Önemli pankreatik transkripsiyon faktörlerinin sentetik mrna'larının dizaynı, ın vıtro üretimi ve beta hücresi farklılaşmasındaki rollerinin incelenmesi
Designing and in vitro production of important pancreatic transcription factors' mrnas and investigation of their roles in beta cell formation
Yazar: MEHMET YILDIZ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ERSİN AKINCI
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Diyabet tedavisinde kullanımının mümkün olmasından dolayı pankreatik beta hücresi programlama büyük bir ilgi görmüştür. Çeşitli çalışmalarda, viral vektörler aracılığıyla, önemli pankreatik transkripsiyon faktörlerinin somatik hücrelerde yüksek ekspresyonu sonucunda somatik hücrelerden insülin sentezleyebilen beta hücresi programlanabildiği gösterilmiştir. Ancak viral vektörlerin kullanımındaki kaygılar, genin ekpresyonu ve hücre içine taşınımı konusunda bilim insanlarını yeni arayışlara sokmuştur. mRNA'ların in vitro sentezi ve transfeksiyonu gen ekpresyonu için güvenli bir yöntemdir. Bu tez çalışmasında önemli insan pankreatik transkripsiyon faktörleri olan Pdx1, Ngn3 ve MafA mRNA'larının dizaynı ve in vitro üretimi yapılmıştır. Ayrıca yapılan çalışmada bu mRNA'ların ekpsresyon verimi hücre kültüründe gösterilmiştir. Yapılan çalışmada öncelikle ilgili genlerin Açık Okuma Çerçeveleri (ORF) ile modifiye edilmiş 5′ ve 3′ UTR'ların ligasyonu yapılmıştır. Ligasyon ürünü plazmite klonlanmış ve in vitro transkripsiyon için hazır hale getirilmiş, in vitro transkripsiyon yapılmıştır. Oluşturulan modifiye mRNA'ların kalitatif ve kantitatif analizleri yapılmış ve proteine translasyon verimleri incelenmiştir. In vitro transkripsiyonu yapılan mRNA'ların insan fibroblast hücrelerine başarılı bir şekilde transfekte edildiği gösterilmiştir. Translasyon sonucu oluşan proteinlerin nükleusta doğru bir şekilde lokalize olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, dizayn edilen ve in vitro üretilen bu önemli pankreatik transkripsiyon faktörlerinin hücre programlama çalışmalarında kullanılabileceği gösterilmiştir.

Abstract:
Direct reprogramming of pancreatic beta cells has a great interest due to its possible use in diabetes treatment. Various studies demonstrated direct reprogramming of insulin expressing beta cells from other somatic cells by over-expressing important pancreatic transcription factors through viral vectors. However, concerns about using viral vectors in clinic have let the scientist to find new approaches for gene delivery and expression. In vitro synthesis and transfection of mRNAs is a safer strategy for ectopic gene expression. In this thesis study we pursued to design and in vitro synthesize human pancreatic transcription factors' mRNAs; Pdx1, Ngn3 and MafA. We also aimed to assess their expression efficiency in cultured cells. First we ligated the open reading frames of these genes to modified 5′ and 3′ UTRs. Ligation products were then cloned into a plasmid and subjected to in vitro transcription to get their corresponding mRNAs. Modified mRNAs were subsequently examined for their quality, quantity, and protein translation efficiency. In vitro-transcribed mRNAs were successfully transfected to the human fibroblast cells. Efficiently translated proteins were correctly localized into the nucleus. It is concluded that pancreatic mRNAs designed and in vitro-transcribed in this study can be used in further direct beta cell reprogramming studies.