3-ADON kemotipindeki fusarium izolatlarının hedefli genotip analizi
Targeted genotype analysis of fusarium isolates in 3-ADON chemotype
Yazar: GÜLİN İNCİ VAROL
Danışman: PROF. DR. GÜLRUH ALBAYRAK ; DOÇ. DR. EMRE YÖRÜK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Yüksek lisans tez çalışması kapsamında tür düzeyinde tanımlanmış Fusarium izolatlarının moleküler düzeyde kemotiplendirmesi ve hedefli genotip analizi ile hem henüz dağılımı bilinmeyen bir mikotoksinin (NX-2) taraması hem de izolatların mikotoksin üretim kapasitelerinin ortaya konması amaçlandı. Bu kapsamda, yurdumuzun ve İran'ın çeşitli bölgelerinden izole edilen toplam 78 Fusarium izolatı ile çalışıldı. 

Bu izolatlardan 30'unda 28S rDNA bölgesi (620 bç) çoğaltılarak, fungal tanı gerçekleştirildi. İzolatlar F. culmorum'a özgün OPT18 ve F. graminearum'a özgün UBC85 SCAR markırları taranarak tür düzeyinde tanımlandı. 9 izolattan çoğaltılan 478 bç boyutlu fragment izolatların F.culmorum; 6 izolattan çoğaltılan 332 bç boyutlu fragment de izolatların F. graminearum olduğunu ortaya koydu. 14 örneğin tür tayini için TEF1α (Translasyon Elongasyon Faktör 1α) geni çoğaltıldı. Çoğaltım ürünleri (700 bç) dizilendi ve veri tabanındaki referans Fusarium genomlarındaki dizilimlerle biyoinformatik araçlar kullanılarak hizalandı. 14 izolatın F. proliferatum ile (%97,60-99,55), birinin ise F. oxysporum (%99,55) ile yakınlığı belirlendi. 

Deoksinivalenol (DON) ve nivalenol (NIV) kemotiplerinin identifikasyonu için Tri5 gen kümesinde bulunan tri13'ün çoğaltımı hedeflendi. 282 bç'lik çoğaltım ürünü DON kemotipinin, 1075 bç'lik fragment de NIV kemotipinin seçimini sağladı. İlginç olarak, her iki çoğaltım ürünü 17-16 kodlu izolatta gözlendi. tri3 genini 583 bç boyutlu olarak taşıyan 15 izolat 3-asetildeoksinivalenol (3-ADON), 863 bç boyutlu olarak taşıyan 3 izolat ise 15-asetildeoksinivalenol (15-ADON) olarak belirlendi. 

Hedefli genotip analizi için tri1 genine ait 821 bç'lik bölge 53 izolatın 30'undan çoğaltıldı. Çoğaltım ürünleri ApoI restriksiyon endonükleazı (RE) ile kesime bırakıldığında 346 ve 475 bç boyutlu fragmentler elde edilemediğinden, NX-2 kemotipi deneysel olarak saptanamadı. Ancak, F. graminearum 17-11'in çoğaltım bölgesi içerisinde ApoI RE kesim noktasını taşıdığı dizileme temelli olarak biyoinformatik araçlar kullanılarak gösterildi. Ek olarak, 17-11'in referans gen bölgesi ve diğer izolatlara ait diziler ile gerçekleştirilen çoklu hizalaması sonucunda bu izolatın 120 bç'lik bir insersiyona sahip olduğu ortaya kondu.

78 izolat DON mikotoksini üretme kapasitesi bakımından tri5-tri6 intergenik bölgenin hedefli genotip analizi ile tarandı. 45 izolatın çok üretici 1'inin ise az üretici olduğu çoğaltılan sırasıyla 200 bç ve 650 bç'lik fragmentlerle ortaya kondu.

Moleküler yaklaşımlarla kemotiplendirme ve hedefli genotiplendirme çalışmalarından elde edilen bulgular, fitopatojenin etkili olduğu agro-ekolojik bölgedeki potansiyel toksikolojik risklerinin haritalanmasına katkıda bulunacaktır. Bu gibi çalışmalardan elde edilecek veriler, tanı kitlerinin geliştirilmesinde kullanılabilecektir. Bu durumda infeksiyöz ajan ve toksinleri erken dönemde tarlada saptanabilecek ve besin zincirinin kontaminasyonunun önüne geçilerek halk sağlığının korunmasına katkıda bulunulabilecektir.

Abstract:
Within the scope of this master's thesis, it was aimed to perform molecular level chemotyping of Fusarium isolates, to investigate a mycotoxin (NX-2) with unknown distribution yet via targeted genotype analysis and also to reveal the mycotoxin production capacity of isolates. In this context, a total of 78 Fusarium isolates which are isolated from various regions of our country and Iran were studied.

In 30 of these isolates, fungal identification was performed by amplification of 28S rDNA region (620 bp). The isolates were identified at the species level by scanning OPT18, which is specific to F. culmorum and UBC85, which is specific to F. graminearum, SCAR markers. 478 bp fragments, which are amplified from 9 isolates, revealed the isolates as F.culmorum; 332 bp fragments amplified from 6 isolates revealed that the isolates as F. graminearum. TEF1α (Translated Elongation Factor 1α) gene was amplified for species identification of 14 samples. Amplification products (700 bp) were sequenced and aligned with the sequences in the reference Fusarium genomes in database by using bioinformatic tools. The impedence of 13 isolates with F. proliferatum (97.60-99.55%) and one with F. oxysporum (99.55%) was determined.

For identification of deoxynivalenol (DON) and nivalenol (NIV) chemotypes, amplification of tri13 in the Tri5 gene cluster was targeted. 282 bp amplified product provided the selection of DON chemotype and the 1075 bp fragment allowed selection of NIV chemotype. Interestingly, both amplified products were observed in 17-16 coded isolate. 15 isolates carrying the tri3 gene as 583 bp were identified as 3-acetyldeoxynivalenol (3-ADON) and 3 isolates carrying the tri3 gene as 863 bp were identified as 15-acetyldeoxynivalenol (15-ADON). 

For targeted genotype analysis, 821 bp regions belongs to tri1 gene were amplified from 30 out of 53 isolates. As the amplification products were not cut with ApoI restriction endonuclease (RE) to 346 and 475 bp fragments, NX-2 chemotype could not be determined experimentally from these isolates. However, it was shown that F. graminearum 17-11 amplification site carries the ApoI RE cut site by the using bioinformatic tools based on sequencing. Additionally, it is revealed that 17-11 has 120 bp insertion via multiple alignment with gene region of reference isolate and the sequences belongs to other isolates.

78 isolates were screened in terms of DON mycotoxin production capacity by targeted genotype analysis of tri5-tri6 intergenic region. It was revealed that 45 isolates become large amount producers and one is small amount producer with of 200 bp and 650 bp fragments, respectively. 
Findings from molecular genotyping and targeted genotyping studies will contribute to the mapping of potential toxicological risks in the agro-ecological region where phytopathogen is effective. Data from such studies can be used to develop diagnostic kits. In this case, infectious agents and toxins can be detected in the field in an early period and it can be contributed to the protection of public health by preventing the food chain contamination.