Bazı ağır metal ve organik kirleticilerin laktat dehidrogenaz enzimi üzerindeki engelleyici etkilerinin belirlenmesi ve enzim inhibisyonuna dayalı biyosensör geliştirilmesi
Determination of inhibition effect of some heavy metals and organic pollutans on lactate dehydrogenase enzyme and biosensor development based on enzyme inhibition
Yazar: İBRAHİM TAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MELEK ÖZKAN
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering

Özet:
Günümüzde teknolojinin ilerlemesi buna bağlı olarak sanayi alanındaki gelişmeler ve sektördeki hızlı artış çevresel sorunları beraberinde getirmiştir. Çevre kirliliğinin kontrol edilebilmesi için çevre kirliliğine sebep olan kirleticilerin hızlı ve doğru şekilde ölçümü önem kazanmıştır. Ölçüm metodları geliştirilirken pratik, hızlı ve doğru ölçüm sonuçları veren cihazlar geliştirilmesine çalışılmaktadır.Bu tez çalışmasında, biyoajan olarak Clostridium thermocellum L-laktat dehidrogenaz enzimini içeren su kirliliğini tayin etmek amacıyla kullanılabilecek bir biyosensör geliştirilmesi hedeflenmiştir. Daha önceki çalışmalarda saflaştırma vektörüne klonlanmış olan enzim Escherichia coli FMJ39 mutant suşundan saflaştırılmıştır (Saflaştırılan enzim metin boyunca GST-LDH olarak isimlendirilmiştir) 13 farklı metal ve nitrit, nitrat, amonyum ve fosforun GST-LDH enziminin aktivitesi üzerindeki engelleyici konsantrasyonları belirlenmiştir. Spektrofotometre ile yapılan ölçümlerde enzim aktivitesinin ağır metal varlığında düştüğü, farklı ağır metallerin GST-LDH enziminin aktivitesi üzerindeki inhibisyon etkilerinin farklı olduğu görülmüştür. Özellikle civa, kobalt ve demirin ppb seviyesinin altındaki konsantrasyonlarda bile enzim aktivitesinde % 20 oranında bir düşüşe neden oldukları saptanmıştır. Enzimi yüksek seviyede engelleyen diğer bir metal ise nikeldir. 0.002 ppm nikel konsantrasyonunda enzim % 30 oranında aktivite kaybetmiştir. Nitrat, amonyum ve fosfor gibi kirleticilerin enzim üzerindeki etkileri ağır metallere kıyasla daha düşüktür. 0.001 ppm düzeyinde nitrit enzim aktivitesini % 25 oranında düşürmüştür.Tezin ikinci aşaması olan biyosensör geliştirme bölümünde spektrofotometre cihazında yapılan ölçümler sonucu yüksek inhibisyon etkisi görülen civa ve nikel ağır metallerinin enzim üzerinde etki gösteren en düşük iki konsantrasyonu çalışılmıştır. Biyosensörün çalışma elektrodu GST-LDH enzimi PGA pirol polimeri ile kaplanmış altın levha üzerine tutuklanarak hazırlanmıştır. Yapılan amperometrik ölçümlerde civa ve nikel metallerinin varlığında alınan sinyallerde düşüş gözlenmesi biyosensörün enzim aktivitesini engeleyen kirletici maddelerin varlığını tespit etmek amacıyla kullanılabileceğini göstermiştir.Tez çalışmasında geliştirilen biyosensör değişken tek bir kirletici madde içeren solusyonlarda kirleticinin konsantrasyonunu tayin etmek amacıyla kullanılabilecektir. Bunun yanı sıra, biyosensör suyun toplam kirliliği hakkında ön bilgi sahibi olmak için kullanılabilecek kullanımı basit bir test cihazı olarak kabul edilebilir. Ayrıca suda 100 ppb'nin üzerindeki konsantrasyonlarda bulunmasına izin verilen metallerin (demir, çinko ve baryum gibi) konsantrasyonunu tespit etmek amacıyla da kullanılabilme potansiyeli vardır.

Abstract:
The evolution of society and the growth of cities and economies have led to an increase in the pollution in our water environment. Although different methods have been reported for analysing water quality, time consuming and complicated procedures always delay the immediate control of pollution. Owing to the advantageous features such as rapidness, simplicity and accuracy, biosensor technology has been introduced to fulfill the requirements of rapid analysis.In this thesis, we aimed for development of a biosensor by using the gene of L-lactate dehydrogenase enzyme of Clostridium thermocellum. The enzyme was previously cloned into a expression vector by our team. In this study, enzyme was purified (the purified enzyme is called GST-LDH during the text) and measurable limits of the inhibitory concentrations of chemicals and heavy metals on enzyme activity was determined. Enzyme was tested in the presence of 13 different metals, and nitrate, nitrite, amonium and phosphorous. It was observed that different pollutants inhibited the enzyme in a different manner. Mercury, cobalt and iron caused about 20 % inhibition on enzyme activity, even their concentration were less than 1 ppb. 30 % inhibition was observed when solution contains 0.002 ppm nickel. Inhibition effect of nitrate, amonium and phosphorous were lower than that of heavy metals. 0.001 ppm nitrite decrease the enzyme activity by 25 %.In the second part of thesis, GST-LDH was immobilized on a gold sheet coated by PGA-pyrol polymeric material, which was then used as a working electrode. It was tested in the presence of two different concentrations of mercury and nickel. Signals generated in the presence of heavy metals were lower as compared to those obtained in control experiment. Results showed that the biosensor developed in this study could be used to measure the concentration of a contaminant if it is only variable in the solution. The biosensor can also be used as a simple device to measure the total contamination of water samples. Moreover, it has a potential to determine the concentrations of metals (like iron, barium and zinc) whose permitted concentrations are more than 100 ppb in water.