Zymomonas mobilis levansukrazının üretimi, saflaştırılması ve kristalizasyonu
Production, purification and crystallisation of Zymomonas mobilis levansucrase
Yazar: GÜLER SÖZGEN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ BURCU KAPLAN TÜRKÖZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Levansukrazlar (E.C.2.4.1.10), sakkarozu substrat olarak kullanarak fruktoz polimerlerinin oluşumunu katalizleyen ve yüksek hidroliz aktiviteleri
nedeniyle GH68 glikozit hidrolaz enzim ailesinde yer alan enzimlerdir. Bu tezde Zymomonas mobilis subsp. mobilis NRRL B-14023 levansukrazının üretimi, saflaştırılması ve üç boyutlu yapının elde edilmesi için kristalizasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir.
Hücre dışı bir enzim olan Z. mobilis levansukrazı 159.01 g/L başlangıç substrat konsantrasyonunda, 30.3 °C sıcaklıkta ve pH 4.91'de statik fermantasyon ile üretilmiştir.
Saflaştırma için ilk önce ve fermantasyon ortamından hücreler santrifüj yoluyla ayrılmıştır. Levansukrazı içeren üstfaz liyofilize edilerek hacim
azaltılması gerçekleştirilmiş ve farklı tamponlar (sitrat fosfat, fosfat, hepes) ve farklı pH'lara (5.4, 7.0, 8.0, 7.4) karşı diyaliz edilmiştir. İleri saflaştırma için iyon değişim ve jel filtrasyon kromatografisi kullanılarak levansukraz enzimi saflaştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre en iyi saflık ve homojenlik 100 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM DTT tamponu ile elde edilmiştir. Jel filtrasyon kromatografisi ile enzim dimerik ve monomerik formlarda birbirinden ayrı olarak elde edilmiştir.
Saflaştırmanın farklı aşamalarında elde edilen proteinler ile hem sallanan hem de oturan damla yöntemleri ile birçok farklı kristalizasyon koşulu denenmiştir. Yapılan 744 farklı deneme sonrasında levansukraz kristalleri elde edilememiştir.
Z. mobilis levansukrazın levan üretme aktivitesi araştırılmıştır. Levan üretme aktivitesi zimogram analizi ile belirlendikten sonra levan üretimi için farklı sıcaklık ve süreler denenmiş ve denemeler arasında en iyi inkübasyon süresi ve sıcaklığı 24 saat ve 25 ° C olarak bulunmuştur. Levan üretim miktarına etki eden faktörler incelenmiş ve artan NaCl konsantrasyonunda levan üretiminde azalma olduğu görülmüştür. Ayrıca 10 mM EDTA ve MgCl2 varlığında enzimin levan üretim aktivitesinde azalma olduğu bulunmuştur. Denemeler sonucunda Z. mobilis levansukrazı ile 62.42 ±0.28 g/L levan üretimi gerçekleştirilmiştir.

Abstract:
Levansucrases [E.C.2.4.1.10] are β-D fructosyltransferase enzymes which catalyze the formation of fructose polymers using sucrose as substrate and are also classified in glycoside hydrolase (GH) family 68 due to their high hydrolysis activity. In this thesis, production, purification and crystallization of levansucrase by Z. mobilis subsp. mobilis NRRL B-14023 was investigated.
Extracellular levansucrase of Z. mobilis was produced by static culture fermentation at an initial substrate concentration of 159.01 g / L, a temperature of 30.3 ° C and a pH of 4.91.
At the first step of purification cells were separated by centrifugation. The enzyme containing supernatants were lyophilized and dialyzed against different buffers (citrate phosphate, phosphate, hepes) with different pH values (5.4, 7.0, 8.0, 7.4). Levansucrase was further purified by ion axchange and gel filtration chromatography. The highest purity and homogenity were obtained in buffer 100 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl and 1 mM DTT. The monomeric and dimeric form of levansucrase were seperated by gel filtration.
The crystallization conditions were investigated using both hanging drop and sitting drop techniques with the proteins obtained at different stages of purification. After 744 trials levansucrase crystals could not be obtained.
Levan production activity of levansucrase was investigated. Levan production activity of levansucrase was shown by zymogram analysis and after that levansucrase's incubation time and temperature for levan production were found as 24 h and 25°C. Effects of ionic strength and different metal ions on levan production activity of Z. mobilis levansucrase were also investigated. Levan production decreased in the presence of increasing concentration of NaCl, in the presence of 10 mM EDTA significantly and also decreased in the presence of 10 mM MgCl2. As a result, 62.42 ±0.28 g/L levan was produced.