DNA'da meydana gelen bazı mutasyonların ve hibridizasyonun tayinine yönelik elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarımı
The design of elekctrochemical DNA biosensors for the detection of some DNA mutations and hybridisation
Yazar: DİLŞAT ÖZKAN ARIKSOYSAL
Danışman: PROF.DR. MEHMET EMİN ŞENGÜN ÖZSÖZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
ÖZETDNA'DA MEYDANA GELEN BAZI MUTASYONLARIN VE HÃ¸BRÃ¸DÃ¸ZASYONUNTAYÃ¸NÃ¸NE YÖNELÃ¸K ELEKTROKÃ¸MYASAL DNA BÃ¸YOSENSÖRLERÃ¸NÃ¸NTASARIMIDNA'da meydana gelen bazı mutasyonların ve hibridizasyonun tayinine yönelik elektrokimyasalDNA biyosensörlerinin tasarımı. DNA'nın çift sarmal yapısının keÃºfinden yarım asır sonra, 21.yüzyılın baÃºlarında bilim dünyası biyolojik araÃºtırmalarda izlenen çok çeÃºitli yöntemlerle karÃºıkarÃºıya bulunmaktadır ve araÃºtırmacılar özellikle moleküler biyoloji ve nanoteknolojialanlarındaki hızlı geliÃºmelerden etkilenmektedir. Gen teknolojisindeki geliÃºmelerle birlikte,analitik tayin yöntemlerinin geliÃºme yönü de yüksek kalitede, gittikçe küçülen boyutlarda ileriteknoloji ürünlerinin moleküler DNA analizleri için geliÃºtirilmesi doÃ·rultusunda ilerlemektedir.ÇalıÃºmamızda DNA hibridizasyonunun ve mutasyonlarının tayinine yönelik farklı özellikleresahip iki elektrokimyasal DNA biyosensörü tasarımı gerçekleÃºtirildi. Moleküler biyolojialanındaki tüm bu geliÃºmeler paralelinde, ilk bölümde Hepatit B hastalıÃ·ı tedavisinde yoÃ·unolarak kullanılan Lamivudin adlı ilacın, bu hastalıÃ·ın etkeni olan Hepatit B virüs genomundameydana getirdiÃ·i nokta mutasyonlarının tayini yapıldı. Kalem grafit elektrot, sentetikoligonükleotitler, klon ürünleri ve polimeraz zincir reaksiyonu ile üretilen ürünler ile yapılantayinlerde diferansiyel puls voltametri tekniÃ·i kullanıldı. Biyosensör tasarımında çeÃºitli deneyselparametrelerin (hedef konsantrasyonu, hibridizasyon süresi, hibridizasyon sonrası sensöryüzeyinin yıkanma süresi, sensör seçimliliÃ·i, en düÃºük tayin sınırı ve tekrarlanabilirlik) tayineolan etkileri incelendi. Asetat tamponu (pH: 4,8) içerisinde gerçekleÃºtirilen ölçümlerde, elektrotyüzeyinden hibridizasyondan önce yanıt alınmazken, hedef dizi ile hibritleÃºme sonrasında eldeedilen yanıtın (guanin yükseltgenme sinyali) yüksek olduÃ·u gözlenmiÃºtir. Prob dizinin hedeftentek bazı farklı ve rastgele dizilerle olan hibridizasyonu ile elde edilen yanıtların ise sırasıylaazaldıÃ·ı gözlenmiÃºtir. Hassas Ãºekilde hasta örneklerinde de mutasyon tayini gerçekleÃºtirilmiÃºtir.Kalem elektrot yüzeyinin kolayca yenilenebilir olması, kalem elektrot sisteminin çoklu analizlereuygulanabileceÃ·i hatta mikroçip cihaz üretiminde kullanılabileceÃ·i fikrini düÃºündürmüÃºtür.Lamuvidin'in uzun süreli kullanımında virüs genomunda oluÃºan nokta mutasyonları, virüsün ilacakarÃºı direnç geliÃºtirmesine neden olduÃ·undan mutasyon tayininin tedaviye yeni bir yön verilmesiaçısından önemi büyüktür. Tasarımı yapılan biyosensörle kısa sürede yapılan mutasyon tayini,klasik tayin yöntemlerine farklı bir alternatif getirmiÃºtir. Bu yeni biyosensör yalnızca hızlı, ucuzve kolay analiz saÃ·lamakla kalmayıp, aynı zamanda iki ayrı türdeki lamivudin direnç mutasyonuhakkında bilgi vermektedir. ÇalıÃºmamızın ikinci bölümünde gıda kaynaklı hastalıklara neden olanSalmonella choleraesuis subsp. choleraesuis bakterisinin tayinine yönelik biyosensör tasarımıyapılmıÃºtır. Salmonella bakterisini tanımlayan DNA parçasının (Salmonella genomunun) tayini,enzime dayalı genosensör ile gerçekleÃºtirilmiÃºtir. Hibridizasyon tayini, biotin-streptavidinetkileÃºiminin kullanıldıÃ·ı, sandviç modelli hibridizasyon tekniÃ·iyle spesifik olarak oluÃºan ürün?Î±-naftol? üzerinden yapılmıÃºtır. Diferansiyel puls ve kare dalga voltametri tekniklerininkullanıldıÃ·ı ölçümlerde, tek kullanımlık perde baskılı karbon elektrot yüzeyinde gerçekleÃºen ikilihibrit yapısı (sandviç hibrit) en yüksek yanıtı vermiÃºtir. Hedef dizi yerine rastgele dizikullanıldıÃ·ında ise yanıtta büyük bir azalma olmuÃºtur. ÇeÃºitli özellikte probların hibridizasyonaetkisi, prob tutturma metodu, hedef konsantrasyonu, polimeraz zincir reaksiyonu ile üretilenürünlerin seyrelme oranı gibi deneysel parametreler incelendi. Ayrıca en düÃºük tayin sınırı vebaÃ·ıl standart sapma gibi parametreler de hesaplandı. Bu elektrokimyasal genosensörle 50 kezseyreltilmiÃº PCR ürünleriyle bile hedefe özgül olarak hibridizasyon tayini yapılabileceÃ·i bulundu.GeliÃºtirilen bu biyosensörle kısa sürede yapılan bakteri tayini klasik tayin yöntemlerine yeni biralternatif getirmiÃºtir. Tasarımı yapılan her iki biyosensörün de ileride DNA çiplerindekullanılabilecek teknolojik altyapıyı içerdiÃ·i bulundu.

Abstract:
ABSTRACTTHE DESIGN OF ELECTROCHEMICAL DNA BIOSENSORS FOR THE DETECTIONOF SOME DNA MUTATIONS AND HYBRIDISATIONAfter half century of the discovery of double-stranded DNA structure, in 21st century, scienceworld has faced with many kinds of diagnosis methods in biological research area so researchershave been influenced on fast advancement in molecular biology and nanotechnology. Thedirection of analytical determination methods have advanced with gene technology, nano-scaledevice technology and nanomaterial usage in biosensors. In this thesis study, two differentelectrochemical DNA biosensors were designed for the detection of DNA hybridization and DNAmutations. In parallel with molecular biological advancement firstly, we described anelectrochemical DNA genosensor for the detection of HBV (YMDD) and the discrimination ofthe point mutation types (YVDD and YIDD) by using the oxidation signal of guanine and adisposable pencil graphite electrode in connection with DPV. The detection scheme containedsynthetic oligonucleotides, cloned products and polymerase chain reaction products. In thebiosensor design, different experimental parameters were examined such as optimum targetconcentration, optimum hybridisation and washing time, specifity of the biosensor, detectionlimit, reproduciblityâ¦ etc. in order to understand the influence of these parameters on thehybridisation/mutation detection. Before the hybridisation, no signal observed because ofguanine-free probe but after the hybridization the highest guanine signal were obtained because oftarget sequence. (Measurement were performed in acetate buffer pH: 4.8) After hybridisationbetween probe modified surface and mismatch/non-complementary sequences, guanine oxidationsignals decrease alternately. In terms of the detection of Lamuvidine resistance, this study is ofimportance because fast and sensitive electrochemical detection of mismatch analysis wasperformed. With the help of the experimental results reported here, a microarray device may beproduced. Additionally, Lamuvidine resistance can be detected from patient samples using thisdevice. The resistance analysis related to the hepatitis B virus (HBV) genotyping and treatmentprocured key information for the study of infected patients. Consequently, the biosensor whichwas designed in this thesis, is provides an alternative detection in comparison to traditionaldetection schemes for mutation analysis. This new biosensor not only provides a rapid, cost-effective, simple analysis but also gives information concerning both genotyping and lamivudineresistance. In the second part of this thesis study, we developed a biosensor for the detection ofSalmonella choleraesuis subsp. choleraesuis bacteria which is caused by food-borne diseases. Inthis work, oligonucleotide modified screen-printed carbon electrodes were used for the enzyme-amplified sensing of DNA sequences that identify the Salmonella bacteria. The capture probe wasimmobilized onto screen-printed carbon electrodes using the adsorption method. Hybridizationreaction was detected through the sandwich format, based on the coupling of biotin-streptavidininteraction using a streptavidin conjugated to alkaline phosphatase. The enzyme catalyzed theconversion of electroinactive -naphthyl phosphate to -naphthol; this product is electroactiveand has been detected by differential pulse voltammetry. Measurements were performed beforeand after the hybridisation reaction. When the sandwich hybrid structure was occured ontoelectrode surface, the highest -naphthol signal was observed. When the non complementaryoligonucleotide was use as a target -naphthol signal decreased sharply. Additionally, differentexperimental parameters were examined such as different types of probe usage, different probeimmobilization methos, optimum target concentration, optimum dilution rate of PCR products,detection limit and reproduciblity in order to understand the influence of these parameters on thehybridisation. The electrochemical genoassay allowed specific detection of the polymerase chainreaction (PCR) amplified targets, even diluting the sample of interest about 50-fold. This newbiosensor provide an alternative detection scheme for bacterial analyis in food. Bothelectrochemical genosensors which were designed in this thesis have substructure of DNAmicrochip technology.