Mekanosensitif iyon kanalı adayı genlerin Astacus leptodactylus türünde klonlanması ve ilgili proteinlerin fonksiyonel ve yapısal özelliklerinin belirlenmesi
Cloning of candidate mechanosensitive ion channel genes and determining the functional and structural properties of the related proteins in Astacus leptodacylus
Yazar: KAAN ARSLAN
Danışman: PROF. DR. NUHAN PURALI
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Gen klonlama = Gene cloning ; İyon kanalları = Ion channels

Özet:
Hücreler, membrandaki gerim veya
ozmotik basınç değişimi gibi çeşitli mekanik uyarılara yanıt verirler.
Mekanosensitif iyon kanalları, mekanik uyarıların elektriksel veya kimyasal
sinyallere dönüştürülmesi olan mekanotransdüksiyon [şlem[nde temel bir rol
oynar. Son yıllarda tanımlanan Piezo1 ve Piezo2 kanalları, bu özelliklere sahip
kanallardır. Ancak Piezo kanalları mekanik uyarılara yanıt veren bazı hücre
popülasyonlarında ifade edilmedikleri için vücuttaki tüm mekanosensitiviteyi
açıklamak için yeterli değildir. TMC ve TMEM63'ün çeşitli türlerde
mekanosensitif oldukları raporlanmıştır. Bu tez, bu kanalların ortologu olan
mRNA'ların Astacus leptodactylus (tatlı su kereviti) türünde ilk defa
klonlanmasını amaçlamıştır. Putatif mRNA'lar klonlandıktan sonra klonlanan
kanalların moleküler özellikleri araştırılmıştır. İlgili proteinlerin üç boyutlu
yapıları hesaplanmış ve bazı fonksiyonel kısımlar tanımlanmıştır. Fonksiyonel
çalışmalarda kullanılmak üzere, klonlanan mRNA'lar sentezlenmiş, plazmid
vektörlere transfer edilmiş ve HEK293T hücre hatlarında ifade edilmiştir.
Mekanosensitivite, çeşitli mekanik uyarılara cevap olarak kalsiyum duyarlı bir
boyanın (Fluo-4 AM) emisyon sinyali kayıt edilerek takip edilmiştir. Bu
çalışmada TMC ve TMEM63 ortologlarını kodlayan iki mRNA de novo
klonlandı. Moleküler hesaplamalar ikisinin de transmembran iyon kanalı
olarak yapılanabileceklerini gösterdi. Fonksiyonel çalışmalar TMEM63'ün bir
mekanosensitif iyon kanalı olarak görev alıyor olabileceğini in situ ve
heterolog ifade sisteminde gösterdi.

Abstract:
Cells respond
to various mechanical stimuli like tension or osmotic pressure changes in the
membrane. Mechanosensitive ion channels play an important role in
mechanotransduction, which is the conversion of mechanical stimuli into
electrical and chemical signals. Recently identified Piezo1 and Piezo2 channels
are representative members of the mechanosensitive channels in eukaryotes.
However, Piezo channels alone can not account for all kinds of
mechanosensitivity modalities in the body since they are not expressed in some
cell populations that respond to mechanical stimuli. TMC and TMEM63 were
recently reported to be mechanosensitive in various species. This thesis aimed
to clone mRNAs of the orthologues of those channels in the crayfish, Astacus
leptodactylus. After cloning the putative mRNAs, molecular properties of the
cloned channels were investigated. Three-dimensional structures of the related
protein sequences were calculated and some functional parts were identified.
To be used in the functional experiments, the cloned mRNAs were synthesized
and transferred to plasmid vectors and expressed in HEK293T cell lines.
Mechanosensitivity was monitored by acquiring the emission signal from a
calcium sensitive dye (Fluo-4 AM) in response to various mechanical stimuli.
Two mRNAs coding TMC and TMEM63 orthologues were de novo cloned.
Molecular calculations illustrated that they both can assemble into a
transmembrane ion channel. Functional studies indicated that TMEM63 could
be a mechanosensitive ion channel both in situ and in a heterologous system.