SPECT/BT yöntemiyle tümör teşhis ve görüntülenmesinde kullanılacak nanoboyutlu lipozom formülasyonlarının geliştirilmesi
Developing of nanosized liposomes used for tumor diagnosis and imaging by SPECT/BT
Yazar: MİNE SİLİNDİR
Danışman: DOÇ. DR. SUNA ERDOĞAN ; PROF. DR. A. YEKTA ÖZER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Radyofarmasi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Görüntüleme = Imaging ; İopromid = Iopromid

Özet:
Çalışmamızın amacı, SPECT/BT gibi hibrit görüntüleme yöntemi ile tümör teşhisi ve görüntülenmesinde kullanılacak nanoboyutta PEG ile kaplı ve tümöre spesifik antikor ile modifiye edilmiş lipozomal taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesidir.Günümüzde tümör görüntülemesinde kullanılan Nükleer Tıp yöntemleri (ör:SPECT, PET) tümör hakkında metabolik bilgi sağlarken, Radyolojik yöntemler (ör: BT, MR) ise anatomik bilgi sağlamaktadır. Hastaların incelenmesinde genellikle bu farklı görüntüleme yöntemlerinden elde edilen veriler beraber değerlendirilmeye çalışılır. Ancak her iki yöntemin ayrı cihazlarda ve farklı zamanlarda yapılması hassasiyet ve özgünlüğü azaltmaktadır. Bu sorunu çözmek için son yıllarda geliştirilen SPECT/BT hibrit görüntüleme sistemleri, kanser görüntülemesinde yeni bir çağ açmıştır. Hibrit sistemler, çalışma prensipleri açısından birbirinden farklı görüntüleme yöntemlerini bir araya getirmiştir. Hibrit görüntüleme cihazlarının rutin kullanıma girmesiyle her iki sistemde de kullanılabilecek kontrast bileşiklere ihtiyaç duyulmuştur.Bu amaçla geliştirdiğimiz, lipozom dispersiyonlarının bileşiminde, biri jel yapıda (DPPC) diğeri sıvı-kristal yapıda (PL 90G) olmak üzere iki farklı fosfolipit, stabilite artırıcı olarak kolesterol, lipozomların dolaşımda uzun süre kalmalarını sağlamak için PEG2000-DSPE, lipozomların tümör dokusuna aktif olarak hedeflendirilmesi için tümöre spesifik antikor olan mAb 2C5 ve Tc-99m'i lipozom yüzeyine stabil şekilde bağlamak için ise şelat yapıcı madde olan DTPA kullanılmıştır. DTPA, iki farklı şekilde lipozom bileşiminde kullanılmıştır; DTPA-PE ve DTPA-PLL-NGPE (PAP). BT görüntüleme için gerekli kontrast madde olan Iopromid içteki sulu faza hapsedilmiş, SPECT için gerekli radyonüklit olan Tc-99m'i ise lipit çifte tabaka yüzeyine bağlanmıştır.Çalışmamız kapsamında, Iopromid:DTPA-PE ve Iopromid:PAP içeren antikor ile modifiye edilmemiş ve tümöre özgü antikor mAb 2C5 ile modifiye edilmiş nanoboyutta PEG kaplı lipozom dispersiyonları hazırlanmış, karakterizasyon ve stabilite çalışmaları yapılmış, tümör hücrelerinde tutulumları incelenmiştir.Tüm dispersiyonların partikül boyutları 100 nm civarında bulunmuştur. DPPC içeren lipozom dispersiyonlarının, PL 90G içeren lipozom dispersiyonlarından daha küçük olduğu, PAP içeren lipozom dispersiyonlarının partikül büyüklüğünün DTPA-PE içeren dispersiyonlardan biraz daha büyük olduğu ve antikor ile modifikasyon sonrası partikül boyutunun az oranda arttığı görülmüştür.DPPC:DTPA-PE ve PL 90G:DTPA-PE içeren dispersiyonlar DPPC:PAP ve PL 90G:PAP içeren dispersiyonlarla karşılaştırıldığında PAP içeren dispersiyonlarda, hapsedilen Iopromid miktarının daha fazla olduğu bulunmuştur.Dispersiyonların lipozomal fosofolipit miktarları karşılaştırıldığında, DPPC içeren lipozomların fosfolipit miktarının, PL 90G içeren lipozomlardan daha az olduğu görülmüştür.Fiziksel stabilite çalışmaları, gerek partikül büyüklüğü değişimi gerekse içte tutulan Iopromid miktarının korunması açısından, hem DPPC hem de PL 90G lipozomlarının stabil olduğunu göstermiştir.In vitro hücre kültür çalışmalarında, MCF-7 ve EL4 tümör hücrelerinde Tc-99m işaretli antikor ile modifiye edilmiş lipozomların, modifiye edilmemiş lipozomlara göre 3-8 kat daha fazla tutulum gösterdiği bulunmuştur. Bu sonuçlar floresans mikroskobu ile yapılan görüntüleme çalışmaları ile de doğrulanmıştır.Sonuç olarak, yapılan çalışmalardan elde edilen bulgular, nanoboyutta PEG kaplı ve yüzeyi tümöre özgü antikor mAb 2C5 ile modifiye edilmiş ve kontrast madde olarak Iopromid içeren ve Tc-99m ile işaretli mAb 2C5 DPPC:PEG2000-PE:Chol:DTPA-PE ve mAb 2C5 DPPC:PEG2000-PE:Chol:PAP (60:0.9:39:0.1; % mol oran) bileşimine sahip lipozom dispersiyonlarının, SPECT/BT ile tümör görüntülemede umut vaat eden kontrast bileşikler olduğunu göstermiştir. Ancak daha kesin bir değerlendirme için, in vivo görüntüleme çalışmalarının yapılmasına ihtiyaç vardır.

Abstract:
The aim of this study is the development of nanosized, tumor specific antibody modified PEGylated liposomes used for diagnosis and imaging of tumor by hybrid imaging systems like SPECT/CT.Among the currently used cancer imaging methods; Nuclear Medicine modalities provide metabolic whereas the radiological modalities provide anatomical information. In the evaluation of the patients the data obtained from both of these modalities were used collaboratively. However; the different acquisition times on separate machines decrease the specificity and accuracy of both modalities. To solve this problem, researchers developed hybrid imaging modalities which opened a new era in the field of cancer imaging. Hybrid imaging systems, like SPECT/CT, consist of imaging modalities, which have different working principles. After the wide spread usage of the hybrid imaging modalities there is a need for a single contrast agent which can be used for both imaging modality.Liposomes, developed for this purpose, consist of two different phospholipids; DPPC (gel state) and PL 90G (liquid-crystalline state) and cholesterol as bilayer condenser. In this formulation, PEG2000-DSPE used to prepare long circulating liposomes, and tumor specific antibody, namely mAb 2C5, used to target the liposomes directly to the tumor cells. DTPA used as chelator agent to provide the stable association of Tc-99m with liposomes, DTPA used in two different forms; DTPA-PE and DTPA-PLL-NGPE (PAP). Iopromide which is contrast agent used for CT and encapsulated in aqueous phase of liposomes and Tc-99m which is radionuclide used in SPECT coupled on the surface of lipid membrane of liposomes.In this study, it was prepared non-modified and 2C5 modified, nanosized PEGylated liposomes containing Iopromide:DTPA-PE and Iopromide:PAP and they were characterized. It was investigated the physical stability of these liposomes and also carried out in vitro cell binding studies of these liposome dispersions.The particle size of all dispersions was found about 100 nm. It was seen that liposome dispersions consisting of DPPC as phospholipid have smaller particle size than liposome dispersions consisting of PL 90G and particle size of liposomes containing PAP was slightly bigger than particle size of liposomes containing DTPA-PE. It was also observed insignificant size increase after the attachment of mAb 2C5 to the liposome surface.When compared the liposomes containing DPPC:DTPA-PE and PL 90G:DTPA-PE with liposomes containing DPPC:PAP and PL 90G:PAP, it was observed that liposome dispersions containing PAP encapsulated higher amount of Iopromide than liposome dispersions containing DTAP-PE.Comparision of liposomal phospholipid amount of all formulations was shown that phospholipid yield of DPPC liposomes was lower that PL 90G liposomes.Physical stability studies was shown that, DPPC and PL 90G liposomes, both, were found stable from particle size change and Iopromide leakage view point during the storage.In cell culture studies, it was observed that Tc-99m labeled-tumor specific antibody modified liposomes demonstrated almost 3-8 fold more increase in cell surface association. This enhanced binding of mAb 2C5-modified liposomes to cancer cells was confirmed by fluorocence microscope images.Briefly, obtained results clearly showed that DPPC:PEG2000-PE:Chol:DTPA-PE and DPPC:PEG2000-PE:Chol:PAP (60:0.9:39:0.1; % mol ratio) liposomes which are nanozised, tumor specific antibody modified PEGylated liposomes encapsulated Iopromide and labeled with Tc-99m might be considered as promising contrast agent for tumor imaging by SPECT/CT. But, further in vivo imaging studies are certainly required for clear decision.