Fosfinotrisin N-asetiltransferaz (PAT) enzimini kodlayan siyanobakteriyel genlerin klonlanması, ekspresyonu ve enzim aktivitelerinin analizi
Cloning and expression of cyanobacterial genes that encode phosphinothricin N-acetyltransferase (PAT) enzyme
Yazar: EBRU YILMAZ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Fosfinotrisin N-asetiltransferaz (PAT), fosfinotrisin (PPT) içeren herbisitlere direnç sağlamak amacıyla bitkilerde ekspresyonu yapılan bakteri kökenli bir enzimdir. Transgenik bitkilerde fosfinotrisin N-asetiltransferaz (PAT) proteininin ekspresyonu, bir herbisit olan glufosinata karşı tolerans kazandırmaktadır. Siyanobakterilerde bu enzimin var olduğu dizi analizleri ile tespit edilmişse de potansiyel PAT aktiviteleri henüz belirlenmemiştir. Bu çalışmada Anabaena sp. PCC7120, Synechocystis sp. PCC6803 ve Gloeobacter violaceus sp. PCC7421 suşlarında, varsayımsal (putatif) olarak PAT enzimini kodladığı belirlenen sırasıyla alr4468, sll1647 ve glr2526 genleri His-Tag etiketi içeren pET28a+ ifade vektörüne klonlanmıştır. Ardından, rekombinant vektörler proteaz içermeyen E. coli BL21(DE3) hücrelerine aktarılmışlardır. 1 mM IPTG ile indüklenen rekombinant E. coli BL21 kültürlerinde rekombinant Alr4468 (rAlr4468) veSll1647 (rSll1647) proteinlerinin ifadeleri sağlanırken rekombinant Glr2526 (rGlr2526)'nin ifadesi gerçekleştirilememiştir. En yüksek in vitro PAT aktiviteleri IPTG ile indüklenmiş hücre özütlerinin kullanıldığı enzim çalışmalarında elde edilmiştir ve kontrollere kıyasla sırası ile 3.47 (rAlr4468 için) ve 2.53(rSll1647 için) kat daha yüksek bulunmuştur.  Sonuç olarak, yüksek yapılı bitkilerle benzer fizyolojik özelliklere sahip olan siyanobakterilere ait alr4468 ve sll1647 genleri, gelecek çalışmalarda herbisitlere dirençli yerel transgenik bitkilerin oluşturulmasında kaynak olarak kullanılabilecektir.

Abstract:
Phosphinothricin N-acetyltransferase (PAT) is a bacterial enzyme that is expressed in plants to provide resistance to herbicides containing phosphinothricin (PPT). The expression of the phosphinothricin N acetyltransferase (PAT) protein in transgenic plants confers tolerance to glufosinate, a herbicide.  Although this enzyme in cyanobacteria has been identified by sequence analysis, PAT activities have not yet been determined. In this study, putative PAT enzyme encoding genes alr4468, sll1647 and glr2526 in Anabaena sp. PCC7120, Synechocystis sp. PCC6803 and Gloeobacter violaceus sp.  PCC7421 strains, respectively, were cloned to His-Tagged pET28a+ expression vector. The recombinant vectors containing the respective genes were was introduced to protease free E. coli BL21 cells. While Alr4468 and Sll1647 were successfully expressed in recombinant E. coli BL21 cultures induced by 1 mM IPTG, recombinant Glr2526 expression could not be achieved.   The highest in vitro PAT activities were obtained in enzyme assays using IPTG- induced cell crude extracts and were found to be 3.47 (for rAlr4468) and 2.53 (for rSll1647) times higher than controls, respectively. As a result, alr4468 and sll1647 genes of cyanobacteria, which have similar physiological properties to those of high-structured plants, might be used as potential sources for the generation of herbicide-resistant native transgenic plants in future studies.