Timokinon (TQ)'un insan hücre hattı modelinde insülin sinyal yolaklarına etkilerinin moleküler düzeyde araştırılması
Investigation of the effects of thymoquinone (TQ) on insulin signaling pathways at the molecular level using a human cell line model
Yazar: SEDAT SEZEN
Danışman: PROF. DR. HALİT CANATAN ; DOÇ. DR. ÇAĞRI ŞAKALAR
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Glükoz = Glucose ; Hücre dizisi = Cell line ; Timokinon = Thymoquinone ; İnsülin = Insulin ; İnsülin direnci = Insulin resistance

Özet:
İnsülin direnci, insülin reseptörünün yapısı ve/veya fonksiyonları veya glukoz transportlarında meydana gelen bozukluklar neticesinde meydana gelmektedir. Timokinon (TQ), Nigella sativa'nın biyoaktif komponentidir. Deneysel çalışmalarda streptozosin (STZ) ile indüklenerek oluşturulan diyabetik hayvan modelleri üzerinde yapılan araştırmalarda, TQ' un hipoglisemik ve antidiyabetik etkiye sahip olduğu bildirilmiştir. 
Bu çalışmada ilk etapta hücre kültürü ortamında insülin direnç modeli oluşturulması amaçlanmıştır. Oluşturulan insülin direnç modelinde TQ' un hücre içerisine glukoz alımındaki etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Son olarak, oluşan insülin direnç modeli üzerinde TQ' un insülin sinyal yolağında gen düzeyinde meydana getirdiği değişikliklerin araştırılması amaçlanmıştır.
Çalışma kapsamda, in vitro ortamda HepG2 hücreleri kullanılarak yüksek doz insülin (1700 nm) verilmesiyle insülin direnç modeli oluşturuldu. TQ' un farklı konsantrasyonlarda (6.25, 12.5, 25, 50 µM) uygulanarak insülin direncine olan etkisi incelendi. TQ' un HepG2 hücrelerinde indüklediği sitotoksisite ve apoptoz incelendi. Sitotoksisite deneyinde,  TQ' un HepG2 hücrelerinde IC50 değeri 23.75 µM olarak belirlendi. Apoptoz deneyinde, kontrol, 6.25, 12.5, 25 ve 50 µM dozlarını kapsayan TQ uygulandığında, apoptoz yüzdelerinin sırasıyla % 1,6 ± 0,16, % 6,8 ± 0,22, % 9,9 ± 1,07,  % 19,4 ± 1,16, % 26,6 ± 1,17 olduğu belirlendi (p<0,05). 
Glukoz alım deneyinde, hücrelerin glukoz alım oranları yüzde olarak,  insülin direnç modeli oluşturulan kontrol grubunda  % 1,56 ± 0,6 iken, farklı TQ dozlarında glukoz alımı şu şekilde belirlendi: TQ-6.25 µM, % 4,31 ± 0,58, TQ-12.5 µM % 6,29 ± 0,89, TQ-25 % 18,87 ± 2,45, TQ-50 µM % 43,04 ± 4,69 (p<0.05). İnsülin direnci oluşturulmayan HepG2 hücrelerinde ise glukoz alımı % 44,06 ±1.89 olarak bulundu. Bu veriler insülin direnci sonucu azalan glukoz alımının TQ tarafından düzeltildiğini açıkca ortaya koymaktadır. 
Gen ifadesi düzeyinde yapılan çalışmada insülin direnci oluşturulmuş hücrelerde farklı TQ dozlarında insülin direnci ile ilişkili 84 genin ekspresyon seviyeleri incelendi. TQ'un 12.5, 25 ve 50 µM konsantrasyonlarında, sitokin-sitokin reseptör etkileşimi ile ilişkili gen ifadelerinin (IL6, TNF-α, IL1R1, IL18R1), insülin sinyal yolağı ile ilişkili gen ifadelerinin (INSR, IRS2, AKT3, PDK2, MAPK) ve sitokin bağlama ile ilişkili gen ifadelerinin (CCR4, CCR5, CXCR3, CXCR4) etkilendiği tespit edildi (p<0,05).  
Sonuç olarak, insülin direnç modeli oluşturulan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 üzerinde TQ' un insülin direnç mekanizmasını zayıflattığını gözlemledik. Buna ilaveten,    TQ' un insülin sinyal yolağı ile ilişkili kritik genlerin ekspresyon seviyelerine etki göstererek glukoz alımına katkı sağladığını düşünmekteyiz. TQ' un gösterdiği bu önemli etkinin in vivo çalışmalarla daha ayrıntılı çalışılarak terapötik bir ajan olarak kullanılma potansiyelinin araştırılması gerektiği öngörmekteyiz.
Anahtar Kelimeler: Timokinon, Glukoz Alımı, HepG2 Hücre Hattı, İnsülin Direnci, İnsülin Sinyal Yolakları,

Abstract:
Insulin resistance develops as a result of irregularities in glucose transports and insulin receptor structure and/or functions. Thymoquinone (TQ) is the active ingredient of Nigella sativa. It has been well documented in experimental studies in which the diabetes is induced by streptozotocin (STZ) in diabetic animals that TQ has hypoglysemic and anti-diabetic effects.
In the present study, insulin resistance model in cell culture has been aimed to be developed in the first phase. It was aimed to study the effect of TQ on intra-cellular uptake of glucose in established insulin resistance model. In the last phase, the aim was to evaluate the effect of TQ on the expression levels genes involved in the insulin signaling pathway in established insulin resistance model.  
Insulin resistance model was established by using high dose insulin (1700 nm) in HepG2 cells in in vitro conditions. Effects of the application of different concentrations of TQ (6.25, 12.5, 25, 50 µM) on insulin resistance were evaluated. Cytotoxicity and apoptosis induced by TQ on HepG2 cells were investigated. IC50 value of TQ on HepG2 cells was detemined to be 23.75 µM in cytotoxicity experiment. In apoptosis experiment, apoptosis levels were determined to be 1,6 ± 0,16 %, 6,8 ± 0,22 %, 9,9 ± 1,07 %, 19,4 ± 1,16 %, 26,6 ± 1,17 %, respectively in control , 6.25, 12.5, 25 and 50 µM TQ doses (p<0.05). 
In glucose uptake experiment, the percentage of glucose uptake of cells was determined to be 1,56 ± 0,6 % in insulin resistance model (control) while different concentrations of TQ value (TQ-6.25 µM, 4,31 ± 0,58 %,  TQ-12.5 µM 6,29 ± 0,89 %, TQ-25  18,87 ± 2,45 %, TQ-50 µM  43,04 ± 4,69 % (p<0.05). Glucose uptake on HepG2 cells without insulin resistance development was detemined to be  44,06 ±1.89 %. These data clearly demostrate that reduced glucose uptake due to insulin resistance is restored by TQ.
In gene expression level study, the effect of different doses of TQ on 84 genes related with insulin resistance were investigated in cells with established insulin resistance with the doses at 12.5, 25, 50 µM of TQ. The expression of genes related with cytokine cytokine interactions (IL6, TNF-α, IL1R1, IL18R1), insulin signaling pathway (INSR, IRS2, AKT3, PDK2, MAPK), cytokine binding (CCR4, CCR5, CXCR3, CXCR4) was determined to be affected (p<0,05).  
In conclusion, we observed that TQ weakens insulin resistance in hepatocellular carcinoma cell line HepG2 with established insulin resistance model. In addition, we believe that TQ contributes to glucose uptake by affecting the expression levels of critical genes in insulin signaling pathway. We propose that this important effect of TQ needs to be further investigated in in vivo studies to explore TQ' s potential as a therapeutic agent.
Key Words: Thymoquinone, Glucose Uptake, HepG2 Cell Line, Insulin Resistance, İnsülin Signaling Pathways,