Nöron hücre kültüründe bilirubinin oluşturduğu nörotoksisitede hipoterminin nöroprotektif etkisi
The neuroprotective effects of hypothermia on bilirubin induced neurotoxicity in neuronal cell cultures
Yazar: NAZLI KUTER
Danışman: PROF. DR. EREN ÖZEK ; PROF. DR. GÜRKAN ÖZTÜRK
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları = Child Health and Diseases
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Bilirubin = Bilirubin ; Hiperbilirubinemi = Hyperbilirubinemia ; Hipotermi = Hypothermia ; Hücre kültürü = Cell culture ; Nöronlar = Neurons ; Nörotoksinler = Neurotoxins

Özet:
Amaç: Primer fare nöron hücre kültürlerinde bilirubin kaynaklı toksisitede hipoterminin nöroprotektif etkilerini araştırmak.
Gereç ve Yöntem: Yenidoğan fare beyinlerinden izole edilen hipokampus hücre kültürleri in vitro 3. günde bilirubin uygulanarak normotermik ortamdan alınıp farklı derecelerde hipotermiye maruz bırakıldılar. Başlangıçta ve bilirubin ile 24 saat inkübasyon sonrasında normotermik (37°C), hafif hipotermik (34°C), orta hipotermik (32°C) ve ağır hipotermik (29°C) gruplar arasındaki hücre sağ kalım ve apoptoz oranları karşılaştırıldı. Hücre ölümü değerlendirmelerinde konfokal mikroskop ve floresan boyalar (Propidiyum-İyodür ve JC-1) kullanıldı. Hipoterminin geç etkilerinin değerlendirilebilmesi için kültürler normotermik ortama geri alındıktan sonra in vitro 7. günde tekrar incelendi. Sonuçların elde edilmesi için tüm deneyler üç kez tekrarlandı.
Bulgular: Bilirubin maruziyetinden 24 saat sonra nöral hücrelerin mortalite oranları 37°C'de %44,2±0,98 (ort±SEM); 34°C'de %33,4±5,62; 32°C'de %18,1±0,48; 29°C'de %27,6±2,33 olarak saptandı (p=0,002). Alt grup analizlerinde normotermik gruba göre orta ve ağır hipotermik gruplarda mortalitede anlamlı düşüş görüldü (p=0,002 ve p=0,032, sırasıyla). Hafif hipotermi grubunun mortalite oranı da normotermik gruba gore düşük olmakla birlikte, anlamlı fark saptanmadı (p=0,230). Ancak apoptoz oranları hafif ve orta hipotermi gruplarında daha düşük iken (%36,5±0,33 ve %32,3±0,63, sırasıyla), ağır hipotermi grubunda düşüş saptanmadı (%45,6±2,61). İn vitro 7. günde (bilirubin maruziyeti sonrası 3. günde), orta hipotermi grubu %25,9±2,7 ile en düşük mortalite oranına sahip olan grup idi ve normotermik gruba göre anlamlı fark mevcuttu (p=0,043).
Sonuç: Sonuç olarak hipotermi, nöron hücrelerinde bilirubin kaynaklı hücre ölümünü azaltmaktadır. Hafif hipotermiye kıyasla orta hipoterminin etkileri daha olumlu iken, 29°C'ye kadar inilen derin hipoterminin hücre viabilitesine olumsuz etkileri mevcuttur. Ağır yenidoğan sarılığında soğutmanın risk ve faydalarının belirlenebilmesi için ileri in vitro ve in vivo çalışmaların yapılması gerekmektedir. 
ANAHTAR SÖZCÜKLER: hiperbilirubinemi, hipotermi, nörotoksisite, apoptoz, nöral hücre kültürü

Abstract:
Aim: To investigate the neuroprotective effects of hypothermia on bilirubin induced toxicity in primary mouse neuronal cell cultures.
Material and Method: Hippocampal cell cultures, isolated from newborn mouse brain were incubated with bilirubin at 3 days in vitro (DIV) and immediately exposed to varying degrees of hypothermia. Before and after 24 hours of incubation with bilirubin, the cell viability and apoptosis rates were compared between the normothermic (37°C), mild (34°C), moderate (32°C) and severe (29°C) hypothermic groups. Confocal microscopy and florescent dyes (Propidium-Iodide and JC-1) were used for cell death evaluation. To determine the late effects of hypothermia, the cultures were also examined at 7 DIV after returning to normothermic conditions. Three independent experiments were carried out to obtain the results.
Results: After 24 hours of bilirubin exposure, the mortality rates of the neural cells were 44.2±0.98% (mean±SEM) at 37°C; 33.4±5.62% at 34°C; 18.1±0.48% at 32°C and 27.6±2.33% at 29°C, (p=0.002). The subgroup analysis showed significant decrease in the overall mortality in the moderate and severe hypothermic groups compared to the normothermic group (p=0,002 and p=0,032 respectively). Mortality in the mild hypothermic group was also lower than the normothermic group, although not significantly (p=0,230). However the apoptosis rate, although lower in the mild and moderate hypothermic groups (36.5±0.33% and 32.3±0.63% respectively), was not decreased in the severe hypothermic group (45.6±2.61%). At 7 DIV (3 days after bilirubin exposure), the moderate hypothermic group had the lowest mortality rate with 25.9±2.7%, significantly different from the normothermic group (p=0,043).
Conclusion: We conclude that hypothermia reduces the cell death induced by bilirubin toxicity in neuronal cells. Although moderate hypothermia has a better outcome than mild hypothermia, deep hypothermia as low as 29°C has adverse effects on neuronal cell viability. Further in vitro and in vivo studies should be performed to assess the risks and benefits of cooling in severe neonatal jaundice.
KEY WORDS: hyperbilirubinemia, hypothermia, neurotoxicity, apoptosis, neural cell culture