Citrus sinensis (L.) Osbeck (portakal) ve Citrus limon (L.) Burm.f. (limon) çiçeklerinden proteaz ve peroksidaz enzimlerinin saflaştırılması ve endüstride kullanımlarının araştırılması
Purification of protease and peroxidase from Citrus sinensis (L.) Osbeck (orange) and Citrus limon (L.) Burm.f. (lemon) flowers and investigation of their usage in industry
Yazar: FATİH UÇKAYA
Danışman: PROF. DR. NAZAN DEMİR
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Ülkemiz, ekolojik koşulların uygunluğu sayesinde, birçok meyvenin ekonomik olarak üretildiği nadir ülkeler arasındadır. Yaklaşık 70 milyon ton olan dünya portakal ve limon üretiminin %6'sı ülkemizde gerçekleşmektedir. Citrus sinensis L. Osbeck (portakal) ve  Citrus limon L. Burm.f. (limon)  çiçekleri, Akdeniz, Ege Bölgeleri ile Doğu  Karadeniz Bölgesi Rize sahil şeridi boyunca yetiştirilmektedir. Çalışmada amaç, Akdeniz bölgesinden toplanan C. sinensis ve C. limon bitkilerinin çiçeklerinin uçucu yağ içerikleri ile antioksidan etkilerinin belirlenmesi, ayrıca çiçeklerden proteaz ve peroksidaz enzimleri saflaştırılarak son ürünlerin endüstride özellikle kozmetik alanında kullanımlarının araştırılmasıdır.  
Kaynak araştırması sonucunda portakal ve limon çiçeklerinden üç fazlı sistem kullanılarak proteaz ve peroksidaz enzimlerinin saflaştırılması ile ilgili çalışmaya rastlanmamıştır. Taze ve dökülen Citrus çiçekleri Antalya ilinin Alanya ilçesinden toplanmış ve bekletilmeden çalışılmıştır. İlk aşamada çiçeklerin hekzan ve metanol ekstreleri hazırlandı. Ekstrelerin toplam fenolik ve flavonoid madde içerikleri belirlendi. Ayrıca ekstrelere DPPH ve KUPRAK metotları uygulanarak antioksidan aktivite tayini yapıldı. Ardından hidrodistilasyon yöntemiyle çiçeklerin uçucu yağları elde edilerek GC-MS ile bileşenleri belirlendi ve bu uçucu yağlar kozmetik ürün formülasyonlarında kullanıldı. İkinci aşamada ise üç fazlı sistem kullanılarak peroksidaz ve proteaz enzimleri Citrus çiçeklerinden saflaştırıldı. Bu amaçla fosfat, asetat, sitrat ve tris-HCl tamponları ile homojenatları hazırlandı. En yüksek peroksidaz ve proteaz aktivitesi gösteren tampon tespit edildi. Uygun tampondan elde edilen homojenat için maksimum t-bütanol oranı ve amonyum sülfat konsantrasyonu belirlendi. Maksimum oranlar kullanılarak elde edilen enzimin karakterizasyonu için optimum pH'sı, optimum sıcaklığı ile peroksidaz içinkullanılan 4-aminoantipirin ve proteaz için kullanılan kazein subatratlarına dair KM ve Vmax değerleri bulundu. C. sinensis ve C. limon bitkilerinin çiçeklerinden elde edilen peroksidaz ve proteaz enzimlerinin saflıklarını kontrol etmek ve molekül ağırlıklarını belirlemek için SDS-PAGE uygulandı. Saflaştırılan peroksidaz enziminin glikoz tayin kitinde kullanımı ve proteaz enziminin sütü çöktürme aktivitesi incelendi. Ayrıca elde edilen uçucu yağlar, ekstreler ve enzimlerin kullanıldığı kozmetik ürünler (krem, şampuan, sabun, kolonya) geliştirildi.
Sonuç olarak, Citrus çiçeklerinden üç fazlı sistem ile peroksidaz ve proteaz enzimi ilk defa bu tez çalışmasında saflaştırıldı. Ayrıca elde edilen uçucu yağ, ekstre ve enzimlerin bazı kozmetik ürün formülasyonları da ilk defa bu çalışmada gerçekleştirildi. Tezin hem metot hem de ürün olarak özgün nitelikte olduğu ve endüstriye katkı sağlayabileceği tespit edildi.

Abstract:
Our country are among the few countries that produces many fruits of economically, due to the suitability of ecological conditions. 6 percent of the World orange production is about 70 million tons are performed in Turkey. Citrus sinensis L. Osbeck (orange) and Citrus limon L. Burm.f. (lemon) flowers are grown throughout the Mediterranean and Aegean regions, and Eastern Black Sea region of Rize along coastline. The aim of the study, determination of antioxidant activity and essential oil content of C. sinensis and C. limon flowers from Mediterranean region and also purificaiton of peroxidase and protease enzymes from flowers of Citrus and investigation of the usage of these enzymes in the industry in particular for cosmetic. 
There was no study about purificiation of peroxidase and protease from orange and lemon flowers by using three-phase partitioning as a result of literature search. Fresh and spilled flowers of Citrus were collected from Alanya district of Antalya and they have been studied without delay. Hexane and methanol extracts of flowers were prepared at first stage. Total phenolic and flavonoid compounds of the extracts were determined. There was also applied DPPH and CUPRAC methods for determination of antioxidant activity. Then essential oils were obtained by hydro-distillation of the flowers and they used in cosmetic formulations. Peroxidase and protease were purified from Citrus flowers by three-phase partitioning at second stage. For this purpose, homogenates were prepared of phosphate, acetate, citrate and tris-HCl buffers, separately. The buffer indicates that the highest peroxidase and protease activity were determined. Then homogenate to t-butanol rate and ammonium sulfate precipitation were studied. Optimum pH, optimum temperature of enzymes and KM and Vmax values of 4-aminoantipyrine and casein were investigated. SDS-PAGE applied to peroxidase and protease from C. sinensis and C. limon for determination of purity and molecular weigth. 
In conclusion, peroxidase and protease enzymes were purified from flowers of Citrus for the first time in this thesis. Moreover some cosmetic formulations of the obtained essential oil, extracts and enzymes were performed for the first time in this study, too. The thesis was found to contribute to the industry and it was confirmed that it was original in terms of method and product.