Bazı liken sekonder metabolitlerin sentezinde poliketid sentez (PKS) genlerinin ve ekspresyonlarının potansiyel etkilerinin belirlenmesi
Determination of the potential effects of polyketide synthesis (PKS) genes and expressions in the synthesis of some lichen secondary metabolites
Yazar: BİRKAN AÇIKGÖZ
Danışman: DOÇ. DR. GÜLŞAH ÖZYİĞİTOĞLU ; DOÇ. DR. NÜZHET CENK SESAL
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Sentetik ilaçlar yerine doğal ürünlerden elde edilen ilaçlar günümüzde hastalıkların tedavisinde tercih edilmektedir. Eski zamanlardan beri hastalıkların iyileştirilmesinde çeşitli likenlerden de yararlanıldığı bilinmektedir. Ancak likenler, oldukça yavaş büyüyen organizmalar olmalarından dolayı, etken madde elde edilmesi bakımından sınırlı bir kaynak olarak düşünülmektedir. Likenlerden endüstriyel anlamda yararlanmak için bazı türlerden uygun miktar materyal bulmak oldukça zor olmaktadır. Ayrıca doğada az görülen bazı liken türlerini korumak ve yayılışı fazla olan türleri de bilinçli toplamak gerekmektedir. Değişen doğal habitat koşullarına bağlı olarak sekonder metabolit üretimindeki olası değişimler de söz konusudur. Bu yaklaşımla, liken maddelerinin labotatuvar şartlarında çoğaltılması amacından yola çıkılarak, likenlerde sekonder metabolitlerin sentezlenmesinde etkili olan poliketid sentez (PKS) genlerinin stres altında ekspresyon seviyesindeki, etken madde üretimindeki ve buna bağlı olarak biyolojik aktivitedeki değişimin incelenmesi hedeflenmiştir. 
Bu amaç doğrultusunda, Bursa Alaçam/Uludağ lokalitesinden toplanan Hypogymnia tubulosa (Schaer.) Hav. örneklerinden elde edilen aseton özütü Pseudomonas aeruginosa PAO1 CECT 4122 ve Staphylococcus aureus ATCC 25923 bakteri suşlarının büyüme eğrisi ve biyofilm oluşumu üzerine etkileri Cytation 3 cihazında spektrofotometrik olarak test edilmiştir. Bakteri suşlarının büyüme eğrisi ve biyofilm oluşumu üzerine aktiviteye sahip olduğu tespit edilen H. tubulosa mikobiyont örnekleri Türkiye'de ilk defa kültüre alınmıştır. Türkiye'de yayılış gösteren H. tubulosa mikobiyont örneğinin moleküler tür tayini ilk defa yapılmış olup biyoinformatik yöntemlerle filogenetik ağaçları oluşturulmuştur. Kültürde büyüyen örneklere sıcaklık, ışık, nitrat ve asetat stresi uygulanmıştır. 15 ve 30 gün süreyle büyüyen örneklerin büyüme oranları hesaplanmıştır. H. tubulosa için ilk kez dizayn edilen primerlerle strese maruz bırakılan örneklerin kRT-PZR'la PKS gen ekspresyon oranındaki değişim incelenmiştir. Stres koşullarının etken madde üretimini ve buna bağlı olarak bakteri suşlarının büyüme eğrisi ve biyofilm oluşumu üzerine aktivitesini etkilemiş olabileceği düşünülerek tüm örneklerden elde edilen aseton özütleri aktivite testine tabi tutulmuştur. Özütlerin içeriği ince tabaka kromatografisi ile incelenmiştir.
Çalışma sonunda, Bursa lokalitesinden toplanan taze liken örneklerinin aseton özütünün S. aureus bakteri suşlarının büyüme eğrisi ve biyofilm oluşumu üzerine oldukça etkili olduğu gözlenmiştir. P. aeruginosa PAO1 suşunun büyüme eğrisi üzerine sınırlı etkisi olsa da, özellikle biyofilm oluşumunu azalttığı tespit edilmiştir. Kültüre alınan H. tubulosa mikobiyont örneklerinin büyüme oranları incelendiğinde 15 günlük örneklerin 30 günlük örneklere göre daha fazla büyüme oranına sahip olduğu belirlenmiştir. Büyümenin daha fazla olduğu 15 günlük örneklerde 30 günlük örneklere oranla gen ekspresyonunun daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Benzer şekilde kültür ortamında asetat stresine maruz bırakılan mikobiyontların büyüme oranının daha az olduğu tespit edilirken, asetat stresine maruz bırakılan mikobiyontlarda gen ekspresyon oranı nitrat ve nitrat-asetat örneklerine göre oldukça yüksek bulunmuştur. PKS ekspresyon oranının büyüme oranı ile ters orantılı olduğu gözlenmiştir. Sıcaklık stresine maruz bırakılan mikobiyontlarda genellikle 15 oC'de ekspresyon oranının arttığı görülmüştür. Işık stresine maruz bırakılan mikobiyontlarda ise karanlık ortamın PKS gen ekspresyonunu artırdığı tespit edilmiştir. 
Strese maruz bırakılan mikobiyontların aseton özütleri P.aeruginosa PAO1 ve S. aureus bakteri suşlarının büyüme eğrisi ve biyofilm oluşumu üzerine etkili bulunmuştur. Özellikle P.aeruginosa PAO1 suşu üzerine sıcaklık ve ışık stresi altındaki mikobiyontların doğal örneklerden daha etkili oldukları tespit edilmiştir. Nitrat ve asetat stresine maruz bırakılan örnekler incelendiğinde PKS gen ekspresyon oranının fazla olduğu asetat örneklerinin antibiyofilm aktivitesinin daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Örneklerin sahip olduğu sekonder metabolitleri tespit etmek için uygulanan kromatografi testleri sonucunda örneklerde belirgin 4 madde tespit edilmiştir. Kültür örneklerinde tespit edilen bu maddelere doğal örneklerde rastlanmamıştır. Stres koşullarının PKS gen ekspresyonunu, metabolit üretimini ve bakteri suşlarının büyüme eğrisi ve biyofilm oluşumu üzerine aktiviteyi etkilediği görülmektedir. Mikobiyontların kültürde çoğaltılarak endüstri alanında uygulanabilmesi için, örneklerin önce boyutunu artırıcı faktörlere maruz bırakılıp yeterli boyuta ulaştıktan sonra strese maruz bırakılarak metabolit üretiminin artırılabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Medicines obtained from natural products instead of synthetic drugs are now preferred in treatment of diseases. It is known that since ancient times various illnesses have benefited from various lichens. However, lichens are considered to be a limited resource in terms of active compounds as they are very slow growing organisms. It is very difficult to find the appropriate amount of material from some species to benefit industrially from lichens. Moreover, it is necessary to conserve some lichen species that are rarely found in nature and to consciously collect the species with a large distribution. Depending on the changing natural habitat conditions, possible changes in the production of secondary metabolites are also discussed. Therefore, with the intent of producing lichen substances under laboratory conditions, it is aimed to investigate the expression levels of polyketide synthase (PKS) genes, which are effective in the synthesis of secondary metabolites with biological activity, in lichens, and the changes in active compound production, biological activity and expression level of these genes under stress. For this purpose, the acetone extracts obtained from Hypogymnia tubulosa (Schaer.) Hav. lichen species collected from Bursa Alaçam / Uludağ locality were tested on Pseudomonas aeruginosa PAO1 CECT 4122 and Staphylococcus aureus ATCC 25923 bacterial strains growth curve and biofilm formation spectrophotometrically with the Cytation 3 instrument. The specimens of H. tubulosa mycobionts that have shown growth and biofilm inhibitory effects were cultured for the first time in Turkey. Molecular identification of the mycobiont samples of H. tubulosa spread in Turkey were performed for the first time and the phylogenetic trees were created by employing bioinformatical methods. "Temperature", "light", "nitrate" and "acetate" stress factors were applied to growing culture samples. The growth rates of the samples for 15 and 30 days were calculated. The change in the ratio of PKS gene expressions were examined via qPCR for the samples exposed to the stress with the primers designed for the first time for H. tubulosa. Acetone extracts from all samples were tested for biological activity given that stress conditions may have affected the active ingredient production and hence the growth curve and biofilm formation of bacterial strains. The ingredients of the extracts were examined by thin layer chromatography.
At the end of the study, it was observed that the acetone extracts of fresh lichen samples collected from Bursa locality were highly effective on the growth curve and biofilm formation of S. aureus bacteria strains. Although there was a limited effect on P. aeruginosa PAO1 growth curve, an inhibitory effect on biofilm formation was observed. When the growth rates of cultured H. tubulosa mycobiont samples were examined, 15-day samples were found to have a higher growth rate than 30-day samples. It was determined that gene expressions were lower in 15 day samples which have shown higher growth, compared to 30 day samples. Similarly, growth rate was lower in mycobionts exposed to acetate stress and gene expression rates were significantly higher than the samples exposed to nitrate and nitrate-acetate stress. PKS expression ratio was observed to be inversely proportional to the growth rate. In mycobionts exposed to heat stress, it was observed that gene expression levels generally increased at 15 oC. Moreover, in the mycobionts exposed to light stress; gene expression levels were found to increase in dark conditions.
The acetone extracts of the mycobionts exposed to stress were found to be effective on the growth curve and biofilm formation of P. aeruginosa PAO1 and S.aureus bacterial strains. It was found that mycobionts under temperature and light stress were more effective on P. aeruginosa PAO1 strains than natural lichen specimens. When the samples exposed to nitrate and acetate stress were examined, it was observed that the acetate samples with higher PKS gene expression ratio had higher anti-biofilm activity. As a result of the chromatographic tests performed to detect secondary metabolites in the samples, 4 distinct substances were identified. These substances were detected in mycobiont samples unlike natural samples. 
Stress conditions have been shown to be effective on PKS gene expressions, metabolite production and growth curve and biofilm production of the bacterial strains. It is concluded that in order for the mycobionts to be applied in industrial field by being propagated in culture, the metabolite production could be increased by first exposing the samples to size enhancing factors, and after reaching adequate size they can be exposed to stress.