Koyun oositlerinin seçim kriterleri ve kültür ortamına göre in vitro gelişim düzeylerinin araştırılması
Investigation of in vitro developmental levels of sheep oocytes according to selection criteria and culture medium
Yazar: RAMAZAN SEVGİ
Danışman: DOÇ. DR. SAKİNE ÜLKÜM ÇİZMECİ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veteriner Doğum ve Jinekoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Akkaraman koyunları = Akkaraman sheep ; Fertilizasyon-in vitro = Fertilization-in vitro ; Oositler = Oocytes

Özet:
Sunulan çalışmada boyama yöntemi ve morfolojik yapılarına göre seçilen koyun oositlerinin
maturasyon, fertilizasyon ve blastosist gelişim oranlarına drop hacmi ve oosit yoğunluğunun etkisinin
belirlenmesi amaçlanmıştır.
Sunulan çalışmanın laboratuvar uygulamaları UHAEM Müdürlüğü bünyesinde bulunan
Embriyo Transferi laboratuvarında yürütüldü. Lokal mezbahadan alınan ovaryumlar antibiyotik içeren
%0,9 fizyolojik tuzlu su içerisinde ve 25-30°C'lik sabit sıcaklık sağlayan termosta 2-3 saat içerisinde
laboratuvara getirildi. Oositlerin maturasyonunda TCM-199, fertilizasyonunda BSOF, kültüründe ise
SOF kullanıldı. Oositler; 2-8 mm çaplı antral foliküllerden 18-G kanül takılan 5 ml'lik enjektör
kullanılarak aspire edildi. Alınan oositler rastgele iki gruba ayrıldı. Birinci gruptaki oositler Brilliant
Cresyl Blue (BCB) ile boyandı. İkinci gruptaki oositler ise morfolojik yapılarına göre değerlendirildi.
Boya alan oositler (BCB+) ve morfolojik değerlendirme sonunda A ve B kalitede olan oositler
çalışmaya dahil edildi. Seçilen oositler, oluşturulan mikro damlacıklarda oosit/solüsyon hacim
oranları; 1 adet /5 µl, 1 adet /10 µl, well of the well (WOW) kültür sisteminde bireysel ve 16 adet /100
µl grubunda toplu halde ve olacak şekilde in vitro maturasyon, fertilizasyon ve kültür aşamalarına tabi
tutuldu. Mezbahadan getirilen 352 adet ovaryumdan 2-8 mm çapındaki foliküllerden toplam 1179
oosit aspire edildi. Elde edilen oositlerin 627'si BCB boyasına maruz bırakıldı ve bunların 367'si boya
alırken (BCB+) 260'ı boya almadı (BCB-). Kalan 554 oosit ise morfolojik yapılarına göre
sınıflandırıldı ve 393 adet oosit A ve B kaliteli olarak değerlendirildi. Çalışmada, boya alan 367 oosit
(BCB+) ve A-B kalitedeki 393 oosit olmak üzere toplam 760 oosit kullanıldı. Hem morfolojik
yapısına göre hem de BCB ile boyama sonrası değerlendirilen oositlere bütün aşamalarda aynı
şartlarda IVP uygulamaları gerçekleştirildi. Yapılan analizde BCB ile seçilen oositlerde; IVM, IVF ve
IVC sonuçları sırası %86,82; %64,57; %26,15 olarak gerçekleşirken morfolojik seçime göre yapılan
değerlendirmede ise bu oranlar %83,20; %57,25; %21,37 olarak gerçekleşti ve gruplar arasında
istatistiki farkın önemli olduğu tespit edildi. A ve B kalite oositler ile farklı büyüklükteki drop
hacimlerine göre yapılan çalışmada ise maturasyon oranları sırası ile %84,86; %76,56; %84,37 ve
%87,50; fertilizasyon oranları %73,46; %64,21; %69,73 ve %69,25 blastosist oranları ise %30,49;
%16,21; %27,72 ve %28,54 olarak tespit edildi. Boyama yöntemi ile seçilen BCB+ oositlerde ise
maturasyon oranları sırası ile %88,20; %79,91; %88,54 ve %90,62; fertilizasyon oranları %78,44;
%67,80; %75,28 ve %74,84; blastosist oranları ise %34,33; %19,52; %30,85 ve %33,33 olarak tespit
edildi. Her iki çalışmada da gruplar arasındaki fark istatistiki bakımdan anlamlı bulundu (P<0,05).
Sonuç olarak, koyunlarda BCB boyası kullanılarak seçilen oositlerin, morfolojik yapısına
göre seçilen oositlere göre in vitro embriyo üretiminin tüm aşamalarında daha iyi gelişim gösterdiği,
oositler boyama işleminden zarar görmediği için subjektif değerlendirmeden daha yararlı bir araç
olarak IVF çalışmalarında kullanılabileceği sonucuna ulaşıldı. Aynı zamanda sunulan çalışma ile
koyunlarda in vitro embriyo üretiminde; hücrelerin maturasyon, fertilizasyon ve kültür ortamında 5 μl
büyüklüğündeki droplarda bireysel olarak da gelişebileceği, grup kültürü ve WOW sistemi ile benzer
oranlarda blastosist geliştirilebildiği belirlenmiştir.

Abstract:
The present study aimed to determine the effect of drop volume and oocyte density on the
maturation, fertilization, and blastocyst development rates of sheep oocytes selected according to
staining method and morphological structures.
The laboratory applications of the present study were carried out in the Embryo Transfer
Laboratory of the UHAEM Directorate. Ovaries were obtained from slaughterhouses close to the
laboratory. TCM-199 was used for maturation, BSOF for fertilization, and SOF for oocyte culture.
Oocytes were aspirated from antral follicles measuring 2-8 mm in diameter. The oocytes were randomly
divided into two groups. The oocytes in the first group were stained with Brilliant Cresyl Blue (BCB).
The oocytes in the second group were scored according to their morphological structures. Stained
oocytes (BCB+) and oocytes with A and B quality at the end of morphological evaluation were included
in the study. The selected oocytes were subjected to in vitro maturation, fertilization, and culture stages
individually in micro drops of 5 µL, 10 µL volume, and well of the well (WOW) culture system and
groups of 16 oocytes in 100 µL drops. A total of 1179 oocytes were collected from follicles 2-8 mm in
diameter from 352 ovaries. Of the collected oocytes, 627 were exposed to BCB staining, of which 367
were stained (BCB+) and 260 were not (BCB-). The collected 554 oocytes were classified according to
their morphological structures and 393 oocytes were classified as A and B quality. A total of 760 oocytes
were used in the study, including 367 oocytes that received dye (BCB+) and 393 oocytes of A-B quality.
Both A-B quality oocytes and BCB+ oocytes were subjected to IVP with the same volume and cell
density at all stages. The results of IVM, IVF, and IVC were 86.82%, 64.57%, and 26.15% respectively
in oocytes selected by BCB, while these rates were 83.20%, 57.25%, and 21.37% in the evaluation
according to morphological selection, and it was found that the statistical difference between the groups
was significant. In the study carried out with A and B quality oocytes according to different drop
volumes, the maturation rates were 84.86%, 76.56%, 84.37%, and 87.50%; the fertilization rates were
73.46%, 64.21%, 69.73%, and 69.25%; the blastocyst rates were 30.49%, 16.21%, 27.72%, and 28.54%.
In BCB+ oocytes selected by staining, maturation rates were 88.20%, 79.91%, 88.54%, and 90.62%;
fertilization rates were 78.44%, 67.80%, 75.28%, and 74.84%; and blastocyst rates were 34.33%,
19.52%, 30.85%, and 33.33%, respectively. In both studies, the difference between the groups was
statistically significant (P<0.05).
As a result, it was concluded that oocytes selected by BCB staining in sheep showed better
development at all stages of in vitro embryo production than oocytes selected by morphological
structure, and since the oocytes were not damaged by the staining process, it could be used as a more
useful tool in IVF studies than subjective evaluation. At the same time, it was found that in vitro embryo
production in sheep, cells can develop individually in 5 μL drops in the maturation, fertilization, and
culture environment, and blastocysts can be developed at similar rates using group culture and the WOW
system.