Kolon kanser hücre hatlarında reseptör tirozin kinaz ve JAK-STAT inhibitörlerinin apoptotik ve anti-proliferatif etkilerinin araştırılması
Investigation of the apoptotic and anti-proliferative effects of receptor tyrosine kinase and JAK/STAT pathway inhibitors in colon cancer cell lines
Yazar: ATİYE SEDA YAR
Danışman: PROF. DR. SEVDA MENEVŞE
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Epidermal büyüme faktörü = Epidermal growth factor ; Gefitinib = Gefitinib ; Hücre dizisi = Cell line ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Tirozin = Tyrosine ; Triterpen = Triterpene ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Kolon kanseri, dünyada kadın ve erkeklerde ölüme neden olan en yaygın 4. kanser tipidir. Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü (EGFR), kolorektal kanser olgularında sıklıkla ifade edilmekte olan bir tirozin kinaz (TK) reseptörüdür. Gefitinib (Gef), EGFR'nün hücre içi TK bölgesinin ATP bağlanma yerine bağlanan, oral olarak aktif TK inhibitörüdür. JAK-STAT gibi EGFR ile ilişkili sinyal yolakları kanser gelişiminde önemli bir rol oynar. Triterpenoid bir bileşik olan Kukurbitasin B (CuB), güçlü anti-tümör aktivitesi ile JAK-STAT sinyal yolağının seçici ve kuvvetli bir inhibitörüdür. Bu çalışmada, CuB'nin tek başına ve Gef ile birlikte kullanımının HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücre hatları üzerine olan apoptotik ve anti-proliferatif etkilerini araştırmayı amaçladık.Çalışmamızda, p53 mutant HT-29 ve p53 yabanıl tip HCT-116 insan kolon adenokarsinom hücre hatlarında, çeşitli doz ve inkübasyon sürelerinde, CuB'nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonrasında, MTT yöntemi, AO/EtBr boyaması ve BrdU ELISA yöntemleriyle hücre canlılığı belirlendi. Apoptotik oran LDH, DNA Fragmentasyon ve Kaspaz-3 ELISA yöntemleri kullanılarak değerlendirildi. Apoptotik ve proliferatif sinyal iletim yolaklarında görev alan Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve p27kip1 genlerinin mRNA ve protein ifade düzeylerinin belirlenmesi için kantitatif Real-Time PCR ve Western Blot yöntemleri kullanıldı.Sonuçlarımız CuB'nin tek başına ve Gef ile birlikte kullanılmasının doza bağlı olarak her iki hücre hattında apoptotik cevaba neden olduğunu gösterdi. Aynı zamanda, CuB'nin apoptotik etkisinin Gef varlığında daha da arttığını belirledik. Bu bulgular, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, apoptotik ve anti-proliferatif genlerin ve proteinlerin, sırasıyla mRNA ve protein ifade düzeylerindeki uygun değişimlerin olması ile doğrulandı. Elde ettiğimiz veriler, CuB'nin kolon kanser tedavisinde potansiyel anti-neoplastik ajan olarak yararlı olabileceğini düşündürmektedir. Sonuç olarak çalışmamız, JAK/STAT yolağı hedefli kanser tedavisinde, CuB'nin kemoterapötik ajanlarla birlikte kullanılmasının, uygun apoptotik ve anti-proliferatif etkiye düşük doz ve sürede ulaştırabilmesine bağlı olarak, klinik açıdan yararlı olabileceğine dikkat çekmektedir. Buna ek olarak, kukurbitasinlerin moleküler etkilerinin tam olarak belirlenmesi kolon kanser tedavisi için yeni moleküler hedeflerin tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.

Abstract:
Colon cancer is the fourth most common cause of cancer death in men and women in the world. The Epithelial Growth Factor Receptor (EGFR) is a tyrosine kinase (TK) receptor that is frequently overexpressed in colorectal cancer. Gefitinib (Gef) is an orally active inhibitor of TK that targets the ATP binding site of the intracellular TK domain of EGFR. The EGFR-associated signaling pathways, such as JAK-STAT, play an important role in cancer development. Cucurbitacin B (CuB) is a triterpenoid compound, which is a potent and selective inhibitor of JAK-STAT signaling pathway with potent antitumor activity. In this study, we aimed to investigate the apoptotic and anti-proliferative effects of CuB as a single agent and in combination with Gef on HT-29 ve HCT-116 colon cancer cell lines.In our study, cell viability was identified in the p53 mutant HT-29 and p53 wild type HCT-116 human colon adenocancer cell lines by MTT assay method and AO/EtBr staining and BrdU ELISA methods, for different dosages and incubation times, following CuB alone and in combination with Gef treatments. Apoptotic ratio was assessed using LDH, DNA Fragmentation and Caspase-3 ELISA methods. Quantitative Real-Time PCR and Western Blot methods were used for analysis of mRNA and protein expression levels of Bcl-2, Bax, Bak, Bad, cyclin D and p27kip1 genes which take part in apoptotic and proliferative signal pathways.Our results showed that treatment with CuB alone and in combination with Gef resulted in an apoptotic response in a dose dependent manner in both cell lines. We also found that the apoptotic effects of CuB increased in the presence of Gef. These results were also confirmed with appropriate changes in the mRNA and protein expression levels of apoptotic and anti-proliferative genes and proteins, in comparison to the control group. Our data suggest that CuB could be useful as a potential anti-neoplastic agent in the management of colon cancer. In conclusion, our study draws attention to the possible clinical effectiveness of use of CuB with chemotherapeutic agents with the opportunity of attaining convenient apoptotic and anti-proliferative effect with reduced dose and time in cancer treatment targeting JAK/STAT pathway. In addition to this, determination of the exact molecular effects of cucurbitacins would allow us to identify new molecular targets for the treatment of the colon cancer.