Travmatik kıkırdak defektinin rejenerasyonunda insanplatelet lizat ve düşük molekül ağırlıklı heparin protaminmikro-nanopartiküllerin etkinliğinin değerlendirilmesi:                                                 deneysel çalışma
Assessment of the effectiveness of human platelet lysate and low molecular weight heparin protamin micro-nanoparticles in the regeneration of traumatic cartilage defects: an experimental study
Yazar: MEHMET AKBALIK
Danışman: PROF. DR. ZEKERİYA TOSUN
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery

Özet:
Rejeneratif tıp, organ ve doku kaybının neden olduğu hastalık ve yaralanmaların zorluklarını ele almak için yenilikçi yaklaşımlar sunan önemli bir alandır. Son yıllarda, rejeneratif tıpta önemli ilerlemeler kaydedilmiş ve çeşitli tedaviler geliştirilip ticarileştirilmiştir.Rejeneratif tıp, kemik, kıkırdakve bağ yaralanmalarının tedavisinde de büyük potansiyel taşımaktadır. Nanoteknolojinin gelişmesi ile üretilen yeni moleküller iskelet sistemi yaralanmalarının tedavisinde yeni olanaklar sunmaktadır.
Platelet kaynaklı ürünler yumuşak doku ve iskelet sistemi lezyonlarının tedavisinde kullanılmaktadır. Plateletler, yara iyileşmesi sürecinde sentezledikleri proteinler ve moleküllerle aktif bir rol oynarlar. Özellikle Alfa granüllerinde bulunan büyüme faktörleri (PDGF, TGF-beta1, VEGF, FGF-2, HGF, EGF, IGF-1) yara iyileşmesinde önemli bir rol oynar. Bu faktörler, hücre proliferasyonunu, migrasyonunu ve doku yenilenmesini uyararak rejenerasyon sürecini hızlandırırlar. 
İnsan Platelet Lizatı, trombositlerin lizise uğratılmasıyla elde edilir. İçerdiği büyüme faktörleri ve sitokinler sayesinde doku iyileşmesini teşvik eder. İPL'nin PRP'den farkı, hücresiz bir yapıya sahip olması ve daha yüksek konsantrasyonlarda büyüme faktörleri içermesidir. Bu özellikleri sayesinde, İPL uzun süre düşük sıcaklıklarda saklanabilir ve PRP'ye göre daha uzun raf ömrüne sahiptir. Ayrıca, PRP'den farklı olarak, İPL'nin immunojenite endişelerini azaltması ve otolog olmamasına rağmen kullanılabilmesi büyük avantajlar sağlar.
Plateletlerin rejenaratif tıpta kullanımındaki en önemli kısıtlılık büyme faktörlerinin ömrünün kısa olması ve ortamdan difüze olmasıdır. Bunu önlemek için büyüme faktür taşıyıcları ve stabilizatörleri araştırılmıştır. DMAH/P N-MP buna örnektir.
DMAH ve protaminin 7/3 oranında birleşimi su içinde çözünmeyen nano/mikro partiküller oluşturabilir. DMAH/P N/MP bir polielektrolit komplekstir. Polielektrolit kompleksler (PEK'ler), zıt yük taşıyan polielektrolitler arasındaki elektrostatik etkileşimler sonucunda oluşurlar. Bu etkileşimlerin dengesiz oranlarda gerçekleşmesi durumunda her PEK parçacığının fazladan bir yük taşımasına neden olur. Proteinler, sentetik ve doğal PEK'lerle etkileşime geçebilir ve bağlanabilir
DMAH/P N/MP, büyüme faktörlerini bağlanır. DMAH/P N/MP büyüme faktörlerini taşıyarak hücre proliferasyonunu ve rejenerasyonu teşvik eder. Ayrıca, bu partiküller kök hücrelerde bulunan integrin benzeri proteinlere bağlanarak vaskülarizasyonu ve fibröz doku oluşumunu tetikler. 
Kondral defektlerin yönetiminde kullanılan mevcut tedaviler arasında artroskopik debridman ve lavaj, osteokondral greftleme, otojen kondrosit implantasyonu ve kemik iliği stimülasyon teknikleri bulunmaktadır. Osteokondral otolog greftleme, yük binen alandaki kıkırdak defektlerini yük binmeyen bölgeden alınan otolog greft ile tedavi etmeyi amaçlar. Otojen kondrosit implantasyonu tekniği ise eklem kıkırdağından alınan hücrelerin uygun ortamlarda kültüre edilerek defekt bölgesine enjekte edilmesini içerir. Mikrofraktür tekniği bir kemik iliği stimülasyon tekniğidir. Mikrofraktür en çok destek bulan onarıcı yöntemlerden biridir. Bu teknikte, subkondral kemik plağı kontrollü olarak delinir böylece mezenkimal kök hücreler ve büyüme faktörleri defekt bölgesine çekilerek fibrokartilaj onarım dokusu oluşturulur. 
Bu çalışmada İPL ve DMAH/P N-M/P'nin kıkırdak rejenerasyonuna etkisinin değerlendirilmesi için tavşan kullanılarak deney modeli oluşturuldu. 5 grupta toplam 40 New Zealand tavşanda çalışma gerçekleştirildi. Medial parapatellar artrotomi yapıldı. Punch ile femoral trokleada 3 mm çapında 4 mm derinliğinde defekt oluşturuldu. Sadece 2. Gurup tavşanda punch ile oluşturulan defektte alınan greft yerine iade edlidi. İntraoperatif; 1. gruba 0.5 cc sf uygulandı. Çıkarılan kıkırdağın, greft olarak yerine iade edildiği 2. Gruba 0.5 cc sf enjeksiyonu yapıldı. 3. Guruba intraoperatif 0.5 cc insan platelet lizat enjekte edildi. 4. Guruba intraoperatif 0.5 cc düşük molekül ağırlıklı heparin protamin mikro-nanopartikül enjekte edildi. 5. Guruba intraoperatif 0.5 cc insan platelet lizat ve 0.5 cc düşük molekül ağırlıklı heparin protamin mikro-nanopartikül enjekte edildi. Post operatif 1. Ve 2. haftada intraartiküler 1. Gruba 0.5 cc SF, 2. Gruba 0.5 cc SF, 3 gruba 0.5 cc İPL, 4. Gruba DMAH/P N/MP, 5. Gruba 0.5 cc İPL ve 0.5 cc DMAH/P N/MP enjekte edildi. 6. Haftada tüm tavşanlar yüksek doz anestezi ile sakrifiye edildi.
Bu çalışmada İPL kullanılan gurupta anjiyogenez ve kıkırdak proliferasyonunda SF kullanılan gruptan istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulunmuştur. Ancak İPL gurubu anjiyogenez ve VEGF değerlendirildiğinde DMAH/P N/MP gurubundan anlamlı olarak düşük bulunmuştur. Kıkırdak defektinde kemik iliği stimülasyonu için 2-4 mm derinlikte defektler önerilmektedir. Bizim çalışmamızda oluşturulan defekt derinliği 4mm'dir buda kemik iliğinin defekte dolmasını sağlamaktadır. Kemik iliği kaynaklı kök hücre ve büyüme faktörlerinin açığa çıkması iyileşmeyi tetiklemektedir. Çalışmamızda kullandığımız DMAH/P N/MP'lerin kemik iliği kaynaklı kök hücre ve büyüme faktörlerini stabilize ederek rejeneasyona katkı sağlaması beklenmiştir. 
İstatistiksel olarak değerlendirdiğimizde DMAH/P N/MP kullanılan grubun SF ve Greft grubuna göre ossifikasyon, anjiyogenez ve organizasyonda anlamlı olarak üstün olduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıca yapılan pcr değerlendirmesinde VEGF DMAH/P N/MP grubunda SF,Greft grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur.
Greft grubu histolojik değerlendirmesinde ossifikasyon, anjiyogenez ve organizasyonda DMAH/P N/MP ve DMAH/P N/MP -İPL gurubundan daha düşük çıksada kıkırdak hücre sayısında tüm diğer gruplardan anlamlı olarak daha yüksek bulunmuştur. Bu kıkırdak dokusunun avasküler, anöral ve oksijensiz ortamda sağkalımındaki başarısında bağlanmıştır.
Hem histolojik değerlendirme hemde pcr değerlendirmesinde bütün serilerde DMAH/P N/MP ve DMAH/P N/MP -İPL gruplarında benzer sonuçlar çıkmıştır.Bu çalışmada bütün biyopsiler 6. haftada değerlendirilmiştir. 6. haftada tek başına DMAH/P N/MP, DMAH/P N/MP -İPL grubu ile benzer sonuç göstersede farklı zaman aralıklarında bunun değişkenlik gösterebileceği düşünülmektedir. Bunun için farklı zaman aralıklarında rejenerasyonu değerlendirecek ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. 
Deney sonucunda DMAH/P N/MP'nın rejenerasyona önemli ölçüde katkı sağladığı görülmüştür. Artiküler kartilaj defektinin rejenerasyonunda kemik iliği stimülasyonu için mikrofraktür veya drilleme birçok cerrah tarafından hala kullanılmaktadır. Kemik iliği stimülasyonu yapan bu yöntemlerle beraber, kök hücre ve büyüme faktörü stabilizatörü olan DMAH/P N/MP'nın kullanılması etkili bir silah olacaktır. Bu çalışmamızın literatüre en önemli katkısıdır.

Abstract:
Regenerative medicine is an important field that offers innovative approaches to address the challenges of diseases and injuries caused by organ and tissue loss. In recent years, significant progress has been made in regenerative medicine, and various treatments have been developed and commercialized. Regenerative medicine also holds great potential in the treatment of bone, cartilage, and ligament injuries. The development of nanotechnology has provided new opportunities for the treatment of skeletal system injuries with newly produced molecules.
Platelet-derived products are used in the treatment of soft tissue and skeletal system lesions. Platelets play an active role in the wound healing process with the proteins and molecules they synthesize. Growth factors (PDGF, TGF-beta1, VEGF, FGF-2, HGF, EGF, IGF-1) found in Alpha granules, in particular, play a significant role in wound healing. These factors accelerate the regeneration process by stimulating cell proliferation, migration, and tissue renewal.
Human Platelet Lysate (HPL) is obtained by lysing platelets. It promotes tissue healing through its contained growth factors and cytokines. Unlike Platelet-Rich Plasma (PRP), HPL is a cell-free structure and contains higher concentrations of growth factors. Due to these properties, HPL can be stored for a long time at low temperatures and has a longer shelf life compared to PRP. Moreover, unlike PRP, HPL reduces concerns about immunogenicity and can be used despite not being autologous, providing significant advantages.
The main limitation in the use of platelets in regenerative medicine is the short lifespan and diffusion from the environment of growth factors. To prevent this, growth factor carriers and stabilizers have been investigated. DMAH/P N-MP is an example of this.
The combination of DMAH and protamine in a 7/3 ratio can create insoluble nano/micro particles in water. DMAH/P N/MP is a polyelectrolyte complex. Polyelectrolyte complexes (PECs) form as a result of electrostatic interactions between oppositely charged polyelectrolytes. When these interactions occur in unbalanced proportions, each PEC particle carries an extra charge. Proteins can interact and bind with synthetic and natural PECs.
DMAH/P N/MP binds growth factors. By carrying growth factors, DMAH/P N/MP promotes cell proliferation and regeneration. Additionally, these particles trigger vascularization and fibrous tissue formation by binding to integrin-like proteins found in stem cells.
Current treatments for managing chondral defects include arthroscopic debridement and lavage, osteochondral grafting, autologous chondrocyte implantation, and bone marrow stimulation techniques. Autologous osteochondral grafting aims to treat cartilage defects in weight-bearing areas with an autologous graft taken from non-weight-bearing areas. Autologous chondrocyte implantation involves culturing cells taken from joint cartilage and injecting them into the defect area. The microfracture technique is a bone marrow stimulation technique. Microfracture is one of the most supported reparative methods. In this technique, the subchondral bone plate is deliberately perforated, allowing mesenchymal stem cells and growth factors to be drawn to the defect area, creating a fibrocartilage repair tissue.
In this study, an experimental model was created using rabbits to evaluate the effect of HPL and DMAH/P N-M/P on cartilage regeneration. A total of 40 New Zealand rabbits were studied in 5 groups. Medial parapatellar arthrotomy was performed. A 3 mm diameter, 4 mm depth defect was created in the femoral trochlea with a punch. Only in Group 2 rabbits, the graft was returned to the defect created with the punch. Intraoperatively, 0.5 cc SF was applied to Group 1. In Group 2, a 0.5 cc SF injection was performed in the defect where the removed cartilage was returned as a graft. In Group 3, 0.5 cc human platelet lysate was injected intraoperatively. In Group 4, 0.5 cc low molecular weight heparin protamine micro-nanoparticles were injected intraoperatively. In Group 5, 0.5 cc human platelet lysate and 0.5 cc low molecular weight heparin protamine micro-nanoparticles were injected intraoperatively. Postoperatively, intra-articular injections were performed in Weeks 1 and 2. In Week 6, all rabbits were sacrificed under high-dose anesthesia.
In the group where HPL was used, angiogenesis and cartilage proliferation were found to be statistically significantly higher than in the SF group. However, when the HPL group was evaluated for angiogenesis and VEGF, it was found to be significantly lower than the DMAH/P N/MP group. The depth of the defect in the cartilage defect is recommended to be 2-4 mm for bone marrow stimulation. The depth of the defect created in our study is 4mm, which ensures that the bone marrow fills the defect. The release of bone marrow-derived stem cells and growth factors triggers healing. It was expected that the DMAH/P N/MPs used in our study would contribute to regeneration by stabilizing bone marrow-derived stem cells and growth factors.
Statistically, it was concluded that the group using DMAH/P N/MP was superior to the SF and Graft groups in ossification, angiogenesis, and organization. Additionally, in the PCR evaluation, VEGF were found to be significantly higher in the DMAH/P N/MP group compared to the SF and Graft groups.
In the histological evaluation of the Graft group, although ossification, angiogenesis, and organization were lower than the DMAH/P N/MP and DMAH/P N/MP - HPL groups, the number of cartilage cells was significantly higher than in all other groups. This is attributed to the success of cartilage tissue survival in avascular, aneural, and hypoxic environments.
Both histological evaluation and PCR evaluation yielded similar results in all series. All biopsies in this study were evaluated at Week 6. Although DMAH/P N/MP alone showed similar results with the DMAH/P N/MP - HPL group at Week 6, it is considered that this may vary at different time intervals. Therefore, further studies are needed to evaluate regeneration at different time intervals.
The experiment results revealed that DMAH/P N/MP significantly contributed to regeneration. Microfracture or drilling is still used by many surgeons for bone marrow stimulation in the regeneration of articular cartilage defects. Along with these methods for bone marrow stimulation, the use of DMAH/P N/MP, a stem cell and growth factor stabilizer, will be an effective tool. This is the most important contribution to the literature.