Kronik miyeloid lösemi tedavisinde ruxolitinibin in vitro uygulanması ile meydana gelen moleküler biyolojik değişikliklerin incelenmesi
Examination of molecular biologic changes that occur result of in-vitro application of ruxolitinib in chronic myeloid leukemia treatment
Yazar: BAKİYE GÖKER
Danışman: DOÇ. DR. ÇIĞIR BİRAY AVCI
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Kronik miyeloid lösemi hematopoietik kök hücrenin klonal bir hastalığıdır. Philadelphia kromozomu olarak bilinen resiprokal (9;22) trasnslokasyonu sonucu BCR-ABL füzyon proteininin aşırı ifade seviyesi lösemik fenotipin meydana gelmesinden sorumludur.   
Ruxolitinib, miyelofibroz tedavisine karşı geliştirilen ilk ajandır ve hematopoiez için zorunlu olan çeşitli sitokin ve büyüme faktörlerinin sinyalleşme yolağında bulunan seçici JAK 1 ve 2 inhibitörüdür.  
Apoptoz ve otofaji sırasıyla tip I ve tip II hücre ölümü olarak da bilinmektedir. Bu iki mekanizma hücrenin uyarılara yanıt veren önemli protein kaskadlarını düzenleyerek hücre yaşamını ya da ölümünü belirler. Kanserlerde çeşitli etken maddelerle apoptotik ve otofajik etkinliğin arttırılması güncel bir terapötik hedeftir.  
Çalışmamızda K-562 insan kronik miyeloid lösemi hücre hattı ve NCI-BL 2171 insan normal B lenfositleri üzerine güçlü JAK inhibitörü olan ruxolitinibin uygulanması sonucu meydana gelen sitotoksik, apoptotik ve otofajik değişikliklerin, apoptoz, otofaji ve lösemi ilişkili genlerin ifadelerindeki değişikliklerin kontrol grubuyla karşılaştırılarak belirlenmesi amaçlanmıştır.  
K-562 ve NCBI-BL 2171 hücrelerinde ruxolitinibin sitotoksik etkisi WST-1 analizi kullanılarak zaman ve doza bağımlı olarak değerlendirilmiştir. Ruxolitinib uygulanan K-562 ve NCIBL 2171 hücrelerinden ve kontrol olarak kullanılan, doz uygulanmayan hücrelerden total RNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir.  cDNA sentezi için ters transkripsiyon protokolü uygulanmıştır. Ruxolitinibin apoptotik etkisi JC-1 ve Annexin V metotlarıyla belirlenmiş, gen ifadelerindeki değişiklikler RT-qPCR ile değerlendirilmiştir.  Ruxolitinibin IC50 dozu (48. saat),  K-562 ve NCI-BL 2171 hücreleri için sırasıyla 20µM ve 23,6µM olarak belirlenmiştir. Ruxolitinib hücreler üzerinde apoptotik etkiye neden olmamakla birlikte K-562 ve NCI-BL 2171 hücrelerinde sırasıyla 2,01 ve 1.79 kat otofajiyi indüklemiştir. Ruxolitinibin mTOR, AKT ve STAT gibi otofaji inhibitörlerinin ekspresyon seviyelerini azaltarak hücre ölümünü gerçekleştirdiğini düşünmekteyiz.  
Kronik miyeloid lösemide BCR-ABL tirozin kinaz inhibitörlerinin kullanımının yarattığı en büyük sorun zamanla direnç ya da ilaca karşı duyarsızlık oluşmasıdır. Ruxolitinibin BCR-ABL tirozin kinazının aşağı-akış yönündeki hedeflerinden JAK/STAT yolağını bloklayarak kronik miyeloid lösemide potansiyel bir tedavi yöntemi olacağı düşünülmekle birlikte otofajiyle ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır.  Ruxolitinibin moleküler mekanizmaları aydınlatılarak kronik miyeloid lösemi tedavisinde otofaji indüksüyonu aracılığıyla yeni bir bakış açısı oluşturacağını düşünmekteyiz.

Abstract:
Chronic myeloid leukemia is a clonal disorder of hematopoietic stem cells. Over-expression level of BCL-ABL fusion protein is the result of reciprocal (9;22) translocation known as Philadelphia chromosome is responsible for occurring leukemic phenotype.   
Ruxolitinib is the first agent approved for the treatment of myelofibrosis. Ruxolitinib is a selective inhibitor of Janus kinases (JAK) 1 and 2, which are involved in the signalling pathway of various cytokines and growth factors essential to haematopoiesis. 
Apoptosis and autophagy known as type I and type II programmed cell death, respectively. These two mechanisms determine cell survival or death via regulating important protein cascades as essential response of cell to stimulus.  Raise of apoptotic and autophagic activity in cancers is a novel therapeutic target using different active substance. 
In our study we aimed to determine cytotoxic, apoptotic and autophagic changes in K-562 human chronic myeloid cell line and NCI-BL 2171 human normal B lymphocyts treated with potent JAK inhibitor ruxolitinib compared to untreated control group, and detect the expression changes of apoptosis, autophagy and leukemogesis related genes with the treatment of ruxolitinib.   
The cytotoxic effects of ruxolitinib on K-562 and NCI-BL 2171 cells were determined in time and dose dependent manner by using WST-1 analysis. Total RNA was isolated from K-562 and NCI-BL 2171 cells treated with ruxolitinib and untreated cells as control group. Reverse transcription procedure was performed for cDNA synthesis. Apoptotic effect of ruxolitinib was evaluated with JC-1 and Annexin-V methods, and gene expressions were shown by RT-qPCR. 
IC50 (48th hours) dose of ruxolitinib was determined as 20µM, 23,6µM for K-562 and NCI-BL 2171 cells, respectively. Ruxolitinib caused no apoptotic effect on K-562 and NCI-BL2171 cells. However, ruxolitinib induced autophagy in K-562 and NCI-BL 2171 cells 2,01 and 1,79 fold, respectively. We supposed that ruxolitinib realizes this cell death via down-regulating autophagy inhibitors mTOR, AKT and STATs.   
Ruxolitinib is thought to be potential treatment method in chronic myeloid leukemia by blocking JAK/STAT pathway known as BCR-ABL downstream target, but there has been no study correlated with autophagy. The most critical trouble caused by using BCR-ABL tyrosine kinase  inhibitors in chronic myeloid leukemia treatment is drug resistance or loss of sensitiveness in patients. We suggest that a new perspective would be generated in treatment of chronic myeloid leukemia by clarifying of molecular mechanisms of ruxolitinib through autophagy induction.