Jiangella aurantiaca enkapsülin sisteminin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of the Jiangella aurantiaca encapsulin system
Yazar: MİRAY ŞAHİNKAYA
Danışman: PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Moleküler klonlama = Molecular cloning

Özet:
Enkapsülinler, kendilerine özgü kargo proteinleri bulunan, doğal, bakteri kaynaklı ve protein yapılı kapsüllerdir. Bu çalışmada, Jiangella aurantiaca 8K307'nın peroksidaz-enkapsülin sistemi karakterize edildi. Ayrıca, enkapsülinle ilişkisiz Anoxybacillus ayderensis A9'in oligo-1,6-α-glukosidazına, Dyp'ye ait olan kargo yükleme peptidi (CLP) eklenerek, enkapsülinin oligo-1,6-α-glukosidaz üzerindeki etkileri araştırıldı.

Enkapsülin, Dyp, oligo-1,6-α-glukosidaz ve CLP etiketli oligo-1,6-α-glukosidaz genleri, rekombinant olarak üretildiler ve gen ekspresyonlarının ardından saf olarak elde edildiler.

Enkapsülinin TEM ve DLS analizleri ile 24 nm'lik kapsül yapısı belirlendi. Kapsül formun stabil olduğu fizyolojik koşullar belirlendi. Enkapsülinin, Dyp ve CLP etiketli oligo-1,6-α-glukosidaz ile in vitro kapsülasyonları sağlandı. Zimogram ve Native PAGE analizleri ile kapsülasyonlar tespit edildi.

Enkapsülinlenen ve serbest Dyp, enkapsülinlenen ve serbest oligo-1,6-α-glukosidaz ve CLP etiketi bulunmayan oligo-1,6-α-glukosidazın, optimum pH, optimum sıcaklık ve kinetik parametreleri belirlendi. Sürfaktanlar, metal şelatörler, indirgeyici ajanlar, organik çözücüler ve metallerin Dyp, oligo-1,6-α-glukosidaz ve CLP etiketi bulunan oligo-1,6-α-glukosidaz üzerindeki etkileri test edildi.

Sonuçta, enkapsülinin özel kargo proteini olan Dyp ve ilişkisiz kargo proteini olan oligo-1,6-α-glukosidaz üzerindeki koruyucu etkileri ayrıntılı olarak karakterize edildi

Abstract:
Encapsulins are natural, bacterial-derived, protein-structured capsules with specific cargo proteins. In this study, the peroxidase-encapsulin system of Jiangella aurantiaca 8K307 was characterized. In addition, the effects of encapsulin on oligo-1,6-α-glucosidase were investigated by adding the cargo loading peptide (CLP) belonging to Dyp to the oligo-1,6-α-glucosidase of Anoxybacillus ayderensis A9, which is unrelated to encapsulin.

Encapsulin, Dyp, oligo-1,6-α-glucosidase and CLP-labeled oligo-1,6-α-glucosidase genes were produced recombinantly and obtained in pure form after gene expression. The 24 nm capsule structure of encapsulin was determined by TEM and DLS analyses. Physiological conditions under which the capsule form was stable were determined. In vitro encapsulation of encapsulin was achieved with Dyp and CLP labeled oligo-1,6-α-glucosidase. Encapsulations were detected by zymogram and Native PAGE analyses.

Optimum pH, optimum temperature and kinetic parameters of encapsulinated and free Dyp, encapsulinated and free oligo-1,6-α-glucosidase, and oligo-1,6-α-glucosidase without CLP label were determined. The effects of surfactants, metal chelators, reducing agents, organic solvents, and metals on Dyp, oligo-1,6-α-glucosidase, and CLP-tagged oligo-1,6-α-glucosidase were tested.

As a result, the protective effects of encapsulin on the specific cargo protein Dyp and the unrelated cargo protein oligo-1,6-α-glucosidase were characterized in detail