Erkek germline kök hücre-benzeri hücrelerin olgun sperme ın vitro farklılaşması ve ın vivo spermatogenez restorasyonuna etkisi
In vitro differentiation of male germline stem cell-like cells into mature sperm and their effect on in vivo spermatogenesis restoration
Yazar: DÜNYA AYDOS
Danışman: PROF. DR. KAMİL CAN AKÇALI
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre ve (Rejeneratif) Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı / Kök Hücre ve Doku Yenilenmesi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Azospermi = Azoospermia ; Germ hücreleri = Germ cells ; Kök hücre taransplantasyonu = Stem cell transplantation ; Kök hücreler = Stem cells ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells

Özet:
Germline kök hücresi (GKH), germ hattı gelişimi sırasında kendini yenileyerek veya farklı evre/alt tipte kök hücrelere dönüşerek daha fazla kök hücre üreten ve yavru oluşturmak için spermatozoa ve ovaya farklılaşan benzersiz bir hücre türüdür. Testis biyopsisinden elde edilen spermatogonyal kök hücreler (SKH)/GKH'ler veya yetişkin dokulardan elde edilen uPKH'lerden türetilen primordiyal germ hücresi-benzeri hücreler (PGHBH), Klinefelter sendromu gibi genetik hastalıklara veya başka nedenlere bağlı non-obstrüktif azoospermik yetişkin erkeklerde ve radyoterapi/kemoterapi alacak kanser teşhisi konmuş prepubertal erkek çocuklarında spermatogenez restorasyonu amacıyla otolog transplantasyon için veya in vitro spermatogenez için kullanılabilirler. Gen mutasyonları taşıyan hastaların GKH'leri veya PGHBH'leri, CRISPR/CAS9 teknolojisi kullanılarak transplantasyondan önce düzeltilebilir. Bununla birlikte, uPKH'lerin in vitro gametogenez alanına katkısı hafife alınamasa da, yeniden programlama ile ilişkili epigenetik modifikasyonlar açısından güvenliği ile ilgili kaygılar bulunmaktadır. Bu çalışmada ilk kez CD49f+ GKH'lerin GDNF, EGF, bFGF, IGF2, SCF ve mLIF varlığında pluripotensi belirteçlerinin ifadelerinde anlamlı artış ve alkalen fosfataz aktivitesi gösteren GKHBH'lere dönüşebileceğini gösterdik; özellikle, bu AP+CD49f+ GKHBH kolonileri, >%95 GATA4+ testiküler somatik hücre (TSH) besleyici tabakası üzerinde iki aydan uzun bir süre çoğaltılabildi. AP+CD49f+ GKHBH'ler, TGF-β/Aktivin/Nodal yolu inhibitörü, SB431542 ve ardından retinoik asit uygulandığında in vitro ortamda mayozu tamamladı ve kuyruk gelişimi olan sperm-benzeri hücrelere farklılaştı. SB431542 ön aşamasından sonra leptoten spermatositler gözlenmiş olsa da, retinoik asidin kombine etkisi üzerine mayozun daha ileri aşamasındaki pakiten ve diploten spermatositler ile sperm-benzeri hücrelerin bir arada bulunduğu heterojen bir popülasyon saptandı. Elde edilen sperm-benzeri hücreler, intrasitoplazmik enjeksiyondan sonra blastokist oluşumunu tetikleyebildi. GKHBH'lerin ve Sertoli hücrelerince zengin TSH'lerin germ hücre ablasyonu yapılmış fare testislerine ko-transplantasyonunun ardından, tübül başına düşen DDX4+SYCP3+ hücreler, yalnızca TSH transplante edilenlerden daha yüksekti. Sonuç olarak, TSH'ler bozulmuş nişi yeniden oluşturarak endojen spermatogenezi yeniden başlatabilirken, eksojen GKHBH'ler sağlıklı niş hücreleri varlığında başarılı bir şekilde spermatogenezi tamamlayabildi. Genel olarak yaklaşımımız, tanımlanmış kültür koşulları altında GKH'lerin fonksiyonunu ve canlılığını kaybetmeden sayıca arttırılabileceğini ve GKH-GKHBH hücre dönüştürme yöntemimizin, Oct4a, Sox2, Nanog, SSEA-1 pluripotensi belirteçlerinin ekspresyonunu upregüle edebileceğini, GKHBH'lerin in vitro olarak fonksiyonel sperm-benzeri hücrelere farklılaşabileceğini ve somatik niş hücresi desteğiyle de in vivo spermatogenezi yeniden başlatabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Germline stem cell (GSC) is a unique cell type that produces more stem cells through self-renewal or generating different stage/subtype stem cells during germline development and differentiates into spermatozoa and ova to produce offspring. Spermatogonial stem cells (SSCs)/GSCs obtained from testicular biopsy or primordial germ cell-like cells (PGCLCs) derived from iPSCs obtained from adult tissues can be used for autologous transplantation to restore spermatogenesis or for in vitro spermatogenesis in adult men with non-obstructive azoospermia due to genetic diseases such as Klinefelter syndrome or other causes, and in prepubertal boys diagnosed with cancer who will receive radiotherapy/chemotherapy. Patients carrying gene mutations can have their SSC or PGHBH corrected prior to transplantation using CRISPR/CAS9 technology. However, although the contribution of iPSCs to the field of in vitro gametogenesis cannot be underestimated, there are concerns regarding their safety in terms of epigenetic modifications associated with reprogramming. In this study, we showed for the first time that CD49f+ GSCs can transform into GSCLCs that show a significant increase in the expression of pluripotency markers and alkaline phosphatase activity in the presence of GDNF, EGF, bFGF, IGF2, SCF and mLIF; notably, those GSCLC colonies could be propagated for more than two months on >95% GATA4+ testicular somatic cell (TSC) feeders. AP+CD49f+ GKHBHs completed meiosis in vitro and differentiated into sperm-like cells with tail development when TGF-β/Activin/Nodal pathway inhibitor, SB431542 followed by retinoic acid were introduced. Although leptotene spermatocytes were observed after the SB431542 pre-treatment, upon the combined effect of retinoic acid, a heterogeneous population of pachytene and diplotene spermatocytes and sperm-like cells in more advanced meiosis were detected. The resulting sperm-like cells were able to induce blastocyst formation after intracytoplasmic injection. After co-transplantation of GSCLCs and Sertoli cell-rich TSCs into germ cell ablated mouse testes, DDX4+SYCP3+ cells per tubule were higher than those transplanted with TSCs alone. TSCs were able to restore endogenous spermatogenesis by reforming the impaired niche, whereas exogenous GSCLCs were able to undergo successful spermatogenesis in the presence of healthy niche cells. Overall, our approach suggests that under defined culture conditions, GSCs can be expanded in number without losing their function and viablity and our GSC-GSCLC conversion method can upregulate the expression of Oct4a, Sox2, Nanog, SSEA-1 pluripotency markers, GSCLCs can undergo stepwise differentiation into functional sperm-like cells in vitro and can also reinitiate spermatogenesis in vivo with somatic niche cell support.