYÇE FADİME DÜZENLİ
Danışman: DOÇ. DR. GİZEM ÇUFAOĞLU
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Gıda Hijyeni ve Teknolojisi (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu tez çalışmasında, çoklu antibiyotik direnci gösteren Escherichia coli izolatlarında bakteriyofaj uygulamasının fenotipik antibiyotik direnci üzerine etkisinin in-vitro olarak araştırılması amaçlandı. Bu amaç doğrultusunda, tavuk boyun derisinden izole edilen P21x, P67b, P91 ve P106 jenerik E. coli izolatları ile sığır karkas sürüntüsünden izole edilen 120GA, 180KD, 19RA ve 10KoKC E. coli O157 izolatları test mikroorganizmaları olarak kullanıldı. Ayrıca, mezbaha atık sularından izole edilen ve karakterizasyonu yapılmış E. coli'ye litik etkili üç adet bakteriyofaj (M8A, M11A ve M12A) çalışmaya dahil edildi. Çalışmada kullanılan test suşları üzerine bakteriyofajların litik etkisi çift katlı katı besiyerinde konfirme edildi. Ardından, suşlarının antibiyotik direnci üzerine bakteriyofaj kokteylinin etkisini belirlemek için izolatların minimal inhibisyon konsantrasyon (MİK) değerleri EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing - Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi) tarafından belirtilen broth mikrodilüsyon yöntemi kullanılarak ortaya kondu. Bu kapsamda, faj ile muamele edilmeyen kontrol grubu, faj ile bakterinin aynı anda muamele edildiği faj+bakteri grubu ve faj ile muamele edildikten sonra canlı kalanların oluşturduğu faj mutant grubu olmak üzere üç grup oluşturuldu. Suşların MİK testi sonuçları EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing - Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi) tarafından Enterobacterales için belirtilen MİK değerlerine (μg/ml) göre yorumlanarak dirençli (R) veya duyarlı (S) olarak belirlendi. Çalışmada beş farklı antibiyotik grubuna mensup olan ampisilin, tobramisin, fosfomisin, kloramfenikol ve nitrofurantoin antibiyotikleri kullanıldı. Analiz neticesinde, E. coli O157 izolatlarının tamamının fosfomisin faj+bakteri grubunda ve kloramfenikol faj ile faj mutant grubunda duyarlı hale geldiği tespit edildi. Jenerik E. coli izolatlarında ise nitrofurantoine dirençli suşların faj mutant grubunda tamamının duyarlı hale geldiği tespit edildi. Bununla birlikte, tüm ampisilin dirençli suşlarda faj+bakteri grubunda MİK değerlerinin belirgin şekilde arttığı gözlendi. Tobramisin için tüm izolatlarda faj+bakteri grubunda genel olarak MİK değerlerinde artış gözlenirken, faj mutant grupta duyarlılaşma tespit edildi. Sonuç olarak, bakteriyofaj ve antibiyotiklerin kombinasyonlarının çoklu antibiyotik direnci gösteren suşlarda fenotipik antibiyotik direncinde duyarlılaşmaya neden olduğu ancak, faj ve antibiyotik sinerjik etkisinin suşa ve antibiyotiğe göre büyük değişkenlik gösterdiği belirlendi. Bu durum antibiyotiklerin terapötik amaçla kullanılmadan önce faj-antibiyotik sinerjizminin in-vitro olarak ortaya konmasının altını çizmektedir. Öte yandan, faj-antibiyotik sinerjizm mekanizmalarının daha net bir şekilde ortaya konması için daha ileri in-vivo ve moleküler çalışmaların gerçekleştirilmesi gerekmektedir. Faj ve antibiyotiklerin sinerjik etkisinden faydalanılarak, yalnızca çoklu antibiyotik dirençli bakterilere karşı klinik etkinliğin artması değil, aynı zamanda antibiyotiğe dirençli bakteriyel patojenlerin insidansını potansiyel olarak yavaşlatılabileceği veya tersine çevrilebileceği öngörülmektedir.

Abstract:
In this thesis study, it was aimed to investigate in-vitro the effect of bacteriophage application on phenotypic antibiotic resistance in multiple antibiotic-resistant Escherichia coli isolates. For this purpose P21x, P67b, P91, and P106 generic E. coli strains isolated from chicken neck skins and 120GA, 180KD, 19RA, and 10KoKC E. coli O157 strains isolated from beef carcass swabs were used as test microorganisms. Additionally, three bacteriophages (M8A, M11A and M12A) were included in the study, which were isolated from slaughterhouse wastewater and had lytic activity against E. coli. The lytic effect of bacteriophages on the test strains was confirmed in double-layer agar. Then, to determine the effect of the bacteriophage cocktail on the antibiotic resistance of the strains, the minimal inhibition concentration (MIC) values of the isolates were determined using the broth microdilution method specified by CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). In this context, three groups were formed: a control group that was not treated with phage, a phage group in which phage and bacteria were treated simultaneously, and a phage mutant group consisting of those that remained alive after treatment with phage. The MIC test results of the strains were interpreted according to the MIC breakpoints (μg/ml) specified for Enterobacterales by EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) and were determined as resistant (R) or susceptible (S). Ampicillin, tobramycin, fosfomycin, chloramphenicol and nitrofurantoin antibiotics, which belong to five different antibiotic groups, were used in the study. As a result of the broth microdilution test, it was determined that all E. coli O157 isolates became sensitive in the fosfomycin phage group and in the chloramphenicol phage and phage mutant group. In generic E. coli isolates, it was determined that all nitrofurantoin-resistant strains became sensitive in the phage mutant group. However, it was observed that MIC values increased significantly in the phage group in all ampicillin-resistant strains. For tobramycin, a general increase in MIC values was observed in all isolates in the phage group, while sensitization was detected in the phage mutant group. As a result, it was determined that combinations of bacteriophages and antibiotics caused sensitization in phenotypic antibiotic resistance in multiple antibiotic-resistant strains, but the synergistic effect of phage and antibiotics varied greatly depending on the strain and antibiotic. This underlines that phage-antibiotic synergism should be demonstrated in vitro before antibiotics are used for therapeutic purposes. On the other hand, further in-vivo and molecular studies need to be carried out to more clearly reveal the mechanisms of phage-antibiotic synergism. By exploiting the synergistic effect of phages and antibiotics, it is foreseen that not only will clinical efficacy against multiple antibiotic-resistant bacteria be increased, but the incidence of antibiotic-resistant bacterial pathogens can also be potentially slowed or reversed.