İn vitro koşullarda uyarılmış pluripotent kök hücrelerden endotelyal öncül ve düz kas hücrelerinin farklılaştırılması
İn vitro differentiation of induced pluripotent stem cells to endothelial progenitor and smooth muscle cells
Yazar: MOHAMMADREZA DASTOURI
Danışman: PROF. DR. AHMET RÜÇHAN AKAR
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology

Özet:
Endotelyal öncül hücreler, kemik iliğinden köken alarak kana geçen ve yüksek derecede farklılaşma potansiyeline sahip olan kök hücrelerden oluşmaktadır. Bu hücreler anjiyogenezde, tümör büyümesinde rol oynamaktadır. Çeşitli sitokinler, büyüme faktörleri ve hormonların etkisi ile harekete geçerek, yerleştiği bölgelerde kan damarı oluşumunu sağlarlar. Bu hücrelerin hasar görmüş dokuların onarımında rol oynadıkları bilinmektedir. Endotel progenitör hücreler miyokard infarktüs gibi kalp ve damar hastalıkları sonrasında harekete geçerek, kalp krizinden zarar gören kan damarlarının onarımını sağlarlar. Bu hücreler anjiyogenezis ve vaskülogenez de büyük bir rol oynamaktadırlar. Endotelyal progenitör hücreleri farklı kaynaklardan elde edilmesi ve bu hücreleri rejeneratif tıp alanında kullanması birçok bilim insanının ilgisini çekmiştir. Embriyonik kök hücrelerden endotelyal progenitör hücre elde etmek son yılların önemli projelerinde yer almıştır. 2006 yılında Yamanaka ve arkadaşları tarafından bilim dünyasına sunulan uyarılmış pluripotent kök hücreler, rejeneratif tıp ve kök hücre biyolojisinde yeni bakış açısı yaratmıştır. Bu hücreler avantajlarından dolayı birçok araştırmacı tarafından farklı amaçlarla araştırılmıştır.
Bu tezde, son dönemde geliştirilen uyarılmış pluripotent kök (uPK) hücreler kullanılarak ilk aşamada, Flk1+ öncül hücreler elde edildi. Çalışmamızda bu hücrelerin izolasyonu için en uygun zamanı (5.5. gün) belirlemek amacıyla 10 farklı genin ifade seviyeleri değerlendirildi. İkinci aşamada, izole edilen hücreler iki farklı hücre gurubuna yani endotelyal öncül hücrelere (CD31+, AC133+) ve düz kas hücrelerine (αSMA+) farklılaştırıldı. Buna ek olarak elde edilen EÖH'lerin Arteryal ve venöz endotel hücrelere farklılaşma potansiyeli ve bu hücrelerin belirteçleri olan EphrinB2 ve VCAM genlerinin ifade seviyelerinin artışı ile değerlendirildi. Farklılaştırma süreçinde elde edilen hücrelerin karakterizasyonu için gen ifade analizleri 11 farklı gen ifadesi ile değerlendirildi. Elde edilen sonuçların validasyonu için protein ifade analaizleri farklılaştırmanın her aşamasından western blot analizi yapıldı. Bu projede damar oluşumunda (anjiogenezis ve revaskülarizasyon) önemli rol oynayan iki hücre grubu in vitro koşullarda üretildi ve bu hücrelerin endotelyal ve düz kas hücrelerine dönüştükleri günümüzün gelişmiş teknolojik metotlarıyla başarıyla üretilip karakterize edildi.

Abstract:
Endothelial progenitor cells (EPC) are bone marrow-derived stem cells that circulate in the blood with high differentiation potential. These cells are important in tumor growth and angiogenesis. Various cytokines, growth factors, and hormones cause hematopoietic cells, and by association endothelial progenitor cells, to be mobilized into the peripheral circulation, ultimately homing to regions of blood vessel formation. These cells are known to play a role in the repair of damaged tissues. After cardiovascular diseases such as myocardial infarction, endothelial progenitor cells mobilized and provide to repair of damaged blood vessels. These cells play a key role in angiogenesis and vasculogenesis. Obtained endothelial progenitor cells from different sources and use in filed regenerative medicine studied by many scientists. To achieve endothelial progenitor cells from embryonic stem cells has been involved in major projects in recent years. In 2006 Yamanaka and colleagues presented induced pluripotent stem cells (iPSc) to the scientific world and has created a new perspective in regenerative medicine and stem cell biology. Some advantages of these cells encouraged many scientists to use of these cells in their researches.
In this study, in the first stage we differentiated iPS cells to Flk-1+ progenitor cells. In the next stage, we were able to differentiate Flk-1+ cells to two different cell types (CD31+, AC133+ endothelial progenitor cells, and αSMA+ smooth muscle cells) successfully. We concluded that optimal time for harvesting Flk-1+ cells on by MACS was is day 5.5 of initial differentiation. Following isolation of Flk-1+ progenitor cells, they were further matured into CD31+/CD133+ cells and smooth muscle cells (SMA+) within 4 days of induction. In addition, we evaluated differentiation potential of these EPCs to the arterial and venous endothelial cells by the increase in ephrin B2 and VCAM gene expression levels as a marker of arterial and venous markers. We characterized two different cell types that have an important role in angiogenesis and revascularization with high technology methods and validation with immunostaining, qRT-PCR and MACS methods. In conclusion, we showed that early EPC cells could be successfully derived from mouse fibroblast-driven iPS cells. We suggest that those iPS cell-derived EPC cells may be used in the treatment of heart failure, ischemic heart disease, and critical limb ischemia by remodeling the blood vessels and could be considered for an in vivo model for the translational research.