Helıcobacter pylorı biyofilm oluşumunun karakterizasyonunda virulans ve antimikrobiyal direnç ile ilişkisinin araştırılması
Heli̇cobacter pylori determination of biofilm formation and its relationship with the characterization in virulance and antimicrobial resistance
Yazar: SİBEL GÜLSEROĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ YAVUZ DOĞAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Helicobacter pylori (H. pylori), gastrik inflamasyon, peptik ülser ve gastrik kanser etiyolojisinde önemli rol oynayan gram-negatif bir bakteridir. Bu patojenin kronik enfeksiyonlar oluşturmasında, biyofilm oluşturma yeteneği kritik bir rol oynar. 
Çalışmada H. pylori ATCC 26695 ve izole edilmiş 3 klinik H. pylori suşunun biyofilm oluşumlarının değerlendirilmesi,  biyofilm ile ilişkili genlerin varlığının araştırılması,  klaritromisin ve kekik yağının suşlarda antibiyofilm aktivitelerinin karşılaştırması amaçlandı.
 Çalışmaya Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi'ne gelen hastaların antrum ve korpus gastrik biyopsilerinden elde edilen 3 klinik izolat retrospektif olarak elde edildi. H. pylori ATCC 26695 standart suşu pozitif kontrol olarak kullanıldı. 
Suşların klaritromisin, tetrasiklin, metranidazol, linezolid minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri E-test yöntemi ile belirlendi.  Suşlarda biyofilm oluşumu kristal viyole yöntemiyle değerlendirildi. Biyofilmle ilişkili luxS, rpoD, homD, hypothetical protein K747_10375,  K747_09130,  K747_06625, flagellar protein,  alpha-(1,3)-fucosyltransferase, ,  cag pathogenicity island protein hedef genlerini belirlemede PCR yöntemi kullanıldı.
 Biyofilm oluşturan suşların  (n=4) morfolojik yapısı,  klaritromisin ve kekik yağına karşı antibiyofilm aktivitesi "scanning electron microscopy" (SEM) ile görüntülenerek değerlendirildi.
Suşların 3'ünde (%75) güçlü biyofilm oluşumu ve 1'inde (%25) zayıf biyofilm oluşumu saptandı (OD595).  H. pylori ATCC 26695 standart suşunun klinik suşlara göre daha güçlü biyofilm oluşturduğu görüldü.
Suşların 4'ünde   (%100)  lüxS,  (%100) rpoD, (%100) homD saptandı. Araştırılan dokuz gen bölgesinden 6' sına rastlanmadı.  
Tüm suşlar klaritromisine 0,78 µg/mL konsantrasyonda ve Thymus capitatus esansiyel yağına 0,75 µg/mL konsantrasyonda maruz bırakılarak biyofilm formasyonları SEM ile analiz edildi. Klaritromisine karşı maruziyet sonrası biyofilm biokütlesinde bozulma biyofilm biokütlesinde bozulma üç suşda görülürken 2. Klinik suşda bir değişiklik görülmemiştir. Thymus capitatus esansiyel yağı maruziyetinde ise tüm suşlarda biyofilm formasyonlarında bozulma gözlenmiştir.


Bu çalışmada, H. pylori suşlarının biyofilm oluşumunda ilişkili genlerin varlığı saptanmış, klaritromisin ve kekik yağının benzer antibiyofilm etkisi görülmüş, biyofilm hedefli tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesinin, H. pylori enfeksiyonlarının eradikasyonundaki başarının artırılması için kritik olduğunu buna ilişkin ileri çalışmalara ihtiyaç olduğu değerlendirilmiştir.

Abstract:
Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram-negative bacterium that plays an important role in the etiology of gastric inflammation, peptic ulcers, and gastric cancer. Biofilm formation plays a critical role in the formation of chronic infections. The aim of the study was to evaluate the biofilm formation of H. pylori ATCC 26695 and 3 isolated clinical H. pylori strains, to investigate the presence of biofilm-related genes, and to compare the antibiofilm activities of clarithromycin and thyme oil in the strains. Three clinical isolates retrospectively obtained from antrum and corpus gastric biopsies of patients admitted to Dokuz Eylül University Hospital. H. pylori ATCC 26695 standard strain was used as a positive control.

Clarithromycin, tetracycline, metronidazole, linezolid minimum inhibitory concentration (MIC) values of the strains were determined by the E-test. Biofilm formation in the strains was evaluated by the crystal violet method. Biofilm-associated genes luxS, rpoD, homD, hypothetical protein K747_10375, K747_09130, K747_06625, flagellar protein, alpha-(1,3)-fucosyltransferase, cag pathogenicity island protein target genes identified by PCR. 
The morphological structure of the biofilm-forming strains (n=4) and their antibiofilm activity against clarithromycin and oregano oil were evaluated by imaging with "scanning electron microscopy" (SEM). It was observed that the standard strain H. pylori ATCC 26695 formed a stronger biofilm than the clinical strains. In 4 of the strains luxS, rpoD and homD gene regions were detected but 6 out of the 9 gene regions investigated were not found. All strains were examined by SEM after exposed to clarithromycin at a concentration of 0.78 µg/mL and Thymus capitatus essential oil at a concentration of 0.75µg/mL. In case clarithromycin exposure deterioration in the biofilm biomass was observed unless there was no change was observed at 2nd clinical strain. After exposure of Thymus capitatus essential oil deterioration in the biofilm biomass was observed in all strains.
In this study, the presence of genes related to biofilm formation of H. pylori strains was determined, similar antibiofilm effects of clarithromycin and thyme oil were observed, and it was evaluated that the development of biofilm-targeted treatment approaches is critical for increasing the success in eradication of H. pylori infections and that further studies are needed on this subject.