Primer ve sekonder immün yetmezlikli hastalarda saptanan sitomegalovirüs suşlarında gansiklovir direncinin genotipik yöntemlerle araştırılması
Investigation of ganciclovir resistance in cytomegalovirus strains isolated from patients wi̇th primary and secondary immunodefi̇ci̇ency by genotypic methods
Yazar: AYTEKİN FIRTINA
Danışman: PROF. DR. AHMET PINAR
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
İmmün yetmezliği olan hasta grupları modern tıbbın ilerlemesiyle birlikte artmaktadır. Sitomegalovirüs (CMV), özellikle nakil hastaları ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile yaşayan bireyler gibi immün yetmezliği olan hasta gruplarında fırsatçı patojen olarak ciddi hastalık ve ölümlere sebep olmaktadır. Bazen, bu enfeksiyonlar ilk tedavi seçeneği olan gansiklovire klinik olarak yanıt vermemektedir. Sonuçta uzamış tedavi ve hastaneye yatış süresi, yan etkileri daha fazla olan medikal tedavi değişiklikleri, kalıcı organ hasarları ve ölüme kadar gidebilen süreçler yaşanabilmektedir. Tüm bunlar göz önüne alındığında tedavi sürecinde antiviral direnç testlerinin önemi daha da artmaktadır. Bu çalışmada, Hacettepe hastanelerine başvuran primer ve sekonder immün yetmezliği olan hastalarda görülen CMV enfeksiyonları ve bu enfeksiyona sebep olan CMV suşlarında gansiklovire karşı direnç varlığının genotipik yöntemlerle araştırılması amaçlanmıştır. CMV organ tutulumu olan hastalarda, olmayanlara oranla daha fazla antiviral direnç görülmesi öngörülmüştür. Bir yıl boyunca çalışmaya dahil edilen hasta plazmaları ileriye dönük olarak toplanmıştır. Toplamda 142 hastaya ait plazma örneklerinden CMV DNA izolasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Primer tasarlanması ve nested-PZR optimizasyonu yapıldıktan sonra tüm DNA izolatları bu PZR deneyine dahil edilmiştir. Deneyler sonucunda 77 hastada hedeflenen bölgede amplikon saptanmıştır. Elde edilen amplikonlar Sanger DNA dizileme yöntemi ile dizilenmiş ve sonuçta 77 hasta için veri elde edilmiştir. Elde edilen diziler kullanıma açık olan bir direnç ilişkili mutasyon saptayan platform üzerinden yorumlanmıştır. Sonuçta 77 hastadan ikisinde gansiklovir direnciyle ilişkili M460V ve A594V mutasyonları saptanmıştır. İki hastada genetik polimorfizmle ilişkili olan D605E mutasyonu bulunmuştur. Ayrıca gansiklovir direncine olan etkisi bilinmeyen V542I mutasyonu üç hastada, A435V ve A427T mutasyonlarının varlığı ise iki ayrı hastada gösterilmiştir. Hematopoetik kök hücre nakli (HKHN) alıcısı olan 32 hastanın üçüne olası akciğer tutulumu ve bir hastaya CMV pnömonisi tanısı koyulmuştur. Yine bu grupta iki hastada gastrointestinal sistem (GİS) tutulumu ve dört hastada retinit görülmüştür. Bir HIV hastasında görülen akciğer tutulumu hariç tüm organ tutulumları HKHN alıcılarında görülmüştür. Ayrıca çalışmamıza yedi solid organ nakli (SOT), üç HIV enfeksiyonu, iki konjenital CMV enfeksiyonu ve diğer hastalıklara bağlı immün yetmezliği olan 33 hasta katılmıştır. Direnç ilişkili M460V mutasyonu CMV retiniti olan hastada, A594V mutasyonu ise CMV pnömoni tanısı alan hastada saptanmıştır. Sonuç olarak; CMV organ tutulumu olan ve olmayan hasta grupları arasında gansiklovir direnci açısından anlamlı fark saptanmamıştır (p=0,610). Hasta gruplarındaki katılımcı sayısının artırılıp, her bir hasta grubunun tek başına değerlendirildiği çalışmalara ihtiyaç olduğu kanısına varılmıştır. 

Anahtar Kelimeler: CMV antiviral duyarlılık; genotipik antiviral duyarlılık testleri; antiviral direnç; Sanger dizileme yöntemi; immün yetmezlik
Destekleyen kuruluş: Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Koordinasyon Birimi, Proje no: THD-2022-20069

Abstract:
Patient groups with immunodeficiency are increasing with the advancement of modern medicine. CMV causes serious illness and death as an opportunistic pathogen, especially in immunocompromised patient groups such as transplant patients and individuals living with HIV. Sometimes, these infections do not respond clinically to ganciclovir, the first-line treatment option. As a result, prolonged treatment and hospitalization time, medical treatment changes with more side effects, permanent organ damage and processes that can lead to death may occur. Considering all these, the importance of antiviral resistance tests in the treatment process increases even more. In this study, it was aimed to investigate CMV infections in patients with primary and secondary immunodeficiency admitted to Hacettepe hospitals and the presence of resistance to ganciclovir in CMV strains causing this infection by genotypic methods. It has been hypothesized that patients with CMV organ involvement have more antiviral resistance than those without. Plasma from patients included in the study for one year were prospectively collected. CMV DNA isolation was performed from plasma samples of 142 patients in total. After primer design and nested-PCR optimization, all DNA isolates were included in this PCR experiment. As a result of the experiments, bands were detected in the targeted region in 77 patients. Band-detected sequences were sequenced by the Sanger DNA sequencing method, resulting in data for 77 patients. The resulting sequences were interpreted on a readily available resistance-associated mutation detection platform. As a result, M460V and A594V mutations associated with ganciclovir resistance were detected in two of 77 patients. D605E mutation associated with genetic polymorphism was found in two patients. In addition, the V542I mutation with unknown effect on ganciclovir resistance was shown in three patients, and the presence of A435V and A427T mutations in two separate patients. Thirty two patients were hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients, and three patients had possible lung involvement and one patient had CMV pneumonia. The patient diagnosed with CMV pneumonia was the patient with the A594V mutation. In this group, GIS involvement was observed in two patients and retinitis was observed in four patients. The M460V mutation was observed in the patient who was treated with the diagnosis of CMV retinitis. Except for the lung involvement seen in one HIV patient, all organ involvements were seen in HSCT recipients. In addition, seven solid organ transplant (SOT), three HIV infection, two congenital CMV infection and 33 patients with immunodeficiency due to other diseases participated in our study. Possible CNS involvement was observed in one of the patients with congenital CMV infection. In conclusion, no significant difference was found between the patient groups with and without CMV organ involvement in terms of ganciclovir resistance. It was concluded that there is a need for studies that increase the number of participants in patient groups and evaluate each patient group individually.

Keywords: CMV antiviral susceptibility; genotypic antiviral susceptibility tests; antiviral resistance; Sanger sequencing method; immunodeficiency
Supporting organization: Hacettepe University Scientific Research Coordination Unit, Project no: THD-2022-20069