Tödürge gölünde (Sivas) yaşayan bazı Cyprinidae türlerinin karaciğer ve kas dokusu yağ asiti bileşiminin mevsimsel değişimi ve karaciğer lipaz enziminin saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerinin karşılaştırılması
Determination of seasonal changes of fatty acid composition of liver and muscle tissue of some Cyprinidae species living in the Lake Tödürge (Sivas) and purification and comparision of biochemical properties of liver lipase enzyme
Yazar: SALİH GÖRGÜN
Danışman: PROF. DR. MEHMET ALİ AKPINAR
Cumhuriyet Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Fizyoloji = Physiology
Dizin: Chalcalburnus chalcoides = Chalcalburnus chalcoides ; Cyprinus carpio = Cyprinus carpio ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Leuciscus cephalus = Leuciscus cephalus ; Lipaz = Lipase ; Tödürge Gölü = Tödürge Lake ; Yağ asitleri = Fatty acids

Özet:
Bu çalışmada, Chalcalburnus chalcoides, Leuciscus cephalus ve Cyprinus carpio'nun karaciğer ve kas dokusu yağ asitlerinin mevsimsel değişimi ve karaciğer lipaz enzimlerinin (E.C. 3.1.1.3) saflaştırılması, bazı kinetik özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.İncelenen türlerin karaciğer ve kas dokusu yağ asitleri kalitatif fark göstermezken, mevsime bağlı olarak kantitatif farkların olduğu belirlenmiştir. Yağ asitleri gaz kromatografisi ile analizlenmiştir.Karaciğer ve kas dokusunda tüm mevsimlerde en fazla bulunan yağ asitlerinin palmitik asit (C16:0), stearik asit (C18:0), palmitoleik asit (C16:1 n-7), oleik asit (C18:1 n-9), C18:1 n-7, linoleik asit (C18:2 n-6), arakidonik asit (C20:4 n-6), eikosapentaenoik asit (C20:5 n-3), dokosapentaenoik asit (C22:5 n-3) ve dokosahekzaenoik asitin (C22:6 n-3) olduğu bulunmuştur.Su sıcaklığı ve türlerin üreme periyotlarına bağlı olarak, karaciğer ve kas dokusu toplam doymuş yağ asiti (DYA) ve aşırı doymamış yağ asiti (ADmYA) miktarlarının önemli derecede etkilendiği belirlenmiştir. Yazın yüksek oranlarda temsil edilen DYA miktarlarının kış periyoduyla azaldığı belirlenmiştir. Bununla birlikte, incelenen türlerin üreme periyotları esnasında toplam ADmYA oranlarında önemli düşüş olmuştur. Bu periyotlarda en fazla düşüş gösteren yağ asitlerinin C20:4 n-6 ve C22:6 n-3 olduğu belirlenmiştir. Kış sezonuyla birlikte, ADmYA seviyelerinde önemli artışlar saptanmıştır. İnsan sağlığı açısından önemli fizyolojik etkilere sahip olan n-3 formu ADmYA'nin incelenen türlerin karaciğer ve kas dokularında oldukça yüksek miktarlarda bulunduğu görülmüştür.Bu çalışmada C. chalcoides, L. cephalus ve C. carpio'nun karaciğer lipaz enzimleri saflaştırılmış ve bazı kinetik özellikleri karakterize edilmiştir. Saflaştırma işlemi homojenatın hazırlanması, PEG-6000 ile çöktürme ve Q sefaroz, Sefakril S 200 HR, fenil sefaroz CL-4B'yi kapsayan kromatografik işlemlerden oluşmuştur.Anyon değişim kromatografisi olan Q sefaroz tüm türlerde önemli saflaştırma parametreleri sağlamıştır (C. chalcoides'te 32.96 µmol/dk.mg protein spesifik aktivite ve 30.49 kat saflık, L. cephalus'ta 30.99 µmol/dk.mg protein spesifik aktivite ve 33.05 kat saflık, C. carpio'da 29.72 µmol/dk.mg protein spesifik aktivite ve 24.83 kat saflık). Sefakril S 200 HR kromatografisi L. cephalus'ta saflaştırma sağlamamıştır. Son saflaştırma basamağında kullanılan fenil sefaroz CL-4B ile elde edilen saflaştırma parametreleriyle C. chalcoides'te 52.84 µmol/dk.mg protein spesifik aktivite ve 48.88 kat saflık, L. cephalus'ta 51.41 µmol/dk.mg protein spesifik aktivite ve 54.84 kat saflık, C. carpio'da 90.38 µmol/dk.mg protein spesifik aktivite ve 75.50 kat saflık elde edilmiştir. Bu sonuçlara göre, en yüksek saflaştırma parametreleri C. carpio'da belirlenmiştir.Kinetik parametreler karşılaştırıldığında, incelenen türlerin karaciğer lipazlarının optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 37 °C ve 8.00 olarak belirlenmiştir. Km değerleri C. chalcoides için 0.77 mM pNPB, L. cephalus için 0.58 mM pNPB ve C. carpio için 0.17 mM pNPB olarak bulunmuştur. Vmax değerleri C. chalcoides'te ve L. cephalus'ta 2.8 µmol/mL.dk, C. carpio' da 2.6 µmol/mL.dk olarak belirlenmiştir.% 0.5 oranındaki SDS, Triton X-100 ve Sodyum taurokolik asit'in, saflaştırılan karaciğer lipazlarına etkileri, bu ajanlarla belirli sürelerde inkübe etmek suretiyle değerlendirilmiştir. SDS enzimde hızlı bir inaktivasyona neden olmuştur. Triton X-100 ve sodyum taurodeoksikolat benzer bir etki göstermiş ve genel olarak 2. saatin sonunda enzim aktivitesinde önemli bir düşüşün olduğu tespit edilmiştir. SDS-PAGE tekniği ile yapılan saflık kontrolü sonucunda her üç türün karaciğer lipaz enzimlerinin tek bant ve 74.05 kDa olduğu bulunmuştur.Anahtar Sözcükler: Tödürge Gölü, Chalcalburnus chalcoides, Leuciscus cephalus, Cyprinus carpio, karaciğer, kas dokusu, yağ asiti bileşimi, lipaz (E.C. 3.1.1.3), saflaştırma, karakterizasyon.

Abstract:
In this study, it has been aimed to determine seasonal changes in the liver and muscle fatty acid compositions and purification of liver lipases (E.C. 3.1.1.3) together with the determination of some kinetic properties of the lipases from liver of Chalcalburnus chalcoides, Leuciscus cephalus and Cyprinus carpio.Although liver and muscle fatty acid composition of the species investigated did not show any qualitative differences, it was observed that there were quantitative differences depending on seasons. Fatty acids were analyzed in Gas Chromatography (GC).It was found that the most abundant fatty acids in liver and muscle fatty acids in all seasons were palmitic acid (C16:0), stearic acid (C18:0), palmitoleic acid (C16:1 n-7), oleic acid (C18:1 n-9), C18:1 n-7, linoleic acid ((C18:2 n-6), aracidonic acid (C20:4 n-6), eicosapentaenoic acid (C20:5 n-3), docosapentaenoic acid (C22:5 n-3) and docosahexaenoic acid (C22:6 n-3).Total saturated (SFA) and unsaturated (PUFA) fatty acid amounts of liver and muscle tissue were found to be effected significantly, depending on the water temperature and reproduction periods of species. It was determined that SFA amounts expressed in high ratios in summer season decreased together with the winter periods. Hovewer, there were significant recessions in the amounts of total PUFA during the reproduction periods of the species investigated. During this periods, it was determined that the fatty acids showing the highest recession were the C20:4 n-6 and C22:6 n-3. Together with the winter season, it was detected to be significant increases in the ratios of total PUFA. It was observed that the n-3 form of PUFA having important physiological effects on human health had the considerably high amounts in the liver and muscle tissues of the species investigated.In this study, liver lipase enzymes of C. chalcoides, L. cephalus and C. carpio were purified and characterized some kinetic properties of the purified enzymes. The purification procedure consisted of the preparation of homogenate, precipitation with PEG-6000 and chromatographic operations involving in the Q sepharose, Sephacryl S 200 HR and Phenyl sepharose CL-4B.Q sepharose, which is an anion exchange chromatography, provided significant purification parameters in all species (32.96 U/mg.protein specific activity and 30.49 fold purity in C. chalcoides, 30.99 µmol/dk.mg protein specific activity and 33.05 fold purity in L. cephalus, 29.72 µmol/dk.mg protein specific activity and 24.83 fold purity in C. carpio). Sephacryl S 200 HR did not provided any purification in L. cephalus. The purification parameters obtained with the phenyl sepharose CL-4B chromatography used in the final purification step were found to be 52.84 µmol/dk.mg protein specific activity and 48.88 fold purity in C. chalcoides, 51.41 µmol/dk.mg protein specific activity and 54.84 fold purity in L. cephalus, 90.38 µmol/dk.mg protein specific activity and 75.50 fold purity in C. carpio. According to these results, the highest purification parameters have been determined in C. carpio.When compared the kinetic parameters, the temperature and pH optimums of liver lipases of the species investigated were found as 37 °C and 8.00, respectively. Km values were determined as 0.77 mM pNPB for C. chalcoides, 0.58 mM pNPB for L. cephalus and 0.17 mM pNPB for C. carpio. Vmax values were the same in C. chalcoides and L. cephalus as 2.8 µmol/mL.dk, while 2.6 µmol/mL.dk in C. carpio.The effects of SDS, Triton X-100 and Sodium taurocholic acid in the ratio of % 0.5 were assessed on the liver lipases purified, incubating them these agents in given times. SDS caused a fast inactivation on the enzymes. Triton X-100 and sodium taurocholic acid exhibited similar effects and in general, it was detected that there was a marked decrease in the enzyme activity. In the result of the purity control by revelaed SDS-PAGE technique, the liver lipase enzymes in every three species were found to be a single band and 74.05 kDa.Key words: The Lake Tödürge, Chalcalburnus chalcoides, Leuciscus cephalus, Cyprinus carpio, liver, muscle tissue, fatty acid composition, lipase (E.C. 3.1.1.3), purification, characterization.