Ailevi akdeniz ateşi (AAA) hastalığında belirlenen aday miRNA'ların dolaşımdaki varlığının eksozomlar üzerinden araştırılması
Investigation of candidate exosomal miRNAs in the circulation in familial mediterranean fever (FMF) disease
Yazar: ZEYNEP TAVUKÇUOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. BANU PEYNİRCİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Ailesel akdeniz ateşi = Familial mediterranean fever ; Eksozomlar = Exosomes ; Mikro RNA = Micro RNA ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA) otozomal resesif kalıtım modeline
sahip bir hastalıktır ve monogenik bir hastalık olmasına rağmen fenotipik heterojenite
görülmektedir. Epigenetik faktörlerden biri olan kodlamayan RNA'lardan mikroRNA
(miRNA)'ların, bu heterojeniteye sebep olan etkenlerden biri olabileceği
düşünülmektedir. Eksozomlar; miRNA, lipid, protein gibi birçok önemli molekülü
taşıyan önemli nanovesiküllerdir ve değişik vücut sıvılarında bulundukları
bilinmektedir. Bu tez çalışmasında, AAA hastalığında eksozomal miRNA'ların
araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, hem pediatrik hem de erişkin hasta
gruplarında M694V/M694V AAA hastaları, sağlıklı kontroller ve diğer sistemik
otoinflamatuvar hastalığa sahip bireylerden üç çalışma grubu oluşturulmuştur. Bu
bireylerin plazma ve serum örneklerinden eksozom izolasyonu yapılarak, eksozom
karakterizasyonu için geçirimli elektron mikroskobu (Transmission Electron
Microscopy- TEM) ve akım sitometrisi (Flow cytometry- FC) kullanılmıştır. TEM
analizinde, eksozomlar fosfotungstik asit (PTA) boyama ajanı ile başarılı bir şekilde
görüntülenebilmiş olup, akım sitometri kullanılarak, CD63 ve CD81 yüzey belirteçleri
ile yapılan analiz sonucunda plazmadan %68,1, serumdan ise %53,3 oranında
eksozom ayrıştırılabildiği görülmüştür. Eksozomlardan RNA izolasyonu yapılarak
kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (quantitative real timepolymerase
chain reaction- qRT-PCR) ile belirlenen miRNA'ların ifadesi
karşılaştırılmıştır. Bunun sonucunda, miR-197-3p, miR-20a-5p, miR-374b-5p, miR-
30e-3p, miR-186-5p ve miR-29c-3p'nin eksozomlarda taşındığı gösterilmiş olup,
bunlardan miR-197-3p, miR-20a-5p, miR-374b-5p'nin sistemik otoinflamatuvar hasta
gruplarında değişken ifadeye sahip olduğu görülmüştür. Dolaşımdaki varlığı
gösterilen, hasta ve kontrol gruplarında ifade açısından farklılığı olan bu miRNAlar,
ileride sistemik otoinflamatuvar hastalıkların tanı ve tedavisinde biyobelirteç olma
özelliğine sahip olabileceklerdir.

Anahtar Kelimeler: Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA), eksozom, miRNA, qRT-PCR
Bu tez, Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi
tarafından desteklenmiştir

Abstract:
Familial Mediterranean Fever (FMF) is inherited in
an autosomal recessive manner. FMF is a monogenic disease however, phenotypic
heterogeneity can be seen in different patient groups. Epigenetic factors including
miRNAs might be a reason behind this heterogeneity. Exosomes are nanovesicles
which are the carriers of many important molecules such as microRNAs, lipids,
proteins and they can be found in many biofluids. The aim of this thesis is to determine
the different exosomal miRNA signatures in FMF disease. For this purpose, three
study groups (healthy control group, M694V/M694V homozygote FMF patient group
and another systemic autoinflammatory disease group) were constituted for both adult
and pediatric patients. After performing exosome isolation from plasma and serum
samples of these individuals, characterization of exosomes was done with
Transmission Electron Microscopy (TEM) and Flow Cytometry (FC). In TEM
analysis, exosomes were visualized successfully with phosphotungstic acid (PTA). In
FC analysis, exosome populations from plasma (68.1%) and serum (53.3%) were
assessed through CD63 and CD81 surface markers. miRNAs were isolated from
exosomes and the expression analysis of candidate miRNAs was done using qRTPCR.
It was shown that miR-197-3p, miR-20a-5p, miR-374b-5p, miR-30e-3p, miR-
186-5p, miR-29c-3p were carried through exosomes and miR-197-3p, miR-20a-5p,
miR-374b-5p were found to have differential expression pattern in systemic
autoinflammatory disease patient groups. These miRNAs, which are shown to be
circulating through exosomes and have varying expression levels between the patient
and control groups, may be considered as biomarkers in the diagnosis and treatment
of systemic autoinflammatory diseases in the future.

Key words: Familial Mediterranean Fever (FMF), exosome, miRNA, qRT-PCR
This thesis was supported by Hacettepe University Scientific Research Coordination
Uni