Kefirden izole edilen laktik asit bakterilerinin probiyotik özelliklerinin ve biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi
Determination of probiotic properties and biological activities of lactic acid bacteria isolated from kefir
Yazar: HÜMEYRA BODUR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ CEREN BAŞKAN ; DR. ÖĞR. ÜYESİ MERVE YURTTAŞ
Amasya Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Probiyotik mikroorganizmalar hastalıkları önlemek ve tedavi etmek amacıyla yıllardır kullanılmaktadır. Özellikle bu mikroorganizmaların ürettikleri bakteriyosinler ve ekzopolisakkaritlerin mikrobiyotada önemli yeri bulunmaktadır. Fermente bir süt ürünü olan kefir probiyotik mikroorganizma açısından zengin olması sebebiyle giderek artan bir ürün haline gelmiştir. Bu sebeple çalışmada, kefirden izole edilen laktik asit bakterilerinin probiyotik özelliklerinin ve biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla 12 ticari, 3 ev yapımı olmak üzere toplam 15 adet kefir örneği toplanmıştır. Öncelikle kefir örnekleri pH, toplam asitlik, kuru madde ve kül analizleri gibi fizikokimyasal parametreler açısından analiz edilmiştir. pH, kuru madde ve kül analizleri bakımından elde edilen sonuçlar ise literatür ile uyumlu olmakla birlikte bu sonuçların kefir üretim parametreleri ve kullanılan hammaddeye göre değişebildiği görülmüştür. Fizikokimyasal parametrelerin ardından örneklerden konvansiyonel yöntemlerle elde edilen laktik asit bakterilerini tür düzeyinde doğrulamak için fenotipik testler uygulanmıştır. Fenotipik testler sonucunda 142 izolat şüpheli laktik asit bakterisi olarak belirlenmiştir. Belirlenen şüpheli izolatların 16S rRNA PZR analizi ile genotipik olarak tanımlanmış ve 37 izolatın 1500 bç bölgesinde bant verdiği gözlemlenmiştir. Fenotipik ve genotipik testler yapılan bakterilerinden bakteriyosin elde edilmiş ve dört Gram pozitif (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacıllus cereus ATCC 7064, Bacıllus subtilis ATCC 6633, Streptococcus mutans ATCC35668) dört Gram negatif (Esherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Salmonella enteridis ATCC13076) bakteri üzerindeki antimikrobiyal etkileri kuyu difüzyon yöntemiyle tespit edilmiştir. Kuyu difüzyon sonucuna göre 3 izolatın S. mutans üzerinde bakteriyosin özelliği pozitif olarak belirlenmiştir. Bakteriyosin pozitif olan izolatların 16S rRNA sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. Dizileme sonucu elde edilen okumaların kalitesi BioEdit programı ile birleştirilmiş ve NCBI Nuclotide BLAST programı kullanılarak Gen bankasında en yakın ilişkili tür belirlenmiştir. Sekans analizi sonucunda 1 izolat Leuconostoc mesenteroides olarak belirlenmiştir. Fenotipik ve genotipik olarak doğrulanan laktik asit bakterisinden ekzopolisakkarit elde edilmiş DLD-1 (insan kolon adenokarsinomu) ve CCD-18Co (normal kolon) hücre hatları üzerindeki 24, 48 ve 72 saatteki sitotoksik aktivitesi MTT yöntemi ile analiz edilmiştir. MTT testi sonucunda ekzopolisakkartin DLD-1 hücre hattı üzerindeki sitotoksik aktivitesi 24 saat için IC50 değeri 2500 µg/mL olarak belirlenmiş, CCD-18Co hücre hattı üzerinde ise herhangi bir sitotoksik aktivite göstermediği tespit edilmiştir. Bu durum ekzopolisakkartin sağlıklı kolon hücrelerine zarar vermeden kolon kanser hücresi üzerinde seçici toksik etki oluşturacağını göstermektedir. Yapılan bu çalışma ile kefirin mikrobiyota üzerindeki olumlu etkisi bir kez daha vurgulanmıştır.

Abstract:
Probiotic microorganisms have been used for years to prevent and treat diseases. Especially the bacteriocins and exopolysaccharides produced by these microorganisms have an important place in the microbiota. Kefir, which is a fermented milk product, has become an increasing product due to its richness in probiotic microorganisms. For this reason, in this study, it was aimed to determine the probiotic properties and biological activities of lactic acid bacteria isolated from kefir. For this purpose, a total of 15 kefir samples, 12 commercial and 3 homemade, were collected. Firstly, kefir samples were analyzed in terms of physicochemical parameters such as pH, total acidity, dry matter and ash analysis. Although the results obtained in terms of pH, dry matter and ash analyzes are compatible with the literature, it has been observed that these results may vary according to the kefir production parameters and the raw material used. Phenotypic tests were applied to confirm the lactic acid bacteria obtained from the samples by conventional methods at the species level. As a result of phenotypic tests, 142 isolates were determined as suspicious lactic acid bacteria. The suspected isolates were identified genotypically by 16S rRNA PCR analysis and it was observed that 37 isolates gave bands in 1500 bp region. Afterwards, bacteriocin was obtained from the bacteria for which phenotypic and genotypic tests were performed, and its antimicrobial effects on four Gram positive and four Gram negative bacteria were determined by the well diffusion method. According to the well diffusion results, 3 isolates were positive for bacteriocin on S. mutans. 16S rRNA sequence analyzes of bacteriocin positive isolates were performed. The quality of the reads obtained as a result of sequencing was combined with the BioEdit program and the most closely related species was determined in the Genbank using the NCBI Nuclotide BLAST program. As a result of the sequence analysis, 1 isolate was determined as Leuconostoc mesenteroides. The cytotoxic activity at 24, 48 and 72 hours on DLD-1 (human colon adenocarcinoma) and CCD-18Co (normal colon) cell lines obtained from exopolysaccharide obtained from phenotypically and genotypically confirmed lactic acid bacteria was analyzed by MTT method. As a result of the MTT test, the cytotoxic activity of exopolysaccharin on the DLD-1 cell line was determined as 2500 µg/mL for 24 hours, and it was determined that it did not show any cytotoxic activity on the CCD-18Co cell line. This shows that exopolysaccharin will have a selective toxic effect on colon cancer cells without harming healthy colon cells. With this study, the positive effect of kefir on the microbiota was emphasized once again.