Meme kanserine karşı hibridoma teknolojisine dayalı poliklonal antikor üretilmesi
Production of polyclonal antibodies against breast cancer based on hybridoma technology
Yazar: ATIFCAN DEMİRCİOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. MALAHAT BAGHIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Meme kanseri =   ; Poliklonal antikor = Polyclonal antibody

Özet:
Dünya'da kalp damar hastalıklarından sonra kanser ikinci sırada yer alır. Dünya sağlık örgütünün yayınladığı verilere göre sadece 2018 yılında 18 milyon insanda kanser tespit edilmiştir. Bu vakaların yaklaşık  2 milyonu meme kanseri oluşturur. Monoklonal antikorlar tanı ve tedavide yüksek spesiviteye sahip olmalarına rağmen bu spesivite tek epitop bölgesine bağlanabildikleri için poliklonal antikorlar ile karşılaştırıldıklarında  düşük avidite sonuçlarıyla karşılaşılmaktadır. 
Literatürde hibridoma teknolojine dayalı çalışmalarda meme kanseri hücrelerinden farklı yöntemlerle antijenin hazırlanmasına yönelik  (sonikasyon, dondurma-çözme, otoklavlama) çalışmalar bulunsa da bunların farklı adjuvanlar ile formülasyonlarının immün yanıt oluşturmasının karşılaştırılmasına yönelik çalışmaya rastlamadık.  Tez çalışmasının amacı insan meme kanser hücresinden farklı yöntemlerle antijenin hazırlanması ve farklı adjuvanlar ile kombinasyonlarının geliştirilmesi tanı ve tedavide kullanılmak üzere hibridoma teknolojine dayalı poliklonal antikorların üretilmesidir. 
Poliklonal antikorların üretilebilmesi için, MCF-7 kültürü yapılarak bu hücrelerden sonikasyon, dondurma-çözdürme, otoklavlama yöntemleri lizatlar hazırlandı. Bu lizatlarda bulunan antijenler ile Polioksidonyum ve Freund komple adjuvanı karıştırılarak Balb/C tipi fareler immünize edildi.  İmmünizasyonların ardından deneklerden elde edilen serumlardan ELİSA ile antikor titreleri tayin edildi. Tayinin ardından deneklerin dalaklarından izole edilen B hücreleri ile AG-8 hücreleri füzyona uğratılarak hibridomalar elde edildi ve bu hibridomaların antikor üretimi gerçekleştirdikleri ELİSA testi ile tespit edilip Herceptin İle karşılaştırıldı.
Sonikasyon ile elde edilen antijen miktarının, dondurma çözme ile üretilen antijen miktarından %50 daha fazla, otoklavlama ile elde edilen antijen miktarından ise 8 kat daha fazla antijen sağladığı, Makrofaj Nitrik Oksit Kültür Sistemi testinde tek başına antijen kullanımının etkisiz olduğu, Freund komple adjuvanı veya Polioksidonyum adjuvanının kullanılması gerektiği gözlenmiştir. Formülasyonların immünizasyonu sırasında 6. immünizasyona kadar sonikasyon metoduyla hazırlanan antijenlerin dondurma çözme yöntemiyle hazırlanan antijenlere nazaran ortalamada 1.5 kat daha hızlı sonuç verdiği, otoklavla ile hazırlanan antijenlere nazaran ise 2 kata kadar daha hızlı sonuç verdiği tespit edilmiştir. Üretilen hibridomalardan elde edilen antikorların ise beklenildiği gibi monoklonal antikorlara nazaran 2 kata kadar daha yüksek aviditeye sahip olduğu ELİSA sonuçları ile gözlenmiştir.

Abstract:
Cancer second important diasease after cardiovascular diseases in the world. According to the data published by the World Health Organization, cancer was detected in 18 million people in 2018 alone. Approximately 2 million of these cases was breast cancer cases. Monoclonal antibodies have high specificity in diagnosis and treatment, low avidity results are encountered when compared with polyclonal antibodies,  since they can bind to a single epitope region to compared multiple epitope.
Although there are studies in the literature on the preparation of antigens from breast cancer cells by different methods (sonication, freezing-thawing, autoclaving) in studies based on hybridoma technology, we did not find any study to compare the immune response of their formulations with different adjuvants. The aim of this thesis is to prepare the antigen from human breast cancer cells with different methods and to use their combinations with different adjuvants to produce polyclonal antibodies based on hybridoma technology for use in diagnosis and treatment.
In order to produce polyclonal antibodies, MCF-7 cells cultured and lysates were prepared from these cells by sonication, freezing-thawing, autoclaving methods. Balb / C type mice were immunized by mixing the antigens contained in these lysates with Polyoxidonium and Freund's complete adjuvant. Antibody titers were determined by ELISA from the sera obtained from Balb/c mices after the immunizations. After the determination of anti-MCF-7 sera antibodies, hybridomas were obtained by fusing AG-8 cells and B cells isolated from the spleens of Balb/c mice, and these hybridomas (antiMCF-7 polyclonal antibody producting hibridomas) were controlled by ELISA tests that produced antibodies and compared with Herceptin.
As result the amount of antigen obtained by sonication provides 50% more antigen than the amount of antigen obtained by freezing and thawing and 8 times more than the amount obtained by autoclaving, At the Macrophage Nitric Oxide Culture System test shown, the use of antigen alone is ineffective, Freund's complete adjuvant or Polyoxidonium adjuvant should be used in formulations. During the immunization of the formulations, it was determined that the antigens prepared by sonication method until the 6th immunization gave results 1.5 times faster than the antigens prepared by freezing and thawing method, and up to 2 times faster than the antigens prepared by autoclave. It was observed with ELISA results that polyclonal antibodies obtained from the produced hybridomas have up to 2 times higher avidity compared to monoclonal antibodies as expected.