Leıshmanıa ınfantum'un farklı antijen kombinasyonlarını içeren  poli(laktik-ko-glikolik asit) nanopartiküllerinin sentezi, karakterizasyonu ve visseral leishmaniasis'e karşı aşı adayı olarak etkinliklerinin in vitro ve in vivo incelenmesi
Synthesis, characterization and in vitro and in vivo investigation of effectiveness as vaccine candidate against visceral leishmaniasis of poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles containing combination of different antigens of leishmania infantum
Yazar: ÖZLEM AYŞE TOSYALI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MELAHAT BAGIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Leishmaniasis, Leishmania türündeki zorunlu hücre içi parazitlerin neden olduğu tropikal bir hastalık olup Dünya'nın ve Türkiye'nin en önemli halk sağlığı problemlerinden biridir. Dünyada 350 milyon kişi bu hastalığa yakalanma riski altındadır. Hastalık Türkiye'nin de içinde olduğu 98 ülkede endemik olup, enfekte kişilerin sayısı ise 12 milyondur. Özellikle Suriye'de meydana gelen iç savaşlar nedeniyle Güneydoğu Anadolu bölgemizde olgu sayısı oldukça artmış durumdadır. Sağlık bakanlığı verilerine göre 2012-2017 arasında Suriyeli misafirlerde 8.513 Kutanöz Leishmaniasis vakası tespit edilerek tedavileri yapılmıştır. Hastalığın ülkemizde ve dünyada yaygın olmasının başlıca nedenleri; iklim değişiklikleri, hastalığın vektörlerinde kullanılan insektisitlere, parazitlerde ise ilaçlara karşı dirençliliğin gelişmesidir. 
Tüm bunlar Leishmaniasis'e karşı aşının geliştirilmesinin oldukça önemli olduğunu  ortaya koymaktadır.  Günümüze kadar üç jenerasyonda aşı adayları geliştirilse de, her birinin farklı dezavantajları nedeniyle henüz etkin ve güvenilir bir aşı elde edilmesi mümkün olmamıştır. Birinci nesil grubuna dahil olan aşılar öldürülmüş parazit antijenleriyle veya zayıflatılmış canlı (attenüe) Leishmania parazitlerinden oluşmaktadır. Attenüe aşılar, parazitin tekrar aktifleşebilme olasılığı olduğundan risk taşımaktıdır. Bu nedenle kullanımı sınırlıdır. Çözünür leishmania (ÇLA) ve otoklavlanmış leishmania antijenleri (OLA) gibi antijenler yapısında birçok hedef protein içerdiğinden birçok MHC ile etkileşim olanağı sağlayıp yüksek immün yanıt oluşturabilmektedir.  Bunun yanında elde edilmesi kolay ve maliyeti düşüktür. Ancak bu antijenler de tek başlarına ve günümüze kadar çeşitli adjuvanlarla birlikte kullanımı düşük koruma derecesi sergilemiştir. Buna göre de bu antijenlerinin oluşturduğu immün yanıtı arttırabilmek için daha uygun adjuvanların araştırılması oldukça önemlidir. İkinci jenerasyon aşılar daha çok parazitin yüzey molekülleri, hücre içi molekülleri, strese duyarlı molekülleri ve metabolik yolaklardaki diğer birçok biyomoleküller antijen olarak kullanılmıştır. Bunlar içerisinde Lipofosfoglikan (LPG) parazitin yüzeyinde en çok bulunan immünojen bir moleküldür. Ancak tek başına subunit antijenler de yeterli immün yanıt oluşturamamaktadır. Üçüncü nesil içersinde yer alan DNA aşıları ise nispeten kolay üretilebilmeleri, yönlendirilmesi kolay, immünojen olmaları taşınmasında birçok geni bir araya getirebilme olanağı sağlaması nedeniyle avantajlıdır. Ancak birçoğunun etkinliğinin düşük olması ve yeterli koruma sağlayamaması ve maliyet gibi nedenler dezavantajlarını oluşturmaktadır. 
Laboratuvarımızda daha önce TÜBİTAK projesi kapsamında tamamlanan çalışmada ilk kez olarak Leishmania parazitlerinin immünojenik yüzey moleküllerinden olan LPG'nin (poliakrilikasit) PAA ile konjugatının in vivo modellerde %80 koruma sağladığı ve böylece önemli bir aşı adayı olduğu ortaya konulmuştur. Ancak son zamanlarda nanoteknolojide meydana gelen gelişmeler aşı çalışmalarına yeni bir boyut getirmiştir. Nanopartiküler, antijenlerin biyolojik sistemde degrede olmadan, kontrollü ve efektif olarak salımını ile hedefe yönelik taşınımlarına olanak sağlamaktadır. Özellikle kombinasyon şeklinde birden fazla antijenin aynı antijen sunucu hücre tarafından alınması nanopartiküler antijen taşıyıcı sitemin en önemli avantajlarından biridir. Taşıyıcı sistem olarak biyouyumlu, biyobozunur ve aynı zamanda adjuvan özelliğe sahip FDA onaylı PLGA (poli laktik-ko glikolik asit) nanopartikülleri sıkça kullanılmaktadır. Literatürü incelediğimizde çözünür ve otoklavlanmış leishmania antijenini ile lipofosfoglikan ikili antijen kombinasyonu içeren PLGA nanopartikülleri ve immünojenik özellikleriyle ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı, L.infantum parazitlerinden izole edilen lipofosfoglikan molekülünün çözünür leishmania antijeni veya otoklavlanmış leishmania antijeni ile kombinasyon halinde FDA onaylı PLGA nanopartiküllerine enkapsüle edilmesi, karakterizasyonu ve elde edilen nanoformülasyonların etkinliğinin in vitro ve in vivo olarak incelenmesiyle dünyada ve ülkemizde Visseral Leishmaniasis'e karşı yeni nesil aşı adayı formülasyonların geliştirilmesidir. Tezin amaç ve hedefine uygun olarak çalışma kapsamında, tüm parazit antijenini içeren ÇLA ve OLA ile parazit yüzeyinde bol miktarda bulunan immünojen özellikli LPG molekülü elde edilmesi için parazitin biyoreaktörde büyük ölçekli kültürü yapılıp biyomasdan elde edilmiştir. Daha sonra biyomasdan elde edilen antijenler PLGA içerisine enkapsüle edilmiştir. Ardından oluşturulan nanoformülasyonların karakterizasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen hem tek başına LPG, ÇLA ve OLA antijenlerini içeren PLGA nanoformülasyonları (F1, F2 ve F3) hem de ÇLA-LPG ve OLA-LPG ikili antijen içeren PLGA nanoformülasyonlarının (F4 ve F5) toksisitesi J774 makrofaj ve L929 fibroblast hücre kültüründe MTT yöntemi ile incelenmiştir. Ardından toksik olmadığı belirlenen formülasyonların makrofaj hücre kültüründe sitokin ve Nitrik Oksit (NO) üretme potansiyeli incelenmiştir. Daha sonra bu nanoformülasyonların aşı adayı olarak koruyucu etkinlikleri in vivo olarak fareler üzerinde incelemek için iki hafta aralıklarla immünizasyon işlemi gerçekleştirilmiş ve oluşan antikor miktarı deney hayvanlarının serum örneklerinden ELISA ile belirlenmiştir. İmmünizasyonların ardından her bir gruptaki fareler L.infantum parazitleri ile enfekte edilmiştir ve enfeksiyonun kontrolü Giemsa boyama ve mikro kültür yöntemi ile takip edilmiştir. Bir ay sonra kontrol grubunda enfeksiyonun tespit edilmesinin ardından fareler sakrifiye edilerek; dalak ve karaciğer parazit yükü  (LDU) belirlenmiştir. Ayrıca farelerin dalak lenfositleri izole edilmiş ve lenfositlerden salgılanan IL-4, IL-10, IL-12 ve IFN-γ sitokinleri ticari bir kit yardımıyla tayin edilmiştir.
Elde edilen sonuçlara göre, incelenen farklı konsantrasyonlarda F4 ve F5 nanoformülasyonlarının J774 makrofaj ve L929 fibroblast hücre kültüründe kontrole kıyasla 500 μg/ml'a kadar anlamlı bir toksik etki göstermediği saptanmıştır. Formülasyonların, makrofajların NO üretmeleri üzerindeki etkinliği incelendiğinde ise, makrofaj hücrelerinde NO üretimine en fazla etkiyi kontrole kıyasla NO üretimini 15 kat arttıran F4 nanoformülasyonu ve 20 kat arttıran F5 nanoformülasyonun gösterdiği saptanmıştır. Benzer şekilde aşı formülasyonları uygulanan makrofaj hücrelerinin ürettiği  IL-12 ve IFN-γ sitokin seviyelerinin kontrol grubuna göre, 4-6 kat arasında arttırırken tek başına antijen kombinasyonlarıyla anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Bunun nedeninin, PLGA nanopartiküllerinin içerisindeki antijenlerin zamanla 72 saatlik kısa süre sonunda yalnızca az miktarda antijenin ortama salınması olabilir. IL-4 ve IL-10 seviyelerinde anlamlı bir değişikliğin meydana gelmediği belirlenmiştir. IL-12 ve IFN-γ sitokinlerinin Th1 yanıtını, IL-4 ve IL-10 sitokinlerinin ise Th2 yanıtını indüklediği bilinmektedir. IL-12 ve IFN-γ seviyelerinin kontrole göre yüksek olması immün yanıtın Th1 tipi yönünde gelişebileceğini düşündürmektedir. Daha sonra tüm  nanoformülasyonlar Balb/c fareler üzerinde incelendi. En yüksek antikor seviyesi F5 nanoformülasyonu uygulanan gruplarda gözlenmiştir. Ayrıca farelerin sakrifikasyonunun ardından F4 ve F5 formülasyonu ile immünize edilen deney hayvanlarında parazit enfeksiyonuna karşı sırasıyla yaklaşık %75 ve %78 koruma sağlandığı gözlenmiştir. İncelenen bir diğer parametre dalak hücrelerindeki sitokin seviyeleridir. F4 ve F5 nanoformülasyonlarının IL-12 için sırasıyla 9 ve 15, IFN-γ sitokin için ise sırasıyla yaklaşık 10 ve 18 kat arttırdığı, diğer yandan IL-4 seviyelerinde herhangi bir değişikliğin olmadığı ve  IL-10 değeri ise F5 formülasyonu için kontrole nazaran 2 kat azalma gösterdi. Elde edilen sonuçlara göre, her iki formülasyonun da farelerde gerek antikor seviyesini gerek parazit yükünde meydana gelen azalma gerekse de Th1 immün yanıtı indükleyen IL-12 ve IFN-γ sitokin seviyelerini arttırması, bu aşı formülasyonlarının immünojenik özelliklerini net bir şekilde ortaya koymaktadır. Bu sonuç uygulanan aşı formülasyonlarının hücresel ve hümoral yanıtı tetikleyerek organlardaki parazit enfeksiyonunu önemli derecede engellediği düşündürmektedir. Böylece bu tez çalışması kapsamında Dünyada ve Ülkemizde ilk kez olarak, Visseral Leishmaniasis'e karşı etkinliği in vitro ve in vivo kanıtlanmış ÇLA-LPG ve OLA-LPG ikili antijen kombinasyonu içeren PLGA temelli yeni nesil nanoaşı formülasyonları geliştirilmiş oldu.

Abstract:
Leishmaniasis, one of the serious public health problems of Turkey and the world, is a tropical disease which is obligatory intracellular Leishmania parasites. Through the world, nearly 350 million people are under the risk of this disease.  The disease is also in Turkey, where endemic in 98 countries, the number of people infected is 12 million. The number of incidents in the Southeastern Anatolia region has increased considerably due to the civil wars especially in Syria. Climate change, the development of resistance to the drugs and also many mammals have a disease reservoir play a major role in this widespread disease. In addition, the problems in the diagnosis of the disease, the difficulties in treatment and the development of resistance clearly reveal the necessity of an effective and safe vaccine the against the disease. Even though vaccine candidates have been developed in three generations to date, still there is no an effective and safe vaccine because of their different disadvantages.  Vaccines from the first generation group consist of killed parasite antigens or attenuated Leishmania parasites. The attenuated vaccines were risky as the parasite was likely to be reactivated. Therefore, its use is limited. Due to the contain many target proteins in their structure, soluble leishmania (SLA) and autoclaved leishmania antigens (ALA) can interact with many MHC molecules and produce a high immune response. Besides this, it is easy to obtain and low cost. However, these antigens alone and/with the use of various adjuvants to date showed a low degree of protection. So, in order to increase the immune response of these antigens, it is very important to investigate more appropriate adjuvants. Second generation vaccines based on mostly surface molecules, intracellular molecules, stress sensitive molecules and many other biomolecules in metabolic pathways as a antigen. Among these, lipophosphoglycan (LPG) is a molecule that most immunogenic and abundant in parasite surface. However, subunit antigens alone cannot produce adequate immune responses. DNA vaccines in the third generation are advantageous because they are relatively easy to produce, easy to direct, and have the ability to combine many genes in their transport. However, reasons such as low efficiency and not being able to provide adequate protection and also cost factors are DNA vaccines' disadvantages. Recent advances in nanotechnology have brought a new dimension to vaccine studies.  Nanoparticular allows controlled and effective release of antigens without degredation in the biological system and their targeted transport. In particular, the combination of multiple antigens in the form of the same antigen presenting cell is one of the most important features of the nanoparticular antigen-carrying system. FDA-approved PLGA (poly lactic co-glycolic acid) nanoparticles are commonly used as carrier systems due to the biocompatible, biodegradable and also adjuvant properties. When we review the literature, there is no study about PLGA nanoparticles and immunogenic properties of soluble and autoclaved leishmania antigen combination with lipofosfoglycan. Accordingly, the aim of this thesis is to encapsulate the lipofosfoglycan molecule isolated from L.infantum promastigotes in combination with soluble leishmania antigen or autoclaved leishmania antigen to FDA-approved PLGA nanoparticles, to investigate the effectiveness of the nanoformulations in vitro and in vivo against the visceral leishmaniasis. In this thesis, the parasite cultured in a bioreactor in order to obtain biomass for isolation of SLA, ALA and LPG antigens. The obtained antigens used as a both single and binary combination to encapsulated into PLGA. The characterization of the nanoformulations was then performed using different devices.  The amount of antigen and the release profile of the nanoformulations were determined using the UV-spectrophotometer. Both LPG, SLA and ALA antigens alone (F1, F2 and F3) and SLA-LPG and ALA-LPG binary antigens (F4 and F5) encapsulated in PLGA was investigated toxicity by MTT method in J774 macrophage and L929 cell culture. The potential for the production of cytokine and nitric oxide (NO) was investigated in macrophage cell culture. Immunization was carried out at two week intervals to investigate protective activities of these nanoformulations as a vaccine candidate in vivo, and the amount of antibody level was determined by ELISA from the serum samples of the experimental animals. After 8 immunizations, mice in each group were infected with L.infantum parasites and control of infection was monitored by Giemsa staining and micro-culture method. One month later after the detection of infection in the control group, the mice were sacrificed; The parasite load (LDU) in the spleen liver and bone marrow were determined. In addition, IL-4, IL-10, IL-12 and IFN-γ cytokines secreted from lymphocytes were determined by a commercial kit. According to the results, it was found that the different concentrations of nanoformulations in J774 macrophage and L929 cell culture did not show a significant toxic effect up to 500 μg/ml compared to the control. When the effectiveness of the formulations on the NO production of macrophages was examined, it was found that the highest effect on NO production in macrophage cells was F4 nanoformulation which increased NO production by 15-fold and F5 nanoformulation which increased 20-fold compared to control. Similarly, vaccine formulations increased the levels of IL-12 and IFN-γ cytokines produced by macrophage cells to 4 to 6 fold compared to the control group, while no significant difference was observed with antigen combinations alone.  The reason for this may be the release of only a small amount of antigens into the medium after 72 h of short time in time the antigens within the PLGA nanoparticles. There was no significant change in IL-4 and IL-10 levels. IL-12 and IFN-γ cytokines are known to induce Th1 response and IL-4 and IL-10 cytokines induce Th2 response. High levels of IL-12 and IFN-γ levels suggest that the immune response may develop in the Th1-type. The all  groups were then examined on Balb/c mice. The highest antibody level was observed in F5 nanoformulation groups. In addition, it was observed that 75% and 78 % protection against parasitic infection in experimental animals immunized with respectively F4 and F5 formulation following sacrification of mice. Another examined parameter is cytokine levels in spleen cells. It was found that F4 and F5 nanoformulations increased 9 and 15 fold for IL-12 level and 10 and 18 fold for IFN-γ cytokine, respectively. On the other hand, no change was observed for IL-4 levels and 2-fold decrease IL-10 levels shown in F5 nanoformulation compared to control. According to the results obtained, both F4 ve F5 nanoformulations clearly demonstrate the immunogenicity of these vaccine formulations in which both the increase in antibody level and IL-12 and IFN-γ cytokine levels inducing the Th1 immune response and also decrease the parasite load in mice are evident. This result suggests that the administered vaccine formulations significantly inhibit the parasite infection in the organs by inducing cellular and humoral response.  Thus, for the first time in this study, nanoformulations containing binary leishmania antigens such as SLA-LPG and ALA-LPG for the first time have been shown to have significant potential as a vaccine candidate against visceral leishmaniasis in vitro and in vivo.