Haloarcula SP. ve Halolamina SP. suşlarında selülaz enzim aktivitelerinin belirlenmesi
Determination of cellulase enzyme activity in Haloarcula SP. and Halolamina SP. strains
Yazar: HAKTAN ŞAFAK
Danışman: DOÇ. DR. ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Halofilik selülazlar, yüksek sıcaklık, yüksek NaCl konsantrasyonu ve ekstrem pH gibi koşullarda veya organik çözücülerin varlığında optimum aktiviteleri nedeni ile dayanıklı biyokatalizörler olarak ağır endüstriyel işlemlerin vazgeçillmez enzimleridir. Endüstriyel açıdan önemli bir selülaz enzimini elde etmek amacıyla bu çalışmada daha önce tuzcul habitatlardan izole edilmiş on Haloarcula sp. ve Halolamina sp. suşları selülaz aktiviteleri bakımından karşılaştırılmıştır. Ham selülaz aktivitesinin en yüksek olduğu suş Haloarcula sp. ÇKT3 olarak bulunmuştur. Optimizasyon çalışmaları, enzimin 70 °C, pH: 7.0 ve 4 M NaCl konsantrasyonunda optimum aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir (169.6 U/mL). Haloarcula sp. ÇKT3'te selülaz enzimini kodlayan endoglukanaz geni (ÇKT3eg) karakterize edilmiş ve ardından E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde heterolog ifadesi gerçekleştirilmiştir. rÇKT3eg enziminin 151.7 U/mL ile optimum 50 °C, pH: 7.0 ve 3 M NaCl konsantrasyonunda aktivite gösterdiği belirlenmiştir.  Farklı sıcaklık ve pH değerleri ile farklı konsantrasyonda NaCl ve organik çözücü varlığında 24 saat inkübasyon sonrasında enzimlerin stabiliteleri test edilmiştir. Her iki enzimin pH ve NaCl stabilitesi sırasıyla pH: 7.0 ve 3 M NaCl'de %98'dir. Ham selülaz enzimi 37 °C'de %96 termostabilite değerine sahipken, rÇKT3eg'nin en iyi termostabilitesi 25 °C'de %94 olarak bulunmuştur. Ayrıca, ham  selülazın  %25 DMSO varlığında aktivitesini %23 oranında kaybettiği, 3.5 mM SDS varlığında ise en kararlı aktivitesini sergilediği tespit edilmiştir. Etanol rÇKT3eg'nin aktivitesini %30 oranında azaltırken, 3.5 mM SDS en az inhibisyona neden olmuştur. Optimum koşullarda ham ve rekombinant selülaz enzimlerinin spesifik aktiviteleri sırası ile 16.9 ve 31.6 U/mg'dır. Sonuç olarak, ÇKT3eg, ekstrem koşullardaki dayanıklılığı ile endüstriyel kullanım açısından umut verici bir aday enzimdir.

Abstract:
Halophilic cellulases are indispensable enzymes of heavy industrial processes as resistant biocatalysts due to their optimum activity at high temperature, high NaCl concentration and extreme pH conditions or in the presence of organic solvents. In order to obtain an industrially important cellulase enzyme, ten Haloarcula sp. and Halolamina sp. strains previously isolated from saline habitats were compared in terms of cellulase activity. The strain with the highest crude cellulase activity was found as Haloarcula sp. ÇKT3. Optimization studies showed that the enzyme has optimum activity at 70 °C, pH: 7.0 and 4 M NaCl concentration (169.6 U/mL).  The endoglucanase gene (ÇKT3eg) encoding the cellulase enzyme in ÇKT3 was characterized and then heterologous expression was performed in E. coli BL21 (DE3) cells. It was determined that rÇKT3eg enzyme has 151.7 U/mL activity at optimum 50 °C, pH: 7 and 3 M NaCl concentration. Stability of enzymes was tested after 24 hours of incubation in the presence of different NaCl concentrations and organic solvents, with different temperature and pH values. The pH and NaCl stability of both enzymes were 98% in pH: 7.0 and 3 M NaCl, respectively. The crude cellulase enzyme has a thermostability value of 96% at 37 °C while the thermostability of rCKT3eg was found as 94% at 25 °C.  Furthermore, it was found that the crude cellulase lost its activity by 23% in the presence of 25% DMSO and exerted the most stable activity in the presence of 3.5 mM SDS. While ethanol reduced the activity of rCK3eg by 30%, 3.5 mM SDS caused the least inhibition. At optimum conditions, the specific activities of the crude and recombinant cellulase enzymes are 16.9 and 31.6 U/mg, respectively. As a result, ÇKT3eg is a promising enzyme for industrial use with its durability in extreme conditions.