Scorpıo fuscus venomunun karakterizasyonu ve insan kolon kanseri üzerine moleküler düzeyde etkilerinin incelenmesi
Characterization of scorpio fuscus venom and investigation of its effects on human colon cancer at the molecular level
Yazar: HALİME ŞEYMA AKALIN
Danışman: PROF. DR. SERDAR KARAKURT
Selçuk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Dünyada genellikle kolorektal adenokarsinom olarak bilinen kolorektal kanser (KRK), en yaygın malign neoplazmalardan ve kanser araştırmalarında en çok çalışılan kanser türlerinden biridir. Kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olan KRK için, geleneksel kemoterapi, radyoterapi, immünoterapi ve gen terapisi dahil olmak üzere çeşitli tedaviler kullanılmaktadır. Bugüne kadar yaygın olarak kullanılan geleneksel kemoterapi, yaygın anti-kanser ilaçlarına dirençli ve irinotekan, oksaliplatin, lökovorin, 5-florourasil gibi bilinen bazı ilaçların kullanılmasından da oluşarak ana tedavi seçeneği olmaya devam etmiştir. Ancak ciddi yan etkileri ve yetersizliği nedeniyle de sınırlı klinik uygulamalara sahip olması, tatmin edici başarılar sergilemeyerek alternatif veya tamamlayıcı olan yeni stratejiler üzerinde durulmaktadır. Bundan dolayı araştırmacılar birçok hastalığın tedavisinde kullanabilme potansiyelleri olan akrep zehri gibi doğal kaynaklara odaklandılar. Son birkaç yılda akrep zehirleri müthiş bir dizi biyolojik özellik sundukları için çeşitli malignite türlerini tedavi etmek için umut verici terapötik ajan olarak büyük ilgi görmüştür.
Ülkemizde yayılım gösteren ve sitotoksik özellikte zehire sahip olan Scorpio fuscus türü akrepler, Adana ve Mersin illerinden toplanarak zehirleri elektrostimülasyon tekniği ile elde edilmiştir. Elde edilen zehirlerden peptitlerin ve proteinlerin ekstraksiyonu 2-D elektroforez yöntemi ile ayrılmış, MS spektrumları MALDI TOF kütle spektrometresi ile belirlenmiş ve HPLC gibi kromatografik yöntemler ile saflaştırılmıştır. Total akrep zehrinin insan kolon hücre hatları DLD-1, CaCo-2, HT-29 ve sağlıklı kolon epitel hücre hattı CCD-18Co hücrelerinin canlılığı, proliferasyonu, metastazı ve koloni oluşturma potansiyelleri üzerine etkileri in vitro koşullarda incelenmiştir. Kanser hücresine toksik etki gösteren ancak sağlıklı hücreye toksik etki göstermeyen doz (IC50) belirlendikten sonra akrep zehrinin kanser hücreleri üzerinde apoptoz etkisi flow sitometrik yöntem ile belirlenmiştir. Hücre ölüm mekanizması üzerindeki etkisinin moleküler mekanizmasını aydınlatabilmek amacıyla apoptoz yolağında rol alan 86 genin ve kolon kanser yolağında rol alan APC, BRAF, KRAS, MLH-1, SMAD-4 ve TP53 genlerin mRNA ekspresyonu qRT-PCR yöntemi ile belirlenmiştir. akabinde apoptoz ve kolon kanser yolağında rol alan genlerin kodladığı proteinlerin ekspresyonları ise western blot yöntemi ile belirlenmiştir. Son olarak ise, Scorpio fuscus türü akrep zehrinin etkisi in vivo çalışmalar ile gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, ksenogreft kolon kanseri fare modeli geliştirilmiş, tümör gelişimi ve çapı üzerine etkileri belirlenmiştir. 
Yapılan bu çalışmalar doğrultusunda elektrostimülasyon tekniği ile Scorpio fuscus türü akrep zehrinden 18.5 mg zehir elde edilmiştir. Elde edilen zehir, 2-D elektroforez yöntemi ile 12 protein spotu belirlenmiştir. Belirlenen protein spotları, MALDI TOF kütle spektrometresi ile 4 MS spektrumu analiz edilmiştir. Ayrıca insan kolon kanser hücre hattı olan DLD-1'de doza bağımlı olarak 14.80 µg/mL ile en yüksek sitotoksik etki gösterirken, sağlıklı kolon epitel hücre hattı CCD-18Co'de >250 µg/mL ile toksisite göstermediği bulunmuştur. Akabinde akrep zehrinin DLD-1 hücrelerinin güçlü metastatik etkilerini %94.42 inhibe ettiği (p<0.0001) görülmüştür. Koloni oluşturma çalışmaları incelendiğinde ise, akrep zehrinin DLD-1 hücrelerinin koloni oluşturma potansiyellerini %55.81 azalttığı (p<0.001) da belirlenmiştir. Akrep zehrinin DLD-1 hücrelerini kontrol hücresine kıyasla, 21.3-kat daha fazla erken apoptoza sürüklemiştir. Akrep zehri insan kolon kanser hücrelerinde 86 apoptoz ve 6 kolon kanser yolağında rol alan genlerin mRNA ekspresyonları ile bu genlerin kodladığı proteinlerin ekspresyon seviyelerindeki değişim aşağı ya da yukarı doğru regülasyon yapması ile açıklanmıştır. Son olarak ise, insan kolon kanseri DLD-1 hücrelerinin subkutan ve ortotopik enjeksiyonu ile hücre kaynaklı ksenogreft fare tümör modeli geliştirilmiştir. Scorpio fuscus türü akrep zehri enjekte edilen farelerde primer tümör odaklarında belirgin düzeyde azalma görülmüşken, metastatik odakların görülmediğine ulaşılmıştır.
Tez kapsamında elde edilen veriler ile akrep zehri içerisinde terapötik potansiyele sahip peptit/proteinlerin tanımlanması gerçekleştirilmiş olup in vitro koşullarda KRK karşı moleküler düzeyde etkisi belirlenmiştir. Böylece Scorpio fuscus türü akrep zehri, dünyada ciddi bir hastalık olan KRK'nin tedavi protokollerinde umut verici terapötik ajan olarak evrensel bir boyut kazanmıştır.

Abstract:
Colorectal cancer (CRC), commonly known as colorectal adenocarcinoma in the world, is one of the most common malignant neoplasms and one of the most studied cancer types in cancer research. Various treatments are used for CRC, which is one of the leading causes of cancer-related death, including conventional chemotherapy, radiotherapy, immunotherapy, and gene therapy. Traditional chemotherapy, which has been widely used to date, has continued to be the main treatment option, including the use of some known drugs that are resistant to common anti-cancer drugs and such as irinotecan, oxaliplatin, leucovorin, and 5-fluorouracil. However, due to its serious side effects and inadequacy, it has limited clinical applications, does not show satisfactory success, and alternative or complementary strategies are focused on. For this reason, researchers focused on natural resources such as scorpion venom, which have the potential to be used in the treatment of many diseases. In the last few years, scorpion venoms have attracted great interest as promising therapeutic agents to treat various types of malignancies, as they offer an amazing array of biological properties.
Scorpio fuscus type scorpions, which are widespread in our country and have cytotoxic venom, were collected from Adana and Mersin provinces and their venom was obtained by electrostimulation technique. Extraction of peptides and proteins from the obtained poisons was separated by 2-D electrophoresis method, MS spectra were determined by MALDI TOF mass spectrometry and purified by chromatographic methods such as HPLC. The effects of total scorpion venom on the viability, proliferation, metastasis and colony formation potential of human colon cell lines DLD-1, CaCo-2, HT-29 and healthy colon epithelial cell line CCD-18Co cells were investigated in vitro. After determining the dose (IC50), which has a toxic effect on cancer cells but not on healthy cells, the apoptosis effect of scorpion venom on cancer cells was determined by flow cytometric method. In order to elucidate the molecular mechanism of its effect on cell death mechanism, mRNA expression of 86 genes involved in apoptosis pathway and APC, BRAF, KRAS, MLH-1, SMAD-4 and TP53 genes involved in colon cancer pathway were determined by qRT-PCR method. Subsequently, the expressions of the proteins encoded by the genes involved in apoptosis and colon cancer pathways were determined by western blot method. Finally, the effect of Scorpio fuscus species scorpion venom was carried out by in vivo studies. For this purpose, a xenograft mouse model of colon cancer was developed and its effects on tumor development and diameter were determined.
In line with these studies, 18.5 mg venom was obtained from Scorpio fuscus species scorpion venom by electrostimulation technique. The resulting poison was determined by the 2-D electrophoresis method with 12 protein spots. Identified protein spots were analyzed by MALDI TOF mass spectrometry in 4 MS spectra. In addition, while it showed the highest cytotoxic effect with 14.80 µg/mL in a dose-dependent manner in the human colon cancer cell line DLD-1, it was found that it did not show toxicity at >250 µg/mL in the healthy colon epithelial cell line CCD-18Co. Subsequently, it was observed that scorpion venoms inhibited the potent metastatic effects of DLD-1 cells by 94.42% (p<0.0001). When colony formation studies were examined, it was determined that scorpion venoms reduced the colony formation potential of DLD-1 cells by 55.81% (p<0.001). Scorpion venoms drove DLD-1 cells to early apoptosis 21.3-fold more than control cell. Scorpion venoms are explained by the up- or down-regulation of the mRNA expressions of genes involved in 86 apoptosis and 6 colon cancer pathways in human colon cancer cells, and the change in the expression levels of the proteins encoded by these genes. Finally, a cell-derived xenograft mouse tumor model was developed by subcutaneous and orthotopic injection of human colon cancer DLD-1 cells. Mice injected with Scorpio fuscus species scorpion venom showed a significant reduction in primary tumor foci, while metastatic foci were not observed.
With the data obtained within the scope of the thesis, peptide/proteins with therapeutic potential in scorpion venom were identified, and their effects against CRC at the molecular level were determined in vitro. Thus, Scorpio fuscus species scorpion venom has gained a universal dimension as a promising therapeutic agent in the treatment protocols of CRC, which is a serious disease in the world.