Sıcak su kaynaklarından termofilik filamentli fungusların izolasyonu, tanılanması ve fitaz enzimi üretimlerinin araştırılması
Isolation and identification of thermophilic filamentous fungi from hot spring waters and researching of their phytase production
Yazar: DERYA BERİKTEN
Danışman: PROF. DR. MERİH KIVANÇ
Anadolu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada sıcak su kaynaklarından termofilik filamentli fungusların izolasyonu, morfolojik ve moleküler tekniklerle identifikasyonu ve fitaz enzimi üretimi yeteneklerinin araştırılması amaçlanmıştır. Kütahya ilinde bulunan 12, Afyon ilinde bulunan 4 kaplıcadan 2008 ve 2009 yıllarında birer kere örnekleme yapılmıştır. Bu sıcak su kaynaklarından alınan 47 farklı sıcak su örneğinden yapılmış olan izolasyon işlemleri sonucunda toplam 137 adet fungus izolatı elde edilmiştir. Bu izolatlardan 25 tanesinin termofilik olduğu yapılmış olan sıcaklık testleri ile belirlenmiştir. Termofilik fungus izolatlarının morfolojik ve ITS, 26-28S rDNA'nın D1/D2 bölgelerine dayalı moleküler tanılamaları gerçekleştirilmiştir. Fitaz enzimi tarama çalışmaları ile seçilen Thermomyces lanuginosus kullanılarak katı faz fermentasyon (KFF) yoluyla fitaz enzimi üretimi gerçekleştirilmiştir. Klasik yöntem ve cevap yüzey yönteminin merkezi bileşke tasarımı fitaz üretiminin optimizasyonunda kullanılmıştır.
Morfolojik ve moleküler identifikasyonlar sonucunda termofilik fungus izolatlarının Myceliophthora thermophila, Myceliophthora hinnulea, Melanocarpus albomyces, Rhizomucor pusillus, Thermomyces lanuginosus, Humicola grisea, Humicola insolens, Scytalidium thermophilum, Talaromyces thermophilus, Thielavia terrestris ve Malbranchea cinnamomea türlerinin üyeleri olduğu saptanmıştır. Bu tanılama çalışmaları ile Kütahya ve Afyon illerindeki sıcak su kaynaklarındaki termofilik funguslar ilk kez ortaya konmuştur.
Fitaz enziminin üretiminde kullanılmış olan optimizasyon stratejisi geleneksel ve istatistiksel yöntemlerin bir kombinasyonunu oluşturmuştur. Maksimum fitaz aktivitesi substrat olarak pirinç kepeğinin kullanılması ile elde edilmiştir. Maksimum enzim aktivitesi elde edilmesini sağlayan parametrelerin optimum seviyeleri %70 nem, 7 gün fermentasyon süresi, %40 inokulum büyüklüğü, 55 oC inkübasyon sıcaklığı, 7,5 başlangıç pH, %30 havalandırma alanı, 5 günlük aşı kültür, %1 sükroz, 2,5 mM ZnSO4 olarak belirlenmiştir. Uygulanan optimizasyon çalışmaları sonucunda fitaz aktivitesinde 10,83 kat artış sağlanmıştır (0,30 ? 3,248 U/ml/dk) ve spesifik fitaz aktivitesi 8,97 U/mg olarak belirlenmiştir. SDS-PAGE ile T. lanuginosus fitaz enziminin molekül ağırlığının ~30 kDa oluşturduğu belirlenmiştir ve zimogram analizi bu bandın fitaz enzimine ait olduğunu doğrulamıştır.

Anahtar Kelimeler: Termofilik fungus, Moleküler identifikasyon, Sıcak su kaynakları, Fitaz, Cevap yüzey yöntemi

Abstract:
This study focused on the isolation of thermophilic filamentous fungi from hot spring waters, characterization of morphologic and molecular tecnique and researching of their phytase production capabilities. The sampling was performed one time of year 2008 and 2009 from 12 hot spring in Kütahya and 4 hot spring in Afyon. Totally 137 fungus isolates were obtained as the results of the isolation procedures from 47 different hot water samples taken from hot spring waters. It was determined by temperature tests that 25 of them from these isolates were thermophilic. Morphologic and molecular identification based on ITS, D1/D2 region of 26-28S rDNA of thermophilic isolates was carried out. Phytase enzyme production by using Thermomyces lanuginosus which is selected by phytase screening studies was carried out by solid state fermentation (SSF). Classical approach and Central composite design (CCD) of response surface methodology were applied for the optimization of phytase production.
As a result of the morphologic and molecular identifications it was determined that thermophilic fungi isolates were the members of Myceliophthora thermophila, Myceliophthora hinnulea, Melanocarpus albomyces, Rhizomucor pusillus, Thermomyces lanuginosus, Humicola grisea, Humicola insolens, Scytalidium thermophilum, Talaromyces thermophilus, Thielavia terrestris ve Malbranchea cinnamomea species. Thermophilic fungi of hot spring waters of Kütahya and Afyon provinces were exhibited with these identification studies for the first time.
Optimization strategy which was used to production of phytase was constituted a combination of traditional and statistical methods. Maximum pyhtase activity was achieved by using rice bran. The optimum levels of variables that supported maximum enzyme activity were moisture 70%, culture time 7 days, inoculum size 40%, culture temperature 55 0C, initial pH 7,5, aeration area 30%, age of seeding culture 5 days, sucrose 1%, ZnSO4 2,5 mM. An overall 10,83-fold enhancement in phytase activity (0,30 to 3,248 U) was attained due to the optimization and spesific phytase activity was determined as 8,97 U/mg. Molecular weight of T. lanuginosus phytase enzyme was determined as ~30 kDa by SDS-PAGE and zymogram analysis proved that this band belong to phytase enzyme.

Key words: Thermophilic fungus, molecular identification, hot spring water, phytase, response surface methodology.