Aktivasyon temeline dayalı amperometrik biyosensör sistemleri geliştirilmesi ve uygulamaları
Developing activation based amperometric biosensor systems and applications
Yazar: PINAR AKBAYIRLI
Danışman: DOÇ. DR. EROL AKYILMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tezde, aktivasyon temeline dayalı olarak glukoz tayini için katalaz ve bakır tayini içinde askorbat oksidaz temelli biyosensörler geli?tirildi. Her iki biyosensör için belirtilen enzimler immobilizasyon materyali olarak jelatin ile karı?tırılarak elde edilen enzim-jelatin karı?ımları çözünmü? oksijen probu üzerine yayıldı ve glutaraldehit ile çapraz bağlandı. Ölçümlerin temel prensibi enzimatik reaksiyonlar uyarınca aktivatör etkisi gösteren glukoz ve bakır konsantrasyonlarıyla orantılı olarak tüketilen oksijen miktarının farklanmasının belirlenmesidir. Bu prensipten yola çıkarak tüketilen oksijen miktarındaki artı?ın glukoz ve bakır konsantrasyonlarıyla doğru olarak deği?tiği standart grafikler yardımıyla sonuçlara ula?ılmı?tır.Hazırlanan biyosensörler için öncelikle biyoaktif tabaka bile?enlerinin optimizasyonları gerçekle?tirildi. Optimizasyon çalı?maları sonucunda katalaz biyosensörü için en uygun enzimmiktarı, jelatin miktarı ve glutaraldehit yüzdesi sırasıyla; 662 U/cm2, 5,9 mg jelatin/cm2 ve %2,5, askorbat oksidaz biyosensörü için ise sırasıyla; ; 6,7 mg/cm2 homojenat, 5,9 mg jelatin/cm2 ve %2,5 olduğu saptandı. Çalı?ma ko?ullarının optimizasyonu denemeleri sonucunda katalaz biyosensörü için çalı?ma tamponunun pH:7,0, 50mM?lık fosfat tamponu olmasına ve ölçümlerin 35oC sıcaklıkta gerçekle?tirilmesine, askorbat oksidaz biyosensörü için ise çalı?ma tamponunun pH: 7,5, 50mM Tris-HCl tamponu olmasına ve ölçümlerin 35oC sıcaklıkta gerçekle?mesine karar verildi. Hazırlanan biyosensörlerin karakterizasyon çalı?malarında, katalaz biyosensörü ile glukoz için 0,5-5,0 ?M konsantrasyon aralığında, askorbat oksidaz biyosensörü ile bakır için yine 1,0-5,0 ?M konsantrasyon aralığında doğrusal sonuçlar alınabildiği belirlendi. Geli?tirilen biyosensörlerin tekrarlanabilirliğine yönelik yapılan çalı?malarda; katalaz biyosensörü için 3 ?M glukoz standardı ve 1mM H2O2 varlığında (n=8) ile ortalama değer X=3.05 ? M, standart sapma, S.S = ? 0.08 ve varyasyon katsayısı V.K = % 2,64, askorbat oksidaz biyosensörü için ise 2,5 ?M bakır standardı ve 15 ?M L-askorbik asit standardı (n=8) ile ortalama değer X=2.44 M, standart sapma, S.S= 0.018 ve varyasyon katsayısı, V.K= %0.72 olarak bulundu. Ayrıca biyosensörlerin operasyonel kararlılıkları, depo kararlılıkları , bazı maddelerin aktivasyon etkileri gibi parametreleri belirlendi. Farklı kan örneklerinde glukoz, farklı ilaç örneklerinde ise bakır tayinleri ve analitik parametreler belirlendi.Anahtar kelimeler: Aktivasyon temelli biyosensör, katalaz, askorbat oksidaz, glukoz, bakır

Abstract:
In this thesis, activation based amperometric biosensor systems were developed. Catalase based biosensor for glucose determination and ascorbate oxidase based biosensor for copper determination were prepared. In order to prepare biosensors, enzymes mixed with immobilization material gelatin and the crosslinked with glutaraldehyde after fixed on pretreated teflon membrane. The principle of the measurements based on the determination of the differences at consumed oxygen levels related to concentration of glucose and copper ions that activated the enzymes. Determinations were carried out by standart curves which were obtained by the measurements of increase in the consumed oxygen level related to glucose and copper concentration.Firstly, the optimum concentration of the bioactive layer components were established for both biosensors. In the optimization studies the most suitable enzyme, gelatine amounts and glutaraldehyde ratio were determined as 662 U/cm2, 5.9 mg gelatin/cm2 and 2.5 %, for catalase biosensor and 6,7 mg/cm2 homogenat, 5.9 mg gelatin/cm2 and 2.5 % for ascorbate oxidase biosensor respectively. For catalase biosensor pH:7.0, 50mM phosphate buffer and 35oC, for ascorbate oxidase biosensor pH: 7.5, 50mM Tris-HCl buffer and 35oC were established as providing the optimum working conditions. In the characterization studies, a linearity in the glucose concenration range 0.5-5.0 ?M was obtained with catalase biosensor and a linearity in the copper concentraion range 1.0-5.0 ?M was obtained with ascorbate oxidase biosensor. The repeatability studies (n=8) revealed that for 3 ?M glucose and 1mM H2O2, the avarege value ( x ) was 3.05 ? M, standart deviation (SD) was ? 0.08 and variation coefficient (CV) was 2.64 % for catalase biosensor and the repeatability studies (n=8) revealed that for 2.5 M copper and 15 M L-ascorbic acid , the avarege value ( x ) was 2.44 M, standart deviation (SD) was 0.018 and variation coefficient (CV) was 0.72 % for ascorbate oxidase biosensor. Besides, operational and storage stability of both biosensors were investigated. In addition, glucose concentration of different blood samples, copper concentration of different medicine samples and analytical parameters were determined.Keywords: Activation based biosensor, catalase, ascorbate oxidase, glucose, copper