Bilgisayar-destekli antikolinesteraz flavonoid türevlerinin sentezi ve intraoperatif kanser görüntüleme özelliklerinin incelenmesi
Synthesis of anticholinesterase flavonoid derivatives with computer aided drug discovery procedures and investigation of their intraoperative cancer imaging properties
Yazar: BURCU BÜTÜN
Danışman: PROF. DR. TURAN ÖZTÜRK ; PROF. DR. GÜLAÇTI TOPÇU
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Çağımız insanının yoğun stres altında olmasından dolayı erken yaşlanma ve erken bunama gibi problemleri vardır. Günümüzde yaklaşık 20 milyon insan Alzheimer hastasıdır. Nörodejeneratif bir hastalık olan AH antioksidan ve antiradikal hatta antienflamatuar mekanizmalarla çok ilişkilidir. Bu tez çalışmasında bilgisayar-destekli ligand keşif ve tasarım prosedürleri uygulanarak aktif AChE ve/veya BChE enzim inhibisyonu gösteren flavonoid ailesinden 3-hidroksiflavon türevlerinin potansiyeli araştırılmıştır ve yüksek potansiyelli türevler tasarlanmıştır. Çalışmalarımız enzimlerin kristal yapısının protein veri bankasından (www.pdb.org) en uygunun seçilmesi ile sentezleyeceğimiz olan ligandların bu bölgeye docklanmasıyla başlamıştır. Daha sonra uyum skorları ve enzim içi kurdukları bağlar ve etkileşimleri GOLD (bilgisayar programı) ile incelenmiştir. Sentezlenmeden önce aktivite göstermeyeceği öngörülen bileşikler elenmiş böylelikle gereksiz zaman ve kimyasal madde sarfiyatı engellenmiştir. Bunun akabinde hedef bileşikler sentezlenmiş, spektral analizlerle yapı tayinleri yapılmış ve bu bileşiklerin antikolinesteraz aktiviteleri in vitro bir test olan Elman metodu ile araştırılmıştır. Bilgisayar destekli çalışmaların sonuçları ile in vitro testlerin sonuçlarının birbiriyle uyumlu olduğu gözlenmiştir. Tezin içerisinde de belirtildiği gibi yüksek uyum skoru ve etkileşim gösteren bileşiklerin aynı zaman da in vitro test sonuçlarının da iyi IC50 değeri verdikleri gözlemlenmiştir. Genel olarak tasarlanan bileşiklerin AChE'den ziyade BChE'ye karşı daha yüksek % inhibisyon ve daha düşük IC50 değerlerine sahip oldukları görülmüştür. Bu sonuçlardan bileşiklerimizin butirilkolinesteraz enzimine karşı seçimli olarak inhibisyon gösterdiği anlaşılmaktadır. 19.34 µM değeriyle BChE enzimine karşı FN34 bileşiğinin standart madde galantaminden de iyi bir IC50 değerini verdiğini görüyoruz ki aynı şekilde FN34 bileşiğinin AChE enzimine karşı da 78.47 µM ile en iyi ikinci değeri gösterdiği belirlenmiştir. Diğer taraftan  FN28, FN11, FN23, FN24, FN35 ve FN 38 bileşiklerinin BChE'ye karşı inhibisyon değerlerine bakıldığında standart madde galantaminle yarışacak şekilde oldukça iyi değerler verdikleri görülmektedir. 
Yapı-aktivite ilişkisi (SAR) bakımından sonuçlar değerlendirildiğinde B halkasında hidroksil bulunduran FN15, FN28 ve yine FN34 bileşikleri 4'-konumunda bulundurdukları OH grupları sayesinde H-bağı yaparak enzimle olan etkileşimi artırdıklarından yüksek uyum içinde oldukları gözlenmişti. Nitekim in vitro test sonuçları incelendiğinde  BChE'ye karşı FN34 bileşiği en iyi (IC50=19.36 µM) , FN28 bileşiği ise ikinci en iyi inhibisyon değerini (IC50=33.30 µM) vermiştir. Bunu takiben 4' konumundaki dimetilamin fragmentini bulunduran FN23 ve FN38 bileşikleri çevre aminoasitlerle yaptıkları hidrojen bağları sayesinde  yüksek uyum skoru verip in vitro anti-butirilkolinesteraz testleri incelendiğinde de sırasıyla yine en iyi  IC50= 39.95 µM ve IC50=38.44µM değerlerini vermişlerdir. Tez çalışmamızın temelini oluşturan Alzheimer hastalığının oksidatif stres ve inflamasyonla seyreden bir hastalık olduğu savından yola çıkarak ayrıca bu tezde sentezlenen tüm bileşiklerin ß-karoten lipid peroksidasyon yöntemi, DPPH serbest radikali süpürücü yöntem, ABTS katyon radikali giderim yöntemi ve CUPRAC yöntemi ile antioksidan potansiyellerini araştırdık. Bu dört testin sonuçlarına göre en iyi IC50 değerlerini ABTS katyon radikali giderim yöntemi ile elde ettik. Elde edilen sonuçlara bakıldığında FN38, FN21, FN41, FN23, FN15, FN27, FN28 VE FN5'in standart madde olan BHT ve α-Toc'den daha iyi değer gösterdiği görülmüştür. Bir 3HF türevi olan kersetin standart bileşikler içinde araştırılan her dört konsantrasyonda da en yüksek değerleri vermiştir. Yine bir radikal giderim ajanı olan DPPH serbest radikal giderim aktivitesi sonuçları incelendiğinde FN23'ün kersetinden sonra en iyi hatta diğer standart maddelerden bile daha iyi IC50 (58.60 µM) değeri verdiği görülmüştür. ß-karoten lipid peroksidasyonu inhibisyonu sonuçlarına bakıldığında ise FN5 200 µM konsantrasyonda 93.59 ile en iyi % inhibisyon değeri ve en iyi IC50 (70.06 µM) değerini vermiştir. Yapısında iki metoksi grubu bulunan FN5'in aktivite sonuçları metoksi grubunun molekülün lipofilik karakterini arttırmasına bağlı olduğu sonucunu göstermektedir. CUPRAC antioksidan aktivitesi sonuçlarında ise en yüksek konsantrasyonda (100 µM) en yüksek absorbans değerini 2.69 ile FN7 bileşiği vermiştir. Bu da standart madde BHA, BHT ve α-Toc'den daha yüksektir. Yine standart maddelerden  bir 3HF olan kersetinin 3.16 ile en yüksek değeri verdiği izlenmiştir ki en üst değerin 4.00 olduğu bilinmektedir. Zaten literatür verileri incelendiğinde doğadaki en güçlü antioksidan maddelerin flavonoidler olduğu görülmektedir. 3-Hidroksiflavonların da C2-C3 arasında çifte bağa ve 3 numaralı karbonda hidroksil grubuna sahip olmaları nedeniyle en iyi antioksidan çekirdekler olduğu bu çalışma ile de ispatlanmıştır. Yaptığımız test sonuçları da 3HF'lerin oldukça iyi antioksidan çekirdekler olduğunu göstermiştir. Neredeyse yaptığımız bütün antioksidan deneylerinde iyi sonuç veren FN5, FN7 ve FN23 bileşiklerinde metoksi grubu bulunduğu görülmüştür. Ayrıca elde edilen test sonuçlarından OH grubu sayısı arttıkça antioksidan aktivitenin arttığı gerçeğidir. Yine hem enzim (AChE ve BChE) inhibisyon test sonuçları hem de in silico deney sonuçları incelendiğinde 4' konumundaki OH grubunun hem antikolinesteraz aktiviteyi arttırdığı hem de antioksidan aktivite ile paralel sonuçlar verdiği görülmüştür.

Dünyada her yıl milyonlarca insan kansere yakalanmakta ve bu hastalığın çoğu zaman sonu ölümle sonuçlanmaktadır. Kanser tedavisi bazı durumlarda tümörlü dokunun çıkarılması ile başlar, kemoterapi ve diğer yardımcı tedavi yöntemleri ile devam eder. Biz bu tezde kanserli organın tümünü değil, sadece tümörlü dokunun çıkarılmasını hedefleyerek boyar madde ajanları ile görüntüleme sağlamayı hedefledik. Ameliyat sırasında yani intraoperatif olarak hasarlı dokunun floresans kaynaklı fotodinamik olarak görüntülenebilmesi için istenilen dalga boylarında floresans verecek bir 3-hidroksiflavon (FN15) sentezleyerek bunu iki polimerik zincirli amfifilik bir materyal haline dönüştürdük. Bunu polimerleştirme ve click reaksiyonları ile gerçekleştirdik. Elde ettiğimiz amfifilik karakterli bileşiği kanserli dokulara hedefli olarak gönderebilmek için (EPR effect) "gelişmiş geçirgenlik ve alıkonma etkisi" prensipleri çerçevesinde misel haline getirdik. Uygulamaya geçmeden önce 2 farede Ehrlich tümor modeli oluşturuldu. Ehrlich tümörü oldukça agresif kısa sürede büyüyen bir tümör modeli olduğundan bir hafta sonra kontrol edildiğinde, tümörlerin büyüdüğü görülmüştür. Farelerin ölümüne sebep olmasın diye elde edilen misel çok fazla bekletilmeden ameliyattan bir gün önce subkutan (karın boşluğuna) enjekte edilmiştir. Bir gün sonra ameliyat operatör doktor tarafından dikkatlice yapılmıştır. Ameliyat sırasında görüntüleme için UV lamba (366 nm) kullanılmıştır ve misellerin hedefli olarak tümörlü dokuya giderek boyama yaptığı görülmüştür. Böylece cerrahi girişim sırasında tüm dokunun değil, sadece kanserli alanın çıkartılması başarılmıştır. İleride doğal kökenli olan flavonoid bileşiklerinin genelde toksik etkilerinin olmadığı esasına dayanarak ileri klinik çalışmalarla ispatlanarak bu uygulamanın hayvanlarla sınırlı kalmayıp insanlar içinde uygulanabilir olacağını umuyoruz. Böylelikle cerrahi girişim masraflarını yükseltmeden ve hastaya fazla külfet yüklemeden belki de cerrahi alanda bir çığır açılmış olacaktır.  
Bu çalışma, İstanbul Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir (Proje No: BAP-40259).

Abstract:
In our era people are facing with aging and dementia due to being under different stress factors. There are approximately 20 millions people are Alzheimer's Disease. Alzheimer's disease which is a neurodegenerative disease is related with anti-inflammatory, antioxidant and antiradical mechanisms. 
In this thesis  we searched cholinesterase enzyme's inhibition ability of 3-hydroxyflavones (3HF) from flavonoid's family and designed more potential 3HFs derivatives with computer aided drug discovery procedures. We prepared a small library of synthetically accessible 3-hydroxyflavone derivatives and using acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) enzyme's crystal structures from protein data bank (www.pdb.org) with virtual screening procedures. Firstly, compounds were subject to  docking studies using the GOLD software package to identify compounds with high docking scores. Subsequently, the high-scoring compounds were visually inspected for enzyme-inhibitor binding interactions. Compounds predicted to be inactive were screened and eliminated before synthesis, so that waste of time and unnecessary chemical consumption were prevented. After this procedures selected compounds were synthesized, spectral analysis of each other were done and cholinesterase enzymes' inhibition capacity of synthesized compounds tested with using the Ellman method. We observed that computer-aided ligand discovery results and in vitro cholinesterase inhibition  test results were well in allignment with each other. As mentioned in results section, compounds with high docking scores are also showed good IC50 values in vitro tests. Synthesized compounds showed high inhibition potential to BChE enzyme more than AChE and have also low IC50 values. To these results we discovered our ligands are selectively inhibited BChE to AChE. FN34 showed best inhibiton to BChE enzyme with IC50=19.34 µM even better than standard compound galantamin and second high inhibition to AChE with IC50 =78.47 µM value. In addition FN28, FN11, FN23, FN24, FN35 and FN 38 showed high inhibition to BChE enzymes to compete with standard compound galantamine.

When the results are evaluated in terms of the structure activity relationship (SAR), FN15, FN28 and FN34 which have hydroxy group at B ring, forming H-bonding with amino acids by means of these groups. These bonds increase the interactions with BChE enzyme and give high docking scores. As a matter of fact that when the results of in vitro test assays' are examined. FN34 gave best result with IC50=19.36 µM and FN38 gave second good IC50=33.30 µM value to BChE enzyme as expected. FN23 and FN38 which have dimethylamine fragments at 4' position at B ring, gave good IC50 values (IC50= 39.95 µM and IC50=38.44 µM respectively) due to hydrogen bonds with amino acids by nitrogen atom of dimethylamine. 
Alzheimer's disease is a disease based on oxidative stress and inflammation so that we also searched the capacity of antioxidant potential of compounds with several assays such as Beta carotene lipid peroxidation inhibitory activity, DPPH free radical-scavenging assay, ABTS cation radical decolorization assay and Cupric Reducing Antioxidant Capacity (CUPRAC). In this way our study have gained a scientific character with combination of anticholinesterase and antioxidant assays. ABTS cation radical decolorization assay gave best IC50 results. The IC50 values of FN38, FN21, FN41, FN23, FN15, FN27, FN28 and FN5 are even better than standard compounds BHT ve α-Toc's IC50 values. Quercetin is also a 3HF showed best results in standard compounds. When DPPH free radical-scavenging assay results are wieved FN23 have best IC50 =58.60 µM value even between standard compounds except quercetin. In lipid peroxidation inhibitory activity results FN5 showed best inhibition with 93.59 µM at 200 µM and gave best IC50=58.60 µM value. We thought that two methoxy groups in structure gave lipophilic character to FN 5. When the results of CUPRAC assay evaluated FN7 showed best absorbance value with 2.67 at 100 µM. It was better result than standard compounds BHA, BHT and α-Toc. Quercetin also showed best result again with 3.16 µM. As a matter of fact that literature data showed the flavonoids are the most strong antioxidant structures in the nature. 3-Hydroxyflavones have gained more antioxidant character due to having double bond between C2-C3 and OH group at C3. Conjugation gives them the best antioxidant nucleus character between flavonoids. Our new synthesized 3HF derivatives results also reaffirmed this claim one more time. FN5, FN7 and FN23 which showed best results nearly in all antioxidant tests, have methoxy groups in their structures. In addition, general observation of us the more OH groups the better antioxidant activity. Hydroxy groups at C-4' position increase both the capacity of cholinesterase enzyme's inhibiton and antioxidant activity. 
In the world millions of people are caught with cancer every year and this ilness resulting with dead mostly. Cancer treatement is started with removel of tumor tissue and continues with chemotherapy generally and other methods. In this thesis, we aimed to remove only timor tissue instead of all cancer organ with using colouring targeted agents. During surgery (intraoperative), to wiev the tumor tissue with photodynamically, we synthesized a 3HF compound FN15 as a starting material. We made an amphiphilic material with adding two polymeric chains to the starting material with polymerization and click reactions.  We obtained a micelle from amphiphilic compound in order to be able to target only cancer tissue on the basis of  "enhanced permeability and retention effect" (EPR effect) principles. Ehrlich tumor model was created in 2 mice before application. Because of the Ehrlich tumor is a very aggressive short-term tumor that grew up quickly, we checked them after one week and saw it is ready to operation. Micelles were injected to mices subcutaneously (abdominal cavity). one day before from surgery due to preventing the sudden death of mices. After a day the surgery was done carefully by general surgeon. A UV lamp (366 nm) was used during the operation and it was seen that the micelles were targeted and accumulated to the only tumor tissue. Thus, removal of only tumour tissue was achieved instead of all cancerous area. Since there is no toxic effect of flavonoids which are natural compounds, it will able to be applied on not only animals but also humans with advanced clinical studies in the future. Thus, without raising the costs of surgical intervention it will be a new epoch in the field of surgery.
This study was supported by the Istanbul Technical University, Scientific Research Projects Unit (Project No: BAP-40259).