İlaç preparatlarında etken madde ve katkı maddelerinin HPLC ile bir arada tayini
Simultaneous determination of active components and additive components in pharmaceutical preparations by HPLC
Yazar: AYŞE ASLAN ÇAKIR
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM AKSU DÖNMEZ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada çeşitli şurup preparatlarında etken madde olarak kullanılan efedrin hidroklorür ve guaifenesin ile katkı maddeleri olarak kullanılan metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarinin bir arada tayini için gradient HPLC yöntemi geliştirildi. Yöntemin optimizasyonu 4 faktörlü, 3 seviyeli Box-Behnken tasarımı kullanılarak yapıldı. Faktör olarak pH, akış hızı, hareketli faz oranı ( tetrabütil amonyum hidroksit(TBAH) içeren fosfat (H2PO4-/HPO42-) tamponu ve metanol çözücü sisteminde % fosfat tamponu) ve %TBAH   miktarları seçildi. Seviyeler pH için 6,5-7,0-7,5; akış hızı için 0,6-0,8-1,0, %fosfat tamponu için 45-50-55 ve %TBAH için ise 0,1-0,2-0,3 olarak belirlendi. Faktörlerin düşük seviyeleri için (–1), orta seviyeleri için (0) ve yüksek seviyeleri için (+1) kodları kullanıldı. Sırası rastgele belirlenen toplam 27 deney yapıldı. HPLC kromatogramındaki piklerin ayırma gücü üzerine bu faktörlerin hem kendi başlarına hem de birbirleri ile olan etkileşimlerinin etkileri incelendi.  Optimizasyon tasarımı ile elde edilen verilere regresyon analizi yapıldı. ANOVA yapılarak sonuçların doğruluğu test edildi. Yapılan çalışmalarda pH , akış hızı ve hareketli faz oranı  ile hareketli faz oranı ve pH'nın ikinci dereceden etkilerinin ayırma gücü üzerinde etkili olduğu görüldü.   Regresyon sonuçları kullanılarak ayırma gücüne ait matematiksel bir model elde edildi. Elde edilen modelden teorik ayırma gücü değerleri bulundu. Modelin uygunluğunu test etmek için teorik ayırma gücü değerleri ile deneysel ayırma gücü değerleri arasındaki ilişki incelendi. Regresyon katsayısı 0,9195 olarak bulundu ve modelin uygun olduğuna karar verildi.
Modele göre kromatografik şartlar; hareketli fazın pH'sı 6,5; oranı ve bileşimi  % 0.15 TBAH içeren  fosfat tamponu/metanol (52:48); akış hızı 0,6 mL/dak olarak belirlendi. Gradient program 0-8,5 dak. %52 fosfat tamponu, 8,5-25 dak. %40 fosfat tamponu olacak şekilde uygulandı. Belirlenen bu şartlarda maddelerin kromatogramları 210 nm'de spektrofotometrik dedektör kullanılarak kaydedildi.
Geliştirilen yöntemin validasyonu doğrusallık, tekrarlanabilirlik, doğruluk (% geri kazanım), tanıma- tayin sınırı (LOD-LOQ) ve dayanıklılık parametreleri incelenerek yapıldı. Doğrusallık için yapılan çalışmalarda regresyon katsayıları (R2) efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarin için sırasıyla 0,9981; 0,9995; 0,9994; 0,9970; 0,9993;  0,9999 olarak bulundu. Efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarin için güniçi tekrarlanabilirlik testlerinde %RSD değerleri sırasıyla; 0,56-1.62; 0,09-0,89; 1,20-1,60; 0,40-099; 0,59-1,02; 0,77-1,60, günlerarası tekrarlanabilirlik testlerinde ise %RSD değerleri yine sırasıyla 0,78-1,89; 1,02-1,9; 1,44-1,88; 0,80-1,34; 0,98-1,20 1,32-1,85 aralığında bulundu. Doğruluk için, incelenen maddeleri içeren örnek çözeltisi, içine 3 farklı konsantrasyonda efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarin ilave edilerek analiz yapıldı. Sırasıyla   %100,86-%102,50; %96,47-%101,22;  %99,00-%101,20; %99,67-%101,80; %95,00-%99,80; %100,70-%102,58 aralığında geri kazanım değerleri elde edildi. Efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarin  için sırası ile tanıma sınırı; 0,25; 0,02; 0,18; 0,12; 0,11; 0,008 μg/ mL, tayin sınırı;  0,83; 0,07; 0,60; 0,40; 0,38; 0,03 μg/ mL olarak hesaplandı. Çözeltilerin stabilitelerini incelemek amacıyla çalışılan maddeler su ve hareketli faz içerisinde, oda sıcaklığında ve 4Co'de belli sürelerde bekletilerek analiz edildi. 
Efedrin hidroklorür, guaifenesin, metil paraben, propil paraben, ponso 4R ve sakarinin   bir arada analizi için geliştirilen HPLC yöntemi Brodil ve Broksin adlı şurup preparatlarına  başarıyla uygulandı. Bu preparatların 1,044 - 1,320 mg/mL metil paraben, 0,139 mg /mL propil paraben, 0,153-0,154 mg/mL ponzo 4R ve 3,223-5,095 mg /mL sakarin içerdiği saptandı. Etken maddeler için 99,39-103,82 aralığında % geri kazanım değerleri bulundu.

Abstract:
In this study, a gradient HPLC method was developed for simultaneous analysis of ephedrine hydrochloride, guaiphenesin used as active ingredients and methylparaben, propylparaben, ponceau 4R, saccharin used as additives in various syrup preparations. The optimization process was carried out using 3 levels 4 factors Box-Behnken design. pH, flow rate, mobile phase ratio (ratio of phosphate buffer (H2PO4-/HPO42-) in mobile phase system consisted of phosphate buffer containing tetrabutylammoniumhydroxid(TBAH) and methanol) and TBAH%  were selected as  factors. The levels were determined as pH 6,5-7,0-7,5, flow rate 0,6-0,8-1,0, phosphate buffer %  45-50-55 and TBAH% 0,1-0,2-0,3. The codes; -1, for low, 0, for middle, and +1, for high levels of the factors were used. 27 experimental runs were randomly carried out. Effects of these factors and the interactions between them on resolution between peaks in HPLC chromatogram were analyzed. Regression analysis was performed on data obtained by the optimization design. ANOVA was performed to test reliability of the results. In studies, it was determined that pH (A), flow rate (B), mobile phase ratio (C) and   quadratic contribution of mobile phase ratio and pH (AA and CC) can influence the resolution significantly.  A mathematical model related to resolution was obtained using regression results. According to the data obtained a model was created with respect to the resolution . Theoretical resolution values were obtained from the model. The relationship between these values and the experimental values has been examined to test the suitability of the model. Regression coefficient was found 0,9195 and it was decided that the model is appropriate. 
According the model chromatographic conditions were found as   pH 6,5; flow rate 0,6 mL min-1  and the mobile phase system phosphate buffer (pH = 6.5) containing  0.15 % TBAH/ methanol (52:48). Gradient programme was applied that 0-8,5 min. %52 phosphate buffer; 8,5-25 min. %40 phosphate buffer. 
Chromatograms of the substances at the determined conditions were recorded by using spectrophotometric detector at 210 nm.
Analytical method validation was made by the examination of  linearity, repeatability, accuracy(Recovery %), limit of quantification-limit of detection and stability parameters. In studies for linearity, the regression coefficients (R2)  for ephedrine hydrochloride, guaiphenesin, methylparaben, propylparaben, ponceau 4R and saccharin were found  0,9981; 0,9995; 0,9994; 0,9970; 0,9993;  0,9999 respectively. The RSD% values of  the intra-day repeatability analysis for ephedrine hydrochloride, guaiphenesin, methylparaben, propylparaben, ponceau 4R, saccharin  were found 0,56-1.62; 0,09-0,89; 1,20-1,60; 0,40-099; 0,59-1,02; 0,77-1,60 and inter-day repeatability analysis were found 0,78-1,89; 1,02-1,90; 1,44-1,88; 0,80-1,34; 0,98-1,20 1,32-1,85 respectively. In order to calculate accuracy, analyses were performed by the addition of 3 different concentrations of ephedrine hydrochloride, guaiphenesin, methylparaben, propylparaben, ponceau 4R and saccharin, into the examined samples which contain the substances. The recovery percentage values were obtained respectively, %100,86-%102,50; %96,47-%101,22;  %99,00-%101,20; %99,67-%101,80; %95,00-%99,80; %100,70-%102,58. The limit of detection values were calculated as 0,25; 0,02; 0,18; 0,12; 0,11; 0,008 μg/ mL,  and the limit of quantification values were calculated as ;  0,83; 0,07; 0,60; 0,40; 0,38; 0, μg/ mL  for ephedrine hydrochloride, guaiphenesin, methylparaben, propylparaben, ponceau 4R and saccharin. In order to determine stabilities of the solutions of substances, they were analyzed both in water and the mobile phase and both at 40C and room temperature.
The developed HPLC method for the simultaneous determination of ephedrine hydrochloride, guaiphenesin, methylparaben, propylparaben, ponceau 4R and saccharin was applied to Brodil and Broksin syrup preparations, successfully. It was determined that these samples contain 1,044 -1,320mg/ mL methylparaben, 0,139 mg/ mL propylparaben, 0,153-0,154 mg/ mL ponceau 4R, 3,223-5,095 mg /mL saccharin. The RSD% values for the active componenets were found between 99,39-103,82 from the sample analysis.