Diabetik sıçanlarda eritropoetinin hasarlı dokularda kök hücre düzeylerine olan etkisinin değerlendirilmesi
Assessment of eritropoetin effect on stem cells in damaged tissue of diabetic rats
Yazar: DİDEM MELİS ÖZTAŞ GELBAL
Danışman: DOÇ. DR. MURAT UĞURLUCAN
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kalp ve Damar Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi = Thoracic and Cardiovascular Surgery ; Kardiyoloji = Cardiology
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Eritropoietin = Erythropoietin ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kök hücreler = Stem cells ; Sıçanlar = Rats ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries

Özet:
Giriş: Diabetes mellitus günümüzde halen tedavisi bulunamamış kronik bir hastalıktır. Hastalığın seyri sırasında bozuk dengede ve yüksek seviyelerde seyredebilen kan glukoz düzeyi kardiyovasküler sistem, hepatorenal sistem, gastrointestinal sistem, akciğerler ve merkezi sinir sistemi üzerinde olumsuz etkiler göstermekte, geri dönüşümsüz hasara sebep olabilmektedir. Kök hücreler ile ilgili yapılan çalışmalar kalp cerrahisi alanında da büyük öneme sahiptir. Fakat yapılan bir çok çalışmada diabetik hasta grubu göz ardı edilmiştir. Ancak muhtemel kök hücre düzeyindeki farklılıkların neden olduğu düşünülen bir çok postoperatif morbidite için diabetin de literatürde bir risk faktörü olduğunu bilmekteyiz. Biz bu çalışmada diabetin direk kardiyovasküler sistem dokusu üzerine olan etkilerini, diabetik sıçanlarda serum ve diğer dokulardaki kök hücre düzeyinin normal populasyondan farklı olup olmadığını ve kök hücre seviyelerini artırdığı bilinen eritropoetin maddesinin bu sıçanlarda etkinliğini araştırmayı planlıyoruz.
Materyal ve Metod: Çalışmada 25 adet erişkin erkek Spragie Dawley sıçan; kontrol grubu (grup 1), diabetik grup (grup 2) ve eritropoetinle indüklenmiş diabetik grup (grup 3) olmak üzere 3 gruba ayrılmıştır. Grup 2 ve grup 3'teki sıçanlara intraperitoneal yolla 50mg/kg Streptozocin (STZ) verilerek geri dönüşümsüz pankreas beta hücre hasarı oluşturularak diabet modeli oluşturulmuştur. Diabetin muhtemel yan etkilerinin ve özellikle de kardiyovasküler etkilerinin ortaya çıkması için sıçanlar 1 ay yaşatılmıştır. Grup 3'teki sıçanlara, kök hücre sentezini indüklemek amacıyla, dördüncü hafta içinde iki kere 3000U/kg eritropoetin verilmiştir. Bir ayın sonunda tüm gruplardaki sıçanlara ötenazi uygulanmıştır. Kök hücre düzeylerini değerlendirmek amacıyla sıçanlardan kan örnekleri ile birlikte yeterli büyüklükte sağ atrium, sağ ventrikül, sol atrium ve sol ventrikül dokuları çıkarılmıştır. Kan retikülosit sayımı otomatik hemogram cihazı ile belirlenmiş ve her 3 gruptaki değişimler ve farklılıklar değerlendirilmiştir. Fibroz miktarını belirlemek için dokular standart H/E ve Mason-Trikrom ile boyanmıştır. İmmunohistokimyasal değerlendirme için alınan dokunun güvenli bir kök hücre belirteci olan CD34 ve rejenerasyon için gerekli olan neovaskülarizasyonun en önemli göstergelerinden biri olan VEGF ile boyanma derecesi analiz edilmiştir. Histolojik derecelendirme 0 puan: CD34/VEGF negatif; 1 puan: hücrelerin %10'unda CD34/VEGF boyanması pozitif; 2 puan: hücrelerde %10-50 arasında CD34/VEGF boyanması pozitif; 3 puan: hücrelerin %50'sinden fazlasında CD34/VEGF boyanması pozitif şeklinde düzenlenmiştir.
Bulgular: Gruplardaki tüm sıçanlarda deney öncesi ölçülen kan şekeri düzeyi ortalama 72,80±11,516mg/dl olarak bulunmuştur. STZ uygulaması sonrası kan şekerleri ikinci günde 358,70±44,749mg/dl; birinci hafta sonunda ise 382,80±34,941mg/dl ölçülmüştür. Kan şekerindeki bu artış deney sonunda grup 2'de retikülosit miktarında anlamlı miktarda düşüşe neden olmuştur. Ayrıca kan şekerindeki artış grup 2 ve grup 3'te doku düzeyinde fibrozis, CD34 ve VEGF miktarında istatistiksel olarak anlamlı artışa neden olmuştur. Grup 1 ve grup 2'deki sıçanlar karşılaştırıldıklarında fibrozis, CD34 ve VEGF düzeyi kalp dokularında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artmış olarak tespit edilmiştir. Grup 3'te ise diğer gruplarla karşılaştırıldığında doku düzeyinde CD34 ve VEGF'in anlamlı olarak daha fazla arttığı gözlenmiştir. Grup 2 ve grup 3 karşılaştırıldığında her ne kadar kalp dokularında fibrozis saptanmış olsa da, özellikle grup 3'teki dokularda fibrozis miktarının daha az olduğu gözlenmiştir. Ayrıca CD34 ve VEGF düzeyleri grup 3'te grup 2'ye oranla istatistiksel olarak daha fazla artış göstermiştir. 
Sonuç: Diabet hastalığında sıçanlarda kardiyovasküler sistemde fibrozis miktarı artmaktadır. Hücreleri koruma ve rejenerasyonla görevli CD34 ve VEGF molekülünün sentezi güvenle kullanılabilen eritropoetin sayesinde daha da artırılabilir. Çalışmamızda, literatürde ilk defa olarak kardiyovasküler sistemde diabetik ve eritropoetin ile indüklenmiş diabetik sıçanlarda CD34 ve VEGF düzeyleri değerlendirilmiştir. Serum retikülosit ve sağ atrium, sağ ventrikül, sol atrium ve sol ventrikül CD34 ve VEGF düzeylerinin birlikte göz önünde bulundurulmuş olmasının çalışmanın özgünlüğünü artırdığı kanaatindeyiz.

Abstract:
Objective: Diabetes mellitus is a metabolic disease characterized with chronic hyperglycemia and disorders of carbohydrate, protein and lipid metabolism. Incidence of the disease increases in recent years and the pathology has become a global public health problem. Clinical importance of the disease is related with its complications. Diabetes mellitus increases the tendency of atherosclerotic disorders and ischemic heart disease. Upto date effort was given to the effects of diabetes on endothelium and coronary arteries in many researches. In this study, we planned to investigate the effects of diabetes directly on cardiac and aortic tissues. Studies performed on stem cells have gained advance on cardiac surgery in the recent years. However, the diabetic patient group has not been taken into consideration in most of these studies. On the other hand, it is very well known that diabetes mellitus is also a risk factor for many of the postoperative morbidities leading to alterations on stem cell levels. In this study, the effects of diabetes mellitus on cardiovascular system were investigated by assessing the stem cells levels in serum and heart and compared with the normal population. Additionally, efficacy of erythropoietin, which is known to increase stem cells, was studied on diabetic rats.
Material and Methods: Twenty-five male Spragie Dawley rats were divided into three groups as; control group (group 1), diabetic group (group 2) and glutamin induced diabetic group (group 3). Diabetes model was created by damaging the pancreatic beta-cells irreversibly with intraperitoneal 50mg/kg Streptozocin (STZ). Rats were survived one month in order to see the side effects of diabetes. In group 3, with the purpose to induce stem cells, rats received 3000U/kg erythropoietin two times in the fouth week. Euthanasia was performed at the end of one month and blood and adequate tissue samples were obtained from right atrium, right ventricle, left atrium, and left ventricle. Blood reticulocyte levels were determined automatically with automatic hemogram device and changes were assessed in 3 groups. Tissues were stained with routine H/E and Mason-Tricrom to determine the degree of fibrozis. Tissues staining for immunohistochemical assessment of a reliable stem cell marker, the CD34 and VEGF, a necessary predictor of tissue regeneration were analyzed. Histologic analysis scores were determined as; 0 point: CD34/VEGF negative; 1 point: 10% of cells being stained for CD34/VEGF; 2 points: 10-50% of cells being stained for CD34/VEGF; 3 points: more than 50% of cells being stained for CD34/VEGF.
Results: The glucose levels were measured to be 72,80±11,516mg/dl among the rats in all groups before the procedure. They increased to 358,70±44,749mg/dl and 382,80±34,941mg/dl at the end of second day and first week, respectively, following STZ administration. This increase in the blood glucose levels resulted in significant decrease in reticulocyte levels in group 2. Additionally, the increase in blood glucose levels resulted in statistically significant increase in tissue level of fibrozis, CD34 and VEGF. When the rats in Group 1 and 2 were compared the fibrozis, CD34 and VEGF levels were found to increase statistically significant. When the group 3 was compared with the other groups, the tissue level of CD34 and VEGF were more significantly enhanced. When group 2 and group 3 were compared, even though the myocardial tissues expressed fibrozis, especially the amount of fibrozis was lower in group 3 tissues. In addition, the levels of CD34 and VEGF were significantly higher in group 3 than group 2. 
Conclusion: Fibrozis occurs and increases in the cardiovascular system in rats in case of diabetes mellitus. The amount of CD34 and VEGF which function in cellular protection and tissue regeneration may be enhanced with safely applicable erythropoietin. We investigated the levels of CD34 and VEGF in the cardiovascular system in diabetic and erythropoietin induced diabetic rats for the first time in the literature. We believe the originality of the study is raised by measurement of reticulocyte levels in serum, and CD34 and VEGF levels in right atrium, right ventricle, left atrium, and left ventricle.