Protoiurus kraepelini (Scorpiones: Iurıdae) zehrinin peptidomik karakterizasyonu ve biyoaktivite taraması
Peptidomic characterization and bioactivity screening of protoiurus kraepelini (Scorpiones: Iuridae) venom
Yazar: TUĞBA DOĞAN
Danışman: PROF. DR. AFİFE İZBIRAK ; DOÇ. DR. CAN ÖZEN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Hayvan zehirleri biyolojik olarak aktif ve inaktif maddelerin bir karışımıdır. Zehirler; proteinler, peptitler, poliamin nörotoksinler, enzimler, nükleik asitler, serbest amino asitler, monoaminler, serbest asitler ve inorganik tuzlar gibi çok çeşitli ve neredeyse sınırsız biyolojik fonksiyona sahip biyoaktif moleküllerden oluşmaktadır. Ancak esas biyolojik aktiviteye protein ve peptit bileşenleri sahiptir. Zehirlerin yapısında bulunan peptitler farmasötik öneme sahiptir. Bu peptitler milyonlarca yıllık evrimsel süreçte doğal seçilim yoluyla oluşmuş peptit kütüphaneleri olarak tanımlanabilir ve yeni ilaçların geliştirilmesi açısından büyük bir kaynak durumundadırlar.
Bu çalışmanın amacı, Türkiye'de tanımlanmış ülkemize endemik bir akrep türü olan Protoiurus kraepelini zehrinin peptit içeriğinin 
karakterize edilmesi ve biyoaktivitesinin taranmasıdır. Bu amaçla biyokimyasal ve peptidomik yaklaşımlar takip edilmiş aynı zamanda da biyoaktivite taranması için hücresel sistemler kullanılmıştır. Ham zehrin kuru ağırlığa göre protein miktarı %70 olarak bulunmuştur. Elektroforetik tekniklerle zehir yapısında bulunan protein ve peptitlerin molekül ağırlıklarının dağılımı saptanmıştır. Ham zehir için yapılan Glisin SDS-PAGE jelinde yaklaşık 240 kDa'a kadar protein bandları gözlenmektedir. Ham zehir jelinde bulunan 10 kDa civarındaki yoğun bantlar peptit fraksiyonu için yapılan Trisin SDS-PAGE jelinde de doğrulanmıştır. Düşük molekül ağırlıklı peptit ve proteinlerin daha yüksek ayrımını mümkün kılan Trisin SDS-PAGE jelinde ise yaklaşık 2-10 kDa aralığında protein ve peptit bantları gözlenmiştir. Kromatografik yöntemlerle zehir saflaştırılmış ve peptit fraksiyonlarına ayrılmıştır. Peptit fraksiyonu, kütle spektrometre teknolojisi kullanılarak analiz edilmiş ve yapısında bulunan peptitlerin genel kütle profili çıkarılmıştır. Buna göre, P.kraepelini zehrinin peptit fraksiyonunda 1000 ile 5000 Da arasında peptit kütleleri gözlenmiştir. Ayrıca, hem ham zehir hem de fraksiyonlar ile antimikrobiyal, sitotoksisite ve potasyum iyon kanal testleri gerçekleştirilerek, zehir bileşimi biyoaktivite açısından taranmıştır. Ham zehir (1mg/mL) Escherichia coli ve Staphylococcus aureus üzerinde antimikrobiyal etki göstermiştir; peptit fraksiyonlarından ters faz kromatografideki 6 numaralı fraksiyonun (RPF6) 80 µg/mL konsantrasyonda E.coli bakterilerinde büyümeyi inhibe etmeye başladığı ve 300 µg/mL konsantrasyonda ise tamamen öldürdüğü, yani güçlü bir antimikrobiyal etkiye sahip olduğu saptanmıştır. Ham zehirden elde edilen sonuçlara göre Jurkat hücreleri üzerinde herhangi bir sitotoksik etki gözlenmezken, peptit fraksiyonu ile (0,25 mg/mL-1mg/mL) doza bağımlı sitotoksik bir etki görülmüştür. Ham zehir (1 mg/mL) ve peptit fraksiyonları (40-80 µg/mL) için K+ iyon kanalı üzerinde herhangi bir bloke edici aktivite gözlemlenememiştir. Zehrin peptit bileşiminin saptanması, zehrin yapısının tanımlanması ve muhtemel biyoaktif bileşenlerin ortaya konması yeni bir peptit ilaç keşfi yönünde önemli bir adım olacaktır. Bu çalışmada ortaya koyulan aktivitelerin hangi peptit ya da peptitlerden kaynaklandığı ileri araştırmalar ile belirlenebilir. 

Anahtar Kelimeler: Protoiurus kraepelini, peptidomiks, peptit, toksin, akrep zehri, sitotoksisite, antimikrobiyal etki, K+ iyon kanalları, zehirli hayvanlar

Abstract:
Animal venoms are mixture of biologically active or inactive substances. They comprise variety of bioactive molecules such as proteins, peptides , polyamines neurotoxins, enzymes , nucleic acids, free amino acids, monoamines, free acids and inorganic salts with unlimited biological functions. However, the main components are proteins and peptides having biological activity. Venom peptides possess pharmacological importance. These peptides are defined as peptide libraries consisting of millions of years by natural selection in the evolutionary process and are a major source in case of development of new drugs .
The aim of this study is to characterize venom of Protoiurus kraepelini, a species of scorpions endemic to our country in Turkey, focusing on the content of the venom peptide and check for bioactivity. Peptidomic biochemical approaches have been followed for this purpose and also for detecting bioactivity cellular systems were used. The amount of protein based on dry weight of the crude venom was found to be 70%. The distribution of molecular weights of proteins and peptides found in the venom content was determined by electrophoretic techniques. For crude venom, on Glycine SDS-PAGE gel, up to about 240 kDa protein bands were observed. In the crude venom gel, intense bands near 10 kDa peptide is confirmed by Tricine SDS-PAGE gel for the peptide fraction. Tricine SDS- PAGE enables a higher separation of low molecular weight peptides and proteins. Using this gel, about 2-10 kDa protein and peptide bands were observed. Venom purified with chromatographic methods and is divided into peptide fractions. The peptide fraction was analyzed using mass spectrometry and mass profile of peptides present in this fraction was detected. Molecular weights of the peptides present in the peptide fraction were found to be about 1000 and 5000 Da. Additionally, both crude venom and peptide fractions were screened for bioactivity with antimicrobial, cytotoxicity and potassium ion channel assays. Crude venom (1 mg/mL) showed antimicrobial effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureus; the peptide fraction 6 from reverse phase chromatography (RPF6)  (80 µg/mL) showed growth inhibition effect on E.coli,  at 300 µg/mL concentration completely inhibited the growth of E.coli. According to the results obtained from the crude venom, no cytotoxic effect on Jurkat cells was observed. However, with the peptide fraction (0,25 mg/mL to 1 mg/mL) a dose-dependent cytotoxic effect was observed on Jurkat cells. No observable K ion channel blocking activity was detected for crude venom (1 mg/mL) and venom fractions (40-80 µg/mL). Determination of the venom peptide composition and to demonstrate the potential of bioactive components will be a major step towards the discovery of new peptide drugs. Further research should be conducted to understand which  peptides  individually responsible for the observed activities. 

Keywords: Protoiurus kraepelini, peptidomics, peptide, toxin, scorpion venom, cytotoxicity,  antimicrobial action, K+ ion channels, venomous animals