Yoğun bakım hastalarından izole edilen Pseudomonas aeruginosa izolatlarının virulans faktörlerinin ve quarum sensing genlerinin belirlenmesi ve baicalin maddesinin biyofilm üzerine etkisinin araştırılması
Determination of virulance factors and quorum sensing genes of Pseudomonas aeruginosa isolates from intensive care unit patients and investigation of the effect of baiucalin on biofilm
Yazar: İLKNUR BIYIK
Danışman: DOÇ. DR. YELİZ TANRIVERDİ ÇAYCI
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı /  Tıbbi Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Amaç: Yoğun bakım hastalarının farklı örneklerinden izole edilen P. aeruginosa (n:136) izolatının biyofilm oluşumunun belirlenip filogenetik yakınlıklarının değerlendirilerek, virülans faktörlerinin üretiminde düzenleyici rolü olan toxA, algD, plcN, plcH, lasB, lasI, lasR, rhII, rhIR varlığının araştırılmasıdır. Ayrıca güçlü biyofilm üreten bakterilerin (3+) seftazidim, kolistin kombinasyonun sinerjik etkinliğinin ve baicalinin biyofilm oluşumunu engelleyici etkisinin belirlenmesidir.
Materyal ve Metot: Biyofilm oluşumunun belirlenmesinde fenotipik yöntemlerden olan mikroplakta absorbans ölçümüne dayalı olarak biyofilm derecelendirilmesi yapıldı. Filogenetik ilişkinin ERIC-2 primerleri kullanılarak RAPD-PZR yöntemiyle araştırıldı. Gen bölglerinin varlığı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi ile saptandı. Biyofilm testi sonucunda 3 + olan suşlara kolistin ve seftazidim kombinasyonun invitro sinerjik etkinliği checkerboard yöntemi ile değerlendirildi. Ayrıca baicalinin biyofilm önleyici etkisi sub-MİK ile belirlendi.
Bulgular: Biyofilm mikroplak yöntemine göre derecelendirme (0,1,2,3) oranları sırası ile %37,5, %44,85, %12,5, %5,15 olduğu belirlenmiştir. Mikroplak yöntemine göre güçlü (3+) biyofilm üretme derecesine sahip olan suşların baicalin sub-MİK değerinin 512 µg/ml olduğu belirlenmiştir. Seftazidim, kolistin kombinasyonunda sinerji oluşumu gözlemlenmemiştir. Gen pozitifliklerinin sırasıyla (toxA, plcH, algD, lasB, plcN; intakt ve internal quarum sensing (lasI, lasR, rhlI ve rhlR)) %87,50, %99,26, %100, %100, %100, %93,38, %83,08, %98,52, %93,38; %95,58, %97,05, %100, %98,52. Filogenetik yakınlıklarının belirlenmesi için RAPD-PZR yapılarak dendograma çizilmiş; 10-113, 109-39, 50-53, 35-78, 40-74, 45-95-97, 103-49, 133-66, 23-34, 14-28, 1-19, 22-6, 83-86, 105-32, 125-30, 108-82, 117-88 suşlarının kökenlerinin aynı olabileceği belirlenmiştir.
Sonuç: Yoğun bakımdan izole edilen P. aeruginosa suşlarının biyofilm üretim, belirlenen virülans gen pozitiflik ve çoklu antibiyotik direnç oranının yüksek olduğu, fakat filogenetik yakınlıklarının %80 eşik değerinde benzerliklerin olduğu belirlenmiştir. Yüksek biyofilm üreten suşlarda seftazidim, kolistin antibiyotiklerinin sinerjik etki gözlemlenmemiş olup, biyofilme baicalinin belli konsantrasyonunun etkili olduğu belirlenmiştir.

Abstract:
Objective: To determine the biofilm formation of P. aeruginosa (n:136) isolates isolated from different samples of intensive care patients, to evaluate their phylogenetic affinities and to investigate the presence of toxA, algD, plcN, plcH, lasB, lasI, lasR, rhII, rhIR which have a regulatory role in the production of virulence factors. In addition, to determine the synergistic efficacy of ceftazidime, colistin combination and the inhibitory effect of baicalin on biofilm formation in strong biofilm producing bacteria (3+).
Materials and Methods: Biofilm grading was performed based on absorbance measurement in microplate, which is one of the phenotypic methods for determining biofilm formation. Phylogenetic relationship was investigated by RAPD-PZR method using ERIC-2 primers. The presence of gene regions was determined by polymerase chain reaction (PCR). The in vitro synergistic efficacy of colistin and ceftazidime combination on strains with 3+ biofilm test results was evaluated by checkerboard method. In addition, the anti-biofilm effect of baicalin was determined by sub-MIC.
Results: According to the biofilm microplate method, the rates of grading (0,1,2,3) were 37.5%, 44.85%, 12.5%, 5.15%, respectively. According to the microplate method, the baicalin sub-MIC value of the strains with strong (3+) biofilm production was determined to be 512 µg/ml. No synergy was observed in the combination of ceftazidime and colistin. Gene positivity rates (toxA, plcH, algD, lasB, plcN; intact and internal quorum sensing (lasI, lasR, rhlI and rhlR)) were 87.50%, 99.26%, 100%, 100%, 100%, 100%, 93.38%, 83.08%, 98.52%, 93.38%; 95.58%, 97.05%, 100%, 98.52%, respectively. RAPD-PZR was performed to determine their phylogenetic affinities and dendograms were drawn; it was determined that the strains 10-113, 109-39, 50-53, 35-78, 40-74, 45-95-97, 103-49, 133-66, 23-34, 14-28, 1-19, 22-6, 83-86, 105-32, 125-30, 108-82, 117-88 may have the same origin.
Conclusion: Biofilm production, virulence gene positivity and multiple antibiotic resistance rates of P. aeruginosa strains isolated from intensive care unit were found to be high, but phylogenetic similarities were determined at 80% threshold. No synergistic effect of ceftazidime, colistin antibiotics was observed in high biofilm producing strains, and it was determined that certain concentration of baicalin was effective on biofilm.