Rekombinant yapay peptitler ile hücre hedefleme yaklaşımı
Cell targeting approach with recombinant artificial peptides
Yazar: SANEM YILDIZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. AYFER ATALAY
Pamukkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: DNA hasarı = DNA damage ; Hücre kültürü = Cell culture ; Hücreler = Cells ; Peptidler = Peptides ; Rekombinasyon-genetik = Recombination-genetic

Özet:
Canlı sistemlerinin en alt birimi olan hücreler, canlının yapı-işlev ilişkilerini araştırmak için model olarak kullanılmaktadır. Kanser hücreleri ile yapılan çalışmalar, hücre yaşayabilirliği, çoğalması ve amaca yönelik koşulların kolaylıkla sağlanabilmesi nedeniyle hücre kültür yöntemlerinin kullanım alanlarını genişletmiştir. Gen mühendisliği ve biyoteknoloji alanlarındaki gelişmeler, antikorlar, enzimler ve hücre yüzey reseptörleri gibi birçok molekülü konformasyonel etkileşim ile tanıyabilecek peptidlerin faj yüzeyinde ekspresyonu esasına dayanan faj gösterim tekniğinin yerini önemli kılmaktadır. Hedef moleküllere yüksek ilginlik gösteren peptidler bu yöntemle tanımlanmaktadır. Hücre hedefleme yaklaşımlarında, hücre membran yapılarını özgün olarak algılayabilen rekombinant moleküllerin (peptid formatında) molekülsel tanıda kullanılması mümkün olabilmektedir.Rekombinant peptidlerin hücre işlevleri üzerine etkilerini incelemeyi amaçladığımız çalışmamızda, işlevsel ve yapısal olarak iyi tanımlanmış insan eritrolösemi hücresi kökenli, doksorubisine dirençli K562 hücreleri (K562-dox) model olarak kullanılmıştır. Çalışmada, 12-mer yapay peptid kütüphanesi kullanılarak, K562-dox hücrelerini özgün olarak tanıyan peptidler seçilmiş, amino asit dizileri belirlenmiş ve bu peptidlerin hücre sağ kalımı analizleri ile hücreler üzerindeki etkileri incelenmiştir. K562-dox hücrelerinin 12-mer'lik lineer peptid kütüphanesi ile yapılan biyopaningler sonucu, DNA dizi analizleri sonucunda elde edilen 29 faj klonunun K562-dox hücre sağ kalımına negatif etkileri gözlenmiştir. Bu fajlarla birlikte doksorubisinin hücre sağ kalımına katkıları irdelendiğinde, bazı klonlarda doksorubisin ile birlikte daha negatif etkili oldukları, birkaç klonda ise doksorubisinin fajın etkisini tersine çevirdiği saptanmıştır.Hücre hedefleme yaklaşımı çalışmaları ile molekülsel biyofizik ve membran biyofiziği çalışmalarına temel bilimsel katkı sağlanması düşünülmektedir. Çalışmamızda elde edilen veriler doğrultusunda, ileri çalışmalarda, peptid-hücre etkileşimlerinin doğasının detaylandırılması ile ilgili farklı yöntemler kullanılmalıdır. Bu şekilde, AFM, SPR, Flow Sitometri, Patch Kenetleme gibi tekniklerin kullanılması, peptid-hücre modellerinde bağlanma-ayrılma kinetikleri, peptidin hücre üzerine uyguladığı gerilme kuvvetleri ve etkileri, peptidlerin hücre membranı üzerindeki kanallar ile etkileşimleri ve hücredeki elektriksel faaliyetlere etkisi, hücre membranın tanımlanması gibi pek çok biyofiziksel özellik ayrıntılı olarak incelenmesi, bu konulardaki yaklaşımların daha iyi hazırlanıp değerlendirilebilmesine katkılar sağlayacağı öngörülmektedir.

Abstract:
Cell lines are being used as a model to investigate the structural and functional properties of living organisms. Cell culture is one of the laboratory methods to observe cancer cells activity such as proliferation and differentation. Phage display is also another laboratory method based on peptide libraries, a number of peptides that interact with protein targets, in some cases with high affinity and specificity with the target molecule. The ability of a peptide to target a specific protein in vitro have a potential for recognizing the cell membrane structure, protein-protein and receptor-ligand interactions.Main objectives of the thesis is to develop peptides recognizing the membrane motifs of doxorubicin resistant K562 cells (K562-dox) and their effects on membrane biophysics. Our aim is to contribute the molecular and cell membrane biophysics in the model of K562-dox cells. Specific peptides were selected via phage library approach and their functions on the cells were determined by viability assay. On the basis of molecular interactions, phage display procedure was done for targeting K562-dox cells. In this study, 12-mer peptide library was screened to find specific binding clones to K562-dox cells. Peptides recognizing K562-dox cells were identified according to peptide sequences and amino acid properties. We selected 29 different phages from biopannings with the cells. According to our cell viability assay results, selected phages were effected negatively to the viability of the K562-dox cells.Depending on our results, AFM, SPR, Flow Cytometry, Patch Clamp approaches should be used for further investigations. Biophysical properties including peptide and cell membrane, peptide ? targets binding kinetics, streching forces and ion channel characteristics should be analyzed to understand interaction between molecules of cell membrane and peptides. Additionally, such peptide could be used in some molecular recognation researches and cell targeting approaches.