GRP78 inhibitörü bapta ve velcade kombinasyonunun 4T1 hücre kültürü üzerindeki etkilerinin in vitro belirlenmesi
Determination of the in vitro effects of GRP78 inhibitor bapta and velcade combination on 4T1 cell culture
Yazar: ELİF ERDOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. AZMİ YERLİKAYA
Dumlupınar Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
GRP78/BIP, protein katlanmasında ve katlanmamış protein cevabının  oluşmasında görev alan 78 kDa ağırlığında bir şaperon proteindir (Hendershot vd., 1994; Hendershot, 2004; Roller ve Maddalo, 2013). Endoplazmik retikulum stresi durumunda ekspresyonu artmaktadır. Proteozom inhibitörü velcade'in ise endoplazmik retikulum stresine neden olduğu bilinmektedir (Kardosh vd., 2008). Ayrıca, bortezomibe direnç gösteren hücrelerde GRP78'in up-regüle olduğu görülmüştür (Roué vd., 2011). Bu çalışmada, velcade'in GRP78 ekspresyonuna etkisi doza ve zamana bağlı olarak 4T1 meme kanseri hücrelerinde araştırılmıştır. 4T1 meme kanseri hücreleri logaritmik fazdayken çeşitli velcade dozları ile (10, 50, 100 ve 200 nM) ve lizozom inhibitörü leupeptin (10 µM) ile 24 saat muamele edildiler. GRP78 ekspresyonu Western blot ile incelenmiştir. Artan dozlarda velcade'in, GRP78 ekspresyonunu uyardığı gözlenmiştir. Fakat, beklediğimizin aksine lizozomal inhibitör leupeptinin de GRP78 ekspresyonunu artırdığı gözlenmiştir. Bu sonuç, hem proteozomun hem de lizozomun GRP78 regülasyonunda rol oynadığını göstermektedir. Zamana bağlı etkiyi belirlemek için 4T1 meme kanseri hücreleri 10 nM velcade ile 0, 12, 24 ve 48 saat süreyle muamele edildiler. Benzer şekilde, proteozom inhibisyonun GRP78 ekspresyonunu zamana bağlı olarak artırdığı görülmüştür; maksimum ekspresyon 24. saatte gözlenmiştir. Benzer şekilde, proteozomun inhibe olup-olmadığını göstermek için poliubiquitin konjugatlarının birikmesi Western blot yöntemi ile araştırılmıştır. Poliubiquitin konjugatlarının doza ve zaman bağlı olarak birikmesi proteozomun inhibe olduğunu göstermiştir. Kombine tedavinin etkisini belirlemek için ilk önce GRP78 inhibitörü BAPTA-AM'nin IC50 değeri MTT testi ile araştırılmıştır. MTT ile yapılan sitotoksisite çalışması sonucu BAPTA-AM'nin IC50 değeri 13.6 µM olarak belirlenmiştir. 4T1 hücreleri üzerinde velcade ve BAPTA-AM'nin kombine etkisi araştırılmıştır. 10 nM velcade + 5 μM BAPTA-AM kombinasyonunun monoterapilerden (yani, 10 nM velcade tek başına ve 5 μM BAPTA-AM tek başına kullanıldığında) daha etkili olduğu görülmüştür (p < 0.05). WST-1 testiyle ve gerçek-zamanlı iCELLigence sistem ile de BAPTA-AM ve velcade kombinasyonları (örneğin, 10 velcade + 5 μM BAPTA-AM) benzer sonuçlar vermiştir. Tüm bu çalışmalar proteozom inhibitörü velcade'in antiapoptotik proteinlerden GRP78 ekspresyonunu güçlü bir şekilde uyardığını göstermiştir. Bu da GRP78 ekspresyonun BAPTA-AM gibi ajanlarla engellenmesi durumunda proteozom inhibitörlerinin klinik uygulamalarda daha etkili olabileceğini göstermektedir. GRP78 ekspresyonun artmasından kaynaklanan direncin de önlenebileceği kanaatindeyiz.

Abstract:
GRP78/BIP is involved in protein folding and the unfolded protein response, and is a 78 kDa chaperone protein (Hendershot vd., 1994; Hendershot, 2004; Roller and Maddalo, 2013). Its expression is increased during endoplasmic reticulum stress. Proteasome inhibitor velcade is known to cause endoplasmic reticulum stress (Kardosh vd., 2008). Also, it is found that GRP78 expression is up-regulated in the cells resistant to bortezomib (Roué vd., 2011). In this study, the effect of bortezomib on GRP78 expression is investigated in dose and time-dependent manner on 4T1 breast cancer cells. 4T1 cells were treated with various doses of bortezomib (10, 50, 100 and 200 nM) and lysosomal inhibitor leupeptin (10 μM) for 24 hours in the logarithmic phase of the growth. GRP78 expression was examined by Western blot. Velcade at increasing doses, was observed to induce the expression of GRP78. However, in contrast to our expectations, lysosomal inhibitor leupeptin also enhanced the expression of GRP78. These results suggest that, in addition to the proteasome, lysosome plays a role in the regulation of GRP78. To determine the time-dependent effects, 4T1 cells were treated with 10 nM bortezomib for 12, 24 and 48 hours. Similarly, inhibition of proteasome was found to increase GRP78 expression with respect to time; maximum expression was observed at 24 hours. Similarly, to determine whether the proteasome was inhibited or not, the accumulation of the polyubiquitin conjugates was investigated by Western blot. The accumulation of polyubiquitin conjugates in dose and time dependent manner indicated that the proteasome was inhibited. In order to determine the effect of combined treatment, first the GRP78 inhibitor BAPTA-AM's IC50 value was investigated by MTT assay. In  the cytotoxicity studies carried out by MTT test, IC50 value of BAPTA-AM was determined to be 13.6 μM. Then, the combined effect of velcade and BAPTA-AM on 4T1 cells was investigated. The combination of 10 nM velcade + 5 μM BAPTA-AM is found to be more effective (p < 0.05) than monotherapies (i.e., when 10 nM velcade and 5 μM BAPTA-AM are used alone). Similar results were obtained with WST-1 assay and real time iCELLigence system (i.e., 10 nM velcade + 5 μM BAPTA-AM). All of these studies suggest that the proteasome inhibitor velcade strongly induces the expression of antiapoptotic GRP78 protein. And this suggest that if expression of GRP78 is blocked by agents such as BAPTA-AM, proteasome inhibitors may be more effective in clinical practices. We also believed that the resistance caused by increased expression of GRP78 can be prevented.