siRNA taşınımında kullanılmak üzere yıldız tipi polimerlerin sentezi ve karakterizasyonu
Synthesis and characterization of star shaped polymers to be used in siRNA delivery
Yazar: SERHAT ÖZTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. LOKMAN UZUN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
siRNA temelli RNA interferans mekanizmasından faydalanılarak gen ifadelenmesinin baskılanması, spesifik genlerin temel işleyişlerini ortaya çıkarmada kullanılmakla birlikte buna ek olarak viral enfeksiyonlar, genetik, kardiyovasküler rahatsızlıklar ve kanser gibi hastalıklar üzerinde etkiye sahip bir gen tedavisi uygulamasıdır. Günümüzün en önemli ve ölümcül hastalıklarından olan kanser, her yıl on binlerce insanın hayatını tehdit etmekte ve bu rakamlar her geçen yıl artmaktadır. Kanser hastalığı ile mücadele için birçok geleneksel yöntem olması ile birlikte; bu yöntemlerin hastalar üzerinde olumsuz etkiler göstermesi, kanser tedavisi üzerine yoğunlaşan araştırmacıları yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yöneltmektedir. Bu yan etkilerin başında günümüzde kullanılan geleneksel tedavi yöntemlerinin kanser hücreleri ile birlikte sağlıklı hücrelere de zarar vermesidir. Son yapılan çalışmalarda bu sorun üzerine yoğunlaşılmış ve kanser hücrelerini hedeflemeyi amaç edinen yöntemler geliştirilmiştir. Geliştirilen bu yeni nesil kanser hücresi odaklı yöntemlerden birisi de siRNA tedavisidir. siRNA tedavisi yöntem olarak doğrudan sorunlu gene mRNA düzeyinde etki ederek potansiyel bir terapötik olarak karşımıza çıkmaktadır. Bununla birlikte siRNA'nın terapötik olarak kullanımını zorlaştıran, sahip olduğu yükün etkisi ile hücre membranından geçememesi ve hücre içerisine etkin bir şekilde girememesi gibi sınırlamaları mevcuttur. Bunun yanı sıra siRNA'ların nükleazlar tarafından enzimatik degredasyona uğrama ihtimallerinin oluşu, yarı ömürlerinin oldukça kısa olmasına neden olur. Bunun gibi olumsuz etkileri bertaraf etmek adına siRNA taşınımı için uygun ve etkili bir taşıyıcı sistemin kullanımı gereksinimi oluşmaktadır. Bu noktada yıldız polimerler taşıyıcı sistem gereksinimini ortadan kaldırmak ve siRNA degredasyonunun önüne geçmek için etkili bir polimer olarak karşımıza çıkmaktadır. Gen yüklemedeki olağanüstü enkapsülasyon kapasiteleri, gen etkileşimi için elektriksel yüke sahip küre yapısı, fonksiyonellendirme için bol miktarda iç ve dış aktif gruplara sahip olması gibi özellikleri ile siRNA taşınımı için en etkili sistemin geliştirilmesine olanak sağlamaktadır.
Sunulan tez kapsamında, siRNA'lar ile etkileşecek olan yıldız polimerlerin sentezi, fonksiyonellendirilmesi ve karakterizasyonunun gerçekleştirilerek siRNA'lar için etkili bir taşıyıcı sistem geliştirilmesi hedeflenmiştir. Buradan yola çıkarak belirlenen hedefe ulaşmak için ilk olarak taşıyıcı sistem olan ATRP ile hazırlanan polietilen glikol (PEG) tabanlı, azot içeren çekirdeğe sahip yıldız polimerlerin sentezi gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen yıldız polimerler çeşitli karakterizasyon teknikleri kullanılarak incelenmiş ve siRNA taşınımı için optimum değerleri veren yıldız tipi polimerik taşıyıcı sistemler elde edilmiştir.
Çalışmanın ikinci kısmında ise elde edilen katyonik özellik gösteren yıldız polimerlerin canlı hücreler üzerine sitotoksik etkileri ve larinks kanseri hücre hattı olan HEp-2 hücre hattı üzerinde de siRNA yüklenmiş katyonik partiküllerin gen susturma çalışmaları in vitro olarak gerçekleştirilmiş ve HEp-2 hücreleri üzerinde gen ifadelenmesi başarılı bir şekilde sağlanmıştır.

Abstract:
Utilizing the siRNA-based RNA interfering mechanism, suppression of gene expression, in addition to being used to elucidate the basic functioning of specific genes, is a gene therapy application that has an effect on diseases such as viral infections, genetics, cardiovascular diseases and cancer. Cancer is one of the most important and deadly diseases in the world and nowadays threatens thousands of people and these numbers are increasing every year. Although there are many traditional methods for fighting cancer disease, these methods have negative effects on the patients, and researchers who are focused on cancer treatment lead to the development of new treatment strategies. One of the side effects of traditional treatment methods is that destroy cancer cells as well as healthy cells. Recent studies have focused on this problem and developed methods aiming at targeting cancer cells. One of the new generation cancer cell-based methods developed is siRNA therapy. siRNA therapy directly acts as a potential therapeutic agent by acting directly on the problematic gene at mRNA level. However, siRNA has limitations such as it's ability to pass through the cell membrane and not to enter the cell effectively, which makes it difficult to use therapeutically. Moreover, the possibility of siRNA's undergoing enzymatic degradation by nuclease causes the half-life of siRNAs to be quite short. In order to avoid such adverse effects, there is a need to use an appropriate and effective carrier system for siRNA delivery. At this point, the star polymers are effective polymer to remove the need for carrier system and to prevent siRNA degradation. Development of the most efficient system for siRNA delivery with properties such as extraordinary encapsulation capacities for gene load, sphere structure with electrical charge for gene interaction and abundant internal and external active groups for functionalization.
Within the scope of the thesis, it is aimed to develop an effective carrier system for siRNAs by synthesizing, functionalizing and characterizing star polymers which will interact with siRNAs. From this point, to reach the determined target, synthesis of star polymers with polyethylene glycol based and nitrogen containing nucleus prepared with ATRP, which is the carrier system, was first carried out. Synthesized star polymers were studied using various characterization techniques and star- shaped polymeric carrier systems were obtained which gave optimum values for siRNA transport.
In the second part of the study, the cytotoxic effects of star polymers showing cationic properties on the living cells and gene silencing studies of siRNA loaded cationic particles on the HEp-2 cell line, which is a larynx cancer cell line, were performed in vitro and gene expression on HEp-2 cells was successful.