Denizhıyarı özütünün anti-tümör etkileri ve geleneksel kemoterapik ilaçlarla sinerjistik etkileşiminin araştırılması
Anti-tumor effects of sea cucumber extract and investigation of synergistic interaction with traditional chemotherapic drugs
Yazar: NURAY ARSLAN
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Kanser, hücrelerin kontrolsüz bir şekilde çoğalması ile karakterize edilen ve dünyadaki başlıca sağlık problemlerinin başında gelen hastalıklardan biridir. Bu nedenle, hem güvenli hem etkili antikanser ajanlarının geliştirilmesi kaçınılmazdır.  Kanser tedavisindeki temel problem geliştirilen ilaçların toksik etkisidir. Bunun için girişimlerin çoğu anti-kanser ilaçlarla kombinasyonunda sinerjistik etkili olan besin kaynaklarının ve fitoterapik ajanların araştırılmasına yönelmiştir. Bitki veya denizel organizmalardan elde edilen özütlerin geleneksel kemoteröpatik ajanlarla kombinasyonu kanser tedavisinde etkiyi arttırmaktadır. Farklı coğrafik bölgelerden ve farklı denizhıyarı türlerinden yeni anti-kanser bileşiklerin tanımlanması için önemli bir potansiyel bulunduğu bilinmektedir.  Bu nedenle, bu çalışmada, Gökova körfezinden toplanan Holothuria sanctori türünden elde edilen özütlerin anti-tümör etkilerinin çeşitli kanser hücreleri üzerinde etkisinin araştırılması ve bu özütlerin kullanımda olan ticari kanser ilaçları (cisplatin, docetaxel) ile sinerjistik etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Holothuria sanctori'nin aseton (HSA) ve metanol (HSM) ile hazırlanan özütlerinin A549 ve PC-3 hücreleri üzerinde sitotoksik etkileri ve mekanizmaları araştırılmıştır. HSM ve HSA özütlerinin 24, 48 ve 72 saatlerdeki inkübasyon sürelerinde doz ve zamana bağlı olarak sitotoksik aktivitelerine bakıldığında; Holothuria sanctori aseton ve metanol özütlerinin A549 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisinin doza ve zamana bağlı olarak değiştiği; en etkili doz –zaman ikilisinin 72 saat ve 20 mg/ml'lik dozlar olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, her iki özütün de en etkili olduğu 72 saat inkübasyon sonrasında IC50 değerleri karşılaştırıldığında, HSA'nın (1.7 mg/ml) daha düşük dozlarda daha yüksek etki gösterdiği gözlenmiştir. PC-3 hücre hattı için ise; HSM ve HSA ile hazırlanan özütlerin zamana bağlı olarak sitotoksik etkilerinin arttığı söylenebilir. Aynı zamanda, HSM ve HSA özütlerinin sitotoksik etkilerinin PC-3 ve A549'a kıyasla sağlıklı hücre hattı olan HEK293 üzerinde daha az olduğu görülmüştür. Farklı konsantrasyonlardaki HSM özütüne maruz kalan A549 ve PC-3 hücrelerinde apoptotik hücre ölümü, Annexin-V kullanılarak gerçekleştirilen flow sitometri yöntemi ile belirlenmiştir. 
A549 hücrelerinde kaspaz-3 aktivitesinin kontrol hücreleri ile kıyaslandığında yaklaşık 2.1 kat; PC-3 hücrelerinde ise 1.9 kat arttığı belirlenmiştir. HSM özütünün A549 ve PC-3 hücre hattında apoptozu indüklediğini flow sitometri ve kaspaz-3 analizleri  ile gösterilmiştir. Holothuria sanctori' ye ait HSA ve HSM özütlerinin kanser tedavisinde yaygın olarak kullanılan cisplatin ve docetaxel ile kombinasyonlarının, etkileşimlerine bakıldığında, tüm etkileşimlerin antagonistik olduğu saptanmıştır. HPLC analizi ile HSM özütünün içeriğindeki fenolik bileşikler incelendiğinde, HSM özütünde en fazla bulunan fenolik bileşiklerin ellagic asit ve epicatechin olduğu tespit edilmiştir. Gelecek çalışmalar bu bireysel bileşiklerin kanser hücreleri üzerindeki etki mekanizmalarını belirleyecektir. Sonuç olarak, bu çalışma ile ekonomik değeri oldukça yüksek olan ve ülkemiz denizlerinde de yayılış gösteren bir denizhıyarı türü olan Holothuria sanctori'nin sitotoksik etkileri ve bu etkiye neden olan mekanizmalar aydınlatılmaya çalışılmıştır.

Abstract:
Cancer is one of the major health problems in the world, characterized by uncontrolled proliferation of cells. Therefore, the development of both safe and effective anticancer agents is inevitable. The main concern in cancer treatment is the toxic effect of the developed drugs. Most attempts have been directed to the search for synergistically effective nutrient sources and phytotherapeutic agents in combination with anti-cancer drugs. The combination of extracts from plant or marine organisms with conventional chemotherapeutic agents increases the efficacy in cancer treatment.  It is known that there is significant potential for the identification of new anti-cancer compounds from different geographic regions and different species of cucumber. Therefore, the main aim of this study was to investigate anti-tumor effects of extracts from a sea cucumber species Holothuria sanctori collected from Gökova Bay on various cancer cells and to investigate the synergistic effects of these extracts with commercial cancer drugs (cisplatin, docetaxel) in use. The cytotoxic effects and mechanisms of Holothuria sanctori extracts prepared with acetone and methanol on A549 and PC-3 cells were investigated. When the cytotoxic activities of HSM and HSA extracts in 24, 48 and 72 hours incubation periods were examined according to dose and time; The cytotoxic effect of Holothuria sanctori acetone and methanol extracts on A549 cells varies depending on dose and time; the most effective dose – time paired for 72 hours and 20 mg/ml. Furthermore, HSA (1.7 mg/ml) showed a higher effect at lower doses when IC50 values were compared after 72 hours incubation, where both extracts were most effective. For the PC-3 cell line; it can be said that the extracts prepared with HSM and HSA have increased cytotoxic effects over time. The healthy cell line HEK293; the cytotoxic effects of HSM and HSA extracts were found to be less than those of PC-3 and A549. It was determined by using flow cytometry method using Annexin V that HSM extract drains A549 cells to apoptosis. Apoptotic cell death was observed in PC-3 cancer cells exposed to different concentrations of HSM extract. The caspase-3 activity in A549 cells was approximately 2.1-fold compared to control cells; PC-3 cells increased 1.9 fold. It can be said that the HSM extract induces apoptosis in the A549 and PC-3 cell line and is consistent with the data obtained from flow cytometry analysis and MTT assay results. When the interaction of HSA and HSM extracts of Holothuria sanctori with cisplatin and docetaxel, which are widely used in cancer treatment, are examined; all interactions were found to be antagonistic. HPLC analysis revealed phenolic compounds in the HSM extract. According to this analysis, the most common phenolic compounds in the HSM extract are ellagic acid and epicatechin. Future studies will identify the mechanism of effects of each compound on these cancer cells. In conclusion, this is the first study elucidating the cytotoxic effects of Holothuria sanctori which has a high economic value and is widespread in the seas of our country.