Linagliptin ve pioglitazon'un tip 2 diyabetik sıçan femuru kırık modelinde kemik iyileşmesine etkilerinin araştırılması /
Yazar: HAMISI MWARINDANO MRAJA
Danışman: ÖĞR. GÖR. SEVER ÇAĞLAR
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Bağcılar Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Diabetes mellitus-tip 2 = Diabetes mellitus-type 2 ; Femoral kırıklar = Femoral fractures ; Kırık iyileşmesi = Fracture healing ; Kırıklar-kemik = Fractures-bone ; Linagliptin = Linagliptin ; Pioglitazon = Pioglitazone ; Sıçanlar = Rats ; Yara iyileşmesi = Wound healing

Özet:
Amaç: Diabetes mellitus'un osteoporoz ile yakından ilişkili olduğu ve kırık
riskini arttırdığı bilinmektedir. Ayrıca, metabolik kemik hastalığının hipoglisemik
terapi ile etkili bir şekilde tedavi edildiği bilinmektedir. Tiazolidindionların (TZD'ler)
uzun süreli kullanımı, tip 2 diyabetli (T2DM) hastalarda kemik kaybı ve artmış kırık
riski ile ilişkilendirilmiştir. Son zamanlarda, yeni bir oral antidiyabetik ilaç olan
dipeptidil peptidaz- IV (DPP IV) inhibitörlerinin kemik metabolizması üzerindeki
etkileri geniş çapta incelenmiştir. DPP4-i tedavisi, diyabetik sıçanlarda kemik
kaybını azaltır ve mekanik kemik gücünü iyileştirir. Bu çalışmamızda streptozotosin
ile indüklenmiş diyabetik sıçanlarda femur kırık modeli oluşturarak DPP4-i olan
Linagliptin, TZD olan Pioglitazon ve bunların kombine kullanımının kırık iyileşmesi
üzerindeki etkilerini radyolojik, histomorfometrik, immunohistokimyasal ve
biyomekanik açıdan incelemeyi amaçladık.
Gereç ve Yöntem: Çalışmada 72 adet 10 haftalık Sprague Dawley sıçan
kullanıldı. Tüm sıçanlara intraperitoneal olarak 45mg/Kg streptozotocin (STZ)
(Sigma®, Chemical Company, St. Louis, USA) verilerek Tip 2 diyabet modeli
oluşturulduktan sonra rastgele 4 gruba ayrıldı ve her bir grupta 18 sıçan olacak
şekilde; Tedavisiz diyabet grubu (TD), Pioglitazon grubu (P), Linagliptin grubu (L)
ve Pioglitazon + Linagliptin grubu (PL) oluşturuldu. Pioglitazon ve linagliptin
10mg/kg/gün dozunda oral verildi. PL grubuna 10 mg/kg/gün Pioglitazon + 10
mg/kg/gün Linagliptin oral verildi. Bu çalışmada, femur kırık modeli oluşturulduktan
sonra intrameduller stabilizasyon sağlandı. Ameliyattan 2 ve 6 hafta sonra, sıçanlara
radyolojik, histolojik, immünohistokimyasal ve biyomekanik açıdan kemik iyileşme
parametrelerinin analizi için sakrifiye edildi. Sağ femurlar yumuşak dokulardan
ayrıldıktan sonra intrameduller çivisi çıkarıldı. Biyomekanik analiz için femura üç
nokta bükme testi kullanılarak değerlendirildi. İmmunohistokimyasal olarak CD-34
ve VEGF değerlendirildi. İstatiksel analizleri one way ANOVA testi ile, gruplar arası
farklılıklar ise t-testi ve Kruskal-Wallis, Mann-Whitney U test ile karşılaştırıldı.
Bulgular: Radyolojik incelemede, 2. haftada L grubunda PL grubundan
anlamlı olarak %94.3 daha fazla kallus geliştiği değerlendirilmiştir (p <0.05). 2.
haftada P grubunda BMD değeri PL ve TD grubundan anlamlı olarak daha düşüktü
xi
(p <0.05). L grubunda BMD değeri PL ve TD grubundan anlamlı olarak daha
düşüktü (p <0.05). 2. haftada P ve L grubunda TD grubundan anlamlı olarak daha
fazla kallus gelişmiştir (p <0.05). Biyomekaniksel incelemede, 6 haftalık
biyomekaniksel dayanıklılık açısından L ve PL grubunda eğilme dayanımı-σbend
(MPa) değeri P grubundan daha anlamlı yüksekti (p <0.05). Histopatolojik
incelemede, P grubunun 6. hafta histolojik iyileşme skoru L grubundan anlamlı
derecede düşüktü (p <0.05). 2. haftada, P ve PL grupları inflamasyon skorları L
grubundan daha anlamlı yüksek bulunmuştur (p <0.05). 6. haftada, P grubun
inflamasyon skoru TD grubundan daha anlamlı yüksek bulunmuştur (p <0.05).
İmmunohistokimyasal incelemelerinde, 6. haftada L grubunun CD 34
immunoreaktivite skorunun, 2. haftaya kıyasla anlamlı derecede arttığı belirlenmiştir
(p <0.05). 2. haftada, PL grubunun CD 34 immunoreaktivite skoru P grubundan daha
anlamlı düşüktü (p <0.05). 6. haftada, PL grubunun CD 34 immunoreaktivite skoru L
grubundan daha anlamlı düşüktü (p <0.05).
Sonuç: Sonuçlarımıza göre, kemirgen modellerinde, oral yoldan uygulandığında
Linagliptinin T2DM sıçanlardaki kırıklarda artan mineralize doku oluşumu ve
biyomekanik özellikler için uygun ortam sağladığı, kallus oluşumu ve angiogenezis
üzerinden kırıkların iyileşmesinde additif etki yarattığı görüldü. Linagliptin ve
Pioglitazon kombinasyonu sadece BMD ve biyomekanik açıdan daha iyi kırık
iyileşmesini sağlamıştır. Daha önceki çalışmalarda gösterildiği gibi Pioglitazonun
oral tedavisinin BMD'i azaltarak osteopeni yaptığı çalışmamızda da gösterilmiştir.
Ayrıca pioglitazon tedavisi kırık iyileşmesinde tedavisiz diyabetik sıçanlardan daha
fazla kallus gelişimini sağlamış olsa da genel olarak kırık iyileşmesi üzerindeki etkisi
L ve PL gruplarından daha az bulunmuştur. Linagliptin klinik uygulamalarda T2DM
hastalarında tek başına kullanılamadığından bu sonuçlar kombine tedavinin
(Pioglitazon + Linagliptin) hem T2DM'un tedavisinde hem de bu protokol
altındayken hastaların mevcut olan kırık riski meydana gelmesi durumunda
iyileşmenin daha avantajlı olmasını sağladığını işaret edilebilmektedir.
Anahtar kelimeler: Femur, Kırık iyileşmesi, Linagliptin, Pioglitazon,
Streptozotocin, Tip 2 Diyabet mellitus

Abstract:
Aim: Diabetes mellitus has been testified to be closely related with
osteoporosis and an increased risk of fracture. Subsequently, metabolic bone disease
has been described to be effectively treated with hypoglycemic therapy. Long-term
use of thiazolidinediones (TZDs) is associated with bone loss and an increased risk
of fracture in patients with type 2 diabetes (T2DM). Recently, the effects of
dipeptidyl peptidase- IV (DPP IV) inhibitors, a new type of oral antidiabetic drug, on
bone metabolism have been widely studied. DPP IV inhibitor treatment attenuates
bone loss and improves mechanical bone strength in diabetic rats. In our study, we
aimed to examine the effects of DPP IV inhibitor; Linagliptin, TZD; Pioglitazone
and their combined use on fracture healing in terms of radiological,
histomorphometric and biomechanics by creating a femoral fracture model on a
streptozotocin-induced diabetic rat model.
Material and Methods: In our study, we included 10-week-old 72 Sprague–
Dawley rats. Type 2 diabetes model was established by administering 45mg/Kg of
streptozotocin (STZ) (Sigma®, Chemical Company, St. Louis, USA) to all rats
intraperitoneally ant then they were randomly divided all the rats into 4 groups
consisting of 18 rats each; Non-treated diabetes group (TD), Pioglitazone group (P),
Linagliptin group (L), and Pioglitazone + Linagliptin group (PL). 10 mg/kg/day
dosage of pioglitazone and linagliptin was administered orally. As for the PL group,
10 mg/kg/day pioglitazone and 10mg/kg/day linagliptin was orally given. In this
study, femur fractures were produced and stabilized intramedullary. After 2 and 6
weeks, rats were sacrifised for radiographic, micro-CT, histologic,
immunohistochemistry and biomechanical analysis of the bone healing parameters.
The right femurs were then harvested and the marrow-nail was extracted. The
biomechanic analysis of femora to fracture was assessed using a three-point bending
test. CD-34 and VEGF was analysed immunohistochemically. Statistical analysis
was perfomed with one-way ANOVA test and Comparisons between were assessed
using t-test, and Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U tests.
Results: In radiological evaluation, the 2-week fracture healing process
evaluation of the callus developed in the L group was significantly 94.3% more than
xiii
in the PL group (p <0.05). BMD value of P group was significantly lower than PL
and TD groups (p <0.05). BMD value of L group was significantly lower than PL
and TD groups (p <0.05). As for the 6-week fracture healing process evaluation the
callus developed in the TD group was significantly more than in the P and L groups
(p <0.05). In biomechanical evaluation, in terms of the 6-week biomechanical
strength, bending strength-σbend (MPa) value was significantly higher in L and PL
groups than in P group (p ˃0.05). In histopathological evaluation, histological
healing score in the 6th week P group was significantly lower than L group (p <0.05).
In inflammation evaluations, the scores of P and PL groups in the 2nd week were
significantly higher than L group while in the 6th week P group was significantly
higher than TD group (p <0.05). In immunohistochemical evaluation, the CD 34
immunoreactivity score of L group in 6th week was significantly higher than in the
2nd week whereas PL group in 2-week was significantly lower than P group and also
the PL group in 6-week was significantly lower than L group (p <0.05).
Conclusion: According to our results they indicate that in rodent models
when linagliptin is administered orally there is an additive effect on the fracture
healing in T2DM rats, and this supplemented effect was specific by providing the
framework for enhanced mineralized tissue formation and biomechanical properties
hence leading to callus formation and angiogenesis process of the newly formed
bone. The combination therapy (Pioglitazone + Linagliptin) only provided better
BMD and biomechanical strength of the healed fracture. As shown in previous
studies, it was also shown in our study that oral treatment of Pioglitazone decreases
BMD displaying the osteopenia. In addition, although Pioglitazone developed more
callus in fracture healing than untreated diabetic rats, its effect was generally less
than the L and PL groups. Since Linagliptin cannot be used alone in the treatment
protocol of T2DM patients clinically, these results indicate that T2DM patients who
have high risk of bone fractures, under this protocol of combined therapy
(Pioglitazone + Linagliptin) may provide advantageous healing of bone fractures.
Keywords: Bone healing, Femur, Linagliptin, Pioglitazone, Streptozotocin,
Type 2 diabetes