Kas (detrusor) invazyonu göstermeyen (PTA ve PT1) mesane karsinomlarında histolojik derecelendirme, P53, PHH3 ve Kİ-67 immünhistokimyasal belirleyicileri ve FGFR3 mutasyonunun prognoz ile ilişkisi
Histological grading, p53, phh3, ki-67 immunhistochemical markers and FGFR3 mutation relationship wi̇th prognosis in nonmuscle invasi̇ve (PTA and PT1) bladder cancers
Yazar: SERAP TAŞ
Danışman: DOÇ. DR. MESUDE YASEMİN ÖZLÜK
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Biyobelirteçler = Biomarkers ; Genler-P53 = Genes-P53 ; Karsinoma = Carcinoma ; Ki-67 = Ki-67 ; Mesane neoplazmları = Urinary bladder neoplasms ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Prognoz = Prognosis ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Mesane kanseri olan olgular genel olarak kas invazyonu yapmadan erken evrede başvururlar. Yeni mesane kanseri tanısı almış olguların yaklaşık %80'i mukoza ya da submukozaya sınırlı yüzeyel mesane kanserleridir. Erken evre mesane kanserleri %50-70 oranında rekürrens, %15-25 oranında ise progresyon gösterirler. Yüksek rekürrens ve düşük progresyon oranları bu tümörlerin yakın takibini gerektirir. Histopatolojik bulguların yanısıra, tümörün rekürrens riskini belirlemede güvenilir parametreler olması, hastalığın izlemi ya da tedavi agresifliği konusunda yardımcı olacaktır.
Mesane ürotelyal neoplazilerinin güncel sınıflaması, moleküler genetik ve histopatolojik bulguların birlikte değerlendirilmesi üzerine kurulmuştur. Son genetik veriler mesane ürotelyal kanserlerinin en az iki majör yolaktan (FGFR3 ve TP53 ilişkili yolaklar) geliştiğini göstermiştir. Düşük dereceli papiller non-invaziv ürotelyal tümörler, genetik olarak stabil, sık olarak 9. kromozom alterasyonları ve FGFR3 geninde aktive edici mutasyonlar ile karakterizedirler. Bu tümörlerin rekürrense yüksek eğilimleri olup, invazyon ve metastazları nadirdir. Yüksek dereceli ürotelyal tümörler, ürotelyal displaziden köken alırlar ve in situ karsinom veya yüksek dereceli non-invaziv papiller karsinom olarak başlarlar. Bunlar TP53 ve Rb gibi tümör supresör genlerinde sık mutasyonlar içerirler. Mesane kanserlerinde elde edilen moleküler veriler ışığında, moleküler ve ışık mikroskopik bulgular birleştirilerek yapılan moleküler derecelendirmenin benzer histopatolojik özelliklere sahip olgularda yüksek riskli olguları düşük riskli olgulardan ayırmada kullanılabileceği kanıtlarıyla gösterilmiştir. Morfolojik, immünhistokimyasal ve moleküler derecelendirme belirteçlerinin birlikte kullanılması mesane kanserlerinde risk sınıflamasının daha doğru yapılmasını sağlayacaktır. Moleküler alterasyonların aydınlatılması, bu değişikliklere yönelik hedef terapötik ajanların bulunmasına olanak sağlayacak ve normal dokuları koruyarak hedef tümör hücrelerinin ortadan kaldırılmasını mümkün kılacaktır.
Bu çalışmadaki amacımız, non-invaziv (pTa) ve erken invaziv (pT1) ürotelyal karsinom tanılı olgularda retrospektif olarak moleküler yöntemlerle FGFR3 mutasyonunu araştırmak, yeni kesitlere uygulanacak p53, PHH3 ve Ki-67 immünhistokimyasal belirteçlerinin farklı değişkenler ile ilişkisini sorgulamak ve bunlar arasında prognostik olarak kullanılabilecek parametreleri belirlemektir. 
Çalışmaya %54,5'i pTa, %31,4'ü pT1a, %14,1'i pT1b evresinde 46'sı (%38) düşük dereceli, 75'i (%62) yüksek dereceli toplam 121 olgu dahil edilmiştir. 
Proliferasyon belirteçlerinin (HE mitoz, PHH3 mitoz, Ki-67) birbiri ile olan ilişkisine bakıldığında üç yöntemin de birbiriyle en az orta derecede korelasyon gösterdiği belirlenmiştir. Histomorfolojik olarak ve PHH3 immünhistokimyasal yöntemi ile belirlenen mitoz sayılarının ve Ki-67 proliferasyon indeksinin histolojik derece ve evre yükseldikçe arttığı görülmüştür.
p53 ekspresyonuna histolojik dereceler açısından bakıldığında, düşük dereceli olgularda %67 oranında düşük (≤%10) boyanma görülürken, yüksek dereceli olguların %40'ı yüksek (>%10) boyanma göstermiştir. Evreler arası karşılaştırmada p53 boyanma yüzdeleri arasında anlamlı fark bulunmamıştır.
FGFR3 geninde, 63 olgudan 34 (%54)'ünde R248C, S249C, A371A, G372C, S373C, Y375C somatik nokta mutasyonları tespit edilmiştir. Mutasyon sıklığı 7. ekzonda %58,3 iken, 9. ekzonda %41,7 bulunmuştur. En sık mutasyon ise %47,2 oranıyla 7. ekzonda görülen S249C mutasyonudur. 
Düşük derece ve düşük Ki-67 proliferasyon indeksi gösteren tümörlerde rekürrens oranı anlamlı olarak daha yüksek bulunmuştur. Çok değişkenli analizlerde ise benzer klinikopatolojik özelliklere sahip tümörler dikkate alındığında FGFR3 mutasyonu ve pT1b evresi rekürrensi öngörmede bağımsız parametreler olarak öne çıkmaktadır. Rekürrenssiz sağkalım değerlendirmesinde ise düşük dereceli tümörler yüksek dereceli olanlara göre daha kötü seyreden grup olarak belirlenmiş, çok değişkenli Cox regresyon analizinde ise evre tek başına prognostik belirteç olarak ortaya çıkmıştır.
Progresyon oranlarının p53 boyanması ile ilişkisine bakıldığında, boyanması yüksek (>%10) olan olgularda boyanması düşük (≤%10) olanlara göre daha fazla progresyon saptanmıştır. Progresyonsuz sağkalım değerlendirmesinde tek değişkenli Cox regresyon analizlerine göre %10'dan fazla p53 ekspresyonu gösteren olgular daha kısa progresyonsuz sağkalım göstermişlerdir. Yaş, histolojik derece, evre, FGFR3 mutasyonu ve Ki-67 proliferasyon indeksine göre adapte edilerek yapılan çok değişkenli Cox regresyon analizinde ise p53 boyanması tek başına prognostik belirteç olarak ortaya çıkmıştır.
Mesane kanseri gelişiminde iki önemli yolak olan FGFR3 mutasyonu ve TP53 mutasyonunu yansıtan p53 aşırı ekspresyonu göz önüne alınarak bir moleküler derecelendirme modeli oluşturulmuştur. Buna göre olgular 3 ana gruba ayrılmıştır: 1-Moleküler Grad 1 (mGrad1): mFGFR3/negP53 (FGFR3 mutasyonu olan, p53 boyanması ≤%10 olan olgular), 2-Moleküler Grad 2 (mGrad2): wFGFR3/negP53 (FGFR3 mutasyonu olmayan, p53 boyanması ≤%10 olan olgular), 3-Moleküler Grad 3 (mGrad3): w/mFGFR3/pozP53 (FGFR3 mutasyonu olsun veya olmasın p53 boyanması >%10 olan olgular). Düşük dereceli tümörlerde daha çok (%55,2) mGrad1 görülürken, yüksek dereceli tümörlerde mGrade3 tümörler çoğunlukta olarak belirlenmiştir (%53). Evreler arası karşılaştırmada evresi pTa olan olgularda en sık (%45,2) mGrad1 görülürken, evresi pT1b olan olgularda en sık (%55,6) mGrad3 görülmüştür. Proliferasyon belirteçleri açısından bakıldığında her iki yöntemle (HE, PHH3) belirlenen mitoz sayılarının ve Ki-67 proliferasyon indeksinin en yüksek mGrad3 tümörlerde olduğu görülmüştür. Çalışma grubumuzda, rekürrens açısından yapılan değerlendirmede moleküler derecelendirmenin herhangi bir üstünlüğü olmadığı belirlenmiştir. Progresyon açısından değerlendirildiğinde ise moleküler derecelendirme grupları arasında mGrad3 grubu daha kısa progresyonsuz sağkalım göstermesi açısından ön plana çıkmıştır.
Sonuç olarak, çalışmamız mesane kanserlerinde en son derecelendirme olan WHO 2004 sisteminin klinik önemini desteklemiştir. Hücre proliferasyon belirleyicileri olarak kullanılan mitoz sayımı ve Ki67 indekslerinin histolojik derece ile korele olmakla birlikte, proliferasyon belirteçlerinin standart histolojik değerlendirmeye herhangi bir katkısının olmadığı görülmüştür. Mesane kanserlerinde patogenezde ve dolayısıyla prognozda etkili iki yolak olan FGFR3 ve p53 mutasyonlarının önemi, serimizde de ortaya çıkmaktadır. Mesane kanserlerinde önemli klinik sonuçlar olan ve sık rastlanan rekürrens ve progresyonu belirlemek amacıyla histolojik ve immünhistokimyasal belirleyicilerin kullanılabileceğini öne sürmektedir. Ayrıca çalışmamız, FGFR3 ve p53 mutasyonunun gerek mutasyon analizleri gerek immünhistokimyasal yöntemler kullanılarak saptanacağı ve bu verilere dayanarak yapılacak moleküler derecelendirmenin klinik önemini ortaya koymakta olup bu alanda yapılacak çalışmalara katkı sağlamıştır.

Abstract:
Most bladder carcinomas present in non-muscle invasive (early) stage. Superficial tumors are the most frequent of all newly diagnosed bladder cancers, comprising 80%. Superficial bladder carcinomas are confined to the bladder mucosa (pTa) or submucosal layer (pT1). Bladder cancer in early stage has high rates of recurrence (50-70%). Progression is seen in 15-25% of superficial bladder carcinomas. The presence of high rates of recurrence and low rates of progression create the need for accurate tumor surveillance. Biomarkers are needed to establish the risk of recurrence for the patient follow-up and aggressiveness of the therapy.
Current classification of bladder cancer is based on the combination of molecular and histopathologic findings. Recent molecular data showed that bladder cancers develop from two major pathways such as FGFR3 and TP53. Low-grade papillary non-invasive urothelial neoplasms are genetically stable and characterized by alterations in chromosome 9 and activated mutations in FGFR3 gene. These tumors show high risk of recurrence, whereas invasion and metastasis are rare. High-grade urothelial tumors originate from dysplasia and in situ carcinoma in the urothelium and initiate as high-grade non-invasive papillary tumor. High-grade tumors have mutations in tumor suppressor genes TP53 and Rb. The integration of both molecular and microscopic findings is used for molecular grading. Molecular grading might be used for risk assessment among cases sharing same histopathologic features. Highlighting molecular alterations in bladder carcinoma is thought to guide targeted therapy in bladder cancer.
The aim of this retrospective study was to define histopathologic and molecular markers to predict recurrence and progression in superficial (non-invasive pTa and early invasive pT1) bladder carcinomas. FGFR3 mutation, immunohistochemical analysis of p53, PHH3 and Ki-67 were analyzed in formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissues.
A total of 121 cases were included in this study. The stage distribution was as follows: 54.5%, 31.4% and 14.1% of the cases were pTa, pT1a and pT1b, respectively. Forty-six cases (38%) were low-grade and 75 (62%) were high-grade in histology.
Proliferation markers included in this study (mitotic count by HE and PHH3, Ki-67) showed at least moderate correlation with each other. High mitotic count by both methods (HE and PHH3) and Ki-67 profileration indices were detected in cases with high-grade histology and invasive stage.

Low-grade tumors showed low p53 expression (≤%10) with a rate of 67%, whereas high-grade tumors displayed high p53 expression (>10%) in 40%. No significant difference was seen among different stages regarding p53 staining patterns.
Mutation testing in FGFR3 gene was performed in 63 cases, 34 (54%) of which showed point mutations of R248C, S249C, A371A, G372C, S373C, Y375C. Mutation distribution was as follows: 58.3% in Exon 7 and 41.7% in Exon 9. The most frequent mutation was S249C present in Exon 7 with a frequency of 47.2%.
The recurrence rates for cases with low stage and low Ki67 proliferation indices were significantly higher. FGFR3 mutation and pT1b stage were shown as independent prognostic parameters for recurrence in multivariate analysis. Recurrence free survival was shorter for patients with low-grade tumors. However, in multivariate analysis, stage was seen as the only independent prognostic marker for recurrence.
The number of patients having progression were higher for tumors showing p53 staining in more than 10% of tumor cells when compared to tumors with p53 staining in ≤%10. Progression free survival was poor for tumors with higher p53 expression. When adjusted for age, histologic grade, stage, FGFR3 mutation and Ki-67 proliferation indices, the multivariate analysis showed that p53 immunohistochemistry was the only independent factor for progression free survival.
A model for molecular grading was created by including both FGFR3 mutation and p53 expression (as a marker for TP53 mutation). Three groups of molecular grade were generated as follows: 1- Molecular Grade 1 (mGrade1): mFGFR3/negP53 (mutant FGFR3, p53 staining ≤10%), 2- Molecular Grade 2 (mGrade2): wFGFR3/negP53 (wild type FGFR3, p53 staining ≤10%), 3- Molecular grade 3 (mGrade3): w/mFGFR3/posP53 (mutant or wild type FGFR3, p53 >10%). Low-grade tumors showed higher rates of mGrade 1 (55.2%), whereas high-grade tumors showed mGrade3 (53%). Similar findings were seen among stages, such as mGrade1 was present in 45.2% in pTa tumors and mGrade3 in 55.6% in pT1b. The highest counts for cell proliferation markers (mitotic count, Ki-67 indices) were seen in mGrade3 tumors. Molecular grading did not affect recurrence rates. However, progression free survival was shorter for mGrade3 tumors when compared to other molecular grades.
In conclusion, clinical impact of WHO 2004 histologic grading system was supported by our study. Although histologic grades were correlated with cell proliferation markers (mitotic count and Ki-67 proliferation indices), these markers add no significant advantage to histologic grading. The importance of two main pathways in bladder carcinogenesis and prognosis was reinforced in our study cohort. We suggest using histopathologic and immunhistochemical markers for prediction of recurrence and progression. FGFR3 and TP53 mutation can be detected either by mutation analysis or immunohistochemical methods. Molecular grading through the combination of FGFR3 and p53 status has clinical impact. The current study supports the present data with addition of new insights regarding molecular studies on superficial bladder carcinomas.