Salmonella'nın lamp yöntemi ile tespiti için tanı prototipi geliştirilmesi ve bu prototipin tanısal değerinin araştırılması
Development of a diagnostic prototype for detection of salmonella by the lamp method and investigation of the diagnostic value of this prototype
Yazar: GÜLNUR SERDAR
Danışman: PROF. DR. OKTAY GENÇ
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: LAMP = LAMP ; Salmonella = Salmonella ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis teknikleri ve prosedürleri = Diagnostic techniques and procedures

Özet:
Salmonellozis, Salmonella cinsi bakterilerin neden olduğu insan ve hayvanlarda görülen bulaşıcı bir hastalıktır. Hastalık tüm evcil hayvan türlerini etkilemekle birlikte; genç, gebe ve laktasyondaki hayvanlar hastalığa karşı daha duyarlıdır. En sık görülen klinik belirti enteritistir, bununla birlikte akut septisemi, abort, artrit ve solunum sistemi hastalıkları da görülebilmektedir.
        Salmonella'nın neden olduğu enfeksiyonların tanısı için çok sayıda moleküler teşhis yöntemi mevcuttur. Ancak kullanım kolaylığı, uzun zaman gerektirmemesi ve bir uzmana ihtiyaç duyulmaması, LAMP yöntemini sınırlı imkanlarda öne çıkarmaktadır. LAMP tekniği, reaksiyon bileşenlerinin izotermal koşullara tabi tutulduğu ve tüm amplifikasyon ve tespit işlemlerinin tek bir adımda gerçekleştirildiği, basitliği ile karakterize bir yöntemdir. LAMP metodu, Bsm (Bacillus subtilis) veya Bst (Bacillus sterotermophilus) polimeraz enziminin izotermal iplikçik-yer değiştirme aktivitesine dayanmaktadır.
Bu çalışmada, Salmonellanın nükleik asit amplifikasyon temelli yöntemler (PCR, RT-PCR)  yerine; hızlı,  kolay ve saha koşullarında kullanımı mümkün LAMP yöntemiyle değerlendirilmesi için tanı prototipi geliştirilmesi amaçlandı. Salmonella'nın cins düzeyinde tanımlanması amacıyla yaygın olarak kullanılan invaziv A (invA) geni tercih edildi. LAMP testinde primer tasarımı için, https://primerexplorer.jp/e/ web sayfası PrimerExplorerV5 yazılımından yararlanıldı. 
Bu çalışmada, LAMP reaksiyonu 65ºC sıcaklıkta 60dk'da gerçekleştirildi ve sonuçlar hem elektroforez ile hem de SYBR Green I boyası kullanılarak görsel hale getirildi. LAMP testinin saptanabilir limiti S. Enteritidis için 3.66x102 cfu/ml olarak belirlenirken, PCR ve RT-PCR testlerinin saptanabilir limiti sırasıyla 3.66x104 cfu/ml ve3.66x103 cfu/ml olarak tespit edildi.LAMP testinin özgüllüğü ise %100 olarak belirlendi.
Sonuç olarak, gelecek dönemde LAMP testinin standardizasyon çalışmalarının sürdürülmesi ve saha validasyonunun yapılarak testin diyagnostik performansının belirlenmesi konusunda planlama yapıldı.

Abstract:
Salmonellosis is a contagious disease of humans and animals caused by Salmonella bacteria. Although the disease affects all types of animals; young, pregnant and lactating animals are more susceptible to the disease. The most common clinical symptom is enteritis, however, acute septicemia, abortion, arthritis and respiratory tract diseases can also be seen.
There are many molecular diagnostic methods for the diagnosis of infections caused by Salmonella. However, the ease of use, not the requirement of a long time, and no need for an expert, make the LAMP method stand out in limited opportunities. The LAMP technique is a method characterized by its simplicity, in which the reaction components are subjected to isothermal conditions and all amplification and detection processes are performed in a single step. The LAMP method is based on the isothermal strand-displacement activity of the Bsm (Bacillus subtilis) or Bst (Bacillus stereothermophilus) polymerase enzyme. 
In this thesis, it was aimed to develop a method that can detect Salmonella quickly and easily under limited conditions and also differentiate pathogen/apathogen to investigate alternatives to nucleic acid amplification-based methods (PCR, qPCR,). The invA gene, which is widely used for identification of Salmonella at genus level, was preferred. For the primer design in the LAMP test, the https://primerexplorer.jp/e/ web page PrimerExplorerV5 software was used. 
In this study, the LAMP reaction was performed at 65ºC for 60 minutes and the results were visualized by both electrophoresis and SYBR Green I. The detectable limit of the LAMP test was determined as 3.66x102 cfu/ml for S. Enteritidis, while the limit of PCR and RT-PCR tests were determined as 3.66x104 cfu/ml and 3.66x103 cfu/ml, respectively. The specificity of the LAMP test was determined as 100%.
As a result, planning was made to continue the standardization studies of the LAMP test in the future and to determine the diagnostic performance of the test by performing field validation.