Renal transplant alıcılarında proteomik yöntemlerle yeni biyobelirteçlerin araştırılması
Investigation of new biomarkers in renal transplant recipients with proteomic methods
Yazar: FİLİZ ÖZCAN
Danışman: PROF. DR. SÜLEYMAN GÜLTEKİN YÜCEL
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Nefroloji = Nephrology
Dizin: Böbrek hastalıkları = Kidney diseases ; Böbrek nakli = Kidney transplantation ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Netrin-1 = Netrin-1 ; Taşıyıcı proteinler = Carrier proteins

Özet:
Renal transplantasyon, son dönem böbrek hastalığının tedavisinde en iyi seçenektir. Renal allogreft biyopsi rejeksiyonun tanısında referans yöntemdir. Ancak invaziv doğası nedeniyle, rejeksiyonun erken tanısını sağlayan yeni klinik ve biyokimyasal belirteçler böbrek nakli bir öncelik olmuştur. İdrar karaciğer- yağasidi bağlanma proteini (L-FABP) insan böbrek transplant hastalarında renal iskeminin umut vadeden erken bir biyobelirteci olarak değerlendirilmektedir. Netrin-1 renal transplantasyon sonrası akut böbrek hasarının (AKI) yararlı bir erken diagnostik biyobelirteci olabilir. Klinik pratikte L-FABP ve netrin-1 kullanımının bu biyobelirteçler ile özgüllük, doğruluk ve sağlamlığı birleştiren bir analitik yöntem ile ilişkili olması gerekir. Bu çalışmada renal transplantasyon hastalarında idrar L-FABP ve netrin-1 düzeylerini ölçmek için tandem kütle spektrometresi-ultra hızlı sıvı kromatografisi (LC-MS/MS) kullanılarak optimize edilmiş çoklu reaksiyon izleme (MRM) yöntemini geliştirmeyi amaçladık. Rekombinant insan L-FABP ve netrin-1 triptik standartları, Matriks Destekli Lazer Desorpsiyon İyonizasyon- uçuş zamanlı kütle spektrometre (MALDI TOF) MS/MS ve LC-MS/MS cihazlarında, kantitasyon amacıyla MRM metodu geliştirmede kullanılacak peptidlerin seçimi için analiz edildiler. L-FABP ve netrin-1'in kütle spektrometrik analizinden önce, renal transplant alıcılarından alınan idrar örneklerinde izolasyon, konsantrasyon, çöktürme ve triptik kesim işlemleri yapıldı. Netrin- ve L-FABP düzeyleri hem serum hem de idrar örneklerine enzim immunoassay ile ölçüldü. LC-MS/MS analizleri için L-FABP kantitasyonunda en iyi sinyal MH+ of 50FTITAGSK57 (m/z 824) triptik peptidinden sağlandı. MALDI-TOF MS/MS spektralarından elde edilen 50FTITAGSK57 MH+ iyonunun, çarpışma indüklü parçalanması (CID) sonucunda belirlenen y3 fragment iyonu kantitatif MRM metodu için kullanıldı. Benzer bir şekilde netrin-'in LC-MS/MS kantitasyonu için 270DSYFYAVSDLQVGGR284 MH+2 (m/z 839) iyonu en iyi sinyali sağladı. MALDI-TOF MS/MS spektralarından elde edilen 270DSYFYAVSDLQVGGR284 MH+2 iyonunun, çarpışma indüklü parçalanması (CID) sonucunda belirlenen y8, y9, ve y11 fragment iyonları kantitatif MRM metodu için kullanıldı. Serum L-FABP ve netrin-1 düzeyleri ELISA ve LC-MS/MS metodları ile ölçüldü. Serum örneklerinde transplantasyon öncesi ve sonrasında her iki protein için herhangi bir fark gözlemlenmedi. ELISA ile analiz edilen idrar L-FABP düzeyleri transplantasyon sonrası anlamlı düzeyde artmış bulundu. LC-MS/MS ile ölçülen transplantasyon sonrası idrar L-FABP ve netrin-1 anlamlı derecede yüksek bulundu. İki metod arasındaki sperman korelasyon katsayısı istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Gün içi ve günler arası ölçümlerin varyasyon katsayıları LC-MS/MS analizinin validasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik sağladı. L-FABP ve netrin-1'in LC-MS/MS ile kantitasyonu insan böbrek transplant hastalarında bu potansiyel biyobelirteçlerin değişimlerini belirlemek için yeni referans metod olarak kullanılabilir.

Abstract:
Renal transplantation is the best choice for the treatment of end-stage kidney disease. Renal allograft biopsy is the reference standard for diagnosis of rejection, however due to its invasive nature, new clinical and biochemical diagnostic markers allowing early prediction of rejection has been a priority in renal transplantation. Urinary liver-fatty acid binding protein (L-FABP) has been evaluated as a promising early biomarker of renal ischemia in human kidney transplant patients. Netrin-1 can be a useful early diagnostic biomarker of acute kidney injury (AKI) after renal transplantation. The use of L-FABP and netrin-1 in clinical practice requires that these biomarkers be associated with an analytical method that combines specificity, accuracy and robustness. This study aimed to develop an optimized multiple reaction monitoring (MRM) method using ultrafast liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to measure urinary L-FABP and netrin-1 levels in renal transplant recipients. Purified recombinant human L-FABP and netrin-1 tryptic standards were analyzed by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF) MS/MS and LC-MS/MS to select for peptides that provided specificity and adequate response in developing an MRM method for urinary L-FABP and netrin-1 quantification. Human urine samples collected from kidney transplant recipients were isolated, concentrated, precipitated and trypsin digested before mass spectrometric analysis of L-FABP and netrin-1. Netrin-1 and L-FABP levels were also measured in urine and serum samples by enzyme immunoassay. The tryptic peptide ion MH+ of 50FTITAGSK57 (m/z 824) provided an adequate signal and was used for quantification of L-FABP under conditions employed for LC-MS/MS analysis. MALDI-TOF MS/MS spectra obtained by collision-induced dissociation of the parent MH+ ion 50FTITAGSK57 resulted in an y3 product ion that was used for quantitative analysis by MRM method. Likewise, the tryptic peptide ion MH+2 of 270DSYFYAVSDLQVGGR284 (m/z 839) provided an adequate signal and was used for quantification of netrin-1 under conditions employed for LC-MS/MS analysis. MALDI-TOF MS/MS spectra obtained by collision-induced dissociation of the parent MH+2 ion 270DSYFYAVSDLQVGGR284 resulted in y8, y9 and y11 product ions that were used for quantitative analysis by MRM method. Serum L-FABP and netrin-1 levels were evaluated via ELISA and LC-MS/MS methods. But there were not any difference between protein levels in serum samples before and after transplantation. Urinary L-FABP levels analyzed with ELISA was significantly increased after transplantation. Urinary L-FABP and netrin-1contents measured by LC-MS/MS after transplantation was significantly higher compared to before transplantation levels. The Spearman correlation coefficient between the two methods was statistically significant. Intra-day and inter-day coefficient of variation provided good repeatability and reproducibility for validation of LC-MS/MS analysis. LC-MS/MS quantification of L-FABP and netrin-1 may provide a new reference method to determine changes of this potential biomarker in human kidney transplant patients.