Evagreen ve taqman tabanlı gerçek zamanlı RT-PCR analizlerinin validasyonu ve karşılaştırılması: Apis mellifera'da black queen cell virusunun kantitatif moleküler teşhisi için yeni yaklaşımlar
Validation and comparison of evagreen- and taqman-based REAL-time RT-PCR assays: Novel approaches for quantitative molecular diagnosis of black queen cell virus in apis mellifera
Yazar: MUSTAFA EMİN ÖZ
Danışman: DOÇ. DR. OĞUZHAN AVCI
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Viroloji Ana Bilim Dalı / Viroloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Apis mellifera = Apis mellifera ; Bal arısı = Honey bee ; Black queen cell virus = Black queen cell virus ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Virüs hastalıkları = Virus diseases

Özet:
Black queen cell virus (BQCV), bal arılarında genelde subklinik enfeksiyon oluşturan ve küresel dağılım gösteren yaygın bir virustur. BQCV'nin diğer bazı bal arısı patojenleriyle (acute bee paralysis virus, deformed wing virus, Nosema spp.) karşılıklı potansiyel sinerjik etkileşiminin ve bal arısı biyolojisinde keşfedilmeyi bekleyen etkilerinin anlaşılması araştırmacıların ilgisini çekmiştir. Bu çalışmanın amacı, erişkin arı ve larva-pupada BQCV'nin tespiti için BQCV yapısal protein (SP-VP1) ve yapısal olmayan protein (NSP-RdRp) genlerin amplifikasyonuna dayanan TaqMan prob ve EvaGreen (EG) dye tabanlı kantitatif real-time reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) analizlerinin geliştirilmesi ve validasyonunun gerçekleştirilmesidir. Ayrıca real-time RT-PCR analizleri için yaygın kullanılan EG dye ve TaqMan prob kimyasallarının analiz performansları karşılaştırıldı. Analizlerin validasyonu için hazırlanan standart RNA alikotları ile oluşturulan standart eğrilere dayalı metot etkinlik hesapları, lineer regresyon performansı ve güvenilirlik değerlerine dayalı doğruluk profilleri bu analizlerin doğruluk, kesinlik, kabul edilebilirlik ve güvenilirlik açısından uygun olduğunu kanıtladı. BQCV-SP TaqMan ve EG real-time qRT-PCR analizleri için çalışma aralığı sırasıyla 2,61-7,61 log10 RNA kopyaları/reaksiyon ve 2,61-7,79 log10 RNA kopyaları/reaksiyon arasında belirlendi. BQCV-NSP TaqMan ve EG real-time qRT-PCR analizleri için çalışma aralığı sırasıyla 6,83-11,83 log10 RNA kopyaları/reaksiyon ve 6,98-11,98 log10 RNA kopyaları/reaksiyon arasında tespit edildi. Bu yeni analizleri kullanarak Akdeniz ve İç Anadolu Bölgelerinde doğal olarak enfekte olmuş kovanlarda BQCV'nin prevalansı ve viral yükü hesaplandı. BQCV'nin prevalansı erişkin arı ve larva-pupada sırasıyla %84 ve %44 bulundu, viral yükü ise validasyon sürecinde belirlenen analizlerin çalışma aralığındaydı. Saha örneklerinin tamamı asemptomatik olduğundan, bu analizleri kullanarak BQCV'nin gizli ve açık enfeksiyonu arasındaki ayrımı tahmin edebilecek bir viral genom yükü önerilemedi. Ancak larva-pupaların asemptomatik enfeksiyonunda BQCV-SP real-time qRT-PCR analizi için ≤8,80 log10 RNA kopyalar/reaksiyon ve BQCV-NSP real-time qRT-PCR analizi için ≤11,80 log10 RNA kopyalar/reaksiyon gibi bir tanı eşik değeri bulundu. EG dye ve TaqMan prob kimyasallarının analitik ve tanısal performans analizlerinde kıyaslanabilir sonuçlar elde edildi ve hesaplanan Ct değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (Wilcoxon Signed Ranks Test 2-tailed). Böylece EG'nin, Taqman proba benzer olarak, real-time RT-PCR analizleri için sağladığı yüksek amplifikasyon etkinliği teyit edildi. Sonuç olarak BQCV'nin tespiti için son derece hassas ve analitik olarak spesifik olan bu yeni real-time qRT-PCR analizlerinin, BQCV'nin etiyolojik ve epidemiyolojik çalışmalarına katkı sağlayacağı ifade edilebilir.

Abstract:
Black queen cell virus (BQCV) is a common virus that causes covert infection in hives and has a global distribution. It is of interest to honey bee virologists to understand the potential synergistic interaction between BQCV and some other honeybee pathogens (acute bee paralysis virus, deformed wing virus, Nosema spp.) and to elucidate the unexplored effects of BQCV in honey bee biology. This study aims to develop and validate the TaqMan probe and EvaGreen (EG) dye-based real-time reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) assays based on the amplification of the BQCV structural protein (SP-VP1) and non-structural protein (NSP-RdRp) genes for BQCV detection in adult honey bees and larva-pupa. Additionally, the analysis performances of commonly used EG and TaqMan chemicals for real-time RT-PCR analyses were compared. Method efficiency calculations based on standard curves created with standard RNA aliquots prepared for the validation of the analyses, linear regression performance, and accuracy profiles based on reliability values proved that these analyses were proper in terms of accuracy, precision, acceptability, and reliability. The operating range for BQCV-SP TaqMan and EG real-time qRT-PCR analyses was calculated from 2,61 to 7,61 log10 RNA copies/reaction and 2,61 to 7,79 log10 RNA copies/reaction, respectively. The operating range for BQCV-NSP TaqMan and EG real-time qRT-PCR analyses was calculated from 6,83 to 11,83 log10 RNA copies/reaction and 6,98 to 11,98 log10 RNA copies/reaction, respectively. Using these novel analyses, the prevalence and viral load of BQCV were calculated in naturally infected hives in the Mediterranean and Central Anatolia Regions. The prevalence of BQCV was found to be 84% and 44% in adult honey bees and larvae-pupae, respectively. BQCV viral load was within the operating range of the analyses determined during the validation. All of these samples had the covert infection. Therefore, a viral genome load that could predict the distinction between covert and overt infection of BQCV using the analyses could not be proposed. However, a diagnostic threshold value of ≤8,80 log10 RNA copies/reaction for BQCV real-time qRT-PCR analysis and ≤11,80 log10 RNA copies/reaction for BQCV real-time qRT-PCR analysis was found in the covert infection of larvae-pupae. Comparable results were obtained in analytical and diagnostic performance analyses of the EG dye and TaqMan probe chemicals, and no statistically (Wilcoxon Signed Ranks Test 2-tailed) significant difference was found between the calculated Ct values. Thus, the high amplification efficiency of the EG dye for RT-PCR analyses was confirmed, similar to the Taqman probe. In conclusion, highly sensitive and analytically specific for the detection of BQCV, these novel real-time qRT-PCR assays will benefit the etiological and epidemiological studies of BQCV.