Plasmodium vivax yabanıl tip laktat dehidrogenaz enziminin saflaştırmasının optimizasyonu ve yabanıl tip ile mutant enzimlerinin kinetik analizlerinin yapılması
The optimization of the purification of the wild type Plasmodium vivax lactate dehydrogenase enzyme and the kinetic analaysis of the wild type and mutant enzymes
Yazar: ÖZAL MUTLU
Danışman: DOÇ. DR. DİLEK TURGUT BALIK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Laktat dehidrogenaz = Lactate dehydrogenase ; Plasmodium vivax = Plasmodium vivax ; Sıtma = Malaria

Özet:
Günümüzde kullanılan antimalaryal ilaçlara karşı olan direnç, sıtmanın kontrolünü aksatan bir temel halk sağlığı sorunudur. Bu durum yeni ilaçların geliştirilmesini zorunlu kılmaktadır. Bu sebeple, bu tezde Plasmodium vivax'ın glikolotik enzimi olan laktat dehidrogenaz yeni antimalaryalların tasarımında hedef olarak belirlenmiştir.Tezin ilk bölümünde, Plasmodium vivax laktat dehidreogenaz enzimi C- terminalinde His-tag'a sahip olarak klonlanmış ve saf ve aktif enzim yoğun optimizasyon çalışmaları sonucunda elde edilmiştir. Optimizasyon çalışmaları neticesinde, rekombinant Plasmodium vivax LDH enzimi kinetik çalışmalar için yeterli saflıkta ve miktarda saflaştırılmıştır.Tezin ikinci bölümünde, daha önceden yönlendirilmiş mutagenez çalışmaları sonucunda aktif bölge halkasından her seferinde bir amino asit çıkarılması ile elde edilmiş olan PvDLDH ve PvKLDH mutant Plasmodium vivax LDH enzimlerinin kinetik çalışmaları yapılmıştır. Aktif bölge halkasının kısaltılması sonucunda enzimlerin substratına olan afiniteleri ve benzer şekilde kcat değeri düşmüştür.Tezin son bölümü, önceden yönlendirilmiş mutagenez çalışmalarıyla Toxoplasma gondii I LDH, Toxoplasma gondii II LDH, Eimeria acervulina LDH, Eimeria tenella LDH enzimlerinin taklit edildiği mutant Plasmodium vivax LDHlarının saflaştırılmasını ve kinetik analizlerinin yapılmasını içermektedir. Temel fark mutant enzimlerin substratlarına olan affinitesinde gözlenmiştir.Elde edilen tüm veriler yabanıl tip Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimin kinetik sonuçlarıyla karşılaştırılmış ve yeni antimalaryalların geliştirilmesinde aktif bölge halkasının ve aktif bölge halkasının amino terminalinin önemi kanıtlanmıştır.

Abstract:
Resistance to currently available antimalarial drugs is a major public healt problem that hinders the control of malaria. This necessitates development of new drugs. To this end, in this thesis glycolytic enzyme lactate dehydrogenase of Plasmodium vivax has been targetted for the design of novel antimalarials.In the first part of the thesis, Plasmodium vivax lactate dehydrogenase was expressed with having a C-terminal His-tag and the pure and active enzyme has beeen obtained by applying intense optimization studies. As a result of optimization studies, recombinant Plasmodium vivax LDH has been purified in the sufficient purity and quantity for the kinetic analysis.In the second part of the thesis, kinetic studies have been done on the PvDLDH and PvKLDH mutant Plasmodium vivax LDH enzymes that were previously obtained by deleting one amino acids each time from the active site loop by the site directed mutagenesis. As a result of shortening of the active site loop caused a decrease in the affinity of the enzymes to their substrate and similarly a decrease in the kcat value.The last part of the thesis consisted of purification and kinetic analysis of the previously mutated Plasmodium vivax LDHs to mimick Toxoplasma gondii I LDH, Toxoplasma gondii II LDH, Eimeria acervulina LDH, Eimeria tenella LDH. Main difference was observed in the affinity of the mutant enzymes to their substrate.All of the results were compared with the kinetic results of wilde type Plasmodium vivax lactate dehydrogenase and proved the importance of the active site loop and amino terminal of the active site loop in the design of new antimalarials.