Multiple miyeloma'da toll like reseptörleri ve sinyal yolu bileşenlerinin hastalık patolojisiyle ilişkisinin incelenmesi
Investigation of the relationship of toll like receptors and signal path components with disease pathology in Multiple myeloma
Yazar: KAMURAN AVCI
Danışman: PROF. DR. MÜJGAN ÖZDEMİR ERDOĞAN
Afyonkarahisar Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Karfilzomib = Carfilzomib ; Multipl miyelom = Multiple myeloma ; Reseptörler-toll like = Receptors-toll like ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Venetoklaks = Venetoclax ; İxazomib = Ixazomib

Özet:
Multiple miyeloma (MM) genellikle 50 yaş üzerinde ortaya çıkmaktadır. Kemik lezyonları ile karakterize bir plazma hücre malignitesidir. Tedavi, kemoterapi ajanları, immünomodülatörler ve proteazom inhibitörleriyle (Pİ) yapılmaktadır. MM hücreleri tüm ökaryotik hücrelerde hayati öneme sahip proteazomun mutant bir formuna sahip olduğu için Pİ'ler tedavide oldukça etkili ve kullanışlıdır. Karfilzomib ve İxazomib, immünoproteazom üzerinde farklı etki mekanizmalarına sahip ikinci nesil Pİ'lerdir. Diğer taraftan, apoptozdan kurtulma terapide MM hücre sağ kalımının ana mekanizmalarından biri olarak öne çıkmaktadır. Venetoklaks, antiapoptotik proteinlere seçici olarak bağlanan ve proapoptotik proteinler üzerindeki aktivitelerini inhibe eden bir ajandır. Çeşitli hematolojik malignitelerin tedavisinde kullanımı onaylanmıştır. Günümüzde bu ajanların kombinasyonel kullanımıyla MM tedavisinde daha etkili ve düşük toksisiteli antitümör sistemlerinin geliştirilmesi hedeflenmektedir. Bunlara ek olarak MM tedavisinde farklı seçeneklerin üretilmesi araştırma konusudur. Toll like reseptörlerinin (TLR) fonksiyonunun deşifre edilmesi ve kanser tedavisinde kullanılabilecek mekanizmalardaki rolünün anlaşılması önemlidir. Bu nedenle MM hücrelerindeki TLR'lerin terapide ilaca duyarlılaştırma stratejisi olarak kullanımı yakın zamanda ön plana çıkmıştır.
Bu bağlamda çalışmanın amacı, TLR1/2 agonisti, anti-apoptotik protein inhibitörü ve yeni nesil proteazom inhibitörlerinin kombinasyonel kullanımının antikanser etkinliğinde sinerjisini araştırmaktır. MM modeli olarak U266, RPMI 8226 ve NCI H929 hücre hatları kullanıldı. TLR1/2 agonisti Pam3CSK4, anti-apoptotik protein inhibitörü Venetoklaks, yeni nesil proteazom inhibitörleri Karfilzomib ve İksazomib ajanları ile deney uygulamaları yapıldı. Hücre proliferasyonları, gen ekspresyon profilleri, anti-apoptotik yanıtlar ve sitotoksik direnç mekanizmaları agonist ve inhibitör kombinasyonlarıyla analiz edildi. Proliferasyon, gen ekspresyonu ve protein kantitasyonu sırasıyla WST, RT-PCR ve Western Blot teknikleriyle incelendi.
TLR1/2 ligandı Pam3CSK4 varlığında, 3 hücre hattında TLR sinyal yolunun aktivasyonu gerçekleşti. Anti-apoptotik protein inhibitörü verimli şekilde hücre ölümünü indükledi. Karfilzomib, İksazomib'e göre doza ve zamana bağlı olarak daha etkili inhibisyona ve apoptoza yol açtı. Proliferasyonun inhibitörler ve hücre hatları arasında heterojen olduğu gözlendi. Normal kültür koşullarında elde edilen IC50 değerlerinin TLR1/2 agonistli ve anti-apoptotik protein inhibitörlü kombinasyonlara göre daha düşük olduğu gözlendi. TLR1/2 sinyal yolunda görevli adaptör proteinlerin ve apoptoz ilişkili proteinlerin gen ekspresyonunda oldukça heterojen bir profili bulundu. Benzer şekilde TLR1/2 sinyal yoluna ve kemoterapik ajanlara bağlı gelişen apoptotik proteinlerin ekspresyonunda oldukça heterojen bir profil belirlendi.
Bulgularımız, MM hücrelerinde proteazom inhibitörleri aracılığıyla oluşturulan stresin gerek apoptotik protein inhibitörleri gerekse TLR sinyal yolunu uyarıcı ligandlarla modülasyon potansiyelini gösterdi. Verilerimiz MM tedavisinde TLR agonistlerinin, yeni nesil proteazom inhibitörlerinin ve anti-apoptotik protein inhibitörlerinin kombinasyonlarının etkili olabileceği göstermektedir.

Abstract:
Multiple myeloma (MM) usually occurs over the age of 50. It is a plasma cell malignancy characterized by bone lesions. Treatment is carried out with chemotherapy agents, immunomodulators and proteasome inhibitors (PI). Since MM cells have a mutant form of the proteasome, which is vital in all eukaryotic cells, PIs are very effective and useful in treatment. Carfilzomib and Ixazomib are second generation PIs with different mechanisms of action on the immunoproteasome. On the other hand, recovery from apoptosis stands out as one of the main mechanisms of MM cell survival in therapy. Venetoclax is an agent that selectively binds to anti-apoptotic proteins and inhibits activity on pro-apoptotic proteins. It is approved for use in the treatment of various hematological malignancies. Today, it is aimed to develop more effective and low-toxicity anti-tumor systems with the combinational use of these agents in the treatment of MM. In addition, the production of different options in the treatment of MM is the subject of research. It is important to decipher the function of Toll like receptors (TLR) and to understand their role in the mechanisms that can be used in cancer treatment. Therefore, the use of TLRs in MM theraphy as a drug sensitization strategy in therapy has recently come to the fore.
In this context, the aim of the study was to investigate the synergy of combinational usage of TLR1/2 agonist, anti-apoptotic protein inhibitor and next generation proteasome inhibitors in anti-cancer effect. MM model consisted of U266, RPMI 8226 and NCI H929 cell lines. TLR1/2 agonist Pam3CSK4, anti-apoptotic protein inhibitor Venetoclax, new generation proteasome inhibitors Carfilzomib and Ixazomib were applied in experiments. Cell proliferations, gene expression profiles, anti-apoptotic responses and cytotoxic resistance mechanisms were analyzed with agonist and inhibitor combinations. Proliferation, gene expression and protein expressions were investigated respectively with WST, RT-PCR and Western Blot techniques.
TLR signaling pathway was activated in 3 cell lines in the presence of TLR1/2 ligand Pam3CSK4. The anti-apoptotic protein inhibitor efficiently induced cell death. Carfilzomib caused more effective inhibition and apoptosis in a dose and time-dependent content compared to Ixasomib. Proliferation was observed to be heterogeneous between inhibitors and cell lines. It was observed that IC50 values obtained under normal culture conditions were lower than combinations with TLR1/2 agonist and anti-apoptotic protein inhibitor. Highly heterogeneous profiles were found in gene expression of adapter proteins and apoptosis-related proteins involved in the TLR1/2 signaling pathway. Similarly, highly heterogeneous profiles were determined in the expression of apoptotic proteins that develops due to TLR1/2 signaling pathway and chemotherapeutic agents.
Our findings demonstrated the potential for modulation of proteasome inhibitor-mediated stress in MM cells with both apoptotic protein inhibitors and ligands stimulating the TLR signaling pathway. Our data show that combinations of TLR agonists, new generation proteasome inhibitors and anti-apoptotic protein inhibitors may be effective in the treatment of MM.