Sularda hepatit A ve E virusları varlığının real time RT-PCR ile araştırılması ve saptanan viruslarda hedef genin dizi analizi
A study of hepatitis A and E viruses with the real-time RT-PCR in waters and detected virus's targeted gene sequencing.
Yazar: EMİNE DERYA ÜRSE
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN YILMAZ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Genler = Genes ; Hepatit A virüsü = Hepatitis A virus ; Hepatit E virüsü = Hepatitis E virus ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Su = Water ; İçme suyu = Drinking water

Özet:
Hepatit A (HAV) ve E virusları (HEV) ülkelerdeki hijyen ve sanitasyon uygulamalarına bağlı olmak üzere gıdalar, su ve insanlarda değişen oranlarda rapor edilmiştir. Hepatit E virusunun son yıllarda özellikle domuz, geyik ve bu hayvanların ürünleri vasıtasıyla bulaştığının gösterilmiş olması zoonotik açıdan dikkat çekilmesi gereken bir durumdur. Hepatit A ve E virusu infeksiyonları ülkemiz dahil hala bazı ülkelerde sorun olmaya devam etmektedir. HAV ve HEV'u ile kontamine gıdalar (özellikle çiğ tüketilen) ve sular başlıca bulaşma yoludur. Ülkemizde hepatit A ve E viruslarının gıda, su ve hayvanlarda (Hepatit E)  bulaşma sıklığı ile ilgili bir veri yoktur. Halkımızın kontamine gıda ve sular yoluyla bu viruslara ne kadar maruz kaldığı belirsizdir. Bu virusların yayılması, bulaşması ve sulardaki sıklığı hakkında gerçek bir veri henüz belirlenememiştir. Keza su orijinli hepatit A ve E viruslarının dizi ve soy ağacı ile ilgili veri de bulunmamaktadır.  
Bu çalışmada, deniz suyu, doğal kaynak suları (doğal kaynak çeşme suyu ve artezyen kuyu) ve ticari içme sularında hepatit A ve E viruslarının moleküler yöntemle saptanması, suların bu virusları bulaştırmada ve yayılmasındaki rolünün araştırılması ve sularda saptanan hepatit A ve E viruslarının dizi analizi verilerine dayanarak soy ağacının oluşturulması amaçlandı.
Deniz suyu için İstanbul'da denize girilen semtlerden 20 örnek, 50 adet doğal kaynak  suyu, 50 adet farklı marka damacana suyu, 10 farklı markanın 10 farklı partisine ait pet şişe su örneği filtrasyon ve takiben real time RT-PCR yöntemi kullanılarak incelendi. 
Yapılan analizler sonucunda real time PCR ile sadece 1 doğal kaynak çeşme suyu örneğinde HAV-RNA saptandı. Real time RT-PCR ile HAV-RNA saptanan doğal kaynak çeşme suyu ile sekans amacıyla farklı primerlerle yapılan RT-PCR'da herhangi bir ürün saptanmadı. HAV-RNA pozitif doğal kaynak çeşme suyu ile real-time RT-PCR sonucu elde edilen 117 bp büyüklüğündeki ürünün sekans ve filogenetik analizleri sonucuna göre doğal kaynak çeşme suyunda saptanan HAV'unun HAV genotip-IB olduğu bulundu. Buna karşın incelenen hiç bir su örneğinde HEV-RNA saptanmadı. 
Sonuç olarak, sularda virus yükü düşük olduğu için virusların saptanmasında moleküler testlerden real time RT-PCR'ın kullanılmasında yarar vardır. Bu çalışmada doğal kaynak çeşme suyunda HAV-RNA saptanmış olması suların viral kontaminasyon sonucu halk sağlığını tehdit edebileceğini göstermektedir. Çalışmada saptanan HAV genotip-IB daha önce ülkemizde saptanan HAV genotipine benzer bulunmuştur

Anahtar Kelimeler: Hepatit A, Hepatit E, Virus, Su, Real-Time RT-PCR, Sekans,
Filogenetik

Abstract:
Hepatitis A (HAV) and E virus (HEV) were reported in food, water and humans in varying proportions depending on the hygiene and sanitation practices in the countries. It has been shown that in recent years hepatitis E virus transmitted by especially pigs, deer, and products of these animals is a situation that needs special attention from a zoonotic perspective. Hepatitis A and E virus infections still continue to be a problem in some countries including Turkey. HAV and HEV contaminated foods (especially when consumed raw) and water are the main transmission routes. There are no frequency-related data available for hepatitis A and E viruses infected food, water, and animals (hepatitis E) in Turkey. It is unclear how often our people are exposed to the virus through contaminated food and water. The spread of these viruses, contamination and the frequency in waters has not yet been determined as a real figure. Likewise, the number of hepatitis A and E viruses and phylogeny of water-related viruses are not available.
In this study, detection of hepatitis A and E viruses with molecular methods in sea water, ground water (tap water) and drinking water, the transmission of these viruses in the water and its role in the spread and based on sequence analysis of hepatitis A and E viruses and creation of phylogenetic tree from determined data has been planned.
Twenty samples of sea water collected sea side districts of Istanbul, 50 samples of underground water, 50 different brands of bottled water, 10 different brands' bottled water samples belonging to 10 different batches were examined using filtration, followed by real time RT-PCR method.
As a result of the analyses by real time PCR, HAV-RNA was detected in only 1 tap water sample. Real time RT-PCR HAV-RNA sequences in order to determine the tap water made with different primers in RT-PCR were not found in any other product. HAV-RNA positive tap water with the real-time RT-PCR according to the results obtained from 117 bp in the product sequence and phylogenetic analysis of RNA detected in tap water was HAV genotype IB.  However HEV-RNA were not detected in any of the samples analysed in this study.  
In conclusion,  because the virus load in the water is low for detection, it is useful to use real time RT-PCR as molecular test for water samples. Detection of HAV-RNA in the tap water as the results of this study indicates that viral contamination of water may threaten public health. HAV genotype IB detected in this study was similar to those previously detected HAV genotypes in Turkey.

Key words: Hepatitis A, Hepatitis E, Virus, Water, Real-Time RT-PCR, Sequences, Phylogeneti