Erişkin Tip 1 diyabetli ve sağlıklı kişilerin dışkı florasındaki bacteroıdetes ve fırmıcutes grubu bakteri miktarının konaktaki TLR2/TLR4 gen ekspresyonları üzerine etkisi
Bacteroidetes and firmicutes ratios on gut microbiota and effects of hosts TLR2 / TLR4 gene expression levels between adult TYPE 1 diabetes patients and healthy people
Yazar: MEHMET DEMİRCİ
Danışman: PROF. DR. HRİSİ BAHAR TOKMAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Tip 1 diyabet, insulin üreten pankreatik beta hücrelerine vücudun kendi immun sisteminin saldırısı ile oluşan otoimmun bir hastalıktır. Gerçek patagonezi bilinmemektedir ancak genetik ve çevresel faktörlerin hastalığın gelişmesinde önemli etkileri vardır.  Son yıllarda dışkı mikrobiyotasının diyabet gelişiminde rolü  olduğu öne sürülmekte ve yapılan çalışmalarda, sağlıklı kişilere göre tip 1 diyabetli hastaların dışkı mikrobiyotasında Bacteroidetes miktarında artış Firmicutes  miktarında ise düşüş saptandığı bildirilmektedir. Toll-like reseptorler (TLR) geniş bir alanda eksprese edilebilen transmembran proteinleridir. TLR4, Gram negatiflerin dış membranının ana komponenti olan lipopolisakkaritler (LPS) ve yağ asitleri ile uyarılır, plazma LPS seviyeleri ise  dışkı mikrobiyotası tarafından düzenlemektedir. TLR2, yine bakteriyal, fungal ve viral antijenleri tanır ve doğal immunitede makrofajları uyarır. Bunun insulin direncine karşı koruyucu etki yaptığı düşünülmektedir. Yine son yıllarda yapılan çalışmalarda TLR2 ve TLR4 gen ekspresyonlarının özellikle fare modellerinde dışkı mikrobiyotasının kompozisyonu  ile değiştiği gösterilmiştir. Çalışmamızda tip 1 diyabet tanısı almış 28 erkek ve 25 kadın toplam 53 bireyden alınan dışkı örnekleri ile  aynı yaş gruplarında sağlıklı 28 erkek ve 25 kadın olmak üzere toplam 53 bireyin dışkı örnekleri Bacteriodetes, Firmicutes, B.fragilis, L.acidophilus ve L.casei miktarları bakımından  qPZR ile kantitatif olarak incelenmiş ve  sonuçlar gruplar arasında karşılaştırılmıştır. Ayrıca hasta ve kontrol grubundaki tüm bireylerin dışkı örnekleri alındığı sırada EDTA'lı kan örnekleri de alınmış ve hücrtesel TLR2 ile TLR4'ün gen ekspresyonu düzeyleri qPZR ile kantitatif olarak incelenmiş ve sonuçlar gruplar arasında karşılaştırılmıştır.
Çalışmamıza katılan tüm T1DM'lu erkek ve kadın hastalarda saptanan Bacteroidetes ve Firmicutes miktarı, sağlıklı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, hasta grubunda Bacteroidetes miktarının  istatistiksel olarak ileri derecede yüksek olduğu, Firmicutes miktarının ise istatistiksel olarak ileri derecede düşük olduğu saptanmıştır (p<0,001, p<0,001) Ayrıca T1DM'lu erkek ve kadın hastalarda ortalama Firmicutes/Bacteroidetes oranları sağlıklı kontrollere göre çok ileri derecede düşük bulunmuştur. T1DM'lu hasta kadınların ve erkeklerin 1 gram dışkısında bulunan B.fragilis miktarının tüm kontrollerde saptanan miktarlara göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek olduğu (p<0,01), buna karşın L.acidophilus ve L.casei miktarları bakımından T1DM'lu hastalar ve sağlıklı kontroller arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadığı belirlenmiştir.(p>0,05).
T1DM'lu hasta grubunda saptanan ortalama TLR4 gen ekspresyon düzeylerinin, kontrol grubuna göre istatistiksel olarak ileri derecede yüksek, ortalama TLR2 gen ekspresyon düzeylerinin, kontrol grubuna göre istatistiksel olarak ileri derecede düşük olduğu saptanmıştır. T1DM'lu erkek ve kadın hastalarda Bacteroidetes ve Firmicutes miktarları ile yine aynı grupta saptanan TLR2 ve TLR4 gen ekspresyon düzeyleri arasındaki ilişki  incelendiğinde, Bacteroidetes düzeyinin, TLR4 gen ekspresyon düzeyi ile olan ilişkisinin çok güçlü olduğu (rs: >0,85), TLR2 gen ekspresyon düzeyi ile olan ilişkisinin ise istatistiksel olarak zayıf olduğu saptanmıştır (rs: 0,25-0,50). Firmicutes düzeyinin, TLR4 gen ekspresyon düzeyi ile olan ilişkinin zayıf (rs: 0,25-0,50), TLR2 gen ekspresyon düzeyi ile olan ilişkinin ise çok güçlü olduğu (rs: >0,85) belirlenmiştir

Abstract:
Type 1 diabetes is an autoimmune disease caused by immune systems attacks to its own pancreatic insulin producing beta cells. Real pathogenesis still unknown but genetic and environmental factors have major effects for development of the disease. At last publications, Gut Microbiota have been proposed to play important role in the development of the disease and in these studies, increased amount of Bacteroidetes, decreased amount of Firmicutes have been reported at type 1 diabetes patients. Toll-like receptors (TLR) are transmembrane proteins which can be expressed widely. TLR4 are stimulated via fatty acids and plasma lipopolysaccharides (LPS) which is main compartment of gram negative outer membrane. Plasma LPS level is regulated with gut microbiota. TLR2 also recognizes bacterial, fungal and viral antigens and stimulates macrophage on natural immunity. It's believed to have protective effects on insulin resistance.  Also, recent studies on mouse models shown that TLR2 and TLR4 gene expression pattern have changed with composition of the gut microbiota. In this study, we investigate the amount of Bacteriodetes, Firmicutes, B.fragilis, L.acidophilus and L.casei from 53 type 1 diabetes patient (28 male and 25 female) and 53 healthy control (28 male and 25 female) fecal samples via qPCR and the results were compared between the groups. Also, EDTA whole blood samples collected from these groups and TLR2 & TLR4 gene expression level were measured with qPCR and the results were compared between these groups. 
In our study, the amount of Bacteroidetes and Firmicutes compared between type 1 diabetes patients and healthy control group. The amount of Bacteroidetes and Firmicutes were found significantly higher and lower respectively than healthy control groups (p<0,001, p<0,001). 
Besides, both male and female, Firmicutes / Bacteroidetes ratios of type 1 diabetes were found significantly lower than healthy controls. The amount of B.fragilis were found significantly higher than healthy controls (p<0,01) in both male and female paticipants but no significant differences were found for the amount of L.acidophilus and L.casei in both sexes (p>0,05).
In Type 1 diabetes patients, TLR2 and TLR4 gene expression levels were found to be statistically lower and higher respectively, compared to healthy controls. Relationship between the amount of Bacteroidetes & Firmicutes and TLR2 & TLR4 gene expression level in male and female patients with type 1 diabetes were investigated. We determined that the Bacteroidetes level relationship with TLR4 gene expression level is very strong (rs: >0,85) while the relationship with TLR2 gene expression level were found to be statistically weak (r: .25-.50).  The Firmicutes levels relationship with the TLR4 gene expression level is weak (r: 0.25 to 0.50), but the relationship with TLR2 gene expression level is very strong (r:> 0.85).