?-galaktozidaz enziminin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için ters misel sistemlerinin geliştirilmesi
Development of reverse micelles systems for the extraction and purification of ?-galactosidase
Yazar: KADRİYE GEZER
Danışman: PROF. DR. SEÇİL ÖNAL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyokimya = Biochemistry ; Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Misel = Micelle ; Mısır = Maize ; Protein ekstraksiyonu = Protein extraction ; Protein saflaştırma = Protein purification

Özet:
?-D-Galaktozidazlar (?-D-galaktozid galaktohidrolaz, EC 3.2.1.22) doğada oldukça yaygın olarak bulunan hidrolaz sınıfı enzimlerdir. Bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan çok çeşitli teknikler ile izole edilerek saflaştırılan bu enzimler galaktooligosakkaritler ve polisakkaritlerde bulunan ?-1,6-galaktoz birimlerini hidrolizlerler. Özellikle şeker endüstrisinde önemli bir potansiyele sahip olan ?-galaktozidazlar, kompleks karbohidratların biyolojik fonksiyonlarının belirlenmesinde, organik sentezlerde, yapı analizlerinde ve medikal alanda oldukça önemli uygulama alanları olan enzimlerdir.Bu çalışmada, mısırdan (Zea mays) izole edilen ?-D-galaktozidaz enzimi ters misel sistemi (Reverse Mİcelles Systems; RMs) kullanılarak saflaştırıldı. Ters misel sisteminde misel oluşturmak için surfaktan olarak Aerosol OT (AOT) ve setil trimetil amonyum bromür (CTAB) surfaktanları kullanıldı. Ters misel sistemini optimize etmek ve enzimi iyi bir verimle saflaştırabilmek için sistemi etkileyen temel parametreler (surfaktan tipi ve konsantrasyonu, pH, iyonik şiddet, sisteme eklenen protein miktarı, sulu faz/organik faz oranı) incelendi. Saflaştırılan ?-galaktozidaz enzimi karakterize edildi. Bu amaçla, enzim aktivitesine ve kararlılığına sıcaklık ve pH'ın etkisi incelenerek kinetik sabitler (Km ve Vmax) belirlendi. Ayrıca, D-galaktozun enzim aktivitesine etkisi araştırıldı ve inhibisyon kinetiği belirlendi.Sonuç olarak Aerosol OT (AOT) tabanlı ters misel sistemi için oda sıcaklğında 50 mM'lık sitrat tamponuyla (pH 6), 50 mM KCl tuz çözeltisi ve 1 mg protein içerek şekilde, 1:1 faz oranı (v/v) ile sistem hazırlandı. Setil trimetilamonyum bromür (CTAB) ters misel sistemi için ise yine oda sıcaklığında 50 mM'lık sitrat tamponuyla (pH 4.5), 2 mg protein içerek şekilde, 1:1 faz oranı (v/v) ile sistem hazırlandı. Optimize edilmiş koşullarda, ters misel sistemi ile ?-galaktozidaz enzimi AOT surfaktanı içeren ters misel sistemiyle %47 aktivite verimi ile 4,8 kat saflaştırıldı, CTAB surfaktanı içeren ters misel sistemiyle ise %89 aktivite verimi ile 2,0 kat saflaştırıldı. Her iki ters misel sistemi ile saflaştırılan enzimlerinin optimum sıcaklık ve optimum pH `sı sırasıyla 37°C ve pH 4,5 olarak belirlendi. Saflaştırılan enzimin, 4-50°C ve pH 4.0-6.5 aralığında oldukça kararlı olduğu belirlendi. ?-Galaktozidaz enziminin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 4.54 mM ve 0.05 U (AOT tabanlı ters misel sistemi) olarak belirlendi, 2.27 mM ve 0.29 U (CTAB tabanlı ters misel sistemi) olarak hesaplandı. D-Galaktozun ?-galaktozidaz enzimi inhibitörü olduğu ve inhibisyon tipinin kompetetif olduğu belirlendi. Geleneksel çok adımlı metodlara kıyasla ?-galaktozidaz enziminin saflaştırılmasında kullanılan bu tek adımı ters misellerle ekstraksiyon metodu bast, ekonomik ve etkili bir metod olup hazırlanan enzim preperatı sahip olduğu katalitik özellikler bakımından endüstriyel alanda kullanılabilecek uygun bir enzim preperatıdır.

Abstract:
?-Galactosidases (?-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.22) are a common class of hydrolases which are widely distributed in nature. They have been isolated and purified with different techniques from various sources, such as plants, animals and microorganisms. They catalyse the hydrolysis of ?-1,6-galactose bonds which found in galactooligosaccharides and polysaccharides. ?-Galactosidases which has a significant potential especially in the sugar industry are enzymes having important application areas. These provide to determine the biological functions of complex carbohydrates, organic synthesis, structural analysis and applications in the medical field.In this study, ?-D-galactosidase isolated from corn (Zea mays) and purified by reverse micelles systems (RMs). Aerosol OT (AOT) and cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) surfactants were used to create micelle in reverse micelle system. The main parameters (surfactant type and concentration, pH, ionic strength, amount of protein added to the system, the aqueous phase:organic phase ratio) were analyzed to optimize reverse micelles systems and to purify enyzme effeciently. The purified ?-Galactosidase was also characterized. For this aim, the effect of pH and temperature on the activity and stability of the enzyme and determination of kinetic parameters (Km and Vmax) were also investigated.As a result, it is decided to prepare the cationic surfactant AOT based reverse micelles system with 1:1 (v/v) phase ratio, 50 mM KCl salt concentration including 1 mg protein and 50 mM sodium citrate buffer (pH 6) in room temperature. For CTAB based reverse micelles system, it is decided to prepare with 1:1 (v/v) phase ratio, 50 mM sodium citrate buffer (pH 4,5) in room temperature, including 2 mg protein. Under optimised conditions, with AOT based reverse micelles system ?-galactosidase enzyme is purified with 4,8 fold and 47% activity recovery. With the CTAB based reverse micelles system ?-galactosidase enzyme is purified with 2,0 fold and 89% activity recovery. The optimum temperature and pH were found as 370C and pH 4.5, respectively for the enzyme purified with both reverse micelles system. Purifed enzyems were very stable in the temperature range of 4-500C and also pH 4.0-6.5. The KM and Vmax values of purified enzyme were calculated as 4.54 mM nd 0.05 U (AOT based system) and 2.47 mM and 0.29 U (CTAB based system). It was found that D-galactose was an inhibitor for corn ?-galactosidase and the type of inhibition was as competitive. Compared to multi-step methods, extraction with reverse micelles systems is verys simple, economc and effective method. Beside of this, according to catalytic properties of the enzyme it caan be used for industrial applications.