Pneumocystis jirovecii isolatlarındaki genotipik varyasyonların ve sülfonamid ilaç direncinin araştırılması
Investigation of genotypic variations and sulfonamide drug resistance in isolats of pneumocystis jirovecii
Yazar: CEREN ERGÜDEN GÜRBÜZ
Danışman: PROF. DR. SOYKAN ÖZKOÇ
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Genetik varyasyon = Genetic variation ; Genotip = Genotype ; Nekrosülfonamid = Necrosulphonamide ; Pnömoni = Pneumonia ; Pnömosistis jirovecii = Pneumocystis jirovecii ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial ; İzmir = Izmir

Özet:
İnsana özgü bir tür olan Pneumocystis jirovecii (P. jirovecii), immun sistemi zayıflamış kişilerde Pnemocystis jirovecii pnömonisi (PCP) olarak bilinen, ölümle sonuçlanabilen ciddi interstisyel pnömonilere neden olabilmektedir. Organizmanın tanısında direkt mikroskobi altın standarttır. Düşük organizma yükünün gözlendiği durumlarda PCR gibi moleküler yöntemlere de ihtiyaç duyulmaktadır. 
Çalışmamızda İzmir ili ve çevresinden elde edilen P. jirovecii isolatlarındaki mtLSU-rRNA ve DHPS gen polimorfizmi araştırıldı. Bu amaçla hastane kökenli hastaların bronkoalveolar lavaj (BAL) örnekleri ve otopsi vakalarının akciğer doku örneklerinden elde edilen toplam 157 P. jirovecii isolatı incelendi. Nested PCR sonrasında Sanger sekanslama ile mtLSU-rRNA genotiplendirmesi yapılırken, RFLP yöntemiyle DHPS polimorfizmi değerlendirildi. mtLSU-rRNA genotiplendirmesi yapılabilen 138 P. jirovecii isolatı arasında genotip 2, %58 ile en sık karşılaşılan genotip olarak bulundu. Genotip 2' den sonra en sık saptanan genotipler sırasıyla genotip 3 (13%), genotip 1 (11,6%) ve genotip 4; (5,1%) olarak bulunurken genotip 5 (0.7%) sadece bir otopsi örneğinde saptandı. Bunun yanısıra 16 (%11,6) olguda ikili veya üçlü koenfeksiyonlar mevcuttu. Yaş, cinsiyet, immun durum ve PCP/kolonizasyon farklılığı gibi özelliklerin genotip dağılımında etkili olmadığı gözlenirken; solid organ tümörlerindeki genotip 2 baskınlığı ve akciğer hastalığı olanlardaki miks enfeksiyon yüksekliği istatistiksel olarak anlamlıydı. DHPS geni, çalışmaya alınan 157 örneğin 137 (%87.3)'sinde çoğaltılabildi. RFLP sonucunda 135 örnekte herhangi bir mutasyona rastlanmazken (vahşi tip); hastane kökenli iki (%1.5) örnekte vahşi tip ve 57. kodon mutasyonun birlikte olduğu miks enfeksiyon (vahşi tip + mut 57) saptandı. 
Bu çalışmada ilaç direnci ile ilişkilendirilmiş olan DHPS gen mutasyonlarının toplumumuzda bulunabildiği gösterilirken; mtLSU-rRNA genotiplerinin dağılımı ile ilgili önemli epidemiyolojik veriler elde edilmiş oldu. Öte yandan çalışmamız real-time PCR'ın P. jirovecii laboratuvar tanısında etkili bir yöntem olduğunu ortaya koymuştur. Konvansiyonel n-PCR yönteminin çok düşük yoğunluktaki etken varlığında real-time PCR'a göre daha başarısız olduğu gösterilmiştir.

Abstract:
Pneumocystis jirovecii (P. jirovecii) is a human-specific species known as Pnemocystis jirovecii pneumonia (PCP) that can cause severe interstitial pneumonia, which can be fatal, in immunocompromised individuals. Direct microscopy is the gold standard in the diagnosis of the organism. In cases where low organism load is observed, molecular methods such as PCR are also needed.
In our study, mtLSU-rRNA and DHPS gene polymorphism in P. jirovecii isolates were investigated from Turkey's Izmir province and its surroundings. For this purpose, a total of 157 P. jirovecii isolates obtained from BAL samples of patients of hospital origin and lung tissue samples of autopsy cases were examined. After nested PCR, mtLSU-rRNA genotyping was performed by Sanger sequencing and DHPS polymorphism was evaluated by RFLP method. Among the 138 P. jirovecii isolates that can be genotyped, mtLSU-rRNA genotype was found as the most common genotype with 2, 58%. The most common genotypes found after genotype 2 were genotype 3 (13%), genotype 1 (11.6%) and genotype 4 (5.1%), while genotype 5 (0.7%) was detected in only one autopsy sample. In addition, 16 (11.6%) cases had double or triple coinfections. It was observed that features such as age, gender, immune status and PCP/colonization difference did not affect genotype distribution. But, genotype 2 dominance in solid organ tumors and mixed infection height in patients with lung disease were statistically significant. DHPS gene was reproduced in 137 (87.3%) of 157 samples included in the study. As a result of fragment lenght polymorphism (RFLP), no mutation was found in 135 samples (wild type). In two hospital-based samples (1.5%), mixed infection (wild type + mut 57) with wild type and 57th codon mutations were detected. 
In this study, it was shown time that DHPS gene mutations associated with drug resistance can be found in our society. In addition, important epidemiological data on the distribution of mtLSU-rRNA genotypes were obtained. On the other hand, our study demonstrated that real-time PCR is the effective method in the diagnosis of P. jirovecii laboratory. Conventional n-PCR method was found to be is less successful than real-time PCR in the presence of very low density organism.