Yüksek sıcaklık ve PH'da aktif yeni bir kimerik ksilanazın  oluşturulması ve karakterizasyonu
Construction and characterization of a new chimeric xylanase active at high temperature and PH
Yazar: MERVE TUNÇEL
Danışman: PROF. DR. SABRİYE ÇANAKÇI
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Halofilik bakteriler = Halophilic bacteria ; Rekombinant DNA teknolojisi = Recombinant DNA technology ; Termofilik bakteriler = Thermophilic bacteria

Özet:
Bu çalışmada, Bacillus halodurans C-125 ve Geobacillus sp. TF16 ksilanaz genleri PCR'la çoğaltıldı. Bu genler PGEMT-Easy vektörüne klonlandı ve sekans analizi yapılarak istenen gene ait diziler oldukları belirlendi. Daha sonra B. halodurans C-125 bakterisine ait ksilanaz geni E. coli ekspresyon vektörü olan pET20b(+)'ye aktarıldı. Fakat B. halodurans C-125 ksilanazında ekspresyon görülmedi. Geobacillus sp. TF16 ksilanaz geni ise pET20b(+) vektörüne aktarılamadığından, ksilanaz proteini bakteriden doğrudan elde edildi. TF16 ksilanazı amonyum sülfat çöktürmesi ve iyon değişimi kolon kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. TF16 ksilanaz enzimi optimum pH, optimum sıcaklık ve kinetik parametreler açısından değerlendirildi. Enzimin optimum pH'sı; 9.0, optimum sıcaklığı; 70 °C, Km; 6,86± 0,615 mg/ml, Vmax; 720,24± 22,99 U/mg olarak hesaplandı.
B. halodurans C-125 ve Geobacillus sp. TF16 ksilanaz genleri kullanılarak DNA shuffling yöntemini temel alan bir yaklaşımla kimerik ksilanaz genleri oluşturuldu. Bu kimerik genler; GeoInH2CTer, GeoInH2CTer2, GeoIntraH2Int3 ve GeoIntraH2Int4 olarak isimlendirildi. Kimerik genler pET28a(+) ekspresyon vektörüne aktarılarak, E. coli BL21 (DE3) suşu içerisinde çoğaltıldı. Aktarım sonucunda GeoIntraH2Int3 ve GeoIntraH2Int4'de ekspresyon görülürken, GeoInH2CTer, GeoInH2CTer2'de ekspresyona rastlanmadı. GeoIntraH2Int3'ün optimum sıcaklığı 60 °C, pH'sı 8,0, GeoIntraH2Int4'ün optimum sıcaklığı 50-60 °C, optimum pH'sı ise 8,0-10,0 olarak bulundu.

Anahtar Kelimeler: Bacillus halodurans C-125, Geobacillus sp. TF16, DNA shuffling, Kimerik gen

Abstract:
In this study, the xylanase genes of Bacillus halodurans C-125 and Geobacillus sp. TF16 were amplified with PCR. These genes were cloned into the pGEMT Easy cloning vector and the sequences of the genes were revealed. After that the B. halodurans C-125 xylanase gene was cloned into pET20b(+) expression vector, but there was no expression in B. halodurans C-125 xylanase gene. Because Geobacillus sp. TF16 xylanase gene can't transferred into pET20b(+) vector, the protein harvested directly from bacteria. The purification of TF16 xylanase has been performed by ammonium sulphate precipitation and ion-exchange column chromatography. Optimum pH, optimum temperature and kinetic parameters of the enzyme were determined. Optimum pH was 9.0, optimum temperature was 70 °C and Km, Vmax values were 6,86 ± 0,615 mg/ml, 720,24 ± 22,99 U/mg, respectively.
Chimeric xylanase genes were constructed from B. halodurans C-125 and Geobacillus sp. TF16 genes with a method based on DNA shuffling. These chimeric genes were named as GeoInH2CTer, GeoInH2CTer2, GeoIntraH2Int3 and GeoIntraH2Int4. Chimeric genes were cloned into pET28a(+) expression vector. GeoIntraH2Int3 and GeoIntraH2Int4 were succesfully expressed in E. coli BL21 (DE3), but there was no expression for GeoInH2CTer and GeoInH2CTer2. Optimum temperature of GeoIntraH2Int3 and GeoIntraH2Int4 were 60 °C, 50-60 °C and optimum pH of them were 8,0 and 8,0-10,0, respectively


Key Words: Bacillus halodurans C-125, Geobacillus sp. TF16, DNA shuffling, Chimeric gene