Prenatal fonksiyonel pinealektomi ve eksojen melatonin uygulanan gebe ratların yavrularında karbon tetraklorür (CCL₄) ile oluşturulmuş karaciğer fibrozisi üzerine cynara scolymus  L.(enginar)'un etkisinin radyolojik, biyokimyasal ve histolojik olarak değerlendirilmesi
Prenatal functional pinealectomy and exogenous melatonin in the offspri̇ng of pregnant rats administered the effect of cynara scolymus  L.(artichoke) on carbon tetrachloride (CCL₄)-induced liver fibrosis radiologic, biochemical and histologic evaluation
Yazar: CANSU ÇADİRCİ
Danışman: PROF. DR. MEHMET TURGUT
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Amaç: Kronik hastalıkların prevalansı, geri dönüşümsüz fonksiyon kayıpları ve yaşam boyu süren tedavi gereksinimleri nedeniyle dünya genelinde artmaktadır. Anne karnında gelişimini sürdüren fetüs de bu hastalıklardan etkilenmektedir. Fetal dönemde fetüsün DNA dizilimi, maternal faktörler ve çeşitli çevresel stresörlerin etkisiyle yeniden programlanabilmektedir. Fetal programlama hipotezine göre, fetusun maruz kaldığı bu stresler, yetişkinlik dönemindeki kronik hastalıkların temelini oluşturmaktadır. Prenatal dönemde hormonların fetüsün gelişiminde büyük değişiklikler ve ihtiyaçlar doğurduğu bilinmektedir. Bu dönemde önemli bir rol oynayan hormonlardan biri de melatonindir. Melatonin, uyku düzeni, biyolojik ritimler, üreme ve bağışıklık gibi birçok biyolojik faaliyetin düzenlenmesinde görev alan endojen bir hormon olup, karanlıkta epifiz bezi tarafından salgılanır. Nöroprotektif etkileri ve sirkadiyen ritim düzenleyici görevleri olan melatoninin salınım düzeyi, anne karnındaki embriyo için oldukça önemlidir. Melatoninin prenatal dönemdeki bu kritik rolü, fetüsün gelişim süreçlerini ve uzun vadeli sağlık sonuçlarını belirlemede önemli bir faktör olarak öne çıkmaktadır.
Bu çalışmada, prenatal dönemde fonksiyonel pinealektomi ve eksojen melatonin uygulamalarının postnatal dönemde genç sıçanlarda Cynara scolymus L. ekstraktının (ALE) antioksidan özellikleri üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Araştırma, karbon tetraklorür (CCl₄) kullanılarak oluşturulan deneysel karaciğer fibrozis modeli üzerinden gerçekleştirilmiştir. Bu bağlamda, çalışmada doğada bulunan ve kolaylıkla elde edilebilen ALE (Artichoke Leaf Extract), CCl₄ ile oluşturulan karaciğer hasarını tamir etmeye yönelik potansiyel iyileştirici etkileri detaylı bir şekilde incelenmiştir. Ayrıca, melatoninin "fetal programming" olarak bilinen süreç üzerindeki olası etkileri de değerlendirilmiştir. Fonksiyonel pinealektomi ve eksojen melatonin uygulamalarının, karaciğer fibrozisinin iyileşme süreci üzerindeki etkilerini ortaya koymak, ALE'nin antioksidan özelliklerinin karaciğer dokusundaki hasarı nasıl etkilediğini belirlemek ve melatoninin prenatal dönemdeki uygulamalarının postnatal dönemdeki karaciğer iyileşme sürecine olan katkılarını incelemek bu araştırmanın temel hedeflerindendir. Bu amaçlar doğrultusunda yapılan araştırmanın bulguları, karaciğer hastalıklarının tedavisinde yeni yaklaşımlar geliştirilmesine ve melatoninin fetal dönemdeki etkilerinin daha iyi anlaşılması amacı ile yapılmıştır.
Gereç ve Yöntem: Çalışmamıza, 24 adet "Wistar Albino" cinsi dişi sıçan ile başlandı ve gebelikleri vajinal smear ile belirlendi. Gebeliğin 5. Günü itibari ile 3 gruba ayrıldı; Kontrol (12 saat aydınlık/12 saat karanlık) herhangi bir uygulama yapılmadı, Aydınlık (24 saat aydınlık) Pinealektomi oluşturulan grup herhangi bir uygulama yapılmadı ve Melatonin (24 saat aydınlık) 40 mg/kg melatonin i.p. olarak gün aşırı uygulandı. Gebelik sonrası laktasyon dönemi boyunca her grup kendi yavruları ile aynı kafeste herhangi bir uygulama olmadan (12 saat aydınlık/ 12 saat karanlık) 21 gün boyunca yem ve su ile beslendi. 21. Günün sonunda anne sıçanlar deney dışı bırakılarak yavrular alt gruplara cinsiyet farkı gözetilerek ayrıldı. Her bir grup için dört alt grup oluşturuldu. Kontrol grubu (Aydınlık, Melatonin ve Kontrol gruplarından doğan yavrular için ayrı ayrı oluşturuldu) bu gruba herhangi bir uygulama yapılmadı, ALE grubu  (Aydınlık, Melatonin ve Kontrol gruplarından doğan yavrular için ayrı ayrı oluşturuldu) 1.5 g/kg ALE gavaj yoluyla gün aşırı 21 gün uygulandı, CCl₄+ ALE grubu (Aydınlık, Melatonin ve Kontrol gruplarından doğan yavrular için ayrı ayrı oluşturuldu) 1.5 g/kg ALE gavaj yoluyla gün aşırı ve CCl₄ 0.5 ml CCl₄ + 0.5 ml zeytinyağı=1ml/kg 3 günde 1 intraperitonel (i.p.) şekilde 21 gün boyunca uygulandı, CCl₄ grubu (Aydınlık, Melatonin ve Kontrol gruplarından doğan yavrular için ayrı ayrı oluşturuldu) CCl₄ 0.5 ml CCl₄ + 0.5 ml zeytinyağı=1ml/kg 3 günde 1 intraperitonel (i.p.)  21 gün boyunca uygulandı. Deney 21. Günde sona erdi, her gruptan rastgele olarak 1 denek seçilerek radyolojik analizleri Samsung RS80 cihazın LA2-9A lineer probu ile radyoloji uzmanı tarafından gerçekleştirildi. Deney bitiminde, tüm gruplardaki sıçanların karaciğer dokuları çıkartıldı. SOD (Süperoksit Dismutaz), CAT (Katalaz), MDA (Malondialdehit), GSH (Glutatyon) ve IL-6 (İnterlökin-6) testleri ELISA yöntemi ile çalışılarak biyokimya bulguları incelendi. HematoksilenveEozin ve Masson Trikrom boyanarak histololjik incelendi.
Deney süresi sona erdiğinde, 21. günün hemen ardından, tüm gruplardaki sıçanlar intraperitoneal (i.p.) yolla uygulanan anestezik maddeler (ketamin ve ksilazin) ile servikal dislokasyon yapılarak sakrifiye edilmiştir. Sakrifikasyon işleminin ardından, çıkarılan karaciğer dokuları makroskobik olarak görüntülenmiş, biyokimyasal analizler için uygun boyutlarda kesilerek -80°C'de saklanmış ve histolojik inceleme için %10'luk formaldehit çözeltisine konulmuştur.
Bulgular: Çeşitli tedavi ve kontrol gruplarının karaciğer inflamasyonu ve oksidatif stres üzerine olan etkilerini anlamada önemli bilgiler sağlamaktadır. Mann-Whitney U testi sonuçlarına göre, IL-6, CAT, MDA, SOD ve GSH seviyelerinde anlamlı farklılıklar tespit edilmiştir. CCl₄ uygulaması, inflamatuar yanıtı ve oksidatif stresi artırarak karaciğerde hücresel hasara yol açmıştır. ALE ve melatonin kombinasyonları ise bu etkileri azaltarak karaciğer dokusunda iyileşme sağlamıştır.
Makroskobik incelemelerde, kontrol grubunda patolojik bulgu gözlenmezken, CCl₄ uygulanan gruplarda belirgin karaciğer hasarı tespit edilmiştir. ALE uygulanan gruplarda karaciğer dokusu daha sağlıklı görünmüş, melatonin ve ALE kombinasyonu ise CCl₄ 'ün toksik etkilerini belirgin şekilde azaltmıştır.
Radyolojik bulgular da bu sonuçları desteklemiştir; kontrol grubunda normal homojen ekojenite gözlenirken, CCl₄ uygulanan gruplarda ultrasonografik olarak karaciğerde heterojenite ve fibrozis bulguları tespit edilmiştir. Melatonin ve ALE kombinasyonunun, CCl₄ uygulamasının neden olduğu bu patolojik değişiklikleri azaltmada etkili olduğu görülmüştür.
Histopatolojik bulgular ise her bir deney grubunda farklı özellikler göstermiştir. Kontrol grubunda, karaciğer dokusu sağlıklı bir yapıda olup patolojik bulguya rastlanmamıştır. Aydınlık grubunda (24 saat ışık altında tutulan), lenfosit infiltrasyonu ve hafif düzeyde mikroveziküler yağlanma tespit edilmiştir. Melatonin grubunda, melatoninin anti-inflamatuar etkisi sayesinde inflamasyon ve yağlanma belirtilerinde azalma gözlenmiştir. CCl₄ uygulanan grupta ise belirgin makroveziküler yağlanma, lenfosit infiltrasyonu ve sinüzoidal dilatasyon gibi ciddi fibrotik değişiklikler gözlenmiştir. CCl₄ ve ALE kombinasyonu uygulanan grupta, karaciğer dokusunda kısmen iyileşme gözlenmiş, özellikle vasküler konjesyon ve nekroz gibi parametrelerde azalma sağlanmıştır. Melatonin ve ALE kombinasyonu uygulanan grupta ise CCl₄ kaynaklı hasarın önemli ölçüde azaldığı ve karaciğer dokusunun daha sağlıklı bir görünüm sergilediği belirlenmiştir.
Sonuç: Bu çalışma, prenatal dönemde uygulanan melatonin ve fonksiyonel pinealektominin, postnatal dönemde ALE ile kombine edildiğinde karaciğer inflamasyonu ve oksidatif stresi anlamlı derecede etkilediğini göstermektedir. Bu bulgular, ALE ve melatoninin karaciğer sağlığını koruyucu potansiyel taşıdığına işaret etmekte ve fetal programlama çerçevesinde bu müdahalelerin uzun vadeli etkilerinin daha kapsamlı araştırılması gerektiğini ortaya koymaktadır.

Anahtar kelimeler: Fetal Programlama, Karaciğer Fibrozisi, Karban Tetraklorür (CCl₄), Melatonin, Cyanara scolymus.

Abstract:
Objective: The prevalence of chronic diseases is increasing worldwide due to irreversible loss of function and the need for lifelong treatment. The fetus developing in the womb is also affected by these diseases. During the fetal period, the DNA sequence of the fetus can be reprogrammed under the influence of maternal factors and various environmental stressors. According to the fetal programming hypothesis, these stresses experienced by the fetus lay the foundation for chronic diseases in adulthood. It is known that hormones during the prenatal period bring about significant changes and needs in the development of the fetus. One of the hormones that play an important role during this period is melatonin. Melatonin is an endogenous hormone that regulates many biological activities such as sleep patterns, biological rhythms, reproduction, and immunity, and it is secreted by the pineal gland in the dark. The release level of melatonin, which has neuroprotective effects and circadian rhythm regulatory functions, is very important for the embryo in the womb. The critical role of melatonin during the prenatal period stands out as an important factor in determining the developmental processes and long-term health outcomes of the fetus.
This study aims to investigate the effects of functional pinealectomy and exogenous melatonin applications during the prenatal period on the antioxidant properties of ALE in young rats during the postnatal period. The research was conducted through an experimental liver fibrosis model created using carbon tetrachloride (CCl₄). In this context, the potential healing effects of artichoke extract, which is readily available in nature, in repairing liver damage caused by CCl₄ were examined in detail. Additionally, the possible effects of melatonin on the process known as "fetal programming" were evaluated. The primary goals of this research are to reveal the effects of functional pinealectomy and exogenous melatonin applications on the recovery process of liver fibrosis, to determine how the antioxidant properties of artichoke extract affect liver tissue damage, and to examine the contributions of melatonin applications during the prenatal period to the liver healing process during the postnatal period. The findings of the research, conducted for these purposes, aim to develop new approaches in the treatment of liver diseases and to better understand the effects of melatonin during the fetal period.
Material and Methods: Our study began with 24 female "Wistar Albino" rat, and their pregnancies were determined by vaginal smear. Starting from the 5th day of pregnancy, they were divided into three groups: Control (12 hours light/12 hours dark) without any application, Light (24 hours light) Pinealectomy group without any application, and Melatonin (24 hours light) 40 mg/kg melatonin was administered i.p. every other day. During the lactation period following pregnancy, each group was kept in the same cage with their pups and fed with food and water (12 hours light/12 hours dark) for 21 days without any application. At the end of the 21st day, the mother rats were excluded from the experiment, and the pups were divided into subgroups without considering gender differences. Four subgroups were created for each group. Control group (separately created for the pups born from Light, Melatonin, and Control groups) without any application, ALE group (separately created for the pups born from Light, Melatonin, and Control groups) 1.5 g/kg ALE was administered by gavage every other day for 21 days, CCl₄ + ALE group (separately created for the pups born from Light, Melatonin, and Control groups) 1.5 g/kg ALE was administered by gavage every other day and CCl₄ 0.5 ml CCl₄ + 0.5 ml olive oil = 1 ml/kg was administered subcutaneously every 3 days for 21 days, CCl₄ group (separately created for the pups born from Light, Melatonin, and Control groups) CCl₄ 0.5 ml CCl₄ + 0.5 ml olive oil = 1 ml/kg was administered subcutaneously every 3 days for 21 days. The experiment ended on the 21st day, and a random subject from each group was selected for radiological analysis performed by a radiologist using a Samsung RS80 device with an LA2-9A linear probe. At the end of the experiment, the liver tissues of the rats from all groups were removed. The SOD (Superoxida Dismutase), CAT (Catalasa), MDA (Malondialdehydum), GSH (Glutathionum) and IL-6 (Interleucinum-6) tests were studied using the ELISA method, and biochemical findings were examined. Histological examination was performed by staining with Hematoxylin ve Eosin and Masson Trichrome.
At the end of the experimental period, immediately after day 21, all rats in the groups were sacrificed by cervical dislocation under intraperitoneal (i.p.) anesthesia using ketamine and xylazine. Following the sacrifice, the excised liver tissues were macroscopically imaged, cut into appropriate sizes for biochemical analysis and stored at -80°C, and placed in a 10% formaldehyde solution for histological examination.
Results: The findings provide important insights into the effects of various treatment and control groups on liver inflammation and oxidative stress. According to the Mann-Whitney U test results, significant differences were found in the levels of IL-6, CAT, MDA, SOD, and GSH. CCl₄ administration increased the inflammatory response and oxidative stress, leading to cellular damage in the liver. The combination of ALE and melatonin, however, reduced these effects and promoted liver tissue recovery.
Macroscopic examinations showed no pathological findings in the control group, while significant liver damage was observed in the CCl₄-administered groups. The liver tissue appeared healthier in the groups treated with ALE, and the combination of melatonin and ALE significantly mitigated the toxic effects of CCl₄.
The radiological findings also supported these results; while normal homogeneous echogenicity was observed in the control group, ultrasonographic examination revealed heterogeneity and fibrosis in the liver of the CCl₄-treated groups. The combination of melatonin and ALE was found to be effective in reducing these pathological changes induced by CCl₄.
The histopathological findings showed distinct characteristics in each experimental group. In the control group, the liver tissue exhibited a healthy structure with no pathological findings. In the light-exposure group (kept under 24-hour light), lymphocyte infiltration and mild microvesicular steatosis were detected. In the melatonin group, a reduction in inflammation and steatosis was observed due to the anti-inflammatory effects of melatonin. In the CCl₄-treated group, significant fibrotic changes, such as marked macrovesicular steatosis, lymphocyte infiltration, and sinusoidal dilation, were observed. In the group treated with a combination of CCl₄ and ALE, partial recovery in liver tissue was noted, with a reduction particularly in parameters such as vascular congestion and necrosis. In the group treated with a combination of melatonin and ALE, CCl₄-induced damage was significantly reduced, and the liver tissue exhibited a healthier appearance.
Conclusion: This study demonstrates that prenatal melatonin administration and functional pinealectomy, when combined with postnatal ALE, significantly affect liver inflammation and oxidative stress. These findings suggest that ALE and melatonin have potential hepatoprotective effects, highlighting the need for further research into the long-term impacts of these interventions within the framework of fetal programming. 
Keywords: Fetal Programming, Liver Fibrosis, Carbon Tetrachloride (CCl₄), Melatonin, Cynara scolymus.