İletken polimer/çok duvarlı karbon nanotüp modifikasyonuna dayalı mikrobiyal temelli biyosensör tasarımı ve parasetamol tayininde kullanılması
Development of microbial biosensor based on conductive polymer/multiwalled carbon nanotube and its application to paracetamol determination
Yazar: EZGİ BAYRAM
Danışman: PROF. DR. EROL AKYILMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu tez çalımasında biyosensör teknolojisine yeni ve orijinal bir bakış açısı getiren parasetamol tayinine yönelik, polianilin - çok duvarlı karbon nanotüp (MWCNT) - Basillus sp. - glutaraldehit modifiye mikrobiyal biyosensör geliştirilmesi amaçlandı. Bu biyosensör sisteminde anilin ve MWCNT kullanılarak altın (Au) elektrot yüzeyinde elektropolimerizasyon ile polianilin kompozit yapısı oluşturuldu. Modifiye Au elektrot yüzeyinde MWCNT bulunmasından ileri gelen karboksil grupları, EDC-NHS ile aktifleştirilerek damlatma yöntemiyle Basillus sp. yüzeye immobilize edildi. Glutaraldehit (GA) ile çapraz bağlama yapılarak mikroorganizmaların yüzeyden kaçışı engellenmiş oldu.
Tasarlanan biyosensör sistemiyle parasetamol ölçümleri 0,5 V' ta amperometrik metodla yapılmıştır. Bunun yanısıra differensiyal puls (DP) ve döngüsel voltammogramlar (DV) metodları ile de biyosensör cevabı tayin edilmiş ve bazı optimizasyon çalışmalarında (0 - 0,8) V aralığında DP metodu kullanılmıştır. Parasetamol konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak artan akım değerlerinden yola çıkılarak tayinler gerçekleştirilmiştir. 
Geliştirilen biyosensörün optimizasyon çalışmalarında öncelikle Au elektrot yüzeyinde oluşturulan biyoaktif tabakanın bileşenlerine yönelik çalışmalar yapıldı. Bu doğrultuda, optimum anilin, MWCNT, EDC-NHS, mikroorganizma ve GA miktarının belirlenmesine yönelik çalışmalar gerşekleştirildi. Çalışma koşullarının optimize edilmesi için sıcaklık ve pH optimizasyonu çalışmaları yapıldı. Mikrobiyal biyosensörün karakterizasyonuna yönelik yapılan çalışmalarda ise parasetamol doğrusal tayin aralığının belirlenmesi, tekrarlanabilirlik, depo kararlılığı, substrat spesifikliği, girişim etkisi parametreleri araştırılmış ve ilaç örneklerinde parasetamol tayini yapılmıştır.    
Optimizasyon çalışmaları sonucunda parasetamol tayine yönelik olarak geliştirilen mikrobiyal biyosensör için en uygun  optimum anilin, MWCNT, EDC-NHS, mikroorganizma ve GA miktarı sırasıyla; 0,05 M, 1 mg/mL, 1 : 1,5 M, 10 mg/mL ve % 0,5 bulunmuştur. Çalışma koşullarının optimizasyonu amacıyla yapılan denemelerde mikrobiyal biyosensör için çalışma tamponu olarak 50 mM pH 7,0 fosfat tamponu ve çalışma sıcaklıklığı 30 ˚C olarak tespit edilmiştir. Mikrobiyal biyosensörün karakterizasyonuna ilişkin yapılan çalışmalarda 0,5 V amperometrik metot için doğrusal tayin aralığı 25 – 250 µM ve tayin limiti 7,9 µM ve cevap süresi 4,8 s olarak bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik denemelerinde ise 250 µM parasetamol için (n=7) ortalama değer 250,65 µM, standart sapma (S.S) ±1,55 µM ve varyasyon katsayısı (V.K) % 0,62 olarak bulunmuştur. Ayrıca geliştirilen mikrobiyal biyosensör ve referans bir metot ile ilaç örneklerinde parasetamol tayini de yapılmıştır.

Abstract:
In this thesis, development of a multi-walled carbon nanotube (MWCNT) -Basillus sp. - glutaraldehyde modified microbial biosensor which brings a new and original perspective to biosensor technology intended for paracetamol determination. Polianiline-MWCNT composite was formed with aniline and MWCNT on a gold electrode (Au) surface in this biosensor system. Basillus sp. was immobilized on the electrode surface by dropping after activated of carboxl groups by EDC-NHS. Microorganism was crosslinked by glutaraldehyde (GA) so that prevented of running away the microorganism from the surface of the biosensor.
Paracetamol measurements were carried out at 0.5 V with amperometric method by developed biosensor system. In addition, detection of the response of the biosensor by using differential pulse (DP) and cyclic voltammetry (CV) methods and DP method was used for some immobilization studies at (0 - 0.8) V potential range. The measurements were carried out with the determination of increasing current values directly proportional with paracetamol concentration using amperometric method.
In the optimization studies of the biosensor firstly bioactive layer components such as optimum aniline concentration, optimum MWCNT amount, optimum EDC-NHS proportion, optimum microorganism amount and optimum glutaraldehyde concentration were carried out. In the optimization of working conditions; optimum pH and optimum temperature were also investigated. In the characterization studies of the biosensor some paramaters such as linearity, reproducibility, storage stability, substrat specificity, interference effect and drug sample analysed were determined. 
From the result of the optimization studies, the optimum aniline concentration, optimum MWCNT amount, optimum EDC-NHS proportion, optimum microorganism amount and optimum glutaraldehyde concentration were determined to 0.05 M, 1 mg/mL, 1 : 1.5 M, 10 mg/mL ve 0.5 %, respectively. From the experiments the phosphate buffer (50 mM, pH 7.0) and 30˚C were chosen to be optimum working conditions for the microbial biosensor. It was determined at the characterization studies on the biosensor that linear curves were obtained between the ranges from 25 to 250 µM paracetamol concentration, detection limit and response time were reached 7.9 µM and 4.8 s, respectively. At the repeatability experiments (n=7), the average value, standard deviation, (SD) and coefficent of variation (CV %) were calculated to be  250.65 µM, ±1.55, 0.62 % for 250 µM paracetamol concentration, consecutively. Also, determination of paracetamol were carried out in drug samples by developed biosensor and a reference method.