P2X reseptörlerinin aktive ettiği membran geçirgenliğinde 
seçiciliğinin, tür farklarının ve gedik-kavşak proteinlerinin rolünün incelenmesi
Investigetion of the role of selectivity, species difference and gap-junction proteins i̇n P2X-activated membrane permeability
Yazar: ŞERİFE CANKURTARAN SAYAR
Danışman: PROF. DR. MEHMET UĞUR
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Membran filtrasyon tekniği = Membrane filtration technique ; Membranlar = Membranes ; Mikroskopi-flüoresans = Microscopy-fluorescence ; Proteinler = Proteins ; Reseptörler = Receptors

Özet:
P2X7, küçük katyonlara geçirgen bir iyon kanalı olan P2X reseptör ailesinin 7 üyesinden biridir. P2X7 reseptörlerinin aktivasyonu hücre membranının 800 Da' a kadar olan büyük moleküllere geçirgen hale gelmesine yol açmaktadır ve bu bakımdan diğer P2X reseptörlerinden farklılık göstermektedir. P2X7 reseptörlerinin bu özelliği çok sayıda araştırmaya konu olmuştur. Membran geçirgenliğindeki bu artışın seçici olduğu ve hücre tipine göre bu seçiciliğin değiştiği gösterilmiştir. Bu geçirgenliğin panneksin-1 adlı gedik-kavşak proteini aracılığıyla oluştuğu iddia edilmektedir. Panneksin-1 bir membran proteinidir ve 1 kDa'a kadar olan molekülleri geçirebilmektedir. Hücre içi [Ca2+] artışı, membran depolarizasyonu ve mekanik stres gibi durumlarda aktive olabilmektedir.
Bu tezde, RAW 264.7 hücreleri ile bu hücrelerden klonlanan P2X7 reseptörünü ifade eden HEK-mP2X7 hücreleri kullanılmıştır. RAW 264.7 hücrelerinde endojen olarak ATP uyarısıyla aktive olan geçirgenlik yanıtının P2X7 aracılı olup olmadığını ve geçirgenlikteki artış için reseptörün yeterli olup olmadığını test etmek için bu yöntem düşünülmüştür. Öncelikle bu iki hücre arasında geçirgenlik farkı görülmüştür. ATP uyarısıyla RAW 264.7 hücreleri hem pozitif yüklü YO-PRO-1' i hem negatif yüklü Lucifer Yellow' u geçirmektedir. HEK-mP2X7 hücreleri ise sadece pozitif yüklü YO-PRO-1'i geçirmektedir. İkinci olarak, hücreler arasında agonist etkinlikleri farklı bulunmuştur. Dolayısıyla, Lucifer Yellow girişi için P2X7 reseptörünün kendisi yetmemekte yardımcı bir proteine ihtiyaç duymaktadır.
Diğer yandan, panneksin-1 ve anyon taşıyıcı inhibitörleri YO-PRO-1 girişini etkilemediği dozlarda, Lucifer Yellow girişini açıkça arttırmaktadır. Tek başına reseptör ekspresyonunun Lucifer Yellow geçirgenliği için yetersizliği ve geçirgenlik yolaklarının inhibitörlerden farklı şekilde etkilenmeleri, Lucifer Yellow ve YO-PRO-1 girişinin farklı geçirgenlik yolakları ile  olduğunu göstermektedir.

Abstract:
P2X7 is one of the seven members of P2X receptor family which is permeable to small cations. It activates a permeablity to large molecules up to 800 Da and in this respect differs from other P2X receptors.  This property of P2X7 receptors has been a subject of many investigations. It is showed that this increase in permeability is selective and  the selectivity depends on the cell type.  It  is claimed that this permeability occurs  via a gap-junction protein called pannexin-1. Pannexin-1 is a membrane protein and permeable to large molecules up to 1 kDa. It is activated by increase in intracellular [Ca2+]i, membrane depolarization, and mechanical stress.
In this thesis, RAW 264.7 cells and HEK-mP2X7 cells expressing P2X7 receptor cloned from RAW 264.7 cells were used. This method were thought to test whether  the permeability response endogenously activated by ATP in RAW 264.7 cells occurs via P2X7 or not and to test whether P2X7 receptor is sufficient  to large permeability or not. Firstly, a permeability difference has been seen between these cells. RAW 264.7 cells uptake both positively charged YO-PRO-1 and negatively charged  Lucifer Yellow. HEK-mP2X7 cells uptake only positively charged YO-PRO-1. Secondly,  agonist  potency differences  between cells have been found. Therefore,  P2X7 receptor per se is not sufficient to uptake Lucifer Yellow and it needs an accessory protein.
On the other hand,  inhibitors of pannexin-1 and anion transporters clearly enhanced Lucifer Yellow uptake at concentrations that they did not  effect  YO-PRO-1 uptake.  Insufficiency of receptor expression to  activate  Lucifer Yellow permeability and  differential effects of inhibitors on permeability pathways showed that Lucifer Yellow and YO-PRO-1 uptake were different permeability pathways.