Mitokondriyal sitopati öntanılı hastalarda MT-TL1 gen mutasyonlarının incelenmesi
Investigating MT-TL1 gene mutations in patients with suspected mitochondrial cytopathy
Yazar: BENGİSU KEVSER BULDUK
Danışman: PROF. DR. YUSUF ÇETİN KOCAEFE
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: DNA = DNA ; Genler = Genes ; Mitokondrial hastalıklar = Mitochondrial diseases ; Mitokondriler = Mitochondria ; Mutasyon = Mutation ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Mitokondriyal DNA'nın tRNA
ve rRNA genlerini içeren kısımlarında görülen nokta mutasyonları, mitokondriyal
protein sentezi mekanizmasını olumsuz etkileyerek oksidatif fosforilasyon işlev
bozukluklarına neden olur. Klinikte "Mitokondriyal Sitopatiler" olarak tanımlanan bu
klinik tablonun önemli bir kısmını, mitokondriyal tRNALeu (UUR) (MT-TL1) geninde
meydana gelen nokta mutasyonları oluşturmaktadır. MT-TL1 geninde görülen
m.3243A>G mutasyonu MELAS hastalarının %80'ninde tanımlanmıştır. Ancak, aynı
gende tanımlanmış olan m.3256C>T, m.3260 A>G, m.3271 T>C, m. 3291T>C ve
m.3303 C>T nokta mutasyonları da mitokondriyal sitopatilerle ilişkilendirilmiştir. Bu
tez çalışması kapsamında, MT-TL1 geninde belirlenmiş 6 nokta mutasyonunu
taranmasına yönelik yenilikçi bir ARMS-PZT yaklaşımı standardize edilmiştir.
"Yüksek çözünürlüklü erime eğrisi" (HRM) teknolojisinin kullanımı ile bu yaklaşımın
tanımlayıcı hassasiyeti geliştirilmiştir. in vitro koşullarda PZT tabanlı mutagenez
çalışmasıyla farklı oranlarda heteroplazmik mutasyon taşıyan rekombinant mtDNA
standartları oluşturularak yöntemin sınırları ve hassasiyeti gösterilmiştir. Hacettepe
Üniversitesi Nöroloji Anabilim Dalı ve Çocuk Hastanesi Nöroloji ünitesinde takip
edilmiş ve mitokondriyal sitopati öntanısı almış 219 hastanın kan ve/veya doku
örnekleri, geliştirilen yöntem ile taranmıştır. Tarama sonucunda iki hastanın m.3243
A>G mutasyonu, bir hastanın m.3290 T>C varyasyonu ve bir hastanın m.3303 C>T
mutasyonu taşıdığı belirlenmiş, mutasyonlar DNA dizi analizi ile doğrulanmıştır. Bu
yenilikçi yöntem, MT-TL1 nokta mutasyonlarının taranmasında ucuz, güvenilir ve
hızlı bir alternatif sunmaktadır. Bu çalışma ve sonuçları, hastalarda nadir gözlenen
diğer mtDNA varyasyonlarının da taranabilmesi için ileriye yönelik yeni ve teknolojik
bir "kavram kanıtı" ortaya koymaktadır.

Abstract:
Point
mutations in mitochondrial tRNA and rRNA genes cause oxidative phosphorylation
defects by negatively affecting protein synthesis function. The majority of
"mitochondrial cytopathies" are caused by point mutations in the tRNALeu (UUR) (MTTL1) gene. m.3243A>G mutation in the MT-TL1 gene is described in 80% of MELAS
patients. However, other rare mutations such as m.3256 C>T, m.3260 A>G, m.3271
T>C, m. 3291 T>C and m.3303 C>T are also identified in the same gene and associated
with mitochondrial cytopathies. Within the scope of this study, a novel ARMS-PCR
assay has been standardized to screen for the six described point mutations in the MTTL1 gene. The descriptive sensitivity of this approach was aimed to be improved by
combining it with HRM technology. Detection limits and the precision of this novel
method is verified by using recombinant mtDNA standards carrying heteroplasmic
mutations at different rates which is created by PCR-based mutagenesis. Peripheral
blood or skeletal muscle tissue samples of 219 patients, prediagnosed as mitochondrial
cytopathies at the Departments of Neurology and Child Neurology Units of Hacettepe
University Hospitals were screened using the developed method. The results of the
screening procedure revealed two patients to have m.3243 A> G mutation, one patient
with m.3290 T> C variation, and one patient carrying m.3303 C>T mutation. These
mutations were further confirmed by DNA sequence analysis. This novel ARMS-PCR
assay study and its results provide a new and technological "proof of concept" for
future screening of other rarely observed mtDNA variations in patients.