Katalaz enziminin Thymus nummularius'den saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of catalase enzyme from Thymus nummularius
Yazar: ESMA TOPRAK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ NURİ GÜLEŞCİ
Gümüşhane Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Geçmişten günümüze hastalıkların doğal tedavisinde kullanılan bitkiler, içerdikleri biyoaktif fenolik bileşenler sayesinde geleneksel tıbbın yanı sıra ilaç endüstrisinin de odak noktası olmuştur. Katalaz enzimi, biyolojik ve biyokimyasal sistemlerde antioksidan özelliğinden dolayı zarar verici bir yapıya sahip olan yükseltgen hidrojen peroksidi (H2O2) ortamdan uzaklaştırarak hücreyi korur. Bu çalışmada; katalaz enzimi Thymus nummularius (Yayla Kekiği) bitkisinden saflaştırılarak, kinetik özellikleri (Km, Vmax), termal ve depolama kararlılıkları araştırılmış, optimum sıcaklığı, optimum pH'ı belirlenmiş ve SDS-PAGE elektroforezi ile molekül ağırlığı tespit edilmiştir. Ham katalaz ekstraktında toplam protein miktarı 6.150 mg/mL, toplam spesifik aktivite değeri 161.50 U/mg protein olduğu tespit edilmiştir. Amonyum sülfat kullanılarak oluşturulan çöktürmede en yüksek aktivite %70'lik tuz derişiminde görülmüştür. Protein tayini sonucunda bulunan toplam protein miktarı 2.350 mg/mL, toplam spesifik aktivite değeri 236.73 U/mg proteindir. PD-10 kolon kromatografisinden sonra protein tayini yapılmış ve toplam protein miktarı 0.156 mg/mL, toplam spesifik aktivite değeri 1260.96 U/mg prot. olduğu görülmüştür. Bu işlem sonunda CAT enzimi 7.81 kat saflaştırılmıştır. Enzimin optimum pH ve sıcaklık çalışmaları sonucunda; optimum pH 8.0; optimum sıcaklık 25 °C olarak tespit edilmiştir. Termal kararlılıkları mukayese edildiğinde; 40 °C'de 24 saat bitiminde enzim aktivitesinin %18.99'unu muhafaza ederken, 25 °C'de ise enzim aktivitesinin %40.51'ini muhafaza ettiği tespit edilmiştir. Depolama kararlılığı için 4 °C'de çalışılmış ve 15 gün sonunda katalaz enzim aktivitesinin %5.96'sını muhafaza ettiği belirlenmiştir. Km değerinin 38.151 mM ve Vmax değerinin 303.03 U/mg protein olduğu tespit edilmiştir. SDS-PAGE elektroforez işleminden sonra enzimin molekül ağırlığı 42 ile 52 kDa aralığında olduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
Plants used in the natural treatment of diseases from the past to the present have become the focus of the pharmaceutical industry as well as traditional medicine thanks to the bioactive phenolic components they contain. Due to its antioxidant characteristics in biological and metabolic systems, the catalase enzyme is crucial in the removal of harmful and oxidizing hydrogen peroxide (H2O2) from cells. In this study; catalase enzyme was purified from Thymus nummularius (Thyme) plant, kinetic properties (Km, Vmax), thermal and storage stability were investigated, optimum temperature, optimum pH was determined and molecular weight was determined by SDS-PAGE electrophoresis. The total amount of protein in the raw catalase extract was found to be 6.150 mg/mL, the total specific activity value was found to be 161.50 U/mg protein. Maximum activity was found in precipitation with ammonium sulfate at a salt concentration of 70%. As a result of protein determination, the total amount of protein was found to be 2.350 mg/mL and the total specific activity value was found to be 236.73 U/mg protein. Protein determination was performed after PD-10 column chromatography and the total protein amount was found to be 0.156 mg/mL, the total specific activity value was 1260.96 U/mg protein. At the end of this process, the CAT enzyme was purified 7.81 times. As a result of optimum pH and temperature studies of the enzyme; optimum pH 8.0; the optimum temperature was determined to be 25°C. When their thermal stability was compared, it was determined that they maintained 18.99% of enzyme activity at the end of 24 hours at 40 °C and 40.51% of enzyme activity at 25 °C. The storage stability was examined at 4 °C and it was found that it retained 5.96% of the catalase enzyme activity at the end of 15 days. Km value was determined as 38.151 mM and the Vmax was determined as 303.03 U/mg protein. As a result of SDS-PAGE electrophoresis, the molecular weight of the enzyme was found to be between 42 and 52 kDa.