Nörofibromatozis tip1 olgularında NF1 gen mutasyonlarının yeni nesil dizileme teknolojisi ile araştırılması
Investigation of NF1 gene mutations with next generation sequencing technology in neurofibromatosis type1 cases
Yazar: SHAHRASHOUB SHARIFI
Danışman: PROF. DR. KIVANÇ ÇEFLE
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı / Genetik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Dizi analizi = Sequence analysis ; Genler-nörofibromatoz 1 = Genes-neurofibromatosis 1 ; Genom = Genome ; Mutasyon = Mutation ; Nörofibromatozis = Neurofibromatoses

Özet:
Von Recklinghausen hastalığı olarak da bilinen Nörofibromatosis Tip1 (MIM # 162200), etnik ve ırksal kökenden bağımsız, dünya genelinde 3000 ila 4000 kişide 1 prevalansına sahip yaygın bir Ailevi kanser sendromudur. Bu hastalık, kromozom 17q11.2'de lokalize tümör baskılayıcı bir gen olan NF1 genindeki dominant mutasyonlardan kaynaklanan kalıtsal bir bozukluktur. NF1 geni, nörofibromin (NM_000267) olarak adlandırılan sitoplazmik bir protein kodlar. Nörofibromin, esas olarak GTPaz aktive edici protein GAP olarak işlev görür ve RAS (rat sarkom proteini) aktivitesini inhibe eder. Yapilan araştırmalar, NF1 ile ilişkili tümörlerde, nörofibromin ekspresyon kaybının yüksek seviyelerde aktif RAS ile ilişkili olduğunu göstermektedir. NIH tarafından belirlenen NF1 tanı kriterleri arasında çoklu cafe-au-lait lekeleri, iriste Lisch nodülleri, aksiller ve inguinal çillenme ve nörofibrom adı verilen benign periferik sinir kılıfı tümörleri, optik gliom, özgün kemik lezyonları ve aile hikayesi bulunmaktadır. NF1 ile ilişkili diğer klinik komplikasyonlar arasında nörolojik, renal, kardiyovasküler, gastrointestinal, endokrin ve ortopedik tutulum, öğrenme ve entellektüel yetersizlik, dikkat eksikliği ve perferik sinir kılıfı veya merkezi sinir sistemi maligniteleri bulunmaktadır. NF1 hastalarının yaklaşık dörtte biri önemli morbidite ve mortaliteye neden olan bu klinik komplikasyonlardan birini veya birkaçını göstermektedir. Genel olarak farklı hastalardan elde edilen tümör dokularında saptanan germline ve somatik mutasyonların karakterizasyonu, NF1 gen mutasyonunun tipi, doğası ve sıklığı hakkında bilgiler sağlamış olsa da, NF1'de tümör oluşumunun moleküler mekanizmaları hakkındaki mevcut bilgimiz halen sınırlıdır. Bunun yanı sıra birçok sendrom nörofibromatozisi ile ortak klinik bulgular göstermekte ve bu durum özellikle antenatal dönemde kesin tanı açısından zorluklara yol açabilmektedir. Bu nedenle, nörofibromatozis ile benzer sendromların sıklıklarının ve moleküler etiyopatogenezlerinin bilinmesi, prenatal ve postnatal olguların izlemi açısından önem kazanmaktadır. NF1'nin klinik heterojenliği, hastalığın tanısıda sorumlu NF1 genin tüm ekzonlarını eş zamanlı dizilenmesini, delesyon/duplikasyon araştırılmasının yapılmasını gerektirmektedir. Çalışmamızda, klinik tanı olarak NF1 düşünülen olgularda, ilişkili NF1 geninin tüm ekzonları ve ekzon-intronsınır bölgelerini içeren, tasarlanmış NF1gen testi ile YND; Ion Torrent platformunda yapılan araştırmadan elde edilen varyantlar incelendi. Klinik kesin tanıda önemi belirlenen varyantlara özgün Primerler tasarlanarak Sanger dizileme ile doğrulandı, olanaklı olgularda segregasyon analiz sonuçları araştırıldı, herhangi bir varyant ilişkisi saptanmayanlarda yöntemin tasarımı gereği kapsanmayan bölgeleri Sanger dizileme ile incelendi. Sanger dizilemede patojenik varyant saptanmayan olgularda MLPA yöntemi ile delesyon/duplikasyon analizi yapıldı. Del/dup analiz sonucu pozitif olgularda array-CGH yöntemi ile NF1 mikrodelesyonu sendromu araştırıldı. Sonuç olarak toplalm 27 ailede klinik kesin tanılı olgularda NF1 geninde tanımlanmış 11 yeni variant ve literatürde bildirilmemiş 11 olası ilişkili variant saptandı ve tanı oranı % 94 olarak belirlendi. Çalışma sonuçlarımızın, Türk toplumunda NF1 geni mutasyon tipleri ve frekanslarının saptanmasına, taşıyıcı bireyleri belirlenerek iyi ve kötü huylutümörler açısından erken dönemden itibaren takip olanağının sağlanmasına, genetik danışmada, prenatal veya pre-implantasyon öncesi genetik tanıda yardımcı olmasına katkı sağlaması beklenir.

Abstract:
Neurofibromatosis Type 1 (NF1), also known as Von Recklinghausen disease, is a common familial cancer syndrome independent of ethnic and racial origins, Itaffects approximately 1 in 3000 to 4000 people worldwide. This disease is an inherited disorder caused by dominant mutations in the NF1 gene. The NF1 gene encodes a cytoplasmic protein called neurofibromin (NM_000267) that is a negative regulator of the RASpathway. Previous studies have shown increased expression of neurofibromin in NF1-related tumors. The diagnostic criteria for NF1 defined by National Institutes of Health are multiple cafe-au-lait (CAL) spots, benign peripheral nerve sheath tumors (neurofibromas), Lischnodules, axillary and inguinal freckles, optic glioma, spesific bone lesions and family history. Other clinical manifestations associated with NF1 include neurological, renal, cardiovascular, gastrointestinal, endocrine and orthopedic, learning and intellectual disabilities, attention deficit, and peripheral nerve sheath or central nervous system malignancies. About a quarter of NF1 cases eventually develop one or more of theseclinical complications that lead to significant morbidity and mortality. Although Characterization of the germline and somatic mutations in tumor tissues provided information about the type, nature and frequency of NF1 gene mutation, information about the molecular mechanisms of the tumor formation is still limited. In addition, somes sendromes present clinical findings that overlap with neurofibromatosis, and this can lead to problems in diagnosis, especially in the prenatal period. Therefore, understanding the frequency of molecular etiopathogenesis of neurofibromatosis is important for the follow-up of prenatal and postnatalcases. Given the clinical heterogeneity of NF1, rapid, accurate parallel sequencing of this gene and deletion / duplication analysis (when necessary) is required for proper diagnosis. In this study, we performed sequencing of the NF1 gene with in-house-designednext generation sequencing (NGS) targeted NF1 gene, using an Ion Torrentplatform, coveringng all exons and exon-intron boundaries in 27 families diagnosed with neurofibromatosis type 1. When sequencing did not yield any pathologic variants, the gene was analysed with MLPA for deletion/duplications. If MLPA showed a deletion, a possible microdeletion involving the NF1 gene was investigated with array-CGH. As a result, we identified 11 previously reported possible related variants and 11 variants that were not previously reported in the literature. Thus the frequency of diagnosis was 94% in this study. The results of our research are expected to contribute to the present knowledge about NF1 gene mutation types and frequencies in the Turkish population. This will provide follow-up opportunities which will allow early detection of benign and malignant tumors as well as proper genetic counseling including prenatal or pre-implantation genetic diagnosis.