Borik asitin Bacillus thuringiensis insektisidal kristal protein üretimi ve biyoaktivitesi üzerinde etkilerinin incelenmesi
Investigations on effects of boric acid on Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein production and bioactivity
Yazar: BURCU ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ
Muğla Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bacillus thuringiensis (Bt) günümüzde yaygın olarak kullanılan bir biyopestisittir. Toprak, bitki ve böceklerden izole edilebilen Bt sporlu bir bakteridir ve sporulasyonu sırasında ürettiği insektisidal kristal proteinleri ile önem kazanır. Bt bazlı biyopestisitler pek çok böcek türünün kontrolünde kullanıldığından günümüzde yeni Bt suşlarının izolasyonu ve kristal protein miktarı ile insektisidal etkiyi artıran etkenlerin araştırılması önemlidir.Bu tez çalışmasında borlu bir bileşik olan borik asitin B. thuringiensis insektisidal kristal protein üretimi ve biyoaktivitesi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla, hem borlu ortamdan izole edilen Bt izolatları hem de önceki çalışmalarımızdan toksik etkileri bilinen Bt izolatları kullanılmıştır. Öncelikle, borlu ortamlardan Bt izolasyonu gerçekleştirilip bu izolatların cry gen profilleri belirlenmiştir. Elde edilen Bt izolatlarının bor toleransları nokta bor tolerans analizi ve büyüme eğrileri ile tespit edilmiştir. Borik asitin kristal protein üretimi ve toksik potansiyeli üzerindeki etkileri sırasıyla SDS-PAGE analizi ve biyoaktivite denemeleri ile araştırılmıştır.Balıkesir, Bandırma, Kütahya-Emet-Hisarcık ve çevre bölgelerden toplanan 35 borlu toprak örneğinden toplam 17 Bt izolatı elde edilmiştir. Bu izolatlar faz-kontrast mikroskobu incelemesine dayanarak, referans suşların kristal oluşumlarına kıyasla çok iyi, iyi, orta veya az olarak gruplandırılmıştır. Beş ayrı cry geni için PCR analizleri yapıldığında, Bt izolatlarının hepsinin cry1 geni ve % 41'inin cry2 geni içermesine rağmen izolatların hiçbirinin cry3, cry4 ve cry9 içermedikleri bulunmuştur. Buna ilaveten, Bt izolatlarının bor toleransına bakıldığında, çoğu izolatın 0, 25 ve 50 mM'da üreyebildikleri, bazılarının 75 mM'da çok az gelişebildiği ancak 100 mM borik asit içeren ortamda ise hiç gelişme göstermedikleri tespit edilmiştir. Büyüme eğrilerine göre ise, izolatların hepsinin 25 mM borik asitte büyüdüğü; bazılarının çok geç de olsa 50 mM'da da üreyebildiği, buna karşın hiçbirinin 75 ve 100 mM borik asit ortamında büyüyemedikleri tespit edilmiştir.Farklı konsantrasyonlardaki borik asitin (0, 5, 10, 20 ve 40 mM) kristal protein profilleri üzerindeki etkisi incelendiğinde, kontrole kıyasla borik asit varlığında protein konsantrasyonunun düştüğü ve en fazla azalmanın 40 mM borik asit içeren ortamda bulunduğu kaydedilmiştir. SDS-PAGE analizine göre, incelenen borik asit konsantrasyonlarının hepsinde Cry1 ve Cry2 proteinlerinin üretildiği, sırasıyla 130 kDa ve 65 kDa protein bantlarının varlığıyla gösterilmiştir. Son olarak biyoaktivite analizlerine göre, KE63-64 izolatının incir kurdu larvalarına karşı 50 ppm'de bile %80 toksik etki gösterdiği bulunmuştur. Buna karşın Bt izolatlarından elde edilen spor kristal karışımının farklı borik asit konsantrasyonlarında incir kurdu larvaları üzerindeki toksisitesinde sinerjistik bir etki oluşturmadığı görülmüştür.Anahtar Kelimeler: Bacillus thuringiensis, Cry proteinleri, cry genleri, Borik asit, Biyoaktivite

Abstract:
Bacillus thuringiensis (Bt) is a widely used biopesticide today. Bt, which is isolated from soil, plants and insects is a spore-forming bacterium and is important for its insecticidal crystal protein that is produced during sporulation. Bt-based biopesticides are used to control many insect species. Therefore, isolation of new Bt strains and searching the factors that increase crystal protein production and insecticidal activity is important.In this thesis, it was aimed to investigate the effects of boric acid on Bt insecticidal crystal protein production and bioactivity. For this purpose, both Bt isolates isolated from boron environment and Bt isolates whose toxic effects are known from our previous studies were used. First, Bt was isolated from boron environments and cry gene profilles were examined. Boron tolerance of obtained Bt isolates were determined by point boron tolerance test and growth curves. The effects of boric acid on crystal protein production and toxic potential were investigated by SDS-PAGE analysis and bioactivity assays, respectively.17 Bt isolates were obtained from 35 soil samples collected from Balıkesir, Bandırma, Kütahya-Emet-Hisarcık and surrounding areas. These isolates were grouped by comparing crystal formation of reference strains, as `very good, good, moderate or less? based on phase-contrast microscope examination. PCR analysis was carried out on DNA samples to identify the presence or absence of five different cry genes. While all the isolates contained cry1 and % 41 of them contained cry2 genes, none of them had cry3, cry4 and cry9 genes. Besides, according to results of boron tolerance test; most isolates could grow at 0, 25 and 50 mM boric acid, a few of them demonstrated very little growth at 75 mM, but none of them grew in medium containing 100 mM boric acid. According to growth curves, it was determined that all the isolates could grow at 25 mM boric acid, although some of them could grow very late at 50 mM, but none of the isolates grew at 75 and 100 mM boric acid concentration.The effect of different boric acid concentrations (0, 5, 10, 20 ve 40 mM) on crystal protein profiles was examined. The results showed that protein concentration decreased when the media contained boric acid and the most decrease was observed in the media containing 40 mM boric acid. According to SDS-PAGE analysis, production of Cry1 and Cry2 proteins in all boric acid concentrations was shown with the presence of 130 kDa and 65 kDa protein bands, respectively.Finally, it was found that KE63-64 isolate had 80 % toxic effect against Cadra cautella larvaes even at 50 ppm. However, it was indicated that spore-crystal mixtures derived from Bt isolates didn?t produce a synergistic effect at different boric acid concentrations against fig moth larvae.Keywords: Bacillus thuringiensis, Cry proteins, cry genes, Boric acid, Bioactivity.