Üçlü faz sistemi ile B. licheniformis SO8'den lakkaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve boyar madde dekolorizasyonunda kullanılması
Purification and characterization of laccase from B. licheniformis SO8 by three-phase partitioning system and its application in decolorization of dye
Yazar: SEMİH YILDIRGAN
Danışman: PROF. DR. MELDA ŞİŞECİOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Ayırma = Separation ; Bacillus licheniformis = Bacillus licheniformis ; Enzim aktivitesi = Enzyme activity ; Lakkaz = Laccase ; Renk giderme = Decolorization

Özet:
ÖZET 
YÜKSEK LİSANS TEZİ ÜÇLÜ FAZ SİSTEMİ İLE Bacillus licheniformis SO8'DEN LAKKAZ 
ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI, KARAKTERİZASYONU VE BOYAR MADDE 
DEKOLORİZASYONUNDA KULLANILMASI Semih YILDIRGAN 
Danışman: Prof. Dr. Melda ŞİŞECİOĞLU 
Amaç: Lakkazlar, nispeten geniş aralıktaki aromatik bileşiklerin, organik kirleticilerin ve inorganik substratların oksidasyonunu katalizleyebilme özellikleri nedeniyle çeşitli çevresel ve endüstriyel uygulamalarda oldukça büyük bir potansiyel göstermekte ve yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında; termofilik Bacillus licheniformis SO8'den lakkaz enziminin hızlı, basit, genellikle tek adımda gerçekleştirilen bir biyo-ayırma tekniği olan üç fazlı ayırma yöntemi (TPP) ile saflaştırılması, biyokimyasal karakterizasyonu ve enzimin biyoteknolojik açıdan uygulanabilirliğinin araştırılması hedeflenmiştir. 
Yöntem: B. licheniformis SO8 (GenBank No: MG076978) suşundan lakkaz enzimi TPP yöntemi kullanılarak saflaştırılmış, saflaştırılan lakkaz enziminin biyokimyasal karakterizasyon çalışmaları kapsamında optimum sıcaklık ve pH, stabil sıcaklık ve pH, substrat spesifitesi, enzime bazı metal iyonlarının, organik çözücülerin, yüzey aktif maddelerin ve inhibitörlerin etkisi incelenmiştir. Ayrıca, lakkazın çeşitli sentetik boyarmaddelerin renk giderimindeki etkileri araştırılmıştır. 
Bulgular: Lakkaz enziminin TPP yöntemiyle saflaştırılması sırasında ilk olarak  tuz, organik çözgen ve pH optimizasyonu yapıldı ve pH 9,0'da, 1,0:1,0 (ham enzim çözeltisi:t-bütanol oranı) ve %70 doygun amonyum sülfat kullanılarak enzim, %102,07 verimle 5,65 kat saflaştırıldı. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile ~38,7 kDa olarak hesaplandı. Lakkaz enzimi için optimum pH 9,0 ve optimum sıcaklık 70°C olarak belirlendi. Enzimin 20-90°C sıcaklık aralığında tüm sıcaklık değerlerinde, 1 saatlik inkübasyon süresinin sonunda %65 oranında aktivitesini koruduğu tespit edildi. %1 ve %5'lik konsantrasyonlardaki yüzey aktif maddelerin varlığında enzimin yüksek oranda stabil kaldığı, Fe2+ ve Mn2+ metalleri varlığında ise enzimin aktivitesinin arttığı belirlendi. B. licheniformis SO8 lakkaz enziminin ABTS substratı için Km, Vmax,  Kcat ve Kcat/ Km değerleri sırasıyla 110 μM, 19,6 μmol.L-1.dk-1, 0,048 s-1 ve  0,44 s-1.mM-
1 olarak hesaplandı. Son olarak lakkaz enziminin bazı sentetik boyalarının renk giderimi üzerine 
etkisini incelemek için Asit siyah 1, Kongo kırmızı, Metilen mavisi, Turuncu, Asit kırmızı 27, Reaktif siyah 5 boyaları kullanıldı ve en yüksek boya gideriminin Asit Kırmızı 27 boyası üzerinde ~%38 oranında olduğu tespit edildi. 
Sonuç: Lakkazların çevre ve endüstriyel biyoteknolojideki artan uygulamaları göz önüne alındığında, farklı fizikokimyasal ve katalitik özelliklere sahip lakkaz üreten yeni suşları keşfetmek oldukça önemlidir. Ekstraselüler lakkaz üreten B. licheniformis SO8'den saflaştırılan enzimin alkali pH ve yüksek sıcaklık koşullarında uzun bir süre aktivesini koruduğu tespit edildi. Bu durum, saflaştırılmış lakkazı çeşitli endüstriyel işlemler için uygun hale getirmektedir. Ayrıca lakkazın renk giderme özelliği, metal iyonlarına karşı önemli bir stabiliteye sahip olması endüstriyel atık suların renksizleştirilmesinde ve atık su arıtımında olası uygulamaya sahip olabileceğini göstermektedir. 
Anahtar Kelimeler: Lakkaz, Bacillus licheniformis, TPP, enzimatik karakterizasyon, dekolorizasyon. Eylül 2022, 80 sayfa

Abstract:
ABSTRACT 
MASTER THESIS PURIFICATION OF LACCASE FROM Bacillus licheniformis SO8 WITH THREE PHASE PARTITIONING, CHARACTERIZATION, AND USAGE IN DYE DECOLORIZATION Semih YILDIRGAN Supervisor: Prof. Dr. Melda ŞİŞECİOĞLU 
Purpose: Laccases show great potential and are widely used in various environmental and industrial applications due to their ability to catalyze the oxidation of a relatively wide range of aromatic compounds, organic pollutants and inorganic substrates. In this thesis study; Purification of laccase enzyme from thermophilic Bacillus licheniformis SO8 by three-phase separation method (TPP), which is a fast, simple, usually one-step bioseparation technique, biochemical characterization and investigation of the biotechnological applicability of the enzyme. 
Method: Within the scope of biochemical characterization studies of laccase enzyme purified from B. licheniformis SO8 (GenBank No: MG076978) strain using TPP method, optimum temperature and pH, stable temperature and pH, substrate specificity, some metal ions, organic solvents, surfactants and The effect of inhibitors was studied. In addition, the effects of laccase on the decolorization of various synthetic dyestuffs were investigated. 
Finding: During the purification of the laccase enzyme by TPP method, salt, organic solvent and pH optimization were performed first, and the enzyme was synthesized using 1.0:1.0 (raw enzyme solution:t-butanol ratio) and 70% saturated ammonium sulfate at pH 9.0. It was purified 5.65-fold in 102.07% yield. The molecular mass of the enzyme was calculated as ~38.7 kDa by SDS-PAGE. The optimum pH was determined as 9.0 and the optimum temperature for the laccase enzyme was determined as 70°C. It was determined that the enzyme remained active at the rate of 65% at the end of the 1-hour incubation period at all temperature values in the temperature range of 20-90°C. It was determined that the enzyme remained highly stable in the presence of 1% and 5% concentrations of surfactants, and increased its activity in the presence of Fe2+ and Mn2+ metals. The Km, Vmax, Kcat and Kcat/Km values for the ABTS substrate of the B. licheniformis SO8 laccase enzyme were 110 μM, 19.6 μmol.L-1.dk-1, 0,048 s-1 and 0,44 s-1.mM1, respectively. Finally, Acid black 1, Congo red, Methylene blue, Orange, Acid red 27, Reactive black 5 dyes were used to examine the effect of laccase enzyme on the color removal of some synthetic dyes and it was determined that the highest dye removal was on Acid Red 27 dye with ~38%. 
Results: Considering the increasing applications of laccases in the environment and industrial biotechnology, it is very important to discover new laccase-producing strains with different physicochemical and catalytic properties. It was determined that the enzyme purified from B. licheniformis SO8, which produces extracellular laccase, remained active for a long time under alkaline pH and high temperature conditions. This makes purified laccase suitable for a variety of industrial processes. In addition, the decolorization property of laccase and its significant stability against metal ions indicate that it may have possible application in the decolorization of industrial wastewater and wastewater treatment. 
Keyword: Laccase, Bacillus licheniformis, TPP, enzymatic characterization, decolorization. September 2022, 80 pages