İmidazol grubu antifungal ilaçların kromatografik davranışlarının ve bozunma ürünlerinin RPLC yöntemiyle belirlenmesi
Determination of chromatographic behaviour and degradation products of imidazoles from antifungal agents by using RPLC method
Yazar: ZEHRA ÜSTÜN
Danışman: DOÇ. DR. EBRU ÇUBUK DEMİRALAY
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Alkali hidroliz = Akaline hydrolysis ; Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Asidik hidroliz = Acidic hydrolysis ; Fotobozunma = Photodegradation ; Kimyasal oksidasyon = Chemical oxidation ; Termal parçalanma = Thermal degradation ; Ters faz kromatografisi = Reverse phase chromatography

Özet:
Heterosiklik kimyada benzersiz bir yere sahip olan imidazoller ve türevleri son yıllarda kimya ve farmakolojide çok yönlü özelliklerinden dolayı büyük ilgi görmüşlerdir. İmidazol bileşikleri birçok alanda önemli rol oynamakta olup aynı zamanda birçok ilacın yapısında bulunmaktadır. Bu grubu içeren ilaçlar antifungal, antimikrobiyal, antiinflamatuar, antikanser, antiviral, antidiyabetik vb. gibi birçok durumda terapötik bir etkiye sahiptir.Bu özellikleri nedeniyle, imidazol içeren ilaçların tüm klinik, farmakokinetik ve kimyasal çalışmaları, ilaç araştırmaları ve keşiflerinde son derece önem teşkil etmektedir. 

Protonasyon sabiti (pKa) değeri, bazik bir bileşiğin pH'a göre iyonlaşma durumunu tahmin etmek için kullanılan anahtar bir parametredir. Bu parametrenin bilinmesi ilaçların ADMET özelliklerinin belirlenmesinde oldukça önemlidir çünkü özellikle emilim ve dağılım bileşiğin iyonlaşmasından büyük ölçüde etkilenir. Bu tez, altı adet imidazol grubu içeren ilaçların (klimbazol, lanokonazol, bifonazol, butokonazol, oksikonazol ve sertakonazol) alıkonma davranışları üzerine çözünenin iyonlaşma etkisini incelemekte ve asetonitril yüzdesi 35, 40, 45, 50 ve 55% (v/v) olan asetonitril-su karışımlarındaki kromatografik verileri kullanarak bileşiklerin pKa değerlerini belirlemektedir. Bunu yaparken, pH değerleri aktivite katsayıları dikkate alınarak su yerine mobil faz olarak kullanılan hidroorganik karışımda ölçülmüştür. Suda çözünürlüğü az olan bu ilaçların, RPLC yöntemi ile asetonitril-su ikili karışımlarında elde edilen pKa değerlerinden yararlanarak sudaki pKa değerlerinin tahmin edilmesinde üç farklı yaklaşım kullanılmıştır. Ekstrapole edilen sonuçların Chemicalize programı ile hesaplanan pKa değerleri ile uyum içinde olduğu görülmüştür.

Tüm kromatografik ayırmalar 25°C'de, Pinnacle DB Cyano (5 µm, 250 x 4,6 mm) kolonda gerçekleştirilmiştir. Mobil fazın akış hızı ve çalışılan dalga boyu ise sırasıyla1 mL/dakika ve 202 nm olarak belirlenmiştir. Ayrıca, su-asetonitril karışımı mobil fazların pH'sı ve alıkonma faktörü arasındaki ilişki kullanılarak optimum ayırma koşulu belirlenmiştir. Bu ilişki incelendiğinde optimum ayırma koşulu pH'sı 7 olan (%45:55, v/v) asetonitril-su karışımı olarak belirlenmiştir. Geliştirilen metodun belirlenen referans değerlere uygunluğunun ölçülebilmesi için sistem uygunluk testleri yapılmış ve sonuçlar yeterli bulunmuştur. Geliştirilen RPLC yönteminin validasyonu doğrusallık, seçicilik, doğruluk, kesinlik ve geri kazanım parametreleri kullanılarak yapılmıştır. Her bir bileşik için doğrusal derişim aralıkları belirlenmiş ve korelasyon katsayıları 0,998'den büyük olacak şekilde bulunmuştur. Çalışılan bileşikler için LOD ve LOQ değerleri hesaplanmış ve bu şekilde metodun hassasiyetinin ve seçiciliğinin de yeterli olduğu görülmüştür. Gün içi ve günler arası çalışmalar sonucunda %RSD değerleri hesaplanmış ve her bir çalışma için %RSD değeri 1'in altında bulunmuştur. Bileşikler için geri kazanım deneyleri gerçekleştirilmiş ve geri kazanım yüzdeleri hesaplanarak metodun doğruluğu belirlenmiştir. Belirlenen bu optimum ayırma koşulunda bileşiklerin topikal kremde, ticari şampuanda ve insan idrarında kantitasyonları gerçekleştirilmiştir.
Zorlanmış bozunma deneyleri, ilaçların kararlılılığın belirlenebilmesi ve ilaçların bozunma davranışlarının anlaşılabilmesi amacıyla ilaç geliştirme çalışmalarında kullanılan bir yöntemdir. Bu çalışmada ilaçların çeşitli stres koşulları altındaki (hidrolitik, oksidatif, fotolitik ve termal) bozunmalarının belirlenebilmesi için basit, spesifik ve doğru bir RPLC yöntemi geliştirilmiştir. Bileşikler, oda sıcaklığında asit (0,1 M HCl) ve alkali (0,1 M NaOH) hidrolitik koşulların yanı sıra oksidatif bozunmaya (%3 (v/v) H2O2) tabi tutulmuştur. Buna ek olarak, fotolitik koşulda bileşikler 365 nm UV ışığında, benzer şekilde termal çalışmalarda ise iki farklı sıcaklığa (60°C ve 80°C) maruz bırakılmıştır. Çeşitli stres koşulları altında oluşan tüm bozunma ürünlerinin RPLC ile ayrımı Pinnacle DB Cyano kolon kullanılarak pH'sı 7 olan asetonitril-su ikili karışımında (%45:55, v/v) gerçekleştirilmiştir. Bütün stres koşulları altında bileşiklerde meydana gelen maksimum bozunmanın oksidatif koşulda meydana geldiği bozunma yüzdelerinin hesaplanması ile belirlenmiştir. Bu bileşiklere ait yapılmış çok az çalışma olduğundan bu tezin sonuçları literatüre önemli katkı sağlayacaktır.

Abstract:
Imidazoles have occupied a unique position in heterocylic chemistry and its derivatives have attracted considerable interests in recent years for their versatile properties in chemistry and pharmacology. Drugs containing this group and its derivatives have a therapeutic effect in many cases such as antifungal, antimicrobial, antiinflammatory, anticancer, antiviral, antidiabetic etc. Due to these properties, all clinic, pharmacokinetic and chemical studies of imidazole-containing drugs are extremely important in drug research and discovery. 

The protonation constant (pKa) value is a key parameter to predict the ionization state of a basic compound with respect to pH. Knowledge of this parameter is essential in the estimation of ADMET properties since absorption and distribution are highly affected by the ionization of the compound. This thesis examines the effect of solute ionization on the retention behaviour of imidazole group containing drugs (climbazole, lanoconazole, bifonazole, butoconazole, oxiconazole and sertaconazole) and evaluates their pKa values using chromatographic data in acetonitrile-water mixtures with acetonitrile percentages of 35, 40, 45, 50 and 55% (v/v). In doing so, the pH values were measured in the hydroorganic mixture, which was used as the mobile phase, instead of in water, taking into account the effect of activity coefficients. Three different approaches were evaluated and used to estimate the aqueous pKa values of studied drugs sparingly soluble in water from their pKa values in acetonitrile-water binary mixtures obtained by reversed phase liquid chromatography (RPLC). The extrapolated results are in good agreement with pKa values calculated by Chemicalize program. 

All chromatographic separations were carried out on a Pinnacle DB Cyano (5 µm, 250 x 4.6 mm) column at 25oC. The flow rate of mobile phase and detection wavelength were 1 mL/min and 202 nm, respectively. Optimum separation conditions were determined using the relationship between retention factors and pH of the water-acetonitrile mobile phases. The optimum assay conditions were acetonitrile-water binary mixture (45:55, v/v) and pH 7.0 as the mobile phase. System suitability tests were conducted to determine the suitability of the developed method conditions to the reference values and the results were found to be satisfactory. The validation of the developed RPLC method was performed using linearity, selectivity, accuracy, precision and recovery parameters. Linear concentration ranges were determined for each compounds and the correlation coefficients were found to be greater than 0.998. LOD and LOQ values were calculated for studied drugs and the sensitivity and selectivity of the method were found to be sufficient. As a result of the intra-day and inter-day precision studies, RSD% values were calculated and it was observed that each RSD% value were less than 1. The recovery studies of the compounds were carried out and the percentages of recovery values were calculated then accuracy of the method was found sufficient. Quantification of the compounds were carried out in the topical cream, commercial shampoo and human urine at the determined optimum condition. 

Forced degradation is a used routinely in pharmaceutical development in order to develop stability-indicating methods that lead to quality stability data and to understand the degradation pathways of the drug substances and drug products. In the forced degradation study, simple, specific and accurate RPLC method was developed in order to study decomposition of studied drugs under the various stress conditions (hydrolytic, oxidative, thermal and photolytic). Compounds were subjected to acid (0.1 M HCl) and alkaline (0.1 M NaOH) hydrolytic conditions as well as to oxidative decomposition (3% (v/v) H2O2) at room temperature. In addition, in photolytic studies, the compounds were exposed to 365 nm UV light, similarly in thermal studies the compounds were exposed to two different temperatures (60oC and 80oC).The RPLC method that could separate all degradation products formed under various stress conditions involved a Pinnacle DB Cyano column and a mobile phase comprising of acetonitrile-water binary mixture (45:55%, v/v) at pH 7.0.In all the stress conditions applied to the compounds, the maximum degradation was determined by the calculated percentage of degradation values that occur in the oxidative condition. Since there are very little studies conducted on these compounds the results of the this thesis will contribute significantly to the literature.