İnsan göbek kordonu stroma dokusunun kök hücresi transplantasyonları amacıyla kullanılmak üzere kontrollü dondurulması koşullarının belirlenmesi
The assessment of the controlled cryopreservation conditions of human umbilical cord stroma with a potential usage for stem cell transplantations
Yazar: DENİZ BALCI
Danışman: PROF. DR. ALP CAN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Son yıllarda mezankimal kök hücre kaynağı olarak gösterilen göbek kordonu stroması içinde yeralan hücreler, mezankimal seri hücreleri olan adiposit, kondrosit, osteosit ve myosite olanfarklılaşmalarıyla onarımsal tıp uygulamalarında dikkati çekecek kadar ümit verici biçimde ortayakonmuştur. Bazı araştırmalarda işlevsel sinir hücrelerine dek varan farklılaşma gerçekleştirilmiştir.Bunun da ötesinde bu hücrelerin ksenotransplantasyonlarında bile alıcıda immün yanıt oluşmamışve doku reddi ile karşılaşılmamıştır.Bu çalışmada, daha önce kök hücre özelliklerini ayrıntılarıyla gösterdiğimiz bu hücrelerin kaynağıolan dokunun kontrollü bir biçimde dondurulması, ardından çözülerek kök hücrelerin izoleedilmesi ve dondurma öncesinde ve sonrasında hücrelerin yapısal ve işlevsel açıdan incelenmesi vedeğerlendirilmesi amaçlanmıştır.Bilgisayar kontrollü yavaş dondurma sistemi kullanılarak uygun dondurma ortamı ve soğutmaoranı optimize edilmeye çalışılmıştır. Dakikada 1°C ve 0,3°C olacak şekilde ısı düşürülerek ikifarklı soğutma oranı karşılaştırılmıştır. Dondurulan dokulardan ve taze dokudan daha sonra hücreizolasyonu yapılarak hücre morfolojisi, proliferasyon düzeyleri ve sağkalımı değerlendirilmiştir.Dondurma sonrası hücre sağkalımı % 80'in üzerinde bulunmuştur. Dakikada 0,3°C soğutma oranı1°C'ye göre hücre sağkalımını arttırdığı saptanmıştır. Dondurma öncesi ve sonrası hücremorfolojisinde ve mezankimal hücre belirteci olan CD90 (Thy1), vimentin, BMP-4 (bonemorphogenetic protein-4), embriyonik kök hücre belirteçi olan ve bu hücrelerde ifade olduğubilinen Nanog oranlarında, kontraktil proteinler olan aktin, desmin ve ?-düz kas aktini, bir diğerara filaman olan sitokeratin seviyesinde ve yerleşiminde herhangi bir farklılık saptanmamıştır.Bu çalışma sonucunda önemli bir mezankimal kök hücre kaynağı olarak gösterilen göbek kordonudokusunun dakikada 0,3°C ısının düşürülmesiyle bilgisayar kontrollü yavaş dondurulmasıyönteminin güvenilir, etkin bir yöntem olduğu, bu dokunun doğumdan hemen sonra bu yöntemkullanılarak yıllarca saklanabileceği ve gerektiğinde çözülerek kök hücrelerin izole edilebileceğiortaya konmuştur (Bu çalışma Sanayi Bakanlığı STZ 00139.2007/2 nolu projeyle desteklenmiştir).

Abstract:
In recent years, Umbilical cord stromal cells as a new source of stem cells, are successfullydifferentiated into mesenchymal cells; adipocytes, chondrocytes, osteocytes and myocytes, thusthey are considered as remarkable and promising stem cell source in cellular therapies. In additionto the mesenchymal lineages they were also differentiated into functional neuron-like cells.Furthermore, no immune response or graft rejection has been reported in the recipient organism.Even in the xenotransplantation studies.In the present study, controlled cryopreservation of the umbilical cord tissue pieces as a source ofstromal stem cells has been tested. The success rate has been determined by constitutional,functional examination and assessment of these cells before and after the cryopreservation.The computer controlled slow freezing system was used for optimizing the proper freezingenvironment and proper freezing proportion. The freezing rate was decreased to 1°C or 0,3°C perminute during which two different conditions were compared regarding the tested parameters.The survival rate was found over 80 % after controlled freezing. The 0,3°C per minute freezingratio was found higher the survival rate compared to the 1°C per minute freezing ratio. Nosignificant difference was noted before and after the cryopreservation in terms of cell morphologyand the levels of mesenchymal cell indicator CD90 (Thy1), vimentin, BMP-4 (bone morphogeneticprotein), the embryonic stem cell indicator; Nanog, and the in situ expression of the contractileproteins; actin, desmin, ?- smooth muscle actin and cytokeratin.In conclusion, the computer controlled slow freezing technique applied for the freezing of theumbilical cord tissue strips turned out to be an valuable tool in preserving the mesenchymal stemcell source, by decreasing the freezing rate to 0,3°C per minute. Using this reliable and effectivecryopreservation method might save the umbilical cord tissues for years right after the birth. Whennecessary they can be successfully thawed and stem cells could be isolated. (This study wassupported by The Ministry of Industry STZ 00139.2007/2 project)