Biofilm formation of Streptococcus Mutans on restorative material surfaces and in vitro assessment of efficacy of probiotic lactic acid bacteria on biofilm
Restoratif materyallerin yüzeylerinde S. Mutans`ın  biyofilm oluşturması ve Probiyotik Laktik Asit bakterisinin biyofilm üzerine etkinliğinin in vitro olarak değerlendirilmesi
Yazar: ALP KAYAHAN KIVANÇ
Danışman: DOÇ. DR. HAKTAN YURDAGÜVEN
Yeditepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Restoratif Diş Tedavisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Dental materyaller = Dental materials ; Dental restorasyon = Dental restoration ; Lactobacillus rhamnosus = Lactobacillus rhamnosus ; Laktik asit = Lactic acid ; Laktik asit bakterileri = Lactic acid bacteria ; Probiyotikler = Probiotics ; Streptococcus mutans = Streptococcus mutans

Özet:
ÖZET



Kivanc, AK. (2018). Restoratif materyallerin yüzeylerinde S.mutans`ın  biyofilm oluşturması ve Probiyotik Laktik Asit bakterisinin biyofilm üzerine etkinliğinin in vitro olarak değerlendirilmesi

Yeditepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Restoratif Diş Tedavisi Anabilim Dalı, Doktora Tezi, Istanbul.


Kompozit rezinler, cam ionomer simanlar ve seramik malzemeler restoratif diş hekimliğinde hem estetik özellikleri hem de doldurucu özellikleri nedeniyle dişlerin restorasyonunda sıklıkla kullanılmaktadır. Ancak yapılan restorasyonların bir kısmının zaman içinde yenilenmesi gerekmektedir. Bu ise hem zaman kaybına hem de ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu restorasyonların değiştirilmesine sebep olan başarısızlıkların en önemli sebeplerinden biri sekonder çürüklerdir. Sekonder çürüklerin nedeni kenar sızıntısı, ağız hijyeni uygulamalarının eksik veya yanlış yapılması sonucu bakteri plağı oluşumudur. 
Çürüklerin oluşumuna sebep olan dental plak polisakkarit bir matriks içinde çok sayıda bakteriyi barındıran bir biyofilmdir. Bakteriyal adezyon kuvveti ve agregasyonla bakteriyal veya tükürük proteinleri ile ilişkili olup lipidler ve nukleik asitlerde bu yapı da yer alabilir. S. mutans, asidogenik özelliği ile diş sert dokusuna zarar verir. Sükroz varlığında suda çözünmeyen glukanlar sentezleyerek  diş yüzeyinde kolonize olarak dendal plağın oluşmasına neden olur. Restorasyonun altında ve civarında çürük oluşmasına neden olur.
Oral bakteriler tarafından oluşturulan biyofilmi önlemek için çeşitli tedavi ve yöntem başvurulmaktadır. En çok uygulanan yöntemlerden bazıları çeşitli kimyasal maddelerin  ve antibiyotiklerin kullanılmasıdır. Son yıllarda laktik asit üreten bakterilerinin etkin olabileceği belirlendikten sonra probiyotik bakterilere ilgi artmıştır.  Probiyotikler canlı mikroorganizmalar olup konokçının sağlığına yararlı etkileri bulunmaktadır.
Restoratif materyallerin yüzeyinde S.mutans'ın biyofilm oluşumu ve biyofilmin probiyotik bakterilerle önlenmesi ile ilgili az sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu  nedenle çalışmamızda güncel restorasyon malzemelerin yüzeyinde (G-ænial (GC), Clearfil Majesty ES 2 (Kuraray), Ælite all purpose body (Bisco), Beautiful II (Shofu), Sonic fill 2 (Kerr),Equia Forte (Gradia), Emax (ivoclar) ve Lava (3M Espe) ) S. mutans1' in biyofilm oluşumu ve bir probiyotik bakteri olan L. rhamnosus12' in biyofilm oluşumu üzerine etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
Restoratif materyallerden hazırlanan diskler üzerinde S.mutans1'ın biyofilm oluşturması diskler tükürükle kaplandıktan sonra invitro koşullarda % 2 sukroz içeren Brain heart infusion broth içinde 24 saat 37oC de inkübe edilerek beklenmiştir. Oluşan biyofilm kristal viyole ile boyandıktan sonra glasiyal asetik asit ile kaldırılarak spektrofotomerede  570 nm dalga boyunda okunarak değerlendirilmiştir. Ayrıca disklerdeki biyofilm içindeki canlı bakteri sayımı da damlatma plak yöntemi ile belirlenmiştir. L. rhamnosus 12'nin biyofilm üzerine etkisini belirlemede ise iki yol izlenmiştir. Birinci uygulamada S. mutans1 ve  L. rhamnosus 12 birlikte, ikinci uygulamada ise L. rhamnosus12' filtre içine konularak yapılmıştır. Her iki uygulamada da biyofilm oluşumu spektrofotometre ile belirlenmiş ve biyofilmdeki bakteri sayımları yapılmıştır. Her uygulamada son pH belirlenmiştir. 
S.mutans1 en yüksek biyofilmi G-ænial ve Ælite purpose body  ve Majesty ES 2 , en düşük biyofilmi ise Beatiful II oluşturmuştur. Canlı bakteri sayımı ise en yüksek 8,370,41log cfu/mL olarak Equia forte' de saptanmıştır. Bunu beatiful II (7,800,61log cfu/mL ) ve G-ænial (7,880,70 log cfu/mL takip etmiştir. En düşük sayımlar ise Emax (5,500,70 log cfu/mL )  ve Lava'da  (4,450,24 log cfu/mL ) olmuştur.  
L. rhamnosus12 sükroz içeren ortamda restoratif materyallerde düşük biyofilm oluşturmuştur. En yüksek biyofilm oluşumu kurarayda olurken en düşük biyofilm ise hidroksi apatit, Emax ve Lava'da belirlenmiştir. En yüksek bakteri sayısı Equia forte (7,510,19 log cfu/mL) ve Beatiful II (7,300,57 log cfu/mL) de saptanmıştır. En düşük sayım ise Emax (2,370,50 log cfu/mL) da belirlenmiştir. 
Yapılan annova  analizinde S.mutans1'ın ve  L. rhamnosus12 'un biyofilm oluşturması açısından restoratif materyaller arasında istatistiki olarak önemli  bir farklılık olduğu (p<0.05) belirlenmiştir.
L. rhamnosus12'un biyofilm oluşumuna etkisine bakılacak olursa,   S. mutans1 ile birlikte uygulandığında hidroksi apatit dışında diğer restoratif materyallerde değişen oranlarda biyofilm oluşumunu azaltmıştır. Bu farklılık istatistiksel olarak  önemli bulunmuştur (p<0.05). L. rhamnosus12'un filtre içine uygulandığı işlemde ise bütün restoratif materyallerde biyofilm oluşumu önemli ölçüde azalmıştır. 
S.mutans1sayımları gerek birlikte uygulamada ve gerekse L. rhamnosus12'un filtre içine uygulandığı işlemlerde düşük olarak saptanmıştır. 
Biyofilm oluşumu restoratif materyallere göre değişiklik göstermiştir. L.rhamnosus 12 restoratif materyallerde ve diş yapısına benzer bir yapı gösteren hidroksi apatitte biyofilm oluşumunu etkilemiştir. Bu etki istatistiksel (p<0.05) olarak önemli bulunmuştur. SEM görüntüleri ile de bu durum doğrulanmıştır. Seçtiğimiz L.rhamnosus`un etkili bir suş olduğu görülmektedir. S.mutans`ın biyofilm oluşumunu önemli ölçüde azaltmıştır.

Anahtar Kelimeler: Restoratif materyal, biyofilm, probiyotik, S.mutans, laktik asit bakterileri, L.rhamnosus

Abstract:
ABSTRACT


Kivanc, AK. (2018).  Biofilm formation of Streptococcus mutans on restorative material surfaces and in vitro assessment of efficacy of probiotic lactic acid bacteria on biofilm         

Institute of Medical Sciences of Yeditepe University, Department of Restorative Dentistry, PhD dissertation, Istanbul

Composite resins, glass ionomers and ceramic materials are frequently used in the restoration of teeth because of both their aesthetic properties and filling properties in the restorative dentistry. However, some of the restorations should be renewed over time. This causes both time loss and economic losses. One of the most important reasons for the failures that cause these restoration changes are the secondary decays. The cause of the seconder decays is the formation of bacterial plaque, which is the result of edge leakage or incorrect oral hygiene practices. 
The dental plaque that causes the formation of decays is a biofilm that contains a large number of bacteria in a polysaccharide matrix. Bacterial adhesion is associated with bacterial or salivary proteins with force and aggregation, which can also occur in lipids and nucleic acids. S. mutans damages the hard tissue of the tooth with its acidogenic properties. In the presence of sucrose, it synthesizes water-insoluble glucans and causes colonization of the tooth surface resulting in dendritic plaque formation. It causes decays under and around the restoration.
Various treatments and methods are applied to prevent the biofilms caused by the oral bacteria. Some of the most common methods are the use of various chemical substances and antibiotics. Interest in probiotic bacteria has increased since it has been proven in recent years that lactic acid producing bacteria may be effective. Probiotics are living microorganisms and have beneficial effects on the health of the host.
There are few studies on the formation of biofilms of S. mutans on the surface of restorative materials and the prevention of biofilm with probiotic bacteria. For this reason, in our study, we aimed to determine the biofilm formation of S. mutans1 and the effect of L. rhamnosus12, a probiotic bacteria, on biofilm formation on the surface of current restorative materials (G-ænial (GC), Clearfil Majesty ES 2 (Kuraray), Ælite all-purpose body (Bisco), Beautiful II (Shofu), Sonic fill 2 (Kerr), Emax (Ivoclar) and Lava (3M Espe)).
The formation of biofilm by the S. mutans1 on the discs prepared from restorative materials discs were kept for 24 hours at 37 ° C in a brain heart infusion broth containing 2% sucrose after covering them with saliva. The resulting biofilm was stained with crystal violet, then removed with glacial acetic acid and read and evaluated at 570 nm wavelength on the spectrophotometer. Furthermore, viable bacterial counts in the biofilm in the discs were also determined by the drip plaque method. In determining the effect of L. rhamnosus12 on biofilm, two methods were used. In the first method, S. mutans1 and L. rhamnosus12 were combined together and in the second method, L. rhamnosus12 was placed in the filter. In both methods, the biofilm formation was determined by spectrophotometer and bacterial counts were made in the biofilm. The final pH was determined in each method. 
S.mutans1 formed the highest biofilm in G-ænial and Ælite al purpose body and Majesty ES 2, and the lowest biofilm in Beatiful II. The count of live bacteria was found to be the highest of 8,37 ± 0,41 log cfu / mL in Equia forte. This was followed by beatiful II (7,80 ± 0,61 log cfu / mL) and G-ænial (7,88 ± 0,70 log cfu / mL. The lowest counts were detected in Emax (5,50 ± 0,70 log cfu / and in the Lava (4,45 ± 0,24 log cfu / mL). 
L. rhamnosus 12 produced low biofilm in restorative materials in medium containing sucrose. The highest biofilm formation was in the reserve while the lowest biofilm was found in the hydroxyapatite, Emax and Lava. The highest bacterial counts were in the Equia forte (7,51 ± 0,19 log cfu / mL) and Beatiful II (7,30 ± 0,57 log cfu / mL). The lowest count was also in Emax (2,37 ± 0,50 log cfu / mL). 
Annova analysis showed that there was a statistically significant difference (p <0.05) between the restorative materials in terms of biofilm formation of S. mutans 1 and L. rhamnosus 12.
As far as the effect of L. rhamnosus12 on biofilm formation is concerned, it reduced biofilm formation at varying rates in other restorative materials except hydroxyapatite when applied together with S. mutans1. This difference was statistically significant (p <0.05). In the process of applying L. rhamnosus12 into the filter, the formation of biofilm in all restorative materials decreased considerably. 
It was found that S.mutans1 counts were low both in co-practice and when the L. rhamnosus12 was applied within the filter. 
The formation of biofilm varied according to the restorative materials. L. rhamnosus12 affected the formation of hydroxyapatite biofilm in restorative materials and in hydroxyapatite that had in a structure similar to dental structure. This effect was statistically significant (p <0.05). SEM images also confirmed it. The L. rhamnosus that we have chosen seems to be an effective strain. It significantly reduced biofilm formation of S. mutans.

Key Words : Restorative material, biofilm, probiotic, S.mutans, lactic acid bakteria, L.rhamnosus.