Tavşan embriyolarının gelişme hızlarını ve x kromozomuna bağlı enzim aktivasyonlarını ölçerek cinsiyetlerini saptama üzerinde çalışmalar
Studies on sexing of rabbits ambryos by measuring of growth rate and x-linked enzyme activity
Yazar: MURAT FINDIK
Danışman: PROF.DR. HAKKI İZGÜR
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Doğum ve Jinekoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 1999
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Enzim aktivasyonu = Enzyme activation ; Tavşanlar = Rabbits ; Üreme = Reproduction

Özet:
80 ÖZET Tavşan Embriyolarının Gelişme Hızlarını Ve X Kromozomuna Bağlı Enzim Aktivasyonlarım Ölçerek Cinsiyetlerini Saptama Üzerinde Çalışmalar Bu çalışmadaki amaç kolay bir şekilde ve kısa sürede, minimum maliyetle embriyonik cinsiyeti saptayabilecek bir yöntemin araştırılmasıdır. Bu çerçevede tavşan embriyolarının gelişme hızları ve X kromozomuna bağlı enzim aktivasyonları ile cinsiyetleri arasındaki ilişki belirlenmeye çalışılmıştır. Çalışmanın hayvan materyalini 40 adet dişi ve 10 adet erkek Yeni Zelanda beyaz tavşanı oluşturdu. Dişi tavşanlardan 20 adeti çiftleşmeden sonraki 96. ve diğer 20 adeti ise 120. saatte operasyona alındı. Çalışmada süperfollikülasyon amacıyla PMSG (50 IUx3 gün, i. m.), ovulasyonu uyarmak amacıyla da hCG (50 IU, i.v.) hormonları, tavşanları genel anesteziye almak için Xylazine ve Ketamin HCI kullanıldı. X kromozomuna bağlı enzim aktivasyonunu belirleyerek cinsiyeti saptamak için Brilliant Cresyl Blue (Sigma) ve Reaksiyon Karışımı [Phosphate Buffered Saline (PBS) + %0,3 Bovine Serum Albumin (BSA) + 0,05 mM p-NADP + 0,5 mM Na-G6P; Sigma] kullanıldı. Tavşanlara median çizgiden laparatomi yapılarak her iki ovaryum üzerindeki corpus luteum, patlamamış follikül ve hemorajik folliküller sayıldı. Oviduct ve uterus yıkanarak embriyolar elde edildi. Embriyolar stereo mikroskop altında incelenerek ulaştıkları gelişme safhaları belirlendi (erken blastosist, blastosist, gelişen blastosist, genişlemiş blastosist) ve düzgün morfolojik yapılı embriyolar gelişme safhalarına göre ayrı ayrı petri kutularına konularak enzim aktivasyonları ölçüldü. Gelişme safhaları ve enzim aktivasyonları belirlenen embriyoların gerçekte hangi cinsiyete sahip olduklarını belirlemek için karyotipleri hazırlandı. Bu çalışmada kullanılan 40 tavşanda ortalama 14,22±5,0 adet corpus luteum, 10,42±3,4 adet hemorajik follikül ve 16,9±7,3 adet patlamamış follikül sayıldı. Çiftleşmeyi takip eden 96. saatte yapılan81 uterus yıkaması sonucunda embriyo ve oosit elde edilme oranı %61,17 olurken bu oran 120. saatte %64,23 olarak belirlendi. Kullanılan 40 tavşanda ortalama 7,35±4,6 adet embriyo ve 1,55+1,4 adet oosit elde edildi ve toplam elde edilme oranı %62,57 oldu. Gelişme safhasına göre çiftleşme sonrası 96. saatte toplanan erken blastosist safhasındaki embriyoların %0'ının, blastosist safhasındaki embriyoların %36,95'inin, genişleyen blastosist safhasındaki embriyoların %97,3'ünün ve gelişmiş blastosist safhasındaki embriyoların %100'ünün; 120. saatte toplanan embriyolarda ise erken blastosist safhasındaki embriyoların %0'ının, blastosist safhasındaki embriyoların %7,14'ünün, genişleyen blastosist safhasındaki embriyoların %82.05'inin ve gelişmiş blastosist safhasındaki embriyoların %100'ünün erkek olduğu belirlendi. Çalışmada gelişme safhalarına göre 113 dişi ve 122 erkek embriyo elde edildi. G6PD aktivitesine göre dişi embriyolardan %60,18'inin, erkek embriyolardan ise %58,2'sinin doğru teşhis edildiği saptandı (p>0,05). Kromozom analizi sonucunda, gelişme safhasına göre erkek olarak ayrılan embriyolardan %53,7'sinde ve dişi olarak ayrılan embriyolardan %50'sinde cinsiyetin doğru teşhis edildiği belirlendi. Çalışma sırasında enzim aktivitesine göre dişi oldukları belirlenen 119 embriyodan %55,32'sinin dişi; erkek oldukları belirlenen 116 embriyodan ise %60'mın erkek olduğu doğrulandı. Kromozom analizi için kullanılan 147 embriyonun 92'sinde (%62,59) embriyonik cinsiyet belirlendi. Bu embriyoların 48'inin erkek (%52,17) ve 44'ünün (%47,83) dişi olduğu saptandı (p>0,05). Çalışma sonucunda gelişme safhasına göre cinsiyetin erkeklerde %53,7, dişilerde %50; G6PD aktivitesi sonuçlarına göre de erkeklerde %60, dişilerde %55,32 oranında doğrulukla belirlendi. Her iki yöntemde de erkek:dişi oranları genelde birbirine yakın bulundu (p>0,05). Anahtar Sözcükler: Tavşan, embriyonik cinsiyeti saptama, gelişme hızı, X kromozomuna bağlı enzim aktivitesi.

Abstract:
82 SUMMARY Studies on Sexing of Rabbit Embryos by Measuring of Growth Rate and X-Linked Enzyme Activity. In the present study, the aim was to research a sexing technique which is economical and not time consuming. For this purpose, the relationship between sex and growth rate of rabbit embryos and X-linked enzyme activity has been tried to determine. In this study, 40 female and 10 male New Zealand white rabbits were used as a material. Twenty out of 40 female rabbits have been operated at postcoital 96th hour and the other twenty at 120th hour. In the study, for superovulation PMSG (50 IU x 3 days, im.), for stimulation of ovulation hCG (50 IU, iv.) and for general anaesthesia xylazine and ketamine HCI were used. In order for sex identification by determining X- linked enzyme activity, Brilliant Cresyl Blue (Sigma) and reaction mixture (Phosphate Buffered Saline (PBS) + 0.3% Bovine Serum Albumin (BSA) + 0.05 mM p-NADP + 0.5 mM Na-G6P; Sigma) was used. Laparatomie through median line has been carried out and corpus luteum, unovulated and haemorrhagic follicles on both ovaries have been counted. Embryos were collected by flushing oviduct and uterus. Then, embryos were examined microscopically and their stages were determined (early blastocyst, blastocyst, expanding blastocyst, expanded blastocyst). Next, morphologically normal embryos have been put in petri dishes according to the stage of embryos and their enzyme activities were measured. So as to specify which sex they possess the karyotype of embryos of which their stage and enzyme activities determined was prepared. In total 40 rabbits, average 14.22 ± 5.0 corpus lutetium, 10.42 + 3.4 haemorrhagic follicles and 16.9 ± 7.3 unovulated follicles were counted. While the isolation rate of embryo and oocyte, by uterus flushing, was 61.17% at postcoital 96th hour, this rate was 64.23% at 120th hour. In 40 rabbits, average 7.35±4.6 embryos and 1.55±1.4 oocytes were obtained and isolation rate was 62.56%.83 Of the embryos of postpartum 96th hour, 0% of early blastocyst- stage embryos, 36.95% of blastocyst-stage embryos, 97.3% of expanding blastocyst-stage embryos and 100% of expanded blastocyst- stage embryos were identified as male. As to the embryos collected at postcoitus 120th hour, 0% of early blastocyst-stage embryos, 7.14% of blastocyst-stage embryos, 82.05% of expanding blastocyst-stage embryos and 100% of expanded blastocyst-stage embryos were defined to be male. In this study 113 female and 122 male embryos have been obtained variable in stage. According to G6PD activity, 60.18% of female embryos and 58.2% of male embryos were correctly identified as to sex (p>0,05). As a result of chromosome analysis, in 53.7% of male embryos and 50% of female embryos sex identification was correct as to their stages. In the study, 119 embryos have been determined as female and 116 embryos have been determined as male according to enzyme activity. Finally, 55.32% of 119 female embryos and 60% of 116 male embryos were correctly determined. In 92 of 147 embryos (62.59%) used for chromosome analysis embryonic sexing specified. Of these embryos, 48 (52.17%) and 44 (47.83%) were found to be male and female respectively (p>0,05). As a consequence, as to embryo stage, correct embryo sexing rate was 53.7% in males and 50% in females. As for G6PD activity this rate was 60% in males and 55.32% in females. In both techniques, male-female ratio was found to be similar (p>0,05). Key Words: Rabbit, embryo sexing, growth rate, X-linked enzyme activity.