Poliester fiber destekli dolgulu reaktörlerde hibridoma kültürü ve monoklonal antikor üretimi
Hybridoma culture and monoclonal antibody production in polyester fiber packed bed reactors
Yazar: ESİN ASLANKARAOĞLU AKÇAEL
Danışman: PROF.DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
POL ESTER F BER DESTEKL DOLGULU REAKTÖRLERDE H BR DOMAKÜLTÜRÜ VE MONOKLONAL ANT KOR ÜRET MEsin Aslankaraoğlu AkçaelÖZETSunulan tez çalışmasında, endüstriyel boyutta monoklonal antikor (MAb) üretimineyönelik olarak hibridoma hücrelerinin immobilize edildiği poliester fiber destekli veserumsuz kültür sistemlerinin kullanılabilirliği araştırılmıştır. Bu amaçla şapvirüsüne karşı MAb üreten hibridoma hücre hattı ile dokunmamış (nonwoven)poliester fabrik diskler (NWPF) üzerinde hücre kültür çalışmalarıgerçekleştirilmiştir.Tez kapsamındaki çalışmaların ilk aşamasında, hücreler %10 serum içeren RPMIbesi ortamı kullanılarak, durgun koşullarda, disksiz ve diskli Petri kaplarında(çalışma hacmi=5ml) üretilmişlerdir. Bu koşullarda disksiz ve diskli Petrikaplarındaki hücreler sırasıyla 0.048 ve 0.027 saat-1 özgül üreme hızları ileyaklaşık aynı maksimum hücre konsantrasyonuna (~2x106 hücre.ml-1)ulaşmışlardır. Disksiz hücrelerin özgül glukoz tüketim hızları (0.246 Âµmol 10-6hücre-1 saat-1) da diskli hücrelerinkinden 2 kat daha yüksek bulunmuştur. Bununlabirlikte diskli kültürlerin canlılık indeksleri (197.4 x106 hücre.saat.ml-1) %40 dahayüksek olup, ELISA sonuçları da kültür sonunda daha yüksek MAb miktarınaulaşıldığını göstermiştir (0.548 mg) .Serumlu besi ortamı ile yapılan süspanse kültür çalışmalarında, hücreler farklıkonsantrasyonlarda (5.0g.L-1, 7.5g.L-1, 10.0g.L-1) disk içeren dolgulu karıştırmalıreaktörlerde (çalışma hacmi=500 mL) üretilmiştir. Hacimsel besin tüketim ve ürünüretim analizleri sonucu, disk konsantrasyonu arttıkça daha hızlı hücre üremesi veyüksek hücre konsantrasyonuna ulaşıldığı saptanmış ve en yüksek maksimumMAb konsantrasyonu (176 mg.L-1) ve kümülatif MAb miktarı (175 mg) 10.0g.L-1disk içeren reaktörde elde edilmiştir. Ancak bu reaktörde yüksek üreme hızı laktatmiktarını arttırdığı ve pH kontrolünü zorlaştırdığından, daha dengeli bir üremeninmeydana geldiği ve yeterince yüksek MAb veriminin (161mg) elde edildiği 7.5g.L-1disk konsantrasyonundaki reaktörün uzun süreli kültür ve MAb üretimi için dahauygun olduğu sonucuna varılmıştır.Sonraki aşamada düşük serumlu ve serumsuz koşullarda MAb üretimi amacıylahibridomaların bu ortamlara adaptasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu amaçlaiki farklı adaptasyon yöntemi uygulanmış ve kombine besi ortamı formülasyonu ileçok aşamalı olarak yapılan adaptasyon yönteminin başarılı olduğu belirlenmiştir.Adapte edilmiş hücrelerle, düşük serumlu (%2) besi ortamında gerçekleştirilendurgun kültürlerde, disksiz ve diskli hücrelerin üreme hızlarının (sırasıyla 0.020 ve0.016 saat-1) her iki durumda da serumlu koşullardakinden daha düşük olduğu veözellikle disksiz ortamdaki düşüşün daha önemli olduğu belirlenmiştir. Disksizkültürlerin besin tüketim hızları değişirken, diskli kültürlerde yaklaşık olarak sabitkalmıştır. %2 serumlu ortamda, disksiz ve diskli kültürlerin özgül MAb üretimhızları (sırasıyla 1.03 ve 1.10 Âµg 10-6 hücre-1saat-1) ise, serumlu koşullara göresırasıyla %12 ve % 75 artış göstermiş ve sonuç olarak diskli ortamda kültürsonunda daha yüksek miktarda MAb (1.59 mg) elde edilmiştir.Serumsuz koşullarda yürütülen durgun kültür çalışmalarında ise, diskli kültürlerinüreme hızları (0.018 saat-1), düşük serumlu ortama göre %11 artarken, disksizkültürlerinki sabit kalmıştır. Ayrıca diskli kültürlerde maksimum hücrekonsantrasyonu ve kültür süresi de uzun olduğundan disksiz hücrelere göre %32daha yüksek canlılık indeksine (105.5x106 hücre.saat.ml-1) ulaşılmıştır. Disklikültürde maksimum MAb konsantrasyonu 10. günde 148 mg.L-1'ne ulaşırken,disksiz kültürde 7.günde ~90 mg.L-1'de kaldığı saptanmıştır. Özgül MAb üretimhızları ise her ikisi için de düşük serumlu ortama göre yaklaşık %30 oranındaartmıştır. Ancak serumsuz besi ortamının neden olduğu stres yüzündenkültürlerde, diğer serumlu ve düşük serumlu koşullara göre (%) hücre canlılığıoranları ve kültür sürelerinin daha düşük olduğu gözlenmiştir.Serumsuz, süspanse koşullarda gerçekleştirilen 7.5g.L-1 disk konsantrasyonunasahip reaktör kültürlerinde hücre üreme hızının, serumlu koşullara göre dahayavaş olduğu, ancak kültür süresinin uzamasına bağlı olarak MAb üretiminin uzunsüre devam edebildiği saptanmıştır. Serumsuz koşullarda hücreler çok dahahassas olduğu için poliester fiber disklerde immobilizasyon hücrelerin üreme veMAb üretimini destekleyerek avantaj sağlamıştır.Son bölümde ise özellikle serumsuz kültür koşullarında çok hassas olan hücrelerincanlılığını arttırmak ve MAb üretimini zenginleştirmek için, hibridoma hücrelerineanti-apoptotik (programlı hücre ölümünü engelleyici) Bcl-2 geni transfeksiyonugerçekleştirilmiştir. Karşılaştırma amacıyla yürütülen kesikli kültürlerde,transfeksiyon sonucu elde edilen hücre hattının, orijinal hücre hattıyla yaklaşıkaynı maksimum hücre yoğunluğu ve üstel faz süresine sahip olduğu saptanmıştır.Üstel fazdan sonra orijinal ve kontrol transfektan hücreler 8.günde tamamenölmelerine rağmen, Bcl-2 transfektan hücrelerinin yaklaşık 72x104 hücre.ml-1 hücrekonsantrasyonu ile, tükenmiş glukoza rağmen canlılıklarını devam ettirdikleribelirlenmiştir. Bcl-2 transfektan hücrelerin MAb üretiminin de devam ettiği vesonuçda daha yüksek MAb konsantrasyonuna ulaşıldığı bulunmuştur.Anahtar Kelimeler: Hibridoma, monoklonal antikor (MAb), dokunmamış fabrik,fiber dolgulu reaktör, serumsuz kültür.Danışman: Prof.Dr. Menemşe GÜMÜŞDEREL OĞLU, Hacettepe Üniversitesi,Kimya Mühendisliği Bölümü.

Abstract:
HYBRIDOMA CULTURE AND MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION INPOLYESTER FIBER PACKED BED REACTORSEsin Aslankaraoğlu AkçaelABSTRACTIn this study, polyester fiber supported serum free culture system has beendeveloped to culture hybridoma cells for large scale production of monoclonalantibody (MAb). For this purpose, cell culture studies were performed by usinghybridoma cell line producing MAb against Foot and Mouth Disease virus onnonwoven polyester fabric (NWPF) discs.In the first part of study, cells were produced by using RPMI medium containing10% serum, in Petri dishes (operation volume=5ml) with and without disc atstationary conditions. At these conditions, the specific growth rates of cells were0.048 and 0.027 hour-1, in the presence and absence of disc, respectively and thecells reached approximately to the same maximum cell concentration (~2x106cell.ml-1). It was indicated that the specific glucose consumption rates of disc-freecells (0.246 Âµmol 10-6 cell-1 hour-1) were two times higher than cells on disc. Onthe other hand, the viability index of disc cultures were 40% higher (197.4 x106cell.hour.ml-1) and also ELISA tests showed that a higher final MAb quantity(0.549mg) was reached at the end of the cultivation.In suspension cultures using serum containing media, the cells were produced inpacked-bed stirred reactors (operation volume=500ml) including different discconcentrations (5.0g.L-1, 7.5g.L-1, 10.0g.L-1). From the results of volumetric nutrientconsumption and product producing analysis, it was determined that higher cellgrowth rate and higher cell concentration can be established by increasing discconcentration. Additionally, the highest cumulative MAb production (175mg) wasachieved at the reactor, in which 10.0g.L-1 disc included. Hovewer, it was realizedthat higher growth rate causes increasing lactate level and also make pH controldifficulty. By taking into account its moderate growth level and sufficient MAbefficiency (161mg), the reactor with 7.5g.L-1-disc concentration was proposed asfor the long-term cultivation and MAb production.Furthermore, adaptation studies of hybridoma cells to grow in reduced-serum andserum-free medium to produce MAb was carried out. For this purpose, twodifferent kinds of adaptation methods were applied and the multi-step adaptationmethod, which uses combined medium formulation, gave pretty good results.In the next part of study, stationary cultures were studied by using adapted cells toreduced-serum (2%) medium. It was determined that the growth rates of cells withdisc and disc-free (0.020 and 0.016 hour-1, respectively) were both lower than thatof the cells in medium containing 10% serum. Especially, disc-free media causemuch significant growt rate decrease. Nutrient consumption rate of disc cultureswas approximately constant while there was a change in disc-free cultures. In the2% serum medium, the specific MAb production rates of disc and disc-freecultures (1.03 and 1.10 Âµg 10-6 cell-1hour-1, respectively) showed 12% and 75%increase, respectively corresponded with serum media. Consequently, higher MAbproductivity (1.59mg) was obtained through the disc media at the end of thecultivation.The studies realized in serum-free medium and stationary conditions showed thatthe specific growth rate of disc cultures (0.018 hour-1) increased 11% compared tothe reduced-serum cultures while disc-free cultures kept it constant. Additionally,because of the high maximum cell concentration and long-time culture period ofdisc-cultures, they had 32% higher viability index (105.5x106 cell.hour.ml-1) ascompared with disc-free cells. It was determined that maximum MAb concentrationin disc cultures was 148 mg.L-1 on day 10 while the MAb concentration in disc-freeculture reached ~90 mg.L-1 on day 7. Specific MAb production rates were alsoincreased approximately 30% for both when corresponding with reduced-serumcultures and it was found that the final MAb quotient in disc-cultures were higherthan that of the disc-free cultures. However, it was observed that the (%) cellviability values and cultivation periods were much lower in serum-free culturesthan that of the serum-containing and reduced serum containing media becauseof stress caused by serum-free medium.In serum free and suspended conditions, the reactor cultures containing 7.5gL-1disc had lower cell growth rate than serum cultures. On the other hand, MAbproduction could continue for a long time due to long culture life span. Since thehybridoma cells are much sensitive in serum-free media, immobilization inpolyester fiber disc carriers had an advantage to support growth and MAbproduction of cells.In the last part of the study, anti-apoptic (preventing programmed cell death) Bcl-2gene transfection to hybridoma cells was executed to increase viability and enrichMAb production of cells, which are very sensitive especially in serum-freeconditions. In batch cultures carried out to make a comparison, it was determinedthat transfectant Bcl-2 cell line had a same maximum cell density and sameexponential phase period with original cell line. It was also found that after theexponential phase, original and transfectant-control cells were completely deadon day 8, however Bcl-2 transfected cells with approximately 72x104 cell.ml-1 cellconcentration were still survived in the glucose-depleted medium. The resultsshowed that Bcl-2 transfected cells supported the long term MAb production andthus the realtively high MAb concentrations were obtained.Key words: Hybridoma, monoclonal antibody (MAb), nonwoven fabric, fiberpacked reactor, serum free culture.Supervisor: Prof.Dr.Menemşe GÜMÜŞDEREL OĞLU, Chemical EngineeringDepartment, Hacettepe University.