DPP-4 inhibitörü vildagliptin ve saksagliptin' in SH-SY5Y hücrelerinde koruyucu etkilerinin araştırılması
Investigation of protective effects of DPP-4 inhibitors vildagliptine and saxagliptine on SH-SY5Y cell line
Yazar: ALİM HÜSEYİN DOKUMACI
Danışman: DOÇ. DR. MÜKERREM BETÜL AYCAN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Eczacılık Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Amiloid = Amyloid ; Memantine = Memantine ; Saksagliptin = Saxagliptin ; Vildagliptin = Vildagliptin

Özet:
Bu tez çalışmasında Dipeptidil peptidaz-4 (DPP-4) enzim inhibitörü antidiyabetik ilaç olarak kullanılan vildagliptin ve saksagliptinin amiloid-beta (Aβ) uygulamasına karşı SH-SY5Y hücrelerinde koruyucu etkisi hücresel bazı yolaklar üzerinden araştırılmıştır. 

Deney grupları: Kontrol; vildagliptin (250, 100, 50 µM); saksagliptin (200, 100, 50 µM); memantin (100µM); Aβ (5µM) olarak belirlenmiştir. Etken maddelerin tek başlarına ve Aβ varlığında gerçek zamanlı hücre analizi yöntemi (GZHA), (3-(4,5-Dimetil-2-tiyazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolium bromid) MTT ve suforodamin B (SRB) yöntemleri ile SH-SY5Y hücrelerine olan etkileri incelenmiştir. Western blot tekniği ile 24. saatteki p-tau, kaspaz-3, kaspaz-9, kaspaz-12 protein ekspresyon düzeyleri analiz edilmiştir. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile Amiloid prekürsör protein (APP), presenilin1 (PSEN1) ve presenilin2 (PSEN2) gen ekspresyon düzeyleri ölçülmüştür. Mitokondrial membran potansiyeli (MMP) ve nitrik oksit (NO) düzeyleri de yine hücrelere etken maddeler ve Aβ uygulandıktan sonra 24. saatte ölçülmüştür.
Aβ uygulanan gruplarda kontrole göre canlılık istatistiksel olarak anlamlı (p<0,001) azalmıştır. 250 µM vildagliptin (p<0,001), 100 µM saksagliptin (p<0,01) ve 100 µM memantin (p<0,001) uygulanan gruplar da canlılığı Aβ uygulanan gruba göre anlamlı arttırmıştır. MMP düzeyinde ise, vildagliptinin 250 ve 100 µM uygulanan grup ile saksagliptinin 100 µM  uygulanan gruplarda kontrole yakın grafik alınmıştır.
Aβ uygulanan gruplarda kontrole göre kaspaz-3 (p<0,01) ve kaspaz-12 (p<0,001) artmıştır. Vildagliptinin 250 µM kaspaz-3 (p<0,05) ve kaspaz-9'u (p<0,001) Aβ uygulanan gruba göre anlamlı azaltmıştır. Fosforile tau proteini Aβ uygulanan gruplarda kontrole göre artmış (p<0,01), vildagliptin ve saksagliptin konsantrasyona bağımlı p-tau'yu Aβ grubuna göre azaltmıştır. Memantin ise p-tau'yu Aβ grubuna göre anlamlı (p<0,05) azaltmıştır.
APP mRNA düzeyi saksagliptinin 200µM konsantrasyonu uygulanan grupta kontrole kıyasla düşmüştür. PSEN1 mRNA düzeyi vildagliptinin tüm konsantrasyonlarda, 100 µM memantin uygulanan grupta ve saksagliptinin 100 ve 50  µM konsantrasyonu uygulanan gruplarda kontrole göre anlamlı (p<0,001) düşmüştür. PSEN2 mRNA düzeyi 100 µM vildagliptin ve 50 µM saksagliptin uygulanan gruplarda kontrole göre anlamlı (p<0,01) düşmüştür.
DPP-4 inhibitörü oral antidiyabetik ilaçlardan olan vildagliptin ve saksagliptinin SH-SY5Y hücrelerinde Aβ toksisitesine karşı ve yalnız başlarına gösterdikleri etkilerin ilk kez incelendiği bu tezden elde edilen veriler ışığında vildagliptin ve saksagliptinin Alzheimer hastalığı (AH) tedavisinde temel stratejilerden olan nörodejenerasyon ve apoptozu önlemede daha ileri çalışmalarla da desteklenmek kaydıyla etkili olabileceği çıktısı elde edilmiştir.

Abstract:
In this thesis , we investigated possible protective effect of vildagliptine and saxagliptine, which are being used for their oral anti-diabetic effect as DPP-4 enzyme inhibitors, against Aβ toxicity on SH-SY5Y cell line.
Experimental groups are assigned as control; vildagliptine (250, 100, 50 µM); saxagliptine (200, 100, 50 µM); memantine 100µM; Aβ 5µM. Drug's cell response profiles eludicated with xCELLigence, SRB and MTT assay. Than optimum doses of drugs used for advanced analysis. Caspase-3, caspase-9, caspase-12 and p-tau protein levels were investigated after 24 hours post treatment of drugs and Aβ with Western blot assay. APP, PSEN1 and PSEN2 mRNA levels were measured after 24 hours post treatment of drugs with RT-PCR technique. Also MMP and NO levels were measured at the same time.
Cell viability was decreased by Aβ treated group significantly (p<0.001). Viability was increased by vildagliptine (250µM), saxagliptine (100µM) and memantine (100µM) comparing to Aβ treated group significantly p<0.001, p<0.01, p<0.001, respectively. MMP values decreased by Aβ treatment. Furthermore vildaglitine (250, 100 µM) and saxagliptine (100µM) recovered MMP to nearby control group.
Caspase-3 and caspase-12 protein levels were increased (p<0.01 and p<0.001, respectively) by Aβ treated group comparing to control. Vildagliptine decreased caspase-3 and caspase-9 levels comparing to Aβ treated group (p<0.05 and p<0.001, respectively). Phosphorylated tau protein was increased comparing to control (p<0.01), vildagliptine and saxagliptine decreased p-tau in a dose dependent manner comparing to Aβ treated group. Memantine also decreased p-tau level comparing to Aβ treated group (p<0.05).
APP mRNA level was decreased by saxagliptine (200 µM) comparing to control group. PSEN1 mRNA level was decreased by vildagliptine (250, 100, 50 µM), saxagliptine (100, 50 µM) and memantine (100µM) comparing to control (p<0.01). PSEN2 mRNA level was decreased by vildagliptine (100µM) and saxagliptine (50µM) comparing to control.
In this thesis, we investigated the oral anti-diabetic drugs; vildagliptine and saxagliptine, whether they have any effects to above parameters on SH-SY5Y cell line or not first time.
Vildagliptine and saxagliptine decreased the p-tau protein, PSEN1 and PSEN2 mRNA levels which are playing important role in Alzheimer's disease. Caspase-3 and caspase-9 protein levels, play critical role on apoptosis, decreasing by vildagliptine comparing to Aβ treated group. In addition vildagliptine and saxagliptine protected SH-SY5Y cells against Aβ toxicity. This effect obtained with real time cell response profiles and MTT assay and for the first time have been showed in this thesis.