Miyokard proteinlerinin iki boyutlu elektroforezle ayrılması
Separation of myocardial proteins by two dimensional gel electrophoresis
Yazar: SEDA KARAKAŞ
Danışman: PROF. DR. FİKRİYE URAS
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kalp hastalıkları = Heart diseases ; Miyokard = Myocardium ; İzoelektrik odaklama = Isoelectric focusing

Özet:
İki boyutlu jel elektroforezi, kompleks protein karışımlarının ayrılması vekarakterizasyonunda kullanılan en etkin tekniklerden birisidir. Bu çalışmanın amacı, ikiboyutlu poliakrilamid jel elektroforezi ile normal kalp dokusunun protein haritasınıçıkarmaktır.B u çalışmada kapak hastalığı olan iki hastadan, ameliyat sırasında alınan papillerkas dokusunun protein dağılımı incelendi. Örnekler serum fizyolojikle yıkandı ve -80°C'de yaklaşık bir hafta saklandı.P roteinlerin, önce izoelektrik odaklama yöntemiyle, geniş pH gradienti (pH 3-10)kullanılarak birinci boyut ayrımı yapıldı. Sonra %12'lik ayırma jeli (resolving gel) ve%4'lük yükleme jeli (stacking gel) kullanılarak SDS-PAGE ile ikinci boyut ayrımıyapıldı. Protein spotları Sypro Ruby ile boyanarak görünür hale getirildi. Jellerde oluşanspotlar bilgisayar sistemine bağlı bir fotağraf analiz yöntemi olan PDQUEST ileincelendi.Molekül ağırlıkları 10-70 kDa arasında değişen ve izoelektrik noktaları 5-10 arasındabulunan proteinler saptandı. I. örneğin jelinde 998 spot, II. örneğin jelinde 980 spotgörüldü. Bu iki jel birbirleriyle karşılaştırıldığında, 236 protein spotunun tam eşleştiğisaptandı. İki örnek arasında gözle görülen bazı spot farklılıkları belirlendi. II. örnekte I.örneğe göre bir spotun daha belirgin olduğu, ancak bir spotun da I.örnekte görülüp II.örnekte kaybolduğu görüldü. Ancak bu spotların hepsinin protein spotu olduğunu kesinolarak söyleyemeyiz. İki jel arasındaki bu farklılıklar, örneklerin ameliyat sonrasındayıkanması sırasında kan proteinlerinin tam olarak uzaklaştırılmamasından dolayıolabileceği gibi, yüklenen protein kütle farklılıklarından ve biyolojik farklılıklardankaynaklanabilir.P rotein spotlarıyla ilgili daha doğru yorumlar yapabilmek için, ileri çalışmalaraihtiyaç vardır; MALDI-, SELDI-TOF gibi analiz yöntemleriyle incelemek gerekir. Dahaçok sayıda vakada bu araştırmanın sürmesi ile normal kalp dokusunun protein haritasıdaha etkin bir şekilde ortaya konabilecektir. Çeşitli kalp hastalıklarındaki bulgularla,normal bulguların karşılaştırılması kalp hastalıklarının sebebini açığa kavuşturmada çokyararlı olabilir.Anahtar kelimeler: İki boyutlu jel elektroforezi / İzoelektrik Odaklama / Kalphastalıkları / Miyokardiyum / Proteom

Abstract:
Two Dimensional gel electrophoresis is one of the most effective techniques used inthe separation and characterization of complex protein mixtures. The purpose of thestudy is to obtain a protein map of normal cardiac tissue by two dimensional gelelectrophoresis. In this study, the papillary smooth muscle tissue samples obtained fromtwo patients who had valvular operation. The cardiac tissue was washed withphysiological saline and preserved in -80 °C for one week. Proteins were separated byisoelectric focusing in the first dimension of a wide pH gradient (pH 3-10). Later theywere separated by SDS-PAGE in a second dimension using the concentration of 12%resolving gel and 4% stacking gel. Protein spots were made visible by staining withSypro Ruby. The spots in the gels were examined with PDQUEST which is software ofphotographic analysis method. The molecular weights of the proteins were 10-70 kDaand the isoelectric points were 5-10. 998 spots in the first sample gel, 980 spots in thesecond sample gel were observed. When the spots of two different samples compared toeach other, 236 spots were same in both of the gels; one spot which was seen in the firstgel was absent in the second gel. It is hard to say that all these spots are significantprotein spots. The differences between two gels may be due to some reasons which arethe amount of protein applied to the gel, biological variations and the incompletewashing to remove blood after surgery. It will provide more data for interpretation ofthe spots by further studies such as MALDI- and SELDI-TOF. The protein map ofnormal heart tissue will provide reference data to compare with data in somepathological conditions. These findings compared with the corresponding findings inheart diseases might be helpful to illuminate the secrets behind cardiac diseases.Key words: Two dimensional gel electrophoresis / isoelectric focusing / heart diseases /myocardium / proteomics