Spektroflorimetrik analiz yöntemlerinin toplam antioksidan kapasite tayinlerine uygulanması
Application of spectrofluorometric analysis methods to total antioxidant capacity assays
Yazar: SEFA BAKİ
Danışman: PROF. DR. REŞAT APAK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants

Özet:
Flavonoidler antioksidan, antiviral, antikanserojen ve antienflamatuvar (iltihapla savaşan) aktiviteleri dolayısıyla insan sağlığı için yararlıdır ve bu nedenle analizleri önemlidir. Flavonoidlerin bitkilerde en yaygın olarak bulunan sınıfı flavonoller olup bunların en önemlileri kuersetin, mirisetin, fisetin ve kaemferoldur. Toplam flavonoid tayini için en yaygın yöntem AlCl3/potasyum asetat spektrofotometrik yöntemi olup bu çalışmada mevcut yönteme (aynı reaktif kullanılarak) florometrik bir seçenek önerilmiştir. Bu amaçla geliştirilen AlCl3/potasyum asetat spektroflorometrik yöntemi, etanol ve (daha önce lipofilik antioksidanlar için geliştirilmiş olan) aseton/M-ß-CD (metil-ß-siklodekstrin) çözücü ortamlarına uygulanmış ve sonuçlar, gerek AlCl3/KAc, gerekse CUPRAC (bakır(II) iyonu indirgeyici antioksidan kapasite) spektrofotometrik yöntemlerinkiyle kıyaslanmıştır. Spektroflorometrik yöntemde çoğu flavonoidler için, aynı reaktifi kullanan spektrofotometrik yöntemde rastlanan 10-7 M dolayındaki belirtme sınırları (LOD değerleri) 10-8 M düzeyine indirilmiştir, ancak rutin, galangin, luteolin ve kuersitrin için kalibrasyon eğrisi doğrusallığı ve duyarlılık, spektrofotometriye göre daha yetersiz bulunmuştur. Bazı flavonoidler için florometride doğrusallığın düşük oluşu, spektrofotometride belirgin olarak oluşan tek bir kromofordan farklı olarak çeşitli stökiyometrilerdeki Al-flavonol komplekslerinin floresans sönüm ömürlerinin farklı oluşundan kaynaklanabilir. AlCl3/potasyum asetat spektrofotometrik yönteminin kromoforu, alüminyum katyonunun flavon ve flavonollerin C-4 keto grubu ve C-3 veya C-5 hidroksil gruplarından biriyle oluşturduğu kararlı kelat kompleksidir ve flavonoidlerden flavon, flavonol ve isoflavon grupları bu tayine yanıt verir. Spektroflorometrik yöntemde flavonoidlerin Al-kelatlarının floresans intensiteleri ortaklaşa 470 nm eksitasyon dalga boyu ve 525 nm emisyon dalga boyunda ölçülmüştür. Spektroflorometrik yöntem, spektrofotometrik olana nazaran pH değişimlerine fazlaca duyarlı olup optimal pH 7 bulunmuştur. Aşırı pH duyarlılığının olası nedeni, floresans olayında kelat bağı yapmamış flavonoid ?OH gruplarının uyartılmış konumda pKa değerlerindeki şiddetli değişime paralel olarak floresans özelliklerinin değişmesidir. Spektroflorometrik yöntemde etanol ve aseton/M-ß-CD çözücü ortamlarında flavonoid bileşiklerin kalibrasyon doğruları oluşturularak QREFC (Kuersetin Eşdeğeri Flavonoid Konsantrasyonu) katsayıları bulunmuştur. Her iki çözücü ortamında da flavonollerin ikili ve üçlü kombinasyonlarından oluşan sentetik karışımları hazırlanarak, karışımı oluşturan flavonoid bileşenlerin floresans intensitelerinin (yaklaşıklıkla) toplamsal karakterde olduğu gözlemlenmiştir. Bu toplamsallık özelliği, antioksidan veya flavonoid kapasitesi ölçümlerinin presizyonunda önemlidir. Flavonolce zengin gerçek örneklerin (kırmızı şarap, soğan, yeşil çay vb.) toplam QREFC flavonoid içerikleri, gerek her iki çözücü ortamında uygulanan AlCl3/potasyum asetat spektroflorometrik ve spektrofotometrik yöntemleri, gerekse CUPRAC yöntemi ile belirlenmiştir. Spektroflorometrik yöntemde bazı flavonoidler (özellikle kötü lineer kalibrasyon eğrisi verenler) için elde edilen, spektrofotometrik sonuçlara göre aşırı düşük QREFC değerleri, karışımların gözlenen toplam flavonoid kapasiteleri içinde bunların temsil katkı paylarının görece düşük kalmasına yol açmıştır. Uygulanan dört yöntem yardımıyla gerçek örnekler arasında QREFC flavonoid kapasiteleri cinsinden sıralama yapıldığında, hepsinde en yüksek QREFC değerinin kırmızı şaraba ait olduğu ve sıralamaların birbiriyle uyumlu olduğu gözlenmiştir.

Abstract:
Flavonoids are health beneficial compounds in regard to their antioxidant, anticancer and anti-inflammatory activity, and therefore their analysis is important. Flavonols are the most widely found flavonoid class in the plant kingdom, and their leading representatives are quercetin, myricetin, fisetin, and kaempferol. The most frequently used method in literature for total flavonoid assay is the spectrophotometric aluminium chloride/potassium acetate (AlCl3/KAc) method, and this work proposes an alternative spectrofluorometric method for flavonoid assay using the same reagent. For this purpose, the developed AlCl3/KAc method was applied to flavonoids dissolved in ethanol and in acetone-methyl-ß-cyclodextrin (M-ß-CD) solution (previously developed for the assay of lipophilic antioxidants), and the results were compared to those of both the AlCl3/KAc the CUPRAC (cupric reducing antioxidant capacity) spectrophotometric assays. Compared to the 10-7 M detection limits (LOD values) of the AlCl3/KAc spectrophotometric method, the LOD of the spectrofluorometric method was reduced down to 10-8 M levels for most flavonoids, except for rutin, galangin, luteolin, and quercitrin, which gave poorer linear calibration curves. The lower linear correlation coefficients for the latter flavonoids in spectrofluorometry may arise from the fact that spectrophotometry measures the color of a unique chromophore while a number of complexes with different stoichiometries may emerge in spectrofluorometry each having different fluorescence decay lifetimes. The major chromophore in AlCl3/KAc spectrophotometry is the stable Al-chelate formed with the C-4 keto and either C-3 or C-5 hydroxyl groups of flavons and flavonols, and the flavon, flavonol, and isoflavon sub-classes of flavonoids respond to this spectrophotometric method. As mutual analytical wavelengths of flavonoids in the developed fluorometric method, fluorescence intensities with excitation at 470 nm and emission at 525 nm were measured. Spectrofluorometry was more dependent on pH than spectrophotometry, and the optimal pH of fluorescence measurement was 7. The strong dependence on pH of spectrofluorometry may be attributed to changes in fluorescence properties of Al-chelates of flavonoids arising from intense changes in the excited-state pKa values of certain ?OH groups that have not chelate-bonded to Al(III). The quercetin-equivalent flavonoid concentrations (QREFC values) of individual flavonoids were found from the calibration curves drawn in ethanol and in acetone/ M-ß-CD media. In both solvent media, binary and ternary mixtures of flavonols were prepared, and the fluorescence intensities of mixture constituents were found to have additive property (i.e., signal obtained from the mixture was approximately equal to the sum of the signals due to individual mixture constituents). This additive property is essential for precise capacity measurements of antioxidants and flavonoids. The total QREFC flavonoid capacities of a number of real samples such as red wine, onion, and green tea were measured with both the developed spectrofluorometric and the two spectrophotometric (i.e., AlCl3/KAc and CUPRAC) methods carried out in two different solvent media. In spectrofluorometry, the QREFC coefficients of certain flavonoids (which gave relatively poor calibration curve linearities) were quite lower than found in spectrophotometry, which may pose a problem in the representative weights of these flavonoids in the observed total flavonoid capacities of mixtures. The order of QREFC flavonoid capacities of real samples measured with four different methods were generally in accordance, with red wine showing the highest QREFC value in each method.