Talaromyces annesophieae metabolitlerinin biyolojik aktivitelerinin araştırılması
Investigation of biological activities of talaromyces annesophieae derived metabolites
Yazar: MERYEM DOYMUŞ
Danışman: PROF. DR. MESUT TAŞKIN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Amaç: Funguslar; polisakkarit, peptit, pigment, alkoloid, fenolik bileşikler gibi çeşitli biyoaktif metabolitleri üreten ökaryotik organizmalardır. Mevcut çalışmada, filamentli mikrofunguslardan elde edilen doğal metabolitlerin biyoaktif özelliklerinin araştırılması amaçlanmaktadır. 
Yöntem: Çalışmada kullanılan filamentli mikrofungusların izolasyonu, Erzurum'daki (Türkiye) farklı çam orman toprak örneklerinden PDA besiyeri kullanılarak gerçekleştirildi. Fungal izolatların kültür süpernatantlarının antibakteriyel etkinliği agar kuyucuk difüzyon yöntemine göre belirlendi. En yüksek antimikrobiyal aktiviteye sahip izolatın (en büyük zon çapı) tanılanması 18S rRNA dizi analizine göre yapıldı. Bu izolatın kültür süpernatantından hazırlanan EtOAc ve DCM ekstraktları da antimikrobiyal etkinlik açısından test edildi. En yüksek antimikrobiyal aktiviteyi gösteren ekstrakt preparatif HPLC ile fraksiyonlara ayrıldı. Her fraksiyonun antimikrobiyal aktivitesi test edildi ve çalışmanın geri kalanına en yüksek aktiviteye sahip fraksiyon ile devam edildi. Metabolitlerin farmasötik potansiyelini ortaya çıkarmak için antimikrobiyal, antikanser, antioksidan ve anti-aging aktiviteleri test edildi. Fraksiyonun antikanser aktivitesi in vitro'da WST-1 hücre canlılık testine göre analiz edildi. Antikanser etkinliğinin gen düzeyindeki değişimleri qRT-PCR yöntemi ile analiz edildi. Antimikrobiyal aktivitesi kuyucuk difüzyon ve antioksidan aktivitesi ABTS, DPPH radikallerini giderme testlerine göre analiz edildi. Anti-aging aktivitesi ise insan deri fibroblastları üzerinde in vitro'da WST-1 analizi ile test edildi.
Bulgular: İzole edilen mikrofunguslar arasında, MD2 izolatının süpernatantının en yüksek antimikrobiyal etkinliğe sahip olduğu belirlendi. MD2 izolatı Talaromyces annesophieae (GenBank: PQ252671) olarak tanılandı. İzolatın DCM ekstraktının EtOAc ile ekstraksiyonuna göre daha yüksek aktiviteye sahip olduğu belirlendi. DCM ekstraktından elde edilen fraksiyonun HT-29 (kolon), DU-145 (prostat), SH-SY5Y (nöroblastoma) kanser hücre hatlarında yüksek sitotoksik aktiviteye sahip olduğu, sağlıklı insan akciğer fibroblast hücreleri üzerinde herhangi bir toksik etkiye sahip olmadığı belirlendi. Gen ekspresyon analizi, fraksiyonun antikanser aktivitesinin otofaji ve apoptozis yollarındaki etki mekanizmalarıyla ilişkili olduğunu ortaya koydu. Fraksiyonların Gram pozitif (Staphylococcus aureus ve Bacillus cereus)ve Gram negatif (Esherichia coli ve Klebsiella pneumoniae) bakterilere karşı antimikrobiyal aktivite sergilediği ancak Candida albicans'a karşı herhangi bir antimikrobiyal aktiviteye sahip olmadığı sonucuna ulaşıldı. In vitro aktivite testi, fraksiyonun DPPH ve ABTS radikallerini giderdiğini ve cilt fibroblastlarını H2O2 kaynaklı yaşlanma sürecine karşı koruyabileceğini ortaya koydu. Dahası metabolitlerin antikanser, antioksidant, yaşlanma karşıtı ve antibakteriyel aktivitelerinin doza bağlı olarak arttığı tespit edildi.
Sonuç: Talaromyces annesophieae MD2 mikrofungusunun DCM ekstraktından metabolitlerin eldesi literatürde ilk kez gerçekleştirildi. Metabolitlerin çok yüksek seviyede antikanser ve antibakteriyel aktivitelere orta seviyede ise antioksidan aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Bu nedenle, Talaromyces annesophieae'den elde edilen metabolitlerin gıda, biyomedikal, kozmetik ve ilaç endüstrilerinde insan yararına uygulama alanı bulabileceği öngörülmektedir.

Abstract:
Purpose: Fungi are eukaryotic organisms that produce various bioactive metabolites such as polysaccharides, peptides, pigments, alkaloids, phenolic compounds. The aim of the present study is to investigate the bioactive properties of natural metabolites obtained from filamentous microfungi.
Method: The filamentous microfungi from different pine forest soils in Erzurum (Turkey) was performed on potato dextrose agar (PDA) medium. The antibacterial efficiency of the culture supernatants of the fungal isolates was determiend to according to well diffusion method. The identification of the isolate with the highest antimicrobial activity (the largest zone diameter) was performed according to 18S rRNA sequence analysis. EtOAc and DCM extracts prepared from the culture supernatant of this isolate were also tested for antimicrobial efficiency. The extract showing the highest antimicrobial activity was separated into fractions with preparative HPLC. The antimicrobial activity of each fraction was tested and the remainder of the study was continued with the fraction with the highest activity.  Antimicrobial, anticancer, antioxidant and anti-aging activities were tested to reveal the pharmaceutical potential of the metabolites. The in vitro anticancer activity of the fraction was analyzed according to the WST-1 cell viability test. The anticancer activity-related gene expression analysis was performed by qRT-PCR method. Its antimicrobial activity was analyzed according to the well diffusion and antioxidant activity ABTS, DPPH radical scavenging tests. Anti-aging activity of metabolites was tested on human skin fibroblasts in vitro by WST-1 analysis.
Findings: Among the isolated microfungi, the supernatant of the isolate MD2 was determine to have the highest antimicrobial efficiency. The isolate MD2 was identified as Talaromyces annesophieae (GenBank: PQ252671). The DCM extract of the isolate was found to have higher antimicrobial activity than its EtOAc extract. The fraction prepared from the DCM extract had high cytotoxic activity in HT-29 (colon), DU-145 (prostat), SH-SY5Y (neuroblastoma) cancer cell lines and did not have any toxic effect on MRC-5 (healthy human lung fibroblast cell line). The gene expression analysis revealed that the anticancer activity of the fraction is related the its effect mechanisms on autophagy and apoptosis pathways. The fraction exhibited antimicrobial activity against Gram-positive (Staphylococcus aureus and Bacillus cereus) and Gram-negative (Esherichia coli and Klebsiella pneumoniae) bacteria, but did not have any antimicrobial activity against Candida albicans. In vitro activity assay elucidated that the fraction could scavenge DPPH and ABTS radicals, and protect skin fibroblasts against H2O2-induced aging process. Furthermore, the anticancer, antioxidant, antiaging and antibacterial activities of the fraction increased depending on the dose.
Result: The biological activity of DCM extract of Talaromyces annesophieae MD2 microfungus was investigated for the first time in the literature. The metabolites of the extract exhibited very high anticancer, antiaging and antibacterial activities and moderate antioxidant activity. Therefore, it is anticipated that metabolites obtained from Talaromyces annesophieae may find applications for human benefit in the food, biomedical, cosmetic and pharmaceutical industries.