Termofilik bakterilerden proteaz üretimi, saflaştırılması, karakterizasyonu ve endüstriyel uygulama potansiyellerinin belirlenmesi
Production, purification, characterization and determination of industrial application potentials of protease from thermophilic bacteria
Yazar: SEZGİN KARAMAN
Danışman: PROF. DR. KUBİLAY METİN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Hücre dışı proteaz = Extracellular protease ; Karakterizasyon = Characterization ; Rekombinant proteaz üretimi = Recombinant protease production ; Tasarım optimizasyonu = Design optimization

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında termofilik bakteri kaynaklı proteaz enziminin saflaştırılarak karakterize edilmesi ve bu enzimin rekombinant DNA teknolojisi aracılığıyla üretiminin artırılarak endüstriyel uygulama alanlarının belirlenmesi amaçlanmıştır.
Materyal ve Yöntem: Kalitatif ve kantitatif proteaz aktivitesi tayin yöntemleri kullanılarak 201 termofilik bakteri arasından en fazla proteaz üreten izolat seçilmiştir. Seçilen izolatın türü 16s rRNA metodu ile tayin edilip proteaz enzimi üretim koşulları deneysel tasarım ile optimize edilmiştir. Proteaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi, hidrofobik etkileşim kromatografisi ve iyonik etkileşim kromatografisi kullanılarak saflaştırılmış ve kimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. Karakterize edilen enzim pET-30a(+) vektörü kullanılarak kimyasal transformasyon yöntemi ile E. coli BL21(DE3) hücrelerine klonlanmıştır. Rekombinant enzimin karakterizasyonu yapılarak endüstriyel uygulama potansiyelleri araştırılmıştır.
Bulgular: Seçilen termofilik bakterinin Geobacillus thermoleovorans türü olduğu tanımlanmış ve salgıladığı proteaz enzimi E. coli BL21(DE3) hücrelerinde 470 katlık artışla rekombinant olarak üretilmiştir. Yabanıl ve rekombinat enzimlerin optimum olarak pH 8,0 ve 70 °C'de çalıştıkları saptanmıştır. Rekombinant enzimin kollajenaz, keratinaz, et hidroliz ve leke çıkarma aktiviteleri tespit edilmiştir.
Sonuç: Termofilik bakteri kökenli olan proteaz enziminin rekombinant DNA teknolojisi ile yüksek miktarda üretebileceği ve üretilen enzimin Ca+2 varlığında zorlu endüstriyel süreçlere dayanıp yüksek sıcaklıkta optimum olarak kullanabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Objective: In this PhD thesis, it is aimed to purify and characterize the protease enzyme obtained from thermophilic bacteria and to determine the industrial application areas by increasing the production of this enzyme with recombinant DNA technology.
Material and Methods: The highest protease producing isolate was determined by quantitative and qualitative protease activity determination methods among 201 thermophilic bacteria. The protease production of the selected isolate was optimized by the experimental design and strain identification was performed by the 16s rRNA method. The enzyme was purified using ammonium sulfate precipitation, hydrophobic interaction chromatography and ionic interaction chromatography. After determining the type of enzyme by chemical characterization, it was cloned into E. coli BL21(DE3) cells by chemical transformation method using the pET-30a(+) vector. Industrial application potentials of the obtained recombinant enzyme were investigated.
Results: Geobacillus thermoleovorans species was identified among thermophilic bacteria and the protease enzyme it secreted was produced recombinantly in E. coli BL21(DE3) cells with a 470-fold increase. It was determined that wild and recombinant enzymes work optimally at pH 8,0 and 70 °C. Collagenase, keratinase, meat hydrolysis and destaining activities of the recombinant enzyme were determined.
Conclusion: It was concluded that the protease enzyme obtained from thermophilic bacteria can be produced in high quantities by recombinant DNA technology and can be used in industrial processes with high temperatures due to in the presence of Ca+2