İncir alanlarından Bacillus thuringiensis izolasyonu, karakterizasyonu ve biyoaktivitelerinin belirlenmesi
Isolation, characterization and investigations on bioactivity of Bacillus thuringiensis from fig areas
Yazar: MEHLİKA ALPER
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Bacillus thuringiensis = Bacillus thuringiensis ; İncir = Fig

Özet:
Bacillus thuringiensis (Bt), sporulasyon süresince ?insektisidal kristal proteinler? olarak adlandırılan parasporal kristal inklüzyonları üretme yeteneğine sahip bir bakteridir. Bu kristal proteinler, farklı böcek türleri üzerinde yüksek oranda özgün insektisidal etkiye sahip ve çevre için güvenli olduklarından, B. thuringiensis tarım zararlıların kontrolünde kimyasal pestisitlere önemli bir alternatiftir. İncir, Türkiye'de ekonomik olarak önemli bir bitkidir ve Aydın İli Türkiye'de üretilen incirin yarıdan fazlasını karşılamaktadır. Bu çalışmada, ana incir zararlılarına karşı etkili Bt suşu elde etmek amacıyla Aydın İli'nin incirlik alanlarından Bt izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiş olup Bt izolatlarının 5 farklı incir zararlısı üzerindeki biyoaktiviteleri araştırılmıştır. Aydın İli'nin 8 ilçesinden alınan 44 toprak örneğinden toplam 589 bakteri izolatı elde edilmiştir. Bu izolatlardan 315 tanesinde parasporal kristal üretimi gözlenmiş olup 177 tanesinin cry gen içeriği belirlenmiştir. cry pozitif 117 izolatın cry1, cry2, cry3, cry4 ve cry9 genlerinin frekansı sırasıyla %90, %54, %8, %4 ve %15 olarak bulunmuştur. Sadece cry1 taşıyan izolat sayısının, cry1 ve cry2 genlerini birlikte taşıyan izolat sayısına eşit olduğu belirlenmiştir. İncir zararlılarından Tetranychus urticae (iki noktalı kırmızı örümcek), Ceroplastes rusci (kanlı balsıra), Ceratitis capitata (Akdeniz meyve sineği), Carpophilus hemipterus (ekşilik böceği) ve Cadra cautella (incir kurdu) üzerinde yapılan biyoaktivite denemelerinde Tetranychus urticae, Ceroplastes rusci ve Ceratitis capitata'ya karşı önemli ölçüde etkili doğal Bt izolatları bulunamamıştır. Coleoptera ile birlikte, Lepidoptera ve Diptera'ya karşı etkili olduğu bilinen cry genleri taşıyan 69T, 71T ve 153T izolatları C. hemipterus larvalarına karşı %50'nin üzerinde öldürücü etki göstermiştir. Buna ilaveten Lepidoptera ve Diptera'ya karşı etkili olduğu bilinen cry genleri taşıyan 13MY, 42MY ve 45 MY izolatlarının C. cautella larvalarına karşı %82'nin üzerinde öldürücü etkiye sahip oldukları bulunmuştur. Bu izolatlar arasında C. cautella larvalarına karşı en düşük LC50 değerine (63 ppm) sahip olan Bt izolatı 13MY'dir.Bunlara ilaveten, incir zararlıları üzerinde farklı toksik etkilere sahip 13 izolatta cry gen alt gruplarını belirlemek amacıyla özgün primerler ile yapılan PCR analizinde 4 farklı cry1 gen, 2 farklı cry2 ve 2 farklı cry3 gen profili tespit edilmiştir. Ayrıca, 13 Bt izolatının yeni cry geni içerip içermediği PCR-RFLP analiziyle araştırılmış olup izolatların hepsisinin de aynı restriksiyon profili gösterdiği bulunmuştur. B. thuringiensis subsp. kurstaki (Btk)' den farklı restriksiyon profili göstermiş olan Bt izolatlarının cry1Ea geni taşıdıkları; ancak Btk'nın ise cry1Aa genine sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca cry2 geni için yapılan PCR-RFLP'de hem Bt izolatlarının hem de referans suş Btk'nin aynı restriksiyon profili verdiği ve cry2Aa ve cry2Ab genlerine sahip oldukları tespit edilmiştir. Bu izolatların cry1 geni için yapılan kısmi DNA dizi analizleri sonucu, mevcut cry1Ea genleri ile %100 oranında benzerlik gösterdiği bulunmuştur. Bunlara ilave olarak, Bt izolatlarının moleküler sınıflandırılması amacıyla yapılan 16S-ITS rDNA PCR-RFLP analizinde Bt izolatları arasında ayırt edici restriksiyon profili görülmemiştir.Sonuç olarak, Aydın İli, incirlik alanlarında, ana incir zararlılarına karşı etkili doğal Bt izolatlarının bulunduğu ve bunlardan özellikle 13MY ve 42MY izolatlarının C. cautella'ya karşı etkili biyopestisit olarak kullanılma potansiyeline sahip olduğu gösterilmiştir.

Abstract:
Bacillus thuringiensis (Bt) is a bacterium which has ability to produce parasporal crystalline inclusions called ?insecticidal crystal proteins? during sporulation. Because these crystal proteins exhibit highly specific insecticidal activity against different insect species and is safe to environment, B. thuringiensis is an important alternative to chemical pesticides on pests control. Fig is one of the economically important plants in Turkey and Aydın province supplies more than half of figs production in Turkey. The aims of this study are to perform Bt isolation from fig areas in Aydın province and to characterize of Bt isolates obtained and to determine their bioactivities on the five main fig pests. A total of 589 isolates were obtained from 44 soil samples which collected from 8 different districts of Aydın province. Parasporal crystal production have been observed in 315 of the isolates and cry gene content of 177 isolates has beeen investigated. The frequency of cry1, cry2, cry3, cry4 and cry9 genes of cry positive 117 isolates was found to be 90%, 54%, 8%, %4 and %15, respectively. Number of isolates carrying only cry1 gene were determined to be equal to the number of isolates carrying cry1 and cry2 genes together. Bioassays carried out on Tetranychus urticae (two-spotted spider mite), Ceroplastes rusci, Ceratitis capitata (Mediterranean fruit fly), Carpophilus hemipterus and Cadra cautella (fig moth) showed that Bt isolates were not effective against Tetranychus urticae, Ceroplastes rusci and Ceratitis capitata. Isolates of 69T, 71T and 153T carriying cry genes known as efficient on Coleoptera, Lepidoptera and Diptera were found to cause mortality more than 50% against C. hemipterus larvae. In addition to that, 13MY, 42MY and 45MY isolates carriying cry genes known as efficient against Lepidoptera and Diptera were found to have mortality more than 82% against C. cautella larvae. It was determined that 13MY was the isolate which has the lowest LC50 value (63 ppm) for C. cautella larvae.PCR analysis was carried out in order to determine cry gene subgroups of 13 isolates toxic against fig pests and 4 different cry1 gene, 2 different cry2 as well as 2 different cry3 gene profiles were found. In addition, PCR-RFLP analysis was performed to determine if these 13 Bt isolates contain novel type of cry gene. It was found that all isolates exhibited the same restriction profile different from that of B. thuringiensis subsp. kurstaki (Btk). Based on PCR-RFLP analysis Bt isolates contain cry1Ea gene but Btk contains cry1Aa gene. Moreover, PCR-RFLP analysis carried out for cry2 gene indicated that both Bt isolates and Btk resulted in same restriction profile and harbored cry2Aa and cry2Ab genes. Partial DNA sequence analysis for cry1 gene of Bt isolates showed 100% homology with cry1Ea genes in Genbank. Finally, 16S-ITS rDNA PCR-RFLP analyse was carried out for molecular classification of Bt isolates and found that no distinct restriction profile was obtained among Bt isolates.In conclusion, this study indicated the presence of toxic Bt isolates against main fig pests in Aydın province. Among Bt isolates, especially isolates 13MY and 42MY have a potential to be used as biopesticide against C. cautella.