Polietilen tereftalat (PET) türü plastiği parçalayan petaz enziminin escherichia coli'de biyoteknolojik olarak üretimi
Biotechnologically production of polyethylene terephthalate (PET) type plastic degrading enzyme petase in escherichia coli
Yazar: BEGÜM ESRA AYTAN
Danışman: PROF. DR. ŞULE ARI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Polietilen tereftalat (PET), dünya üzerinde en çok kullanılan ve dolayısıyla en çok çevre kirliliğine sebep olan plastik türlerinden biridir. PET'in, geri dönüştürülmesi için kullanılan ve birçok dezavantaja sahip fiziksel ve kimyasal yöntemler ile karşılaştırıldığında biyolojik geri dönüşüm, plastik materyalin bozunurluğunu artırmayan, toksik etkisi bulunmayan, düşük maliyetli ve etkin bir çözüm olarak öne çıkmaktadır. Ideonella sakaiensis bakterisi; salgıladığı Polietilen tereftalat hidrolaz (PETaz) ve Monoetilen tereftalat hidrolaz (MHETaz) enzimleriyle PET'i karbon kaynağı olarak kullanmak üzere monomerlerine parçalar. Günümüzde fiziksel ve kimyasal yöntemlerle geri dönüştürülen PET türü plastiğin biyoteknolojik yöntemler aracılığıyla geri dönüştürülmesi konusu özellikle son 10 yıldır yoğun bir biçimde çalışılmakta olup, diğer PET parçalayıcı enzimlere oranla sahip olduğu yüksek aktivite ve substrat özgüllüğü gibi avantajları nedeniyle PETaz enzimi bu alanda güçlü bir alternatif oluşturmaktadır. 
Bu tez çalışmasında I. sakaiensis bakterisi tarafından üretilen PETaz enziminin, verimli ve etkin şekilde üretimi amacına yönelik olarak PETaz geninin biyoinformatik tasarımı ve E. coli'de biyoteknolojik olarak üretimi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda; biyoinformatik yolla (1) PETaz geninde kodon optimizasyonun yapılması, (2) ekspresyon vektörü pET26b'ye klonabilmesi için gene, restriksiyon enzim kesim bölgelerinin eklenmesi, (3) üretilecek rekombinant proteini periplazmik alana yönlendiren, plazmite ait pelB sinyal dizisinin restriksiyon enzimlerinin sınırları içinde tutulması, (4) enzim üretimi sonrası saflaştırma yapılabilmesi için gene Histidin etiketinin eklenmesi ve  biyoinformatik yolla tasarlanmış sentetik sentetik genin rekombinant DNA teknolojisi ile ekspresyon vektöründe klonlanması, ardından da PETaz enziminin hücre sitoplazmasında yüksek aktivitede üretilmesi amacıyla, ürettiği DsbC proteini sayesinde disülfit bağlarını sitoplazma içerisinde yapma yeteneğindeki E.coli SHuffle bakterisine aktarılması hedeflenmiştir. 
Belirlenen hedefler doğrultusunda bu tez çalışmasında I. sakaiensis'e ait orijinal PETaz geninin, aktif ve verimli olarak üretilebilmesi amacıyla, biyoinformatik olarak yeniden tasarımı gerçekleştirildi. Bu kapsamda; kodon optimizasyonu ile, tasarlanan sentetik PETaz geninde GC içeriği %68,73'ten %56.78'e düşürülürken, Kodon Adaptasyon Endeksi (CAI) 0.64'ten 0.80'e çıkarıldı. Genin 5' ucuna NdeI, 3' ucuna HindIII restriksiyon enzimlerinin tanıma bölgeleri ile gen anlatımı sonrası üretilen enzimin bakteriden saflaştırılabilmesi için genin 3' ucuna 6'lı Histidin etiketine ait nükleotit dizisi eklendi. Tasarlanan PETaz geni pTZ57R/T plazmiti içerisinde sentetik olarak elde edildi ve transformasyon yolu ile transformasyon etkinliği: 4,5x102 CFU/g olacak şekilde E. coli DH5α bakterisinde başarıyla çoğaltıldı. PETaz geni, E. coli DH5α'dan izole edilen pTZ57R/T-PETaz plazmit DNA'sından HindIII ve NdeI restriksiyon enzimleri ile çıkarıldı. E. coli DH5α'ya transformasyonla aktarılarak (transformasyon etkinliği: 3,08x102 CFU/g) çoğaltılmış ve izole edilmiş disülfit bağlı enzimlerin yüksek verimde üretilmesine olanak veren yüksek kopya sayılı bir ekspresyon vektörü olan pET26b ekspresyon plazmiti de aynı restriksiyon enzimleri ile kesildi. Agaroz jelde ayrılıp jelden saflaştırılmış beklenen boyutlardaki PETaz geni ve pET26b plazmit omurgasının T4 DNA Ligaz ile ligasyonu gerçekleştirilerek pET26b-PETaz rekombinant plazmiti elde edildi. Rekombinant plazmit, E. coli DH5α'da çoğaltılarak (transformasyon etkinliği: 1,62x102 CFU/g), disülfit bağı taşıyan PETaz enziminin sitoplazmada üretilebilmesi için disülfit bağlarını yapabilme yeteneğindeki E. coli SHuffle bakterisine de 1,24x103 CFU/g etkinliğinde transformasyon ile aktarıldı. Koloni PCR ile rekombinant plazmiti içerdiği saptanan 4 koloniden kurulan kültürlerde 100 mM IPTG ile gen anlatımı indüklendi. Bu kültürlerin 3'ünden PETaz enzimi, polihistidin etiketli proteinlerin izolasyonunu sağlayan manyetik saflaştırma sistemi ile saflaştırıldı. Enzim saflığı 280 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak absorbans ölçümü ve Bradford Yöntemi ile analiz edildi. Rekombinant hücrelerden yüksek verimle izole edilen bu 3 örnekteki saf protein konsantrasyonları sırasıyla 0.935, 0.56 ve 0.59 mg/mL olarak belirlendi. İndüksiyon sonrası toplanarak lizize uğratılan 4. kültüre ait homojenattaki toplam protein konsantrasyonu ise 3.9544 mg/mL olarak belirlendi. Protein izolasyonu sonrası elde edilen en düşük ve en yüksek saf protein konsantrasyonlarının, Chlamydomonas reinhardtii'den elde edilen saf protein konsantrasyonlarından1.44 ile 2.44 kat, total protein miktarının da E.coli'ye ait en düşük ve en yüksek total protein miktarlarından 29 ile 60 kat daha fazla olduğu saptandı.
Bu tez çalışmasında, PETaz geninin pET26b ekspresyon plazmitinde klonlanarak verimli bir şekilde çoğaltılabilmesi ve sitoplazma içerisinde disülfit katlanmalarını yapabilen E.coli SHuffle bakterisinde yüksek konsantrasyonda enzim üretilip saflaştırılabilmesi; PETaz enziminin biyoinformatik tasarımının ve uygulanan genetik mühendisliği yaklaşımlarının başarıyla gerçekleştiğini ortaya koymaktadır. Elde edilen bulgular, PET türü plastiğin biyoteknolojik yolla geri dönüştürülmesinde önemli bir potansiyele sahip olan PETaz enziminin büyük ölçekte üretimi için kullanılabilir.

Abstract:
Polyethylene terephthalate (PET) is one of the most used plastic types in the world, thus causing the most environmental pollution. Compared to physical and chemical methods used for recycling PET, biological recycling stands out as a low-cost and effective solution that does not increase the degradability of the plastic material and does not have toxic effects. Ideonella sakaiensis bacterium; degrades PET into its monomers with Polyethylene terephthalate hydrolase (PETase) and Monoethylene terephthalate hydrolase (MHETase) enzymes it secretes  and uses these monomers as carbon source. The issue of recycling PET type plastic, which can be recycle by physical and chemical methods at the present time, through biotechnological methods has been studied intensively for the last decade, and PETase enzyme constitutes a strong alternative in this field.
In this thesis, it is aimed to bioinformatically design PETase enzyme, which is produced by I. sakaiensis bacterium and hydrolyzes PET to MHET in an efficient and effective manner, and biotechnologically produce it in E. coli bacterium. For this goal; by using bioinformatics tools, (1) codon optimization of PETase gene, (2) addition of restriction enzyme cleavage sites to the gene for cloning into pET26b expression vector, (3) keeping the pelB signal sequence of plasmid that directs the recombinant protein to be produced to the periplasmic area within the boundaries of the restriction enzymes, (4) addition of the Histidine tag to the gene that needed for purification after the enzyme production, and cloning of the bioinformatically designed synthetic gene into expression vector by recombinant DNA technology; then, produce PETase enzyme with high activity in the cytoplasm of the cell with high activity, it was aimed to be transferred to E.coli SHuffle bacteria, which is capable of making disulfide bonds in the cytoplasm, thanks to DsbC protein in it produces.
In this thesis, the original PETase gene of I. sakaiensis was bioinformatically redesigned in order to be able to produce actively and efficiently. In this context, with codon optimization of the designed synthetic PETase gene, the GC content was reduced from 68.73% to 56.78%, while the Codon Adaptation Index (CAI) was increased from 0.64 to 0.80. The NdeI at the 5' and HindIII restriction enzymes recognition sites at the 3' end and the nucleotide sequence of 6X Histidine tag were added to the 3' end of the gene so that the enzyme produced after gene expression can be purified from bacteria. The designed PETase gene was synthetically obtained in pTZ57R/T plasmid successfully transferred to E.coli by transformation with a transformation efficiency of 4.5x102 CFU / μg. The PETase gene was extracted from pTZ57R/T-PETase plasmid DNA that was amplified and isolated in E.coli DH5α with HindIII and NdeI restriction enzymes. The pET26b expression plasmid, which was previously amplified with transferred into E. coli DH5α by transformation (transformation efficiency: 3,08x102 CFU/g) and then isolated from bacteria, was also cut with the same restriction enzymes. PETase gene and pET26b plasmid backbone with expected size isolated from agarose gel and put into the ligation reaction with T4 DNA Ligase enzyme. Thus, the pET26b-PETase recombinant plasmid was obtained. The obtained pET26b-PETase recombinant plasmid was successfully transformed to E. coli DH5α bacteria for amplification, with a transformation efficiency: 1.62x102 CFU/μg. Then, the obtained recombinant plasmid was transferred by transformation to E. coli SHuffle bacterium, which is capable of making disulfide bonds in the cytoplasm, in order to produce PETase enzyme in cytoplasm which carries 2 disulfide bonds, transformation efficiency: 1.24x103 CFU/μg. By  the colony PCR technique, 4 colonies determined to contain the recombinant plasmid were selected and gene expression was induced with 100 mM IPTG. After the induction, PETase enzyme was purified from 3 out of 4 clone cultures by magnetic purification system that enables isolation of polyhistidine tagged proteins. Enzyme purity was analyzed spectrophotometrically at 280 nm wavelength by absorbance measurement and Bradford Assay. Pure protein concentrations of these 3 samples, isolated from recombinant cells with high yield, were determined as 0.935, 0.56 and 0.59 mg/mL. The homogenate of fourth culture was used as a protein source. The total protein concentration in this sample was determined as 3.9544 mg/mL. It was determined that the lowest and highest pure protein concentrations obtained after protein isolation were 1.44 and 2.44 times higher, respectively, compared to the lowest and highest pure protein concentrations obtained from Chlamydomonas reinhardtii. Again, in this study, the total amount of protein obtained from bioinformatically redesigned and produced PETase gene were 29 and 60 times higher than the lowest and highest total protein amounts that are obtained from the medium of E. coli in an previous study, which MalE and LamB signal sequences were used for the production of PETase enzyme in the periplasm of E.coli.
In this thesis, the ability to reproduce the PETase gene efficiently by cloning in the pET26b expression plasmid, and produce and purification of high concentration enzyme in E.coli SHuffle bacterium, which can make disulfide bonds in th cytoplasm reveals that; th codon optimisation based bioinformatics design of the PETase enzyme and the applied genetic engineering approaches have been successfully implemented. The findings obtained can be used for large scale production of PETase enzyme, which has an important potential in biotechnological recycling of PET type plastic.