Yaban mersininde bulunan hidroksisinnamik asidlerin antioksidan aktivitesi ve kanser hücre kültüründe apopitozis induksiyonu üzerine etkisi
Antioxidant activity of  hydroxycinnamic acids in wild blueberry and effects of hydroxycinnamic acids on apoptozis induction in cancer cell culture
Yazar: BURAK DURMAZ
Danışman: PROF. DR. ESER SÖZMEN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Halk Sağlığı = Public Health ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Apoptozis = Apoptosis ; Enzime bağlı immünosorbent testi = Enzyme-linked immunosorbent assay ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Sinnamik asit = Cinnamic acid ; Tümör nekroz faktörleri = Tumor necrosis factors ; Yaban mersinleri = Blueberries

Özet:
Son zamanlarda, Yaban merisini meyvesi ülkemizde oldukça popülerdir. Yaban mersini,  sahip olduğu Hidroksisinnamik asitler nedeniyle tıbbi özellikleri olan antioksidan bileşiklerin ümit verici bir kaynağı olan aromatik bir bitkidir. Sıkılaştırıcı fakat tatlı ve yenilebilir olan mavi-siyahımsı meyveler, güçlü antioksidan özelliklere sahip olan flavanoidler ve Hidroksisinnamik asitler (Kafeik, p-Kumarik ve Ferulik asit) içerir. Bu tür gıdalarda bulunan fenolik bileşikler, serbest radikal temizleme, oksijen radikal absorbansı ve metal iyonlarının şelatlanması gibi birçok potansiyel yolla antioksidan olarak hareket edebilirler. Yaban mersininde bolca bulunan C vitamini, serbest radikalleri tutarak hücrenin DNA'sını korur ve kanser oluşumunu engeller. Yine yaban mersininde bulunan antisiyaninler, ellagik asit ve urolitin gibi maddeler, DNA'nın serbest radikallerce hasarını azaltarak kansere karşı koruyucu etki göstermektedir.
Bu çalışmada ülkemizde doğal olarak yetişen Yaban mersini bitkisinin meyvelerini ve yapraklarını kullanarak farklı infüzyon ve kaynama yöntemleri ile elde edilen yaban mersini çayları, içerisinde bulunan Hidroksisinnamik asitlerin varlığı, antioksidan aktiviteleri ve apopitosiz üzerine değerlendirilecektir. Yaban mersini çayları; yapraklar, ham meyve, kurutulmuş ve parçalanmış ham meyve, meyve çekirdekleri ve çekirdeksiz ham meyve farklı infüzyonlar ve kaynatma: 1 dak, 3 dak, 5 dak,7 dak, 10 dak. Fenolik seviyeler LC MS / MS tekniği ile belirlenmiştir. Tüm ürünlerin invitro HCT-116 Kolon kanseri hücre hattında antioksidan ve aktiviteleri spektrofotometrik yöntemlerle analiz edilmiştir. Antioksidat aktivitesi için MDA ve TEAC değerlendirilmiştir. Sitotoksisite ve canlılık testleri WST-8 (Water Soluble Tetrazolium Salt-8) solüsyonu eklenerek yapılmıştır. Apopitosiz için ise intrensek ve ekstrensek yolakların kaspazlarının aktive olması için gerekli reseptörlerinden olan TRAIL ve Apaf-1 ELISA Kit yöntemiyle değerlendirilmiştir.
Sonuç olarak, Yaban mersini çay ekstraktlarında bulunan hidrosinnamik asitlerin HCT-116 kolon kanseri hücre hattında antioksidan potansiyelini değerlendiren ilk çalışma olup TEAC trolox eşdeğerine göre etken maddeler karşılaştırıldığında en yüksek sonuçlar yaban mersini çay ekstratı 13,5 mM olarak hesaplanmıştır ve elde ettiğimiz veriler  5 dk kaynatma yöntemi kullanılarak hazırlana yaban mersini çayının zengin antioksidan kaynağı olduğunu göstermektedir. Hidrosinnamik asit olan Kafeik, p-kumarik ve Ferulik asit ve bunların kombinasyonları ile ve yaban mersinin kendisiyle gerçekleştirerek hücre kültürü in vivo çalışmalarında tekli olarak hidrosinnamik asitleri değerlendirdiğimizde 48.saat IC50 konsantrasyonu 39,9 μg/ml ile p-Kuarik asit en etkili hidroksisinnamik asit olarak değerlendirilmektedir. Yapılan ikili ve üçlü hidrosinnamik asit konsantrasyonlarında görülmektedir ki kafeik asid ve ferulic asidin 1:1 oranında IC50 dozlarının yarısının birleşiminin yapmış olduğu sitotoksite, tek başarına yaptığı belirlenen IC50 dozlarının yarısının yapmış olduğu sitotoksite, 2.6 kat daha fazladır.
Yapılan üçlü kombinasyonda yine her bir hidroksisinnamik asidin 1:1 oranında IC50 dozlarının yarınsın birleşiminin yapmış olduğu sitotoksiteden, tek başarına yaptığı belirlenen IC50 dozlarının yarısının yapmış olduğu sitotoksiteden 4.5 kat daha fazladır. 5 dk kaynama yöntemi ile yapılan yaban mersini çayının içerisindeki hidroksisinnamik asitler hesaplandığında yaban mersini çayının tekli ve kombine şekildeki hidroksisinnamik asitlerden daha fazla etkili olduğu gözlenmektedir. Yaptığımız çalışmada ayrıca TRAIL ve Apaf-1 ELISA kit sonuçlarına bakılarak Kafeik, p-Kumarik, Ferulik asit başta olmak üzere bu hidrosinnamik asitlerin kombinasyonları ve yaban mersini çay ekstraktının karşılaştırılmasıyla elde edilen en yüksek değerin 80000 μg/mL  % 50 öldürme konsantrasyonunda 5 dk kaynama yöntemi ile hazırlanan yaban mersini çay ekstraktının olduğu görülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Yaban Mersini, Antioksidan, Apopitosiz, Kolon kanseri, Apaf-1,TRAIL

Abstract:
Antioxidant Activity of  Hydroxycinnamic Acids in Wild Blueberry and Effects of Hydroxycinnamic Acids on Apoptozis Induction in Cancer Cell Culture
Recently, wild blueberry is very popular in our country. Blueberries are an aromatic plant that is a promising source of antioxidant compounds with medicinal properties due to their hydroxycinnamic acids. Blueberry fruits that are firming but sweet and edible include flavnoids and Hydroxycinnamic acids (Caffeic, p-Kumaric and Ferulic acid) with strong antioxidant properties. Phenolic compounds found in such foods can act as antioxidants in many potential ways, such as free radical scavenging, oxygen radical absorbance, and chelating of metal ions. Vitamin C, abundant in blueberries, retains free radicals, protecting the DNA of the cell and preventing cancer formation. Antibiotics such as antacids, ellagic acid and urolithin in blueberries also have a protective effect against cancer by reducing the free radical damage of DNA.
In this study, wild bleuberry tea obtained by different infusion and boiling methods using the fruits and leaves of naturally grown blueberry plant in our country will be evaluated for the presence of hydroxycinnamic acids, antioxidant activities and apoptosis. Blueberry tea; leaves, raw fruit, dried and chopped raw fruit, fruit seeds and seedless raw fruit in different infusions and boiling: 1 min, 3 min, 5 min, 7 min, 10 min. Phenolic levels will be determined by LC MS / MS technique. The antioxidants and activities of all products in the in vitro HCT-116 colon cancer cell line will be analyzed by spectrophotometric methods. MDA and TEAC were evaluated for antioxidant activity. Cytotoxicity and viability tests were performed by adding WST-8 (Water Soluble Tetrazolium Salt-8) solution. Apoptosis was assessed using the TRAIL and Apaf-1 ELISA Kit methods, which are necessary receptors for the activation of the caspases of the intersecting and extrinsic pathways.
As a result, it is the first study evaluating the antioxidant potential of HCT-116 colon cancer cells in hydrocineramic acids in blueberry tea extracts. When the active substances according to the TEAC trolox equivalent were compared, the highest results were calculated as 13.5 mM of blueberry tea extract and the obtained results were evaluated as 5 min boiling suggesting that blueberry tea is a rich source of antioxidants. When we evaluate hydroxysinnamic acids in combination with ferulic, cafeic and p-coumaric acid, which is a hydrocinnamic acid, and combinations thereof, and in vitro studies of cell culture in vivo by wild blueberry alone, p-coumaric acid is the most effective hydrocycinnamic acid with an IC50 concentration of 39.9 μg/mL. It is observed that in double and triple hydrocinnamic acid concentrations, the cytotoxicity of a mixture of IC50 doses at a ratio of 1: 1 of caffeic acid and ferulic acid is 2.6 times higher than that of the cytotoxicity that half of the determined IC50 doses do.
The triple combination is still 4.5 times more cytotoxic than the cytotoxic one-half of the IC50 doses of each hydroxycinnamic acid in the ratio 1: 1, making half of the IC50 doses determined to be successful in one single pass. When hydroxycinnamic acid in wild bluberry tea is prepared by 5 min boiling method, it is observed that blueberry tea is more effective than single and combined hydroxycinnamic acid. The highest  value obtained by comparing the combinations of these hydrocinnamic acids and the blueberry tea extract, especially caffeic, p-Kumaric, ferulic acid and TRAIL and Apaf-1 ELISA kit results, 80000 μg / mL It is seen that there is a blueberry tea extract prepared with 5 min boiling method in 50% killing concentration. 
Keywords: Blueberry, Antioxidant, Apoptosis, Colon cancer, Apaf-1, TRAIL