Normoksik ve hipoksik koşullarda hepatosellüler karsinom hücrelerinde ve eksozomlarında paraoksonaz enzim ailesi ile pı3k/akt sinyal yolağı ilişkisinin incelenmesi
An investigation of the relationship between paraoxonase enzyme family and pi3k/akt signaling pathway in hepatocellular carcinoma cells and their exosomes under normoxic and hypoxic conditions
Yazar: TUĞBA KEVSER UYSAL
Danışman: PROF. DR. ÖZEN ÖZENSOY GÜLER
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Hepatoselüler karsinom (HCC), hipoksik tümör mikroçevresi ve oksidatif stres ile karakterize edilen, kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Enzimatik bir antioksidan olan paraoksonazın (PON) (EC 3.1.1.2), hücreleri oksidatif stresten koruyarak, apoptozun engellenmesi ve kanser hücresinin sağkalımında rol oynadığı düşünülmektedir. ROS detoksifikasyonunda, redoks homeostazında ve PON düzenlenmesinde Fosfatidilinositol-3-kinaz (PI3K)/Akt sinyal yolağı etkilidir. Sinyal iletimine aracılık eden eksozomlar karsinogenez süreciyle de yakından ilişkilidir. Non-invaziv olarak elde edilen eksozom içeriklerinin, erken tarama, erken tanı, terapötik etkilerin izlenmesi ve ilaç direncinin saptanmasında kullanılabilirliği son yıllarda dikkat çekmektedir. Hipoksi ve oksidatif stres koşullarında, eksozom salınımı artmakta ve eksozom içeriği değişmektedir. Çalışmamızın amacı, normoksik ve hipoksik koşullarda hepatosellüler karsinom hücre hattında (HepG2) ve eksozomlarında, PON enzim ailesi ile PI3K/Akt sinyal yolağı proteinlerinin ilişkisini belirlemektir.
Çalışmamızda, MACS sistemiyle HepG2 hücre hattı eksozomları izole edilerek Bradford, SEM ve NTA yöntemleriyle karakterize edilmiştir. HepG2 hücre hattı için uygun hipoksi maruziyet süresinin belirlenmesi adına farklı hipoksik zaman dilimlerinde (2, 4, 6, 12 ve 24 saatler) HIF-1α protein seviyeleri western blot ve ELISA kullanılarak tespit edilmiştir. Hem normoksik hem de uygun süredeki hipoksik koşullarda çoğaltılan HepG2 hücre hattından hücre ve eksozom lizatları elde edilmiştir. Paraoksonaz ve laktonaz enzim aktiviteleri spektrofotometrik olarak tayin edilmiştir. Ayrıca PON enzim ailesi (PON1, PON2, PON3) ve PI3K/Akt sinyal yolağı proteinleri (Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR)  western blot ile analiz edilmiştir.
Çalışmamız sonucunda HepG2 hücre hattı için uygun hipoksi maruziyet süresi 4 saat olarak belirlenmiştir. Söz konusu HepG2 hücre hattından eksozomlar başarılı bir şekilde izole edilmiştir. Normoksik koşullara kıyasla hipoksik koşullarda, PON enzim ailesi (PON1, PON2, PON3) protein düzeylerinde anlamlı bir artış olmasına rağmen, paraoksonaz ve laktonaz enzim aktivitelerinde azalma tespit edilmiştir (p˂0.05). Hipoksik koşullar; Akt, p-Akt, mTOR ve p-mTOR düzeylerinde, HepG2 hücrelerinde artışa sebep olurken, eksozomlarında azalmaya sebep olmuştur.

Bu sonuçlara göre; hipoksik koşullarda PON enzim aktivite azalmasının HCC'nin karsinogenez sürecine katkı sağladığı gösterilmiştir. PON enzimlerinin ekspresyon artışının da onkogen gibi davranarak PI3K/Akt sinyal yolağının aktifleşmesinde rol oynadığı düşünülmektedir. PI3K/Akt ve PON arasındaki bu ilişkide eksozomların da rol oynadığı tespit edilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Eksozom, Hepatosellüler karsinom, Hipoksi, Paraoksonaz, PI3K/Akt sinyal yolağı.

Abstract:
Hepatocellular carcinoma (HCC), characterized by hypoxic tumor microenvironment and oxidative stress, is the one of the leading cause of cancer deaths worldwide. Paraoxonase (PON) (EC 3.1.1.2) is an enzymatic antioxidant and plays a role in protecting cells from oxidative stress. The PON enzyme family is associated with important mechanism such as inhibition of apoptosis and cancer cell survival during carcinogenesis. The phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway is effective in ROS detoxification, redox homeostasis and PON regulation. Exosomes that mediate signal transduction are also closely related to the carcinogenesis process. The use of non-invasively obtained exosome contents for early screening, early diagnosis, monitoring therapeutic effects and detecting drug resistance has attracted attention recently. Under hypoxia and oxidative stress conditions, exosome release increases and exosome content changes. The aim of our study is to determine the relationship between PON enzyme family and the PI3K/Akt signaling pathway proteins in hepatocellular carcinoma cell line (HepG2) and exosomes under normoxic and hypoxic conditions.


To this end, we isolated exosomes using MACS system and characterized exosomes using Bradford, SEM, and NTA analyzes in the HepG2 cell line. HIF-1α protein levels were determined by ELISA assay and western blot under both normoxic and hypoxic (2, 4, 6, 12, and 24 hours) conditions to determine the appropriate hypoxia exposure time for the HepG2 cell line. Cell and exosome lysates were obtained from HepG2 cells cultured under these two conditions. The levels of paraoxonase and lactonase enzymes were measured spectrophotometrically. In addition, the enzyme family PON (PON1, PON2, PON3) and the proteins of the PI3K/Akt pathway (Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR) were analyzed by western blot.

Based on the results, we suggest an appropriate hypoxia exposure time of 4 hours for the HepG2 cell line. In addition, our results show that exosomes were successfully isolated from the HepG2 cell line. Although there was a significant increase in protein levels of the PON enzyme family (PON1, PON2, PON3) under hypoxic conditions compared to normoxic conditions, a decrease in paraoxonase and lactonase enzyme activities was observed (p˂0.05). While hypoxic conditions increased Akt, p-Akt, mTOR and p-mTOR levels in HepG2 cells, it caused a decrease in exosomes.
Our results suggest that decreased PON enzyme activity under hypoxic conditions has been shown to contribute to the carcinogenesis process of HCC. The increased expression levels of PON is thought to be involved in activating the PI3K/Akt signalling pathway by acting as an oncogone. In this study the results of exosomes status was also crucial to play a role in the relationship between PI3K/Akt and PON.

Keywords: Exosome, Hepatocellular carcinoma, Hypoxia, Paraoxonase, PI3K/Akt pathway.