İndirgenmiş folat taşıyıcısı 1'in rolünün iskemik inme ve retinal iskemi modellerinde araştırılması
The investigation of the role of reduced folate carrier 1 in ischemic stroke and retinal ischemia models
Yazar: GÖKÇE GÜRLER
Danışman: PROF. DR. MÜGE YEMİŞCİ ÖZKAN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Nörolojik ve Psikiyatrik Temel Bilimler Ana Bilim Dalı / Temel Nörolojik Bilimler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoloji = Biology ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Beyin iskemisi = Brain ischemia ; Kan beyin bariyeri = Blood brain barrier

Özet:
Beyin parankimine folat taşınması iki şekilde olmaktadır. Bunlardan birincisi koroid pleksus üzerinden folat reseptör alfa (FOLRα) aracılığıyladır diğeri ise indirgenmiş folat taşıyıcısı 1 (RFC1, SLC19A1) ile kan-beyin bariyeri (KBB) üzerindendir. RFC1 literatürde özellikle koroid pleksustan folat taşınmasının bozulduğu durumlarda KBB üzerinden folat taşınmasını artırıcı alternatif bir yol olarak çalışılmıştır. Ancak güncel literatürde RFC1'in potansiyel yeni rolleri tanımlanmaya başlanmıştır. Yakın zamanda RFC1, Gen Seti Zenginleştirme Analizi (Gene Set Enrichment Analysis) sonucunda hipoksi-immün ilişkili bir gen olarak tanımlanmıştır. Geniş bir insan popülasyonunun değerlendirildiği bir klinik çalışmada, RFC1 polimorfizmleri iskemik inme, küçük damar oklüzyonu ve sessiz beyin enfarktına yatkınlıkla ilişkilendirilmiştir. Ayrıca beyin mikrodamarlarını sararak mikrodolaşımın ve KBB'nin kontrolünü sağlayan ve iskemide önemli görevleri bulunan heterojen gen ifade profilli mural hücrelerde (perisitler ve vasküler düz kas hücreleri) ortak genleri araştıran bir meta-analiz çalışmasında RFC1 üç ortak genden biri olarak öne çıkmıştır. Güncel literatürde iskemideki potansiyel rolüne yapılan dolaylı atfa rağmen RFC1'in iskemik inme ile direkt bağlantısına yönelik bir çalışma yapılmamıştır. Ayrıca, iskemik inme patofizyolojisinde önemli rolü bulunan perisitlerde protein düzeyinde varlığı gösterilmemiştir ve mikrodamarlardaki potansiyel rolü de çalışılmamıştır. Retina, beynin uzantısı olarak benzer anatomik ve fizyolojik özelliktedir ancak vücutta en yüksek perisit yoğunluğuna sahip olan dokudur. İç kan-retina bariyeri (KRB), KBB'ye benzer niteliktedir ve retinal iskemi ile iskemik inme arasında da önemli benzerlikler bulunmaktadır. Ancak, RFC1 proteini literatürde iç KRB'yi oluşturan perisit ve endotel hücrelerinde gösterilmemiş, retinal iskemideki potansiyel rolü çalışılmamıştır. Bu tez çalışmasında, erişkin erkek ve dişi Swiss albino fareler kullanılarak öncelikle RFC1 proteininin beyin perisitlerinde varlığının beyin kesitlerinde ve izole mikrodamar preparatlarında; retinada ise iç KRB'deki varlığının tüm retinada ve retinanın tripsin ile sindirilerek elde edilmiş mikrodamarlarında,
immunohistokimyasal olarak gösterilmesi hedeflenmiştir. Ardından proteinin fonksiyonu ve seviyeleri; RFC1'in gen susturumu için özel olarak tasarlanmış small interfering RNA (siRNA), gen ifadesinin artırılması için RFC1 geninin aşırı eksprese edilmesini sağlayan Lentiviral Vektör ve uygun kontrolleri kullanılmıştır. Bunlar beyne intrakortikal, göze intravitreal enjeksiyonlar ile tatbik edilmiştir. Ayrıca RFC1'in kompetetif inhibitörü olan metotreksat sistemik olarak verilerek taşıyıcı farmakolojik olarak modifiye edilmiştir. Fokal serebral iskemi/rekanalizasyon intraluminal model, retinal iskemi FeCl3 modeli ile oluşturulmuştur. Bu patolojik durumların RFC1 proteini üzerindeki etkileri ve RFC1 proteini modifikasyonlarının patofizyolojideki rolleri immünohistokimya, histokimyasal yöntemler, Western blotlama ve diğer tamamlayıcı yöntemler ile incelenmiştir. Ayrıca başka bir grup farenin beynine RFC1-siRNA verildikten sonra iskemi/rekanalizasyon uygulanarak enfarkt hacminin değişimi ve KBB'den kontrast ajanı -gadolinyum- sızması in vivo yüksek çözünürlüklü (7 Tesla) manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile araştırılmıştır. Bu tezden elde edilen sonuçlardan ilki RFC1 proteininin beyin perisitlerinde bulunduğudur. Literatürde ilk kez iç KRB'de hem perisitlerde hem de endotel hücrelerinde RFC1 proteinin varlığı retina dokusunda ve tripsin ile izole edilen mikrodamarlarda gösterilmiştir. Intravitreal veya intrakortikal verilen RFC1-siRNA ile RFC1 protein ifadesinin susturulmasıyla 24 saat içinde KBB ve iç KRB fonksiyonel bütünlüğü bozulmuş ve endojen IgG damar dışına sızmıştır. RFC1-siRNA'nın bariyerde yol açtığı fonksiyonel yıkıma sıkı bileşke ve bazal membran proteinlerinin azalmasının eşlik ettiği retina damarlarında gösterilmiştir. Retina damarlarında bir saat retinal iskeminin RFC1 proteinini artırdığı saptanmıştır. Ancak beyin iskemisi sonrası farklı rekanalizasyon sürelerinde iskemik enfarkt, periinfarkt ve kontralateral bölgede RFC1 proteini değişmiştir. RFC1 proteinin beyin veya retina iskemisinden önce RFC1-siRNA ile azaltılması, iskeminin bariyerler üzerindeki yıkıcı etkilerini şiddetlendirmiş ve daha fazla IgG sızmasına sebep olmuştur. Ayrıca, RFC1-LV'nin intravitreal olarak retinal iskemi öncesi uygulanması ile yapılan ön tedavi, iskemiden sonra azaldığı gösterilen kollajen-4 ve okludin seviyelerini kurtararak iskeminin bariyer proteinleri üzerindeki etkisinin şiddetini azaltmıştır. Tek doz metotreksatın sistemik uygulanmasından bir saat sonra RFC1 seviyelerinde artış, 48 saat sonra ise azalış gözlemlenmiş ve metotreksatın RFC1 ifadesi üzerindeki modifiye edici etkisi
gösterilmiştir. RFC1-siRNA enjeksiyonu yapılan retinalarda kontrole göre aktif folat seviyeleri karşılaştırılmış ve RFC1 substratı folat ile ve RFC1'in bariyer üzerindeki kontrolü arasındaki ilişki araştırılmıştır. RFC1-siRNA uygulanan retinalarda kontrole göre istatistiksel anlamlı bir değişim gözlenmemiştir. Sonuç olarak, bu tez RFC1'in folat taşınması dışında fizyolojik durumda ve iskemide iç KRB ve KBB'de rolü olduğunu göstermiştir. Beyinde perisitlerde ve retinada iç KRB'de RFC1 proteininin varlığını göstermiş ve RFC1'in KBB ve KRB'nin bütünlüğünü sağlamaktaki önemini ortaya koyarak yeni bir bakış açısı sunmuştur. Erişkin farelerde bölgesel (intravitreal veya intrakortikal) RFC1 susturulması ile bariyerlerde 24 saat içinde meydana gelen yıkım RFC1'in bariyer özelliklerinin akut düzenleyicisi olduğunu göstermiştir. Bir saatlik retinal iskemide düzeyinin artışı, beyin iskemisinde ise farklı rekanalizasyon sürelerinde düzeyinin değişmesi, RFC1 proteininin gen bankalarının analizi ile elde edilen hipoksi-immun ilişkili gen tanımına uyduğunu ve iskemik inme ve retinal iskemi patofizyolojilerinde rolü olabileceğini desteklemektedir. İskemi öncesi RFC1LV tedavisi ile iskeminin bariyer proteinlerinde meydana getirdiği azalmanın iyileşmesi, RFC1'e yönelik müdahalelerin retinal iskemi ve iskemik inme patofizyolojilerinde bariyer koruyucu işlev görebileceğini göstermiştir. RFC1 susturumu ile retina dokusunda aktif folat seviyesinde istatistiksel anlamlı bir değişim olmaması dokunun RFC1 susturulmasına karşılık folat seviyelerini kısmen telafi ettiği ve bariyerlerde meydana gelen değişimin dokunun veya organizmanın aktif folat düzeyleri ile ilişkisiz olabileceğini önermiştir. Tüm bu sonuçlar RFC1'in, beyin ve retina parankimine folat taşıma fonksiyonun yanı sıra sağlıkta ve iskemide KBB ve KRB'nin dinamik bir düzenleyicisi olduğuna ve RFC1 polimorfizmlerinin yatkınlık yarattığı iskemi ilişkili durumların altta yatan patogenezinin bu açıdan araştırılması gerektiğine işaret etmektedir. Bu tez, RFC1 proteinin yeni işlevlerini ortaya koymakla beraber varlığı ve önemi bilinmeyen ancak gen veri bankalarının matematiksel analizi veya -omik yaklaşımları ile yapılan araştırmalarda adı ön plana çıkan proteinler için kavramsal bir çalışma modeli önermektedir. Günümüzde bu yaklaşımlar her ne kadar ileri ve gelişmiş olsalar bile beyin araştırmalarında in vivo modellerin ve 'gözle görme'nin önemini, proteinlerin rollerinin anlaşılmasında şaşırtıcı sonuçlar ortaya koyabileceğini göstermektedir. RFC1'in KBB ve iç KRB üzerinde sahip olduğu etkinin mekanizmasının anlaşılmaya çalışılması bu tezden sonra bir odak noktası olmaya devam edecektir. İleri araştırmalar, RFC1'in özelliklerini, protein-protein etkileşimlerini ve patofizyolojide üstlendiği rolleri aydınlatmayı amaçlamaktadır.

Abstract:
Reduced Folate Carrier 1 (RFC1, SLC19A1) is the folate transporter in the brain located at the blood-brain barrier (BBB). Polymorphisms of RFC1 in humans are linked to an increased risk of ischemic stroke. Transcriptomic studies have shown an abundant presence of RFC1 mRNA in cerebral microvascular mural cells; however, RFC1 protein had not been demonstrated yet. Our previous studies revealed the importance of microcirculation in stroke pathophysiology. The presence of RFC1 protein and its probable role in ischemic stroke, and retinal ischemia from the perspective of microvessels, remain enigmatic. In this thesis, RFC1 protein in the brain and retinal pericytes as well as in the inner blood-retina barrier (BRB) was characterized in adult mice. RFC1 protein was evaluated by the immunohistochemistry of the whole mount retinas, cerebral sections, isolated microvessels, Western blotting, and cerebral 7 Tesla MRI in separate experiments that include knock down by short interfering RNA (siRNA), and overexpression by Lentiviral Vector (LV), and pharmacological modification by methotrexate. Knocking down retinal RFC1 led to structural abnormalities in microvessels, and decreased in the expression of barrier proteins occludin, claudin-5, ZO-1, and collagen-4, resulting in the functional failure of inner BRB, as seen by an extensive IgG leakage. This failure in the brain was also detected by contrast agent leakage in MRI. Additionally, the detrimental effects of ischemia on the barriers were exacerbated. Pre-treatment with RFC1-LV partially restored collagen-4 and occludin levels in retinal ischemia. In essence, this thesis clarifies the presence of RFC1 protein in the cerebral pericytes and the inner BRB, offering a novel perspective on RFC1 as a dynamic regulator of the BBB and inner
BRB under physiologic states, and emphasizes its critical role during ischemia.