Paklitaksel'in in vitro ve in vivo nörotoksik etkileri
In vitro and in vivo neurotoxic effects of paclitaxel
Yazar: MELİH DAĞDEVİREN
Danışman: PROF. DR. NEFİSE ÜLKÜ KARABAY YAVAŞOĞLU
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Mikrodizilim analizi = Microarray analysis ; Paklitaksel = Paclitaxel ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Paklitaksel (PTX) sıklıkla kullanılan bir antikanser ajandır. Bu çalışmada PTX'in in vitro ve in vivo nörotoksik etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. In vitro nörotoksik etkileri araştırmak için normal insan astrosit hücre hattı kullanılmıştır. Bu çalışmada insan astrosit hücrelerinin farklı dozlarda PTX ile 24 ve 48 saat inkübasyonu sonucu IC50 değerleri sırasıyla 31,68 µg/ml, ve 15,71 µg/ml olarak belirlenmiştir. In vivo nörotoksik etkilerin incelenmesi için ise 27 adet erişkin erkek BALB/c fare kullanılmıştır. Hayvanlar her gün tartılmıştır ve rastgele olacak şekilde üç gruba ayrılmışlardır: kontrol (Saline, n=11), paklitaksel (PTX, n=8), taşıyıcı (Vehicle, n=8). PTX grubuna 0., 4., 8. ve 9. günlerde toplam 4 kere intraperitoneal (i.p.) PTX enjeksiyonu yapılmıştır. Kontrol ve taşıyıcı gruplarına aynı hacimde serum fizyolojik veya taşıyıcı i.p. uygulanmıştır. Davranış deneyleri olan sıcak plaka ve kuyruk çekme testleri enjeksiyonlardan bir gün önce, 0'ıncı, 1'inci, 4'üncü, 5'inci, 8'inci ve 9'uncu günlerde yapılmıştır. Son gün, davranış testlerinden sonra fareler anestezi altında servikal dislokasyon ile sakrifiye edilmiştir. Hayvanlardan siyatik sinir dokusu ve beyin korteks dokusu alınmıştır. Sağ siyatik sinirler ve beyin korteks dokuları immünohistolojik deneylerde kullanılmıştır. Bu dokularda apoptoz TUNEL yöntemi ile NFκB, iNOS ve VEGF protein ekspresyonlarıyla birlikte histolojik olarak incelenmiştir. Sol siyatik sinirler ve beyin korteks dokuları da qRT-PCR ve mikroarray deneylerinde kullanılmıştır, kaspaz-3, -8 ve -9 mRNA ekspresyonları ve total mRNA ekspresyon seviyeleri, adı geçen moleküler genetik deneylerle incelenmiştir. Deney süresince PTX uygulaması, hayvanların vücut ağırlığında diğer gruplara göre anlamlı bir değişiklik ortaya çıkarmamıştır. Davranış deneyleri sonuçlarına göre; sıcak plaka testinde PTX alan hayvanların tepki süresi oranları 8'inci günde Vehicle grubuna göre, 9'uncu günde hem Vehicle hem de Saline grubuna göre anlamlı azalmıştır. PTX uygulaması hayvanların periferik sinir sisteminde hassasiyet yaratmıştır. Kuyruk çekme testi sonuçlarına göre günler boyunca gruplar arasında anlamlı bir davranış farkı ortaya çıkmamıştır. qRT-PCR sonuçlarına göre; siyatik sinir dokusunda PTX ve Vehicle gruplarında kaspaz-3 ve kaspaz-9 ekspresyonu Saline grubuna göre istatistiksel anlamlı artmıştır. Kaspaz-8 ekspresyonunda ise gruplar arası anlamlı bir fark yoktur. Beyin korteks dokusunda ise, tüm gruplar arasında kaspaz-3, -8 ve -9 ekspresyonları açısından bir farklılık görülmemiştir. Bu sonuçlara göre PTX ve taşıyıcı siyatik sinirde içsel apoptotik yolları aktive etmişlerdir. Fakat PTX'in de taşıyıcının da beyin korteks dokusunda apoptotik etkisi mRNA seviyesinde gözlenmemiştir. Mikroarray sonuçlarına göre, bu bulguların yanında içsel yol ara elemanı olan sitokrom-c siyatik sinirde PTX ve taşıyıcı gruplarında Saline grubuna göre anlamlı artmıştır. Hematoksilen&Eozin (H&E) boyama sonuçlarına göre siyatik sinirde PTX grubunda epinöryumda damarlarda dolgunluk, perinöryumda fibrozise bağlı kalınlaşma, endonöryumda hafif düzeyde ödem gözlenmiştir. Vehicle ve Saline gruplarında herhangi bir histolojik değişiklik gözlenmemiştir. Beyin korteks dokusunda ise H&E boyama sonuçlarına göre PTX, Vehicle ve Saline grupları arasında histolojik bir farklılık yoktur. TUNEL boyaması sonuçlarına göre siyatik sinirde ise taşıyıcı ve PTX kontrole göre apoptozu artırmıştır, PTX alan grupta bu artış dramatiktir. iNOS boyaması sonuçlarına göre beyin dokusunda gruplar arası bir fark yoktur. Siyatik sinirde ise PTX grubunda iNOS ekspresyonu diğer gruplara göre artmıştır. NFκB ekpresyonları açısından hem beyin dokusunda hem de siyatik sinirde gruplar arasında bir farklılık gözlenmemiştir. Hem beyin dokusunda hem siyatik sinirde, -PTX daha çok olmak kaydıyla- PTX ve Vehicle uygulamaları, Saline grubuna göre VEGF ekspresyonunu artırmıştır. Bulgulara göre PTX'in kısmen de taşıyıcının sağlıklı beyin ve siyatik sinir dokusu üzerinde yıkıcı etkileri olmaktadır. Bu çalışmada PTX uygulamasının sağlıklı siyatik sinir dokusu üzerinde hem davranışsal, hem moleküler hem biyokimyasal yıkıcı etkileri ortaya konmuştur.

Abstract:
Paclitaxel (PTX) is a widely used anticancer agent. In this study in vitro and in vivo neurotoxic effects of PTX were investigated. To investigate the in vitro neurotoxic effects; normal human astrocyte cells were used. After culturing astrocytes, with increasing doses of PTX for 24 and 48 hours, IC50 values were determined as 31.68 µg/ml, and 15.71 µg/ml respectively. For in vivo neurotoxic effects 27 male adult BALB/c mice were used. Animals were weighted each day and divided into three groups randomly: control (Saline, n=11), paclitaxel (PTX, n=8), vehicle (Vehicle, n=8). To PTX group, on 0th, 4th, 8th and 9th days, total of four intraperitoneal (i.p.) injections were given. Saline and Vehicle groups received same volume of serum physiologic or vehicle as i.p. Behavioral tests; hot plate and tail flick were applied to animals on one day prior to injections, 0th, 1st, 4th, 5th, 8th and 9th days. On last day of experiments, mice were sacrificed under anesthesia by cervical dislocation. Sciatic nerve and brain cortex tissues were taken. Right sciatic nerves and brain cortex hemispheres were used for histology/immunohistology. These tissues used for TUNEL apoptosis assay and, NFκB, iNOS, VEGF protein expressions on histologic level. Left sciatic nerves and brain hemispheres were used in qRT-PCR and microarray experiments. Caspase-3, -8 and -9 mRNA and total mRNA expression levels were investigated with aforementioned molecular experiments. During experiments PTX administration didn't affected the body weights of animals significantly when compared to others. According to the behavior experiment results; for hot plate results, PTX group had significant shorter response times on 8th day compared to Vehicle, on 9th day compared to both Saline and Vehicle groups. PTX created sensitivity on animals' peripheral nervous system. According to tail flick results there is no significant difference between groups. According to the qRT-PCR results; on sciatic nerves caspase-3 and caspase-9 expressions were increased significantly in PTX and Vehicle groups when compared to Saline. For caspase-8 expressions, there is no significant difference between groups. In brain cortex tissue, there is no statistical difference between all groups according to their caspase-3, -8 and -9 expression levels. These results showed PTX and vehicle activated the intrinsic apoptotic pathways in sciatic nerve. However there is no apoptotic effect of PTX and vehicle at the mRNA level in brain cortex. According to microrray results; besides an intrinsic pathway element cytochrome-c was determined as significantly expressed in sciatic nerve tissues of PTX and Vehicle groups when compared to Saline. According to Hematoxylene&Eosine (H&E) staining; for sciatic nerve there is repletion in vessels of PTX group epineurium, thickness due to fibrosis in perineurium, mild edema in endoneurium were observed. There is no histologic difference in sciatic nerves of other groups with H&E. For brain cortices there is no histological difference between all groups for H&E staining. According to TUNEL results in sciatic nerves apoptotic isles increased dramatically with PTX, also there is increase in apoptotic isles with Vehicle. According to iNOS staining results, there is no difference between groups for brain tissues; however for sciatic nerve PTX application increased the iNOS expression when compared to other groups. There is no significant difference between groups in brain and sciatic nerve tissues according to their NFκB staining results. Both in brain and sciatic nerves, VEGF expression increased in PTX and Vehicle groups when compared to Saline, this increase is slightly more in PTX. It is possible to speculate that partially vehicle and dominantly PTX has damaging effects on healthy brain and sciatic nerve tissues. We demonstrated the damaging effects of PTX application on healthy sciatic nerve at behavioral, biochemical and molecular level.