Periodontal apse örneklerinin bakteriyel içeriğinin real time PCR ile kantitatif olarak araştırılması
Quantitative investigation of the bacterial content of periodontal abscess samples by REAL time PCR
Yazar: ERCAN ERGÜN
Danışman: PROF. DR. TURGUT DEMİR
Atatürk Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Periodontoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2021
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Bakteriler = Bacteria ; DNA = DNA ; Enfeksiyonlar = Infections ; Genom = Genome ; Periodontal hastalıklar = Periodontal diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Amaç: Bu çalışmanın amacı, daha önce kültür yardımıyla periodontal apselerden
ilk kez tespit edilen bakterilerin yanı sıra, periodontal apse oluşmasının nedeni olarak
kabul edilmiş olan periodontitis etkeni bakteriler ve son dönemde periodontal hastalık
etkeni olabileceği ileri sürülen yeni bakteri türlerinin periodontal apse örneklerinde total
bakteriler arasındaki mevcudiyeti ve yoğunluğunun Real Time PCR ile kantitatif olarak
belirlenmesidir.
Materyal ve Metot: Sistemik olarak sağlıklı, son üç ay içerisinde antibiyotik ve
antienflamatuvar ilaç kullanmamış, klinik ve radyolojik muayene sonucu endodontik
problemi olmayıp periodontal apse teşhisi konulan 30 gönüllü hastadan peridontal apse
içeriği alındı. Toplanan Periodontal Apse örneklerinden genomik DNA izolasyonu için
Genomic DNA Purification sistemi kullanılarak üretici firmanın protokolüne göre
yapıldı. Periodontal apse örneklerinde araştırdığımız bakterilerin kantitatif miktarının
belirlenmesi amacıyla SYBR Green Real Time PCR (qPCR) yöntemi kullanıldı. İzole
edilen genomik DNA'nın konsantrasyonu ve saflık derecesi nanodrop cihazı kullanılarak
spektroskopik olarak belirlendi. Periodontal apse içerisindeki bakterilerin nispi ölçümü
için Real-Time PCR hassas, etkili ve güvenilebilir bir yöntemdir. Sunulan çalışmada
toplam bakteri yükü içerisindeki hedef bakteri prevalansını ölçmek için oluşturulan
standart eğri için Escherichia coli jm 109 suşu kullanıldı. İlk olarak 108 den 101 e kadar
değişen sayılarda Escherichia coli hücrelerinden izole edilecek genomik DNA'lar
kullanılarak SYBR Green Real Time PCR yöntemiyle her bir genomik DNA için CT (eşik
döngüsü) değeri hesaplanarak standart grafik oluşturuldu. Daha sonra 30 gönüllü
bireyden toplanan periodontal apse örneklerlerinden elde edilen genomik DNA
kullanılarak her bir bakteri ve total bakteri (16S rRNA) için qPCR yapıldı. Elde edilen
CT değerleri standart grafiğe yerleştirilerek total bakteri içindeki araştırılan bakterinin
sayısı belirlendi.
Bulgular: Araştırdığımız 21 bakteriden 17'sinin periodontal apse içeriğindeki
varlığı, tespit sıklığı ve miktarları belirlendi. A.actinomycetemcomitans, S.pneumoniae,
S.haemolyticus ve M.cerebrosus incelediğimiz örneklerde tespit edilemedi.
P.gingivalis'in periodontal apse içeriğinde en yüksek rölatif bakteri sayısına sahip olan
bakteri olduğu saptandı. Yeni çalışmalarda periodontal hastalıklarda etkili olan bakteriler
olan D.pneumosintes, P.endodontalis ve F.alocis yüksek prevalans ve sayılarda tespit
edildi. Diğer taraftan kültür yöntemiyle yakın zamanda ilk kez saptanmış olan bakteriler
olan S.mitis, S.gordonii, S.constellatus, A.naeslundii ve bunun yanında P.acnes'in
prevalans ve rölatif bakteri sayısı değerleri belirlendi.
Sonuç: Periodontal patojen oldukları bilinen bakterilerin, son zamanlarda yapılan
çalışmalarda periodontal hastalıklarda etkili oldukları düşünülen bakterilerin, yakın
zamanda kültür yöntemiyle periodontal apse içeriğinde ilk kez bulunduğu belirtilen ve
farklı vücut bölgelerinde apse gelişiminde etkili olduğu bilinen bakterilerin periodontal
apse içeriğindeki varlık, prevalans ve sayıları belirlendi.
Anahtar Kelimeler: periodontal apse, PCR, mikrobiyoloji, genomik DNA,
periodontopatojen bakteri

Abstract:
Objective: The aim of this study was to determine the presence and density of
periodontitis causative bacteria, which has been accepted as the cause of periodontal
abscess formation, and the presence and density of new bacterial species, which have
recently been suggested to be the cause of periodontal disease, among total bacteria in
periodontal abscess samples, as well as the bacteria detected for the first time from
periodontal abscesses with the help of culture. It is determined quantitatively by Real
Time PCR.
Material Method: Periodontal abscess contents were obtained from 30 volunteer
patients who were systemically healthy, did not use antibiotics and anti-inflammatory
drugs in the last three months, had no endodontic problems as a result of clinical and
radiological examination, and were diagnosed with periodontal abscess. Genomic DNA
isolation from collected Periodontal Abscess samples was performed according to the
manufacturer's protocol using the Genomic DNA Purification Kit system. SYBR Green
Real Time PCR (qPCR) method was used to determine the quantitative amount of
bacteria that we investigated indicated in periodontal abscess samples. The concentration
and purity of the isolated genomic DNA were determined spectroscopically using a
nanodrop device. Real-Time PCR is a sensitive, effective and reliable method for the
relative measurement of bacteria in periodontal abscess. Escherichia coli jm 109 strain
was used for the standard curve created to measure the prevalence of target bacteria in
the total bacterial load in the present study. First, a standard graph was created by
calculating the CT (cycle threshold) value for each genomic DNA using the SYBR Green
Real Time PCR method using genomic DNAs to be isolated from Escherichia coli cells
in numbers ranging from 108 to 101. Then, qPCR was performed for each bacteria and
total bacteria (16S rRNA) using genomic DNA obtained from periodontal abscess
samples collected from 30 volunteer individuals. The CT values obtained were placed on
the standard graph and the number of the investigated bacteria in the total bacteria was
determined.
Results: The presence, detection frequency and amounts of 17 of the 21 bacteria
we investigated in the periodontal abscess content were determined.
A.actinomycetemcomitans, S.pneumoniae, S.haemolyticus and M.cerebrosus could not be
detected in the samples we examined. It was determined that P.gingivalis was the bacteria
with the highest relative bacterial count in periodontal abscess content. In new studies,
D.pneumosintes, P.endodontalis and F.alocis, which are the bacteria that are effective in
periodontal diseases, were detected in high prevalence and numbers. On the other hand,
the prevalence and relative bacterial count values of S.mitis, S.gordonii, S.constellatus,
A.naeslundii as well as P.acnes, which were detected for the first time by culture method,
were determined.
Conclusion: The presence, prevalence and numbers of bacteria known to be
periodontal pathogens, bacteria that are thought to be effective in periodontal diseases in
recent studies, and bacteria that are known to be effective in the development of abscesses
in different body regions, were determined.
Key Words: periodontal abscess, PCR, microbiology, genomik DNA,
periodontopathic bacteria