İnsan akciğer fibroblastlarında kollagen sekresyon vesiküllerinin taşınmasından sorumlu moleküllerin belirlenmesi
Identification of molecules responsible for the transport of collagen secretion vesicles in human lung fibroblasts
Yazar: RESUL KIYMAZ
Danışman: PROF. DR. FÜSÜN ÖZTAY
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Fibrozis, başta kollagen ve fibronektin proteinleri olmak üzere, ekstrasellülar matriks (ECM)
elemanlarının aşırı miktarda üretimi ve interstisiyel alanda birikimi ile karakterize edilen
patolojik bir durumdur. Akciğer dahil, deri, karaciğer, böbrek ve kalp olmak üzere pek çok
organda görülebilmektedir. Kollagen, fibrotik odaklarda birikerek dokunun sertleşmesine ve
scar doku oluşumuna neden olur. Salgı proteinlerinin hücre içinde taşınmasında kinesin motor
proteinleri (KIF) görev alır. Farklı KIF'lerin farklı salgı moleküllerini taşıyan sekresyon
vesiküllerine bağlandıkları düşünülmektedir. Pulmoner fibrozise katkı sağlayan akciğer
fibroblastlarında, kollagen içeren sekresyon vesiküllerinin hücre periferine taşınmasından
sorumlu KIF'ler bilinmemektedir. Çalışmamızda, insan akciğer fibroblastlarında (MRC-5
hücreleri) ve interstisiyel akciğer hastalarından alınan fibrotik akciğer örneklerinde kollagen
taşınmasından sorumlu KIF proteinlerinin ve onların muhtemel regülatör proteinlerinin
belirlenmesine odaklanılmıştır.
Transforme edici büyüme faktörü-beta (TGF-β, 1ng/ml) ile kollagen sentezi ve sekresyonu
uyarılan MRC-5 hücreleri, uyarımı takip eden 24, 48 ve 72. saatlerde toplandılar. Hücrelerden
ve medyumdan RNA ve protein izolasyonları yapıldı. Kollagen taşınımı ile ilişkili olabilecek
KIF'leri kodlayan genlerin mRNA seviyeleri qRT-PCR ile belirlendi. Ayrıca, hücresel ve
salgılanan kollagen ve fibronektin miktarları ile hücrelerdeki KIF5A, kinesin bağlayıcı protein
(KBP) ve mikrotübül ile ilişkili protein-7 (MAP7) seviyeleri Western emdirim yöntemi ile
belirlendi. PCR sonuçlarına göre seçilen KIF genlerinin farklılaşmış gen ifade düzeyleri,
idiyopatik pulmoner fibrozisli hastalarının primer akciğer fibroblastlarına ait RNA dizileme
verileri kullanılarak karşılaştırıldı. Ayrıca, fibrotik ve fibrotik olmayan insan akciğerlerinde
İNSAN AKCİĞER FİBROBLASTLARINDA KOLLAGEN SEKRESYON
VESİKÜLLERİNİN TAŞINMASINDAN SORUMLU MOLEKÜLLERİN
BELİRLENMESİ
xiv
kollagen, fibronektin, KIF5A, KBP ve MAP7 protein seviyeleri yanı sıra Co-IP analizleri ile
KIF5A/MAP7 ve KIF5A/KBP fiziksel etkileşimleri belirlendi.
TGF-β uyarımını takip eden zaman diliminde deneyin 24. saatinden itibaren kollagen ve
fibronektin gibi ECM elemanlarının sentezi ve deneyin 48 ve 72. saatlerinde bu moleküllerin
hücrelerden sekresyonu arttı. Kollagen sentezi ve hücreden salgılanmasının yüksek olduğu
zaman diliminde, salgı vesiküllerin taşınmasında etkiliği olabileceği düşünülen KIF'lerden
KIF3A, KIF3B, KIF5A, KIF13A, KIF13B ve KIFC3 genlerinin ifade düzeylerinin arttığı
belirlendi. Bu KIF'ler arasından, hücrede kollagen geninin transkripsiyonunun, protein
miktarının artış gösterdiği ve salgılanmak üzere hücre periferine taşındığı zamanlarda
ekspresyonları artış gösterenler dikkate alındığında, KIF5A'nın ifade düzeyinin değişimlerin
hücre içi kollagen sentezindeki ve hücre içi taşınımla paralel değişimler (artış yönünde)
sergilediği tespit edildi. Miyofibroblast farklılaşmasının uyarıldığı MRC-5 hücrelerinde KBP
protein miktarı ilk 24 saatte artarken, daha sonra kollagen sekresyon granüllerinin hücre
periferine taşınımının ve hücreden sekresyonunun arttığı zamanlarda (deneyin 48 ve 72.
saatlerinde) azaldı. TGF-β ile uyraılan MRC-5 hücrelerinde MAP7 proteinin varlığı tespit
edilmedi. İnsan fibrotik akciğerleri üerinde yapılan analizler, fibrotik akciğerlerde kontrollere
kıyasla daha yüksek miktarda KIF5A, KBP ve MAP7 olduğunu gösterdi. Ayrıca, insan
akciğerlerinde yapılan Co-KIF5A IP analizleri ile KIF5A ve KBP arasında fiziksel bir
etkileşimin varlığını ortaya koydu.
Çalışmamzın verileri dikkate alındığında, TGF-β ile uyarılan MRC-5 hücrelerinde ve fibrotik
insan akciğerlerinde kollagenin salgılanmak üzere hücre periferine taşınmasında KIF5A ve
KBP'nin birlikte görev alabileceği ve bu süreçte KBP'nin KIF5A'nın negatif regülatörü
olarak KIF5A aracılı kollagen taşınımını regüle edebileceğini düşünülmektedir. İnsan akciğer
fibroblastlarında kollagenin salgılanmak üzere hücre periferine taşınmasının önlenmesinde
KIF5A ve KBP'nin bu yeni anti-fibrotik tedavi yaklaşımı için hedef moleküller olarak
önerilebilir.

Abstract:
Fibrosis is a pathological condition characterized by excessive production and accumulation of
extracellular matrix (ECM) elements, mainly collagen and fibronectin proteins, in the
interstitial space. It can be seen in many organs, including the lung, skin, liver, kidney, and
heart. Collagen accumulates in fibrotic foci and contributes to the hardening of the tissue and
scar tissue formation. Kinesin motor proteins (KIF) are involved in the transport of secretory
proteins inside the cell. Different members of KIFs are thought to bind to secretory vesicles
carrying different secretion molecules. However, the KIFs responsible for transporting
collagen-containing secretion vesicles to the cell periphery are unknown in lung fibroblasts
contributing to pulmonary fibrosis. In the current study, the KIF proteins responsible for
collagen transport and their possible regulatory proteins were investigated in human lung
fibroblasts (MRC-5 cells) and fibrotic lung samples from patients with interstitial lung diseases.
Collagen synthesis and secretion were stimulated by transforming growth factor-beta (TGF-β,
1ng/ml) in MRC-5 cells. They were harvested at 24, 48, and 72 hours after stimulation. RNAs
and proteins were isolated from cells and medium. The mRNA levels of genes encoding KIFs
that may be associated with collagen transport were determined by qRT-PCR. In addition,
cellular and secreted collagen and fibronectin amounts and KIF5A, kinesin-binding protein
(KBP), and microtubule-associated protein-7 (MAP7) levels in cells were assayed by Western
blotting. Altered gene expression levels of KIF genes selected based on PCR results were
compared using the RNA-seq data of primary lung fibroblasts of patients with idiopathic
pulmonary fibrosis. In addition, collagen, fibronectin, KIF5A, KBP, and MAP7 protein levels
and possible physical interactions of KIF5A/MAP7 and KIF5A/KBP were determined by
Western blot and Co-KIF5A-IP analyses in fibrotic and non-fibrotic human lungs.
IDENTIFICATION OF MOLECULES RESPONSIBLE FOR THE
TRANSPORT OF COLLAGEN SECRETION VESICLES IN HUMAN LUNG
FIBROBLASTS
xvi
Following TGF-β stimulation, the synthesis of ECM elements such as collagen and fibronectin
increased from the 24th hour of the experiment, and the secretion of these molecules from the
cells at the 48th and 72nd hours. Furthermore, it was determined that the expression levels of
KIF3A, KIF3B, KIF5A, KIF13A, KIF13B, and KIFC3 genes are thought to be effective in the
transport of secretory vesicles increased during the stage when collagen synthesis and secretion
from the cell were high. We detected that the alterations (in the direction of increase) in the
expression level of KIF5A were in parallel with the alterations in the intracellular collagen
synthesis and intracellular transport, taken into consideration among all KIFs, having induced
gene expression when the transcription and translation of the collagen gene, and its transport to
the periphery of the cell for secretion. In MRC-5 cells, which differentiate into myofibroblast,
the level of KBP protein increased in the first 24 hours, then it decreased when the transport of
collagen secretion granules to the cell periphery and their secretion from the cell increased (at
48 and 72 hours of the experiment). MAP7 protein was not detected in MRC-5 cells stimulated
with TGF-β. Analyzes on human fibrotic lungs showed increased KIF5A, KBP, and MAP7
levels in fibrotic lungs compared to controls. Also, analyses of Co-KIF5A-IP in human lungs
revealed the existence of a physical interaction between KIF5A and KBP.
The current study's data revealed that KIF5A and KBP might transport collagen to the cell
periphery for secretion in MRC-5 cells stimulated with TGF-β and fibrotic human lungs.
Additionally, KBP can regulate KIF5A-mediated collagen transport in the cell as a negative
regulator of KIF5A. Therefore, KIF5A and KBP can be suggested as target molecules for this
novel anti-fibrotic treatment approach in preventing collagen transport to the cell periphery
for secretion in human lung fibroblasts.