Yeni sentezlenmiş katyonik stiril boyanın biyomoleküllerle etkileşiminin spektroskopik ve moleküler kenetlenme metotları ile incelenmesi
Investigation of interaction of A novel cationic STYRYl dye wi̇th biomolecules by spectroscopic and molecular docking methods
Yazar: BENSU DOYURAN
Danışman: PROF. DR. ELMAS GÖKOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Analitik Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Boya testleri = Paint tests ; Boyalar = Paints ; Enzimler = Enzymes ; Moleküler kenetleme = Molecular docking ; Pepsin = Pepsin ; Peptid hidrolazlar = Peptide hydrolases ; Stiril boya = Styryl dye ; Termodinamik = Thermodynamics ; Tripsin = Trypsin

Özet:
Tez çalışmasında (E)-2-(4-(dibütilamino)stiril)-1,3,3-trimetil-3H-indol-1-yum iyodür (Ci5) olarak verilen yeni katyonik stiril boya sentezlenmiştir ve spektral özellikleri karakterize edilmiştir. Ci5 bileşiğinin,  proteaz enzimleri olan tripsin ile pH 7.4, pepsin ile pH 2.0 tampon ortamında etkileşimleri çoklu spektroskopik (floresans, absorpsiyon, FTIR ve CD) ve moleküler kenetlenme  yöntemleri kullanılarak  incelenmiştir. Ayrıca Ci5-DNA arasındaki etkileşim ise spektroskopik yöntemle incelenmiştir ve bağlanmanın, oluk türü bağlanma olduğu sonucuna varılmıştır. Florimetrik çalışmalarda, floresans sönümden elde edilen verilerden Ci5 bileşiği ile  pepsin/tripsin etkileşiminin  statik sönüm mekanizması ile gerçekleştiği ve bu etkileşimin kompleks oluşumuna dayandığı sonucuna varılmıştır. Bağlanma türleri ve özellikleri farklı sıcaklıklarda elde edilen termodinamik parametrelere (H ve S) dayanarak açıklanmıştır. Pozitif S ve negatif H parametreleri, Ci5 ile pepsin etkileşiminde hem  elektrostatik kuvvetlerin hem de hidrofobik etkileşimlerin  rolü olduğu sonucunu göstermiştir. Negatif ΔS ve negatif ΔH değerleri, Ci5'in tripsin ile etkileşiminde van der Waals kuvvetlerinin ve hidrojen bağlarının varlığını göstermiştir. FTIR çalışmaları, pepsin/tripsinin amid bantlarında oluşan kaymalar nedeniyle, boya ile enzimler arasında etkileşimin varlığına işaret etmiştir. Ayrıca CD sonuçları, Ci5 in pepsin/tripsine bağlanmasında, enzim heliks yapısının kararlılığının azalması ile sekonder yapıda konformasyonal değişiklik meydana geldiğini göstermiştir. 

Förster teorisine göre, donör-akseptör molekül çiftleri arasındaki uzaklık (r) Ci5-pepsin çiftinde 3.53 nm, Ci5-tripsin çiftinde ise 3.27 nm olarak bulunmuştur. Boya/enzim çiftleri arasında rezonans enerji aktarımının ışımasız yolla oluştuğu sonucuna varılmıştır. Deneysel sonuçlar, moleküler kenetlenmeden elde edilen veriler ile karşılaştırılmıştır ve desteklenmiştir. Moleküler kenetlenme sonuçları, Ci5'in pepsin/tripsinin belli  amino asit uçları ile ve DNA'nın  nükleotitleri ile bağlandığını göstermiştir. Ayrıca bağlanma kuvvetleri ve bağ mesafeleri hesaplanmıştır.

Ci5'in pepsin ve tripsin varlığındaki tayini için elde edilen analitik verilere göre gözlenebilme sınırı (LOD); pepsin varlığında 1.324x10-5 M ve tripsin varlığında ise 4.238x10-6 M'dır. Tayin sınırı (LOQ) ise pepsin varlığında 4.414x10-5 M ve tripsin varlığında 1.413x10-5 M olarak bulunmuştur.

Abstract:
In this thesis, a novel cationic styryl dye given as (E)-2-(4-(dibütilamino)stiril)-1,3,3-trimetil-3H-indol-1-yum iyodür (Ci5) was synthesized and its spectral properties were characterized. The interactions of the Ci5 compound with the protease enzymes trypsin at pH 7.4 and pepsin at pH 2.0 in buffer solutions were studied by multiple spectroscopic (fluorescence, absorption, FTIR and CD) and molecular docking methods. In addition, the interaction between Ci5-DNA was analyzed in a spectroscopic methods and groove  binding was observed. In fluorimetric studies, it was concluded from the data obtained from fluorescence quenching that the interaction of pepsin/trypsin with the Ci5 compound occurs by static quenching  mechanism. It has shown that the interaction between the Ci5 compound and the enzymes is based on complex formation. The type of binding and its properties are described based on the thermodynamic parameters (H ve S) obtained at different temperatures. The positive S and negative H parameters indicated that both electrostatic forces and hydrophobic interactions also have a role in the interaction of Ci5 and pepsin. Negative ΔS and negative ΔH  values indicated  the presence of van der Waals forces and hydrogen bonds in the interaction of trypsin with Ci5. The shifts in the amide bands of pepsin/trypsin in FTIR studies indicated the presence of interaction between the dye and the enzyme. And also CD results indicated that the binding of Ci5 to pepsin/trypsin caused to secondary structure changes of enzymes, with the loss of helical stability. 

According to Forster theory, the distance (r) between donor-acceptor molecular pairs was found as 3.53 nm in the Ci5-pepsin pair and 3.27 nm in the Ci5-tripsin pair.  It was concluded that resonance energy transfer between dye/enzyme pairs occurs in a non-radiation way.The obtained experimental data were supported and validated by molecular docking results. In view of on the molecular docking data, it was concluded that the pepsin/trypsin of Ci5 binds to certain amino acid residues and to the nucleotides of DNA. In addition, binding energy and bond distances were calculated.

 The analytical data obtained for the determination of Ci5 in the presence of pepsin and trypsin, the limit of dedection (LOD) is 1.324x10-5 M in the presence of pepsin and 4.238x10-6 M in the presence of trypsin. The limit of quantification (LOQ) was calculated as  4.414x10-5 M in the presence of pepsin, 1.413x10-5 M in the presence of trypsin.