Biyolojik osmolitlerin termofilik Geobacillus kaustophilus DSM 7263t L-asparajinaz üzerindeki koruyucu etkisinin araştırılması ve akrilamidin giderimindeki etkisinin belirlenmesi
Investigaton of the protective effect ofbiological osmolites on thermophilic Geobacillus kaustophilus DSM 7263t L-asparaginase and determination oftheir effect on acrylamide removal
Yazar: ÖZGE DEMİRTAŞ
Danışman: DOÇ. DR. FATMA İNCİ ÖZDEMİR
Gebze Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
L-asparajinazlar, L-asparajinden aspartik asit ve amonyak oluşumunu kataliz eden amino hidrolaz grubuna ait enzimlerdir. Bu enzimler günümüzde kemoterapötik ajan olarak ilaç endüstrisinde ve L-asparajini hidroliz etme yeteneğinden dolayı gıda ürünlerinin kızartılması sırasında akrilamid oluşumunun inhibisyonu ile gıda endüstrisinde kullanılmaktadır.
L-asparaginaz gibi ilaç ve gıda endüstrilerinde önemli uygulamaları olan enzimler çevresel etmenlere karşı oldukça duyarlıdır. Enzimlerin inaktivasyonları veya etkinliklerinin azalması sıcaklık, ortam pH'sı, denatüre edici ajanlar gibi birçok faktörün etkisi ile gerçekleşir. Bu nedenle enzimlerin stabilizasyonu aktivitelerinin korunması açısından zorunlu hale gelmiştir. Protein agregasyonu hem gıda hem de ilaç endüstrisinde önemli bir sorundur. Protein stabilitesini arttırmak için kullanılan popüler stratejilerden biri, katlanmış proteinleri destekleyen şekerler, polioller ve nötr amino asitler gibi küçük organik moleküller olan ozmolitlerin kullanılmasıdır.
Bu tez çalışmasında Geobacillus kaustophilus'tan elde edilen GkASNaz enziminin ozmolitler ile kullanarak stabilitesinin korunması ve aynı zamanda akrilamid giderimindeki etkinliğinin arttırılması amaçlanmıştır. Seçilen ozmolitler arasında GkASNaz 30 günlük depolama süresinde en yüksek kararlılığı maltoz ve arjinin varlığında göstermiştir. Maltoz 37°C ve 55°C'de, düşük pH aralığında (pH 5.0 ve pH 7.0) aktivitesini yaklaşık 2 kat arttırmıştır. Maltoz ve arjinin ozmolitlerin varlığında enzimin optimum sıcaklığı değişmemiş ayrıca 55°C sıcaklığın altında ve üstündeki derecelerde enzim aktivitesi artış göstermiştir. 2 gün ozmolitler varlığında +4°C'da inkübe edilmiş olan GkASNaz'ın Km değerleri 37 ve 55°C'da kontrollerine kıyasla azalmış ve Vmax değerleri artmıştır. Bu sonuçlar, enzimin katalitik etkinliğinin osmolitlerin varlığıyla arttığını ve maltozun arjininden daha etkili olduğunu göstermiştir. GkASNaz'ın arjinin aracılı stabilizasyonu, enzimatik aktiviteyi arttırmıştır; 12. sa'tin sonunda 37°C'de %83, 55°C'de ise %77 olarak belirlenmiştir. Ozmolitler varlığında +4°C'da 2 gün inkübe edilen GkASNaz 15 dk'lık reaksiyonda akrilamid giderimini 1.7 kat arttırmıştır.

Abstract:
L-asparaginases are enzymes belonging to the group of amino hydrolases that catalyse the formation of aspartic acid and ammonia from L-asparagine. These enzymes are currently used in the pharmaceutical industry as chemotherapeutic agents and in the food industry by inhibition of acrylamide formation during frying of food products due to its ability to hydrolyse L-asparagin. L-asparaginase, which have important applications in pharmaceutical and food industries, are very sensitive to environmental factors. Inactivation or decrease in the activity of enzymes occurs under the influence of many factors such as temperature, ambient pH, denaturing agents. Therefore, stabilisation of enzymes has become mandatory for the preservation of enzyme activity. Protein aggregation is an important problem in both food and pharmaceutical industries. One of the popular strategies used to increase protein stability is the use osmolytes, which are small organic molecules such as sugars, polyols and neutral amino acids that support folded proteins.
In this thesis, it was aimed to maintain the stability of GkASNase enzyme obtained from Geobacillus kaustophilus by using osmolytes and to increase its efficiency in acrylamide removal. Among the selected osmolytes, GkASNase showed the highest stability in the presence of maltose and arginine during 30 days of storage. Maltose increased its activity about 2-fold at 37 and 55°C in the low pH range (pH 5.0 and pH 7.0). In the presence of maltose and arginine osmolytes, the optimum temperature of the enzyme did not change and enzyme activity increased at temperatures below and above 55°C. Km values of GkASNase incubated at +4°C in the presence of osmolytes for 2 days decreased and Vmax values increased at 37 and 55°C compared to controls. These results showed that the catalytic activity of the enzyme increased with the presence of osmolytes and maltose was more effective than arginine. Arginine-mediated stabilisation of GkASNase at elevated temperature helped to maintain the enzymatic activity; at the end of 12 h, the enzyme activity was 83% at 37°C and 77% at 55°C. At 55°C. GkASNase incubated at +4°C for 2 days in the presence of osmolytes increased acrylamide removal 1.7 times in 15 minutes reaction.