İzoniyazid dirençli Mycobacterium tuberculosis kompleks suşlarında gen mutasyonlarının karakterizasyonu
Characterization of gene mutations in isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis complex strains
Yazar: NAZLI ARSLAN
Danışman: PROF. DR. AYŞE AYDAN ÖZKÜTÜK
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji = Infectious Diseases and Clinical Microbiology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antibiyotik dirençliliği =   ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis

Özet:
Tüberküloz halen dünya çapında enfeksiyon hastalıklarına bağlı ölüm nedenleri arasında ikinci sırada yer almaktadır. Tüberkülozun kontrol altına alınmasında en büyük problem ilaç direncidir. Tüberküloz tedavisinde birinci seçenek ilaçlardan en sık izoniyazide (INH) karşı direnç görülmektedir. Bu nedenle direncin doğru ve hızlı belirlenmesi, tedavi rejiminin etkili ve başarılı yönlendirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Izoniyazid direnç gelişiminde tüm dünyada sıklıkla katG S315T ve inhA promotör bölge genlerindeki mutasyonlar öne çıksa da, fenotipik direncin %10-37'si bu mutasyonlarla açıklanamamaktadır Bu çalışmada, bölgemizden izole edilen fenotipik INH dirençli Mycobacterium tuberculosis kompleks (MTBC) suşlarında sık görülen katG S315T mutasyon varlığının sanger sekans analizi ile araştırılması ve mutasyon saptanmayan izolatlarda tüm genom analizi ile ilgili gen bölgesinin incelenmesi amaçlanmaktadır.
 Çalışmamızda 2014-2019 yılları arasında izole edilmiş 50 fenotipik INH dirençli MTBC izolatlarında katG S315T mutasyonu sanger sekansı ile araştırılmış ve mutasyon saptanmayan izolatlardan altısına tüm genom analizi yapılmıştır. İlgili mutasyonların saptanmasında, Genom Analiz Araç Seti (GATK) biyoinformatik yazılım kullanılarak varyant çağırma ve varyant tanımlama adımları için temizlenmiş okumalar ön işlemlenmiştir. Varyantlar "HaplotypeCaller" ile tespit edilmiş ve GATK'nın önerdiği katı filtreleme kriterlerine göre tanımlanmış olup, NCBI RefSeq açıklama GTF dosyası ve Dünya Sağlık Örgütü tarafından 2023 yılında geliştirilen, M. tuberculosis ilaç direnç ile ilişkili mutasyonları sunan bir veri tabanı kullanılarak açıklanmıştır. Ayrıca "TB-Profiler pipeline" aracı kullanılarak, tüm dizileri içeren ham fastq dosyalarından izolatların soy türleri ve INH direnci ile ilişkili mutasyonlar belirlenmiştir. 
Çalışmada 50 fenotipik INH dirençli izolatın %36'sında katG S315T mutasyonu saptanmıştır. Sanger dizi analizi ile katG S315 mutasyonu olmadığı doğrulanan altı izolatın tüm genom analizi sonucunda INH direnci ile ilişkili dört ana gen bölgesinden katG geninde Gln679Pro (%16.6), Tyr337Asp (%16.6), Phe183Cys (%16.6), Trp107A (%16.6) mutasyonları, inhA geninde C-15T (%33.3), fabG1 geninde c-219C>T(%16.6), ahpC geninde c-74G>A(%16.6), ve C-51G>A(%16.6) mutasyonları saptanırken, yardımcı gen bölgelerinden Rv2752c geninde ise Gln308Pro (%16.6) ve c-89 C>T(%16.6), Rv0010c C-73 T>C(%16.6), dnaA C-1131C>A(%16.6)ve mshA C-730T>C(%33.3) mutasyonları olmak üzere toplam 13 mutasyon saptanmıştır. KatG Trp107A ve inha C-15T mutasyonu haricinde diğer genlerin direnç gelişiminde önemi bilinmememektedir. Fenotipik direnci açıklayacak diğer gen bölgelerine ait mutasyonların tüm genom analizi ile ayrıntılı değerlendirilmesi bölgemizdeki dirençli izolatların moleküler karakterizasyonu için yol gösterici olacaktır.

Abstract:
Tuberculosis remains the second leading cause of death from infectious diseases worldwide. The major challenge in controlling TB is drug resistance. Resistance to isoniazid (INH), one of the first-line drugs in the treatment of tuberculosis, is most frequently observed. Therefore, accurate and rapid determination of resistance plays an important role in directing the treatment regimen effectively and successfully. Although mutations in the kit S315T and inhale promoter region genes frequently contribute to INH resistance globally, 10-37% of phenotypic resistance cannot be explained by these mutations. In our study, we aimed to investigate the presence of the common kit S315T mutation in phenotypic INH-resistant Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) strains isolated from our region using Sanger sequencing analysis. For isolates where no mutation was detected, we conducted a full genome analysis of the relevant gene region.
We analyzed 50 phenotypic INH-resistant MTBC isolates collected between 2014 and 2019. For six isolates with no detected mutations, we performed whole genome sequencing. Cleaned reads were pre-processed for variant calling and identification using the Genome Analysis Toolkit (GATK) bioinformatics software. Variants were detected using the "Haplotype Caller" and identified based on strict filtering criteria recommended by GATK, using the NCBI RefSeq annotation GTF file and a WHO-developed database of M. tuberculosis drug resistance-associated mutations (2023). Additionally, strain types and INH resistance-associated mutations were identified from raw fastq files using the "TB-Profiler pipeline" tool.
In our study, the kit S315T mutation was detected in 36% of the 50 phenotypic INH-resistant isolates. Whole genome analysis of the six isolates without the kit S315T mutation revealed mutations in several key genes associated with INH resistance: Gln679Pro (16.6%), Tyr337Asp (16.6%), Phe183Cys (16.6%), Trp107A (16.6%) in the kit gene; C-15T (33.3%) in the inhale gene; c-219C>T (16.6%) in fabG1; -74G>A (16.6%) and C-51G>A (16.6%) in the ahpC gene. Additionally, mutations in auxiliary gene regions were detected: Gln308Pro (16.6%) in Rv2752c; c-89 C>T (16.6%), C-73 T>C (16.6%) in Rv0010c; C-1131C>A (16.6%) in dnaA; and mshA C-730T>C (33.3%). Except for kit Trp107A and inhale C-15T, the role of these other mutations in resistance development is unknown. Detailed evaluation of these mutations through whole genome analysis will be crucial for the molecular characterization of resistant isolates in our region.