Fusobacterium nucleatum'a karşı oluşan antikorların kolorektal kanserin serolojik tanısında değerinin araştırılması
Utility of anti-Fusobacterium nucleatum antibody detection to the serological diagnosis of colorectal cancer
Yazar: MELİKE KURT
Danışman: PROF. DR. ZEKİ YUMUK
Kocaeli Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antikorlar = Antibodies ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Etyoloji = Etiology ; Fusobacterium nucleatum = Fusobacterium nucleatum ; Kolorektal neoplazmlar = Colorectal neoplasms ; Mikrobiyota = Microbiota ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Prekanseröz durumlar = Precancerous conditions ; Seroloji = Serology

Özet:
Giriş ve amaç 
Fusobacterium nucleatum, intestinal mikrobiyotanın değerli bir üyesi olan anaerobik gram negatif bir bakteridir. F.nucleatum, mikrobiyota bakterileri içerisinde denge halinde az sayıda bulunmaktadır ve en önemlisi kolorektal kanserin (KRK) başlangıcında ve gelişiminde rol oynamaktadır. Bu çalışmada,  KRK veya benign kolon hastalığı olanlarda bağırsak lezyon ve normal mukoza dokularındaki F.nucleatum miktarı karşılaştırıldı. Aynı zamanda, KRK tanısında F.nucleatum‟a karşı oluşan antikorların kullanılabilirliğinin araştırılması amaçlanmıştır. 
Gereç ve yöntem 
Çalışmamız, Mayıs 2018 ve Ağustos 2019 tarihleri arasında Kocaeli Üniversitesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi‟ne başvuran KRK hastaları, benign kolon hastalığı olanlar ve kolonoskopi ile kolorektal patolojisi saptanmayan kişiler ile yapıldı. Hastalardan alınan doku ve serum örnekleri çalışmaya kadar -80oC‟de saklandı. Hastaların lezyon dokuları ve normal mukoza dokularındaki F.nucleatum miktarı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (kPZR) (Qiagen,Almanya) yöntemi kullanılarak belirlendi. F.nucleatum‟a karşı oluşan IgA ve IgG antikorları ELISA ile saptandı. ELISA plaklarını kaplamak amacıyla F.nucleatum ATCC 25586 suşu kullanıldı. Her test üç defa tekrar edildikten sonra elde edilen OD değerlerinin ortalaması alındı. Antikorların tanı değeri, ROC eğrisi analizi ile değerlendirildi. 
Bulgular 
F.nucleatum miktarının analizi için, 15 KRK hastası, 26 benign kolon hastalığı olan hasta çalışmaya alındı. Antikor analizi, KRK tanısı olan 22 hastaya, benign kolon hastalığı olan 35 hastaya ve sağlıklı 21 kişiye ait serum örnekleri ile yapıldı. Kolorektal kanser ve normal mukoza dokularında F.nucleatum pozitifliği sırasıyla  %86,6, %66,6 oranlarında saptandı ve kanser dokusunda normal dokuya oranla miktarı fazla bulundu (p<0,05). Begin kolon lezyonlarında ve normal mukoza dokularında sırasıyla %73, %58 oranlarında pozitiflik bulundu ve örneklerdeki miktarlar arasında anlamlı fark bulunmadı (p>0,05). Kolorektal kanserlilerdeki IgA ve IgG antikorları sağlıklılardakine oranla anlamlı derecede artmıştır ve antikorlar pozitif korelasyon gösterdi (p<0,05, R=0,524). ROC eğrisi analizi ile IgA ve IgG antikorunun eğri altında kalan alanlar sırasıyla 0,712, 0,683 Ģeklinde saptandı. IgA için sınır değer 0,246 olarak belirlendiğinde duyarlılık %96, özgüllük %48, IgG için sınır değer 0,055 olarak belirlendiğinde duyarlılık %77, özgüllük %48 olmaktadır.  
Sonuç 
F.nucleatum‟un KRK etiyolojisinde var olabileceği kanısına varılırken, benign kolon lezyonlarında buna benzer bir kanı gelişmemiştir. İleride yapılacak olan çalışmalar ile F.nucleatum‟un sayısındaki artışın kanserleşme üzerine etkisi netleştirilmiş olacaktır. Buna paralel olarak kanserli hastalarda antikor miktarının saptandığı serolojik testler ile KRK teşhisinin konması mümkün olabilir. Bunun için gelecekte daha fazla çalışma yapılması önerilmektedir. 
Anahtar Sözcükler: Fusobacterium nucleatum, ELISA, kPZR, Kolorektal Kanser, Kanser etiyolojisi

Abstract:
Utility of anti-Fusobacterium nucleatum antibody detection to the serological diagnosis of colorectal cancer 
Introduction and purpose 
Fusobacterium nucleatum is an anaerobic gram negative bacterium which is a valuable microbiota member of human intestine. F.nucleatum is generally in small number and having a balance within the microbiota bacteria and most importantly it is playing a role in the onset and development of colorectal cancer (CRC). In this study, the number of F.nucleatum in intestine lesion tissue and normal mucosal tissue were compared in patients with CRC or benign colon disease. Also, it‟s was aimed to investigate the utility of antiF.nucleatum antibodies in the diagnosis of CRC. 
Materials and methods 
Our study was performed with patients with CRC, patients with benign colon disease and people with no colorectal pathology by colonoscopy between May 2018 and August 2019 at Kocaeli University Research and Education Hospital. Tissue and serum samples were stored at -80oC until the study. The amount of F.nucleatum in the lesion tissues and normal mucosal tissues of the patients was determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) (Qiagen, Germany) method. IgA and IgG antibodies against F.nucleatum were detected by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. F.nucleatum ATCC 25586 strain was used to coat ELISA plates. After each test was repeated three times, the OD values obtained were averaged. The diagnostic value of the antibodies was evaluated by ROC curve analysis. 
Results 
For analysis of the amount of F.nucleatum, 15 patients with CRC and 26 patients with benign colon disease were included in the study. Antibody analysis was performed with serum samples of 22 patients with CRC, 35 patients with benign colon disease and 21 healthy controls. F.nucleatum positivity was found 86.6% and 66.6% of CRC and normal mucosal tissues, respectively, and it was found to be higher in cancer tissue compared to normal tissue (p <0.05). Begin colon lesions and normal mucosal tissues were positive in 73% and 58%, respectively, and there was no significant difference between the amounts of F.nucleatum in the samples (p> 0.05). IgA and IgG antibodies in patients with CRC were significantly increased compared to those in healthy participants and showed positive correlation (p <0.05, R = 0.524). ROC curve analysis revealed that the areas under the curve of IgA and IgG antibody were 0.712, 0.683, respectively. When the cut-off value for IgA was determined as 0.246, the sensitivity was 96%, specificity was 48%; when the the cut-off value for IgG was determined as 0.055, the sensitivity was 77%, and the specificity was 48%. 
Conclusion 
While it was concluded that F.nucleatum may be present in the etiology of CRC, no similar conclusion has developed in benign colon lesions. Further studies will clarify the effect of the increase in the number of F.nucleatum on cancer formation. In parallel, it may be possible to establish the diagnosis of CRC by serological tests that determine the amount of antibody in cancer patients. For this, further studies are recommended in the future. 
Keywords: Fusobacterium nucleatum, ELISA, qPCR, Colorectal cancer, Cancer etiology