In utero elektroporasyon ile gen aktarımı yapılarak motor nöron hasarı oluşturulan sıçanların davranış testleriyle değerlendirilmesi
Evaluation of rats with motor neuron damage produced by in uteroelectroporation via behavioral tests
Yazar: İLKİM BÜYÜKGÜDÜK
Danışman: PROF. DR. EMEL ULUPINAR
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Sinir Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Anatomi = Anatomy ; Genetik = Genetics ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Davranış = Behavior ; Genetik = Genetics ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Motor nöron hastalığı = Motor neuron disease ; Motor nöronlar = Motor neurons ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Hücre içerisinde proteinleri kodlayan genlerin doğru ifade edilişi ve doğru
katlanmış protein konsantrasyonu hücrenin yaşam döngüsünü devam
ettirebilmesi için kritik öneme sahiptir. Nöronlarda proteostazın sağlanamadığı
durumlarda patoloji oluşma riski artmaktadır. Son yıllarda, TDP-43 adı verilen
proteinini kodlayan TARDP genindeki mutasyonların amiyotrofik lateral skleroz
(ALS) ve frontotemporal lobar demans (FTLD) başta olmak üzere nörodejeneratif
hastalıkları tetiklediği gösterilmiştir.
 Bu tez çalışmasında, insanlarda TDP-43 proteinini kodlayan gende üç farklı
mutasyon oluşturularak, in utero elektroporasyon yöntemi ile sıçan
embriyolarına aktarımı ile motor nöron hasarını taklit eden hayvan modellerinin
oluşturulması ve meydana gelen değişikliklerinin davranış testleriyle
değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
 Motor nöronlarda hasar oluşturmak amacıyla iki farklı nokta mutasyonu
(N276S ve A315T) ve NLS sinyali delesyona uğratılmış mutant TDP-43 geni
kullanılmış ve bu genlerin motor nöronlarda uzun süreli ekspresyonu CBA
(chicken β-actin) promotoru ile sağlanmıştır. Sprague-Dawley cinsi erişkin dişi
sıçanlar (n=7) çiftleştirildikten sonra hamileliklerinin 16. gününde, amniyon
kesesi içinde bulunan embriyolarının lateral ventrikülleri içine mutant DNA‟yı
içeren plazmidler nanojektör ile enjekte edilmiştir. Enjeksiyon yapılmayan
yavrular ise kontrol grubu olarak kullanılmıştır. Özel olarak dizayn edilmiş bir
elektropod aracılığıyla DNA lateral ventrikülden motor kortekse doğru
yönlendirildikten sonra batın usulüne uygun olarak kapatılmış ve gebe sıçanlar
doğuma kadar kontrol koşullarında bakılmıştır. Gen aktarımı yapılan deney
hayvanlarında motor fonksiyonları değerlendirmek amacıyla, postnatal (P) 90,
120, 150, 180 ve 300. günlerde olmak üzere, aktivitemetre, modifiye grip, rotarod ve cat-walk yürüme testleri uygulanmış ve gruplar arası farklılıklar nonparametrik istatistiksel testler ile karşılaştırılmıştır. Sıçanların spontan
lokomotor aktivitelerini değerlendirilmek amacıyla yapılan testlerde horizontal,

Abstract:
Proper expression of the genes encoding proteins and the right concentration
of folded proteins in the cell are critical for maintaining the life cycle of cell.
There is an increased risk of pathology in neurons when proteostasis cannot be
achieved. In recent years, mutations in the TARDP gene encoding the protein
called TDP-43 have been shown to trigger neurodegenerative diseases, primarily
amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and fronto-temporal lobar dementia (FTLD).
 In this thesis study, generation of three different mutations in the gene
encoding TDP-43 protein, their transfer to rat embryos via utero electroporation
method and evaluation of phenotypic alterations via behavioral tests were aimed.
 In order to produce motor neuron damage, two different point mutations
(N276S and A315T) and deletion of the NLS signal in the TDP-43 gene were used
and the long-term expression of the genes was maintained by the CBA (chicken βactin) promoter. After mating Sprague-Dawley adult female rats (n = 7), on the
17th day of their pregnancy, plasmids containing mutant DNA were injected into
the lateral ventricles of the embryos growing inside of the amniotic sac via a
nanojector. Pups without injection were used as a control group. By using a
specially designed triple-electrode probe, DNA was directed from the lateral
ventricle to the motor cortex and then abdominal layers were closed accordingly
and pregnant rats were remained under control conditions until birth. In order to
evaluate motor functions in animals, activity meter, modified grip, rota-rod and
cat-walk walking tests were applied on postnatal days (P) 90, 120, 150, 180 and
300, and differences among groups were analyzed by non-parametric statistical
tests.
 Spontaneous locomotor activities of rats were evaluated based on the number
of horizontal, vertical, stereotypical and total movements, total traveled distance,
ambulation and resting time, and no significant difference was observed among
iv
groups. However, only at P120, the total number of movements was lower in the
N267S group than those of control group.
 On the other hand, when the mean number of falls in the rota-rod test was
compared; there was a statistically significant increase in the A315T mutation
group starting from P120, N276S mutation group starting from P150 and NLS
deleted group at P240 and P300, in comparison to the control group. Similarly, in
the modified grip test, mutation groups had lower scores than those of controls.
Especially at the early stages (P90 and P120), significant differences were found
between the scores of the TDP43 group with NLS deletion and the control group.
Also that the scores of all mutation groups were lower than those of the control
group in the modified grip test, at P120.
 In the cat-walk test, no significant difference was observed among the groups
in terms of the parameters including; distance between two consecutive steps,
right and left, front and back, as well as the maximum footprint area for each
foot and the overlapping frequency of consecutive steps.
 The results obtained in this thesis study showed that various mutations in
the TDP-43 genome might produce cell type-specific damages in a specific neuron
population within a specified time frame using the in utero electroporation
technique. In this thesis study, this technique has been used to investigate the
effects of defective proteins expressed due to the genetic risks, at the behavioral
level. However, in further studies, it is also a very useful method for investigation
of the morphological and functional changes in motor neurons.
Keywords: gene transfer, in utero electroporation, rota-rod, modified grip,
activitymeter, cat-walk test.