Farklı yöntemler ile enkapsüle edilen probiyotiklerin in vitro ve in vivo etkinliğinin belirlenmesi
Evaluation of in vitro and in vivo effectiveness of encapsulated probiotics using different methods
Yazar: BERNA MADALI
Danışman: DOÇ. DR. DERYA DİKMEN
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Beslenme ve Diyetetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Beslenme ve Diyetetik = Nutrition and Dietetics ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Mikroenkapsülasyon = Microencapsulation ; Nano parçacık = Nano particles ; Probiyotikler = Probiotics ; İn vitro = In vitro ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Probiyotiklerin belirtilen etkilerini hastalık durumlarında göstermesine karşın sağlıklı bireylerde etkinliğinin değerlendirildiği oldukça az sayıda çalışma vardır. Bu çalışmanın amacı; farklı probiyotik türlerinin farklı yöntemlerle enkapsüle edilerek, in vitro koşullarda canlılık düzeylerinin değerlendirilmesi, kısa süreli depolama koşullarında stabilitelerinin belirlenmesi ve in vivo koşullarda farklı türdeki probiyotik bakterilerin, sağlıklı fare dokularında inflamasyon biyogöstergeleri üzerine etkilerinin incelenmesidir. Çalışmada ilk olarak, inflamasyonda etkili olduğu belirtilen Lactobacillus rhamnosus (LGG) ve Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) probiyotik bakterilerinin mikroenkapsülasyon (ME) ve nanoenkapsülasyon (NE) yöntemleri ile  enkapsülasyonu (EK) yapılmıştır. In vitro koşullarda canlılık düzeyi daha yüksek bulunan EK yöntemi seçilerek, bir hafta boyunca depolamadaki (+4°C) stabiliteleri değerlendirilmiştir. Çalışmanın in vivo aşamasında, C57BL/6J türü 35 adet sağlıklı erkek fare çalışmaya dahil edilmiştir. Farelere üretilen ME probiyotikler ve fosfat buffer saline (PBS); 6 hafta boyunca her gün oral gavaj ile verilmiştir. Müdahalenin sonunda karaciğer dokularından PCR ile inflamatuvar sitokinlerin (IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α ve IFN-γ) gen ekspresyon düzeyleri analiz edilmiştir. Çalışmanın sonunda; in vitro koşullarda serbest bakterilerin canlılığını büyük oranda kaybettiği (p<0.05), her iki yöntemle enkapsüle edilen bakterilerde ise canlılık oranlarının daha yüksek olduğu bulunmuştur (EcN için, p<0.05 ve LGG için p>0.05). Yöntemlere göre bakterilerin canlılığını koruma düzeylerine bakıldığında ise LGG için benzer oranlarda koruduğu görülürken (ME için, %41,9±1,24 ve NE için, %41,2±7,05), EcN için nanofiberle enkapsülasyona kıyasla, ME yönteminde canlılığın daha yüksek olduğu bulunmuştur (sırasıyla %71,2±1,65 ve %83,9±1,31, p<0.05). ME ve serbest formda bulunan bakteriler bir hafta depolandığında (+4°C), depolama süresince 1, 3 ve 7. günlerdeki canlılığında anlamlı bir azalma olmadığı görülmüştür (p>0.05). IFN-γ gen ekspresyon düzeylerinde serbest EcN, ME EcN ve kontrol grupları arasında anlamlı bir fark olduğu görülmüştür (p=0.048). IL-6, TNF-α, IL-4 ve IL-10'un gen ekspresyon düzeylerinde gruplar arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır (p>0.05). Bu çalışmanın sonuçları, in vitro koşullarda probiyotiklerin serbest formlarına kıyasla enkapsüle formlarının canlılıklarını daha iyi koruduğunu ve stabilitelerini arttırdığı, ayrıca sağlıklı farelerde probiyotik kullanımının inflamasyon üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığını göstermiştir. Bu çalışma sonuçlarının, farklı materyaller kullanılarak nanofiberle enkapsülasyon yöntemleri ve bu doğrultuda üretilen ürünlerin etkinliklerinin sağlıklı bireylerde de değerlendirilmesine yönelik yapılacak çalışmalara yol gösterici olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Probiotics have beneficial effects on several diseases although, very few studies evaluate their effects in healthy individuals. This study aimed to evaluate the viability levels of different probiotic species by encapsulation (EK) with different methods, compare the methods in vitro, determine their stability under short-term storage conditions, and examine the effects of probiotics on inflammation biomarkers in healthy mice in vivo. Lactobacillus Rhamnosus (LGG) and Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), which were known effective in inflammation, were encapsulated using microencapsulation (ME) and nanoencapsulation (NE) methods in the study. The method that preserves the higher viability of probiotics in vitro conditions was chosen, and their stability in storage conditions (+4°C) for one week was evaluated. In vivo assay was performed on the healthy C57BL/ 6J male mice (n=35). Microencapsulated probiotics and phosphate-buffered saline (PBS) were given to mice daily for six weeks by oral gavage. At the end of the probiotics intervention, inflammatory cytokine (IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α ve IFN-γ) gene expression levels were analyzed from the liver tissues. As a result,  free bacteria lost their viability significantly in vitro conditions (p<0.05), while the viability of probiotics were higher in bacteria encapsulated by both methods (p<0.05 for EcN and p>0.05 for LGG). When the encapsulation methods were compared in terms of viability, it was found that viability of LGG preserved similarly in both methods (for microencapsulation, 41.9±1.24% and nanofiber encapsulation, 41.2±7.05%). In contrast, the viability of EcN was higher in the microencapsulation method than encapsulation with nanofiber (83.9%±1.31% and 71.2%±1.65%, respectively, p<0.05). There was no significant decrease in their viability after the first, third and seventh days of storage (+4°C) (p>0.05). IFN-γ levels were significantly different between free EcN, ME EcN and control groups (p=0.048). There was no significant difference between the groups in IL-6, TNF-α, IL-4 and IL-10 levels (p>0.05). This study results indicate that the encapsulated forms of probiotics preserve the viability of probiotics greater, increase their stability than the free forms, and have no effect on inflammation in healthy mice. The results of this study are thought to guide the studies related to nanofiber encapsulation using different materials and to evaluate the effectiveness of the encapsulated probiotics in healthy individuals.