Şurup örneğindeki etken ve katkı madde analizi ve validasyonu
Analysis and validation of active and ingredients in syrup sample
Yazar: ÖZGE HACIMUSTAFA
Danışman: PROF. DR. BÜRGE AŞÇI
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada HPLC cihazı gradient akışta kullanılarak, şurup preparatlarında etken madde olan gliserol guaiakolat (guafenesin) ve psödoefedrin ile katkı maddeleri olan metil 4-hidroksibenzoat (metil paraben), propil 4-hidroksibenzoat (propil paraben), asit kırmızı 18 (ponzo 4R) ve günbatımı sarısının (sunset yellow) bir arada tayini için HPLC yöntemi geliştirildi. Bahsi geçen maddelerin kromatografik olarak birbirinden ayrışması için klasik yöntemle c18 kolonda farklı akış hızında ve farklı pH'larda olan çözücü sistemleri denendi. Spektrofotometrik dedektör kullanılarak 215 nm dalga boyunda maddelerin kromatogramları kaydedildi. Klasik yöntem ile bulunan analiz şartları deneysel tasarım ile optimize edildi. Bu optimizasyonda 4 tane faktör belirlendi. Bu faktörler pH, akış hızı, Gradient 1  ve Gradient 2 tampon oranıdır. Her bir faktörün hem bireysel hem de birbirleri ile etkileşimleri sonucunda ayırma gücüne etkileri Box-Behnken tasarımı kullanılarak 3 seviyede, 4 faktör ile incelendi. İncelenen seviyeler pH için 6-6,5-7, akış hızı için 2-2,2-2,4 ml/dakika, gradient 1 oranı için 75-80-85 % fosfat tamponu, gradient 2 oranı için 50-55-60 % fosfat tamponudur. Her Box-Behnken tasarımında yapıldığı gibi yüksek faktörler için +1, orta faktörler için 0, düşük faktörler için -1 kullanıldı. Toplamda 27 deney yapıldı. Deney sonuçlarına regresyon analizi yapılmış olup; ayırma gücüne etki eden faktörler saptandı. Sonuç güvenilirliğini sağlamak adına ANOVA testi uygulandı. Bütün elde edilen veriler ile bir model oluşturuldu. Oluşturulan modele göre kromatografik şartlar; akış hızı 2,4 mL/dakika, hareketli faz pH 6,3 fosfat tamponu/ asetonitril (0–4 dk, %85; 4-9 dakika % 60;9-10 dakika % 30 fosfat tamponu) olarak belirlendi.
Geliştirilmiş olan bu metot için analitik yöntem validasyonu yapıldı. Doğrusallık parametresi için, gliserin guaiakolat, psödoefedrin, metil 4-hidroksibenzoat, propil 4-hidroksibenzoat, asit kırmızı 18 ve günbatımı sarısı konsantrasyonları ile pik alanları arasındaki ilişki incelendi. Sonuçlara regresyon analizi yapıldığında regresyon katsayısı (R2) sırası ile 0,9999; 0,9999; 0,9979; 0,9986; 0,9983; 0,9973 olarak bulundu. Tekrarlanabilirlik parametresi için, her maddenin 3 farklı konsantrasyonda hazırlanan çözeltilerinin aynı gün içinde 3 kez ve 4 farklı günde analizi yapıldı. Gliserin guaiakolat, psödoefedrin, metil 4-hidroksibenzoat, propil 4-hidroksibenzoat, asit kırmızı 18 ve günbatımı sarısı için sırasıyla aynı gün içinde yapılan analizlerde 0,197, 1,734, 0,064; 0,317, 0,09, 0,369; 1,885, 1,952, 1,27; 1,522, 1,916, 1,322; 0,97, 1,02, 1,47;1,707, 1,695, 1,608; farklı günlerde yapılan analizlerde 0,147, 1,116, 0,052; 1,962, 1,060, 1,236; 1,639, 1,934, 1,082; 1,975, 1,504, 1,928; 1,764, 1,161, 0,639;1,960, 0,890, 1,700 % RSD değerleri elde edilmiştir. Doğruluk parametresi için, örnek çözeltisi içine gliserin guaiakolat, psödoefedrin, metil 4-hidroksibenzoat, propil 4-hidroksibenzoat, asit kırmızı 18 ve günbatımı sarısından farklı konsantrasyonlarda ilave edilerek analiz yapıldı. Sırası ile %97,47-102,47; 103,15-98,18; 101,20-97,30; 103,73-102,94; 98,00-100,67; 99,00-100,67 % geri kazanım değerleri elde edildi. Gliserin guaiakolat, psödoefedrin, metil 4-hidroksibenzoat, propil 4-hidroksibenzoat, asit kırmızı 18 ve günbatımı sarısı tanınma sınırı 0,16; 0,22; 0,08; 0,09; 0,06; 0,14 μg mL-1, tayin sınırı 0,40; 0,73; 0,27; 0,30; 0,20; 0,47 μg mL-1 olarak hesaplandı. Çözeltilerin stabilitelerini incelemek için çözeltiler su, metanol ve hareketli faz içerisinde, oda sıcaklığında ve 4Co'de belli sürelerde bekletilerek analiz edildi. Gliserin guaiakolat, psödoefedrin, asit kırmızı 18 ve günbatımı sarısının mobil faz ve suda; metil 4-hidroksibenzoat, propil 4-hidroksibenzoatın metanolde 4Co de 1 ay dayanıklı olduğu görüldü.
Optimum koşullarda analiz edildiğinde şurup örneği içeriği, 0,604-1,972 aralığında % RSD değerleri ile 101,43 mg/5mL gliserol guaiakolat, 30,16 mg/5mL psödoefedrin, 4.90 mg/5mL metil 4-hidroksibenzoat, 0,72 mg /5mL propil 4-hidroksibenzoat, 0,14 mg/5mL asit kırmızı 18 ve 0.41 mg /5mL günbatımı sarısı olarak bulundu. Analiz sonucunda bulunan etken madde miktarları ile etiket değerleri karşılaştırıldı. Gliserol guaiakolat için 101,43%, psödoefedrin için 100,53 % geri kazanım elde edildi.

Abstract:
In this thesis, a gradient HPLC method is developed for analysis active ingredients of pseudoephedrine and glycerol guaiacolate and methyl 4-hydroxybenzoate, propyl 4-hdroxybenzoate, red acid 18 and sunset yellow which are added as preservatives and colourants. Different flowrates and pHs are tested for good separation of chemicals with classical method. Chromatograms are obtained with spectrophotometric dedector at 215 nm wavelength. Also, analytical conditions observed by classical method are optimized with experimental design. In this optimization 4 different factors are specified. These factors are pH, flowrate, Gradient 1 and Gradient 2 ratios. Effects to resolution are obtained frominteractions of factors. Box-Behnken design used for examination of 4 factors for 3 levels. Examined levels are for pH 6-6.5-7, flowrate 2-2.2-2.4 ml/min, gradient 1 ratio 75-80-85, gradient 2 ratio 50-55-60 % of phosphate buffer. The values are -1 for low level, 0 for medium level and +1 for high level of the factors are used. Totally 27 experiments are done. At the end of experiments regression analysis is done with results and factors that affect to resolution are obtained. ANOVA test is performed to show the reliability. According to obtained data, a model is created. Optimum chromatographic conditions are found according to created model as flowrate 2.4 ml/min, mobile phase pH 6.3 phosphate buffer/acetonitrile (0-4 minutes 85%, 4-9 minutes 60%, 9-10 minutes 30 % phosphate buffer).
Analytical method validation is performed with optimum conditions obtained from experimental design. For linearity, interactions between concentration and peak areas of glycerol guaiacolate, pseudoephedrine, methyl 4-hydroxybenzoate, propyl 4- hdroxybenzoate, acid red 18 and sunset yellow are observed. Regression coefficints are 0,9999; 0,99987; 0,99787; 0,99863; 0,99735; 0,99829 respectively. For the repeatability parameter solutions are prepared in 3 different concentrations of each substance and method is performed 3 times within the same day and 4 times on various days. Obtained RSD values are in same day 0.197, 1.734, 0.064; 0.317, 0.09, 0.369; 1.885, 1.952, 1.27; 1.522, 1.916, 1.322; 1.707, 1.695, 1.608; 0.97, 1.02, 1.47; on various days 0.147, 1.116, 0.052; 1.962, 1.060, 1.236; 1.639, 1.934, 1.082; 1.975, 1.504, 1.928; 1.960, 0.890, 1.700; 1.764, 1.161, 0.639 respectively. For accuracy, glycerol guaiacolate, pseudoephedrine, methyl 4-hydroxybenzoate, propyl 4- hdroxybenzoate, acid red 18  and sunset yellow are added to sample solution in different concentrations and analysed. 97,47-102,47; 103,15-98,18; 101,20-99,60; 103,10-102,94; 98,00-100,67; 99,00-100,67 recovery percentages are obtained respectively. Limit of detection of glycerol guaiacolate, pseudoephedrine, methyl 4-hydroxybenzoate, propyl 4- hdroxybenzoate, acid red 18 and sunset yellow are 0,16; 0,22; 0,08; 0,09; 0,06; 0,14 μg mL-1and Limit of quantitation values are 0,4; 0,73; 0,27; 0,30; 0,20; 0,47 μg mL-1 are calculated, respectively. Finally for stability of solution study, solutions are prepared with water, methanol and mobile phase and allowed to them stay at 4˚C and room temperature. Glycerol guaiakolat, psödoefedrin, acid red 18 and sunset yellow are stable for 1 month in mobile phase and water; methyl 4-hydroxybenzoate and propyl 4- hdroxybenzoateare stable for 1 month in methanol.
101.43 mg /5 ml glycerol guaiacolate, 30.16 mg /5 ml pseudoephedrine, 4.90 mg /5 ml methyl 4-hydroxybenzoate, 0.72 mg /5 ml propyl 4-hydroxybenzoate, 0.14 mg /5 ml acid red 18 and 0.41 mg /5 ml sunset yellow are obtained from the syrup sample analysed with optimum conditions in the interval of 0.604-1.972 of RSD% .  Results that obtained from analysis are compared with label claim. There is 101.43 % recovery of glycerol guaiacolate and 100.53 % recovery of pseudoephedrine.