İnsan plasental glutatiyon S-transferazının saflaştırılması ve bazı özellikleri /
Yazar: N. NURAY ULUSU
Danışman: PROF.DR. NAZMİ ÖZER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 1990
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Glütatyon transferaz = Glutathione transferase ; Plasenta = Placenta ; İnsan = Human

Özet:
Plasental glutatiyon S-transferaz normal plasentadan PBE94 (iyon değiştirici) ve S-hekzilglutatiyon Sepharose 4B (afinite kolonu) kullanılarak %71 verim ve 35 ünite/mg spesifik aktivite ile saf laştırıldı. Enzim preparatının saflığı; SDS/PAGE, kromatofokuslama ve "Ouchterlony double-diffusion" teknikleri kullanılarak gösterildi. Saflaştırılan enzim SDS/PAGE'de 24.000 daltona karşılık gelen tek bir protein bandı, kromatof okuslamada tek bir zirve (pl 4.82) ve "Ouchterlony double diffusion" plağında tek bir çökelme bandı verdi. Basit ardışık model kullanılarak yapılan "steady-state" kinetik analizinden GSH ve CDNB için enzimin Km değerleri sırasıyla 0.4, 0.8 ve 0.3, 2.0 mM olarak bulundu. Seyreltilmiş ve 37 C'de inköbe edilen enzimin iki fazlı inaktivasyona uğradığı ve inaktivasyonun birinci fazının yarı ömrünün 5 dakika, ikinci fazının yarı ömrünün ise 128 dakika olduğu ve inaktivasyonun seyreltme ortamında GSH veya GSSG varsa engellendiği bulundu. Ancak inaktivasyonun geri çevrilmesi ve çevrilme yüzdesinin bu ajanların ne zaman inkübasyon ortamına eklendiğine bağlı olduğu gözlendi. Nitekim %20 aktivite kaybetmiş enzimde reaktivasyon %100 iken, yaklaşık %60 aktivite kaybetmiş enzimde reaktivasyon %71'de kaldı. Bu sonuçlar dimerik enzimin ardışık tepkime mekanizması ile önce tersinir olarak aktif monomerlere daha sonra bu monomerlerin inaktif forma dönüştüğü şeklinde yorumlandı.

Abstract:
Placental glutathione S-transferase was purified from a full-term placenta, using PBE94 anion exchanger and S-hexylglutathione coupled Sepharose 4B affinity columns. The enzyme obtained with 71% yield had a specific activity of 35 units per milligram protein. The purity of the preparation was tested using SDS/PAGE, chromatof ocusing and "Ouchterlony double-diffusion" techniques. The purified placental enzyme gave a single protein band or SDS/PAGE corresponding to 24000 daltons. It also gave a single peak on choromatof ocusing pi 4.82 and a single precipitation line on Ouchterlony double diffusion plate with antibody developed against it. Analysis of the steady-state kinetics, using a simple sequential model for the kinetic data obtained with GSH and CDNB as substrates gave Km values for glutathione (0.4 and 0.8mM) and for CDNB (0.3 and 2.0mM). Incubation of the diluted enzyme at 37°C and pH 6.5 resulted in inactivation (t^/p 5 min) which could be prevented by the addition of GSSG or GSH to the incubation medium. Reversal of inactivation was also observed with these agents. The extent of reactivation was found to depend on the time of addition of GSSG or GSH. An enzyme sample which had lost 20% of its initial activity could be fully reactivated where as at 60min of inactivation reversel could be achieved only to 70% of zero-time activity. The results were interpreted in terms of a consecutive mechanism involving potentially reversible dissociation of the dimeric enzyme to yield active monomers in a rate-limiting step, followed by conversion of the active monomers to an inactive form.