Diazotrofik koşullarda çoğaltılan Rhodobacter sphaeroides O.U 001 ile hidrojen üretimi ve Nifh gen ifade analizi
Hydrogen production by rhodobacter sphaeroides O.U 001 grown under diazotrophic conditions and expression analysis of Nifh gene
Yazar: MERVE SERT
Danışman: PROF. DR. GÖKHAN KARS
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Azot = Nitrogen ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hidrojen = Hydrogen ; Rhodobacter sphaeroides = Rhodobacter sphaeroides

Özet:
ÖZET
Fotosentetik bakteri grubundan olan mor kükürtsüz (PNS) bakteriler hidrojen (H2) üretimi, azot (N2) ve karbondioksit (CO2) fiksasyonu gibi zengin metabolik aktivitelere sahip olduklarından farklı fizyolojik koşullarda yaşamlarını sürdürebilmektedirler. Bu özelliklerinden dolayı PNS bakterileri temel metabolik olayların araştırılmasında model organizma olarak kullanılmıştır. Fotosentetik ve mor kükürtsüz bakterilerden biri olan Rhodobacter sphaeroides O.U.001 de N2 fiksasyonu, H2 ve polihidroksibutirat (PHB) üretimi gibi çok yönlü metabolizmaya sahip olup tüm genom dizisinin bilinmesi nedeniyle araştırmalarda sıkça kullanılan model bir bakteridir. Bu çalışmanın amacı, diazotrofik (N2'nin sabitlendiği) koşullarda kültüre edilen R. sphaeroides ile hidrojen üretimi gerçekleştirmektir. Bu kapsamda bakteriler karbon kaynağı olarak malat'ın (15 mM) ve azot kaynağı olarak N2'nin kullanıldığı besiyerinde çoğaltılmıştır. Kontrol grubu olarak ise karbon kaynağı olarak malat'ın (15 mM) ve azot kaynağı olarak glutamat'ın (2 mM) kullanıldığı besiyeri (non diazotrofik ortam) kullanılmıştır. Hidrojen üretimlerine ek olarak azot fiksasyonu sonucu oluşan amonyum miktarları da ölçülmüştür. Ayrıca, bu iki koşul altında çoğaltılan bakterilerde nifH geninin ekspresyon seviyesi kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) ile tespit edilmiştir. Ek olarak, bu iki farklı fizyolojik koşulun bakteri morfolojisine etkisi alan emisyonlu taramalı elektron mikroskobu (FE-SEM) ile incelenmiştir. Sonuçlara göre, diazotrofik koşullarda 13,95 mL hidrojen üretilirken, non diazotrofik koşullarda 11,05 mL hidrojen üretimi tespit edilmiştir. Bu sonuca paralel olarak, diazotrofik koşullardaki nifH gen ekspresyonu non diazotrofik koşullardaki gen ekspresyonunun 2,3 katı olarak hesaplanmıştır. Diazotrofik ve non diazotrofik kültürlerde ölçülen amonyum miktarları da sırasıyla 5,05 mg/L ve 3,38 mg/L olarak bulunmuştur. Bu iki koşulda çoğaltılan bakterilerin FE-SEM görüntüleri incelendiğinde ise bakterilerin morfolojilerinde belirgin bir fark gözlemlenmemiştir. Sonuç olarak, diazotrofik büyüme koşullarında kültüre edilen R. sphaeroides ile daha yüksek miktarlarda hidrojen, nifH gen ifadesi ve sabitlenmiş amonyum tespit edilmiştir. Bu sonuç, azotun hidrojen üretiminden sorumlu olan nitrojenaz enziminin aktivite veya miktarını stimüle ettiği şeklinde yorumlanmıştır. Gelecekteki çalışmalarda enzim miktar ve aktivite tayinleri ile bu bulguların desteklenmesi öngörülmektedir

Abstract:
ABSTRACT
Purple nonsulfur (PNS) bacteria from the photosynthetic bacteria group can survive in different physiological conditions as they have rich metabolic activities such as hydrogen (H2) production, nitrogen (N2) and carbon dioxide (CO2) fixation. Because of these properties, PNS bacteria have been used as a model organism in the investigation of basic metabolic events. Rhodobacter sphaeroides O.U.001, one of the photosynthetic and purple nonsulphur bacteria, is frequently used in research as a model bacterium because it has a versatile metabolism such as N2 fixation, H2 and polyhydroxybutyrate (PHB) production and its whole genome sequence is known. The aim of this study is to perform hydrogen production with R. sphaeroides cultured under diazotrophic (N2 fixation) conditions. In this context, bacteria were propagated in a medium using malate (15 mM) as a carbon source and N2 as a nitrogen source. As the control group, medium (non-diazotrophic medium) containing malate (15 mM) as carbon source and glutamate (2 mM) as nitrogen source was used. In addition to hydrogen production, ammonium amounts formed as a result of nitrogen fixation were also measured. In addition, the expression level of the nifH gene in bacteria grown under these two conditions was determined by quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). Finally, the effects of these two different physiological conditions on bacterial morphology were investigated by field emission scanning electron microscopy (FE-SEM). According to the results, 13.95 mL of hydrogen was produced under diazotrophic conditions, while 11.05 mL of hydrogen was produced under non-diazotrophic conditions. In parallel with this result, nifH gene expression in diazotrophic conditions was calculated as 2.3 times the gene expression in non-diazotrophic conditions. Ammonium amounts measured in diazotrophic and non-diazotrophic cultures were found to be 5.05 mg/L and 3.38 mg/L, respectively. When the FE-SEM images of bacteria grown in these two conditions were examined, no significant difference was observed in the morphology of the bacteria. As a conclusion, higher amounts of hydrogen, nifH gene expression and fixed ammonium were detected in R. sphaeroides cultured under diazotrophic growth conditions. This result was interpreted as nitrogen stimulating the activity or amount of nitrogenase enzyme, which is responsible for hydrogen production. In future studies, it is projected that these findings will be supported by enzyme amount and activity tests