Anopheles sacharovi nesillerinde sterol taşıyıcı protein-2 geninin moleküler karakterizasyonu ve ekspresyon analizleri
Molecular characterization and expression analysis of the sterol-carrier protein-2 gene in anopheles sacharovi generations
Yazar: SÜMEYYE AYGÜN
Danışman: PROF. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Anopheles = Anopheles ; Anopheles sacharovi = Anopheles sacharovi ; Gen ifadesi = Gene expression ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Steroller = Sterols ; Taşıyıcı proteinler = Carrier proteins

Özet:
Bu çalışmada, Türkiye'yi de içine alan Palearktik bölgede geçmişten günümüze Plasmodium vivax sıtmasının en etkin vektörlerinden olan Anopheles sacharovi'de insektler ile biyoteknolojik mücadele kapsamında çeşitli zararlı ve/veya hastalık nakleden insektler için aşı adayı veya hedef ilaç bölgelerinden birisi olarak nitelenen sterol taşıyıcı protein-2 (SCP-2) geninin ilk kez moleküler karakterizasyonunu yapmak ve bu proteini kodlayan genin An. sacharovi gelişim dönemleri ve dişi nesillerin tükürük bezi, orta bağırsak ve yağ dokusu gibi farklı dokularında ekspresyon düzeylerinin karşılaştırılmalı olarak ortaya çıkarmak ve dolayısıyla ilgili alanda literatüre özgün veriler sağlamak amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında Sultan Sazlığı yöresindeki endemik odaklardan toplanan ergin dişi An. sacharovi ve bunlardan insektaryumda elde edilen gelişim dönemleri proje materyalini oluşturmuştur. Morfolojik ve moleküler tür identifikasyonu yapılan An. sacharovi nesilleri ve ergin dişi dokularından total RNA ekstraksiyonunu takiben cDNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen cDNA kalıplarında SCP-2 geninin 216 bp fragmenti optimize edilmiş primerlerle amplifiye edilmiş ve elde edilen amplikonlar sekanslanmıştır. Elde edilen sekansların in-silico analizlerle işlenerek genetik karakterizasyonları sağlanmıştır. Sekans analizine alınan toplam 14 izolata ait SCP-2 nükleotid sekanslarının 12'sinin %100 identik olduğu birbirine homolog olan diğer iki izolata ait SCP-2 sekanslarının ise 183. bazda tek nükleotid değişimi gösterdiği belirlenmiştir. Anopheles sacharovi SCP-2 gen bölgesinin 216 bp fragmentinin 72 amino asit zincirini kodladığı tespit edilmiştir. Filogenetik analiz sonucu SCP-2 gen sekanslarının izolatları sivrisinek türü ve soyu bazında monofiletik olarak kümelendirdiği, An. sacharovi izolatlarının Anopheles kümesi içerisinde An. stephensi ve An. funestus'la birlikte alt küme oluşturduğunu ortaya koymuştur. qPCR'da ekspresyon analizleri sonucunda SCP-2'nin en yüksek ergin erkeklerde ifade olduğu bunu sırasıyla ergin dişi, L4, L3, L2, L1 ve pupa dönemlerinin izlediği belirlenmiştir. Ergin dişi dokularında ise SCP-2'nin en yüksek fatbody'de ifade olduğu bunu sırasıyla midgut ve tükrük bezinin izlediği belirlenmiştir. 
Sonuç olarak bu çalışma vektör potansiyeli ve önemi yüksek olan An. sacharovi için aşı adayı veya hedef ilaç bölgelerinden önemli birisi olan SCP-2 ilk kez karakterizeedilmiş, ve ilgili sivrisineğin gelişim evreleri ve dokularındaki ekspresyonel farklılıklar ortaya konulmuştur. 
Anahtar Kelimeler: Anopheles sacharovi; Ekspresyon Analizleri; Sterol Taşıyıcı Protein-2; Moleküler Karakterizasyon;

Abstract:
In this study, it was aimed to characterize the sterol carrier protein-2 (SCP-2) gene, which is considered as a vaccine candidate or one of the target drug sites for various pests and/or disease-transmitting insects within the scope of biotechnological control against insects, in Anopheles sacharovi, one of the most effective vectors of Plasmodium vivax malaria from past to present, in the Palearctic region including Turkey by molecular methods for the first time, and to reveal the expression levels of An. sacharovi developmental stages and female generations in different tissues such as salivary gland, midgut and adipose tissue, and thus provide specific data to the literature in the relevant field. Within the scope of the study, the adult female An. sacharovi collected from endemic foci in the Sultan Sazlığı region and the developmental stages in the insectarium constituted the project material. cDNA isolation was performed following total RNA extraction from An. sacharovi strains identified with morphological and molecular analyses and adult female tissues. The 216 bp fragment of the SCP-2 gene was amplified with optimized primers in the obtained cDNA templates and was sequenced. Genetic characterization of the obtained sequences was provided by in silico analysis. It was determined that 12 of the SCP-2 nucleotide sequences of 14 isolates included in the sequence analysis were 100% identical and the SCP-2 sequences of the other two isolates that were homologous to each other showed a single nucleotide change at base 183. It was determined that the 216 bp fragment of the An. sacharovi SCP-2 gene region encodes the 72 amino acid chain. Phylogenetic analysis revealed that SCP-2 gene sequences clustered the isolates monophyletically on the basis of mosquito species and strains, and that An. sacharovi isolates formed a subcluster together with An. stephensi and An. funestus within the Anopheles cluster. As a result of qPCR-mediated expression analysis, it was determined that the SCP-2 gene was expressed highest in adult males, followed by adult female, L4, L3, L2, L1 and pupal stages, respectively. In adult female tissue pieces, the SCP-2 gene was expressed the highest in the fat body, followed by the midgut and salivary glands, respectively.
In conclusion, SCP2, which is an important vaccine candidate or target drug site for Anopheles sacharovi with high vector potential and importance, was characterized for the first time with this study and the developmental stages and expression differences in the tissues of the relevant mosquito were revealed.
Keywords: Anopheles sacharovi; Expression analyses; Sterol Carrier Protein-2; Molecular characterization.