Chilo iridescent virüs muhtemel apoptosis inhibitör genlerinin araştırılması ve fonksiyonel analizi
Functional analysis of a putative inhibitor genes of apoptosis (IAP) encoded by Chilo iridescent virus
Yazar: İKBAL AGAH İNCE
Danışman: PROF. DR. ZİHNİ DEMİRBAĞ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Programlanmış hücre ölümü böcek hücrelerinin viral enfeksiyonlara karşı geliştirdiği başlıca savunma mekanizmalarından biridir. Virüslerin konak hücrede etkin bir enfeksiyon oluşturabilmesi, konak hücrelerin viral enfeksiyona karşı yanıt oluşturduğu apoptosis mekanizmasının baskılanabilmesiyle doğrudan ilişkilidir. Chilo iridescent virüs (CIV) genomunun analizi sonrasında üç ORF`nin baculovirus Cydia pomonella granülovirüs genomunda bulunan apoptosis inhibitör genlerine (iap) yüksek oranda homoloji gösterdiği belirlenmiştir. Bu ORF`ler 157L, 193R ve 332L sırasıyla 152, 208 ve 234 amino asitlik proteinleri kodlamaktadır. Bu proteinler Cydia pomonella granülovirüs IAP-3 proteiniyle homolojiye sahiptir. ORF 193R tarafından kodlanan proteinin amino ucunda baküloviral inhibitör motifi (BIR) ve karboksi ucunda da RING finger motifi belirlenmiştir. CIV genomu içerisinde belirlenen baküloviral inhibitör tekrar İridoviridae familyası içinde şu ana kadar tüm genom analizi tamamlanan 12 üye içerisinde ilk ve tek baküloviral inhibitör motifidir (BIR). RT-PCR analiziyle genin transkriptomik analizi, transkripsiyon başlama noktası ve 5`UTR bölgesi tespit edilmiştir. İnhibitörler varlığında gerçekleştirilen enfeksiyonlarla da genin transkripsiyon sınıfı belirlenmiştir. SPC-BM-36 ve Sf21 hücrelerinde baküloviral en erken promotor ie1 kontrolünde genin geçici ifadesi sağlanarak aktinomisin D ile teşvik edilen apoptosisin baskılanması üzerinde genin etkinliği belirlenmiştir. CIV`nin genetik viral 193R mutantı RNAi tekniği kullanılarak oluşturulduktan sonra gen aktivitesinin doğal enfeksiyondaki durumu tespit edilmiştir. Sonuç olarak, biyoinformatik analizler sonucunda apoptosis inhibitör geni olduğu düşünülen ORF 193R`nın ?en erken? gen grubunda ifade edildiği, transkripsiyonun enfeksiyon sonrası 0-36. saatler arasında gerçekleştiği, transkripsiyon başlangıç noktasının -18. pozisyonundaki adenin (A) bazı olduğu ve genin fonksiyonel bir apoptosis inhibitör proteini kodladığı belirlenmiştir.

Abstract:
Programmed cell death or apoptosis is a major defense mechanism used by insects in response to viral infections. Viruses can only successfully infect the host if they inhibit this apoptosis. The genome of Chilo iridescent virus (CIV) has three ORFs with homology to baculovirus inhibitor of apoptosis (iap) genes. The proteins encoded by the 157L, 193R, and 332L genes contain 152, 208 and 234 amino acids, respectively, and shares homology to the IAP-3 protein of Cydia pomonella granulovirus. The protein encoded by ORF 193R contains a BIR motif (baculoviral iap repeat) in the amino-terminal segment and a carboxy-terminal RING finger motif. The presence of a BIR domain in a CIV open reading frame is a unique feature among Iridoviridae. Transcriptomic analysis of the gene by RT-PCR allowed us to determine the transcription start point and 5` UTR region of the gene. Transcription classes were determined in infection of Bombyx mori cells in the presence of inhibitors of DNA or protein synthesis and showed that CIV iap is an immediate-early gene. Transcription of the CIV iap gene initiated 18 nt upstream of the translational start site. When this putative CIV iap was transiently expressed in SPC-BM-36 and Sf21 cells under control of an early baculovirus promoter (ie1) it blocked apoptosis induced by actinomycin-D. RNA interference was used to knockdown the expression of 193R during CIV infection in SPC-BM-36 cells. The conclusion from these results is that CIV ORF 193R encodes a functional IAP protein.