Anoxybacillus gonensis Z4 suşundan ekstraselüler ?-amilaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of extracellular ?-amylase from anoxybacillus gonensis Z4 strain
Yazar: NİMET BALTAŞ
Danışman: PROF. DR. SEVGİ KOLAYLI ; YRD. DOÇ. DR. BARBAROS DİNÇER
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada, yeni bir termofilik bakteri olan Anoxybacillus gonensis Z4 suşundan ekstraselüler a-amilaz, jel filtrasyon kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı ve karakterize edildi. Saf enzim, doğal ve SDS-poliakrilamid jel elektroforezlerinde tek bir bant halinde belirlendi. Optimum ? -amilaz aktivitesi, pH'ın ve sıcaklığın bir fonksiyonu olarak, çözünür patates nişastası substratı kullanılarak belirlendi. Enzimin optimum pH'sı, çözünür patates nişastası varlığında, 5,5-10,5 arasında bulundu. Enzimin optimum sıcaklığı ise, 70 oC olarak belirlendi. Saf enzimin ısıl kararlılık profili incelendiğinde 10 gün sonunda, +4 °C de aktivitesinin tamamını koruduğu, 70 °C' de % 65' ini koruduğu ve 90 °C' de aktivitesinin %43' ünü koruduğu gözlendi. Patates nişastası, amilopektin ve amiloz substratları için, Anoxybacillus gonensis Z4 ? -amilaz'nın Km değerleri, Lineweaver-Burk eğrisi yardımıyla, sırasıyla, 0,9 mg/mL, 1,3 mg/mL ve 0,5 mg/mL olarak bulundu. Vmaks değerleri ise sırasıyla 833,3 U/mg protein, 1000 U/mg protein ve 769 U/mg protein olarak belirlendi. EDTA, Hg2+, B4O7-2, OH-, CN- ve üre için hesaplanan IC50 değerleri sırasıyla 16,5 mM, 15,2 mM, 8,2 mM ve 10,9 mM olarak bulundu. Bu sonuçlar, elde edilen Anoxybacillus gonensis Z4 ?? amilazı, ısıl ve pH kararlılığı ve diğer özellikleri açısından endüstriyel uygulamalarda kullanılabilecek bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Abstract:
In this study, a-amylase, was isolated from a new termophilic bacterium Anoxybacillus gonensis Z4 using gel filtration chromotography. The purified enzyme was migrated as a single band on native and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Optimum ?-amylase activity as a function of pH and temperature was determined using soluble patato starch as substrate. The optimum pH of the enzyme was found between 5,5 to10,5 in the presence of soluble patato starch. The optimum temperature was determined at 70oC. When the thermal stability profile of the purified enzyme was investigated, at the end of ten days, it was observed that the purified enzyme was extremely stable +4 °C, the enzyme retained over 65 % of its original ?-amylase activity at 70°C, the enzyme retained over 43 % of its original ?-amylase activity at 90 °C. The Km values of Anoxybacillus gonensis Z4 ? -amylase for soluble starch, amylopectin and amylose substrates were determined 0,9 mg/mL, 1,3 mg/mL and 0,5 mg/mL by Lineweaver-Burk curve, respectively. The Vmax values of Anoxybacillus gonensis Z4 ? -amylase for the same substrates, were determined 833,3 U/mg protein, 1000 U/mg protein and 769 U/mg protein by Lineweaver-Burk curve, respectively. IC50 values of Anoxybacillus gonensis Z4 ? -amylase for EDTA, Hg2+, B4O7-2, OH-, CN- and urea inhibitors were determined as 8 mM, 5,75 mM, 16,5 mM, 15,2 mM, 8,2 mM ve 10,9 mM respectively. It is clear from the present results that the pH- and thermo- stabilities and other biochemical features of the extracellular enzyme make it potential for industrial applications.