Leishmania RNA virüs pozitif ve negatif suşların transkriptomik analizi ile farklı ifade edilen genlerin  değerlendirilmesi
Evaluation of differently expressed genes by transcriptomic analysis of Leishmania RNA virus positive and negative strains
Yazar: MUHAMMED NALÇACI
Danışman: DOÇ. DR. AHMET MERMER ; PROF. DR. SERAY TÖZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Biyoinformatik = Bioinformatics ; Leishmania = Leishmania ; Leishmania tropika = Leishmania tropica ; RNA virüsleri = RNA viruses

Özet:
Leishmaniasis, Leishmania parazitinin neden olduğu, deri ülserlerinden ölümcül organ hasarına kadar değişen karmaşık patolojiye sahip ihmal edilmiş bir tropikal hastalıklar grubudur. Leishmania parazitleri enfekte kum sineklerinin ısırmasıyla bulaşırlar ve konak makrofajlarını enfekte ederler. Şu anda dünya genelinde yaklaşık 12 milyonun üzerindeki kişi bu hastalığa yakalanmıştır ve her yıl 1 milyondan fazla yeni vaka ortaya çıkmaktadır. Leishmaniasis'in kutanöz (KL), visseral (VL) ve mukokutanöz (MKL) olmak üzere çeşitli klinik formları vardır. Leishmaniasis için insan aşısı yoktur ve mevcut tedaviler, doğrudan parazite karşı etki eden ilaçları içermektedir. Ancak bu ilaçların kullanımı sonrasında görülen olası yan etkiler, hastalığın nüksetmesi ve ilaç direnci gibi durumlar söz konusu olabilmektedir.
Bazı Leishmania suşlarının Leishmania RNA virüsü (LRV) barındırdığı tespit edilmiştir. Leishmania RNA virüsü, bir kapsid proteini ve RNA'ya bağımlı RNA polimerazı kodlayan bir dsRNA genomu içeren küçük bir parazitik virüstür ve yalnızca parazitin sitoplazmasında bulunur. Çift zincirli bir RNA virüsü olan LRV Yeni ve Eski Dünya'da sırasıyla LRV1 ve LRV2 olarak iki farklı gruba ayrılmıştır. Leishmania endosimbiyontu olan LRV1 Yeni Dünya Leishmania türlerinde hastalık şiddetini, metastazı ve tedaviye direnci etkileyen faktörlerden biri olduğu konusunda birçok sayıda araştırma bulunmaktadır. Yakın zamanda Türkiye'deki Leishmania major ve Leishmania tropica türlerinde de moleküler yöntemlerle saptanan LRV2'nin konak hücre ile etkileşim mekanizması ve virüsün hastalık sürecine olan muhtemel etkisi konusunda bir çalışma bulunmamaktadır. İlk kez tarafımızca saptanan LRV2 negatif/pozitif (-/+) L. tropica suşlarında transkriptom profilinin belirlenmesi, transkriptom sonuçlarının biyoinformatik analizlerle değerlendirilmesi, farklı ifade edilen genlerin (differentially expressed genes, DEGs) tespit edilmesi ve bu DEG'lerin ifadelerinin valide edilmesi, tez çalışmasının amacını oluşturmaktadır. 
Çalışmamızda, Türkiye'den izole edilmiş olan LRV2 –/+ L. tropica suşlarının (i) transkriptom verilerinin analizlerinin yapılması; (ii) analizler sonucu elde edilen verilerin biyoinformatik analizler ile değerlendirilerek ayırıcı gen hedefleri ve farklı DEG'lerin saptanması; (iii) seçilen 33 DEG (yukarı ve aşağı regüle) Türkiye'den izole edilen ve virüs pozitif/negatifliği belirlenmiş çeşitli türlerden oluşan 30 Leishmania suşunu içeren parazit grubunda qRT-PCR ile gen ekspresyon analizi uygulanarak karşılaştırılması ve genlerin LRV2 ile ilişkisini araştırmayı hedef alan bir iş yöntemi izlendi.
Tez çalışmasında RNA-Seq analizleri sonucunda BGISEQ-500 dizileme platformunda toplamda yaklaşık 10.53 Gb baz okuma elde edildi. Tüm örnekler bir araya getirildikten ve filtrele işleminden sonra 18.934 Unigen elde edildi; Unigenlerin toplam uzunluğu, ortalama uzunluğu, N50 ve GC içeriği sırasıyla 30.731.061 bp, 1.623 bp, 2.781 bp ve %59,27'dir. Ardından, 14.637 (NR: %77.31), 18.863 (NT: 99.63%), 6.032 (Swissprot: 31.86%), 5.597 (KOG: 29.56%), 6.666 (KEGG: 35.21%), 7,792 (GO: 41,15%) ve 5,449 (InterPro: 28,78%) gibi yedi işlevsel biyoinformatik veritabanıyla hizalayarak tanımlamalar gerçekleştirildi.
Leishmania RNA virüs 2-/+ L. tropica suşları arasındaki gen ekspresyon analizinde 5023 aşağı ve 1751 yukarı regüle edilmiş gen olduğu tespit edildi. Leishmania RNA Virüs+ L. tropica'da Leishmania'nın hücre içi parazit sağkalımı, transkripsiyon, translasyon, sinyal iletimi, biyosentetik süreç, parazit proliferasyonu ve konak hücreler üzerindeki etki mekanizmaları gibi temel yaşamsal faaliyet gösteren genlerde önemli ölçüde anlamlı olarak sonuçlar elde edildi. İncelemeye tabi tutulan yukarı ve aşağı regüle genler arasında; yağ asidi elongaz 2, vamp8 snare proteini, histon 4, gp63, ppgi, sinyal müsin Msb2, sitozolik triparedoksin peroksidaz, DNA onarım alkB gibi genlerin birçoğunun savunma, sinyal, üreme ve hayatta kalma mekanizmaları ile ilgili olduğu belirlendi. 
Leishmania RNA virüs 2-/+ L. tropica'nın ilk başarılı RNA-Seq ve fonksiyonel ek açıklama analizi olan çalışmamız, LRV2 ve Leishmania parazitleri arasındaki ilişkiye önemli bir genel bakış sağlamaktadır. Hastalık üzerindeki etkilerine, virüsün terapötik bir strateji olarak spesifik olarak hedeflenebilme potansiyeline ve potansiyel virüs bileşenlerinin hedef olarak tanımlanmasına ışık tutmaktadır. LRV2'nin hastalık patogenezindeki rolü ve katkısına ilişkin anlayış, viral olarak enfekte olmuş parazitlere ilişkin anlayışımızı derinleştirmenin yanında, aynı zamanda LRV2'yi potansiyel bir terapötik hedef olarak değerlendirmek için yeni olanaklar sunmaktadır. Dolayısıyla bu tez, sadece LRV2 ve Leishmania arasındaki ilişkiye yeni bir bakış açısı sunmakla kalmamakta, aynı zamanda antileishmanial tedavi için potansiyel olarak yeni hedefler veya stratejiler ortaya çıkarmakta ve bu alanda önemli bir ilerleme sağlamaktadır.

Abstract:
Leishmaniasis is a neglected tropical disease caused by the parasite Leishmania, which has complex pathology ranging from skin ulcers to fatal organ damage. They are transmitted by the bite of infected sandflies and infect host macrophages. Currently, over 12 million people worldwide are infected with the disease, and more than 1 million new cases occur each year. There are several clinical forms of leishmaniasis: cutaneous (CL), visceral (VL) and mucocutaneous (MKL). There is no human vaccine for leishmaniasis, and current treatments include drugs that act directly against the parasite. However, there are possible side effects, relapse of the disease and drug resistance after the use of these drugs.
Some Leishmania strains have been found to harbour the Leishmania RNA virus (LRV). Leishmania RNA virus is a small parasitic virus containing a capsid protein and a dsRNA genome encoding an RNA-dependent RNA polymerase. It is found only in the cytoplasm of the parasite. Leishmania RNA virus, a double-stranded RNA virus, is divided into two groups in the New and Old World, LRV1 and LRV2, respectively. Many studies show that LRV, a Leishmania endosymbiont, is one of the factors affecting disease severity, metastasis and resistance to treatment in New World species. There is no study on the interaction mechanism of LRV2, which was recently detected by molecular methods in Leishmania major and Leishmania tropica species in Turkey, with the host cell and the possible effect of the virus on the disease process. This thesis is structured around four main objectives. First, to determine the transcriptome profile of LRV2 -/+ L. tropica strains detected by us for the first time. Second, to evaluate the transcriptome results by bioinformatic analyses. Third, to identify differentially expressed genes (DEGs). And finally, to validate the expression of these DEGs.  
In our study, the following methodology was implemented for virus-negative and positive L. tropica strains isolated from Turkey: (i) analysis of transcriptome data; (ii) evaluation of the obtained data through bioinformatics analyses to identify distinctive gene targets and differentially expressed genes (DEGs); (iii) comparison of gene expression levels of 3 selected DEGs (both upregulated and downregulated) using qRT-PCR in a control group consisting of 30 Leishmania strains isolated from Turkey with known virus-positive/negative status, and visualization of some of the significant gene regions at the protein level using Western blotting.
Approximately 10.53 Gb base reads were obtained on the BGISEQ-500 sequencing platform. After assembling and filtering all samples, 18,934 Unigenes were obtained; the total length, average length, N50 and GC content of Unigenes were 30,731,061 bp, 1,623 bp, 2,781 bp and 59.27%, respectively. Then, identifications were performed by aligning with seven functional bioinformatics databases, such as 14,637 (NR: 77.31%), 18,863 (NT: 99.63%), 6,032 (Swissprot: 31.86%), 5,597 (KOG: 29.56%), 6,666 (KEGG: 35.21%), 7,792 (GO: 41.15%) and 5,449 (InterPro: 28.78%).
Gene expression analysis between LRV2 -/+ L. tropica strains revealed 5023 down-regulated and 1751 up-regulated genes. Significantly significant results were obtained in LRV2+ L. tropica for genes involved in basic vital activities of Leishmania, such as intracellular parasite survival, transcription, translation, signal transduction, biosynthetic process, parasite proliferation and mechanisms of action on host cells. Among the up-and down-regulated genes examined were fatty acid elongase 2, vamp8 snare protein, histone 4, gp63, ppgi, signalling mucin Msb2, cytosolic triparedoxin peroxidase, DNA repair protein alkB, etc. Many of them were found to be related to defence, signalling, reproduction and survival mechanisms.
Our study, the first successful RNA-Seq and functional annotation analysis of LRV2 - and + L. tropica, provides an essential overview of the relationship between LRV2 and Leishmania parasites. It sheds light on their impact on disease, the potential to specifically target the virus as a therapeutic strategy, and the identification of potential virus components as targets. Understanding the role and contribution of LRV2 in disease pathogenesis deepens our understanding of virally infected parasites and opens new possibilities for evaluating LRV2 as a potential therapeutic target. Therefore, this thesis offers a new perspective on the relationship between LRV2 and Leishmania and potentially uncovers new targets or strategies for antileishmanial therapy, providing significant advances in this field.