Brokoli'den (Brassica oleracea L. var. İtalica) glutatyon S-transferazın saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı herbisit türevlerinin enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification, characterization of glutathione S-transferase from broccoli (Brassica oleracea L. var. İtalica) and investigation of the effects of some herbicides derivatives on enzyme activity
Yazar: HACER ERDEM KIZILTUNÇ
Danışman: DOÇ. DR. MİNE AKSOY ; DOÇ. DR. HALİS ŞAKİROĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Brokoli = Broccoli ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzim-inhibisyon yöntemi = Enzyme-inhibition method ; Karakterizasyon = Characterization ; Saflaştırma = Purification ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Amaç: Mahsullerde ve yabani otlarda herbisit bozunmasının nispi oranı, herbisit seçiciliğinin önemli bir belirleyicisidir. GST'ler, herbisit metabolizması ve seçiciliğindeki rolleri nedeniyle bitkilerde incelenmiştir. Çeşitli herbisitler, mahsullerde GST katalizörlüğünde GSH konjugasyonu yoluyla hızla metabolize edilir. Buna karşılık, birçok yabani ot, daha düşük detoksifiye edici GST aktiviteleri içerir ve herbisitlere karşı hassastır. Herbisit toleransında GST'lerin önemi, bitkilerde GST'nin incelenmesiyle ortaya konmuştur.
Yöntem: Bu tez çalışmasında bitki GST'lerinin aydınlatılmasına katkıda bulunmak amacıyla brokoli bitkisinden GST enzimi glutatyon agaroz afinite kromatografisi yöntemiyle saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Son aşamada seçilen bazı herbisit türlerinin brokoliden saflaştırılan enzim aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi incelenmiştir. 
Bulgular: Tez kapsamında yapılan saflaştırma çalışmalarında GST enzimi brokoliden %18,84 verimle, 101,34 kat saflaştırılmıştır. Karakterizasyon çalışmaları ile enzimin optimum pH'sı 7,5, optimum sıcaklığı 60 °C, iyonik şiddeti 1,25 M bulunmuştur. GST enziminin KM, değerleri iki subsratı olan CDNB ve GSH için sırasıyla 0,465 ve 2,355 mM, Vmax  değerleri ise 0,251 ve 0,424 µmol/L.dk olarak belirlenmiştir. SDS-PAGE ile enzimin saflığı kontrol edilmiş ve 36 kDa'a yakın molekül ağırlıklı bir olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca inhibisyon çalışmalarında pendimethalin, bentazone, glifosat herbisitlerinin inhibisyon etkisi incelenmiştir. IC50 değerleri pendimethalin, bentazone, glifosat herbisitleri için sırasıyla 173,25, 0,438, 0,536 µM olarak tespit edilmiştir. 
Sonuç: Bulgular sonucunda GST enzimi brokoliden başarıyla saflaştırılmıştır. Karakterizasyon çalışmaları ile optimum şartlar belirlenmiştir. İnhibisyon çalışmaları ile GST enziminin en iyi inhibitörünün en küçük Ki değeri ile bentazone (Ki: 0,318 ± 0,079 µM) olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Purpose: The relative rate of herbicide degradation in crops and weeds is an important determinant of herbicide selectivity. GSTs have been studied in plants for their role in herbicide metabolism and selectivity. Various herbicides are rapidly metabolized in crops via GST-catalyzed GSH conjugation. In contrast, many weeds contain lower detoxifying GST activities and are susceptible to herbicides. The importance of GSTs in herbicide tolerance has been demonstrated by examining GST in some plants.
Method: In this thesis, GST enzyme from broccoli plant was purified and characterized by glutathione agarose affinity chromatography method in order to contribute to the elucidation of plant GSTs. In the last step, the inhibitory effect of some selected herbicide species on the enzyme activity purified from broccoli was investigated.
Findings: In the purification studies carried out within the scope of the thesis, the GST enzyme was purified 101.34 fold from broccoli with a yield of 18.84%. With the characterization studies, the optimum pH of the enzyme was 7.5, its optimum temperature was 60 °C, and its ionic strength was 1.25 M. The KM values of the GST enzyme were determined as 0.465 and 2.355 mM for its two substrates, CDNB and GSH, respectively, and the Vmax values were determined as 0.251 and 0.424 µmol/L.dk. The purity of the enzyme was checked by SDS-PAGE and it was determined that it is with close molecular weight in the 36 kDa. In addition, the inhibitory effects of pendimethalin, bentazone, glyphosate herbicides were investigated in inhibition studies. IC50 values were determined as 173.25, 0.438 and 0.536 µM for pendimethalin, bentazone and glyphosate herbicides, respectively. 
Results: As a result of the findings, GST enzyme was successfully purified from broccoli. Optimum conditions were determined by characterization studies. With the inhibition studies, it was determined that the best inhibitor of the GST enzyme was bentazone (Ki: 0.318 ± 0.079 µM) with the smallest Ki value.