Proteozom inhibitörü bortezomib ve topoizomeraz inhibitörleri camptothesin ve etoposidin myeloid lösemi hücre hatlarında nf-κb sinyal yolağı ve apoptozis üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of proteosome inhibitor bortezomibe and topoisomerase inhibitors camptothesin and etoposide on nf-κb signaling pathway and apoptosis in the myeloid leukemia cell line
Yazar: BARIŞ KERİMOĞLU
Danışman: DOÇ. DR. KAMİLE ÖZTÜRK
Aksaray Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Hematoloji = Hematology
Dizin: Lösemi-miyeloid = Leukemia-myeloid ; Moleküler biyoloji = Molecular biology

Özet:
Nükleer faktör kappa B (NF-κB) tümör oluşumu ile doğrudan ilişkili olan hücre proliferasyonu, apoptozis, anjiogenez ve metastazın yanında, bağışıklık sistemi ve inflamasyon gibi birçok önemli olayda rol alan 500'den fazla genin regülasyonunu uyaran bir transkripsiyon faktörüdür. NF-κB'nin hematolojik malignitelerin nerdeyse tamamında ve birçok solid tümörde daimi olarak aktif olduğu gösterilmiştir. Bu durum NF-κB sinyal yolağını bloke eden ajanları kanser terapi için iyi bir hedef haline getirir. Ancak NF-κB sinyal yolağını bloke eden ajanların tümür gelişiminde rol alan mekanizmaları baskılamasının yanında inflamasyon ve bağışıklık sistemi gibi mekanizmaları da inhibe etmesi istenilmeyen bir durum olduğu için kombine terapilerin geliştirilmesi gerekmektedir. 

Bu tez çalışmasında; klinikteki etkinlikleri proteozomu inhibe etmek olan Bortezomib (Bort), topoizomeraz I inhibitörü olan Camptothesin (CPT) ve topoizomeraz II inhibitörü olan Etoposid (Eto) ilaçlarının tek başına ve kombine uygulamalarının kronik myeloid lösemi (K562) ve akut premyeloitik lösemi (HL-60) hücre hatlarında etkin bir kemoterapötik rejim oluşturup oluşturmadığı, Bort'in DNA'da hasar yapıp yapmadı ve buna ek olarak; topoizomeraz inhibitörlerinin NF-κB sinyal yolağını aktive edip etmediğini bulmak ve bu mekanizmaların apoptozisle olan ilişkisini moleküler düzeyde saptamak amaçlanmıştır. Bu amaçlara ulaşmak için öncelikle tek başına ve ikili ilaç kombinasyonları uygulanan hücre örneklerine MTT test kullanılarak hücre canlılıkları saptanmıştır. Real time RT-PCR yöntemi ile apoptozis, DNA hasarı ve NF-κB sinyal yolağı arasındaki ilişki gen düzeyinde araştırılmıştır. Bu ilişkiyi saptamak için NF-κB1 (p50), Rel-A (p65), ATM, ATR, p53 genlerinin ve apotozis için anti-apoptotik Bcl-2, pro-apoptotik Bax ve Kaspas-3 genlerinin mRNA düzeyindeki değişimler 2-∆∆Ct yöntemi kullanılarak saptanmıştır.

Sonuç olarak, Bort, CPT ve Eto'in tek başına her iki hücre hattında da doz bağımlı olarak hücre canlılığını azalttığını ve apoptozise neden olduğunu gözlemledik. Ayrıca, Bort'in her iki hücre hattında da ATM, ATR ve p53 genlerinin mRNA düzeyinde kontrole göre anlamlı bir artışa neden olduğunu bulduk. Bu durum Bort'in bilinen NF-κB inhibisyonu yanında DNA'da da hasar yaparak apoptozise neden olabileceğini gösterdi. Buna ek olarak; Bort'in K562 ve HL-60 hücrelerinde Rel-A gen ifadesindeki artışa bağlı olarak NF-κB sinyal yolağını tamamen inhibe etmek yerine NF-κB'nin pro-apoptotik fonksiyonunu açığa çıkardığı bulundu. Çalışmamızda Eto ve CPT'in DNA'da hasar yaptığını ve ayrıca Eto ve CPT'nin, Rel-A ve NF-κB1 gen ifade düzeylerinde anlamlı bir artışa neden olarak NF-κB sinyal yolağının aktive edebileceğini bulduk. Bort, Eto ve CPT'in birlikte kullanıldığı ilaç kombinasyonları her iki hücrede de sitotoksik etkinin artmasına neden oldu. Hücre canlılığı deneyleri K562 hücrelerinin (%0-20 ye kadar düşen canlılık ile) HL-60 hücrelerine göre kombine terapiye daha iyi cevap verdiğini gösterdi. Tüm ikili kombinasyonların her iki hücre hattında da Bcl-2'de azalma, Bax ve Kaspaz 3 genlerinin ifadesinde artışa neden olması kombine terapinin apoptozise yol açtığını doğruladı ve her iki hücre hattında da Rel-A gen ifadesinde kontrole göre anlamlı bir artışa neden olduğu bulundu. Bu sonuç tüm kombinasyonlarının Rel-A bağımlı NF-κB sinyal yolağına etki ettiğini ve sonuçta Rel-A'nın NF-κB sinyal yolağının pro-apoptotik mekanizmasını tetiklemede elzem olduğu fikrini ileri sürmektedir. 


Anahtar Kelimeler: NF-κB, Apoptozis, DNA Hasarı, Bortezomib, Etoposid, Camptothesin, qRT-PCR

Abstract:
Nuclear factor kappa B (NF-κB) is a transcription factor which triggers more than 500 genes regulation that play an important role in many cases such as inflammation and immune system in addition to cell proliferation, apoptosis, angiogenesis, and metastasis. NF-κB has been shown to be constitutive activation in almost all hematologic malignities and solid tumors. In this case, the blocking agents of NF-κB signaling pathway have become a good target in the cancer therapy. However, combination treatments should be developed for the undesirable situations in which the blocking agents of NF-κB signaling pathway inhibit the mechanisms that play a role in tumor progression, in addition to inhibition of mechanisms such as inflammation and immune systems.

In this study, it has been studied whether alone or combined usage of medicines which are bortezomibe (Bort), camptothecin (CPT), etoposide (Eto), which respectively inhibits proteasomes, topoisomerase I, topoisomerase II in clinics, affect chemo-therapeutically on chronic myeloid leukemia (K562) and acut-promyelocytic leukemia(HL-60). Another significant aim of this study is to find out whether bortezomib which gets NF-κB signaling pathway stopped by inhibiting its proteasome, causes a DNA damage or not. Additionally, we aimed to find whether the inhibitors of topoisomerase, which cause DNA damage, activate NF-κB signaling pathway or not, and to find the link between these mechanisms and apoptosis in molecular level. To achieve these aims, firstly the viability of cells was found by the application of alone or combined medicines in MTT test. The relation among apoptosis, DNA damages and the NF-κB signaling pathway was analyzed in gene level by real-time RT-PCR method. To determine the relation, the changes in mRNA level of NF-κB1 (p50), Rel-A (p65), ATM, ATR, p53 genes, and for apoptosis anti-apoptotic Bcl-2, pro-apoptotic Bax and Caspas-3 was found by 2-∆∆Ct method.

As a result, we observed that Bort, CPT, and Eto cause a decrease in cell viability and apoptosis on both cell lines according to their dose by finding the changes of cell viability and the expression of apoptotic genes. Interestingly, we found that Bort cause an increase in ATM, ATR and p53 gene expression in mRNA level on both cell lines. Additionally, we have found that Bort triggers the pro-apoptotic function of NF-κB based on the increase of RelA expression in K562 and HL-60 cells rather than inhibiting NF-κB signaling pathway. We surprisingly found that Eto and CPT have an effect on Rel-A and NF-κB1 gene expression and they activate NF-κB signal pathway while confirming Eto and CPT cause DNA damage. All two-combined application of Bort, Eto and CPT caused an increase in cytotoxic activity. However, we determined that K562 cells had a better response(by %0-20 survivor rate) in cell vitality tests compared to HL-60 cells. All two combination of these medicines on both cell lines cause a decrease in bcl-2 and increase in Bax ve Caspaz 3 genes expression levels. The data confirmed that combined-therapy causes apoptosis. These results assert that all combinations effect NF-κB signal pathway which is related to Rel-A and eventually, these results support that Rel-A is an essential molecule for triggering the pro-apoptotic mechanism of NF-κB signal pathway.


Keywors: NF-κB, Apoptosis, DNA Damage, Bortezomibe, Etoposide, Camptothecin, qRT-PCR