Doku ve plazma 3-nitrotirozin düzeylerinin yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile ölçümü
The measurement of tissue and plasma 3-nitrotyrosine levels by high pressure liquid chromatography (HPLC)
Yazar: HALİL YAMAN
Danışman: PROF.DR. M. KEMAL ERBİL
GATA / Tıp Fakültesi / Biyokimya ve Klinik Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2000
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
VI-OZET DOKU VE PLAZMA 3-NİTROTİROZİN DÜZEYLERİNİN YÜKSEK BASINÇLI SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC) İLE ÖLÇÜMÜ Serbest radikaller normal hücre fonksiyonları üzerine etkisi olan, çeşitli hücre içi organeller ve moleküllerde (lipidler, proteinler, nükleik asitler, karbohidratlar) hasar oluşturacak potansiyelleri ile normal aerobik hücre metabolizmasının istenmeyen ürünleridirler. Reaktif oksijen türlerinden olan süperoksid (02") ile reaktif nitrojen türlerinden olan nitrik oksid (NO)'in reaksiyona girmesi sonucu güçlü bir oksidan ve nitratlayıcı tür peroksinitrit oluşmaktadır. Peroksinitrit, tirozin rezidülerini nitratlayarak 3-nitrotirozin (3-NT) oluşturmaktadır. 3-NT ile peroksinitrit aracılıktı doku hasarını belirlenebilmektedir. Bu çalışmada hastanemiz koşullarında doğruluğu, duyarlığı ve özgüllüğü yüksek olarak bilinen Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) tekniğini kullanarak, kalp dokusu ve plazma örneklerinde 3-NT'in miktar tayinini yapmayı amaçladık. Bu amaçla HPLC ile UV dedektörün kullanıldığı bir yöntemi modifiye ettik. Bu yöntemde ilk önce, peroksinitrit elde ederek in vitro çalışmaları yaptık. Daha sonra in vivo çalışmalar için, kalp dokusunu ve plazmayı denedik. Bu maksatla dokuların ve plazmaların 6 N HCI ile hidrolizini gerçekleştirdik. Ters faz elüsyon kullanılarak 3-NT'in ayrıldığı bu HPLC yönteminde, mobil faz olarak % 8 metanol içeren 50 mmol/L NaOAc / 50 mmol/L sitrat tampon (pH:3.1), kolon olarak C18, ODS-2, 250 x4.6 mm boyutlarındaki çelik kolon kullanıldı. Dedektör dalga boyu 274 nm'ye ayarlandı. Yöntemin doğruluk çalışmalarında, 3-NT için retansiyon zamanı standartlar için 13.75 ± 0.5 dakika iken; doku ve plazma örneklerinde ise daha öne alındığını görüldü. Gün içi CV % 1.90, günler arası CV % 2.34 olarak bulundu. 3-NT ölçümü için yöntemin 10 ^mol/L'ye kadar lineer olduğu saptandı. Sonuç olarak; 3-NT ölçümü için uygun bir HPLC yöntemi saptandı. Daha sonra insan plazma ve hayvanlardan elde edilen kalp doku örneklerinde çalışıldı. Sağlıklı bireylerden ve aterosklerozlu hastalardan elde edilen plazmalarda 3-NT tespit edilemedi. E.Coli verilen hayvanların dokularında 3-NT saptanırken; antioksidan olarak melatonin, vitamin A, vitamin C verilen hayvanlar ve kontrol grubu hayvanlardan elde edilen kalp dokularında ise 3-NT tespit edilemedi. Böylelikle melatonin, vitamin A'nın koruyucu ve vitamin C'nin ise tedavi edici rollere sahip oldukları görüldü. Uyguladığımız HPLC yönteminin tekrarlanabilirliği olan, duyarlı, güvenilir bir yöntem olduğu kanısına varıldı. 57

Abstract:
VII-SUMMARY THE MEASUREMENT OF TISSUE AND PLASMA 3-NITROTYROSINE LEVELS BY HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) Free radicals are such undesirable products of physiological aerobic cell metabolism that affect the normal cellular functions and have the potential to damage various intracellular organelles and molecules (lipids, proteins, nucleic acids, carbohydrates). An highly oxidant and nitrating peroxynitrite is formed by the reaction occurred between superoxide (02"), one of the reactive oxygen species, and nitric oxide (NO), one of the reactive nitrogen species. Then, peroxynitrite forms 3-nitrotyrosine (3-NT) by nitrating tyrosine residues. Therefore, peroxynitrite-mediated tissue damage can be detected by 3-NT. In this study, we aimed to determine the levels of 3-NT in plasma and heart tissue samples by using HPLC which is known as technique with high accuracy, sensitivity and specificity in our hospital conditions. Thus we modified a method using HPLC and UV detection. For this method, firstly, in vitro studies were performed by peroxynitrite obtained. Then, we used plasma and heart tissue samples for in vivo experiments and these samples were hydrolysed by using 6 N HCI. In this HPLC method with reversed-phase separation of 3-NT, we used mobile phase comprising of 50 mmol/L NaOAc and 50 mmol/L citrate buffer (pH:3.1) including 8 % methanol, and column (250 x 4.6 mm I.D.) packed with ODS-2 C-|8 (5 ^im). The UV detector was set at 274 nm. Retention time for 3-NT was 13.75 ± 0.5 min for standards and earlier for samples. The within-day and between-day coefficients of variation were found to be 1.90 % and 2.34 %, respectively. The limit of detection was also found linear to 10 jj.mol/L for 3-NT measurement. Consequently, an available HPLC method for the measurement of 3-NT was established. Then, heart tissue samples of animals and human plasma samples were examined by using this modified method. However, 3-NT could not be detected in plasma obtained from healthy individuals and patients with atherosclerosis. 3-NT was identified in tissue samples of animals administered by E.coli, but could not also be determined in heart tissues of animals given antioxidants such as melatonin, vitamin A and vitamin C. So, it was aggreed that melatonin and vitamin A had protective, but vitamin C had therapeutic effect. It was also concluded that HPLC method we performed in the present study was the sensitive and specific method with good precision. 58