Erken embriyonik dönemde alkalozdan savunma mekanizmasının incelenmesi
Investigation of activity changes of anion exchanger against  intracellular alkalosis during early preimplantation embryonic stages
Yazar: ŞENAY DAĞILGAN
Danışman: PROF. DR. ŞEREF ERDOĞAN
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Alkaloz = Alkalosis ; Anyonlar = Anions ; Embriyo = Embryo ; Fareler = Mice ; Hidrojen iyon konsantrasyonu = Hydrogen-ion concentration ; Hücreler = Cells ; Zigot = Zygote

Özet:
Hücre içi pH (pHi) düzenlenmesi, temel homeostatik mekanizmalardan biridir. Bu düzenleme, alkali şoklara karşı HCO3-/ Cl- değiştiricisi (AE), asidik şoklara karşı ise Na+/H+ ile Na+,HCO3-/Cl- değiştiricileri ile gerçekleştirilir. Yeni canlının gelişimini sağlayacak olan oosit ve sonuçta gelişen embriyoların sağlıklı olabilmesi için, bu düzenleyicilerle pHi değerlerini dar sınırlar içinde tutmaları gerekir. Yapılan çalışmalar, profaz I aşamasındaki oositlerde AE aktif iken mayotik matürasyon sürecinde bu değiştiricinin baskılandığını göstermiştir. Bu çalışmada ise, saptanan bu değişimin daha sonraki embriyonik gelişim aşamalarında,   pronüklear zigottan (PN) sekiz hücreli (8h) embriyolara kadar, incelenmesi amaçlanmıştır. 
Çalışmada beş ? sekiz haftalık matür Balb/c soyu farelere süperovülasyon protokolü uygulanarak ve kopülasyonları sağlanarak uygun zamanlarda PN zigot, iki hücreli (2h), dört hücreli (4h) ve 8h embriyolar elde edildi. Kültür ve kayıt solüsyonları olarak KSOM esaslı solüsyonlar kullanıldı. Elde edilen zigot ve embriyolar, pH-sensitif florofor 2,7 bis karboksi etil 5-6 karboksi florosin (BCECF) ile yüklendi ve mikrospektrofluorometrik yöntem ile ratiometrik olarak pHi kayıtları alındı. Cl- uzaklaştırma metodu ile AE aktivitesi fonksiyonel olarak saptandı. Zigot/embriyoların amonyum puls tekniği ile indüklenen alkalozdan iyileşmeleri ve bu iyileşmelerin AE inhibitörü DIDS ile etkilenmesi incelendi. 
Hücreleri alkali şoklardan koruyan AE aktivitesi, PN zigot aşamasında yüksek iken (0,068±0,01 pHU/dk)  2h, 4h ve 8h embriyo aşamasına kadar olan gelişimsel süreçte giderek azaldı (pHU/dk olarak sırasıyla; 0,058±0,01; 0,042±0,01 ve 0,033±0,01). Aktivitedeki bu azalma 8h aşamada, PN zigot ve 2h embriyo değerlerine göre, istatistiksel olarak anlamlı idi (p<0,05). PN zigot ve tüm embriyo aşamalarında indüklenmiş alkali şoklardan tam olarak iyileşme gerçekleşti. Çalışılan PN zigot, 2h ve 4h embriyolarda AE aktivitesi, ortama eklenen DIDS ile anlamlı olarak baskılandı ancak DIDS, 8h embriyolarda etkisiz idi.  
 Preimplantasyon aşamalarında bulunan PN zigot, 2h, 4h ve 8h embriyoların gelişim sürecinde AE aktivitesi giderek azalmakta, buna karşın çalışılan tüm aşamalarda alkalozdan iyileşme tam olarak gerçekleşmektedir. Bu iyileşme PN zigot, 2h ve 4h embriyolarda AE aktivitesi sayesinde olmakta iken 8h embriyolarda alkalozdan iyileşmenin doğası saptanamamıştır. Bu bulgular ışığında, gelişmekte ve metabolizmaları değişmekte olan embriyoların (daha fazla asidik yük oluştururlar), alkali ovidukttan asidik uterusa ilerlerken,  metabolizma ve dış ortamlarına uygun şekilde savunma mekanizmalarını oluşturdukları sonucuna varılabilir. 

Anahtar Sözcükler: Anyon değiştirici, fare, hücre içi pH düzenlenmesi, zigot, embriyo

Abstract:
Intracellular pH (pHi) regulation is an important component of mammalian cell homeostasis. pHi is maintained within a narrow range by three major regulatory-mechanisms: the HCO3-/Cl- exchanger (AE), which alleviates alkalosis, and the Na+/H+ (NHE) and Na+-dependent HCO3-/Cl- (NDCBE) exchangers, both of which alleviate acidosis. pHi should be kept within narrow range by these regulators for healthy developing embryos, as well.  Findings of studies performed showed that although AE activity of oocyte at prophase I stage high, this activity is inhibited during meiotic maturation. In this study, we aimed to investigate AE activity during early preimplantation embryonic developmental process, from PN zygote to 8-c stage. 
In this study, PN zygotes, two-cell (2-c), four-cell (4-c), eight-cell (8-c) stage embryos were obtained by classical procedure from 5-8 week old mature female Balb/c strain mouse following superovulation protocol. KSOM based solutions were used as culture and recording solutions. Intracellular pH (pHi) was recorded by using microspectrofluorometric technique from zygotes/embryos which were loaded with pH-sensitive florophore, BCECF. AE activity was determined by Cl- removal assay. Function of AE was investigated using recovery response from induced-alkalosis and confirmed by DIDS, specific inhibitor of AE.
While AE activity was high at PN zygotes (0,068±0,01 pHU/min), this activity gradually decreased as embryos develop to 2-c, 4-c and 8-c stages (in pHU/min; 0,058±0,01, 0,042±0,01 and 0,033±0,01, respectively). These activity changes were statistically significant at PN zygote and 2-c embryo when compared to 8-c stage (p<0,05). Complete recovery from induced-alkalosis was determined at all-stages of embryos; and, DIDS inhibited these recovery responses at all stages except 8-c embryo.
	In the light of these findings, it is possible to conclude that embryos, which are developing and changing their metabolisms, constitute appropriate defense mechanisms in accordance with the environment, as they move along from alkaline oviduct to acidic uterus.

Keywords: Anion exchanger, mouse, intracellular pH regulation, zygote, embryo