Kolon kanserinde K-RAS siRNA yüklü manyetik nanopartiküllerin teranostik kullanımı
Theranostic use of K-RAS siRNA-loaded magnetic nanoparticles in colon cancer
Yazar: FEYSEL ÇAKMAK
Danışman: PROF. DR. VEYSEL TOLAN
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Kanser günümüzde sıkça görülen ve insan yaşam kalitesini düşüren bir hastalıktır. GTPaz proteini olarak bilinen KRAS, c-Raf ve PI3K gibi EGFR sinyal yollarındaki birçok proteinin aktivasyonunu sağlar. KRAS'ın aktif olarak mutasyona uğraması kansere neden olmakla birlikte KRAS mutasyonları kolon kanserinde sıkça görülmektedir. Nanobiyoteknoloji veya Nanotıp, günümüzde sağlık alanında ilaçların taşınmasını, hedef bölgeye gönderilmesini, sadece gönderilen hedef bölgede etkin olmasını sağlayan ve hızla gelişen bir teknoloji olarak karşımıza çıkmaktadır. Mutasyona uğramış genlerin susturulması stratejisi ve tedavi amaçlı kullanımı umut vadetmektedir. Bu çalışmada yeni sentezlenen süper manyetik demiroksit nanopartikülerinin (SPION) siRNA taşınmasında sistemin bir parçası olarak lipozom nanopartiküllerine entegre edilmesiyle, KRAS genini susturmak için bir araç olarak kullanılması amaçlanmıştır. Öncelikle, süper manyetik demiroksit nanopartiküleri birlikte çöktürme yöntemiyle sentezlenerek KRAS siRNA ile birlikte, DSPC:DC-Cholesterol: PEG olarak hazırlanan katyonik bir lipozomla kapsüllenmesi yapılmıştır. Sentezlenen nanopartikül TEM, FTIR, XRD, VSM ve Zeta Potansiyeli ile karakterizasyonu yapılmıştır. Magneto-lipozomun farklı dozlarıyla, Caco-2 ve HT29 kolon kanseri hücre hatlarında KRAS genin susturulması, BCL-2 ve BAX gen ifadeleri, sitotoksisite, yara iyilişme ve apoptoz testleri yapılmıştır. Mission siRNA transfeksiyon ajanı hem Caco-2 hem de HT29 hücre hatları için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Caco-2 hücreleri için KRAS genin sustuğu en yüksek % 65 orana sahip Mission siRNA transfeksiyon ajanından sonra 4 nolu örnekte kontrol ile kıyaslandığında %58 oranında gen susturması görülmüştür. En düşük susturma oranı, %39 oranla 3 nolu örnekte gözlemlenmiştir. HT29 hücreleri için KRAS geninin baskılandığı en yüksek oran %72 Mission siRNA TA görülmektedir. 1 nolu örnekte %64 ve diğer örneklerde 1 nolu örneğe yakın gen baskılandığı gözlemlenmiştir. BCL-2/BAX gen oranları incelendiğinde, Caco-2 hücrelerini apoptoza götürdüğü, HT29 hücreleri ise kanser spesifik olarak apoptozdan kaçtığı gözlemlenmiştir. Caco-2 hücreleri MTT sitotoksik etkisi, 48. Saatte bütün dozlarda bir hücre ölümü olduğu ve bu azalmayı 72. Saat değerleri takip etmektedir. HT29 hücreleri MTT sitotoksik etkisi, bütün dozlarda 72. Saatte sitotoksisite etki gösterdiği gözlemlenmiştir. Caco-2 yara iyileşme değerleri bütün dozlarda az etkisiyle birlikte diğer örneklerle kıyaslandığında 1 ve 4 nolu örneklerde en çok etki olduğu, HT29 hücrelerinde ise yara iyileşmesi 3 ve 4 nolu örneklerde en geç kapandığı gözlemlenmiştir. Annexin v ile florasan mikroskopla belirlenen apoptoz değerlerinde, Caco-2 hücreleri için pozitif kontrol ve 4 nolu örnekte daha çok nekroz olduğu, HT29 hücreleri için 4 nolu örnekte geç apoptozun fazla olduğu gözlemlenmiştir

Abstract:
Cancer is a disease that is frequently seen today and reduces the quality of human life. KRAS is knowing GTPase  protein that can activate many proteins  such as  c-Raf and PI3K in the EGFR signaling pathways. Active mutation of KRAS causes cancer and KRAS mutations are frequently seen in colon cancer. Nanobiotechnology or Nanomedicine is the most developed technology in the field of health today due to the transport of drugs and sending them to the target region. Strategies for silencing mutated genes hold some therapeutic hopes. In this study, it was aimed to integrate new synthesis super magnetic iron oxide nanoparticles (SPION) into liposome nanoparticles as part of the gene transport system for KRAS gene silencing. Firstly, supermagnetic iron oxide nanoparticles were synthesized by co-precipitation method and KRAS siRNA was encapsulated together with, supermagnetic iron oxide nanoparticles by a cationic liposome prepared as DSPC:DC-Cholesterol:PEG. The synthesized nanoparticle was characterized by TEM, FTIR, XRD,VSM and Zeta Potential. Silencing of KRAS gene,  BCL-2 and BAX gene expression, cytotoxicity, wound healing and  apoptosis tests were performed in Caco-2 and HT29 colon cancer cell lines with different dose rates of siRNA loaded magnetoliposomes. The Mission siRNA transfection agent used as positive control for both Caco-2 and HT29, for Caco-2 cells  Mission siRNA TA was the highest rate of silencing of the KRAS gene was 65%.  Following the Mission siRNA TA gene silencing was observed as %58  in sample No:4 compared to the control. The lowest silencing rate of 39% was observed in sample No:3. For HT29 cells, the highest rate of suppression of the KRAS gene is 72% by Mission siRNA TA. It was observed that the gene suppression was 64% by No:1 sample and other samples closed to the No:1 sample. Considering the BCL-2 and BAX gene expresion, it was found that Caco-2 cells lead to apoptosis while HT29 cells which was observed that cancer specifically escaped apoptosis. Considering the cytotoxic effect of MTT on Caco-2 cells that cells death is observed at all doses at the 48th hour and this decrease is followed by the 72nd hour values. Cytotoxic effect of MTT for HT29 cells  observed that all doses showed cytotoxicity at 72 hours. Caco-2 wound healing values that all doses showed a small effect while most affect in samples No:1 and No:4 to compare with other samples. Wound healing for HT29 cells was observed to close at the latest in samples No: 3 and No: 4. In the apoptosis values determined by fluorescent microscope with Annexin v, it was observed that there was more necrosis in the positive control and sample No: 4 for Caco-2 cells and the rate of late apoptosis was higher in sample No:4 for HT29 cells.