Sıçan spinal kord hasarı modelinde izoalantolakton'un nöroinflamasyon üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of antiinflammatory effects of isoalantolactone on experimental traumatic spinal cord injury model in rats
Yazar: BASEL I.S. TARAZI
Danışman: PROF. DR. MELİKE MUT AŞKUN
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroşirürji Ana Bilim Dalı / Nöroşirürji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Metilprednizolon = Methylprednisolone ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases ; Nükleer faktör-kappa B = Nuclear factor-kappa B ; Spinal kord = Spinal cord ; Spinal kord yaralanmaları = Spinal cord injuries ; Sıçanlar = Rats ; İzoalantolakton = İsoalantolactone

Özet:
Giriş ve amaç: Spinal kord hasarı (SKH) birçok vücut fonksiyonunu etkileyen kompleks ve yıkıcı bir durumdur. Spinal kord travmasından sonra, hasar oluşumunu takiben ilk 24 saatte serbest oksijen radikallerinin üretimi, mitokondri fonksiyonlarının bozulması ve hasarlı hücrelerdeki (mikroglia, astrosit, nöron) potasyum ve genetik materyalin hücre dışına çıkması ile omurilik dokusunun özelleşmiş makrofajları olan mikroglialar aktifleşir. Prostaglandin E2, cyclooxygenase 2 (COX2), nitrooksidase (İNOS) ve aktifleşen mikroglialar tarafından TNF-α, IL-1β, IL-6 gibi proinflamatuar sitokinler salgılanır. Özetle, inflamasyon sürecinde görevli moleküler yolaklar aktive olur. Günümüzde temel tedaviler, bu hastaların hastaneye başvurması, tanı konması ve tedavilerinin başlamasına kadar geçen süreçte, ikincil hasarın azaltılması üzerinedir.
İzoalantolakton (IAL), geniş biyolojik aktiviteye sahip yeni nesil bir ilaçtır. Yapılan çalışmalarda izoalantolakton'un antibakteriyel, antiinflamatuar ve antiapoptotik etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca sıçan travmatik beyin hasarı modelinde nöroprotektif etkisi gösterilmesine rağmen, travmatik spinal kord hasarında bu ilacın etki mekanizmasını açıklayan bir çalışma bulunmamaktadır.
Bu çalışmada, spinal kord travması modelinde intraperitoneal olarak sıçanlara enjekte edilen İzoalantolakton (IAL)'un travmadan 24 saat sonra  nöroinflamasyon üzerine etkilerinin incelenmesi ve sık kullanılan bir anti-inflamatuar ilaç olan metilprednizolon ile etkilerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. 24. saatin sonunda post travmatik nörolojik değerlendirme yapılıp sakrifiye edilmiştir. Daha sonra TNF-α, IL-6 gibi proinflamatuar sitokinler spinal kord dokusunda ELİSA yöntemi, IL-6, CD3, Mikroglia (Iba-1) ve Makrofaj (F4/80) antikorları, immünohistokimya yöntemi ile incelenip, kontrol gruplarıyla karşılaştırılmıştır. Ayrıca inflamatuar mediatörlerin sentezinden sorumlu olan transkripsiyon faktörü NF-κB'nin alt birimi olan NF-κB p65, immünohistokimyasal yöntem ile incelenmiştir. 
Gereç ve Yöntem: Çalışmada her grupta 8 adet (n=8) olacak şekilde toplam 32 adet erkek Wistar sıçan kullanılmıştır. Gruplar Sham grubu, travma grubu, travma ve Metilprednizolon uygulanan grup, travma ve İzoalantolakton uygulanan grup olmak üzere 4 gruba ayrılmıştır. Sıçanlara ketamin / xylazine anestezisi altında 10 cm yükseklikten 15 gr serbest ağırlık düşürülerek spinal travma modeli oluşturulmuştur. Travmadan yarım saat sonra bir gruba tek doz intraperitoneal 20 mg/kg İzoalantolakton , kontrol gruplarına ise intraperitoneal yolla serum fizyolojik veya 60 mg/kg Metilprednizolon intraperitoneal uygulanmıştır. Tüm grupların sakrifiye edilmesinden önce davranış deneyleri yapılmış, 24. saatin sonunda sıçanlar sakrifiye edilerek gruplar arasında spinal dokularındaki histopatolojık ve immunhistokimyasal bulgular karşılaştırılmıştır.

Bulgular: Izoalantolakton (IAL), travmatik spinal kord hasarında inflamasyonu ceşitli yollarla azaltmaktadır, bunlardan birisi NF-κB yolağıdır. IAL kullanarak spinal kord hasarında nörolojik olarak anlamlı bir iyileşme ve düzelme sağlandığı (p<0,0001) saptanmıştır. IAL verilen grupta diğer gruplara göre NF-κB işaretli total hücre sayısı azalmıştır (p<0,0001). IAL, NF-κB yolağı üzerinden gelişen nöro-inflamasyonu inhibe edici etkisi gösterilmiştir. IAL verilen grupta doku TNF-α ve IL-6 düzeyleri travma, ve Sham gruplarına göre azalmıştır (p<0,002), Ancak bu bulgu MPZ alan travma grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı çıkmamıştır (p=0,068). Bu durumun örneklem sayısının yetersizliğinden kaynaklandığı düşünülmüştür. IAL verilen grupta IL-6 ve TNF-α salınımı anlamlı olarak azalmıştır (p=0,002). Iba-1 ve F4/80 ile mikroglial ve makrofaj hücreler değerlendirildiğinde, IAL etkisi altında mikroglia aktivasyonu ve makrofaj göçünün anlamlı olarak azaldığı görülmektedir (p=0,0025), (p=0,0363). IAL'nin travma sonrası gelişen mikroglia aktivasyonunu baskılamak yoluyla nöro-inflamasyonu azaltan etkileri gösterilmiştir (p<0,0001), CD3 + T lenfositler IAL ile anlamlı olarak azalmıştır (p=0,0084). IAL histopatolojık olarak travma sonrası ödemi belirgin olarak azaltmıştır. Ayrıca nörodejeneratif görünümdeki hücre sayısında travma grubuyla karşılaştırıldığında bir düşüşe sebep olduğu da anlaşılmıştır.

Sonuç: Sonuç olarak IAL orta şiddette spinal travmaya bağlı nöro-inflamasyonda, makrofaj, mikroglia aktivasyonu ve NF-κB yolağını inhibe ederek nörolojik fonksiyonlarda düzelmeye katkı sağlamıştır.


Anahtar Kelimeler: Spinal kord hasarı, Metilprednizolon, İzoalantolakton, NF-κB, nöroinflamasyon

Abstract:
Introduction & Objectives: Spinal cord injury (SCI) is a complex and destructive condition that affects many body functions. After the spinal cord trauma, the production of free oxygen radicals in the first 24 hours following the occurrence of damage, disruption of mitochondrial function, and the release of potassium and genetic material from damaged cells (microglia, astrocytes, neurons). Activation of microglial cells in the damaged spinal cord tissue in which trigger the releasing of Pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, IL-6, also secreted prostaglandin E2, cyclooxygenase 2 (COX2), Nitro-oxidase (INOS) and activated microglial cells increase the inflammatory cascade.  In summary, the pathways of the molecules involved in the inflammation process are activated. Nowadays, the main treatments are about reducing the secondary damage in the process of admission, diagnosis and treatment of these patients.
        Isoalantolactone (IAL), is a new generation drug with broad biological activity. Studies have shown that isoalantolactone has antibacterial, anti-inflammatory and antiapoptotic effect. In addition, although neuroprotective effect has been demonstrated in rat traumatic brain injury model, there is no study explaining the mechanism of action of this drug in traumatic spinal cord injury. The aim of this study was to investigate the effects of isoalantolactone (IAL) injected intraperitoneally into rats in the spinal cord trauma model on neuroinflammation 24 hours after the trauma and to compare its effects with the commonly used anti-inflammatory drug methylprednisolone. At the end of the 24th hour, post-traumatic neurological evaluation was performed and sacrificed. Then, proinflammatory cytokines such as TNF-α, IL-6 were examined by ELISA method, IL-6, CD3, Micorglia (Iba-1) and Macrophage (F4 / 80) antibodies in spinal cord tissue and compared with control groups. In addition, the subunit of the transcription factor NF-κB, which is responsible for the synthesis of inflammatory mediators, was examined by NF-κB-p65 immunohistochemistry method. This allowed us to evaluate the course of inflammation.

Material & Methods: A total of 32 male Wistar rats (n = 8) were used in the study. The groups were divided into four groups as sham group, trauma group, trauma and methylprednisolone group, trauma and isoalantolactone (IAL) group. Spinal trauma model was created by dropping 15 gr free weight from 10 cm height under ketamine / xylazine anesthesia to rats. Half an hour after trauma, a single dose of 20 mg / kg isoalantolactone was administered intraperitoneally, and control groups received intraperitoneal saline or 60 mg / kg methylprednisolone intraperitoneally. Behavioral experiments were performed in all groups before sacrification. At the end of 24th hour, rats were sacrificed and histopathological and immunhistochemical findings of spinal tissues were compared between groups

Findings: Isoalantolactone (IAL) reduces inflammation in various ways in traumatic spinal cord injury, one of which is the NF-κB pathway. Using IAL, neurologically significant improvement was achieved in spinal cord injury (p<0.0001). In the IAL group, the total number of NF-κB-labeled cells decreased compared to the other groups (p<0.0001). According to these findings, the neuroinflammatory pathway developed over the NF-κB pathway in the rat spinal cord trauma model was shown. IAL has been shown to inhibit neuroinflammation through the NF-κB pathway. Tissue TNF-α, IL-6 levels were decreased in the IAL group (p<0.002), but not statistically significant (p=0.068). IL-6 and TNF-α secretion were significantly decreased in the IAL group (p=0.002). When microglial and macrophage cells were evaluated with Iba-1 and F4/80, it was seen that microglial and macrophage migration with IAL was significantly less (p=0.0025), (p=0.0363). IAL has been shown to reduce neuroinflammation by suppressing microglia activation after trauma. (p<0.0001), CD3 + T lymphocytes were significantly reduced by IAL (p=0.0084). IAL significantly reduced post-traumatic edema histopathologically. It also reduced the number of neurodegenerative cells compared to the trauma group.

Conclusion: In conclusion, Isoalantolactone (IAL) contributed to improvement of neurological functions in moderate spinal cord injury by inhibiting macrophage, microglial activation and NF-κB pathway of the neuroinflammation process.


Keywords: Traumatic Spinal Cord injury, methylprednisolone, İsoalantolactone, neuroinflammation, NF-κB .