Nitrik oksidin preadipositlerde (3T3-L1) proliferasyon, diferensiyasyon ve aktin hücre iskeleti organizasyonu üzerine etkileri: RHO/RHO-kinaz yolağının olası katkısı
Effects of nitric oxide on preadipocyte (3T3-L1) proliferation, differentiation, and reorganization of actin cytoskeleton: possible role of RHO/RHO-kinase signalling
Yazar: AHMET SENCER YURTSEVER
Danışman: PROF. DR. KANSU BÜYÜKAFŞAR
Mersin Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Adipokinler = Adipokines ; Aktinler = Actins ; Hücre iskeleti = Cytoskeleton ; Lipopolisakkaritler = Lipopolysaccharides ; Lisofosfatidik asit = Lysophosphatidic acid ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Rhokinaz = Rhokinase ; Trombin = Thrombin

Özet:
Ahmet Sencer Yurtsever tarafından yapılan bu tezde 3T3-L1 preadipositlerinin diferensiyasyonu, proliferasyonu ve aktin hücre iskeleti organizasyonu üzerine nitrik oksidin (NO) sentez/salıverilmesini artıran ajanların ve NO donörlerinin etkisi araştırıldı. Buna ek olarak bu olası etkinin yine preadipositlerin diferensiyasyonunda önemli bir sinyal ileti mekanizması olduğu görünen Rho/Rho-kinaz yolağı ile olası ilişkisi incelendi.
Çalışmamızda bu amaçla, NO donörleri olarak DETA-NO [2,2′-(Hidroxinitrozohidrazono)bis-etanimin] ve sodyum nitrit (NaNO2)kullanıldı. Buna ek olarak NO sentez ve salıverilmesini artıran lipopolisakkarid ile Rho-kinaz aktivatörü lizofosfatidik asit (LPA) ve trombin'in ve ayrıca Nitrik oksit sentaz (NOS) enzim inhibitörü L-NAME'nin (NG-nitro-L-arginin metil ester) ve Rho-kinaz enzim inhibitörleri Y-27632 ve H-1152'nin preadipositlerin (3T3-L1 hücrelerinin) proliferasyon, diferensiyasyon ve hücre iskeleti aktininin organizasyonu üzerine olan etkilerini araştırdık. Bu amaçla post-konfluent preadipositlere diferensiyasyon protokolünün çeşitli günlerinde (0-2, 2-4, 4-8, 0-8. günler) NO donörleri ve NOS indükleyicileri DETA-NO (10-7-10-5 M), NaNO2 (10-7-10-3 M), LPS (10, 100 ng/ml), RhoA aktivatörleri LPA (10-7-10-5 M), Trombin (1-5 U/ml), Rho-kinaz inhibitörleri Y-27632 (10-5 M), H-1152 (10-7-10-6 M) uygulandı. Oil red O boyaması yapılarak 3T3-L1 hücrelerinin diferensiyasyonu değerlendirildi. Adiposit proliferasyonunu değerlendirmek için MTT testi, Rho-kinaz enzim ekspresyon ve aktivitesini değerlendirmek için Western blot yöntemi kullanıldı. Griess metodu ile nitrit/nitrat tayini yapıldı ve RhoA aktivitesini ölçmek için G-LISA yöntemleri kullanıldı. Aktin hücre iskeletindeki değişimler ise floresan boyama yöntemi ile değerlendirildi.
NO donörleri DETA-NO ve NaNO2'in, preadiposit diferasyonu üzerine, uygulandıkları zaman aralıklarında, (0-2, 0-4, 4-8. günlerde) herhangi bir etkisi olmadı. Bununla birlikte iNOS sentezini artırdığı bilinen bakteriyel lipopolisakkarid (LPS), 0-2. Gün dışındaki diğer zaman aralıklarında diferensiyasyonu baskıladı. NOS inhibitörü L-NAME, diferensiyasyonu baskılamakla birlikte LPS ile kombine olarak uygulandığında LPS'nin oluşturduğu supresyonu önlemedi. Rho-kinaz (ROCK) enzim inhibitörü Y-27632, [(R)-(+)-trans-4-(1-Aminoetil)-N-(4-Piridil)siklohekzankarboksamid dihidroklorid] diferensiyasyonu stimüle etti. Rho/ROCK yolağının aktivasyonuna yol açtığı bilinen trombin, 3T3-L1 hücre diferensiyasyonunu suprese etti. Trombin, buna ek olarak Y-27632'nin oluşturduğu diferensiyasyon artışını önledi. Çalışmamızda kullanılan ajanların proliferasyon üzerine etkilerine gelince, Y-27632, 3T3-L1 hücrelerinde proliferasyonu baskıladı. Y-27632'nin LPA ile kombine olarak uygulanması bu etkiyi değiştirmedi. 2x10-4 M L-NAME, tek başına proliferasyon üzerine belirgin bir etki oluşturmamakla beraber 0-8 gün boyunca uygulandığında proliferasyonu azalttı. LPS ile L-NAME kombinasyonunun proliferasyon üzerine anlamlı bir etkisi olmadı. L-NAME, daha yüksek konsantrasyonda (5x10-4 M), uygulandığında genellikle proliferasyonu baskıladı ancak 10 ve 100 ng/ml LPS ile kombine edilmesi, proliferasyon üzerine belirgin bir etki göstermedi. Öte yandan, trombin 1-5 U/ml konsantrasyonda, uygulandığında preadiposit proliferasyonunu değiştirmedi. Ancak 0-8. Gün aralığında aynı dozda trombin uygulanması, proliferasyonu stimüle etti. Y-27632, trombin tarafından oluşturulan proliferasyon artışını önledi.
Sonuç olarak 3T3-L1 hücrelerinin gerek proliferasyonunda ve gerekse diferansiyasyonunda nitrik oksit ve Rho/Rho-kinaz yolağının farklı zamanlarında (0-2-4-8. günlerde) farklı etkiler oluşturmaktadır.
Öte yandan, NO donör ve sentez/salıverilme artışı yapan ajanlar ile Rho/ROCK yolağını etkileyen ajanların RhoA ve ROCK aktivasyonu (LIM kinaz fosforilasyonu üzerinden) ile ROCK ve iNOS ekspresyonları üzerine olan etkileri değerlendirildiğinde, LPS (10 ve 100 ng/ml), ROCK-2 enziminin ekspresyonunu artırdı. NOS inhibitörü L-NAME'nin ön uygulaması bu artışı ortadan kaldırmadı. Çalışmamızda ortaya çıkan ilginç bir nokta L-NAME'in tek başına uygulamasının ROCK ekspresyonunda up-regülasyon oluşturmasıydı. Öte yandan, NO donörü DETA-NO (10-7-10-5 M) ROCK-2 ekspresyonları üzerine anlamlı etki göstermedi. LPS, her iki (10, 100 ng/ml) konsantrasyonda da3T3-L1 hücrelerinde iNOS ekspresyonunu artırdı ve buna ek olarak uygulandıktan sonra 30. dakikada ROCK aktivitesinin bir göstergesi olan LIM kinaz fosforilasyonunda da bir artış oluşturdu. Ancak L-NAME (2x10-4 M) ön uygulaması sonrası LPS uygulandığında, LIM kinaz fosforilasyonunda artış oluşmadı. L-NAME tek başına uygulandığında LIM kinaz fosforilasyonu üzerine etki göstermedi. İlginç olarak NaNO2, 10-7 M konsantrasyonda uygulandığında LIM kinaz fosforilasyonunu arttırdı.
Başka bir deney serisinde ise nitrit/nitrat ölçümleri yapıldı. LPS uygulandığı her iki konsantrasyonda da nitrit/nitrat düzeylerinde anlamlı bir değişiklik oluşturmadı. L-NAME ile LPS'nin kombine uygulaması da nitrit/nitrat düzeylerinde bir değişiklik oluşturmadı. LPA (10-7-10-5 M) uygulaması nitrit/nitrat düzeyleri üzerine etki göstermedi. Buna karşın ROCK inhibitörü Y-27632 (10-5 M), 3T3-L1 nitrit/nitrat düzeylerinde anlamlı artışlar oluşturdu.
Elde edilen bulgular, inflamatuar bir ajan olan LPS'nin iNOS indüksiyonu yaptığını ve bunun yanı sıra ROCK-2 enzim ekspresyonunda up-regülasyon oluşturduğunu ve LPS'nin bu etkisine NO'in aracılık etmediğini göstermektedir; çünkü, LPS ile oluşturulan ROCK-2 up-regülasyonu L-NAME tarafından önlenmedi. Bunun dışında, DETA-NO, ROCK-2 ekspresyonunda belirgin bir değişiklik oluşturmadı. Sonuç olarak, LPS, ROCK-2 up-regülasyonuna yol açmaktadır ve bu etki olasılıkla NO dışında başka inflamatuar mediyatör(ler) aracılığı ile olmaktadır.
Trombin ve Lizofosfatidik asit ve 3T3-L1 hücrelerinde RhoA translokasyonunu anlamlı olarak artırdı. Trombin ile indüklenen RhoA aktivasyonunun göstergesi olan RhoA translokasyonu Clostridum botulinum ekzoenzimi C-3 tarafından kısmen bloke edildi. İlginç olarak NO donörleri DETA-NO ve NaNO2, RhoA aktivasyonu üzerine herhangi bir etki oluşturmazken NO sentaz inhibitörü L-NAME RhoA translokasyonunda anlamlı artışlar oluşturdu.
NO donör ve sentez/salıvericilerinin Aktin hücre iskeleti reorganizasyonu üzerine etkilerine gelince, NO donörleri, DETA-NO, NaNO2 ile RhoA aktivatörü LPA, hücre iskeleti aktininde belirgin bir şekil değişikliği oluşturmadı. Ancak NOS inhibitörü L-NAME, preadipositlerin aktininde hücre iskeletinde bir toplanma ve membran şekil değişikliği oluşturmuştur. Rho-kinaz enzim inhibitörü Y-27632 uygulaması ise 3T3-L1 hücrelerinde belirgin uzamalar ve şekil değişiklikleri oluşturdu. Öte yandan 0-2. gün zaman aralığında DETA-NO ve NaNO2 uygulaması hücre iskeletinde bir değişiklik oluşturmazken LPA aktin hücre iskeletinde toplanmalar ve hücre şekil değişikliği meydana getirdi. DETA-NO ve NaNO2, 0-4. ve 0-8 gün zaman aralığında uygulandığında aktin hücre iskeletinde belirginleşmeler, hücre sınırlarına çekilmeler, stres lifleri ve hücre hacminde artışlar oluşturdu. NOS inhibitörü L-NAME, 0-2, 0-4. ve 0-8. günlerde aktin hücre iskeletiüzerine etki göstermedi. ROCK inhibitörü Y-27632, 0-8. gün zaman aralığında uygulandığında lipid damlacıkların oluşumunu artırdı, bu da Y-27632'nin lipogenezi stimüle ettiğini gösterebilir.
Sonuç olarak, 3T3-L1 preadipositlerin hücre iskeleti aktininin morfolojisi üzerine NO ve RhoA/Rho-kinaz yolaklarının etkiler oluşturduğu açık olarak görülmektedir. Ancak uygulamanın preadiposit diferensiyasyonun hangi günlerinde yapıldığına bağlı olarak bu etkiler değişebilmektedir. Bunun yanı sıra, birçok hücre tipinde de RhoA aktivasyonu oluşturan trombin ve LPA, 3T3-L1 preadipositlerde de RhoA translokasyonuna (aktivasyonuna) neden oldu.

Anahtar Kelimeler: Adiposit, Aktin hücre iskeleti, Diferensiyasyon, H-1152, LPA, LPS, Nitrik oksit, Proliferasyon, Rho-kinaz, Trombin, Y-27632.

Danışman: Prof. Dr. Kansu BÜYÜKAFŞAR, Mersin Üniversitesi, Tıbbi farmakoloji Anabilim Dalı, Mersin.

Abstract:
In this thesis dissertation which performed by Ahmet Sencer Yurtsever, it is aimed to investigate possible effects of nitric oxide (NO) donors and the compounds inducing NO synthesis/release on the proliferation, differentiation and reorganization of actin cytoskeleton. Furthermore, we sought any relationship between NO signalling and Rho/Rho-kinase pathway that seems to be essential for pre/adipocytes metabolism.
In this purpose, NO donors and NO generators, DETA-NO (10-7-10-5 M), NaNO2 (10-7-10-3 M), bacterial lipopolysaccharide (LPS, 10, 100 ng/ml), RhoA activators including lysophosphatidic acid (LPA, 10-7-10-5 M) and thrombine (1-5 U/ml) as well as Rho-kinase inhibitors, Y-27632 (10-5 M), and H-1152 (10-7-10-6 M) were treated on 3T3-L1 cells at different time points of differentiation (0-2, 2-4, 4-8, 0-8. days). In order to assess pre/adipocyte proliferation, MTT cell analysis and for differentiation, Oil Red O staining were performed. To evaluate Rho-kinase activity and expression, Western blotting was used. Moreover, the detection of nitrite/nitrate levels and RhoA activity, Griess and G-LISA methods were respectively used. Finally, specific fluorescent staining was employed for the assessment of actin cytoskeleton reorganization.
NO donors, DETA-NO and NaNO2, had no effects on preadipocyte differentiation at different day points tested (0-2nd, 0-4th, 4-8 th days). The bacterial lipopolysaccharide known to induce INOS supressed the differentiation in general. The NOS inhibitor, L-NAME supressed the differantiation; while, it did not prevent the suppresive effect of LPS. The Rho-kinase (ROCK) enzyme inhibitor, Y-27632, facilitated the differentiation. Thrombin, which has been reported to activate Rho/ROCK signalling decreased the differentiation. Moreover, it prevented the increase of the differentiation by the ROCK inhibitor, Y-27632. As to the effects of these agents over the preadipocyte proliferation, Y-27632 decreased the rate of proliferation of 3T3-L1 cells. The combination of Y-27632 with LPA did not differentiate this effect. 2x10-4 M L-NAME, had no effects of the proliferation at all time points except 0-8th day-application in which it suppressed the 3T3-L1 cell growth. The combination of LPS with L-NAME had no substantial changes on the proliferation. The higher concentration of L-NAME (5x10-4 M) generally suppressed the growth but its combination with LPS had no effects. Another compound tested, thrombin also did not alter the growth rate at all time points except 0-8th day-application in which it boosted the proliferation, which was attenuated by the ROCK inhibitor, Y-27632.
In conclusion, nitric oxide and Rho/ROCK signalling seem to have differential effects on 3T3-L1 cell growth and differentiation at different application points (0-2nd, 0-4th, 4-8 th days)
With regard to the effects of NO donors and generators as well as the agents that manipulate Rho/ROCK pathway on RhoA activation, ROCK expression and the reorganization of actin cytoskeleton, LPS (10, 100 ng/ml) upregulated ROCK-2 protein, which was not prevented by L-NAME pre-treatment. Interestingly, L-NAME alone did upregulate ROCK-2 too. NO donors, DETA-NO (10-7-10-5 M) did not significantly change the expression. In addition to ROCK-2, LPS also induced iNOS expression not to mention LIM kinase, which shows ROCK activation. However, under the condition in which L-NAME (2x10-4 M) was pre-treated to 3T3-L1 cell, LPS did not up-regulate LIM kinase as LPS alone did. L-NAME did not modify the phosphorylation of LIM kinase. Interestingly, NaNO2 (10-7 M) also increased LIM kinase phosphorylation.
In another sets of experiments, nitrite/nitrate level was detected as an index of NO production. LPS, in contrast to the iNOS induction, failed to elevate the nitrite/nitrate level. The combination of L-NAME with LPS did not also induce any changes. LPA (10-7-10-5 M) also did not regulate these NO metabolites. However, the ROCK inhibitor, Y-27632 (10-5 M) dramatically elevated nitrite/nitrate level in the medium culturing 3T3-L1 cells.
Taken together, as an inflammatory agent, LPS up-regulated ROCK as well as iNOS. However the induction of iNOS by LPS was not modified in the presence of L-NAME, implying that NO may not be involved. Furthermore an NO donor, DETA-NO did not altered ROCK-2 expression. Overall, some inflammatory agents other than NO might take roles in the up-regulation of ROCK-2.
As to the effects of NO-donors, DETA-NO and NaNO2, on preadipocyte cell shape changes and actin re-organization, either these NO donors or the RhoA activator, LPA induced no substantial changes in cytoskeleton actin re-organization and cell shape changes. In contrast, a NOS inhibitor, L-NAME (applied between 0-2 days) evoked the assembly of actin fibers and cell shape changes.  The ROCK inhibitor, Y-27632 produced elongation of preadipocytes and cell shape changes in 3T3-L1 cells. On the other hand, DETA-NO and NaNO2, applied between day 0-2 induced no cell shape changes. LPA elicited an assembly of actin fiber together and cell shape changes. However, both DETA-NO and NaNO2 applied for 4 and 8 days, caused a dense collection of actin fiber at the borders of cells, formation of stress fibers and an increase of cell volume. L-NAME, aplied on 0-2, 0-4. and 0-8. days had no effects on cell cytoskeleton.  The ROCK inhibitor, Y-27632 applied between 0-8 days, facilitated lipogenesis, so increase the appearence of lipid droplet in cells.
In conclusion, it seems that nitric oxide as well as Rho/ROCK signaling cascade may have a role on preadipocyte proliferation, differentiation and cell cytoskeleton. However, it differs based on the stage of preadipocyte differentiation. Moreover, known activator of RhoA in different kind of cell types, LPA and thrombin also induced a substantial increase in RhoA activation in preadipocytes.

Keywords: Adipocyte, Actin cytoskeleton, Differentiation, H-1152, LPA, LPS, Nitric oxide, Proliferation, Rho-kinase, Thrombin, Y-27632.

Advisor: Prof. Kansu BÜYÜKAFŞAR, Department of Medical Pharmacology, University of Mersin, Mersin.