Vasküler endotelyal büyüme faktörünü kodlayan genin susturulmasına ilişkin in vitro çalışmalar
In vitro studies on the silencing of the vascular endothelial growth factor gene
Yazar: FULDEN ERDEM ÇAKMAK
Danışman: YRD. DOÇ. DR. SUNA ÖZBAŞ TURAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Kompleksler = Complexes ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Protaminler = Protamines

Özet:
Gen tedavisi, genetik defektlerin düzeltilmesi amacıyla genetik materyalin aktarımı, hatalı veya fazla çalışan genlerin susturulması ve bazı genlerin işlevlerinin değiştirilmesi olarak da tanımlanan multidisipliner bir çalışma alanıdır. Anjiogenez tümör gelişiminde önemli bir basamaktır. Dolayısıyla anjiogenezi susturmak, gen tedavisinde etkili bir yaklaşımdır. Son yıllarda, gen ekspresyonunun inhibisyonu, kısaca RNAi (RNA interferans), başta kanser olmak üzere birçok önemli hastalıkların tedavisinde geleneksel tedavilere alternatif olarak araştırılmaktadır. Ancak shRNA ile tedavide, en önemli sorun bu moleküllere karşı hücre membranı permeabilitesinin zayıf olmasıdır ve uygun bir taşıyıcı sistem seçimi önemlidir. Bu amaçla çalışmamızda, anjiogenik bir protein olan VEGF'in inhibisyonu için pozitif yüklü, doğal ve biyouyumlu bir polimer olan kitozan ve peptid yapıda protamin ile hazırlanan kompleks ve nanopartikül formülasyonlarının shRNA taşıyıcı potansiyeli araştırılmıştır. VEGF-A shRNA içeren kitozan, protamin ve kitozan/protamin kompleksleri ile kitozan/TPP nanopartikül formülasyonları hazırlanmış ve in vitro karakterizasyonları yapılmıştır. Komplekslerin ve nanopartiküllerin HEK293, HeLa ve MCF-7 hücre hatlarında in vitro transfeksiyon etkinliği ve gen inhibisyonu özellikleri incelenmiştir. Kullanılan polimerler ile ortalama 299nm, 253nm, 338nm boyutlarında ve +8-28mV, -12-9mV, +8-21mV yük değerinde kitozan/shRNA, protamin/shRNA ve kitozan/protamin/shRNA kompleksleri elde edilmiştir. Ayrıca 280nm boyutunda ve 8-21mV yük değerinde shRNA içeren kitozan/TPP nanopartikülleri hazırlanmıştır. Taşıyıcı sistemler, VEGF-A shRNA'yı serum ve nükleaz degredasyonuna karşı korumuştur. Nanopartikül formülasyonları ile uzun süreli kontrollü bir salım profili elde edilmiştir. Taşıyıcı sistemler ile in vitro transfeksiyon çalışmalarında maximum VEGF-A gen inhibisyonu 1/2/1 kitozan/protamin/shRNA kompleksleriyle HEK293 hücrelerinde sağlanmıştır (%98; HEK293>HeLa>MCF-7). Kompleksler (kitozan/protamin/shRNA> protamin/shRNA > kitozan/shRNA) ile nanopartiküllere (?%50) kıyasla daha yüksek düzeyde VEGF gen inhibisyonu elde edilmiştir. Sonuç olarak kitozan ve protamin esaslı taşıyıcı sistemler ile VEGF-A shRNA'nın formülasyonu ve etkin bir gen transferi mümkündür. Elde edilen veriler, RNAi teknolojisinde, VEGF-A shRNA stabilitesi ve transferi çalışmalarına önemli ölçüde katkıda bulunacak niteliktedir.

Abstract:
Gene therapy is a multidiciplinary area with the purpose of transfering genetic material, inhibiting defective or amplified genes for the correction of genetic defects. Angiogenesis is an important step in the development of tumor. Therefore, inhibiting angiogenesis is an effective approach in gene therapy. In recent years, the inhibition of the gene expression, in other words RNAi ( RNA inteference) is heavily researched as an alternative to the traditional treatments of many important diseases including cancer. However, the most important problem in shRNA therapy is that these molecules against the cell membrane permeability weak. For this purpose in our thesis study, for the inhibition of VEGF which is an angiogenic protein; the complex which is prepared with positive charged, natural and biocompatible polymer chitosan and protamin which is a peptide and the potential of nanoparticle formulations with shRNA carrier were investigated. The chitosan/TPP nanoparticles formulations are prepared with chitosan containing VEGF-A shRNA, protamine and chitosan/protamine complexes, and in vitro characterization is done. In vitro transfection efficiency and gene inhibition properties of complexes and nanoparticles are analyzed in HEK293, HeLa and MCF-7 cell lines. With the used polymers, averagely 299nm, 253nm, 338nm sized and 8-28mV, -12-9 mV, 8-21mV surface charged chitosan/shRNA, protamin/shRNA and chitosan/protamin/shRNA complexes are obtained. Furthermore, nearly 280 nm sized and 8-21 surface charged shRNA containing chitosan/TPP nanoparticles were prepared. The carrier systems protected VEGF-A shRNA against serum and nuclease degradation. A long term controlled release profile has been obtained with the nanoparticle formulations. With carrier systems, In in vitro transfection studies the most highest VEGF-A gene inhibition was obtained with 1/2/1 chitosan/protamine/shRNA complexes in HEK293 cell line(%98, HEK293>HeLa>MCF-7). We obtained more higher VEGF gene inhibition compared with complexes (chitosan/protamine/shRNA> protamine/shRNA>chitosan/shRNA) and nanoparticles(?%50). As a result, with chitosan and/or protamin-based carrier systems, formulation of VEGF-A shRNA and effective gene transfer can be possible. The data obtained have the quality to provide significant contribution to VEGF-A shRNA stability and transfer studies in the RNAi technology.