Sülforafan'ın n9 fare mikroglia hücrelerinde nlrp3 inflamazom aktivasyonuna ve inflamazom ile indüklenen hücre ölümüne etkisi
The effects of sulforaphane on nlrp3 inflammasome activation and inflammasome activated cell death in n9 murine microglial cells
Yazar: KAMER BURAK İŞCİ
Danışman: PROF. DR. KEMAL KÜRŞAD GENÇ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı / Temel Sinirbilimler Bilim dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Hücre ölümü = Cell death ; Nöroglia = Neuroglia ; Sülforafan = Sulforaphane ; İnflamazom = Inflammasome ; İzotiyosiyanat = Isothiocyanate

Özet:
NLRP3 inflamazomu, kaspaz-1 proteinini aktif eden ve proinflamatuar sitokinler olan IL-1β ve IL-18'i cevap olarak salgılanmasına neden olan bir multiprotein kompleksidir. Sülforafan ise anti-inflamatuvar ve anti-oksidan etkileri bilinen bir izotiyosiyanattır. Bu çalışmadaki amaç, Sülforafanın mikroglial hücrelerde inflamazom aktivasyonuna ve inflamazom aktivasyonu ile indüklenen hücre ölümüne etkisinin incelenmesidir.
Bu çalışmada N9 fare mikroglia hücre hattı kullanılmıştır. Hücre ölümü Laktat Dehidrojenaz (LDH) ve [2-(4-iyodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disülfofenil)-2H-tetrazolyum tuzu redüksiyonu (WST) testleri ile, apoptoz ise Cell Death ELISA kiti ve Akım sitometresi ile değerlendirilmiştir. Kaspaz-1 aktivitesi, Ac-DEVD-pNA substratı ile analiz edilmiştir. İnflamatuar sitokinlerin (IL-1β ve IL-18) protein seviyeleri  ELISA yöntemi ile, sitokinlerin ve NLRP3 hedef genlerinin mRNA seviyeleri ise qPCR yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir. Kapsaz-1, NLRP3 ve IL-1β protein seviyeleri Westernblotting yöntemi ile belirlenmiştir. 
Çalışmamızda inflamazom aktivasyonu parametrelerinden olan sitokin salınımlarına bakıldı, LPS ve ATP ile IL-1β ve IL-18'de gözlenen artış, SFN preinkübasyonu ile istatistiksel olarak anlamlı şekilde azalma gösterdi. Daha sonra bu sitokinler ve NLRP3 inflamazom kompleksinin mRNA düzeyinde bakıldığında benzer sonuçlar gözlendi. Aynı yolakta bulunan kaspaz-1 proteininin seviyesi de LPS ve ATP ile artış gösterirken SFN ile bu artışta azalma gözlendi. İnflamazom aktivasyonu parametrelerinden olan ROS miktarı ve mitokondrial bütünlük bozunması, ölçüldüğünde LPS ve ATP  ile artan ROS miktarında SFN'nin baskılayıcı etkileri gözlendi. LPS ve ATP hücre ölümünü arttırırken, SFN ön uygulaması, hücre ölümünü azaltıcı etki gösterdi. Oluşan hücre ölümünün apoptotik olmadığı ve piroptotik hücre ölümünün SFN ile azaldığı gözlendi. Son olarak NLRP3 kompleksinin oluşmasında ASC molekülünün speck oluşumlarının LPS ve ATP ile arttığı ve bu artışın SFN ile azaldığı gösterildi.

Abstract:
NLRP3 inflammation is a multiprotein complex that activates caspase-1 protein and causes secretion of IL-1β and IL-18, which are proinflammatory cytokines, in response. Sulforaphane is an isothiocyanate known to have anti-inflammatory and anti-oxidant effects. The aim of this study is to investigate the effect of sulforafane on inflammasome activation in inflammasome activated microglial cells and cell death induced by inflammasome and the mechanism of this effect.
	N9 murine microglia cell line was used in this study. Cell death was assessed by Lactate Dehydrogenase (LDH) and [2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H- tetrazolium salt reduction (WST), ELISA kit and flow cytometer. Caspase-1 activity was analyzed by Ac-DEVD-pNA substrate. Protein levels of inflammatory cytokines (IL-1β and IL-18) were analyzed by ELISA and mRNA levels of cytokines and NLRP3 target genes were analyzed using the qPCR method.
	In our study, cytokine secretion was first measured in the parameters of inflammatory activation, and the increase in IL-1β and IL-18 with LPS and ATP was reduced by SFN preincubation. A similar result was observed when mRNA levels of these cytokines and NLRP3 inflammasome complex were examined. At the same time, the level of caspase-1 protein in the pathway was increased by LPS and ATP, while this decrease was further observed by SFN. The amount of ROS and mitochondrial integrity depolarization, when measured, had constructive effects on SFN. Finally, the formation of the NLRP3 complex has been shown to be enhanced by LPS and ATP and by increased SFN in the ASC molecule.