Kültür levrek balıklarında (Dicentrarchus labrax L.) tenacibaculum maritimum'un identifikasyonunda diyagnostik tekniklerinin karşılaştırılması
Comparision of diagnostic techniques for identification of tenacibaculum maritimum in cultured sea bass (Dicentrarchus labrax L.)
Yazar: REMZİYE EDA YARDIMCI
Danışman: PROF. DR. GÜLŞEN TİMUR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Su Ürünleri Yetiştiriciliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Bu çalışmada yurdumuzun Ege kıyılarında özellikle Bodrum çevresindeki işletmelerde yetiştirilen ve tenacibaculosis semptomu gösteren levrek balıklarından (Dicentrarchus labrax, L.), bu hastalığın etkeni olan Tenacibaculum maritimum'un identifikasyonu için bakteriyolojik, serolojik, histopatolojik ve moleküler diyagnostik yöntemler kullanılarak hastalık etkeninin teşhisinde bu yöntemlerin avantaj ve dezavantajları ortaya çıkarılmaya çalışılmıştır.Nisan 2008-Nisan 2010 tarihleri arasında Ege Bölgesi'nde Muğla ili Güllük ve Güvercinlik Körfezleri'nde yer alan Akbük, Ziraat Adası, Salih Adası ve Göltürkbükü beldelerinde bulunan 5 adet levrek işletmesinde ağırlıkları 0,5 g'dan 250 g'a kadar değişen tenacibaculosis şüpheli hasta levrek balıklarında ülseratif deri lezyonları yanısıra alt ve üst çenede erime ve operkulum üzerinde, çenelerde ve yüzgeç diplerinde yaygın hemorajiler tespit edilmiştir.Hasta balık örneklerinin eksternal lezyonlarından ve iç organlardan FMM, MECA, MA ve %1,5 NaCl içeren TSA besiyerlerine yapılan bakteriyolojik ekimlerde 22-24°C'de 48 saatlik inkübasyon süresi sonunda deri lezyonları ve böbreklerden yapılan ekimlerde TSA besi yeri hariç diğer besi yerlerinde yassı soluk sarı renkte düzgün kenarlı olmayan T. maritimum kolonileri izole edilmiştir.Beş işletmeye ait hasta balık örneklerinden izole edilen bu 19 adet T. maritimum izolatına ait bakterilerin Gram negatif, ince uzun çomak veya filamentler şeklinde (4-20 X 0,5 µm) pleomorfizm gösterdiği, kayma hareketi yaptığı, sitokrom oksidaz ve katalaz testine pozitif reaksiyon verdiği, O/F glukoz ortamında oksidatif özelliğe sahip olduğu, flexirubin pigment üretmediği, kongo kırmızısını absorbe ettiği, pteridine fosfat'a karşı (O/129 vibirostat testi) hassas olduğu, nitratı nitrite indirgediği, lizin ve ornitinden dekarboksilaz ve arjininden dihidrolaz ve H2S üretmediği, jelatinaz enzimini ürettiği tespit edildiğinden bu bakteriler T.maritimum olarak identifiye edilmiştir. T.maritimum olarak identifiye edilen bu izolatların API ZYM profil sonuçları da bu bakterilerin identifikasyonunun konfirmasyonunu sağlamıştır. T. maritimum izolatlarının bakteri hücrelerine ait spesifik floresan görünümü IFAT ile ortaya çıkarılmıştır.Hasta levrek balıklarında yapılan 11 örnekleme çalışmasında T. maritimum çoğunlukla Vibrio türleri ile, birkaç örneklemede Vibrio türlerinin yanısıra hareketli veya hareketsiz aeromonadlardan biriyle birlikte ve 2 örnekleme çalışmasında da tek başına hastalık etkeni olarak izole ve identifiye edilmiştir. Çalışmada elde edilen bakteriyolojik ve histopatolojik bulgular T.maritimum'un yurdumuzdaki işletmelerde çoğunlukla Vibrio ve aeromonad türleri ile karma enfeksiyon yaptığı sadece 1 işletmedeki yavru levrek balıklarının sekonder bir enfeksiyon etkeni olmadan tenacibaculosisden öldüğü tespit edilmiştir.T.maritimum ile enfekte hasta balıklarda genellikle epidermisin eriyerek kaybolduğu ve dermisin kollojen fibrillerinin açığa çıktığı yüzeysel lezyonlar ile kasa kadar inen derin ülseratif deri lezyonları, filamentöz bakterilerin tutunduğu solungaç filamentlerinde erime, karaciğerde hepatic hücrelerde, böbrek tübüllerinde ve dalağın parankim hücrelerinde dejenerasyon ve liquefactive nekroz odakları ve dalak ve böbreğin haemopoietik dokusunda boşalma tespit edilmiştir.Hasta levrek balıklarından izole edilen T. maritimum'un Dot blot testi ile serotiplendirilmesi yapılarak suşlarının serotip O1 oldukları tespit edilmiştir. Bakteri izolatlarının moleküler identifikasyonunda PCR ve hasta balıkların doku örneklerinde ise nested PCR tekniği kullanılarak bu etkenin varlığı saptanmıştır.Hasta balıkların kan serumlarında bu patojene karşı oluşan antikor varlığı aglütinasyon ve ELISA yöntemi ile tespit edilmiştir. Doku örneklerinde bu patojen bakterinin tespiti için IFAT kullanılmıştır. IFAT kullanılarak bakteriyolojik kültür metodu ile izolasyonu yapılamayan dalak ve karaciğer dokularında da T. maritimum'un varlığı tespit edilmiştir.Sonuç olarak bu çalışmada ELISA, IFAT, PCR, Nested-PCR ve histopatolojik tekniklerin T. maritimum'un özellikle hasta balıkların karma infeksiyonlarda tespitinde konvansiyonel bakteriyolojik metodlara göre daha hassas, hızlı ve yeterli teknikler oldukları ortaya çıkarılmıştır.

Abstract:
A comparative study was carried out for to identification of Tenacibaculum maritimum from cultured sea bass (Dicentrarchus labrax, L.) showing tenacibaculosis symptoms reared in the farms at the Aegean Sea coast of Turkey, especially located in Bodrum peninsula using by bacteriological, serological, histopathological and molecular diagnostic methods for to reveal advantages and disadvantages of these methods in this study.During the research period between April 2008 and April 2010, tenacibaculosis suspected sea bass specimens supplied from five sea bass farms weighing between 0.5 g and 250 g which was located in Akbük, Ziraat Island, Salih Island, Göltürkbükü towns of Güllük and Güvercinlik Gulfs in Muğla province showed erosive jaws and skin lesions, gill rot and diffuse hemorrhages on the upper and lower jaws, operculum and fins were observed.Bacterial inoculations were streaked on FMM, MECA, MA and TSA containing 1,5 % NaCl from the external skin lesions and some visceral organs of the diseased fish samples, incubated at 22-24 °C for 48 hours, flat, pale yellow colored with irregular edges T. maritimum colonies were observed on FMM, MECA and MA from skin lesions and kidney of diseased fish accept on TSA containing 1,5% NaCl.The bacteria of the 19 T. maritimum isolates were obtained from diseased fish samples were collected from five farms were found as Gram negative thin long rods or filamentous bacteria, showing pleomorphism with gliding motility with a size ranging 4-20 x 0.5 µm and gave positive reaction in cytochrome oxidase and catalase tests, oxidative reaction in O/F glucose test, did not produce flexirubin pigment but absorbed Congo red, showed sensitivity to pteridine phosphate (O/129 vibriostatic agent), reduced nitrate to nitrite, did not produce lysine and ornithine decarboxylase, arginine dihydrolase and H2S and produce gelatinase enzyme and these isolates were identified as T. maritimum. API ZYM profile results of these strains confirmed the identification of these bacteria. Specific fluorescence appearance of the bacteria cells of T.maritimum isolates was revealed by using IFAT test as the cause of disease often.Although T. maritimum was isolated alone in two sampling studies from diseased fish during eleven sampling studies, it was mostly isolated with Vibrio species, but it was also isolated one of the motile or non-motile aeromonads in addition to Vibrio species in a few sampling studies. Although bacteriological and histopathological findings showed that T.maritimum caused natural tenacibaculosis that induced mortality of the cultured sea bass without a secondary pathogen only in one farm but it was mostly caused mixed infections with Vibrio as a seconder and with Aeromonas spp. as a tertiary pathogen in Turkey.T.maritimum infected fish generally showed either superficial skin lesions with completely missing epithelial layers which exposed to the collagen fibers of the dermis or deep ulcerative skin lesions with exposure of muscle, erosive gill lesions with adherent filamentous bacteria, degeneration or liquefactive necrosis of hepatic cells, kidney tubules and parenchyma cells of spleen and reduced hemopoietic tissue in the kidney and spleen.The serotypes of T. maritimum strains recovered from the diseased sea bass were determined as serotype O1 by using Dot-Blot test. PCR technique was used for the molecular identification of T. maritimum strains and the presence of this pathogen in the tissue samples of diseased fish was detected by using Nested-PCR technique.The presence of antibodies in the blood sera of the diseased fish against this pathogen was detected by using agglutination and ELISA techniques. IFAT was used for the identification of this pathogen bacterium in the tissue samples. The presence of T. maritimum was detected by using IFAT in the spleen and liver tissue samples which could not be recovered from these tissues by using bacteriological culture method.As a result, in the present work, ELISA, IFAT, PCR, Nested-PCR and histopathological techniques proved to be more sensitive, rapid and efficient than the conventional bacteriological methods in detecting of T.maritimum in the diseased fish especially in the mixed infections.