Ranolazinin insan koroner arter endotel hücreleri üzerindeki etkisinin in-vitro şartlarda araştırılması
The investigation of the effects of ranolazine on human coronary artery endothelial cells under in-vitro conditions
Yazar: SELÇUK ÖZTÜRK
Danışman: PROF. DR. YAŞAR MURAT ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Kök Hücre ve Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Kardiyoloji = Cardiology
Dizin: Anjiyogenez = Angiogenesis ; Anjiyogenezi indükleyen ajanlar = Angiogenesis inducing agents ; Endotelyal hücreler = Endothelial cells ; Endotelyum-vasküler = Endothelium-vascular ; Koroner damarlar = Coronary vessels ; Ranolazin = Ranolazine ; İn vitro = In vitro

Özet:
Kardiyovasküler hastalıklar, tüm dünyada ve Türkiye' de önemli bir sağlık problemi olmaya devam etmektedir. Tanısal süreçte ve tedavi noktasında ciddi gelişmeler olsa da bu hastaların birçoğu kronik stabil angina pektoris ve kalp yetmezliği ile yaşamlarını idame ettirmeye devam etmektedir. Yaşam kalitesini bozan ve ölüm riskini arttıran bu durumu düzeltmek için değişik mekanizmalar üzerinden etki eden antianginal ilaçlar sıklıkla kullanılmaktadır. İlaç kullanımının yanında, bu hastalar için araştırma aşamasında olan alternatif hücresel tedavi yöntemlerinden birisi de koroner kollateral damar gelişimini uyararak iskemik miyokard dokusunda terapotik anjiyogenezi uyarmaktır. Bu konudaki çalışmalar daha çok anjiyojenik protein, gen veya hücre uygulamalarını içerse de bu konu ile ilgili yapılmış klinik çalışmalarda net bir klinik fayda gösterilememiştir. Oral yoldan etkili olan ranolazin, kronik stabil angina pektoris hastalarının kullanımı için ilk kez 2006 yılında kullanım onayı almıştır. Molekülün etki mekanizmasına dair yapılan çalışmalarla, molekülün miyokard hücresi içinde yağ asidi oksidasyonunu inhibe ettiğini göstermiş ve bu yüzden geçmişte 'metabolik modülatör' olarak değerlendirilmiştir. Fakat daha sonradan yapılan in-vitro ve in-vivo çalışmalar göstermiştir ki ilacın antianginal etkisi hücre içindeki metabolik değişimden ziyade iskemi sırasında daha da aktifleşen geç sodyum kanallarının inhibisyonu ile olmaktadır. Molekül, terapotik aralığın üzerindeki dozlarda hücre içinde yağ asidi oksidasyonunu inhibe ederek metabolik modülatör aktivite sergilemekte, terapotik sınırdaki dozlarda ise geç sodyum kanal akımında selektif ve kuvvetli bir inhibisyon etkisi göstermektedir. Yapılan klinik çalışmalarda, ilacın antianginal etkinlik göstermesinin yanında hastalarda diyabet parametrelerinde düzelme gösterilmiştir. Bu etki klinik çalışmaların yanında hem in-vitro hem de in-vivo çalışmalarda gösterilmiştir. Bunun yanında, klinik çalışmalarda gösterilmiş olan anti-aritmik bir etki de mevcuttur. İlacın hem ventriküler hem de atriyal aritmileri iyileştirdiğine dair literatürde yapılmış birçok çalışma ve olgu serileri mevcuttur. Ayrıca ilacın pankreas hücrelerinde ve sinir hücrelerinde anti-inflamatuar ve anti-apoptotik  bir etkinliği olduğu gösterilmiştir. Fakat literatürde ilacın endotel hücreleri üzerindeki etkinliği ile ilgili yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada ranolazinin in-vitro koşullarda insan koroner arter endotel hücreleri (İKAEH) üzerindeki etkisi araştırılması amaçlandı.

Bu çalışmada öncelikle İKAEH  in-vitro kültür ortamında çoğaltıldı. Çoğaltılan hücreler xCELLigence RTCA sistemi kullanılarak son konsantrasyonları 0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 ve 200 μM olacak şekilde ranolazin ile muamale edildi ve hücrelerin proliferasyon ve sitotoksisite yanıtları 96 saat boyunca gözlemlendi. Ardından in-vitro anjiyogenezi test etmek için matrijel tüp formasyonu testi yapıldı. İKAEH matrijel membrana ekildikten sonra son konsantrasyonları 50 ve 200 μM olacak şekilde ranolazin ile mumale edildi ve 4, 8, 12 ve 16. saatlerde invert mikroskop kullanılarak resimleri çekildi. Faz-kontrast görüntüleri Wimasis Image Analysis programı kullanılarak değerlendirildi. Anjiyogenezin biyokimyasal göstergesi olarak vaskuler endotelyal growth faktör (VEGF) seviyeleri ELISA yöntemi kullanılarak ölçüldü. Son konsantrasyonları 50 ve 200 μM olacak şekilde inkübe edilen insan koroner arter endotel hücrelerinin besiyerlerinden 12, 24 ve 48. saatlerde örnek alındı ve ELISA yöntemi ile VEGF miktarları tespit edildi. 
Çalışmanın sonucunda test edilen hiçbir ranolazin dozunda proliferasyonda artış ve/veya sitotoksik etki gözlemlenmedi. Ranolazin içermeyen hücre grubuna kıyasla ranolazin içeren hücre grubunda tüp oluşum kapasitesinde artış tespit edildi. Tüp oluşum kapasitesi 200 μM ranolazin içeren grupta 50 μM ranolazin içeren gruba göre anlamlı olarak daha yüksekti. ELISA testinde ise 12, 24 ve 48. saatlerdeki VEGF ölçümlerinde herhangi bir artış tespit edilmedi. Sonuç olarak bu tez çalışmasında gösterilmiştir ki ranolazin molekülünün endotel hücreleri üzerinde çok yüksek dozlarda dahi toksik etkisi bulunmamaktadır. Matrijel membranda her ne kadar tüp oluşturma kapasitesinde artış gözlemlense de, VEGF seviyelerinde bir artış gözlemlenmemiş olması ilacın İKAEH' de anjiyogenez etkisi bulunabileceğine dair yorum yapılmasını destekleme noktasında yetersiz kalmaktadır.

Abstract:
Cardiovascular diseases continue to be an important health problem both in the whole world and Turkey. Although there are serious developments in the diagnostic processes and treatment modalities, most of these patients keep on to suffer from chronic stabile angina pectoris and heart failure. Antianginal medications, which have different mechanisms of action, are widely used to ameliorate this situation, which disrupts quality of life and increases risk of mortality. In addition to medical therapies, there are alternative approaches under investigation to help these patients such as therapeutic angiogenesis, which aims to facilitate the growth of coronary collateral vessels in the ischemic myocardium. These approaches mainly include angiogenic protein, gene and cell therapies although no clinical benefit has been shown in the clinical trials until today. Ranolazine, which is orally effective, has been approved for clinical usage in chronic stabile angina patients first in 2006. Studies aiming to investigate the mechanism of action showed that ranolazine inhibits free fatty acid oxidation in the cytoplasm of cardiomyocyte and the drug has been considered as a 'metabolic modulator' at that time. Subsequently in-vitro and in-vivo studies showed that, the antianginal mechanism of the drug is the inhibition of the late sodium channels, which are more activated during ischemia, instead of a metabolic ex-change in the cytoplasm. Molecule inhibits free fatty acid oxidation above the therapeutic doses but inhibits late sodium currents very strongly and specifically within therapeutic limits. In the clinical trials performed, it has been shown that the drug has anti-diabetic effects in addition to its antianginal effects. This effect has also been proven in in-vitro and in-vivo studies. In addition, there is an antiarrhythmic effect, which has been demonstrated in the clinical trials. There are a lot of studies and case series in the literature demonstrating the effectiveness of the drug on atrial and ventricular arrhythmias. Besides, ranolazine has been found to demonstrate anti-inflammatory and anti-apoptotic activity in neural and pancreatic cells. But there is no study in the literature about the effects of the drug on endothelial cells. In this study, it is aimed to investigate the effects of ranolazine on human coronary artery endothelial cells (HCAECs) under in-vitro conditions.  

In this study, firstly HCAECs were expanded under in-vitro conditions. By xCELLigence RTCA system, expanded cells were treated with a final concentration of 0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 ve 200 μM ranolazine to evaluate the potential effects on proliferation and cytotoxicity and cells were observed for 96 hours. Then matrigel tube formation test was applied to test the in-vitro angiogenesis. After HCAECs were embedded to matrigel membrane, cells were treated with a final concentration of 50 and 200 μM ranolazine and at 4th, 8th,12th and 16th hours pictures were obtained by inverted microscope.  Phase-contrast micrographs were evaluated by Wimasis Image Analysis program. As a biochemical indicator of angiogenesis, vascular endothelial growth factor (VEGF) levels were quantified by ELISA method. From the medium of cells treated with a final concentration of 50 and 200 μM ranolazine, samples were taken at 12th, 24th and 48th hours and VEGF levels were evaluated by ELISA method.

As a result of the study, there was no increase in the proliferation and/or cytotoxic effect of ranolazine at all tested concentrations. Compared to cells without ranolazine, there was an increase in the tube formation capacity of cells treated with ranolazine. Tube forming capacity was higher in cells treated with 200 μM ranolazine compared to cells treated with 50 μM ranolazine. In the ELISA analysis, there was no increase in VEGF levels at 12th, 24th and 48th hours. As a result, it was demonstrated in this study that ranolazine molecule does not have cytotoxic effects on endothelial cells even in very high doses. Although there was an increase in the tube forming capacity of cells in matrigel membrane assay, the fact that there was no increase in VEGF levels limits the support the suggestion that the drug may have angiogenic effects on HCAECs.