Trakya Bölgesi'nde yetişen boletus edulis mantarından izole edilen lakkaz enziminin çeşitli desteklere immobilizasyonu ve tekstil atık sularındaki boyarmaddelerin renksizleştirilmesinde kullanılması
Immobilization on the various supports of laccase enzyme isolated from boletus edulis mushroom growing in Trakya Region and decolorization of the dyestuffs in the textile waste waters
Yazar: DİDEM TUNCAY
Danışman: PROF. DR. HÜLYA YAĞAR
Trakya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada, lakkaz enzimi yenilebilir Boletus edulis mantarından izole edilerek üçlü faz ayırma tekniği (TPP) ile kısmi olarak saflaştırıldı ve modifiye edilen ayçiçek sapı ve pirinç kabuğuna adsorbsiyon yöntemi ile immobilize edildi. Bu immobilize lakkaz sistemleri ile tekstil boyarmaddelerinden Reaktif Mavi-19 (RB-19), Reaktif Sarı-15 (RY-15), Reaktif Kırmızı-239 (RR-239)'un belirlenen optimum koşullarda renk giderimleri gerçekleştirildi. 
Kırklareli-Demirköy'den toplanan Boletus edulis mantarları Triton X-100 ve polivinilpirolidon içeren 0.15 M NaCl çözeltisi ile Waring blender kullanılarak oda sıcaklığında homojenize edildi. Elde edilen ham ekstrakt TPP yöntemi ile deriştirildi ve kısmi olarak saflaştırıldı. Bu amaçla; % 40-60 doygunlukta amonyum sülfat eklenen ham ekstrakta 1.0:1.0 (v/v) oranında t-bütanol eklendi. Santrifüj sonrasında proteince zengin orta faz ayrılarak dializlendi. Uygulanan protein ve enzim aktivitesi sonuçlarına göre Boletus edulis lakkazının 11.7 kat oranında saflaştırıldığı belirlendi. Bu enzim çözeltisi modifiye edilen ayçiçek sapı ve pirinç kabuğuna adsorbsiyon metodu ile immobilize edildi, immobilize enzim preparatları DASE ve DPKE olarak tanımlandı. DASE ve DPKE'nin 2,2'-azinobis[3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit]diamonyum tuzu (ABTS) substratı için bazı özellikleri belirlendi. DASE ve DPKE için optimum pH 3.5 ve optimum sıcaklık değeri 45 °C olarak belirlendi. Lineweaver-Burk grafiğinden yararlanılarak Km ve Vmax değerleri DASE için 0.789 mM ve 175.44 U/mg protein; DPKE için 1.616 mM and 153.85 U/mg protein olarak hesaplandı. Termal kararlılık çalışmasında, 60 °C'de 30 dakika bekletilen DASE ve DPKE'nin başlangıç aktivitelerinin sırasıyla % 72.54 ve % 37.2'sini koruduğu belirlendi.  Tekrar kullanılabilirlik çalışması ile DASE ve DPKE'nin 7. döngü sonunda ABTS için başlangıç aktivitelerinin sırasıyla % 71 ve % 65.4'ünü koruduğu gözlendi. 
DASE ve DPKE'nin renk giderme aktivitelerini belirlemek üzere; RB-19, RY-15 ve RR-239 boyarmaddeleri için 50-250 mg/mL konsantrasyon aralığında çalışıldı. HBT ve VA medyatörlerine gerek duymaksızın DASE ve DPKE sistemleri, belirlenen optimum koşullarda RB-19, RY-15 ve RR-239 için 1 saatin sonunda % 85'in üzerinde renk giderme aktivitesi gösterdi. DASE ve DPKE'nin renk giderme aktivitelerinin asidik koşullarda daha yüksek olduğu belirlendi. Tekrar kullanılabilirlik çalışmasında, DASE ve DPKE'nin boya giderme aktivitelerinin 10. döngü sonunda % 50'sini koruduğu görüldü. İmmobilize sistemler ile işlem gören RB-19, RY-15 ve RR-239 boyarmaddelerinin biyodönüşümleri UV-VIS spektrofotometre ile görüntülendi. DASE ve DPKE'nin renk giderme aktivitelerinin 10 mM Mn+2 ve Cu+2 ile artarken, 10 mM Fe+2 iyonu, 10 mM Tween 80 ve 1000 mg/L PVA ile azaldığı belirlendi.

Abstract:
In this study, laccase which isolated from the edible mushroom Boletus edulis was partially purified with Three-phase partitioning (TPP) method. Boletus edulis laccase was immobilized onto modified sunflower stalks or modified rice husks with adsorption method. Also, these immobilized laccase systems were used for the decolorization assays of textile dyes including Reactive Blue-19 (RB-19), Reactive Yellow-15 (RY-15) and Reactive Red-239 (RR-239) in the determined optimum conditions. 
Boletus edulis mushrooms obtained from Kırklareli-Demirköy were homogenized with 0.15 M NaCl solution containing Triton X-100 and polyvinylpyrrolidone by using Waring blender at room temperature. Laccase was concentrated and partially purified from this crude extract by using TPP method. For this purpose, ammonium sulphate at 40-60 % saturation was added to crude extract, and then t-butanol was added to salty solution at the rate of 1:1 (v/v). This mixture was centrifuged, and the middle phase which is rich with protein was separated, and then dialyzed. The results of protein and enzyme activity assays showed that laccase was purified 11.7-fold compared to crude extract. Boletus edulis laccase were immobilized onto modified sunflower stalks and rice husks by using adsorption method. Immobilized enzymes were defined as DASE and DPKE, respectively. Some properties of DASE and DPKE were determined for 2,2'-azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]diammonium salt (ABTS) used as substrate. Optimum pH and temperature were 3.5 and 45 °C for both DASE and DPKE, respectively. The Km and Vmax values were calculated from Lineweaver-Burk plot as 0.789 mM and 175.44 U/mg protein for DASE, respectively. For DPKE, these parameters were 1.616 mM and 153.85 U/mg protein. In thermal stability assay at 60 °C, DASE and DPKE saved 72.54 % and 37.2 % of their initial activities for 30 minutes, respectively. In reusability assays, DASE and DPKE saved about 71 % and 65.4 % of theirs initial activities at the end of 7 cycles for ABTS. 
The immobilized laccases efficiently decolorized the dye solutions including RB-19, RY-15 and RR-239 prepared in the concentration range of 50-250 mg/mL without addition of HBT and VA as redox mediator. DASE and DPKE showed the decolorization activity about 85 % at the end of 1 h for RB-19, RY-15 and RR-239 in the determined optimum conditions. The decolorization activities of DASE and DPKE were observed to be higher in the acidic conditions. In reusability assays, DASE and DPKE saved about 50 % of their initial activities at the end of 10 cycles for all dyes. The biodegradation of RB-19, RY-15 and RR-239 were monitored with UV-VIS spectrophotometer. The decolorization activities of DASE and DPKE increased with 10 mM Mn+2 and Cu+2, but they decreased with 10 mM Tween 80 and 1000 mg/L PVA.