Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe'de antifungal ilaçların etkin kullanım için araştırılması
Investigation of antifungal drugs for effective use in fission yeast Schizosaccharomyces pombe
Yazar: MUSTAFA KAÇMAZ
Danışman: PROF. DR. BEDİA PALABIYIK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antifungal aktivite = Antifungal activity ; Azoller = Azoles ; Mantar hastalıkları = Mycoses ; Schizosaccharomyces pombe = Schizosaccharomyces pombe

Özet:
Fırsatçı mantar patojenlerinin neden olduğu fungal enfeksiyonlar insan ölümlerinin önde gelen nedenlerinden biridir. Patojenik mantarlardan Candida, Aspergillus, Cryptococcus ve Pneumocystis türlerinin neden olduğu invaziv fungal enfeksiyonların dünya çapında yol açtığı morbidite ve mortalite oranı ciddi bir tehlike oluşturmaktadır. Sistemik mantar 
enfeksiyonlarını tedavi etmek için başlıca üç sınıf antifungal ilaç kullanılmaktadır. Bunlar ergosterol biyosentezini hedefleyen azoller, mantar hücre duvarı biyosentezini engelleyen ekinokandinler ve mantar hücre zarında hücre parçalanmasına yol açan ve ergosterole bağlanan polienlerdir. Son yıllarda bu ilaçların düzensiz, uzun süreli ve dikkatsiz kullanımı, söz konusu patojenlerin zaman içinde direnç kazanmasına yol açmıştır. Antifungal ilaç direncinin altında yatan nedenler olarak, ilaç hedef değişikliği veya aşırı ekspresyonu, çoklu ilaç taşıyıcılarının yukarı regülasyonu ve stres tepkilerinin aktivasyonu gibi çok sayıda adaptif mekanizma bulunmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında 19 yeni aday gen ve literatür taramasından flukonazol hedefi erg11 geni dahil flukonazole direnç ile ilişkili 5 genin antifungal ilaç direncindeki rolleri araştırıldı. Bu amaçla, patojenik fungilerle çok fazla ortak özellik paylaşan fisyon mayasının (Schizosaccharomyces pombe) ED666 yabani suşu ve ele alınan genler bakımından delesyonlu 21 suĢ (SPAC22H10.09, bun107, mug166, nnt1, nas2, yih1, hrk1, SPAC4H3.06, msh1, rpb9, qcr8, rsv2, srp14, clp1, bgs4 ve plh1, rhp18, SPCC338.06c, SPBC27B12.05 phb2 ve erg31) çalışma materyali olarak kullanıldı. Bu kapsamda, S. pombe ED666 ırkında, üç farklı antifungal ajanın (flukonazol, tetrakonazol ve tiyabendazol) ayrı ayrı ve flukonazol ve tetrakonazol kombine şekilde kullanılarak minimum inhibe edici konsantrasyonları (MĠK) hesaplandı. Hücrelerin bu ajanlar arasında flukonazole karşı MİK'in üzerindeki değerlerde hücre duvarı içeriğini değiştirerek üremeye devam ettiği paradoksiyal etki gözlendi. Bu tez kapsamında gerçekleştirilen ileri analizlerde sadece flukonazolün üremenin seyrinin değişime başladığı konsantrasyonlar olan IC5 ve IC10 değerleri S. pombe yabani suşunda kullanıldı. Buna göre, bazı genlerin (SPAC22H10.09, bun107, mug166, nnt1, nas2, yih1, SPAC4H3.06, msh1, rpb9, qcr8, rsv2, erg6 ve erg9) transkripsiyon seviyeleri IC5 dozunda artarken, IC10 dozunda azaldığı gözlendi. Buna karşın, diğerlerinin her iki dozda azalan (srp14, clp1, bgs4 ve phb2) ve artan (plh1, erg11 ve erg31) seviyeleri tespit edildi. Parental ve mutant suşlarda kayda değer bir ROT artışı gözlemlenmedi. Bu sonuç, dirençli suşlarda ROT seviyesinin düşük olmasıyla uyumludur. Sonuç olarak, SPAC22H10.09, bun107, mug166, nnt1, nas2, yih1, SPAC4H3.06, msh1, rpb9, qcr8, rsv2, srp14, clp1, bgs4, plh1 ve phb2 genlerinin ilk defa bu tez çalışmasında ilaç direnci ile ilişkisi ortaya konurken, dirençte bu genlerin aşağı düzenlenmiş olmalarının da rolü olduğu önerilmektedir.

Abstract:
Fungal diseases caused by opportunistic fungal species, it is one of the leading causes of deaths, especially in individuals suffering from certain health problems or immunosuppressive therapy. The worldwide morbidity and mortality rate caused by invasive fungal infections from pathogenic fungal species such as Candida, Aspergillus, Cryptococcus 
and Pneumocystis poses a serious threat. There are three main classes of antifungal drugs used in the treatment of systemic fungal infections. These are azoles that target ergosterol biosynthesis, echinocandins that inhibit fungal cell wall biosynthesis, and polyenes that bind to ergosterol in the fungal cell membrane and cause cell lysis. Recently, the irregular, longterm and careless use of these drugs has led to the resistance of pathogens over time. There are many underlying causes of antifungal drug resistance, including adaptive mechanisms such as drug target change or overexpression, upregulation of multiple drug transporters, and activation of stress responses. Within the scope of this thesis study, the roles of 19 new candidate genes and 5 fluconazole resistance-related gene from literature review, including fluconazole target erg11 gene, in antifungal drug resistance were investigated. In this context, ED666 parental strain of fission yeast (Schizosaccharomyces pombe), which shares much in common with pathogenic fungi, and 21 strains with deletions in various genes (SPAC22H10.09, bun107, mug166, nnt1, nas2, yih1, hrk1, SPAC4H1, rpb9sh) , qcr8, rsv2, srp14, clp1, bgs4 and plh1 rhp18, SPCC338.06c, SPBC27B12.05, phb2 and erg31) were considered as study material. In this context, the minimum inhibitory concentrations (MIC) of three different antifungal agents (fluconazole, tetraconazole and thiabendazole) in S. pombe ED666 strain were calculated separately and in combination with fluconazole and tetraconazole. A paradoxical effect was observed in which the cells continued to reproduce by changing the cell wall content at values above the MIC against fluconazole among these agents. In the further analyzes performed within the scope of this thesis, only the IC5 and IC10values, which are the concentrations at which the growth rate of fluconazole begins to change, were used in S. pombe ED666 wild type. Accordingly, while the transcription levels of some 
genes (SPAC22H10.09, bun107, mug166, nnt1, nas2, yih1, SPAC4H3.06, msh1, rpb9, qcr8, rsv2, erg6 ve erg9) were upregulated on IC5 dose, downregulated on IC10. In contrast, downregulated (srp14, clp1, bgs4 and phb2) and upregulated (plh1, erg11 and erg31) levels of the other genes were detected at both doses. No significant increase in ROT was observed in parental and mutant strains. This result is compatible with the low level of ROT in resistant strains. In conclusion, the relationship of SPAC22H10.09, bun107, mug166, nnt1, nas2, yih1, SPAC4H3.06, msh1, rpb9, qcr8, rsv2, srp14, clp1, bgs4, plh1 ve phb2 genes with drug resistance was revealed for the first time in this thesis study. It is suggested that downregulation of these genes also plays a role in resistance.