Manyetik yüklü polimerik nanopartikül esaslı plazmid dna saflaştırma kitlerinin geliştirilmesi
Development of plasmid dna purification kits based on magnetically loaded polymeric nanoparticles
Yazar: EMEL SEMİZ
Danışman: PROF. DR. ERHAN BİŞKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Bölümü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kimyasal Teknolojiler Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Plazmit DNA = Plasmit DNA ; Saflaştırma = Purification

Özet:
Son yıllarda moleküler düzeydeki gelişmeler ve nükleik asitlere yoğunlaşan biyomedikal çalışmalar, plazmid DNA'nın ilaç ve gen tedavisi amacıyla kullanıldığı yeni uygulamalara imkan sağlamıştır. Gen tedavisi ve aşı gibi uygulamalarda kullanılan plazmid DNA'nın saflığı, en önemli parametrelerden biridir. Plazmid DNA'nın bu uygulamalarda kullanılmasının amaçlanmasıyla birlikte saflaştırma yöntemleri de geliştirilmeye başlanmış ve bugün amaçlanan ultra saflıktaki plazmid DNA'nın en kısa ve en ucuz yolla elde edilmesini sağlayacak yöntemler, son zamanların gözde konuları arasında yerini almıştır. Bu amaçla kullanılan kromatografik yöntemlerin yanı sıra, piyasada, laboratuvar ölçekte plazmid saflaştırılması için üretilmiş patentli pratik saflaştırma kitleri bulunmaktadır. Bu kitler, kullanıcı amaçlarına göre farklı özelliklerde ve miktarlarda ürün sağlar. Fakat hızla ilerleyen teknoloji, plazmid DNA saflaştırılması için yeni malzeme tasarımlarına ve yeni yöntemlere olanak vermektedir. Yapılan çalışmada bakteri (E.Coli) lizatından plazmid DNA'yı saflaştırmak için manyetik yüklü polimerik nanopartiküllerin sentezi ve uygun etkileşim tamponlarının saptanması amaçlanmıştır. Bu amaçla, ilk önce yaklaşık 44 nm çapındaki manyetit (Fe3O4) partiküller ikili çöktürme yöntemi ile sentezlenmiştir. Sentezlenen manyetik nanopartiküller yüzey aktif madde içermeyen emülsiyon polimerizasyonu yöntemi kullanılarak St/PEG-MA/DMAPM terpolimeriyle kaplanmış ve yaklaşık 104±7 nm boyutlarında partiküller elde edilmiştir. Nanopartiküllerin hücre üzerindeki sitotoksik etkileri MTT testi ile belirlenmiştir. Bu nanopartiküllerin boyutsal karakterizasyonu Zeta Sizer, AFM, yapısal karakterizasyonları ise XRD, FTIR ile yapılmış, VSM ile de manyetik özellikleri belirlenmiştir. Basit alkali lizis işlemine tabi tutulmuş bakteri lizatına, belirlenen adsorpsiyon/desorpsiyon tamponları kullanılarak partikül-tampon sistemi uygulanmış; farklı partikül miktarları ve uygulama süreleri ile elde edilen saflaştırma sonuçları elektroforez yöntemi ile değerlendirilmiştir. Mini ölçekte elde edilen saflaştırılmış plazmid yaklaşık 15 µg civarındadır. Son aşamada, sentezlenen partiküller L929 fare fibroblast hücre hattı transfeksiyonunda vektör olarak kullanılmış ve gen aktarım etkinlikleri incelenmiştir.Sonuç olarak tez kapsamında manyetik yüklü St/PEG-MA/DMAPM kaplı polimerik nanopartiküller sentezlenmiş; partiküllerin plazmid DNA ile etkileşimi için uygun tampon ortamlarında optimum adsorpsiyon-desorpsiyon koşulları belirlenmiş ve bu sistem bakteri lizatından plazmid DNA saflaştırılması amacıyla kullanılarak, verimliliği en bilinen ticari kitlerden biri ile kıyaslanmıştır. Ayrıca saflaştırma amacının dışında, bu tezde sentezlenen partiküllerin gen transfeksiyonunda non-viral vektör olarak kullanımı değerlendirilmiştir.

Abstract:
In recent years, improvements in molecular level and biomedical researches focused on nucleic acids, have given opportunity to new applications in which plasmid DNA is used as pharmaceutical and gene therapy agent. The purity of plasmid DNA, which is used in applications such as gene therapy and vaccination, is one of the most important parameters. As soon as it was aimed to use plasmid DNA in such applications, the purification methods have been started to be developed and the techniques to obtain the desired ultra purified plasmid DNA with the shortest and cheapest way have taken place among the highlighted topics of research areas. Beyond the chromatographic methods used for this purpose, some commercial kits produced for plasmid purification in laboratory scale are present in the market. These kits provide products which have different qualifications and amounts due to the user aims. However by the help of fast going technology, it has been possible to synthesize new materials and designing new techniques in plasmid DNA purification. In this study, to isolate the plasmid DNA from bacterial lysate (E.Coli), it is aimed to synthesize magnetically loaded polymeric nanoparticles and specify the suitable buffer conditions for interaction. With this purpose, first magnetite (Fe3O4) particles about 44 nm diameter were synthesized by co-precipitation method. The magnetic nanaoparticles were coated with terpolymer structure St/PEG-MA/DMAPM by emulsifier free emulsion polymerization and particles about 104±7 nm diameter, were obtained. The cytotoxic effect of nanoparticles in cell culture was tested with MTT test. The size characteristics of particles were determined by Zeta Sizer, AFM; the structural characterizations were determined by XRD, FTIR and magnetic properties were detected by VSM. Particle-buffer system was applied to the bacterial lysate (which was exposed to basic alkaline lysis procedure) by using specified adsorption/desorption buffers and the purification results for different amount of particles and different application times were evaluated by electrophoresis method. In mini scale, it was obtained about 15 µg purified plasmid with this system. Finally, the synthesized particles were used in transfection of L929 mouse fibroblast cell line and their effects on gene transfer were investigated.As a result, magnetically loaded St/PEG-MA/DMAPM coated polymeric nanoparticles were synthesized; for interaction of particles with plasmid DNA in suitable buffer conditions, optimum adsorption-desorption conditions were determined and this system was used for isolation of plasmid DNA from bacterial lysate and compared to a well- known commercial kit. Additionally, the usage of these particles as non-viral vectors in gene transfection was examined.