Bir grup antifungal etkin maddenin tayinine yönelik sıvı kromatografik yöntemlerin geliştirilmesi ve analitik yöntem geçerliliği çalışmaları
Devepolment and analytical method validation studies of liquid chromatographic methods for the determination of a group of antifungal drug substances
Yazar: MEHMET CAN SEZGİN
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA EMRAH KILINÇ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Kromatografi-sıvı = Chromatography-liquid ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Metronidazole = Metronidazole ; Mikonazol = Miconazole ; İtraconazol = Itraconazole

Özet:
Metronidazol (MTR), klotrimazol (CLT), ekonazol (ECO), mikonazol (MCO) ve itrakonazol'ün (ITR) yapay vücut sıvılarında tayinine yönelik HPLC-PDA yöntemi geliştirilmiş ve ICH Q2(R1) kılavuzuna göre yöntem geçerliliği çalışmaları yürütülmüştür. Sırasıyla 1,58; 2,38; 3,16; 4,04 ve 5,58 dakikalık alıkonma zamanlı pikler yüksek çözünürlükle (yaklaşık R>2) ayrılmıştır. Doğrusal derişim aralığı tüm etkin maddeler için 1-50 ppm olarak (R2= 0,9999)  sağlanmıştır. MTR, CLT, ECO, MCO ve ITR için kalibrasyon grafiklerine ait denklemler sırasıyla y=0,1119x+0,0066, y=0,6217x–0,067, y=0,3282x–0,0785, y=0,398x–0,0656 ve y=0,359x–0,0913 şeklindedir.
Kesinlik parametresi için tüm standartların çoklu enjeksiyonları (n=3) ile 1; 2,5; 5; 10; 25 ve 50 ppm derişimleri için yapılarak sonuçların %RSD değeri hesaplanmıştır. Hesaplanan %RSD değerlerine göre yöntemimiz tüm standartlar için  <%2,5 şartını sağlamaktadır.
MTR, CLT, ECO, MCO ve ITR için belirleme sınırı (LOD) değerleri sırasıyla 0,0107 ppm (6,25x10-8M), 3,22x10-3 ppm (9,34x10-9M), 0,092 ppm (2,07x10-7M), 0,144 ppm (3,01x10-7M) ve 0,105 ppm (1,49x10-7M) düzeylerinde hesaplanmıştır. Aynı etkin maddeler için tayin sınırı (LOQ) değerleri ise sırasıyla 0,173 ppm (1,01x10-6M), 0,262 ppm (7,60x10-7M), 0,863 ppm (1,94x10-6M), 0,865 ppm (1,81x10-6M) ve 0,944 ppm (1,34x10-6M) olarak saptanmıştır.
Yapay vücut sıvıları olarak yapay idrar 1 ve 2 (U1 ve U2), tükrük 1 ve 2 (S1 ve S2), mide vasatı (G), barsak vasatı (I), suni barsak vasatı (AI) yapay vücut sıvılarına 40'ar ppm'lik standart ve ayrıca müstahzar karışımları ekilmiş ve geri kazanımları için HPLC-PDA analizleri yapılmıştır. MTR haricinde diğer standartların geri kazanımında en yüksek yüzde değerleri U2, S1 ve S2 yapay vücut sıvılarında gözlemlenmiştir. Görece en düşük geri kazanımlar ise I ve AI yapay vücut sıvılarında görülmektedir.
Doğruluk parametresi için yapay vücut sıvılarına 40 ppm standart karışımı ekimi yapılarak (n=3) HPLC ile tayinleri gerçekleştirilmiştir. Tayinler sonrası saptanan düzeylerin ortalaması, standart sapması ve bağıl hata (%) değerleri hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, AI barsak vasatı haricinde genel olarak diğer yapay vücut sıvılarında kabul edilebilir eksi veya artı yönde yapılmış bağıl hata oranları ile doğruluk parametresi sağlanmıştır. 
Literatürde triazol yapılı antifungal ilaç etkin maddelerinin tayini için geliştirilmiş yeterli sayıda HPLC-PDA yöntemi olmakla birlikte tezimizde çalışılan antifungal etkin maddeler olan MTR, CLT, ECO, MCO ve ITR'nin eş-zamanlı tayin edildiği bir HPLC-PDA yöntemine rastlanılmamıştır.

Abstract:
HPLC-PDA method, for the determination of metronidazole (MTR), clotrimazole (CLT), econazole (ECO), miconazole (MCO) and itraconazole (ITR) in simulated artificial body fluids, is developed and method validation studies were performed in accordance to ICH Q2(R1) guideline.
Peaks with the retention times of 1.58, 2.38, 3.16, 4.04 and 5.58 minutes, respectively were separated with high resolution (approximate R>2). Linear concentration range was obtained as 1-50 ppm (R2= 0,9999)  for entire drug substances. Equations of the calibration graphs for  MTR, CLT, ECO, MCO and ITR were as y=0.1119x+0.0066, y=0.6217x–0.067, y=0.3282x–0.0785, y=0.398x–0.0656 and y=0.359x–0.0913, respectively.
For the precision parameter, multiinjections (n=3) of entire standards at 1, 2.5, 5, 10, 25 and 50 ppm concentrations were performed and  RSD% values of the findings were calculated. According to calculated RSD% values, our method provides <2.5% requirement for entire standards.
Limit of detection (LOD) values for MTR, CLT, ECO, MCO and ITR were calculated as 0.0107 ppm (6.25x10-8M), 3.22x10-3 ppm (9.34x10-9M), 0.092 ppm (2.07x10-7M), 0.144 ppm (3.01x10-7M) and 0.105 ppm (1.49x10-7M) levels, respectively. For the same drug substances limit of quantification (LOQ) values were determined as 0.173 ppm (1.01x10-6M), 0.262 ppm (7.60x10-7M), 0.863 ppm (1.94x10-6M), 0.865 ppm (1.81x10-6M) and 0.944 ppm (1.34x10-6M), respectively.
Standards and separately commercial drugs mixture of 40 ppm were spiked into artificial urine 1 and 2 (U1 and U2), saliva 1 and 2 (S1 and S2), gastric juice (G), intestinal juice (I), artificial intestinal juice (AI) as artificial body fluids, and HPLC-PDA analysis were conducted for the recoveries. Highest recovery percentages of standards except MTR were observed in U2, S1 and S2 artificial body fluids. Relatively the lowest recoveries were observed in I and AI artificial body fluids.
For the accuracy parameter 40 ppm standards mixture was spiked into artifiacial body fluids (n=3) and determined by HPLC. After determinations averages, standart deviations and relative errors (%) of the determined levels were calculated. In accordance to obtained results, for entire artificial body fluids except AI, accuracy parameter was achieved with reasonable negative and positive relative errors
Even though sufficient amount of HPLC-PDA methods, developed for the determination of  triazole stuctured antifungal drug substances, are present in literature no HPLC-PDA method was met for the simultaneous determination of MTR, CLT, ECO, MCO and ITR as the antifungal drug substances studied in our thesis.