Ventilatörle ilişkili pnömonilere neden olan etkenlerde biyofilm oluşumunun ve biyofilm tabakalarına etkili antibiyotiklerin araştırılması
Evaluation of biofilm formation capacities and antibiotics effective on biofilm layers in the causetive agents leading to ventilator-associated pneumonia
Yazar: BETÜL SADIÇ
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA ORAL ÖNCÜL
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Biyofilmler = Biofilms ; Mikrobiyal duyarlılık testleri = Microbial sensitivity tests ; Pnömoni = Pneumonia ; Sinerji = Synergy ; Vantilatör = Ventilator ; Ventilatörler-mekanik = Ventilators-mechanical

Özet:
ÖZET
Giriş ve Amaç: Bu çalışmada ventilatörle ilişkili pnömoni (VİP) tanısı almış yoğun bakım ünitesi (YBÜ) hastalarında, risk faktörlerinin, klinik bulguların ve prognozun değerlendirilmesi; endotrakeal aspirat (ETA), bronkoalveoler lavaj (BAL) gibi alt solunum yolu örneklerinde üreyen bakterilerin dağılımının, antibiyotik duyarlılıklarının ve biyofilm oluşturma yeteneklerinin belirlenmesi; çeşitli antibiyotiklerin, VİP etkenlerinin oluşturduğu biyofilm tabakasına karşı tek başına ve kombinasyon halindeki etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntemler: İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Hastanesi Genel ve Travma Acil YBÜ'lerinde 1 Nisan 2016-31 Mart 2017 tarihleri arasında en az 48 saattir mekanik ventilasyon altında olan 18 yaş üzeri hastalar,  Centers for Disease Control and Prevention  (CDC) ölçütleri doğrultusunda VİP gelişip gelişmediğine göre ikiye ayrıldı. Bu hastalarda ETA'da ≥105 cfu/ml veya BAL'da ≥104 cfu/ml olarak üreyen ve VİP etkeni olarak değerlendirilen bakteriler, klasik biyokimyasal yöntemler kullanılarak tanımlandı. Bu bakterilerin antibiyotiklere duyarlılıklarının belirlenmesinde disk difüzyon yöntemi,  Etest® ve sıvı mikrodilüsyon yöntemleri için European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) tarafından belirlenen zon çapları ve minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri kullanıldı. Bakterilerin biyofilm oluşturma yetenekleri mikroplak yöntemiyle gösterildi. Antibiyotiklerin biyofilm üzerine tek başına etkinliği, minimum biyofilm inhibe edici konsantrasyon (MBİK) ve minimum biyofilm eradike edici konsantrasyon (MBEK) belirlenerek; kombinasyon halinde etkinliği ise dama tahtası ("checkerboard") ve zamana bağlı öldürme ("time-kill") yöntemleriyle gösterildi. 
Bulgular: Çalışmaya 177 hasta dahil edildi. Bunların 71 (%40.1)'inde VİP geliştiği tespit edildi. VİP gelişen hastalarda YBÜ'de kalış süresi, ortalama 29 (3-107) gün iken, bu süre VİP gelişmeyen hastalarda 12 (3-70) gün olarak bulundu (p<0.001). Ventilasyon süresi, rektal karbapeneme dirençli K. pneumoniae (KDKp) kolonizasyonu ve sigara kullanımı, VİP gelişimi için risk faktörü olarak bulundu (sırasıyla "Odds ratio", OR: 1.07, 4.93, 3.89; %95 Güven aralığı, GA: 1.02-1.12,  2.09-11.64, 1.68-8.93). Yaş, SOFA skoru ve rektal KDKp kolonizasyonunun, VİP gelişen hastalardaki mortalite için risk faktörleri olduğu saptandı (sırasıyla OR: 1.15, 1.60, 15.21; %95 GA: 1.03-1.28, 1.05-2.43, 2.33-99.01). Etken olarak saptanan K. pneumoniae, Pseudomonas ve Acinetobacter suşlarının sırasıyla %94, %63.6 ve %100'ünün biyofilm oluşturduğu;  meropenem, siprofloksasin ve kolistinin bu suşlara karşı saptanan MBİK ve MBEK değerlerinin, MİK değerlerinden en az 100 kat daha yüksek olduğu görüldü. Sinerji testi sonucunda serbest formlarda meropenem ve siprofloksasin kombinasyonunda "aldırmazlık" görülürken, biyofilm oluşturan suşlarda bu kombinasyonla aynı yöntemle "sinerjik etki" görüldü. Zamana bağlı öldürme yönteminde de sinerjik etki bu kombinasyon için Acinetobacter spp. ve K. pneumoniae suşlarında saptandı. P. aeruginosa, Acinetobacter spp. ve K. pneumoniae suşlarında zamana bağlı öldürme yöntemiyle meropenem-kolistin ve meropenem-siprofloksasinin farklı konsantrasyonlarında sinerjik etki tespit edildi.
Sonuç: VİP gibi mortalite ve morbiditesi oldukça yüksek olan hastane infeksiyonlarının tedavisinde etken bakterilerin yüksek biyofilm yapma potansiyelleri göz ardı edilmemelidir. Hayatı tehdit eden ve bu bakterilerin neden olduğu infeksiyonların tedavi başarısı için biyofilm varlığının araştırılması, ayrıca antibiyotik duyarlılıklarının saptanması için MBİK ve MBEK değerlerinin araştırılması, daha doğru bir yaklaşım olacaktır. Bunları rutin laboratuvar şartlarında belirlemenin ve antibiyotik kombinasyonlarının biyofilm üzerine etkinliğini tayin etmenin güçlüğü göz önünde bulundurulduğunda,  bunları test edilebilecek daha pratik yaklaşımların ve cihazların gerekliliği öne çıkmaktadır. Rutinde kullanılabilecek pratik bir yöntem, hem rasyonel antibiyotik kullanımına önemli katkı sağlayacak, hem de antibiyotik direnci gelişiminde olumlu sonuçlara neden olarak tedavi başarısını doğrudan etkileyecektir.

Anahtar kelimeler: Ventilatörle ilişkili pnömoni, biyofilm, sinerji.

Abstract:
ABSTRACT 
Objectives: In this study, we aimed to evaluate the risk factors, clinical findings and prognosis in patients diagnosed as ventilator-associated pneumonia (VAP) in intensive care unit (ICU), to determine the distribution,  antibiotic susceptibilities, and  the biofilm formation capacities of bacteria isolated from their lower respiratory tract samples such as endotracheal aspirate (ETA), bronchoalveolar lavage (BAL), and to investigate the activity  of various antibiotics alone or in combination against bacteria in the biofilm layer produced by VAP agents. 
Materials and methods: In Istanbul University Istanbul Faculty of Medicine Hospital General and Emergency Trauma ICU between April 1, 2016 and March 31, 2017,  patients with 18 years of age under mechanical ventilation for at least 48 hours were divided into two categories for development of VAP diagnosed by means of Centers for Disease Control and Prevention (CDC) criteria. In these patients, bacterial isolates which were grown as  ≥105 cfu/ml in ETA or  ≥104 cfu/ml in BAL and evaluated as causative agents of VAP were identified using conventional biochemical methods. Zone diameters and minimum inhibitor concentration (MIC) values recommended by European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) were used to determine antimicrobial susceptibility of these bacteria by disk diffusion, Etest® and broth microdilution methods. The ability of bacterial biofilm formation was demonstrated by microplate method. Activity of antibiotics alone on biofilm was demonstrated by determination of  minimum biofilm inhibitory concentration (MBMC) and the minimum biofilm eradicating concentration (MBEC), whereas their activity  in combination was shown using checkerboard and time-kill methods.
Results: 177 patients were included in the study. It was determined that 71 patients (40.1%) developed VAP. In terms of the duration of stay in ICU, it was 29 (range 3-107) days in patients with VAP, whereas  it was 12 (3-70) days in patients without VAP (p<0.001). Ventilation time, rectal colonization of carbapenem-resistant K. pneumoniae (CRKP) and smoking was found to be risk factors contributing to VAP (odds ratio, OR: 1.07, 4.93, 3.89; 95% confidence interval, CI 1:02 to 1:12, 2.09-11.64, 1.68-8.93, respectively). Age, SOFA score and CRKP colonization were identified as risk factors contributing to mortality in patients with VAP (OR: 1.155, 1.606, 15.211; 95% CI: 1.036-1.288, 1.059-2.435, 2.337-99.018, respectively). It was observed that biofilm formation rates of K. pneumoniae, Pseudomonas and Acinetobacter strains determined as causative agents were 94%, 63.6% and 100%, respectively,  and MBIC and MBEC values of meropenem, ciprofloxacin and colistin for these strains were at least 100 times higher than their MIC values.  In the synergy test, combination of meropenem and ciprofloxacin was demonstrated "indifference'' against free forms, although "synergistic effect" was seen with this combination against biofilm forming strains. In the time-dependent killing method, synergistic effect was also found against Acinetobacter and K. pneumoniae strains for this combination. The synergistic effect of different concentrations of meropenem-colistin and meropenem-ciprofloxacin pairs against P. aeruginosa, Acinetobacter and K. pneumoniae strains was determined in time-dependent killing.
Conclusions: High biofilm formation potential of pathogenic bacteria should not be overlooked in the treatment of hospital infections with high mortality and morbidity such as VAP. Investigation of biofilm formation for treatment of life-threatening infections caused by these bacteria in addition to investigation of MBIC and MBEC values for detection of antibiotic susceptibility will be a more correct approach for treatment success. However, identifying these values in laboratory conditions and determining the efficacy of antibiotic combinations on biofilm forming bacteria are not routinely available in clinical laboratories, so the practical approaches and devices that can be tested for them are critical. A practical method that can be used on a routine basis will have a positive impact on the development of antibiotic resistance which will make a significant contribution to the use of rational antibiotics and will directly affect the treatment success.

Key words: Ventilator-associated pneumonia, biofilm, synergy.