Patojenik mikroorganizmaların tanısına yönelik elektrokimyasal nanogenosensör tasarımı
Electrochemical nanogenosensor design for the detection of pathogenic microorganisms
Yazar: SEZİN YÜKSEL
Danışman: PROF. DR. PINAR KARA KADAYIFCILAR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomedikal Teknolojiler Ana Bilim Dalı / Biyomedikal Teknolojiler Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyosensörler = Biosensors ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Grafen oksit = Graphene oxide ; Patojenler = Pathogens

Özet:
Bu çalışmada, patojenik mikroorganizmaların tayinine yönelik elektrokimyasal temelli bir nanogenosensör tasarımı gerçekleştirilmiştir. Tek kullanımlık kalem ucu elektrotlar (PGE) sensör yüzeyi olarak kullanılmış ve bu sensör yüzeyleri Grafen Oksit (GO) nanomateryali ile zenginleştirilmiştir. Tasarımı yapılan nanogenosensörde model mikroorganizma olarak Escherichia coli (E. coli) bakterisine ait 22 baz uzunluğundaki gen bölgesi kullanılmıştır. Model patojenik mikroorganizma E. coli'nin hem sentetik dizileriyle hem de gerçek örnekleriyle çalışılmıştır.
Genosensörün hassasiyet ve seçiciliğini artırmak için Grafen Oksit nanomateryali kullanılmıştır. Grafen, karbon atomunun sp² hibritleşmesi yapan bal peteği örgülü yapılarından meydana gelen iki boyutlu bir nanomateryaldir. Grafen Oksit (GO) ise; grafitin oksidasyonu ile elde edilen grafen türevidir. Grafen oksitin yapısında farklı oksijen grupları bulunduğu için diğer moleküller ile daha iyi bağlanma imkanı sunmaktadır. Bu amaçla, Grafen Oksitin yüzeye daha iyi bağlanması için sensör yüzeylerine karbodimid kimyası uygulanarak, Grafen Oksit modifikasyonu gerçekleştirilmiştir. GO kaplı sensör yüzeylere kovalent yolla E. coli prob dizisi immobilize edilerek, E. coli hedef dizi ve tüm bazları hedeften farklı Mycobacterium tuberculosis hedef dizi ile hibridizasyona tabi tutulmuştur. Sensör yüzeyindeki etkileşimler 5mM [Fe(CN)6]3-/4- varlığında Elektrokimyasal Empedans Spektroskopisi (EIS) yöntemi ile analiz edilmiştir.
Tüm nanogenosensörün seçiciliği ve optimizasyon koşulları sentetik diziler ile elde edilmiştir. En uygun hibridizasyon koşullarını (prob ve hedef konsantrasyonu, hibridizasyon tamponu, yıkama tamponu vb.) saptamak amacıyla çalışmalar yapılmıştır. Optimizasyon koşullarının elde edilmesinin ardından PCR ürünleri (gerçek örnekler) ile çalışmaya başlanmıştır. Belirlenen tüm optimum koşullar altında tasarlanan nanogenosensörü doğrulayıcı çalışmalar ile devam edilmiştir.
Kalıtsal ve bulaşıcı hastalıkların tanısında kullanılan diğer yöntemlere göre; daha hızlı, kolay ve maliyeti düşük bir nanogenosensör tasarımı gerçekleştirilmiştir. Yüzey alanları ve hassasiyetlerini artıran bu nanogenosensörler, klinik tanıya uygulanabilirliği ve tek kullanımlık sistem ile mikroçip teknolojilerinin temeli olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, an electrochemical based nanogenosensor design for the detection of pathogenic microorganisms was carried out. Disposable pen tip electrodes (PGE) were used as sensor surfaces and these sensor surfaces were enriched with Graphene Oxide (GO) nanomaterials. In the designed nanogenosensor, 22 base length gene region of Escherichia coli (E. coli) bacteria were used as model microorganism. The model pathogenic microorganism E. coli was studied with both synthetic sequences and real samples.
A nanomaterial called Graphene Oxide (GO) is used to improve sensibility and selectivity of the genosensor. Graphene is a two-dimensional nanomaterial consisting of honeycomb braided structures that hybridize to sp² of carbon atoms. Graphene Oxide (GO) is a graphene derivative obtained by oxidation of graphite. Since graphene oxide has different oxygen groups in its structure, it provides better bonding with other molecules. For this purpose, Graphene Oxide modification was performed by applying carbodimide chemistry to sensor surfaces for better bonding of Graphene Oxide to the surface. The GO coated sensor surfaces were covalently immobilized with the E. coli probe sequence, hybridizing with the E. coli target sequence and the Mycobacterium tuberculosis sequence with all bases different from the target sequence. Interactions on the sensor surface were analyzed by Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) method in the presence of 5mM [Fe (CN) 6] 3- / 4-.
The selectivity and optimization conditions of all nanogenosensors were obtained with synthetic sequences. Studies have been conducted to determine the optimal hybridization conditions (probe and target concentration, hybridization buffer, wash buffer, etc.). After the optimization conditions were obtained, PCR products (real samples) were used. The study continued with verification of nanogenosensor that is designed under optimum conditions.
A faster, easier and more cost-effective nanogenosensor design was performed compared to other methods used in the diagnosis of hereditary and infectious diseases. These nanogenosensors, which increase their surface areas and sensitivity, have been found to be the basis of microchip technologies with their applicability to clinical diagnosis and a single-use system.