Bakteriyel toksinlerin kardiyak miyositler üzerine apoptotik etkisi
Apoptotic effect of bacterial toxins on cardiac myocytes
Yazar: SULTAN YOLBAKAN
Danışman: PROF. DR. TURGUT İMİR
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Bakteriler = Bacteria ; Kardia = Cardia ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Toksinler = Toxins

Özet:
Bakteriyel toksinlerden kolera toksin, difteri toksini, Stafilokokkal Enterotoksin B, Lipoplisakkarit `in farklı konsantrasyonları 24h rat embriyonik kardiyak miyositler ( H9c2 ) ile inkübe edilmiştir. Bakteriyel toksinlerin sitotoksik etkisi, hücre canlılığı ( % )'nın belirlenebilmesi için MTT yöntemi ile analiz edilmiştir.Kolera toksin, Stafilokokkal Enterotoksin B, Lipopolisakkarit 'in H9c2 hücrelerinin canlılığı üzerine etkisi kontrol grubuna göre anlamlı bulunmamıştır. Difteri toksininin H9c2 hücrelerinin canlılığı üzerine etkisinin doz bağımlı olduğu belirlenmiştir. Difteri toksininin 50 ? g/ml konsantrasyonu H9c2 hücrelerinin canlılık değeri ( % ) değerlendirilmesinde kontrol grubuna göre anlamlı bulunmuştur.Difteri toksininin 50 ? g/ml konsantrasyonu ile 24h inkübe edilen H9c2 hücrelerinde Flow Sitometri yöntemi ile Apoptotik Hücre Artışı ( % ), difteri toksininin farklı konsantrasyonları ile 24h inkübe edilen H9c2 hücrelerinde DCF yöntemi ile reaktif oksijen türleri salınımı, difteri toksininin 50 ? g/ml konsantrasyonu ile 5h inkübe edilen H9c2 hücrelerinde RT-PCR yöntemi ile Kaspaz 2, Kaspaz 8, Kaspaz 9, Kaspaz 3, Kaspaz 6, Kaspaz7, Fas, Tnfrsf11b, Apaf1, Traf1, Bax mRNA seviyeleri belirlenmiştir. Difteri toksininin 50 ? g/ml konsantrasyonu ile 24h inkübe edilen H9c2 hücrelerinde Apo BRDU yöntemi ile internükleozomal DNA fragmantasyonu, nüklear morfolojinin belirlenmesi amacıyla Hoechst Dye yöntemi kullanılmıştır.Difteri toksininin sitotoksik etkisinin hücrelerde meydana gelen apoptotik etkiden kaynaklandığı apoptotik hücre artışı ( % ) değeri ile belirlenmiştir.Difteri toksininin H9c2 ( rat embriyonik kardiyak miyositler ) üzerine apoptotik etkisinde Kaspaz 2, Kaspaz 9, Kaspaz 7 mRNA seviyesi aktive olmakta Kaspaz 8, Kaspaz 3, Kaspaz 6 mRNAseviyesi değişmemektedir. Apoptotik etkide kaspaz aktivitesi önemlidir.Apoptotik yolda rol alan diğer gen aktivasyonları değerlendirildiğinde Tnfrsf11b , Traf1 mRNA seviyesi aktive olmaktadır. Apaf1 mRNA seviyesi azalmaktadır.Sonuç olarak ; difteri toksini H9c2 hücreler üzerinde apoptotik etki oluşturmaktadır. Bu etki apoptozisi indükleme ve inhibe etme olmak üzere iki farklı şekilde meydana gelmektedir.

Abstract:
Rat embryonic cardiac myocytes ( H9c2 ) were incubated with different concentrations of bacterial toxins, such as cholerae toxin, diphtheriae toxin, Staphylococcus Enterotoxin B, Lipopolysaccharide for 24hs. The cytotoxic effect of bacterial toxins was analysed by MTT assay for the percentage of cell viability.There was no statistical significance for the effects of cholerae toxin, Staphylococcus Enterotoxin B, Lipopolysaccharide on viability in H9c2 cells. The effect of Diphtheriae toxin on the viability of H9c2 cells was dose-dependent. Diphtheriae toxin in the concentration of 50 ? g/ml affected the percentage of viability in H9c2 cells significantly.H9c2 cells were incubated with Diphtheriae toxin in the concentration of 50mikrog/ml for 24hs. The percentage of apoptotic cells were analysed by Flow Cytometry. H9c2 cells were incubated with different concentrations of diphtheriae toxin for 24hs. Production of Reactive Oxygen Species were analysed by DCF assay. H9c2 cells were incubated with diphtheriae toxin in the concentration of 50mikrog/ml for 5hs. mRNA levels of Caspase 2, Caspase 8, Caspase 9 , Caspase 3, Caspase 6, Caspase 7, Fas, Tnfrsf11b, Apaf1, Traf1, Bax were analysed by RT-PCR . H9c2 cells were incubated with diphtheriae toxin in the concentration of 50mikrog/ml for 24hs. İnternucleosomal DNA fragmentation, which is known as terminal stage of Apoptosis, was analysed by Apo-BRDU assay, nuclear morphology was analysed by Hoechst Dye assay.According to the percentage of Apoptotic cells, the cytotoxic effect of Diphtheriae toxin on H9c2 cells results from apoptotic effect of toxin itself.Diphtheriae toxin increased production of ROS in a dose-dependent manner and increased mRNA levels of Caspase 2, Caspase 9, Caspase 7, Tnfrsf11b, Traf1 in H9c2 cells. Diphtheriae toxin decreased mRNA levels of Apaf1 in H9c2 cells.In conclusion; Diphtheriae toxin increased apoptotic effect through dose-dependent production of ROS and increased apoptotic effect by augmentation of mRNA levels of Caspase 2, Caspase 9, Caspase 7 in H9c2 cells. Diphtheriae toxin decreased Apoptotic effect by reducing of mRNA levels of Apaf1, Traf1 in H9c2 cells.