Kistik fibrozisin erken tanısına yönelik IRT2'ye karşı monoklonal antikor geliştirilmesi
Monoclonal antibody production against IRT2 for cystic fibrosis early diagnosis
Yazar: TUĞÇE NUR ERALP
Danışman: DOÇ. DR. BANU MANSUROĞLU ; DOÇ. DR. FATIMA YÜCEL
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Antikorlar-monoklonal = Antibodies-monoclonal ; Hibridoma teknolojisi = Hybridoma technology ; Poliklonal antikor = Polyclonal antibody

Özet:
Kistik fibrozis otozomal çekinik geçiş gösteren, beyaz ırkta en sık rastlanan genetik hastalıktır. Dünyada prevalansı yaklaşık olarak her 3000 bebekte 1 olarak saptanmıştır. Pankreas, bağırsak, akciğer,  ter bezleri ve dış salgı bezleri gibi vücudun birçok önemli sistem ve organını aynı anda etkileyebilen bu rahatsızlıkta, sindirim sistemi ve solunum sistemi kalın ve yapışkan bir mukoza salgısıyla tıkanır. Hastaların yaşam süresinin ortalama 37 sene ile sınırlandığı bu hastalıkta,  etkin tedavilerin erken başlatılabilmesi için erken tanının önemi giderek artmaktadır. Yenidoğanda kandaki, İmmunoreaktif Tripsinojen (IRT) düzeyi, normal yenidoğan  kanına gore 5 ile10 kat daha fazladır.IRT bir yenidoğan tarama aracıdır  ve yenidoğan tarama programlarında ilk incelenmeye başlanan belirteç olmuştur Bu hastalığın erken tanısı Amerika, Yeni Zelanda ve birçok Avrupa ülkesinde yenidoğan tarama programında uygulamadadır. Tarama programlarında, bebeklerin topuk kanından IRT düzeylerine bakılmakta, bazı ülkelerde ise DNA testi ile gen mutasyonu incelenmektedir. Ülkemizde de 2015 yılı itibariyle, T.C. Sağlık Bakanlığı Yenidoğan Ulusal Tarama Programında yenidoğan topuk kanı örneklerinde Kistik Fibrozis hastalığının taranması  zorunlu testler arasına alınmış ve IRT analizlerine başlanmıştır. Kistik fibrozisin tanısında kullanılan ELISA temelli tanı kitleri yurt dışından ithal edilmekte ve ülke ekonomisine büyük külfet oluşturmaktadır. Bu sorunları aşmak amacıyla konu ile ilgili ülkemizde yapılan çalışmalar da oldukça yetersizdir. Bu nedenle tümüyle yurt dışından satın alınan, yılda yaklaşık 1 270 000 yeni doğan bebek için yapılacak ve tekrar testleriyle birlikte yaklaşık 2 000 000 adete ulaşacak olan IRT test kiti ihtiyacı ülkemiz için çok önemlidir.  
Bu tez çalışmasında  Kistik fibrozisin tanısına yönelik geliştirilmesi planlanan yerli ELISA kitlerinde kullanılmak üzere IRT2' ye karşı monoklonal ve poliklonal antikorlar üretildi.Bu amaçla, ticari olarak temin edilen IRT2 antijeni ile 6-8 haftalık BALB/c türü fareler immünize edildi. Hibridoma teknolojisi kullanılarak güçlü antikor yanıtı alınan fareler ile 7 ayrı füzyon çalışmaları gerçekleştirildi. Füzyonlarda, B lenfosit kaynağı olarak dalak organı kullanıldı. Dalak hücreleri ile fare myeloma hücreleri, polietilen glikol varlığında birleştirildi. Füzyon çalışmaları sonucunda 3 adet klonun ürettiği antikorun IRT2 antijeni ile özgün reaksiyon verdiği dolaylı ELISA yöntemi ile belirlendi.
Sonuç olarak; elde ettiğimiz bu monoklonal antikorlar kullanılarak yenidoğan kanlarında IRT2 nin tespiti için hızlı, basit, güvenilir ve hassas sistemler olan ELISA tanı sistemlerinin geliştirilmesi mümkün olacaktır.

Abstract:
Cystic fibrosis is an autosomal recessive genetic disease and has an incidence rate of one in 3.000 infants in worldwide. Cystic fibrosis affects multiple systems and organs simultaneously; including lungs, pancreas, bowls, sweat glands and external glands where in lungs and digestive system, causes obstruction with a viscous mucosal secretion. Most life threatining part of the disease is malnutrition. Cystic fibrosis affects multiple systems and organs simultaneously; including lungs, pancreas, bowls, sweat glands and external glands where in lungs and digestive system, causes obstruction with a viscous mucosal secretion.Disease's survival to a median predicted age of ~37 years for children born with cystic fibrosis today. It is important to early detection of disease for start in  effective treatment strategy. In recent years, cystic fibrosis was included in the neonatal screening programs in many countries such as USA, New Zealand and any other European countries. In these screening programs, immun reactive trypsinogen levels are tested from the heel bleedings of the newborns, in the other hand some countries screen genetic mutation analysis. In our country, after 2015, there is no cystic fibrosis diagnosis test. Since 2015, Health Ministry of Turkish Republic included cystic fibrosis tests to the obligatory National Neonatal Screening Program, and heel bleedings of the newborn were tested for IRT levels. But, neonatal cystic fibrosis scrrening tests are imported and this is an economical inconvenience for our country. There is no sufficient labor in the diagnosis technology area. Therefore, a need around  2.000.000 IRT test kits in order to test approximately 1270 000 babies per year with replicas, poses a great importance for our country.
With this purpose, commercially obtained IRT2 antigen is used for immunisation of 6-8 weeks old BALB/c mice in the experiments. By using hybridoma technology, seven fusion studies were carried out with the high immune response giving mice. The spleen was used as a lymphocyte source in the fusion studies. Spleen and myeloma cells were fused in the presence of polyethylenglycol. As a result of fusion, 3 positive hybrid clones were obtained and  produced spesific monoclonal antibody against IRT2 by indirect ELISA.
In conclusion, using this monoclonal antibody it will be possible to develope quick, easy and cheap ELISA diagnostic systems to detect the IRT 2  in newborn bloots.
According to this, the aim of this thesis study as a first time in our country is to produce monoclonal and polyclonal antibody against IRT2 antigen. Using the hybridoma technology process, we obtained original and high affinity monoclonal and polyuclonal antibodies. Antibodies were purified and characterized.