PC12 hücrelerinde amiloid beta'nın oluşturduğu kaspaz-8 aktivasyonuna eritropoetinin etkisi
The effect of erythropoietin on caspase-8 activation induced by amyloid beta in PC12 cells
Yazar: SERVET KIZILDAĞ
Danışman: PROF.DR. MERAL FADILOĞLU
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2004
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
I ÖZET PC12 HÜCRELERİNDE AMİLOİD P'NIN OLUŞTURDUĞU KASPAZ-8 AKTİVASYONUNA ERİTROPOETİNİN ETKİSİ Amaç: Alzheimer Hastalığı, merkezi sinir sisteminin dejenerasyonu ve nöron kaybı ile karakterize olan nörodejeneratif bir hastalıktır. Alzheimer Hastalığı'nm nöropatoloj isinde hücre dışı amiloid plaklarının ve hücre içi nörofibriler yumakların gözlendiği yaygın nöronal yıkım sözkonusudur. Nöron ölümünün apoptozis yolu ile gerçekleştiği bilinmektedir. Bu nedenle hücre kültürü deney modellerinde nöronları apoptotik ölümden koruyabilecek ajanların test edilmesinin, Alzheimer Hastalığı için uygulanabilecek etkin tedavi yöntemlerinin bulunmasına katkısı olabilir. Eritropoetinin değişik hasar modellerinde nöroprotektif etkisi gösterilmiştir. Amiloid P peptidinin neden olduğu nöron ölümü modelinde eritropoetin uygulanmasının, kaspaz kaskadının aktivasyonu, nöronal apoptoz ve oksidatif stres üzerine etkisinin değerlendirilmesi amaçlanmış ve planlanmıştır. Gereç ve Yöntemler: Bu tez çalışmasında apoptotik nöron ölümü modeli sıçan feokromasitoma hücre hattı ortamına amiloid P peptidi (25-35) fragmanı uygulanarak oluşturuldu. Nöronal hasarın ve eritropoetinin olası koruyucu etkinliğinin değerlendirilmesinde 3-(4,5~ dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür redüksiyonu ve trypan mavisi ile boyama testleri kullanıldı. Apoptotik hücre ölümünün değerlendirilmesinde ise apostain immünofloresan boyama yöntemi kullanıldı. Kaspaz-8 aktivasyonu western blotting yöntemi ile değerlendirildi. Hücre kültür ortamının nitrik oksit ölçümleri ise "Nitric oxide colorimetrik assay" kiti kullanılarak yapıldı. Bulgular: Sıçan feokromasitoma hücre hattında, amiloid p peptidinin neden olduğu apoptotik nöron ölümü modelinde eritropoetin uygulanması hücre canlılığını koruyucu etki göstermiştir. Apostain immünofloresan boyama yöntemi ise apoptotik hücre ölümünü azaltıcı etkisi olduğunu göstermiştir. Western blotting yöntemi ise, eritropoetin uygulanmasının apoptotik hücre ölümünün aracılarından biri olan kaspaz-8 aktivasyonunu azaltıcı etkisi olduğunu göstermiştir. Gruplar arasında nitrik oksit düzeyleri açısından anlamlı farklılık gözlenmemiştir. Sonuçlar: Eritropoetin' in, amiloid P peptidinin neden olduğu nörotoksisitede hücre canlılığını koruyucu etkisinin olduğu ve apoptozu başlatıcı rol oynayan kaspaz-8 aktivasyonunu azaltarak nöronal apoptozu azalttığı gösterilmiştir. Bu sonuçlar bize eritropoetinin Alzheimer Hastalığı'nda gözlenen amiloid P nörotoksisitesinin sağaltımında yer alabileceğini düşündürmüştür.

Abstract:
2 SUMMARY THE EFFECT OF ERYTHROPOIETIN ON CASPASE-8 ACTIVATION INDUCED BY AMYLOID P IN PC12 CELLS Aim of the study : Alzheimer's Disease is a neurodegenerative disorder characterized by central nervous system degeneration and neuronal loss. The neuropathological hallmark of Alzheimer's Disease includes widespread neuronal loss, extracellular amyloid plaques and intracellular neurofibrillary tangles. Evidence suggests that this neuronal loss occurs through apoptosis. Therefore, determining the agents that may prevent neuronal death in experimental cell culture models in vitro might contribute to establish effective treatment strategies for Alzheimer's Disease. It has been shown that in various models erythropoietin has a neuroprotective effect. Evaluation of the impact of erythropoietin administration on caspase cascade, neuronal apoptosis and the oxidative stress in the neuronal death model induced by amyloid P peptide is aimed and planned. Material and methods : In this study, apoptotic neuronal death was induced in PC 12 cells by the administration of amyloid P(25-35) peptide fragment. In evaluating levels of neuronal injury and the potential protective effect of erythropoietin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide reduction cell viability assay and trypan blue exclusion were performed. Apostain immunofluorescein staining has been used for the evaluation of apoptotic cell death. Caspase-8 activation was evaluated by western blotting method. Nitric oxide levels of cell culture medium is measured using nitric oxide colorimetric assay kit. Results : Erythropoietin administration was shown to protective effect on cell viability in amyloid P induced neuronal cell death. Apostain immunofluorescein staining revealed that erythropoietin had an anti-apoptotic effect in this experimental model. A reduction in caspase- 8 activation was observed after erythropoietin administration. No significant difference was observed in nitric oxide levels between experimental groups. Conclusion: Erythropoietin was demonstrated to have a cell protective effect in neurotoxicity induced by amyloid P peptide and to diminish the apoptosis by decreasing activation of caspase-8 which promotes apoptosis. This results suggest that erythropoietin may have a role in management of amyloid p peptide neurotoxicity in Alzheimer's Disease.