Homolog olmayan uç birleşmesi (NHEJ) DNA onarım yolağının MCF7 hücre hatlarında gelişen doksorubisin direncine etkisinin araştırılması
Investigation of impact of non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair pathway in the development of doxorubicin resistance in MCF7 cell lines
Yazar: MEHMET ALİ AYKAÇ
Danışman: DOÇ. DR. ÖZLEM DARCANSOY İŞERİ
Başkent Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: DNA = DNA ; DNA onarımı = DNA repair ; Doksorubisin = Doxorubicin ; Hücre dizisi = Cell line ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Mikro RNA = Micro RNA ; Neoplazmlar = Neoplasms ; İlaçlara direnç-çoklu = Drug resistance-multiple

Özet:
Homolog olmayan uç birleşimi DNA onarım mekanizması hücre bölünmesi ve çoklu ilaç direnci gelişimini de içerecek biçimde hücrede DNA ile ilişkili birçok farklı süreç ile ilişkilendirilmiştir. 
Çalışmamızda, bir antrasiklin türevi olan doksorubisine karşı dirençlilik gösteren MCF7 meme kanseri alt hücre hatlarında NHEJ yolağının gelişen ilaç direncindeki etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. 
Doksorubisine duyarlı (MCF7/S) ve dirençli alt hücre hatlarına 4µM doksorubisin 1, 6, 12 ve 24 saat uygulanmış ve tüm paramatreler bu uygulama sürelerinde analiz edilmiştir. MTT, doksorubisinin zamana bağlı sitotoksisitesinin değerlendirilmesinde kullanılmıştır. Doksorubisin genotoksisitesi alkali tek hücreli jel elektroforezi ile analiz edilmiştir. NHEJ mekanizmasının analizi için 53BP1 proteininin immünofloresan etiketlenmesi gerçekleştirilmiştir. NHEJ yolağının temel bileşenlerini kodlayan genlerin (XRCC4, XRCC5, XRCC6, XRCC7, LIG4 ve XLF) ve bunların ifadelenmesini düzenleyen iki miRNA'nın (miR-101 ve miR-502) ifadelenmesi qPCR ile analiz edilmiştir.
24 saatlik doksorubisin uygulamasından sonra MCF7/S, MCF7/400Dox ve MCF7/1000Dox hücrelerinde hücre proliferasyonu azalmıştır. Tüm hücrelerde uygulamanın 6. saatinde doksorubisine bağlı genotoksik hasar gerçekleşmiştir. 24 saatlik doksorubisin uygulaması, duyarlı hücrelerde dirençli hücrelere göre daha yüksek genotoksik hasara yol açmıştır. Duyarlı hücrelerde doksorubisin uygulamasından 1 saat sonra NHEJ yolağının aktivesi tespit edilmişken, dirençli hücrelerdeki aktivite 12. saatte tespit edilmiştir. NHEJ bileşenlerinin ifadelenmesi duyarlı hücrelerin kontrol grubunda dirençli hücre hatlarının kontrol gruplarından daha yüksek olmasına rağmen, MCF7/1000Dox hücrelerinde doksorubisin uygulamasına cevap belirgin biçimde artış göstermiştir. 4µM doksorubisin uygulanan MCF7/1000Dox hücre hattında, NHEJ yolağındaki genlerde gerçekleşen ifadelenme artışıyla NHEJ yolağının DNA onarımında etkin rol üstlendiği sonucuna varılmaktadır. Bununla birlikte, önerilen miRNA'ların dirençli hücrelerde NHEJ yolağı üzerinde kontrolünün olmadığı belirlenmiştir.
Sonuç olarak, NHEJ onarımı tepki hızı ve seviyesinin farklı dirençlilik seviyelerine ve mekanizmalarına sahip alt hücre hatlarında duyarlı hücreler ile karşılaştırmalı incelenmesi doksorubisin bağımlı oluşan genotoksik hasarın onarımı ve gelişen ilaç direnci hakkında daha fazla bilgi sahibi olmamızı sağlamıştır. Bu tez çalışması, gelecekte konu ile ilgili yapılacak olan ileri çalışmalara kaynaklık edebilecek ve literatüre katkı sağlayacak niteliktedir.

Abstract:
Non-homologous end joining DNA repair mechanism is assoicated with many of cell precesses. Multidrug resistance and cell devision involves diverse cellular pathways.
Aim of this study was to investigate involvement of NHEJ repair mechanism in the development of an anthracycline type doxorubicin resistance in MCF7 cell lines. 
Doxorubicin (4µM) were applied to sensitive and resistant sublines, and all parameters were tested after 1, 6, 12, and 24h of applications. MTT was used to evaluate time-dependent cytotoxicity of doxorubicin. Doxorubicin induced genotoxicity was tested by single cell alkaline gel electrophoresis assay. Immunoflorescent labeling of 53BP1 protein performed for the analysis of NHEJ. Expression of the genes coding the essential components of the NHEJ pathway, XRCC4, XRCC5, XRCC6, XRCC7, LIG4 and XLF, and two control miRNAs of the pathway, miR-101 and miR502, were analyzed by real-time PCR analysis.
Results demonstrated that cell proliferation decreased in MCF7/S, MCF7/400Dox, and MCF7/1000Dox cells, due to 24h doxorubicin application. Doxorubicin induced genotoxic damage after 6h incubation in all cells. After 24h of incubation, doxorubicin caused higher genotoxic damage in sensitive cells in comparison to resistant cells. NHEJ pathway was activated after 1h of doxorubicin application in sensitive cells, whereas activity was observed after 12h in resistant cells. Though, expression of NHEJ components was higher in control group sensitive cells in comparison to respective resistant cells, expression of these genes were significantly upregulated in MCF7/1000Dox cells in response to doxorubicin application. miR-101 and miR502 alterations were correlated to XRCC7, and XRCC5, LIG4 and XLF gene expressions, respectively in sensitive cells. 
Conclusively, NHEJ pathway components were upregulated in 24h of doxorubicin application. Doxorubicin induced NHEJ response were more rapid and high in MCF7/1000Dox cells, although pathway did not seem to be under the control of proposed miRNAs.
Investigation of timing and level of NHEJ DNA damage response in cells having varying resistance indices and different resistance mechanisms, provided a better understanding of the repair of doxorubicin induced genotoxic damage and development of drug resistance in these cells. The results of the thesis will provide basic knowledge for further studies.