Bazı Alkanna türlerinin biyoaktivite rehberli izolasyon yöntemi kullanılarak çeşitli kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerinin in vitro ortamda taranması
In vitro screening of cytotoxic effects of some Alkanna species on various cancer cell lines by using bioassay-guided isolation
Yazar: ŞEBNEM BIÇKICI
Danışman: DOÇ.DR. ERDAL BEDİR
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Alkanna Tausch, Türkiye florasında 34 tür (31 tür endemiktir) ve 40 takson iletemsil edilmektedir. Türkiye'de yeti en Alkanna türlerinin ço unun endemik olu u venaftokinonların do al olarak DNA topoizomeraz inhibitörleri olmasından dolayı,projenin ilk hedefi, tümör hücre hatlarına kar ı yüksek aktivite gösteren, bu sınıfbile iklerin Alkanna cinsinden elde edilmesidir.Bu hedefe ula mak için, be Alkanna türünün [A. tubulosa (endemik), A.cordifolia (endemik), A. orientalis (endemik), A. tinctoria ve A. hirsutissima] metanolekstreleri (toprak üstü ve kök kısımları), be kanser (K-562, MCF-7, HL-60, SaOs-2,Hep-3B) ve iki normal hücre hattına (L929 ve VERO) kar ı, MTT testi kullanılarak,sitotoksik aktiviteleri için taranmı tır. Kök ekstrelerinin IC50 de erleri, 16 ile 32Âµg/mlarasında da ılım gösterirken, toprak üstü ekstrelerinde önemli bir sitotoksisitegözlenmemi tir. A. cordifolia'nın (endemik) kök ekstresi anlamlı sitotoksik aktivitesergiledi inden, biyoaktivite rehberli ileri fraksiyonlama için seçilmi tir.Ön fraksiyonlama çalı malarında, A. cordifolia kökünün, metanol vekloroform:metanol (1:1) ekstreleri, uygun fraksiyonlama sistemi belirlenmek üzere,Açık Kolon Kromatografisi ve Vakum Sıvı Kromatografisi (VSK) yöntemleri ile farklısabit fazlarda (Silika jel, RP-18 ve Sefadeks LH-20) denenmi tir.Aktif kısımların en iyi, silika jelde da ılım gösterdi i gözlenmi tir. Bu nedenle,A. cordifolia'nın hekzan ekstresinin büyük ölçekli izolasyonu, Biotage SP-2 YüksekPerformans Fla Kromatografisi ile silika jel kullanılarak gerçekle tirilmi tir. Toplanan536 fraksiyon, nce Tabaka Kromatografisi profillerine göre birle tirilerek yirmi yedi altfraksiyon elde edilmi tir.Yirmi yedi alt fraksiyondan on bir tanesi (Frk92-110, Frk111-120, Frk121-160, Frk161-, Frk244-274, Frk275-319, Frk336-403, Frk404-417, Frk418-439, Frk465-488 ve Frk521-526), 10Âµg/ml202konsantrasyonda yüksek sitotoksik aktivite göstermi tir. Bazı aktif fraksiyonların ilerifraksiyonlaması çok yüksek aktivite gösteren Frk4 (1 Âµg/ml) (Al.cor-RPE-19.04.06)kodlu fraksiyonun elde edilmesini sa lamı tırBu çalı ma, Türkiye'de yeti en Alkanna türlerinin ilk sitotoksisite rehberlifraksiyonlama çalı masıdır.

Abstract:
Alkanna Tausch is represented with 34 species (31 endemic species) and 41taxon in the flora of Turkey. Since most of the Alkanna species growing in Turkey areendemic and naphthoquinones are naturally occurring DNA-topoisomerases inhibitors,the first goal of the project is to isolate this class of compounds from Alkanna genus asleads with increased activity against tumor cell lines.In order to achieve this goal, methanolic extracts (aerial parts and roots) of fiveAlkanna species [A. tubulosa (endemic), A. cordifolia (endemic), A. orientalis(endemic), A. tinctoria and A. hirsutissima] were screened for cytotoxic activity againstfive cancer (K-562, MCF-7, HL-60, SaOs-2, Hep-3B) and two non-tumorogenic celllines (L929 and VERO) by using MTT test. The root extracts exhibited IC50 valuesranging from 16 Âµg/ml to 32 Âµg/ml, whereas the aerial part extracts had no significantcytotoxicity. Since the root extract of A. cordifolia (endemic) exhibited significantcytotoxic activity, it was the species that selected for further bioassay-guidedfractionation.During our preliminary fractionation studies, the methanolic andchloroform:methanol (1:1) extracts of A. cordifolia root was subjected to differentstationary phases (Silica gel, RP-C18 and Sephadex LH-20) by using Open ColumnChromatography and Vacuum Liquid Chromatography (VLC) to determine optimumfractionation system. We noted that the active parts were spread out well by silica gel.Thus, the scale-up isolation of A. cordifolia hexane extract was performed on BiotageSP-2 High Performance Flash Chromatography by using normal phase silica gel to yieldtotal of 536 fractions which were pooled into twenty-seven subfractions based on theirThin Layer Chromatography profiles.Eleven out of twenty seven subfractions (Frk92-110, Frk111-120, Frk121-160, Frk161-202,Frk244-274, Frk275-319, Frk336-403, Frk404-417, Frk418-439, Frk465-488 and Frk521-526) showed highcytotoxic activity at 10Âµg/ml. Further fractionation of some of the active fractionsresulted in the isolation of very potent fraction [Frk4 (1 Âµg/ml) (Al.cor-RPE-19.04.06)].This study represents the first cytotoxicity-guided fractionation of Alkannaspecies growing in Turkey.