Sıvı kromatografisi-tandem MS metodu ile granülositlerde lökosit sistin ölçümünün geliştirilmesi
Development of measurement of leukocyte cystine in granulocytes by liquid chromatography-tandem MS method
Yazar: AYTAN MALIKOVA
Danışman: DOÇ. OYTUN PORTAKAL AKÇİN
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases
Dizin: Granülosit = Granulocyte ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Lökositler = Leukocytes ; Maleimidler = Maleimides ; Sisteamin = Cysteamine ; Sistinozis = Cystinosis

Özet:
Sistinoz, sistin taşınmasındaki bozukluğa bağlı olarak lizozomlarda sistin birikmesine yol açan nadir bir kalıtsal bozukluktur. Sisteamin tedavisi ile glomeruler hasar geciktirilir. Sistinoz tanısı ve sisteamin tedavi takibinde lökositlerde sistin konsantrasyonu ölçümü altın standarttır. Bu tez çalışmasında, lökosit içi sistin konsantrasyonu ölçümü için, duyarlılık ve doğruluğu yüksek bir ESI tandem MS metodunun geliştirilmesi amaçlanmıştır. Örnekler ACD tüplere alındı ve granülosit izolasyonu yapıldı. Sisteinin sisteine oksidasyonunu ve SH grupları ile interferansı önlemek için N-etilmaleimid kullanıldı. Sistin, 3N butil-HCl ile türevlendirildikten sonra di-butil ester türevi ESI tandem MS ile ölçüldü. Metodun 0 - 41.38 mol/L aralığında lineer olduğu saptandı. Çalışma içi ve günler arası presizyon (%CV) <% 6 ve kantitasyon limiti (LoQ) 0.095 mol/L idi. Geri elde % 92.2-107.4 olarak bulundu. Anlamlı bir carry over izlenmedi. Hemolizin anlamlı interferansa neden olduğu izlendi (bias %20). Sistinin -80 0C derecede saklanan örneklerde 30 gün stabil kaldığı ve don-çöz yapılmaması gerektiği bulundu. Sonuç olarak, bu çalışmada granülositlerde sistin ölçümü için yeni bir ESI-tandem MS metodu geliştirilmiştir. Sistein oksidasyonu ve sistinin disülfid değişim reaksiyonları NEM ile engellenmiştir. Analitik değerlendirme yöntemin yeterli olduğunu göstermiştir. Elde edilen kanıtlar göz önüne alındığında, bu metod sistinoz ve sisteamin takibinde lökosit içi sistin konsantrasyonu ölçümü için uygundur. Klinisyenler testi güvenilir bir şekilde rutin ölçümlerde kullanabilir.

Abstract:
Cystinosis is a rare hereditary disorder that causes cystine to accumulate in lysosomes due to impaired cystine transport. Glomerular damage is delayed with cysteamine treatment. Cystine concentration measurement in leukocytes is the gold standard in the diagnosis of cystinosis and cysteamine treatment follow-up. In this thesis, it is aimed to develop an ESI tandem MS method with high sensitivity and accuracy for the measurement of cystine concentration in the leukocyte. Samples were taken into ACD tubes and granulocyte isolation was performed. N-ethylmaleimide was used to avoid oxidation of cysteine to cysteine and interference with SH groups. Cystine was derivatized with 3N butyl-HCl, then di-butyl ester derivative ESI was measured by tandem MS. The method was found to be linear in the range of 0 - 41.38 mol / L. Within run and between days precision (% CV) was <6% and the quantitation limit (LoQ) was 0.095 µmol / L. Recovery was found as 92.2-107.4%. No significant carry-over was observed. Hemolysis was observed to cause significant interference (bias 20%). It was found that cystine remained stable for 30 days in samples stored at -80 0C and should not be freeze-thawed. As a result, a new ESI-tandem MS method has been developed for the measurement of cystine in granulocytes in this study. Cysteine oxidation and disulfide exchange reactions of cystine were inhibited by NEM. Analytical evaluation has shown that the method is sufficient. Considering the evidence obtained, this method is suitable for measuring intra-leukocyte cystine concentration in cystinosis and cysteamine monitoring. Clinicians can use the test reliably for routine measurements.