Eksozom yüklü sıkıştırılabilir kemik greftleri
Compressible bone gfafts loaded by exosomes
Yazar: TÜLAY SELİN ERTEKİN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU ; DR. ÖĞR. ÜYESİ SONER ÇAKMAK
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Bu çalışma, 'Eksozom Yüklü Sıkıştırılabilir Kemik Greftlerinin Geliştirilmesi' başlıklı Hızlı Destek Projesi kapsamında (FHD-2017-16332 nolu) Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir.
Sunulan tez çalışmasında amaç, biyoaktivitesi artırılmış, biyouyumlu, fiziksel ve mekanik özellikleri geliştirilmiş, sıkıştırılabilir formdaki doku iskelelerinin, üç boyutlu (3B) in vitro kültür çalışmaları ile kemik onarımı ve rejenerasyonuna olan etkisinin incelenmesidir. Belirtilen amaç kapsamında ilk olarak bir mikrodalga reaktörü içerisinde, 9 kez 30 s süresince 600 Watt mikrodalga ışıması altında, yapay vücut sıvısından (SBF) hidroksiapatit (HA) partikülleri çöktürülmüştür. Elde edilen HA partikülleri 1,1,1,3,3,3-hekzafloro-2-propanol (HFIP) içerisinde kütlece % 7'lik oranda çözünmüş olan poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA;50:50) kopolimeri içerisine katılarak 3B elektroeğirme yöntemi ile 3B (PLGA)/HA kompozit doku iskeleleri üretilmiştir. Üretilen 3B PLGA/HA kompozit doku iskelelerinin ıslatılabilirlik özelliklerinin geliştirilmesi için NaOH ile alkali muamelesi uygulanmış ve yüzeyi modifiye edilen doku iskelelerinin fizikokimyasal yapısı çeşitli yöntemler ile karakterize edilmiştir. Uygulanan bu yüzey modifikasyonunun hücre canlılığı üzerine olan etkisi 3B in vitro çalışmalar ile değerlendirilmiş ve 0.1M derişimdeki NaOH ile muamele edilen örneklerin kontrol grubuna göre hücre proliferasyonunu artırdığı görülmüştür.  Ardından ultrasantrifüj yöntemi ile MC3T3-E1 kemik öncülü hücre kaynaklı eksozomların izolasyonu gerçekleştirilmiş ve çeşitli karakterizasyon çalışmaları (TEM, Bradford Protein Testi, Nanodrop A280 Protein Testi, Akış sitometrisi, boyut ve çap analizi) ile izole edilen yapının eksozom olduğu kanıtlanmıştır. Ultrasantrifüj yöntemi ile izole edilen eksozomların hücreler üzerindeki etkisi MC3T3-E1 hücre hattı ile gerçekleştirilen hücre kültür çalışmaları ile incelenmiştir. Sonuçlar eksozomların hücre proliferasyonunu desteklediğini göstermiştir. Son aşamada ise yüzey özellikleri alkali yüzey işlemi ile geliştirilmiş 3B PLGA/HA doku iskelelerine kemik öncülü türevli eksozomlar yüklenerek, eksozom yüklü sıkıştırılabilir kemik greftlerinin kemik doku ve onarımı üzerindeki etkisi incelenmiştir.  Üç boyutlu fibröz PLGA/HA kompozitleri ile yapılan in vitro kültür çalışmalarında iskelelerin 2 saat boyunca 37°C'de hücre kültür ortamında bekletildiğinde hacminin yaklaşık % 80'ini kaybederek küçüldüğü görülmüştür. Boyut ve gözeneklerdeki bu önemli değişiklik nedeniyle, hücrelerin iskeleye tutunmadığı ve iskele içine penetre olmadığı sonucuna varılmıştır. Eksozomlarla gerçekleştirilen 3B in vitro hücre canlılık analizlerinde kontrol ve deney gruplarında herhangi bir hücresel aktivite gözlenmemesi bu sonucu desteklemiştir. Bu bilgiler doğrultusunda 3B PLGA/HA kompozit doku iskeleleri elektroeğirme ile üretildikten sonra yüzey aktif madde olan Pluronik® ile muamele edilmiş ve büzüşmenin engellendiği belirlenmiştir.
Tez kapsamında elde edilen veriler ışığında, alkali yüzey modifikasyonu ile biyouyumluluğu artırılmış fibröz 3B PLGA doku iskeleleri başarıyla üretilmiştir. Hücre kültür çalışmalarında iskelelerin kültür ortamı içinde gözenek ve boyutunda görülen büzüşme sorunları ortadan kaldırılmıştır. İlerleyen çalışmalarda eksozom yükleme ve kültür çalışmalarının Pluronik® ile muamele edilen iskelelerde yapılmasına karar verilmiştir.

Abstract:
This study was financially supported by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit with the project entitled "Compressible Bone Gafts Loaded By Exosomes" (FHD-2017-16332).
The goal of this thesis is to investigate the effect of enhanced bioactive, biocompatible, improved physical and mechanical properties of compressible scaffolds on bone repair and regeneration with three-dimensional (3D) in vitro culture studies. Within the scope of the thesis purpose, firstly, hydroxyapatite (HA) particles were precipitated from synthetic body fluid (SBF) in a microwave reactor under 600 Watt microwave irradiation for 9 times 30 s. The obtained HA particles were added to the poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA, 50:50) copolymer dissolved in 1,1,1,3,3,3 hexafluoro-2 propanol (HFIP) 7% by mass, and the 3D PLGA / HA composite scaffolds were fabricated by 3D electrospinning method. In order to improve the wettability of the fabricated 3D PLGA / HA composite tissue scaffolds, alkali treatment with NaOH was applied and the physicochemical characterization of the surface modified scaffolds were done by various methods. The effect of the applied surface modification on cell viability were evaluated with in vitro studies and it was seen that the samples treated with NaOH at 0.1M concentration increased the cell proliferation as compared to the control group. Afterwards, the isolation of MC3T3-E1 pre-osteoblasts derived exosomes was performed by ultracentrifugation method and by applying various characterization studies (TEM, Bradford Protein Test, Nanodrop A280 Protein Test, Flow cytometry, size and diameter analysis), it was proved that the isolated structures were exoxomes. The effect of exosomes on cell proliferation was examined by in vitro cell culture studies carried out with MC3T3-E1 cell line. The results showed that exosomes has no toxic effect on cells. In the last stage, the effect of exosome loaded compressible bone grafts on bone tissue and repair was investigated by loading pre-osteoblast derived exosomes on 3D PLGA/HA scaffolds which surface properties were improved by alkali surface treatment. In vitro culture studies showed that 3D fibrous PLGA / HA composite scaffolds lost approximately 80% of their volume when scaffolds were immersed into the cell culture medium at 37°C for 2 h. Due to this significant change in size and pore structures, it was concluded that the cells did not attach to the scaffold and did not penetrate into the scaffold. The absence of any cellular activity in the control and experimental groups in 3D in vitro cell viability assays performed with exosomes supported this result.  In order to prevent the shrinkage of scaffolds, they were treated by surfactant Pluronic®.
In the light of the data obtained within the scope of this thesis, fibrous 3D PLGA scaffolds with increased biocompatibility via alkali surface modification have been successfully produced. The shrinkage problem that was seen in the pore structure and size of the scaffolds during cell culture studies were eliminated. It was decided that the exosome loading and culture studies are to be performed on scaffolds treated with Pluronic® in the outgoing studies.