Karadeniz alabalığında (Salmo trutta Labrax) bazı kromozom manipülasyon çalışmaları
Some chromosomal manipulation studies on Black Sea trout (Salmo trutta Labrax)
Yazar: RAHMİ CAN ÖZDEMİR
Danışman: DOÇ. DR. AYGÜL EKİCİ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı / Su Ürünleri Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Bu tez çalışması, Avrupa'da ilk kültüre alınan kahverengi alabalığın (Salmo trutta) alt türü olan ve ülkemiz iç sularında doğal olarak bulunan Karadeniz alabalığının (Salmo trutta labrax) ginogenetik üretiminin gerçekleştirilmesi amacıyla yapılmıştır. Çalışmada; Rize-Çamlıhemşin Ardesom alabalık üretim çiftliğinden temin edilerek Kastamonu ili Ilgaz Gürsu alabalık tesisine getirilen ortalama boyu 55,7±7,9 cm, ağırlığı 1320±220 g olan 17 adet dişi ve boyu 59,2±8,4 cm, ağırlığı 1418±310 g olan 24 adet erkek Karadeniz alabalığı kullanılmıştır.
Çalışma süresince uygun sperm sulandırma ortamının oluşturulması ve sulandırma oranının tespiti, spermatozoaya uygulanan UV ışık şiddetinin, dölleme ve sıcak şok uygulamasının optimizasyonu üzerine çalışmalar yapılmıştır. Ginogenez ve triploid uygulamalarının başarısını tespit etmek amacıyla deneme gruplarının larval yaşam oranları tespit edilmiş, karyotip analizi, eritrosit çap ölçümü ve akım sitometrisi ile DNA miktar tayini yapılmış ve ginogenez uygulamasının başarısı salmonid erkeklik geni (sdY) için moleküler tarama yapılarak gerçekleştirilmiştir.
Çalışmada, sperm sulandırıcısı olarak hazırlanan 5 farklı solüsyonun sperm motilitesi üzerine etkileri tespit edilmiştir. Karadeniz alabalığı spermasının osmotik basınç değerinin 210-360 mOsm.kg-1 ve pH'nın 7-8,5 arasında olduğu tespit edilmiştir. Sperm sulandırma solüsyonları, spermanın osmotik basınç ve pH değerlerine yakın değerlerde hazırlanmıştır. En iyi sperm motilite değeri olan %70-90 oranı HBSS solüsyonunun 1:20 (sperm : HBSS) oranında
Karadeniz Alabalığında (Salmo trutta labrax) Bazı Kromozom Manipülasyon Çalışmaları
xv
sulandırılması ile elde edilmiştir. Döllemede kullanılan sperm+HBSS karışımı spermatozoa genetik materyalini inaktif hale getirmek amacıyla UV ışığına maruz bırakılmıştır. Spermi öldürmeden genetik materyali inaktif hale getirecek optimal ışıma dozu farklı enerji seviyeleri (2500-5000 kJ/cm2) kullanılarak test edilmiştir. Bu testler, 4500 kJ/cm2 gibi yüksek bir dozun spermi tamamen öldürdüğünü (%0 motilite), 3600 kJ/cm2 gibi bir dozun yaşam oranlarını en az düşürerek (>%60 motilite) sperm DNA'sını etkisiz hale getirdiğini göstermiştir.
Ginogenetik üretim denemeleri üç tekrarlı olarak dört grup; haploid, diploid normal (kontrol), diploid ginogen ve triploid, üzerinde gerçekleştirilmiştir. Her bir deneme grubunda 32,5±2,5 g (375±50 adet) yumurta kullanılmıştır. Dölleme sonrası sıcak şok uygulaması 5 farklı sıcaklık derecesinde 15 ve 20 dk süreyle gerçekleştirilmiştir. En iyi gözlenme oranı (%89,59±2,18), yumurtadan çıkış (%82,86±3,11) ve larval yaşam (%79,61±1,25) oranları 28,5°C'lik sıcaklık şokuna maruz kalan döllenmiş yumurtalarda görülmüştür. Deneme grupları arasında yapılan istatistiksel analizler ile şoklama sıcaklığı arttıkça gözlenme, yumurtadan çıkış ve larval yaşam oranlarının düştüğü ortaya konulmuştur (P<0,05). Embriyolojik gelişim ve yumurtadan çıkış süreleri karşılaştırıldığında, kontrol (440 gün-derece), ginogen diploid (460 gün-derece) ve triploid (448 gün-derece) gruplar arasında istatistiksel bir farkın olmadığı (P>0,05), haploid gruba ait embriyoların tamamının 3-7. günler sonunda öldüğü tespit edilmiştir.
Karyotip analizi sonuçları incelendiğinde, kontrol ve ginogen diploid grup kromozom sayılarının 2n=80 olduğu, triploid grupta kromozom sayısının ise 80'in üzerinde olduğu tespit edilmiştir.
Eritrosit çap ölçümü sonuçları incelendiğinde, triploid grup (T) ile diploid ginogen grup (G) eritrosit çapları oranının T/G=1,8 olduğu, kontrol grup (D) ile ginogen diploid grup eritrosit çapları oranının ise D/G=0,98 olduğu tespit edilmiştir. T/D oranının >1,5 ve G/D oranının ≈1 olması uygulamaların başarısını ortaya koymuştur. Akım sitometrisi sonuçları incelendiğinde, ploidi seviyesini belirleyen G0+G1 değerinin gruplar arasındaki oranlarının T/D = 1,978 ve G/D = 1,016 olduğu belirlenmiştir. Bu oranlar; T/D>1,5 ve G/D≈1, yine uygulamaların başarısını ortaya koymuştur.
Salmonid erkeklik geni sdY'nin varlığı ya da yokluğuna dayalı moleküler tanı yöntemi kullanılarak bireylerin cinsiyeti belirlenmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak gerçekleştirilen bu işlem sonucunda, ginogen olduğu varsayılan grupların tamamında sdY geninin bulunmadığı tespit edilmiş ve ginogen üretimin başarısı doğrulanmıştır.
Embriyolojik gelişim aşamaları, karyotip analizi, akım sitometri ve sdY gen tespiti sonuçları değerlendirildiğinde, ginogenetik Karadeniz alabalığı (Salmo trutta labrax) üretiminin başarı ile gerçekleştirildiği ortaya konulmuştur. Moleküler tanımlamada kullanılan sdY geninin tespiti amacıyla Salmo trutta labrax türüne özgü yeni primer setleri belirlenmiştir. Yüksek yaşama oranına (>%80) sahip ginogenetik üretimi için bu çalışmada geliştirilen yöntem, akuakültür sektörü tarafından triploid alabalık üretiminde de kullanabilir. Bu tez çalışması sayesinde geliştirilen ginogenetik Karadeniz alabalığı üretim tekniği, su ürünleri yetiştiriciliğinde önemli yere sahip tek cinsiyetli kültür ve genetik performans artırma çalışmaları açısından da fayda sağlayacaktır.

Abstract:
The study in this dissertation was carried out in order to produce gynogenetic black sea trout (Salmo trutta labrax) that is naturally found in Turkey's inland waters which is a subspecies of brown trout (Salmo trutta) cultured first species in Europe. Seventeen female fish with an average length of 55,7 ± 7,9 cm and an average weight of 1320 ± 220 g, 23 male fish with an average length of 59,2 ± 8,4 cm and an average weight of 1418 ± 310 g used in this study were obtained from Ardesom trout farm located in Rize-Çamlıhemşin and brought to Ilgaz Gürsu trout farm in Kastamonu Province.
The different stages of study were included determination of appropriate sperm dilution media and dilution rate, works done on optimization of UV irradiation dose for spermatozoa, fertilization and heat shock applications. Evaluation of larval survival rates of the experimental groups, karyotypes, erythrocyte diameters, DNA quantity by flow cytometry both gynogenetic and triploid induction success by molecular screening for salmonid male-determining gene (sdY).
In the study, the effects 5 different sperm diluent solutions on sperm motility were determined. The osmotic pressure and pH values of black sea trout semen were determined to be in between 210-360 mOsm.kg-1 and 7-8.5, respectively. All diluent solutions were prepared at close values to natural osmotic pressure and pH of fish semen. The best sperm motility ratio of 70-90% was
Some Chromosomal Manipulation Studies on Black Sea Trout (Salmo trutta labrax)
xvii
obtained with HBSS solution at a dilution ratio of 1:20. Sperm+HBSS mixture used for fertilization were exposed to UV irridation in order to inactive sperm genetic material. Optimal UV irradiation dose to inactivate the genetic material without killing sperm was evaluated at different energy levels (2500-5000 kJ/cm2). These trials revealed that a UV dose as high as 4500 kJ/cm2 killed all sperm (0% motility), a UV dose of 3600 kJ/cm2 had the least effect on sperm survival rates (>60% motility) and successfully inactivated the sperm genetic material.
Gynogenetic production experiment was carried out in triplicates on 4 groups; haploid, diploid normal (control), diploid gynogen and triploid. In each experimental group, 32.5 ± 2.5 g (375 ± 50) eggs were used. Heat shock treatments after fertilization was performed at 5 different temperature levels for 15 and 20 minutes. The group with the best eyeing ratio (89,59±2,18%), hatching ratio (82,86±3,11%) and larval survival rate (79,61±1,25%) was obtained at 28,5°C heat shock treatment. Statistical analysis revealed that there is a inverse relationship in between shock temperature and eyeing ratio, hatching ratio and larval survival rates (P<0.05). When embryonic development and hatching times were compared, there was no statistical differences among control (440 degree-days), gynogen diploid (460 degree-days) and triploid (448 degree-days) groups (P> 0,05) and complete mortality occurred at the end of 3.-7. day in embryos belonging to the haploid group.
When karyotype analysis results were examined, it was determined that chromosome numbers of control and gynogen diploid groups were 2n = 80 and triploid group had more than 80 chromosomes. Examination the results from erythrocyte diameters demonstrated that the ratio of erythrocyte diameters in between the triploid group (T) and the gynogen group (G) was T/G=1.8, and the ratio of erythrocyte diameters in between the control group (D) and the gynogen diploid group was D/G = 0.98. The ratio of >1.5 for T/D and ≈1 for G/D confirmed the success of applications. When the flow cytometry results were examined, it was determined that the ratio of G0 + G1, which determines ploidy level in between the groups, was T/D = 1,978 and G/D = 1,016. Again these ratios; T/D>1.5 and G/D ≈1, showed the success of applications.
Molecular analysis based on the presence or absence of salmonid male determining gene sdY were run to determine the gender of individuals. The results of this process, which was performed using polymerase chain reaction (PCR), demonstrated that no indivual from presumptive ginogenetic groups carried sDY gene and confirmed the success of gynogen production.
The results from embryonic development, karyotype analysis, flow cytometry and molecular detection of sdY gene altogether showed that gynogenetic black sea trout (Salmo trutta labrax) was successfully produced in this study. During the study, new primer sets were evaluated for the detection of sdY gene. The high surviving (> 80%) gynogenetic production procedure developed during this study can also be used by triploid production in aquaculture sector. Additionally, gynogenetic Black sea trout (F1) production technology developed through this study can be benefited by the other important technologies commonly employed in aquaculture such as monosex culture or genetic performance improvement.