Testis kanseri hücre dizilerinde n-asetilsisteinin bleomisinin sitotoksisitesi üzerine etkileri
The effects of n-acetylcysteıne on cytotoxıcıty of bleomycın in testıcular cancer cell lınes
Yazar: ERTAN KÜÇÜKSAYAN
Danışman: PROF. DR. GÜLTEKİN YÜCEL
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Apoptozis = Apoptosis ; Bleomisin = Bleomycin ; Hücre kültürü = Cell culture ; N-asetilsistein = N-acetylcysteine ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Testiküler neoplazmlar = Testicular neoplasms ; Testis = Testis

Özet:
Kanser hücrelerinde oksidatif stresin, hücre proliferasyonunun stimülasyonu, mutasyonların ve genetik instabilitenin artışı, antikanser ilaçlarına karşı hücresel duyarlılığın değişmesi gibi belirgin sonuçları olabilir. Buna karşıt olarak, oksidatif stresin artışı, kanser hücrelerini öldürmek için bir fırsat da sağlayabilir. Çalışmamızda kullandığımız Bleomisin, süperoksid ve hidrojen peroksid gibi reaktif oksijen türlerini üretir. Bleomisin testis kanserinin tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir ilaçtır ve bu ilacın yüksek düzeyde ROS oluşumuna yol açtığı gösterilmiştir. Oluşan bu ROS sonucunda hücrenin hayatta kalmasını sağlayan yapı taşları hasara uğramaktadır. Lipidlerden ve proteinlerden oluşan zarlar ROS hasarına karşı hassastırlar. Ayrıca ROS seviyelerinin yüksekliğinin hücrede apoptozisi indüklediği bilinmektedir. Antineoplastik ajanların, oksidanları indükleyerek kanser hücrelerini apoptozis yoluyla öldürdüğünü bildiren birçok çalışma vardır.Çalışmamızda Bleomisin'in tedavi sırasında antioksidanlarla birlikte kullanılmasının tedavi sürecini olumsuz yönde etkileyebileceğini düşündük. N-asetilsistein (NAC) antioksidan olarak in vivo ve in vitro yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. NAC canlı organizmalarda üretilen ve sülfür içeren doğal amino asit türevi güçlü antioksidan özelliği olduğu bilinen bir bileşiktir. Bu nedenle Bleomisin'in testis kanseri hücre kültüründe oluşturduğu sitotoksik etki üzerinde, bir antioksidan olarak tedaviye etkisi tartışmalı olan NAC'in etkisi incelenmiştir. NAC detoksifikasyonda rol oynadığı gibi, oksidatif strese karşı hücreyi ve komponentlerini korur. Bu özelliğinden dolayı çalışmamızda NAC'ın Bleomisin'in oluşturduğu oksidatif stres üzerindeki etkileri incelenmiştir. Oksidatif stresin etkileri Protein Karbonil kiti ile ölçülmüştür.Çalışmamızda testis kanseri hücre kültürlerinde Bleomisin'in sitotoksik dozu belirledik. Kontrol, Bleomisin, NAC ve Bleomisin ile birlikte NAC olmak üzere dört deney grubu oluşturduk. Bu deney gruplarında 24, 48 ve 72 saatlik inkübasyonlar sonucunda sitotoksisite MTT testi ile belirlendi. Oksidanların, apoptozisi indükleyerek hücreleri öldürdüğünü ileri süren çalışmaların bir kısmı kantitatif değildir, birçok çalışmada apoptozis ve nekrozla ölen hücrelerin yüzde oranı tayin edilmemiştir. Bizim Kaspaz-3 ve Anneksin V kitleri kullanarak yaptığımız çalışma apoptozis ve nekrozla ölen hücrelerin yüzdelerini belirleme açısından tam anlamıyla kantitatif bir çalışma olmuştur. Tüm deney gruplarında inkübasyondan 6 saat sonra erken apoptozisi gösteren Anneksin V testi Flow Sitometri cihazı kullanılarak uygulandı. Bleomisin grubunda apoptozisin yüzdesinin en fazla olduğu ve NAC+Bleomisin grubunda ise apoptozisin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı belirlendi. 24 saatlik inkübasyondan sonra yapılan Kaspaz-3 deneyi sonuçları da Anneksin V testini desteklemektedir.Yaptığımız tüm deney sonuçlarına göre testis kanseri olan hastalara yapılacak olan kemoterapötik tedavinin hastalığın prognozu açısından önemli olduğunu düşünmekteyiz. Bu çalışmamızın sonuçları ROS üreterek testis kanseri hücrelerini öldüren Bleomisinin, tedavisi sırasında antioksidanlarla birlikte kullanılmasının tedavi sürecini olumsuz yönde etkileyeceği görüşünü desteklemektedir.

Abstract:
In cancer cells, oxidative stress, stimulation of cell proliferation, mutations and genetic instability increase,such as cellular sensitivity change to anticancer drugs may be significant consequences. In contrast, increase oxidative stress, it can also provide an opportunity to kill cancer cells. Used in our study bleomycin generates reactive oxygen species such as superoxide and hydrogen peroxide. Bleomycin is a drug commonly used to treat of testicular cancer and It?s shown to lead to the formation of ROS high levels of this drug. A result of ROS formed building blocks to ensure the survival of the cell are damaged. Membranes composed of lipids and proteins sensitive to damage ROS. In addition, the height of the levels of ROS are known to induce cell apoptosis. Antineoplastic agents inducing oxidants cancer cells killed by apoptosis many studies have reported.In our study, we thought during therapy the use of bleomycin with antioxidants can adversely affect the process of treated. N-acetylcysteine (NAC) as an antioxidant widely used in vivo and in vitro. NAC produced by living organisms and the natural sulfur-containing amino acid derivative is a compound known to have powerful antioxidant properties. Therefore, on cytotoxic effects in testicular cancer cell culture formed by Bleomycin, which is controversial as an antioxidant effect of NAC treatment were investigated. Like NAC play a role in detoxification protects a cell and the components of the cell against oxidative stress. Due to the property, in our study examined the effects of NAC on oxidative stress created by Bleomycin. The effects of oxidative stress was measured by protein carbonyl kit.In our study, we identified the cytotoxic dose of bleomycin in testicular cancer cell lines. Control, bleomycin, NAC and bleomycin with NAC were created four experimental groups. This experimental groups, 24, 48 and 72-hour incubations with the cytotoxicity was determined by MTT test. Oxidants, cells killed by apoptosis, which suggests some of the studies are not quantitative, percentage of dead cells of apoptosis and necrosis have not been determined in many studies. In our study we made using the Caspase-3 and Annexin V kits in terms of determining the percentage of cells died of apoptosis and necrosis has been working a fully quantitative. After 6 hours of incubation in all experimental groups, indicating early apoptosis Annexin V test was performed using Flow Cytometer. Bleomycin group has the highest percentage of apoptosis and apoptosis were statistically significantly decreased in the NAC + bleomycin group. After 24-hour incubation Caspase-3 experiment results support Annexin V also testing.We think it is important for prognosis of the disease of the chemotherapeutic treatment of patients with testicular cancer all the experiment results. During treatment Bleomycin kills testicular cancer cells by generated ROS. Because of antioxidants prevent ROS, we believe that the use of antioxidants during treatment with Bleomycin negatively affect the treatment process.