Ailesel dental transpoziyon olgularında ekzom dizileme yöntemi kullanılarak aday gen araştırılması
Candidate gene identification using whole exome sequencing method in familial dental transposition cases
Yazar: ABDURRAHMAN BALABAN
Danışman: PROF. DR. GÖKMEN KURT
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Ortodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2020
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry ; Genetik = Genetics
Dizin: Dizi analizi = Sequence analysis ; Diş anomalileri = Tooth abnormalities ; Diş hekimliği = Dentistry ; Ekzom dizileme = Exome sequencing ; Genler = Genes

Özet:
Amaç: Dental transpozisyon, diş sürme mekanizmasındaki bozulmaya bağlı olarak iki komşu dişin yer değiştirmesi şeklinde tanımlanmaktadır. Günümüze kadar çeşitli sınıflandırmalar yapılmıştır. Güncel sınıflamada ise tamamlanmış ve tamamlanmamış dental transpozisyon olmak üzere iki alt birime ayrılmaktadır. Dünya popülasyonundaki prevalansı %0,1-2,4 arasında olmakla birlikte, Türk popülasyonundaki prevalansı %0,1 ve %0,6 arasında değişmektedir. Genel olarak tek taraflı olarak görülmekte ve kadınlarda daha sık ortaya çıkmaktadır. Etiyolojisinde kalıtım, travma, migrasyon, vb. gibi teoriler yer almakla birlikte etiyolojisi günümüze kadar tam olarak aydınlatılamamıştır. Ancak ailesel kümelenme göstermesi, doğumsal kalıtımsal geçiş gösteren diş eksikliği (agenezi) gibi bazı dental anomalilerle yakın ilişkili olması ve dudak-damak yarığı (DDY) (%4-18)- Down (%3-15) sendromu gibi sendromlarla birlikte ortaya çıkması gibi sebeplerle kalıtımsal olabileceği bildirilmiştir. Fakat, genetik olarak bu anomaliye sebep olabilecek gen veya değişimleri (varyasyon) tespit etmeye yönelik herhangi bir çalışma yapılmamıştır. 
Bu tez çalışmasında sendromik olmayan ailesel dental transpozisyona sahip bireylerde; transpozisyona sebep olabilecek gen ve değişimlerin tespit edilmesinin yanı sıra, transpozisyonla birlikte görülen anomali ve sendromlara (agenezi, Down, DDY) sebep olan genlerdeki yeni değişimlerin saptanması amaçlanmıştır. 
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmaya 3 aileden toplam 6 birey (5E, 1K) dahil edilmiştir. Bireylerden DNA eldesi için swab çubuğu ile yanak epitelinden örnek alınmıştır. Bu örneklerden genomik DNA izole edilerek, kullanılan kitin protokolüne uygun olarak NovaSeq Illumina 6000 cihazı ile tüm ekzom dizileme (TED) yapılmıştır. Elde edilen veri biyoinformatik yöntemler ile analiz edilerek aday genler belirlenmiştir. Bu genler; daha önce bilinen genlerden olması, dental gelişimde rol oynayan bir yolağın içinde yer alması, dental transpozisyon ile akraba dental ageneziye bağlı bir yolağın içinde yer alması, DDY ve Down sendromu gibi dental transpozisyonun görüldüğü sendromlara sebep olan bir yolağın içinde yer alması, Minor Alel Frekans değerinin popülasyon çalışmalarıyla uyumluluk göstermesi (MAF<%0,6) gibi kriterler kullanılarak yorumlanmıştır.
Bulgular: Çalışmaya katılan bütün bireylerde etkilenen dişlerden bir tanesinin kanin diş olduğu, transpozisyonun sağ ve sol tarafta eşit olmak üzere tek taraflı olarak ortaya çıktığı, kadınlarda daha çok görüldüğü tespit edilmiştir. Dental transpozisyonun gömük diş, sürme gecikmesi, persiste süt dişi ve konjenital 3. molar agenezi ile birlikte görüldüğü bulunmuştur. Ancak 3. Molar dışında herhangi bir agenezi (özellikle lateral dişlerde) veya peg-shape lateral dişe rastlanmamıştır.
Daha önce dental gelişimde rol oynadığı bildirilen DSPP, DSP, GLI3 PRICKLE2 genlerinde, dental transpozisyona sebep olabileceği düşünülen değişimler saptanmıştır.
DSPP genindeki değişimlerin otozomal dominant (OD) dentinogenesis imperfekta, dentin displazisi gibi gibi dokusal problemlere yol açtığı bilinmektedir. Bizim bireylerimizde de homozigot karakterde DSPP değişimleri bulunmasına rağmen bu tip hastalıklar görülmemiştir. Bu sebeple bu genin dental transpozisyonda rol oynama ihtimali düşük görülmektedir. Ancak DSPP geninde ayrıca heterozigot bir değişimin bulunması ve DSPP'nin WNT yolağı ile ilişkisi sebebiye agenezi mekanizmasında rol oynayabileceği göz önüne alındığında dental transpozisyon mekanizmasında etkili olabileceği düşünülmüştür. Sanger dizi analizi ve segregasyon analizi ile doğrulama çalışmaları gerekmektedir. 
Yine DSP ve GLI3 genlerinin dental gelişimde rol aldıkları, sendromik ve sendromik olmayan agenezi-oligodonti ile ilişkilendirildikleri bilinmektedir. Bu değişimlerin görüldüğü bireylerde bu genlerde homozigotik karakterde değişimler bulunmasına rağmen hipodonti-agenezi görülmemiştir. Fakat DSP ve GLI3'ün dental gelişimde rol oynaması, GLI3 geninin dental gelişimde önemli bir görev gören SHH yolağı ile ilişkili olması, yine GLI3 geninin kraniyofasiyal iskeletsel morfolojinin belirlenmesinde etkili olabileceği düşünülmesi sebebiyle bu iki genin de dental transpozisyon mekanizmasında düşük de olsa etkili olabileceği düşünülmüştür. Ancak etkilenmemiş aile bireylerinin de dahil olduğu bir gruba Sanger dizi analizi ve segregasyon analizi ile bu durumun doğrulanması gerekmektedir.
PRICKLE2 geninin düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sisteminde görev alması, hücresel davranış, sinyalizasyon ve biyolojik süreçlerde yer alması ve amelogeneziste rol oynaması sebebiyle dental transpozisyon mekanizmasında görev alabileceği düşünülmüştür. Bu değişimin bireylerde heterozigot karakterde görülmesi de OD geçişli bir anomali olabileceğini ve hafif bir fenotip olarak dental transpozisyonun ortaya çıktığını düşündürmüştür. PRICKLE2 geninin dental transpozisyonun yanı sıra diğer dental anomalilerin oluşmasında da rol oynayabileceği düşünülmüştür. Çünkü PRICKLE2 değişimi tespit edilen ailedeki indeks bireyde dental transpozisyona ilave olarak 3. molar eksikliği, diş gömüklüğü, sürme gecikmesi, mandibular retrognati, üst keser retroklinasyonu; ebeveynde ise ilave olarak 3. molar eksikliği tespit edilmiştir. Ayrıca PRIKCLE2 geni ageneziye, kötü şekilli dişlere ve kök eksikliğine sebep olan WNT yolağında yer almaktadır. Bu bilgiler ışığında en muhtemel adayımız olarak PRICKLE2 geni görülmüştür. Ancak kesin sonuçlara ulaşabilmek amacıyla bu genin dental transpozisyon göstermeyen aile bireylerinin de dahil olduğu tüm aile üzerinde yapılacak Sanger dizi analizi, segregasyon analizi ile doğrulanması ve sağlıklı popülasyonlar üzerinde yapılacak ileri çalışmalarla kesinleştirilmesi ve hayvan modelinde fonksiyon testleri yapılması planlanmaktadır.
Bunlara ilave olarak Gli3 eksikliği olan farelerde DDY görülmesi, SHH yolağında yer alan GLI3 ve WNT yolağında yer alan PRICKLE2 genlerinin Down sendromunda salınımının değiştiğinin bilinmesi, ailesel dental transpozisyonun bu hastalıklarda subklinik fenotipik bir dışavurum olabileceği düşünülmüştür. Ancak özellikle DDY'de literatürle uyumlu olarak; dental anomalilerin daha çok yarık bölgesindeki alveolar kretlerin ve diş germlerinin yer değiştirmesi, cerrahi işlemler sebebiyle oluşan skar dokusunun etkisiyle maksiller gelişim yetersizliği görülmesi gibi çevresel etmenler sebebiyle oluşmasının daha muhtemel olduğu öngörülmüştür. 
Dental gelişimde çok önemli rol oynadığı bilinen ve daha önce mandibular kanin transpozisyonunda etiyolojik faktör olabileceği düşünülen MSX1 ve PAX9 genlerinde herhangi bir anlamlı değişim bulunamamıştır. 
Sonuç: Bu tez çalışmamızda dental transpozisyonun daha çok maksiller kaninlerde, sağ ve solda eşit olmak üzere tek taraflı, daha çok kadınlarda görülmesi gibi genel literatür bilgileriyle uyumlu sonuçlar elde edilmiştir. Diş gelişimi ve herediter karaktere sahip dental agenezi mekanizmasında görev alan bazı genlerde değişimler saptanması ve ailesel kümelenme sebebiyle dental transpozisyonun da OD geçişli kalıtımsal bir karakter gösterebileceği tespit edilmiştir. Diş gelişiminin karmaşık yapısı sebebiyle dental transpozisyon oluşumunda tek bir gen değil de multifaktöriyel etkileşimlerin görev aldığı düşünülmüştür. Ancak kesin sonuçlar için daha ileri aile çalışmalarına ihtiyaç duyulduğu tespit edilmiştir. Ayrıca etkilenen tüm dişlerin maksiller kaninler olması sebebiyle migrasyon teorisinin de göz ardı edilmemesi gerektiği ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada kullanılan TED yönteminin aday gen belirlemede efektif olduğu bulunmuştur. Elde edilen bulguların dental gelişimin daha iyi anlaşılmasına önayak olacağı, böylece bu tip anomali ve maloklüzyonlara farklı bir bakış açısı getirilerek erken dönemde en uygun teşhis ve tedavi imkânı sunulabileceği değerlendirilmiştir.

Abstract:
Aim: Dental transposition is defined as the displacement of two adjacent teeth due to the disruption in the tooth eruption mechanism. Although different classifications have been made by different authors about the classification of dental transposition, it is generally accepted that dental transposition is divided into two sub-classes as completed and incomplete. While its prevalence in the world population is between 0.1-2.4%, in the Turkish population is between 0.1-0.6%. It is seen unilaterally in the permanent dentition and it is more common in women, differing between genders. There are several theories such as heredity, trauma, migration, etc. in etiology. Because of dental transposition is closely related to some dental anomalies such as congenital agenesis (hereditary tooth deficiency), shows familial clustering (familial agenesis) and occurs together with syndromes such as cleft lif-palate (CLP) (4-18%)- Down (3-15%) syndrome, the most widely accepted among of these theories has been the heredity. However, which of these theories is correct has not been clarified until today. In addition, no study has been found in the current literature to report genes or variations that may play a role in the pathway of dental transposition.
In this thesis, in individuals with non-syndromic familial dental transposition; it was aimed to determine the genes and variations that cause dental transposition, also new variations in genes that cause anomalies and syndromes (agenesis, Down, CLP etc.) associated with dental transposition.
Materials and methods: A total of 6 individuals (5F, 1M) from 3 families were included in this study. To obtain DNA from individuals, samples were taken from the buccal epithelium with a swab stick. Genomic DNA was isolated from this sample and the whole exome sequencing (WES) was performed with the NovaSeq Illumina 6000 device in accordance with the protocol of the kit. Candidate genes were determined by analyzing the obtained data with bioinformatics methods. These genes were filtered and interpreted using the following criteria: being from previously known genes, located in a pathway that plays a role in dental development, located in a pathway dental agenesis related to dental transposition, located in a pathway that causes CLP and Down syndrome, the Minor Allele Frequency value is consistent with population studies (MAF <0.6%).
Results: Transposition appeared unilaterally and equally on the right and left sides, and it was more common in women, in accordance with the literature,. It was found that dental transposition was seen with impacted tooth, eruption delay, persistent deciduous tooth and congenital 3rd molar agenesis. However, no agenesis other than the 3rd Molar (especially in lateral teeth) or peg-shape lateral teeth was found. Also in all individuals participating in the study, it was determined that one of the affected teeth was maxillary canine.
Candidate variants for dental transposition pathway were detected in DSPP, DSP, GLI3 and PRICKLE2 genes, which were previously reported to play a role in dental development.    
Variants in the DSPP gene cause structural abnormalities such as autosomal dominant (AD) dentinogenesis imperfecta and dentin dysplasia. Although DSPP variants of homozygous character were found in our individuals, such clinical diseases were not observed. For this reason, it seems unlikely that this gene plays a role in dental transposition. However, considering that there is also a heterozygous variant in the DSPP gene and that DSPP may play a role in the agenesis mechanism due to its relationship with the WNT pathway, it is thought that it may be effective in the dental transposition mechanism, albeit low. Verification studies with Sanger sequence analysis and segregation analysis are required.
DSP and GLI3 genes play a role in dental development and are associated with syndromic and non-syndromic agenesis-oligodontics. Although variants in these genes were seen in two of the individuals in our study in homozygous character, hypodontics-agenesis was not observed in these individuals. For this reason, the probability of these two genes to play a role in the dental transposition pathway is unlikely. But it is known that DSP and GLI3 play a role in dental development, the GLI3 gene is associated with the SHH pathway, which plays an important role in dental development, and the GLI3 gene is thought to be effective in determining craniofacial skeletal morphology. So this situation should be verified by Sanger sequence analysis and segregation analysis for a group including unaffected family members.
PRICKLE2 gene plays a role in the planar cell polarity (PCP) system, participates in cellular behavior, signaling and biological processes, and takes part in amelogenesis For this reason, it is thought that it can take part in the dental transposition mechanism. The fact that this variant is seen in heterozygous character in individuals suggests that it may be an AD inherited anomaly and dental transposition appears as a mild phenotype. In addition, dental impaction, eruption delay, 3rd molar agenesis, mandibular retrognathy, upper incisor retroclination in the index individual and 3rd molar agenesis in the parent together with dental transposition; it suggests that the PRICKLE2 gene may play a role in the cause of other dental anomalies. Also PRICKLE2 gene is located in the WNT pathway that causes agenesis, malformed teeth and root agenesis. In the light of these findings, PRICKLE2 gene seems to be our most likely candidate. However, in order to reach definitive results, it is planned to verify this gene with Sanger sequence analysis, segregation analysis to be carried out on the whole family, including family members who do not show dental transposition, and to be confirmed by further studies on healthy populations and to perform functional tests in animal model.
Gli3 deficient mice are seen CLP, and the expression of GLI3 gene in the SHH pathway and PRICKLE2 gene in the WNT pathway changes in Down syndrome. Therefore, familial dental transposition is thought to be a subclinical phenotypic in these diseases. However, especially in CLP in accordance with the literature; it has been predicted that dental anomalies are more likely to occur due to environmental factors such as the displacement of alveolar crests and tooth germs in the cleft region, and maxillary growth failure due to the effect of scar tissue caused by surgical procedures.
No significant variants were found in MSX1 and PAX9 genes, which are known to play a very important role in dental development and were previously thought to be an etiological factor in mandibular canine transposition.
Conclusions: In this thesis, results were obtained in accordance with the general literature information such that dental transposition is mostly seen in maxillary canines, unilateral, equally on the right and left sides, mostly in women. It has been determined that dental transposition may also show AD inheritance due to variants in some genes involved in tooth development and dental agenesis mechanism, which has a hereditary character, and due to familial clustering. Because of the complexity of tooth development, it was thought that the occurrence of dental transposition was caused by multifactorial interactions rather than a single gene disorders. But it was determined that further family studies were needed. Surprisingly, since all the affected teeth are maxillary canines, it is thought that the migration theory should not be ignored. The WES method used this study was thought to be effective in determining candidate gene. The findings of this thesis obtained will lead to a better understanding of dental development. Thus, by bringing a different perspective to these types of anomalies and malocclusions, the most appropriate diagnosis and treatment opportunity will be provided in the early period.