Escherichia coli sialiltransferaz geninin klonlaması, ekspresyonu ve yapı-işlev ilişkileri
Cloning, expression and structure-function relationship in sialyltransferase gene of escherichia coli
Yazar: YOSUN MATER
Danışman: PROF. DR. SABİRE KARAÇALI ; PROF. DR. FÜSUN GÜMÜŞEL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2004
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
ÖZET Hücre yüzeylerinde yer alan sialik asitler canlıda tanıma, tutunma, farklılaşma ve immün düzenleme gibi önemli biyolojik olaylarda işlevsel olan polisakkaritlerdir. Prokaryotlarda sialik asit ve metabolizması üzerine yapılan çalışmalar, kapsül senteziyle ilintili gen bölgelerinde odaklanmıştır. E. coli K92'nin kapsüler polisakkariti -8-NeuAca2 ve -9-NeuAca2 bağlarım içerir. Bu tez çalışmasında a-2,8 ve a-2,9 bağlı polimerleri sentezleme yeteneği taşıdığı bilinen tek enzim olan sialitransferazın (ST) sentezinden sorumlu neuS geni, E. coli K92 genomik DNA'sından klonlanmıştır. PCR ürünü olan 1.23 kb büyüklüğündeki parça pUC vektörüne yerleştirilmiş ve protein E. coli JM109 soyunda eksprese edilmiştir. Yaklaşık 47.5 Kda büyüklüğünde bir bandın varlığı yapılan SDS/PAGE analizlerinin bazılarında gözlenmiş ancak anti-ST antikorları sağlanamadığından Western Blot analizi ile doğrulanamamıştır. neuS genini taşıyan plazmit, bu çalışmada gen kaynağı olarak kullanılan E. coli K92 soyunun transforme edilmesinde de kullamlmıştır. Rekombinant soylarla yapılan elektron mikroskobik analizler, rekombinant K92'de ciddi bir yüzey farklılığının oluşmamasına karşın, E. coli JM109-ST hücrelerinde yüzey sialik asitlerinin kaim bir tabaka oluşturduklarına işaret etmiştir. Tez çalışmasının ikinci aşamasında, bakteriyel ST yapı işlev ilişkilerinin belirlenmesine yönelik çalışmalara katkıda bulunmak amacıyla 3 farklı yönlendirilmiş mutagenez çalışması yapılmıştır. Bunlardan ikisi başarılı olmuş ve toplam 409 amino asitten oluşan E. coli K92 ST'mda K173N, K175E, P176A ve W185G amino asit değişiklikleri yapılmıştır. Mutagenez çalışmalarının sonuçlan, W185G değişikliğinin enzimin polimerizasyon aktivitesini etkilediğine ve K173N, K175E, P176A değişimlerinin gerçekleştirildiği ve olası membran bağlanma bölgelerinden birisinde yer alan KKKP motifinin enzimin hücre zarına bağlanmasında işlevsel olduğuna ve belirtilen mutasyonlann bu bağlantıyı bozduğuna işaret etmiştir. Mutant klonlarda yüzey değişikliklerinin ötesinde çeşitli morfolojik farklılıklar saptanmıştır.

Abstract:
vn ABSTRACT Sialic acids are cell surface polysaccharides functional in biological processes such as recognition, binding, differentiation and immune regulation. The research activities targeting sialic acid and its metabolism have been mainly focussed on the genes related to capsule synthesis. Capsular polysaccharide of E.coli K92 consists of -8- NeuAcoc2 and -9-NeuAcoc2 bonds. In this study, neuS gene, responsible for the synthesis of the sialyltransferase which is unique with its ability to synthesize a- 2,8 and a- 2,9 linked polymers among the know gylcosyltransferases, was cloned from E. coli K92 genomic DNA. The PCR product of 1.23 kbp long fragment was inserted into pUC 19 vector and the protein expression was achieved in E. coli JM109. The presence of 47.5 kDa protein band was observed in some of the SDS/PAGE analyses, but it was not confirmed by Western Blotting since anti-ST antibodies can not be obtained. The plasmid carrying neuS gene was also used in transformation of E. coli K92. Electron microscopical analyses in recombinant strains show that although serious surface differences was not seen in recombinant K92 strains, formation of a thick layer by surface sialic acids was seen in JM109-ST cells. At the second step, three different site-directed mutagenesis studies was performed to determine bacterial ST structure-function relationships. Two of them was successful and K173N, K175E, P176A and W185G amino acid substitutions were introduced into 409 amino acids long K92-ST. The results of mutagenesis studies indicated that W185G substitution affected the polymerization activity of the enzyme and the KKKP motif, in which K173N, K175E, PI 76 A substitutions were realized, located on one of the possible membrane binding sites, was functional in the binding of the enzyme to the cell membrane and the binding was abolished by the corresponding mutations. In mutant clones, besides the surface differences, several morphological changes were also detected.