Kan kültürlerinden izole edilen candida türlerinin floresan in situ hibridizasyon yöntemiyle tanımlanması ve antifungal duyarlılıklarının araştırılması
Determination of candida species isolated from blood cultures with floresan in situ hibridization method and investigation of antifungal susceptibilty
Yazar: GONCA AYDEMİR
Danışman: PROF. DR. AYŞE NEDRET KOÇ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Antifungal duyarlılık testleri = Antifungal sensitivity tests ; FISH = FISH ; Kan = Blood ; Kandida = Candida ; Nükleik asit = Nucleic acids ; Peptidler = Peptides

Özet:
Son yıllarda yoğun bakım ünitelerinde kalan, organ nakli yapılan, immunosupresif tedavi alan ve geniş spektrumlu antibiyotiklerin kullanan hastaların sayısının artması sistemik kandidoz insidansını artırmıştır. Kandidoz içinde de en sık görülen klinik gösterge  kandidemidir.
Bu çalışmada; kan kültürlerinde üreyen Candida türlerinin tanımlanmasında, Peptid nükleik asit fluoresan in situ hibridizasyon (PNA FISH), kromojenik agar yöntemlerinin değerlendirilmesi ve suşların antifungal duyarlılıklarının belirlenmesi, referans mikrodilüsyon ve Etest yöntemlerinin karşılaştırılması amaçlandı.
Temmuz 2011 -  2012 tarihleri arasında Erciyes Üniversitesi Gevher Nesibe Araştırma ve Uygulama Hastanesi kliniklerinde sistemik mantar enfeksiyonu ön tanısıyla takip edilen ve kan kültüründe maya üreyen 50 hasta çalışmaya alındı. Üreyen Candida suşlarının tanımlanması; makroskobik morfolojisi ve mikroskobik morfolojisi için lam kültürü, germ tüp testi, sikloheksimid hassasiyeti, üreaz testi, karbonhidrat asimilasyonu testi için API 20C AUX (Biomerieux) testleri göre yapıldı. Kromojenik besiyeri olarak BrillianceTM Candida Agar  (Oxoid, England) kullanıldı. PNA FISH yöntemi için Yeast Traffic Light® PNA FISH®(AdvanDx,USA) kiti  kullanıldı. Çalışmaya alınan Candida suşlarının amfoterisin B, flukonazol, kaspofungin ve vorikonazol antifungal duyarlılığı referans mikrodilüsyon yöntemi (CLSI M27-A3 ve M27-S4) ve Etest ( Biomerieux, France) kullanıldı. 
 İzole edilen 50 Candida  suşu morfolojik ve biyokimyasal yöntemlere (konvansiyonel yöntemler) göre; %38'i C.albicans, %24'ü C.glabrata, %10'u C.parapsilosis, %10'u C.kefyr, %8'i C.krusei, %4'ü  C.guilliermondi, %4'ü  C.tropicalis, %2'i C.lusitaniae olarak tanımlandı.Konvensiyonel yöntemler ile kromojenik besiyeri karşılaştırıldığında; kromojenik besiyerinin tanımlayamadığı 5 C.kefyr, iki C.guillermondi ve bir C.lusitania suşu hariç tüm suşlar (%100) uyumluydu. Konvansiyonel yöntemler ile PNA FISH karşılaştırıldığında; PNA FISH değerlendirme prospektüsünde olmayan 5 C.kefyr, iki C.guillermondi, bir C.lusitania suşunu ve testin tanımlayabildikleri arasında da bir C.tropicalis suşu haricindeki suşlar (%97.6) uyumluydu. Suşların in vitro duyarlılıkları referans mikrodilüsyon yöntemine göre; MIK50, MIK90 ve MIK aralıkları sırasıyla; amfoterisin B için 0.125, 0.25, 0.3-0.50; flukonazol için 0.50, 16, 0.125-125; vorikonazol için 0.03, 0.25,0.03-0.50 olarak bulundu Suşların in vitro duyarlılıkları Etest yöntemine göre; MIK50, MIK90 ve MIK aralıkları sırasıyla; amfoterisin B için 0.064, 0.50, 0.002-0.50; flukonazol 1, 16, 0.016-16 ; vorikonazol için 0.016, 0.25, 0.002-0.50 ve kasfofungin için 0.064, 0.25, 0.002-0.50 olarak bulundu. 
Suşların antifungallere in vitro duyarlılıkları Etest yönteminin referans mikrodilüsyon yöntemle karşılaştırıldığında; tüm antifungaller açısından temel uyumu  %72, kategorik uyumu %95 olarak belirlendi. Temel ve kategorik uyum antifungallere göre sınıflandığında sırasıyla; amfoterisin B için %77-%100; flukonazol için %68-%82 ve vorikonazol için %64-%100 idi. Antifungallere göre Etest yönteminin referans yöntemle karşılaştırıldığında; tüm kategorik hataların küçük hatada (%9,2) yoğunlaştığı görülmüştür. Büyük hatanın görüldüğü tek antifungal flukonazol ( %5,2) dü. Çalışmamızda çok büyük hata yoktu. 
Sonuç olarak; hastanemizde kan kültürlerinden en sık izole edilen tür C.albicans olarak bulunmasıyla birlikte C.glabrata ve C.parapsilosis suşlarıda sıklığı artmıştır. Kan kültürlerinden Candida türlerini tanımlamada hem kromojenik besiyeri hem de PNA FISH yöntemlerinin kolay ve güvenilir olması nedeniyle rutin laboratuarlarda kullanılabileceği belirlendi. İzole edilen suşlara karşı antifungaller (flukonazole karşı doğal dirençli olan C.krusei ve doza bağlı duyarlı olan C.glabrata haricinde) amfoterisin B, flukonazol, vorikonazol ve kaspofungine duyarlı olarak belirlendi. 
Candida türlerine karşı  antifungal duyarlılıklarının belirlenmesinde Etest yönteminin referans mikrodilusyon yöntemi  göre kategorik uyumun yüksek olması ve çok büyük hatanın olmamasından dolayı rutin laboratuarlarda güvenle kullanılabilecek kolay bir yöntem olduğu düşünülmektedir.

Abstract:
In the recent years, incidence of systemic candidiasis have been increased due to increase in numbers of patients having intensive care, immunosuppressive therapy, broad-spectrum antibiotics and patients who had organ transplantation. Within Candidiasis, the most common clinical indicator is candidemia. In this study; We aimed to compare , peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH) test, chromogenic agar methods, determination of antifungal susceptibility of strains, reference microdilution and Etest methods for the identification of the Candida species that isolated from blood cultures.
From July, 2011 to July, 2012,  at Gevher Nesibe Research and Application Hospital Clinics, 50 patients who were followed with the pre-diagnosis of systemic fungal infections and yeast isolated from blood cultures were enrolled in the study. In order to identify isolated Candida strains, macroscopic and microscopic morphology, culture slides, germ tube test, cycloheximide sensitivity, urease test, carbohydrate assimilation test and API 20C AUX (Biomerieux) tests were used. For Chromogenic broth, BrillianceTM Candida Agar (Oxoid, England) was used. For PNA FISH method, Yeast Traffic LIGHT® PNA FISH® (AdvanDx,USA) kit was used. Candida strains were evaluated for antifungal susceptibility to amphotericin B, fluconazole, caspofungin and voriconazole using   reference microdilution method (CLSI M27-A3 and M27-S4) and Etest (Biomerieux, France).
Fifty Candida strains were isolated and identified as follows according to morphological, biochemical methods (conventional methods); C. albicans (% 38) , C. glabrata (% 24), C.parapsilosis (% 10), C.kefyr (% 10), C.krusei (% 8), C.guilliermondi (% 4), C.tropicalis (% 4) and, C.lusitania (% 2). When the chromogenic media was compared with conventional methods, except for 5 C.kefyr, two C.guilliermondi and, one C.lusitania strains which were could'nt be identified by chromogenic media, all strains were consistent. When the PNA FISH  was compared with conventional methods; except for 5 C.kefyr, two C.guilliermondi and, one C.lusitania strains that were not in the PNA FISH assessment prospectus and one  C.tropicalis strain, all stains were (97.6%) consistent. In vitro susceptibility of strains were found out to be according to the reference microdilution methods; MIC50, MIC90 and MIC ranges, respectively; For amphotericin B  0.125, 0.25, 0.3-0.50; for fluconazole 0.50, 16, 0.125-125; For voriconazole 0.03, 0.25, 0.03-0.50. In vitro susceptibility of strains were found out to be according to the Etest method; MIC50, MIC 90 and MIC ranges, respectively; For amphotericin B 0.064, 0.50, 0.002-0.50; for fluconazole 1, 16, 0.016-16; for voriconazole 0.016, 0.25, 0.002-0.50 and for caspofungin 0.064, 0.25, 0.002-0.50. When the Etest and reference microdilution method results were compared according to  in vitro antifungal susceptibility of strains; compliance was determined as % 75 in terms of all antifungals and, categorical agreement  was determined as 95%. When the essential  and categorical agreement  classified according to antifungals: for amphotericin B; % 77- % 100, for fluconazole; % 68- % 82 and, for voriconazole; It was % 64- % 100. According to Antifungals, When the Etest and reference method were compared, all categorical errors  were found to concentrate on minor  error (% 9.2). Only antifungal that major error was seen was fluconazole (5.2%). In our study, there wasn't very major  error.
Conclusion; In our hospital, while the most common isolated strain was C. albicans,  frequency of C.glabrata and C. parapsilosis species were increased. For the identification of Candida species from blood cultures, both chromogenic media and PNA FISH methods, which were easy and reliable, were determined that they could be used at routine laboratories. Isolated strains were identified as sensitive to antifungals; (except those, C.krusei whish is naturally resistant to fluconazole and C.glabrata which is dose-dependently susceptible) amphotericin B, fluconazole, voriconazole and caspofungin. For the determination of antifungal susceptibility of Candida species, Etest when compared to reference microdilution method was thought to be an easy and reliable method in routine laboratory because of  higher categorical agreement  and  lack of  major  errors.