İskemi
reperfüzyon sonrası kan beyin bariyeri bozulmasının mekanizmalarının mikrodolaşımda astrosit son ayakları ve endotel düzeyinde incelenmesi / Mechanisms of ischemia / reperfusion-induced BBB damage at the astrocytic end feet and endothelial level
Yazar: MÜGE YEMİŞÇİ
Danışman: PROF. DR. TURGAY DALKARA
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Nörolojik Bilimler Ana Bilim Dalı / Temel Nörolojik Bilimler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Nöroloji = Neurology

Özet:
İnmeli hastalarda uygulanan trombolitik tedavi ile dokuya yeniden kan
akımı sağlanabilmesine rağmen yeterli fonksiyonel iyileşmenin sağlanamaması,
kanama ve ödem gibi yan etkilerin görülmesinin bir nedeni reperfüzyon
hasarıdır. İskemi / reperfüzyondan sonra oluşan KBB hasarında oksidatif ve
nitratif stres önemlidir. Nitrik oksitle eş zamanlı artan süperoksit birbirleriyle
reaksiyona girerek daha toksik olan peroksinitrit radikalini oluşturur. Beyinde,
iskemi / reperfüzyon sonrası süperoksit ve peroksinitritin, mikrodamarlar ve
bunları sıkıca çevreleyen astrosit son ayaklarında yoğunlaştığı gösterilmiştir. Bu
çalışmada 2 saat iskemi ve 6 saat reperfüzyondan sonra peroksinitrit
oluşumunun bir kolu olan nitrik oksit, seçici olmayan NOS inhibitörü L-NA ve
seçici eNOS inhibitörü L-NIO ile kısmi olarak; peroksinitrit oluşumunun diğer
kolu olan süperoksit ise, serbest radikal tutucu PBN ile inhibe edildi. KBB yıkımı
Evans mavisi sızıntısı ve albumin ekstravazasyonu ile değerlendirildi ve her üç
ajanın da KBB'ni koruduğu saptandı. Ayrıca biyokimyasal yöntemlerle L-NA, LNIO
ve PBN'un beyinde 3-nitrotirozini, nöroprotektif etkilerine paralel bir şekilde
inhibe ettiği ama lipid peroksitleri oluşumunu inhibe etmediği görüldü ve
peroksinitritin oluşumunda endotel kaynaklı nitrik oksit ve oksijen radikallerinin
önemi rol oynadığı saptandı. İskemi / reperfüzyon sonrası mikrovasküler lümen
açıklığı horseradish peroksidaz ile incelendi ve L-NA ve PBN'in iskeminin neden
olduğu mikrodolaşım bozukluğunu azalttığı bulundu. KBB fonksiyonunda önemli
rol alan sıkı bileşke proteinlerinden klaudin-5'in peroksinitrit ile nitrasyonu ikili
immünoflüoresan işaretleme yapılarak, lazer taramalı konfokal mikroskobi ile
değerlendirildi ve 3-nitrotirozin immünoreaktivitesinin %79'unun klaudin-5 ile
örtüştüğü saptandı. İki saat iskemi ve 6 saat reperfüzyondan sonra astrosit son
ayaklarında bulunan Aqp4 miktarında hem immünoflüoresan işaretleme hem de
Western blotlama ile değişiklik olmadığı gösterildi. Bu bulgular, reperfüzyon
sırasında mikrodamarlarda oluşan süperoksit, nitrik oksit ve peroksinitritin sıkı
bileşke proteinlerinin fonksiyonunu bozarak ve MMP'leri aktive ederek KBB
hasarına neden olabileceğini düşündürmektedir. Trombolitik tedavinin serbest
radikal tutucular ve düşük doz NOS inhibitörleri ile birlikte kullanılması bu
tedavinin kar/zarar oranını iyileştirebilir.
Anahtar Kelimeler: Fokal serebral iskemi, kan beyin bariyeri, reperfüzyon
hasarı, nitrik oksit, peroksinitrit, astrosit son ayağı, microvasküler endotel, HRP,
Aquaporin4, sıkı bileşke proteinleri, klaudin-5, PBN, L-NA, L-NIO.

Abstract:
Despite restoration of normal blood flow by
thrombolytic treatment in stroke patients, unsatisfactory functional recovery as
well as serious adverse effects (bleeding and edema formation) significantly limit
its use. The unfavourable effects of thrombolytic therapy are attributed to
reperfusion-induced oxidative and nitrative injury to the blood brain barrier
(BBB). Concomitant surges of superoxide and nitric oxide yield to formation of
peroxynitrite radical that is a strong oxidant. Following ischemia and reperfusion,
elevated concentrations of superoxide and peroxinitrite in microvasculature and
in the astrocyte endfeet surrounding the brain capillary have been
demonstrated. in this study, nitric oxide formation, hence peroxynitrite
generation, was partially inhibitted by non-selective NüS inhibitor L-NA and
selective eNüS inhibitor L-Nlü after 2 hours of ischemia and 6 hours of
reperfusion in mice. The other arm of peroxynitrite formation (superoxide) was
inhibited by the free radical scavenger PBN. BBB damage was assessed with
Evans blue leak and albumin extravasation. AII three agents reduced the infarct
volume and protected the BBB. Besides their neuroprotective effects; L-NA, LNlü,
and PBN were demonstrated to inhibit 3-nitrotyrosine formation but not lipid
peroxidation in the brain tissue. it was found that the major source Nü and
superoxide leading to peroynitrite-induced BBB damage was the endothelium.
Besides L-NA and PBN preserved the patency of microvascular lumen as
detected by systemically administered horse radish peroxidase. Nitration of
claudin-5 with peroxynitrite, which is one of the tight junction proteins playing a
crucial role in BBB function, was assessed by laser scanning confocal
microscope after double immunofluorescence staining. Approximately 80% of 3-
nitrotyrosine (a marker of peroxinitrite toxicity) overlapped with claudin-5
immunoreactivitiy, suggesting that peroxynitrite might distrupt the BBB function
soon after reperfusion by nitrating tight junction proteins. No change in Aqp4
levels, which are located at astrocyte endfeet, were found after 2 hours of
ischemia and 6 hours of reperfusion with both immunofluorescent staining and
Western blotting. These data suggest that superoxide, Nü and peroxynitrite
formed in the microvasculature during reperfusion may distrupt the BBB by
causing tight junction dysfunction as well as activating MMPs. Combination of
trombolytic therapy with oxygen radical scavengers or low dose NüS inhibitors
may improve its risk/benefit ratio.
Key Words: Focal cerebral ischemia, blood brain barrier, reperfusion injury,
nitric oxide, peroxynitrite, astrocyte endfeet, microvascular endo