Hiperisin yüklü kitosan nanopartiküllerin A549 akciğer kanser hücrelerinde etkilerinin araştırılması
Investigation of effects of hypericin loaded chitosan nanoparticles in A549 lung cancer cells
Yazar: BELİZ TAŞKONAK
Danışman: DOÇ. DR. AYSUN KILIÇ SÜLOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Zooloji = Zoology

Özet:
Akciğer kanseri halen günümüzde en sık karşılaşılan ve en yüksek ölüme sebep olan kanser türlerinden biri olarak görülmektedir.  Hiperisin (HY), Hypericum perforatum bitkisinden elde edilen hidrofobik, doğal bir anti-kanser bileşendir. HY gibi ışıkla duyarlı maddelerin kullanımına dayanan fotodinamik terapi (FDT), sıklıkla tercih edilen alternatif tedavi yaklaşımlardan biri olmaktadır. HY, fotoreaksiyon ile oksijen bağımlı reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşmasıyla hücre ölümüne sebep olmaktadır. HY nispeten büyük moleküler bir yapıya sahiptir ve tek başına kümeleşme göstermektedir, bunun yanı sıra alımının sınırlı olması ve fizyolojik ortamda degredasyona uğraması oluşturacağı cevabı etkilemektedir. Bu sebeplerden dolayı hidrofobik ilaç taşıyıcı sistemlerinin önemli bir parçası olan nanopartiküller (NP) kullanılarak HY'nin suda çözünebilir hale getirilmesi açısından oldukça önem taşımaktadır. 
HY ile görülmesi beklenen anti-kanser etkinin, NP'ler sayesinde daha özgül ve daha uzun süreli bir tedavi yaklaşımı sağlaması hedeflenmiştir. 
Nanopartikülün polimerik yapısını oluşturan Kitosan, kitinden elde edilen doğal bir bileşen olmakla birlikte biyouyumluluğu, sınırlı sitotoksisiteye sahip olması ve kolayca çözünebilir olması nedenleriyle öne çıkmaktadır. Kanser ilaçları ile tümör dokularının hedeflendirilmesiyle potansiyel bir anti-kanser aracı olarak görülmektedir. Tez kapsamında, A549 akciğer kanseri hücre hattında HY ile ve/veya HY içeren kitosan yüklü nanopartiküller (HY-NP) kullanılarak FDT uygulanmıştır ve anti-kanser özelliği değerlendirilmiştir. Kitosan NP'ler iyonik jelasyon yöntemi ile sentezlenmiş ve taramalı elektron mikroskobunda (SEM) yapısı incelenmiştir. Belirlenen değerlerdeki HY dozları (200 nM, 400 nM, 600 nM) NP'lerin sentezi sırasında eklenmiş ve hücrelere uygulanmıştır. 24 saat sonrasında 6 lux/J cm2 dozunda 30 dk ışıma yapılmıştır. Işıma süresinin bitiminden 24 saat ve 48 saat sonra ise hücresel analizler gerçekleştirilmiştir. 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolyum bromit (MTT) canlılık analizi, DCFDA (2',7'-dikloroflorosein diasetat) ile hücrede oluşan reaktif oksijen türlerinin miktarı ölçülürken, AO/PI floresan boyaması ile hücre ölüm tipi değerlendirilmiştir. FITC (Fluorescein isothiocyanate) ile NP'lerin hücresel alımı ve TumorTac kiti ile apoptoz oluşumu incelenmiştir. Tüm deney grupları arasında NP içeren gruplarında hücre ölümünün daha çok artmasıyla, HY'nin hücresel alımının arttığı sonucuna varılmıştır. MTT analizinin sonucunda 48 saatte HY-NP 600 nM grubunda hücre canlılığında %56'ya kadar düşüş görülürken, nanopartikül grupları içerisinde HY konsantrasyonunun artması ile doza bağlı canlılıktaki azalmanın da arttığı tespit edilmiştir. Hücre ölüm tipi AO/PI floresan boyaları ile değerlendirildiğinde ise hücrelerin büyük kısmında nekroz oluşumu görülmüştür. Oluşturulan NP'lerin karakterizasyon çalışmaları SEM analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Kitosan NP'lerin geliştirilerek kanser hücrelerinde etken maddenin alımının arttırılabileceği ve ilaçların yerine bitkisel bileşenlerin kullanılarak yan etkilerin azaltılabileceği öngörülmektedir. Kitosan NP kullanılarak gerçekleştirilen HY aracılı FDT'nin akciğer kanserinin tedavisinde umut vaad ettiği düşünülmektedir.

Abstract:
Lung cancer still continues to be one of the most common types of cancer today and is the leading cause of cancer death. Hypericin (HY) is a hydrophobic, natural anti-cancer component derived from the plant Hypericum Perforatum. HY is one of the preferred molecules in photodynamic therapy based on activation by light. HY causes cell death by the formation of oxygen-dependent reactive oxygen species (ROS) by photoreaction. HY has a relatively large molecular structure and shows clustering alone, as well as limited uptake and degradation in the physiological environment, which affects the response it will create. For these reasons, it is crucial to make HY water-soluble by using nanoparticles (NP), which are an important part of hydrophobic drug carrier systems. It is aimed that the anti-cancer effect expected to be seen with HY will provide a more specific and longer-term treatment approach by the virtue of NPs. 
Chitosan, which forms the polymeric structure of the nanoparticle, is a natural component obtained from chitin, but it stands out because of its biocompatibility, limited cytotoxicity, and easy solubility. It is seen as a potential anti-cancer tool by targeting tumor tissues with cancer drugs. Within the scope of the thesis, the anti-cancer property of A549, lung cancer epithelial cell, was evaluated, by direct HY and loaded with chitosan nanoparticles. The ionic gelation method was preferred for the synthesis of chitosan nanoparticles; its structure has been studied in scanning electron microscopy (SEM). HY concentrations of the determined values (200 nM, 400 nM, 600 nM) were added during synthesis and applied to cells. After 24 hours incubation, cells were exposed to light for 30 minutes at a dose of 6 lux/J cm2. Analysis was carried out after 24 hours at the end of the PDT period. Cell viability analysis was measured with MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) agent and the amount of reactive oxygen species formed was evaluated with DCFDA (2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate) while cell death type was specified with AO/PI fluorescent staining. Cellular uptakes of NPs were imaged wih FITC (Fluorescein isothiocyanate) fluorescent dye and apoptosis formations with Tumortac kit have been studied. Among all experimental groups, NP groups were seen to increase the uptake of HY as targeted, with more increasing cell death. As a result of MTT analysis, up to 56% decrease in cell viability was observed in the HY-NP 600 nM group within 48 hours, while increasing the HY concentration in nanoparticle groups also increased the decrease in dose-related viability. When cell death type AO/PI was evaluated with fluorescent dyes, necrosis was observed in most cells. Characterization studies of the generated NPs were carried out by SEM analysis. By developing chitosan NPs, it has been suggested that the uptake of the active ingredient in cancer cells can be increased and side effects can be reduced by using herbal ingredients instead of drugs. It is promising for tumor tissues formed in lung cancer.