Kasava (Manihot esculenta C.) bakteriyel yanıklık hastalık etmeni Xanthomonas axonopodis pv. manihotis' in real-tıme pcr ile tanısı, tespiti ve pulsed-fıeld jel elektroforezis ile moleküler karakterizasyonunun yapılması
Molecular characterization, identification and detection of Xanthomonas axonopodis pv. manihotis, the causal agent of cassava bacterial blight disease in cassava (Manihot esculenta C.) by real - time pcr and pulsed-field gel electrophoresis
Yazar: MUNTALA ABDULAI
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN BASIM
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Kasava (Manihot escualanta Crantz) Gana' da önemli bir kültür bitkisidir. Bu çalışmada, Gana'nın 8 farklı bölgesinden toplanan, Kasava Yanıklık Hastalığı simptomları gösteren örnekler izole edilmiş ve besi ortamında- Nütrient Agar (NA, Acumedia, USA) ve X. axonopodis pv. manihotis (Xam) yarı seçici ortam, Cefazolin Trehalose Agar (CTA) üzerinde geliştirilmiştir.
 
İzolatların duyarlı kasava Esam çeşidindeki patojenisite test sonucunda, izolatların (toplam 32 adet) hepsi Xam simptomları göstermiş ve inoküle edilen kasava bitkilerinden izole edilerek Koch postulatları tamamlanmıştır. 

Klasik PCR' da, Xanthomonas spesifik primer, RST2/RST3 ve Xam spesifik Değişken Numara Tandem Tekrarlama (VNTRs) lokus primeri, XaG1_67F/R, farklı bitki patojeni bakterilerin genomlarından hiçbir amplifikasyon tespit edilmemesine rağmen, test edilen tüm Gana ve referans Xam strainlerinden 840 ve 446 ba'lik amplifikasyonlar elde edilmiştir. Ortaya çıkan PCR ürünleri, GenBank nükleotit veri tabanından alınan Xam strainleri ile %93 ile %100 arasında homoloji gösterdiği BLASTn programı kullanılarak ortaya çıkarılmıştır.

Kasava yetiştiriciliğinde önemli ürün kayıplarına sebep olan Kasava Bakteriyel Yanıklık etmeni Xam' in Real-Time PCR yöntemi ile kısa sürede, hassas bir şekilde tanısını yapmak amacıyla primer ve prob (LNA, Locked Nucleic Acid) setleri geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob setlerinin spesifikliği; farklı Xam strainleri, farklı bitki patojeni bakteriler ve kasava genomik DNA'sı kullanılarak test edilmiştir. Xam izolatların LNA probu kullanılarak Real-Time PCR yöntemi ile hassas ve seçici olarak tanıları ve tespitleri yapılmıştır.

PCR analiz sonuçlarına göre, Kasava Bakteriyel Yanıklığı Hastalığın Ganadaki yaygınlığı en yüsek Ashanti (%70) bölgesinde olup, Volta (%60), Brong-Ahafo (%40), Eastern (%40) ve Greater Accra (%20) şekilde sıralamıştır.   

Bu çalışmada geliştirilen yöntemin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı X. a. pv. manihotis 1 hücre olarak tespit edilmiştir. Geliştirilen yöntemin DNA düzeyindeki hassasiyet sınırı ise, 13 pg olarak tespit edilmiştir.

Sonuç olarak, Real-Time PCR yöntemini kullanarak her birine özel primer ve prob setleri geliştirilen Kasava Bakteriyel Yanıklık Hastalığına sebep olan X. a pv. manihotis'nin hem bakteriyel hücreden hem de hastalıklı bitki dokularından hızlı (20-25 dk) ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği ortaya çıkarılmıştır.

Pulsed-Field Jel Elektroforezis (PFGE) yöntemi ile Gana'da yaygın kasava üretimi yapılan beş farklı bölgeden izole edilen Xam izolatları arasındaki genotipik farklılıkları az sıklıkla kesen restriksiyon enzimleri kullanılarak ortaya çıkarılmıştır.

Gana'dan toplanan  32 izolat arasındaki genetik farklılıklar PFGE tarafından SpeI enzimi kullanılarak belirlenmiştir. PFGE sonuçlarına göre tüm izolatların iki farklı haplotip oluşturmuştur.

Abstract:
Cassava (Manihot escualanta Crantz) is one of the most important plant cultivar in Ghana. In this study, cassava samples showing symptoms of Cassava Bacterial Blight diseases were collected from eight different regions of Ghana. The putative pathogen was isolated and cultured on the Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) semi-selective, Cefazolin Trehalose Agar (CTA) and Nutrient Agar (NA) media.

The pathogenicity test of all the 32 isolates on the susceptible Esam cassava variety produced symptoms typical of Xam and was consistently re-isolated from the inoculated cassava plants and thereby satisfying the Koch's postulates.

The classical PCR was conducted using Xanthomonas genus specific primer RST2/RST3 and Xam specific Variable Number Tandem Repeat (VNTRs) locus primer, XaG1_67F/R, which yielded 840 and 446 bp amplification products, respectively. The resulting PCR products were sequenced and analyzed using a BLASTn program, which revealed homology between 93 to 100% with several other Xam strains retrieved from the GenBank nucleotide database. 

Xanthomonas axonopodis pv. manihotis causing serious yield loss on cassava cultivation has been detected in a short time with a Real-Time PCR method, using the developed probe (LNA, Locked Nucleic Acid) and primer sets. The specificity of the developed probe and primer sets in this study were tested against different Xam strains, various other plant pathogenic bacteria from different genus and species and cassava genomic DNA. The Xam isolates were sensitively and selectively detected by Real-Time PCR using LNA probes.

The results of the PCR analysis showed that Ashanti region had the highest incidence of CBB, which recorded 70%, followed by Volta region (60%); Brong Ahafo region (40%); Eastern region (40%) and Greater Accra region (20%).

The developed method in this study was used for the detection of Xanthomonas axonopodis pv. manihotis from cell suspension, which showed sensitivity limit of 1 cells, whereas, the sensitivity of the detection limit of the genomic DNA in picogram (pg) of the bacterial was also found to be 13 pg.

In conclusion, Real-Time PCR method using specific primer and probe sets detected Xanthomonas axonopodis pv. manihotis causing Cassava Bacterial Blight disease from both bacterial cell and diseased cassava plant tissue. The developed method was very quick and sensitive for the identification and detection of this pathogen within relatively short time (20-25 min).

The genotypic differences between the Xam isolates isolated from the five most cassava producing regions of Ghana were examined by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) after  digesting the genome with the rare-cutting restriction enzymes.

The genetic differences between the 32 isolates collected from Ghana were determined by PFGE using SpeI enzyme. All the isolates were grouped into two different haplotypes by the PFGE.