Astrosit-GBM hücre hatlarında radyasyona bağlı bystander etkisinin değerlendirilmesi
Assessment of radiation-induced bystander effect in astrocyte-GBM cell lines
Yazar: FULYA ÇAĞLAR
Danışman: PROF. DR. EMİNE SERRA KAMER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Onkoloji = Oncology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Astrositler = Astrocytes ; Beyin neoplazmları = Brain neoplasms ; DNA hasarı = DNA damage ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Hücre dizisi = Cell line ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Radyasyon = Radiation ; Radyasyon etkileri = Radiation effects ; Serbest radikaller = Free radicals

Özet:
Glioblastoma (GBM) glia hücrelerinden köken alan intra-kranial bir beyin tümörüdür. GBM'de en etkin tedavi yöntemi cerrahi rezeksiyon sonrası radyoterapi (RT) ve kemoterapi uygulanmasıdır. RT, tümör hücrelerinde DNA hasarı oluşturması ve oluşan DNA hasarının kanserli hücreyi apoptoza sürüklemesini amaçlamaktadır. Ancak, RT'de radyasyon ile hedeflenmemiş olan hücrelerde radyasyona maruz kalan hücreler tarafından gelen farklı düzeylerdeki sinyallerin etkisi altındadır. Bystander etkisi olarak bilinen bu etkinin normal hücreler üzerindeki etkisi henüz tam olarak bilinmemektedir. Bu tez çalışmasında, bystander etkisinin normal astrositik hücreler üzerindeki reaktif oksijen türevleri (ROS) ve DNA hasarı meydana getirme etkinliği, kanser ve normal hücre sınırını belirli düzeyde taklit eden ve GBM tümörünü modelleyen ko-kültür deneyi ile araştırılmıştır.
Bu amaçla, astrosit ve GBM hücreleri ko-kültür çalışması ile birlikte kültüre edildi. GBM tümörlerinde kanser hücreleri normal hücreler içerisine invaze durumdadır. Bu yapıyı taklit edebilmek için GBM hücreleri ve normal astrosit hücreleri plakadaki kuyucuk içerisine aynı düzlemde belirli alanlara ayrı olarak ekildi. Dört Gy ve 2Gy'lik radyasyon; ko-kültürlere uygulanarak 2, 4, 6 ve 8 saatlik inkübasyona bırakıldı. Aynı koşullar kullanılan hücre hatlarına tek başına kültür uygulaması da yapıldı. Ayrıca radyasyonla etkileşime geçen hücre kültürü ortamının olası bystander etkisinin varlığını araştırmak için, 4Gy radyasyon uygulanan ko-kültür hücre grubunun ortamı radyasyon uygulanmayan ko-kültür hücre grubuna aktarıldı. Hücre hatlarında radyasyona bağlı reaktif oksijen türevleri ROS tanımlama deneyi ile belirlendi. Radyasyonun DNA üzerindeki hasar etkinliği TUNEL deneyi ile tanımlandı. Verilerin analizi SPSS statistics 17.0 ve GraphPad Prism 6.0 yazılımları ile gerçekleştirildi. Hücre grupları arasındaki farklılıklar Wilcoxon Signed Rank testi ile değerlendirildi. Gruplar arasındaki korelasyon ilişkisi Spearman'ın rank korelasyon katsayısı ile test edildi. 
Sonuç olarak, direk radyasyon uygulanan bazı hücre grupları ile sadece ortam aktarılarak by-stander etkisi ölçülen hücre grupları arasında DNA çift iplik kırıkları (DSB) ve ROS miktarında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar bulundu. GB hücre hatlarının astrosit hücre hatları ile ko-kültüre edilmiş modelimizde, azalmış hücre ölümü ve ROS değerleri göz önüne alındığında, hücresel sinyal mekanizmasının olası radyasyon direncini açıklayıcı bir model olarak çalışılması gerekliliğini ortaya koymaktadır.


Anahtar Kelimeler: Astrosit; Glioblastoma; Bystander

Abstract:
Glioblastoma (GBM) is an intra-cranial brain tumor originating from glial cells. The most effective treatment modality in GBM is radiotherapy (RT) and chemotherapy after surgical resection. RT aims to induce DNA damage in tumor cells and to induce DNA damage leading to apoptosis. However, cells which are not affected by radiation in RT are under the influence of signals at different levels from the cells exposed to radiation. The effect of radiation, known as the bystander effect, on normal cells has not been well understood. In this thesis, the efficacy of the bystander effect on reactive oxygen derivatives (ROS) and DNA damage in normal astrocytic cells was examined by a co-culture experiment mimicking the boundary between cancer and normal cells and modeling the GBM tumor.
For this purpose, astrocytes and GBM cells were co-cultured in the current study. In tumor tissue, GBM cells invade into normal astrocytes. To mimic this construct, GBM cells and normal astrocyte cells were separately seeded into certain areas on the same plane of well-plate. Four Gy and 2Gy radiation were applied to the co-cultures and then allowed to incubation for 2, 4, 6 and 8 hours. The same conditions on which were used the cell lines was applied to normal culture. Furthermore, in order to determine a possible bystander effect of the cell culture medium interacted with the radiation, the medium of the co-culture obtained from 4Gy radiation was transferred into non-irradiated co-cultures. Radiation-dependent reactive oxygen derivatives in cell lines were determined by the ROS-defined assay. The damage by the radiation to DNA was identified by the TUNEL assay. Data were analyzed using SPSS statistics 17.0 and GraphPad Prism 6.0 software. Differences between cell groups were evaluated by Wilcoxon Signed Rank test. Correlation between groups was tested with Spearman's rank correlation coefficient.
As a result, there were statistically significant differences in the amount of DNA double-stranded breaks (DSB) and reactive oxygen derivative (ROS) between some of the all cell groups that were directly irradiated by radiation and cell groups whose bystander effect of transferred media was measured. It was observed that the radiation-exposed medium could not induce itself a bystander effect on non-irradiated cells. In our co-cultured model of GB cell lines with astrocyte cell lines, considering the decreased cell death and ROS values, it is necessary to study the cellular radiation mechanism as a model to explain the possible radiation resistance.


Keywords: Astrocytes; Glioblastoma; Bystander