APOBEC1 enzimi ve yardımcı kofaktörleri için hücresel klonların üretilmesi
Generation of cellular clones for APOBEC1 enzyme and auxiliary cofactors
Yazar: MAHMUT ÖZER
Danışman: DOÇ. DR. VEYSEL TOLAN
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, RNA düzenleme enzimi APOBEC1 tarafından indüklenen RNA düzenlemesinin analizi için uygun bir hücresel model oluşturma amaçlanmıştır. "RNA düzenleme" terimi, DNA üzerinde bulunan nükleotidler tarafından belirlenen RNA nükleotid dizilerinden farklı olan dizilerin oluşmasına yol açan sayısız hücresel süreçleri tarif etmek için kullanılmıştır. RNA'ları etkileyen bu süreçler, değişikliğe uğramış transkriptlerin fonksiyonunu veya kodlama potansiyelini değiştirmekle beraber bu modifikasyonların elde edildiği hücresel mekanizmaların karakterize edilmesinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir.
Genel olarak, bu çalışma araştırmanın iki yönünü ele almaktadır. Birincisi, apolipoprotein B'nin mRNA düzenlemesinin in vivo olarak gerçekleştiği ince bağırsak enterositlerine fenotipik olarak benzemelerini sağlamak amacıyla belirli kültür ortamında Transwell filtreleri üzerinde kültürlenen Caco-2 hücrelerinin hücre farklılaşmasına yönelik koşulların düzenlemesi ile ilgilidir. Bu nedenle, APOBEC1 ve onun kofaktörleri olan ACF (Apobec1 Complementation Factor) ve RBM47'nin (RNA Binding Molecule 47) eksik olduğu Caco-2 hücre klonları oluşturulmuştur.
Diğer yönüyle, bu araştırma editozom elementleri olan APOBEC1, ACF ve RBM47'yi kodlayan genleri inaktif hale getirme çalışmasını kapsamaktadır. Bu süreçte, bakteriyel CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR-associated 9) sisteminden türetilen çok popüler bir genom düzenleme aracını kullanılmıştır. Son aşamada ise, APOBEC1, ACF ve RBM47 proteinlerinin eksik olduğu Caco-2 hücreleri, knock-out edilmiş ilgili genlerin dizi analizi için spesifik bir ortamda kültürlenmiştir.

Abstract:
In this study, we aimed the generation of a cellular model suitable for the analysis of RNA editing induced by the RNA editing enzyme APOBEC1. The term RNA editing has been used to describe numerous cellular processes that result in the modification of RNA sequences differing from that designated by their DNA templates. These processes, affecting RNAs can alter the function or coding potential of the modified transcripts, and significant advances have been made in characterizing the largely unrelated cellular mechanisms by which these modifications are achieved. 
Overall, my study focused on two aspects of this research. The first one regards the setting up of the conditions for the cytodifferentiation of Caco-2 cells on Transwell filters in specific culture medium to allow them to resemble phenotypically the small intestine enterocytes where the mRNA editing of apolipoprotein B takes place in vivo. Therefore, we have generated clones of Caco-2 cells which are deficient for APOBEC1 and its cofactors namely ACF (Apobec1 Complementation Factor) and RBM47 (RNA Binding Molecule 47).
The other aspect regards the work to inactivate the genes that code for the elements of editosome, namely APOBEC1, ACF and RBM47. During this process, we used a very recent and popular genome editing tool derived from the bacterial CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR-associated 9) system. At the final step, APOBEC1, ACF and RBM47 deficient Caco-2 cells have been cultured in specific media ultimately for the sequence analysis of knocked-out genes.