Cetuxımabın tek başına ve epirubıcın ile birlikte parental ve epirubicin dirençli karaciğer kanseri hücrelerinde sitotoksik ve apoptotik etkilerinin araştırılması
Investigation of cytotoxic and apoptotic effects of cetuximab alone and with epirubicin on parental and epirubicin resistant liver cancer cells
Yazar: AYŞE ERDOĞAN
Danışman: PROF. DR. AYSUN ÖZKAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, epidermal büyüme faktörü reseptörüne (EGFR) hedeflendirilmiş bir monoklonal antikor olan cetuximabın, tek başına ve epirubicin-HCl ile birlikte parental karaciğer kanseri hücreleri (P-Hep G2) ve epirubicin-HCl dirençli karaciğer kanseri (R-Hep G2) hücreleri üzerine sitotoksik, antiproliferatif, hücre döngüsünü bloke edici, oksidatif stres yaratma,  apoptotik etkisi ve etki mekanizmaları araştırılmıştır.

Cetuximabın tek başına ve epirubicin-HCl ile birlikte hücreler üzerine sitotoksik etkisi Cell Titer-BlueR Hücre Canlılığı ve Laktat Dehidrogenaz (LDH) Aktivite testleri ile belirlenmiştir. Cetuximab ve epirubicin-HCl'nin IC50 değerleri (hücrelerin %50'sini öldüren konsantrasyonu) P-Hep G2 ve R-Hep G2 hücrelerinde sırasıyla cetuximab için 1000 g/ml ve 2279 g/ml olarak hesaplanırken epirubicin-HCl için ise 0.80 g/ml ve 0.95 g/ml olarak hesaplanmıştır. Cetuximabın epirubicin-HCl ile birlikte uygulanması hem P-Hep G2 hem de R-Hep G2 hücrelerinde sitotoksik etkiyi arttırmıştır.  P-Hep G2 hücrelerinde en etkili sitotoksik etki gösteren kombinasyon IC50 cetuximab + IC40 epirubicin-HCl bulunurken, R-Hep G2 hücrelerinde ise IC50 cetuximab + IC5 epirubicin-HCl kombinasyonu bulunmuştur. Hücre membran bütünlüğünün bozulması sonucu salınan sitoplazmik bir enzim olan laktat dehidrogenaz (LDH) aktivitesindeki en fazla artış hem P-Hep G2 hem de R-Hep G2 hücrelerinde cetuximabın epirubicin-HCl ile birlikte uygulanmasında görülmüştür. Cetuximab ve epirubicin-HCl birlikte uygulandığında glutatyon peroksidaz aktivitesinin kontrol grubu hücrelerine göre P-Hep G2 hücrelerinde 1.75 kat,  R-Hep G2 hücrelerinde ise 2.3 kat arttığı gözlenmiştir. Apoptotik yolağın anahtar enzimlerinden biri olan kaspaz-3/7 aktivitesi 72 saatlik cetuximab uygulaması sonunda P-Hep G2 hücrelerinde kontrole göre 3 kat artarken cetuximab epirubicin-HCl ile birlikte uygulandığında yaklaşık olarak 4.7 kat artışın olduğu bulunmuştur. Cetuximab kaspaz-3/7 aktivitesinde R-Hep G2 hücrelerinde kontrole göre 1.5 kat artışa neden olurken epirubicin-HCl ile birlikte uygulandığında yaklaşık olarak 2.5 kat artışa neden olmuştur. 

Antiproliferatif etkiyi ortaya koyan prolifere hücre nüklear antijeninin (PCNA) ve hücre döngüsünü durdurucu etkiye sahip olan siklin D1 mRNA ekspresyonlarının azalmasında P-Hep G2 hücrelerinde tek başına cetuximab uygulaması daha etkili olmuştur. R-Hep G2 hücrelerinde ise cetuximabın epirubicin-HCl ile birlikte uygulamasının daha etkili olduğu görülmüştür. Pro-apoptotik bir gen olan Bax mRNA'sının ekspresyonu her iki uygulamada da hem P-Hep G2 hücrelerinde hem de R-Hep G2 hücrelerinde kontrol grubu hücrelerine göre artmıştır. Cetuximabın epirubicin-HCl ile birlikte uygulamasının tek başına cetuximab uygulamasına göre apoptozda daha etkili olduğu bulunmuştur. Cetuximab epirubicin-HCl ile birlikte uygulandığında anti-apoptotik bir gen olan Bcl-2 ekspresyonu hem P-Hep G2 hücrelerinde hem de R-Hep G2 hücrelerinde tek başına cetuximab uygulamasına göre daha fazla azalmıştır. Dolayısıyla, hem tek başına cetuximab uygulaması hem de cetuximabın epirubicin-HCl ile birlikte uygulaması her iki hücrede Bax/Bcl-2 oranında artışa neden olmuştur.

P-Hep G2 ve R-Hep G2 hücrelerine cetuximabın epirubicin-HCl ile birlikte uygulamasından elde edilen sonuçlar birlikte uygulamanın tek başına uygulamaya göre sitotoksik etkide ve apoptozun uyarılmasında daha etkili olduğunu göstermiştir. Ayrıca, birlikte uygulama hücrelerin ilaç direnç özelliğine göre pro-apoptotik/anti-apoptotik genlerin ekspresyonları üzerinde farklı etki göstermiştir.

Abstract:
In this study, cytotoxic, antiproliferative, cell cycle inhibitive, oxidative stress generation and apoptotic effects and effect mechanisms of cetuximab, which is a monoclonal antibody targeted to epidermal growth factor receptor (EGFR), alone and together with epirubicin-HCl on parental liver cancer cells (P-Hep G2), and epirubicin-HCl resistant liver cancer cells (R-Hep G2) were investigated. 

Cytotoxic effects of cetuximab alone and together with epirubicin-HCl on cells were determined by Cell Titer-BlueR Cell Viability and Lactate Dehydrogenase (LDH) Activity tests. IC50 values (concentration that kills 50% of cells) of cetuximab and epirubicin-HCl in P-Hep G2 and R-Hep G2 cells were calculated respectively for cetuximab 1000 mg/ml and 2279 mg/ml while they were calculated as 0.80 mg/ml and 0.95 mg/ml for epirubicin-HCl. Cetuximab with epirubicin-HCl treatment increased the cytotoxic effect on both P-Hep G2 and R-Hep G2 cells. While IC50 cetuximab + IC40 epirubicin-HCl was found to be the combination that showed the most effective cytotoxic effect on P-Hep G2 cells, on R-Hep G2 cells IC50 cetuximab + IC5 epirubicin-HCl combination was the most effective. The maximum increase in cytoplasmic enzyme lactatedehydrogenase (LDH) activity, which is a cytoplasmic enzyme released as a result of the disruption of the cell membrane integrity, was observed with cetuximab with epirubicin HCl treatment both in P-Hep G2 and R-Hep G2 cells. When cetuximab was treated together with epirubicin-HCl, glutathione peroxidase activity was observed to increase 1.75 times in P-Hep G2 cells while it increased 2.3 times in R-Hep G2 cells compared to the control group cells. At the end of 72 hours of cetuximab treatment to P-Hep G2 cells, caspase-3/7, which is one of the key enzymes of apoptotic pathway, activity increased 3 times in comparison to control group while the increase was found to be approximately 4.7 times in cetuximab treated together with epirubicin-HCl. Cetuximab caused an increase on caspase-3/7 activity 1.5 times in R-Hep G2 cells compared to the control group although when treated together with epirubicin-HCl the increase was found to be approximately 2.5 times compared to control group.

Cetuximab treatment by itself was more effective in P-Hep G2 cells in decreasing proliferating cell nuclear antigen (PCNA) revealing antiproliferative effect, and cycline D1 mRNA expressions which have cell cycle inhibiting effect. As for R-Hep G2 cells, cetuximab with epirubicin HCl treatment was found to be more effective. mRNA expression of Bax, which is a pro-apoptotic gene, increased in both treatments to both P-Hep G2 cells and R-Hep G2 cells compared to the control group cells. In apoptosis, cetuximab with epirubicin HCl treatment has been found to be more effective compared to cetuximab treatment by itself. The expression of Bcl-2 which is an anti-apoptotic gene when it is treated with cetuximab with epirubicin HCl, decreased more both in P-Hep G2 cells and R-Hep G2 cells compared to cetuximab treatment by itself. Therefore, both cetuximab treatments by itself and cetuximab with epirubicin-HCl treatment caused increases Bax/Bcl-2 ratio in both cells.

Results obtained from the treatment of cetuximab in combination with epirubicin-HCl to P-Hep G2 and R-Hep G2 cells showed that treatment of the combination was more effective in the cytotoxic effects and inducing apoptosis comparison to applying cetuximab by itself. Also, combination treatment showed different effects on pro-apoptotic/anti-apoptotic genes expression according to cells drug resistance properties.