Kırgızistanda yetişen endemik fritillaria eduardii bitkilerinde ve fritillaria cinsine ait diğer türlerde mirna analizleri
Fritillaria тукумуна таандык түрлөрдүн жана Кыргызстандын эндемиги Fritillaria eduardii нин микроРНК анализдери
Yazar: DANİEL KİMSANALİEV
Danışman: YRD. DOÇ. DR. YILMAZ KAYA ; DOÇ. DR. SEVGİ MARAKLI
Kırgızistan-Türkiye Manas Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Кыргызстан аянты боюнча дүйнөнүн бир топ өлкөсүнө салыштырмалуу кичинекей болгондугуна карабастан, көптөгөн өсүмдүктөрдүн жана жаныбарлардын биологиялык ар түрдүүлүгүнө бай болуп саналат. Кыргызстандын тоолуу аймагы, деңиз деңгээлинен бийиктиги жана климаттык шарттардын уникалдуулугу болсо, жүздөгөн эндемик түрлөрдүн Кыргызстанда байырлоосуна себеп болгон. Айгүл гүлү (Fritillaria eduardii) борпоң карбонат топурактуу, ири ным корумдуу, акиташтуу, шагылдуу токой алкагында, бадалдардын арасында, дарактардын алдында, аска - зоолордун алдында (негизинен батыш жана тескей жагында), ортоңку тоо беттеринде деңиз деңгээлинен 700-2500 метр бийиктиктерде (Кыргызстанда- 1550-2000 м, тик ылдый түндүк-тескей беттеринде) өсөт. Марттын башынан апрелдин аягына чейин гүлдөйт. Көчөттөр 7 жашка толгондон кийин гана гүл ачат. Гүлдөрүнүн санына карап Кыргызстан аянты боюнча дүйнөнүн бир топ өлкөсүнө салыштырмалуу кичинекей болгондугуна карабастан, көптөгөн өсүмдүктөрдүн жана жаныбарлардын биологиялык ар түрдүүлүгүнө бай болуп саналат. Кыргызстандын тоолуу аймагы, деңиз деңгээлинен бийиктиги жана климаттык шарттардын уникалдуулугу болсо, жүздөгөн эндемик түрлөрдүн Кыргызстанда байырлоосуна себеп болгон. Айгүл гүлү (Fritillaria eduardii) борпоң карбонат топурактуу, ири ным корумдуу, акиташтуу, шагылдуу токой алкагында, бадалдардын арасында, дарактардын алдында, аска - зоолордун алдында (негизинен батыш жана тескей жагында), ортоңку тоо беттеринде деңиз деңгээлинен 700-2500 метр бийиктиктерде (Кыргызстанда- 1550-2000 м, тик ылдый түндүк-тескей беттеринде) өсөт. Марттын башынан апрелдин аягына чейин гүлдөйт. Көчөттөр 7 жашка толгондон кийин гана гүл ачат. Гүлдөрүнүн санына карап Айгүл гүлүнүн жашын аныктоого да болот. Айгүл гүлүнүн жаратылышта башка өсүмдүктөрдөн айырмалап турган мүнөздүү белгиси – гүлдөрүндө эч кандай специификалык жыты жок. Нектарынын курамында канттын саны өтө аз, гүлдөрүндө курт-кумурскалардын 13 түрү аныкталган жана чаңдашуусу курт-кумурскалар аркылуу ишке ашат. Майдын аяк чендеринде Айгүл гүлүнүн топурактын үстүнкү бөлүгүндө жайгашкан органдары куурап калат. Жаратылышта уругу аркылуу гана көбөйөт, уругунун өнүмдүүлүгү 60% дан кем. Пияз түбү шар сымал, 4 - 9 см калыңдыкта. Сабагы тик, бийиктиги 37-95 смге чейин жетет. Жалбырактары сабагынын жарымын курчаган, төмөнкү жалбырактарынын узундугу 10-15 см, туурасы 5-12 см. Гүл тобунда 15 ке чейин гүл болот. Гүл коргону ачык - кызыл, кара - кочкул-кызыл, жазы коңгуроодой, узундугу 4,5-6,5 см. Мөмөсү кургак кутуча формада, узундугу 6-7 см, уругу болсо майда күрөң түстө.
Айгүл гүлү (F. eduardii) өзүнүн кооздугу менен бир гана Баткен облусунун белгилүү эндемик өсүмдүгү катары таанылбастан бүткүл Кыргызстан үчүн маанилүү жана баалуу өсүмдүк болуп эсептелет. Бүгүнкү күндө бул өсүмдүк жоголуу коркунучундагы пияз түптүү өсүмдүктөрдүн катарына кирет. Айгүл гүлү өскөн жерлер атайын коргоого алынып, аны жулууга, башка жакка алып кетүүгө тыюу салынган. Магистрдик иштин максаты – in silico ыкмаларын колдонуу менен Айгүл гүлүндө жана Fritillaria тукумуна кирген башка түрлөрдө ар кандай метаболизм процесстери менен байланышы болгон жаңы микроРНКды аныктоо болуп саналат. Колдонулган программалар; NCBI маалымат базасы, miRBase маалымат базасы, BLASTN программасы, RNAfold Web Server, RNA Hybrid, Clustal Omega жана MEGA11.
Изилдөөнүн алкагында алгач miRBase маалымат базасына киргизилген жалпы өсүмдүктөрдөн 10 494 микроРНК тизмектери алынды. miRBase маалымат базасында бир гана өсүмдүктүктөрдүн эмес, адамдарда, жаныбарларда жана вирустарда бул мезгилге чейин изилдөөлөрү, анализдери жүргүзүлүп, бул жандуу организмдерде табылган микроРНК тизмектери жайгашкан. Ар түрдүү өсүмдүктөрдөн алынган микроРНКлардын нуклеотид тизмектери менен Fritillaria тукумуна кирген өсүмдүк түрлөрүнүн нуклеотид тизмектери NCBI маалымат базасында жайгашкан BLASTN программасын колдонуу аркылуу салыштырылды. Салыштыруу адабияттарда көрсөтүлгөн нормаларга жана эрежелерге ылайык жүргүзүлдү. Нормага туура келбеген микроРНК тизмектери кийинки этаптагы анализдерге өткөрүлгөн жок. МикроРНКлар белоктун синтезинде ар түрдүү ролдорду ойногондугуна карабастан, белоктун синтезинде коддолбойт б.а белок синтездебеген тизмектер болуп саналат. Экинчи этапта нуклеотид тизмектеринин салыштырууларынан кийин, окшоштугу болгон пре-микроРНК тизмектери белокту коддоп же коддобогондугу текшерилди. Белок коддобогон микроРНК тизмектери болсо, кийинки этапка өткөрүлдү. Белок коддобогондугу аныкталган pre-miRNA (прекурсор микроРНК) ырааттуулугунун экинчилик структуралары "RNAfold Web Server" программасы аркылуу аныкталды. Жаңы аныкталган микроРНКлар менен miRBase маалымат базасындагы башка өсүмдүктөрдө аныкталган тизмектердин ортосундагы эволюциялык байланыш Clustal Omega жана филогенетикалык дарак анализдери (MEGA11) менен каралды. Бул микроРНК тизмектеринин бута (мишень) гендери "RNA Hybrid" программасы аркылуу аныкталды. Натыйжада алгачкы жолу in silico методдорду колдонуу аркылуу Fritillaria тукумунда 5 микроРНК тизмеги жана бута (мишень) гендер аныкталды.
miRBase маалымат базасынан 4 класска таандык болгон 82 өсүмдүк түрүнөн 8615 пре-микроРНК жана 10314 жетилген микроРНК тизмектери алынды. Бул тизмектердин арасынан Chlorophyta классына таандык 50 пре-микроРНК жана 86 жетилген микроРНК тизмеги, Coniferophyta классына таандык 662 пре-микроРНК жана 669 жетилген микроРНК тизмектери, Embryophyta классына таандык 305 пре-микроРНК жана 362 жетилген микроРНК тизектери, Magnoliophyta классына таандык 7598 пре-микроРНК жана 9297 жетилген микроРНК тизмектери табылды. микроРНКларды идентификациялоо үчүн микроРНК тизмектери жана Fritillaria тукумундагы өсүмдүк түрлөрүнүн нуклеотид ырааттуулугу BLASTN программасын колдонуу аркылуу салыштыруу жүргүзүлдү. Салыштырууда тизмектердин арасындагы нуклеотиттердин ортосунда кеминде ≤ 7 дал келбөөчүлүк болушу абзел. 7 ден көп дал келбөөчүлүк (ката) болсо, анда ал тизмек жараксыз деп табылды. Андан соң BLASTX программасынын жардамы менен бул тизмектердин белокту коддогон же коддобогону текшерилди. МикроРНК тизмектеринин экинчилик структуралары RNA Web Server программасы аркылуу текшерилип, диаграммасы тартылды. Натыйжада Fritillaria тукумуна кирген өсүмдүк түрлөрүндө жаңы беш түрдүү микроРНК үй-бүлөлөрү- miR399, miR169, miR391, miR1432 жана miR8602 аныкталды. Жүргүзүлгөн изилдөөдө Айгүл гүлүнө таандык жаңы микроРНК тизмектери табылган жок. Анын себеби Айгүл гүлүнүн геномунун толук кандуу изилденбегендиги деп айтууга болот. Fritillaria тукумунда аныкталган жаңы микроРНК үй-бүлөлөрү менен башка өсүмдүк түрлөрүндө аныкталган микроРНКлардын эволюциялык байланышы филогенетикалык дарак түзүлүп талданды. Жыйынтыгында fri-

Abstract:
Aygül bitkisi (F. eduardii), güzelliğinden dolayı Batken bölgesinin tanınmış bir endemik bitkisinden öte tüm Kırgızistan için önemli ve değerlidir. Günümüzde, bu bitki doğal ortamında sınırlı sayıda bulunmakta ve kaçak sökümler nedeniyle nesli tükenme tehdidi altındadır. Aygül bitkisi yerel yönetim kurumların koruması altındadır ve çiçek açtığı alanda otlatma yasağı getirilmiştir. Bu bitkinin doğada çoğaltılarak neslinin korunmaya alınması günümüzün güncel problemlerindendir.
Bu tez çalışmasının amacı; in siliko yöntemler kullanılarak Aygül lalesinde ve Fritillaria cinsine ait diğer türlerde farklı metabolik yolaklarla ilişkili yeni miRNA dizilerinin belirlenmesidir. Tez çalışmasında kullanılan veri tabanları ve programlar; NCBI veri tabanı, miRBase veri tabanı, BLASTN programı, RNAfold Web Server, RNA Hybrid, Clustal Omega, MEGA11'dir. Tezin amacına ulaşmak için, miRBase veri tabanında bulunan farklı bitkilere ait referans 10 494 miRNA dizileri elde edildi. Elde edilen referans miRNA dizileri kullanılarak tezde uygulanan metodlara göre eleme aşamaları gerçekleştirildi. NCBI veri tabanında bulunan BLASTN programı kullanılarak aynı bitkiye ait nt veri tabanında karşılaştırıldı. Uygun olan miRNA dizilerinin ikincil yapıları (pre-miRNA) "RNAfold Web Server" programı kullanılarak belirlendi. Ayrıca yeni miRNA dizileri ile referans miRNA'lar arasındaki evrimsel ilişki, hizalama (Clustal Omega) ve filogenetik ağaç analizleri (MEGA11) ile incelendi. Bu miRNA dizilerinin hedef genleri, "RNA Hybrid" programı ile tanımlandı. Sonuç olarak Fritillaria cinsine ait diğer türlerde miR399, miR169, miR391, miR1432 ve miR8602 olmak üzere ilk defa 5 miRNA dizisi ve bu dizilerin hedef genleri belirlendi. Bununla birlikte Aygül lalesinde herhangi bir miRNA tanımlanmadı. Aygül bitkisi ile ilgli detaylı genom bilgisi bulunmadığı için sonuçların bu şekilde çıktığı düşünülmektedir. Bu tez, Fritillaria cinsinde, farklı miRNA ailelerinin ve onların hedeflerinin belirlendiği ilk detaylı incelemedir. Elde edilen sonuçların bu cinsin üyelerinde yapılacak biyoteknolojik analizler için temel bilgi oluşturması beklenmektedir.