Gastrointestinal traktus nöroendokrin neoplazilerinde Ki-67 proliferasyon indeksinin hesaplanmasının optimizasyonu
Optimization of Ki-67 proliferation index in gastrointestinal tractus neuroendocrine neoplasms
Yazar: EMİN BÜYÜKTALANCI
Danışman: DOÇ. DR. MURAT SEZAK
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Patoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Patoloji = Pathology
Dizin: Gastrointestinal hastalıklar = Gastrointestinal diseases ; Gastrointestinal neoplazmlar = Gastrointestinal neoplasms ; Hücre çoğalması = Cell proliferation ; Ki-67 = Ki-67 ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nöroendokrin tümörler = Neuroendocrine tumors ; Nöroendokrinoloji = Neuroendocrinology ; Sayısal görüntü analizi = Digital image analysis ; Sinaptofizin = Synaptophysin

Özet:
Nöroendokrin tümör (NET)'ler morfolojik, immünfenotipik ve ultrastrüktürel olarak nöroendokrin özellikler taşıyan epitelyal tümörlerdir. NET'ler ayrıca heterojen tümörler olup çok çeşitli klinik ve biyolojik karakterde olabildikleri bildirilmiştir. NET'lerin derecelendirilmesi proliferatif aktivite temeline dayandırılarak; mitotik aktivite ve Ki-67 proliferasyon indeksinin (Pİ) değerlendirilmesi ile yapılır. Bu iki belirtecin farklı dereceleri önermesi durumunda yüksek olan kabul edilir ve Ki-67 Pİ'nin genellikle daha yüksek dereceyi gösterdiği görülmüştür. Sınıflamada Ki-67 Pİ'deki %1 gibi çok küçük bir farkın tümör derecesini değiştirmesi nedeniyle hasta tedavisi ve takip açısından da doğru sayımın yapılması kritik öneme sahiptir.
Ki-67 değerlendirilmesinde fotoğraf üzerinden sayım (FS), göz kararı değerlendirme (GKD), dijital görüntü analiz sistemi (DGS) gibi yöntemler kullanılmaktadır. En az 2000 hücrenin / 2mm2 alanın sayılmasının önerildiği NET'lerde, değerlendirmedeki temel sıkıntı; zeminde sayımı etkileyebilecek tümöre benzeyen hücreler ile tümör içinde ve çevresinde bulanabilen tümör-dışı proliferatif hücrelerin varlığıdır. Çalışmamızda, bu problemlere yönelik olarak en doğru sayım yöntemi ve tümör hücrelerindeki Ki67 proliferasyon indeksini en doğru şekilde saptamamıza destek olabileceğini düşündüğümüz dual immunhistokimya yöntemininin olası katkısı araştırılmaktadır. Bu yöntemde; tümör hücreleri ve Ki-67, aynı kesit üzerinde farklı renkte kromojenler ile boyanarak Ki-67'nin gerçekten "tümör hücresinde" değerlendirilebilmesi hedeflenmektedir. 
Çalışmamızda 2013-2018 yılları arasında tanı almış ve 60'ı non-dual yöntem (sadece Ki-67), 60'ı dual yöntemle (sinaptofizin+Ki-67 beraber) boyanmış, gastrointestinal sistem lokalizasyonlu toplam 120 NET olgusu değerlendirilmiştir. Her iki grupta da Ki-67 boyanmasının en yoğun olduğu alandan çekilen fotoğraf üzerinden tek tek sayılarak (FS) "toplam hücre sayısı" ve "Ki-67 pozitif hücre sayısı/Pİ" belirlenmiş ve "altın standart" olarak kabul edilmiştir. Dual ve non-dual boyama yöntemlerinin FS, GKD ve DGS gibi 3 farklı Ki-67 sayım yöntemi ve GKD için gözlemciler arası uyum üzerindeki etkisi istatistiksel olarak sınıf içi korelasyon katsayısı (SKK) ve Bland-Altman analizleri ile; tümör dereceleri arasındaki uyum Kappa analizi ile incelenmiştir.
FS yöntemi ile karşılaştırıdığında GKD yönteminde patolog-1 için toplam hücre sayısı açısından non-dual ve dual gruptaki SKK'ları sırasıyla 0,513 ve 0,805; Ki-67 yüzdeleri için non-dual ve dual grupta sırasıyla 0,952 ve 0,994 bulundu. Bu oranlar Patolog-2'de toplam hücre sayısı için sırasıyla 0,627 ve 0,823; Ki-67 yüzdeleri için sırasıyla 0,957 ve 0,989 idi (p<0,001). GKD yönteminde patolog-1 ve patolog-2 arasındaki gözlemciler arası uyum dual yöntemde daha yüksek olacak şekilde; non-dual ve dual gruplarda toplam hücre sayısı için sırasıyla 0,641 ve 0,958; Ki-67 yüzdeleri için sırasıyla 0,907 ve 0,998 olarak değerlendirildi (p<0,001). 
DGS yönteminde ise toplam hücre sayısı için non-dual ve dual gruptaki SKK'lar FS ile uyum açısından sırasıyla 0,873 ve 0,930 iken Ki-67 yüzdeleri için non-dual'e göre dual grupta daha düşük (0,996'ya karşılık 0,978) bulundu. Tümör derece uyumları tüm gruplarda (DGS yöntemi hariç) dual grupta çok daha iyi bulundu (p<0,001, Kappa). Bland-Altman analizlerinde ise toplam hücre sayıları ve Ki-67 yüzdeleri için dual gruplardaki farklar non-dual gruplardan daha az olacak şekilde saptandı. Tüm yöntemlerde dual grupta harcanan süreler daha kısa idi (p<0,001).
Sonuç olarak; çalışmamızda Ki-67 Pİ değerlendirmesinde dual immünhistokimya yönteminin özellikle FS ve GKD yöntemlerinde yüksek uyum oranları sağlayan hızlı, güvenilir, pratik bir yöntem olduğu saptanmıştır. Dual immunhistokimyanın DGS ile kullanımı, renk analiz sorunları nedeniyle daha kısıtlı olmasına rağmen, gelişen teknolojiler ile birlikte, DGS yöntemlerinin de Ki-67 proliferasyon indeksinin saptanmasında güvenli sonuçlar vermeye başlayarak daha fazla öne çıkabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Neuroendocrine tumors (NET) are epithelial tumors with neuroendocrine features that are morphological, immunophenotypic and ultrastructural. NETs are also heterogeneous tumors and have been reported to have a wide range of clinical and biological characteristics. The grading of NETs is based on proliferative activity; it is performed by evaluating mitotic activity and Ki-67 proliferation index (PI). If these two markers suggest different degrees, the higher one is accepted and Ki-67 PI generally shows higher degree. Since a very small difference of 1% in Ki-67 PI in the classification changes the tumor grade, accurate counting is critical for patient treatment and follow-up.
In the Ki-67 evaluation, methods such as manuel counting on photo (MC), eyeball estimation (EE), digital image analysis system (DIA) are used. In NETs where it is recommended to count at least 2000 cells / 2mm2 area; the main problem in evaluation is the presence of tumor-like cells that can affect counting on the ground and non-tumor proliferative cells that can be found in and around the tumor. In our study, we investigate the most accurate counting method for these problems and the possible support of the dual immunohistochemistry method, which we think can support us to determine the Ki67 proliferation index in tumor cells in the most correct way. In this method; the tumor cells and Ki-67 are stained with different colored chromogens on the same section and it is aimed that the Ki-67 can really be evaluated in the "tumor cell".
In our study, a total of 120 NET cases with gastrointestinal system localization diagnosed between 2013-2018, 60 were stained by non-dual method (Ki-67 only) and 60 were dual method (synaptophysin + Ki-67 together) were evaluated. In both groups, the total number of cells and the number of Ki-67 positive cells / PI were determined and accepted as the "gold standard" by counting one by one from the photograph taken from the area where Ki-67 staining was the most intense. The effects of dual and non-dual staining methods on 3 different Ki-67 counting methods such as MC, EE and DIA, and inter-observer compliance for EE were statistically analyzed by intraclass correlation coefficient (ICC) and Bland-Altman analyzes. The agreement between tumor grades was examined by Kappa analysis.
In comparison with the MC method and EE method for pathologist-1, in terms of total number of cells, the ICCs in the non-dual and dual groups were 0.513 and 0.805, respectively; for the Ki-67 percentages in the non-dual and dual groups were 0.952 and 0.994, respectively. These rates were 0.627 and 0.823 for the total number of cells in pathologist-2, respectively; the Ki-67 percentages were 0.957 and 0.989 respectively (p <0.001). In the EE method, the inter-observer agreement between pathologist-1 and pathologist-2 will be higher in dual method; 0,641 and 0,958 for the total number of cells in non-dual and dual groups, respectively; for Ki-67 percentages, it was evaluated as 0,907 and 0,998, respectively (p <0,001).
In the DIA method, the ICCs in the non-dual and dual group for the total number of cells were 0.873 and 0.930, respectively, in terms of compliance with the MC; while the percentage of Ki-67 was lower in the dual group compared to non-dual (0.996 vs 0.978). Tumor grade correlations in all groups (except DIA method) was found to be much better in dual group (p <0.001, Kappa).In Bland-Altman analysis, differences in dual groups for total cell numbers and Ki-67 percentages were found to be less than non-dual groups (p <0.01). The time spent in the dual group was shorter in all methods (p <0.001).
As a result; in our study, it was found that dual immunohistochemistry method is a fast, reliable and practical method that provides high correlation rates especially in MC and EE methods. Although the use of dual immunhistochemistry with DGS is more limited due to color analysis problems, it is thought that, along with the developing technologies, DGS methods may become more important by starting to give safe results in determining the Ki-67 proliferation index.