Kızılcık proantosiyanidinlerinin ve molekuler bileşenlerini meydana getiren kateşin ve epikateşinin anti-rotavirus aktivitesinin araştırılması
Investigations into anti-rotavirus activity of cranberry proanthocyanidins and this molecule's component of catechin and epicatechin
Yazar: FATMA SALİHA ÖZEN
Danışman: DOÇ. DR. OYA BULUT
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Epikateşin = Epicatechin ; Flavonoidler = Flavonoids ; Kateşin = Catechin ; Kızılcık = Cornelian cherry ; Moleküller = Molecules ; Proantosiyanidin = Proanthocyanidin ; Rotavirüsler = Rotaviruses

Özet:
Flavonoidlerin (ikincil bitki metabolitleri) duyarlı konaklardaki antiviral aktivitesi enfektivite titrasyon testi ile gösterilebilmektedir. Ancak, hücresiz test sisteminde flavonoidlerin dogrudan virus enfektivitesi/kapsit bütünlüğüne olan etkisine yönelik henüz bir çalışma bildirilmemiştir.Bu çalışma proantosiyanidin ve proantosiyanidinin yapısal olarak farklı molekül bileşenleri olan kateşin [(+)- Catechin hydrate] ve epikateşinin [(-)- Epicatechin; EC] antiviral aktivitesini belirlemek amacıyla yapılmıştır. Simian rotavirus SA-11 suşu (ATCC VR-1565) temsili bir enterik viral sistem için kullanılmıştır. Antigen capture [viral kapsid protein 6 (VP6)] enzyme immunoassay (ELISA), rotavirusun proantosiyanidin, kateşin ve epikateşin ile muamelesi sonucu viral enfektivite/kapsit bütünlüğünde meydana gelen kaybı ölçmek için kullanıldı. Rotavirus enfektivite titresi, monkey kindey (MA-104) monolayer hücre kültürleri kullanılarak tespit edilmiştir. ELISA sonucunda rotavirusa karşı antiviral etkisi belirlenen numunelerin etkili oldukları konsantrasyon ve süresinin hücrelere toksik olup olmadığı sitotoksisite testi ToxilightR Non-Destructive Cytotoxicity BioAssay (Lonza) ile belirlendi. Araştırmada, Gold labeled immunelektron mikroskopi, virus-proantosiyanidin komplekslerinin mikroskop altında inceleyebilmek için kullanılmıştır. Kırmızı kan hücreleri ve rotaviruslar arasındaki hemaglutinasyonu proantosiyanidinlerin inhibe etme yeteneklerinin olup olmadığını belirlemek için mikrohemaglütinasyon testinden yararlanılmıştır.İkiyüz ve 100 ug/ml kızılcık proantosiyanidini sırasıyla %91.8 ve %50 oranlarında virus enfektivite kaybına neden olmuştur. Proantosiyanidin bileşenlerinden flavan-3-ol monomerleri olan kateşin ve epikateşinin yüksek konsantrasyonları (5.000 ve 10.000 ug/ml) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında en fazla %30-50'ye varan rotavirus enfektivite kaybına sebep olmuştur. İkiyüz ug/ml proantosiyanidin konsantrasyonu ile muamele edilen rotavirusların hemaglütinasyon yetenekleri üzerinde proantosiyanidinlerin inhibitör etkisi olduğu belirlenmiştir. Rotavirus antijenik determinantlarının kırmızı kan hücrelerindeki sialik asit reseptörüne bağlanmasını proantosiyanidinlerin inhibe ettiği düşünülmektedir. Gold labeled immunelektron mikroskopi çalışmasında rotavirus parçacıkları proantosiyanidinler tarafından sarıldığı, hapsolduğu Transmisyon Elektron Mikroskobunda (TEM) gözlenmiştir. Bu çalışmada kullanılan proantosiyanidinler, kateşin ve epikateşin konsantrasyonları MA-104 monolayer hücre kültüründe sitotoksisite göstermemiştir.Bu çalışmada elde edilen verilerle ilk kez hücresiz deney sistemi kullanılarak rotavirus enfektivite/kapsit bütünlüğüne olan direkt antiviral etkisi gösterilmiştir. Kateşin ve epikateşin proantosiyanidinin bileşenleri olmasına rağmen, tek tek test edildiğinde minimal etkili olduğu, bileşik haldeyken daha etkili olduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
Flavonoids (secondary plant metabolites) display antiviral activity upon infectivity titration testing in susceptible hosts. However, no studies have reported the direct loss of virus infectivity/virus structural integrity by flavonoids in the cell-free assay system.Accordingly, experiments were performed to determine the extent of antiviral activity by proanthocyanidins (PACs) and the structurally different PAC component molecules catechin [(+)- Catechin hydrate] and epicatechin [(-)- Epicatechin; EC]. The simian rotavirus stain SA-11 (ATCC VR-1565) was used as a representative enteric viral system. A quantitative antigen capture [viral capsid protein 6 (VP6) enzyme immunoassay assay was used to measure loss of viral infectivity/viral capsid integrity in the presence and absence of treatment regimens with PACs, catechin and EC. Rotavirus (RTV) stock titers were determined by monkey kidney epithelial (MA-104) cell culture monolayers grown in 96-well microtiter plates. Cytotoxicity testing was performed by the ?ToxilightR Non-Destructive Cytotoxicity BioAssay? (Lonza). Gold-labeled immunoelectron microscopy was performed to visualize the virus-PAC complexes. A microhemagglutination assay was used to investigate whether PACs were capable of inhibiting red blood cell (RBC) aggregation by rotavirus.Two hundred and 100 ug/ml PACs affected a direct loss of virus infectivity to 91.8 and 56% of control, respectively. PAC component flavan-3-ol monomers (i.e., catechin and EC), mandated elevated concentrations (ca., 5,000 to 10,000 ug/ml) to affect a RTV loss of infectivity approaching 30-50% of control. At a concentration of 200 ug/ml, PACs displayed an inhibitory effect upon the RTV-induced hemagglutination. These data suggest an inhibitory effect on the binding of RTV antigenic determinants to RBC sialic acid receptor sites. Utilizing gold-labeled immunoelectron microscopy technique, RTV particles were found to be shrouded within solubilized PACs and sequestered within PAC aggregates by Transmission Electron Microscopy (TEM). At the concentrations used in this study, neither PACs, catechin, nor EC, proved cytotoxic to MA-104 cells grown in monolayer culture.The data from this study show for the first time, a direct antiviral effect on rotavirus infectivity/structural integrity using a cell-free assay system. Catechin and EC, although components of PACs, were minimally effective as antiviral agents when individually tested. The components were found to be more effective when the compound.