Hücre modelinde sırt4 (sirtuin4)'ün eksitotoksisiteye karşı koruyucu etkisinin araştırılması
Investigation of the protective effect of sirt4 (sirtuin4) against exitotoxicity in A cellular model
Yazar: MERVE ÇOLAK
Danışman: DOÇ. DR. GİZEM DÖNMEZ YALÇIN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Eksitotoksisite = Excitotoxicity ; Glutamat = Glutamates ; Kainik asit = Kainic acid ; Kainik asit = Kainic acid ; Sirtuin = Sirtuin ; Sirtuin = Sirtuin

Özet:
Glutamat, merkezi sinir sisteminde birçok nörolojik işleve sahiptir ve beyinde yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Sinir terminallerinde glutamat, yoğun olarak bulunur ve hücre içindeki konsantrasyonu dışındaki konsantrasyona göre çok daha fazladır. Sinir hücre membranının depolarizasyonu ile kalsiyuma bağlı bir süreçte presinaptik sinir uçlarındaki veziküllerden hücreler arası boşluğa glutamat salınır ve postsinaptik nörondaki glutamat reseptörleri uyarılır. Glial hücrelerde yer alan glutamat taşıyıcılarının hücreler arası boşluktan glutamatı toplanmasıyla uyarım bitirilir. Glutamat seviyesinin nöronal boşlukta artışı toksiktir, nöron hasarı ve ölümüne neden olur. Bu durum, glutamata bağlı eksitotoksisite olarak adlandırılır. Eksitotoksisite, travma, serebral iskemi, epilepsi, Parkinson Hastalığı, Alzheimer Hastalığı gibi birçok nörolojik hastalığın altındaki sebeplerdendir. Kainik asit, glutamat analogudur, nörotoksisite oluşturulması için kullanılan kimyasal bir modeldir. Sessiz bilgi düzenleyicisi (Sir) protein ailesinin ilk üyesi olan Sir2'nin homologları sirtüinler olarak adlandırılır. Memelilerde yedi tane sirtüin (Sirt1-7) bulunur. Sirt4, deasetilaz ve ADP-ribosilaz etkinliği gösteren ve mitokondride bulunan memeli sirtüinidir. Sirt4, GDH'ı aracı olarak kullanarak glutamin metabolizmasını düzenler. Bundan dolayı, Sirt4'ün nöronal uyarılar ve eksitotoksisite sırasında artan glutamat seviyesine cevabı düzenleyeceği düşünülmektedir. Bu çalışmada, N2A hücreleri 10 µM, 50 µM, 200 µM ve 1000 µM'lık kainik asit konsantrasyonlarıyla muamele edildi. Ardından, hücrelerin canlılık seviyeleri MTT testi ile değerlendirildi. 200 µM ve 1000 µM'lık kainik asit konsantrasyonlarında hücre canlılık seviyesinde anlamlı düşüş olduğu belirlendi. Takip eden deneylerde 1000 µM'lık kainik asit konsantrasyonunun kullanılmasına karar verildi. N2A hücrelerinde transfeksiyon yöntemi ile Sirt4 ifadesi arttırıldı ve ifade artışı western blot yöntemi ile gösterildi. Sirt4 ifadesi arttırılmamış (kontrol) ve Sirt4 ifadesi arttırılmış (transfekte edilmiş) N2A hücre grupları 1000 µM konsantrasyonda kainik asit ile muamele edildi. Muamele sonrasında, kontrol N2A, kainik asit muamelesi yapılmış N2A, yalnızca Sirt4 ifadesi arttırılmış ve kainik asit muamelesi yapılmış ve Sirt4 ifadesi arttırılmış olmak üzere dört farklı N2A hücre grubu elde edildi. Bu hücre gruplarındaki canlılık seviyesi MTT testi ile ölçüldü. Kontrol N2A ile kainik asit muamelesi yapılmış N2A grupları arasında yapılan kıyaslamada, kainik asit muamelesi sonucu hücrelerin canlılık seviyelerinde anlamlı bir düşüş gözlendi. Sirt4 ifadesinin arttırılmasının ise hücre canlılığındaki düşüşü azalttığı gözlendi. Ayrıca, bu dört farklı deney grubunda glutamat salınımı 0, 12, 24, 48 saatlik süre için ölçüldü. Kainik asit muamelesi yapılmış ve Sirt4 ifadesi arttırılmış deney grubunda, yalnızca kainik asit ile muamele edilmiş deney grubuna kıyasla, hücre ölümünün daha az olduğu, bu nedenle daha fazla glutamat salınımı yapıldığı gösterildi. Dolayısıyla, Sirt4'ün eksitotoksisiteyi engelleyerek hücre ölümünü azaltabileceği gösterildi.

Anahtar kelimeler: Eksitotoksisite, glutamat, kainik asit, sirtüin, Sirt4.

Abstract:
Glutamate has many neurological functions in the central nervous system and is found at high concentrations in the brain. At the nerve terminals, glutamate is densely present and has a much higher concentration outside the cell. By depolarization of the nerve cell membrane, glutamate is released from the vesicles of the presynaptic nerve endings into the intercellular space and the glutamate receptors in the postsynaptic neuron are stimulated. Stimulation is terminated by collecting glutamate from the intercellular space by glutamate transporters on glial cells. Increased levels of glutamate in the neuronal space are toxic, causing neuron damage and death. This is called glutamate-induced excitotoxicity. Excitotoxicity is among the causes of many neurological diseases such as trauma, cerebral ischemia, epilepsy, Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease. Kainic acid is a glutamate analogue, a chemical model used to generate neurotoxicity. The homologues of Sir2, the first member of the silent information organizer (Sir) protein family, are called sirtuins. There are seven sirtuins (Sirt1-7) in mammals. Sirt4 is a mammalian sirtuin which is present in the mitochondria, showing deacetylase and ADP-ribosylase activities. Sirt4 regulates glutamine metabolism using GDH as a mediator. Therefore, Sirt4 is thought to regulate the response to increased glutamate levels during neuronal stimuli and excitotoxicity. In this study, N2A cells were treated with 10 µM, 50 µM, 200 µM and 1000 µM kainic acid concentrations. The viability of the cells was then assessed by the MTT test. There was a significant decrease in cell viability at 200 µM and 1000 µM kainic acid concentrations. In the following experiments, 1000 µM concentration of kainic acid was decided to be used. In N2A cells, Sirt4 expression was increased by transfection and the the enhanced expression was assesed by western blot method. N2A cell lines with or without Sirt4 overexpression were treated with kainic acid at a concentration of 1000 µM. After treatment, four different groups of N2A cells were obtained, control N2A, N2A treated with kainic acid, Sirt4 overexpressed, and kainic acid treated and Sirt4 overexpressed. The viability of these cells was measured by MTT test. Kainic acid treatment lead to a decrese in the cell viability. Increasing Sirt4 expression reduced the decrease in cell viability. In addition, glutamate release in these four different experimental groups was measured for 0, 12, 24, 48 hour periods. It was shown that in the experimental group with Sirt4 overexpression and kainic acid treatment, the cell death was less than that of the experimental group treated with kainic acid alone, therefore more glutamate was released. Thus, it has been shown that Sirt4 can reduce cell death by inhibiting excitotoxicity.

Keywords: Excitotoxicity, glutamate, kainic acid, sirtuin, Sirt4.