Vapreotid'in tau ilişkili nörodejenerasyona etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of vapreotide on tau related neurodegeneration
Yazar: EBRU UZUNHİSARCIKLI
Danışman: PROF. DR. MÜKERREM BETÜL AYCAN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Hücre dizisi = Cell line ; Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Tau proteinleri = Tau proteins ; Vapreotid = Vapreotid

Özet:
Alzheimer hastalığı (AH) nöron ve sinapsların kaybıyla karakterize ilerleyici nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu tez çalışmasında somatostatinerjik ileti ile kognitif fonksiyonlar arasındaki ilişkiden yola çıkılarak somatostatin analoğu olan Vapreotid'in Alzheimer patolojisi üzerindeki etkinliği ve etki mekanizmasının araştırılması amaçlanmıştır.
Bu çalışma kapsamında, SH-SY5Y hücre hattına pcDNA3.1 vektörüne klonlanan MAPT geni ve transfeksiyon ajanı kullanılarak tau transfeksiyonu işlemi gerçekleştirildi. Hücre canlılığı ve antagonizma deneyleri için gerçek zamanlı hücre analizörü (GZHA) kullanıldı.
Pozitif kontrol olarak 10 µM Memantin kullanılan canlılık deneylerinde, Vapreotid 50 µM (p<0,0001) ve 100 µM (p<0,05)'da hücre canlılığını korurken, CYN154806'nın 100 µM'da hücre canlılığını azalttığı (p<0,05) görüldü. Tau transfekte SH-SY5Y hücrelerinde Vapreotid'in 24 saatlik EC50 değeri 35,6 µM iken CYN154806'nın IC50 değeri 42,36 µM olarak hesaplandı. GZHA aracılığıyla CYN154806'nın kompetitif antagonist olduğu tespit edilerek Schild analizi ile pA2 değeri hesaplandı. Western blot yöntemi ile Vapreotid'in (50, 100, 200 µM), p-Tau ve Tau proteinlerinin ekspresyon düzeylerini ve fosforilasyonunu azalttığı (50 µM-p<0,001; 100 µM-p<0,001; 200 µM-p<0,001) belirlendi. Vapreotid, mitokondriyal membran potansiyelini değiştirmezken; qPCR yöntemi ile Vapreotid'in hücreyi apoptoza götüren parametrelerden biri olan Bax/Bcl2 (50 µM-p<0,001; 100 µM-p<0,01; 200 µM-p<0,001) ekspresyon düzeyini ve AH için genetik açıdan risk oluşturan APOE gen düzeyini (50 µM-p<0,01; 100 µM-p<0,01; 200 µM-p<0,001) azalttığı tespit edildi. 
Sonuç olarak, tau transfekte SH-SY5Y insan nöroblastoma hücresinde, gerçek zamanlı hücre çoğalma eğrileri ve Vapreotid'in bu hücrelerde EC50 değeri ilk kez bu tez çalışması ile belirlendi. Ayrıca, tau transfekte SH-SY5Y hücrelerinde Vapreotid'in tau fosforilasyonunu inhibe ettiği; APOE geninin ekspresyon düzeyini azalttığı ve Bax/Bcl2 ekspresyon düzeyini azalttığının da yine ilk kez gösterildiği bu çalışma, Alzheimer hastalığında somatostatin analoğu olan Vapreotid'in potansiyel terapötik rolünü göstermektedir.

Abstract:
Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease characterized by loss of neurons and synapses. The aim of this thesis is to investigate the effect of somatostatin analogue Vapreotide on Alzheimer's pathology and mechanism of action based on the relationship between somatostatinergic transmission and cognitive functions.
In this study, tau transfection was performed using the MAPT gene cloned into the PCDNA3.1 vector and transfection reagent into the SH-SY5Y cell line. Real-time cell analyzer (RTCA) was used for cell viability and antagonism experiments. In viability experiments using 10 µM Memantine as a positive control, it was observed that Vapreotide at 50 µM (p<0.0001), 100 µM (p<0.05) had a protective effect on cell viability, 100 µM CYN154806 was found to decrease (p<0.05) cell viability. In tau transfected SH-SY5Y cells, EC50 value of Vapreotide was calculated to be 35.6 µM, IC50 value of CYN154806 was calculated to be 42.36 µM at 24 hours. CYN154806 was determined to be a competitive antagonist by means of GZHA and pA2 value was calculated via Schild analysis. It was determined that Vapreotide, decreased the expression levels (50 µM-p<0.001; 100 µM-p<0.001; 200 µM-p<0.0001) and phosphorylation of Tau and p-Tau proteins by western blot method. While Vapreotide was not change mitochondrial membrane potential; with the qPCR method it was found that Vapreotide, decreased Bax/Bcl2 (50 µM-p<0.001; 100 µM-p<0.01; 200 µM-p<0.001) expression level, which is one of the parameters leading to cell apoptosis, and decreased the expression level (50 µM-p<0.01; 100 µM-p<0.01; 200 µM-p<0.001) of the APOE gene, which constitutes a genetic risk for AD. 
In conclusion, real-time cell proliferation curves and EC50 value of Vapreotide in tau-transfected SH-SY5Y human neuroblastoma cells were determined for the first time by this thesis study. In addition, revealing for the first time that Vapreotide inhibited tau phosphorylation in transfected SH-SY5Y cells and decreased the expression level of the APOE gene, and decreased Bax/Bcl2 expression level, this study demonstrates a potential therapeutic role for a somatostatin analogue Vapreotide in Alzheimer's disease.