Deneysel iskemi modelinde neurod2 tedavisinin moleküler etkilerinin incelenmesi
Investagation of the molecular effects of neurod2 treatment in experimental ischemia model
Yazar: BUSENUR BOLAT
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MERVE BEKER
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Hamidiye Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen tedavisi = Gene therapy ; Glükoz = Glucose ; Nöronal plastisite = Neuronal plasticity ; Oksijen = Oxygen ; İnme = Stroke ; İnme rehabilitasyonu = Stroke rehabilitation ; İskemi = Ischemia

Özet:
Amaç: Günümüzde beyin felcinde klinik uygulanabilirliği olan tek tedavi edici ajan,
doku plazminojen aktivatörüdür (tPA). Günümüzde transkripsiyon faktörleri olası tedaviler 
arasında yer almaktadır. NeuroD2 beyinde salgılanan nörogenezi ve farklılaşmayı 
indükleyen nöronal bir transkripsiyon faktörüdür. Yapılan bu çalışmada in vitro deneysel 
iskemi yönteminde, nöroplastisiteyi ve sağ kalımı tetikleyen bir transkripsiyon faktörü olan 
NeuroD2 ifadesinin arttırılma ve inhibe edilmesiyle beraber gerçekleşen moleküler 
değişikliklerin araştırılması amaçlanmıştır. 

Gereç ve Yöntem: Lentiviral vektörler içerisine gen klonlama yöntemleri aracılığı 
ile NeuroD2 geninin over-ekspresyon ve inhibisyon grupları oluşturulmuştur. Oksijen 
Glikoz Deprivasyonu (OGD) yöntemi ile in vitro ortamda fare nöroblastoma hücreleri olan 
N2a hücreleri üzerinde iskemi koşullarının oluşturulmuştur. Apoptoz analizleri Terminal 
deoksinükleotidil transferaz dUTP uç etiketleme (TUNEL) yöntemi ile yapılmıştır. NeuroD2 
over-ekspresyonun ve inhibisyonun protein ifadesine etkisini tespit edebilmek için Western 
Blot yöntemi kullanılmıştır. 

Bulgular: İskemik koşullar altında NeuroD2 over-ekspresyonun grubunun
hücrelerdeki sağ kalımını arttırdığı ve hücrelerin apoptoza girmesini anlamlı olarak azalttığı, 
NeuroD2 inhibisyon grubunun ise sağ kalımı anlamlı olarak azalttığı görülmüştür. NeuroD2 
over-ekspresyon grubunun p-PTEN ve p-GSK3 α/β ifadesini azaltarak, mTOR ifadesini ise 
arttırarak AKT sağ kalım yolağını düzenlediği düşünülmektedir. NeuroD2 over-ekspresyon 
grubununda azalan p-Nfκ-β ve nNOS proteinlerinin ifadelerinin azaldığı gözlemlenmiştir.
NeuroD2 inhibisyon grubunda p-PTEN, p-GSK3α/β, mTOR, p-Nfƙ-B ve nNOS 
proteinlerinin ifadesinde ve TUNEL boyamasında anlamlı bir değişim gözlemlenmemişken 
p-AKT ifadesi anlamlı olarak artış göstermiştir. NeuroD2 over-ekspresyon ve inhibisyon
grubunda Sinaptofizin ve HIF1α ifadelerinde anlamlı bir değişim gözlenmemiştir. 

Sonuç: NeuroD2 over-ekspresyonu anlamlı bir şekilde hücrelerin hipoksik ortamda 
sağ kalımını arttırmakta, apoptosisi, inflamasyonu ve oksidatif stresi azaltmaktadır ve AKT yolağını düzenlediği görülmektedir. Bu bağlamda NeuroD2 iskemi tedavisi için potansiyel 
bir aday olabilmektedir.

Abstract:
Aim: Currently, the only therapeutic agent with clinical applicability in stroke is 
tissue plasminogen activator (tPA). Today, transcription factors are among the possible 
treatments. NeuroD2 is a neuronal transcription factor secreted in the brain that induces 
neurogenesis and differentiation. In this study, it was aimed to investigate the molecular 
changes that occur with increasing and inhibiting the expression of NeuroD2, a transcription 
factor that triggers neuroplasticity and survival, in the in vitro experimental ischemia 
method.

Materials and Methods: Over-expression and inhibition groups of NeuroD2 gene 
were formed by gene cloning methods into lentiviral vectors. With the Oxygen Glucose 
Deprivation (OGD) method, ischemia conditions were established on N2a cells, which are 
mouse neuroblastoma cells, in vitro. Apoptosis analysis were performed by Terminal 
deoxynucleotidyl transferase dUTP end-tagging (TUNEL) method. Western blot method 
was used to determine the effect of NeuroD2 over-expression and inhibition on protein 
expression.

Results: It was observed that under ischemic conditions, the NeuroD2 overexpression group increased cell survival and significantly reduced cell apoptosis, while the 
NeuroD2 inhibition group significantly decreased survival. NeuroD2 over-expression group 
is thought to regulate the AKT survival pathway by decreasing p-PTEN and p-GSK3 α/β 
expression and increasing mTOR expression. It was observed that the expression of p-Nfκβ and nNOS proteins decreased in the NeuroD2 over-expression group. In the NeuroD2 
inhibition group, no significant change was observed in the expression of p-PTEN, pGSK3α/β, mTOR, p-Nfƙ-B and nNOS proteins and TUNEL staining, whereas p-AKT 
expression increased significantly. No significant change was observed in Synaptophysin 
and HIF1α expressions in NeuroD2 over-expression and inhibition group.

Conclusion: NeuroD2 over-expression significantly increases cell survival in a 
hypoxic environment, reduces apoptosis, inflammation and oxidative stress, and appears to regulate the AKT pathway. In this context, NeuroD2 may be a potential candidate for the 
treatment of ischemia.