Kanser tanısında kullanılmak üzere yeni nesil kolorimetrik biyosensörlerin geliştirilmesi
Development of new generation colorimetric biosensors for cancer diagnosis
Yazar: İREM ÇELEBİER
Danışman: PROF. DR. NEVİN KESKİN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Altın nanopartiküller = Gold nanoparticle ; Kolorimetri = Colorimetry ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Protein kinazlar = Protein kinases

Özet:
Meme kanseri, kadınlar arasında görülen en yaygın kanser türüdür. Günümüzde meme kanserinin teşhisi uzman analizi gerektiren, taşınması zor, pahalı ve zaman alıcı tekniklerle belirlenmekte olup, spesifik ve aşırı duyarlı yeni cihazlara olan ihtiyaç artmaktadır. Kanserin erken teşhisi, hastanın hayatta kalması ve tedavinin başarısı için oldukça önemlidir. Biyosensör teknolojisinin kanser teşhisinde kullanılmasıyla beraber birçok araştırmacı düşük maliyetli, hızlı, kullanıcıyla uyumlu ve hasta bakım noktasında kullanılabilen biyosensörlerin geliştirilmesine yönelmiştir. 
Bu tez çalışmasında, meme kanseri teşhisine yönelik yeni nesil kolorimetrik bir biyosensör tasarlanmıştır. Sensör platformu olarak, optik-immüno-algılama için kullanışlı olan cam kapiller tüpler tercih edilmiştir. Cam yüzeyler sıvı ve gaz fazında iki farklı yöntem kullanılarak, aminle fonksiyonel hale getirilmiştir. Cam yüzeyler, X-ışını fotoelektron spektrometresi (XPS) ile analiz edilerek, gaz fazında yapılan aminleme işleminin daha etkili olduğu belirlenmiştir. Gaz fazında aminleme için, basıncın ve APTES konsantrasyonunun aminlemeye olan etkisi incelenerek, en iyi aminlemenin 50 μl APTES ile 0.06 Mpa basınç altında gerçekleştiği tespit edilmiştir.
Biyolojik algılama elemanı olarak, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü-2 (HER-2) ve kanser antijeni 15-3 (CA15-3) meme kanseri antikorları kullanılmıştır. Oksidasyon işlemiyle aktif hale getirilen belirleyici antikorlar (det-ab) amin ile fonksiyonel hale getirilmiş cam yüzeyler üzerine immobilize edilmiştir. Hedef molekül (belirteç) olarak, HER-2 ve CA15-3 antijenleri ve SK-BR-3 HER2(+) meme kanseri hücreleri kullanılmıştır. 
Kolorimetrik biyosensörde meme kanseri belirteçlerinin saptanması ve görselleştirilmesi için sinyal verici olarak, eşsiz optik özelliklere sahip olan altın nanopartiküller (AuNP) kullanılmıştır. Modifiye ettiğimiz kimyasal yöntemle sentezlenen AuNP' ler, spesifik tanıma ve bağlanma bölgeleri oluşturmak için MUA ile kaplanarak tek katmanlı hale getirilmiştir. AuNP' ler Zeta-Sizer, UV-VIS, FTIR, TEM gibi çeşitli teknikler kullanılarak karakterize edilmiş ve 25 nm boyutunda AuNP' ler elde edilmiştir. Sentezlenen AuNP' ler yakalayıcı antikorlar ile muamele edilerek, antikorların AuNP yüzeyine konjugasyonu gerçekleştirilmiştir.
Tasarlanan cam kapiller tabanlı kolorimetrik biyosensör; belirleyici antikor, kanser antijeni ve yakalayıcı antikor kaplı AuNP' ler ile muamele edilerek validasyon gerçekleştirilmiştir. Belirleyici antikor miktarı, AuNP' ler ile muamele edilen yakalayıcı antikor miktarı, antijen konsantrasyonu ve inkübasyon süresi gibi farklı parametrelerin immobilizasyona etkisi incelenerek biyosensör optimize edilmiştir. Cam yüzey üzerinde gerçekleşen immobilizasyon FTIR tekniği ile karakterize edilerek, -NH pikleri ve amid bantlarının görülmesi ile doğrulanmıştır. 
Tasarlanan kolorimetrik biyosensörün validasyon sonuçları herhangi bir cihaza ihtiyaç duyulmadan çıplak gözle ve mikroskop altında görüntülenmiştir. Meme kanseri biyobelirteçleri (HER-2 ve CA15-3) ve HER2(+) hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen immobilizasyon işlemi, cam yüzeylerde meydana gelen renkli tabakalaşma ile tespit edilmiştir. Gerçekleşen renk oluşumları meme kanseri teşhisi için tasarlanan yeni nesil kolorimetrik biyosensörün çalışma etkinliğini doğrulamıştır. Tasarlanan biyosensörün taşınabilir boyutu, uzman kişilere ihtiyaç duymadan kolaylıkla uygulanabilme ve sonuç elde edebilme gibi özellikleri ileride kanser teşhisi için tasarlanacak tarama testlerine önemli bir katkı sağlayacaktır.
Bu tez çalışmasının, meme kanseri teşhisi için kullanımı kolay, uygun maliyetli ve hasta bakım noktasında uygulanabilir bir yaklaşıma sahip yeni nesil biyosensörlerin geliştirilmesine fayda sağlayacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Breast cancer is the most common type of cancer among women. Today, breast cancer diagnosis is determined by techniques requiring expert analysis, difficult to carry, expensive, and time-consuming, and the need for specific and hypersensitive new devices is increasing. Early diagnosis of cancer is crucial for patient survival and the success of the treatment. With biosensor technology in cancer diagnosis, many researchers have turned to improving low-cost, fast, convenient biosensors that can be used at the point of care.
In this thesis, a new generation colorimetric biosensor was designed for the diagnosis of breast cancer. Glass capillary tubes, which are helpful for optical-immuno-sensing, were chosen as sensor platform. Glass surfaces are functionalized with amine by using two different methods in liquid and gas phase. Glass surfaces were analyzed with XPS. It was determined that the amination process in gas phase was more effective. The effect of pressure and APTES concentration on amination was examined for gas-phase amination. It was determined that the best amination was achieved with 50 μl APTES under 0.06 Mpa pressure.
Human epidermal growth factor receptor-2 (HER-2) and cancer antigen 15-3 (CA15-3) breast cancer antibodies were used as the biological sensing element. Detection antibodies activated by the oxidation process were immobilized on glass surfaces functionalized with amine. HER-2 and CA15-3 antigens and SK-BR-3 HER2(+) breast cancer cells were used as markers.
Gold nanoparticles (AuNP) with unique optical properties have been preferred as signal transmitters to detect and visualize breast cancer markers in colorimetric biosensor. AuNPs synthesized by the chemical method modified were coated with MUA to form specific recognition and binding sites and made into a monolayer. AuNPs were characterized using various techniques such as Zeta-Sizer, UV-VIS, FTIR, TEM, and 25 nm AuNPs were obtained. The synthesized AuNPs were treated with capturing antibodies and the antibodies were conjugated to the AuNP surface.  
The glass capillary-based colorimetric biosensor was validated using detection antibody cancer antigen, and capture antibody coated AuNPs. The biosensor was optimized by examining the effects of different parameters such as antigen concentration, incubation time, the amount of detection antibody, and capture antibody coated with AuNPs on immobilization. The immobilization on glass surface was characterized by FTIR and was confirmed by the appearance of -NH peaks and amide bands.
The validation results of the designed colorimetric biosensor were viewed with the naked eye and under a microscope without the need for any device. The immobilization which breast cancer biomarkers (HER-2 and CA15-3), and HER2(+) cells was detected by the colored layering on the glass surfaces. The resulting color formations confirmed the working efficiency of the new generation colorimetric biosensor designed for breast cancer diagnosis. The features of designed biosensor, such as its portable size, easy application, and obtaining results without an expert, will make a significant contribution to the screening tests to be designed for cancer diagnosis in the future.
We hope that this study will be helpful in the development of new generation biosensors with a simple, easy-to-use, cost-effective and applicable approach for cancer diagnosis.