Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak üzere nanokompozit hidrojelin sentezlenmesi ve in vitro denemeleri
Nanocomposite hydrogel synthesis for cartilage tissue engineering along with in vitro studies
Yazar: PINAR TULUM
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM YEŞİL ÇELİKTAŞ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Doku mühendisliği = Tissue engineering

Özet:
Bu tez çalışmasında kıkırdak doku mühendisliği kapsamında kullanılabilecek sert ve aynı zamanda elastik biyomalzeme üretmek için, Laponit XLS kili ile aljinat (Alg), akrilamit (PAAm) polimerleri kullanılarak nanokompozit hidrojeller sentezlenmiştir. Yüksek su tutma kapasitesine sahip olan hidrojeller doğal kıkırdak dokusunun taklit edilebilmesi için uygun birer biyomalzemedir. Fakat basma, çekme, bükülme gibi daima kompleks ve dinamik bir fizyolojik ortamda olan kıkırdak dokunun yüksek dayanıklılığı hidrojeller tarafından tam anlamıyla karşılanamamaktadır. Hidrojellerin kıkırdak doku mühendisliğindeki kullanımını kısıtlayan zayıf mekanik özelliğinin kil eklentisiyle arttırılması ve aynı zamanda biyolojik olarak fonksiyonelleştirilmesi de amaçlanmıştır. 
Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılması hedeflenen hidrojeller klasik optimizasyon yaklaşımı benimsenerek basma testi sonuçlarına göre optimize edilmiştir. In-situ serbest radikal polimerizasyon yöntemi ile sentezlenen hidrojellerin morfoloji ve kimyasal bileşimlerinin analizi ise sırasıyla taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve Foruier Transform infrared spektroskopisi (FTIR) ile yapılmıştır. Hidrojellerin şişme testi fosfat tuzu çözeltisi (PBS) içerisinde oda sıcaklığı ve in vitro bozunma tayini PBS içerisinde 37 oC'de inkübe edilerek yapılmıştır. Vücuda implante edilecek olan hidrojellerin sitotoksisitelerini belirlemek amacıyla standartlara uygun şekilde fare bağ doku fibroblast hücresi (L929), fare makrofaj hücresi (Rav 264.7), fare teratokarsinoma hücrelerinden farklılaştırılmış kondrojenik hücre hattı (ATDC5), insan fötal osteoblastik hücre hattı (HFOB) kullanılarak MTT testi ve dolaylı temas (agar difüzyon) testi yapılmıştır. Ek olarak üzerlerine ATDC5, HFOB hücre hatları ekilerek doku iskelesi olarak kullanılan hidrojeller; 37 oC'de, %5 CO2 içeren nemlendirilmiş atmosferde kültüre edilmiştir. İskelelerin hücre adezyonu, çoğalması üzerine etkileri ışık mikroskopisi, SEM ve belirlenmiş zaman aralıklarında yapılan MTT analizi ile incelenmiştir. 
Basma testi sonucuna göre, en yüksek basma modülü 152.81 kPa olarak %30 toplam polimer, %5 Laponit XLS içeren hidrojellerden elde edilmiştir. Buna eş olarak aynı konsantrasyonda polimer ile N,N-metilen-bis-akrilamid (MBAa) kullanırak PAAm-Alg hidrojeli sentezlenmiştir. PAAm-Alg hidrojelinin basma modülü ise 71.81 kPa olarak belirlenmiştir.  SEM bulguları PAAm-Alg ve PAAm-Alg-XLS hidrojellerinin sırasıyla 50-100 nm ile 400-800 nm arasında değişen gözenek boyutlarına sahip olduğunu göstermiştir. FTIR spekturumları hidrojelleri oluşturan polimerleri yapısında bulundurduğunu göstermiştir. Hidrojellerin kültür koşulları altında stabil olduğu in vitro bozunma tayini ile ortaya konmuştur. Yapılan sitotoksisite çalışmaları sonucu PAAm-Alg-XLS hidrojelinin dört farklı hücre grubu üzerinde de %70 canlılık sınırı üzerinde seyrettiğinden dolayı PAAm-Alg hidrojellerine kıyasla daha yüksek biyouyumlu özellikler sergilediği belirlenmiştir. Doku iskelesi olarak kullanılan hidrojellere ekilen hücrelerin tutundukları ve yayıldıkları gözlemlenmiştir. Özellikle HFOB hücresinin proliferasyonunun Laponit eklentisiyle pozitif yönde indüklendiği belirlenmiştir. Bu sonuçlara göre; Laponit XLS kullanılarak sentezlenen hidrojel, osteoartrit gibi kemiğin de zarar gördüğü ileri seviye kıkırdak doku hasarlarında kullanılabilecek bir biyomalzeme olarak değer taşımaktadır.

Abstract:
In this thesis, nanocomposite hydrogels are synthesized by using Laponite XLS clay and alginate (Alg), polyacrylamide (PAAm) polymers in order to produce tough and elastic biomaterials that is used in cartilage tissue engineering. Hydrogels are suitable biomaterials for mimicking native cartilage tissue due to high water retention capacity. However, native cartilage is always under complex and dynamic physiological conditions such as compression, shear stresses. Therefore, serving the dynamic mechanical environment purpose by hydrogels are of prime importance. Yet, weak mechanical properties of hydrogels are still challenging in tissue engineering especially for load-bearing applications. The aim was to increase the weak mechanical properties of hydrogels with clay additive as well as the biological functionalization.
The PAAm-Alg-XLS hydrogels are optimized according to the compression test results by adopting the classical optimization approach. The morphology and chemical composition of hydrogels are analyzed by scanning electron microscopy (SEM) and Fourier Transform infrared spectroscopy (FTIR), respectively. The swelling and in vitro degradation of hydrogels are determined by incubation in phosphate salt solution (PBS) at room temperature and 37 °C. To determine the cytotoxicity of hydrogels MTT and agar diffusion test are done with mouse fibroblast cell line (L929), mouse macrophage cell line (Rav 267.5), differentiated chondrogenic cell line from mouse teratocarcinoma (ATDC5) and human fetal osteoblastic cell (HFOB) lines. In addition, ATDC5, HFOB cell lines are seeded on hydrogels and cultured in a humidified atmosphere containing 5% CO2 at 37 °C. The adhesion and proliferation of the seeded cells on hydrogels are evaluated by light microscopy, SEM and MTT analysis.
Compression test results revealed the highest compression modulus as 152.81 kPa, which was obtained from PAAm-Alg XLS hydrogel formulation with 30% total polymer, where 5% was Laponite XLS. Also, PAAm-Alg hydrogels containing same amount of polymer was synthesized traditionally with using N, N methylene-bis-acrylamide (MBAa) as a crosslinker instead of clay. The compression modulus of PAAm-Alg hydrogel was calculated as 71.81 kPa. SEM results showed PAAm-Alg and PAAm-Alg-XLS hydrogels exhibited pore sizes of 50-100 nm and 400-800nm, respectively. FTIR spectra proven the existence of polymers that form the structure of hydrogels. The in vitro degradation of hydrogels was stable under culture conditions. Cytotoxicity studies showed that PAAm-Alg-XLS hydrogel exhibited higher biocompatibility compared to PAAm-Alg hydrogels due to over 70% viability on four different cell lines. In particular, proliferation of HFOB cells was positively induced by Laponite addition. As for evaluating the hydrogel as a tissue scaffold, cells were observed to attach and spread on hydrogels providing a suitbale interface. According to these results, the hydrogel synthesized using Laponite XLS is of value as a biomaterial that can be used in advanced cartilage tissue damage such as osteoarthritis where bone is damaged.