Avrupa kestanesinde (Castanea sativa mill.) olgunlaşmamış kotiledonlardan somatik embriyogenesis ve bitki rejenerasyonu
Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature cotyledons of european chestnut (Castanea sativa mill.)
Yazar: MEHMET SEZGİN
Danışman: PROF. DR. HATİCE DUMANOĞLU
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Bitki rejenerasyonu = Plant regeneration ; Castanea sativa = Castanea sativa ; Kestane = Chestnut ; Somatik embriyogenez = Somatic embryogenesis

Özet:
Bu araştırma, Avrupa kestanesinde (Castanea sativa Mill.) Osmanoğlu ve Sarıaşlama çeşitlerinde serbest tozlanma sonucu oluşmuş olgunlaşmamış tohumların kotiledonlarında somatik embriyogenesisi uyarmak ve somatik embriyolardan bitki rejenerasyonunu sağlamak amacıyla yapılmıştır. Kotiledon eksplantlarında somatik embriyogenesisi uyarmak amacıyla başlangıç kültürlerinde temel besin ortamları MS (Murashige ve Skoog), DKW (Driver ve Kuniyuki Walnut) ve WPM (Woody Plant Medium), organik maddeler (L-glutamin (250 mg/l) veya kazein hidrolizat (1000 mg/l)), AgNO3 (gümüş nitrat) (0 ve 1.7 mg/l), katılaştırıcılar (agar (6 g/l) ya da gelrite (2.1 g/l)) ve 7 farklı büyüme düzenleyici madde kombinasyonu (1) 1 mg/l BA + 2 mg/l KIN + 0.01 mg/l IBA, (2) 1 mg/l BA + 0.1 mg/l TDZ + 0.01 mg/l IBA, (3) 2 mg/l KIN + 0.1 mg/l TDZ + 0.01 mg/l IBA, (4) 1 mg/l BA + 2 mg/l KIN + 0.02 mg/l 2,4-D, (5) 1 mg/l BA + 0.1 mg/l TDZ + 0.02 mg/l 2,4-D, (6) 2 mg/l KIN + 0.1 mg/l TDZ + 0.02 mg/l 2,4-D ve (7) 1 mg/l BA + 1 mg/l NAA denenmiştir. Başlangıç ortamlarında 4 hafta tutulan kotiledon eksplantlar somatik embriyo oluşumu için organik madde, AgNO3 ve büyümeyi düzenleyici madde içermeyen agar ile katılaştırılmış temel besin ortamlarına transfer edilmiştir. Başlangıç ortamlarının, somatik embriyogenesis oranı ve ortalama embriyo sayısı (adet/kotiledon eksplant) üzerine etkileri aylık periyotlarla alt kültüre alınan kotiledon eksplantlarında 4. ayın sonunda belirlenmiştir.Uygulamalar arasında interaksiyonların ortaya çıktığı Osmanoğlu çeşidinde en yüksek somatik embriyogenesis değerleri (%4.7-9.7) (1), (2) ve (3) no'lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonlarında, L-glutamin ya da kazein hidrolizat ilave edilmiş AgNO3 içeren ya da içermeyen agar ya da gelrite ile katılaştırılmış temel besin ortamlarından elde edilmiştir. Bu oran, Sarıaşlama çeşidinde DKW temel besin ortamına ilave edilen (1) ve (2) no'lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonlarında sırasıyla %12.0 ve %11.2 olarak belirlenmiştir. Uygulamalara göre ortalama somatik embriyo sayısı Osmanoğlu çeşidinde 0-0.65 adet/eksplant ve Sarıaşlama çeşidinde 0-0.49 adet/eksplant arasında değişmiştir. Genel olarak her iki çeşitte de WPM temel besin ortamında somatik embriyo oluşumuna rastlanmamıştır.Somatik embriyolardan kök, sürgün ve kök+sürgün rejenerasyonu çalışmalarında kurutma (doymuş MgCl2.6H2O bulunan desikatörde 4 gün süreyle), soğuklatma (4°C'de 8 hafta), GA3 (0, 1, 3, 5, 7, 9 mg/l), BA (0.1 mg/l) ve BA+oksin (0.1 mg/l IBA ya da NAA) uygulamaları yapılmıştır. Kurutma, kurutmaya ilave olarak soğuklatma ya da GA3 (3 mg/l) uygulamalarından sonra BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) içeren makro element düzeyi ½ olan MS çimlendirme ortamına alınan somatik embriyolarda %27.5 rejenerasyon sağlanmıştır.

Abstract:
This study was carried out for induction of somatic embryogenesis and plant regeneration from immature cotyledons of open-pollinated seeds in European chestnut (Castanea sativa Mill.) cultivars `Osmanoğlu? and `Sarıaşlama?. To induce somatic embryogenesis from cotyledon explants, basal mediums of MS (Murashige and Skoog), DKW (Driver and Kuniyuki Walnut) and WPM (Woody Plant Medium) supplemented with organic matter (L-glutamine (250 mg/l) or casein hydrolysate (1000 mg/l)), AgNO3 (silver nitrate) (0 or 1.7 mg/l), gelling agent (agar (6 g/l) or gelrite (2.1 g/l)) and plant growth regulator combinations (1) 1 mg/l BA + 2 mg/l KIN + 0.01 mg/l IBA, (2) 1 mg/l BA + 0.1 mg/l TDZ + 0.01 mg/l IBA, (3) 2 mg/l KIN + 0.1 mg/l TDZ + 0.01 mg/l IBA, (4) 1 mg/l BA + 2 mg/l KIN + 0.02 mg/l 2,4-D, (5) 1 mg/l BA + 0.1 mg/l TDZ + 0.02 mg/l 2,4-D, (6) 2 mg/l KIN + 0.1 mg/l TDZ + 0.02 mg/l 2,4-D, (7) 1 mg/l BA + 1 mg/l NAA were tested in initial cultures. Cotyledon explants were cultured for four weeks in the initial medium. Then, they were transferred to a basal media solidified with agar without plant growth regulators, organic matters and silver nitrate to induce embryogenesis. The effects of initial cultures on the percentage of somatic embryogenesis and average number of embryos per cotyledon explants subcultured monthly were determined at the end of four months.There were interactions among the treatments for `Osmanoğlu? cultivar. The highest percentages of somatic embryogenesis (4.7-9.7%) were obtained in basal mediums solidified with gelrite or agar, and supplemented with (1), (2) and (3) plant growth regulator combinations plus L-glutamine or casein hydrolysate, and with or without silver nitrate. The highest percentages (12.0% and 11.2%) of somatic embryogenesis for `Sarıaşlama? were obtained in DKW basal medium supplemented with plant growth regulator combinations of (1) and (2), respectively. The average number of somatic embryo changed between 0 and 0.65 per explant in `Osmanoğlu? and between 0 and 0.49 per explant in `Sarıaşlama?. In general, somatic embryo formation was not observed in WPM basal medium for both of the cultivars.In regeneration experiments of root, shoot and root+shoot from somatic embryos dessication (on saturated MgCl2.6H2O in a dessicator for 4 days), cold (at 4°C for 8 weeks), GA3 (0, 1, 3, 5, 7, 9 mg/l) and BA alone (0.1 mg/l) or in combination with auxins (0.1 mg/l IBA or NAA) treatments were applied. Somatic embryos which were transferred to MS basal medium with half strength macro elements containing 0.1 mg/1 BA + 0.1 mg/l NAA after treatments of dessication or desiccation plus cold or GA3 (3 mg/l) resulted in 27.5% regeneration.