Bebek mamalarında cronobacter sakazakıı' nın alternatif hızlı metot (PCR) ile tespit edilmesinin klasik kültürel yöntem ile karşılaştırılması
Comparison of cronobacter sakazakii detection by using rapid method (PCR)  with classical cultural method in infant formula
Yazar: YASEMİN DEMİRHAN
Danışman: PROF. DR. ÖZGE ÖZGEN ARUN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Besin Hijyeni ve Teknolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bebek beslenmesi = Infant nutrition ; Bebek mamaları = Infant food ; Besinler = Foods ; Beslenme = Nutrition ; Enterobacter sakazakii = Enterobacter sakazakii ; Model geçerliliği = Model validation ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Bebek formülleri, bebeklerin yaşamlarının ilk ayları boyunca anne sütünün yetersiz olduğu ya da verilemesinin uygun olmadığı durumlarda içerik olarak anne sütüne yakın formüle edilmiş özel beslenme ihtiyacını karşılayan ürünlerdir. Bir çok gıda ürününde olduğu gibi bebek maması da, üretim aşamasında ya da sonrasında sağlığı tehdit eden patojen mikroorganizmalar açısından risk taşımaktadır. Bebek mamasında, yenidoğanlar için risk oluşturan patojen mikroorganizmaların başında Cronobacter sakazakii gelmektedir. C. sakazakii, su aktivitesi (aw=0.2) oldukça düşük olan toz bebek mamasında uzun süre canlı kalabilmesinden dolayı, bağışıklığı henüz gelişmekte olan bebekler tarafından tüketildiğinde, ölüm ile sonuçlanan ciddi sonuçlara neden olabilmektedir. Dolayısıyla, C. sakazakii ile kontamine bebek mamasında, bu mikroorganizmanın hızlı ve güvenilir bir yöntem ile tespit edilmesi, gerekli önlem ve aksiyonların alınabilmesi açısından önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında; C. sakazakii'nin bulunduğu tek ve çoklu rekabetçi kültür ortamları ve farklı kirletme seviyeleri oluşturularak, bebek maması yapay olarak kirletilmiş, bu örnekler referans ve hızlı metot ile analiz edilerek, iki metodun sonuçları arasındaki uyum değerlendirilmiştir. Bu amaç doğrultusunda, C. sakazakii (ATCC 29544) ve rekabetçi florayı oluşturmak için E. coli (ATCC 25922), S. epidermidis (ATCC 12228), C. freundii (ATCC 8090) ve S. Enteritidis (ATCC 13076) referans kültürleri kullanılmıştır. Tek rekabetçi kültür için; C. sakazakii (ATCC 29544) ve E. coli (ATCC 25922) ve çoklu rekabetçi kültür için; Cronobacter sakazakii (ATCC 29544), E. coli (ATCC 25922), C. freundii (ATCC 8090), S. Enteritidis  (ATCC 13076), S. epidermidis (ATCC 12228)  referans kültürleri kullanılmış ve bebek mamaları 1-5 kob/25 g, 5-10 kob/25g ve 100 kob/25 g olacak şekinde kirletilmiştir. Deneysel sonuçlar şunu göstermiştirki;  hızlı metodun tek rekabetçi kültür için uyum dereceleri rölatif doğruluk (% RD) 97,1, rölatif hassasiyet (% RH) 98,6 ve rölatif özgüllük  (% RÖ) 93,8; çoklu rekabetçi kültür için rölatif doğruluk (% RD) 85,9, rölatif hassasiyet (% RH) 91,5 ve rölatif özgüllük  (% RÖ) 77,4 seviyelerindedir. Aynı zamanda rölatif tespit limiti (RTL) çalışması için 1-5 kob/25 g kirletme düzeyinde her iki yöntem ile % 84,6 pozitif sonuç alınırken;  çoklu rekabetçi kültür için sırasıyla % 75 (hızlı metot) ve % 60 (referans metot) pozitif sonuç alınmış ve RTL değeri 1-5 kob/25g olarak belirlenmiştir. Bu sonuçlar göstermektedir ki hızlı metot ile oldukça güvenilir ve kabul edilebilir hassasiyette sonuçlar elde edilebilmektedir. Hızlı metodun, referans metoda oranla oldukça kısa sürece sonuç veriyor olmasıda kullanıcı için ek bir avantaj olarak karşımıza çıkmaktadır. Bunun  yanında, rekabetçi florayı oluşturan mikroorganizma sayısının artması, hedef bakterinin tespitini zorlaştırmakta ve her iki yönteminde tespit hassasiyetini düşürmektedir.

Abstract:
Infant formula, is a food formula which is given to babies in their first days/weeks of their life in the cases that the mother's breast milk is not sufficient or is not suitable for the baby (allergy, intolerance etc.). They are special nutrients which are formulated in a very close substitute to the human breast milk. Like many other foods, infant formulas are also a risk factor for foodborne pathogens. Cronobacter sakazakii is one of the leading pathogens risk originating from infant formula, for newborns. Because, C. sakazakii, can survive in infant formula which has significantly low level of water activity (aw=0.2) for a certain period of time, it can cause severe infections in newborn babies with death in several cases. Thus, realible and rapid detection of C. sakazakii in contaminated formulas is very important for planning preventive/corrective actions. In this thessis, various levels of C. sakazakii accompanied with single and multiple microorganisms to form competetive flora, were used for spiking infant formula samples. The artifically spikes samples were, detected in paralel with reference clasical cultural method and rapid PCR method and the agreement of the results of these two methods, was evaluated. For this purpose, besides C. sakazakii (ATCC 29544),  E. coli (ATCC 25922), S. epidermidis (ATCC 12228), C. freundii (ATCC 8090) and S. Enteritidis  (ATCC 13076) reference cultures were used to prepare competetive flora. For single competetive flora; C. sakazakii (ATCC 29544) and E. coli (ATCC 25922), and for multiple competetive flora Cronobacter sakazakii (ATCC 29544), E. coli (ATCC 25922), C. freundii (ATCC 8090),  S. Enteritidis  (ATCC 13076) and S. epidermidis (ATCC 12228) reference cultures were used to spike samples at levels of 1-5 cfu/25 g, 5-10 cfu/25g and 100 cfu/25 g. The experimental results indicated that, the agreement degrees of the two method is as fallows; for single competetive flora, relative accurarcy (RA %) is 97.1, relative sensitivity (RS %) is 98.6 and relative specificity (RS %) is 93.8 and for multiple competetive flora; relative accurarcy (RA %) is 85.9, relative sensitivity (RS %) is 91.5 and relative specificity (RS %) is 77.4. Additionally, the relative limit of detection (RLoD) was determined as 1-5 cfu/25 g; as positive detection at this spiking levels could be obtained at the ratios 84.6 % with both methods in samples containing single competive flora and 75 % (for rapid method) and 60 % (for reference method) in samples containing multiple competetive flora. These results showed that, rapid method provides reliable and relatively sensitive results in short detection period. The faster resulting capability is an other additional advantage for the user, besides accurate detection. In addition, our results proved that, the range of the type of bacteria in the competetive flora, makes the detection of target bacteria more difficult and the sensitivity of both methods decreases.