Mikrodesenli biyoaktif malzemelerin dizaynı, karakterizasyonu ve doku mühendisliği'ndeki uygulamaları
Design, characterization and tisuue engineering applications of micropatterned bioactive materials
Yazar: AYŞE GÖNEN KARAKEÇİLİ
Danışman: PROF.DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, doku mühendisliği uygulamalarına yönelik olarakbiyosinyal moleküllerin immobilizasyonu ile biyoaktif özellik kazandırılmış iki farklıtipte polimerik malzemenin sentezi, karakterizasyonu, mikrodesenli olarakhazırlanması ve hücre kültür sistemlerinde kullanılabilirliği araştırılmıştır.Tez kapsamındaki çalışmaların ilk aşamasında, biyomalzeme olarak kullanılmasıöngörülen kitosan membranların ve sıcaklık-duyarlı vinil eter bazlı hidrojellerinsentezi ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Kitosan membranlar odasıcaklığında, çözelti buharlaştırma yöntemiyle hazırlanmıştır. Membranların yüzeyözelliklerini belirlemek amacıyla FTIR-ATR, SEM, ESCA (XPS), AFM ve temasaçısı ölçümü tekniklerinden yararlanılmıştır. Tez çalışması kapsamında kullanılanve sıcaklık-duyarlı özelliğe sahip olan hidrojel, etilen glikol vinil eter ve bütil vinileter monomerleri kullanılarak Î³-radyasyon polimerizasyonu tekniği ilesentezlenmiştir. Sentezlenen poli(etilen glikol vinil eter-bütil vinil eter) (P(EGVE-BVE)) hidrojelinin sıcaklık-duyarlı özelliğini belirlemek amacıyla sıcaklığa bağlışişme deneyleri gerçekleştirilmiş ve hidrojelin 37ºC'de denge su içeriğinin%44.8Â±0.7 olduğu bulunurken, bu değerin ortam sıcaklığının +4ºC'ye düşmesiyle%117.4Â±2.4 değerine çıktığı ve sıcaklığın düşmesiyle hidrojelin şişmekapasitesinde artış olduğu saptanmıştır. Hidrojelin yüzey özellikleri FTIR-ATR,SEM ve ESCA (XPS) çalışmaları ile karakterize edilmiştir.Tez çalışmasının sonraki aşamasında, karakterizasyonu tamamlananbiyomalzemelerin, çeşitli biyosinyal moleküller kullanılarak biyomodifikasyonugerçekleştirilmiştir. Kitosan membranların biyomodifikasyonunda hücre yapıştırıcıbir peptid olan fibronektinin RGDS (Arg-GlyAsp-Ser) sekansı ve bir büyümefaktörü olan EGF (epidermal büyüme faktörü) kullanılmıştır. Biyosinyalmoleküllerin membran yüzeylere immobilizasyonunda fotokimyasalimmobilizasyon tekniği kullanılmış ve fotoreaktif bir molekül ile reaksiyona sokulanbiyosinyal moleküllerin yüzeye immobilizasyonu UV ışını varlığındagerçekleştirilmiştir. RGDS ve EGF biyosinyal moleküllerinin immobilizasyonusonrasında kitosan membranların karakterizasyonu FTIR-ATR, ESCA (XPS) veAFM yöntemleriyle yapılmıştır. FTIR-ATR analizi sonucu peptid yapısında bulunanAmid bağlarının yapıya katıldığı saptanmıştır. ESCA analizlerinden elde edilensonuçlarda, biyomodifikasyon öncesinde kitosan membrana ait yüzey atomikbileşimlerinde, N1s oranı %5.8 iken, bu değerin RGDS ile modifiye edilmişmembranda %6.2'ye, EGF ile modifiye edilmiş membranda ise %8.7'ye çıktığıgörülmüştür. AFM analizinden elde edilen sonuçlar, biyomodifikasyon sonrasıyüzey pürüzlülüğünün azaldığını ortaya koymuştur.Tez çalışması kapsamında sentezlenen sıcaklık-duyarlı hidrojellerinbiyomodifikasyonu hücre yapıştırıcı peptid sekansı olan RGD (Arg-Gly-Asp)ikullanılarak yine fotokimyasal immobilizasyon tekniği ile gerçekleştirilmiştir.Yapılan ESCA (XPS) analizlerinde, modifiye edilmemiş hidrojel yüzeyinde N1spikine rastlanmazken, biyomodifikasyon sonrasında yüzeydeki N1s atomikyüzdesinin %2.2 olduğu saptanmıştır. FTIR-ATR analizinde, biyomodifikasyonsonrasında Amid bandına ait pikler saptanmıştır. Biyomodifikasyon sonrasındayapılan şişme deneyleri sonucunda, hidrojelin sıcaklık-duyarlı özelliğini koruduğuve fotokimyasal immobilizasyon tekniği ile gerçekleştirilen immobilizasyonişleminin hidrojelin sıcaklık-duyarlı davranışı üzerinde olumsuz bir etkiye sahipolmadığı bulunmuştur.Kitosan membranların kullanıldığı mikrodesenleme çalışmalarında, yüzeymikrodesenleme tekniği olarak fotokimyasal mikrofabrikasyon tekniğininkullanılmasına karar verilmiştir. RGDS ile gerçekleştirilen mikrodesenlemeçalışmalarında, biyosinyal molekülün membran yüzeye fotokimyasalimmobilizasyonu 100 Âµm çapında desenlere sahip olan kuartz-krom maskevarlığında UV ışını ile gerçekleştirilmiştir. Bu işlem sonunda RGDS moleküllerininmikrodesenli olarak immobilize edildiği membranlar elde edilmiştir.Tez çalışmasının son bölümünde, sentezlenen ve biyomodifikasyonugerçekleştirilen polimerik malzemeler ile L929 fare fibroblast hücre hattınınkullanıldığı hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiş ve biyosinyal moleküllerinhücre yapışması ve üremesi üzerindeki etkisi ortaya konmuştur. Biyomalzemelerüzerindeki hücre yapışması ve üremesi hemositometrik sayım, kristal viyolemetodu ve MTT yöntemi ile takip edilmiştir. Hücrelerin morfolojisini saptamakamacıyla invert mikroskop ve SEM görüntüleri alınmıştır.Kitosan membranlar ile serumlu ve serumsuz besi ortamlarında gerçekleştirilençalışmalarda, RGDS ile modifiye edilmiş membranlar üzerinde 2. saat sonundaserumlu ortamda hücre yapışmasının modifiye edilmemiş membranlara oranlaâ¼%38 daha fazla olduğu saptanmıştır. Serumsuz ortamda yürütülen çalışmalarda24 saatlik inkübasyon süresi sonunda, modifiye edilmemiş membranlardahücrelerin fibroblastik morfolojisi gözlenemezken, RGDS ile modifiye edilmişmembranlarda hücre yayılması ve fibroblastik morfoloji saptanmıştır. Serumluortamda modifiye edilmemiş membranlarda özgül hücre yapışma hızı (k) 0.72saat-1 olarak bulunurken RGDS ile modifiye edilmiş membranlarda bu değer 1.00saat-1 olarak saptanmıştır. Kitosan membranlarda hücre üremesinin incelendiğiçalışmalarda ise, hücre üremesinin EGF ile modifiye edilmiş olan membranlardaen yüksek seviyede olduğu saptanmıştır. Membranlarda L929 fibroblast özgülhücre üreme hızları hesaplandığında (Âµ), en yüksek değerin EGF ile modifiyeedilmiş membranlarda olduğu bulunmuştur (Âµ=0.046 saat-1).Mikrodesenli membranlar ile gerçekleştirilen hücre kültür çalışmalarında,hücrelerin mikrodesenli bölgelerde kontrollü yapışma davranışı incelenmiştir.Mikrodesenli yüzeylerde, 2. saat sonunda hücrelerin RGDS immobilize olmuşdesenli bölgeleri tercih ederek bu bölgelerde yapıştığı ve yayıldığı gözlenmiştir.Kullanılan fotokimyasal mikrofabrikasyon tekniği ile kitosan membranlardakontrollü hücre yapışması sağlanmıştır.Sıcaklık-duyarlı hidrojeller ile yürütülen hücre kültür çalışmalarında, RGD ilemodifiye edilmiş hidrojellerde hücre yapışmasının 4.saat sonunda â¼%90 değerineiiulaştığı görülmüştür. Sıcaklık-değişimi ile hücrelerin yüzeyden koparılmaçalışmalarında, üzerinde hücre bulunan hidrojeller 37ºC'deki kültür ortamındanalınarak 30 dakika süreyle 10ºC'de tutulmuş ve bu yolla yüzeye yapışan hücrelerin%80'inin geri kazanımı mümkün olmuştur.Anahtar Kelimeler : doku mühendisliği, kitosan, sıcaklık-duyarlı hidrojeller,fotokimyasal immobilizasyon, mikrodesenleme, RGD, EGF.Danışman : Prof. Dr. Menemşe GÜMÜŞDEREL OĞLU, Hacettepe Üniversitesi,Kimya Mühendisliği Bölümü.iii

Abstract:
In this study, the synthesis, characterization and micropatterning of two differentkinds of polymeric materials with bioactive properties and their possible use in cellculture systems for tissue engineering applications have been investigated.In the first part of the study, the synthesis and characterization of chitosanmembranes and temperature-sensitive vinyl ether based hydrogels were realized.Chitosan membranes were prepared by solvent casting method at roomtemperature. In order to define the surface characterization of the membranes,FTIR-ATR, SEM, ESCA (XPS), AFM and contact angle measurements wereconducted. Temperature-sensitive hydrogels were synthesized by Î³-irradiatonpolymerization technique in the presence of ethylene glycol vinyl ether and butylvinyl ether monomers. In order to investigate the temperature sensitivity of thesynthesized poly(ethylene glycol vinyl ether-butyl vinyl ether) (P(EGVE-BVE))hydrogel, swelling experiments at different temperatures were performed. Theequilibrium swelling ratio of the hydrogel at 37ºC was found as %44.8Â±0.7,whereas this ratio was found to be %117.4Â±2.4 at +4ºC showing that a decrease intemperature causes an increase in the swelling capacity. The surface properties ofthe hydrogel were characterized by FTIR-ATR, SEM and ESCA (XPS) analysis.In the next part of the study, the polymeric materials were biomodified by usingvarious biosignal molecules. For the biomodification of chitosan membranes, thecell adhesion factor RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser)-a sequence of fibronectin- and a cellgrowth factor EGF (epidermal growth factor) were used. The biomodification wasrealized by using photochemical immobilization technique, in which the biosignalmolecule was first reacted with a photoreactive molecule and then immobilized onthe surface in the presence of UV irradiation. The characterization of the modifiedmembranes after RGDS and EGF immobilization were realized by FTIR-ATR,ESCA (XPS) and AFM analysis. The results obtained from FTIR-ATR studiesshowed the presence of Amide bonds on the membranes after biomodification.ESCA (XPS) results showed that, the atomic ratio of N1s on chitosan membraneswas raised from 5.8% to 6.2% after RGDS immobilization. N1s atomic ratio waseven higher (8.7%) on EGF immobilized membranes. The results obtained fromAFM analysis showed that after biomodification process the surface roughnesswas decreased.The biomodification of temperature-sensitive hydrogels was realized by the celladhesive peptide RGD (Arg-Gly-Asp) by using photochemical immobilizationtechnique also. The ESCA (XPS) analysis showed that the N1s ratio on modifiedhydrogel surfaces was 2.2%, whereas no N1s peak was detected on unmodifiedhydrogels. FTIR-ATR analysis showed the presence of Amide bonds afterbiomodification. The swelling experiments showed that, the hydrogels kept theirivtemperature sensitivity after biomodification and photochemical immobilizationtechnique had no reverse effect on temperature sensitivity.In the micropatterning studies, chitosan membranes were micropatterned by usingphotochemical microfabrication technique. RGDS biosignal molecules wereimmobilized on chitosan membranes in a defined pattern by performing thephotochemical immobilization in the presence of a photomask. The photomaskused was a quartz-chromium mask with 100 Âµm circle patterns in diameter. By thistechnique, chitosan membranes with micropattern immobilized RGDS moleculeswere obtained.In the last part of the study, the synthesized and biomodified polymeric materialswere used in cell culture experiments by using L929 mouse fibroblast cell line, inorder to investigate the effect of biosignal molecules on cell adhesion and cellproliferation. The cell adhesion and proliferation on biomaterials were investigatedby haemocytometric counting, crystal violet method and MTT assays. Themorphology was determined by invert microscope and SEM images.Cell culture experiments were realized both in serum-containing and serum-freemedia with chitosan membranes. In serum-containing medium, the cell adhesionon RGDS modified chitosan membranes was â¼%38 higher than on the unmodifiedmembranes at the end of 2 hours of culture. At the end of 24 hours culture, inserum-free medium it was impossible to detect the fibroblastic morphology onunmodifed chitosan membranes, whereas cell spreading and fibroblasticmorphology were clearly observed on RGDS-modified membranes. In serum-containing medium, the rate of cell adhesion on RGDS membranes was higherthan on unmodifed membranes as the rate constants for RGDS-chitosan andunmodified chitosan membranes were 1.00 h-1 and 0.72 h-1 respectively. Thehighest cell proliferation was detected on EGF modifed membranes. The specificcell proliferation rate (Âµ) for L929 fibroblasts on EGF modified chitosanmembranes was calculated as, 0.046 h-1.The controlled cell attachment behavior of L929 mouse fibroblasts were alsoinvestigated on RGDS-micropatterned chitosan membranes. On micropatternedsurfaces, at the end of 2 hours of incubation, cells adhered and spreaded onRGDS immobilized patterns. The controlled attachment was achieved by usingphotochemical immobilization technique.In cell culture studies conducted with temperature-sensitive hydrogels, the cellattachment was found to be â¼ 90% on RGD modified hydrogels. The recovery ofattached cells from the hydrogel surface by low-temperature treatment wasrealized by changing the environment from 37ºC where the cells were cultured to10ºC. By this way it was possible to recover â¼80% of the attached cells from thehydrogel surface.Key words : tissue engineering, chitosan, temperature-sensitive hydrogel,photochemical immobilization, micropatterning, RGD, EGF.Supervisor : Prof. Dr. Menemşe GÜMÜŞDEREL OĞLU, Hacettepe University,Chemical Engineering Department.v