Fibroblast hücre kültüründe jak-stat sinyal yolağı inhibisyonunun kollajen biyosentezi üzerine etkilerinin araştırılması
The investigation of the effects of jak-stat signal inhibition on collagen biosynthesis in fibroblast cell culture
Yazar: MEHTAP ŞAHİN
Danışman: DOÇ. DR. HÜSEYİN AYDIN
Sivas Cumhuriyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Biyosentez = Biosynthesis ; Fibroblastlar = Fibroblasts ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kollajen = Collagen ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Tofasitinib = Tofacitinib

Özet:
Fibrozisin arttığı çeşitli hastalıklarda (hepatik fibroz, skleroderma gibi) kontrolsüz kollajen sentezi ve birikimi olmaktadır. Kollajen sentezini inhibe eden ajanlar oldukça sınırlıdır. Tofasitinib selektif JAK-kinaz (1/3) inhibitörüdür. Günümüzde romatoid artrit tedavisinde kullanılmaktadır. JAK yolağı inhibisyonun kollajen sentezine etkileri net olarak bilinmemektedir. Çalışmamızın amacı fibroblast hücre kültüründe JAK-STAT yolağı inhibisyonunun kollajen biyosentezi üzerine etkisini araştırmaktır. BJ-CRL 1474 (cilt) ve BRL3A (hepatik) fibroblast hücre kültürlerinin uygun ortamda çoğalması sağlandı. 96'lık flasklarda çoğalan fibroblast hücrelerine sırasıyla 25nM, 50nM, 100nM, 200nM, 400Nm ve 800nM konsantrasyonlarında tofasitinib uygulandı. Hücre canlılığı ve miktarı spektrofotometreyle okundu. Ayrıca ELİSA yöntemi ile doku metalloproteinaz inhbitörü (TIMP-1), matriks metalloproteinaz 3 (MMP-3), dönüştürücü büyüme faktörü (TGF-1β) ve hidroksiprolin düzeyleri ölçüldü. Tofasitinib'in sitotoksik etkisi 100nM konsantrasyonda başladı (p<0,05). En yüksek etki ise 800nM'de elde edildi. Tofasitinib'in zamana bağlı sitotoksik etkisi 72. saatte, 24. ve 48. saate göre tüm konsantrasyonlarda anlamlı olarak daha yüksek saptandı (p<0,05). Kollajen sentezinin ana uyarıcısı olan TFG-1β düzeyi 25nM konsantrasyonda dahi anlamlı olarak düşük saptandı (p<0,05). En düşük düzeye 800nM konsantrasyonlarında ulaşıldı. Konsantrasyonlar arasındaki farklar istatistiksel olarak bulundu (p<0,05). Yine sırasıyla MMP-3, TIMP-1 ve hidroksiprolin sevilerinde kontrole göre anlamlı düşüş saptandı (p<0,05).  Her üç biyobelirteçteki düşüş 100nM konsantrasyonunda başladı. Her iki hücre kültüründeki (hepatik ve deri) sonuçlar benzerdi ve istatistiksel olarak anlamlı değildi (p>0,05). JAK-kinaz inhibitörü olan tofasitinib'in fibroblast hücre kültüründe fibroblast hücre proliferasyonunu zamana ve konsantrasyona göre baskıladığı gösterdik. Ancak bu etkinin klinik yansımaları için daha kapsamlı hayvan model ve insan çalışmalarına ihtiyaç vardır.

Abstract:
Uncontrolled collagen synthesis and deposition occur in various diseases such as hepatic fibrosis, scleroderma. The agents that inhibit collagen synthesis are very limited. Tofacitinib is a selective JAK-kinase (1/3) inhibitor. Currently it used in the treatment of rheumatoid arthritis. The effects of JAK pathway inhibition on collagen synthesis are not clearly known. The aim of the study is to investigate the effect of JAK-STAT pathway inhibition on collagen biosynthesis in fibroblast cell culture. BJ-CRL 1474 (skin) and BRL3A (hepatic) fibroblast cell cultures were proliferated in the appropriate medium. Tofacitinib was administered to fibroblast cells proliferating on 96-well flasks at concentrations of 25nM, 50nM, 100nM, 200nM, 400Nm and 800nM, respectively. Cell viability and quantity were read by spectrophotometer. Tissue metalloproteinase inhibitor (TIMP-1), matrix metalloproteinase 3 (MMP-3), transforming growth factor (TGF-1β) and hydroxyproline levels were measured by ELISA method. The cytotoxic effect of tofacitinib started at 100 nM concentration (p <0.05). The highest effect was obtained at 800nM. The time-dependent cytotoxic effect of tofacitinib was significantly higher 72th hours than at 24th and 48th hours at all concentrations (p <0.05). TFG-1β, the major stimulus of collagen synthesis, was found to be significantly low even at 25 nM concentration (p <0.05). The lowest concentration was reached at 800nM. The differences between the concentrations were statistically significant (p <0.05). Again, there was a significant decrease in MMP-3, TIMP-1 and hydroxyproline levels, respectively (p <0,05). The decline in all three biomarkers started at a concentration of 100nM. The results in both cell cultures (hepatic and skin) were similar and not statistically significant (p> 0.05). JAK kinase inhibitör, tofacitinib has been shown to inhibit fibroblast cell proliferation in fibroblast cell culture by time and concentration. However, more extensive animal model and human studies are needed for clinical manifestations of this effect.