Paraoksonaz (PON1) enziminin üç faz ayrımı (ÜFA) yöntemiyle saflaştırılması, karakterize edilmesi ve karadut (Moris nigra) ekstraktları immobilize edilmiş γ-Fe2O3 nanopartiküllerinin PON1, glioblastoma ve primer rat korteks sinir hücreleri üzerine etkilerinin araştırılması
Characterization and purification of paraoxonase (PON1) enzyme by TPP (Three phase partitioning) and investigation of effects of black mulberry (Moris nigra) extracts are immobilized of γ-Fe2O3 nanoparticles on PON1, glioblastoma and primary rat cortex nerve cells
Yazar: SEMRA ÇİÇEK
Danışman: PROF. DR. HAYRUNNİSA NADAROĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Hayvansal Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmanın birinci aşamasında paraoksonaz enzimi ilk olarak üç fazlı ayrıştırma yöntemi (ÜFA) ile insan serumundan saflaştırılarak üzerinde kinetik ve karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Çalışmanın ikinci aşamasında γ-Fe2O3 nanopartikülleri üzerine karadutun (Morus nigra) alkol ve su ektraksiyonu immobilize edilmiştir. Oluşturulan grupların glioblastoma hücre hattı (U87MG) ve primer rat korteks sinir hücrelerindeki sitotoksik etkisi araştırılmıştır. Yine bu grupların GRIN2C ve SLC1A2 genleri üzerinden real time PCR uygulamaları ile glutamat toksisitesi üzerine etkileri çalışılmıştır. ÜFA saflaştırma işlemi 3 aşamada gerçekleştirilmiştir. İlk aşamada PON1 %60-80 amonyum sülfat çöktürmesine maruz bırakılmıştır, ikinci aşamada 1,0:0,5 oranında insan serumu/t-bütanol ve % 20'lik amonyum sülfat doygunluğu kullanılmıştır. Üçüncü aşamada ise ara faz üzerinden yapılan ikinci ÜFA aşamasında sabit insan serumu:t-bütanol oranı kullanılarak %49, 87 verim ve 182,66 saflaştırma katsayısı ile PON1 enzimi insan serumundan saflaştırılmıştır.  Saflaştırılan enzimin kinetik özelliklerine yönelik yapılan çalışmalarda optimum pH 8,1, stabil pH 7.0, optimum sıcaklık 37°C, stabil sıcaklık 20°C olarak belirlenmiştir. SDS-PAGE'de yürütülen enzimin moleküler ağırlığı, 45 kDa olarak bulunmuştur. Karadut ekstraktlarının γ-Fe2O3 nanopartiküllerine immobilizasyonuna ait yapılan optimizasyon çalışmalarında optimum immobilizasyon süresi ve optimum materyal konsantrasyonu her iki ekstrakt için sırasıyla 60 dk, 10mg/mL olarak tespit edilmiştir. Optimum pH ve optimum sıcaklık KSE ve KAE için sırasıyla; pH 7,0, 30°C ve pH 6,0, 20°C olarak belirlenmiştir. Karadut ekstraktları kullanılarak oluşturulan grupların nöron hücreleri üzerindeki toksisite etkisine dair yapılan çalışmada; KSE1, KSE2 ve KSEF1 grupları nöron hücrelerinde kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı bir toksisiteye sebep olmazken U87MG kanser hücre kültüründe KSE1 (%73,7), KSE2 (%58,7) anlamlı azalmalara yol açmıştır. Real Time PCR çalışmalarında nöron kültüründe KSE2, KAE2, KAEF2 grupları, SLC1A2'nin ekspresyonunu kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttırırken GRIN2C ekspresyonunu KSE2, KSEF2, KAE2, KAEF2 ve T grupları anlamlı olarak azaltmışlardır. U87MG kanser hücre kültüründe ise, KSE2, KSEF2, KAE2, KAEF2 grupları Slc1a2 ekspresyonunu kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttırırken, KSEF2, KAE2, KAEF2 ve T grupları ise GRIN2C ekspresyonunu kontrol grubuna göre anlamlı olarak azaltmışlardır.

Abstract:
In the first step of this study, paraoxonase enzyme was first purified from human serum with three-phase fractionation method and kinetic and characterization studies were performed on purified enzyme. In the second phase of the study,  alcohol and water extraction of black mulberry (Morus nigra) were immobilized onto γ-Fe2O3 nanoparticles. It was investigated cytotoxicity effect of created groups on glioblastoma cell line (U87MG) and primary rat cortex neurons cells. Also, effects of these ones on glutamate toxicity with real-time PCR applications via GRIN2C and SLC1A2 gene were studied. TPP purification process was performed in three stages.  In first stege, PON1 was exposed to 60-80% ammonium sulfate precipitation, in the second stage,  1,0:0,5 ratio of human serum/ t-butanol and 20% ammonium sulfate saturation were used. In the third stage, the second TPP stage made over the intermediate,  PON1 enzyme was purified from human serum with 49,87% recovery and 182,66 purification fold using constant ratio of human serum:t-butanol. In studies of the purified enzyme for kinetic properties, optimum pH, stable pH, optimum temperature, stable temperature were determined as 8,1, 7,0, 37°C, 20°C. Molecular weight of enzyme was found to be 45 kDa from SDS-PAGE. In done optimization studies belongin to Black mulberry extracts immobilization on γ-Fe2O3 nanoparticles, optimum immobilization time and optimum material concentration were determined 60 min, 10 mg/mL for both extract, respectively. The optimum pH and optimum temperature were determined as pH 7,0, 30°C and pH 6,0, 20°C for KSE and KAE, respectively. In the study of toxicity effect of groups forming by used Black Mulberry extracts on neuronal cells, according to control group, KSE1, KSE2 and KSEF1 groups were not cause statistically significant toxicity in neuronal cells while KSE1 (73,7%), KSE2 (58,7%)  groups led to a significant decreases in U87MG cancer cell culture. In the studies of Real Time PCR, according to control group, KSE2, KAE2, KAEF2 groups significantly increased SLC1A1 expression while KSE2, KSEF2, KAE2, KAEF2 and T groups significantly decreased GRIN2C expression in neuronal cell culture. According to control group, KSE2, KSEF2, KAE2, KAEF2 groups significantly increased SLC1A2 ekspression, while KSEF2, KAE2, KAEF2 and T groups significantly decreased GRIN2C ekspression in U87MG cancer cell line.