Kimyasallarla indüklenen meme kanseri oluşum mekanizmalarında olası antikanser ilaç hedeflerinin araştırılması
Investigation of mechanisms of chemically-induced breast cancer as targets for anticancer drugs
Yazar: ELİF İNCE
Danışman: PROF. DR. HANDE GÜRER ORHAN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Aromataz = Aromatase ; Genler-CYP 1B1 = Genes-CYP 1B1 ; Melatonin = Melatonin ; Meme neoplazmları = Breast neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Neoplazmlar-deneysel = Neoplasms-experimental ; Östrojenler = Estrogens ; İlaç hedefleme = Drug targeting ; İnhibisyon = Inhibition

Özet:
Meme kanseri, dünyada görülme sıklığı hızla artan ve kadınlarda kanserden ölüm nedenleri arasında ikinci sırada yer alan bir kanser türüdür. Endojen östrojenlerin ve eksojen östrojenik bileşiklerin bazılarının hem reseptör aracılığıyla hücre proliferasyonunu arttırarak, hem de metabolizmaları sonucu oluşan reaktif kinon metabolitlerinin DNA'ya bağlanmasıyla kanserin oluşum ve gelişimine katkıda bulunduğu bildirilmektedir. 
Endojen bir hormon olan melatoninin hormon-ilişkili meme kanserinde östrojen reseptörü aracılıklı etkileri değiştirdiği ve dokularda lokal östrojen sentezini inhibe ettiği bilinmektedir. Meme kanserinin önlenmesi ve tedavisinde destekleyici ajan olarak kullanımının diğer ilaçların etkinliğini artırdığı ve yan etkilerini azalttığı gösterilmiştir. Ancak melatoninin yarılanma ömrünün kısa oluşu ve oral biyoyararlanımının düşük oluşu ilaç olarak kullanımını kısıtladığı için bu tez çalışmasında bazı indol türevi melatonin analoglarının benzer etkinliklerinin test edilmesi düşünülmüştür.
Tez çalışması kapsamında 1-etilindol, 5-metoksiindol-3-aldehit hidrazon ve 2-metilindol yapısındaki melatonin analoğu bileşiklerin kimyasallarla indüklenen meme kanserinin oluşumunda rol oynayan hedefler üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu hedefler, östrojenik bileşiklerin bağlanması ile hücre proliferasyonunu artıran östrojen reseptörü, lokal östrojen sentezini katalize eden aromataz enzimi ve östrojen ya da kimyasalları genotoksik metabolitlere dönüştüren CYP1B1 enzimidir. Türevlerin sırasıyla potansiyel östrojen reseptör antagonisti, aromataz inhibitörü ve CYP1B1 inhibitörü etkileri araştırılmıştır. Ayrıca hem insan sağlıklı meme epiteli hücre hattı (MCF-10A), hem de ER+ (MCF-7 BUS) ve üçlü negatif (MDA-MB-231) insan meme kanseri hücre hatları üzerindeki kısa ve uzun süreli sitotoksik etkileri de değerlendirilmiştir.
Maddelerden bazılarının ER antagonizması, aromataz inhibisyonu veya CYP1B1 inhibisyonu yönünde etkileri olduğu, bazılarının ise birden fazla hedefte etkileri olduğu görülmüştür. Etkili bazı türevlerin sağlıklı meme hücrelerinde sitotoksisite göstermezken meme kanseri hücrelerinde sitotoksisite göstermeleri ve özellikle uzun süreli maruziyet ile hücrelerin koloni oluşumunu tamamen engellemiş olmaları ilaç adayı olabilecekleri yönünde umut vericidir. Bazılarının MCF-7 BUS hücrelerindeki sitotoksik etkilerinin MDA-MB-231 hücre hattına kıyasla daha güçlü bulunması sitotoksik etkilerinin hormon-ilişkili olabileceğini, bazılarında hücreler arasında etki farkı gözlenmemesi ise sitotoksik etkilerinin temelinde test edilen hedeflerin dışında mekanizmaların da rol oynadığını düşündürmektedir. 
Sonuç olarak indol türevi melatonin analoglarından bazılarının belirlenen üç farklı hedef üzerinde melatoninden daha etkili oldukları bulunmuştur. Bununla birlikte araştırılan hedefler üzerinde etkili olduğu bulunan bileşikler, etki güçleri bakımından mevcut tedavi ajanlarına alternatif olabilecek üstünlükte bulunmamıştır. Bu nedenlerle sözkonusu bileşiklerin meme kanserinin önlenmesinde kemopreventif ve/veya tedavi etkinliğini güçlendirerek yan etkileri azaltmaya aday adjuvan ajan olabilecekleri düşünülmektedir. Tez çalışmasında ortaya konan yapı-aktivite ilişkileri, var olan ilaçlardan daha güçlü yeni ilaç adaylarının geliştirilmesine olanak sağlayabilecektir. Bu tezde klinik öncesi ilaç keşif çalışmaları kapsamında yer alan hedef belirleme, etki belirleme/ölçme yöntemi seçimi ve validasyonu, orta/hızlı çıktılı tarama, moleküler modelleme ile öngörüsel veri elde etme ile in vitro etkinlik ve toksisite testlerini kapsayan bütüncül bir yaklaşım kullanılarak hit/öncü-molekül belirlenmesi amaçlanmış ve gerçekleştirilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Meme kanseri; ER antagonizması; Aromataz inhibisyonu; CYP1B1 inhibisyonu,  sentetik melatonin analogları.

Abstract:
Breast cancer is the second cause of death among female cancers and its incidence is increasing rapidly all over the world. It was reported that endogen estrogens and xenoestrogens play a role in the initiation and progression of breast cancer via two complementary pathways; by increasing cell proliferation via binding to estrogen receptor and by inducing oxidative DNA damage as a result of metabolism of estrogens to their reactive quinone metabolites. Melatonin, a natural indolic hormone, is known to be beneficial in breast cancer via modulation of estrogen receptor mediated effects and via inhibiting local biosynthesis of estrogens by aromatase inhibition. Furthermore melatonin is reported to play a role as a potent adjuvant agent to increase effectiveness and to reduce side effects of the conventional breast cancer therapy. However short half-life and low bioavailibility of melatonin limit its therapeutic use.
 Therefore the present thesis is aimed to investigate the potential effects of melatonin analogues on the selected targets that are involved in the chemical-induced breast carcinogenesis. Our selected target proteins were are estrogen receptor, aromatase and CYP1B1 enzymes. The inhibitory activies of the compounds on estrogen induced cell proliferation as a consequence of their ER antagonist effects were investigated. Inhibitory effects of the compounds on both aromatase, enzyme responsible for local estrogen biosynthesis, and CYP1B1, enzyme catalysing biotransformation of chemicals/estrogens to their reactive metabolites, were investigated. Furthermore short-term and long-term cytotoxicity of the compounds were evaluted in both non-tumorigenic breast epithelial cell line (MCF-10A) and two different breast cancer cell lines (MCF-7 BUS and MDA-MB231).
We found that some of the compounds have ER antagonist, aromatase inhibitor and/or CYP1B1 inhibitory activitiy; some of them were effective against more than one target. Some of the compounds that were found to be effective on selected targets caused cytotoxicity on human breast cancer cell lines without having cytotoxic effect on non-tumorogenic breast cancer cell line which indicates that these molecules can be promising candidates for breast cancer therapy without causing harm to the healthy cells. Some of the tested indol derivatives were found to inhibit formation of colonies dramatically in long term cytotoxicity studies in MCF-7 cells which suggests an important role for them as novel drug candidates. It was also found that some compounds are more cytotoxic to ER + (MCF-7 BUS) cells than ER-(MDA-MB-231) breast cancer cells implying the hormon related mode of action of their cytotoxic activity. On the other hand for some compounds, there were no differences between their cytotoxic effects on ER+ or ER- cell lines suggesting that off-target mechanisms may be involved in their cytotoxicity. Although effective compounds are not as potent as current therapy agents, they were much more effective than their parent compound, melatonin, on all three selected targets. We suggest that these compounds could be promising candidates with lower side-effects in the prevention and treatment of breast cancer as an adjuvant therapeutical agent. The structure-activity relationships obtained from this study may provide data for further studies to develope more potent molecules and alternatives to current therapies. In the present thesis, target identification, selection and validation of method,  medium/high throughput screening on selected target, molecular modelling studies to provide predictive data, early phases of the efficacy and toxicity determination were conducted to identify a hit/lead among tested indole derivative melatonin analogs as in the preclinical stages of drug discovery studies. 

Keywords: Breast cancer; ER antagonist; Aromatase inhibitor; CYP1B1 inhibitor,  Melatonin analogues