Dimetiloksalilglisin ile ön koşullandırılan mezenkimal kök hücrelerden elde edilen şartlandırılmış medyum özelliklerinin incelenmesi
Investigation of conditioned medium properties obtained from mesenchymal stem cells preconditioned with dimethyloxalylglycine
Yazar: HANİFE NURDAN OLCAR
Danışman: PROF. DR. MERAL KOYUTÜRK
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Cerrahpaşa Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2022
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Dimetiloksalilgilisin = Dimethyloxalylglycine ; Eksozomlar = Exosomes ; Kök hücreler = Stem cells ; Mikroskopi-elektron = Microscopy-electron ; Ön koşullama = Pre-conditioning ; Şartlandırılmış medyum = Conditioned medium

Özet:
Amaç: İnsan umblikal kord kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (UK-MKH'lerin) dimetiloksalilglisin (DMOG) ile ön koşullandırılmasıyla elde edilen şartlandırılmış medyumun (ŞM'nin) ön koşullandırılmadan elde edilen ŞM ile karşılaştırılması, eksozomların ve MKH'lerin ultrastrüktürel incelenmesi ve terapötik açıdan önemli olabilecek olası değişikliklerin tespit edilmesi amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem: Umblikal korddan (UK'den) izole edilen MKH'lerin karakterizasyon deneyleri yapıldı. MKH'leri farklı dozda ve sürede DMOG ile ön koşullandırarak immünositokimyasal HIF-1α ekspresyonları değerlendirildi. MKH'lerde en yüksek HIF-1α ekspresyonu sağlayan DMOG dozu ve süresi uygulanarak ŞM'ler hazırlandı. ŞM'lerdeki total protein miktarı belirlendi. Büyüme faktörleri ve sitokinler ELISA yöntemiyle ölçüldü. ŞM'den izole edilen eksozomlar western blot (WB) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile karakterize edildi. MKH'ler TEM'de incelendi.
Bulgular: MKH'lerin izolasyonunun ve karakterizasyonunun ardından MKH'lere HIF-1α analiziyle belirlenen dozda (1000 μM) ve sürede (24 saat) DMOG uygulandı. DMOG ile ön koşullandırılan MKH'lerden elde edilen ŞM'de (DMOG-ŞM'de) VEGF, NGF ve IL-4 düzeylerinin arttığı tespit edildi. Her iki grupta BDNF, GDNF, IL-10, IL-17 ve IFN-γ düzeylerine rastlanmadı. İzole edilen eksozomların varlığı CD63 ile WB'de gösterildi. DMOG-ŞM'deki eksozomlar negatif boyanma ile TEM'de görüntülendi. TEM'de incelenen MKH'ler aktif hücre özellikleri sergilerken, DMOG ile ön koşullandırılan MKH'lerde artmış otofagozom, otolizozom, miyelin figür yapıları dikkat çekti.
Sonuç: Bu çalışmada; DMOG ön koşullandırması ile ŞM'deki sekretom içeriklerinin artırılabildiği gösterilmiş ve UK-MKH'lerdeki ultrastrüktürel değişiklikler ortaya konmuştur. DMOG-ŞM'lerin terapötik açıdan güvenle kullanılabilmeleri için UK-MKH'ler ve ŞM içeriğindeki değişikliklerin geniş kapsamlı yeni araştırmalarla aydınlatılması gerekmektedir.
Anahtar Sözcükler: Dimetiloksalilglisin, Eksozom, Mezenkimal Kök Hücre, Şartlandırılmış Medyum, Transmisyon Elektron Mikroskobu

Abstract:
Aim: It is aimed to detect therapeutically important changes by comparing the conditioned medium (CM) obtained by preconditioning human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) with dimethyloxalylglycine (DMOG) and the CM obtained without preconditioning, ultrastructural examination of exosomes and MSCs.
Material and Method: Characterization experiments of MSCs isolated from the UC were performed. Immunocytochemical HIF-1α expressions were evaluated by preconditioning MSCs with DMOG at different doses and times. CMs were prepared by applying DMOG dose and time, which has the highest HIF-1α expression in MSCs. Total protein in CMs was measured. Growth factors, cytokines were measured by ELISA. Exosomes isolated from CM were characterized by western blot (WB) and transmission electron microscopy (TEM). MSCs were examined in TEM.
Results: After isolation and characterization of MSCs, 1000μM DMOG was applied to MSCs for 24 hours. VEGF, NGF, IL-4 levels were found to be increased in CM obtained from MSCs preconditioned with DMOG. BDNF, GDNF, IL-10, IL-17, IFN-γ levels were not found in both groups. The presence of isolated exosomes was demonstrated in WB. Exosomes in DMOG-CM were visualized in TEM with negative staining. MSCs examined in TEM exhibited active cell properties. Increased autophagosome, autolysosome, myelin figure structures were observed in MSCs preconditioned with DMOG.
Conclusion: It has been shown that secretome contents in CM can be increased with DMOG preconditioning, and ultrastructural changes in UC-MSCs have been demonstrated. In order for DMOG-CMs to be used therapeutically safely, changes in UC-MSCs and CM content need to be clarified with extensive new researches.
Keywords: Conditioned Medium, Dimethyloxalylglycine, Exosome, Mesenchymal Stem Cell, Transmission Electron Microscopy