Astrosit hücrelerinde indüklenen senesens üzerine metforminin etkisi
Effect of metformin on senescence in astrocyte cells
Yazar: ELİF İMRAL DEMİR
Danışman: DOÇ. DR. GÜLAY SEZER
Erciyes Üniversitesi / Gevher Nesibe Genom ve Kök Hücre Enstitüsü  / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Astrositler = Astrocytes ; Galaktoz = Galactose ; Hidrojen peroksit = Hydrogen peroxide ; Hücre kültür teknikleri = Cell culture techniques ; Metformin = Metformin ; Senesens = Senescence

Özet:
Birçok nörodejeneratif hastalıkta beyindeki astrosit hücrelerinin senesense uğramış oldukları bildirilmiştir. Bu çalışmada iki farklı ajan ile senesensi indüklediğimiz astrosit hücrelerinde, yaygın olarak kullanılan bir antidiyabetik ilaç olan metforminin etkisini in vitro koşullarda araştırmayı amaçladık.
Bu amaçla primer kültürden çoğalttığımız astrosit hücrelerine hidrojen peroksit (H2O2) ve D-galaktoz (D-gal) uygulamaları ile senesens indüklenerek β-galaktozidazı görüntelemek için X-gal, lipofussinler için Sudan Black B ile boyama yapıldı. Metforminin beyin ve plazmadaki konsantrasyonları (0.75, 7.5, 75 µM) varlığında senesens ile ilgili belirteçler incelendi. Astrosit hücrelerinde p53, p21 ve p16 mRNA ifadeleri qRT-PCR yöntemi ile, reaktif oksijen türlerinin (ROS) düzeyindeki değişim DCFH-DA yöntemi ile ve DNA çift sarmal kırığı tayini histon H2A.X immünofloresan boyaması yapılarak analiz edildi. 
Senesens oluşumu hücrelerdeki morfolojik değişim ve histokimyasal boyamalar ile anlaşılmıştır. H2O2 uygulanan grupta p53 ve p21 mRNA ifadeleri kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde artarken metformin uygulanması ile anlamlı şekilde azalmıştır. D-gal uygulanan grupta meydana gelen p21 ve p16 mRNA ifadelerindeki anlamlı artış üzerine metforminin etkisi olmamıştır. H2O2 uygulaması ROS düzeylerinde anlamlı bir artışa neden olurken, metformin varlığında belirgin şekilde azalmıştır. D-gal uygulaması ile ROS düzeyinde kontrol grubuna göre anlamlı bir artış meydana gelmemiştir. H2O2 uygulaması ile DNA çift sarmal kırıklarında kontrol grubuna kıyasla artış istatistiksel olarak anlamlı değildir. D-gal uygulaması ile DNA çift sarmal kırıklarında anlamlı artış meydana gelmiş ancak metformin odak sayısını azaltmada etkili olamamıştır.
Astrosit hücrelerinde H2O2 ile indüklenen senesenste metformin ROS düzeylerini düşürerek senesens gelişimini engellemiş ancak D-gal üzerinde etkili olmamıştır. Metforminin nörodejeneratif hastalıklardaki olası faydalı etkisinde astrosit hücrelerinde senesens gelişimini engelleyici rölünün in vivo çalışmalar ile desteklenerek araştırılmasında fayda vardır. 

Anahtar Kelimeler:  Astrosit; D-galaktoz; Hidrojen peroksit; Hücre kültürü; Metformin; Senesens

Abstract:
It has been reported that brain cells undergo senescence in many neurodegenerative diseases. In this study, we aimed to induce senescence with two different agents in astrocyte cells and to investigate how senescence is affected in the presence of metformin. 
For this purpose, hydrogen peroxide (H2O2) and D-galactose (D-gal) were used to induce senescence in astrocytes and metformin pretreatment was performed to investigate its effect. X-gal was used to stain β-galactosidase and Sudan Black B staining to detect lipofuscins in senescent cells. We analyzed the changes in the p53, p21 and p16 mRNA levels of astrocytes by qRT-PCR and the change in reactive oxygen species (ROS) were by DCFH-DA method.  DNA double-strand break determination was analyzed by counting foci per cell by performing histone H2A.X immunofluorescence staining.
Senescence formation was determined by morphological changes in cells and histochemical stainings. While p53 and p21 mRNA expressions increased statistically in the H2O2 administered group compared to the control group, decreased significantly with metformin administration. Metformin had no significant effect on the D-gal increased p21 and p16 mRNA expressions. While H2O2 administration caused a significant increase in ROS levels, decreased significantly in the presence of metformin. There was no significant increase in ROS level with D-gal administration. There was an increase in DNA double strand breaks (H2A.X foci) with H2O2 compared to the control group, but was not significant. Metfromin induced decrease in H2A.X foci number was not statistically significant compared to the H2O2 group. There was a significant increase in the H2A.X foci number with D-gal however no significant decrease with metformin pretreatments.
As a result, metformin prevented senescence development by decreasing ROS levels in H2O2-induced senescence in astrocyte cells, but had no effect on D-gal's. The possible beneficial effects of metformin in neurodegenerative diseases and its role in senesscence of astrocytes need to be investigated by supporting in vivo studies.

Keywords: Astrocyte; Cell culture; D-galactose; Hydrogen peroxide; Metformin; Senescence