Su bazlı propolisin antikanser aktivitesi
Anticancer activity of water-based propolis
Yazar: MUHSİN ATTİLA GÖKSOY
Danışman: PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Genetik = Genetics
Dizin: Antikanser = Anticancer

Özet:
Kanser dünya çapında en önemli sağlık sorunlarından biridir. Çok yaygın olmasının yanı sıra yüksek morbidite ve mortalitesi nedeniyle yüzyılımızın önemli bir hastalığı olarak kabul edilmektedir. Kanser türleri arasında gastrointestinal sistem kanserleri çok önemli bir yer tutmaktadır. Mide ve kalın bağırsak gastrointestinal sistemin en önemli bileşenleridir ve bu organlarda ortaya çıkan kanserler günümüzde en sık görülen kanser türleri arasındadır. Son yıllarda kemoterapi, radyoterapi ve cerrahideki gelişmeler sayesinde gastrointestinal sistem kanserlerinin tedavisinde önemli başarılar elde edilmiştir. Ancak sağkalım sürelerinde istenen gelişme sağlanamamıştır. Kemoterapi, kanser tedavisinin en önemli bileşeni olup, 5-fluorourasil (5-FU) gibi çeşitli kemoterapötik ilaçlar klinik pratikte kullanılmaktadır. Kemoterapötik ilaçlar birçok kanser türünün tedavisinde etkilidir, ancak kanser hücrelerinin geliştirdiği direnç mekanizmaları ve uzun süreli ilaç kullanımına bağlı toksisite gibi yan etkiler tedavi etkinliğinin azalmasına neden olmaktadır. Bu nedenle kanser tedavisinde yeni ilaç arayışları devam etmekte ve tedavide etkili olabilecek doğal ürünlerle ilgili araştırmalara ilgi artmaktadır.

Etkinliği araştırılan doğal ürünler arasında bal arısı ürünleri önemli bir yere sahiptir. Bal arısının en önemli ürünlerinden biri olarak bilinen propolise özel bir önem verilmektedir ve son yıllarda üzerinde yoğun araştırmalar yapılmaktadır. Propolisin antiinflamatuar, antibakteriyel, antiviral, antimikrobiyal, antioksidan ve hepatoprotektif özelliklerinin yanı sıra çeşitli kanser hücrelerinde antiproliferatif ve antikanser aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur.

Yapılan bu tez çalışmasının amacı, su bazlı propolisin tek başına ve 5-FU ilacı ile kombine halde antikanser aktivitesini AGS insan mide kanseri ve Caco-2 insan kolon kanseri hücrelerinde araştırmaktır.

Çalışmanın ilk aşamasında, su bazlı propolisin ve 5-FU'nun farklı konsantrasyonlarının AGS ve Caco-2 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Her iki madde için de doza- ve zamana-bağlı artan sitotoksik etki bulunmuştur. Elde edilen verilere göre, kombine uygulamalar için uygun dozlar seçilmiş ve bu dozların iki hücre hattında sitotoksisitesi belirlenmiştir. Propolis ve 5-FU ilacının sinerjistik etkisini bulmak için SynergyFinder ve Compusyn yazılımları kullanılmıştır. Her iki hücre hattı için yüksek sinerji değerine sahip 100 µg/mL propolis ve 10 µM 5-FU kombinasyonu seçilmiştir. 

Seçilen propolis ve 5-FU dozları ile bunların kombinasyonlarının hücre migrasyonu üzerindeki etkileri in vitro çizik deneyleriyle test edilmiştir. Kombine uygulamanın tekli uygulamalara göre migrasyonu daha fazla önlediği görülmüştür. Uygulamaların apoptotik etkisini belirlemek için Hoechst-33342/Propidium iyodür (HO/PI) floresan boyaması yapılmıştır. Apoptoz belirteci proteinlerin anlatım düzeyleri Western blot yöntemi ile belirlenmiştir. Propolis, 5-FU ve propolis+5-FU uygulamaları sonrasında floresan mikroskop altında yapılan analizler, her iki hücre hattındaki apoptotik hücre sayısının, kombine tedavi uygulanan deney gruplarında diğer gruplara göre anlamlı derecede yüksek olduğunu ortaya koymuştur.Western blot analizi sonuçları, tüm uygulamalardan sonra hem AGS hem de Caco-2 hücrelerinde apoptotik marker proteinlerin anlatım düzeylerinde önemli değişiklikler olduğunu göstermiştir. Bax/Bcl-2 oranında ve kaspaz-8, kaspaz-3 ve PARP1'in kesilmiş formlarında artış görülmüştür. Hücre döngüsünün tutuklanmasında ve hücre ölümünde önemli rolleri olan p21 ve p53 protein anlatımlarının her iki hücre hattında da kombine uygulamanın yapıldığı grupta arttığı tespit edilmiştir.

Bu sonuçlar, su bazlı propolis ve 5-FU'dan oluşan kombine uygulamanın, AGS mide kanseri ve Caco-2 kolon kanseri hücrelerinde apoptozu indüklediğini ve hücre migrasyonunu önlediğini, her iki aktivitede de tekli tedaviye kıyasla daha etkili olduğunu ortaya koymaktadır.

Elde edilen bulgular, kanser tedavisinde su bazlı propolis içeren yeni ilaç kombinasyonlarının geliştirilmesine katkı sağlayabilir. Ancak, su bazlı propolisin mide ve kolon kanserleri başta olmak üzere çeşitli kanser türlerinin tedavisinde tek başına veya 5-FU gibi kemoterapi ilaçlarıyla birlikte kullanılması için daha kapsamlı in vitro ve in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Cancer is one of the most important health problems worldwide. In addition to being very common, it is considered an important disease of our century due to its high morbidity and mortality. Gastrointestinal system cancers have a very important place among cancer types. The stomach and large intestine are the most important components of the gastrointestinal system, and cancers arising in these organs are among the most common types of cancer today. In recent years, significant success has been achieved in treating gastrointestinal system cancers thanks to the developments in chemotherapy, radiotherapy, and surgery. However, the desired improvement could not be achieved in the survival rates. Chemotherapy is the most crucial component of cancer therapy, and various chemotherapeutic drugs, such as 5-fluorouracil (5-FU), are being used in clinical practice. Chemotherapeutic drugs are effective in treating many types of cancer, but side effects such as resistance mechanisms developed by cancer cells and toxicity caused by long-term drug use cause a decrease in the effectiveness of the treatment. For this reason, the search for new drugs in cancer therapy continues, and there is an increasing interest in research on natural products that can be effective in treatment.

Honey bee products have an important place among natural products whose effectiveness has been investigated. Special attention is given to propolis, which is known as one of the most important products of the honey bee, and intensive research has been carried out on it in recent years. Besides its anti-inflammatory, antibacterial, antiviral, antimicrobial, antioxidant, and hepatoprotective properties, propolis has been found to have antiproliferative and anticancer activity in various cancer cells.

The aim of this thesis study was to investigate the anticancer activity of water-based propolis alone and in combination with 5-FU in AGS human gastric cancer and Caco-2 human colon cancer cells.

In the first phase of the study, the effects of different concentrations of water-based propolis and 5-FU on the viability of AGS and Caco-2 cells were investigated through MTT assay. A dose- and time-dependent increased cytotoxic effect was found for both substances. According to the data obtained, appropriate doses were selected for combined applications, and the cytotoxicity of these doses in two cell lines was determined. SynergyFinder and Compusyn software was used to find the synergistic effect of propolis and 5-FU. A combination of 100 µg/mL propolis and 10 µM 5-FU with a high synergy value was chosen for both cell lines.

The effects of selected propolis and 5-FU doses, both alone and in combination, on cell migration were tested by in vitro scratch assay. It has been observed that the combined treatment prevented migration more than the single treatments. Hoechst-33342/Propidium iodide (HO/PI) fluorescent staining was performed to determine the apoptotic effect of the treatments. Expression levels of apoptotic marker proteins were determined by the Western blotting method. After propolis, 5-FU, and propolis+5-FU treatments, the analyzes under a fluorescent microscope revealed that the number of apoptotic cells in both cell lines was significantly higher in the experimental groups in which the combined treatment was done than in the other groups. Western blot analysis results showed significant changes in the expression levels of apoptotic marker proteins in both AGS and Caco-2 cells after all treatments. Increased Bax/Bcl-2 ratio and cleaved forms of caspase-8, caspase-3, and PARP1 were seen. It was determined that p21 and p53 protein expressions, which have important roles in cell cycle arrest and cell death, increased in both cell lines in the group to which the combined treatment was done. 

These results revealed that the combined treatment consisting of water-based propolis and 5-FU induced apoptosis and prevented cell migration in AGS gastric cancer and Caco-2 colon cancer cells, more effectively in both activities compared to the single treatments.

The findings may contribute to the development of new drug combinations containing water-based propolis in cancer treatment. However, more extensive in vitro and in vivo studies are needed for the use of water-based propolis alone or in combination with chemotherapy drugs such as 5-FU in the treatment of various types of cancer, especially stomach and colon cancers.