İskemi-reperfüzyonun sıçan frenik sinir diyafram preparatında yarattığı elektrofizyolojik değişimlerin numerik analiz yöntemleriyle incelenmesi
Investigation of elecrophysiological alterations caused by ischemia-reperfusion in rat phrenic nerve-diaphragma preparations with numerical analysis techniques
Yazar: SEÇKİN TUNCER
Danışman: PROF. DR. NİZAMETTİN DALKILIÇ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Abdomen = Abdomen ; Aort anevrizmaları = Aortic aneurysm ; Diyafram = Diaphragm ; Frenik sinir = Phrenic nerve ; Kas kontraksiyonu = Muscle contraction ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; Sıçanlar = Rats ; İskemi = Ischemia

Özet:
Vasküler cerrahi operasyonlar başta olmak üzere birçok operasyon dokulara kan akışının kesilmesini yani iskemi oluşturulmasını zorunlu kılmaktadır. İskemi sonrasında kan akışının tekrar sağlanmasıyla dokuların reperfüzyonu gerçekleştirilmektedir. Reperfüzyon başta olmak üzere her iki aşamada da operasyon bölgesine yakın dokularla birlikte uzak dokularda da çeşitli yapısal ve fonksiyonel hasarlar meydana gelmektedir. Toplumda rastlanma sıklığı oldukça fazla olan Abdominal Aorta Anevrizmasının (AAA) tedavisinde de abdominal aortanın kan dağıtımının infrarenal bölgeden kapatılmasıyla iskemi ve takiben reperfüzyon meydana gelmektedir. Açık cerrahi kullanılarak gerçekleştirilen AAA tedavisinden sonra meydana gelen solunumsal disfonksiyonun sebebi tam olarak bilinmemekle birlikte, diyaframın fonksiyonel bozukluklarından kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Çalışmamızda, mortalitesi yüksek olan post-operatif solunum disfonksiyonunun diyaframın hangi elektrofizyolojik özelliklerindeki değişimlerden kaynaklanıyor olabileceği araştırılmıştır. 
Bunun için, Wistar Albino türü 48 adet sıçan her birinde 24?er tane olmak üzere iskemi reperfüzyon grubu (IR) ve kontrol grubu (SHAM) olarak adlandırılan iki gruba ayrılmıştır. Hafif anestezi altında (8 mg/100 gr ketamin, 1 mg/100 gr ksilazin) IR grubu sıçanların abdominal aortadan kan akışı infrarenal bölgeden vasküler klip ile kapatılmış, 30 dakika sonra klip kaldırılarak 2 saat kan akışı sağlanmıştır. SHAM grubunda ise yalnızca klip yerleştirme işlemi gerçekleştirilmemiştir. Bekleme süresinin ardından diyaframlar izole edilerek, fizyolojik koşullara en yakın koşullar altında kasın mekanik ve elektriksel özellikleri araştırılmıştır. İzole edilen diyaframlara ayrıca in vitro 3 nM Ryanodine uygulaması ile Na+ ve K+ akımları blokasyonu (0,3 mM 4-Aminopiridin ve 127 mM N-metil-D-glukamin) deneyleri gerçekleştirilmiştir. Kare biçimli 0,2 ms süreli supramaksimal uyaranlar, 1 Hz, 50 Hz ve 25-70 Hz aralığında değişen frekansta uygulanarak, elde edilen kas sarsıları kaydedilmiştir. Hücrelerin içerisine 10-20 M? dirence sahip mikroelektrotlar ile girilerek Dinlenim Zar Potansiyeli (DZP) ve supramaksimal kare biçimli 0,2 ms süreli uyaranlarla elde edilen hücre içi Aksiyon Potansiyeli (AP) yanıtları kaydedilmiştir. 
Çalışmanın sonucunda, kasılma kuvvetinin (1 Hz ve 50Hz) IR grubunda anlamlı azaldığı (p<0,01) ve tetanusa girme frekansının düştüğü gözlenmiştir. Hücrenin dinlenim durumundayken IR grubunda daha hiperpolarize olduğu gözlenmiştir. Kaydedilen AP yanıtlarından elde edilen ortalama tepe değeri, genlik, alan değerlerinin IR grubunda anlamlı olarak arttığı, depolarizasyonun ve repolarizasyonun ise anlamlı olarak hızlandığı bulunmuştur (p<0,01). 
Elde edilen bulgular değerlendirildiğinde, diyafram kasının mekanik özelliklerinin IR grubunda görülen değişimine Ca++ homeostazının bozulmasının sebep olduğu gösterilmiştir. Dinlenimde persistan Na+ akımının IR grubunda azaldığı ve AP biçimindeki değişimlerin ise, Na+ iyon kanallarının kinetiklerindeki değişimden ve voltaj bağımlı K+ kanallarının aktivasyonunun gecikmesinden kaynaklandığı gösterilmiştir.

Abstract:
Cessation of blood flow that is called ischemia is prerequisite for some surgical operations especially vascular surgery. After ischemia, blood supply to the tissues is provided again and tissues are reperfused. For each process some structural and functional damages occur in tissues that may be both close and far to the operation area. In the Abdominal Aorta Aneurysm (AAA) which has a high prevalence among the human population, by closure of the abdominal aorta?s blood delivery from the infrarenal area, ischemia and reperfusion occurs. Reason of respiratory dysfunction after open surgical AAA repair is not known well and thought to be arising from functional changes of diaphragm muscle. In our study, we investigated the changes in the electrophysiological properties of diaphragm that is caused post-operative respiratory dysfunction. 
For that purpose, 20 Wistar Albino rats were divided into groups that called ischemia-reperfusion group (IR) and control group (SHAM), by means of 10 rats for each. Under light anesthesia (8 mg/100 gr ketamine, 1 mg/100 gr xsylazine) in IR group blood delivery is occluded from the infrarenal area of the abdominal aorta by using a vascular clamp, after 30 minutes the clamp was removed and blood delivery was alloved for 2 hours. In SHAM group, only clamp was not placed. Following the waiting period diaphragms are isolated and mechanical and electrical properties of muscle was investigated under the physiologic conditions. 3 nM Ryanodine application and Na+ and K+ current blockage (0.3 mM 4-Aminopiridine and 127 mM N-methyl-D-glukamine) experiments were carried out on the isolated diaphragms in vitro. Square shaped supramaximal pulses having 0.2 ms duration, 1 Hz, 50 Hz and between 25-70 Hz frequency were applied and muscle twitches were recorded. Resting Membrane Potentials (DZP) and Action Potential (AP) responses to square shaped supramaximal pulses having 0,2 ms duration were recorded by entering into the cell by using microelectrodes that have resistances between 10-20 M?. 
As a result, for IR group the contraction force (1 Hz and 50 Hz) decreased significantly (p<0.01) and there is also decline in tetanus frequency. It is also found that resting state of cells of IR group is more hyperpolarized as compared to SHAM group. Average overshoot, amplitude and area of action potential increased significantly and the rate of depolarization and repolarization found to become faster significantly in the IR group (p<0.01). 
Evaluating the obtained values, the mechanical alterations in IR group are shown to be caused by deterioration of Ca++ homeostasis. In the IR group the persistant Na+ current is found to be desreased at the resting state and the alterations of the shape of AP has shown to be arised from the changed kinetics of Na+ ion channels and the delayed activaion of voltage dependent K+ ion channels.