Dishormonogenezli konjenital hipotirodi hastalarında yeni nesil dizi analizi ile genetik etiyoloji değerlendirilmesi
Evaluation of genetic etiology with a new generation sequence analysis in congenital hypothrody patients with dishormonogenesis
Yazar: ÜMRAN POTA
Danışman: PROF. DR. SELDA AYÇA ALTINCIK ; PROF. DR. GÖKHAN OZAN ÇETİN
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Çocuk Endokrinolojisi Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases

Özet:
Hipotiroidi, hipotalamus-hipofiz-tiroid bezi aksında herhangi bir sorun nedenli tiroid bezi tarafından yetersiz tiroid hormonu üretilmesi olarak tanımlanır. Konjenital ya da edinsel olabilir. Konjenital hipotiroidi yenidoğan döneminde en sık görülen endokrin bozukluk olup önlenebilir mental retardasyonun en önemli sebeplerindendir. Geçici (%40-50) veya kalıcı (%50-60) olarak görülebilir. İyot eksikliği veya fazlalığı, annenin otoimmun tiroid hastalıkları, annenin antitiroid ilaç kullanımı veya yenidoğan dönemi kullanılan bazı ilaçlara bağlı olarak geçiçi hipotroidi nedenleri arasındadır. Kalıcı hipotrodiler ise tiroid bezinin disgenezileri (%60) veya dishormonogenez (%40), hipotalamohipofizer nedenlere bağlı sekonder veya santral hipotroidi ve tiroid hormonlarının transport /metabolizma defektlerine bağlı olarak görülebilir. 
Doğumsal hipotiroidinin insidansı 1/4000 olarak bilinmektedir ancak son yıllarda görülme sıklığında artış olduğuna dair yayınlar mevcut olup, güncel insidansı 1/2000 olarak bildirilmiştir. Vaka sayısındaki artışın etiyolojisi tam olarak bilinememektedir. Endokrin bozucu ajanlar, hipotroidi tarama testinde kullanılan tirotropin (TSH) eşik değerinin düşürülmüş olması ve tıbbi hizmetlerin daha çok insana ulaşması gibi nedenler bu artışın sebebi olarak düşünülmektedir. Etiyolojik olarak bakıldığında, geçmiş yıllara kıyaslandığında, disgenezi ve ciddi hipotroidi sıklığında artış olmadığı; dishormonogeneze bağlı veya hafif-geçici seyirli vakalarda artış olduğu saptanmıştır. Konjenital hipotiroidi hastalarında %15-40 arasında dishormonogenez sıklığı bildirilmiştir ve artış olduğu düşünülmektedir.
Primer konjenital hipotroidi nedenlerinden olan dishormonogenez bağlı hipotroidi, tiroid hormon sentez basamaklarında görevli reseptör veya enzimleri kodlayan genlerin mutasyonları sonucu, sıklıkla otozomal resesif geçişli görülür. Tiroid bezi ötopik (normal) yerleşimli olup, sıklıkla normal büyüklükte veya hafif büyüktür (guatr). Sodyum/iyot simporter (NIS veya SLC5A5), tiroid peroksidaz (TPO), tiroglobulin (TG), dual oksidaz 2 ve reseptörü (DUOX2 ve DUOXA2), pendrin (SLC26A4 veya PDS), IYD/DEHAL1 ve SLC26A7 etiyolojiden sorumlu genler olarak bildirilmiştir. 
Teknolojinin gelişmesi sonucunda, karşılaştırılmalı genetik hibridizasyon (CGH), yeni nesil dizileme (targeted NGS) ve tüm ekzom sekanslama (WES) gibi yeni yöntemler, konjenital hipotirodili olgularda geniş populasyon çalışmalarını mümkün kılmış, hastalarda hipotroidiye neden olan birden fazla gende varyasyon saptanmış olup, hastalığın oligogenik kalıtım paternini göstermiştir. Konjenital hipotiroidizm ile ilişkili genlerin sayısının artmasına rağmen, konjenital hipotiroidizmin tam olarak ne kadarının bilinen genetik nedenlere atfedilebildiği ve spesifik genlerdeki mutasyonların göreceli prevalansı kesin olarak bilinmemektedir ve çalışmaların sonuçları arasında farklılıklar mevcuttur. Örneğin yapılan çalışmalarda Doğu Asya toplumlarında en çok sorumlu tutulan gen gibi görünen DUOX2, Kore, Japonya ve Çin'de konjenital hipotiroidizm hastalarda %16-32, Avrupa ve Ortadoğu hastalarından oluşan bir grupta % 18 sıklıkta bildirilmiştir. Bu farklılıklar kohortun etnik kökeni ve çalışılan konjenital hipotiroidi tipi (disgenezi/dishormonogenez) seçiminden kaynaklanabilir.
Ülkemizde, akraba evliliğinin sık olması ve otozomal resesif geçiş paterninin hakim olduğu dishormonogeneze bağlı hipotroidi grubunda, bilinenden farklı bir genetik yelpazeye katkıda bulunmuş olabilir. Dishormongeneze bağlı hipotiroidinin genetik etiyolojisi ile ilişkili geniş kapsamlı ulusal verimiz oldukça az sayıdadır.
Artan konjenital hipotiroidi vakalarından, hafif klinik seyirli olan ve dishormonogeneze bağlı olan konjenital hipotroidilerin sorumlu olduğu düşünülmektedir. Bu artışın nedeni tam olarak bilinmemektedir. Çalışılan konjenital hipotiroidi tipi, etnik köken açısından farklılık gösteren kohort seçimleri nedeni ile dishormonogenez prevalansı ve klinik seyri kesin olarak bilinmemektedir.
Bu çalışmada amaç dishormonogenetik konjenital hipotiroidizm hastalarından oluşan iyi karakterize edilmiş bir kohortta, yeni nesil dizilemeyi kullanarak moleküler nedeni aydınlatmaktır. Çalışmamızda dishormonegeneze bağlı hipotroidi düşünülen çocuk hastalar alınmıştır. Çalışmaya görüntüleme yöntemleri ile tiroid disgenezisi (ektopi, agenezi, hipoplazi,   hemiagenezi) dışlanmış ve aşağıdaki kriterlere giren hastalar alınmıştır; 
1.	Birinci derece akrabalarında (anne, baba veya kardeş) doğumsal hipotiroidi tanısı olan 
2.	Ebeveynleri arasında akrabalık öyküsü olan 
3.	L-tiroksin tedavi kesimi denenip, kontrolde TSH değeri ≥10 IU/mL olan hastalar alınacaktır. 
4.	Subklinik hipotroidi tanısı ile izlenip, tedavi almaz iken TSH değerleri >10 IU/L devam eden hastalar. 
5.	Konjenital hipotroidi tanısı ile izlenip, üç yaşını doldurmasına rağmen, L-tiroksin ihtiyacı > 2 μg /kg/gün olan ve tedavi kesimi bu nedenle denenmemiş olanlar.
6.	Konjenital hipotroidi tanısı ile birlikte guatrı olanlar.
Hastalardan yeni nesil dizileme (NGS) yöntemi ile GLIS3, TSHB, THRA, THRB, PAX8, NKX2-5, NKX2-1, FOXE1, TSHR, SLC5A5, SLC26A4, TG, TPO, DUOX2, DUOXA2, IYD, SLC26A7, DUOX1, ZNF607, SLC6A4, DIO1, DIO2, DIO3, TTR, GNAS, TRH, ALB, POR, TRHR, PHEX, SLC16A2, SERPINA7, IGSF1 genlerinden oluşan bir panel taraması yapılmıştır.
Sonuç; Çalışmaya kriterleri karşılayan 59 hasta (30 erkek, 29 kız) alındı. Otuzbir (%52,5)  hastada herhangi bir gende varyant saptadık. Oligogenik kalıtımdan bağımsız olarak kohortumuzdaki en yaygın olarak varyant saptanan gen TSHR geniydi (16/31). Bunu sırasıyla TG (7/31), TPO (6/31) SLC26A4 (3/31), DUOX2(2/31) THRB(1/31), DUOX1 (1/31) ve DUOXA2 (1/31) izlemekteydi. Altı adet olguda oligogenik kalıtım (TSHR-DUOXA2, TSHR-TG, SLC26A4-TG, TG-TPO, DUOX2-TSHR) söz konusuydu. Bir adet olguda TSHR geninde biallelik varyant mevcuttu. Yirmiki hastada (%71) TSHR, TPO, DUOX1,DUOX2, THRB, SLC26A4 ve TG'de monoalelik varyantlar tespit edildi. Beş adet novel varyant saptandı. 
Bu çalışma sonucunda elde edilen veriler, ileri dönemlerde dishormonogeneze bağlı konjenital hipotiroidi olguları için tanı, tedavi ve takip protokollerinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir; olası muhtemel gen tedavisi için yol gösterici olabilir. Sonraki nesillere verilebilecek prenatal ve postnatal genetik danışmanlıkta da bu verilerin önemli olacağı kanaatindeyiz.

Abstract:
Hypothyroidism is defined as insufficient thyroid hormone production by the thyroid gland due to any problem in the hypothalamus-pituitary-thyroid gland axis. It can be congenital or acquired. Congenital hypothyroidism is the most common endocrine disorder in the neonatal period and is one of the most important causes of preventable mental retardation. It can be seen as temporary (40-50%) or permanent (50-60%). Iodine deficiency or excess is among the causes of transient hypothyroidism due to maternal autoimmune thyroid diseases, maternal antithyroid drug use, or some drugs used in the neonatal period. Permanent hypothyroidism can be seen due to dysgenesis of the thyroid gland (60%) or dyshormonogenesis (40%), secondary or central hypothyroidism due to hypothalamo-hypophyseal causes, and transport/metabolism defects of thyroid hormones.
          The incidence of congenital hypothyroidism is known as 1/4000, but there are publications showing an increase in its incidence in recent years, and its current incidence has been reported as 1/2000. The etiology of the increase in the number of cases is not known exactly. Reasons such as endocrine disrupting agents, lowering of the TSH threshold value used in the hypothyroidism screening test, and access to more people by medical services are thought to be the reasons for this increase. Etiologically, there was no increase in the frequency of dysgenesis and severe hypothyroidism when compared to previous years; It has been determined that there is an increase in cases related to dyshormonogenesis or with mild-transient course. The frequency of dyshormonogenesis has been reported to be between 15-40% in patients with congenital hypothyroidism and it is thought to increase .
Dyshormonogenesis-induced hypothyroidism, which is one of the causes of primary congenital hypothyroidism, is frequently seen in autosomal recessive inheritance as a result of mutations in the genes encoding the receptors or enzymes involved in the thyroid hormone synthesis steps. The thyroid gland is eutopically located (normally), often of normal size or slightly enlarged (goiter). Sodium/iodide symporter (NIS or SLC5A5), thyroperoxidase (TPO), thyroglobulin (TG), dual oxidase 2 and its receptor (DUOX2 and DUOXA2), pendrin (SLC26A4 or PDS), IYD/DEHAL1 and SLC26A7 have been reported as genes responsible for the etiology .
As a result of the development of technology, new methods such as comparative genetic hybridization (CGH), next generation sequencing (targeted NGS) and whole exome sequencing (WES) have enabled large population studies in cases with congenital hypothyroidism. showed an oligogenic inheritance pattern. Although the number of genes associated with congenital hypothyroidism is increasing, the exact extent of congenital hypothyroidism attributable to known genetic causes and the relative prevalence of mutations in specific genes is not known with certainty, and results vary between studies. For example, DUOX2, which seems to be the most responsible gene in East Asian populations in studies, has been reported with a frequency of 16-32% in congenital hypothyroidism patients and 18% in a group of European and Middle Eastern patients in Korea, Japan and China. These differences may be due to the ethnic origin of the cohort and the choice of congenital hypothyroidism type (dysgenesis/dyshormonogenesis) studied .
In our country, the frequency of consanguineous marriages and the autosomal recessive inheritance pattern may have contributed to a different genetic spectrum than is known in the dyshormonogenesis-related hypothyroidism group . We have limited national data on the genetic etiology of hypothyroidism due to dyshormonogenesis.
Congenital hypothyroidism due to dyshormonogenesis with a mild clinical course is thought to be responsible for the increasing cases of congenital hypothyroidism. The reason for this increase is not fully known. The prevalence and clinical course of dyshormonogenesis are not known precisely due to the type of congenital hypothyroidism studied and the selection of cohorts differing in ethnicity. 
The aim of this study is to elucidate the molecular cause using next generation sequencing in a well-characterized cohort of dyshormonogenetic congenital hypothyroidism patients. In our study, pediatric patients who were thought to have hypothyroidism due to dyshormonogenesis were included. Thyroid dysgenesis (ectopia, agenesis, hypoplasia, hemiagenesis) was excluded by imaging methods and patients with one of the following criteria were included in the study;
1. First degree relatives (mother, father or sibling) diagnosed with congenital hypothyroidism
2. Having a history of consanguinity between parents
3. L-thyroxine treatment cut will be tried and patients with TSH value ≥10 IU/mL in the control will be taken.
4. Patients with a diagnosis of subclinical hypothyroidism who continue to have TSH values of >10 IU/L while not receiving treatment.
5. Those who are over three years old and L-thyroxine requirement is >2μg/kg/day.
6. Those with the diagnosis of congenital hypothyroidism and goiter.

Using the next generation sequencing (NGS) method from patients, GLIS3, TSHB, THRA, THRB, PAX8, NKX2-5, NKX2-1, FOXE1, TSHR, SLC5A5, SLC26A4, TG, TPO, DUOX2, DUOXA2, IYD, SLC26A7, 7DUOX1, ZNF60 A panel screen of the genes, SLC6A4, DIO1, DIO2, DIO3, TTR, GNAS, TRH, ALB, POR, TRHR, PHEX, SLC16A2, SERPINA7, IGSF1 was performed.
Conclusion; Fifty nine patients were included in the study. A total of 31 patient (52.5%) were detected to have a variant. Independent of oligogenic inheritance, the TSHR was the most common variant detected gene in our cohort (16/32).The second most common gene was TG (8/32) and the other genes were TPO (6/32) SLC26A4 (3/32) , DUOX2( 2/32) THRB (1/32), DUOX1 (1/32) DUOXA2 (1/32). Six cases had oligogenic inheritance (TSHR-DUOXA2, TSHR-TG, SLC26A4-TG, TG-TPO, DUOX2-TSHR). One case had a biallelic variant in the TSHR gene. Monoallelic variants were detected in TSHR, TPO, DUOX1, DUOX2, THRB, SLC26A4 and TG in 22 patients (71%). Five novel variants were identified.
The data that obtained as a result of this study may contribute to the development of diagnosis, treatment and follow-up protocols in the future since they have congenital hypothyroidism due to dyshormonogenesis; It will be a guide for possible gene therapy. This data will also be important in prenatal and postnatal genetic counseling that can be given to future generations.