Çift hedefli biyouyumlu nanopartiküllerin pankreas kanseri üzerine etkisi
The effect of the dual-targeting biomimetic nanoparticles on pancreatic cancer
Yazar: AYŞE NUR NURDOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE KARATUĞ KAÇAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Antikanser = Anticancer

Özet:
Hücrelerin kontrolsüz büyüme ve yayılım göstermesi sonucu çeşitli organlarda kanserin farklı türleri meydana gelmektedir. Pankreas dokusunun hem endokrin hem de eksokrin kısımlarında farklı tip kanserler gözlenmektedir. Pankreas kanseri teşhisi konulan hastaların çok azı, teşhisten sonra en fazla 5 yıl kadar yaşayabilmektedir. Hastaların çok az bir kısmı cerrahi müdahale ile tedaviye açık olmakta ve çoğu hasta kemoterapi ya da radyoterapi yöntemlerine karşı direnç göstermektedir. Bu nedenle pankreas kanserinden kaynaklı ölümlerin sayısı da her geçen gün artmaktadır. 
Bir kumarin bileşiği olan eskuletin birçok çalışmada anti-kanser ajan olarak kullanılmıştır. Benzer şekilde Curcuma longa bitkisinin rizomlarından elde edilen kurkumin bileşiğinin de anti-kanser etkisi çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Nanobiyoteknoloji alanındaki gelişmeler sayesinde hedefe yönelik nanoyapılar oluşturulabilmekte ve bu sayede daha az yan etkiyle birlikte hedef dokuda kontrollü ilaç salınımı gerçekleştirilebilmektedir. Çeşitli çalışmalar nanopartiküller ile ilaç taşınımının ilacın çıplak olarak verildiği koşullara göre daha etkili olduğunu göstermiştir. Diğer yandan, oluşturulan nanopartikülün immün cevabı tetiklememesi ve tümörün daha etkin bir şekilde hedeflenebilmesi için, nanopartiküller kök hücre ve kanser hücrelerini de içeren çeşitli hücre membranları ile kaplanabilmektedir. Bu sayede oluşturulan nanopartikülün immün sistem tarafından eliminasyonu engellenerek kanda dolaşım süresi arttırılmaktadır. 
Yapmış olduğumuz çalışmada eskuletin ve kurkuminin MiaPaCa-2 pankreas kanser hücreleri üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Eskuletin, kurkumin ve kombinasyonu hem çıplak olarak hem de PLGA ile kaplı olarak hücrelere uygulanmıştır. Ayrıca, pankreatik ada türevli progenitör hücreler (PID-PC) ve MiaPaCa-2 hücrelerinden izole edilen membran ve sitozolik proteinler eskuletin, kurkumin ve kombinasyonlarını içeren PLGA-nanoformülasyonlar ile kaplanarak çift hedefli ve biyouyumlu nanoformülasyonun pankreas kanseri üzerindeki etkisi incelenmiştir. Hücre canlılığı MTT ile analiz edilmiştir. Oluşturulan nanopartiküllerin boyut analizi ''Dynamic Light Scattering (DLS)'' yöntemi ile belirlenmiş, ayrıca eskuletin ve kurkumin yüklü nanopartiküllerin in vitro salım profilleri diyaliz membran yöntemiyle araştırılmıştır. 
MiaPaCa-2 hücrelerinin canlılığı kontrol grubuna kıyasla, eskuletinin çıplak uygulanması sonucunda anlamlı derecede azalmış, kurkuminin çıplak olarak uygulanması sonucunda anlamlı bir farklılık gözlenmemiş, eskuletin ve kurkumin kombinasyonunun uygulanması sonucunda ise anlamlı olarak azalmıştır. PLGA-Eskuletin, PLGA-Kurkumin ve PLGA-Eskuletin-Kurkumin kombinasyonunun MiaPaCa-2 hücrelerine uygulanması sonucu hücre canlılığında kontrol grubuna kıyasla anlamlı bir azalma gözlenmiştir. PID-PC ve MiaPaCa-2 hücrelerinden izole edilen membran ve sitozolik proteinler MiaPaCa-2 hücrelerine çıplak olarak uygulandığında hücre canlılığında kontrol grubuna kıyasla bir farklılık gözlenmemiştir. PLGA ile kaplanmış PID-PC'lerden izole edilen membran proteinlerinin yüksek dozunda MiaPaCa-2 hücrelerinin hücre canlılığı üzerine anlamlı bir artış gözlenmiştir. Diğer izole edilen proteinlerin PLGA ile kaplanması sonucu yapılan uygulamada herhangi bir değişiklik olmamıştır. İzole edilen proteinlerin PLGA-Eskuletin, PLGA-Kurkumin ve kombinasyonları ile oluşturulan nanoformülasyonların MiaPaCa-2 hücrelerine uygulanması ile hücre canlılıkları kontrol gruplarına göre anlamlı olarak azalmıştır. 
Eskuletinin PLGA'dan salınımı ilk 6 saatte oldukça yavaş iken sonrasında artan bir ivme kazanarak 48 saat sonrasında ilacın tümü salınmıştır. PLGA-Eskuletinin izole edilen proteinler ile kaplanması ilk saatlerden itibaren salım hızını arttırmıştır. Kurkumin PLGA'dan ilk 6 saatte salınım göstermezken, sonrasında salım yavaş bir şekilde ilerlemiş ve 72 saat sonrasında ilacın yalnızca %30'u salınmıştır. PLGA-Kurkumin PID-PC'den ve MiaPaCa-2'den izole edilen membran proteinler ile kaplandığında ilk 6 saat sonrasında salım hızlanmışken, PID-PC'den izole edilen sitoplazmik proteinler ile kaplandığında salım açısından bir farklılık oluşmamıştır. MiaPaCa-2'den izole edilen sitoplazmik proteinler ile kaplandığında ise kurkumin salımı gerçekleşmemiştir.   
PLGA-Eskuletin-Kurkumin kombinasyonunun MiaPaCa-2 hücrelerine uygulaması sonucu hesaplanan IC50 değeri baz alınarak bu konsantrasyonda hazırlanan maddeler, oluşturulan tüm gruplara uygulanmıştır. Hem çıplak, hem PLGA kaplı, hem de izole edilern farklı proteinler ile oluşturulan nanoformülasyonlarda sadece PID-PC sitoplazmik, MiaPaCa-2 sitoplazmik ve MiaPaCa-2 membran proteinleri ile kaplı kurkumin grupları hariç tüm gruplarda apoptotik hücre ölümü gözlenmiştir. Nekrotik hücre ölümü ise araştırılan tüm gruplarda tespit edilmiştir. Kurkuminin PLGA, PID-PC sitoplazmik, PID-PC membran ve MiaPaCa-2 sitoplazmik proteinleri ile kaplı grupları hariç tüm gruplarda ROS seviyesinde kontrol gruplarına göre azalma görülmüştür. 
İlk kez tarafımızca formüle edilen çift hedefli ve biyouyumlu nanoformülasyonların MiaPaCa-2 hücrelerine uygulanması sonucu hücre canlılığının azaldığı ve farklı tip hücre ölümleri ile sonuçlandığı gösterilmiştir. Bu kapsamda, yapmış olduğumuz çalışma pankreas kanseri tedavisi açısından literatüre katkı sağlamaktadır. Apoptotik hücre ölümünü hedeflemek için farklı doz ve inkübasyon sürelerinin denenmesi gerekmektedir. Çalışma ileri aşamalarda in vivo deneyler ile desteklenerek pankreas kanseri tedavisi için önem arz edecek nitelik kazanacaktır.

Abstract:
The various types of cancer occur in different organs due to the uncontrolled growth and spread of cells. Different types of cancers are observed in both the endocrine and exocrine parts of pancreatic tissue. Only a small percentage of patients diagnosed with pancreatic cancer can survive for up to five years after diagnosis. Few patients are amenable to surgical intervention, with most showing resistance to chemotherapy or radiotherapy methods. Therefore, the number of deaths due to pancreatic cancer is increasing day by day.
Esculetin, a coumarin compound, has been used as an anti-cancer agent in many studies. Similarly, curcumin derived from the rhizomes of the Curcuma longa plant has been shown to have anti-cancer effects in various studies. Advances in nanobiotechnology allow the creation of targeted nanostructures, enabling controlled drug release in target tissues with fewer side effects. Several studies have shown that drug delivery with nanoparticles is more effective than administering the drug in its naked form. Furthermore, to prevent the nanoparticle from triggering an immune response and to target the tumor more effectively, nanoparticles can be coated with various cell membranes, including stem cells and cancer cells. In this way, the elimination of the created nanoparticle by the immune system is prevented and the circulation time in the blood is increased.
In our study, the effects of esculetin and curcumin on MiaPaCa-2 pancreatic cancer cells were investigated. Esculetin, curcumin, and their combination were applied to cells both in their naked form and encapsulated in PLGA. Additionally, membrane and cytosolic proteins isolated from pancreatic island-derived progenitor cells (PID-PC) and MiaPaCa-2 cells were coated with PLGA-nanoformulations containing esculetin, curcumin, and their combinations, and the effect of the dual-target and biocompatible nanoformulation on pancreatic cancer was examined. Cell viability was analyzed using the MTT assay. The size analysis of the nanoparticles was determined by Dynamic Light Scattering (DLS), and the in vitro release profiles of esculetin and curcumin-loaded nanoparticles were investigated using the dialysis membrane method.
Compared to the control group, the viability of MiaPaCa-2 cells decreased significantly when esculetin was applied in its naked form, no significant difference was observed when curcumin was applied naked a significant decrease was observed when the combination of esculetin and curcumin was applied. Applying PLGA-Esculetin, PLGA-Curcumin, and PLGA-Esculetin-Curcumin combinations to MiaPaCa-2 cells resulted in a significant decrease in cell viability compared to the control group. When membranes and cytosolic proteins isolated from PID-PC and MiaPaCa-2 cells were applied naked to MiaPaCa-2 cells, no difference in cell viability compared to the control group was observed. A significant increase in cell viability of MiaPaCa-2 cells was observed at high doses of membrane proteins isolated from PID-PCs coated with PLGA. There was no change in the application as a result of coating the other isolated proteins with PLGA. When the nanoformulations created with PLGA-Esculetin, PLGA-Curcumin, and combinations of the isolated proteins were applied to MiaPaCa-2 cells, cell viability was significantly reduced.
While the release of esculetin from PLGA was quite slow in the first 6 hours, it gained increasing rate and entire drug was released after 48 hours. Coating PLGA-Esculetin with the isolated proteins increased the release rate from the first hours. While curcumin did not release from PLGA in the first 6 hours, the release proceeded slowly thereafter and only 30% of the drug was released after 72 hours. When PLGA-Curcumin was coated with membrane proteins isolated from PID-PC and MiaPaCa-2, the release was accelerated after the first 6 hours, while there was no difference in release when it was coated with cytoplasmic proteins isolated from PID-PC. When coated with cytoplasmic proteins isolated from MiaPaCa-2, curcumin release did not occur.
The substances obtained based on the IC50 value calculated after the application of the PLGA-Esculetin-Kurkumin combination to MiaPaCa-2 cells were applied to all groups created. Apoptotic cell death was observed in all groups except for the PID-PC cytoplasmic, MiaPaCa-2 cytoplasmic, and MiaPaCa-2 membrane protein-coated curcumin groups, regardless of whether they were applied naked, PLGA-coated, or coated with different isolated proteins. Necrotic cell death was detected in all investigated groups. A decrease in ROS levels was observed in all groups except for curcumin groups coated with PLGA, PID-PC cytoplasmic, PID-PC membrane, and MiaPaCa-2 cytoplasmic proteins. 
It has been demonstrated that the application of dual-targeted and biocompatible nanoformulations to MiaPaCa-2 cells resulted in decreased cell viability and various types of cell deaths. In this context, our study contributes to the literature on pancreatic cancer treatment. Different doses and incubation periods need to be tested to target apoptotic cell death. The study holds significance for pancreatic cancer treatment, especially when supported by in vivo experiments.