Toprakta denitrifiyer populasyon büyüklüğünün ölçümü, bakteri kommunite yapıları ve kültüre alınabilen denitrifiyerlerin nosZ ve 16s rrna genlerinin karşılaştırılması
Quantification of denitrifier population size in soil, bacteria community structures and comparison of nosz and 16s rRNA genes from culturable denitrifying
Yazar: CUMHUR AVŞAR
Danışman: PROF. DR. EMİNE SÜMER ARAS
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Genler-bakteriyal = Genes-bacterial ; Gram negatif bakteriler = Gram negative bacteria ; Gram pozitif bakteriler = Gram positive bacteria ; Toprak bakterileri = Soil bacteria

Özet:
Tarım topraklarında bakteriyel denitrifikasyon, nitroz oksidin temel kaynağıdır. Denitrifikasyon, nitrat ve nitritin gaz halindeki nitrik oksid, nitroz oksid ve moleküler nitrojene indirgenmiş bir yıkım sürecidir. N2O tamamlanmamış denitrifikasyon sonucu yayılabilir. N2O, güçlü bir sera gazıdır ve ozon tabakasının tahribatına katkıda bulunur. Bu çalışmanın amaçları; (i) klasik mikrobiyolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak kültüre alınabilir denitrifiyer bakterilerin izolasyon ve karakterizasyonu, (ii) moleküler marker olarak 16S rRNA ve nosZ genlerinin karşılaştırılması, (iii) SSCP analizi aracılığıyla toprak örneklerinde bakteri komunite yapısı ve çeşitliliğini belirlemek ve (iv) real-time PCR'yi kullanarak, 16S rRNA ve denitrifikasyon fonksiyonel gen kopya sayılarının kültürden bağımsız miktar tayinlerini saptamak ve ayrıca gen kopya sayıları ve toprak fiziko-kimyasal özellikleri arasındaki ilişkileri incelemektir. Bu çalışmada, Proteobacteria (37 tür) ve Firmicutes (12 tür) olarak 49 bakteri izolatı kültüre alınmış ve filogenetik analizlerle iki filuma ayrılmıştır. Çalışmamız sonucunda, nosZ fonksiyonel geninin, çevrede denitrifiyer bakteri bolluğu tespiti için kullanılabileceğini ancak saf bakteri kültürlerini tanımlamak için kullanılamayacağını göstermiştir. Ayrıca bakteri komunite yapısı çeşitli toprak tipleri arasında önemli farklılıklar göstermiştir. Komunite yapısının filogenetik analizi, 51 klonun 2 filotipe ayrılabileceğini göstermiştir. Kültüre alınmamış bakteriler (%80,4) ve Gamma-proteobacteria (%19,6) toprak bakteriyel komunitenin baskın bileşenleri olarak görülmüştür. Toprak örneklerinin qPCR analizi, kuru toprağın gramı başına 16S rRNA, nirS, nirK, nosZI ve nosZII ortalama yoğunluklarını sırasıyla, 3.0x108, 2.25x107, 2.9x105, 4.0x106 ve 1.75x107 olarak göstermiştir. Aynı zaman da 16S rRNA genlerine göre (nirS+nirK), nosZI ve nosZII bolluğunun sırasıyla, %1.4-%34.1, %0.06-%3.95 ve %1.3-%39 olduğu, böylece denitrifiyerlerin topraktaki toplam bakteriye göre düşük oranının doğrulandığı görülmüştür. Bu durum, denitrifiyer olmayan nosZII-tipi bakterilerin toprakta, N2O tüketimine önemli ölçüde katkıda bulunabileceğini göstermiştir. Bakteri komunite bolluğu, çeşitliliği ve yapısındaki değişimler ve denitrifikasyon fonksiyonel gen kopya sayıları ile çeşitli toprak faktörleri arasında önemli ölçüde korelasyonlar tespit edilmiştir.

Abstract:
Bacterial denitrification in agricultural soils is a major source of nitrous oxide. Denitrification is a dissimilatory process in which nitrate and nitrite are reduced to gaseous nitric oxide, nitrous oxide and molecular nitrogen. N2O can be spread as a result of incomplete denitrification. N2O is a potent greenhouse gas and contributor to ozone layer destruction. The objectives of this study were (i) to isolate and characterize of cultivable denitrifying bacteria using classic microbiological and molecular methods; (ii) comparison of the 16S rRNA and nosZ genes as molecular markers; (iii) to determine bacterial community structure and diversity in soil samples by using SSCP analysis, and (iv) to use real-time PCR for culture-independent quantification of the copy numbers of 16S rRNA and denitrification functional genes, and also the relationships between gene copy numbers and soil physicochemical properties. In this study, 49 bacterial isolates were cultivated and phylogenetic analyses grouped them into two phyla: Proteobacteria (37 species) and Firmicutes (12 species). Our study showed that the nosZ functional gene could be used to identify denitrifying bacteria abundance in environment but could not be used to identify pure bacterial cultures. In addition, the bacterial community structure showed significant differences among the various soil types. Phylogenetic analysis of community structure indicated that 51 clones could be divided into 2 phylotypes. Uncultured bacteria (80.4%) and Gamma-proteobacteria (19.6%) were the dominant components of the soil bacterial community. qPCR analysis of the soil samples showed 16S rRNA, nirS, nirK, nosZI and nosZII average densities 3.0x108, 2.25x107, 2.9x105, 4.0x106 ve 1.75x107 copies per gram of dry soil, respectively. In addition, the abundances of (nirS+nirK), nosZI and nosZII relative to 16S rRNA genes were 1.4%-34.1%, 0.06%-3.95% and 1.3%-39%, respectively, confirming the low proportion of denitrifiers to total bacteria in soil. This showed that the non-denitrifying nosZII-type bacteria may contribute significantly to N2O consumption in the soil. Furthermore, the shifts in abundance, diversity, and structure of the bacterial communities and denitrification functional gene copy numbers correlated significantly with the various soil factors.