Melatonin´in mikroglial hücrelerde inflamazom aktivasyonu üzerine etkisi
The effects of melatonin on inflammasome activation in  microglial cells
Yazar: BURAK İBRAHİM ARIÖZ
Danışman: PROF. DR. ŞERMİN GENÇ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı / Temel Sinirbilimler Bilim dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Adenozin trifosfat = Adenosine triphosphate ; Hücre ölümü = Cell death ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Melatonin = Melatonin ; Nöroglia = Neuroglia ; İnflamazom = Inflammasome

Özet:
Doğal bağışıklık sistemi vücuda giren patojenik mikropların hızlı bir şekilde tanınıp
tayin edilmesinde görevlidir. Gerek membrana bağlı gerekse sitozolik reseptörler bu süreçte
görev almaktadır. İnflamazom aktivasyonu klasik inflamatuar yanıtlardan farklıdır. Mikrobiyal
ajanların yanı sıra metabolik stres ürünlerinin (ürik asit, ATP gibi) ve asbestos, silika gibi dışsal
ajanların inflamazom aktivasyonuna neden olduğu bilinmektedir. İnflamazom aktivasyonu,
inflamatuar yanıtların başlatılmasında rolü olan bir süreçtir. Aktivasyon hücreden IL-1β, IL-18
sitokinlerinin salınımı ve Kaspaz-1 aktivasyonu ile sonlanır. Buna bağlı olan inflamazom
başlangıcı ise inflamatuar yanıtların harekete geçirmesi suretiyle piroptotik hücre ölümüne yol
açar. Bu nedenle inflamazom aktivasyonunun baskılanması gereklidir.
Melatonin (MEL) sitoprotektif ve aynı zamanda anti-inflamatuar bir moleküldür. Bu
projede MEL'in N9 mikroglial hücre hattında inflamazom aktivasyonuna etkisinin incelenmesi
amaçlanmıştır. Projemizde N9 mikroglia hücrelerine LPS ve ATP verilerek inflamazom
aktivasyonu sağlanmıştır. MEL'in inflamazom modelinde etkisi N9 mikroglial hücrelerde
incelenmiştir. IL-1β, IL-18 ve Kaspaz-1 seviyeleri ELISA ve Western Blot yöntemleriyle;
Hücre canlılığı WST-8 testi ile; Hücre toksisitesi LDH testiyle; Piroptotik ölüm PI boyamayla;
Mitokondrial bütünlük ve süperoksit üretimi Mitosox ve JC-1 boyamayla; IL-1β, IL-18 ve
NALP3 gen seviyelerindeki değişim rtPCR yöntemiyle bakıldı.
Çalışmamızda, MEL, LPS ve ATP ile IL-1β, IL-18 ve NLRP3 için protein ve gen
düzeyindeki artışı istatistiksel anlamlılıkla önlemiştir. LDH ve WST testleriyle MEL'in, LPS
ve ATP ile artan inflamazom aktivasyonuyla oluşan hücre ölümü üzerinde istatistiksel olarak
anlamlı azaltıcı etkisi saptandı. Bunlara ek olarak uyaran ile artan mitokondrial ROS ve
mitokondrial bütünlük bozulması LPS+ ATP grubuna göre MEL verildikten sonra yine
istatistiksel anlamlılıkla azaldığı gözlemlendi. Sonuçlarımız MEL'in N9 mikroglial hücrelerde
NLRP3 inflamazom aktivasyonunu baskıladığını ortaya koymuştur.
Bu çalışma MEL'in mikroglial hücrelerde inflamazom aktivasyonunu baskılaması
üzerine etkili olduğu kanıtlayan ilk çalışmadır.
Anahtar kelimeler: Melatonin, mikroglia, inflamazom, piroptoz, LPS, ATP

Abstract:
The natural immune system is responsible for the rapid identification and identification
of pathogenic microbes entering the body. Both membrane-bound and cytosolic receptors are
involved in this process. Inflammatory activation is different from classical inflammatory
responses. In addition to microbial agents, metabolic stress products (such as uric acid, ATP)
and exogenous agents such as asbestos and silica are known to cause inflammatory activation.
Inflammatory activation is a process that has a role in the initiation of inflammatory responses.
Activation results in the release of IL-1β, IL-18 cytokines and activation of Caspase-1 in the
cell. Inflammatory activation may also result in inflammation of the inflammatory response, as
well as pyrogenic death of the cell. Therefore, suppression of inflammatory activation is
necessary.
Melatonin (MEL) is a cytoprotective and anti-inflammatory molecule at the same time.
In this project, it is aimed to investigate the effect of MEL on N9 microglial cell line for
inflammatory activation. In our protocol, N9 microglia cells were given LPS and ATP to
activate inflammation. The effect of MEL in the inflammatory model was examined in N9
microglial cells. IL-1β, IL-18 and Caspase-1 levels by ELISA and Western Blot methods; Cell
viability was assessed by WST-8 test; Cell toxicity by LDH assay; Piroptopic cell death with
PI staining; Mitochondrial integrity and superoxide production Mitosox and JC-1 staining;
Changes in IL-1β, IL-18 and NALP3 gene levels were assessed by rtPCR.
In our study, the increase in protein and gene levels for IL-1β, IL-18 and NLRP3 with
MEL, LPS and ATP was statistically significant. LDH and WST tests showed statistically
significant reductions in cell death due to increased inflammation of MEL, LPS and ATP. In
addition, increased mitochondrial ROS and mitochondrial integrity deterioration with stimuli
were observed to decrease with statistical significance after administration of MEL according
to LPS + ATP group. Our results demonstrate that MEL suppresses NLRP3 inflammatory
activation in N9 microglial cells. This is the first study to demonstrate that MEL is effective on
suppressing inflammatory activation in microglial cells.
Keywords: Melatonin, microglia, inflammasome, piroptosis, LPS, ATP