Streptomyces bottropensis SY8 kökenli melaninin biyolojik aktivitelerinin araştırılması
Investigation of biological activities of Streptomyces bottropensis SY8 -derived melanin
Yazar: ŞEVVAL YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. MESUT TAŞKIN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Amaç: Bakteri kaynaklı pigmentlerin en bilinenleri melaninler, karotenoidler, prodigiozin, viyolasin, piyosiyanin, bakteriyoklorofiller ve monasinlerdir. Melaninler, UV, güneş ve gama radyasyonuna karşı koruyucu bir rol oynar ve ağır metal toksisitesine karşı dayanıklılık sağlar. Bu çalışma, hücre dışı melanin üretebilen yeni bir Streptomyces suşunun izole edilmesi ve bu izolattan saflaştırılan melaninin biyolojik aktivitelerinin araştrılması amacıyla gerçekleştirilmiştir.
Yöntem: İzolasyon deneyleri tirozin agar besiyerinde gerçekleştirilmiştir. İzolatların melanin üretim yetenekleri tirozin broth besiyeri ortamında test edilmiştir. Melanin üretici en iyi izolatın tanımlanması 16S rRNA dizi analizine göre gerçekleştirilmiştir. Bu izolatın melanin üretme yeteneğini artırmak için, farklı besiyerleri, kültür pH' ları, sıcaklıklar ve inkübasyon süreleri test edilmiştir. Melanin saflaştırılması asit çöktürmesi (5N HCl) yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılan melaninin karakterizasyonu için, fonksiyonel grup analizi (FTIR) ve dalga boyu taraması (UV-VIS spektrofotometre) yapılmıştır. Melaninin in vitro antioksidant aktivitesi DPPH, ABTS, hidroksil (OH•) ve süperoksit (O2•) radikallerine karşı test edilmiştir. Melaninin sitotoksisitesi, deri yaşlanma karşıtı (H2O2 ile indüklenen hücre yaşlanması) ve yara iyileştirme özellikleri (çizik yöntemi) in vitro' da L929 hücre hattı (fare fibroblast hücre hattı) üzerinde araştırılmıştır. Melaninin irritasyon özelliği Tavuk yumurtası-koryoallantoik membran (HET-CAM) testine, antibakteriyel özelliği ise kuyu-difüzyon yöntemine göre analiz edilmiştir.
Bulgular: Toplam 18 bakteri izolatı arasında, patates tarlası toprağından izole edilen SY8 suşunun en fazla melanin ürettiği belirlenmiştir. Bu izolat S. bottropensis (GenBank: PQ565816) olarak teşhis edilmiştir. Bu izolattan maksimum melanin üretimi PYITB (pepton-maya ekstraktı-demir-tirozin broth) besiyerinde başarılmıştır. Melanin üretimi için diğer optimal parametrelerin pH 8, 30°C' lik sıcaklık ve 168 saatlik inkübasyon süresi olduğu belirlenmiştir. Saflaştırılan melanin için maksimum absorbans 235 nm'de ölçülmüştür. FTIR analizlerinde, melanin yapısını işaret eden absorbans bandları tespit edilmiştir. Melaninin, DPPH, ABTS, OH• ve O2• radikallerini etkisizleştirebildiği belirlenmiştir. Melanin L929 hücreleri üzerinde sitotoksisiteye neden olmamış ancak ve H2O2 ile indüklenen hücre yaşlanmasını azaltabilmiştir. HET-CAM testi melaninin irritasyona neden olmadığını, kuyu-difüzyon testi ise melanin antibakteriyel etkinliğe sahip olmadığını ortaya çıkardı. Çizik testi ise kontrole oranla melaninin hücre göçünü ve yara kapanmasını istatiksel olarak artırdığını ortaya çıkardı.  
Sonuçlar: Bu çalışma, S. bottropensis'in melanin üretim potansiyeline ilişkin ilk rapordur. Çalışma bu bakteriden elde edilen melaninin, deri yaşlanmasının engellenmesi ve deri yaralarının iyileştirilmesi amacıyla kullanılabileceğini ortaya çıkarmıştır.

Abstract:
Purpose: The most well-known pigments of bacterial origin are melanins, carotenoids, prodigiosin, violacin, pyocyanin, bacteriochlorophylls and monacins. Melanins play a protective role against UV, solar and gamma radiation and provide resistance to heavy metal toxicity. This study was performed to isolate a new Streptomyces strain capable of producing extracellular melanin and to investigate the biological activities of melanin purified from this isolate.
Method: Isolation experiments were carried out on tyrosine agar medium. Melanin production potentials of isolates were tested in tyrosine broth medium. Identification of the best melanin producing isolate was carried out according to 16S rRNA sequence analysis. To increase the melanin-producing ability of this isolate, different media, culture pHs, temperatures and incubation times were tested. Purification of melanin was carried out by acid precipitation (5N HCl) method. For the characterization of purified melanin, functional group analysis (FTIR) and wavelength scanning (UV-VIS spectrophotometry) were performed. The in vitro antioxidant activity of melanin was tested against DPPH, ABTS, hydroxyl (OH•) and superoxide (O2•) radicals. The cytotoxicity, skin anti-aging (H2O2-induced cell senescence) and wound healing properties (scratch method) of melanin were investigated in vitro on the L929 cell line (mouse fibroblast cell line). The irritation property of melanin was analyzed according to the Chicken egg-chorioallantoic membrane (HET-CAM) test, and its antibacterial property was analyzed according to the well-diffusion method.
Findings: Among the 18 bacterial isolates, the SY8 strain isolated from potato field soil was found to produce the maximum amount of melanin. This isolate was identified as S. bottropensis (GenBank: PQ565816). Maximum melanin production from this isolate was achieved in PYITB (peptone-yeast extract-iron-tyrosine broth) medium. Other optimal parameters for melanin production were initial pH of 8, temperature of 30°C and incubation time of 168 hours. The maximum absorbance for purified melanin was measured at 235 nm. In FTIR analyses, absorbance bands indicating the structure of melanin were detected. Melanin could neutralize DPPH, ABTS, OH• and O2• radicals. It was determined that melanin did not cause cytotoxicity on L929 cells but could reduce H2O2-induced cell senescence. The HET-CAM test revealed that melanin did not cause irritation, while the well-diffusion test revealed that melanin did not have antibacterial activity. The scratch test revealed that melanin statistically increased cell migration and wound closure compared to the control.
Conclusions: This study is the first report on the melanin production potential of S. bottropensis. The study revealed that melanin obtained from this bacterium can be used to prevent skin aging and heal skin wounds.