4-boyutlu baskılama ile fonksiyonel iskelet kası doku mühendisliği
Functional skeletal muscle tissue engineering with 4-dimensional printing
Yazar: EMRE ERGENE
Danışman: PROF. DR. PINAR HURİ ; PROF. DR. GÖKHAN DEMİREL
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Akıllı malzemeler = Intelligent materials ; Biyomalzemeler = Biomaterials ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Hidrojeller = Hydrogels ; N-izopropilakrilamid = N-isopropylacrylamide ; Üç boyutlu baskı = 3D printing

Özet:
İskelet kasları güçlü bir yenilenme kapasitesine sahip olsa da yüksek enerjili travmalar sonrasında büyük hacimli kas kayıpları meydana gelebilir ve bu durum kas işlevselliğinin kaybına yol açabilir. Günümüz literatüründe otolog kas transferi iskelet kası onarımı için altın standart olarak kabul edilse nakledilebilecek kas miktarı sınırlı olduğu için çeşitli alternatifler araştırılmaktadır. Bunların başında hücre transplantasyonları gelmektedir. Uydu hücreleri, kas öncül hücreleri, mezenkimal kök hücreler gibi hücrelerin doğrudan yara bölgesine nakilleri çoğunlukla başarılı olmamaktadır. Literatürde hücresel tedavilerin fiziksel bir destek sistemi olan taşıyıcı iskeleler vasıtasıyla uygulanmasının etkin sonuçlar almak için bir gereklilik olduğu görüşü hakimdir. Diğer yandan taşıyıcı iskelelerin hedeflenen dokunun geometrik şekline benzer olduğu durumlarda daha başarılı sonuçlar alınmaktadır. Doğal dokuların kendilerine has geometrileri oldukça karmaşıktır. Bu karmaşık geometrilerin üretimi için aralarında 3 boyutlu (3B) ve 4 boyutlu (4B) basım stratejilerinin de olduğu pek çok yenilikçi üretim metodu geliştirilmektedir. Bir uyaran altında "şekil hafızası" veya "kendiliğinden harekete geçme" gibi bir davranış sergileyebilen akıllı malzeme ve sistemler 4B basım stratejilerinin ana odağını oluşturmaktadır. 
Bu tez çalışması iskelet kasının kendine has iç içe geçmiş hücre tabakalarına benzer bir modeli 3B ve 4B basım stratejileri vasıtasıyla üretmeye odaklanmıştır. Çalışmanın birinci kısmında sıcaklık duyarlı bir polimer olan N-izopropilakrilamid (PNIPAm)'in uygun koşullar altında şekil değişim potansiyeli incelenmiştir. Bu amaçla aktif (sıcaklık duyarlı) ve pasif katmanlardan oluşan bir akıllı hidrojel platformu üretilmiştir. Literatürdeki geleneksel direkt ısıtma yönteminden farklı olarak ışık enerjisi yardımıyla sıcaklığın seçili bölgelerde artırılması sağlanmış ve böylelikle platformun şekil değişimi kontrol edilmiştir. Sıcaklığın 470 nm mavi ışık yardımıyla seçili bölgelerde artırılması için PNIPAm desenler ışığın daha fazla soğurulmasını sağlayacak şekilde sarı, kırmızı ve yeşil boyalarla renklendirilmiştir. Hareketin yönü, bu renklendirilmiş desenlerin platform üzerindeki konumlanışı ile doğrudan ilişkilidir. Bulgularımıza göre sarı renkli desenler üzerindeki sıcaklık diğer renkli desenlere göre daha erken ve daha fazla gerçekleşmiştir. Bu durum hem tepki süresini daha aşağıya çekmiş hem de uygun desenle bir araya getirildiğinde istenilen son şeklin verilebilmesini sağlamıştır. Düz bir platforma bu sayede tübüler bir şekil verilmesinin ardından sarı renkli desenleme kullanılarak dört kollu yeni bir model üretilmiştir. Bir kavram kanıtı uygulaması gerçekleştirmek için bu platformun kollarıyla bir hedefin yakalanması sağlanmıştır. Daha sonra platformlar üzerinde 7 günlük bir hücre kültürü deneyi yürütülmüş ancak hücre tutunmasının zayıf olduğu gözlenmiştir. 
Birinci kısım çalışmamız bir kavram-kanıtı çalışmasıdır. Çalışma sayesinde akıllı malzemelerin üretimi, kullanımı ve püf noktaları analiz edilmiş ve ikinci kısım çalışmada 4B basım konsepti ile bir biyolojik uygulama amaçlanmıştır. 
Çalışmamızın ikinci kısmında, hücrelerle olan yüksek uyumluluğu ile bilinen jelatin polimeri metakrilat reaksiyonu (GELMA) ile foto-çapraz bağlanabilir hale getirilmiş ve aljinat malzemesi ile vizkozitesi artırılarak 3B yazıcıda kullanılabilecek bir biyomürekkep elde edilmiştir. Bu biyomürekkep C2C12 fare miyoblast hücreleriyle yüklü bir şekilde, sonradan 4B şekil değişimi için kullanılacak bir substrat üzerine basılmıştır. Substrat, silikon rubber (EcoFlex) ve karbonil demir tozları kullanılarak manyetik özellikli olacak şekilde üretilmiştir. 3B basımın ardından biyomürekkep substrat üzerinde önce CaCl2, sonra 470 nm mavi ışık kullanılarak çapraz bağlanmıştır. Ardından bir permanent mıknatıs yardımıyla manyetik substratlar rulo edilmiştir. Kontrol grubu olarak, bu örneklerin rulo edilmeden açık şekildeki halleri kullanılmıştır. Örneklere Açık ve Rulo grupları olmak üzere 7 günlük hücre kültürü yapılmıştır. Yapılan gözlemde hücrelerin polimer matris içerisinde yayılamadıkları anlaşılmış ve matris yoğunluğunun azaltılması için aljinat, kültürün 24. saatinde aljinat liyaz enzimi yardımıyla sistemden çıkartılmıştır.  Bu uygulamanın ardından hem hidrojel yapısında gözeneklilik sağlanmış hem de hidrojelin elastisite modülü literatürde C2C12 hücrelerinin tutunması için uygun sertlik değeri olarak belirtilen 13-45kPa seviyesine indirilmiştir. Yapılan hücre canlılığı analizlerinde hücrelerin hayatta kaldığı ve 7 günlük deney sonuna kadar çoğalmayı başardıkları gözlenmiştir. İmmünfloresan uygulaması sonucunda ise C2C12 hücrelerinin 7.gün itibarıyla miyotüpler oluşturmaya başladığı gözlenmiştir. Rulo edilmiş örneklerde Açık gruba göre MyoD1 ifadesi ile çakışmayan daha az hücre çekirdeği gözlenmesi bu örneklerde bulunan hücrelerin daha dar bir alanda daha fazla hücre-hücre etkileşiminde bulunduğu ve bu nedenle daha fazla miyotüp oluşturma eğiliminde olduğu göstermektedir.

Abstract:
Although skeletal muscles have a strong regenerative capacity, large volumes of muscle wasting may occur after high-energy trauma, leading to loss of muscle function. Although autologous muscle transfer is accepted as the gold standard for skeletal muscle repair in today's literature, various alternatives are being investigated since the amount of muscle that can be transplanted is limited. Cell transplantation is one of them. Transplantation of satellite cells, muscle progenitor cells, and mesenchymal stem cells directly to the wound site are often unsuccessful. In the literature, the view is that application of cellular therapies through a physical support system is necessary for obtaining effective results.
This thesis focuses on producing a similar model of skeletal muscle's unique nested cell layers through 3D and 4D printing strategies. In the first part of the study, the shape change potential of N-isopropyl acrylamide (PNIPAm), a thermo-sensitive polymer, was investigated under suitable conditions. For this purpose, a smart hydrogel platform consisting of active (thermo-sensitive) and passive layers has been produced. Unlike the traditional direct heating method in the literature, the temperature was increased in selected regions with the help of light energy. Thus light illumination controlled the shape change of the platform. To increase the temperature in selected regions with the use of 470 nm blue light, PNIPAm patterns were colored with yellow, red, and green dyes to provide more light absorption. The direction of the movement is directly related to the positioning of these colored patterns on the platform. According to our findings, the temperature on the yellow-colored patterns raised earlier and more than the other colored patterns. This situation reduced the response time and provided the desired final shape when combined with the appropriate pattern. After giving a flat platform a tubular form in this way, a new four-armed model was produced using yellow patterning. A target has been captured with the arms of this platform to perform a proof-of-concept application. Afterward, a 7-day cell culture experiment was carried out on the platforms, but poor cell adhesion was observed.
Our first part study is a proof-of-concept study. Thanks to the study, smart materials' production, use, and tricks were analyzed, and a biological application was aimed at the concept of 4D printing in the second part of the study.
In the second part of the study, gelatin polymer, known for its high compatibility with cells, was made photo-cross-linkable by the methacrylate reaction (GELMA), and a bio-ink that can be used in 3D printers was obtained by increasing its viscosity with the alginate material. This bio-ink was printed with C2C12 mouse myoblast cells loaded onto a substrate that will subsequently be used for 4D shape-shifting. The substrate is produced to be magnetic using silicon rubber (EcoFlex) and carbonyl iron powders. After 3D printing, the bio-ink was crosslinked on the substrate using CaCl2 and 470 nm blue light. Then, the magnetic substrates were rolled with the help of a permanent magnet. These samples were used as unrolled (open) as the control group. Seven days of cell culture was performed on the samples as Open and Rolled groups. However, it was understood that the cells could not spread in the polymer matrix. To reduce the matrix density, alginate was removed from the system with the help of the alginate lyase enzyme at the 24th hour of culture. Alginate lyase ensured the porosity of the hydrogel structure. Moreover,  it reduced the stiffness to 13-45 kPa, specified as the appropriate stiffness value for the adhesion of C2C12 cells in the literature. In the cell viability analyses, it was observed that the cells survived and could proliferate until the end of the 7-day experiment. As a result of immunofluorescence application, it was observed that C2C12 cells started to form myotubes as of the 7th day. Fewer cell nuclei were observed in the rolled samples that did not overlap with MyoD1 expression compared to the Open group, indicating that the cells in these samples had more cell-cell interaction in a narrower area and therefore tended to form more myotubes.