Pullulanazın enkapsülasyon ile modifikasyonu ve kararlılığının incelenmesi
Modification of the pullulanase with encapsulation and investigation of stability
Yazar: ELİF GEDİKOĞLU
Danışman: PROF. DR. AYŞEGÜL PEKSEL ; DOÇ. DR. MUSA KAMACI
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: DNS = DNS ; Enzim immobilizasyonu = Enzyme immobilization ; Karboksimetil selüloz = Carboxymethylcellulose ; Polivinil alkol = Polyvinyl alcohol ; Pullulanaz = Pullulanase

Özet:
Enzim immobilizasyonu, enzimin verimli bir şekilde katalize etme görevini gerçekleştirebilmesi için serbest enzimin bir materyalde tutuklanması ya da fiziksel olarak belirli bir bölgede kısıtlanması anlamına gelmektedir. İmmobilizasyondan sonra, enzimin katalitik performansı ve kararlılığı artmaktadır. Pullulanaz, pullulan, amilopektin ve diğer nişastalı polisakkaritlerin α(1→6) glukozidik bağlarını ayıran önemli bir enzimdir. Bu çalışmada, pullulanazın polivinil alkol (PVA) jel içerisinde ve karboksimetil selüloz-polivinil alkol (CMC-PVA) jel karışımı içerisinde tutuklama metoduyla immobilizasyonu ve immobilizasyon sonrası bazı özelliklerinin belirlenerek serbest enzimle karşılaştırılması amaçlandı. İlk olarak pullulanazın, PVA-Jel ve CMC-PVA-Jel içerisinde tutuklama yöntemiyle immobilizasyonları gerçekleştirildi. Çalışmada, 3,5-Dinitrosalisilik asit (DNS) metodu kullanılarak immobilize enzimlerin en yüksek aktiviteye sahip olduğu optimum pH değerleri PVA-Jel enzim için 6, CMC-PVA-Jel enzim için 6, serbest enzim için ise 5 olarak bulundu. İmmobilize enzimlerin optimum sıcaklık değerleri PVA-Jel enzim için 50 °C, CMC-PVA-Jel enzim için 50 °C, serbest enzim için ise 30 °C olarak tespit edildi. İmmobilize enzimlerin değişen pH ve sıcaklık koşullarında kararlılığının incelenebilmesi amacıyla değişen sıcaklık ve pH koşullarında termal ve pH kararlılığı çalışmaları gerçekleştirildi. Serbest ve immobilize enzimlerin en yüksek aktiviteye sahip olduğu optimum koşullarda altı hafta boyunca +4 °C' de depo kararlılıkları incelendi. Ayrıca, enzim aktiviteleri üzerine dört farklı (% 0,1 a/h, %1 a/h, %2 a/h, %5 a/h) substrat konsantrasyonunun etkisi incelendi. Lineweaver-Burk eğrisi kullanılarak serbest enzimin ve immobilize enzimlerin Km sabitleri sırasıyla PVA-Jel enzim için 0,054 mg glu/mL, CMC-PVA-Jel enzim için 0,013 mg glu/mL, serbest enzim için 0,065 mg glu/mL olarak;  maksimum hızları (Vmak) ise sırasıyla PVA-Jel enzim için 1,01 U/mL, CMC-PVA-Jel enzim için 0,88 U/mL, serbest enzim için 0,93 U/mL olarak bulundu. Serbest ve immobilize enzimler için aktivasyon enerjileri (Ea) hesaplandı. Ea değerleri sırasıyla, PVA-Jel enzim için 0,64 J/mol, CMC-PVA-Jel enzim için 0,31 J/mol, serbest enzim için 0,35 J/ mol olarak bulundu. Çalışmada oluşturulan PVA-Jel enzim ve CMC-PVA-Jel enzim Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FT-IR) cihazı kullanılarak karakterize edildi. Elde edilen polivinil alkol (PVA), karboski metil selüloz (CMC) içeren jellerin ısı karşısındaki davranışları Perkin-Elmer Pyris Sapphire Termogravimetrik Analiz (TGA) cihazı kullanılarak aydınlatıldı.   PVA veya CMC içeren jellerin termal geçiş sıcaklıkları ise Perkin-Elmer Pyris Sapphire Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) cihazı kullanılarak belirlendi. Çalışma sonucunda elde edilen bilgiler ışığında, iki farklı yöntemle yapılan immobilize enzimlerin, ısıl işlem gerektiren ve bazik ortamda gerçekleşmesi gereken endüstriyel proseslerde serbest enzime göre çok daha avantajlı bir seçim olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
Enzyme immobilization means that the free enzyme is trapped in a material or physically restricted in a specific region so that the enzyme can perform its catalyzing task efficiently. The catalytic performance and stability of the enzyme increase after the immobilization. Pullulanase is an important enzyme that cleaves α(1→6) glucosidic bonds of pullulan, amylopectin and other starchy polysaccharides. In this study aimed to immobilize the pullulanase into polyvinyl alcohol (PVA) gel and carboxymethyl cellulose-polyvinyl alcohol (CMC-PVA) gel mixed by the entrapment method and compare it with the free enzyme by determining some properties after the immobilization. Firstly, the immobilization of the pullulanase into the PVA-Gel and the CMC-PVA-Gel was performed by the entrapment method. In the study, optimum pH values with the highest activity of immobilized enzymes using the 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) method were found to be 6 for the PVA-Gel enzyme, 6 for the CMC-PVA-Gel enzyme and 5 for free enzyme. The optimum temperature values of immobilized enzymes were determined as 50 °C for the PVA-Gel enzyme, 50 °C for the CMC-PVA-Gel enzyme and 30 °C for the free enzyme. In order to examine the stability of the immobilized enzyme under changing pH and temperature conditions, thermal and pH stability studies were carried out under varying temperature and pH conditions. The storage stability was investigated for six weeks under optimum conditions where the free and immobilized enzymes have the highest activity. In addition, the effects of four substrate concentrations (0.1% w/v, 1.0% w/v, 2.0% w/v, 5.0% w/v) on enzyme activities were investigated. The Km constants of the free enzyme and the immobilized enzymes were found to be 0.054 mg glu/mL for the PVA-Gel enzyme, 0.013 mg glu/mL for the CMC-PVA-Gel enzyme, 0,065 mg glu/mL for the free enzyme, respectively  and the maximum rate (Vmax) were found to be 1.01 U/mL for the PVA-Gel enzyme, 0,88 U/mL for the CMC-PVA-Gel enzyme and 0.93 U/mL for free enzyme respectively, by using the Lineweaver-Burk curve. Activation energies (Ea) for the free and immobilized enzymes were calculated. The Ea values were found to be 0.64 J/mol for the PVA-Gel enzyme, 0.31 J/mol for the CMC-PVA-Gel enzyme, and 0.35 J/mol for the free enzyme, respectively. The PVA-Gel enzyme and the CMC-PVA-Gel enzyme formed in the study were characterized using Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) device. The thermal behavior of the obtained gels containing polyvinyl alcohol (PVA), and carboxy methyl cellulose (CMC) was elucidated using the Perkin-Elmer Pyris Sapphire Thermogravimetric Analysis (TGA) device. The thermal transition temperatures of the gels containing PVA or CMC were determined using the Perkin-Elmer Pyris Sapphire Differential Scanning Calorimetry (DSC) device. In the light of the information obtained as a result of the study, it is thought that the immobilized enzymes made by two different methods are a much more advantageous choice than the free enzyme in case of  industrial processes that require heat treatment and need to be carried out in a basic environment.