Mercimek proteini ile soğan kabuğu fenolikleri interaksiyonunun fonksiyonel özellikler ve biyoaktivite üzerine etkisi
The effect of lentil protein and onion skin phenolic interaction on functional properties and bioactivity
Yazar: DENİZ GÜNAL KÖROĞLU
Danışman: PROF. DR. ESRA ÇAPANOĞLU GÜVEN
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Emülsiyonlar = Emulsions ; Fonksiyonel besinler = Functional foods ; Kraker = Cracker ; Köpürme = Foaming ; İn vitro = In vitro

Özet:
Fenolik bileşikler bitkilerde bulunan antioksidan özelliğe sahip bileşiklerdir. Tüketicilerin sağlıklı tercihlere yönelmesi ile birlikte, bitkilerden saflaştırılan fenolik bileşikler özellikle sentetik antioksidanlar yerine veya fonksiyonel gıdalarda bileşen olarak kullanılmaktadır. Bunun yanında, her geçen gün büyümekte olan gıda sektöründe büyük oranlarda gıda atıkları oluşmakta ve çevre kirliliği gibi birçok soruna neden olmaktadır. Doğal bir kaynak olan gıda atıklarından fenolik bileşiklerin geri kazanılması, gıda atıklarının tekrar kullanılması için olanak sağlamaktadır. Özellikle işlenmiş soğana talebin son yıllarda artması, soğan atıklarının çoğalmasına sebep olmuştur. Soğanın iç kısmının fenolik bileşikler yönünden zengin olmasına karşın benzer fenolik profiline sahip olan kabuk kısmının fenolik madde miktarı daha fazladır; fakat bu kısım gıda hazırlama sürecinde atılmaktadır. Bu çalışmanın amacı (1) floresan sönümleme ile mercimek proteini~soğan kabuğu fenolik ekstraktı kompleks oluşum mekanizmasını analiz etmek, in-vitro gastrointestinal sindirilebilirlikleri ile birlikte (2) model sistemlerde protein fonksiyonel özellikleri üzerine etkisini ve (3) fonksiyonel bir gıda ürününde kompleks oluşumunun etkilerini tanımlamaktır.
İlk aşama olarak, mercimek proteinleri ile fenolik ekstraktların kompleks oluşum mekanizması hakkında bilgi almak amacıyla floresan sönümle analizi yapılmıştır. Her iki ekstraktın, mercimek proteinlerinin floresan yoğunluğunda konsantrasyonlarına bağlı olarak düşmeye sebep olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, kırmızı soğan kabuğu fenolik ekstraktının sarı soğan kabuğu fenolik ekstraktına kıyasla daha düşük konsantrasyonlarda sönümleme etkisi olduğu belirlenmiştir. 
Mercimek proteini~sarı soğan kabuğu fenolik ekstraktı kompleksi için mercimek proteininin maksimum emisyonunda maviye kayma olmuştur. Diğer bir deyişle, interaksiyona giren fenolik grubunun proteinin içinde gömülü olduğunu göstermiştir. Ayrıca, kompleks oluşumu doğrusal bir Stern-Volmer grafiği ile statik söndürmeyi ifade etmektedir. Mercimek proteini~sarı soğan kabuğu fenolik ekstraktı kompleksinin termodinamik parametreleri hesaplanmıştır. Etkileşimin baskın olarak hidrofobik, entalpi güdümlü olduğu ve kendiliğinden gerçekleşmediği bulgusuna ulaşılmıştır.
Mercimek proteini~kırmızı soğan kabuğu fenolik ekstraktı kompleksi için kırmızıya kayma, yani proteinlerin yapısal açılımını ifade etmektedir. Diğer bir yandan, Stern-Volmer grafiği doğrusal değildir. Dinamik ve statik olmak üzere iki sönümleme mekanizmasının mercimek proteini~kırmızı soğan kabuğu fenolik ekstraktı kompleksi için aynı anda meydana geldiği "eylem alanı modeli" (sphere of action) söz konusudur.
Çalışmanın ikinci aşamasında, protein-fenolik interaksiyonunun mercimek proteinlerinin fonksiyonel özellikleri üzerine ve farklı sistemlerin (fenolik ekstrakt çözeltileri, protein-fenolik çözeltileri, emülsiyonlar) in-vitro gastrointestinal sindirilebilirliği üzerine etkileri araştırılmıştır. Fenolik bileşiklerin varlığı konsantrasyona bağlı olarak mercimek proteinlerinin çözünürlüğü, köpürme ve emülsiyon özelliklerini olumsuz etkilemiştir ve Pearson korelasyon katsayısı analizi ile fenolik konsantrasyonunun proteinlerin bu fonksiyonel özellikleri ile ilişkisinin negatif olduğu da belirlenmiştir.
Farklı model sistemlerde (fenolik ekstrakt çözeltileri, protein-fenolik çözeltileri, emülsiyonlar) in-vitro gastrointestinal sindirim öncesi, toplam fenolik madde miktarları büyükten küçüğe sırasıyla ekstrakt çözeltisi, emülsiyon ve protein-fenolik çözeltisi şeklindedir. Mercimek proteini varlığında toplam fenolik madde miktarında düşme vardır. Toplam fenolik madde miktarı mide fazından sonra ekstrakt çözeltileri ve emülsiyonlarda düşmüştür ve protein-fenolik çözeltilerinde ise sindirim öncesi değerlere benzerdir. Bütün çözelti sistemlerinde, aynı çözelti için toplam fenolik madde miktarı bağırsak fazında en yüksektir. Antioksidan aktivite değerleri toplam fenolik madde sonuçları ile benzer değişmiştir.
Protokateşik asit ve fenolik asit türevleri çözelti içerisindeki diğer fenolik bileşiklerin parçalanmasından dolayı sindirim öncesi değerlerinin neredeyse iki katı olmuştur. Kırmızı soğan kabuğu fenolik ekstraktında belirlenmiş her bir antosiyaninin miktarı sindirim öncesinde emülsiyon~ekstrakt çözeltisi>protein-fenolik çözeltisi şeklinde iken mide fazından sonra emülsiyon>ekstrakt çözeltisi~protein-fenolik çözeltisi şeklindedir. Bağırsak fazından sonra ise ekstrakt çözeltilerindeki antosiyanin miktarı diğerlerine kıyasla daha fazladır. Antosiyaninler protein içeren sistemlerde sindirim sonunda daha az tanımlanabilmiştir.
Mercimek proteinlerinin varlığıyla sindirim öncesi her bir fenolik bileşiğin miktarında azalma gözlenmiştir. Bu azalma kuersetin ve türevleri için daha fazla olmuştur. Mide fazından sonra kuersetin ve türevlerinin miktarı düşmüş, bağırsak fazından sonra mide fazına benzer olmuştur. Bu durum, toplam fenolik madde miktarında ve antioksidan kapasitesinde gözlemlenen belirgin düşmenin sebebi olarak düşünülmüştür. Tüm sistemlerde bağırsak fazından sonra kuersetin tespit edilmezken, kuersetin türevleri emülsiyonlarda en yüksektir. Protein varlığında, model bir sistemde, her bir fenolik bileşiğin in-vitro gastrointestinal sindirimden farklı etkilendiği gözlenmiştir.
Üçüncü aşamada, iki farklı oranda fenolik (soğan kabuğu tozu, soğan kabuğu fenolik ekstraktı ve kuersetin) içeren fonksiyonel krakerlerde fenolik içerikte/antioksidan aktivitede değişim protein-fenolik interaksiyonları dikkate alınarak değerlendirilmiştir. Fonksiyonel krakerler benzer besin değerlerine (p>0.05), daha düşük L* ve daha yüksek a* değerlerine sahiptir. b* değeri daha yüksek oranda soğan kabuğu tozu veya soğan kabuğu fenolik esktraktı ile düşmüş, kuersetin katkısı ile artmıştır. Fonksiyonel krakerlerde fenolik/antioksidan geri kazanımı fenolik oranı arttıkça azalmıştır ve kuersetin 7,4-diglikozit miktarı teorik değerden düşük bulunmuşken kuersetin miktarı yüksektir. İn-vitro gastrointestinal sindirim krakerlerde uygulanmıştır ve fenolik/antioksidan/protein ulaşılabilirliği belirlenmiştir. Fenolik (BIF) ve antioksidan (BIA) biyoerişilebilirlik indeksi in-vitro gastrointestinal sindirim öncesi ve sonrası toplam fenolik madde miktarı ve antioksidan aktiviteye göre hesaplanmıştır. Fonksiyonel krakerlerde BIF değeri küçükten büyüğe soğan kabuğu tozu, soğan kabuğu fenolik ekstraktı ve kuersetin eklenen krakerler şeklinde iken, BIA değerleri kuersetin eklenen krakerlerde en düşüktür. Kuersetin sadece soğan kabuğu fenolik ekstraktı içeren buğday veya mercimek krakerinde tanımlanabilmiştir. 
Ağız ve mide fazında tüm fonksiyonel buğday krakerlerinde TCA'da çöken peptid miktarı kontrolden küçüktür. Sindirim sonunda buğday krakerlerinin TCA'da çöken peptitleri tanımlanamamıştır. Ağız fazından sonra fonksiyonel mercimek krakerlerinin TCA'da çöken peptid miktarı birbirine yakın (p<0,05) kontrolden küçüktür, mide fazından sonra ise fazladır. Bağırsak fazından sonra TCA'da çöken protein miktarı kuersetin içeren mercimek krakerinde en düşüktür. Gastrointestinal sindirim boyunca genel olarak TCA'da çöken peptid miktarı azalırken, serbest amino grupları miktarında artış gözlenmiştir. Ağız fazından sonra serbest amino grupları miktarı kontrol krakerlere istatistiksel olarak benzer olmuştur (p<0.05). Mide ve bağırsak fazından sonra ise buğday krakerlerinde kontrole kıyasla daha düşük miktarda serbest amino grupları miktarı saptanmıştır. Mide fazından sonra fonksiyonel mercimek krakerlerinin serbest amino miktarı kontrolden yüksektir, bağırsak fazından sonra ise düşüktür.
Sonuç olarak, sarı ve kırmızı soğan kabuğu fenoliklerinin mercimek proteinleri ile interaksiyon mekanizması bu çalışma ile ilk defa araştırılmıştır ve her iki ekstraktın farklı yollarla interaksiyona girdiği belirlenmiştir. Bu doktora çalışması, soğan kabuğu fenoliklerin mercimek proteinlerinin fonksiyonel özellikleri üzerine belirgin etkisi olduğunu ve özellikle protein varlığında fenoliklerin biyoerişilebilirliğinin hem model sistemlerde hem de bir gıda matriksinde önemli ölçüde etkilendiğini gösteren özgün bir çalışmadır.

Abstract:
Phenolic compounds are compounds with antioxidant properties in plants. Along with the healthy preferences of consumers, phenolic compounds purified from plants are used especially instead of synthetic antioxidants or as ingredients in functional foods. Further, in the food sector, which is growing day by day, large amounts of food waste occur and cause many problems such as environmental pollution. The recovery of phenolic compounds from food waste, which is a natural resource, provides an opportunity for the reuse of food waste. In particular, the increase in demand for processed onions in recent years has led to a rise in onion waste. Although the inner part of the onion is rich in phenolic compounds, the phenolic substance content of the skin, which has a similar phenolic profile, is higher; but this part is discarded during the food preparation process. The aim of this study was (1) to analyze the lentil protein~phenolic extracts of onion skin complex formation mechanism by fluorescent quenching, as well as to determine the effect of complex (2) on protein functional properties in model systems, and (3) in a functional food product (cracker) along with their in-vitro gastrointestinal digestibility.
As a first phase, fluorescence quenching analysis was performed to obtain information about the complex formation mechanism of lentil proteins and phenolic extracts. It was determined that both extracts caused a decrease in fluorescence intensity of lentil proteins depending on their concentration. Further, it was determined that red onion skin phenolic extract had a quenching effect at lower concentrations compared to yellow onion skin phenolic extract. 
There was a blue shift in the maximum emission of lentil protein for the lentil protein~yellow onion skin phenolic extract complex. In other words, it showed that the interacting phenolic group was buried in the native protein. Moreover, Also, complex formation represented static quenching with a linear Stern-Volmer plot. Thermodynamic parameters of lentil protein~yellow onion skin phenolic extract complex were calculated. It has been found that the interaction was predominantly hydrophobic, enthalpy driven, and non-spontaneously.
It was concluded that the redshift for the lentil protein~red onion skin phenolic extract complex, that is, the structural unfolding of the proteins. On the other hand, the Stern-Volmer plot is non-linear. There is a "sphere of action" in which two damping mechanisms, dynamic and static, occur simultaneously for the lentil protein~red onion skin phenolic extract complex.
In the second phase of the study, the effects of protein-phenolic interaction on the functional properties of lentil proteins and the in-vitro gastrointestinal digestibility of different systems (phenolic extract solutions, protein-phenolic solutions, emulsions) were investigated. The presence of phenolic compounds adversely affected the solubility, foaming, and emulsion properties of lentil proteins depending on the concentration, and Pearson correlation coefficient analysis revealed that the phenolic concentration was negatively correlated with these functional properties of the proteins.
In different model systems (phenolic extract solutions, protein-phenolic solutions, emulsions), before in-vitro gastrointestinal digestion, the total phenolic content was extract solution, emulsion, and protein-phenolic solution, respectively, from large to small. In the presence of lentil protein, there was a decrease in the total phenolic content. The total phenolic content decreased in extract solutions and emulsions after the gastric phase and was similar to pre-digestion values in protein-phenolic solutions. In all solution systems, the total phenolic content for the same solution was highest after the intestinal phase. Antioxidant activity values were changed similarly to the total phenolic content results.
Protocatechuic acid and phenolic acid derivatives were almost twice their pre-digestion values due to the degradation of other phenolic compounds in the solution. The amount of each anthocyanin determined in the red onion skin phenolic extract was as follows: emulsion~extract solution>protein-phenolic solution before digestion, and emulsion>extract solution~protein-phenolic solution after the gastric phase. After the intestinal phase, the number of anthocyanins in the extract solutions was higher than in the others. Anthocyanins were less defined at the end of digestion in protein-containing systems.
A decrease in the amount of each phenolic compound was observed before digestion with the presence of lentil proteins. This decrease was greater for quercetin and its derivatives. The amount of quercetin and its derivatives decreased after the gastric phase and became similar to the gastric phase after the intestinal phase. This was thought to be the reason for the significant decrease observed in the total phenolic content and antioxidant capacity. Quercetin derivatives were highest in emulsions, while quercetin was not detected after the intestinal phase in all systems. In the presence of protein, it was observed that in a model system, each phenolic compound was differently affected by in-vitro gastrointestinal digestion.
In the third phase of the study, the changes in phenolic content/antioxidant activity in functional crackers containing two different ratios of phenolics (onion peel powder, onion skin phenolic extract, and quercetin) were evaluated by considering protein-phenolic interactions. Functional crackers had similar nutritional values (p>0.05), lower L* and higher a* values. The b* value decreased with a higher percentage of onion skin powder or onion skin phenolic extract but increased with the addition of quercetin. In functional crackers, phenolic/antioxidant recovery decreased as the phenolic ratio increased and the amount of quercetin 7,4-diglycoside was found to be lower than the theoretical value, while the amount of quercetin was high. In-vitro gastrointestinal digestion was applied to crackers and phenolic/antioxidant/protein bioaccessibility was determined. The phenolic (BIF) and antioxidant (BIA) bioaccessibility index were calculated according to the total phenolic content and antioxidant activity before and after in-vitro gastrointestinal digestion. The ascending order of BIF value in functional crackers was onion skin powder, onion skin phenolic extract and quercetin added crackers, BIA values were lowest in quercetin added crackers. Quercetin could only be identified in wheat or lentil crackers containing onion skin phenolic extract.
The amount of TCA-precipitated peptide in all functional wheat crackers after the oral and stomach phase was lower than the control. TCA-precipitated peptide in wheat crackers at the end of digestion could not be identified. TCA-precipitated peptide of the functional lentil crackers after the oral phase was close to each other (p<0.05), less than the control, and higher after the gastric phase. TCA-precipitated peptide after the intestinal phase was the lowest in quercetin-containing lentil crackers. During in-vitro gastrointestinal digestion, TCA-precipitated peptide decreased, while the number of free amino groups increased. The number of free amino groups after the oral phase was statistically similar to the control crackers (p<0.05). After the gastric and intestinal phase, a lower amount of free amino groups was detected in wheat crackers compared to the control. The number of free amino acids in functional lentil crackers after the gastric phase was higher than that of control, but it was lower after the intestinal phase.
Consequently, the interaction mechanism of yellow and red onion skin phenolics with lentil proteins was investigated for the first time in this study and it was determined that both extracts interacted in different ways. This doctoral study is an original study showing that onion skin phenolics had a significant effect on the functional properties of lentil proteins and that the bioaccessibility of phenolics was significantly affected in both model systems and a food matrix, especially in the presence of protein.