Sinir doku onarımı için polimerik nanofiber doku iskeleleri
Polymeric nanofibrous scaffolds for peripheral nerve regeneration
Yazar: MURAT DEMİRBİLEK
Danışman: PROF. DR. EMİR BAKİ DENKBAŞ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu çalışmada bakteriyel poliester, poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat) (PHBV) üretimiş ve elektrospin tekniği ile yönlendirilmiş nanofibriler doku iskeleleri üretilmiştir. Daha sonra doku iskeleleri sıçan periferal sinir doku onarımında kullanılmıştır.PHBV üretimi için üç farklı karbon kaynağı (propiyonik asit, valerik asit ve butirik asit) kullanılmıştır. Bu çalışmanın amacı yüksek oranda 3-hidroksi valerat monomeri içeren PHBV üretmektir. PHBV'lerin XRD, C-NMR ve DSC ile kristaliniteleri, termal özellikleri ve yapısal özellikleri incelenmiştir. Viskozimetrik molekül ağırlıkları bulunmuştur. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucunda propiyonik asit ile üretilen PHBV'nin diğerlerine göre daha düşük viskozimetrik molekül ağırlığına ve daha az kristaliniteye sahip olduğu saptanmıştır. Bu nedenle diğer çalışmalarda propiyonik asit ile üretilen PHBV kullanılmıştır.PHBV %5 konsantrasyonda klorofomda çözülmüş ve DS güç kaynağı kullanılarak elektrospinlenmiştir (0,1ml/dak hızda, 25kV voltaj altında, enjektör ucu-toplayıcı mesafesi 15 cm). Toplayıcı olarak 3,5cm eninde, 6cm çapında bir disk kullanılmıştır. Disk 3100rpm'de dönen bir motora takılmıştır. Elde edilen nanofiber doku iskelesinin karakterizasyonu SEM ile yapılmıştır ve 400-600 nm çapında, yönlenmiş nanofibriler bir yapının elde edildiği görülmüştür.L929 hücreleri ISO standart çalışmalarında kullanılan bir hücre hattıdır. Bu nedenle elde edilen nanofibriler yönlenmiş doku iskelelerinin biyouyumluluk çalışmaları için kullanılmıştır. Doku iskelelerinin üzerinde, farklı günlerde kültüre edilen hücrelerin ALP aktiviteleri ve hücre proliferasyonu belirlenmiştir. PC12 hücre hattı sıçan adrenal medulla hücreleridir ve bir öncül hücre hattıdır. Bu nedenle yönlendirilmiş doku iskelelerinin PC12 hücre hattı ile etkileşimi incelenmiştir ve doku iskeleleri üzerinde farklı günlerde kültüre edilen hücrelerin proliferasyonu çalışılmıştır. L929 (p<0,05) ve PC12 (p<0,05) hücre hatlarının proliferasyonu MTT testi ile yapılmıştır. Hücre kültür çalışmaları sonucunda zaman göre doku iskelesi üzerinde kültüre olan hücrelerin konsantrasyonun da arttığı saptanmıştır. Ayrıca L929 hücrelerinin ALP aktivitelerinde de zamana bağlı olarak artış olduğu saptanmıştır (p<0,05).Son olarak hazırlanan PHBV sinir greftlerinin işlevselliği sıçanların peroneal sinir demetlerinde yapılan 10mm uzunluğundaki kesiğin rejenerasyonunda incelenmiştir. Sıçanlar kontrol grubu olarak otogreft grubu (dokuz adet sıçan) ve PHBV greft grubu (27 adet sıçan) olarak iki gruba ayrılmıştır. Otogreft grubu sıçanlar otolog dokunun proksimali distale, distali de proksimale gelecek şekilde 10,0 nylon suturla dikilmiştir.Yönlendirilmiş nanofibriler doku iskelelerinde 1mm çapında, 15mm uzunluğunda tüp şeklinde greftler hazırlanmıştır. Hazırlanan greftler PHBV greft grubu sıçanların peroneal sinir demetlerinde yapılan 10mm uzunluğundaki kesiğin tamirinde kullanılmıştır. PHBV greftlerin içersine proksimal ve distal uçlarına 5mm uzunluğunda peroneal sinir demeti yerleştirilmiş ve 10 nylon sütur ile dikilmiştir.Operasyonlardan sonra, peroneal sinir demetlerindeki rejenerasyon fonksiyonel testlerle incelenmiştir. Operasyonlardan dört, sekiz ve onaltı hafta sonra sıçanların siyatik sinir fonksiyon indeksleri hesaplanmıştır. Bu sonuçlara göre otogreft grubunda iyileşme PHBV greft grubuna göre dördüncü haftada %16 (p=0,197), on altıncı haftada da %23 (p=0,103) daha hızlı olduğu saptanmıştır. Operasyonlardan sekiz ve on altı hafta sonra sıçanların elektromiyografik incelemeleri yapılmıştır ve birleşik kas aksiyon potansiyelleri (compound muscle action potantial, CMAP) hesaplanmıştır. CMAP değerlerine göre otogreft grubu PHBV greft gruba göre rejenerasyon dördüncü haftada %31,28 (p=0,394), on altıncı haftada %31,1 (p=0,286) daha hızlıdır.Operasyonlardan sekiz ve on hafta sonra PHBV greftler ve otogreftler histolojik açıdan incelenmiştir. Işık mikroskobunda incelemeleri için, greftlerden alınan yarı-ince kesitler metilen mavisi-azur II ile boyanmış ve greftlerdeki akson ve kan damarı sayıları belirlenmiştir. Otograft grupta 8 ve 16 haftada birbirinden istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermeyen eş dereceli düzenli akson fasiküllerinin varlığında gerçekleşen sağlıklı bir sinir rejenerasyon izlenmiştir. Bu gruptaki akson sayısı 8 haftanın sonunda PHBV greft grubuna göre anlamlı bir biçimde daha fazladır (p= 0.008). Kan damarı sayısı 8. haftada otogreft grubunda PHBV greft gruba göre daha az görülmüştür (p= 0,008). 16 haftanın sonunda PHBV greft grubunda akson sayısı ve kan damarı sayısı otogreft grubuyla anlamlı fark göstermeyecek şekilde benzer oranda olduğu saptanmıştır.Aynı zamanda transmisyon elektron mikroskobu incelemeleri için greftlerden alınan yarı-ince kesitler uranil asetat-kurşun sitrat ile boyanmıştır. Daha sonra miyelin kılıf kalınlığı incelenmiştir. Elektron mikroskobunda tüm gruplarda değişen derecelerde miyelinlenmiş schwann hücreleri ile çevrili akson toplulukları izlenmiştir. PHBV greft grubunda 8 ve 16 haftalar arasında miyelin kalınlığı anlamlı olarak artarken (p=.0.008) otogreft grubunda anlamlı bir değişim görülmemiştir. Sekizinci haftada miyelin kalınlığı otogreft grubunda, PHBV greft grubundan (p=.0.008) daha fazla gözlenmiştir. On altıncı haftada PHBV greft grubundaki ortalama miyelin kalınlığı otogreft grubu ile anlamlı farklılık göstermemiştir. Sonuç olarak PHBV greft'in16 haftada sinir rejenerasyonu prosesini bir miktar hızlandırarak otogreft grubu yakaladığı saptanmıştır. Diğer yandan 16 haftada otogreft gruba ait iyileşme skorlarının PHBV greft gruba göre daha iyi seyrettiği gözlenmiştir.

Abstract:
In this study microbial polyester, poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) was synthesized and electrospun into alignment nanofibrous scaffolds for rat peripheral nerve regeneration.Three different carbon sources (propionic acid, butyric acid and valeric acid) were used to obtain PHBV. The aim of used three carbon sources was to synthesize PHBV, containing more 3-hydroxy valerate monomer. Characterizations of the PHBVs were performed. XRD, C-NMR and DSC were used to evaluate of the polymers crystallites, thermal properties and structural analyses. Viscosimetric molecular weights of the polymers were performed. As a result, PHBV synthesized by using propionic acid was found less crystallite and less molecular weight than others. These indicate that, this PHBV were more biocompatible than the others. So, the PHBV was used for other studies.The polymer concentrations were 5% (w/v) in solvents chloroform. Electrospinning was carried out using 10ml syringe and syringe pump. The speed of the syringe pump was 0,1 ml/min. The DS positive electrode was connected to the metallic needle of syringe and, thus, the polymer solution was positively charged. A rotating collector (3100rpm) was placed 25 cm away from the tip of needle, negative electrode was connected to the rotating collector. Rotating collector was cylindrical form with a diameter of 3,5 cm. The applied potential was 25 kV. In order to examine the electrospun structure, scanning electron microscope (SEM) was used and 400-600 nm dimension, alignment fiber mat was obtained. No bed was observed.L929 cell line is one of the reference cell lines for ISO standards. So, cells were cultured onto the alignment nanofibrous scaffolds for different days and cell proliferation and ALP activities were performed. MTT test was used to evaluate cell proliferation. PC12 cell line is a rat adrenal medulla cells. Also PC12 cells were cultured on the alignment nanofibrous scaffolds and cell proliferation was performed by MTT test. It was observed that, cultivation time was increased for both L929 cells (p<0,05) and PC12 cells (p<0,05), cell density was increased. Also ALP activities of L929 cells was increased, cultivation time was increased (p<0,05).Final part of the study, PHBV nerve grafts performance was evaluated by using 10mm long gap on rat peroneal nerve. Rats were divided otograft group (nine rat) as a control group and PHBV graft group (twenty seven rat). In otograft group, each rat peroneal nerve was repaired using an otograft. Proximal side was sutured to distal side and distal side was sutured to proximal side, used 10-0 nylon suture. It was required one suture per end of nerve.1mm dimension, 15mm long PHBV grafts were formed as a tube form. In PHBV graft group, PHBV grafts were used to repair the 10mm gap and filled in the grafts with 1% agarose to prevent the grafts collapse. The PHBV grafts were split longitudinally and the nerve was pulled into the grafts both proximally and distally for a distance of 5 mm and sutured. It was required two sutures per end of nerve.The rats were evaluated for functional recovery, at the end of fourth, eighth and sixteen weeks with sciatic verve functional index (toe spread analysis) was used to measure the population of regenerated axons. The toe spread results showed that, otograft group was 16 % in 4th week (p=0,197), %23 in 16th week (p=103) better than PHBV graft group. At the end of eighth and fifteen weeks, electromyography evaluations of the otograft and PHBV graft group were performed to measure the population of regenerated axons as another functional test, used compound muscle action potential (CMAP). The CMAP results showed that, otograft group was 31, 28 % in 4th week (p=0,394), %31,1 in 16th week (p=0,286) better than PHBV graft group.At the end of the 8th and 16th weeks, histological examinations of otografts and PHBV grafts were performed. For light microscopy examination, semi-thin sections were stained with methylene blue-azur II and the total number of axons and the blood vessels were separately counted. Also thin sections were stained with uranyl acetate and lead citrate and analyzed on a transmission electron microscope for the myelin sheath.In the otograft group, a well-coordinated and healthy regenerating nerve exhibiting regular fascicles of axons was noted. The nerve regeneration process did not show any significant difference between seven and sixteen weeks in the otograft group. The nerve sheaths and the vascular elements were very well defined in this group. The number of axons was significantly higher in this group when compared to the PHBV graft group on week seven (p=.0.008). Simultaneously, the PHBV graft group contained more blood vessel comparing to otograft group on week seven (p=.0.008). No significant difference was observed between the PHBV graft group related to the number of the axons and the blood vessels on week sixteen.At the transmission electron microscopic level all groups exhibited varying amounts of myelination single or clustered nerve fibers surrounded by schwann cells. The myelin sheath thickness was not different in otograft group when compared to both the PHBV graft group. As a conclusion, the PHBV application slightly improved the nerve regeneration process comparing to the control on week sixteen.