Büyüme faktörüyle uyarılmış kordon kanı mononükleer hücrelerinin in vitro kültürlerde proliferasyonu ve immünfenotipik özelliklerinin incelenmesi
Evaluation of immunophenotypic characteristics and proliferation of in vitro cultures of cord blood mononuclear cells stimulated with growth factors
Yazar: FARUK SÜZERGÖZ
Danışman: PROF.DR. SERAP ERDEM KURUCA
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İmmünoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2002
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology

Özet:
ÖZET Bir çok hematolojik hastalıkta ve genetik bozuklukta hematopoetik kök hücre transplantasyonuna gereksinim duyulmaktadır. Kemik iliği transplantasyonlarında karşımıza çıkan en önemli problem, doku uyuşmazlığı nedeniyle uygun verici bulmadaki güçlüklerdir. Doku uyumunun tam olmadığı transplantasyonlarda GvHD gelişimi nedeniyle organizmada ölümcül hasarlar meydana gelmektedir. Kordon kam ile kemik iliği ve mobilize periferik kanla yapılan transplantasyonlar karşılaştırıldığında, GvHD'nin görülme sıklığında anlamlı bir azalma bildirilmektedir. Ayrıca görülen GvHD olgularında hafif seyirli oluğu gözlemlenmiştir. Kordon kanının kemik iliği transplantasyonu için uygun bir kök ve projenitor hücre kaynağı olmasına karşın, tek bir kordon kanından elde edilen total mononükleer hücre sayısının sınırlı olması nedeniyle, erişkin hastalara transplantasyon için gereksinim duyulan hücre sayısına ulaşmak her zaman mümkün olamamaktadır. Bu problemi ortadan kaldırabilmek için kordon kam mononükleer hücrelerini doğrudan veya kök hücre olduğu düşünülen hücre alt gruplarım ayırarak in vitro kültürlerde çoğaltma çalışmaları sürmektedir. Çalışmamızda, kordon kam mononükleer hücrelerinin kültürlerini yaparak, büyüme faktörlerinin; hücre sayısı, hücrelerin immünfenotipi ve koloni oluşturma kapasiteleri üzerine etkilerini incelemeyi amaçladık. Sağlıklı ve zamanında doğum yapan 15 gönüllüden alınan kordon kanları IL-3, IL-6, IL-11, FL, SCF ve Tpo eklenen kültür medyumunda, 37 °C de % 5 CO2 içeren nemli ortamda 2 hafta inkübe edildi. Kültür öncesi, kültürün 1. ve 2. haftası sonunda yapılan incelemelerde hücre sayısında, CD33, CD34, HLA-DR ekspresyonunda istatistiksel olarak anlamlı artışlarla birlikte CD4 ekspresyonunda ve BFU-E koloni sayısında anlamlı azalma gözlendi. İncelenen parametreler arasında korelasyon analizlerinde CD4 ile CD34 ekspresyonu ve hücre sayısı arasında negatif korelasyon, CD34 ile CD33, CD38 ve HLA-DR ekspresyonları arasında pozitif korelasyon gözlendi. Ayrıca CFU-GM ile CFU-GEMM koloni sayılan arasında pozitif korelasyon saptandı. 72Elde edilen veriler değerlendirildiğinde, kordon kanı örneklerinde hücre sayısında ve kök hücreye spesifik CD34 ekspresyonunda anlamlı artış gözlenmiştir. Buna paralel olarak miyelomonositik seriye spesifik CD33 ve HLA-DR ekspresyonunda artış tesbit edilmiştir. İki haftalık kültür sonucunda elde edilen kordon kanı hücreleri transplantasyon amacıyla kullanıldığında, kemik iliğine engrafman kapasitesinde artış ve transplantasyon sonrası mutlak nötrofil ve trombosit sayısına ulaşma süresinde kısalmanın olabileceğini düşünmekteyiz. Ayrıca kültürde kordon kanı CD4 T lenfositlerindeki azalma sonucu transplantasyonlarda görülme riski olan GvHD' nin önlenebileceğini ve ayrıca CD8 T lenfositlerinin yaşamını sürdürmesi ile de GvL etkisinin korunmuş olabileceğini düşünmekteyiz. Sonuç olarak, kordon kanı hücrelerinin kısa süreli kültürü ile az sayıdaki hücrelerden yeterli sayıda ve nitelikli transplantasyon materyali elde etmek mümkün görünmektedir. 73

Abstract:
SUMMARY Haematopoietic stem cell transplantation is required in various haematologic diesases and genetic disorders. The main problem in bone marrow transplantations is the histoincompatibility in donor providing. Fatal damages may occur because of GvHD observed after transplantation by mild histocompatibility. In cord blood transplants, compared to transplantations of mobilized peripheral blood or bone marrow, a significant decrease in GvHD frequency is observed. In addition, in case of observed GvHD, the disease is mild. Although the cord blood is a useful source of stem and progenitor cells for bone marrow transplantation, it is not possible to obtain sufficient mononuclear cells from a single human umbilical cord for successful transplantation in adults. In order to avoid this problem, in vitro proliferation studies of total cord blood mononuclear cells or separated cells, considered as stem cells, are required. In our study, we aimed to evaluate the effects of growth factors on cell counts, immunophenotypic characteristics and their colony forming capacities in cord blood mononuclear cell cultures. Cord bloods harvested from 15 healthy subjects and volunteers delivering in term were incubated in culture medium supplemented with IL- 3, IL-6, IL-1 1, FL, SCF and Tpo for 2 weeks in humidified incubator 5 % C02 in 37° C. Before and at the end of the first and second weeks of culture, statistically significant increase in cell counts, CD33, CD34, HLA-DR expressions, significant decrease in CD4 expressions and BFU-E colony numbers were observed. In correlation analyses; negative correlation was seen between CD4 and CD34, and cell counts. Furthermore, positive correlation was detected in colony numbers between CFU-GM and CFU-GEMM, and also between CD38 and HLA-DR expressions. 74Evaluation of the obtained data in cord blood samples showed significant increase in cell counts and CD34 expressions specific for stem cells. Accordingly increases in CD33 and HLA-DR expressions specific for myelomonocytic lineage were reported. We suggest that transplantation of cord blood cells after culture for two weeks may increase engrafment capacity of the cells to bone marrow and may shorten the time for reaching absolute neutrophil and platelet counts after transplantation. In addition the decrease in CD4+ T lymphocytes in cord blood cultures may prevent GvHD and maintenance of CD8+ T lymphocytes may protect the GvL effect. As a result; sufficient and qualified transplantation material might be obtained after short term culture of cord blood cells. 75