Ratlarda oluşturulan deneysel periodontitis üzerine probiyotik (Lactobacillus reuteri) uygulamasının etkisi
Effect of probiotic (Lactobacillus reuteri) application on experimental periodontitis in rats
Yazar: MEHMET SERDAR KESKİN
Danışman: PROF. DR. İSMAİL MARAKOĞLU
Selçuk Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Periodontoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2022
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Lactobacillus reuteri = Lactobacillus reuteri ; Periodontal hastalıklar = Periodontal diseases ; Periodontitis = Periodontitis ; Probiyotikler = Probiotics ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Probiyotikler insan vücudunda ve özellikle gastrointestinal sistemde sağlığa yararlı etkileri bilimsel olarak kanıtlanmış canlı mikroorganizmalardır. Fakat periodontal sağlık ve hastalıktaki rolleri hakkında yeterince bilgi ve araştırma bulunmamaktadır. Bu çalışmanın amacı sistemik olarak uygulanan probiyotik L. reuteri'nin (BioGaia®, Eczacıbaşı) ratlarda oluşturulan deneysel periodontitis modelleri üzerine etkisini araştırmaktır. Bu amaç kapsamında çalışmada probiyotiklerin periodontal hastalığın oluşumunu önleme (protektif) veya periodontal hastalığı tedavi edici (teröpatik) etkisi olup olmadığının histolojik incelemesi, IL-1 beta, IL-10, TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) değerlendirilmesi yapıldı.
Çalışmanın hayvan deneyi kısmı, Selçuk Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma ve Uygulama Merkezinde 48 adet erkek Wistar Albino cinsi rat kullanılarak yapıldı. Hayvanlar her grupta 8 hayvan olacak şekilde 6 gruba ayrıldı. Gruplar protektif etki için değerlendirilen; 40 gün probiyotik 30. gün periodontitis (Grup 1), 40 gün probiyotik (Grup 2), 30. gün periodontitis (Grup 3) ve teröpatik etki için değerlendirilen; kontrol (Grup 4), 10 gün periodontitis 30 gün probiyotik (Grup 5), 10 gün periodontitis (Grup 6) şeklinde ayarlandı. Deneysel periodontitis Grup 1, Grup 3, Grup 5 ve Grup 6 daki ratların üst çene 2. molar dişlerinin etrafına 3-0 ipek sütur bağlanıp, 10 gün beklenmesiyle oluşturuldu.  Grup 1, Grup 2 ve Grup 5 için probiyotik uygulaması, gruplar için belirlenen süreler dahilinde her gün L. reuteri içeren Biogaia® (1x10⁸ CFU/5 damla, Süspansiyon, Eczacıbaşı İlaç Pazarlama A.Ş) enteral besleme (gavaj) yoluyla yapıldı. Deney süresinin bittiği 40. gün tüm hayvanlar sakrifiye edilerek histolojik inceleme için üst çeneleri paraformaldehit solüsyonu içerisine alındı. Histolojik incelemeler ve ölçümler Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalında yapıldı. Histolojik incelemelerde kemik kaybı, IL-1 beta, IL-10 ve TRAP ölçümleri Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) programı kullanılarak hesaplandı. 
IL-1β seviyeleri incelendiği zaman protektif etkiyi değerlendirdiğimiz Grup 3 deki IL-1β seviyesi Grup 1 deki IL-1β seviyesine göre anlamlı olarak yüksek bulundu. IL-10 seviyeleri incelendiği zaman protektif etkiyi değerlendirdiğimiz Grup 2 ve Grup 3 deki IL-10 seviyesi Grup 1 deki IL-10 seviyesine göre anlamlı olarak düşük bulundu. Terapötik etkiyi değerlendirdiğimiz ikinci deney düzeninde gruplar arasında IL-1β ve IL-10  açısından fark anlamlı bulunmadı. TRAP değerleri incelendiği zaman protektif etkiyi değerlendirdiğimiz Grup 1 ve Grup 2'deki TRAP değerlerinin Grup 3'e kıyasla anlamlı şekilde daha düşüktür, bununla birlikte Grup 1 ve Grup 2 arasında anlamlı bir farklılık bulunmadı. Terapötik etkiyi değerlendirdiğimiz ikinci deney düzeninde de TRAP değerleri incelendiğinde Grup 6'daki TRAP değerlerinin Grup 4 ve Grup 5'e kıyasla anlamlı şekilde yüksek olduğu saptandı. Kemik kayıp miktarı incelendiğinde ilk deney düzeninde mezial ölçümlerin Grup 1 ve Grup 3'deki değerlerin Grup 2'ye kıyasla anlamlı şekilde daha yüksek, bununla birlikte Grup 1 ve Grup 3 arasında anlamlı bir farklılık bulunmadı. Diğer taraftan, ikinci deney düzeninde de mezial ölçümlerin Grup 6'daki değerlerinin Grup 4 ve Grup 5'e kıyasla, ayrıca Grup 5'deki mezial ölçümlerinin de Grup 4'e kıyasla anlamlı şekilde yüksek olduğu saptandı. Distal ölçümlerin Grup 1 ve Grup 3'deki değerleri Grup 2'ye kıyasla anlamlı şekilde daha yüksektir, bununla birlikte Grup 1 ve Grup 3 arasında anlamlı bir farklılık bulunmadı. Diğer taraftan, ikinci deney düzeninde de distal ölçümlerin Grup 6'daki değerleri Grup 4 ve Grup 5'e kıyasla anlamlı şekilde yüksek bulundu, fakat Grup 4 ve grup 5'deki distal ölçüm değerleri arasında anlamlı bir farklılık bulunmadı.
	Protektif etkiyi değerlendirdiğimiz ilk deney düzeninde probiyotik L. reuteri'nin 30 gün boyunca kullanımı; IL-1β seviyelerine göre periodontal hastalık şiddetini azaltmakta, IL-10 seviyelerine göre periodontal hastalığın gelişimini yavaşlatmakta ve TRAP seviyelerine göre periodontal hastalığın kemik yıkımı üzerine olan etkisini azaltmaktadır. Terapötik etki için baktığımız ikinci deney düzenine göre periodontitis oluştuktan sonra 30 gün boyunca uygulanan L. reuteri; TRAP seviyelerine göre periodontal hastalığın kemik yıkımı üzerine olan etkisini azaltmakta ve iyileşmeye katkı sağlamakta, mezial ve distal kemik seviyesi ölçümlerine göre de yıkım üzerine olan azalmış etki kanıtlanmaktadır. Probiyotiklerin uzun süre kullanımının doku iyileşmesine katkısı olduğu ve periodontal hastalık oluşumunu yavaşlattığı, etken ortadan kaldırıldıktan sonra ya da FAZ 1 tedavi yapıldıktan sonra destekleyici yan etkisi olmayan ürün olarak kullanılabileceği hayvan çalışması olarak gösterildi. Bildiğimiz kadarıyla çalışmamız ratlarda oluşturulan deneysel periodontitis modelinde L. reuteri'nin sistemik olarak uygulandığı ilk çalışma olduğundan dolayı; tüm periodontal dokuları ve serum örneklerini içeren, daha geniş parametrelerin ve daha geniş doz rejimlerinin incelendiği ek çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Abstract:
Probiotics are living microorganisms that have scientifically proven beneficial effects on the human body and especially in the gastrointestinal tract. However, there is not enough information and research about their role in periodontal health and disease. The aim of this study is to investigate the effect of systemically administered probiotic L. reuteri (BioGaia®, Eczacıbaşı) on experimental periodontitis models in rats. Within the scope of this purpose, histological examination of whether probiotics have a preventive (protective) or curative (therapeutic) effect on periodontal disease, evaluation of IL-1 beta, IL-10, TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) were carried out in the study.
The animal experiment part of the study was carried out using 48 male Wistar Albino rats at Selcuk University Experimental Medicine Research and Application Center. The animals were divided into 6 groups with 8 animals in each group. The groups were set to evaluated for protective effect; 40 days of probiotics, 30th day periodontitis (Group 1), 40 days of probiotics (Group 2), 30th day periodontitis (Group 3) and evaluated for therapeutic effect; control (Group 4), periodontitis for 10 days, probiotics for 30 days (Group 5), and periodontitis for 10 days (Group 6). Experimental periodontitis was created by tying 3-0 silk sutures around the maxillary second molar teeth of the rats in Group 1, Group 3, Group 5 and Group 6 and waiting for 10 days. For Group 1, Group 2 and Group 5, probiotic application was made by enteral feeding (gavage) with Biogaia® containing L. reuteri (1x10⁸ CFU/5 drops, Suspension, Eczacıbaşı İlaç Pazarlama A.Ş) every day within the periods determined for the groups. All animals were sacrificed on the 40th day, when the experiment period ended, and their upper jaws were taken into paraformaldehyde solution for histological examination. The histological examinations and measurements were made in the Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Selcuk University. Bone loss in histological examinations, IL-1 beta, IL-10 and TRAP measurements were calculated using Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) program.
When IL-1β levels were examined, the IL-1β level in Group 3, for which we evaluated the protective effect, was found to be significantly higher than the IL-1β level in Group 1. When IL-10 levels were examined, the IL-10 level in Group 2 and Group 3, for which we evaluated the protective effect, was found to be significantly lower than the IL-10 level in Group 1. In the second experimental setup, in which we evaluated the therapeutic effect, no significant difference was found between the groups in terms of IL-1β and IL-10. When TRAP values were examined, the TRAP values in Group 1 and Group 2, in which we evaluated the protective effect, were significantly lower than Group 3, however, no significant difference was found between Group 1 and Group 2. When TRAP values were examined also in the second experimental setup in which we evaluated the therapeutic effect, it was found that the TRAP values in Group 6 were significantly higher than those in Group 4 and Group 5. When the amount of bone loss was examined, it was observed that the mesial measurements in Group 1 and Group 3 were significantly higher than in Group 2 in the first experimental setup, but in the meantime, no significant difference was found between Group 1 and Group 3. On the other hand, in the second experimental setup too, the mesial measurements in Group 6 were found to be significantly higher compared to Group 4 and Group 5, and the mesial measurements in Group 5 were found to be significantly higher compared to Group 4. The values of distal measurements in Group 1 and Group 3 were significantly higher than in Group 2, but nonetheless, no significant difference was found between Group 1 and Group 3. On the other side, in the second experimental setup too, the values of the distal measurements in Group 6 were found to be significantly higher compared to Group 4 and Group 5, but there was no significant difference between the distal measurement values in Group 4 and Group 5.
In the first experimental setup, in which we evaluated the protective effect, the use of probiotic L. reuteri for 30 days reduces the severity of periodontal disease according to IL-1β levels, slows the development of periodontal disease according to IL-10 levels, and decrease the effect of periodontal disease on bone destruction according to TRAP levels. According to the second experimental setup we examined for the therapeutic effect, L. reuteri applied for 30 days after periodontitis occurs reduces the effect of periodontal disease on bone resorption and contributes to healing, according to the levels of TRAP. The reduced effect on destruction is proven with the mesial and distal bone level measurements. It has been shown in animal studies that long-term use of probiotics contributes to tissue healing and slows down the formation of periodontal disease, and can be used as a supportive product without side effects after the agent is eliminated or after PHASE 1 treatment. As far as we know, our study is the first study in which L. reuteri was applied systemically in the experimental periodontitis model created in rats; additional studies are needed, including all periodontal tissues and serum samples, examining wider parameters and broader dose regimens.