GW8510 farmakolojik inhibitörünün ın vitro pankreas kanseri modeli üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of GW8510  pharmacological inhibitor on in vitro pancreatic cancer model
Yazar: DUYGU GENÇALP
Danışman: PROF. DR. HANDAN AK
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Gemsitabin = Gemcitabine ; Gen ifadesi = Gene expression ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre kültürü = Cell culture ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms ; Ribonükleotidler = Ribonucleotides

Özet:
Pankreas kanseri yüksek insidans ve kötü prognoz ile karakterize bir hastalıktır. Pankreas kanseri hastalarının birçoğu, hastalığın ileri evrelerine kadar asemptomik olarak kalabilmektedirler. Güncel koşullarda hastalığın etkin bir tedavisi bulunmamakta ve tedavi edilebilen hastalarda bile hayatta kalma süresinin çok kısa olduğu bilinmektedir. Yaşam süresinin bu denli kısa olduğu bilinen pankreas kanseri hastalığını tedavi etmeye yönelik yeni stratejilerin geliştirilmesinin önemli ve gerekli olduğu görülmektedir.
Bu tez kapsamında yapılan ön çalışmada TCGA (The Cancer Genome Atlas- Kanser Genom Atlası) veri bankasında bulunan 176 pankreas kanseri hastasından alınan doku örneklerinden elde edilen tüm genom gen ekspresyon mikroarray verileri ve hastaların klinik bulguları değerlendirilmiştir.  Bu değerlendirme sonucunda Ribonükleotid Redüktaz Alt ünite M2 proteinini kodlayan RRM2 geninin pankreas kanseri hastalarında yüksek oranda eksprese olduğunu ve bu yüksek ekspresyonun hastalarda düşük yaşam oranı ve kötü prognoz ile ilişkisinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu tespit edilmiştir (p= 1.62e-4). Kötü prognoz ve yüksek mortalite ile ilişkili bulunan RRM2'ye yönelik literatürde yapılan inhibitör araştırması GW8510'un RRM2 üzerinde inhibitör etkili olduğu fakat bu etkiye yönelik pankreas kanserinde hiçbir araştırma bulunmaması sebebiyle GW8510'un pankreas kanserindeki terapötik etkinliğini araştırmaya yönelik olarak bu tez projesi tasarlanmıştır.
Bu amaçla, pankreas kanseri tedavisinde sıklıkla kullanılan Gemsitabin ile GW8510'in sinerjik etkinliği araştırılmıştır.  Hücre canlılığı analizi WST-8 metodu ile gerçekleştirilmiş, ardından kullanılan iki kimyasal ajanın sinerjitik etki gösterdiği dozlar CompuSyn kombinasyon analiz programı ile belirlenmiştir. Apoptoz ve hücre döngüsü deneyleri akış sitometri yöntemi kullanılarak, laboratuvar ortamında oluşturulan yara iyileşme modelinin analizi ise Image-J programı ile gerçekleştirilmiştir. GW8510 ajanının RRM2 protein seviyeleri üzerine olan etkisi ise ELISA yöntemi ile belirlenmiştir.
Elde ettiğimiz sonuçlar, 10 µM dozda GW8510 uygulanan PANC-1 hücrelerinde % 34 oranında hücre canlılığının inhibe olduğu göstermiştir. Kombinasyon analizi ile 10 µM GW8510 : 10 µM Gemcitabin kombinasyonunun sinerjistik etkileşim gösterdiği belirlenmiştir. Bu kombinasyon dozunun % 89.9 oranında hücrelerin migrasyonunu inhibe ettiği tespit edilmiştir. Bu tez ile GW8510 ajanının PANC-1 pankreatik karsinom hücrelerinde RRM2 protein seviyeleri üzerindeki inhibitör etkisi ilk kez gösterilmiştir.
GW8510 'un RRM2 geninin inhibisyonu aracılığıyla pankreas kanseri tedavisindeki kullanım potansiyeli umut vericidir. GW8510'un pankreatik karsinom hücreleri üzerine olan sitotoksik etkinliğinde farklı metabolik yolakların olası rolünün aydınlatılması için ileri çalışmalara ihtiyaç bulunmaktadır.

Abstract:
Pancreatic cancer is a disease characterized by high incidence and poor prognosis. Many patients with pancreatic cancer remain asymptomatic until the later stages of the disease. Currently, there is no effective treatment of the disease and it is known that survival time is very short even in patients who can be treated. It is seen that the development of new strategies to treat pancreatic cancer disease, is important and necessary.
In this study, all genome gene expression microarray datas obtained from tissue samples taken from 176 pancreatic cancer patients in TCGA (The Cancer Genome Atlas) database and clinical findings of patients were evaluated. As a result of this evaluation, we showed that RRM2 gene which encodes the Ribonucleotide Reductase subunit  M2 protein is highly expressed in patients with pancreatic cancer and it is statistically significant that this high expression correlates with low survival rate and poor prognosis in patients (p= 1.62e-4). 
In the literature review on inhibitors of RRM2, GW8510 has been found to have an inhibitory effect on RRM2 which is associated with poor prognosis and high mortality. This study was designed to investigate the therapeutic efficacy of GW8510 in pancreatic cancer since GW8510 molecule-mediated RRM2 inhibition, has not previously been shown in PANC-1 pancreatic cancer cells in the current literature.
Cell viability analysis was performed by WST-8 method, and dosages in which two chemical agents show synergistic effects used in this study were determined by the CompuSyn combination analysis program. Apoptosis and cell cycle assays were performed using flow cytometry. The effect of GW8510 on the RRM2 protein levels was determined using the ELISA method. 

It was observed that the cell viability was inhibited 34 % in PANC-1 cells treated with 10 µM GW8510. When combination analysis was performed, it was determined that the combination of 10 µM GW8510 : 10 µM Gemcitabin showed synergistic interaction. t was found that this combination dose inhibited the migration of cells by 89.9%. In addition, the inhibitory effect of GW8510 agent on RRM2 protein levels in PANC-1 cells was shown for the first time with this thesis.
The potential use of GW8510 in the treatment of pancreatic cancer through the inhibition of the RRM2 gene is promising. Further studies are needed to clarify the possible role of different metabolic pathways in the cytotoxic activity of GW8510 on pancreatic carcinoma cells.