Beyin hasarı biyobelirteçlerinin biyolojik numunelerden erken teşhisine yönelik analitik yöntem geliştirilmesi
Development of analytical methods for early diagnosis of brain injury biomarkers from biological samples
Yazar: CEM ERKMEN
Danışman: PROF. DR. BENGİ USLU ; DOÇ. DR. GÖZDE AYDOĞDU TIĞ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Analitik yöntem = Analytical method ; Aptamerler = Aptamers ; Biyobelirteçler = Biomarkers ; Biyosensörler = Biosensors ; Elektrokimyasal sensörler = Electrochemical sensors ; Erken teşhis = Early diagnosis ; Leptin = Leptin ; Sensörler = Sensors ; Teşhis = Diagnosis

Özet:
Bu tez çalışması kapsamında, Leptin tayinine yönelik üç farklı özgün elektrokimyasal biyosensör platformunun geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu platformlarda, biyobileşen olarak aptamerler kullanılarak Leptin tayinine yönelik ilk kez elektrokimyasal aptasensörler ve hibrit sensör geliştirilmiştir. İlk aptasensör tasarımında, aptamerlerin yüzeye etkin bir şekilde immobilizasyonu için, perde baskılı elektrotlar titanyum dioksit nanopartiküller ve altın nanopartiküller modifiye edilmiştir. Aptasensörün performasına etki eden aptamer derişimi, immobilizasyon süresi ve Leptin ile etkileşim süresi optimize edilmiştir. Fe(CN)63-/4- redoks molekülünün impedans yanıtları takip edilerek 1,0-100,0 pg/mL ve 100,0-1000,0 pg/mL olmak üzere iki derişim aralığında doğrusallık elde edilmiştir. Bu aptasensör için, teşhis sınırı ve tayin alt sınırı değerleri sırasıyla 0,312 pg/mL ve 1,0 pg/mL olarak bulunmuştur. Leptin tayinine yönelik sandviç tip aptasensörün tasarımı için elektrotların yüzeyi çinko oksit nanopartiküller ve altın nanopartiküller modifiye edilmiştir. Tiyol fonksiyonlu aptamerin derişimi, biyotin fonksiyonlu aptamerin derişimi ve immobilizasyon süresi ve Leptin ile etkileşim süresi optimize edilmiştir. Sandviç yapıda enzim etiketi olarak kullanılan alkalen fosfataz enzimi ve substratı α-naftil fosfat arasındaki reaksiyon ürünü α-naftol'ün akım sinyalleri takip edilerek, 0,01 pg/mL ile 100,0 pg/mL derişim aralığında doğrusallık elde edilmiştir. Bu aptasensör için, teşhis sınırı ve tayin alt sınırı değerleri sırasıyla 0,0035 pg/mL ve 0,01 pg/mL olarak bulunmuştur. Son sensör tasarımında ise, aptamerlerin ve moleküler baskılı polimerlerin benzersiz özellikleri birleştirilerek hibrit sensör geliştirilmiştir. Bu sensör için çalışma elektrodunun yüzeyi platin nanoküreler ve altın nanopartiküller modifiye edildikten sonra, polimer kaplama için polimerizasyon döngü sayısı, uzaklaştırma çözeltisinin uygulama süresi ve Leptin'in yeniden bağlanma süresi optimize edilmiştir. Fe(CN)63-/4- redoks molekülünün akım cevapları takip edilerek 1,0 fg/mL-10,0 pg/mL derişim aralığında doğrusallık elde edilmiştir. Bu hibrit sensör için, teşhis sınırı ve tayin alt sınırı değerleri sırasıyla 0,31 fg/mL ve 1,0 fg/mL olarak bulunmuştur. Geliştirilen üç sensör için de gerçekleştirilen tekrarlanabilirlik, seçicilik, geri kazanım ve stabilite çalışmaları, bu sensörlerin Leptin analizi için mevcut yöntemlere kıyasla daha avantajlı ve alternatif olarak tercih edilebilecek sensörler olduğunu göstermiştir.

Abstract:
Within the scope of this thesis, it is aimed to develop three different novel electrochemical biosensor platforms for Leptin determination. In these platforms, electrochemical aptasensors and hybrid sensor were developed for the first time for the determination of Leptin using aptamers as biocomponents. In the first aptasensor design, screen printed electrodes were modified with titanium dioxide nanoparticles and gold nanoparticles for efficient immobilization of aptamers to the surface. Aptamer concentration, immobilization time and interaction time with Leptin, which affect the performance of the aptasensor, were optimized. By following the impedance responses of the Fe(CN)63-/4-redox molecule, the linearity was obtained in two concentration ranges, 1.0-100.0 pg/mL and 100.0-1000.0 pg/mL. For this aptasensor, the limit of detection and lower limit of quantitation were found to be 0.312 pg/mL and 1.0 pg/mL, respectively. For the design of the sandwich type aptasensor for Leptin determination, the surface of the electrodes was modified with zinc oxide nanoparticles and gold nanoparticles. The concentration of thiol-functionalized aptamer, the concentration and immobilization time of biotin-functionalized aptamer, and the interaction time with Leptin were optimized. By following the current signals of α-naphthol, the reaction product between alkaline phosphatase enzyme used as enzyme label in sandwich structure and its substrate α-naphthyl phosphate, the linearity was obtained between 0.01 pg/mL and 100.0 pg/mL concentration range. For this aptasensor, the limit of detection and lower limit of quantitation values were found to be 0.0035 pg/mL and 0.01 pg/mL, respectively. In the final sensor design, a hybrid sensor was developed by combining the unique properties of aptamers and molecularly imprinted polymers. For this sensor, after the surface of the working electrode was modified with platinum nanospheres and gold nanoparticles, the number of polymerization cycles, the application time of the removal solution, and the rebinding time of Leptin were optimized for the polymer coating. By following the current responses of the Fe(CN)63-/4-redox molecule, the linearity was obtained in the concentration range of 1.0 fg/mL-10.0 pg/mL. For this hybrid sensor, the limit of detection and lower limit of quantitation values were found to be 0.31 fg/mL and 1.0 fg/mL, respectively. The reproducibility, selectivity, recovery and stability studies performed for all three sensors have shown that these sensors are more a