Farmasötiklerin mikrobiyal lakkaz aracılı biyodegradasyonunun araştırılması ve toksisite değerlendirmeleri
Investigation of microbial laccase mediated biodegradation of pharmaceuticals and toxicity assessment
Yazar: SULTAN KÜBRA TOKER
Danışman: DOÇ. DR. ALİ KOÇYİĞİT
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Bu tez çalışmasında farmasötiklerin içinde yer alan antiviral ve antibiyotik ilaçların, mikrobiyal lakkaz enzimi aracılığıyla biyodegradasyon potansiyeli iki farklı yerel fungal izolat ile araştırılmıştır. Ayrıca, bu süreçte ortaya çıkan ürünlerin prokaryotik ve ökaryotik organizmalara toksisitelerini değerlendirmek ve farmasötiklerin çevresel sistemlere zarar vermeden giderimini sağlayacak çevre dostu yöntemler geliştirilmesi hedeflenmiştir. Doğal ortamlarında farmasötik bileşiklerin parçalanmasında etkili olabilecekleri bilinen birçok enzim üretim potansiyeline sahip Ganoderma adspersum A1ve Alternaria sp. D21 funguslarının lakkaz üretme kapasiteleri dört ayrı indikatör bileşikle tarandıktan sonra lakkaz aktiviteleri kantitatif olarak ölçülmüştür. Ascomycota ve Basidiomycota temsilcileri olarak seçilen iki fungusun adapte oldukları çevreler de birbirinden tamamen farklılık göstermektedir. Çevresel farklılığın ve adaptasyonun lakkaz ilişkili giderim proseslerinde oluşturabileceği farklılıklar bu anlamda karşılaştırılmıştır. Karasal orjinli Ganoderma adspersum A1'in en yüksek lakkaz aktivitesi 923,17 U/L olarak ölçülmüştür. Kısmi saflaştırma aşamasından sonra bu değer 2,5 kat artmıştır. Deniz orjinli Alternaria sp. D21 ise 685 U/L enzim aktivitesi göstermiştir. İzolatın morfolojik ve moleküler tanılamaları yapıldıktan sonra farmasötik gradient testleri ile maksimum tolere edebilecekleri ilaç düzeyleri belirlenmiştir. Farmasötik gradient testleri ile ilaç düzeyleri belirlendikten sonra degradasyon deneylerine geçilmiş olup ilaçların biyodegradasyonu üç yaklaşımla (Disk difüzyon, TLC ve HPLC) belirlenmiştir. Seçilen farmasötikler yoğun olarak reçete edilen, pandemi ya da salgınlar sonrasında su sistemlerinde oranlarının artışı bildirilen, çevrede potansiyel toksik risk ve direnç gelişimi endişesi yaratan oseltamivir, favipiravir ve siprofloksasindir. Disk difüzyon testleri ile dört farklı test bakterisine (E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis ve Staphylococcus epidermidis) karşı siprofloksasinin biyodegradasyon sonucunda antibiyotik etkinliğinin azalışı takip edilmiştir. Elde edilen sonuçlar lakkaz ile biyoderadasyona bağlı olarak saptanan antibiyotik zonlarının küçüldüğünü doğrulamaktadır. TLC analizleri ile ise ilaçların günlük takibi yapılarak biyodegradasyon günlük olarak takip edilmiştir. Buna göre Alternaria sp. D21 izolatı ile inkübasyona bırakılan siprofloksasinin varlığını gösteren TLC bandı 5. gün görece küçülmüş 9. gün ise tamamen kaybolmuştur. Ganoderma adspersum A1 izolatı ile yapılan çalışmada ise ilacın tüm günlerde stabil kaldığı, TLC bandının ise 15. gün görece küçüldüğü takip edilmiştir. TLC takibine dayanarak Ganoderma adspersum A1 izolatının Alternaria sp. D21 izolatına göre favipiravir giderim potansiyelinin ise daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Ganoderma adspersum A1izolatının 5. Günden itibaren etkili bir biyodegradasyon potansiyeli TLC bandının görece küçülmesiyle belirlenmiştir. Oseltamivir fosfat için ise ilacın stabil kaldığı saptanmıştır. HPLC ile farmasötik kalıntı analizlerine göre Alternaria sp. D21siprofloksasini %98,53, favipiraviri %60,3 ve oseltamivir fosfatı %64,51 oranında gidermiştir. Ganoderma adspersum A1 ise siprofloksasini %47,51, favipiraviri %66,03 gidermiş olup, oseltamivir fosfat üzerinde etkili bir biyodegradasyon potansiyeli gösterememiştir. Elde edilen bulgular 3 yöntem için de tutarlı olarak tespit edilmiştir.
Biyodegradasyon sürecinde ortaya çıkan metabolitlerin toksisite profilleri incelendiğinde, değişken seviyelerde prokaryotik toksisite gösterdikleri bulunmuştur. Ökaryotik sistemlerde yapılan testler ise, bu metabolitlerin kontrol gruplarına göre daha az toksik olduğunu ortaya koymuştur. Toksisite analizleri standardize edilmiş ve rutin kullanılan Microtox akut toksisite ve Fitotoksisite yöntemleri ile yapılmıştır. Bulgular izole edilen lakkaz üretici fungusların biyolojik atık su arıtma sistemlerinde etkin bir şekilde kullanılabileceğini ve çevresel riskleri minimize edebileceğini göstermektedir. Söz konusu ilaçların lakkaz ile biyodegradasyonunda kullanımının, çevresel yönetim stratejilerinde potansiyel bir çözüm olarak değerlendirilmesi ve daha fazla araştırılması gerekmektedir.

Abstract:
In this thesis, the biodegradation potential of pharmaceuticals, including antiviral and antibiotic drugs, through the microbial laccase enzyme was investigated using two different local fungal isolates. Additionally, the aim was to evaluate the toxicity of the products formed during this process on prokaryotic and eukaryotic organisms and to develop environmentally friendly methods to remove pharmaceuticals without harming environmental systems. The laccase production capacities of the fungi Ganoderma adspersum A1 and Alternaria sp. D21, which are known to have the potential to produce various enzymes capable of degrading pharmaceutical compounds in their natural environments, were screened using four different indicator compounds, and their laccase activities were quantitatively measured. The two fungi selected as representatives of Ascomycota and Basidiomycota exhibit completely different adaptations to their environments. The differences in their environmental adaptation and adaptation's potential impact on laccase-mediated degradation processes were compared in this context. The terrestrial-origin Ganoderma adspersum A1 exhibited the highest laccase activity measured at 923.17 U/L. Following partial purification, this value increased by 2.5 times. On the other hand, marine-origin Alternaria sp. D21 showed an enzyme activity of 685 U/L. After conducting morphological and molecular identifications of the isolates, maximum drug tolerance levels were determined using pharmaceutical gradient tests. Following the determination of drug levels through pharmaceutical gradient tests, degradation experiments were initiated to assess drug biodegradation using three approaches (Disk diffusion, TLC, and HPLC). The selected pharmaceuticals, oseltamivir, favipiravir, and ciprofloxacin, are heavily prescribed drugs that have been reported to increase in environmental concentrations in water systems following pandemics or outbreaks, raising concerns about potential toxic risks and the development of resistance. Disk diffusion tests were conducted to assess the decrease in antibiotic effectiveness of ciprofloxacin against four different test bacteria (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, and Staphylococcus epidermidis) following biodegradation. The results confirmed that the antibiotic zones determined by laccase-dependent biodegradation decreased in size. Using TLC analysis, the daily biodegradation of drugs was monitored. Accordingly, the TLC band indicating the presence of ciprofloxacin incubated with Alternaria sp. D21 isolate decreased significantly by the 5th day and completely disappeared by the 9th day. In contrast, in the study with Ganoderma adspersum A1 isolate, the drug remained stable throughout the days, with the TLC band showing relative reduction by the 15th day. Based on TLC monitoring, Ganoderma adspersum A1 isolate exhibited a higher potential for favipiravir degradation compared to Alternaria sp. D21 isolate. Ganoderma adspersum A1 isolate exhibited effective biodegradation potential starting from day 5, as determined by the relative reduction in the TLC band. For oseltamivir phosphate, it was observed that the drug remained stable. According to HPLC analysis of pharmaceutical residues, Alternaria sp. D21 degraded ciprofloxacin by 98.53%, favipiravir by 60.3%, and oseltamivir phosphate by 64.51%. Ganoderma adspersum A1, on the other hand, degraded ciprofloxacin by 47.51% and favipiravir by 66.03%, but did not show effective biodegradation potential for oseltamivir phosphate. The findings were consistent across all three methods. 
When the toxicity profiles of metabolites generated during biodegradation were examined, it was found that they exhibit variable levels of prokaryotic toxicity. However, tests conducted on eukaryotic systems demonstrated that these metabolites are less toxic compared to control groups. Toxicity analyses were standardized and conducted using routine methods such as Microtox acute toxicity and Phytotoxicity assays. The findings indicate that laccase-producing fungi isolated in this study could be effectively utilized in biological wastewater treatment systems, thereby minimizing environmental risks. The use of laccase for the biodegradation of these pharmaceuticals should be considered a potential solution in environmental management strategies and should be further researched.