Sitokrom c saflaştırılması için süpermakrogözenekli immobilize metal afinite kromotografi adsorbentler
Supermacroporous immobilized metal affinity chromatography (IMAC) adsorbents for cytochrome c purification
Yazar: DUYGU ÇİMEN
Danışman: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Sitokromlar, kendilerine has görünür bölge spektrumlarına sahip kırmızı kahverengi hem proteinleridir. Elektron transfer sistemlerindeki sitokromlar genellikle absorpsiyon spektrumlarındaki dalga boyuna bağlı olarak a, b, c gibi harflerle tanımlanmaktadırlar. Sitokromlar içerdikleri metal iyonu üzerinden yükseltgenme indirgenme reaksiyonlarına uğrarlar.Kriyojeller, monomer veya polimer başlatıcıların kısmi olarak dondurulmuş çözeltilerde hazırlanmış jel matrislerdir. Birbirleri ile bağlantılı makrogözeneklerden oluşurlar ve ozmotik, kimyasal ve mekanik özellikleri sayesinde birçok biyolojik uygulamada kullanılırlar.İmmobilize metal afinite kromotografisi (İMAK); terapötik proteinlerin, peptitlerin, nükleik asitlerin, hormonların ve enzimlerin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılan bir analitik ayırma yöntemidir. Birçok geçiş iyonu elekronca zengin bileşiklerle kararlı kompleksler oluştururlar ve O, N, S içeren moleküllerle iyon dipol etkileşimleriyle koordinasyon bağı kurarlar. Birinci sıra geçiş metal iyonları (Zn2+, Ni2+, Cu2+ ve Fe3+) iminodiasetikasit, nitriloasetik asit ve tris(karboksimetil) etilendiamin gibi bileşikler üzerinden kompleksleştirilerek İMAK sorbenti elde edilir. İMAK'da biyomoleküllerin şelatlanmış metal iyonlarına olan afiniteleri temeline göre ayırma sağlanır.Bu çalışmada Cu2+ bağlı poli(2-hidroksietil metakrilat-N-metakriloil-(L)-histidin metil ester), PHEMAH, temelli kriyojeller destek malzemesi olarak kullanılarak İMAK yöntemiyle sitokrom c saflaştırılmıştır. Elementel analiz ile azot stokiyometrisinden faydalanılarak PHEMAH kriyojelin yapısına katılan MAH miktarı 113.7 µmol/g polimer olarak bulunmuştur. İkinci basamakta PHEMAH kriyojele Cu2+ iyonları takılmıştır. Cu2+ bağlanma miktarı 58.7 µmol/g'dır. Hazırlanan adsorbentin sitokrom c bağlama özellikleri farklı koşullarda sitokrom c'nin sulu çözeltilerinde incelenmiştir. PHEMAH kriyojelin maksimum adsorpsiyon miktarı 3.1 mg sitokrom c/g adsorbenttir. Cu2+ takılması adsorpsiyon miktarı önemli derecede artırmıştır. Cu2+ bağlı PHEMAH kriyojelin pH=8.0 fosfat tamponunda maksimum adsorpsiyon miktarı 20.8 mg sitokrom c/g adsorbent olarak belirlenmiştir. Adsorpsiyon miktarı akış hızının 0.5 ml/dk'dan 3.5 ml/dk'ya çıkarılması ile 12.37 mg sitokrom c/g adsorbentten 5.82 mg sitokrom c/g adsorbent değerine düşmüştür. Sprague dawley sıçan karaciğerinden elde edilen maksimum sitokrom c adsorpsiyon miktarı 1 gram polimer başına 37.7 mg olarak bulunmuştur. İMAK ile saflaştırılan sitokrom c'nin molekül ağırlığı ve saflığı standart sitokrom c ile karşılaştırılarak SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile belirlenmiştir. Sitokrom c'nin kriyojel kolondan desorpsiyonu için 1 M NaCl kullanılmıştır. Sitokrom c'nin adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir azalma olmadan PHEMAH-Cu2+ kriyojel kolona tekrar tekrar adsorbe ve desorbe edilebileceği gösterilmiştir.

Abstract:
Cytochromes are heme proteins which have characteristic absorption peaks in the visible region of the electromagnetic spectrum. Cytochromes are generally identified with letters such as a, b and c according to the wavelength of the absorption bands in the absorption spectrum. Cytochromes include metal ions which interconvert between the oxidation states and allow cytochromes to perform oxidation and reduction.Cryogels are gel matrices of the monomers or initiators of poylmers which are prepared in partially frozen solvents. They are composed of interconnected macropores and used in various biological applications owing to their osmotic, chemical and mechanical features.Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) is a method which is widely used to purify therapeutic proteins, peptides, nucleic acids, hormones and enzymes. A number of transition metal ions form complex with electron-rich compounds and form coordinate covalent bond with molecules which contain oxygen, nitrogen and sulfur atom. IMAC sorbent is obtained via complexation of first row transition metal ions (Zn2+, Ni2+, Cu2+ ve Fe3+) with chelating agent such as iminodiacetic acid, nitrilotriacetic acid and tris(carboxy-methyl)ethylenediamine. IMAC is a separation technique that is based on different affinities of biomolecules towards metal ions.In this study, cytrochrome c was purified by IMAC with Cu2+ chelated poly(2-hydroxyethyl methacrylate N-methacryloyl-L-histidine methylester), PHEMAH, based cryogels. MAH content of PHEMAH cryogels was found to be 113.7 µmol/g polymer according to elemental analysis by using nitrogen stoichiometry. In the second step, Cu2+ ions were bound to PHEMAH cryogels. The amount of Cu2+ ions which are bound to cryogels is 58.7 µmol/g polymer. The binding affinity of the prepared adsorbent was examined under different circumstances. The amount of cytochrome c which are bound to PHEMAH cryogels is 3.1 mg/g polymer. Binding of the Cu2+ to the cryogel increased the adsorption significantly. The maximum adsorption value of the cryogels was determined as 20.8 mg cytochrome c /g in the pH=8 phosphate buffer solution. The adsorption capacity decreased significantly from 12.37 mg cytochrome c/g to 5.82 mg cytochrome c/g polymer with the increase of the flow-rate from 0.5 ml/min to 3.5 ml/min. Maximum adsorption amount from the extract of sprague dawley rat livers was determined to be 37.7 mg per dry gram of adsorbent. Molecular weight and purity of cytochrome c purified by IMAC was determined by SDS-PAGE comparing with standart protein markers. Desorption of cytochrome c from cryogel column was accomplished by 1 M NaCl. It was observed that cytochrome c could be repeatedly adsorbed and desorbed with PHEMAH-Cu2+ cryogel column without significant decrease in column capacity.