Kafeik asit fenetil ester yüklü polimerik nanopartiküllerin insan glioblastoma hücreleri üzerindeki anti-proliferatif ve apoptotik etkilerinin incelenmesi
Investigation of anti-proliferative and apoptotic effects of caffeic acid phenethyl ester loaded polymeric nanoparticles on human glioblastoma cells
Yazar: AYSU SALBAŞ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AYŞEGÜL ERDEMİR ÜSTÜNDAĞ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Antikanser = Anticancer ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Kafeik asit = Caffeic acid ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Temozolomid = Temosolomide

Özet:
Yetişkinlerde sık görülen primer beyin tümörü glioblastoma multiforme (GBM), hızlı gelişmesi, radyasyon ve kemoterapiye dirençli olmasıyla tahrip edici kanser türlerindendir. GBM tedavisinde standart hale gelen kemoterapötik ilaç temozolomid (TMZ), beyindeki transport sistemlerindeki engelleri aşamamakta ve farklı yan etkiler barındırmaktadır. Kafeik asit fenetil ester (CAPE), anti-mitojenik, anti-viral, anti-inflamatuar ve anti-kanser özelliklere sahip bir propolis biyoaktif bileşenidir. Ancak düşük çözünürlüğü ve hidrofobik doğası anti-kanser ajan olarak kullanımını sınırlamaktadır. Biyouyumlu polimerik nanopartiküller, etken maddelerin hücre içine alımının kolaylaştırılması ve sağlıklı hücrelere sitotoksik etki yaratmaması gibi özellikleri sayesinde ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanılmaktadır.
Bu tez çalışmasında amaç; glioblastoma tedavisinde daha etkin bir ilaç dağıtımı için CAPE-temozolomid yüklü PLGA nanopartiküler formülasyonların sentezlenmesi ve U87MG insan glioblastoma hücre hattı üzerinde anti-proliferatif ve apoptotik etkilerinin araştırılmasıdır. Tekli emülsiyon (w/o) çözücü uçurma metoduyla sentezlenen CAPE-temozolomid yüklü nanopartiküllerin (CT-NP) boyut, zeta potansiyeli, çoklu dağılım indeksleri hesaplanarak karakterizasyonu yapılmış, etken madde yükleme verimi (DL) ve enkapsülasyon etkinliği (EE) belirlenmiştir. CT-NP'de EE, CAPE için %83,2, temozolomid için %40; DL, CAPE için %33,54, temozolomid için %6,45 olarak hesaplanmıştır.
CT-NP'nin U87MG hücreleri üzerindeki sitotoksik aktivitesi MTT (metiltiazol difenil tetrazolyum) yöntemi ile belirlenmiştir. Serbest CAPE-temozolomid molekülleri (CT) ve CT-NP'lerin U87MG hücrelerinde inkübasyonu sonucunda IC50 değeri 11,69 μg/ml (CT-NP 24.saat), 55,7 μg/ml ve 18,21 μg/ml (48 saat ) olarak hesaplanmıştır. CT ve CT-NP'nin U87MG hücreleri üzerindeki hücre göçüne etkisi analiz edilmiş ve kanser hücrelerinin migrasyonunu önemli ölçüde azalttığı tespit edilmiştir. Ayrıca, CT-NP'nin U87MG hücrelerinde koloni oluşturma potansiyelini baskıladığı görülmüştür. CT-NP'nin U87MG hücreleri üzerindeki apoptotik aktivitesi mRNA ve protein düzeyinde incelendiğinde sitokrom-c, Bax, kaspaz-8, kaspaz-9 ekspresyonlarının arttığı ve apoptozun teşvik edildiği gösterilmiştir. Apoptotik hücrelerin TUNEL yöntemi ile işaretlenmesi sonucu CT-NP'nin U87MG hücreleri üzerinde apoptozu indüklediği doğrulanmıştır.
Sonuç olarak, bu tez çalışması ile CT-NP'nin U87MG hücrelerinde apoptozu teşvik ederek hücre bölünmesini durduğu ve glioblastoma tedavisi için potansiyel bir biyoteknolojik ilaç adayı olabileceği gösterilmiştir.

Abstract:
Glioblastoma multiforme (GBM), primary brain tumor, is one of the aggressive types of cancer with its rapid development and resistance to radiation and chemotherapy. The chemotherapeutic drug temozolomide (TMZ), which has become the standard in GBM treatment, cannot overcome the obstacles in the transport systems of the brain and has different side effects. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE) is a propolis bioactive component with anti-mitogenic, anti-inflammatory and anti-cancer activities. However, its low solubility and hydrophobic nature limit its use as an anti-cancer agent. Biocompatible polymeric nanoparticles are powerful tools as drug delivery systems, owing to their features such as facilitating the uptake of active substances into cells, not causing cytotoxic effects to healthy cells and increasing solubility.
The aim of this thesis study is to synthesize CAPE-temozolomide loaded PLGA nanoparticles for more efficient drug delivery for the treatment of glioblastoma and to investigate their anti-proliferative and apoptotic effects on the U87MG human glioblastoma cell line. CAPE-temozolomide loaded nanoparticles (CT-NP) were synthesized by single emulsion (w/o) solvent evaporation method, their size, zeta potential, multidispersion indexes were calculated and characterized, active ingredient loading efficiency and encapsulation efficiency were determined. The encapsulation efficiency (EE) of CT-NP was calculated as 83.2% for CAPE, 40% for temozolomide, and the active ingredient loading efficiency (DL) for CAPE 33.54%, and 6.45% for temozolomide.
The cytotoxic activity of CT-NP on U87MG cells was determined by the MTT method. After incubation of CT and CT-NPs in U87MG cells, the IC50 value was calculated as 11.69 μg/ml (CT-NP, 24 hours), 55.7 μg/ml and 18.21 μg/ml (48 hours). The effect of CT and CT-NP on cell migration on U87MG cells was analyzed and it was found that they significantly reduced the migration of cancer cells. In addition, CT-NP was found to suppress the colony forming potential in U87MG cells. When the apoptotic activity of CT-NP on U87MG cells was examined at the mRNA and protein level, it was shown that cytochrome-c, Bax, caspase-8, caspase-9 expressions were increased and apoptosis was promoted. It was confirmed that CT-NP induced apoptosis on U87MG cells by labeling apoptotic cells with the TUNEL method.
In conclusion, with this thesis, it has been shown that CT-NP inhibits cell division by promoting apoptosis in U87MG cells and can be a potential biotechnological drug candidate for the treatment of glioblastoma.