İnsan olfaktör kök hücrelerin izolasyonu kültürünün yapılması karakterizasyonu ve hasar görmüş fasiyal sinirin (ratlarda) rejenerasyonuna etkisinin incelenmesi
Isolation, culture and characterization of human olfactory stem cells and investigation of their effect on regeneration of damaged rat facial nerves
Yazar: OLGA NEHİR ÖZTEL
Danışman: PROF. DR. ADIL ALLAHVERDIYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kulak Burun ve Boğaz = Otorhinolaryngology (Ear-Nose-Throat)

Özet:
Fasiyal paraliz dünyada ve ülkemizde görülen, popülasyonda 30/100.000 insidansı olan, konjenital, nörolojik, metabolik, toksik, neoplastik, enfeksiyöz, travmatik, iatrojenik ve idiopatik nedenlere bağlı olarak ortaya çıkabilen bir hastalıktır. Bu hastalık, insan sağlığını ciddi olarak etkilemenin yanında estetik ve dolayısıyla psikolojik problemlere de neden olur. Şimdiye kadar hastalığın tedavisine yönelik çeşitli yaklaşımlar uygulanmasına rağmen gerek iyileşme hızı gerekse de iyileşme hızına bağlı sekeller, hastalığın tedavisinin önünde önemli engeller oluşturmaktadır. Bu nedenle hasar görmüş sinire bağlı patolojilerin giderilmesinde yeni yaklaşımların geliştirilmesi oldukça önemlidir. Kök hücre alanındaki gelişmeler ve kök hücreye dayalı tedavi yaklaşımlarındaki ilerlemeler sinir doku hasarlarının tedavisinde de yeni ümitlere yol açmaktadır. Periferik sinir hasarlarında yağ, kemik iliği ve hipokampal nöral kök hücre kullanan deneysel çalışmalarda bazı olumlu sonuçlar elde edilse de problemin çözümü henüz mümkün olmamıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kök hücre tedavilerinde başarının sağlanması için hasar görmüş bölgenin sahip olduğu mikroçevre ile uygulanan kök hücre kaynağının uygun olması gerektiği vurgulanmaktadır. Literatürde bu konu ile ilgili çalışmalar az sayıda olsa da giderek önem kazanmaktadır. Ayrıca şimdiye kadar fasiyal sinir hasarlarının rejenerasyonunda bu alanda herhangi bir çalışmaya da rastlanılmamıştır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; insan olfaktör mukoza biyopsi öneklerinden kök hücrelerin izolasyonu, devamlı kültürünün yapılması, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonunu gerçekleştirilmekle, olfaktör kök hücrelerden yeterli miktarda hücre kitlesi elde edilip ilk kez olarak hasar görmüş fasiyal sinir rejenerasyonunda (ratlarda) niş temellerine dayalı yeni bir yaklaşım geliştirilmesi ayrıca ileride hücresel tedaviler ve doku mühendisliği çalışmalarında kullanılmak üzere olfaktör kök hücre kriyobankının oluşturulması olmuştur. Bu amaçla tez kapsamında İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kulak Burun Boğaz Baş ve Boyun Cerrahisi Bölümü'nde septoplasti operasyonu öncesi onamları alınan 3 hastadan olfaktör mukoza biyopsi örnekleri alınarak Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği Laboratuvarı'nda getirildi ve olfaktör kök hücrelerin izolasyonu, kültürü, karekterizasyonu ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi. Devamlı kültürü yapılan hücreler morfolojik olarak incelendi. Elde edilen hücrelerin kök hücre karakterizasyonunu yapmak üzere hücreler adipojenik, osteojenik ve nörojenik farklılaşma kitleri ile indüklendi ve akım sitometri yöntemi ile immünfenotipik karakterizasyonları yapıldı ve elde edilen kök hücrelerin kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi. Olfaktör kök hücreler, in vivo çalışmalarda kullanılmak üzere CM-DiI ile işaretlendi ve hücrelerin üst üste 9 kez pasajlanmasıyla çok tabakalı hücre kitlesi elde edildi. Elde edilen çok tabakalı hücre kitlesinin canlılığının belirlenmesi için in vitro kültürü yapıldı. CM-DiI ile işaretli olfaktör kök hücre kitlesi ile deneysel fasiyal paraliz oluşturulan ratlarda kök hücrelerin periferik sinir rejenerasyonuna etkisini belirlemek üzere in vivo çalışmalar iki aşamada gerçekleştirildi. Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarı'nda 7 adet Wistar Hannover (350–380 gr) dişi rat kullanılarak yapılan ön çalışmalarda fasiyal kesi sonrası 4 farklı yöntem kullanılarak kök hücrelerin kesi bölgesine inokülasyonu sağlandı. Çalışmada 1. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi, 2. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi ve inokülasyon bölgesi rattan alınan yaklaşık 1mm3 yağ dokusu ile (fasya) ile sarıldı, 3 ve 4. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi ve inokülasyon bölgesine fibrin glue uygulaması yapıldı, 5 ve 6. ratların hasar bölgesine CM-DiI ile işaretlenen çok tabakalı hücre kitlesi inoküle edildi, kontrol grubu olarak 7. ratın hasar bölgesine 10µl PBS aktarıldı. Deney öncesi fasiyal paralizin ölçümü, deney sonrası ise iyileşmenin belirlenmesi için tam kat kesi öncesi ve sonrası 2., 4., 6., ve 8., haftalarda bıyık hareketleri Wiskers skorlama olarak değerlendirildi. Sonuçlar Mann Whitney U istatistiği kullanılarak hesaplandı. Ön çalışma sonuçları dikkate alınarak in vivo çalışmaların ikinci basamağında 27 adet rat M, T ve K isimleri verilerek 3 gruba ayrıldı her bir grupta ratların sol fasiyal siniri kesildikten ve sinir uçları neurotube poliglikolik asit konduite anastomoz yapıldı. Konduitin içine M grubu için hazırlanan çok tabakalı hücre pelleti, T grubu için PBS eklendi. Kontrol grubu olan K grubuna herhangi bir madde verilmedi. Ratlarda iyileşme 2., 4., 6., 8., ve 10. haftalarda  fizyolojik, bıyık hareketleri ve elektrofizyolojik olarak izlendi. 10 hafta sonunda ratlar sakrifiye edilerek hasar bölgesinden histolojik inceleme için preparatlar hazırlandı. Preparatlar hematoksilen, eozin, S100, Toluidin Blue ile boyandı ve florasan mikrokopta incelendi. Sonuçlar Mann-Whitney U ile ve Annova ile yapılan istatistik ile değerlendirildi. Elde edilen sonuçlara göre olfaktör dokudan elde edilen hücrelerin morfolojik, immünfenotipik ve farklılaşma özellikleri bakımından kök hücre karakterine sahip oldukları ayrıca dondurularak saklanan hücrelerin 24 ay sonunda canlılıklarını %91 oranında korudukları belirlendi. Olfaktör kök hücrelerin CM-DiI boyası ile işaretlediği ayrıca hücrelerin 9 kez üst üste pasajlanmasıyla elde edilen çok tabakalı hücre kitlesinin kültür ortamında canlılığını koruduğu belirlendi. Whiskers skorlamalarına göre yapılan ön çalışma sonuçlarına göre, uygulanan 4 farklı yöntem içinde en fazla iyileşmenin görüldüğü grubun olfaktör kök hücreler ile hazırlanan çok tabakalı hücre kitlesi uygulanan grup olduğu belirlendi. 27 rat ile yapılan in vivo çalışmalarda elde edilen fizyolojik ve elektrofizyolojik sonuçlara göre fasiyal sinir rekonstrüksiyonunda olfaktör kök hücreler kullanılan grupta sinir rejenerasyonun daha hızlı gerçekleştiği (p=0,030) ve bıyık hareketlerindeki düzelmenin amplitüd değerlerindeki artış ilişkili olarak daha fazla ve anlamlı olduğu belirlendi (p=0,001). S100 boyama ile yapılan histolojik değerlendirmede gözlenen sonuçlara bakıldığında da M grubunda hasar bölgesine nakledilen kök hücrelerin Schwann benzeri hücrelere dönüştükleri belirlendi. Elde edilen bu sonuçlar olfaktör kök hücrelerin kullanıldığı grupta belirlenen sinir rejenerasyon hızı ve düzeyini destekler niteliktedir (p<0,05). 2012-07-04 KAP02 numaralı proje ile Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Proje Koordinatörlüğü tarafından desteklen bu çalışma ile TÜBİTAK tarafından yayınlanan 2003-2023 Teknoloji Öngörü Çalışmasında vurgulanan "Türkiye'de yapılması gereken bilimsel çalışmalar için kök hücre teknolojilerinin geliştirilmesi ve özellikle rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilir hale gelmesi" hedefine de uygun olarak ulaşılabilir tek nöral kök hücre olan olfaktör kök hücrelerin ülkemizde ilk kez olarak izolasyonu, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi, kriyobankı oluşturuldu, doku mühendisliğinde kullanılmak üzere çok tabakalı hücre kitlesi hazırlandı ve fasiyal sinir hasarlarında kullanılmasıyla sinir rejenerasyonunu hızlandıran etkin bir hücresel tedavi yöntemi önerildi.

Abstract:
Facial paralysis is a disorder that is seen in our country and worldwide, has an incidence of 30/100.000 and can result from congenital, neurological, metabolic, toxic, neoplastic, infectious, traumatic, iatrogenic and idiopathic reasons. The disorder, as well as affecting human health seriously, creates esthetic and psychological problems. Although several approaches are in application in order to treat this disorder, recovery rate and sequels related to recovery rate are grand obstacles against treatment. For that matter, development of new approaches is required to remove pathologies related to damaged nerves. Progresses in stem cell research and their application for treatment are also very promising for treatment of the damages in nervous tissue. Although fat, bone marrow and hippocampal neural stem cells have been shown to have affirmative consequences on peripheral nerve damages in some experimental studies, a precise solution has not been shown yet. Latest studies state that in order to succeed in stem cell treatments, the micro-environment of the damaged area and the stem cell source have to be coherent. Studies in the literature related to this topic are numerically few, but they progressively gain importance. Besides, until now, no study has been conducted in this area to show the effect on regeneration of damaged facial nerves. Hereunder, the aim of this thesis study is stem cell isolation from human olfactory mucous biopsies, continuous culture, characterization and cryopreservation of these cells, development of a new approach based on niche for regeneration of damaged facial nerves (of rats) for the first time and generation of an olfactory stem cell cryobank for the use of cellular treatment and tissue engineering studies. For this purpose, olfactory mucous biopsy samples were obtained from three patients with consent prior to a septoplasty operation in Istanbul Education and Research Hospital, Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery and brought to Yildiz Technical University, Department of Bioengineering in Cell Culture and Tissue Engineering Laboratory for isolation, culture, characterization and cryopreservation. Continuously cultured cells were morphologically investigated. Cells that were obtained from biopsy samples were induced with adipogenic, osteogenic and neurogenic differentiation kits for stem cell characterization, immunophenotypically characterized by flow cytometry and obtained stem cells were cryopreserved. Olfactory stem cells were stained with CM-DiI to be used in in vivo studies and a multi-layered cell mass was obtained after passaging the cells 9 times. Obtained multi-layered cell mass was cultured in vitro to determine viability. In vivo studies to investigate the effect of CM-DiI labeled olfactory stem cell mass on peripheral nerve regeneration of experimentally face paralyzed rats have been conducted in two steps. In the preliminary examination, 7 Wistar Hannover (350-380 gr) female rats were used for a facial cut and inoculation of stem cells in the cut area using 4 different methods in Bezm-i Alem University Experimental Animal Laboratory. In this study, 500.000 CMD-DiI labeled olfactory stem cells in 10µl PBS were inoculated in damaged area of rat 1, 500.000 CMD-DiI labeled olfactory stem cells in 10µl PBS were inoculated in damaged area of rat 2 and the inoculation area was covered with approximately 1mm3 fat tissue (fascia) from the same rat, 500.000 CMD-DiI labeled olfactory stem cells in 10µl PBS were inoculated in damaged area of rat 3 and 4 and fibrin glue was applied to inoculation area, CM-DiI labeled multi-layered cell mass was inoculated on damaged area of rats 5 and 6 and as a control group rat 7 was given 10µl PBS into damaged area. In order to determine facial paralysis before the experiment and recovery rate after the experiment; whisker movements were scored on Weeks 2, 4, 6 and 8 before and after the full-thickness cut. The results were calculated using Mann Whitney U statistics. Considering the results of preliminary experiments; on the second step of in vivo studies, 27 rats were divided into 3 groups named M, T and K and for each group rat facial nerves on the left side were cut and nerve ends were anastomosed into neurotube poliglycolic acid conduit. Multi-layered cell pellet was added into conduit for Group M and PBS was added into conduit for Group T.  Group K was not supplemented additionally since it was the control group. Recovery in rats was monitored physiologically, electrophysiologically and with whisker movements on weeks 2, 4, 6, 8 and 10. At the end of Week 10, rats were sacrificed and preparations were taken from damage area for histological examination. Preparations were stained with hematoxylene, eosin, S100, Toluidine Blue and observed under fluorescent microscope. The results were statistically evaluated using Mann-Whitney U and Annova. According to the results, the cells obtained from olfactory tissue had stem cell characteristics in terms of morphology, immunophenotype and differentiation features and the cells were able to remain 91% viable after 24 months after cryopreservation. It was determined that the olfactory stem cells were labeled with CM-DiI stain and the multi-layered cell mass obtained from passaging the cells 9 times was able to preserve viability in the culture media. According to the whisker scores, among the four different methods the highest recovery rate was observed in the group that was applied with multi-layered cell mass prepared from olfactory stem cells. Physiological and electrophysiological results obtained from in vivo studies on 27 rats show that nerve regeneration in facial nerve reconstruction was faster in groups applied with olfactory stem cells (p=0,030. It was shown using histological evaluation with S100 staining that stem cells applied to the damage area in Group M were differentiated into Schwann-like cells. This study, supported by 2012-07-04 KAP02 numbered project and Yıldız Technical University Scientific Research Projects Coordination Department, aims to fulfill the statement published on 2003-2023 Technology Foresight Study by TÜBİTAK that highlights the importance of  "development of stem cell technologies for scientific studies to be conducted in Turkey and their availability especially in regenerative medicine" by isolating, characterizing and cryopreserving of olfactory stem cells which are the only available neural stem cells for the first time in our country, by creating a cryobank, by generating a multi-layered cell mass to be used in tissue engineering and by pointing to a new cellular treatment method that accelerates nerve regeneration of facial nerve damages