Bacillus subtilis ATCC 6051'den α-amilazın klonlanması  
ve karakterizasyonu
Cloning and characterization of α-amilaz from Bacillus subtilis ATCC 6051
Yazar: BESİ SERİN
Danışman: PROF. DR. FİKRET UYAR ; YRD. DOÇ. DR. CEM ÖZİÇ
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Alfa amilaz = Alpha amylase ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Gen klonlama = Gene cloning

Özet:
Günümüzde gelişen teknoloji ile birlikte enzim teknolojisi de gelişmektedir. Enzim teknolojisi, endüstriyel öneme sahip enzimlerin daha saf, ucuz ve bol miktarda üretilmelerine olanak tanımaktadır. Mikroorganizmalardan elde edilen enzimler endüstriyel sahada yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bu çalışmada Bacillus subtilis ATCC 6051 kullanılmıştır. Bakterinin bol miktarda α-amilaz üretebilmesi, tüm genom yapısının bilinmesi ve stabil olması nedeniyle klonlama ve saflaştırma çalışmaları için kullanılabileceğine karar verilmiştir. Bunun için gen kütüphanesinden Bacillus türlerine ait α-amilaz geni taranarak primer dizayn edilmiştir. Bacillus subtilis ATCC 6051'in genomik DNA'sı izole edilmiş ve α-amilaz gen bölgesi PCR'da amplifiye edilmiştir. Elde edilen PCR ürünleri, agaroz jelde ve nanodropta saflık kontrolleri yapıldıktan sonra 3519 bç uzunluğundaki pCR-Blunt II TOPO klonlama kitine aktarılmıştır. Klonlama vektörü olarak 8274 bç uzunluğundaki pDG148 plazmidi kullanılmıştır. PCR ürünü, pCR-Blunt TOPO klonlama kitinden HindIII ve SphI restriksiyon enzimleriyle kesilmiş ve aynı enzimlerle kesilmiş olan klonlama vektörü pDG148'e klonlanmıştır. Böylece 10 244 bç uzunluğunda pDG148-Bs-amyE klonu elde edilmiştir. Genin ekspresyonu için 6xhis takısı bulunan pET16b ekspresyon vektörü olarak seçilmiş, amyE geni bu vektöre aktarılmış ve Escherichia  coli BL21(DE3) kompetan hücrelerine transformasyonu yapılmıştır. Ardından amilaz proteininin izolasyonu ve saflaştırması yapılmıştır. Saflaştırma için histidin affinitesi gösteren Ni-NTA agaroz kullanılmıştır. Saflaştırılan proteinin SDS-PAGE'de molekül ağırlığı 67 kDa olarak tespit edilmiştir. Saflaştırılan proteinin doğru protein olduğu, Western blot analizleriyle teyit  edilmiştir. Amilaz üretiminden sorumlu amyE geninin ifade ettiği proteinin tahmini üç boyutlu yapısı, daha önce kristal yapısı tanımlanmış amilaz ile SWISS-MODEL programı kullanılarak karşılaştırılmıştır. Klonlanan genin biyoinformatik analizlerinde, Bacillus subtilis sp. amyE genine %99 oranında benzerlik gösterdiği görülmüştür. Bu sonuç hedeflenen genin başarılı biçimde klonlandığını göstermiştir. amyE geninin ifade ettiği proteinin tahmini amino asit dizisi Genetool programı kullanılarak elde edilmiştir. Dizinin yaklaşık 659 amino asit dizisinden oluştuğu tespit edilmiştir.

Abstract:
The enzyme technology is also evolving with today's emerging technologies. The enzyme technology allows to produce cheaper, more pure and abundantly industrially important enzymes. Enzymes obtained from microorganisms are widely used in the industrial field. Bacillus subtilis ATCC 6051 was used in this study. Because of producing a large amounts of α-amylase, known all genome structures and its being stable, it was used for cloning and purification. For this, screening primer was designed after detection the gene belonging to Bacillus α-amylase from gen library. The genomic DNA of Bacillus subtilis ATCC 6051 was isolated and α-amylase gene was amplified by PCR. The resulting PCR products were controlled in agarose gel and purity NanoDrop then was transferred to 3519 bp long pCR-Blunt II TOPO cloning kit. pDG148 cloning vector plasmid was used in the 8274 bp long. PCR product from pCR-Blunt II TOPO cloning kit cut with restriction enzymes HindIII and SphI and pDG148 cloning vector cut with the same enzymes to have been cloned. Thus 10 244 bp long pDG148-Bs-amyE clone was obtained. For the gene expression, 6xhis tag relating pET16b was chosen as an expression vector and amyE gene of the vector was transferred to Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. Then the isolation and purification of amylase protein was performed. For the purification,  Ni-NTA agarose showed affinity of histidine was used. The molecular weight of purified protein was determined as 67 kDa by SDS-PAGE. The purified protein was confirmed to be correct protein with Western blot analysis. The estimated of three dimensional structure of protein expressed by amyE gene responsible for amylase production was compared to amylase previously defined crystal sturucture using SWISS-MODEL program. Bioinformatics analysis of the cloned gene showed that 99% homology to Bacillus sp. amyE gene. These result showed that targeted gene was cloned successfully. The estimated of amino acid sequence of protein expressed by AmyE gene was obtained using Genetool programme. The protein was determined to consist of about 659 amino acid sequences.