Çamaşır makinesinin deterjan çekmecesi üzerinde biyofilm oluşumunun engellenmesi çalışmaları
Inhibition of biofilm formation on washing machine drawer
Yazar: DUYGU ÖZÇELİK
Danışman: PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Biyofilm oluşumu endüstride su hatlarında, üretim hatlarında, çeşitli yüzeylerde ve evsel koşullarda uzun yıllardan beri problem oluşturmaktadır. Özellikle gıda gibi insan temasının yüksek olduğu alanlarda oluşan biyofilmler sağlığı tehdit etmektedir.  Bu nedenle biyofilm ile mücadele uzun yıllardan beri çalışılan konular arasındadır. Evsel koşullarda birçok alanda mikrobiyal birikim oluşmakta ve biyofilme neden olmaktadır. Özellikle mutfak, banyo gibi yerlerde sürekli nemli kalan alanlar ve yüzeyler biyofilm oluşumu için uygun ortamı oluşturmaktadır. Bunların yanında evsel koşullarda kullanılan buzdolabı, çamaşır makinesi, bulaşık makinesi gibi ürünlerde de kullanım koşullarına bağlı olarak zamanla mikrobiyal oluşumlar görülmektedir. Özellikle günümüzde en çok kullanılan beyaz eşya ürünlerinden biri olan çamaşır makinesi bu konuda en çok sorunla karşılaşılan ürün olmaktadır. Çamaşır makinesi tekstil ürünlerinde oluşan kirliliklerin giderilmesi amacıyla kullanılmaktadır. Tekstil üzerinde çamur, boya gibi fiziksel ve kimyasal kirlerin yanında, mikrobiyolojik kirlilikler de toplanabilmektedir ve bu mikroorganizmalar çoğunlukla insan ve ortam kaynaklı olmaktadır. Evcil hayvanlardan da bazı durumlarda tekstile mikroorganizma geçişinin olduğu bilinmektedir. Bu kirli tekstillerin çamaşır makinesi ile yıkanması sırasında mikroorganizmaların çamaşır makinesine geçişi söz konusudur. Özellikle son yıllarda enerji tasarrufu sağlayan düşük sıcaklıklardaki yıkama programlarının ve ağartıcı içermeyen sıvı deterjanların kullanılmaya başlanmasıyla makineye bulaşan mikroorganizmalar giderilememektedir. Çamaşır makinesi içinin ve deterjan çekmecesi gibi bölümlerinin sürekli nemli kalması mikroorganizmaların çoğalması ve birikim oluşturması için uygun ortamı sağlamaktadır. Çamaşır makinesinin körük, deterjan çekmecesi bölümlerinde oluşan bu birikimler zamanla biyofilm oluşumuna yol açmakta ve ayrıca gözle görülen rahatsız edici kirliliklere neden olmaktadır. Hatta bazı durumlarda makine içinde oluşan mikrobiyal birikimlerden kaynaklı koku oluşumu olmaktadır. Koku oluşumu da çamaşır makinesi için şikayet edilen konular arasındadır. Bu sebeplerden dolayı çamaşır makinesinde oluşan mikrobiyal kirliliklerin giderilmesi ve biyofilm oluşumunun engellenmesi amacıyla yapılan çalışmalar önem kazanmaktadır. 
Bu tez çalışmasında çamaşır makinesi deterjan çekmecesinde oluşan mikrobiyal birikimler ve bu birikimlerin giderilmesine yönelik yöntemler konu alınmıştır. Bu amaçla öncelikle deterjan çekmecesinde karşılaşılan problemlerin tarifi yapılmıştır. Bunun için müşteri koşulunda kullanılan çamaşır makinelerine ait görsel kirliliği bulunan 5 adet deterjan çekmecesi temin edilmiştir. Deterjan çekmecelerinin ana yıkama ve yumuşatıcı gözlerindeki mikroorganizma seviyeleri belirlenmiştir. Yumuşatıcı gözünün ana yıkama gözüne göre daha kirli olduğu görülmüş ve yumuşatıcı gözündeki Pseudomonas ve toplam canlı mikroorganizma seviyelerinin 106 - 107 kob/mL seviyelerine ulaştığı görülmüştür. Problemin daha iyi anlaşılabilmesi amacıyla kontrollü koşullarda çamaşır makinesinde Günlük 40 °C programında ardışık 20 çevrim yıkama yapılarak deterjan çekmecesi üzerindeki birikim incelenmiştir. Burada toz deterjan ve sıvı deterjan kullanımı iki farklı koşul olarak incelenmiş ve aynı sayıda yıkama sonrasında ikisi arasında mikrobiyal birikim açısından farklılık olup olmadığı incelenmiştir. Testler sonucunda sıvı deterjan kullanımında oluşan mikrobiyal birikimin toz deterjana kıyasla daha yüksek seviyelerde olduğu görülmüştür. Sıvı deterjan kullanımında hem ana yıkama gözünde hem de yumuşatıcı gözündeki Pseudomonas, küf/maya ve toplam canlı türlerinin 106 kob/mL seviyelerine ulaştığı tespit edilmiştir. Toz deterjan kullanımında ise ana yıkama gözünde bu seviyeler 104 kob/mL civarındadır. 20 ardışık yıkama sonrasında deterjan çekmecesinde gözle görülür kirlilik oluşturulamamış, mikrobiyal birikimin olduğu görülmüş ve sıvı deterjanın mikrobiyal birikime daha yatkın olduğu sonucuna varılmıştır.
Ayrıca biyofilm oluşum aşamalarının incelenmesi ve biyofilm giderme yöntemlerinin test edilmesinde kullanılması amacıyla laboratuvar koşulunda polipropilen diskler üzerinde biyofilm oluşturma çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Pseudomonas aeruginosa mikroorganizmasının kullanıldığı biyofilm oluşturma çalışmalarında dönen disk biyoreaktörü ve akış hücresi (flowcell) yöntemleri kullanılmış ve çalışma sonunda diskler üzerinde oluşan mikrobiyal birikim seviyesi belirlenmiştir. Akış hücresinde PP diskler üzerinde 107 kob/mL seviyesinde birikim gözlenirken, biyoreaktörde diskler üzerinde 109 kob/mL mikrobiyal birikim oluşturulmuştur. Bu sebeple, mikrobiyal birikim giderme yöntemlerinin giderme etkinliği test edilirken biyoreaktörde biyofilm oluşturulmuş kuponlar kullanılmıştır.
Deterjan çekmesinde oluşan mikrobiyal birikim ve biyofilm oluşum aşamaları incelendikten sonra çamaşır makinesi deterjan çekmesi üzerinde oluşan mikrobiyal birikimin giderilmesi ve biyofilm oluşumun engellenmesi amacıyla çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bunun için öncelikle sıcak su uygulaması ile mikrobiyal birikim giderme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Beko BK 9121BT Model 9kg / 1200 devir çamaşır makinesi kazan temizleme programında, kazanda  70 °C sıcaklığa ulaşan suyun deterjan çekmecesine yönlendirildiği prototipler oluşturulmuştur. Suyun yönlendirilmesi için ek dağıtıcının bulunmadığı Konsept 1 tasarım, su yönlendirme için ek üçgen dağıtıcının eklendiği Konsept 2 tasarım ve üçgen dağıtıcıya ek olarak ekstra nozüllerin eklendiği Konsept 3 tasarımı mikrobiyal birikim giderme etkinliği açısından incelenmiştir. Bunun için öncelikle mikroorganizmalı çamaşır yükü kullanılarak makinede ardışık yıkamalar yapılmış ve deterjan çekmecesi üzerinde 104 – 106 kob/mL seviyelerinde mikrobiyal birikim oluşturulmuştur. Ardışık yıkamalar sonunda kazan temizleme programı çalıştırılarak 110 dk boyunca kazandaki sıcak su deterjan çekmecesine yönlendirilmiştir. Aynı zamanda biyoreaktörde kuponlar üzerinde 108 – 109 kob/mL seviyelerinde biyofilm oluşturulmuş ve kuponlar deterjan çekmecesine yerleştirilerek kazan temizleme programında sıcak su yönlendirilmiştir. Sıcak su yönlendirme sonucunda üç konseptte de mikrobiyal birikimin ve biyofilmin sıfırlandığı görülmüştür. Fakat test sırasında oluşan tıkanıklık sebebi ile Konsept 1 tasarımından vazgeçilmiştir. Sıcak su yönlendirme sırasında en etkin akış şekli Konsept 2'de elde edilmiştir. Bu sebeple makine üzerine uygulanabilecek en uygun tasarım olduğuna karar verilmiştir.  
Son olarak deterjan çekmecesinde birikimin önlenmesi amacıyla deterjan çekmecesi hammaddesine katılması için antimikrobiyal katkı çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Deterjan çekmecesi malzemesi olan polipropilen plastik malzemeye antimikrobiyal etkinlik gösteren katkıların plastik enjeksiyon prosesi sırasında eklenmesiyle antimikrobiyal aktivite gösteren deterjan çekmecesi oluşturulması amaçlanmıştır. Bu amaçla deterjan çekmecesinde iyonik sıvıların antimikrobiyal aktivitelerinden faydalanmak için 1-desil-3-metil-imidazolyum klorür [DMIM] iyonik sıvısı temin edilmiştir. Temin edilen iyonik sıvının 1 – 25 mM konsantrasyonlarında çözeltileri hazırlanarak tekstile ve filtre kağıdına emdirilmiş, doğrudan antimikrobiyal etkinliğine bakılmıştır. Sonuçlar değerlendirildiğinde 1-desil-3-metil-imidazolyum klorür [DMIM] iyonik sıvısının doğrudan kullanıldığında 1 mM gibi küçük konsantrasyonlarda dahi antibakteriyel aktivitesinin olduğu fakat antifungal etkinliğinin düşük olduğu görülmüştür. Sonrasında saf su ve etil alkol çözücüleri kullanılarak 25 – 500 mM aralığında farklı konsantrasyonlarda iyonik sıvı çözeltileri hazırlanarak 3M Accurel® XP/MP marka polipropilen köpük maddeye emdirilmiş ve plastik enjeksiyon prosesi ile iyonik sıvı katkılı polipropilen plakalar elde edilmiştir. 300 ve 500 mm iyonik sıvı kullanılarak elde edilen plakalarda antibakteriyel etkinliğe rastlanmış, antifungal etkinlik görülmemiştir. İyonik sıvının PP maddeye katılmasının zor olduğu ve proses sırasında antimikrobiyal etkinliğin kaybolduğu sonucuna varılmıştır. Bu sebeple alternatif antimikrobiyal toz katkıların PP plastik malzeme içindeki antimikrobiyal etkinliği test edilmiştir. Bunun için ticari olarak Life Materials adlı firmadan satın alınan Vanzide ZP katkılı %1 KD-00-2A + %1 CP-00-1A kodlu ve Topane katkılı %1 GF-00-5A + %1 CP-00-1A kodlu toz antimikrobiyal katkılar temin edilmiştir. Toz antimikrobiyal katkılar polipropilen malzemeye enjeksiyon prosesi aşamasında katılarak % 1, % 1.5 ve % 2 katkılı plakalar elde edilmiştir. Elde edilen toz antimikrobiyal katkılı polipropilen plakaların tümünde antimikrobiyal ve antifungal etkinliğin olduğu tespit edilmiştir. Yapılan standart antibakteriyel yüzey testi sonucunda katkılı plakalar üzerindeki Escherichia coli ve Staphylococcus aureus mikroorganizmalarının % 99.9998 oranında giderildiği tespit edilmiştir. Toz katkılar ile hazırlanmış deterjan çekmecesinin antimikrobiyal aktivite ömrünün belirlenmesi amacıyla katkılı PP plakalara % 1 standart deterjanlı çözelti içerisinde 60 °C'de yaşlandırma testi gerçekleştirilmiştir. Yaşlandırma sonrasında % 1.5 ve % 2 katkılı plakalarda başlangıçta görülen antimikrobiyal etkinliğin devam ettiği görülmüştür. Yaşlandırma sonrası plakalara yapılan standart antibakteriyel yüzey testi sonucunda katkılı plakalar üzerindeki Escherichia coli ve Staphylococcus aureus mikroorganizmalarının % 99.99 oranında giderildiği tespit edilmiştir. 
Sonuç olarak sıcak su uygulamasının mikrobiyal birikim giderme etkinliğinin oldukça iyi olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, ticari toz antimikrobiyal katkılar ile elde edilen PP plakaların yaşlandırma öncesi ve sonrasında antibakteriyel ve antifungal aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. Bu sebeple deterjan çekmecesinde biyofilm oluşumunun engellenmesi için sıcak su uygulamasının ve antimikrobiyal toz katkıların kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Biofilm formation has been a problem for many years on industrial water lines, production lines, various surfaces and domestic conditions. Biofilms that form in areas where human contact is particularly high, such as food, are a threat to health. For this reason, the fight against biofilm has been a crucial topic for many years. Microbial accumulation occurs in many areas in domestic conditions and causes biofilm. Especially in areas such as kitchens, bathrooms and surfaces that are constantly damp, it creates a suitable environment for biofilm formation. In addition to these, it is observed that microbial occurrences on the household products such as refrigerators, washing machines, dishwashers due to usage conditions over time. Washing machine, which is one of the most used white goods products in particular today, is the most problematic product in this issue. The washing machine is used to remove the contaminants in textile products. In addition to physical and chemical dirt such as sludge and paint, microbiological contaminants can also be collected on textile products. Textile-contaminated microorganisms are mostly originated by humans and the environment they are in. It is known that there are some microorganisms passing from pets in some cases. These microorganisms are transmitted from the textile to the washing machine during washing. Especially in recent years, low-temperature washing programs which save energy and bleach-free liquid detergents have begun to use for washing of textiles. Therefore, microorganisms on textiles and washing machines are not removed effectively. The constant dampness on the parts of washing machine such as the detergent drawer provide a suitable environment for the growth and accumulation of microorganisms. These microbial accumulations which are formed on detergent drawer parts of the washing machine, lead to the formation of biofilm over time and also cause visible irritating fouling. In some cases, there are odor formation caused from microbial accumulation in the machine, and smell formation is among the complaints for the washing machine. Due to these reasons, studies aiming to eliminate microbial contamination in the washing machine and to prevent biofilm formation gain importance.
In this thesis, microbial accumulations in detergent drawer of washing machine and methods for eliminating these deposits were taken up. For this purpose, the problems encountered in the detergent drawer have been described first. For this, 5 detergent drawers with visual contamination of the washing machines used in the customer condition were supplied. The levels of microorganisms in the main wash and softener parts of the detergent drawers were determined. Therefore, microbial level of softener part was higher than the level of main wash part in all provided detergent drawer. Also, results showed that Pseudomonas levels and total viable counts in softener parts of drawers were found to reach levels of 106 - 107 CFU/mL.
In order to better understand the problem, the accumulation on the detergent drawer was investigated by 20 times sequential washes in the washing machine at Daily 40 ° C program under controlled conditions. Here, the use of powder detergent and liquid detergent was examined as two different conditions and it was examined whether there was a difference in microbial accumulation between the two after the same number of washes. As a result of the tests, the microbial accumulation in the use of liquid detergent was found to be higher than the powder detergent. After sequential washing with liquid detergent, it was found that Pseudomonas, mold/yeast and total living species in both the main washing part and the softener part reached level of 106 CFU/mL. In the case of using powder detergent, these levels were around 104 CFU/mL in the main washing eye. After 20 washing cycles, no visible contamination was found in the detergent drawer, microbial accumulation was observed and the liquid detergent was more likely to have microbial accumulation.
In addition, biofilm formation studies have been carried out on polypropylene discs in laboratory conditions in order to examine the biofilm formation stages and to test for biofilm removal methods. Rotating disc bioreactors and flowcell methods were used in biofilm formation studies using Pseudomonas aeruginosa microorganism and the level of microbial accumulation on the discs was determined at the end of the study. Microbial accumulation level of 109 CFU/mL was formed on the discs in the bioreactor when accumulation level of 107 CFU/mL was observed on the PP discs in the flow cell. For this reason, biofilm formation on coupons with the bioreactor was used while the removal efficiency of biofilm eradication methods were tested. 
After the microbial accumulation and biofilm formation stages of detergent drawer have been examined, studies have been carried out to remove microbial accumulation on the washing machine detergent drawer and to prevent biofilm formation. First of all, microbial accumulation removing studies with hot water application have been carried out. For this aim, Beko BK 9121BT Model 9 kg / 1200 rpm washing machine and its drum cleaning program was used. The temperature of the water in the drum at this program is reached to approximately 70 °C, so this program is developed to clean the drum and to remove the microbial accumulation in the drum of the washing machine. In studies to use hot water sanitation at the drawer, hot water in the drum at drum cleaning program was directed to the detergent drawer. For this redirection of water, prototypes of three different detergent drawers and direction systems were prepared and these prototypes were tested in terms of removal effectiveness of microbial accumulation and biofilm in drawer. Therefore, firstly sequential washing cycles were made by using laundry with microbial contamination in washing machines. Microbial accumulation on drawer was formed as 104 – 106 CFU/mL. After the wash cycles, drum cleaning program on washing machine was run and hot water was directed from drum to drawer during 110 minutes. At the same time, biofilms were formed at 108 - 109 CFU/mL levels on the coupon in the bioreactor and the coupons were placed in the detergent drawer and the hot water was directed to the dispenser in the drum cleaning program. As a result of the hot water sanitation, microbial accumulation and biofilm on detergent drawer were completely removed for three different concept designs. However, the Concept 1 design has been failed due to the blockage by textile fibers during the test. The most efficient flow shape during hot water sanitation was obtained in Concept 2. For this reason, it is decided that it is the most suitable design that can be applied on the washing machine.
Finally, antimicrobial additive studies have been carried out to participate in detergent drawer raw materials which is polypropylene plastic material to prevent microbial accumulation in the detergent drawer. It has been aimed to form antimicrobial detergent drawer by adding the additives which have antimicrobial activity to the polypropylene plastic material during the plastic injection process. For this purpose, 1-decyl-3-methyl-imidazolium chloride [DMIM] ionic liquid has been provided to take advantage of the antimicrobial activities of ionic liquids in the detergent drawer. Solutions were prepared between 1 to 25 mM concentrations of the supplied ionic liquid and impregnated into the textile and filter paper, and the antimicrobial activity of ionic liquid was directly examined by zone inhibition test. When the results were evaluated, it was found that the antibacterial activity even at a small concentration like 1 mM but the antifungal activity was low when 1-decyl-3-methylimidazolium chloride [DMIM] ionic liquid solutions was used directly. Later, ionic liquid solutions were prepared at different concentrations in the range of 25 - 500 mM using pure water and ethyl alcohol solvents and impregnated with 3M Accurel® XP / MP branded polypropylene foam. Therefore, ionic liquid was added to PP plates by plastic injection methods and antimicrobial activities of these plates were tested. Antibacterial activity was found in PP plates obtained using 300 and 500 mM ionic liquid, and no antifungal activity was observed. Consequently, it has been found that it is difficult to incorporate the ionic liquid into the PP material and the antimicrobial activity was lost during the process.
At the same time with the ionic liquid studies, 1% KD-00-2A + 1% CP-00-1A and 1% GF-00-5A + 1% CP-00-1A code powdered antimicrobial additives were obtained, these are commercially available from Life Materials. The antimicrobial activities of these powdered additives are based on some antimicrobial compounds like Vanzide ZP and Topane. 1%, 1.5% and 2% powdered antimicrobial mixtures were added to the polypropylene material during the injection process to obtain additive plastic plates. Plateau zone inhibition and antimicrobial surface activity tests were performed to test the antimicrobial activities of these obtained powder antimicrobial-added polypropylene plates. As a result of the standard antibacterial surface test, 99.9998% of the microorganisms of Escherichia coli and Staphylococcus aureus on the plates were removed. In order to determine the antimicrobial activity lifetime of detergent drawers prepared with powder additives, aging tests were carried out at 60 ° C in a 1% standard detergent solution. The plates containing additive were soaked and mixed in this solution during 168 hours. The antimicrobial activity initially observed in 1.5% and 2% platelets continued after aging. As a result of the standard antibacterial surface test made on plates after aging, it was determined that Escherichia coli and Staphylococcus aureus microorganisms on plated plates were removed by 99.99%.
As a result, it was determined that the hot water application had very good microbial accumulation removal efficiency. It was also found that PP plates obtained with commercial powdered antimicrobial additives show antibacterial and antifungal activity before and after aging. Consequently, hot water application and antimicrobial powder additives can be used to prevent biofilm formation in the detergent drawer.