Arabidopsis thaliana'da tuz ön uygulaması ile bor tolerans kazanımında antosiyaninin çoklu fonksiyonel rollerinin araştırılması
Investigation of multiple functional roles of anthocyanin in boron tolerance acquisition by salt pre-treatment of Arabidopsis thaliana
Yazar: EFE DALLI
Danışman: PROF. DR. YASEMİN EKMEKÇİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Botanik = Botany
Dizin: Antioksidan enzimler = Antioxidant enzymes ; Antosiyaninler = Anthocyanins ; Arabidopsis thaliana = Arabidopsis thaliana ; Bor toksisitesi = Boron toxicity ; Fotosentetik parametreler = Photosynthetic parameters ; Gen ifadesi = Gene expression ; Tolerans = Tolerance ; Ön uygulama = Pre-application

Özet:
Bu tez kapsamında model bitki Arabidopsis thaliana'da tuz ön uygulaması ile bor tolerans kazanımının 1) bazı fizyolojik, fotokimyasal ve antioksidan enzim aktiviteleri ve 2) çoklu fonksiyonlara sahip antosiyaninin sentez yolağında yer alan bazı genlerin ifade değişimleri araştırılarak, aydınlatılması amaçlanmıştır.

Arabidopsis tohumları MS besiyeri ortamı içeren petri kapları içerisinde 3 gün +4°C'de karanlık koşullarda stratifikasyon işlemine tabi tutulduktan sonra çimlenen bitkiler kontrollü iklim kabininde (22± 1 °C sıcaklık, 16/8 fotoperiyot, 200 µmol.m-2s-1 ışık şiddeti ve %50-60 nem koşullarında) 12 gün boyunca yetiştirilmiştir. Ardından ön uygulama grupları 3 gün boyunca NaCl tipi tuz içeren besiyerlerine aktarılmış, 3 günün sonunda ön uygulamasız gruplar ile beraber farklı bor konsantrasyonları içeren (3 ve 5 mM H3BO3) petri kaplarına transfer edilerek 7 gün süre ile bor toksisitesine maruz bırakılmışlardır.

Arabidopsis bitkisinde bor birikimine bağlı olarak, sürgün biyokütlesi ve yaprak yüzey alanı azalmıştır. Bunun yanı sıra, bor toksistesi, Arabidopsis bitkilerinin sürgününde bor birikimi ile birlikte Cl- alımının artmasına, K+ alımının ise azalmasına neden olmuştur. Yapraklara taşınan borun toksik seviyeleri, fotosentetik aparatları ve fotosentetik aktiviteyi olumsuz etkilemiştir. Bor toksisitesi, tilakoid membranlardaki fluoreans geçişlerinde (Kaustky eğrisi), spesifik (ABS/RC, TRO/RC, ETO/RC, DIO/RC, RE/RC) ve fenomenolojik (ABS/CS, TRO/CSO, ETO/CSO, DIO/CSO) enerji akışlarında, kuantum veriminde (EO), PSII'nin donör (VK/VJ) ve PSI'in akseptor (ΔVIP) kısımlarının etkinliğinde değişimlere yol açmıştır. Bu değişimler fotosentetik performans (PIABS / PITOP)  bileşenlerinde de önemli düzeyde azalmalara sebep olmuştur. Bor toksisitesi altındaki bitkilerin fotokimyasal etkinliğindeki azalışın,  aktif reaksiyon merkezindeki azalış ve enerjinin ısı şeklinde kaybındaki artış ile ilişkili olduğunu ortaya konulmuştur. Ayrıca B toksisitesinin her iki fotosistemi de olumsuz etkilediği ve PSI 'in PSII'ye göre daha fazla etkilendiği belirlenmiştir. Model bitkide bor toksisitesinin neden olduğu bu olumsuz etkilenmenin membran bütünlüğü ile anten ve aktif reaksiyon merkezlerindeki pigment miktarlarını etkilese de bu etkinin, fotosistemlerin işlevselliklerini durduracak düzeyde olmadığı ve tuz ön uygulaması ile hafifletilebildiği belirlenmiştir. Bu bulgular MDA sonuçları ve biyokütledeki değişim ile de uyumludur.

Arabidopsis bitkisi, tuz ön uygulaması ile antioksidan enzim aktivitelerinde ve fenolik bileşikler (antosiyanin ve flavonoid) içeriğindeki artışlar ile koruyucu savunma sistemlerini düzenleyerek bor toksisitesine karşı tolerans kazanmıştır. Toksik bor seviyelerinde antioksidan enzimlerden  özellikle POD aktivitesinin belirgin ve tutarlı bir şekildeki artışı, oksidatif hasar sonucu oluşan H2O2 detoksifikasyonunda etkin rol aldığını göstermektedir. Bunun yanısıra askorbat-glutatyon yolunda yer alan APX ve GR ile GST aktivitelerindeki artışlar, hasarlara karşı bitkiyi korumada rol almışlardır. Tüm bu enzimlerin aktiviteleri tuz ön uygulamalı gruplarda daha yüksek çıkmıştır.

Antosiyaninin savunmadaki çoklu fonksiyonları, antosiyanin sentezinde görev alan bazı genlerin ve transkripsiyon faktörlerindeki ifade değişimleri incelenmiştir.  Transkripsiyon faktörlerinden olan MYB75, MYB114 ve MYBD ifadelerinde toksisite altında artış görülmüştür. Sentez yolağında görev alan PAL2, 4CL3, C4H genlerinin ifadesi artmış olup, ANS geninde herhangi bir fark görülmemiştir.  GSH1 ve GST26 genlerindeki ifade artışı, antosiyanin-GSH ve/veya GST-antosiyanin kompleksleri oluşturarak ve bor elementini bağlayarak, oksidatif hasara karşı korumada rol almış olabileceğini gösterir.
 
Tuz ön uygulamasının bitkilerin savunma sistemini yıkıcı toksisiteyle karşılaşmadan önce uyarıyor ve yüksek konsantrasyonda bor ile karşılaştığında bu duruma tolerans kazanımı sağladığı ortaya konulmuştur. Bunun yanında antosiyanin sentez yolağında yer alan ve antosiyaninle ilişkili genlerdeki artan ifade miktarları bu sistemin savunmada önemli bir rol aldığını göstermektedir.

Abstract:
In the scope of this thesis, it is aimed to elucidate the acquisition of boron tolerance by salt pretreatment in the model plant Arabidopsis thaliana by investigating 1) some physiological, photochemical and antioxidant enzyme activities and 2) the changes in some genes expression involved in the synthesis pathway of anthocyanin which has multiple functions. 

After Arabidopsis seeds were subjected to stratification in petri dishes containing MS medium for 3 days at +4°C in dark conditions, the germinated plants were grown in a controlled growth chamber (22± 1°C temperature, 16/8 photoperiod, µmol.m-2s-1 light intensity and 50-60% humidity) for 12 days. Then, the pre-treatment groups were transferred to media containing NaCl-type salt for 3 days, and at the end of 3 days, they were transferred to petri dishes containing different boron concentrations (3 and 5 mM H3BO3) together with the groups without pre-treatment and exposed to boron toxicity for 7 days. 

Due to boron accumulation in Arabidopsis plant, shoot biomass and leaf area decreased. In addition to this, boron toxicity caused an increase in Cl- uptake and a decrease in K+ uptake with boron accumulation in shoots of Arabidopsis plants. Toxic levels of boron transported to leaves adversely affected photosynthetic apparatus and photosynthetic activity. Boron toxicity led to changes in fluorescence transitions (Kaustky curve), specific (ABS/RC, TRO/RC, ETO/RC, DIO/RC, RE/RC) and phenomenological (ABS/CS, TRO/CSO, ETO/CSO, DIO/CSO) energy flows in thylakoid membranes, quantum yield (ϕEO), the efficiencies of the donor side(VK/VJ) of PSII and the acceptor (ΔVIP) side of PSI. These changes caused significant reductions in photosynthetic performance (PIABS / PITOP) and components. It has been revealed that the decrease in the photochemical efficiency of plants under boron toxicity is associated with the decrease in the active reaction center and the increase in the loss of energy in the form of heat. In addition, it was determined that B toxicity affects both photosystems negatively and PSI is affected more than PSII. Although this negative effect caused by boron toxicity in the model plant affected the membrane integrity and the amounts of pigments in the antenna and active reaction centers, it has been determined that this effect was not at a level to cease the functionality of the photosystems and could be alleviated with salt pre-treatment. These findings are also consistent with the MDA results and the change in biomass.

Arabidopsis plant gained tolerance against boron toxicity by regulating its protective defense systems with the increases in antioxidant enzymes activities and the content of phenolic compounds (anthocyanin and flavonoid) with salt pretreatment. The significant and coherent increase in the activity of antioxidant enzymes, especially POD, at toxic boron levels has showed that it plays an active role in the detoxification of H2O2 resulting from oxidative damage. Besides, increases in the activities of APX, GR and GST, which are involved in the ascorbate-glutathione pathway, have been involved in protecting the plant against damages. The activities of all these enzymes were higher in salt pre-treated groups. 

Multiple functions of anthocyanin in defense, the changes in expression of some genes and transcription factors involved in anthocyanin synthesis were investigated. Expressions of MYB75, MYB114 and MYBD, which are transcription factors, increased under toxicity. Expression of PAL2, 4CL3, C4H genes involved in the synthesis pathway increased, but no difference was observed in the ANS gene. The increase of expression of GSH1 and GST26 genes might have played a role in protection against oxidative damage by forming anthocyanin-GSH and/or GST-anthocyanin complexes and binding the boron element.

It has been exhibited that salt pre-treatment has been inducing the defense system of plants before they encounter destructive toxicity and, it provides tolerance to this situation when it encounters high concentrations of boron. In addition, the increased expression amounts in anthocyanin-related genes which are involved in the anthocyanin synthesis pathway show that this system plays an important role in defense.