Meme kanseri tedavisinde miR-145-5p uygulamasının SMAD-3 ve SMAD-4 hedef genlerin ifadesine etkilerinin validasyonu
Validation of the effects of miR-145-5p application on the expression of SMAD-3 and smad-4 target genes in breast cancer
Yazar: AYNURA ALIYEVA
Danışman: DOÇ. DR. EMEL ERGENE
Anadolu Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, meme kanserinde baskılandığı Meta-analizle belirlenmiş olan, miR-145-5p tümör baskılayıcı miRNA özgül sentetik mimiği, meme kanserinde metastaz mekanizmasının önlenmesi veya geciktirilmesi amacıyla, transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. "Hi-Perfect Reagent Transfection Agent" yardımıyla hedef hücrenin içine in-vitro olarak transfekte edilmiştir (miRNA replecement therapy). Transfekte edilen miRNA'nın hücre çoğalmasını, farklaşmasını ve hücre ölümünü kontrol eden TGF-β sinyal yolağında etkili SMAD-3 ve SMAD-4 gen ürünlerinin (mRNA) ekspresyonlarındaki değişiklik gerçek zamanlı kantitatif PCR (RT-qPCR) analizi ile belirlenmiştir. Ardından, bu 2 adet hedef genin protein seviyesindeki değişiklikleri görmek için Western Blot analizi yapılmıştır. Ayrıca, uygulanan mimiğin hücresel metastaz üzerindeki etkisini göstermek amaçlı göç testi gerçekleştirilmiştir. Mimik uygulama sonrasında hücrelerde kontrole göre göçün durduğu görülmüştür. Aynı zamanda RT-qPCR analizinde mimik uygulanan hücrelerde kontrole göre SMAD-3 ve SMAD-4 gen ürünlerinin ekspresyonlarında azalma saptanmıştır. Son olarak, Western Blot analizinde SMAD-3 protein seviyesinin kontrolle kıyasta mimik uygulanan hücrelerde %86 azaldığı, SMAD-4 proteininin ise %100 azaldığı elde edilen bant yoğunluğu analiziyle tespit edilmiştir. Bu da RT-qPCR analizinin sonuçlarını desteklemektedir.

Anahtar Kelimeler: Meme kanseri, miRNA Yerine Koyma (Replacement) Tedavi, miRNA, miR-145-5p, TGF-β, SMAD-3, SMAD-4, RT-qPCR, Western Blot, mimik transfeksiyonu, Göç testi.

Abstract:
In this study, miR-145-5p tumor suppressor miRNA specific synthetic mimic, which was determined by Meta-analysis in breast cancer, was transfected to prevent or delay the metastasis mechanism in breast cancer. In-vitro transfected into the target cell by "Hi-Perfect Reagent Transfection Agent" (miRNA replecement therapy). The change in expression of SMAD-3 and SMAD-4 gene products (mRNA) in the TGF-β signaling pathway that control cell proliferation, differentiation and cell death of transfected miRNA was determined by real-time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis. Western Blot analysis was then performed to see changes in the protein level of these target genes. In addition, migration test was performed to show the effect of mimic on cellular metastasis. After the mimic application, migration was stopped according to the control in the cells. Also in the RT-qPCR analysis, the expression of SMAD-3 and SMAD-4 gene products decreased compared to control in mimic transfected cells. Finally, in Western blot analysis, the SMAD-3 protein level was determined by the control band and the SMAD-4 protein was reduced by 86% and the SMAD-4 protein was reduced by 100%. This supports the results of the RT-qPCR analysis.

Keywords: Breast cancer, miRNA Replacement Therapy, miRNA, miR-145-5p, TGF-β, SMAD-3, SMAD-4, RT-qPCR, Western Blot, mimic transfection, Migration test.