Pichia pastoris mayası ile rekombinant ksilanaz enzim üretiminin optimizasyonu
Pichia pastoris mayasi ile rekombinant ksilanaz enzim üretiminin optimizasyonu
Yazar: HİLAL YILDIZ KURAL
Danışman: PROF. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Ksilanaz = Xylanese

Özet:
Son yıllarda, ksilanazların çok farklı endüstüriyel alanlarda kullanılmasının yanında, hayvan yemlerinin formülasyonuna giren önemli bir bileşim unsuru olduğu görülmektedir. Günümüzde endüstriyel kullanımı olan enzim preparatları için en önemli konu enzim üretim maliyetinin ve buna bağlı olarak da prosese girdi maliyetinin düşürülmesidir. Ksilanazın da aralarında bulunduğu alfa amilaz, selülaz, pektinaz, proteazlar, lipazlar gibi enzimlerin üretimi üzerine sürdürülen araştırmalar, uygun bir üretici mikroorganizmanın bulunması ve aynı zamanda ucuz ve bol bulunabilen kaynaklardan oluşan bir üretim ortamı kompozisyonun oluşturulması yönünde devam etmektedir. Enzim üretim prosesine ilişkin diğer problemler önemli ölçüde aşılmıştır. Ksilanaz enzimi bakteri, maya ve fungus grubunda yer alan çeşitli mikroorganizmalar tarafından üretilebilmektedir.
Bu çalışma üç bölümden oluşmaktadır. İlk bölümde ksilanaz enziminin rekombinant ve ekstraselüler olarak dört farklı sinyal protein, HSA(İnsan serum albumin), PIR(Protein with Internal Repeats), PHO(Asit fosfotaz) ve α-mating faktör, kullanılarak P. pastoris te üretimi yapılmıştır. Bu bölüm sonucunda hepsinde üretim görülmüştür.
İkinci bölümde üretim verimler karşılaştırılmış ve verimin en yüksek olduğu sinyal protein belirlenmiştir. Bu bölüm sonucunda, HSA 4147 U/ml, PIR 5366 U/ml, PHO 4252 U/ml ve α-mating faktör 4247 U/ml enzim ürettiği belirlenmiştir. En yüksek üretimin PIR sinyal proteininde olduğu görülmüştür. Üçüncü bölümde ise üretilen enzim saflaştırılmış ve enzimin optimum çalışma sıcaklığı ve pH sı belirlenmiştir.
Sonuç olarak, Pichia pastoris mayası ile ksilanaz üretimi gerçekleştirilmiş ve en uygun sekresyon sinyalinin PIR olduğu belirlenmiştir. Ksilanaz enziminin sonundaki polihistidin kuyruğu uzaklaştırıldığında fırıncılık ürünlerinde ve hayvan yemlerinde kullanılma imkanı bulunmaktadır.
ANAHTAR KELİMELER: Pichia pastoris, ksilanaz, HSA(İnsan serum albumin), PIR(Protein with Internal Repeats), PHO(Asit fosfotaz), α-mating faktör

Abstract:
In recent years, xylanases are important ingredient of animal feed formulations in addition to other industrial applications. The most important issue for use of enzymes for industrial applications is reduction of production cost and the cost of goods. Studies are ongoing to determine the best production host and cheap media compositions for production of enzymes including xylanases, alpha amylase, cellulase, pectinase, proteases and lipaes etc. The other problems related to the enzyme production process relatively solved.  Xylanase are produced in bacteria, yeast and by various microorganisms.
This study consists of three parts. In the first part, four secretion signal sequences were evaluated for extracellular production of Aspergillusniger xylanase (XylB) in Pichia pastoris. These sequences were namely; Saccharomyces cerevisiae  α -matingfactor (α -MF), Human Serum Albumin (HSA), P. pastoris Acid Phosphatase (PHO1) and P. pastoris Protein with Internal Repeats (PIR1) secretion signals.  Xylanase production was achieved with  all constructs.
In the second part of the study, the production efficiency of xylanse was compared with four leader sequences and best signal for secretion was determined.  Xylanase enzyme activities for single-copy clones with α-MF, HSA, PHO1 and PIR1 as secretion sequence were 4247, 4147, 4252 and 5366 U/mL, respectively. The best production signal was determined to be PIR. The last part of the study consist of purification of the enzyme product and determination of the optimum temperature and pH.
Consequently, xylanase production in Pichia pastoris was achieved and PIR secretion signal was determined to be the best secretion signal among the tested signals. Xylanase produced in Pichia pastoris can be utilized in animal feed and bakery products after removing the His-tag sequence.
KEYWORDS: Pichia pastoris, xylanase, HSA(Human serum albumin), PIR(Protein with Internal Repeats), PHO(acid phosphatase), α-mating factor