TGF-β1 ile transfekte edilmiş pulpal kök hücre ve PRP uygulamasının kondrojenik diferensiasyon üzerine etkileri
Effects of TGF-β1 transfected pulpal stem cell and PRP application on chondrogenic differentiation
Yazar: HASAN SALKIN
Danışman: DOÇ. DR. NÜKHET KÜTÜK
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Dental pulpa = Dental pulp ; Kök hücreler = Stem cells ; Transfeksiyon = Transfection ; Transforme edici büyüme faktörleri = Transforming growth factors ; Transforme edici büyüme faktörü-beta = Transforming growth factor-beta ; Trombositten zengin plazma = Platelet rich plasma

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı, TGF- β1 ve PRP' nin kök hücrelerin kondrogenezinde etkili bir kaynak olabileceği hipotezinden yola çıkılarak TGF-β1 geni ile transfekte edilmiş tavşan dental pulpa kök hücrelerinin ve normal/kondrojenik medyum üzerinde PRP uygulamasının kondrojenik farklılaşma üzerindeki etkilerini araştırmaktır.
Gereç ve Yöntem: Tavşan diş pulpasından elde edilen MKH'ler akım sitometri, immün boyama, kantitatif Real Time PCR ve Farklılaşma testleri gibi analizlere tabi tutularak karakterize edildi. Hücreleri karakterize etmek için CD29, CD44 ve CD45 mezenkimal kök hücre belirteçleri kullanıldı. Çalışmamızda,   tavşan diş pulpasından elde edilen kök hücrelere elektroporasyon yöntemi ile TGF-β1 geninin transfeksiyonu yapıldı. %10 konsantrasyonda inaktif PRP eklenmiş normal medyum, kondrojenik medyum ve normal+kondrojenik medyum ile oluşturulan deney gruplarında dental pulpa kök hücrelerinin kondrojenik farklılaşması incelendi. Deney grupları arasında kondrojenik farklılaşma açısından PCR verileri, transfeksiyon etkinliği ve hücre canlılığı istatistiksel olarak karşılaştırıldı.
Bulgular: Dental pulpadan elde edilen kök hücrelerin CD29+, CD44+ ve CD45- oldukları akım sitometri, immünofloresan boyama, real time PCR ile tespit edildi. Ayrıca bu hücrelerin adipojenik ve osteojenik olarak farklılaştırıldıkları adipo red, alizarin red ve alkalen fosfataz pozitif boyanmaları ile gösterildi. TGF- β1 transfeksiyonu yapılan hücrelerde ve normal+kondrojenik medyuma PRP eklenen deney gruplarında SOX9, MM13, Aggrecan gen ekspresyonlarının çok erken günlerde arttığı ve kondrojenik farklılaşmada etkili olduğu tespit edildi. Deney gruplarında TGF- β1 transfekte hücreler ve PRP uygulanan hücrelerin safranin-O ve toludine blue ile ekstraselüler matrikslerinin pozitif boyandıkları tespit edildi. Gruplar arasında istatistiksel analizler sonucu anlamlı fark bulundu (p<0,05).
Sonuç: Dental pulpa kaynaklı kök hücrelerin kondrogenezinde TGF- β1 gen transferi ile PRP uygulaması etkili bir kaynaktır ve kondrojenik farklılaşmayı artırmaktadır.

Abstract:
Aim: The aim of this study was to evaluate the effects of normal and chondrogenic medium with PRP on chondrogenic differantiation of dental pulp stem cells (DPSCs)  that are transfected with TGF-β1 gene, based on the hypothesis of TGF- β1 and PRP can be effective on the chondrogenesis of stem cells.   
Materials and Methods: MSCs that were derived from rabbit dental pulp were characterized by using flow cytometry, immunofleurosan staining, cantitative Real Time PCR, and differantiation tests. For the characterization, CD29, CD44 and CD45 mesenchymal cell markers were used. Stem cells from the rabbit dental pulp were transfected with TGF-β1 gene using electroporation technique. Chondrogenic differantiation of dental pulp stem cells were evaluated in experimental groups in which normal medium with 10% inactive PRP, chondrogenic medium, and normal+chondrogenic medium were used. PCR data, transfection efficiency, and cell viability of different groups were analyzed statistically.
Results: CD29+,CD44+ ve CD45- dental pulp stem cells were confirmed by using flow cytometry, immunofleurosan staining, and cantitative Real Time PCR. Adipgenic and osteogenic differantiation of these cells were shown with adipo red, alizin red, and alkalyn phosphatase positive staining. The expression of SOX9, MM13 and Aggrecan genes increased earlier in TGF-β1 transfected cells, and in normal+chondrogenic medium with PRP, and these groups were effective in chondrogenic differantiation. The extracellular matrix of the cells which were transfected with TGF-β1, and which were subjected to PRP were positively stained with saphranin O and toluidine blue. Statistically significant difference was found between groups (p<0,05).
Conclusion: TGF-β1 gene transfection and PRP can be effective in chondrogenesis of dental pulp stem cells, and can enhance chondrogenic differantiation.