Hücre kültürü temelli biyoteknolojik üretimlerde kullanılmak üzere farklı hücre hatlarının biyoproses verimliliklerinin kıyaslanması
Comparison of bioprocess efficiencies of different cell lines to be potentially used in cell culture-based biotechnological productions
Yazar: SÜLEYMAN FURKAN DEMİRDEN
Danışman: DOÇ. DR. SUPHİ ŞURİŞVAN ÖNCEL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Biyofarmasötiklere devamlı artan yüksek talep sebebiyle kısa sürede ve yüksek kalitede üretimini gerçekleştirmek biyoproses endüstrisinin hedefi haline gelmiştir. Biyoproseslerde elde edilmek istenen ürün göz önüne alınarak üretimlerde yer alacak olan ekspresyonel platformlar öne çıkmaktadır. Özellikle aşılar, monoklonal antikorlar ve büyüme faktörleri gibi kompleks üretim süreçlerine sahip ürünlerin üretiminde hayvan hücre kültürleri kullanılmaktadır. Bu açıdan hücre hatlarının büyük ölçeğe uyarlanabilirliği, kültür ortamı ihtiyaçları ve ürün verimi gibi parametreler üzerinden bunların değerlendirilmesi yapılmaktadır. Ayrıca, otorite kurumlar endüstriyel üretimlerde hayvansal kaynaklı bileşenlerin kullanılmasını sakıncalı bulmaktadır. Bu nedenle, bu amaç için kullanılacak hücrelerin serumsuz besin ortamlarında üretilebilmeleri büyük önem taşımaktadır. Hücre hatlarının serumsuz ortama adaptasyonlarıyla beraber süspanse koşullara üremeye de adapte edilmeleri üretim kolaylığı ve maliyet açısından da avantaj sağlamaktadır. Bunlarla beraber hücre hatlarının endüstriye uyarlanabilirliklerinin değerlendirilmesinde nihai amaç ticari bir üretim olduğu için büyük ölçek çalışmaları ve birim zamanda hedeflenen ürünü üretim verimi diğer önemli değerlendirme kriterleridir. Böylelikle üretimde kullanılması planlanan ekspresyonel platform olan hücre hatlarının endüstriyel potansiyeli belirlenmektedir. Tüm bunlarla beraber biyofarmasötik ürünlerin hedef kitlesi insan olduğu için ekspresyonel platfom olarak kullanılan hücre hatlarının insan kökenli olması ürünün yüksek doğrulukta olması açısından fayda sağlamaktadır. 
Bu amaçla belirli üretimler için endüstriyel kullanımda veya üretim çalışmalarında yer alan ve diğer ürünlerin üretimi için de yüksek potansiyele sahip hücre hatları olarak seçilen CHO-K1, MDCK, HEK-293 ve THP-1 farklı adaptasyon yöntemleriyle serumsuz ortamda kültürlenmeye adapte edildi. Ayrıca THP-1 dışında orjinalinde adherent karakterde olan diğer hücre hatları aynı zamanda süspanse koşullarda üremeye de adapte edildi. Sonrasında tüm adepte hücre hatları sırasıyla erlen, spinner flask ve 1 L çalışma hacimli karıştırmalı tank biyoreaktöründe üretimleri yapılarak ölçek büyütme çalışmaları gerçekleştirildi. Bu hücre hatları endüstriyel uygunluklarının belirlenmesi adına adaptasyon süresi, ikilenme süresi, maksimum hücre konsantrasyonu, metabolit ve total protein analizleri üzerinden değerlendirmeler yapıldı. Son olarak, özellikle aşı üretimi açısından tüm hücre hatları H1N1 alt tipindeki influenza A virüsüyle enfekte edilerek virüs üretim başarısı üzerinden bu hücre hatlarının kıyaslaması yapıldı. Tüm bunlar sonucunda, çalışmada kullanılan her bir hücre hattının çeşitli amaçlardaki biyoproseslerde kullanılmak üzere endüstriyel üretimlere uygunluğu belirlendi.
Yapılan çalışmalar sonucunda tüm hücre hatlarının serumsuz ortama başarı ile adapte olduğu belirlendi. Doğrudan adaptasyon yönteminin özellikle adherent kültürlerin süspanse üremeye adapte edilmesindeki geçiş aşamasında hücre kümeleşmesi ve adherent karakterden uzaklaşma açısından daha başarılı olduğu gözlendi. Ölçek büyütme çalışmalarında biyoreaktörde kullanılan bıçak tipine uygun olarak spinner flaskta deneysel olarak belirlenen karıştırma hızlarında spesifik güç girişi üzerinden yapılan hesaplamalar sonucundan biyoreaktör için belirlenen karıştırma hızlarının anlamlı olduğu belirlendi. Tüm hücrelerin metabolit ve protein analizleriyle beraber yapılan influenza virüsü enfeksiyon çalışmalarında hücrelerin hem adapte hallerinin hem de orijinal hallerinin virüs ile enfekte olduğu görülerek bunlar TCID50 ve RT-qPCR ile değerlendirildi. Tüm bunlar üzerinden bütün hücre hatları endüstriyel biyoproseslerde kullanılabilirlik açısından değerlendirildi.

Abstract:
Due to the ever-increasing demand for biopharmaceuticals, it has become the target of the bioprocess industry to produce in a short time and at high quality. In this respect, expression platforms that will take place in productions come to the fore, considering the product desired to be obtained in bioprocesses. In particular, animal cell cultures are used in the production of products with complex structure and production process such as vaccines, monoclonal antibodies and growth factors. In this respect, they are evaluated on parameters such as adaptability of cell lines to large scale, culture medium requirements and product yield. In addition, institutions that have become the authority for the licensing of biopharmaceutical products find it objectionable to use of animal originated components in industrial production. For this reason, expression platforms should be produced in serum-free culture medium. Also, adaptation of cell lines to growth in suspension conditions along with their adaptation to serum-free culture provides advantages in terms of ease of production and cost. In addition, large-scale studies and production efficiency of the targeted product in certain time are other important evaluation criteria, since the ultimate goal is evaluating the industrial adaptability of cell lines in commercial production. Thus, the industrial potential of cell lines, which are the expression platforms planned to be used in production, is determined. With all these, since the target audience of biopharmaceutical products is human, the human origin of the cell lines used as the expression platform provides benefits in terms of high accuracy of the product.
For this purpose, CHO-K1, MDCK, HEK-293 and THP-1, which are selected cell lines with high potential for industrial use or production studies for certain productions and for the production of other products, were tried to be adapted to culture in serum-free medium with different adaptation methods. In addition, other cell lines that were originally adherent, except for THP-1, were also adapted to grow in suspension growth conditions. Afterwards, the adapted states of all these cell lines were produced in a flask, spinner flask and a stirred tank bioreactor with 1 L working volume, respectively, and scale-up studies were carried out. Afterwards, evaluations were made on adaptation time, doubling time, maximum cell concentration, metabolite and total protein analyzes to determine the industrial suitability of all cell lines. Finally, especially in terms of vaccine production, all cell lines were infected with H1N1 subtype influenza A virus and these cell lines were compared on the success of virus production. As a result of all these, it was determined that each cell line used in the study was suitable for industrial production to be used in bioprocesses for various purposes.
As a result of the studies, it was observed that all cell lines were successfully adapted to the serum-free medium. Among the two adaptation methods tested, the direct adaptation method was observed to be more successful in terms of cell aggregation and removal from non-adherent character, especially at the transition stage of adapting adherent cultures to suspension growth. As a result of the calculations made over the specific power input at the experimentally determined mixing speeds in the spinner flask in accordance with the blade type used in the bioreactor in scale-up studies, it was seen that the mixing speeds determined for the bioreactor were significant. Afterwards, in influenza virus infection studies performed with metabolite and protein analyzes of all cells, it was observed that both the adapted and original states of the cells were infected with the virus, and these were evaluated with TCID50 and RT-qPCR. All cell lines were evaluated for usability in industrial bioprocesses.