Kütle spektrometrisi ile proteinlerin ubikitinasyon bölgelerinin düşük derişimlerde belirlenmesi
Determination of ubiquitination site of proteins at low concentrations by mass spectrometry
Yazar: ÜLKÜ GÜLER TOKAT
Danışman: PROF. DR. BEKİR SALİH
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Proteinlerin; fosforilasyon, glikozilasyon, asetilasyon, ubikitinasyon ve diğer post-translasyonel modifikasyonları birçok hücresel işlevin ve hücre içi sinyal olaylarının düzenlemesine olanak sağlamaktadır. Ubikitinasyon; birçok protein grubunun düzenlenmesi ve bozunmasında anahtar rol oynayan, çok fazla rastlanan bir post-translasyonel modifikasyon türüdür. Proteomiks alanında ubikitinasyon ve poliubikitinasyon analizleri, en aktif çalışma alanlarından biri olarak öne çıkmaktadır. Kanser, metabolik sendromlar, nörodejeneratif hastalıklar (Alzheimer, Parkinson, Huntington), inflamatuar bozukluklar, otoimmünite (kendi dokularındaki antijenlere karşı antikor oluşması), enfeksiyon ve kas erimesi gibi hastalıkların başlangıç ve ilerlemelerinde ubikitinasyon aktif olarak rol almaktadır. Ubikitinasyona uğramış protein fonksiyonlarının anlaşılması için ubikitinasyon bölgelerinin tespit edilmesi ve bağlanma mekanizmalarının aydınlatılması, hastalıkların teşhis ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde son derece önemlidir. Hücrelerde, ubikitinasyon post-translasyonel modifikasyonuna uğramış protein düzeyi onların original haldeki derişimlerine göre oldukça düşük olduğundan, ubikitinasyon tayini ve ubikitinasyon bölgelerinin tespiti oldukça zordur. Ubikitinasyon bölgelerinin yüksek hassasiyet ile tayin edilmeleri, uygun bir zenginleştirme metodunu takiben gerçekleştirilen analizlerde en hassas ve güvenilir sonuçların elde edilebileceği kütle spektrometrik teknikler kullanılarak yüksek hassasiyette yapılmaktadır. Tez kapsamında, öncelikle Histon 2B peptidi ve ubikitinasyona uğramış Histon 2B peptidi model olarak alınmış ve araştırma laboratuvarımızda bulunan matriks yardımlı lazer desorpsiyon iyonlaşmalı uçuş zamanlı kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS) kullanılarak çeşitli örnek hazırlama ve cihaz analiz parametreleri optimize edilerek çalışmayla ilgili temel analizler gerçekleştirilmiştir. Yapılan analizler sonucunda referans biyomoleküllere ait spektrumlardaki peptit sinyallerinin yorumlanması ile ubikitinasyon post-translasyonel modifikasyonun kütle spektrometrik olarak izlenmesinin mümkün olduğu tespit edilmiştir. İleri çalışmalarda ise, ubikitinasyon enzimi olarak kanser hücresi ölümünde ubikitinasyonun rolünü aydınlatmak için bir E3 ubikitin protein ligazı olan UHRF1 (Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1) seçilmiştir. UHRF1_siRNA' ları verilmiş RKO hücreleri ve kontrol RKO hücreleri üzerine yürütülen eş zamanlı proteomiks çalışmalarında yapılan veri analizlerinin sonuçlarına göre, siRNA eklenen hücrelerde UHRF1 down-regülasyonu gözlenmesi, UHRF1_siRNA'larının UHRF1'e özgü olduğunu kanıtlamıştır. İmmünoafinite çöktürme ile gerçekleştirilen zenginleştirme çalışmalarından sonra tespit edilen ubikitinasyona uğramış proteinlerin sayısında büyük bir artış gözlenmiştir. Dolayısıyla tripsin parçalaması sonucu elde edilen peptitler üzerinde ubikitinasyon tayinine özgü etkin bir zenginleştirme işleminin gerçekleştirilmesinin şart olduğu sonucuna varılmıştır. Tezin son kısmında, amin fonksiyonel grupları içeren sol jel, poli-L-Lizin immobilize sol-jel, poli-L-arjinin immobilize sol-jel, poli-L-ornitin immobilize sol-jel, titanyum, zirkonyum ve tantalyum temelli sol-jeller, sülfonil grubu içeren anyonik yüzey, ipek ve son olarak pamuk malzemeleri monoubikitinasyona uğramış Histon 2B peptidinin parçalanma ürünleri ile inkübe edilmiştir. Bu zenginleştirme amaçlı gerçekleşetirilen deneyler sonucunda, ubikitinasyon bölgesine ait sinyalin en iyi gözlendiği malzemenin sülfonil grubu içeren anyonik yüzey malzemesi olduğu ve ileri çalışmalarda ubikitinasyona uğramış peptidlerin zenginleştirilme işleminde kullanılabileceği tespit edilmiştir.

Abstract:
Post-translational modifications of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, acetylation, ubiquitination and the other various post-translational modifications allow the regulation of many cellular functions and intracellular signaling events. Ubiquitination is a very common post-translational modification that plays a key role in the regulation and degradation of many protein groups. Analysis of ubiquitination and polyubiquitination is one of the most active study area in the field of proteomics. Ubiquitination is actively involved in the onset and progression of diseases such as cancer, metabolic syndromes, neurodegenerative diseases (Alzheimer, Parkinson, Huntington), inflammatory disorders, autoimmunity (the formation of antibodies against their own antigens in tissues), infection and muscular dystrophy. Identification of ubiquitination sites and enlightenment of the binding mechanisms for understanding the functions of ubiquitinated proteins are crucial in the development of diagnostic and therapeutic methods for diseases. Since the level of post-translationally modified ubiquitinated proteins are very low in cells compared to their native forms, the detection of ubiquitination and ubiquitination sites is quite difficult. Analyzes needed for high sensitivity for the determination of ubiquitination sites are performed by using mass spectrometric techniques, where the most accurate and reliable results can be obtained in analyzes following a suitable enrichment method prior to the mass spectrometric analyses. In the scope of this thesis, based on the Histon 2B peptide and ubiquitinated Histon 2B peptide, basic analysis of the study was performed by optimizing various sample preparation and instrumental analysis parameters using Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS). As a result of the analyses, it was determined that it is possible to observe the ubiquitination as a post-translational modification mass spectrometrically by interpreting the peptide signals in the spectra of the reference biomolecules. In the further studies, an E3 ubiquitin protein ligase UHRF1 (Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1) was selected as an ubiquitinating enzyme to elucidate the role of ubiquitination in cancer cell death. The downregulation of UHRF1 in UHRF1_siRNA transfected cells proved that UHRF1_ siRNAs are specific to UHRF1 according to data analysis results of simultaneous proteomics studies on UHRF1_siRNA transfected RKO cells and control RKO cells. A significant increase in the number of detected ubiquitinated proteins was observed after the enrichment studies performed with the immunoaffinity precipitation. Therefore, it was decided that an efficient enrichment method for ubiquitination detection assay is required for the trypsin digested peptides. In the last part of the thesis, the poly-L-Lysine immobilized sol-gel, poly-L-arginine immobilized sol-gel, poly-L-ornithine immobilized sol-gel, titanium, zirconium based sol-gels, sulfonyl group containing surface, silk and finally, the cotton materials were incubated with the digestion products of the monoubiquitinated Histone 2B peptide. As a result of this enrichment experiments, it was found that the material with the best signal of ubiquitination region was sulfonyl group containing anionic surface material and could be used for the enrichment of ubiquitinated peptides in advanced studies.