Larinksin preinvaziv epiteliyal lezyonlarında uygulanan Dünya Sağlık Örgütü (1991) ve Ljubljana (1997) sınıflandırmalarının immundokukimyasal işaretleyiciler (Ki-67, p53, CD34) kullanılarak karşılaştırılması (54 olgu)
To compared with the World Health Organization (1991) ve Ljubljana classifications applied for the laryngeal preinvasive epithelial lesions by using immunohistochemical markers
Yazar: SELMA ŞENGİZ
Danışman: PROF. DR. UĞUR PABUÇÇUOĞLU
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2001
Konu: Patoloji = Pathology

Özet:
Giriş ve amaç: Larinksin invaziv karsinoma ilerleyebilen epiteliyal hiperplastik- displastik lezyonları en sık olarak kord vokal ve interaritenoid alanda izlenir. Bu lezyonlar daha çok orta-yaşlı sigara içen erkeklerde ortaya çıkmaktadır. Laringeal epiteliyal hiperplastik-displastik lezyonlar A farklı risk gruplarına göre derecelendirilmektedir. Ancak bu lezyonların histolojik özellikleri ve biyolojik davranışları arasındaki ilişkinin her zaman uyumlu olmamasına bağlı olarak bazı zorluklar ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle, kaynaklarda laringeal epiteliyal hiperplastik-displastik lezyonlarla ilişkili 20'den fazla sınıflandırma önerilmiştir. Çeşitli araştırmacılar farklı histomorfolojik ölçütleri kullanarak bu lezyonları sınıflandırmışlardır. Bu lezyonlar, DSÖ (1991) sınıflamasında hafif, orta, şiddetli displazi ve in situ karsinom olarak derecelendirilirken, 1997 yılında Ljubljana'da önerilen yeni sınıflamaya göre basit, anormal, atipik hiperplazi ve in situ karsinom olarak derecelendirilmiştir. Laringeal displastik lezyonların malign transformasyon oranı % 1.5 ile % 52.9 arasında değişmektedir. Displazinin yalnızca mikroskopik olarak derecelendirilmesi bazı yanlış pozitif ve daha çok da yanlış negatif sonuçlara yol açmaktadır. Daha nesnel bir değerlendirmeye ve lezyonların neoplastik potansiyelinin tahmin etmeye yardımcı olabilecek yeni histolojik belirleyicilere gereksinim vardır. Bu çalışmada laringeal epiteliyal hiperplastik-displastik lezyonlarda uygulanan başlıca sınıflamalar olan DSÖ ve Ljubljana sınıflandırmalarının karşılaştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla çalışma kapsamındaki hiperplastik ve displastik lezyonlarda anti Ki-67, p53 ve CD34 immundokukimyasal belirleyicileri kullanılarak proliferatif aktivite, genetik değişiklikler ve anjiogenezis hakkında nesnel verilerin sağlanması ve söz konusu sınıflandırmalardaki histolojik ölçütlerin geçerliliğinin bu nesnel verilerle değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve yöntemi DEÜTF Patoloji Anabilim Dalında 1990-2000 yılları arasında laringeal epiteliyal hiperplastik-displastik lezyon tanısı almış 108 olgudan 54'ü çalışma kapsamına alınmıştır. Bu olgulara ait H&E preparatların tümü 54yeniden gözden geçirilip, her bir olgu DSÖ ve Ljubljana sınıflamalarına göre yeniden derecelendirilmiştir. Daha sonra olgulara Ki-67, p53 ve CD34 antijenleri için immunhistokimya uygulanmıştır. Ki-67 antijeni için pozitif boyanan hücre yüzdesi, 1000 hücre sayılarak hesaplanmıştır. p53 antijeni için nükleer boyanma gösteren hücrelerin epitelin içindeki dağılımına göre skorlanma yapılmıştır. CD34 antijeni içinse subepiteliyal alandaki endotelyal hücreler görülebilir hale getirildikten sonra, her olgu için üç alandaki damar sayılarının ortalaması hesaplanmıştır. İstatistik: DSÖ ve Ljubljana sınıflamasına göre derecelendirilen olguların Ki-67 ve CD34 ekspresyonları artan histolojik dereceler bazında Kruskal Wallis testi ile karşılaştırılmıştır. Ki-67, p53 ve CD34 ekspresyqnlan ile her iki sınıflamadaki artan histolojik dereceler arasındaki korelasyon Spearman korelasyon testi ile araştırılmıştır. Ayrıca basit hiperplazi olguları kontrol grubu olarak ele alınıp, hiperplazi olgularındaki immundokukimyasal ekspresyonlar DSÖ sınıflamasındaki hafif displazi ve orta dereceli displazi olgularının immundokukimyasal ekspresyonları ile; ayrıca yine kontrol grubunun verileri Ljubljana sınıflamasındaki anormal hiperplazi olgularının immundokukimyasal verileri ile Mann-Whitney U ve Chi-Square testleri kullanılarak karşılaştırılmıştır. Ayrıca DSÖ sınıflamasındaki hafif displazi olguları ile orta dereceli displazi olgularının immundokukimyasal verileri aynı istatistik testler kullanılarak karşılaştırılmıştır. Bulgular: Çalışmada yer alan 54 olgunun 48'i (% 88.8) erkek, 6'sı (% 11.1) kadındır. Genel yaş ortalaması 52±12 (27-76) yıldır. DSÖ sınıflamasına göre 6 olgu basit hiperplazi, 22 olgu hafif displazi, 8 olgu orta derecede displazi, 12 olgu şiddetli displazi ve 6 olgu karsinoma in situ tanısı almıştır. Ljubljana sınıflamasına göre ise 6 olgu basit hiperplazi, 26 olgu anormal hiperplazi, 15 olgu atipik hiperplazi ve 7 olgu karsinoma in situ tanısı almıştır. Her iki sınıflamada olguların artan histolojik dereceleri ile Ki-67 ve CD34 ekspresyonları arasında anlamlı sonuç elde edilmiştir. Yine her iki sınıflamada olguların histolojik dereceleri ile Ki-67, p53 ve CD34 ekspresyonları arasında pozitif yönlü korelasyon saptanmıştır. Basit hiperplazi olguları kontrol grubu olarak ele alındığında, DSÖ sınıflamasına göre derecelendirilen hafif displazi ile basit hiperplazi olguları; orta derecede displazi ile basit hiperplazi olguları ve hafif displazi ile orta derecede displazi olguları Ki-67 ekspresyonları açısından karşılaştırıldığında anlamlı bir fark elde edilmiştir. Benzer sonuçlar Ljubljana sınıflamasına göre derecelendirilen anormal hiperplazi ile basit hiperplazi olguları arasında da elde edilmiştir. CD34 ile boyanan damar sayıları açısından, DSÖ sınıflamasına göre derecelendirilen hafif displazi olguları ile basit hiperplazi olguları; orta derece displazi olguları ile basit hiperplazi olguları karşılaştırıldığında anlamlı bir fark elde edilirken, hafif displazi olguları ile orta derece displazi olguları karşılaştırıldığında anlamlı bir fark elde edilmemiştir. Ljubljana sınıflamasına göre derecelendirilen anormal hiperplazi olguları ile basit hiperplazi olguları karşılaştırıldığında yine anlamlı bir fark elde edilmiştir. DSÖ sınıflamasına göre derecelendirilen orta dereceli displazi olguları ile basit hiperplazi olguları p53 ekspresyonları açısından karşılaştırıldığında anlamlı bir fark elde edilirken, hafif displazi olguları ile basit hiperplazi olguları ve hafif displazi olguları ile orta dereceli displazi olguları arasında anlamlı bir fark elde edilememiştir. Ljubljana sınıflamasına göre derecelendirilen anormal hiperplazi olguları ile basit hiperplazi olguları p53 ekspresyonu açısından karşılaştırıldığında ise anlamlı bir fark elde edilmiştir. Tartışma ve sonuç: Her iki sınıflamada da Ki-67, p53 ve CD34 ekspresyonları artan histolojik dereceler ile olumlu korelasyon göstermektedir. Ancak, p53 ve 1 CD34 ekspresyonları ile ilgili verilerimiz DSÖ sınıflamasından çok Ljubljana sınıflamasmdaki derecelerin daha nesnel ölçütlere dayandığı tezini desteklemektedir. Ortaya çıkan verilere göre, DSÖ sınıflamasında lezyonların hafif ve orta derece displazi şeklinde ayrılması p53 ve CD34 ekspresyonları ile tam bir paralellik göstermemektedir. DSÖ sınıflamasmdaki bu kategorilerin, Ljubljana sınıflamasında olduğu gibi tek bir başlık altında toplanması makul görünmektedir. Ancak çalışmamızda kullandığımız olgu serisinin çok geniş olmaması ve sınırlı sayıda belirleyicilerin kullanılmış olması nedeniyle, DSÖ ve Ljubljana sınıflamalarının yeterliliği ve nesnelliğini test etrne açısından daha geniş serilerde yapılan çalışmalara gereksinim vardır.

Abstract:
Introduction and objective: Laryngeal epithelial hyperplastic-dysplastic lesions with progression to invasive carcinoma are seen most common in the vocal cord and interarytenoid field. These lesions most often occur on mid aged smoking males. Laryngeal epithelial hyperplastic-dysplastic lesions are graded according to different risk groups. As there is sometimes discordance between established histopathological criteria and the biological behavior of these lesions, some difficulties occur. So, more than 20 classifications have been proposed associated with laryngeal epithelial hyperplastic-dysplastic lesions in literature. Various investigators classified these lesions using different histomorphological criteria. While these lesions graded as mild, moderate, severe dysplasia and in situ carcinoma for WHO (1991) classification, according to new classification suggested in Ljubljana on 1997 these lesions graded as simple, abnormal, atypical hyperplasia and in situ carcinoma.The rate of malignant transformation of laryngeal dysplastic lesions ranges between 1.5% and 52.9%. Evaluations of dysplasia solely based on light microscopic examination may lead to false-positive or even to false-negative results. Therefore, new markers are required in order to provide more objective data when it comes to determining the neoplastic potential of these lesions. In this study, the comparison of the WHO and the Ljubljana classifications applying to laryngeal epithelial hyperplastic-dysplastic lesions was aimed. With this purpose, it was aimed to provide objective data about proliferative activity, genetic changes and angiogenesis by using Ki-67, p53 and CD34 immunohistochemical markers and to evaluate validity of histological criteria of these classifications with these objective data.Material and methods: Of 108 cases diagnosed laryngeal epithelial hyperplastic-dysplastic lesion from the archives of Dokuz Eylul University, School of Medicine, Department of Pathology between 1990-2000 years, 54 cases were included in this study. The histologic slides were re-examined, and each case was reclassified according to both the WHO and the Ljubljana classifications.58Then, sections from each paraffin block were stained for Ki-67, p53 and CD34 antibodies. For Ki-67 antigen, evaluation of immunostaining was based on the percentage of positively stained nuclei by counting 1000 cells. For p53 antigen, scoring was done based on the distribution of positively stained cells within the epithelium. For CD34 antigen, subepithelial CD34-positive vessels were counted in three high power fields for each case, and then the mean value was calculated.Statistical analysis: Ki-67 and CD34 expressions of cases graded according to the WHO and the Ljubljana classifications were compared by Kruskal Wallis test with increasing histological grades. Correlation between Ki-67, p53 and CD34 expressions and increasing histological grades according to the WHO and the Ljubljana classifications was investigated by Spearman corelation test. Also simple hyperplasia was taken as control group, immunohistochemical expressions of cases with hyperplasia were compared with immunohistochemical expressions of cases with mild dysplasia and moderate dysplasia at the WHO classification; also results of control group were compared with immunohistochemical expressions of cases with abnormal hyperplasia at the Ljubljana classification by using Mann-Whitney U and Chi-Square tests. Also immunohistochemical expressions of cases with mild dysplasia were compared with immunohistochemical expressions of cases with moderate dysplasia at the WHO classification by using same statistical tests.Results: Of 54 cases, 48 were men (88.8%) and six were women (11.1%). The mean age for all cases was 52±12 (27-76) years. According to the WHO classification, six cases were squamous cell hyperplasia, 22 cases were mild dysplasia, eight cases were moderate dysplasia, 12 cases were severe dysplasia and six cases were carcinoma in situ. According to the Ljubljana classification, six were simple hyperplasia, 26 cases were abnormal hyperplasia, 15 cases were atypical hyperplasia and seven cases were carcinoma in situ.There was a significant result between cases of increasing histological grades and Ki-67 and CD34 expressions of both the WHO and the Ljubljana classifications. As well as there was a positive correlation between Ki-67, p53 and CD3459expressions and histological grades. When simple hyperplasia was taken as control group, there was a significant difference between mild dysplasia and simple hyperplasia, moderate dysplasia and simple hyperplasia, and mild and moderate dysplasia graded according to the WHO classification compared with Ki-67 expressions. Similar results were obtained between abnormal hyperlasia and simple hyperplasia graded according to the Ljubljana classification. With regard to counts of vessels with stained CD34, a significant difference was obtained between mild dysplasia and simple hyperplasia and moderate dysplasia and simple hyperplasia, there was not a significant difference between mild and moderate dysplasia graded according to the WHO classification. A significant difference was also obtained between abnormal hyperlasia and simple hyperplasia graded according to the Ljubljana classification. For the p53 expression scores, there was a significant difference between moderate dysplasia and simple hyperplasia graded according to the WHO classification, there were not significant differences between mild dysplasia and simple hyperplasia, and mild dysplasia and moderate dysplasia. When compared with p53 expressions, a significant difference was obtained between abnormal hyperplasia and simple hyperplasia graded according to the Ljubljana classificationDiscussion and conclusion: There was a positive correlation between and Ki-67, p53 and CD34 expressions of both the WHO and the Ljubljana classifications. But results of p53 and CD34 expressions supported thesis that grades of the Ljubljana classification based on more objective criteria compared with the WHO classification. According to obtained results, it showed no correlation between mild and moderate dysplasia categories of the WHO classification with regard to p53 and CD34 expressions. These categories in the WHO classification was favored to collect under a single title as in the Ljubljana classification. Since our case series were not very large and limited markers were used in our study, there is necessity to studies done with more large series in terms of examining the sufficiency and objectivity of the WHO and the Ljubljana classifications.