Helichrysum plicatum SUBSP. pseudoplicatum bitki ekstresindeki klorojenik asitin HPLC yöntemi ile analizi ve bitki ekstresinin yara iyileştirme üzerine etkisinin incelenmesi
Analysis of chlorogenic acid in helichrysum plicatum SUBSP.  pseudoplicatum plant extract BY HPLC method and investigation of the effect of plant extract on wound healing
Yazar: ABDULBAKİ AKPINAR
Danışman: DOÇ. DR. FATMA DEMİRKAYA MİLOĞLU ; DOÇ. DR. GÜLŞAH GÜNDOĞDU
Atatürk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Bitki özütü = Plant extract ; Helichrysum plicatum = Helichrysum plicatum ; Klorojenik asit = Chlorogenic acid ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Yara iyileşmesi = Wound healing

Özet:
Amaç: Helichrysum türleri (Altınotu) geleneksel tıpta kullanılan ve fenolik bileşikler açısından zengin olup özellikle çiçeklerinde ana bileşen klorojenik asittir. Erzurum yöresinde kaydedilen Helichrysum türü H.plicatum subsp. pseudoplicatum'dur. Bu çalışmada, H. plicatum subsp. pseudoplicatum bitkisinin çiçeklerinin metanol ekstresinde HPLC yöntemi ile klorojenik asidin belirlenmesi ve bitki ile klorojenik asidin insan dermal hücre hattında in-vitro olarak hücre canlılığı üzerindeki proliferatif, oksitadit stres ve yara iyileşmesi etkilerinin araştırılması amaçlanmaktadır.
Materyal ve Metot:  Erzurum Köşk Köyü merasında 1950 m rakımda H. plicatum subsp.  pseudoplicatum bitkisi toplandı ve kurutuldu ve bitkinin çiçekleri toz haline getirilerek metanol ile ekstrakte edildi. Elde edilen bitki ekstresinde klorojenik asidin miktar tayini için, HPLC yönteminde deney koşulları merkezi kompozit tasarım yöntemi ile optimize edildi. Kromatografik ayırım, C18 (250x4.6 mm.5µm) kolonunda asetonitril ve % 0.2 ortofosforik asit içeren su (95:5 h/h) hareketli fazı kullanılarak 330 nm dalga boyunda gerçekleştirildi. Bitki ekstresinin ve klorojenik asitin hücre canlılığı üzerine proliferatif etkileri XTT testi, oksidatif stres etkinlikleri TAS-TOS ticari kiti ve yara iyileşmesi etkileri ise hücrelerin 0, 12, 18. ve 24. saatlerde mikroskobik görüntüleri alınarak Scratch deneyi ile insan dermal hücreleri üzerinde değerlendirildi.
Bulgular: Klorojenik asidin belirlenmesinde HPLC yönteminin 0.1-100 µg/mL derişim aralığında doğrusal; gün içi ve günlerarası yapılan deneyler sonucu  % 3.32 %BSS değerleri ile kesin ve  ±4.05 BH değerleri ile doğru olduğu belirlendi. Geliştirilen yöntem ile H. plicatum subsp.  pseudoplicatum bitkisinin çiçeklerinin metanol ekstraktında klorojenik asit miktarı 97.70±2.818 (µg/g ekstrakt) olarak tespit edildi. XTT test sonuçlarına göre, sırasıyla 75-250 μM ve 0.5-10 μM doz aralıklarında klorojenik asitin ve H. plicatum subsp. pseudoplicatum bitki ekstresinin önemli proliferatif etkiye sahip oldukları tespit edildi. TAS-TOS sonuçlarına göre, sırasıyla 100-250 µM ve 1-10 µg/mL doz aralıklarında klorojenik asitin ve bitki ekstresinin önemli oranda TAS düzeyini arttırdığı gözlendi. Sırasıyla 75-125 µM ve 1-5 µg/mL derişim aralığında klorojenik asit ve bitki ekstresinin 12. saatte hücre göçünü arttırmaya başlayıp 24. saatte belirgin şekilde yara bölgesini kapattığı belirlendi. Belirtilen doz aralığında hem hücre canlılığında ve antioksidan etkide hemde yara iyileşmesinde en güçlü etkiye sahip olduğu tespit edildi.
Sonuç: Klorojenik asidin H. plicatum subsp. pseudoplicatum bitkisinin çiçeklerinde bulunan önemli bir doğal ürün olduğu ve bitki ekstresinin  klorojenik aside göre daha düşük dozlarda ve daha dar terapotik aralığında hücre göçünü artırarak yara iyileşmesini hızlandırdığı sonucuna varıldı.

Anahtar Kelimeler: H. plicatum subsp. pseudoplicatum, HPLC, Klorojenik asit, Yara iyileştirilmesi

Abstract:
Aim: Helichrysum species (Altınotu) are rich in phenolic compounds used in traditional medicine, and the main component in their flowers is chlorogenic acid. The Helichrysum species recorded in the Erzurum region is H. plicatum subsp. pseudoplicatum. In this study, it is aimed to determine chlorogenic acid in methanol extract of flowers of H. plicatum subsp. pseudoplicatum plant by HPLC method and to investigate the proliferative, oxidative stress and wound healing effects of chlorogenic acid on human dermal cell line in vitro on cell viability.
Material and method: The H. plicatum subsp. pseudoplicatum plant was collected and dried in the meadow of Erzurum Köşk Köyü at an altitude of 1950 m, and the flowers of the plant were pulverized and extracted with methanol. For the determination of chlorogenic acid in the obtained plant extract, the experimental conditions in the HPLC method were optimized by the central composite design method. Chromatographic separation was performed at 330 nm wavelength using a mobile phase of acetonitrile and water (95: 5 v / v) containing 0.2% orthophosphoric acid coupled with C18 (250x4.6 mm.5µm) column. The proliferative effects of plant extract and chlorogenic acid were evaluated by XTT test, oxidative stress activities TAS-TOS commercial kit and wound healing effects on human dermal cells with the Scratch experiment by taking microscopic images of the cells at 0, 12, 18 and 24 hours.
Results: The HPLC method for determining chlorogenic acid exhibit linearity in the concentration range 0.1-100 µg / mL; As a result of the experiments conducted during the day and between days, proposed method was accurate with 3.32% RSD values and ± 4.05RE values. According to the developed method, chlorogenic acid amount was determined as 97.70 ± 2.818 (µg / g extract) in the methanol extract of the flowers of H. plicatum subsp. pseudoplicatum plant. According to the XTT test results, chlorogenic acid and H. plicatum subsp. pseudoplicatum plant extract has prolipherative effect at 75-250 μM ve 0.5-10 μM concentrations, respectively. According to TAS-TOS results, it was observed that TAS levels significantly increased in chlorogenic acid at the dose ranges of 100-250 µM and in plant extract at the dose ranges 1-10 µg/mL. 75-125 µM chlorogenic acid and 1-5 µg/mL plant extract started to increase cell migration at the 12th hour and significantly closed the wound area at the 24th hour. it has the strongest effect on both cell viability, antioxidant effect and wound healing was found to be in this dose range.
Conclusion: It was concluded that chlorogenic acid is an important natural product found in the flowers of H. plicatum subsp. pseudoplicatum plant, and the plant extract accelerates wound healing by increasing cell migration in lower doses and constricted therapeutic range compare to chlorogenic acid.

Keywords: H. plicatum subsp. pseudoplicatum, HPLC, chlorogenic acid, wound healing