Dikumarolün bir antikanser ajanı olarak mitotik ve mayotik hücreler üzerine etkileri
Effects of dicoumarol  on mitotic and meiotic cells as an anticancer agent
Yazar: DURU ARAS
Danışman: PROF. DR. ALP CAN ; DOÇ. DR. ÖZGÜR ÇINAR
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Çeşitli kanser hücre hatlarında bazı kumarin türevlerinin antikanser etki gösterdiği bilinmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, bir kumarin türevi olan dikumarolün çeşitli kanser hücre hatlarında hücre çoğalmasını baskıladığını, bazı antikanser ajanlarının sitotoksik etkilerini değiştirdiğini ve pankreas kanseri hücrelerinde apopitotik hücre ölümünü arttırdığını ortaya koymaktadır. Yaygın olarak kullanılan bazı antikanser ajanları gonad yetmezliğine ve buna bağlı olarak infertiliteye neden olmaktadır. Çalışmamızda dikumarolün bir antikanser ajanı olarak klinik kullanım potansiyelinin doğurganlığın korunması yönünden değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla dişi BALB/c farelerin ovaryumlarından ovositler ve bunları barındıran granüloza hücreleri izole edilmiştir. Dikumarol uygulanan ovositlerin in vitro matürasyonları izlenerek, metafaz-II aşamasına ulaşan ovositler mayoz mekiği ve kromozom morfolojileri açısından değerlendirilmiştir. Dikumarolün granüloza hücrelerinde hücre çoğalması, canlılık oranları ve apopitotik hücre ölümüne etkileri Vero (maymun böbrek epiteli) ve MCF-7 (insan meme kanseri) hücre hatlarıyla karşılaştırmalı olarak gösterilmiştir. İntraperitoneal olarak dikumarol uygulanan farelerde ovaryumun farklı bileşenlerinde apopitozun değişimi incelenmiştir. 

Çalışmamızda dikumarolün Vero ve MCF-7 hücrelerinde hücre çoğalmasını baskıladığı, canlılık oranlarını düşürdüğü ve apopitotik hücre ölümünü arttırdığı gözlenmiştir. Doz ve süre bağımlı bu etkiler granüloza hücrelerinde izlenmemiştir. İn vivo veya in vitro dikumarol uygulamasının ovosit matürasyonunu engellemediği belirlenmiştir. Metafaz-II evresine ulaşan ovositlerde mayoz mekiği ve kromozom morfolojileri normal görünümde izlenmiştir. İn vivo dikumarol uygulanan farelerin ovaryumlarında apopitotik hücre ölümünde bir artışa rastlanmamıştır. Hücre bölünmesi üzerine etkili olması beklenen bir antikanser ajanının hücre çoğalmasını baskılarken ve/veya hücre ölümünü uyarırken sağlıklı hücrelere zarar vermemesi istenir. Bu çerçeveden bakıldığında elde ettiğimiz bulgular dikumarolün ideal bir antikanser ajanı olduğunu ortaya koymaktadır.

Dikumarol bir hücre içi oksidoredüktaz olan NQO1'in inhibitörüdür. Son yıllarda dikumarolün mikrotübülüsleri stabilize edebildiği öne sürülmektedir. Farklı çalışmalar dikumarolün antikanser etkilerini NQO1 proteininin inhibisyonu veya mikrotübülüs stabilizasyonuyla açıklamaktadır. Çalışmamızda her iki hipotez de şu gerekçelerle reddedilmiştir: 1) Vero hücrelerinde NQO1 ifadesine rastlanmamıştır. 2) Dikumarol uygulanan Vero, MCF-7 ve granüloza hücrelerinde mitozun duraklamadığı gösterilmiştir. 3) Dikumarol uygulanan germinal vezikül evresindeki ovositler mayoz bölünmelerini tamamlamıştır. Çalışmamızda Vero ve MCF-7 hücreleri kültür ortamında hızlı çoğalan, granüloza hücreleri ise yavaş çoğalan hücreler olarak tanımlanmıştır. Buna göre dikumarolün antikanser etkileri hücrelerin çoğalma hızlarıyla ilişkili olabilir. İlerleyen çalışmalarda bu ilişkiyi düzenleyen moleküler mekanizmaların aydınlatılması literatüre önemli katkı sağlayacaktır.

Abstract:
It is known that certain coumarin derivatives indicate anticancer effects at various cancer cell lines. Recent studies suggest that dicumarol, a coumarin derivative, suppresses cell proliferation in various cancer cell lines, changes cytotoxic effects of certain anticancer agents and increases apoptotic cell death at pancreatic cancer cells. Some widely used anticancer agents consequently lead to gonadal failure and thus infertility. This study targets to assess the potential clinical use of dicumarol as an anticancer agent in terms of fertility preservation. For this purpose, oocytes and surrounding granulosa cells were isolated from the ovaries of female BALB/c mice. In vitro maturation of dicoumarol treated oocytes were monitored. Metaphase-II stage oocytes were examined in terms of meiotic spindle and chromosome morphology. Dicumarol's effects on cell proliferation, viability and apopitotic cell death in granulosa cells, as well as Vero (monkey kidney epithelial) and MCF-7 (human breast cancer) cell lines were determined. Apopitotic changes in the ovaries of dicoumarol treated mice were marked.

The study has shown that dicumarol suppresses cell proliferation, decreases viability and increases apopitotic cell death in Vero and MCF-7 cells. The dose and duration dependent effects were not observed in granulosa cells. It is also determined that in vivo or in vitro dicumarol application doesn't block oocyte maturation. Meiotic spindle and chromosome morphology of metaphase-II stage oocytes were normal. Ovaries of dicoumarol treated mice had shown no significant change in apopitosis. Cell division targeted anticancer agents are expected to inhibit cell proliferation and/or induce cell death without damaging healthy cells. From this point of view our findings reveal that dicumarol is an ideal anticancer agent.

Dicumarol is an inhibitor of NQO1 protein which is an intracellular oxidoreductase. In recent years it has been suggested that dicumarol is able to stabilize microtubules. Different studies disclose the anticancer effects of dicumarol as the inhibition of NQO1 or the stabilization of microtubules. In our study both hypothesis were rejected due to following reasons: 1) No NQO1 expression was observed in Vero cells. 2) No pause in mitosis has been shown in dicumarol treated Vero, MCF-7 or granulosa cells. 3) Dicumarol treated germinal vesicule stage oocytes has completed meiosis in given time. In our study Vero and MCF- 7 cells were described as rapidly proliferating cells in culture media, where granulosa cell proliferation is gradually slow. Accordingly dicumarol's anticancer effects may be associated with the proliferative properties of the cells. Following studies enlightening the molecular mechanisms regulating this relationship will provide an important contribution to the literature.