Antibiyotikli kanal patlarının apikal papilla mezenkimal kök hücrelerinde meydana getirdiği değişikliklerin ve antimikrobiyal etkinliklerinin incelenmesi
Evaluation of the antimicrobial efficiency and effects of antibiotic included root canal pastes on the mesenchymal stem cells from apical papilla
Yazar: SEÇİL ÇALIŞKAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. MUSTAFA AYDINBELGE
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Pedodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Antienfektif ajanlar = Anti infective agents ; Dental materyaller = Dental materials ; Endodonti = Endodontics ; Gen ifadesi = Gene expression ; Kök hücreler = Stem cells ; Kök kanal dolgu materyalleri = Root canal filling materials

Özet:
Rejeneratif tedaviler, travma, kanser, hastalık ya da konjenital nedenlerle hasara uğramış doku ve organların tekrar oluşumunu hedeflemektedir. Rejenetatif tıp ve doku mühendisliğinin hızlı gelişimi, diş hekimliği alanında da bu uygulamaların sıkça gündeme gelmesini sağlamıştır. Doku mühendisliğinin diş hekimliği alanındaki en önemli hedeflerinden biri de, rejeneratif endodontik prosedürler ile pulpa-dentin kompleksindeki hücrelere ek olarak, dentin ve özellikle apikal olmak üzere tüm kök yapısını içeren zarar görmüş yapıların yenisi ile yer değiştirmesini sağlayan biyolojik temelli yapıların oluşturulmasıdır. Rejeneratif endodontide geliştirilmekte olan yöntemler; kök kanalının revaskülarizasyonu, kök hücre tedavisi, pulpa implantı, scaffold (iskelet, çatı) implantı, enjekte edilebilir scaffold uygulamaları, üç boyutlu hücre yazılımı ve gen terapisi şeklinde sıralanabilir.
Çalışmamızda rejeneratif endodontik prosedürler uygulanırken kök kanalının dezenfeksiyonunda kullanılan üçlü, ikili ve modifiye üçlü antibiyotik patların (TAP, DAP, m TAP) apikal papilla kök hücrelerinde meydana getirdiği değişikliklerin hücre, RNA düzeyinde incelenmesi, antimikrobiyal etkinlikleri ve klinik uygulamalarda kullanımları ile ilgili verilerin elde edilmesi hedeflenmiştir. Hücre düzeyinde değerlendirme yapabilmek amacı ile canlılık, apoptoz ve proliferasyon testleri yapılmıştır. RNA bazında ise osteokalsin, dentin sialo fosfoprotein (DSPP) ve alkalen fosfataz (ALPP) seviyeleri değerlendirilmiştir. Ayrıca antimikrobiyal değerlendirme amacıyla agar difüzyon testi yapılmıştır.
Grupların karşılaştırılmasında bağımsız gruplarda tek yönlü varyans analizi, çoklu karşılaştırma testlerinde ise Tukey testi kullanıldı (p<0,05).
Elde edilen veriler ışığında; bu çalışmada, her bir materyal için 14 ve 28 günlük grup değerlendirildiğinde hücre canlılık, proliferasyon, erken apoptoz, geç apoptoz ve total apoptoz oranlarındaki değişimlerde anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Gen ekspresyon düzeyleri değerlendirildiğinde; 14 gün ilaç uygulaması yapılan DAP grubunda, osteokalsin ve DSPP genlerinin ekspresyon düzeylerinde anlamlı yükseliş tespit edilmiştir. Bununla birlikte, 28 gün mTAP uygulaması yapılan grupta yine DSPP geni ekspresyon düzeyinde anlamlı yükseliş tespit edilmiştir. Ayrıca Enterococcus Faecalis dışındaki bakterlere karşı olan antimikrobiyal etkinlikte medikamanlar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık tespit edilememiştir.
Sonuç olarak, çalışmada kullandığımız medikamanların hiçbiri SCAP üzerine olumsuz etki göstermemekle birlikte, 0,01 g/ml konsantrasyonda kullanıldığında osteojenik ve odontojenik farklılaşmaya olumlu katkı sağlamışlardır. Rejeneratif tedavilerde, bahsi geçen antibiyotiklerin belirtilen doz ve uygulama sürelerine dikkat edilerek kullanımı uygun bulunmuştur.
Çalışmamızda ulaştığımız veriler, günümüzde rejeneratif endodontik uygulamalarda kullanılan çeşitli antibiyotik kombinasyonlarının sitotoksisite ve antimikrobiyal etkilerinin incelenmesine önemli katkılar sağlamakla birlikte, çalışmamızdan önce hiçbir çalışmada gen ekpresyon analizlerinin yapılmadığı gerçeği göz önünde bulundurularak, bu alanda ex-vivo ve in-vivo koşullarda yapılacak iyi planlanmış, kapsamlı çalışmalara ihtiyaç olduğu düşünülmektedir.

Anahtar kelimeler: Antibiyotikli pat, antimikrobiyal etki, apikal papilla mezenkimal kök hücresi, gen ekspresyonu, rejeneratif endodontik tedavi

Abstract:
Regenerative therapies aim at recreating the tissues and organs that have been damaged by trauma, cancer disease or congenital causes. The incredible development of the regenerative medicine and tissue engineering have (been brought) bring on the agenda in dentistry. One of the most important goal of tissue engineering in dentistry is the creation of biologically based structures that allow replacement of the damaged tissues with dentin and whole root structure, especially in apical region. Recently developing methods for regenerative endodontics are root canal revascularization, stem cell therapy, pulp implants, scaffold (skeletal, roof) implants, injectable scaffold applications, three dimensional cell software and gene therapy.
In this study, the aim was to evaluate the antimicrobial effects, use of clinical applications and the changes on apical papilla stem cells viability, apoptosis, proliferation and gene expression at RNA level with the application of triple double and modified triple antibiotic pastes during regenerative endodontic procedures are applied. To be able to evaluate at cellular level viability, proliferation, and apoptosis tests were applied.  Osteocalcin, dentin sialo phosphoprotein (DSPP) and alkaline phosphatase (ALPP) levels were evaluated on the RNA side. In addition, agar diffusion test was performed for antimicrobial evaluation. 
One-way analysis of variance was used for independent groups in the comparison of the groups, and Tukey test was used in multiple comparison tests (p <0,05).
According to the obtained data in this study; no significant difference was observed about changes in cell viability, proliferation, early apoptosis, late apoptosis and total apoptosis rates for each material at 14 and 28 day groups. Evaluation of gene expression levels showed a significant increase in the expression levels of osteocalcin and DSPP genes in the DAP group at 14 days of drug administration. However, a significant increase in the DSPP gene expression level was also observed in the 28 day mTAP administration group. Furthermore, no statistically significant difference found between medicaments in antimicrobial efficacy against bacteria except Enterococcus faecalis.
In conclusion, none of the medicaments in our study have a negative effect on SCAP, however all groups have positive contribution on osteogenic and odontogenic differentiation when used at a concentration of 0.01 g / ml. It has been identified that, in regenerative therapies, the mentioned antibiotics are suitable for use within the range of the stated doses and application times.
The data that we received in our study provide important contributions to the examination of the cytotoxicity and antimicrobial effects of various antibiotic combinations which are still using in regenerative endodontic applications,
Considering the fact that no gene expression analyzes have been performed before our study, there is a requirement for well-planned, ex-vivo and in-vivo comprehensive studies on this field.

Key Words: Antibiotic Pat, Antimicrobial Effect, Stem Cells From Apical Papilla, Gene Expression, Regenerative Endodontic