Trikalsiyum fosfata bağlanmış mezenkimal kök hücre eksozomlarının kemik yenilenmesine etkisi
Effect of mesenchymal stem cell exosomes bound to tricalcium phosphate on bone regeneration
Yazar: EDA ÇİFTCİ DEDE
Danışman: PROF. DR. PETEK KORKUSUZ ; DOÇ. DR. FERAY BAKAN MISIRLIOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kemik fizyolojik koşullarda kendini yenileyebilen bir doku olmasına rağmen metabolik hastalıkları, nekrotik ya da travmatik hasarlarında yapı ve işlevleri bozulabilir.  Kritik kemik kayıplarının, kemik inorganik matriksinin ana bileşeni osteokondüktif kalsiyum fosfat bileşiklerinin yanında osteoindüktif büyüme faktörleri ya da bunlara kaynak sağlayan kök/öncül hücreler ile desteklenmesi gereklidir. Mezenkimal kök hücre eksozomları, kemikte rejeneratif etkili molekülleri içermeleri, hedef hücreye kolayca alınmaları ve immün yanıt oluşturmamaları nedeniyle, mezenkimal kök hücreler yerine tercih edilebilir. Bu çalışmada anneksin V ile kalsiyum eksik hidroksiapatite kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomları bağlanarak oluşturulan biyomühendislik temelli formülasyon ile osteoblastların çoğalma, matriks sentezi ve mineralizasyonunun uyarılabileceği varsayılmıştır. Bu hipotezi  test etmek için, deney ve kontrol gruplarını içeren in vitro deney düzeneğinde (1) kalsiyum eksik hidroksiapatitin üretilmesi ve karakterizasyonu, (2) insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının izolasyonu ve karakterizasyonu, (3) kalsiyum eksik hidroksiapatit ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre  eksozomlarının anneksin V aracılığı ile bağlanması, bağlanma ve salımın karakterizasyonu, (4) oluşan bu formülasyonun osteoblastların çoğalma ve mineralizasyonuna etkisinin değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Hedefler doğrultusunda kimyasal çöktürme yöntemiyle kalsiyum eksik hidroksiapatit sentezi gerçekleştirilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatitin X-ışını difraksiyonuyla ve Raman spektroskopisiyle yapısal karakterizasyonu, geçirimli elektron mikroskobunda morfolojik karakterizasyonu yapılmıştır. İnsan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler morfoloji, kültür plağına tutunma, spesifik yüzey belirteçleri ve kondrojenik farklılaşma analizi yöntemleriyle karakterize edildikten sonra ultrasantrifüjleme ve MACS yöntemleriyle eksozomları izole edilmiştir. Eksozomlar transmisyon elektron mikroskobunda değerlendirilmiş; BCA analizi ile protein konsantrasyonları, NTA yöntemiyle partikül sayısının ve partikül boyutlarının analizi yapılmıştır. Akım sitometresiyle CD 9 ile yakalanan eksozomların CD63 ile ve CD81 ile işaretlendikleri, her üç belirtece de sahip oldukları gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatite, anneksin V aracılığıyla insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının bağlanması; Raman spektroskopisi ve jel elektroforezi ile gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatite bağlı eksozomların BCA analiz yöntemi ile ilk 12 saatte büyük çoğunluğunu kontrollü olarak saldığı gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatit ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının insan fetal osteoblastlarındaki etkili proliferatif dozu gerçek zamanlı impedans temelli olarak 1. günden 3. güne ölçülmüş ve sırasıyla 0.1 µg/ml ve 25 µg/ml olarak belirlenmiştir. Belirlenen etkili dozlarda hazırlanan formülasyon osteoblastlara uygulandığında gerçek zamanlı olarak osteoblastların çoğaldıkları; matriks sentezi ve mineralizasyonu gösteren ALP aktivitesinin 0-7 gün zaman aralığında kontrol grubuna göre arttığı saptanmıştır. Sonuç olarak bu tez çalışması ile ilk kez kalsiyum eksik hidroksiapatit, anneksin V ile kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarına bağlanarak orijinal ve yenilikçi, yüksek teknolojik, kişiye özel ve hedefli bir formülasyon geliştirilerek in vitro koşullarda insan osteoblastlarındaki yenileyici etkisi ortaya konmuştur. Bu yeni formülasyonun in vivo hastalık modellerindeki deneysel validasyonunu takiben klinikteki metabolik ya da travmatik kemik hasarlarının onarılmasında otojenik, kişiye özel ya da allojenik bir tedavi ajanı olarak yer alma potansiyeli bulunmaktadır. Tez kapsamındaki biyomühendislik temelli yeni tedavi ürününün ülkemizin ortopedik hastalıkların tedavisine ait uluslararası pazarda rekabet gücünü arttırma hedefini karşılaması önemlidir. Bu kapsamda, tezden elde edilen çıktılar ile Hacettepe Teknokent Teknoloji Transfer Merkezi Patent Ofisine patent başvurusu yapılmıştır (Başvuru no: 2021/002221).

Abstract:
The structure and functions of bone may be impaired with metabolic diseases such as osteoporosis, necrotic or traumatic damages, although it is a dynamic tissue that can renew itself under physiological conditions. Critical bone losses need to be supported by osteoinductive growth factors, stem/precursor cells, as well as osteoconductive calcium phosphate compounds. Mesenchymal stem cell exosomes could be preferred instead of mesenchymal stem cells because they contain molecules that have regenerative effects in bone, be easily taken into the target cell, and do not create an immune response. In this study, it was hypothesized that the proliferation, matrix synthesis, and mineralization of osteoblasts can be stimulated with bioengineered formulation formed by binding annexin V to calcium deficient hydroxyapatite and human bone marrow-derived mesenchymal stem cell exosomes. In order to test this hypothesis, an in vitro study consisting of an experiment and control group was designed. The objectives of the thesis are ; (1) production and characterization of calcium deficient hydroxyapatite, (2) isolation and characterization of human bone marrow-derived mesenchymal stem cell exosomes, (3) production and characterization of new formulation that contain calcium deficient hydroxyapatite, human bone marrow-derived mesenchymal stem cell exosomes, and binding material annexin V, and (4) evaluating the effect of a newly formulated material on proliferation and mineralization potentials of osteoblasts. In line with these goals, calcium-deficient hydroxyapatite was synthesized using a chemical precipitation method and characterized by X-ray diffraction, Raman spectroscopy, and transmission electron microscopy. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were characterized by morphology, attachment to the culture plate, specific surface markers, osteogenic and chondrogenic differentiation analysis methods, and then exosome isolation was performed by ultracentrifugation and MACS methods. Exosomes were observed in the transmission electron microscope, protein concentrations were determined by BCA analysis and particle analysis with NTA. Exosomes have been shown by flow cytometry to specifically have all three markers (CD9, CD63, CD81). Calcium deficient hydroxyapatite has linked human bone marrow-derived mesenchymal stem cell exosomes via annexin V and has been characterized by Raman spectroscopy and SDS-PAGE. The release study was carried out by BCA analysis. The exosomes are released from the hydroxyapatite in 12 hours. The proliferative dose of calcium-deficient hydroxyapatite and human bone marrow-derived mesenchymal stem cell exosomes were determined by real-time cell proliferation analysis 0.1 µg/ml, and 25 µg/ml respectively. The material prepared with effective doses was applied to the osteoblasts. The proliferative potential and matrix mineralization induction effect were reported by using real-time cell proliferation and ALP activity analyses, respectively. As a result, with this thesis study, an original and innovative, high-tech, personalized, and targeted formulation was developed by a newly formulated material that contains calcium deficient hydroxyapatite and human bone marrow-derived mesenchymal stem cell exosomes with an annexin-V binding molecule for the first time, and its regenerative effect on human osteoblasts in vitro was demonstrated. Following experimental validation of this new formulation in in vivo disease models, it has the potential to be involved in the repair of clinical metabolic or traumatic bone injuries as an allogeneic or autogenous personalized treatment agent. The new bioengineering-based treatment product produced within the scope of the thesis meets our country's goal of increasing the competitiveness in the international market in the treatment of orthopedic diseases. A patent application was made to Hacettepe Technopolis Technology Transfer Center Patent Office with the new formulation obtained from the thesis. (Application number: 2021/002221).