Yetişkin leydig hücrelerinin farklanmaları sırasında osteokalsinin testosteron ve ınsl3 sentezine etkisinin araştırılması
Effects of osteocalcin on synthesis of testosteron and insl3 during adult leydig cell differentation
Yazar: GÜLFİDAN COŞKUN
Danışman: PROF. DR. SAİT POLAT
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Etan = Ethane ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Leydig hücreleri = Leydig cells ; Osteokalsin = Osteocalcin ; Somatomedinler = Somatomedins ; Testosteron = Testosterone ; Yetişkinler = Adults

Özet:
Testosteron, üreme sistemi başta olmak üzere çeşitli organ ve dokuların fonksiyonlarında rol oynayan önemli bir steroid hormondur. Testosteronun insan hayatı boyunca iskelet gelişimi ve kemik sağlığı için gerekli olduğu bilinmektedir. Kemik metabolizmasında kritik role sahip bir diğer hormon olan İnsülin Benzeri Faktör-3 (INSL3), testosteron gibi prenatal ve postnatal dönemde Leydig hücrelerinde üretilir. INSL3 ekspresyonunun, Leydig hücrelerinin gelişim sürecini ve fonksiyon kapasitelerini yansıttığı bilinmektedir. Ancak literatürde testisteki sentezi ve regülasyonuna ilişkin henüz yeterli kanıt bulunmamaktadır. Kemik yapımından sorumlu osteoblastlardan salınan Osteokalsin (OC) de pankreasta B hücre proliferasyonu ve insülin sekresyonunu uyarması dışında, Hipotalamo-Hipofiziyer-Gonad (HPG) aksından bağımsız olarak, testiste Leydig hücrelerinde testosteron üretimini indüklemektedir. Fetal ve yetişkinlik döneminde 2 farklı jenerasyondan gelişen Leydig hücreleri, proliferasyon ve farklanmalarını pubertede tamamlarlar. Çok sayıda çalışmada postnatal normal gelişim süreci dışında, Etan Dimetan Sülfonat (EDS) uygulaması sonrasında yetişkin Leydig hücre popülasyonunun elimine edildiği ve tekrar prolifere oldukları rapor edilmiştir. Literatürde kemik ve testis arasındaki ilişkiyi destekleyen birçok çalışma bulunmasına rağmen, OC'in Leydig hücre gelişimine ve bu süreçte testosteron ve/veya INSL3 sentezi üzerine olası etkileriyle ilgili herhangi bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu çalışmada yetişkin Leydig hücrelerinin farklanmaları sırasında, testosteron ve INSL3 sentezinin OC aracılı regülasyonun incelenmesi ve OC'in olası etkilerinin Lüteinizan Hormon (LH) ile karşılaştırılması amaçlandı. 
Otuz iki adet prepubertal sıçan ile EDS enjeksiyonu yapılan 40 adet yetişkin sıçandan oluşan 2 ana grup oluşturuldu. Her bir grup kendi içinde 4 alt gruba ayrıldı. Postnatal 35-63. günler ile EDS uygulamasını takip eden 35.-63. günler arasında, bu alt gruplara Gonadotropin Salgılatıcı Hormon (GnRH) antagonisti ve/veya OC uygulamaları yapıldı. Yetişkin Leydig hücrelerinin gelişimini tamamladıkları 63. günün sonunda, sakrifiye edilen deneklerden elde edilen testis doku örnekleri, ışık ve elektron mikroskobik, immünohistokimyasal ve biyokimyasal yöntemlerle incelendi.
Yalnızca GnRH antagonisti uygulanan gruplara ait testis doku kesitlerinde, ışık ve elektron mikroskobik düzeyde seminiferöz tübüller ve Leydig hücrelerinde belirgin dejenerasyon, 3βHSD, INSL3 ve GPRC6A ekspresyonları ile Leydig hücre sayısı ve serum LH, testosteron, ucOC (Ankarboksile Osteokalsin) seviyelerinde belirgin bir azalma izlendi. GnRH antagonisti ile osteokalsin uygulanan grupların testis doku kesitlerinde ise, ışık ve elektron mikroskobik düzeyde kısmen bir düzelmenin olduğu, 3βHSD, INSL3 ve GPRC6A ekspresyonlarında ve serum testosteron seviyesinde kısmi bir artışın gerçekleştiği tespit edildi. Yalnızca osteokalsin uygulanan gruplara ait testis doku kesitlerinin ışık ve elektron mikroskobik bulgularının kontrol gruplarına benzediği görüldü. Leydig hücre sayısında anlamlı bir farklılık görülmezken, INSL3 ve GPRC6A ekspresyonlarında ve serum testosteron, ucOC seviyelerinde anlamlı bir artışın varlığı dikkati çekti.
Bütün bulgular birlikte değerlendirildiğinde; yetişkin Leydig hücrelerinin normal postnatal gelişim süreci ve EDS uygulaması sonrası rejenerasyonları sırasında, yalnızca osteokalsin uygulamasının, Leydig hücre sayısında anlamlı bir farklılık oluşturmadığı, ancak mevcut Leydig hücrelerinin fonksiyonunu artırıcı yönde etki ederek, testosteron seviyesini yükselttiği belirlendi. Osteokalsin-testosteron ve osteokalsin-INSL3 arasındaki pozitif ilişkinin, in vivo koşullarda LH'dan tamamen bağımsız olmadığı sonucuna varıldı.

Abstract:
Testosterone is an important steroid hormone that plays a role in the functions of various organs and tissues, especially the reproductive system. Testosterone is known to be essential for skeletal development and bone health throughout human life. Insulin Like Factor-3 (INSL3) is an another hormone that plays a critical role in bone metabolism, produced by prenatal and postnatal Leydig cells such as testosterone. It is known that INSL3 expression reflects the development process and functional capacities of Leydig cells. However, there is not enough evidence in the literature about its synthesis and regulation in the testis. Osteocalcin (OC) released from osteoblasts responsible for stimulating pancreatic B cell proliferation and insulin secretion, induces testosterone production in Leydig cells independent from HPG (Hypothalamo-Pituitary-Gonad) except for bone formation. Leydig cells that develop from 2 different generations during fetal and adulthood, complete their proliferation and differentiation mainly in puberty. In many studies, it has been reported that the adult Leydig cell population is eliminated and regenerated by Ethane Dimethane Sulphonate (EDS) administration, except for the postnatal normal developmental process. Although there are many studies supporting the relationship between bone and testis in the literature, any studies have been encountered about the possible effects of OC on testosterone and/or INSL3 synthesis during Leydig cell development. In this study, it was aimed to investigate OC-mediated regulation of testosterone and INSL3 synthesis and compare the possible effects of OC and LH (Luteinizing Hormone) during differentiation of adult Leydig cells.
Rats were divided into 2 groups: 32 prepubertal rats and 40 adult EDS injected rats. Each group was divided into 4 subgroups. Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) antagonist and/or OC were applied to these subgroups between prepubertal 35-63 days and between 35-63 days following EDS administration. At the end of the 63th day when adult Leydig cells completed their development, testicular tissue samples obtained from the sacrificed rats were examined by light and electron microscopic, immunohistochemical and biochemical methods.
Significant degeneration in seminiferous tubules and Leydig cells in light microscopic and electron microscopic levels, down-regulation in 3βHSD, INSL3 and GPRC6A expressions, reduction in Leydig cell counts and serum LH, testosterone, ucOC levels were observed in testicular tissue sections of GnRH antagonist treated groups. Slight up-regulation in 3βHSD, INSL3 and GPRC6A expressions, increase in serum testosterone levels with a partial improvement in light and electron microscopic levels were observed in the testis tissue sections of the groups treated with GnRH antagonist and osteocalcin. Light and electron microscopic findings of testicular tissue sections in osteocalcin-treated groups were similar to control groups. While there was no significant difference in the number of Leydig cells, the presence of a significant increase in INSL3 and GPRC6A expressions, serum testosterone and ucOC levels were remarked.
When all the findings are evaluated together; it was determined that the application of osteocalcin did not make a significant difference in the number of Leydig cells, but increases the level of testosterone by improving the function of existing adult Leydig cells during normal postnatal developmental process and post-EDS regeneration. This positive association between osteocalcin-testosterone and osteocalcin-INSL3 was concluded to be independent from LH in vivo conditions.