Biyomedikal uygulamalarda kullanılabilecek fonksiyonel polimerik yapıların hazırlanması
Preparation of utilizable functional polymeric structure in biomedical applications
Yazar: GÖZDE DEVECİ
Danışman: DOÇ. DR. MUHAMMET ÜBEYDULLAH KAHVECİ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology

Özet:
Fonksiyonel polimerik malzemeler ana zincir ya da yan zincirlerinde fonksiyonel gruplar bulunduran makromoleküler yapıların eşsiz bir sınıfıdır. Çevresel uyarılara yanıt oluşturabilme, biyoaktivite gibi özellikler fonksiyonel polimerlere kolaylıkla kazandırılabilmekte bu sebeple; ilaç salımı, sensör ve görüntüleme sistemleri gibi çeşitli biyomedikal uygulamada sıklıkla tercih edilmektedirler. Gerçekleştirilen bu tez çalışmasında biyomedikal uygulamalar için özgün ve yüksek kullanılma potansiyeline sahip biyoaktif fonksiyonel mikroküre ve  fonksiyonel polimer-cam hibrit yüzey ile ışıkla parçalanabilir mikro-nano partikül olmak üzere üç farklı polimerik yapı sentezlenmiştir. 
Tez çalışmasının ilk bölümünde poli[poli(etilen glikol) metakrilat-co-N-akrilamido süksinimid] (Poli(PEGMA-co-NMAS)) saçaklar bulunduran mikro küreler sentezlenmiş ve glukoza reaktif  bir çeşit lektin proteini olan Concanavalin A ile konjugasyon gerçekleştirilerek polimerik kürelere biyoaktivite kazandırılmıştır. Son olarak biyoaktif mikroküreler bakterilerin hücre duvarındaki mannoz reseptörlerini hedefleyerek bakteri belirlenmesinde etkin bir şekilde kullanılmıştır. Öncelikle yüzeyinde alkil bromür gibi bir Atom Transfer Radikal Polimerizasyonu (ATRP) başlatıcısı içerecek şekilde metil metakrilat esaslı mikroküreler, metil metakrilat, 2(2-Bromobütiriloksi)etil metakrilat  (BBEMA) ve etilen glikol dimetakrilatın benzoilperoksit ile başlatılan serbest radikal süspansiyon polimerizasyonu ile elde edilmiştir. Elde edilen brom fonksiyonlu mikroküreler PEGMA ve NMAS monomerlerinin ATRP ile kopolimerizasyonunda  başlatıcı olarak kullanılmış ve yüzeyde başlatılan ATRP (SI-ATRP) ile kürelerin yüzeyinde poli(PEGMA-co-NMAS) zincirleri oluşturulmuştur. Ardından Concanavalin A, üzerine aşılama yöntemi kullanılarak polimer saçaklarındaki amino (-NH2) gruplarıyla süksinimidil ester gruplarının reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Süspansiyon polimerizasyonu sonrası FT-IR karakterizasyonunda elde edilen 1760 cm-1 civarındaki keskin karbonil pikleri ile ışık ve SEM mikroskobunda görülen 20-80 µm boyutundaki pürüzsüz küreler çalışmanın ilk aşmasının başarılı bir şekilde gerçekleştirildiğini göstermektedir. Sentezlenen brom fonksiyonlu küreler yüzey başlatıcılı atom transfer radikal polimerizasyonu için başlatıcı olarak kullanılmış ve bu başlatıcı üzerinden PEGMA ve NMAS monomerlerinin polimerizasyonu gerçekleştirilmiştir. Yine FT-IR spektrumundan elde edilen verilere göre  3600 cm-1 civarında görülen –OH bandının oluşması,  1782 cm-1 ve 1811 cm-1 civarında iki yeni karbonil bandı ile 1100 cm-1 civarında örülen eterik bandların görülmesi küresel polimerin başarılı bir şekilde modifiye edildiğini göstermektedir. Saçaklı küresel polimerlerin sahip olduğu amin reaktif NHS grupları ile bir çeşit lektin proteini olan Concanavalin A konjuge edilmiş ve Protein polimer konjugasyonu ise Bradford testi kullanılarak belirlenmiştir. Daha sonra kürelerin bakteri tespitinde kullanılma potansiyelleri yeşil floresans proteini (GFP) eksprese eden E.coli'lerin belirlenmesinde test edilmiştir. Floresans mikroskobunda görülen ışıma yoğunluğundaki değişme bu çalışmanın başarılı bir şekilde gerçekleştiğini ispatlamıştır. 
Tez kapsamındaki bir diğer bir çalışma olan fonksiyonel hibrit cam yüzeylerin hazırlanması  için, cam yüzeyler sırasıyla Piranha Çözeltisi, 3-amino propil trietil siloksan (APTES) ve 2-bromobütüril bromür - trietil amin solüsyonlarıyla muamele edilerek brom fonksiyonlu cam yüzeyler elde edilmiştir. Ardından fonksiyonel küresel polimer çalışmasında belirtilen yaklaşıma benzer olarak SI-ATRP ve Concanavalin A konjugasyonu uygulanmış ve Concanavalin A bulunduran polimer kaplı cam yüzeyler elde edilmiştir. Her aşamadan sonra cam yüzeyler sırasıyla –OH, -NH2, -Br grupları ve poli(PEGMA-co-NMAS) polimerik saçaklarla fonksiyonlandırılmış ve temas açı ölçüm cihazı ile elde edilen 68,046°, 21,38°, 56,22°, 80,63° ve 66,65° açı değerleri fonksiyonlandırma işleminin başarısını kanıtlamıştır. Ayrıca FT-IR spektrumunda 1734 cm-1'de poli(PEGMA)'nın karakteristik piklerinden biri olan -C=O- bantlarının polimer fonksiyonlu ve Con A konjugatı bulunan camlarda görülmesine karşın brom grupları içeren camlarda gözlenmemesi, yine polimer saçaklı ve Con A konjugatlı camlarda 1500 cm-1 civarında görülen –N-O- bandı başarılı bir sentez olduğunu desteklemektedir. Diğer çalışma ile benzer şekilde hücre tesbiti çalışması GFP E. coli ile gerçekleştirilmiş ve florsesans mikroskobunda elde edilen yoğun ışıma yüksek afinitede bakterilerin yüzeye bağlandığını ispatlamıştır. 
Son olarak tez çalışmasında ışıkta parçalanabilir mikro ve nano polimerik küreler sentezlenmiş ve parçalanma eğilimleri incelenmiştir. Bunun için 1,6-diizosiyanohekzan, 2-nitrobenzaldehit ve akrilik asit reaktiflerinin Passerini Reaksiyonu ile o-nitro benzil ester fonksiyonlu çapraz bağlayıcı sentezlenerek mikropartikül için süspansiyon, nanopartikül için mini-emülsüyon polimerizasyonu gerçekleştirilmiştir ve o-nitrobenzil ester fonksiyonlu çapraz bağlayıcı FT-IR ve 1H NMR spektroskopisi ile analiz edilmiştir. Işıkta parçalanır çapraz bağlayıcının FT-IR spektrumunda 1530 cm-1 ve 1350 cm-1 'deki pikler çapraz bağlayıcıda bulunan nitro gruplarını göstermektedir. Ek olarak 1730 cm-1 daki pik C=O bağlarını, 1200 cm-1 deki pik ise çapraz bağlayıcının ucunda bulunan alken gruplarını temsil etmektedir. 1H NMR spektrumuna bakıldığında ise 7,81 ve 8,04 ppm  arasındaki   4 pik aromatik grupları temsil ederken molekülün sonunda bulunan çift bağ  6,73 ppm de görülmüştür. H NMR ve FT-IR spektrumlarından elde edilen sonuçlar çaprazbağlayıcının başarılı bir şekilde sentezlendiğini desteklemiştir. Mikro ve nanoküreler SEM ile görüntülendiğinde mikroküreler için yaklşık 60 µm nanoküreler içinse 600 nm.'lik boyurlara sahip pürüzsüz kürelerin elde edildiği görülmüştür. Bu çalışmanın son basamağında ise yaklaşık 350 nm.'lik UV ışık altında polimerik kürelerin parçalanma çalışması gerçekleştirilmiş UV spektroskopisinde her altı saat için parçalanmış kürelerin absorbansındaki değişim incelenmiştir. Degradasyon sonrasın kromoforik gruplardaki artış sonucu absorbanstaki artış ve parçalanma sonrası polimerik kürelerin SEM görüntülerindeki şekilsizlik parçalanma işleminin başarı ile gerçekleştiğini göstermektedir.
Sentezlenen tüm fonksiyonel polimerik yapıların istenilen kimyasal ve morfolojik özelliklere sahip farklı formlarda hazırlanması tercih edilen polimerizasyon yöntemleri ile hem de kullanılan fonksiyonel gruplarla etkili bir şekilde gerçekleşmiştir. Biyoaktif polimerik küreler ile polimer-cam hibrit yüzeylerin tıbbi tanı amaçlı görüntüleme ve sensör ve kit uygulamaları için büyük bir potansiyele sahip olduğu, ışıkta parçalan kürelerin de ilaç salım istemleri için önemli bir model çalışma olduğu bu çalışmada ispatlanmıştır. Kolaylıkla modifiye edilebilir olan bu polimerik yapılar biyomedikal uygulamalar için umut vaadedicidir. Çalışma boyunca fonksiyonel yapıların karakterizasyonu 1H NMR, Bradford Assay, FT-IR, UV Spektroskopi, ışık mikroskobu, SEM, Temas Açı Ölçüm Cihazı ve Floresans Mikroskobu ile sağlanmıştır.

Abstract:
Functional polymeric materials are one of the unique class of macromolecules that carry functional groups on the main chain or side chain. Several properties such as stimuli responsiveness or bioactivity can be gained easily to functional polymers, therefore these polymers often have been preferred especially for biomedical applications like drug delivery, sensors or bioimaging systems. In this thesis, a bioactive functional polymeric microspheres, a bioactive polymer-glass hybrid surface, and photodegradable mico-nano particles had been synthesized, such materials would have high potential for biomedical applications.
In the first part, microspheres that have poly(PEGMA-co-NMAS) dangling chains on the surface were synthesized and mannose reactive, kind of lectin protein Concanavalin A was conjugated to hairy polymer spheres leading to bioactivity. In the last step, bioactive microspheres were employed in targeting sugar molecules on the cell surface receptors of bacteria effectively. During the preparation of bioactive polymeric microspheres, methyl methacrylate-based microspheres containing bromo functionality as an Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) initiator were synthesized by free radical suspension copolymerization of methyl methacrylate, 2(2-bromobutyryloxy)ethyl methacrylate  (BBEMA), ethylene glycol methacrylate in the presence of benzoyl peroxide. Copolymerization of poly(ethylene glycol) methacrylate (PEGMA) and N-meth acryl amido succinimide (NMAS) monomers on bromo functional polymeric microspheres was performed via surface initiated ATRP (SI-ATRP) yielding an amine reactive polymeric surface. Next, Concanavalin A, was conjugated to the polymer surface via grafting to conjugation method. Bacterial detection efficiencies of the Concanavalin A conjugated microspheres were analyzed using GFP expressing E. coli  as a model bacterium. Regarding characterization of the polymers and the conjugates, first FT-IR analysis was carried out. Strong carbonyl bands around 1760 cm-1 which were observed in FT-IR spectrum after suspension polymerization. SEM and light microscopy analyses revealed that the microspheres had a smooth texture on the surface and 20-80 µm diameter. Bromo functional microspheres were used as SI-ATRP initiator and PEGMA and NMAS monomers were polymerized over bromide functional microspheres. The FT-IR spectrum of hairy microspheres showed that a characteristic  –OH band around 3600 cm-1 , two new carbonyl bands around 1782 cm-1 and 1811 cm-1 and an etheric band around 1100 cm-1; all these results proved successful modification. Concanavalin A was conjugated onto polymeric microspheres through amine-reactive NHS groups located on hairy polymeric chains of the microspheres and amount of Concanavalin A conjugated was detected via Bradford assay.
The second study of the thesis is preparation of polymer-glass hybrid surfaces. Firstly, the glass surface has been treated with Piranha Solution, (3-aminopropyl) tetraethoxysilane, and 2-bromo-butyrylbromide-triethylamine solution, to obtain bromide functionalized surface initiator. Successively, SI-ATRP and Concanavalin A conjugation was performed similiar to previous work. After each modification step –OH, -NH2, -Br and poly(PEGMA-co-NMAS) hairy surfaces were obtained respectively and contact angle measurement results were observed as 21,38°, 56,22°, 80,63° ve 66,65° each step. Moreover, untreated glass surface, bromo functional glass surface and polymeric hairy glass surfaces were examined via FT-IR spectroscopy. As a result of this study, while a characteristic feature of poly(PEGMA), –C=O- bands had been seen around   1734 cm-1 for polymeric hairy surfaces and Concanavalin A conjugated surfaces, Bromide functional glass surfaces did not have this peak on the spectrum. In addition, N-O- band around 1500 cm-1 in the spectrum of Concanavalin A conjugated glass surfaces proved successful synthesis. Concanavalin A conjugated microspheres were also employed in bacterial detection as well.
In the last part of the thesis, photo-cleavable micro/nano particles were synthesized and degradation of these spheres was examined.  Passerini Reaction of 1,6-diisocyanohexane, 2-nitrobenzaldehyde, and acrylic acid yielded a diacrylate with o-nitrobenzyl ester moieties. Next, microspheres and nanospheres were synthesized via suspension and mini-emulsion polymerization, respectively. The characterization of the crosslinker and the resulted micro/nano spheres was analyzed via FT-IR and 1H NMR spectroscopy. FT-IR spectra showed that cross-linkers displayed bands at 1530 cm-1 and 1350 cm-1 which implies that the cross-linker contains nitro groups. In addition, the band at 1730 cm-1 is atributed to C=O, and the band around 1200 cm-1 represents alkene end groups in cross-linker compounds. In the NMR spektrum, four peaks between 7,81 and 8,04 ppm represents aromatic groups. All spectroscopic analysis prooved successful preparation. Polymeric microspheres and nanospheres diameter were determined 60 µm and 600 nm approximately via SEM microscopy. Finally, photo-degradation of polymeric spheres was examined for six hours intervals under UV light via UV spectroscopy. After degradation, spherical polymers were disintegrated and changed soft shapeless form observed by SEM. 
Preparation of various functional polymeric structures with various topology and various functionalities have been performed successfully through different synthetic approaches. Bioactive polymeric spheres and polymer-glass hybrid surfaces have big potential for bioimaging, sensors and kits.  Photocleavable spheres are important for drug delivery systems. These polymeric structures are easy to modify, thus each one shows big potential for biomedical applications.