Yapay beyin omurilik sıvısında kokainin ve ana metaboliti benzoilekgoninin sıvı kromatografisi ardışık kütle spektrometresi yöntemiyle belirlenmesi
Determination of cocaine and its main metabolite benzoylecgonine in artificial cerebrospinal fluid by liquid chromatography tandem mass spectrometry method
Yazar: TUĞBA TEKİN BÜLBÜL
Danışman: DOÇ. DR. ZEYNEP TÜRKMEN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Kimya = Chemistry ; Uyuşturucu Alışkanlığı ve Alkolizm = Drug Addiction and Alcoholism
Dizin: Adli toksikoloji = Forensic toxicology

Özet:
Beyin omurilik sıvısı (BOS), postmortem toksikolojinin kan ve idrara alternatif matrisler arayışıyla kıymetli bir vücut sıvısı haline gelmiştir. Adli toksikoloji açısından sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile kantitatif analize imkan veren BOS, kana alternatif vücut sıvısı oluşuyla analizlerde tamamlayıcı sonuçlar verebilmektedir. BOS numunesi ile yapılacak analizlerin yöntem geliştirilmesinde, gerçek BOS numunesi kullanmadan gerçek sıvıya vekil niteliğinde yapay BOS (yBOS) sıvısı ile araştırmalar yapılmaktadır. 
Kokain, keyif almak için kullanılan ve kullanımı her geçen gün artan yasa dışı bir alkaloiddir. Beyne olan etkisi nedeniyle bağımlılığı yüksek bir madde olan kokainin; kullanım türüne, vücuda alım yoluna, kişinin metabolizasyonuna ve kullanım sıklığına bağlı olarak vücut sıvılarında bulunabilirliği farklıdır. Bu nedenle toksikolojik analizlerde kokain tespit ve tayinine dair farklı vücut sıvılarında daha hassas yöntemler geliştirmeye karşı ilgi artmıştır. Bu nedenle bu çalışmada gerçek numuneye en yakın haliyle hazırlanmış yBOS içerisinden kokaini ve ana metaboliti benzoilekgonini tespit ve tayin edebilmek için katı faz ekstraksiyon (SPE) yöntemi kullanılarak sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometresi (LC-MS/MS) sistemi ile hassasiyeti ve verimliliği yüksek analitik yöntem geliştirilmiştir.
Yapılan çalışmalarla kokain için metanol çözücüsünde 9 noktalı 0,2-100 ng/mL aralığında kalibrasyon grafiği çizdirilmiş r2 değeri 0,999 bulunmuştur. Kokainin ana metaboliti benzoilekgonin için ise 8 noktalı 0,5-100 ng/mL aralığında ve r2 değeri 0,999 olan kalibrasyon grafiği çizdirilmiştir. Metanol çözücüsüne ilaveten, matris etkisiyle daha doğru sonuçlar alabilmek adına yBOS numunesi ile de kalibrasyon grafiği çizdirilmiştir. Kokain için yBOS matrisinde 7 noktalı 0,5-50 ng/mL aralığında kalibrasyon eğrisi çizidirilmiş ve r2 değeri 0,998 bulunmuştur. Benzoilekgonin için ise yine 7 noktalı 0,5-50 ng/mL aralığında ve r2 değeri 0,998 olan kalibrasyon grafiği çizdirilmiştir. Kokain ve benzoilekgonin için metanol içerisinde elde edilen LoQ değerleri her ikisi için de 0,05 ng/mL bulunurken yBOS matrisi içerisinde sırasıyla 0,1 ng/mL ve 0,05 ng/mL bulunmuştur. 
Belirlenen SPE yöntemiyle 3 farklı konsantrasyonda 6 tekrarlı yapılan tekrarlanabilirlik ve 7 gün sonrasındaki ara kesinlik çalışmalarının sonuçlarında yüzde bağıl standart sapma (%RSD) değeri  <20 elde edilmiştir. Geri kazanım çalışmaları tekrarlanabilirlik ve ara kesinlik için hazırlanan 3 farklı konsantrasyon için toplamda 12 örnek üzerinden hesaplanmış ve tüm ölçüm sonuçları %70-120 geri kazanım aralığında bulunmuştur. Bulunan %RSD ve geri kazanım sonuçları ile geliştirilen yöntemin doğruluğu kanıtlanmıştır. Stabilite çalışmaları için 3 farklı konsantrasyonda hazırlanmış örneklerin her 3 tanesi oda sıcaklığı, +4 ºC, -20 ºC ve -80 ºC derecelerde 7 günlük süreyle bekletilmiştir. 7 gün sonrasında yapılan ölçümlerle değişim değerlerinin %1'in altında olduğu bulunmuş, geliştirilen yöntemin kararlılığını ispatlanmıştır. 
yBOS numunesinden kokain ve benzoilekgonin tespiti için geliştirilen yöntemin tüm validasyon çalışmaları uygun sonuçlarla tamamlanmıştır. Sonrasında, kokaine ait diğer metabolitleri de değerlendirmeye katarak daha hassas yöntemler geliştirmek ve bu yöntemleri gerçek numunelerde çalışarak doğrulamak hedeflenmektedir. Böylelikle postmortem olgularda kan örneğine alternatif olan ve korunaklı yapısıyla postmortem yeniden dağılımdan oldukça az etkilenen BOS numunesi, adli toksikolojiye ve adalete katkı sağlayabilecektir.

Abstract:
Cerebrospinal fluid (CSF) has become a valuable body fluid as postmortem toxicology seeks alternative matrices to blood and urine. CSF, which allows quantitative analysis with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in terms of forensic toxicology, can give complementary results in analyzes as it is an alternative body fluid to blood. In the development of the method for the analysis to be made with the CSF sample, researches are carried out with artificial CSF (aCSF) fluid as a substitute for the real fluid, without using the real CSF sample.
Cocaine is an illegal alkaloid that is used for pleasure and its use is increasing day by day. Cocaine, which is a highly addictive substance due to its effect on the brain; the availability in body fluids is different depending on the type of use, route of intake, metabolism of the person and frequency of use. Therefore, there has been increased interest in developing more sensitive methods for the detection and determination of cocaine in different body fluids in toxicological analyses. For this reason, in this study, in order to detect and determine cocaine and its main metabolite benzoylecgonine from aCSF prepared in the closest form to the real sample, LC-MS/MS system using solid phase extraction (SPE) method with high sensitivity and efficiency method has been developed.
The r2 value was found to be 0,999, with the calibration graph drawn in the range of 0,2-100 ng/mL with 9 points in methanol solvent for cocaine. For benzoylecgonine, the main metabolite of cocaine, a calibration chart was drawn with an 8-point range of 0,5-100 ng/mL and an r2 value of 0,999. In addition to the methanol solvent, a calibration graph was drawn with the aCSF sample in order to get more accurate results with the matrix effect. A calibration curve was drawn for cocaine in the range of 0,5-50 ng/mL with 7 points in the aCSF matrix and the r2 value was found to be 0,998. For benzoylecgonine, a 7-point calibration chart was drawn in the 0,5-50 ng/mL range and with an r2 value of 0,998. For cocaine and benzoylecgonine, the LoQ values obtained in methanol were 0,05 ng/mL for both, while 0,1 ng/mL and 0,05 ng/mL were found in the aCSF matrix, respectively.
In the results of the reproducibility and intermediate precision studies performed with 6 replications at 3 different concentrations with the determined SPE method, the percent relative standard deviation (%RSD) value was <20. Recovery studies were calculated on 12 samples in total for 3 different concentrations prepared for reproducibility and intermediate precision, and all measurement results were found in the recovery range of 70-120%. The accuracy of the developed method has been proven with the %RSD and recovery results found. For stability studies, each of the 3 samples prepared at 3 different concentrations were kept at room temperature, +4 ºC, -20 ºC and -80 ºC for 7 days. With the measurements made after 7 days, the change values were found to be below 1%, and the stability of the developed method was proven.
All validation studies of the developed method for the detection of cocaine and benzoylecgonine from the aCSF sample were completed with appropriate results. Afterwards, it is aimed to develop more sensitive methods by including other metabolites of cocaine into the evaluation and to verify these methods by working on real samples. Thus, the CSF sample, which is an alternative to blood sample in postmortem cases and is less affected by postmortem redistribution with its sheltered structure, will contribute to forensic toxicology and justice.