İpekböceği (Bombyx mori L.) sinir sisteminde yaşlanma sürecinde şeker değişikliklerinin belirlenmesi
Determination of sugar changes in nervous system of silkworm (Bombyx mori L.)during aging
Yazar: SEÇKİN SOYA
Danışman: PROF. DR. SABİRE KARAÇALI
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Bombyx mori = Bombyx mori ; Elektroforez-poliakrilamid jel = Electrophoresis-polyacrylamide gel ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Lektinler = Lectins ; Monosakaritler = Monosaccharide ; Siyalik asitler = Sialic acids ; Yaşlanma = Aging ; İpek böceği = Silkworm

Özet:
Bu çalışmada, Bombyx mori `nin 3.(en genç) ve 5. (genç) evre larva, hareketsiz prepupa (yaşlı larva) ve pupa (ergine yapılanma) dönemlerine ait (1) beyin ve ip merdiven sinir sistemi dokularında yaşlanma sürecine bağlı olarak glukoz, mannoz, galaktoz, N-asetilglukozamin (GlcNAc), N-asetilgalaktozamin (GalNAc), fukoz, sialik asit (Neu5Ac), ksiloz, arabinoz ve riboz monosakkaritlerinin miktar değişiklikleri analitik bir teknik olan CapLC-ESI-MS/MS?le, (2) beyin doku örneklerinde ise; sialik asitin glikozidik bağ tipi değişiklikleri optik bir yöntem olan fluoresan mikroskopla, (3) beyin ve ip merdiven sinir sistemi dokularında protein ve glikoprotein miktar değişiklikleri ise SDS-PAGE yöntemi ile  belirlenmiştir.  
Monosakkarit belirlemeleri için metanol içinde homojenize edilen doku örneklerine glikokonjugatlardan monosakkaritlerin koparılması için asit hidroliz yöntemi uygulanmıştır. Sialik asit DMB ajanı ile, diğer monosakkaritler PMP ajanı ile türevlendirilmiş ve CapLC-ESI-MS/MS?le analiz edilmiştir. Glikan profilleri, glikokonjugatlar için özel olan monosakkaritlerin oranlarıyla hesaplanmıştır. Fluoresan mikroskop analizi için beyin doku örneklerine, FITC işaretli dört farklı lektin [LFA (Limax flavus aglutinin), MAA (Maackia amurensis aglutinin), SNA (Sambucus nigra aglutinin), PSL (Polyporus squamosus aglutinin)] uygulanmış ve fluoresan mikroskopla fotoğrafları çekilmiştir. SDS-PAGE yönteminde protein ve glikoprotein değişikliklerinin belirlenmesi poliakrilamid jellerin sırasıyla Coomassie mavisi ve Periyodik asit-Schiff ile boyanması ile gerçekleştirilmiştir. 
Karşılaştırılan evrelerde en fazla bulunan monosakkarit glukozdur. Onu riboz şeker izlemektedir. Bütün monosakkaritler en fazla en genç (3.evre) dönemde bulunurken, yaşlanma sürecinde genel olarak azalmaktadır. Pupal evrede ise miktarlarında yeniden artışlar gözlenmiştir. Yaşlanma sürecinde en fazladan başlayarak monosakkaritlerde azalma sırasıyla ksiloz/arabinoz, galaktoz, riboz ve sialik asit, mannoz, fukoz ve N-asetilglukozamin şekerlerde görülmektedir. Proteoglikanlar, N- ve O-bağlı glikoproteinler ve polilaktozaminler genç örneklerde en fazla, yaşlı örneklerde en az bulunmaktadır. N- ve O-bağlı glikanları farklılaştıran fukoz şeker ile, oligosakkaritlerin son ucunda yer alan sialik asitler benzer şekilde genç ve yaşlı örneklerde sırasıyla en fazla ve azalarak bulunmuştur. Yaşlanmayla azalan N- ve O-glikanlarda azalmanın derecesi O-glikanlara göre N-glikanlarda daha büyük ölçüdedir. N-glikanların hibrit ve karmaşık tipleri en fazla en genç organizmada görülürken yüksek mannoz tip N-glikanlar ise en fazla pupa evresinde bulunurlar. Tüm sialik asitlere (LFA), N- ve O-glikanlarla polilaktozamin ve gangliositlerdeki Neu5Aca2,3Gal dizisine (MAA),  Neu5Aca2,6Gal/GalNAc dizisine (SNA), N-glikan, polilaktozamin ve gangliositlerdeki Neu5Aca2,6Galß1,4GlcNAc dizisine (PSL) özel olan fluoresan işaretli lektinlerle en fazla ışıma en genç beyinlerde görülmüştür. Genç evrelerde azalan ışıma yaşlı beyinlerde var-yok düzeyine düşmektedir. Pupal dönemde de ışımalar tekrar biraz artmaktadır. MAA ışımasının bütün devrelerde en fazla olması a2,3 bağlı sialik asitlerin bolluğunu işaret etmektedir. a2,6 bağlı sialik asitler için en fazla ışıma en genç ve genç beyinlerde bulunmuştur.  SDS-PAGE yöntemiyle protein içerikleri en yüksek yaşlı evre olan hareketsiz prepupada belirlenmiştir. Genç ve olgun evrelerden (3. ve 5.evre) yaşlı evreye (hareketsiz prepupal) doğru gidildikçe protein içeriklerinin kademeli olarak arttığı tespit edilmiştir. Fakat pupal dönemde protein miktarları yeniden düşük bulunmuştur. Periyodik asit-Schiff boyaması ile glikoproteinlerin değişimlerinin belirlenmesi analizleri, genç ve olgun evrelerde glikoproteinlerin az, yaşlanan bireylerde ise en bol bulunduğu göstermektedir. 
Sonuç olarak; glikokonjugat tipleri için karakteristik olan monosakkaritlerin oranlarındaki değişiklikler, N- ve O-bağlı glikanlarla polilaktozaminlerin ve glikozaminoglikanların yaşlanma sürecinde azaldıklarını göstermektedir. a2,3 ve a2,6 bağlı sialik asitler de benzer şekilde azalmaktadır. Protein ve glikoproteinler gittikçe artarak yaşlı larval sinir sisteminde en yüksek düzeye ulaşırken proteoglikanların glikozaminoglikanları ise tersine gittikçe azalarak en düşük düzeyde bulunmaktadır. İpekböceği sinir sistemindeki şeker değişikliklerinin yaşlanma sürecinde belirlendiği ilk çalışma olan bu doktora tezinin, yaşlanma mekanizmaları hakkında bilinenlere katkıda bulunacağı düşünülmektedir.

Abstract:
In this study, it is determined (1) by CapLC-ESI-MS/MS in order to find amount changes of glucose, mannose, galactose, N-acetylglucosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), fucose, sialic acid (Neu5Ac), xylose, arabinose and ribose monosaccharides in brain and ventral nerve cord tissues during aging process, (2) by fluorescent microscope in order to find changes of sialic acid glycosidic binding types in brain tissue samples, (3) by SDS-PAGE technique in order to find amount changes of proteins and glycoproteins among 3rd (the youngest) and 5th (young) larval instar, motionless prepupae (old larvae) and pupae (adult development) stages of Bombyx mori. 
For monosaccharide determination, acid hydrolysis method was carried out for the samples, which were homogenized in methanol, in order to break monosaccharide linkages. Derivatization of sialic acid was performed with solution of DMB, and the other monosaccharides was derivatized with PMP agent and analyzed with CapLC-ESI-MS/MS. Glycan profiles were calculated by rates of monosaccharides which are specific for glycoconjugates. For fluorescent microscope analysis, brain tissue samples were treated with four FITC-labeled lectin [LFA (Limax flavus aglutinin), MAA (Maackia amurensis aglutinin), SNA (Sambucus nigra aglutinin), PSL (Polyporus squamosus aglutinin)] and then were photographed. In SDS-PAGE technique, determination of protein and glycoprotein changes was carried out with Coomassie Brillant Blue and Periodic acid-Schiff staining, respectively. 
In all stages, the most abundant monosaccharide is glucose. Second abundant is ribose. Although all monosaccharides are present mostly in the youngest stage (3rd instar), they generally reduce during aging process. In pupal stage, amounts of monosaccharides were observed as in increase. In aging process, if it is started with the most decreased ones, order of monosaccharides reduction seems like xylose/arabinose, galactose, ribose and sialic acid, mannose, fucose and N-acetylglucosamine, respectively. Proteoglycans, N- and O-linked glycoproteins and polylactosamines are mostly abundant in young samples, but poor in old samples. Fucose that differentiates N- and O-linked glycans and sialic acids that locate on terminal of oligosaccharides were found highest in young samples and reduced in old ones. N- and O-glycans decrease in aging process but reduction level is higher in N-glycans than in O-glycans. Although hybrid and complex types of N-glycans are highest in youngest samples, high mannose N-glycans are highest in pupal stage. The fluorescences were found the highest in youngest brain samples by application of FITC-labelled lectins which include LFA that is specific for all sialic acids, MAA that is specific for Neu5Aca2,3Gal sequence of N- and O-glycans, polylactosamine and gangliosides, SNA that is specific for Neu5Aca2,6Gal/GalNAc sequence, PSL that is specific for Neu5Aca2,6Galß1,4GlcNAc sequence of N-glycans, polylactosamine and gangliosides. Fluorescences decrease in young samples and are almost nonexistent in old ones but increase somewhat in pupal stages. Excess of MAA fluorescences in all stages indicate that a2,3 linked sialic acids are abundant. a2,6 linked sialic acids are mostly present both in the youngest and young brain. Through SDS-PAGE technique, the protein contents are found highest in motionless prepupae which is old stage. From young and mature stages (3rd and 5th) to old stage (motionless prepupae), protein contents were found gradually in increase. During aging, protein contents were found as in increase, but they are found in decrease again in pupal stage. Periodic acid-Schiff staining indicates that glycoproteins are less in young and mature stages, but abundant in aged stage.   
As a consequence, changes of monosaccharides ratios which are characteristic for glycoconjugate types indicate that N- and O-linked glycans, polylactosamines and glycosaminoglycans are in decrease in aging process. Similarly, a2,3 and a2,6 linked sialic acids are in decrease, too. Although proteins and glycoproteins act cumulatively with the highest level in old larval nervous system, glycosaminoglycans of proteoglycans act in decrease and present in lowest level. It is thought that this PhD thesis, which is first demonstration of sugar content changes during aging process in silkworm nervous system, contributes to the knowledge about aging mechanisms.