Biber tohumlarından polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of polyphenol oxidase from pepper seed
Yazar: CANAN AFŞİN
Danışman: DOÇ. DR. REYHAN GÜL GÜVEN
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Enzimler canlı organizmalar için yürüyen reaksiyonlarda düzenleyici görev aldıklarından, yüksek ve büyük bir seçicilikle katalizlediklerinden bazen istenmeyen durumlarda organizmaya negatif etki ederek bozukluklara sebep olmaktadırlar. Bu sebeplerin ortadan kaldırılması ancak o enzimleri karakterize ederek mekanizmalarını belirlemek ve onlara uygun inhibitörlerin belirlenmesi ile mümkün olmaktadır. Son yıllarda in vitro çalışmalarda enzimlerden yararlanma çalışmaları hızla artmaktadır. Günümüzde yapı ve mekanizması bilinen birçok enzim tıp, biyoteknoloji, gıda gibi birçok alanda kullanılmaktadır. Enzimatik esmerleşme tarım sektörünü, hem ürünlerin bozulması hem de ekonomik açıdan olumsuz yönde etkilemektedir. Bu yüzden bu esmerleşmeye sebep olan enzimler üzerinde yapılan çalışmalar bu alanda yarar sağlayacaktır.
Bu çalışmanın amacı, PPO enziminin güneydoğu bölgesinde yetiştirilen yeşil top biber tohumunda saflaştırılması ve karakterize edilmesidir. Bu amaçla biber tohumundan izole edilen enzim daha sonra amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz, ultrafiltrasyon ve jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Enzimin özellikleri, optimum pH ve sıcaklık, sıcaklık stabilitesi, inhibitör ve karbonhidratların etkisi belirlenmiştir.
Elde edilen bulgulardan;  denenen substratlardan enzim ilgisinin en yüksek olduğu substratın 4-metilkatekol olduğu, termal stabilitesinin yüksek olduğu, sodyum azidin % 64,4 EDTA'nın % 60,10, SDS'nin % 36,6 ve askorbik asidin ise % 65,7 oranında enzimi inhibe ettiği tespit edilmiştir. Ayrıca etkisi araştırılan karbonhidratlardan ribozun enzimi % 34 oranında aktif ettiği, glikozun ve sukrozun ise enzimi inhibe ettiği ortaya çıkmıştır. 4-metilkatekol subsratı kullanıldığında PFO enziminin optimum  sıcaklık 40 OC,  katekol kullanıldığında ise optimum sıcaklık 30 ºC olarak tespit edilmiş,  optimum pH değerleri ise katekol ve 4-metilkatekol substratları kullanılarak sırasıyla 7 ve 5 olarak tespit edilmiştir.

Ayrıca PFO'nın substrat spesifikliği ve sıcaklık stabilitesi incelenmiştir. PPO enziminin uygun değer pH ve sıcaklıkta katekol ve 4-metil katekol substratları için Km ve Vmax değerleri Linewear-Burk yöntemi ile bulunmuştur. Vmax/ Km değerlerine göre PPO enzimi için en uygun substratın 4-metilkatekol olduğu bulunmuştur. Ayrıca artan ısı inaktivasyon süresine paralel olarak PFO aktivitesinin bariz bir şekilde azaldığı gözlemlenmiştir.

Abstract:
Enzymes, because of taking the duty of regulation at reactions for living organisms and catalysing with high-level and large-scale selectivity, sometimes cause distruptions by affecting the organisms negatively in undesirable situations. To prevent these, it will be only possible that the enzymes should be characterised by identifying the mechanisms and identifiying their appropriate inhibitors. In recent years, beneficial studies on enzymes have increased in vitro. Novadays, a lot of enzymes known for their structures and mechanisms are used different areas such as medical science, biotechnology and nutrition. Enzymatic browning affects the agriculture negatively not only by deteriozing the yield but also economically. So, the studies on these enzymes which cause browning will provide benefit in that area.
     The aim of this study is to refine and characterise the PPO enzyme in the seed of green pepper grown in The Southeastern Anatolia. For this purpose, the enzyme insulated from the seed of pepper was partially purified later with ammonium sulfate sedimentation, dialysis, ultrafiltration and gel filtration chromatography. Features of enzyme, including optimum pH and temperature, temperature stability, the effects of inhibitors and carbonhydrates were determined. 
     The results obtained showed that among the tested substrates, 4-methylcatechol had the highest relation with the enzyme which displayed a higher thermal stability, and sodium azide,  EDTA, SDS and asorbic acid inhibited the enzyme by 64,4%, 60,10%,  36,6% and 65,7%, respectively. In addition, among the carbonhydrates investigated, ribose has activated the enzyme at %34, glucose and sucrose have inhibited the enzyme. Using 4-methylcatechol as substrate  the optimum temperature of PFO enzyme was found as 40'C, when catechol used the optimum temperature was found as 30'C.  The optimum pH values were 5.0 and 7.0 in turn by using catechol and 4-methylcatechol substrates, respectively.
     Besides these, PPO's specificity and the temperature stability were studied. Km and Vmax values for PPO enzyme at optimum pH and temperature for catechol and 4-methylcatechol  have been found by the Linewear-Burk Approach. According to Vmax/Km values, the most appropriate substrate was 4-methylcatechol. In addition, it has been observed that when the temperature inactivation time increases the PFO activity decreases dramatically in parallel.