Desellülarize sinir grefti ile periferik sinir defektlerinin onarımında wharton jeli kaynaklı mezenkimal kök hücre, condıtıoned medıum ve cerrahi anjiyogenezin sinir rejenerasyonu üzerindeki etkinliğinin araştırılması: Deneysel çalışma
Investigation of the effects of wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells, conditioned medium, and surgical angiogenesis on nerve regeneration in peripheral nerve defects using decellularized nerve grafts: An experimental study
Yazar: OĞUZ EKER
Danışman: PROF. DR. ZEKERİYA TOSUN
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery

Özet:
Giriş
Periferik sinir defektleri duyusal ve motor fonksiyon kaybına yol açan, klinik pratikte sık karşılaşılan önemli bir sorundur. Otogreftler kritik boyuttaki defektlerin onarımında altın standart olarak görülmekle birlikte duyu kaybı, nöroma, ağrı ve skar gibi donör alan problemlerine ve uzamış operasyon süresine neden olabilmektedir (4). Literatürde otogreftlere alternatif olabilecek asellüler sinir allogreftleri (ASG) tanımlanmış olsa da ASG ile fonksiyonel kazanımlarda henüz istenilen düzeye ulaşılamamış olması araştırmacıları ek arayışlara yönlendirmiştir.
Bu çalışmanın amacı, periferik sinir defektlerinin ASG ile onarımlarında daha iyi fonksiyonel rejenerasyon sağlayabilmek için Wharton Jeli kaynaklı mezenkimal kök hücre (WJ-MKH), Conditioned medium (CM) ve cerrahi anjiyogenezin (CA) etkinliğinin değerlendirilmesidir. 
Gereç ve Yöntem
A.	Çalışma Planı
Etik kurul onayını takiben 56 adet, 7-12 haftalık, 250-350 gr Wistar Albino cinsi erkek rat çalışmaya dahil edildi. Her grupta 8 rat olacak şekilde rastgele 7 gruba ayrıldı. Tüm ratların sol arka ekstremitesinde, literatürde tanımlanan kritik boyutta 10 mm'lik siyatik sinir defekt modeli oluşturuldu. 
Grup 1: Kontrol grubu, Otogreftle onarım
Grup 2: ASG
Grup 3: ASG + WJ-MKH
Grup 4: ASG + CM
Grup 5: ASG + CA
Grup 6: ASG + WJ-MKH + CA
Grup 7: ASG + CM + CA
B.	Allogreftlerin Eldesi ve Desellülarizasyonu
24 adet, 7-12 haftalık, 250-350 gr Sprague Dawley rattan bilateral 10 mm'lik siyatik sinir grefti alındı. Greftlerin desellülarizasyonunda  'Noniyonik deterjan + Anyonik deterjan' prosedürü uygulandı. 
C.	WJ-MKH ve CM Hazırlanması ve Ön Koşullama
WJ-MKH'lere, serum aracılı kök hücre aktivasyonu tekniğine uygun olarak ön koşullandırma yapıldı ve kültüre edildi. Hücrelerin karakterizasyonu, farklılaşma potansiyeli ve hücre sayımı flow sitometrik olarak incelenerek validasyon yapıldı. Kültür sıvılarından CM elde edildi. WJ-MKH ve CM'nin ASG'ye ekimi, fibrin damla yöntemiyle gerçekleştirildi. WJ-MKH ve CM içeren gruplarda, her bir ASG için 1x106 WJ-MKH ve bunlardan üretilmiş CM uygulandı.
D.	Cerrahi Teknik
Tüm gruplarda, mikroskop altında gluteal kas ve biceps femoris kası arasındaki intermusküler oluktan insizyon yapıldı. Künt diseksiyonla siyatik sinir açığa çıkarıldı. 10 mm'lik sinir defekti oluşturuldu. Çıkarılan sinir grefti, Grup 1'de otogreft olarak uygulandı. Diğer tüm gruplarda ASG ile defekt onarımı yapıldı. 
Grup 5, Grup 6 ve Grup 7'de (CA eklenen gruplar) Süperfisyal İnferior Epigastrik Arter Adipofasyal Flebi, literatürde tarif edildiği şekilde ventral abdomen bölgesinden kaldırılıp cilt altı tünelden geçirilerek siyatik sinir onarım bölgesine pediküllü olarak taşındı ve ASG etrafına sarıldı. Flebin viabilitesinin gösterilmesi amacıyla, lazer yardımlı ICG anjiyografisi (SPY Elite, Novadaq Technologies, USA) yapıldı ve flep dolaşımı teyit edildi. 
E.	Değerlendirme 
3, 6 ve 9. haftalarda Video Yardımlı Yürüme Analizi (VYYA), Siyatik Fonksiyonel İndeks (SFİ) ve Pin-prick Testi yapıldı. 
Bunlara ek olarak 9. haftada Elektrofizyolojik Değerlendirme (EMG), Histopatolojik ve İmmünhistokimyasal Analiz, Tibialis Anterior Kası Ağırlık ve Hacim Ölçümü yapıldı.
F.	İstatistik
Veriler SPSS 26.0 ile normal dağılım testine tabi tutuldu, parametrik veriler One-way ANOVA ve nonparametrik veriler Kruskal-Wallis testi kullanılarak değerlendirildi. p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Bulgular
1.	Fonksiyonel Değerlendirme Bulguları 
Motor fonksiyonun değerlendirilmesinde kullanılan 9. hafta SFİ ve VYYA testlerinde, yalnızca ASG uygulanan grup, otogreft grubundan anlamlı şekilde düşük bulunurken (p<0.05), ASG'ye ek olarak WJ-MKH, CM, WJ-MKH+CA ve CM+CA uygulanan gruplarda otogreft grubu kadar üstün motor fonksiyonel sonuçlar elde edildi.
Duyu fonksiyonunun değerlendirilmesinde kullanılan 6. hafta pin-prick testinde, yalnızca ASG uygulanan grup, otogreft grubundan anlamlı şekilde düşük bulunurken (p<0.05), ASG'ye ek olarak WJ-MKH, CA, WJ-MKH+CA ve CM+CA uygulanan gruplarda otogreft grubu kadar üstün duyusal fonksiyonel sonuçlara ulaşıldı.
Elektrofizyolojik değerlendirme ile kas ağırlık ve hacim indeksi değerlendirmesinde gruplar arasında fark oluşmadı (p>0.05).

2.	Histopatolojik ve İmmünhistokimyasal Bulgular
Organize akson rejenerasyonu, beklendiği şekilde otogreft grubunda diğer tüm gruplardan anlamlı olarak yüksekti (p<0.05). WJ-MKH ve CA uygulanan tüm gruplarda, yalnızca ASG uygulanan gruba göre daha iyi organize akson rejenerasyonu elde edildi (p<0.05).
ASG'ye ek olarak WJ-MKH, CA ve CM+CA uygulaması yapılan gruplarda otogreft grubundaki kadar üstün vaskülarizasyon elde edildi (p>0.05). Yalnızca ASG uygulanan grup, otogreft grubundan vaskülarizasyon açısından belirgin olarak düşük bulundu (p<0.05). 
Tartışma
Plastik cerrahi klinik pratiğinde, kritik boyuttaki sinir defektlerinin onarımında ASG kullanımı umut vadetmekte, ancak otogrefte benzer ideal fonksiyonel sonuç arayışları devam etmektedir. Fonksiyonel sonuçlardaki yetersizliklerin, ASG'nin revaskülarize olmasına kadar geçen sürede, greftin santralinde gelişen nekroz ve fibrozisin akson rejenerasyonunu engellemesine bağlı olduğu düşünülmektedir.  
Bu çalışmada, yalnızca ASG kullanımı ile giderilemeyen bu olumsuzluklar için, vaskülarizasyonu arttırdığı bilinen WJ-MKH, CM ve CA'nın fonksiyonel kazanımlara olan etkisi araştırılmıştır. 
CA'nın ASG'nin etrafında vaskülarizasyonu arttırdığı literatürde gösterilmiştir. Skarlı  ve avasküler yara yataklarında ve kritik boyuttaki sinir defektlerinde gözlenen zorlu sinir rejenerasyonunun, sinir mikroçevresindeki lokal kan akımı artışı ile üstesinden gelinebileceği düşünülmektir. Çalışmamızda, CA uygulamanın, CA'ya ek olarak CM uygulamanın ve WJ-MKH uygulamanın vaskülarizasyon ve organize akson rejenerasyonu skorlamasında belirgin artış sağladığı gösterilmiştir. Aynı gruplardaki 6. ve 9. haftalarda duyusal ve motor fonksiyonel iyileşme parametrelerinin otogreft grubundaki kadar üstün olmasının, yüksek miktarda vaskülarizasyon ve akson rejenerasyonuna bağlı olduğu düşünülmüştür.
MKH'ler, CM olarak adlandırılan içerisinde sitokinler, büyüme faktörleri, egzozomlar ve mikroveziküller barındıran biyoaktif faktörler salgılar. Düşük immünojenitesi, geniş güvenlik ve doz aralığı, uzun süre depolanabilmesi CM'nin temel avantajlarıdır. Literatürde CA ile CM uygulamasının bir arada kullanıldığı çalışma bulunmamakta olup çalışmamızda bu kombinasyonun etkisi araştırılmıştır. CM tek başına kullanıldığında vaskülarizasyon ve organize akson rejenerasyonu açısından anlamlı artış sağlayamazken, CA ile birlikte kullanıldığında her iki parametrede de anlamlı artış gözlenmiştir. CM ve CA'nın aynı anda uygulanmasının yalnızca CM ya da yalnızca CA uygulamasının aksine hem duyu hem de motor fonksiyon açısından otogreftle benzer sonuçlar sunması, CM ve CA'nın sinerjistik etkisine bağlanmıştır. 
İyi bir fonksiyonel kazanım sağlanması için sinir grefti içerisinde yeterli düzeyde akson rejenerasyonu olması gereklidir. Çalışmamızda, ASG'nin WJ-MKH+CA ile birlikte uygulandığı grupta, otogreft grubunda olduğu kadar üstün akson rejenerasyonu sağlanmıştır. WJ-MKH ve CA birlikte uygulandığında, ayrı ayrı uygulanmalarının aksine, VYYA'da otogreft grubu kadar üstün motor fonksiyonel sonuçlar elde edilmiş, bu durum WJ-MKH ve CA'nın sinerjistik etki göstermelerine bağlanmıştır.
Sonuç
WJ-MKH ve CM, kritik boyuttaki sinir defektlerinde CA ile birlikte uygulanmasının fonksiyonel sonuçları belirgin şekilde arttırdığı ve otogrefte benzer sonuçlar elde edildiği, bu kombinasyonun kanlanması zayıf, skarlı alıcı alanlarda ASG uygulamasında klinik pratiğe uyarlanabilecek etkin ve güvenilir bir rekonstrüksiyon seçeneği olabileceği gösterilmiştir.

Abstract:
Introduction
Peripheral nerve defects are a significant issue encountered frequently in clinical practice, leading to sensory and motor function loss. While autografts are considered the gold standard for repairing critical-sized defects, they can cause donor site complications such as sensory loss, neuroma, pain, and scarring, as well as prolonged operation times. Although acellular nerve allografts (ANA) have been described as potential alternatives to autografts in the literature, their functional outcomes have not yet reached the desired level, prompting further research.
This study aims to evaluate the effectiveness of Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ-MSC), conditioned medium (CM), and surgical angiogenesis (SA) in achieving better functional regeneration in the repair of peripheral nerve defects using ANA.
Materials and Methods
A. Study Design
Following ethical committee approval, 56 male Wistar Albino rats, aged 7-12 weeks and weighing 250-350 grams, were included in the study. They were randomly divided into 7 groups, each containing 8 rats. A 10 mm critical-sized sciatic nerve defect model, as described in the literature, was created on the left hind limb of all rats.
Group 1: Control group, repaired with autograft
Group 2: ANA
Group 3: ANA + WJ-MSC
Group 4: ANA + CM
Group 5: ANA + SA
Group 6: ANA + WJ-MSC + SA
Group 7: ANA + CM + SA
B. Decellularization of Allografts
Bilateral 10 mm sciatic nerve grafts were obtained from 24 male Sprague Dawley rats, aged 7-12 weeks and weighing 250-350 grams. The 'Nonionic detergent + Anionic detergent' procedure was applied for graft decellularization.
C. Preparation and Preconditioning of WJ-MSCs and CM
WJ-MSCs were preconditioned and cultured according to the serum-mediated stem cell activation technique. Characterization, differentiation potential, and cell counting were validated via flow cytometry. CM was obtained from the culture media. WJ-MSCs and CM were implanted into the ANA using the fibrin drop method. In groups containing WJ-MSCs and CM, each ANA received 1x106 WJ-MSCs and their derived CM.
D. Surgical Technique
In all groups, a skin incision was made at the intermuscular groove between the gluteal muscle and biceps femoris muscle under a microscope. The sciatic nerve was exposed by blunt dissection, and a 10 mm nerve defect was created. The removed nerve graft was applied as an autograft in Group 1. In all other groups, the defect was repaired with ANA.
In Groups 5, 6, and 7 (CA-added groups), the Superficial Inferior Epigastric Artery Adipofascial Flap was raised from the ventral abdomen region and pedicled to the sciatic nerve repair site through a subcutaneous tunnel. The viability of the flap was confirmed using laser-assisted ICG angiography.

E. Assessment Tests
Video-Assisted Walking Analysis (VAWA), Sciatic Functional Index (SFI), and Pin-prick Test were performed at weeks 3, 6, and 9. Additionally, at week 9, Electrophysiological Evaluation, Histopathological and Immunohistochemical Analysis, Tibialis Anterior Muscle Weight and Volume Measurement were conducted.
F. Statistics
Data were tested for normal distribution with SPSS 26.0, and parametric data were evaluated using One-way ANOVA, while nonparametric data were assessed using the Kruskal-Wallis test. A p-value of <0.05 was considered statistically significant.

Results
Functional Evaluation Results
In the 9th-week SFI and VAWA tests, the group with only ANA had significantly lower motor function compared to the autograft group (p<0.05). However, groups receiving WJ-MSCs, CM, WJ-MSCs + SA, and  CM + SA  achieved superior motor functional results comparable to the autograft group.
In the 6th-week pin-prick test for sensory function evaluation, the ANA group had significantly lower results compared to the autograft group (p<0.05). However, groups receiving WJ-MSCs, SA, WJ-MSCs+SA, and CM + SA achieved superior sensory functional results comparable to the autograft group.
No significant differences were found between the groups in electrophysiological evaluation and muscle weight and volume index assessment (p>0.05).





Histopathological and Immunohistochemical Findings
Organized axon regeneration was significantly higher in the autograft group compared to all other groups (p<0.05). All groups receiving WJ-MSCs and SA had better-organized axon regeneration compared to the group with only ANA (p<0.05).
Superior vascularization was achieved in groups receiving WJ-MSCs, SA, and CM + SA, comparable to the autograft group (p>0.05). The ANA group had significantly lower vascularization compared to the autograft group (p<0.05).

Discussion
In plastic surgery clinical practice, the use of ANA for repairing critical-sized nerve defects is promising, but the search for ideal functional results similar to autografts continues. The inadequacies in functional outcomes are thought to be due to necrosis and fibrosis in the graft center, which hinder axon regeneration until the ANA is revascularized.
This study investigated the impact of WJ-MSCs, CM, and SA, known to enhance vascularization, on functional gains to address the shortcomings that cannot be resolved by using ANA alone.
The literature has shown that SA increases vascularization around the ANA. It is thought that the challenging nerve regeneration observed in scarred and avascular wound beds and critical-sized nerve defects can be overcome by increasing local blood flow in the nerve microenvironment. Our study demonstrated that applying SA, adding CM to SA, and applying WJ-MSCs significantly increased vascularization and organized axon regeneration scores. The superior sensory and motor functional improvement parameters in these groups at 6 and 9 weeks, comparable to the autograft group, are thought to be due to high levels of vascularization and axon regeneration.
MSCs secrete bioactive factors, including cytokines, growth factors, exosomes, and microvesicles, termed CM. The main advantages of CM are its low immunogenicity, wide safety, and dosage range, and long-term storage. While there are no studies in the literature combining SA and CM, our study investigated this combination's effects. CM alone did not significantly increase vascularization and organized axon regeneration, but significant increases were observed when used with SA. The superior sensory and motor functional outcomes comparable to the autograft group observed with the simultaneous application of CM and SA, unlike CM or SA alone, were attributed to the synergistic effect of CM and SA.
Adequate axon regeneration within the nerve graft is essential for achieving good functional gains. In our study, the group receiving ANA with WJ-MSCs + SA achieved superior axon regeneration comparable to the autograft group. When WJ-MSCs and SA were applied together, unlike their separate applications, superior motor functional results comparable to the autograft group were obtained in VAWA, attributed to the synergistic effect of WJ-MSCs and SA.
Conclusion
It has been demonstrated that the application of WJ-MSCs and CM together with SA significantly improves functional outcomes in critical-sized nerve defects, achieving results similar to autografts. This combination could be an effective and reliable reconstruction option adaptable to clinical practice in applying ANA in poorly vascularized, scarred recipient areas.