Hedeflendirilmiş ve antibakteriyel nanosistemlerin üretimi ve biyolojik aktivitesinin değerlendirilmesi
Production of targeted and antibacterial nanosystems and evaluation of their biological activity
Yazar: İREM ÇOKSU
Danışman: PROF. DR. SERAP DERMAN
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Antibakteriyel aktivite = Antibacterial activity ; Antimikrobiyal peptidler = Antimicrobial peptides ; Konjugasyon = Conjugation ; Nanopartiküller = Nanoparticles

Özet:
Doğal antibiyotikler olarak da bilinen katyonik özellikli antimikrobiyal peptidler (AMP), seçici amino asit sekansları yardımıyla negatif yüklü bakteriyel hücre yüzeyi ile etkileşime girebilmekte ve böylece ilaca dirençli hale gelmiş bakteriler de dahil olmak üzere geniş spektrumda etki gösterebilmektedir. Bu antimikrobiyal ajanların nanopartiküller (NP) ile entegrasyonu sonucu sağlanabilecek kontrollü salım ile plazma konsantrasyonu istenilen aralıkta (terapötik pencere) sabit tutulabilir, formülasyonun yüzey modifikasyonu ile istenilen doku, organ ya da organizmaya hedeflendirilmesi sağlanabilir, sistemik toksisitesi azaltılabilir, hücre içine alım oranı artırılabilir ve çoklu ilaç dirençliliğinin önüne geçilebilir. Bu kapsamda antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu bilinen HF-18 peptidi literatürde ilk kez PLGA (poli laktik-ko-glikolik asit) NP'lerine ikili emülsiyon çözücü buharlaştırma yöntemi ile enkapsüle edilmiştir. Üretilen NP'lerin S. aureus ve metisiline dirençli S. aureus bakteri hücrelerine yönlendirilebilmesi için yüzeyine literatürde daha önce hedefleyici ajan olarak kullanılmamış Peptid 6.2 (P6.2) peptidi iyi bilinen 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorid (EDC) çapraz bağlayıcısı ile konjuge edilmiştir. Üretilen NP'lerin reaksiyon verimi gravimetrik yöntem ile, enkapsülasyon etkinliği ve peptid yükleme kapasitesi LC-ESI-MS kullanılarak indirekt yöntem ile hesaplanmıştır. NP'lerin ortalama boyutu ve polidispersite indisi (PDI) dinamik ışık saçılması (DLS) yöntemi ile, zeta potansiyel değeri ise elektroforetik ışık saçılması (ELS) yöntemi ile belirlenmiştir. Sentezlenen NP'lerin Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) ile elde edilen spektrumları kullanılarak enkapsülasyonun ve biyokonjugasyonun gerçekleşip gerçekleşmediği incelenmiştir. NP'lerin yüzey morfolojisi atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ve taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ile analiz edilmiştir. NP'lerden HF-18 peptidinin in-vitro salımı ise dissolüsyon metodu ile değerlendirilmiştir. Üretilen P6.2 peptidi ile hedeflendirilmiş HF-18 peptidi yüklü PLGA NP'lerin Escherichia coli, Staphylococcus aureus ve metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) üzerindeki antibakteriyel aktiviteleri broth mikrodilüsyon yöntemi kullanılarak in-vitro olarak incelenmiştir. Serbest peptidlerin (HF-18 ve P6.2) ve üretilen NP'lerin fare fibroblast (L929) hücre hatları üzerindeki canlılığına etkisi MTT (3-(4,5 dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür) yöntemi ile belirlenmiştir. P6.2 peptidi ile hedeflendirilen NP'lerin bakteri hücrelerini seçici hedeflediğini göstermek için konfokal mikroskobu kullanılmıştır.

Abstract:
Cationic antimicrobial peptides (AMP), also known as natural antibiotics, can interact with the negatively charged bacterial cell surface with the help of selective amino acid sequences, and thus, they can act in a wide spectrum, including bacteria that have become drug resistant. Thanks to the controlled release that can be achieved because of the integration of these antimicrobial agents with nanoparticles (NP), the plasma concentration can be kept constant within the desired range (therapeutic window), the formulation can be targeted to the desired tissue, organ or organism by surface modification, its systemic toxicity can be reduced, the rate of uptake into the cell can be increased and multidrug resistance can be prevented. In this context, HF-18 peptide, which is known to have antibacterial activity, was encapsulated in PLGA (poly lactic-co-glycolic acid) NPs in the literature for the first time by double emulsion solvent evaporation method. To direct the produced NPs to S. aureus and methicillin-resistant S. aureus bacterial cells, Peptide 6.2 (P6.2) peptide, which has not been used as a targeting agent in the literature before, was conjugated with the well-known 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) crosslinker. The reaction efficiency of the produced NPs was calculated by gravimetric method, encapsulation efficiency and peptide loading capacity were calculated by indirect method using LC-ESI-MS. Average size and polydispersity index (PDI) of NPs were determined by dynamic light scattering (DLS) method, and zeta potential value was determined by electrophoretic light scattering (ELS) method. By using the spectra obtained by FT-IR of the synthesized NPs, it was investigated whether encapsulation and bioconjugation took place. The surface morphology of the NPs was analyzed by atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM). In-vitro release of HF-18 peptide from NPs was evaluated by the dissolution method. Antibacterial activities of HF-18 peptide-loaded PLGA NPs targeted with P6.2 peptide on Escherichia coli, Staphylococcus aureus and methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) were investigated in-vitro using broth microdilution. The effect of free peptides (HF-18 and P6.2) and produced NPs on the viability of mouse fibroblast (L929) cell lines determined by MTT (3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) method. Confocal microscopy was used to demonstrate that NPs targeted with the P6.2 peptide selectively target bacterial cells.