Kistik fibroz hastalarının solunum yolu örneklerinden Pseudomonas aeruginosa saptanmasında, konvansiyonel kültür yöntemi ile moleküler yöntemlerin karşılaştırılması
Comparison of conventional culture and molecular methods for detection of Pseudomonas aeruginosa in respiratory track samples of cystic fibrosis patients
Yazar: SEDA SEVİLAY KOLDAŞ
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL KARAHASAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Fibroz = Fibrosis ; Kistik fibroz = Cystic fibrosis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Pseudomonas aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ; Solunum sistemi = Respiratory system ; Teşhis testleri = Diagnostic tests

Özet:
Kistik Fibroz Hastalarının Solunum Yolu Örneklerinden Pseudomonas aeruginosa Saptanmasında, Konvansiyonel Kültür Yöntemi ile Moleküler Yöntemlerin Karşılaştırılması
Seda Sevilay Koldaş, Ayşegül Karahasan, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı	
AMAÇ: Pseudomonas aeruginosa ile akciğer enfeksiyonu, kistik fibroz (KF) hastaları arasında morbidite ve mortalitenin başlıca nedenidir. P.aeruginosa'nın erken saptanması, hastalığın prognozunda önemli bir rol oynamaktadır ve enfeksiyon tespit edilir edilmez erken antibiyotik tedavisi, kronikleşmenin önüne geçecektir. Mikrobiyolojik kültür, laboratuvar tanısı için altın standart olmasına rağmen patojenin klinik materyallerden izolasyonu ve tanımlanması 24-48 saat gerektirmektedir. Çalışmamızın amacı ise KF hastalarının solunum yolu örneklerinden P.aeruginosa'nın saptanmasında moleküler yöntemlerin etkinliği ve maliyetinin konvansiyonel yöntem ile karşılaştırılmasıdır.
GEREÇ ve YÖNTEM: Çalışmaya Temmuz-Aralık 2017 tarihleri arasında Çocuk Gögüs Hastalıkları Anabilim Dalı tarafından takip edilen KF hastalarının balgam ve derin farengeal sürüntü örnekleri dahil edildi. Klinik örnekler agar plaklarına ekildi ve aerobik koşullarda 35,5°C'de 24 saat inkübe edildi. Koloniler, MALDI-TOF MS (BioMerieux) yöntemi ile tanımlamaları yapıldı.  Moleküler tanı için DNA, ticari bir kit (QIAGEN) kullanılarak numunelerden direkt olarak izole edildi. Amplifikasyon gerçek zamanlı PCR (qPCR) için 23SrDNA ve klasik PCR için exoA genine spesifik primerler kullanılarak gerçekleştirildi.
BULGULAR: Çalışmaya 67 adet balgam 33 adet derin farengeal sürüntü örneği (DFS) dahil edildi. DFS örneği alınan hastaların medyan yaşı 6, balgam örneği alınan hastaların medyan yaşı 15'dir. qPCR pozitifliği balgam örneği için Ct<28, DFS örneği için Ct<32 olarak kabul edildi. Buna göre qPCR analizinin P.aeruginosa'yı saptama limiti 103kob/ml olarak belirlenmiştir. Kültür altın standart olarak alındığında klasik PCR ile P.aeruginosa saptanmasında balgam örneği için sensitivite %94, spesifite %93, DFS örneği için sensitivite %50, spesifite %100'dür. qPCR ile P.aeruginosa saptanmasında balgam örneği için sensitivite %94, spesifite %93, DFS örneği için sensitivite %44, spesifite %100'dür. Kültürle izolasyon ve tanımlama 24-48 saat sürerken, klasik PCR ile yaklaşık 6 saat, qPCR ile 4 saatte sonuca ulaşmak mümkün olabilmiştir.
SONUÇLAR: Erken agresif antibiyotik tedavisi, P.aeruginosa ile enfeksiyon vakalarında kronik akciğer kolonizasyonunu önlemek veya ertelemek için çok önemlidir. Kültür güvenilir bir tanı yöntemi olmasına rağmen KF solunum yolu örneklerinden P.aeruginosa'yı saptamak için daha hızlı ve hassas bir yol gereklidir. Çalışmamızda, kültürle P.aeruginosa izolasyonu altın standart olarak alındığında, PCR ile kültürün uyumu balgam örneklerinde yüksek bulunmuştur. Moleküler yöntemler rutin laboratuvarlarda uygulanmadan önce geçerliliğin onaylanması gerekmektedir. PCR ile tespitin kültürle uyuşmaması durumunda klinik uygulamada sonuçların dikkatlice değerlendirilmesi ve antibiyotik tedavisi göz önünde bulundurularak her iki yaklaşımın birleştirilmesi makul olabilir.  
Anahtar sözcükler: Pseudomonas aeruginosa, Kistik Fibroz, exoA, 23SrDNA, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu

Abstract:
Comparison of Conventional Culture and Molecular Methods for Detection of Pseudomonas aeruginosa in Respiratory Track Samples of Cystic Fibrosis Patients
Seda Sevilay Koldaş, Ayşegül Karahasan, Department of Microbiology
AIM: Pseudomonas aeruginosa is the most important cause of lung infection and major cause of morbidity and mortality among Cystic Fibrosis (CF) patients. 
Early detection of P. aeruginosa is a key element in management and  once infection is detected, early antibiotic treatment will postpone the transition to chronic lung infection. Although culture is the gold standard for laboratory diagnosis; isolation and identification from clinical materials require 24-48 hours. We aimed  to compare the efficacy and cost effectivity of molecular methods for detection of P. aeruginosa from respiratory samples of CF patients  to conventional  methods. 
MATERIAL-METHODS: Sputum and deep pharyngeal swab samples (DPS) of CF patients followed by Pediatric Pulmonology Division in July-December 2017 were included in the study. Samples were inoculated into conventional agar plates and incubated 24h at 37 0C aerobically before colonies identified phenotypically. DNA was extracted directly from the samples by using the DNA isolation mini kit (QIAGEN). Molecular detection was done by using  23S rDNA specific primers with Taqman probe for qPCR, and  exoA gene specific primers for in house PCR.
RESULTS: A total number of 67 sputum and 33 DPS samples were included to the study. Median age was 6 (2-14) for DPS and 15(7-33) for sputum samples. qPCR positivity was defined as a Ct value of <28 for sputum and as a Ct value of < 32 for DPS.  Detection limit was 103 cfu/ml for qPCR which displayed 94% sensitivity and 93% specificity for sputum; 44% sensitivity and 100% specificity for DPS. Classical PCR displayed 94% sensitivity and 93% specificity for sputum; 50% sensitivity and 100% specificity for DPS. Isolation and identification take 24-48 hours with conventional method, about 6 hours with classical PCR and 4 hours with qPCR.
CONCLUSION: Early aggressive antibiotic treatment is crucial in order to prevent or to postpone chronic lung colonization, in the case of P. aeruginosa isolation. Although culture is a reliable detection technique, a more rapid and sensitive way to detect P. aeruginosa from CF airway samples is essential. In our study which culture is accepted as a gold standard; PCR results is promising especially for sputum samples. Validation of molecular methods is necessary before implementation in routine laboratories. Clinical implications of discrepant results between culture and PCR detection should be carefully evaluated and combining both approaches considering antibiotic treatment could be reasonable.
KEY WORDS: Pseudomonas aeruginosa, Cystic Fibrosis, exoA, 23SrDNA, real-time polymerase chain reaction