Farklı uygulamaların patlıcan (Solanum melongena L.)'da mikrospor kültürü ile haploid embriyo ve bitki üretimi üzerine etkileri
The effects of different application to induce haploid embryo and plant formation on eggplant (Solanum melongena L.) microspore culture
Yazar: BUSE ÖZDEMİR ÇELİK
Danışman: PROF. DR. AHMET NACİ ONUS
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture

Özet:
Araştırmada iki adet F1 ("A117" ve "Amadeo") patlıcan çeşidinde mikrospor kültürü yoluyla haploid ve DH bitki elde etme olanakları üzerine çalışılmıştır. Bu amaçla, ilk olarak uygun mikrospor gelişme dönemindeki mikrosporlar (çoğunluğu vakuol mikrospor ve genç çift çekirdekli polen) anterlerden izole edilerek 35°C'de 3 gün karanlık koşullarda ön uygulamaya maruz bırakılmış ve ardından mikrosporlar % 2 sakkaroz, 0.5 mg/l NAA ve 0.5 mg/l BAP, pH 5.9, içeren NLN ortamında kültüre alınmış ve bir ay boyunca 25°C'de karanlıkta bekletilmiştir. Bir ay sonunda mikrospor kültürü tekniğine çeşitlerinin tepkisinin belirlenmesi amacıyla, kültüre alma sırasında canlı mikrospor yüzdesi, ön uygulama sonrasında canlı mikrospor yüzdesi, toplam kallus sayısı/petri, 1 mm'den büyük kallus sayısı/petri ve elde edilen embriyo sayıları incelenmiştir. Mikrospor kültürü için "Amadeo" çeşidi kallus ve embriyo oluşumu oranları ile "A117" çeşide göre öne çıkmıştır. Çalışmada daha sonra kullanılan çeşitlerde mikrospor kültürü yöntemini geliştirmek amacıyla arabinogalaktan proteinlerinin, absisik asidin ve farklı hormon konsantrasyonlarının etkisi araştırılmıştır.  AGP etkisini belirlemek amacıyla 10 mg/l, 1 mg/l ve 0.1 mg/l olarak belirlenen dozların patlıcanda mikrospor kültürü üzerine etkileri değerlendirilmiş ve AGP uygulamasının kullanılan çeşitlerde mikrospor kültürü üzerine teşvik edici herhangi bir etkisinin bulunmadığı görülmüştür. ABA'in etkisini belirlemek amacıyla ön uygulama süresince farklı dozlarda ve sürelerde mikrosporlara uygulanmıştır. İlk olarak farklı doz ve sürelerde uygulanan ABA'in mikrosporlarda stres uygulaması ardından kontrole göre mikrosporlarda canlılık üzerine etkileri araştırılmıştır. Her iki çeşitte de kontrole göre tüm ABA konsantrasyonlarının ve uygulama sürelerinin mikrosporlarda canlılık yüzdesini artırıcı etkisinin olduğu belirlenmiştir. "A117" çeşidinde en yüksek mikrospor canlılığı yüzdesi 0.1 mg/l ABA'in 24 saat süreyle uygulanmasından elde edilmiştir. Amadeo çeşidinde ise 1 mg/l ABA'in 24 saat süreyle uygulanmasıyla canlılık yüzdesinde artış meydana gelmiştir. Bu sonuçlardan hareketle 35°C'de 3 günlük ön uygulamanın ilk 24 saatinde "A117" çeşidinde 0.1 mg/l ABA, "Amadeo" çeşidinde ise 1 mg/l ABA uygulanarak mikrosporlar standart protokole göre kültüre alınmıştır. Bir ay sonunda "A117" çeşidinde hem kontrol ortamından hem de ABA uygulaması yapılan ortamlarda herhangi bir kallus gelişimi meydana gelmemiştir. "Amadeo" çeşidinde ise toplam kallus ve 1 mm'den büyük kallus sayıları değerlendirildiğinde; kontrol grubuyla ABA uygulaması arasında istatistiki olarak farklılık önemli bulunmamıştır. Denemenin son aşamasında 2,4-D ve kinetinin farklı konsantrasyonlarını içeren 16 farklı ortam kombinasyonu hazırlanmış ve bu ortamların etkisi incelenmiştir. Araştırma sonunda "A117" çeşidinde toplam kallus sayısı ve 1 mm'den büyük kallus sayısı açısından en etkili ortam 12 numaralı ortam (0.5 mg/l 2,4-D + 1 mg/l KIN) olarak belirlenirken, "Amadeo" çeşidinde en fazla toplam kallus sayısı ve 1 mm'den büyük kallus sayısı kontrol ortamından elde edilmiştir. Çalışmada kullanılan mikrospor kültürü tekniği değerlendirildiğinde mikrosporlardan elde edilen kallus ve embriyolardan başarılı bir şekilde bitki elde edilmiştir. "A117" çeşidinden 36 kallusdan 18 bitki, "Amadeo" çeşidinden ise 70 adet kallusdan 25 bitki elde edilmiştir. Mikrospor kültüründen elde edilen kalluslardan geliştirilen bitkilerin flow sitometri analizleri sonucunda ise bitkilerin ploidi seviyeleri diploid ve triploid olarak belirlenmiştir. Bu bitkilerde DH bitki oranı "A117" çeşidinde % 68 olarak, "Amadeo" çeşidinde ise % 60 olarak belirlenmiştir. Mikrospor kültüründen elde edilen embriyolardan ise yalnızca haploid bitkiler elde edilmiştir. Mikrospor kültüründen elde edilen bitkiler dış koşullara aktarılmış ve daha sonra arazi koşullarına dikilerek meyveleri olgunlaştığında meyveler hasat edilmiş bunlardan tohum üretimi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen tohumlar tekrar ekilerek bunlardan double haploid homozigot hatlar elde edilmiştir.

Abstract:
In the study, two F1 ("A117" and "Amadeo") eggplant cultivars were studied on the possibilities of obtaining haploid and DH plants by microspore culture. For this purpose, microspores were firstly isolated from the anthers of the appropriate microspore developmental stage (mostly vacuole microspores and young twin pollen) and subjected to pretreatment application at 35°C for 3 days in dark conditions. Afterwards microspores were incubated with 2 % sucrose, 0.5 mg/l NAA and 0.5 mg/l BAP, pH 5.9, and incubated in the dark at 25°C for one month. At the end of one month in order to determine the responds of cultivars to microspore culture, percentage of alive microspores at 1st day of microspore isolation, percentage of alive microspores at the end of  3rd day after pretreatment, number of total calli/petri, 1 mm at the end of culture (1st day) number of callus/petri and number of embryos obtained were evaluated. Experimental results revealed that "Amadeo" was prominent in a comparision to "A117" variety in terms of callus and embryo formation rates.  Later on in the study, the effects of arabinogalactan proteins (AGPs), abscisic acid (ABA) and different hormone concentrations were investigated in order to improve the microspore culture method. To determine the AGPs effect on microspore culture, different of doses (10 mg/l, 1 mg/l and 0.1 mg/l) were evaluated and AGP application was found to have no stimulating effect on microspore culture in the cultivars used. ABA was applied to microspores at different doses and durations throughout the pre-treatment period to determine ABA effects. First of all, after stress pre-treatment, the effects of ABA apllied at different doses and durations was compared with control group in terms of microspore viability. It was determined that all applied ABA concentrations and durations in both cultivars enhanced the microspore viability percentage. The highest percentage of microspores viability percentage in the "A117" was obtained by application of 0.1 mg/l ABA for 24 hours. In the "Amadeo" cultivar, the increase in the viability percentage was recorded when 1 mg/l ABA was applied for 24 hours. Based on these findings, microspores were cultured in accordance with standard protocol with applications of  0.1 mg/l ABA for in "A117" and 1 mg/l ABA for in "Amadeo" cultivar in the first 24 hours of 3 days pre-treatment at 35°C. At the end of one month, no callus development occurred in the "A117" in both control and ABA application. When the total callus and callus numbers greater than 1 mm were evaluated in the "Amadeo" cultivar, no statistically significant difference was found between the control group and ABA applications. In addition to AGPs and ABA applications, effects of different doses of 2,4-D and kinetin added to media were investigated. For this purpose, 16 different media combinations containing different concentrations of 2,4-D and kinetin were prepared. At the end of the study, while the most effective medium in terms of total number of calli and number of calli bigger than 1 mm was media 12 (0.5 mg / l 2,4-D +1 mg / l KIN), control medium gave the best result in terms of total number of calli and number of calli bigger than 1 mm for Amadeo. When the microspore culture technique used in the study was evaluated, the plantlets were successfully obtained from the calli and embryos obtained from microspores. A total of 18 plants from 36 calli for "A117" cultivar and 25 plants from 70 calli were obtained for "Amadeo" cultivar. The flow cytometry analyzes of the plants developed from the calli obtained from microspore culture revealed that the ploidy levels of obtained plants were diploid and triploid. The DH plant percentage of plants obtained from calli was determined as 68 % in the "A117" cultivar and 60 % in the "Amadeo" cultivar.  On the other hand, only haploid plants were obtained from the embryos obtained from microspore culture. The plants obtained from the microspore culture were transferred to field conditions for selfing. After selfing obtained seeds were planted in the field conditions and the fruits were harvested when the fruits were mature. The obtained seeds were re-seeded to obtain double haploid homozygous lines.