Sıçan duyusal sinir hücrelerinde kisspeptinin hücre içi kalsiyum sinyalleşmesi üzerine etkisi
Kisspeptin leads to calcium signaling in cultured rat dorsal root ganglion neurons
Yazar: FERAH BULUT
Danışman: PROF. DR. METE ÖZCAN
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Ağrı algısı = Pain perception ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Hücre içi sinyal peptidleri ve proteinleri = Intercellular signaling peptides and proteins ; Kalsiyum = Calcium ; Kisspeptin = Kisspeptin ; Nöronlar = Neurons ; Protein kinaz C = Protein kinase C ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Bir hipotalamik nöropeptid olan kisspeptin, kemirgenlerde ağrı duyarlılığını değiştirdiği bilinen RF-amid ailesinin bir üyesidir. Ağrının hücresel modeli olan dorsal kök ganglionu (DKG) nöronlarında kisspeptin ve G protein-bağlı reseptör (GPR54)'ün eksprese edildiği ve kisspeptinin kemirgenlerde ağrı modülasyonu ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Buna rağmen, kisspeptinin duyusal nöronlar üzerindeki etkileri ve mekanizmaları üzerine yapılmış bir çalışma henüz yoktur. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, kisspeptinin sıçan DKG nöron kültüründe hücre içi serbest kalsiyum ([Ca+2]i) seviyeleri üzerindeki nosiseptif/antinosiseptif etkilerini ve mekanizmasını araştırmaktır. 
Bu tez çalışmasında DKG nöronları primer hücre kültürü, 1-2 günlük Spraque- Dawley sıçanlar (n=20) kullanılarak hazırlanmıştır. DKG nöronları, 1 μmol Fura-2 asetoksi metil ester (AM) ile boyanmış ve [Ca+2]i yanıtları, 340 nm ve 380 nm'de eksitasyon ve 510 nm'de emisyon ile dijital görüntüleme mikroskobu kullanılarak 340 nm /380 nm oranındaki değişikliklerle ölçülmüştür.  Farklı dozlarda (100 nM, 300 nM ve 1000 nM, en az 3 tekrar) kisspeptin-10 uygulamasının [Ca+2]i seviyelerine etkisi gözlenmiştir. Ayrıca hücre dışı kalsiyum yokluğunda, kisspeptinin, [Ca+2]i üzerine etkilerini ve bu etkileri Protein Kinaz C (PKC) yolağı üzerinden gösterip göstermediğini belirlemek için PKC inhibitörü şeletrin klorit  (ChCl) ön muamelesi ile de etkileri gözlenmiştir. 
Kisspeptin-10'un, DKG nöronlarına uygulanması [Ca+2]i seviyesini doza bağımlı ve anlamlı olarak arttırmıştır. 340 nm/ 380 nm oranları sırasıyla (bazal 100,0±0.0 % vs kisspeptin): % 118,4±4,6 (100 nM kisspeptin, n=41, p<0.01), % 126,6±4,1 (300 nM kisspeptin, n=36, p<0.001) ve % 140,2±4,9 (1000 nM kisspeptin, n=44, p<0.001) olarak ölçülmüştür. Hücre dışı Ca+2'un yokluğunda, kisspeptin, [Ca+2]i seviyelerinde çok güçlü olmasa da önemli bir artışa neden olmuştur. [Ca+2]i yanıtları, PKC inhibitörü varlığında da devam etmiştir. 
Sonuç olarak, kisspeptin-10' un, kültüre edilmiş sıçan duyusal nöronlarda PKC'den bağımsız olarak [Ca+2]i sinyalini aktive ettiği ortaya konulmuş olup, bu sonuçlar kisspeptinin ağrının modüle edici etkisinde periferal bölgenin de rol alabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Kisspeptin, a hypothalamic neuropeptide, is a member of the RF-amide family known to alter pain sensitivity in rodents. It is known that kisspeptin and G protein-coupled receptor (GPR54) is expressed in dorsal root ganglion (DRG) neurons, the cellular model of pain, kisspeptin is associated with pain modulation in rodents. Despite this, there are no studies yet on the effects and mechanisms of kisspeptin on sensory neurons. Therefore, the purpose of this study is to investigate the nociceptive/antinociceptive effects and mechanism of kisspeptin on intracellular free calcium ([Ca2+]i) levels in rat DRG neuron culture. 
In this thesis study, DRG neurons were prepared using primary cell culture, Spraque-Dawley 1-2 day old rats (n = 20). DRG neurons were loaded with 1 µM Fura-2 acetoxy methyl ester (AM) and intracellular free calcium responses were measured with excitation at 340 nm and 380 nm and emission at 510 nm by digital imaging microscopy with changes of the ratio 340 nm/ 380 nm. The effect of kisspeptin-10 administration at different doses (100 nM, 300 nM and 1000 nM, at least 3 replicates) on [Ca2+]i levels was observed. In the absence of extracellular calcium, the effects of kisspeptin were also observed with the Protein Kinase C (PKC) inhibitor chelerythrine chloride (ChCl) pretreatment to determine whether it exhibited its possible effects on [Ca2+]i signal via the PKC pathway. 
Bath application of kisspeptin-10 to DRG neurons increased [Ca2+]i levels in a dose-dependent and significant way. 340 nm / 380 nm ratios respectively (baseline 100.0 ± 0.0% vs kisspeptin): 118.4 ± 4.6% (100 nM kisspeptin, n = 41, p <0.01), 126.6 ± 4.1% ( 300 nM kisspeptin, n = 36, p <0.001) and 140.2 ± 4.9% (1000 nM kisspeptin, n = 44, p <0.001). In the absence of extracellular calcium, the kisspeptin induced attenuated but still significant increase in [Ca2+]i levels. [Ca2+]i responses persisted in the presence of protein kinase C (PKC) inhibitor. 
Results, it has been revealed that kisspeptin-10 activates the [Ca2+]i signal in cultured rat sensory neurons independent of PKC; and this suggests that the peripheral site is also involved in the pain modulating effect of kisspeptin.