Antraks atağında ajanın hızlı deteksiyon ve identifikasyonu için yöntemlerin irdelenerek saptanması
Comparison of the methods for rapid detection and identification of agent in any anthrax attack
Yazar: MESUT ORTATATLI
Danışman: PROF. DR. TURAN KARAYILANOĞLU
GATA / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi NBC Savunması Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
ÖZETBiyolojik Savaş Ajanları (BSA), genellikle aerosol şeklinde kullanılır,solunum yolu ile alındıklarında çok küçük dozlarda bile ağır seyirli, mortalitesiyüksek klinik tablolar oluştururlar. Bir tür kitle imha silahı olan BSAkullanılması durumunda olay yerinde ya da laboratuvarda ilk belirlemeişleminin kısa sürede ve yüksek doğrulukta gerçekleştirilmesi ile uygulanacaktedavi ve buna bağlı alınacak koruyucu tedbirlerin etkinliği daha da artacaktır.Bu çalışmada, BSA içerisinde kullanılma potansiyeli en fazla olanB.anthracis`in tanısında, real-time polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ilekonvansiyonel tanı yöntemleri irdelenmiş, birbirlerine olan avantaj vedezavantajları belirlenip, tanıda real-time PCR'ın uygulanabilirliği ortayakonmaya çalışılmıştır. PCR için gerekli olan DNA ekstraksiyon yöntemleridenenmiştir. Hızlı, güvenli, kolay uygulanabilir ve ucuz bir yöntem olandondurma-kaynatma yöntemi geliştirilmiş ve duyarlılığı belirlenmiştir. Sözkonusu yöntem, proteinaz K'nın kullanıldığı enzimatik ekstraksiyon yöntemiile karşılaştırılmıştır. B.anthracis'in plazmidlerinde (pXO1 ve pXO2) bulunangen bölgelerine özgü yeni primerler tasarlanmış ve ticari kit primerleri ileduyarlılık yönünden karşılaştırılmıştır.Dondurma-kaynatma DNA ekstraksiyonu ile elde edilen DNA'nınsaflığı (1.45Â±0.17), enzimatik ekstraksiyona (1.58Â±0.13) göre daha düşükbulunmasına rağmen (pâ¤0.05), miktar ve PCR etkinlikleri arasındaistatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmemiştir (p>0.05).Real-time PCR uygulamalarında yeni tasarlanan ve ticari kitprimerlerinin duyarlılıkları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkbulunmamıştır (p>0.05).Tanı yöntemlerinin karşılaştırılmasında, real-time PCR %100,mikroskopik inceleme %66.7, konvansiyonel kültür işlemlerinin ise %80-93.4oranında doğru tanı koyma yüzdesine sahip oldukları görülmüştür.Sonuç olarak çalışmamızda; bir antraks atağında, etkeninkonvansiyonel tanı yöntemleri ile gösterilmesinin yanında, hızlı tanı veidentifikasyon için ucuz, güvenli, kolay uygulanabilir olan dondurma -kaynatma yöntemiyle elde edilen DNA'ların PCR ile çoğaltılıpiiigösterilmesinde ticari kite bağlı kalmaksızın tasarlanan yeni primerlerinkullanılabileceği gösterilmiştir.iv

Abstract:
SUMMARYBiological warfare agents (BWA) which are generally used in aerosolsprays may cause severe clinical pathologies with mortality even in case ofexposure to small doses via inhalation. In the use of BWA, a type of weaponsof mass destruction, rapid detection with high accuracy at the incident site orlaboratory would lead the increase in effectivity of the treatment andprotective measures taken in the medical management.In this study, real-time PCR method and conventional microbiologicalassay used in the detection of B.anthracis, the most likely agent to be usedamongst BWAs, were compared in terms of advantages and disadvantages,and the analytical application of real-time PCR was experimented. In thisregards, DNA extraction methods required for PCR applications wereexamined. ?Freezing-Boiling? technique which is supposed to be rapid,reliable and cost-effective method was developed and its sensitivity wasdetermined. This method was compared with the enzymatic extractionmethod where proteinase-K was used. New primers specific for gene areasfound in B.anthracis plasmids (pXO1 and pXO2) were designed and itssensitivity was compared with that of primers in commercial kits.DNA purity (1.45Â±0.17) obtained by the extraction via ?freezing-boiling?method was found lower than that is done by enzymatic extraction(1.58Â±0.13) (pâ¤0.05). However, there was no significant difference betweenthese two methods with respect to their concentrations and PCR effectivities(p>0.05).No statistically significant difference was also found between thesensitivities of newly designed primers and commercial primers in theapplications of real-time PCR methods (p>0.05).In methods evaluation study, diagnostic sensitivities of real-time PCR,microscopic examination and conventional culture methods were found as100%, 66.7% and 80-93.4%, respectively.As a consequence, for the detection of anthrax in any biologicalincident, new designed primers can be used to perform the real-time PCR ofvDNAs obtained by freezing-boiling method in addition to conventionaldiagnosis of the agent amongst microbiological diagnostic procedures.vi