Glı̇omasferlerde tı̇yorı̇dazı̇n aracılı hücre ölüm çeşı̇tlerı̇nı̇n araştırılması
Investigation of thioridazine-mediated cell death types in glioma spheres
Yazar: EZGİ ERSÖZ
Danışman: PROF. DR. MEHMET KORKMAZ
Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Glioma = Glioma ; Hücre ölümü = Cell death ; Klorokin = Chloroquine ; Monolayer kültür = Monolayer culture ; Otofaji = Autophagy ; Sferoid = Spheroid ; Tiyoridazin = Thioridazine

Özet:
Klasik in vitro çalışmalarında kullanılan monolayer (2B) hücre kültür yöntemi in vivo araştırmalara ön veri elde etmede yetersiz kaldığı öne sürülmektedir. Son yıllarda kullanılmaya başlanan sferoid (3B) hücre kültür yöntemi, hücrelerin in vivo koşullarındaki mikroçevre ve hücre-hücre etkileşimini oluşturmayı hedefleyen bir yöntemdir. Bu sayede in vitro koşullarda elde edilen veriler in vivo koşullara daha fazla benzerlik sağlayacağı düşünülmektedir. Yetişkinlerde gözlenen malign beyin tümörlerinden biri olan glioblastoma multiforme (GBM) IV Evre Astrositomdur. Cerrahi operasyon, kemoterapi ve radyoterapi tedavilerine rağmen sağ kalım oranı 12-15 aydır. Anti-psikotik bir ajan olan Tiyoridazin (THZ)' in yapılan çalışmalar doğrultusunda anti-kanser özelliği olduğu ortaya konmuştur. Buradan yola çıkarak monolayer ve sferoid hücre kültürlerinde karşılaştırmalı olarak THZ' nin GBM hücre hatları T98G ve U-87 MG üzerindeki sitotoksik etkileri ve tetiklediği ölüm mekanizmaları ortaya konulması amaçlanmıştır.

Sferoid hücre kültürlerini oluşturmak amacıyla asılı damla yöntemi kullanılmıştır. THZ' nin monolayer ve sferoid kültürlerdeki sitotoksik etkisi MTT yöntemi ile ölçülmüştür. Ölüm mekanizmasının belirlenmesi amacıyla da Muse hücre analiz cihazıyla uyumlu testler ve ölüm yollarına spesifik inhibitörler kullanılmıştır.

Monolayer ve sferoid hücre kültürlerine ayrı ayrı yapılan sitotoksisite deneyleri sonucunda IC50 değerleri sırasıyla 12,67 µM (monolayer T98G 24 saat), 29,30 µM (sferoid T98G 24 saat), 12,80 µM (monolayer U-87 MG 24 saat), 28,68 µM (sferoid U-87 MG 24 saat) olarak bulunmuştur. THZ' nin monolayer ve sferoid hücre kültürleri üzerindeki sitotoksik etkisinin otofaji mekanizması üzerinden tetiklendiği Muse hücre analiz yöntemi ve ölüm yoluna özgü inhibitörler aracılığıyla belirlenmiştir.

Çalışmamızda THZ' nin hücresel etkisinin monolayer ve sferoid GBM kültürlerinde farklılık gösterdiği ilk kez ortaya konuldu. Bu çalışmanın bulguları ışığında ileride yapılacak in vitro sitotoksisite çalışmalarının sadece monolayer kültürlerde değil aynı zamanda in vivo' ya benzerliği açısından sferoid kültürlerde de yapılması önerilmektedir. Bununla birlikte, GBM hücre hatlarında THZ' nin sitotoksik etkisinin otofaji yolağı üzerinden etkili olduğunun tespit edilmiş olması bu ilacın, apoptozu uyaran kemoterapötiklere karşı dirençli olan GBM tedavisinde kullanılabilecek bir ajan olduğunun düşünülmesine neden olmaktadır. 

Anahtar kelimeler: Sferoid (3B) hücre kültürü, Monolayer (2B) hücre kültürü, Glioblastoma, Tiyoridazin, Sitotoksisite, Apoptozis, Otofaji.

Abstract:
It has been suggested that monolayer (2B) cell culture method used in classical in vitro studies is inadequate to obtain preliminary data in in vivo studies. Spheroid (3B) cell culture method, which has been introduced in recent years, is a method aimed to form micro-environment and cell-to-cell interaction of cells in in vivo conditions. In this way, the data obtained from in vitro conditions is shown with more similarities to in vivo conditions. Glioblastoma Multiforme (GBM) is the IV Stage Astrocytoma which one of the malignant brain tumors that observed in adults. Despite the treatments through surgical operation, chemotherapy and radiotherapy, the survival rate is 12-15 months. Thioridazine (THZ), an anti-psychotic agent, has been shown to be an anti-cancer agent in the course of its studies. Starting from this, cytotoxic effects of THZ on GBM cell lines T98G and U-87 MG was aimed to determine comparatively in monolayer and spheroid cell cultures.
 
Hanging drop method was used to form spheroid cell cultures. The cytotoxic effect of THZ in monolayer and spheroid cultures was measured by MTT method. In order to determine the mechanism of cell death tests, which are compatible with the Muse cell analyzer and specific inhibitors were used.
 
The IC50 values were determined as 12,67 μM (monolayer T98G 24 hours), 29.30 μM (spheroid T98G 24 hours), 12.80 μM (monolayer U-87 MG 24 hours) 28.68 μM (spheroid U-87 MG 24 hours) as a result of cytotoxicity experiments performed separately on monolayer and spheroid cell cultures. It has been determined that THZ stimulates the cytotoxic effect on monolayer and spheroid cell cultures through the autophagy mechanism by Muse cell analysis method and death pathways specific inhibitors.
 
In our study, it has shown for the first time that cellular effects of THZ differentiate in monolayer and spheroid GBM cultures. It is suggested in the light of this study's findings that in vitro cytotoxicity studies should perform with not only monolayer cell cultures but also with spheroid cell cultures for obtaining data in vivo-like. After all THZ has been shown to be cytotoxic effective in the GBM cell lines via the autophagic pathway, suggesting that this drug is an agent that can be used in the treatment of GBM, which is resistant to apoptosis-inducing chemotherapeutics.
 
Keywords: Spheroid (3B) cell culture, Monolayer (2B) cell culture, Glioblastoma, Thioridazine, Cytotoxicity, Apoptosis, Authophagy.