MİR-99A-3P ve MİR-877'nin yara iyileşmesi üzerine etkilerinin in vitro değerlendirilmesi
In vitro evaluation of the effects of MİR-99A-3P and MİR-877 on wound healing
Yazar: HÜLYA ARKAN
Danışman: PROF. DR. İLHAN ONARAN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Mikro RNA = Micro RNA ; RNA = RNA ; Transfeksiyon = Transfection ; Yara iyileşmesi = Wound healing ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries ; İn vitro = In vitro

Özet:
Yara iyileşmesi dahil birçok biyolojik süreçte etkili olduğu belirtilen çeşitli miRNA'lar tanımlanmış olsa da bu miRNA'lara dair çalışmalar klinikte kullanımları için henüz yeterli değildir. Bu tez çalışmasında, daha önceki mikrodizin ve biyoinformatik çalışmalarımız sonucunda yara iyileşmesinde etkili olabileceğini gösterdiğimiz miR-99a-3p ve mir-877'nin, hedef genlerin ifade düzeylerine, hücre fizyolojisine ve hücrenin salgısal moleküllerine etkileri araştırıldı. Bu bağlamda 3T3 fibroblast hücreleri miR-99a-3p, miR-877-5p, miR-877-3p veya bunların kombine formunun mimik veya inhibitörleri ile transfekte edildi. Bu miRNA'ların potansiyel hedef genleri olan Mapk1, Mmp9, Tagln ve Tnf gen ifade düzeylerine qPZR analizi ile bakıldı. Ayrıca, bu miRNA'ların hücre fizyolojisine etkilerini gözlemlemek için hücre canlılığı ve in vitro yara iyileşmesi testleri yapıldı. FTIR spektroskopisi ile de fibroblastlar tarafından kültür besiyerlerine salınmış olan moleküller değerlendirildi. qPZR analizi sonucunda miR-877-5p mimiği Mapk1; kombine miRNA mimiği ve miR-99a-3p inhibitörü Tagln; miR-877-5p inhibitörü Tnf; kombine miRNA inhibitörü ise Mmp9, Tagln ve Tnf ifade seviyelerinde 1,5 ile 12,38 kat arasında anlamlı değişikliklere neden oldu (p<0,05). Gruplar arasında yara iyileşme hızı karşılaştırıldığında sadece kombine inhibitör grubunda anlamlı artış olduğu görüldü (p=0,0286). Bu bulgular temel alınarak miRNA inhibitörleri uygulanmış gruplarda FTIR analizinin uygulanmasına karar verildi. Kontrole kıyasla 2956 cm-1 bandı haricinde lipid, protein ve nükleik asit bant bölgelerinde anlamlı farklılıklar bulundu (p<0,05). Bantlar, alan ve oranlarına göre analiz edildiğinde, en fazla anlamlı değişim miRNA inhibitörleri kombine uygulandığında görüldü. Artan lipid, protein, fosfolipid, kolesterol, nükleik asit ve kollajen miktarları hücre dışına salınan ekzozomlar ve kollajen gibi yapı ve moleküllerin artışı olarak değerlendirildi. Hücreler miRNA'ların kombine inhibitörleri ile transfekte edildikten sonra Mmp9, Tagln ve Tnf ifadesinin azalmasıyla beraber, kollajen miktarının ve ekzozomların arttığı ve hücre göçünün azaldığı bulundu. Bu bulgular miRNA'ların tek tek değerlendirilmesinin yanı sıra, kombine etkilerinin değerlendirilmesinin de önemli olduğunu göstermiştir. Elde edilen bu sonuçların yara iyileşmesinin hızlandırılması için yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesine ipuçları verebileceğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Although various miRNAs have been identified, which are stated to be effective in many biological processes, including wound healing, studies on these miRNAs are not yet sufficient for their clinical use. In this thesis, the effects of miR-99a-3p and mir-877, which we have shown to be effective in wound healing as a result of our previous microarray and bioinformatics studies, on the expression levels of target genes, cell physiology and secretory molecules of the cell were investigated. In this context, 3T3 fibroblast cells were transfected with miR-99a-3p, miR-877-5p, miR-877-3p or their combined form mimics or inhibitors. The gene expression levels of Mapk1, Mmp9, Tagln and Tnf, which are the potential target genes of these miRNAs, were examined by qPCR analysis. In addition, cell viability and in vitro wound healing tests were performed to observe the effects of these miRNAs on cell physiology. The molecules released into culture media by fibroblasts were evaluated with FTIR spectroscopy. As a result of the PCR analysis, miR-877-5p mimic, combined miRNA mimic and miR-99a-3p inhibitor, miR-877-5p inhibitor, and combined miRNA inhibitör caused to the 1.5 to 12.38 fold significant changes in the expression levels of Mapk1, Tagln, Tnf, and Mmp9, Tagln and Tnf, respectively (p<0.05). When the wound healing rate was compared between the groups, it was observed that there was a significant increase only in the combined inhibitor group (p=0.0286). Based on these results, it was decided to apply FTIR analysis to groups that were treated with inhibitory miRNA. Significant differences were found in the lipid, protein and nucleic acid band regions except for the 2956 cm-1 band compared to the control (p<0.05). When the bands were analyzed according to their area and ratio, the most significant change was seen when miRNA inhibitors were combined. Increased amounts of lipid, protein, phospholipid, cholesterol, nucleic acid and collagen were evaluated as the increase in structure and molecules such as exosomes and collagen released out of the cell. It was found that after the cells were transfected with combined miRNA inhibitors, the expressions of Mmp9, Tagln and Tnf, and the cell migration decreased, and the amounts of collagen and exosomes increased. This findings showed that besides evaluating the individual miRNAs, it was also important to evaluate their combined effects. We think that these obtained results may give clues to the development of new treatment protocols to accelerate wound healing.