Virüs aracılı gen susturma (VIGS) yöntemiyle haşhaş süspansiyon kültüründe alkaloid üretiminin modifikasyonu
Modification of alcaloide production in opium poppy suspension culture by virus induced gene silencing (VIGS) method
Yazar: DENİZ ECE ŞALLI
Danışman: PROF. DR. SEMİHA ERİŞEN ; DR. DENİZ KÖM
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Biyosentez = Biosynthesis ; Metabolik mühendislik = Metabolic engineering ; Morfin = Morphine ; Papaver somniferum = Papaver somniferum

Özet:
Papaveraceae familyasına ait bir tür olan Papaver somniferum L. (afyon haşhaşı) kapsül
kabukları yüksek oranda noskapin, buprenorfin, morfin, papaverin, tebain ve kodein
gibi tıbbi açıdan değerli alkaloidler içerir. Ağrı kesici, spazm giderici ve öksürük
baskılayıcı etkileri olan bu maddeler yarı sentetik ilaçların üretimi için önemli bir ticari
hammaddedir. Bu alkoloidlerin kimyasal sentezi olmadığından sadece bitkisel
kaynaklardan elde edilebilmektedir. Belli bir alkaloidin bitkideki miktarını artırabilmek
ancak klasik ve biyoteknolojik ıslah yöntemleri ile mümkün olabilmektedir. Virüs
aracılı gen susturma (VIGS), bitkilerde hem viral hem de hücresel mRNA'ları hedef
alan, nükleotit dizisine özgü transkripsiyon sonrası gen susturma (PTGS)
mekanizmasıdır. Yakın zamanlarda, spesifik alkaloid sentaz genlerinin fonksiyonunu
araştırmak, ilgili genlerin transkript seviyelerini değiştirmek için etkili bir araç olarak
gösterilmiştir. Bu tez çalışmasında, VIGS tekniği kullanılarak morfin biyosentezinde
görevli CODM, T6ODM, DIOX2 genlerinin susturulmasına yönelik araştırmalar
yapılmıştır. Hedeflenen gene özel tasarlanmış primerlerler ile oluşturulan DNA
sekansları TRV2 plazmitine klonlanmıştır. Farklı kombinasyonları içeren TRV2
plazmitleri Agrobacterium tumefaciens bakterisine aktarılmış ve ardından haşhaş 
süspansiyon kültürlerinde somatik embriyolara transformasyon işlemi
gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak, morfin biyosentezinde anahtar enzimler olan CODM
ve T6ODM gen ifadelerinde %82 ve %65'e varan azalış elde edilmiştir. Ayrıca
haşhaşda A.tumefaciens aracılı transformasyon için somatik embriyolara maserozim
enzimi ön uygulamasını içeren yeni bir protokol geliştirilmiştir. Çalışmadan elde edilen
sonuçlar mevcut haşhaş alkaloid üretim stratejilerine katkı sunar niteliktedir.

Anahtar Kelimeler: Papaver somniferum, VIGS, morfin biyosentezi, morfin,
metabolik mühendisliği

Abstract:
Capsule shells of Papaver somniferum L. (opium poppy), a species belonging to the
family Papaveraceae, contain high levels of noscapine and valuable disposable alkaloids
such as buprenorphine, morphine, papaverine, thebaine, and codeine. These substances,
which have analgesic, antispasmodic, and cough suppressant effects, are important
commercial raw materials for the production of semi-synthetic drugs. Since there is no
chemical synthesis for these alkaloids, they can only be obtained from plant sources.
Increasing the amount of a certain alkaloid in the plant is only possible with classical
and biotechnological breeding methods. Virus-induced gene silencing (VIGS) is a posttranscriptional gene silencing (PTGS) defense system that targets both viral and cellular
mRNAs in plants. Recently, it has been shown to be an effective tool investigating the
function of specific alkaloid synthase genes and alter the transcript levels of related
genes. In this thesis, studies were conducted to silence the CODM, T6ODM, and DIOX2
genes involved in morphine biosynthesis using the VIGS technique. DNA sequences
created with primers designed specifically for the targeted gene were cloned into the
TRV2 plasmid. TRV2 plasmids containing different combinations were transfected into
Agrobacterium tumefaciens and then transformed into somatic embryos in poppy
suspension cultures. As a result, CODM and T6ODM gene expressions, which are the
key enzymes in morphine production, were reduced by up to 82% and 65%,
respectively. Additionally, a new protocol has been developed for A. tumefaciens
mediated transformation in poppies, which includes the pre-application of the
maserozyme enzyme to somatic embryos. The results obtained from the study present
the minimum contribution of the current poppy alkaloid production.

Keywords: Papaver somniferum, VIGS, morphine biosynthesis, morphine, metabolic
engineering