Türk inflamatuvar bağırsak hastalarının bağırsak mikrobiyomlarının sağlıklı bireylerle genomik düzeyde karşılaştırılması
Comparison of gut microbiota between Turkish patients with inflammatory bowel disease and healthy individuals at genomic level
Yazar: MUNKHTSETSEG BANZRAGCH YAĞCI
Danışman: PROF. DR. ŞULE ARI ; PROF. DR. ÖZGÜR KURT
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gastroenteroloji = Gastroenterology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
İnflamatuar Bağırsak Hastalığı (İBH), bağırsak mikrobiyotasının disbiyozu ile ilişkili gastrointestinal (GI) sistemin bir grup kronik idiyopatik inflamatuar hastalığıdır. İBH hastalarının bağırsak mikrobiyotasının metabarkod tabanlı profili genellikle hastalardan toplanan ve nadiren mukozayla ilişkili mikrobiyotayı temsil eden dışkı örneklerine dayanır. İBH'nın mukozal bileşeninin rutin olarak izlenmesi için ideal örnekleme stratejisi henüz belirlenmemiştir.
Bu tez çalışmasında, kolonoskopi sırasında toplanan kolonik yıkama sıvısının (KYS) mikrobiyota içeriğini İBH hastalarından alınan dışkı örnekleriyle karşılaştırarak KYS materyalinin İBH ve bağırsak mukozal mikrobiyotası arasındaki ilişkiyi ne ölçüde yansıttığının ortaya konması amaçlanmıştır. Bu kapsamda, farklı beslenme alışkanlığına sahip Crohn hastalığı ve ülseratif koliti olan İBH hastaları ile sağlıklı kontrollerden KYS ve dışkı örnekleri toplanmış ve örneklerden genomik DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Çalışma gruplarındaki Dientamoeba fragilis ve Blastocytis varlığı Polimeraz Zincir Reaksiyonuyla (PZR) saptanarak bu protozoonların İBH ilişkisi araştırılmıştır. Hasta ve kontrol gruplarının dışkı ve KYS örneklerinin genomik materyalleri Illumina HiSeq sisteminde 16S rRNA amplikon dizileme-temelli metabarkodlama işlemine tabi tutularak elde edilen dizileme verileri QIIME2, DADA2, SILVA, veritabanları ile analiz edildikten sonra DESeq2 ve ANCOM-BC2 testleriyle anlamlılık gösteren amplikon dizi varyantları saptanmış ve  örneklerin kolonik bakteriyel mikrobiyota içeriği belirlenmiştir. Bu yaklaşımlarla İBH hastalarında kontrole göre anlamlı derecede artmış ve azalmış taksonomik gruplar filum, cins ve tür düzeyinde belirlenmiştir.
Hasta ve kontrol gruplarında PZR yöntemiyle incelenen Dientamoeba fragilis ve Blastocytis varlığı her iki grupta da oldukça düşük düzeyde bulunmuştur. Ancak, dizileme sonuçları kontrol grubu ile İBH dışkı örneklerinin mikrobiyota içeriği arasında anlamlı farklar göstermiştir. Bunun dışında, KYS ve dışkı örnekleri arasında da İBH etiyolojisi ile özellikle de mukozal mikrobiyota ile ilişkilendirilebilecek Lachnospiraceae familyası altındaki kısa zincirli yağ asidi üreten bakteriler, aktinobakteriyel cins Bifidobacterium, proteobakteriyel Sutterella ve Raoultella türleri belirgin farklar göstermiştir. Bu anlamda, KYS örneklerinin dışkı örneklerinde bulunmayan birçok bakteri türünü içerdiği saptanmıştır. Beslenme alışkanlığı açısından değerlendirildiğinde, kontrol ve İBH mikrobiyota içeriği arasında anlamlı bir fark saptanmamıştır. Bu bulgunun, hasta ve kontrol gruplarındaki bireylerin aşırı kilolu ve obez olmalarından kaynaklandığı düşünülmüştür.
Sonuç olarak, KYS mikrobiyotasının, İBH hastalarını sağlıklı kontrollerden ayırt etme kapasitesine sahip olduğu ve bu nedenle, İBH biyobelirteç araştırmalarında erken tanı ve hastalık prognozunun takibi için alternatif bir analiz stratejisi oluşturabileceği değerlendirilmiştir.

Abstract:
Inflammatory Bowel Disease (IBD) is a group of chronic idiopathic inflammatory diseases of the gastrointestinal (GI) tract associated with the dysbiosis of gut microbiota. Metabarcoding- based profiling of the gut microbiota of IBD patients is generally based on the stool samples collected from individual patients which rarely represent the mucosa-associated microbiota. The ideal sampling strategy for a routine monitoring of the mucosal component of IBD has yet to be determined.
The aim of this thesis study is to evaluate the extent to which the colonic cleansing fluid (CCF) material collected during colonoscopy reflects the relationship between IBD and the gut mucosal microbiome by comparing the microbiota composition of the CCF with stool samples from IBD patients. To this end, CCF and stool samples were collected from IBD patients with Chron's disease, ulcerative colitis and healthy control subjects with different dietary habits, and isolation of genomic DNA was accomplished in these collected materials. The presence of Dientamoeba fragilis and Blastocytis species was detected in the study groups in order to explore the association of these protozoans with IBD. Next, the genomic DNA of CCF and stool samples from both patients and control groups were subjected to 16S rRNA amplicon-sequencing based metabarcoding and the acquired data analyzed by using QIIME2, DADA2, SILVA databases were tested by DESeq2 and ANCOM-BC2 to detect significant amplicon sequence variants. By using these approaches, significantly increased and decreased taxonomic groups were determined at phylum, genus and species levels.
Dientamoeba fragilis and Blastocytis were found only in a few samples in both patients and control groups as shown by polymerase chain reaction. However, sequencing results pointed to significant difference between the microbiome contents of IBD and control stool samples. Moreover, short-chain fatty acid-producing bacteria under the Lachnospiraceae family, actinobacterial genus Bifidobacterium, proteobacterial Sutterella and Raoultella species, which can be associated with IBD etiology and especially mucosal microbiota, showed significant differences between CCF and stool samples. In this sense, it was determined that the CCF samples contained many bacterial species that were not found in the stool samples. When evaluated in terms of nutritional habits, no significant difference was found between control and IBD microbiota content. This finding was thought to be due to the fact that individuals in the patient and control groups were overweight and obese.
In conclusion, it was evaluated that the CCF microbiota has the capacity to distinguish IBD patients from healthy controls, and therefore, it may constitute an alternative analysis strategy for early diagnosis and follow-up of disease prognosis in IBD biomarker studies.