İmmunoglobulin G saflaştırılması için L-lizin baskılanmış seçici kriyojellerin hazırlanması
Preparation of L-lysine imprinted specific cryogels for immunoglobulin G purification
Yazar: SENEM ÇULHA
Danışman: PROF. DR. SERAP ŞENEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
IgG glikoproteini, bağışıklık sistemi zayıf olan hastalarda enfeksiyon önleyici olarak ve pediatrik HIV, kronik lenfositik lösemi gibi birçok hastalık için ise tedavi amacı ile kullanılmaktadır. Tedavide genellikle uzun zaman dilimlerinde yüksek doz gereksiniminden ötürü, IgG izolasyon veya saflaştırılması önem kazanır. Bu amaçla kullanılan afinite temelli (Protein A kromatografisi, boya afinite kromatografisi, tiyofilik afinite kromatografisi vb.) ve afinite bazlı olmayan (iyon değişim kromatografisi, boyutça ayırma kromatografisi vb.) yöntemler mevcuttur.
Afinite temelli ayırma teknikleri arasında ''Moleküler Baskılama'' tekniği önemli bir seçenektir. Adsorpsiyon için seçilen matrisin seçiciliği arttırılmış olur. Matrisin kriyojel formunda sentezi ise makrogözenekler, kısa difüzyon yolu, alçak basınç düşmesi gibi birçok avantaj sağlar.
Bu çalışmada, L-Lizin ve N-Metakriloil-L-aspartik asit sırası ile kalıp molekül ve fonksiyonel monomer olarak seçilerek, epitop baskılama tekniği ile L-Lizin baskılanmış poli(HEMA-MAAsp) kriyojelleri sentezlenip, FTIR, SEM, BET, şişme ve sıkma testleri ile karakterize edilmiştir. Baskılanmış ve baskılanmamış kriyojeller için spesifik yüzey alanları sırası ile 34.2 m2/g ve  21.3 m2/g' dır.
Adsorpsiyon-desorpsiyon işlemi sürekli sistemde incelenerek, adsorpsiyon kapasitesine etki eden faktörler optimize edilmiştir. 25°C'de, pH:7.0, 0.5 mL/dak akış hızı ve 1.0 mg/mL'lik IgG başlangıç derişimi ve 2 saat etkileşim süresi için saptanan adsorpsiyon kapasitesi 55.1 mg/g'dır. Plazma ile yapılan çalışmalar sonunda 1/20 seyreltilmiş plazmadan % 90.4 IgG uzaklaştırılmıştır. 0.5 M NaCl ile saptanan desorpsiyon oranları % 90'ın üstündedir. Kriyojelin adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir değişme olmaksızın on kez tekrar döngüde kullanılabileceği saptanmıştır.
Adsorpsiyon izotermi Langmuir modeline, adsorpsiyon kinetiği ise yalancı-ikinci dereceden modele uymaktadır. Sentezlenen, baskılanmış kriyojellerin IgG'ye; albumine göre 1.79 kat, hemoglobine göre ise 1.45 kat daha seçici olduğu saptanmıştır.
Ayrıca adsorpsiyona ait ?Hº, ?Sº, ?Gº gibi termodinamik parametreler hesaplanmıştır.

Abstract:
Glycoprotein IgG use as preventing infections in patients with a weak immune system and therapeutic purpose for many diseases such as pediatric HIV and chronic lymphocytic leukemia. Treatment is usually in the longer range due to the high dose requirements, this is because isolation or purification of IgG gain importance. For this purpose affinity-based (Protein A chromatography, dye affinity chromatography, thiophilic affinity chromatography, etc.) and non-affinity based (ion-exchange chromatography, size exclusion chromatography etc.) methods are available.
Molecular imprinting technique among affinity-based separation technique is an important option. Selectivity of the selected matrix for adsorption is improved by imprinting. Synthesis of matrix in cryogel form provides many advantages such as macropores, short diffusion path, low pressure drop, etc.
In this study, L-Lysine and N-methacryloyl-L aspartic acid were chosen as template and functional monomer, respectively. L-Lysine imprinted poly(HEMA-MAAsp) cryogels were synthesized and characterized with FTIR, SEM, BET, swelling and squeezing tests. Specific surface area for imprinted and non-imprinted cryogels are 34.2 m2/g and 21.3 m2/g, respectively. 
Adsorption-desorption process was examined in continuous system, factors affecting adsorption capacity were optimized. Detected adsorption capacity is 55.1 mg/g at 25°C; pH 7.0; 0.5 mL/min flow rate; 1.0 mg/mL IgG initial concentration and for 2 hours interaction time. At the end of the studies with 1/20 diluted plasma, % 90.4 IgG was removed. Detected desorption rate by using 0.5 M NaCl solution is higher than 90%. It has been identified that cryogels can be used in the cycle for ten times without significant loss in adsorption capacity.
Adsorption isotherm and adsorption kinetics fit to Langmuir and pseudo-second-order model, respectively. Synthesized L-Lysine imprinted cryogel was determined to be 1.79 times more selective to IgG molecule than albumin, 1.45 times more selective than hemoglobin.
Also thermodynamic parameters belonging to the adsorption such as ?Hº, ?Sº, ?Gº were calculated.