PKR kinaz aktivasyonunun koryokarsinom hücrelerinde kemoterapötik ajana duyarlılığına etkisi
The effect of PKR kinase activation on the sensitivity of choriocarcinoma cells to a chemotherapeutic agent
Yazar: BÜŞRA BİLEN
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH YALÇIN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Doksorubisin = Doxorubicin ; Koryokarsinom = Choriocarcinoma

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı hücre kültüründe çoğaltılan koryokarsinom (swan 71) hücrelerinin PKR aktivasyonu sonucunda proliferasyon ve apoptotik özelliklerinin ne şekilde değişeceğini belirmeyi amaçlandı. Ayrca  PKR aktivasyonunun koryokarsinom hücrelerinde kemoterapötik ajan doksorubisine karşı duyarlılığını belirleyerek, kanser tedavisinde kullanabilecek bir alternatif olabileceğini göstermeyi hedeflendi.
Gereç ve Yöntem: İlk olarak hücre kültürü yöntemiyle insan plasenta trofoblast karsinom swan 71 hücreleri çoğatıldı. Hücreler, doksorubisin grubu ve poly I:C/LPS/doksorubisin grubu olarak iki gruba ayrıldı. Doksorubisin grubunda doksorubisin, farklı dozlarda (0.39 μg/ml, 1.56 μg/ml, 6.25 μg/ml, 25 μg/ml, 100 μg/ml) hücrelere 24 saat boyunca uygulandı. PKR aktivasyonu oluşturmak için ise LPS ve poly I:C swan 71 hücrelerine 48 saat uygulandı. Ardından gruplar; kontrol, doksorubisin, poly I:C/LPS ve poly I:C/LPS/doksorubisin olarak oluşturuldu. Deney gruplarına göre,  hücrelere uygulanan 50 μl poly I:C ve 500 μl LPS 48 saat boyunca inkübasyona, 100 μl doksorubusin ise 24 saat inkübasyona bırakıldı. LPS, poly I:C ve doksorubisinin swan 71 hücreleri üzerine olan etkilerine belirlemek için MTT canlılık testi yapıldı. Daha sonra bu gruplar arasında doksorubisin ile 24 ve 48 saat  muamele edilen hücrelerde ve poly I:C/ LPS  48 ve 72 saat muamele edilen hücrelerde flow sitometri yöntemiyle canlılığa, nekroz ve apoptoz yolaklarına bakıldı. Son olarak, deney gruplarına doksorubisin 24 saat ve poly I:C/LPS 48 saat muamele edildi ve bu hücrelerden protein izolasyonu metoduyla protein elde edildi. Ardından, bradford deneyi ile elde edilen protein miktarı belirlendi. PKR aktivasyonun tespiti ve PKR aktivasyonunda doksorubisinin etkisini belirlemek için western blot deneyi yapılarak p-PKR ve a-tubuline bakıldı. 
Bulgular: İlk olarak hücre sayım cihazıyla yapılan deneyde doksorubisinin farklı dozları ile (0.39 μg/ml, 1.56 μg/ml, 6.25 μg/ml, 25 μg/ml, 100 μg/ml)  muamele edilen swan 71 hücrelerinde kontrole oranla doza ve zamana bağlı canlılık yüzdesinde konsantrasyon arttıkça istatistiksel olarak anlamlı azalmalar gözlendi (p < 0,05, p < 0,001). Doksorubisinin farklı dozları ile muamele edilen PKR aktive edilmiş hücrelerde, kontrole oranla doza ve zamana bağlı istatistiksel olarak anlamlı azalmalar gözlendi (p < 0,05, p < 0,001).  Doksorubisin, PKR aktive edilen hücrelerde, doza bağlı ve zamana bağlı olarak hücreleri öldürücü etkiye direnç sağlamıştır ve istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Devamında MTT testi; kontrol, LPS/poly I:C, doksorubisin ve LPS/poly I:C/dox gruplarında değerlendirildi fakat sonuç elde edilemedi. Flow sitometride kontrol, LPS/poly I:C, doksorubisin ve LPS/poly I:C/dox gruplarında 24 ve 48 saat canlılık değerlerine bakıldığında ise poly I:C/LPS grubunda kontrole göre anlamlı derecede artış gözlendi (p<0,05, p<0,001). Poly I:C/LPS/dox grubunda ise doksorubisin grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış saptandı (p<0,05, p<0,001). Daha sonra kontrol, LPS/polyI:C, doksorubisin ve LPS/poly I:C/dox gruplarında 24 ve 48 saat süreyle nekroz yolağına bakıldığında, LPS/polyI:C grubunun kontrole oranla nekroz yolağına gitmediği, LPS/polyI:C/dox grubunun ise doksorubisin grubun göre nekroz yolağına gittiği görüldü. Kontrol, LPS/polyI:C, doksorubisin ve LPS/poly I:C/dox gruplarında 24 saat ve 48 saat boyunca apoptoz yolaklarına bakıldığında, LPS/polyI:C/dox grubunun doksorubisin grubuna göre apoptoza gittiği gözlendi. Son olarak tüm gruplarda p-PKR aktivasyonu western blot analiziyle tespit edildi. PKR aktivasyonunun doksorubisinin duyarlılığını engellediği görüldü.  
Sonuç: Mevcut çalışmada, PKR aktivasyonunun koryokarsinom hücrelerinde bir kemoterapötik ajan olan doksorubisine karşı direnç gösterdiği gözlendi.

Abstract:
Objective: Objective: The aim of this study was to determine how the proliferation and apoptotic properties of choriocarcinoma (swan 71) cells grown in cell culture would change as a result of PKR activation. In addition, it was aimed to determine the sensitivity of PKR activation to the chemotherapeutic agent doxorubicin in choriocarcinoma cells and to show that it can be an alternative that can be used in cancer treatment.
Materials and Methods: First, human placenta trophoblast carcinoma swan 71 cells were grown by cell culture method. Cells were divided into two groups as doxorubicin group and poly I:C/LPS/doxorubicin group. In the doxorubicin group, different doses of doxorubicin (0.39 µg/ml, 1.56 µg/ml, 6.25 µg/ml, 25 µg/ml, 100 µg/ml) were applied to the cells for 24 hours. To induce PKR activation, LPS and poly I:C were applied to swan 71 cells for 48 hours. Then the groups; control, doxorubicin, poly I:C/LPS and poly I:C/LPS/doxorubicin. According to the experimental groups, 50 μl of poly I:C and 500 μl of LPS applied to the cells were incubated for 48 hours, and 100 μl of doxorubucin for 24 hours. MTT viability assay was performed to determine the effects of LPS, poly I:C and doxorubicin on swan 71 cells. Then, viability, necrosis and apoptosis pathways were examined by flow cytometry in cells treated with doxorubicin for 24 and 48 hours and in cells treated with poly I:C/LPS for 48 and 72 hours. Finally, experimental groups were treated with doxorubicin for 24 hours and poly I:C/LPS for 48 hours, and protein was obtained from these cells by protein isolation method. Then, the amount of protein obtained by the bradford experiment was determined. In order to detect PKR activation and to determine the effect of doxorubicin on PKR activation, western blot experiment was performed and p-PKR and α-tubulin were examined.
Results: Doxorubicin in swan 71 cells treated with different doses (0.39 µg/ml, 1.56 µg/ml, 6.25 µg/ml, 25 µg/ml, 100 µg/ml) in the experiment performed with the cell counter, compared to the control Statistically significant decreases were observed in percent viability as the concentration increased (p < 0.05, p < 0.001). Statistically significant dose- and time-dependent reductions were observed in PKR-activated cells treated with different doses of doxorubicin compared to control (p < 0.05, p < 0.001). Doxorubicin provided dose- and time-dependent resistance to the lethal effect in PKR-activated cells and was found to be statistically significant. In the following, MTT test; were evaluated in the control, LPS/poly I:C, doxorubicin and LPS/poly I:C/dox groups, but no results were obtained. When the 24-hour and 48-hour viability values in the control, LPS/poly I:C, doxorubicin and LPS/poly I:C/dox groups were examined in flow cytometry, a significant increase was observed in the poly I:C/LPS group compared to the control (p<0.05, p<0.001). A statistically significant increase was found in the Poly I:C/LPS/dox group compared to the doxorubicin group (p<0.05, p<0.001). Then, when the necrosis pathway was examined for 24 and 48 hours in the control, LPS/polyI:C, doxorubicin and LPS/poly I:C/dox groups, it was observed that the LPS/polyI:C group did not go to the necrosis pathway compared to the control, the LPS/polyI:C/dox group On the other hand, it was observed that doxorubicin went to the necrosis pathway according to the group. When the apoptosis pathways were examined for 24 hours and 48 hours in the control, LPS/polyI:C, doxorubicin and LPS/poly I:C/dox groups, it was observed that the LPS/polyI:C/dox group went into apoptosis compared to the doxorubicin group. Finally, p-PKR activation was detected in all groups by western blot analysis. It was observed that PKR activation inhibited the sensitivity of doxorubicin.
Conclusion: In the current study, it was observed that PKR activation showed resistance to doxorubicin, a chemotherapeutic agent, in choriocarcinoma cells.