Tip 1 diabetes mellitus modelinde langerhans adacık ve mezenkimal kök hücre tabakalarının makrokapsülasyon yoluyla konak savunma sisteminden korunarak fonksiyonunun devamlılığının sağlanması
Ensuring continuity of function by using macroencapsulation technique langerhans islet and mesenchymal stem cell sheets protection from host immune system in type 1 diabetes mellitus model
Yazar: BÜŞRA ÖNCEL DUMAN
Danışman: PROF. YUSUFHAN YAZIR
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı / Kök Hücre ve Doku Yenilenmesi Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları = Endocrinology and Metabolic Diseases
Dizin: Aljinatlar = Alginates ; Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Diabetes mellitus-tip 1 = Diabetes mellitus-type 1 ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Kök hücreler = Stem cells ; Langerhans adacıkları = Islets of langerhans ; Makrokapsüller = Macrocapsules

Özet:
Amaç: Diabetes Mellitus, dünya genelinde yaklaşık 347 milyon kişiyi etkileyen ve metabolik bozukluk ile karakterize bir hastalıktır. Bu hastalığının yaklaşık % 10'unu oluşturan Tip 1 Diabetes Mellitus (T1DM) ise bağışıklık sisteminin, kan şekerini düzenlemek için gerekli olan insülini üreten beta hücrelerine saldırdığı otoimmün bir hastalıktır. Hastalık normalde günlük insülin enjeksiyonlarıyla tedavi edilmektedir. Uzun yıllardır süregelen araştırmalarda alternatif tedavi şekli olarak ise insülin üreten beta hücrelerinin pankreas, adacık veya hücre şeklinde naklini yapabilmek için, çeşitli yöntemler denenmektedir. Bu yöntemlerden olan adacık nakli, kan şekeri seviyesini birkaç yıla kadar normale döndürme yeteneğini gösteren bir cerrahi işlemdir, ancak bu nakilden sonra yabancı kabul edilen adacıklar konağın immun sistemi tarafından yok edilmektedir. İmmun atakların engellemesi ve nakledilen doku, organ veya hücrelerin nakil bölgesinde fonksiyonlarını devam ettirebilmesi için doku reddinin engellenmesi gerekmektedir. Bu olumsuz durumun giderilmesi için şimdiye kadar, çeşitli hücre kapsülleme teknikleri geliştirilmiştir. Adacık makrokapsülleme, biyouyumlu bir polimerle kaplanarak bağışıklık sisteminden adacıkları korumak için tasarlanmış bir biyomedikal yeniliktir. Bu amaçla kullanılan polimerlerin biyouyumluluğu, kararlılığı ve geçirgenliği, başarılı bir klinik uygulama için ana faktörlerdendir. Aljinat hücre enkapsülasyonunun potansiyel klinik uygulaması son on yılda çok büyük ölçüde gelişmiştir. Aljinat besinlerin ve küçük proteinlerin nakil dokusu ile difüzyonunu sağlayarak atık ürünlerinde malzemeden çıkışına izin vermektedir. Bu nedenle çalışmamızda, hücre tabakası aljinat ile makrokapsüle edilip savunma sistemi hücrelerinden korunarak, hücre tabakasının daha uzun süre fonksiyonunun devamını sağlayacak en uygun hücresel tedavi yöntemi ve makrokapsül aygıtını tasarlamak amaçlanmıştır.
Yöntem: Çalışmamız in-vitro ve in-vivo olmak üzere iki adımda gerçekleştirildi. Mezenkimal kök hücreler (MKH) ve beta-hücreleri, sıcaklık-duyarlı kültür kabında ortak kültür edildi. Sonrasında hücre tabakasına aljinat ile kapsülleme işlemi yapıldı. Kapsülün mekanik dayanıklılığı ve hücreler üzerindeki etkileri analiz edildi. İn vivo deney grupları T1DM+Kapsül+Beta, T1DM+Kapsül+Beta+MKH, T1DM+Kapsül+Beta+MKH tabaka olarak belirlendi. Elde edilen graft diyabetik sıçanların dorsal subkutan bölgesine nakledilerek deney süresi boyunca kan-glukoz değerleri ve ağırlıkları takip edildi. 30. günde intraperitonal glukoz tolerans testi (IPGTT) uygulandı ve insülin, c-peptid ELISA çalışıldı. Sıçanlar sakrifiye edildi. Nakledilen graft histolojik takibe alındı ve immunohistokimyasal yöntemle analiz edildi.
Bulgular: T1DM+Kapsül+Beta+MKH tabaka grubundakan glukozu, nakil sonrası hızlıca düştü ve 190 gün boyunca da aynı seviyelerde kaldı. T1DM+Kapsül+Beta, T1DM+Kapsül+Beta+MKH gruplarında beklenen normoglisemi değerine ulaşılamadı. Ayrıca T1DM+Kapsül+Beta+MKH tabaka grubunda ELISA analizi sonucunda c-peptid ve insülin seviyesinin, diğer gruplara kıyasla önemli ölçüde yüksek olduğu belirlendi. Greftin immunflouresan analizinde beta hücreleri insülin, c-peptit, PDX-1, Pax4 antikorları ile pozitif boyandı.
Sonuç: Gelecekte T1DM hastalarına uygulanan pankreatik adacık nakillerine alternatif bir tedavi yöntemi olarak sıcaklık-duyarlı kültür kaplarında oluşturduğumuz adacık dokusuna benzeyen derialtı makrokapsül aygıtı elde edilmiştir. Hücre kapsüllemede kullanılan çeşitli biyomalzemeler olmasına rağmen; doğal polimer olan aljinat makrokapsül uygulaması, hem daha fazla hücre içererek hem bu hücreleri immun reaksiyonlardan koruyarak, hem de canlı organizma ile yüksek biyo-uyumluluk göstererek greftin uzun süreli sağ kalımını sağlamıştır. MKH tabakası ile desteklediğimiz makrokapsül grubunda daha uzun süreli normoglisemi sağlanması MKH lerin anti-apoptotik, immunsupresif ve immunmodülatör etkileri sayesinde olduğunu düşünmekteyiz. Çalışmamızın bulguları değerlendirildiğinde T1DM hastalarında uzun vadeli hücresel tedavi sağlamak amacıyla, makrokapsüllerin içerisinde beta hücreleri ile birlikte MKH lerin bulunması en iyi ve uzun etkili tedavi yöntemi olmakla birlikte bu yöntemin kullanılacağı gelecekte yapılacak insan çalışmaları için zemin hazırlamaktadır.
Anahtar Kelimeler: Tip1 Diabetes Mellitus, makrokapsül, mezenkimal kök hücre, aljinat, doku mühendisliği

Abstract:
Objective: Diabetes Mellitus is a disease that affects approximately 347 million people worldwide and is characterized by a metabolic disorder. Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM), which accounts for about 10% of this disease, is an autoimmune disease in which the immune system attacks the beta cells that produce insulin necessary to regulate blood sugar. The disease is normally treated with daily insulin injections. In researches that have been going on for many years, various methods have been tried to transplant insulin-producing beta cells in the form of pancreas, islets or cells as an alternative treatment methods. One of these methods, islet transplantation is a surgical procedure that shows the ability to normalize blood sugar levels for up to a few years, but after this transplant, islets that are considered foreign are destroyed by the host's immune system. Tissue rejection must be prevented so that immune attacks can be prevented and the transplanted tissue, organ or cells can continue their functions in the transplanted area. Various cell encapsulation techniques have so far been developed to overcome this adverse situation. Tissue rejection must be prevented so that immune attacks can be prevented and the transplanted tissue, organ or cells can continue their functions in the transplanted area. Various cell encapsulation techniques have so far been developed to overcome this adverse situation. The biocompatibility, stability and permeability of the polymers used for this purpose are among the main factors for a successful clinical application. The potential clinical application of alginate cell encapsulation has improved enormously over the past decade. Alginate allows for the diffusion of nutrients and small proteins through the transport tissue, allowing waste products to exit the material. Therefore, in our study, it is aimed to design the most appropriate cellular treatment method and macrocapsule device that will ensure the continuation of the cell sheet function for a longer time by protecting the cell layer from the cells of the defense system by macroencapsulation with alginate.
Method: Our study was carried out in two steps, in-vitro and in-vivo. Mesenchymal stem cells (MSCs) and beta-cells were co-cultured in a temperature-responsive culture dish. Afterwards, the cell sheet was encapsulated with alginate. The mechanical strength of the capsule and its effects on cells were analyzed. In vivo experimental groups were determined as T1DM + Capsule + Beta, T1DM + Capsule + Beta + MSC, T1DM + Capsule + Beta + MSC sheet. The obtained graft was transferred to the dorsal subcutaneous area of diabetic rats and blood-glucose values and weights were monitored during the experiment period. On the 30th day, intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was performed and insulin and c-peptide ELISA was studied. Rats were sacrificed. The transplanted graft was followed histologically and analyzed by immunofluorescence method.
Results: In the T1DM + Capsule + Beta + MSC sheet group, blood glucose dropped rapidly after transplantation and remained at the same levels for 190 days.  The expected normoglycemia value could not be reached in the T1DM + Capsule + Beta, T1DM + Capsule + Beta + MSC groups. In addition, in the T1DM + Capsule + Beta + MSC layer group, ELISA analysis revealed that the c-peptide and insulin levels were significantly higher than the other groups. In the immunofluorescence analysis of the graft, beta cells were stained positively with insulin, c-peptide, PDX-1, Pax4 antibodies.
Conclusions: As an alternative treatment method to pancreatic islet transplants applied to T1DM patients in the future, an islet-like subcutaneous macrocapsule device that we created in temperature-responsive culture vessels was obtained. Although there are various biomaterials used in cell encapsulation; The application of alginate macrocapsules, which is a natural polymer, provided long-term survival of the graft by containing more cells, protecting these cells from immune reactions and showing high biocompatibility with the living organism. We think that the longer-term normoglycemia in the macrocapsule group supported by the MSC sheet is due to the anti-apoptotic, immunosuppressive and immunomodulatory effects of MSCs. When the findings of our study are evaluated, the presence of MSCs together with beta cells in macrocapsules is the best and long-lasting treatment method in order to provide long-term cellular therapy in T1DM patients, and it provides a basis for future human studies where this method will be used.
Keywords: Type 1 Diabetes Mellitus, macrocapsule, mesenchymal stem cell, alginate, tissue engineering