Schizosaccharomyces pombe'nin inozin monofostat dehidrogenaz (gua1) geninin klonlanması ve yapısal analizi
Cloning and structural analysis of Schizosaccharomyces pombe inosine monophosphate dehydrogenase (gua1) gene
Yazar: SEMİAN KARAER
Danışman: PROF.DR. GÜLER TEMİZKAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2001
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Biyosentez = Biosynthesis ; Genler = Genes ; Guanozin monofosfat = Guanosine monophosphate ; Klonlama = Cloning ; Schizosaccharomyces pombe = Schizosaccharomyces pombe

Özet:
ÖZET Schizosaccharomyces pombe'mn İnozin Monofosfat Dehidrogenaz (gual) Geninin Klonlanması ve Yapısal Analizi Bu çalışmada, ökaryotik organizmalar için uygun model sistem oluşturan bir maya türü olan Schizosaccharomyces pombe' de guanozin monofosfatın (GMP) de novo biyosentezinin ilk aşamasını katalizleyen inozin monofosfat dehidrogenaz (IMPDH) enzimini şifreleyen gual geni klonlanarak moleküler yapısı araştırıldı. Genin izolasyonu S. pombe' de komplemantasyon temeline göre yapıldı. Bunun için, gualura4 ikili mutantı pUR19 vektöründe kurulmuş S. pombe genom bankası kullanımıyla transformasyona uğratıldı. Elde edilen, gual genini taşıdığı düşünülen 5 adet pozitif klondan plazmidler geri alınarak Escherichia cö/fnin DH5a ırkında klonlandı. En küçük boyutta DNA parçasını taşıyan plazmidin (pGS4) boyutu saptanıp restriksiyon haritası çıkartıldı ve alt klonlamalar yapılarak gual geninin DNA parçasındaki pozisyonu ve yaklaşık boyutu araştırıldı. Alt klonlarla yapılan transformasyon deneyleri sonucunda komplemantasyon yapabilen en küçük DNA parçasının boyutu ~ 1.2 kb olarak belirlendi. Daha sonra,gen ayrışımı analiziyle baskılayıcı gen taşımadığı anlaşılan, bu DNA parçası pUC18 vektöründe klonlandı ve "revers" primerler kullanılarak otomatik dizileme cihazinda nükleotid dizisi çıkartıldı. Elde edilen dizi S. pombe genom dizileme projesi kapsamında II. kromozoma ait kozmitte klonlanmış c2F12'deki olası gual gen dizisi ile karşılaştırıldı. Karşılaştırma sonucunda, 1.2 kb'lik dizide gual geninin sadece C-ucundaki 446 nükleotidlik bölgesinin bulunduğu anlaşıldı ("GenBank" erişim no.AJ293460). gual genine ait küçük bir parçanın komplemantasyonda nasıl pozitif bir sonuç verdiğini açıklayabilmek üzere genin anlatımı önce RNA düzeyinde kontrol edildi. Bu amaçla yabani tip (972K), gualura4 (konak hücre) ve trahsformantlardan total RNA' lar izole edildi. RNA'larla yapılan "Dot" ve "Northern" analizlerinde bütün örneklerde melezlenmenin görülmesi ikili mutant da dahil olmak üzere genin transkripsiyon düzeyinde anlatım yaptığına işaret etti. Daha sonra, bu hücrelerde gual geninin ürünü olan IMPDH enziminin aktivitesine bakıldığında, ikili mutantta enzim aktivitesinin bulunmamasına karşılık transformantta yabani tiptekine yakın değer saptandı. Elde edilen sonuçlar, S. pombe'de gual geninin C-ucundaki sadece 446 nükleotidlik bölgesinin aktif IMPDH enziminin meydana gelmesine yol açabildiğim kanıtlamaktadır. X

Abstract:
SUMMARY Cloning and Structural Analysis of Schizosaccharomyces pombe Inosine Monophosphate Dehydrogenase (gual) Gene In this study, gual gene encoding inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) that catalyzes the first step in de novo biosynthesis of guanosine monophosphate (GMP) in Schizosaccharomyces pombe, a yeast that is very suitable model system for eukaryotic organisms, has been cloned and analyzed structurally. gual gene was isolated from S. pombe by complementation. For this purpose, the gualura4 double mutant was transformed using S. pombe genome bank established intiie^URl^vector. The plasmids were rescued from five positives clones which were thought to be carrying gual gene and clohedlh DH5a strainoffecfencWa coli. The plasmid (pGS4) carrying the smallest size of DNA was selected and its restriction map is made and the position and approximate size of gual gene in the DNA fragment was investigated by subcloning. The smallest size of DNA that is able to make complementation, was identified as ~1.2 kb from the result of transformation experiments using subclones. This DNA fragment that appeared not to carry a suppressor gene by segregation analysis was cloned to pUC18 vector, and then sequenced in a automated nucleotide sequencer using reverse primers. The sequence obtained was compared with putative gual gene sequence cloned to cosmid c2F12 belonging to the II. chromosome in the scope of S. pombe genome project. Only 446 nucleotides long region of the C-terminal of gual gene was found within the 1.2 kb sequence (GenBank Accession Number AJ293460). In order to explain how this small fragment belonging to gual gene makes complementation, gene expression was controlled at the RNA level. Total RNAs were isolated from wild type (972K), gualura4 (host cell) and fransformants. Hybridizations were observed in all samples of Dot and Northern analysis pointing out that the expression of the gene occurred at the transciption level including the double mutant. When the activity of IMPDH enzyme product of gual gene was tested in those cells, the enzyme activity was not found in the double mutant, however, the amount of activity determined in the transformant was close to the wild type. The obtained results proved that only the 446 nucleotides region at C-terminal of gual gene in S. pombe caused the way to the forming of active IMPDH. XI