Mutant ve yabanıl Tip HCT-116 kolon kanser hücre hatlarında farnesil transferaz inhibitörünün apoptotik ve anti-proliferatif etkilerinin araştırılması
Mutant ve yabanil Tip HCT-116 kolon kanser hücre hatlarinda farnesil transferaz i̇nhibitörünün apoptotik ve anti-proliferatif etkilerinin araştirilmasi
Yazar: ZÜBEYİR ELMAZOĞLU
Danışman: PROF. DR. EMİNE SEVDA MENEVŞE
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Genler = Genes ; Genler-RAS = Genes-RAS ; Hücre dizisi = Cell line ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Kolon kanserinin kesin etiyolojisi bilinmemekle birlikte bazı genetik ve çevresel faktörlerin kolon kanserinde önemli rol oynadıkları yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Kolorektal kanserlerde mutasyon ile aktive olmuş K-Ras major olarak Ras/Raf/MEK/ERK ve Ras/PI3K/Akt sinyalizasyon yolakları üzerinden sağkalım ve hücre çoğalmasında görev alan genlerin transkripsiyonunu regüle etmektedir. K-Ras'ın hücre zarına post-translasyonel dönüşümle bağlanmasının ilk basamağı olan prenilasyon aşaması, Ras aracılı sinyalizasyonun hız belirleyici basamağını oluşturmaktadır. LB42708, Ras proteinlerinin post-translasyonel dönüşümünün ilk basamağında görev alan farnesil transferaz ve geranil geranil transferaz enzimlerini inhibe ederek K-Ras proteinlerinin normal ve alternatif prenilasyon mekanizmalarını ortadan kaldırarak MAPK/ERK/p38 ve PI3K/Akt üzerinden hücre çoğalması ve sağkalım sinyallerini bloke etmektedir. Çalışmamızda, LB42708 ajanının belirli doz ve zaman aralığında uygulanması sonucunda p53 +/+ ve p53 -/- HCT-116 insan kolon kanser hücre hatlarında MTT yöntemi, AO/EtBr boyaması ve BrdU ELISA yöntemleriyle hücre canlılığı belirlenmiştir. Apoptotik oran LDH, DNA Fragmentasyon analizi ile doğrulandı. Apoptotik ve proliferatif sinyal iletim yolaklarında görev alan genlerin mRNA ifade düzeylerinin belirlenmesi için kantitatif Real-Time PCR yöntemi kullanıldı. Buna göre LB42708'nin, artan doza bağlı olarak anti-apoptotik genlerin (Bcl-2, Bcl-XL) ekspresyonunu azaltması, pro-apoptotik (Bax, Bak, Bim) genlerin ekspresyonunu artırması ve hücre döngüsünde G1/S geçişinde görev alan Siklin D1 ekspresyonunu azaltması ile hücrelerin apoptoza yönlendiğini ve ayrıca hücre proliferasyonunda görev alan c-Myc mRNA düzeylerini azaltması ile proliferasyonu azalttığı gen düzeyinde belirlenmiştir. Sonuç  elde ettiğimiz bulgular, LB42708 uygulanması in vivo modellerde yapılacak çalışmalar ile kolorektal kanserlere karşı potansiyel antineoplastik ilaç olabileceği düşüncesini güçlendirmektedir.

Abstract:
The main ethiology of colon cancers is unknown, however most studies have shown that some genetic and enviromental factors play important role on formation of colon cancers. In colorectal cancers, mutationally activated K-Ras, regulates genes transcription of cell proliferation and survival signals via  Ras/Raf/MEK/ERK and Ras/PI3K/Akt pathways. The first and rate limiting step of post-translational modification leading K-Ras to anchor the inner surface of the cell membrane is the prenylation step. LB42708 is an farnesyltransferase and geranylgeranyltransferase inhibitor that inhibits normal and alternative prenylation of K- Ras protein, leading to the inhibition of cell survival and proliferation by arresting the MAPK/ERK/p38 and PI3K/Akt pathways. In this study we aimed to investigate the apoptotic and anti-proliferative effects of LB42708, at different doses at a period of time on p53 +/+ and p53 -/- HCT-116 colon cancer cell lines by MTT assay, AO/EtBr staining and BrdU ELISA methods and confirmed our results with LDH and DNA fragmentation analysis. We use RT-PCR analysis to evaluate the mRNA levels of the genes involved in apoptotic and proliferative signaling pathways. According to this, treatment with the increasing dose of LB42708 has shown that the transcription levels of anti-apoptotic genes  (Bcl-2, Bcl-XL) had been decreased, pro-apoptotic genes (Bax, Bak, Bim) had been increased and cell cycle G1/S transition facilitator cyclin D1 had been decreased. Moreover, c-myc mRNA levels, which involves in cell proliferation, had been decreased. Our results along with in vivo models strengthen the idea LB42708 will be a potential antineoplastic drugs against colorectal cancer.