Deneysel morfin bağımlılığı modelinde hipotalamik ve hipokampal Semaforin 3A ve reseptörleri gen ifadelerinin araştırılması
Investigation of hippothalamic and hippocampal Semaphorin 3A and its receptors gene expression in an experimental morphine addiction model
Yazar: KANİYE ZEYNEP ÇALIŞKAN SAK
Danışman: PROF. DR. SELİM KUTLU
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı / Fizyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Nörofizyoloji = Neurophysiology

Özet:
Ratlar üzerinde deneysel morfin bağımlılığı oluşturularak, hipotalamus ve hipokampus dokularındaki SMF 3A NRF1 ve PLA1 gen ifade düzeylerinin incelenmesi amaçlanmıştır. 
Mevcut çalışmada ağırlıkları ortalama 300-350 gr olan 48 adet Wistar ırkı erkek sıçan kullanılmıştır. Randomize olarak alınan ratlar 4 grup halinde ve her grupta 12 adet sıçan olacak şekilde ayrılmıştır. Bu gruplardan kontrol grubuna serum fizyolojik, morfin grubuna 10 mg/kg/gün morfin sülfat, nalokson grubuna serum fizyolojik, morfin + nalokson grubuna deri altı yolla 10 mg/kg/gün morfin sülfat 5 gün boyunca enjekte edilmiştir.
5. gün sabah nalokson ve kontrol gruplarına serum fizyolojik, morfin + nalokson ve morfin gruplarına ise 10 mg/kg/gün morfin sülfat verilmiştir. Bu enjeksiyonlardan 1.5 saat sonra aynı dozda olacak şekilde kontrol ve morfin grubuna SF, nalokson ve morfin+nalokson grubuna nalokson enjekte edilerek davranış testine alınmıştır. Tüm sıçanların hipotalamus ve hipokampus dokularındaki SMF 3A, NRF1 ve PLA1 reseptörlerinin gen ekspresyon seviyeleri kantitatif RTPCR ile analiz edilmiştir. Elde edilen tüm veriler Instat İstatistiksel Paket Programı (Instat Graphad Software 8.0.1, San Diago, CA, USA) aracılığı ile analiz edilmiştir. Verilerin normalliğini test etmek için Shapiro-Wilk testi kullanılmıştır. Tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey ikili çoklu karşılaştırma testi, eşit grup varyanslarına sahip normal dağılımlı veriler için kullanılmıştır. Anormal dağılımlı veriler için Kruskal-Wallis testi ve ardından Dunn'ın ikili çoklu karşılaştırma testi kullanılmıştır. Hayvanların ilk ve son ağırlık kıyaslaması iki yönlü ANOVA testi ile yapılmıştır. 2−ΔΔCT değerleri ortalama ± Ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ve davranış deneyleri sonuçları ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. p<0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
 Deney hayvanlarına nalokson uygulanmasının ardından ratlarda belirgin olarak morfin çekilme davranış bulguları saptanmıştır. Hipotalamus ve hipokampus dokularının her ikisinde de SMF 3A, NRF1 ve PLA1 reseptörlerinin gen ifadesi seviyelerinde morfin grubu ile morfin+nalokson grubu arasında anlamlı düzeyde fark oluşmuştur.  
Genel olarak sonuçlarımızı değerlendirdiğimizde, morfin uyguladığımız grupta hem SMF 3A hem de reseptörleri olan NRF1 ve PLA1 gen ekspresyonlarının arttığı, bunun tam tersi olarak morfin uygulanan gruba nalokson uygulanmasını takiben belirgin olarak azaldığı gözlemlenmiştir. Mü opioit antagonisti uygulandığı zaman sonucun tersine dönmesi morfinin etkisinin reseptör aracılı olduğunu göstermektedir. Nalokson bir opioit antagonisti olarak, kontrole göre kıyaslayınca etkiyi tam tersine döndürmüş olsaydı, beyinde endojenik olarak mü-opioiderjik bir aktivitenin olduğu ve bunların tonik etki oluşturduğu ve sadece nalokson uygulamasıyla bu etkinin ortadan kalktığı düşünülebilirdi. Ancak bulgulara göre nalokson ve kontrol grubunun değerlerinin birbirine çok yakın olması, sadece nalokson uygulamasının SMF 3A ve reseptörleri üzerinde anlamlı bir etki oluşturmadığını ve hipotalamus ve hipokampüste SMF 3A ve reseptörleri üzerinde opioiderjik tonik baskılamanın olmadığını gösterdi. Morfin uygulaması hipotalamusta ve hipokampüste SMF 3A ve reseptörlerinin düzeyini belirgin olarak arttırdı. Bu durum, endojen B-endorfin veya morfin gibi mü opioit reseptör agonistlerinin beyin dokusunda belli düzeyde yükselmesinin sonucunda SMF 3A, NRF1 ve PLA1 ekspresyon düzeyini arttırabileceğini, bu artışın da semaforinerjik aktivasyonla beraber, nöronal entegrasyon ve nöronlar arası bağlantısallığın belirgin düzeyde azalmasına yol açması kuvvetle muhtemeldir. 
Anahtar Kelimeler. Hipotalamus, Hipokampus, SMF 3A, Nörofilin 1, Pleksin A1.

Abstract:
It was aimed to investigate the SMF 3A, NRF1 and PLA1 gene expression levels in hypothalamus and hippocampus tissues by inducing experimental morphine addiction in rats. 
In the present study, 48 male Wistar rats with an average weight of 300-350 g were used. The rats were randomly divided into 4 groups with 12 rats in each group. The control group was injected with saline, the morphine group with 10 mg/kg/day morphine sulphate, the naloxone group with saline, and the morphine + naloxone group with 10 mg/kg/day morphine sulphate subcutaneously for 5 days. 1.5 hours after these injections, SF was injected into the control and morphine groups at the same dose, naloxone was injected into the naloxone and morphine+naloxone groups and they were subjected to behavioural test. The gene expression levels of SMF 3A, NRF1 and PLA1 receptors in the hypothalamus and hippocampus tissues of all rats were analysed by quantitative RTPCR. All data obtained were analysed using Instat Statistical Package (Instat Graphad Software 8.0.1, San Diago, CA, USA). Shapiro-Wilk test was used to test the normality of the data. One-way ANOVA followed by Tukey's pairwise multiple comparison test was used for normally distributed data with equal group variances. Kruskal-Wallis test followed by Dunn's pairwise multiple comparison test was used for abnormally distributed data. Initial and final weight comparison of animals was performed by two-way ANOVA test. 2-ΔΔCT values are given as mean ± standard error of the mean (SEM) and results of behavioural experiments as mean ± standard deviation. p<0.05 was considered statistically significant.
Following the administration of naloxone to the experimental animals, morphine withdrawal behavioural signs were detected in rats. There was a significant difference between morphine group and morphine+naloxone group in the gene expression levels of SMF 3A, NRF1 and PLA1 receptors in both hypothalamus and hippocampus tissues. 
When we evaluated our results in general, we observed that both SMF 3A and its receptors NRF1 and PLA1 gene expressions increased in the morphine-treated group and, on the contrary, decreased significantly following the administration of naloxone to the morphine-treated group. The reversal of the result when an opioid antagonist was administered indicates that the effect of morphine is receptor mediated. If naloxan, as an opioid antagonist, had reversed the effect compared to the control, we could say that there is an endogenous muopioidergic activity in the brain, which produces a tonic effect and that this effect is eliminated only by naloxan administration. However, according to our findings, the fact that the values of naloxone and control group were very close to each other showed that only naloxone administration had no significant effect on SMF 3A and its receptors and there was no opioidergic tonic suppression on SMF 3A and its receptors in the hypothalamus and hippocampus. Morphine administration significantly increased the level of SMF 3A and its receptors in the hypothalamus and hippocampus. This suggests that endogenous B-endorphin or mu opioid receptor agonists such as morphine may increase the expression level of SMF 3A, NRF1 and PLA1 as a result of a certain level of opioid receptor agonists in brain tissue, and it is highly probable that this increase may lead to a significant decrease in neuronal integration and inter-neuronal connectivity with semaphorinergic activation. 
Keywords: Hypothalamus, Hippocampus, SMF 3A, Neurophilin 1, Pleksin A1.