Toxocara canis enfeksiyonlarında  İn-Vitro ve İn-Vivo yaklaşımlarla eksozomal mikrorna'ların karakterizasyonu, ekspresyon profilleri ve fonksiyonel önemleri
Characterization, expression profiles, and functional importance of exosomal micrornas in Toxocara canis infections with In-Vitro and In-Vivo approaches
Yazar: GUPSE KÜBRA KARADEMİR
Danışman: PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Toxocara canis, (T. canis) dünya çapında dağılıma sahip ihmal edilmiş zoonoz bir hastalık olan toxocariasisin etkenidir. Medikal ve veteriner önemi oldukça yüksek olan parazit son konağı köpekler ve neden olduğu larval toxocariasis ile başta insan olmak üzere birçok omurgalı için ciddi tehdit oluşturmaktadır. Bu çalışmada gen ifadesinin temel düzenleyicileri olduğu bilinen small RNA (sRNA) 'lardan en önemlileri olarak bilinen mikroRNA (miRNA) 'ların hücre-hücre iletişiminin en önemli aracılarından birisi olan eksozomlardan izole edilmesi, larval T. canis enfeksiyonlarında karakterizasyonlarının yapılması  ve ifade düzeylerinin in-vitro ve in-vivo zeminde araştırılarak parazitin gelişim biyolojisinin yanı sıra konak etkileşimleri ve biyobelirteç oluşturma potansiyelleri gibi moleküler düzeyde hastalık üzerine özgün verilerin sağlanması amaçlanmıştır. Bu kapsamda T. canis'in enfektif dönem larvalarını içeren kültür medyumu ile deneysel enfekte BALB/C farelerin kontrol grubu, 1. ve 7. hafta serum örneklerinden eksozom izolasyonları yapılmıştır. İzole edilen eksozomlar elektron mikroskobi, nanopartikül izleme analizi ve Western Blot yöntemleriyle karakterize edildikten sonra ilgili örneklerden sRNA'lar izole edilmiştir. Uygun konsantrasyondaki sRNA izolatları kullanılarak kütüphaneler oluşturulmuş ve Yeni Nesil Dizileme (NGS) platformunda sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. NGS okumaları kalite skoru temelinde filtrelendikten sonra okumalar içerisinde biyoinformatik analizlerle deney gruplarında 107-260 arasında değişen bilinen ve 5-234 arasında değişen potansiyel yeni miRNA karakterize edilmiştir. BALB/C fare deney grupları arasında ekspresyonel farklılıkların araştırılması sonucunda kontrol grubuna göre enfeksiyon sonrası 1. hafta ve 7. hafta gruplarında toplam 12 miRNA'nın artan, 5 miRNA'nın ise azalan ifade gösterdiği tespit edilmiştir. Farklı ifade gösterdiği belirlenen bu miRNA'lar için gen ontoloji ve Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analizleri ile metabolik süreçte regüle ettikleri genlerin zenginleştiği yolaklar üzerine özgün çıktılar sağlanmıştır.  Enfeksiyon gruplarında kat değişimi ve önemlilik düzeyine göre artan ifade gösteren bilinen dört miRNA'nın (miR-100, miR-1-3p, miR-9-5p ve miR-184) farelerin dolaşımındaki varlığı ve ifade düzeylerini göstermek için RT-qPCR analizleri gerçekleştirilmiş ve sonuçlar yalnızca miR-1-3p için NGS sonuçlarını valide etmiştir. Bu sonuç da miR-1-3p'nin T. canis enfeksiyonlarının teşhisinde potansiyel aday bir biyobelirteç olabileceğini ve moleküler epidemiyolojik çalışmalarda kullanılabileceğini göstermiştir. Sonuç olarak bu tez çalışması ile toxocariasis üzerine sonraki araştırmalara temel oluşturabilecek eksozomal miRNA'lar üzerine ilk veriler sağlanmış olup moleküler epidemiyoloji temelinde larval T. canis enfeksiyonunun patogenezinin daha iyi anlaşılması ve teşhis için etkin biyobelirteçlerin geliştirilmesi noktasında da yüksek yaygın etki gösterebilecek çıktılar elde edilmiştir. 

Anahtar kelimeler: biyobelirteç, eksozom, miRNA, moleküler epidemiyoloji, Toxocara canis, yeni nesil dizileme

Abstract:
Toxocara canis, (T. canis) is the causative agent of toxocariasis, a neglected zoonotic disease with worldwide distribution. This parasite, which has a high medical and veterinary importance, poses a serious threat to many vertebrates, especially humans, with its definitive host, dogs, and the larval toxocariasis it causes. In this study, it was aimed to isolate microRNAs (miRNAs), which are known to be the most important of the small RNAs (sRNAs) known to be the basic regulators of gene expression, from exosomes, one of the most important mediators of cell-cell communication, to characterize them in larval T. canis infections and to investigate their expression levels in vitro and in vivo to provide unique data on the developmental biology of the parasite as well as host interactions and biomarker potentials on the disease at the molecular level. In this context, exosomes were isolated from 1st and 7th week serum samples of BALB/C mice experimentally infected with culture medium containing T. canis infective period larvae together with the control group. After the isolated exosomes were characterized by electron microscopy, nanoparticle tracking analysis and Western Blot methods, sRNAs were isolated from the samples. Libraries were constructed using sRNA isolates at appropriate concentrations and sequence analysis was performed on a next generation sequencing (NGS) platform. After filtering the NGS reads based on quality score, bioinformatic analyses were performed to characterize 107-260 known and 5-234 potential novel miRNAs in the experimental groups. As a result of the investigation of expression differences between the BALB/C mouse experimental groups, it was determined that a total of 12 miRNAs showed increased expression and 5 miRNAs showed decreased expression in the 1st week and 7th week groups after infection compared to the control group. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyses were performed for these miRNAs that showed differential expression, and unique outputs were provided on the pathways enriched by the genes they regulate in the metabolic process.  RT-qPCR analyses were performed to show the presence and expression levels of four known miRNAs (miR-100, miR-1-3p, miR-9-5p and miR-184) in the circulation of BALB/C mice, which showed fold change and increased expression according to significance level in infection groups, and the results validated the NGS results only for miR-1-3p. This result showed that miR-1-3p could be a potential candidate biomarker for the diagnosis of T. canis infections and could be used in molecular epidemiological studies. As a result, this thesis provides the first data on exosomal miRNAs that can form the basis for further research on the disease, and outputs that can have a high widespread impact on better understanding the pathogenesis of larval T. canis infection on the basis of molecular epidemiology and the development of effective biomarkers at the point of diagnosis.

Key words: biomarker, exosome, miRNA, molecular epidemiology, next generation sequencing, Toxocara canis