Endometriyoziste endometriyal kök hücrelerin endoplazmik retikulum (ER) stresinin araştırılması
Investigation of endoplasmic reticulum (ER) stress of endometrial stem cells in endometriosis
Yazar: SELENAY HÜMEYRA FURAT RENÇBER
Danışman: PROF. DR. YUSUFHAN YAZIR
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Endometriyoz = Endometriosis ; Endometriyum = Endometrium ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Endoplazmik retikulum stresi = Endoplasmic reticulum stress ; Kök hücreler = Stem cells

Özet:
Amaç: İnsan endometriyumu yaklaşık 400-500 kez proliferasyon, farklılaşma, dökülme ve onarım döngüleri geçirdiği için rejenerasyon kapasitesi oldukça yüksek bir organdır. Bu kapasiteden kök/progenitör hücreler sorumludur. Glandular epitelyal kök hücreler proliferasyon ve migrasyonla luminal epitel hücrelerini oluştururken, mezenkimal kök hücreler (MKH) ise farklılaşarak stromal hücreleri meydana getirir. MKH'ler ayrıca mezenkimal-epitelyal dönüşüme de uğrayarak luminal epitelin oluşumuna katkıda bulunurlar. Bu kök hücrelerin endometriyumdaki rejenerasyon görevlerinin yanı sıra, embriyo implantasyonu ve plasental gelişim için gerekli olan immünmodulasyon, immüntolerans, steroid hormonlara yanıt ve inflamasyonda rol oynadıkları rapor edilmiştir. Endometriyozis, sıklıkla uterus dışında, reaktif fibrozis ile birlikte disfonksiyonel endometriyal-benzeri bezlerin ve stromanın varlığı ve büyümesini içeren, yaygın, inflamatuvar, iyi huylu (benign), jinekolojik bir hastalıktır. Milyonlarca kadını etkileyen bu hastalık, infertilite ve pelvik ağrının en önemli nedenidir ve üreme çağındaki kadınların yaklaşık %10'ununda, infertil kadınların ise %20-50'sinde görülmektedir. Kadınlar arasında yaygın olarak görülmesine rağmen hastalığın etiyolojisi ve patofizyolojisi tam olarak bilinmemektedir. Son dönemde yapılan çalışmalarla birlikte gelişen hipotezler kök hücrelerin endometriyozis patolojisine yol açtığı yönündedir. Endoplazmik retikulum (ER); sentez, katlanma, modifikasyon, protein trafiği, Ca+2 deposu olmak üzere hücrede hayati fonksiyonları yerine getirmekle yükümlü membrana-bağlı bir organeldir. Fizyolojik ve patolojik şartlar altında katlanmayan proteinler ER'de birikir ve ER homeostazını bozar ve ER stresine neden olur. Hücre ER stresi ile başa çıkabilmek için kendini kurtarma mekanizması olan katlanmamış protein cevabı (UPR) aktive eder. Bu protein homeostazındaki bozulmaların endometriyozis dahil çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynadığı tespit edilmiştir. 
Bu çalışmanın amacı, endometriyozis patogenezinde, endometriyal MKH'lerdeki olası ER stresini araştırmak ve hastalığın altında yatan mekanizmayı aydınlatmaya yönelik bulgular ortaya koymaktır.
Yöntem: Bu amaçla, sağlıklı (kontrol) ve endometriyozisli (ötopik ve ektopik) kadınlardan proliferatif ve sekretuvar evrede örnekler toplanmıştır. In vitro çalışmalarda, bu örneklerden endometriyal MKH'lerin (eMKH) izolasyonu ve flow sitometri ile karakterizasyonu sağlanmış, daha sonra bu hücrelerde ER stres proteinleri proteomiks analiziyle belirlenmiştir. İkinci aşamada bu proteinler western blot ve immunofloresan metod ile; onları kodlayan genler ise RT-qPCR ile analiz edilmiştir. Ayrıca bu hücrelerdeki ER stresi Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) ile ultrastrüktürel olarak incelenmiştir. In vivo çalışmada ise histolojik değerlendirme için H&E boyaması gerçekleştirilmiştir. Bunun yanı sıra endometriyal dokulardaki SUSD2+ eMKH'lerde ER stres belirteçleri immünofloresan yöntemle işaretlenmiş ve konfokal mikroskopta görüntülenmiştir. SPSS programı ile istatistiksel analiz gerçekleştirilmiştir.
Bulgular: Kontrol, ötopik ve ektopik endometriyal doku örneklerinden eMKH'ler başarılı bir şekilde izole edilmiştir. Proteomiks analizi sonucunda kontrol grubuna göre seviyesi anlamlı derecede değişen ER stresi-ilişkili proteinler (DDRGK1, RTN3, ERp44, TMED2, TMEM33, TMX3) ortaya konmuştur. Western blot analizi ve immunofloresan boyama sonuçları protein seviyesinde; RT-qPCR ise gen seviyesinde bu bulguları desteklemiştir. TEM analizleri de endometriyozis gruplarında (ötopik ve ektopik) ER stresinin varlığını ultrastrülktürel olarak göstermiştir. 
Sonuç: Sonuç olarak, endometriyozis patogenezinde, endometriyal MKH'lerdeki ER stresinin varlığı çeşitli moleküler yöntemler kullanılarak ortaya konmuştur. Çalışmamızdan elde edilen bulguların, endometriyozis patolojisinin aydınlatılmasına katkı sağlayarak hastalığın non-invaziv tanısında ve potansiyel tedavisinde etkili olabilecek yolakların tanımlanmasında büyük imkanlar sunacağını düşünmekteyiz. Böylece toplumda giderek artan bir sorun olan infertilitenin önlenmesine yönelik bir yaklaşımın geliştirilmesine olanak sağlanacaktır.

Abstract:
Objective: The human endometrium has a very high regeneration capacity that undergoes approximately 400-500 cycles of proliferation, differentiation, shedding and repair. Stem/progenitor cells are responsible for this capacity. While glandular epithelial stem cells (gEpSCs) form luminal epithelial cells by proliferation and migration, mesenchymal stem cells (MSCs) differentiate and form stromal cells. MSCs also contribute to the formation of the luminal epithelium by undergoing mesenchymal-epithelial transition. In addition to regeneration functions, these stem cells play a role in immunomodulation, immuntolerance, response to steroid hormones and inflammation, which are necessary for embryo implantation and placental development. Endometriosis is a common, inflammatory, benign, gynecological disease involving the presence and growth of dysfunctional endometrial-like glands and stroma with reactive fibrosis and often seen outside of the uterus. This disease affects millions of women and is the most important cause of infertility and pelvic pain, seen in approximately 10% of women of reproductive age and 20-50% of infertile women. Despite prevelance among women, the etiology and pathophysiology of endometriosis remain unknown. Hypotheses developed in line with recent studies indicate that stem cells cause the pathology of endometriosis. The endoplasmic reticulum (ER) is a membrane-bound organelle responsible for performing vital functions in the cell, including synthesis, folding, modification, protein trafficking, and Ca+2 storage. Under physiological and pathological conditions, unfolded proteins will accumulate in the ER and disrupt ER homeostasis, leading to ER stress. To cope with ER stress, cells trigger self- adaptive mechanisms called unfolded protein response (UPR). Disruptions in this protein homeostasis have been found to play a role in the pathogenesis of various diseases, including endometriosis. 
The aim of this study is to investigate the possible ER stress in endometrial MSCs in the pathogenesis of endometriosis and to reveal findings to elucidate the underlying mechanism of the disease.
Method: For this purpose, samples were collected from healthy (control) and women with endometriosis (eutopic and ectopic) in the proliferative and secretory stages. In in vitro studies, endometrial MSCs (eMSCs) were isolated from these samples and characterized by flow cytometry, and then ER stress proteins in these cells were determined by proteomics analysis. In the second step, these proteins were determined by western blot and immunofluorescence method and encoding genes were analyzed by RT-qPCR. Also ER stress in these cells was examined ultrastructurally with TEM. In the in vivo study, H&E staining was performed for histological evaluation. Besides, ER stress markers was detected by immunoflorescense staining in SUSD2+ eMSCs in tissues and screened on confocal microscope. Statistical analysis was performed with the SPSS program.
Results: eMSCs have been successfully isolated from control, eutopic, and ectopic endometrial tissue samples. As a result of proteomics analysis, ER stress-related proteins (DDRGK1, RTN3, ERp44, TMED2, TMEM33, TMX3) whose levels were significantly different compared to the control group were revealed. Western blot analysis and immunofluorescence staining results at protein level; RT-qPCR supported these findings at the gene level. TEM analyzes also showed ultrastructural presence of ER stress in endometriosis groups (eutopic and ectopic).
Conclusions: In conclusion, the presence of ER stress in endometrial MSCs in the pathogenesis of endometriosis has been demonstrated using various molecular methods. We suggest that the findings obtained from our study will contribute to the elucidation of the pathology of endometriosis and provide great opportunities in defining the pathways that may be effective in non-invasive diagnosis and potential treatment of the disease. Thus, it will be possible to develop an approach to prevent infertility, which is an increasing problem in society.