Zeytin (Olea europaea L.) lipaz enziminin rekombinantüretimi ve analizi
Recombinant production and analysis of olive (Olea europaea L.) lipase enzyme
Yazar: SÜMEYYE PINAR ÖZTEKİN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞENAY VURAL KORKUT ; ÖĞR. GÖR. MUNİSE YURTSEVER
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Lipaz = Lipase ; Pichia pastoris = Pichia pastoris ; Rekombinant protein üretimi = Recombinant protein production ; Zeytin = Olive

Özet:
Lipazlar, triaçilgliserollerin, yağ asitleri ve gliserole hidrolize edilmesini
katalizleyen hidrolazlardır. Aynı zamanda esterifikasyon, ara esterifikasyon,
aminoliz, transesterifikasyon, asidoliz ve alkoliz gibi çok çeşitli reaksiyonlarda da
görev alan enzimlerdir. Organik bir ortamda lipazlar esterifikasyon,
transesterifikasyon ve interesterifikasyon reaksiyonlarını, su miktarının az olduğu
ortamlarda ise sentetik reaksiyonları katalize edebilme özelliğine sahiptir.
Lipazların katalize ettikleri reaksiyonların çeşitliliğine bağlı olarak sayısız
endüstriyel ve biyoteknolojik kullanımı mevcuttur. Lipazlar bölge seçicilik ve
enantioselektivite özellikleri sayesinde lipit biyoteknolojisinde çok yönlü
katalizörler olarak kabul edilirler. Çok yönlü enzimler olmaları sebebiyle kozmetik,
gıda, biyodizel üretimi, tarım gibi pek çok endüstriyel üretim alanında tercih
edilirler.
Lipazlar bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan elde edilebilir. En çok
tercih edilen kaynaklar hayvansal ve mikrobiyal kökenli olsa da, düşük maliyet, kolay kabul edilebilirlik ve kısmi saflaştırma ile biyokatalizör olarak doğrudan
uygulamalarda kullanılabilirlik gibi avantajlarıyla bitkisel kaynaklara olan ilgi
artmaktadır.
Pichia pastoris, hem araştırmada hem de endüstride çok sık kullanılan metilotrofik
bir konakçı hücredir. Pichia pastoris hücreleri, kolay, düşük maliyetli bir besi yeri
ortamında hızlı şekilde büyüyebilme, protein üretim şartlarının kolayca kontrol
edilebilmesi ve genetik olarak kolay manipüle edilebilmesi gibi özelliklerinden
ötürü heterolog protein üretiminde oldukça avantajlıdır. Bu projede
laboratuvarımızda daha önceki bir çalışmada tam uzunlukta cDNA'sı elde edilen
zeytin yaprak lipazının kodon optimizasyonu yapılarak Pichia pastoris'te heterolog
ekspresyonu hedeflenmiştir. Bu amaçla lipaz nükleotid dizisi çevrimiçi kodon
optimizasyon aracı ile Pichia kodon kullanımına göre değiştirilip zeytin yaprak
lipazının kendine ait sinyal dizisi de eklenerek ekspresyon vektörüne aktarılmıştır.
Ekspresyon şartları optimize edilerek denenen çalışmalarda, rekombinant zeytin
yaprak lipazının pH 8-9 aralığında ve 35⁰C'de aktivite gösterdiği belirlenmiştir. En
yüksek aktivitenin görüldüğü kültür şartları ise 6 saatlik önkültür basamağı ile 96
saat, 28⁰C'dir.

Abstract:
Lipases are hydrolases that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols to fatty acids
and glycerol. In an organic medium, lipases catalyze esterification,
transesterification, and interesterification reactions. It also can catalyze synthetic
reactions in less aqueous environments. The different reactions they catalyze
include hydrolysis, esterification, intermediate esterification, aminolysis,
transesterification, acidolysis, and alcoholysis. Lipases have numerous industrial
and biotechnological applications based on the variety of reactions they catalyze.
Lipases are considered versatile catalysts in lipid biotechnology due to their
regioselectivity and enantioselectivity. Thanks to these properties, they are used in
many industrial production areas such as cosmetics, food, biodiesel production,
and agriculture. Lipases are mostly derived from plant, animal, and microbial
sources. Generally, the most preferred sources are animal and microbial sources.
There is an increasing interest in plant sources with advantages such as low cost,
easy acceptability, and direct application as biocatalysts by partial purification. Pichia pastoris is a methylotrophic host cell that is widely used in both academia
and industry. Pichia pastoris cells are highly advantageous in the production of
heterologous proteins due to their ability to grow rapidly in an easy, low-cost
medium, to easily control protein production conditions, and to be easily
manipulated genetically. In this study, we aimed to heterologously express the
codon-optimized olive leaf lipase, whose full-length cDNA was obtained in a
previous study in our laboratory, in Pichia pastoris. For this purpose, the lipase
nucleotide sequence was changed according to the Pichia codon usage with the
online codon optimization tool, and the native signal sequence of the olive leaf
lipase was added and transferred to the expression vector. In the expression
optimization studies, it was determined that the recombinant olive leaf lipase was
active in the pH range of 8-9 and at 35⁰C. The highest enzyme activity was
observed in 96-hour-culture following a 6-hour preculture step at 28⁰C.