Tetrasiklin tayinine yönelik aptamer bağlı peroksidaz benzeri mikropartiküllerin geliştirilmesi
Development of aptamer-linked peroxidase-like microparticles for tetracycline detection
Yazar: SENA KILIÇ
Danışman: DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR ; PROF. DR. SÜLEYMAN ALİ TUNCEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
İnsan güvenliğini ve sağlığını korumak için gıdalarda ve sularda biriken antibiyotik kalıntılarının tayinine yönelik hassas ve seçici yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Kullanımı yaygın olan tetrasiklinin kalıntılarının tayini için kullanılan geleneksel yöntemlerin zaman alıcı olması, profesyonel çalışma becerisi gerektirmesi ve tayin için yüksek maliyetli cihazlar kullanılması gibi dezavantajları vardır. Sunulan tez kapsamında, sulu çözeltilerde tetrasiklin antibiyotiğinin tayini için peroksidaz benzeri aktivite gösteren manyetik mikropartikül ve aptamerden oluşan bir biyosensörün geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada kullanılan peroksidaz benzeri aktivite gösteren manyetik mikropartiküller, son yıllarda kullanılan tetrasiklinin tayin yöntemlerine alternatif oluşturmak için geliştirilmiştir. 
Bu kapsamda, (3-glisidiloksipropil) trimetoksisilan (GLYMO)-bağlı manyetik silika (MagSiO2) mikropartiküller ve (3-aminopropil)trietoksisilan (APTES)-bağlı mikropartiküller sentezlenmiştir. GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin sentezi için, MagSiO2 mikropartikülleri, tolüen ve GLYMO ile 110ºC'de reflux sisteminde 8 saat boyunca reaksiyona girmiştir. Mikropartiküller sırasıyla etanol, ddH2O ve sodyum karbonat (Na2CO3) ile yıkandıktan sonra etilendiamin ve Na2CO3 ile 60ºC'de t=24 st boyunca reaksiyona bırakılmıştır. Reaksiyonun ardından mikropartiküller sırasıyla fosfat tampon çözeltisi (PB) ve ddH2O ile yıkandıktan sonra gravimetrik analiz ile partikülün yoğunluğu belirlenmiş ve mikropartiküller tekrar PB ile yıkanmıştır. APTES-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin sentezi için APTES, MagSiO2 mikropartikülleri, tolüen ve tris-etilamin ile de benzer bir sentez yöntemi izlenmiştir. Mikropartiküllerin peroksidaz benzeri aktivitesini ölçmek için o-fenilendiamin (OPD) kullanılmıştır. GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin, APTES-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerden daha fazla absorbans değeri verdiği görülmüştür. 
Gluteraldehit çapraz bağlayacısı ile GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküller 18-24 saat süre aralığında, oda sıcaklığında ve karanlıkta reaksiyona girmiş, sonrasında partiküller PB ile yıkanmıştır. Aptamerler ise 5 dakika boyunca 95°C'de denature edildikten sonra 10 dk buzun üzerinde bekletilmiş; aptamer çözeltisi ve mikropartiküller oda sıcaklığında t=2 st boyunca reaksiyona bırakılmıştır. Aptamer tutuklanmış mikropartiküller, PB ile yıkandıktan sonra tetrasiklin çözeltisi (100-200-500-1000-2000 ng/µl) ile karanlıkta t=30 dk boyunca reaksiyona girmiştir. Partikül-aptamer-tetrasiklin PB ile yıkandıktan sonra OPD ile oda sıcaklığında ve karanlıkta, t=45-75 dk zaman aralığında reaksiyona bırakılmıştır. Farklı iyon ve derişimlere sahip tampon çözeltiler kullanılarak değişen aptamerin katlanma şeklinin ve aptamer yoğunluğunun tetrasiklin tayinine olan etkisi de incelenmiştir. OPD çözeltisi hazırlanırken pH, ortam tampon çözeltisi, çözeltinin derişimi ve H2O2 miktarının optimizasyonu yapılmıştır. Plaka okuyucuda OD=450 nm'de yapılan ölçümler sonucunda pH=7 olan fosfat sitrat tampon çözeltisi ile hazırlanmış 10 mM OPD solüsyonu kullanıldığında en yüksek ΔA değerine ulaşılmış ve t=60 dk'nın optimum reaksiyon süresi olduğu sonucuna varılmıştır. OPD'nin reaksiyonunu durdurmak için 3 M HCl kullanılmış, OD=492 nm'de yapılan ölçümler sonucunda HCl miktarı arttıkça absorbans değerinin arttığı, ancak ΔA değerinin azaldığı tespit edilmiştir. 
Yapılan tüm optimizasyon çalışmaları neticesinde tetrasiklin derişimi taranmış, alt tespit limiti LOD=100 ng/µl olarak bulunmuştur. Sütte izin verilen tetrasiklinin maksimum kalıntı limitleri ise Avrupa Birliği'nde 200 ng/µl'dir. Sonuç olarak bu çalışmada, tetrasiklini tayinine yönelik kullanımı kolay, düşük maliyetli, enzim benzeri özellik gösteren mikropartiküller ile aptamer-bağlı bir biyosensör geliştirilmiştir.

Abstract:
Sensitive and selective methods are needed for the determination of antibiotic residues accumulated in food and water sources to protect human safety and health. Traditional methods used for determination of tetracycline residues, which are widely used, have disadvantages such as being time consuming, requiring professional working skills, and using expensive devices for determination. A biosensor including aptamer and a magnetic microparticle with peroxidase-like activity was developed for tetracycline detection in aqueous solutions. In this study, magnetic microparticle with peroxidase-like activity was developed as an alternative to tetracycline determination methods currently used. 
Within this scope, (3-glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GLYMO)-linked MagSiO2 microparticles and (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)-linked MagSiO2 microparticles were synthesized. For the synthesis of GLYMO-linked MagSiO2 microparticles, magnetic silica microparticles MagSiO2, toluene and GLYMO were reacted under reflux at 110°C for t=8 hours. Microparticles were washed with ethanol, ddH2O and sodium carbonate (Na2CO3), respectively. After that, microparticles were reacted with ethylenediamine and Na2CO3 at 60°C for t=24 h, washed with phosphate buffer (PB) and ddH2O. After determination of particle density by gravimetric analysis, microparticles were washed with PB again. For the synthesis of APTES-linked MagSiO2 microparticles, (APTES), magnetic silica microparticles (MagSiO2), toluene and tris-ethylamine were used in a similar synthesis protocol. O-phenylenediamine (OPD) was used as substrate in the peroxidase-like activity measurements. Measurements showed that the absorbance value of GLYMO-linked MagSiO2 microparticles was greater than APTES-linked MagSiO2 microparticles. 
GLYMO-linked MagSiO2 microparticles and glutaraldehyde crosslinker were reacted in the dark, at room temperature for 18-24 hours. After the reaction, microparticles were washed with PB. Aptamers were denatured at 95°C for t=5 min, followed by a cooling step on ice for t=10 min. After that, aptamers and microparticles were reacted at room temperature for t=2 h. After the mixture of aptamer and microparticles were washed with PB, the mixture was reacted with tetracycline solutions (100-200-500-1000-2000 ng/µl) at room temperature for t=30 min and than washed with PB. Thereafter, the mixture was reacted in the dark with OPD at room temperature for t=45-75 min. The effect of aptamer concentrations and aptamer folding within buffer solutions having different ions and ion concentrations on tetracycline determination was also studied. Amount of H2O2 solution, medium buffer solution and it's pH value were optimized for the OPD solution. Absorbance values were measured at 450 nm in a plate reader, and 10 mM OPD solution prepared with phosphate citrate buffer solution with pH=7 had greater ΔA than other OPD solutions. The optimum reaction time was obtained for t=60 min. To stop the reaction of OPD, 3 M HCL was used. According to absorbance values measured at 492 nm, as the amount of HCl was increased, the absorbance values increased, but ΔA values decreased. 

After all the optimizations, tetracycline concentrations were scanned and a limit of detection LOD=100 ng/µl was obtained, while the maximum residue limits of tetracycline allowed in milk are 200 ng/µl in the European Union. Overall, an easy, inexpensive, aptamer-linked, enzyme-like magnetic particle based biosensor has been developed towards tetracycline detection.