FSH'nın fare granüloza hücrelerine etkisinin hippo sinyal yolağı proteinleri (YAP, TEAD ve p73) ve mikroRNA'ları (miR129-5p ve miR145-5p) ile değerlendirilmesi
Evaluation of the high-dose fsh effect on mice granulosa cells with hippo signal pathway proteins (YAP, TEAD and p73) and microRNAs (miR129-5p and miR145-5p)
Yazar: GÜLSEN ZÜBEYDE KARAMAN
Danışman: PROF. DR. MAHMUT KEMAL ÖZBİLGİN
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Fareler = Mice ; Folikül uyarıcı hormon = Follicle stimulating hormone ; Granüloza hücreleri = Granulosa cells ; Mikro RNA = Micro RNA ; RNA = RNA ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
Rekombinant gonadotropinler aynı anda birden fazla folikülün gelişiminin uyarılması için yardımlı üreme tekniklerinde yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Ancak FSH'nın (folikül stimülan hormon) aşırı kullanımının folikül gelişimini bozduğuna dair çalışmalar mevcuttur. Hormonlar, büyüme faktörleri ve miRNA'lar overdeki hücre proliferasyonunu ve homeostazisi Hippo yolağı aracılığıyla düzenlemektedirler. Bu yolağın üyelerinden YAP/TEAD hücrelerin hayatta kalması ve proliferasyonu yönünde etki ederken; YAP/p73 apoptoza gidişi kontrol eder.
Bu çalışmada YAP1/TEAD3 immunreaktivitesi ve bununla ilişkili miR-129-5p ve p73 immunreaktivitesi ve bununla ilişkili miR-145-5p düzeyleri incelenmiştir. Doğrulama amacıyla kaspaz-3 ve bax immunreaktiviteleri değerlendirilmiştir. Yüksek doz FSH uygulamasının granüloza hücreleri üzerindeki etkisinin Hippo sinyal yolağı üzerinden değerlendirilmesi ve bahsi geçen miRNA'lar ile ilişkisinin açıklanması amaçlanmıştır.
Balb/c cinsi, 18 adet, 6-8 haftalık dişi fareler kontrol, sham ve deney grubu olarak üçe ayrılmıştır. Deney grubuna her 12 saatte bir sırasıyla 10-10-5-5 IU/ml olmak üzere toplam 4 doz FSH intraperitoneal olarak uygulanmıştır. Sham grubuna deney grubuna verilen FSH hacmine eşit miktarda eş zamanlı olarak %0.09 SF yapılmıştır. Fareler son enjeksiyondan 12 sa. sonra sakrifiye edilmiştir. Over dokuları ve kan örnekleri alınarak RT-PCR ve immunohistokimya teknikleriyle analiz edilmiştir.
Over doku kesitlerinin immunohistokimya ile analizinde, granüloza hücrelerinde YAP1 ve TEAD3 immunreaaktivitesi artarken p73 ve kaspaz-3 immunreaktivitelerinde değişiklik gözlenmedi. Gruplar arasında Bax immunreaktivitesinde anlamlı farklılık yoktu. MiR-129-5p ve miR-145-5p, FSH uygulaması sonrası downregüle oldu. P73, Kaspaz3 ve Bax'ın granüloza hücrelerinde değişmeyen immunreaktivitesi yüksek doz FSH sonrası atreziye gidiş olmadığını göstermektedir. YAP1 ve TEAD3 immunreaktivitesinde artış ile miR-129-5p ve miR-145-5p düzeylerinde görülen azalma overde proliferatif sürecin baskın olduğunu ve yüksek doz FSH'ın bu etkiyi Hippo sinyal yolağı üzerinden açığa çıkarttığını göstermektedir.

Abstract:
Recombinant gonadotropins are widely used in assisted reproductive techniques for the development of many follicles. However, in cases requiring excessive FSH (follicle-stimulating hormone) use, follicle development is also impaired. Hormones, growth factors, or miRNAs in ovaries control cell proliferation and homeostasis by regulating the Hippo pathway. While TEAD/YAP genes in the pathway allow cells to survive; YAP/p73 controls progression to apoptosis. 
In this study, TEAD3/YAP1 expressions which also associated miR-129-5p and p73 expression which also associated miR-145-5p levels were investigated. The expressions of the casp3 and bax apoptosis markers were also evaluated for confirmation. It was aimed to reveal the effect of the Hippo pathway on granulosa cells after high-dose FSH administration and link with miRNA reflections. 
Eighteen, 6-8 w Balb/c female mice were divided into three groups including control, sham, and FSH groups. FSH group were injected by 10-10-5-5 IU/ml FSH respectively, every 12 hours, 4 doses total. The same amount of saline was applied to sham group. The animals were sacrificed 12 hr after the last injection. Ovary tissues and blood were taken for analysis by RT-PCR and immunohistochemistry technics.
YAP1 and TEAD3 expressions were increased, while p73, caspase-3 expressions weren't changed in granulosa cells in ovary. There was no difference in the bax expression among the groups. MiR-129-5p and miR-145-5p were downregulated in FSH-treated group. The unchanged expression of p73, caspase-3 and bax in granulosa cells indicates no progression to atresia following administration of high-dose FSH. The increase in YAP1 and TEAD3 expressions and the decrease in miR-129-5p and miR-145-5p revealed that the proliferative process is dominant in the ovary and high-dose FSH exerts this effect through the Hippo pathway.