Transgenik tavşan embriyosu üretiminde ıcsı, intrasitoplazmik enjeksiyon ve pronüklear enjeksiyon yöntemlerinin karşılaştırılması
Comparing icsi, intracytoplasmic injection and pronuclear injection methods for production of transgenic rabbit embryos
Yazar: AYŞE CAN
Danışman: PROF. DR. SEMA BİRLER
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Embriyo = Embryo ; Gen teknolojisi = Gene technology ; Gen transfer teknikleri = Gene transfer techniques ; Genler = Genes ; Tavşanlar = Rabbits

Özet:
İlk kez 1973 yılında bakteriler üzerinde yapılmış ve biyoteknoloji çalışmaları içerisinde önemli bir yeri olan transgenezis çalışmaları; günümüzde hastalıklara model hayvan oluşturma, organ transplantasyonu ve transgenik hayvanların süt gibi doğal ve kolay elde edilebilen ürünlerinden değerli proteinlerin üretilmesini amaçlamaktadır. Transgenik hayvan üretimi için çeşitli yöntemler geliştirilmiş, ancak tavşanlarda pronüklear gen enjeksiyonu (PNI), intrasitoplazmik gen enjeksiyonu (ISI) ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu ile transgenezis (ICSI-t) tekniklerinin birbirleri ile karşılaştırılması yönünde bir çalışmaya henüz rastlanılmamıştır. 
Tez çalışmasında, tavşanlarda in vivo gelişmiş oositlere ICSI-t, in vivo gelişmiş embriyolara PNI ve ISI yöntemleri ile gen transferi uygulanarak, bu 3 tekniğin ve farklı gen konsantrasyonlarının transgenik tavşan embriyosu üretimi üzerine etkinliği araştırıldı. Gen konstraktı olarak yeşil floresan protein (GFP) geni taşıyan hiperaktif plazmid (pmhyGENIE-3) kullanıldı. Tavşan başına 75 IU HMG ve 100 IU hCG ile süperovulasyon uygulandı ve hCG uygulamasından 15-16 saat sonra genel anestezi altında laparatomi yapıldı. Ovidukt yıkaması ile elde edilen oosit ve embriyolarda 10 ve 20 ng/µl olmak üzere 2 farklı gen miktarı, 3 yöntem için denendi. Embriyolar, TCM-199 medyumunda in vitro kültüre edilerek 24., 48., 72., 96. ve 120. saatlerde bölünme, gelişme durumları ile gen ekspresyonları kontrol edildi.
Çalışma sonucunda en düşük blastosist oranları ICSI-t ve ISI gruplarında görülürken, en yüksek blastosist oranlarına PNI grubunda ulaşıldı. PNI 10 ng/µl grubunda blastosist oranı %42,1, GFP ekspresyonu görülen blastosist oranı %37,5; PNI 20 ng/µl grubunda blastosist oranı %12,9, GFP ekspresyonu görülen blastosist oranı %75,0 olarak saptandı. Altı grup içerisinde, en iyi grubun PNI 10 ng/µl grubu olduğu görüldü.

Abstract:
Transgenesis studies carried out on bacteria for the first time in 1973 have a major role in biotechnology field. Today the aims to produce transgenic animals are to produce model animals for human diseases, organ transplantation and obtaining valuable proteins. New techniques have been developed for production of transgenic animals, however there is no published study about comparing pronuclear gene injection (PNI), intracytoplasmic gene injection (ICI) and intracytoplasmic sperm injection transgenesis (ICSI-t) on rabbits.
In the thesis study, the efficacy of 3 methods and 2 different gene concentratitons (10 and 20 ng/µl) to produce transgenic rabbit embryos by transferring genes into oocytes and embryos developed in vivo were researched. The hyperactive plasmide (pmhyGENIE-3) that carries green fluorescent protein (GFP) was used as a gene construct. For superovulation, 75 IU HMG and 100 IU hCG were used. After 15-16 hours from hCG injection, oocytes and embryos were flushed from oviducts laparatomically under general anesthesia. After gene injections, embryos were cultured in vitro in TCM-199 media. The developmental status and gene expressions were checked in 24th, 48th, 72th, 96th and 120th hours. 
The lowest blastocyst rates were obtained in ICSI-t and ICI groups, while the PNI groups had the highest blastocyst rates. In PNI 10 ng/µl and 20 ng/µl groups, blastocyts rates were 42,1% and 12,9%; and GFP+ blastocyst rates were 37,5% and 75,0%, respectively. PNI 10 ng/µl group was found to be the best group of 6 all.