Hyaluronik asit sentaz geninin Lactococcus lactis'te ekspresyonu
Hyaluronic acid synthase gene expression in Lactococcus lactis
Yazar: CANSU SUNGUROĞLU
Danışman: YRD. DOÇ. DR. PINAR AYTAR ÇELİK
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji ve Biyogüvenlik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Hyaluronik asit, tıbbi ve endüstriyel alanlarda yaygın olarak kullanılan ve dünya genelinde önemli bir pazar payına sahip bir biyopolimerdir. Birçok yapısal, fizyolojik ve biyolojik fonksiyona sahip olan bu biyopolimer hemen hemen tüm dokuların fonksiyonel bileşenidir. Hyaluronik asit yüksek su tutma kapasitesi, immünojenik olmaması, yüksek biyouyumluluğu sebebi ile ortopedik uygulamalarda, kozmetik, medikal ve farmasötik gibi çeşitli alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Hyaluronik asit ticari olarak hayvansal dokular ve patojenik Streptococcus cinsi bakteriler olmak üzere iki temel kaynaktan elde edilmektedir. Ancak bu kaynaklardan elde edilen hyaluronik asitin çeşitli kontaminasyon riskleri içermesi ve alerjik reaksiyonlar meydana getirmesi nedeniyle alternatif kaynakların geliştirilmesi önem kazanmıştır.

Bu çalışmada hyaluronik asit üreten alternatif rekombinant bir suş oluşturulması hedeflenmiştir. Patojenik Streptococcus equi subsp. zooepidemicus suşundan elde edilen hyaluronik asitin kontaminasyon riskinden kaçınmak için bu suşun hyaluronan sentaz enzimini kodlayan hasA geni, bir laktik asit bakterisi olan Lactococcus lactis'e aktarılmıştır ve Lactococcus lactis'in hyaluronik asit üreten rekombinant L. lactis CES15 olarak adlandırdığımız suş oluşturulmuştur. Bu kapsamda öncelikle Streptococcus equi subsp. zooepidemicus'un hasA geninin 5' ve 3' ucuna spesifik primerler kullanılarak amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Amplifiye edilen gen bölgesi nisin kontrollü promotor sistemine sahip bir plazmid vektör olan pNZ8150'ye aktarılmıştır. Rekombinant Lactococcus lactis CES15 suşu nisin ile indüklenerek hyaluronan sentaz geninin ekspresyonu kontrol edilmiştir ve hyaluronik asit üretim yeteneği araştırılmıştır. Çalışmada 7,5 ng/ml nisin ile indüklenen rekombinant Lactococcus lactis CES15'in 3 saatlik indüksiyondan sonra, 2,9746 mg/ml gibi yüksek bir miktarla hyaluronik asit ürettiği belirlenmiştir. Bu yüksek sonuca sadece tek bir genin klonlanması ile ulaşılmıştır ve 3 saat indükleme süresi literatüre kıyasla oldukça kısadır.

Abstract:
Hyaluronic acid that widely used in medical and industrial area and has a significant market share worldwide is a biopolymer. This biopolymer having many structural, physiological and biological functions is functional components of virtually all tissues. Hyaluronic acid because of high water holding capacity, lack immunogenic, the high biocompatibility characteristics, are widely used in various fieldssuch as in cosmetics, medical and pharmaceutical and orthopedic applications. Hyaluronic acid is commercially obtained from two main sources as animal tissues and pathogenic bacteria, Streptococcus genus. Alternative sources of production are also important because of hyaluronic acid which obtained from these sources including various risks of contamination and giving allergic reactions.

In this study, it was targeted the creation of an alternative strain recombinant producinghyaluronic acid. To avoid the risk of contamination of hyaluronic acid enzyme encoding gene, hyaluronan synthase obtained from strain ofpathogenic Streptococcus equi subsp. zooepidemicushas been transferred with a lactic acid bacterium Lactococcus lactis and recombinant Lactococcus lactis strain CES15 strain was formed from Lactococcus lactis producing hyaluronic acid. In this context, the hasA gene 5 'and 3' end amplification of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus was performed using specific primers. The amplified gene in a plasmid vector with a nisin-controlled promoter systems pNZ8150 has been transferred. The expression of hyaluronan synthase gene was controlled by induced recombinant strains of Lactococcus lactis nisin CES 15 and hyaluronic acid production capability was investigated. In this study, recombinant Lactococcuslactis CES15 with induced 7.5 ng/ml nisin was determined producing hyaluronic acid as 2.9746 mg/ml.