Brucella melitensis Rev1 yüzey membran proteinin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve diagnostik etkinliğinin tespit edilmesi
Brucella melitensis Rev1 surface membrane protein's cloning, expression, purification and determine of diagnostics to the effectiveness
Yazar: İSMAİL KOYUNCU
Danışman: PROF. ABDURRAHİM KOÇYİĞİT ; DOÇ. ŞAHBETTİN SELEK
Harran Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Brusella, aerobik, spor oluşturmayan, hareketsiz, gram negatif bir kokobasil olup, insanlarda kronik enfeksiyona neden olan, NIH/CDC'ye göre B kategorisinde bir bioterör ajanıdır. Bruselloz, hayvanlardan ya da bunların ürünlerinden insanlara bulaşan zoonotik bir hastalıktır. Türkiye'de dahil olmak üzere birçok gelişmekte olan ülkede; hem halk sağlığı hem de ekonomik önemi olan bir zoonozdur. Erken teşhis ve enfekte hayvanların ayrımı, hastalığı kontrol etmek için önemlidir. Brusella için serodiagnostik testler, hücrenin lipopolisakkarid (LPS) bileşenine karşı geliştirilmiş antikorların saptanması temeline dayanır. Ancak, diğer gram negatif bakterilerle çapraz reaksiyon nedeniyle yanlış pozitif sonuç vermesi bu yöntemin yararını sınırlamaktadır. Bu çalışmada, LPS `ye alternatif olarak Brucella melitensis Rev1'e ait antijenik dış membran proteini (omp28 precursor) klonlandıktan sonra üretilip saflaştırıldı. Rekombinant proteinin tespitini ve saflaştırılmasını kolaylaştırmak için N-terminal kısmına His-sumo tag eklenmiştir. B. melitensis Rev1 omp28 precursor geninin, ORF gen bölgesi PCR ile çoğaltılıp, direkt olarak pETSUMO vektörüne klonlandı. Klonlanan plazmitinin bütünlüğü PCR ve sekans analizi kullanılarak doğrulandı. Recombinant vektör E. coli One Shot® Mach1? hücrelerinde çoğaltıldıktan sonra, E. coli BL21(D3) hücrelerine transfer edilip, protein ekspresyonu IPTG ile indüklendi. Eksprese edilen rekombinant protein Ni-agaroz kromatografisi ile saflaştırıldı ve anti-His antikoru kullanılarak yapılan westernblot ve dot blotla doğrulandı. Saflaştırılmış omp28 precursor proteinin brusella teşhisindeki etkinliği, Şanlıurfa'da çeşitli hastanelerden toplanan serumlarla indirect enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) yapılarak çalışıldı. Pozitif ve negatif olduğu bilinen serum örnekleri kullanıldığında omp28 precursor proteinin brusella enfekte insan serumlarında immünreaktif olduğu tespit edildi. Altmış insan serumu; omp28 precursor antijen tabanlı ELISA testi ile tarandı ve sonuçlar Rose Bengal Plate aglütinasyon testi (RBPT) ile karşılaştırıldı. Rekombinant omp28 precursor temelli ELISA testinin; sensivitesi % 87,8 spesifitesi % 96,2 pozitif prediktif değer % 96,6 negatif prediktif değer % 78,7 ve test geçerliliği % 91,6 olarak tespit edildi. Rekombinant B. melitensis Rev1 omp28 precursor proteinin insan bruselloz tanısı için bir protein antijeni olarak kullanılabileceği sonucuna varıldı.ANAHTAR KELİMELER: Brucella melitensis Rev1, Omp28 precursor, Rekombinant DNA,Klonlama, Protein ekspresyonu, Protein Saflaştırma, ELISA

Abstract:
Brucella, an aerobic, nonsporeforming, nonmotile Gram-negative coccobacillus, is a NIH/CDC category B bioterror threat agent that causes chronic human illness. Brucellosis is a zoonotic disease transmitted to humans either from animals or from their products. It is a zoonosis of both public health and economic importance in many developing countries including Turkey. Early detection and segregation of the infected animals are important in order to control the disease. Serodiagnostic tests for brucellosis is mainly based on detection of antibodies developed against lipopolysaccharide (LPS) component of cell. However, the usefulness of this method is limited by false-positive reactions due to cross-reaction with other Gram negative bacteria. In this study we evaluated a protein antigen, outer membrane 28 precursor protein (omp28 precursor), of Brucella melitensis Rev1 as an alternative to LPS. In this study, we cloned, expressed, and purified omp28 precursor of Brucella melitensis Rev1. The recombinant protein was fused with 6-His and sumo epitope tags at their N- termini to facilitate detection and purification. The B. melitensis Rev1 omp28 precursor gen was PCR synthesized based on their ORF sequence and directly cloned into an pETSUMO vector. The integrity of the constructed plazmid was confirmed using PCR and sequencing. The recombinant entry construct were propagated in E. coli One Shot® Mach1? cells then transformed into E.coli BL21 (D3) cells for IPTG induced protein expression. The expressed recombinant protein was purified by chromatography through Ni-agarose and confirmed with Western blot and Dot blot analysis using anti-His antibody. The efficacy of purified omp28 precursor was studied in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for diagnosis of brucellosis in field sera collected from different hospital in Şanlıurfa. Using known negative and positive serum samples. it was found that omp28 precursor is immunoreactive to Brucella infected human sera. Sixty human sera were screened by omp28 precursor antigen-based ELISA and the results were compared to rose Bengal plate agglutination Test (RBPT). Recombinant omp28 precursor antigen based ELISA has shown sensitivity of 87,8% specificity of 96,2% positive predictive value 96,6 %, negative predictive value 78,78 % and accuracy of 91,6%. It was concluded that recombinant B. melitensis Rev1 omp28 precursor could be used as a protein antigen for diagnosis of brucellosis in human.KEY WORDS: Brucella melitensis Rev1, Omp28 precursor, Recombinant DNA, Cloning, Protein expression, Protein Purification, ELISA