Cnisin'in konvensiyonel kemoterapötik ajanlarla kombinasyonunun kanser ilişkili sinyal yolları üzerindeki moleküllere etkilerinin ve biyoaktivitesinin araştırılması
Investigation of the bioactivity and effects of cnicin in combination with conventional chemotherapeutic agents on molecules on cancer-associated signaling pathways
Yazar: LATİFE MERVE OKTAY ÇELEBİ
Danışman: DOÇ. DR. NUR SELVİ GÜNEL
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Cnisin = Cnisin ; Fosfoinositid 3-kinaz = Phosphoinositide 3-kinase ; Mammalian target of rapamycin = Mammalian target of rapamycin ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Pankreas hastalıkları = Pancreatic diseases ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms ; Sinyal nakli = Signal transduction ; İlaç tedavisi = Drug therapy

Özet:
Pankreas kanseri, şimdiye kadar bilinen bir kemo-tedavisi olmayan, yıkıcı ve ölümcül bir malignitedir. Pankreas tümörlerinin %90'ından fazlasını oluşturan pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) tüm solid maligniteler arasında en yüksek ölüm oranlarından birine sahiptir ve 5 yıllık sağkalım %10'dan azdır. Erken evrede spesifik semptomların olmaması nedeniyle genellikle rezeke edilemez ve ilerlemiş aşamada tespit edilir. PDAC tedavisi; geç tanı, erken metastaz ve sınırlı kemoterapi etkileri nedeniyle halen yetersizdir. Genel olarak, kombinasyon tedavilerinin monoterapiden daha etkili olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir. Pankreas kanserinde daha iyi tedavi seçeneklerini bulmak için anti-kanser etkilerini sinerjize eden kombinasyonları belirlemeye yönelik temel çalışmalara ve antikanser tedavisinin klinik sonucunu iyileştirmek için daha etkili terapötik yaklaşımlara önemli düzeyde ihtiyaç vardır. Anti-inflamatuar, antifungal, antibakteriyel ve sitotoksik aktiviteleri ile bilinen bir seskiterpen lakton olan Cnicin, Türkiye'de yabani olarak yetişen Centaurea cinsi bir bitkinin ana bileşiğidir. Cnicin'in çeşitli kanser türlerinde güçlü anti-proliferatif etkilerinin olduğu in vitro olarak gösterilmiştir. Doksorubisin bugüne kadar bilinen pek çok kanser türünde güçlü sitotoksik etkiler göstermiş olan antrasiklin türevi bir anti-kanser ajandır. Ancak Doksorubisin'in etkin dozları geri dönüşü olmayan ciddi sistemik yan etkilere neden olduğundan kullanımını kısıtlamaktadır.
Bu tez çalışmasında pankreas kanseri için terapötik bir strateji geliştirebilmek amacıyla, Cnicin ve Doksorubisin kombinasyon uygulamasının pankreas kanseri hücrelerinde olası sitotoksik, apoptotik etkileri ve PDAC patogenezinde ve migrasyonunda anahtar rolleri olduğu bilinen PI3K/Akt/mTOR ve WNT sinyal iletim yolakları üzerindeki etkileri moleküler düzeyde araştırılmıştır.
Pankreas kanseri (PANC-1 ve MIA PaCa-2) ve sağlıklı fibroblast (WI-38) hücre hatlarında Cnicin, Doksorubisin ve kombinasyonunun sitotoksik etkileri MTT yöntemi ile belirlendi. Belirlenen IC50 değerlerinin apoptoz üzerine etkileri kaspaz-3, kaspaz-8, kaspaz-9 ve APAF1 protein miktarlarının ELISA yöntemi kullanılarak ölçülmesi ile saptandı. PI3K/Akt/mTOR ve WNT sinyal iletim yolakları ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkileri qRT-PCR yöntemi ile tespit edildi. 
Cnicin ve Doksorubisin'in PANC-1 ve MIA PaCa-2 hücre hatlarında doz ve zamana bağlı artan güçlü sitotoksik etkilere sahip olduğu belirlendi. Cnicin'in Doksorubisin'den farklı olarak sağlıklı hücre hattı WI-38'de belirgin şekilde daha düşük sitotoksik etkilerinin olduğu görüldü. Kombinasyon analizlerinde ED50 dozlarının PANC-1 hücreleri için additif, MIA PaCa-2 hücreleri için sinerjistik etkili olduğu saptandı. Her iki etken maddenin de hem ölüm reseptörleri hem de mitokondriyal yolak üzerinde bulunan kaspazlar üzerinden apoptozu indükledikleri, kombinasyonlarının ise daha yüksek oranda apoptozu indüklediği görüldü. Cnicin'in, Doksorubisin'in ve kombinasyonlarının PI3K/Akt/mTOR yolağı üzerindeki genlerin ekspresyon seviyelerini regüle ederek hücre proliferasyonunu inhibe ediyor olabileceği, apoptotik süreçlere katkısının olabileceği ve WNT yolağı üzerindeki genlerin ekspresyon seviyelerini regüle ederek migrasyonu baskılıyor olabileceği gösterildi. 
Cnicin'in pankreas kanseri tedavisinde yeni bir terapötik yaklaşım oluşturabilecek umut verici bir molekül olduğunu, bitkisel kaynaklı terapötik moleküllerin sentetik olanlara göre daha güvenli olduğu kabul edildiğinden kombinasyon uygulamasının, geleneksel kemoterapötik ajanların etkin dozlarının azaltılmasına ve böylece ilaç toksisite risklerinin indirgenmesine etkisinin olabileceğini öngörmekteyiz.

Abstract:
Pancreatic cancer is a devastating and deadly malignancy with no known chemo-cure to date. More than 90% of pancreatic tumors are pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), which has one of the highest mortality rates of all solid malignancies with a 5-year survival rate of fewer than 10%. Due to the absence of specific symptoms in the early stage, it is usually detected in the unresectable and advanced stage. PDAC treatment is still insufficient due to late diagnosis, early metastasis and limited chemotherapy effects. It is generally acknowledged that combination therapies outperform monotherapy in terms of effectiveness. To develop better pancreatic cancer treatment options and to enhance the clinical outcome of anticancer therapy, fundamental investigations are urgently needed to uncover combinations that synergistically enhance anti-cancer effects. Cnicin, a sesquiterpene lactone known for its anti-inflammatory, antifungal, antibacterial and cytotoxic activities, is the main compound of a plant of the genus Centaurea that grows wild in Turkey. It has been shown that Cnicin has potent anti-proliferative effects in various types of cancer in vitro. Doxorubicin is an anthracycline derivative anti-cancer agent that has shown strong cytotoxic effects in many cancer types known to date. However, effective doses of Doxorubicin limit its use because it causes serious irreversible systemic side effects.
In this thesis, in order to develop a therapeutic strategy for pancreatic cancer, the possible cytotoxic and apoptotic effects of Cnicin and Doxorubicin combination application in pancreatic cancer cells and the effects on PI3K/Akt/mTOR and WNT signal transduction pathways, which are known to have key roles in the pathogenesis and migration of PDAC, were looked into on a molecular level.
The cytotoxic effects of Cnicin, Doxorubicin and their combination were determined by MTT method in pancreatic cancer (PANC-1 and MIA PaCa-2) and healthy fibroblast (WI-38) cell lines. The effects of the determined IC50 values on apoptosis were determined by measuring the protein amounts of caspase-3, caspase-8, caspase-9 and APAF1 using the ELISA method. The effects of genes related to PI3K/Akt/mTOR and WNT signal transduction pathways on expression levels were identified by the qRT-PCR method.
It was determined that Cnicin and Doxorubicin have dose- and time-dependent increasing cytotoxic effects in PANC-1 and MIA PaCa-2 cell lines. Unlike Doxorubicin, Cnicin had significantly lower cytotoxic effects in the healthy cell line WI-38. In combination analyses, ED50 doses were found to be additive for PANC-1 cells and synergistic for MIA PaCa-2 cells. It was observed that both active substances induced apoptosis via caspases located on both death receptors and mitochondrial pathway, and their combinations induced apoptosis at a higher rate. It has been shown that Cnicin, Doxorubicin and their combinations may inhibit cell proliferation by managing the expression levels of genes on the PI3K/Akt/mTOR pathway, may contribute to apoptoic processes, and may suppress migration by regulating the expression levels of genes on the WNT pathway.
Since herbal-derived therapeutic molecules are thought to be safer than synthetic ones, we believe that Cnicin is a promising drug candidate that has the potential to develop a novel therapeutic strategy for the management of pancreatic cancer. The combination application may also have an impact on lowering the effective doses of conventional chemotherapeutic agents, thereby lowering the risk of drug toxicity.