Nöropsikiyatrik ilaç kullanımında yeni nesil dizileme yöntemi ile tanı paneli geliştirilmesi
The development of pharmacogenetics diagnostic panels with next generation sequencing methods in neuropsychatric drug use
Yazar: NİGAR DUYGU TORLAK
Danışman: DOÇ. FAHRİ AKBAŞ
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Antidepresif ajanlar = Antidepressive agents ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Enzimler = Enzymes ; Farmakogenetik = Pharmacogenetics ; Nöropsikiyatri = Neuropsychiatry ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; Sitokrom P 450 = Cytochrome P 450 ; Teşhis = Diagnosis ; İlaç kullanımı = Drug utilization

Özet:
Tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de yüksek sermayeli teknolojik gelişmelerin kullanılması sonucu olarak sağlık harcamaları artmıştır, aynı zamanda gelişen teknoloji ile harcamalarda bazı tasarruflara imkânda sağlamıştır. Bu tasarrufun en etkili yardımcısı farmakogenetik testler olacaktır. Türkiye'de sağlık harcamalarında ilaçların payı %46, İngiltere ve Amerika'da ise bu oran sadece %12'dir.  Farmakogenetik, kişilerin genetik yapılarındaki varyasyonlar nedeni ile ilaçlara verdikleri yanıtlardaki değişiklikleri inceleyen bir bilim dalıdır. 2003 yılında İnsan Genom Projesi'nin tamamlanmasından sonra önem kazanarak dünyada hızla yaygınlaşmaktadır. Bireyin genetik yapısı ile hastalığının tedavisinde kullanılabilecek ilaçların karşılaştırılmasıyla, en etkili ilacın yan etkisi en az olabilecek dozda verilebilmesi sağlanmaktadır. Günümüzde epilepsi, diyabet, kalp hastalıkları, mide hastalıkları, kanser ve depresyon gibi birçok hastalığın tedavisinden önce bireylere farmakogenetik testler yapılabilmektedir.
Farmakogenetiğin geleceğiyle ilgili olarak özellikle üç alan öne çıkacak gibi görünmektedir. Bu alanlar psikiyatri, kardiyoloji ve onkolojidir.
2000 yılında depresyon, ''Yeti Yitimine Ayarlanmış Yaşam Yılı'' olarak değerlendirilen global hastalık yükünün sebepleri arasında dördüncü sırada yer almaktadır. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) raporlarına göre, 2020 yılına gelindiğinde, depresyon, tüm yaş ve cinsiyet grupları için ''Yeti Yitimine Ayarlanmış Yaşam Yılı'' değerlendirmelerinde ikinci sırayı alacaktır.
Çalışmamızın konusu olan psikiyatrik hastaların kullandıkları ilaçlar %35-45'i tedaviye yanıt verirken, %30-50'si tedaviye cevap verememekte veya günlük hayatının akışını bozacak şiddetli yan etkiler oluşturmaktadır. Nöropsikiyatri alanında kullanılan neredeyse tüm ilaçlar karaciğerde üretilen ve polimorfizmi yüksek olan CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP1A2 ve CYP3A4 enzimleri tarafından metabolize edilir. Yaygın olarak kullanılmamakla birlikte bu genlerdeki polimorfizmler DNA analiz yöntemleriyle tespit edilebilmekte ve tedaviye başlamadan önce uygun ilaç ve dozu belirlenebilmektedir. Söz konusu analizler farklı yöntemler kullanılarak yapılmaktadır ve henüz bir standardizasyon sağlanamamıştır. PCR-RFLP, Sanger DNA dizi analizi, Real-time PCR, mikroarray gibi yöntemlerle maliyeti yüksek test hizmetleri sunulmaktadır.
Projenin amacı, literatürdeki bilgilere göre polimorfimleri ve etki mekanizmaları bilinen, rutinde uygulamaları yapılmakta olan bu genlerin tümünü tek bir panel olarak analizini sağlayan moleküler tanı kiti oluşturmaktır. 
Metod olarak hedefteki enzimleri kodlayan genlerde bulunan ve nöropsikiyatriye yönelik farmakogenetik analizlerde en sık kullanılan 52 polimorfik nokta 22 primer ile çoğaltılması planlanmıştır. Noktaların analizine imkân sağlayacak şekilde uygun primerler tasarlanmış ve optimizasyonu yapılmıştır. Optimize edilen primerler kullanılarak PCR yöntemi ile genlerin amplifikasyonu sağlanmıştır. Daha sonra yeni nesil dizileme teknolojisi ile (Illumina platformu) dizi analizleri yapılmıştır. Dizileme işlemi sonrasında verilerin kalite analizi yapıldıktan sonra taşıdıkları polimorfizmler tespit edilmiştir.
Yapılan çalışma bir polimorfizm üzerinden toplum taraması olmayıp, çok sayıda genin tek seferde analizini gerçekleştiren bir polimorfizm analiz paneli/kiti oluşturulmuştur. Metod geliştirmeye yönelik olduğundan rastgele seçilmiş 20 farklı bireye ait genomik DNA kullanılmıştır. Klinik kullanıma yönelik standart, daha ekonomik ve yeni nesil teknolojiye dayanan bir kit geliştirilmiştir.

Abstract:
As in the whole world, health expenditures have increased as a result of the use of high-tech technological developments in our country, and at the same time, we have been able to make some savings in spending with developing technology. Pharmacogenetic tests will be the most effective assistant to this saving. The share of medicines in health expenditures in Turkey 46%, while in Britain and America, this ratio is only 12%. Pharmacogenetics is a scientific discipline that examines changes in the responses people give to drugs and the reasons for variations in genetic constitution. After the completion of the Human Genome Project in 2003 and is spreading rapidly in the world. By comparing the genetic structure of the individual with the drugs that can be used in the treatment of the disease, it is ensured that the side effect of the most effective drug can be given in the least possible dose.  Nowadays pharmacogenetic tests can be performed on individuals before treatment of many diseases such as epilepsy, diabetes, heart diseases, stomach diseases, cancer and depression. 
In the future of pharmacogenetics, three areas appear to be particularly prominent. These areas are psychiatry, cardiology and oncology. 
In 2000, depression was ranked fourth among the causes of the global illness burden, which was assessed as '' Disability-adjusted life year (DALY) ''. According to the World Health Organization (WHO) reports, by the year 2020, depression will take the second place in the " Disability-adjusted life year" evaluations for all age groups and gender groups.
While 35-45% of the drugs used by our psychiatric patients respond to treatment, 30-50% of them produce severe side effects that either do not respond to treatment or interfere with the flow of daily life. Nearly all drugs used in the field of neuropsychiatry are metabolized by the enzymes CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP1A2 and CYP3A4, which are produced in the liver and have high polymorphism Although not widely used, polymorphisms in these genes can be detected by DNA analysis methods and appropriate drugs and doses can be determined before treatment begins. These analyzes are made using different methods and no standardization has been achieved yet. PCR-RFLP, Sanger DNA sequence analysis, Real-time PCR, microarray, etc. The purpose of the project is to create a molecular diagnostic kit that provides analysis of all of these genes, which are known to be routinely applied, based on polymorphisms and mechanisms of action according to the literature. 
As a method, it was planned to replicate 52 polymorphic spots with 22 primers which are most frequently used in pharmacogenetic analysis for neuropsychiatric genes in genes encoding the target enzymes. Suitable primers were designed and optimized to allow analysis of points. Amplification of the genes was achieved by PCR using the optimized primers. Later, sequence analyzes were performed with the next generation of scaling technology (Illumina platform). After the quality analysis of the data, the polymorphisms they carried out were determined after the scaling process.  The study was not a community survey through a polymorphism, but a polymorphism analysis panel / kit was developed to perform analysis of many SNP at once. Genomic DNA of 20 different individuals randomly selected was used for the method development. The  kit designed, more economical and next generation technology for clinical use has been developed.