Akım sitometrisi yönteminin insan sperm hücrelerinde  i) fosfolipaz C-zeta ve ızumo-1, ii) dna'sında kırık olan sperm hücrelerinin saptanması için optimize edilmesi
Optimization of flow cytometry application to detect in human spermatozoa with i) fosfolipaz C-zeta and izumo-1 II) spermatozoa having dna
Yazar: ZEYNEP ÇAKAR
Danışman: PROF. DR. ÖZGÜR ÇINAR
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Sağlık Eğitimi = Health Education ; Üroloji = Urology
Dizin: Akım sitometrisi = Flow cytometry ; DNA = DNA ; Fertilizasyon = Fertilization ; Fosfolipazlar = Phospholipases ; Sperm = Spermatozoa ; Üreme teknikleri = Reproduction techniques

Özet:
Akım sitometrisi yönteminin insan sperm hücrelerinde i) fosfolipaz C-zeta ve Izumo-1, ii) DNA'sında kırık olan sperm hücrelerinin saptanması için optimize edilmesi
Döllenme sürecinin tamamlanması ve ardından embriyon gelişimi, dişi ve erkek gametlerin kalitesiyle doğrudan ilişkilidir. Erkek üreme hücresi olan sperm hücrelerinin kalitesi, rutin uygulamalarda hareketlilik ve morfoloji kriterlerine göre belirlenir. Sperm hücrelerinin fertilizasyon yeteneğinin sadece fiziksel parametreleriyle ilişkili kalmayıp fonksiyonel kapasitelerinin de önemli olduğu anlaşılmaktadır. Üreme konusunda pek çok bilinmeyenin yanında fertilizasyon süreci ve süreçte sperm hücresinin oositi nasıl aktive ettiği, üzerinde çalışmaların yürütüldüğü konulardan birisidir. Son yıllarda öne çıkanlar proteinlerden biri PLC-ζ (fosfolipaz C-zeta) proteini olmuştur. Yapılan çalışmalarda, PLC-ζ'nın sperm hücrelerinde varlığı gösterilmiş, mRNA ya da protein düzeyinde oosite verilmesinin oositte kalsiyum ossilasyonlarını uyardığı belirtilmiş ve PLC-ζ düzeylerindeki azlığın infertiliteye neden olabileceği dolaylı yollardan ifade edilmiştir. Öne çıkan proteinlerden bir diğeri ise testise spesifik olan ve olgun sperm hücrelerinde bulunan sperm-oosit füzyon proteini Izumo-1'dir. Yapılan çalışmalarda Izumo-1 knockout farelerde sperm hücrelerinin oosite bağlanabilme yeteneklerinin etkilendiği gösterilmiş ve Izumo-1'in insan gamet füzyonu için gerekliliği vurgulanmıştır. Sperm kalitesinin belirlenmesinde spermatozoonun DNA bütünlüğünün, rutin semen analizine ek olarak iyi bir belirteç olabileceği öngörülmektedir. TUNEL yöntemi kırık DNA uçlarına  (3'-OH uçlarına) işaretli nükleotidlerin bir enzim aracılığıyla eklenmesi prensibine dayanarak kırık DNA uçlarını belirler. Akım sitometri yöntemi son yıllarda kullanımı artmış, tanı amaçlı kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntemin üreme alanında da tanıya yönelik olarak kullanımının arttırılması oldukça önem taşımaktadır. Tüm bu çalışmaların doğrultusunda bu yüksek lisans tezinin amacı, insan sperm hücrelerinde yukarıda belirtilen parametrelerin akım sitometrisi yönteminde doğru olarak saptanabilmesi ve ileride tanı amaçlı klinik kullanıma sokulabilmesi için optimizasyon aşamalarının tanımlanmasıdır. Bu amaç doğrultusunda bu optimizasyon sağlanmış olup bulgular immünoflüoresan boyamalar ile de doğrulanmıştır.

Anahtar sözcükler: akım sitometri, Fosfolipaz C-zeta, Izumo-1, sperm seçimi, TUNEL

Abstract:
The completion of the fertilization process and embryo development is closely related to the successful fusion of both gametes. In routine applications, the quality of sperm is determined by the tests based on their motility and morphology. Thus, assessing an individual's fertility not only depends on physical parameters of spermatozoa but also on their functional capability. There are many unknowns about reproduction. In recent years, studies have been carried out on how sperm cells activate oocytes during the fertilization process. PLC-ζ (phospholipase C-zeta) protein has been postulated as one of the candidate proteins during last decade. In studies conducted, the presence of PLC-ζ in spermatozoa was demonstrated. PLC-ζ has been shown to stimulate oocyte calcium oscillations at the mRNA or protein level. It has also been expressed indirectly that the low level of PLC-ζ may cause infertility. The other protein studied in the sperm-oocyte fusion is Izumo-1, which is the testis-specific and found in mature sperm. It was shown that Izumo-1 has oocyte-binding ability and it was emphasized that Izumo-1 is necessary for human gamete fusion. Numerous studies have reported that sperm DNA fragmentation is linked with reduced fertility rates. TUNEL assay is used to identify DNA fragmentation that is caused by apoptotic signaling cascades. Mechanism of TUNEL assay depends on the presence of nicks in the DNA that can be recognized by terminal deoxynucleotidyl transferase or TdT, an enzyme will catalyze the addition of dUTPs that are secondarily labeled with a marker. Flow cytometer is a robust and widely used technique to analyze multiple parameters of individual cells within heterogeneous populations. It is very important to increase the use of this method for diagnosis in the reproductive area. The aim of this thesis of master degree is to describe the optimization steps with using flow cytometer to detect these proteins and DNA fragmentation in human sperm. This optimization has been achieved for this purpose and the findings have been confirmed by immünoflüoresanfluoresce staining.

Keywords: flow cytometry, Izumo-1, phospholipase C-zeta, sperm selection, TUNEL