Psödogeni olan genlerin uzun okumalarla değerlendirilmesi: GBA1 geni varyantlarının nanopor ile dizilenmesi
Evaluation of pseudogenes with long reads: Sequencing of GBA1 gene variants with nanopore
Yazar: YAĞMUR KÜÇÜMEN KILCI
Danışman: PROF. DR. AHMET OKAY ÇAĞLAYAN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
GBA1 geni, lizozomal enzim olan glukoserebrosidazı kodlar ve biallelik GBA1 mutasyonları, Gaucher hastalığına (GH) neden olurken, heterozigot taşıyıcılık Parkinson hastalığı (PH) ve Lewy cisimcikli demans (LCD) gibi nörodejeneratif hastalıklar için risk faktörüdür. GH'lı ailelerde yapılan çalışmalar, GBA1 varyantlarının PH ve LCD ile ilişkilendirilebileceğini göstermiştir.
Psödogenler, aktif genlerden evrimleşmiş ve mutasyonlar sonucu işlevini yitirmiş DNA dizileridir. GBA1 geninin işlevsiz psödogeni olan GBAP1 ile %96 homolojisi bulunur. Yeni nesil dizileme (YND) teknolojisi, genetik hastalıkların araştırılmasında önemli bir araç olsa da GBA1 gibi psödogeni olan genlerde doğrulama gerektirir. GBA1 varyantlarının doğrulanması için Sanger dizileme, uzun menzilli PCR ve yeni nesil nanopore teknolojisi gibi yöntemler kullanılmaktadır. Nanopor, YND'nin eksik kaldığı tekrar bölgeleri ve uzun okuma gerektiren yerlerde daha başarılıdır ve GBA1-GBAP1 ayrımını yapmada etkili bir çözüm sunar.
Bu çalışma, Türkiye'de nanopore teknolojisi ile GBA1 geninin dizilenmesini hedefleyen ilk araştırma olup, PH ve demans hastalarında GBA1 varyantlarının doğrulanmasına odaklanmaktadır. Bu yeni teknoloji, GBA1-GBAP1 ilişkisinin daha iyi anlaşılmasına ve genetik hastalıkların tanısında önemli bir adım olmayı amaçlamaktadır. 
Bu amaçla Haziran 2019 ile Temmuz 2024 tarihleri arasında, Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik polikliniklerine PH ve Demans ön tanısı ve ya aile taraması amacıyla ile başvuran danışanların Tıbbi Genetik hasta dosyaları ve Probel HBYS sistemi kayıtları geriye dönük olarak incelendi. Bu hastalar içerisinden GBA1 geni varyantı taşıyan hastalar ile iletişime geçilerek nanopor dizileme çalışmasına katılmak isteyen on bir hasta tespit edildi. On bir hastada yeni nesil dizileme paneli ve Sanger ile saptanan on iki varyant için nanopor dizileme aşamasına geçildi. GBA1 geni ve GBAP1 psödogeni polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılarak, kütüphane hazırlığı, nanopor dizileme ve biyoinformatik analizler yapıldı.
On iki varyantın sadece 2 tanesi varyant çağırma basamaklarını geçti ve 16,67%'lik varyant saptanma oranına ulaşıldı. Varyant çağırma basamağını geçemeyen ancak IGV'de görülebilen varyantlar da bu orana dahil edilirse tespit edilen varyant sayısı on bire ulaşılmakta ve 91.67%'lük bir saptama oranı elde edilmektedir. 
Sonuçlarımız, düşük tespit oranına rağmen, nanopore teknolojisinin uzun dizileri başarıyla dizileyebildiğini göstermektedir. Ancak, cihazın yaygın kullanıma sunulmadan önce biyoinformatik adımlarının ele alınarak geliştirilmesi gerekmektedir. Ülkemizde GBA1 geni ve GBAP1 psödogeni uzun okumalar ile ilk defa bizim çalışmamızda nanopor ile dizilenmiştir ve bu çalışma sonraki çalışmalara öncü olacak niteliktedir

Abstract:
The GBA1 gene encodes the lysosomal enzyme glucocerebrosidase, and biallelic mutations in GBA1 cause Gaucher disease (GD), while heterozygous carriers are at increased risk for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease (PD) and Lewy body dementia (LBD). Studies on families with GD have shown that GBA1 variants can be associated with PD and LBD.
Pseudogenes are DNA sequences that have evolved from active genes and lost their function due to mutations. The GBA1 gene has a non-functional pseudogene, GBAP1, with 96% homology. Although next-generation sequencing (NGS) technology is a significant tool for investigating genetic disorders, genes like GBA1, which have pseudogenes, require additional validation. Methods such as Sanger sequencing, long-range PCR, and nanopore sequencing technology are used to confirm GBA1 variants. Nanopore sequencing is particularly successful in regions requiring long reads and in distinguishing between GBA1 and GBAP1 where NGS falls short.
This study is the first in Turkey to target GBA1 gene sequencing using nanopore technology, focusing on validating GBA1 variants in patients with PD and dementia. This new technology aims to enhance understanding of the GBA1-GBAP1 relationship and represents an important step in the diagnosis of genetic disorders.
For this purpose, between June 2019 and July 2024, patient files from the Medical Genetics outpatient clinics of Dokuz Eylül University Faculty of Medicine and records from the Probel HBYS system were retrospectively reviewed for individuals referred for PD and dementia pre-diagnosis or family screening. Eleven patients carrying GBA1 variants were identified and invited to participate in the nanopore sequencing study. The next-generation sequencing panel and Sanger identified twelve variants in these eleven patients, and nanopore sequencing was performed. GBA1 gene and GBAP1 pseudogene were amplified via polymerase chain reaction (PCR), followed by library preparation, nanopore sequencing, and bioinformatic analyses.
Only two out of twelve variants passed the variant calling steps, resulting in a 16.67% detection rate. When including variants visible in IGV but not passing the variant calling step, the number of detected variants increased to eleven, achieving an 91.67% detection rate.
Our results demonstrate that despite the low detection rate, nanopore technology successfully sequences long reads. However, bioinformatics steps must be improved and refined before the device is widely adopted. In our country, GBA1 and its pseudogene GBAP1 were sequenced using long reads for the first time in our study, which serves as a pioneering effort for future research.