HMG-Koa redüktaz inhibitörlerinin meme adenokarsinom hücre hattı MCF-7 üzerinde hücre proliferasyonu ve hücre ölüm mekanizmaları (Apoptoz ve otofaji) üzerine etkisinin incelenmesi
Evaluation of the effects of HMG-Coa Reductase İnhibitors on the cell proliferation and cell death mechanisms (Apoptosis and autophagy) of the breast adenocarcinoma cell line MCF-7
Yazar: TUĞBA DEMİRCİ
Danışman: PROF. DR. SEVDA F. MÜFTÜOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Antikolesteremik ajanlar = Anticholesteremic agents ; Apoptozis = Apoptosis ; Hücre dizisi = Cell line ; Koenzimler = Coenzymes ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Otofaji = Autophagy

Özet:
Meme kanseri, dünya genelinde kadınlarda görülme sıklığı en yüksek olan kanser türüdür. Meme kanseri ölüme yol açması açısından ise akciğer kanserinden sonra ikinci sırada yer alır. Birçok kanser de olduğu gibi meme kanserinde de yeni tedavilerin geliştirilmesi amacıyla çalışmalar yürütülmektedir. Günümüzde en çok serebrovasküler ve kardiyovasküler hastalıkları önlemek için kullanılan ve kolesterol sentezini hidroksi-metil glutaril koenzim A (HMG-KoA) redüktaz enzimi inhibisyonu ile spesifik olarak bloke eden statinler, son çalışmalarda kanser tedavisinde umut vadeden ilaçlar olarak gösterilmektedir. Statinlerin kanser hücre dizilerinde sitotoksik etkilerinin araştırıldığı birçok yayın bulunmasına karşın meme kanser hücrelerindeki antiproliferatif ve apoptotik etkilerinin mekanizması tam olarak açıklanamamıştır. Kanser hücrelerinde tedaviye yönelik çalışılan ölüm çeşitlerinden biri de otofajidir. Otofaji, hücrenin stres altında iken hasarlı organellerini ve makromoleküllerini yıkması olarak tanımlanan yeni bir hücre ölüm çeşididir. Son yıllarda farklı hücre hatları üzerinde otofajik etkileri gösterilmiş olan statinlerin, meme kanseri hücrelerinde otofajik mekanizmalar üzerine etkisine ilişkin literatür bilgisi bulunmamaktadır. Bu çalışmada statinlerin meme kanser hücrelerindeki otofajik mekanizmalar üzerine olan etkisi incelenmiştir. Aynı zamanda meme kanseri hücrelerinde apoptoz ve otofaji arasındaki ilişkinin aydınlatılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda statin grubu ilaçlardan atorvastatin, simvastatin ve fluvastatinin farklı konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muamele sonrasında, MCF-7 insan meme adenokarsinom hücrelerinde ilaç doz artışına paralel hücre proliferasyonlarında azalma saptanmıştır. Bunlardan en etkin sitotoksiteye sahip olan ilaç grubu fluvastatin olarak bulunmuştur. 24 saat atorvastatin, simvastatin ve fluvastatinin 10?M, 20?M ve 80?M konsantrasyonları ile muamele edilen hücre gruplarında TUNEL yöntemi ile elde edilen apoptoz sonuçları, doz artışına paralel apoptotik hücre yüzdesinde artış olduğunu göstermiştir. 80?M konsantrasyon uygulanan gruplarda hücrelerin birçoğunda nekrotik özellikler izlenmiştir. Klinikte en yaygın kullanım alanına sahip olan atorvastatinin 10?M, 20?M ve 80?M konsantrasyonları ile 24 ve 48 saat muamele edilen MCF-7 hücre gruplarına immunohistokimya yöntemi uygulanarak hücrelerde kaspaz3 ile apoptoz; beklin-1 ve LC3 belirteçleri ile otofaji gösterilmiştir. Meme adenokarsinom hücrelerinin ELISA ve immunohistokimyasal çalışmalarımızı destekleyen nitelikteki elektron mikroskobik incelemelerinde; hücrelerde apoptotik, otofajik ve nekrotik ince yapı değişiklikleri saptanmıştır.Sonuç olarak statinlerin sitotoksik etki mekanizmalarına farklı bir bakış açısı getiren çalışmamız, statinlerin MCF-7 meme adenokarsinom hücrelerinde apoptoz mekanizmalarının yanı sıra otofajik mekanizmalar üzerinden de etkili olduğunu gösteren ilk çalışmadır. MCF-7 hücrelerinde apoptoz ve otofaji ilişkisini daha net ortaya koyacak, otofaji inhibitörleri kullanılarak planlanacak ileri çalışmalara bilgi kaynağı oluşturacaktır.

Abstract:
Breast cancer is the most common cancer worldwide among women and is the second leading cause of cancer deaths. In recent years many studies about the new treatment modalities of breast cancer have been conducted. Statins, mostly used for the prevention of cardiovascular and cerebrovasculer diseases, block cholesterol synthesis by specific inhibition of HMG-Coa reductase. In the last few years, use of statins gained interest for cancer preventation and treatment. Although there are many articles that indicate cytotoxic effects of statins on cancer cells, the exact mechanism of antiproliferative and antiapoptotic effects of them on breast cancer cells is not clearly understood. Autophagy is a new insight about death pathways and it is defined as the process by which cells recycle their own unessential organelles and components under stress conditions. Autophagic effects of statins on different kinds of cancer cell lines are well known but the effects of statins on breast cancer cells have not been investigated in aspect of autophagy. Therefore, our aim was to determine if statins induce autophagy in breast cancer cells. We further investigated the relationship between apoptosis and autophagy specifically induced by statins in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells. In this study, it is found that treatment of MCF-7 breast cancer cells with different concentrations of atorvastatin, simvastatin, fluvastatin inhibited the proliferation of the cells in 24 and 48 hours. Fluvastatin appeared to induce a more evident proliferation inhibition. After tumor cells were treated with 10, 20 and 80 ?M concentrations for 24 hours, increase in apoptosis of MCF-7 cells were detected by concentration-dependent manner in TUNEL stainings of cells. When tumor cells were treated with 80 ?M statin for 48 hours, necrotic morphologic changes were more prominent. By 24 and 48 hours after Atorvastatin 10?M, 20?M and 80?M treatment, in MCF-7 cells apoptosis was detected by caspase 3 and autophagy was observed by beclin-1 and LC3 immunofluoresance staining. We further confirmed this observations with electron microscopic analysis, which showed apoptotic, autophagic and necrotic morphological changes in MCF-7 cells.Finally, our results present the first demonstration of autophagy of MCF-7 cells induced by statins. Thus our study establish a novel mechanism for apoptotic and antiproliferative effects of statins on breast cancer cells. To determine the exact relationship between apoptosis and autophagy induced by statins, further studies should be conducted by using autophagy inhibitors. In this work, showing the autophagic effects of statins on breast cancer cells, will provide the scientific foundation for subsequent research of new treatment modalities of breast cancer.