STZ-diyabetik farelere uygulanan kombine antioksidanın pankreas üzerine immunohistokimyasal ve biyokimyasal etkileri
Immunohistochemical and biochemical effects on pancrease of combined treatment with antioxidant in STZ-diabetic mice
Yazar: AYŞE KARATUĞ
Danışman: PROF. DR. ŞEHNAZ BOLKENT
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Fizyoloji = Physiology
Dizin: Antioksidan enzimler = Antioxidant enzymes ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Fareler = Mice ; Selenyum = Selenium ; Vitamin E = Vitamin E

Özet:
Hayvanlarda diyabet oluşturmak için kullanılan streptozotosin (STZ) ile insülin seviyelerinin azalması ve hiperglisemi belirtileri ile birlikte pankreatik beta hücrelerinin yıkımı gerçekleşir. Diyabette antioksidan savunma sistemindeki azalma ve oksidatif hasardaki artmadan dolayı serbest radikallerin üretilmesi ve ortamdan uzaklaştırılması arasındaki dengenin bozulması hücre ve dokuların zarar görmesine neden olmaktadır. Antioksidan terapi diyabette oluşan oksidatif hasarı gidermek için oldukça önemlidir. Alfa-lipoik asit (ALA), vitamin E (Vit.E) ve selenyum (Se) oksidatif bir hasarda etkili biyolojik antioksidanlardır ve membran lipit peroksidasyonunu azaltmada oldukça etkinlerdir. Bu çalışmada STZ verilerek diyabet oluşturulan bireylerin pankreas dokularında oluşan oksidatif hasarın hem mikroskopik olarak hem de biyokimyasal (mitokondriyal fraksiyonda) olarak incelenmesi ve ALA+Vit.E+Se'un birlikte verilmesi ile oksidatif hasar ve antioksidan sistem üzerindeki olası etkilerinin ortaya konması amaçlanmıştır.Çalışmada 2-2,5 aylık Balb/c erkek fareler rastgele seçilerek 5 gruba ayrılmıştır. Grup I: 5 ardışık gün sitrat tamponu (ST)'nun intraperitonal (i.p.) enjeksiyon ile verildiği kontrol grubu; Grup II: 5 ardışık gün ALA (50 mg/kg)+Vit.E (100 mg/kg)+ Se (0.25 mg/kg)'un gavaj yolu ile verildiği kontrol grubu; Grup III: 5 gün antioksidanların çözücülerinin gavaj yolu ile verildiği kontrol grubu; Grup IV: 5 ardışık gün STZ'nin (40 mg/kg) verildiği deney grubu; Grup V: 5 ardışık gün aynı dozlarda ALA+Vit.E+Se'un verilmesinden sonra, 5 ardışık gün aynı doz STZ'nin verildiği deney grubu. Grup I'in bireyleri ilk ST verilmesini takiben, grup II'nin bireyleri son antioksidan verilmesinden sonra, grup III'ün bireyleri son antioksidan çözücünün verilmesinden sonra, grup IV'ün bireyleri ilk STZ verilmesini ve grup V'in bireyleri antioksidan verildikten sonra ilk STZ verilmesini takiben 30 gün yaşatılmıştır. Formalin ile fikse edilmiş kesitlere immunohistokimyasal teknik olarak insülin immunohistokimyası uygulanmıştır. Ayrıca pankreas dokusunun mitokondriyal fraksiyonunda glutatyon (GSH) ve lipit peroksidasyon (LPO) seviyeleri, manganez süperoksit dizmutaz (MnSOD), katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) enzimlerinin aktiviteleri spektrofotometrik olarak tayin edilmiştir.STZ verilen diyabetik bireylerde % insülin pozitif hücre alanında azalmanın, kan glukoz değerlerinde artmanın, MnSOD aktivitelerinde azalmanın ve lipit peroksidasyon seviyelerinde artmanın istatistiksel olarak anlamlı olduğu, üçlü antioksidan uygulaması sonrasında STZ verilen deney grubunda ise % insülin pozitif hücre alanında artmanın, kan glukoz değerlerinde azalmanın, MnSOD aktivitelerinde artmanın anlamlı ve lipit peroksidasyon seviyelerinde anlamlı olmayan azalmanın olduğu dikkati çekmiştir. Oysa GSH değerlerinde ve CAT aktivitelerinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç elde edilemezken, GSH-Px aktivitesine de rastlanılmamıştır. Bu çalışmadan elde edilen immunohistokimyasal bulgulara göre, üçlü antioksidan uygulamasının diyabetik farelerin pankreası üzerinde koruyucu etkisinin olduğu mikroskopik olarak gösterilmiştir. Ayrıca, farelerin pankreasının mitokondriyal fraksiyonunda yapılan biyokimyasal çalışmalara göre diyabetik bireylerde gözlenen oksidatif hasarın üçlü antioksidan uygulamasından sonra azaldığı sonucuna varılmıştır.

Abstract:
With streptozotocin (STZ), used to induce diabetes in animals, insulin levels are reduced and pancreatic beta cells are destroyed along with hyperglycemic symtoms. In diabetes, cells and tissues are damaged due to the imbalance between production of free radicals and removal of them from the medium, because of the decrease in antioxidative defence system and increase in oxidative damage. Antioxidative treatment is very important to remove the oxidative damage occurring in diabetes. The effective biologic antioxidants for oxidative damage are alpha-lipoic acid (ALA), vitamin E (Vit.E) and selenium (Se) and they are also quite effective in diminishing membrane lipit peroxidation. In this study, by using microscopic and biochemical (in the mitochondrial fraction) methods, it was aimed to investigate the oxidative damage occurring in the pancreatic tissues of the individuals rendered diabetic with STZ administration, along with suggesting the possible effects of ALA+Vit.E+Se combination on oxidative damage and antioxidant system.In the study, 2-2.5 month-old Balb/c male mice were selected randomly and divided into 5 groups. Group I: the control group which received intraperitoneal (i.p.) injection of citrate buffer for 5 consecutive days; Group II: the control group which were given ALA (50 mg/kg)+Vit.E (100 mg/kg)+Se (0.25 mg/kg) for 5 consecutive days by gavage technique; Group III: the control group which were given the solvents of the antioxidants for 5 consecutive days by gavage technique; Group IV: the experimental group receiving STZ (40 mg/kg) for 5 consecutive days; Group V: the experimental group given ALA+Vit.E+Se for 5 consecutive days at same doses, followed by the administration of STZ at same doses for 5 consecutive days. Individuals of the groups were rendered alive for 30 days, starting from administration of the following: Group I, first citrate buffer, Group II, last antioxidant, Group III, solvent of the last antioxidant, Group IV, first STZ dose, Group V, first STZ dose after receiving antioxidants. Insulin immunohistochemistry was applied as the immunohistochemical technique to the cross sections fixed with formalin. In addition, spectrophotometric methods were used in the determinations of glutathione (GSH) and lipit peroxidation (LPO) levels and the activities of the enzymes, namely, manganese superoxide dismutase (MnSOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) for mitochondrial fraction of pancreatic tissue.For diabetic individuals received STZ, decrease of percent insulin positive cell area, increase of blood glucose levels, decrease of MnSOD activities and increase of lipit peroxidation levels were found to be statistically significant, while a significant increase of percent insulin positive cell area, decrease of blood glucose levels, increase of MnSOD activities and an unsignificant decrease of lipit peroxidation levels were also found to be in the experimental group received STZ after triple antioxidant therapy. A statistically significant result for GSH levels and CAT activities was not present within the groups, where GSH-Px activity was not found at all. According to the immunohistochemical findings obtained from this study, it was shown in a microscopic method that triple antioxidative treatment has a protective effect on the pancreas of diabetic mice. In addition, biochemical data obtained from mitochondrial fraction of the pancreas in mice suggested that the oxidative damage observed in diabetic individuals shows a decrease after triple antioxidative administration.