Nog gen ifadesi susturulmuş hücrelerin oluşturulması ve ipek doku iskeleleri üzerinde osteojenik farklılaşmalarının incelenmesi
Generation of Nog knockdown cells and examination of their osteogenic differentiation on silk scaffolds
Yazar: SÜMEYRA NUR FUERKAITI
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU ; ÖĞR. GÖR. ANIL SERA ÇAKMAK
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışma "CRISPR/Cas9 ile Nog Gen İfadesi Susturulmuş Hücrelerin Oluşturulması ve İpek Doku İskeleleri Üzerinde Osteojenik Farklılaşmalarının İncelenmesi" başlıklı Lisansüstü Tez Projesi (FYL-2018-17253) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. 
Sunulan tez çalışmasında, öncelikle moleküler gen düzenleme mekanizmaları kullanılarak (CRISPR-Cas9, siRNA), kemik morfogenetik proteini (BMP) sinyal yolağının antagonisti olan Noggin protein sentezinin inhibe edilmesiyle preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri üzerinde moleküler düzenlenmenin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Ardından bu hücreler ile üç boyutlu (3B) ipek doku iskelelerinde osteojenik farklılaşmanın arttırılması hedeflenmiştir.
Bu hedeflere yönelik olarak, sunulan tez çalışması 4 basamakta gerçekleştirilmiştir. İlk basamakta, Bombyx mori ipek kozalarından ipek çözeltisi elde edilmiş ve çözücü döküm partikül uzaklaştırma yöntemi kullanılarak ipek doku iskeleleri üretilmiştir. SEM görüntüleri ile doku iskelelerinin içsel bağlantılara sahip gözenekli bir yapı sergiledikleri belirlenmiş ve gözeneklilik  %93.5 olarak hesaplanmıştır. Büyük gözeneklerin ortalama çapı 448±76 μm, küçük gözeneklerin ortalama çapı ise 85±27 μm olarak bulunmuştur. İpek doku iskelesinin yaklaşık 5. dk'da %1300 değerinde denge su tutma kapasitesine ulaştığı belirlenmiştir. 
Tez çalışmasının ikinci basamağında, MC3T3-E1 hücreleri üzerinde UltraCruz® ve Lipofektamin®3000 transfeksiyon ajanları kullanılarak kontrol CRISPR plazmidinin transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Ancak, kullanılan transfeksiyon ajanlarının etkin transfeksiyon için yeterli olmadığı saptanmıştır. Etkin transfeksiyonun sağlanabileceği elektroporasyon veya virüs bazlı transfeksiyon metotlarının kullanılması için laboratuvar koşullarımızın yeterli olmaması nedeniyle transfeksiyon çalışmalarına siRNA ile devam edilmiştir. 
Üçüncü basamakta, siNog ile MC3T3-E1 hücreleri üzerinde transfeksiyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir.  Öncelikle kırmızı floresan işaretli kontrol siRNA/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon koşulları belirlenmiştir. Sonrasında, iki boyutlu ortamda (2B) MC3T3-E1 hücreleri üzerinde siNog/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) analizi sonucunda, siNog grubunda Nog gen ekspresyonunun, kontrol ve negatif kontrol grubuna göre anlamlı derecede azaldığı görülmüştür (p<0.05*). 
Tezin son basamağında, MC3T3-E1 hücreleri 3B ipek doku iskelesi üzerine ekilmiş ve siNog/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Kültür 100 ng/mL BMP2 içeren osteojenik farklılaşma ortamıyla 21 gün devam ettirilmiştir. Sonrasında, kemik doku oluşumunu ve transfeksiyon etkinliğini incelemek amacıyla; Nog, Alp, Col1a1, Osp ve Ocn genlerinin ekspresyon düzeyleri RT-PCR ile belirlenmiştir. RT-PCR sonucunda, Nog gen ekspresyonunun siNog grubunda başarılı bir şekilde baskılandığı ve özellikle Ocn gen ifadesinin, kültürün 21. gününde siNog grubunda kontrol grubuna göre yaklaşık 5 kat arttığı belirlenmiştir (p<0.05*). Hücrelerin proliferasyon davranışları MTT (3-[4,5-Dimetilazol-2-il]-Difeniltetrazolyum Bromür) testi ile analiz edilmiş ve transfekte hücrelerin hücre yapışmasını ve proliferasyonunu olumsuz etkilemediği sonucuna ulaşılmıştır. SEM analizi ile hücre morfolojisi incelendiğinde, kontrol ve siNog gruplarında hücrelerin gözeneklerin iç kısmına kadar ulaştıkları, başarılı bir şekilde doku iskelesi üzerinde üredikleri gözlemlenmiş ve siNog gruplarında kontrol grubundan farklı olarak mineral yapılarına rastlanmıştır. EDAX analizi ile mineral yapıları incelendiğinde, siNog gruplarında hücreler üzerinde kümelenmiş yoğun Kalsiyum (Ca) ve Fosfor (P) elementlerine rastlanmıştır. Histolojik boyamalar sonucunda, siNog gruplarında yoğun mineralize bölgelerin olduğu görülmüştür. 
Sonuç olarak, ipek doku iskelesine ekilip siNog ile transfekte edilen MC3T3-E1 hücrelerinin kontrol grubuna göre daha etkin bir osteojenik farklılaşma gösterdiği, mineralizasyondan sorumlu olan Ocn gen ifadesinin daha yüksek seviyede olduğu ve yoğun mineralize bölgelere sahip olduğu belirlenmiştir. siNog ile transfekte edilen preosteoblastik hücrelerin 3B ipek doku iskeleleri ile birlikte kullanılmasıyla, özellikle mineralizasyonun arttırılmasına bağlı olarak kemik doku mühendisliği çalışmalarında avantaj sağlayacağı sonucuna ulaşılmıştır.

Anahtar Kelimeler: İpek, siRNA, BMP2, Noggin, Kemik doku mühendisliği

Abstract:
This study was funded by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit (BAP) graduate project entitled "Generation of Nog Knockout Cells by CRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing and Examination of Their Osteogenic Differentiation on Silk Scaffolds." (FYL-2018-17253). 
This thesis, aimed to investigate gene editing mechanisms (CRISPR-Cas9, siRNA) to inhibit the synthesis of Noggin protein, which is an antagonist of bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway to achieve molecular regulation in MC3T3-E1 cells. Then, it is aimed to increase the osteogenic differentiation of transfected MC3T3-E1 cells seeded on silk scaffolds.
For these purposes, the thesis study was carried out in 4 steps. In the first step, a silk solution was obtained from Bombyx mori silk cocoons and the solvent casting-particulate leaching process was performed to produce silk scaffolds. SEM images showed that the scaffolds have a porous structure with internal connections and the porosity was calculated as 93.5%. The average diameter of large pores was found to be 448±76 μm, while the average diameter of small pores was 85±27 μm. It was determined that equilibrium water uptake capacity of silk scaffolds reached 1300% in 5 minutes.
In the second step of the thesis, the transfection study of the control CRISPR plasmid was performed on MC3T3-E1 cells using Ultracruz® and Lipofectamin®3000 transfection agents. However, it was found that the transfection agents were not sufficient for efficient transfection. Our laboratory conditions were not able to use electroporation or virus-based transfection methods to ensure efficient transfection, therefore transfection studies were continued with siRNA.
In the third step, transfection studies were carried out with siNog on MC3T3-E1 cells. Primarily, transfection parameters were optimized with red fluorescence-labeled control siRNA/Lipofectamine®3000. Subsequently, a transfection study with siNog/ Lipofectamin®3000 was performed on MC3T3-E1 cells in static culture conditions.  Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) analysis showed that the Nog gene expression was significantly decreased in the siNog group compared to control and negative control groups (p <0.05*).
In the final step, the siNog/Lipofectamin®3000 transfection studies were performed on MC3T3-E1 cells seeded silk scaffolds. The culture was continued for 21 days with an osteogenic differentiation medium containing 100 ng/mL of BMP2. To investigate the bone formation and the transfection efficiency, gene expression levels of Nog, Alp, Col1a1, Osp, and Ocn measured by RT-PCR. As a result of RT-PCR, it was determined that Nog gene expression was successfully suppressed in siNog group and Ocn gene expression on the 21st day of cell culture, increased approximately 5 times in the siNog group compared to the control group (p <0.05*). The proliferation behavior of the cells was analyzed with the MTT (3- [4,5-Dimethylazol-2-yl] -Diphenyltetrazolium Bromide) test and it was concluded that transfected cells did not adversely affect cell adhesion and proliferation. When the cell morphology was examined by SEM analysis, it was observed that the cells in the control and siNog groups reached the inner surface of the pores, successfully grown on the t scaffold, and mineral structures were observed in the siNog groups. When mineral structures were examined with EDS analysis, intense Calcium (Ca) and Phosphorus (P) elements were found clustered on cells in siNog groups. Histological staining showed that siNog group have a more intense mineralized area compared to the control group. 
As a result, siNog transfected MC3T3-E1 cells seeded on silk scaffolds showed a more efficient osteogenic differentiation compared to the control group. Ocn gene expression which is responsible for mineralization was higher than that of control group and intense mineralized areas were observed in the siNog group. It was concluded that due to the increased mineralization, the siNog transfected preosteoblastic cells on 3D silk scaffolds can be used to induce bone regeneration.

Keywords: Silk, siRNA, BMP2, Noggin, Bone tissue engineering