Her2 pozitif meme karsinomu dokularında immunhistokimyasal yöntemlerle her3, CD1A ve ki-67 ekspresyonunun araştırılması, sonuçların prognostik parametreler ile ilişkisinin saptanması /
Yazar: BURCU GÜZELBEY
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN RIDVAN İLHAN
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2013
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Antijenler-CD = Antigens-CD ; ErbB reseptörleri = ErbB receptors ; Karsinoma = Carcinoma ; Ki-67 = Ki-67 ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prognoz = Prognosis

Özet:
AMAÇ: İnvaziv meme karsinomları kadınlarda en sık görülen tümör olup, kadın kanserlerinin %22?sini, gelişmiş ülkelerde ise %26?sını oluşturur. Prognozunda hastanın yaşı, tümör boyutu, deri ve göğüs duvarı invazyonu, lenfovasküler invazyon, evre, histolojik derece, lenf nodu tutulumu, hormon reseptör durumu, histolojik tip, Her2 onkojen aşırı sentezi gibi faktörler rol oynar. Tümör hücrelerinin proliferasyon kapasitesi de bu faktörlerden birisidir. Tümörün proliferatif kapasitesini göstermede kullanılan yöntemler çok çeşitli olup Ki-67 non-histon proteini ölçümü en sık kullanılan immünhistokimyasal yöntemdir. Ki-67 proliferasyon indeksi pek çok çalışmada hastalıksız ve total sağ kalımla ters ilişkili bulunmuştur.
 Meme karsinomu tedavisinde hedefe yönelik tedavide hormon reseptör durumu ve Her2 onkojen tayini büyük öneme sahiptir.
Her2, EGFR diğer adıyla ERB reseptör ailesinin bir üyesidir. Bu reseptörler ekstrasellüler sinyallerin hücre içi iletiminde görev alırlar. Bu sinyal iletimlerinin sonucu hücre diferansiyasyonu, proliferasyonu ve sağkalımı sağlanır. Bu aile üyelerinin diğer bir özelliği de birbirleriyle heterodimer ya da homodimerler yaparak aktif hale gelmeleridir. Bu dimer yapılarından en potent olanı Her2?nin Her3 ile yaptığı heterodimerdir. Her2-Her3 heterodimeri aynı zamanda Her2?yi hedefleyen kemoterapötik ajan olan Trastuzumaba direnç gelişmesinde etkilidir. Her3 aşırı ekspresyonunun Trastuzumab tedavisinde başarısızlığa neden olması dikkatleri Her3 `e çevirmiş, bu reseptörün prognoz üzerindeki etkilerini araştıran çok sayıda çalışma yapılmıştır. Çalışmaların büyük bir bölümünde Her3 aşırı ekspresyonunun total sağ kalımda negatif etkili olduğu sonucuna varılmıştır.
Günümüzde meme kanserinin non-immunojenik bir tümör olduğu yönündeki düşünceler geride kalmıştır. Son yıllarda meme karsinomlarında antijen sunan hücrelerin rolü konusunda pek çok çalışma yapılmış, gerek tümördeki dendritik hücre yoğunluğu, gerekse dendritik hücrelerin yerleşim paterni ile prognoz arasında ilişki gösterilmiştir. CD1a glikolize tip I transmembran proteini olup insan tümörlerinde dendritik hücre belirleyicisi olarak sıklıkla kullanılır.
Bu çalışmada Her2?yi aşırı sentezleyen ve Trastuzumab içerene neoadjuvan kemoterapi  alan meme karsinomlarında Her3, CD1a düzeyinin ve Ki67 proliferasyon indeksinin immünhistokimyasal yöntem ile saptanması hedeflenmiştir. Elde edilen veriler ile prognostik parametreler karşılaştırılmış ve sağ kalıma etkileri saptanmıştır.
GEREÇ VE YÖNTEM: İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı?nda bilgisayar ortamında oluşturulan arşiv kayıtlarındaki raporlar incelenerek 2003-2010 yılları arasında invaziv meme karsinomu tanısı almış hasta kayıtlarına ulaşıldı. İçlerinden immünhistokimya veya SISH yöntemiyle Her2 gen amplifikasyonu saptanan 48 adet olgu tespit edildi. Olguların tamamı neoadjuvan terapi olarak Trastuzumab tedavisi almış olduğu öğrenildi. Olguların tedavi rejimi ve nüks bilgilerine ulaşıldı, total ve hastalıksız sağ kalım süreleri belirlendi.
Meme karsinomlu dokulardan elde edilen parafin kesitlere Her3,CD1ave Ki67 immünhistokimyasal boyaları uygulandı.
HER3 boyanmasının değerlendirilmesi amacıyla invaziv tümör hücrelerinin boyanma yüzdesi belirlendi . Boyanma yüzdesi ve kuvvetini birlikte değerlendirebilmek amacıyla Allred skorlama indeksi hesaplandı. 
Dendritik hücreler 50 BBA?da sayıldı. Dendritik hücrelerin tümör hücreleri ile ilişkisi, dokudaki homojen ve heterojen dağılımları, çevre dokuda dendritik hücre varlığı araştırıldı.
Ki67 ile boyanmanın en yoğun olduğu alanda 100 hücre sayılarak çekirdek boyanması olanların sayısı belirlendi. Heterojen boyanmanın olduğu tümörlerde dokunu genelindeki Ki67 proliferasyon indeksi ile en yoğun alandaki boyanmanın ortalaması alındı.
Çalışmaya dahil edilen hastaların deskriptif bilgileri ve immünhistokimya sonuçları SPSS  programına aktarıldı. Değişkenler arasındaki ilişki Pearson? ², Fischer?s exact test kullanılarak saptandı. Total ve hastalıksız sağ kalım analizi Kaplan Meier testi ile yapıldı.
BULGULAR: Her3 pozitifliği 48 vakanın 23?ünde (%47.9) izlenmiştir. Boyanma yüzdesi ortalama %16?dır. Olguların tamamında sitoplazmik boyanma izlenmiş, membranöz boyanma görülmemiştir.. Boyanma yüzdesi ile boyanma kuvvetini birlikte değerlendirildiği Allred skorlama sistemi kullanılmış, tümör boyutu, lenf gangliyonu tutulumu ve sağ kalım ile arasında anlamlı ilişki saptanmamıştır. Her3 pozitifliği hasta yaşı, tümör boyutu ve reseptör durumu ile ilişkisiz bulunmuştur. Her3 pozitif ve negatif tümörlerde 5 yıllık total ve hastalıksız sağ kalım açısından istatistiksel olarak anlamlı sonuç elde edilememiştir. Bununla birlikte sonuçlar oransal açıdan dikkat çekicidir. Her3 negatif olguların 5 yıllık sağ kalım oranı %62, Her3 pozitif olguların 5 yıllık sağ kalım oranı %53?tür. Her3 negatif olguların 5 yıllık hastalıksız sağ kalım oranı %51, Her3 pozitif olanların 5 yıllık hastalıksız sağ kalım oranı %40?tır. Her3 aşırı eksprese eden tümörlerde nükleer grad (p=0.02),  Ki67 proliferasyon indeksi (p=0.05) ve lenf gangliyonu tutulumu daha yüksektir. Olguların yaklaşık yarısında (%47.9) CD1a pozitif dendritik hücreler saptanmıştır.  Ortalama CD1a pozitif hücre sayısı 16, median değer ise 7 olarak belirlenmiştir. CD1a pozitif dendritik hücreler tümör hücreleri ile iç içe yerleşimliydiler. CD1a pozitivitesi görülen hastalarda 5 yıllık sağ kalım oranı %58 iken , CD1a?sı negatif olan hastalarda 5 yıllık sağ kalım oranı %48?dir. İstatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamakla birlikte (p= 0.73) oransal olarak CD1a pozitif tümörlerde 5 yıllık sağ kalım daha yüksektir. Hastalıksız sağ kalım açısından bakıldığında da istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamakla birlikte (p= 0.9) oransal olarak CD1a pozitif tümörlerde 5 yıllık  hastalıksız sağ kalım daha yüksektir. CD1a pozitif dendritik hücre içeren tümörlerde 5 yıllık hastalıksız sağ kalım oranı %49 iken CD1a negatif olan tümörlerde %36?dır. CD1a (+) immatür dendritik hücre varlığı ve sayısıyla, tümör boyutu ve aksiler lenf gangliyonu metastazı arasında belirgin ilişki saptanmamıştır. Nükleer derecesi yüksek olan olgularda (p=0.01) ve Ki67 proliferasyon indeksinin yüksek olduğu tümörlerde (p=0.02)  CD1a pozitivitesinin daha yüksek olduğu görülmüştür. Ki67 proliferasyon indeksi tümör boyutu, lenf gangliyonu tutulumu ve nüks durumu ile ilişkisiz bulunmuştur. Ki67?si yüksek olan olgularda nükleer gradın daha yüksek olduğu sonucuna varılmıştır (p<0.0001). Beş yıllık genel sağ kalım Ki67?si %20?nin altında olan olgularda %83, %20?nin üstünde olan tümörlerde %47?dir. Bu fark istatistiksel olarak da anlamlı olmaya yakındır (p=0.07).
SONUÇ: Her 3 pozitif olgularda oransal olarak 5 yıllık total ve hastalıksız sağ kalım daha düşüktür. Her3 aşırı eksprese eden tümörlerde nükleer grad (p=0.02),  Ki67 proliferasyon indeksi (p=0.05) ve lenf gangliyonu tutulumu daha yüksektir. CD1a ile boyanma görülen olgularda oransal olarak 5 yıllık total ve hastalıksız sağ kalım daha yüksektir. Nükleer derecesi yüksek olan olgularda (p=0.01) ve Ki67 proliferasyon indeksinin yüksek olduğu tümörlerde (p=0.02)  CD1a pozitivitesinin daha yüksek olduğu görülmüştür. Ki67?si yüksek olan olgularda nükleer gradın daha yüksek olduğu sonucuna varılmıştır (p<0.0001). Beş yıllık genel sağ kalım Ki67?si %20?nin altında olan olgularda %83, %20?nin üstünde olan tümörlerde %47?dir. Bu fark istatistiksel olarak da anlamlı olmaya yakındır (p=0.07).

Abstract:
Breast carcinoma is the second leading cause of cancer-related mortality among women. Recognized disease prognosticators for individuals diagnosed with breast carcinoma include tumor size, histologic grade, and the presence of lymph node or distant metastases. The proliferation rate of tumor cells is one of these prognosticators. There are many ways to show proliferation capacity of the tumor. Ki-67 non-histon protein is the most practical way . In many studies higher Ki-67 proliferation indices are related to worse prognosis. 
Hormone receptor status is a very important indicator to determine and decide therapy options. Recently, there has been much interest in the prognostic and treatment implications of the expression by breast tumors of the HER-2 receptor, a member of the type 1 growth factor receptor (EGFR) family
The EGFR family consists of 4  transmembrane receptors: HER-1 (also known as epidermal growth factor receptor and c-erb B-1), HER-2 (c-erb B-2), HER-3 (c-erb B-3), and HER-4 (c-erb B-4). The EGFR receptors exist as dimers (homodimers or heterodimers). HER-2 and HER-3 are only active when they form a heterodimer because HER-2 is a ligandless receptor and HER-3 lacks tyrosine kinase activity.  The HER-2/HER-3 heterodimer is the most potent dimerization of this family. Her2-Her3 heterodimer causes trastuzumab resistance as well. Majority of the studies determine that Her3 has a negative effect on overall survival.
Breast carcinoma was known as a non immunogenic tumor in the past. Recently, many studies investigated the role of antigen presenting cells in breast carcinoma and determined that higher dendritic cell infiltration causes favourable outcome. CD1a is a glikolise type I transmembran protein which is used as a marker of dendritic cells.
The objective of the current study was to determine the association between HER-3, CD1a and Ki-67 expression and known clinicopathologic breast carcinoma prognosticators (tumor size, lymph node status, tumor grade, receptor status) and also disease-free and overall survival in Her2 positive breast carcinomas cases.
Archival samples of 48 patients with invasive breast carcinoma, with available paraffin blocks, whose biopsies exemined at  Pathology Department of İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi between 2003 and 2010. All the cases have either shown overexpression of  Her2 protein or amplification of Her2 gene. 
The tumor tissues were immunostained  using Her3, CD1a and Ki-67 antibodies. Her3 staining was assessed according to the percentage of cytoplasmic staining.  We used Allred scoring index to evaluate Her3 staining percentage and intensity  together.  Number of dendritic cells determined at 50 high power area. We counted at least 100 cells in each case and defined the percentage of Ki-67 positive cells .
All the statistical analyses were performed using SPSS software. Relationships between variables analysed with  Pearson? ², Fischer?s exact tests. Survival data were examined by Kaplan Meier method. 
Of 48 cases, 23 (47.9%) revealed positive immunoreactivity for Her3. The mean percentage of staining for Her3 was 16%. All of the positive samples showed only cytoplasmic staining. There was no statistical association between Allred scoring index of Her3 and tumour size, axiller lymph node positivity , receptor status or survival. Nor was any statistical association between Her3 positivity and patient age, tumor size or receptor status. Although overall and disease free survival  percentages were higher at Her3 negative patients , there was no statistical association between Her3 positivity and survival. There was a statistically significant association between Her3 positivity and higher tumor grade, higher Ki-67 proliferation index and axillary lymph node metastasis.
The mean and median number of CD1a positive dendritic cells were 16 and 7, respectively. CD1a positive cells were localised inside tumor cell groups at all samples.  Although overall and disease free survival  percentages were higher at CD1a positive patients , there was no statistical association between CD1a positivity and survival.  Nor was any statistical association between CD1a positivity and tumour size or axillary lymph node metastasis. However a statistically significant association between CD1a positivity and higher tumour grade, higher Ki-67 proliferation index were observed.
There was a statistically significant association between Ki-67 proliferation index and some pathological prognostic factors including tumor size, axillary lymph node metastasis and recurrences. Similarly a significant  association between higher Ki-67 proliferation index and higher tumour grade was detected. Overall and disease free  survival were worse at patients with higher Ki-67 proliferation indices although they did not reach to statistical significance.