Biyobozunur polimerik materyaller ve/veya bunların kalsiyum fosfat kompozitlerinin üretimi ve sert doku onarımında kullanımı
Production of biodegradable polymeric materials and/or their calcium phosphate composites and their use in hard tissue repair
Yazar: HALİL MURAT AYDIN
Danışman: PROF. DR. ERHAN PİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Tez çalışmasının amacı polimerik ve/veya kompozit malzemelerden oluşan biyobozunur skafoldların hazırlanmasıdır. Daha özel olarak bu çalışma skafoldların yapı ve yüzey özelliklerinin yeni yaklaşımlar kullanılarak iyileştirilmesini ve bu yapıların biyouyumluluk, biyobozunma ve kemik oluşturma kapasitesi gibi özelliklerinin değerlendirilmesini hedeflemektedir. Çalışma dört alt-grup altında incelenebilir. Tezin ilk aşamasında, doku mühendisliği için gözenek bağlantılarını iyileştiren yeni bir teknik geliştirilmiştir. Bu amaç için, ikili porojen yaklaşımıyla, çözücü buharlaştırma ve partikül ekstraksiyonu tekniğiyle skafoldların üretilmesi için medikal saflıkta poli(laktik asit) kullanılmıştır. Makro-gözenek boyunu 106-250 µm arasında tutmak için sodyum klorür (NaCl) kullanılırken, naftalin ya da süperkritik karbon dioksit gözenekler arası bağlantıların iyileştirilmesi için ikinci porojen olarak kullanılmıştır. Naftalinle ya da naftalin kullanılmadan süperkritik karbon dioksit ile üretilen skafoldların üç boyutlu morfolojisi optik koherens tomografi ve taramalı elektron mikroskobu ile incelenmiştir. Skafoldların mekanik özellikleri sıkıştırma testleriyle karakterize edilmiştir. Hücre tutunmasının incelenmesi için skafoldlara MG63 osteoblastik hücreleri ekilmiştir. Hücre canlılığı konfokal mikroskop ile değerlendirilmiştir. Çözücü buharlaştırma/partikül ekstraksiyon sürecinde ikinci porojen olarak naftalin kullanımının gözenekler arası bağlantıları iyileştirdiği ortaya çıkarılmıştır. Naftalinle hazırlanan ya da tekli porojen tekniğiyle üretilen hücre-skafold yapıları live/dead flüoresans boya kiti kullanıldığında, skafold hazırlama sürecinde kullanılan naftalinin hücre canlılığını etkilemediğine işaret edecek şekilde güçlü yeşil flüoresans vermiştir.Tezin ikinci aşamasında ise kalay oktoat katalizinde iki biyobozunur polimer, poli(L-laktat) (PLA) ve poli( ? -kaprolakton) (PCL) sentezlenmiştir. Polimerlerin molekül ağırlıkları PLLA ve PCL için sırasıyla yaklaşık olarak 200 kDa ve 40 kDa olarak hesaplanmıştır. Gözenekler arası bağlantıların arttırılması için süperkritik karbon dioksitin (sc-CO2) uygulandığı, gözeneklerin oluşturulmasında ise oldukça klasik bir tuz ekstraksiyon yönteminin kullanıldığı ikili porojen yaklaşımıyla polimerik skafoldların üretilmesi için bu iki polimerin bir blendi (ağırlıkça 50/50) kullanılmıştır. Bozunma ve mekanik davranışın karşılaştırılması için diğer blendler de hazırlanmıştır. Bu amaçla 6 aylık bir in vitro bozunma çalışması ve bir dizi mekanik test yapılmıştır. Salım kinetiklerinin değerlendirilmesi için, bu skafoldlardan protein salımını araştırmak üzere bir BSA modeli kullanılmıştır.Çalışmaların üçüncü aşamasında ise polimerik blendden hazırlanan skafoldlar ile bunların kolojen ve/veya kolojen artı hidroksiapatit (HA) partikülleri (25-45 µm) ile kaplanmış olanları arasında bir karşılaştırmanın yapılması amaçlanmıştır. SEM ve mikro-CT görüntüleri, HA partiküllerinin matris içerisinde, gözenekliliği önemli ölçüde değiştirmeksizin gözenek yüzeylerinde iyi bir şekilde dağıtıldığını göstermiştir. Mikro-CT ile ölçülen gözeneklilik HA kaplamanın ardından % 94,7'den % 84,7'ye inmiştir. Hücrelerin bu skafoldlarla etkileşiminin gözlenmesi için hücre kültüründe bir MG63 osteoblastik hücre hattı kullanılmıştır. SEM ve konfokal mikroskop görüntülerinin yanında DNA ve protein analizleri kolojen + HA kaplı skafoldlarda daha iyi bir hücre tutunması ve proliferasyonu olduğunu göstermiştir.Tezin son aşamasında ise bu biyobozunur skafoldlar, dişi Sprague Dawley sıçanlarının (n=96) kullanıldığı 6-aylık bir hayvan deneyinde osteokondüktif özellikleri bakımından incelenmiştir. Deney hayvanları, skafold grubu, mezenkimal kök hücre grubu ve skafold artı kök hücre grubu adında 3 gruba ayrılmıştır. Seçilen zaman noktalarında (1, 3 ve 6 ay) kemik numuneleri çıkartılmış, fikse edilmiş ve bir mikrotom kullanılarak kalınlığı 5 mikrometre olan kesitler alınmıştır. Hematoksilin & eozin ve Masson trikrom boyanmış kesitler hücrelere ve/veya implanta cevaben defekt iyileşmesi, yeni kemik oluşumu ve doku cevabı açısından değerlendirilmiştir. 20 kesitten rasgele bir kesit alınmış ve her bir numune için hesaplama yapılmıştır. Bu aşamada bir nicel analiz kullanılmıştır. Defektteki yeşile boyanmış yeni kemik alanı Masson trikrom boyalı kesitler üzerinde hesaplanmıştır. Yeni kemik miktarının istatistiksel açıdan önemliliğini değerlendirmek için parametrik varyans analiz testi (sırasıyla çoklu karşılaştırmalar için one way ANOVA ve post-hoc test olarak Tukey testi) yapılmıştır. Kemik iyileşmesi ve doku cevabı parametrik-olmayan testlerle (çoklu karşılaştırmalar için Kruskal-Wallis ve Beonferoni düzeltmesi ile post-hoc test olarak Mann Whithey U) analiz edilmiştir. Osteoblastik ve osteoklastik aktivite tarafından kontrol edilen kortikal kemik yeniden yapılanması ve kemik iliği elemanlarının iyileşmesi de yine her bir grup için semikantitatif olarak incelenmiştir. Histoloji çalışmaları neticesinde yeni kemik oluşumunun en ileri düzeyde gözlendiği grubun skafold + kök hücre grubu olduğu bulunmuştur. Kullanılan skafolda herhangi bir doku cevabı gelişmemiştir. Skafold biyouyumlu olarak izlenmiştir.

Abstract:
The object of the thesis is to prepare biodegradable scaffolds consist of polymeric and/or composite materials. More particularly, this study is aimed at enhancing scaffolds? structural and surface properties by using novel approaches and evaluating the biocompatibility, biodegradation and bone forming capacity features thereof. Study can be divided into four sub-groups. At the first stage of the thesis, a new scaffold fabrication technique enhancing pore interconnectivity for tissue engineering has been developed. For this purpose, medical grade poly (lactic acid) was utilized to generate scaffolds by solvent-evaporating and particulate-leaching technique using a new dual porogen approach. Sodium chloride (NaCl) was used to control macro-pore size as to 106 to 250 ? m; whilst naphthalene or supercritical carbon dioxide was utilized as a porogen to increase pore interconnections. In another part of this stage, supercritical carbon dioxide was utilized as a second porogen. The three dimensional morphology of the scaffolds manufactured with and without naphthalene and by using supercritical carbon dioxide was examined by optical coherence tomography and scanning electron microscope. The mechanical properties of the scaffolds have been characterized by compression tests. MG63 osteoblastic cells were seeded in the scaffolds to study the cell attachment. Cell viability was evaluated by confocal microscopy. It is revealed that introducing naphthalene as the second porogen in solvent-evaporating/particulates-leaching process resulted in improvement of the pore interconnectivity. Both cell-scaffold constructs made with and without naphthalene exhibited strong green fluorescence when using live/dead fluorescent dye kit, indicating that the naphthalene in the scaffold preparation process did not affect cell viability.In the second part of the thesis, two different biodegradable polymers, namely poly(L-lactide) (PLLA) and poly( ? -caprolactone) (PCL) were synthesized by using stannous octoate as the catalyst. Molecular weights of the polymers were about 200 kDa and 40 kDa for PLLA and PCL, respectively. A blend of these two polymers (with a weight ratio of 50/50) was used to produce polymeric scaffolds with the dual porogen approach in which a rather classical salt leaching technique was applied in order to create pores within the matrix, while supercritical-CO2 (sc-CO2) treatment was used for enhancing the interconnectivity. Other blends were also produced to compare degradation and mechanical behavior. For this purpose, a 6-months in vitro degradation study and a series of mechanical tests were performed. In order to evaluate release kinetics, a BSA model was used to investigate protein release from these scaffolds.Third part of the thesis was aimed at to make a comparison between the scaffolds made of polymeric blend and their respective collagen and/or collagen plus hydroxyapatite (HA) particles (25-45 µm) incorporated ones. SEM and micro-CT images exhibited that HA particles are thoroughly distributed within the matrices onto the pore surfaces without changing the porosity significantly. Porosity measured with micro-CT was decreased from 94.7 % to 84.7 % after HA coating. A MG63 osteoblastic cell line was used to observe interaction of cells with these scaffolds in cell cultures. SEM and confocal microscopy images as well as DNA and protein assays showed better cell attachment and proliferation on the collagen + HA coated scaffolds.In the final part of the thesis, these biodegradable scaffolds were evaluated for their osteoconductive properties in a 6-months animal experiment performed by using female Sprague Dawley rats (no=96). Animals divided into three groups, namely scaffold group, mesenchymal stem cells group, and mesenchymal stem cells plus scaffold group. After selected time points (1, 3, and 6 months), bone specimens were removed, fixed and serial sections of five micrometer in thickness were cut with a sliding microtome. Haematoxylin & Eosin and Masson?s trichrome stained sections were evaluated for defect healing, new bone formation and tissue response to cells and/or implant. One section from each 20 sections was randomly taken, and quantified from each sample. At this stage quantitative analysis was performed. The green stained new bone area in the defect was calculated on Masson?s trichrome-stained sections. The quantity of new bone was analyzed by parametric variance analysis test (one way ANOVA and Tukey test for multiple comparison and as post-hoc test respectively) to assess statistical significance. Bone healing and tissue response were analyzed by non-parametric tests (Kruskal-Wallis for multiple comparison and Mann Whitney U as post-hoc test with Bonferoni correction). Cortical bone remodeling by controlled osteoblastic and osteoclastic activity and the bone marrow elements recovery were also semiquantitatively examined for each group. According to histology results, the highest degree in new bone formation was occurred in scaffold + stem cell group. There has been no tissue response to implanted materials. Scaffold was found to be biocompatible.