Sıçanlarda siklofosfamide bağlı ovaryan toksisitede yağ dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin pten/akt/foxo3a yolağına etkisi
The effect of adipose tissue derived mesenchymal stem cells on pten/akt/foxo3a signaling pathway cyclophosphamide induced ovarian toxicides in rats
Yazar: ÖZEN ÖNAL
Danışman: PROF. DR. GÜLÇİN METE
Pamukkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology
Dizin: Kök hücreler = Stem cells ; Over = Ovary ; Over yetmezliği-prematür = Ovarian failure-premature ; Overyan folikül = Ovarian follicle ; Siklofosfamid = Cyclophosphamide ; Sıçanlar = Rats ; Toksisite = Toxicity

Özet:
GİRİŞ:Günümüzde birçok kanserin tedavisinde kemoterapi ve radyoterapinin yaygın olarak kullanılmaya başlanması ile kanser hastalarının 5 yıllık yaşam süresi artmıştır. Ancak uygulanan bu tedavilerin toksik etkileri yüzünden hastalar tedavi sonrasında bazı tıbbi sorunlar ile karşı karşıya kalmakta ve yaşam kaliteleri düşmektedir. Önemli bir konu da bu tedavilerin uygulandığı genç hastalarda üremeyi korumaya yönelik işlemlerdir. Alkilleyici grubu kemoterapotiklerden olan Siklofosfamid pekçok kanserin tedavisinde yaygın olarak kullanılmakta ve genital organlar üzerine olan toksik etkileri yüzünden infertiliteye neden olmaktadır. Siklofosfamid (CTX) kullanımı ile ovaryum rezervini temsil eden primordiyal foliküllerin kitlesel kaybı olur ve böylece prematür ovaryan yetmezlik gelişir. Daha önce yapılan çalışmalarda PTEN/AKT/FOXO3a yolağının primordiyal foliküllerin gelişimi ve hayatta kalımı ile ilişkili olduğu belirtilmiştir. Ayrıca Siklofosfamidin bu sinyal yolağı üzerinden primordiyal foliküllerin aktiflenmesine yol açarak ovaryum rezervinin yok olmasına neden olduğu bilinmektedir. Biz bu çalışmada siklofosfamidin ovaryuma olan toksik etkisine karşı mezenkimal kök hücrelerin tedavi edici etkisini ve PTEN/AKT/FOXO3a yolağı üzerine olan rolünü araştırmayı amaçladık.
GEREÇ-YÖNTEM:Bu çalışmada, toplam 18 adet, 8 haftalık, 150±15 gram ağırlığındaWistar Albino cinsi dişi sıçan üzerinde çalışıldı. Sıçanlar rastgele seçilerek 3 gruba ayrıldı. Grup1: Siklofosfamid grubu (CTX,n=6), Grup 2: Siklofosfamid+Mezenkimal Kök Hücre grubu (CTX+KH, n=6) Grup 3: Kontrol grubu (K, n=6) olarak 3 grup oluşturuldu. Grup 1 ve Grup 2' ye ilk gün 50 mg/kg siklofosfamid intraperitoneal verildi ve aynı gruplara takip eden 13 gün boyunca günlük 8mg/kg siklofosfamid enjekte edildi. Daha sonra sadece Grup 2'ye siklofosfamid enjeksiyonunun son gününden 2 gün sonra yağ dokudan elde ettiğimiz mezenkimal kök hücreleri (Herbir overe 50.000 mezenkimal kök hücreyi 0.05ml FBS içerisinde) cerrahi yöntemle direk sıçanların her iki ovaryumuna enjekte edildi.                                                           
Kök hücre enjeksiyonundan 8 hafta sonra tüm sıçanların ovaryumlarını çıkarılarak rutin ışık mikroskop takibi yapıldı. Parafin bloklardan 3 µm luk kesitler alınarak  Hematoksilen&Eozin ile  boyandı. PTEN, pPTEN, AKT, pAKT, FOXO3a ve pFOXO3a ekspresyonları İmmnohistokimyasal ve Western blot  yöntemiyle incelendi.
BULGULAR: Siklofosfamidin ovaryum dokusunu hasara uğrattığı ve  normal yapılı  follikül sayısının azalttığı gözlemlenmiştir. CTX+ Kök hücre verilen grupta Siklofosfamidin neden olduğu hasarın engellediğini izlendi. Aynı zamanda CTX+kök hücre grubunda pAKT ve pFOXO3a ekspresyonlarının kuvvetli pozitif olduğunu belirlendi. Follikül sayımı sonucunda primordial folliküller en az grup 1 (CTX) ve grup2' de (CTX+KH grubu) (p=0,936) bulunurken sekonder ve tersiyer follküller grup 1' e (CTX grubu) karşın grup 2' de (CTX+KH grubu) oldukça fazla sayıda olduğu belirlendi (p=0,007, p=0,002).
TARTIŞMA ve SONUÇ: Siklofosfomid PTEN/AKT/FOXA3a yolağına etki etmemekte ancak ovaryumda ciddi hasara neden olmaktadır. Kök hücre uygulaması ise bu hasarı azaltmakta aynı zamanda pAKT ve pFOXA3a ekspresyonunu aktifleyerek primordial follikülün primere farklanmasına neden olmaktadır. Kök hücre ugulaması primordial follikül havuzu negatif etkilemekle birlikte ovulasyona giden sağlıklı antral follkül sayısını arttırmaktadır.

Anahtar kelimeler: Siklofosfamid, Prematür Ovaryan Yetmezlik, PTEN/AKT/FOXO3a, Mezenkimal Kök Hücreler

Abstract:
INTRODUCTION: Today, the widespread use of chemotherapy and radiotherapy in the treatment of many cancers has increased the life span of cancer patients for 5 years but due to the toxic effects of these treatments, the patients are faced with some medical problems and their quality of life decreases. An important issue is the protection of young patients's fertility in the treatment of these diseases. Cyclophosphamide, an alkylating group of chemotherapeutics, is widely used in the treatment of many cancers and causes infertility due to toxic effects on the genital organs. The use of cyclophosphamide results in the massive loss of primordial follicles that represent the ovarian reserve, therefore ovarian toxicity and premature ovarian failure develop. Previous studies have suggested that the PTEN / Akt/ Foxo3a pathway is associated with the development and survival of primordial follicles.It is also known that cyclophosphamide leads to the activation of primordial follicles via this signal pathway, thus destroying the ovarium reserve. In this study, we aimed to investigate the restorative effect of mesenchymal stem cells against the toxic effect of cyclophosphamide on the ovary and its effect on the PTEN / AKT / FOXO3a pathway.

MATERIAL-METHOD: In the study, a total of 18, 8 weekly, Wistar Albino female rats weighing 150 ± 15 grams were studied. Rats were randomly selected and divided into3 groups. There groups were formed: Group 1: Cyclophosphamide group (6 rats), Group 2: Cyclophosphamide + Mesenchymal stem cell, Group 3: Control group (6 rats).Group 1 and Group 2 were injected intraperitoneally with 50 mg / kg Cyclophosphamide on the first day and 8 mg / kg Cyclophosphamide was injected daily for the following 13 days in the same groups. 15 days after the first day of cyclophosphamide injection, we injected adipose tissue derived mesenchymal stem cells (50,000 mesenchymal stem cells in 0.05ml FBS per ovary) in Group 3 directly into both ovaries of the rats directly by surgical procedure.After 8 weeks from the injection, we removed the ovaries of the rats and sacrificed all the rats. Histologic sections of the ovaryes were Hematoxylin&Eosin stained. In addition, PTEN, pPTEN, AKT, PAKT, FOXO3a and pFOXO3a antibodies were studied by immunohistochemistry and western blot methods.

RESULTS: Cyclophosphamide was cause deterioration of integrity destroys the ovarian tissue and reduces the number of normal follicles. We observed that damage caused by cyclophosphamide was inhibited the in the CTX + stem cell given group. We also found that the expressions of pAKT and pFOXO3a in the CTX + stem cell group were strongly positive. The mean primordal follicle count was lowest in Group 1 (ctx group) and group 2 (ctx+ mesenchymal stem cell) and the mean primordial follicle counts were higher in Groups 3 (control group) than in Group 1, 2. But secondary and tersiyer follicle higher in group 2 and 3 than group1 (p=0,007, p=0,002 sırasıyla)

DİSCUSSION and CONCLUSION: CTX did not effect on  PTEN / AKT / FOXO3a pathway but causes degeneration in the ovarium. In the case of stem cell application, reducing this damage also activates the expression of pAKT and pFOXA3a leading to primordial follicle differentiation in primaries. Stem cell application is to increase the number of antral follicles in the health to the ovulation while affecting the primordial follicle pool negatively.

Key Words: Cyclophosphamide, Premature Ovarian Insufficiency, PTEN / AKT / FOXO3a, Stem Cells