Empedans değişimi üzerinden mikroorganizma tayini yapmayı hedefleyen sensör sistemi çalışması
Sensor system study targeted to microorganism detection under impedance change
Yazar: SEVİLAY BURCU ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Artan dünya nüfusu, tarım ve enerji üretimi, iklimsel bozulmalar, endüstriyel
kirlenmeler gibi nedenler ile kullanılabilir su kaynakları günden güne azalmaktadır.
Birleşmiş Milletler'in 2017 yılında yayınlamış oldukları rapora göre günümüzde
dünya üzerinde var olan toplam nüfusun üçte ikisi yılın en az bir ayı su kıtlığı
çekmektedir. Su kaynaklarının bu denli az oluşu, birçok bölgede insanları düşük
kalitede içme ve kullanma suyu tüketmeye itmektedir. Hindistan, Endonezya,
Nijerya, Pakistan gibi ülkeler başta gelmek üzere dünya üzerinde 1 milyar insan
güvenli içme ve kullanma suyuna erişememektedir.
İçme ve kullanma suyu riski yaşamayan ülkeler için de su kaynaklı hastalıkların
insanların yaşam kalitelerini etkilediğini söylemek mümkündür. Birçok sebeple içme
veya kullanma sularının insan sağlığını ciddi oranda etkileyecek kontaminasyonlar
taşıması mümkün olabilir. Örneğin, klor ile sterilizasyonu sağlanmış şebeke suyu,
dağıtım hatlarının eski ve bakımsız olması nedeniyle evlerimize ulaşana kadar
kontamine olabilmektedir. Su soğutucu / ısıtıcı sistemlerin çıkış borularında gelişen
biyofilm tabakası nedeniyle steril olarak alınan ambalajlı ticari suları kontamine
olabilmektedir. Tüm bu durumlar dikkate alındığında insanların tükettikleri suyun
kalitesi ile ilgili kaygı taşımaları kaçınılmaz bir sorun olarak karşımıza çıkmaktadır.
Bu durumda, var olan kaygıları gidermek veya risk altında olan bölgelerde güvenliği
sağlamak amacıyla insanlara sunulabilecek bir teknolojiye ihtiyaç olduğunu
söylemek mümkündür.
Bir su örneğinin sahip olduğu mikrobiyal kirliliğin tayininin yapılmasında tercih
edilen en temel ve yaygın kullanılan yöntem klasik mikrobiyolojik ekim
teknikleridir. Bu uygulama sadece bu alanda uzman bir kişi tarafından
yürütülebilmekte, özel donanım ve malzemeler gerektirmektedir. Ayrıca bu
uygulamalarda sonuç yaklaşık 1-2 gün sonunda elde edilmektedir. Bu nedenle
insanların günlük hayatlarında tükettikleri içme ve kullanma sularının güvenliğini
tayin etmede kendilerinin uygulayacağı bir teknik hala mevcut değildir. Son yıllarda
sıklıkla çalışılan bir alan olan biyosensör sistemler, hem çok çeşitli olması hem de
hızlı ve kesin ölçümler sunması nedeniyle mevcut sorun ve taleplere bir çözüm
sunma ihtimali taşımaktadır.
Bu tez çalışmasında tüketicilere sunulabilecek kolay kullanımlı, hızlı ve kesin ölçüm
sunan, portatif veya cihaz içi kullanıma uyumlu, tek kullanımlı olmayan ve düşük
maliyetli bir suda mikroorganizma tayini yapmayı sağlayan sensör sistem
geliştirilmesi temel hedef olarak belirlenmiştir. Bu alanda yapılan literatür ve piyasa
araştırmaları sonucunda en çok çalışılan biyosensör çalışmalarından olan
elektrokimyasal biyosensörler altında yer alan empedimetrik sensör sistemlerin bu
amaca uygunluğu öğrenilmiştir.
İlk olarak 1899 yılında kan örnekleri içine aşılanan mikroorganizmaların metabolik
faaliyetlerinden dolayı meydana getirdikleri değişimler ile mikroorganizma
konsantrasyonu ilişkilendirilmiştir. Bu ilişkiden yola çıkarak gelişen "Empedans
Mikrobiyoloji" alanı özellikle 70'li yıllarda çok çalışılmış ve günümüze kadar
gelişerek birçok teknoloji sunmuştur.
Bu sistemler, basit tasarıma sahip oldukları için süt, dondurma, su gibi farklı tür
örnekler için evrilmesi kolaydır. Klasik mikrobiyolojik ekim yöntemleri ile
kıyaslandığında daha düşük maliyet ve kolay kullanım sunmaları bu sistemlerin
laboratuvar ortamları için de uygunluğunu gündeme çıkarmıştır. Bu teknikle tayin
yapmayı hedefleyen BacTrac (Sy-Lab, Purkersdorf, Austria) gibi cihazlar
laboratuvar testleri için alternatif olarak piyasada mevcuttur.
Bu tez çalışmasında klasik empedans mikrobiyoloji temeline dayanarak tasarlanan
iki sensör sistem test edilmiş, su ve sıvı besi yeri örneklerinde bakteriyel
kontaminasyonların tayini hedeflenmiştir. Ancak bu sistemlerin saatler içinde sonuç
veriyor olması, tayin limitinin yüksek olması, ortam koşullarının değişiminden
fazlaca etkileniyor olması gibi dezavantajlardan dolayı literatürde sistem üzerinde
birçok araştırma ve geliştirmeye gidildiği görülmektedir. Bu gelişimlerden bir tanesi
elektrot tasarımında yapılan gelişimler olarak karşımıza çıkmaktadır. Özellikle
interdigitated elektrotlar ile kurulan sistemlerin oldukça yüksek başarı sundukları
görülmektedir.
İnterdigitated elektrot, iki elin parmaklarının iç içe geçmesi gibi iç içe geçmiş
mikroelektrot parmaklardan oluşan elektrot tasarımıdır. Bu tasarım sayesinde çok
daha az hacimde örnek kullanılarak daha yüksek hassasiyette ölçüm alınmasını
sağlamak hedeflenmiştir. Ayrıca mikro akışkan sistemler için uygun olan bu teknik
ile sensör sistem kurulması için Dropsens (Asturias, İspanya), Micrux (Asturias,
İspanya), AB Tech (Richmond, Virjinya) gibi firmalardan farklı özelliklere
interdigitated elektrotların temin edilmesi mümkündür. Malzeme, boyut, üretim
özellikleri, kullanım alanları farklılıkları ile oldukça çeşitli elektrot tasarımlarına
ticari olarak erişmenin mümkün olmasının yanı sıra literatürde birçok araştırma
ekibinin kendi amaçlarına yönelik özellikleri taşıyacak elektrotları kendilerinin
üretmeleri de karşılaşılan bir durumdur.
Bu tez çalışmasında, Dropsens (Asturias, İspanya) firmasından temin edilen
mikroelektrot parmak aralıklarının 5 ve 10 μm olduğu iki tip altın interdigitated
elektrotun LCR metre cihazına bağlanması ile mikroorganizma algılama sensör
sistemi kurulmuştur. Maksimum 100 μL örnek hacmi ile çalışılan bu sistemde farklı
E. coli konsantrasyonuna sahip su örnekleri test edilmiştir. Farklı özelliklere sahip su
örneklerinin test edilmesi ile kurulan sistemin birden fazla alanda kullanılabilir
olması başlıca hedeflerden biri olmuştur.
Yapılan çalışmalar doğrultusunda sistemin en uygun çalışma parametreleri
belirlendikten sonra ölçüm hassasiyetini geliştirmek ve ölçüm süresini kısaltmak için
dielektroforez uygulaması ile sistem üzerinde gelişim kaydedilmiştir.
Dielektroforez, alternatif akım altında düzgün olmayan elektrik alanda kısmi yüklü
bir parçacığın hareketini sağlayacak kuvvettir. Kısmi negatif yüke sahip
mikroorganizma hücreleri, pozitif dielektroforetik kuvvet etkisi ile elektrik alanın
büyük olduğu tarafa çekilerek elektrot yüzeyinde toplanması sağlanır. Bu çekim
işlemi etkisinde kalan mikroorganizma hücreleri inci dizileri gibi ardışık olarak
dizilerek karşılıklı gelen iki mikroelektrot parmak arasında köprü oluşturur. Bu köprü nedeniyle elde edilen sinyal değişiminden yola çıkarak mikroorganizma varlığı ve
miktarının tayin edilmesi mümkündür.
Bu çalışmada literatürden elde edilen bilgiler doğrultusunda sisteme uygulanan
pozitif dielektroforetik kuvvet sayesinde tayin limitinin düşmesi, tayin süresinin
kısalması, çevresel etkilerin ölçüm üzerine olan olumsuz etkilerinin azaltılması gibi
talepler test edilmiştir. Elde edilen olumlu sonuçların ardından daha geniş kapsamda
numunenin test edilmesi ile yüksek numune iletkenliği ve kısa elektrot ömrünün bu
sistemin başarısının önünde en temel engel olduğu sonucuna varılmıştır.
Sonuç olarak, bu tez çalışmasında içme suyu mikrobiyal kontaminasyonunun yüksek
hassasiyette ve hızlı bir şekilde tespit etmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, üç farklı
sensör sistem için yürütülen testlerin sonunda interdigitated elektrotlar ile tasarlanmış
sensör sistemlerin dielektroforez uygulaması ile birlikte tayin için kullanılmasının
yüksek verim sunduğu gözlemlenmiştir. Kurulan sistemde tayin limiti 103 kob/mL
mikroorganizma kontaminasyonu olarak belirlenmiş olduğundan hedeflenen sensör
hassasiyetini kısmi olarak karşılayamamıştır. Sistem üzerinde yürütülen testlerin
optimizasyonlarının yapıldığı 7 log/mL mikroorganizma kontaminasyonu koşulunda
ise yaklaşık % 70 empedans değişimi elde edilerek tayinin gerçekleştirilebiliyor
olması sistemin gerekli hassasiyette çalıştığının kanıtı olmuştur. Bu verilere
dayanarak tasarlanmış olan sensör sistemi içme ve kullanma suyunda
mikroorganizma algılama işlemi yapabilen bir cihaz haline getirilebilmiştir.
Tasarlanan sistemin en büyük eksikliği, yapılan testlerin sonunda elde edilen verilere
göre tasarımda kullanılan elektrotların maksimum 8 kullanıma kadar
değerlendirilebilir sonuç vermesidir. Yapılan testlerde yaklaşık 200 μS/cm üst
limitine kadar sistemin etkili bir şekilde çalıştığı ve bu değerin üzerine çıkıldıkça
verimde düşüş olduğu tespit edilmiştir. Ambalajlı suların dâhil olduğu bu üst limit ile
mevcut sistem piyasanın ihtiyacını karşılamaktadır. Ancak daha yüksek iletkenlik
değerine sahip yüzey suyu, şebeke suyu veya atık su gibi numunelerin test
edilebilmesi için sisteme ilave bir çözüm sunulmalıdır. Sonuç olarak tasarlanan
cihazda, tüm dezavantajları uzaklaştırmaya yönelik; kullanım paketinin
oluşturulması, kit tasarımı gibi ek çözümler ile, geliştirilen sensör sisteminin mevcut
su hijyeni problemlerine hitap edebilecek bir ürün olarak piyasaya sunulabilmesi
mümkündür.

Abstract:
Because of some important reasons such as growing population on the world,
agriculture or energy production, climate change, industrial pollution etc., usable
water sources have reduced daily. According to World Water Development Report of
United Nations, some descriptions of governments, total population of the world is
suffering from water scarcity at least one month per year. It is known obviously that
most people in the world have to be forced to use low quality water because water
sources are very few and not suitable for use. Especially people living in countries
like India, Indonesia, Nigeria, Pakistan, today 1 billion people cannot access the safe
drinking water. Unsafe drinking water is the major problem on the spreading of
infectious diseases such as dengue fever around the world. Because of these, not only
these countries had a safe water problem but also all of the world is responsible from
water quality.
Water quality is a major problem on human health not only in underdeveloped
countries but also in developed countries. In developed countries, drinking water or
tap water can have a contamination that affect human life quality and health even
there is a disinfection application. For example, chlorine disinfection is most popular
way to disinfect tap water on many countries. However, this disinfected water can be
contaminated on the distribution lines, which are old and neglected. In addition to
this, biofouling on the outlet pipes of water-cooling / heating systems may be reason
for drinking water contamination. Even these systems are generally disinfected by
ozonation on certain periods, if biofouling layer is constructed on the pipe surface it
is hard to remove microorganisms from there. This situation can be the most
common reason for contamination of drinking water. However, these systems are
very popular and commonly used in many place. Because of this, it can pose a risk
for human health. When all these situations are taken into the consideration, it is
inevitable for people to worry about the quality of the water they consume. In the
light of this problem it is possible to say that there is an urgent need for technology
that can be offered to people in order to get rid of existing concerns or to provide
security at risk areas.
The most basic and widely used method for determining the microbial contamination
of a water sample is classical microbiological techniques. This practice can only be
carried out by a specialist, also required special equipment and materials. In addition,
the results are obtained after about 1-2 days in these applications. For this reason,
there is still no technique to be applied by people to determine the safety of drinking
water they consume in their daily lives. Biosensor systems, which have been a lot of
work carried out in recent years, are likely to offer a solution in this area because
they are both very versatile and offer fast and accurate measurements.
In this thesis, it is aimed to develop a sensor system which can provide an easy-touse,
fast and precise measurement, portable or integrable. When this system will be
presented to the consumer, microorganism determination can be made easily from
water. As a result of the literature and market research, impedimetric sensor system
was found as most popular and suitable sensor system for microbial contamination
detection.
In 1899 it was discovered that microorganism concentration was correlated with
changes of electrical parameters on the blood sample. Based on this relationship,
"Impedance Microbiology" area was developed. In this field it is considered that
microorganisms are very dynamic life forms which exchange some materials used on
their metabolic reactions by their environments. By these exchanges, low charged
materials such as glucose are taken from environment, used on the inside of the cell
and more charged end products are obtained and removed from outside of the cell. In
addition to these reactions, microorganisms have ion exchange by their ion channels.
All of these situations cause significant changes of some electrical parameters of the
environment. By following these changes, scientists aim to estimate level of
microbial contamination of the tested sample on impedance microbiology studies.
These studies are very common and excessive especially in the 70's, media,
conductivity, temperature and other effects on these aspects were well characterized
in this period. By the time this approach is used to develop detection of
microorganisms by sensor system. Since these systems have a simple design, it is
easy to evolve for different types of samples such as milk, ice cream, and water.
When this technology is compared to conventional microbiological methods, they
offer lower cost and ease of use, by which these systems shows suitability for use in
laboratory. According to the literature, today there are many technologies depended
on impedance microbiology. Devices such as BacTrac (Sy-Lab, Purkersdorf,
Austria) that are available on the market aim to make this technique as an alternative
to laboratory testing.
Here, we have aimed two sensor systems designed on the basis of classical
impedance microbiology, which have been tested for detection of bacterial
contamination in water and liquid media samples. Different electrode designs and
materials were tested and optimum parameters were determined by samples. Effects
such as frequency and voltage, duration, temperature, etc. were tested. By all the
tests, it was gained an idea about that usefulness of the system, yield, state of hope
for future studies. It was proved that these systems have some disadvantages such as
giving results within hours, high limit of detection, affecting much from
environmental changes. Because of these, many researches were studied in the
literature to improve these systems. One of these improvements are also made in
electrode design. Especially interdigitated electrodes established by the system
appears to be quite successful. Because of this, it was decided in this thesis study that
interdigitated electrodes were obtained commercially and tested to have more
sensitive sensor system.
The interdigitated electrode is a special electrode design consisting of nested
microelectrode fingers like hand fingers. Thanks to this design, it is possible to take
measurements with higher precision using much less volume of sample. It is also
possible to provide interdigitated electrodes for different features from companies
such as Dropsens (Asturias, Spain), Micrux (Asturias, Spain), AB Tech (Richmond,
Virginia). In addition to all of these properties, sensor systems are suitable to
construct microfluidic systems. Although it is possible to access a wide variety of electrode designs commercially, many researchers in the literature have preferred to
produce themselves by designing their electrodes for their own purposes.
In this thesis, two types of gold interdigitated electrodes, which have 5 and 10 μm
spacing between microelectrode fingers were provided by Dropsens (Asturias,
Spain). These electrodes were connected to the LCR meter and the microorganism
detection sensor system was installed. In the beginning of the study, optimum
parameters such as frequency, voltage, volume, duration etc. were determined by
working with pure water. In all tests, water samples with different E. coli
concentrations were studied in this system with a maximum of 100 μL volume. This
volume is important to get enough signal from system because it covered all
microelectrode area. The other main idea of these study was construction of the
sensor system for making microorganism detection on diverse water samples which
have different conductivity. For these water samples and different microbial
concentrations, optimum parameters of the system had been determined. However,
the system had low efficiency at the high microbial contamination and high water
conductivity. Because of this, dielectrophoresis application was used to improve
system, which was preferred to obtain high accuracy with short measurement time.
Dielectrophoresis is a force providing movement of partially charged particles on the
nun- uniform electric field under alternating current. Microorganism cells that have a
partially negative charge have been pulled on the electrode surface by the effect of
positive dielectrophoretic force. Under these force, microorganism cells have been
sequenced like pearl chain. By the way, the bridge is constructed by microorganisms
between the microelectrode fingers. Because of these pearl chain form of
microorganisms, rapid impedance change is obtained from system and detection is
done. It is possible to find many studies which made rapid detection with high
accuracy even in low microbial concentrations by using dielectrophoresis on
interdigitated electrode systems. In addition to this, microfluidics systems, smart
phone controlled systems and also portable systems was successfully studied
according to the literature sources.
The usage of dielectrophoresis on the system constructed by using interdigitated
electrode provides opportunity to improve yield of the system. Low detection time
and detection limit was obtained, as the system has a high accuracy to detect
microorganisms. However, the system is very sensitive against conditional changes
such as temperature, conductivity, pH, etc. Since the main idea of this study is rapid
detection microorganism from drinking water, conductivity of tap water or drinking
water is the major obstacle on the system.
As a result, in this thesis study it is aimed to detect microbial contamination of
drinking water with high sensitivity and speed. The system, which was designed by
using both interdigitated electrode and dielectrophoresis, provided maximum
efficiency. As the detection limit of the system was determined as 103 cfu / mL,
targeted high measurement accuracy was not achieved. The system shows about 70%
impedance change in case of 7 log/mL microorganism contamination. These results
have been proof that the system works with the required accuracy. Based on all these
data it is possible that the sensor system can be turned into a device that is capable of
microorganism detection in contaminated drinking water.
However, it has been observed that the electrodes used in the sensor design can be
used for maximum 8 applications. In addition to this limited usage of electrodes, 200
μS / cm is the upper sample conductivity amount because decrease in yield was
observed in proportion to the increased conductivity. This upper limit, which
includes packaged water, is enough for providing of market needs. However, an
additional solution to the system must be provided for other samples such as surface
water, municipal water or wastewater which have higher conductivity value.
All in all, by improvement of these three types impedimetric sensor systems, it is
mainly aimed construction of sensor system that have a high accuracy, low detection
of limit, portable or entegrable, miniaturized, long-lasting, useful on different
application. It was seen that this system can be constructed by using both
interdigitated electrodes and dielectrophoresis. Even there are some problems about
short-life electrode, high sample conductivity and limit of detection, all of these can
be solved by using the solutions such as creating usage package and designing kits. It
is obvious that the sensor system is convenient to solve a very common water safety
concern problem in many part of the world.