Ağır metal iyonlarının insan lenfositleri üzerindeki genotoksik etkilerinin mikronükleus tekniğiyle belirlenmesi
Detecting genotoxic effects of heavy metal ions on human lymphocytes by micronucleus technique
Yazar: İSA BEYTULLAH DOĞAN
Danışman: PROF. DR. TUNCAY ORTA
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Genel Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Çevremizdeki ağır metal konsantrasyonları, günümüzde sanayileşme ve endüstrinin giderek çoğalması ve pek çok metal bileşiğinin günlük hayatımızda yer bulan araç gereçlerde kullanılması neticesinde giderek artmaktadır. Birçok metal iyonu insan metabolizması için esansiyel öneme sahip olsa da bazı ağır metallerin yüksek konsantrasyonlarının toksik karakter gösterdiği pek çok bilimsel çalışmayla ortaya konulmuştur. Olası toksik etkiler doku, hücre ve molekül seviyesinde gözlemlenebilir.
Ağır metaller elementtir ve yer kabuğunun doğal bileşenleridir. Bu sebeple birçok organik veya inorganik kirleticinin ve toksik materyalin aksine daha zararsız bileşenlere indirgenemez veya yok edilemezler. Bu sebeple özellikle hayatımıza sık olarak giren bazı ağır metaller için geri dönüşüm programları hayata geçirilmiştir. Fakat günümüzde hem bu geri dönüşüm programlarının yeterli derecede uygulanmaması hatta bazı metaller için gerçekleştirilmemesi, hem de kullanımlarının giderek artması sonucu ağır metal kirliliği büyük bir sorun haline gelmiştir. 
Ağır metallerin sitotoksik ve genotoksik etkileri her bir elemente göre değişiklik gösterebilmektedir fakat temelde toksisite mekanizmaları direkt ve indirekt olarak iki ana başlık altında toplanabilir. İndirekt etkiler de DNA tamir mekanizmalarını engellemeleri, oksidatif stres oluşumunu tetiklemeleri ve hücre bölünmesi kontrol mekanizmasını devre dışı bırakabilmeleri olarak sıralanabilir.
Alüminyum (Al) ve kadmiyum (Cd) elementlerinin insan lenfosit hücreleriyle etkileşiminin incelendiği bu çalışmada, bu metallerin suda çözülebilen tuz formları olan alüminyum sülfat (Al2(SO4)3) ve kadmiyum klorür (CdCl2) kullanılmıştır. Taşıyıcı olarak suyun tercih edilmesinin nedeni, diğer çözücülerin de kendilerine has olası toksik etkilerinin deney sonuçlarına negatif olarak yansımasının önüne geçmektir.
Bu çalışmada yöntem olarak, sigara kullanmayan sağlıklı üç bireylerden temin edilen periferik kan lenfositleri incelenecek olan metallerin tuz formlarıyla muamele edilmiş, elde edilen preparatların değerlendirilmesi için mikronükleus tekniği kullanılmıştır. Bu teknik, uygulama ve değerlendirme aşaması basit, hızlı ve güvenilir olduğu için tercih edilmiştir. İncelenen periferik kanlar, kültüre alındıktan sonra "Phytohaemagglutinin" (PHA) ile muamele edilmiş ve mitoza girmeleri sağlanmıştır.  Daha sonra kültürlere metaller eklenmiş, son aşamada ortama "Cytochalasin-B" (CytoB) ilave edilerek metafaz aşamasında kalıp bölünmesi durdurulan binükleat hücrelerdeki kromozom hasarı, gözlemlenen mikronükleus (MN)'ların skorlanması ile değerlendirilmiştir.
Doz başına 1000 binükleat hücrenin değerlendirildiği bu çalışmada her bir doz, kendi kontrol grubuyla ki kare testi uygulanarak karşılaştırılmıştır. Her iki metalde de belirli dozlarda kontrol grubunun 1,5-2 katı kadar mikronükleus artışı gözlemlenmiş fakat elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı görülmemiştir. Bununla birlikte aynı metal için elde edilen sonuçlar donör grupları arasında tek yönlü anova testi uygulanarak birbiriyle karşılaştırıldığında, her iki metal için de bireylerdeki mikronükleus artışları arasında anlamlı farklılık gözlemlenmiştir (p<0,0001).
Her iki metal ve donörler için proliferatif indeksler (Pİ) de ayrıca değerlendirilmiştir. Preparatlardaki bütün hücrelerin skorlanmasıyla hesaplanan bu değerler kullanılarak, uygulanan dozlara göre hücrelerin sağ kalım grafikleri çizilmiş ve regresyon analizi kullanılarak birbirleriyle karşılaştırılmışlardır. Hücrelerin Pİ değerleri, her iki metal için, doza bağlı olarak anlamlı şekilde düşüş göstermiştir (p<0,01, R2>0,7). Ayrıca Pİ değerleri her bireye özgün bir şekilde farklılık göstermesine rağmen, aynı metal için dozlara verilen cevapların, regresyon grafiğinde çizilen doğruların eğimleri karşılaştırıldığında anlamlı bir şekilde paralellik gösterdiği görülmüştür (p>0,5).

Abstract:
Recently, the concentration of heavy metals in our environment has increasingly been on the rise as a result of industrialization, modernization and the use of many heavy metals in production of materials that we use in our everyday lives. Although many metal ions are essential to human metabolism, many scientific studies have demonstrated the toxicological character of heavy metals at higher concentrations. Some of the toxic effects may be observed at the tissue, cellular and molecular levels. 
Heavy metals are elements and are present in natural composition of Earth's crust. For this reason; as opposed to many toxic organic or inorganic impurities, they cannot be destroyed, eliminated, or reduced to less harmful derivatives. Hence, recycling programs have been developed especially for those heavy metals that are routinely used in our daily lives. However, the heavy metal pollution has still been a big issue because these recycling programs have either not adequately been applied to; even not at all implemented for some of the metals, or consumption of them have increased.
The cytotoxic and genotoxic effects of heavy metals may be showing differences based on each element but toxicity mechanism essentially may be classified as direct and indirect. The indirect effects can be listed as inhibition of DNA repair mechanisms, triggering the formation of oxidative stress and deregulating the cell division mechanisms. 
In this study, in which the interactions of aluminum (Al) and cadmium (Cd) elements with human lymphocyte cells were examined, the water-soluble salt forms of aluminum sulfate (Al2(SO4)3) and cadmium chloride (CdCl2) were used. The reason why water is used as a carrier solvent is to prevent the possibility of special toxic effects of other solutions that may have a negative impact to the experimental results.
As for the method used in this study; the peripheral blood lymphocytes drawn from non-smoking three healthy volunteers treated with the salts of the metals intended to be investigated and micronucleus technique was used for the evaluation of the samples obtained. This technique was preferred because the application and the evaluation stages were simple, fast, and reliable.  After the peripheral blood samples cultured, they were treated with "Phytohaemagglutinin" (PHA) to undergo a mitotic division. Then, metals were added to the cultures, and at the last stage; the chromosome damage in binucleate cells, the division of which was stopped at metaphase stage by adding "Cytochalasin-B" (CytoB), were evaluated by scoring of observed micronuclei (MN). 
In this study where 1000 binucleate cells were evaluated per dose, each dose was compared with its own control group by applying chi-square test. For both metals, at certain doses an increase of 1.5 to 2 times micronucleus as the control group was observed but the results obtained were not found to be statistically meaningful. Besides, when the obtained results of the same metal are compared with each other between the donor groups using the one-way anova test, there have been a meaningful difference between micronucleus increases in different individuals (p < 0.0001).
The proliferation index (PI) values for both metals and the donors were also evaluated. The cell survival graphs were drawn based on doses by using the calculated values from the all scored cell samples and compared with each other by using the regression analysis. For both metals, the PI values have shown a meaningful decrease based on the dose (p < 0.01, R2 > 0.7). In addition, despite the PI values show differences for each individual, when the curves of lines drawn in regression graph are compared, a meaningful parallelism is observed (p > 0.5) for the response to doses for the same metal.