Pilositik astrositomlarda doku mikroarray yöntemi ile nöral kök hücre immunofenotipik kompozisyonunun ve nüks yönünden riskli grupların araştırılması
Analysis of neural stem cell immunophenotypic composition with tissue microarray method and high-risk groups for recurrence in pilocytic astrocytomas
Yazar: AYÇA ERŞEN SARAÇOĞLU
Danışman: PROF. DR. UĞUR PABUÇCUOĞLU
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2009
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Astrositom = Astrocytoma ; Kök hücreler = Stem cells ; Mikrodizilim analizi = Microarray analysis ; Nüks = Recurrence ; İmmünofenotip tayini = Immunophenotyping

Özet:
Amaç ve hipotez: Günümüzde birincil beyin tümörlerinin kök hücrelerden kaynaklandıgıhipotezi güçlenmektedir. Çalısmamızda nöral kök hücre belirleyicilerinin pilositikastrositomlardaki ekspresyonunu ve sonuçların prognostik açıdan degerini arastırmakamaçlanmıstır. Kök hücre belirleyicilerinden CD133, CD34, p75NTR, Sox-2 antikorlarıpilositik astrositom olgularına immunohistokimyasal yöntemle uygulanmıs, ekspresyonlarglial belirleyicilerin (olig-2, GFAP, vimentin) ve nöronal belirleyicilerin (Nörofilamen, Neu-N, sinaptofizin) ekspresyonları ile karsılastırmalı olarak incelenmistir. Bu tümörlerde ayrıcaEGFR, p53, bcl-2, Ki-67 gibi tümör iliskili antijenler arastırılmıstır. Moleküler degisiklikleryanısıra olguların klinik özellikleri de tümörün biyolojik davranısını aydınlatmak içinincelenmistir.Yöntem: 1990-2005 yılları arasında tanı alan 62 pilositik astrositom olgusundan dokumikroarray blok ve kesitleri hazırlanmıstır. Otopsi vakalarına ait fetal ve eriskin normalserebral korteks, serebellum dokuları kontrol amaçlı kullanılmıstır. Kesitlereimmunohistokimyasal yöntemle CD133, CD34, p75NTR, bcl-2, EGFR, Nörofilamen, GFAP,vimentin, sinaptofizin, Sox-2, Olig-2, p53, Ki-67, NeuN antikorları uygulanmıs, floresan insitu hibridizasyon yöntemi ile de 15 olguda 1p/19q delesyonu incelenmistir.Bulgular: Olguların yas ortanca degeri 84 aydır (aralık 14-193 ay). Kız/erkek oranı esittir.Olguların %68'i (n=42) arka çukur, %29'u (n=18) supratentoryal bölge, %3'ü (n=2) medullaspinalis yerlesimlidir. 32 olguya (%52) total, 30 olguya (%48) subtotal eksizyonuygulanmıstır. Olguların %15'inde (n=9) ortalama 12 ay içerisinde nüks saptanmıstır.Vimentin tüm olgularda, GFAP ise fokal boyanma gösteren dört olgu (%10) dısında yaygıneksprese edilmistir. Sinaptofizin immunoreaktivitesi 40 olgunun 25'inde (%62), Nörofilamen57 olgunun %21'inde (n=12), NeuN 50 olgunun %4'ünde (n=2) pozitiftir. EGFR ve p53pozitifligi olguların hiçbirinde izlenmemistir. Bcl-2 antikoru ile 39 olgunun %16'sında (n=6)ekspresyon saptanmıstır. Ki-67 41 olguda ortalama %2 (aralık %0-8) oranında pozitiftir.CD133 bir olgu dısında olguların hiçbirinde, CD34, p75NTR de hiçbir olguda pozitifsaptanmamıstır. Sox-2, 48 olguda ortalama %45 (aralık %0-90) oranında, Olig-2 ise 50olguda ortalama %35 (aralık %0-90) oranında pozitiftir.statistiksel inceleme sonucunda nüks gelisimi cerrahi eksizyon derecesi ve yas ile tersyönde, Ki-67 boyanma indeksi ile pozitif yönde iliskili bulunmustur. Yası 5'ten küçükolguların hem tüm olgular hem de sadece subtotal eksizyon uygulanan olgular arasındanükssüz sagkalım süreleri daha kısadır. Ki-67 boyanma indeksi %2'den yüksek olgulardanükssüz sagkalım süreleri daha kısadır. mmunohistokimyasal belirleyiciler ile nüks gelisimiarasında istatistiksel olarak anlamlı iliski saptanmamıstır. Floresan in situ hibridizasyonyöntemi uygulanan 15 olguda 1p/19q delesyonu saptanmamıstır.Sonuç: Pilositik astrositom olgularında glial belirleyiciler yanı sıra daha düsük oranlarda olsada nöronal belirleyicilerin eksprese edilmesi tanısal yaklasım için önemlidir. Özgül olmayanbir nöral kök hücre belirleyicisi Sox-2'nin pilositik astrositomlarda varlıgı kök hücrehipotezini desteklemektedir. Olig-2'de izlenen immunoreaktivite sonuçları, GFAP vevimentin sonuçları ile birlikte pilositik astrositomlardaki glial diferansiasyonu göstermekte,1p/19q delesyonunun saptanmaması oligodendroglial diferansiasyon olasılıgındanuzaklastırmaktadır. Subtotal eksizyon uygulanan, 5 yas altında tanı alan ve Ki-67 boyanmaindeksi %2'den yüksek olgular nüks yönünden riskli gruplardır. Bazı kök hücrelerde venadiren yüksek dereceli glial tümörlerinde izlenebilen CD133, p75NTR antijenleri pilositikastrositomlarda gözlenmemistir. Yüksek dereceli glial tümörlerde görülen p53 mutasyonu,EGFR amplifikasyonu pilositik astrositomlarda nüks gelisimi ile iliskili degildir. Çalısmadakullanılan doku mikroarray yöntemi genis immunohistokimyasal panel ve in situhibridizasyon incelemesini kolaylastırmıstır.Anahtar kelimeler: Pilositik astrositom, nöral kök hücre, nüks, doku mikroarray yöntemi

Abstract:
Aim and hypothesis: There is growing evidence for the role of stem cells in some primarycentral nervous system tumors. In order to determine the presence and the prognosticsignificance of stem cell markers in pilocytic astrocytoma, we have analyzed the expressionof a set of antibodies including CD133, CD34, p75NTR, Sox-2, in a large series of pilocyticastrocytomas. In addition, we have analyzed the expression of glial (olig-2, GFAP, vimentin)and neuronal (neurofilament, synaptophysin, and NeuN)) markers to determine a relationshipbetween the above groups of markers. We have also analyzed some of the tumor-associatedantigens, such as EGFR, p53, bcl-2, and Ki-67 in this group of tumors. The results were thencorrelated with clinical findings in order to determine an association between the markerstatus of tumors and their clinical characteristics in order to determine biologically importantfactors.Method: The tissue microarray blocks and slides were prepared from 62 pilocyticastrocytoma cases. Fetal and adult normal cerebral and cerebellar brain sections from autopsycases were used as controls. All microarrays were stained with antibodies against CD133,CD34, p75NTR, bcl-2, EGFR, Neurofilament, GFAP, vimentin, synaptophysin, Sox-2, Olig-2, p53, Ki-67 and NeuN using standard immunohistochemical techniques. Fifteen randomcases were also analyzed for 1p/19q deletion by flourescent in situ hybridization.Results: There were 62 patients with a median age of 84 months (range 14-193 months).Femal/male ratio was equal. The tumor localizations were as follows: posterior fossa, 68%(n=42); supratentorial, 29% (n=18); spinal cord, 3% (n=2). Gross total resection wasperformed in 32 cases (52%) and the remainder of the cases underwent subtotal resection.There were nine recurrences (15%) with a mean recurrence free period of 12 months. Allcases strongly expressed vimentin and GFAP was diffusely positive in all but four cases inwhich the staining was focal. There was synaptophysin positivity in 25, neurofilamentpositivity in 12 and NeuN positivity in two cases. No tumor was positive for EGFR, p53,p75NTR and CD34 protein. Bcl-2 was found positive in six cases (16%). The mean Ki-67labeling index for all tumors was 2% (range 0-8%). CD133 was detected in only one case.The mean percentage of Sox-2 positive cells was 45% (range 0-90%) and Olig-2 positive cellswas 35% (range 0-90%). There were no deletions on 1p/19q analysis by flourescent in situhybridization.In univariate/bivariate analysis, recurrence negatively correlated with extent ofsurgical resection and age at initial diagnosis, positively correlated with Ki-67 labeling index.Patients younger than 5 years of age had shorter recurrence free period even among patientswith subtotal resection. Tumors with a Ki-67 labeling index higher than 2% also had a shorterrecurrence free period. There was no statistically significant correlation between theexpression of immunohistochemical markers and recurrence free survival.Conclusion: The positive staining with neuronal markers highlight the challenges oftenexperienced in practical surgical pathology in the diagnosis of pilocytic astrocytomas. Whilewe believe most such staining were either due to incorporated normal brain tissue,immunopositivity of neuronal markers in pilocytic astrocytomas requires further scrutiny. Thepresence of a non-specific stem cell marker; sox-2 in pilocytic astrocytoma also suggests thatsome tumor cells may have stem-cell like properties, or may have been derived from sox-2positive stem cells. Olig-2 positivity along with GFAP and vimentin simply implies a strongglial differentiation, and absence of a so-called oligodendroglial differentiation, especially intumors that resemble oligodendroglioma, is further supported by the absence of 1p/19qdeletion. p53, EGFR, p75NTR, CD133 antigens don?t seem to have a role in the biologicalbehaviour of pilocytic astrocytomas. Subtotal or incomplete surgical resection still seems tobe a major risk for recurrence, so are age less than 5 years at diagnosis and Ki67 labelingindex greater than 2%. Other immunohistochemical markers tested in this study were notassociated with recurrence-free or overall survival. Tissue microarray method providedbenefits in this study; enabled the use of a large immunohistochemical panel and in situhybridization, and can be recommended for similar studies.Key words: Pilocytic astrocytoma, neural stem cell, recurrence, tissue microarray method