Insan pankreas kanserinin biyoinformatik araçlar ile genom boyu ifade analizi
Genome wide expression analysis of human pancreatic cancer with bioinformatics tools
Yazar: LÜTFİYE KADIOĞLU DALKILIÇ
Danışman: DOÇ. DR. ABDULLAH ASLAN
Fırat Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Biyoinformatik = Bioinformatics ; DNA = DNA ; Gen ifadesi = Gene expression ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms ; RNA-haberci = RNA-messenger

Özet:
Pankreas kanseri, tanısı ve tedavisi oldukça zor olan, yüksek derecede metastatik özellikte olup oldukça kötü prognozlu ve sağkalım oranı düşük bir malignitedir. Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC), pankreas kanserleri içinde en sık görülen tip olup oldukça kötü prognoza sahip bir kanserdir. Bir yıllık sağ kalım oranı yaklaşık %18'dir. Hastalık, erken dönemde belirti vermediği için teşhis edildiğinde genellikle 3. veya 4. evrede olmaktadır. Erken teşhisin çok önemli olduğu bu tür patolojilerde, hastalık teşhisinden kısa süre sonra (6-12 ay) hasta kaybedilmektedir. Bu durumun en önemli sebebi, pankreas kanserinin erken teşhisinde kullanılabilecek invazif olmayan moleküler biyobelirteçler (genler) tespit edilememiş olması bundan dolayı da hastalığın genellikle ileri veya metastatik safhada tespit edilebilmesidir. Bu anlamda, pankreas kanseri tanısı konulmuş hastaların sadece %20 'si cerrahi rezeksiyon için uygunluk gösterir. Çünkü teşhis esnasında hastaların çoğunda lokal ve uzak metastaz görülür. 
Pankreas kanserinin teşhisinde kullanılabilecek invazif olmayan bir tarama testi yoktur. Pankreas kanserinde  CA 19-9, P53, K-ras ve mikro RNA'lar en sık incelenmiş ve pankreas kanseri ile ilişkilendirilmiş tümör markerlarıdır. Tanıda en çok tercih edilen CA 19-9 serum markırıdır. Ancak bu belirtecin pankreas kanserine spesifitesi ve hassasiyeti şüphelidir. Serum karbohidrat antijeni CA 19–9 (CA 19–9)  tümör ilişkili bir antijen olup, Lewis a-antijeni olarak da bilinir.  CA 19–9 normal şartlarda pankreas, safra kanalı hücreleri, mide, kolon, endometrium, tükrük bezleri ve bronşiyal epitelyum hücrelerinden salgılanır. CA 19–9, pankreas kanseri tanısında en yaygın olarak kullanılan tümör markeridir. CA 19–9, sadece pankreas adenokarsinomları için spesifik olmayıp gastrointestinal sistemin de neden olduğu birçok tümörde de yükselebilir. Aynı zamanda CA 19-9'un kan grubu antijenleri ile de  ilişkisi vardır. CA 19-9 sentezi genotip olarak Lewis a-b- olan kişilerde, oluşmaz. Bu nedenle bu hasta grubu yanlış sonuçlarla değerlendirilebilir. Son yıllarda yeni tümör markerları üzerine çalışmalar yapılmaktadır. Hücre çoğalması ve büyümesinde oluşan genetik değişikliklerin kanser gelişimindeki etkisi bilinmektedir. Onkogenlerin fonksiyonu, uyarılmasındaki artışı, tümör baskılayıcı  genlerin inhibe olması, DNA tamir mekanizmalarında  meydana gelen değişimler ve  apoptozdan sorumlu genlerdeki bozukluklar kanserin temel moleküler patolojisinden sorumludur. Diğer bir belirteç olan K-ras ise bir guanin nükleotid bağlanma proteini olarak büyüme faktörü sinyal iletiminde görev alır. Bu fonksiyonu ile hücre çoğalması artar ve apoptoza karşı direnç gelişir. K-ras insan kanserleri içerisinde en sık tespit edilen mutasyona uğramış onkogendir. Pankreatik duktal orijinli kanserlerin yaklaşık %90'ında K-ras onkogeninde mutasyon tespit edilir ve karsinogenezin özellikle ilk evrelerinde önem kazanır. K-ras mutasyonu sadece pankreas doku hücrelerinde değil, pankreatik sıvıda duodenal fırça biopsilerinde, kan ve gaita örneklerinde tespit edilebilir. 
Günümüzde pankreas kanserinin tanısında; Ultrason, EUS, CT, ERCP, MR ve ince iğne aspirasyonu kullanılmaktadır. Ancak bu yöntemler, hastalığın erken teşhisi için bir ipucu vermemektedir. 
Yaptığımız çalışmada öncelikle NCBI GEO DataSet veri bankasında bulunan transkriptom ham verileri kullanılarak in siliko analizler yapılmıştır. Bu analizlerde Pankreas kanseri ile normal doku ve kan örneklerinin ifade profilleri karşılaştırılmış ve bu iki grup arasında ifade düzeyi farklılık gösteren genler belirlenmiştir. Farklı veri setlerinden gelen bu gen listeleri kullanılarak Gene Set Enrichment Analysis, Hierarchical Cluster Analizleri ve Yolak Analizleri yapılmıştır. Bu biyoinformatik analizler sonucunda belirlenen aday gen listesinde bulunan genlerin validasyonu ise pankreas kanseri hastaların hem kan hem de tümör doku örnekleri kullanılarak QRT-PCR ile valide edilmiştir. Bu şekilde hem pankreas kanserinin oluşumunda hem de prognoz sürecinde rol oynayan moleküler mekanizmalar hakkında bilgi edinilmekte hem de pankreas kanserinin moleküler alt tipleri hakkında önemli veriler elde edilebilmektedir. Bu çalışmaların bazılarında bu kanserin 3 farklı moleküler alttipi olduğu bazılarında ise dört farklı moleküler alttipi olduğu ifade edilmiştir. Ancak bu konuda yapılan çalışmalar daha çok yeni olduğu için bu konuda yeterince veri bulunmamaktadır. Bundan dolayı gelecek açısından pankreas kanserine spesifik olan, invazif olmayan, klinik uygulamaya geçme potansiyeli yüksek doğru ve özgül olabilecek bir moleküler biyobelirtecin geliştirilmesi büyük önem arz etmektedir.

Abstract:
Pancreatic cancer is a highly metastatic malignancy with a very poor prognosis and low survival rate, which is difficult to diagnose and treat. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most common type of pancreatic cancer and is a cancer with a very poor prognosis. The one-year survival rate is approximately 18%. Since the disease does not show symptoms in the early period, it is usually in the 3rd or 4th stage when diagnosed. In such pathologies, where early diagnosis is very important, the patient is lost soon (6-12 months) after the diagnosis of the disease. The most important reason for this situation is that non-invasive molecular biomarkers (genes) that can be used in the early diagnosis of pancreatic cancer have not been detected, so the disease can usually be detected in the advanced or metastatic stage. In this sense, only 20% of patients diagnosed with pancreatic cancer are suitable for surgical resection. Local and distant metastases are seen in most of the patients at the time of diagnosis.
There is no non-invasive screening test that can be used to diagnose pancreatic cancer. In pancreatic cancer, CA 19-9, P53, K-ras and microRNAs are the most frequently studied and associated tumor markers with pancreatic cancer. CA 19-9 is the most preferred serum marker for diagnosis. However, the specificity and sensitivity of this marker to pancreatic cancer is questionable. Serum carbohydrate antigen CA 19–9 (CA 19–9) is a tumor-associated antigen, also known as Lewis a-antigen. CA 19-9 is normally secreted from cells of the pancreas, bile duct, stomach, colon, endometrium, salivary glands, and bronchial epithelium. CA 19–9 is the most commonly used tumor marker in the diagnosis of pancreatic cancer. CA 19–9 is not only specific for pancreatic adenocarcinomas, but may also be elevated in many tumors caused by the gastrointestinal tract. It is also associated with blood group antigens of CA 19-9. CA 19-9 synthesis does not occur in individuals with the genotype Lewis a-b-. Therefore, this patient group can be evaluated with false results. Again, CA 19-9 is not very sensitive in small pancreatic tumors. In recent years, studies on new tumor markers have been carried out. The effect of genetic changes in cell proliferation and growth on the development of cancer is known. The function of oncogenes, increase in their stimulation, inhibition of tumor suppressor genes, changes in DNA repair mechanisms and defects in genes responsible for apoptosis are responsible for the basic molecular pathology of cancer. Another marker, K-ras, as a guanine nucleotide binding protein, takes part in growth factor signal transduction. With this function, cell proliferation increases and resistance to apoptosis develops. K-ras is the most frequently detected mutated oncogene in human cancers. Mutations in the K-ras oncogene are detected in approximately 90% of cancers of pancreatic ductal origin, and it becomes important especially in the early stages of carcinogenesis. K-ras mutation can be detected not only in pancreatic tissue cells, but also in pancreatic fluid, duodenal brush biopsies, blood and stool samples. As the cellular type increases, the K-ras oncogene mutation rate also increases. 
Today, in the diagnosis of pancreatic cancer; Ultrasound, EUS, CT, ERCP, MR and fine needle aspiration are used. However, these methods do not give a clue for early diagnosis of the disease. 
In our study, in silico analyzes were performed using the raw transcriptome data in the NCBI GEO DataSet database. In these analyzes, the expression profiles of pancreatic cancer and normal tissue and blood samples were compared, and genes with different expression levels were determined between these two groups. Gene Set Enrichment Analysis, Hierarchical Cluster Analysis and Pathway Analysis were performed using these gene lists which obtained from different datasets. The validation of the genes in the determined candidate gene list as a result of these bioinformatics analyzes was validated by QRT-PCR using both blood and tumor tissue samples of pancreatic cancer patients. In this way, information about the molecular mechanisms that play a role in both the formation of pancreatic cancer and the prognosis process can be obtained, and important data can be obtained about the molecular subtypes of pancreatic cancer.
Recently, intensive studies have been carried out to determine the molecular subtypes of pancreatic cancer. In some of these studies, it was stated that this cancer has 3 different molecular subtypes, and in some, it has four different molecular subtypes. However, since the studies on this subject are relatively new, there is not enough data on this subject. Therefore, for the future, it is of great importance to develop a non-invasive, accurate and specific molecular biomarker that is specific for pancreatic cancer and has a high potential for clinical application.