Metabolik sendromlu sıçan kortikal nöronlarında endoplazmik retikulum stresiyle ilgili faktörlerin araştırılması
Investigation of endoplasmic reticulum stress markers at cortical neurons of rats with metabolic syndrome
Yazar: ŞULE KIZIL
Danışman: PROF. DR. BELGİN CAN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Metabolik sendrom (MetS), insülin direnci temelinde ortaya çıkan ve klinik tablosunda glukoz intoleransı veya tip 2 diyabet,  abdominal obezite,  hipertansiyon, hiperlipidemi ile karakterize; proinflamatuvar ve protrombotik öğeleri bulunduran ve prematüre aterosklerozun yer aldığı artmış kardiyovasküler hastalık riski oluşturan bir patolojidir. MetS'in en önemli parametrelerinden birisi insulin direncidir. Endoplazmik retikulumun (ER) normal fonksiyonunun bozulması sonucu ER stresi ortaya çıkmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar insülin sinyal yolağının düzenlenmesinde ER stresinin önemli bir rol oynadığını göstermektedir. ER stresinin metabolik hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar ve kardiyovasküler hastalıklar gibi çeşitli patolojik koşulları tetiklediği bilinmektedir. Bu nedenle çalışmamızda, MetS modeli oluşturulmuş sıçanların kortikal nöronlarında ER stresinin varlığını ve egzojen insülinin ER stresi üzerine etkilerini göstermek üzere ER stresiyle ilişkili belirteçlerin araştırılması amaçlanmıştır.
Çalışmamızda 3 grup içinde toplam 30 adet 2 aylık Wistar albino erkek sıçan kullanılmıştır. Kontrol grubunda yer alan sıçanlar (n=10) standart sıçan yemi ve çeşme suyu ile beslenirken, MetS (n=10) ve MetS+İnsülin (n=10) grupları standart sıçan yemine ek olarak %32 sükroz içeren çeşme suyu ile 20 hafta boyunca beslenmiştir. 20 haftalık süre sonucunda MetS ve MetS+İnsülin gruplarında MetS deney modelinin oluşumu bozulmuş glukoz toleransı, insülin direnci, arteriyel kan basıncında artış ve serum insülin seviyesinde artış sonucunda doğrulanmıştır. MetS deney modelinin oluşumu doğrulandıktan sonra MetS+İnsülin grubundaki deney hayvanlarına 15 gün boyunca 3 IU/gün dozunda subkutan insülin uygulanmıştır. Bu sürenin sonunda deney hayvanları sakrifiye edilerek beyinleri çıkarılmıştır. Çıkarılan beyinlerde sol hemisfere ait prefrontal korteks bölgesi Western blotlama deneylerinde kullanılırken sağ hemisfere ait prefrontal korteks bölgesi ışık mikroskobik incelemeler için kullanılmıştır. Deney hayvanlarından elde edilen beyin dokularında ER stres belirteçlerinden IRE1α, p-IRE1, PERK, p-PERK, ATF6, GRP78, GSK3α/β ve pro-Caspase 12 ile apopitoz belirteçlerinden Caspase 3 ve TUNEL için incelemeler gerçekleştirilmiştir. İncelemeler sonucunda elde edilen veriler IBM SPSS 22 programı kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirilmiştir.
Hematoksilin-Eozin ve Krezil Viyole boyamaları ile gerçekleştirilen genel doku incelemelerinde gruplar arasında belirgin farklılıklar görülmemiştir. İmmünohistokimyasal işaretlemeler ve Western blotlama deneylerinden elde edilen bulgularda kontrol grubu ile karşılaştırıldığında MetS ve MetS+İnsülin gruplarında ATF6 ekspresyonundaki azalma ile EDEM, p-IRE1, GRP78 ve Caspase 3 protein ekspresyonlarındaki artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Bu çalışmanın sonuçları, kortikal nöronlarda ER stresi ve MetS arasındaki ilişkinin ortaya konulması açısından önemli bilgiler sunmaktadır.
Anahtar sözcükler: apopitoz, ER stresi, insülin direnci, kortikal nöron, metabolik sendrom

Abstract:
Metabolic syndrome (MetS) emerges with the basis of  insulin resistance and characterized by glucose intolerance or type 2 diabetes, abdominal obesity, hypertension, hyperlipidemia at the clinical profile; it contains proinflammatory and prothrombotic items and it's defined as a pathology that increased risk of cardiovascular disease involving premature atherosclerosis. One of the most important parameters of MetS is the insulin resistance. Disturbance of the normal function of the endoplasmic reticulum (ER) causes ER stress. Recent studies show that ER stress plays an important role in the regulation of the insulin signaling pathway. It is known that ER stress triggers various pathological conditions such as metabolic diseases, neurodegenerative diseases and cardiovascular diseases. Therefore, we aimed to investigate the presence of ER stress in cortical neurons of the MetS modeled rats and the effects of exogenous insulin on ER stress with the markers related to ER stress.
In this study 2 month old and a total number of 30 Wistar albino male rats in 3 groups were used. While rats in the control group (n = 10) were fed with standard rat diet and tap water, the groups of MetS (n = 10) and MetS + Insulin (n = 10) were fed with standard tap water containing 32% sucrose in addition to the standard rat diet for 20 weeks. At the end of the 20 weeks period, the formation of the MetS experimental model in the MetS and MetS + Insulin groups was confirmed with the results of impaired glucose tolerance, insulin resistance, increased arterial blood pressure and serum insulin levels. Once the formation of the MetS test model was confirmed, subcutaneous insulin was administered to the MetS + Insulin group animals at a dose of 3 IU /day for 15 days. At the end of this period, the animals were sacrificed and their brains removed. The brains' prefrontal cortex region of the left hemisphere was used in Western blotting experiments whereas the prefrontal cortex region of the right hemisphere was used for light microscopic investigations. The ER stress markers IRE1α, p-IRE1, PERK, p-PERK, ATF6, GRP78, GSK3α / β; and pro-Caspase 12 and apoptosis markers Caspase 3 and TUNEL assays applied on the brains obtained from the experimental animals. The datas obtained with the results of the analyzes were statistically evaluated using the IBM SPSS 22 program.
There were no significant differences between the groups with the hematoxylin-eosin and cresyl violet staining. When compared with the control group, the increase in EDEM, p-IRE1, GRP78 and Caspase 3 protein expressions and the decrease in ATF6 expression in the MetS and MetS + insulin groups was found to be statistically significant with the results obtained from immunohistochemical markers and Western blotting experiments. The results of this study provide important information about the relationship between ER stress in cortical neurons and MetS.
Keywords: apopitosis, cortical neuron, ER stress, insülin resistance, metabolic syndrome