Biyomalzeme kullanımına yönelik sığır sıs deselülerizasyonu ve sıçanlarda kritik boyutlu tam kalınlık yara iyileşme modelinde etkinliğinin değerlendirilmesi
Decellularization of bovine sis for biomaterial use and assessment of efficacy in a rat critical-size full-thickness wound repair model
Yazar: MAHMUT PARMAKSIZ
Danışman: PROF. DR. Y. MURAT ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Dermatoloji = Dermatology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Yara iyileşmesi = Wound healing

Özet:
Bu çalışmada, biyomalzeme kullanımına yönelik sığır ince barsak submukoza tabakasının (SIS) yeni tasarlanan yöntem ile deselülerizasyonu gerçekleştirildi. Bu amaçla mekanik, kimyasal ve fiziksel yöntemlerin beraber kullanımını kapsayan ideal bir protokol geliştirilerek büyük ölçüde hücrelerinden arındırılmış lifsi yapıda membranlar hazırlandı. Deselülerizasyon yönteminin etkinliği SEM, histokimya ve DNA içeriği analizleriyle belirlendi. Deselülerize edilen membranların yüzey özellikleri ile su ve tampon tutma kapasiteleri de incelendi. Daha sonra, deselülerize sığır SIS membranlara sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (Kİ-MKH) tohumlandı ve 21 gün boyunca kültürü sürdürüldü. Deney süresince, belirli zaman noktalarında hücrelerin canlılığı ve çoğalması MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür] yöntemi ve histokimyasal analizlerle takip edildi. Sıçan Kİ-MKH'leri tohumlanmış ve hücresiz sığır deselülerize SIS membranlarının sıçanlarda kritik boyutlu (7 cm2) tam kalınlık yara iyileşme modelinde etkinliğinin incelenmesi amacıyla in vivo çalışmalar tasarlandı. Çalışmada, aynı boyutta oluşturulan açık yaralar kontrol olarak kullanıldı. İyileşme süreci boyunca, yara boyutunda meydana gelen değişim, iltihaplanma, kızarıklık, şişme, vb. durumlar günlük makroskopik olarak takip edildi. Ayrıca yara iyileşme sürecinin daha iyi değerlendirilebilmesi amacıyla, belirli zaman noktalarında doku örneklerinin sıçanlardan eksplante edilmesinin ardından histo- ve immünhistokimya boyamaları ile analiz edildi. Deselülerize sığır SIS membranlarının sıçan Kİ-MKH'ler için uygun bir iskele olduğu ve yara iyileşmesini kontrole göre daha az skar oluşumu ile yaklaşık iki kat hızlandırdığı belirlendi. Elde edilen sonuçlar, deselülerize sığır SIS membranlarının, hücresiz veya Kİ-MKH'leri ile kombine edilerek, rejeneratif tıpta yara grefti olarak kullanılma potansiyeline sahip olduğu görüşünü desteklemektedir.

Abstract:
In this study, bovine small intestinal submucosa (SIS) was decellularized using a novel method for use as a biomaterial. For this aim, highly fibrous and cell free membranes were prepared with the optimized method involving chemical, physical and mechanical treatments. The efficiency of the decellularization method was assessed using SEM, histochemistry and DNA content analyses. Surface properties and water/buffer uptake capacity of decellularized membranes were also assessed. Afterwards, rat bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) were seeded and cultured on decellularized bovine SIS membranes up to 21 days. During this period, cell viability and proliferation were evaluated via MTT [3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay and histochemical staining at predetermined time points. The in vivo studies were designed to investigate the efficacy of empty and BM-MSCs-seeded bovine SIS, in the critical-size (7cm2) full-thickness rat skin defect model. The open wound in same size was chosen as the control. During the healing process, observations such as changes in the diameter, inflammation, bleariness, exudation and swelling were recorded daily for each wound macroscopically. And also, samples were explanted from rats at predetermined time points and were evaluated using histology and immunohistochemistry for in-depth analyses of the wound healing process. Findings supported the notion that, decellularized bovine SIS membranes could be a suitable scaffold for rat BM-MSCs and accelerate wound healing approximately two-fold, with minor scarring. In conclusion, decellularized bovine SIS has potential as a wound graft in regenerative medicine alone or in combination with BM-MSCs.