Başkalaşım geçiren Galleria mellonella (Lepidoptera)'nın yaşlanan ipek bezlerinde mikroskobik (floresan ve elektron) ve analitik (Cap LC-ESI-MS/MS) yöntemlerle sialik asitlerin belirlenmesi
Sialic acids determination with microscopic (fluorescent and electron) and analytical (Cap LC-ESI-MS/MS) methods from undergoing metamorphosis of Galleria mellonella?s aging silk glands
Yazar: MERVE AÇIKEL
Danışman: DOÇ. DR. REMZİYE DEVECİ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Tam başkalaşım (metamorfoz) geçiren böceklerde, larval organların pek çoğu pupal dönemde tamamen bozulur, bazıları da ergin için yeniden yapılanırlar. Lepidopterlerde koza ipeği oluşturan ipek bezleri pupal dönemde tamamen bozulan ve yok olan larval organların tipik bir örneğidir. Çalışmada, ipek bezlerinin yaşlanmaya bağlı morfolojik değişiklikleri ile yapılarındaki sialik asit (Sia) lerin tipleri ve değişimlerini optik ve analitik yöntemler kullanarak belirlemek ve Sia tiplerinin dağılışını bozulma süreciyle ilişkilendirmek amaçlanmıştır.Bu amaçla, Galleria mellonella'nın olgun larva, prepupa ve pupa dönemlerindeki ipek bezlerinin morfolojisi, ışık ve transmisyon elektron mikroskobuyla incelenmiştir. Bunun için, Karnovsky ve OsO4 tespitli örnekler Epon 812'ye gömülmüştür.Yarı ince kesitler Toluidin mavisiyle, ince kesitler uranil asetat-kurşun sitratla boyanmıştır. Sia belirlemeleri için 5µm'lik frozen kesitlere floresan işaretli lektinlerden; tüm Sia'lara bağlanabilen LFA (Limax flavus agglutinin) ve LPA (Limulus polyphemus agglutinin) ile Sia'nın sırasıyla ? 2-3 ve ? 2-6 bağ tipine özgün olan MAA (Maackia amurensis aglutinin) ve SNA (Sambucus nigra aglutinin) uygulanmıştır. LC-ESI-MS/MS uygulaması için ise G.mellonella'dan çıkartılan ipek bezleri, miktara uygun olarak hesaplanan 2M asetik asit çözeltisine aktarılmıştır. Homojenizasyon, hidroliz ve türevlendirme basamaklarının ardından Sialar belirlenmiştir.Çalışmada, lektinlerin ışımaları salgı oluşturan bez hücrelerinde ve hücreleri dıştan saran bazal tabaka alanında karşılaştırılmıştır. LFA ve LPA lektinlerlerin ışımaları gençten yaşlıya azalmıştır. MAA lektinin ışıması, SNA'ya göre karşılaştırılan evrelerde daha yoğun olarak gözlenmiştir. MAA ile ışımada, gelişmenin genç döneminde fazla orandayken, yaşlı dönemde oldukça azalmıştır. SNA genç dönemin bazal tabakasında fazla ışıma gösterirken hücrelerde ışıma ayırt edilmemiştir. İleri prepupa hücrelerinde az miktarda ışıma görülürken bazal tabakada hiç ışıma bulunmamıştır. Pupa döneminde ise her iki bölgede de ışıma görülmemiştir.LC-ESI-MS/MS sonuçlarına göre ipek bezinde iki tip Sia (Neu5Ac ve Neu5,9Ac2) belirlenmiştir.Bu sia tiplerinin karşılaştırılmaları, üç devredeki değişimleri optik yöntemlerle lektin uygulama sonuçlarına paralel elde edilmiştir.Sonuç olarak; İpek bezi hücrelerinde incelenen devrelerde bozulma sürecinde Sia miktarında azalma görülmüştür. Bu sonuç, farklı bağ tiplerindeki Sia azalmalarıyla uyumludur ve Sia'ların ipek bezinde yaşlanma ve bozulma mekanizmalarının düzenlenmesinde rolü olduğunaişaret etmektedir.Anahtar Kelimeler: Sialik asit, İpek bezi, Lektin, Transmisyon elektron mikroskobu, LC-MS/MS, Yaşlanma, Galleria mellonella, Böcek

Abstract:
Holometabolous insects have larval organs, most of these organs are totally break down during pupal stage and they regenerate these organs for adult stage. The silk glands of Lepidopteran produce coccon. Silk glands make a good model for larval organ degeneration. Silk glands are totally break down and dissepear at pupal stage. This study aims to show the morphological alteration of silk glands which depend on aging and the changing of sialic acid (Sia) types, determine the Sia presence on the silk glands, how aging relates to the distribution of two types of Sia, depend on glycosidic linkage and the connection between structural changes during degeneration stages. Optic and analytic methods used for these purposes.For this aim, larval, prepupal and pupal stages of silk glands from Galleria mellonella examined with light and transmission electron microccopy for morphological structure. Therefore these glands fixed with Karnovsky solution and embedded in Epon 812 resin. Semi thin sections were dyed with toluidin blue and thin sections were dyed with Uranyl acetate- lead citrate. To determine the Sia presence, 5 µm frozen sections were dyed with fluorescent labelled LFA (Limax flavus agglutinin) and LPA (Limulus polyphemus agglutinin) bind to all Sia types, MAA (Maackia amurensis agglutinin) and SNA (Sambucus nigra agglutinin) lectins which respectively recognize Neu5Ac?2,3Galß1,4GlcNAc and Neu5Ac?2,6Gal/GalNAc chains, were used. For the LC-ESI-MS/MS application, silk glands were dissectioned from Galleria mellonella.Issued glands, in accordance with the calculated amount, transfered 2M asetic acit solution. After the homogenization, hydrolysis and derivatization steps, Sias were determined.In this work, lectins emission signals were comparison with secrecion cell layers and basal lamina which surrounded by the external cells. LFA and LPA emission signals are most extensively found at young stage. MAA lectin emission signals more extensive than SNA signals for examinated stages. MAA lectin spreaded extensive signals at young stage. MAA lectin signals reduced at old stage. SNA spreaded extensive signals in basal lamina but these signals absent in secresion cells at young stage. SNA lectin signals were weak emission in secresion cells but these signals were absent in basal lamina at prepupal stage. SNA signals was not observed in both regions at pupal stages. According to LC-ESI-MS/MS results, two type of Sia (Neu5Ac ve Neu5,9Ac2) observed. Our results parallel with lectin applications which obtained from optical methods at three stages.As results, the silk gland of G.mellonella undergoes histolysis during examined stages. The amount of Sias showed a decrease during histoliysis at examined stages.These result are coherent with different linkage of Sialic acids decreases and show that Sias play a role in the regulation of aging and histolysis mechanisms.Keywords: Sialic acid, Silk gland, Lectin, Transmission electron microscope, LC-MS/MS, Aging, Galleria mellonella, Insect