Bazı termofilik Bacıllus türlerinin termostabil α-glukozidaz üretim kapasiteleri ve enzim/lerin kısmi karakterizasyonu
Thermostable -glucosidase production capacities of some thermophilic Bacillus spp. and partial characterization of enzyme/s
Yazar: ARZU ÇÖLERİ
Danışman: PROF.DR. CUMHUR ÇÖKMÜŞ
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
ÖZETDoktora TeziBAZI TERMOFİLİK BACILLUS TÜRLERİNİN TERMOSTABİL Î±-GLUKOZİDAZÜRETİM KAPASİTELERİ VE ENZİM/LERİN KISMİ KARAKTERİZASYONUArzu ÇÖLERİAnkara ÜniversitesiFen Bilimleri EnstitüsüBiyoloji Anabilim DalıDanışman: Prof.Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞÎ±-Glukozidaz üreticisi termofilik Bacillus spp. izolatlarını belirlemek amacıyla Aydın,Ankara, Denizli, İzmir, Manisa ve Nevşehir illerinde bulunan 46 farklı sıcak sukaynağından toplanan 191 adet örnekden koloni morfolojileri yönünden farklılık gösterentoplam 451 adet termofilik Bacillus izolatı elde edilmiştir. Yüksek amilaz aktivitesinesahip 67 adet termofilik Bacillus izolatı seçilerek izolatların hücre içi ve hücre dışı Î±-glukozidaz üretim kapasiteleri, pNPG substratı kullanılarak belirlenmiştir. İzolatların Î±-glukozidaz üretme kapasiteleri, toplam enzim miktarları baz alınarak belirlenmiş veizolatların pelet yaş ağırlığına göre toplam Î±-glukozidaz miktarları 77.18-0.001 U/ml/garasında bulunmuştur. Yüksek enzim üretme kapasitesine sahip Bacillus sp. A333 (48.64U/ml/g), A343 (10.79 U/ml/g), E134 (32.09 U/ml/g), F84a (36.64 U/ml/g) ve F84b(77.18 U/ml/g) izolatlarının 48 saatlik zamana bağlı Î±-glukozidaz üretimleri, standartolarak kullanılan G. stearothermophilus ATCC 12980 suşu (34.26 U/ml/g) ilekarşılaştırılarak belirlenmiştir. Hücre içindeki maksimum enzim üretimi zamanı 4. saat(A343, E134), 8. saat (F84a, F84b) ve 12. saat (A333) olarak belirlenmiş olup izolatlaragöre değişiklik göstermiştir. Bacillus sp. A333 izolatı hücre dışı, Bacillus sp. A343 izolatise hücre içi Î±-glukozidaz üreticisi olarak seçilmiş ve kısmen saflaştırılan enzimlerin%10'luk N-PAGE ve 4-MUG substratı ile yapılan aktivite analizi sonuçları, A333 veA343 izolatlarında ayırıcı birer enzim bandı yanında standart suşlarda da elektroforetikmobiliteleri aynı olan ortak bir enzim bandı olduğunu göstermiştir. Î±-Glukozidaz enzimidaha sonra N-PAG'deki bu bantlardan ekstrakte edilerek %10'luk SDS-PAGE'deayrılmış ve Bacillus sp. A333 ile A343 enzimlerinin, molekül ağırlıkları 44 ve 60 kDacivarında ikişer adet farklı proteine sahip oldukları belirlenmiştir. A333 Î±-glukozidazıoptimum pH'ı 6.8, optimum aktivite sıcaklığı 60ºC ve pNPG substratına karşı Km değeri1.38 mM olarak bulunurken, bu değerler A343 enzimi için sırasıyla 7.0, 65ºC ve 0.85mM olarak belirlenmiştir. İki izolata ait enzimlerin 20 farklı substrata olan spesifikliği veince tabaka kromatografisi sonuçları A333 Î±-glukozidazının yüksek derecedetransglukozilasyon aktivitesine, A343 enziminin ise geniş substrat spesifikliğine sahipolduğunu göstermiştir. Bunun yanısıra, Bacillus sp. A333 Î±-glukozidazının, A343enzimine göre daha geniş bir pH ve sıcaklık aralığında stabilite gösterdiği ve her ikienzimin de test esilen inhibitörlerin çoğuna dirençli olduğu bulunmuştur. Yapılan buçalışma ile biyoteknolojik uygulamalarda kullanım potansiyeline sahip yeni termostabilekzo-Î±-1,4-glukozidaz üreticisi iki Bacillus sp. izolatı belirlenmiştir.2007, 175 sayfaAnahtar Kelimeler: Termostabil Î±-glukozidaz, glukozil hidrolaz, Bacillus spp.

Abstract:
ABSTRACTPh.D ThesisTHERMOSTABLE Î±-GLUCOSIDASE PRODUCTION CAPACITIES OF SOMETHERMOPHILIC BACILLUS Spp. AND PARTIAL CHARACTERIZATION OFENZYME/SArzu ÇÖLERİAnkara UniversityGraduate School of Natural and Applied SciencesDepartment of BiologySupervisor: Prof.Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞA total of 191 samples were collected from 46 different hot springs in Aydın, Ankara,Denizli, İzmir, Manisa and Nevşehir cities in order to determine the Î±-glucosidaseproducer thermophilic Bacillus spp. From these samples 451 thermophilic Bacillusisolates having different colony morphology were obtained and screened for amylaseactivity. Sixtyseven of 451 thermophilic Bacillus isolates which had high amylaseactivity were selected to determine the intracellular and extracellular Î±-glucosidaseproduction capacities by using pNPG substrate. Î±-Glucosidase production capacities ofthe isolates were designated basing on their total enzyme amount per pellet wet weight,and were found between 77.18-0.001 U/ml/g. Time course of high enzyme producersBacillus sp. A333 (48.64 U/ml/g), A343 (10.79 U/ml/g), E134 (32.09 U/ml/g), F84a(36.64 U/ml/g) and F84b (77.18 U/ml/g) were determined by comparing with standardstrain G. stearothermophilus ATCC 12980 (34.26 U/ml/g) for 48 hours. The maximumintracellular enzyme production time was found as 4 hours (A343, E134), 8 hours(F84a, F84b) and 12 hours (A333) which showed variations according to the isolates.Bacillus sp. A333 and A343 were selected as an extracellular and intracellular Î±-glucosidase producers, respectively. After partial purification of Î±-glucosidases fromtwo isolates, 10% N-PAGE and activity staining with 4-MUG substrate showed thatboth A333 and A343 had a differential enyzme band in addition to a common bandshowing the same electrophoretic mobilities with the standard strains. Î±-Glucosidasewas then eluted from N-PAG bands and seperated by 10% SDS-PAGE, and resultsshowed that Bacillus sp. A333 and A343 isolates had two different protein bands havingapproximately 44 and 60 kDa molecular weight. A333 Î±-glucosidase showed optimumactivity at 60ºC, pH 6.8 and 1.38 Km value for pNPG substrate while these results werefound 65ºC, 7.0 and 0.85, respectively for isolate A343. Specificity for 20 differentsubstrates and Thin layer chromatography of enzymes demonstrated that A333 enzymehad high transglycosylation activity while A343 had wide substrate specificity. Inaddition, the results showed that Bacillus sp. A333 Î±-glucosidase was more stable in awide range of pH and temperature, and both enzymes were found to be resistant to themost of the inhibitors tested. By this study, two new thermostable exo-Î±-1,4-glucosidaseproducer Bacillus strains were isolated having biotechnological pottential.2007, 175 pagesKey Words : Thermostable Î±-glucosidase, glucosyl hydrolase, Bacillus spp.