Farklı bor konsantrasyonlarında yetiştirilen Arabidopsis thaliana L. bitkilerinde 24-epibrassinolid'in etkilerinin araştırılması
Investigation of 24-epibrassinolide effects on Arabidopsis thaliana L. plants grown under different boron concentrations
Yazar: YONCA SURGUN
Danışman: PROF. DR. BETÜL BÜRÜN
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics
Dizin: Arabidopsis thaliana = Arabidopsis thaliana ; Bor stresi = Boron stress ; Büyüme = Growth ; Fizyolojik parametreler = Physiological parameters ; Gen ifadesi = Gene expression ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Brassinosteroidler  (BR'ler) bitki büyüme ve gelişimindeki önemli rollerinin yanı sıra, çevresel streslere karşı toleransı da arttırmaktadır. Bu çalışmada, moleküler ve fizyolojik çalışmaların öncü ve tercih edilen bitkisi olan Arabidopsis thaliana L.'da borun yaratacağı stres ve buna karşı brassinosteroidlerin anti-stres etkileri biyokimyasal ve moleküler düzeyde araştırılmıştır. Biyokimyasal deneyler kapsamında A. thaliana bitkileri hidroponik olarak yetiştirilmiş ve dört haftalık bitkiler 50 veya 100 ppm borik asit içeren ortamlara aktarılmıştır. Borik asit uygulamalarını takiben bitkilerin yapraklarına spreyleme yöntemi ile 0.01 veya 1 µM 24-Epibrassinolid (EBL) uygulamaları yapılmıştır. Borik asit konsantrasyonundaki artış ile bitkilerde büyüme inhibe olmuş ve toksik semptomlar ortaya çıkmıştır. EBL uygulamaları yüksek bor konsantrasyonu altında büyüme (gövde yaş ve kuru ağırlığı, yaprak alanı, meyve boyu ve ağırlığı), pigment içeriği (total klorofil ve karotenoid) ve antioksidan sistem üzerinde artışlar sağlamıştır. Katalaz (E.C. 1.11.1.6), askorbat peroksidaz (E.C. 1.11.1.11) ve guaiakol peroksidaz (E.C. 1.11.1.7) enzim aktivitelerinin artışında genel olarak düşük konsantrasyonda EBL uygulaması daha etkili iken süperoksit dismutaz (E.C. 1.15.1.1) enzim aktivitesi ve prolin miktarındaki artışlar EBL konsantrasyonundaki artışla paralel olmuştur. Borik asit uygulamalarıyla artış gösteren lipid peroksidasyon miktarı EBL uygulamaları sonucu istatiksel olarak önemli olacak şekilde azalmıştır. Bununla birlikte, 1 µM EBL uygulaması yaprak, kök ve çiçek salkımı kısımlarında bor birikimini azaltmıştır. Sonuç olarak, EBL uygulamaları ile düşük konsantrasyonda borun yarattığı stresin etkileri nötralize edilirken, yüksek konsantrasyonda borun yarattığı inhibisyonun kısmen üstesinden gelinmesi sağlanmıştır. 
Moleküler deneyler kapsamında dört haftalık A. thaliana bitkileri borik asit (50 ve 100 ppm) ve/veya EBL (0.01 ve 1 µM) ilaveli besin ortamında 60 saat boyunca inkübe edilmiştir. EBL uygulamalarının bor taşıyıcı genlerin (BOR1, BOR2, BOR3, BOR4 ve BOR5), yüksek bor konsantrasyonu altında ekspresyonu teşvik olan genlerin (MATE taşıyıcı ve Hsp-like), hücre döngüsü (CycD3;1) ve hücre duvarı ile ilgili genlerin (TCH4 ve KOR), BR'ler tarafından ekspresyonları teşvik edilen genlerin (Hsp 70-4 ve Hsp 90-1) ve diğer streslerle ile ilgili genlerin (LTI/COR78 ve LEA4-5) ekspresyonları üzerine etkileri borik asit uygulamalarına maruz bırakılan A. thaliana bitkilerinin yaprak ve kök dokularında semi-quantitative RT-PCR tekniği ile araştırılmıştır. Borik asit uygulamaları BOR1 ve BOR3 genlerinin ekspresyonları hem yaprak hem kök dokusunda azaltırken, EBL uygulaması (1 µM) kök dokusunda bu genlerin ekspresyonlarını daha da azaltmıştır. BOR2 ve BOR4 genlerinin mRNA seviyesi hem yaprak hem kök dokusunda artan borik asit konsantrasyonlarına paralel olarak artmıştır. 1 µM EBL tek başına ya da borik asit uygulamaları ile birlikte kökte BOR4 geninin ekspresyonunda önemli azalmalara neden olmuştur. Borik asit uygulamaları sonucu MATE taşıyıcı geninin ekpresyon profili yaprak ve kökte farklılık göstermiş bununla birlikte tek başına ya da borik asit uygulamaları ile birlikte yapılan EBL uygulamaları sonucu her iki dokuda da ekspresyon artmıştır. Hsp-like geninin mRNA seviyesi araştırılan her iki dokuda da borik asit ve EBL uygulamaları sonucu artmıştır. Borik asit ve EBL uygulamaları CycD3;1, TCH4, KOR, Hsp70-4 ve Hsp90-1 genlerinin mRNA seviyelerini yaprak dokusunda çok fazla değiştirmez iken, kök dokusunda yapılan uygulamalar sonucu farklı sonuçlar gözlenmiştir. Borik asit uygulamaları LTI/COR78 ve LEA4-5 genlerinin ekspresyonlarını arttırmış ve yüksek konsantrasyonda EBL uygulaması bu genlerin ekspresyonlarını arttırmada daha etkili olmuştur. Sonuç olarak elde edilen bulgular brassinosteroidlerin strese yanıtta koruyucu özelliklerini anlamaya yönelik önemli veriler sağlamıştır. 
Bu spesifik konuya ilk biyokimyasal ve moleküler yaklaşım olma özelliğine sahip olan tez çalışması, bor-brassinosteroid ilişkisinin göreceli olarak detaylı araştırılmasının yanında, tarımda pratik uygulamalar için bilgi sağlayacak temel bir araştırma niteliğini taşımaktadır.

Abstract:
Brassinosteroids (BRs) improve the tolerance of plants for various environmental stresses and its pivotal role in plant growth and development. In this study, the stress induced by boron and the anti-stress responses generated by BRs were investigated at the biochemical and molecular level in Arabidopsis thaliana (L.) as a model plant for molecular and physiological studies. In biochemical studies, A. thaliana plants were grown in hydroponic culture and four-week-old plants were transferred to the media containing 50 or 100 ppm boric acid. Following boric acid treatment, 0.01 or 1 µM 24-Epibrassinolide (EBL) was sprayed on the whole foliar region of the seedlings. As the boron concentrations increased, the growth of the plants was comparatively inhibited and the toxic symptoms were observed. EBL treatments increased growth (shoot fresh and dry mass, leaf area, silique number, length and weight), pigment content (total chlorophyll and caroteneoid) and antioxidant system in the plants under high boron conditions. While the activities of catalase (E.C. 1.11.1.6), ascorbate peroxidase (E.C. 1.11.1.11) and guaiacolperoxsidase (E.C. 1.11.1.7) were found higher especially when the lower concentrations of EBL (0.01 µM) used, the increase in the activity of superoxide dismutase (E.C. 1.15.1.1) and proline content were proportional to the concentration of EBL. Enhanced level of lipid peroxidation observed during high boron stress in the plants and then decreased following EBL treatment. Also, 1 µM EBL treatment considerably decreased boron accumulation in the leaves, roots and inflorescences. In conclusion, while the effects of the stress caused by the low boron concentration were overcome by means of follow up EBL treatments, the detrimental effects of toxicity were only partially overcome under higher boron concentration. 
In molecular studies, four-week-old A. thaliana plants were transferred to media containing boric acid (50 and 100 ppm) and/or EBL (0.01 and 1.0 µM) and incubated for 60 hours. The effects of EBL treatments on expression patterns of boron transporter genes (BOR1, BOR2, BOR3, BOR4 and BOR5), high boron-induced genes (MATE transporter and Hsp-like), cell cycle (CycD3;1) and cell wall-related genes (TCH4 and KOR), BR-induced genes (Hsp70-4 and Hsp90-1) and other stress-related genes (LTI/COR78 and LEA4-5) were examined in response to boric acid, using semi-quantitative RT-PCR in leaf and root tissues of A. thaliana. Boric acid treatments led to down regulation of BOR1 and BOR3 genes in leaf and root tissues and addition of EBL (1 µM) decreased expression of these genes in roots. The transcript levels of BOR2 and BOR4 increased in leaf and root tissues in response to boric acid. A significant down regulation of BOR4 gene expression was observed in roots by EBL (1 µM) alone or with boric acid treatments. MATE transporter showed different expression patterns in leaf and root tissues after boric acid treatments, whereas treatment with EBL alone or together with boric acid caused up regulation of this gene in both tissues. mRNA levels of Hsp-like gene were higher in both tissues of the seedlings treated with boric acid and EBL. While transcript levels of CycD3;1, TCH4, KOR, Hsp70-4 and Hsp90-1 genes were slightly changed in leaf under all treatments, expression patterns of these genes showed differences in root tissues. Expression of LTI/COR78 and LEA4-5 genes was induced by boric acid and higher concentration of EBL was found to be more effective in increasing expression of these genes. To conclude, the results provide inputs towards understanding protective properties of BRs in stress response.
Focusing the value of presenting a biochemical and molecular approaches, this thesis is the first study in the specific field, and carries the potential quality of the basic research that would provide the knowledge for practical agricultural applications, and also presents the detailed understanding for the relationships between boron and brassinosteroids.