Sıcaklık duyarlı yüzeylerde hücre tabakası yaklaşımı ile hücre kültürü ve üroteliyal greft tasarımı
Urothelial graft design by cell sheet approach with cell culture on thermo-responsive surfaces
Yazar: ALPER KEMAL DOĞAN
Danışman: PROF. DR. EROL AKSÖZ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, doku mühendisliği uygulamalarına yönelik olaraksıcaklık-duyarlı yüzeylerde hücre tabakası yaklaşımı ile hücre kültürü yapılmış veelde edilen üroteliyal hücre tabakasının doku grefti olarak kullanıma uygun olupolmadığı belirlenmiştir.Tez kapsamındaki çalışmaların ilk aşamasında, sıcaklık-duyarlı yüzeylerinoluşturulması için kullanılması öngörülen PNIPAAm bazlı polimerlerin sentezi, vestandart polistiren hücre kültür kaplarına aşılanması gerçekleştirilmiştir. Polimersentezi ve yüzeye aşılama amacıyla PNIPAAM [poli(N-izopropilakrilamid)] polimeriiçin elektron demeti polimerizasyonu ve poli(NIPAAm-NtBAm) poly(Nizopropilakrilamid)?poly(N-tert-bütilakrilamid) için serbest radikal polimerizasyonuteknikleri kullanılmıştır. Sıcaklık-duyarlı yüzeylerin özelliklerini belirlemek amacıylaAFM ve SEM tekniklerinden yararlanılmıştır.Tez çalışmasının sonraki aşamasında, karakterizasyonu tamamlanan sıcaklıkduyarlıyüzeylere polimer aşılama yoğunluğundan bağımsız olarak hücretutunmasını sağlamak amacıyla Kollajen Tip I fiziksel olarak immobilize edilmiştir.Yüzey modifikasyonu sonrasında karakterizasyon SEM ve AFM yöntemleriyleyapılmıştır.Tez çalışmasının sonraki bölümünde, sentezlenen ve modifikasyonugerçekleştirilen sıcaklık-duyarlı yüzeyler ile g/G fare mesane üroteliyal hücrehattının kullanıldığı hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiş ve hücre adhezyonpromotoru ile modifikasyonun hücre üremesi ve yapışması üzerindeki etkisi ortayakonmuştur. Biyomalzemeler üzerindeki hücre yapışması ve üremesi,hemositometrik sayım, Alamar blue ve MTT, ve yöntemleri ile takip edilmiştir.Hücrelerin morfolojisini saptamak amacıyla invert mikroskop ve SEM görüntülerialınmıştır. Lusiferin-lusiferaz bazlı ATP testi ile yüzeye yapışan hücrelerin aktifadhezyon davranışı ortaya çıkartılmıştır.Hücre tabakasının doku grefti olarak kullanıma uygun olup olmadığınınbelirlenmesi amacıyla terminal hücre farklılaşma parametresi olarak ürotel dokuspesifik Uroplakin I ve Claudin 3,4 proteinlerinin ifadesine bakılmıştır. Proteinifadesinin tayini için ile western-blot analizi gerçekleştirilmiştir.Kollajen Tip I ile modifiye edilmiş yüzeylerde 2 saatlik kültür sonunda hücreyapışmasının, modifiye edilmemiş yüzeylere oranla ~%97 daha fazla olduğusaptanmıştır. Kollajen Tip I ile modifiye edilmiş sıcaklık-duyarlı yüzeylerde özgülhücre yapışma hızının modifiye edilmemiş yüzeylere oranla daha yüksek olduğusaptanmıştır. Değerler P(NIPA-NtBA) yüzeyler 0.11 saat-1 için ve Kollajen modifiyeiiP(NIPA-NtBA) için 0.87saat-1 ve Standart TCPS için 0.69 saat-1 olarakbulunmuştur.Hücresel ATP miktarının ölçümü Lusiferin'in ATP varlığında lusiferaz tarafındanindirgenmesi ve biyoluminesans özellikte oksilusiferin oluşturması prensibinedayalı yöntemle gerçekleştirilmiştir. Konsantrasyonu bilinen ATP çözeltileri ilehazırlanan kalibrasyon grafiğine göre hücresel ATP miktarı nmol cinsindenbelirlenmiştir.Sıcaklık etkisi ile yüzeyden hücre tabakası eldesi için g/G fare mesane üroteliyalhücreleri ortamdaki besiyerinin 4°C dereceye getirilmiş besiyeri ile değiştirilmesisonucunda yüzeyden koparılmıştır. Hücre-tabakası biçiminde ayrılma 5.dakikadan itibaren görüntülenmiştir. Ayrılma kültür kabının kenarlarından başlamışve hücre tabakası ortaya doğru katlanma gözlemlenmiştir. 20 dakikanın sonundaelde edilen hücre tabakası tamamen kendi üstüne katlanmış bir forma gelmiştir.Proteinlerin jelde yürtülmesi neticesinde Uroplakin Ia ve Uroplakin Ib bantlarısırasıyla 27 kD ve 28 kD sevyesinde, Claudin 3 ve Claudin 4 bantları ise 20kDseviyesinde görüntülenmiştir. Bu sonuçlara dayanarak protein ekspresyonusonuçları değerlendirildiğinde elde edilen hücre tabakasının terminal düzeydefarklılaşma gösterdiği sonucuna varılmıştır.Sonuç olarak, sunulan tez çalışması kapsamında hazırlanan PNIPAAm bazlısıcaklık-duyarlı yüzeylerde gerçekleştirilen üroteliyal hücre kültürü sonucu eldeedilen hücre tabakasının doku grefti olarak kullanılabilirlik potansiyeli olduğusonucuna varılmıştır.Anahtar Kelimeler : doku mühendisliği, hücre tabakası, sıcaklık-duyarlı yüzeyler,üroteliyal hücre kültürü, üroteliyal greft

Abstract:
In the presented study, urothelial cells have ben cultured on thermo-responsivesurfaces by cell sheet approach in order to determine its potential as an urothelialtissue graft.On he first phase of the study, in order to obtain thermo-responsive surfaces,polymers of choice PNIPAAM [poli(N-izopropilacrylamide)] and P(NIPAAm-NtBAm) poly(N-isopropylacrylamide)(NIPAM) ?poly(N-tert-butylacrylamide) havebeen synthesized and grafted onto tissue culture polystyrene surfaces by e-beampolymerization and free radical polymerization. Surface properties of the thermoresponsivedishes have been characterized by SEM and AFM analysisaccordingly. In order to make the cells attach to the surface free of grafting densityof the thermo-responsive polymer, grafted surfaces have further been modifiedwith Collagen Type I as cell adhesion promoter.In the next phase of the study, g/G mouse urothelial epithel cells have beencultured on surface modified and non-modified thermo-responsive dishes. Cellattachment and proliferation have been identified by Alamar blue assay, MTTassay and haemocytometric cell counts. Urothelial cell morphology has beenvisualized by inverted and phase contrast microscopy. Adherence behaviour of theurothelial cells have been monitored with Luciferine/Luciferase ATP assay.For the determination of adequacy as a tissue graft, terminal differentiationmarkers expressed as proteins have been identified specifically for urothelial cells,which are Uroplakin Ia and Uroplakin Ib along with Claudin 3 and Claudin 4. Afterprotein extraction and antibody binding, western-blot analysis have beenperformed in order to determine the protein expression.On Collagen modified thermo-responsive surfaces, cell adhesion was 97% morethan cells on non-modified surfaces. The rate of cell attachment on Collagen TypeI modified surfaces has been higher when compared with non-modified surfaces.The rate of cell adhesion on modified and non-modified thermo-responsive disheswere calculated as 0.87 hour-1 and 0.11 hour-1 respectively.Temperature-controlled cell sheet detachment have been manipulated bychanging the cell media with 4oC medium. Total cell sheet detachment took placein 20 minutes and have been visualised. Sheet detachment began at 5th minutefrom the edge of the culture flask and finalized at 20th minute. At the time of totaldetachment, cell sheet folded onto itself.ivResults of terminal differentiation marker analysis with western blotting confirmedthat the urothelial cell sheet had been differentiated terminally and can be utilizedas an urothelial tissue graft. After gel electrophoresis, protein bands for UroplakinIa and Ib have been detected at 27-28 kD level, Claudin 3 and Claudin 4 bandshave been visualized at 20kD level respectively.In conclusion, cell sheets obtained from urothelial cell culture on temperatureresponsivePNIPAAm based surfaces have the potential to be used as urothelialtissue grafts.Key words : tissue engineering, cell sheet, temperature-sensitive surfaces,urothelial cell culture, urothelial graft.