EZH2 aracılıklı h3k27me3 modifikasyonunun hepatoselüler karsinoma gelişimindeki rolü
The role of EZH2 mediated H3K27ME3 modification in the development of hepatocellular carcinoma
Yazar: SANEM TERCAN AVCI
Danışman: PROF. DR. ŞERİFE ESRA ERDAL BAĞRIYANIK
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Genler = Genes ; Karaciğer neoplazmları = Liver neoplasms ; Karsinoma = Carcinoma ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular ; Neoplazm kök hücreleri = Neoplastic stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms

Özet:
Hepatoselüler karsinoma (HCC) kötü prognozu, ilaç direnci ve agresif karakteri ile, ölüm oranı sıralamasında tüm dünyada kanserlerin içinde ikinci sıradadır. Son yıllarda, tümör başlatıcı hücreler olarak kabul edilen EpCAM+ hepatik kanser kök hücrelerin (HpKKH), metastaz ve ilaç direncindeki önemi gösterilmiş olsa da, bu hücrelerde gerçekleşen epigenetik düzenlemelerin tümör gelişimindeki rolleri bilinmemektedir. PcG kompleksi ve onun katalitik altbirimi olan EZH2 gelişim sırasında, hücresel kimliğin belirlenmesi ve sürdürülmesinde görevli birçok genin düzenlenmesinde rol oynayan anahtar moleküllerdir. HCC'de ise EZH2'nin aşırı ekspresyonu agresif fenotip ile ilişkilendirilmiştir. Dolayısıyla, EZH2'nin kanser kök hücre davranışındaki rolü ve bu rolü hangi genleri kontrol ederek düzenlediğinin belirlenmesi, HCC tedavisinde yeni stratejilerin geliştirilmesi için önemlidir. 
Çalışmamızda, ilk olarak, lentiviral shRNA yöntemi ile kalıcı olarak EZH2 geni sessizleştirilen HuH-7 hücreleri ve/veya bunlardan ayrımlanan HpKKH altpopulasyonunda, proliferasyon, motilite, invazyon ve/veya tümörogenez aktivitelerindeki farklılıklar ve sonrasında bu hücrelerde EZH2 aracılıklı H3K27me3 modifikasyonunun transkripsiyonunu düzenlediği genler ChIP-sekanslama yöntemi ile belirlenmiştir. Buna göre, atasal HuH-7'de, EZH2 ekspresyonundaki azalmanın anlamlı şekilde EpCAM+ hücre sayısında azalmaya ve ayrımlanan EpCAM+ HpKKH'lerin proliferasyonunda artmaya, buna karşın, invaziv hücre sayısında azalmaya neden olduğu bulunmuştur. Sonrasında, bu koşullarda EZH2 aracılıklı histon kodu ile düzenlenen genler analiz edildiğinde, hücre farklılaşması, hücre sinyal iletimi ve hücre çoğalması gibi biyolojik süreçlerde görevli gen setlerine rastlanmıştır. Bunlar arasından seçilen ve kök hücrelerin potensisini kontrol ettiği bilinen KLF4'ün değişimi konvensiyonel yolla doğrulanmış olup, bu genin HpKKH'lerde EZH2 aracılıklı H3K27me3 modifikasyonu ile regüle edildiği ilk kez bu çalışmada gösterilmiştir. 
Çalışmamızda biyoinformatik analizlerini gerçekleştirdiğimiz, epigenetik olarak regüle edilen gen veya gen setlerinin ileride HCC tedavisinde hedeflenebilecek molekül ve/veya mekanizmalar olarak kullanılma potansiyellerinin yüksek olduğunu düşünmekteyiz.

Abstract:
Hepatocellular carcinoma (HCC) is second of most fatal malignancy in all cancers worldwide because of its highly aggressive characteristics, poor prognosis and drug resistance. Although EpCAM+ hepatic cancer stem cells (HpCSC), which are accepted as tumor initiating cells, has recently been shown to be important for drug resistance and metastasis, the role of epigenetic regulations in these cells during tumorogenesis is still not clear. PcG complex and its catalytic subunit EZH2 are the key molecules with their roles in the regulation of the genes responsible for cell fate decision and maintenance during development. EZH2 overexpression is related to aggressive phenotype in HCCs. Thereby it is important to clearify the roles of EZH2 in HpCSCs, determine the genes it controls and how it regulates these roles in order to develop new treatment strategies.
In our study, firstly, we stably silenced EZH2 by shRNA lentiviral system in HuH-7 cells and/or HpCSC that we sorted from these cells and we determined the differences in cell proliferation, motility, invasion and/or in vivo tumorogenesis. Then we specified the genes that are regulated by EZH2 mediated H3K27me3 in HpCSC by using ChIP sequencing technique. We showed that the number of EpCAM+ cells in parental HuH-7 are reduced and the sorted HpCSC are more proliferative, although the number of invasive cells are reduced due to EZH2 silencing. In the same conditions we analyzed the genes that are regulated by histone code and we determined the gene sets involved in biological processes such as cellular differentiation, cell signaling and cell proliferation. KLF4 gene that is critical for stem cell pluripotency is chosen from these gene sets and alterations in the expression of this gene is confirmed by a conventional method. In this study it has been shown for the first time that KLF4 is regulated by EZH2 mediated H3K27me3 modification in HpCSC.
In conclusion, the molecules/mechanisms discovered in this project have the potential to be candidate targets in HCC treatment.