Ekinezya türlerinin (Echinacea pallida (Nutt) Nutt., Echinacea purpurea (L.) Moench) doku kültürü teknikleri ile çoğaltılması ve ın vıtro koşullarda sekonder metabolit içeriğinin araştırılması
Propagation of echinacea species (Echinacea pallida (Nutt) Nutt., Echinacea purpurea (L.) Moench) using tissue culture techniques and investigation of secondary metabolite content under in vitro conditions
Yazar: MÜNÜRE TANUR ERKOYUNCU
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA YORGANCILAR
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Bu çalışmada, Echinacea pallida ve Echinacea purpurea L. türlerinde kallus ve sürgün kültürlerinin oluşturulması ile hem etkili bir rejenerasyon ve mikroçoğaltım sisteminin kurulması hem de in vitro kültür koşullarının optimizasyonu ile sekonder metabolit içeriğinin artırılması amaçlanmıştır. 
Araştırmada her iki türün yaprak, yaprak sapı, kotiledon ve kök eksplantlarından farklı tip ve konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicileri içeren besin ortamlarında başarılı bir şekilde kallus uyarımı sağlanmıştır. Her eksplant tipi için en iyi kallus gelişimi; E. purpurea türünde 1.0 mg/l 2,4-D+2.0 mg/l BAP (yaprak), 1.0 mg/l NAA+0.5 mg/l TDZ (yaprak sapı), 2.0 mg/l NAA+1.0 mg/l TDZ (kotiledon), 0.5 mg/l NAA+0.5 mg/l BAP (kök) içeren ortamlarda, E. pallida türünde ise 0.2 mg/l NAA+1.0 mg/l TDZ (yaprak), 4.0 mg/l NAA+0.5 mg/l TDZ (yaprak sapı), 4.0 mg/l NAA+0.2 mg/l TDZ (kotiledon), 0.5 mg/l NAA+0.2 mg/l TDZ (kök) içeren ortamlarda sağlanmıştır. Her iki bitki türünün, dört farklı eksplant tipi, belirlenen büyüme düzenleyicilerinde 4, 6, 8 ve 10 hafta boyunca kültüre alınmış ve elde edilen kallus dokularında kaftarik asit, klorojenik asit, kafeik asit ve kikorik asit miktarları belirlenmiştir. En yüksek kaftarik asit (4.11 mg/g) ve kikorik asit (57.89 mg/g) miktarları E. purpurea L. türünün yaprak sapı eksplantlarından, klorojenik asit (8.83 mg/g) ise kök eksplantlarından 10 haftalık kültür süresi sonunda elde edilen kalluslarda tespit edilmiştir. Büyüme düzenleyicisi ve kültür süresi optimizasyonu yapılan kallus kültürlerinde, farklı azot oranlarının, farklı karbon kaynakları ve miktarlarının, farklı polietilen glikol (PEG) miktarlarının sekonder metabolit üretimi üzerine etkileri incelenmiştir. Bu uygulamalar arasında, en yüksek kaftarik asit (9.38 mg/g), klorojenik asit (0.71 mg/g), kafeik asit (0.29 mg/g) ve kikorik asit (34.77 mg/g) miktarları, 0:35 mM amonyum/nitrat oranı içeren besin ortamında 10 haftalık kültür süresi sonunda E. purpurea L. türünün kök eksplantından elde edilen kallus dokularında tespit edilmiştir. 
Mikroçoğaltım amacıyla, her iki türün nodal segmentlerinden farklı tip ve konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicisi içeren ortamlarda çoklu sürgün uyarımı başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. E. purpurea L. türünde en yüksek sürgün oluşumu farklı konsantrasyonlarda BAP ve KIN içeren ortamlarda, eksplant başına sürgün sayısı değeri ise (3.47 adet) 0.50 mg/l BAP + 0.10 mg/l NAA içeren ortamda elde edilmiştir. E. pallida türünde ise en yüksek sürgün oluşumu BAP ve BAP'ın NAA ile kombinasyonlarını içeren ortamlarda, eksplant başına sürgün sayısı ise (2.45 adet) 0.50 mg/l BAP + 0.50 mg/l NAA içeren ortamda elde edilmiştir. Her iki türde elde edilen sürgünler, kök uyarımı için farklı konsantrasyonlarda (0.5, 1.0 veya 1.5 mg/l) ve tiplerde oksin (NAA, IBA, IAA) içeren ve içermeyen besin ortamlarında kültüre alınmıştır. En yüksek köklenme oranları, E. purpurea L.'da %29, E. pallida'da ise %6 olmak üzere büyüme düzenleyicisi içermeyen ortamlarda elde edilmiştir.
Elde edilen sürgünlerde farklı tip ve konsantrasyonlardaki büyüme düzenleyicilerinin sekonder metabolit miktarlarına etkileri belirlenmiştir. E. purpurea L. türünde, en yüksek kaftarik asit (7.41 mg/g) 4.0 mg/l BAP, klorojenik asit (5.04 mg/g) 2.0 mg/l KIN, kikorik asit miktarları ise (46.27 ve 45.22 mg/g) sırasıyla 4.0 mg/l KIN+0.5 mg/l NAA ve 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA içeren ortamlardan elde edilen sürgünlerde tespit edilmiştir. E. pallida türünde ise en yüksek kaftarik asit (6.43 mg/g) 4.0 mg/l BAP+0.1 mg/l NAA, klorojenik asit (3.47 mg/g) 0.50 mg/l BAP+0.10 mg/l NAA, kikorik asit miktarı ise (24.83 mg/g) 1.0 mg/l BAP içeren ortamlarda elde edilen sürgünlerde tespit edilmiştir.
Bu tez çalışmasının sonucunda, önemli iki ekinezya türünde kallus ve sürgün kültürleri aracılığıyla etkili ve tekrarlanabilen rejenerasyon ve mikroçoğaltım protokolleri belirlenmiş olup, aynı zamanda in vitro koşullarda kafeik asit türevlerinin içeriğinin artırılmasına yönelik kültür koşullarının optimizasyonu ve farklı uygulamaların etkileri belirlenmiştir.
Anahtar Kelimeler: Ekinezya, Kafeik asit türevleri, Kallus kültürü, In vitro çoğaltım, Sekonder metabolit, Sürgün kültürü

Abstract:
In this study, it was aimed to increase the secondary metabolite content by the formation of callus and shoot cultures in Echinacea pallida and Echinacea purpurea L. species, both by establishing an effective regeneration and micropropagation system and by optimization of in vitro culture conditions.
Callus induction was achieved in media containing growth regulators of different types and concentrations from leaf, petiole, cotyledon and root explants of both species. Best callus development for each explant type; In E. purpurea species, 1.0 mg/l 2,4-D+2.0 mg/l BAP (leaf), 1.0 mg/l NAA+0.5 mg/l TDZ (petiole), 2.0 mg/l NAA+1.0 mg/l TDZ (cotyledon), 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l BAP (root) was provided in the media, while E. pallida species 0.2 mg/l NAA+1.0 mg/l TDZ (leaf), 4.0 mg/l NAA+0.5 mg/l TDZ (petiole), 4.0 mg/l NAA+0.2 mg/l TDZ (cotyledon), 0.5 mg/l NAA+0.2 mg/l TDZ (root) was provided in the media. Both plant species were cultured for 4, 6, 8 and 10 weeks in growth regulators with four different explant types and the amounts of caftaric acid, chlorogenic acid, caffeic acid and chicoric acid were determined in the callus tissues obtained. The highest amounts of caftaric acid (4.11 mg/g) and chicoric acid (57.89 mg/g) were obtained from petiole explants of E. purpurea L., the amount of chlorogenic acid (8.83 mg/g) was determined in callus obtained from root explants after 10 weeks of culture. The effects of different nitrogen ratios, different carbon sources and amounts, different amounts of polyethylene glycol (PEG) on secondary metabolite production were investigated in callus cultures with growth regulator and culture time optimized. Among these applications, the highest amounts of caftaric acid (9.38 mg/g), chlorogenic acid (0.71 mg/g), caffeic acid (0.29 mg/g) and chicoric acid (34.77 mg/g), 0:35 mM ammonium/nitrate rate of nutrient medium containing 10 weeks of culture at the end of E. purpurea L. species obtained from the root explants were determined in callus tissues.
For the purpose of micropropagation, multiple shoot induction was successfully performed in media containing growth regulators of different types and concentrations from nodal segments of both species. The highest shoot formation in E. purpurea L. species was obtained in media containing different concentrations of BAP and KIN and the number of shoots per explant (3.47) was obtained in medium containing 0.50 mg/l BAP+ 0.10 mg/l NAA. In E. pallida species, the highest shoot formation was obtained in the medium containing BAP and BAP with NAA, and the number of shoots per explant (2.45) was obtained in the medium containing 0.50 mg/l BAP + 0.50 m /l NAA. The shoots obtained from both species were cultured in media with and without auxin (NAA, IBA, IAA) in different concentrations (0.5, 1.0 or 1.5 mg/l) and types for root induction. The highest rooting rates were obtained in 29% of E. purpurea L. and 6% of E. pallida without growth regulators.
The effects of growth regulators of different types and concentrations on secondary metabolite amounts were determined in the shoots obtained. In E. purpurea L., the highest caftaric acid (7.41 mg/g) 4.0 mg/l BAP, chlorogenic acid (5.04 mg/g) 2.0 mg/l KIN, and the chicoric acid amounts (46.27 and 45.22 mg / g) were respectively, 4.0 mg/l KIN + 0.5 mg/l NAA and 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA. In E. pallida species, the highest amount of caftaric acid (6.43 mg/g) 4.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l NAA, chlorogenic acid (3.47 mg/g) 0.50 mg/l BAP+0.10 mg/l NAA and chicoric acid (24.83 mg/g) 1.0 mg/l BAP.
As a result of this thesis, effective and reproducible regeneration and micropropagation protocols were determined by using callus and shoot cultures of two important echinacea species, and the effects of different conditions and optimization of culture conditions for increasing the content of caffeic acid derivatives in vitro were determined.
Keywords: Caffeic acid derivatives, Callus culture, Echinecea, In vitro propagation, Secondary metabolites, Shoot culture