Farelerde Toxoplasma Gondii ME49 suşu ile deneysel enfeksiyonda patolojik bulgular, kist lokalizasyonu ve kist büyüklüklerinin incelenmesi
Evaluation of pathological findings, cyst localization and cyst sizes in experimental infection of Toxoplasma Gondii ME 49 strain in mice
Yazar: SEYHAN BÜYÜKKAYAER
Danışman: DOÇ. DR. OĞUZ KUL
Kırıkkale Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Patoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2010
Konu: Patoloji = Pathology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Beyin = Brain ; Fareler = Mice ; Hayvan hastalıkları = Animal diseases ; Kistler = Cysts ; Toksoplazma = Toxoplasma ; İmmünperoksidaz boyama tekniği = Immunoperoxidase staining procedure

Özet:
Toksoplazmoz insan dahil memeli hayvanlar ile kanatlılarda Toxoplasma gondii tarafından oluşturulan, atık, ölü doğum ve ölümcül enfeksiyonlarla karakterize sistemik protozoer bir enfeksiyondur. Toxoplasma gondii doku kistleri, parazitin konak savunmasından kolaylıkla saklanabildikleri ve yavaş çoğalan dinlenme aşaması olarak bilinirler. Toksoplazmozun doku kistleri üzerine yapılan deneysel invivo çalışmalarda, etkenin ookistleri oral ya da intraperitoneal yolla verilerek enfeksiyon şekillendirilebilmektedir. Özellikle, bir molekül ya da ilacın doku kistine etkinliğinin araştırıldığı deneysel çalışmalarda, deney hayvanlarının beyinlerinde kist varlığı, yerleşimi, büyüklüğü ve sayısının önceden bilinmesi büyük önem taşımaktadır. Benzer şekilde değişik inokülasyon yollarında, beynin hangi bölgesinde daha çok doku kisti oluştuğu ya da herhangi bir patolojik anatomik bölge seçimi olup olmadığı konularının aydınlatılmasına ihtiyaç bulunmaktadır.Bu çalışmada, oral ve intraperitoneal yollarla T. gondii ME49 suşu verilerek, inokülasyon sonrası 30 ve 60 ıncı günlerde şekillenen doku kistlerinin; beyinde yerleşimi, büyüklükleri, sayılarının belirlenmesi ve beyinde şekillenen histopatolojik değişikiklerle birlikte değerlendirilmesi amaçlandı. Çalışmada 28 adet 2 aylık Swiss albino dişi fare kullanıldı. Her birinde 7 fare yer alacak şekilde 4 ayrı grup oluşturuldu. Grup 1 (n=7) ve Grup 2 (n=7) `ye oral yolla, Grup 3 (n=7) ve Grup 4 (n=7) `e ise intraperitoneal yolla 2x10² Toxoplasma gondii ME49 ookisti verildi. Etken inokülasyonundan 30 gün sonra Grup 1 ve Grup 3, 60 gün sonra ise Grup 2 ve Grup 4'deki farelere ötenazi yapılarak beyinleri çıkarıldı. Rutin doku takip yöntemleri ile işlenmek üzere; beyincik, beyin kökü, orta beyinden geçecek şekilde alınan parasagittal kesitler parafine gömülerek, 5 µm kalınlığındaki kesitler alındı ve hematoksilen eozin ile boyandı. Toxoplasma gondii doku kisti antijenine karşı hazırlanan poliklonal fare anti-T.gondii primer antikoru kullanılarak immunoperoksidaz teknikle muayene edildi. Histopatolojik incelemede beynin farklı bölgelerinde meydana gelen; meningitis, perivasküler hücre infiltrasyonu ve gliozis şiddeti skorlanarak karşılaştırıldı. Enfeksiyon sonrası meydana gelen yangısal reaksiyonun, intraperitoneal grup fare beyinlerinde, oral inokülasyon yapılanlara oranla nispeten daha şiddetli olduğu ve inokülasyon sonrası geçen zamanla birlikte yangı şiddetinin azaldığı tespit edildi. Doku kistlerinin dağılımı açısından, orta beyin bölümünün beyin kökü ve beyinciğe oranla daha yoğun doku kisti içerdiği izlendi. Doku kistlerinin etrafında çoğu zaman herhangi bir yangısal reaksiyona rastlanmazken bazı bölgelerde yoğun mikroglia ve astrosit kümeleri içeren fokal alanlara rastlandı.Lezyonlar başlıca sırasıyla; orta beyin, beyin kökü ve beyincikte azalan şiddette tespit edildi. Orta beyinde özellikle ammon boynuzu, perihipokampal bölge ve amigdaloid komplekste lezyonların yoğun bir şekilde meydana geldiği görüldü. Doku kistlerinin özellikle damarlar etrafında yoğunlaştığı ve orta beyin bölgesinde görülen doku kistlerinin birbiriyle temas edecek kadar yakın dizilerek gruplar oluşturduğu gözlendi. Oluşan doku kistlerinin çap ortalaması Grup 1 de 16,29 µm , grup 2 de 17,83 µm, grup 3 te 21,05 µm ve grup 4 te 23,47 µm bulunmuştur. Buna göre intraperitoneal inokülasyon yapılan gruplarda inokülasyon sonrası aynı günlerde oluşan doku kistlerinin, oral inokülasyon yapılan gruplara oranla daha büyük olduğu anlaşıldı.İmmunoperosidaz test sonuçlarına göre; etkilenen bölgelerde dejeneratif ve nekrotik nöron sitoplazmaları, mikroglia ve bazı astrosit sitoplazmalarında T. gondii doku kisti spesifik antijen pozitif reaksiyonlara rastlandı. Özellikle, gliozis alanlarında, noktasal ve granüler tarzda immunreaksiyonlar tespit edildi. Doku kistlerinin, hem bradizoit, hem de daha zayıf olmak üzere kist duvarı anti- Toxoplasma gondii antikoruna karşı immunreaksiyon gösterdi. Doku kistleri içerisindeki bradizoitler, her biri ayrı ayrı seçilebilecek çilek veya üzüm salkımı benzeri bir görüntü gösterirken, immunoreaktivitenin yoğun olduğu doku kistlerinde iç detay seçilemedi.Sonuç olarak; İntraperitoneal inokülasyon yapılan farelerde, oral inokülasyon yapılan farelere oranla gliozis, meningitis ve perivasküler hücre infiltrasyonunun daha şiddetli şekillendiği ve doku kistlerinin daha büyük olduğu görülmüştür. Beyincik, orta beyin ve beyin kökü gliozis açısından incelendiğinde; lezyonların beyincikte en hafif düzeyde seyrettiği görülmüştür. Yine bu üç anatomik bölge lezyonların şiddeti açısından değerlendirildiğinde en şiddetli lezyonların orta beyinde meydana geldiği dikkati çekmiştir. Ayrıca intraperitoneal inokülasyon yapılan farelerde 30. günde nekropsi yapılan farelerde şekillenen perivasküler hücre infiltrasyonunun 60. günde nekropsi yapılan farelere oranla daha şiddetli seyrettiği anlaşılmıştır. Bu çalışmayla birlikte, T. gondii ME 49 suşu ile fare beyinlerinde doku kisti modeli Türkiye'de ilk kez uygulanmıştır. Türkiye'de daha önceden gerçekleştirilen deneysel çalışmaların birçoğu, T. gondii Tip I suşları (RH, Ankara) ile akut ve ölümcül sonlanan deney hayvanı modellerine işaret etmektedir.

Abstract:
Toxoplasmosis is an infection that is characterized by stillbirth and lethal infection induced by Toxoplasma gondii in birds and mammals including human beings. Tissue cysts of Toxoplasma gondii are known as a resting and slowly dividing phase of parasite by the affects of immunocompotent host immunity. In the experimental in vivo studies that are made on Toxoplasma gondii tissue cysts, infection can be produced by applying oocysts via oral or intraperitoneal way. Especially, in the experimental studies, in which it is researched that a molecule or a medicine has effects on tissue cyst, it is very important that to know the existence, localization, size and number of cyst in the brains of experimental animals in advance. Accordingly, it is needed to be enlightened about the subjects that more tissue cysts are formed or whether it is any pathologic anatomic location at which part of the brain.In this study, it is aimed to determine the localization, size and number of the tissue cysts, which take form on the 30th and 60th days after inoculation, and assessment with histopatological changes taking place in brain. Four separate groups, each having 7 mice, have been formed. 2x102 Toxoplasma gondii ME49 oocysts has been given to the Group 1 (n = 7) and Group 2 (n = 7) orally and to the Group 3 (n = 7) and Group 4 (n = 7) via intraperitoneal way. The brains of the mice in the Group 1 and Group 2 were extracted through euthanasia postinoculation 30th day, and the brains of the mice in the Group 3 and Group 4 were extracted through euthanasia after 60 days from the inoculation. Parasagittal sectioned brain samples, which are taken in a way that can pass through the cerebellum, brainstem and midbrain and sections, having a thickness of 5 ?m, have been taken and they have been stained with haematoxylin and eosin, routinely. Polyclonal anti-T. gondii primary antibody has been used and the mouse, which is prepared against Toxoplasma gondii tissue cyst antigen, has been treated with immunoperoxidase technique. Meningitis, perivascular cell infiltration and gliosis, occurred at the different parts of the brain has been compared and scored at histopathological examination. It has been detected that the inflammatory reaction, which has occurred after the infection, is more severe at the brains of intraperitoneal group mice than the brains of oral group mice and the severity of the inflammation has decreased as time passed after inoculation. From the point of the distribution of tissue cysts, it has been observed that midbrain comprises of more tissue cysts than the ones at brainstem and cerebellum. While there is not any inflammatory reaction around the tissue cysts, it is seen that there are focal areas, which consist of dense microglia and astrocyte accumulation, in some places.Lesions have been detected mainly in a decreasing severity in the midbrain, brainstem and cerebellum respectively. It has been observed that lesions have been occurred densely at midbrain especially at cornu ammonis, perihippocampal area and amygdaloid complex. It has been observed that the tissue cysts have become dense especially around the venous capillaries and the tissue cysts, which have been seen at midbrain area, have formed groups by having lines close as if they can touch with one another. Approximate diameter of the tissue cysts is 16,29 ?m in Group 1, 17,83 ?m in Group 2, 21,05 ?m in Group 3 and 23,47 ?m in Group 4. According to this, it has been understood that the tissue cysts, which have been formed on the same days after inoculation at the groups, at which intraperitoneal inoculation have been applied, are bigger than the groups at which oral inoculation has been applied.According to the immunoperoxidase test results; T. gondii tissue cyst specific antigen positive reactions were detected in degenerative and necrotic neuron cytoplasm in the affected areas and in microglia and some astrocyte cytoplasms. Especially, pointed and granular immune reactions have been seen. Bradyzoites showed a strong T. gondii antigen positive immunreaction but reaction against tissue cyst wall was weak. While bradyzoites inside the tissue cysts have an image similar to strawberry or bunch of grapes that can be recognized separately, close details have not been recognized at the tissue cysts in which the immune reactivity is dense.As a result; it has been seen that gliosis, meningitis and perivascular cell infiltration were more severe and the tissue cysts are bigger in the mice of intraperitoneal inoculation, than the ones at the mice at which oral inoculation has been applied. When the cerebellum, midbrain and brainstem are examined; it has been seen that lesions are in the mildest level in the cerebellum. When these three anatomic areas are assessed by means of the severity of the lesions again, it has been seen that the most severe lesions occur at midbrain. Besides, it has been understood in the mice, in which intraperitoneal inoculation is applied, that perivascular cell infiltration in the mice, on which necropsy is applied on the 30th day, is more severe than the mice, on which necropsy is applied on the 60th day. With this study, T. gondii ME 49 strain and tissue cyst model in the mouse brain have been established for the first time in Turkey. Most of the experimental studies performed before in Turkey indicate the experimental animal models, which were gave acute and fatal results of T. gondii Type I strains (e.g. RH, Ankara).