Beta galaktozid alfa-2,6-siyaliltransferaz (ST6Gal1)'ın Sporadik İnklüzyon Cisimcik Miyoziti (sIBM) patogenezindeki rolünün in vitro model oluşturularak araştırılması
Identification of the role of beta galactoside alpha-2,6-sialyltransferase (ST6Gal1) in the pathogenesis of Sporadic Inclusion Body Myositis (s-IBM) by the use of an in-vitro culture model
Yazar: BURCU BALCI
Danışman: PROF. DR. PERVİN DİNÇER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
sIBM, 50 yaş ve üzerindeki bireylerde en sık karşılaşılan dejeneratif kas hastalığı olup, şu ana kadar nedenleri ve başarılı bir tedavi yaklaşımı bulunamamıştır. Kalıtsal formu olan hIBM ise, siyalik asit biyosentezinin ilk iki aşamasında görevli GNE enzimini kodlayan gende meydana gelen mutasyonlar sonucunda oluşmaktadır. Hem hIBM hem de sIBM'de dejenerasyon yolağını başlatan mekanizmalar aydınlatılamamış olsa da, anahtar patojenik rolü Aß birikiminin oynadığı düşünülmektedir. Toksik Aß, APP'nin sırasıyla ß ve ? sekretazlar tarafından kesilmesi sonucunda oluşur. BACE1, ß sekretaz olup APP'nin ilk kesim enzimidir. BACE1'in temel substratı ST6Gal1'dir. ST6Gal1 enzimleri, BACE1 enzimi tarafından proteolitik kesime uğrayarak katalitik bölgeleri ile birlikte çözünür formda vücut sıvılarına salgılanırlar. Salgılanan ST6Gal1'in hücre dışına salgılanan çözünür glikoproteinlere ?-2,6 siyalik asit birimleri eklediği düşünülmektedir. IBM hastalığının her iki formunda da ST6Gal1 enziminin ifade düzeyi ve hücre dışına salgılanma seviyesi ile ilgili bir çalışma şu ana kadar yapılmamıştır. GNE genindeki mutasyonlara bağlı olarak siyalik asit biyosentezindeki bozuklukların hIBM hastalığının patogenezini oluşturduğu bilinmektedir. Ancak, sIBM'de siyalik asit biyosentezi doğru şekilde gerçekleştiğinden, ST6Gal1'in IBM patolojik yolağının herhangi bir noktasında işlevi olup olmadığı araştırılmamıştır. Tez çalışmamız kapsamında, sIBM hücre kültür modelinin oluşturulması ve bu modeli kullanarak ST6Gal1 enziminin sIBM patogenezindeki olası rolünün araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, C2C12 hücrelerinde APP'nin yüksek düzeyde ifadesi sağlanarak sIBM hücre kültür modeli oluşturulmuştur. Transfekte edilmiş C2C12 hücrelerindeki ve hücre kültür ortamındaki proteinler izole edildikten sonra Western Blot analizine alınarak, ST6Gal1 enziminin hücre içi ve salgılanan formları kontrol hücrelerle karşılaştırmalı olarak analiz edilmiştir. Çalışmamız sonucunda APP'nin yüksek düzeyde ifadesinin sağlandığı C2C12 hücrelerinde, ST6Gal1 enziminin hücre içi formunun ifade düzeyinin ve ST6Gal1 salgılanma seviyesinin arttığı sonucuna ulaşılmıştır.

Abstract:
Sporadic inclusion body myositis (s-IBM), the most common muscle disease of persons aged 50 years and older is of unknown cause and unconfirmed pathogenesis. No consistently succesful treatment is available. Hereditary form of sIBM that is called h-IBM, results from mutations in the GNE gene which encodes a bifunctional enzyme that catalyses the first two steps committed toward sialic acid biosynthesis. Accumulation of Aß plays a key pathogenic role in the development of both the sporadic and hereditary forms of this disease. Toxic Aß is formed after sequential cleavage of the APP by ß-secretases and ?-secretases. BACE1 is the major ß-secretase for generation of toxic Aß peptides. It has been implicated in the proteolytic processing of another physiological substrate other than APP, which is ST6Gal1. ST6Gal1 is secreted with its catalytic domain after proteolytic cleavage by BACE1. The biological significance and function of soluble ST6Gal1 in body fluid has been a mystery for many years. It has been suggested that cleavage and secretion of ST6Gal1 enhances the ?-2,6 sialylation of soluble glycoprotein substrates. In both forms of IBM, the expression and secretion level of ST6Gal1 enzyme are not known. Loss of GNE activity in h-IBM is thought to impair sialic acid production and interfere with proper sialylation of glycoconjugates. But it remained unclear if ST6Gal1 enzyme affects sIBM pathogenesis since sialic acid biosynthesis is unaffected in s-IBM. In this study, our aim was to establish a cell culture model of s-IBM for investigation of the role of ST6Gal1 in the pathogenesis of s-IBM. For this purpose, we developed a cell culture model of s-IBM induced by overexpression of APP in C2C12 mouse myogenic cell line. We then analyzed the effect of overexpression of APP on expression and secretion of ST6Gal1. Control and transfected cell culture lysate and culture media were collected and the protein samples were subjected to Western Blot analysis. The results of our study shows that, APP overexpression in C2C12 cells increases the expression and the secretion of ST6Gal1 enzyme.