Trabectedın'in insan glioblastoma hücre kültürlerindeki apoptotik ve otofajik etki mekanizmalarının araştırılması
Investigation of apoptotic and autophagic effects of trabectedin on human glioblastoma cell lines
Yazar: EMİR BOZKURT
Danışman: DOÇ. DR. FEYZAN ÖZDAL KURT
Celal Bayar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology

Özet:
Glioblastoma yetişkinlerde en sık rastlanan beyin tümörüdür. Tümörün aşırı invazif karakteri, beyindeki lokalizasyonu, kan beyin bariyeri ve hücrelerin kemoterapi/radyoterapiye karşı doğal direnci, standart tedavi seçeneklerine yanıt oluşumunu engellemekte ve kötü prognoza neden olmaktadır. Bu nedenle, glioblastoma tedavisinde yeni yaklaşımların geliştirilmesine ihtiyaç vardır.
Günümüzde kanser tedavisi için klinik kullanım onayı almış yalnızca 4 adet denizel kaynaklı antikanser ilaç bulunmaktadır. Bunlar arasında en umut vadedici olarak bilinen Trabectedin, yumurtalık ve sarkoma tümörlerinin klinik tedavisinde kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, glioblastoma hücre kültürlerinde Trabectedin ile indüklenen hücre ölüm mekanizmalarının detaylı olarak aydınlatılmasıdır. 
Apoptotzis'in gösterilmesinde DNA fragmentasyonu, kaspaz 3/7 aktivitesi, TMRE/Hoechst ve Annexin V/7-AAD boyamaları, Kaspaz 8 / 9 inhibitörleri ve iç/dış apoptotik yolakta rol oynayan proteinlerin ekspresyon düzeyleri araştırıldı. Otofajinin araştırılması için MDC boyaması, LC3-I/II dönüşümü, SQSTM1/p62 ve Beclin1 ekspresyon düzeyleri ölçüldü. p53 ailesi üyelerinin Trabectedin aracılı hücre ölümü üzerindeki rolleri siRNA ve spesifik inhibitörler ile araştırıldı. Trabectedin'in apoptozis ve otofaji arasındaki önemli etkileşimlerden biri olan Bcl-2/Beclin-1 dimerizasyonu üzerindeki etkisi co-immunopresipitasyon yöntemiyle araştırıldı.  
Trabectedin'in T98G hücre kültürlerinde hem iç hem de dış yolağı aktive ederek apoptozisi indüklediği belirlendi. Bu apoptotik etkinin p63 aracılı olarak gerçekleştiği saptandı. U-87 MG hücrelerinde ise, otofajinin indüklendiği ve otofajinin p53 aracılı olarak gerçekleştiği belirlendi. Bcl-2/Beclin-1 dimerizasyonunun Trabectedin etkisiyle her iki hücre kültüründe de ayrıldığı gösterildi. Sonuç olarak, bu preliminer çalışma Trabectedin'in GBM tedavisi için umut vadedici bir aday olabileceğini göstermektedir. Trabectedin'in apoptotik ve otofajik etkilerinin in vivo GBM modellerinde araştırılacağı çalışmalara ihtiyaç vardır.

Abstract:
Glioblastoma is the most common brain tumor in adults. Features of the tumor such as invasiveness, localization, natural resistance against chemo/radiotherapy and blood brain barrier prevent the response to standard treatment options and lead to poor prognosis. Therefore, new treatment options are urgently needed. 
Today, there are only 4 marine-derived drugs approved for clinical cancer treatment. Probably the most promising one among them, Trabectedin, is currently in use for treatment of ovarian and sarcoma tumors. The aim of this study was to investigate Trabectedin-induced cell death mechanisms in glioblastoma cell cultures. 
DNA fragmentation, caspase 3/7 activity, TMRE/Hoechst and Annexin V/7-AAD staining, caspase 8/9 inhibitors and expression levels of key proteins in both intrinsic and extrinsic apoptotic pathways were investigated to show apoptosis. To investigate autophagy, MDC staining, LC3-I to II conversion and expression levels of SQSTM1/p62 and Beclin-1 proteins were measured. The role of p53 family proteins in Trabectedin-induced cell death was investigated by using siRNAs and specific inhibitors. The effect of Trabectedin on Bcl-2/Beclin-1 dimerization, which is one of the important crosstalks between apoptosis and autophagy, was measured by using co-immunoprecipitation. 
Trabectedin induced both intrinsic and extrinsic apoptosis in T98G cell cultures. Moreover, it was found that apoptotic effect of Trabectedin is mediated by p63. On the other hand, in U-87 MG cell line, Trabectedin induced autophagy and this induction was found to be mediated by p53. In conclusion, this preliminary study indicates that Trabectedin might be a good candidate for the treatment of GBM. Further studies are needed to evaluate apoptotic and autophagic effects of Trabectedin on in vivo GBM models.