Adli kimliklendirmede kullanılmak üzere 19 lokuslu STR (Short Tandem Repeat) paneli geliştirilmesi ve validasyonu
Development and validation of a 19-Loci STR (Short Tandem Repeat) panel for forensic identification
Yazar: HANDE TAŞKIN
Danışman: DOÇ. DR. GÖNÜL FİLOĞLU TÜFEK
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine

Özet:
Günümüz adli kimliklendirme çalışmalarında, DNA'nın (Deoksiribonükleik Asit) kodlamayan bölgelerinde (intron bölgeleri) yer alan kısa ardışık tekrar dizileri (Short Tandem Repeats veya STR) kullanılmaktadır. STR lokusları, insan genomu boyunca dağılmış olarak bulunan ve 2-7 baz çifti uzunluğunda kısa ardışık tekrar eden DNA dizileridir. Bu lokuslardaki tekrarlanan ünite sayılarında varyasyonun çok yüksek olması ve kişiden kişiye farklılık göstermesinden dolayı birçok genetik çalışmasında markır olarak kullanılmaktadır. Gelişen teknolojiler sayesinde adli kimliklendirme analizlerinde, yüksek ayrım gücünün önemi ortaya çıkmaktadır. Olay yerinden elde edilen biyolojik örnekler, farklı çevre koşullarına maruz kalabilir ve farklı kişilere ait karışım örneklerinden de oluşabilirler. Bu durumda dışlama gücü ve ayrım gücü yüksek sistemlerin kullanılması önemlidir. Güvenilir, hızlı ve yüksek ayrım gücüne sahip STR sistemleri tüm dünyada yaygın bir şekilde kullanılarak adli bilimler alanında ortak bir dil oluşturmaktadır. Ticari STR kitlerinin hızlı sonuç vermesi adına atılan en büyük adım, multipleks sistem kurularak farklı lokusların tek bir reaksiyonda amplifiye edilmesine imkân tanımasıdır. Günümüzde CODIS (Combined DNA Index Systems)'de yer alan ve ayırt etme gücü oldukça yüksek olan polimorfik STR markırları kullanılarak çeşitli multipleks paneller hazırlanmıştır. Olay yerinden gelen karışım örneklerinde kimliklendirme sırasında karşılaşılan en büyük problem ise çoğu panelde Y-STR lokusunun bulunmamasıdır. Bu problemin önüne geçebilmek için karışım örneklerinde, otozomal STR markırlarına ek olarak Y-STR ve Y-InDel (insersiyon/delesyon) markırlarının incelenmesiyle DNA profillemesi yapılmaktadır. Bu tez çalışmasında, DNA kimliklendirmesine yönelik 20 lokustan oluşan (20pleks) bir STR panelinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Multipleks STR paneli içerisinde; ticari kitlerde yaygın olarak kullanılan 15 STR markırı (D8S1179, THO1, D21S11, TPOX, D7S820, vWA, D13S317, D3S1358, D19S433, D18S51, D2S1338, D16S539, D5S818, CSF1PO, FGA), cinsiyet markırı olan Amelogenine ek olarak 3 adet Y-STR markırı (DYS391, DYS570, DYS576) ve 1 Y-InDel (rs16664 kodlu) markırı kullanılmıştır. Belirlenen her bir markıra özgü primerler tasarlanmıştır. DYS570 lokusuna ait primer (AttoRho13 boya işaretli), tekli lokus çalışmalarında başarılı bir şekilde amplifiye edilmesine rağmen multipleks çalışmada pik elde edilemediği için panelden çıkarılmıştır. Optimizasyon çalışmalarına 15 otozomal STR markırı, Amelogenin markırı, 2 adet Y-STR markırı (DYS391, DYS576) ve 1 Y-InDel (rs16664 kodlu) markırı dahil edilerek toplamda 18 STR lokusu ve 1 Y-InDel ile devam edilmiştir. Her bir primerin tekli ve multipleks çalışmaları ile panelin optimizasyonu yapılmıştır.  Optimizasyon çalışmalarının ardından analiz eşik değeri (limit of detection), dinamik alan (lineer çalışma alanı), duyarlılık (limit of quantification), stokastik eşik ve karışım çalışmalarından elde edilen sonuçlar değerlendirilerek panelin validasyonu gerçekleştirilmiştir. Multipleks STR panelinin optimizasyon ve validasyon çalışmaları tamamlanarak adli kimliklendirme amacı ile kullanılabilecek bir ürün ortaya çıkarılmıştır. Çalışmalar sonucunda multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) optimum bağlanma sıcaklığı (Tm) 60°C olarak saptanmıştır. Multipleks STR paneli ile tam profilin elde edilebildiği en az DNA konsantrasyonu 0,125 ng/μl olarak belirlenmiştir. Karışım örneklerinde ise minimum 1:5 oranındaki kadın-erkek örneklerde DNA profillendirme yapılabileceği tespit edilmiştir. Sonuç olarak, ayrım gücü yüksek, otozomal ve Y kromozomuna özgü STR markırlarının kombinlenmesine olanak sağlayan bir STR paneli geliştirilmiştir. Böylece hızlı, güvenilir ve düşük maliyetli olarak üretilebilen multipleks STR paneli, ülkemizde rutin kimliklendirme yapan laboratuvarlarda kullanılabilecek bir STR paneli oluşturulmuştur.

Abstract:
In today's forensic identification studies, Short Tandem Repeat (STR) sequences located in non-coding gene regions (intronic regions) of DNA are used. STR loci are short tandem repeating DNA sequences of 2-7 base pairs distributed throughout the human genome. Due to the very high variation in the number of repeated units in these loci, they differ a lot from person to person, therefore these STR loci are used as markers in many genetic studies. Owing to the developing technologies, the importance of high discrimination power emerges in forensic identification analysis. Biological samples obtained from the crime scene may be exposed to different environmental conditions and may consist of a mixture belonging to samples from different people. In this case, it is very important to use DNA-based systems with high exclusion power and discrimination power. Reliable, fast and highly discriminative STR systems are widely used all over the world, forming a common language in the field of forensic sciences. The most crucial step for commercial STR kits to provide fast results is to allow different loci to be amplified in a single reaction by utilizing a multiplex system. Today, various multiplex panels have been prepared using polymorphic STR markers that are included in CODIS (Combined DNA Index Systems) and they have a very high discrimination power. The biggest problem in the identification of mixed samples from the crime scene, is the absence Y-STR locus in most of the panels. In order to avoid this problem, DNA profiling in mixed samples is performed by analyzing the Y-STR and Y-InDel (insertion/deletion) markers in addition to the autosomal STR markers. The aim of this thesis study is to develop a 20-plex STR panel for DNA identification. This multiplex STR panel consists of 15 STR markers that are widely used in commercial kits (D8S1179, THO1, D21S11, TPOX, D7S820, vWA, D13S317, D3S1358, D19S433, D18S51, D2S1338, 16S539, D5S818, CSF1PO, FGA), Amelogenin as gender marker, 3 Y-STR markers (DYS391, DYS570, DYS576) and Y-InDel (coded as rs16664) marker. Specific primers were designed for each identified marker. The primary of DYS570 locus (marked with AttoRho13 dye) was removed from the panel because although it was successfully amplified in single locus studies, the peak of locus could not be amplified in multiplex studies. Optimization studies were continued with 18 STR loci and 1 Y-InDel in total by including 15 autosomal STR markers, Amelogenin markers, 2 Y-STR markers (DYS391, DYS576) and 1 Y-InDel marker (coded rs16664). The panel was optimized by singleplex and multiplex studies of each primer. Following the optimization studies, various parameters were evaluated such as the analysis threshold value (limit of detection), dynamic range (linear working range), sensitivity (limit of quantification), stochastic threshold and mixture studies. Thus, the validation of the panel was accomplished. Optimization and validation studies of the multiplex STR panel have been completed and a product that can be used for forensic identification has been developed. As a result of the studies, the optimum annealing temperature (Tm) of the multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction) was determined as 60°C. The minimum DNA concentration at which the complete profile could be obtained with the multiplex STR panel was determined as 0.125 ng/μl. In mixed samples, it was determined that DNA profiling could be performed with a minimum ratio of 1:5. As a result, this newly developed STR panel enables the combination of markers with high discrimination power and STR markers specific to the Y chromosome. Thus, the multiplex STR panel, which is fast, reliable and cost-efficient, can be used in our country for routine identification analyses in the laboratories.