Periapikal lezyonlarda mitojenler tarafından aktive edilmiş protein kinaz (MAPK) yolağı; selenyumun etkileri
Mitogen activated protein kinase (MAPK) in periapical lesions; the effects of selenium
Yazar: NERGİZ BOLAT
Danışman: PROF. DR. BULEM ÜREYEN KAYA
Süleyman Demirel Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Endodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Mitojenler = Mitogens ; Otofaji = Autophagy ; Periapikal abse = Periapical abscess ; Periapikal hastalıklar = Periapical diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Protein kinazlar = Protein kinases ; Selenyum = Selenium ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı, deneysel periapikal lezyon modelinde MAPK yolağı ve otofajik hücre aktivitesinin değerlendirilmesi ve antioksidan aktivitesi bilinen selenyumun olası etkilerinin ortaya konulmadır. 
Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada 30 adet erişkin Sprague-Dawley cinsi erkek rat rastgele pozitif kontrol, negatif kontrol ve selenyum grubu olmak üzere 3 gruba ayrıldı. Pozitif kontrol ve selenyum grubundaki ratlarda alt çene 1. azı dişlerinde periapikal lezyon oluşumu tetiklendi. Selenyum grubundaki ratlara deney süresince (28 gün) 0,1 mg/kg periton içine selenyum uygulanırken pozitif kontrol ve negatif kontrol grubundaki ratlara aynı dozda serum uygulaması gerçekleştirildi. Yirmi sekiz gün sonunda ratlar sakrifiye edildi. Periapikal lezyon alanı radyografik ve histomorfometrik, enflamasyon şiddeti histopatolojik olarak değerlendirildi. Mikroorganizmaların kök kanalı boyunca ve periapikal dokulardaki penetrasyonu Gram boyama ile belirlendi. Periodontal ligament kollajen yıkımı Picro Sirius Red boyama ile tespit edildi. Periapikal IL-6, HIF-1, COX-2 ve Kaspaz-3 ekspresyon yoğunluğu immunohistokimyasal analiz ile değerlendirildi. MAPK sinyal yolağı değerlendirmesinde p38 MAPK/fosfo-p38 MAPK protein ekspresyon düzeyi Western-blot yöntemi ile incelendi. Hücresel otofajik akışın değerlendirilmesinde LC3-II/I, Beclin-1, ATG3, ATG5, ATG7, ATG12, ATG16-L1 ifadeleri mRNA gen ekspresyon seviyesi gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile hücresel otofajik akışın değerlendirilmesinde Beclin-1, ATG5, LC3-II, LC3-II/I, p62/SQSTM1 ifadelerinin protein ekspresyon düzeyi WB yöntemleri ile değerlendirildi. Verilerin parametrik testlerin ön şartlarını sağlayıp sağlamadığı Levene testi ile kontrol edildi. Alan açısından elde edilen veriler faktöriyel düzende tekrarlanan ölçümlü varyans analizi (ANOVA) ile değerlendirildi. Grup ortalamaları arasındaki farklılığın belirlenmesinde çoklu karşılaştırma yöntemlerinden Tukey testi kullanıldı. Histopatolojik, Gram boyama ve immünohistokimyasal değerlendirme sonuçları ile elde edilen skor verilerinin analizinde tek yönlü varyans analizi ve grup ortalamaları arasındaki farklılığın belirlenmesinde Duncan testi kullanıldı. Grupların lezyon alanlarına ait verilerin değerlendirilmesinde tek yönlü varyans analizi kullanıldı. mRNA ve protein ifadelerindeki kat değişim verileri iki bağımsız örneklemli t Testi ile analiz edildi.
Bulgular: Pozitif kontrol ve selenyum grubuna ait radyografik değerlendirme sonucunda selenyum grubunda periapikal lezyon alanı pozitif kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede daha küçüktü (p<0,01). Histopatolojik değerlendirmelerde enflamasyon şiddeti karşılaştırıldığında, semi-kantitatif değerlendirmede gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulundu (p<0,01). Selenyum grubunda periapikal lezyon alanları pozitif kontrol grubuna göre daha küçüktü (p<0,01). Periodontal ligamentin kollajen reaksiyonu Picro Sirius Red boyama ile değerlendirildiğinde selenyum grubu örneklerinde enflamatuvar reaksiyonun azalmasının yanı sıra periodontal ligament ve çevre bağ doku yapısının korunmuş olduğu saptandı. Gram boyama kullanılarak bakteri yerleşimi değerlendirildiğinde pozitif kontrol grubu örneklerinde en yüksek skor değerleri gözlenirken, selenyum grubu ile arasında istatistiksel fark tespit edildi (p<0,01). İmmunohistokimyasal analizde pozitif kontrol grubunda IL-6, HIF-1, COX-2 ve Kaspaz-3 ekspresyon düzeyleri diğer gruplara göre anlamlı derecede daha yüksek bulunurken, HIF-1 ve COX-2 ekspresyon düzeyleri gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulundu (p<0,01). qRT-PCR yöntemi kullanılarak otofajik belirteç düzeyleri değerlendirildiğinde Beclin-1, ATG3, ATG7, ATG12 ve ATG16L1 ekspresyonu açısından tüm grup karşılaştırmalarında istatistiksel fark tespit edildi (p<0,05). Pozitif kontrol grubunda en yüksek ATG5 ekspresyon seviyesi izlenirken, selenyum grubunda pozitif kontrol grubuna göre önemli düzeyde azalma gözlendi. ATG16L1 ekspresyonu açısından tüm grup karşılaştırmalarında istatistiksel fark tespit edildi (p<0,05). Pozitif kontrol grubunda en yüksek ATG16L1 ekspresyon seviyesi izlenirken, selenyum grubunda pozitif ve negatif kontrol gruplarına göre önemli düzeyde azalma gözlendi. Western blotlama yapılarak değerlendirilen Beclin1, ATG5, LC3-II, LC3-II/LC-3I, fosfo-p38 MAPK/p38 MAPK, p62/SQSTM1 protein ifadesi düzey analizlerinde bütün guplar arasında anlamlı farklılık görülmüştür (p<0,05). Beclin1, ATG5, LC3-II, fosfo-p38 MAPK/p38 MAPK ifadelerinde pozitif kontrol gruplarında en yüksek ekspresyonlar izlenmiştir.            
Sonuç: Ratlarda deneysel olarak oluşturulan periapikal lezyonlarda selenyumun antioksidan ve antienflamatuvar etkileri gösterilmiş; periapikal kemik yıkımını azalttığı görülmüştür. Ayrıca sistemik selenyum uygulaması periapikal lezyon patogenezinin p38 MAPK sinyal yolağı üzerinden düzenlendiğini göstermiştir. Bununla birlikte selenyum uygulamasının otofajik akışta rol oynayan markerların protein düzeylerini otofajiyi azaltacak yönde etkilediği gösterilmiştir.
Anahtar Kelimeler: Periapikal lezyon, Selenyum, Otofaji, Mitojenler tarafından aktive edilmiş protein kinaz, Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu

Abstract:
Objective: The aim of this study is the evaluation of MAPK pathway and autophagic cell activity in the experimental periapical lesion model and the possible effects of the antioxidant activity of selenium.
Materials and Methods: In this study, 30 adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups, positive control, negative control and selenium group. Periapical lesion was induced in mandibular first molars in the positive control and selenium groups. Rats in the selenium group were applied to intraperitoneal 0.1 mg/kg selenium during 28 days, the same dose of serum in the rats in the positive control and negative control group were performed. At the end of twenty-eight days, the rats were sacrificed. Periapical lesion area was examined radiographically and histomorphometrically; inflammation severity was evaluated histopathologically. The penetration of microorganisms along the root canal and periapical tissues were determined by Gram staining. Periodontal ligament collagen was detected by Picro Sirius Red staining. Periapical IL-6, HIF-1, COX-2 and Kaspaz-3 expression density was evaluated with immunohistochemical analysis. The MAPK signal pathway evaluation was examined by the p38 MAPK/phospho-p38 MAPK protein expression level using Western-blot method. In the evaluation of cellular autophagic expressions flow by the LC3-II/I, Beclin-1, ATG3, ATG5, ATG7, ATG12, ATG16-L1 mRNA gene expression level with quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), in the evaluation of the cellular autophagical flow by Beclin-1, ATG5, LC3-II, LC3-II/I, p62/SQSTM1 expressions were evaluated by WB methods of protein expression levels. The mRNA gene expression level was evaluated with the quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) with the evaluation of the cellular autophagic flow with Beclin-1, ATG5, LC3-II, LC3-II/I, p62/SQSTM1 protein expression level WB methods. The data was checked with the Levene test where the data provides the prerequisites of parametric tests. The data obtained in the field were evaluated with the analysis of variance (ANOVA) in the factorial order. Tukey test was used from multiple comparison methods in determining the difference between group averages. In the analysis of the score data obtained by histopathological, Gram staining and immunohistochemical evaluation results the Duncan test was used to determine the difference between the analysis and group averages of variance. One-way variance analysis was used to evaluate the data of the groups of the groups. The floor exchange in mRNA and protein statements were analyzed by two independent sampled t test. 
Results: As a result of the radiographic evaluation of the positive control and the selenium group, the periapical lesion area in the selenium group was significantly smaller than the positive control group (p<0.01). In histopathological evaluations, there was a statistically significant difference between the groups in semi-quantitative evaluation compared to the intensity of inflammation (p<0.01). The selenium group took statistically significantly lower inflammation score values according to the positive control group. There was a statistically significant difference between the two groups in the histomorphometric evaluation of periapical lesion areas in positive control and selenium groups (p<0.01). Periapical lesion areas in the selenium group were smaller than the positive control group (p<0.01). When the collagen reaction of the periodontal ligament, the collagen reaction was evaluated with Picro Sirius Red staining, in addition to the reduction of the inflammatory reaction in the selenium group samples, as well as periodontal ligament and environmental bond tissue structure was preserved. When the bacterial layout was evaluated using Gram staining, the highest score values were observed in the positive control group samples, while the statistical difference was found between the selenium group (p<0.01). In immunohistochemical analysis, IL-6, HIF-1, COX-2 and Kaspaz-3 expression levels in the positive control group are significantly higher than other groups, while HIF-1 and COX-2 expression levels were statistically significant differences between groups (p<0.01). The statistical difference was found in all group comparisons of Beclin-1, ATG3, ATG7, ATG12 and ATG16L1 expression when the autophagic token levels are evaluated using the qRT-PCR method (p<0.05). No statistical difference was detected in terms of negative control and selenium groups in terms of ATG5 expression (p> 0.05). In the positive control group, the highest ATG5 expression level was monitored, while the result of the positive control group was observed in the selenium group. The statistical difference was detected in all group comparisons in terms of ATG16L1 expression (p<0.05). In the positive control group, the highest ATG16L1 expression level is monitored, while the selenium group was significantly reduced in the positive and negative control groups. The Western blotting was evaluated by beclin1, ATG5, LC3-II, LC3-II/LC3-I, phospho-p38 MAPK /p38 MAPK, p62/SQSTM1 protein expression level analysis was a significant difference between all groups (p<0.05). Beclin1, ATG5, LC3II, phospho-p38 MAPK/p38 MAPK statements in positive control groups were monitored in the highest expression.  
Conclusion: The antioxidant and anti-inflammatory effects of selenium are shown in the experimental periapical lesion model and it has also been seen to reduce periapical bone destruction. Selenium, which is known to increase antioxidant enzyme synthesis, is thought in periapical lesions that are experimentally generated in the rats showed anti-inflammatory effects also selenium has been seen to reduce periapical bone destruction. In addition, systemic selenium application has shown that the p38 MAPK pathogenesis of the periapical lesion pathogenesis is arranged over the p38 MAPK signal pathway. However, the selenium application has been shown to influence the protein levels of markers in the autophagic flow to reduce autophagy.
Key Words: Periapical lesion, Selenium, Autophagy, Mitogen activated protein kinase, the quantitative real-time polymerase chain reaction