Selülaz enziminin immobilizasyonu, karakterizasyonu ve uygulamaları
Immobilization, characteristics and applications of cellulase enzyme
Yazar: DUYGU BAKIR
Danışman: PROF. DR. TÜLİN AYDEMİR
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Lignoselülozik biyokütle, monomerik şekerlerin selülotik enzimle hidrolizi ile üretiminde, potansiyel yenilenebilir kaynaklardır. Endoglukanaz, ekzoglukanaz ve β-glikozidaz enzim karışımlarından oluşan selülaz enzimi, bu enzimlerin sinerjik etkileriyle selülozu glikoza parçalar. Bu enzimler başta mantarlar olmak üzere çok çeşitli mikroorganizmalar ile üretilebilmektedir. Bu çalışmada Trichoderma reesei ATCC 26921'den saflaştırılan ticari selülaz, iki farklı çapraz bağlama maddesi: glutaraldehit ve genipin kullanılarak sentezlenen kitosan ve manyetik kitosan boncukları üzerine immobilize edildi. İmmobilize selülazın fiziksel, kimyasal ve biyokimyasal özellikleri ve bunun lignoselülozik biyokütle sakkarifikasyonunda kullanımı kapsamlı bir şekilde araştırıldı. Sentezlenen kompozit boncukların yapısı ve morfolojisi SEM, TGA, FTIR ve VSM analizleriyle karakterize edildi. Serbest ve immobilize selülazın optimum sıcaklık ve pH değeri sırasıyla 50oC ve pH 5.0 olarak bulundu. Genipin ve glutaraldehit ile aktive edilmiş kompozit boncuklar üzerine immobilize edilmiş selülazın pH ve sıcaklıktaki değişikliklere karşı daha yüksek tolerans gösterdiği gözlendi. Aynı zamanda kompozit boncuklar üzerine immobilize edilen selülaz, serbest selülaza göre daha iyi depolama stabilitesi gösterdi. Optimizasyon çalışmalarında en yüksek aktivitenin gözlendiği optimum konsantrasyon genipin  ve glutaraldehit için sırasıyla % 0.6 (w/v) ve % 4 (v/v) olarak belirlendi. Yüzde geri kazanılan enzim aktivitesi, genipin ve glutaraldehit ile aktive edilmiş manyetik kitosan boncuklar için sırasıyla  % 82 ve % 76 olarak bulundu. İmmobilize enzimlerin katalitik performansınn tahlil edilmesi için yapılan sakkarifikasyon çalışmasında genipin ve glutaraldehit ile aktive edilen boncukların 5 kullanımdan sonra aktivitesi sırasıyla % 78 ve %74 olarak belirlendi ve taşıyıcı morfolojisi değişmediği gözlendi.  Sakkarifikasyon işlemi sonrası yapılan hesaplamalar neticesinde mısır yapraklarının, enginar yapraklarının ve çam ağacı kabuklarının sakkarifikasyon oranının sırasıyla % 92, % 79, % 68 olduğu belirlendi. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar enzim immobilizasyonunda çapraz bağlayıcı olarak çok sık kullanılan glutaraldehit yerine alternatif bir çapraz bağlanma eko-dostu olarak genipinin kullanılabileceğini desteklemekte ve her iki immobilize enzimin sakkarifikasyon işleminde kullanılabilirliğini göstermektedir.

Abstract:
Lignocellulosic biomass is a potential renewable resource in the production of monomeric sugars by hydrolysis of cellulosic enzymes. Cellulase enzyme consisting of endoglucanase, exoglucanase and β-glycosidase enzymes, cellulosic glycoside fragments with synergistic effects of these enzymes. These enzymes can be produced with a wide variety of microorganisms, especially fungi. In this study, cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 was immobilized on chitosan and magnetic chitosan beads using two different crosslinking agents: glutaraldehyde and genipin. The physical, chemical and biochemical properties of immobilized cellulase and its use in lignocellulosic biomass saccharification have been extensively researched. The structure and morphology of the synthesized composite beads were characterized by SEM, TGA, FTIR and VSM analyzes.  Optimum temperature and pH values of free and immobilized cellulase were 50 °C and 5.0, respectively.  It was observed that the immobilized cellulase on genipin and glutaraldehyde activated composite beads showed higher tolerance to changes in pH and temperature. 
Also, the cellulase immobilized on composite beads showed better storage stability than free cellulase.  Optimum concentration was found to be 0.6% (w / v) and 4% (v / v) for genipin and glutaraldehyde, respectively. The percent recovered enzyme activity was found to be 82% and 76% for the magnetic chitosan beads activated with genipin and glutaraldehyde, respectively. In the saccharification study to analyze the catalytic performance of immobilized enzymes, the activity of genipin and glutaraldehyde-activated beads after 5 uses was 78% and 74%, respectively, and carrier morphology was not changed. As a result of the calculations made after saccharification, the saccharification rate of corn leaves, artichoke leaves and pine bark was 92%, 79%, 68% respectively. The results obtained in this study support the use of genipin as an alternative eco-friendly alternative to glutaraldehyde, which is commonly used as crosslinker in enzyme immobilization, and demonstrate the utility of both immobilized enzymes in the saccharification process.