Nekrotizan enterokolitte mukozal hasarlanmada apoptozisin yeri
The Role Of Apoptosis In Mucosal Injury In Necrotizing Enterocolitis
Yazar: UFUK ATEŞ
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN DİNDAR
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Çocuk Cerrahisi = Pediatric Surgery
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Enterokolit = Enterocolitis ; Enterokolit-psödomembranöz = Enterocolitis-pseudomembranous ; Genler = Genes ; Mukozalar = Mucous membrane ; İntestinal hastalıklar = Intestinal diseases ; İntestinal mukoza = Intestinal mucosa ; İskemi = Ischemia

Özet:
Çalışmanın Amacı: Nekrotizan enterokolit ile ilişkili apoptotik ve anti-apoptotik genleri ortaya koyarak NEK ile apoptozis arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak.Gereç ve Yöntem: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Cerrahisi AD'da ve Zekai Tahir Burak Eğitim ve Araştırma Hastanesi Çocuk Cerrahisi kliniğinde 01.01.2010 tarihinden 01.01.2012 tarihine kadar NEK nedeniyle cerrahi işlem uygulanan 6 hastadan çıkarılan ince barsak segmentinden hastalıklı doku örneklerinden 1x0.5 cm boyutunda alındı. Kontrol amacı ile 01.01.2010 tarihinden 01.01.2012 tarihine kadar 6 rezeksiyon anastomoz yapılan intestinal atrezili bebeklerden çıkarılan intestinal segmentten veya herhangi bir nedenle ileostomi açılmış hastaların iyileştikten sonrası ileostomi kapatılması sırasında ostomi ağzından 1x0.5 cm boyutunda alınan normal (hastalıksız) doku örnekleri alındı. Alınan doku örneklerinin yarısı çalışmalar için sıvı nitrojen içinde -80 derecede ve diğer yarısı formol içinde muhafaza edildi. Hastadan alınan bir doku parçası da histopatolojik olarak NEK açısından değerlendirildi. Apoptozis histopatolojik olarak TUNEL yöntemi ile belirlendi. Apoptotik ve anti-apoptotik gen düzeyleri PCR Array yöntemi ile belirlendi.Bulgular: Hematoksilen-Eozin ile yapılan histolojik incelemede kontrol grubunda dört hastada grade 1 doku hasarı varken, bir hastada grade 2, bir hastada grade 3 doku hasarı mevcuttu. NEK grubunda ise üç hastada grade 4 doku hasarı varken, iki hastada grade 3 ve bir hastada grade 2 doku hasarı mevcuttu. NEK'li grup ile kontrol grubu karşılaştırıldığında doku hasarının NEK'li bebeklerde belirgin olarak daha fazla olduğu izlenmiştir (p<0.01).TUNEL yöntemiyle değerlendirilen örneklerde kontrol grubuna ait üç hastada skor 1 ile uyumlu TUNEL (+) nukleuslar izlenirken, iki hastada skor 2 ile uyumlu TUNEL (+) nukleus grupları görüldü. Bir hastada ise skor 3 TUNEL (+) hücre nükleusları izlendi. NEK grubunda üç hasta skor 3 ile uyumlu TUNEL (+) nukleuslar izlenirken, diğer üç hastanın örneklerinde skor 4 TUNEL (+) nukleus gruplarının varlığı izlendi.NEK'li grup ile kontrol grubu karşılaştırıldığında apoptozisin NEK'li bebeklerde belirgin olarak daha fazla olduğu izlenmiştir (p<0.01).RT Real Time PCR kullanılarak barsaklardaki apoptotik ve anti-apoptotik genlerin ekspresyonları değerlendirildi. Apoptotik genlerden kaspaz-2, kaspaz-6, kaspaz-7, BIRC2, Bax genlerinin mRNA düzeyleri NEK grubunda kontrol grubuna göre belirgin olarak yüksek bulunmuştur (p<0.01). Anti-apoptotik Bcl-2A1 geninin mRNA düzeyi ise NEK grubunda kontrol grubuna göre belirgin olarak düşük bulunmuştur (p<0.01). Kaspaz-1, kaspaz-3, kaspaz-9 genlerinin mRNA düzeylerinde ise iki grup arasında istatistiksel olarak anamlı fark bulunamadı.Sonuç: NEK patofizyolojisinde apoptozisin önemli rol oynadığı bilinmekte olup apoptotik genlerden Bax, kaspaz-2, kaspaz-6, kaspaz-7, BIRC2 genlerinin mRNA düzeyleri artmış olup, anti-apototik genlerden Bcl-2A1 geninin mRNA düzeyi azalmış ve kaspaz-1, kaspaz-3 ve kaspaz-9 genlerinin mRNA düzeylerinde ise anlamlı bir değişiklik olmamıştır. Böylece apoptotik genlerden hangilerinin NEK'te arttığı, anti-apoptotik genlerden hangilerinin azaldığı gösterilerek daha sonraki çalışmalarda bu genler üzerinden apoptozisin moleküler düzeyde inhibisyonunu saylayacak yöntemler bulunarak NEK'in oluşmaması sağlanabilir.

Abstract:
Aim: The aim of this study is to better understand the relationship between necrotising enterocolitis (NEC) and apoptosis by measuring the expressions of apoptotic and anti-apoptotic genes.Material and methods: Six neonates were undergone surgical treatment having a diagnosis of NEC between 01.01.2010 and 01.01.2012 in University of Ankara Department of Pediatric Surgery and Zekai Tahir Burak Research Hospital Department of Pediatric Surgery. Pathological intestinal segments were removed and tissue samples of 1cm were obtained. The control group consisted of 6 neonates who were undergone resection and anastomosis because of intestinal atresia and closure of stoma which was performed for any reason. 1cm tissue samples were obtained from normal (disease free) stoma tissue. The samples were kept in liquid nitrogen in -80?C and formaldehyde. Apoptosis was histopathologically evaluated by using TUNEL procedure. Apoptotic and anti-apoptotic gene levels were evaluated by using PCR array.Results: The histological examination with Hematoxylen-Eosin revealed grade 1 tissue damage in four patients, grade 2 in one patient and grade 3 in one patient in the control group, whereas in NEC group grade 4 tissue damage was present in three patients, grade 3 in two patients and grade 2 in one patient. Tissue damage was significantly more in NEC group when compared with control group (p<0.01).TUNEL examination revealed score 1 TUNEL (+) nuclei in three patients, score 2 in two patients and score 3 in one patient in the control group, whereas it revealed score 3 in three patients and score 4 in the remaining three patients in NEC group. Apoptosis was significantly more in NEC group when compared with control group (p<0.01)..The expression of apoptotic and anti-apoptotic genes in intestines had been estimated by using RT Real Time PCR. mRNA levels of Bax, CASP2, CASP6, CASP7, BIRC2genes, which are the apoptotic genes were significantly increased in NEC group when compared to control group (p<0.01). Anti-apoptotic Bcl-2A1 mRNA levels were significantly decreased in NEC group when compared to control group (p<0.01) however there was no statistically significant difference in mRNA levels of CASP1, CASP3, CASP9 genes between two groups.Conclusion: Apoptosis plays a significant role in the pathophysiology of NEC. The apoptotic Bax, CASP2, CASP6, CASP7, BIRC2 genes levels have increased and anti-apoptotic Bcl-2A1 gene levels have decreased and there are no significant difference in CASP1, CASP3 and CASP9 genes. Therefore, by providing information about which apoptotic genes increase and which anti-apoptotic genes decrease, NEC would be prevented by inhibiting apoptosis in the molecular level.