Tekirdağ'da insanlarda Giardia spp. varlığının mikroskobik yöntem ve PCR aracılığıyla takibi
Investigation of Giardia spp. existence by using microscopic method and PCR in human in Tekirdag
Yazar: ŞADİYE KAPLAN KÜÇÜK
Danışman: DOÇ. DR. SIRRI KAR
Namık Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Bölümü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Parazitoloji = Parasitology

Özet:
Giardiosis, tüm dünyada ve Türkiye'de, insanlarda ve hayvanlarda görülen zoonotik bir protozoon hastalığıdır. Hastalığın klinik karakteri subklinikten, şiddetli ishal ile karakterize akut forma kadar değişir. Etkeni Giardia cinsinde yer alan kamçılı protozoonlardır. Başlıca bağırsaklarda etkili olan parazitin doğadaki döngüsü temel olarak fekal oral bulaşma esasına dayanır. Dışkı ile atılan kist formları, değişen çevresel koşullara oldukça dirençli olduğundan ve özellikle sulu ortamda uzun süre canlı kalabildiğinden, hastalığa genelde yaygın olarak rastlanır.
Bu tezde, 01.01.2011- 31.12.2011 tarihleri arasında Tekirdağ Devlet Hastanesine özellikle sindirim sistemi şikayeti ile başvuran 573 hastadan gaita numuneleri alınmış ve söz konusu süreçte hastaya ve gaita numunelerine yönelik temel parametreler kaydedilmiştir. Takibinde numuneler natif muayene ve doymuş çinko sülfat flotasyon tekniği kullanılarak, mikroskop altında Giardia spp. kistleri yönünden incelenmiştir. Bu numunelerden, kist yönünden pozitif olanlar ve hastalığın subklinik formuna sahip olabileceği düşünülen örneklerden 90'ı seçilmiş ve DNA ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir. Takibinde Giardia duodenalis spesifik, ß-giardin gen bölgesine yönelik primerler kullanılarak nested PCR yapılmış ve ürünler HaeIII enzimi ile kesilerek poliakrilamid jel elektroforez-PAGE'de yürütülmüştür.
Sonuç olarak, natif muayenede 21 (%3,66), doymuş çinko sülfat flotasyonu ile 26 (%4,54), nested PCR ile 27 (%4,71) pozitif elde edilmiştir. Sınırlayıcı enzim parça uzunluk çeşitliliği-RFLP verilerine göre, pozitif örneklerin 15'inin (%55,56) assemblage A, 2'sinin (%7,41) assemblage B ve 10'unun (%37,03) assemblage B ve assemblage E miks olduğu anlaşılmıştır. Kaydedilen verilerle sonuçlar karşılaştırıldığında, Tekirdağ'da insan giardiosisinin belli bir önem taşıdığı ve hastalığın zoonotik dinamiğinin bölgede önemli bir role sahip olabileceği görülmüştür. Yine bu tez çalışmasıyla, dünyada ilk defa insanlarda bu derecede yoğun assemlage E bildirimi yapılmakta olup, ilgili olguların belirgin klinik öneme sahip olması, söz konusu türe yönelik daha ayrıntılı çalışmalar yapılması gerektiğini göstermiştir.

Anahtar kelimeler: Giardia, assemblage, PCR, RFLP, insan, Tekirdağ

Abstract:
Giardiosis is a zoonotic protozoan disease, which is seen worldwide, including in Turkey. Clinical feature of the disease varies from subclinical infection to overt, acute form characterised with severe diarrhea. The agent is flagellated protozoan in Giardia genus. Natural life cycle of the parasite, which especially affects the small intestine, is based on primarily faecal-oral transmission route. The disease is prevalent because the cyst form, excreated with faeces, is highly resistant to different environmental conditions, and can survive for a long period especially in water.
In this study, single stool samples were collected from the 573 patients who applied to the public hospital especially with complaints of gastrointestinal symptoms, between 01 January 2011-31 December 2011, in Tekirdag, and in this period, all the information were recorded, about the faeces specimen and the patients. Subsequently, the samples were examined using wet-mount and saturated zinc sulfate centrifugal flotation method, and the slides were screened for the cysts of Giardia spp. under light microscope. Of the total specimen, 90 samples, which were either cyst positive or negative but obtained from the patients who were suspected of having subclinical form of the disease, were selected and DNA extraction was performed. After that, nested PCR was conducted using Giardia duodenalis specific primers targeted to DNA sequences of ß-giardin gene region, and the yields of the PCR were restricted with endonuclease HaeIII and run on polyacrylamide gel electrophoresis-PAGE.
As a result, 21 (3.66%), 26 (4.54%) and 27 (4.71%) positive were detected in the wet-mount, saturated zinc sulfate centrifugal flotation, and nested PCR methods respectively. According to the restriction fragment length polymorphism-RFLP, it was observed that out of the positive samples, 15 (55.56%) were assemblage A, 2 were (7.41%) assemblage B, and 10 (37.03%) were mix of assemblage B and assemblage E. It was evaluated that human giardiosis has a certain importance in Tekirdag, and zoonotic cycle of the disease should have an important role in the region. In this thesis, assemblage E infection, at this high prevalence level in humans, is reported first here, and serious clinical features of the related cases pointed to the need for more detailed studies on this assemblage.

Keywords: Giardia, assemblage, PCR, RFLP, human, Tekirdag