Mycoplasma gallisepticum varlığının PCR ve loop mediated isothermal amplification yöntemi ile karşılaştırılmalı olarak belirlenmesi
Comperative detection of the precense of mycoplasma gallisepticum by conventionel polimerase chain reaction and loop mediated isothermal amplification
Yazar: ELİF BULUT
Danışman: PROF. DR. MURAT YILDIRIM
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: LAMP = LAMP ; Mikoplazma galliseptikum = Mycoplasma gallisepticum ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Tavukçuluk = Chicken farming ; Tavukçuluk işletmeleri = Poultry enterprises ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu tez çalışmasının amacı, ülkemizde tavukçulukta verdiği kayıplar yönünden önemi bilinen kanatlı mikoplazmozu etkenlerinden Mycoplasma gallisepticum (MG)'un kısaca LAMP olarak bilinen tanı yönteminin PCR'a göre daha kısa zamanda, düşük maliyetle ve yüksek doğruluk oranıyla teşhis edilip edilemeyeceğini belirlemektir. Enfeksiyöz özellikte ve solunum yoluyla kısa sürede bulaşan Mycoplasma gallisepticum'un kontolü; düzenli aralıklarla denetlenmesi ile hastalığın endüstriyel işletmelerdeki ciddi maddi zararların önüne geçilmesi mümkündür. Bu enfeksiyöz hastalıkta sadece hayvanın karkas özelliklerinin olumsuz yönde etkilenmemekte, yumurta eldesinin azalması ve hastalığın bertaraf edilmesi için ciddi boyutta sağaltım harcamaları yapılması nedeniyle nedeniyle oldukça düşündürücü sonuçları beraberinde getirmektedir. Kanatlı hayvanlarda MG'nin neden olduğu enfeksiyon sadece solunum sistemini etkilemekle kalmaz, aynı zamanda bağışıklık sisteminin zayıfladığı durumlarda birçok organ veya sistemde ciddi sonuçlar doğurur. Ayrıca kümes hayvanlarında uzun süreli maruziyetten sonra kronik solunum yolu hastalığına neden olur. 
Çalışmada, Kırıkkale ve Ankara çevresindeki kanatlı işletmelerinde solunum sistemi infeksiyonu belirtileri gösteren tavuklardan alınan trakeal svablar, ölen ve nekropsisi yapılmış hayvanlardan alınan akciğer ve a örnekleri (10 işletmeden işletme başına 20'şer adet) ile çalışıldı. Her bir kümesten alınarak beşerli havuzlar (4 havuz) oluşturulan akciğer ve trakea örneklerinden yapılan DNA izolasyonu sonrasında örnekler LAMP ve PCR ile değerlendirildi. İncelenen DNA amplifikasyon sonrası yapılan jel elektroforez görüntüleri sonucunda PCR metoduyla toplam 46 tane havuz örneği (her bir havuz 5 akciğer veya trakeadan oluşmaktadır)'nden akciğer için %32,6 (15 tane akciğer havuz örneği)'i ve trakea için %34,78 (16 tane trakea havuz örneği)'i MG varlığı yönünden pozitif olarak değerlendirildi. Toplam 46 tane havuz örneğinden izole edilen DNA'ların LAMP metodu ile amplifikasyon sonucunda akciğerde %43,47 (20 adet akciğer havuz örneği) ve trakeada %60,87 (28 adet trakea havuz örneği) MG 'ye özgü DNA varlığı belirlendi. LAMP yöntemi PCR yöntemiyle kıyaslandığında, thermal cycler gibi özel ve pahalı gibi cihazlara ihtiyaç duyulmadan ve kontaminasyon riski olmadan yapılması yanı sıra kullanım kolaylığı ve yaklaşık yarım saat gibi kısa bir sürede sonuç alınabilmesi gibi avantajları ile sahada ve ekipman imkanları az olan laboratuvarlarda validasyon ve verifikasyon çalışmalarının yapılarak rutin kullanıma aday bir yöntem olarak kullanılabileceği sonucuna varıldı. LAMP yönteminin ülkemizde hastalıkların tanılandırılmasında daha da yaygınlaştırılması ve diğer etkenler için de etkinliğinin ortaya konmasının yararlı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
The aim of this study reflects on the advantages of infectious Mycoplasma gallisepticum (MG) which is one of the newly comprehended poultry mycoplasmosis agents, in terms of losses caused by epidemics in poultry in our country, in a shorter time with low cost and high accuracy rated diagnosis. Mycoplasma gallisepticum which is infectious and transmitted by respiration in a short period time, can be controlled regularly and makes serious damages on the material can be prevented in industrial poultry enterprises. With this infectious disease, not only the carcass characteristics of the animal are adversely affected, but also because of the reduction of egg production and the treatment of the disease to a great extent, it gets quite thought-provoking results. The infection caused by MG in poultry does not only affect the respiratory system but also in cases of the weakened immune system, many organs or systems have severe consequences. It also causes chronic respiratory disease after long-term exposure in poultry. 
In this study, tracheal swabs taken from chickens showing signs of respiratory system infection, lung and a samples taken from dead and necropsied animals were studied in poultry farms around Kırıkkale and Ankara (20 per farm from 10 farms). After DNA isolation from lung and trachea samples, which were taken from each house and formed pools of five (4 pools), the samples were evaluated by LAMP and PCR. After DNA isolations from lung and trachea samples which were collected from each coop, five pools were formed, then the samples were evaluated with LAMP. As a result of the gel electrophoresis images made after the DNA amplification, a total of 46 pool samples (each pool consists of 5 lungs or trachea) from a total of 46 pool samples 32.6% (15 lung pool samples) for the lung and 34.78% for the trachea (16 tracheal pool samples) were evaluated as positive for the presence of MG. As a result of amplification of DNAs isolated from a total of 46 pool samples by LAMP method, the presence of MG-specific DNA was determined in 43.47% (20 lung pool samples) and 60.87% (28 tracheal pool samples) in the trachea. Compared to the PCR method, the LAMP method is performed without the need for special and expensive devices such as a thermal cycler and without the risk of contamination, as well as its advantages such as ease of use and obtaining results in a short time of about half an hour, by performing validation and verification studies in the field and in laboratories with less equipment facilities. It was concluded that it can be used as a candidate method for routine use. It is thought that it will be useful to make the LAMP method more widespread in the diagnosis of diseases in our country and to reveal its effectiveness for other factors.