Klinik örneklerden campylobacter türlerinin üretilmesinin araştırılması ve antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesi
Investigation of growth of campylobacter species from clinical specimens and determination of their antimicrobial susceptibility
Yazar: RECEP BORUCU
Danışman: YRD. DOÇ. DR. YELİZ TANRIVERDİ ÇAYCI
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Eritromisin = Erythromycin ; Kampilobakter = Campylobacter ; Kampilobakter enfeksiyonları = Campylobacter infections ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Mikrobiyal duyarlılık testleri = Microbial sensitivity tests ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Campylobacter türleri insanda sistemik enfeksiyon ve ishallerin önemli sebeplerindendir. Özellikle yaz aylarında ishal etkenleri arasında kimi ülkelerde ilk sıralarda yer almaktadır. İnsanda enfeksiyonun araştırılmasında temel sorunlardan biri dışkıdan izolasyonunun güç ve biraz da zaman alıcı olmasıdır. Bu nedenle birçok laboratuvarda Campylobacter üretimi için rutinde kullanılan besiyeri bulunmamaktadır ve antibiyotik duyarlılığı çalışılmamaktadır. Yapılan çalışmalarda, tedavide yaygın olarak kullanılan kinolonlara karşı belirgin direnç artışı olduğu bildirilmektedir.
Bu çalışmadaki amacımız Campylobacter üretimini sağlamak için uygun besiyerini araştırmak ve üretilecek bakterilere antimikrobiyal duyarlılık testleri çalışarak direnç profillerini tespit etmektir. Üretilecek bakterilerin tanımlamasında yeni bir sistem olan MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-Of-Flight Mass Spectrometry) ile tanımlanması ve antibiyotik duyarlılığının da yeni kullanılmaya başlanan EUCAST laboratuvar kılavuzuna göre değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
Çalışmamıza 01 Mayıs 2016 - 01 Ekim 2016 tarihleri arasında Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi hastanesinin ilgili polikliniklerine ishal yakınması ile başvuran hastalardan, mikrobiyoloji laboratuvarına kültür için gönderilen 405 gaita örneği  dahil edilmiştir. Tüm örneklerin ekim yapılmadan önce mikroskobik incelemesi yapılmıştır. Bu örneklerin aynı zamanda bakteriyoloji laboratuvarının rutin hizmetlerinden olan Salmonella, Shigella yönünden de kültürü yapılmıştır. Campylobacter üretimi için mCCDA (Modifiye Charcoal Cephoperazone Deoxycholate Agar) ve Skirrow besiyeri olmak üzere iki farklı besiyeri kullanılmıştır. Ekim yapılan örnekler 2,5 litrelik kapaklı plastik jar içine yerleştirildikten sonra mikroaerofilik ortam sağlamak için jar içine bir poşet Gas Pak EZ Campy container system konuldu ve 42°C'lik etüvde 72 saat inkübasyona bırakıldı. Üreme görülen kültürlerdeki bakterilere konvansiyonel testler yapıldı ve Campylobacter şüpheli olanların Vitek MS ile tanımlaması yapıldı. İncelenen 405 dışkı örneğinin 9'unda Campylobacter (%2,2) türü bakteri üremesi saptanmıştır. Bunların 6'sı Campylobacter jejuni, diğer 3 tanesi ise Campylobacter coli olarak tanımlanmıştır. Campylobacter olarak tanımlanan tüm örneklere hippurat hidroliz testi yapılmıştır. Ayrıca incelenen 405 gaita örneğinin 13 tanesinde Salmonella spp (%3,2) üremesi olmuştur.  Shigella spp üremesi hiç saptanmamıştır.
Elde edilen 9 izolatın 7'si (% 77,8) kan bazlı Skirrow besiyerinde üremiştir. Bu 7 izolattan 2'si aynı zamanda kömür bazlı mCCDA besiyerinde de üremiştir. İki izolat (% 22,2) ise sadece mCCDA besiyerinde üremiştir.
İzole edilen 9 Campylobacter türü izolata EUCAST kılavuzunun önerileri doğrultusunda disk difüzyon yöntemiyle antibiyotik duyarlılığı çalışıldı. Duyarlılık çalışılması için Mueller Hinton Fastidious (MHF) agar besiyeri kullanıldı. Kılavuzda çalışılması önerilen 3 antibiyotik test edilmiştir. Bu amaçla eritromisin 15 μg, tetrasiklin 30 μg ve siprofloksasin 5 μg diskleri kullanılmıştır. Test edilen antibiyotikler içinde eritromisin en duyarlı (%77,7), siprofloksasin ise en dirençli (%77,7) olarak bulunmuştur. Tetrasiklin duyarlılığı ise (%55,6) olarak bulunmuştur.
Besiyeri olarak; kan bazlı besiyerinin kömür bazlı besiyerine göre daha iyi üreme sağladığı görülmüştür. Antibiyotiklerden en duyarlı olarak bulunan  eritromisin'in ilk tercih olarak kullanılması ve yüksek bulunan kinolon direncinin dikkate alınması gerektiği düşünülmektedir.

Anahtar kelimeler: Campylobacter, mCCDA, Skirrow,  MALDI-TOF MS, EUCAST

Abstract:
Campylobacter species are a major cause of systemic infection and diarrhea for human. Considering the pathogens of diarrhea especially in summer season, it is in the first place for some countries. One of the basic challenges in investigating infections in human is difficult and time consuming process of its isolation from the feaces. Therefore, in most laboratories, there are no routinely used mediums for the isolation of Campylobacter and antibiotic susceptibilty is not performed. It has been reported in the previous studies that there is a evident increase of resistance against the widely used quinolones in the treatment.
In this study we aimed  to inverstigate the proper medium to ensure Campylobacter isolation and to identify the resistance profiles of the isolates by studying antimicrobial susceptibility tests.  In addition, it is aimed to use a new system called MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-Of-Flight Mass Spectrometry) in the identification of isolates and antibiotic susceptibility is aimed to be evaluated according to a recently used laboratory manual known as EUCAST.
Fourhundred and five stool samples which were sent to the microbiology laboratory from the patients who had been consulted to the relevant polyclinics of the Ondokuz Mayıs University Medical Faculty Hospital with diarrhea complaint had been included in this study between May 01, 2016 and October 01, 2016. All samples were examined under microscobe  before microbial culturing. At the same time, these samples were also cultured in terms of Salmonella and Shigella as a routine services of bacteriology laboratory. Two different mediums - CCDA (Charcoal Cephoperazone Deoxycholate Agar) and Skirrow - have been used for Campylobacter isolation. Inoculated samples have been placed into 2.5 liters plastic jars and subsequently one package of Gaz Pak EZ Campy container system have been added to provide microaerophilic environment and thereafter allowed to incubate for 72 hours under 42 degree Celcius. Conventional tests have been performed on bacteria in isolated cultures and those with suspected Campylobacter were identified with Vitek MS. Campylobacter spp (2.2%).growth has been detected in 9 stool samples among the tested 405. Six of them were identified as Campylobacter jejuni and the other 3 as Campylobacter coli. All specimens identified as Campylobacter were subjected to hippurate hydrolysis test. In addition, Salmonella spp (3,2%) was found in 13 of the 405 faeces samples which had been examined whereas Shigella spp growth has not been detected.
Seven (77.8%) of the 9 isolates has been obtained on blood-based Skirrow medium. Two of those 7 isolates have been obtained on coal-based CCDA medium at the same time. Two isolates (22.2%) have been grown only on CCDA medium.
Antibiotic susceptibility has been examined by using disc diffusion method in accordance with the recommendations of the EUCAST on 9 isolated Campylobacter isolates. Mueller Hinton Fastidious (MHF) agar medium has been used for susceptibility analysis. The 3 antibiotics recommended in the guideline have been tested. For this purpose, erythromycin 15 μg, tetracycline 30 μg and ciprofloxacin 5 μg discs have been used. Among the tested antibiotics, erythromycin (77.7%) was most susceptible and ciprofloxacin (77.7%) was found to be most resistant. Tetracycline's susceptibility was detected as 55.6%.
It has been seen that blood-based medium  provides a better growth in comparison to coal-based medium. It is thought that erythromycin, which has been found to be most sensitive among the antibiotics, should be used as the first choice and high quinolone resistance should be taken into consideration.

Keywords: Campylobacter, CCDA, Skirrow,  MALDI-TOF MS, EUCAST