Mortierella ramanniana küfünün β-karoten üretiminde kullanilacak besiyeri bileşiminin ve fermentasyon parametrelerinin optimizasyonu
Optimization of β-carotene production and fermentationparameters of Mortierella ramanniana
Yazar: HATİCE KÜBRA KIZILAY
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MUAMMER DEMİR
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Karotenoidler yağda çözünen pigmenlerdir. Sarıdan kırmızıya değişen aralıkta renklere sahiptir. Temel yapısında konjuge çift bağ serisi bulunan tetraterpenden oluşur. Karotenoidler doğal boya özelliğine sahip olup gıda, farmasötik, kozmetik, yem sanayi gibi farklı alanlarda kullanımı oldukça geniştir. İnsan ve hayvan sağlığına olan yararlı etkilerinden dolayı son zamanlarda karotenoidlere olan ilgi artmıştır. Doğal yollardan karotenoid elde edilmesinde hayvansal ve bitkisel kaynaklardan faydalanılmaktadır. Ancak coğrafi, iklim, mevsim, çeşit vs gibi kısıtlayıcı sebeplerden dolayı oluşan kaynak kıtlığı, araştırmacıları karotenoidleri mikrobiyal yollardan üretime yönlendirmiştir. Özellikle son zamanlarda mikrobiyal yolla β-karoten ve okside olmuş türevlerinin üretimine odaklanılmıştır. Biyoteknolojik olarak üretilen β-karotein miktarının arttırılması için kritik faktörlerin belirlenip çeşitli istatistik dizayn programları ile optimizasyonu yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu sayede endüstriyel çapta yeterli miktarda üretimi yapılabilmekte, böylece gıda, yem ve farmasötik sanayi sahalarındaki yeri giderek genişlemektedir.
Bu tez çalışması kapsamında Mortierellacea ailesinin bir üyesi olan Mortierella ramanniana küfü kullanılarak β-karoten üretiminin optimizasyonu çalışılmıştır. Optimizasyonun ilk aşamasına geçmeden önce besiyerinin temel iki bileşeni olan karbon ve azot kaynağının belirlenmesi gerçekleştirilmiştir. Bunun için karbon kaynağı olarak 9 farklı şeker (mannoz, laktoz, sukroz, ksiloz, maltoz, glukoz, galaktoz, arabinoz, fruktoz) kullanılmış, bunların arasından laktoz, maltoz ve glukoz seçilmiştir. Sonrasında seçilen bu şekerler ile 6 farklı azot ((NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, KNO3, Üre, Glisin, Asparajin) kaynağı kullanılarak üretimler yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre besiyeri optimizasyonu için karbon kaynağı olarak laktoz, azot kaynağı olarak ise KNO3 seçilmiştir. Ardından Plackett-Burman tasarımı 8 faktörle (laktoz, KNO3, KH2PO4, Na2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, maya, mineraller) oluşturulmuştur. Deneysel veriler alındıktan sonra yapılan çoklu regresyon ve varyans analizi (ANOVA) sonuçları değerlendirildiğinde, azot kaynağı olan KNO3 ve maya ekstraktının β-karoten üretiminde çok kritik olduğu belirlenmiştir.
Optimizasyonun ikinci aşamasında ise Plackett-Burman sonuçlarında etkili olan azot kaynağının, besiyerinde karbon kaynağı ile olan oranının (C:N), karbon kaynağı
olarak laktoz konsantrasyonunun ve fermentasyon koşullarından olan çalkalama hızının, β-karoten ve biyokütle üretimine olan etkileri Yanıt Yüzey Yöntemlerinden olan Box Behnken deneme deseni kullanılarak incelenmiştir. Tasarımın önerdiği deneyler sonucunda bağımsız değişkenlerin yanıtlar üzerine olan etkilerini ifade eden modeller oluşturulmuş olup modellerin uygunluğu varyasyon analizleri (ANOVA) ile değerlendirilmiştir. Elde edilen veriler sonucunda optimum olarak belirlenen koşullar; laktoz konsantrasyonu, 32.42 g/L; C:N oranı 20:1, çalkalama hızı ise 130 rpm olarak tespit edilmiştir. Bu şartlar altında β-karoten üretimi 1.141 mg/L ve biyokütle üretimi ise 13.14 g/L olarak saptanmıştır. Elde edilen bu sonuçların, istenen hedefe ulaşma fonksiyonuna ait değeri 0.925 olarak bulunmuştur. Kontrol besiyeri ile karşılaştırıldığında, β-karoten üretimi 564.3 μg/L'den 1141 μg/L'e, biyokütle üretimi ise 10.01g/L'den 13.14 g/L'ye çıkarılmıştır. Optimizasyon çalışması sonucu β-karoten üretimi iki katına, biyokütle üretimi ise 1.3 katına çıkarılmıştır.

Abstract:
Carotenoids are lipid soluble pigments that have yellow to red colour. Also They have conjugated double bond in their backbonds forming tetraterpenes. Carotenoids are vital natural grade dyes that have wide range of areas used in as food, pharmaceutics, cosmetics, feed industry. The undersatnding of having beneficial effects of carotenoids on human and animal health have caused growing attention on carotenoids recently. Most of the carotenoid productions are synthesized chemically but a few of them are synthesized by natural ways as plants. However, the source scarcity results from season, climate, location dependent plant growing leads reseachers to obtain carotenoids from other sources as biotechnologically. Especially last decade, researcher have focused on production of β-carotene and its oxidized derivatives.It can be done that critical factors are determined during optimization study to increase in production rate of β-carotene. Thus, β-carotene production can be produced suffient amount in terms of industrial scale. So the utility of the compound with incresing rate can be involved in food, feed and pharmaceutical areas of industry.
In this study, Mortierella ramanniana, one of a members of Mortierellacea family, is used in β-carotene production and optimization of the production is the main topic of this study. Prior to the first stage of optimization, two main compounds found in the medium were assessed. 9 different carbon sources and 6 different nitrogen sources were tried to produce maximum amount of β-carotene. First trial resulted in lactose, maltose and glucose selection as a best source of β-carotene production. After that six nitrogen sources were assayed with these three carbon sources. As a result of these trials lactose was selected as the best carbon source and KNO3 as nitrogen source. In the firt step of optimization Plackett-Burman design was used with 8 factors for optimizing the medium ingredients. Multiple regression and variance analysis of experimental data were assesed after Placket-Burman runs had been done. As a result, It was determined that nitrojen sources KNO3 and yeast extract were statistically important for Mortierella ramanniana while producing β-carotene.
In the second stage of optimization, Box-Behnken design was used which is one of the response surface methods. In this step, effects of C:N ratio, lactose concentration and agitation rate on β-caroten production and biomass accumulation were studied. Following the runs proposed by the Box Behnken design were done, the models which
are express that the effects of independent variable on responce were acquired. The selected model sufficiency was controlled by checking variance analysis (ANOVA) and multiple regression analysis results. After optimization process, the optimum contition were determined as lactose concentration of 32.42 g/L, C:N 20:1 and agitation rate 130 rpm. Under these conditions, β-carotene production was 1141 μg/L and biomass accumulation was 13.14 g/L. It is stated that β-carotene production was increased two times and biomass accumulation was increased 1.3 times as a compared to the control medium.