Sağlıklı insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden (uPKH'lerden) NGN2, LHX3 ve ISL1 üçlü kasedi kullanarak motor nöron eldesi
Motor neuron generation from healthy human induced pluripotent stem cells (iPSC) Using NGN2, LHX3 and isl1 triple cassette
Yazar: RUMEYSA TAŞPINAR
Danışman: PROF. DR. FAHRİYE DUYGU UÇKAN ÇETİNKAYA ; DOÇ. DR. AYÇA ARSLAN ERGÜL
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı / Kök Hücre Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Amyotrofik lateral skleroz = Amyotrophic lateral sclerosis ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Kök hücreler = Stem cells ; Motor nöronlar = Motor neurons ; Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Nöronlar = Neurons ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells

Özet:
Nörodejeneratif hastalıklar bireylerin yaşam standartını düşüren, önemli fonskiyonel kayıplara yol açan, ilerleyici ve ölümcül hastalıklardır. Amyotropik lateral skleroz (ALS) hastalığı motor nöron dejenerasyonunun yol açtığı bir hastalıktır ve alt-üst motor nöronları etkilemektedir. ALS hastalığında Superoxide dismutaz (SOD1) genin yanı sıra yaklaşık 40 gen mutasyonunun da bu hastalıkta etkin olduğu görülmüştür. Spinal müsküler atrofi (SMA), SMN1 ve SMN2 genlerindeki mutasyonlar sonucu ortaya çıkan kalıtsal bir hastalıktır. SMA hastalığı motor nöronları etkileyerek kas distrofisine sebep olur. Bireyin merkezi, periferik ve iskelet kas sisteminin kontrollü kas hareketlerini etkiler ve giderek artan güçsüzlük, kas kütlesi kaybı semptomları ile karakterizedir. Nörodejeneratif hastalıkları çalışabilmek için çeşitli yöntemler kullanılmakta fakat insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (uPKH'ler) insan hastalıklarının seyrini anlayabilmek ve kişisel tedavi yöntemlerini geliştirmek için güçlü bir alternatif oluşturmaktadır. Bu tez çalışmasında sağlıklı insan uPKH'lerinden Neurogenin 2 (NGN2), Islet 1 (ISL1), LIM homeobox 3 (LHX3) üçlü piggyBac plasmid kaseti kullanılarak motor nöron elde edilmiştir. uPKH'lere piggyBac üçlü kaseti lipid-aracılı transfeksiyon yöntemi ile transfekte edilmiş ve stabil transfekte olan hücreler puromisin seleksiyonu ile seçilmiştir. Doksisiklin ile uyarılan hücrelerde transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi sağlanarak uPKH'lerin nöral soya geçişi sağlanmıştır. Elde edilen motor nöronların karakterizasyonu nöronal gen ifadelerine bakılarak ve nöronal belirteçlerle immün floresan boyanarak yapılmıştır. İleride çeşitli ilaç denemelerinin yapılacağı motor nöron hastalıklarını modellemek için kullanılacak bu yöntem ile ön veri sağlanmış ve yöntem optimize edilmiştir.

Abstract:
Neurodegenerative diseases are progressive and fatal diseases that reduce the standard of living of individuals and cause significant functional losses. Amyotropic lateral sclerosis (ALS) is a disease caused by motor neurone degeneration and affects upper and lower motor neurons. In addition to the Superoxide dismutase (SOD1) gene, approximately 40 gene mutations have been found to be effective in ALS. Spinal muscular atrophy (SMA) is an inherited disease caused by mutations in the SMN1 and SMN2 genes. SMA affects motor neurons and causes muscular dystrophy. It affects the controlled muscle movements of the individual's central, peripheral and skeletal musculature and is characterised by symptoms of progressive weakness and loss of muscle mass. Various methods have been used to study neurodegenerative diseases, but human induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a powerful alternative to understand the course of human diseases and to develop personalised therapies. In this thesis, motor neurons were obtained from healthy human iPSCs using Neurogenin 2 (NGN2), Islet 1 (ISL1), LIM homeobox 3 (LHX3) triple piggyBac plasmid cassette. iPSCs were transfected with the piggyBac triple cassette by lipid-mediated transfection method and stably transfected cells were selected by puromycin selection. In doxycycline-stimulated cells, transcription factors were overexpressed and iPSCs were transferred to neural lineage. The obtained motor neurons were characterized by analyzing neuronal gene expression and immunofluorescent staining with neuronal markers. With this method, preliminary data was provided and the method was optimized to be used to model motor neuron diseases for future drug trials.