Lipaz enziminin polivinil alkol (PVA) üzerine immobilizasyonu ve bazı organik çözgenlerde kullanım olanaklarının araştırılması
Immobilization of lipase on polyvinyl alcohol (PVA) and investigation of application potential in certain organic solvents
Yazar: TAYLAN KURTULUŞ ÖZTÜRK
Danışman: DOÇ. DR. ALİ KILINÇ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Esterleşme = Esterification ; Gaz kromatografisi = Gas chromatography ; Lipaz = Lipase ; Organik çözücüler = Organic solvents ; Su aktivitesi = Water activity ; İmmobilizasyon = Immobilization

Özet:
Susuz sistemlerde katalizleyebildikleri reaksiyonlar nedeniyle lipazlar biyoteknolojide en çok ilgi çeken hidrolaz sınıfı enzimlerdir. Susuz sistemlerde lipazların sentetik reaksiyonlarının kullanım olanaklarının geliştirilmesi için solvent denatürasyonunun önlenmesi ve enzimin sürekli sistemlerde kullanabilmesi için immobilizasyon gereklidir. Bu çalışmada domuz pankreatik lipaz çapraz bağlı polivinil alkol üzerine adipoil diklorür ile kovalent bağlanarak immobilize edildi. İkinci olarak immobilizasyon verimliliğinin arttırılması ve enzimin immobilizasyon sırasında denatürasyondan korunması amacıyla ortama çeşitli zincir uzunluğuna sahip çift karbon sayılı yağ asitleri ilave edildi. Aktivite veriminin en yüksek olduğu immobilizasyon koşulları hidrolitik aktiviteler karşılaştırılarak belirlendi ve en uygun yağ asidinin 500mM oktanoik asit olduğu belirlendi. Yağ asidi varlığında gerçekleştirilen immobilizasyon, yağ asidi kullanılmayan immobilizasyona kıyasla 4 kat aktivite artışı sağladı. Yağ asidi varlığında ve yokluğunda gerçekleştirilen immobilize PPL'nin optimum pH, optimum sıcaklık, pH stabilite, termal ve depo kararlılığı gibi özellikleri tayin edilerek serbest enzimle kıyaslandı. İmmobilize preparatlarda en yüksek esterifikasyon aktivitesi optimum 0.973 su aktivitesinde gerçekleşirken, bu değerde serbest lipaz düşük aktivite gösterdi. Serbest ve immobilize pankreatik lipaz preparatlarının esterifikasyon aktiviteleri, farklı zincir uzunluğuna sahip yağ asitleri ve n-bütanolün, n-hegzan içerisinde esterifikasyonu ile gerçekleştirildi. Lipaz katalizli esterifikasyon sonucunda oluşan bütil esterleri gaz kromatografisi ile nicel olarak tayin edildi. Oktanoik asit varlığında immobilize lipazın esterifikasyon reaksiyonu sonucunda en yüksek ürün verimi %91.6 ile oktanoik asit esterinde elde edildi. Serbest enzim ve yağ asidi kullanılmayan immobilize enzimde bu oran sırasıyla %30.4 ve 56.4 olarak bulundu. Serbest ve immobilize enzim preparatlarının başlangıç sentez hızları, oktanoik asidin n-bütanol esteri sentezi için karşılaştırıldığında yağ asidi varlığında gerçekleştirilen immobilizasyon sonucunda lipaz bu esterin sentezini daha yüksek hız ve verimle katalizlediği belirlendi.Elde edilen veriler ışığında yağ asidi varlığında gerçekleştirilen immobilizasyonun organik solvent içerisinde enzimin aktif merkezinin, immobilizasyondan kaynaklanan denatürasyondan korunmasında etkin olduğu ve elde edilen immobilize pankreatik lipazın susuz sistemlerde serbest enzime kıyasla çok daha yüksek verimle ve etkin biçimde kullanılabileceği belirlendi.

Abstract:
Lipases are one of the most attractive hydrolitic enzymes in biotechnology because of their reactions in non-aqueous systems. The use of lipases in synthetic reactions and continous process the immobilization of lipases is needed to protect the enzyme from solvent denaturation. In this work porcine pancreatic lipase was covalently immobilized on polyvinyl alcohol with adipoyl dichloride in the presence of various chain length fatty acids. Various chain length even carbon fatty acids were added to immobilization media to increase the enzyme activity and protect the enzyme denaturation due to immobilization process. Optimized conditions of immobilization were determined by comparison of hydrolytic activities and caprylic acid was found the best fatty acid additive with the concentration of 500 mM. Even though the addition of the fatty acid has not have any effect on bounded protein, the increase of specific activity reached 4 fold over the non-additive immobilized lipase in the presence of caprylic acid.Initial water activity control is the key step for esterification reactions. Because of this reason enzymes and reaction components initial water activities equilibrated with saturated salt solutions. The highest esterification activities of immobilized enzymes were obtained at the aw=0.973 (K2SO4) but free commercial enzyme was the lowest at this water activity. Synthesis activity of the free and immobilized lipases was monitored by the esterification reaction of various chain length fatty acids with n-butanol in n-hexane. Butyl esters analyzed quantatively by gas chromatography. Although the highest product yield was obtained in the end of esterification reaction catalyzed by immobilized enzyme with caprylic acid additive with 91.6 % (caprylic acid butyl ester), for free and non-additive immobilized enzyme, this percentage was 30.4% and 56.4%, respectively. In comparison with the results of initial reaction rates of immobilized enzymes (with additive and non-additive) and free commercial enzyme by the synthesis of caprylic acid esters, it was demonstrated that addition of the fatty acid affects the type of the reaction in its own synthesis route.As a conclusion, it was determined that, addition of fatty acids protect the active site of the enzyme from denaturizing effects of immobilization steps and increase the activity yield and catalysis effect in non-aqueous systems with the comparison of free enzyme and non-additive immobilized enzyme.