Gestasyonel diabetik plasentalarda, PI3K p85/p110 alfa ve glukoz transport proteinleri korelasyonu
Correlation of PI3K p85/p110 alpha and glucose transport proteins in gestational diabetes
Yazar: SELMA AYDEMİR
Danışman: DOÇ. DR. BAŞAK BAYKARA
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Diabet-gebelik sırasında = Diabetes-gestational ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Fosfoinositid 3-kinaz = Phosphoinositide 3-kinase ; GLUT-1 = GLUT-1 ; Glükoz = Glucose ; Kaspazlar = Caspases ; Plasenta = Placenta ; Taşıyıcı proteinler = Carrier proteins ; Tümör nekroz faktörü-alfa = Tumor necrosis factor-alpha

Özet:
Gestasyonel diabet mellitusun (GDM) oluşumunun altında yatan moleküler mekanizmayı; plasental glukoz translokasyonun, reseptör ve postreseptör düzeyindeki olası ilişkisini plasentanın farklı alanlarında aynı olup olmadığını göstermeyi amaçladık. Hücresel glukoz metabolizmanın kontrolünü reseptör düzeyinde GLUT (1-3-4-12) ve postreseptör düzeyinde PI3K P85/p110 alfa gen ekspresyon düzeylerin GDM'nin patogenezinde rolleri araştırıdı. Aynı zamanda diabetin oluşumundan sorumlu olduğu düşünülen bu moleküllerin mRNA ekspresyon kat değişim düzeyleri ile 75 g OGTT kan-glukoz seviyelerindeki değişimlerin olası ilişkisinin özellikle hangi alan ve proteinlerde gerçekleştiğini göstermeyi amaçladık. 
	Metod: 
Çalışmamıza Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Polikliniğine başvuran gestasyonel yaşı 37-42. gebelik haftaları arasında olan gönüllü gebeler dahil edildi.



Kontrol Grubu (K Grubu): Herhangi bir sistemik hastalığı olmayan sağlıklı 25 gebe
Gestasyonel Diabetes Mellitus Grubu (GDM grubu): Gestasyonel diabetes tanısı alan 20 olgu olmak üzere toplam 45 gebeden doğum sonrası elde edilen plasenta dokuları analiz edildi. 
Plasentanın maternal ve fetal yüzlerinin merkez ve periferik alanlarından alınan biopsi örnekleri; Maternal Merkez (MM), Maternal Periferik (MP), Fetal Merkez (FM) ve Fetal Periferik (FP) şeklinde oluşturuldu. Her iki grupta tüm alanlarda ışık mikroskobik ve moleküler incelemeler yapıldı.

Işık mikroskobik incelemeler için elde edilen kesitler Hematoksilen&Eozin ve Periyodik Asit Schift (PAS) ile boyandı. Plasenta genel morfolojisi ve bazal membran kalınlığı değerlendirildi. İmmünohistokimyasal değerlendirmeler için glukoz transport proteinleri sırasıyla GLUT 1, GLUT 3, GLUT 4 ve GLUT 12, TNF alfa, Bcl-2 ve Aktif kaspaz 3 boyama yapıldı. 
Moleküler analiz değerlendirmelerinde ise GLUT 1, GLUT 3, GLUT 4, GLUT 12, PI3K p85 alfa ve PI3K p110 alfa olmak üzere toplam 6 genin ekspresyon düzeylerine bakıldı.

Kontrol ve GDM grubu olguların 75 g 0GTT 0. Saat, 1.saat ve 2.saat kan-glukoz seviyelerindeki değişiklikleri, tüm olguların plasentaları; Fetal Merkez (FM), Fetal Periferik (FP), Maternal Merkez (MM) ve Maternal Periferik alanlarında GLUT 1, GLUT 3, GLUT 4, GLUT 12 gen ekspresyonları ile GLUT (1-3-4-12) gen ekspresyon ortalama ve PI3K p85 alfa, PI3K p110 alfa ile PI3K p85/p110 alfa ortalama gen ekspresyon düzeylerini kan glukoz konsantrasyonu ile olası ilişkisini hem grupların kendi içersinde hemde gruplar arasında istatiksel olarak karşılaştırdık.





Sonuç
Yaptığımız araştırmanın tüm verilerini sonuç olarak genel özetlediğimizde gestasyonel diabetik plasentalarda gebelik ile birlikte fizyolojik olarak artan hipergliseminin akut etkilerine karşı plasentanın farklı alanlarında GLUT ve PI3K p85/p110 alfa gen ekspresyonlarında farklılıklar olduğunu tespit ettik. Kontrol grubu plasentalarında genel anlamda hem reseptör düzeyinde hem de postreseptör düzeyinde pozitif korelasyonu görürken gestasyonel diabetik plasentalarda daha çok post reseptör düzeyine kaydığını söyleyebiliriz. Plasentanın her alanında glukoz tüketim oranındaki farklılıklar ve adaptif özellikler nedeniyle Kontrol grubu plasentalarında GLUT 1 proteinin primer glukoz taşıyıcı proteini olarak görev yaptığını insüline yanıtta da hem GLUT 4 'ün hem GLUT 12 korele bir şekilde çalıştığını ve bu mekanizmanın p110 bağlı p85 alfa ve p110 alfa kompleksi sayesinde rol oynabileceğini düşünmekteyiz. Ancak gestasyonel diabetik plasentalarda p85 alfa ile p110 alfa arasındaki oranın bozulduğu ve gestasyonel diabetik plasentalarda insüline yanıt olarak glukoz geçişini sağlayan primer protein, GLUT 4 proteini olabilir. Aynı zamanda GDM'li grupta glukoz konsantrasyonuna bağlı olarak primer glukoz transport gerçekleştiren proteinin GLUT 1 proteini yerine GLUT 3 protein rol oynayabilir. Alansal olarak değerlendirdiğimiz veri sonuçlarına göre plasentanın Fetal periferik (FP) alandaki gen ekspresyon düzeylerinin korunmaya çalıştığı ancak plasentanın maternal yüzeyinde ve özellikle Maternal Merkez (MM) alanda bu mekanizmanın bozulduğunu düşünmekteyiz.

Bu verilerle birlikte plasentanın glukoz transport ile hücre sağkalımını, trofoblast bölgelerinde düşük apoptozis ve yüksek inflamasyon nedeni ile uterusda mevcut koşullarda fetal büyümeyi optimize etmek için gestasyonel diabetik plasentalardaki fonksiyonel adaptasyonları açıklayabilir şeklinde ifade edebiliriz. Sonuç olarak, değişmiş plasental fenotip ve genotipin bir sonucu olarak fetüse sağlanan besin miktarındaki zararlı değişikliklerin yetişkin sağlığı ve morbite üzerinde uzun vadeli bir etkisi olacağını tahmin etmekteyiz. Aynı zamanda gestasyonel diabetik plasentalardaki apoptotik ve enflamatuar süreçlerin plasentadaki rolünü daha iyi açıklamaya çalışan araştırmalar sayesinde, GDM'li gebelerde plasenta ve fetal büyümeyi aşırı indükleyen mekanizmalara karşı terapotik yaklaşımlara yol açacağını düşünmekteyiz.

Bu veriler ışığında kan glukoz konsantrasyon düzeylerini plasental GLUT ve PI3K p85/p110 alfa gen ekspresyon düzeyleri ile karşılaştırdığımızda anlamlı olarak 0.saat 100 ve üzeri, 1. Saat 160 ve üzeri ve 2. Saat 140 ve üzerinde gen ekspresyon düzeylerinde anlamlı farklılıklar gözledik (p<0,05). Bu sebeple benzer çalışmalar ile desteklenmesi, kan glukoz konsantrasyonu ile özellikle GLUT gen ekspresyon düzeyleri ile olası ilişkisi değerlendirilerek GDM tanı kriter düzeylerine farklı bir yönden katkı sağlanabilir.

Abstract:
Objective	
Aim of this research is to show the molecular mechanism underlying the formation of gestational diabetes mellitus (GDM), in detail, whether the possible relationship of placental glucose translocation at the receptor and post-receptor level is the same or not in different areas of the placenta. The role of cellular glucose metabolism genes expression levels in the pathogenesis of GDM were investigated by PI3K P85 / p110 alpha and GLUT (1-3-4-12) gene expression, at the receptor and postreceptor levels, respectively.
At the same time, the possible relationship between mRNA expression fold change of these molecules and 75 g OGTT blood-glucose levels, which are thought to be responsible for the formation of diabetes, was attempted to be detected in specific area or/and protein groups. 



Method
The samples were collected from volunteering pregnant women with gestational age between 37-42 weeks of pregnancy, who were admitted to Dokuz Eylül University Medical Faculty Hospital Gynecology and Obstetrics Clinic.

The placenta tissues obtained from 45 pregnant women were analyzed, of which 25 are part of the Control Group (Group K) as in healthily pregnant without any systemic disease and of which 20 are Gestational Diabetes Mellitus Group (GDM group) as in pregnant women with gestational diabetes.

Biopsy specimens from the central and peripheral areas of the maternal and fetal faces of the placenta were preapared in the forms of Maternal Center (MM), Maternal Peripheral (MP), Fetal Center (FM) and Fetal Peripheral (FP). Light microscopic and molecular investigations were performed in all groups in all groups.

Sections obtained for light microscopic examination were stained with Hematoxylin & Eosin and Periodic Acid Schift (PAS). General morphology of the placenta and basement membrane thickness were evaluated. Glucose transport proteins for immunohistochemical evaluations were GLUT 1, GLUT 3, GLUT 4 and GLUT 12, TNF sırasıyla, Bcl-2 and Active caspase 3 were stained respectively.

In the molecular analysis GLUT 1, GLUT 3, GLUT 4, GLUT 12, PI3K p85 alpha and PI3K p110 alpha expression levels of a total of 6 genes were examined.

Control and GDM group 75 g 0GTT 0. hour, 1st hour and 2nd hour blood-glucose levels changes, placental all cases; GLUT 1, GLUT 3, GLUT 4, GLUT 12 gene expression in the Fetal Center (FM), Fetal Peripheral (FP), Maternal Center (MM) and Maternal Peripheral (MP) areas, and also average of the GLUT (1-3-4-12) gen expression, p85 alpha, PI3K p110 alpha and PI3K p85 / p110 alpha mean gene expression levels with blood glucose were compared and statistical analysiss was carried out both within groups and between groups. 
Result
The results of this study indicated that the differences in GLUT and PI3K p85 / p110 alpha gene expressions in different areas of placenta against the acute effects of hyperglycemia increased physiologically in gestational diabetic placentas. In the control group placentas, there is a positive correlation both at the receptor and postreceptor level; while it shifts more to the post-receptor level in gestational diabetic placentas. We concluded that due to the differences in glucose consumption rate and adaptive properties in each area of placenta, GLUT 1 protein acts as primary glucose transporter protein in control group placentas. It worked with both GLUT 4 and GLUT 12 in a correlated manner in insulin response through p110-dependent p85 alpha and p110 alpha complex. However, in gestational diabetic placentas, the ratio between p85 alpha and p110 alpha was impaired and GLUT 4 protein may be involved in the allowing of the passage of glucose in response to insulin. At the same time, GLUT 3 protein can function instead of the GLUT 1 protein which is transporting the primary glucose depending on the glucose concentration in the GDM group. The results of the data evaluated from different areas suggested that the placenta tries to preserve the gene expression levels in the Fetal Peripheral area (FP) but this mechanism is impaired in the maternal surface area, especially at the Maternal Center (MC). 

These results allow us to explain the cell survival of the placenta through glucose transport and the functional adaptations of gestational diabetic placentas to optimize the fetal growth in the uterus due to low apoptosis and high inflammation in the trophoblast regions. Consequently, we predict that harmful changes in the amount of nutrients provided to the fetus as a result of altered placental phenotype and genotype will have a long-term impact on adult health and morbidity. Furthermore, we suggest, on the basis of previous studies which tried to better explain the role of apoptotic and inflammatory processes in the gestational diabetic placentas, that it may lead to therapeutic approaches to over-induce placenta and fetal growth mechanisms in the pregnant women with GDM.

As a conclusion, the comparison of blood glucose concentration levels with placental GLUT and PI3K p85 / p110 alpha gene expression levels revealed distinguishable differences in gene expression levels significantly at 0.hr 100 and above, 1st hour 160 and above and 2nd hour 140 and above (p <0.05). Therefore, it may be possible to contribute to GDM diagnostic criteria levels by supporting with similar studies, by evaluating the relationship between blood glucose concentration and GLUT gene expression levels in particular.