Akut iskemik inmeli hastalarda disfonskiyonel hdl, myeloperoksidaz, lipid hidroperoksidaz değerlerinin inme şiddeti ve enfarkt volümüyle ilişkisi ve disabiliteyi tayin etmede prognostik değeri
The relationship of dysfunctional hdl, myeloperoxidase, lipid hydroperoxides levels with stroke violence and infarctus volume, and its prognostic value in determining disability in acute ischemic stroke
Yazar: ESRA DEMİR
Danışman: DOÇ. DR. GÖNÜL VURAL
Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroloji Ana Bilim Dalı / Nöroloji Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Nöroloji = Neurology

Özet:
Giriş: İskemik inme, vasküler hasara bağlı olarak beynin belirli bir bölgesinde serebral kan akımının azalması sonucu akut gelişen nörolojik bir bozukluk olup tüm dünyada mortalite ve morbiditenin en önemli nedenlerinden biridir. İskemik inme sürecinde artan oksidatif stres sonucu oluşan myeloperoksidaz (MPO), superoksit serbest radikalleri, hidrojen peroksit, nitrik oksit ve lipid peroksidasyonu gibi mikro ve makroanjiopatinin temelini oluşturan endotel disfonksiyonuna ve plak stabilitesizliğine yol açan enflamatuar mekanizmalar, antiinflamatuar ve antiaterojenik fonksiyonları kötü yönde etkileme ve yüksek yoğunluklu lipoproteini (HDL) disfonksiyonel hale getirmek suretiyle aterojenik ve trombojenik süreci başlatır ki, bu durum gerek kardiyovasküler sistemi gerekse serebrovasküler sistemi etkileyerek inme adına önemli bir risk faktörü oluşturmaktadır. Bu çalışmanın amacı akut iskemik inmeli hastalarda serum disfonksiyonel HDL, MPO ve lipid hidroperoksidaz (LOOH) düzeyleri ile inmenin klinik şiddeti ve enfarkt hacmi ile etkileşiminin incelenmesi ve bu parametrelerin disabiliteyi tayin etmedeki prognostik değerinin belirlenmesidir.
Gereç ve Yöntem: Bu çalışma prospektif tanımlayıcı vaka serisi olarak Nisan 2020 ile Eylül 2020 tarihleri arasında Ankara Şehir Hastanesi Acil Servis Kliniği'ne akut iskemik inme ile ilk 24 saatte başvuran ve Nöroloji Kliniği'nde yatarak tedavi görmekte olan, 18-80 yaş aralığında 100 gönüllü hasta ve Nöroloji Polikliniği'ne başvuran 18-80 yaş aralığında 50 gönüllü kontrol grubu katılımcının yazılı onamları alınarak gerçekleştirildi. Hastaların klinik değerlendirilmelerinde; her bir hastada yatış/taburculuk NIHSS Skoru (National Institues Of Healt Stroke Scale Scores) ile taburculukta Modifiye Rankin Ölçeği (mRS) kullanılarak erken dönem özürlülükleri tespit edildi. Hastaların hikaye ve özgeçmişlerinden edinilen bilgiler doğrultusunda iskemik inme tipi, geçirilmiş inme hikayesi veya sekelinin olup olmadığı, öncesinde antiagregan ve antikoagülan ilaç dahil kullanılan ilaçlar, ek kronik hastalıklar not edildi. Kan örnekleri, iskemik serebrovasküler hastalık tanısı klinik ve kraniyal görüntülemeler ile doğrulandıktan sonra serum disfonskiyonel HDL, MPO, LOOH, HBA1C, serum lipid profili dahilinde total kolesterol (TC), düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL)), HDL ve trigliserit (TG) değerlerini ölçmek amacıyla hasta ve kontrol gruplarından toplandı. Serum Disfonksiyonel HDL, serum MPO, serum LOOH ile ilgili biyokimyasal değerlendirme Ankara Şehir Hastanesi Biyokimya Kliniği tarafından gerçekleştirildi. Disfonksiyonel HDL ölçümü için HDL'lelerin izole edilerek,  HDL'nin disfonksiyonel özelliği ile myeloperoksidaz-paraoksonaz oranının yüksek pozitif korelasyonu ve bu oranın HDL'nin fonksiyon bozukluğunu tespit edilme prensibine dayanılarak yapıldı. PON enzim aktivitesi ölçümü, substrat olarak kullanılan paraoksonun enzimatik hidrolizi sonucu oluşan        4-nitrofenolün spektrofotometrik olarak 412 nm dalga boyunda ölçülmesi esasına göre gerçekleştirildi. 4-nitrofenol oluşumunun ölçülmesiyle paraokson hidroliz oranları değerlendirildi. PON enzim aktivitesi molar ekstinsiyon katsayısı olarak 17,1000 M-1 cm kullanıldı. MPO ölçümü için örnekler alındıktan sonra pıhtılaşmanın tamamlanması amacıyla 30 dakika beklenip, takiben 1300xgde 10 dakika santrifüj edildi. Örnekler analize kadar –80 C'de eppendorf tüplerinde muhafaza edildi. MPO düzeylerinin ölçümü, ticari olarak mevcut olan Human Myeloperoxidase ELISA kitleri (Cayman Chemical, Michigan, ABD) kullanılarak yapıldı. Human Myeloperoxidase ELISA
kiti için örneklerin analizindeki tespit aralığı 0,2-10 ng/mL ve sensitivitesi 0,2 ng/mL olarak belirlendi. Kit için çalışma içi ve çalışmalar arası CV (coefficient of variation, varyasyon katsayısı) sırasıyla %3,83 ve %8,13 olarak belirlendi. LOOH, ksinelol turuncusu yöntemiyle ölçüldü. Yöntem asidik ortam içerisinde Fe+2'nin LOHH ile Fe+3 'e oksidize olması ilkesine göre uygulandı. Hastaların tümünün kranyel manyetik rezonans grafisi (MRG) difüzyon (DWI) sekansında enfarkt volümü hesaplandı. Enfarkt volümü hesaplamak için DWI kesitlerde Free hand ROI aracı ile enfarktın olduğu her kesitte enfarkta ait alan hesaplaması yapıldı ve her kesitten elde edilen bu alan bilgisi toplandı. Kesit kalınlığı olan 5 mm ile interslice gap olan 1 mm'nin toplamı (6 mm) ile çarpılarak hacim bilgisi oluşturuldu. Akut inmeli hastalarda enfarkt volümü incelemesi ile paralel olarak ilgili biyokimyasal parametrelerin istatistiksel olarak korelasyonuna bakıldı. Verilerin değerlendirilmesinde SPPS 25 (IBM Corp. Released 2017. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 25.0. Armonk, NY: IBM Corp.) istatistik paket programı kullanıldı. Hasta ve sağlıklı bireylerin ölçüm parametrelerine göre kesim puanları ROC analizi ile değerlendirildi. AUC Değeri, Duyarlılık, Seçicilik değerleri hesaplanmıştır. p<0,05 düzeyi istatistik olarak anlamlı kabul edildi.
Bulgular: Hasta grubu demografik veriler( yaş, cinsiyet, ırk, medeni hali, kronik hastalıklar ve ilaç kullanımı vb.), klinik dizabilite skorları (geliş NIHS, taburculuk NIHSS, taburculuk mRS), MRG enfarkt volümü (ROI CM2) ve serum HBA1C, TC, LDL, TG, HDL, LOOH, MPO ve MPO/PON ile kontrol grubu ise serum TC, HDL, LDL, TG, LOOH, MPO ve MPO/PON ile değerlendirildi. Araştırmaya 100 hasta ve 50 sağlıklı gönüllü dahil edildi. Çalışmaya dahil edilen hastaların %57'si kadın (n:57) %48'i (n:48) erkek; kontrol grubunun ise %52'si kadın (n:26), %48'i erkekti (n:24). Yaş ortalaması hasta grubunda 66,31±11,947, kontrol grubunda64,9±6,11 idi. Cinsiyet dağılımı ve yaş ortalamaları gruplar arasında benzerdi (p=0,561; p=0,121, sırasıyla). Hasta ve kontrol grubunda serum TC, HDL, LDL, TG, PON, LOOH, MPO ve MPO/PON değerleri ölçüldü ve karşılaştırıldı. TG hariç ölçülen diğer parametreler gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdi. TC, LDL, LOOH, MPO seviyeleri ve MPO/PON oranı sağlıklı kontrollerde hasta grubuna göre daha düşük iken; HDL ve PON hasta grubunda anlamlı olarak daha düşük bulundu TG düzeyi her ne kadar inmeli hastalarda yüksek bulunmuş olsa da istatistiksel anlamlılığa ulaşmadı. Serum TC, HDL, LDL, TG, PON, LOOH, MPO, MPO/PON düzeyleri ile geliş NIHSS, taburculuk NIHSS, taburculuk MRS ve enfarkt volümü (ROI (cm 3 ) arasında ilişki olup olmadığını araştırmak için korelasyon analizleri yapıldı. PON ile geliş NIHSS arasında ve LOOH ile taburculuk mRS arasında negatif yönlü zayıf ilişki tespit edildi (sırasıyla r=-0,204 p<0,05; r=-0,244 p<0,05). Enfarkt volümü ile TG düzeyleri arasında negatif korelasyon, MPO/PON oranı
pozitif korelasyon tespit edildi (sırasıyla r=-0,226 p <0,05; r=0,204 p<0,05). İnme şiddetine (NIHSS skoru 6 ve üzeri) ve erken özürlülüğü (mRS skoru 2 ve üzeri) etkileyebilecek faktörleri ortaya koymak için yapılan lojistik regresyon analizleri lipid profili, LOOH, PON, MPO, MPO/PON için istatistiksel anlamlılık göstermezken, inme şiddeti için hipertansiyon (OR=3,287, 95% CI=1,080-10,009, p=0,036) ve diyabet varlığı (OR=0,292, 95% CI=0,089-0,962, p =0,043), HbA1c seviyeleri (OR=1,487, 95% CI=1,096-2,019, p =0,011); erken özürlülük içinse diyabet varlığı (OR=0,011, 95% CI=0,000-0,893, p =0,044), HbA1c seviyeleri (OR=5,059, 95% CI=1,222-20,939, p =0,025), enfarkt volümü (OR=1,027, 95% CI=1,008-1,047, p =0,005) ve geliş NIHSS skoru (OR=21,646, 95% CI=3,113-150,524, p =0,002) bağımsız risk faktörü olarak tespit edildi. Lipid profili, PON, MPO, LOOH düzeyleri ve PON/MPO oranının inme şiddeti ve erken özürlülüğü predikte etmede sensitivite ve spesifitesini ortaya koymak için yapılan ROC eğrisi analizlerinde sadece LOOH için istatistiksel anlamlılık ortaya koydu. Erken özürlülük için mRS skorunda kesim noktası 2 kabul edildiğinde LOOH, %68,49 duyarlılık ve %55,56 seçicilik ile (p=0,0375); mRS skorunda kesim noktası 4 kabul edildiğinde %76,00 duyarlılık ve %57,33 seçicilik ile (p=0,0377) özürlülüğü predikte edebilmektedir. Cut-off değeri sırasıyla 7,2 ve 6,2 dir.
Sonuç: Çalışmamızda akut inmeli hastalarda ki inflamatuar sürece katkıda bulunan aterosklerotik açıdan önemli risk faktörlerinden olan serum disfonksiynel HDL, oksidatif strese yanıt olarak lökositlerden salgılanan lizozomal bir enzim olan ve endotelyal disfonksiyona neden olarak serebrovasküler olaylarda hem bir risk faktörü hemde inme rekürrensi adına önemli etiolojik faktörlerden olan MPO ve onun aktivitesini gösteren PON ile MPO/PON değerleri ve serebral kan akımının etkilenmesine bağlı olarak serbest oksijen radikallerinin artmış düzeyini gösteren belirteçlerden olan LOOH aktivite düzeyleri değerlendirildi. Bu parametrelerin inme şiddeti ve enfarkt volümü ile ilişkisi ve disabiliteyi tayin etmede prognostik değeri incelendi. Bu parametrelerin hasta grubunda anlamlı derecede serum düzeylerinde artmış olduğu gösterildi ve enfarkt volümü ile klinik dizabiliteye katkı sağladıkları istatsitiksel olarak kanıtlandı. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda düşük HDL seviyeleriyle inme rekürrensinin ilişkisini ortaya konmuş olsada aslında HDL düzeyinden ziyade HDL nin işlevselliğinin inme hastalarında önemli olabileceğine
dair yapılmış yeterli sayıda çalışma yoktur. Bu açıdan bizim çalışmamız inmeli hastalarda disfonksiyonel HDL ile enfarkt volümünün ve keza PON aktivitesi ile inme şiddetinin korelasyonunu göstermesi bakımından ufuk açıcı olacaktır. Bu itibarla, inmeli hastaları değerlendirirken lipid profili test bataryalarına disfonksiyonel HDL de dahil edilmelidir. Bu alanda benzer öngörüler içeren pek çok çalışmaya ihtiyaç vardır.

Abstract:
Introduction: Ischemic stroke is a neurological disorder that develops acutely as a result of decreased cerebral blood flow to a specific area of the brain due to vascular damage and is one of the most important causes of mortality and morbidity worldwide. Inflammatory mechanisms such as myeloperoxidase, superoxide free radicals, hydrogen peroxide, nitric oxide and lipid peroxidation, which lead to endothelial dysfunction and plaque instability, which are the basis of micro and macroangiopathy, which are formed as a result of increased oxidative stress in the ischemic stroke process, adversely affect anti-inflammatory and antiatherogenic functions, It initiates the atherogenic and thrombogenic process, which affects both the cardiovascular system and the cerebrovascular system, creating an important risk factor for stroke. The aim of this study is to examine the interaction of serum dysfunctional HDL, myeloperoxidase and lipid hydroperoxidase levels with clinical severity of stroke and infarct volume level in patients with acute ischemic stroke and to determine the prognostic value of these parameters in determining disability.
Materials and Methods:This prospective descriptive case series consists of 100 patients aged 18-80 years who were admitted to Ankara City Hospital Emergency Department between April 2020 and September 2020 with acute ischemic stroke in the first 24 hours and were inpatient in the Neurology Clinic. It was carried out by obtaining written consents of 50 volunteer control group participants between the ages of 18-80 who applied to the Neurology Outpatient Clinic. In the clinical evaluation of the patients; early disability was detected in each patient using the National Institues Of Healt Stroke Scale Scores(NIHSS) and the Modified Rankin Scale(MRS) at discharge. In line with the information obtained from the patients history and medical history, the type of ischemic stroke, the presence of a previous stroke or sequelae, the drugs used including antiaggregant and anticoagulant drugs before and additional chronic diseases were noted. Immediately after the diagnosis of ischemic cerebrovascular disease is confirmed with clinical and cranial imaging, blood samples were collected from each participant to measure serum dysfunctional HDL, myeloperoxidase (MPO), lipid hydroperoxidase (LOOH), HBA1C, serum lipid profile ((total cholesterol (TC), LDL (Low density Lipoprotein), HDL (High density lipoprotein)) triglyceride (TG)). Biochemical evaluation of Serum Dysfunctional HDL (Paraxonase (PON) activity), serum MPO, serum LOOH was carried out by Ankara City Hospital Biochemistry Clinic. For the measurement of dysfunctional HDL, isolation of HDLs was performed based on the principle of high positive correlation between the dysfunctional feature of HDL and the myeloperoxidase / paraoxonase ratio and detecting the dysfunction of HDL. PON enzyme activity measurement was performed on the basis of spectrophotometric measurement of 4-nitrophenol formed as a result of enzymatic hydrolysis of paraoxon used as substrate at 412 nm wavelength. Paraoxon hydrolysis rates were evaluated by measuring 4-nitrophenol formation spectrophotometrically at 25C 412 nanometers. PON enzyme activity was used as a molar extinction coefficient of 17, 1000 M-1 cm. After taking samples for MPO measurement, it was waited for 30 minutes to complete coagulation, followed by centrifugation at 1300xg for 10 minutes. Samples were kept in each eppendorf tubes at -80 ° C until analysis. Measurement of MPO levels was made using commercially available Human Myeloperoxidase ELISA kits (Cayman Chemical, Michigan, USA). For the Human Myeloperoxidase ELISA kit, the detection range in the analysis of the samples was determined as 0.2-10 ng / mL and the sensitivity as 0.2 ng / mL. The within-run and inter-run CV (coefficient of variation) for the kit was determined as 3.83% and 8.13%, respectively. LOOH was measured by the xinelol orange method. The method was applied according to the principle that Fe + 2 oxidized to Fe + 3 with LOHH in an acidic environment. In order to calculate the infarct volume, the area of​the infarct was calculated with the Free hand ROI tool in DWI sections, and this area information obtained from each section was collected. The volume information was created by multiplying the section thickness of 5 mm by the sum of the interslice gap 1 mm (6 mm).Volume information was created by multiplying. In parallel with the infarct volume examination in patients with acute stroke, the statistical correlation of the relevant biochemical parameters was investigated. SPPS 25 (IBM Corp. Released 2017. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 25.0. Armonk, NY: IBM Corp.) statistical package program was used to evaluate the data. The cut-off scores of the patients and healthy individuals according to the measurement parameters were evaluated by ROC analysis. AUC Value, Sensitivity, Selectivity values were calculated. A p<0.05 level was considered statistically significant.
Results: Patient group was evaluated with demographic data (ie age, gender, race, marital status, chronic diseases and drug use), clinical disability scores (arrival NIHS, discharge NIHSS, discharge mRS), MRI infarct volume (ROI CM2) and serum HBA1C, TC, LDL , TG, HDL, LOOH, MPO and MPO / PON. The control group was evaluated with serum TC, HDL, LDL, TG, LOOH, MPO and MPO-PON. 57% of the patients included in the study were female (n: 57) 48% (n: 48) were male; 52% of the control group was female (n: 26) and 48% were male (n: 24). The mean age was 66.31 ± 11.947 in the patient group and 64.9 ± 6.11 in the control group. Gender distribution and mean ages were similar between the groups (p =0.561; p = 0.121, respectively). Serum TC, HDL, LDL, TG, PON, LOOH, MPO and MPO / PON values ​​were measured and compared in the patient and control groups. Except for TG, other measured parameters showed statistically significant difference between groups. While TC, LDL, LOOH, MPO levels and MPO / PON ratio were lower in healthy controls than in the patient group; HDL and PON were found to be significantly lower in the patient group, although the TG level was found to be high in patients with stroke, it did not reach statistical significance. Correlation analyzes were performed to investigate whether there was a relationship between serum TC, HDL, LDL, TG, PON, LOOH, MPO, MPO / PON levels and arrival NIHSS, discharge NIHSS, discharge MRS and infarct volume (ROI (cm 3). A weak negative correlation was found between NIHSS and between LOOH and discharge mRS (r =-0.204 p<0.05; r = -0.244 p<0.05,). Logistic regression analyzes performed to reveal factors that may affect stroke severity (NIHSS score 6 and above) and early disability (mRS score 2 and above) did not show statistical significance for lipid profile, LOOH, PON, MPO, MPO / PON. Hypertension (OR =3.287, 95% CI = 1.080-10.009, p = 0.036), presence of diabetes (OR = 0.292, 95% CI = 0.089-0.962, p = 0.043) and HbA1c levels (OR = 1.487, 95) % CI = 1.096- 2.019, p = 0.011) were determined as an independent risk factor for stroke severity. For early disability, presence of diabetes (OR = 0.011, 95% CI = 0.000-0.893, p = 0.044), HbA1c levels (OR = 5.059, 95% CI = 1.222-20.939, p = 0.025), infarct volume (OR = 1.027, 95% CI = 1.008-1.047, p = 0.005) and arrival NIHSS score (OR = 21.646, 95% CI = 3.113-150.524, p = 0.002) were determined as independent risk factors. ROC curve analyzes performed to reveal the sensitivity and specificity of lipid profile, PON, MPO, LOOH levels and PON / MPO ratio in predicting stroke severity, and early disability revealed statistical significance only for LOOH. The cut-off point in the mRS score for early disability is accepted as 2, LOOH, with 68.49% sensitivity and 55.56% selectivity (p = 0.0375); The cut-off point is accepted as 4 in the mRS score, it can predict disability with 76.00% sensitivity and 57.33% selectivity (p = 0.0377). The cut off value is 7.2 and 6.2, respectively.
Conclusion: Conclusion: In our study, serum dysfunctional HDL, which is an important atherosclerotic risk factor contributing to the inflammatory process in patients with acute stroke, MPO, which is a lysosomal enzyme secreted from leukocytes in response to oxidative stress and is an important etiological factor in cerebrovascular events by causing endothelial dysfunction and PON showing its activity, LOOH activity levels, which are indicators of increased levels of free oxygen radicals due to the effect of MPO / PON values ​​and cerebral blood flow, relationship with stroke severity and infarct volume, and its prognostic value in determining disability were examined. It has been shown that these markers are significantly increased in serum levels in the patient group and it has been statistically proven that they contribute to the infarct volume and clinical disability. Although the relationship between low HDL levels and recurrence of stroke has been demonstrated in studies up to now, there are not enough studies on the effect of HDL functionality in stroke patients, rather than HDL level. In this respect, our study will be seminal in terms of showing the correlation between dysfunctional HDL and infarct volume, as well as PON activity and stroke severity in stroke patients. As such, dysfunctional HDL should be included in lipid profile test batteries when evaluating stroke patients. Many studies with similar predictions are needed in this area.