İnterlökin-2 ile uyarılmış mezenkimal kök hücrelerin anaplastik tiroid kanseri hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin incelenmesi
Investigation of cytotoxic effects of interleukin-2 induced mesenchymal stem cells on anaplastic thyroid cancer cells
Yazar: BULUT YURTSEVER
Danışman: YRD. DOÇ. DR. GÜLÇİN GACAR
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre ve Doku Yenilenmesi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Kök hücreler = Stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Tiroid neoplazmları = Thyroid neoplasms ; İnterlökin 2 = Interleukin 2 ; İnterlökinler = Interleukins

Özet:
Amaç: Hücrelerin bölünme faaliyetleri sırasında meydana gelen hataların ve mutasyonların etkileri sonucu, kontrolsüz hücre bölünmesi olarak adlandırılan, hücrelerin kanserleşme süreçlerine karşı onlarca yıldır yapılan çalışmalarda geliştirilen stratejiler genel olarak cerrahi, radyoterapi, kemoterapi, hedeflenmiş tedaviler olarak gösterilebilir. Bu stratejilere ek olarak hücresel temelli immünoterapi stratejisi son yıllarda öne çıkmayı başarmıştır. İmmün sistemi düzenleme ve modüle etme özellikleri, mezenkimal kök hücrelerin kansere karşı kullanımını olanaklı hale getirmiştir. İmmün sistemi düzenleyen bir başka mekanizma da sitokinlerin etkileridir. İnterlökin ailesinin immün sistem hücreleri üzerine olan etkilerinden biri hücrelerin çoğalmasını ve uyarılmasını sağlamaktır. Bu bağlamda İnterlökin-2 sitokini mezenkimal kök hücreleri uyarmak ve kanser hücrelerini öldürmek amacıyla kullanılmıştır. Bu çalışmada, mezenkimal kök hücrelerin tek başlarına ve sitokin ile birlikte kanser hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin incelenmesi amaçlanmaktadır. 
Yöntem: Bu çalışmada, insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler kültüre alınıp çoğaltılmıştır. Hücreler 3.pasaja kadar çoğaltıldıktan sonra karakterizasyonları yapılmıştır. Anaplastik tiroid kanseri hücreleri olan CAL62 tümör hücre hattı ile ko-kültüre edilmiştir. Mezenkimal kök hücrelerin tümör hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin anlaşılabilmesi için sitokinli ve sitokinsiz olarak ayrı ayrı gruplar oluşturularak ko-kültür düzenekleri kurulmuştur. Sitokinin etkilerinin zamana bağlı olarak nasıl bir etki gösterdiğinin anlaşılabilmesi için ölçümler 24., 48. ve 72. saatler baz alınarak yapılmıştır. Mezenkimal kök hücrelerin CAL62 anaplastik tiroid kanseri hücreleri üzerine sitotoksik ve antiproliferatif etkilerinin incelenebilmesi için WST-I ve ELIZA  (ELİSA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)  analizleri yapılmıştır. Kanser hücrelerinin ko-kültür sonrası hücre siklusundaki değişimler akım sitometrik analizler ile incelenmiştir. MKH'lerin ve CAL62 anaplastik tiroid kanseri hücrelerinin yüzey belirteçleri akım sitometrik analizler ile incelenmiştir. CAL62 hücrelerinin ko-kültür öncesi ve sonrası telomeraz enzim aktivitesindeki değişimler TRAP (Telomerase Repeated Amplification Protocol) yöntemi ile incelenmiştir. Ayrıca MKH'lerin ve CAL62 hücrelerinin gen ekspresyon seviyeleri Gerçek zamanlı polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile incelenmiştir.
Bulgular: Analizler sonucunda, mezenkimal kök hücrelerin tek başlarına ve sitokin ile birlikte kanser hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin olduğu gözlemlenmiştir. Gruplar arasındaki farklar incelendiğinde, mezenkimal kök hücrelerin sitokin ile birlikte ve direkt ko-kültür olarak kullanıldığında en etkili sonuçların elde edildiği gözlemlenmiştir.
Sonuç: Analizlerin sonuçlarına göre, İnterlökin-2 sitokininin mezenkimal kök hücrelerin uyarılmasını sağladığı ve CAL62 anaplastik tiroid kanseri hücreleri üzerine sitotoksik etki oluşturduğu görülmüştür. Ayrıca direkt ko-kültürün, indirekt ko-kültüre göre antiproliferatif etkilerin gözlemlenmesi bakımından daha etkili olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Objective: Strategies developed during decades of studies on cancer cell proliferation, which are termed as uncontrolled cell division, are generally referred to as surgery, radiotherapy, chemotherapy, targeted therapies. In addition to these strategies, the strategy of cell-based immunotherapy has come to the forefront in recent years. Modulation and modulating properties of the immune system have made possible the use of mesenchymal stem cells against cancer. Another mechanism that regulates the immune system is the effects of cytokines. One of the effects of the interleukin family on the immune system cells is to proliferate and stimulate the cells. In this context, Interleukin-2 cytokines have been used to stimulate mesenchymal stem cells and kill cancer cells. In this study, the cytotoxic effects of mesenchymal stem cells alone and on cytokines and cancer cells are investigated.
Method: In this study, human bone marrow derived mesenchymal stem cells were cultured and multiplied. After the cells were amplified to the 3rd pascal, characterization was made. The CAL62, anaplastic thyroid cancer cells, was co-cultured with the tumor cell line. In order to understand the cytotoxic effects of mesenchymal stem cells on tumor cells, co-culture systems have been established by creating separate groups with cytokines and without cytokines. The measurements were based on 24, 48 and 72 hours so that the effects of cytokine were affected by time. WST-I and ELISA analyzes were performed to examine the cytotoxic and antiproliferative effects of mesenchymal stem cells on CAL62 anaplastic thyroid cancer cells. Changes in cell cycle of cancer cells after co-culture were examined by flow cytometric analysis. Surface markers of MSCs and CAL62 anaplastic thyroid cancer cells were examined by flow cytometric analysis. Changes in telomerase enzyme activity of CAL62 cells before and after co-culture were examined by TRAP (Telomerase Repeated Amplification Protocol) method. In addition, gene expression levels of MSCs and CAL62 cells were examined by RT-PZR (Gerçek zamanlı PZR).
Results: As a result of the analyzes, it has been observed that cytotoxic induction of mesenchymal stem cells alone and in combination with cytokines on cancer cells has been observed. When the differences between the groups were examined, it was observed that mesenchymal stem cells had the most effective results with cytokine and direct co-culture.
Conclusion: According to the results of the analyzes, Interleukin-2 cytokine induces mesenchymal stem cells and CAL62 cytotoxic effect on the cells of anaplastic thyroid cancer. It has also been concluded that direct co-cultures are more effective in observing cytotoxic effects than indirect co-cultures.