Epigenetik bir baskılayıcı olan RNF2 genini hedefleyen miRNA' ların belirlenmesi ve metastaz ve invazyona etkisinin araştırılması
Identification of miRNAs that target an epigenetic supressor RNF2 gene and its effect on metastasis and invasion
Yazar: CEYDA OKUDU
Danışman: PROF. DR. SİBEL OĞUZKAN BALCI
Gaziantep Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Genler = Genes ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Meme kanseri kadınlar arasında en sık görülen ve yüksek mortaliteye sahip bir kanser türüdür. Histopatolojik çeşitliliğinin yanı sıra karmaşık moleküler alt yapısı nedeniyle meme kanserinde tedavi hedefleri için moleküler çalışmalara ihtiyaç bulunmaktadır. RNF2, polycomb baskılayıcı kompleks içerisinde yer alan bağlandığı proteini ubikitinleyerek baskılayan bir proteindir. Embriyonik ve yetişkin evrede önemli rol oynayan RNF2' nin, bir çok metastatik kanser türünde ifadesinin artması ile beraber tümör baskılayıcı genleri susturması RNF2' ye onkojenik bir rol kazanmıştır. Bu çalışmada meme kanseri hücre hatlarında RNF2 gen ifade düzeyindeki değişimler ve bu genin miR-17-5p, miR-20a-5p ve miR-106b-5p tarafından baskılanıp baskılanmadığı analiz edilmiştir. Ayrıca bu miRNA' ların transfekte edilmesi ile metastaz ve invazyon üzerine etkisi incelenmiştir. Bunun için MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3 ve ZR-75-1 meme kanseri hücre hatlarında miRNA transfeksiyonu öncesi ve sonrasında RNF2 gen ifade düzeyleri RT-PCR; protein ifade düzeyleri ise western blot ile analiz edilmiştir. Metastaz ve invazyon üzerine etkisi ise yara iyileşme ve boyden chamber yöntemleri kullanılarak saptanmıştır. RNF2' nin, MDA-MB-231 ve SK-BR-3 hücre hatlarında sırasıyla 4,1 ve 7,1 kat ifadesinin arttığı tespit edildi (sırasıyla p=0,048 ve 0,045). miR-17-5p ve miR-20a-5p miRNA transfeksiyonu sonrasında MDA-MB-231 hücre hattında RNF2 gen ifade düzeyinde anlamlı bir azalış saptandı (sırasıyla 3,5 ve 7,3 kat) (sırasıyla p= 0,045 ve 0,039). Protein düzeyinde ise MDA-MB-231 hücre hattında her üç miRNA' nın da RNF2 proteinini azalttığı saptandı. Ayrıca miR-17-5p ve miR-20a-5p metastaz ve invazyonu baskılarken miR-106b-5p' nin baskılamadığı saptandı. Sonuç olarak, metastatik yeteneği fazla olan meme kanseri hücrelerinde RNF2' nin ifadesi artmıştır. miR-17-5p ve miR-20a-5p, RNF2 aracılığı ile metastaz ve invazyonu baskılamaktadır. RNF2 meme kanseri için prognostik bir belirteç olmaya aday bir gen olarak değerlendirilebilir.


Anahtar Kelimeler: Meme kanseri, metastaz, miRNA, polycomb, RNF2.

Abstract:
Breast cancer is the most common type of cancer among women and has a high mortality rate. In addition to its histopathological diversity, new molecular and molecular investigations are needed in the treatment of breast cancer due to its complex molecular background. RNF2 is a protein that is repressed by ubiquitin binding of the protein bound in the polycomb repressor complex. RNF2, which plays an important role in a number of biological processes in embryonic development and adult stage, has acquired an oncogenic role due to overexpression in several types of metastatic cancers, as well as silencing tumor suppressor genes. In this study, changes in the level of RNF2 gene expression in breast cancer cell lines were analyzed and whether this gene was suppressed by miR-17-5p, miR-20a-5p and miR-106b-5p. Furthermore, the effect of transfection of these miRNAs on metastasis and invasion has been investigated. For this reason, RNF2 gene expression levels before and after miRNA transfection in MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3 and ZR-75-1 breast cancer cell lines were analyzed by qRT-PCR and western blot analysis of protein expression levels. The effect on metastasis and invasion was observed using wound healing and dyed chamber methods. RNF2 was overexpressed 4.1 and 7.1fold in the MDA-MB-231 and SK-BR-3 cell lines, respectively (p=0,048 ve 0,045 respectively). A significant decrease in gene expression after miRNA transfection was observed in miR-17-5p and miR-20a-5p (3.5 and 7.3 fold, respectively) (p= 0,045 ve 0,039 respectively) at MDA-MB-231 cell line. At the protein level, it was observed that all three miRNAs decreased RNF2 protein at MDA-MB-231 cell line. It was also observed that miR-17-5p and miR-20a-5p suppressed metastasis and invasion and miR-106b-5p could not suppress it. As a result, RNF2 is overexpressed in breast cancer cells with more metastatic ability. miR-17-5p and miR-20a-5p suppress RNF2 targeting and suppress metastasis and invasion in this direction. RNF2 may be considered as a candidate gene to be a prognostic marker for breast cancer.

Key Words: Breast cancer, metastasis, miRNA, polycomb, RNF2.