Konak makrofajlarında mikobakteriyel enfeksiyonlara karşı doğal ve sentetik terapötik bileşiklerin antimikobakteriyel aktivitesinin ve moleküler mekanizmalarının değerlendirilmesi
Evaluation of the antimycobacterial activity and molecular mechanisms of natural and synthetic therapeutic compounds against mycobacterial infections in host macrophages
Yazar: SİBEL DAĞLI
Danışman: PROF. DR. NİZAMİ DURAN
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) = Reverse transcription polimerase chain reaction ; Mikobakteriler =

Özet:
Mycobacterium tuberculosis, insan ölümlerine yol açan en önemli patojenlerden biridir. Özellikle son yıllarda ilaç dirençli suşların yaygınlaşması, mevcut terapötiklere alternatif yeni ilaç araştırmalarını kaçınılmaz hale getirmiştir. Bu çalışmada, standart anti-tüberkülozik ajanlar ile doğal ve sentetik bileşiklerin etki ve direnç mekanizmalarını aydınlatarak yeni tedavi stratejileri geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla mikobakterilerin konak hücre enfeksiyon sürecindeki etkilerini anlamak ve değerlendirmek amacıyla standart ilaç olarak izoniazid ve rifampisin kullanılırken, bileşik gruplarında likopen, linalool, rosmarinik asit, rosuvastatin ve oleik asitin etkileri değerlendirilmiştir.  Sitotoksisite testleri için Vero hücre hattı, enfeksiyon modeli için Raw 264.7 hücre hattı ve mikobakteriyel enfeksiyon için M. avium suşu kullanılmıştır. Hücre sitotoksisitesi MTT yöntemiyle ölçülmüş, proenflamatuar sitokin (IL-6, CXCL1 (IL-8), IL-1β, TNF-α, IL-12 (P40)), anti-enflamatuar (IL-10, IL-27), enflamatuar süreçlerde rol oynayan enzim genleri (CYP1A1, COX-2, iNOS) ile transkripsiyon faktörü Egr-1 geninin ekspresyon seviyeleri ise RT-PCR ile analiz edilmiştir.
M. avium ile enfekte edilen Raw 264.7 hücrelerinde yapılan gen ekspresyon analizleri hem kontrol grubuyla hem de doğal bileşiklerle tedavi edilen gruplar arasında önemli farklılıklar göstermiştir. Oleik asit tedavisi, IL-1β, IL-6 ve TNF-α gen ekspresyonlarında kontrol grubuna kıyasla belirgin bir azalma sağlamıştır. Kontrol grubunda IL-1β ekspresyonu 2.4 kat artarken, oleik asit grubunda bu artış 1.22 kat ile sınırlı kalmıştır (p<0.0001). Benzer şekilde, IL-6 ve TNF-α ekspresyonları kontrol grubunda daha yüksekken, oleik asit tedavisi bu genlerde sırasıyla 0.42 kat ve 1.75 kat artışla daha düşük seviyelerde regülasyon sağlamıştır. IL-12 ekspresyonu ise oleik asit grubunda 25.61 kat artarken, kontrol grubunda bu artış 21.36 kat olarak ölçülmüştür. Proinflamatuar sitokinlerin genel ekspresyonu, doğal bileşiklerle tedavi edilen gruplarda kontrol grubuna kıyasla güçlü şekilde regüle edilmiştir. Örneğin, CYP1A1 gen ekspresyonu kontrol grubunda 2.86 kat artarken, izoniazid grubunda 4.10 kat ve rifampisin grubunda 2.84 kat artış göstermiştir. COX-2 gen ekspresyonu kontrol grubunda 6.12 kat artış gösterirken, izoniazid ve rifampisin tedavi gruplarında bu artışlar sırasıyla 3.78 kat ve 3.85 kat olarak tespit edilmiştir. iNOS gen ekspresyonu kontrol grubunda 12.56 kat artış göstermiş, doğal bileşiklerle tedavi edilen gruplarda ise bu artış daha düşük seviyelerde saptanmıştır. Özellikle likopen, rosmarinik asit, rosuvastatin ve oleik asit ile tedavi edilen gruplarda iNOS ekspresyon artışları sırasıyla 9.92 kat, 7.12 kat, 8.75 kat ve 9.25 kat olarak belirlenmiştir. IL-10 gen ekspresyonu kontrol grubunda azalma eğilimi gösterirken, doğal bileşik tedavi gruplarında anlamlı bir artış sağlamıştır. Bunun yanında, IL-12 ekspresyonu doğal bileşiklerin kullanıldığı gruplarda standart ilaçlara kıyasla daha düşük seviyelerde artış göstermiştir.
Bu çalışma, M. avium enfeksiyonunun tedavisinde hem standart ilaçların hem de doğal bileşiklerin enflamatuar yanıt üzerindeki düzenleyici etkilerini ortaya koymuştur. Antibakteriyel ilaçların etkinliğinin, konak hücre immün yanıtının regülasyonu ile doğrudan ilişkili olduğu belirlenmiştir. Özellikle proenflamatuar sitokinlerin regüle edilmesi, enflamatuar yanıtın kontrol altına alınması ve antienflamatuar genlerin ekspresyonunun artırılması, mikobakterilerin makrofajlar içinde hapsedilmesi veya yok edilmesinde kritik öneme sahiptir. Doğal bileşiklerin (likopen, rosmarinik asit, linalool, rosuvastatin ve oleik asit) proenflamatuar gen ekspresyonunu düzenlediği ve inflamasyon sürecini dengelediği görülmüştür. Bu sonuçlar, doğal bileşiklerin standart tedavilere destekleyici ajanlar olarak eklenmesiyle ilaç direncinin kırılmasında ve çoklu ilaç dirençli tüberküloz vakalarının tedavi başarısında artış sağlanabileceğini göstermektedir. Gelecekte yapılacak klinik çalışmalar, bu yaklaşımların doğrulanması ve geliştirilmesi açısından önemlidir.

Abstract:
Mycobacterium tuberculosis is one of the most important pathogens that cause human deaths. Especially in recent years, the prevalence of drug-resistant strains has made new drug research as alternatives to existing therapeutics inevitable. In this study, we aimed to develop new treatment strategies by elucidating the mechanisms of action and resistance of standard anti-tuberculosis agents and natural and synthetic compounds. For this purpose, isoniazid and rifampicin were used as standard drugs to understand and evaluate the effects of mycobacteria on the host cell infection process, while the effects of lycopene, linalool, rosmarinic acid, rosuvastatin and oleic acid were evaluated in compound groups.  Vero cell line was used for cytotoxicity tests, Raw 264.7 cell line for infection model and M. avium strain for mycobacterial infection. Cell cytotoxicity was measured by MTT method and expression levels of pro-inflammatory cytokines (IL-6, CXCL1 (IL-8), IL-1β, TNF-α, IL-12 (P40)), anti-inflammatory (IL-10, IL-27), enzyme genes involved in inflammatory processes (CYP1A1, COX-2, iNOS) and transcription factor Egr-1 gene were analyzed by RT-PCR. While ısoniazid and rifampicin were used as standard drugs, the effects of lycopene, linalool, rosmarinic acid, rosuvastatin, and oleic acid were evaluated in natural compound groups.
Gene expression analyses performed in Raw 264.7 cells infected with M. avium showed significant differences between the control group and those treated with natural compounds. Oleic acid treatment caused a significant decrease in IL-1β, IL-6, and TNF-α gene expressions compared to the control group. While IL-1β expression increased 2.4-fold in the control group, this increase was limited to 1.22-fold in the oleic acid group (p<0.0001). Similarly, IL-6 and TNF-α expressions were higher in the control group, while oleic acid treatment regulated these genes at lower levels with 0.42-fold and 1.75-fold increases, respectively. IL-12 expression increased 25.61-fold in the oleic acid group, while this increase was 21.36-fold in the control group. The overall expression of proinflammatory cytokines was strongly regulated in the groups treated with natural compounds compared to the control group. For example, CYP1A1 gene expression increased 2.86-fold in the control group, 4.10-fold in the ısoniazid group, and 2.84-fold in the rifampicin group. COX-2 gene expression increased 6.12-fold in the control group, while these increases were determined as 3.78-fold and 3.85-fold in the ısoniazid and rifampicin treatment groups, respectively. iNOS gene expression increased 12.56-fold in the control group, while this increase was lower in the groups treated with natural compounds. In particular, iNOS expression increases were determined as 9.92-fold, 7.12-fold, 8.75-fold, and 9.25-fold in the groups treated with lycopene, rosmarinic acid, rosuvastatin, and oleic acid, respectively. While IL-10 gene expression tended to decrease in the control group, it provided a significant increase in the natural compound treatment groups. In addition, IL-12 expression increased at lower levels in the natural compound groups compared to standard drugs.