Işınlanmış balıkta doz tahmininde kullanılmak üzere dna temelli moleküler metodolojilerin geliştirilmesi
Development of dna based molecular methodologies for dose estimation in irradiated fish
Yazar: ERGÜN ŞAKALAR
Danışman: PROF. SÜHENDAN MOL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Avlama ve İşleme Teknolojisi Ana Bilim Dalı / İşleme Teknolojisi Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Genetik = Genetics ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmada ışınlanmış balıketlerinin ışınlanıp ışınlanmadığını ve balıketine ne kadar ışınlama yapıldığını tahmin edebilen metodolojilerin geliştirilmesi amacı ile RAPD ve real-time PCR teknikleri kullanılmıştır. Alabalık (Oncorhynchus mykiss) örnekleri gamma cell'de 0,250, 0,500, 1, 3, 5, 7 ve 9 kGy ışınlama dozlarına maruz bırakılmıştır. Işınlanan örneklerden depolanmadan önce ve depolandıktan sonra DNA izolasyonları yapılmıştır. Hem çekirdek DNA hem de mitokondriyal DNA üzerindeki farklı uzunluktaki bölgelere primer tasarlanmıştır. Tasarlanan herbir primer, ışınlanmış örneklerin DNA'larını amplifiye etmede için kullanılmıştır. Mitokondriyal ve çekirdeksel DNA ya ait olan amplikon eğrileri ve bu eğriler arasındaki korelasyonlar elde edilmilştir. 18S RNA geninin 519 bç uzunluğundaki bölgesi en iyi korelasyon değerlerini sağlanmıştır. Bu korelasyon değerlerinden elde edilen standart eğri verileri kullanılarak balık etine uygulanan ışınlama dozu ve her bir dozun DNA' ya verdiği zarar hesaplanmıştır. Işınlamış balıkların DNA'larında rastgele amplifikasyonlar yapmak için ERP primerleri tasarlandı ve RAPD PCR uygulanmıştır ve amplikonların agaroz jel profilleri çıkarıldı. Ek olarak bu çalışmada geliştirilen moleküler metodolojilerin doğrulamasını yapmak amacıyla ışınlanmış her bir örnekte meydana gelen DNA parçalanmaları Komet Deneyi ile tespit edilmiştir. Sonuç olarak ışınlanmış alabalık etinin kalitatif analizine kolayca imkan verebilen ve uygulanan dozun kantitatif tahminlerinin yapılabildiği iki moleküler metodoloji tasarlanmıştır. Tasarlanan bu metodolojiler yaklaşık 0.5 kGy ddüşük doz uygulamasına kadar ışınlanmış ve üç ay süre ile depolanmış alabalık etlerinin analizlerine imkan sağlamaktadır.

Abstract:
In this study, RAPD and real-time PCR were used for the development of metodologies that can able to estimate irradiation dose was done and distinguishing between irradiated and non irradiated fish. Trout (Oncorhynchus mykiss) samples were exposed to radiation doses of 0.250, 0.500, 1, 3, 5, 7 and 9 kGy in gamma cell. DNAs were extracted from irradiated samples before and after storage. Primers were designed on regions with different lengths of both nuclear and mitochondrial DNA and each primer was used to amplify DNA of irradiated samples. The amplicon curves of mitochondrial and nuclear DNA and the values of the correlations among the amplicon curves were obtained. 519 bp reagon of the 18S RNA gene on nuclear DNA provided the best correlation values. Radiation doses applied to the fish fillets were estimated using the standard curve data obtained from correlation values, and DNA damage caused by each dose was calculated. ERP primers were designed to make randomly amplifications on the DNA of the irradiated samples, and RAPD PCR was applied and obtained the agarose gel profiles of amplicons. In addition, DNA fragmentation occurring in each dose was determined by Komet test for the purpose of verification of molecular methodologies developed in this study. As a result, two molecular methodologies enabling to easily qualitative analysis of irradiated trout meat and enables quantitative estimations of the administered dose were developed. These methodologies allow the analysis of the trout flesh irradiated and stored for a period of three months up to the dose limit of around 0.5 kGy.