Advers reaksiyonlarda hücre ve organel düzeyinde toksisite yolaklarının belirlenmesi
Identification of toxicity pathways in adverse reactions at cellular and organelle levels
Yazar: FUAT KARAKUŞ
Danışman: PROF. DR. HİLMİ ORHAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Toksikoloji Ana Bilim Dalı / Farmasötik Toksikoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Asetaminofen = Acetaminophen ; Hücreler = Cells ; Hücresel yolaklar = Cellular pathways ; Mitokondriler = Mitochondria ; Nefrotoksisite = Nephrotoxicity ; Organeller = Organelles ; Sistein = Cysteine ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; Toksisite = Toxicity ; İlaç reaksiyonlarını raporlama sistemleri = Adverse drug reaction reporting systems

Özet:
Potansiyel toksik bir kimyasal maddenin organizmada hedef molekül ve yapılarla nasıl etkileştiği ve organizmanın bu etkileşmeye nasıl yanıt verdiği, yani toksisitenin oluşmasından sorumlu mekanizmaların anlaşılması önemlidir, çünkü ancak bu durumda o maddeye maruz-kalım durumundaki potansiyel tehlike değerlendirilebilir ve toksisiteye karşı önlem almanın yolu açılmış olur. Söz konusu mekanizmalar hücresel hatta organel düzeyde gerçekleşebilmektedir. Bu tez çalışmasında açıklanan bağlamda toksisite mekanizması halen anlaşılamamış olan parasetamolün (PAR) aşırı dozunda ortaya çıkan böbrek hasarının mekanizmasını açıklamaya yönelik olarak "ilacın oksidatif metabolitinin glutatyonla konjuge olması ve sonrasında birkaç basamakta hidrolizi ile oluşan PAR sistein konjugatının (PAR-Cys) böbrek proksimal tübül hücrelerinde β-liyaz enzimi aracılığı ile aktive edilmesi ve reaktif ara ürün oluşturmasına bağlı mitokondri ve hücre hasarı" hipotezi test edilmiştir. Öncelikle PAR-Cys'in β-liyaz substratı olduğu gösterilmiş ve insan, fare ve sıçan böbrek fraksiyonlarında enzim afinitesi-reaksiyon kinetiği açısından karakterize edilmiştir. Ardından PAR'ın farede böbrek dokusuna ne oranda dağıldığı ve PAR-Cys'in dokuda kinetik özellikleri belirlenmiştir. PAR-Cys'in β-liyaz tarafından katalize edilen reaksiyon sonucu reaktif ara ürün oluşturup oluşturmadığı belirlenmiş, söz konusu olasılıkta in vitro koşullarda böbrek hücre hattı olarak HEK293T ve böbrek dokusundan taze izole edilen mitokondrilerde herhangi bir toksik etkiye yol açıp açmadığı test edilmiştir. Sonuçlarımız PAR-Cys'in mitokondriyel enzim formları başta olmak üzere fare ve insan β-liyaz tarafından substrat olarak kullanıldığını, bu reaksiyon sonucunda reaktif özellikte bir takım ara ürün ya da ürünler oluştuğunu ve bunların patolojik bir fizyolojik dönüşüm olan mitokondriyel geçirgenlik dönüşüm porlarının oluşumunu indüklediğini göstermektedir. PAR-Cys'in -p konumunda -OH grubu içermeyen benzeri ile yapılan çalışmalarda alınan zıt aktivasyon sonuçları, PAR-Cys'in kinon ya da kinonimin türevleri aracılığı ile toksik olabileceğini düşündürmüştür. Dolayısı ile PAR aşırı dozunda karaciğerin yanı sıra gözlenen böbrek doku hasarının mekanizmasında PAR-Cys'in böbrekte proksimal tübül hücrelerinin sitozolik ve/veya mitokondriyel β-liyaz enzim formları tarafından reaktif ara ürünlere aktive edilebileceği, bu ürünlerin de başta mitokondriler olmak üzere hücresel hasar yolu ile gözlenen böbrek hasarında rol alabileceği gösterilmiştir.

Abstract:
It is critical to understand how a potentially toxic chemical interacts with its target molecule and structures in the organism, and how organism respond to this insult, i.e. mechanisms responsible for the manifestation of toxicity. Because only by this way it would be possible to evaluate ther potential hazard of a certain chemical in case of exposure, and to pave the way for prevention of its toxicity. These mechanisms occur at cellular even organelle level. In this thesis, the hypothesis of "metabolic hydrolysis of paracetamol (PAR) oxidative metabolite-glutathione conjugate to the corresponding cysteine conjugate (PAR-Cys) that is bioactivated by kidney proximal tubule enzyme β-lyase to reactive intermediates and subsequent mitochondrial and cellular damage" was tested on yet unknown mechanism of paracetamol over dose-induced kidney damage. First, it has been shown that PAR-Cys is a substrate for β-lyase and it has been characterized in terms of enzyme affinity-reaction kinetics in human, mouse and rat kidney fractions. Second, in vivo distribution of PAR to kidney tissue and kinetics of PAR-Cys in kidney tissue of mice have been determined. It has been tested whether PAR-Cys generates reactive intermediates upon the reaction catalyzed by β-lyase, and whether such intermediates cause toxicity on either kidney cell line HEK293T or freshly isolated mitochondria from mouse kidney tissue in vitro. 
Our results showed that PAR-Cys is used as substrate for mouse and man β-lyase, especially for mitochondrial form, reactive intermediate(s) is/are formed upon, and these induce formation of mitochondrial permeability transition pores, which is a pathological process. The opposite results of the structural analogue of PAR-Cys that does not contain -OH at -p position on activation studies suggested that PAR-Cys may exert its toxicity by a quinone or quinoneimine-like structure. Consequently, it has been showed that PAR-Cys may be bioactivated by cytosolic and/or mitochondrial β-lyase enzyme formes in kidney proximal tubule cells to reactive intermediates, and these intermediates may play a role in kidney toxicity by mitochondrial and cellular damage