GHB, ketamin, norketamin, fenobarbital, tiyopental, zolpidem, zopiklon ve fenitoin'in LC-MS/MS yöntemi ile idrardan eşzamanlı tayini
Simultaneous determination of GHB, ketamine, norketamine, fenobarbital, tiyopental, zolpidem, zopiklon and fenitoin in urine using LC-MS/MS
Yazar: BERİL ANILANMERT
Danışman: PROF. DR. MÜNEVVER AÇIKKOL ; PROF. DR. İBRAHİM NARİN
İstanbul Üniversitesi / Adli Tıp Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Antikonvülsanlar = Anticonvulsants ; Barbitüratlar = Barbiturates ; Cinsel suçlar = Sex offenses ; Fenitoin = Phenytoin ; Fenobarbital = Phenobarbital ; Hidroksibutiratlar = Hydroxybutyrates ; Ketamin = Ketamine ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Tiyopental = Thiopental ; İdrar tahlili = Urinalysis

Özet:
Hipnotik maddelerin tecavüz, organ hırsızlıklarında ve maddi hırsızlıklarda kullanılma potansiyelleri de bulunduğu için adli bilimlerde önemi büyüktür. Renksiz, tatsız ve kokusuz olduklarından, içkilere ilave edildiğinde etkisiz hale getirilmek istenilen kurbanlar fark etmeden bunları içebilmektedirler. Bu maddelerin sinerjistik kombinasyonları da bilinç kaybına sebep olduğundan, söz konusu suçlarda sıkça kullanılmaktadır. Bunların vücut sıvılarından kaybolmadan, zamanında ortaya çıkarılmasında, tarama ve doğrulama testlerinin hızlı ve ucuz metodlarla yapılmasının önemi büyüktür.  Bu çalışmada GHB, ketamin, norketaminin fenobarbital, tiyopental, zolpidem ve zopiklon maddelerine ve adli vakalarda kullanımı yeni yeni rapor edilen antikonvülsif etkili antiepileptik bir ilaç olan fenitoine ilişkin, sıvı kromatografi - ardışık kütle spektrometresi (LC-MS/MS) sistemi ile idrarda tarama ve doğrulama amaçlı eşzamanlı tayin yöntemi geliştirilmiştir. 

1,000 mL idrar, NaF ve I.S. ilavesinin ardından 40oC de 45 dakika hidroliz edilmiş, aşamalı asidik ve 2 aşamalı bazik ekstraksiyonun ardından, 50:50 oranında %0,1 lik formik asit:asetonitril (v/v) mobil faz sistemi kullanılarak, 0,3 mL/dk akışta yeni nesil C18 poroshell kolonda analiz edilmiştir. Ekstraksiyon öncesi ve ekstraksiyon sonrası analit karışımı katılan idrarlarda gerçekleştirilen validasyon sonucunda GHB için ortalama %71,46(±2,54), diğer analitler için ise  %80,98 ile 99,27 arasında değişen geri kazanımlar sağlanmıştır. Yöntemin lineer olduğu konsantrasyon aralıkları tespit edilmiş, LOD ve LOQ değerleri     GHB için 3,44 ve 6,00 μgmL-1, diğer analitler için 0,59-49,50 ve 9,20-80,80 ngmL-1 arasında bulunmuştur. LOQ hesabı, klasik hesaplara göre daha güvenilir sonuçlar veren EURACHEM yöntemine göre yapılmıştır. Horrat değerlerinin, AOAC'nin dökümanlarında geçen sınırlar arasında olması günler arası ve analistler arası tekrarlanabilirliğin kabul edilebilir olduğunu ortaya koymaktadır.

Bu çalışmada 8 analitin idrarda LC-MS/MS ile eşzamanlı tayini için 4 aşamalı bir ekstraksiyonun ardından, 5,5 dakika gibi kısa bir zamanda, izokratik elüsyonla, etkin, tekrarlanabilir, yüksek geri kazanımlı bir yöntem geliştirilmiş ve valide edilmiş olması; adli suçlarda GHB, ketamin ve barbitüratların kombine istismarının ve zolpidem, zopiklon, gibi maddelerin istismarının yanı sıra bu maddelerin birlikte kullanılmasına bağlı ölüm sebeplerinin ortaya çıkarılması açısından da önemlidir.

Abstract:
Rape of hypnotic agents are of great importance, since they have the potential to be used in drug-facilitated sexual assault, organ theft and property theft. Since they are colorless, tasteless and odorless, victims can drink without noticing, when added to the beverages. The synergistic combinations of these drugs are also used in such crimes, since they also cause loss of consciousness. In the detection of these drugs in time, before they clear from the biofluids, its important to carry out screening and confirmation tests with fast and cheap methods. In this study, a simultaneous determination method using liquid chromatography - tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) has been developed for urine screening and confirmation of GHB, ketamine, norketamine the phenobarbital, thiopental, zolpidem, zopiclone and phenytoin, an anticonvulsant and antiepileptic drug, which is newly reported in drug facilitated sexual assault.

1.000 mL NaF and I.S spiked urine samples were hydrolyzed at 40oC for 45 minutes. After the 2 steps basic and 2 steps acidic extraction, the extracts were analyzed in new age C18 poroshell column using 50:50 0,1% formic acid:acetonitrile (v/v) mobile phase in 0.3 mL/min flow rate. At the end of the validation which was carried out in the pre- and post-extraction spiked urines, high recoveries were found as  %71.46(±2.54) for GHB, and between %80.98- 99.27 for the other analytes.
The concentration ranges which the method was linear were determined, LOD and LOQ values were found as  3.44 and 6.00 μgmL-1 for GHB, in the ranges of 0.59-49.50 and 9.20-80.80 ngmL-1 for the other analytes. LOQ was calculated using EURACHEM method which gives more reliable results than classical calculations. Horrat values, which remain inside the limits mentioned in AOAC documents, reveal that the inter-day and interanalist precisions are acceptable. 

In this study, development and validation of an effective, precise method with high recovery for the simultaneous determination of these 8 analytes in urine, using LC-MS/MS with a short isocratic elution as 5.5 minutes after a 4 step extraction, will be important from the point of determining the combined use of GHB, ketamine and barbiturates as well as zolpidem and zopiclone abuse in crimes and finding out the reasons of deaths related to these drugs.