Leishmania SPP. plasmodium SPP. ve toxoplasma gondii'nin gerçek zamanlı polimeraz zincirleme tepkimesi ile tanısı: Limit saptama
Diagnosis of leishmania sPP., plasmodium SPP. and toxoplasma gondii with polymerase chain reaction: Limit determination
Yazar: TUBA OYUR KURT
Danışman: PROF. DR. AHMET ÖZBİLGİN
Celal Bayar Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Leishmania = Leishmania ; Paraziter hastalıklar = Parasitic diseases ; Plasmodium = Plasmodium ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Teşhis = Diagnosis ; Toksoplazma = Toxoplasma ; Toxoplasma gondii = Toxoplasma gondii ; Toxoplasma gondii = Toxoplasma gondii

Özet:
AMAÇ: Kan ve dokularda yerleşen paraziter hastalıklar insan sağlığı için dünya çapında büyük tehlike oluşturmaktadır. Bunlar arasında yer alan sıtma, leishmaniasis ve toksoplazmosis her yıl çok sayıda kişinin hayatını kaybetmesine neden olmakta, oluşturdukları hastalık tablosunun tedavisi ve bireysel iş gücü kaybı nedeniyle de ülke ekonomilerine de büyük yük getirmektedir. Sıtma, Plasmodium cinsi protozoonların yol açtığı, tüm dünyada her yıl 300 milyondan fazla kişinin enfekte olduğu ve bu kişilerden en az bir milyonunun ölümüne neden olan ciddi bir enfeksiyon hastalığıdır. Türkiye'nin anofel cinsi sivrisineklerin yaşama ve üremesi için uygun bir iklim kuşağında yer alması sıtmanın ülkemiz için sürekli bir tehdit olmasına yol açmaktadır. Leishmaniasis de vektör aracığıyla insanlara bulaşabilen ve gelişmekte olan ülkelerde ciddi halk sağlığı sorunları yaratan bir parazit hastalığıdır. Dünya Sağlık Örgütü'nün verilerine göre, bugün tüm dünyada toplam 98 ülke ve yaklaşık 12 milyon insan leishmaniasis'e yakalanmış durumda olup 350 milyon kişi ise risk altındadır. Toksoplasmoz ise hücre içi protozoon olan Toxoplasma gondii'nin neden olduğu zoonotik karakterli bir hastalık olup insanlara kedi dışkısında bulunan ookistlerin kirli su ve yiyeceklerle ağız yoluyla alınmasıyla, pişmemiş et yenilmesiyle, organ nakliyle ve laboratuvar enfeksiyonuyla bulaştığı bilinmektedir. İmmün sistemi sağlıklı bireylerde toksoplazmosis bazen semptomsuz geçirilse de, bağışıklık sistemi zayıf hastalarda ölümcül beyin iltihaplarıyla kendini gösterebilmektedir. Ayrıca, gebeliğin ilk 3 ayında alınan toksoplazmosis nedeniyle fetüs ya ölü doğmakta ya da çeşitli nörolojik hasarlarla dünyaya gelmektedir. Bu ve benzeri tehlikeli enfeksiyon hastalıklarının tanısı için örnek almak da bazen güç olabilmekte ve geleneksel yöntemlerle etken saptanamayabilmektedir. Bu gibi durumlarda tanı genellikle duyarlılık ve özgünlüğü yüksek polimeraz zincirleme tepkimesi (PZR) ile konulabilmektedir. PZR'nin sonradan geliştirilen gerçek zamanlı uygulaması (Gerçek Zamanlı PZR [GZ-PZR]), daha hızlı sonuç vermesi ve kontaminasyon riskinin düşük olması nedeniyle geleneksel PZR'den daha sık tercih edilmektedir. Tanısal özgünlük ve duyarlılığı son derece yüksek GZ-PZR yöntemi ile paraziter hastalıklara tanı konulabilmektedir. Bununla birlikte, parazit sayısının bazı örneklerde son derece az olduğu düşünüldüğünde her bir paraziter ajanın GZ-PZR testindeki tanısal duyarlılığının bilinmesi son derece önemlidir. Bu çalışmanın amacı, Türkiye için önemli üç parazitin (Plasmodium spp., Leishmania spp. ve T. gondii) GZ-PZR ile tanısında en örneğin mikrolitresinde az kaç parazit bulunduğunda sonuç alınabildiğinin belirlenebilmesi, test koşullarının belirlenip protokolün oluşturulması suretiyle GZ-PZR testinin rutin sağlık hizmetlerine dahil edilmesidir.
GEREÇ ve YÖNTEM: Çalışma için Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı'nda sıvı azot içinde -196°C'de saklanmakta olan Leishmania tropica ve Leishmania infantum, Plasmodium falciparum ve Plasmodium vivax ile Toxoplasma gondii parazitleri canlandırılmış ve her biri mililitrede 107 parazit olacak şekilde PBS solüsyonu ile süspanse edilmişlerdir. Bu karışımdan parazitlerin PBS solüsyonu mikrolitrede 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 2500, 5000 ve 10.000 parazit olacak şekilde dilüsyon yapılmıştır. Daha sonra bu tüpler tek tek kullanılarak farklı GZ-PZR ile reaksiyonun pozitif sonuç verdiği en ileri dilüsyon tespit edilmiştir. Saptanan pozitif dilüsyon ile negatif saptanan bir önceki dilüsyon arası tekrar dilüsyon yapılarak en düşük parazit sayısı saptanmıştır
BULGULAR: Yapılan GZ-PZR testinde Plasmodium falciparum, Leishmania tropica (promastigot), Leishmania infantum (promastigot), Leishmania tropica (amastigot), Leishmania infantum (amastigot) parazitlerinde en düşük parazit sayısı 10 olarak bulunurken, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii parazitlerinde parazit sayısı 12 olarak bulunmuştur.
SONUÇLAR: Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii'nin gerçek zamanlı polimeraz zincirleme tepkimesi ile tanısında örneklerdeki düşük sayıdaki parazitleri bile başarı ile saptaması bu testin her üç parazitin moleküler tanısında güvenle kullanılabilineceğini düşündürmüştür.

Abstract:
AIM: Parasitic diseases that involve blood and tissues may pose a significant threat to human health. Among these, malaria, leishmaniasis and toxoplasmosis kill thousands of people worldwide annually, while bringing outstanding burden to developing economies for the treatment of patients and the loss of work power. Malaria is caused by the protozoa that belong to Plasmodium genus, and infects more than 300 million people worldwide, killing over 1 million, annually. Turkey's being a suitable habitat for Anopheles species, puts it under a continuous threat for malaria. Leishmaniasis is also a vector-borne disease that causes devastating public health effects in developing countries. According to the data of World Health Organization, there are 12 million people with leishmaniasis today in 98 countries, while 350 million are under the risk of the infection. Toxoplasmosis is a zoonotic disease caused by the intracellular protozoon, Toxoplasma gondii. It is transmitted to humans through various ways such as ingestion of the oocysts present in the stools of cats; ingestion of raw or undercooked meat; organ transplantation or laboratory infection. It may be a non-symptomatic infection in healthy individuals, but is associated with life-threatening brain infections in immunocompromised individuals. In addition, due to toxoplasmosis acquired in the first three months of pregnancy, fetus may die or born with neurological defects. Taking body samples for the diagnosis of such dangerous infections is sometimes difficult and the causative agent may not be detected with conventional diagnostic methods. Such cases are necessarily diagnosed with polymerase chain reaction (PCR) today. Advanced application of PCR, the Real Time PCR (RT-PCR), is preferred more common today compared to conventional PCR, due to its advantages such as faster application and lower contamination risk. Parasitic infections can also be diagnosed with RT-PCR owing to its specificity and sensitivity. However, since parasitic load may be extremely low in some cases, it is essential to know the limits of the diagnostic sensitivity of RT-PCR for each parasitic agent. The aim of the present study is to determine the lowest number of parasites at when the RT-PCR for each Plasmodium spp., Leishmania spp. and T. gondii turn from negative to positive results, and thus allocate the standards of these RT-PCR applications to routine health services after the conditions are settled.
MATERIALS AND METHODS: Isolates of Leishmania tropica, Leishmania infantum, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax and Toxoplasma gondii kept in liquid nitrogen at -196°C in Celal Bayar University Faculty of Medicine Department of Parasitology were revived and suspensions of each were prepared with PBS having 107 parasites in a mililitre. Serial dilutions were then prepared from each isolate having 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 2500, 5000 and 10.000 parasites in a mililitre. Real Time PCR (RT-PCR) tests were conducted with each dilution with an aim to determine the highest dilution with the positive outcome. The lowest number of positive RT-PCR test with each parasite were finally determined by making further dilution between the first positive and the following negative one. 
RESULTS: Our assessments showed that the lowest number of parasites necessary for positive RT-PCR were 10 for Plasmodium falciparum, Leishmania tropica (promastigotes), Leishmania infantum (promastigotes), Leishmania tropica (amastigotes), Leishmania infantum (amastigotes), while 12 for Plasmodium vivax and Toxoplasma gondii. 
CONCLUSIONS: These results show that, RT-PCR is a reliable diagnostic option for the detection of Leishmania spp., Plasmodium spp. and Toxoplasma gondii, even for infections with low parasitemia.