Ratlarda beyin hipoksi reperfüzyon yaralanmasında kalsiyum dobesilatın etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of calcium dobesilate on brain hypoxia reperfusion injury in rats
Yazar: ALEMİDDİN ÖZDEMİR
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA ÖĞDEN
Kırıkkale Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Beyin iskemisi = Brain ischemia ; Hipoksi = Hypoxia ; Kalsiyum dobesilat = Calcium dobesilate ; Nekroz = Necrosis ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; Serebrovasküler bozukluklar = Cerebrovascular disorders ; Sinir cerrahisi = Neurosurgery ; Sıçanlar = Rats ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Serebral iskemi (inme) arteryel kan damarlarının daralması, tıkanması veya hipotansiyon sonrası beyne kan akışının yetersiz kaldığı ciddi bir klinik durum olup dünya çapında önemli bir ölüm ve maluliyet sebebidir. Hipoksi/reperfüzyon hasarında oksidatif stres, inflamasyon, nekroz, apoptoz ve otofaji önemli rol oynamaktadır.  Literatürde serebral hipoksi/reperfüzyon hasarını azaltabilmeye yönelik birçok farmakolojik ajan hem deneysel hem de klinik çalışmalarda araştırılmış ancak etkinliği ispatlanmış bir farmakolojik ajan henüz tarif edilememiştir. 
Kalsiyum dobesilatın anti-trombotik, anti-inflamatuar, anti-oksidan, anti-otofajik ve anti-apoptotik etkilerinin olduğu bildirilmiştir. Ancak literatürde kalsiyum dobesilatın serebral hipoksi/reperfüzyon hasarındaki etkilerine yönelik herhangi bir çalışma bulunamamıştır. 
Bu çalışmada serebral hipoksi/reperfüzyon hasarının birçok basamağına etki edebileceği düşünülen kalsiyum dobesilatın oluşan hasar sonrasındaki nöroprotektif ve iyileştirici etkilerini araştırmak amaçlandı.
Çalışmada 40 adet, 300-350 gr ağırlığında, Wistar albino erkek rat Kontrol grubu (cerrahi girişim uygulanmadı ve hiçbir farmakolojik ajan verilmedi, n=6+2); SHAM-A grubu (sadece cerrahi girişim uygulandı; n=6+2); DBL-A grubu (cerrahi girişim uygulandı ve 3 gün intraperitoneal 100 mg/kg/gün kalsiyum dobesilat verildi; n=6+2); SHAM-K grubu (sadece cerrahi girişim uygulandı; n=6+2); DBL-K grubu (cerrahi girişim uygulandı ve 10 gün intraperitoneal 100 mg/kg/gün kalsiyum dobesilat verildi; n=6+2) şeklinde gruplara ayrıldı
Kontrol grubu dışındaki tüm ratlara sedasyon anestezisi sonrası ön boyun bölgelerine orta hattan vertikal insizyonla girildi ve her iki ana karotid arter ortaya konulup nervus vagustan ayrıldı. Daha sonra her iki ana karotid artere 30 dakika süreyle geçici anevrizma klibi yerleştirildi ve takiben anevrizma klipleri çıkarılıp reperfüzyon sağlandı. Cerrahi işlemden dört saat sonra ilgili gruplara kalsiyum dobesilat planlanan sürelerde verildi. Daha sonra belirlenen süreler sonunda tüm deneklere ötenazi uygulandı ve beyinleri tamamen çıkarılıp sol beyin hemisferleri histopatolojik (hemotoksilen ve eosin boyama) ve immünohistokimyasal (Beclin-1, anti-MHC class II ve anti-CD-68 boyama) inceleme için ve sağ hemisferleri biyokimyasal ("Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay", "Western Blot" ve spektrofotometri teknikleri) incelemeler için uygun şartlarda saklandı. Patolojik preparatlarda hipokampal kornu ammonis (CA1, CA2, CA3) bölgelerinde ve komşu paryetal korteks tabakasında nekrotik ve piknotik nöronlar sayıldı. Ayrıca immünohistokimyasal boyamalarla mikrogliaların M1 fenotip sayıları ve apopitoz düzeyleri belirlendi. Biyokimyasal incelemelerle TNF-α, IL-1β, IL-6, kaspaz-3, GSH/GSSG, malondialdehit, protein karbonil, LC3II/LC3I ve beclin-1 düzeyleri ölçüldü.
Elde edilen verilere istatistiksel analizler uygulandı. Normal dağılan veriler ortalama±standart sapma ve normal dağılmayan veriler medyan (minimum-maksimum) olarak sunuldu. Akut ve kronik dönem grupları arasında normal dağılım gösteren bulgular One Way-Analysis of Variance (ANOVA) testi kullanılarak karşılaştırıldı ve post hoc değerlendirmede Tukey Multiple Comparisons testi kullanıldı. Normal dağılım göstermeyen veriler Krusskal-Wallis testi kullanılarak karşılaştırıldı ve ikili grup karşılaştırmalarında Mann-Whitney U testi kullanıldı. p<0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Histopatolojik incelemelerde kalsiyum dobesilatın hipoksik dokularda nekrozu azaltarak akut ve kronik dönemde hipoksi/reperfüzyon hasarını azaltabildiği görüldü. Ayrıca immünohistokimyasal incelemelerde kalsiyum dobesilatın hipoksik dokuda akut ve kronik dönemde mikrogliaların M1 fenotipine polarizasyonunu ve apopitozu azaltabildiği saptandı. Biyokimyasal analizlerde kalsiyum dobesilatın hasarlı dokularda serbest oksijen radikallerini, protein karbonillenmesini, lipid peroksidasyonunu, IL-1β, IL6, TNF-α, kaspaz-3, beclin-1 ve LC3B düzeylerini azaltabildiği saptandı. 
Bu sonuçlarla ratlarda oluşturulan hipoksi/reperfüzyon modelinde kalsiyum dobesilat tedavisinin hipoksik beyin dokularında nekrozu azaltabildiği, anti-inflamatuar, anti-oksidan, anti-apopitotik ve anti-otofajik etkiler oluşturabildiği görüldü. Bu özellikleri ile bu farmakolojik ajanın serebral hipoksi/reperfüzyon hasarını azaltabilmek için klinik uygulamalarda yer alabileceği düşünüldü.

Abstract:
Cerebral stroke, still an important cause of death and morbidity/disability worldwide is a serious clinical condition and oxidative stress, inflammation, necrosis, apoptosis, and autophagy play important roles in its pathogenesis. To reduce the destructive effects of stroke, many pharmacological agents have been investigated in many studies, but any pharmacological agent with proven efficacy has not yet been described in literature. 
Although calcium dobesilate (CD) has anti-thrombotic, anti-inflammatory, anti-oxidant, anti-autophagic, and anti-apoptotic effects, no investigation of its impact on cerebral stroke was found in literature. This study aimed to investigate the possible neuroprotective and healing effects of CD on cerebral hypoxia/reperfusion injury in rats.
In this study, 40 Wistar albino male rats weighing 300-350 g were divided into Control group (no surgery was performed and no pharmacological agent was given, n=6+2); SHAM-A group (only surgery was performed; n=6+2); DBL-A group (surgery was performed and CD 100 mg/kg/day was administered intraperitoneally for 3 days; n=6+2); SHAM-K group (only surgery was performed; n=6+2); and DBL-K group (surgery was performed and 100 mg/kg/day CD was administered intraperitoneally for 10 days; n=6+2).
After sedation anesthesia, both common carotid arteries of all rats except control group were exposed through a vertical midline anterior neck incision, and then, temporary aneurysm clips were placed on them for 30 minutes, and then, clips were removed and reperfusion was achieved. Four hours later, CD was given to the relevant groups at the scheduled times. Then, at the end of the specified periods, all subjects were euthanized and their brains were completely removed and stored for histopathological, immunohistochemical, and biochemical investigations. Necrotic and pycnotic neurons were counted in the hippocampal cornu ammonis (CA1, CA2, CA3) regions and adjacent parietal cortex layer histopathologically (hematoxylin and eosin staining). In addition, M1 phenotype numbers of microglia and apoptosis levels were determined immunohistochemically (Beclin-1, anti-MHC class II and anti-CD-68 staining). TNF-α, IL-1β, IL-6, caspase-3, GSH/GSSG, malondialdehyde, protein carbonyl, LC3II/LC3I, and beclin-1 levels were measured biochemically ("Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay", "Western Blot" and spectrophotometry techniques).
Parametric study findings between acute and chronic period groups were compared using One Way-Analysis of Variance (ANOVA) test, and post hoc evaluation was done using Tukey Multiple Comparisons test. Non-parametric data were compared using Kruskal-Wallis test, and Mann-Whitney U test was used for pairwise group comparisons. p<0.05 was considered statistically significant.
Histopathological examination results revealed that CD could reduce hypoxia/reperfusion injury in acute and chronic periods by reducing necrosis in hypoxic tissues. Additionally, immunohistochemical examinations showed that CD could mitigate polarization of microglia to the M1 phenotype and apoptosis in hypoxic tissue in both periods. Biochemical analysis results demonstrated that CD could reduce free oxygen radicals, protein carbonylation, lipid peroxidation, IL-1β, IL6, TNF-α, caspase-3, beclin-1, and LC3B levels in damaged neuronal tissues.
With these results, it was observed that CD treatment could reduce neuronal necrosis and create anti-inflammatory, anti-oxidant, anti-apoptotic, and anti-autophagic effects in the hypoxia/reperfusion model created in rats. With these properties, it was thought that this pharmacological agent would be used in clinical applications to reduce cerebral hypoxia/reperfusion injury.