Deselülerize miyokard-elastomer yamaların hazırlanması ve ın vıtro performanslarının incelenmesi
Preparation of decellularized myocardium-elastomer patches and investigation of in vitro performance
Yazar: GÜLÇİN GÜNAL KARATAŞ
Danışman: PROF. DR. HALİL MURAT AYDIN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kalp yetmezliği, miyokard enfarktüsü gibi çoğu kardiyovasküler hastalığın son aşamasıdır. Kemik ve deri gibi diğer dokuların aksine, kalp dokusu kendisini yenileme ve onarma yeteneğinden yoksundur. Bu da enfarktüs geçirmiş hastaların kalp kaslarında geri dönüşü olmayan hücre ölümlerine neden olmaktadır. Son yıllarda kardiyak doku mühendisliği, miyokard doku yamalarının oluşturulmasında umut verici bir terapötik tedavi yöntemi sunar. Miyokard doku mühendisliği kapsamında bu tür durumların rejeneratif çözümüne yönelik kök hücreler ve hücre tabakası teknolojileri, deselülerize edilmiş ve sentetik olarak hazırlanmış kardiyak yamalar yaygın olarak çalışılmaktadır. Kardiyak doku yamalarının hücrelendirilmesi (reselülerizasyonu) ve yenilenmesini sağlamak için mekanik dayanımı yüksek ve immünolojik etkisi bulunmayan doku iskelelerin oluşturulması bu tedavi yöntemi için oldukça önemli bir basamaktır. 
Deselülerizasyon yöntemi ile hazırlanan doku iskelelerinin immünojenik tepkiyi azaltması nedeniyle, bu yöntemle hazırlanan yamaların nakli ve implantasyonu oldukça umut vericidir. Bu tez çalışması kapsamında kalp kası rejenerasyonu için hibrit ve kompozit yapıda kardiyak yamalar hazırlanmış, karakterize edilmiş ve kardiyomiyositler ile statik ve dinamik hücre kültür performansları incelenmiştir. 
Çalışmanın ilk aşamasında sığır kalp dokularından disekte edilen miyokardiyal kesitler kimyasal yöntem ve süperkritik CO2 akışkan yöntemi ile iki farklı şekilde deselülerize edilmiştir. Yapılan deselülerizasyon çalışmaları histoloji boyamaları, biyokimyasal analizler, yapısal analizler, kimyasal analizler, termal analizler ve makro ve nano mekanik analizler ile karakterize edilmiştir. Kimyasal yöntemle deselülerizasyonu ile elde edilen miyokard doku iskeleleri süperkritik CO2 akışkan yöntemi ile elde edilen doku iskeleleriyle kıyaslanmış ve süperkritik CO2 akışkan yönteminin deselülerizasyon etkisinde üstünlüğü ortaya konulmuştur. Tez çalışmasının ikinci aşamasında deselülerize doku iskeleleri poli(gliserol-sebakat) (PGS) polimeri ile katkılanarak hibrit formdaki kardiyak yamalar elde edilmiştir. Elde edilen hibrit kardiyak yamalar kimyasal, termal, morfolojik, mikroskobik ve mekanik olarak analiz edilmiştir. PGS polimerinin deselülerize dokular içerisinde çapraz bağlanabildiği kimyasal, termal ve mikroskobik olarak kanıtlanmıştır. Ayrıca, deselülerizasyon ve liyofilizasyon sonrasında doğal miyokard dokusunun zayıflayan mekanik özellikleri, hibrit formların eldesi ile iyileştirilmiştir. Bir sonraki aşamada deselülerize doku iskeleleri poli(gliserol-sebakat) (PGS) polimeri ve karbon nanotüp geometrileriyle katkılanarak kompozit formdaki kardiyak yamalar elde edilmiştir. Elde edilen kompozit kardiyak yamaların kimyasal ve mekanik analizleri yapılmış, mikroskop ve tomografi görüntüleri alınmış ve iletkenlik ölçümleri gerçekleştirilmiştir. PGS polimerinin karbon nanotüp katkısıyla beraber deselülerize dokular içerisinde çapraz bağlanabildiği kimyasal ve mikroskobik olarak gösterilmiştir. Tomografi analizleri ile karbon nanotüplerin yapı içerisinde homojen bir şekilde dağıldığı gösterilmiştir. Mekanik özelliklerin iyileştirilmesine ek olarak kompozit kardiyak yamaların hibrit kardiyak yamalara kıyasla iletken özellikte olduğu bildirilmiştir. 
Son olarak elde edilen tüm kardiyak yamalar insan kardiyomiyosit hücreleri ile tekrar hücrelendirilmiş; statik ve dinamik olarak in vitro kültürleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen kardiyak yamaların sitotoksisite analizleri yapılmış, kardiyomiyosit hücrelerinin kardiyak yamalarla etkileşimi sonrasında hücre metabolik aktiviteleri, hücre canlılıkları, hücre davranışları, GAG sekresyonları ve gen ekspresyonları incelenmiştir. Statik olarak incelenen kültür sonuçları, mekanik stimülasyona maruz bırakılan iskelelerin kültür sonuçları ile kıyaslanmıştır. Dinamik kültür koşullarının, statik koşullara göre hücre davranışları üzerindeki olumlu etkileri bildirilmiştir.

Abstract:
Heart failure is the final stage of most cardiovascular diseases, such as myocardial infarction. Unlike other tissues such as bone and skin, heart tissue does not have the ability to regenerate and repair itself. This causes irreversible cell death in the heart muscles of infarcted patients. In recent years, cardiac tissue engineering offers a promising therapeutic treatment for regeneration of myocardial tissue patches. Within the scope of myocardial tissue engineering, stem cells, cell sheet technologies, decellularized and synthetic cardiac patches are widely investigated. The synthesis of scaffolds within high mechanical strength and have no immune effects is critical for this treatment method to provide recellularization and regeneration of cardiac tissue patches.
Within the scope of this thesis studies, hybrid and composite cardiac patches were prepared and characterized for cardiac muscle regeneration and static and dynamic cell culture performances with human cardiomyocytes were examined. 
In the first stage of the study, myocardial sections dissected from bovine heart tissues were decellularized in two different methods by chemically and supercritical CO2 fluid system. Decellularization process was characterized via histological stainings, biochemical analysis, structural analysis, chemical analysis, thermal analysis and macro and nano mechanical analysis. Myocardial tissue scaffolds obtained by chemical decellularization were compared with the tissue scaffolds obtained by the supercritical CO2 fluid method, and the advantage of the supercritical CO2 fluid method in the decellularization effect was demonstrated. In the second stage of the thesis, decellularized tissue scaffolds were reinforced with poly(glycerol-sebacate) (PGS) polymer to obtain cardiac patches in hybrid form. The hybrid cardiac patches were analyzed chemically, thermally, morphologically, microscopically and mechanically. It has been proven that the PGS polymer can be crosslinked within decellularized tissues by chemically, thermally and microscopically. In addition, the weakened mechanical properties of native myocardial tissue after decellularization and lyophilization were improved by hybrid forms. In the next step, cardiac patches in composite form were synthesized by doping with poly(glycerol-sebacate) (PGS) polymer and carbon nanotube geometries in to decellularized scaffolds. Composite cardiac patches were characterized by chemically and mechanically and microscope and tomography images were taken, and conductivity measurements were performed. It has been demonstrated by chemically and microscopically that PGS polymer can be crosslinked within decellularized tissues with the addition of carbon nanotubes. Through tomography analysis, it has been shown that carbon nanotubes are homogeneously dispersed within the structure. In addition to improved mechanical properties, composite cardiac patches have been reported to be conductive compared to hybrid cardiac patches.
Finally, all cardiac patches were recellularized with human cardiomyocyte cells; static and dynamic in vitro cultures studies were performed. Cytotoxicity analyzes of the obtained cardiac patches were performed, and after seeding of cardiomyocyte cells on cardiac patches, cell metabolic activities, cell viability, cell behavior, GAG secretions and gene expressions were examined. The results of static culture conditions were compared with the dynamic culture which scaffolds exposed to mechanical stimulation. The positive effects of dynamic culture conditions on cell behavior compared to static conditions have been reported.