Vıgna caracalla L. Verdc. (İzmir sarmaşığı) bitkisinin In Vitro rejenerasyon potansiyelinin çeşitli biyoreaktör tiplerinde incelenmesi
Investigation of In Vitro regeneration potential of Vigna caracalla L. Verdc. in various bioreactor types
Yazar: BUSE CAN
Danışman: PROF. DR. AYNUR GÜREL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu tez çalışmasında, Vigna caracalla L. Verdc. (İzmir Sarmaşığı) bitkisinin çeşitli biyoreaktör tiplerinde in vitro meristematik nodüllerden embriyo rejenerasyon potansiyeli incelenmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, temin edilen Vigna caracalla L. Verdc. bitkisinin tohumlarının yüzey sterilizasyonu gerçekleştirilmiş ve ardından in vitro steril bitkicikler elde edilmiştir. Yaprak eksplantları, farklı hormon ve sükroz konsantrasyonu içeriklerine sahip yarı katı MS besin ortamlarında kallus oluşumu için kültüre alınmıştır. Kallus rejenerasyonu için 2 mg/L 2,4-D+ 0,1 mg/L KIN+ 30 g/L sükroz içeren MS besin ortamı (K5), en iyi sonucu (%100) vermiştir. Kalluslar; yeşil renkleri ve gevrek yapıda oldukları için sıvı kültürlere daha uygun olduğu belirlenmiştir. 
Sıvı kültürlerde gerçekleştirilen denemelerin ilk basamağı olan kalluslardan meristematik nodüllerin gelişimini sağlamak için 2 haftalık kültür süresince kalluslar 4 mg/L BAP+ 100 mg/L Askorbik asit içeren ½ MSB5 besin ortamında (S1) kültüre alınmışlardır. Elde edilen meristematik nodüller, sekonder çoğaltımın sağlanması adına 4 mg/L BAP+ 100 mg/L Askorbik asit+ 100mg/L L-Glutamin içeren ½ MSB5 besin ortamına (S2) aktarılmışlardır. Bu ortamda büyüme indeksi 1,59 olarak kaydedilmiştir. En yüksek spesifik büyüme hızı ise 10. günde 0,18 olarak kaydedilmiştir.
Araştırmada, elde edilen meristematik nodüllerden embriyo rejenerasyonunun sağlanması için farklı geçici daldırma sistemlerine (SETISTM ve RITA®) ve ayrıca farklı pnömatik havalandırmaya (0.1, 0.2, 0.3 vvm) ve hacimlere (2000 mL ve 3000 mL) sahip biyoreaktörler kullanılmıştır. Denemelerde hormonsuz 4 farklı besin ortamı (MS, B5, N6 ve 2x kuvvetinde NH4NO3 MS) kullanılmıştır. RITA® biyoreaktöründe en yüksek büyüme indeksi 2,14 ile 3dk/3sa'lik daldırma periyoduna sahip hormonsuz MS bazlı 2x kuvvette NH4NO3 içeren besin ortamında (RMN1) kaydedilmiştir. mL başına elde edilen en yüksek embriyo adedi 0,26 adet/g/mL olarak 3dk/3sa'lik daldırma periyoduna ve MS besin ortamında (RM1) elde edilmiştir. SETISTM biyoreaktörlerinde gerçekleştirilen denemelerde, en yüksek büyüme indeksi 1,38 ile 3dk/6sa'lik daldırma frekansında B5 bazal besin ortamında (SB52) kaydedilmiştir. SETISTM biyoreaktöründe mL başına elde edilen en yüksek embriyo adedi 0,76 adet/g/mL ile MS temelli SM1 kodlu besin ortamında belirlenmiştir. 2000 mL'lik pnömatik havalandırmaya sahip otoklavlanabilir şişe biyoreaktöründe en yüksek büyüme indeksi 1,63 olarak 0.2 vvm'lik havalandırma hızında ve N6 besin ortamında (ON62) kaydedilmiştir. En yüksek mL başına embriyo sayısı ise 0,024 adet/g/mL olarak 0.2 vvm havalandırma hızında ve MS temelli OM2 kodlu besin ortamında elde edilmiştir. 3000 mL hacme sahip pnömatik havalandırmalı şişe biyoreaktörlerle kurulan denemede; en yüksek büyüme indeksi (1.30), 0.2 vvm havalandırma hızında ve MS temelli KM2 kodlu besin ortamında sağlanmıştır. mL başına en yüksek embriyo adedi ise 0,24 adet/g/mL olarak yine aynı besin ortamında kaydedilmiştir.
Çalışmamızda kurulan denemeler sonucunda, geçici daldırma sistemleri (RITA® ve SETISTM) ve pnömatik havalandırmaya sahip büyük ölçekli biyoreaktörler (2000 mL ve 3000 mL) ele alındığında, en yüksek büyüme indeksi değeri (2,14) RITA® biyoreaktöründe, mL başına en yüksek embriyo adedi (0,76 adet/g/mL) ise SETISTM biyoreaktöründen elde edilmiştir. Bunlara ek olarak, pnömatik havalandırmaya sahip büyük ölçekli biyoreaktörlerde en yüksek değerler 0.2 vvm'lik havalandırma hızında kaydedilmiştir. Elde edilen bu bilgiler, Vigna caracalla L. Verdc. bitkisinin kitlesel üretimi için yol gösterici niteliktedir

Abstract:
In this thesis, Vigna caracalla L. Verdc. (İzmir Ivy) plant embryo regeneration potential from meristematic nodules in various bioreactor types in vitro was investigated. In the first stage of the study, the obtained Vigna caracalla L. Verdc. the surface sterilization of the seeds of the plant was performed and then sterile plantlets were obtained in vitro. Leaf explants were cultured for callus formation in semi-solid MS nutrient media with different hormone and sucrose concentration contents. For callus regeneration, MS nutrient medium (K5) containing 2 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L KIN+30 g/L sucrose gave the best result (100%). Calli; it has been determined that they are more suitable for liquid cultures because of their green color and brittle structure.
In order to ensure the development of meristematic nodules from the calli, which is the first step of the experiments carried out in liquid cultures, the calli were cultured in ½ MSB5 nutrient medium (S1) containing 4 mg/L BAP + 100 mg/L Ascorbic acid during 2 weeks of culture. Obtained meristematic nodules were transferred to ½ MSB5 nutrient medium (S2) containing 4 mg/L BAP+ 100 mg/L Ascorbic acid+ 100mg/L L-Glutamine for secondary growth. In this medium, the growth index was recorded as 1.59. The highest specific growth rate was recorded as 0.18 on the 10th day.
In the research, bioreactors with different temporary immersion systems (SETISTM and RITA®) as well as different pneumatic aeration (0.1, 0.2, 0.3 vvm) and volumes (2000 mL and 3000 mL) were used to ensure mass production of meristematic nodules and embryo regeneration. Four different hormone-free nutrient media (MS, B5, N6 and NH4NO3 MS at 2x strength) were used in the experiments. In the RITA® bioreactor, the highest growth index of 2.14 was recorded in the non-hormonal MS-based 2x strength NH4NO3 nutrient medium (RMN1) with an immersion period of 3 min/3 h. The highest number of embryos per mL was 0.26 units/mL in the MS nutrient medium (RM1) with an immersion frequency of 3 min/3 h. In the trials performed in SETISTM bioreactors, the highest growth index of 1.38 was recorded in B5 basal nutrient medium (SB52) at an immersion frequency of 3 min/6 h. In the SETISTM bioreactor, the highest number of embryos per mL was 0.76 units/mL in the MS-based SM1 coded nutrient medium. In 2000 mL autoclavable bottle bioreactor with pneumatic aeration, the highest growth index of 1.63 was recorded at 0.2 vvm aeration rate and N6 nutrient medium (ON62). The highest number of embryos per mL was recorded as 0.024 units/mL at an aeration rate of 0.2 vvm and MS-based nutrient medium coded OM2. In the experiment with 3000 mL pneumatic aerated bottle bioreactors, the highest growth index (1.30) was obtained at 0.2 vvm aeration rate and MS-based KM2 nutrient medium. The highest number of embryos per mL was 0.24 units/mL in the same nutrient medium.
As a result of the experiments established in our study, considering the temporary immersion systems (RITA® and SETISTM) and large-scale bioreactors with pneumatic aeration (2000 mL and 3000 mL), the highest growth index value (2.14) was obtained in the RITA® bioreactor and the highest number of embryos per mL (0.76 units/mL) was obtained in the SETISTM bioreactor. In addition, in large-scale bioreactors with pneumatic aeration, the highest values were recorded at an aeration rate of 0.2 vvm. This information obtained, Vigna caracalla L. Verdc. it is a guide for mass production of the plant.