Adherent tip hücre kültürleri için nanofiber temelli 3D hücre taşıyıcı ve kriyoprezervasyon sistemleri
Nanofiber-based 3D cell carrier and cryopreservation systems for adherent cells
Yazar: DUA ÖZSOYLU
Danışman: PROF. DR. SEFA KIZILDAĞ ; PROF. DR. TORSTEN WAGNER
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Adherent hücreler = Adherent cells ; Biyosensörler = Biosensors ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Hücre kültürü = Cell culture ; Nanolif = Nanofiber ; Çip = Chip

Özet:
Son zamanlarda hücre-temelli (cell-based) ve elektrokimyasal biyosensörleri kullanan ileri çip-üstü-laboratuvar (lab-on-a-chip) cihazları geliştirmek için önemli çabalar sarf edilmektedir. Buna rağmen, mevcut sistemler, "yerinde kullanıma-hazır" (ready-to-use on-site) formatlar için hala uygun değildir, çünkü cihazın içindeki hücrelerin, son kullanıcıya alışılagelmiş nakliyatı sırasında hayatta kalmayı sağlayacak inkübatör koşullarına (CO2, besinler, vb.) ihtiyaçları vardır. Bu çalışmada, adherent hücrelerin bir sensör yüzeyinde, örn. ışıkla-adreslenebilen potansiyometrik sensör (LAPS), dondurularak (-80°C) korunmasını sağlayan sensör-üstü kriyoprezervasyon (OSC) adını verdiğimiz bir strateji ortaya koyuldu. 
LAPS yüzeyindeki adherent hücrelerin kriyo-hasarına eğilimli olduğu anlaşıldı. Bu yüzden, yüzey OSC sonrası hücre geri kazanımını arttırmak üzere modifiye edildi. Bu modifikasyon: i) yüksek termal genleşme katsayısına ve düşük camsı geçiş sıcaklığına sahip polietilen vinil asetattan (PEVA) oluşan elastik elektro-eğirilmiş liflerinin entegrasyonuna ve ii) O2 plazma ile muamele edilmesine dayanmaktadır. Modifiye edilmiş sensör, yalnız hızlı çözme için kritik olan termal kütleyi azaltmak için değil, aynı zamanda hassas bir şekilde kontrol edilebilen bir mikro-ortam sağlamak için bir mikroakışkan çip sistemine entegre edildi. Bu yeni kriyo-çip sisteminin, OSC sırasında hücreleri canlı tutmak için etkili olduğu bulundu. Konseptin ispatı deneyleri kapsamında, kanser hücrelerinin (CHO-K1) hücre dışı asitleştirilmesi, diferansiyel LAPS ölçümleri ile değerlendirildi. Sonuçlar, literatürde ilk kez, kriyo-çip kullanan OSC'ye dayalı stratejimizin, çözmeden hemen sonra etiketsiz ve kantitatif ölçümlere izin verdiğini ve bunun da çözme sonrası ek kültürleme adımlarını ortadan kaldırdığını gösterdi. 
Üretim aşamasındayken hücreleri içeren çiplerin OSC'ye dayalı dondurulması ve bir soğuk-zincir nakli yoluyla son kullanıcıya gönderilmeleri, "yerinde kullanıma-hazır" formatı mümkün hale getirebilir. Dahası, bu strateji, gelecekte diğer hücre-temelli çip-üstü-laboratuvar cihazlarına da potansiyel olarak uyarlanabilir.

Abstract:
Significant efforts have been recently made to develop advanced cell-based lab-on-a-chip devices using electrochemical sensors. However, current systems are still not suitable for a ready-to-use format as the cells inside the device need incubator conditions (CO2, nutrients, etc.) for survival during conventional transportation. Herein we propose a strategy called on-sensor cryopreservation (OSC), which enables the adherent cells to be preserved by freezing (-80°C) on a sensor surface, such as the light-addressable potentiometric sensor (LAPS). 
Adherent cells on the LAPS surface were prone to cryo-injury; thus, the surface was modified to enhance the cell recovery for OSC. It relies on i) the integration of elastic electrospun fibers composed of polyethylene vinyl acetate (PEVA), which has a high thermal expansion coefficient and low glass-transition temperature, and ii) the treatment with O2 plasma. The modified sensor is integrated into a microfluidic chip system not only to decrease the thermal mass, which is critical for fast thawing, but also to provide a precisely controlled micro-environment. This novel cryo-chip system is effective for keeping cells viable during OSC. As a proof-of-concept application, the extracellular acidification of cancer cells (CHO-K1) was evaluated by differential LAPS measurements. Results show, for the first time, that our strategy based on OSC using the cryo-chip allows label-free and quantitative measurements directly after thawing, which eliminates additional post-thaw culturing steps. 
The freezing of the chips containing cells at the manufacturing stage and sending them via a cold-chain transport could open up a new possibility for the ready-to-use on-site format. Moreover, this strategy is potentially adaptable to other cell-based lab-on-a-chip devices in the future.