Multiple miyelomalı hastalardan elde edilen kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşma kapasitelerinin incelenmesi
Osteogenic differentiation potential of multiple myeloma patients derived bone marrow mesenchymal stem cells
Yazar: AYÇA AKSOY
Danışman: PROF. DR. ADIL ALLAHVERDIYEV ; PROF. DR. ERDAL KARAÖZ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Multipl miyelom = Multiple myeloma

Özet:
Multipl miyelom, kemik iliğinde malignant plazma hücrelerinin çoğalımıyla karakterize bir plazma hücre neoplazisidir. Multipl miyelom insanların yaşadığı coğrafya, sosyo-ekonomik şartlar ve etnik kökene göre değişiklik gösteren bir kanser türü olmasının yanında diğer kanser türlerinde olduğu gibi hücrelerin genetik yapılarındaki değişimler sonucunda ortaya çıkmaktadır. Erkeklerde kadınlara oranla daha sık rastlanan bu hastalık Avrupa, Kuzey Amerika ve Avustralya başta olmak üzere tüm dünya genelinde yaygın olarak görülmektedir. Multipl miyelomda, kemik ağrısı ve kırıklarının gözlendiği osteolitik kemik lezyonlarıyla sonuçlanana yıkıcı bir kemik hastalığı da gelişmektedir. Hastalarda oluşan kemik kırıkları ve yoğun kemik ağrıları hastalığın ilerleyen evrelerinde veya tedavi süreci içerisinde hayat kalitelerini oldukça düşürmektedir. Normal fizyolojik koşullarda kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden osteoblastarın farklılaşmasıyla kemik yapımı ve osteoklastik aktivite aracılığıyla kemik yıkımı denge halindedir. Multipl miyelom hastalarında ise kemik iliği mikroçevresindeki plazma hücrelerinin salgıladığı çeşitli faktörler tarafından indüklenen osteoklastik aktivitenin artması ve osteoblastik aktivitenin azalması, kemik yapım-yıkım dengesini bozmaktadır. Bunun bir sonucu olarak tümör gelişimi esnasında kemik lezyonları artmaktadır. 
Günümüzde multipl miyelom kemik hastalığının tedavisinde kullanılan bisfosfanatlar osteoklastların aktivitelerini inhibe etmekte ve apoptozunu uyarmaktadır. Bunun yanında, osteoklastogenezi engelleyerek osteoklast öncüllerinin oluşumunu inhibe etmektedir. Ancak kemik iliğindeki mezenkimal kök hücrelerden osteoblastların oluşumu ve kemik yapımının arttırılmasına yönelik tedavi stratejileri henüz yetersizdir. Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin kendini yenileme ve kemik, kıkırdak, kas ve yağ hücrelerine farklılaşma kabiliyetleri bilinmektedir. En son gerçekleştirilen çalışmalarda, multipl miyelom hastalarından elde edilen kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin in vivo ve in vitro olarak osteojenik farklılaşma bozuklukları olduğu belirlenmiştir. Multipl miyelom hastalarının kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin osteoblastlara farklılaşma kabiliyetlerinde ki bu kayıp, kemik deformasyonlarının nedeni olarak açıklanabilmektedir. Ancak günümüze kadar multipl miyelom kemik hastalığında osteoblastogenezdeki bu bozukluklar tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, multipl miyelom hastalarında kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin in vitro osteojenik farklılaşma yolaklarındaki moleküler mekanizmaların ve gen ifadelerinin ayrıntılı incelenmesi, kemik hastalığının patogenezinin anlaşılmasında ve dolayısıyla hedefe yönelik yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde oldukça önemlidir.
Günümüze kadar gerçekleştirilen çalışmalarda multipl miyelom plazma hücrelerinin kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin osteojenik farklılaşması üzerindeki olumsuz etkilerini belirlemek amacıyla, ortak kültür sistemleri kullanılarak kemik iliği mikroçevresi in vitro ortamda taklit edilmektedir. Gerçekleştirilen çalışmalar, kemik iliği mikroçevresi olmaksızın multipl miyelom kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin sağlıklılardan fenotipik olarak farklı olduğunu ve osteojenik farklılaşma kapasitelerinin düşük olduğunu göstermektedir. Ancak mikroçevrenin etkisi olmaksızın kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin osteojenik indüksiyon sonrasında osteojenik yolaklarda rol oynayan gen ifadelerinin ayrıntılı olarak incelendiği bir çalışma literatürde henüz bulunmamaktadır. Kemik yapımından sorumlu olan osteoblastların, multipl miyelom kemik hastalığında mikroçevrenin etkisi olmaksızın in vitro koşullardaki davranışlarının belirlenmesi ileride gerçekleşmesi olası kök hücre tedavileri veya rejeneratif tıp yaklaşımları için önemlidir. Aynı zamanda kemik iliği mikroçevresinin önemli bir kısmını oluşturan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin multipl miyelom hastalarındaki in vitro karakterizasyonları tümör sağkalımı ve yayılımında da önemli bulgular elde edilmesine öncü olacaktır.
Bu hedefe yönelik olarak amacımız, multipl miyelom hastalarından elde edilen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin mikroçevrenin etkisi olmaksızın in vitro osteogenik indüksiyon öncesinde ve sonrasında osteojenik yolaklarda rol oynayan gen ifadelerinin analiz edilmesidir. 
Bu amaçla sağlıklı donörlerden ve multipl miyelom hastalarından kemik iliği mezenkimal kök hücreleri elde edilmiştir. Mezenkimal kök hücrelerin karakterize edilmesinden sonra hücreler, gen ifadelerinin ve alkalen fosfataz aktivitelerinin incelenmesi amacıyla osteojenik farklılaşmaya indüklenmiştir. Alkalen fosfataz aktivitesi tayini 4., 7., 14. ve 21. günlerde ölçülerek sağlıklı ve multipl miyelom grupları karşılaştırılmıştır. Gen ifade analizlerinde özel olarak osteojenik farklılaşma için üretilmiş gerçek zamanlı PZR plakaları kullanılmıştır. Osteojenik indüksiyonun öncesinde ve otuz gün sonrasında osteojenik farklılaşma yolağında rol oynayan genlerin ifadeleri analiz edilmiştir. Veriler istatistiksel olarak eşli t-test kullanılarak değerlendirilmiştir.
Elde edilen bulgulara göre multipl miyelom grubunda tüm günlerde ALP aktivitesinin sağlıklılara göre anlamlı olarak düşük olduğu tespit edilmiştir. Gen ifade analizleri karşılaştırıldığında ise sağlıklılara göre MM'da osteojenik yolaklarda rol oynayan 8 genin anlamlı derecede farklı olduğu belirlenmiştir. Bu genlerden BMP4, CSF1, ICAM1 ve VDR ifadeleri multipl miyeloma grubunda osteojenik indüksiyon sonrasında anlamlı derecede artış gösterirken; COL3A1,  ITGB1 ve VEGFA gen ifadeleri anlamlı olarak azalmıştır. Ayrıca TWIST1 gen ifadesi sağlıklı mezenkimal kök hücrelerde osteojenik indüksiyon sonrası anlamlı derecede artış gösterirken, multipl miyelom grubunda değişmemiştir. 
Sonuç olarak elde edilen bulgular ile multipl miyelom hastalarında kemik iliğindeki tümörojenik mikroçevrenin etkisi olmaksızın, in vitro osteojenik indüksiyonları sonrasında mezenkimal kök hücrelerinin alkalen fosfataz aktivitelerinin sağlıklılara göre düşük oluşu ve osteojenik farklılaşmayla ilişkili gen ifade farklılıklarının multipl miyelomdaki kemik defektleri ile ilişkili olabileceği gösterilmiştir.

Abstract:
Multiple myeloma is a plasma cell neoplasia characterized by proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow. Multiple myeloma is a kind of cancer; same as the other cancer types, resultant of genetic changes of the cells variants of geography, socio-economic conditions and ethnic origin of human. This disease is more common in men than women which commonly seen across the globe, particularly in Europe, North America and Australia. In multiple myeloma, development of a destructive bone disease that results osteolytic bone lesions, bone pain and fractures is observed. Bone fractures and intense bone pain in later stages of the disease or in treatment process, are considerably reduces the quality of life of patients. Under normal physiological conditions, osteoblast formation and differentiation from bone marrow mesenchymal stem cells and bone resorbtion through osteoclastic activity are in balance. However in multiple myeloma patients, an imbalance between osteoblastic and osteoclastic activity was present, which is induced by numerous inhibitory factors secreted by plasma cells into bone marrow microenvironment. During tumor progression, bone lesions increase consequently. 
Up to date, bisphosphonates which uses for the treatment of multiple myeloma bone disease, inhibits the activity of osteoclasts and induces them to apoptosis. Furthermore, by inhibiting osteoclastogenesis the formation of osteoclasts precursors are inhibited. However, in multiple myeloma, the formation of osteoblasts from mesenchymal stem cells in the bone marrow and bone formation is still unclear for the improvement of treatment strategies. The capability of self-renewal and differentiation potential of bone marrow mesenchymal stem cells into bone, cartilage, muscle and fat cells are well known. In vivo and in vitro osteogenic differentiation and proliferation abnormalities of bone marrow mesenchymal stem cells derived from patients with multiple myeloma have been shown in latest studies. The loss of differentiation capacity of bone marrow mesenchymal stem cells of multiple myeloma patients into osteoblasts might explain the reason for bone deformations. The comparative gene analysis promise better knowledge in molecular pathways of osteogenic differentiation progress between the normal and diseased cells after in vitro osteogenic differentiation without the influence of microenvironment. 
Until today, the studies performed co-culture systems for mimicing bone marrow microenvironment in vitro to determine negative effects of multiple myeloma plasma cells on bone marrow-derived mesenchymal stem cells osteogenic differentiation. These studies show multiple myeloma bone marrow derived mesenchymal stem cells are different from healthy donors with their phenotype and their osteogenic differentiation capacitys'looseness. However, without the influence of the microenvironment, the genes which play roles in osteogenic pathways after osteogenic induction of bone marrow derived mesenchymal stem cells have not report in the literature yet. Osteoblasts responsible for bone formation in multiple myeloma bone disease without the influence of the microenvironment, in vitro determination of behavior likely to happen in the future of stem cell therapy or regenerative medicine approaches are important. At the same time constitutes a significant portion of the bone marrow microenvironment of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro characterization of multiple myeloma patients in the survival and invasion of the tumor to obtain significant findings will be pioneers.
Our aim for this goal is to analyze the gene expressions of bone marrow mesenchymal stem cells derived from multiple myeloma patients, without the influence of the microenvironment, before and after in vitro osteogenic induction osteogenic pathways.
For this purpose, bone marrows obtained from healthy donors and multiple myeloma patients in order to isolate mesenchymal stem cells. After the characterization of the mesenchymal stem cells, osteogenic induction will be performed in order to compare the gene expressions of the cells before and after of osteogenic induction. This analyses completed by Real Time PCR using expression arrays specially designed for osteogenic differentiation. The gene expressions which are important in osteogenic differentiation pathways were analysed. Data were statistically evaluated using the paired t-test.
The results demonstrate that ALP activity was lower in multiple myeloma group. We compared expressions of genes that play roles in osteogenic pathway between healthy donors and multiple myeloma mesenchymal stem cells and the levels of 8 genes were significantly different expressed in multiple myeloma mesenchymal stem cells. From these genes; BMP4, CSF1, ICAM1 and VDR expressions showed a significantly increase in multiple myeloma group after osteogenic induction. But, COL3A1, ITGB1 and VEGFA genes significantly decreased. Besides this, TWIST1 gene expression significantly incrased in healthy donors after osteogenic induction, but did not change in multiple myeloma group.
In conclusion the results have shown that the difference of osteogenic gene expressions of in multiple myeloma bone marrow mesenchymal stem cells and defect of alkaline phosphatase activity may be related with osteogenic disorders of multiple myeloma in addition to presence of other tumorogenic microenviroment of bone marrow.