Termofilik Geobacillus sp. TF17 suşundan esteraz saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of esterase from a thermophilic bacterium, Geobacillus sp. TF17
Yazar: ÇİĞDEM AYNA
Danışman: PROF. DR. AHMET ÇOLAK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Esterazlar = Esterases ; Karakterizasyon = Characterization ; Saflaştırma = Purification ; İyon değişim kromotografisi = Ion exchange chromatography

Özet:
Gerçekleştirilen bu çalışmada, termofilik bir bakteri olan Geobacillus sp. TF17 suşundan esteraz enzimi iyon değişim kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı ve karakterize edildi. Saf enzim eluatında esteraz varlığı doğal PAGE ile tek bir bant halinde ortaya konuldu. pNPB substratı varlığında, enzimin optimum pH'sı 7,5, optimum sıcaklığı ise, 50 °C olarak belirlendi. Saf enzimin, 4 °C'de pH 4,0-9,0 aralığında 72 saatlik inkübasyon süresi sonunda optimum pH değerindeki aktivitesini tamamen koruduğu gözlendi. Saf enzimin 30-80 °C arasındaki sıcaklıklarda yapılan kararlılık denemelerinde enzimin 70 ve 80 °C'de 4. saat sonunda aktivitesini tamamen kaybettiği, buna karşılık 30, 40 ve optimum sıcaklığı olan 50 °C'de aktivitesini 3. günün sonunda %100 oranında koruduğu tespit edildi. Yapılan kinetik çalışmalar sonucunda, pNPB substratı varlığında hesaplanan Km ve Vmaks değerleri sırasıyla 0,056 mM ve 19,38 U/mg protein olarak belirlendi. Bazı genel organik çözücüler varlığında enzim aktivitesinin davranışları ortaya konulmuş olup, denenen organik çözücülerden izopropanol ve asetonitrilin enzim aktivitesinin %60'dan fazlasını inhibe ettiği görüldü. Ayrıca bazı metal iyonlarının enzim aktivitesini farklı oranlarda etkilediği tespit edildi. Sonuç olarak, Geobacillus sp. TF17 esterazının oldukça pH ve ısıl kararlı olduğu gözlemlenmiş ve ayrıca Km değeri açısından literatürde bilinen esterazlardan bazı üstün özelliklere sahip olduğu, Vmaks değerinin ise literatürle uyumlu olduğu ortaya konmuştur. Elde edilen veriler dikkate alındığında enzimin endüstriyel uygulamalarda kullanılabilecek bir potansiyele sahip olduğu görülmektedir.

Abstract:
In this study, an esterase was purified from a thermophilic bacterium, Geobacillus sp. TF17, by using a Q-Sepharose ion exchange column and characterized. The purified enzyme was observed as a single band on native polyacrylamide gel electrophoresis. In the presence of pNPB as a substrate, the optimum temperature and pH of the enzyme were found to be 7.5 and 50 °C, respectively. The purified enzyme was extremely stable, in the range of pH 4.0-9.0, in the optimum pH value after 72 hour incubation at 4°C. When the thermal stability profile of the purified enzyme was analyzed, it was determined that the enzyme was extremely stable in the range of 30-50 °C after 72 h incubation. The Km and Vmax values of the purified enzyme were calculated as 0.056 mM and 19,38 U/mg protein, respectively, from the Lineweaver-Burk plot. The enzyme was inhibited more than about 60% of activity in the presence of some organic solvents such as isopropanol and acetonitrile. Additionally, it was detected that some metal ions affect the enzyme activity at different rates. As a result, Geobacillus sp. TF17 esterase had good pH and thermal stability. In addition this esterase has superior features than known in the literature in terms of Km, the Vmax values were shown to be compatible with the literature. Considering data obtained from this study, purified esterase has advantages for industrial or biotechnological applications in terms of especially its high thermal- and pH-stability.