Horseradish peroxidase-inorganik hibrit nano yapıların (nanoflowers) hazırlanması, katalitik aktiviteleri ve stabilitelerinin incelenmesi
Preparation of horseradish peroxidase-inorganic hybrid nano structures (nanoflowers), investigation of catalytic activities and stability
Yazar: OYA ÜSKÜP
Danışman: PROF. DR. TÜLİN AYDEMİR
Manisa Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Enzimlerin devamlı olarak kullanılabilmesi için, aktivitelerinin, kararlılıklarının ve geri kazanımlarının arttırılması gerekmektedir. Serbest enzimlerin, reaksiyon ortamından ayrılmalarının ve tekrar kullanılmalarının zor olması gibi dezavantajlarından dolayı uygulamaları sınırlıdır. Tüm bu sınırlamaları gidermek için enzim immobilizasyonu, kullanılan pek çok yöntemden biri olmuştur. 
Bu çalışmada, yaban turbu peroksidaz (HRP) enzimi ile Cu2+, Ca2+ ve Mn2+ iyonları kullanılarak hibrit nanoçiçek yapıları sentezlendi. Sentezlenen hibrit nanoçiçekler glutaraldehit ile çapraz bağlandı ve tüm hibrit nanoçiçeklerin optimum pH, sıcaklık, boya gideriminde tekrar kullanılabilirlikleri, substrat spesifikllikleri ve enzim kaçış oranları belirlenerek kinetik parametreleri tayin edildi. 
Sentezlenen hibrit nanoçiçeklerin karakterizasyon çalışmalarında SEM, FTIR, XRD ve EDX analizleri yapıldı. SEM görüntüleri incelendiğinde; çiçek şekilli CuNF-HRP, CaNF-HRP ve MnNF-HRP hibrit nanoçiçek yapılarının oluştuğu gözlemlendi. Glutaraldehit ile çapraz bağlanan hibrit nanoçiçek yapıları incelendiğinde; normal hibrit nanoçiçek yapılarına göre boyutlarının küçüldüğü, gözeneklerinin sıkılaştığı tespit edildi. Sentezlenen hibrit nanoçiçek yapılarının immobilizasyon verimleri CuNF-HRP için %91, CaNF-HRP için %88 ve MnNF-HRP için %85 olarak bulundu. Yapılan optimizasyon çalışmalarında, serbest ve immobilize nanoçiçek yapılarının optimum sıcaklık değeri 40oC, optimum pH değeri ise 6,0 olarak bulundu. Serbest enzimin KM ve Vmax değerleri sırasıyla 25,16 mM ve 22,27 U/mL olarak saptandı. Hibrit nanoçiçek yapılarında ise CuNF-HRP için KM ve Vmax değerleri 30,53 mM ve 5,63 U/mg, CaNF-HRP için KM ve Vmax değerleri 34,24 mM ve 5.51 U/mg, MnNF-HRP için KM ve Vmax değerleri 31,83 mM ve 4,95 U/mg bulundu. 
Çalışmanın ikinci kısmında elde edilen hibrit nanoçiçek yapılarının katalitik performanslarını incelemek amacı ile boya giderimi ve fenolik bileşik oksidasyonu yapıldı. Boya giderim çalışmaları için Amarant, Tartrazin ve Kristal Viole model boyalar olarak kullanıldı. Fenol oksidasyonu için Katekol, Pirogallol, L-Tirozin, Fenol ve Gayakol fenolik bileşikleri kullanıldı. Sentezlenen immobilize enzimler %80-96 aralığında boya giderimi, %65-91 aralığında ise fenolik bileşik oksidasyonu sağladığı tespit edildi.

Abstract:
In order to use the enzymes continuously, their activity, stability and recovery should be increased. Their application is limited due to the disadvantages that free enzymes are difficult to separate and reuse from the reaction medium. Enzyme immobilization has been one of the many methods used to address all these limitations.
In this study, hybrid nano-flower structures were synthesized using horseradish peroxidase (HRP) enzyme using Cu2 +, Ca2 + and Mn2 + ions. The synthesized hybrid nanoflowers were crosslinked with glutaraldehyde and the kinetic parameters were determined by determining the reusability, substrate specificity and enzyme escape rates of all hybrid nanoflowers at optimum pH, temperature, dye removal. 
SEM, FTIR, XRD and EDX analyzes were performed in the characterization studies of synthesized hybrid nanoflowers. When SEM images were examined; flower-shaped CuNF-HRP, CaNF-HRP and MnNF-HRP hybrid nanoflower structures were observed. When hybrid nano-flower structures cross-linked with glutaraldehyde were examined; According to the normal hybrid nano-flower structures were reduced in size, pores tightened. The immobilization yields of the synthesized hybrid nanoflower structures were found to be 91% for CuNF-HRP, 88% for CaNF-HRP and 85% for MnNF-HRP. In the optimization studies, the optimum temperature value of free and immobilized nano-flower structures was found to be 40 ° C and the optimum pH value was 6.0. KM and Vmax of the free enzyme were 25.16 mM and 22.27 U / mL, respectively. In hybrid nanoflower structures, KM and Vmax values for CuNF-HRP were 30.53 mM and 5.63 U / mg, KM and Vmax values for CaNF-HRP were 34.24 mM and 5.51 U / mg, KM and Vmax for MnNF-HRP. 31.83 mM and 4.95 U / mg.
In the second part of the study, dye removal and phenolic compound oxidation were performed in order to investigate the catalytic performance of hybrid nanoflower structures. Amarant, Tartrazine and Crystal Viole model paints were used for dye removal. Catechol, Pyrogallol, L-Tyrosine, Phenol and Guaiacol phenolic compounds were used for phenol oxidation. It was determined that the immobilized enzymes produced dye removal in 80-96% and phenolic compound oxidation in 65-91%.