Glukozamin (GA) bağlı hyaluronik asit (HA) nanopartiküllerin (GA-nHA) geliştirilerek yapısal özelliklerinin belirlenmesi ve ın vıtro hücre kültüründeki etkilerinin araştırılması
Development, characterization and research of efficacy on in vitro cell culture of glucosamine (GA) conjugated hyaluronic acid (HA) nanoparticles (GA-nHA)
Yazar: ŞEBNEM ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. FEZA KORKUSUZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı / Nanoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology

Özet:
Osteoartrit (OA) eklemde ağrı, hareket kısıtlılığı, deformite ve tedavi edilmediği taktirde sakatlığa ve ölüme yol açabilen eklem hastalığıdır. Hastalığın seyrini değiştiren glukozamin (GA) ve kondroitin sülfat (KS)'ın eklem kıkırdağını besleyen sinovyal sıvıya nasıl ulaştığı ve etkisini nasıl gösterdiği az bilinir. Çalışmanın araştırma soruları; (1) Hyaluronik asit (HA) nanopartikül (nHA) şeklinde geliştirilerek eklem içinde kontrollü ilaç salım sistemi olarak kullanılabilir mi? (2) GA, nHA kullanılarak eklem içine taşınabilir mi? (3) GA'lar nHA'lardan kontrollü bir şekilde salınır mı? (4) GA-nHA hücre yapışması ve çoğalmasını arttırabilir mi? (5) GA-nHA'lar kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (Kİ-MKH) kıkırdak hücresine farklılaşmasına pozitif yönde etki eder mi? (6) GA-nHA'lar sağlıklı ve OA'lı insan kıkırdak hücrelerinin ekstraselüler matriks sentezini artırıp OA işaretlerini azaltır mı? 
nHA üretildikten sonra yapısal özellikleri Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), Dinamik Işık Saçılımı (DLS) ve Nükleer Manyetik Rezonans (¹H NMR) ile belirlenmiştir. nHA'ya GA ve KS bağlandıktan sonra bu moleküllerin salımı Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile ölçülmüştür. KS'in nHA'dan salınmadığı görüldüğü için deneyler GA ile sürdürülmüştür. 1, 10 ve 100 µg/ml GAnHA'ların kondrosarkoma (SW-1353) hücreleri üzerindeki etkisi WST-1 hücre 
ii 
 
proliferasyon testi ile ölçülmüştür. GA-nHA'nın Kİ-MKH üzerindeki erken kondrojenik farklılaşma işaretlerinden SRY-Box-9 (SOX-9) ve kıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) ifadelerinin üzerine etkisini ölçmek için RT-PCR yapılmıştır. GA-nHA'ların sağlıklı ve OA'lı kondrositler üzerindeki ekstraselüler matriks işaretleri olan tip II kollajen (COL2A1) ve COMP üzerine etkisi ve OA işareti olan matriks metalloproteinaz-13 (MMP-13) üzerindeki etkisi ise yine RTPCR ile değerlendirilmiştir. 
¹H NMR sonuçlarındaki 0.6-5.0 ppm arasındaki pikler nHA'ların başarılı bir şekilde sentezlendiğini, SEM ve DLS sonuçları ise partiküllerin 200-600 nm boyutları arasında homojen dağıldığını göstermektedir. HPLC ile ölçülen salım sonuçlarıyla GA'ların nHA'lardan 21 günde %20 oranında salım yaptığı belirlenmiştir. WST-1 proliferasyon testi sonuçlarına göre GA-nHA'nın üç dozu da hücre proliferasyonunu kontrol grubuna göre anlamlı olarak artırmamıştır. Ancak, GA'yı tek başına hücrelere uygulamanın kontrol grubuna göre anlamlı olarak proliferasyonu artırdığını göstermiştir. GA-nHA kondrojenik farklılaşma işaretleri olan SOX-9 ve COMP ifadesini anlamlı olarak değiştirmemiştir. OA'lı kondrositlerde 1 µg/ml GA-nHA MMP-13 seviyesini düşürmüş, 10 µg/ml GA-nHA uygulaması ise MMP-13 seviyesini düşürürken COMP ve COL2A1 seviyelerinde artışa neden olmuş ancak istatistiksel fark bulunmamıştır. Sağlıklı kondrositlerde ise üç dozda GA-nHA uygulaması kontrol grubu ile karşılaştırıldığında MMP-13 ifadesini baskılamış ancak bu da istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Tek başına GA uygulandığında ise MMP-13 seviyesi anlamlı olarak düşmüş , farklılaşma işareti olan COMP seviyesini ise anlamlı olarak yükseltmiştir. Tek başına 10 µg/ml HA uygulaması sağlıklı kondrositlerin COMP ve COL2A1 seviyesinde artış sağlasa da yine kontrol grubu ile istatistiksel olarak anlamlı fark yoktur. 
GA-nHA'ların hücre proliferasyonuna ve Kİ-MKH'lerin kondrojenik farklılaşmasında bir etkisi olmamakla beraber OA'lı kondrositlerde MMP-13 ifadesini düşürdüğü, COMP ve COL2A1 seviyesini artırdığı görülmüştür. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı olmasa da klinik olarak anlamlı olduğu düşünülmektedir. GA ve HA'yı tek başına uygulamalarda bazı olumlu sonuçlara ulaşmamız, GA-nHA'nın nanopartikül formunda hücrenin kullanamayacağı bir forma getirilmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir. GA-nHA'ların OA tedavisinde etkili bir yöntem olup olmadığının belirlenebilmesi için hücre kültür ortamındaki dinamikleri, hücreye alım, hücrede işlenme mekanizmaları izlenmeli ve hücre kültüründeki etkileri uzun dönemde araştırılmalıdır.

Abstract:
Osteoarthritis (OA) is a articular joint disease which causes pain, limitation of movement, deformity and can lead to disability and mortality. Glucosamine (GA) and chondroitin sulfate (CS) are alter the course of the disease but it is lesser known that how they are reach to the synovial fluid and show their effects. Research questions of this study whether (a) we could produce and use as a drug delivery system hyaluronic acid nanoparticles (nHA). (b) GA would transport to joint cavity using with nHAs. (c) GA-nHA would increase cell proliferation, (d) GAnHA would stimulate chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), and (e) GA-nHA would improve extracellular matrix (ECM) production and reduce OA markers of normal and osteoarthritic chondrocytes. 
After production of nHA's its structural property determined with SEM, DLS and ¹H NMR. After conjugating CS and GA to nHA's, release dynamics of these molecules determined with HPLC. CS didn't release from nHA's so studies contiuned with GA. Effects of 1, 10, 100 µg/ml GA-nHA's on chondrosarcoma cell line (SW-1353) measured by WST-1 Cell Proliferation Assay. Efficacy of early chondrogenic markers including cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and SRY-Box-9 (SOX-9) expression on BM-MSCs of GA-nHAs measured by RT-PCR.  Efficacy of extracellular matrix components including type II collagen (COL2A1) and COMP expression and OA marker matix metalloproteinase-13 (MMP-13) 
iv 
 
expression on healthy and osteoarthritic human chondrocytes of GA-nHAs mesaured by RT-PCR, again. 
Peaks between 0.6 and 5.0 ppm of ¹H NMR results showed that nHAs succesfully synthesised. SEM and DLS results showed particule size dispersed between 200 and 600 nm homogeneously.  HPLC results showed us GA released in the ratio of 20% in 21 days. Three doses of GA-nHA's didin't increase proliferation of chondrosarcoma cells according to WST-1 Proliferation Assay outcomes. However, application of GA alone increased the proliferation significantly compare to control group. GA-nHAs did not significantly change the SOX-9 and COMP expressions. On OA chondrocytes, 1 µg/ml GA-nHA administration significantly decreased MMP-13 expression, 10 µg/ml GA-nHA administration decreased MMP-13 expression and incresed COMP and COL2A1 expressions, yet there is no significant difference was found. On healthy chondrocytes, three doses of GAnHA administration repressed the MMP-13 expression compared with the control group, but no significant changes were observed. When GA applied alone, MMP13 levels significantly decreased and chondrogenic marker COMP levels significantly increased compared with the control group. Also, 10 µg/ml HA group increased COMP and COL2A1 levels of healthy chondrocytes but there is no significant difference with control group. 
In conclusion, GA-nHAs did not effect cell proliferation and chondrogenic differentiation but decreased MMP-13 expression, increased COMP and COL2A1 expression of OA chondrocytes. Although these results are not statistically significant, they may be clinically significant. When we apply GA and HA alone, some of the positive results may be due to the fact that GA-nHA is in a form that cells can not use with nanoparticle form. In order to determine whether GA-nHAs is an effective method in the treatment of OA, the dynamics of cell culture medium, cellular uptake, cell processing mechanisms of GA-nHA should be monitored and long term effects of cell culture should be investigated.