Prostat kanserine özgül glikoproteinlerin tanımlanması için lektin afinite sorbentlerin hazırlanması
Preparation of lectin affinity sorbents for identification of spesific glycoproteins in prostate cancer
Yazar: NESLİHAN İDİL
Danışman: PROF. DR. NİLÜFER AKSÖZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Prostat kanserinin (PCa) tanısı ve izleminde biyoişaret olarak kullanılan glikoprotein yapısındaki prostat spesifik antijenin (PSA) hastalık sürecinde değişen glikozillenme özelliği, patogenezin anlaşılabilmesi için yeni ve önemli bir bakış açısı kazandırmıştır. Bu çalışmada, Konkanavalin A (Con A) immobilize manyetik poli(glisidilmetakrilat) (mPGMA) mikroküreler hazırlandı ve lektin-glikoprotein etkileşimlerinden yararlanılarak bu mikrokürelerin PCa ve benign prostat hiperplazideki (BPH) PSA bağlama kapasiteleri karşılaştırıldı. Söz konusu mikrokürelere manyetik özellik kazandırmak amacıyla demir oksit (Fe3O4) nanopartüküller sentezlendi. Bu nanopartiküller kullanılarak dispersiyon polimerizasyonu yöntemi ile mPGMA mikroküreler hazırlandı. Karakterizasyon çalışmaları, taramalı elektron mikroskobu, elektron spin rezonans, termogravimetrik analiz, yüzey alanı analizi, fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi ve titreştirici örnek manyetometresi ile gerçekleştirildi. mPGMA mikrokürelerin PSA bağlama kapasitesine uzatıcı kolun etkisinin araştırılması amacıyla 1,6 diaminohekzan (HDMA) kullanıldı. Uzatıcı kol takılan mPGMA mikroküreler glutaraldehit ile aktive edildikten sonra kovalent bağlama ile Con A immobilizasyonu gerçekleştirildi. Adsorpsiyon çalışmaları öncesinde, serumda yüksek derişimde bulunan albümin ve immunoglobulin-G, sırasıyla Cibacron mavisi-F3GA immobilize poli(hidroksietil metakrilat) (PHEMA) kriyojel diskler ve HiTrap rProtein A FF kolonu ile uzaklaştırıldı. PCa'lı ve BPH'lı bireylerden alınan serum örneklerinde uzatıcı kol takılan ve takılmayan mPGMA mikrokürelerin PSA bağlama kapasiteleri karşılaştırıldı. Serum örneklerindeki PSA miktarları CLIA (Kemilüminesans immunassay) ile ölçüldü. Uzatıcı kol takılı Con A immobilize mPGMA (mPGMA-HDMA-Con A) mikrokürelerin total PSA (tPSA) ve serbest PSA (fPSA) bağlama kapasitesi, uzatıcı kol takılı olmayan Con A immobilize mPGMA (mPGMA-Con A) mikroküreler ile karşılaştırıldığında daha yüksek bulundu.  Söz konusu mikrokürelerin PSA bağlama kapasitesi sıcaklık, başlangıç serum derişimi, ligand yükleme miktarı ve zaman parametreleri açısından incelendi. Elde edilen verilere adsorpsiyon modelleri ve kinetikleri uygulandı. Elüsyon ajanı olarak 0.1 M mannoz kullanıldı ve yaklaşık %85 oranında desorpsiyon gerçekleştiği belirlendi. mPGMA-HDMA-ConA mikrokürelerin bağlanma kapasitesinde önemli derecede bir kayıp olmaksızın ardışık kullanılabileceği gösterildi. Serum fraksiyonları SDS-PAGE (Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile analiz edildi. 
Çalışmamızda hazırlanan mPGMA-HDMA-ConA mikrokürelerin serum gibi karmaşık bir ortamdan PSA gibi bir PCa biyoişaretini bağlama kapasitesine sahip olduğu gösterilmiştir. Söz konusu mikrokürelerin ticari kitlerin geliştirilmesinde yararlı araçlar olarak kullanılabileciği düşünülmektedir. Lektin immobilize mPGMA mikrokürelerin henüz keşfedilmemiş diğer glikoprotein yapısındaki biyoişaretler için model bir sistem olabileceği görüşüne varılmıştır.

Abstract:
Prostate specific antigen (PSA) is a glycoprotein and has been used as a biomarker in the prognosis and diagnosis of prostate cancer (PCa). The alterations in the glycosylation feature of PSA during disease processes have brought a new and important perspective in order to understand the pathogenesis. In this study, Concanavalin A (Con A) immobilized magnetic poly(glycidyl methacrylate) (mPGMA) beads were prepared and PSA binding capacities of these beads were compared in PCa and BPH using lectin-glycoprotein interactions. For generating a magnetic property, iron oxide nanoparticles were synthesized. Then, mPGMA beads were prepared by dispersion polymerization using these iron oxide nanoparticles. Characterization studies were performed with scanning electron microscopy, electron spin resonance, thermogravimetric analysis, surface area analysis, fourier transform infrared spectroscopy and vibrating sample magnetometer. Before adsorption studies, high abundant proteins in the serum such as albumin and immunoglobulin G were depleted with Cibacron blue-F3GA immobilized poly(hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) cryogel discs and HiTrap rProtein A FF column, respectively. In order to investigate the effect of spacer-arm attachment to the PSA binding capacity of the beads, a spacer arm (1,6 diaminohexane-HDMA) was used. Following the spacer-arm attachment, mPGMA beads were activated with glutaraldehyde, then Con A immobilization was carried out by covalent binding. The PSA binding capacities of plain and spacer-arm attached mPGMA beads were compared in the serum samples of patients with PCa and BPH. The PSA concentrations in the serum samples were measured by CLIA (Chemiluminescent immunoassay). The total PSA (tPSA) and free PSA (fPSA) binding capacities of mPGMA-HDMA-Con A beads were found to be higher than that of mPGMA-Con A beads. PSA binding onto the mPGMA-HDMA-ConA beads was investigated in terms of temperature, initial serum concentration, ligand loading and time parameters. Adsorption models and kinetics were applied to the obtained data. Up to 85% of the bound PSA was eluted using 0.1 M mannose as an elution agent. It was observed that the mPGMA-HDMA-Con A beads could be appropriate for sequential use without a remarkable reduction in the binding capacities. Serum fractions are analyzed with SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). 
In our study, mPGMA-HDMA-ConA beads were shown to be capable of binding PCa biomarkers such as PSA from a complex media like serum. It is considered that these beads could be regarded as promising tools in the development of commercial kits. It can be suggested that lectin immobilized mPGMA-HDMA-ConA beads were expected to be a model system for other glycoprotein biomarkers which have not been discovered yet.