Temozolomid ve genistein yüklü polimerik nanopartiküllerin anti-proliferatif ve apoptotik etkilerinin insan glioblastoma hücrelerinde karşılaştırmalı analizi
Comparative analysis of antiproliferative and apoptotic effects of temozolomide and genistein loaded polymeric nanoparticles in human glioblastoma cells
Yazar: İREM METEOĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ AYŞEGÜL ERDEMİR ÜSTÜNDAĞ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Beyin hücreleri = Brain cells

Özet:
Glioblastoma multiforme (GBM), en yaygın ve agresif beyin kanser türlerinden biridir. GBM'nin yüksek düzeyde invaziv doğası ve kan-beyin bariyeri (KBB) gibi fizyolojik engellerden ilaç penetrasyonunun zorluğu GBM tedavisini zorlaştırmaktadır. Temozolomid (Tmz), GBM tedavisinde kullanılan standart kemoterapi ajanıdır. Ancak, KBB ve tümör hücre zarlarından düşük geçirgenlik, Tmz'nin farmakolojik aktivitesini ve biyoyararlanımını azaltmaktadır. Daha etkin glioblastoma tedavisi için kemoterapi duyarlılığını arttıracak ve yan etkileri azaltacak yeni stratejilerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. 
İnsan diyetindeki en büyük izoflavon olan genistein (Gen) hücre bölünmesi kontrolü, apoptotik hücre ölümü, hücre göçü, invazyon, anjiyogenez ve metastaz gibi hücresel olayları kontrol eden potansiyel bir kemoterapötik ajandır. Ancak bu molekülün anti-kanser ajan olarak kullanımı suda düşük çözünürlüğü sebebiyle sınırlıdır. Nano-ilaç taşıma sistemleri, hem temozolomid hem de genisteinin dezavantajlarının üstesinden gelmek ve biyolojik aktivitelerini geliştirmek için kullanılabilecek önemli araçlardır.  
Bu tez çalışmasında, Gen ve Tmz yüklü PLGA nanopartikül sistemlerinin (TmzGenNP) üretimi, karakterizasyonu ve U87MG glioblastoma hücreleri üzerindeki anti-tümör aktivitelerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla temozolomid ve genistein yüklü PLGA nanopartiküller tekli emülsiyon (o/w) çözücü uçurma yöntemi ile sentezlenmiştir. Nanopartiküllerin fizikokimyasal karakterizasyonu, nanopartiküllerin küçük boyutlu, uniform ve kontrollü salım özelliklerine sahip olduğunu ortaya koymuştur. TmzGenNP'nin U87MG glioblastoma hücreleri üzerindeki sitotoksik aktiviteleri MTT yöntemi ile belirlenmiştir. U87MG hücrelerinin Tmz/Gen kombinasyonu ve TmzGenNP ile 24 saat inkübasyonu sonrası IC50 değerleri sırasıyla 15.29 μg/ml ve 16.72 μg/ml, 48 saat inkübasyonu sonrası IC50 değerleri ise 71.48 μg/ml ve 3.43 μg/ml olarak belirlenmiştir. Yara iyileşme testi ile TmzGenNP'nin U87MG hücre göçünü önemli ölçüde inhibe ettiği gösterilmiştir. BrdU inkorporasyon analizi, TmzGenNP'nin U87MG hücre proliferasyonunu doza bağımlı olarak azalttığını ortaya koymuştur. TmzGenNP'nin apoptotik genlerin ekspresyonunu arttırdığı kantitatif real-time PCR analizi ile gösterilmiştir. Ayrıca, TmzGenNP'nin U87MG hücrelerinde intrinsik apoptozu indüklediği immunoblot analizi ile tespit edilmiştir. Bu tez çalışmasından elde edilen bulgular, TmzGenNP'nin U87MG hücrelerinde gelişmiş anti-tümör aktivitesi sergilediğini ve ikili nano-ilaç dağıtımının glioblastomaya karşı umut verici bir strateji olabileceğini göstermiştir.

Abstract:
Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most common and aggressive types of brain cancer. The highly invasive nature of GBM and the difficulty of drug penetration from physiological barriers such as the blood-brain barrier (BBB) make GBM treatment difficult. Temozolomide (Tmz) is the standard chemotherapy agent used in the treatment of GBM. However, low permeability through BBB and tumor cell membranes reduces the pharmacological activity and bioavailability of Tmz. For more effective glioblastoma treatment, new strategies are needed to increase chemotherapy sensitivity and reduce side effects.
Genistein (Gen), the largest isoflavone in the human diet, is a potential chemotherapeutic agent that controls cellular events such as cell division control, apoptotic cell death, cell migration, invasion, angiogenesis, and metastasis. However, the use of this molecule as an anti-cancer agent is limited due to its low solubility in water. Nano-drug delivery systems are important tools that can be used to overcome the disadvantages of both temozolomide and genistein and improve their biological activity.
In this thesis, it is aimed to produce and characterize Gen and Tmz loaded PLGA nanoparticle systems (TmzGenNP) and to evaluate their anti-tumor activities on U87MG glioblastoma cells. For this purpose, temozolomide and genistein-loaded PLGA nanoparticles were synthesized by a single emulsion (o/w) solvent evaporation method. Physicochemical characterization of nanoparticles revealed that nanoparticles have a small size, uniform, and controlled release properties. The cytotoxic activities of TmzGenNP on U87MG glioblastoma cells were determined by the MTT method. After 24 hours incubation of U87MG cells with Tmz/Gen combination and TmzGenNP, IC50 values were determined as 15.29 μg/ml and 16.72 μg/ml, respectively and after 48 hours of incubation, IC50 values were determined as 71.48 μg/ml and 3.43 μg/ml, respectively. With the wound healing assay, it has been shown that TmzGenNP significantly inhibited U87MG cell migration. BrdU incorporation analysis revealed that TmzGenNP decreased U87MG cell proliferation in a dose-dependent manner. Quantitative real-time PCR analysis has shown that TmzGenNP increases the expression of apoptotic genes. In addition, induction of intrinsic apoptosis in U87MG cells by TmzGenNP was determined by immunoblot analysis. Findings from this thesis showed that TmzGenNP exhibits enhanced anti-tumor activity in U87MG cells and dual nano-drug delivery can be a promising strategy against glioblastoma.