Pankreas kanseri tedavisinde potansiyel bir doğal yan ürün olarak gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792) deri mukusunun in vitro araştırılması
In vitro investigation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792) skin mucus as a potential natural byproduct in pancreatic cancer therapy
Yazar: BÜŞRA ÖZÇAY EKŞİ
Danışman: PROF. DR. EMİNE ARSLAN
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Su Ürünleri = Aquatic Products

Özet:
Pankreas kanseri, pek çok kanser türüne kıyasla geç tanı koyulan, 5 yıllık sağ kalım oranı oldukça düşük, sınırlı tedavi seçeneği bulunan ve kötü prognozu ile bilinen ölümcül bir gastrointestinal kanser türüdür. Balıklar gibi doğuştan güçlü bir bağışıklık sistemine sahip alt omurgalılardaki deri mukusu, benzersiz pek çok biyoaktif bileşene sahiptir ve bu bileşenlerin antikanser özellikleri daha önce bildirilmiştir. Pankreas kanserinin oldukça kötümser tablosundan ve gökkuşağı alabalığının ülkemizdeki kültür balıkçılığındaki öneminden yola çıkarak, bu tez çalışması kapsamında, pankreas kanserine karşı gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) deri mukusunun anti kanser potansiyeli in vitro olarak değerlendirilmiştir. 
Tez kapsamında gerçekleştirilen in-vitro analizlerin ilk basamağı olarak, deri mukusu non-invaziv bir teknikle canlıya zarar vermeden toplandı ve PBS içerisinde homojenize edildi. Ardından homojenat liyofilize edilerek toz halde stoklandı. Antikanser aktivitenin ilk basamağı olarak ise pankreas kanseri hücre hattı olan PANC-1 ve sağlıklı kolon hücre hattı olan CCD18-co hücrelerine yönelik balık mukusunun sitotoksisitesi MTT metodu ile belirlenerek balık mukusunun selektif aktivitesi değerlendirildi. Deri mukusunun, PANC-1 hücrelerinde migrasyon kabiliyeti üzerine etkisi ise wound healing assay (yara iyileşme deneyi) ile analiz edildi. Ayrıca, pankreas kanseri gelişiminde sürücü genler olarak kabul edilen onkogenik KRAS ve tümör baskılayıcı p53 genlerinin ekspresyon seviyelerine balık mukusu maruziyetinin etkisi de qPCR metodu ile değerlendirildi. Son olarak balık mukusu maruziyetinin PANC-1 hücrelerinde meydana getirdiği DNA hasarı ve genotoksik etkisi ise fosforillenmiş histon H2A.X (Ser139)'e bağlanan, Alexa Fluor 488 konjuge monoklonal antikor kullanılarak gerçekleştirilen immün boyama metodu ile analiz edildi.
Elde edilen bulgular, deri mukusunun PANC-1 ve CCD18-co hücrelerine karşı 24, 48 ve 72 saatlik tüm inkübasyon periyotları için selektif sitotoksisitesi göstermektedir. Bununla birlikte PANC-1 hücreleri için 3,10 mg/mL olarak elde edilen IC50 konsantrasyonu sonucu en verimli maruziyet süresi 48 saat olarak tespit edilmiştir. Gerçekleştirilen migrasyon analizi sonrasında ise balık mukusunun PANC-1 hücrelerinde doza bağımlı anti metastatik potansiyeli tespit edilmiştir. Ayrıca, gerçekleştirilen qPCR çalışmaları sonuçlarına göre balık mukusu maruziyeti PANC-1 hücrelerinde, p53 tümör süpressör geninin ekspresyonunu yukarı yönde düzenlemektedir. Genotoksisite analizleri ise balık mukusu muamelesinin PANC-1 hücrelerinde doza bağımlı bir şekilde DNA hasarı meydana getirdiğini göstermektedir. Sonuç olarak, tüm bu bulgular birlikte ele alındığında, gökkuşağı alabalığının ticari değeri olmayan yan ürünü niteliğindeki deri mukusunun, PANC-1 kanser hücrelerine karşı keşfedilmemiş bir anti kanser terapötik ajan potansiyeli olduğunu göstermektedir. Elde edilen bu verilerin daha ileri çalışmalara katkı sağlayarak yeni tedavi yaklaşımlarının keşfedilmesine ışık tutacağı kanaatindeyiz.

Abstract:
Pancreatic cancer is a gastrointestinal malignancy that is diagnosed later than many other cancers, exhibits a markedly low 5-year survival rate, has restricted therapeutic alternatives, and is characterized by a dismal prognosis. The skin mucus of lower vertebrates, such as fish, which have a naturally strong immune system, contains many unique bioactive components, and the anticancer properties of these components have been reported previously. This thesis study assessed the anticancer potential of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) skin mucus against pancreatic cancer in vitro, considering the bleak outlook of pancreatic cancer and the important role of rainbow trout in our country's aquaculture. 
The initial phase of the in vitro investigations for the thesis involved collecting skin mucus, rich in several bioactive chemicals, using a non-invasive method that did not injure the living fish. This was followed by homogenizing the mucus in PBS. The final homogenate was lyophilized and preserved as a powder. The MTT assay was employed to evaluate the cytotoxicity of fish mucus on the pancreatic cancer cell line PANC-1 and the healthy colon cell line CCD18-co. Thus, the selective anti-cancer efficacy was assessed. A wound-healing assay was used to examine the effect of fish mucus on the migratory capacity of PANC-1 cells. The effect of fish mucus treatment on the expression levels of the oncogenic KRAS and tumor suppressor p53 genes, key drivers in pancreatic cancer development, was assessed using the qPCR method. The DNA damage and genotoxic effects caused by fish mucus treatment in PANC-1 cells were assessed using an immunostaining technique using an Alexa Fluor 488-conjugated monoclonal antibody specific to phosphorylated histone H2A.X (Ser139).
The results indicate that skin mucus demonstrates selective cytotoxicity against PANC-1 cells in comparison to CCD18-co cells across the 24, 48, and 72-hour incubation periods. The most effective exposure time for PANC-1 cells was established at 48 hours, with an IC50 value of 3.10 mg/mL. The migration assay demonstrated that fish mucus exhibits a dose-dependent anti-metastatic effect on PANC-1 cells. Furthermore, the results of the qPCR investigations indicate that exposure to fish mucus enhances the expression of the p53 tumor suppressor gene in PANC-1 cells. Genotoxicity investigations indicate that treatment with fish mucus induces dose-dependent DNA damage in PANC-1 cells. In summary, based on all findings, the skin mucus of the rainbow trout, a non-commercial byproduct, exhibits unexplored potential as an anti-cancer therapeutic agent against PANC-1 cancer cells. We believe that the information collected will enhance ongoing research and highlight the identification of novel therapeutic strategies.