Bazı pestisitlerin ayırma yöntemleri ile analizi, pestisit-DNA etkileşimin incelenmesi ve DNA hasarının araştırılması
Analysis of some pesticides with separation methods, investigation of pesticide-DNA interaction and investigation of DNA damage
Yazar: BOĞAÇ BUĞRA BARUT
Danışman: PROF. DR. BENGİ USLU
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: DNA analizi = DNA analysis ; DNA hasarı = DNA damage ; Dietofenkarb = Dietofencarb ; Epoksikonazol = Epoxiconazole ; Hekzakonazol = Hexaconazole ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Pestisitler = Pesticides ; Tarım ilaçları = Pesticides ; Tebukonazol = Tebuconazole ; Tiram = Thiram

Özet:
Bu tezin amacı mantarlara karşı kullanılan pestisitlerden Tiram, Epoksikonazol, Hekzakonazol, Tebukonazol ve Dietofenkarb'ın ters faz sıvı kromatografisi tekniği ile ilk kez eş zamanlı bir şekilde tayin edebilmektir. Bunun için, bir çok sabit faz deneyerek maddelerin ayrımları için ideal olan sabit faz bulunmuştur. Ayrıca, akış hızı etkileri, farklı derişimlerde tampon çözeltileri, sıcaklıkların etkileri, çeşitli hareketli faz kompozisyonları gibi çalışma koşulları da optimize edilmiştir. LUNA C18 (150 x 4,6 mm, 5µm) kolon ve metanol: tampon çözelti (5 mM, amonyum asetat), 77,5:22,5 (h/h) hareketli faz kompozisyonunu kullanarak ideal kromatografik ayrım yapılmıştır. Analizler 220 nm dalga boyunda, 1mL/dk akış hızında ve 25 °C sıcaklıkta yapılmıştır. Validasyon çalışmaları neticesinde çalışılan tüm pestisitler çözücü, elma suyu, toprak, içme suyu, kuyu suyu, atık su, sentetik serum, idrar numunelerinde 0,5-100 µg/mL aralığında (R2≥0,990) doğrusallık sergilemiştir. Her matriksde elde edilen tayin alt sınırları yöntemin hassasiyetini gösterirken, gün içi ve günler arası tekrar edilebilirlik çalışmaları sonucunda %2'den daha düşük bulunan bağıl standart sapma değerleri de yöntemin kesinliğini göstermiştir. Ayrıca geri kazanım çalışmaları sonunda %93-107 arasında değişen geri kazanım değerleri yöntemin doğruluğunu göstermiştir. Önerilen hızlı ve duyarlı ters faz sıvı kromatografisi yöntemi Tiram, Epoksikonazol, Hekzakonazol, Tebukonazol ve Dietofenkarb'ın eş zamanlı miktar tayinleri için oldukça basit numune hazırlama prosedürü ile çevre ve gıda kalite kontrol laboratuvarlarında kolaylıkla uygulama imkanı sunmaktadır.
Tezin ikinci bölümünde ise Tiram, Epoksikonazol, Hekzakonazol, Tebukonazol ve Dietofenkarb'ın DNA ile etkileşimlerinin kromatografik olarak incelenmesi ve DNA hasarı araştırılmıştır. Yanlış pestisit kullanılması, pestisit kullanıldıktan sonra yeterli süre beklemeden hasat yapılması ve bilinçsiz pestisit kullanımı sonucunda DNA'ya ciddi oranda hasar vermekte ve hatta ölümler gözükmektedir, bu yüzden pestisit DNA etkileşimi günümüzde oldukça önemli bir yer tutmaktadır. Bu amaçla, pestisitlerin derişimleri sabit tutularak her birine artan derişimlerde DNA ilavesi yapılmış ve pestisitlere ait pik alan değerleri incelenerek bağlanma katsayıları hesaplanmıştır. Dietofenkarb ile DNA arasında herhangi bir etkileşim gözlenmezken, Epoksikonazol, Hekzakonazol ve Tebukonazol için bağlanma katsayıları sırasıyla, 5,66x104, 1,50x104 ve 5,62x104 olarak bulunmuştur. İncelenen pestisitlerden Tiram, 1,10x106 bağlanma katsayısı ile DNA'ya karşı en yüksek afiniteyi sergilemiştir. Bu pestisitlerin DNA hasarları incelendiği zaman, Tiram 3 ve 5 µg/mL'lik derişimlerde DNA hasarını anlamlı olarak artırmaktadır. Dietofenkarb test edilen 5, 10, 20 ve
30 µg/mL derişimlerde kuyruk yoğunluğu değerlerini artırmamış, kontrolle karşılaştırıldığında DNA hasarını indüklememiştir. Tebukonazol, 10, 20 ve 30 µg/mL derişimlerde DNA hasarını anlamlı olarak artırmaktadır. Hekzakonazol, 20 ve 30 µg/mL derişimlerde DNA hasarını anlamlı olarak artırmaktadır. Son olarak, Epoksikonazol ise, sadece 30 µg/mL'de DNA hasarını kontrole göre anlamlı olarak artırmaktadır.

Abstract:
The aim of this thesis is to determine the pesticides used against fungi such as Tiram, Epoxiconazole, Hexaconazole, Tebuconazole and Dietofencarb simultaneously for the first time with the reverse phase liquid chromatography technique. For this, by trying many stationary phases, the ideal stationary phase for the separation of substances has been found. In addition, operating conditions such as flow rate effects, buffer solutions at different concentrations, effects of temperatures, various mobile phase compositions are also optimized. Ideal chromatographic separation was made using a LUNA C18 (150 x 4,6 mm, 5µm) column and methanol: buffer solution (5 mM, ammonium acetate), 77,5:22,5 (v/v) mobile phase composition. Analyzes were performed at a wavelength of 220 nm, a flow rate of 1 mL/min, and a temperature of 25 °C. As a result of validation studies, all pesticides studied showed linearity in the range of 0,5-100 µg/mL (R2≥0,990) in solvent, apple juice, soil, drinking water, well water, waste water, synthetic serum, urine samples.  While the lower limits of determination obtained in each matrix showed the sensitivity of the method, the relative standard deviation values found to be less than 2% as a result of intra-day and inter-day repeatability studies also showed the precision of the method. In addition, recovery values varying between 93-107% at the end of the recovery studies showed the accuracy of the method. The proposed fast and sensitive reversed phase liquid chromatography method offers easy application in environmental and food quality control laboratories with a very simple sample preparation procedure for the simultaneous determination of Tiram, Epoxiconazole, Hexaconazole, Tebuconazole and Dietofencarb.
 
In the second part of the thesis, chromatographic examination of the interactions of Thiram, Epoxiconazole, Hexaconazole, Tebuconazole and Dietofencarb with DNA and DNA damage were investigated. The use of wrong pesticides, harvesting without waiting for a sufficient time after pesticide use and unconscious pesticide use cause serious damage to DNA and even deaths appear, so pesticide-DNA interaction has a very important place today. For this purpose, increasing concentrations of DNA were added to each of the pesticides by keeping the concentrations constant, and the binding coefficients were calculated by examining the peak area values of the pesticides. While no interaction was observed between dietofencarb and DNA, the binding coefficients for Epoxiconazole, Hexaconazole and Tebuconazole were found to be 5.66x104, 1.50x104 and 5.62x104, respectively. Among the pesticides examined, Tiram exhibited the highest affinity for DNA with a binding coefficient of 1.10x106. When DNA damage of these pesticides is examined, Tiram significantly increases DNA damage at 3 and 5 µg/mL concentrations. Dietofencarb did not increase tail density values at the 5, 10, 20 and µg/mL concentrations tested and did not induce DNA damage compared to control. Tebuconazole significantly increases DNA damage at 10, 20 and 30 µg/mL concentrations. Hexaconazole significantly increases DNA damage at 20 and 30 µg/mL concentrations. Finally, Epoxiconazole significantly increases DNA damage at only 30 µg/mL compared to control.