Fusobacterıum nucleatum'un enolaz enzimini kodlayan genin klonlanması ve analizi
Cloning and analysis of the gene encoding enolase enzyme from fusobacterium nucleatum
Yazar: SİNEM YAKARSÖNMEZ
Danışman: PROF. DR. DİLEK TURGUT  BALIK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Genetik = Genetics

Özet:
Fusobacterium nucleatum insanlarda periodontitis, gingivitis gibi periodontal hastalıklara neden olmaktadır. Ayrıca F. nucleatum oral mikrobiyomda bulunan yaygın türlerden biri olup, oral floradaki diğer bakteriler ve konak epitelyal hücreler ile etkileşmektedir. Fusobacteria'larda antibiyotik duyarlılığının rapor edilmesi, bu türe karşı alternatif ilaçların geliştirilmesi gerektiğini göstermektedir.
Enolaz F. nucleatum'un glikolitik yolağındaki, 2- fosfogliserik asidin (2-PGA) fosfoenol pirüvata (PEP) dönüşümü reaksiyonundan sorumlu enzimdir. Bakterinin metabolizmadaki rolünden dolayı F. nucleatum'un enolaz enzimi bu çalışmada hedef molekül olarak seçilmiştir. F. nucleatum enolaz enzimi literatürde ilk defa izole edilmiş, klonlanmış, eksprese edilmiş, kinetik ve yapısal olarak analiz edilmiştir.
F. nucleatum enolazı (FnENO) kodlayan gen ilk olarak pGEM®-T Easy Vektör sistemine klonlanmıştır. Daha sonra Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde enzimin ekspresyonunun yapılması için pLATE 31 vektörüne alt-klonlaması yapılmıştır. Ni-NTA agarozu kullanılan affinite kromatografisi ile protein saflaştırılmasını sağlamak için proteinin C- terminal ucuna 6xHis-tag bölgesi eklenmiştir. Protein saflaştırma işleminden sonra 46,37 kDa olan proteinin SDS-PAGE analizinde enzimin, % 95'in üzerindeki yüksek saflıkta elde edildiği gösterilmiştir. Bu enzimin kinetik karakterizasyonu öncesinde optimum pH ve termostabilite analizleri yapılmıştır. FnENO enziminin optimum pH'ı 8,5 olarak bulunmuştur ve spesifik aktivitesi 57,14 U/mg olarak hesaplanmıştır. Termostabilite analizleri FnENO aktivitesinin 30-60 0C arasında stabil kaldığını göstermiştir. Kinetik analiz pH 8,5 ve 250C'de yapılmıştır. Saflaştırılmış FnENO enziminin kinetik parametreleri GraFit 3.0 kullanılarak belirlenmiştir. Kinetik değerler, 2-PGA substratının kullanılmasıyla Km: 0,4825 mM, Vmax: 0,1587, kcat: 20,38 s-1 and kcat/Km: 4,22 x 104 M-1s-1 olarak elde edilmiştir. Fusobacterium nucleatum enolaz enziminin homoloji modellemesi Enterococcus hirae enolazının yapısı kalıp alınarak oluşturulmuş ve muhtemel ilaç hedef bölgeleri tanımlanmıştır. Tüm bu sonuçlar yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı doğrultusunda yeni görüşler ortaya çıkarabilecek ve enolaz, insandaki Fusobacterium nucleatum enfeksiyonlarını baskılamak için aday olabilecektir.
Anahtar kelimeler: Fusobacterium nucleatum, enolaz, periodontal hastalıklar, kinetik karakterizasyon, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı.

Abstract:
Fusobacterium nucleatum is related to periodontal diseases such as gingivitis and periodontitis in human. It is also one of the prevalent species in the oral microbiome and interacts with other bacteria in oral flora and host epithelial cells. Antibiotic susceptibility in Fusobacteria has been reported, so this showed that development of alternative drugs against this species is required.
Enolase is an enzyme which is responsible from a reaction in glycolytic pathway of F. nucleatum and converts 2-phosphoglyceric acid (2-PGA) to phosphoenolpyruvate (PEP). In this study, F. nucleatum enolase was chosen as a target molecule because of its role in the metabolism of the bacteria. The enzyme was isolated, cloned, expressed and analysed both kinetically and structuraly, for the first time in the literature.
The gene encoding enolase from F. nucleatum (FnENO) was first cloned into pGEM®-T Easy Vector system and then sub-cloned into pLATE 31 vector for the expression of enzyme in Escherichia coli BL21 (DE3) cells. 6xHis-tag region was added to the C-terminal of the protein to enable purification of the protein by affinity chromotography using Ni-NTA agarose. SDS-PAGE analysis of the 46,37 kDa protein showed that the enzyme was obtained at high purity, over >% 95, following the protein purification process. Optimum pH and thermostability analyses were performed prior to kinetic characterization of the enzyme. It was found that the optimum pH was 8,5 for this enzyme and specific activity was calculated as 57,14 U/mg. Thermostability analyses showed that FnENO activity remained stable between 30-60 0C. Kinetic analysis was performed at pH 8,5 and 250C. Staedy state kinetic parameters of purified FnENO was determined using GraFit 3.0. Kinetic values were obtained using 2-PGA as substrate; Km: 0,4825 mM, Vmax: 0,1587, kcat: 20,38 s-1 and kcat/Km: 4,22 x 104 M-1s-1. Homology modelling of Fusobacterium nucleatum enolase enzyme was built using Enterococcus hirae enolase structure as template and possible drug target regions were described. All these results may open new insights towards structure based drug design studies and enolase may be a candidate molecule to combat Fusobacterium nucleatum infections in human.
Keywords: Fusobacterium nucleatum, enolase, periodontal diseases, kinetic characterization, structure based drug design.