Çoklu doymamış yağ asitlerinin beyindeki mikrogliyalar üzerindeki etkilerinin in vitro yöntemlerle araştırılması
Investigation of the effects of polyunsaturated fatty acids on microglia in the brain by in vitro methods
Yazar: HANDENAZ DERE YELKEN
Danışman: DOÇ. DR. PERİM FATMA TÜRKER
Başkent Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Beslenme ve Diyetetik Ana Bilim Dalı / Beslenme ve Diyetetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Beslenme ve Diyetetik = Nutrition and Dietetics
Dizin: Beyin = Brain ; Hücre canlılığı = Cell survival ; Mikroglia = Microglia ; Nöroinflamatuar hastalıklar = Neuroinflammatory diseases ; Nörojenik inflamasyon = Neurogenic inflammation ; Yağ asitleri-doymamış = Fatty acids-unsaturated ; Yağ asitleri-omega 3 = Fatty acids-omega 3 ; Yağ asitleri-omega 6 = Fatty acids-omega 6 ; İn vitro = In vitro

Özet:
Bu çalışmada nöroinflamasyona etkisi olabileceği düşünülen omega-6 (Ω-6), omega-3 (Ω-3) ve beslenme biliminde farklı diyet modellerine işaret eden her bir omega-6/omega-3 oranının mikrogliyalar ve bunlardan salınan sitokinlerin üzerindeki etkisini saptamak amaçlanmıştır. Çalışma Ankara Sağlık Bilimleri Üniversitesi Gülhane Sağlık Bilimleri Enstitüsü Kök Hücre Merkezi laboratuvarında, 2022 yılı Temmuz ayında gerçekleştirilmiştir. Çalışma, mikrogliyalardan salınan mediyatörler ile çoklu doymamış yağ asitleri (ÇDYA)'nin farklı oranları arasındaki ilişkiyi aydınlatmak için yapılan özgün bir vitro araştırma olma niteliğini taşımaktadır. Mikrogliyalar Dulbecco's Modification of Eagle's Medium besi yerinde çoğaltılmış ve 1μg/ml LPS ile inkübe edilmiştir. Ω-3 olarak eikosapentanoik asit, Ω-6 olarak linoleik asit kullanılmıştır. Toplamda 6 çalışma grubu oluşturulmuştur. 1.Grup kontrol grubu [Hücre kültürüne sadece dimetil sülfoksit (DMSO) eklenmiştir.], 2.Grup Ω-3, 3.Grup Ω-6, 4.Grup; Ω-6:Ω-3=15:1 oranı, 5.Grup Ω-6:Ω-3=7:1 oranı, 6.Grup Ω-6:Ω-3=2:1 oranı oluşturularak karıştırılmıştır. Yağ asitleri DMSO içerisinde emülsifiye edilerek mikrogliyalar üzerine uygulanmıştır. Sonrasında tiazolil mavi tetrazolium bromür deneyi yapılarak canlılıkları ölçülmüştür. ELISA yöntemi kullanılarak mikrogliyalardan salınan sitokinlerin (TNF-α, IL-17, IL-1β, IL-6, IL-4, IL-10) tayini yapılmıştır. 30 μM'lık yağ asidi müdahalesi sonrasında Ω-6 grubunda diğer tüm Ω-3 içeren ÇDYA gruplarına kıyasla daha az sayıda hücre canlılığı görülmüştür (p<0.01). 10 μM yağ asidi uygulaması sonrasında Ω-3 grubunda en yüksek sayıda canlı hücre saptanmıştır (p<0.05). TNF-α salınımı kontrol grubuna kıyasla diğer tüm yağ asidi gruplarında (Ω-3, Ω-6, 15/1, 7/1, 2/1 grupları) anlamlı olarak daha düşük saptanmıştır (p<0.01). IL-4 ELISA testi tek başına Ω-6 yağ asidi uygulanan grupta IL-4 sekresyonu diğer gruplara (Ω-3, 15/1, 7/1, 2/1) kıyasla daha yüksek bulunmuştur (p<0.05). IL-10 ELISA testi sonucunda kontrol grubuna kıyasla 7/1 oranındaki ÇDYA uygulamasında mikrogliyalardan daha az miktarda IL-10 sekresyonu olmuştur (p<0.05). IL-6 sitokin sekresyonunun en az olduğu grup 2/1 grubudur (p<0.05). DMSO kontrol grubunda ve Ω-3 takviyesi yapılan grupta lipit oksidayonunu gösteren malondialdehit (MDA)'e rastlanılmamıştır. Araştırmanın
iii
sonuçlarına göre, ÇDYA uygulaması yapılan tüm gruplarda kontrol grubuna kıyasla inflamatuvar sitokin salınımı (TNF- α) azalmıştır. Yüksek oranlarda Ω-6 tüketiminin inflamatuvar sitokin salımını (IL-6) arttığı ve antiinflamatuvar sitokin salımını (IL-10) azalttığı görülmüştür. Yağ asidi oranlarındaki değişimin nöroinflamasyonla ilişkili bazı parametrelere olan etkisini saptamak ve bu konu hakkında net bir kanıta ulaşabilmek için daha çok çalışmaya ihtiyaç vardır.

Abstract:
In this study, it was aimed to determine the effect of omega-6 (Ω-6), omega-3 (Ω-3) which is thought to have an impact on neuroinflammation, and each omega-6/omega-3 ratio on microglia and cytokines released from them. The study was carried out in Ankara Health Sciences University Gulhane Health Sciences Institute Stem Cell laboratory in July 2022. The study is an original in vitro study to elucidate the relationship between mediators released from microglia and different rates of PUFA. Microglia were propagated in Dulbecco's Modification of Eagle's Medium and incubated with 1μg/ml LPS. Eicosapentanoic acid was used as Ω-3 and linoleic acid was used as Ω 6. In total, 6 groups were formed. 1.Group control group [Only dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to the cell culture.], 2.Group Ω-3, 3.Group Ω-6, 4.Group; Ω-6:Ω-3=15:1 ratio, 5th Group Ω-6:Ω-3=7:1 ratio, 6th Group Ω-6:Ω-3=2:1 ratio were formed and mixed.Fatty acids were emulsified in DMSO and applied to microglia. Afterward, their viability was measured by performing the thiazolyl blue tetrazolium bromide experiment. The cytokines released from microglia (TNF-α, IL-17. IL-1β, IL-6, IL-4, IL-10) were determined using the ELISA method. After 30 μM fatty acid intervention, less cell viability was observed in the Ω-6 group compared to all other Ω-3-containing PUFA groups (p<0.01). After 10 μM fatty acid application, the highest number of viable cells was detected in the Ω-3 group (p<0.05). TNF-α secretion was found to be significantly lower in all other fatty acid groups (Ω-3, Ω-6, 15/1, 7/1, 2/1 groups) compared to the control group (p<0.01). In the IL-4 ELISA test, IL-4 secretion was found to be higher in the group administered Ω-6 fatty acid alone compared to the other groups (Ω-3, 15/1, 7/1, 2/1) (p<0.05). As a result of 10 ELISA tests, there was less IL-10 secretion from microglia in the 7/1 PUFA application compared to the control group (p<0.05). The group with the lowest IL-6 cytokine secretion was the 2/1 group (p<0.05). and malondialdehyde (MDA) showing lipid oxidation was not found in the group supplemented with Ω-3. According to the study's results, inflammatory cytokine release (TNF-α) was decreased in all PUFA-applied groups compared to the control group. Inflammatory cytokine release (IL-6) increased and decreased the release of anti-
v
inflammatory cytokine (IL-10). More studies are needed to determine the effect of the change in fatty acid ratios on neuroinflammation and to reach clear evidence.