Parkinson hastalığının sigara kullanımı ile ilişkisinin araştırılması
Investigation of the relationship between parkinson's disease and  
cigarette smoking
Yazar: ELÇİN DENİZ ÖZDAMAR
Danışman: PROF. DR. BİNAY EKE
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Genetik = Genetics
Dizin: Parkinson hastalığı = Parkinson disease

Özet:
Parkinson Hastalığı (PH) 65 yas üstü popülasyonun % 2'den fazlasını etkileyen, Alzheimer'dan sonra görülen ikinci en yaygın nörodejeneratif hastalıktır. Substantia Nigradaki (SN) nöron kaybıyla karakterize olup beraberinde dinlenme halinde tremor, rijidite, bradikinezi ve postural bozukluk gibi belirtiler gözlenmektedir. Hastalığın patalojisinin ayırdedici özelliği dopaminerjik nöron kaybı ve Lewy cisimciği olarak bilinen hücre içi protein agregatlarının varlığı olmakla birlikte etiyolojisi henüz tam olarak aydınlatılabilmiş değildir. PH'nın patogenezinde arkaplanda yaşlanmayla birlikte genetik ve çevresel birçok faktörün rol oynadığı düşünülmektedir. Bugüne kadar hayvan ve insanda yapılmış çok sayıda çalışma vardır. Ancak Parkinson Hastalığına (PH) neden olan birincil sebepler hala bilinememektedir.
Birçok gen mutasyonunun ve delesyonunun PH'nın patogenezinde rol oynadığı düşünülmektedir. GST'ler ve CYP450'ler PH ile ilişkisi olabileceği düşünülen çevresel kimyasallların ve ksenobiyotiklerin detoksifikasyonunda ve metabolizmasında rol oynadığından gerek genetik polimorfizmleri gerek enzim aktiviteleri ve gen ekspresyonularıyla ilgili çalışmalar ilgi çekmektedir. İdiyopatik PH tanısı konmuş kişilerde, sigara dumanı ve pestisitler gibi bazı çevresel bileşikleri metabolize ve/veya detoksifiye etme kapasitelerinin düşük olduğu görülmüştür. 
Vaka-kontrol çalışması olarak tasarlanan araştırmada, GST ailesine ait, mü (GSTM1) omega (GSTO1), pi (GSTP1), ve teta (GSTT1) ve CYP450 ailesinden CYP2E1 gen polimorfizmlerine bakılmış, bu genlerin sigara kullanımı ve PH ile ilişkileri değerlendirilmiştir. Tez kapsamında, Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi Nöroloji Kliniğinden sağlanan; yaş, cinsiyet ve etnik köken olarak uyumlu 68 idiyopatik Parkinson hastası ve 105 kontrolle çalışılmıştır. Uygulanan genetik yaklaşımlar Multipleks PZR, PZR ve RFLP analiz yöntemleridir. Tüm bu genetik analizler sonucunda, genotip frekansları kontrol ve PH grupları için sırasıyla, GSTP1 ekzon 6 polimorfizm frekansları, Ala/Ala (wt) %81,9, %58,8; Ala/Val (h) %18,1, %38,2 ve Val/Val (m) %2,9'dur. Kontrol grubunda Val/Val mutant genotipine rastlanmamıştır. GSTP1 ekzon 5 polimorfizm frekansları İle/İle (wt) %42,9, %41,2, İle/Val (h) %47,6, 47,1% ve Val/Val (m) %9,5, %11,8 bulunmuştur. GSTO1 A140D polimorfizm frekansları A/A (wt), %39, %39,7; A/D (h) %46,7, %45,6 ve D140D (m) % 14,3 ve %14,7 olarak hesaplanmıştır. CYP2E1 *5b polimorfizm sonuçları, c1/c1 (wt) %89,5, %94,1; c1/c2 (h) %9,5, %5,9 ve c2/c2 (m) %1'dir. PH grubunda c2/c2 (m) genotipine rastlanmamıştır. Son olarak, CYP2E1*6 polimorfizmine ait genotip freakansları D/D (wt) %81, %86,8, D/C (h) %19, %13,2 bulunmuştur. C/C mutant genotipine her iki grupta da rastlanmamıştır. GSTP1 ekzon6 Val alleline (OO=2,85, %95 GA: 1,53–5,3) ve GSTT1(+) (OO= 4,04, %95 GA: 1,91–8,57) genine sahip bireylerin PH'ya yakalanma risklerinin kontrole göre anlamlı olarak daha fazla olduğu gözlenmiştir. Diğer polimorfizmler için herhangi bir anlamlılık görülmemiştir. PH için, çalışılan GST'lerle, CYP2E1*5B, CYP2E1*6 genleri ve sigara arasında anlamlı bir ilişkiye rastlanmamıştır. Gen-gen etkileşimlerine bakıldığında ise, GSTM1(+) ve GSTT1(+) (OO=2,85, %95 GA: 1,53–5,3) genlerine; GSTP1ek5 (h) veya GSTP1ek6 (h), (OO=2.4, %95 GA: 1,14–5,32); GSTT1(+) and GSTP1ek5 (h/m), (OO=2,5, %95 GA: 1,3–4,7); GSTP1ek6 (h/m) ve GSTO1 (h/m) (OO=5,82, %95 GA: 2,5–13,5); GSTM1 (+) ve GSTT1(+)/GSTP1ek6 (h/m), (OO=9,0 %95 GA: 1,8–44,6); GSTM1 (+) veya GSTT1(+)/GSTP1ek6 (h/m), (OO=9,0 %95 GA: 2,1–38,8); GSTM1(-) ve GSTT1(-)/GSTP1ek6 (h/m), (OO=%8,95 GA: 1,16–55,3) genotiplerine sahip bireylerde PH'ya yakalanma riskinin daha fazla olduğu gözlenmiştir. 
C57BL/6 cinsi Kontrol ve MPTP grubundaki farelerde spesifik aktivitelerin ortanca değerlerine bakıldığında, MPTP uygulanan farelerde CDNB ve ENPP'nin spesifik aktivitelerinin, kontrole göre istatiksel olarak anlamlı bir şekilde artış gösterdiği tespit edilmiştir. Benzer anlamlılık EAA ve DCNB için görülmemiştir. Buna göre, ENPP'nin substrat olarak kullanıldığı GSTT aktivitesinde kontrole göre 1,13 katlık anlamlı bir artış gözlenmiştir. CDNB'nin substrat olarak kullanıldığı total GST aktivitesinde ise 1,6 katlık anlamlı bir artış bulunmaktadır. DCNB'nin substrat olarak kullanıldığı GSTM aktivitesindeki 1,13 katlık azalma ve EAA'nın substrat olarak kullanıldığı GSTP aktivitesindeki 1,22 katlık artış ise istatiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.
MPTP uygulanan farelerde aynı zamanda qPCR yöntemi kullanılarak GSTM1 ve GSTP1 genlerinin ekspresyon düzeylerine bakılmıştır. GSTP1 mRNA ekspresyon düzeyinin referans gen olarak kullanılan 18S'e göre 1,55 katlık anlamlı bir artış gösterdiği gözlenmiştir. GSTM1 mRNA ekspresyon düzeyi için anlamlı bir artış gözlenmemiştir.

Abstract:
Parkinson disease, the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer disease, affecting up to 2% of individuals after the age 65, is characterized by progressive motor decline and loss of dopaminergic neurons from the substantia nigra (SN) leading resting tremor, rigidity, bradykinesia and postural instability. Differential characteristics of PD pathology is the loss of dopaminergic neurons and the presence of intracellular protein aggregates (Lewy bodies). The etiology of the disease is still unknown and it is likely due to a multifactorial interaction of genes and the environmental factors on the background of ageing. 
A number of gene mutations and deletions have been reported to play a role in the pathogenesis of PD. The impact of genetic polymorphisms, enzyme activities and gene expressions in GSTs and CYP450s on PD has recieved particular interest since these enzymes play an important role in the detoxification and metabolism of several environmental chemicals and xenobiotics which may be associated to PD. Patients with idiopathic PD appear to have reduced capacity for detoxification and/or metabolism of certain environmental compounds such as cigarette smoke and pesticides.
Using a case-control study design, we examined polymorphisms of the mu (GSTM1) omega (GSTO1), pi (GSTP1), and theta (GSTT1) classes of GST and CYP2E1 of CYP450 family to elucidate the effects and smoking-GST interactions on PD risk. From Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi Nöroloji Kliniği, we recruited 68 idiopathic PD cases, clinically confirmed by our study neurologist and 105 healthy controls, matched by age, gender, and race. PCR/RFLP techniques are applied during the analysis. Results of frequencies for GSTP1 exon 6 polymorphism are, Ala/Ala (wt) 81.9%, 58.8%; Ala/Val (h) 18.1%, 38.2% and Val/Val (m) 2.9% for control and PD groups, respectively. Val/Val mutant genotype is not found for control group. GSTP1 exon 5 polymorphism frequencies are İle/İle (wt) 42.9%, 41.2%. İle/Val (h) 47.6%, 47.1% and Val/Val (m) 9.5%, 11.8%. GSTO1 A140D polymorphism frequencies are calculated as A/A (wt), 39%, 39.7%; A/D (h) 46.7%, 45.6% and D140D (m) 14.3% and 14.7%. CYP2E1 *5b polymorhism results, c1/c1 (wt) 89.5%, 94.1%; c1/c2 (h) 9.5%, 5.9% and c2/c2 (m) 1%. No result for. c2/c2 (m) PD group. Finally results for CYP2E1*6 polymorphism are calculated as D/D (wt) 81% 86.8%, D/C (h) 19%, 13.2%. C/C mutant genotype is not found. We observed an increased risk in subjects carrying Val allele for GSTP1 exon6 (OR=2.85, 95% CI: 1.53–5.3) and GSTT1(+) (OR= 4.04, 95% CI: 1.91–8.57). No significant effects were observed for the rest of polymorphisms. We didn't determined any significant association between cigarette smoking and GSTs studied, CYP2E1*5B, CYP2E1*6. According to the combined gene effects, we observed increased risk for subjects having GSTM1(+) and GSTT1(+) (OR=2.85, 95% CI: 1.53–5.3); GSTP1ex5 (h) or GSTP1ex6 (h), (OR=2.4, 95% CI: 1.14–5.32); GSTT1(+) and GSTP1ex5 (h/m), (OR=2.5, 95% CI: 1.3–4.7); GSTP1ex6 (h/m) and GSTO1 (h/m) (OR=5.82, 95% CI: 2.5–13.5); GSTM1 (+) and GSTT1(+) with GSTP1ex6 (h/m), (OR=9.0 95% CI: 1.8–44.6); GSTM1 (+) or GSTT1(+) with GSTP1ex6 (h/m), (OR=9.0 95% CI: 2.1–38.8); GSTM1(-) and GSTT1(-) with GSTP1ex6 (h/m), (OR=8,95% CI: 1.16–55.3). 
In addition to the polymorhism studies, GST teta, mü, pi and total GST activities are studied in a MPTP exposed animal model of Parkinsonism. We observed 1.13 fold increase in cytosolic GST teta (GSTT) activity (used ENPP as a substrate) and 1.66 fold increase in cytosolic total GST (GST) activity (used CDNB as a substrate) which are statistically significant. However, 1.22 fold increase in cytosolic GST mü (GSTM) activity (used EAA as a substrate) and 1.13 fold decrease in cytosolic total GST pi (GSTP) activity (used DCNB as a substrate) were not statistically significant.
In the same animal model we also investigated the gene expression levels of GSTM1 and GSTP1 using the method qPCR. Our results indicated an significant 1.55 fold relative increase for GSTP1 mRNA expression level according to the reference gene 18S mRNA expression level which was taken as 1. We did't observed any significant increase for GSTM1 mRNA expression level.