Spinal kord hasarı modelinde ferroptoz yolağının baskılanmasının iyileşme üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of suppressing the ferroptos path on healing in a model of spinal cord damage
Yazar: ARMAN VAHABİ
Danışman: DOÇ. ANIL MURAT ÖZTÜRK
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Ortopedi ve Travmatoloji = Orthopedics and Traumatology
Dizin: Spinal kord yaralanmaları = Spinal cord injuries

Özet:
Spinal kord hasarı temel olarak primer ve sekonder hasar fazları olarak kategorize edilebilir. Primer hasar, hasarın boyutunu etkileyen en önemli değişken konumundadır ve hasar anındaki yaralanmayı meydana getiren fiziksel kuvvetin yarattığı hasarı ifade eder. Sekonder (ikincil) hasar kaskatı, omurilik hasarından sadece birkaç saat sonra başlayan ve ilk yaralanmadan 6 ay sonra dahi devam edebilen bir dizi değişikliği ifade etmektedir. İkincil hasar mekanizmaları yüzünden yaşanan fonksiyonel hücre kaybının primer hasar sebebiyle meydana gelen kayıp miktarından daha fazla olduğu bildirilmiştir. İkincil hasar yolaklarını baskılamak amacıyla uygulanan terapötik yaklaşımlar tedavi arayışı anlamında umut vadetmektedir

Güncel araştırmalar sonucunda apoptotik olmayan üç yeni kontrollü hücre ölüm yolağı tanımlanmıştır.  Bunlar nekroptoz, piropitoz ve ferroptozdur. Bu yolakların tanımlanmasından sonra, bilimsel bilginin gelişim yönü bu yolakların çeşitli hastalıklarda rolünü ortaya koyarak yeni tedavi stratejileri geliştirmek olmuştur. Burada unutulmaması gereken nokta, hücre yapım-yıkım döngüsünün homeostazın önemli bir parçası olduğudur. Hastalıkların tedavisinde baskılanacak olan kontrollü hücre ölüm yolaklarının inhibisyonunun başka hastalıklara yol açabileceği öngörülebilmektedir. Çalışma verileri yorumlanırken veya uyarlanırken, biyokimyasal yolakların farklı in-vivo/in-vitro yolaklarda farklı davranabileceği hatta aynı modelde farklı dozlarda doz bağımlı etkilerin tamamen farklı yönlerde oluşabileceği akılda tutulmalıdır. Ferroptozun moleküler basamaklarının kısa özeti, hücre içindeki demir birikimi ile birlikte glutatyonun (GSH) tüketimi ve bununla birlikte lipid-peroksit indirgenmesi için GPX4ün (Glutatyon peroksidaz 4) inaktivasyonudur.  Sonuç olarak lipid peroksidasyonu ve lipid reaktif oksijen türleri hücrede artmaktadır.

Ferroptoz yolaklarını baskılamak açısından olası yeni terapötik arayışlarda temel birkaç mekanizmadan biri hedef alınabilmektedir. Bunlar; demir birikiminin önüne geçilmeye çalışılması, reaktif oksijen ürünlerinin miktarının artmasının engellenmesi, lipid peroksidasyon ürünlerinin önüne geçilmesidir. Ortaya konmuş ferroptoz ilişkili yolakların heterojenliği ve karmaşıklığı henüz bu alanda ortaya konulması beklenen pek çok bilinmeyen olduğunu ön gördürmektedir. Ferroptozun spinal kord hasarı sonrası sekonder hasar yolaklarında bulunduğu net şekilde ortaya konmuştur ancak bunun klinik uygulamaya geçirilebilecek net bir terapötik avantaja henüz dönüştürülebilmiş değildir.


	Deferoksaminin spinal kord hasarı sonrası terapötik etkinliği daha önce çalışılmış ve ortaya konmuş bir veridir. Ancak burada tanımlanmamış eksik noktalar deferoksaminin etki etme yolakları ve bu süreçteki olası regülatörleridir.

Silibinin molekülü ile farklı modellerde yapılan pek çok çalışma; silibininin anti-oksidan, pro-apoptotik ve anti-inflamatuar özellikler sergilediğini işaret etmektedir. Bu farmakolojik etkileri, in-vivo ve klinik çalışmalara, nöroprotektif, hepatoprotektif, anti-kanser, anti-diyabetik, kardiyoprotektif ve immunomodülatör olarak yansımıştır. Silibininin antioksidan etkinliği ön plandadır. Bu etkilerini; Direkt ROS inaktivasyonu (O2-, H2O2, OH ), sinyal yolaklarının modülasyonu (Nrf2, PPAR, NF-kB), antioksidan enzim miktarını arttırarak (SOD, CAT, GPX), prooksidan enzimlerin baskılanması (NOX, Ksantin oksidaz), metal iyon Şelasyonu yaparak göstermektedir.

Çalışmamız deneysel hayvan modeli olarak tasarlanmıştır. Spinal kord hasar yöntemi olarak klip-kompresyon modeli uygulanmıştır. Biyokimyasal analizler spinal kord doku numunelerinden 24.saat, 72. Saat ve 6. Haftada örnekler alınmıştır. Bu numunelerde Fe+2, GSH, GPX4, TfR1, FPN, MDA, 4-HNE düzeyleri çalışılmıştır. Fonksiyonel değerlendirme skalası olarak BBB lokomotor skalası kullanılmıştır.

Çalışmada elde edilen veriler ışığında, silibinin için etkilerini göstermede demir şelasyonunun bir etken olduğu ortaya koydu. Silibinin molekülünün MDA düzeylerini SCI grubuna göre anlamlı derecede düşürebildiği ancak DFO' nun 72. saatten itibaren MDA seviyelerini daha etkin düşürdüğü gösterilmiştir. DFO uygulamasının tedavi uygulanmamış gruba nazaran GSH seviyesini her üç zaman ekseninde de anlamlı şekilde yüksek tuttuğu, GPX4 yolağını anlamlı olarak baskıladığını ortaya konmuştur. Bu veriler hem silibininin antioksidan etkinliğini GSH aracılığı ile yaptığını desteklemekte, hem de ferroptoz açısından önemli bir enzim olan GPX4'ün aktivitesini arttırma potansiyeli olduğu gösterilmiştir. DFO' nun 4-HNE değerleri göz önüne alındığında etkisinin uzun süreli tedavi sonrası 4-HNE açısından etkisini kaybettiği görülmektedir. Diğer tarafta silibininin grubunda 4-HNE düzeyleri takip süreci boyunca anlamlı şekilde azalarak devam etmiştir. Silibinin 4-HNE düzeyleri açısından ele alındığında DFO ya oranla lipid peroksidasyon ürünlerini daha etkin azalttığı ortaya konulmuştur. Hem DFO hem silibininin TfR1 üzerindeki etkilerinin kısa süreli etkiler olduğu ortaya konmuştur.

Fonksiyonel kazanım olarak değerlendirildiğinde 6 haftalık takip sürecinin sonunda hem DFO hem silibinin kontrol grubuna göre daha yüksek iyileşme skorları elde etmiştir. Silibinin ve DFO karşılaştırmasında da silibinin daha yüksek skorlar almıştır.

Silibinin molekülünün, spinal kord hasarı modelinde terapötik etkinliği vardır. Bu etkinliğini antiferroptotik olarak tanımlanabilecek demir metabolizması üzerindeki ve lipid peroksidasyonu üzerindeki etkilerinden ileri gelmektedir. Silibinin spinal kord hasarı modelinde çalışılmış ve etkinliği gösterilmiş deferoksaminden daha etkin bir lokomotor iyileşmeyi mümkün kılmış, bu anlamda deferoksamine üstün gelmiştir. Ferroptoz yolağı, ferroptoz yolağının regülatörleri pek çok araştırma alanının yanında, spinal kord hasarı çalışmalarında da yanıtlanması gereken pek çok soru içermektedir. Sekonder hücre ölümünün önemli bir değişken olduğu spinal kord yaralanmasında, sekonder hasar mekanizmalarını etkin ve güvenli bir şekilde baskılamayı başaran terapötik ajanlar gelecekte kurgulanacak klinik araştırmalara konu edilebilecektir.

Abstract:
Spinal cord injuries can be broadly classified into primary and secondary injury phases. The primary damage is the most critical factor determining the extent of injury, and it occurs at the time of the initial physical force that caused the injury. On the other hand, the secondary injury cascade refers to a series of changes that begin shortly after the spinal cord injury and can persist for up to 6 months after the initial incident. Studies have shown that the loss of functional cells due to secondary damage mechanisms exceeds the loss caused by the primary damage. Promising therapeutic approaches aim to mitigate the effects of secondary damage pathways and are significant in the search for effective treatments.

Recent research has revealed three new non-apoptotic controlled cell death pathways: necroptosis, pyroptosis, and ferroptosis. Following their discovery, the focus of scientific efforts has shifted towards developing new treatment strategies by understanding the roles of these pathways in various diseases. However, it is crucial to remember that the cell production-destruction cycle plays a vital role in maintaining homeostasis. Therefore, inhibiting these controlled cell death pathways during disease treatment may potentially lead to other health issues. When interpreting or applying data from such studies, it is essential to consider that biochemical pathways may behave differently in in-vivo and in-vitro settings. Additionally, dose-dependent effects can vary significantly at different dosage levels within the same model.
To provide a brief summary of the molecular steps involved in ferroptosis, it is characterized by the depletion of glutathione (GSH) and the accumulation of iron within the cell. This leads to the inactivation of GPX4 (Glutathione peroxidase 4), which is responsible for reducing lipid peroxides. Consequently, there is an increase in lipid peroxidation and lipid reactive oxygen species within the cell.

In potential new therapeutic endeavors aimed at suppressing the ferroptosis pathway, several key mechanisms can be targeted. These include preventing the accumulation of iron, inhibiting the increase of reactive oxygen species, and mitigating lipid peroxidation. It is important to note that the heterogeneity and complexity of the ferroptosis-related pathways suggest the existence of numerous unknown factors that are yet to be discovered in this field. While it has been clearly demonstrated that ferroptosis is involved in secondary damage pathways following spinal cord injury, a definitive therapeutic advantage that can be translated into clinical practice has not been achieved yet. Further research and development are needed to fully harness its potential in clinical applications.

Previous studies have explored and demonstrated the therapeutic efficacy of deferoxamine following spinal cord injury. However, what remains unidentified here are the pathways through which deferoxamine operates and the potential regulators involved in this process.

Numerous studies have investigated the silibinin molecule using different models, demonstrating its antioxidant, pro-apoptotic, and anti-inflammatory properties. These pharmacological effects have been observed in both in-vivo and clinical studies, showcasing its neuroprotective, hepatoprotective, anti-cancer, anti-diabetic, cardioprotective, and immunomodulatory properties. Notably, silibinin's antioxidant activity stands out, as it directly neutralizes reactive oxygen species (ROS) such as O2-, H2O2, and OH , modulates signal pathways (Nrf2, PPAR, NF-kB), increases the levels of antioxidant enzymes (SOD, CAT, GPX), suppresses prooxidant enzymes (NOX, Xanthine oxidase), and chelates metal ions.

Our study was designed as an experimental animal model, where we utilized the clip-compression method to induce spinal cord injury. We collected samples from the spinal cord tissue at 24 hours, 72 hours, and 6 weeks. These samples were then subjected to biochemical analyses to measure Fe+2, GSH, GPX4, TfR1, FPN, MDA, and 4-HNE levels. To assess functional improvement, we employed the BBB locomotor scale as an evaluation tool.

Based on the data obtained from this study, it was revealed that iron chelation plays a significant role in mediating the effects of silibinin. The results indicated that the silibinin molecule effectively reduces MDA levels compared to the spinal cord injury (SCI) group, although DFO demonstrates a more pronounced reduction in MDA levels starting from the 72nd hour. Additionally, the application of DFO consistently maintains higher GSH levels throughout all three time points compared to the untreated group and significantly inhibits the GPX4 pathway. These findings support the notion that silibinin exerts its antioxidant activity through GSH and has the potential to enhance the activity of GPX4, a crucial enzyme in the context of ferroptosis. Regarding 4-HNE levels, the effectiveness of DFO diminishes after long-term treatment, whereas the silibinin group continues to significantly decrease 4-HNE levels throughout the follow-up period. Thus, silibinin appears to be more effective than DFO in reducing lipid peroxidation products based on the 4-HNE values.

Both DFO and silibinin demonstrated short-term effects on TfR1. Functionally, both treatments led to higher recovery scores at the end of the 6-week follow-up period compared to the control group, with silibinin receiving higher scores in the direct comparison between silibinin and DFO.

The therapeutic efficacy of the silibinin molecule in the spinal cord injury model can be attributed to its antiferroptotic effects on iron metabolism and its impact on lipid peroxidation. Silibinin's effectiveness was demonstrated to surpass that of deferoxamine, resulting in a more significant locomotor recovery. As such, silibinin presents itself as a superior option to deferoxamine. Nonetheless, many questions surrounding the ferroptosis pathway and its regulators remain to be answered in spinal cord injury studies and various research areas. Considering the importance of secondary cell death in spinal cord injury, therapeutic agents that can effectively and safely suppress secondary damage mechanisms may serve as promising subjects for future clinical studies