In vitro koşullarda kaempferol'ün insan kolorektal karsinoma hücreleri üzerine etkilerinin moleküler düzeyde incelenmesi
Investigation of in vitro effects of kaempferol on human colorectal carcinoma cells at molecular level
Yazar: HATİCE GÜL BATUR
Danışman: DOÇ. DR. SERDAR KARAKURT
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Kamferol = Kaempferol ; Karsinoma = Carcinoma ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Moleküler yapı = Molecular structure ; İn vitro = In vitro

Özet:
Kanser ülkemizde ve dünyada önde gelen hastalık sebeplerinden biri olup mortalite ve morbidite nedeniyle ciddi bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir.  En yaygın kanser türlerinden biri olan kolorektal kanser, dünya çapında kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. Son zamanlarda, kanser tedavisi için yeni bir terapötik strateji olarak doğal bileşiklerin uygulanmasına yoğun bir dikkat çekilmiştir. Bireylerin kemoterapötik ilaçlara karşı dayanıklılıkları ve bu ilaçların ciddi yan etkileri, insan kolorektal karsinomu da dahil olmak üzere kanser tedavisinde yeni ve alternatif ilaç adaylarının araştırılmasını hızlandırmıştır. Kanserin önlenmesi, kanser tedavisi ya da yan etkilerin azaltılması için alternatif çözümler ve destek tedavileri sıklıkla denenmekte ve ilgi görmektedir. Bitkisel fenolik bileşikler genellikle kanser tedavisinde çokça kullanılan ve çok popüler bileşiklerdir. Bu bileşiklerden biri de, iyi bilinen bir anti-enflamatuar, antioksidan, anti-kanserojen bileşik olan flavonoid Kaempferol'dür. Kaempferolün birçok kanserin malignitesini modüle ettiği iyi bilinmektedir. 
Kaempferolün antioksidan aktivitesi DPPH, ABTS ve CUPRAC yöntemleri ile bulundu. Kaempferolün stabilitesi HPLC ve UV-Vis ile belirlendi. Kaempferolün beş farklı kanser hücresi ve sağlıklı epitel hücre üzerindeki sitotoksik etkisi Alamar Mavisi reaktifi kullanılarak hücre inhibisyonunun sigmoidal grafiğinden yararlanılarak IC50 değerinden bulundu. İnsan kolon kanserinin koloni oluşumu ve migrasyonu üzerindeki etkileri ise sırasıyla koloni oluşumu ve yara iyileşme deneyi ile tespit edildi. Kaempferolün kolon kanserindeki apoptoz ve nekroz üzerine etkileri flow sitometrik yöntem ile Annexin V-APC ve 7-AAD antikorları kullanılarak belirlendi. Kaempferolün insan kolon kanseri hücrelerindeki apoptoz ve çeşitli sinyal yolağında görev alan protein ve genlerin ekspresyonununda meydana getirdiği değişiklikler ise sırasıyla Western Blot ve qRT-PCR yöntemi ile bulundu.
Kaempferol, DLD-1 hücrelerinin (İnsan Kolorektal Karsinomu) canlılığına karşı en güçlü inhibitör olduğu görülürken, A549 (Akciğer Kanseri), HUH-7 (Hepatokarsinom), HeLa (Rahim Kanseri), NCI-H295R (Adrenal Bez) proliferasyonunu önemli ölçüde azaltmadığı bulundu. Kaempferol'ün moleküler yapısının 48 saate kadar stabil olduğu ve 481 nm ve 529 nm'de iki floresan tepe noktasına sahip olduğu bulundu. Sitoplazmada lokalize olan Kaempferol ve doza bağlı olarak, IC50 değeri 49.55 µM olan DLD-1 hücrelerinin çoğalmasını inhibe ederken, insan sağlıklı epitel hücre hattı CCD-18Co için toksik olmadığı görüldü (sitotoksisitesi 250 µMdan büyük olduğu bulundu.). Kaempferol, DLD-1 hücrelerinin göçünü ve koloni oluşumunu önemli ölçüde inhibe etti ve apoptozu %47 oranında yükseltti (p<0.0001). Kaempferol'ün apoptoz yolağında aktif rol alan Bcl-2, Bax, Kaspaz-3, Kaspaz-9, Kaspaz-12, Nf-κB, p53(TP53)'ün protein ve gen ekspresyonlarını önemli ölçüde değştirdiği bulundu. Aynı zamanda TGFβ ve Wnt yolaklarında rol alan APC, MLH-1, SMAD-4'ün gen ekspresyonunu önemli ölçüde modüle ettiği görüldü. Endoplazmik retikulum stres yolağı proteinleri olan XBP-1, ATF6 ve PERK'nin protein ekspresyonlarının da Kaempferol tarafından önemli ölçüde modüle edildiği görüldü. 
Bu çalışma ile kaempferolün endoplazmik retikulum stresi oluşturarak ve hücreleri apoptoza sürükleyerek insan kolorektal karsinom hücrelerinin ölümüne neden olduğu ve KRK tedavisinde kullanılabilecek bir ilaç ajanı olabileceği gösterilmiştir.

Abstract:
Cancer is one of the leading causes of disease in our country and the world and continues to be a serious health problem due to mortality and morbidity. Colorectal cancer, one of the most common types of cancer, is the third leading cause of cancer-related death worldwide. Recently, intense attention has been paid to the application of natural compounds as a new therapeutic strategy for cancer treatment. The resistance of individuals to chemotherapeutic drugs and the serious side effects of these drugs has accelerated the search for new and alternative drug candidates in the treatment of cancer, including human colorectal carcinoma. Alternative solutions and supportive treatments for cancer prevention, cancer treatment, or reduction of side effects are frequently tried and attracted attention. Herbal phenolic compounds are widely used and very popular compounds in cancer treatment. One of these compounds is the flavonoid Kaempferol, which is a well-known anti-inflammatory, antioxidant, anti-carcinogenic compound. It is well known that kaempferol modulates the malignancy of many cancers.
The antioxidant activity of kaempferol was found by DPPH, ABTS, and CUPRAC methods. The stability of kaempferol was determined by HPLC and UV-Vis. The cytotoxic effect of kaempferol on five different cancer cells and healthy epithelial cells was determined from the IC50 value using the sigmoidal plot of cell inhibition using the Alamar Blue reagent. The effects on colony formation and migration of human colon cancer were determined by colony formation and wound healing assay, respectively. The effects of kaempferol on apoptosis and necrosis in colon cancer were determined by flow cytometric method using Annexin V-APC and 7-AAD antibodies. The changes caused by kaempferol in the expression of proteins and genes involved in apoptosis and various signaling pathways in human colon cancer cells were found by Western Blot and qRT-PCR methods, respectively.
Kaempferol appeared to be the most potent inhibitor to the viability of DLD-1 cells (Human Colorectal Carcinoma), while it was found not to significantly reduce the proliferation of A549 (Lung Cancer), HUH-7 (Hepatocarcinoma), HeLa (Uterine Cancer), NCI-H295R (Adrenal Gland). The molecular structure of Kaempferol was found to be stable up to 48 hours and had two fluorescent peaks at 481 nm and 529 nm. Kaempferol localized in the cytoplasm and dose-dependently inhibited the proliferation of DLD-1 cells with an IC50 of 49.55 µM, while it was not toxic to the human healthy epithelial cell line CCD-18Co (cytotoxicity was found to be greater than 250 µM). Kaempferol significantly inhibited migration and colony formation of DLD-1 cells and increased apoptosis by 47% (p<0.0001). It was found that Kaempferol significantly changed the protein and gene expressions of Bcl-2, Bax, Caspase-3, Caspase-9, Caspase-12, Nf-κB, p53(TP53), which play an active role in the apoptosis pathway. At the same time, it was observed that APC, MLH-1, SMAD-4, which play a role in TGFβ and Wnt pathways, significantly modulate gene expression. It was observed that protein expressions of endoplasmic reticulum stress pathway proteins XBP-1, ATF6, and PERK were significantly modulated by Kaempferol.
In this study, it has been shown that kaempferol causes the death of human colorectal carcinoma cells by creating endoplasmic reticulum stress and leading the cells to apoptosis, and it can be a drug agent that can be used in the treatment of CRC.