Hepatit c virüs'ün  LAMP  yöntemi ile tespitinde çıplak gözle sonuçların değerlendirilebilmesi için yöntem geliştirilmesi
Evaluating the accuracy of visual observation in detecting the hepatitis c virus using the loop-mediated isothermal amplification ( LAMP ) method
Yazar: KEVSER HANNE ALTIN
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE İSTANBULLU TOSUN ; DR. ESRA AĞEL
İstanbul Medipol Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji = Infectious Diseases and Clinical Microbiology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Dünya sağlık örgütün 2016'da başlattığı küresel hepatit stratejisi programına göre aşılama, eğitim, tanı ve ilaçlar ile 2030 yılında yeni hepatit vakalarında %90 azalmayı ön görmektedir. Fakat 2024 yılındaki bildiriye göre yeni enfeksiyon ve ölüm oranlarında artış gözlenmiştir. HCV enfeksiyonu asemptomatik ve ciddi organ harabiyetine sebep vermektedir. Serolojik testler ile plazmadaki HCV antikorların tespiti birkaç hafta sürmesi HCV RNA'nın erken tanıdaki önemini ortaya çıkarmaktadır.  Moleküler tabanlı testlerden döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) yöntemi ile HCV RNA'sı tespit edilebilmektedir.  Altı farklı primerin sekiz bölgeyi hedeflediği LAMP yöntemin reaksiyon ortamına saldığı pirofosfat ile görsel tanı mümkün olmaktadır. DSÖ'nun 2030 yılına kadar prematüre ölümlerinin azalımı için düşük ve orta gelirli ülkeleri hedeflemektedir. HCV taramaları sağlanması için sahaya uygun maliyetsiz moleküler yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu nedenle sabit sıcaklıkta, pahalı cihaz gerektirmeyen, uzman kişi ihtiyacı duyulmayan, kullanımı ve sonuç yorumlaması kolay LAMP yöntemi sahaya uygunluğu ile ön plana çıkmaktadır. Çalışmada çıplak göz ile HCV RNA tespiti için çeşitli boyaların ve altın nanopartikülün LAMP yöntemi ile entegrasyonu sonunda kolorimetrik analiz sağlamaktır. Ayrıca enterkalasyon boyalı LAMP yöntemin sahada kantitatif sonucu ile hastalık süreci hakkında bilgi sağlanması hedeflendi. Geliştirilen kolorimetrik ve erime sıcaklık eğrili LAMP yöntemlerinin tespit limit analiz sonuçları 10 kop/µL gözlemlendi. Toplam 58 hasta plazma ile sağlanan analiz sonuçlarına göre geliştirilen RT-HLAMP yöntemler %90 hassaslık ve %100 özgüllük göstermiştir. Hasta plazmalarından elde edilen sonuçların Kantitatif PCR sonuçları ile kappa analiz sonucuna göre iki yöntemin anlamlı uyumlu olduğu gözlemlendi.  Geliştirilen RT-HLAMP yöntemlerin yüksek hassaslığı, pozitif ve negatif örnek renk farkının belirliginliği ile tanının kolaylığı sahaya uygunluğunu göstermiştir.

Abstract:
The World Health Organization's (WHO) global hepatitis strategy program, initiated in 2016, aims to achieve a 90% reduction in new hepatitis cases by 2030 through the implementation of vaccinations, education, and medications.
Nevertheless, as stated in 2024, there was a noticeable rise in both the incidence of new infections and the number of mortality. HCV infection is asymptomatic and can lead to severe organ damage. Finding the presence of HCV antibodies in plasma requires a few weeks, highlighting the significance of HCV RNA in the early detection of the virus. WHO aims to decrease premature mortality in countries with low or middle incomes by 2030. These countries demand methods that are suitable for use in the field. Due to its constant temperature, the LAMP method is cost-effective, user-friendly, and easily interpretable, making it highly suitable for field applications. This study reveals the efficacy of various dyes and gold nanoparticles with the LAMP method to visually identify HCV RNA. Furthermore, we aimed to gain information regarding the disease from the quantitative results of the intercalation dye LAMP method. The detection limit study of the colorimetric and melting temperature curve LAMP methods is 10 kop/µL. After evaluating a total of 58 patient plasma samples, we found a sensitivity of 90% and a specificity of 100%. Kappa analysis displayed that results obtained from patient plasma were found to be very consistent with the quantitative PCR results. Colorimetric LAMP methods have shown great sensitivity and rapid diagnosis, rendering them suitable for application in the field.