Peptit kaplı ve kemoterapötik ilaç yüklü süperparamanyetik demiroksit nanopartiküllerin sentezi ve glioblastoma hücre hattında kullanılmak üzere hipertermi maruziyet sisteminin geliştirilmesi
Synthesis of peptide coated and chemotherapeutic drug loaded superparamagnetic iron oxide nanoparticles and development of a hyperthermia exposure system for use in glioblastoma cell lines
Yazar: FATİH ŞENTÜRK
Danışman: PROF. DR. GÖKNUR GÜLER ÖZTÜRK
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Demir oksit = Iron oxide ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Hipertermi = Hyperthermia ; Kurkumin = Curcumin ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Polietilen glikoller = Polyethylene glycols ; Poliglikolik asit = Polyglycolic acid ; Radyofrekans = Radiofrequency ; Temozolomid = Temosolomide

Özet:
Glioblastoma Multiforme (GBM), yüksek invaziflik ve düşük hayatta kalma ile karakterize IV. derece diffüz gliomadır. Son yıllarda, GBM patogenezinin anlaşılmasında önemli gelişmeler olmasına rağmen, GBM hastalarının ortalama sağ kalım süresi 12-15 ay arasında değişmektedir ve GBM tedavisinde yeni ve daha etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tez çalışmasında, radyofrekans (RF)-alan kaynaklı hipertermi maruziyet sisteminin üretimi ve üretilen bu cihazla farklı fonksiyonel özellikler kazandırılan nanopartiküllerin RF-alan hipertermi ile etkinliğinin arttırılması ve in vitro koşullarda GBM hücrelerinde (T98G) araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, öncelikle, 13,56 MHz frekansta RF-alan hipertermi maruziyet sisteminin tasarımı ve üretimi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra, alternatif manyetik alan (AMF) ile etkileşerek hedef bölgede ısı oluşumu sağlayacak süperparamanyetik demir oksit nanopartiküller (SPDON'lar) sentezlenmiş ve karakterize edilmiştir. Elde edilen SPDON'lar, PLGA-b-PEG di-blok ko-polimeri ile kaplanarak, poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) polimerinin biyobozunur/biyouyumluluk, poli(etilen glikol)'ün (PEG) ise makrofajlarca tanınmama özellikleri ile fonksiyonlandırılmış ve manyetik özellikli PLGA (PLGA+SPDON) nanopartiküller (NP'ler) üretilmiştir. Ardından, PLGA+SPDON NP'lere temozolomid (TMZ) enkapsülasyonu çalışmaları yapılmış, ancak TMZ'nin % enkapsülasyon verimi (%EE, %4) düşük çıktığından, T98G hücrelerinde etkin toksik doz derişimine ulaşılamamıştır. Bu nedenle, etken madde değiştirilerek GBM tedavisi için potansiyel bir ajan olan kurkumin (CUR) çalışılmış ve CUR yüklü manyetik PLGA NP'ler sentezlenerek, bu NP'lere, yüzeylerine fibronektin yapışma sekansı olan glisin-arjinin-glisin-aspartik asit-serin (GRGDS) peptit konjugasyonu ile hücresel alım/hedeflendirme fonksiyonu kazandırılmıştır. Ayrıca, üretilen ve farklı biyo-aktif özellik kazandırılan tüm nanopartiküllerin karakterizasyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. Bu aşamadan sonra, hücre kültürü deneyleri yapılmıştır ve peptit bağlı CUR yüklü manyetik PLGA NP'ler 6 kat daha az CUR içermesine rağmen CUR yüklü manyetik PLGA NP'ler ile T98G hücreleri üzerinde 24, 48 ve 72. saatlerde MTT analizlerinde benzer toksik etkiler görülmüştür ve 72. saatte bu etkiler canlı/ölü hücre boyama ve Anneksin V/PI analizleri ile desteklenmiştir. Bu durum, GRGDS ile fonksiyonelleştirilmiş PLGA NP'lerin hücresel alım/hedeflendirme başarısıyla açıklanabilir. Ayrıca, RF-hipertermi uygulanan NP'ler, T98G hücrelerinin % canlılık değerlerini RF-hipertermi uygulanmayan PLGA+SPDON, PLGA+SPDON+CUR ve PLGA+SPDON+CUR+GRGDS NP'lere göre istatistiksel olarak anlamlı derecede azaltmıştır. Sonuç olarak, peptit bağlı kurkumin yüklü manyetik PLGA NP'lerin RF-hipertermi ile birlikte glioblastoma tedavisinde etkili bir anti-tümör sistemi olarak kullanılabileceği in vitro deneylerle gösterilmiştir.

Abstract:
Glioblastoma Multiforme (GBM) is characterized by high invasiveness and low survival IV. degree diffuse glioma. In recent years, despite significant improvements in understanding the pathogenesis of GBM, the average overall survival of GBM patients varies between 12-15 months, so new and more effective treatment strategies need to be developed in GBM treatment. In this thesis, it is aimed to produce hyperthermia exposure system originated from the radiofrequency (RF)-field and to increase the effectiveness of nanoparticles with different functional properties with this device to investigate in GBM cells (T98G) in vitro conditions. For this purpose, firstly, the design and production of RF-field hyperthermia exposure system at 13,56 MHz frequency was realized. Subsequently, superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) were synthesized and characterized, which would interact with the alternating magnetic field (AMF) to generate heat in the target area. The obtained SPIONs were coated with PLGA-b-PEG di-block co-polymer which functionalized due to both biodegradability/biocompatibility of poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) polymer and the non-recognition properties of poly (ethylene glycol) (PEG) by macrophages, and then magnetic PLGA (PLGA+SPDON) nanoparticles (NPs) were produced. Afterwards, temozolomide (TMZ) encapsulation studies were performed on PLGA+SPDON NPs, but effective toxic dose concentration could not be achieved in T98G cells since TMZ's % encapsulation efficiency (EE%, 4%) was low. Therefore, curcumin (CUR), a potential agent for GBM treatment, was studied by changing the active ingredient, and CUR-loaded magnetic-PLGA NPs were synthesized, and these NPs were provided with cellular uptake/targeting function by their glycine-arginine-glycine-aspartic acid-serine (GRGDS) peptide conjugation on their surface. In addition, characterization processes of all nanoparticles produced and brought into different bioactive properties were carried out. After this, cell culture experiments were conducted and although the peptide-bound CUR-loaded magnetic-PLGA NPs contained 6 times less CUR than CUR-loaded magnetic-PLGA NPs, they showed similar toxic effects on T98G cells at 24, 48 and 72 hours in MTT analysis, and at 72 hours, these effects were supported by live/dead staining and Anneksin V/PI analysis. This can be explained by the cellular uptake/targeting success of PLGA NPs functionalized with GRGDS. In addition, NPs applied RF-hyperthermia statistically significant reductions in PLGA+SPDON, PLGA+SPDON+CUR and PLGA+SPDON+CUR+GRGDS NPs were observed in the % cell viability of T98G cells compared to NPs without RF-hyperthermia. In conclusion, in vitro experiments have been shown that peptide-bound CUR-loaded magnetic-PLGA NPs can be used as an effective anti-tumor system in the treatment of glioblastoma with RF-hyperthermia.