Radyoterapi ile eşzamanlı letrozol kullanımının meme kanseri hücre hattında hücre ölüm mekanizmaları üzerine etkilerinin araştırılması
Study of the effect of concurrent use of letrozole with radiotherapy to the cell death mechanisms in the breast cancer cell line
Yazar: BURCU DURMAK İŞMAN
Danışman: PROF. DR. İLKNUR BİLKAY GÖRKEN
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Radyasyon Onkolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2010
Konu: Onkoloji = Oncology ; Radyoloji ve Nükleer Tıp = Radiology and Nuclear Medicine
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre ölümü = Cell death ; Letrozol = Letrozole ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Otofaji = Autophagy ; Radyoterapi = Radiotherapy

Özet:
Meme kanseri dünyada üçüncü sıklıkla rastlanan kanserdir ve kadınlarda en sık görülen malignitedir. Kadınlardaki kanser olgularının %37'sinden sorumludur. Meme kanserli hastaların adjuvan endokrin tedavi standartlarında son yıllarda önemli değişiklikler olmuştur. Preklinik ve klinik çalışma sonuçlarına göre hormon reseptör pozitif tümörler moleküler, biyolojik ve klinik farklılıklar göstermektedir. Hormon reseptörü pozitif meme kanserlerinin çoğunda hormonal tedavi kullanımı sağkalım süresini uzatmaktadır. Premenapozal kadınlarda standart endokrin tedavi tamoksifendir. Reseptör pozitif postmenapozal hastalarda ise optimal adjuvan hormonal tedavi, aromataz inhibitörlerini başlangıç tedavisi olarak ya da tamoksifen tedavisi sonrasında kullanmaktır. Üçüncü jenerasyon aromataz inhibitörleri ile yapılan çalışmalarla bu ilaçların ne zaman kullanıldığından bağımsız olarak progresyona kadar geçen süre ve hastalıksız sağkalım açısından en az tamoksifen kadar etkili ve daha üstün oldukları gösterilmiştir .Meme kanserinde postoperatif radyoterapi hem yerel bölgesel hastalığı kontrol etmek, yinelemeleri engellemek, hem de sağkalımı arttırmak amacıyla kullanılır. Deneysel ve klinik çalışmalarda tamoksifenin radyoterapi ile kullanımının radyoduyarlaştırıcı etkisi ve radyoterapiye bağlı akciğer fibrozisini arttırdığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, aromataz inhibitörleriyle eşzamanlı olarak radyoterapi uygulamasının etki ve yan etkileriyle ilgili çok kısıtlı bilgi vardır. Yapılan tek bir deneysel çalışmada letrozolün meme kanseri hücrelerinin radyasyon duyarlılığını arttırdığı ortaya konmuştur.Bu çalışmanın amacı hücre kültüründe iyonize radyasyon ve letrozolün eşzamanlı kullanımının hücre ölüm mekanizmaları üzerine etkisini incelemektir.Gereç ve Yöntem:Meme kanseri hücrelerinde radyoterapi ile eşzamanlı letrozol kullanımının hüc-re ölüm mekanizmaları üzerine olan etkilerini göstermeyi hedeflediğimiz çalışmamız in vitro koşullarda hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yapıldı ve çalışmamızda, model olarak MCF-7 aro meme kanseri hücre hattı ve kontrol grubu olarak da MCF-7 hücreleri kullanıldı.Letrozol 100 nM, 500 nM ve 1000 nM dozlarında uygulandı. Hücre hatları 1,3 ve 6 gün letrozole maruz bırakılarak, Cobalt-60 kullanılarak, 2 ve 4 Gy dozlarıyla ışınlandı. Deneyler radyoterapi sonrası 24. saatte yapıldı. Apoptotik hücre ölümü ,?Fluorometric Caspase 3 Assay Kit? ile apoptotik davranış ölçümü ve ?Annexin-V FITC Apoptoz Tespit Kiti? ile akım sitometrede PI ile boyanan ölü hücrelerin analizi ile gösterildi. Hücre hatlarında otofajide rol alan beclin geninin ekspresyonunun protein düzeyinde belirlenmesi için western blot tekniği kullanıldı. MCF-7 hücreleri ile deneyler 3 kez tekrarlandı. MCF-7 aro hücrelerinin elde edilmesinde yaşanan problemler nedeniyle , bu hücre hattıyla deneyler sadece 1 kez yapılabildi.Bulgular:MCF-7 hücrelerinde hücre ölüm mekanizması şekillerinden biri olan apoptotik ölümü Kaspaz-3 ve Annexin-V yöntemi ile değerlendirdiğimiz deneylerimizde 1, 3 ve 6 günlük letrozol maruziyeti sonrası artan ilaç ve radyasyon dozlarında; erken apoptoz, geç apoptoz ve nekroz açısından anlamlı bir fark olmadığı gözlenmiştir. MCF-7 aro hücelerinde ise Letrozol varlığında hücre ölümünde genel olarak yüksek dozlarda apoptozisde azalma görmekteyiz. Deneyler sonucu gözlenen nekrozdaki azalma, hücre ölümünün nekrozdan apoptoza kaydığını göstermektedir.MCF-7 hücrelerinde 1 günlük belirlenen dozlardaki Letrozol maruziyeti ardından 4 Gy ışınlama sonrası kontrol grununa göre otofajide bir artış gözlenmektedir. 3 ve 6 günlük Letrozol maruziyeti sonrası ise otofajide hiçbir artış izlenmemektedir.MCF-7 Aro hücrelerinde her ne kadar tekrarlanması gerekse de Letrozol'ün in-düklediği otofajiyi değerlendirdiğimizde genel olarak 2 ve 4 Gy `de kontrol grubuyla karşılaştırıldığında bir artış gözlenmektedir.Sonuç:Elde edilen veriler doğrultusunda Letrozol'ün eşzamanlı kullanımının hormon duyarlı, reseptör pozitif ve aromataz enzimi eksprese eden hücrelerde hücre ölüm mekanizmaları üzerinde olumlu etkisi olduğu söylenebilmekle beraber daha sağlıklı bilgiler verebilmek için devam eden deneylerin sonuçlarına da ihtiyaç vardır. Bu konu ile ilgili yapılmış çok fazla çalışma olmaması nedeniyle bu sonuçlar geliştirilmiş ça-lışmalarla desteklenmelidir.

Abstract:
Purpose:Breast cancer is the third most common cancer worldwide and the most common malignancy in women. It is responsible for 37% of cancer cases in women. Recently, there have been important changes regarding standard adjuvant endocrine therapy in breast cancer patients. According to the results of preclinical and clinical studies, hormone receptor-positive tumors have molecular, biological and clinical differences. Using hormonal treatment prolongs survival for the majority of hormone receptor positive breast cancerIn premenopausal women standard endocrine therapy is tamoxifen; the optimal adjuvant hormonal therapy in ER (+), postmenopausal patients is aromatase inhibitors as initial therapy or after tamoxifen treatment. In the third-generation aromatase inhibitors studies, progression and disease-free survival rates have shown that aromatase inhibitors are at least as effective and are superior to tamoxifenPostoperative radiotherapy (RT) decreases the risk of locoregional recurrence. RT is also associated with improved survival in high-risk premenopausal and postmenopausal women with breast cancer. Experimental and clinical studies show that concurrent use of tamoxifen sensitizes cells to radiotherapy and increases radiotherapy induced pulmonary fibrosis. Whether letrozole sensitizes breast cancer cells to RT has not been determined with sufficient number of studies. There is a single experimental study of breast cancer cells that revealed increased radiation sensitivity with letrozole.The purpose of this study is to investigate the effect of concurrent use of letrozolewith radiotherapy to the cell death mechanisms in the breast cancer cell line.Materials and methods:In our study in vitro cell culture methods were used, as a model MCF-7 aro breast cancer cell lines were chosen as model and MCF-7 cells were chosen as the control group.Letrozole was used with varying doses of 100, 500, 1000 nM, and cell lines were exposed to letrozole for 1, 3 and 6 days; Irradiations were performed using a cobalt-60 source with doses 2 and 4 Gy. Experiments were held 24 hours after radiotherapy. Apoptotic cell death was evaluated with "Fluorometric Caspase 3 Assay Kit?; by measurement of the apoptotic behavior ,with ?Annexin-V FITC Apoptoz Detection Kit " by showing of dead cells with PI staining in flow analysis. Western blot technique was used for determination Beclin gene expression which has a role in autophagy in cell line. The experiments were repeated three times for MCF-7 cells but experiments with MCF-7 aro cells could be done only one time because of the problems to optain the cell line.Results:In our experiments with MCF-7 cell line, we evaluated caspase-3 and Annexin-V results for 1,3, and 6 day incubation with letrozole. There was no significant difference for early apoptoz, late apoptoz and necrosis. Apoptozis was reduced by increasing radiation doses in MCF-7 aro cells under Letrozol effect. The experimental results of decreasing necrosis showed that there was a trend from necrosis to apoptoz.Our study showed a increased autophagy in cells which received 4 Gy irradiation and incubated with letrozole for 1 day compared with the control group. There was no difference in cells which received 2-4 Gy irradiation and incubated for 3 and 6 days. Also we found a increased autophagy in MCF-7 Aro cells which received 2 - 4 Gy irradiation and incubated with letrozole for 1 day compared with the control group.Conclusion:In accordance with the data obtained, we had positive effect on cell death mechanisms for hormone-sensitive, receptor-positive and aromatase enzyme expressed cells with concurrent use of letrozole. The results of ongoing studies are needed to provide better information. This study must be supported by improved results because there isn?t sufficient information for this topic in the literatureKey Words: MCF-7 and MCF-7 aro cell line, Radiotherapy, Letrozole, Apoptoz, Autophagy